(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性である少なくとも１種のヒトサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含む、３０個までのアミノ酸の配列からなる単離されたペプチドであって、
該ペプチドが、配列番号１０、５７、５８、６１、７６、８３、８４、８７、８８及び９１の配列のいずれか１つを含む、配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の３０個までの連続したアミノ酸の配列からなる群から選択され、
該ペプチドが、特異的ヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答を刺激することができ、
前記ペプチドに特異的なヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答の平均強度が、少なくともＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１５分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を発現するヒト個体の群において少なくとも２．８％であり、前記ペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレスポンダーの頻度が、ヒト個体の該群において少なくとも６５％であることを特徴とする、単離されたペプチド。
【請求項２】
配列番号１０、５７、５８、６１、７６、８３、８４、８７、８８及び９１の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
（ｉ）請求項１又は２に記載の少なくとも１種の第１のペプチド、又は該ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを含む、免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項４】
前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるエピトープ以外の少なくとも１種のＣＤ４＋  Ｔエピトープ及び／又は１種のＣＤ８＋  Ｔエピトープ及び／又は１種のＢエピトープを含む少なくとも１種の第２のペプチドを更に含み、
前記第１及び第２のペプチドは、単離されている、請求項３に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項５】
前記第２のペプチドが、配列番号３３、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、４９、５０、５４、６０、６９、７３、７４、７５、８５、８６及び９０の配列のいずれか１つを含む配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の３０個までの連続したアミノ酸の配列からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＰ４０１及びＨＬＡ−ＤＰ４０２分子から選ばれる少なくとも６種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含むペプチドである、請求項４に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項６】
前記第２のペプチドが、配列番号３３、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、４９、５０、５４、６０、６９、７３、７４、７５、８５、８６及び９０の配列からなる群から選択される、請求項５に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項７】
前記第２のペプチドが、配列番号２５、２９、３２、３４、３６、３７、３８、４７、５３、５５、５６、５９、６６、７２及び７８の配列のいずれか１つを含む配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の３０個までの連続したアミノ酸の配列からなる群から選択される、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＰ４０１及びＨＬＡ−ＤＰ４０２分子から選ばれる３〜５種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含むペプチドである、請求項４に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項８】
前記第２のペプチドが、配列番号２５、２９、３２、３４、３６、３７、３８、４７、５３、５５、５６、５９、６６、７２及び７８の配列からなる群から選択される、請求項７に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項９】
前記ペプチドが、Ｎ末端アミノ酸残基のアセチル化及び／又はＣ末端アミノ酸残基のアミド化、非タンパク原性アミノ酸によるアミノ酸の置換、反応性官能基における化学基の付加、ペプチド結合の修飾、及び該ペプチドのアミノ酸配列と目的の異種タンパク質又は異種ポリペプチドとの融合からなる群から選択される少なくとも１つの化学修飾を更に含む、請求項３から８までのいずれか一項に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項１２】
サイクリンＢ１の過剰発現に関連するがんの予防的又は治癒的免疫療法（immunotheraphy）におけるその使用のための、請求項３〜９の何れか１項に記載の免疫原性又はワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数のクラスＩＩ  ＨＬＡ（ＨＬＡ  ＩＩ）分子に結合し、ヒトにおいて、多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を有する対象におけるＣＤ４＋  Ｔリンパ球の特異的活性化を誘導することができる、サイクリンＢ１腫瘍抗原に由来する免疫原性ペプチドに関する。本発明はまた、がんワクチンとして、及びがん診断のため又はがん若しくは抗がん治療の間のサイクリンＢ１に対する細胞応答のイムノモニタリング（immunomonitoring）のための試薬としてのこのようなペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞が腫瘍細胞へと分化するのは、生物における細胞の増殖及び増大を促進する遺伝的調節不全の結果である。この調節不全は、正常細胞において通常控えめに発現されるか、全く発現されず、又は一過的に発現されるタンパク質の発現をもたらす。これらのタンパク質のうち一部は、免疫系による認識に十分な量で発現され、腫瘍抗原を構成する。抗腫瘍ワクチン接種は、健康な細胞は見逃す(spares)腫瘍特異的免疫応答を誘導することができるように、標的としてこれらの腫瘍抗原を用いる。これらの抗原は、その発現機序に応じて数種類のカテゴリーに分けられる。
【０００３】
腫瘍特異的細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発見以来、この細胞の活性化を誘導するために相当な労力が払われてきた。ＣＴＬ誘導が、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の活性化に依存すること（Ａｓｓｕｄａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００７、５６、７０〜８０）、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球が、ＣＴＬ非依存性機構、恐らくは、マクロファージ活性化を介して腫瘍の制御を行うこと、これらが細胞傷害性となる場合もあることが現在認められることを考慮して、多くの研究は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識されるペプチドの位置に関係する。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子によってそれらの細胞に提示された腫瘍ペプチド（ＣＤ４＋  Ｔエピトープとして公知）を認識する。認識は、直接的に生じることがあるが（即ち、腫瘍それ自体が、Ｔリンパ球にペプチドを提示する）、主な活性化経路は、樹状細胞が関与するであろう。その表面に多数のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子を保有し、腫瘍細胞片を捕捉することができるこの細胞は、実際には、ナイーブＴリンパ球をｉｎ  ｖｉｖｏでリクルートすることができる主な抗原提示細胞である。
【０００４】
３種類のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子が存在する：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ及びＨＬＡ−ＤＰ。ＤＲＢ１遺伝子にコードされるＨＬＡ−ＤＲ分子は、最も広く発現され、最も広く研究されている。これは、大部分は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の応答に関与するようであり、この応答は、実際、通常はＨＬＡ−ＤＲＢ１に拘束されている。多くの個体は、ＨＬＡ−ＤＲ分子をコードする、ＤＲＢ３、ＤＲＢ４及びＤＲＢ５と呼ばれる他の遺伝子座を保有する。多くのＨＬＡ  ＩＩ分子変異体が存在する。よって、９５９種の異なるタンパク質をコードする１２８５種の異なるＨＬＡ−ＤＲＢ１アレルが、世界中に存在する。しかし、これらのアレルは、世界中に均一に分布している訳ではない。例えば、欧州及び米国において、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１：０１、１５：０１、０３：０１、０４：０１、１１：０１、１３：０１、０７：０１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ３＊０１：０１、−ＤＲＢ４＊０１：０１及び−ＤＲＢ５＊０１：０１アレルにコードされる７種のＨＬＡ−ＤＲ分子、並びに（ＤＰＢ１＊０４０１及びＤＰＢ１＊０４０２）アレルにコードされるＨＬＡ−ＤＰ４分子が優勢であり、人口の大部分を占める（表Ｉ）。
【表１】
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【０００５】
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子は全て、非常に類似した三次元構造を採る。これらのペプチド結合部位は、２個のアルファ−ヘリックスが置かれたベータ−シート床部で構成される。この部位は、２つの末端で開口し、収容するペプチド残基の位置に対応する５個の特異的ポケット（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７及びＰ９）を有する（Ｓｔｅｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９４、３６８、２１５〜２２１）。クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合するペプチドは、一般に、１１〜２５アミノ酸の間のサイズを有する。クラスＩＩ  ＨＬＡ分子間の配列の差は、本質的にペプチド結合部位のポケットに位置するため、ＣＤ４＋  Ｔエピトープは、そのクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に従って個体毎に変動する。
【０００６】
効率的となるために、腫瘍抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答は、多数のリンパ球を動員しながら、十分な規模（又は強度）のものとなる必要があり、大多数の個体において生じる必要がある。
【０００７】
