(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブチリルコリンエステラーゼの四量体形成を可能にするポリプロリン接着ドメインと結合したブチリルコリンエステラーゼ分子を含む、組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物であって、
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物は、少なくとも５０％のシアリル化および少なくとも５０％の四量体形成を呈し、
四量体化した生成物は、グリコシル化部位をさらに含み、そのグリコシル化部位の少なくとも７０％は、単一の末端シアル酸に結合している、
組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物。
【請求項２】
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物が、植物または植物細胞から作製される、請求項１に記載の生成物。
【請求項３】
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物が、少なくとも６０％の四量体形成を呈する、請求項１に記載の生成物。
【請求項４】
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物が、少なくとも７０％のシアリル化を呈する、請求項３に記載の生成物。
【請求項５】
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物が、植物または植物細胞から作製される、請求項３に記載の生成物。
【請求項６】
前記組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物が、植物または植物細胞から作製される、請求項４に記載の生成物。
【請求項７】
植物、植物細胞、またはその両方からの組換えブチリルコリンエステラーゼの生成のための方法であって、以下のステップ：
ａ）前記ブチリルコリンエステラーゼを発現することが可能な少なくとも１つのベクターを有する前記植物、植物細胞、またはその両方を提供するステップ；
ｂ）前記ブチリルコリンエステラーゼの合成を誘起する条件であって、前記ブチリルコリンエステラーゼでの、ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアル酸ホスファートシンターゼ、ＣＭＰシアル酸シンターゼ、ＣＭＰシアル酸トランスポーター、ガラクトシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の導入によるシアリル化グリカンの生成および四量体形成を含む条件で、前記植物、植物細胞、またはその両方をインキュベートして、シアリル化および四量体形成を呈するブチリルコリンエステラーゼ生成物を形成させるステップ；ならびに
ｃ）前記植物、植物細胞、またはその両方からステップ「ｂ」の前記ブチリルコリンエステラーゼ生成物を単離するステップ、
を含み、
前記ブチリルコリンエステラーゼを発現することが可能な少なくとも１つのベクターは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドと共有結合されたブチリルコリンエステラーゼ分子をコードし、前記第２のヌクレオチド配列は、四量体形成をもたらす、共発現されるポリプロリン接着ドメインと結合されたシグナルペプチドをコードする、
方法。
【請求項８】
前記ブチリルコリンエステラーゼ生成物が、シアリル化および四量体形成の両方を呈する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ブチリルコリンエステラーゼ生成物が、少なくとも５０％のシアリル化および少なくとも５０％の四量体形成を呈する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１０月１日に出願された係属中の米国特許仮出願第６１／８８５，４９２号の利益を主張するものである。該特許出願全体が、参照により本明細書に組入れられる。
【０００２】
政府による使用権許諾の権利
本発明は、米国陸軍研究所（ＡＲＯ）の契約番号ＨＲ００１１−１２−Ｃ−０１０３の下、米国政府の助成によってなされた。米国政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
組換えブチリルコリンエステラーゼ（ｒＢｕＣｈＥ）の、新規で信頼性があり容易に規模拡大可能で、かつ再現性がある生成方法を提供する。植物トランスフェクション手順の利用により、様々な植物株が、効果的かつ規模拡大可能な量のｒＢｕＣｈＥを許容し得る製造工程の下で作製して、所望の神経剤防御要件（四量体生成物を含む）に合う、そのような酵素の信頼性のあるレベルを実現することが示された。その上、遺伝子操作された植物系統でのそのような方法は、グリカン形成およびシアリル化（末端基の）を含みながらこれらの酵素を四量体形態で適切に生成して、有機リン剤暴露に対する最適な効力と植物供給源中での適正な免疫原性応答を可能にすることを示した。したがって、生存細胞内での（真菌、細菌、植物、または動物のどの細胞かにかかわらず）トランスフェクションおよび産生、ならびに植物からのそのような信頼性のある供給基盤に伴う工程ステップをはじめとし、生成方法全体が本発明に包含される。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
有機リン化合物（ＯＰ）は、アセチルコリン加水分解酵素の強力な阻害剤として働く。コリン作動性伝達の主要なシナプス調節物質であるアセチルコリンエステラーゼを阻害するそれらの能力は、不可逆的な神経損傷から死亡まで、ヒトへの高度毒性作用をもたらし得る。ＯＰは、比較的良性の殺虫剤およびかなり有害な化学兵器をはじめとし複数の形態に見出され得る。第二次世界大戦前から今日に至るまで、様々な形態のＯＰが開発され、非道的な目的で神経剤として配備されてきた。これらの薬剤は、２つの一般的群：１）タブン（ＧＡ）、サリン（ＧＢ）、ソマン（ＧＤ）およびシクロサリン（ＧＦ）をはじめとするＧ剤と、２）ＶＸのＶ剤と、に分類される。Ｇ剤は、一般に非持続性で揮発性の液体であり、高度に持続性で不揮発性であり、より活性のＶＸ化合物とは対照的である。これらの化学兵器を禁止および破壊することへの多くの賛同があるにもかかわらず、合成および配備が比較的容易なために、これらの薬剤は市民および軍隊の両方の人々に高いリスクを与えるテロリスト活動にとって理想的なツールになっている。これらの薬剤の配備は、呼吸器または皮膚への暴露による即座の健康リスクと、固体表面での持続残留により再使用前に大規模な操作汚染除去を必要とするような潜在的脅威と、の両方を併せ持つ。
【０００５】
例として、１９９５年の東京地下鉄でのサリンガス放出は、大量破壊の化学兵器（ＷＭＤ）およびそれらの潜在的破滅作用に対する人口集中の弱点を示す不幸な例を与えている。そのような閉鎖的場所では、多くの人々がそのようなＯＰ剤への暴露により死亡する。そのような世界中で起こり得る脅威により（今日のシリアの状況もまた別の発生例）、ヒトの健康リスクおよび操作汚染除去の両方に取り組む方策が、緊急に求められている。
【０００６】
有機リン酸神経剤への急性暴露は、典型的にはアトロピンと、オキシム再賦活剤（２−ピリジンアルドキシムメチルクロリドまたは２−ＰＡＭを含む）と、抗痙攣薬とのカクテルの反復投与により処置される。これらの処置は、相当な有害反応、困難な服薬遵守、および不十分な有効性を生じる。現行の薬物の性能を改善する新たな方策で投薬量を減少させるか、または作用機序を加えることにより有効性を増大させる必要がある。ブチリルコリンエステラーゼ（ＢｕＣｈＥ）は、主要なヒト血清コリンエステラーゼであり、それは結合および加水分解する化学基質に関して顕著な混乱を示す。これらの特性によって、それは環境で発生したＯＰ（殺生物剤）、およびＧ分類とＶ分類の両方の化学神経剤に即座に結合することができる。これらの多様な化学剤にする高い結合定数（Ｋｍ）にもかかわらず、加水分解（Ｋｃａｔ）は非常に緩やかで、１  酵素：１  ＯＰ分子の機能的阻害速度になる。ヒトおよび細菌の両方を起源とする酵素活性剤の同定を、多くのグループが懸命に模索した。そのため、研究は大部分がＢｕＣｈＥ開発に集中した。
【０００７】
少なくとも、ＢｕＣｈＥが有意義であることを立証された哺乳動物対象には、他の条件および状況が存在する。例えば、アルツハイマー病などの特定の神経疾病が、適正な機能および可能性のある神経変性の減少に関してブチリルコリンエステラーゼへの依存性を示すことが理解された。同様に、例えば中毒性物質であるコカインによって引き起こされる特定の生理学的状態は、ＢｕＣｈＥを処置剤として導入することにより処置され得る。対象の体内に存在する天然量の欠乏、または対象生物体内で少量産生される突然変異ＢｕＣｈＥ酵素遺伝子の存在による欠乏を克服するために導入されたブチリルコリンエステラーゼの使用を含む酵素置換療法もある。なお、本質的にＯＰ中毒処置の可能性が、いずれの型のＢｕＣｈＥ使用によっても有意義になるとしても、効果的なＢｕＣｈＥ製造の要件が非常に有益になり得るような他の状況が存在する。
【０００８】
ウマの血清およびヒト供給源から精製されたｈＢｕＣｈＥが、マウス、モルモット、および非ヒト霊長類を、両分類の様々なＯＰ神経剤のＬＤ５０用量の３〜５倍から防御し得ることが、初期の研究から実証された。ヒト血清由来ＢｕＣｈＥは、四量体の性質と、シアル酸を末端とするグリカン構造を示して、実験動物の血清中で約７３時間の半減期を誘導し、それによりヒト臨床試験において安全性を示した酵素を提供する。しかしソマンのＬＤ５０の２〜５倍用量を処置するための酵素２００ｍｇという要件（平均サイズのヒトの場合）は、利用可能な供給原料が多量で低収率であるため、血清確保を実現不能にしている。組換えＢｕＣｈＥ（ｒＢｕＣｈＥ）が、トランスジェニックヤギから産生されたが、それは主に単量体または二量体構造を示し、シアル酸末端をほとんど示さず、急速な血清中半減期を示す。ポリエチレングリコールでの修飾が、好適な薬物動態プロファイルの実現に必要であり、今も尚、臨床試験によりヒトの安全性を適正にテストされなければならない。加えて、ＢｕＣｈＥの供給源である使用期限の切れたヒト血漿またはトランスジェニックヤギは両者とも、量的に不十分で、コストがかかり過ぎて、リスクのある軍隊および一般市民に必要な量のＢｕＣｈＥを提供できないと思われる。
【０００９】
ｒＢｕＣｈＥは、効力、特異性、および安全性プロファイルが見込まれるため、ＯＰ防御のための魅力的分類である。しかし、酵素製品を用いた大量破壊兵器（ＷＭＤ）の課題に取り組む上で、複数の独特な製造課題が提示されている。ＷＭＤ防御および応答に関連する様々な適用に取り組む規模が、重要となる。リスクのあるエリアで軍事集団への予防的応答および暴露後の応答の両方を提供するには、あまり高くないレベルでの製造が利用され得る。同じく、ＷＭＤ放出の場合に市民への暴露に取り組むには、製品の十分な供給を確保するために極めて高レベルの製造が必要となろう。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の典型的な製造方法は、哺乳動物細胞の反応装置を使用する。このアプローチは、予測可能な供給要件を有する疾患に取り組むための使用には成功したが、大規模な哺乳動物培養物は、細胞生育施設に関連する設備投資要件のために、迅速な応答および様々な規模での製造に十分には適さない。空間および利用の償却のために、適切な上流施設の建設に必要となる莫大なコスト（例えば、一部の推定によると５億ドルを超える）のための助成金が提供されない。加えて、必要となる製品の定期修理サイクルの時間枠が、一般に連続供給オプションの場合に不十分となる。さらに、より広範囲の化学構造および特異性に取り組むために新しい酵素製品が入手されるようになるため、構築物の開発からｃＧＭＰ生成までの工程が、細胞株最適化、工程の適合、および必要な規模拡大要件（特に哺乳動物の生成供給源に関して）のために２〜３年の期間に及ぶ可能性がある（新世代を含むそのような動物の場合、飼育、衛生および摂餌などの一般的コストに言及していない）。最後に、伝統的製造でのｍＡｂ（例えば、ＣＨＯまたはＮＳ０細胞）は、神経剤暴露の非予測性に必要となる長期継続的予防および治療製品を効果的に提供するには不十分なシアリル化および他のグリカン修飾能力を有する。最小限のシアリル化または化学的シアリル化方法を示す哺乳動物細胞株は、見通しが立たず、とりわけ既に相当な額にのぼる製造コストに加えて、高い特許権使用料が課される。したがって、そのような高コストの構造は、ＷＭＤ問題の解決策とするには不都合である。これらの制約から、そのような酵素製品のための新しく、より規模拡大が可能で、応答性があり、有効な製造方策が、明らかに望まれている。
【００１０】
さらに重要なこととして、ＢｕＣｈＥ構造に関するこれまでの研究では、四量体形成とシアリル化の結果を併せて提供することができなかった。特に、細胞のシアリル化が、組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物では実現され得るものの、その四量体を提供する能力が、特に哺乳動物細胞の場合にないと決定された。したがってブチリルコリンエステラーゼ類が、特に哺乳動物系で、多数の処置目的に極めて魅力的であったとしても、この手法で費用効果がある製品だけでなく、哺乳動物処置のための適切な適合性も示す（例えば、シアリル化および四量体化がなされた）そのような製品を製造する能力が、今も尚、開発されなければならない。今日まで、本質的にＢｕＣｈＥの信頼性のある供給源を、反復可能な工程および比較的低い全体的コストでシアリル化四量体形成と共に提供する任意の効果的開発は、全くなされていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明の利点および概要
