(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を含む水性溶媒、該微生物の培養物を含む水性溶媒および該培養物の処理物を含む水性溶媒のいずれかの水性溶媒とヒドロキシナフトエ酸を混合する方法により、ヒドロキシナフトエ酸を水酸化してジヒドロキシナフトエ酸を調製した後に、該ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とするジヒドロキシナフタレンの製造方法であって、
１）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、４０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，３−ジヒドロキシナフタレンを生成させる、または
２）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、８０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，６−ジヒドロキシナフタレンを生成させる、方法。
【請求項２】
前記微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌からなる群より選択される微生物であることを特徴とする請求項１に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【請求項３】
ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が、以下の（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）に示す蛋白質、以下の（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３）ならびに、以下の（ｃ１）、（ｃ２）または（ｃ３）に示す蛋白質の３つの蛋白質からなる水酸化酵素複合体であることを特徴とする請求項１または２に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
（ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ａ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｂ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｂ３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｃ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｃ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｃ３）配列番号６に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
【請求項４】
下記（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）に示す蛋白質、（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３）、ならびに（ｃ１）、（ｃ２）または（ｃ３）に示す蛋白質の３つの蛋白質からなる水酸化酵素複合体。
（ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ａ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｂ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｂ３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｃ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｃ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
（ｃ３）配列番号６に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位を水酸化する機能を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項４に記載の水酸化酵素複合体を構成する３種類の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒドロキシナフトエ酸を原料として微生物を用いてジヒドロキシナフトエ酸を得た後に脱炭酸反応に供することにより、樹脂、染料および医薬品などの合成原料として有用なジヒドロキシナフタレンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジヒドロキシナフタレンには、１，２−ジヒドロキシナフタレン、１，３−ジヒドロキシナフタレン、１，４−ジヒドロキシナフタレン、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，６−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、１，８−ジヒドロキシナフタレン、２，３−ジヒドロキシナフタレン、２，６−ジヒドロキシナフタレン、２，７−ジヒドロキシナフタレンの合計１０種類の異性体が存在する。ジヒドロキシナフタレンは、樹脂、染料、樹脂の改質剤および医薬品などの合成原料として有用なことが知られている。ジヒドロキシナフタレンの一般的な工業的製法としては、ナフタレンをスルホン化して得たナフタレンスルホン酸を水酸化ナトリウムで中和した後、アルカリ融解反応によってジヒドロキシナフタレンを調製する方法が知られている。しかし、この製造方法は、反応過程で異性体も生成しやすいうえに多段階の合成反応を必要とすることから、製造コストが高くなるという問題点がある〔非特許文献１、２〕。また、１，３−ジヒドロキシナフタレンについては、マロン酸ジエチルとフェニルアセチル・クロライドを原料として５段階の化学反応により製造する方法が知られている〔非特許文献３〕。
【０００３】
微生物を用いたジヒドロキシナフタレンの生産については、ナフタレン・ジオキシゲナーゼとナフタレン１，２−ジヒドロジオール・デヒドロゲナーゼを発現している大腸菌を用いてナフタレンを原料として１，２−ジヒドロキシナフタレンを生産できることが知られているが〔非特許文献４〕、その生産量は約１ｇ／Ｌと低く、工業生産に適しているとはいえない。また、水酸化酵素シトクロームＰ４５０酵素のＣＹＰ１１０が２−ヒドロキシナフタレンを２，３−ジヒドロキシナフタレンに転換する活性を持つことも報告されているが、その転換活性は極めて低い〔特許文献１〕。
【０００４】
微生物を用いてヒドロキシナフトエ酸をジヒドロキシナフトエ酸に転換する反応については、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ１９９Ａ２）を用いて１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸をそれぞれ１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に転換できることが報告されているが〔非特許文献５、６〕、これらジヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフタレンを得られることは報告されていない。
【０００５】
また、チトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ１９９Ａ４）が、２−ナフトエ酸から７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成することが報告されているが〔非特許文献７〕、ヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフトエ酸を生成できることは報告されていない。
【０００６】
１，３−ジヒドロキシナフタレンの生産については、ナフタレンを酸化することにより製造されるのではなく、マロン酸ジエチルとフェニルアセチル・クロリドを出発原料として、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を得た後、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に対して脱炭酸処理を施すことにより製造できることが知られている〔非特許文献３〕。１，３−ジヒドロキシナフタレン以外のジヒドロキシナフタレンの製造に関しては、ジヒドロキシナフトエ酸の製造コストが高くなるので、ジヒドロキシナフトエ酸を経由し
てジヒドロキシナフタレンを生産することは知られていない。
【０００７】
なお、ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒に対して加熱処理を加えることにより脱炭酸反応を起こさせてジヒドロキシナフタレンを得る反応については、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の水溶液を１００℃で２時間加熱処理を行うことにより１，３−ジヒドロキシナフタレンが得られることが報告されているが〔非特許文献３〕、この報告以外に、ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒に対して加熱処理を加えることにより脱炭酸反応を起こさせる反応については報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】有機合成化学協会誌39巻、960-997ページ（1981年）
【非特許文献２】FUNDAMENTAL PROCESSES OF DYE CHEMISTRY、（HANS EDUARD FIERZ-DAVIDand Louis BLANGEY共著）、INTERSCIENCE PUBLISHERS LTD., LONDON (1949)
【非特許文献３】Org. Synth. Vol. 25, p. 73 (1945)
【非特許文献４】Tetrahedron Letters Vol. 38, p. 6267-6270 (1997)
【非特許文献５】Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol. 73, p.2796-2799 (2009)
【非特許文献６】Appl. Environ. Microbiol. Vol. 78, p.6087-6094 (2012)
【非特許文献７】Chem. Eur. J. Vol. 18, p.16677-16688 (2012)
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１０−２２０６０９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、工業的に生産されている３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸などのヒドロキシナフトエ酸を原料として、ジヒドロキシナフトエ酸を経由してジヒドロキシナフタレンを生産するための方法を提供することにある。また、ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を用いることにより製造コストを低減し、さらに得られたジヒドロキシナフトエ酸をもとに簡易な反応によりジヒドロキシナフタレンを生産するための方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために、工業的に生産されているヒドロキシナフトエ酸をもとに、ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物、該微生物の培養物または該培養物の処理物を用いてジヒドロキシナフトエ酸を生成させた後に、脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフタレンを生産する手段を考案し、鋭意研究を行った。
【００１２】
まず、日本国の複数地点の土壌を採取し、これらを混合した土壌サンプルから、２−ナフトエ酸を炭素源とする集積培養法により単離したバークホルデリア・テラエ（Burkholderia terrae）ＴＮＡ２４１株が２−ナフトエ酸を原料として１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生産することを見出した。続いて、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株のゲノム配列を決定することにより、２−ナフトエ酸を１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に転換するのに必要な芳香環水酸化酵素複合体（以下、２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体と呼ぶ）を構成する３種類の蛋白質をコードする新規遺伝子を同定することに成功した。これら３種類の遺伝子を発現するエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K-12株（以下、大腸菌という）の培養液に対して３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、１
，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を４０℃以上に加熱することにより１，３−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、１，３−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出し、工業的に生産されている安価なヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフトエ酸を経由してジヒドロキシナフタレンを効率よく生産できることを実証した。
【００１３】
さらに、上記３種類の遺伝子を発現する大腸菌の培養液に対して６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を８０℃以上に加熱することにより１，６−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、１，６−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出し、工業的に生産されている安価なヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフトエ酸を経由してジヒドロキシナフタレンを効率よく生産できることを実証した。
【００１４】
また、本発明で開示するように、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas
palustris）ＣＧＡ００９株のシトクロームＰ４５０水酸化酵素ＣＹＰ１９９Ａ２を、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＡＴＣＣ１７４５３株が持つフェレドキシンとフェレドキシン・レダクターゼとともに発現する大腸菌を作製した後に、この大腸菌の培養液に対して１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、１，７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を７０℃以上に加熱することにより１，７−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出した。
【００１５】
さらに、上記のＣＹＰ１９９Ａ２を発現する大腸菌の培養液に対して、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を高温高圧容器内で２００℃以上に加熱することにより２，６−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成することを見出した。
【００１６】
さらに、上記のＣＹＰ１９９Ａ２を発現する大腸菌の培養液に対して、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を２２５℃以上に加熱することにより２，３−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成することを見出した。
【００１７】
また、本発明で開示するようにロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株のシトクロームＰ４５０水酸化酵素ＣＹＰ１９９Ａ２の１８５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換したアミノ酸配列を有する蛋白質（以下、ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体という）をシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３株が持つフェレドキシンとフェレドキシン・レダクターゼとともに発現する大腸菌を作製した後に、この大腸菌の培養液に対して１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を７０℃に加熱することにより１，５−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成し、さらに該水溶液の温度を上げることにより、１，５−ジヒドロキシナフタレンの生成率が向上することを見出した。
【００１８】
また、上記のＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体を発現する大腸菌の培養液に対して、
３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を２２５℃以上に加熱することにより１，７−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成することを見出した。
【００１９】
また、上記のＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体を発現する大腸菌の培養液に対して、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を加えたところ、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が効率よく生成することを見出した。続いて、培養液から回収した５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液を２５０℃以上に加熱することにより１，２−ジヒドロキシナフタレンが効率よく生成することを見出した。
【００２０】
以上、ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を用いることによりヒドロキシナフトエ酸をもとに多種類のジヒドロキシナフトエ酸を生成させた後に、これらジヒドロキシナフトエ酸を含む水溶液に対して加熱処理を施すことにより、１，３−ジヒドロキシナフタレンと１，６−ジヒドロキシナフタレン以外に、１，２−ジヒドロキシナフタレン、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、２，３−ジヒドロキシナフタレンおよび２，６−ジヒドロキシナフタレンを生成できることを確認することにより、発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１６）に関する。
【００２２】
（１）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を含む水性溶媒、該微生物の培養物を含む水性溶媒および該培養物の処理物を含む水性溶媒のいずれかの水性溶媒とヒドロキシナフトエ酸を混合する方法によりヒドロキシナフトエ酸を水酸化してジヒドロキシナフトエ酸を調製した後に、該ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とするジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２３】
（２）前記ヒドロキシナフトエ酸が、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からなる群より選択される一種または二種以上のヒドロキシナフトエ酸であることを特徴とする前記（１）に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２４】
（３）前記ジヒドロキシナフタレンが、１，２−ジヒドロキシナフタレン、１，３−ジヒドロキシナフタレン、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，６−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、２，３−ジヒドロキシナフタレンおよび２，６−ジヒドロキシナフタレンからなる群より選択される一種または二種以上のジヒドロキシナフタレンであることを特徴とする前記（１）または（２）に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２５】
（４）前記微生物が、エシェリヒア（Escherichia）属細菌、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、シュードモナス（Pseudomonas）属細菌およびコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌からなる群より選択される微生物であることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２６】
