(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における三種陰性乳癌の治療に使用するための組成物であって、
（ａ）ヘレグリン−αの受容体結合ドメインに由来するＨｅｒセグメントと、ペントンベースセグメントと、正電荷を持つドメインと、を含むポリペプチド分子、ならびに
（ｂ）（１）前記ポリペプチドの配列に静電相互作用により結合された核酸分子、および前記核酸分子に非共有結合により連結された化学療法薬；または（２）前記ポリペプチド分子に結合されたコロール分子、
を含む薬物送達分子を含み、
前記三種陰性乳癌はＨＥＲ３を発現する、
組成物。
【請求項２】
前記正電荷を持つドメインがポリリジンモチーフである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記正電荷を持つドメインがデカリジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリペプチド分子はＨｅｒＰＢＫ１０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記薬物送達分子が、前記ポリペプチドの配列に静電相互作用により結合された核酸分子と、前記核酸分子に非共有結合により連結された化学療法薬と、を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９に記載されるポリヌクレオチド配列またはそれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸分子は二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチドは前記ポリペプチド分子に静電相互作用により結合されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記化学療法薬はドキソルビシンまたはその薬学的等価物である、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記化学療法薬は、前記核酸分子にインターカレートされている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記薬物送達分子は、前記ポリペプチド分子に結合されたコロール分子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記コロール分子がスルホン化コロール分子である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記コロール分子は、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）またはガリウム（Ｇａ）を含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記薬物送達分子はＨｅｒＭｎ、ＨｅｒＦｅまたはＨｅｒＧａである、請求項１〜４および１１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年４月４日に、Ｌａｌｉ  Ｋ．ＭＥＤＩＮＡ−ＫＡＵＷＥらにより出願され、「ＨＥＲ３標的ナノ粒子によりトラスツズマブ耐性ＨＥＲ２＋乳癌を標的にすること（“ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＴＲＡＳＴＵＺＵＭＡＢ  ＲＥＳＩＳＴＡＮＴ  ＨＥＲ２＋  ＢＲＥＡＳＴ  ＣＡＮＣＥＲ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＨＥＲ３−ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ  ＮＡＮＯＰＡＲＴＩＣＬＥ”）」と題する米国仮特許出願第６１／９７５，６８７号（図面を含むその全開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）について優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、これによりその全体が参照により組み込まれる配列表を含む。２０１５年４月４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーはＥＯＳ００６ＰＣＴ＿ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと指定され、サイズが１７キロバイトである。
【０００３】
政府権利
本明細書で開示される対象物は、国立衛生研究所／国立癌研究所により与えられた認可番号ＮＩＨ／ＮＣＩ  Ｒ０１  ＣＡ１４０９９５号およびＮＩＨ／ＮＣＩ  Ｒ０１  ＣＡ１２９８２２号の助成金を受け、政府支援によりなされた。米国政府は開示された対象物において一定の権利を有する。
【０００４】
発明の分野
本発明は、治療学の分野、より特定的には癌治療の分野に含まれる。
【背景技術】
【０００５】
細胞中のＨＥＲファミリーの受容体、例えばＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４受容体の過剰発現により、細胞において強く、一定の増殖シグナル伝達が引き起こされ、これにより、最終的に特定の型の癌、例えば乳癌の発症が引き起こされることがよく知られている。ＨＥＲ２陽性乳癌は侵襲性乳癌のほぼ４分の１に相当し、低い患者の生存を示す。トラスツズマブはＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体を妨害するモノクローナル抗体である。それは、現在のところ、特定の乳癌の治療のために、いくつかの商標名、例えばハーセプチン（登録商標）で市販されている。ペルツズマブは別のモノクローナル抗ＨＥＲ２抗体であり、これは癌治療に使用される。ラパチニブは乳癌において治療効果を発揮する小分子有機化合物である。これらの療法は一般に、他の治療レジメンが失敗した後、癌に対する最後のとりでとして使用される。不運なことに、ＨＥＲ２陽性乳癌を有する多くの患者は、最初、これらの抗ＨＥＲ２治療に応答するが、かなり患者がこれらの療法に耐性を示すようになる。いったん、後期治療に対する耐性が現れると、実際、治療の選択肢は非常に少なくなる。その結果として、これらの療法に対して非応答性であるか、または耐性となったこれらのＨＥＲ２＋腫瘍に対して有効な新しい薬物を開発することが大いに必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
患者において癌を治療する方法が本明細書で開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法による治療に耐性がある患者を同定すること；ならびに患者に、ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ポリペプチド配列に、静電相互作用により結合された核酸分子；ならびに核酸配列に非共有結合により連結された化学物質、を含む薬物送達分子を投与することを含む。抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法もまた開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を薬物送達分子と接触させることを含む。
【０００７】
さらに、患者において癌を治療する方法が本明細書で開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法に耐性がある患者を同定すること；ならびに患者に治療的有効量の、ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびにポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子を含む、薬物送達分子を投与することを含む。最後に抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法が本明細書で開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を、ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびにポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子を含む薬物送達分子と接触させることを含む。
【０００８】
図２５は、ＨｅｒＤｏｘは腫瘍標的送達をインビトロおよびインビボで媒介することを示す。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施形態による送達系を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態による、ＤｏｘをＨＥＲ２＋乳癌細胞に送達するように構成された送達系を示す図である。工程（１）は細菌において組換え融合タンパク質として産生および精製されたＨＥＲＰＢＫ１０を示す。工程（２）は非共有結合インターカレーション相互作用により形成されたＤＮＡ−Ｄｏｘを示す。工程（３）は、ＤＮＡ−Ｄｏｘは非共有結合性電荷相互作用によりＨｅｒＰＢＫ１０に結合することを（アニオン性ＤＮＡリン酸は求電子的にカチオン性ポリリジンに結合する）を示す。
【図３】本発明の一実施形態による、ＤｏｘをＨＥＲ２＋乳癌細胞に送達するように構成された送達系の動作の概略図であり、（１）細胞膜での受容体結合、（２）複合体のインターナリゼーション、（３）インターカレーション相互作用により、ｄｓＤＮＡに非共有結合により結合された化学療法薬（Ｄｏｘ）のサイトゾル放出、ならびに（４）化学療法薬およびｄｓＤＮＡの核侵入が含まれる。
【図４Ａ】ＤＮＡ−Ｄｏｘアセンブリ中の濾液中の相対Ｄｏｘを示す図である。相補的な３０ｂｐオリゴヌクレオチドをアニールすることにより調製したｄｓ−オリゴを１時間室温で、Ｄｏｘと共に１：１６モル比ＤＮＡ：Ｄｏｘでインキュベートした。遊離Ｄｏｘを１０ＭＷカットオフスピンカラムを通して濾過することにより除去した。最初のＤｏｘ除去スピン（洗浄１）後、フィルタを後４回、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）で洗浄した（洗浄２〜５）。
【図４Ｂ】ＤＮＡ−Ｄｏｘアセンブリ中の濾液および残余分のＵＶ／Ｖ吸光度を示す図である。
【図５】ＨｅｒＤｏｘアセンブリを示す図である。ＤＮＡ−ＤｏｘをＨｅｒＰＢＫ１０と、氷上で２時間、９：１モル比ＨｅｒＰＢＫ１０：ＤＮＡ−Ｄｏｘでインキュベートした。混合物を、サイズ排除ＨＰＬＣに供し、画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで６〜１０分で収集し、免疫ブロッティングした。ＨｅｒＤｏｘを、６分ピークから収集した。ＨｅｒＤｏｘ中のＤｏｘの濃度を、４８０ｎｍ（Ｄｏｘ吸収波長）で吸光度を測定することにより評価した。ＨｅｒＤｏｘ画分１〜５のＨＰＬＣ精製は、６〜１０分に収集した試料に対応する。画分１〜５の免疫ブロットはまた、ＨｅｒＰＢＫ１０を同定するために使用したペントンベース抗体と共に図示される。
【図６Ａ】異なる貯蔵条件下、または血清中でのコンジュゲート安定性を示す図である。ＨｅｒＤｏｘを１２日まで４℃、室温、または３７℃でインキュベートした。試料を、限外濾過スピンカラムを通して一日おきに濾過した。残余分および濾液吸光度を４８０ｎｍで測定し、それぞれ、コンジュゲートからの相対Ｄｏｘ保持または放出を決定した。
【図６Ｂ】培地中でのＨｅｒＤｏｘの細胞への長期曝露を模倣する。Ｎｉ−ＮＴＡビーズ上に固定されたＨｅｒＤｏｘを、ウシ血清と共にＤＭＥＭ中で、示された時間の間、３７℃でインキュベートし、その後、各試料をペレット化した。上清（濾液）およびビーズ溶離液（残余分）の吸光度を４８０ｎｍで測定し、Ｄｏｘを検出した。血清における相対Ｄｏｘ放出または保持は、対照に対して正規化されたものとして表される（血清を欠く対応する試料）。Ｎ＝３／時間点。対照と比較した試料のＴ検定（Ｐ＜０．０５）は有意の差を示さなかった。
【図７】標的毒性を示す図である。各細胞株をｒＨｅｒＤｏｘ（０．５μＭ  Ｄｏｘ  ｃｏｎｅ）、Ｄｏｘ単独（０．５μＭ）、またはＨｅｒＰＢＫ１０単独に、４時間、３７℃で完全（すなわち血清含有）培地中で曝露し、続いて、吸引して遊離コンジュゲートを除去し、新鮮培地を添加し、その間細胞を連続して増殖させた。細胞力価を代謝（すなわちＭＴＴ）アッセイにより決定した。図７上パネルは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＥＲ２−）およびＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ＨＥＲ２＋）細胞生存に関するＨｅｒＤｏｘの効果を示す。相対生存細胞数は、対応する未処置細胞の％として表される。図７下パネルはＨｅｒＤｏｘ、Ｄｏｘ単独、またはＨｅｒＰＢＫ１０単独のＨＥＲ２−およびＨＥＲ２＋細胞生存に関する比較を示す。処置の第３日の相対生存（未処置細胞の％として）が示される。
【図８】受容体特異性を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（ＨＥＲ２＋）細胞を、遊離リガンド（ｅＨＲＧ）と共に、ＨｅｒＤｏｘの１０×モル過剰で１時間、４℃にてインキュベートした。培地を吸引して、遊離ｅＨＲＧを除去し、ＨｅｒＤｏｘ（０．５μＭ）を含む新鮮培地を細胞に添加した。細胞生存を、ＭＴＴアッセイにより測定し、相対未処置細胞数の％として表した。
【図９Ａ】混合細胞培養におけるターゲティングを示す図である。等しい数のＭＤＡ−ＭＢ−４３５およびＧＦＰ（＋）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞をＤｏｘ単独（０．５μＭ）、Ｈｅｒ−Ｄｏｘ（０．５μＭＤｏｘを含む）、またはＨｅｒＰＢＫ１０（１．２μｇ／ウェル、ＨｅｒＤｏｘにおけるＨｅｒＰＢＫ１０に等しい）で処置した。ウェルをＧＦＰ蛍光（相対ＭＤＡ−ＭＢ−２３１数を決定する）およびクリスタルバイオレット染色（総細胞数を決定する）に対してアッセイした。
【図９Ｂ】さらに混合細胞培養におけるターゲティングを示す図である。細胞生存を、クリスタルバイオレット染色（総細胞）およびＧＦＰ蛍光（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞）に基づき対照（ｃｏｎ）細胞により正規化された、実験（ｅｘｐ）細胞の相対倍加時間（ＤＴ）を計算することにより決定した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５のＤＴを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のＤＴを総細胞ＤＴから減算することにより決定した。相対生存は処置の第２日に対して示される。
【図９Ｃ】細胞培養において安定性が存在することを示す図である。ＨｅｒＤｏｘを含む培地のアリコート（示された時間の間、３７℃でインキュベートした後）を２％アガロースゲル上で電気泳動させた。３７℃でＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水中、血清欠如にてインキュベートしたＨｅｒＤｏｘを並行して処理した。Ｄｏｘ蛍光をＵＶ励起により可視化した。遊離Ｄｏｘ（Ｄｏｘ単独）は、ゲル中に保持されないが、一方、ＨｅｒＤｏｘに組み込まれたＤｏｘは保持される。蛍光バンドをＨｅｒＰＢＫ１０と整列させ、ローディング／レーンを評価するために、ゲルをクーマシーブルーで染色した。これもまた、培地試料からの血清タンパク質を同定した。
【図１０】ＧＦＰ−ＨｅｒのＨＥＲ２＋腫瘍への選択的なターゲティングを示す図である。腫瘍を有するマウスに、３ｎｍｏｌのＧＦＰ−Ｈｅｒを尾静脈を介して注射した。組織を、注射後３．５時間に採取し、Ｘｅｎｏｇｅｎ小動物撮像装置を用いて可視化した。ＧＦＰ蛍光は疑似カラー赤色である（青色疑似カラーは、蛍光がないことを示し、ＧＦＰ強度はカラーバーにおける赤色に向かう明度シフトにより反映される）。
【図１１Ａ】ＨｅｒＤｏｘのＨＥＲ２＋腫瘍への選択的なターゲティングを示す図である。腫瘍を有するマウスに、０．７５ｎｍｏｌのＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘを尾静脈を介して注射し、カスタム小動物撮像装置を用いて画像化した。図１１Ａは、ＨｅｒＤｏｘのＩＶ送達後の生存マウスのイメージングを示す。腫瘍は、矢印により示される。
【図１１Ｂ】さらに、ＨｅｒＤｏｘのＨＥＲ２＋腫瘍への選択的なターゲティングを示す図である。腫瘍を有するマウスに、０．７５ｎｍｏｌのＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘを尾静脈を介して注射し、カスタム小動物撮像装置を用いて画像化した。図１１ＢはＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘの注射後３時間で採取した腫瘍および組織のイメージングを示す。Ｄｏｘからの蛍光シグナルは、カラーバーにより疑似カラー化され、１００に向かうシフトは高い蛍光強度を示す。図１１Ｂは、Ｄｏｘが単独投与されたものと比較した（右パネル）、本発明の一実施形態による送達系を用いた、他の器官および組織への最小送達を伴う、ＤｏｘのＨＥＲ２＋乳癌細胞への標的送達の比較（左パネル）を示す。
【図１２Ａ】腫瘍増殖に関するＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘの比較を示す図である。
【図１２Ｂ】動物体重に関するＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘの比較を示す図である。
【図１２Ｃ】心臓組織に関するＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘの比較を示す図である。
【図１２Ｄ】心機能に関するＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘの比較を示す図である。
【図１３】マウス全血中での安定性を示す図である。ＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘとの３７℃での、１時間までのインキュベーション後、新たに収集した全血を限外濾過により１０Ｋ  ＭＷカットオフ膜を通して、処理した。０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを抗凝固薬として使用したので、ＥＤＴＡのみ（−血液）中のＨｅｒＤｏｘを並行して処理した。バーは保持された（残余分）または放出された（濾液）Ｄｏｘの蛍光を、各試料の総蛍光のパーセンテージとして表す。Ｙ軸のスケールは濾液試料の存在を示すように調整される。Ｎ＝３／処置。
【図１４Ａ】生細胞におけるＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘ細胞内移行および標的の比較を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、ＨｅｒＤｏｘまたは遊離Ｄｏｘ（０．５μＭ）と共に３７℃でインキュベートした。生（非固定）細胞を、明視野および蛍光顕微鏡法により画像化した。
【図１４Ｂ】生細胞におけるＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘ細胞内移行および標的の比較を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、ＨｅｒＤｏｘまたは遊離Ｄｏｘ（０．５μＭ）と共に３７℃でインキュベートした。生（非固定）細胞を、ＤＩＣおよび共焦点蛍光顕微鏡法により画像化した。
【図１５】乳癌細胞におけるＨｅｒＤｏｘ輸送を示す図である。ＨｅｒＤｏｘと共に３７℃でインキュベートした細胞を示された時間点で固定し、免疫蛍光法のためにＨｅｒＰＢＫ１０に対する抗体を使用して処理した。画像を、共焦点顕微鏡法を使用して、蛍光および明視野下で獲得した。ｎ、核；バー、約８ミクロン。
