(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
湖羊精液凍結保存液であって、Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、卵黄液、クエン酸ナトリウム、グルタチオン、グリセロール、キバナオウギ抽出物、ペニシリン及びストレプトマイシンを成分として含むことを特徴とする湖羊精液凍結保存液である。
【請求項２】
濃度でＴｒｉｓ  ３０〜３５ｇ／Ｌ、グルコース８〜１５ｇ／Ｌ、トレハロース３０〜５０ｇ／Ｌ、卵黄液１５〜２０％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム１５〜２０ｇ／Ｌ、グルタチオン０．５〜１ｇ／Ｌ、グリセロール５〜８％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．０５〜０．１５ｇ／Ｌ、ペニシリン０．８〜１ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン０．８〜１ｇ／Ｌを成分として含むことを特徴とする請求項１に記載の湖羊精液凍結保存液である。
【請求項３】
前記キバナオウギ抽出物の濃度は０．１ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項２に記載の湖羊精液凍結保存液である。
【請求項４】
Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、クエン酸ナトリウム、グルタチオン及びキバナオウギ抽出物を所定の比率で秤取し、再蒸留水に加え、十分に溶解させて均一に混合した後、０．２ｕｍ濾過膜で濾過し、次にペニシリン及びストレプトマイシンを加え、均一に混合して、溶液Ａを得るステップ（１）と、溶液Ａに卵黄液を所定の比率で加え、均一に混合して、溶液Ｂを得るステップ（２）と、溶液Ｂにグリセロールを所定の比率で加え、均一に混合して、前記湖羊精液凍結保存液を得るステップ（３）と、を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の湖羊精液凍結保存液の調製方法である。
【請求項５】
湖羊精液凍結保存方法であって、
湖羊の新鮮原精液を準備し、精液の運動率を評価し、運動率が０．８より大きいと凍結保存に用いるステップ（１）と、（２）請求項１〜４のいずれか１項に記載の湖羊精液凍結保存液をステップ（１）で準備した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で１〜２ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に８〜１０ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存するステップと、を含むことを特徴とする湖羊精液凍結保存方法である。
【請求項６】
前記ステップ（２）の凍結保存管における精液の密度は６×１０８個／ｍＬであることを特徴とする請求項５に記載の湖羊精液凍結保存方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、湖羊養殖の技術分野に属し、具体的には、湖羊精液凍結保存液及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
湖羊は、太湖平野の重要な家畜の１つであり、中国国家一級保護地方家畜・家禽種である。湖羊は、中柄であり、オスとメスの両方に角がなく、頭部が長くて狭く、鼻梁が高く、ほとんどの耳が垂れ下がっていて、首が細長く、体が長くて狭く、腰部や背部が平らでまっすぐであり、腹部がわずかに垂れ下がっており、尾が平たくて丸く、尾の先端が反っており、四肢が比較的細くて長い。体全体にわたって白い毛が被覆され、腹部の毛が粗くて薄く短く、体が丈夫である。湖羊は、希少な白色子羊皮用の品種であり、成熟が早く、一年中発情期であり、１年に２回の出産が可能であり、１腹当たりの産子数が多く、泌乳能力が高く、成長発育の速度が速く、改良後、優れた肉産量を示し、耐高温や耐湿度などの優良な性状を有し、中国の太湖地域で分布しており、一年中舎飼いされている子羊皮用の中国ヒツジの品種であり、出生後１〜２日で屠殺されて剥がれる子湖羊の羊皮は、美しい模様を有し、世界的に有名である。
【０００３】
