(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２．５〜４％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０２％（ｗ／ｖ）の金属イオンキレート剤を含む脂肪間質細胞を分離する組成物。
【請求項２】
当該金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸又はそのナトリウム塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸又はそのナトリウム塩、ジエチレントリアミン五酢酸又はそのナトリウム塩、ポリリン酸塩、有機リン酸塩、リン酸エステル、ポリアクリル酸塩、有機リン酸塩、グルコン酸ナトリウム、又はこれらの混合から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
当該金属イオンキレート剤はＥＤＴＡである請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
（ａ）脂肪組織を採取するステップ、  （ｂ）請求項１に記載の組成物を加え、均質化して反応させることで、消化された組織の混合物を取得するステップであって、当該組成物は、２．５〜４％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０２％（ｗ／ｖ）の金属イオンキレート剤を含むステップ、  （ｃ）ステップ（ｂ）の消化された組織の混合物を遠心分離し、異物を除去して、脂肪間質細胞を含む第１濾液を取得するステップ、  （ｄ）低張液をステップ（ｃ）の第１濾液に加えることで、血球細胞が除去された脂肪間質細胞の第２濾液を取得するステップ、及び  （ｅ）ステップ（ｄ）の第２濾液を中和して遠心分離するステップ、を含む脂肪間質細胞を分離する方法。
【請求項５】
当該金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸又はそのナトリウム塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸又はそのナトリウム塩、ジエチレントリアミン五酢酸又はそのナトリウム塩、ポリリン酸塩、有機リン酸塩、リン酸エステル、ポリアクリル酸塩、有機リン酸塩、グルコン酸ナトリウム、又はこれらの混合から選択される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
当該金属イオンキレート剤はＥＤＴＡである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更に、総反応時間を１時間以内として脂肪組織を消化し、当該脂肪間質細胞を取得することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
５グラムの脂肪組織から少なくとも１００万個の脂肪間質細胞を分離する効果を有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
当該脂肪間質細胞は、脂肪細胞、造血細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞又は上皮細胞に分化可能である請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪間質細胞を急速分離する組成物、及び、脂肪間質細胞を急速分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ＡＤＳＣｓ）とは、昨今、組織工学や再生医療分野に広く応用されている成体幹細胞であり、骨髄間質細胞と同様に多方向分化能を有している。現在、実験室で常用されているＡＤＳＣｓ分離培養法では、脂肪組織から細胞を分離して取得する。この方式は数十年にわたって利用されており、一般的には組織を取得して粉砕し、コラゲナーゼ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）で細胞外基質を分解することで組織から単一細胞を放出させる。しかし、組織の分解には約１２時間以上もの時間を要する（通常は一晩静置）。また、時間を要するだけでなく、長時間にわたり細胞を酵素環境に置くことは細胞の生存に不利となる。このため、往々にして細胞の生理状態が不安定となり、細胞が死亡することで細胞取得数が減少する場合もある。また、機械的手法や酵素処理方法によって赤血球等の成熟細胞を除去した後、１０％のウシ胎児血清を含む培地で培養するが、こうした幹細胞の培養方法には、手法が複雑、抽出される幹細胞数が少ない、純度が低い、継代増殖が遅いといった欠点がある。
【０００３】
一方、巷で使用されている脂肪吸引技術で取得された液状の脂肪組織をコラゲナーゼで分解し、遠心分離して得られる非脂肪単一細胞は間質血管細胞（Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ，ＳＶＦ）と称される。この場合、単一細胞の取得が迅速化するものの、脂肪吸引用プローブは超音波振動方式により脂肪を溶解して吸い出すことから、細胞の損傷が極めて大きく、細胞生存率に影響してしまう。
【０００４】
近年では、特に整形外科での再生医療研究において、間葉系幹細胞を骨の再生・修復の細胞供給源として用いることが強調されている。そのため、将来的には、自家幹細胞の移植、特に成体脂肪幹細胞の自家移植が幹細胞移植における研究開発の流れとなってゆくだろう。しかし、自家組織から間葉系幹細胞を分離して純化するには相当複雑な操作手順を経ねばならず、時間も要する。例えば、体外で間葉系幹細胞を十分に使用可能な細胞数まで増加させるには、優良試験所基準（Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ＧＬＰ）に準じた試験場でこれを実施し、体外操作の時間を長期化しつつ、細胞の細菌又はウイルス感染の確率を低下させる必要がある。以上が幹細胞の臨床利用を制限する要因となっているが、本発明は、将来的に手術室で短時間のうちに間質細胞を急速分離し、再生医療に応用するにあたり有用である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本文中に別途規定がない限り、本発明で使用する科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。よって、これら用語の意味及び範囲は明瞭であるが、潜在的に複数の解釈が可能な場合には、本文中で示す定義がいかなる辞書又は外部の定義に優先される。
