(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞を培地中で培養することを含む、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、幹細胞エキソソームの作製方法であって、
前記培養は、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記間葉系幹細胞をヒートショックする工程を包含し、
前記無血清培地は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した前記エキソソームを含有する、
ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、幹細胞エキソソームの作製方法。
【請求項２】
前記無血清培地から前記エキソソームを単離することをさらに含み、
任意で、前記単離することは、１または２以上の遠心分離工程によって実行され、かつ任意で、前記１または２以上の遠心分離工程は、１００，０００×ｇまたは１００，０００×ｇより大きい遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに含み、前記エキソソームは室温において保存することができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒートショックする工程に続いて、前記間葉系幹細胞を無血清培地中で、約３６℃から３８℃の温度において、約２４時間から７２時間培養することをさらに含み、及び／又は
前記無血清培地は、動物製品を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ストレス応答分子はＨＳＰ７０を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む、組織修復組成物。
【請求項７】
前記組成物は、増加したレベルのＨＳＰ７０ヒートショックストレス応答分子を包含する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、液体、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、ムース、スプレー、ペースト、粉末、または固形の形態である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
皮膚線維芽細胞の増殖を増やす方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、皮膚線維芽細胞に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは皮膚線維芽細胞の細胞増殖を誘導する、組成物。
【請求項１０】
線維芽細胞の炎症反応を抑制する方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、事前又は同時に１以上の細菌種に暴露した、線維芽細胞に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは炎症反応を抑制する、組成物。
【請求項１１】
ＵＶＢによって誘導される皮膚細胞の炎症に対して保護する方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、皮膚細胞に前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームはＵＶＢによって誘導される炎症を保護する、組成物。
【請求項１２】
軟組織および／または腱のコラーゲン分解を減少または抑制する方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、軟組織および／または腱に前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは軟組織および／または腱のコラーゲン分解の減少または抑制する、組成物。
【請求項１３】
歯根膜線維芽細胞の増殖を増やす方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、歯根膜線維芽細胞に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは歯根膜線維芽細胞の細胞増殖を誘導する、組成物。
【請求項１４】
皮膚線維芽細胞におけるコラーゲンＩ産生を増やす方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、皮膚線維芽細胞に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは皮膚線維芽細胞内で増加したコラーゲンＩ産生を誘導する、組成物。
【請求項１５】
歯根膜線維芽細胞におけるコラーゲンＩ産生を増やす方法に用いる、ヒートショックされた胎盤または脂肪由来の間葉系幹細胞に由来するヒートショックエキソソーム及び薬学的に許容される担体を含む組成物であって、
前記方法は、歯根膜線維芽細胞に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または接触することの１または２以上を含み、
前記ヒートショックエキソソームは歯根膜線維芽細胞内で増加したコラーゲンＩ産生を誘導する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１５年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／１９９，６９６号の利益を主張し、その開示はその全体が参照により本願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、軟組織の修復、歯周組織の修復、および放射線治療の結果として生じるやけどを包含するやけどの修復を包含する使用のための、幹細胞エキソソーム組成物、およびその調製に関する。
【背景技術】
【０００３】
老化およびしわのある皮膚のための既存の治療法は一時的であり、かつ多くの治療法は効果がない、または望ましくない副作用を有する。老化プロセスの間、真皮層中のコラーゲンおよび他の弾性タンパク質の損失のために、皮膚は厚さおよび弾力性を失う。これらの損失は、小じわおよびしわにつながり得る。小じわおよびしわを治療するための一般的な非侵襲的方法には、製剤を局所的に皮膚に塗布することが包含される。製剤は、一般に、αおよびβヒドロキシル酸、レチノイン酸、アルギニン、およびビタミンを含む。これらの製剤のいずれも、完全にしわを除去せず、かつ多くは高価である。さらに、いくつかの製剤は創傷治癒反応を引き起こすために皮膚を刺激するが、これは年齢に関連する欠陥を十分に治療および／または予防するための、薄くなっている皮膚の補給につながらない。
【０００４】
皮膚老化は、コラーゲン合成の減少およびコラーゲン分解の増加によって特徴づけられる。コラーゲンの分解は、メタロプロテイナーゼによって媒介されることが一般的に受け入れられている（１）。真皮コラーゲンの損失は、小じわおよびしわの出現に寄与すると考えられている。創傷治癒におけるコラーゲン産生を刺激する生物学的因子は、老化した皮膚に利益をもたらすと考えられている。結果として、小じわおよびしわの出現を治療する、および／または減少させるためのものといった、皮膚の状態を調節するための製剤は、増殖因子、ペプチド断片、および他の生物学的活性分子を包含し得る。
【０００５】
増殖因子は、典型的には、様々な生物学的効果を有するペプチドである。たとえば、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、および線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を包含するいくつかの増殖因子ファミリーは、創傷治癒および表皮リモデリングに有用であると認定されている。皮膚の状態を調節するための増殖因子の１つの源には、培養された生きた細胞によって分泌されるものが包含される。増殖因子ならびにタンパク質およびペプチドを包含する他の細胞外分子は、それらが培養される栄養培地に分泌される。培養中で細胞に曝露される培地は、「条件培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）」と称される。
【０００６】
増殖因子などの細胞外タンパク質を分泌することに加えて、培養細胞はまた、微小胞またはエキソソームとして知られる細胞外小胞を分泌する。いったん細胞培養においてコンタミネーションしたデブリスと考えられると、エキソソームとも呼ばれるこれらの分泌された微小胞は、タンパク質およびＲＮＡの積み荷（ｃａｒｇｏ）を詰め込まれる。エキソソームは、標的細胞によって取り込まれ得る、機能的ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質分子を含有する。エキソソームの積み荷のプロテオーム解析およびゲノム解析により、細胞型特異的であり、かつ分泌細胞の環境に基づいて異なって制御される、広範囲のシグナル伝達因子が明らかになった［２］。ＨＳＰ７０はエキソソームの積み荷の成分であることが以前に示されている［３，４，５］。エキソソームに含有される遺伝情報は、例えば、標的細胞の活性化、遊走、増殖、分化または脱分化を誘発することによって、またはアポトーシスまたは壊死を促進することによって、標的細胞の運命に影響を及ぼし得るか、または標的細胞の運命を指示することさえできる。このように、エキソソームは、創傷治癒および表皮リモデリングにおける補助のための追加の細胞因子を提供し得る。
【０００７】
幹細胞療法はまた、損傷した組織を修復するための魅力的な手段を代表し、およびこれらの戦略のいくつかは、口腔組織および頭蓋顎顔面骨（ｃｒａｎｉｏｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ  ｂｏｎｅ）の修復のために評価されている［６〜８］。例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、利用しやすく、数多く、かつ十分に特徴づけられた幹細胞の源の代表である。広範囲の研究において、脂肪組織および骨髄に由来する幹細胞を包含している研究によって、歯周組織を再生する幹細胞の能力が調査されている［９，１０］。しかしながら、これらの報告は、歯肉炎および歯周炎における幹細胞に基づく治療法の可能性を裏付けているが、これらのいずれもまだ市販されていない。
【０００８】
骨、軟骨および腱などの組織の修復におけるＭＳＣ誘発性改善の繰り返しの実証にもかかわらず、ＭＳＣ誘発性修復のコンセンサスな機構は依然として捉えにくい。治療力のある幹細胞が、組織損傷の部位に植え付き、かつ分化するという直観的な概念は、開発中のマイクロビーズおよび細胞シートなどの多数のカプセル化および運搬技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏ注入部位で経時的に保持される細胞が少数であることから、よくは支持されていない［１１，１２］。代替的に、ＭＳＣは、宿主部位損傷修復カスケードを誘発する因子を分泌するパラクリン様式を介して組織修復効果を発揮することが示されている［１３〜１５］。歯周靱帯細胞は、幹細胞に由来する条件付けした培地に応答して増殖することも示されている［１６］。さらに、炎症促進性サイトカイン（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）および血小板ライセートなどの環境因子が、ＭＳＣパラクリン因子の組成および存在量の変化を刺激することが示されている［１７，１８］。ＭＳＣパラクリン活性への関心が高まっていることに伴い、ＭＳＣ由来のエキソソームは、研究の比較的新しい標的となっている［１９］。エキソソームが幹細胞の主要なパラクリン活性を発揮するという仮説は、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織修復モデルを通して支持を集めている［２０，２１］。
