(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含む、血糖上昇を抑制するための飲食品。
【請求項２】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩としてトマトの果実から得られたものを含む、請求項１に記載の飲食品。
【請求項３】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、飲食品全体に対して０．００１〜１重量％の割合で含まれる、請求項１又は２に記載の飲食品。
【請求項４】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、細胞内へのグルコース透過を抑制すること及び／又はＳＧＬＴ１の発現を抑制することにより血糖上昇を抑制する、請求項１〜３のいずれかに記載の飲食品。
【請求項５】
サプリメント、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、機能性食品又は健康補助食品である、請求項１〜４のいずれかに記載の飲食品。
【請求項６】
ジュース、清涼飲料、豆乳、ドリンク剤、茶、ビスケット、タブレット、顆粒粉末、粉末、カプセル、ペースト、ゼリー、スープ、調味料、ドレッシングの形状である、請求項５に記載の飲食品。
【請求項７】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を有効成分として含む、血糖上昇を抑制するための組成物。
【請求項８】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩としてトマトの果実から得られたものを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、組成物全体に対して０．００１〜８０重量％の割合で含まれる、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、細胞内へのグルコース透過を抑制すること及び／又はＳＧＬＴ１の発現を抑制することにより血糖上昇を抑制する、請求項７〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
血糖上昇抑制用の剤である、請求項７〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
サプリメント又は食品添加剤である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トマト種子由来サポニンであるトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含有する、血糖上昇を抑制する飲食品又は組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２０１３年の国際糖尿病連合の調査によると、日本における糖尿病の患者数はおよそ７２０万人であり、その予備群である「糖尿病の可能性を否定できない」人の人数は１，３００万人と推定されている。つまり、約１／６の日本国民が、少なくとも糖尿病の可能性を否定できない状態にある。
糖尿病は、失明や慢性腎不全、足の壊疽による切断といった合併症につながるばかりでなく、動脈硬化を促進し、心筋梗塞や脳梗塞など生命に関わる病気に至らしめることも少なくない。
【０００３】
近年の健康志向の高まりの下、糖尿病を予防するために、食事療法や運動療法が推奨されている。しかしながら食事や運動に関わる生活習慣は改善しにくいため、より習慣化しやすい手軽な方策として、血糖値の低下に予防的に用いることのできる飲食品が求められている。
特許文献１には高血糖症及び２型糖尿病を含む障害の治療、軽減又は予防に使用するための少なくとも１種のフラボノイドのグリコシド抱合体が加えられている組成物として、前記グリコシド抱合体が天然の食品又はその抽出物の形態で組成物に加えられているものについて記載されている。特許文献２には、ある特定の化合物とブドウ種子抽出物に含まれるプロアントシアニジンとを組み合わせた血糖値上昇抑制剤や同剤を含む飲食品について開示されている。プロアントシアニジンについては、血中ヘモグロビン糖化率を低値に制御し、糖尿病性白内障を含む種々な合併症の進行の予防と治療に有効であることが見出されている（特許文献３）。
【０００４】
さらに、特許文献４には、血糖値上昇を抑制する天然物由来の化合物として、紅茶水溶性画分から単離した、６単糖３分子と５単糖１分子からなる糖鎖を有する特定のナリンゲニン配糖体に、筋肉細胞へのグルコース取込み作用や血糖上昇抑制作用があることについて報告されている。特許文献５には、スピロ型サポニンを有効成分として含む医薬組成物として、糖吸収抑制剤について報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１５−５０５８２１号公報
【特許文献２】国際公開第２０１２／１４７６１９号パンフレット
【特許文献３】特開２０００−０４４４７２号公報
【特許文献４】特開２００８−０１３５２５号公報
【特許文献５】特開２００８−１６７３号公報
【特許文献６】国際公開第２０１２／１１５０２６号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）５７、３７８６−３７９１
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）５６、１１４３２−１１４４０
【非特許文献３】日本未病システム学会雑誌（２００６）１２、１−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、近年の健康志向の高まりに充分に応えられるほど、血糖上昇を十分に抑制する飲食品はない。したがって、本発明は、血糖上昇を十分に抑制する飲食品、及びかかる飲食品に用いることができる組成物を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねたところ、トマト果実のある特定の部分に含まれる成分が血糖上昇を抑制し得ることを見出し、さらに研究を重ねた結果本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、少なくとも以下の各発明に関する：
[１]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含む、血糖上昇を抑制する飲食品。
[２]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩としてトマトの果実から得られたものを含む、上記[１]に記載の飲食品。
[３]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、飲食品全体に対して０．００１〜１重量％の割合で含まれる、上記[１]又は[２]に記載の飲食品。
[４]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、細胞内へのグルコース透過を抑制すること及び／又はSGLT1の発現を抑制することにより血糖上昇を抑制する、上記[１]〜[３]のいずれかに記載の飲食品。
[５]サプリメント、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、機能性食品又は健康補助食品である、上記[１]〜[４]のいずれかに記載の飲食品。
