(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下により表される構造：
【化１】
0006773677.tif 000048
（式中、
Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ2は水素であるか、又は、Ｒ1は水素であり、かつＲ2はアルキル基であり、
Ｌ1及びＬ2はリンカーであり、
Ｘはシクロオクチンを含み、そして
Ｙは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物。
【請求項２】
前記アルキル基がメチル基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下により表される構造：
【化２】
0006773677.tif 000049
（式中、
Ｒ1及びＲ1´はそれぞれアルキル基であり、かつＲ2及びＲ2´はそれぞれ水素であるか、又は、Ｒ1及びＲ1´はそれぞれ水素であり、かつＲ2及びＲ2´はそれぞれアルキル基であり、
Ｘはシクロオクチンを含み、
Ｙは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物。
【請求項４】
前記アルキル基がメチル基である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
以下により表される構造：
【化３】
0006773677.tif 000050
（式中、
Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つは、メチル又はエチルであり、
Ｌ1は第１リンカーであり、
Ｌ2は第２リンカーであり、そして
Ｙは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物。
【請求項６】
Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項１０】
以下により表される構造：
【化４】
0006773677.tif 000051
（式中、
Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つは、メチル又はエチルであり、
Ｌ1はリンカーであり、そして
Ｙは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物。
【請求項１１】
Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１５】
以下により表される構造：
【化５】
0006773677.tif 000052
（式中、Ｒは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項１６】
以下により表される構造：
【化６】
0006773677.tif 000053
（式中、Ｒは、ＲＮＡｉ剤を含む）
を有する、請求項１０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
合成オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンス分子、アプタマー、リボザイム及びＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子は、生物医学的研究、診断及び治療にますます使用されている。これらの合成オリゴヌクレオチドは、配列依存的にイン・ビトロ、イン・サイチュ（in situ）、及びイン・ビボでの遺伝子の発現を阻害し又はノックダウンするために使用されてきた。
【０００２】
標的リガンド又は他の薬理学的修飾因子を合成オリゴヌクレオチドに、特に治療的イン・ビボ送達のために、結合又は連結することがしばしば有用である。有用であるためには、異なる合成オリゴヌクレオチド、並びに異なる標的リガンド及び薬理学的修飾因子に容易に適用可能であるように、結合化学（linkage chemistry）はモジュラー（modular）でなければならない。さらに、結合化学は、単純な反応条件を有し、効率的であり（すなわち高い化学的収率を与え）、毒性又は他の有害な生成物を必要とせず、そして毒性又は他の有害な副生成物を生成してはならない。結合化学はまた、標的細胞の外側で、例えば循環、皮下空間、又は細胞外空間において安定だが、最終作用部位で、例えば標的細胞の内側で容易に切断可能でなければならない。
【０００３】
合成オリゴヌクレオチドを標的リガンド又は他の薬理学的修飾因子に連結するのに有用なそのような反応の例は、環状アルキン及びアジドの環付加であり、それは「クリック反応（click reactions）」又は「クリックケミストリー（click chemistry）」として知られている反応の一つである。クリック反応では、２つの別個の分子実体（アジドで荷電したものと、歪シクロアルキンで荷電したもの）が、歪み促進アジド−アルキン環付加（strain-promoted azide-alkyne cycloaddition）（ＳＰＡＡＣ）と呼ばれる反応によって単一の分子へと自発的に組み合わされることになる。当該反応は性質が穏やかで、迅速かつ高収率であり、そして、おおよそ生理学的ｐＨで、水中で、及び生体分子官能基の付近で起こる。この反応は、生体分子（例えばタンパク質、脂質、グリカンなど）の生体直交型（bioorthogonal）標識及び画像化、プロテオミクス並びに材料科学のための汎用ツールとなっている。環付加反応は、触媒の不存在下で自発的に進行する。金属を含まない環付加はまた、「無金属（metal-free）クリック反応」と呼ばれる。生体直交型標識のためのＳＰＡＡＣの能力は、単離された環状アルキン又はアジドが、生物学的官能基、例えばアミン、チオール、酸又はカルボニルなどに対して完全に不活性であるが、組み合わせると迅速かつ不可逆な環付加を受け、安定なトリアゾールコンジュゲートをもたらすという事実にある。例えば、栄養要求細菌での発現、遺伝子工学又は化学変換によって得られたアジド修飾タンパク質は、シクロオクチンコンジュゲートとアジド−タンパク質を単に撹拌すると、ビオチン、蛍光色素分子、ＰＥＧ−鎖又は他の官能基によりきれいに標識することができる。また、小さいサイズのアジドは、化学リポーター戦略による特定の生体分子の画像化におけるＳＰＡＡＣの適用に非常に有用であることが証明されている。
【０００４】
本発明者らは、現在入手可能なアルキンジスルフィド、例えばジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ：
【０００５】
【化１】
0006773677.tif 000002
【０００６】
が、化合物の修飾中に不十分な安定性を提供し、不十分な合成収率及び望ましくない不純物の存在をもたらすことを見出した。本発明者らは、これより、改善された安定性特性を有し、改善された収率及び純度をもたらす、改善されたアルキンジスルフィドについて説明する。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本明細書に記載されるのは、以下により表される構造：
【０００８】
【化２】
0006773677.tif 000003
【０００９】
（式中、Ｒ1及び／又はＲ2はアルキル基であり、Ｌ1及びＬ2はリンカーであり、Ｘはシクロオクチンであり、そしてＹは反応性基、合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉ剤を含む）を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物である。いくつかの実施形態では、Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2はアルキル基であり、かつＲ1は水素である。いくつかの実施形態では、前記アルキル基は、メチル基又はエチル基である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００１０】
本明細書に記載されるのは、以下により表される構造：
【００１１】
【化３】
0006773677.tif 000004
【００１２】
（式中、Ｒ1、Ｒ1´、Ｒ2及び／又はＲ2´はアルキル基であり、Ｘはシクロオクチンを含み、そして、Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物である。いくつかの実施形態では、Ｒ1及びＲ1´はアルキル基であり、かつＲ2及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2及びＲ2´はアルキル基であり、かつＲ1及びＲ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ1はアルキル基であり、かつ、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ1は水素である。いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチル基である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００１３】
本明細書に記載されるのは、以下により表される構造：
【００１４】
【化４】
0006773677.tif 000005
【００１５】
（式中、Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つは、メチル又はエチルであり、Ｌ1は第１リンカーであり、Ｌ2は第２リンカーであり、そして、Ｙは反応性基、合成オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ剤を含む）を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物である。いくつかの実施形態では、Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００１６】
本明細書に記載されるのは、以下により表される構造：
【００１７】
【化５】
0006773677.tif 000006
【００１８】
（式中、Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つはメチル又はエチルであり、Ｌ1はリンカーであり、そして、Ｙは反応性基、合成オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ剤を含む）を有する、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物である。いくつかの実施形態では、Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００１９】
