(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子と、
前記多孔質ポリマー粒子の表面上に設けられた、インプリント用ポリマーを含み分子インプリント法による鋳型を形成している分子鋳型膜と、
を有し、
前記インプリント用ポリマーが、ポリドーパミンと、（メタ）アクリルアミド又はその誘導体を含むモノマーから形成されたアミド基含有ポリマーとを含む、
分離材。
【請求項２】
前記分子鋳型膜が、前記多孔質ポリマー粒子の表面上に形成された、前記ポリドーパミンを含む下地層と、前記下地層上に形成された、前記アミド基含有ポリマーを含む表層と、を有する、請求項１に記載の分離材。
【請求項３】
前記分離材の細孔径分布におけるモード径が、０．１〜０．５μｍである、請求項１又は２に記載の分離材。
【請求項４】
前記分離材の５％圧縮変形弾性率が１００〜５００ＭＰａである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項５】
前記分離材の比表面積が３０ｍ２／ｇ以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項６】
前記分離材の粒径のＣ．Ｖ．値が５〜１５％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項７】
前記分子鋳型膜が、標的タンパク質と相互作用する鋳型を形成しており、
当該分離材が、牛血清アルブミンに対して３〜１０倍の選択性で前記標的タンパク質を吸着する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項８】
前記標的タンパク質の吸着量が、当該分離材１ｇ当たり１５ｍｇ以上である、請求項７に記載の分離材。
【請求項９】
前記アミド基含有ポリマーが温度応答性を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離材。
【請求項１０】
架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子の表面上に、ポリドーパミンを含む下地層を形成させる工程と、
前記下地層に鋳型分子を吸着させる工程と、
前記鋳型分子を吸着している前記下地層上に、（メタ）アクリルアミド及び／又はその誘導体を含むモノマーの重合により、アミド基含有ポリマーを含む表層を形成させる工程と、
前記鋳型分子を除去して、前記表層と前記下地層とを有し前記鋳型分子に由来する鋳型を形成している分子鋳型膜を形成させる工程と、
を備える、分離材を製造する方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離材を備えるカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラム充填材等として用いることのできる分離材、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子識別能力を有する機能性高分子材料の創製に向けた研究が盛んに行われている。その開発手法のひとつとして「分子インプリント法」への注目が高まっている。分子インプリント法とは、分子識別のターゲット分子（鋳型分子）の存在下でモノマーを重合した後、鋳型分子を取り除くことで、その形状及び性質といった情報を生成する架橋ポリマーの網目に記憶させるといった非常に簡便な手法である。分子インプリント法により得られた架橋ポリマーを含むインテリジェントゲルは、鋳型分子を選択的に吸着又は捕捉することが可能であり、高い選択性及び高感度な分離、センサー、及び触媒などへの応用が期待されている。
【０００３】
例えば、Ｄｅｒｅｋらは、ターゲット分子としてボビンヘモグロビン（ＢＨｂ）を用い、その存在下でポリアクリルアミドゲルを作製した（非特許文献１）。ここで、アクリレート系の窒素含有ポリマであるポリアクリルアミド（ＰＡＡｍ）は、水溶性であり安価で、容易に生成できる。ポリアクリルアミドは、魅力的な構造パラメータを有するように設計されているため、生体分子をインプリントする基板として適当であることが報告されている。得られたゲルからＢＨｂを取り除くことで、ゲル内にＢＨｂのインプリント空隙を有するゲルを作製し、これが他の構造類似体に比べＢＨｂに対して高い選択性を示す。
【０００４】
しかしながら、従来の分子インプリント法により得られるバルクゲルにおいて、インプリントの空隙が形成される場の形態を制御することは困難であった。３次元網目構造のゲル内部に形成されたインプリントの空隙で鋳型分子を捕捉するには、鋳型分子がゲルに接近するだけでなく、その内部に侵入することが必要である。鋳型分子が、タンパク質のようなある程度大きな分子量の高分子である場合、タンパク質をゲル内部へ侵入させることは容易ではない。
【０００５】
特許文献１は、多孔質無機微粒子の表面上に、タンパク質の分子形状鋳型を有するポリマーを設けた材料を開示している。
【０００６】
Ｗａｎｇらは、ナノ多孔性アルミナの孔壁（内壁）にＢＨｂを固定化し、次いでアクリルアミド（ＡＡｍ）とメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）の混合物で孔内を満たし、これらを重合した。その後、アルミナ膜を除去することで、最表面近傍のみにインプリントの空隙を有する細いチューブ状のポリマーを形成した（非特許文献２）。
【０００７】
特許文献２は、単分散ポリマー微粒子の表面にタンパク質を固定化した後、リビングラジカル重合を経て、表面に分子インプリント形状を有する粒子を合成している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許３０６２７４５号公報
【特許文献２】特許４５５８０９７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｄｅｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  ５４２，  ６１−６５  （２００５）
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ，  ７８，  ３１７−３２０  （２００６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
分子インプリント技術を利用した従来の分離材は、タンパク質等の標的分子の吸着量又は吸着選択性が不足する傾向があった。
【００１１】