【０００９】
したがって、歯周組織の修復、および放射線治療の結果生じるやけどを包含するやけどの修復を包含する、軟組織の創傷を修復するためのより有効な製剤の満たされていない要求がいまだ残されている。
【００１０】
本開示の主題は、軟組織の損傷を修復するための、改良されたエキソソーム組成物、ならびにその調製方法および使用を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一実施形態においては、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、幹細胞エキソソームの作製方法を提供し、該方法は、幹細胞を培地中で培養することを含み、該培養は、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含し、該無血清培地は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを含有する。
【００１２】
一実施形態においては、組成物を提供し、該組成物は、ｉ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離された幹細胞エキソソームを含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した前記エキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造される。
【００１３】
一実施形態においては、皮膚の状態を治療するための方法を提供し、該方法は、生体の皮膚上の領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離された幹細胞エキソソームを含む組成物をつけること、埋め込むこと、または充填することの１または２以上を含み、該幹細胞は、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した前記エキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、皮膚の領域の状態は、領域に、組成物をつけること、埋め込むこと、または充填することによって治療される。
【００１４】
一実施形態においては、歯周炎を治療するための方法を提供し、該方法は、生きている動物の口の中の歯肉の領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離された幹細胞エキソソームを含む組成物をつけること、埋め込むこと、または充填することの１または２以上を含み、該幹細胞は、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した前記エキソソームを前記無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、前記歯肉の前記領域上の前記歯周炎は、治療される。
【００１５】
一実施形態においては、軟組織を修復するための方法を提供し、該方法は、生体の軟組織の創傷領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離された幹細胞エキソソームを含む組成物をつけること、埋め込むこと、および充填することの１または２以上を含み、該幹細胞は、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、生体の前記創傷領域は、修復される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本開示の１以上の実施形態にかかる単離されたヒートショックエキソソームの代表的なサンプルのサイズ分布（平均１５２ｎｍ、モード１０７ｎｍ）を示すグラフである。図１の挿入画は、本開示の１以上の実施形態にかかる、単離したヒートショックエキソソームの別個の代表的なサンプルの走査電子顕微鏡画像であり、エキソソーム粒子の大きさおよび形を示している。
【図２】図２は、定量ウエスタンブロットのデータの棒グラフであり、以下の２つの別個のエキソソームの調製物中の、β‐アクチンタンパク質に対する相対的なＨＳＰ７０タンパク質の量を示す：１）３７℃においてヒートショック工程なしで培養した細胞によって分泌されたもの（対照；白地およびハッチングした棒は、別個の調製物を表す）；および２）本実施形態にかかる、４３℃における２時間のヒートショック工程を受けた細胞によって分泌されたもの（ヒートショック；白地およびハッチングした棒は、別個の調製物を表す）。
【図３】図３は、単離したエキソソームとともにインキュベートしたＨＰＡＥ細胞からのフローサイトメトリのデータのヒストグラムのグラフであり、エキソソームに充填した染料が、ＨＰＡＥ細胞へと移動することを示している。ＨＰＡＥ細胞を、染料を充填したエキソソームとともに４℃（もっとも左側のヒストグラム）または３７℃（もっとも右側のヒストグラム）においてインキュベートした。本開示の１以上の実施形態にしたがって、単離したエキソソームを、ヒートショック工程を受けた幹細胞から調製した。
【図４】図４Ａは、無血清培地、さまざまな増殖因子、または本開示の１以上の実施形態にかかるヒートショック工程あり、もしくはなしで培養した細胞から分泌されたエキソソームを用いた、３日間のインキュベーション後の、歯根膜線維芽細胞における細胞増殖の量を示すグラフである。Ｙ軸上に示した値は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。  図４Ｂは、無血清培地、さまざまな増殖因子、または本開示の１以上の実施形態にかかるヒートショック工程あり、もしくはなしで培養した細胞から分泌されたエキソソームを用いた、３日間のインキュベーション後の、皮膚線維芽細胞における細胞増殖の量を示すグラフである。Ｙ軸上に示した値は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）である。
【図５】図５Ａは、対照培地、さまざまな増殖因子、または本開示の１以上の実施形態にかかるヒートショック工程あり、もしくはなしで培養した細胞から分泌されたエキソソームを用いた、４８時間のインキュベーション後の、歯根膜線維芽細胞におけるコラーゲンＩの産生量を示すグラフである。Ｙ軸上に示した値は、コラーゲンのｎｇ／ｍｌである。  図５Ｂは、対照培地、さまざまな増殖因子、または本開示の１以上の実施形態にかかるヒートショック工程あり、もしくはなしで培養した細胞から分泌されたエキソソームを用いた、４８時間のインキュベーション後の、皮膚線維芽細胞におけるコラーゲンＩの産生量を示すグラフである。Ｙ軸上に示した値は、コラーゲンのｎｇ／ｍｌである。
【図６】図６は、以下の処理によって一晩インキュベートした歯根膜線維芽細胞（ＰＤＬＦ）からの炎症性サイトカインＩＬ６の定量ＲＴ−ｑＰＣＲのデータを示すグラフである：本開示の１以上の実施形態にかかる、ＨＫＰＧまたはエキソソームなし（Ｔｘなし）、１０７／ｍｌのＨＫＰＧあり、かつエキソソームなし（エキソソームなし）、または、１０７／ｍｌのＨＫＰＧと、ヒートショック工程を用いた（ヒートショックエキソソーム）、もしくは用いなかった（標準エキソソーム）細胞培養から調製した、脂肪幹細胞由来の単離したエキソソームとの組み合わせ。
【図７】図７Ａは、本開示の１以上の実施形態にかかる、真皮が除去された直径２ｃｍの４つの領域を有するげっ歯類の背側表面を示す画像であり、創傷直後（０日目）に撮影された画像である。  図７Ｂは、本開示の１以上の実施形態にかかる負傷から２週間後（１４日）に撮影された、図７Ａにかかる画像であり、下段の左を、生理食塩水対照によって処理し、かつ残りの３つの非対照の創傷を、ヒートショック工程を用いて培養した（ＨＥＡＴ  ＳＨＯＣＫ）幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理した。  図７Ｃは、本開示の１以上の実施形態にかかる負傷から２週間後（１４日）に撮影された、図７Ａにかかる画像であり、下段の左を、生理食塩水対照によって処理し、かつ残りの３つの非対照の創傷を、ヒートショック工程を用いて培養した幹細胞から分泌され、凍結乾燥され、およびそれから処理のために元に戻された（ＬＹＯ）、単離したエキソソームによって処理した。
【図８】図８は、本開示の１以上の実施形態にかかる、図７Ａおよび図７Ｂに示した動物の、創傷閉鎖の割合に対する、負傷後の日数を示すグラフであり（３つの動物の平均値）、創傷閉鎖の割合は、示した日の創傷の直径を１日目の創傷の直径で割り、１００を掛け、およびそれからこの数字を１００から引くことによって計算した（星―エキソソームによって処理した創傷；点―生理食塩水によって処理した対照の創傷）。
【図９】図９Ａは、本開示の１以上の実施形態にかかる、図７Ｂで示した動物の、対照として生理食塩水によって処理された創傷から取得し、ｋｉ−６７について染色した、組織切片の画像である。  図９Ｂは、本開示の１以上の実施形態にかかる、図７Ｂで示した動物の、ヒートショック工程を用いて培養した幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理された創傷から取得し、ｋｉ−６７について染色した、組織切片の画像である。
【図１０】図１０Ａは、本開示の１以上の実施形態にかかる、図７Ｂで示した動物の、対照として生理食塩水によって処理された創傷から取得し、ＥＶＧによって染色した、組織切片の画像であり、少量のコラーゲンのみが構造的構成を欠いて存在していたことを示す（矢印によって示した；１００倍拡大）。  図１０Ｂは、本開示の１以上の実施形態にかかる、図７Ｂで示した動物の、ヒートショック工程を用いて培養した幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理された創傷から取得し、ＥＶＧによって染色した、組織切片の画像であり、中程度の量のコラーゲンが穏やかな（ｍｉｌｄ）構造的構成で存在していたことを示す（矢印によって示した；１００倍拡大）。
【図１１】図１１は、本開示の１以上の実施形態にかかる、培地対照と比較した（培地のみ）、さまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の非存在下（ＵＶＢなし）における、ヒト成人ケラチノサイトによるＩＬ−８産生の減少を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本開示の１以上の実施形態にかかる、培地対照と比較した（培地のみ）、さまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）における、ヒト成人ケラチノサイトによるＩＬ−８産生の減少を示すグラフである。