植物を基にした系が、全体的速度および規模拡大性の利益に加えて四量体化構造の均一性により、非常に望ましいシアリル化およびグリカン形成を呈することにより、唯一の哺乳動物生成スキームおよび製造問題を超える明確な利点を提示することが、ここに決定された。非限定的にニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｂ）株をはじめとする遺伝子操作された植物生物体の使用によって、そのような植物産生酵素は、所望の期間内で発現構築物から先導的なワクチン候補物質の適切な量および供給源を提供することが可能である。そのような系は、シアリル酸などの哺乳動物系と同様の高均質性グリカンの明白な利点も提供するが、著しいレベルの植物特異性グリカン結合を欠くことで、治療薬、ワクチンまたは他の型のヒト送達工程で用いられた場合に、植物特異的な免疫原性に関する任意の安全性問題が排除される。植物を基にした系は、伝統的な哺乳動物細胞培養物の製造に比較して著しいコスト削減（製造設備の建設コストおよび製造ＣＯＧＳの両方で）によって、哺乳動物タイプを超えるさらに別の利点を提示する。同じく本明細書に記載されたそのような方法は、非限定的に酵母、サッカロマイセスおよびピキアなどの真核微生物細胞、ならびに哺乳動物細胞をはじめとする他の動物細胞などの他のタイプの生存細胞内での、ＢｕＣｈＥの信頼性のある四量体形成およびシアリル化という有利な能力を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
植物は、生物製剤のための代わりの製造システムとして行政上の承認を着実に増やしている。本発明のアプローチは、急速な製造サージ能力を有する植物分類を利用して、ｒＢｕＣｈＥを製造し、差異のある製造要件に関連する難題に迅速に取り組むために使用することができ、新規病原および新たに発生した病原への脅威に取り組むよう適合させることができる。全体的手順は、上流のバイオマスおよび原産物の農業規模拡大を可能にする一過性の植物系製造アプローチを、伝統的な下流のタンパク質精製、放出、および製剤化と共に利用することを含む。このアプローチによって、該植物を基にした系は、伝統的な哺乳動物製造に比較して規模、コストおよび柔軟性において顕著な利点を提示する。
【００１３】
本明細書に記載された１つの可能な実施形態により作製されたｒＢｕＣｈＥ生成物は、一過性植物発現系により生成され、サージ能力を呈し、一般市民および軍隊における神経剤の脅威のタイミングおよび規模の予測不能性に迅速に取り組むのに有用である。非限定的な一例としてニコチアナ株をはじめとする遺伝子操作された植物変種の使用を介して、植物産生ｒＢｕＣｈＥ生成物は、先に記載された通り、著しいレベルの植物特異性結合を欠くことで植物特異的な免疫原性に関する任意の安全性問題を排除した、高均質性の哺乳動物様グリカンを有する。植物由来酵素が、αガラクトシダーゼＡ、リソゾーム酸性リパーゼおよびｒＢｕＣｈＥをはじめとする伝統的製造によるｍＡｂ（例えば、ＣＨＯ、Ｐｅｒ−Ｃ６またはＮＳ０細胞）により産生されたものと同等に強力であることも発見されている。植物を基にした系は、効力での利点に加えて、高い効力または特異性（例えば新しい化学剤に対する）を示す新規な酵素の迅速で規模拡大可能な製造を可能にする。適切な遺伝子操作グリカンを有する新規酵素の製造ロットを、１ヶ月以内に製造および販売することができ、ｃＧＭＰ生成までの時間がおよそ６ヶ月になり得る（哺乳動物細胞培養物よりも２〜３倍迅速である）。本発明の植物を基にした生成系は、伝統的な哺乳動物細胞培養物の製造に比較して著しいコスト削減（製造施設の建設コストおよび製造された製品のコストの両方に関係して）も提示する。
【００１４】
したがって本発明は、少なくとも約５０％のシアリル化および少なくとも約５０％の四量体形成（植物、植物細胞および他の生存細胞、例えば酵母、サッカロマイセスおよびピキアなどの真核微生物細胞および他の動物細胞、例えば哺乳動物細胞などから産生され得る）を呈する、好ましくは少なくとも７０％のシアリル化および少なくとも６０％の四量体形成を呈する、組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物を包含する。同じく本明細書に包含されるのは、植物、植物細胞、またはその両方（あるいは植物もしくは動物のいずれかにかかわらず任意の生存細胞）からの組換えブチリルコリンエステラーゼの生成方法であって、以下のステップ：ａ）前記ブチリルコリンエステラーゼを発現することが可能な少なくとも１つのベクターを有する前記植物、植物細胞、またはその両方（または他の生存細胞）を提供するステップ；ｂ）前記ブチリルコリンエステラーゼの合成を誘起し、前記ブチリルコリンエステラーゼでのシアリル化グリカンの作製、四量体形成またはその両方を含む条件で、前記植物、植物細胞、またはその両方（または生存細胞）をインキュベートして、シアリル化および四量体形成のうちの少なくとも一方を呈するブチリルコリンエステラーゼ生成物を形成させるステップ；ならびにｃ）前記植物、植物細胞、またはその両方（または生存細胞）からステップ「ｂ」の前記ブチリルコリンエステラーゼ生成物を単離するステップ（好ましくは生成物は、少なくとも約５０％のシアリル化、より好ましくは少なくとも約７０％のシアリル化と、少なくとも約５０％の四量体形成、より好ましくは少なくとも６０％の四量体形成など、シアリル化と四量体形成の両方を呈する）、を含む、方法である。さらに、前記ブチリルコリンエステラーゼでシアリル化グリカンの作製を誘起する前記条件が、シアル酸合成、ガラクトース転移、およびシアル酸転移のうちの少なくとも１つを発現する遺伝子を、前記生存細胞内に導入することを含み、前記遺伝子発現が、インビボで、または代わりもしくは一過性に、ブチリルコリンエステラーゼシアリル化を生成し、前記ブチリルコリンエステラーゼで四量体形成の生成を誘起する前記条件が、前記生存細胞に内在し、シアル酸合成、ガラクトース転移、およびシアル酸転移のうちの少なくとも１つを発現する遺伝子を、前記生存細胞内に導入することを含み、前記遺伝子発現が、インビボでブチリルコリンエステラーゼシアリル化四量体を作製する、製造方法もまた、本明細書に包含される。加えて、本発明はさらに、ステップ「ａ」（先に要約された方法から）の前記少なくとも１つのベクターが、ペプチド四量体化を発現し、糖タンパク質シアリル化も発現する、そのような方法をさらに包含する。本発明全体はまた、哺乳動物対象を処置する方法であって、前記処置が、ａ）少なくとも約５０％のシアリル化および少なくとも約５０％の四量体形成を呈する組換えブチリルコリンエステラーゼ生成物を提供するステップ；ｂ）哺乳動物対象内での内部転移のための適切な組成物または配合剤にステップ「ａ」の前記生成物を導入するステップ；ならびにｃ）一例として有機リン剤中毒を低減または予防する目的で、静脈内または筋肉内手順により前記哺乳動物対象内にステップ「ｂ」の前記組換えブチリルコリンエステラーゼ含有組成物または配合剤を導入するステップ、を含む、方法も包含する。
【００１５】
本発明に関係する植物を基にした一過性発現分類、さらに一例としてＮｂ類を利用すれば、ｒＢｕＣｈＥは、得られた純度が９９％を超え、予測された比活性および神経剤結合特性を保持する、完全な四量体配座で生成されるだけでなく、そのような結果が種子中の遺伝子修飾により植物作製に伝達されている。したがってそのようなｒＢｕＣｈＥ生成スキームの作成は、費用効果および信頼性のある再現性および規模拡大性のある形態で提供された。加えて、これに関係する必要な翻訳後修飾も提供する一過性のシアリル化系が、開発された。先に記載された通り、そのようなシアリル化および四量体化の結果は、有機リン系薬剤に対抗する効果的手段を当業界に供給するために有意義である。比較として、純粋な単量体／二量体ｒＢｕＣｈＥ（非シアリル化生成物）は、約３０分の血清中半減期を示し、シアリル化された単量体／二量体は、およそ４時間の半減期を示した。しかし本発明の四量体／シアリル化生成物、特にほぼ５０％の末端シアル酸占有率のものは、約４４時間の血清中半減期を示した。シアル酸占有率の上昇（生成宿主中のグリコシル化経路の修飾により末端シアル酸残基が７０％を超えるなど）は、以下の表１に示される通り、対照酵素活性をベースラインとして用いると、静脈内で送達された場合には６３時間を超え、筋肉内経路で送達された場合には８６時間より多い末端薬物動態半減期を呈する。さらに、ｒＢｕＣｈＥ  ＰＫ半減期を増大させるための、四量体化とシアリル化との最小限に追加的で、可能ならば相乗的な役割が存在することも明白と思われる。これらの半減期の値は、今日まで報告されたｒＢｕＣｈＥの任意の他の組換え形態よりも有意に高い。
【００１６】
そのような結果は、植物を基にした生成スキームにより利用可能な能力が、少なくとも人への静脈内または筋肉内送達では、ＰＫ特性に関して十二分に存在することを意味している。以下の表１は、これに関する比較的考察と、本発明の植物を基にした系の予想外に効果的な結果を、類似構造の他の生成手順に対比させて示している。
【表１】
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【００１７】
したがって、四量体形成および高いシアル酸占有率を有する植物を基にした組換え産物は、明らかに、高レベルの酵素および薬剤親和性と薬物動態特性によって神経剤暴露をインビボ防御するための魅力的候補物質となる。
【００１８】
それにより、実際の生成方法論の改善が、この可能性のある経路を実行可能にするのに重要となることが理解された。この目的に向けて、四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物のコストを削減し、製造能力を強化するために、多重生成により四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥを生成する能力を示す一組のトランスジェニック植物系統が得られることが、決定された。トランスジェニック宿主を用いた生成、後世代の種子の誘導、および個々の系統のシアリル化能力についての個別のテストなど、そのような植物系統を最適化する能力が、この全体的方法のさらなる魅力を創り出している。例えば４つの遺伝子導入により生成されたｒＢｕＣｈＥバッチの分析のうち、３つが７０〜７３％の末端シアル酸占有率を示し、もう１つが、約５０％を示した。そのような測定レベルは、一過性試料での観察と類似していた。遺伝子導入による生成によって、遺伝子操作された植物の種子から生成されたシアリル化レベルが異なる占有率測定を示しながらも一般に静脈内および筋肉内の送達目的で許容され得るレベルであることが、示される。本明細書ではＴ３系統と称される個々の植物もまた、類似の方法で機能すると思われる。要するに、任意の専門の科学的根拠に依存することなく、植物が魅力的なＰＫ特性を示す四量体化シアリル化ｒＢｕＣｈＥの優れた組換え形態を生成するための迅速なサージ適合性アプローチを提示することが、理解された。本発明により生成された結果的なｒＢｕＣｈＥ構造を、哺乳動物の生物体（ハートレー系モルモット）内での実行可能性についてもテストした（先に記載された通り静脈内および筋肉内導入による）。結果は以下の通りであり、静脈内（ＩＶ）経路で送達された場合に６３．４時間のｔ１／２を示し、筋肉内（ＩＭ）経路で送達された場合に少なくとも８６時間のｔ１／２を示した。同時に得られたデータを、表２にさらに詳述する。
【表２】
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【００１９】
神経剤テストにおいて一過性シアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物の実行可能性を評価するために、同じハートレー系モルモット集団において初期有効性テストも実施した。そのようなテストは、先のＳＲＩ薬物動態本試験において用いられたｒＢｕＣｈＥ生成物の利用を包含し、ｒＢｕＣｈＥの静脈内送達を利用した短期間投与の有効性についてテストした。植物産生ｒＢｕＣｈＥは、モルモットモデルにおいて、ＧＤ、ＧＢおよびＶＸに対する有効性を示し、該生成物の翻訳容易性を実証した。
【００２０】
最初に、ＧＤおよびＶＸ神経剤に関して、雄ハートレー系モルモット（３００〜３５０グラム）へのＩＶカロチドカテーテルを介した本発明の植物を基にした四量体シアリル化ＢｕＣｈＥ  ２６．１５ｍｇ／ｋｇの投与についてのテストを実施した。１５分後に、２６．１５ｍｇ／ｋｇを投与された動物に、ＬＤ５０の３倍のＧＤまたはＶＸを、Ｓ．Ｃ．注射により暴露した（それぞれｎ＝６）。
【００２１】
ＧＢ神経剤の場合、対象モルモットの雄ハートレー系モルモット（３００〜３５０グラム）に、ＩＶカロチドカテーテルを介して本発明の植物を基にした四量体シアリル化ＢｕＣｈＥ  ５２．３ｍｇ／ｋｇを投与した。１５分後に、対象動物にＬＤ５０の３倍のＧＢを、Ｓ．Ｃ．注射により暴露した（ｎ＝６）。各試料において、動物全てが２４時間生存し、ＯＰ中毒の兆候は認められなかった。モルモットにおいてテストされた材料を生成するために用いられた一過性シアリル化方法論と比較して、タンパク質をシアリル化することが可能なトランスジェニック植物を用いて産生されたｒＢｕＣｈＥの四量体化とシアリル化が同レベルであったため、遺伝子導入により得られた生成物に関して類似の有効性結果が推測された。
【００２２】
