(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗体であって、
（ａ）配列番号１５６の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含み、配列番号１５６に対して少なくとも９８％同一である成熟重鎖可変領域と（ここで、配列番号１５６からの任意の変異は、可変領域フレームワーク内にある）、
（ｂ）配列番号１６０の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含み、配列番号１６０に対して少なくとも９８％同一である成熟軽鎖可変領域と（ここで、配列番号１６０からの任意の変異は、可変領域フレームワーク内にある）を含む、前記ヒト化抗体。
【請求項２】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５６に対して少なくとも９９％同一であり（ここで、配列番号１５６からの任意の変異は、可変領域フレームワーク内にある）、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１６０に対して少なくとも９９％同一である（ここで、配列番号１６０からの任意の変異は、可変領域フレームワーク内にある）請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５６の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１６０の前記アミノ酸配列を有する請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５６の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１６０の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が、配列番号１７３のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端リジンを伴ってまたは伴わない重鎖定常領域と、配列番号１７０のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５６の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１６０の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が、配列番号１７３のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端リジンを伴ってまたは伴わない重鎖定常領域と、配列番号１７１のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
前記成熟重鎖可変領域が配列番号１５６の前記アミノ酸配列を有し、及び前記成熟軽鎖可変領域が配列番号１６０の前記アミノ酸配列を有し、前記ヒト化抗体が、配列番号１７４のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端リジンを伴ってまたは伴わない重鎖定常領域と、配列番号１７１のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域とを含む請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
さらに、前記成熟重鎖可変領域の３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＫによって占められるという条件で請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
さらに、前記成熟重鎖可変領域の９３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＴによって占められるという条件で請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項９】
さらに、前記成熟重鎖可変領域の４２位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＥによって占められるという条件で請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
さらに、前記成熟軽鎖可変領域の４３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められるという条件で請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１１】
さらに、前記成熟軽鎖可変領域の９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められるという条件で請求項１〜１０のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
さらに、前記成熟軽鎖可変領域の１９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＶによって占められるという条件で請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
抗原結合断片である請求項１〜３、７〜１２のいずれか一項に記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
前記成熟重鎖可変領域は重鎖定常領域と融合し、且つ前記成熟軽鎖可変領域は軽鎖定常領域と融合する、請求項１〜３、７〜１２いずれか一項に記載のヒト化抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１４年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９５２，１２３号、２０１４年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０２３，６９８号、及び２０１４年１０月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／０６８，４３８号に対して優先権を主張し、前述の出願はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表、表またはコンピュータプログラムリストへの参照
「抗ＭＣＡＭ抗体及び関連する使用方法」について２０１５年３月４日に作成したファイル４５９０１４ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに書き込まれた配列表は１４８キロバイトである。このファイルに含有される情報は参照によって本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
ＴＨ１７細胞（Ｔヘルパー１７細胞）と呼ばれるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットは、多数の自己免疫疾患、特に、たとえば、多発性硬化症及び動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）のようなＴ細胞のＣＮＳ浸潤が関与する神経炎症性の状態の病態形成に関与している。ＴＨ１７細胞はＩＬ−１７及びＩＬ−２２を含む多数の選ばれたサイトカインを分泌することが報告されている。ＴＨ１７細胞は特異的な動員及び組織の浸潤を起こすことが報告されている。ＭＣＡＭはＴＨ１７細胞上で発現され、リガンドとしてラミニンα−４を結合することが報告されている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、配列番号１５６の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含み、及び配列番号１５６に対して少なくとも９７％同一である成熟重鎖可変領域と、配列番号１６０の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含み、及び配列番号１６０に対して少なくとも９７％同一である成熟軽鎖可変領域とを含むヒト化抗体を提供する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号１５６に対して少なくとも９８％または９９％同一であり、及び成熟軽鎖可変領域は配列番号１６０に対して少なくとも９８％または９９％同一である。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域は配列番号１５６のアミノ酸配列を有し、及び成熟軽鎖可変領域は配列番号１６０のアミノ酸配列を有する。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域の９３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＴによって占められ；成熟重鎖可変領域の４２位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＥによって占められ；成熟軽鎖可変領域の４３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められ；成熟軽鎖可変領域の９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められ；成熟軽鎖可変領域の１９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＶによって占められる。一部の抗体では、成熟重鎖可変領域の９３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＴによって占められ；成熟重鎖可変領域の４２位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＥによって占められ；成熟重鎖可変領域の３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＫによって占められ；成熟軽鎖可変領域の４３位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められ；成熟軽鎖可変領域の９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＳによって占められ；成熟軽鎖可変領域の１９位（Ｋａｂａｔの番号付け）がＶによって占められる。一部の抗体では、成熟重鎖定常領域は配列番号１７３若しくは１７４のアミノ酸配列を有し、及び／または成熟軽鎖定常領域は配列番号１７０若しくは１７１のアミノ酸配列を有する。
【０００５】
本発明はさらに、アミノ酸残基３１８を含むエピトープにてヒトＭＣＡＭ（配列番号１１）に結合する抗ＭＣＡＭ抗体を提供する。一部のそのような抗体では、エピトープはアミノ酸残基３２４を含む。一部のそのような抗体では、エピトープはアミノ酸残基３２６を含む。一部の抗体では、エピトープはアミノ酸残基３１８を含むヒトＭＣＡＭの少なくとも５つの隣接するアミノ酸残基を含む。一部のそのような抗体では、該抗体は、
（ａ）配列番号１８に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号１３に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン１５；
（ｂ）配列番号７に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号２に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン１７；
（ｃ）配列番号３５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号３０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１１７４．１．３；
（ｄ）配列番号４５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号４０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１４１４．１．２；
（ｅ）配列番号５５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号５０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１４１５．１．１；
（ｆ）配列番号６５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号６０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１７４９．１．３；
（ｇ）配列番号７７に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号７０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する２１２０．４．１９；
（ｈ）配列番号８９に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号８４に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する２１０７．４．１０；及び
（ｉ）モノクローナル抗体、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９及び２１０７．４．１０に実質的に由来するＣＤＲを含む抗体から成る群から選択される抗体ではない。一部のそのような抗体では、該抗体はモノクローナルである。一部のそのような抗体では、該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ化抗体またはヒト抗体である。
一部のそのような抗体では、該抗体は、
（ａ）配列番号１８に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号１３に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン１５；
（ｂ）配列番号７に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号２に相当する成熟軽鎖可変領域とを有するクローン１７；
（ｃ）配列番号３５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号３０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１１７４．１．３；
（ｄ）配列番号４５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号４０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１４１４．１．２；
（ｅ）配列番号５５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号５０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１４１５．１．１；
（ｆ）配列番号６５に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号６０に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する１７４９．１．３；
（ｇ）配列番号７７に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号７０、７１または７２に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する２１２０．４．１９；
（ｈ）配列番号８９に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号８２または８４に相当する成熟軽鎖可変領域とを有する２１０７．４．１０；及び
（ｉ）モノクローナル抗体、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９及び２１０７．４．１０に実質的に由来するＣＤＲを含む抗体から成る群から選択される抗体ではない。一部のそのような抗体では、該抗体はモノクローナルである。一部のそのような抗体では、該抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、べニヤ抗体またはヒト抗体である。
【０００６】
本発明はさらに、上述の抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
本発明はさらに、身体における炎症の部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性疾患の治療のための薬物の製造における前述の抗体のいずれかの使用を提供する。そのような炎症性疾患は、中枢神経系（ＣＮＳ）へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とするＣＮＳの炎症性疾患であってもよい。
【０００８】
本発明はさらに多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性大腸疾患、クローン病、または、たとえば、黒色腫のような癌（たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍）の治療のための薬物の製造における前述の抗体のいずれかの使用を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、炎症の部位へのＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性疾患を治療する方法を提供し、該方法はそれを必要とする哺乳類対象に有効量の上述の抗体のいずれかを投与することを含む。一部の方法では、疾患は、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性大腸疾患、クローン病、または、たとえば、黒色腫のような癌（たとえば、固形腫瘍または血液腫瘍）である。一部の方法では、ＭＣＡＭ発現細胞はＴＨ１７細胞である。一部の方法では、哺乳類対象はヒトである。方法の一部では、抗体は、ラミニンα−４を含むタンパク質へのＭＣＡＭの結合を阻害する。一部の方法では、哺乳類対象はヒトである。方法の一部では、ＭＣＡＭ発現細胞はＴＨ１７細胞である。
【００１０】
本発明はさらに、抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体を結合するエピトープを含む単離されたペプチドを提供し、その際、該ペプチドはアミノ酸残基３１８を含むヒトＭＣＡＭ（配列番号１１）の５〜５０の隣接するアミノ酸残基を含む。これらのペプチドの一部では、該ペプチドはキャリアポリペプチドに連結される。これらのペプチドの一部では、該ペプチドはアジュバントと併用される。
【００１１】
本発明はさらに、
（ａ）上述のペプチドで対象を免疫することと、
（ｂ）Ｂ細胞を対象から単離し、該Ｂ細胞が抗体を分泌することと、
（ｃ）抗体をスクリーニングしてラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を特定することとを含む、ラミニンα−４鎖へのヒトＭＣＡＭの結合を阻害する抗体を生成する方法を提供する。方法の一部では、該方法はさらに
（ｄ）培養にてＢ細胞を不死化した細胞と融合させ、モノクローナルな抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成することと、
（ｅ）該ハイブリドーマ細胞を培養することと、
（ｆ）培養物からモノクローナル抗体を単離することとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】決定的なクローンの特定を示す図である。平均表面発現値の関数としてプロットした１７４９．１．３の平均結合値（灰色の菱形）。＜３０％のモノクローナル抗体の反応性と＞５０％のマウス血清の結合の閾値を適用して抗体結合については陰性であるが、表面発現については陽性であるクローン（黒色の菱形）を特定した。
【００１３】
【図２】Ｃ２７２、Ｙ３１８、Ｃ３２０、Ｖ３４０、及びＷ３７７を含む１７４９．１．３についての潜在的に決定的な結合部位として特定された５つの残基の位置を示す、ヒトＭＣＡＭの相同性モデルを示す図である。
【００１４】
【図３Ａ】ヒト化１７４９軽鎖成熟可変領域を伴った１７４９．１．３のアミノ酸配列の配列比較を示す。ＡＢＡ７１４０７．１及びＣＡＩ９９８００．１はヒトのアクセプターＶＬ配列である。Ｋａｂａｔの定義に従ったＣＤＲ領域は灰色で強調する。
【００１５】
【図３Ｂ】ヒト化１７４９重鎖成熟可変領域を伴った１７４９．１．３のアミノ酸配列の配列比較を示す。ＡＡＸ８２４９４．１及びＡＤＸ６５６７６．１はヒトのアクセプターＨＬ配列である。Ｋａｂａｔの定義に従ったＣＤＲ領域は灰色で強調する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
配列の簡単な説明
配列番号１は、抗体クローン１７の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００１７】
配列番号２は、抗体クローン１７の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号３は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号４は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号５は、抗体クローン１７のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号６は、抗体クローン１７の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００２２】