精液の凍結保存及び人工授精技術は、現代の畜産生産において極めて重要な役割を果たし、凍結精液で人工授精を行うと、時間、地域、品種及び個体によって制限されず、雄家畜の飼育頭数を大幅に減少させ、生産コストを低減させ、種付け用の優良雄家畜の利用率を上昇させ、養殖業の経済的利益を向上させる。また、当該技術は、品種導入、交雑改良、及び繁殖性能の向上、疾患制御及び遺伝的多様性の保護に対しても重要な意味を持っている。羊の精子は、鶏や牛の精子よりも弱く、凍結と融解では損傷されて受精能を失うことが発生しやすい。従来の羊凍結精液は、融解後の運動率が低く、且つ多くの「老化」精子及び死んだ精子が存在し、有効精子が少なく、運動性が低く、品質が低く、人工授精の要求を満たしにくい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許出願公開第105638643号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第108094409号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上に鑑み、本発明の目的は、上記従来技術の不備な点を克服するために、湖羊精液の保存における生存率、運動性及び完全性を効果的に向上させることができ、保存された精液が融解後でも良好な授精能力を有し、受胎効果が安定し、湖羊凍結精液に対する人工授精の要求を満たす湖羊精液凍結保存液を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成させるために、本発明が採用する技術案は、以下のとおりである。湖羊精液凍結保存液は、Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、卵黄液、クエン酸ナトリウム、グルタチオン、グリセロール、キバナオウギ抽出物、ペニシリン及びストレプトマイシンを成分として含む。
【０００７】
キバナオウギ抽出物は、マメ科植物であるキバナオウギの根の抽出物であり、サポニン、フラボン、多糖やアミノ酸などの成分を含み、免疫力を高め、エネルギーを増やし、疲労を抑制し、突然変異を防止し、肝臓を保護して破骨細胞の働きを阻害するなどの作用を有する。キバナオウギ多糖類は、コレステロールとトリグリセリドである血中脂質を下げ、高密度リポタンパク質を増やすという作用を有し、たとえばアテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、末梢血管疾患や高脂血症などの心臓・脳血管疾患を予防及び治療することができる。アストラガロシドは、血糖、糖化ヘモグロビン、尿タンパク質を大幅に減少させる作用を有し、腎皮質及び血清におけるＡＧＥｓを減少させることができ、アストラガロシドは、抗酸化作用を有し、アルドース還元酵素に対して阻害作用を有し、さらにメサンギウム細胞の増殖を抑制し、腎肥大を軽減させるという作用を有する。本願の発明者は、研究したところ、キバナオウギ抽出物を含む凍結保存液が湖羊精液の凍結保存効果を効果的に向上でき、また凍結保存液における前記キバナオウギ抽出物の濃度が０．１ｇ／Ｌである場合、得られた凍結保存の効果が最適であることを見出した。
【０００８】
好ましくは、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３０〜３５ｇ／Ｌ、グルコース  ８〜１５ｇ／Ｌ、トレハロース  ３０〜５０ｇ／Ｌ、卵黄液  １５〜２０％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム  １５〜２０ｇ／Ｌ、グルタチオン  ０．５〜１ｇ／Ｌ、グリセロール  ５〜８％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物  ０．０５〜０．１５ｇ／Ｌ、ペニシリン  ０．８〜１ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン  ０．８〜１ｇ／Ｌを成分として含む。
【０００９】
好ましくは、前記湖羊精液凍結保存液におけるキバナオウギ抽出物の濃度は、０．１ｇ／Ｌである。
【００１０】
好ましくは、前記卵黄液調製方法は、新鮮な無菌卵の卵黄を繰り返してピペットして均一に混合して、前記卵黄液を得るステップを含む。
【００１１】
本発明は、Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、クエン酸ナトリウム、グルタチオン及びキバナオウギ抽出物を所定の比率で秤取し、再蒸留水に加え、十分に溶解させて均一に混合した後、０．２ｕｍ濾過膜で濾過し、次にペニシリン及びストレプトマイシンを加え、均一に混合して、溶液Ａを得るステップ（１）と、溶液Ａに卵黄液を所定の比率で加え、均一に混合して、溶液Ｂを得るステップ（２）と、溶液Ｂにグリセロールを所定の比率で加え、均一に混合して、前記湖羊精液凍結保存液を得るステップ（３）と、を含む前記湖羊精液凍結保存液の調製方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、湖羊精液凍結保存における前記湖羊精液凍結保存液の用途をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、湖羊新鮮原精液を準備し、精液の運動率を評価し、運動率が０．