近年の研究は、抗原に対するＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答（又は特異的ＣＤ４＋  Ｔ応答）の規模が、生物内を循環する、この抗原に特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球のレパートリーのサイズに依存することを示す（Ｍｏｏｎら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２００７、２７、２０３〜２１３）。このレパートリーサイズは、抗原毎に非常に可変性である。これは一方では、抗原を認識することができる全ＴＣＲ再編成及び胸腺選択に起因する。クラスＩＩ  ＨＬＡ四量体の使用（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２、１８８、４１３５〜４１４０）又は非特異的刺激（Ｇｅｉｇｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００９、２０６、１５２５〜１５３４）若しくは特異的刺激（Ｄｅｌｌｕｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１６、４５４２〜４５４５；Ｄｅｌｌｕｃら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２０１１、２５、２０４０〜２０４８；国際出願ＷＯ２０１０／０７６４１３）によるＣＤ４＋  Ｔリンパ球の増幅のいずれかに基づく様々な方法により、抗原に特異的なレパートリーを定量化することが可能である。特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ドナー血液中に非常に低い頻度で存在するため、特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、抗原刺激のサイクルによって増幅される；ＣＤ４＋  Ｔ細胞のペプチド特異性は、増幅後に評価される。これらの検査は、ヒトにおける特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答の強度を予測することができ、特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球の最大レパートリーを有し、従って、最強の特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答を刺激することができるタンパク質又はペプチドの同定を可能にする。加えて、多様なクラスＩＩ  ＨＬＡ分子を有するドナーのセットにおいて行われる場合、これらの検査は、高いレスポンダー頻度を有するタンパク質、ペプチド又はペプチドの組合せの実証を可能にする。よって、特異的刺激によるＣＤ４＋  Ｔリンパ球増幅の検査は、免疫原性ではない治療用抗体から免疫原性の治療用抗体を区別し（Ｄｅｌｌｕｃら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２０１１、２５、２０４０〜２０４８）、組換えエリスロポエチンの免疫原性を明らかにすること（Ｄｅｌｌｕｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１６、４５４２〜４５４５）を可能にした。
【０００８】
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子の多型を考慮すると、大多数の個体における特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を刺激する抗原の能力は、多数のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子によって提示されるその能力に依存する。この提示能力は、抗原に存在するペプチド配列のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に対する親和性に依存し、ＣＤ４＋  Ｔエピトープは、実際、強い親和性のペプチドに主に見出される。クラスＩＩ  ＨＬＡ分子の結合特異性は、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子毎に非常に可変性であるため、これらのペプチドは、個体毎に変動する。しかし、ある特定のペプチドは、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子と相互作用する共通ゾーンを介して数種類の分子に結合することができる。これらは、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子と相互作用する数種類のゾーンを収容することもできる。抗原又は該抗原に由来するペプチドに対するレスポンダーの頻度の評価は、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子の多型を考慮に入れることを必要とする。第１の評価は、最も高頻度のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に対する、抗原に由来するペプチドの親和性を測定することによって行うことができる。この親和性は、特に、ＨＬＡ−ＤＲ分子（米国特許第６６４９１６６号）及びＨＬＡ−ＤＰ４分子（国際出願ＷＯ０３／０４０２９９）に特異的な結合検査によって測定することができる。より正確な評価は、最も高頻度のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子の総てを網羅する多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を有する十分な数の個体を用いて為される、特異的刺激によるＴリンパ球の増幅の検査によって行われる（国際出願ＷＯ２０１０／０７６４１３）。
【０００９】
サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）は、細胞周期調節、より詳細にはＧ２期からＭ期への移行に関与する、４３３アミノ酸、４８ｋＤａのタンパク質である。ヒトサイクリンＢ１は、ＵｎｉＰｒｏｔ配列Ｐ１４６３５又は配列番号１に一致する。健康な細胞において、これは、細胞周期Ｇ２期の間に、サイクリン依存性キナーゼ１（ｃｄｋ１；ｃｄｃ２とも呼ばれる）に会合して、Ｍ期促進因子（ＭＰＦ）を形成する。Ｇ２／Ｍ移行の間のこの複合体の活性化は、それの核への移行をもたらし、そこで、核膜断片化、紡錘体アセンブリ、染色体凝縮及び染色分体分離に寄与する。続いて、ＣＣＮＢ１は、ユビキチン化及びプロテアソームによる破壊によって急速に分解され、これにより、ｃｄｃ２不活性化及び有糸分裂終了を可能にする。従って、健康な細胞におけるＣＣＮＢ１発現は一過性である。ＣＣＮＢ１合成は、Ｓ期の終わりに開始され、続いてＧ２期の間に徐々に増加し、Ｇ２／Ｍ移行のレベルにおいてピークに達し、その後停止される。ＣＣＮＢ１は、Ｇ２期を通して細胞質に維持され、その後、有糸分裂の初め（Ｇ２／Ｍ移行）に核移行する。
【００１０】
ＣＣＮＢ１は、乳がん（Ｏｈｔａら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ、１９９７、４、１７〜２４）、結腸がん（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１９９７、１２３、１２４〜１２７）、前立腺がん（Ｍａｓｈａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９６、５６、４１５９〜４１６３）、食道がん（Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ：Ａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９９９、４３４、１５３〜１５８）、胃がん（Ｙａｓｕｄａら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２００２、１２８、４１２〜４１６）、肺がん（Ｓｏｒｉａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６０、４０００〜４００４）及びＥＮＴがん（Ｈｏｆｆｍａｎｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１、３１、３１５１〜３１５７）を含む、多数のがんにおいて過剰発現される。腫瘍細胞において、サイクリンＢ１は、核及び細胞質の両方に見出される。この異常発現は、その発現が阻害される実験によって示される通り（Ｙｕａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４、２３、５８４３〜５８５２）、腫瘍成長に寄与する（Ｋｅｙｏｍａｒｓｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３、９０、１１１２〜１１１６）。この過剰発現は、ｐ５３タンパク質の機能喪失によるものと思われる（Ｙｕら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、３８、９８１〜９８７）。サイクリンＢ１は、低い耐容能誘導に都合よいことに、多様ながんにおいて頻繁に発現され腫瘍成長に必須であるが、健康な細胞において一過的に発現されることを考慮すると、がんワクチンの開発のための選択肢となる標的を提示する。
【００１１】
数例の研究は、サイクリンＢ１（ＣＣＮＢ１）が、免疫応答の標的となり得ることを示した。様々な起源の腫瘍細胞から抽出されたクラスＩ  ＨＬＡ分子から溶出された、サイクリンＢ１に由来するペプチド（Ｋａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１、１９４、１３１３〜１３２３）は、特異的ＣＴＬ応答を誘導することができる（表ＩＩ；Ｋａｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００１、１９４、１３１３〜１３２３；Ｓｏｒｅｎｓｅｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００９、１５、１５４３〜１５４９；Ａｎｄｅｒｓｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００１、６０、２２７〜２３４；国際出願ＷＯ０３／０３３５２０）。
【表２】
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【００１２】
ＣＣＮＢ１に向けられた、先験的にＣＤ４＋リンパ球依存性の自発的体液性応答が、がんを患う患者において観察された（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２００５、１１、１５２１〜１５２６）。ＣＣＮＢ１の重複するペプチド（１２〜１５アミノ酸）によるＣＤ４＋  Ｔリンパ球の刺激の検査は、このタンパク質の領域２１５〜２３３を網羅する３種のペプチドのみ（ＣＣＮＢ１  ２１５〜２２９、２１９〜２３３及び２２３〜２３４）が、数名の健康な個体におけるＣＤ４＋  Ｔ及びＣＤ８＋  Ｔリンパ球を活性化できたことを示した（Ｖｅｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００９、１０６、１４０１０〜１４０１５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、レスポンダーの頻度が、未知ＨＬＡハプロタイプの個体において、即ち、ＨＬＡ  ＩＩ分子多型を考慮に入れることなく決定されたことを考慮すると、このペプチドの実際の有効性は実証されていない。加えて、これらのペプチドに対するＣＤ４＋  Ｔ応答の定性的解析のみが行われることを考慮すると、これらのペプチドに対するＣＤ４＋  Ｔ応答の強度は分からない。
【００１４】
従って、がんに対し有効なワクチンを開発するために、有効なＣＤ４＋  Ｔ応答、即ち、多数の個体において高い強度の応答を誘導することができる、サイクリンＢ１の新たなＣＤ４＋  Ｔエピトープを得る現実の要求がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であり、以前に記載された（表ＩＶ）領域２１５〜２３３の３種のＣＤ４＋  Ｔエピトープとは異なる、ヒトサイクリンＢ１のＣＤ４＋  Ｔエピトープのセットを同定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるサイクリン（cylin）Ｂ１のこれらのＣＤ４＋  Ｔエピトープは、サイクリンＢ１タンパク質による刺激により生成されたＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって特異的に認識される限りにおいて、サイクリンＢ１に向けられたＣＤ４＋  Ｔ応答に寄与する。先行技術のＣＤ４＋  Ｔエピトープに反して、ＨＬＡ  ＩＩ分子に関するその拘束は未知であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるこれらのＣＤ４＋  Ｔエピトープは、コーカサス人種集団において最も高頻度の全ＨＬＡ−ＤＲＢ１分子（ＨＬＡ−ＤＲ１、−ＤＲ３、−ＤＲ４、−ＤＲ７、−ＤＲ１１、−ＤＲ１３及び−ＤＲ１５；表Ｉ及びＩＶ）を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を保有する個体において認識される。本発明者らは、コーカサス人種集団において最も高頻度のＨＬＡ  ＩＩ分子（表ＶＩ）への結合に対する幅広い特異性を有するペプチドも同定した。
【００１６】
