(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）および（２）の工程を含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌を互いに区別して検出する方法。
（１）下記（Ａ２）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ２）で示されるリバースプライマーからなる１つのプライマーセットを用いて核酸増幅を行い増幅産物を得る工程：
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（２）（１）の工程で得られた増幅産物を検出する工程
【請求項２】
以下の（１）および（２）の工程を含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｃａｐｉｔｉｓの３種類のブドウ球菌を互いに区別して検出する方法。
（１）下記（Ａ２）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ２）で示されるリバースプライマーからなる１つのプライマーセットを用いて核酸増幅を行い増幅産物を得る工程：
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（２）（１）の工程で得られた増幅産物を検出する工程
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、工程（２）で増幅産物を長さの差によって互いに区別して検出する方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の方法において、工程（２）で増幅産物を塩基配列の差によって互いに区別して検出する方法。
【請求項５】
下記（Ａ２）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ２）で示されるリバースプライマーからなるプライマーセット。
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
【請求項６】
請求項５に記載のプライマーセットを含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌を互いに区別して検出するための組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のプライマーセットを含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｃａｐｉｔｉｓの３種類のブドウ球菌を互いに区別して検出するための組成物。
【請求項８】
請求項５に記載のプライマーセットを含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌を互いに区別して検出するためのキット。
【請求項９】
請求項５に記載のプライマーセットを含む、試料中においてＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｃａｐｉｔｉｓの３種類のブドウ球菌を互いに区別して検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブドウ球菌の検出方法及びそのための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブドウ球菌とは、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属）（以下、微生物名を属とその下位分類（種など）とで表す場合は、属名をＳ．と略記する。）に属するグラム陽性球菌である。特に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）はヒトに対して病原性を持つとともに臨床分離される数も多い（非特許文献１）。
【０００３】
さらに、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓやＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓはメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃＡ）などの薬剤耐性遺伝子を持つことで薬剤耐性を示すことが知られている（特許文献１）。したがって、治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等を目的として、これらの菌を迅速に検出、分類できる方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−０４８６２０
【特許文献２】特表２０１３−５３５９５１
【特許文献３】特表２００１−５１８２８３
【特許文献４】特表２００３−５１１０１５
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，７（５），１３１３−１３２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
核酸同定による複数種のブドウ球菌の検出方法が公知技術として知られているが、従来技術では菌種を分類するために複数のプライマーセットを用意する必要があるため（特許文献２、特許文献４）、操作が複雑であるとともにコストがかかるという問題があった。
【０００７】
また、ユニバーサルプライマーを用いて複数種のブドウ球菌を検出する方法もあるが、該手法では電気泳動によるブドウ球菌の種の同定までは困難であった（特許文献３、特許文献４）。該手法で菌種の同定を行うには、さらに検出用プローブを反応系に加える必要があった。
【０００８】