そこで、本発明は、標的分子を分離するために用いられる分離材に関して、標的分子の吸着量及び吸着選択性を更に向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一側面は、架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子と、多孔質ポリマー粒子の表面上に設けられた、インプリント用ポリマーを含み分子インプリント法による鋳型を形成している分子鋳型膜と、を有する分離材を提供する。一側面に係るインプリント用ポリマーは、ポリドーパミンと、（メタ）アクリルアミド又はその誘導体を含むモノマーから形成されたアミド基含有ポリマーとを含む。
【００１３】
この分離材は、標的分子の吸着量及び吸着選択性の点で十分な性能を発揮することができる。
【００１４】
本発明の別の側面は、架橋ポリマーを含む多孔質ポリマー粒子の表面上に、ポリドーパミンを含む下地層を形成させる工程と、下地層に鋳型分子を吸着させる工程と、鋳型分子を吸着している下地層上に、（メタ）アクリルアミド又はその誘導体を含むモノマーの重合により、アミド基含有ポリマーを含む表層を形成させる工程と、鋳型分子を除去して、表層と下地層とを有し鋳型分子に由来する鋳型を形成している分子鋳型膜を形成させる工程と、を備える、分離材を製造する方法を提供する。
【００１５】
この方法によれば、標的分子の吸着量及び吸着選択性の点で十分な性能を発揮することができる、分離材を製造することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、標的分子を分離するために用いられる分離材に関して、標的分子の吸着量及び吸着選択性を更に向上させることができる。分離材が、アミド基含有ポリマ−とポリドーパミンとの複合体により形成された分子鋳型膜を有することにより、タンパク質等の標的分子を選択的に吸着脱離できる。分離材をカラムに充填したときの通液速度、耐久性（取り扱い性）も改善される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
（多孔質ポリマ粒子）
多孔質ポリマー粒子は、二重結合を二つ以上有する多官能モノマーを含むモノマー原料に由来するモノマー単位を含有する架橋ポリマーを含み得る。モノマー原料のうち９０質量％以上が多官能モノマーであってもよい。多孔質ポリマー粒子は、例えば、モノマー原料、多孔化剤及び水性媒体を含む乳化液中での懸濁重合により合成することができる。
【００１９】
モノマー原料として用いられるモノマーは、特に限定されないが、スチレン及びスチレン誘導体等のビニルモノマーであってもよい。モノマー原料は、単官能性モノマーを含んでいてもよい。
【００２０】
多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルビフェニル、ジビニルナフタレン、及びジビニルフェナントレン等のジビニル化合物が挙げられる。これらの多官能性モノマーは、単独で使用しても２種類以上を併用してもよい。これらのなかでも耐久性、耐酸、アルカリ性の観点より、ジビニルベンゼンを使用することが好ましい。
【００２１】
単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、ｏ−メチルスチレン、ｍ−メチルスチレン、ｐ−メチルスチレン、α−メチルスチレン、ｏ−エチルスチレン、ｍ−エチルスチレン、ｐ−エチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、ｐ−ｎ−ブチルスチレン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ｐ−ｎ−ヘキシルスチレン、ｐ−ｎ−オクチルスチレン、ｐ−ｎ−ノニルスチレン、ｐ−ｎ−デシルスチレン、ｐ−ｎ−ドデシルスチレン、ｐ−メトキシスチレン、ｐ−フェニルスチレン、ｐ−クロロスチレン、３，４−ジクロロスチレン等のスチレン及びその誘導体が挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上組み合わせて用いることができる。これらの中でも耐酸、耐アルカリ性を有するスチレンを使用することが好ましい。また、カルボキシル基、アミノ基、水酸基、アルデヒド基等の官能基を有するスチレン誘導体も使用することができる。
【００２２】
多官能性モノマーは、多官能アクリルモノマーであってもよい。多官能アクリルモノマーとしては（ポリ）エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、（ポリ）テトラメチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール系ジ（メタ）アクリレート；ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、エトキシ化シクロヘキサンジメタノールジ（メタ）アクリレート、エトキシ化ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、トリシクロデカンジメタノールジ（メタ）アクリレート、プロポキシ化エトキシ化ビスフェノールＡジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタンジ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルエタントリ（メタ）アクリレート、１，１，１−トリスヒドロキシメチルプロパントリアクリレート、ジアリルフタレートおよびその異性体、トリアリルイソシアヌレートおよびその誘導体が挙げられる。商業的に入手可能な多官能アクリルモノマーとしては、新中村化学工業（株）製のＮＫエステル（Ａ−ＴＭＰＴ−６Ｐ０、Ａ−ＴＭＰＴ−３Ｅ０、Ａ−ＴＭＭ−３ＬＭＮ、Ａ−ＧＬＹシリーズ、Ａ−９３００、ＡＤ−ＴＭＰ、ＡＤ−ＴＭＰ−４ＣＬ、ＡＴＭ−４Ｅ、Ａ−ＤＰＨ）等が挙げられる。これらの単量体は、単独で使用しても、２種類以上を併用してもよい。
【００２３】