本明細書に記載されるのは、以下によって表される構造：
【００２０】
【化６】
0006773677.tif 000007
【００２１】
（式中、Rは反応性基、NHS反応性基、合成オリゴヌクレオチド、又はRNAi剤である）を有する化合物である。
【００２２】
本明細書に記載されるのは、以下によって表される構造：
【００２３】
【化７】
0006773677.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒは、反応性基、ＮＨＳ反応性基、合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉ剤を含む）を有する化合物である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＤＢＣＯ−アルカン−ＳＳ−ＮＨＳの合成を説明する反応スキーム。
【図２】ＤＢＣＯ−メチル−ＳＭＰＴ−ＮＨＳの合成を説明する反応スキーム。
【図３】ＤＢＣＯ−メチル−ＳＭＰＴ−ＮＨＳのＥＳＩ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ分析を示すグラフ。
【図４】ＤＢＣＯ−メチル−ＳＭＰＴ−ＮＨＳのＨＩ  ＮＭＲを示すグラフ。
【図５】特定のシクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ化合物の開示された実施形態。Ｒは反応性基、ＮＨＳ反応性基、合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉ剤を含む。ｎ及びｍは０〜１０の整数である。
【図６】特定のシクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ化合物の開示された実施形態。Ｒは反応性基、ＮＨＳ反応性基、合成オリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉ剤を含む。
【図７】非分岐ＤＢＣＯジスルフィド修飾因子（ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ＮＨＳエステル）で調製したＲＮＡｉ剤センス鎖コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図８】ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルで調製したＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図９】ＤＢＣＯ−アルカン（メチル）−ジスルフィド修飾因子で調製したＲＮＡｉ剤センス鎖コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１０】分岐ＤＢＣＯ−アルカン（ジメチル）−ジスルフィド修飾因子で調製したＲＮＡｉ剤センス鎖コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１１】ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＳＭＰＴで調製したＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１２】特定のシクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−オリゴヌクレオチド化合物の開示された実施形態。Ｒはオリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ剤を含む。示されたリン酸基は、合成オリゴヌクレオチド又はＲＮＡｉ剤の一部であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
シクロオクチン及び分岐ジスルフィドを含む新規化合物、それらの合成、及びそれらの使用方法が、本明細書に開示される。本明細書に開示された改善された化合物は、先に述べたシクロオクチンを含有する組成物に対して、改善された安定性を示す。
【００２７】
本明細書に開示されるのは、シクロオクチン−アルキル−ジスルフィド−修飾オリゴヌクレオチド、それらの合成、及びそれらの使用方法である。シクロオクチン−アルキル−ジスルフィド−修飾オリゴヌクレオチドは、目的の化合物、例えば標的リガンド、脂質、コレステロール、送達剤（例えばエンドソーム溶解性（endosomolytic）ポリマー）、又は薬理学的修飾因子、に容易に結合される。当該シクロオクチン−アルキル−ジスルフィド−修飾オリゴヌクレオチドは、対応するシクロオクチン−ジスルフィド−修飾オリゴヌクレオチドよりも、改善された収率で容易に合成され、かつ少ない不純物を有する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００２９】
【化８】
0006773677.tif 000009
【００３０】
（式中、
Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ2は水素であるか、又は、Ｒ1は水素であり、かつＲ2はアルキル基であるか、又は、Ｒ1及びＲ2はアルキル基であり、
Ｘはシクロオクチンを含み、
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００３１】
Ｘ及びＹはリンカーを介して結合されてもよい。いくつかの実施形態では、アルキル基はメチル又はエチルである。いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチルである。
いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００３３】
【化９】
0006773677.tif 000010
【００３４】
（式中、
Ｒ1、Ｒ1´、Ｒ２、及びＲ２´の１又は複数はアルキル基であり、
Ｘはシクロオクチンを含み、
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００３５】
Ｘ及びＹはリンカーを介して結合されてもよい。いくつかの実施形態では、前記アルキル基は独立してメチル又はエチルである。いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ1及びＲ1´はアルキル基であり、かつＲ2及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2及びＲ2´はアルキル基であり、かつＲ1及びＲ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ1´、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ1は水素である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００３７】
【化１０】
0006773677.tif 000011
【００３８】
（式中、
Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ2は水素であるか、又は、Ｒ1は水素であり、かつＲ2はアルキル基であるか、又は、Ｒ1及びＲ2はアルキル基であり、
Ｌ1及びＬ2はリンカーであり、
Ｘはシクロオクチンを含み、そして
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチル又はエチルである。いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチルである。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００４１】
【化１１】
0006773677.tif 000012
【００４２】
（式中、
Ｒ1、Ｒ1´Ｒ2及びＲ2´の１又は複数はアルキル基であり、
Ｌ1は第１リンカーであり、
Ｌ2は第２リンカーであり、
Ｘはシクロオクチンを含み、そして
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記アルキル基は独立してメチル又はエチルである。いくつかの実施形態では、前記アルキル基はメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ1及びＲ1´はアルキル基であり、かつＲ2及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2及びＲ2´はアルキル基であり、かつＲ1及びＲ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ1はアルキル基であり、かつＲ1´、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ2、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ2´はアルキル基であり、かつＲ1、Ｒ1´、及びＲ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ2´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ1´、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ2は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ2はアルキル基であり、Ｒ1´は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ1´、Ｒ2、及びＲ2´はアルキル基であり、Ｒ1は水素である。いくつかの実施形態では、ＹはＲＮＡｉ剤を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００４５】
【化１２】
0006773677.tif 000013
【００４６】
（式中、
Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つは、メチル又はエチルであり、
Ｌ1は第１リンカーであり、
Ｌ2は第２リンカーであり、そして
