(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
広角Ｘ線回折法及び電子線回折法から選ばれる１種以上を用いて解析される、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を指標とする敏感肌の評価方法。
【請求項２】
角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層中の細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたオルソロンビック構造の存在比率を非敏感肌の角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率と比較する比較工程とを含む請求項１に記載の敏感肌の評価方法。
【請求項３】
角層を採取するための電子顕微鏡用グリッド及び接着剤、並びに角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定するための透過型電子顕微鏡を含む敏感肌の評価キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、敏感肌の評価方法及びその評価キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、敏感肌を意識する消費者が増加する傾向にあり、化粧品等についてもより刺激の少ないものが要望されるようになってきている。敏感肌には明確な定義がなく、非常に広範囲な解釈がなされているが、一般的には、普段から化粧品や紫外線、外気等で皮膚トラブルを起こしやすく、多くの人では反応しない物質に対して特異的に反応する、アレルギー性物質や刺激性物質に体質的に過敏な肌をいうものとされている（非特許文献１）。
【０００３】
敏感肌であるかどうかは、スティンギングテストや、問診等を用いた本人の自覚症状の申告により判定されることが多かったが、この判定方法では、消費者に負担をかける、消費者本人が自覚症状を感じにくいことがある等の問題があったため、敏感肌かどうかを客観的な指標により判定する方法が望まれてきた。
【０００４】
敏感肌の客観的な判定方法としては、例えば、経皮水分蒸散量（TEWL）等の測定により皮膚バリア機能の低下を指標とする方法、角層中のマクロファージ遊走阻止因子（MIF）の発現量の多寡を指標とする方法（特許文献１）、角層細胞の配列規則性（例えば、角質細胞の大きさや形状など）の年間差から算出することによる方法（特許文献２）、角質細胞におけるカルプロテクチンの存在量の多寡を指標とする方法（特許文献３）等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2015-52622号公報
【特許文献２】特許5312984号公報
【特許文献３】特許4469762号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fragrance Journal, 22, 25-34, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述したような客観的な敏感肌の判定方法では、例えば角質細胞の大きさや形状を外観から評価するためには熟練した技術が必要であったり、或いは生化学的指標を測定するためには試料調製が必要であるなど、判定するまでにいくつかの複雑な工程が介在する等の問題があった。また、TEWLの測定などによる方法では、明確に敏感肌かどうか判別することは困難であった。このため、敏感肌かどうかを客観的な指標により明確に判別でき、かつ微量の試料で簡便に測定でき被験者の負担を軽減可能な評価方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑みて鋭意研究を行い、敏感肌と非敏感肌の皮膚から角層細胞間脂質を採取し、その炭化水素鎖側方充填構造を解析したところ、側方充填構造を構成するヘキサゴナル（Hexagonal）構造とオルソロンビック（Orthorhombic）構造、流動相の３種類のうち、オルソロンビック（Orthorhombic）構造の存在比率が、敏感肌では非敏感肌と比べて有意に少ないことを見出した。本発明者らは、この知見に基づき更に研究を進め、角層細胞間脂質配列におけるオルソロンビック構造の存在比率を指標として敏感肌を評価する本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を指標とする敏感肌の評価方法を提供するものである。換言すれば、本発明は、敏感肌を評価する目的で、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定する方法に関する。