【図１６】ＨＥＲ２＋またはＨＥＲ２−乳癌患者由来のヒト血清におけるＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を示す図である。細胞は、５人のＨＥＲ２＋乳癌患者または同年齢のＨＥＲ２−対照（どちらも前化学療法処置を受けた）の各々由来のヒト血清を含む培地においてＨｅｒＰＢＫ１０（１．２μｇ／ウェル）で処置した。細胞をＥＬＩＳＡのためにＨｅｒＰＢＫ１０に対する抗体を使用して処理した。１００ｘモル過剰競合的リガンド阻害剤を含まない、または含む（＋Ｈｅｒ）ウシ血清含有培地中のＨｅｒＰＢＫ１０を加えた対照（Ｃ）ウェルを、空白バーにより示す。患者血清はシーダーズ・サイナイ・メディカルセンターのＷＣＲＩ組織バンクにより提供された。Ｎ＝３ウェル／処置。
【図１７Ａ】細胞型に関する相対細胞表面ＨＥＲサブユニットレベルおよび細胞毒性を示す図である。細胞を、標準手順を使用して、抗ＨＥＲサブユニット抗体と、続いて、ＨＲＰ−コンジュゲート二次抗体と共にインキュベートした。相対細胞数をクリスタルバイオレット染色により測定し、５９０ｎｍでクリスタルバイオレット吸光度を測定することにより定量した。相対サブユニットレベルは、相対細胞数により正規化された各細胞集団のＥＬＩＳＡシグナル、またはＡｂｓ４５０ｎｍ／５９０ｎｍとして報告される。図１７Ａは、ＥＬＩＳＡにより測定した相対細胞表面ＨＥＲサブユニットレベルのグラフを示す。
【図１７Ｂ】異なるＨＥＲ２を呈する細胞への毒性を示す図である。ある範囲のＨｅｒＤｏｘ用量からの細胞毒性を、各細胞株上で代謝アッセイにより評価し、クリスタルバイオレット染色により確認した。対数スケールで示されるＣＤ５０値をＨｅｒＤｏｘ用量曲線の非線形回帰分析により、科学グラフプログラムを使用して決定し、計算機を使用して確認した。各細胞株の相対ＨＥＲ２レベルを各ＣＤ５０値の隣に示す。
【図１８】ＨｅｒＰＢＫ１０の最適化を示す図である。修飾タンパク質、ＨｅｒＰＢｒｇｄＫ１０の送達能力を非ウイルス性遺伝子導入複合体との関連で試験し、送達効率をＭＤＡ−ＭＢ−４５３ヒト乳癌細胞における導入遺伝子（ルシフェラーゼ）発現により評価した。＊＝Ｐ＜０．００５  等しい濃度のＨｅｒＰＢＫ１０と比較、両側Ｔ検定により決定。図により、発明は、決して、ＨｅｒＰＢＫ１０に制限されないことが証明される。というのも、タンパク質のターゲティング、受容体結合、細胞侵入および／または細胞内輸送を改善する様々な突然変異が導入され得るからである。
【図１９】ＤＳ−オリゴ長は標的複合体中へのＤｏｘ組み込みに影響しないことを証明するグラフを示す図である。グラフにより、３０または４８塩基対二本鎖のいずれかを使用するＤｏｘ組み込みにおいて認識できる差はないことが証明される。
【図２０Ａ】ＨｅｒＤｏｘは、神経膠腫細胞に対して毒性であることを示す図である。図２０ＡはＵ２５１ヒト神経膠腫細胞に関するＨＥＲ免疫蛍光法を示す。画像を、レーザー走査型共焦点顕微鏡法を使用して獲得した。
【図２０Ｂ】Ｕ２５１細胞に対するＨｅｒＤｏｘ対Ｄｏｘ毒性のグラフを示す図である。両側検定により有意な差が決定された。
【図２１Ａ】耐性はＨｅｒＤｏｘ毒性を増強させることを示す図である。ＡＥＬＩＳＡにより膜透過処理なしで検出された、親およびトラスツズマブ耐性乳癌細胞株に関するＨＥＲ３（およびＨＥＲ２）の相対表面レベル。Ｎ＝３．＊＝ｐ＜０．０５  親と比較。
【図２１Ｂ】トラスツズマブ単独、ペルツズマブ単独、およびトラスツズマブ−ペルツズマブ併用処置と比較した、ＨｅｒＤｏｘによる腫瘍細胞死滅を示す図である（処置後４８〜７２時間まで）。Ｎ＝３。
【図２２】ＨｅｒＤｏｘは、トラスツズマブ耐性腫瘍をインビボで死滅させることを示すグラフである。ＪＩＭＴ−１腫瘍を有する雌ヌードマウスは、腫瘍が約１００ｍｍ３に到達した時に、示された試薬を示された用量でＩＶ（尾静脈）注射により投与された（週２回注射を４〜６週間）。腫瘍体積をノギスにより測定した。第０日は、処置の第１日に対応する．Ｎ＝１０腫瘍／処置。
【図２３】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示すグラフである。親または非耐性細胞（Ａ〜Ｃ）およびトラスツズマブ耐性細胞（Ｄ〜Ｆ）を、トラスツズマブにより、示された濃度で（Ｘ軸上部を参照されたい）、ＨｅｒＤｏｘ処置前４時間および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２４Ａ】非共有結合性、血清安定自己組織化により形成されたＨｅｒＤｏｘを示す図であり、描出された機能ドメインを有するＨｅｒＰＢＫ１０、ならびにＤｏｘがインターカレートされたｄｓ−オリゴとの求電子性結合が示される。
【図２４Ｂ】ＨｅｒＤｏｘ粒子のクライオＥＭ画像を示す図である。
【図２４Ｃ】ＨｅｒＤｏｘのＨＰＬＣクロマトグラムであり、Ｄｏｘ吸光度の溶離プロファイルを示す。図２４Ｃは、さらにＨＰＣＥ収集画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図２４Ｄ】ＨｅｒＰＢＫ１０によるｄｓ−オリゴの血清ヌクレアーゼ消化からの保護を示す図である。ｄｓ−オリゴを２０分間、１００％マウス血清（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）中でインキュベートし、その後、ＰＡＧＥおよびＥｔＢｒ染色し、ＤＮＡを可視化させた。
【図２４Ｅ】ＨｅｒＤｏｘは血液中で安定なままであることを示す図である。ＤｏｘまたはＨｅｒＤｏｘを１時間、マウス血液中、３７℃でインキュベートし、続いて、限外濾過し、全ての放出されたＤｏｘ（濾液）を複合体（残余分）から分離した。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５、個々の残余分と比較。
【図２５−Ａ】ＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘで処置した別々の培養物中のＨＥＲ２＋（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）およびＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞に対する細胞毒性を比較する（０．５μＭ最終Ｄｏｘ濃度）。処置の第３日での相対細胞生存（未処置細胞の％として）。（＋Ｈｅｒ）、ＨｅｒＤｏｘ投与前にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の受容体−ブロッキングリガンド（組換えヘレグリン）とのプレインキュベーション。Ｎ＝３。
【図２５−Ｂ】異なるＨＥＲ２−３を発現する腫瘍を有するマウスにおけるＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘの体内分布を比較する。組織を注射後、示された時点で安楽死させた、注射したマウスから独立して採取し、蛍光強度／組織を多モード撮像装置を使用して獲得した。
【図２５−Ｃ】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＨｅｒＤｏｘ取込後１時間でのＨｅｒＰＢＫ１０およびＤｏｘ位置を示す図である。ｎ、核。バー、約４μｍ。
【図２５−Ｄ】腫瘍増殖に関してＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘを比較した図である（Ｎ＝８〜１０腫瘍／処置）。第０日＝尾静脈注射前３日（マウスは毎日、７日間注射を受けた）。対照（生理食塩水が注射された）マウスは、腫瘍潰瘍形成のために、ＩＡＣＵＣ方針を順守して早期に安楽死させた。
【図２５−Ｅ】標的でない組織に対するＨｅｒＤｏｘおよびＤｏｘを比較した図である。第０日＝尾静脈注射前３日（マウスは毎日、７日間注射を受けた）。対照（生理食塩水が注射された）マウスは、腫瘍潰瘍形成のために、ＩＡＣＵＣ方針を順守して早期に安楽死させた。図２５−Ｅにおける顕微鏡写真（２０×倍率）は処置マウス由来の、心筋の代表的なＨ＆Ｅ染色標本および肝臓の免疫蛍光標本を示す。核中の緑色蛍光はアポトーシスを示す（陽性ＴＵＮＥＬ染色）。上のグラフ、ＴＵＮＥＬ染色の定量化；下のグラフ、注射後２５日での心エコー測定。＊、Ｐ＜０．０５、生理食塩水との比較（モック）。
【図２６−Ａ】競合的阻害剤としての可溶性ＨＥＲ３ペプチドとの−／＋プレインキュベーション（ＨＥＲ３ブロック）の、固定化ＨＥＲ３（ヒトＥｒｂＢ３細胞外ドメイン；Ｐｒｏｓｐｅｃ）へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合のＥＬＩＳＡを示す図である。Ｕｎ、ＨｅｒＰＢＫ１０なし。
【図２６−Ｂ】競合的阻害剤としての、１×および１０×モル比の可溶性ＨＥＲ３ペプチド、可溶性ＨＥＲ４ペプチド（ＥＲＢＢ４ペプチド、Ａｂｎｏｖａ）、ベータセルリン（１０μｇ／ｍＬ）、またはペルツズマブ（Ｐｚ）との−／＋プレインキュベーションの、ＨＥＲ２＋細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合のＥＬＩＳＡを示す図である。ＨＥＲ３へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合は、患者血清により阻害されない。
【図２７−Ａ】耐性はＨｅｒＤｏｘ毒性を増強させることを示す図である。図２７−Ａは、ＥＬＩＳＡにより、膜透過処理なしで検出される、親およびＴｚ耐性乳癌細胞株上のＨＥＲ３（およびＨＥＲ２）の相対表面レベルを示す。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  親と比較。
【図２７−Ｂ】耐性はＨｅｒＤｏｘ毒性を増強させることを示す図である。図２７−ＢはＴｚ、Ｐｚ、Ｔｚ＋Ｐｚ、およびＤｏｘ単独と比較した、ＨｅｒＤｏｘ（処置後４８〜７２時間）による腫瘍細胞死滅を示す。Ｎ＝３。
【図２７−Ｃ】ＨＥＲ３の標的毒性への寄与を示す図である。親および耐性細胞株を、ＨｅｒＤｏｘ−／＋ＨＥＲ３ブロッキングペプチド（ＥｒｂＢ３ヒト；Ｐｒｏｓｐｅｃ）により処置し、４８時間後の細胞生存に対して試験した。特定的には、ＨｅｒＤｏｘは、ＨＥＲ３ペプチドと、等モル比ＨＥＲ３：ＨｅｒＰＢＫ１０で冷ＰＢＳ中、１時間の間吸着され、その後、細胞に０．１μＭ（ＪＩＭＴ−１、自然にトラスツズマブ処置に耐性）、０．１２５μＭ（ＢＴ−４７４）、または１μＭ（ＳＫＢＲ３）の最終ＨｅｒＤｏｘ濃度で添加された。処置をモック（生理食塩水）処置と比較した。Ｎ＝３．＊、ｐ＜０．０５  モックとの比較
【図２７−Ｄ】ＥＬＩＳＡにより、膜透過処理なしで検出される、親およびＴｚ耐性乳癌細胞株上のＨＥＲ３（およびＨＥＲ２）の相対表面レベルを示す図である。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  親と比較。
【図２７−Ｅ】Ｔｚ、Ｐｚ、Ｔｚ＋Ｐｚ、およびＤｏｘ単独と比較した、ＨｅｒＤｏｘ（処置後４８〜７２時間）による腫瘍細胞死滅を示す図である。Ｎ＝３。
【図２８】ＨｅｒＤｏｘは、トラスツズマブ耐性腫瘍増殖をインビボで排除することを証明する。ＪＩＭＴ−１腫瘍を有する雌ヌードマウスは、腫瘍が約１００ｍｍ３に到達した時に、示された試薬を示された用量で静脈内（尾静脈）注射により投与された（週２回の注射を４週間）。腫瘍体積をノギスにより測定した。第０日は、処置の第１日に対応する。Ｎ＝１０腫瘍／処置。
【図２９−Ａ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。図２９−Ａは、ＴｚによるＨＥＲ３の誘導された上昇およびＨｅｒＰＢＫ１０による増強された結合を示す。親細胞株を０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｚで２４時間前処置し、その後、これらの細胞を表面ＨＥＲ３レベルに対して試験した。
【図２９−Ｂ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。図２９−Ｂは、ＴｚによるＨＥＲ３の誘導された上昇およびＨｅｒＰＢＫ１０による増強された結合を示す。親細胞株を０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｚで２４時間前処置し、その後、これらの細胞をＨｅｒＰＢＫ１０結合に対して試験した。
【図２９−Ｃ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。ＳＫＢＲ３親細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２９−Ｄ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。ＳＫ−４７４親細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２９−Ｅ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５非耐性細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２９−Ｆ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。Ｔｚ耐性細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２９−Ｇ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。Ｔｚ耐性細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図２９−Ｈ】トラスツズマブ前処置は、ＨｅｒＤｏｘ毒性を増大させることを示す図である。Ｔｚ耐性細胞を示された濃度のＴｚで（Ｘ軸上部を参照されたい）ＨｅｒＤｏｘ処置前４および２４時間に処置し、処置後４８〜７２時間に生存についてアッセイした。Ｎ＝３。
【図３０−Ａ】ＨｅｒＰＢＫ１０およびＴｚの体内分布および細胞内輸送の比較を示す図である。図３０−Ａは標識されたＨｅｒＰＢＫ１０、Ｔｚ、およびＢＳＡによる体内分布のキセノゲンイメージングおよび蛍光定量化を示す。
【図３０−Ｂ】ＨｅｒＰＢＫ１０（緑色）およびＴｚ（緑色）による細胞表面結合後の異なる時間点での、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の蛍光共焦点顕微鏡写真を示す。グラフは、細胞表面ＥＬＩＳＡにより定量され、細胞密度により正規化された、ＨＥＲ２（左バー）およびＨＥＲ３（右バー）の相対細胞表面レベルを示す。
【図３１−Ａ】ヒト原発腫瘍細胞への結合を示す図である。ＨＥＲ２＋患者の外科標本から取得した原発腫瘍細胞を、細胞表面受容体レベルについて調べた。
【図３１−Ｂ】ヒト原発腫瘍細胞への結合を示す図である。ＨＥＲ２＋患者の外科標本から取得した原発腫瘍細胞を、ＨｅｒＰＢＫ１０結合について調べた。
【図３２−Ａ】ヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびマウスＨＥＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のドメインＩ−ＩＩ（ヘレグリン−結合ドメイン）のアミノ酸配列アライメントを示す図である。
【図３２−Ｂ】ＥＬＩＳＡ（透過処理なし）により、ヒトおよびマウスＨＥＲ３の両方と交差反応する抗ＨＥＲ３抗体（１Ｂ２Ｅ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して検出した、異なる細胞株上での相対ＨＥＲ３レベルを比較する。
【図３２−Ｃ】ＨｅｒＰＢＫ１０の４Ｔ１マウス乳房腫瘍細胞への結合を示す図である。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  ＨｅｒＰＢＫ１０単独との比較。
【図３３−Ａ】メタル化された（Ｓ２Ｇａ、Ｓ２ＭＮ）、およびメタル化されていない（Ｓ２ＦＢ）スルホン化コロールの化学構造、ならびに、それぞれ、ＨｅｒＦＢ、ＨｅｒＧａ、およびＨｅｒＭｎと指定される丸い粒子を形成する、ＨｅｒＰＢＫ１０との非共有結合性アセンブリの概略を示す図である。表は、３つのコロールの際立った特徴の概要を示す。
【図３３−Ｂ】ＨｅｒＧａのクライオＥＭ画像を示す。
【図３３−Ｃ】溶液中のＨｅｒＭｎの動的光散乱測定を示す図である。挿入図はＨｅｒＭｎ粒子のＴＥＭを示す。
【図３４−Ａ】メタル化されたコロールではなくＳ２ＦＢがＳＯＤ１を阻害することを示す図である。インビトロアッセイはＸＯＤ−／＋ＳＯＤからのスーパーオキシド産生を測定する。Ｓ２ＦＢ（１μＭ）のみがＳＯＤ活性に影響し、これを約３分の１だけ減少させる。
【図３４−Ｂ】Ｓ２ＦＢ吸光度ピークはＳＯＤとのインキュベーションによりシフトする（矢印）ことを示す図である。
【図３４−Ｃ】ＣｕＣｌ２はＳ２ＦＢ蛍光を消光させることを示す図である。
【図３５−Ａ】ランダム変異誘発および変異ペントンベースライブラリのバイオパニングを要約するスキームを示す図である。
【図３５−Ｂ】ｗｔ  ＨｅｒＰＢＫ１０と整列させた、バイオパニングから単離した全長および切断型クローンの概略を示す図である。
【図３５−Ｃ】Ｎ末端ヒスチジンタグに対する抗体を使用して検出された、細胞下画分の免疫ブロット（２０μｇ／レーン）を示す図である。
【図３５−Ｄ】示された組換えタンパク質の３０分取込での、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の免疫蛍光を示す図である（１０μｇ／ウェル、１２ウェル皿）。バー、約１０μｍ。
【図３６−Ａ】Ｓ２Ｇａは、ＴＳＰＯと相互作用することを示す図である。図３６−Ａは、可溶性組換えＴＳＰＯタンパク質をＳ２Ｇａと、等モル濃度（１μＭ）で約２０分間室温でインキュベートし、続いて、限外濾過して、遊離、非結合Ｓ２Ｇａを除去したことを示す。残余分を、タンパク質結合コロールの存在について、吸光度および蛍光スペクトルを測定することにより評価した。示されている場合、ＰＫ１１１９５をＴＳＰＯ上のポルフィリン結合部位に対する競合的阻害剤として使用した。
【図３６−Ｂ】さらに、Ｓ２Ｇａは、ＴＳＰＯと相互作用することを示す図である。図３６−Ｂは、可溶性組換えＴＳＰＯタンパク質をＳ２Ｇａと等モル濃度（１μＭ）で約２０分間、室温にてインキュベートし、続いて、限外濾過して、遊離、非結合Ｓ２Ｇａを除去したことを示す。残余分を、タンパク質結合コロールの存在について、吸光度および蛍光スペクトルを測定することにより評価した。示されている場合、ＰＫ１１１９５を、ＴＳＰＯ上のポルフィリン結合部位に対する競合的阻害剤として使用した。
【図３６−Ｃ】インサイチューでのＴＳＰＯとのＨｅｒＧａ相互作用の証拠を示す図である。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を、細胞をＨｅｒＧａで処置する２４時間前に、外因性ＴＳＰＯを発現するプラスミドでトランスフェクトし、ミトコンドリアにおける赤色蛍光染料蓄積の低減および細胞質における緑色蛍光の蓄積により証明される、ＨｅｒＧａ媒介ミトコンドリア破壊に対し調べた。
【図３６−Ｄ】図３６−Ｃにおいて見られる赤色蛍光の定量化を示す図である。＊、ｐ＜０．０５。
【図３７】ヒトＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２−腫瘍細胞に対するＨｅｒＭｎ毒性を示す図である。各細胞株は示された濃度のＨｅｒＭｎまたはＳ２Ｍｎが投与され、クリスタルバイオレット（ＣＶ）染色により、２４時間後の生存について評価された。Ｎ＝３／濃度、３つの別の実験から。
【図３８−Ａ】ＨｅｒＭｎ細胞毒性のメカニズムを示す図である。共焦点蛍光画像は、ＨｅｒＭｎのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に対する効果を示す。スケールバー＝１０μｍ。図３８−Ａは、１０μＭ  Ｓ２ＭｎまたはＨｅｒＭｎ、続いて、２４時間後にＴＭＲＭ（３０ｎＭ）を含むＨＢＳＳを投与された細胞におけるミトコンドリア膜電位の低減を示す。対照、ＰＢＳ処置。
【図３８−Ｂ】ＨｅｒＭｎ細胞毒性のメカニズムを示す図である。共焦点蛍光画像はＨｅｒＭｎのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に対する効果を示す。スケールバー＝１０μｍ。図３８−Ｂは、細胞上での２４時間インキュベーション後、ＨｅｒＭｎ（５μＭ）によるアクチン（赤色）およびチューブリン（緑色）のスーパーオキシド媒介崩壊を示す。Ｓ２Ｍｎ（５μＭ）、ＨｅｒＰＢＫ１０（ＨｅｒＭｎと等しいタンパク質濃度）およびＰＢＳは、対照として機能した。追加の細胞はＨｅｒＭｎ処置前１時間の間タイロン（５ｍＭ）を投与された。
【図３９】腫瘍を有するマウスにおける体内分布を示す図である。尾静脈注射後の、Ａｌｅｘａ６８０標識ＨｅｒＭｎ、ＴｚおよびＢＳＡ（各々１２ｎｍｏｌ）のキセノゲンイメージングおよび定量化。グラフ、平均蛍光−／＋ＳＥＭ。