これらのデータから、この方法論が、測定可能なシアリル化を示す生成物の選択的単離よりもむしろｒＢｕＣｈＥの全体的単離から、効率的な四量体生成物（６０％を超える四量体形成を有する）および高度にシアリル化された生成物（５０％を超えるシアリル化を有する）を生成することが示される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．Ｍａｒ  １１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２１８４１６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．  ２０１４  Ａｐｒ；９（４）：５０１−１０１７）。これらの文献では、トランスフェクトされた葉からの間隙画分（アポプラスト）から得られたｒＢｕＣｈＥのみが、４０％を超えるシアリル化を示している。さらにこの領域における過去の研究では、ｒＢｕＣｈＥの非常に低い発現により、精製された材料がいずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分析されず、クーマシーブルーまたは他の染色剤により直接視覚化されなかった、とする生成方法が繰り返し示された。そのような過去の研究は、オリゴマー化、特に安定した四量体の形成を実証するデータを提示していない。タンパク質の非常に低い全体的収率と、ＥＲ内およびアポプラスト内に配置された非対象にシアリル化された生成物との組み合わせにより、生成された四量体およびシアリル化生成物が全体として極めて低レベルになっている。低い効率レベルと、シアリル化ｒＢｕＣｈＥ材料を均質なレベルに精製することの本質的な難しさが、このタンパク質のＰＫ特性の確定的測定の欠如、およびそのような材料を含む任意のＰＫ分析の欠如に寄与している。加えて、ｒＢｕＣｈＥの遺伝子導入による発現が、約５０％の四量体形成をもたらすことが見出されたが、そのような生成物で得られたｔ１／２測定値が、特にネイティブ植物産生形態において非常に低かった（約４分）（Ｇｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２３，２０１０，ｖｏｌ，１０７，ｎｏ．４７，２０２５１−２０２５６１１）。有意で生物学的に関連するＰＫ特性を実現するようにレベルを増加させるために、酵素とＰＥＧ（５ｋまたは２０ｋ）とのコンジュゲーションが実施された。事実、ＰＥＧ−ｒＢｕＣｈＥコンジュゲートは、３〜５時間の初期クリアランスｔ１／２、２３〜５８時間のｔ１／２（５ｋ  ＰＥＧ）、および二相型ＰＫプロットの第二の緩やかなクリアランス相での値については約１５時間のｔ１／２（２０ｋ  ＰＥＧ）を示している。これとは逆に、本明細書に開示された一過性の方法は、Ｃｅｙｅｒらの一過性の方法に比較して、植物中のｒＢｕＣｈＥの四量体形成を有意に改善する手法を提供し、ＰＥＧ修飾トランスジェニック植物産物と比較して、改善されたＰＫ特性を有するインビボシアリル化生成物を生成する（ＰＥＧ修飾トランスジェニック生成物の最大５８時間と比較して、特にＰＥＧ生成物の第二のクリアランス相と比較して、シアリル化四量体植物産物はＩＶで６３．４時間、そしてＩＭで８６時間）。さらに遺伝子導入方法論では、非効率的収率および非常に低い生成物蓄積が示される（基本的に、Ｃｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００８１；Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０２；Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１３；およびＣａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１４に開示される通り、経済的視点から不適切である量）。加えて、Ｉｌｙｕｓｈｉｎａら（ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１２１１１１８１１０１４）は、遺伝子導入された哺乳動物細胞から７０％までの四量体蓄積を示している。哺乳動物が産生した酵素のｔ１／２は、ネイティブな哺乳動物グリコシル化（シアリル化がない）が存在する場合には、ラットおよびマウスでそれぞれ約１５〜１６時間と測定されている（Ｄｕｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｉｌｙｕｓｈｉｎａらは、ｒＢｕＣｈＥ四量体を産生および精製するための哺乳動物細胞内でのインビトロポリシアリル化法を開示している。しかしこのエクスビボシアリル化方法論は、植物からインビボシアリル化四量体タンパク質を産生する本発明の方法よりも低効率で高価であり、薬物動態プロファイルに関して魅力が小さかった。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞からのネイティブ産生ｒＢｕＣｈＥは、マウスにおいて３〜４時間のｔ１／２を示す。インビトロシアリル化は、ＰＫプロファイルを１６〜２３時間に改善する。しかしこれらの時間は、本明細書に開示された植物産生インビボシアリル化ｒＢｕＣｈＥで観察されたものよりも約３倍短い。これらのデータは、シアリル化四量体ｒＢｕＣｈＥを生成する一過性植物発現法の優越性を示している。さらに、以下により詳細に開示される通り、一過性発現ｒＢｕＣｈＥのトランスジェニックシアリル化は、特に規模および製造の経済性に関して、一過性アプローチと同等のシアリル化および四量体化効率を生じる。
【００２３】
さらなる判断材料として、ヒトタンパク質をシアリル化する能力を呈した所有権のある哺乳動物細胞株ＰｅｒＣ６がある（Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００９５）。しかしそのような研究は、ペプチドの四量体化とＰｅｒＣ６シアリル化との組み合わせを可能にする示唆のレベルに及ばなかった。例えばＹｉｍ  ｅｔ  ａｌ．６への米国特許第８，７２９，２４５号には、四量体サイズによる、大部分の四量体ｒＢｕＣｈＥの生成に関与する難題が記載されている。同じく、存在するペプチドの四量体化を含む、または含まない哺乳動物細胞産生ｒＢｕＣｈＥは、四量体と二量体と単量体の形態の混合物で、非常に低収率である。製造工程自体が、非常に複雑であり、得られた半減期は、非常に短期間であり（安定性のためにペグ化が必要）、得られた生成物は、全体的構造が非常に不均質であり（そしてその結果、特徴づけおよびＦＤＡ認可の獲得がどちらかといえば困難であり）、非常に高い製造コストになる。結果として、このＹｉｍらの開示は、ｒＢｕＣｈＥの切断された単量体形態が中心で、四量体シアリル化構造ではない。そのような道筋は、表向きは収率、コスト、および最終生成物の特性に関して存在する難題のせいで、この業界の典型となった。したがってＹｉｍらの研究は、ＰｅｒＣ６細胞内の単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥの産生に限定された。加えて、そのような開示は、そのような生成物の生化学的特徴づけに限定され、実際の薬物動態挙動に関するものではない。本明細書に記載された本発明から、単量体／二量体シアリル化生成物が生存動物中でかなり低い安定性を示すことが実証されている（表１〜２；１６〜１７）。加えて、適正なグリコシル化および／またはシアリル化の欠如による二量体／四量体シアリル化生成物の安定性の論争が存在するというＹｉｍらの論点が不正確であると、以下に示されている（以下の表１６）。それゆえ、本明細書に記載された方法は、ネイティブヒトＢｕＣｈＥと類似の薬物動態活性を有するｒＢｕＣｈＥのシアリル化四量体形態を高収率で生成するための当該技術分野で未知の方法を実証した。
【００２４】
したがって本発明の植物を基にした手順により作製された基本的生成物に関して、ＯＰ防御への大きな期待が示されている。単糖およびオリゴ糖の同定およびプロファイリングをはじめとする、四量体構造でのシアリル化の程度およびタイプに関係するさらなる試験も、以下に示した。加えて、先に示唆された通り、連続的で拡大可能な生成物製造目的のための植物系統を提供する能力を、全体的信頼性の問題のために検討し、必要な四量体化形態を即座に生成するさらなる能力を、そのような目的に関する本発明の方法の実行可能性を示すために実行した。さらに、そのような四量体化形態でのグリカン形成の能力が、拡大可能かつ反復可能な工程であることが示された。最後に、即座に入手可能で信頼性のある生成手段のためにこの手法で作製された種子系統の能力が立証された。ｒＢｕＣｈＥを生成するためのこの植物由来の方法は、費用効果のある手法でもある。本質的に、植物を基にした系を利用して規模の経済性を活用すること、および製造工程を最適化することで、最終生成物の有効性を損なうことなく商業的な規模拡大性が可能になる。そのような全体的製造能力および効果的処置を、以下により詳細に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】全体的なｒＢｕＣｈＥ生成システムの植物トランスフェクション手順の技法を示す。
【図２】図１の「大規模な」トランスフェクション手順の図を示す
【図３】本発明の方法により生成された単量体ｒＢｕＣｈＥの試料の図を示す。
【図４Ａ】本発明の生成方法のシアリル化経路を提供するｐＩＣＨ８８２６６の多重遺伝子構築物を組立てるためのレベル１発現カセットの略図である。
【図４Ｂ】シアリル化経路を提供する多重遺伝子構築物ｐＩＣＨ８８２６６を組立てるためのレベルＭ中間構築物の略図である。
【図４Ｃ】シアリル化経路を提供する最終構築物ｐＩＣＨ８８２６６の略図である。
【図５】ＢｕＣｈＥ遺伝子を運ぶ一過性ベクターと、ｐＩＣＨ８８２６６ベクターを含有するアグロバクテリウム培養物の異なる希釈物との共浸潤の後の、粗植物抽出物中の本発明のブチリルコリンエステラーゼ（ｒＢｕＣｈＥ）活性の測定を示す。
【図６】本発明の生成方法におけるシアリル化経路を提供するｐＩＣＨ８８２６６ベクターの異なる希釈物について、ｒＢｕＣｈＥシアリル化レベルのウェスタンブロット分析を示す。
【図７】本明細書に記載された方法の可能な実施形態により生成された本発明のシアリル化四量体生成物の特性の測定を示す。
【図８】一過性共発現方法を利用して単量体および四量体ｒＢｕＣｈＥのシアリル化の実演を示す。
【図９】ネイティブ血清由来ＢｕＣｈＥ生成物のデータを示す。
【図１０】本発明の内在性シアリル化生成物のために用いられる命名法の叙述を示す。
【図１１】外因性遺伝子シアリル化の遺伝子導入生成に用いられた方策の叙述を示す。
【図１２】ｒＢｕＣｈＥを発現する一過性ベクターがトランスフェクトされたＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−８８２６６＃１１植物から産生されたｒＢｕＣｈＥの末端シアル酸残基の立体配座の方法の詳細を示す。
【図１３】Ｔ２植物系統におけるシアリル化ｒＢｕＣｈＥの発現のブロット結果を示す。
【図１４】血漿由来ＢｕＣｈＥを用いた、植物産生の遺伝子導入でシアリル化されたｒＢｕＣｈＥへの様々なＯＰ神経剤、ＧＡ、ＧＢ、ＧＤ，ＧＦ、ＶＸおよびＶＲの結合をテストすることに関係した結果の叙述を示す。
【図１５】各変異体の単一静脈内用量２５ｍｇ／ｋｇを投与された雄ハートレー系モルモットからの血漿中ｒＢｕＣｈＥ活性を示す。
【図１６】単一ＩＶまたはＩＭ用量２５ｍｇ／ｋｇを投与された雄ハートレー系モルモットの血漿中のｒＢｕＣｈＥ活性を示す。
【図１７】単一ＩＶまたはＩＭ用量２５ｍｇ／ｋｇを投与された雄ハートレー系モルモットの血漿中のｒＢｕＣｈＥ活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
好ましい実施形態および図の詳細な説明
以下の記述および添付の図の説明は、特に本発明の可能な実施形態に関係する情報を提供することを意図するものである。本発明全体の大きさおよび範囲の限定のいずれも、本明細書に提供された開示により解釈されるべきではない。
【００２７】
本明細書で用いられる以下の用語は、以下の通り理解されるものとする：
【００２８】
「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」または類似の言語は、細胞（ネイティブまたは非ネイティブのいずれかにかかわらず）の中での遺伝子材料の発現を可能にするための、そのような細胞内の核酸の計画的導入を意味するものとする；
【００２９】
「ベクター」または「複数のベクター」または類似の言語は、外来遺伝子材料を細胞（ネイティブまたは非ネイティブのいずれかにかかわらず）内に転移することで細胞内部での遺伝子発現を可能にするビヒクルとして働くＤＮＡ分子（例えばプラスミドなど）を意味するものとする；
【００３０】
「発現」または「遺伝子発現」または類似の言語もしくは複数の言語は、次の機能的遺伝子産物を合成するために遺伝子からの情報を伝達する工程を意味するものとする；
【００３１】
「内在性」は、細胞、組織または生物体内を起源とすることを意味する；
【００３２】
「トランスジェニック」または「遺伝子導入」または類似の言語は、後に生物体の子孫に伝達される新しい特性の移行のために生存生物体に遺伝子を導入する工程を意味するものとする。なお、本明細書に記載された遺伝子導入方策の全てに、遺伝子発現を可能にするベクターの利用が含まれた。
【００３３】
実施例１：ＮｂＲＮＡｉＤＸＦ植物中の単量体／二量体ｒＢｕＣｈＥの生成
本発明の生成系は、一過性の植物ウイルスに基づく生成系を含むアグロバクテリウム株の植物への浸潤により開始された一過性で最小のウイルスに基づく系を用いる。その技術および応用は、数多くの刊行物に記載されている。この一過性の系（図１）は、新鮮なバイオマス１キログラム（ｋｇ）あたりに可溶性タンパク質総量が１グラム（ｇ）を超えるレベルで、サイトカイン、インターフェロン、細菌およびウイルス抗原、成長ホルモン、ワクチン抗原、一本鎖抗体、ならびにモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をはじめとする数多くの異種タンパク質の発現の実証によって、多様性が立証された。
【００３４】
図１に示された通り、Ｔ−ＤＮＡボーダーにより挟まれたウイルスベクター（遺伝子成分および外来遺伝子（緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ）の挿入が記載された拡大図に示す）を含むプラスミドが、左上図に示されている。このプラスミドをアグロバクテリウム株にトランスフェクトして、全植物に浸潤するために発育および使用し、植物の全ての葉をベクターで同時感染させた。アグロバクテリウムは、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞核に送達し、そこで植物のポリメラーゼが感染性ウイルスベクターの転写産物を産生し、細胞質に輸送した後、高レベルまで複製して、左下図に認められる通り、隣接する細胞に感染を拡大して浸潤された葉全体で高レベルの組換えタンパク質（ＧＦＰ）を産生するために、移行タンパク質を独立して産生する。