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がメチル又はエチルであり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ6がメチル又はエチルであり、かつＲ5、Ｒ7及びＲ8は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5及びＲ6が独立してメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がメチル又はエチルであり、かつＲ8、Ｒ5及びＲ6は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ8がメチル又はエチルであり、かつＲ7、Ｒ5及びＲ6は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7及びＲ8が独立してメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、前記合成オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ剤である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキルジスルフィド化合物は、以下により表される構造：
【００４９】
【化１３】
0006773677.tif 000014
【００５０】
（式中、
Ｒ3はＣ（Ｒ5Ｒ6）であって、ここで、Ｒ5は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ6は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ4はＣ（Ｒ7Ｒ8）であって、ここで、Ｒ7は水素、メチル又はエチルであり、かつＲ8は水素、メチル又はエチルであり、
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、及びＲ8の少なくとも１つは、メチル又はエチルであり、
Ｌ1はリンカーであり、そして
Ｙは、反応性基又は合成オリゴヌクレオチドを含む）
を有する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、Ｒ5又はＲ6がメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がメチル又はエチルであり、かつＲ6、Ｒ7及びＲ8は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ6がメチル又はエチルであり、かつＲ5、Ｒ7及びＲ8は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5及びＲ6が独立してメチル又はエチルであり、かつＲ7及びＲ8がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7又はＲ8がメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がメチル又はエチルであり、かつＲ8、Ｒ5及びＲ6は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ8がメチル又はエチルであり、かつＲ7、Ｒ5及びＲ6は水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7及びＲ8が独立してメチル又はエチルであり、かつＲ5及びＲ6がいずれも水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ5がＣＨ3であり、かつ、Ｒ6、Ｒ7及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、Ｒ7がＣＨ3であり、かつ、Ｒ5、Ｒ6及びＲ8がそれぞれ水素である。いくつかの実施形態では、前記合成オリゴヌクレオチドがＲＮＡｉ剤である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキル−ジスルフィド−アミン反応性基化合物は、以下により表される構造：
【００５３】
【化１４】
0006773677.tif 000015
【００５４】
【化１５】
0006773677.tif 000016
【００５５】
【化１６】
0006773677.tif 000017
【００５６】
（式中、Ｒは、以下：活性化エステル、ＮＨＳ、ＴＦＰ、ＰＦＰ、テトラジン、ノルボルネン（norbomenes）、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ヒドラジン（例えばｈｙｎｉｃ）、アミノオキシ試薬、及びアルデヒド（例えば４−ホルミル安息香酸）、からなる群から選択される反応性基を含む）を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−アミン反応性基化合物は、図５〜６に示される構造を有する。
【００５８】
いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−合成オリゴヌクレオチド化合物は、以下によって表される構造：
【００５９】
【化１７】
0006773677.tif 000018
又は
【化１８】
0006773677.tif 000019
【００６０】
（式中、ＲＮＡはＲＮＡｉ剤を含む）
を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、記載されたシクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−合成オリゴヌクレオチド化合物は、オリゴヌクレオチドをアジド含有化合物に連結するために使用される。いくつかの実施形態では、前記アジド含有化合物は、以下：標的リガンド、脂質、コレステロール、又は送達剤、例えばエンドソーム溶解性ポリマー、ポリアミン、修飾ポリアミン、又は薬理学的修飾因子、からなる群から選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、記載されたシクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−オリゴヌクレオチドは、ポリマーにコンジュゲートされ、ここで、前記ポリマーはアジド基を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリマーは、オリゴヌクレオチドのイン・ビボ送達を促進するポリマーである。いくつかの実施形態では、前記オリゴヌクレオチドはＲＮＡｉ剤を含む。
【００６３】
本明細書に開示されるのは、合成オリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡｉ剤を、医薬修飾因子又は送達ポリマーに、共有結合させる方法であって、ここで、前記合成オリゴヌクレオチドが記載のシクロオクチン−アルキル−ジスルフィド−アミン反応性基化合物にコンジュゲートされて、シクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−合成オリゴヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、シクロオクチン−アルキル−Ｓ−Ｓ−合成オリゴヌクレオチドは、医薬修飾因子又は送達ポリマーとさらに反応し、ここで、前記医薬修飾因子又は送達ポリマーは少なくとも１つのアジド基を含む。
【００６４】
記載された化合物及び方法は、治療剤、診断剤として使用されるか、又は分子生物学研究における使用のための、ＲＮＡｉ剤含有組成物を形成するために使用することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、シクロオクチンは銅を含まないアルキンコンジュゲーション試薬である。シクロオクチンには、これらに限定されるものではないが、以下：ジアリールシクロオクチン、ＤＢＣＯ（また、アザジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ又はＡＤＩＢＯ）、アリール基に縮合したシクロオクチン部分（ベンゾ環化（benzoannulated）系）、が挙げられる。
【００６６】
【化１９】
0006773677.tif 000020
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、化合物の２つの部分を接続する有機部分を意味する。リンカーは典型的には、以下のものを含む：直接結合、又は原子、例えば酸素若しくは硫黄、単位、例えばＮＲL（ここで、ＲLは水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である）、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ2、ＳＯ2ＮＨ、又は原子鎖、例えば、これらに限定されるものではないが、置換又は非置換アルキル、置換又は非置換アルケニル、置換又は非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル（alkylhererocyclylalkynyl）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリール（alkynylhereroaryl）であって、その１又は複数のメチレンが以下のものによって中断又は終了することができる、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ2、Ｎ（ＲL）（ここで、ＲLは水素、アシル、脂肪族又は置換脂肪族である）、Ｃ（Ｏ）、置換又は非置換アリール、置換又は非置換ヘテロアリール、置換又は非置換複素環式；−（ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2）nＮ−、−（ＣＨ2）nＯ−、−（ＣＨ2）nＳ−、−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）m−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）x−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ2）m− −Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）m−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）m−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）m−（ＣＨ2）x−、−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−、−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−、−Ｏ−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ2−、−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−、−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｏ−、−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−ＣＨ2−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）n−、−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−、−（ＣＨ2−ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ2−、