[６]ジュース、清涼飲料、豆乳、ドリンク剤、茶、ビスケット、タブレット、顆粒粉末、粉末、カプセル、ペースト、ゼリー、スープ、調味料、ドレッシングの形状である、上記[５]に記載の飲食品。
[７]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を含む、血糖上昇を抑制するための組成物。
[８]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩としてトマトの果実から得られたものを含む、上記[７]に記載の組成物。
[９]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、組成物全体に対して０．００１〜８０重量％の割合で含まれる、上記[７]又は[８]に記載の組成物。
[１０]トマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩が、細胞内へのグルコース透過を抑制すること及び／又はSGLT1の発現を抑制することにより血糖上昇を抑制する、上記[７]〜[９]のいずれかに記載の組成物。
[１１]血糖上昇抑制用の剤である、上記[７]〜[１０]のいずれかに記載の組成物。
[１２]サプリメント又は食品添加剤である、上記[１１]に記載の組成物。
[１３]上記[７]〜[１２]のいずれかに記載の組成物を配合した飲食品。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、糖尿病の原因となる血糖上昇を抑制するための飲食品及び組成物が提供される。本発明の該組成物を飲食品（特にトマト加工飲食品）に配合した配合物に調製することにより、風味が損なわれず摂取しやすく、しかもトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩を単独で摂取するより効能がすぐれた飲食品が提供される。
【００１１】
トマトは、野菜の中で最も多く栽培されており、世界中で広く食され、人々の健康増進に高く貢献している野菜である。トマトには、例えば、リコピン、食物繊維（セルロース、ペクチン等）等、多くの種類の機能的な成分が含まれ、長年にわたってその研究が進められてきた。
サポニンの一種であるトマトシドＡは、トマト種子（種子を含むゼリー部）に非常に多く存在する成分であり（非特許文献１）、界面活性作用を有することが知られている（非特許文献２）。また、サポニンの中には血糖上昇抑制作用を有するものがあることも報告されている（非特許文献３）。しかしながら、これまでにトマトシドＡ又はその生理学的に許容される塩による血糖上昇の抑制に関する報告はない。例えば、特許文献６にはトマトシドＡを含むコレステロール上昇抑制剤、トリグリセリド上昇抑制剤や肝中コレステロール蓄積抑制剤について開示されているが、同文献には血糖上昇の抑制やトマトシドＡが血糖上昇抑制作用を有することについて全く示唆さえなされていない。
本発明は、トマトシドＡが公知の物質にはない作用機構により血糖上昇を抑制することを見出したことに基礎を置く、当業者といえどもその構成に想到し得ないばかりでなく、奏される効果を予測することも不可能な発明なのである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】トマトシドＡがグルコース透過に及ぼす影響の検討のうち、処理時間の影響を調べた試験例１−１において、トマトシドＡを分析するための３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｐｙｒａｚｏｌｉｎｅ−５−ｏｎｅ誘導体化法を示す図である。
【図２】試験例１−１におけるＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳ分析条件を示す図である。
【図３】試験例１−１において、３時間以上のトマトシドＡ処理において有意なグルコース透過抑制作用が認められたことを示す図である。
【図４】グルコース透過抑制作用に関するトマトシドＡの処理濃度を検討した試験例１−２において、１０μＭ以上のトマトシドＡにおいて有意なグルコース透過抑制作用が認められたことを示す図である。
【図５】トマトシドＡのＣａｃｏ−２細胞毒性を調べた試験例１−３において、トマトシドＡ添加群はＣｏｎｔｒｏｌ群と比べて細胞の増殖に差はなかったことを示す図である。
【図６】トマトシドＡのグルコーストランスポーターに及ぼす影響について調べた試験例２−１において、トマトシドＡ処理により、Ｃａｃｏ−２細胞のＳＧＬＴ１（ナトリウム依存型グルコース共役輸送体）の発現量が有意に抑制されたことを示す図である。
【図７】試験例２−１において、トマトシドＡはＧＬＵＴ２の発現量に影響しなかったことを示す図である。
【図８】トマトシドＡの腸管上皮における動態を評価した試験例２−２において、Ｃａｃｏ−２細胞単層膜を用いた透過試験の結果を示すＬＣ/ＴＯＦ−ＭＳ分析のチャートを示す図である。  トマトシドＡの頂膜側から側基底膜側への透過は認められなかったことにより（上から２番目のチャート）、トマトシドＡの腸管吸収性が極めて低いという従来の知見が確認されるとともに、６０分間のインキュベートによりトマトシドＡの側基底膜側から頂膜側への透過が認められたことから（上から３番目のチャート）、トマトシドＡが腸管上皮細胞に一度取り込まれた後、細胞外に排出されている可能性が示される。
【図９】試験例２−２において、腸管上皮の頂膜側及び側基底膜側の両方において、トマトシドＡのトマトシドＢへの代謝は認められなかったことを示す図である。
【図１０】トマトシドＡのＣａｃｏ−２細胞における細胞外排出経路への関与を評価した試験例２−３において、腸管における主要な排出トランスポーターであるＰ−ｇｐ及日ＭＲＰ２からの排出を遮断状態においてトマトシドＡのグルコース抑制作用が有意に消失したことを示す図である。
【図１１】トマトシドＡのＣａｃｏ−２細胞における細胞内流入経路について検討した試験例２−４において、ＡＳＢＴ（胆汁酸トランスポーター）からの細胞内流入を遮断した状態においてトマトシドＡのグルコース透過抑制作用が有意に消失したことを示す図である。
【図１２】ＡＳＢＴ―ノックダウン細胞株を用いてトマトシドＡの細胞内流入経路としてのＡＳＢＴの関与を評価した試験例２−５において、ＡＳＢＴ−ｓｉ ＲＮＡ濃度２５ｎＭ ４８時間インキュベートにおいて有意にＡＳＢＴのタンパク質発現量の抑制が認められたことを示すウエスタンブロットの写真図及び試験例２−５において、ＡＳＢＴ−ｓｉ ＲＮＡ濃度２５ｎＭ、４８時間インキュベートにおいて有意にＡＳＢＴのタンパク質発現量の抑制が認められたことを示す図である。
【図１３】試験例２−５において、ＡＳＢＴ-ＫＤ細胞株におけるトマトシドＡのグルコース透過抑制作用はみられなかったことを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明をより具体的に説明する。
本発明において「血糖上昇を抑制する」、「血糖上昇の抑制」、「血糖上昇抑制」とは、個人において、本発明の飲食品又は組成物を摂取する前に生じていた、血糖値が増大する傾向が緩和されることを意味する。
【００１４】
（トマトシドＡについて）
本発明の飲食品及び組成物の有効成分であるトマトシドＡ（「トマトサイドＡ」又は「ｔｏｍａｔｏｓｉｄｅ Ａ」と称されたり記載されたりすることがある）は、以下の構造を有する化合物である。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