【００３５】
さらに、用いられたベクターは、２種の異なる植物ウイルスゲノム：ＴＭＶ関連ウイルスであるターニップベインクリアリングトバモウイルス（ＴＶＣＶ；図１）またはポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）から構築される。ウイルスＲＮＡ複製のために必要な遺伝子全てをコードするウイルスレプリコンのｃＤＮＡを、アグロ浸潤工程によって開始され、そこでは最初、導入されたアグロバクテリウム細菌ベクターにより運搬されるウイルスベクターを、トランスフェクト植物全体の多くの細胞に導入する。その後、ベクターを、トランスファーまたはＴ−ＤＮＡ領域からの転写により「活性化」し、インビボでウイルスＲＮＡを産生し、それをウイルスコード化タンパク質を介してＲＮＡ増幅のために細胞質に輸送する。これらのベクターは、トバモウイルスを基にしたベクターおよびそのトリプルブロック産物からの移行（３０Ｋ）タンパク質、ならびにポテックスウイルスを基にしたベクターのためのコートタンパク質を含む細胞移行に必要なタンパク質をコードする。これらのタンパク質は、接種された葉の中でウイルスベクターゲノムを部分的に移動させて細胞の大部分を感染させ、５〜１０日という短期間で所望のタンパク質生成物の生成部位になる。植物の空気中の部分は、一般に接種後（ｄｐｉ）６〜８日までに回収され、所望の生成物について抽出される。一過性のｒＢｕＣｈＥ産生の場合、アグロバクテリウム細胞株中で異なるＴＶＣＶおよびＰＶＸベクター（オオムギαアミラーゼシグナルペプチドに融合された全長ＢｕＣｈＥヒト遺伝子（ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７；ＴＶＣＶベクター））が用いられる。この実施例は、野生型ｒＢｕＣｈＥの発現、蓄積、精製および特徴づけを詳述しているが、これらの方法は、コカイン解毒のために最適化されたものなど、任意のＢｕＣｈＥ変異体に適用し得る（Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４１７）。野生型ｒＢｕＣｈＥの発現は、ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７構築物単独のトランスフェクションにより実施されて、単量体ｒＢｕＣｈＥ生成物を生じる。
【００３６】
植物における単量体ｒＢｕＣｈＥの一過性発現の場合、ニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｂ）植物に、ウイルス発現ベクターをコードするプラスミドを含むアグロバクテリウム株を浸潤させる。Ｎｂ植物を、２２〜２４℃の密閉された生育ルーム内で２４〜２６日間生育させて、真空浸潤法に用いた。ｒＢｕＣｈＥ（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）のために一夜生育されたアグロバクテリウム培養物を、浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．５）中で混合した。ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７を１：１０００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈した。産生は、野生型およびトランスジェニックＮｂ植物系統中で実施され、ＲＮＡｉ技術を利用して、キシロースおよびフコースの両方のトランスフェラーゼ活性をノックダウンした（ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ）。ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ植物から得られたタンパク質は、高度に均質な哺乳動物グリコフォームを示し、内在性および組換えタンパク質のほとんどが、いかなる植物特異性フコースまたはキシロース残基を含まない。浸潤溶液を、ケンタッキー・バイオプロセシングによる注文製の真空（浸潤）チャンバーに移した（図２に示す）。植物全体の空気中の部分を、さかさまにして細菌／緩衝溶液に沈め、２４水銀柱インチの真空を２分間適用して開放した。回収植物のバイオマス８０ｋｇの場合、浸潤溶液２８０Ｌが、ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７  ２８０ｍＬを要しながら生成された。浸潤後に、植物を標準生育条件下の生育ルームに戻した。植物全体の空気中の部分の回収を、７ｄｐｉ（浸潤後日）に行った。
【００３７】
図２にさらに示された通り、プラスミドベクター（左上）を特徴づけて、ＭＣＢおよびＷＣＢ誘導体化および特徴づけのためにアグロバクテリウム株に形質転換する。ＷＣＢを、浸潤のために増幅し、特別に設計されたふたを有するトレイに植物を播種して生育させ、土壌および根の成分のためのバリアを設けた。適切なサイズに植物が生育した後、トレイがコンベヤに載せられて、真空規格のチャンバーに入る（右上にドア開放前および後と中身のない様子が示される）。コンベアは、１８０°回転してチャンバーに入り（右下）、植物をアグロバクテリウム含有溶液に沈めて、真空を適用して開放する。植物をチャンバーから取り出し、余分な溶液を排出して、右上の位置に回転させ、続いて生育のため、そして生成物の蓄積、抽出および精製のために温室に移す（左下）。
【００３８】
さらに、得られた単量体／二量体ｒＢｕＣｈＥを精製するために、規模拡大可能な抽出、透明化、および非親和性精製の方法論を開発した。リン酸緩衝液の存在下、感染したバイオマスの機械的分解を利用して、酵素抽出を完遂した。最初の抽出物を、ｐＨ変化と、その後のプレート／フレームフィルタープレスおよび珪藻土フィルターエイドを用いた深層ろ過を利用して透明化させた。カプト・アドヒア（商標）マルチモーダル樹脂（ＧＥヘルスケア）を用いて透明化された抽出物からｒＢｕＣｈＥを捕捉し、ｐＨ低下を利用して溶出を完遂した。その後、捕捉ステップからの溶離液を低導電率まで希釈して、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型マルチモーダル樹脂（バイオラッド・ラボラトリーズ）に加えた。塩化ナトリウム勾配の上昇を利用してＣＨＴからｒＢｕＣｈＥを溶出し、高濃度のリン酸ナトリウムを使用して宿主タンパク質をカラムから剥離させた。ＣＨＴ溶離液を１％ｖ／ｖトリトンＸ−１１４と共にインキュベートした後、加熱して、エンドトキシンの大部分を含む沈殿した洗浄剤の相を生成させた。その後、水相（上清）を洗浄剤相から取り出し、最終的な研磨に備えて低導電率まで希釈した。ｒＢｕＣｈＥをカプトＱ（商標）強陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合させ、その後、緩衝液で大規模に洗浄してカラムから洗浄剤を完全に洗い流すことにより、残留する洗浄剤を除去した。カプトＱからのｒＢｕＣｈＥの溶出は、塩化ナトリウム勾配の上昇を利用して完遂した。その後、カプトＱ溶離液をアルギニン含有リン酸緩衝生理食塩水に透析ろ過し（ｄｉｆｉｌｔｅｒｅｄ）、次にタンジェンシャルフロー限外ろ過を利用してほぼ２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．２μｍろ過を利用して原薬物質を滅菌して、２〜８℃で貯蔵した。
【００３９】
したがって本発明の手順は、ｒＢｕＣｈＥにおける四量体形成を実現するための多重遺伝子発現方策と、他の実施例に示されたようなインビボでの生成物のシアリル化をもたらす宿主修飾とを統合しながら、発表されたトランスジェニック植物のアプローチよりも数倍高いレベルでｒＢｕＣｈＥを発現するＮｂ宿主植物と共に、この植物の一過性発現技術を利用することを含む。この技術の系は、遺伝子発現を開始するための、Ｎｂ植物への、ＤＮＡ発現ベクター含有アグロバクテリウム株の規模拡大可能な浸潤に依存する。この系を用いて、９５％純度を超える単量体／二量体ｒＢｕＣｈＥを１グラム量ロットよりも多く生成した。この酵素（約１．５グラム／ロットを生成）は、図３に示された通り、米国陸軍化学防衛医学研究所（Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｅｎｓｅ）により提供されたトランスジェニックヤギ供給源から精製された陽性対照材料と類似の、高い酵素活性を示す。特にこの図は、本明細書に記載された植物由来の工程を通して生成された単量体ｒＢｕＣｈＥの１グラムを超える生成ロットからの試料が、Ａに示された通り９５%を超える純度を呈することを示している。全ての非全長のバンドは、生成物の起源を示す抗ＢｕＣｈＥ抗体に対して免疫応答性がある。その生成物のオリゴマー状態をＢに示しており、６４％を超える単量体構造が実証されている。対照と比較した本発明の生成物の比活性をＣに示しており、同じくそのようなヤギ由来生成物と同等の結果であることが示される。
【００４０】
実施例２：一過性シアリル化ベクターの作製
シアル酸を合成してガラクトースおよびシアル酸を植物ゴルジ体内の末端Ｎ結合グリカン構造に転移させるために、該タンパク質をコードする遺伝子を含むように、多重遺伝子構築物を設計および構築した。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、本発明の一過性ベクター作成手順の様々な例を示している。図４Ａでは、合成およびＮ−グリカンへのシアル酸転移に必要な遺伝子の発現のための６つと、トランスジェニック植物の作製のための１つの選択マーカと、の７つの発現カセットからなるプラスミド構築物ｐＩＣＨ８８２６６を示している。各発現カセットは、プロモータと、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）と、タンパク質コード配列（ＣＤＳ）と、ターミネータとからなる。様々な構造は以下の通り定義される：Ａｃｔ２  −  アラビドプシス・アクチン２遺伝子のプロモータ；Ａｃｔ２ｔｅｒ  −  アラビドプシス・タリアナ・アクト２遺伝子の転写終結配列；ＣＭＰ−ＳＡＳ  −  ホモサピエンスＮ−アシルノイラミナートシチジリルトランスフェラーゼ遺伝子；ＳＰＭ  −  ジーメイズ・Ｓｐｍ転移性要素ＭＰ遺伝子のプロモータ；ＧＣＲＰｔｅｒ  −  アラビドプシス・タリアナＧＣＲＰ（Ｇ共役受容体タンパク質）遺伝子転写終結配列；ＢＡＲ  −  ストレプトマイセス・ヒグロスコピクスのホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子；Ω  −  タバコモザイクウイルスの５’−非翻訳リーダー配列（オメガと呼ばれる）；ＮＯＳ  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンス・ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子のプロモータ；ＮＯＳｔｅｒ  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンス・ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の転写終結配列；ＧＮＥ  −  ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードするムス・ムスキュラス遺伝子；３５Ｓｔｅｒ  −  カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ遺伝子転写終結配列；ＳＡＳ−  Ｎ−アセチルノイラミン酸９−ホスファートの合成を触媒するホモサピエンスシアル酸シンターゼ遺伝子；３４Ｓ  −  フィグワートモザイクウイルスの３４Ｓプロモータ；Ｒｂｃｓ１ｔｅｒ  −  アラビドプシス・タリアナＲｂｃｓ１（リブロース−１，５−ビスホスファートカルボキシラーゼ小サブユニット）遺伝子転写終結配列；ＣＳＴ  −  ムス・ムスキュラスＣＭＰ−シアル酸トランスポータ（ＣＳＴ）遺伝子；Ａｔ  Ｒｂｃｓ１Ｂ  −  アラビドプシス・タリアナのＲｂｃｓ１（リブロース−１，５−ビスホスファートカルボキシラーゼ小サブユニット）遺伝子のプロモータ；ＬＨＢ１Ｂ２  −  アラビドプシス・タリアナのＬＨＢ１Ｂ１（集光性クロロフィルタンパク質複合体ＩＩサブユニットＢ１）遺伝子のプロモータ；ｒＳＴ  −  ラツス・ノルベギクスβ−ガラクトシドα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１遺伝子；ＧＡＬ  −  ホモサピエンスβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子；ＡＧＳｔｅｒ  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉ−プラスミドからのアグロシノピンシンターゼ（ＡＧＳ）遺伝子転写終結配列；ＳＴＬＳ  −  ソラヌム・ツベロスムＳＴＬＳ（光誘導性組織特異性）遺伝子のプロモータ；ｇ７ｔｅｒ  −  アグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ−ＤＮＡからの遺伝子７転写終結配列；ｒＳＴ-。
【００４１】