【００６８】
【化２０】
0006773677.tif 000021
【００６９】
反応性基は、当該技術分野において一般的に利用可能なもの、及び、これらに限定されるものではないが、活性化エステル、ＮＨＳ、ＴＦＰ、ＰＦＰ、テトラジン、ノルボルネン（norbomenes）、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、ヒドラジン（例えばｈｙｎｉｃ）、アミノオキシ試薬、及びアルデヒド（例えば４−ホルミル安息香酸）、を含む。
【００７０】
標的リガンド（標的基とも呼ばれる）は、標的細胞又は組織、又は特定の細胞型に対する化合物の標的化又は送達に使用される。標的リガンドは標的細胞への分子の会合を増強する。したがって、標的リガンドは、それらが結合しているコンジュゲートの薬物動態的特性又は生体内分布特性を増強して、コンジュゲートの細胞分布及び細胞取り込みを改善することができる。細胞又は細胞受容体に対する標的基の結合は、エンドサイトーシスを開始し得る。標的基は、１価、２価、３価、４価であるか、又はより高い原子価を有してもよい。標的基は、これらに限定されるものではないが、細胞表面分子に親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、及び細胞表面分子に親和性を有する抗体模倣物、疎水性基、コレステロール、コレステリル基、又はステロイドで有り得る。いくつかの実施形態では、標的基は細胞受容体リガンドを含む。様々な標的基が、薬物及び遺伝子を、細胞及び特定の細胞受容体に標的化するために使用されてきた。細胞受容体リガンドは、これらに限定されるものではないが、以下：炭水化物、グリカン、糖類（これらに限定されるものではないが：ガラクトース、ガラクトース誘導体（例えばＮ−アセチル−ガラクトサミン）、マンノース、及びマンノース誘導体を含む）、ハプテン、ビタミン、葉酸、ビオチン、アプタマー、及びペプチド（これらに限定されるものではないが：ＲＧＤ含有ペプチド、ＲＧＤ模倣物、インスリン、ＥＧＦ、及びトランスフェリンを含む）であってもよい。
【００７１】
本明細書で使用される場合、立体安定剤は、立体安定剤を含まない分子と比較して、それが結合している分子の分子内又は分子間相互作用を防止又は阻害する、非イオン性親水性ポリマー（天然、合成、又は非天然のいずれか）である。立体安定剤は、それが結合している分子が静電相互作用に関与するのを妨げる。静電相互作用は、正電荷と負電荷との間の引力による２つ以上の物質の非共有会合である。立体安定剤は、血液成分との相互作用、従ってオプソニン化、食作用、及び細網内皮系による取り込みを阻害することができる。したがって、立体安定剤は、それらが結合している分子の循環時間を増加させることができる。立体安定剤はまた、分子の凝集を阻害することができる。好ましい立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧ誘導体である。本発明に適しているＰＥＧ分子は、約１〜１２０個のエチレングリコールモノマーを有する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量の少なくとも１種類のＲＮＡｉ剤及び１又は複数の薬学的に許容される賦形剤を含有する。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、安全性について適切に評価されており、かつ薬物送達システムに意図的に含まれる、活性医薬成分（ＡＰＩ、治療薬、例えば、ＲＮＡｉ剤）以外の物質である。賦形剤は、意図された投与量で治療効果を発揮しないか、又は発揮することが意図されない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達システムの処理に役立ち、ｂ）ＡＰＩの安定性、生物学的利用能又は患者受容性を保護、支持、又は増強し、ｃ）製品の識別を助け、及び／又は、ｄ）保存又は使用中にＡＰＩの全体の安全性、有効性、送達の、任意の他の属性を増強するように作用する。
【００７３】
賦形剤には、これらに限定されるものではないが、以下：吸収促進剤、抗付着剤、消泡剤、抗酸化剤、結合剤、結合剤、緩衝剤、担体、被覆材、着色料、送達促進剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤、充填剤、香味料、流動促進剤、保湿剤、潤滑剤、油、ポリマー、保存剤、生理食塩水、塩、溶媒、糖類、懸濁化剤、徐放性マトリックス、甘味料、増粘剤、等張化剤、ビヒクル、防水材、及び湿潤剤、が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤は不活性物質であってもなくてもよい。
【００７４】
医薬組成物は、医薬組成物に一般的に見られる他の付加的な成分を含有することができる。薬学的に活性な物質は、これらに限定されるものではないが：抗掻痒剤、収斂剤、局所麻酔、又は抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン、ジフェンヒドラミン等）を含んでもよい。本明細書に定義されたＲＮＡｉ剤を発現し又は含む細胞、組織又は単離された器官が、「医薬組成物」として使用され得ることも想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療上有効量」又は単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的又は予防的結果を生じるためのＲＮＡｉ剤の量をいう。
【００７５】
本明細書で使用される場合、薬理学的修飾因子とは、保存又は使用中のＡＰＩの安定性、生物学的利用能、送達、有効性、又は患者受容性を保護し、支持し、又は増強する化合物である。
【００７６】
本明細書で使用される場合、送達ポリマーとは、ＡＰＩのイン・ビボでの生物学的利用能又は送達を増強するポリマーである。送達ポリマーの例としては、これらに限定されるものではないが：両親媒性膜活性ポリアミン、及び可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミン、が挙げられる。
【００７７】
本明細書で使用される場合、膜活性ポリアミンとは、生体膜に対して以下の効果の１つ又は複数を誘導することができる界面活性な両親媒性ポリアミンである：非膜透過性分子を細胞に入れ、又は膜を横切らせることを可能にする膜の改変又は破壊、膜内での孔形成、膜の分裂、あるいは膜の破壊又は溶解。本明細書で使用される場合、膜、又は細胞膜は、脂質二重層を含む。膜の改変又は破壊は、少なくとも１つの以下のアッセイにおけるポリアミンの活性によって機能的に定義することができる：赤血球溶解（溶血）、リポソーム漏出（liposome leakage）、リポソーム融合、細胞融合、細胞溶解、及びエンドソーム放出。原形質膜上でエンドソーム又はリソソームの破壊を選択的に引き起こすポリアミンは、エンドソーム溶解性であると考えられている。細胞膜上の膜活性ポリアミンの効果は一時的であり得る。膜活性ポリアミンは当該膜に対して親和性を有し、かつ二重層構造の変性又は変形を引き起こす。細胞へのＲＮＡｉ剤の送達は、膜活性ポリアミンが原形質膜又は内部小胞膜（例えばエンドソーム又はリソソーム）を破壊又は不安定化することによって媒介され、膜内に細孔を形成すること、あるいはエンドソーム又はリソソーム小胞を破壊し、それによって小胞の内容物を細胞質に放出させることによるものを含む。いくつかの実施形態では、膜活性ポリアミンは、メリチン（melittin）又はメリチン様ペプチド（ＭＬＰ）を含む。
【００７８】
ポリヌクレオチド又はポリ核酸という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーを指す技術用語である。ヌクレオチドはポリヌクレオチドポリマーのモノマー単位である。１２０未満のモノマー単位を有するポリヌクレオチドはしばしば、オリゴヌクレオチドと呼ばれる。天然の核酸は、デオキシリボース−又はリボース−リン酸骨格を有する。非天然又は合成ポリヌクレオチドは、イン・ビトロで又は無細胞系で重合され、かつ、同一又は類似の塩基を含むが、天然リボース又はデオキシリボース−リン酸骨格以外のタイプの骨格を含み得る、ポリヌクレオチドである。合成オリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の任意の方法を用いて合成することができる。当該技術分野で知られているポリヌクレオチド骨格には：ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデート、モルホリノ、及び天然核酸のリン酸骨格の他の変形体が含まれる。塩基はプリン及びピリミジンを含み、さらに天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類縁体を含む。プリン及びピリミジンの合成誘導体は、これらに限定されるものではないが、ヌクレオチド上に新たな反応性基を置く改変、例えば、これらに限定されるものではないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びアルキルハライド、を含む。塩基という用語は、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類縁体のいずれかを包含する。ポリヌクレオチドという用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）、並びに、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び他の天然及び合成ヌクレオチドの組み合わせを含む。