【０００６】
本文中の「複数の」との用語は、本発明の部材又はユニットの数を記載するためのものである。この用語は別途明確な指定がない限り、２つ以上と解釈される。
【０００７】
本文中の「一の」又は「一種の」との用語は、本発明の部材及び成分を記載するためのものである。この用語は記載の便宜上、及び本発明の基本理念を示すためのものにすぎない。このような記載は、一種又は少なくとも一種を含むと解釈され、且つ、別途明確な指定がない限り、単数の場合と複数の場合を含む。
【０００８】
本文中の「又は」との用語は、「及び／又は」と同義である。
【０００９】
本発明は従来技術の不足を補うべく、患者の苦痛を軽減し、安全な臨床利用を可能とするとともに、間質細胞を短時間のうちに急速分離する組成物及び方法を提供する。
【００１０】
本発明は、濃度０．５〜８％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、濃度０．１〜０．６％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び濃度０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属イオンキレート剤を含む脂肪間質細胞を分離する組成物を提供する。
【００１１】
本発明で使用する「金属イオンキレート剤」とは、エチレンジアミン四酢酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＥＤＴＡ）又はそのナトリウム塩、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＥＧＴＡ）又はそのナトリウム塩、ジエチレントリアミン五酢酸（Ｄｉｅｔｈｙｌｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，ＤＴＰＡ）又はそのナトリウム塩、ポリリン酸塩、有機リン酸塩、リン酸エステル、ポリアクリル酸塩、有機リン酸塩、グルコン酸ナトリウム、又はこれらの混合から選択される。
【００１２】
好ましい具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する組成物において、当該金属イオンキレート剤はＥＤＴＡである。
【００１３】
他の好ましい具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する組成物において、２〜４％（ｗ／ｖ）の当該コラゲナーゼタイプＩ、０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡを含む。
【００１４】
具体的実施例において、本発明の脂肪間質細胞を分離する組成物は無菌である。
【００１５】
具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する組成物において、脂肪間質細胞を十分に遊離させるとともに、細胞が損傷を受けないよう保護する効果を有する。
【００１６】
更に、本発明は、（ａ）脂肪組織を採取するステップ、（ｂ）本発明に記載の脂肪間質細胞を分離する組成物を加え、均質化して反応させることで、消化された組織の混合物を取得するステップであって、当該組成物は、０．５〜８％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１〜０．６％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０１〜０．２％（ｗ／ｖ）の金属イオンキレート剤を含むステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の消化された組織の混合物を遠心分離し、異物を除去して、脂肪間質細胞を含む濾液を取得するステップ、（ｄ）低張液をステップ（ｃ）の濾液に加えて反応させることで、血球細胞が除去された脂肪間質細胞の濾液を取得するステップ、及び（ｅ）ステップ（ｄ）の濾液を中和した後に遠心分離し、脂肪間質細胞を取得するステップ、を含む脂肪間質細胞を分離する方法を提供する。
【００１７】
本発明の具体的実施例において、当該脂肪組織は動物又はヒトを含む個体に由来する。
【００１８】
本発明の好ましい具体的実施例において、当該金属イオンキレート剤はＥＤＴＡである。
【００１９】
本発明の他の好ましい具体的実施例において、当該コラゲナーゼタイプＩの濃度は２〜４％（ｗ／ｖ）、トリプシンの濃度は０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）、及びＥＤＴＡの濃度は０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。
【００２０】
本発明の具体的実施例において、脂肪間質細胞を分離する方法は無菌である。
【００２１】
好ましい具体的実施例において、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法は更に、総反応時間を１時間以内として当該脂肪組織を十分に消化し、大量の脂肪間質細胞をより容易に取得可能であるとの特徴を有する。
【００２２】
他の好ましい具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法において、５グラムの脂肪組織から少なくとも１００万個の脂肪間質細胞を分離可能である。
【００２３】
具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法において、当該脂肪間質細胞は、脂肪細胞、造血細胞、血管内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、神経細胞又は上皮細胞に分化可能である。