【図４０−Ａ】ＨｅｒＭｎの治療効果を示す図である。図４０−Ａは、毎日、ＨｅｒＭｎまたはＳ２Ｍｎ（５ｎｍｏｌコロール／注射）の静脈内注射（尾静脈を介する）を、１回／日、６連続日の間投与された雌ヌードマウスにおける、ＨＥＲ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍増殖を示す。対照群は生理食塩水またはＨｅｒＰＢＫ１０をＨｅｒＭｎと等しい濃度で投与された。処置は、約２００ｍｍ３平均腫瘍体積で開始された。腫瘍体積を試薬の注射前（第１日）、中（第３日）、および後（８、１５、および２２日）に測定した。Ｎ＝８〜１０腫瘍／群。＊ｐ＜０．０５（一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図４０−Ｂ】ＨｅｒＭｎ、Ｓ２Ｍｎ、ＨｅｒＰＢＫ１０、またはドキソルビシン（Ｄｏｘ）への４８時間曝露後のヒトＣＤＣ生存率を示す図である。Ｎ＝３／濃度、３つの別の実験から。
【図４１−Ａ】ＨｅｒＭｎはＭＲＩコントラストを増強することを示す図である。図４１−Ａは溶液中でのＴ１緩和短縮を示す。
【図４１−Ｂ】ＨｅｒＭｎはインビボでＭＲＩコントラストを増強することを示す図である。画像（左）は、ＨｅｒＭｎまたはＳ２Ｍｎ（８ｎｍｏｌ／注射）の全身（ＩＶ）注射を８日間毎日受け、シグナルの蓄積を可能にした後、またはイメージング１０分前の０．１ｍｍｏｌ／ｋｇガドリニウムの１回注射後の、腫瘍を有するマウスの断面を示す。腫瘍は囲み領域により描出され、拡大される（右）。
【図４２−Ａ】ＥＬＩＳＡにより、膜透過処理なしで検出される、親およびＴｚ耐性乳癌細胞株上のＨＥＲ３およびＨＥＲ２の相対表面レベルを示す図である。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  親と比較。
【図４２−Ｂ】ＥＬＩＳＡにより、膜透過処理なしで検出される、ＪＩＭＴ−１乳癌細胞株上のＨＥＲ３およびＨＥＲ２の相対表面レベルを示す図である。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  親と比較。
【図４２−Ｃ】ＴｚによるＨＥＲ３の誘導された上昇およびＨｅｒＰＢＫ１０による増強された結合を示す。親細胞株を０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｚで２４時間前処置し、その後、細胞表面ＨＥＲ３レベルを測定した。
【図４２−Ｄ】ＴｚによるＨＥＲ３の誘導された上昇およびＨｅｒＰＢＫ１０による増強された結合を示す。親細胞株を０．５ｍｇ／ｍＬ  Ｔｚで２４時間前処置し、その後、これらの細胞をＨｅｒＰＢＫ１０の結合に対して試験した。
【図４２−Ｅ】ＨＥＲ２＋患者の外科標本から取得した原発腫瘍細胞上の細胞表面受容体レベルを示す図である。
【図４２−Ｆ】ＨＥＲ２＋患者の外科標本から取得した原発腫瘍細胞上でのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を示す図である。
【図４３】ＨｅｒＧａなどのコロールナノ生物学的粒子は、Ｔｚ耐性腫瘍細胞に対し、インビトロおよびインビボで増強された毒性を示すことを示す図である。
【図４３−Ａ】ＥＬＩＳＡにより、膜透過処理なしで検出される、親およびトラスツズマブ耐性乳癌細胞株上でのＨＥＲ３の相対表面レベルを示す図である。Ｎ＝３。＊、ｐ＜０．０５  親と比較。
【図４３−Ｂ】Ｔｚと比較した、ＨｅｒＧａによる腫瘍細胞死滅（処置後４８〜７２時間まで）を示す図である。Ｎ＝３。
【図４３−Ｃ】Ｔｚ＋Ｐｚ併用治療と比較した、ＨｅｒＧａによる腫瘍細胞死滅（処置後４８〜７２時間まで）を示す図である。Ｎ＝３。
【図４３−Ｄ】インビボでの腫瘍増殖の消失を示す図である。ＢＴ４７４腫瘍を有する雌ヌードマウスは、腫瘍が約１００ｍｍ３に到達した時に、示された試薬を示された用量で、静脈内注射（尾静脈）により投与された（週２回注射を４〜６週間）。腫瘍体積をノギスにより測定した。第０日は、処置の第１日に対応する。Ｎ＝１０腫瘍／処置。
【図４３−Ｅ】インビボでの腫瘍増殖の消失を示す図である。ＢＴ４７４腫瘍を有する雌ヌードマウスは、腫瘍が約１００ｍｍ３に到達した時に、示された試薬を示された用量で、静脈内注射（尾静脈）により投与された（週２回注射を４〜６週間）。腫瘍体積をノギスにより測定した。第０日は、処置の第１日に対応する。Ｎ＝１０腫瘍／処置。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
治療方法
１つの態様では、患者において癌を治療する方法が本明細書で開示され、方法は下記を含む：
抗ＨＥＲ２療法による治療に耐性がある患者を同定すること；ならびに
患者に治療的有効量の、
ある型の細胞を標的にするように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；
ポリペプチド配列に、静電相互作用により結合された核酸分子；ならびに
核酸配列に非共有結合により連結された化学物質
を含む、薬物送達分子を投与すること。
【００１１】
本明細書で開示される方法において使用される薬物送達分子は、どこかで記載される。例えば、国際公開ＷＯ２００９／００９４４１号および米国特許出願公開ＵＳ２０１０／０３３１２７３Ａ１号は、詳細に、薬物送達分子の成分およびこれを調製する方法を記載する。これらの刊行物の両方の内容は、参照により、図面を含むその全体が本明細書に組み込まれる。特定的には、公開ＵＳ２０１０／０３３１２７３Ａ１号の段落［００５５］〜［００９４］、図面およびそれらの説明、および配列表は参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
「治療的有効量」は、本明細書では、癌を有する患者において有益な結果を達成することができるその量を示す。治療的有効量は個々に決定することができ、少なくとも一部は、哺乳類の生理的特性、使用される送達系または治療技術の型および疾患の進行に対する投与時間の考慮に基づくであろう。下記の時に、有益な結果が得られる：１）癌性腫瘍のサイズが縮む；２）癌性腫瘍が増殖を中止する；または３）癌性腫瘍の増殖速度が療法の投与前の期間と比べて減速される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は抗体療法を含む。これらの実施形態では、ＨＥＲ２に対して有効な抗体が患者に投与される。これらの抗体の例としては、トラスツズマブおよびペルツズマブ、またはそれらのバイオ後続品が挙げられる。他の実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は小分子療法を含む。これらの実施形態では、小有機分子、すなわち、ポリペプチド、核酸、またはポリマーでない化合物（その化合物はＨＥＲ２に対して有効である）が患者に投与される。小分子治療薬の一例はラパチニブである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子はターゲティングリガンドを含む。特定の実施形態では、ポリペプチド分子は、正電荷を持つドメインを含む。他の実施形態では、ポリペプチドは組換え融合タンパク質である。これらの実施形態のいくつかでは、組換え融合タンパク質は、Ｈｅｒセグメントを含む。特定の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ペントンベースセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、受容体結合ドメインを含み、それは、いくつかの実施形態では、ヘレグリン−αである。特定の実施形態では、ポリペプチド分子は、エンドソーム溶解性ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、エンドソーム溶解性ドメインは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含み、一方、他の実施形態では、エンドソーム溶解性ドメインはＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含む。特定の実施形態では、ポリペプチド分子は、ポリリジンモチーフを含み、これは、いくつかの実施形態では、デカリジン（Ｋ１０）である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはそれらの組み合わせである。特定の実施形態では、ポリペプチド配列はＨｅｒＰＢＫ１０である。
【００１５】
本明細書では、「ＰＢ」は、感染の初期段階中のアデノウイルス血清型５の細胞結合、侵入、およびサイトゾル浸透を正常に媒介するペントンベースセグメントを示す。ペントンベースタンパク質の一例は本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０として提供される。このペントンベースタンパク質は普通、ＲＧＤモチーフ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を有する。本明細書では、「Ｋ１０」は、デカリジンモチーフを示し、これは、求電子性相互作用により核酸に結合する能力を有し、本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１として提供される。ＨｅｒＰＢＫ１０をコードするヌクレオチド配列の一例は本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として提供され、その相補鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。同様にＲＧＤモチーフの点変異は、ＥＧＤモチーフ（Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）を作製するのに使用することができ、ＨｅｒＰＢｒｇｄＫ１０ポリペプチド分子（ＨｅｒＰＢＫ１０ではなく）が得られる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、核酸分子は二本鎖オリゴヌクレオチドである。これらの実施形態のいくつかでは、二本鎖オリゴヌクレオチドは組換え融合タンパク質に静電相互作用により結合される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、化学物質は毒素である。いくつかの実施形態では、化学物質は化学療法薬であり、これは、特定の実施形態ではドキソルビシン、またはその薬学的等価物である。特定の実施形態では、化学物質は核酸分子とインターカレートされる。本明細書では、「インターカレーティング」は、既存の構造、例えばポリヌクレオチド配列中に挿入する能力を示す。
【００１８】
「化学療法薬」は、本明細書では、癌細胞または腫瘍を破壊し、死滅させ、またはその増殖を妨害する、かつ／または別様に、それに対して有害効果を有する能力を有する作用物質を示す。これらとしては、下記が挙げられるが、それらに決して限定されない：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロランブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、ダカルバジン、メクロレタミン、メルファラン、およびテモゾロミド）、ニトロソウレア（例えば、ストレプトゾシン、カルムスチン、およびロムスチン）、アントラサイクリンおよび関連薬物（例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、およびミトキサントロン）、トポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤（例えば、トポテカン、イリノテカン、エトポシドおよびテニポシド）、および有糸分裂阻害剤（例えば、タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル、およびビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）。他の化学療法薬は当業者により理解され、ルーチン作業の行使により、本明細書で開示される他の実施形態と組み合わせて使用することができる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、細胞の型は抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞である。通常、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブまたはペルツズマブによる、または小分子、例えばラパチニブによる療法に応答する。療法に「応答する」ということにより、抗体をインビボで全身的に癌患者に投与することにより、あるいは細胞をインビトロで抗体と接触させることにより、抗体が癌細胞に投与されるとすぐに、試料中のまたは患者における細胞の数のいずれかが、例えば誘導されたアポトーシスにより減少する、または試料中のまたは患者における細胞の増殖が減速または停止されることが意味される。患者において、これは、抗体の投与の前の期間と比べた場合の、癌性腫瘍の縮み、腫瘍の増殖の欠如、または腫瘍の増殖の減速として観察される。「抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞」は抗体または小分子による治療に応答しないそれらの細胞である。これらの細胞は治療薬が投与された後であっても増殖し続ける。いくつかの細胞はもともと治療に耐性がある。これらの細胞は、治療に決して応答しない。他の細胞は治療に対する耐性を獲得する。細胞は最初、治療に応答するが、一定期間後応答するのを止める。このように、患者は治療に不応性となる。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、非療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞上の表面ＨＥＲ３レベルよりも高い表面ＨＥＲ３レベルを有する。「非療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞」により、治療薬、例えば抗ＨＥＲ２抗体または小分子による治療に応答し、不応性となっていないＨＥＲ２＋癌細胞が意味される。他の実施形態では、耐性乳癌細胞は、非療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞上で見られるのと同じレベルの表面ＨＥＲ３発現を示す。特定の実施形態では、抗ＨＥＲ２抗体はトラスツズマブまたはペルツズマブである。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、抗ＨＥＲ２療法にもともと耐性であるが、一方、他の実施形態ではＨＥＲ２＋乳癌細胞は抗ＨＥＲ２療法に対する耐性を獲得している。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法はさらに、抗ＨＥＲ２治療薬を薬物送達分子と共に共投与する工程を含む。これらの実施形態のいくつかでは、治療薬および薬物送達分子は同時に投与される。実施形態のいくつかでは、治療薬および薬物送達分子の両方は同じ投与可能な剤形中に存在する。他の実施形態では、治療薬および薬物送達分子は異なる時間に投与される。いくつかの実施形態では、患者は治療薬治療を受けていない。他の実施形態では、患者は治療薬による治療をしばらくの間受けてきており、その後、薬物送達分子治療が治療レジメンに加えられる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、患者はマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、サル、チンパンジー、類人猿、およびヒトからなる群より選択される哺乳類である。特定の実施形態では、患者はヒトである。
【００２３】
別の態様では、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法が本明細書で開示され、方法は下記を含む：
抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を、
ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；
ポリペプチド配列に、静電相互作用により結合された核酸分子；ならびに
核酸配列に非共有結合により連結された化学物質
を含む、薬物送達分子と接触させること。
【００２４】
この態様の実施形態では、薬物送達分子は、以上および本明細書の別の箇所で記載される通りである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、接触はインビトロである。例えば、これらの実施形態では、細胞は研究室で増殖され、接触は、研究室実験の一部として起こる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、接触はインビボである。これらの実施形態では、薬物送達分子、またはそのプロドラッグは患者に投与される。プロドラッグが投与される場合、そうすると、プロドラッグが薬物送達分子に変換され、接触が患者の体内で起こる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞は哺乳類細胞であり、その哺乳類は任意で、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、サル、チンパンジー、類人猿、およびヒトからなる群より選択される。
【００２８】
第３の態様では、患者において癌を治療する方法が本明細書で記載され、方法は下記を含む：
抗ＨＥＲ２療法に耐性がある患者を同定すること；ならびに
患者に治療的有効量の、
ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびに
ポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子
を含む、薬物送達分子を投与すること。
【００２９】
この態様のいくつかの実施形態では、スルホン化コロール分子は、限定はされないが、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、および／またはガリウム（Ｇａ）などの金属を含む。いくつかの実施形態では、薬物送達分子はＨｅｒＭｎ、ＨｅｒＦｅ、またはＨｅｒＧａである。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は抗体療法を含む。これらの実施形態のいくつかでは、抗体はトラスツズマブまたはペルツズマブである。別の実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は小分子療法を含む。これらの実施形態のいくつかでは、小分子はラパチニブである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、ターゲティングリガンドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、正電荷を持つドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは組換え融合タンパク質である。これらの実施形態のいくつかでは、組換え融合タンパク質は、Ｈｅｒセグメントを含む。他の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ペントンベースセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、受容体結合ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、受容体結合ドメインはヘレグリン−αである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、エンドソーム溶解性ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、エンドソーム溶解性ドメインは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含む。他の実施形態では、エンドソーム溶解性ドメインは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、ポリリジンモチーフを含む。これらの実施形態のいくつかでは、ポリリジンモチーフはデカリジンである。