（５）前記（１）に記載のナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が、以下に示す水酸化酵素複合体Ａ、水酸化酵素Ｄ、および水酸化酵素Ｅからなる群より選択される一種または二種以上の酵素または酵素複合体であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
水酸化酵素複合体Ａ：以下の（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）に示す蛋白質、以下の（
ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３）ならびに、以下の（ｃ１）、（ｃ２）または（ｃ３）に示す蛋白質の３つの蛋白質からなることを特徴とする水酸化酵素複合体。
（ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ａ２）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ａ３）配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｂ１）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｂ２）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｂ３）配列番号４に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｃ１）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｃ２）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｃ３）配列番号６に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素Ｄ：以下の（ｄ１）、（ｄ２）または（ｄ３）に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
（ｄ１）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質。
（ｄ２）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の７位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｄ３）配列番号８に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を示すアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の７位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
水酸化酵素Ｅ：以下の（ｅ１）、（ｅ２）または（ｅ３）に示す蛋白質であることを特徴とする水酸化酵素。
（ｅ１）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質。
（ｅ２）配列番号１０に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の５位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
（ｅ３）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の５位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質。
【００２７】
（６）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、４０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，３−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２８】
（７）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、８０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，６−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００２９】
（８）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素複合体Ａであることを特徴とする前記（６）または（７）に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３０】
（９）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の７位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、７０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより脱炭酸反応により１，７−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３１】
（１０）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の７位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、２００℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより２，６−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３２】
（１１）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の７位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、２２５℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより２，３−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３３】
（１２）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素Ｄであることを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３４】
（１３）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の５位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、７０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，５−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３５】
（１４）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の５位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られ３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、２２５℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，７−ジヒドロキシナフタレンを生成させることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３６】
（１５）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の５位を水酸化する酵素または酵素複合体であり、かつ該酵素または該酵素複合体の作用により６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸から得られる５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、２５０℃以上の加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより１，２−ジヒドロキシナフタレンを生成することを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３７】
（１６）ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体が前記水酸化酵素Ｅであることを特徴とする前記（１３）〜（１５）のいずれか一項に記載のジヒドロキシナフタレンの製造方法。
【００３８】
（１７）前記（５）に記載した（ａ１）、（ａ２）または（ａ３）に示す蛋白質、（ｂ１）、（ｂ２）または（ｂ３）、ならびに（ｃ１）、（ｃ２）または（ｃ３）に示す蛋白質からなる水酸化酵素複合体Ａ。
【００３９】
（１８）水酸化酵素複合体Ａを構成する３種類の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、従来の製造法と比べて製造コストも低減でき、かつ危険な薬品を使わず、かつ危険な廃棄物も生成せず、かつ環境問題を解決するバイオプロセス法と加熱処理という２つの方法の組み合わせにより、工業的に生産されているヒドロキシナフトエ酸をもとにジヒドロキシナフタレンを安価に製造する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】加熱処理によって１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸から１，３−ジヒドロキシナフタレンが生成し、その生成量がｐＨで変化することを示す図。
【図２】加熱処理による１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，６−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図３】加熱処理による１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図４】加熱処理による３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，６−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図５】加熱処理による６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，３−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図６】加熱処理による１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，５−ジヒドロキシナフタレンと１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図７】加熱処理による３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【図８】加熱処理による５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，２−ジヒドロキシナフタレンと２，３−ジヒドロキシナフタレンの生成を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００４３】
本発明では、ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を用いてヒドロキシナフトエ酸を水酸化してジヒドロキシナフトエ酸を調製した後に、該ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを生産させる製造することができる。
【００４４】
ジヒドロキシナフタレンを生産させるための出発原料として用いるヒドロキシナフトエ酸としては、２位にカルボキシル基を有するヒドロキシ−２−ナフトエ酸類、すなわち１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、４−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、５−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、７−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および８−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸のいずれのヒドロキ
シナフトエ酸を用いることができる。好ましくは、工業的に生産されている１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸および６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いることができる。
【００４５】
ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体を発現する微生物を用いてこれらヒドロキシナフトエ酸を水酸化した後、得られたジヒドロキシナフトエ酸を加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを得ることができる。好ましくは、ジヒドロキシナフタレンを得る際に、加熱温度が350℃以下のときに脱炭酸反応が起こるジヒドロキシナフトエ酸を用いる方がよい。
【００４６】
さらに詳しくは、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発原料とした場合には、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の３位、４位、５位、６位、７位または８位を水酸化する酵素または酵素複合体を用いることにより、それぞれの酵素または酵素複合体による反応により、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または１，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を得ることができる。続いて、得られた１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または１，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより、それぞれのジヒドロキシナフトエ酸から、１，３−ジヒドロキシナフタレン、１，４−ジヒドロキシナフタレン、１，５−ジヒドロキシナフタレン、１，６−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、１，８−ジヒドロキシナフタレンを製造することができる。
【００４７】
３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発原料とした場合には、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位、４位、５位、６位、７位または８位を水酸化する酵素または酵素複合体を用いることにより、それぞれの酵素または酵素複合体による反応により、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または３，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を得ることができる。続いて、得られた１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または３，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより、それぞれのジヒドロキシナフトエ酸から、１，３−ジヒドロキシナフタレン、１，２−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、２，７−ジヒドロキシナフタレン、２，６−ジヒドロキシナフタレン、１，６−ジヒドロキシナフタレンを製造することができる。
【００４８】
６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発原料とした場合には、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位、３位、４位、５位、７位または８位を水酸化する酵素または酵素複合体を用いることにより、それぞれの酵素または酵素複合体による反応により、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、４，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を得ることができる。続いて、得られた１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、４，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６，８−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水性媒体に対して加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことにより、そ
れぞれのジヒドロキシナフトエ酸から、１，６−ジヒドロキシナフタレン、２，７−ジヒドロキシナフタレン、１，７−ジヒドロキシナフタレン、１，２−ジヒドロキシナフタレン、２，３−ジヒドロキシナフタレン、１，３−ジヒドロキシナフタレンを製造することができる。
【００４９】
本発明で用いるナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体としては、ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環の炭素原子を酸化する酵素であれば、いかなる酵素を用いることができるが、好ましくは、ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環の炭素原子を酸化する活性を有する芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ型モノオキシゲナーゼ、シトクロームＰ４５０、フラボ蛋白質モノオキシゲナーゼなどが挙げられる。さらに好ましくは、上述の水酸化酵素複合体Ａ、水酸化酵素Ｄおよび水酸化酵素Ｅが挙げられる。
【００５０】
水酸化酵素複合体Ａは、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株が持つ２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体であり、オキシゲナーゼ・コンポーネントとレダクターゼ・コンポーネントからなる。オキシゲナーゼ・コンポーネントは配列番号２で表される大サブユニット蛋白質と配列番号４で表される小サブユニット蛋白質からなる。レダクターゼ・コンポーネントは配列番号６で表されるレダクターゼ蛋白質である。
【００５１】
水酸化酵素複合体Ａの該大サブユニット蛋白質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。また、該蛋白質として、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能」とは、小サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに１位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。より具体的には、小サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質とともに、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
【００５２】
水酸化酵素複合体Ａの該小サブユニット蛋白質としては、配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。また、該蛋白質として、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能」とは、大サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに１位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。より具体的には、大サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質とともに、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
【００５３】
水酸化酵素複合体Ａの該レダクターゼ蛋白質としては、配列番号６のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。
また、該蛋白質として、配列番号４のアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸の１位の水酸化に関わる機能」とは、大サブユニット蛋白質および小サブユニット蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに１位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。より具体的には、大サブユニット蛋白質および小サブユニット蛋白質とともに、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