トマトシドＡは、サポニンの一種であり、トマト種子に多く含まれることが知られる水に難溶性の化合物である。本発明の組成物における有効成分であるトマトシドＡの生理学的に許容される塩としては上記の構造を有する化合物のナトリウム塩、カリウム塩等が挙げられるが、所望の作用を有し、生理学的に許容される塩であれば限定されない。以下においては、トマトシドＡ及び／又はその生理学的に許容される塩を「トマトシドＡ」ということがある。
【００１７】
本発明の飲食品又は組成物におけるトマトシドＡとしては、化学的に合成したものでも天然物由来のものでもよく、また、市販のものを用いてもよい。トマト種子を含むトマト果実由来物を、抽出溶媒として１０体積％以上９０体積％未満の有機溶媒を用いて抽出する工程を含む公知の方法により、トマトシドＡを含む組成物を簡便に得ることもできる（特許文献５）。
【００１８】
本発明におけるトマトシドＡの原料にできるトマト果実由来物は、トマト種子を含むものであれば限定されず、トマトの品種や成熟度によって、種子の形状、数量が異なることを考慮することが好ましい。トマト果実の搾汁液を得る過程において得られる搾汁粕は、一般的に廃棄されるか、家畜飼料となるが、この搾汁粕を用いれば、廃棄原料を有効利用でき、しかも高濃度のトマトシドＡを含む本発明の飲食品や組成物を一層容易かつ効率よく得ることができるため好ましい。トマトジュース、トマトピューレ、トマトペーストなどに用いるトマト果実の搾汁液は、常法により、トマト果実を洗浄し、破砕したのち予備加熱を行い、次いで、これを搾汁して得られる。この搾汁の過程において、果実の約１〜５％が搾汁粕として発生する。搾汁粕は主として果皮と種子から構成されており、この中には水溶性食物繊維であるペクチンや不溶性食物繊維であるセルロース、ヘミセルロースなどの繊維質が豊富に含まれるだけでなく、ポリフェノール類やサポニン類も残存している。
【００１９】
トマトシドＡをトマトから抽出物として得て、該抽出物として得られたトマトシドＡを含む組成物は、トマトシドＡのほかに、原料としたトマト果実由来物に含まれるポリフェノール類やトマトシドＡ以外のサポニン類も含有し得る。抽出物として得られたトマトシドＡを含む該組成物は必要に応じて、例えば、クロマトグラフィー等によりさらに精製を行ってもよい。得られた組成物にトマトシドＡが含まれているかは、例えば、標準品を用いたＨＰＬＣ等、常法により確認することができる。得られた組成物は、そのまま本発明の飲食品に配合してよいし、本発明の組成物としてもよい。
【００２０】
トマトシドＡの血糖上昇抑制活性については、理論に束縛されるものではないが、グルコースの細胞内への透過の抑制が関与していると考えられる。また、トマトシドＡはナトリウム依存型グルコース共役輸送体であるＳＧＬＴ１の発現を抑制する活性も有する。
したがって、本発明の飲食品及び組成物のうち、グルコースの細胞内への透過の抑制及び／又はＳＧＬＴ１の発現の抑制により血糖上昇を抑制するものは、より効率的に血糖上昇を抑制することができるため好ましい。
なお、本発明において「組成物」とは、飲食品又は化合物単体以外のあらゆる物質を包含し、その用途は、特定の用途について示す記載がない限り限定されない。
【００２１】
（本発明の飲食品）
本発明の飲食品は、有効成分であるトマトシドＡを、摂取者における血糖上昇を抑制し得る量で含む飲食品であれば限定されない。本発明の飲食品に、動物又は植物（それらの器官・組織等の部分を含む）自体は包含されない。
本発明の飲食品におけるトマトシドＡの量は、摂取者における血糖上昇を抑制し得る量であれば限定されない。当該量として、典型的には乾燥重量で好ましくは０．００１〜８０重量％、より好ましくは０．００５〜６０重量％、特に好ましくは０．００５〜０．６重量％含有する。また、トマトシドＡを配合して本発明の飲食品とする場合、上記の量を勘案し、さらにトマトシドＡの含有量の増加に伴い発生する可能性がある苦味を考慮してトマトシドＡを配合することは好ましい。
【００２２】
本発明の飲食品としては、サプリメント、特定保健用食品、栄養機能食品、健康食品、機能性食品、健康補助食品、通常の飲食品等が挙げられる。形状としては、ジュース、清涼飲料、ドリンク剤、茶等の液状、ビスケット、タブレット、顆粒粉末、粉末、カプセル等の固形、ペースト、ゼリー、スープ、調味料、ドレッシング等の半流動状が例示される。これらの飲食品は、いずれも当業者に公知の手法を用いて、トマトシドＡを添加して製造することができる。本発明の飲食品に包含される食品としては、クッキー、ナッツ入りチョコレートケーキ、クラッカー、ブレクファストバー、エナジーバー、コーンフレーク等の穀物食及びケーキのようなベークされた食品であってよく、飲料品としては果汁飲料、野菜飲料、炭酸飲料、スポーツ飲料、コーヒー及び茶飲料等であってよい。
【００２３】
上記の飲食品は、当該飲食品が血糖上昇を抑制する作用を有する旨の表示を付した飲食品であってもよい。
【００２４】
上記の飲食品の摂取量は、用途に応じて適宜調整することができるが、例えば、トマトシドＡを乾燥物換算で０．１〜２００ｍｇ／日、好ましくは１０〜１５０ｍｇ／日、より好ましくは２０〜１００ｍｇ／日程度摂取することができる。摂取量が多いほど所望の効果を得やすい。摂取回数は制限されず、例えば、１日１〜３回であり、必要に応じて摂取回数を増減してよい。
【００２５】
本発明の飲食品の製造方法は限定されず、トマトシドＡを含有するトマトのような天然物を用いた通常の飲食品の製造方法を採用することができる。本発明の飲食品におけるトマトシドＡは、同飲食品を製造する過程において適宜外部から加えて量を調整してよい。この場合の外部から加えられるトマトシドＡは化合物自体であってよいし、液体の希釈剤又は担体に溶解もしくは懸濁させるか、あるいは固体の希釈剤又は担体に保持させるなどして、他の成分とともに、あるいは他の成分とは別個に単独で、配合してよい。
上記液体の希釈剤又は担体として、水、アルコール類、グリコール類、グリセリン及び界面活性剤等が挙げられ、固体の希釈剤又は担体としてデキストリン、トータルミルクプロテイン、アラビアガム及びシュークロース等が挙げられ、これらの希釈剤又は担体の１種又は２種以上の混合物を用いてよい。これら希釈剤又は担体のうち液体の希釈剤又は担体が好ましく、液体の希釈剤又は担体としてアルコール類が好ましく、エタノールが特に好ましい。
また、本発明の飲食品にトマトシドＡ以外の成分を添加する工程がある場合には、当該トマトシドＡ以外の成分を溶解又は懸濁した液体にトマトシドＡを溶解もしくは懸濁して、前記トマトシドＡ以外の成分とともに添加してよい。あるいは、トマトシドＡを溶解もしくは懸濁した液体に、飲食品の他の成分又は原料を加えて、これらの他の成分又は原料とともに添加してもよい。
【００２６】
（本発明の組成物）
本発明の組成物はトマトシドＡを含むものであればその形態やトマトシドＡの含有量は限定されない。
本発明の組成物の形態には血糖上昇抑制用の剤も包含され、当該剤としてサプリメント及び食品添加剤が例示される。本発明におけるサプリメントは、トマトシドＡをトマトシドＡ以外の成分と配合するなどして得られるものである点において組成物に属する一方、単独で経口的に摂取し得ることから飲食品にも属する。
本発明の組成物に、動物又は植物（それらの器官・組織等の部分を含む）自体は包含されない。
本発明の組成物は、有効成分であるトマトシドＡを、乾燥重量で好ましくは０．００１〜８０重量％、より好ましくは０．００５〜６０重量％、特に好ましくは０．００５〜０．６重量％含有する。また、本発明の組成物を特に飲食品に配合する場合、トマトシドＡ含有量の増加に伴い苦味が増す場合もあることも考慮してトマトシドＡを配合する量を調整することは好ましい。
【００２７】