【００３１】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、ポリペプチド配列はＨｅｒＰＢＫ１０である。ＨｅｒＰＢＫ１０をコードするヌクレオチド配列の一例は本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として提供され、その相補鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。
【００３２】
１つの実施形態では、細胞の型は、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞である。これらの実施形態のいくつかでは、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、療法に応答するＨＥＲ２＋乳癌細胞上の表面ＨＥＲ３レベルより高い表面ＨＥＲ３レベルを有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、抗ＨＥＲ２療法にもともと耐性がある。他の実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は抗ＨＥＲ２療法に対する耐性を獲得している。
【００３３】
いくつかの実施形態では、患者は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、サル、チンパンジー、類人猿、およびヒトからなる群より選択される哺乳類である。
【００３４】
第４の態様では、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法が本明細書で記載され、方法は下記を含む：
抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を、
ある型の細胞を標的にするように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびに
ポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子
を含む、薬物送達分子と接触させること。
【００３５】
この態様のいくつかの実施形態では、スルホン化コロール分子は、限定はされないが、マンガン（Ｍｎ）、鉄（Ｆｅ）、および／またはガリウム（Ｇａ）などの金属を含む。いくつかの実施形態では、薬物送達分子はＨｅｒＭｎ、ＨｅｒＦｅ、またはＨｅｒＧａである。１つの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は抗体療法を含む。これらの実施形態のいくつかでは、抗体はトラスツズマブまたはペルツズマブである。別の実施形態では、抗ＨＥＲ２療法は小分子療法を含む。これらの実施形態のいくつかでは、小分子はラパチニブである。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、ターゲティングリガンドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、正電荷を持つドメインを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは組換え融合タンパク質である。これらの実施形態のいくつかでは、組換え融合タンパク質は、Ｈｅｒセグメントを含む。他の実施形態では、組換え融合タンパク質は、ペントンベースセグメントを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、受容体結合ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、受容体結合ドメインはヘレグリン−αである。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、エンドソーム溶解性ドメインを含む。これらの実施形態のいくつかでは、エンドソーム溶解性ドメインは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含む。他の実施形態では、エンドソーム溶解性ドメインは、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド分子は、ポリリジンモチーフを含む。これらの実施形態のいくつかでは、ポリリジンモチーフはデカリジンである。
【００３７】
１つの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、ポリペプチド配列はＨｅｒＰＢＫ１０である。ＨｅｒＰＢＫ１０をコードするヌクレオチド配列の一例は本明細書では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として提供され、その相補鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。
【００３８】
１つの実施形態では、細胞の型は、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞である。これらの実施形態のいくつかでは、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、療法に応答するＨＥＲ２＋乳癌細胞上の表面ＨＥＲ３レベルより高い表面ＨＥＲ３レベルを有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は、抗ＨＥＲ２療法にもともと耐性がある。他の実施形態では、ＨＥＲ２＋乳癌細胞は抗ＨＥＲ２療法に対する耐性を獲得している。
【００３９】
いくつかの実施形態では、患者は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、サル、チンパンジー、類人猿、およびヒトからなる群より選択される哺乳類である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を薬物送達分子と接触させることはインビトロである。他の実施形態では、接触はインビボである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、サル、チンパンジー、類人猿、およびヒトからなる群より選択される。
【００４２】
薬物送達分子
化学物質を細胞にターゲティングさせるための自己組織化複合体を含む送達系が本明細書で開示される。送達系は、インビトロおよびインビボで罹患細胞を標的にすることができ、心臓組織を回避し（そうすることが望ましい場合）、標的細胞に結合し、それ中に浸透する。さらに、複合体は、非共有結合により（すなわち、例えば、化学療法薬の標的担体への化学的結合が必要ない）組織化され、これは小さな核酸担体を架橋として使用し、薬物を標的タンパク質担体ビヒクルと共に組織化する。
【００４３】
任意の数のポリヌクレオチド配列または小さな二本鎖核酸が、本明細書で記載される様々な実施形態により使用され得る。例えば、１つの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、またはそれらの組み合わせがポリヌクレオチド配列または二本鎖核酸として使用される。
【００４４】
任意の数のターゲティングリガンドが本明細書で記載される様々な実施形態により使用され得る。例えば、αｖβ３などのインテグリンを標的にする場合、ＰＢ自体がＰＢＫ１０のターゲティングリガンドとして作用し得る。当業者により知られているように、インテグリンは、様々な型の転移性腫瘍において過度に発現される。そのため、本明細書で記載される様々な実施形態と併用して、ＰＢＫ１０は、転移性腫瘍およびインテグリンを高発現する細胞を標的にするために使用され得る。
【００４５】
開示される送達系は、哺乳類に、様々な投与経路により投与することができる複合体を含み、すぐに、これは標的細胞（例えば、癌細胞）に焦点を合わせ、造影剤または治療薬などの分子を細胞中に送達する。１つの実施形態では、複合体は、正常で、健康な細胞を温存しながら、治療薬の癌細胞への送達を提供する。
【００４６】
図１に示されるように、開示された送達系の一実施形態は、自己組織化して１つの標的コンジュゲートとなる３つの成分を含む。第１の成分（「ユニットＡ」）は特定の型の細胞（複数可）を標的にし、浸透する、特有の細胞透過性タンパク質である。それは、リガンド（受容体結合ドメイン）、膜透過ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインを含む。第２の成分（「ユニットＢ」）はユニットＡに静電相互作用により結合する小さな核酸（例えば、二本鎖オリゴヌクレオチド）である。第３の成分（「ユニットＣ」）はユニットＢにインターカレーション相互作用により結合する化学物質である。１つの実施形態では、化学物質は毒性分子である。１つの実施形態では、細胞の型は癌細胞であり、化学物質は化学療法薬である。別の実施形態では、細胞の型はＨＥＲ２＋乳癌細胞であり、化学物質はＤｏｘ、またはその薬学的等価物である。
【００４７】
１つの実施形態では、ＨｅｒＰＢＫ１０はインターカレートされたドキソルビシン（Ｄｏｘ）を含む小さな３０塩基対二本鎖核酸（ｄｓ−オリゴ）と混合される。いくつかの実施形態では、これにより、クライオＥＭ）により観察されるように、１０〜５０ｎｍ直径の丸い粒子の非共有結合性アセンブリが得られ（図２４Ｂ）、これは限外濾過中Ｄｏｘを保持し、ＨＰＬＣ（図２４Ｃ）、異なる温度で長期貯蔵され、血清（図２４Ｄ）および血液（図２４Ｅ）中での薬物放出に抵抗する。これらの実施形態のいくつかでは、ｄｓ−オリゴの配列は、Ｄｏｘローディングに何の関係もなく、より長いｄｓ−オリゴ、例えば４８ｂｐ断片は必ずしも改善されたローディング能力を示さない。いくつかの実施形態では、１つの３０ｂｐオリゴは５０分子までのドキソルビシンに結合することができる。１つの実施形態では、タンパク質、ＤＮＡ、およびＤｏｘを含む組織化されたナノ粒子は、１０分子までのタンパク質複合体ＨｅｒＰＢＫ１０に結合する。別の実施形態では、組織化された粒子のＵＶ／Ｖｉｓ分光法により、各ｄｓ−オリゴ断片は約５、６、７、８またはそれ以上の分子のＨｅｒＰＢＫ１０および約１０〜４０分子のＤｏｘに結合することが証明された。これは、ＤＮＡを中和し、それをインターカレートされたＤｏｘで飽和するのに必要とされる、予想されるモル比に一致している。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ＨｅｒＤｏｘはＨＥＲ２＋細胞に対し、インビトロおよびインビボで、受容体依存性ターゲティングを示す。それらの実施形態の１つでは、図２５−Ａで示されるように、ＨｅｒＤｏｘ粒子は、別々（図２５−Ａ）および混合細胞培養（図９）の両方において、ＨＥＲ２−細胞ではなく、ＨＥＲ２＋に対し選択的に毒性を示す。別の実施形態では、ＨｅｒＤｏｘ粒子は、ＨＥＲ２−細胞、例えばＨＥＲ３を過剰発現する三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）細胞に対して毒性である。細胞毒性は、受容体−ブロッキングにより阻害される。図２５−Ｂは、ＨｅｒＤｏｘが、インビボでのより低い受容体レベルと比較して、より高い受容体レベルで、腫瘍細胞に対し、選択的な体内分布を示すことを示す。図２５−Ｃに示される１つの実施形態では、腫瘍ターゲティングおよび細胞内輸送研究により、Ｄｏｘは、細胞侵入後までＨｅｒＤｏｘ粒子からの放出を示さず、その時点で、Ｄｏｘは、核中に迅速に蓄積し、一方、ＨｅｒＰＢＫ１０は核周辺に残ったままであることが示される。図２５−Ｄおよび２５−Ｅは、インビボでの全身送達は、非常に低い薬理的用量（０．００４ｍｇ／ｋｇのＤｏｘ）で、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞死を誘発し、一方、肝臓および心臓毒性を回避することを示す。これは非標的Ｄｏｘと対照的であり、それは、同様の腫瘍毒性を誘発するのにより高い用量を必要とし、一方、肝臓組織および心筋ダメージを引き起こす。
【００４９】
１つの実施形態では、ＨＥＲ２阻害への耐性により腫瘍はＨｅｒＤｏｘ攻撃を受けやすくなる。それにもかかわらず、耐性は、ＨｅｒＤｏｘ効力のための必須条件ではなく−ＨｅｒＤｏｘはトラスツズマブ感応性および耐性腫瘍細胞の両方に有効であり、両方、とりわけ耐性細胞に対しシグナル阻害を超える利点を有する。
【００５０】
様々な実施形態では、開示された送達系は医薬組成物中に組み入れられ、それは任意の投与経路を介する送達のために製剤化され得る。「投与経路」は当技術分野で知られている任意の投与経路を示すことができ、限定はされないが、エアロゾル、経鼻、経口、経粘膜的、経皮または非経口が挙げられる。「非経口」は、一般に、眼窩内、注入、動脈内、関節内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、胸骨内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、くも膜下、嚢下、皮下、経粘膜的、または経気管を含む注射と関連する投与経路を示す。非経口経路を介して、組成物は、注入または注射のための溶液または懸濁液の形態、または凍結乾燥粉末の形態とすることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物はまた、任意の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に許容される担体」は、本明細書では、対象となる化合物を１つの組織、器官、または身体の一部から別の組織、器官、または身体の一部に運搬または輸送することに関与する薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを示す。例えば、担体は、液体または固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、またはカプセル化材料、またはそれらの組み合わせであってもよい。担体の各成分は、製剤の他の材料成分と適合可能でなければならないという点で、「薬学的に許容され」なければならない。それはまた、これと接触し得る任意の組織または器官との接触において使用するのに好適でなければならず、毒性、刺激作用、アレルギー応答、免疫原性、またはその治療効果を過度に上回る任意の他の合併症のリスクを伴ってはならないことが意味される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与のために、カプセル化され、錠剤化されあるいはエマルジョンまたはシロップで調製される。
【００５３】
薬学的に許容される固体または液体担体は組成物を増強または安定化するために、または組成物の調製を促進するために添加され得る。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコールおよび水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンが挙げられる。担体はまた、徐放材料、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを、単独またはワックスと共に含み得る。
【００５４】
医薬調製物は、必要とあれば、錠剤形態に対してはミリング、混合、顆粒化、および圧縮；あるいはハードゼラチンカプセル形態を生成するためにはミリング、混合および充填を含む、薬学の従来技術に従い、調製される。液体担体が使用される場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンまたは水性または非水性懸濁液の形態とされるであろう。そのような液体製剤は直接ｐ．ｏ．で投与され得、またはソフトゼラチンカプセルに充填され得る。
【００５５】
本明細書で開示される医薬組成物は、治療的有効量で送達され得る。正確な治療的有効量は、ある被験体において、治療の効力の観点から最も有効な結果を得る組成物のその量である。この量は、様々な因子、例えば、限定はされないが、治療化合物の特性（活性、薬物動態、薬力学、およびバイオアベイラビリティを含む）、被験体の生理的条件（年齢、性別、疾患型および段階、全身的な身体状態、ある投与量に対する応答性、および薬物療法の型を含む）、製剤中の薬学的に許容される１つのまたは複数の担体の性質、ならびに投与経路によって変動するであろう。臨床および薬理学分野における当業者であれば、ルーチン実験により、例えば、化合物の投与に対する被験体の応答をモニターし、それにしたがって、投与量を調節することにより、治療的有効量を決定することができるであろう。さらなるガイダンスのために、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．  ２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，  ＵＳＡ）  （２０００）を参照されたい。
【００５６】
開示された送達系、より特定的には、それにより送達される治療薬（例えば、化学療法薬）、特にＤｏｘ、および／または造影剤の典型的な投与量は、公知の治療化合物または造影剤が使用される場合は製造者に推奨される範囲にあり、インビトロ応答または動物モデルにおける応答により当業者に示される通りである。実際の投与量は、医師の判断、患者の状態、および治療方法の有効性に依存するであろう。
【００５７】
治療の必要な哺乳類への、治療的有効量の、疾患を治療するのに適切な治療薬を含む開示された送達系の投与による疾患を治療する方法もまた開示される。１つの実施形態では、疾患は、癌であり、治療薬は化学療法薬である。別の実施形態では、疾患は乳癌および／またはＨＥＲ２＋乳癌であり、治療薬はＤｏｘである。
【００５８】
薬物の送達
１つの実施形態では、本明細書で開示される薬物送達分子は、既存の化合物の腫瘍部位への送達を促進する。これらの実施形態のいくつかでは、本明細書で開示される薬物送達分子は、治療効果を示すことが知られている化合物の送達を改善するために使用される。いくつかの実施形態では、化合物は、疾患の治療のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている。ある特定の実施形態では、ＦＤＡに認可された薬物は、適応外使用のために使用される。１つの実施形態では、薬物はドキソルビシンである。いくつかの実施形態では、ＨｅｒＤｏｘ複合体内での薬物の安定な捕捉は、薬物送達分子中の薬物の効力および安全性に寄与する。このアプローチは、拡散による漏れとなる傾向がある、薬物をカプセル中にローディングすること、または、その活性および効力に影響する傾向がある共有結合性コンジュゲーションにより薬物を化学的に修飾することよりも有利である。
【００５９】
ＨＥＲ２阻害剤との比較
ＨＥＲ２およびＥＧＦＲ阻害に対する耐性と関連するＨＥＲ３上昇は、ＨＥＲ３を介するシグナル伝達を抑制するための抗ＨＥＲ３抗体の開発に拍車を掛けた。ＨｅｒＤｏｘは、そのような阻害剤を超えるいくつかの利点を有する。１つの実施形態では、ＨｅｒＰＢＫ１０はその治療活性に対するシグナル減衰に依存しないが、代わりにＨＥＲ３を、腫瘍細胞中に迅速に取り込ませる門として使用し、毒性分子の送達により、中から細胞を死滅させる。いくつかの実施形態では、ＨｅｒＰＢＫ１０とは異なり、抗体は取込を誘発しない。代わりに、抗体は受動的に、徐々に、および低レベルでインターナライズする。
【００６０】
１つの例として、ＨｅｒＤｏｘと、臨床使用のために最近承認されたトラスツズマブ−コンジュゲートエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）の間には重要な差がある。第１に、Ｔ−ＤＭ１はＨＥＲ２を標的にし、よってＨＥＲ２阻害耐性腫瘍に向かわない。第２に、Ｔ−ＤＭ１は有糸分裂阻害剤、エムタンシンの送達のためにインターナリゼーションを受けることを意図し、一方、それ自体の上のＨＥＲ２は、取り込まず、代わりに、受容体ターンオーバーまたはＨＥＲ３結合リガンドによる共取込による受動的細胞侵入に依存する。そのため、トラスツズマブ（Ｔｚ）コンジュゲートの取込は遅く（時間のオーダー）、ＨＥＲ−リガンド結合により誘発される強い侵入と対照的に比較的低い。この結果は、図３０に示され、これは、ＨｅｒＰＢＫ１０取込をＴｚ取込と比較する。第３に、Ｔ−ＤＭ１への耐性はＨＥＲ３および薬剤排出トランスポーターの誘導により媒介される。他方、Ｄｏｘは、細胞取込および核への輸送後まで、ＨｅｒＤｏｘ粒子内で保護されたままであり、そこで、薬物は核蓄積のために放出される。この粒子輸送は薬剤排出トランスポーターを逃れる。