以上のモノマーと共重合可能な単官能モノマーとしてはアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ｎ−ブチル、アクリル酸イソブチル、アクリル酸ヘキシル、アクリル酸２−エチルヘキシル、アクリル酸ｎ−オクチル、アクリル酸ドデシル、アクリル酸ラウリル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−クロロエチル、アクリル酸フェニル、α−クロロアクリル酸メチル、メタクリル酸グリシジル、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ｎ−ブチル、メタクリル酸イソブチル、メタクリル酸ヘキシル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、メタクリル酸ｎ−オクチル、メタクリル酸ドデシル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸ステアリル等の（メタ）アクリル酸エステル、（ｉｉｉ）酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、安息香酸ビニル、酪酸ビニル等のビニルエステル、（ｉｖ）Ｎ−ビニルピロール、Ｎ−ビニルカルバゾール、Ｎ−ビニルインドール、Ｎ−ビニルピロリドン等のＮ−ビニル化合物、（ｖ）フッ化ビニル、フッ化ビニリデン、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレン、アクリル酸トリフルオロエチル、アクリル酸テトラフルオロプロピル等のフッ化アルキル基含有（メタ）アクリル酸エステル、（ｖｉ）ブタジエン、イソプレン等の共役ジエンが挙げられる。これらは１種単独で、または２種以上組み合わせて用いられる。
【００２４】
多孔化剤は、重合時に相分離を促し、粒子の多孔質化を促進する成分である。多孔化剤としては、脂肪族若しくは芳香族の炭化水素、エステル、ケトン、エーテル、及びアルコールが挙げられる。具体的には、多孔化剤は、トルエン、キシレン、シクロヘキサン、オクタン、酢酸ブチル、フタル酸ジブチル、メチルエチルケトン、ジブチルエーテル、１−ヘキサノール、２−オクタノール、デカノール、ラウリルアルコール、及びシクロヘキサノール等から選ばれる少なくとも１種であってもよい。
【００２５】
多孔化剤の量は、モノマー原料に対して０〜２００質量％であってもよい。多孔化剤の量で粒子の空孔率をコントロールできる。多孔化剤の種類によって、孔の大きさ及び形状をコントロールすることができる。
【００２６】
溶媒として使用する水又は水性媒体を多孔化剤として機能させてもよい。この場合は、モノマー原料に油溶性界面活性剤を溶解させることで、モノマー原料が水を吸収させ、粒子を多孔質化させることが可能である。
【００２７】
多孔化に使用される油溶性界面活性剤は、分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸、又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のソルビタンモノエステル（例えば、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノミリステート及びヤシ脂肪酸から誘導されるソルビタンモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２脂肪酸又は鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４脂肪酸のジグリセロールモノエステル（例えば、ジグリセロールモノオレエート（例えば、Ｃ１８：１脂肪酸のジグリセロールモノエステル）、ジグリセロールモノミリステート、ジグリセロールモノイソステアレートおよびヤシ脂肪酸のジグリセロールモノエステル）；分岐Ｃ１６〜Ｃ２４アルコール（例えば、ゲルベアルコール）、鎖状不飽和Ｃ１６〜Ｃ２２アルコールおよび鎖状飽和Ｃ１２〜Ｃ１４アルコール（例えば、ヤシ脂肪アルコール）のジグリセロールモノ脂肪族エーテル；およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましい油溶性界面活性剤としては、ソルビタンモノラウレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）２０、好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノラウレート）、ソルビタンモノオレエート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）、好ましくは約４０％、より好ましくは約５０％、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノオレエート）、ジグリセロールモノオレエート（例えば、約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノオレエート）、ジグリセロールモノイソステアレート（例えば、好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるジグリセロールモノイソステアレート）、ジグリセロールモノミリステート（好ましくは約４０％を超える、より好ましくは約５０％を超える、最も好ましくは約７０％を超えるソルビタンモノミリステート）、ジグリセロールのココイル（例えば、ラウリルおよびミリストイル）エーテル、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００２８】
油溶性界面活性剤の量は、モノマー原料に対して５〜８０質量％の範囲であることが好ましい。この量が５質量％以下の場合、水滴の安定性が損なわれることから、大きな単一孔が形成され易くなる傾向がある。この量が８０質量％以上の場合、重合後に粒子形状を保つことが困難となる傾向がある。
【００２９】
水性媒体としては、水、又は、水と水溶性溶媒（例えば、低級アルコール）との混合媒体が挙げられる。水性媒体には、界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤としては、アニオン系、カチオン系、ノニオン系及び両性イオン系の界面活性剤のうち、いずれも用いることができる。
【００３０】
アニオン系界面活性剤としては、例えば、オレイン酸ナトリウム、ヒマシ油カリ等の脂肪酸油、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム等のアルキル硫酸エステル塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム等のジアルキルスルホコハク酸塩、アルケルニルコハク酸塩（ジカリウム塩）、アルキルリン酸エステル塩、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンラウリルエーテル硫酸ナトリウム等のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩が挙げられる。