８より大きいと凍結保存に用いるステップ（１）と、請求項１〜４のいずれか１項に記載の湖羊精液凍結保存液をステップ（１）で準備した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で１〜２ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に８〜１０ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存するステップ（２）と、を含む湖羊精液凍結保存方法をさらに提供する。
【００１４】
好ましくは、前記ステップ（２）の凍結保存管における精液の密度は、６×１０8個／ｍＬである。
【００１５】
従来技術に比べて、本発明の有益な効果は、以下のとおりである。（１）本発明に係る凍結保存液は、湖羊精液の保存過程における生存率、運動性及び完全性を効果的に向上させることができ、保存した精液は、融解後でも良好な授精能力を有し、受胎効果が安定し、湖羊凍結精液に対する人工授精の要件を満たすことができ、将来性が期待でき、（２）本願の発明者は、研究したところ、キバナオウギ抽出物を含む凍結保存液が湖羊精液の凍結保存効果を効果的に向上でき、また凍結保存液における前記キバナオウギ抽出物の濃度が０．１ｇ／Ｌである場合、得られた凍結保存の効果が最適であることを見出した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を理解しやすくするために、本発明をさらに詳細に説明する。しかしながら、本発明は、さまざまな別の形態で実施されてもよく、本明細書に記載の実施例に制限されない。むしろ、これら実施例を提供することは、本発明の開示内容をより徹底的かつ全面的に理解できるようにするためである。
【００１７】
実施例１
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、トレハロース４０ｇ／Ｌ、卵黄液１６％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム１８ｇ／Ｌ、グルタチオン０．６ｇ／Ｌ、グリセロール５％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．１ｇ／Ｌ、ペニシリン１ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン１ｇ／Ｌを成分として含む。
【００１８】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、クエン酸ナトリウム、グルタチオン及びキバナオウギ抽出物を所定の比率で秤取し、再蒸留水に加え、十分に溶解させて均一に混合した後、０．２ｕｍ濾過膜で濾過し、次にペニシリン及びストレプトマイシンを加え、均一に混合して、溶液Ａを得るステップ（１）と、溶液Ａに卵黄液を所定の比率で加え、均一に混合して、溶液Ｂを得るステップ（２）と、溶液Ｂにグリセロールを所定の比率で加え、均一に混合して、前記湖羊精液凍結保存液を得るステップ（３）と、を含む。
【００１９】
実施例２
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３３ｇ／Ｌ、グルコース１５ｇ／Ｌ、トレハロース３０ｇ／Ｌ、卵黄液１５％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム２０ｇ／Ｌ、グルタチオン１ｇ／Ｌ、グリセロール６％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．０６ｇ／Ｌ、ペニシリン１ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン１ｇ／Ｌを成分として含む。
【００２０】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、実施例１と同様であった。
【００２１】
実施例３
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３５ｇ／Ｌ、グルコース１２ｇ／Ｌ、トレハロース３５ｇ／Ｌ、卵黄液２０％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム１６ｇ／Ｌ、グルタチオン０．８ｇ／Ｌ、グリセロール８％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．１３ｇ／Ｌ、ペニシリン０．８ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン０．８ｇ／Ｌを成分として含む。