構築物の組立ては、多重遺伝子構築物のためのモジュラークローニング（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１１５、ならびにＷｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１および２０１２１６内に示される）と併せてゴールデンゲートクローニング技術（Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８７に示される）を用いて実施した。最初、全ての基本的要素を、Ｂｓａ１認識部位を含むレベル０ベクター内でクローニングして、各タイプのモジュールに特異的な４ｂｐオーバーラップ（例えば、ＣＤＳモジュールの場合ＡＡＴＧおよびＧＣＴＴ）を作製した。その後、ゴールデンゲート制限／ライゲーション手順を利用して、レベル０モジュールをレベル１発現カセットに組立てた。レベル１ベクターを、７つの位置のうちの１つに特異的なＢｐｉ１認識部位により骨組みをつくり、最終的な構築物中の発現カセットの順序を画定する。２つのさらなる位置は、トランスジーン挿入部位の分析を容易にする開始および末端配列の２つの約４００ｂｐランダム配列に含まれた。モジュラークローニングシステムは、１つが１つの反応で６つのレベル１構築物を組立て得るように、設計される。７つの遺伝子および２つのランダム配列（即ち、９つのレベル１ベクター）が、最終的な構築物に必要なため、組立てを２つのステップで実施した。両末端のＢＡＲ遺伝子発現カセットおよびランダム配列を、他の遺伝子の組立て前にデスティネーションベクターに導入した。
【００４２】
最初のステップにおいて、レベル１構築物を、それぞれ２つのレベルＭベクター内でのＢｐｉ１ゴールデンゲート反応を介して組立て（図４Ｂ）、適合性のあるＥｓｐ３Ｉ部位により骨組みを作る。したがって最後の反応において、２つのレベルＭ構築物が、レベルＰベクター内で組立てられて、構築物ｐＩＣＨ８８２６６を与える（図４Ｃ、上）。
【００４３】
ｐＩＣＨ８８２６６用に用いられた以下の基本的要素を、表３に表す。
【表３】
0006689742.tif 000005
【００４４】
実施例３：組換えにより植物で産生されたタンパク質の一過性シアリル化工程のテスト
ｒＢｕＣｈＥ（ウイルス発現ベクター）をシアリル化経路ベクターｐＩＣＨ８８２６６と一過性に共発現させる場合には、通常、後者のベクターを抱えるアグロバクテリウムの一夜培養物の１：１０希釈物が用いられる。ウイルス発現ベクターは、上記の技術に基づいており（Ｇｌｅｂａ，  ｅｔ  ａｌ．，２００５９；Ｇｌｅｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７１０）；バイナリーベクターは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）またはポテトウイルスＸ（ＰＶＸ）からの要素を用いてアイコン・ジェネティクスにより開発されている（Ｇｉｒｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６８）。ｐＩＣＨ８８２６６がウイルスベクターでなく、感染細胞からの拡散（短距離移動）が可能でないことを考慮すれば、植物の大規模浸潤のために、ｐＩＣＨ８８２６６を含むアグロバクテリウム培養物が多量に必要となろう。少量のアグロバクテリウムを使用する可能性を検討するために、ＢｕＣｈＥウイルス発現ベクターとの共発現に用いられるベクターｐＩＣＨ８８２６６を抱えるアグロバクテリウム培養物のより高希釈のものを用いた実験を実施した。一夜培養物（ＯＤ６００で約２）の１：１０、１：２５、１：５０、１：１００、１：５００および１：１０００希釈物を、ｒＢｕＣｈＥのシアリル化をもたらすことに関して比較した。
【００４５】
ニコチアナ・ベンタミアナの野生型植物に、１：１０００希釈のＢｕＣｈＥウイルス発現構築物（ｐＩＣＨ９２６３１）を抱えるアグロバクテリウム、およびシアリル化経路構築物ｐＩＣＨ８８２６６の異なる希釈物を浸潤させた。精製の前に、浸潤７日後の植物組織から回収された粗植物抽出物（１ｍＭ  ＥＤＴＡを補充された０．２Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６  ０．３ｍｌ中に抽出された植物組織１００ｍｇ）を、エルマンアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ，１９６１６）を利用してＢｕＣｈＥ活性について予備テストした。予備テストの結果を、図５に示す。この図５において、示されたテスト対象は、以下の通りである：非浸潤  −  任意のベクターを有さない植物組織；ｗ／ｏ  ｐＩＣＨ８８２６６  −  ＢｕＣｈＥを発現する一過性ベクターのみが浸潤された植物組織；他の列は、ＢｕＣｈＥを発現するウイルスベクターと、ベクターｐＩＣＨ８８２６６の異なる希釈物（一夜培養物の１０倍〜１０００倍希釈物）とが共浸潤された植物組織に対応する。
【００４６】
この予備テストの後、ＨｉｓタグＢｕＣｈＥを、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて異なる試料から精製した。シアル酸の検出のために、同等量の精製ＢＣＨＥ（それぞれ約２μｇ）を、ＳＤＳを補充されたポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットして、ビオチン化ＳＮＡレクチン（グリカンへのシアル酸のα−２，６結合中で優先的に末端ガラクトースに付着したシアル酸に結合し、より少ない程度にα−２，３結合中で結合する、サムブクス・ニゲラのレクチン；ベクター・ラボラトリーズ、英国ピーターバラ所在）およびストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ライフ・テクノロジーズ、ドイツ  ダルムシュタット所在）でプローブした。シアリル化ｒＢｕＣｈＥの検出を確認するために、膜を剥離させて、ヤギ抗ＢＣＨＥポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー、ドイツ  ハイデルベルグ所在）および抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ・アルドリッチ、ＵＳＡセントルイス所在）でリプローブした。ｒＢｕＣｈＥのシアリル化は、テストした希釈物全てで検出されたが、１：１０〜１：１００希釈物でより強くなった。加えて、ｒＢｕＣｈＥシアリル化に対応するタンパク質サイズのシフトが、１：１０〜１：１００希釈物で目視できた。ウェスタンブロット分析の結果を、図６に示す。この図において、上のパネルは、ｐＩＣＨ８８２６６を輸送するアグロバクテリウムの異なる希釈物と共浸潤された葉から単離された精製ｒＢｕＣｈＥのウェスタンブロットを示している。このブロットを、シアル酸の検出のために、ビオチン化ＳＮＡレクチン（サムブクス・ニゲラのレクチン；ベクター・ラボラトリーズ、英国ピーターバラ所在）およびストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ライフ・テクノロジーズ、ドイツ  ダルムシュタット所在）でプローブした。下のパネルは、ヤギ抗ＢｕＣＨＥポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー、ドイツ  ハイデルベルグ所在）および抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ・アルドリッチ、ＵＳＡセントルイス所在）でリプローブされた同じブロットを示している。
【００４７】
これらの結果から、ｐＩＣＨ８８２６６を含むアグロバクテリウムの１：１００までのより高希釈のものを基本的に用いることができたが、その結果が定量的でなかったことが示される。それゆえ、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００のｐＩＣＨ８８２６６希釈物を用いた試料のＭＡＬＤＩ分析を実施した。遊離グリカンの分析から、分析された全ての希釈物について、類似量のシアリル化が示された（１：１０希釈物：４６％；１：２５希釈物：４９％；１：５０希釈物：５７％；１：１００希釈物：４２％。詳細を以下の表４により効果的に示す）。結論として、ｐＩＣＨ８８２６６を抱えるアグロバクテリウムの１：５０または１：１００希釈物を、ＢＣＨＥの大規模生成に用いることができる。
【表４】
0006689742.tif 000006
【００４８】
実施例４：一過性シアリル化法を利用したΔＸＴＦＴ  Ｎ．ベンタミアナ（８０ｋｇ  植物バイオマス）におけるｒＢｕＣｈＥの一過性シアリル化四量体形態の産生
ｒＢｕＣｈＥのシアリル化を、（ａ）一過性または（ｂ）遺伝子導入方策、のいずれかを利用して実現することができる。一過性方策（ａ）は、適切なアグロバクテリウム株中のｐＩＣＨ８８２６６植物発現ベクターを伴う、ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７単独でのコトランスフェクション、またはポリプロリン接着ドメイン（ＰＲＡＤ）ペプチド発現ベクターと一緒のコトランスフェクションを含む（それぞれ単量体または四量体生成物に関して先に記載）。ＰＲＡＤペプチドを、ヒトおよびウマＢｕＣｈＥと関連して同定した（Ｄｕｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２５；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００８１２；Ｉｌｙｕｓｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３１１）。哺乳動物細胞中の実験から、ＰＲＡＤペプチドの共発現が高レベルの四量体化ｒＢｕＣｈＥを生成し得ることが示唆される。しかし今日まで、哺乳動物細胞中で効率的に四量体化されたシアリル化ｒＢｕＣｈＥを生成した人はいなかった（上記の参考資料参照）。以下に記載される方法から、ｒＢｕＣｈＥによるＰＲＡＤ共発現が、一過性および遺伝子導入的方法論の効率によりシアリル化され得るｒＢｕＣｈＥ四量体形成を、６０％を超える高割合でもたらすことが実証される（シアリル化された結合の約７０％）。
【００４９】
ｐＩＣＨ８８２６６プラスミドは、シアル酸をＢＡＲ選択マーカ遺伝子と共に植物ゴルジ体中で、合成させ、機能化させて、発生期グリカン株に転移させることが可能な、７つの遺伝子の発現構築物を含む。
【００５０】
四量体ｒＢｕＣｈＥを生成するために、ＰＲＡＤまたは四量体化ペプチドを発現する一過性ベクターのコトランスフェクションをテストした。以下のＰＲＡＤ配列（アミノ酸）を用いて、植物体において発現する遺伝子構築物を生成した。
１．ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧＡＰＳＰＰＬＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＬＰ
２．ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧＡＣＣＬＬＭＰＰＰＰＰＬＦＰＰＰＦＦ
３．ＭＡＮＫＨＬＳＬＳＬＦＬＶＬＬＧＬＳＡＳＬＡＳＧＡＣＣＬＬＭＰＰＰＰＰＬＦＰＰＰＦＦＤＹＫＤＤＤＤＫ
４．ｍａｎｋｈｌｓｌｓｌｆｌｖｌｌｇｌｓａｓｌａｓｇＡＱＰＴＦＩＮＳＶＬＰＩＳＡＡＬＰＧＬＤＱＫＫＲＧＮＨＫＡＣＣＬＬＭＰＰＰＰＰＬＦＰＰＰＦＦ
【００５１】
４つの遺伝子全てを、Ｎｂコドンバイアスに向けて最適化し、合成した。これらのうち、ＰＲＡＤペプチド１（ラメリポジン由来）およびＰＲＡＤペプチド４（コラーゲン様ＣｏＩＱ由来）は、ＰＶＸ一過性ベクターへのクローニングに成功した。不幸にもタンパク質２および３をコードするＰＲＡＤペプチド構築物は、クローニングに成功しなかった。両方の構築物が、四量体様のタンパク質を生成し、ＰＲＡＤペプチド４が、時間的制約のため、連続テスト用に選択された。
【００５２】
植物における四量体−シアリル化ｒＢｕＣｈＥの一過性発現のために、上記のトランスフェクション手順をわずかに改変して用いた。２２〜２４℃の密閉生育ルーム内で２４〜２６日生育させた植物を、真空浸潤に用いた。ｒＢｕＣｈＥのための一夜生育させたアグロバクテリウム培養物（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）と、ＣｏＩＱからの四量体化ペプチド（ベクターＩＤ：テトラ４［他の試験で同様に働くことが示されたＣｏＩＱおよびラメリポジンの両方のベクター］）と、シアリル化経路（ベクターＩＤ：ｐＩＣＨ８８２６６）とを、浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．５）中で混合した。ベクターｐＰＢＣＨＫＢＰ００７を１：１０００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、テトラ４を１：２００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、ｐＩＣＨ８８２６６を１：１０（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈した。浸潤溶液を注文製（ケンタッキー・バイオプロセシング、ケンタッキー州オーウェンズボロ所在）の真空チャンバーに移した。植物全体の空気中の部分を、さかさまにして細菌／緩衝溶液に沈め、２４水銀柱インチの真空を２分間適用して開放した。回収植物のバイオマス８０ｋｇの場合、浸潤溶液２８０Ｌが、ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７  ２８０ｍＬ、ベクターテトラ４  １．４ＬおよびベクターｐＩＣＨ８８２６６  ２８Ｌを要しながら生成された。浸潤後に、植物を標準生育条件下の生育ルームに戻した。植物全体の空気中の部分の回収を、７ｄｐｉ（浸潤後日）に行った。
【００５３】