【００６１】
ＨｅｒＤｏｘと他の抗体の間の作用機序間のこれらの差は、治療効果のために必要とされる投与量に影響を与える。１つの例として、発明者らは、約０．００４ｍｇ／ｋｇのＨｅｒＤｏｘは、マウスにおける心臓および肝臓などの正常組織を温存しながら、腫瘍増殖を標的にし、消失させるのに十分であることを示した。これはＴ−ＤＭ１で必要とされる治療量（約３．６ｍｇ／ｋｇ）、ならびに患者（約１〜５ｍｇ／ｋｇ）およびマウス（０．０４ｍｇ／ｋｇ超）における非標的Ｄｏｘとは対照的であり、これは標的でない組織に対してよく知られた有害作用を誘発する。
【００６２】
１つの実施形態では、本明細書で記載される癌を治療する方法は三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）の治療において使用される。ＴＮＢＣはもともとＨＥＲ２耐性である。これらの腫瘍上のエストロゲン、プロゲステロン、およびＨＥＲ２受容体の欠如は、使用することができる標的療法の型を制限する。最近の研究により、ＴＮＢＣはＨＥＲ３を発現することが示されている。ＥＧＦ−Ｒ阻害剤がこれらの腫瘍のために探索されてきたが、そのような阻害剤への耐性もまた、上昇したＨＥＲ３により促進される。本明細書で記載される癌を治療する方法はそのような生得的なＨＥＲ２耐性腫瘍に適用可能である。同様に本明細書で記載される方法はまた、乳房、胃、結腸、肺、および卵巣における腫瘍に適用可能であり、ここで、ＨＥＲ３上方制御はＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、およびＰＩ３Ｋキナーゼ阻害剤に応じて同定される。
【００６３】
ＨＥＲＤＯＸ作用機序
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２阻害剤に対する獲得耐性を有するＨＥＲ２＋腫瘍は、下記のためにＨｅｒＤｏｘに感受性がある：（ｉ）ＨＥＲ３媒介ターゲティング、（ｉｉ）粒子エンドサイトーシスおよびエンドソーム溶解による受容体隔絶および下方制御、および／または（ｉｉｉ）ペイロード保護および薬剤排出の回避を可能にするエンドソームおよび粒子輸送。
【００６４】
これらの実施形態のいくつかでは、ＨｅｒＤｏｘにより誘導されるＨＥＲ３クラスター化、エンドサイトーシス、およびエンドソーム溶解はＨＥＲ３をＨＥＲ２活性化から隔絶し、シグナル伝達エンドソームを鈍らせる。１つの実施形態では、耐性細胞へのターゲティングを促進する上昇したＨＥＲ３に加えて、多価のＨｅｒＰＢＫ１０ナノ粒子はＨＥＲ３ホモオリゴマー化およびＨＥＲ２（および任意の他のチロシンキナーゼ）からの隔絶を誘導し、よってＨＥＲ３リン酸化および活性化を防止する。別の実施形態では、ＨＥＲ３上昇はまた、リガンド誘導ＨＥＲ３ホモオリゴマーの形成を促進し、よって、そのような現象は、耐性細胞に特有である。その上、細胞質中への侵入を可能にするエンドソーム溶解による受容体隔絶小胞の破壊は、毒性の細胞内標的へのＤｏｘの送達をサポートしながらエンドソームシグナル伝達を消滅させ、よって、全体の細胞毒性に寄与する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、エンドソームおよび粒子輸送はペイロードを薬剤排出から保護する。エンドサイトーシス輸送、ＨｅｒＰＢＫ１０による薬物カプセル化、および核周辺へのＨｅｒＤｏｘ移行の組み合わせは薬剤排出の回避に寄与する。いくつかの実施形態では、ＨｅｒＤｏｘは、併用療法に比べて、ＨＥＲ２阻害剤に対し獲得耐性を有するＨＥＲ２＋腫瘍への改善された標的毒性を与える。これらのＨＥＲ２単独療法および併用治療としては、Ｔｚ、Ｔｚ−Ｐｚ、Ｔｚ−ＬｐおよびＴ−ＤＭ１が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２−阻害剤の効力は、ナイーブＨＥＲ２＋腫瘍に対するＨｅｒＤｏｘ療法のアジュバントとして使用されると、増大される。これらの実施形態のいくつかでは、ＨＥＲ２−阻害剤はＨＥＲ３を誘導し、ナイーブ腫瘍をＨｅｒＤｏｘに対しインビボで感作させる。他の実施形態では、ＨｅｒＰＢＫ１０は、ＨＥＲ２＋患者由来の腫瘍組織にＨＥＲ３を介して結合する。１つの実施形態では、ＨＥＲ２−阻害はヒトＣＤＣへのＨｅｒＤｏｘ毒性を誘導しない。
【００６７】
本明細書で記載されるいくつかの実施形態では、ＴＮＢＣを含むＨＥＲ２−乳腺腫瘍は、ＨｅｒＤｏｘによりＨＥＲ３を介して標的にすることができ、さらに、ＥＧＦ−Ｒ阻害剤を用いるアジュバント治療により感作される。これらの実施形態のいくつかでは、ＥＧＦ−Ｒ阻害剤はＨＥＲ３上昇を誘導し、ＴＮＢＣ細胞をＨｅｒＤｏｘに対してインビトロで感作させる。いくつかの実施形態では、ＨｅｒＤｏｘは転移性および免疫適格性条件の両方において、ＴＮＢＣモデルに関し治療的に有効である。
【００６８】
新規ペイロードとしてのコロール
コロールは、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３３５０２５１Ａ１号（その全開示内容は、参照により、図面を含む本明細書に組み込まれる）で規定され、記載される。
【００６９】
患者において癌を治療する方法が本明細書で開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法に耐性がある患者を同定すること；ならびに患者に治療的有効量の、ある型の細胞を標的にするように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびにポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子を含む薬物送達分子を投与することを含む。抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法もまた、本明細書で開示され、方法は、抗ＨＥＲ２療法耐性ＨＥＲ２＋乳癌細胞を、ある型の細胞を標的にように、かつ／またはこれに浸透するように適合されたポリペプチド分子；ならびにポリペプチド配列に結合されたスルホン化コロール分子を含む薬物送達分子と接触させることを含む。
【００７０】
コロールは、ポルフィリンに構造的に類似する。いくつかの実施形態では、コロールはスルホン化コロールである。いくつかの実施形態では、スルホン化コロールは両親媒性で、生理溶液中で可溶性であり、および／またはポリペプチドに非共有結合性相互作用を介して結合する。いくつかの実施形態では、非共有結合性相互作用は静電相互作用である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は組換え融合タンパク質である。アニオン性スルホン酸基は、負電荷を持つ細胞膜による反発のために非特異的細胞侵入を防止し、よって、担体タンパク質を介する標的細胞中へのコロール送達が生じる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、コロールは金属化学元素を含む。これらの実施形態のいくつかでは、金属は遷移金属である。いくつかの実施形態では、金属は鉄（Ｆｅ）、マンガン（Ｍｎ）、またはガリウム（Ｇａ）である。他の実施形態では、コロールはメタル化されていない。メタル化された、およびメタル化されていないコロールはタンパク質ポケットにおいて結合し、解離は無視できる。１つの例示的な例として、図３３において記載されるＨｅｒＧａはＨｅｒＰＢＫ１０と組織化されたスルホン化ガリウム（ＩＩＩ）コロール（Ｓ２Ｇａ）から構成される。ＨｅｒＧａは、インビトロおよびインビボで、血清タンパク質へのコロール移行に抵抗する。ＨｅｒＰＢＫ１０とのコロールアセンブリにより２５〜３５コロール／タンパク質が得られ、１０〜２０ｎｍの丸い粒子が得られ（図３３−Ｂ）、これは、高速限外濾過に耐える。別の例示的な例として、ＨｅｒＭｎ、ＨｅｒＰＢＫ１０と組織化されたスルホン化マンガン（ＩＩＩ）コロール（Ｓ２Ｍｎ）は約２０ｎｍの丸い粒子を形成する（図３３−Ｃ）。
【００７２】
１つの実施形態では、ＨｅｒＧａは、強く蛍光性であることに加えて、全身送達後、腫瘍選択的ターゲティングをインビボで示し、心臓を含むほとんどの正常組織を迂回し、非常に低い薬理的用量（０．００８ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍増殖消失を誘発する。別の実施形態では、ＨｅｒＭｎは同様の腫瘍選択的ターゲティングおよび増殖消失をインビボで示し、蛍光性ではないが、磁気共鳴（ＭＲ）により、より臨床的に関連するイメージングを可能にする。これらの実施形態の両方において、ＨｅｒＧａおよびＨｅｒＭｎはＲＯＳ媒介細胞骨格およびミトコンドリア破壊を引き起こす。コロール、例えば、限定はされないが、ＨｅｒＧＡは、細胞ホメオスタシスおよび腫瘍維持において重要なミトコンドリアＴＳＰＯタンパク質を標的にし、かつ／またはこれに結合する。同様に、スルホン化されたメタル化されていない遊離塩基コロール（Ｓ２ＦＢ）（図３３−Ｃ）は、これもまた強く蛍光性であり、直接ＳＯＤ１と相互作用し（図３４−Ｂ）、ＳＯＤ活性を阻害することができ（図３４−Ａ）、それは酵素由来の金属リガンドのキレート化による（図４Ｃ）。
【００７３】
１つの実施形態では、本明細書で記載されるＨｅｒＰＢＫ１０−コロール粒子はその蛍光寿命をｐＨに応じて変化させる。よって、コロール粒子は、そのすぐ近くにおける微小環境条件を知らせる診断プローブとして機能する。この特徴は、例えば輸送経路または細胞内位置を研究するために、細胞レベルで有用である。この特徴はまた、例えば腫瘍増殖部位を同定するために、組織レベルで有用である。１つの非限定的例として、ＨｅｒＧａの蛍光寿命は、エクスビボおよびインビボの両方で、腫瘍または肝臓組織に存在するかどうかによって異なり、よって、光学イメージングによる腫瘍と非腫瘍組織間の区別が可能になる。別の非限定的例として、ＨｅｒＭｎは、腫瘍検出のために有用である。というのも、ＨｅｒＭｎ粒子は、溶液中での水分子とのコロール相互作用を防止するからである。一方、腫瘍侵入はＴ１緩和短縮およびコロール増強コントラストを改善し、組織取込後の粒子からのＳ２Ｍｎコロール放出を示唆する。第３の非限定的例として、ＨｅｒＧａは、ＩＴ注射後、腫瘍において長期間保持され、検出可能である（３０日まで）が、非腫瘍組織からは、皮下に注射した場合、より早く排除された。この特徴（一部ＨｅｒＰＢＫ１０により促進され得る）は、ＨｅｒＭｎが有し得る、ＨｅｒＧｄ（Ｇｄ＝ガドリニウム）を超える可能性のある利点に寄与する。というのも、ＨｅｒＧｄは直ちに注射後排除されるからである。
【００７４】
別の実施形態では、本明細書で記載されるＨｅｒＰＢＫ１０−コロール粒子は、光増感剤として作用する。Ｓ２Ｇａの最大蛍光波長での光励起は一重項酸素を生成させ、これはＨｅｒＧａを取り込んだ細胞に急速なダメージを誘導した。ＨｅｒＧａはすでに、照射なしで十分な腫瘍毒性を示したが、その一方、４２４ｎｍでの光励起は実質的にＨｅｒＧａのＩＣ５０を１００〜１０００倍インビトロで低減させた。第２の吸光度ピーク（約６２０ｎｍ）での励起によりほぼ、有効な細胞死が得られ、よって照射のためにより長い波長を使用することができ、これはより深い組織中への浸透をサポートするであろう。
【００７５】
別の実施形態では、本明細書で記載されるコロールナノ生物製剤は薬剤耐性癌細胞に立ち向かう。ＨＥＲ２阻害への耐性を促進するＨＥＲ３上昇は、これらの腫瘍を、特に腫瘍標的コロール治療を受けやすくする。そのため、ＨＥＲ２阻害剤、例えばＴｚは、アジュバントとして作用し、ＨＥＲ３上昇を引き起こすことにより腫瘍をコロールナノ療法に感作させる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、腫瘍標的コロールの治療効果は、ＨＥＲ３媒介受容体下方制御、粒子輸送、および複数の細胞内標的に対するコロール媒介毒性の組み合わせのために、阻害剤耐性腫瘍細胞上で増強される。
【００７７】
１つの実施形態では、コロール粒子により誘導されるＨＥＲ３クラスター化、エンドサイトーシス、およびエンドソーム溶解は、ＨＥＲ３をＨＥＲ２活性化から隔絶させ、シグナル伝達エンドソームを鈍らせる。耐性細胞へのターゲティングを促進する上昇したＨＥＲ３に加えて、多価のＨｅｒＰＢＫ１０ナノ粒子はＨＥＲ３ホモオリゴマー化を誘導し、ＨＥＲ２（および他のチロシンキナーゼ）から隔絶させ、よって、ＨＥＲ３リン酸化および活性化を防止する。ＨＥＲ３上昇はリガンド誘導ＨＥＲ３ホモオリゴマーの形成を促進し、そのような現象は耐性細胞に特有である。その上、細胞質中への侵入を可能にする、エンドソーム溶解による受容体隔絶小胞の破壊は、毒性の細胞内標的へのコロールの送達をサポートしながらエンドソームシグナル伝達を消失させ、よって、全体の細胞毒性に寄与する。これは、ＨｅｒＰＢＫ１０は単独では、その、シグナル刺激リガンドからの誘導にもかかわらず、腫瘍細胞増殖をインビトロまたはインビボで誘導しないという発明者らの観察結果と一致する。
【００７８】
別の実施形態では、コロールは細胞質侵入後、細胞タンパク質への迅速移行により薬剤排出を逃れる。ＨｅｒＧａ蛍光は小胞エスケープ後、生細胞内の細胞質全体に広がり、一方、ＨｅｒＰＢＫ１０は核周辺で蓄積する。その上、ＨｅｒＭｎ粒子ではなく遊離Ｓ２Ｍｎは溶液中で著しいＴ１緩和短縮を示し、一方、ＨｅｒＭｎは組織取込で改善されたＴ１短縮を示す。「Ｔ１緩和」という用語は、本明細書では、スピン−格子緩和を示す。その上、低いｐＨは、Ｓ２ＧａをＨｅｒＰＢＫ１０から放出しない。これらの所見は一緒に、コロールはＨｅｒＰＢＫ１０から、細胞質侵入後、ｐＨ非依存性メカニズムを介して放出されることを示す。さらに、細胞骨格およびミトコンドリアへの酸素ラジカル誘導ダメージの広範な効果（ＲＯＳ生成の近接近を必要とする）は、コロールは、細胞小器官に付着し、全体的な様式でダメージを与えることを示す。そのため、コロールは、細胞取込後、細胞内タンパク質に迅速に移行し、これにより、コロールを薬剤排出トランスポーターから隔絶させたままにすることが助けられる。
【００７９】
別の実施形態では、毒性およびイメージングは相補的コロール活性を組み合わせることにより増大される。Ｓ２ＦＢ媒介ＳＯＤ阻害、Ｓ２ＧａまたはＳ２Ｍｎ媒介ＲＯＳ上昇、およびＳ２Ｇａ媒介ＴＳＰＯ阻害の組み合わせは、相補的活性を組み合わせることにより毒性を増大させる。そのようなアプローチはまた、異なる検出様式、例えば蛍光およびＭＲＩを組み合わせる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、腫瘍ホーミングコロールは、ＨＥＲ２阻害にインビボで耐性であるＨＥＲ２＋腫瘍を標的にする。
【００８１】
これらの実施形態の１つでは、耐性腫瘍へのインビボでの粒子分布は、ＨＥＲ３と相関する。ＨＥＲ２−阻害剤耐性腫瘍（例えば、ＢＴ−４７４ＲおよびＪＩＭＴ−１）は、上昇したＨＥＲ３のために、親腫瘍（例えば、ＢＴ−４７４）と比較してより高い粒子蓄積速度を示す。これらの実施形態のいくつかでは、インビボでの腫瘍ターゲティングは、ＨＥＲ３により媒介される。
【００８２】
別の実施形態では、コロール粒子は、併用療法に比べて、ＨＥＲ２阻害剤に対する獲得および先在耐性を有するＨＥＲ２＋腫瘍への改善された標的毒性を提供する。別の実施形態では、ＨＥＲ２シグナル−ブロッキング阻害剤は、最適化Ｈｅｒ−標的コロールナノ粒子媒介療法のためのアジュバントとして作用する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、腫瘍ホーミングコロールは、播種性癌の免疫適格性条件において、ＨＥＲ３を介してＴＮＢＣ腫瘍を標的にする。
【００８４】
これらの実施形態のいくつかでは、ＥＧＦ−Ｒ阻害剤は、インビトロで、ＨＥＲ３上昇を誘導し、ＴＮＢＣ細胞をコロール粒子に感作させる。１つの実施形態では、ＨｅｒＰＢＫ１０はマウス４Ｔ１細胞上のＨＥＲ３に結合し、ＨＥＲ３レベルは、ヒトＢＴ−５４９細胞上ではさらに高く、最適化されたＨｅｒ−標的コロールナノ粒子がこれらのＴＮＢＣ細胞株への標的毒性を誘発することを示す。加えて、ＴＮＢＣ１５上でのＥＧＦ−Ｒ阻害に対する耐性と関連するＨＥＲ３の上昇は、そのような阻害剤は、これらの細胞への最適化されたＨｅｒ−標的コロールナノ粒子ターゲティングおよび毒性を増大させることを示す。
【００８５】
別の実施形態では、コロール粒子はＴＮＢＣモデル上では、転移性および免疫適格性条件の両方において治療的に有効である。ＢＡＬＢ／ｃ−４Ｔ１モデルは、ＴＮＢＣおよび播種性癌のモデルとして一般的に使用される。マウス乳腺中に移植されると、４Ｔ１細胞は肺および脳へ転移する腫瘍を形成し、ステージＩＶ乳癌モデルを表す。この同系モデルは、播種性腫瘍への標的毒性を説明し、インタクトな免疫環境の存在下での、最適化Ｈｅｒ−標的コロールナノ粒子の治療効果を評価する。
【００８６】
実施例
下記実施例は特許請求される発明をよりよく説明するために提供され、その範囲を制限するものと解釈されるべきではない。特定の材料が言及される範囲内において、それは単に説明目的のものであり、特許請求される発明を制限することは意図されない。当業者は、発明の才能の訓練なしで、ならびに特許請求される発明の範囲から逸脱せずに、等価の手段または反応物を開発し得る。
【００８７】
実施例１：化学療法薬のＨＥＲ２＋乳癌細胞への標的送達
開示された技術をＨＥＲ２＋乳癌細胞に対し、インビトロおよびインビボで試験した。図２で示されるように、ＨＥＲ２＋乳癌を標的にする薬物送達分子を設計するために、ユニットＡは、ＨｅｒＰＢＫ１０と呼ばれるタンパク質を含み、これはＬ．  Ｋ．  Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ８：１７５３−１７６１  （２００１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法により作製される。ＨｅｒＰＢＫ１０は、カルボキシ（Ｃ）末端デカリジンにより修飾された細胞透過性アデノウイルスペントンベースタンパク質に融合されたヘレグリンの受容体結合ドメインを含む。ＨｅｒＰＢＫ１０の「Ｈｅｒ」セグメントは、ヘレグリン−αの受容体結合ドメインから得られ、それはＨＥＲ２／ＨＥＲ３またはＨＥＲ２／ＨＥＲ４サブユニットヘテロ二量体に特異的に結合する。ヘレグリンは直接、ＨＥＲ２ではなく、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４と相互作用するが、リガンド親和性は、ＨＥＲ２により著しく増強される。よって、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍細胞（すなわち、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞）はヘレグリン指向性ターゲティングのための良好な候補となると考えられる。
【００８８】
アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ペントンベースタンパク質の膜透過活性はＨｅｒＰＢＫ１０の「ＰＢ」セグメントに組み込まれ、標的細胞中への浸透を促進する。「Ｋ１０」セグメントは１０個のリジン残基を含み、その正電荷は、負電荷を持つ分子、例えば核酸の輸送を、求電子性相互作用により促進する。
【００８９】
ユニットＢは、共にアニールされた２つの相補的オリゴヌクレオチドを含み、小さな二本鎖核酸を形成する。ユニットＣは化学療法薬、Ｄｏｘを含む。３つの成分は室温でのインキュベーションにより２工程で共に組織化される。工程１では、ユニットＢ  ＤＮＡをユニットＣ  Ｄｏｘとインキュベートし、ＤＮＡ−Ｄｏｘアセンブリ（すなわち、ユニットＢ＋ユニットＣ）を形成させる。これは、ＤＮＡ塩基対間でのＤｏｘ分子のインターカレーションにより形成する。工程２では、ＤＮＡ−Ｄｏｘアセンブリを、ＨｅｒＰＢＫ１０とインキュベートし、ＨｅｒＤｏｘと呼ばれる最終複合体（すなわち、ユニットＡ＋ユニットＢ＋ユニットＣ）を形成させる。この相互作用は、負電荷を持つＤＮＡリン酸塩骨格のＨｅｒＰＢＫ１０の正電荷を持つポリリジン尾部への求電子性結合により形成される。
【００９０】
図３は開示される送達系の、そのこの特定の実施形態における動作の概略図を示す。図１１−Ｂは、従来のＤｏｘ投与と比較した、その、インビボで成功した適用を示す。開示される送達系の使用により、Ｄｏｘの送達は、癌性細胞を標的にし；従来の送達されるＤｏｘに比べ、相対的に高い量の薬物が癌性細胞に送達され、比較的低い量の薬物が非標的健康組織に到達した。
【００９１】
実施例２：ＨｅｒＤｏｘはアセンブリ中、非常に安定である