【００２２】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、実施例１と同様であった。
【００２３】
実施例４
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３０ｇ／Ｌ、グルコース８ｇ／Ｌ、トレハロース５０ｇ／Ｌ、卵黄液２０％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム２０ｇ／Ｌ、グルタチオン０．５ｇ／Ｌ、グリセロール７％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．１５ｇ／Ｌ、ペニシリン０．８ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン０．８ｇ／Ｌを成分として含む。
【００２４】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、実施例１と同様であった。
【００２５】
実施例５
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３５ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、トレハロース４５ｇ／Ｌ、卵黄液１８％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム２０ｇ／Ｌ、グルタチオン０．８ｇ／Ｌ、グリセロール５％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．０５ｇ／Ｌ、ペニシリン０．９ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン０．９ｇ／Ｌを成分として含む。
【００２６】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、実施例１と同様であった。
【００２７】
実施例６
本発明の湖羊精液凍結保存液の一実施例では、前記湖羊精液凍結保存液は、濃度でＴｒｉｓ  ３２ｇ／Ｌ、グルコース１５ｇ／Ｌ、トレハロース４０ｇ／Ｌ、卵黄液１５％（ｖ／ｖ）、クエン酸ナトリウム１８ｇ／Ｌ、グルタチオン０．６ｇ／Ｌ、グリセロール８％（ｖ／ｖ）、キバナオウギ抽出物０．０８ｇ／Ｌ、ペニシリン１ｇ／Ｌ及びストレプトマイシン１ｇ／Ｌを成分として含む。
【００２８】
前記湖羊精液凍結保存液の調製方法は、実施例１と同様であった。
【００２９】
実施例７
凍結保存液の保存効果
偽膣法で大人の湖羊種雄羊の精液を採取し、精液の運動率を測定し、条件を満たすと凍結保存し、保存方法は、精液の密度が６×１０8個／ｍＬとなるように、実施例１〜６の前記湖羊精液凍結保存液を採取した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で２ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に１０ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存することであった。
【００３０】
融解及び検査
上記凍結保存した凍結保存管を液体窒素から取り出した直後、３７℃の水浴鍋に入れ、精液が溶けて透明になるまで振とうさせ、精液を取り出して品質指標の検査を行った。
【００３１】
結果を表１に示す。
表１  品質指標の検査結果
【表１】
0006728463.tif 000002
上記結果からわかるように、本発明の実施例１〜６の上記凍結保存液は、湖羊精液に対して良好な保存効果を有し、融解後でも精子の運動率、運動性及び先体の完全率がいずれも高いレベルに維持され、冷凍した精子の品質を向上させた。
【００３２】
実施例８
本発明の前記凍結保存液は、キバナオウギ抽出物を含み、キバナオウギ抽出物は、サポニン、フラボン、多糖類やアミノ酸などの複数種の成分を含むキバナオウギの乾燥根の抽出物であり、湖羊精液の凍結保存効果を効果的に向上できる。
【００３３】
実験群１及び２を設計し、実験群１は、実施例１の前記凍結保存液で湖羊精液を保存し、実験群２で使用される凍結保存液は、キバナオウギ抽出物を含まない以外、残りの成分が実施例１と同様であった。
【００３４】
偽膣法で大人の湖羊種雄羊精液を採取し、精液の運動率を測定し、条件を満たすと凍結保存し、保存方法は、精液の密度が６×１０8個／ｍＬとなるように、実験群１及び２の前記湖羊精液凍結保存液を採取した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で１．５ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に８ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存することであった。