配列番号７は、抗体クローン１７の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号８は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号９は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１０は、抗体クローン１７のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号１１は、ヒトＭＣＡＭ受入番号ＣＡＡ４８３３２のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１２は、抗体クローン１５の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００２８】
配列番号１３は、抗体クローン１５の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１４は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１５は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１６は、抗体クローン１５のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００３２】
配列番号１７は、抗体クローン１５の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００３３】
配列番号１８は、抗体クローン１５の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号１９は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号２０は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００３６】
配列番号２１は、抗体クローン１５のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号２２は、ヒトＭＣＡＭドメイン１（残基１９〜１２９）のアミノ酸配列である。
【００３８】
配列番号２３は、ヒトＭＣＡＭドメイン２（残基１３９〜２４２）のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号２４は、ヒトＭＣＡＭドメイン３（残基２４４〜３２１）のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号２５は、ヒトＭＣＡＭドメイン４（残基３５５〜４２４）のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号２６は、ヒトＭＣＡＭドメイン５（残基４３０〜５１０）のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号２７は、ヒトラミニン４１１のα４−鎖アイソフォームのアミノ酸配列である（受入番号ＮＰ００１０９８６７６）。
【００４３】
配列番号２８は、ヒトラミニン４１１のα４−鎖アイソフォームのアミノ酸配列である（受入番号ＣＡＡ４８３３２）。
【００４４】
配列番号２９は、抗体１１７４．１．３の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００４５】
配列番号３０は、抗体１１７４．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号３１は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号３２は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号３３は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号３４は、抗体１１７４．１．３の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００５０】
配列番号３５は、抗体１１７４．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号３６は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号３７は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号３８は、抗体１１７４．１．３のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００５４】
配列番号３９は、抗体１４１４．１．２の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００５５】
配列番号４０は、抗体１４１４．１．２の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号４１は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号４２は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号４３は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００５９】
配列番号４４は、抗体１４１４．１．２の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００６０】
配列番号４５は、抗体１４１４．１．２の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号４６は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００６２】
配列番号４７は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号４８は、抗体１４１４．１．２のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００６４】
配列番号４９は、抗体１４１５．１．１の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００６５】
配列番号５０は、抗体１４１５．１．１の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号５１は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ１アミノ酸配列である。
【００６７】
配列番号５２は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ２アミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号５３は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＬ３アミノ酸配列である。
【００６９】
配列番号５４は、抗体１４１５．１．１の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００７０】
配列番号５５は、抗体１４１５．１．１の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００７１】
配列番号５６は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号５７は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００７３】
配列番号５８は、抗体１４１５．１．１のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号５９は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００７５】
配列番号６０は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００７６】
配列番号６１は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号６２は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００７８】
配列番号６３は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００７９】
配列番号６４は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００８０】
配列番号６５は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８１】
配列番号６６は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００８２】
配列番号６７は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００８３】
配列番号６８は、抗体１７４９．１．３のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００８４】
配列番号６９は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００８５】
配列番号７０は、配列番号６９で示された抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８６】
配列番号７１は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８７】
配列番号７２は、抗体２１２０．４．１９の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００８８】
配列番号７３は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【００８９】
配列番号７４は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【００９０】
配列番号７５は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【００９１】
配列番号７６は、抗体２１２０．４．１９の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００９２】
配列番号７７は、抗体２１２０．４．１９の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９３】
配列番号７８は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【００９４】
配列番号７９は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【００９５】
配列番号８０は、抗体２１２０．４．１９のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【００９６】
配列番号８１は、抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００９７】
配列番号８２は、配列番号８１で示された抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【００９８】
配列番号８３は、抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【００９９】
配列番号８４は、配列番号８３で示された抗体２１０７．４．１０の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１００】
配列番号８５は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ１のアミノ酸配列である。
【０１０１】
配列番号８６は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ２のアミノ酸配列である。
【０１０２】
配列番号８７は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＬ３のアミノ酸配列である。
【０１０３】
配列番号８８は、抗体２１０７．４．１０の成熟重鎖可変領域をコードする核酸配列である。
【０１０４】
配列番号８９は、抗体２１０７．４．１０の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１０５】
配列番号９０は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１０６】
配列番号９１は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ２のアミノ酸配列である。
【０１０７】
配列番号９２は、抗体２１０７．４．１０のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【０１０８】
配列番号９３は、抗体１７４９．１．３の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１０９】
配列番号９４は、ヒト化抗体１７４９のバージョン１（ＶＨ１）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１０】
配列番号９５は、ヒト化抗体１７４９のバージョン２（ＶＨ２）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１１】
配列番号９６は、重鎖可変フレームワークドナーＵ９６２８２＿ＶＨのアミノ酸配列である。
【０１１２】
配列番号９７は、抗体１７４９．１．３の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１３】
配列番号９８は、ヒト化抗体１７４９のバージョン１（ＶＬ１）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１４】
配列番号９９は、ヒト化抗体１７４９のバージョン２（ＶＬ２）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１５】
配列番号１００は、軽鎖可変フレームワークドナーＸ０２９９０＿ＶＬのアミノ酸配列である。
【０１１６】
配列番号１０１は、抗体２１０７．４．１０．１８の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１７】
配列番号１０２は、ヒト化抗体２１０７のバージョン１（ＶＨ１）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１８】
配列番号１０３は、ヒト化抗体２１０７のバージョン２（ＶＨ２）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１１９】
配列番号１０４は、ヒト化抗体２１０７のバージョン３（ＶＨ３）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２０】
配列番号１０５は、ヒト化抗体２１０７のバージョン４Ａ（ＶＨ４Ａ）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２１】
配列番号１０６は、ヒト化抗体２１０７のバージョン５Ａ（ＶＨ５Ａ）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２２】
配列番号１０７は、ヒト化抗体２１０７のバージョン６（ＶＨ６）のの成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２３】
配列番号１０８は、重鎖可変フレームワークドナーＡＦ０６２１３３＿ＶＨのアミノ酸配列である。
【０１２４】
配列番号１０９は、抗体２１０７．４．１０．１８の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２５】
配列番号１１０は、ヒト化抗体２１０７のバージョン１（ＶＬ１）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２６】
配列番号１１１は、ヒト化抗体２１０７のバージョン２（ＶＬ２）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２７】
配列番号１１２は、ヒト化抗体２１０７のバージョン３（ＶＬ３）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１２８】
配列番号１１３は、軽鎖可変フレームワークドナーＵ８６８０３のアミノ酸配列である。
【０１２９】
配列番号１１４は、抗体２１２０．４．１９．６の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３０】
配列番号１１５は、ヒト化抗体２１２０のバージョン１（ＶＨ１）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３１】
配列番号１１６は、ヒト化抗体２１２０のバージョン２（ＶＨ２）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３２】
配列番号１１７は、ヒト化抗体２１２０のバージョン３（ＶＨ３）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３３】
配列番号１１８は、ヒト化抗体２１２０のバージョン４（ＶＨ４）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３４】
配列番号１１９は、ヒト化抗体２１２０のバージョン５（ＶＨ５）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３５】
配列番号１２０は、抗体２１２０．４．１９．６の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３６】
配列番号１２１は、ヒト化抗体２１２０のバージョン１（ＶＬ１）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号１２２は、ヒト化抗体２１２０のバージョン２（ＶＬ２）成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号１２３は、ヒト化抗体２１２０のバージョン３（ＶＬ３）成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号１２４は、軽鎖可変フレームワークドナーＸ８４３４３＿ＶＬのアミノ酸配列である。
【０１４０】
配列番号１２５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号１２６は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４２】
配列番号１２７は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号１２８は、ヒト化重鎖／軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４４】
配列番号１２９は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号１３０は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４６】
配列番号１３１は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４７】
配列番号１３２は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４８】
配列番号１３３は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１４９】
配列番号１３４は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５０】
配列番号１３５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５１】
配列番号１３６は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５２】
配列番号１３７は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５３】
配列番号１３８は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５４】
配列番号１３９は、ヒト化抗体２１２０のバージョン３（ＶＨ３）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１５５】
配列番号１４０は、ヒト化抗体２１２０のバージョン４（ＶＨ４）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１５６】
配列番号１４１は、ヒト化抗体２１２０のバージョン５（ＶＨ５）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１５７】
配列番号１４２は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５８】