本発明の組成物は、各種飲食品に配合することができる。かかる飲食品として上記において例示した飲食品を挙げることができる。
【００２８】
本発明の組成物は、トマトシドＡを液体の希釈剤又は担体に溶解もしくは懸濁させるか、あるいは固体の希釈剤又は担体に保持させるなどして、他の成分とともに、あるいは他の成分とは別個のものとしてよい。
上記液体の希釈剤又は担体として、水、アルコール類、グリコール類、グリセリン及び界面活性剤等が挙げられ、固体の希釈剤又は担体としてデキストリン、トータルミルクプロテイン、アラビアガム及びシュークロース等が挙げられ、これらの希釈剤又は担体の１種又は２種以上の混合物を用いてよい。これら希釈剤又は担体のうち液体の希釈剤又は担体が好ましく、液体の希釈剤又は担体としてアルコール類が好ましく、エタノールが特に好ましい。
【００２９】
本発明の組成物は、トマト加工飲食品に好ましく配合して飲食品とすることができる。すなわち、本発明は、本発明の組成物の配合物である飲食品にも関する。
本発明の組成物は、トマト加工飲食品に配合されると、トマトシドＡを添加しても、トマト感やコク味が損なわれず、トマトシドＡを添加しないトマト加工飲食品と比較して風味の損なわれないトマト加工飲食品となるからである。また、トマトシドＡを配合したトマト加工飲食品は、トマトシドＡのみを摂取した場合と比較して、より高い血糖上昇抑制作用を有し得る。
かかるトマト加工飲食品の例としては、トマトジュース、トマトミックスジュース、トマトケチャップ、トマトソース、チリソース、トマト果汁飲料、固形トマト、トマトピューレ、トマトペースト、トマトスープ等が挙げられる。これらのトマト加工飲食品は、通常のトマト加工飲食品の製造法（レシピなど）に従い、トマトシドＡを含む本発明の組成物を添加してそれぞれ通常の製法に従って調製される。なお、一般的にトマト加工飲食品は、製造過程で種子が除去され、トマトシドＡはほとんど検出されない。例えば、後述の実施例１−１に記載のＨＰＬＣ法でトマトジュース中のトマトシドＡ含有量を測定した場合、検出限界以下であったことを本発明者らは確認している。また、さらに高感度の分析法（ＬＣ／ＭＳ）による測定も行ったところ、トマトジュース中のトマトシドＡ含有量は０．０００５重量％以下であると考えられた。
【００３０】
本発明の組成物をトマト加工飲食品に配合した場合、トマト感やコク味が損なわれず、本発明の組成物を添加しないトマト加工飲食品と比較して風味が損なわれないトマト加工飲食品となる。また、本発明の組成物を配合したトマト加工飲食品においては、トマトシドＡのみを摂取した場合と比較して、トマトに由来する他の成分との相乗効果により、より高い血糖上昇抑制作用が奏される可能性がある
【００３１】
以下に例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの記載によりいかなる意味においても制限されるものではない。
[実施例１]
（本発明の組成物の製造：トマト搾汁粕からのトマトシドＡの抽出）
１−１．抽出溶媒の検討
完熟した加工用トマト果実をブラシ洗浄し、チョッパーで破砕した後、間接式のチューブ型加熱器にて予備加熱を行い、これをパルパーフィニッシャーにて搾汁して搾汁液を得た。搾汁過程で発生した搾汁粕を凍結乾燥し、さらに粉砕してトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物を得た。得られた乾燥物２０ｇに、表１に示す各抽出溶媒１，０００ｍＬを加え、２５℃の温度条件下にて２時間撹拌抽出した後、濾過した。得られた抽出液を減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ抽出物を得た。抽出溶媒としては、１０体積％エタノール（水とエタノールの体積比９：１の混合物）、３０体積％エタノール（水とエタノールの体積比７：３の混合物）、５０体積％エタノール（水とエタノールの体積比５：５の混合物）、７０体積％エタノール（水とエタノールの体積比３：７の混合物）、９０体積％エタノール（水とエタノールの体積比１：９の混合物）、０．１％酢酸添加した７０体積％エタノール（水、エタノール、酢酸の体積比３：７：０．０１の混合物）、１％酢酸添加した７０体積％エタノール（水、エタノール、酢酸の体積比３：７：０．１の混合物）を用いたときの各抽出物のトマトシドＡの相対濃度を表１中に併記した。相対濃度は以下に記載の方法で算出した。
【００３２】
相対濃度の算出方法：得られた各抽出液を、常法により、減圧下で濃縮し、逆相系固層抽出カラム(Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ製)に吸着させた後、水洗浄し、次いでメタノールで溶出させた。得られたメタノール溶出液を再度減圧下で濃縮した試料溶液をフィルター（０．４５μｍ）で濾過し、逆相系カラム（Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、資生堂製）を装着した高速液体クロマトグラフ（型式ＳＣＬ−１０ＡＶＰ、島津製作所製）を用いて、カラム温度３５℃でグラディエント法により分析した。移動相Ａ液は蒸留水、Ｂ液はアセトニトリル溶液とし、試料注入量は１０μＬ、検出は蒸発光散乱検出器（型式ＥＬＳＤ−ＬＴII、島津製作所製）により行った。測定後、最も高い抽出効率を示した７０体積％エタノールによる抽出濃縮物のトマトシドＡ含量を１００として、各抽出条件のトマトシドＡの相対濃度を算出した。
【００３３】
表１に示した結果から、トマト種子サポニントマトシドＡは、３０〜７０体積％エタノールを抽出溶媒としたときに十分な抽出効果が得られることが明らかになった。なお、抽出溶媒として用いた水とエタノールの混合液自体のｐＨ測定は困難であったが、抽出溶媒を減圧濃縮してエタノールを除去した後の「濃縮液」のｐＨは：抽出物試料１〜４で用いた抽出溶媒についてｐＨ４．３；抽出物試料５で用いた抽出溶媒についてｐＨ４．２；抽出物試料６で用いた抽出溶媒についてｐＨ３．４；抽出物試料７で用いた抽出溶媒についてｐＨ２．８であった。濃縮液のｐＨよりも抽出溶媒のｐＨが高くなることを考慮すれば、抽出溶媒のｐＨは強酸性ではないことが望ましく、ｐＨ４以上が好ましく、ｐＨ５以上がより好ましいと考えられた。また、上記「相対濃度の算出方法」におけるＨＰＬＣにおいて、予め作製した既知濃度のトマトシドＡ標準溶液と比較することにより、トマトシドＡ濃度を算出したところ、７０体積％エタノールを抽出溶媒としたときに得られる抽出物（未乾燥処理）のトマトシドＡ濃度は、１．３重量％であった。同様の手法を用いて市販のトマトジュース中のトマトシドＡ含有量を測定したところ検出限界以下であったため、ＬＣ／ＭＳ法を用いて測定を行った結果、市販のトマトジュース中のトマトシドＡ含有量は０．０００５重量％以下であると考えられた。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
１−２．本発明の組成物の製造
上記１−１で得られたトマト種子を含むトマト搾汁粕の乾燥物２０ｇに、抽出溶媒として７０体積％エタノール１，０００ｍＬを加え、室温下にて２時間撹拌抽出した後、濾過した。濾過後の残渣について、さらに同様の抽出処理を１回行い、得られた全２回の抽出液を合わせて減圧下にて濃縮し、トマトシドＡ粗抽出物を得た。得られた粗抽出物を逆相系カラムクロマトグラフィー(ＹＭＣ−ＯＤＳ−Ａ、ＹＭＣ製)に吸着させ、水、４０体積％メタノール、７０体積％メタノール、１００体積％メタノールで順次溶出して得た溶出画分を凍結乾燥して、トマトシドＡを６０重量％含有するトマトシドＡ含有調製物として本発明の組成物を得た。
【００３６】