四量体ｒＢｕＣｈＥを精製するために、規模拡大可能な抽出、透明化、および非親和性精製の方法論を開発した。リン酸緩衝液の存在下、感染したバイオマスの機械的分解を利用して、酵素抽出を完遂した。最初の抽出物を、ｐＨ変化と、その後のプレート／フレームフィルタープレスおよび珪藻土フィルターエイドを用いた深層ろ過を利用して透明化させた。カプト・アドヒア（商標）マルチモーダル樹脂（ＧＥヘルスケア）を用いて透明化された抽出物からｒＢｕＣｈＥを捕捉し、ｐＨ低下を利用して溶出を完遂した。その後、捕捉ステップからの溶離液を低導電率まで希釈して、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型マルチモーダル樹脂（バイオラッド・ラボラトリーズ）に加えた。塩化ナトリウム勾配の上昇を利用してＣＨＴからｒＢｕＣｈＥを溶出し、高濃度のリン酸ナトリウムを使用して宿主タンパク質をカラムから剥離させた。ＣＨＴ溶離液を１％ｖ／ｖトリトンＸ−１１４と共にインキュベートした後、加熱して、エンドトキシンの大部分を含む沈殿した洗浄剤の相を生成させた。その後、水相（上清）を洗浄剤相から取り出し、最終的な研磨に備えて低導電率まで希釈した。ｒＢｕＣｈＥをカプトＱ（商標）強陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合させ、その後、緩衝液で大規模に洗浄してカラムから洗浄剤を完全に洗い流すことにより、残留する洗浄剤を除去した。カプトＱからのｒＢｕＣｈＥの溶出は、塩化ナトリウム勾配の上昇を利用して完遂した。その後、カプトＱ溶離液をアルギニン含有リン酸緩衝生理食塩水に透析ろ過し、次にタンジェンシャルフロー限外ろ過を利用して少なくとも２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．２μｍろ過を利用して原薬物質を滅菌して、２〜８℃で貯蔵した。最終生成物の特性を、図７に示す。
【００５４】
しかしこの状況において、一過性シアリル化システムを用いて、またはトランスジェニック植物（非限定的な例として以下の実施例５のものなど）の中での、ＰＲＡＤペプチドでの一過性ｒＢｕＣｈＥ発現を含む本明細書に記載された植物を基にした方法論が、トランスフェクト植物細胞全体に蓄積した高シアリル化生成物を生成し、それが選択的ではないが即座に単離され得ることが、決定された。したがって本発明の技術的な新発見は、実行可能性、拡大可能性、および信頼性に関して非常に予想外であっただけでなく、ＯＰ処理分析のための詳細な動物試験に十分な材料を生成するためにより効率的でもあり、さらに高度な費用効果もある、ということである（全体的生成コストを血清由来酵素ＢｕＣｈＥ生成物と比較して１０〜１００倍削減する可能性がある）。
【００５５】
実施例５：一過性シアリル化法を利用したΔＸＴＦＴ  Ｎ．ベンタミアナ（８０ｋｇ  植物バイオマス）におけるｒＢｕＣｈＥの一過性シアリル化単量体形態の産生
植物における単量体−シアリル化ｒＢｕＣｈＥの一過性発現のために、上記のトランスフェクション手順をわずかに改変して用いた。２２〜２４℃の密閉生育ルーム内で２４〜２６日生育させた植物を、真空浸潤に用いた。ｒＢｕＣｈＥのための一夜生育させたアグロバクテリウム培養物（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）と、シアリル化経路（ベクターＩＤ：ｐＩＣＨ８８２６６）とを、浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．５）中で混合した。ベクターｐＰＢＣＨＫＢＰ００７を１：１０００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、ｐＩＣＨ８８２６６を１：１０（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈した。浸潤溶液を注文製の（ケンタッキー・バイオプロセシング、ケンタッキー州オーウェンズボロ所在）真空チャンバーに移した。植物全体の空気中の部分を、さかさまにして細菌／緩衝溶液に沈め、２４水銀柱インチの真空を２分間適用して開放した。回収植物のバイオマス８０ｋｇの場合、浸潤溶液２８０Ｌが、ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７  ２８０ｍＬ、およびベクターｐＩＣＨ８８２６６  ２８Ｌを要しながら生成された。浸潤後に、植物を標準生育条件下の生育ルームに戻した。植物全体の空気中の部分の回収を、７ｄｐｉ（浸潤後日）に行った。
【００５６】
単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥを精製するために、規模拡大可能な抽出、透明化、および非親和性精製の方法論を開発した。リン酸緩衝液の存在下、感染したバイオマスの機械的分解を利用して、酵素抽出を完遂した。最初の抽出物を、ｐＨ変化と、その後のプレート／フレームフィルタープレスおよび珪藻土フィルターエイドを用いた深層ろ過を利用して透明化させた。カプト・アドヒア（商標）マルチモーダル樹脂（ＧＥヘルスケア）を用いて透明化された抽出物からｒＢｕＣｈＥを捕捉し、ｐＨ低下を利用して溶出を完遂した。その後、捕捉ステップからの溶離液を低導電率まで希釈して、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型マルチモーダル樹脂（バイオラッド・ラボラトリーズ）に加えた。塩化ナトリウム勾配の上昇を利用してＣＨＴからｒＢｕＣｈＥを溶出し、高濃度のリン酸ナトリウムを使用して宿主タンパク質をカラムから剥離させた。ＣＨＴ溶離液を１％ｖ／ｖトリトンＸ−１１４と共にインキュベートした後、加熱して、エンドトキシンの大部分を含む沈殿した洗浄剤の相を生成させた。その後、水相（上清）を洗浄剤相から取り出し、最終的な研磨に備えて低導電率まで希釈した。ｒＢｕＣｈＥをカプトＱ（商標）強陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合させ、その後、緩衝液で大規模に洗浄してカラムから洗浄剤を完全に洗い流すことにより、残留する洗浄剤を除去した。カプトＱからのｒＢｕＣｈＥの溶出は、塩化ナトリウム勾配の上昇を利用して完遂した。その後、カプトＱ溶離液をアルギニン含有リン酸緩衝生理食塩水に透析ろ過し、次にタンジェンシャルフロー限外ろ過を利用して少なくとも２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．２μｍろ過を利用して原薬物質を滅菌して、２〜８℃で貯蔵した。
【００５７】
最終的な精製産物へのＳＮＡ反応性は、単量体タンパク質生成物と四量体タンパク質生成物の両方で類似していた。これらのデータから、一過性シアリル化生成物の潜在的有効性と、新しいトランスジェニック植物株からのシアリル化増加の可能性が裏づけられる。これらのデータは、トランスジェニック植物製造方策を利用すれば、かなりの量のインビボシアリル化が可能であることを示唆している（図８など）。図８は、一過性コトランスフェクション法を利用した単量体および四量体ｒＢｕＣｈＥのシアリル化の実演を示している。この手法では、Ｎｂ植物をｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびｐＩＣＨ８８２６６とコトランスフェクトし、単量体生成物のためにｒＢｕＣｈＥおよびシアリル化経路をコード化し、そして四量体生成物の生成のためにｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびｐＩＣＨ８８２６６と、ＣｏＩＱ  ＰＲＡＤペプチドを発現するＰＶＸ一過性ベクターとをコード化した。シアリル化は、シアル酸末端グリカンに結合するサムブクス・ニゲラのレクチンを利用したサンドイッチウェスタンブロットにより決定し、ｒＢｕＣｈＥもまた、抗ＢｕＣｈＥ抗血清により測定した。各シアリル化単量体および四量体の純度は、関連のタンパク質に関する生成物の９５％を超えていた。シアリル化単量体および四量体の比活性は、それぞれ３３８および３９２Ｕ／ｍｇと測定された。ＳＥＣクロマトグラフィーからも、ｒＢｕＣｈＥ生成物が四量体形態の６０％を超えることが示された。近年の製造ロットに関する純度、オリゴマー状態、および活性を決定する方法は、図７に示されたもの、ならびに単量体および／または二量体生成物（複数可）の予測結果と類似していた。
【００５８】
ネイティブ血清由来ＢｕＣｈＥを、図９に示す。これらのデータは、高レベルの内在性シアリル化残基を示している（このデータの記載目的に用いられる命名法については図１０参照）。トリプシンペプチドを用いた一過性シアリル化系、およびＭＳ／ＭＳ法を利用したグリカン分析を利用して生成された単量体ｒＢｕＣｈＥのグリカン組成について、分析を実施した。ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７ベクターを利用した一過性シアリル化工程（ａ）の利用により、グリカン全ての４５％を超える著しく高レベルのシアリル化が示され、末端グリカン構造上に１つまたは複数のシアル酸残基が示される（表４に示す）。これは、ヒトプラスミドＢｕＣｈＥ中で観察された全シアリル化のおよそ６０％である。単量体ｒＢｕＣｈＥと四量体ｒＢｕＣｈＥとで類似していたＳＮＡ強度から、単量体および四量体生成物において類似量のシアリル化が示唆される。
【００５９】
実施例６：一過性シアリル化単量体／二量体ｒＢｕＣｈＥのグリカン分析
ジアリル化（ｄｉａｌｙｌａｔｅｄ）単量体タンパク質のグリカン分析を、記載された通り実施した：酵素消化物の分離のためのＬＣ／ＭＳ設定は、ギ酸（ＦＡ）移動相およびアセトニトリル勾配溶出での１ｍｍ×１５０ｃｍのＣ１８逆相カラムを利用したキャピラリーＨＰＬＣからなる。ペプチドおよびグリコペプチドイオンの検出は、飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析装置の四重極時間における質量検出によるものである。得られたグリコペプチドイオンスペクトルのトリプシンマップを利用して、予測された質量に対する観察されたイオン質量の比較により、特異的グリカン構造を同定する。トリプシン消化物から得られた予測されたペプチドを、Ｎ−結合グリコシル化について分析した。ロット１３Ｂ００３、ロット１３Ｂ００５、単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ、およびＣＨＴ溶離液の基本的ピークトリプシンマップを決定した。トリプシンマップは、顕著な差異を有する。単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥおよびＣＨＴ溶出液を、ロット１３Ｂ００３および１３Ｂ００５から別個に分析した。１３Ｂ００３および１３Ｂ００５ロットについては、早期に溶出するグリコペプチドを捕捉するための最適な勾配を用いて分析した。該試料は、同じ勾配を用いて分析すると、同等であった。
【００６０】
ＢｕＣｈＥは、９つの潜在的Ｎ−結合部位を有し、本試験は、表５および６に示されたＮ−結合部位の５つにおけるグリカン種の同一性および定量に絞って行った。Ａｓｎ１７、Ａｓｎ５７、Ａｓｎ２５６、Ａｓｎ３４１およびＡｓｎ４５５が、分析の対象であった。得られたトリプシンペプチドを、表４（全ての部位で同定された全ての構造）および表９（主要なグリカン構造を示し、各部位での占有率を報告している）に示している。５つの分析されたＡｓｎから得られたグリコペプチドに関連するシアリル化、非シアリル化およびグリコシル化の平均レベルを、表５に示している。５つの部位それぞれの主なグリカン構造の占有率を、表５および６に示している。比較として、血清由来ＢｕＣｈＥに関連するグリカン構造を、図９に示している。表５および６の場合、植物由来グリカン構造の命名法は、図１０に記載している。Ａｓｎ１０６、Ａｓｎ４８１およびＡｓｎ４８６に関連するペプチドおよび構造を分析する上で、困難に見舞われた。
【００６１】
ネイティブ血清由来ＢｕＣｈＥを、図９に示している。これらのデータは、高レベルの内在性シアリル化残基を示している。その後、トリプシンペプチドを利用した一過性シアリル化システムおよびＬＣ  ＭＳ／ＭＳ法を利用したグリカン分析を用いて、生成された単量体ｒＢｕＣｈＥのグリカン組成物の分析を行った。ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７ベクターを用いた一過性シアリル化工程（ａ）の利用により、著しく高レベルのシアリル化が示される（全グリカンの７０％を超える構造が、末端グリカン構造上に１つまたは複数のシアル酸残基を示す）（表５および６）。これは、ヒト血漿ＢｕＣｈＥで観察された全シアリル化のおよそ７０％である。単量体ｒＢｕＣｈＥと四量体ｒＢｕＣｈＥとの類似のＳＮＡ強度から、単量体生成物と四量体生成物とで類似量のシアリル化が示唆される。
【００６２】
透析された単量体タンパク質のグリカン分析を、記載された通り実施した：酵素消化物の分離のためのＬＣ／ＭＳ設定は、ギ酸（ＦＡ）移動相およびアセトニトリル勾配溶出での１ｍｍ×１５０ｃｍのＣ１８逆相カラムを用いたキャピラリーＨＰＬＣからなった。ペプチドおよびグリコペプチドイオンの検出は、飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析装置の四重極時間における質量検出によるものである。得られたグリコペプチドイオンスペクトルのトリプシンマップを利用して、予測された質量に対する観察されたイオン質量の比較により、特異的グリカン構造を同定する。トリプシン消化物から得られた予測されたペプチドを、Ｎ−結合グリコシル化について分析した。ロット１３Ｂ００３、ロット１３Ｂ００５、単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ、およびＣＨＴ溶離液の基本的ピークトリプシンマップを決定した。トリプシンマップは、顕著な差異を有している。単量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥおよびＣＨＴ溶出液を、ロット１３Ｂ００３および１３Ｂ００５から別個に分析した。１３Ｂ００３および１３Ｂ００５ロットについて、早期に溶出するグリコペプチドを捕捉するための最適な勾配を用いて分析した。該試料は、同じ勾配を用いて分析すると、同等であった。
【００６３】