【００３１】
カチオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルアミンアセテート、ステアリルアミンアセテート等のアルキルアミン塩、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等の第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００３２】
ノニオン系界面活性剤としては、例えば、ポリエチレングリコールアルキルエーテル類、ポリエチレングリコールアルキルアリールエーテル類、ポリエチレングリコールエステル類、ポリエチレングリコールソルビタンエステル類、ポリアルキレングリコールアルキルアミン又はアミド類等の炭化水素系ノニオン界面活性剤、シリコンのポリエチレンオキサイド付加物類、ポリプロピレンオキサイド付加物類等のポリエーテル変性シリコン系ノニオン界面活性剤、パーフルオロアルキルグリコール類等のフッ素系ノニオン界面活性剤が挙げられる。
【００３３】
両性イオン系界面活性剤としては、例えば、ラウリルジメチルアミンオキサイド等の炭化水素界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤及び亜リン酸エステル系界面活性剤が挙げられる。
【００３４】
界面活性剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。上記界面活性剤の中でも、重合時の分散安定性の観点から、アニオン系界面活性剤が好ましい。
【００３５】
必要に応じて添加される重合開始剤としては、例えば、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、オルソクロロ過酸化ベンゾイル、オルソメトキシ過酸化ベンゾイル、３，５，５−トリメチルヘキサノイルパーオキサイド、ｔｅｒｔ−ブチルパーオキシ−２−エチルヘキサノエート、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルパーオキサイド等の有機過酸化物；２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビスシクロヘキサンカルボニトリル、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ系化合物が挙げられる。重合開始剤の量は、モノマー原料１００質量部に対して、０．１〜７．０質量部の範囲であってもよい。
【００３６】
重合温度は、モノマー原料及び重合開始剤の種類に応じて、適宜選択することができる。重合温度は、２５〜１１０℃が好ましく、５０〜１００℃がより好ましい。
【００３７】
重合工程において、粒子の分散安定性を向上させるために、乳化液に高分子分散安定剤を添加してもよい。
【００３８】
高分子分散安定剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリカルボン酸、セルロース類（ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース等）、ポリビニルピロリドンが挙げられ、トリポリリン酸ナトリウム等の無機系水溶性高分子化合物も併用することができる。これらのうち、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンが好ましい。高分子分散安定剤の量は、モノマー原料１００質量部に対して１〜１０質量部が好ましい。
【００３９】
モノマーが水性媒体中で単独で重合した粒子の発生を抑えるために、亜硝酸塩類、亜硫酸塩類、ハイドロキノン類、アスコルビン酸類、水溶性ビタミンＢ類、クエン酸、ポリフェノール類等の水溶性の重合禁止剤を用いてもよい。
【００４０】
分離材の平均粒径は、好ましくは５００μｍ以下、より好ましくは３００μｍ以下、更に好ましくは１００μｍ以下である。また、多孔質ポリマー粒子の平均粒径は、好ましくは１０μｍ以上、より好ましくは３０μｍ以上であり、更に好ましくは５０μｍ以上である。平均粒径が小さくなると、カラム充填後のカラム圧が増加する可能性がある。
【００４１】
分離材の粒径のＣ．Ｖ．値は、通液性を向上させるためには５〜１５％であることが好ましく、５〜１０％であることがさらに好ましい。粒径のＣ．Ｖ．値を低減するために、マイクロプロセスサーバー（日立製作所）等の乳化装置により粒子を単分散化することが可能である。
【００４２】
分離材の細孔容積は、粒子の真体積の３０％以上７０％以下であってもよい。細孔の大部分の直径（細孔径分布におけるモード径）は、０．１μｍ以上、０．５μｍ未満、すなわちマクロポアーであってもよい。さらに好ましくは、細孔容積が４０％以上７０％以下で、細孔径分布におけるモード径が０．１μｍ以上０．５μｍ未満である。細孔がこれより小さい場合、細孔に入れない物質が増える傾向がある。細孔がこれより大きい場合、表面積が小さくなる傾向がある。
【００４３】
分離材は、通常、約３０ｍ２／ｇ以上の比表面積を有する。実用性を鑑みると、多孔質ポリマー粒子の比表面積は、３５ｍ２／ｇ以上であることが望ましく、４０ｍ２／ｇ以上であることが更に望ましい。表面積が小さいと分離する物質の吸着量が少なくなる傾向がある。多孔質ポリマー粒子の比表面積の上限は、特に制限されないが、２００ｍ２／ｇ以下であってもよい。
【００４４】
分離材の５％圧縮変形弾性率は、１００〜５００ＭＰａであってもよい。これにより、カラム圧力の増加を抑制するという効果が得られる。
【００４５】
（分子鋳型膜）
分子鋳型膜は、インプリント用ポリマーを含むポリマーの膜である。インプリント用ポリマーは、ポリドーパミンと、（メタ）アクリルアミド又はその誘導体を含むモノマーに由来するモノマー単位を含有するアミド基含有ポリマーとを含む。インプリント用ポリマーは、（メタ）アクリルアミド及びその誘導体の両方をモノマー単位として含有していてもよい。
【００４６】
ポリドーパミンの量は、例えば、多孔質ポリマー粒子の質量に対して、１０質量％以下である。アミド基含有ポリマー量は、例えば、多孔質ポリマー粒子の質量に対して、５〜０．０１質量％である。
【００４７】
分子鋳型膜は、例えば、ポリドーパミンを含む下地層と、アミド基含有ポリマーを含む表層とから構成される。下地層と表層との組み合わせにより、分離材の最表面又はその近傍に、標的分子と相互作用する鋳型を形成することができる。これにより効率的な鋳型分子の捕捉を実現することができる。下地層の量は、例えば、多孔質ポリマー粒子の質量に対して、１０質量％以下である。表層の量は、例えば、多孔質ポリマー粒子の質量に対して、５〜０．０１質量％である。