（本発明の飲食品の製造）
[実施例２]トマトジュース
シーズンパックトマトジュースの製造方法には、トマト洗浄、選別、破砕、加熱、搾汁、調合、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程があり、この調合工程で、搾汁したトマトジュースにトマトシドＡを添加して調合し、有塩の場合のみ食塩が加えられ、窒素ガスを混合して減圧脱気して、溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、１２１℃、約１分の加熱殺菌をして、９０℃まで冷却され、缶に充填される。また、濃縮還元品の製造法は、開けだし工程で、トマト濃縮物を開けだし、規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈する。その後、トマトシドＡを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。
【００３７】
【表２】
0006719953.tif 000004
【００３８】
[実施例３]野菜ミックスジュース
搾汁したトマトジュース、あるいは、トマト濃縮物を規定の無塩可溶性固形分（４．５以上）に水希釈して得たトマトジュースに、各種野菜汁及びトマトシドＡを添加して調合し、脱気、殺菌、充填、冷却及び箱詰め工程を経て製造される。
【００３９】
【表３】
0006719953.tif 000005
【００４０】
[実施例４]トマトソース
以下の表に示す全原材料を混合して、窒素ガスを混合して減圧脱気して溶存酸素濃度を３ｐｐｍ以下とした後、２号缶に充填し、１１０℃、３０分のレトルト殺菌をする。
【００４１】
【表４】
0006719953.tif 000006
【００４２】
[試験例Ａ]
（トマトシドＡ含有トマトジュースの官能評価）
実施例１で得られたトマトシドＡを６０重量％含有する調製物を、表５に示す量（トマトシドＡ添加量に換算して０ｍｇ〜２０ｍｇ／１００ｇ）添加したトマトジュース（食塩無添加）を作製し、トマト感、コク味及び苦味に関してパネリスト８名による官能評価を行った。トマトシドＡを添加しないトマトジュース（対照）のトマト感、コク及び苦味の強さを７段階中４としたときの、各トマトジュースのトマト感、コク及び苦味の強さを７段階で評価し、パネリスト８名の評価の平均を算出した。結果を表５に示す。トマトシドＡを添加しても、トマトジュースのトマト感やコク味は損なわれず、トマトシドＡを添加しないトマトジュースと比較して遜色ないトマト加工飲食品となった。
【００４３】
【表５】
0006719953.tif 000007
【００４４】
[試験例Ｂ]
（トマトシドＡの血糖上昇抑制作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験））
血中コレステロール抑制作用が報告されているトマトシドＡの腸管のグルコース吸収に及ぼす影響を、ヒト結腸由来細胞株（以下「Ｃａｃｏ−２細胞」と記載する）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏにて評価し、血糖上昇抑制におけるトマトシドＡの有用性を検討した。
本試験は、トマトシドＡがグルコース透過に及ぼす影響を調べること（試験例１）、及びトマトシドＡのグルコース透過抑制作用に至るメカニズムを解明すること（試験例２）を目的とし、試験例１のシリーズとして試験例１−１〜試験例１−３を、試験例２のシリーズとして試験例２−１〜試験例２−５を、それぞれ行った。
【００４５】
（試験例１）
[目的]
トマトシドＡがグルコース透過に及ぼす影響を調べる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）。
[試験例１−１]  トマトシドＡがグルコース透過に及ぼす影響の検討（処理時間依存）
[方法]
コラーゲンコートしたＣｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ-２細胞を４.０×１０５ ｃｅｌｌｓ/ｍＬの濃度で播種し、腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ-２細胞単層膜を形成させた後、１０μＭのトマトシドＡ溶液で１、３、６及び２４時間の処理を行った。
トマトシドＡ溶液除去後、Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔの頂膜側にｐＨ６．０のグルコースを溶解させていないＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ液(以下、「ＨＢＳＳ液」という）を０．５ｍＬ添加し、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔの側基底膜側にｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１５分間プレインキュベーションを行った。
その後、Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔの頂膜側及び側基底膜側のＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側には１３Ｃ６-グルコース（１ｍＭ）を含むＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、側基底膜側にはＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加した。
３７℃のＣＯ２ インキュベーター中で３０分間インキュベーションを行った後、側基底膜側のＨＢＳＳ液を３００μＬ回収し、下記のプロトコールＦｉｇ.１（図１）に従って、トマトシドＡの３-ｍｅｔｈｙｌ-１-ｐｈｅｎｙｌ-２-ｐｙｒａｚｏｌｉｎｅ-５-ｏｎｅ（ＰＭＰ）誘導体化を行った。
その後、下記の条件Ｆｉｇ.２（図２）にてＬＣ-ＴＯＦ/ＭＳ分析に供した。
ＬＣ-ＴＯＦ/ＭＳ分析は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ｓｅｒｉｅｓ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ 及びＭｉｃｒＯ-ＴＯＦ  ＩＩを用い、ポジティブモードにより測定した。
【化２】
0006719953.tif 000008
[結果・考察]
１０μＭのトマトシドＡで１、３、６及び２４時間処理したＣａｃｏ-２細胞単層膜を用いてグルコースの透過試験を行ったところ、Ｆｉｇ.３（図３）に示すように、３時間以上のトマトシドＡ処理において、有意なグルコース透過抑制作用が認められた（％ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ: １時間, １０１．０±１．３；３時間, ６３．０±６．８；６時間, ５９．２±４．１；２４時間，７２．７±７．３）。
以上の結果より、トマトシドＡはグルコース透過抑制作用を有し、その作用発現はトマトシドＡ処理後３時間以上で起こることが示された。
【００４６】
[試験例１−２]  トマトシドＡがグルコース透過に及ぼす影響の検討（濃度依存）
[方法]
・透過試験(処理濃度)
コラーゲンコートしたＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ-２細胞を播種し、腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ-２細胞単層膜を形成させた後、トマトシドＡ溶液（５、１０及び２０μＭ）で３時間処理を行った。