【００１０】
また本発明は、角層を採取するための採取手段と、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定するための測定手段とを含む敏感肌の評価キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の敏感肌の評価方法及び評価キットによれば、敏感肌かどうかを客観的な指標により明確に判別でき、しかも微量の試料で簡便に測定が可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において敏感肌とは、肌がかさつきやすい、肌がかゆくなりやすい、肌が赤くなりやすい等の症状で自覚される肌の総称であって、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎等の皮膚疾患のように臨床的所見からの診断が容易ではない肌状態をいう。また、敏感肌は、例えば、スティンギングテストにおいてスティンギングスコアが高い、角層バリア機能が低下している等を指標の１つとして用いることができる。
【００１３】
角層細胞間脂質とは、皮膚最上層にある角層細胞の間を埋める多層の脂質膜を構成する脂質をいう。角層細胞間脂質は、主にセラミド、遊離脂肪酸、コレステロールなどから構成されており、それらが規則的に配列したラメラ構造をとり、それが何層にも重なって存在している。
【００１４】
ラメラ構造には、脂質分子の長軸方向への配向の周期が約13nmの長周期ラメラ構造と、周期が約６nmの短周期ラメラ構造が知られている。また、ラメラ方向に直行する横断面での炭化水素鎖の並び方（炭化水素鎖側方充填構造）が、全ての格子面間隔で等しいヘキサゴナル構造（六方晶：格子定数は約0.41nm）と、最も密に詰まっているオルソロンビック構造（斜方晶：格子定数は約0.37nm及び約0.41nm）、そして流動相の３種類が存在する。前記ラメラ構造の周期構造は、小角Ｘ線回折などの方法を用いて測定することができる。一方、上記ラメラ構造の炭化水素鎖側方充填構造は、広角Ｘ線回折法、電子線回折法、フーリエ変換IR（FTIR）法、共焦点ラマン分光法等の方法を用いて測定することができる。
【００１５】
本発明の敏感肌の評価方法は、角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層中の細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたオルソロンビック構造の存在比率を非敏感肌の角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率と比較する比較工程とを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明における評価対象部位、すなわち採取工程で角層を採取する部位は、角層及び角層細胞間脂質が入手できる部分であれば、いかなる部位をも包含しうるが、主な部位としては腕（前腕、前腕内側部、上腕内側部等）、頬、額等を挙げることができる。
【００１７】
採取工程において、これらの部位の角層及び角層細胞間脂質を採取する方法としては、グリッドストリッピング、テープストリッピング、擦過、バイオプシー（生検）等による方法等が挙げられるが、非侵襲的に剥離・採取できることから被験者への負担を軽減でき、かつ簡便である観点から、グリッドストリッピングによる方法が好ましい。グリッドストリッピング法は、電子顕微鏡用グリッドに接着剤を塗布し、それを皮膚に直接貼り付け、角層細胞を採取、固定する方法である。この際、採取した角層を光学顕微鏡により観察し、グリッドのメッシュ上に角層細胞が採取されていることを確認することが好ましい。
【００１８】
採取工程により採取された角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率は、角層の構造解析に使用される方法、例えば、広角Ｘ線回折法、電子線回折法、フーリエ変換IR（FTIR）法、共焦点ラマン分光法等を用いた測定結果から求めることができる。本発明では、微量でも測定できる観点から、電子線回折法による測定がより好ましい。
【００１９】