【００７９】
本発明の合成オリゴヌクレオチドは化学的に修飾することができる。化学的修飾ポリヌクレオチドの使用は、ポリヌクレオチドの様々な特性を改善することができ、これらに限定されるものではないが：イン・ビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性、細胞取り込み、活性、及び配列特異的ハイブリダイゼーション、を含む。そのような化学的修飾の非限定的な例には：ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２´−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２´−デオキシ−２´−フルオロリボヌクレオチド、２´−デオキシリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、２´，３´−セコ（seco）ヌクレオチド模倣物（アンロックされた（unlocked）核酸塩基類縁体、本明細書においてＮUNA又はＮＵＮＡと表される）、及び逆デオキシ脱塩基残基取り込み（inverted deoxyabasic residue incorporation）、が挙げられる。これらの化学的修飾は、様々なポリヌクレオチドコンストラクトにおいて使用される場合、細胞におけるポリヌクレオチド活性を保持することを示すと同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、２本の鎖を有する二本鎖を含み、そのうちの１本又は両方を化学的に修飾することができ、ここで、各鎖は、約１９〜約２９（例えば、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９）ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、本発明の合成オリゴヌクレオチドは、１又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。本発明の合成オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置の約５〜約１００％が修飾されたヌクレオチドを含むことができる（例えば、ヌクレオチド位置の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％）。
【００８１】
合成オリゴヌクレオチドは、５´又は３´末端修飾を含んでもよい。３´及び５´末端修飾には、これらに限定されるものではないが、以下：アミン含有基、アルキル基、アルキルアミン基、反応性基、ＴＥＧ基、及びＰＥＧ基、が挙げられる。
【００８２】
「ＲＮＡｉ剤」（「ＲＮＡｉトリガー」、又は二本鎖ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害する。ＲＮＡｉ剤は、典型的には１５〜５０塩基対、及び好ましくは１８〜２６塩基対を含む、二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含み、そして、細胞内で発現される標的遺伝子におけるコーディング配列と少なくとも８５％相補的な核酸塩基配列を有する。ＲＮＡｉ剤には、これらに限定されるものではないが、以下：低分子干渉ＲＮＡ（short interfering RNA）（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）。短ヘアピンＲＮＡ（short hairpin RNA）（ｓｈＲＮＡ）、メロデュプレックス（meroduplexes）、及びダイサー基質が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９、８，３４９，８０９及び８，５１３，２０７号明細書）。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤及びＲＮＡｉトリガーという用語は互換的に使用される。
【００８３】
遺伝子発現を阻害、下方制御、又はノックダウンするとは、遺伝子から転写されたｍＲＮＡのレベル、あるいはｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチド、タンパク質又はタンパク質サブユニットのレベルによって測定された遺伝子の発現が、本明細書に開示された化合物の非存在下で観察されたものよりも低いことを意味する。本発明の組成物によって送達されるポリヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害、下方制御、又はノックダウンは、好ましくは、対照不活性ポリヌクレオチド、スクランブル配列を有するか不活性化ミスマッチを有するポリヌクレオチドの存在下で、あるいは本明細書に開示された組成物へのポリヌクレオチドのコンジュゲーションの非存在下で、観察されたレベルよりも低い。
【００８４】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、部分的に、実質的に、又は完全に、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡｉ剤配列は、第１配列を含むセンス鎖、及び第２配列を含むアンチセンス鎖、を含む。いくつかの実施形態では、２つのＲＮＡｉ剤配列は、第１配列を共に含む２本のセンス鎖、及び第２配列を含むアンチセンス鎖、を含み、ここで、センス鎖及びアンチセンス鎖は共にメロデュプレックスを形成する。センス鎖は連結分子、例えばポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーを介してアンチセンス鎖に接続され得る。
【００８５】
アンチセンス鎖は、標的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの一部と相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は最も好ましくは３０ヌクレオチド未満の長さである。ＲＮＡｉ剤センス鎖は、標的ｍＲＮＡの少なくとも一部と少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む。ＲＮＡｉ剤は、標的遺伝子を発現する細胞への送達時に、イン・ビトロ又はイン・ビボで前記標的遺伝子の発現を阻害する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、天然に存在するヌクレオチドから構成されてもよく、あるいは少なくとも１つの修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド模倣物から構成されてもよい。本発明のＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、当該技術分野で十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。ＲＮＡｉ剤ヌクレオチド、又はヌクレオチド塩基は、リン酸含有（天然）又は非リン酸含有（非天然）共有ヌクレオシド間結合によって連結されてもよく、すなわち、ＲＮＡｉ剤は天然又は非天然オリゴヌクレオチド骨格を有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド塩基間に非標準（非リン酸）結合を含む。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオチド、ヌクレオチド模倣物、脱塩基部位（abasic site）、又は、リボヌクレオチド（２´−ヒドロキシルヌクレオチド）以外の代用置換部分である。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２´−修飾ヌクレオチド（すなわち５員糖環の２´位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）を含む。修飾ヌクレオチドには、これらに限定されるものではないが、以下：２´−修飾ヌクレオチド、２´−Ｏ−メチルヌクレオチド、２´−デオキシ−２´−フルオロヌクレオチド、２´−デオキシヌクレオチド、２´−メトキシエチル（２´−Ｏ−２−メトキシルエチル）ヌクレオチド、２´−アミノヌクレオチド、２´−アルキルヌクレオチド、３´−３´結合（逆位）ヌクレオチド、ヌクレオチドを含む非天然塩基、架橋ヌクレオチド、ペプチド核酸、２´，３´−セコヌクレオチド模倣物（アンロックされた核酸塩基類縁体、ロックされたヌクレオチド、３´−Ｏ−メトキシ（２´ヌクレオチド間結合）ヌクレオチド、２´−Ｆ−アラビノヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド、ビニルホスホネートヌクレオチド、及び脱塩基ヌクレオチド（abasic nucleotides）、が挙げられる。所与のＲＮＡｉ剤における全ての位置が一様に修飾される必要はない。逆に、複数の修飾が単一のＲＮＡｉ剤に、又はさらにはその単一のヌクレオチドに組み込まれてもよい。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤センス鎖及びアンチセンス鎖は、当該技術分野で知られている方法によって合成及び／又は修飾され得る。各ヌクレオチドでの修飾は、他のヌクレオチドの修飾から独立している。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、５´又は３´末端修飾を含んでもよい。３´及び５´末端修飾には、これらに限定されるものではないが：アミン含有基、アルキル基、アルキルアミン基、反応性基、ＴＥＧ基、及びＰＥＧ基が挙げられる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤はオーバーハング（overhang）、すなわち、本明細書で定義したセンス鎖及びアンチセンス鎖の対のコア配列によって通常は形成される二重らせん構造に直接的に関与しない、典型的には不対のオーバーハングヌクレオチド、を含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれに独立して、１〜５塩基の３´及び／又は５´オーバーハングを含み得る。いくつかの実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれも、３´及び５´オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、一方の鎖塩基の３´オーバーハングヌクレオチドの１又は複数は、他方の鎖の１又は複数の５´オーバーハングヌクレオチドと対になる。いくつかの実施形態では、一方の鎖の３´オーバーハングヌクレオチドの１又は複数は、他方の鎖の１又は複数の５´オーバーハングヌクレオチドと対にならない。ＲＮＡｉ剤のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチド塩基を含んでも含まなくてもよい。アンチセンス鎖及びセンス鎖は二本鎖を形成し得るが、ここで、５´末端のみが平滑末端を有する、３´末端のみが平滑末端を有する、５´及び３´末端の両方が平滑末端であるか、あるいは５´末端も３´末端も平滑末端でない。いくつかの実施形態では、オーバーハング内の１又は複数のヌクレオチドは、チオホスフェート、ホスホロチオエート、デオキシヌクレオチド逆位（３´−３´結合）ヌクレオチドを含むか、あるいは、修飾リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドである。