【００３５】
融解及び検査
上記凍結保存した凍結保存管を液体窒素から取り出した直後、３７℃の水浴鍋に入れ、精液が溶けて透明になるまで振とうさせ、精液を取り出して品質指標の検査を行った。
【００３６】
結果を表２に示す。
表２  品質指標の検査結果
【表２】
0006728463.tif 000003
上記結果からわかるように、キバナオウギ抽出物を含む実験群１の前記凍結保存液の湖羊精液に対する保存効果は、キバナオウギ抽出物を含まない実験群２の前記凍結保存液の湖羊精液に対する保存効果よりも顕著に優れ、実験群１の前記凍結保存液で保存された湖羊精液は、融解後でも精子の運動率、運動性及び先体の完全率が実験群２より大幅に高く、キバナオウギ抽出物が凍結保存液の湖羊精液に対する凍結保存効果を効果的に向上できることを示した。
【００３７】
実施例９
本発明の前記凍結保存液におけるキバナオウギ抽出物の濃度は、０．０５〜０．１５ｇ／Ｌであり、本実施例では、キバナオウギ抽出物の濃度による凍結保存液の保存効果に対する影響を研究した。
【００３８】
実験群３〜９を設計し、各実験群の前記凍結保存液は、キバナオウギ抽出物の濃度が異なる以外、残りの成分がいずれも同じであり、具体的には、表３に示された。
表３  凍結保存液におけるキバナオウギ抽出物の濃度の設計
【表３】
0006728463.tif 000004
偽膣法で大人の湖羊種雄羊精液を採取し、精液の運動率を測定し、条件を満たすと凍結保存し、保存方法は、精液の密度が６×１０8個／ｍＬとなるように、実験群３〜９の前記湖羊精液凍結保存液を採取した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で１ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に１０ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存することであった。
【００３９】
融解及び検査
上記凍結保存した凍結保存管を液体窒素から取り出した直後、３７℃の水浴鍋に入れ、精液が溶けて透明になるまで振とうさせ、精液を取り出して品質指標の検査を行った。
【００４０】
結果を表４に示す。
表４  品質指標の検査結果
【表４】
0006728463.tif 000005
上記結果からわかるように、前記凍結保存液におけるキバナオウギ抽出物の濃度が０．０５〜０．１５ｇ／Ｌ（実験群４〜８）である場合、凍結保存液の湖羊精液に対する凍結保存効果が好適であり、特にキバナオウギ抽出物の濃度が０．１ｇ／Ｌである場合、融解後の精液の品質指標が最適であり、キバナオウギ抽出物の濃度が０．０５ｇ／Ｌ（実験群３）より低く又は０．１５ｇ／Ｌ（実験群９）より高い場合、凍結保存液の保存効果に影響を与えて、保存品質が低下した。
【００４１】
実施例１０
本実施例は、実施例１の前記凍結保存液で保存される湖羊精液を例として、本発明の前記凍結保存液で保存される湖羊精液の融解後の授精効果を研究した。
【００４２】
偽膣法で大人の湖羊種雄羊精液を採取し、精液の運動率を測定し、条件を満たすと凍結保存し、保存方法は、精液の密度が６×１０8個／ｍＬとなるように、実施例１の前記湖羊精液凍結保存液を採取した精液に加え、均一に混合した後、凍結保存管に加え、凍結保存管を４℃で２ｈ放置し、次に液体窒素の液面から４〜６ｃｍ離れる箇所に１０ｍｉｎ放置し、最後に液体窒素に投入して保存することであった。
【００４３】
融解
上記凍結保存した凍結保存管を液体窒素から取り出した直後、３７℃の水浴鍋に入れ、精液が溶けて透明になるまで振とうさせ、精液を取り出して人工授精を行った。
【００４４】
検査した結果、上記融解後の湖羊精液は、授精能力を有する時間が２６ｈに達し、発情期の雌の湖羊の受胎率が８５％に達した。
【００４５】
なお、以上の実施例は、本発明の技術案を説明するために過ぎず、本発明の特許範囲を制限するものではなく、好適実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、当業者であれは、本発明の技術案の趣旨及び範囲から逸脱することなく本発明の技術案に対して修正又は同等置換を行えることが理解できる。
【要約】      （修正有）【課題】保存における生存率、運動性及び完全性を効果的に向上させることができ、保存された精液が融解後でも良好な授精能力を有し、受胎効果が安定し、湖羊凍結精液に対する人工授精の要求を満たす湖羊精液凍結保存液の提供。【解決手段】Ｔｒｉｓ、グルコース、トレハロース、卵黄液、クエン酸ナトリウム、グルタチオン、グリセロール、キバナオウギ抽出物、ペニシリン及びストレプトマイシンを成分として含む湖羊精液凍結保存液。【選択図】なし