電子線回折には、例えば加速電圧が100kV〜200kV程度の一般的な透過型電子顕微鏡を使用することができる。電子の発生方法としては、タングステンフィラメントやフィールドエミッションによるものなどが挙げられるが、微量の試料で簡便に測定できる観点から、フィールドエミッションを使用するのが望ましい。また角層に対する電子線のビームダメージの影響を低減化する観点から、電子線の照射量を極力小さく設定する必要があるため、検出器としては、イメージングプレートやCCDなどの高感度のものを使用することが好ましい。また冷却試料ステージを使用して試料を凍結することで、ビームダメージによる構造変化を抑制することも好ましい。
【００２０】
オルソロンビック構造の存在比率を解析する方法としては、次のような方法が挙げられる。
上述の電子線回折法により得られた回折像を、例えば、ビーム中心から方位角方向に強度を一周積算することにより得られる散乱強度プロファイルを散乱ベクトルの絶対値ｓ＝2sinθ／λ（2θ；散乱角、λ；波長）の関数として求める。得られた散乱強度プロファイルは、ガウス関数を用いてフィッティングを行うことにより、反射ピーク位置、強度、面先、幅等を評価することができる。
【００２１】
本発明においては、電子線回折により得られた散乱強度プロファイルから求められた強度をオルソロンビック構造の存在比率（Ort率）として用い、敏感肌の評価を行うことが好ましい。上述の強度の値を用いてオルソロンビック構造の存在比率（Ort率）を求めるには、オルソロンビック構造に特徴的な面間隔0.37nm付近の反射ピークの積分強度Ｉ0.37とオルソロンビック構造（Ort構造）とヘキサゴナル構造（Hex構造）由来の反射ピークが重なっている面間隔0.41nm付近の積分強度Ｉ0.41から、下記式に従ってOrt構造の存在比率（Ｒort）を算出すればよい。
【００２２】
Ｒort＝３Ｉ0.37／(Ｉ0.37＋Ｉ0.41)
【００２３】
本発明の敏感肌の評価方法は、上述のようにして測定された角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を、非敏感肌の角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率と比較する比較工程を有することが好ましい。この場合、非敏感肌を有する人の角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率は、複数人の非敏感肌を有する人の同一評価部位のデータを平均値として使用し、その平均値と比較することにより評価することもできる。
このように比較した結果、測定されたオルソロンビック構造の存在比率が、非敏感肌のオルソロンビック構造の存在比率より少ない場合には、敏感肌を有すると評価することができる。
【００２４】
敏感肌を有すると評価する場合、測定されるオルソロンビック構造の存在比率の程度により、敏感肌の程度を評価できる。すなわち、測定されるオルソロンビック構造の存在比率が非敏感肌のオルソロンビック構造の存在比率と比較して、例えば、統計学的検定法等により有意に少ない場合は、ヘキサゴナル構造の存在比率が優位であると考えられることから、その肌は肌質が敏感であることを強く示し、非敏感肌よりも外界刺激に対する抵抗性が顕著に低く、肌がかさつきやすい、かゆくなりやすい、赤くなりやすい等の症状を生ずる「敏感肌」であると評価できる。
【００２５】
本発明の敏感肌の評価キットは、角層を採取するための採取手段と、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定するための測定手段とを含む。
【００２６】
角層を採取するための採取手段は、角層細胞間脂質を採取できる手段であれば特に限定されないが、非侵襲的に剥離・採取可能で被験者への負担を軽減できること、及び簡便に採取できることから、グリッドストリッピング法に用いる採取手段が好ましい。具体的には、電子顕微鏡用グリッド、接着剤等が挙げられる。
【００２７】
また、角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率を測定するための測定手段としては、試料が微量でも測定でき、被験者への負担を軽減できる観点から、電子線回折法による測定手段が好ましい。具体的には、透過型電子顕微鏡が挙げられる。
【実施例１】
【００２８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は、これら実施例における測定箇所、測定条件等に限定されるものではない。
【００２９】
（試験１）スティンギングテストによる敏感肌の分類