【００５４】
水酸化酵素Ｄは、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株が持つチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ１９９Ａ２）であり、配列番号８で表される蛋白質である。水酸化酵素Ｄとしては、配列番号８のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の７位の水酸化に関わる機能をあげることができる。また、該蛋白質として、配列番号８のアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の７位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸７位の水酸化に関わる機能」とは、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに７位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。より具体的には、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質とともに、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
【００５５】
水酸化酵素Ｅは、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株が持つチトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ１９９Ａ２）のＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体であり、配列番号１０で表される蛋白質である。水酸化酵素Ｅとしては、配列番号１０のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の５位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。また、該蛋白質として、配列番号１０のアミノ酸配列と８０％以上の同一性、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつヒドロキシナフトエ酸の５位の水酸化に関わる機能を有する蛋白質をあげることができる。ここで、「ヒドロキシナフトエ酸の５位の水酸化に関わる機能」とは、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質とともにヒドロキシナフトエ酸と反応させたときに５位に水酸基を有するジヒドロキシナフトエ酸とを生成しうる機能を意味する。より具体的には、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質とともに、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸または６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と反応させたときに、それぞれ１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸または５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成しうる機能を意味する。
【００５６】
上記の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質、小サブユニット蛋白質、レダクターゼ蛋白質またはシトクロームＰ４５０蛋白質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ目的の水酸化酵素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)
（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci.,
USA, 82, 488 (1985)、Biochem J., 462, 257 (2014) に記載の部位特異的変異導入法を用いて、たとえば配列番号２、４、６、８または１０で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質において特定の位置に欠失、置換もしくは付加が導入されるように、それぞれコードする配列番号１、３、５、７または９に表わされるＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される１または数個というアミノ酸の数は、目的の水酸化酵素活性が維持される限り特に限定されないが、配列番号２、４または６、８または１０のアミノ酸配列との違いの個数以内であることが望ましく、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。
【００５７】
本発明で用いられる２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００５８】
本発明で用いられる２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００５９】
本発明で用いられる２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００６０】
本発明で用いられるシトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００６１】
本発明で用いられるシトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体蛋白質をコードするＤＮＡとしては、たとえば、配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。
【００６２】
本発明のＤＮＡには、本発明の目的の水酸化酵素活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡ、たとえば、配列番号１、３、５、７または９に表わされるＤＮＡの全部もしくは一部をプローブとして、ハイブリダイゼーション法によってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも包含する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaClの存在下で65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1 倍濃度ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、150 mM NaCl、15 mMクエン酸ナトリウムである）の中、65℃でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを意味する。なお、ハイブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989年刊〕に記載されている。
【００６３】
ジヒドロキシナフトエ酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環を水酸化できる能力を有している微生物であれば、いずれの微生物を用いることができる。
【００６４】
ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環を水酸化できる能力を有している微生物としては、
ナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体の蛋白質をコードする組換えＤＮＡを導入することにより該蛋白質を発現させることにより該能力を獲得した形質転換体であってもよい。たとえば、配列番号１に示す２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ、配列番号３に示す２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質および配列番号５に示す２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡを組換えＤＮＡ技術を用いてエシェリヒア・コリなどのエシェリヒア属細菌、Pseudoomonas putida（シュードモナス・プチダ）などのシュードモナス属細菌、またはCorynebacterium glutamicum（コリネバクテリウム・グルタミカム）などのコリネバクテリウム属細菌などの宿主細胞に導入した形質転換体であってもよい。また、配列番号７または９に示すシトクロームＰ４５０蛋白質などの水酸化酵素蛋白質をコードする組換えＤＮＡを導入することにより該蛋白質を発現させることにより該能力を獲得した形質転換体であってもよい。
【００６５】
ヒドロキシナフトエ酸のナフタレン環を水酸化する酵素または酵素複合体の蛋白質を組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞に発現させることにより本発明の微生物を得る際には、該酵素または該酵素複合体による酸化反応にとって必要となる電子伝達に関わる蛋白質を発現させることが好ましい。たとえば、バークホルデリア・テラエ（Burkholderia terrae）ＴＮＡ２４１株が持つ２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の場合には、配列番号６のアミノ酸配列を持つレダクターゼ蛋白質がＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け取る役目を担っている。
【００６６】
また、シトクロームＰ４５０水酸化酵素による水酸化反応の場合には、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質を発現している微生物であることが好ましい。該微生物は、シュードモナス・プチダ属細菌、ロドシュードモナス属細菌およびストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌などの細菌から、フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡを単離して、組換えＤＮＡ技術などを用いて宿主細胞に発現させた微生物であってもよい。たとえば、配列番号１２もしくは１４またはこれらの配列と８０％以上同一な配列を有するフェレドキシン蛋白質をコードするＤＮＡならびに配列番号１６またはこの配列と８０％以上同一な配列を有するフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡを組換えＤＮＡ技術などを用いて宿主細胞に発現させることが望ましい。フェレドキシン蛋白質とフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質の発現の代わりに、バシルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）のシトクロームＰ４５０・ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）蛋白質を利用してもよい。すなわち該蛋白質のＰ４５０部分をナフタレン環を水酸化するＰ４５０蛋白質と置換した融合型蛋白質、またはロドコッカス属細菌（Rhodococcus sp.）ＮＣＩＭＢ９７８４株のシトクロームＰ４５０水酸化酵素（ＣＹＰ１１６Ｂ２）蛋白質を利用し、該蛋白質のＰ４５０部分をナフタレン環を水酸化するＰ４５０蛋白質と置換した融合型蛋白質を作製し、宿主細胞に発現させることによっても、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子伝達を効率よく行わせることができる。
【００６７】
本発明の微生物が形質転換体である場合は、モレキュラー・クローニング第２版に記載の方法にしたがって組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを用いて宿主細胞を形質転換することにより取得することができる。以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換体の作製方法について詳しく述べる。なお、その他の形質転換体も同様の方法により取得することができる。
【００６８】
上記のバークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株またはロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株をバークホルデリア属細菌またはロドシュードモナス属細菌の培養に通常用いられる公知の方法により培養する。培養後、公知の方法（たとえば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離・精製する。この染色体ＤＮＡから合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイ
ゼーション法またはポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）法などにより、ヒドロキシナフトエ酸の水酸化に関わる酵素または酵素複合体の蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。また、同様の方法により、シュードモナス属細菌、ロドシュードモナス属細菌およびストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌から、ナフタレン環を水酸化する酵素に電子を伝達する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。
【００６９】
ヒドロキシナフトエ酸の水酸化に関わる酵素または酵素複合体の蛋白質をコードするＤＮＡ、およびナフタレン環を水酸化する酵素に電子を伝達する機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡについては、該ＤＮＡの塩基配列が分かっている場合には、合成ＤＮＡを連結することによっても得ることができる。
【００７０】
上記ＤＮＡを連結するベクターとしては、大腸菌Ｋ１２株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００７１】
該ベクターに上記で取得したＤＮＡを連結して得られる組換えＤＮＡの宿主に用いる大腸菌（エシェリヒア・コリ）は、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリＫ−１２株から派生した菌株であるエシェリヒア・コリMG1655〔Science, 277, 1453 (1997)〕、エシェリヒア・コリ XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。
【００７２】
ロドコッカス属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、またはロドシュードモナス属に属する微生物の中に、上記ＤＮＡを導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかと大腸菌Ｋ１２株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換えＤＮＡを宿主となる該微生物に導入することができる。
【００７３】
組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、たとえば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。
【００７４】
上記のようにして得られた形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、たとえばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。
【００７５】
また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。
【００７６】
上記の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質、小サブユニット蛋白質、レダクターゼ蛋白質、チトクロームＰ４５０蛋白質、フェレドキシン蛋白質および
／またはフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによって得られる。
【００７７】
上記蛋白質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明の蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現にとって最適なコドンとなるように、改変することにより、該蛋白質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより取得することができる。
【００７８】
本発明の蛋白質を発現させる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、フェレドキシン蛋白質およびフェレドキシン・レダクターゼ蛋白質を発現しており、かつジヒドロキシナフトエ酸の代謝能を欠損または減弱している性質を有する微生物を用いることができる。より好ましくは、該性質を有するエシェリヒア属、ロドコッカス属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、スフィンゴモナス属、バークホルデリア属およびストレプトマイセス属の細菌をあげることができる。さらに好ましくは、エシェリヒア・コリＫ１２株をあげることができる。
【００７９】
このような宿主微生物に本発明の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質と小サブユニット蛋白質とレダクターゼ蛋白質、もしくは本発明のシトクロームＰ４５０蛋白質を発現させることにより作製した本発明の微生物を用いることにより、ヒドロキシナフトエ酸からジヒドロキシナフトエ酸を製造することができる。すなわち本発明の微生物をヒドロキシナフトエ酸を含有する培地中に加えてヒドロキシナフトエ酸と反応させることにより、ジヒドロキシナフトエ酸を得ることができる。
【００８０】
また、このような本発明の微生物を増殖させて、ヒドロキシナフトエ酸を細胞内に取り込ませてジヒドロキシナフトエ酸を製造する場合には、ヒドロキシナフトエ酸の輸送（取り込み）能を有する微生物を用いることが好ましい。
【００８１】
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００８２】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。プロモーターからの転写を制御する蛋白質をコードする遺伝子が含まれていてもよい。
【００８３】
本発明の蛋白質、または該蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質をコードするＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、発現するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、たとえばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、たとえば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（イ
ンビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。
【００８４】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。たとえば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター等の、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、およびtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等、およびシュードモナス・プチダのTOLプラスミドのXylS蛋白質により制御されるPmプロモーターを用いることができる。
【００８５】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（たとえば5〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００８６】
組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、たとえば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。
【００８７】
組換えＤＮＡ技術などを用いて、上記いずれか１つ以上の蛋白質の生産量を野生株と比較して増強した微生物を作製し、ジヒドロキシナフトエ酸の生産量を上げることもできる。具体的には、上記いずれかの蛋白質をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとして天然のプロモーターよりも転写活性が強いプロモーターを用いる、あるいは該蛋白質をコードする遺伝子の転写を終結するためのターミネーターとして天然のターミネーターよりも転写終結活性が強いターミネーターを用いる、あるいは発現ベクターとして高コピー数ベクターを利用すること、相同組換えで染色体上に組み込むことなどがあげられる。