配列番号１４３は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１５９】
配列番号１４４は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６０】
配列番号１４５は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６１】
配列番号１４６は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６２】
配列番号１４７は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６３】
配列番号１４８は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６４】
配列番号１４９は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６５】
配列番号１５０は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１６６】
配列番号１５１は、ヒト化抗体２１０７のバージョン１（ＶＨ１）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１６７】
配列番号１５２は、ヒト化抗体２１０７のバージョン４（ＶＨ４）のＣＤＲＨ１のアミノ酸配列である。
【０１６８】
配列番号１５３は、ヒト化抗体２１２０のバージョン１〜５（ＶＨ１〜ＶＨ５）のＣＤＲＨ３のアミノ酸配列である。
【０１６９】
配列番号１５４は、ヒト化軽鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７０】
配列番号１５５は、ヒト化重鎖フレームワーク領域のアミノ酸配列である。
【０１７１】
配列番号１５６は、ヒト化抗体１７４９のバージョン３（ＶＨ３）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１７２】
配列番号１５７は、マウス重鎖可変領域の構造テンプレートＰＢＤ＃１ＨＩＬＶＨのアミノ酸配列である。
【０１７３】
配列番号１５８は、重鎖可変アクセプターフレームワークＡＣＣ＃ＡＡＸ８２４９４．１のアミノ酸配列である。
【０１７４】
配列番号１５９は、重鎖可変アクセプターフレームワークＡＣＣ＃ＡＤＸ６５６７６．１のアミノ酸配列である。
【０１７５】
配列番号１６０は、ヒト化抗体１７４９のバージョン３（ＶＬ３）の成熟軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１７６】
配列番号１６１は、マウス軽鎖可変領域の構造テンプレートＰＤＢ＃２ＬＴＱＶＬのアミノ酸配列である。
【０１７７】
配列番号１６２は、軽鎖可変アクセプターフレームワークＡＣＣ＃ＡＢＡ７１４０７．１のアミノ酸配列である。
【０１７８】
配列番号１６３は、軽鎖可変アクセプターフレームワークＣＡＩ９９８００．１のアミノ酸配列である。
【０１７９】
配列番号１６４は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８０】
配列番号１６５は、配列番号１６４の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８１】
配列番号１６６は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８２】
配列番号１６７は、配列番号１６６の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８３】
配列番号１６８は、成熟重鎖または成熟軽鎖の可変領域に融合することができる例となるシグナルペプチドをコードする核酸配列である。
【０１８４】
配列番号１６９は、配列番号：１６８の核酸配列によってコードされる例となるシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
【０１８５】
配列番号１７０は、Ｎ末端でアルギニンを伴うヒト化１７４９軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１８６】
配列番号１７１は、Ｎ末端でアルギニンを伴わないヒト化１７４９軽鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１８７】
配列番号１７２は、ヒト化１７４９重鎖定常領域のアミノ酸配列である。
【０１８８】
配列番号１７３は、ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。
【０１８９】
配列番号１７４は、ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域のアミノ酸配列である。
【０１９０】
配列番号１７５は、ヒト化抗体１７４９のバージョン３（ＶＬ３＋軽鎖定常領域）の成熟軽鎖領域のアミノ酸配列である。
【０１９１】
配列番号１７６は、ヒト化抗体１７４９のバージョン３（ＶＨ３＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域）の成熟重鎖領域のアミノ酸配列である。
【０１９２】
配列番号１７７は、ヒト化抗体１７４９のバージョン３（ＶＨ３＋ＢＩＰバージョンの重鎖Ｇ１ｍ３アロタイプ定常領域）の成熟重鎖領域のアミノ酸配列である。
【０１９３】
配列番号１７８は、ヒト化抗体２１０７のバージョン４Ｂ（ＶＨ４Ｂ）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１９４】
配列番号１７９は、ヒト化抗体２１０７のバージョン５Ｂ（ＶＨ５Ｂ）の成熟重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
【０１９５】
定義
モノクローナル抗体は通常単離された形態で提供される。このことは、抗体は通常、少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋なタンパク質及びその製造または精製から生じる他の高分子であるが、その使用を円滑にするように意図される、過剰量の薬学上許容可能なキャリアまたは他のビヒクルにモノクローナル抗体が組み合わせられる可能性を排除しないことを意味する。モノクローナル抗体は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５または９９％ｗ／ｗ純粋なタンパク質と製造または精製に由来する他の高分子とであることがある。
【０１９６】
その標的抗原へのモノクローナル抗体の特異的な結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。特異的な結合は検出可能に高い規模であり、少なくとも１つの無関係な標的に対して生じる非特異的な結合とは区別可能である。特異的な結合は、特定の官能基間での結合の形成または特定の空間適合（たとえば、鍵と鍵穴型）の形成の結果であり得るのに対して、非特異的な結合は普通、ファンデルワールス力の結果である。しかしながら、特異的な結合は、モノクローナル抗体が１つの標的に結合する及び１つの標的にしか結合しないことを必ずしも意味しない。
【０１９７】
抗体の基本的な構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対を含み、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は切断可能なシグナルペプチドに連結されて当初発現される。シグナルペプチドを持たない可変領域は成熟可変領域と呼ばれることがある。従って、たとえば、軽鎖成熟可変領域は軽鎖のシグナルペプチドを持たない軽鎖可変領域を意味する。各鎖のカルボキシ末端部分は主としてエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。
【０１９８】
軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖の範囲内で、可変領域と定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって接合され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。（一般に、あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，編，第２版．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９，Ｃｈ．７を参照のこと）。
【０１９９】
各軽鎖／重鎖の対の成熟可変領域は抗体結合部位を形成する。従って、インタクトな抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性の抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。鎖はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって接合される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲはフレームワーク領域によって調整されて特異的なエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖及び重鎖の双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当てはＫａｂａｔのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７及び１９９１），またはＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋのＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖間または異なる軽鎖間での対応する残基には同じ番号が割り当てられる（たとえば、Ｈ８３は成熟重鎖可変領域におけるＫａｂａｔの番号付けによる８３位を意味し；同様にＬ３６位は成熟軽鎖可変領域におけるＫａｂａｔの番号付けによる３６位を意味する、広く使用されている番号付け法（Ｋａｂａｔの番号付け）も提供している。明白に言及されない限り、抗体の可変領域における位置を参照するには全体を通してＫａｂａｔの番号付けを使用する。
【０２００】
用語「抗体」には、インタクトな抗体及びその抗原結合断片が含まれる。通常、別々の重鎖、軽鎖のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）ｃ、二重抗体、Ｄａｂｓ、ナノ抗体、及びＦｖを含む断片は、標的に対する特異的な結合についてそれらが由来するインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えＤＮＡ法、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的な若しくは化学的な分離によって作出することができる。
【０２０１】
用語「抗体」には、二重特異性抗体及び／またはキメラ抗体、及び／またはヒト化抗体も含まれる。二重特異性または二官能性の抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖の対及び２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ及びＬａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照のこと）。一部の二重特異性抗体では、２つの異なる重鎖／軽鎖の対は、ヒト化重鎖／軽鎖の対及び異なるエピトープに特異的な重鎖／軽鎖の対を含んでもよい。
【０２０２】
一部の二重特異性抗体では、一方の重鎖軽鎖の対は以下でさらに開示されるようなヒト化抗体であり、重鎖軽鎖対は、たとえば、インスリン受容体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）受容体、レプチン受容体またはリポタンパク質受容体、またはトランスフェリン受容体のような脳血管関門で発現される受容体に結合する抗体に由来する（Ｆｒｉｄｅｎら，ＰＮＡＳ，８８：４７７１−４７７５，１９９１；Ｆｒｉｄｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：３７３−３７７，１９９３）。そのような二重特異性抗体は、受容体が介在するトランスサイトーシスによって脳血管関門を横切って移動することができる。二重特異性抗体を操作して脳血管関門の受容体への親和性を低下させることによって二重特異性抗体の脳での取り込みをさらに高めることができる。受容体への親和性の低下は脳におけるさらに広い分布を生じた（たとえば、Ａｔｗａｌら．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４３，２０１１；Ｙｕら．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓ．Ｍｅｄ．３，８４ｒａ４４，２０１１を参照のこと）。
【０２０３】
例となる二重特異性抗体は、（１）二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）であることができ、その際、各軽鎖及び重鎖は短いペプチド結合を介して２つの可変ドメインを直列に含有し（Ｗｕら，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｄｕａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ（２０１０））；（２）標的抗原のそれぞれに対して２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体を生じる２つの単鎖二特異抗体の融合体であるタンデム二特異抗体（Ｔａｎｄａｂ）であることができ；（３）多価分子を生じるｓｃＦｖと二特異抗体との組み合わせであるフレキシボディであることができ；（４）Ｆａｂｓに適用すると異なるＦａｂ断片に連結された２つの同一のＦａｂ断片から成る三価の二重特異性の結合タンパク質を得ることができるタンパク質キナーゼＡにおける二量体化及びドッキングドメインに基づいた、いわゆる「ドックアンドロック」分子であることができ；（５）たとえば、ヒトＦｃ領域の両端に融合された２つのｓｃＦｖを含むいわゆる、いわゆるスコーピオン分子であることができる。二重特異性抗体を調製するのに有用なプラットフォームの例には、ＢｉＴＥ（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、ＤＡＲＴ（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、Ｆｃａｂ及びＭａｂ２（Ｆ−ｓｔａｒ）、Ｆｃ−操作したＩｇＧ１（Ｘｅｎｃｏｒ）またはＤｕｏＢｏｄｙ（Ｆａｂアーム交換に基づく、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
用語「エピトープ」は、抗体が結合する抗原における部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、または１以上のタンパク質の三次折り畳みによって並置される隣接しないアミノ酸から形成することができる。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープは変性溶媒への曝露の際、通常保持されるのに対して、三次折り畳みによって形成されたエピトープは変性溶媒による処理の際、通常失われる。エピトープは通常、独特の空間構成にて少なくとも３、さらに普通では少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を含む。エピトープの空間構成を決定する方法には、たとえば、Ｘ線結晶学及び二次元核磁気共鳴が挙げられる。たとえば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。
【０２０５】
「アンタゴニスト」抗体または他の結合作用因子は、それが結合する抗原の生物活性を阻害するものである。そのような抗体は実質的にまたは完全に抗原の生物活性を阻害する。
【０２０６】
ＭＣＡＭに関する用語「生物活性」及び「生物学的に活性のある」は、そのリガンド（ラミニンα４鎖、たとえば、ラミニン４１１のα４鎖）を特異的に結合するその能力及び／またはＭＣＡＭ発現細胞、たとえば、ＴＨ１７細胞のＣＮＳへの浸潤を促す能力を指す。
【０２０７】
「阻害する」は、少なくとも１つの標的、たとえば、ＭＣＡＭの生物活性を低下させる作用因子を意味する。そのような阻害剤は、少なくとも１つの標的の活性を少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％または少なくとも約１００％阻害する。
【０２０８】
「対象」には、予防上のまたは治療上の処置を受けるヒトまたは他の哺乳類の対象が含まれる。
【０２０９】
アミノ酸置換を保存的なものまたは非保存的なものとして分類する目的で、アミノ酸を以下のようにグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性の親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響を与える残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及びグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換には同一クラスにおけるアミノ酸間の置換が含まれる。非保存的置換はこれらのクラスの１つのメンバーを別クラスのメンバーと交換することに相当する。
【０２１０】
配列同一性の比率はＫａｂａｔの番号付け法によって最大限並べられた抗体配列によって決定される。配列比較の後、対象抗体領域（たとえば、重鎖または軽鎖の成熟可変領域全体）が参照抗体の同じ領域と比較されているのであれば、対象抗体と参照抗体の領域の間での配列同一性比率は、ギャップは計数せずに２つの領域の並べられた位置の総数によって割られた対象及び参照の抗体領域双方における同一アミノ酸によって占められる位置の数であり、１００を乗じて比率に変換する。
【０２１１】
１以上の引用された要素を「含む」組成物または方法は、具体的に引用されていない他の要素を含んでもよい。たとえば、抗体を含む組成物は抗体のみを含有してもよいし、または他の成分との組み合わせで抗体を含有してもよい。
【０２１２】
値の範囲の指定には、範囲の範囲内のまたは範囲を定義するすべての整数及び範囲の範囲内の整数によって定義される部分範囲のすべてが含まれる。
【０２１３】
文脈から明らかではない限り、用語「約」は言及される値の測定値の標準誤差（ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
【０２１４】
統計的有意性はｐ≦０．０５を意味する。
【０２１５】
Ｉ．概要
ラミニン４１１のラミニンα４鎖へのＭＣＡＭの結合を阻害する有用な特性を持つ抗体はＷＯ／２０１２／１７００７１及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３にて開示されている。本出願は、とりわけ、（ａ）１７４９．１.３抗体の新規のヒト化形態を提供し、（ｂ）１７４９．１.３抗体が結合するエピトープをマッピングし、（ｃ）同じエピトープに結合する抗体を提供する。
【０２１６】
用語「１７４９．１.３」、「ｍ１７４９」または「マウス１７４９」抗体は、配列番号９３に相当する成熟可変重鎖と配列番号９７に相当する成熟可変軽鎖を有するマウス由来のモノクローナル抗体のクローンを指す。「ヒト化１７４９」または「ｈｕ１７４９」は１７４９．１.３クローンのヒト化変異体を指す。配列番号１５６に相当する成熟重鎖可変領域と配列番号１６０に相当する成熟軽鎖可変領域を有する１７４９のヒト化変異体は本明細書では「ｈｕ１７４９ＶＨ３ＶＬ３」と呼ばれる。
【０２１７】
ＩＩ．標的分子
天然のヒト野生型ＭＣＡＭ（ＣＤ１４６及びＭＵＣ１８としても知られる黒色腫細胞接着分子）は以下のアミノ酸配列を有する６４６アミノ酸のペプチドである：
ＭＧＬＰＲＬＶＣＡＦＬＬＡＡＣＣＣＣＰＲＶＡＧＶＰＧＥＡＥＱＰＡＰＥＬＶＥＶＥＶＧＳＴＡＬＬＫＣＧＬＳＱＳＱＧＮＬＳＨＶＤＷＦＳＶＨＫＥＫＲＴＬＩＦＲＶＲＱＧＱＧＱＳＥＰＧＥＹＥＱＲＬＳＬＱＤＲＧＡＴＬＡＬＴＱＶＴＰＱＤＥＲＩＦＬＣＱＧＫＲＰＲＳＱＥＹＲＩＱＬＲＶＹＫＡＰＥＥＰＮＩＱＶＮＰＬＧＩＰＶＮＳＫＥＰＥＥＶＡＴＣＶＧＲＮＧＹＰＩＰＱＶＩＷＹＫＮＧＲＰＬＫＥＥＫＮＲＶＨＩＱＳＳＱＴＶＥＳＳＧＬＹＴＬＱＳＩＬＫＡＱＬＶＫＥＤＫＤＡＱＦＹＣＥＬＮＹＲＬＰＳＧＮＨＭＫＥＳＲＥＶＴＶＰＶＦＹＰＴＥＫＶＷＬＥＶＥＰＶＧＭＬＫＥＧＤＲＶＥＩＲＣＬＡＤＧＮＰＰＰＨＦＳＩＳＫＱＮＰＳＴＲＥＡＥＥＥＴＴＮＤＮＧＶＬＶＬＥＰＡＲＫＥＨＳＧＲＹＥＣＱＡＷＮＬＤＴＭＩＳＬＬＳＥＰＱＥＬＬＶＮＹＶＳＤＶＲＶＳＰＡＡＰＥＲＱＥＧＳＳＬＴＬＴＣＥＡＥＳＳＱＤＬＥＦＱＷＬＲＥＥＴＤＱＶＬＥＲＧＰＶＬＱＬＨＤＬＫＲＥＡＧＧＧＹＲＣＶＡＳＶＰＳＩＰＧＬＮＲＴＱＬＶＫＬＡＩＦＧＰＰＷＭＡＦＫＥＲＫＶＷＶＫＥＮＭＶＬＮＬＳＣＥＡＳＧＨＰＲＰＴＩＳＷＮＶＮＧＴＡＳＥＱＤＱＤＰＱＲＶＬＳＴＬＮＶＬＶＴＰＥＬＬＥＴＧＶＥＣＴＡＳＮＤＬＧＫＮＴＳＩＬＦＬＥＬＶＮＬＴＴＬＴＰＤＳＮＴＴＴＧＬＳＴＳＴＡＳＰＨＴＲＡＮＳＴＳＴＥＲＫＬＰＥＰＥＳＲＧＶＶＩＶＡＶＩＶＣＩＬＶＬＡＶＬＧＡＶＬＹＦＬＹＫＫＧＫＬＰＣＲＲＳＧＫＱＥＩＴＬＰＰＳＲＫＴＥＬＶＶＥＶＫＳＤＫＬＰＥＥＭＧＬＬＱＧＳＳＧＤＫＲＡＰＧＤＱＧＥＫＹＩＤＬＲＨ（配列番号１１）（受入番号ＡＡＡ２０９２２．１（ＣＡＡ４８３３２）のもとでのＧｅｎＢａｎｋデータベース）。ＭＣＡＭは、細胞接着、及び血管組織の細胞間接合部での内皮単層の接着に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞表面の糖タンパク質である。それはまた、黒色腫及び前立腺癌を含む固形腫瘍のような多数の癌の腫瘍進行も促進する。それは同型／同種親和性で相互作用することが知られており、他のリガンドにも結合し得る。ヒトＭＣＡＭには、配列番号２２〜２６として示される５つの免疫グロブリンドメイン（１：アミノ酸残基１９〜１２９；２：アミノ酸残基１３９〜２４２；３：アミノ酸残基２４４〜３２１；４：アミノ酸残基３３５〜４２４；及び５：アミノ酸残基４３０〜５１０）が含まれる。