【００４８】
下地層及表層から構成される分子鋳型膜は、例えば、多孔質ポリマー粒子の表面上に下地層を形成させる工程と、下地層に鋳型分子を吸着させる工程と、鋳型分子を吸着している下地層上に表層を形成させる工程と、鋳型分子を除去して、鋳型分子に由来する鋳型を形成している分子鋳型膜を形成させる工程と、を有する方法により、形成することができる。下地層又は表層が、ポリドーパミン及びアミド基含有ポリマーを含んでいてもよい。
【００４９】
下地層として、ドーパミンの重合によりポリドーパミン膜を多孔質ポリマー粒子の表面上に形成させることができる。下地層（ここではポリドーパミン膜）は、細孔内の表面を含む多孔質ポリマー粒子の少なくとも一部を覆うように形成される。下地層は、多孔質ポリマー粒子の細孔の一部又は全部に侵入していてもよい。多孔質ポリマー粒子を下地層で覆うことにより、粒子内へのタンパク質の拡散性を向上することができる。また、吸着させるタンパク質と相互作用する物質をポリドーパミン膜に固定化することにより、タンパク質の吸着選択性が向上させることもできる。
【００５０】
ポリドーパミン膜は、例えば、多孔質ポリマー粒子の存在下で、ドーパミンを酸化重合する方法により形成することができる。ドーパミンの優れた接着性と自発的薄膜形成能力が、多孔質ポリマー粒子の表面上でのポリドーパミン膜を形成させることを可能にする。具体的には、ドーパミン水溶液（ｐＨ＝８程度）に多孔質ポリマー粒子を浸漬させると、速やかにドーパミンの自己酸化重合が始まり、多孔質ポリマー粒子の表面に高分子化したドーパミンが堆積して薄膜を形成する。この薄膜（ポリドーパミン膜）は、多孔質ポリマー粒子の表面に安定に接着する。
【００５１】
ドーパミン水溶液の濃度は、特に制限されないが、一般的には０．０１〜０．１モル／リットル程度である。この濃度は、０．０１〜０．０５モル／リットルが好ましい。ドーパミン溶液のｐＨは、一般的には６．４〜１０．８程度であり、最も好ましくは８．０〜８．５である。多孔質ポリマー粒子を浸漬した時のドーパミン水溶液の温度は、１０〜５０℃程度が好ましい。浸漬時間は、目的とするポリドーパミン膜の厚みにより様々であり、一般的には６〜４８時間程度が好適である。ポリドーパミン膜の厚さは、１０〜３０ｎｍ程度が好ましい。
【００５２】
ドーパミン水溶液が、ジヒドロキシフェニルアラニンを含んでいてもよい。これにより、ドーパミンに由来する構成単位と、ジヒドロキシフェニルアラニンに由来する構成単位とを含む、変性ポリドーパミンを含有するポリドーパミン膜（下地層）を形成することができる。下地層がこの変性ポリドーパミンを含有することで、より一層高い吸着選択性が達成され得る。
【００５３】
多孔質ポリマー粒子の表面上に形成された下地層に、鋳型分子（例えばタンパク質）を吸着させることができる。その後さらに、下地層が形成された多孔質ポリマー粒子を含む溶液中で（メタ）アクリルアミド又はその誘導体を含むモノマーを重合させることにより、鋳型分子に由来する鋳型を形成しながら、アミド基含有ポリマーを含む表層が形成される。鋳型分子としてのタンパク質は、酵素、抗体等であってもよい。（メタ）アクリルアミド及び／又はその誘導体を含むモノマーを重合する際にドーパミンを溶液中に存在させることにより、ポリドーパミン及びアミド基含有ポリマーを含む複合膜を、表層として形成させることもできる。
【００５４】
（メタ）アクリルアミド及びその誘導体は、例えば、（メタ）アクリルアミド、ドーパミンアクリルアミド、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルメタアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−イソプロピル（メタ）アクリルアミドからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物であってもよい。Ｎ−ブチル（メタ）アクリルアミドとしては、Ｎ−ｎ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソブチル（メタ）アクリルアミド、及びＮ−ｔ−ブチル（メタ）アクリルアミドが挙げられる。Ｎ，Ｎ−ジプロピル（メタ）アクリルアミドの２つのプロピル基は、同一又は異なって、ｎ−プロピル基であってもイソプロピル基であってもよい。Ｎ，Ｎ−ジブチルメタアクリルアミドの２つのブチル基は、同一又は異なって、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基のいずれであってもよい。親水性が高い点からアクリルアミドが好ましい。多孔質ポリマー粒子表面に形成する分子鋳型膜の分子選択性を向上させる点ではドーパミンアクリルアミドが好ましい。
【００５５】
アミド基含有ポリマーは、溶液重合法、バルク重合法、沈殿重合法などの従来公知の合成方法によって製造することができる。重合に用いる溶媒は、原料モノマーおよび重合開始剤が室温あるいは加熱により可溶であれば特に制限はない。溶媒の例として、水、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、ブタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトンが挙げられる。これらは単独でも２種以上を混合して用いてもよい。重合溶液におけるモノマーの好適な割合は好ましくは５〜９０質量％、より好ましくは１０〜８０質量％、さらに好ましくは２０〜６０質量％である。
【００５６】
機械的強度を高める点で、アミド基含有ポリマーが架橋構造を有していることが好ましい。単官能モノマーを架橋剤と共重合することにより、架橋構造を有するアミド基含有ポリマーを生成させることができる。架橋剤としては、多官能ビニル化合物が挙げられる。その例として、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド、及びＮ，Ｎ‘−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミドが挙げられる。
【００５７】
メタ（ア）クリルアミド及び／又はその誘導体と、親水性の他のアクリルモノマーとを共重合させることもできる。この親水性のアクリルモノマーとしては以下のものが挙げられる
【００５８】
（１）カルボキシル基含有モノマー