トマトシドＡ溶液除去後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側にグルコースを溶解させていないｐＨ６．０のＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、また、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの側基底膜側にｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１５分間プレインキュベーションを行った。
その後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側及び側基底膜側のＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側には１３Ｃ６-グルコース（１ｍＭ）を含むＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、側基底膜側にはＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加した。
３７℃のＣＯ２インキュベーターを用いて３０分間インキュベーションを行った後、側基底膜側のＨＢＳＳ液を３００μＬずつ回収し、試験例１−１のプロトコールに従って、ＰＭＰ誘導体化を行った後、ＬＣ-ＴＯＦ/ＭＳ分析に供し、透過したグルコース量を測定した。
・誘導体化プロトコール：試験例１−１と同様とした。
・ＬＣ/ＴＯＦ-ＭＳ分析条件：試験例１−１と同様とした。
【００４７】
[結果・考察]
処理濃度５、１０及び２０μＭのトマトシドＡ溶液で３時間処理したＣａｃｏ-２細胞単層膜を用いて、グルコースの透過試験を行ったところ、Ｆｉｇ.４（図４）に示すように、１０μＭ以上において有意なグルコース透過抑制作用を示した（％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ：５μＭ, ８１．７±０．４；１０μＭ, ６３．０±６．８；２０μＭ, ７６．０±２．３）。
以上の結果から、本試験において十分なグルコース透過抑制作用が認められたトマトシドＡ濃度１０μＭで３時間処理したＣａｃｏ-２細胞単層膜を用いて以後の検討を行うことにした。
【００４８】
[試験例１−３]  トマトシドＡのＣａｃｏ-２細胞毒性測定
[方法]
コラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートにＣａｃｏ-２細胞を播種した（１．０×１０４ ｃｅｌｌｓ／１００μＬ）。その後、１日間インキュベートし、トマトシドＡ溶液（１０μＭ、１００μＭ）で３時間処理を行った。処理後、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８を添加しプレートリーダーで測定を行った（４５０ｎｍ）。
【００４９】
[結果・考察]
トマトシドＡの細胞毒性試験の結果をＦｉｇ.５（図５）に示す。
トマトシドＡ添加群は、Ｃｏｎｔｒｏｌ群と比べて細胞の増殖に差はなかったことから、トマトシドＡはＣａｃｏ−２細胞に対して、細胞毒性を有していないことが明らかとなった。
【００５０】
（試験例２）
[目的]
トマトシドＡのグルコース透過抑制作用に至るメカニズムを解明する（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験）。
[試験例２−１]  トマトシドＡのグルコーストランスポーターに及ぼす影響
試験例１−１〜試験例１−３により、トマトシドＡがＣａｃｏ−２細胞においてグルコース透過抑制作用を有することが明らかとなった。
腸管上皮細胞には、グルコースの吸収を担うグルコーストランスポーターが存在する。本知見は、トマトシドＡが、頂膜側からグルコースを細胞内へと流入させるナトリウム依存型グルコース共役輸送体ＳＧＬＴ１、及び細胞内から側基底膜側への輸送を担うＧＬＵＴ２の発現に対して影響を及ぼしている可能性を示唆した。
そこで、ウエスタンブロット法を用いてトマトシドＡのグルコーストランスポータータンパク質発現量への影響を評価した。
[方法]
下記スキームにより行った。
【化３】
0006719953.tif 000009
[結果・考察]
膜上で分化させたＣａｃｏ−２細胞を、１０μＭのトマトシドＡ溶液で３時間処理を行い、処理後、Ｃａｃｏ−２細胞からタンパク質を回収し、ウエスタンブロットに供した。その結果をＦｉｇ.６（図６）及びＦｉｇ.７（図７）に示した。
トマトシドＡ処理により、Ｃａｃｏ−２細胞のＳＧＬＴ１の発現量が有意に抑制された（図６）。一方で、ＧＬＵＴ２の発現量に顕著な差はみられなかった（図７）。
よって、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用は、ＳＧＬＴ１発現量の抑制が関与していることが示唆された。
【００５１】
[試験例２−２]  トマトシドＡの腸管上皮における動態の評価
[方法]
コラーゲンコートしたＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ−２細胞を播種し、腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ−２細胞単層膜を形成させた後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側にｐＨ６．０のＨＢＳＳ溶液を０．５ ｍＬ添加し、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの側基底膜側にｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１５分間プレインキュベーションを行った。
その後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側及び側基底膜側の（−）ＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側には１ｍＭのトマトシドＡを含むＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、側基底膜側にはＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で３０分間インキュベーションを行った。
側基底膜側のＨＢＳＳ液を３００μＬずつ回収し、ＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳ分析に供した。当操作の頂膜側と側基底膜側を逆にした試験についても同様に行った。
【００５２】
[結果及び考察]
トマトシドＡの腸管吸収性は極めて低いことが知られているが、Ｃａｃｏ−２細胞単層膜を用いた透過試験の結果（Ｆｉｇ.８）（図８）からもトマトシドＡの頂膜側から側基底膜側への透過は認められなかった。
一方で、１ｍＭトマトシドＡを側基底膜側に添加し同様に透過試験を行ったところ、６０分間インキュベートにより側基底膜側から頂膜側への透過が認められた。本知見は、トマトシドＡが腸管上皮細胞に一度取り込まれた後、細胞外に排出されている可能性を示すものである。
また、腸管上皮においてトマトシドＡがトマトシドＢへの代謝を受けている可能性も示唆されていることから、実験終了後の頂膜側、及び側基底膜側の溶液をＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳに供したところ、頂膜側、側基底膜側両方においてトマトシドＡからトマトシドＢへの代謝は、認められなかった（Ｆｉｇ.９）（図９）。