本発明は、１つのプライマーセットを使用することで、複数種のブドウ球菌を互いに区別して簡便に検出する方法及びそのための組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、特定の塩基配列を有する１つのプライマーセットを使用した核酸同定により、複数種のブドウ球菌を互いに区別して簡便に検出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明の概要は以下の通りである。
【００１０】
［項１］
以下の（１）および（２）の工程を含む、試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出する方法。
（１）下記（Ａ）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ）で示されるリバースプライマーからなる１つのプライマーセットを用いて核酸増幅を行い増幅産物を得る工程
（Ａ）以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ａ１）配列番号１で示される塩基配列
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列
（Ａ３）配列番号１の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ａ４）配列番号２の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ）以下の（Ｂ１）から（Ｂ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３で示される塩基配列
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列
（Ｂ３）配列番号３の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ４）配列番号４の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（２）（１）の工程で得られた増幅産物を検出する工程
［項２］
項１の方法において、工程（２）で増幅産物を長さの差によって互いに区別して検出する方法。
［項３］
項１の方法において、工程（２）で増幅産物を塩基配列の差によって互いに区別して検出する方法。
［項４］
複数種のブドウ球菌が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓおよびＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌である項１から項３のいずれかに記載の方法。
［項５］
複数種のブドウ球菌が、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．  ｃａｐｉｔｉｓの３種類のブドウ球菌である項１から項４のいずれかに記載の方法。
［項６］
１つのプライマーセットが、（Ａ２）または（Ａ４）で示されるフォワードプライマーおよび（Ｂ２）または（Ｂ４）で示されるリバースプライマーである項１から項５のいずれかに記載の方法。
［項７］
下記（Ａ）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ）で示されるリバースプライマーからなるプライマーセット。
（Ａ）以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ａ１）配列番号１で示される塩基配列
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列
（Ａ３）配列番号１の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ａ４）配列番号２の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ）以下の（Ｂ１）から（Ｂ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３で示される塩基配列
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列
（Ｂ３）配列番号３の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ４）配列番号４の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
［項８］
項７に記載のプライマーセットを含む、試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出するための組成物。
［項９］
項７に記載のプライマーセットを含む、試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出するためのキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、１つのプライマーセットを使用することで複数種のブドウ球菌（例えば、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓおよびＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、さらには、前記２種にコアグラーゼ陰性ブドウ球菌属の１つであるＳ．  ｃａｐｉｔｉｓを加えた３種）を互いに区別して簡便に検出できる方法及びそのための組成物を提供することができた。該方法及び該組成物を使用することで、ブドウ球菌感染症に対する治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等に大きく貢献できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓのゲノムＤＮＡ配列をアライメントした図である。フォワードプライマーの設計はこの領域から行った。
【図２】Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓのゲノムＤＮＡ配列をアライメントした図である。リバースプライマーの設計はこの領域から行った。