【図１３】図１３は、図１１および図１２のグラフのデータを並べた比較を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本開示の１以上の実施形態にかかる、培地対照と比較した（培地のみ）、さまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）および非存在下（ＵＶＢなし）における、ヒト成人ケラチノサイトによるＴＧＦ−αの産生量を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａは、組織化学的に染色された、解剖したラットのアキレス腱の薄切片であり、コラーゲン沈着およびコラーゲン線維の構成を示し、本開示の１以上の実施形態にかかる、図１５Ｂの対側の無傷の対照として役立つ。  図１５Ｂは、本開示の１以上の実施形態にかかる、組織化学的に染色された、解剖したラットのアキレス腱の薄切片であり、腱へのコラゲナーゼ注入から１４日後で、後に続く３日後のビヒクル注入の後の、コラーゲン沈着およびコラーゲン線維の構成を示す。  図１５Ｃは、組織化学的に染色された、解剖したラットのアキレス腱の薄切片であり、コラーゲン沈着およびコラーゲン線維の構成を示し、本開示の１以上の実施形態にかかる、図１５Ｄの対側の無傷の対照として役立つ。  図１５Ｄは、本開示の１以上の実施形態にかかる、組織化学的に染色された、解剖したラットのアキレス腱の薄切片であり、腱へのコラゲナーゼ注入から１４日後で、後に続く３日後のヒートショックエキソソームの注入の後の、コラーゲン沈着およびコラーゲン線維の構成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示の理解を促進する目的で、ここで好ましい実施形態を参照し、および特定の言語を用いてこれを記述する。それにもかかわらず、それによって本開示の範囲を限定することが意図されず、本願に例示される開示の変更およびさらなる改変は、本開示が関係する技術分野における当業者が通常想起すると考えられることが理解される。
【００１８】
皮膚損傷、しわ、ならびに、傷跡、ケロイド、皮膚の変色および皮膚の擦り傷を包含する他の欠陥を治療または予防するといった、皮膚の状態を調節するためのより有効な局所的製剤についての満たされていない要求がある。歯周組織の修復、および放射線治療の結果生じるやけどを包含するやけどの修復を包含する、軟組織の損傷を修復するためのより有効な製剤についての満たされていない要求がいまだ残されている。これらの満たされていない要求を解決するために、本開示の主題は、間葉系幹細胞由来のエキソソーム組成物を包含する、改良された幹細胞に由来するエキソソーム組成物、ならびに皮膚の状態の調節および軟組織の損傷の修復のための、それらの調製方法および使用を提供する。
【００１９】
エキソソームは、幅広い適応症、特に脈管構造が減少した組織または顕著な壊死を有する組織への運搬を必要とする適応症のための魅力的な治療法を代表する。幹細胞と異なり、エキソソームはその効果を発揮するために、酸素を含んだ血液の供給を必要としない。また、エキソソームは直接的に細胞膜に融合するため、治癒を促進する積み荷を受容体を介して取りこむ必要がない。したがって、本願によって提供する方法によって製造した、単離したエキソソームは、皮膚の状態の調節および軟組織の損傷の修復のための、既存の全身治療薬または幹細胞の直接適用に対して利点を有する。
【００２０】
本開示の改良されたエキソソームを含有する組成物は、エキソソームの充填の文脈依存性に基づく。より具体的には、本開示は、増殖性および抗炎症性活性の増加などを包含する、向上した治癒活性を有するエキソソームをもたらすように、エキソソーム充填を操作できることを実証する方法を提供する。本開示の単離したエキソソームは、高度に制御された環境において幹細胞培養から調製され、また、エキソソームの積み荷を操作するために、さまざまな刺激が幹細胞培養へと運搬される。治癒促進活性のために操作されたエキソソームを提供する一例においては、幹細胞培養を高温にさらすことによって（さもなければ「ヒートショック」としても知られる）、ストレス応答タンパク質、ＨＳＰ７０を包含する、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを製造する。ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームは、げっ歯類において向上した治癒活性を有し得ること、および、細胞培養において、増加した増殖活性および抗炎症活性を有し得ることが、本願において実証される。
【００２１】
用語「エキソソーム」、「微小胞」、「分泌された微小胞」「細胞外小胞」、および「分泌された小胞」は、本願において、明細書および請求項のために、たがいに交換可能に用いられる。
【００２２】
用語「凍結乾燥」（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）および「凍結乾燥」（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は、本願において、明細書および請求項のために、たがいに交換可能に用いられる。
【００２３】
用語「ストレス応答分子」および「ヒートショックストレス応答分子」は、本願において、明細書および請求項のために、たがいに交換可能に用いられる。これらの用語は、高温にさらされた（さもなければ「ヒートショック」としても知られる）培養幹細胞によって分泌されたエキソソーム内に存在する分子を包含することを意味している。同様に、用語「エキソソーム」および「ヒートショックエキソソーム」および「ヒートショックされたエキソソーム」は、高温にさらされた（さもなければ「ヒートショック」としても知られる）培養幹細胞によって分泌されたエキソソームを表すために、本願において、明細書および請求項のために、たがいに交換可能に用いられる。
【００２４】
本願で用いられる場合、請求項を包含して、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、「１つ以上」を指す。
【００２５】
本明細書および請求項を通して、用語「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）、および「含んでいる」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）は、文脈が他の点で必要とする場合を除いて、非排他的な意味である。同じように、用語「包含する」（ｉｎｃｌｕｄｅ）およびその文法的変形は、非限定的であることを意図している。
【００２６】
本明細書および請求項のために、用語「約」は、１以上の数字または数値範囲に関連して使用される場合、範囲内のすべての数値を包含し、および設定された数値の上と下の境界を拡張することによってその範囲を改変する、すべてのそのような数値を表すことを理解されたい。端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包括されるすべての数、例えば、その分数を含む整数全体を含む。例えば、約４１から約４３の列挙は、４１、４２、および４３、ならびにそれらの分数、例えば、４０．５、４０．６、４０．７、４０．８、４０．９、４１．５、４２．２５、４２．５、４３．１、４３．２、４３．３、４３．４、４３．５などを包含するが、これらに限定されず、ならびに、約１から約３の列挙は、１、２、および３、ならびにそれらの分数、例えば、０．６、０．７、０．８、０．９、１．５、２．２５、３．５など、およびその範囲の中の任意の範囲を包含するが、これらに限定されない。
【００２７】
本開示の一実施形態においては、組成物を提供し、該組成物は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、有効量の単離したエキソソームを含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造される。組成物は、さらに担体を含むことができる。担体は、薬学的に許容される担体であり得る。
【００２８】
組成物は、液体、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、ムース、スプレー、ペースト、粉末、または固形の形態であり得る。
【００２９】
組成物中において、エキソソームを単離することは、１または２以上の遠心分離工程によって実行することができる。１または２以上の遠心分離工程は、１００，０００×ｇ以上の遠心分離を包含することができる。組成物中において、エキソソームを単離することは、単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに包含することができる。組成物中において、プロセスは、ヒートショックする工程に続いて、幹細胞を無血清培地中で、約３６℃から３８℃の温度において、約２４時間から約７２時間培養することを、さらに含むことができる。無血清培地は、動物製品を含まなくてもよい。幹細胞は、間葉系幹細胞であり得る。間葉系幹細胞は、胎盤または脂肪に由来し得る。ストレス応答分子は、ＨＳＰ７０を包含することができる。
【００３０】
一実施形態においては、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、幹細胞エキソソームの作製方法を提供し、該方法は、幹細胞を培地中で培養することを含み、該培養は、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含し、また、無血清培地は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、エキソソームを含有する。
【００３１】
方法は、無血清培地からエキソソームを単離することをさらに含むことができる。該単離は、１または２以上の遠心分離工程によって実行することができる。１または２以上の遠心分離工程は、１００，０００×ｇ、またはそれより大きい遠心分離を包含することができる。
【００３２】
方法は、エキソソームを室温で保存できるよう、単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに含むことができる。
【００３３】
方法は、ヒートショック工程に続いて、無血清培地中で、約３６℃から３８℃の温度において、約２４時間から約７２時間、幹細胞を培養することを、さらに含むことができる。
【００３４】
方法において、無血清培地は、動物製品を含まなくてもよい。幹細胞は、間葉系幹細胞であり得る。間葉系幹細胞は、胎盤または脂肪に由来し得る。ストレス応答分子は、ＨＳＰ７０を包含することができる。
【００３５】
本開示の方法にしたがって製造された、単離したエキソソームの大きさおよび形の特徴づけを、実施例３に記載し、かつ結果を図１のグラフに示す。図１は、平均１５２ｎｍ、モード１０７ｎｍである、単離したエキソソームの代表的なサンプルのサイズ分布を示す。本開示の１以上の実施形態にかかる、他の単離したエキソソームの調製物からの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）の顕微鏡写真を、図１の挿入画に示す。