トマトシドＢは下図に示すとおり、トマトシドＡが部分的に環化されて生成する代謝産物である：
【化４】
0006719953.tif 000010
【００５３】
[試験例２−３]  トマトシドＡのＣａｃｏ−２細胞における細胞外排出経路への関与評価
[目的]
試験例２−２において、Ｃａｃｏ−２細胞においてトマトシドＡが一度細胞に取り込まれ、細胞外へと排出されている可能性が示唆された。
腸管において物質の排出に関わるトランスポーターとして、ＡＴＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＡＢＣトランスポーター）が挙げられる。ＡＢＣトランスポーターは、腸管上皮の頂膜側に局在し、ＡＴＰの加水分解時に生じるエネルギーを利用して細胞内の化合物を排出するトランスポーターである。
そこで、腸管における主要なトランスポーターであるＰ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｐ−ｇｐ）及びＭｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＭＲＰ２）の阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ（５μＭ）を用いてグルコース透過試験を行った。
[方法]
コラーゲンコートした Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ−２細胞を播種し、腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ−２細胞単層膜を形成させた後、１０μＭのトマトシドＡ溶液で３時間処理を行った。
この際、Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰ２の阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎＡ（５μＭ）を添加した。
トマトシドＡ溶液除去後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側にグルコースを溶解させていないｐＨ６．０のＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの側基底膜側にｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で１５分間プレインキュベーションを行った。
その後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側及び側基底膜側のＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側には１３Ｃ６-グルコース（１ｍＭ）を含むＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、側基底膜側にはＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加した。
３７℃のＣＯ２インキュベーターを用いて３０分間インキュベーションを行った後、側基底膜側のＨＢＳＳ液を３００μＬずつ回収し、試験例１−１の項に記載したプロトコールに従ってグルコース-ＰＭＰ誘導体化を行った後、ＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳ分析に供し、透過したグルコースの透過量を測定した。
・誘導体化プロトコール：試験例１−１と同様とした。
・ＬＣ/ＴＯＦ−ＭＳ分析条件：試験例１−１と同様とした。
【００５４】
[結果・考察]
腸管における主要な排出トランスポーターのＰ−ｇｐ及びＭＲＰ２の阻害剤であるＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａを用いて、グルコース透過試験を行った。
その結果、Ｆｉｇ.１０（図１０）に示すようにＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａを用いてＰ−ｇｐ及びＭＲＰ２からの排出を遮断した状態において、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用は有意に消失した。
したがって、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用は、トマトシドＡ自身の細胞外排出が関与する可能性が示された。
【００５５】
[試験例２−４]  トマトシドＡのＣａｃｏ−２細胞における細胞内流入経路の検討
[目的]
試験例２−２により、トマトシドＡが一度細胞内に取り込まれた後に細胞外へと排出される可能性が示唆された。細胞内流入経路として小腸上皮膜において多くのトランスポーターが存在しているが、本試験では、その中でも胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）に着目した。ＡＳＢＴは、腸管上皮の頂膜側に局在し、主に胆汁の再吸収にかかわるトランスポーターである。ＡＳＢＴの阻害剤であるＦｌｕｖａｓｔａｔｉｎ（１００μＭ）を用いてグルコース透過試験を行った。
【００５６】
[方法]
コラーゲンコートした Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ−２細胞を播種し、腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ−２細胞単層膜を形成させた後、１０μＭのトマトシドＡ溶液で３時間処理を行った。この際、ＡＳＢＴの阻害剤であるＦｌｕｖａｓｔａｔｉｎ（１００μＭ）を添加した。
トマトシドＡ溶液除去後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側にｐＨ６．０のグルコースを溶解させていないＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの側基底膜側にｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターを用いて１５分間プレインキュベーションを行った。
その後、Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔの頂膜側及び側基底膜側のＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側には１３Ｃ６-グルコース（１ｍＭ）を含むＨＢＳＳ液を０．５ｍＬ添加し、側基底膜側にはＨＢＳＳ液を１．５ｍＬ添加した。３７℃のＣＯ２インキュベーター中で３０分間インキュベーションを行った後、側基底膜側のＨＢＳＳ液を３００ μＬずつ回収し、試験例１−１又は試験例２−３の項に示したプロトコールに従ってグルコース−ＰＭＰ誘導体化を行った後、ＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳ分析に供し、透過したグルコースの透過量を測定した。
・誘導体化プロトコール：試験例１−１又は試験例２−３と同様とした。
・ＬＣ/ＴＯＦ−ＭＳ分析条件：試験例１−１又は試験例２−３と同様とした。
【００５７】
[結果・考察]