【図３】実施例１の結果を示す図である。左から、マーカー、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、マーカーである。
【図４】実施例２の電気泳動結果を示す図である。左端、右端はマーカーである。
【図５】実施例２の電気泳動で得られた約２８０ｂｐのバンドのシークエンス解析結果を示す。この塩基配列はＳ．ａｕｒｅｕｓと高い相同性を示した。
【図６】実施例２の電気泳動で得られた約４００ｂｐのバンドのシークエンス解析結果を示す。この塩基配列はＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと高い相同性を示した。
【図７】実施例２の電気泳動で得られた約１８０ｂｐのバンドのシークエンス解析結果を示す。この塩基配列はＳ．ｃａｐｉｔｉｓと高い相同性を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の実施態様の一つは、以下の（１）および（２）の工程を含む、試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出する方法である。
（１）下記（Ａ）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ）で示されるリバースプライマーからなる１つのプライマーセットを用いて核酸増幅を行い増幅産物を得る工程
（Ａ）以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ａ１）配列番号１で示される塩基配列
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列
（Ａ３）配列番号１の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ａ４）配列番号２の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ）以下の（Ｂ１）から（Ｂ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３で示される塩基配列
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列
（Ｂ３）配列番号３の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ４）配列番号４の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（２）（１）の工程で得られた増幅産物を検出する工程
【００１４】
［検出対象について］
［ブドウ球菌］
本発明の、検出方法の対象となるブドウ球菌は、ブドウ球菌属に属するグラム陽性球菌であれば特に限定されない。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌の１つであるＳ．  ｃａｐｉｔｉｓなどが挙げられる。Ｓ．  ｃａｐｉｔｉｓは、ヒトの頭皮に多く分布するブドウ球菌であり、ときには心内膜炎や髄膜炎を引き起こすことがある。
【００１５】
本発明の方法によれば、複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出することができ、その組合せは特に限定されない。例えば、少なくともＳ．  ａｕｒｅｕｓおよびＳ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌を含む試料から、その両種を互いに区別して検出することができる。また、少なくとも前記２種にＳ．  ｃａｐｉｔｉｓを加えた３種類のブドウ球菌を含む試料から、その３種を互いに区別して検出することができる。また、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．  ｃａｐｉｔｉｓからなる群のうちいずれか１つ以上を含む試料から、前記３種のうちどのブドウ球菌が含まれているかを判別することができる。
【００１６】
［試料について］
本発明において使用できる測定試料は、生体試料や食品だけでなく、調製した核酸等を用いることができるが、これらに限定されない。
【００１７】
生体試料としては、特に制限されないが、血液、血液培養液、膿、髄液、胸水、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、喀痰、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、分離培養コロニー、カテーテル洗浄液等が挙げられる。生体試料を測定試料とする場合、各生体試料に応じて、希釈や懸濁などの前処理を行ってもよい。
【００１８】
食品としては、水、アルコール飲料、清涼飲料水、加工食品、野菜、畜産物、海産物、卵、乳製品、生肉、生魚、惣菜等が挙げられるが、これらに限定されない。食品を測定試料とする場合、その食品の一部あるいは全部を使用できるだけでなく、食品表面を拭き取ったものも使用できるが、これらに限定されない。また、試料によって細かく破砕する、精製水に懸濁させる等の前処理を行ってもよい。
【００１９】
また、調理器具やドアノブを拭き取った材料あるいはそれらを洗浄した液も試料として用いることができる。
【００２０】
調製した核酸とは、各試料から抽出したＤＮＡやＲＮＡ、人工合成した核酸等を指すが、これらに限定されない。核酸抽出には、各メーカーから販売されているキットを使用してもよい。
【００２１】
試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。
【００２２】
［第一の工程（増幅工程）について］
［プライマーセット（の配列）］
本発明の方法の第一の工程においては、１つのプライマーセットを用いて核酸増幅を行い増幅産物を得る。本発明で用いるプライマーセットの態様としては、下記（Ａ）で示されるフォワードプライマーおよび下記（Ｂ）で示されるリバースプライマーからなるプライマーセットが挙げられる。