注目すべきことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるこのペプチドは、最も有効なペプチド、即ち、コーカサス人種集団において最も高頻度であり、コーカサス人種集団の個体の８０％を単独で網羅する全ＨＬＡ−ＤＲＢ１分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を保有する個体の集団において、最も有効な特異的ＣＤ４＋  Ｔ応答（ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける応答の平均強度が２．８％を超え、６．１％に達することができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレスポンダーの頻度が６５％を超え、８５％に達することができる；表ＩＸ）を誘導することができるペプチドを含む。
【００１７】
このようなペプチドは、サイクリンＢ１に由来し、多数の個体においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで強い規模の特異的ＣＤ４＋  Ｔ応答を誘導することができるという事実のため、がんワクチン開発のための特に有望な候補を提示する。
【００１８】
かくして、本発明は、配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列に由来し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性である少なくとも１種のヒトサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含む、１１〜３０アミノ酸、好ましくは、１５〜２５アミノ酸の配列から本質的になる単離されたペプチドであって、特異的ヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答を刺激することができるペプチドを対象とする。
【００１９】
定義
−  用語「サイクリンＢ１」又は「ＣＣＮＢ１」は、いずれかの哺乳類に由来するサイクリンＢ１タンパク質を意味するものとする；これは好ましくは、ヒトサイクリンＢ１タンパク質である。ヒトサイクリンＢ１は、ＵｎｉＰｒｏｔアミノ酸配列Ｐ１４６３５又は配列番号１に一致する。
【００２０】
−  用語「ＣＤ４＋  Ｔエピトープ」は、少なくとも１種のＨＬＡ  ＩＩ分子、好ましくは、表Ｉに示されている優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子の１種に結合し、このＨＬＡ  ＩＩ分子を保有する個体における特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識される、１１〜２５アミノ酸のペプチドを意味するものとする；該ペプチドは、その末端のそれぞれにおいて少なくとも１アミノ酸、好ましくは、少なくとも２又は３アミノ酸に隣接する、ＨＬＡ  ＩＩ分子に繋留するための残基を含む９アミノ酸の配列を含む。
【００２１】
−  用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性のサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープ」は、サイクリンＢ１タンパク質を提示する自家抗原提示細胞、特に、サイクリンＢ１タンパク質を負荷された自家樹状細胞による少なくとも２連続サイクル、好ましくは、３又は４連続サイクルの刺激によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで以前に刺激されたヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識される、サイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを意味するものとする。
【００２２】
−  用語「優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子」は、そのアレル頻度が参照集団において５％を超える、ＨＬＡ  ＩＩ分子を意味するものとする。
【００２３】
−  用語「がん」は、非限定的な様式において：乳がん、結腸がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、肺がん及びＥＮＴがん等、腫瘍細胞によるサイクリンＢ１タンパク質の過剰発現に関連するがんを意味するものとする。
【００２４】
−  用語「本発明によるペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレスポンダーの頻度」は、検査した全個体と比べた、該ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統が得られた個体のパーセンテージを意味するものとする。
【００２５】
レスポンダーの頻度は、出願ＷＯ２０１０／０７６４１３に記載されている方法に従って決定することができる。
【００２６】
−  用語「本発明によるペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答の強度」は、該ペプチドに特異的なヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答の強度、即ち、培養に付された全ウェルと比べた、該ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球を含有する培養ウェルのパーセンテージを意味するものとする。本発明によるペプチドに対する応答の平均強度は、全ドナーに及ぶ、ドナー毎に計算された強度の平均に相当する。
【００２７】
応答の強度は、出願ＷＯ２０１０／０７６４１３に記載されている方法に従って決定することができる。
【００２８】
−  アミノ酸配列の同一率は、最大配列同一性を得るために、配列を整列化し、必要に応じてスペースを導入した後に参照配列と同一である、比較しようとする配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージによって定義される。次に、同一率は、次式に従って決定される：同一率＝１００×［１−（Ｃ／Ｒ）］、式中、Ｃは、参照配列の全長に亘る、参照配列及び比較しようとする配列の間の差の数であり、（ｉ）比較しようとする配列において整列された対応するアミノ酸を持たない参照配列における各アミノ酸、（ｉｉ）参照配列における各スペース、及び（ｉｉｉ）比較しようとする配列におけるアミノ酸とは異なる参照配列において整列された各アミノ酸が、差を構成し、Ｒは、比較しようとする配列に対して整列化した参照配列における全長に亘るアミノ酸の数であり（即ち、参照配列の全長）、参照配列において作成された各スペースは、アミノ酸としてカウントされる。配列の同一率を決定する目的のための配列整列化は、当業者に公知の様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、２１５、４０３〜）等、利用できる公共ソフトウェアを用いて行うことができる。このソフトウェアは、好ましくは、デフォルトパラメータで用いられる。
【００２９】
本発明は、上に定義されている組換え又は合成ペプチドを包含する。ＨＬＡ  ＩＩ分子に対する本発明のペプチドの結合活性は、それぞれＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ４分子に関する米国特許ＵＳ６６４９１６６及びＰＣＴ国際出願ＷＯ０３／０４０２９９に記載されている免疫酵素的可視化による競合検査等、ＨＬＡ  ＩＩ分子の特異的結合のための従来の検査によって測定される。ナイーブ個体に存在する前駆体から特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答を誘導し、サイクリンＢ１の過剰発現に関連するがんを患う個体におけるこのような特異的細胞を刺激する本発明のペプチドの能力、サイクリンＢ１ペプチド又はタンパク質に関する誘導されたＣＤ４＋  Ｔリンパ球の特異性、並びに特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識される本発明のペプチドの能力は、当業者に公知の標準技法、例えば：細胞増殖検査、ＥＬＩＳＰＯＴ検査（サイトカイン産生細胞をアッセイする）又はＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４若しくはＩＬ−１０等のサイトカインに特異的な細胞内サイトカインアッセイによって評価される。
【００３０】
アミノ酸は、一文字コードを用いて表示される。サイクリンＢ１に由来するペプチドの位置は、ヒト配列（配列番号１）を参照して示される。
【００３１】
前記ペプチドの有利な一実施形態によれば、このペプチドは、少なくとも３、好ましくは、少なくとも４種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合し、これは、好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＰ４０１及びＨＬＡ−ＤＰ４０２分子から選ばれる。好ましくは、これらＨＬＡ  ＩＩ分子は、それぞれＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、ＤＲＢ１＊１１０１、ＤＲＢ１＊１３０１、ＤＲＢ１＊１５０１、ＤＲＢ３＊０１０１、ＤＲＢ４＊０１０４、ＤＲＢ５＊０１０１、ＤＰ＊０４０１及びＤＰ＊０４０２アレルにコードされる。
【００３２】
前記ペプチドの別の有利な実施形態によれば、前記ペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレスポンダーの頻度は、当該個体が由来する集団において優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子、好ましくは、少なくともＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１５分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を発現するヒト個体の群において、少なくとも５５％、好ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７５％である。
【００３３】
前記ペプチドの別の有利な実施形態によれば、前記ペプチドに特異的なヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答の平均強度は、当該個体が由来する集団において優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子、好ましくは、少なくともＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１５  分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を発現するヒト個体の群において、少なくとも２．５％、好ましくは、少なくとも２．８％である。
【００３４】
上述の実施形態の有利な一編成によれば、前記ペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレスポンダーの頻度は、当該個体が由来する集団において優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子、好ましくは、少なくともＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ７、ＨＬＡ−ＤＲ１１、ＨＬＡ−ＤＲ１３及びＨＬＡ−ＤＲ１５分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を発現するヒト個体の群において、少なくとも５５％、好ましくは、少なくとも６５％、好ましくは、少なくとも７５％であり、且つ前記ペプチドに特異的なヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答の平均強度は、当該ヒト個体の群において、少なくとも２．５％、好ましくは、少なくとも２．８％である。
【００３５】
前記ペプチドの別の有利な実施形態によれば、これは、
配列番号１の残基２７９〜２９３で構成される１５アミノ酸の配列を除いて、
ａ）配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、該配列の１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基３〜１１、１９〜２７、２７〜３５、１２０〜１２８、２８２〜２９０、２８７〜２９５、３０５〜３１３、３１７〜３２５、３２２〜３３０、３２５〜３３３、３７６〜３８４、３７９〜３８７、４１２〜４２０、４１８〜４２６又は４２２〜４３０を含む配列、及び
ｂ）ａ）における配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有する、１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）アミノ酸、好ましくは、１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）アミノ酸の配列