【０２１８】
文脈から明らかではない限り、ＭＣＡＭまたはその断片への参照には、上記で示された天然のヒト野生型アミノ酸配列及びそのヒト対立遺伝子変異体が含まれる。
【０２１９】
ラミニンα４はラミニン分子に見いだされるポリペプチド鎖の１つを指し、それは、ほとんどの細胞及び組織にとってタンパク質ネットワークの基盤である（基底膜の）基底板にて発現される。ラミニンは原形質膜分子を介して細胞膜に結合し、細胞の接着に寄与することが知られている。ラミニンα４鎖は通常、ラミニンβ鎖及びラミニンγ鎖と共に複合体を形成する。ラミニンα４鎖は、ラミニン４１１（ラミニン８またはα４β１γ１）；ラミニン４２１（ラミニン９またはα４β２γ１）、及びラミニン４２３（ラミニン１４またはα４β２γ３）を含む多数のラミニン分子で見いだされる。ヒトラミニンα４鎖には２つの主なアイソフォームがある：ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ００１０９８６７６及びＣＡＡ４８３３２（配列番号２７及び２８）。「ラミニン４１１」は３つのポリペプチドのサブユニットまたは鎖：α４鎖、β１鎖及びγ１鎖で構成される三量体ポリペプチド複合体を指す。
【０２２０】
ＭＣＡＭに対するアンタゴニストには、抗体、ＩｇＧ定常領域に対する受容体またはリガンドの融合タンパク質、他の生物結合分子、及び小分子が挙げられる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、たとえば、マウス若しくはラット、非ヒト霊長類のような非ヒト性であることができ、またはヒト性であることができる。抗体はキメラ抗体、ベニヤ化抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体等であることができる。
【０２２１】
ＭＣＡＭアンタゴニストは、ＭＣＡＭの（ｉ）そのリガンド：ラミニンα４鎖、たとえば、ラミニン４１１のα４鎖を特異的に結合する能力、及び／または（ｉｉ）ＭＣＡＭ発現細胞、たとえば、ＴＨ１７細胞が対象の組織に浸潤するまたは移動するのを促す能力を完全にまたは部分的に阻害するアンタゴニストを指す。ＭＣＡＭアンタゴニストには、ＭＣＡＭまたはそのリガンドラミニンアルファ４に結合する抗体または他のアンタゴニストが挙げられる。
【０２２２】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗ＭＣＡＭ抗体１７４９のヒト化形態
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するＣＤＲがヒトの「アクセプター」抗体配列に移植される遺伝子操作された抗体である（たとえば、Ｑｕｅｅｎら，ＵＳ５，５３０，１０１及びＵＳ５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒら，ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５及びＵＳ６，８８１，５５７；及びＦｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７を参照のこと）。アクセプター抗体配列は、たとえば、ヒト抗体成熟可変領域配列、そのような配列の複合物、ヒト抗体可変領域配列のコンセンサス配列（たとえば、Ｋａｂａｔの軽鎖及び重鎖の可変領域コンセンサス配列、１９９１上記）、または生殖系列細胞の可変領域配列であることができる。
【０２２３】
重鎖のアクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受入コードＡＡＸ８２４９４．１（ＧＩ：６２４２１４６１）及び／またはＡＤＸ６５６７６．１（ＧＩ：３２３４３２０７３）を持つヒトの成熟重鎖可変領域である。好ましくは、これらのアクセプターの複合物が本実施例と同様に使用される。重鎖可変領域フレームワークにおいてｍ１７４９重鎖とＡＡＸ８２４９４．１は９１％の配列同一性を有し、ＡＤＸ６５６７６．１は８３％の配列同一性を有するので、これらのアクセプター配列には、同一の規定形態と捻じれた（ｋｉｎｋｅｄ）塩基を持つ同じ長さのＣＤＲ−Ｈ３とを有する２つのＣＤＲが含まれる。軽鎖については、アクセプター配列の例は、ＮＣＢＩ受入コードＡＢＡ７１４０７．１（ＧＩ：７７３７９５０２）及び／またはＣＡＩ９９８００．１（ＧＩ：９８９５６３２４）を持つ軽鎖成熟可変領域である。好ましくは、これらの配列の複合物が本実施例と同様に使用される。軽鎖可変領域フレームワークにてｍ１７４９軽鎖とＡＢＡ７１４０７．１が８５％の配列同一性を有し、ＣＡＩ９９８００．１が８３％の配列同一性を有するので、これらのアクセプター配列には同じ規定形態を有する３つのＣＤＲが含まれる。
【０２２４】
本発明は、ドナーｍ１７４９抗体に完全にまたは実質的に由来するＫａｂａｔによって定義されたような３つの軽鎖ＣＤＲ及び３つの重鎖ＣＤＲと、存在するならば、ヒトの抗体配列に完全にまたは実質的に由来する成熟可変領域フレームワーク配列及び定常領域とを有するヒト化抗体を提供する。同様に、ヒト化された重鎖は、ｍ１７４９抗体の重鎖に完全にまたは実質的に由来するＫａｂａｔによって定義されたような３つの重鎖ＣＤＲと、存在するならば、ヒトの抗体重鎖配列に完全にまたは実質的に由来する成熟重鎖可変配列及び重鎖定常領域配列とを有する重鎖である。同様にヒト化された軽鎖は、ｍ１７４９抗体の軽鎖に完全にまたは実質的に由来するＫａｂａｔによって定義されたような３つの軽鎖ＣＤＲと、存在するならば、ヒトの抗体軽鎖配列に完全にまたは実質的に由来する成熟軽鎖可変配列及び軽鎖定常領域配列とを有する軽鎖である。一部の抗体は、配列番号６６のＫａｂａｔのＣＤＲ１：ＳＹＩＭＳ；配列番号６７のＫａｂａｔのＣＤＲ２：ＴＩＳＳＧＧＳＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ；配列番号６８のＫａｂａｔのＣＤＲ３：ＤＤＤＹＤＶＫＶＦＡＹを含むヒト化された重鎖を含む。一部の抗体は、配列番号６１のＫａｂａｔのＣＤＲ１：ＫＳＳＲＳＬＬＮＳＲＩＲＫＮＹＬＡ；配列番号６２のＫａｂａｔのＣＤＲ２：ＷＡＳＴＲＥＳ；配列番号６３のＫａｂａｔのＣＤＲ３：ＫＱＳＹＮＬＬＴを含むヒト化された軽鎖を含む。一部の抗体は、配列番号６６、６７及び６８の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含むヒト化された重鎖と、配列番号６１、６２及び６３の３つのＫａｂａｔのＣＤＲを含むヒト化された軽鎖とを含む。ＣＨＲＨ２のＫａｂａｔの６０〜６５位が置換され得ることを除いて、残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％がｍ１７４９の対応するＣＤＲにおける対応する残基と同一であるならば、ＣＤＲは実質的にｍ１７４９に由来する。抗体鎖の成熟可変領域フレームワーク配列及び抗体鎖の定常領域配列は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が同一である場合、それぞれヒトの成熟可変領域フレームワーク配列またはヒトの定常領域配列に実質的に由来する。
【０２２５】
ヒトの成熟可変領域フレームワーク残基に由来する特定のアミノ酸は、幾つかある理由の中で特に、ＣＤＲの構造及び／または抗原への結合、重鎖と軽鎖の間の相互作用の介在をすること、定常領域との相互作用、所望のまたは所望ではない翻訳後修飾の部位であること、ヒト可変領域配列のその位置では稀な残基なので潜在的に免疫原性であることに対する考えられる影響に基づいて置換について選択することができる。以下の６つの可変領域フレームワークの位置（Ｄ９Ｓ、Ａ１９Ｖ、Ｐ４３Ｓ、Ｑ３Ｋ、Ｇ４２Ｅ、Ａ９３Ｔ）は、実施例でさらに特定されるようにこれらの理由の１以上についての置換の候補と見なされた。
【０２２６】
他のどこでも同じようにここで、最初に述べた残基はヒトのアクセプターフレームワークにＫａｂａｔのＣＤＲを移植することによって形成されるヒト化抗体の残基であり、二番目に述べた残基はそのような残基を置き換えるために検討される残基である。従って、可変領域フレームワークの範囲内で最初に述べた残基はヒト由来であり、ＣＤＲの範囲内で最初に述べた残基はマウス由来である（たとえば、Ｃ９７Ｓ）。
【０２２７】
ＣＤＲにおいてアミノ酸置換を行うことができる。考えられる変異の１つは、ｍ１７４９抗体のＣＤＲにおける特定の残基を、ヒトのＣＤＲ配列に由来する、通常、例となるヒト化抗体を設計するのに使用されるヒトアクセプター配列のＣＤＲに由来する対応する残基によって置換することである。一部の抗体では、ＣＤＲの一部のみ、すなわち、ＳＤＲと呼ばれる結合に必要とされるＣＤＲ残基のサブセットのみがヒト化抗体にて結合を保持するのに必要とされる。抗原に接触しない及びＳＤＲ内にないＣＤＲ残基は、以前の研究（たとえば、ＣＤＲＨ２における残基Ｈ６０〜Ｈ６５は必要とされないことが多い）に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａの超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１，１９８７）の外にあるＫａｂａｔのＣＤＲの領域から、分子モデル化によって及び／または経験的に、またはＧｏｎｚａｌｅｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８６３，２００４にて記載されたように、特定することができる。そのようなヒト化抗体では、１以上のドナーＣＤＲ残基が存在しない、またはドナーＣＤＲ残基全体が省略される位置で、その位置を占めるアミノ酸はアクセプター抗体配列における対応する位置（Ｋａｂａｔの番号付けによる）を占めるアミノ酸であることができる。含めるためのＣＤＲにおけるドナーアミノ酸のためのアクセプターのそのような置換の数は競合する考慮すべき事柄のバランスを反映する。そのような置換は、ヒト化抗体におけるマウスのアミノ酸の数を減らすことにおいて、及びその結果潜在的な免疫原性を減らすことにおいて潜在的に有利である。しかしながら、置換は親和性の変化を引き起こすこともでき、親和性の有意な低下は好ましくは回避される。ＣＤＲ内の置換の位置及び置換するアミノ酸も経験に基づいて選択されることができる。
【０２２８】
ＣＤＲ内で置換を行う理由の１つは、マウス残基が抗体の発現または集合を妨害し得る翻訳後修飾の部位であることである。
【０２２９】
本発明は、ヒト化重鎖成熟可変領域が配列番号１５６に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示し、及びヒト化軽鎖成熟可変領域が配列番号１６０に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を示すヒト化１７４９抗体の変異体を提供する。一部のそのようなヒト化抗体には、マウスのドナー抗体のそれと同じである、ｈｕ１７４９のＣＤＲ領域に対して完全にまたは実質的に同一である３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲが含まれる。ＣＤＲ領域は、任意の従来の定義（たとえば、Ｃｈｏｔｈｉａ）によって定義することができるが、好ましくはＫａｂａｔによって定義されたとおりである。
【０２３０】
ヒト化重鎖成熟可変領域が配列番号１５６であり、及びヒト化軽鎖成熟可変領域が配列番号１６０であるヒト化１７４９抗体は、１７４９ＶＨ３ＶＬ３と呼ばれる。ヒト化１７４９ＶＨ３ＶＬ３の一部の変異体はｈｕ１７４９ＶＨ３ＶＬ３における逆突然変異の一部またはすべてを保持する。言い換えれば、以下の少なくとも１、２、３、４、５または好ましくは６すべてが存在し：Ｈ３はＫによって占められ、Ｈ４２はＥによって占められ、Ｈ９３はＴによって占められ、Ｌ９はＳによって占められ、Ｌ１９はＶによって占められ、及びＬ４３はＳによって占められる。
【０２３１】
ｈｕ１７４９ＶＨ３ＶＬ３の逆突然変異の少なくとも１、２、３、４、５または好ましくは６すべてを保持することに加えて、ヒト化１７４９抗体は可変領域フレームワークにおいても追加の逆突然変異も含有してもよい。そのような逆突然変異の例には、Ｄによって占められたＨ１、Ｄによって占められたＨ１０、Ｋによって占められたＨ１３、Ｋによって占められたＨ１９、Ａによって占められたＨ１１３、Ｓによって占められたＬ５、Ａによって占められたＬ１５、Ｋによって占められたＬ１８、Ｍによって占められたＬ２１、Ｔによって占められたＬ６３、Ｖによって占められたＬ７８、Ｌによって占められたＬ８３、Ａによって占められたＬ１００、Ｌによって占められたＬ１０４、及び／またはＬによって占められたＬ１０６が挙げられる。治療用製品または診断用製品のための逆突然変異の選択については、それらが一般に親和性を改善しない程度及びさらに多くのマウス残基を導入することが免疫原性の高いリスクを生じ得る程度を考慮に入れるべきである。
【０２３２】
上記抗体のいずれかでは、成熟可変領域フレームワークにて、たとえば、ＣＤＲに接触しない残基にて他のアミノ酸置換を行うことができる。変異体ヒト化配列で行われる置換は、置換されたアミノ酸に関して保存性があることが多い。
【０２３３】
Ｂ．定常領域の選択
キメラ抗体、ベニヤ化抗体またはヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域はヒトの定常領域の少なくとも一部と連結することができる。定常領域の選択はある程度、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性、抗体依存性細胞性貪食作用及び／または補体依存性細胞傷害性が所望であるかどうかに左右される。たとえば、ヒトのアイソタイプＩｇＧ１及びＩｇＧ３は補体依存性細胞傷害性を有し、ヒトのアイソタイプＩｇＧ２及びＩｇＧ４は有さない。ヒトのＩｇＧ１及びＩｇＧ３はヒトのＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも強力な細胞介在性のエフェクター機能も誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであることができる。
【０２３４】
軽鎖及び／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端における１または数個のアミノ酸、たとえば、重鎖のＣ末端リジンは、ある割合の分子でまたはすべての分子で欠けていてもよく、または誘導体化されてもよい。定常領域にて置換を行って補体依存性細胞傷害性若しくはＡＤＣＣのようなエフェクター機能を増減することができ（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒら，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏら，米国特許第５，８３４，５９７号；及びＬａｚａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：４００５，２００６を参照のこと）、またはヒトにおける半減期を延長することができる（たとえば、Ｈｉｎｔｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照のこと）。例となる置換には、抗体の半減期を増やすための２５０位でのＧｌｎ及び／または４２８位でのＬｅｕが挙げられる（この段落では定常領域についてＥＵ番号付けを使用する）。２３４位、２３５位、２３６位及び／または２３７位のいずれかまたはすべてにおける置換は、Ｆｃγ受容体、特にＦｃγＲＩ受容体についての親和性を低下させる（たとえば、ＵＳ６，６２４，８２１を参照のこと）。エフェクター機能を低下させるには、ヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位及び２３７位におけるアラニン置換を使用することができる。一部の抗体は、エフェクター機能を低下させるためにヒトＩｇＧ１の２３４位、２３５位及び２３７位にてアラニン置換を有する。任意で、ヒトＩｇＧ２の２３４位、２３６位及び／または２３７位をアラニンによって置換し、２３５位をグルタミンによって置換する（たとえば、ＵＳ５，６２４，８２１を参照のこと）。一部の抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる２４１位、２６４位、２６５位、２７０位、２９６位、２９７位、３２２位、３２９位、及び３３１位の１以上における変異を使用する。一部の抗体では、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けによる３１８位、３２０位及び３２２位の１以上における変異を使用する。一部の抗体では、２３４位及び／または２３５位がアラニンによって置換され、及び／または３２９位がグリシンによって置換される。一部の抗体では、配列番号１７４におけるように２３４位及び２３５位がアラニンによって置換される。一部の抗体では、アイソタイプはヒトのＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。例となるヒト軽鎖カッパ定常領域は配列番号１７０のアミノ酸配列を有する。配列番号１７０のＮ末端アルギニンは省略することができ、その場合、軽鎖カッパ定常領域は配列番号１７１のアミノ酸配列を有する。例となるヒトＩｇＧ１重鎖定常領域は配列番号１７２のアミノ酸配列を有する（Ｃ末端リジンを伴ってまたは伴わずに）。抗体は、２つの軽鎖及び２つの重鎖を含有する四量体として、別々の重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖとして、または重鎖及び軽鎖の成熟可変ドメインがスペーサーを介して連結される単鎖抗体として発現され得る。
【０２３５】
ヒトの定常領域は、様々な個体間でアロタイプ変異及びイソアロタイプ変異を示し、すなわち、定常領域は１以上の多型位置で様々な個体にて異なることができる。イソアロタイプは、イソアロタイプを認識する血清は１以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。従って、たとえば、別の重鎖定常領域はＩｇＧ１ Ｇ１ｍ３アロタイプものであり、配列番号１７３のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、それがＣ末端リジンを欠くことを除いて配列番号１７３のアミノ酸配列を有する。別の重鎖定常領域は、配列番号１７４のアミノ酸配列を有する。さらに別の重鎖定常領域は、それがＣ末端リジンを欠くことを除いて配列番号１７４のアミノ酸配列を有する。
【０２３６】
本発明はさらに、上記定常領域のいずれかをコードする核酸を提供する。任意で、そのような核酸はさらにシグナルペプチドをコードし、定常領域に連結されたシグナルペプチドと共に発現され得る。
【０２３７】
Ｃ．組換え抗体の発現
抗体を組換え発現によって作出することができる。抗体をコードする核酸は、所望の細胞型（たとえば、ＣＨＯまたはＳｐ２／０）における発現のためにコドンを最適化することができる。組換え核酸の構築物には通常、天然に会合したまたは異種のプロモータ領域を含む、抗体鎖のコーディング配列に操作可能に連結される発現制御配列が含まれる。発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換するまたはそれに形質移入することが可能であるベクターにおける真核細胞のプロモータ系であることができる。ベクターはいったん適当な宿主に組み込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現、及び交差反応する抗体の回収と精製に好適な条件下で維持される。抗体鎖をコードするベクター（単数）またはベクター（複数）は、たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素のような選択可能な遺伝子を含有して抗体鎖をコードする核酸のコピー数の増幅を可能にすることもできる。
【０２３８】
大腸菌は、抗体、特に抗体断片を発現させるのに特に有用な原核細胞宿主である。酵母のような微生物も発現に有用である。サッカロミセスは、所望のような発現制御配列、複製開始点、終結配列等を有する好適なベクターを伴った、酵母宿主の一例である。典型的なプロモータには３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及び他の糖分解酵素が含まれる。誘導性の酵母プロモータには、とりわけ、アルコール脱水素酵素、イソチトクロームＣ、及びマルトースやガラクトースの利用に関与する酵素に由来するプロモータが挙げられる。
【０２３９】
哺乳類細胞は免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチド断片を発現させるのに使用することができる。Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７）を参照のこと。インタクトな異種タンパク質を分泌することが可能である多数の好適な宿主細胞株が当該技術で開発されており、それには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、及びＳｐ２／０やＮＳ０を含む抗体を産生しない骨髄腫が挙げられる。非ヒト細胞を使用することが有利であり得る。これらの細胞のための発現ベクターは、たとえば、複製開始点、プロモータ、エンハンサのような発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び、たとえば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終結配列のような必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。好適な発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモータである。Ｃｏら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【０２４０】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするベクターを細胞培養物に導入して、無血清培地における増殖生産性及び産物の質について細胞プールをスクリーニングすることができる。次いで最も生産性の高い細胞プールをＦＡＣＳに基づく単一細胞クローニングに供してモノクローナル株を生成することができる。培養物のＬ当たり７．５ｇを超える産物タイターに相当する１日当たり細胞当たり５０ｐｇまたは１００ｐｇを上回る特定の生産性が有利であり得る。単一細胞クローンによって産生された抗体を、濁度、濾過特性、ＰＡＧＥ、ＩＥＦ、ＵＶ走査、ＨＰ−ＳＥＣ、炭水化物／オリゴ糖マッピング、質量分光法、及び、たとえば、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅのような結合アッセイについて調べることもできる。次いで選択されたクローンを複数のバイアルに貯め、その後の使用のために凍結保存することができる。