【００８８】
以上のようにして得られる本発明のジヒドロキシナフトエ酸生産微生物を、好ましくは0.1mM〜1.5Mのヒドロキシナフトエ酸を含有する培地で培養し、培養物中にジヒドロキシナフトエ酸を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、ジヒドロキシナフトエ酸を製造することができる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００８９】
本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、たとえばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、たとえばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、たとえばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。ジヒドロキシナフトエ酸を生産するための原料としては、ヒドロキシナフトエ酸を添加する。
【００９０】
培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が
生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のｐＨについても本発明の微生物が生育し得るｐＨであれば特に制限はない。培養中のｐＨ調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。
【００９１】
本発明のジヒドロキシナフトエ酸生産微生物を培養した後、ヒドロキシナフトエ酸を含む水性媒体中に、該微生物の培養物もしくは該培養物の処理物を加えることにより、該媒体中にジヒドロキシナフトエ酸を生成、蓄積させ、該媒体からジヒドロキシナフトエ酸を採取することもできる。
【００９２】
該培養物の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、たとえば0.02〜0.2M程度のリン酸緩衝液（pH6〜10）等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる本発明の蛋白質を含有する抽出物、該抽出物を更に硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる本発明の蛋白質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明のジヒドロキシナフトエ酸の製造に使用することができる。
【００９３】
これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。
【００９４】
反応に用いる水性媒体は、ヒドロキシナフトエ酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、たとえば0.02〜0.2 M程度のリン酸緩衝液（pH6〜10）とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を0.05〜2.0％（w/v）添加することもできる。
【００９５】
水性媒体中の反応原料となるヒドロキシナフトエ酸の濃度は、0.1mM〜1.5M程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびｐＨは特に限定されないが、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃が適当であり、反応液中のｐＨは通常5〜10、好ましくは6〜9付近とすることができる。また、ｐＨの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま、またはそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水または緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をヒドロキシナフトエ酸の存在下、反応させるが、反応液中のヒドロキシナフトエ酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、ヒドロキシナフトエ酸を含む溶液を流す方法も利用できる。反応は、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃、pH5〜9、好ましくはpH6〜9で行う。
【００９６】
また、上記水性媒体に、反応時に抗酸化剤または還元剤を添加すると、ジヒドロキシナフトエ酸の生成収率が一層向上する場合がある。抗酸化剤／還元剤としては、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、システイン、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸塩、チオ硫酸ナトリムなどのチオ硫酸塩が挙げられる。添加濃度は、抗酸化剤／還元剤の種類によって異なるが、ジヒドロキシナフトエ酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜5％（Ｗ/Ｖ）、好ましくは0.005〜1％である。
【００９７】
また、上記水性媒体に、反応時に酸化剤を添加すると、ジヒドロキシナフトエ酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオキソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、ジヒドロキシナフトエ酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001
〜0.05％（Ｗ/Ｖ）、好ましくは0.005〜0.02％である。
【００９８】
培養終了後の培養液または反応液中からのジヒドロキシナフトエ酸は、酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、たとえば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、蒸留法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによってジヒドロキシナフトエ酸を採取することができる。
【００９９】
上述の方法により調製したジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒に対して、加熱による脱炭酸反応を引き起こす処理を施すことによりジヒドロキシナフタレンを得ることができる。上述の方法により調製したジヒドロキシナフトエ酸が固形物の場合には、水または水性緩衝液などの水性溶媒に該固形物を溶解させることにより、ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒を調製する。
【０１００】
該水性溶媒中のジヒドロキシナフトエ酸の濃度は、0.1mM〜1.5M程度が適当であるが、ジヒドロキシナフトエ酸を水性溶媒に溶解する際の温度は、脱炭酸反応が起こる温度を超えないことが好ましい。
【０１０１】
該水性溶媒に溶解させるジヒドロキシナフトエ酸の異性体の種類については、１種類であっても、２種類以上の混合物であってもよい。目的の生産物であるジヒドロキシナフタレンが１種類であるが、２種類以上のジヒドロキシナフトエ酸の混合物を含む該水性溶媒から目的のジヒドロキシナフタレンを得る場合には、加熱温度や水性溶媒中のｐＨを調整することにより該ジヒドロキシナフタレンが優先的に生成する反応条件を選ぶことが望ましい。または、脱炭酸反応により複数種のジヒドロキシナフタレンが生成する場合には、後述する精製法を用いて目的のジヒドロキシナフタレンを分離することもできる。
【０１０２】
一定の割合で複数種のジヒドロキシナフタレンが混合している製品が工業的に使われる場合がある。このような製品の場合には、個々のジヒドロキシナフタレン精製品を一定の割合で混合してよいし、または複数種のジヒドロキシナフトエ酸の混合物を含む水性溶媒を加熱することにより脱炭酸反応を行い、目的の複数種のジヒドロキシナフタレンの混合物を得ることもできる。
【０１０３】
脱炭酸反応を行う温度については、出発物質となるジヒドロキシナフトエ酸の種類によって異なるが、温度が高いほどジヒドロキシナフトエ酸からのジヒドロキシナフタレンの転換効率が高くなる。１位に水酸基を持つジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質とする場合には、１００℃以下の温度でも脱炭酸反応が起こる。より好ましくは、１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸および１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質とする場合には、それぞれ４０℃以上、８０℃以上、７０℃以上および７０℃以上の温度で加熱することにより脱炭酸反応を起こさせることができる。
【０１０４】
１位に水酸基を持たないジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質とする場合には、２００℃以上の温度にしないと効率の良い脱炭酸反応が起こらない。より好ましくは、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸および５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を出発物質とする場合には、それぞれ２００℃以上、２２５℃以上、２２５℃以上および２５０℃以上の温度で加熱することにより脱炭酸反応を起こさせることができる。
【０１０５】
一方で、温度が高すぎると、生成したジヒドロキシナフタレンが重合などの構造変化を引き起こす場合がある。したがって、ジヒドロキシナフトエ酸の異性体の種類によっては、
好適な脱炭酸反応が起きるように脱炭酸反応を行う温度を調整することが望ましい。脱炭酸反応に好適な温度は、ジヒドロキシナフトエ酸の濃度や水性溶媒の種類により異なる場合があるので、予め小さなスケールの容器を用いてジヒドロキシナフトエ酸からのジヒドロキシナフタレンの転換効率と加熱温度との関係を調べてから、大量調製に用いる温度条件を決めることが望ましい。
【０１０６】
ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒を常圧下で１００℃以上の温度に加熱すると、水が蒸発するので、１００℃以上で脱炭酸反応を行う場合には、耐圧容器内で加熱し、高圧下で脱炭酸反応を行わせることが好ましい。
【０１０７】
ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒に酸素が溶存していると、該水性溶媒を加熱する際にジヒドロキシナフトエ酸およびジヒドロキシナフタレンが酸化しやすくなる。したがって、該水性溶媒を加熱する前に、窒素バブリングなどにより該水性溶媒中の酸素を脱気することが望ましい。また、耐圧容器内で加熱する場合には、容器内の気体を窒素で置換することが望ましい。
【０１０８】
ジヒドロキシナフトエ酸を含む水性溶媒を加熱する際に、該水性溶媒のｐＨが低いほど脱炭酸反応効率が向上する場合が多い。ジヒドロキシナフトエ酸を水に溶解する場合には、ｐＨが酸性側になるが、水性溶媒が緩衝液であったり、ジヒドロキシナフトエ酸の塩を水性溶媒に溶解する場合には、ｐＨが酸性にならないこともある。このような場合には、硫酸や塩酸などの酸を該水性溶媒に添加して、ｐＨが酸性になるように調整することが好ましい。より好ましくは、ｐＨを３以下に調整した方がよい。
【０１０９】
加熱による脱炭酸反応処理を行うことにより生成したジヒドロキシナフタレンは、該水性溶媒から酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出する方法、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、蒸留法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって単離・精製することができる。
【実施例】
【０１１０】
以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１１１】
実施例１．バークホルデリア属細菌を用いた３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
【０１１２】
１−１．２−ナフトエ酸分解菌バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株の単離
【０１１３】
２−ナフトエ酸分解菌バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０２１６５）は日本国内20ヵ所の土壌サンプルを加えた5mMの２−ナフトエ酸を含有するＷ液体培地〔Ｗ培地の組成は、1.7g/Lのリン酸一カリウム、9.8g/Lのリン酸二ナトリウム、1.0g/Lの硫酸アンモニウム、0.1g/Lの硫酸マグネシウム七水和物、0.95mg/Lの硫酸鉄七水和物、10.75mg/Lの酸化マグネシウム、2.0mg/Lの炭酸カルシウム、1.44mg/Lの硫酸亜鉛七水和物、0.25mg/Lの硫酸銅五水和物、0.28mg/Lの硫酸コバルト七水和物、0.06mg/Lのホウ酸、51.3μL/Lの塩酸からなる〕を用いた集積培養を行い、２−ナフトエ酸の資化能を指標に単離した。なお、ＴＮＡ２４１株の属種の同定は、後述する実施例２−１で得られたゲノムＤＮＡの塩基配列情報に含まれる16S rRNA遺伝子の配列情報をもとに決定した。
【０１１４】
なお、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株は、２０１５年１１月２０日に独立行政法人 製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンターNBRC（日本国千葉県木更津市
かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号NITE P-02165で寄託されている。
【０１１５】
１−２．バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株による２−ナフトエ酸からの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成
【０１１６】
5mMの２−ナフトエ酸と0.025％乾燥酵母エキスを含有する3mLのＷ培地にバークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株を接種し、30℃、290rpmで3日間振とう培養を行った。培養終了後、吸光度600nmが5.0となる溶液100μLを調製するのに必要な菌体量に相当する培養液を採取し、遠心により菌体を集めた。50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）0.4mLで２回洗浄し、99.6μLの50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁した。以下、特記しない限り「ＴＮＡ２４１株の休止菌体の懸濁液」は、ここで述べた方法を用いて調製した。
【０１１７】
この菌体懸濁液を30℃、1000 rpmで5分間振とうした。その後、0.4μLの0.5M ２−ナフトエ酸の水溶液を加えて、30℃、1000 rpmで反応させた。経時的に反応液を2μLずつ取り、これにアセトニトリルを8μL加えて懸濁した後、遠心分離に供した。その後、上清を全量取り、1.7mLチューブに移し、390μLの水を加えた後、懸濁液を調製した。
【０１１８】
この懸濁液について、表1に示す高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の分離条件でLC-TOF型質量分析計（Waters社、LCT Permier XE；以下、LC-TOF型質量分析計はこの機器を用いた）による分析を行った。以下、特記しない限り「バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株の休止菌体の懸濁液を用いた水酸化酵素反応と反応後の反応産物の分析」はこの方法を用いて行った。各化合物の同定は標品（東京化成工業株式会社より購入）と比較して、ＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長、質量分析計で測定した精密質量値を合わせて行った。
【０１１９】
その結果、反応24時間後に２−ナフトエ酸が消失し、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と同じ溶出時間に質量数187.0412のピークが検出された。２−ナフトエ酸に１原子の酸素が付加した産物をLC-TOF型質量分析計で分析した場合、水素原子が引き抜かれてイオン化したピークの理論的質量数は187.0395と算出される。したがって、実測値との質量数の差が0.0017となり、LC-TOF型質量分析計の測定誤差内で両者の質量数は一致した。この結果、単離したバークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株は２−ナフトエ酸を水酸化して１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成することがわかった。
【０１２０】
【表１】
0006682274.tif 000002
【０１２１】
１−３．バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株による３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成
【０１２２】
上記１−２で述べた方法で調製した菌体懸濁液に対して、0.5M ３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を0.4μL加えることにより、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への水酸化反応を調べた。その結果、反応24時間後に約1mMの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸が消失し、質量数203.0377の化合物の蓄積が新たに検出された。３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に１原子の酸素が付加した産物をLC-TOF型質量分析計で分析した場合、水素原子が引き抜かれてイオン化したピークの理論的質量数は203.0344と算出される。したがって、実測値との質量数の差が0.0033となり、LC-TOF型質量分析計の測定誤差内で両者の質量数は一致した。
【０１２３】
以上の結果より、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株が持つ２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体が３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化する可能性が示唆された。また、後述する実施例２−５に示すように、本菌株から単離した２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体を用いて３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を水酸化することで得られるジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と上述の質量数203.0377の化合物はＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値で一致しており、後述する実施例３−３の脱炭酸反応によって１，３−ジヒドロキシナフタレンが生成することが示されたことから、上述の質量数203.0377の化合物は１,３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であると結論付けた。
【０１２４】
実施例２．組換え大腸菌の培養物および該培養物の処理物を用いた３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
【０１２５】
２−１．バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株のゲノム解析
バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株を5mMの２−ナフトエ酸と0.025％の乾燥酵母エキスを含有する5mLのＷ液体培地に接種し、30℃で3日間振とう培養を行った。培養液から菌体を集めて、該菌体からQIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてＴＮＡ２４１株のゲノムＤＮＡを調製した。
【０１２６】
このゲノムＤＮＡ約20μgを長岡技術科学大学に送付した。長岡技術科学大学においてＴＮＡ２４１株ゲノムＤＮＡのフラグメント・ライブラリーを作製し、イルミナ社製のMiSeqシーケンサーを用いて約1000万塩基の配列を決定した。塩基配列のアセンブリーが行われ、合計の長さが6,019,683塩基であるゲノム配列が得られた。
【０１２７】
バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株のゲノムＤＮＡ配列について、翻訳領域予測プログラムであるGeneLook〔Nishi, T., Ikemura, T., Kanaya, S.: Gene 346, 115-125 (2005)〕を用いて翻訳領域を予測した。続いて、予測された翻訳領域に対してBLAST相同性解析を用いて既存の蛋白質のアミノ酸配列との相同性解析を行った。その結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するオキシゲナーゼ・コンポーネントの大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号１）、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するオキシゲナーゼ・コンポーネントの小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号３）、ならびに配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するレダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５）を同定できた。また、これら３種類の蛋白質が２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換に関わっている２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質、小サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質と推定された。
【０１２８】
２−２．２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換に関わる３種類の蛋白質のクローニング
２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の大サブユニット蛋白質、小サブユニット蛋白質およびレダクターゼ蛋白質をクローニングするために、配列番号１７〜２３に示すフォワードＰＣＲプライマーとリバースＰＣＲプライマーを設計し、合成した。配列番号１７と配列番号１８のＰＣＲプライマーセットは大サブユニット蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。配列番号１９と配列番号２１のＰＣＲプライマーセットと配列番号２０と配列番号２１のＰＣＲプライマーセットはともに小サブユニット蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。また、配列番号２２と配列番号２３のＰＣＲプライマーセットはレダクターゼ蛋白質の遺伝子を増幅させるために合成した。
【０１２９】
なお、ＰＣＲプライマーの合成は株式会社ファスマックに外注した。続いて、上記で得たゲノムＤＮＡを鋳型にし、タカラバイオ社から購入したPrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼとＰＣＲプライマーを用いて、添付の説明書に従って２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の３種類の蛋白質をコードするＤＮＡを増幅した。
【０１３０】
配列番号１７と配列番号１８のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅させた大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡを制限酵素PacIと制限酵素NotIによる消化反応に供した後、大腸菌発現ベクターであるpUXPEaLT19（特開2014-50373を参照）のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT_largeを造成した。同様にして、配列番号１９と配列番号２１のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅させた小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡを制限酵素PacIと制限酵素NotIによる消化反応に供した後、大腸菌発現ベクターであるpUXPEaLT19（特開２０１４−５０３７３を参照）のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT_smallを造成した。
【０１３１】
配列番号２０と配列番号２１のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅させた小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡと配列番号２２と配列番号２３のＰＣＲプライマーセットを用いて増幅させたレダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡはTaqポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）を用いて３'末端にＡ残基を付与する処理を行った後、ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した。精製した目的ＤＮＡをpT7Blue（Novagen社製；タカラバイオ社から購入）のＴベクターに組み込むことにより、それぞれpT7Blue_smallとpT7Blue_reductaseを造成した。pT7Blueに挿入した小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ、およびレダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡはそれぞれ翻訳開始コドンの上流に制限酵素SwaI部位を有しており、終止コドン下流に制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位を有している。各遺伝子は制限酵素SwaI部位と制限酵素NotI部位により切り出すことができ、各遺伝子の終止コドン下流の制限酵素PmeI部位とNotI部位に挿入することができる。pUXPEaLT_largeの制限酵素PmeI部位とNotI部位にレダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入したpUXPEaLT_LRを構築した。このpUXPEaLT_LRに小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡを挿入して、これら３遺伝子を発現するプラスミドpUXPEaLT_LRSを造成した。さらに、同様なＤＮＡ連結法により、２−ナフトエ１−水酸化酵素複合体の３種類の蛋白質をコードする遺伝子のうち、レダクターゼ蛋白質をコードする遺伝子以外の２種類の遺伝子を保持するプラスミドpUXPEaLT_LSを造成した。また、pUXPEaLT_smallの制限酵素PmeI部位とNotI部位にレダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡを挿入して、大サブユニット蛋白質をコードする遺伝子以外の２種類の遺伝子を保持するプラスミドpUXPEaLT_SRを造成した。
【０１３２】
２−３．組換え大腸菌の休止菌体を用いた２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した４種類の発現プラスミドを大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)、JM109/(pUXPEaLT_LR)、JM109/(pUXPEaLT_LS)およびJM109/(pUXPEaLT_SR)を造成した。これら形質転換株を終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む0.
2mLのＬＢ液体培地〔10g/Lのトリプトン（Difco社製）、5g/Lの乾燥酵母エキス（Difco社製）、10g/Lの塩化ナトリウム〕で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3mLのＬＢ液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。ｍ−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で蛋白質を誘導発現するための培養を3時間行った。吸光度600nmで2.0となる溶液100μLを調製するのに必要な菌体量に相当する培養液を採取し、菌体を集めた。該菌体を50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄した後、菌体を1％グルコースを含む99μLの50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁することにより、組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。以下、特記しない限り「組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液」はこの方法を用いて調製した。
【０１３３】
この懸濁液を30℃、1000rpmの条件で5分間加温した。その後、100mMの２−ナフトエ酸水溶液(２−ナフトエ酸は東京化成工業株式会社より購入した）を調製し、その1μLをこの懸濁液に添加した後、30℃、1000rpmの条件で1時間反応させた。反応後、反応液2μLに対して8μLのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心にかけた。上清を全量採取し1.7mLチューブに移し、390μLの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表１に示すＨＰＬＣの分離条件でLC-TOF型質量分析計による分析を行った。以下、特記しない限り「組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を用いた水酸化酵素反応と反応後の反応産物の分析」はこの方法を用いて行った。
【０１３４】
その結果、基質として２−ナフトエ酸を終濃度約1mMとなるように加えて反応させた場合に、オキシゲナーゼ・大サブユニット蛋白質、オキシゲナーゼ・小サブユニットグ蛋白質およびレダクターゼ蛋白質の３種類すべてのタンパク質を発現する組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)、ならびにオキシゲナーゼ・大サブユニット蛋白質とオキシゲナーゼ・小サブユニット蛋白質の２種類のたんぱく質を発現する組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LS)で1.1mMと0.04mMの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産が観察された。なお、オキシゲナーゼ・大サブユニット蛋白質ジオキシゲナーゼ・小サブユニット蛋白質のいずれかを発現しない組換え大腸菌では１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産は検出感度以下であった。１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（340nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１３５】
以上より、オキシゲナーゼ・大サブユニット蛋白質をコードする遺伝子、オキシゲナーゼ・小サブユニット蛋白質をコードする遺伝子、レダクターゼ蛋白質をコードする遺伝子は、２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸への変換に関わっている２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体であることを確認した。
【０１３６】
２−４．組換え大腸菌の菌体処理物（粗酵素液）による２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を、終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む0.2mLのＬＢ液体培地で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3mLのＬＢ液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。ｍ−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で5時間培養を行った後に、菌体を集めた。該菌体を50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄した後、200μLの50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁した。この菌体懸濁液を超音波破砕に供することにより細胞を破砕した。その後、遠心分離（4℃、15分、15000rpm）を行って上清と沈殿物に分離した後、上清を大腸菌の菌体処理物すなわち粗酵素液とした。ブラッドフォード法に基づいたバイオラッド（Bio-Rad）プロテイン・アッセイ（Bio-Rad Laboratories, CA, USA）を用いて粗酵素液の蛋白質濃度を計測した。以下、特記しない限り、組換え大腸菌の粗酵素液はこの方法を用いて調製した。
【０１３７】
該粗酵素液による２−ナフトエ酸から１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産は、5mM NADH、5mM NADPH、0.1mM硫酸鉄七水和物および100μgの蛋白質を含む粗酵素液を含む100μLの反応液に２−ナフトエ酸を1mM加えた後、30℃で１時間保温した。その後、2μLの反応液に対して8μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全部採取し、1.7mLチューブに移し、390μLの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表１に示すＨＰＬＣの分離条件でLC-TOF型質量分析計による分析を行った。以下、特記しない限り、「組換え大腸菌の粗酵素液を用いた水酸化酵素反応と反応後の反応産物の分析」はこの方法を用いて行った。その結果、反応1時間後において0.23mMの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産を確認できた。なお、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（340nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１３８】
２−５．組換え大腸菌の休止菌体による３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記２−３で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)をもとに、ｍ−トルイル酸の添加後の蛋白質発現培養の時間を5時間に変更すること以外は、上記２−３で述べた方法を用いて組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。この懸濁液と100mMの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む溶液1μLを用いて上記２−３で述べた方法により水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には1.31 mMであった３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は1時間の反応で0.16mMに減少し、上記で同定した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から1.15mMと算出された。なお、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（361nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１３９】
２−６．組換え大腸菌の粗酵素液による３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を上記２−４で述べた方法で誘導培養を行い、該組換え大腸菌の粗酵素液を調製した。水酸化酵素反応は２−ナフトエ酸を終濃度1mMの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に、酵素反応時間を1時間から2時間に変更したこと以外は上記２−４で述べた方法で行い、水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には1.24 mMであった３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は2時間の反応で0.64mMに減少し、上記で同定した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から0.6mMと算出された。なお、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（361nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１４０】
実施例３．１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，３−ジヒドロキシナフタレンの生産
３−１．１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の大量調製
上記２−３で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む3.0mLのＬＢ液体培地で一晩培養した。終濃度100mg/Lのアンピシリンを含む100mLのＬＢ液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。ｍ−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で5時間培養を行った後に、菌体を集めた。該菌体を10mLの50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄した後、99mLの１％グルコースを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁した。この懸濁液を30℃、290rpmの条件で5分間加温した。その後、1mLの0.5M ３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記２−４で述べた方法を用いて行った。その結
果、反応開始前には5.54 mMであった３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.13mMに減少し、上記で同定した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から5.41mMと算出された。なお、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（361nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１４１】
３−２．１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の作製
１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む20mLの溶液に0.3mLの6N塩酸を加えて混合し、塩化ナトリウムで飽和した酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5.0mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した14.0mLの酢酸エチル溶液に対して減圧乾燥処理を施して溶媒を蒸発させた。残留物に対して水と水酸化ナトリウムを加えて１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の抽出液を作製した。該抽出液の容量は20.0mLであり、ｐＨは7.02であった。
【０１４２】
３−３. １，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の加熱処理による脱炭酸反応
上記３−２で調製したpH7.02の１，３−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む溶液に塩酸を加えて、pH5.73, 3.65, 1.49の時にそれぞれ1.5 mLを分取した。各ｐＨの溶液50 μLを1.7mLチューブ７本に分注し、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃で30分間加温した。加温後、メチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと略す）を全量で100 μLになるように加えて撹拌した。この溶液から4μLを分取し、16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。上記１−２に記載した方法を用いてＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。その結果、図１に示すように、30℃でも１，３−ジヒドロキシナフタレンの生成が確認され、上記３−２の工程でも脱炭酸反応が起こることが示唆された。また、１，３−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加すること、ならびに同一温度条件下でもｐＨを下げることにより、１，３−ジヒドロキシナフタレンの生成量が増加することも判明した。なお、生成した１，３−ジヒドロキシナフタレンは東京化成工業株式会社より購入した標品の１，３−ジヒドロキシナフタレンとＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、１，３−ジヒドロキシナフタレンの定量は１，３−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（286nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１４３】