【００３６】
実施例４においては、本開示の方法にしたがって製造された、単離したエキソソームの、Ｈｓｐ７０を包含する特異的なタンパク質マーカーについての分析を記載する。得られたデータを図２に示す。図２は、３７℃において、ヒートショック工程なしで培養された幹細胞から分泌されたエキソソーム（対照）、および４３℃における２時間のヒートショック工程にさらされた同じ幹細胞からのエキソソーム中（ヒートショック）の、β‐アクチンに対する相対的なＨＳＰ７０タンパク質の量を示す、定量ウエスタンブロットのデータの棒グラフである。図２のデータは、ヒートショック工程なしで培養した細胞からのエキソソームと比較した、ヒートショックされた細胞からのエキソソーム中における、β‐アクチンに対する相対的なエキソソーム中のＨＳＰ７０の有意なアップレギュレーションを示す。
【００３７】
本開示の方法にしたがって調製した単離したエキソソームの、積み荷を細胞へと運搬する能力を、単離したエキソソームの脂溶性染料を培養中の細胞へと移動させる能力をモニタリングすることによって査定した。実験を実施例５に記載し、かつ結果を図３に示した。結果は、単離したエキソソームからヒト肺動脈内皮（ＨＰＡＥ）細胞へ、染料が効率的に移動し、７５％の細胞が標識されたことを示す。
【００３８】
本開示の方法にしたがって製造された単離したエキソソームの、歯周および表皮細胞に対する効果を、実施例６に記載する。図４Ａおよび４Ｂは、ヒートショックされた細胞から単離したエキソソームによる処理は、歯根膜線維芽細胞（ＰＤＬＦ）および皮膚繊維芽細胞（ＤＦ）の両方の増殖を、ヒートショック工程にさらされなかった細胞から調製された単離したエキソソームと比較して、有意に増加させたことを示す。さらに、ヒートショックされた細胞から単離したエキソソームによって誘導された、ＰＤＬＦおよびＤＦの増殖のレベルは、完全培地および個々の増殖因子によって誘導されたレベルに、近づき、または超えた。
【００３９】
皮膚の老化に関連したコラーゲン線維および細胞外マトリックスの分解、ならびにそれらの創傷修復との関係性に加えて、歯周病は、細胞外マトリックスの分解およびコラーゲン線維の分解に関連する。実施例６に記載した追加の実験は、本開示の方法にしたがってヒートショックされた細胞から調製された単離したエキソソームは、ＰＤＬＦおよびＤＦにおけるコラーゲンＩ合成を誘導することを実証する。図５Ａおよび５Ｂのグラフは、ヒートショックされた細胞からの単離したエキソソームによる処理が、ヒートショック工程にさらされなかった細胞から調製された単離したエキソソームと比較して、ＰＤＬＦおよびＤＦの両方におけるコラーゲンＩ産生を増加させたことを示す。さらに、ヒートショックされた細胞から単離したエキソソームによって誘導された、ＰＤＬＦおよびＤＦのコラーゲンＩ産生の増加は、個々の増殖因子による増加を超えた。これらのデータは、単離したエキソソームは、皮膚の状態の調節および軟組織の損傷の修復において役割を担うことができることを示す。
【００４０】
Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、口腔軟組織細胞に対し致命的なさまざまな毒素を分泌することによって、歯周炎の発病に寄与することが知られている細菌種の１つである。以前の報告は、Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓライセートに対する応答として、歯肉ケラチノサイト（ＧＫ）およびＰＤＬＦにおいて、炎症性分子ＩＬ６およびＩＬ８を包含する、炎症カスケードが誘導されることを示す［２２〜２４］。実施例７に記載した実験においては、ＰＤＬＦ細胞を、熱で殺して凍結乾燥されたＰ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＨＫＰＧ，１０７／ｍｌ）、および本開示の方法にしたがってヒートショックした細胞培養からの培地から単離したエキソソームに、同時に曝露した。結果は、熱で殺したＰ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＨＫＰＧ）、１×１０７／ｍｌによって誘導したＨＰＬＦ細胞における、ＩＬ−６遺伝子発現の統計的に有意な上昇を示す。この上昇は、単離された標準的なエキソソームによって有意に減少し、また、ヒートショック工程を用いて培養した細胞から分泌された、単離したエキソソームによって、よりいっそう減少した。これらのデータは、本開示の単離したヒートショックエキソソームは、単球を炎症部位へと動員するために局所的に働くＩＬ６を包含する、炎症性サイトカインの産生を阻害できることを示す。
【００４１】
実施例８は、本開示の方法にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームが、げっ歯類における皮膚の創傷治癒を改善することを示す実験について記載する。図７Ａから７Ｃまでは、４つの別個の創傷を有するげっ歯類の背側表面の画像であり、本開示のエキソソーム組成物によって、治癒の率の増加がもたらされたことを示す。げっ歯類の画像は、創傷直後（図７Ａ）および創傷後２週間（図７Ｂ〜７Ｃ）に撮影した。それぞれの画像の下段の左は、生理食塩水によって処理した。図７Ｂに示した画像においては、残りの３つの非対照の創傷を、本開示にかかる方法にしたがって、ヒートショック工程を用いて培養された幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理した。図７Ｃに示した画像においては、残りの３つの非対照の創傷を、幹細胞から単離され、凍結乾燥され、その後、処理のために元に戻されたエキソソームによって処理した。２週間後に撮影された画像は、対照、およびエキソソームによって処理した創傷の両方が実質的に治癒されるものの、本開示の方法にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離されたヒートショックエキソソームによって処理された創傷は、実質的により速く治癒したことを示す。図８は、図７Ａおよび図７Ｂで示した動物についての、創傷閉鎖の割合に対する、負傷後の日数を示すグラフである。図８において、星によって明示した線は、エキソソーム処理した創傷を示し、それらは処理後１９日の時間経過の終了時において完全に閉じており、また、生理食塩水によって処理された対照創傷を、点線によって示した。対照の創傷は、時間経過の終了時において開いたままであり、約２５％の創傷の表面領域が残っていた。
【００４２】
さらに、切片を図７Ｂに示した動物から取得し、かつ細胞増殖および創傷治癒に関与することが知られているマーカーについて、組織学的に染色した。具体的には、細胞増殖を示すタンパク質であるｋｉ−６７について、切片を組織化学的に染色した。結果を、図９Ａ（対照１）および図９Ｂ（試験１）に示した。図９Ａに示した切片は、対照として生理食塩水によって処理した創傷から取得し、かつ図９Ｂから取得された切片は、本願に記載したヒートショック処理を用いて培養した幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理した創傷から取得した。図９Ｂで示した切片は、図９Ａで示した生理食塩水対照と比較して、より暗かった。このｋｉ−６７タンパク質のより暗い染色は、対照よりも、ヒートショックエキソソームによって処理した創傷において、細胞がより増殖していることを示す。増殖の増加は、創傷治癒の鍵であり、これは、エキソソーム処理した創傷において閉鎖の時間が減少したことの一つの可能性のある説明である。
【００４３】
ｋｉ−６７タンパク質について染色された切片に加えて、図７Ｂで示した動物から取得された切片についてもまた、コラーゲン沈着および構成について、ＥＶＧによって染色することによって分析し、結果を図１０Ａ（対照）および図１０Ｂ（試験）において示した。生理食塩水の対照から取得された図１０Ａに示した切片は、ＥＶＧによる弱い染色を示し、少量のコラーゲンのみが構造的構成を欠いて存在していたことを示す（矢印によって示した）。対照的に、ヒートショックエキソソーム処理された創傷から取得された図１０Ｂに示した切片は、ＥＶＧによるコラーゲン束の染色の増加を示し、このことは、中程度の量のコラーゲンが穏やかな（ｍｉｌｄ）構造的構成で存在することを明らかにしている（矢印によって示した）。ヒートショックエキソソーム処理された皮膚の創傷における、より大きいコラーゲン沈着および構成は、改善された、及びより速い治癒を示す。これらのデータは、創傷がヒートショックエキソソームで処理されたサンプルにおいてより迅速に閉じるという巨視的な観察を支持し、かつ治癒の改善のための可能性のある分子的機構を示す。
【００４４】
実施例９は、本開示にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームの、ヒト成人ケラチノサイトにおけるＵＶＢ照射に対する保護効果について記載する。この研究では、ヒートショックエキソソームを含有する培地とともにケラチノサイトを１時間インキュベートし、かつ次にケラチノサイトを４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射に曝露した。対照細胞は、ＵＶＢ曝露を除いて、同じプロトコールを経た。ヒートショックエキソソームの効果を、細胞によるＩＬ−８およびＴＮＦ−αの産生の減少を測定することによって査定し、および結果を、図１１、図１２、図１３、および図１４に示した。具体的には、図１１は、培地対照と比較した、さまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の非存在下（ＵＶＢなし）における、ヒト成人ケラチノサイトによる、ＩＬ−８産生の減少を示すグラフである。結果は、試験されたすべての濃度のヒートショックエキソソームが、ＩＬ−８の産生を減少させたことを示す。さらに、８．２３Ｅ＋０５の濃度のヒートショックエキソソームは、ＩＬ−８産生を有意に減少させた。
【００４５】
図１２は、ヒト成人ケラチノサイトによる、培地対照と比較してさまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）の存在下における、ＩＬ−８産生の減少を示すグラフである。結果はＵＶＢの非存在下における実験と同様であり、試験したすべての濃度のヒートショックエキソソームは、２．００Ｅ＋０８の例外を除き、ＩＬ−８の産生を減少させた。
【００４６】
図１３は、図１１および図１２のグラフのデータを並べた比較を示すグラフである。比較は、ＵＶＢ（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）および非−ＵＶＢ（ＵＶＢなし）に曝露したサンプルの両方が、同じ傾向に従うことを示す。ＵＶＢ曝露された細胞における、１ｍＬあたり８．２３Ｅ＋０５、２．４７Ｅ＋０６、７．４１Ｅ＋０６、および２．２２Ｅ＋０７のエキソソーム濃度は、ＵＶＢなしの培地対照中の細胞と比較して、有意差につながらなかった。これらの結果は、ＵＶＢによって誘導された炎症によるヒートショックエキソソームの保護効果を実証する。
【００４７】