（Ａ）以下の（Ａ１）から（Ａ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ａ１）配列番号１で示される塩基配列
（Ａ２）配列番号２で示される塩基配列
（Ａ３）配列番号１の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ａ４）配列番号２の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ）以下の（Ｂ１）から（Ｂ４）のいずれかの塩基配列で示されるオリゴヌクレオチド
（Ｂ１）配列番号３で示される塩基配列
（Ｂ２）配列番号４で示される塩基配列
（Ｂ３）配列番号３の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
（Ｂ４）配列番号４の最も３’末端側の６塩基の配列を、その一部に含む配列
【００２３】
ここで、（Ａ１）（Ａ２）（Ｂ１）（Ｂ２）の各プライマー、すなわち配列番号１ないし４で表される塩基配列は、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．  ｃａｐｉｔｉｓのゲノム配列に対してアライメントを行った場合、共通して同一性が高い部分である。
【００２４】
図１および図２に、配列番号１ないし４で表される塩基配列と、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＦＣＦＨＶ３６，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１１１４７．１）、Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ９４９＿Ｓ８  ｇｅｎｏｍｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ０１０９４２．１）およびＳ．  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＹＰ１０２０，ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００７６０１．１）の３種類のブドウ球菌のゲノム配列とのアライメントを示す。
【００２５】
（Ａ３）（Ａ４）（Ｂ３）（Ｂ４）の各プライマーは、それぞれ、配列番号１ないし４で表される塩基配列の最も３’末端側の６塩基の配列をその一部に含む配列であることを特徴とする。
【００２６】
一般に、特異性の高いプライマーは、３’末端がターゲット配列に対して相補的であることが重要であり、言い換えれば、３’末端が相補的であれば５’末端が相補的でなくとも有効なプライマーとしてはたらくとされている。このことから、本明細書に記載のプライマーも３’末端がゲノム配列に対して相補的な配列を有するように設計することが好ましい。すなわち、本明細書に記載のプライマーは３’末端の塩基配列が特に重要であり、該塩基配列であることで、ブドウ球菌の検出、分類が可能となったと考えられる。
【００２７】
したがって、（Ａ３）（Ａ４）（Ｂ３）（Ｂ４）の各プライマーを使用するときは、配列番号１ないし４で表される塩基配列の最も３’末端側の６塩基の配列を、各プライマーの３’末端側の１０塩基の配列の一部に含めることが好ましい。より好ましくは、各プライマーの３’末端側の８塩基の配列の一部に含めることであり、さらに好ましくは、各プライマーの３’末端側の７塩基の配列の一部に含めることであり、最も好ましくは、各プライマーの３’末端側の６塩基の配列に含めることである。
【００２８】
また、（Ａ３）（Ａ４）（Ｂ３）（Ｂ４）の各プライマーの塩基数は、プライマーとして十分に機能する塩基数の範囲であればよい。核酸増幅に使用するプライマーの塩基数は、その核酸増幅法によって異なるが、好ましい上限は５０塩基であり、より好ましくは３０塩基であり、さらに好ましくは２５塩基である。一方、塩基数の好ましい下限は１０塩基であり、より好ましくは１５塩基である。短いプライマーは十分な特異性が得られないことがあり、長いプライマーは非特異産物の増加、アニーリング効率の低下が発生することがある。
【００２９】
なお、前記プライマーセットも本願発明の一つの態様である。
【００３０】
［増幅に関して、プライマーセット以外について］
核酸増幅は、本発明において請求項に記載の事項以外は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＬＡ−ＰＣＲ（Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  ＰＣＲ）、ＡＢＣ−ＰＣＲを含む競合的ＰＣＲ、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｐｒｉｍｅｒｅｄ  ＰＣＲ、ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ、シャトルＰＣＲ、ＰＣＲ／ＧＣ−ｃａｌｍｐ法、Ｉｍｍｕｎｏ  ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。なお、本発明において各方法における増幅反応の条件は特に制限されず、各方法の条件にて行うことができる。
【００３１】
本発明の組成物には、実施する核酸増幅方法及び検出分類方法に応じていくつかの成分が必要である。一例として、ＰＣＲを用いた核酸増幅方法においては、測定試料、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、反応バッファー、マグネシウム塩が一般的に必要である。また、目的に応じてＵＮＧ（Ｕｒａｃｉｌ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）、ＢＳＡ、ＤＭＳＯ、ベタイン、グリセロール、糖類、アミノ酸、ペプチド、アミン、カリウム塩等を添加物として含めてもよいが、本発明においてこれらに限定されない。
【００３２】