【発明の効果】
【００２４】
好ましい具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法において、当該脂肪間質細胞は、脂肪細胞、骨芽細胞又は軟骨細胞に分化可能である。
【００２５】
好ましい具体的実施例では、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法において、脂肪間質細胞を十分に遊離させるとともに、細胞が損傷を受けないよう保護する効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の脂肪間質細胞を分離する方法の一実施における手順を示す。
【図２】図２は、ＳＤラットの大腿内側の皮下から５グラムの脂肪組織を採取し、異なる濃度の酵素配合比率で１時間以内に分離した間質細胞数の結果を示している。
【図３】図３は、モルモットの大腿内側の皮下から５グラムの脂肪組織を採取し、異なる濃度の酵素配合比率で１時間以内に分離した間質細胞数の結果を示している。
【図４】図４は、抽出した脂肪間質細胞から選別された脂肪幹細胞の分化能に関する分析を示している。
【図５】図５は、分離された脂肪幹細胞の細胞表面におけるバイオマーカーの発現量を示している。
【図６】図６は、酵素配合の濃度別に間質細胞の生存への影響を示している。
【図７】図７は、本発明の組成物に代替して別種の酵素を用いた場合の内容比較を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は別の形態で実施される場合もあり、以下で提示する実例に限定されない。以下の実施例は、本発明における様々な局面及び特性を代表するものにすぎない。
【００２８】
一元配置分散分析（Ａ  ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ（ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ））によって統計的な差を検定するとともに、シェッフェの方法により多重比較（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ）を行った。また、明らかな差があるとは、有意確率値（ｐ−ｖａｌｕｅ）＜０．０５であると定義した。
【００２９】
実施例１  間質細胞の急速分離技術
【００３０】
図１は、本発明の酵素配合をスプラグ−ダウリーラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ，略称ＳＤラット）及びモルモット（Ｇｅｎｉａ  ｐｉｇ）の脂肪組織に適用して間質細胞を急速分離する場合のフローである。
【００３１】
ＳＤラット及びモルモットの大腿内側から５グラムの脂肪組織を採取し、本発明の酵素配合からなる緩衝溶液（０．５〜３％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したもの）を等量（約５ｍＬ）加えた。そして、これを無菌組織ホモジナイザー（ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ）（ミルテニーバイオテク社、ベルギッシュ・グラートバッハ、ドイツ）に投入して１分間均質化し、単一細胞状態となるまで組織を分散させた。続いて、３７℃の水浴槽に漬けて１０分間反応させた後、再び無菌組織ホモジナイザーに投入して１分間均質化し、３７℃の水浴槽に漬けて１０分間反応させた。次に、（３００×ｇ）で１０分間遠心分離した後、上層の脂肪、結合組織又は未粉砕組織を取り除き、ＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄してから１０分間遠心分離（３００×ｇ）した。そして、等量（５ｍＬ）の低張液を加えて室温で５分間静置し、血球細胞を除去した後に、１０ｍＬのＰＢＳ緩衝溶液を投入して中和反応させた。続いて、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に溶液を除去し、最下層の細胞を再び１ｍＬのＰＢＳに浮遊させた後、サンプリングして細胞数をカウントした。なお、総反応時間は１時間以内であった。
【００３２】
実施例２  間質細胞の生成量分析
【００３３】
実施例１で分離した脂肪間質細胞のサンプルから２０μＬを採取し、２０μＬのトリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）を加えて均一に混合・染色した後に、セルカウンターに滴下して生存細胞（非染色細胞）をカウントした。
【００３４】
図２は、ＳＤラットの大腿内側の皮下から５グラムの脂肪組織を採取し、異なる濃度の酵素配合比率で１時間以内に分離した間質細胞数を示している。結果から明らかなように、３％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ（ｔｙｐｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合（符号Ｇ）で１時間以内に抽出された単一細胞数が最も多く、約９×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間質細胞を分離可能であった。
【００３５】
図３は、モルモットの大腿内側の皮下から５グラムの脂肪組織を採取し、異なる濃度の酵素配合比率で１時間以内に分離した間質細胞数を示している。結果から明らかなように、３〜４％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合（符号Ｇ，Ｈ）で１時間以内に抽出された単一細胞数が最も多く、約８×１０６〜８．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの間質細胞を分離可能であった。
【００３６】
実施例３  選別後の脂肪幹細胞の分化能
【００３７】
国際間葉系幹細胞協会が２００６年に発表した間葉系幹細胞の定義によれば、間葉系幹細胞には次の３つの特徴がある。
１．細胞が細胞培養皿に付着可能であること。