実施例４． バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株による１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記１−２で述べた方法と同じ方法を用いて、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株を培養し、集菌した後、上記１−２で述べた方法を用いてＴＮＡ２４１株の休止菌体の懸濁液を調製した。この休止菌体の懸濁液99.6μLを30℃、1000rpmで5分間振とうした。0.4μLの0.5M ６―ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を加え、30℃、1000rpmの条件で反応を行った。経時的に反応液を2μLずつ採取し、それぞれの採取液2μLに対して8μLのアセトニトリルを加えて懸濁し、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、390μLの水を加えた後、懸濁した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、表１に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の同定は東京化成工業株式会社より購入した６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸と比較して、ＨＰＬＣのピークの保持時間と特異吸収波長ならびに質量分析計で測定した精密質量値を合わせて行い、定量は特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。その結果、反応開始前には2.0mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は2
4時間の反応で検出限界以下になり、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の蓄積が検出された。このジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は後述する実施例６−３に示すように、脱炭酸反応により１，６−ジヒドロキシナフタレンが生成することにより、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であることが判明した。
【０１４４】
以上の結果より、バークホルデリア・テラエＴＮＡ２４１株が持つ２−ナフトエ酸１−ヒドロキラーゼは６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の１位を水酸化し、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成することがわかった。
【０１４５】
実施例５．組換え大腸菌を用いた６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
５−１．大腸菌休止菌体による１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)をもとに、上記２−３で述べた方法を用いて誘導培養を行い、組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した。
【０１４６】
この懸濁液と100mMの６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む溶液1μLを用いて上記２−３で述べた方法により水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には1.05 mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は1時間の反応で0.42mMに減少し、実施例４で述べた１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から0.63mMと算出された。なお、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１４７】
５−２．組換え大腸菌の粗酵素液による６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を上記２−４で述べた方法で誘導培養を行い、該組換え大腸菌の粗酵素液を調製した。水酸化酵素反応は２−ナフトエ酸を終濃度1mMの６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸に、酵素反応時間を1時間から2時間に変更したこと以外は上記２−４で述べた方法で行い、水酸化酵素反応と反応産物の分析を行った。その結果、反応開始前には0.85 mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は2時間の反応で0.75mMに減少し、実施例４で述べた１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から0.1mMと算出された。なお、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１４８】
実施例６．１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，６−ジヒドロキシナフタレンの生産
６−１．１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の大量調製
上記で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_LRS)を用いて６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の大量調製を行った。該組換え大腸菌の培養、２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体の誘導発現および休止菌体の調製などは上記３−１で述べた方法と同じ方法で行った。調製した休止菌体の懸濁液を30℃、290rpmの条件で5分間加温した。その後、1mLの0.5M ６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間で4μLの反応液に対して16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表１に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。
【０１４９】
その結果、反応開始前には6.45mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で1.18mMに減少し、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に相当するピークが新たに検出された。生成した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から5.27mMと算出された。なお、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１５０】
６−２．１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の作製
上記６−１で調製した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む20mLの溶液に0.3mLの6N塩酸を加えて混合し、これに飽和量となる塩化ナトリウムを加えた後、酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5.0mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した酢酸エチル層の総量は14.0mLである。
【０１５１】
６−３．１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の加熱処理による脱炭酸反応
上記６−２で抽出した１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む酢酸エチル溶液を0.2mLずつ７本の1.7mLチューブに分注した後に、減圧乾燥処理を施して溶媒を蒸発させた。残留物に0.2mLの水を加え、ボルテックスミキサーで５分間撹拌して残留物を溶解した後に、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃の温度で１時間、加温した。加温後、0.2mLのＤＭＳＯを加えて撹拌した。この溶解液から4μLを分取し、16μLのアセトニトリルを加えて激しく懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表１に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。その結果、図２に示すように、80℃以上で加温することにより１，６−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。１，６−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した１，６−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の１，６−ジヒドロキシナフタレンのＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、１，６−ジヒドロキシナフタレンの定量は１，６−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（286nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１５２】
実施例７．組換え大腸菌を用いた１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
７−１．シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子とロドコキシン（rhodocoxin）遺伝子をコードするＤＮＡの増幅
シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子を得るため、ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、ＡＴＣＣと略記す）から製品番号ＡＴＣＣ・ＢＡＡ−９８として入手した。本菌株をTryptic Soy Broth（BD Difco社製）で培養した後、菌体を集菌し、QIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてゲノムＤＮＡを調製した。
【０１５３】
ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９株のシトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子とロドコキシン（rhodocoxin）遺伝子の塩基配列については、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略す）のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ；以下、ＧＢと略す）データベースから、ＧＢアクセッション番号NC_005296における塩基番号2099919〜2101157の配列（配列番号７）と2101167〜2101487の配列（配列番号１１）として得た。ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子を含むＤＮＡを得るために、ＣＹＰ１９９Ａ２内部の制限酵素サイトNotIサイトとSfiIサイトの破壊を同時に行うため、配列番号２４と２５のＰＣＲプライマーセット、配列番号２６と２７のＰ
ＣＲプライマーセットならびに、配列番号２８と２９のＰＣＲプライマーセットを設計した。これら３組のＰＣＲプライマーセットは、それぞれＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の前半部、中央部および後半部のＤＮＡ領域を増幅するためのＰＣＲプライマーセットである。ロドコキシン遺伝子を含むＤＮＡを得るために配列番号３０と３１のＰＣＲプライマーセットを設計した。なお、ＰＣＲプライマーの合成は株式会社ファスマックに外注した。上記で調製したゲノムＤＮＡを鋳型に上記２−２と同じ方法でＤＮＡの増幅を行った。
【０１５４】
７−２．シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子発現プラスミドの構築とロドコキシン遺伝子のクローニング
上記７−１で配列番号２４と配列番号２５、配列番号２６と配列番号２７、配列番号２８と配列番号２９の各ＰＣＲプライマーセットを用いて増幅させたＣＹＰ１９９Ａ２遺伝子の一部をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ制限酵素PacIと制限酵素HindIII、制限酵素HindIIIと制限酵素NdeI、制限酵素NdeIと制限酵素NotIでそれぞれ消化し、大腸菌発現ベクターであるpUXPEaLT19（特開２０１４−５０３７３を参照）のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pUXPEaLT_CYP199A2を造成した。上記７−１で配列番号３０と配列番号３１のＰＣＲプライマーセットで増幅させたロドコキシン遺伝子をコードするＤＮＡ断片をＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ断片の３'末端にＡ残基を付加した後、ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7Blue由来のＴベクターに組み込むことにより、プラスミドpT7Blue_rhodocoxinを造成した。
【０１５５】
７−３．Ｐ４５０ｃａｍの電子伝達系遺伝子を保持するシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３株の培養とゲノムＤＮＡの調製
シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２を活性化させるための電子伝達系としてＰ４５０ｃａｍの電子伝達系であるプチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子を利用することにした。両遺伝子を保持しているシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３株は理化学研究所微生物系統保存施設よりＪＣＭ６１５７として入手した。本菌株をＬＢ培地で培養し、菌体を集菌した後、該菌体からQIAGEN社製Gentra Puregene Yeast/Bact.キットを用いてゲノムＤＮＡを調製した。
【０１５６】
７−４．Ｐ４５０ｃａｍの電子伝達系遺伝子をコードするＤＮＡの増幅
シュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３株のプチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子の塩基配列については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、ＧＢアクセッション番号NG_036907における塩基番号16111〜16434の配列（配列番号１３）と塩基番号14787〜16055の配列（配列番号１５）として得た。プチダレドキシン遺伝子とプチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子を含むＤＮＡを得るにあたり、配列番号３２と配列番号３３のＰＣＲプライマーセットおよび配列番号３４と配列番号３５のＰＣＲプライマーセットを用いた。なお、ＰＣＲプライマーの合成は株式会社ファスマックに外注した。上記７−３で調製したゲノムＤＮＡを鋳型に上記２−２と同じ方法でＤＮＡの増幅を行った。
【０１５７】
７−５．Ｐ４５０ｃａｍの電子伝達系発現プラスミドの構築
配列番号３４と配列番号３５のＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により得られたプチダレドキシン・レダクターゼをコードするＤＮＡは制限酵素PacIと制限酵素NotIで切り出し、大腸菌低コピー発現ベクターであるpRTCXP19のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、pRTCXP_Redを造成した。なお、大腸菌低コピー発現ベクターであるpRTCXP19はプラスミドベクターpRTC_SfiI(特許公開番号：ＷＯ２０１２０８１０８４０８４を参照）の制限酵素SfiIサイトの中に配列番号３６で表されるＤＮＡを挿入して構築した。なお、配列番号３６に示すＤＮＡは、シュードモナス・プチダｍｔ−２株が持つＰｍプロモーターとＸｙｌＳ遺伝子を持っている。また、pRTCPmc8_lacZ（特開２０１４−５０３７３を参照）のlacZ遺伝子を含むＤＮＡをPacIとNotIで切り出し、pRTCXP19のPacI部位と
NotI部位の間に組み込むことにより、pRTCXP_lacZを造成した。
【０１５８】
配列番号３２と配列番号３３のＰＣＲプライマーセットを用いたＰＣＲ反応により得られたシュードモナス・プチダＡＴＣＣ１７４５３株のプチダレドキシンをコードするＤＮＡはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ・バイオ社製）による３’末端にＡ残基を付与する処理を行った後、ゲル電気泳動後により目的ＤＮＡを精製した。精製した目的ＤＮＡをpT7Blue（Novagen社製で、タカラバイオ社から購入）のＴベクターに組み込むことにより、pT7Blue_Prdxを造成した。
【０１５９】
pT7Blueに挿入したプチダレドキシンをコードするＤＮＡと上記７−２で得たロドコキシンをコードするＤＮＡは翻訳開始コドンの上流に制限酵素SwaI部位を有し、さらに終止コドン下流に制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位を有している。このため両遺伝子は制限酵素SwaI部位と制限酵素NotI部位により切り出すことができ、プチダレドキシン・レダクターゼ遺伝子の終止コドン下流の制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位に挿入することができる。pRTCXP_Redの制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位にプチダレドキシンをコードするＤＮＡを挿入し、Ｐ４５０ｃａｍの電子伝達系遺伝子発現プラスミドpRTCXP_RedPrdxを造成した。同様にして、上記7-2で造成したpT7Blue_rhodocoxinから制限酵素SwaI部位と制限酵素NotI部位により切り出したロドコキシンをコードするＤＮＡを挿入してＰ４５０ｃａｍのプチダレドキシン・レダクターゼとロドコキシン発現プラスミドpRTC_Redrhodを造成した。
【０１６０】
７−６．組換え大腸菌を用いた１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記７−２で造成したＣＹＰ１９９Ａ２発現プラスミドpUXPEaLT_CYP199A2を大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2)を造成した。
【０１６１】
この組換え大腸菌に上記７−５で造成したＰ４５０ｃａｍの電子伝達系遺伝子発現プラスミドpRTCXP_RedPrdx、Ｐ４５０ｃａｍのプチダレドキシン・レダクターゼとロドコキシン発現プラスミドpRTC_RedrhodoおよびpRTCXP_lacZをそれぞれ形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)、JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-Redrhodo)およびJM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-lacZ)を造成した。これらの組換え大腸菌を、それぞれ終濃度100mg/Lのアンピシリンと終濃度50mg/Lのカナマイシンを含む0.2mLのＬＢ液体培地で一晩培養した。同じ濃度の抗生物質を含む6mLのＬＢ液体培地に対して3/100容量の一晩培養液を接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。ｍ−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で蛋白質を誘導発現するための培養を４時間行った。この培養液をもとに、上記２−３で述べた方法を用いて組換え大腸菌の休止菌体の懸濁液を調製した後、この懸濁液を用いて1mMの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む反応液中で30℃、1000rpmの条件で18時間保温した。各反応時間で4μLの反応液に対して16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表１に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。以下、特記しない限り、「ＣＹＰ１９９Ａ２発現組換え大腸菌の休止菌体を用いた水酸化酵素反応と反応後の反応産物の分析」はこの方法を用いて行った。