核酸増幅方法にＰＣＲを用いる場合、使用するＤＮＡポリメラーゼは特に制限されない。例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ等が挙げられるが、本発明においてこれらに限定されない。また、ＤＮＡポリメラーゼは、天然由来酵素だけでなく、人工的にアミノ酸配列を改変した組換え体酵素を使用してもよい。
【００３３】
上記の考え方で設計したフォワードプライマー及びリバースプライマーを１つのプライマーセットとして核酸増幅を行うことにより、後述の実施例１で例示するように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓでそれぞれ約２８０ｂｐ、約４００ｂｐ、約１８０ｂｐの増幅産物を確認することができる。
【００３４】
［第二の工程（増幅産物を区別して検出する工程）について］
本発明の方法の第二の工程は、前記第一の工程で得られた増幅産物を区別して検出する工程である。
【００３５】
増幅産物を互いに区別して検出する方法は、本発明において請求項に記載の事項以外は特に限定されず、公知の核酸検出方法を用いることができる。例えば、増幅産物を長さの差によって区別する方法や、塩基配列の差によって区別する方法を用いることができる。具体的には、融解曲線解析、電気泳動、ＤＮＡプローブ法、インターカレーター法、核酸ハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、質量分析、ＤＮＡシークエンシング、次世代シークエンシング、オートラジオグラフィー等が挙げられるが、本発明ではこれらに限定されない。
【００３６】
増幅産物を互いに区別して検出する方法にＤＮＡプローブ法を用いる場合、前記組成物にさらにＤＮＡプローブを加えてもよい。ＤＮＡプローブには、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ、ＦＲＥＴプローブ、モレキュラービーコン、スコーピオン、ＱＰｒｏｂｅ等が挙げられるが、本発明においてこれらに限定されない。
【００３７】
なお、リアルタイムＰＣＲ、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法を採用する場合は、「増幅」と「区別して検出」を同時に実施することが可能である。
【００３８】
一例として、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブを使用したリアルタイムＰＣＲを行う場合、Ｔａｑポリメラーゼの濃度は０．００１〜１．０Ｕ／μＬ、より好ましくは０．０１〜０．１Ｕ／μＬであり、プライマー濃度は０．０１〜１０μＭ、より好ましくは０．１μＭ〜２μＭであり、ｄＮＴＰｓ濃度は０．０１〜２ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭであり、反応バッファーのｐＨは２〜１３、より好ましくは４〜１０であり、マグネシウム塩濃度は０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは１．０〜５ｍＭであり、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブ濃度は、０．０１〜１μＭ、より好ましくは０．０２〜０．６μＭである。リアルタイムＰＣＲは、公知の条件にて行うことができる。また、Ｔａｑｍａｎ（Ｒ）プローブは測定に応じて複数種類加えてもよい。
【００３９】
また、１例として、ＱＰｒｏｂｅを用いた融解曲線を行う場合、ＫＯＤポリメラーゼの濃度は０．００１〜１．０Ｕ／μＬ、より好ましくは０．０１〜０．１Ｕ／μＬ、プライマー濃度は０．０１〜１０μＭ、より好ましくは０．１μＭ〜８μＭであり、ｄＮＴＰｓ濃度は０．０１〜２ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭであり、反応バッファーのｐＨは２〜１３、より好ましくは４〜１０であり、マグネシウム塩濃度は０．１〜１０ｍＭ、より好ましくは１．０〜５ｍＭであり、ＱＰｒｏｂｅ濃度は、０．０１〜２μＭ、より好ましくは０．１〜０．８μＭである。ＰＣＲや融解曲線解析は、公知の条件にて行うことができる。また、ＱＰｒｏｂｅは測定に応じて複数種類加えてもよい。
【００４０】
先行技術（特許文献２）は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの２種類のブドウ球菌を検出するために少なくとも２つのプライマーセットを必要とするマルチプレックスアッセイであるのに対して、本発明では、１つのプライマーセットで前記２種類のブドウ球菌を区別して検出できる。さらに、本発明では、１つのプライマーセットで少なくともＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓおよびＳ．ｃａｐｉｔｉｓの３種類のブドウ球菌を区別して検出できることから、本発明を用いることで、より簡便にブドウ球菌を検出、分類することが可能となった。
【００４１】
［複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出するための組成物、キット］
本発明の別の態様としては、前記のプライマーセットを含む、試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出するための組成物またはキットが挙げられる。
【００４２】
本発明の方法を実施するための、あるいは、本発明の組成物またはキットに含まれる組成としては、前記プライマーセット以外は、核酸の増幅・検出に必要な試薬を適宜用いれば特に限定されない。核酸の増幅・検出法としては、前記の種々の方法を用いることができ、これらの方法は既に当該技術分野において確立されている。したがって、公知の方法に従い、前記プライマーセットを用いて、各種試料中の複数種のブドウ球菌を互いに区別して検出することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４４】
実施例１：ブドウ球菌の検出と分類
（１）方法