【０２４１】
いったん発現されると、プロテインＡ捕捉、カラムクロマトグラフィ（たとえば、疎水性相互作用またはイオン交換）、ウイルス不活化用の低ｐＨ等を含む、当該技術の標準手順（一般にＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２）を参照のこと）に従って抗体を精製することができる。
【０２４２】
コドンの最適化、プロモータ、転写要素及びターミネータの選択、無血清単一細胞クローニング、細胞バンク、コピー数の増幅のための選択マーカーの使用、ＣＨＯターミネータ、無血清単一細胞クローニング、タンパク質タイターの改善を含む抗体の商業的な製造の方法（たとえば、ＵＳ５，７８６，４６４、ＵＳ５，８８８，８０９、ＵＳ６，０６３，５９８、ＵＳ６，１１４，１４８、ＵＳ７，５６９，３３９、ＷＯ２００４／０５０８８４、ＷＯ２００５／０１９４４２、ＷＯ２００８／０１２１４２、ＷＯ２００８／０１２１４２、ＷＯ２００８／１０７３８８及びＷＯ２００９／０２７４７１を参照のこと）。
【０２４３】
Ｄ．核酸
本発明はさらに、上述の重鎖及び軽鎖のいずれかをコードする核酸を提供する。通常、核酸は成熟の重鎖及び軽鎖に融合されたシグナルペプチドもコードする（たとえば、配列番号１６４、１６６及び１６８によってコードされ得る配列番号１６５、１６７及び１６９のアミノ酸配列を有するシグナルペプチド）。核酸におけるコーディング配列は、コーディング配列の発現を確保する調節性配列、たとえば、プロモータ、エンハンサ、リボソーム結合部位、転写終結シグナル等と操作可能な連結状態にあることができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は単離された形態で存在することができ、または１以上のベクターにクローニングすることができる。核酸は、たとえば、重複するオリゴヌクレオチドの固相合成またはＰＣＲによって合成することができる。重鎖及び軽鎖をコードする核酸は、たとえば、発現ベクターの中で１つの隣接する核酸として連結することができ、または、分離して、たとえばそれ自体の発現ベクターにクローニングすることができる。
【０２４４】
Ｅ．抗体結合のためのＭＣＡＭエピトープの性状分析及びそれに結合する抗体の生成
１．抗体結合のためのＭＣＡＭエピトープ
本発明は、ヒトＭＣＡＭタンパク質の中での特定のエピトープに結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の一部の抗体は１７４９．１.３（ｍ１７４９）と名付けられた抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。
【０２４５】
本発明は、ｍ１７４９と名付けられた抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する抗体を提供する。ＭＣＡＭの残基２７２、３１８、３２０、３４０及び３７７での変異は、ｍ１７４９の特異的な結合を妨害する（たとえば、実施例として記載されるように陽性対照の野生型ＭＣＡＭと比べて変異ＭＣＡＭに対する＜３０％の結合）。相対的に少ない残基が結合に影響し、残基は典型的な線状のエピトープ（たとえば、３〜２０の隣接したアミノ酸）よりも広く間隔を空けているので、これらの結果はｍ１７４９が立体構造エピトープに結合するという指摘を提供する。或いは、結合に影響を及ぼす残基の１以上は抗体と直接接触しないでそのようにアロステリックであって良い。
【０２４６】
ＭＣＡＭの残基２７２、３１８、３２０、３２４、３２６、３４０及び３７７の１以上を含むエピトープに、特に残基３１８、３２４及び３２６の１以上を含むエピトープに結合する抗体は、有用な阻害特性をｍ１７４９と共有すると思われる。従って、その特異的な結合がＭＣＡＭの残基３１８、３２４及び３２６の１以上、特に残基３１８の変異誘発によって阻害される抗体は、ｍ１７４９に類似する特性を共有と思われる。一部のそのような抗体は、ＭＣＡＭの残基３１８、３２４及び／または３２６を含むまたはそれから成るエピトープに結合する。エピトープは、たとえば、特定のアミノ酸（３１８、３２４及び３２６）の１、２若しくは３を含むエピトープ（たとえば、２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、または５〜７０の隣接するアミノ酸）のような線状であることができ、または特定のアミノ酸の１、２若しくは３を含むまたはそれから成る立体構造であることができる。
【０２４７】
２．特定のＭＣＡＭエピトープを結合する抗体の生成
本発明の一部の抗体はｍ１７４９抗体と同じまたは重複するエピトープに結合する。ヒトＭＣＡＭに対する他の非ヒトモノクローナル抗体、たとえば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットのモノクローナル抗体の作出は、たとえば、ヒトＭＣＡＭまたは所望のエピトープ（免疫原）を含むそのペプチド断片で動物を免疫し、任意でｍ１７４９との競合にてＭＣＡＭへの結合について得られた抗体をスクリーニングすることによって達成することができる（あらゆる目的で参照によって組み入れられるＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ，１９８８）を参照のこと）。任意で、免疫原をキャリア分子に抱合する。任意で、免疫原をアジュバントと共に投与する。以下に記載されるように幾つかの型のアジュバントを使用することができる。実験動物の免疫には不完全アジュバントがその後に続く完全フロイントアジュバントが好まれる。ウサギまたはモルモットは通常ポリクローナル抗体を作製するのに使用される。マウスは通常モノクローナル抗体を作製するのに使用される。抗体は、ＭＣＡＭ内での所望のエピトープに対する特異的な結合についてスクリーニングされる。
【０２４８】
本発明は、上述のエピトープに向けられた抗体を創り出すのに使用されるＭＣＡＭのペプチド断片を提供する。そのようなペプチドの例には、長さ２〜５、３〜５、３〜１０、３〜１５、３〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜５０、５〜６０、または５〜７０の間の隣接するアミノ酸であるペプチドが挙げられ、それにはＭＣＡＭのアミノ酸残基３１８、３２４及び３２６の少なくとも１つが含まれる。これらのペプチドの一部では、ペプチドにはアミノ酸残基３１８、３２４及び３２６の３つすべてが含まれる。
【０２４９】
免疫原はキャリア分子、通常、キャリアポリペプチドに抱合されてもよいので、キャリアに抱合された断片に対する免疫応答を引き出すのに役立つ。単一の作用因子を単一のキャリアに連結することができ、複数コピーの作用因子を複数コピーのキャリアに連結することができ、それは次々に互いに連結され、複数コピーの作用因子を単一コピーのキャリアに連結することができ、または単一コピーの作用因子を複数コピーのキャリアまたは異なるキャリアに連結することができる。好適なキャリアには、血清アルブミン、スカシガイのヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、卵白アルブミン、破傷風毒素、または、たとえば、ジフテリア（たとえば、ＣＲＭ１９７）、大腸菌、コレラ、ピロリ菌のような他の病原性細菌に由来する毒素、または弱毒化毒素誘導体が挙げられる。
【０２５０】
免疫原は薬学上許容可能なアジュバントと共に投与されることが多い。アジュバントは、ペプチドが単独で使用された状況に比べて誘導される抗体の力価を高め、及び／または誘導される抗体の結合親和性を高める。ＭＣＡＭの免疫原性断片と組み合わせて種々のアジュバント使用し、免疫応答を引き出すことができる。好まれるアジュバントは応答の定性的形態に影響を与える免疫原に構造変化を生じさせることなく免疫原に対する内在性の応答を増強する。好まれるアジュバントには、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１（ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔａｎａ，現在Ｃｏｒｉｘａの一部を参照）が挙げられる。Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１は南アメリカで見いだされる樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの樹皮から単離されるトリテルペングリコシドまたはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５）；ＵＳ５，０５７，５４０を参照のこと）、（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ；現在Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。他のアジュバントは、任意で、モノホスホリル脂質Ａ（Ｓｔｏｕｔｅら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照のこと）、プロニックポリマー及び殺傷マイコバクテリウムのような免疫刺激剤と組み合わせた水中油エマルジョン（たとえば、スクアレンまたはピーナッツ油）である。別のアジュバントはＣｐＧ（ＷＯ９８／４０１００）である。アジュバントは、活性剤を伴った治療用組成物の成分として投与することができ、または治療剤の投与の前に、それと同時に、若しくはその後に別に投与することができる。
【０２５１】
３．抗体の種類
抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。抗体は、たとえば、マウスまたはラット、非ヒト霊長類のような非ヒト抗体であることができ、またはヒトの抗体であることができる。抗体はキメラ抗体、ベニヤ化抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体等であることができる。
【０２５２】
モノクローナル抗体は上述の方法及びＱｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９；Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３；Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５、６，８８１，５５７；Ｆｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７にて記載された方法を用いてヒト化される。
【０２５３】
本発明はさらに、上述のＭＣＡＭエピトープに特異的に結合する非ヒト抗体のキメラ形態及びベニヤ化形態を提供する。
【０２５４】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえば、マウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域と組み合わせられる抗体である。そのような抗体は実質的にまたは完全にマウス抗体の結合特異性を保持し、約３分の２がヒトの配列である。
【０２５５】
ベニヤ化抗体は、通常、非ヒト抗体のＣＤＲの一部と非ヒト可変領域フレームワークの一部を保持するが、Ｂ細胞若しくはＴ細胞のエピトープに寄与し得る他の可変領域フレームワーク残基、たとえば、ヒト抗体配列の相当する位置に由来する残基に接触する残基を置き換えるヒト化抗体の一種である（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）。結果は、ＣＤＲが完全にまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト様にされる抗体である。
【０２５６】
ＭＣＡＭに対するヒト抗体は以下で記載される種々の技法によって提供される。一部のヒト抗体は、実施例で記載されるマウスモノクローナル抗体の１つのような特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように、競合結合実験によって、Ｗｉｎｔｅｒの、上記のまたはほかのファージディスプレイ法によって選択される。標的抗原としてのＭＣＡＭの断片のみを用いることによって、及び／またはＭＣＡＭの欠失変異の回収に対して抗体をスクリーニングすることによって特定のエピトープ特異性についてヒト抗体をスクリーニングすることもできる。
【０２５７】
ヒト抗体の製造方法には、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，２：３６１−３６７（１９８３）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，米国特許第４，６３４，６６４号；及びＥｎｇｌｅｍａｎら，ＵＳ特許第４，６３４，６６６号のトリオーマ法、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスの使用（たとえば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７（１９９３）；ＵＳ５，８７７，３９７、ＵＳ５，８７４，２９９、ＵＳ５，８１４，３１８、ＵＳ５，７８９，６５０、ＵＳ５，７７０，４２９、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，５４５，８０６、Ｎａｔｕｒｅ、１４８，１５４７−１５５３（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４，８２６（１９９６），Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，ＷＯ９１／１０７４１（１９９１）を参照のこと）、及びファージディスプレイ法（たとえば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７、ＵＳ５，８７７，２１８、ＵＳ５，８７１，９０７、ＵＳ５，８５８，６５７、ＵＳ５，８３７，２４２、ＵＳ５，７３３，７４３及びＵＳ５，５６５，３３２を参照のこと）が挙げられる。
【０２５８】
キメラ抗体、ヒト化（ベニヤ化を含む）抗体及びヒト抗体は通常、上述のような組換え発現によって作出される。
【０２５９】
本発明はさらに、非抗体結合分子を提供する。非抗体結合分子には、たとえば、リガンド結合部位を形成する４つの超可変ループを支える堅いβバレルを特徴とするタンパク質構造であるリポカリンの足場に基づくアンチカリンが挙げられる。新規の結合特異性は、機能的なディスプレイ及び誘導された選択と組み合わせた、ループ領域における標的化された無作為な変異誘発によって操作される（Ｓｋｅｒｒａ（２００８），ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６７７−２６８３）。他の好適な足場には、たとえば、ヒトのフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインに基づくアドネクチンまたはモノボディ（Ｋｏｉｄｅ及びＫｏｉｄｅ（２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５−１０９）、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインに基づくアフィボディ（２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６６８−２６７６））；アンキリン反復タンパク質に基づくＤＡＲＰｉｎｓ（Ｓｔｕｍｐｐら．（２００８），Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，１３：６９５−７０１）；ヒトのＦｙｎタンパク質キナーゼのＳＨ３ドメインに基づくフィノマー（Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら．（２００７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６−３２０４）；Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｌａｒｉｕｓに由来するＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋら．（２００８），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３：１０５８−１０６８）；ヒトのｙ−Ｂ−クリスタリンに基づくアフィリン（Ｅｂｅｒｓｂａｃｈら．（２００７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２−１８５）；膜受容体タンパク質のＡドメインに基づくアビマー（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎら．（２００５），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５５６−１５６１）；システインが豊富なノッチンペプチド（Ｋｏｌｍａｒ（２００８），ＦＥＢＳ  Ｊ．２７５：２６８４−２６９０）；及び操作されたＫｕｎｉｔｚ型阻害剤（Ｎｉｘｏｎ及びＷｏｏｄ（２００６），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．９：２６１−２６８）が挙げられてもよい。概説については、Ｇｅｂａｕｅｒ及びＳｋｅｒｒａ（２００９），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５−２５５を参照のこと。
【０２６０】
これらの抗体の一部では、抗体は、ＷＯ／２０１２／１７００７１及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３にて記載された抗体に完全にまたは実質的に由来するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａまたはそれらの複合物によって定義されるような）を含む抗体のいずれか１つまたは抗体ではなく、特に、ＷＯ／２０１２／１７００７１にてクローン１５（配列番号１２〜２１によって定義された）及びクローン１７（配列番号１〜１０によって定義された）と名付けられた抗体及び１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１及び１７４９．１．３と名付けられたマウス抗ヒトＭＣＡＭモノクローナルクローン及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３に記載された２１２０．４.１９及び２１０７．４.１０と名付けられたラット抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローンではない。
【０２６１】
４．活性について抗体をスクリーニングする方法
本明細書で記載されるＭＣＡＭ抗体の阻害活性は、同じまたは実質的に類似するエピトープ（たとえば、ｍ１７４９）を結合する抗体との競合結合アッセイ及びそのリガンドであるラミニン４１１のラミニンα４鎖とのＭＣＡＭの結合の阻止を含む当該技術で既知の方法によってアッセイすることができる。
【０２６２】
たとえば、ＭＣＡＭとラミニン４１１のラミニンα４鎖との間の相互作用を阻止するＭＣＡＭ抗体の活性は以下のようにスクリーニングすることができる。ＭＣＡＭ発現細胞を、（ａ）候補抗体の存在下または非存在下でラミニンα４鎖、たとえば、ラミニン４１１のα４鎖を含む組換えポリペプチドと共にインキュベートし；（ｂ）たとえば、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって細胞へのラミニンα４の結合のレベルをモニターし；（ｃ）候補抗体の非存在下よりも存在下のほうがラミニンα４の結合のレベルが低ければＭＣＡＭ／ラミニンα４の相互作用の阻害剤として前記候補抗体を特定する。代替のスクリーニングプロトコールには、候補抗体の存在下または非存在下でＭＣＡＭと共にインキュベートすることができるラミニンα４鎖を発現している細胞の集団の使用と、モニターされる細胞集団へのＭＣＡＭの結合が関与する。候補抗体の存在下での細胞集団へのＭＣＡＭの結合が非存在下よりも低ければ、候補抗体はＭＣＡＭのアンタゴニストである。
【０２６３】
モニタリングの他の方法には、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【０２６４】
そのリガンド、たとえば、ラミニンα４鎖へのＭＣＡＭの結合を阻害するその能力に基づいて特定されるＭＣＡＭアンタゴニストは、ＭＣＡＭ発現細胞の浸潤を特徴とする炎症性状態の治療のための候補である。
【０２６５】