図１４は、培地のみの対照（培地のみ）と比較した、ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）および非存在下（ＵＶＢなし）における、さまざまな濃度のヒートショックエキソソームの存在下において製造された、ＴＮＦ−αの量を示しているグラフである。データは、ＵＶＢに曝露されたサンプルにおけるＴＮＦ−α放出が、ＩＬ−８について観察されたものと同じ傾向にしたがい、１ｍＬあたり２．２２Ｅ＋０７の濃度におけるヒートショックエキソソームによる、ＴＮＦ−αの最大減少が約３倍であることを示していた。ＴＮＦ−αの値は、アッセイ限界の下限にあり、これがＵＶＢなしのサンプルの大部分においてデータが見られなかった理由である。
【００４８】
まとめると、結果は、１ｍＬあたり８．２３Ｅ＋０５、２．４７Ｅ＋０６、７．４１Ｅ＋０６、および２．２２Ｅ＋０７のエキソソームのヒートショックエキソソーム濃度によって処理した、ＵＶＢ曝露された細胞からのＩＬ−８放出は、ＵＶＢなしの培地対照と比較して有意差を示さなかったことを示し、このことは、ＵＶＢによって誘導された炎症に対する、ヒートショックエキソソームの保護効果を示す。さらに、１ｍＬあたり８．２３＋Ｅ０５エキソソームの濃度のヒートショックエキソソームによって処理した細胞からのＩＬ−８放出は、ＵＶＢ照射の非存在下において、ＵＶＢなしの培地対照と比較して、有意に減少した。さらに言えば、ヒートショックエキソソームによって処理した細胞からのＴＮＦ−α放出は、３倍も減少した。上記の結果は、ＵＶＢによって誘導された炎症に対するヒートショックエキソソームの保護効果を実証する。
【００４９】
実施例１０は、腱治癒のげっ歯類モデルにおける、本開示にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームの軟組織治癒活性について記載する。具体的には、右のアキレス腱にコラゲナーゼを注入することによって腱の負傷を誘導し、および左の腱は無傷のまま残した。負傷から３日後、エキソソームまたはビヒクル対照を、負傷部位へと注入した。負傷から１４日後、アキレス腱を取り除き、およびコラーゲン含量およびコラーゲン束の配向について、染色した。図１５Ｂは、対側の無傷の対照の腱と比較した（図１５Ａ）、エキソソームの非存在下における、コラゲナーゼ処理の効果を示す。図１５Ｂの、暗く、かつ溝をつけた染色によって示すように、コラゲナーゼは、深刻なコラーゲン分解および配向されたコラーゲン束の損失を誘導する。コラゲナーゼを注入した腱のエキソソーム処理は（図１５Ｄ）、対側の無傷の対照の腱から（図１５Ｃ）、コラーゲン含量またはコラーゲン線維配向において、有意差を示さない。これらのデータは、誘導された腱の負傷の後、ＭＳＣ由来の単離されたヒートショックエキソソームが、コラーゲン分解を大きく減少または阻害し、および／または軟組織および腱の治癒を促進することを示す。
【００５０】
一実施形態においては、歯周炎を治療するための方法を提供し、該方法は、生きている動物の口の中の歯肉の領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離した幹細胞エキソソームを含む組成物を、つけること、埋め込むこと、または充填することの１または２以上を含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、歯肉の領域上の歯周炎が治療される。組成物は、さらに担体を含み得る。担体は、薬学的に許容される担体であり得る。
【００５１】
一実施形態においては、生体の軟組織を修復するための方法を提供し、該方法は、生体の軟組織の創傷領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離した幹細胞エキソソームを含む組成物を、つけること、埋め込むこと、または充填することの１つを含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックすることを包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、生体の創傷領域が修復される。組成物は、さらに担体を含み得る。担体は、薬学的に許容される担体であり得る。
【００５２】
一実施形態においては、皮膚の状態を治療する方法を提供し、該方法は、生体の皮膚上の領域に、本開示の組成物を、つけること、埋め込むこと、または充填することの１または２以上を含み、該組成物は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、有効量の単離したエキソソームを含み、皮膚の状態が治療される。
【００５３】
一実施形態において、皮膚の状態を治療するための方法を提供し、該方法は、生体の皮膚上の領域に、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離された幹細胞エキソソームを含む組成物をつけること、埋め込むこと、または充填することの１または２以上を含み、該幹細胞は、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記幹細胞をヒートショックする工程を包含する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した前記エキソソームを前記無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造され、前記皮膚の前記領域の前記状態は、前記領域に、前記組成物をつけること、埋め込むこと、または充填することによって治療される。組成物は、さらに担体を含み得る。担体は、薬学的に許容される担体であり得る。
【００５４】
皮膚の状態は、たとえば、創傷、やけど、放射線治療の結果として生じるやけど、変色、擦り傷、およびケロイドの１または２以上を包含することができる。
【００５５】
組成物は、液体、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、ムース、スプレー、ペースト、粉末、または固形の形態であり得る。
【００５６】
組成物中において、エキソソームを単離することは、１または２以上の遠心分離工程によって実行することができる。１または２以上の遠心分離工程は、１００，０００×ｇまたは１００，０００×ｇより大きい遠心分離を包含することができる。組成物中において、エキソソームを単離することは、単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに包含することができる。組成物中において、プロセスは、ヒートショックする工程に続いて、幹細胞を無血清培地中で、約３６℃から３８℃の温度において、約２４時間から約７２時間培養することを、さらに含むことができる。無血清培地は、動物製品を含まなくてもよい。幹細胞は、間葉系幹細胞であり得る。間葉系幹細胞は、胎盤または脂肪に由来し得る。
【００５７】
一実施形態においては、皮膚の状態を調節するための局所的組成物を提供し、該組成物は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、有効量の単離したエキソソーム、および担体を含む。
【００５８】
一実施形態においては、皮膚の状態を調節するための局所用組成物を提供し、該組成物は、ｉ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、有効量の単離したエキソソーム、およびｉｉ）担体を含み、単離したエキソソームは、無血清培地中において、約４１℃から約４３℃の温度における約１時間から約３時間の幹細胞のヒートショックを包含する条件下において、幹細胞を培養することによって条件付けした無血清培地から単離する。
【００５９】
一実施形態においては、皮膚の状態を調節するための局所的組成物の作製方法を提供し、該方法は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した単離したエキソソームを、担体と組み合わせることを含み、該単離したエキソソームは、無血清培地中において、約４１℃から約４３℃の温度における約１時間から約３時間の幹細胞のヒートショックを包含する条件下において、幹細胞を培養することによって条件付けした無血清培地から単離する。
【００６０】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物は、液体、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、ムース、スプレー、ペースト、粉末、または固形の形態であり得る。
【００６１】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物において、皮膚の状態を調節することは、細胞の再生による皮膚の完全性の増加を誘導すること；皮膚の含水量または水分を向上すること；経皮の水分損失、皮膚のはく離、および落屑を減少させること；皮膚の厚さを改善すること；皮膚の引っ張り特性を向上すること；真皮の小じわおよびしわの出現を減少させること；皮膚の質感を改善すること；毛穴の大きさを減少させること；皮膚の滑らかさを向上すること；皮膚のしみを改善すること；皮膚の色調を改善すること；または傷跡および皮膚の擦り傷の外観を改善することの１または２以上を包含することができる。
【００６２】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物において、該組成物は、約０．１％から約２０％の保湿剤をさらに含むことができる。保湿剤は、１または２以上の、パンテノール、パントテン酸誘導体、グリセリン、グリセロール、ジメチコン、ワセリン、ヒアルロン酸、またはセラミド、およびそれらの混合物をさらに包含することができる。
【００６３】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物において、該組成物はビタミンＢ３化合物をさらに含むことができる。ビタミンＢ３化合物は、ニコチン酸トコフェロールを包含することができる。
【００６４】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物において、組成物は、抗酸化剤をさらに含むことができる。抗酸化剤は、トコフェロールまたはトコフェロールのエステルの、１つまたは組み合わせを包含することができる。
【００６５】
皮膚の状態を調節するために提供された組成物において、単離したエキソソームは、凍結乾燥されていてもよい。
【００６６】
一実施形態においては、ヒトの皮膚の状態を調節する方法を提供し、該方法は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離したエキソソームを含む、本開示にかかる局所用組成物を、少なくとも７日間にわたって少なくとも１日１回ヒトの皮膚へ適用することを含む。一実施形態においては、ヒトの皮膚の状態を調節する方法を提供し、該方法は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離したエキソソームを含む、本開示にかかる局所用組成物を、少なくとも７日間にわたって少なくとも１日１回、ヒトの皮膚へ適用することを含む。該方法は、本開示にかかる局所用組成物を、少なくとも４０日間にわたって少なくとも１日２回、ヒトの皮膚へ適用することを、さらに含むことができる。
【００６７】