で構成される群から選択される。
【００３６】
本発明は、サイクリンＢ１配列における１個又は複数のアミノ酸の変異（挿入、欠失、置換）によって得られる天然又は合成変異ペプチドを包含する。但し、配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列に由来する当該ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であり、ＨＬＡ  ＩＩ分子、特に、優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができ、サイクリン−Ｂ１特異的ヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球応答を刺激することができる、サイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープのその特性を保持する、即ち、サイクリンＢ１の野生型配列又は天然変異に特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識される。天然変異は、特に、サイクリンＢ１の多型に起因する。加えて、ＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ４分子への結合に関与するアミノ酸残基（繋留残基）並びにＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ４分子への結合におけるこれら残基の修飾の効果が当業者に公知であることを考慮して、他の変異を容易に構築することができる；ＰＣＴ国際出願ＷＯ０３／０４０２９９は、特に、ＨＬＡ−ＤＰ４への結合のため、Ｐ６における残基が、芳香族若しくは疎水性でなければならない又はシステイン残基（Ｃ）からなり、残基Ｐ１及びＰ９のうち少なくとも一方が、Ｐ１が芳香族若しくは疎水性である、及び／又はＰ９が芳香族若しくは疎水性である又はＣ、Ｄ、Ｑ、Ｓ、Ｔ若しくはＥ残基からなるようなものである一方、Ｐ４における残基がいかなるアミノ酸残基であってもよいことを教示する。米国特許ＵＳ６６４９１６６は、ＨＬＡ  ＤＲ分子へ繋留するための残基（Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６、Ｐ７及びＰ９）及びＨＬＡ  ＤＲ分子に対する親和性の修飾を可能にするこれらの残基の突然変異の性質を決定するための一般方法について記載する。ＨＬＡ−ＤＲ分子結合モチーフは、特に、Ｓｔｕｒｎｏｌｉｏら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１９９９、１７、５３３〜５３４及びＲａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９５、４１、１７８〜２２８に記載されている。変異は、サイクリンＢ１の１個又は複数のシステイン残基の、別のアミノ酸、例えばセリンによる置換を含むこともできる。
【００３７】
本実施形態の有利な一編成によれば、前記ペプチドは、
−  配列番号１のヒトサイクリン配列の１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、該配列の１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基３〜１１、２８２〜２９０、２８７〜２９５、３０５〜３１３、３７６〜３８４、４１８〜４２６又は４２２〜４３０を含む配列、
−  配列番号１のヒトサイクリン配列の１５〜３０（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、該配列の１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基３０１〜３１３又は４１８〜４３０を含む配列、及び
−  配列番号１のヒトサイクリン配列の１６〜３０（１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、該配列の１６〜２５（１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基２８２〜２９５を含む配列
で構成される群から選択される。
【００３８】
本実施形態の別の有利な編成によれば、前記ペプチドは、配列番号１０、１２、１３、２６、５７、５８、６１、６３、６４、６５、７６、７７、８２、８３、８４、８７、８８、８９及び９１で構成される群から選択される配列を含む又はこれからなる。好ましくは、前記ペプチドは、配列、配列番号１０、５７、５８、６１、７６、８３、８４、８７、８８及び９１で構成される群から選択される配列を含む又はこれからなる。
【００３９】
前記ペプチドは、有利には、サイクリンＢ１タンパク質の数種類のＣＤ４＋  Ｔエピトープを含む。
【００４０】
本発明はまた、特に、マルチエピトープポリペプチドの形態における、単離された又は互いに組み合わせた、ペプチドの混合物であって、（ｉ）上に定義した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性である少なくとも１種のサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含む少なくとも１種の第１のペプチドと、（ｉｉ）該免疫優性エピトープ以外の少なくとも１種のＣＤ４＋  Ｔエピトープ、及び／又は１種のＣＤ８＋  Ｔエピトープ及び／又は１種のＢエピトープ、特に、サイクリンＢ１及び／又は他の腫瘍抗原の、特にＭＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、サバイビン及びミッドカイン等のＣＤ４＋  Ｔ及び／又はＣＤ８＋  Ｔエピトープを含む少なくとも１種の第２のペプチドとを含む混合物を対象とする。
【００４１】
腫瘍抗原に由来するＣＤ４＋  Ｔ又はＣＤ８＋  Ｔエピトープは、特に、ウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅｄａｔａｂａｓｅ／ｔｕｍｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃ．ｈｔｍ並びにＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／０３６６３８及びＷＯ２００９／１５３４６３に記載されている。
【００４２】
本発明の混合物に取り込むことができるエピトープのうち、特に次のものについて言及することができる：
−  上に定義されているサイクリンＢ１  ＣＤ８＋  Ｔエピトープ（表ＩＩ）、
−  特許ＵＳ６０６３９００及びＰＣＴ出願ＷＯ２００４／０５２９１７に記載されているＭＡＧＥ  ＣＤ８＋  Ｔエピトープ、
−  ＤＲ１拘束されたＭＡＧＥ−Ａ３  ２６７〜２８２（ＰＣＴ国際出願ＷＯ０２／０９５０５１）；ＤＲ４及びＤＲ７拘束されたＭＡＧＥ−Ａ３  １４９〜１６０（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、６１、４７７３〜４７７８）；ＤＲ１１拘束されたＭＡＧＥ−Ａ３  １９１〜２０５及び２８１〜２９５（Ｃｏｎｓｏｇｎｏら、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０１、１０３８〜１０４４；Ｍａｎｉｃｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１８９、８７１〜８７６）及びＤＲ１３拘束されたＭＡＧＥ−Ａ３  １２１〜１３４（米国特許第６７１６８０９号）；ＤＲ１５拘束されたＭＡＧＥ−Ａ１  ２８１〜２９２（ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／７８８０６）；ＤＲ４拘束されたＭＡＧＥ−Ａ６  １０２〜１１６、１２１〜１４４、１４０〜１７０、１４５〜１６０、１５０〜１６５及び２４６〜２６３（Ｔａｔｓｕｍｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、９、９４７〜９５４）；ＤＲ１５拘束されたＭＡＧＥ−Ａ１  ２８１〜２９２（ＰＣＴ国際出願ＷＯ００／７８８０６）；ＤＲ４拘束されたＭＡＧＥ−Ａ６  １０２〜１１６、１２１〜１４４、１４０〜１７０、１４５〜１６０、１５０〜１６５及び２４６〜２６３（Ｔａｔｓｕｍｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００３、９、９４７〜９５４）並びにＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／０２６０７８に記載されているＨＬＡ−ＤＰ４拘束されたＭＡＧＥエピトープ等、ＭＡＧＥ  ＣＤ４＋  Ｔエピトープ、
−  サバイビン９６〜１０４（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号９２）又は９５〜１０４（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号９３）、サバイビン−２Ｂ  ８０〜８８（ＡＹＡＣＮＴＳＴＬ、配列番号９４）及びＢａｃｈｉｎｓｋｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．、２００５、５、６〜の表Ｉに記載されているペプチドから選ばれるサバイビンＣＤ８＋  Ｔエピトープ、
−  ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００７／０３６６３８に記載されているサバイビンＣＤ４＋  Ｔエピトープ、特に、ペプチド１９〜３３、９０〜１０４又は９３〜１０７、
−  ＰＣＴ国際出願ＷＯ２００９／１５３４６３に記載されているミッドカインＣＤ４＋  Ｔ及び／又はＣＤ８＋  Ｔエピトープ、
−  破傷風毒素ペプチドＴＴ８３０〜８４６（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１４７、２６６３〜２６６９）、インフルエンザウイルス赤血球凝集素ペプチドＨＡ３０７〜３１９（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、上述）、ＰＡＤＲＥペプチド（ＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡ、配列番号９５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９４、１、７５１〜７６１）、並びにペプチドＣＳ．Ｔ３（Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８８、３３６、７７８〜７８０）及びペプチドＣＳＰ、ＳＳＰ２、ＬＳＡ−１及びＥＸＰ−１（Ｄｏｏｌａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６５、１１２３〜１１３７）等、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）抗原に由来するペプチド等、天然又は合成ユニバーサルＣＤ４＋  Ｔエピトープ、
−  糖で構成されるＢエピトープ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、上述）であって、好ましくは、糖ペプチドの形態のＢエピトープ、並びに
−  サイクリンＢ１のＢエピトープであって、該腫瘍抗原に対する抗体によって特異的に認識されるＢエピトープ。
【００４３】
前記混合物の一実施形態によれば、第２のペプチドは、上に定義されている少なくとも３、好ましくは、少なくとも６種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含むペプチドである。
【００４４】
有利には、前記第２のペプチドは、
ａ）配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、当該配列の１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基１７０〜１７８、２０１〜２０９、２０４〜２１２、２０９〜２１７、２１４〜２２２、２１８〜２２６、２２３〜２３１、２２７〜２３５、２４３〜２５１、２４６〜２５４、２５２〜２６０、２６９〜２７７、３０１〜３０９、３４４〜３５２、３６５〜３７３、３６８〜３７６又は３７１〜３７９を含む配列、及び
ｂ）ａ）における配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有する、１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個のアミノ酸、好ましくは、１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個のアミノ酸の配列