ＭＣＡＭ抗体の阻害活性は生体内でも評価することができる。ＭＣＡＭ抗体の阻害活性を評価する方法の一例は、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルによる。ＥＡＥはヒトにおける多発性硬化症（ＭＳ）の症状に類似する症状を生じるように実験動物で生成される疾患である。たとえば、Ｂａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ.Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０６：１９２０−１９２５（２００９）を参照のこと。ＥＡＥは一般に、他の動物の中枢神経系に由来する様々なタンパク質、たとえば、ミエリン塩基性タンパク質及び脊髄全体若しくは脳組織の抽出物を、またはミエリンに特異的に反応するＴ細胞を動物に注射することによって作出される。ＥＡＥは一般に、ＭＳの再発または進行形態の経過に従うように使用される。ＥＡＥはＭＳの治療剤を開発すること及びＭＳの特定の疾患過程を研究することの双方で好適な動物モデルとして役立っている。たとえば、Ｇｏｌｄら、Ｂｒａｉｎ，１２９：１９５３−１９７１（２００６）を参照のこと；Ｓｔｅｉｎｍａｎら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．６０：１２−２１（２００６）も参照のこと。
【０２６６】
疾患の進行に対するＭＣＡＭ遮断の効果は、ＴＨ１７の分極形成が生体内で生じるＥＡＥの治療モデルで調べることができる。マウスをＰＬＰ１３９−１５１ペプチドで免疫してＥＡＥを誘導する。疾患の発症後、候補の抗ＭＣＡＭ抗体またはアイソタイプ対照のいずれかによってマウスを腹腔内で処理し、その後、毎日処理する。マウスを毎日モニターし、盲検法でスコア化し、２〜３日ごとに体重を得た。候補ＭＣＡＭ抗体によって処理したマウスにおける再発の遅延及び症状の重症度の有意な軽減は成功した候補抗体を示す。
【０２６７】
Ｆ．標識抗体
ＭＣＡＭに特異的に結合する標識抗体は、破壊のために癌細胞若しくは腫瘍細胞を標的とすることにおいて、または自己免疫疾患若しくは神経炎症性疾患に関与する細胞を標的とすることにおいて有用であり得る。そのような抗体は、少なくとも部分的にＭＣＡＭの発現が介在する疾患を標的とすることにおいても有用であり得る。たとえば、そのような抗体は、他の治療剤、他のタンパク質、他の抗体、及び／または検出可能な標識で標識することができる。ＷＯ０３／０５７８３８；ＵＳ８，４５５，６２２を参照のこと。そのような治療剤は、たとえば、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌のような患者における望ましくない状態または疾患を治療する、それと闘う、それを和らげる、予防するまたは改善するために使用することができる作用因子であることができる。治療剤には、細胞傷害剤、細胞増殖抑制剤、放射性治療剤、免疫調節剤、または抗体の活性を促進する、若しくは高める生物活性剤を挙げることができる。細胞傷害剤は細胞に対して毒性である任意の作用因子であることができる。細胞増殖抑制剤は細胞の増殖を阻害する任意の作用因子であることができる。免疫調節剤は免疫的応答の発生または維持を刺激するまたは阻害する任意の作用因子であることができる。放射性治療剤は放射線を発する分子または化合物であることができる。そのような治療剤が、本明細書で記載される抗体のようなＭＣＡＭ特異的な抗体に結合されるのであれば、結合された治療剤は、他の細胞よりもＭＣＡＭ発現細胞（たとえば、ＴＨ１７発現細胞のような免疫細胞、または悪性メラニン細胞のような癌細胞）に対して特異的な親和性を有するであろう。その結果、標識抗体の投与は、他の周辺細胞及び周辺組織に対する最少限の影響でＭＣＡＭ発現細胞を直接標的とする。このことは、単独で投与するには毒性でありすぎる治療剤にとって特に有用であることができる。加えて、さらに少量の治療剤を使用することができる。
【０２６８】
抗体を抗毒素として作用するように修飾することができる。たとえば、米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。たとえば、植物由来の細胞毒素であるリシンは、抗体について二官能性試薬である無水Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸を用い、リシンについて３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸スクシンイミジルを用いて、抗体に結合することができる。Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８（１６）：４４６９−４４７６（１９９８）を参照のこと。結合は、リシンのＢ鎖の結合活性の喪失を生じる一方で、リシンのＡ鎖の毒性能も抗体の活性も損傷しない。同様に、リボソーム集合の阻害剤であるサポリンは、化学的に挿入されたスルフヒドリル基間のジスルフィド結合を介して抗体に結合することができる。Ｐｏｌｉｔｏら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１８：１２１５−１２２２（２００４）を参照のこと。
【０２６９】
放射性同位元素を抗体に連結することもできる。好まれる放射性同位元素には、イットリウム９０（９０Ｙ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９及びビスマス２１３が挙げられる。放射性同位元素の抗体への結合は従来の二官能性キレートによって行われてもよい。放射性銀−１１及び放射性銀−１９９については、イオウ系リンカーが使用されてもよい。Ｈａｚｒａら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４−２５：１−７（１９９４）を参照のこと。銀放射性同位元素の結合にはアスコルビン酸によって免疫グロブリンを還元することが関与してもよい。１１１Ｉｎ及び９０Ｙのような放射性同位元素については、イブリツモマブ・チウキセタンを用いることができ、それはそのような同位元素と反応してそれぞれ１１１Ｉｎ／イブリツモマブ・チウキセタン及び９０Ｙ／イブリツモマブ・チウキセタンを形成する。Ｗｉｔｚｉｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４８，Ｓｕｐｐｌ，１：Ｓ９１−Ｓ９５（２００１）を参照のこと。
【０２７０】
他の治療剤も抗体に連結させてもよい。治療剤は普通、細胞傷害性または細胞増殖抑制性である。たとえば、抗体は、たとえば、マイタンシン、ゲルダナマイシンのような毒性化学療法剤、たとえば、アウリスタチンのようなチューブリン阻害剤、またはカリケアミシンのような副溝結合作用因子に結合することができる。他の代表的な治療剤には、自己免疫疾患、神経炎症性疾患若しくは癌、または自己免疫疾患、神経炎症性疾患若しくは癌の症状の治療、管理または改善に有用であることが知られる作用因子が挙げられる。そのような治療剤の例は本明細書の他のどこかに開示されている。
【０２７１】
抗体は他のタンパク質にも結合することができる。たとえば、抗体はフィノマーに結合することができる。フィノマーはヒトＦｙｎのＳＨ３ドメインに由来する小さな結合タンパク質（たとえば、７ｋＤａ）である。それらは安定した、及び可溶性であることができ、システイン残基及びジスルフィド結合を欠くことができる。フィノマーは、抗体と同じ親和性と特異性で標的分子に結合するように操作することができる。それらは、抗体に基づいて多重特異性の融合タンパク質を創り出すのに好適である。たとえば、フィノマーは、抗体のＮ末端及び／またはＣ末端に融合されて異なる構造を持つ二重特異性及び三重特異性のＦｙｎｏｍＡｂを創り出すことができる。フィノマーは、ＦＡＣＳ、Ｂｉａｃｏｒｅ、及び最適な特性を持つフィノマーの効率的な選択を可能にする細胞に基づくアッセイを用いたスクリーニング法を介してフィノマーライブラリを用いて選択することができる。フィノマーの例は、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６−３２０４（２００７）；Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．２０：５７−６８（２００７）；Ｓｃｈｌａｔｔｅｒら、ＭＡｂｓ．４：４９７−５０８（２０１１）；Ｂａｎｎｅｒら、Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６９（Ｐｔ６）：１１２４−１１３７（２０１３）；及びＢｒａｃｋら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１３：２０３０−２０３９（２０１４）にて開示されている。
【０２７２】
本明細書で開示されている抗体は１以上の他の抗体に結合するまたは抱合することもできる（たとえば、抗体のヘテロ抱合体を形成するために）。そのような他の抗体はＭＣＡＭ内の異なるエピトープに結合することができ、または異なる標的抗原に結合することができる。
【０２７３】
抗体はまた検出可能な標識にも結合することができる。そのような抗体を、たとえば、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌の診断のために、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、または癌の進行をモニターするために、及び／または治療の有効性を評価するために使用することができる。そのような抗体は、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、若しくは癌を有するまたはそれが疑われる対象にて、またはそのような対象から得られる適当な生物試料にて、そのような判定を行うのに有用であることができる。抗体に結合または連結されてもよい代表的な検出可能な標識には、たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼのような種々の酵素；たとえば、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンのような補欠分子族；たとえば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンのような蛍光物質；たとえば、ルミノールのような発光物質；たとえば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンのような生物発光物質；たとえば、放射性銀−１１１、放射性銀−１９９、ビスマス２１３、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ、）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フルオリン（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、及び１１７スズのような放射性物質；種々のポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロン放出金属；非放射性の常磁性金属イオン；並びに特定の放射性同位元素に放射性標識されるまたは抱合される分子が挙げられる。
【０２７４】
治療剤、他のタンパク質、他の抗体及び／または検出可能な標識は、当該技術で既知の技法を用いてマウス抗体、キメラ抗体、ベニヤ化抗体またはヒト化抗体に直接または中間体（たとえば、リンカー）を介して間接的に結合されてもよく、または抱合されてもよい。たとえば、Ａｒｎｏｎら、"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら（編）、ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，"ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら（編）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，"ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，"ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）；及びＴｈｏｒｐｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。好適なリンカーには、たとえば、切断可能リンカー及び切断可能ではないリンカーが挙げられる。酸性条件下または還元条件下または特定のプロテアーゼへの曝露の際、薬剤を遊離する様々なリンカーを採用することができる。同様に、特定のプロテアーゼへの曝露の際の酸性条件下または還元条件下、または他の定義された条件下、結合された治療剤、タンパク質、抗体及び／または検出可能な標識を遊離する様々なリンカーを採用することができる。
【０２７５】
ＩＶ．治療方法及び医薬組成物
本発明の抗体または他のアンタゴニストは、とりわけ、自己免疫疾患、神経炎症性疾患及び癌を有する（たとえば、ＤＳＭ−ＩＶ−ＴＲまたはＤＳＭ−Ｖのもののような当該技術にて承認された基準を満たす）対象を、または一般集団に比べて自己免疫疾患、神経炎症性疾患及び癌の高いリスクがある対象を治療することまたは対象の予防を達成することに使用することができる。高いリスクは、疾患に関連する１以上の遺伝的マーカー若しくは生化学的マーカーの存在、または疾患と矛盾しないが確定診断を行うには不十分な１以上の症状の存在から評価することができる。上述のカテゴリーまたは疾患は必ずしも相互に互いに排他的ではなく；たとえば、多発性硬化症は神経炎症性または自己免疫性として分類することができる。本方法によって治療可能な一部の具体的な例となる疾患には、多発性硬化症、パーキンソン病、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、炎症性大腸疾患、クローン病、または癌、特に黒色腫のような固形腫瘍が挙げられる。方法の実践はメカニズムの理解に左右されないが、一部の方法では、抗体または他のアンタゴニストは、Ｔ細胞（たとえば、ＴＨ１７細胞）上に発現されるＭＣＡＭと内皮細胞の表面上に発現されるラミニンα４鎖、たとえば、ラミニン４１１のα４鎖との相互作用を阻害することによって少なくともある程度機能すると考えられる。抗体／薬剤の抱合体は、通常、標的とされる細胞内に取り込まれた後、連結された作用因子の細胞傷害性効果または細胞増殖抑制効果を含む追加の作用機序を有することができる。抗体／薬剤の抱合体は腫瘍関連のマクロファージ毒性も誘導してもよい。
【０２７６】
神経炎症性状態は、ＣＮＳの炎症及び／または細胞／組織の損傷を特徴とする。兆候には、高いグリア活性、高い炎症誘発性サイトカイン／ケモカイン（たとえば、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１β）レベル、脳血管関門の透過性の上昇、及び／または免疫細胞（たとえば、白血球）のＣＮＳへの動員／浸潤の上昇を挙げることができる。神経炎症は、免疫系の細胞の慢性的な活性化（すなわち、自己免疫関連の神経炎症）に関連して慢性であることが多いが、代わりにまたはさらに急性の症状の出現を有し得る。
【０２７７】
多発性硬化症は、少なくとも４つの亜型のいずれかにて治療について望ましい疾患である。再発／寛解型ＭＳ（ＲＲ−ＭＳ）はＭＳの最も一般的な形態であり、明瞭に定義される悪化／再発（急性発作）に続く部分的なまたは完全な回復を特徴とする。再発期間の間に疾患の進行はない。当初（診断時）、ＲＲ−ＭＳは新しく診断された対象すべての約８５％に相当する。再発の定義には、高い体温が無症状の病変または古い病変を暴き得るので、少なくとも２４時間存在し、発熱または併発疾患（「風邪」または尿道感染）に関連しない新しい症状または兆候を必要とする。
【０２７８】
原発進行型（ＰＰ−ＭＳ）は明瞭な再発無しで初めから継続する。安定期（安定の期間）があり得る。ＭＳの対象すべての１０〜１５％はこの群であり、高齢者に生じる傾向がある。女性対男性の比は、女性が約２：１で優勢である他の形態とは異なってこの群では均等である。ＰＰ−ＭＳはまた、脳ＭＲＩの変化は少なく、脊髄症／脊髄関連の変化が多い傾向がある。
【０２７９】
二次進行型（ＳＰ−ＭＳ）はＲＲ−ＭＳとして出発し、その後、再発を伴ってまたは伴わずに着実な進行が生じる。再発／寛解型の対象のおよそ５０％が二次進行型に進む。
【０２８０】
個人の約５％で生じる進行性再発型（ＰＲ−ＭＳ）は混合型の再発（回復を伴うまたは伴わない）と共に発症から進行性である。
【０２８１】
ＭＳの診断は普通、既往症、神経検査、及び磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、誘発電位（ＥＰ）及び脊髄液の分析を含む種々の検査に基づく。ＭＳの確定診断には、脳、脊髄及び視神経を含む中枢神経系（ＣＮＳ）の少なくとも２つの別々の領域での損傷の証拠及び損傷が少なくとも１ヵ月離れて生じた証拠及び他の考えられる診断すべての排除が必要とされる。当該技術で承認された基準によるＭＳの診断を有する対象を治療上処置することと同様に、本方法を予防上用いて、健常な個体の一般集団に比べてＭＳの進行の高いリスクに彼らを置くＭＳの少なくとも１つの兆候または症状を有する個体を治療することもできる。たとえば、方法を用いて、ＭＳを発症し始めてもよいし、そうでなくてもよい、初回臨床症状（ＣＩＳ）と呼ばれる−ＭＳ様の症状の１回の発作（再発または悪化とも呼ばれる）を有した個体を治療することができる。ＭＳを発症するリスクがある個体は、幾つかある方法の中でその血清中のタンパク質ＫＩＲ４．１に対する抗体の存在によっても特定することができる。
【０２８２】
神経炎症性疾患にはパーキンソン病も含まれる。パーキンソン病の症状には、震え（たとえば、手、腕、脚、顎及び顔面の震え）、四肢及び体躯の硬直またはこわばり；動作の緩慢または遅さ；姿勢の不安定または損傷されたバランス及び協調；うつ及び他の情動変化；飲み込み、咀嚼及び会話の困難さ；排尿問題または便秘；皮膚の問題；睡眠障害が挙げられる。パーキンソン病は、そのような症状、及び／または脳の走査、及び／または他の疾患を除外する他の検査から診断することができる。
【０２８３】
本方法を用いて癌の増殖または転移を阻害することができる。癌は、造血悪性腫瘍または固形腫瘍、すなわち、前癌様病変を含む良性または悪性の、細胞の過剰な成長または増殖の結果生じる細胞塊であることができる。癌は良性、悪性または転移性であることができる。転移癌はそれが最初に生じた場所から身体の別の場所に広がっている癌を指す。転移性癌細胞によって形成される腫瘍は転移性腫瘍または転移と呼ばれ、それは癌細胞が身体の他の部分に広がる過程を指すのにも使用される用語である。一般に、転移性癌は元々の癌または原発の癌と同じ名称及び同じ型を有する。癌の例には、たとえば、黒色腫、癌腫、芽腫及び肉腫のような固形腫瘍が挙げられる。癌にはまた、たとえば、白血病、またはリンパ腫のようなリンパ系悪性腫瘍のような血液悪性腫瘍も挙げられる。そのような癌のさらに詳しい例には、扁平上皮癌、肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌または胃の癌を含む消化器癌、膵臓癌、神経膠腫、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌、陰茎癌、並びに頭頚部の癌が挙げられる。
【０２８４】
自己免疫疾患には全身性の自己免疫疾患、臓器または組織に特異的な自己免疫疾患、及び自己免疫型の発現を示す疾患が挙げられる。これらの疾患では、生体はそれ自身の抗原の１つに対する細胞性の及び／または液性の免疫応答を発生し、その抗原の破壊及び潜在的な不能化及び／または致命的な結末をもたらす。細胞性の応答は、存在するならば、Ｂ細胞またはＴ細胞またはその双方であることができる。インターロイキン（ＩＬ）−１７及びＩＬ−２２の産生を特徴とするＴヘルパー細胞系列であるＴＨ１７細胞は組織に侵入して、ヒトにおける多発性硬化症及びマウスにおける実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）を含む病原性の自己免疫応答を促すことが報告されている。たとえば、Ｃｕａら、Ｎａｔｕｒｅ，４２１：７４４−７４８（２００３）；Ｉｖｏｎｏｖら，Ｃｅｌｌ，１２６：１１２１−１１３３（２００６）を参照のこと。ＴＨ１７細胞は組織へのその特異的な動員及び浸潤によって炎症性の応答を開始してもよいし、または伝播してもよい。
【０２８５】
自己免疫疾患の例には、グレーブス病、ハシモト甲状腺炎、多腺性自己免疫性症候群、インスリン依存性糖尿病（１型糖尿病）、インスリン抵抗性糖尿病（２型糖尿病）、免疫介在性不妊症、自己免疫性アジゾン病、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、疱疹状皮膚炎、自己免疫性脱毛症、白斑、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、全身硬直症候群、急性リウマチ熱、交感性眼炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、側頭動脈炎、ベーチェット病、炎症性大腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎、線維筋痛、多発性筋炎、皮膚筋炎、強直性脊椎炎、タカヤス関節炎、脂肪織炎、類天疱瘡、起源の分からない血管炎、ＡＮＣＡ陰性血管炎、ＡＮＣＡ陽性血管炎、全身性エリテマトーデス、乾癬性関節炎、関節リウマチ、強皮症、全身性壊死性血管炎、ワーグナー肉芽腫症、ＣＲＥＳＴ症候群、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、好酸球性胃腸炎、非定型局所皮膚炎、心筋症、感染後症候群、感染後心内膜心筋炎、セリアック病、多発性硬化症、サルコイドーシス及び乾癬が挙げられる。
【０２８６】
抗体または他のアンタゴニストは、発症を遅らせる、重症度を軽減する、さらなる悪化を抑制する、及び／または治療される疾患（たとえば、癌）の少なくとも１つの兆候若しくは症状を改善する投与量、投与経路及び投与回数を意味する有効な投薬計画で投与される。患者がすでに疾患を患っているのであれば、投薬計画は治療上有効な投薬計画と呼ばれ得る。患者が一般集団に比べて疾患のリスクは高いが、未だに症状を経験していないのであれば、投薬計画は予防上有効な投薬計画と呼ばれ得る。一部の例では、治療上または予防上の有効性は、同じ患者における歴史的対照または過去の経験に比べて個々の患者で観察することができる。他の例では、治療上または予防上の有効性は、未治療患者の対照集団に比べた治療された患者の集団における前臨床試験または臨床試験で実証することができる。