敏感肌と非敏感肌の分類をスティンギングテストで実施した。スティンギングテストとは、下記のように、被験物質である皮膚刺激性化学物質の感覚刺激性を判定する試験である。皮膚生理パラメーターの測定及び角層のサンプリングは、例えば22℃、45％R.H.条件下にて、洗顔後、20分間馴化し実施する。
【００３０】
（１）方法
皮膚刺激性水溶性物質として、2.5質量％クエン酸水溶液を使用した。試験部位は、頬部の皮膚を使用した。
被験者49名の頬部の一方の側に2.5質量％クエン酸水溶液を、反対側の頬部にはコントロールとして精製水を塗布した。
評価は、塗布開始直後、2.5分後、５分後、それぞれの時点におけるクエン酸に対する刺激（痛み、ほてり、かゆみ、むずむず等）を、０＝刺激を感じない、１＝やや刺激を感じる、２＝刺激を感じる、３＝激しい刺激を感じる、と基準として、0.5ポイント毎の７段階にて自己申告してもらった。各人のスコアを以下の式により判定し、被験者49名について敏感肌パネルと非敏感肌パネルに分類した。
【００３１】
敏感肌パネル：
クエン酸溶液でのスコア最大値−コントロール溶液でのスコア最大値≧１
非敏感肌パネル：
クエン酸溶液でのスコア最大値−コントロール溶液でのスコア最大値＜１
【００３２】
（２）結果
試験１のスティンギングテストに対し、敏感肌パネルは32名であり、非敏感肌パネルは17名であった。この結果より、敏感肌パネルの被験者（32名）を敏感肌群、非敏感肌パネルの被験者（17名）を非敏感肌群とした。
なお、このスティンギングテストによる方法は、被験者の自己申告であること、更に敏感肌パネルの被験者に対する負担が大きいことから、客観的かつ被験者に負担をかけない評価方法とは言い難い。
【００３３】
（比較例１）経皮水分蒸散量（TEWL）測定による敏感肌の判定
（１）方法
試験１の敏感肌群（32名）及び非敏感肌群（17名）に洗顔を行ってもらい、温度22℃、湿度45％条件下にて20分間馴化後に、経皮水分蒸散量（TEWL）をTewameter（Courage & Khazaka社製）で測定した。得られた値は、平均値±標準偏差（Ave.±S.D.）で示し、２群間の統計学的有意差はstudent t-testによる比較を行った。
【００３４】
（２）結果
この結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0006682303.tif 000002
【００３６】
比較例１の方法は、測定が簡易であり、客観的な敏感肌の評価方法であるが、表１の結果より、敏感肌ではTEWL値がやや増加傾向であるとはいえるものの、敏感肌と非敏感肌を明確に判定することは難しいことが分かる。
【００３７】
（実施例１）角層細胞間脂質におけるオルソロンビック構造の存在比率による敏感肌の判定
（１）方法
（1-1）角層細胞及び角層細胞間脂質の採取方法
試験１の敏感肌群（32名）及び非敏感肌群（17名）に洗顔を行ってもらい、温度22℃、湿度45％条件下にて20分間馴化後に、各被験者の頬部の皮膚表面に、接着剤を塗布した電子顕微鏡用メッシュ（φ２mm）を貼着し、金属ヘラで押しつけた後、角層を接合採取した（グリッドストリッピング法）。これを２〜３回繰り返した後、メッシュへ採取した角層を光学顕微鏡により観察し、角層細胞が採取されていることを確認した。
【００３８】
（1-2）電子線回折測定方法
グリッドストリッピング法により中空状態で保持された角層を電子顕微鏡内に挿入し、加速電圧を100 kV、装置設定上のカメラ長を150 cmにして、角層由来の電子線回折像を取得した。角層に対する電子線のビームダメージの影響を抑制するため、単位時間、単位面積あたりの電子線の照射量を1 e/nm-2/s程度に、露光時間を0.5秒に設定して実験を実施した。被験者１人、１部位あたり30枚の回折像を取得し、方位角方向に積算して、逆光子空間における回折強度分布プロファイルを作成し、得られたプロファイルの形状からオルソロンビック構造の存在比率（Ort率）を求めた。得られた値は、平均値±標準偏差（Ave.±S.D.）で示し、２群間の統計学的有意差はstudent t-testによる比較を行った。
【００３９】
（２）結果
この結果を表２に示す。
【００４０】
【表２】
0006682303.tif 000003
【００４１】
表２の結果より、敏感肌では、角層細胞間脂質のオルソロンビック構造の存在比率が非敏感肌と比べて有意に少なく、当該存在比率を指標として、敏感肌と非敏感肌を明確に判定できることが分かる。また、実施例の方法は、測定が簡易であり、敏感肌の被験者に対しても、非常に負担が軽減できる評価方法であることが分かる。
以上のことから、本発明の方法は、測定が簡易であり、かつ客観的な敏感肌の評価方法であることが分かる。