で構成される群から選択される、上に定義した少なくとも６種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるペプチドである。
【００４５】
好ましくは、少なくとも６種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができる前記ペプチドは、配列番号３３、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４８、４９、５０、５４、６０、６９、７３、７４、７５、８５、８６及び９０で構成される群から選択される配列を含む又はこれからなる。
【００４６】
或いは、前記第２のペプチドは、
ａ）配列番号１のヒトサイクリンＢ１配列の１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個の連続したアミノ酸、好ましくは、当該配列の１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個の連続したアミノ酸の配列であって、配列番号１の配列の少なくとも残基１１５〜１２３、１４６〜１５４、１６６〜１７４、１７２〜１８０、１８７〜１９５、１９１〜１９９、１９７〜２０５、２３９〜２４７、２６６〜２７４、２７１〜２７９、２７７〜２８５、２９３〜３０１、３２９〜３３７、３６１〜３６９又は３８７〜３９５を含む配列、及び
ｂ）ａ）における配列と少なくとも７０％の同一性、好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％又は９０％、好ましくは、少なくとも９５％の同一性を有する、１１〜３０（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）個のアミノ酸、好ましくは、１５〜２５（１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）個のアミノ酸の配列
で構成される群から選択される、３〜５種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるペプチドである。
【００４７】
好ましくは、３〜５種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができる前記ペプチドは、配列番号２５、２９、３２、３４、３６、３７、３８、４７、５３、５５、５６、５９、６６、７２及び７８で構成される群から選択される配列を含む又はこれからなる。
【００４８】
上に定義されているサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープ（単数又は複数）の組合せは、有利には、レスポンダー個体の適用範囲を広げ、免疫応答の規模を強化することにより、抗腫瘍免疫応答の改善を可能にする。
【００４９】
前記混合物の別の有利な実施形態によれば、これは、様々なエピトープを含むペプチドの鎖状体形成を含むマルチエピトープポリペプチドを伴う。本発明によれば、様々なペプチドの配列は、ペプチド結合によって互いに連結し、又は外因性配列によって隔てられている。マルチエピトープ誘導体は、サイクリンＢ１の１００個未満の連続したアミノ酸、好ましくは、５０個未満、好ましくは、３０個未満のアミノ酸を含む。マルチエピトープペプチド誘導体は、２０〜２００アミノ酸、好ましくは、３０〜１００アミノ酸、好ましくは、およそ５０アミノ酸の長さを有する。
【００５０】
本発明はまた、ペプチドのアミノ酸残基（単数又は複数）、ペプチド結合又は末端のレベルにおけるいずれかの修飾の導入による、上述のペプチド又はポリペプチドに由来する修飾ペプチド又はポリペプチドであって、ＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができ、特異的ヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球を活性化することができる修飾ペプチド又はポリペプチドを対象とする。当業者に公知の従来の方法によってペプチドに導入される、この又はこれらの修飾（単数又は複数）、好ましくは、１種又は複数の化学修飾（単数又は複数）は、非限定的に、次の化学修飾のうち少なくとも１種を含む：Ｎ末端アミノ酸残基のアセチル化及び／又はＣ末端アミノ酸残基のアミド化（Ｍａｉｌｌｅｒｅら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１１９５、３２、１３７７〜１３８５）、非タンパク原性アミノ酸（Ｄアミノ酸又はアミノ酸アナログ）によるアミノ酸の置換；反応性官能基、特に、側鎖Ｒのレベルにおける化学基（脂質、オリゴ糖又は多糖）の付加；ペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）の修飾、特に、レトロ若しくはレトロ−インベルソ型（−ＮＨ−ＣＯ−）の結合又はペプチド結合以外の結合による修飾；環化；前記ペプチドの配列とあるペプチド（ワクチン接種のための対象とするエピトープ；ペプチドの精製に用いるためのタグ、特に、プロテアーゼにより切断可能な形態のタグ）の配列との融合；前記ペプチドの配列とタンパク質、特に、ＨＬＡ  Ｉ若しくはＨＬＡ  ＩＩ分子のα鎖、ＨＬＡ  ＩＩ分子のβ鎖又は該鎖の細胞外ドメインの配列、或いは特に不変鎖Ｉｉ又はＬＡＭＰ−１タンパク質に由来するエンドソームに向けて標的化するための配列との融合；適切な分子、特に、標識、例えば、蛍光色素又はビオチンへのカップリング。これらの修飾は、特に、安定性、より詳細には、タンパク質分解に対する抵抗性や、溶解性又は免疫原性を増加させること、或いは本発明によるペプチド、又は該ペプチドに特異的なＣＤ４＋及び／若しくはＣＤ８＋細胞のいずれかの精製又は検出を容易にすることが意図される。
【００５１】
本発明の目的のため、用語「ペプチド誘導体」は、本発明によるペプチド、修飾ペプチド又は修飾若しくは非修飾マルチエピトープポリペプチドを意味するものとする。
【００５２】
前記修飾ペプチド又はポリペプチドの有利な一実施形態によれば、これは、１個又は複数のＮ６−アセチル−リシン（単数又は複数）、ホスホセリン（単数又は複数）及び／又はホスホスレオニン（単数又は複数）を含む。好ましくは、Ｎ−アセチル−リシンは、配列番号１の配列の位置７３に、ホスホセリン（単数又は複数）は、位置１２６、１２８、１３３及び／又は１４７に、ホスホスレオニンは、位置３２１にある。
【００５３】
前記修飾ペプチド又はポリペプチドの別の有利な実施形態によれば、これは、そのＮ末端アミノ酸残基のアセチル化及び／又はそのＣ末端アミノ酸残基のアミド化を含む。
【００５４】
前記修飾ペプチド又はポリペプチドの別の有利な実施形態によれば、これは、有利には、前記ペプチド／ポリペプチドの精製又は検出のために、その末端の一方に融合されたタグを含む。タグ、特に、ポリヒスチジン配列又は抗原のＢエピトープは、好ましくは、融合体からペプチド／ポリペプチド配列を単離できるように、プロテアーゼのための切断部位によってペプチド／ポリペプチドの配列から隔てられる。
【００５５】
前記修飾ペプチド又はポリペプチドの別の有利な実施形態によれば、これは、それぞれ、上に定義されているペプチド及びポリペプチドを含むリポペプチド又はリポポリペプチドである。
【００５６】
前記リポペプチド／ポリペプチドは、特に、前記ペプチド又はポリペプチドのアミノ酸側鎖のα−アミノ官能基又は反応性官能基への脂質の付加により得られる；これは、Ｃ４〜Ｃ２０脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、２−アミノヘキサデカン酸、ピメラウチド、トリメキサウチド）又はステロイド誘導体に由来する１種又は複数の必要に応じて分枝した又は不飽和の鎖を含むことができる。好まれる脂質部分は、特に、Ａｃ−Ｋ（Ｐａｍ）とも呼ばれるＮα−アセチル−リシンＮε（パルミトイル）基によって表される。
【００５７】
前記修飾ペプチド又はポリペプチドのさらに別の有利な実施形態によれば、これは、異種タンパク質（サイクリンＢ１以外）又は異種ポリペプチド断片（サイクリンＢ１以外のタンパク質の断片、又はその配列が前記サイクリンＢ１の配列における前記ペプチド若しくはポリペプチドの配列と直接的に隣接しないサイクリンＢ１の断片）と融合された前記ペプチド又はポリペプチドを含む融合タンパク質である。
【００５８】
ペプチド又はポリペプチド断片は、前記異種タンパク質若しくは前記異種ポリペプチド断片のＮＨ２若しくはＣＯＯＨ末端と融合することができる、又は前記タンパク質若しくは前記断片の配列内に挿入することができる。
【００５９】
前記融合タンパク質の有利な一配置によれば、これは、エンドソームに向けて標的化するための配列、好ましくは、ヒト不変鎖Ｉｉ又はＬＡＭＰ−１タンパク質に由来する配列と融合された、上に定義したペプチド又はポリペプチドで構成される。エンドソームに向けて標的化するための配列及び抗原をエンドソームに向けて標的化するためのその使用は、特に、Ｓａｎｄｅｒｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２、７２１７〜７２２２）、Ｗｕら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２、１１６７１〜１１６７５）及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９８、７２、２２４６〜２２５２）に記載されている。
【００６０】
前記融合タンパク質の別の有利な編成によれば、これは、ＨＬＡ分子の鎖のうち一つ、好ましくは、ＨＬＡ  ＩＩ分子のベータ鎖若しくはＨＬＡ  Ｉ分子のアルファ鎖、又は可溶性ＨＬＡ分子に相当するこれらの断片、特に、相同シグナルペプチド若しくは異種シグナルペプチドに先行される細胞外ドメインに相当する断片と融合された、上に定義されているペプチド又はポリペプチドで構成される。前記ペプチドは、有利には、ＨＬＡ−ＤＲ分子に関して記載されている通り（Ｋｏｌｚｉｎら、ＰＮＡＳ、２０００、９７、２９１〜２９６）、シグナルペプチド及びα又はβ鎖の細胞外ドメインのＮＨ２末端の間に挿入される。
【００６１】
前記融合タンパク質のさらに別の有利な編成によれば、これは、特に、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及び蛍光タンパク質（ＧＦＰ及び誘導体）等、当業者に公知の、その精製又はその検出を容易にするタンパク質と融合された、上に定義されているペプチド又はポリペプチドで構成される。この場合、ペプチド又はポリペプチドの配列は、好ましくは、前記ポリペプチドの前記ペプチド又はポリペプチドの精製を容易にするために、プロテアーゼのための切断部位によってタンパク質の残り部分から隔てられる。
【００６２】
本発明はまた、上に定義されているペプチド、ポリペプチド又は融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを対象とする。
【００６３】
本発明によれば、前記ポリヌクレオチドの配列は、前記ペプチド若しくはポリペプチド又は前記融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの配列である。前記配列は、有利には、これが発現される宿主におけるコドン使用が最適となるような仕方で、修飾することができる。
【００６４】
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを対象とする。
【００６５】
本発明の目的のため、用語「ベクター」は、これに連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものとする。本発明において用いることのできるベクターの１種類は、非限定的に、染色体、非染色体（non-chromsomal）、合成又は半合成核酸からなる直鎖状又は環状ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含み、特に、ウイルスベクター、プラスミド又はＲＮＡベクター等である。
【００６６】
真核生物又は原核生物宿主細胞へと導入しそこで維持するために、対象とする核酸分子を挿入することができる多数のベクターが知られている；適切なベクターの選択は、このベクターに想定される使用（例えば、対象とする配列の複製、この配列の発現、染色体外形態でのこの配列の維持、或いは宿主の染色体材料への組み込み）や、宿主細胞の性質に依存する。例えば、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）自体、又は目的とする配列が予め挿入された、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びＡＡＶ等のウイルスベクターを用いることができる；（単離された又はプラスミドベクターに挿入された）当該配列は、トランスポーター、例えば、ナノトランスポーター又はリポソーム若しくはカチオン性ポリマーの調製物等、その宿主細胞膜の通過を可能にする、或いはエレクトロポレーション又はマイクロインジェクション等、物理的方法を用いたその前記宿主細胞への導入を可能にする物質と組み合わせることもできる。加えて、これらの方法は、有利には、例えば、リポソームと組み合わせたエレクトロポレーションを用いるなど、組み合わせることができる。