【０２８７】
抗体の例となる投与量は、０．１〜２０、または０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）または固定投与量として１０〜１５００ｍｇである。投与量は、患者の状態及び以前の治療への応答、もしあれば、数ある因子の中で、治療が予防上である、または治療上であるか、及び疾患が急性である、または慢性であるかに左右される。
【０２８８】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、局所、鼻内または筋肉内であることができる。静脈内投与または皮下投与による全身性循環への投与が好まれる。静脈内投与は、たとえば、３０〜９０分間のような時間にわたる点滴によることができる。
【０２８９】
投与の頻度は、数ある因子の中で、循環における抗体の半減期、患者の状態及び投与の経路に左右される。頻度は、毎日、毎週、毎月、四半期ごとに、または患者の状態若しくは治療される疾患の進行における変化に応じて不定期の間隔であることができる。静脈投与の例となる頻度は、さらに多くのまたは少ない頻度の投与も可能ではあるけれども、治療の持続的な目標に対して毎週と四半期ごととの間である。皮下投与については、例となる投与頻度は、さらに多くのまたは少ない頻度の投与も可能ではあるけれども、毎日から毎月である。
【０２９０】
投与される投薬の数は疾患が急性であるかまたは慢性であるか、及び治療に対する疾患の応答に左右される。急性の疾患または慢性の疾患の急性悪化については、１〜１０回の投与が十分であることが多い。場合によっては、単一ボーラス容量が、任意で分割した形態にて急性の疾患または慢性の疾患の急性悪化のために十分である。治療は急性の疾患の再発または急性悪化のために繰り返すことができる。慢性の疾患については、抗体は、規則的な間隔で、たとえば、毎週、２週ごとに、毎月、四半期ごとに、６ヵ月ごとに少なくとも１、５または１０年間、または患者の生涯、投与することができる。
【０２９１】
非経口投与のための医薬組成物は好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、及びＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は単位剤形（すなわち、単回投与のための剤形）で提供することができる。１以上の生理学的に及び薬学上許容可能なキャリア、希釈剤、賦形剤及び補助剤を用いて医薬組成物を製剤化することができる。製剤化は選択される投与の経路に左右される。注射については、抗体は、水溶液、好ましくは、生理的に適合性緩衝液、たとえば、ハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的な生理食塩水または酢酸緩衝液にて製剤化することができる（注射の部位での不快感を軽減するために）。溶液は、たとえば、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤のような製剤化剤を含有することができる。あるいは、抗体は、使用前に好適なビヒクル、たとえば、無菌の発熱物質を含まない水で構成するための凍結乾燥された形態であることができる。
【０２９２】
本発明の抗体による治療は、治療される疾患に対して有効な他の治療と併用することができる。併用治療は別々に投与するために製剤化することができる。多発性硬化症の治療のための追加の治療剤には、以下：テリフルノミド、インターフェロンベータ−１ａ、インターフェロンベータ−１ｂ、グラチラマー酢酸塩、フィンゴリモド、及びミトキサントロン、または、たとえば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、若しくはデキサメタゾンのようなコルチコステロイドの１以上が挙げられる。
【０２９３】
癌のための追加の治療剤には、たとえば、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、プロカルバジン、及びサイクロホスファミドのようなアルキル化剤；たとえば、フルオロウラシル、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、メソトレキセート及びヒドロキシ尿素のような代謝拮抗剤；植物アルカロイド及び抗生物質を含む天然産物、たとえば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エトポシド、マイトマイシン、ミトキサントロン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びタキソール（パクリタキセル）または関連化合物、たとえばトキソテレ（登録商標）；トポイソメラーゼ１阻害剤イリノテカン；テモゾロミド及びギリアデル（登録商標）、カルムスチン；及びチロシンキナーゼの阻害剤、たとえば、グリベック（登録商標）、ステント（登録商標）（スニチニブリンゴ酸塩）、ネクサバール（登録商標）（ソラフェニブ）及びタルセバ（登録商標）（エルロチニブ）またはイレッサ（登録商標）（ゲフィチニブ）；血管形成の阻害剤；及びＨＥＲ２抗原に対するハーセプチン（商標）；ＶＥＧＦに対するアバスチン（登録商標）；または表皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体に対する抗体、たとえば、アービタックス（登録商標）（セツキシマブ）及びベクチビックス（登録商標）（パニツムマブ）を含むモノクローナル抗体が挙げられる。
【０２９４】
パーキンソン病を治療するための追加の治療剤には、レボドパ、ベンザセリド、カルビドパ、ドーパミンアゴニスト、非麦角系ドーパミンアゴニスト、カテコール−Ｏ−メチル（"ＣＯＭＴ"）阻害剤、たとえば、エンタコポンまたはトルコポン、モノアミンオキシダーゼ（"ＭＡＯ"）阻害剤、たとえば、ラサガリン、アマンタジンまたは抗コリン作用因子が挙げられる。
【０２９５】
Ｖ．キット
本発明はさらに、本発明のＭＣＡＭ抗体または他のアンタゴニスト及び関連用具、たとえば、使用のための指示書（たとえば、「添付文書」）を含むキット（たとえば、容器）を提供する。使用のための指示書は、たとえば、ＭＣＡＭアンタゴニストの投与のための指示書及び任意で１以上の添加剤を含有してもよい。ＭＣＡＭアンタゴニストの容器は単位用量、大量包装（たとえば、複数回用量の包装）または副次単位用量であってもよい。
【０２９６】
添付文書は、そのような製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含有する、治療用製品の商業包装に通例含まれる文書を指す。
【０２９７】
キットはまた、薬学上許容可能な緩衝液、たとえば、注射用の殺菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第２の容器を含むこともできる。それはまた、他の緩衝液、希釈剤、充填剤、針及び注射器を含む、商業的な見地及びユーザーの見地から望ましい他の物質も含むことができる。
【０２９８】
上記または下記で引用されている特許出願、ウェブサイト、他の出版物、受入番号等は、各個々の項目が具体的に及び個々に参照によって組み入れられるように指示されるかのようにと同じ程度にてあらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる。配列の異なるバージョンが異なる時に受入番号に関連するのであれば、本出願の有効な出願日での受入番号に関連するバージョンを意味する。有効な出願日は、実際の出願日または該当する場合、受入番号を指す優先権出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイト等の異なるバージョンが異なる時に公開されるのであれば、指示されない限り、出願の有効な出願日で最も新しく公開されたバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態または態様は、特に指示されない限り、他と組み合わせて使用することができる。明瞭さと理解を目的として説明と例示のために本発明を多少詳しく記載してきたが、添付のクレームの範囲内で特定の変更及び改変が実践され得ることが明らかであろう。
【実施例】
【０２９９】
材料及び方法
抗体の生成／性状分析
マウスＭＣＡＭに結合することができる抗体の生成については、ヒトＩｇＧにマウスＭＣＡＭの細胞外ドメインを融合することによってＭＣＡＭ−Ｆｃを生成し、常法を用いてＣＨＯ細胞にて産生させた。ＣＦＡ中１００μｇのＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）でＬｏｕ／Ｍラットを免疫した。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）によって２週間間隔で２回ラットを追加免疫した。免疫したラットから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘによってクローンを選択した。完全長のマウスＭＣＡＭ遺伝子でＣＨＯ細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によって蛍光標識し、１：１の比で非標識のＭＣＡＭを形質移入したＣＨＯ細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を３０分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるＭＣＡＭ特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗ラット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）により検出した。
【０３００】
ＭＣＡＭ特異的な抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を蛍光標識したマウスＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）と共に３０分間事前にインキュベートした後、ラミニンα４発現細胞株ＷＭ２６６４に加え、フローサイトメトリーによって細胞株へのＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質の結合の中和を測定した。
【０３０１】
ヒトＭＣＡＭに結合することができるラット抗体の生成のために、ヒトＩｇＧにヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインを融合することによってｈＭＣＡＭ−Ｆｃを生成し、常法を用いてＣＨＯ細胞にて産生させた。ＣＦＡ中２５０μｇのｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）でＬｏｕ／Ｍラットを免疫した。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のｈＭＣＡＭ−ＦＣタンパク質（１：１容量）によって２週間間隔で２回ラットを追加免疫した。免疫したラットから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘによってクローンを選択した。完全長のヒトＭＣＡＭ遺伝子でＣＨＯ細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によって蛍光標識し、１：１の比で非標識のヒトＭＣＡＭを形質移入したＣＨＯ細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を３０分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるヒトＭＣＡＭ特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗ラット二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）により検出した。
【０３０２】
ヒトＭＣＡＭに結合することができるマウス抗体の生成のために、ヒトＩｇＧにヒトＭＣＡＭの細胞外ドメインを融合することによってｈＭＣＡＭ−Ｆｃを生成し、常法を用いてＣＨＯ細胞にて産生させた。ＣＦＡ中５０μｇのｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）でＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（１：１容量）によって２週間間隔で２回マウスを追加免疫した。免疫したマウスから標準のプロトコールを用いてハイブリドーマを生成し、Ｃｌｏｎｅｐｉｘによってクローンを選択した。完全長のヒトＭＣＡＭ遺伝子でＣＨＯ細胞に形質移入し、ネオマイシンと常法を用いて安定な発現について細胞を選抜した。常法を用いて親ＣＨＯ細胞（ＭＣＡＭ陰性）をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）によって蛍光標識し、１：１の比で非標識のヒトＭＣＡＭを形質移入したＣＨＯ細胞と混合した。細胞のこの混合物と共にハイブリドーマ上清を３０分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって可能性のあるヒトＭＣＡＭ特異的な抗体の結合を蛍光標識した抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ）により検出した。
【０３０３】
ヒトＭＣＡＭ特異的な抗体について陽性とスクリーニングされたハイブリドーマの上清を蛍光標識したｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）と共に３０分間事前にインキュベートした後、ラミニンα４発現細胞株ＷＭ２６６４に加え、フローサイトメトリーによって細胞株へのｈＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質の結合の中和を測定した。
【０３０４】
核酸及びタンパク質の操作
ＣＤＲの決定のために、ＲＮＡｑｕｏｕｓ−４ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いてハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡの合成に使用した。得られたｄｓｃＤＮＡの５’末端にライゲーションしたｃＤＮＡアダプタによるＭａｒａｔｈｏｎのｃＤＮＡ増幅（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から改変された方法を用いて第１と第２の鎖のｃＤＮＡを合成した。重鎖及び軽鎖双方についての特定の抗体アイソタイプの定常領域の配列に基づいて逆行特異的プライマーを設計し、Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＶＬ及びＶＨの断片双方のＰＣＲ増幅にてアダプタプライマーと共に使用した。増幅したＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。特定されたクローンの配列をＶＬ及びＶＨの配列の範囲内でパーセント同一性について比較した。
【０３０５】
上清におけるＩＬ−１７の濃度の測定については、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）用いてＥＬＩＳＡを行った。
【０３０６】
実施例１：抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体の生成
ヒトのＭＣＡＭタンパク質に向けられたマウス及びラットのモノクローナル抗体を上記の材料及び方法で記載されたように生成した。モノクローナル抗体とヒトＭＣＡＭとの間での特異的な結合は、ヒトＭＣＡＭで形質移入した細胞に結合するモノクローナル抗体の能力を評価することによって確認した。このために、非形質移入細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、非標識のヒトＭＣＡＭで形質移入した細胞と混合した。したがって、非形質移入細胞は分化することができた。
【０３０７】
これらの技法を用いて、８２３の独立したマウス融合クローンを単離し、ヒトＭＣＡＭに結合することができる抗体を発現することを示した。さらに、１５２の独立したラット融合クローンを単離し、ヒトＭＣＡＭに結合することができる抗体を発現することを示した。
【０３０８】
次に、抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体を用いてそのリガンドへのヒトＭＣＡＭの結合を阻止する能力を調べた。ヒトＭＣＡＭ−Ｆｃタンパク質（５μｇ／ｍＬ）をアイソタイプ対照抗体または１０μｇ／ｍＬの試験モノクローナル抗体と共にＰＢＳにて３０分間事前にインキュベートした。混合物を健常な脊髄組織切片に加え、その後、上記の材料及び方法で記載されたように蛍光顕微鏡によって性状分析した。さらに、親ＣＨＯ細胞（ＣＨＯＫ１）またはヒトＭＣＡＭ遺伝子を形質移入したＣＨＯ細胞をＣＨＯ培養培地（ＤＭＥＭ）、組換えラミニン４１１（１０μｇ／ｍＬ）、または組換えラミニン５１１（すなわち、ラミニン１０（α５β１γ１）（１０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４５分間事前にインキュベートした。細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる汎ラミニン抗体によってＭＣＡＭへのラミニン５１１でなはくラミニン４１１の特異的な結合を検出した。ラミニンとのインキュベートに先立ってヒトＭＣＡＭを形質移入したＣＨＯ細胞を抗ＭＣＡＭ抗体（２０μｇ／ｍＬで）とともに事前にインキュベートしたことによりラミニン４１１へのヒトＭＣＡＭの結合が消した。
【０３０９】
この技法を用いて、上述の８２３の独立したマウス融合クローンのうち８７及び１５２の独立したラット融合クローンのうち２６が、ヒトＭＣＡＭタンパク質とそのリガンドであるラミニンのα−４鎖との間の相互作用を阻止することができる抗体を発現した。
【０３１０】
実施例２：抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体のさらなる性状分析
（ｉ）ヒトＭＣＡＭに結合することができ、及び（ｉｉ）ヒトＭＣＡＭタンパク質とラミニンのα−４鎖との間の相互作用を阻止することができるような、上記実施例１で記載された８７の独立したマウス融合クローン及び２６の独立したラット融合クローンを以下のようにさらに性状分析した。先ず、ヒトＭＣＡＭのラミニンのα−４鎖への結合を阻止するモノクローナル抗体の能力についてのＩＣ５０の定量を以下のように測定した。ヒトＭＣＡＭを発現しているＣＨＯ細胞を抗ヒトＭＣＡＭ抗体（種々の濃度で）と共に摂氏４度で３０分間インキュベートした。次いで未結合の抗体を洗い流し、細胞を２０ｕｇ／ｍＬでの組換えヒトラミニン４１１と共に摂氏３７度で４５分間インキュベートした。次いで未結合のラミニンを洗い流し、細胞の表面に結合したラミニンを蛍光標識した抗ラミニン抗体で検出した。洗浄した後、表面に結合したラミニンの量をフローサイトメトリーによって検出し、平均蛍光強度に基づいてＩＣ５０を算出した。
【０３１１】
上述のアッセイを用いて、６つの独立した抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体が、ヒトＭＣＡＭに結合し、及び細胞の表面に発現されたヒトＭＣＡＭとそのリガンドであるヒトのラミニン４１１との間の相互作用を阻止する最大の能力を有すると特定された。これら６つの抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体クローンは本明細書では、（ｉ）マウス抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、及び１７４９．１．３、ならびに（ｉｉ）ラット抗ヒトＭＣＡＭモノクローナル抗体クローン、２１２０．４.１９及び２１０７．４.１０と呼ばれる。これらの抗体の重鎖及び軽鎖、及びそれらの超可変領域のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列は配列番号２９〜９２にて提供されている。さらに具体的には、上記のアッセイでは、モノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０についてのＩＣ５０はそれぞれ、０．４６９ｕｇ／ｍｌ、０．４３１ｕｇ／ｍｌ、０．３０７ｕｇ／ｍｌ、０．５４５ｕｇ／ｍｌ、０．８８８ｕｇ／ｍｌ、及び０．２９０ｕｇ／ｍｌであると測定された。さらに、各モノクローナル抗体の特異的な結合親和性を測定するように実施された実験はそれぞれが高い親和性でヒトのＭＣＡＭタンパク質に結合することができることを実証した（データは示さず）。そのようなものとして、これら特異的なモノクローナル抗体のそれぞれは、ヒトＭＣＡＭに非常によく結合することができ、及び細胞に発現されたヒトＭＣＡＭのそのα−４ラミニン結合リガンドとの相互作用を非常によく阻害することができた。対照的に、２つの対照抗体である、非特異的なヒトＩｇＧ１抗体と、以前記載されたＡＢＸ−ＭＡ１と呼ばれる完全にヒトの抗ＭＣＡＭ抗体（たとえば、Ｍｉｌｌｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：５１０６（２００２），及び米国特許第６，９２４，３６０号、同第７，０６７，１３１号及び同第７，０９０，８４４号を参照のこと）は双方ともヒトＭＣＡＭとそのラミニン４１１の対応部分との間での結合相互作用を阻止することができなかった。そのようなものとして、上記で特定された６つの特異的なモノクローナル抗体は、（ｉ）生細胞の表面上のヒトＭＣＡＭに高親和性で結合する、及び（ｉｉ）細胞に発現されたヒトＭＣＡＭとα−４ラミニンポリペプチド鎖を含むラミニンタンパク質との相互作用を阻止する双方の新規の能力を持つ。