一実施形態においては、皮膚または毛髪の状態を調整するためのコーティング組成物を提供し、該コーティング組成物は、ｉ）ヒートショックストレス応答分子のレベルの増加した、単離したエキソソーム；およびｉｉ）担体を含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で前記幹細胞をヒートショックする工程を包含し、無血清培地は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを含有する、培養すること；および（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること、を含むプロセスによって製造される。
【００６８】
本開示の皮膚または毛髪の状態を調整するためのコーティング組成物において、単離した幹細胞エキソソームの製造方法は、単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに含むことができる。
【００６９】
本開示の皮膚または毛髪の状態を調整するためのコーティング組成物において、単離した幹細胞エキソソームの製造方法は、単離したエキソソームを凍結乾燥することをさらに含むことができ、かつ担体は乾燥した粉末であり得る。
【００７０】
本開示の皮膚または毛髪の状態を調整するためのコーティング組成物は、手袋の内側に適用される、乾燥した粉末状のコーティシング組成物であり得る。
【００７１】
本開示の皮膚または毛髪の状態を調整するためのコーティング組成物は、液体、ローション、クリーム、ゲル、フォーム、ムース、スプレー、ペースト、粉末、または固形の形態であり得る。
【００７２】
一実施形態においては、皮膚を調整するための手袋を提供し、該手袋は内側にコーティング組成物を有し、該コーティング組成物は：ｉ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離した幹細胞エキソソーム；およびｉｉ）粉末状の担体を含み、幹細胞エキソソームは、（ａ）幹細胞を培地中で培養することであって、該培養が、培養温度を約４１℃から約４３℃に上昇させることによって、約１時間から約３時間、無血清培地中で幹細胞をヒートショックする工程を包含し、無血清培地は、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを含有する、培養すること；（ｂ）ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを無血清培地から単離すること；および（ｃ）単離したエキソソームを凍結乾燥すること、を含むプロセスによって製造される。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための当業者に指針を提供するために包含されている。本開示および当該技術分野の一般的なレベルに照らして、以下の実施例は例示に過ぎないことを意図されており、かつ多くの変更、改変、および部分的変更が、本開示の主題の範囲を逸脱することなく使用できることを理解することができる。
【００７４】
＜実施例１  ヒートショックを用いた、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームの調製＞
以下の実施例においては、向上した増殖活性および抗炎症性活性を提供するための、ストレス応答分子のレベルが増加した、単離したエキソソームの製造について記載する。
【００７５】
以下のように、間葉系幹細胞（胎盤または脂肪由来）を、中空糸カートリッジバイオリアクタ（Ｆｉｂｅｒｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内で培養することにより、ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加したエキソソームを製造した。播種に先立って、バイオリアクタを、完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する１０％ＦＢＳ）によって、２４時間、３７℃において、加湿した、５％ＣＯ２を含有する空気中で、条件付けした。バイオリアクタに、３００×１０６の間葉系幹細胞（胎盤または脂肪由来）を播種し、かつ３７℃において、加湿した、５％ＣＯ２を含有する空気中で維持した。エキソソームの収穫をはじめる前に、２週間細胞を増殖させた。エキソソームを含有する培地の収穫に先立って、バイオリアクタを、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で５回洗浄することによって、ウシのエキソソームを取り除いた。洗浄後、細胞を以下のようにヒートショック工程にさらした。バイオリアクタ中の培地を、４１℃に温めた無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地によって置換し、かつバイオリアクタを、４１℃の、加湿した、５％ＣＯ２を含有する空気中に、１時間置いた。次に、４１℃の培地を、３７℃に温めた同じ培地によって置換し、かつバイオリアクタを、３７℃の、加湿した、５％ＣＯ２を含有する空気中に、４８時間置いた。４８時間のインキュベーションの後、条件付けした無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を回収し、かついくつかの例においては、将来の処理のために、−８０℃において保存した。
【００７６】
ヒートショックストレス応答分子のレベルが増加した、単離したエキソソームの別個の調製物においては、いくつかの調製物においてヒートショック工程において用いた培地の温度が約４２℃であり、および他の調製物では約４３℃であり、ならびに、ヒートショックの時間は、約１時間という短時間から、約３時間という長時間までの範囲であったことを除き、上述したものと同じ手順に従った。
【００７７】
上述した条件付けした培地を、解凍した後、または新たに収集した後、条件付けした培地から、室温での３０００×ｇにおける２０分間の培地の遠心分離によって、細胞デブリスをペレット化し（５０、２５０、または５００ｍＬのスクリューキャップ管中で）、エキソソームを単離した。澄んだ上清を収集し、かつ１００，０００×ｇ（平均ＲＣＦ）において２時間、４℃において遠心分離した。上清を吸引し、かつペレットを最小容量のＤＰＢＳ（３００μＬ〜１０００μＬ）に再懸濁した。製造業者の使用説明書にしたがって、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴＨＥＲＭＯ  ＦＩＳＨＥＲ，Ｃｏｒｐ）分光光度計を用いて、タンパク質およびＲＮＡ濃度を見積もった。１ｍＬあたりの粒子（エキソソーム）の数、および粒子（エキソソーム）の大きさを、ｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｔｄ）を用いて、製造業者の使用説明書にしたがって、決定した。単離したエキソソームを１．５ｍＬのスクリューキャップチューブに、適当な容量で等分した。
【００７８】
上述した単離したエキソソームは、−８０℃において保存することができ、かつ次いで、検出可能な活性の低下なしに、使用するために後日解凍することができることが発見された。単離したエキソソームは、凍結乾燥することができ、かつ室温において検出可能な活性の低下なしに保存できることもまた発見された。
【００７９】
＜実施例２  培地添加を用いた、増殖活性および抗炎症性活性が向上したエキソソームの調製＞
以下の実験において、増加した増殖活性および抗炎症性活性を有する単離したエキソソームの製造について記載する。
【００８０】
間葉系幹細胞（胎盤または脂肪由来）を、以下の例外を除いて実施例１において記載した手順にしたがってバイオリアクタ内で培養することによって、増加した増殖性および抗炎症性活性を有する単離したエキソソームを製造する。２週間の細胞増殖の後、バイオリアクタを無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で複数回洗浄することによって、ウシのエキソソームを取り除いた。洗浄後、バイオリアクタ内の培地を、血小板ライセート、ヒト血小板ライセート、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β１、または炎症促進性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの、１つまたは組み合わせを補足した、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地によって置換し、およびバイオリアクタを、３７℃の、加湿した、５％ＣＯ２を含有する空気中に４８時間置いた。４８時間のインキュベーションの後、条件付けした、無血清の、補足されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を回収し、いくつかの例においては、将来の処理のために−８０℃で保存した。
【００８１】
上述した条件付けした培地を、解凍した後、または新たに収集した後、エキソソームを条件付けした培地から単離し、および実施例１で記載したように、将来の使用のために保存した。
【００８２】
＜実施例３  ヒートショックした単離されたエキソソームの大きさの特徴づけ＞
実施例１にしたがって製造した、単離したエキソソームを、以下の実験において記載したように特徴づけした。
【００８３】
実施例１にしたがって製造された、幹細胞由来のエキソソームの大きさを決定するために、単離したエキソソームを、ＱＮＡＮＯ（ＩＺＯＮ  ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｌｔｄ）を用いて、製造業者の使用説明書にしたがって分析した。図１のグラフは、平均１５２ｎｍ、およびモード１０７ｎｍである、代表的なサンプルの得られたサイズ分布を示す。別個のエキソソーム調製物から得た、エキソソームのサンプルを、走査電子顕微鏡（Ｍａｒｂｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって分析することによって、エキソソーム粒子の相対的な大きさおよび形を決定した。取りつけ用スタッドの上で乾燥し、白金で被覆することによって、ＳＥＭのためにエキソソームを調製し、およびＳＥＭによって可視化した（図１の挿入画参照）。ＳＥＭによって計算された、得られた粒子の大きさは、ＱＮＡＮＯによって決定された大きさよりも大きかったが、この差異は、エキソソーム調製物中の有意な大きさの違いというよりも、ＳＥＭ調製および乾燥の所産によるものであろう。
【００８４】
＜実施例４  単離されたヒートショックエキソソームにおいてＨＳＰ７０はアップレギュレートされる＞
特徴づけのプロセスの一部として、実施例１にしたがって調製されたエキソソームを、ウエスタンブロット分析によって、ＣＤ６３、Ｈｓｐ７０、およびＴＳＧ１０１を包含する特定のマーカーについて分析した。具体的には、両方とも通常の培養温度（３７℃）（すなわち、ヒートショック工程なし）における細胞によって製造されたエキソソーム、および実施例１にかかる４３℃における、２時間の培養することを包含する培養条件における細胞によって製造されたエキソソームを、ウエスタンブロット分析によって調査した。図２は、定量ウエスタンブロットのデータの棒グラフであり、以下の２つの別個のエキソソームの調製物中の、β−アクチンタンパク質に対する相対的なＨＳＰ７０タンパク質の量を示す：１）３７℃においてヒートショック工程なしで培養した細胞によって分泌されたもの（コントロール；白地およびハッチングした棒は、別個の調製物を表す）；および２）実施例１に記載したように、４３℃における２時間のヒートショック工程を受けた細胞によって分泌されたもの（ヒートショック；白地およびハッチングした棒は、別個の調製物を表す）。図２のデータは、ヒートショック工程なしで培養した細胞からのエキソソームと比較した、ヒートショックエキソソーム中における、β−アクチンに対する相対的なエキソソーム中のＨＳＰ７０の有意なアップレギュレーションを示す。