【００６７】
好ましくは、前記ベクターは、上に定義されているペプチド、ポリペプチド又は融合タンパク質の発現に必要とされるあらゆるエレメントを含む発現ベクターである。例えば、前記ベクターは、転写及び必要に応じて翻訳に適切な調節配列（プロモーター、エンハンサー、イントロン、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、スプライス部位）の制御下において、上に定義されている少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む。
【００６８】
本発明はまた、上に定義されているペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターを含む、修飾された原核生物又は真核生物宿主細胞を対象とし、該細胞は、安定的に又は一過的に修飾されてよい。細胞は、特に、樹状細胞等、抗原提示細胞である。
【００６９】
本発明はまた、上に定義されている、必要に応じて修飾された（リポペプチド、融合タンパク質）少なくとも１種のペプチド若しくは１種のペプチド混合物（単離されたペプチド又はマルチエピトープポリペプチド）又はベクターと、薬学的に許容される媒体、担体物質又はアジュバントとを含むことを特徴とする、免疫原性又はワクチン組成物を対象とする。
【００７０】
本発明によるワクチン組成物は、有利には、薬学的に許容される媒体、担体物質及び／又はアジュバントを含む。
【００７１】
薬学的に許容される媒体、担体物質及びアジュバントは、従来用いられているものである。
【００７２】
アジュバントは、有利には、油性エマルション、鉱物物質、細菌抽出物、ＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチド、サポニン、水酸化アルミニウム（alumina hydroxide）、モノホスホリルリピドＡ及びスクアレンで構成される群から選ばれる。
【００７３】
担体物質は、有利には、単層又は多重膜リポソーム、ＩＳＣＯＭ、ビロソーム、ウイルス様粒子、サポニンミセル、糖類（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド））又は天然で金を含有する固体マイクロスフェア、及びナノ粒子で構成される群から選択される。
【００７４】
ワクチン組成物は、上に定義されているサイクリンＢ１の腫瘍過剰発現に関連するがんにおける予防的／治療的効果を得ることを可能にする、有効用量のペプチド、ペプチド混合物又はベクターを含む。この用量は、対象の年齢、性別及び体重等の因子に対し決定及び調整される。ワクチン組成物は、一般に、サイクリンＢ１タンパク質に向けられた細胞応答の誘導に十分な用量及び期間で、通常のワクチン接種プロトコールに従って投与される。投与は、皮下、筋肉内、静脈内、真皮内、腹腔内、経口、舌下、直腸、腟、鼻腔内、吸入又は経皮適用によるものとなり得る。
【００７５】
組成物は、選ばれた投与に適した生薬形態のものである：標準プロトコールに従って調製された、注射用無菌溶液、粉末、錠剤、ゲルカプセル、懸濁液、シロップ、坐薬。
【００７６】
前記組成物の有利な一実施形態によれば、これは、上に定義されている、ペプチドの混合物、好ましくは、マルチエピトープポリペプチド、又は該ペプチド若しくは該ポリペプチドをコードする発現ベクターの形態で、少なくとも１種のサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープ及び１種のサイクリンＢ１  ＣＤ８＋  Ｔエピトープを含む。
【００７７】
本発明によるペプチド及び派生製品（ペプチドの混合物、特に、マルチエピトープポリペプチド；融合タンパク質、リポペプチド、組換えベクター）は、サイクリンＢ１を過剰発現する腫瘍の治療における免疫療法において用いることができる。前記ペプチド又は派生製品は、ワクチンとして又は細胞療法において、或いはこの２種のアプローチの組合せにより用いられる。
【００７８】
細胞療法は、治療しようとする患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離と、上に定義されているペプチド（単数又は複数）又はペプチド誘導体（単数又は複数）の存在下における樹状細胞の培養を含む、従来のプロトコールによる抗原提示細胞（樹状細胞）の調製を含む。第２のステップにおいて、ペプチド又はその誘導体を負荷された抗原提示細胞は、該患者に再注入される。
【００７９】
本発明はまた、上に定義したいずれか適切な手段によって、個体へ、上に定義したワクチン組成物を投与することを含むことを特徴とする、予防的又は治療的抗腫瘍ワクチン接種方法を対象とする。
【００８０】
本発明はまた、サイクリンＢ１の過剰発現に関連するがんの予防的又は治癒的免疫療法のための医薬（予防的又は治癒的ワクチン）を調製するための、上に定義したペプチド、ペプチドの混合物又はベクターの使用を対象とする。
【００８１】
本発明はまた、予後の評価又はがん治療（外科手術、放射線療法、化学療法、免疫療法）のモニタリングを意図して、サイクリンＢ１に対する細胞応答をイムノモニタリングするための試薬を調製するための、上に定義した少なくとも１種のペプチドの使用を対象とする。好ましくは、前記試薬は、標識された、及び／又は多量体ＨＬＡ／ペプチド複合体、例えば、標識されたＨＬＡ／ペプチド複合体の四量体の形態で、ＨＬＡ分子と複合体形成された、上に定義されているペプチド又は融合タンパク質を含む。
【００８２】
本発明また、がんの個体におけるサイクリンＢ１に対する細胞応答をイムノモニタリングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
−  該個体由来の生物試料を、上で定義した、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性である少なくとも１種のサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含むペプチド又は該ペプチドのペプチド誘導体と接触させるステップと、
−  いずれか適切な手段によってサイクリンＢ１特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を検出するステップと
を含むことを特徴とする方法を対象とする。
【００８３】
本発明による方法は、がん又は抗腫瘍治療、特に、抗腫瘍免疫療法の間の、サイクリンＢ１に対するＣＤ４＋  Ｔ応答の進展をモニターすることを可能にする；サイクリンＢ１特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球は、ＴＨ１型（ＩＦＮ−γの分泌）、ＴＨ２型（ＩＬ−４の分泌）又は調節性Ｔ型（ＩＬ−１０又はＴＧＦ−βの分泌）であり得る；ＴＨ１型Ｔ応答は、患者（patent）に都合よい進展の徴候であると予想される一方、調節性Ｔ応答は、患者に都合悪い進展の徴候であると予想される。検出は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を含有する生物試料、特に、末梢血試料から単離された単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料を用いて行われる。この方法は、特に、国際出願ＷＯ２００９／１５３４６３（２３頁２０行目〜２６頁１４行目）に記載されている、当業者に既知の従来の技法に従って行われる。
【００８４】
本発明はまた、上で定義した、少なくとも１種のペプチド／ペプチド誘導体を含むイムノモニタリング試薬を対象とする。好ましくは、前記試薬は、キットに含まれる。前記イムノモニタリング試薬は、上で定義したペプチド、ポリペプチド又は融合タンパク質を含み、これらは、有利には、必要に応じて標識又は複合体形成され、特に、標識された多量体ＨＬＡ／ペプチド複合体、例えば、ＨＬＡ／ペプチド複合体の四量体の形態で、標識され、例えば、ビオチン化されたＨＬＡ分子と複合体を形成する。
【００８５】
よって、本発明はまた、サイクリンＢ１特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球を解析するための方法であって、少なくとも次のステップ、
−  細胞試料を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、特に蛍光色素で標識された多量体ＨＬＡ／ペプチド複合体であって、上に定義されている少なくとも１種のペプチド／ペプチド誘導体と可溶性ＨＬＡ分子との結合により形成された複合体と接触させるステップと、
−  特にフローサイトメトリーにより、該ＨＬＡ／ペプチド複合体に結合された細胞を解析するステップと
を含むことを特徴とする方法を対象とする。
【００８６】
前記方法の有利な一実施形態によれば、細胞（ＣＤ４＋  Ｔリンパ球）の解析は、該細胞の選別を含む。
【００８７】
本発明はまた、ペプチド２１２〜２２６、２１６〜２３０及び２２１〜２３５を除き、上で定義した３〜５又は少なくとも６種の異なる優勢なＨＬＡ  ＩＩ分子に結合することができるサイクリンＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープを含むペプチド、並びにこれに由来する修飾ペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞及び免疫原性又はワクチン組成物を対象とする。
【００８８】
上に定義されているポリヌクレオチド、組換えベクター及び形質転換細胞は、特に、本発明によるペプチド、ポリペプチド及び融合タンパク質の産生に役立つ。
【００８９】
本発明によるポリヌクレオチドは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  ＡＵＳＵＢＥＬ、２０００、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  ｓｏｎ  Ｉｎｃ、Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ、ＵＳＡ）に記載されているプロトコール等、標準プロトコールに従って、それ自体が知られている従来の方法によって得られる。例えば、ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲによる核酸（nucleic）配列の増幅、相同プローブとのハイブリダイゼーションによるゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニング、或いは完全又は部分的化学合成により得ることができる。組換えベクターは、それ自体が知られている従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子工学方法によって、構築され、宿主細胞に導入される。
【００９０】
上に定義されているペプチド及びその誘導体は、当業者に既知の従来の技法によって、特に、固相若しくは液相合成によって又は適切な（真核生物又は原核生物）細胞系における組換えＤＮＡの発現によって調製される。
【００９１】
より具体的には：
−  ペプチド及びその誘導体（変異体、マルチエピトープポリペプチド）は、本来Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６４、８５：２１４９〜）によって記載されたＦｍｏｃ技法に従って固相合成し、逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製することができ、
−  リポペプチドは、特に、国際出願ＷＯ９９／４０１１３又はＷＯ９９／５１６３０に記載されているプロセスに従って調製することができ、
−  ペプチド並びに変異体、マルチエピトープポリペプチド及び融合タンパク質等の誘導体は、当業者に公知のいずれかの手段によって得られる、対応するｃＤＮＡから産生することもできる；該ｃＤＮＡは、真核生物又は原核生物発現ベクターにクローニングされ、該組換えベクターによって修飾された細胞において産生されたタンパク質又は断片は、いずれか適切な手段によって、特に、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。
【００９２】
上述の編成に加えて、本発明は他の編成も含み、これは、次の添付の図面を参照して、本発明の対象の実施例に言及する以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】ＣＣＮＢ１に関するＣＤ４＋  Ｔリンパ球の応答の特異性及び規模を示す図である。ＣＣＮＢ１タンパク質を前負荷した自家樹状細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激により、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を得た。Ａ．ＣＣＮＢ１ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の例。Ｂ．ドナー血液におけるＫＬＨ及びＣＣＮＢ１に特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球の頻度。