１つのプライマーセットとして、配列番号２に示すプライマーと配列番号４に示すプライマーを用いてブドウ球菌等の検出、分類を行った。具体的には、該プライマーを使用してＢｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）でＰＣＲを行って核酸増幅した後、電気泳動で増幅産物の有無とその大きさを比較した。測定試料は分離培養したコロニー（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）を使用した。
（ａ）反応液の調製
反応液はＢｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ−の取扱説明書に従って以下のように調製した。また、測定試料は反応液の１／４０容量に相当する量を加えた。
ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ １×
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ− ０．０２５Ｕ／μＬ
プライマー ０．２μＭ ｅａｃｈ
ｄＮＴＰｓ ０．２ｍＭ
（ｂ）ＰＣＲサイクル条件
ＰＣＲは以下の条件で行った。
９４℃ ２分
９４℃ １分 − ５５℃ ３０秒 − ７２℃ １分３０秒 ３７サイクル
（ｃ）電気泳動
得られた増幅産物を６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（東洋紡社）と混合してアガロース電気泳動を行った。アガロースゲルは３％を使用し、泳動条件は１００Ｖ ３０分、マーカーには１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社）を使用した。アガロースゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶ照射によって増幅産物の有無とその大きさを確認した。
（２）結果
測定結果を図３に示す。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは約２８０ｂｐ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは約４００ｂｐ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓは約１８０ｂｐにバンドを確認した。また、ブドウ球菌でないＥ．ｆａｅｃａｌｉｓはバンドが確認されなかった。この結果より、１つのプライマーセットを使用してＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓを検出、分類することができた。また、ブドウ球菌でない菌は検出しないことを確認した。
【００４５】
実施例２：生体試料の測定
（１）方法
１つのプライマーセットとして、配列番号２に示すプライマーと配列番号４に示すプライマーを用いて生体試料の測定を行った。具体的には、該プライマーを使用してＢｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ−（東洋紡社）でＰＣＲを行って核酸増幅した後、電気泳動を行うとともにシークエンス解析を行った。生体試料には分離培養したコロニー１６種類を使用した。
（ａ）反応液の調製
反応液はＢｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ−の取扱説明書に従って以下のように調製した。また、測定試料は反応液の１／４０容量に相当する量を加えた。
ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ １×
Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ（Ｒ） −Ｐｌｕｓ− ０．０２５Ｕ／μＬ
プライマー ０．２μＭ ｅａｃｈ
ｄＮＴＰｓ ０．２ｍＭ
（ｂ）ＰＣＲサイクル条件
ＰＣＲは以下の条件で行った。
９４℃ ２分
９４℃ １分 − ５５℃ ３０秒 − ７２℃ １分３０秒 ３７サイクル
（ｃ）電気泳動
得られた増幅産物を６×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｄｙｅ（東洋紡社）と混合してアガロース電気泳動を行った。アガロースゲルは３％を使用し、泳動条件は１００Ｖ ３０分、マーカーには１００ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ（東洋紡社）を使用した。アガロースゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶ照射によって増幅産物の有無とその大きさを確認した。
（２）結果
電気泳動の結果を図４に示す。約１８０ｂｐ、約２８０ｂｐ、約４００ｂｐにバンドを確認した。バンドが見られた試料はシークエンス解析を行った。約２８０ｂｐ、約４００ｂｐ、約１８０ｂｐのバンドのシークエンス解析結果を図５、図６、図７にそれぞれ示す。各シークエンスを相同性検索したところ、それぞれＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓと高い相同性を示した。この結果より、本発明を用いて試料中に含まれるブドウ球菌を同定、検出できることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明により、ブドウ球菌を検出するとともに、少なくともＳ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓを簡便に分類できる方法及びそのための組成物を提供することができた。該方法及び該組成物を使用することで、ブドウ球菌感染症に対する治療薬の選択、感染拡大防止、食中毒予防等に特に有用であり、研究用途のみならず臨床検査や環境検査、食品検査等にも用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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