【０１６２】
その結果、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)を用いた場合、反応開始前には1.51 mMであった１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は17時間の反応で0.004mMに減少し、新たに保持期間0.94分にジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の蓄積が検出された。このジヒドロキシ−２―ナフトエ酸は後述する実施例８に示すように、脱炭酸反応により１，７−ジヒドロキシナフタレンが生成することにより、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であることが判明した。
【０１６３】
以上の結果より、シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２は、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の７位を水酸化し、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を生成することが示された。また、生成した１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から1.51mMと算出された。
【０１６４】
同様にして、JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-Redrhodo)を用いた場合には、反応開始前には1.56 mMであった１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は17時間の反応で0.87mMに減少し、0.69mMの１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成が認められた。また、電子伝達系遺伝子の代わりにlacZ遺伝子を導入した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-lacZ)を用いた場合でも、17時間の反応で１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から0.19mM
１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生成が観察された。この結果から、大腸菌Ｋ−１２株は保有する電子伝達系でもシトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２の活性化が起こることが示された。なお、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（340nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１６５】
実施例８．１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生産
８−１．１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の大量調製
上記７−６で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPdrx)を用いて、上記３−１で述べた方法と同様の方法を用いて、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の代わりに１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸を原料として、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を大量に調製した。
【０１６６】
組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2- RedPdrx)の一晩培養液を終濃度100mg/mLのアンピシリンと終濃度50mg/mLのカナマイシンを含む200mLのＬＢ液体培地に接種し、対数増殖期になるまで30℃で培養した。ｍ−トルイル酸を終濃度1mMになるように添加し、さらに30℃で蛋白質を誘導発現するための培養を４時間行った。
【０１６７】
集めた菌体を5mLの50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄した後、吸光度600nmで20.0となる量の１％グルコースを含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）に懸濁し、30℃、290rpmの条件で5分間加温した。その後、0.5Mの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記７−６で述べた方法を用いて行った。その結果、反応開始前には1.3mMであった１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は20時間の反応で0.001mMに減少し、実施例７で述べた１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成した１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から1.3mMと算出された。なお、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（340nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１６８】
８−２．１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の作製
上記の反応で生成した１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を以下のようにして抽出した。１,７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む6mLの溶液に0.15mLの6N塩酸を加えて混合し、この溶液に飽和量となる塩化ナトリウムを加えた後、酢酸エチル溶液を5.0mL加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から4.0mLの溶液を回収した。残った溶液に5mLの酢酸エチルを加えて懸濁した後、遠心分離に供し、酢酸エチル層から5.0mLの溶液を回収した。この操作をもう一度繰り返した。回収した酢酸エチル溶液の容量は14.0mLであった。
【０１６９】
８−３．１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液の加熱処理による脱炭酸反応
上記８−２で得た１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸抽出液を0.5mLずつ8本の1.7mLチューブに分注した後、減圧乾燥器内で溶媒を蒸発させた。残留物を0.25mLの水に溶解した後、それぞれ30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃, 80℃, 90℃の温度で１時間、加温した。加温後、0.25mLのＤＭＳＯを加えて撹拌した。各々のチューブの溶液から4μLずつ採取し、それぞれに16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表１に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。その結果、図３に示すように、70℃以上に加温すると脱炭酸反応が起こり、１，７−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成量は加熱温度を上げることにより温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した１，７−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の１，７−ジヒドロキシナフタレンのＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、１，７−ジヒドロキシナフタレンの定量は１，７−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（336nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１７０】
実施例９．組換え大腸菌を用いた３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記７−６で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)を用いて、実施例８で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記７−６で述べた方法を用いて行った。その結果、反応開始前には1.1mMであった３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は20時間の反応で0.02mMに減少し、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが新たに検出された。生成したジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は標品の３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（東京化成工業株式会社より購入）と、ＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値で一致していたことから、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であることが判明した。なお、各化合物の定量はそれぞれの特異吸収波長（３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸：361nm、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸：385nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１７１】
実施例１０．３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，６−ジヒドロキシナフタレンの生産
１０−１．２，６−ジヒドロキシナフタレンの生成条件の検討
標品の３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を用いて、実施例８−３で述べた方法を用いて100℃の加熱により脱炭酸が起こることを確かめたところ、脱炭酸反応は観察されなかった。そこで、以下のようにして、100℃より高温の条件で３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の脱炭酸が起こるかを調べた。
【０１７２】
標品の３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸粉末（10mg）をPTFEサンプル瓶（内容量2mL、東京硝子器機株式会社より購入）に入れ、1mLの水を加えて懸濁することにより、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を調製した。この溶液に対して窒素ガスを１分間吹き付けて溶存酸素を除去した。この３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液が入ったPTFEサンプル瓶を高温高圧釜（デスクトップリアクターＯＭＬ−１特殊型、オーエムラボテック社製）に設置し、密閉した後、高温高圧釜内部を窒素ガスで置換した。反応温度は、175℃、200℃、225℃、250℃および275℃でそれぞれ１時間加温した。室温から各温度までの昇温時間については、175℃と200℃では60分、225℃では90分、250℃と275℃では120分に設定した。反応後、ＤＭＳＯを添加して撹拌することにより反応産物を溶解した後、ＤＭＳＯを追加して溶解液の総量が2mLになるように調整した。続いて、得られた溶解液から4μLを分取し、16μLのアセトニトリルを加えて懸濁した後、遠心分離に
供した。上清を全量採取し、1.7mLチューブに移し、380μLの水を加えた後、懸濁した。表２に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。
【０１７３】
【表２】
0006682274.tif 000003
【０１７４】
その結果、図４に示すように、200℃以上の加熱により３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，６−ジヒドロキシナフタレンの生成が認められ、その生成量は温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した２，６−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の２，６−ジヒドロキシナフタレンのＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、２，６−ジヒドロキシナフタレンの定量は２，６−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（339nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１７５】
１０−２．３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，６−ジヒドロキシナフタレンの生産
実施例６−２に述べた方法を用いて、実施例９で調製した20mLの３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む29.8mLの酢酸エチル溶液を調製した後、減圧濃縮法により2.25mLに濃縮した。
【０１７６】
このようにして得た３，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む1.0mLの酢酸エチル溶液をPTFEサンプル瓶に入れて減圧乾燥器で乾固させた。残留物を1.0mLの水に溶解した後、上記１０−１で述べた方法と同じ方法を用いて、250℃、1時間の加熱処理を行った。250℃までの昇温時間については120分に設定した。加熱処理を行った後、反応産物を上記１０−１で述べた方法と同じ方法を用いて分析した。
【０１７７】
その結果、加熱処理により3.9mMの２，６−ジヒドロキシナフタレンが生成したことがわかった。なお、２，６−ジヒドロキシナフタレンの定量は２，６−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（339nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１７８】
実施例１１．組換え大腸菌を用いた６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記７−６で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2-RedPrdx)を用いて、実施例８で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応さ
せた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記７−６で述べた方法を用い、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計のＨＰＬＣ分析の条件を表３に示す条件に変更して行った。
【０１７９】
その結果、反応開始前には1.01mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.38mMに減少し、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが検出された。生成したジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の減少量から0.63mMと算出された。また、実施例１２で示すように、本ジヒドロキシナフトエ酸をもとに脱炭酸反応により生成したジヒドロキシナフタレンが２，３−ジヒドロキシナフタレンであったことから、生成したジヒドロキシナフトエ酸は６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であることが判明した。なお、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１８０】
【表３】
0006682274.tif 000004
【０１８１】
実施例１２．６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの２，３−ジヒドロキシナフタレンの生産
実施例６−２に述べた方法を用いて、実施例１１で調製した64mLの６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む19.8mLの酢酸エチル溶液を調製した後、減圧濃縮法により2.5mLに濃縮した。
【０１８２】
実施例１０で述べた方法を用いて、この６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸溶液を0.25ｍLずつPTFEサンプル瓶に入れた後、減圧乾燥器で乾固させた後、残留物を1.0mLの水に溶解した。この６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液に対して窒素ガス置換処理を施した後、高温高圧釜内で、200℃、225℃、250℃、275℃および300℃で１時間加温した。室温から各温度までの昇温時間については、200℃では60分、225℃では90分、250℃では120分、275℃と300℃では150分に設定した。反応後、ＤＭＳＯを添加して撹拌することにより反応産物を溶解した後、ＤＭＳＯを追加して溶解液の総量が2mLになるように調整した。続いて、得られた溶解液に含まれる反応産物を実施例１１で述べた方法と同じ方法により分析した。
【０１８３】
その結果、図５に示すように、225℃以上の加熱により６，７−ジヒドロキシ−２−ナフ
トエ酸からの２，３−ジヒドロキシナフタレンの生成が認められ、その生成量は温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した２，３−ジヒドロキシナフタレンの同定は標品の２，３−ジヒドロキシナフタレン（東京化成工業株式会社より購入）のＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、２，３−ジヒドロキシナフタレンの定量は２，３−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（325nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１８４】
実施例１３．組換え大腸菌を用いた１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
１３−１．シトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体の構築
ＣＹＰ１９９Ａ２の１８５番目のフェニルアラニン残基をロイシン残基に置換した変異体（ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体）が２−ナフトエ酸の５位を水酸化できることが報告されている〔非特許文献７：Appl. Environ. Microbiol. Vol. 78, p.6087-6094 (2012)〕。この知見に基づいて、配列番号３７と配列番号３８で表されるＰＣＲプライマーを用いシトクロームＰ４５０・ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体を以下のようにして構築した。
【０１８５】
具体的には上記７−６で構築したpUXPEaLT_CYP199A2を鋳型として、CYP199A2の前半部分のDNAを配列番号２４と配列番号３７のＰＣＲプライマーセットを用いて、ならびにＦ１８５Ｌ変異が導入された後半部分のDNAを配列番号２９と配列番号３８のＰＣＲプライマーセットを用いて上記７−１に示した方法により増幅させた。増幅させたDNA断片をそれぞれ精製し、混合した後、これを鋳型に配列番号２４と配列番号２９のＰＣＲプライマーセットを用いて上記２−２で示した方法によりＦ１８５Ｌ変異が導入されたCYP199A2（以下、CYP199A2_F185Lとする）を増幅した。
【０１８６】
増幅したCYP199A2_F185LのDNA断片を回収し、制限酵素PacIと制限酵素NotIで切り出し、大腸菌発現ベクターであるpUXPEaLT19のPacI部位とNotI部位の間に組み込むことにより、CYP199A2_F185L発現プラスミドpUXPEaLT_CYP199A2_F185Lを造成した。これを大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L)を造成した。この組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L)に上記７−６で造成したＰ４５０ｃａｍの電子伝達系遺伝子発現プラスミドpRTCXP_RedPrdxを形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を造成した。