【００８５】
＜実施例５  単離されたヒートショックエキソソームからＨＰＡＥ細胞への染料の移動＞
実施例１にしたがって調製した単離したエキソソームの、積み荷を細胞へと運搬する能力を、単離したエキソソームの脂溶性染料を培養中の細胞へと移動させる能力をモニタリングすることによって査定した。以下に記載するように、実験を実施した。
【００８６】
実施例１にしたがって製造された、単離したエキソソームのアリコートを、Ｖｙｂｒａｎｔ  ＤＩＩ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）細胞標識溶液によって、３７℃および４℃において２０分間標識し、それぞれの温度における染料の移動を、フローサイトメトリを用いて査定した［２５］。図３は、４℃（もっとも左側のヒストグラム）および３７℃（もっとも右側のヒストグラム）において、染料を充填したエキソソームとともにインキュベートした細胞からのデータのヒストグラムを示す。結果は、単離したエキソソームからヒト肺動脈内皮（ＨＰＡＥ）細胞へ、染料が効率的に移動し、７５％の細胞が標識されたことを示す。
【００８７】
＜実施例６  単離されたヒートショックエキソソームの培養された歯周細胞への効果＞
実施例１にしたがって製造された、単離したエキソソームの培養された歯周細胞への効果を、以下に記載するように決定した。
【００８８】
両方とも通常の培養温度（３７℃）（すなわち、ヒートショック工程なし）における細胞によって製造された、脂肪に由来する幹細胞から単離したエキソソーム、および実施例１にかかるヒートショック工程を用いて細胞を培養することを含む培養条件における細胞によって製造された、単離したエキソソームを、９６ウェル培養プレート中の無血清培地中の、低密度の歯根膜線維芽細胞（ＰＤＬＦ）および皮膚繊維芽細胞（ＤＦ）（３，０００細胞／ウェル）に加え、３日間インキュベートした。単離したエキソソームの増殖効果を比較するために、細胞を、１０％ＦＢＳ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β１、またはＩＧＦ−１を包含する誘導物質によっても処理した。３日後に、細胞をＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｂｌｕｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって２時間処理することによって、増殖を査定した。データを、図４Ａ（ＰＤＬＦ）および４Ｂ（ＤＦ）に示した。図４Ａおよび４Ｂは、ヒートショックされた細胞から単離したエキソソームによる処理は、ＰＤＬＦおよびＤＦの両方の増殖を、ヒートショック工程にさらされなかった細胞から調製された単離したエキソソームと比較して、有意に増加させたことを示す。さらに、ヒートショックされた細胞から単離したエキソソームによって誘導された、ＰＤＬＦおよびＤＦの増殖のレベルは、完全培地および個々の増殖因子によって誘導されたものに、近づき、または超えた。
【００８９】
歯周病は、細胞外マトリックスの分解およびコラーゲン線維の分解に関連する。以下の実験は、ヒートショックされた細胞から調製された、単離したエキソソームが、ＰＤＬＦおよびＤＦにおいてコラーゲンＩ合成を誘導することができるかを決定するために実施した。実験のために、両方とも通常の培養温度（３７℃）（すなわち、ヒートショック工程なし）における細胞によって製造された、ＭＳＣによって単離したエキソソーム、および実施例１にかかるヒートショック工程を用いて細胞を培養することを含む培養条件においてＭＳＣによって製造された、単離したエキソソームを、無血清の、ビヒクルおよび増殖因子から条件付けした培地とともに、プロコラーゲンＩ  Ｃ−ペプチドＥＬＩＳＡ（ＴａＫａＲａ）アッセイを用いて試験した。ＰＤＬＦ細胞を、培地対照（処理なし）、２０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ−１、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦによって、４８時間処理した。４８時間後、条件付けした培地を取り除き、遠心分離によって浄化し、およびＥＬＩＳＡアッセイのために薄めた。得られたデータを、図５Ａ（ＰＤＬＦ）および図５Ｂ（ＤＦ）に示した。図５Ａおよび５Ｂのグラフは、ヒートショックした細胞からの単離したエキソソームによる処理が、ヒートショック工程にさらされなかった細胞から調製された単離したエキソソームと比較して、ＰＤＬＦおよびＤＦの両方におけるコラーゲンＩ産生を増加させたことを示す。さらに、ヒートショックした細胞からの単離したエキソソームによって誘導された、ＰＤＬＦおよびＤＦのコラーゲンＩ産生の増加は、個々の増殖因子による増加を超えた。これらのデータは、エキソソームが歯周靱帯修復において、役割を担うことができることを示す。
【００９０】
＜実施例７  ＡＳＣ由来のヒートショックエキソソームは、炎症性サイトカインの発現を抑制する＞
実施例１にしたがって製造されたＡＳＣ由来の単離したエキソソームが、歯根膜線維芽細胞（ＰＤＬＦ）においてＩＬ６の発現を抑制する可能性を以下に記載するように調査した。
【００９１】
Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、口腔軟組織細胞に対し致命的なさまざまな毒素を分泌することによって、歯周炎の発病に寄与することが知られている細菌種の１つである。以前の報告は、Ｐ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓライセートに対する応答として、ＧＫおよびＰＤＬＦにおいて、炎症性分子ＩＬ６およびＩＬ８を包含する、炎症カスケードが誘導されることを示す［２２〜２４］。ヒートショック工程を用いて培養された細胞から調製された、単離したエキソソームによる処理の、抗炎症性の影響を評価するために、ＰＤＬＦ細胞を、熱で殺して凍結乾燥されたＰ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  （ＨＫＰＧ，１０７／ｍｌ）、およびヒートショックされた細胞培養からの培地から単離したエキソソームに、同時に曝露した。
【００９２】
実験のために、両方とも通常の培養温度（３７℃）（すなわち、ヒートショック工程なし）における細胞によって製造された、ＡＳＣによって単離したエキソソーム、および実施例１にかかるヒートショック工程を用いて細胞を培養することを含む培養条件においてＡＳＣによって製造された、単離したエキソソームを試験した。具体的には、炎症反応を測定するために、炎症性サイトカインＩＬ６  ｍＲＮＡについてのＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。ＰＤＬＦを６ウェルプレートに播種し、かつ一晩インキュベートした：ＨＫＰＧおよびエキソソームなし（Ｔｘなし）、１０７／ｍｌ  ＨＫＰＧあり、かつエキソソームなし（エキソソームなし）、１０７／ｍｌのＨＫＰＧと、ヒートショック工程を用いた（ヒートショックされたエキソソーム）、およびヒートショック工程を用いなかった（標準エキソソーム）細胞培養から調製された、脂肪幹細胞に由来する単離したエキソソームとの組み合わせ。定量ＲＴ−ｑＰＣＲのデータを、図６に示した。結果は、熱で殺したＰ．  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（ＨＫＰＧ）、１×１０７／ｍｌによって誘導した、ＨＰＬＦ細胞におけるＩＬ−６遺伝子発現の統計的に有意な上昇を示す。この上昇は、単離された標準的なエキソソームによって有意に減少し、また、ヒートショック工程を用いて製造された単離された細胞エキソソームによって、よりいっそう減少した。これらのデータは、本開示の単離したエキソソームは、単球を炎症部位へと動員するために局所的に働く、ＩＬ６を包含する炎症性サイトカインの産生を阻害できることを示す。
【００９３】
＜実施例８  げっ歯類における、単離されたヒートショックエキソソームの創傷治癒に対する効果＞
実施例１にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームの皮膚の創傷治癒活性を、以下に記載するように、げっ歯類モデルにおいて調査した。
【００９４】
単離したエキソソームを用いた、皮膚の創傷治癒実験を以下の通りに実施した。４つの、２ｃｍの直径の領域の表皮を、げっ歯類の背側表面から完全に取り除き、４つの別個の創傷を作製した。げっ歯類の画像は、創傷直後（図７Ａ）および負傷の２週間後（図７Ｂおよび図７Ｃ）に撮影した。各画像の下段の左は、生理食塩水によって処理した。図７Ｂに示した画像において、残りの３つの非対照の創傷を、ヒートショック工程を用いて培養された、幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理した。図７Ｃに示した画像において、残りの３つの非対照の創傷を、単離され、凍結乾燥され、その後、処理のために元に戻された幹細胞から分泌されたエキソソームによって処理した。画像は、２週間後に撮影され、対照およびエキソソーム処理した創傷は、両方とも実質的に治癒されるものの、実施例１にしたがって製造した、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームによって処理した創傷が、実質的により速く治癒されたように見えた。
【００９５】
図８は、図７Ａおよび図７Ｂに示した動物の、創傷閉鎖の割合に対する、負傷後の日数を示すグラフである。創傷の直径は、示した日に測定した。創傷閉鎖の割合は、示した日の創傷の直径を１日目の創傷の直径で割り、１００を掛け、およびそれからこの数字を１００から引くことによって計算した。図８中のデータポイントは、３つの動物の平均値を示す。図８において、星によって明示した線は、エキソソーム処理した創傷を示し、それらは処理後１９日の時間経過の終了時において完全に閉じており、また、生理食塩水によって処理された対照創傷を、点線によって示した。対照の創傷は、時間経過の終了時において開いたままであり、約２５％の創傷の表面領域が残っていた。
【００９６】
切片を図７Ｂに示した動物から取得し、かつ細胞増殖および創傷治癒に関与することが知られているマーカーについて、組織学的に染色した。具体的には、細胞増殖を示すタンパク質であるｋｉ−６７について、切片を組織化学的に染色した。結果を、図９Ａ（対照１）および図９Ｂ（試験１）に示した。図９Ａに示した切片は、対照として生理食塩水によって処理した創傷から取得し、また、図９Ｂから取得された切片は、上述したようにヒートショック処理を用いて培養した幹細胞から分泌された、単離したエキソソームによって処理した創傷から取得した。図９Ｂで示した切片は、図９Ａで示した生理食塩水対照と比較して、より暗かった。この、ｋｉ−６７タンパク質のより暗い染色は、対照よりも、ヒートショックエキソソームによって処理した創傷において、細胞がより増殖していることを示す。増殖の増加は、創傷治癒の鍵であり、これは、エキソソーム処理した創傷において閉鎖の時間が減少したことの一つの可能性のある説明である。