【００９１】
既知のｍｉＲＮＡ配列のリストは、研究機関、例えばとりわけ、Wellcome Trust Sanger Institute、Penn Center for Bioinformatics、Memorial Sloan Kettering Cancer Center、及びEuropean Molecule Biology Laboratoryによって管理されているデータベースで見ることができる。既知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び関連した結合部位も、関連する文献に十分に示されている。ＲＮＡｉ剤分子は、当該技術分野で既知の技術によって容易に設計及び生成することができる。さらに、有効かつ特異的な配列モチーフを発見する機会を増やすコンピューターツールがある（Pei et al. 2006, Reynolds et al. 2004, Khvorova et al. 2003, Schwarz et al. 2003, Ui-Tei et al. 2004, Heale et al. 2005, Chalk et al. 2004, Amarzguioui et al. 2004）。
【実施例】
【００９２】
実施例１．ＤＢＣＯ−Ｓ−Ｓ−メチル−ＮＨＳの合成（図１、化合物７）
【００９３】
【化２１】
0006773677.tif 000022
【００９４】
Ａ）Ｎ−Ｂｏｃ−アミノ酸  ３：４−（ピリジン−２−イルジスルファニル）ペンタン酸  １（Annova Chem., INC.、製品＃Ｌ１００６７、８００ｍｇ、３．２９ｍｍｏｌ）を、無水ＭｅＯＨ（１５ｍＬ）中の２−（ｂｏｃ−アミノ）エタンチオール  ２（１．７４８ｇ、９．８６ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．７２ｍＬ、９．８６ｍｍｏｌ）と、Ａｒ下、ＲＴで、１４時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をＤＣＭ（１００ｍＬ）に再溶解し、５％のＫＨＳＯ4（２×２０ｍＬ）、Ｈ2Ｏ（１×２５ｍＬ）、及びブライン（１×２０ｍＬ）で洗浄した。粗生成物をＮａ2ＳＯ4上で乾燥し、濾過し、そしてロータリーエバポレーターで濃縮した。ＳｉＯ2上でのカラム精製により（溶離勾配  ヘキサン：ＥｔＯＡｃ：酢酸＝９：１：０．０５−７：３：０．０５）、純粋生成物３の６５０ｍｇ（７０％）を得た。
【００９５】
Ｂ）アミノ酸  ４：生成物３（６５０ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ）を、ＨＣｌ／ジオキサン（４Ｍ、６ｍＬ）の氷冷溶液中で１０分間、及びＲＴで１．５時間撹拌した。全ての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をＤＭＦ（２．５ｍＬ）中にとり、Ｅｔ2Ｏ（４０ｍＬ）中で粉砕した。分離した生成物を、Ｅｔ2Ｏでトリチュレートし（triturated）、真空中で乾燥させた。収率４１６ｍｇ。
【００９６】
Ｃ）化合物ＤＢＣＯ  ＮＨＳ  ５を、文献の手順に従って８つのステップで調製した。
【００９７】
Ｄ）ＤＢＣＯ誘導体  ６：アミノ酸  ４（４１０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶液（４：１、２０ｍＬ）中でジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル（Sigma-Aldrich）（８９３ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．９６５ｍＬ、５．５４ｍｍｏｌ）と２時間攪拌した。全ての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残留ＤＩＥＡを粗生成物からジオキサンの２回の連続蒸発によって除去した。生成物をＳｉＯ2カラム上で精製した（溶離：勾配ＣＨＣｌ3中の２％〜４％ＭｅＯＨ。収率７０６ｍｇ（６８％）。
【００９８】
Ｅ）ＤＢＣＯ−（モノメチル）アルキン−Ｓ−Ｓ−ＮＨＳ  ７：生成物６（７００ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ）を無水ＡＣＮ（２５ｍＬ）に溶解し、氷浴上で冷却した。ＮＨＳ（１９６ｍｇ、１．７０６ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（３２６ｍｇ、１．７０６ ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間攪拌した。氷浴を交換し、撹拌をＲＴで１４時間続けた。全ての揮発性物質を真空中で除去し、残渣をＣＨＣｌ3（１２５ｍＬ）に再溶解し、２％ＫＨＳＯ4（２×２５ｍＬ）、ブライン（２×２５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（Ｎａ2ＳＯ4）濾過し、真空中で濃縮した。収率８０２ｍｇ（９５％）。（ＮＭＲ：ＡＢ）
【００９９】
【化２２】
0006773677.tif 000023
【０１００】
ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ジメチル−ＮＨＳを７と同様に、以下を出発物質として用いて調製した：
【化２３】
0006773677.tif 000024
【０１０１】
Ｇ）関連化合物が同様の技術を用いて容易に作成され、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：
【０１０２】
【化２４】
0006773677.tif 000025
【化２５】
0006773677.tif 000026
【化２６】
0006773677.tif 000027
【０１０３】
実施例２．ＤＢＣＯ−アルキル−ＳＭＰＴ−ＮＨＳの合成（式ＶＩ、図２、化合物１３）
【０１０４】
【化２７】
0006773677.tif 000028
【０１０５】
ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＳＭＰＴ−ＮＨＳ
Ａ）４−ブロモメチル安息香酸（２２．７ｇ、０．１ｍｏｌ）及びチオ尿素（９．３ｇ、０．１２ｍｏｌ、１．２当量）を、Ｈ2Ｏ（２００ｍＬ）に溶解し、４時間還流で加熱し、次に１１時間ＲＴとした。１０％ＮａＯＨ（ａｑ）（１２０ｍＬ）を添加し、３時間還流で加熱した。次に、混合物を室温に冷却し、６Ｍの塩酸（６０ｍＬ）を添加して、沈殿物を形成した。沈殿物を濾過し、冷Ｈ2Ｏで洗浄し、減圧下で乾燥させた。１０．４ｇ（５８％）の粗生成物８を次のステップに使用した。
【０１０６】
Ｂ）ＭｅＯＨ（２４０ｍＬ）中の４−メルカプトエチル安息香酸  ８（９．６０ｇ、５２．８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＭｅＯＨ（２４０ｍＬ）に溶解したＤＰＤＳ（２３．２ｇ、１０５．６ｍｍｏｌ、２当量）及びＡｃＯＨ（３ｍＬ、５２．８ｍｍｏｌ、１当量）に、氷浴中で撹拌しながら３時間かけて添加した。その後、反応をＲＴにし、２時間継続した。溶媒を減圧下で除去し、残った油状物をシリカゲルカラムに充填した。副生成物をＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ：Ｅｔ３Ｎ（２００：１０：２）で洗浄し、生成物９（９．８ｇ、６４％）をＥｔＯＡｃ：ＥｔＯＨ：ＡｃＯＨ（２００：２０：１）で溶離した。
【０１０７】
Ｃ）ＭｅＯＨ（２０ｍＬ）中の酸  ９（９．７ｇ、３３．８ｍｍｏｌ）の溶液に、２−（Ｂｏｃ−アミノ）エタンチオール（６ｇ、３３．８ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（５．９ｍＬ、３３．８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をアルゴン下で２４時間、還流で、撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニターした。反応混合物をＲＴに冷却し、濃縮し、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）に再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ3（３×３０ｍＬ）及びブラインで洗浄した。ＥｔＯＡｃ層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濃縮し、真空中で乾燥させて、粗生成物を単離し、さらにシリカゲルカラムによって精製して、生成物２Ａ、重量１１ｇ、収率９１．２％を得た。化合物２Ａ（１１ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（５０ｍＬ）中の４ＭのＨＣｌに０℃で溶解させ、冷却浴を除去し、反応物を２時間ＲＴで撹拌した。２時間後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（９．６：０．４：０．０２５））は、出発材料の存在を示さなかった。全ての揮発性物質を３５℃でロータリーエバポレーターで除去し、次にＥｔ2Ｏ（２×５０ｍＬ）でトリチュレートした。生成物１０（ＨＣｌ塩として）を一晩真空中で乾燥させた、重量９．１ｇ、収率１００％。
【０１０８】
Ｄ）化合物ＤＢＣＯ  ＮＨＳ  １１を文献の手順に従って８つのステップで調製した。
【０１０９】