２．表面抗原として、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４又はＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９ａ又はＣＤ１９、或いはＨＬＡ−ＤＲを発現することなく、ＣＤ１０５、ＣＤ７３又はＣＤ９０を発現すること。
３．誘導によって脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞へ分化する特性を有すること。
【００３８】
実施例１で分離した脂肪間質細胞を選択培地（Ｋｅｒａｔｉｏｎｃｙｔｒ−ＳＦＭ、品番：１０７２４−００１、ＧＩＢＣＯ、ニューヨーク、ＵＳＡ）（間葉系幹細胞を選択的に残し、非間葉系幹細胞は死滅させた）で１週間培養したところ、脂肪間葉系幹細胞を選別可能となった。ここで、図４の（ａ）に示したように、分離された脂肪間葉系幹細胞は付着型の細胞であった。また、フローサイトメーターで当該分離された脂肪間質細胞を分析したところ、図５に示したように、細胞表面のＣＤ２７１、ＣＤ７３及びＣＤ９０の発現量がコントロール群の値よりも明らかに高く、ＣＤ３４の発現量がコントロール群の値よりも低いことがわかった。これらより、当該分離された脂肪間質細胞が間葉系幹細胞に属することが明らかとなった。そこで、当該間葉系幹細胞の誘導による脂肪細胞、骨芽細胞及び軟骨細胞への分化能について更に測定した。
【００３９】
前記の分離された脂肪間葉系幹細胞を継代した後、別々の分化誘導培地で２週間培養した（Ａｄｉｐｏ−ｍｅｄｉｕｍ：脂肪細胞への分化誘導培地、Ｏｓｔｅｏ−ｍｅｄｉｕｍ：骨芽細胞への分化誘導培地、及びＣｈｏｎｄｒｏ−ｍｅｄｉｕｍ：軟骨細胞への分化誘導培地。Ａｄｉｐｏ−ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、５００μＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン（３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ＩＢＭＸ）、１μＭのデキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、１μＭのインドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｓｉｎ）、１０μｇ／ｍＬのインシュリン（ｉｎｓｕｌｉ）。Ｃｈｏｎｄｒｏ−ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０ｎＭのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｌ−Ａｓｃｏｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、６．２５μｇ／ｍＬのインシュリン、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β。Ｏｓｔｅｏ−ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、５０μＭのＬ−アスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｌ−Ａｓｃｏｂａｔｅ−２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、０．１μＭのデキサメタゾン、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩（β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）。
【００４０】
グリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，略称ＧＡＧ）を用いた測定により、間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化能を評価した。なお、当該ＧＡＧによる測定は、アルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ）染色により実施した。Ｃｈｏｎｄｒｏ−ｍｅｄｉｕｍで２週間培養した後に旧培地を除去し、１０％のホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）又は４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を加えて１０分間固定した。次に、蒸留水（３ｍＬ）で２度洗浄してから、３％の酢酸（Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）（３ｍＬ）を用いて５分間振動させた。全ての液体を除去した後、シャーレにアルシアンブルー（１％）を加えて１５分間振動させ、染色剤を除去してから蒸留水（３ｍＬ）で２〜３度洗浄し、記録のため撮影を行った。
【００４１】
図４の（ｂ）に示すように、アルシアンブルーにより細胞外基質のＧＡＧが染色され、当該ＧＡＧのブルーへの染色及び細胞の集中によって軟骨細胞の特性が示された。
【００４２】
オイルレッドＯ（Ｏｉｌ  Ｒｅｄ  Ｏ）を用いた脂肪細胞の油滴染色によって、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を評価した。Ａｄｉｐｏ−ｍｅｄｉｕｍで２週間培養した後に旧培地を除去し、１０％のホルマリン又は４％のパラホルムアルデヒドを加えて１０分間固定した。次に、蒸留水（３ｍＬ）で２度洗浄してから全ての液体を除去し、シャーレにオイルレッドＯ（０．５％）を加えて１５分間揺動した。そして、染色剤を除去してから蒸留水（３ｍＬ）で２〜３度洗浄し、蒸留水を加えて記録のため撮影を行った。
【００４３】
図４の（ｃ）に示すように、当該染色細胞のうち油滴が赤色の点状となり、脂肪細胞の特性を示した。
【００４４】