カルボキシル基含有モノマーの具体例は、アクリル酸、メタクリル酸，クロトン酸，ケイ皮酸，イタコン酸，マレイン酸，フマル酸等の不飽和カルボン酸、イタコン酸モノブチル等のイタコン酸モノＣ１〜８アルキルエステル、マレイン酸モノブチル等のマレイン酸モノＣ１〜８アルキルエステル、ビニル安息香酸等のビニル基含有芳香族カルボン酸などの各種カルボキシル基含有単量体およびこれらの塩を含む。これらの化合物は、１種単独で、または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００５９】
（２）水酸基含有モノマー
水酸基含有モノマーの具体例は、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート，２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート，３−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート，４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基含有（メタ）アクリル系単量体、（ポリ）エチレングリコールモノ（メタ）アクリレート，（ポリ）プロピレングリコールモノ（メタ）アクリレート等の（ポリ）アルキレングリコール（メタ）アクリル系単量体、ヒドロキシエチルビニルエーテル，ヒドロキシブチルビニルエーテル等のヒドロキシアルキルビニルエーテル系単量体、アリルアルコール，２−ヒドロキシエチルアリルエーテル等の水酸基含有アリル単量体を含む。これらの化合物は、１種単独で、または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００６０】
アミド基含有ポリマーは、温度応答性を有していてもよい。「温度応答性を有する」とは、温度変化により膨潤収縮するという作用を有することを意味する。アミド基含有ポリマーが温度応答性を有することで、温度変化によりタンパクを吸脱着するという効果が得られる。
【００６１】
標的分子の選択性を向上させるために、標的分子と相互作用する官能基を持つ物質を固定化することもできる。ここでいう相互作用とは、静電相互作用、酵素−基質間類似相互作用、酵素−阻害剤間相互作用、酵素−補酵素間相互作用など、標的分子と強い影響力を及ぼし合う作用を総称していう。
【００６２】
多孔質ポリマー粒子及び分子鋳型膜を有する粒子は、タンパク質等の標的分子の捕捉に好適な分離材である。例えば、タンパク質を含む混合溶液の中に本実施形態の分離材を添加し、鋳型にタンパク質を吸着させた後、分離材を塩濃度の高い水溶液中に添加すれば、分離材の粒子に吸着しているタンパク質を容易に脱離して、これを回収できる。
【００６３】
本実施形態の分離材を用いて分離できる標的分子は、タンパク質等の生体高分子であってもよく、好ましくは水溶性の物質である。具体的には、標的分子は、血清アルブミン及び免疫グロブリンを含む血液タンパク質等のタンパク質、生体中に存在する酵素、バイオテクノロジーにより生産されるタンパク質生理活性物質、ＤＮＡ、及び生理活性を有するペプチド等の生体高分子であることができる。標的分子の分子量は２００万以下であってもよく、さらに好ましくは５０万以下である。
【００６４】
分子鋳型膜が、標的分子としてのタンパク質（標的タンパク質）を吸着する鋳型を形成しており、分離材が、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に対して３〜１０倍の選択性で標的タンパク質を吸着することが好ましい。本実施形態の分離材は、このような高い選択性を容易に達成することができる。
【００６５】
分離材への標的タンパク質の吸着量は、分離材１ｇ当たり１５ｍｇ以上であることができる。本実施形態の分離材は、このような高い吸着量を容易に達成することができる。この吸着量は、分離材に吸着する標的タンパク質の、分離材１ｇ当たりの質量の最大値である。吸着量の上限は、特に制限されないが、通常、分離材１ｇ当たり３００ｍｇ以下程度である。
【００６６】
分離材の粒径は、通常、好ましくは１０〜３００μｍである。分取用又は工業用のクロマトグラフィーでの管状体に充填されるカラム充填材として使用される場合、カラム内圧の極端な増加を避けるために、分離材の粒径は５０〜１００μｍであることが好ましい。本実施形態の分離材の粒子は、カラムクロマトグラフィーのカラム充填材として使用した場合、使用する溶出液の性質に依らず、カラム内での体積変化が殆どないという、操作性における優れた効果を発揮することができる。
【００６７】
多孔質ポリマー粒子、又は分離材の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値は、以下の測定法により求めることができる。
１）粒子を、超音波分散装置を使用して水（界面活性剤等の分散剤を含む）に分散させ、１質量％の粒子を含む分散液を調製する。
２）粒度分布計（シスメックスフロー、シスメックス製）を用いて、上記分散液中の粒子約１万個の画像により平均粒径と粒径のＣ．Ｖ．値を測定する。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例を挙げて本発明についてさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６９】
（実施例１）
多孔質ポリマー粒子の合成
５００ｍＬの三口フラスコに、純度９６％のジビニルベンゼン１４ｇ、オクタノール５ｇ、スパン８０（界面活性剤）３ｇ、及び過酸化ベンゾイル０．６４ｇを、ポリビニルアルコール水溶液（濃度０．５質量％）に加え、マイクロプロセスサーバーを使用して乳化した。得られた乳化液をフラスコに移し、８０℃のウォーターバスで加熱しながら、攪拌機を用いて約８時間撹拌し、ポリマー粒子を生成させた。ポリマー粒子をろ過により回収し、アセトンで洗浄して、多孔質ポリマー粒子を得た。得られた多孔質ポリマー粒子の５％圧縮変形弾性率を微小硬度計を用いて測定した。
【００７０】
分子鋳型膜の形成
ポリドーパミンによるコーティング（下地層の形成）
ドーパミン塩酸塩０．２ｇ、２−ブロモイソブチルブロマイド０．４９ｇ、及びトリエチルアミン０．２１ｇをＤＭＦ１０ｍＬに加え、３時間攪拌した。得られた溶液に、多孔質ポリマー粒子を１ｇを添加し、そこに、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）を９０ｍＬ添加した。次いで、溶液を室温で２４時間攪拌した。粒子を水にて洗浄して、多孔質ポリマー粒子の表面上に形成された、下地層としてのポリドーパミン膜を有する粒子を得た。
【００７１】
タンパク質鋳型の形成（表層の形成）