小腸膜上皮及びＣａｃｏ−２細胞に存在する胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）の阻害剤であるＦｌｕｖａｓｔａｔｉｎを用いてグルコースの透過試験を行った。
その結果、Ｆｉｇ.１１（図１１）に示すようにＡＳＢＴからの細胞内流入を遮断した状態においてトマトシドＡのグルコース透過抑制作用は有意に消失した。したがって、トマトシドＡのグルコース 透過抑制作用は、ＡＳＢＴの細胞内流入が関与する可能性が示された。
【００５８】
[試験例２−５]  ＡＳＢＴ−ノックダウン細胞株を用いたトマトシドＡの細胞内流入経路としてのＡＳＢＴの関与評価
[目的]
試験例２−４において、トマトシドＡの細胞内流入経路が胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）である可能性が示された。そこで、ｓｉ―ＲＮＡを用いて、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＡＳＢＴ−ノックダウン株（ＡＳＢＴ−ＫＤ株）を新たに構築し、細胞内流入経路としてＡＳＢＴの関与評価を行った。
【００５９】
●ＡＳＢＴ−ＫＤ細胞株の構築
[方法]
・ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（Ｃａｃｏ−２細胞へのｓｉＲＮＡ導入）
２，３００μＬのＤＭＥＭ／５％ＦＢＳ培地を用いてＣａｃｏ−２細胞を６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ に播種した（２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎまで、通常の培養生育条件下(３７℃、５％ ＣＯ２)でインキュベートした。マイクロエッペンにｓｉＲＮＡの終濃度が２５ｎＭになるように８００ｎｇのｓｉＲＮＡを１００μＬのＤＭＥＭ培地で希釈した。２４μＬのＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを添加し、ヴォルテックスでよく撹拌した。室温（１５―２５℃）でインキュベートし、ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘを形成させた。
このｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘを６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅのｗｅｌｌに各容量を１滴ずつ滴るよう添加した。プレートを静かに回してｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘの分布を一様にした。通常の培養生育条件下（３７℃、５％ ＣＯ２）で４８時間インキュベートした(同調培養)。４８時間後、培地交換を行った。同様にｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｉ−ＲＮＡ（終濃度２５ｎＭ）を用いてネガティブコントロール株を作製した。
・ｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎプロトコール
下記のプロトコールに従ってｓｉＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを行った。
【化５】
0006719953.tif 000011
【００６０】
・ＡＳＢＴ-ＫＤ細胞株を用いたグルコース透過試験
[方法]
コラーゲンコートしたＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにＣａｃｏ-２細胞を播種した。腸上皮分化促進培地で３日間培養することでＣａｃｏ-２細胞単層膜を形成させる際に、２日目から腸上皮分化促進培地に、ＡＳＢＴ-ｓｉＲＮＡ＋Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｔ(終濃度２５ｎＭ)を添加し、４８時間のＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ処理を行った。
その後、１日間ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで培養を行い、透過試験に用いた。透過試験では、細胞膜をトマトシドＡ溶液（１０μＭ）で、３時間処理を行った。
サンプル除去後、腸膜側のＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにｐＨ６．０のＨＢＳＳ液を０．５ｍｌ添加し、側基底膜側のＣｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｓｅｒｔにｐＨ７．４のＨＢＳＳ液を１．５ｍｌ添加した。１５分間プレインキュベーション後、ＨＢＳＳ液を除去し、頂膜側に１３Ｃ６-グルコース（１ｍＭ）を含むＨＢＳＳ液、側基底膜側にＨＢＳＳ液をインキュベーションと同様量添加した。３０分後に３００μＬ回収した。得られた透過液をＰＭＰ誘導体化し、ＬＣ−ＴＯＦ/ＭＳ分析に供した。
【００６１】
[結果・考察]
ＡＳＢＴ-ｓｉＲＮＡを用いてＣａｃｏ-２細胞におけるＡＳＢＴ-ＫＤ細胞株を構築した。
その結果、Ｆｉｇ.１２（図１２）に示すように、ＡＳＢＴ-ｓｉＲＮＡ濃度２５ｎＭ、４８時間インキュベートにおいて有意にＡＳＢＴのタンパク質発現量の抑制が認められた（％ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ: ＡＳＢＴ, ８０．０ ± ３．３ ; Ｎｅｇａｔｉｖｅ, ９１．６ ± １．８ ）。
続いて、この新たに作製したＡＳＢＴ-ＫＤ細胞株を利用し、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用を評価したところ、Ｆｉｇ.１３（図１３）に示すように、ＡＳＢＴ-ＫＤ細胞株において、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用は見られなかった(％ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ: ＡＳＢＴ-ＫＤ＋トマトシドＡ, ８７．４±４．７)。なお、ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｉ−ＲＮＡによる影響は見られなかった。
以上より、トマトシドＡの細胞内流入経路としてＡＳＢＴが関与していることが示された。
【００６２】
これらの試験の結果から、トマトシドＡがグルコース透過を抑制することが明らかになった。
また、これらの試験の結果から、トマトシドＡのグルコース透過抑制作用にはＳＧＬＴ１発現量の抑制が関与していることが示されるとともに、ＡＳＢＴの細胞内流入が関与している可能性があることが示された。
トマトシドＡを含む本発明の飲食品及び組成物が、血糖上昇を抑制する活性を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によれば、血糖上昇を十分に抑制する飲食品及びかかる飲食品に用いることができる組成物が提供される。したがって、本発明は、飲食品産業及び健康産業ならびにこれらの産業に関連する産業の発展に貢献するところ大である。
【図１】
0006719953.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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