ＢｕＣｈＥは、９つの潜在的Ｎ−結合部位を有し、本試験は、表５に示されたＮ−結合部位の５つにおけるグリカン種の同一性および定量に絞って行った。Ａｓｎ１７、Ａｓｎ５７、Ａｓｎ２５６、Ａｓｎ３４１およびＡｓｎ４５５が、分析の対象であった。得られたトリプシンペプチドを、表５（全ての部位で同定された全ての構造）および表６（主要なグリカン構造を示し、各部位での占有率を報告している）に示している。５つの分析されたＡｓｎから得られたグリコペプチドに関連するシアリル化、非シアリル化および非グリコシル化の平均レベルを、表５に示している。５つの部位それぞれの主なグリカン構造の占有率を、表６に示している。比較として、血清由来ＢｕＣｈＥに関連するグリカン構造を、図１２に示している。表５および６の場合、植物由来グリカン構造の命名法は、図１３に記載している。Ａｓｎ１０６、Ａｓｎ４８１およびＡｓｎ４８６に関連するペプチドおよび構造を分析する上で、困難に見舞われた。
【表５】
0006689742.tif 000007
【表６】
0006689742.tif 000008
【００６４】
ネイティブ血清由来ＢｕＣｈＥを、図１２に示している。これらのデータは、高レベルの内在性シアリル化残基を示している。その後、本発明者らは、トリプシンペプチドを利用した一過性シアリル化システムおよびＬＣ  ＭＳ／ＭＳ法を利用したグリカン分析を用いて生成された単量体ｒＢｕＣｈＥのグリカン組成を分析した。ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７ベクターを用いた一過性シアリル化工程（ａ）の利用により、著しく高レベルのシアリル化（全グリカンの７０％を超える）が示され、末端グリカン構造上に１つまたは複数のシアル酸残基が示される（表５および６）。これは、ヒト血漿ＢｕＣｈＥで観察された全シアリル化のおよそ７０％である。単量体ｒＢｕＣｈＥと四量体ｒＢｕＣｈＥとの類似のＳＮＡ強度から、単量体生成物と四量体生成物とで類似量のシアリル化が示唆される。
【００６５】
この一般的方法により作製された一過性シアリル化四量体生成物上の単糖およびオリゴ糖の両方の構成要素で、さらなる分析を実施した。グリカン構造を量について、そして一過性生成スキームが最適なＯＰ有効性のための効果的で高占有率の測定を与えるかどうかについて、基本的に分析した。
【００６６】
回収された試料を、約２４時間、脱イオン水を流しながら４−ｋＤａ膜を通して透析させた。透析した後、試料を単糖組成分析に備えて凍結乾燥した。次に、各試料のアリコットを、中性およびアミノ糖分析用（約２００μｇ）と、シアル酸分析用（約２００μｇ）に配分した。中性およびアミノ糖用のアリコットは、２．０Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で加水分解させたが、シアル酸用のアリコットは、２Ｍ酢酸で加水分解させた。加水分解の後、消化物を窒素気流の下で乾燥させ、Ｈ２Ｏに溶解して、氷中で５分間音波処理し、注入バイアルに移した。
【００６７】
中性およびアミノ糖標準と、シアル酸標準との、既知モル数の混合物を、試料と同じ手法で同じ時間に加水分解した。４種の濃度の標準混合物（中性およびアミノ糖とシアル酸）を調製して、較正式を作成した。試料中の各単糖のモル数を、残基エリア単位（ｒｅｓｉｄｕｅ  ａｒｅａ  ｕｎｉｔｓ）を較正式に線形補間することにより、定量した。
【００６８】
勾配ポンプ、電気化学的検出器、およびオートサンプラーを具備したジオネックス  ＩＣＳ３０００システムを用いたＨＰＡＥＣにより、単糖を分析した。個々の中性およびアミノ糖、ならびにシアル酸を、アミノトラップを有するジオネックス・カルボパックＰＡ２０（３×１５０ｍｍ）分析カラムにより分離した。勾配プログラムは、以下の移動相溶離液を用いた：中性およびアミノ糖の場合、脱気したナノピュア水、および２００ｍＭ  ＮａＯＨ；シアル酸の場合、１００ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  酢酸ナトリウム。注入は、中性およびアミノ糖の場合４０分ごとに、シアル酸の場合３５分ごとに実施した。
【００６９】
その後、２種の試料を特定のグリカン残基について分析し、その結果を表７に示している。
【表７】
0006689742.tif 000009
【００７０】
フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびマンノースが、４種の試料全てで検出された。シアル酸のうちＮＡＮＡが、４種の糖タンパク質全てで検出された。
【００７１】
実施例７：ｒＢｕＣｈＥのシアリル化四量体形態の生成
ｒＢｕＣｈＥのシアリル化を、（ａ）一過性または（ｂ）遺伝子導入方策、のいずれかを利用して実現することができる。一過性方策（ａ）は、適切なアグロバクテリウム株中のｐＩＣＨ８８２６６植物発現ベクターを伴う、ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７単独でのコトランスフェクション、またはプロリンリッチ接着ドメイン（ＰＲＡＤ）ペプチド発現ベクターと一緒のコトランスフェクションを含む（それぞれ、単量体または四量体生成物に関して先に記載）。ｐＩＣＨ８８２６６プラスミドは、シアル酸をＢＡＲ選択マーカ遺伝子と共に植物ゴルジ体中で、合成させ、機能化させて、発生期グリカン株に転移させることが可能な、７つの遺伝子の発現構築物を含む。
【００７２】
植物における四量体−シアリル化ｒＢｕＣｈＥの一過性発現のために、「マグニフェクション」（アイコン・ジェネティクス  ＧｍｂＨ、ドイツ  ハレ（ザーレ）所在）手順を、わずかに改変して用いた。２２〜２４℃の密閉生育ルーム内で２４〜２６日生育させた植物を、真空浸潤に用いた。ｒＢｕＣｈＥのための一夜生育させたアグロバクテリウム培養物（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）と、ＣｏＩＱからの四量体化ペプチド（ベクターＩＤ：テトラ４［他の試験で同様に働くことが示されたＣｏＩＱおよびラメリポジンの両方のベクター］）と、シアリル化経路（ベクターＩＤ：ｐＩＣＨ８８２６６）とを、浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．５）中で混合した。ベクターｐＰＢＣＨＫＢＰ００７を１：１０００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、テトラ４を１：２００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、ｐＩＣＨ８８２６６を１：１０（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈した。浸潤溶液を注文製の（ケンタッキー・バイオプロセシング、ケンタッキー州オーウェンズボロ所在）真空チャンバーに移した。植物全体の空気中の部分を、さかさまにして細菌／緩衝溶液に沈め、２４水銀柱インチの真空を２分間適用して開放した。回収植物のバイオマス８０ｋｇの場合、浸潤溶液２８０Ｌが、ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７  ２８０ｍＬ、ベクターテトラ４  １．４ＬおよびベクターｐＩＣＨ８８２６６  ２８Ｌを要しながら生成された。浸潤後に、植物を標準生育条件下の生育ルームに戻した。植物全体の空気中の部分の回収を、７ｄｐｉ（浸潤後日）に行った。
【００７３】
本発明の四量体ｒＢｕＣｈＥを精製するために、規模拡大可能な抽出、透明化、および非親和性精製の方法論を開発した。リン酸緩衝液の存在下、感染したバイオマスの機械的分解を利用して、酵素抽出を完遂した。最初の抽出物を、ｐＨ変化と、その後のプレート／フレームフィルタープレスおよび珪藻土フィルターエイドを用いた深層ろ過を利用して透明化させた。カプト・アドヒア（商標）マルチモーダル樹脂（ＧＥヘルスケア）を用いて透明化された抽出物からｒＢｕＣｈＥを捕捉し、ｐＨ低下を利用して溶出を完遂した。その後、捕捉ステップからの溶離液を低導電率まで希釈して、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型マルチモーダル樹脂（バイオラッド・ラボラトリーズ）に加えた。塩化ナトリウム勾配の上昇を利用してＣＨＴからｒＢｕＣｈＥを溶出し、高濃度のリン酸ナトリウムを使用して宿主タンパク質をカラムから剥離させた。ＣＨＴ溶離液を１％ｖ／ｖトリトンＸ−１１４と共にインキュベートした後、加熱して、エンドトキシンの大部分を含む沈殿した洗浄剤の相を生成させた。その後、水相（上清）を洗浄剤相から取り出し、最終的な研磨に備えて低導電率まで希釈した。ｒＢｕＣｈＥをカプトＱ（商標）強陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合させ、その後、緩衝液で大規模に洗浄してカラムから洗浄剤を完全に洗い流すことにより、残留する洗浄剤を除去した。カプトＱからのｒＢｕＣｈＥの溶出は、塩化ナトリウム勾配の上昇を利用して完遂した。その後、カプトＱ溶離液をアルギニン含有リン酸緩衝生理食塩水に透析ろ過し、次にタンジェンシャルフロー限外ろ過を利用して=２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．２μｍろ過を利用して原薬物質を滅菌して、２〜８℃で貯蔵した。最終生成物の特性を、図１４に示している。
【００７４】
実施例８：ΔＸＴＦＴ  Ｎ．ベンタミアナ植物からのトランスジェニックシアリル化ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ植物系統の産生
ｐＩＣＨ８８２６６ベクターからの遺伝子をＮｂＲＮＡｉΔＸＦ植物株に形質転換して、ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ植物系統を生成することにより、遺伝子導入方策を外来遺伝子シアリル化のために開発した。用いられた方策を、図１１に詳述している。サムブクス・ニゲラのレクチン（ＳＮＡ）を用いたＰＣＲ方法論およびウェスタンブロットを利用して、植物系統をスクリーニングし、ホモ接合性について選択した。表８に、植物系統の選択を要約している。損なわれていない遺伝子座（ＰＣＲ分析による）およびグリコシル化表現型（例えば、グリカン鎖上で末端シアル酸に結合するＳＮＡにより結合で決定された、分泌タンパク質上のシアル酸残基の存在）を有するＴ１およびＴ２子孫を、同定した。これらの植物系統は、機能的組換えタンパク質シアリル化を示す８つの遺伝子産物全てを発現するホモ接合型の安定したトランスジェニック系統を開発するために、現在、繁殖プログラムの最中である。その後、ホモ接合型種子を、表９に詳述された通り、選択されたＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−８８２６６＃１１系統から産生した。
【表８】
0006689742.tif 000010
【表９】
0006689742.tif 000011
【００７５】
各系統からの種子が少量であったが大規模な製造が必要であったため、Ｎｂ  ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ種子を製造のために混合した。その量は重量に関して等しかったが、各系統は異なる効率（より高いまたは低いシアリル化活性）を有する可能性があった。特に種子およびＮｂ  ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−８８２６６＃１１からプールされた植物に、１：１０００希釈のＢｕＣｈＥウイルス発現構築物（ｐＩＣＨ９２６３１）を抱えるアグロバクテリウムを浸潤させた。精製の前に、回収された７ｄｐｉ植物組織からの粗植物抽出物（１ｍＭ  ＥＤＴＡを補充された０．２Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ６  ０．３ｍｌ中に抽出された植物組織１００ｍｇ）を、エルマンアッセイを利用してＢｕＣｈＥ活性について予備テストした。この予備テストの後、ＨｉｓタグＢＣＨＥを、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて異なる試料から精製した。シアル酸の検出のために、同等量の精製ＢＣＨＥ（それぞれ約２μｇ）を、ＳＤＳを補充されたポリアクリルアミドゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜にブロットして、ビオチン化ＳＮＡレクチン（サムブクス・ニゲラのレクチン；ベクター・ラボラトリーズ、英国ピーターバラ所在）およびストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（ライフ・テクノロジーズ、ドイツ  ダルムシュタット所在）でプローブした。シアリル化ｒＢｕＣｈＥの検出を確認するために、膜を剥離させて、ヤギ抗ＢＣＨＥポリクローナル抗体（サンタ・クルーズ・バイオテクノロジー、ドイツ  ハイデルベルグ所在）および抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼコンジュゲート（シグマ・アルドリッチ、ＵＳＡセントルイス所在）でリプローブした。
【００７６】
ｒＢｕＣｈＥのシアリル化が、ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−８８２６６＃１１系統の多くの植物において検出された（図１２および表９）。したがってトランスジェニックアプローチは、シアリル化ｒＢｕＣｈＥを生成するための可能な経路であると理解された。より早期の実施例から、ｒＢｕＣｈＥ（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）のためのアグロバクテリウム培養物と、ＣｏＩＱからの四量体化ペプチド（ベクターＩＤ：テトラ４［ＣｏＩＱおよびラメリポジンの両方のベクターが他の試験で同様に働くことが示された］）と、ラメリポジンベクターと、によるＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−８８２６６＃１１植物のトランスフェクションを測定して、四量体化およびシアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物を生成した。四量体化生成物のサイズ増大、およびシアリル化に関する血清由来ＢｕＣｈＥへの類似性もまた、哺乳動物内でのＰＫ性能改善により神経剤除去に関して優れた生成物を生成すると予測された。