ポリドーパミン膜を有する粒子１ｇを、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）を１０ｍｇ／ｍＬ含有する５ｍＬグリシルグリシン水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）に投入し、１２時間かけてＧ−６−ＰＤＨをポリドーパミン膜に吸着させた。その後、粒子をろ過により回収した。この粒子を、アクリルアミド１．０ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１３ｇ、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミド０．１３ｇ、二臭化銅６７ｍｇ、トリスジメチルアミノエチルアミンｍｇ、及び水８０ｇを含む反応液に添加し、反応液を窒素でバブリングした。その後、１１９ｍｇのアスコルビン酸を含む水溶液２０ｇを添加し、５時間かけてモノマーを重合させ、ポリマーの膜を形成させた。得られた粒子をＮａＣｌの０．１Ｍ水溶液に浸漬し、鋳型分子のタンパク質（Ｇ−６−ＰＤＨ）を脱離させた。反応液から回収した粒子を、水で洗浄して、鋳型を形成している分子鋳型膜を有する分離材の粒子を得た。得られた分離材の粒径をフロー型粒径測定装置で測定し、平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を算出した。分離材の細孔径分布におけるモード径を、水銀圧入法で測定した。ここでのモード径は、測定される分離材の細孔径分布における最頻値に対応する細孔径を意味する。
【００７２】
（実施例２）
オクタノールの量を２ｇに、スパン８０の量を３ｇに変更して多孔質ポリマー粒子を合成したこと以外は実施例１と同様にして、分離材の粒子を合成した。ジビニルベンゼンの量は実施例１から変更しなかった。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７３】
（実施例３）
スパン８０の量を７ｇに変更して多孔質ポリマー粒子を合成したこと以外は実施例１と同様にして、分離材の粒子を合成した。ジビニルベンゼンの量、及びオクタノールの量は、実施例１から変更しなかった。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７４】
（実施例４）
表層を形成させる際のモノマーとして、Ｎ−（３，４−ジヒドロキシフェネチル）アクリルアミド０．５ｇ、イソプロピルアクリルアミド０．５ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１３ｇ、及びＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミド０．１３ｇを使用したこと以外は実施例１と同様にして、分離材の粒子を得た。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７５】
（実施例５）
オクタノールの量を２ｇに、スパン８０の量を３ｇに変更して多孔質ポリマー粒子を合成したこと以外は実施例４と同様にして、実施例２と同様の多孔質ポリマー粒子を有する分離材の粒子を合成した。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７６】
（実施例６）
モノマーをジビニルベンゼンからエチレングリコールジメタクリレート１４ｇに変更し、スパン８０の量を５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にして、分離材の粒子を合成した。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７７】
（比較例１）
モノマーをジビニルベンゼンからエチレングリコールジメタクリレート５ｇ、及びグリシジルメタクリレート９ｇに変更し、スパン８０の量を５ｇに変更し、マイクロプロセスサーバーで乳化を行わなかったことの他は実施例１と同様にして、粒子を合成した。合成した粒子１０ｇ、水８０ｇ、及びジエチルアミン２０ｇをフラスコに入れ、５０℃で３時間の反応により、粒子表面にアミノ基を導入した。得られたポリマー粒子におけるアミノ基の量は、粒子の質量を基準として３．２ｍｍｏｌ／ｇであった。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００７８】
（比較例２）
アクリルアミド９ｇ、メチレンビスアクリルアミド１ｇ、ＢＳＡ１５０ｍｇ、及び酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）１５０ｍｇを２０ｍＬのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に加えた。得られた溶液を、エチルセルロースのトルエン溶液（濃度０．２質量％）に添加した。窒素置換を１５分行った後、過硫酸カリウム０．１ｇ、及び亜硫酸水素ナトリウム０．０５ｇを含む水溶液１０ｍＬを滴下し、２５℃で３時間かけて、モノマーを重合させた。
【００７９】
重合後、生成した粒子を１０体積％の酢酸水溶液（ドデシル硫酸ナトリウム１０質量％含有）で洗浄し、鋳型分子としての酵素を除去した。粒子を水で洗浄後、比較例２の分離材として使用した。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００８０】
（比較例３）
カラム充填剤用の粒子であるリクロソルブ（登録商標）ＲＰ−１８（粒子径１０μｍ、Ｍｅｒｃｋ製）に、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランで二重結合を付与した。この粒子１０ｇを、酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）１８０ｍｇと、ＢＳＡ１８０ｍｇと、モノマーとしてのアクリル酸２．５ｍＬ、アクリルアミド２．３ｇ、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド１．２ｇ、及びメチレンビスアクリルアミド１．２ｇとを含む１２ｍＭのリン酸緩衝液水溶液３００ｍＬに添加して、溶液を攪拌した。そこに、過硫酸アンモニウム０．６ｇを含む水溶液１．５ｇ、及び１．２ｇのテトラメチレンジアミンを添加し、６時間かけてモノマーを重合させた。重合後、粒子を比較例２と同様に洗浄し、鋳型分子としての酵素を除去した。その後、粒子を水で洗浄して、比較例３の分離材として使用した。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００８１】