Ｅ）ＤＢＣＯ  ＮＨＳ  １１（１２．４ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）及びアミン  １０（９．１ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ混合物（４：１、２００ｍＬ）に溶解した。ＤＩＥＡ（１１ｍＬ、６１．６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を２時間Ａｒ下で撹拌した。全ての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をオイルポンプで乾燥させ、生成物をＳｉＯ2カラム上で精製して（溶離：勾配  ＣＨＣｌ3中の１〜３％ＭｅＯＨ）、化合物１２を白色固体として得た、重量１１．７ｇ、収率７０％。
【０１１０】
Ｆ）ＤＢＣＯ  ＳＭＰＴ  １３（最終生成物）：酸  １２（１０．９ｇ、２０ｍｍｏｌ）をＡＣＮ／ＴＨＦ混合物（４：１、１５０ｍＬ）に溶解し、溶液を氷浴で冷却した。ＮＨＳ（２．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ（４ｇ、２１ｍｍｏｌ）を、攪拌反応混合物に連続的に加え、冷却浴を除去し、反応を１６時間ＲＴで続けた。全ての揮発性物質をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をＣＨＣｌ3（２００ｍＬ）に再溶解し、Ｈ2Ｏ（２×５０ｍＬ）及びブライン（５０ｍＬ）で２回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレータ―によって濃縮して、最終生成物ＤＢＣＯ  ＳＭＰＴ（１３）を白色固体として得た、重量１２．５ｇ、収率９７．５％。
【０１１１】
Ｇ）関連化合物が同様の技術を用いて容易に作成され、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：
【０１１２】
【化２８】
0006773677.tif 000029
【化２９】
0006773677.tif 000030
【化３０】
0006773677.tif 000031
【化３１】
0006773677.tif 000032
【０１１３】
実施例３．第ＶＩＩ因子遺伝子を標的とするＲＮＡｉ剤を、非分岐リンカー（ＡＤ０００９６）、メチル分岐リンカー（ＡＤ００９１９）、又はジメチル分岐リンカー（ＡＤ００９２０）にコンジュゲートした。
【０１１４】
【化３２】
0006773677.tif 000033
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【化３３】
0006773677.tif 000034
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【化３４】
0006773677.tif 000035
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１１５】
ＨＰＬＣ分析（図７、９、１０）は、分岐リンカーを使用する場合に、有意に少ない不純物を示した。収率も改善された。
【０１１６】
Ａ）ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成
【０１１７】
【化３５】
0006773677.tif 000036
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１１８】
５′  Ｃ−６アミノ修飾を有する粗ＲＮＡ（２．７ｍｇ、４０２ｎｍｏｌ）を、ＥｔＯＨ中の酢酸ナトリウム（０．５Ｍ）を用いて沈殿させ、凍結乾燥し、４４２μＬの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3、ｐＨ８〜９に溶解させた。ジベンゾシクロオクチン−Ｓ−Ｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ−ＳＳ−ＮＨＳ）エステル（２．３ｍｇ、４０６３．６ｎｍｏｌ）を２２７μＬのＤＭＦに溶解し、ＲＮＡ溶液に添加した。反応混合物を十分に混合し、２時間室温で進行させた。反応をＲＰ−ＨＰＬＣを用いてモニターし、純度を反応完了時に決定した（純度３４．４％）。反応完了後、反応混合物を乾燥させ、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製した。ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを１８％収率（７５ｎｍｏｌ）で調製した。ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの最終純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し（純度：９２．４％）、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって確認した（計算された質量：７１６４．０；観察された質量：７１６５．３）。図７．ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ＮＨＳエステルで調製されたＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＭ００２５３−ＳＳ、１１４１−６６Ｋ＿６）。
【０１１９】
Ｂ）ＤＢＣＯ−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成
【０１２０】
【化３６】
0006773677.tif 000037
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１２１】
ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを、ジスルフィド結合を有さないＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルを用いて同様に調製した。反応完了時に純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した（純度：５４．０％）。ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを６０％収率（２７０ｎｍｏｌ）で調製した。最終純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し（純度：９０．１％）、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって確認した（計算された質量：６９９９．３；観察された質量：６９９８．７）。図８．ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステルで調製されたＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＭ０１７０７−ＳＳ、１１４１−１８Ｋ＿１）。
【０１２２】
Ｃ）ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成
【０１２３】
【化３７】
0006773677.tif 000038
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１２４】
ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを、ジスルフィド結合を安定化するメチル基を有するＤＢＣＯ−ＳＳ−メチル−ＮＨＳエステルを用いて同様に調製した。反応完了時の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した（純度：７４．７％）。ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを５３％収率（１８０８ｎｍｏｌ）で調製した。最終純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し（純度：９６．６％）、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって確認した（計算された質量：７１９１．３；観察された質量：７１９１．７）。図９．ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＮＨＳで調製されたＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＭ０１６３７−ＳＳ、１１４１−１１Ｋ＿５）。
【０１２５】
Ｄ）ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ジメチル−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成
【０１２６】
【化３８】
0006773677.tif 000039
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１２７】
ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを、ジスルフィド結合を安定化する２つのメチル基を有するＤＢＣＯ−ジスルフィド−ジメチル−ＮＨＳエステルを用いて調整した。反応完了時の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した（純度：８０．６％）。ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを６６％収率（２２５９ｎｍｏｌ）で調製した。最終純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し（純度：９６．６％）、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって確認した（計算された質量：７２０５．３；観察された質量：７２０４．９）。図１０．ＤＢＣＯ−ジスルフィド−ジメチル−ＮＨＳで調製されたＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＭ０１６３８−ＳＳ、１１４１−１１Ｋ＿４）。
【０１２８】
Ｅ）ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＳＭＰＴ−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの合成
【０１２９】
【化３９】
0006773677.tif 000040
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１３０】
ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを、ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＳＭＰＴを用いて調製した。反応完了時の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定した（純度：７２．７％）ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを３５％収率（１０５０ｎｍｏｌ）で調製した。最終純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって決定し（純度：９６．６％）、同一性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦによって確認した（計算された質量：７２３８．３；観察された質量：７２３８．３）。図１１．ＤＢＣＯ−ジスルフィド−メチル−ＳＭＰＴで調製されたＲＮＡｉ剤コンジュゲートの反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム（ＡＭ０２４５５−ＳＳ、１１８３−６１Ｋ＿２）。
【０１３１】
【表１】
0006773677.tif 000041
【０１３２】
ジスルフィド結合を安定化すると、ＲＮＡｉ剤コンジュゲートは精製前により高い純度で調製することができ、より高い反応収率を可能にする。
ＬＣは、分岐リンカー（ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートしたＤＢＣＯ）を用いる不純物の減少を示した。
【０１３３】
【化４０】
0006773677.tif 000042
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【化４１】
0006773677.tif 000043
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【化４２】
0006773677.tif 000044
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【化４３】
0006773677.tif 000045
（リン酸基は、ＲＮＡｉ剤又はＲＮＡｉ試薬センス鎖の一部で有り得る。）
【０１３４】
実施例４．アルキン−ジスルフィド−アルキル修飾因子のイン・ビボ有効性
Ａ）以下の配列のＲＮＡｉ剤を、市販の６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（Glen Researchから）を用いて付加されたセンス鎖の５´末端にＣ６アミノリンカーを有する標準的なホスホロアミダイト化学を用いて合成した。
【０１３５】
【表２】
0006773677.tif 000046
【０１３６】
Ｂ）Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート及びｓｅｃ−ブチルアクリレート（ＥＡＢ）のＲＡＦＴコポリマー。酢酸ブチル中のＡＩＢＮ（１．００ｍｇ／ｍＬ）及びＲＡＦＴ剤ＣＰＣＰＡ（１０．０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を調製した。モノマーモル供給量は５５％のＮ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート、４５％のｓｅｃ−ブチルアクリレートであった（ＣＡＳ＃２９９８−０８−５）。理論的Ｍｗは１００，０００であった。
【０１３７】
Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミンアクリレート（０．８９０ｇ、３．４３ｍｍｏｌ）ｓｅｃ−ブチルアクリレート（０．３９１ｍＬ、０．３６０ｇ、２．８１ｍｍｏｌ）ＣＰＣＰＡ溶液（０．３５０ｍＬ、０．０１２５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ溶液（０．３０８ｍＬ、０．００１８８ ｍｍｏｌ）、及び酢酸ブチル（５．３ｍＬ）を、スターラーバーを備えた２０ｍＬガラスバイアルに加えた。バイアルをセプタムキャップ（septa cap）で密閉し、出口としての第２シリンジを有するロングシリンジを用いて１時間、溶液を窒素で通気（bubbled）した。シリンジを除去し、バイアルを８０℃に１６時間、油浴を用いて加熱した。溶液を室温に冷却し、ヘキサン（３５ｍＬ）を溶液に添加する前に、５０ｍＬ遠心管に移した。溶液を２分間４，４００ｒｐｍで遠心分離した。上清層を注意深くデカントし、底部（固体又はゲル状）層をヘキサンですすいだ。次に底部層をＤＣＭ（７ｍＬ）に再溶解し、ヘキサン（４０ｍＬ）で沈殿させ、再度遠心分離した。上清をデカントし、底部層をヘキサンですすいだ後、ポリマーを減圧下で数時間乾燥させた。粗ＥＡＢコポリマーの収率は０．８５６ｇであった。粗ポリマーのサンプルを多角度光散乱（ＭＡＬＳ）のために採取した。乾燥した粗コポリマーをＤＣＭ（１００ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。ヘキサンを曇り点に達する直後まで添加した。得られた乳状溶液を遠心分離した。底部層を抽出し、ヘキサン中に完全に沈殿させた。画分を遠心分離し、その後コポリマーを単離しそして真空下で乾燥させた。ＥＡＢコポリマーの単離された画分の収率は０．４７８ｇであった。分画コポリマーのサンプルを1Ｈ−ＮＭＲ及びＭＡＬＳのために採取した。1Ｈ−ＮＭＲによって決定された組成物は６１％Ｎ−Ｂｏｃ−エトキシエチルアミン及びアクリレート、３９％ｓｅｃ−ブチルアクリレートであった。
【０１３８】
ＭＡＬＳ分析
約１０ｍｇのコポリマーを、０．５ｍＬの７５％ジクロロメタン、２０％テトラヒドロフラン、５％アセトニトリルに溶解した。分子量及び多分散性（ＰＤＩ）を、Jordi 5μ 7.8×300 Mixed Bed LS DVBカラムを使用するShimadzu Prominence HPLCを取り付けたWyatt Heleos II多角度光散乱検出器を用いて測定した。粗ポリマー：ＭＷ：５９，０００（ＰＤＩ  １．３）、分画ポリマー：ＭＷ  ７０，０００（ＰＤＩ：１．１）。
【０１３９】
脱保護／透析
乾燥したサンプルを酢酸中の２ＭのＨＣｌ（〜７ｍｌ）で１時間処理して、ＢＯＣ保護基を除去した。次に反応物を２０ｍＬの水で希釈し、１０〜１５分間撹拌した。次に、高塩、高塩、及び水でそれぞれ１５時間、８時間、及び１５時間、３５００ＭＷ透析チューブを用いて画分を透析した。次に画分を５０ｍＬ遠心管に移し、３日間又は乾燥するまで凍結乾燥した。乾燥サンプルをさらなる研究のために水で２０ｍｇ／ｍＬに調製した。
【０１４０】
ＲＮＡｉ剤−ポリマー製剤
５ｍＭのｐＨ８．０  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のポリアクリレートＥＡＢを、１．５ｗｔ％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化ＰＥＧ4アジド（アジド−ｄＰＥＧ4−ＮＨＳエステル、Quanta Biodesignから）で修飾し、ＲＮＡｉ剤のその後の結合のためのアジド基を提供した。次に、アジド−修飾ポリマーを６０ｍｇ／ｍＬのＨＥＰＥＳ塩基で５ｍｇ／ｍＬに希釈した。この溶液に１５ｍｇ／ｍＬ（３重量当量）のＰＥＧマスキング試薬ＰＥＧ−Ａｌａ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣを添加して、４０〜５０％の利用可能なアミン基を修飾した。１時間後、ＤＢＣＯ−修飾げっ歯類第ＶＩＩ因子ＲＮＡｉ剤（ポリマーに対して０．１２５重量当量）をポリマー溶液に加えた。一晩インキュベーション後、利用可能なアミン基に対してモル過剰のＮ−アセチルガラクトサミン誘導体ＮＡＧ−Ａｌａ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣの添加によってコンジュゲートをさらに修飾し（表２に示される）、３０分間インキュベートした。
【０１４１】
マウス及び注入手順
６〜８週齢の雌ＩＣＲマウスを、Harlan Sprague-Dawley（インディアナポリス、ＩＮ）から入手した。Arrowhead Madison Incの動物実験委員会によって承認された動物使用プロトコルに従って、全てのマウスを取り扱った。げっ歯類を１２時間の明／暗サイクルで、水及び食料（Harlan Teklad Rodent Diet、ハーラン、マディソン、ＷＩ）への自由なアクセスで維持した。送達製剤を、０．２ｍＬ（マウス）の総容量のＨＥＰＥＳ緩衝（５ｍＭ、ｐＨ７．５）等張グルコースで標準的な条件下で尾静脈にボーラスとして注入した。マウスは、０．２５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉ剤にコンジュゲートした２ｍｇ／ｋｇのポリマーを用いて注入された。血清試料を注入後５日、採取した。
【０１４２】
血清ＦＶＩＩ活性測定
血清サンプルを、標準的な手順に従って０．１０９Ｍのクエン酸ナトリウム抗凝血剤（１体積）を含むマイクロ遠心管に、顎下出血により血液を採取することによって調製した。血清中のＦＶＩＩ活性を、製造業者の推奨に従って試験キット（BIOPHEN VII、Aniara、Mason、ＯＨ）を用いて、発色法により測定した。比色展開（colorimetric development）の吸光度を、４０５ｎｍでＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ−２マイクロプレートリーダーを用いて測定した。
【０１４３】
【表３】
0006773677.tif 000047
【図１】
0006773677.tif 000054
【図２】
0006773677.tif 000055
【図３】
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【図４】
0006773677.tif 000057
【図５】
0006773677.tif 000058
【図６】
0006773677.tif 000059
【図７】
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【図８】
0006773677.tif 000061
【図９】
0006773677.tif 000062
【図１０】
0006773677.tif 000063
【図１１】
0006773677.tif 000064
【図１２】
0006773677.tif 000065
【配列表】
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