【図２】図２は、ＣＣＮＢ１タンパク質の、該ペプチドに向けられたＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統による認識を示す図である。ＣＣＮＢ１ペプチドを前負荷した自家樹状細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激により、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を得た。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を、ＣＣＮＢ１を前負荷した自家樹状細胞と接触させ、２４時間のインキュベーション後に、ＩＦＮ−ガンマＥｌｉｓｐｏｔによりその活性化を検査した。Ａ．ＣＣＮＢ１を認識するＣＣＮＢ１ペプチド特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の例。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の名称及びそのペプチド特異性を象限（quadrant）に示す。Ｂ．ＣＣＮＢ１を認識するペプチド特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の数。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
（例１）
材料と方法
１）ペプチド合成
Ｒｉｎｋアミド型の樹脂により、固相平行合成におけるＦｍｏｃ戦略に従ってペプチドを合成し、ＨＰＬＣにより精製し、質量分析（ＥＳ−ＭＳ）により制御した。全ペプチドのＮ末端は遊離され、全ペプチドのＣ末端はアミド化されている。
【００９５】
２）組換えヒトＣＣＮＢ１タンパク質の産生及び精製
エレクトロポレーション（２５００Ｖ、４．８ｍｓ）により、ヒトＣＣＮＢ１遺伝子がクローニングされたｐＥＴ−２８ａ−（＋）プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）でＢＬ２１株の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を形質転換した。ＬＢ培地における２０分間３７℃の前培養後に、形質転換した細菌を４８時間３７℃でＬＢ／カナマイシン選択培地において培養し、次に、ＩＰＴＧの存在下における２１時間１５℃のインキュベーションにより、サイクリンＢ１の発現を誘導した。細胞溶解により（リゾチームによる処理と、続く機械的粉砕と、その後のベンゾナーゼ処理）、Ｈｉｓタグを有する産生されたタンパク質を細菌から抽出し、続いて数回の連続的クロマトグラフィー操作により精製した：ＨｉｓＴｒａｐカラム（ニッケルカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるアフィニティークロマトグラフィーのステップ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）における排除クロマトグラフィーのステップ、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）におけるイオン交換クロマトグラフィーのステップ、及びＥｎｄｏＴｒａｐ  Ｂｌｕｅカラム（Ｌｏｎｚａ）におけるアフィニティークロマトグラフィーによるエンドトキシン除去のステップ。２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、最終溶液におけるタンパク質の濃度を決定し、その純度を質量分析により検証した。
【００９６】
３）細胞調製
血液試料（バフィーコート）は、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｕ  Ｓａｎｇ［フランス血液バンク］（Ｒｕｎｇｉｓセンター）から入手する。フィコール勾配によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び１０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＡＩＭ−Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における５日間の培養後の接着細胞の分化によって、ＰＢＭＣから未成熟樹状細胞（ＤＣ）を得た。リポ多糖（ＬＰＳ）の存在下で２日間培養した後に、未成熟ＤＣから成熟ＤＣを得た。抗ＣＤ４抗体にカップルした磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、ＰＢＭＣからＣＤ４＋  Ｔリンパ球を精製した。Ａｌｌ  Ｓｅｔ＋ＴＭＧｏｌｄ  ＳＳＰ  ＨＬＡ−ＤＲＢ１キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた配列特異的ＰＣＲにより、ドナーのＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子型判定を行った。
【００９７】
４）ＣＣＮＢ１又はペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の産生
丸底９６ウェルプレートにおいて、１．２μＭのＣＣＮＢ１を前負荷し、ＬＰＳの存在下で成熟させた自家未成熟ＤＣと共に、又はペプチド（１０μｇ／ｍｌ）のプールを前負荷した自家成熟ＤＣと共に、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球（１〜３×１０５）を培養した。１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有する、群ＡＢのヒト血清を補充したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（完全ＩＭＤＭ培地）において培養を行う。ＣＣＮＢ１タンパク質又はペプチドのプールを負荷した１００００〜３００００個のＤＣ、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加することにより、１週間後に培養物を刺激する。１４及び必要に応じて２１日間の培養後に、さらなる刺激を行う。最終刺激５〜７日後の間に、ＥｌｉＳｐｏｔによって特異性検査を行う。各培養ウェルは、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を構成する。
【００９８】
５）ＥｌｉＳｐｏｔによる、ＣＣＮＢ１又はペプチドと共に培養したＣＤ４＋  Ｔリンパ球の特異性の評価
１×ＰＢＳに溶解した２．５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＦＮ−γ抗体１−Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、４℃における一晩インキュベーションにより、９６ウェルＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）−ＨＡプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に吸着させる。次に、完全ＩＭＤＭ培地による２時間３７℃のインキュベーションにより、このプレートを飽和させる。ＡＩＭ−Ｖ／ＩＬ−７培地（０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７）において洗浄した後に、このプレートにおいて１６時間３７℃でＣＤ４＋  Ｔリンパ球をインキュベートする。４時間ＣＣＮＢ１タンパク質若しくはＫＬＨ（０．５〜３μＭ）を前負荷した自家未成熟ＤＣ（５０００細胞／ウェル）、又は１０μｇ／ｍｌのペプチドの存在下でインキュベートしたＰＢＭＣ（５００００細胞／ウェル）を提示細胞として用いる。インキュベーション後に、蒸留水、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ及びＰＢＳでプレートを洗浄する。１×ＰＢＳ／１％ＢＳＡに溶解した０．２５μｇ／ｍｌのビオチン化抗ヒトＩＦＮ−γ  Ａｂ  ７−Ｂ６−１（Ｍａｂｔｅｃｈ）を１００μｌ／ウェルでプレートに添加し、これを１時間３０分間３７℃でインキュベートする。ＰＢＳ又はＰＢＳ／０．０５％ｔｗｅｅｎにおける数回の洗浄後に、エキストラビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）及びＮＢＴ／ＢＣＩＰを添加することにより、ＩＦＮ−γ分泌が実証される。５〜１０分間のインキュベーション後に、流水で洗浄することにより反応を停止させる。乾燥させた後に、Ｅｌｉｓｐｏｔリーダー（ＡＩＤ）においてスポットをカウントする。抗原を含有するウェルにおけるスポット数が、抗原を含有しないウェルよりも少なくとも２倍高く、この２種類のウェルの間の差が、少なくとも２５を超える場合、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統は、抗原特異的であると考慮される。ドナー血液に存在するＣＤ４＋  Ｔリンパ球の頻度は、ポアソン法則分布を用いて、次式に従って推定される：頻度＝−Ｌｎ（（非特異的系統の数／検査した系統の総数））／（各ウェルにおいてインキュベートしたＣＤ４＋  リンパ球の数）。
【００９９】
６）クラスＩＩ  ＨＬＡ分子の精製
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子がホモ接合性の、ＥＢＶウイルスで形質転換したリンパ芽球様細胞をクラスＩＩ  ＨＬＡ分子の供給源として用いた（Ｔｅｘｉｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６４、３１７７〜３１８４；Ｔｅｘｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００１、３１、１８３７〜１８４６；Ｃａｓｔｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００２、１６９、６９２８〜６９３４）。プロテインＡセファロースＣＬ  ４Ｂゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にカップルしたＬ２４３抗ＨＬＡ−ＤＲ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＵＳＡ）及びＢ７／２１抗ＨＬＡ−ＤＰモノクローナル抗体によるアフィニティークロマトグラフィーによって、ＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ分子を精製する。
【０１００】
７）クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に対するペプチドの相対的親和性の測定
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に関するビオチン化ペプチド及び被験ペプチドの間の競合により、ペプチドの親和性を評価する。ＥＬＩＳＡにより複合体が明らかになる。これらの検査は、それぞれＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ４分子に関して、米国特許ＵＳ６６４９１６６及びＰＣＴ国際出願ＷＯ０３／０４０２９９に記載されている。様々な抗原に由来するペプチドの結合に関する活性を測定するための、これらの検査の使用は、米国特許ＵＳ６６４９１６６並びにＰＣＴ国際出願ＷＯ０２／０９０３８２、ＷＯ０３／０４０２９９及びＷＯ２００４／０１４９３６に図解されている。
【０１０１】