ＨｅｒＤｏｘは３つの成分から構成される：Ｄｏｘ；小さな二本鎖核酸（Ｄｏｘを運搬するのに直接関与する）；ならびに標的タンパク質、ＨｅｒＰＢＫ１０。ＨｅｒＤｏｘは２工程で組織化される。最初に、ＤｏｘをＤＮＡと混合し、ＤＮＡインターカレーションによりＤＮＡ−Ｄｏｘ対を形成させる。その後、ＤＮＡ−Ｄｏｘ対をＨｅｒＰＢＫ１０と混合し、ＨｅｒＤｏｘを求電子性相互作用により形成させる。ＤＮＡ−Ｄｏｘを遊離Ｄｏｘから分離するために、混合物は限外濾過遠心分離を受けた。発明者らは、ＤＮＡに添加したＤｏｘの＞９５％は、限外濾過スピン中、ＤＮＡから放出されなかったことを見出し、高速スピン中であっても薬物の高い保持が示される（図４−Ａ）。このスピンからの残余分および濾液の吸光度スペクトルにより、残余分の吸光度極大が濾過されていないＤｏｘと一致し、一方、そのような吸光度は、濾液では検出できないことが確認される（図４Ｂ）。残余分をその後、ＨｅｒＰＢＫ１０とインキュベートし、得られたＨｅｒＤｏｘ複合体を遊離成分から高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）サイズ排除分離により分離した。ここで、発明者らは、Ｄｏｘ吸光度は、大部分はＨｅｒＰＢＫ１０と共に共溶離されることを示し（図５）、これは、溶離画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認される（図５）。
【００９２】
実施例３：ＨｅｒＤｏｘは貯蔵中および血清中で非常に安定である
発明者らは、ＨｅｒＤｏｘの安定性を１２日にわたり、異なる貯蔵温度下で試験した：４０℃、室温、または３７℃。毎日、試料は限外濾過を受け、その後、濾液および残余分を測定し、Ｄｏｘが複合体から放出されたかどうかを決定した。４℃では、１００％の生成物が１２日までインタクトなままであったが、興味深いことに、室温および３７℃では、薬物のＨｅｒＤｏｘ生成物中への組み込みが増強されたようであった（図６−Ａおよび６−Ｂ）。結局、これらの所見から、ＨｅｒＤｏｘは異なる温度下での長期貯蔵後安定なままであり、Ｄｏｘを放出しないことが示唆される。発明者らはまた、血清含有培地において３７℃でＨｅｒＤｏｘ安定性を調べた。ニッケルセファロース上に固定されたＨｅｒＤｏｘ（ＨｅｒＰＢＫ１０ヒスチジンタグを介して）を３７℃で完全（すなわち１０％ウシ胎仔血清含有）培地において（組織培養条件を模倣するため）異なる期間インキュベートし、その後、ビーズをペレット化し、上清をＤｏｘ放出に対して測定した。コンジュゲート中でのＤｏｘ保持もまた、コンジュゲートをビーズから各時間点で溶離させることにより評価した。発明者らは、血清は、「（＋）血清」試料中でのＤｏｘ濾液吸光度の増加により検出されるであろう、コンジュゲートからのＤｏｘの有意の放出を生成させず（図６−Ｂ、上パネル）、Ｄｏｘはコンジュゲートにより各時間点で完全に保持された（図６−Ｂ、下パネル）ことを観察した。
【００９３】
実施例４：ＨｅｒＤｏｘは標的毒性を生成し、一方、Ｄｏｘ単独は生成しない
発明者らは、等しい投与量で（Ｄｏｘ濃度に関して０．５μＭ）、別々の皿中のＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２−乳癌細胞に対するＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘ単独の効果を比較した。３日までに、ＨｅｒＤｏｘはＨＥＲ２＋細胞数を７５％超低減させたが、ＨＥＲ２−細胞生存は、影響されなかった（図７）。等しい濃度のＤｏｘは単独でＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２−細胞の両方を同じオーダーの大きさ低減させた（図７）。これらの所見は、非標的薬物が標的外（すなわちＨＥＲ２−）細胞に影響を与えることを示すことにより、ターゲティングの重要性を強調する。重要なことには、タンパク質担体、ＨｅｒＰＢＫ１０単独では、ＨｅｒＤｏｘ中の等しいタンパク質濃度（０．１μＭ）で細胞株のいずれにも、増殖誘導の欠如を含む影響を有さなかった（図７）。受容体ターゲティングを試験するために、発明者らは遊離ヘレグリンリガンド（ＨｅｒまたはｅＨＲＧ）を競合的阻害剤として使用した。遊離リガンドは完全にＨｅｒＤｏｘによる細胞死滅を阻害し（図８）、ＨｅｒＤｏｘはヘレグリン受容体を介して細胞に結合し、侵入したことを示した。最終インビトロ誘発として、発明者らは、ＨｅｒＤｏｘがＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２−乳癌細胞の混合培養物中で特異的にＨＥＲ２＋細胞に対して毒性を誘発するかどうかを試験した。これをするために、発明者らは混合培養物中での細胞同定のために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でタグされたＨＥＲ２−細胞株を生成させた（図９−Ａ）。発明者らは、ＨｅｒＤｏｘは非ＧＦＰ（ＨＥＲ２＋）細胞増殖をほとんど完全に低減させ、一方、ＧＦＰ（ＨＥＲ２−）細胞増殖は変化しなかったことを見出した（図９−Ｂ）。結局、これらの所見により、ＨｅｒＤｏｘは、選択的に毒性をＨＥＲ２＋細胞に標的させる能力を有することが示される。重要なことには、これらの実験は全て完全（すなわち血清含有）培地で実施され、よって、ＨｅｒＤｏｘは血清タンパク質の存在に関係なく、細胞を標的にすることが示された。その上、ＨＥＲ２＋およびＨＥＲ２−細胞の混合培養物中でのＨＥＲ２＋細胞の選択的細胞死滅は、標的細胞の死および溶解後、それらの細胞中に放出されたＤｏｘは、ＨＥＲ２−細胞に対して毒性を誘導し続けることはできないことを意味する。細胞培養におけるＨｅｒＤｏｘの安定性をさらに確認するために、ＨｅｒＤｏｘを培地から、別の実験において、示された時点で回収し、アガロースゲル上で電気泳動させ、これをその後、ＵＶ照射し、Ｄｏｘを検出し、ならびにクーマシーブルーで染色し、ＨｅｒＰＢＫ１０タンパク質を検出した（図９−Ｃ）。ゲルは遊離Ｄｏｘを保持しないので、時間に伴うＤｏｘ蛍光の損失は、コンジュゲートがＤｏｘを放出したことを示すであろう。血清含有培地において、ＨｅｒＤｏｘからのそのような損失は検出できない。血清を含まない条件では、Ｄｏｘ蛍光は１時間までに減少したようであるが、しかしながらクーマシーブルー染色は、減少した蛍光はゲルレーンにロードされた試料がより少ないことによることを示す。ＨｅｒＰＢＫ１０バンドの共泳動はさらに、細胞培地中でコンジュゲートはインタクトなままであったことを証明した。前に記載される血清−安定性アッセイと共に、これらの所見は、コン��ュゲートは、細胞培養（これは常に少なくとも１０％の血清を含む）における長期インキュベーション中インタクトなままであることを示す。
【００９４】
実施例５：ＧＦＰ−Ｈｅｒはインビボターゲティングの指標を提供する
リガンドのインビボでのターゲティング能力を検知し、インビボターゲティングの指標を確立するために、発明者らは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ付けリガンド（ＧＦＰ−Ｈｅｒを使用した。重要なことには、このリガンドはＨｅｒＰＢＫ１０の「Ｈｅｒ」ドメインと同一である。彼等は、６〜８週雌ヌードマウスにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の両側側腹部注射を介してＨＥＲ２＋腫瘍を形成した。腫瘍が２５０〜３００ｍｍ３に到達した時（腫瘍細胞移植後−３〜４週）、３ｎｍｏｌのＧＦＰ−Ｈｅｒを尾静脈を介して注射した。モック注射したマウスは生理食塩水のみを投与された。示された組織を、注射後３．５時間に採取し、ＧＦＰについてＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ３次元小動物インビボイメージングシステム（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して画像化した。ＧＦＰ蛍光の選択的な蓄積が、他の組織を超えて腫瘍において検出された（図１０）。低〜無視できるレベルの蛍光が肝臓および筋肉で検出され、ＧＦＰ蛍光は心臓を含む他の組織では検出不能であった（図１０）。モック処置動物由来の組織は蛍光を示さなかった。
【００９５】
実施例６：ＨｅｒＤｏｘはＨＥＲ２＋乳癌細胞をインビボで標的にする
Ｄｏｘは適切な波長励起で赤色蛍光を放出し、それは、ＨｅｒＤｏｘの全身送達後の体内分布を検出するために使用される。第４週の腫瘍（約７００〜８００ｍｍ３）を有するマウスは、ＤｏｘまたはＨｅｒＤｏｘの単回尾静脈注射を受け（Ｄｏｘ  ｃｏｎｅに関して０．００８ｍｇ／ｍＬ）、リアルタイムで獲得した生存マウスの画像、または注射後３時間に採取した器官／組織の画像を、カスタマイズしたマクロ照明および検出システムを用いて獲得した。蛍光はＨｅｒＤｏｘ注射後１０分で、全身で明らかになり、その後、直ちに、腫瘍に２０分までに蓄積し、注射後１００分までは腫瘍中で検出可能なままであった（図１１Ａ）。ＨｅｒＤｏｘ注射後約３時間で採取した組織および腫瘍は、腫瘍中で強い蛍光を示したが、実質的に低いレベルの蛍光が肝臓で検出可能であった（図１１Ｂ）。いくらかの蛍光が腎臓では辛うじて検出できたが、心臓、脾臓、肺、および骨格筋を含む他の組織は蛍光を示さなかった。対照的に、等しい用量のＤｏｘを注射したマウスから採取した組織は、肝臓、腫瘍、および腎臓において検出可能な蛍光を示した。より低いレベルの蛍光もまた、肺および骨格筋において検出可能であった。
【００９６】
インビボ腫瘍毒性を評価するために、３〜４週両側側腹部腫瘍を有するマウスは毎日、ＤｏｘまたはＨｅｒＤｏｘ（Ｄｏｘ  ｃｏｎｅに関して０．００４ｍｇ／ｋｇ）、ＨｅｒＰＢＫ１０単独（ＨｅｒＤｏｘに等しいタンパク質濃度）または生理食塩水の尾静脈注射を７連続日の間、受け始めた。尾静脈注射２週前に開始して腫瘍増殖の間ずっと腫瘍を測定し、Ｄｏｘは腫瘍増殖を減速させ、ＨｅｒＤｏｘは生得的に腫瘍増殖を防止したが、ＨｅｒＰＢＫ１０単独および生理食塩水は、効果を有さなかったことが示される（図１２Ａ）。時間に伴う認識できる体重減少は処置または対照マウスのいずれにおいても観察されなかった（図１２Ｂ）。
【００９７】
注射後２５日に、腫瘍および器官を採取し、組織化学のために処理した。Ｄｏｘは急性および長期心毒性を誘導することができることが確立されており、そのため、発明者らは、ＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘで処置したマウスの心臓を調べた。Ｄｏｘ処置マウス由来の心臓は、ＨｅｒＤｏｘおよび生理食塩水処置マウス由来の心臓に比べてわずかに肥大し、拡張したようであり（図示せず）、Ｄｏｘ毒性と関連する拡張型心筋症が示唆される。生理食塩水処置マウス由来の心筋は、正常な心臓形態を示し、一方、Ｄｏｘ処置マウス由来のものは局所変性、筋原線維喪失、細胞質空胞化の増加、および核凝縮または溶解、典型的なＤｏｘ誘導心毒性を示し、一方、ＨｅｒＤｏｘ処置マウス由来の心筋は生理食塩水処置マウスと同様の形態を示した（図１２−Ｃ）。これらの所見に一致して、処置マウスにおける心機能を評価するために取得した心エコー図は、ＨｅｒＤｏｘ処置マウスにおいて検出可能でないＤｏｘ誘導機能障害の徴候を示し：一方、Ｄｏｘは、一回拍出量、心拍出量、および左心室内部寸法および体積の中程度〜顕著な低減を誘導し、ＨｅｒＤｏｘはこれらの測定について効果を有さず、モック（生理食塩水）処置マウスと同様に見えた（図１２−Ｄ）。
【００９８】
インビボ安定性を測定する実現可能性を評価するために、発明者らはＨｅｒＤｏｘ（０．１２ｍｇ／ｍＬ最終Ｄｏｘ  ｃｏｎｅ）または遊離Ｄｏｘを等しい濃度でマウスから新たに収集した全血中でインキュベートし、混合物を３７℃で１時間までインキュベートした。抗凝固薬として、０．５ｍＭＥＤＴＡが採血物中に存在し、パラレル試料を３７℃でＥＤＴＡ単独中でインキュベートした。インプットＨｅｒＤｏｘを表す試料（血液中でのインキュベーション前）を３７０ＣでＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水中でインキュベートした。全ての試料をその後、１  ＯＫ  ＭＷカットオフフィルタを通して遠心分離し、Ｄｏｘ蛍光を残余分および濾液中で測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２）。結果は、とりわけＨＢＳまたはＥＤＴＡ中でインキュベートしたＨｅｒＤｏｘ、または遊離Ｄｏｘと比較して、ＨｅｒＤｏｘの濾液蛍光の検出可能な増加が欠如していることから明らかなように、コンジュゲートからのＤｏｘの検出可能な損失はないことを示す（図１３）。同様に、生理食塩水またはＥＤＴＡ単独中でインキュベートしたものに比べて、血液中でインキュベートした試料からのＨｅｒＤｏｘ残余分からのＤｏｘの認識できる損失はない（図１３）。バイオイメージング結果と一緒にすると、これらの所見は、ＨｅｒＤｏｘは血液中でインタクトなままであり、インビボで、腫瘍標的への輸送中で安定性を保持することを示す。
【００９９】
実施例７：ＨｅｒＤｏｘメカニズム：細胞質中でのＤｏｘ放出＆核中での蓄積
ＨｅｒＰＢＫ１０単独では細胞死を誘導せず（図７）、そのため、ＨｅｒＤｏｘによる細胞死滅を促進するのは、細胞中へのＤｏｘの送達である。ＨｅｒＤｏｘ媒介腫瘍細胞死のメカニズムを理解するために、発明者らは、ＨＥＲ２＋細胞をＨｅｒＤｏｘによる処置後、Ｄｏｘ蛍光を使用して顕微鏡的に調べ、細胞内位置を検出した。投与後早くに（取込の０分に）、ＨｅｒＤｏｘは大部分は細胞周辺に現れ、コンジュゲートが細胞表面に結合されたが、まだインターナライズされていないことが示される（図１４−Ａ）。対照的に、遊離Ｄｏｘはすでに細胞内、核周辺で見出されている（図１４−Ａ）。６０分で、ヘレグリン標的タンパク質の大部分が細胞に侵入すると、Ｄｏｘは、遊離Ｄｏｘと同様に、核内に蓄積した（図１４−Ａ）。これらの動力学は、前のターゲティング結果に加えて、受容体介在性ＨｅｒＤｏｘ侵入メカニズムを支持する。Ｄｏｘの核内パターンでさえも、ＨｅｒＰＢＫ１０により送達されると、遊離Ｄｏｘとは異なる。非標的Ｄｏｘは細胞核内に蓄積するが、ＨｅｒＤｏｘは選択的に核小体構造内に蓄積し、いくらかの細胞質蛍光が依然として視認可能である（図１４−Ｂ）。
【０１００】
取込中、ＤｏｘがＨｅｒＰＢＫ１０に付着されたままであるかどうかを決定するために、発明者らはＨｅｒＰＢＫ１０に対する免疫蛍光を使用した。取込の１５分で、ＨｅｒＰＢＫ１０は大部分、Ｄｏｘと共存し、ＨｅｒＤｏｘの実質的な集団は依然としてインタクトなままであるが、Ｄｏｘのいくらかの核蓄積がすでに視認可能であることが示唆される（図１５）。３０および６０分で、増加するレベルのＤｏｘが核内に蓄積するが、一方、ＨｅｒＰＢＫ１０の大部分は細胞質中に残ったままである（図１５）。固定細胞では、核小体蓄積は生細胞のように検出可能でなかった（図１４Ｂ）。結局、これらの所見は、ＨｅｒＰＢＫ１０はＤｏｘを細胞中に送達し、Ｄｏｘを細胞内に放出し、そこでは、これは核蓄積を受け、送達のメカニズムと一致することを示す（図１１−Ｂ）。
【０１０１】
実施例８：ヒト血清は、細胞結合に対し顕著な効果を有さない
ＨｅｒＰＢＫ１０が、血清中に存在し得る循環リガンドと競合するかどうかを決定するために、発明者らは、ＨＥＲ２＋患者から得られたヒト血清中で、ＨＥＲ２＋乳癌細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を試験した。シーダーズ・サイナイの女性の癌研究所では時折、制限された量の患者血清が得られ、そのうち、ＨＥＲ２＋患者由来の血清はさらに少ない小数部分を占める。特に、ここで使用されるヒト血清は、実際の血清画分であり、ＨＥＲ２＋および同年齢ＨＥＲ２−患者の収集した全血から単離したタンパク質と関連する。初期の実験により、ＨｅｒＤｏｘは１０％ウシ血清を含む完全培地中で細胞標的に結合すること、およびこの結合は過剰の遊離リガンドにより競合的に阻害されることが証明される。ここで、発明者らは、ルーチン培養培地中のウシ血清を、獲得した患者試料から得られたヒト血清に置き換え、とりわけ、ＨＥＲ２＋患者由来のヒト血清が細胞結合を阻害するかどうかを評価した。発明者らは、処置前に、ヒト血清に対して確実に細胞をかなり曝露した（２時間、これは任意の循環リガンドの受容体結合に対し十分な時間を提供する）。ＨＥＲ２＋患者、ＨＥＲ２−患者のいずれか由来の血清、またはウシ血清における細胞結合の直接比較は有意の差を示さず（図１６）、ここで試験したヒト血清は、標的細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を妨害しなかったことが示される。１００×ヘレグリンリガンド（＋Ｈｅｒ）による競合的阻害により、コントロール結合活性はヘレグリン受容体に特異的であることが確認される。
【０１０２】
実施例９：ＨＥＲサブユニットレベルおよび提案した細胞型に対する細胞毒性
発明者らは、前に記載されるレベルが使用される入手可能な細胞における実際のレベルを反映しない可能性があるので、本明細書で記載される様々な細胞株および型上でのＨＥＲサブユニットの細胞表面レベルを測定した。発明者らは、ＡＴＣＣおよびＮＩＨ／ＮＣＩから指された細胞株を獲得し、これらをＨＥＲサブユニットレベルに対してプロファイリングした（図１７Ａ）。ＨｅｒＤｏｘがＨＥＲ２レベルに従い毒性を誘導するかどうかを評価するために、発明者らはかなり高い（ＳＫＢＲ３）、中程度（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＨｅＬａ）、および低〜検出不能（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）レベルでＨＥＲ２を提示する株を選択し、細胞毒性用量曲線を実施した。発明者らは、ＨｅｒＤｏｘＣＤ５０は、これらの選択した株上の細胞表面ＨＥＲ２レベルと逆相関し：かなり高いＨＥＲ２を提示する細胞株は、ＨｅｒＤｏｘに対してかなり高い感受性を示し、一方、低いＨＥＲ２を提示する細胞株は低い感受性を示し、中間ＨＥＲ２レベルを提示する株は同様に中間感受性を示すことを観察した（図１７Ｂ；ＣＤ５０は対数スケールで示される）。
【０１０３】
実施例１０
【表１】
0006728056.tif 000002
＊ＥＬＩＳＡにより決定される相対細胞表面レベル（平均±１ＳＤ）。Ｎ＝３つのウェル。
＊＊ＨｅｒＤｏｘ用量曲線の非線形回帰分析により決定される、細胞生存において５０％低減が得られる濃度（平均±ＩＳＤ）。Ｎ＝３つの処置ウェル／用量。
【０１０４】
実施例１１：ＨｅｒＰＢＫ１０の最適化
ＨｅｒＰＢＫ１０タンパク質はアデノウイルスペントンベースタンパク質に由来し、その自然結合標的はα−ｖインテグリンであるので、発明者らは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）インテグリン結合モチーフの突然変異がタンパク質のカーゴを細胞内に送達する能力を改善するかどうかを評価した。前の研究により、ヘレグリン受容体結合リガンドのペントンベースへの付加がそれをほぼ排他的にヘレグリン受容体に再指向させる（競合的阻害アッセイにより証明される）ことが示されるが、ＨｅｒＰＢＫ１０は依然として、インテグリン受容体を利用することができ、それはタンパク質を異なる細胞内経路に再指向させる、またはタンパク質自体上の結合部位に対し競合することができることが可能である。点変異によりＲＧＤモチーフをＥＧＤにすることは、インテグリン結合を無効にする。そのため、この突然変異を有する変異タンパク質ＨｅｒＰＢｒｇｄＫ１０が生成された。これを、親ＨｅｒＰＢＫ１０と比較して、遺伝子送達に対して試験した。等しいタンパク質濃度では、ＨｅｒＰＢｒｇｄＫ１０は中程度（約１．８倍）〜劇的（約１８倍）な遺伝子導入の増強を示した（図１８）が、これは増強された受容体結合または結合後活性を反映する可能性がある。
【０１０５】
実施例１２：ＤＮＡコンストラクト
発明者らは配列５’−ＡＴＣＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＧＧＣＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＡＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む一般的な５’オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ｐＪＭｌ７アデノウイルスゲノムテンプレート由来の野生型およびリジンタグ付けペントン配列の両方を増幅した。３’プライマーの配列はＰＢ：５’−ＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＡＴＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＰＢＫ１０５’−ＣＡＴＧＡＡＴＴＣＡ（ＴＴＴ）１０ＡＡＡＡＧＴＧＣＧＧＣＴＣＧＡＴＡＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）である。ｐＲＳＥＴ−Ａ細菌発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中への野生型およびリジンタグ付けペントンの両方のインフレーム挿入のために、ＢａｍＨＩ制限部位を、５’プライマーに導入し、ＥｃｏＲｌ制限部位を、３’プライマーに導入した。このプラスミドは組換えタンパク質を、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる親和性精製のためのＮ末端ヒスチジンタグ付け融合物として発現する。