【０１８７】
１３−２．組換え大腸菌を用いた１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
上記で造成した組み換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を用いて実施例８で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記７−６で述べた方法を用い、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計のＨＰＬＣ分析の条件を表４に示す条件に変更して行った。その結果、反応開始前には1.47mMであった１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.41mMに減少し、精密質量数からジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と推定される新たな２つの化合物のピークがＨＰＬＣ保持時間1.54分と1.58分に出現した。保持時間1.58分の化合物は、保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値を合わせることにより、１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であると同定された。また、保持時間1.54分の化合物は、実施例１４で後述するように脱炭酸によって１，５−ジヒドロキシナフタレンが生成したことから、１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であると同定された。なお、１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（340nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１８８】
【表４】
0006682274.tif 000005
【０１８９】
実施例１４．１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，５−ジヒドロキシナフタレンと１，７−ジヒドロキシナフタレンの生産実施例６−２に述べた方法を用いて、上記で調製した5.0mLの１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む14.8mLの酢酸エチル溶液を得た。
【０１９０】
この１，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と１，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む酢酸エチル溶液を1.48mLずつ分注し、減圧乾燥器中で乾固した後、それぞれ1mLの水に懸濁した。続いて、上記８−３に述べた方法に従って加熱処理を行った後、表７に示す条件でＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計による分析を行った。
【０１９１】
その結果、図６に示すように、70℃以上に加温すると脱炭酸が起こり、１，５−ジヒドロキシナフタレンと１，７−ジヒドロキシナフタレンが生成することが確認され、その検出量は温度に依存して増加することが明らかになったなお、生成した１，５−ジヒドロキシナフタレンおよび１，７−ジヒドロキシナフタレンの同定は標品の１，５−ジヒドロキシナフタレン（東京化成工業株式会社より購入）および１，７−ジヒドロキシナフタレン（東京化成工業株式会社より購入）のＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、各化合物の定量はそれぞれの特異吸収波長（１，５−ジヒドロキシナフタレン：315nm、１，７−ジヒドロキシナフタレン：336nm）で形成されるそれぞれのピークエリアから算出した。
【０１９２】
実施例１５．組換え大腸菌を用いた３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
【０１９３】
実施例１３で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を用いて、実施例８で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は上記７−６で述べた方法を用いて行った。
【０１９４】
その結果、反応開始前には0.56mMであった３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で検出限界以下にまで減少し、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来するピークが溶出時間0.87分に検出された。このジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は、標品の３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（東京化成工業株式会社より購入）と比較して、ＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較から３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸であると同定した。生成した３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸は0.56mMと算出された。なお、各化合物の定量はそれぞれの特異吸収波長（３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸：361nm、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸：374nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１９５】
実施例１６．３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生産
１６−１．３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸から１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成条件の検討
東京化成工業株式会社より購入した３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸をもとに、上記１０−１で述べた方法と同じ方法を用いて３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液の脱炭酸条件を調べた。高温高圧釜の加熱温度は、200℃、225℃、250℃および275℃であり、１時間加温した。室温から各温度までの昇温時間については200℃を60分、225℃を90分、250℃と275℃を120分に設定した。反応後、ＤＭＳＯを添加して撹拌することにより反応産物を溶解した後、ＤＭＳＯを追加して溶解液の総量が2mLになるように調整した。続いて、得られた溶解液に含まれる反応産物を上記１０−１で述べた方法と同じ方法により分析した。
【０１９６】
その結果、図７に示すように、225℃以上の加熱により３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生成が認められ、その生成量は温度に依存して増加することが明らかになった。なお、生成した１，７−ジヒドロキシナフタレンの同定は東京化成工業株式会社より購入した標品の１，７−ジヒドロキシナフタレンのＨＰＬＣの保持時間、特異吸収波長およびＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて求めた精密質量値の比較により行った。また、１，７−ジヒドロキシナフタレンの定量は、１，７−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（336nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０１９７】
１６−２．３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，７−ジヒドロキシナフタレンの生産
実施例６−２に述べた方法を用いて、実施例１５で調製した25.0mLの３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む29.8mLの酢酸エチル溶液を得た。これを減圧乾燥器で1.25mLにまで濃縮した。
【０１９８】
このようにして得た３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む酢酸エチル溶液の内、1.0mLをPTFEサンプル瓶に入れて減圧乾燥器で乾固させた。残留物を1.0mLの水に溶解した後、上記１０−１で述べた方法と同じ方法を用いて、250℃、1時間の加熱処理を行った。250℃までの昇温時間は150分に設定した。加熱処理を行った後、反応産物を上記１０−１で述べた方法と同じ方法を用いて分析した。
【０１９９】
その結果、３，５−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸から、加熱処理により2.5mMの１，７−ジヒドロキシナフタレンが生成したことがわかった。なお、１，７−ジヒドロキシナフタレンの定量は１，７−ジヒドロキシナフタレンの特異吸収波長（336nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０２００】
実施例１７．組換え大腸菌を用いた６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の生産
実施例１３で造成した組換え大腸菌JM109/(pUXPEaLT_CYP199A2_F185L-RedPrdx)を用いて、実施例８で述べた方法と同じ方法を用いて菌体懸濁液を調製した。0.5Mの６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液を最終濃度で1.5mMになるように添加し、30℃、290rpmの条件で反応させた。各反応時間における反応液中の基質と反応産物の分析は実施例１１で述べた方法を用いて行った。その結果、反応開始前には1.49mMであった６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の濃度は15時間の反応で0.12mMに減少し、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に由来する２つのピークが保持時間1.26分と1.32分に新たに検出された。保持時間1.32分のピークは実施例１１で生成させた６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と特異吸収波長が一致していることから、６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と同定した。なお、６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の定量は６−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸の特異吸収波長（305nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０２０１】
一方、ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸に相当する分子量を持つ保持時間1.26分のピークは、実施例１８で後述するように、脱炭酸反応により１，２−ジヒドロキシナフタレンが生成したことから、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸と同定した。
【０２０２】
実施例１８．５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸からの１，２−ジヒドロキシナフタレンの生産
実施例６−２に述べた方法を用いて、実施例１７で調製した82mLの５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液をもとに酢酸エチルによる抽出操作を行って、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む19.8mLの酢酸エチル溶液を得た。これを減圧乾燥器で1.52mLにまで濃縮した
【０２０３】
このようにして得た５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸溶液を0.2ｍｌずつPTFEサンプル瓶に入れた後、減圧乾燥器で乾固させた。残留物を1.0mLの水に溶解して得られた５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸水溶液に対して窒素ガス置換処理を施した後、高温高圧釜内で、225℃、250℃、275℃および300℃の温度で１時間加温した。室温から各温度までの昇温時間については、225℃と250℃を120分、275℃と300℃を150分に設定した。反応後、ＤＭＳＯを添加して撹拌することにより反応産物を溶解した後、ＤＭＳＯを追加して溶解液の総量が2mLになるように調整した。続いて、得られた溶解液に含まれる反応産物を実施例１１で述べた方法と同じ方法により分析した。
【０２０４】
その結果、図８に示すように、５，６−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を含む溶液を250℃以上に加温すると、１，２−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。また、この溶液には少量の６，７−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸が混在しており、図８に示すように、275℃以上に加温すると、２，３−ジヒドロキシナフタレンが生成することがわかった。各化合物の定量は、それぞれの特異吸収波長（１，２−ジヒドロキシナフタレン：333nm、２，３−ジヒドロキシナフタレン：325nm）で形成されるピークエリアから算出した。
【０２０５】
[配列表の説明]
配列番号１：Burkholderia terrae TNA241株２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号２：Burkholderia terrae TNA241株の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質
配列番号３：Burkholderia terrae TNA241株の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号４：Burkholderia terrae TNA241株の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質
配列番号５：Burkholderia terrae TNA241株の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号６：Burkholderia terrae TNA241株の２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質
配列番号７：シトクロームＰ４５０水酸化酵素ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号８：シトクロームＰ４５０水酸化酵素ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質
配列番号９：ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５変異体の蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号１０：ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５変異体蛋白質
配列番号１１：ロドコキシン蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号１２：ロドコキシン蛋白質
配列番号１３：プチダレドキシン蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号１４：プチダレドキシン蛋白質
配列番号１５：プチダレドキシン・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡ
配列番号１６：プチダレドキシン・レダクターゼ蛋白質
配列番号１７：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号１８：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・大サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号１９：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー１
配列番号２０：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー２
配列番号２１：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・小サブユニット蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号２２：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号２３：２−ナフトエ酸１位水酸化酵素複合体・レダクターゼ蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号２４：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の前半部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号２５：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の前半部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号２６：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の中央部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号２７：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の中央部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号２８：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の後半部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号２９：ＣＹＰ１９９Ａ２蛋白質の後半部をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号３０：ロドコキシン蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号３１：ロドコキシン蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号３２：プチダレドキシン蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号３３：プチダレドキシン蛋白質をコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プ
ライマー
配列番号３４：プチダレドキシン・レダクターゼをコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用フォワード・プライマー
配列番号３５：プチダレドキシン・レダクターゼをコードするＤＮＡのＰＣＲ増幅用リバース・プライマー
配列番号３６： プラスミドベクターpRTCXP19内の２つのSfiI部位に挟まれた合成ＤＮＡ由来の塩基配列
配列番号３７：ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体蛋白質の作製用の合成ＤＮＡ１
配列番号３８：ＣＹＰ１９９Ａ２・Ｆ１８５Ｌ変異体蛋白質の作製用の合成ＤＮＡ２
【図１】
0006682274.tif 000006
【図２】
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【図３】
0006682274.tif 000008
【図４】
0006682274.tif 000009
【図５】
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【図６】
0006682274.tif 000011
【図７】
0006682274.tif 000012
【図８】
0006682274.tif 000013
【配列表】
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