より具体的には、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭドデシルマルトシド（ＤＭ）及び１０ｍＭシトラートと、固定濃度のビオチン化ペプチド及び被験ペプチド希釈物を含有する１０ｍＭホスファートバッファーに、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子を希釈する。プレートを２４時間〜７２時間インキュベートする。０．００３％チメロサール、０．３％ＢＳＡ及び１ｍＭ  ＤＭを含有する５０μｌの４５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ＝７．５による中和後に、１０μｇ／ｍｌ濃度のＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ）又はＢ７／２１（抗ＨＬＡ−ＤＰ）抗体が吸着された９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ（登録商標）、Ｎｕｎｃ）に試料を移す。このプレートも、０．３％ＢＳＡ及び０．００３％チメロサールを含有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ＝７．５で飽和させた。２時間のインキュベーション後に、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄する。ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び基質としてのリン酸４−メチルウンベリフェリル（Ｓｉｇｍａ）の連続的インキュベーションにより、ウェルにおけるビオチン化ペプチドの存在が明らかになる。Ｇｅｍｉｎｉ分光蛍光光度計（spectrofluorimeter）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって、３６５ｎｍにおける励起後に放射された蛍光は、４５０ｎｍにおいて測定される。競合者を含有しないウェルによって最大結合が得られ、ＨＬＡ分子を含有しないウェルにおいてバックグラウンドノイズを測定する。ペプチド毎に、最大結合の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）を評価する。非ビオチン化型のトレーサーペプチドである参照ペプチドを用いて各実験を制御する。これらの配列及びこれらのＩＣ５０値を次に示す：ＨＡ  ３０６〜３１８（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ；配列番号２）はＤＲＢ１＊０１：０１（１ｎＭ）、ＤＲＢ１＊０４：０１（６ｎＭ）、ＤＲＢ１＊１１：０１（５ｎＭ）及びＤＲＢ５＊０１：０１（３ｎＭ）、ＹＫＬ（ＡＡＹＡＡＡＫＡＡＡＬＡＡ；配列番号３）はＤＲＢ１＊０７：０１（１０ｎＭ）、Ａ３  １５２〜１６６（ＥＡＥＱＬＲＡＹＬＤＧＴＧＶＥ；配列番号４）はＤＲＢ１＊１５：０１（３０ｎＭ）、ＭＴ  ２〜１６（ＡＫＴＩＡＹＤＥＥＡＲＲＧＬＥ；配列番号５）はＤＲＢ１＊０３：０１（１２１ｎＭ）、Ｂ１  ２１〜３６（ＴＥＲＶＲＬＶＴＲＨＩＹＮＲＥＥ；配列番号６）はＤＲＢ１＊１３：０１（５１ｎＭ）、ＬＯＬ  １９１〜２１０（ＥＳＷＧＡＶＷＲＩＤＴＰＤＫＬＴＧＰＦＴ；配列番号７）はＤＲＢ３＊０１：０１（２８ｎＭ）、Ｅ２／Ｅ１６８（ＡＧＤＬＬＡＩＥＴＤＫＡＴＩ；配列番号８）はＤＲＢ４＊０１：０１（１０ｎＭ）及びＯｘｙ  ２７１〜２８７（ＥＫＫＹＦＡＡＴＱＦＥＰＬＡＡＲＬ；配列番号９）はＤＰＢ１＊０４：０１（７ｎＭ）及びＤＰＢ１＊０４：０２（６ｎＭ）。相対的親和性：ペプチドのＩＣ５０／参照ペプチドのＩＣ５０の形態でデータを表現する。１００未満の相対的親和性値は、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子のリガンドであるペプチドに相当する。各値は、少なくとも２回の独立的実験の平均である。
【０１０２】
（例２）
ＣＮＢＢ１ペプチドの配列の選択
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子並びに特にＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ分子は、ペプチドの配列に存在する数個の繋留残基を介して抗原ペプチドに結合する。これらのペプチドは、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子のポケットＰ１内に収容される主要繋留残基を構成するそのＮ末端部分に疎水性又は芳香族残基を有する。クラスＩＩ  ＨＬＡ分子へのペプチドの結合を最適化するために、これら全てがそのＮ末端部分に疎水性又は芳香族残基を有するような仕方で、ＣＣＮＢ１配列全体を網羅するペプチドの重複を選んだ。その配列を表ＩＩＩに示すこれらのペプチドを合成した。
【表３】
0006728040.tif 000004
【０１０３】
（例３）
ＣＣＮＢ１タンパク質特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の産生
多様であり、その大部分がコーカサス人種集団において非常に高頻度であるＨＬＡ分子を含む８名の健康なドナーを選択した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において組換えにより産生されたＣＣＮＢ１タンパク質を前負荷した自家樹状細胞とＣＤ４＋  Ｔリンパ球との共培養により、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を得た。培養の終わりに、Ｅｌｉｓｐｏｔによって、ＣＣＮＢ１タンパク質の配列を網羅するペプチドのプールを認識するその能力に関して各系統を検査し、続いて、第２の検査において、該プールに含有される個々のペプチドは、該系統によって認識された。各ドナーが、応答する能力を有したことを確信するために、ＫＬＨ特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統も産生した。
【０１０４】
表ＩＶは、サイクリンＢ１特異的ＣＤ４＋  Ｔリンパ球によって認識されるペプチド及びそれに関連する特異的系統の数を示す。
【表４】
0006728040.tif 000005
【０１０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるＣＣＮＢ１  ＣＤ４＋  Ｔエピトープに相当する１５種の異なるペプチドを同定した（表ＩＶ）。３種のペプチドは、少なくとも２個体に共通である（表ＩＶ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるこれら１５種のＴエピトープは、公知のＴエピトープ（エピトープ２１５〜２２９、２１９〜２３３及び２２３〜２３４；Ｖｅｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００９、１０６、１４０１０〜１４０１５；出願ＵＳ２０１１／０２８０８９７）とは異なり、ＣＮＢＢ１の相当する領域（領域２１５〜２３３；Ｖｅｌｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００９、１０６、１４０１０〜１４０１５；出願ＵＳ２０１１／０２８０８９７）の外側に位置する。加えて、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球が、ＣＣＮＢ１タンパク質による刺激によって作製されたことを考慮すると、同定されたペプチドは、ＣＣＮＢ１に対する応答に関与する。ＣＣＮＢ１及び該タンパク質のペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球の系統の例を示す（図１Ａ）。
【０１０６】
得られた系統の数に基づいて、ドナーの血液中に先在するＣＤ４＋  Ｔリンパ球の頻度を評価した。これら８名のドナーに関して、この平均頻度は、ＣＣＮＢ１が０．８２であり、ＫＬＨが少なくとも９．２であり、全ドナーは、該２種のタンパク質に対するレスポンダーである（図１Ｂ）。この前駆体頻度値は、免疫原性タンパク質に相当する（Ｄｅｌｌｕｃら、Ｂｌｏｏｄ、２０１０、１１６、４５４２〜４５４５；Ｄｅｌｌｕｃら、Ｆａｓｅｂ  Ｊ．、２０１１、２５、２０４０〜２０４８）。
【０１０７】
（例４）
クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に対するＣＣＮＢ１ペプチドの親和性
サイクリンＢ１配列を網羅する重複するペプチドは全て、例１に記載されている競合的結合アッセイによって、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合するその能力に関して検査した。ペプチドに応じて３つの異なる表にデータを示す：以前の実験の間にｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるＣＣＮＢ１  Ｔエピトープのものであることが判明したペプチド（表Ｖ）、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子に関する幅広い結合特異性を有する追加的なペプチド（表ＶＩ）及び残りのペプチド（表ＶＩＩ）。ペプチド毎に、最大結合の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）を評価する。相対的親和性：ペプチドのＩＣ５０／参照ペプチドのＩＣ５０の形態でデータを表現する。１００未満の相対的親和性値は、クラスＩＩ  ＨＬＡ分子のリガンドであるペプチドに相当する。２０未満の相対的親和性値は、強い親和性を有するペプチドに相当する（太字の値）。各値は、少なくとも２回の独立的実験の平均である。太字のペプチドをその後の実験のために選択した。
【表５】
0006728040.tif 000006
【０１０８】
表Ｖは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であると同定された１５種のペプチドのうち、１１種のペプチドが、少なくとも４種の異なるクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合し、３種のペプチドが、検査した１２種のうち１１種を超える分子に結合することを示す。
【０１０９】
表ＶＩは、幅広いクラスＩＩ  ＨＬＡ分子結合特異性を同様に有する他のペプチドの結果を示す。これらのペプチドは、少なくとも６種の異なる分子に結合する。
【表６】
0006728040.tif 000007
【０１１０】
表ＶＩＩは、残るペプチドの結果を示す。
【表７】
0006728040.tif 000008
【０１１１】
表ＶＩＩのペプチドの一部は、４又は５種のクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合することができる。
【０１１２】
表ＶＩのペプチド及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であり、少なくとも４種の異なるクラスＩＩ  ＨＬＡ分子に結合する１１種のペプチド（表Ｖ）を更なる研究のために保持した。他方では、評価することができるペプチドの数が限定されていたため、表ＶＩＩのペプチドは保持しなかった。
【０１１３】
（例５）
サイクリンＢ１ペプチドに特異的なＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の誘導
ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統誘導検査のために保持されたペプチドを表ＶＩＩＩに記す。７種のペプチドに関して、重複する配列を互いに組み合わせて、最大２０アミノ酸に及ぶより長いペプチドを形成した。
【表８】
0006728040.tif 000009
【０１１４】
多様であり、その大部分がコーカサス人種集団において非常に高頻度であるＨＬＡ分子を含む１３名の健康なドナーを選択した（表ＩＸ）。
【０１１５】
ペプチドのプールを前負荷した自家樹状細胞とＣＤ４＋  Ｔリンパ球との共培養により、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統を得た。Ｔリンパ球の増幅後に、Ｅｌｉｓｐｏｔにより各系統を検査した（表ＩＸ）。ペプチドに対する応答が観察された回数の形態で結果を報告する。全ペプチドが、Ｔリンパ球応答を誘導するが、応答の強度及びレスポンダーの数は非常に可変性である。９種のペプチドが、ドナーの半分超におけるＴリンパ球を活性化する。
【０１１６】
しかし、注目すべきことに、コーカサス人種集団の個体の８０％を単独で網羅する、コーカサス人種集団において最も高頻度なあらゆるＨＬＡ−ＤＲＢ１分子を含む多様なＨＬＡ  ＩＩ分子を保有する個体の集団における、最も有効な特異的ＣＤ４＋  Ｔ応答（６．１％に達し得る２．５％を超える応答強度及び８５％に達し得る６５％を超えるレスポンダー頻度）を誘導することができる最も有効なペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫優性であるペプチドに相当する。
【表９】
0006728040.tif 000010
【０１１７】
（例６）
ＣＤ４＋  Ｔリンパ球によるＣＣＮＢ１の認識
ＣＣＮＢ１タンパク質を認識するＣＤ４＋  Ｔリンパ球の能力を評価するために、ＣＣＮＢ１を前負荷した自家樹状細胞の存在下でＣＤ４＋  Ｔリンパ球系統の一部を培養し、続いてその活性化をＩＦＮ−ガンマＥｌｉｓｐｏｔにより検査した。ＣＣＮＢ１タンパク質に対する応答の例を図２Ａに示す。ＣＣＮＢ１タンパク質を認識することができるＣＤ４＋  Ｔリンパ球を生じた全ペプチドを図２Ｂに示す。全ペプチドを検査することができた訳ではない。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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