【００９７】
さらに、図７Ｂに示した動物から取得した切片を、製造業者の使用説明者にしたがって、ＶＥＲＨＯＥＦＦ‘Ｓ  ＶＡＮ  ＧＩＥＳＯＮ（ＥＶＧ；ＰＯＬＹＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＩＮＣ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）によって染色することにより、コラーゲン沈着および構成について分析し、結果を図１０Ａおよび図１０Ｂに示した。具体的には、生理食塩水対照から取得した図１０Ａに示した切片は、ＥＶＧによる弱い染色を示し、少量のコラーゲンのみが構造的構成を欠いて存在していたことを示す（矢印によって示した；１００倍拡大）。対照的に、ヒートショックエキソソームによって処理した、創傷から取得した図１０Ｂに示した切片は、ＥＶＧによるコラーゲン束の染色の増加を示し、このことは、中程度の量のコラーゲンが穏やかな（ｍｉｌｄ）構造的構成で存在していたことを示す。ヒートショックエキソソームによって処理した皮膚における、より大きいコラーゲン沈着および構成は、より速いおよびより良い率の治癒を示す。
【００９８】
これらのデータは、創傷がエキソソーム処理されたサンプルにおいてより迅速に閉じるという巨視的な観察を支持し、また、それがどのように起こるかについての可能性のある分子的機構を示唆する。
【００９９】
＜実施例９  ヒト成人ケラチノサイトにおける、ＵＶＢ光に対するヒートショックエキソソームの保護効果＞
実施例１にしたがって製造されたＭＳＣ由来の単離したエキソソームの、ヒト成人ケラチノサイトにおける、ＵＶＢ照射に対する保護効果を、以下に記載するように調査した。
【０１００】
太陽紫外線（ＵＶ）光へ皮膚を曝露することによって、光老化、日焼け、ＤＮＡ損傷、および発癌が引き起こされる。ＵＶＢ（２９０〜３２０ｎｍ）は、紅斑、および表皮中のシクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）などのＤＮＡ損傷を誘発する。ＵＶＢ照射はまた、炎症につながり、炎症はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、例えばＴＮＦ−ａ、ＩＬ−８、およびＰＧＥ２などの、炎症促進性メディエータによって測定することができる。さらに、ＵＶＢは、細胞を不可逆的に損傷し得（日焼け細胞）、日焼け細胞は、アポトーシスの誘導によって除去される。
【０１０１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの生物学的方法は、それによってＵＶＢによって引き起こされた分子の損傷を査定し、また、日焼け止め製品、および皮膚をＵＶＢから保護することにおける、化学的、または生物学的技術を包含する局所的製剤の有効性を評価するための、優れた道具を提供する。ヒト成人ケラチノサイト培養モデルは、小分子および他の製剤の保護効果を評価するための研究の道具として、およびヒト被験者に対する試験の限界を克服するために、よく確立されている。
【０１０２】
この研究においては、ヒト成人ケラチノサイトを、ＵＶＢによって誘導された細胞損傷、および本明細書に記載したヒートショックエキソソームの保護活性を査定するために用いた。エキソソームを含有する培地を、ケラチノサイトに１時間適用し、それから吸引した。それからケラチノサイト上にＰＢＳを置き、かつ４０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢに曝露した。曝露の後に、ＰＢＳを吸引し、かつ新しい、ストックのＫＭ−２培地を、細胞に対して適用した（２００μＬ）。培地を、２４時間において収集した。非ＵＶＢ照射サンプルは、ＵＶＢ曝露を除いて、同じプロトコールを経た。
【０１０３】
ヒートショックエキソソームの効果を、細胞によるＩＬ−８およびＴＮＦ−αの産生の減少を測定することによって査定し、結果を図１１、図１２、図１３、および図１４に示した。具体的には、図１１は、ヒト成人ケラチノサイトにおける、培地対照と比較したさまざまな量のヒートショックエキソソームによる、ＵＶＢ照射に非存在下（ＵＶＢ照射なし）におけるＩＬ−８減少を示すグラフである。結果は、試験したすべての濃度のヒートショックエキソソームが、ＩＬ−８の産生を減少させたことを示す。さらに、８．２３Ｅ＋０５ヒートショックエキソソームの濃度は、ＩＬ−８産生を有意に減少させた（ｔ−テスト、両側、不等分散）。
【０１０４】
図１２は、培地対照と比較してさまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）における、ヒト成人ケラチノサイトにおけるＩＬ−８産生の減少を示すグラフである。結果は、ＵＶＢの非存在下における実験と同様であり、試験したすべての濃度のヒートショックエキソソームが、２．００Ｅ＋０８を除き、ＩＬ−８の産生を減少させた。具体的には、１ｍｌあたり２．７４Ｅ＋０５、２．４７Ｅ＋０６、７．４１Ｅ＋０６、２．２２Ｅ＋０７、および６．６７Ｅ＋０７のヒートショックエキソソームは、ＩＬ−８産生を有意に減少させた（ｔ−テスト、両側、不等分散）。
【０１０５】
図１３は、図１１および図１２のグラフのデータを並べた比較を示すグラフである。この比較は、ＵＶＢ（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）および非ＵＶＢ（ＵＶＢなし）に曝露された細胞の両方が、同じ傾向にしたがうことを示す。ＩＬ−８産生の基底レベル（ＵＶＢなし、培地のみ）は、２０２ｐｇ／ｍＬである（破線でしるしをつけた）。ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ、培地のみ）におけるＩＬ−８産生の基底レベルは、６８５ｐｇ／ｍＬである（点線でしるしをつけた）。ＵＶＢに曝露した細胞における１ｍｌあたり８．２３Ｅ＋０５、２．４７Ｅ＋０６、７．４１Ｅ＋０６、および２．２２Ｅ＋０７のエキソソーム濃度は、ＵＶＢなしの培地対照における細胞と比較して、有意差につながらなかった。これらの結果は、ＵＶＢによって誘導された炎症に対する、ヒートショックエキソソームの保護効果を実証する。
【０１０６】
図１４は、さまざまな量のヒートショックエキソソームを用いた、ＵＶＢ照射の存在下（４０ｍＪ／ｃｍ２  ＵＶＢ）および非存在下（ＵＶＢなし）における、培地対照と比較した（培地のみ）、ヒト成人ケラチノサイトによるＴＧＦ−αの量を示すグラフである。ＵＶＢに曝露されたサンプルにおけるＴＮＦ−α放出は、ＩＬ−８において観察されたものと同じ傾向にしたがい、１ｍＬあたり２．２２Ｅ＋０７の濃度におけるヒートショックエキソソームによる、ＴＮＦ−αの最大減少は約３倍であった。ＴＮＦ−αの値は、アッセイ検出の下限にあり、これがＵＶＢなしのサンプルの大部分においてデータが見られなかった理由である。
【０１０７】
まとめると、結果は、１ｍＬあたり８．２３Ｅ＋０５、２．４７Ｅ＋０６、７．４１Ｅ＋０６、および２．２２Ｅ＋０７のエキソソームのヒートショックエキソソーム濃度によって処理した、ＵＶＢ曝露された細胞からのＩＬ−８放出は、ＵＶＢなしの培地対照と比較して有意差を示さなかったことを示し、このことは、ＵＶＢによって誘導された炎症に対する、ヒートショックエキソソームの保護効果を示す。さらに、１ｍＬあたり８．２３＋Ｅ０５エキソソームの濃度のヒートショックエキソソームによって処理した細胞からのＩＬ−８放出は、ＵＶＢ照射の非存在下において、ＵＶＢなしの培地対照と比較して、有意に減少した。さらに言えば、ヒートショックエキソソームによって処理した細胞からのＴＮＦ−α放出は、３倍も減少した。上記の結果は、ＵＶＢによって誘導された炎症に対するヒートショックエキソソームの保護効果を実証する。
【０１０８】
＜実施例１０  げっ歯類における、コラゲナーゼ誘導腱変性に対する、単離されたヒートショックエキソソームの効果＞
実施例１にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームの軟組織の治癒活性を、以下に記載するように、げっ歯類モデルにおいて調査した。
【０１０９】
単離されたヒートショックエキソソームを用いた、軟組織の治癒実験を、以下の通り実施した。ラットの右脚を定位置に保持し、皮膚を切開することによって、アキレス腱を露出させた。２５μＬの生理食塩水中０．３ｍｇのコラゲナーゼの溶液を、腱の中央部分に注入することによって、腱の負傷を誘導した。左のアキレス腱は無傷のまま残した。負傷３日後、エキソソームまたはビヒクルの対照を、１００μＬの容量で負傷部位に注入した。負傷から１４日後、アキレス腱を取り除き、組織学的評価のために、４％パラホルムアルデヒドによって固定した。固定した腱組織をパラフィンブロックに埋め込み、また、コラーゲンを濃紺に染色するマッソントリクロームを用いて染色した薄切片は、コラーゲン含量およびコラーゲン束配向を明らかにした。図１５Ｂは、対側の無傷の対照の腱と比較した（図１５Ａ）、エキソソームの非存在下における、コラゲナーゼ処理の効果を示す。コラゲナーゼは、図１５Ｂの暗く、かつ溝をつけた染色の損失によって示すように、深刻なコラーゲン分解および配向されたコラーゲン束の損失を引き起こす。コラゲナーゼ注入した腱のエキソソーム処理は（図１５Ｄ）、対側の無傷の対照の腱（図１５Ｃ）から、コラーゲン含量およびコラーゲン線維配向において、有意差を示さなかった。これらのデータは、実施例１にしたがって製造された、ＭＳＣ由来の単離したエキソソームは、コラーゲン分解を大きく減少または阻害し、および／または、誘導された腱の負傷後に、軟組織および腱の治癒を促進することを示す。
【０１１０】
〔参考文献〕
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【０１１１】
本明細書中で言及されたいずれの特許または刊行物も、本開示が関係する当業者のレベルを示す。これらの特許および刊行物は、各個々の刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられると示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
当業者であれば、本開示が目的を実行し、上述した目的および利点、ならびにそれらに固有の目的および利点を得るために十分に適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に記載された本実施例および方法は、現在好ましい代表的な実施態様であり、それらは例示的であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者が想起するその中の変更および他の用途は、特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨の範囲内に包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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