（比較例４）
１５ｍｇの酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）を溶解させた１５ｍＬのリン酸緩衝液５０ｍＭに、２５０ｍｇのマクロポーラスシリカ（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ  Ｓｉ１０００）を加え、溶液を３時間攪拌して、酵素をマイクロポーラスシリカに吸着させた。その後、マイクロポーラスシリカをろ過により取り出して洗浄して、吸着していない酵素を分離した。マイクロポーラスに５０ｍｇの酵素が吸着された。得られた粒子を１０ｍＬのトリス緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８）に添加した。そこに２０ｍｇのドーパミンを添加し、溶液を２４時間攪拌した。その後、０．５ＭのＮａＣｌ水溶液を用いて、鋳型分子として使用した酵素を脱離させ、粒子を水で洗浄して、これを比較例４の分離材として使用した。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００８２】
（比較例５）
実施例１において得られた、分子鋳型膜を形成する前の多孔質ポリマー粒子１ｇを、リン酸緩衝液でｐＨを８．５に調整したドーパミン塩酸塩水溶液５０ｇに浸漬し、２４時間、室温で溶液を攪拌した。溶液中のドーパミン塩酸塩の量を、多孔質ポリマー粒子１ｇに対して２ｍｇとした。その後、回収した粒子の表面のＸＰＳ測定を行ったところ、窒素原子を確認できたため、ポリドーパミン膜が粒子表面上に形成されたことが確認された。
ポリドーパミン膜が形成された粒子１ｇを、グルコース−６−リン酸脱水素酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する５ｍＬのグリシルグリシン水溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．５）に投入し、１２時間かけて粒子にＧ−６−ＰＤＨを吸着させた。その後、再度上記条件にてポリドーパミン膜を形成することで鋳型を形成させた。次いで、０．１ＭのＮａＣｌ水溶液に粒子を浸漬させ、鋳型分子のタンパク質（Ｇ−６−ＰＤＨ）を脱離させた。溶液から回収した粒子を水で洗浄して、鋳型を形成している分子鋳型膜を有する分離材の粒子を得た。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００８３】
（比較例６）
モノマーとしてのアクリルアミド１．０ｇ、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド０．１３ｇ、及びＮ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）−ビスアクリルアミド０．１３ｇと、過硫酸カリウム０．１ｇと、メタノール８０ｇとを含む反応液を調製した。そこに、実施例１において得られた、分子鋳型膜を形成する前の多孔質ポリマー粒子１ｇを加え、反応液中で窒素をバブリングした。その後、テトラエチレンジアミン、及び１００ｍｇのアスコルビン酸を水２０ｇに溶解させた溶液を添加し、２５℃で５時間かけてモノマーを重合させて、多孔質ポリマー粒子の表面上にポリマー膜を形成させた。得られた粒子は凝集しており、多孔質ポリマー粒子の細孔がポリマー膜で埋まっていた。得られた粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を測定した。
【００８４】
表１に、実施例及び比較例の各粒子の平均粒径及び粒径のＣ．Ｖ．値を示す。
【００８５】
【表１】
0006728684.tif 000002
【００８６】
タンパク質の吸着能評価
ＢＳＡ及び酵素（Ｇ−６−ＰＤＨ）をそれぞれ濃度１０ｍｇ／ｍＬで含有し、グリシルグリシンを濃度０．１ｍｏｌ／Ｌで含有する酵素溶液５ｍＬ（ｐＨ８．５）を調製した。０．１Ｍのグリシルグリシン緩衝溶液１０ｍｌ、ＭｇＣｌ２２２８ｍｇ、グルコース−６−リン酸２ナトリウム１８ｍｇ、及びＮＡＤＰ＋４０ｍｇを混合して、標準溶液を調製した。この標準溶液に酵素溶液を投入し、分光光度計で３４０ｎｍのピークを１分ごとに追跡して、ＮＡＤＰ＋の還元反応速度を測定した。
【００８７】
実施例又は比較例の粒子０．５ｇを酵素溶液に投入し、３０分間攪拌して、ＢＳＡと酵素を粒子に吸着させた。その後、酵素溶液を標準溶液に投入し、分光光度計で３４０ｎｍのピークを１分ごとに追跡して、ＮＡＤＰ＋の還元反応速度を測定した。測定された還元反応速度を、標準溶液における還元反応速度と比較することで、粒子への酵素の吸着量を求めた。また、２８０ｎｍの吸光度に基づいて、粒子へのＢＳＡの吸着量を測定した。酵素とＢＳＡの吸着量から、吸着選択性（酵素吸着量／ＢＳＡ吸着量）を算出した。各粒子の吸着能に関して、酵素の吸着量の合計が１５ｍｇ／粒子ｇ以上である場合を○、１５ｍｇ／粒子ｇ以下である場合を×と判定した。
【００８８】
振とう試験
実施例又は比較例の粒子１ｇを、１０ｇの水中に分散させた。得られた分散液を２０ｍＬサンプル管に投入し、振とう機で６時間、振とうさせた。振とう後、サンプル管を１０分間静置してから、上澄みの濁度を測定した。振とうに対する粒子の耐性に関して、水の透過度が３％以上であった場合を×、３％以内であった場合を○と判定した。
【００８９】
カラム圧評価
実施例又は比較例の粒子をメタノールと混合してスラリーを調製した（粒子濃度３０質量％）。このスラリーを、φ７．８×３００ｍｍのステンレスカラムに１５分かけて充填した。８００ｃｍ／ｈの流速で水をカラムに流しながら、カラム圧の初期値を測定した。次いで、３０００ｃｍ／ｈに流速を上昇させ、１時間、水を通液させた。その後、流速を８００ｃｍ／ｈに下げて、カラム圧を測定した。カラム圧が初期値（３０００ｃｍ／ｈに流速を上げる前）より１０％以上向上した場合を×、１０％以内である場合を○とした。
【００９０】
【表２】
0006728684.tif 000003
【００９１】
表２の結果からも分かる通り、多孔質ポリマー粒子の表面上に、アクリルアミドを含む親水性モノマーから形成されたポリマーとポリドーパミンとの複合体から構成される分子鋳型膜を形成することにより、タンパク質を選択的に吸着できることが分かった。また、高流速においてもカラム圧が変動しないことが分かった。さらに多孔質ポリマー粒子の表面上に分子鋳型膜を形成することにより、振とう試験で破壊しない粒子が得られた。以上の結果より、本発明の粒子はカラム充填剤等の分離材として非常に有用であることが分かった。