【０１０６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用して、短いポリグリシンリンカーをコードする配列をＰＢＫ１０のアミノ（Ｎ）末端に付加した。リンカーをコードする配列は追加のクローニングのための５ＯｃＩＩ制限部位を含む。ヘレグリンターゲティングリガンドを、ヘレグリン遺伝子２９の上皮成長因子（ＥＧＦ）様ドメインのＰＣＲ増幅により、ＰＢＫ１０とインフレームでクローニングするために、ＢａｍＨＩ部位を含む５’オリゴヌクレオチドプライマーおよびＳａｃＵ部位を含む３’プライマーを使用して、生成させた。ターゲティングリガンドをリジンタグ付けコンストラクトに付加し、ＨｅｒＰＢＫ１０を、ＰＣＲ産物をＰＢＫ１０に対しちょうどＮ末端に連結させることにより、生成させた。ＨｅｒおよびＧＦＰ−Ｈｅｒの構築は前に記載されている（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  Ｌ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０００，  ２９：  ６０２−６０９）。ＨｅｒＫ１０は、ＨｅｒコンストラクトのＰＣＲ増幅により、５’Ｈｅｒプライマー（Ｍｅｄｉｎａ−Ｋａｕｗｅ  Ｌ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０００，  ２９：  ６０２−６０９）および配列５’−ＡＴＧＡＡＴＴＣＡ（ＴＴＴ）１０ＡＧＡＴＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を含む３’オリゴヌクレオチドプライマーを使用して作製した。
【０１０７】
実施例１３：ＤＳ−オリゴ長は標的複合体中へのＤｏｘ組み込みに影響しない
Ｄｓ−オリゴ二本鎖を、相補的な３０ｂｐ配列、ＬＬＡＡ−５（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）およびＬＬＡＡ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）または４８ｂｐ配列、ＢｇｌＩＩＨｉｓ−５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＢｇｌＩＩＨｉｓ−３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）から形成させた。Ｄｏｘをアニールされた二本鎖の各組に１：１０、１：２０、または１：４０のいずれかのモル比の二本鎖：Ｄｏｘで（２０、４０、または８０μＭのいずれかの最終Ｄｏｘ濃度）、１０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中、３０分間室温で添加した。混合物をその後限外濾過膜を通して（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭｌＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１０，０００×ｇで遠心分離し、遊離Ｄｏｘを組み込まれたＤｏｘから分離した。残余分および濾液を別々に収集し、各々の吸光度を４８０ｎｍでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。結果（図１９）は、３０または４８ｂｐ二本鎖のいずれかを用いるＤｏｘ組み込みにおいて認識できる差はないことを示す。
【０１０８】
実施例１４：ＨｅｒＤｏｘは、神経膠腫細胞に対して毒性である
Ｕ２５１ヒト神経膠腫細胞を、非透過処理免疫組織化学法により、ＨＥＲサブユニットレベルについて評価し、かなり著しいレベルの細胞表面ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４を示すことを見出した（図２０Ａ）。
【０１０９】
皿内で増殖するＵ２５１細胞を、ＨｅｒＤｏｘまたはＤｏｘのいずれかと共に（０．５μＭまたは１μＭのいずれか）培地中、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、その後新鮮完全培地を添加し、最終培養体積をおよそ４倍増加させ、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４日間維持した。細胞をトリプシン処理し、最終日にカウントした。
【０１１０】
発明者らの結果は、ＨｅｒＤｏｘはＵ２５１細胞に対し等しい濃度のＤｏｘよりも８〜１０倍多い毒性を示し、同様に、１０×少ないＨｅｒＤｏｘがＤｏｘと同じ毒性を誘発することを示す（図２０Ｂ）。
【０１１１】
実施例１５：ＨＥＲ２＋腫瘍に対するインビボでのターゲティングおよび治療効果に対する、修飾カプシドタンパク質、ｄｓ−オリゴ、およびＤＮＡインターカレーターから構成される最適化複合体の試験
耐性腫瘍細胞は上昇したＨＥＲ３およびＨｅｒＤｏｘへの増大した感受性を示す。トラスツズマブへの獲得耐性を有するＨＥＲ２＋乳癌細胞株は親株と比較すると、ＨＥＲ３の上昇した細胞表面レベルを示し（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３）（図２１−Ａ）、ＨＥＲ３上昇は薬物耐性と関連することを示す別の研究と一致する。ＨｅｒＤｏｘ処置を、培養下のＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３親およびトラスツズマブ耐性株に対するトラスツズマブおよびトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用療法と比較した。各処置を、治療効果を誘発するために前に確立された濃度範囲で投与した。トラスツズマブ（Ｔｚ）は、親ＢＴ４７４細胞生存を、５０％低減させ、ペルツズマブ（Ｐｚ）の追加は、有意に細胞死を増加させなかった（図２１Ｂ）。どちらのレジメンも、ＢＴ４７４耐性細胞に対して無効であった。ＨｅｒＤｏｘは、ＴｚおよびＴｚ＋Ｐｚに比べ、ＢＴ４７４親細胞に対し、より高い細胞死を示し、ＢＴ４７４耐性細胞を完全に全滅させた。ＳＫＢＲ３に関する所見は同様であった。というのも、親および耐性細胞のどちらも、Ｔｚ単独または併用療法（Ｔｚ＋Ｐｚ）のいずれにもほとんど応答を示さなかったからである（図２１Ｂ）。対照的に、ＨｅｒＤｏｘは５０％細胞死を親ＳＫＢＲ３に対して、ＳＫＢＲ３耐性細胞に関しては＞８０％細胞死を誘発した。
【０１１２】
ＨｅｒＤｏｘの効力をまた、先在耐性を有する細胞株に関して調べた。ＪＩＭＴ−１細胞株を、トラスツズマブ治療に決して応答しなかった腫瘍から誘導した。これらの細胞はＴｚおよびＴｚ＋Ｐｚに対し、広い濃度範囲にわたって無応答性のままであった（図２１−Ｃ）。対照的に、ＨｅｒＤｏｘは用量依存的細胞死をもたらし、９０％までの細胞を死滅させた（図２１−Ｃ）。加えて、ＨｅｒＤｏｘの、ＪＩＭＴ−１腫瘍を有するマウスへの全身送達は、ＴｚおよびＤｏｘ単独と対照的に腫瘍増殖を消失させた（図２２）。
【０１１３】
トラスツズマブ前処置はＨＥＲ２＋細胞をＨｅｒＤｏｘに感作させる。前の研究は、ＨＥＲ３は、ラパチニブまたは遺伝子サイレンシングのいずれかによるＨＥＲ２阻害後４時間するとすぐに、転写的にかつ翻訳的に上昇したことを示した。親細胞を超える、Ｔｚ耐性細胞に対するＨｅｒＤｏｘの増強された効力は、トラスツズマブはＨｅｒＤｏｘのためのアジュバントとして作用する可能性があり、ＨＥＲ３上昇を誘導し、ＨｅｒＤｏｘの耐性細胞へのホーミングを増加させることを示唆する。これを試験するために、親および耐性株をＨｅｒＤｏｘ処置前４または２４時間トラスツズマブで前処置した。ＨｅｒＤｏｘはすでに、親ＳＫＢＲ３細胞に対しトラスツズマブと比べて、改善された細胞死滅を示し、一方、前処置は、試験した最高用量で、毒性を４０〜５０％さらに増大させた（図２３Ａ）。親ＢＴ４７４細胞に対するＨｅｒＤｏｘ毒性は、トラスツズマブよりも適度に改善されたが、トラスツズマブによる４時間前処置はＨｅｒＤｏｘ毒性をさらに５０％増強させ、２４時間前処置はほぼ７５％の毒性の増強を可能にした（図２３Ｂ）。ＨＥＲ２−３発現ＭＤＡ−ＭＢ−４３５であっても（すでにＨｅｒＤｏｘに感受性である）、トラスツズマブによる２４時間前処置で、中程度の毒性の増強を示した（図２３Ｃ）。他方、Ｔｚ耐性株はすでに、ＨｅｒＤｏｘに対する強力な感受性を示し、よって、前処置はほとんどの場合不要であった（図２３Ｄ〜Ｆ）。Ｔｚ耐性ＢＴ４７４細胞は特に、試験した全てのＨｅｒＤｏｘ濃度で完全細胞死を呈した（図２３Ｅ）。したがって、ＨｅｒＤｏｘ濃度を、トラスツズマブ前処置が効果を有するかどうかを評価するために低減させた。５倍低いＨｅｒＤｏｘ濃度は依然として強力な効果を細胞生存に対して有し、トラスツズマブ前処置はさらに細胞毒性を増強させた（図２３Ｆ）。結局、これらの所見から、トラスツズマブはＨｅｒＤｏｘ処置のための有用なアジュバントとして作用し得ることが示唆される。
【０１１４】
実施例１６：ＨｅｒＰＢＫ１０は、ＨＥＲ３に特異的である
図２６は、ＨｅｒＰＢＫ１０は、ＨＥＲ３に特異的であることを示す。というのも、ＨｅｒＰＢＫ１０はヒトＨＥＲ３の細胞外ドメインを含む固定化ペプチドに結合するからであり、これは、インビトロでの、遊離ＨＥＲ３ペプチドによるＨｅｒＰＢＫ１０の前吸着により阻害された（図２６−Ａ）。同じ前吸着はまた、培養下のＨＥＲ２＋細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を阻害した（図２６−Ｂ）。重要なことには、ＨＥＲ２のＨＥＲ３との二量体化は、ＨｅｒＰＢＫ１０結合のために必要とされず、というのも、ヘテロ二量体−遮断抗体、ペルツズマブ（Ｐｚ）はＨＥＲ２＋細胞上のその受容体へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を防止しなかった（図２６−Ｂ）。結合はまた、ＨＥＲ４ペプチドまたはベータセルリン（ＨＥＲ４をブロックする）により阻害されなかった（図２６−Ｂ）。
【０１１５】
実施例１７：受容体結合は、患者血清により阻害されない
５人のＨＥＲ２＋患者および同年齢対照由来の血清は培養下のＨＥＲ２＋細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を防止せず、互いの間で有意の差を示さなかった。そのため、受容体結合は、患者血清により阻害されない。免疫適格性マウスにおけるＨｅｒＰＢＫ１０の治療的および１０倍高いレベルでの繰り返し投与では、そのタンパク質に対する検出可能な中和抗体形成が得られなかった。
【０１１６】
実施例１８：耐性腫瘍細胞は上昇したＨＥＲ３およびＨｅｒＤｏｘへの増大した感受性を示す
図２７Ａは、トラスツズマブに対する獲得耐性を有するＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＨＥＲ２阻害剤の濃度を増加させる、長期培養の標準レジメンを使用する）は、親株と比較するとＨＥＲ３の上昇した細胞表面レベルを示すことを示す図である（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３）。この結果は、ＨＥＲ３上昇は、薬物耐性と関連するという当技術分野で知られている知識と一致する。
【０１１７】
ＨｅｒＤｏｘの癌細胞への効果を、（ｉ）トラスツズマブ、ならびに（ｉｉ）トラスツズマブ（Ｔｚ）およびペルツズマブ（Ｐｚ）の併用療法と比較した。実験をＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３親細胞株およびトラスツズマブ耐性細胞株に対して培養下で実施した。各療法薬を、治療効果を誘発するために、前に確立したまたは当技術分野で知られている濃度範囲で投与した。Ｔｚは親ＢＴ４７４細胞生存を５０％だけ低減させ；Ｐｚの追加は有意に細胞死を増加させなかった（図２７−Ｂ）。どちらのレジメンもＢＴ４７４耐性細胞に対して無効であった。他方、ＨｅｒＤｏｘは、ＴｚおよびＴｚ＋Ｐｚに比べ、ＢＴ４７４親細胞に対しより高い細胞死を示し、効果的にＢＴ４７４耐性細胞を排除した。
【０１１８】
同様の結果がまた、ＳＫＢＲ３細胞株に対して得られた。親および耐性細胞はＴｚ単独または併用療法（Ｔｚ＋Ｐｚ）のいずれにもほとんど応答を示さなかった（図２７−Ｂ）。対照的に、ＨｅｒＤｏｘは５０％親ＳＫＢＲ３細胞死、およびＳＫＢＲ３耐性細胞について＞８０％細胞死を誘発した。そのため、これらの結果は、耐性腫瘍細胞は、ＨｅｒＤｏｘへの増大した感受性を示すことを示す。
【０１１９】
ＨＥＲ３のリガンド−結合ドメインを含むペプチドを用いたＨｅｒＤｏｘの前吸着は細胞毒性をブロックしたかどうかを評価することにより、ＨＥＲ３の標的毒性への寄与を評価した。ＨｅｒＤｏｘは親および耐性株について著しい細胞死を誘発したが、一方、これは、ＨＥＲ３ペプチドにより阻害され（図２７−Ｃ）、細胞死はＤｏｘペイロードのリガンド指向性送達を介して起きたことが示される。図２７Ｅは、先在耐性を有する細胞株に対するＨｅｒＤｏｘの効力を示す。ＪＩＭＴ−１細胞株をトラスツズマブ治療に決して応答しなかったＨＥＲ２＋腫瘍から誘導した。これらの細胞はＴｚおよびＴｚ＋Ｐｚに無応答性のままであり、広い濃度範囲にわたって、部分的にのみＤｏｘに応答した。対照的に、ＨｅｒＤｏｘは用量依存的細胞死をもたらし、９０％までの細胞を排除した（図２７−Ｅ）。最後に、ＨｅｒＤｏｘのＪＩＭＴ−１腫瘍を有するマウスへの全身送達は、ＨｅｒＤｏｘと同じ薬物用量でのＴｚおよびＤｏｘ単独と対照的に、腫瘍増殖を消失させた（０．００４ｍｇＤｏｘ／ｋｇ／注射）。実際、ＴｚまたはＤｏｘ単独の腫瘍増殖に対する影響は、モック生理食塩水処置と比べてわずかにすぎない（図２８）。そのため、これらの結果は、ＨｅｒＤｏｘは耐性腫瘍細胞に対して著しい細胞死を誘発することを示す。
【０１２０】
実施例１９：トラスツズマブはＨＥＲ２＋細胞をＨｅｒＤｏｘに感作させる
図２９Ａは、インビトロでのＴｚ前処置は、親細胞においてＨＥＲ３を上昇させ（図２９−Ａ）、これらの細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合を増大させ（図２９−Ｂ）、これらの細胞へのＨｅｒＤｏｘ毒性を増強させる（図２９−Ｃ、２９−Ｄ）ことを示す。親および耐性細胞株を、Ｔｚで、ＨｅｒＤｏｘ処置前４または２４時間の間前処置した。ＨｅｒＤｏｘはすでに親ＳＫＢＲ３細胞に対してＴｚと比べて、改善された細胞死滅を示したが、一方、前処置は、試験した最高用量で、毒性を４０〜５０％さらに増大させた（図２９−Ｃ）。親細胞を超える、Ｔｚ耐性細胞に対するＨｅｒＤｏｘの増強された効力は、トラスツズマブは、ＨｅｒＤｏｘのためのアジュバントとして作用し、ＨＥＲ３上昇を誘導し、ＨｅｒＤｏｘの耐性細胞へのホーミングを増加させることを示す。
【０１２１】
親ＢＴ４７４細胞に対するＨｅｒＤｏｘ毒性はＴｚよりも適度に改善されたが、トラスツズマブによる４時間前処置はＨｅｒＤｏｘ毒性をさらに５０％増強させ、２４時間前処置はほぼ７５％の毒性の増強を可能にした（図２９−Ｄ）。ＨＥＲ２−３発現ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞であっても（すでにＨｅｒＤｏｘに感受性である）、Ｔｚによる２４時間前処置で中程度の毒性の増強を示した（図２９−Ｅ）。他方、Ｔｚ耐性株はすでに、ＨｅｒＤｏｘに対する強力な感受性を示し、よって、前処置はほとんどの場合不要であった（図２９−Ｆ、２９−Ｇ）。Ｔｚ耐性ＢＴ４７４細胞は特に、完全細胞死を試験した全てのＨｅｒＤｏｘ濃度で受けた（図２９−Ｇ）。したがって、ＨｅｒＤｏｘ濃度をトラスツズマブ前処置が効果を有するかどうかを評価するために低減させた。５倍低いＨｅｒＤｏｘ濃度は依然として強力な効果を細胞生存に対して有し、Ｔｚ前処置はさらに細胞毒性を増強させた（図２９−Ｈ）。結局、これらの所見から、Ｔｚは、ＨｅｒＤｏｘ処置のための有用なアジュバントとして作用することが証明される。同様に、ペルツズマブ、ラパチニブ、Ｔ−ＤＭ１もまた、ＨｅｒＤｏｘ処置のためのアジュバントとして作用する。
【０１２２】
実施例２０。ＨｅｒＰＢＫ１０取込はトラスツズマブと比べてより迅速で効率的である
蛍光標識されたＨｅｒＰＢＫ１０を調製し、標識されたＴｚと比較して、その体内分布および細胞取込を評価した。等しい用量の各試薬をＨＥＲ２＋腫瘍を有するマウスの尾静脈に注射した。組織を、注射後４時間に、イメージングのために採取した。どちらの試薬も標識された非標的タンパク質のＢＳＡと比べた。ＨｅｒＰＢＫ１０およびＴｚは、等しいレベルの腫瘍蓄積を示し（どちらもＢＳＡより高かった）、心臓、脾臓、および筋肉への送達はほぼなかった（図３０−Ａ）。しかしながら、他の非腫瘍組織、例えば、肝臓、肺、および腎臓への送達はＨｅｒＰＢＫ１０よりもＴｚで高かった。Ｔｚと対照的に、ＨｅｒＰＢＫ１０は肺送達を示さなかった（図３０−Ａ）。
【０１２３】
ＨＥＲ２＋ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における取込もまた評価した。これらの細胞における細胞表面受容体レベルを図３０−Ｂにおいてグラフにより示す。ＨｅｒＰＢＫ１０は、細胞取込後４５分以内に、細胞表面クラスター化、続いて、著しいエンドサイトーシスを示した（図３０−Ｂ）。対照的に、これらの細胞上のＨＥＲ３と比較して上昇したＨＥＲ２レベルに関係なく、Ｔｚは細胞結合後２時間までに細胞上に低密度に点状領域で残った細胞表面上での低密度の結合を示した（図３０−Ｂ）。
【０１２４】
これらの結果は、ＨｅｒＰＢＫ１０取込はＴｚと比べてより迅速で効率的であることを示す。
【０１２５】
実施例２１：ＨｅｒＰＢＫ１０は、ＨＥＲ２よりも上昇したＨＥＲ３を発現する患者腫瘍組織上で、トラスツズマブよりも高い結合を示す
本出願で記載されるナノ粒子はヒト組織上のＨＥＲ３を認識することができるかどうかを決定するために、乳腺腫瘍組織をＨＥＲ２＋患者の外科標本から入手した。組織を調べ、ＨｅｒＰＢＫ１０がこの組織にＨＥＲ３を介して結合するかどうかを決定した。図３１は、ＨｅｒＰＢＫ１０およびＴｚはどちらもこの腫瘍試料由来の脱凝集された細胞への濃度依存性結合を示し、ＨｅｒＰＢＫ１０はＴｚよりも強い結合を示すことを示す（図３１−Ｂ）。この結合曲線は、腫瘍細胞表面上で測定された上昇したＨＥＲ３および非常に低いＨＥＲ２と相関した（図３１−Ａ）。
【０１２６】
実施例２２：ＨｅｒＰＢＫ１０はマウスＨＥＲ３を認識する
ＢＡＬＢ／ｃマウス乳房腫瘍から取得したマウス４Ｔ１細胞は三種陰性であり、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける同系ＴＮＢＣモデルとして使用されている。ＨＥＲ３は、４Ｔ１の細胞表面上で、著しいレベルで発現され（図３２−Ｂ）、ＨｅｒＰＢＫ１０により認識され（図３２−Ｃ）、かつヒトＨＥＲ３ペプチドにより競合的に阻害される（図３２−Ｃ）。ＨｅｒＰＢＫ１０のマウスＨＥＲ３への受容体特異的結合はマウスとヒトＨＥＲ３間の高レベルのアミノ酸配列同一性を反映する：全タンパク質では９１％同一性およびヘレグリン結合領域（細胞外ドメインＩおよびＩＩ）における９４％（図３２−Ａ）。これらの所見は、ＢＡＬＢ／ｃ−４Ｔ１モデルは、免疫適格性条件におけるターゲティングを試験するために使用することができることを示す。加えて、マウスＨＥＲ３のＨｅｒＰＢＫ１０による認識は異種移植片モデルにおける我々の既存の所見の臨床関連を増大させる：ＨｅｒＤｏｘはマウスにおける内在性ＨＥＲ３を認識する場合であっても選択的な腫瘍標的毒性を示す。重要なことには、ヒトＢＴ−５４９細胞（これらもまた、ＴＮＢＣから誘導される）は、細胞表面上で上昇したＨＥＲ３を示し（図３２−Ｂ）、追加のＴＮＢＣ細胞株を標的に提供する。
【０１２７】
実施例２３：ペントンベースドメインはサイトゾル中への浸透のために必要とされる