分離された脂肪間葉系幹細胞による骨形成誘導作用の効果を、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ−ｒｅｄ）染色により検出した。Ｏｓｔｅｏ−ｍｅｄｉｕｍで２週間培養した後に旧培地を除去し、４％のホルマリンを加えて１５分間固定した。次に、蒸留水（３ｍＬ）で２度洗浄してから全ての液体を除去し、シャーレに２％のアリザリンレッドを加えて常温で２０分間反応させた。そして、染色剤を除去してから蒸留水（３ｍＬ）で２〜３度洗浄した後、記録のため撮影を行った。
【００４５】
図４の（ｄ）に示すように、当該染色細胞によるカルシウム析出が赤色の点状で現れ、骨芽細胞の特性を示した。
【００４６】
実施例４  酵素配合濃度の違いによる間質細胞の生存への影響
【００４７】
実施例１で分離した脂肪間質細胞を、選択培地（Ｋｅｒａｔｉｏｎｃｙｔｒ−ＳＦＭ、品番：１０７２４−００１、ＧＩＢＣＯ）（間葉系幹細胞を選択的に残し、非間葉系幹細胞は死滅させた）で１週間培養したところ、脂肪間葉系幹細胞を選別可能となった。そこで、実施例１で提示した好ましい脂肪間質細胞の分離生成量となる以下３種類の酵素配合で、細胞毒性試験を実施した。
１．２．５％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合。
２．３％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合。
３．４％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合。
【００４８】
１０５個の脂肪間葉系幹細胞を上記酵素配合に投入し、０．５時間、１時間、２時間培養した。そして、０．５時間、１時間、２時間培養した後に細胞を取り出し、実施例２のトリパンブルー染色を実施して細胞生存率をカウントしたところ、図６に示すように、上記配合では明らかな細胞毒性現象は認められなかった。
【００４９】
実施例５  別種の酵素による代替比較
【００５０】
２％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩＶ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡと、２．５％のコラゲナーゼタイプＩＶ、０．１％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡと、３％のコラゲナーゼタイプＩＶ、０．１％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡと、３．５％のコラゲナーゼタイプＩＶ、０．１％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡと、４％のコラゲナーゼタイプＩＶ、０．１％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡ、というように、同様の配合濃度で本発明で使用したものと類似する別の酵素に置き換え、実施例１で教示した脂肪間質細胞の分離操作方法を実施した。その結果、図７に示すように、本実施例の配合では、３％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のＥＤＴＡからなる酵素配合に近似する細胞数は得られなかった。即ち、３％（ｗ／ｖ）のコラゲナーゼタイプＩ、０．１％（ｗ／ｖ）のトリプシン、及び０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡからなる酵素配合は、脂肪間質細胞の急速分離において代替不可能であった。
【００５１】
以上の内容では、本発明を十分に理解可能なように多くの具体的詳細事項について述べたが、本発明はここで述べたもの以外のその他の実施形態で実施することも可能である。当業者であれば、本発明の内容を逸脱することなく類似の展開が可能なことから、本発明は上記で開示した具体的実施例に制限されない。
【符号の説明】
【００５２】
Ａ  ０．５％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．０５％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｂ  ０．５％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｃ  ０．５％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．２％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｄ  １％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｅ  ２％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｆ  ２．５％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｇ  ３％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｈ  ４％のコラゲナーゼタイプＩ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｅ’  ２％のコラゲナーゼタイプＩＶ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｆ’  ２．５％のコラゲナーゼタイプＩＶ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｇ’  ３％のコラゲナーゼタイプＩＶ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｉ’  ３．５％のコラゲナーゼタイプＩＶ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
Ｈ’  ４％のコラゲナーゼタイプＩＶ＋０．１％のトリプシン＋０．０２％のＥＤＴＡ
【図１】
0006781752.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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