【０３１２】
実施例３：抗ＭＣＡＭモノクローナル抗体のドメイン結合分析
ＦｏｒｔｅＢｉｏ分析を用いて、モノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０によって認識され、及び結合されるヒトＭＣＡＭタンパク質上の抗原エピトープの位置を決定した。以下のプロトコールを使用した：ＦｏｒｔｅＢｉｏ抗ヒトＩｇＧＦｃバイオセンサーを用いて、バイオセンサーの表面に完全長のＭＣＡＭｈＦｃタンパク質を含む種々のＭＣＡＭｈＦｃドメインを不動化した。これらのドメインまたは完全長のタンパク質への結合の検出のために、これらのセンサーをＭＣＡＭ特異的な１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０抗体に浸した。これらの試料を黒色９６穴プレートに負荷した後、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄを以下のようにプログラムした：ベースライン＃１について６０秒；種々のドメインの負荷について１８０秒；ベースライン＃２について６０秒；ドメインへの抗体の会合について１８０秒；及びドメインからの抗体の解離について２４０秒。
使用した試薬及び用品
１．ＭＣＡＭｈＦｃ最終濃度＠５ｕｇ／ｍＬ
２．抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０＠５ｕｇ／ｍＬ
３．動態実験用のＦｏｒｔｅＢｉｏ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー、カタログ＃１８−５０６０
４．Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ＃６５５２０９の黒色９６穴プレート
５．ＦｏｒｔｅＢｉｏのＯｃｔｅｔＲｅｄ機
６．新鮮な組織培養培地、２０％ＦＣＳを伴ったＤＭＥＭを希釈用培地として使用した。
これらの分析の結果は以下のとおりである。
【０３１３】
モノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、及び１７４９．１．３はすべて、ヒトＭＣＡＭタンパク質のアミノ酸２４４〜３２１（配列番号２４）によって具体的に定義されるヒトＭＣＡＭタンパク質のドメイン３にて見いだされる抗原エピトープに結合することが示された。これらのモノクローナル抗体は、ヒトＭＣＡＭのドメイン１（すなわち、アミノ酸１９〜１２９、配列番号２２）、ドメイン２（すなわち、アミノ酸１３９〜２４２、配列番号２３）またはドメイン１と２の組み合わせ（すなわち、アミノ酸１９〜２４２）に結合することはできなかった。したがって、モノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、及び１７４９．１．３はヒトのＭＣＡＭタンパク質のドメイン３の中に位置する新規の抗原エピトープを定義する。
【０３１４】
モノクローナル抗体クローン、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０はそれぞれ、ヒトＭＣＡＭのドメイン１（すなわち、アミノ酸１９〜１２９、配列番号２２）とドメイン２（すなわち、アミノ酸１３９〜２４２、配列番号２３）の組み合わせによって定義される抗原エピトープに結合することが示された。これら２つ抗体のいずれもヒトＭＣＡＭのドメイン１自体には結合しなかった。したがって、モノクローナル抗体クローン、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０は、ヒトＭＣＡＭタンパク質のドメイン１及び２双方の存在によって決定される新規の抗原エピトープを定義する。
【０３１５】
上記とは対照的に、以前記載された完全にヒト型の抗ＭＣＡＭ抗体であるＡＢＸ−ＭＡ１は、上記のものとは異なる抗原エピトープ、すなわち、ヒトＭＣＡＭのドメイン１のみの中で完全に定義され、包含される抗原エピトープに結合する。
【０３１６】
これらの結果を考えると、モノクローナル抗体クローン、１１７４．１．３、１４１４．１．２、１４１５．１．１、１７４９．１．３、２１２０．４．１９、及び２１０７．４．１０は（ｉ）ヒトＭＣＡＭへの結合することができ、及び（ｉｉ）ヒトＭＣＡＭとα−４ラミニン含有タンパク質との間の相互作用を阻止することができるので、ＡＢＸ−ＭＡ１抗体はヒトＭＣＡＭに結合することのみが可能であるが、ヒトＭＣＡＭとα−４ラミニン含有タンパク質との間の相互作用を阻止しないのに対して、これらの結果はヒトＭＣＡＭのドメイン２、ヒトＭＣＡＭのドメイン３及びそれらの組み合わせがα−４ラミニン鎖との結合相互作用で役割を担うことを実証している。これを考えると、ヒトＭＣＡＭのドメイン２、ヒトＭＣＡＭのドメイン３及び／またはそれらの組み合わせに結合する抗体は、ヒトＭＣＡＭとα−４ラミニンとの間の相互作用を阻止することができる作用因子として使用されることになり、それによって、その相互作用から生じる本明細書で記載される種々の因果関係を阻害するのに使用されることは明らかである。それに対して、ヒトＭＣＡＭのドメイン１によってのみ定義される抗原エピトープに結合する抗体（たとえば、本明細書で記載されるＡＢＸ−ＭＡ１）は、ＭＣＡＭ／α−４ラミニンの相互作用及びその下流の種々の生物学的帰結を阻止するには有用ではない。
【０３１７】
実施例４：ショットガン変異誘発エピトープマッピング
ショットガン変異誘発と、真核細胞内での変異させた標的タンパク質の大きなライブラリの発現及び分析を可能にする高処理能力細胞発現技術とを用いて、抗ＭＣＡＭ抗体の結合について関心のある種々のアミノ酸残基を特定した。ヒトＭＣＡＭタンパク質におけるあらゆる残基を個々にアラニンまたは他の特定された残基に変異させて機能における変化をアッセイした。タンパク質は標準的な哺乳類細胞株の範囲で発現された。
【０３１８】
表１は、ショットガン変異誘発ライブラリを生成するのに使用された試薬及び方法の要約を示す。
【表１】
0006728053.tif 000002
【０３１９】
完全長のヒトＭＣＡＭで上手くコドンを最適化し、合成し、哺乳類の高発現ベクターにサブクローニングした。次いで、親構築物の配列を検証し、免疫検出法によって哺乳類細胞での発現について正当性を立証した。
【０３２０】
１７４９．１.３抗体及びマウス血清のＭＣＡＭへの結合の免疫蛍光による検出は高処理能力ショットガン変異誘発方式について上手く最適化された。３８４穴の形式にて単一希釈の二次抗体によって各一次抗体の連続希釈を調べた。ヒトＭＣＡＭを発現している２９３Ｔ細胞及びＢＨＫ細胞の検出について抗体を調べた。完全な変異ライブラリをスクリーニングするために最適なアッセイ条件を選択した。
【０３２１】
５４５のクローン（５２８／５３６のアラニン変異体と１７／１７の部位特異的変異体）から成り、それぞれアラニンへの単一残基の置換（アラニン残基はセリンに置換する）または特定された置換のいずれかを持つＭＣＡＭ変異ライブラリを創り出し、配列を検証した。残基３５、６６、１６１、２６１、３４２、３８０、４１４、及び４３５はライブラリでは表されない。マウス血清への結合についての免疫検出によって３つ組で変異ライブラリをスクリーニングした。これによって各変異体クローンについて細胞表面の発現の正当性を立証する。
【０３２２】
複数回の最適化を行ってマッピングに好適である条件を決定した。以下の変数：複数のラミニン濃度及び抗ラミニン二次抗体の濃度、非特異的な結合を減らすための種々のブロッキング緩衝液、複数の細胞型及び複数の洗浄工程を評価した。
【０３２３】
１７４９．１.３抗体への結合についての免疫検出によって３つ組で変異ライブラリをスクリーニングした。各変異体について反応性を定量し、結合の喪失を示す点突然変異体を特定した。
【０３２４】
各変異体クローンについてモノクローナル抗体及び血清の反応性を定量して表面発現に影響を与えることなく結合の喪失を示す点突然変異体を特定した。各変異体クローンの血清の結合プロファイルとモノクローナル抗体の結合プロファイルを比較することによって各抗体について決定的な残基を特定した。
【０３２５】
３８４穴の形式にて野生型（ＷＴ）のＭＣＡＭまたはベクター単独のいずれかでＢＨＫ細胞に形質移入し、その後免疫検出を行った。ＷＴまたはベクター単独に対する免疫反応性について各抗体の連続希釈（４μｇ／ｍＬで開始して）を調べた（表２）。各点は４つの２つ組の平均を表す。
【表２】
0006728053.tif 000003
【０３２６】
１７４９．１.３及びＭｓ血清の免疫検出及びエピトープのマッピングについて最適なスクリーニング条件を決定した。これらの条件を用いて各抗体は、確固たるシグナル、高いシグナル対バックグランド値及び反復間の低いばらつきを実証した。これらのデータは、これらの条件が上手く行く高処理能力エピトープマッピングに好適であることを示している。１７４９．１.３については０．５μｇ／ｍＬの最終スクリーニング濃度を、Ｍｓ血清については１：８００の希釈を用いた。Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅａｓｅｒｃｈの二次抗体はＭＡｂ及び血清の検出のために１：４００で使用した。表３は高処理能力免疫検出のために最適化された実験パラメータを示す。
【表３】
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【０３２７】
表面発現（マウス血清の結合）及びモノクローナル抗体の結合について３つ組にて変異ライブラリをアッセイした。各生データのポイントはバックグランドを差し引き、野生型ＭＣＡＭの反応性の値に対して基準化した。結果を表１に示す。各クローンについてのモノクローナル抗体の平均結合値を表面発現平均値の関数としてプロットする（図１、灰色の菱形）。＜３０％のモノクローナル抗体の反応性及び＞５０％のマウス血清の結合の閾値を適用して、モノクローナル抗体の結合については陰性であるが、表面発現については陽性であるクローン（図１、黒色の菱形）を特定した。
【０３２８】
その全体的な表面発現（血清の平均反応性）に比べた各クローンのモノクローナル抗体の平均反応性を評価することによって１７４９．１.３について決定的な残基を特定した。抗体結合に関与する残基は、モノクローナル抗体の結合については陰性である（＜３０％ＷＴ）が、表面発現については陽性である（＞５０％ＷＴ）ものとして特定した（表４）。平均反応性（及び標準偏差）を決定的な残基についてそれぞれ決定した。
【表４】
0006728053.tif 000005
【０３２９】
ショットガン変異誘発マッピングによって特定された決定的なアミノ酸は１７４９．１.３抗体についての結合部位を示唆している。データは１７４９．１.３がＭＣＡＭの第３Ｉｇドメインにて立体構造的に複雑なエピトープを結合することを示している。
【０３３０】
決定的な残基は、第２及び／または第３のＩｇドメインのジスルフィド結合が寄与する構造的安定性に大きく依存すると思われる。システイン２７２または３２０いずれかへの変異が抗体結合を無効にするということは、第３のＩｇドメインの共有ジスルフィド結合がエピトープを安定化するのに重大な役割を担うことを示唆している。
【０３３１】
実施例５：抗体及びラミニンの結合についての確証的ＭＣＡＭエピトープマッピング
ヒトＭＣＡＭにて１７４９．１.３の結合部位を特定するために、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｍａｅｓｔｒｏを用いてｐｄｂ  ３ＫＶＱ＿Ａ、３Ｖ２Ａ＿Ｒ、２ＩＥＰ＿Ａ及び２ＹＤ１＿ＡにてヒトＭＣＡＭ Ｉｇ３の相同性モデルを作り上げた（図２）。構造情報及びショットガン変異誘発の情報に基づいた２０の点突然変異体を設計し、生成した。これらの変異体を哺乳類細胞で発現させ、ＦＡＣＳ用いて１７４９．１.３及びラミニンα−４のＭＣＡＭ変異体との結合を調べた。３つのＭＣＡＭ単一変異体、Ｉ１４１Ａ、Ｄ２１６Ａ及びＹ３１８Ａはラミニンα−４の結合の完全な喪失を明らかにした。Ｙ３１８Ａ変異体は１７４９．１.３の結合の完全な喪失を明らかにした。
【０３３２】
データをさらに裏付けるために、それぞれＩ１４１Ａ、Ｐ１４５Ｖ、Ｄ２１６Ａ及びＹ３１８Ａを発現している安定な細胞株を生成した。上述のような精製したタンパク質でＦｏｒｔｅｂｉｏアッセイを行った。対照のＡＢＸ−ＭＡ１抗体は野生型ＭＣＡＭ及びＭＣＡＭの変異体に結合した。１７４９．１.３抗体はＭＣＡＭのＹ３１８Ａへの十分な結合を示さなかった。
【０３３３】
実施例６：１７４９．１.３抗体のヒト化
ヒト化のための出発点またはドナー抗体は、ＷＯ／２０１２／１７００７１及びＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５８７７３に記載されたハイブリドーマによって産生されたマウス抗体１７４９である。成熟ｍ１７４９の成熟重鎖可変のアミノ酸配列及び核酸配列はそれぞれ配列番号９３及び６４として提供されている。成熟ｍ１７４９の成熟軽鎖可変のアミノ酸配列及び核酸配列はそれぞれ配列番号９７及び５９として提供されている。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６６、６７及び６８として提供されている。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６１、６２及び６３として提供されている。この実施例の全体にわたってＫａｂａｔの番号付けを使用する。
【０３３４】
ｍ１７４９の可変カッパ（Ｖｋ）は、ヒトのＫａｂａｔ亜群４に相当するマウスのＫａｂａｔ亜群１に属する。ｍ１７４９の可変重鎖（Ｖｈ）はヒトのＫａｂａｔ亜群３に相当するマウスのＫａｂａｔ亜群３ｄに属する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，１９９１）。１７残基のＣＤＲ−Ｌ１はＶｋにおける規定クラス３に属し、７残基のＣＤＲ−Ｌ２は規定クラス１に属し、８残基のＣＤＲ−Ｌ３は規定クラス３に属する（Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６）。５残基のＣＤＲ−Ｈ１は規定クラス１に属し、１７残基のＣＤＲ−Ｈ２は規定クラス１または３に属する（Ｍａｒｔｉｎ及びＴｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００−１５，１９９６）。ＣＤＲ−Ｈ３は規定クラスを有さないが、１１残基のループはＳｈｉｒａｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５５：１８８−９７（１９９９）のルールに従って多分捻じれた（ｋｉｎｋｅｄ）塩基を有する。
【０３３５】
ＶｋドメインとＶｈドメインの間の界面における残基は一般に見いだされるものである。ＰＤＢデータベース（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ２３３−７，２００５）においてタンパク質配列にて検索を行い、１７４９の粗構造モデルを提供することになる構造を見いだした。ｍ１７４９Ｖｋとの良好な全体の配列類似性を有するので、ループについて同じ規定構造を保持する、大腸菌における内在性膜タンパク質ＤｓｂＢに対する抗体。モデル化ではＶｋ構造について抗ＤｓｂＢ抗体のＸ線結晶構造（ｐｄｂコード２ＬＴＱ；Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２５：１６７０−８２，２０１３；配列番号１６１）を用いた。インフルエンザウイルス血球凝集素に由来するペプチド免疫原に向けられた抗体は１７４９Ｖｈの構造に対する良好で全体的な配列類似性を有する。それはまた捻じれた（ｋｉｎｋｅｄ）塩基を伴った類似の長さのＣＤＲ−Ｈ３も有する。インフルエンザウイルス血球凝集素に由来するペプチド免疫原に向けられた抗体の構造（１ＨＩＬ；Ｒｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：９５９−６５，１９９２；配列番号１５７）は、理に適った解像度（２．０Ａ）を有し、モデル化においてＶｈ構造に使用された。加えて、１Ｈ１ＬのＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２は、ＣＤＲ−Ｈ１及びＣＤＲ−Ｈ２について１７４９Ｖｈのそれと同じ規定構造を有する。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ（登録商標）を用いて１７４９Ｆｖの粗構造をモデル化した。
【０３３６】
ＮＣＢＩに由来する非冗長タンパク質配列のデータベースの検索によってその中にマウスＣＤＲを移植するヒトの好適なフレームワークの選択が可能になった。ＶKについては、２つのヒトのカッパ軽鎖を選択し、第１の鎖はＮＣＢＩ受入コードＡＢＡ７１４０７．１（ＧＩ：７７３７９５０２；配列番号１６２）（Ｍａｎｓｋｅら、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：１０６−２０，２００６）を持ち、及び第２の鎖はＮＣＢＩ受入コードＣＡＩ９９８００．１（ＧＩ：９８９５６３２４；配列番号１６３）（Ｓｕら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１２６４−７１，２００８）を持つ。これはＣＤＲ−Ｌ１、Ｌ２及びＬ３について同じ規定クラスを有する。ＡＢＡ７１４０７．１はマウス１７４９の軽鎖に対して軽鎖可変領域フレームワークで８５％の配列同一性を有する。ＣＡＩ９９８００．１は、マウス１７４９の軽鎖に対して軽鎖可変領域フレームワークで８３％の配列同一性を有する。
【０３３７】
Ｖｈについては、２つのヒトＩｇ重鎖を選択したが、第１の鎖はＮＣＢＩ受入コード
ＡＡＸ８２４９４．１（ＧＩ：６２４２１４６１；配列番号１５８）（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７４：３２２２−３１，２００６）を持ち、第２の鎖は受入コードＡＤＸ６５６７６．１（ＧＩ：３２３４３２０７３；配列番号１５９）（未発表）を持つ。それは１７４９のＣＤＲ−Ｈ１及び−Ｈ２の規定形態を共有し、Ｈ３は予測された捻じれた（ｋｉｎｋｅｄ）塩基を伴って１１残基長い。ＡＡＸ８２４９４．１は、マウス１７４９重鎖に対して可変領域フレームワークで９１％の配列同一性を有する。ＡＤＸ６５６７６．１はマウス１７４９重鎖に対して可変領域フレームワークで８３％の配列同一性を有する。
【０３３８】
上記の置換（Ｈｕ１７４９ＶＨｖ３；配列番号１５６及びＨｕ１７４９ＶＬｖ３；配列番号１６０）を含有するヒト化された軽鎖可変領域の変異体とヒト化された重鎖可変領域の変異体を構築した（図３Ａ及び３Ｂ）。Ｈｕ１７４９ＶＨｖ３及びＨｕ１７４９ＶＬｖ３におけるＨ３、Ｈ４２、Ｈ９３、Ｌ９、Ｌ１９、Ｌ４３でのアミノ酸を表５にて列記する。
【表５】
0006728053.tif 000006
【０３３９】
置換の候補としての上記の位置の選択についての論理的根拠は以下のとおりである。
【０３４０】
Ｑ３Ｋ（フレームワークの逆突然変異について他のどこでも同じようにここでは、最初に述べた残基はヒトの残基であり、２番目はマウスの残基である）：ＫはＣＤＲＨ３にてＹ１０２に接触する。したがって、それはフレームワークにて維持されるべきである。
【０３４１】
Ｇ４２Ｅ：ＥはヒトのアクセプターＡＡＸ８２４９４．１にてＤと類似の側鎖を有する。この逆突然変異はタンパク質の安定性に寄与する。
【０３４２】
Ａ９３Ｔ：この位置はＶｋ／Ｖｈの界面の残基である。
【０３４３】
Ｄ９Ｓ：この残基はＣＤＲ及び／または界面に接触せず、または影響を与えない。ヒトのフレームワーク領域にてＳの頻度はＤより大きい。
【０３４４】
Ａ１９Ｖ：ヒトのフレームワーク領域にてＶ及びＡの頻度は類似している。
【０３４５】
Ｐ４３Ｓ：ＳはＶＨにおける２つの界面残基Ｙ９１とＷ１０３に接触する。したがって、それは重要であり、フレームワークで維持されるべきである。
【０３４６】
＞Ｈｕ１７４９ＶＨｖ３
0006728053.tif 000007
【０３４７】
＞Ｈｕ１７４９ＶＬｖ３
0006728053.tif 000008
【０３４８】
実施例７：変異体、ヒト化１７４９Ｈ３Ｌ３抗体の性状分析
重鎖Ｈｕ１７４９ＶＨｖ３と軽鎖Ｈｕ１７４９ＶＬｖ３を含むヒト化１７４９抗体の結合動態を性状分析した。
【０３４９】
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ機器（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いたバイオ層干渉分光法（ＢＬＩ）によってヒト化１７４９抗体の結合動態を測定した。キメラ１７４９抗体及びヒト化１７４９抗体について詳細な結合動態パラメータ（会合速度、見かけのｋａ、解離速度、見かけのｋｄ、及び親和性定数、見かけのＫＤ）を測定した（表６）。見かけのｋａ、見かけのｋｄ、及び見かけのＫＤはＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイ形式を用いて得られる結合動態パラメータである。
【０３５０】
ＳＥＭの範囲内で１７４９．１.３と同じである最低の解離定数（最高の会合定数）を与えるＨｕ１７４９Ｈ３Ｌ３の変異体を見いだした。
【表６】
0006728053.tif 000009
【０３５１】
加えて、動的光散乱（ＤＬＳ）による分析は、親ｍ１７４９抗体のそれに類似するｈ１７４９Ｈ３Ｌ３抗体の多分散性のレベル（％ＰＤ）を示す（表７）。動的光散乱の測定値は、石英キュベット内の１０マイクロリットルサイズの容量でＷｙａｔｔ  ＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ動的光散乱機器にて得られた。測定値はすべて３７℃で得られ、各測定は５秒間の取得時間で１０回の取得を有した。Ｒａｙｌｅｉｇｈ  Ｓｐｈｅｒｅｓモデルを用いたＷｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ７．０ソフトウエアによって基準化を行った。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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