ＰＢドメインが欠如している、ＨｅｒＰＢＫ１０の欠失変異体はＳ２Ｇａを細胞の細胞質中に送達することができなかった。これにより、ＨｅｒＰＢＫ１０のペントンベースドメインが、受容体介在性取込後にエンドソーム膜透過のために必要とされることが立証される。
【０１２８】
実施例２４：定向進化により生成された細胞内輸送変異体
定向進化およびファージディスプレイバイオパニングを潜在的に増大された細胞内輸送活性を有するペントンベースドメインのタンパク質バリアントを単離するために適用した。この技術は、組換えペントンベース遺伝子のランダム変異誘発、Ｔ７バクテリオファージ上での得られた変異体ライブラリの発現、および培養下のＨｅＬａ細胞（ペントンベースを取り込む）上のファージライブラリのスクリーニングを必要とした。スクリーンに適用された「選択圧」は、増大したサイトゾルおよび／または核分配を示す変異体を単離すること、タンパク質が細胞中への完全浸透を促進したことを示すこと、および所望の細胞内コンパートメントへ輸送することから構成された（図３５−Ａ）。ＨｅｒＰＢＫ１０にクローニングされ、ペントンベースドメインと置き換わった点変異を有する、いくつかの切断型および全長バリアントを単離した（図３５−Ｂ）。これらの全長変異体のうちの２つ（１１１Ｃおよび３３３Ｆ）は、親タンパク質（ｗｔ  ＨｅｒＰＢＫ１０）と比較して、サイトゾル、細胞骨格、および核コンパートメントへの増強した分配を示し（図３５−Ｃ）、一方、切断型バリアント（すなわちＴＭ）はエンドソームを免れることができなかった（図３５−Ｄ）。
【０１２９】
実施例２５：Ｓ２Ｇａは、ＴＳＰＯと相互作用する
コロール毒性のメカニズムを探る研究は、ＨｅｒＧａが細胞骨格ならびにミトコンドリア膜透過性に対するスーパーオキシド媒介ダメージを引き起こし、アポトーシス死に導くことを明らかにした。図３６−Ａおよび３６−Ｂは、Ｓ２Ｇａは、直接ミトコンドリア外膜タンパク質、ＴＳＰＯに結合することを示す（図３６Ａ〜Ｂ）。ＴＳＰＯは、ポルフィリンおよび他の代謝産物を処理のためにミトコンドリア中に移動させ、ならびに、ミトコンドリア透過性移行膜孔複合体の成分と相互作用し、細胞ホメオスタシスにとって重要であり、というのも、ＴＳＰＯのノックアウトはマウスにおいて胚性致死であるからである。Ｓ２Ｇａは特定的にはＴＳＰＯ上のポルフィリン結合部位を認識し（図３６Ａ〜Ｂ）、というのも、Ｓ２Ｇａ結合は、ＰＫ１１１９５により競合的に阻害されるからであり、これは、ＴＳＰＯへのポルフィリン結合を阻害する。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞における組換え可溶性ＴＳＰＯの過剰発現は、ミトコンドリア膜電位のＨｅｒＧａ媒介破壊を防止し（図３６Ｃ〜Ｄ）、ＨｅｒＧａは、ＴＳＰＯとインサイチューで相互作用することが証明される。
【０１３０】
実施例２６：ＨｅｒＭｎは標的毒性およびＭＲ検出を可能にする
ＨｅｒＧａの蛍光特質はコロールの造影剤としての使用を確立したが、光学イメージングの臨床適用性は励起波長および再発光波長の限定された侵入深さにより制限される。したがって、ＨｅｒＰＢＫ１０と組み合わされると、ＨｅｒＧａと同じくらい細胞毒性となるが、十分なコントラスト特性を有する別のメタル化コロールを使用し、臨床的に関連する様式、例えば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を用いた検出が可能になった。ＨｅｒＭｎは培養下のＨＥＲ２−腫瘍細胞ではなく、ＨＥＲ２＋への標的毒性を示し、一方、Ｓ２Ｍｎは細胞生存に対して効果を有さない（図３７）。ＨｅｒＭｎはスーパーオキシド上昇により、ミトコンドリア膜電位（図３８−Ａ）および細胞骨格を崩壊させる（図３８−Ｂ）。ＨｅｒＭｎは全身送達後インビボで腫瘍にホーミングし、心臓を含むほとんどの正常組織を迂回し（図３９）、非常に低い薬理的用量で腫瘍増殖を消失させ（０．００８ｍｇ／ｋｇ）、遊離Ｓ２Ｍｎ、ＨｅｒＰＢＫ１０単独または生理食塩水処置と対照的である（図４０−Ａ）。溶液中では、ＨｅｒＭｎ粒子は、遊離Ｓ２Ｍｎと比べて制限されたＴ１（スピン−格子）緩和短縮を示し（図４１−Ａ）、タンパク質粒子中でのカプセル化は水分子へのアクセスを防止することが示唆される。しかしながら、インビボでのＨｅｒＭｎの送達は、遊離Ｓ２ＭｎおよびＧｄと比較して、腫瘍中で著しいＴ１緩和低減およびＭＲＩコントラスト増強を与え（図４０−Ｂ）、コロールは組織取込後粒子から放出されことが示唆される。腫瘍組織におけるコロールの長期保持は、ＨｅｒＭｎがＧｄの迅速クリアランスと比べてより長寿命の造影剤として機能し得ることを示す。
【０１３１】
実施例２７：ＨｅｒＧａおよびＨｅｒＭｎはヒト心筋球由来細胞（ＣＤＣ）に対し無毒性である
翻訳可能性を評価するために、ヒト心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の生存率をＨｅｒＧａおよび／またはＨｅｒＭｎの存在下で調べた。ＨｅｒＧａ、ＨｅｒＭｎおよび個々の成分（ＨｅｒＰＢＫ１０単独、Ｓ２Ｇａ単独およびＳ２Ｍｎ単独）の濃度を増大させると、Ｄｏｘ（図４０−Ｂ）（公知の心毒性を有する）と対照的に、ＣＤＣ生存率に検出可能な効果を有さない。
【０１３２】
実施例２８：耐性腫瘍細胞は上昇したＨＥＲ３およびＨｅｒＰＢＫ１０への増大した結合を示す
Ｔｚに対する獲得耐性を有するＨＥＲ２＋乳癌細胞株（ＨＥＲ２阻害剤の濃度を増加させた長期培養の標準レジメンを用いる）は、親株と比較して、ＨＥＲ３の上昇した細胞表面レベルを示し（ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３）（図４２−Ａ、４３−Ａ）、ＨＥＲ３上昇は、薬物耐性と関連するという当技術分野における知識と一致した。ＪＩＭＴ−１乳癌株（Ｔｚ処置に決して応答しなかったＨＥＲ２＋腫瘍から誘導した）もまた、ＨＥＲ２と比較して、上昇したＨＥＲ３を示した（図４２−Ｂ）。ＨＥＲ３は、Ｌｐまたは遺伝子サイレンシングのいずれかによる、ＨＥＲ２阻害後４時間するとすぐに、転写的にかつ翻訳的に上昇した。親株をＴｚに２４時間曝露し、その後、非処置親細胞と比較して、細胞表面ＨＥＲ３レベルを測定した。Ｔｚ処置により、上昇したＨＥＲ３レベルが得られただけでなく、これらの細胞へのＨｅｒＰＢＫ１０の結合が比例して増加した（図４２−Ｃ、４２−Ｄ）。本明細書で記載されるナノ粒子がヒト組織上のＨＥＲ３を認識することができるかどうかを評価する手段として、乳腺腫瘍組織をＨＥＲ２＋患者の外科標本から取得し、ＨｅｒＰＢＫ１０がこの組織にＨＥＲ３を介して結合できるかどうかを調べた。ＨｅｒＰＢＫ１０およびＴｚはどちらもこの腫瘍試料由来の脱凝集された細胞に対し濃度依存性結合を示し、ＨｅｒＰＢＫ１０はＴｚよりも強い結合を示した（図４２−Ｆ）ことが見出された。この結合曲線は、腫瘍細胞表面で測定された上昇したＨＥＲ３および非常に低いＨＥＲ２と相関した（図４２−Ｅ）。
【０１３３】
実施例２９：ＨｅｒＧａはインビトロおよびインビボにおいて、Ｔｚ耐性腫瘍細胞に対し増強された毒性を示す
ＨｅｒＧａのＴｚおよび併用療法（Ｔｚ＋Ｐｚ）に対する有効性をＢＴ４７４親およびＴｚ耐性株について比較した。各治療薬を、治療効果を誘発するために当技術分野で知られている濃度範囲で投与した。Ｔｚは親ＢＴ４７４細胞生存を５０％だけ低減させ（図４２−Ｂ）、Ｐｚの追加は有意に細胞死を増加させなかった（図４３−Ｃ）。ＨｅｒＧａは親細胞に対して同様の結果を示した（図４３−Ｂ、４３−Ｃ）。ＴｚおよびＴｚ＋Ｐｚは、ＢＴ４７４耐性細胞に対して無効であった（図４３−Ｂ、４３−Ｃ）。対照的に、ＨｅｒＧａは完全にＢＴ４７４耐性細胞を排除した（図４３−Ｂ）。Ｔｚ＋Ｌｐ耐性ＢＴ４７４細胞に対する所見は、Ｔｚは効力を示さなかったが、一方、ＨｅｒＧａはほぼ完全な細胞死を誘発したという点で同様であった。
【０１３４】
ＨｅｒＧａ（０．００８ｍｇ／ｋｇ／注射）の、ＢＴ４７４Ｔｚ耐性腫瘍を有するマウスへの全身送達は、Ｓ２ＧａおよびＨｅｒＰＢＫ１０単独と対照的に、腫瘍増殖を消失させた（図４３−Ｄ）。これらのマウスには、耐性を維持するための、維持用量のＴｚが与えられなかったので、Ｔｚに対する感受性はインビボで回復したように見えたが、これらの腫瘍は、最終的にはＴｚ処置に耐性となり、治療量のＴｚにも関わらず、サイズが増大し始めた（図４３−Ｅ）．これらのマウスへのＨｅｒＧａの静脈内送達はこれらの腫瘍サイズを低減させた（図４３−Ｅ）。
【０１３５】
発明を、特定の実施形態および実施例との関連で開示してきたが、発明の実施形態は特定的に開示された実施形態を超えて他の実施形態および／またはその使用および改変および等価物まで拡大することが当業者により理解されるであろう。
【０１３６】
多くの変更および別の要素が本発明の実施形態で開示されている。さらに、さらなる変更および別の要素は当業者に明らかになるであろう。これらの変更の１つは、限定はされないが、発明の組成物、ならびにこれを用いて診断され、予知され、治療され得る疾患および他の臨床状態に対する構成モジュールの選択である。本発明の様々な実施形態は特定的に、これらの変更または要素のいずれかを含むまたは排除することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、発明の特定の実施形態を記載し、特許請求するために使用される、材料成分の量、濃度などの特性、反応条件、などを表す数値は、場合によっては、「約」という用語により修飾されることが理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、書かれた説明および添付の特許請求の範囲において明記される数値パラメータは、特定の実施形態により得られるように求められた所望の特性に依存して変動し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁の数を考慮して、通常の四捨五入技術を適用することにより解釈されるべきである。発明のいくつかの実施形態の広い範囲を明記する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、具体例で明記される数値は実用可能な限り正確に報告される。発明のいくつかの実施形態で提示された数値は、それらの個々の試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じるある一定の誤差を含み得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、発明の特定の実施形態の記載との関連で（とりわけ、特定の下記特許請求の範囲との関連で）使用される、「１つの（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語および同様の言及は、単数形および複数形の両方を含むと解釈することができる。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内にある各々別個の値に、個々に言及する省略方法として機能することを意図するにすぎない。本明細書で別記されない限り、各個々の値は、それが、本明細書で個々に列挙されるかのように、明細書に組み込まれる。本明細書で記載される全ての方法は、本明細書で別記されない限り、または、別に文脈により明確に反対されない限り、任意の好適な順序で実施することができる。本明細書における特定の実施形態に関して提供される、任意および全ての実施例、または例示的な言語（例として「例えば」）の使用は、発明をよりよく説明することを意図するにすぎず、別様に特許請求される発明の範囲を制限しない。明細書において言葉がないのは、発明の実施に必須の任意の特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきである。
【０１３９】
本明細書で開示される発明の別の要素または実施形態のグループ分けは制限するものと解釈されるべきではない。各グループメンバーは個々に、またはそのグループの他のメンバーまたは本明細書で見出される他の要素との任意の組み合わせで言及および特許請求され得る。あるグループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由のために、あるグループに包含され、またはそれから削除され得る。そのような包含または削除のいずれが起きても、明細書は、ここでは、添付の特許請求の範囲において使用される全てのマーカッシュ群の書かれた説明をこのように満たす、改変されたグループを含むと判断される。
【０１４０】
発明を実施するために発明者らに知られている最良の形態を含む、この発明の好ましい実施形態が本明細書で記載される。それらの好ましい実施形態に対する変更は、前記記載を読めば当業者に明らかになるであろう。熟練した技術者であれば、そのような変更を必要に応じて採用することができ、発明は、特定的に本明細書で記載される以外に実施することができることが企図される。したがって、この発明の多くの実施形態は、適用法により許容される、これに添付された特許請求の範囲に列挙された対象物の全ての改変および等価物を含む。その上、その全ての可能な変更における上記要素の全ての組み合わせは、本明細書で別記されない限り、または別に文脈により明確に反対されない限り、発明により包含される。
【０１４１】
さらに、多くの特許および印刷された刊行物がこの明細書を通して参照されている。上記引用した参考文献および印刷された刊行物の各々は、その全体が、本明細書で、個々に、参照により組み込まれる。
【０１４２】
最後に、本明細書で開示される発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることが理解されるべきである。使用することができる他の改変は発明の範囲内に含めることができる。よって、例として、制限はしないが、本発明の別の構成が本明細書の教示にしたがい使用され得る。したがって、本発明の実施形態は、厳密に、図示され、記載されるものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５−Ａ】
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【図２５−Ｂ】
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【図２５−Ｃ】
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【図２５−Ｄ】
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【図２５−Ｅ】
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【図２６−Ａ】
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【図２６−Ｂ】
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【図２６−Ｃ】
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【図２７−Ａ】
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【図２７−Ｂ】
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【図２７−Ｃ】
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【図２７−Ｄ】
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【図２７−Ｅ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−Ａ】
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【図３０−Ｂ】
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【図３１−Ａ】
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【図３１−Ｂ】
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【図３２−Ａ】
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【図３２−Ｂ】
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【図３２−Ｃ】
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【図３３−Ａ】
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【図３３−Ｂ】
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【図３３−Ｃ】
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【図３４−Ａ】
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【図３４−Ｂ】
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【図３４−Ｃ】
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【図３５−Ａ】
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【図３５−Ｂ】
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【図３５−Ｃ】
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【図３５−Ｄ】
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【図３６−Ａ】
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【図３６−Ｂ】
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【図３６−Ｃ】
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【図３６−Ｄ】
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【図３７】
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【図３８−Ａ】
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【図３８−Ｂ】
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【図３９】
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【図４０−Ａ】
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【図４０−Ｂ】
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【図４１−Ａ】
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【図４１−Ｂ】
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【図４２−Ａ】
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【図４２−Ｂ】
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【図４２−Ｃ】
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【図４２−Ｄ】
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【図４２−Ｅ】
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【図４２−Ｆ】
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【図４３】
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