【００７７】
Ｎｂ  ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ種子を播種して、ＳＮＡウェスタンブロット方法論を利用してシアリル化能力に関してテストした。表１０は、元の形質転換体Ｎｂ  ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−１１および−５由来の特定の植物系統を示している。ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ−１１および−５子孫植物（Ｔ２世代）および対照（ベンズ（Ｂｅｎｚ））を生育させて、ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７の１：１０００希釈物およびテトラ４ベクターの１：２００希釈物を感染させて、７ｄｐｉに回収した。該植物をＳＮＡおよびＢＣＨＥウェスタンブロット分析のために抽出した。
１．陰性対照ベンズ
２．陰性対照  トランスジェニック
３．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４１
４．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４２
５．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４３
６．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４５
７．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４６
８．ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７およびテトラペプチド４を有するＮＢＧ４７
【００７８】
２：１の緩衝液対バイオマス比を利用して、抽出を実施した。緑葉の搾汁４５ｍＬを直ちに遠心分離して、Ｓ１試料を生成させた。Ｓ１ペレットを、４℃で１０分間の１００００×ｇにより生成させた。Ｓ１  １０００μＬを１６０００×ｇで２分間遠心分離して、Ｓ２を生成させた。還元されたＮｕＰＡＧＥ試料を調製して、ゲルを２００Ｖで５０分間泳動させた。結果およびロードの順序を、図１３に示している。
【００７９】
これらのデータは、１０４枚の細胞皿で生育された６つのシアリル化トランスジェニック種子系統が、ｒＢｕＣｈＥの強い発現を示し、ｒＢｕＣｈＥおよび他のタンパク質のバンドがＳＮＡレクチンと強い反応性を示すことを実証しており、シアリル化系が損なわれておらず、全てのＴ２系統において機能することが示される（表１０）。これらのデータから、プールされた種子集団を使用して、分析およびテストのためにトランスジェニック系統の中でシアリル化ｒＢｕＣｈＥを産生させた。
【表１０】
0006689742.tif 000012
【００８０】
さらなる繁殖および選択が、シアリル化経路に関してより安定性を示すと予測されたＴ３系統に関して引き続き行われている。原種名Ｎｂｇ−４５およびＮｂｇ−４３（両者とも初期シアル酸トランスジェニック植物Ｎｂ８８２６６−１１からのもの）を、エタノールおよび次亜塩素酸ナトリウムを用いて表面滅菌し、その後、除草剤ホスフィノトリシンを補充したムラシゲ・スクーグ培地＋ガンボルグビタミンプレート上に播種した。ホスフィノトリシン耐性は、トランスジェニック系においてマーカ遺伝子として働く。発芽して緑色を維持する植物は、マーカ遺伝子を含み、シアリル化遺伝子カセットが損なわれていないことを示唆している。発芽およびホスフィノトリシンの結果を、播種後１０日目（ｄｐｓ）に記録し、全ての植物が成長していて緑色であった。種子生成のために、植物を培地のプレートから５ガロンポット中の無土壌植物培地に移植した。１３ポットを、原種Ｎｂｇ−４５からの植物用に作製し、１２ポットをＮｂｇ−４３用に作製した。
【００８１】
植物における種子ポット回収は、移植の６１日後に開始した。標準種子生成プロトコルによって、個々のプラントからの種子ポットを１〜２週間の期間にわたって回収し、その後、ライトカートに移動させて、ポッド乾燥工程を完了させる。その後、種子を浄化し、ふるい工程でサイズ決定した。過度に小さい、または過度に大きい種子は、研究目的では可能な限り保持されると理解されたが、適正なサイズのふるいにより保持された種子を、適格なものとした。この回収、乾燥および浄化ステップを、回収時間全体にわたり反復した。浄化された種子を、個々の植物ごとに一緒にまとめて、十分なテストによって個々の植物からの種子が一緒にまとめられ得ると結論づけられるまで、別にしておく。典型的なＮ．ベンタミアナΔＸＦ種子ロットテストには、発芽、活力、形態学、およびｎｐｔＩＩテスト（カナマイシン耐性マーカ遺伝子を示す）が含まれる。シアル酸トランスジェニック種子系統の特異的テストを、以下のプロトコルに関連して実施した：
１．ホスフィノトリシン培地プレートでの発芽。ホスフィノトリシンの分離が記録されたら、分離植物からの種子を非分離植物からの種子と一緒にしなかった。
２．ホスフィノトリシン培地の結果が、１００％陽性であれば、小植物を無土壌培地を含むポットに移し、ＨｉｓタグＢｕＣｈＥベクターを含むＩＦを注入するのに十分大きくなるまで生育させた。ＩＦポットの抽出を実施し、その後、磁気ビーズ（ダイナビーズ（登録商標）Ｈｉｓタグ・アイソレーション・アンド・プルダウン）を用いてＢｕＣｈＥを濃縮した。抗ＢｕＣｈＥウェスタンおよびＳＮＡブロットを、ＢｕＣｈＥおよびシアリル化の存在の決定のために実施した。シアリル化に関する分離が記録されたら、分離植物からの種子を非分離植物からの種子と一緒にしなかった。
【００８２】
ホスフィノトリシン除草剤選択およびＢｕＣｈＥ／ＳＮＡ  ウェスタン（発芽、活力、形態学、およびｎｐｔＩＩ）テストについて１００％陽性とテストされた種子ロットを一緒にして、以後のＢＣＨＥ生成実験での使用に承認された。大規模使用の前に、種子（全てまたは一部）をペレット化して、自動播種システムでの使用を容易にした。
【００８３】
種子および２００ｇを回収し、およそ７５ｇを浄化してふるいにかけた（３ｇ／植物×２５本＝７５ｇ）。推定でおよそ６００〜８００グラムの種子が最終的な大量種子ロット（２５本の植物全てが一緒になったもの）で生成されたことが示されるまで、種子回収をさらに６〜８週間継続した。そのような種子量は、潜在的に７２０万〜９６０万の植物を生成することができ、製造のためのトランスジェニック方策の規模拡大性および堅牢性が実証される。
【００８４】
実施例９：トランスジェニックシアリル化ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ植物系統における四量体化ｒＢｕＣｈＥの産生
ｒＢｕＣｈＥ植物を基にした生成物の四量体形成を、以下のベクターの利用により実施した：
・ｒＢｕＣｈＥ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７（１：１０００希釈）
・ＰＲＡＤペプチド４：テトラ４（１／２００希釈）
【００８５】
各系統からの種子が少量であったが大規模な製造が必要であったため、Ｎｂ  ＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦ種子を生成のために混合した。その量は重量に関して等しかったが、各系統はより高いまたは低いシアリル化活性に関して異なる効率を有する可能性があった。植物における四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥの一過性発現のために、マグニフェクション手順をわずかに改変して再度利用した。２２〜２４℃の密閉生育ルーム内で２４〜２６日生育させた植物を、真空浸潤に用いた。ｒＢｕＣｈＥのための一夜生育させたアグロバクテリウム培養物（ベクターＩＤ：ｐＢＣＨＥＫＢＰ００７）と、ＣｏＩＱからの四量体化ペプチド（ベクターＩＤ：テトラ４）と、シアリル化経路（ベクターＩＤ：ｐＩＣＨ８８２６６）とを、浸潤緩衝液（１０ｍＭ  ＭＥＳ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ５．５）中で混合した。ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７を１：１０００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、テトラ４を１：２００（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈し、ｐＩＣＨ８８２６６を１：１０（アグロバクテリウム細胞：緩衝液）に希釈した。浸潤溶液を真空チャンバーに移した。ニコチアナ・ベンタミアナＳＩＡＬ−ＮｂＲＮＡｉΔＸＦのプールした種子からの植物全体の空気中の部分を、さかさまにして細菌／緩衝溶液に沈め、２４水銀の真空を２分間適用して開放した。回収植物のバイオマス８０ｋｇの場合、浸潤溶液２８０Ｌが、ベクターｐＢＣＨＥＫＢＰ００７  ２８０ｍＬ、ベクターテトラ４  １．４ＬおよびベクターｐＩＣＨ８８２６６  ２８Ｌを要しながら生成された。浸潤後に、植物を標準生育条件下の生育ルームに戻した。植物全体の空気中の部分の回収を、７ｄｐｉに行った。
【００８６】
四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物を精製するために、規模拡大可能な抽出、透明化、および非親和性精製の方法論を開発した。リン酸緩衝液の存在下、感染したバイオマスの機械的分解を利用して、酵素抽出を完遂した。最初の抽出物を、酸性ｐＨ変化と、その後のプレート／フレームフィルタープレスおよび珪藻土フィルターエイドを用いた深層ろ過を利用して透明化させた。カプト・アドヒア（商標）マルチモーダル樹脂（ＧＥヘルスケア）を用いて透明化された抽出物からｒＢｕＣｈＥを捕捉し、ｐＨ低下を利用して溶出を完遂した。その後、捕捉ステップからの溶離液を低導電率まで希釈して、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）Ｉ型マルチモーダル樹脂（バイオラッド・ラボラトリーズ）に加えた。塩化ナトリウム勾配の上昇を利用してＣＨＴからｒＢｕＣｈＥを溶出し、高濃度のリン酸ナトリウムを使用して宿主タンパク質をカラムから剥離させた。ＣＨＴ溶離液を１％ｖ／ｖトリトンＸ−１１４と共にインキュベートした後、加熱して、エンドトキシンの大部分を含む沈殿した洗浄剤の相を生成させた。その後、水相（上清）を洗浄剤相から取り出し、最終的な研磨に備えて低導電率まで希釈した。ｒＢｕＣｈＥをカプトＱ（商標）強陰イオン交換樹脂（ＧＥヘルスケア）に結合させ、その後、緩衝液で大規模に洗浄してカラムから洗浄剤を完全に洗い流すことにより、残留する洗浄剤を除去した。カプトＱからのｒＢｕＣｈＥの溶出は、塩化ナトリウム勾配の上昇を利用して完遂した。その後、カプトＱ溶離液をアルギニン含有リン酸緩衝生理食塩水に透析ろ過し、次にタンジェンシャルフロー限外ろ過を利用して約２５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。０．２μｍろ過を利用して原薬を滅菌して、２〜８℃で貯蔵した。
【００８７】
ＯＰ剤の結合を、遺伝子導入によりシアリル化されたｒＢｕＣｈＥと血漿由来ＢｕＣｈＥとで比較した。阻害定数を評価する連続的方法（改変エルマンアッセイにおいてブチリルチオコリンを用いる）を用いて、ＫＢＰ  ＢｕＣｈＥを有するＯＰ神経剤のＫｉ値を、ヒト血漿由来ＢｕＣｈＥに比較しながら測定した。図１４に示される通り、任意のテストされたＯＰ神経剤への結合に関して、植物生成ｒＢｕＣｈＥと血漿由来ＢｕＣｈＥの間に統計学的差異はなかった。
【００８８】
同じく図１４に示される通り、本発明の植物由来四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥと比較した、二量体、オリゴマーおよび血漿由来のタイプの範囲内の先に記載された異なるＢｕＣｈＥを、ＯＰ効果を阻害する能力について測定した。例として、示されたグラフは、トランスジェニック植物から精製されたシアリル化ｒＢｕＣｈＥ四量体の結合の比較測定を示しており、植物産生ｒＢｕＣｈＥと血漿由来ＢｕＣｈＥの間にある結合定数の類似性を示している。これらの実験において、阻害定数が高い程、より良好な結果が示される。本発明の植物由来生成物は、各有機リン種（具体的にはＧＡ、ＧＢ、ＧＤ、ＧＦ、ＶＸ、およびＶＲ）に関して血漿由来化合物と等しいか、またはそれより優れていた。製造が比較的容易なことおよびかなり安価であることに加え、植物を基にした生成物の一般により高い産生能力と、同じく拡大可能性および連続供給のための遺伝子導入能力によって、該植物を基にした方法がこの手法で非常に効果的な結果をもたらすことは、明白である。
【００８９】
実施例１０：遺伝子導入によりシアリル化されたｒＢｕＣｈＥのグリカン分析
四量体化シアリル化ｒＢｕＣｈＥ植物由来生成物グリカン構成要素で、さらなる分析を実施した。グリカン構造を量について、そして一過性生成スキームが最適なＯＰ有効性のための効果的で高占有率の測定を与えるかどうかについて、基本的に分析した。
【００９０】
各試料の未処理のアリコットを、中性およびアミノ糖分析用（約２００μｇ）とシアル酸分析用（約２００μｇ）に配分した。中性およびアミノ糖用のアリコットは、２．０Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で加水分解したが、シアル酸用のアリコットは、２Ｍ酢酸で加水分解した。加水分解の後、消化物を窒素気流の下で乾燥させ、Ｈ２Ｏに溶解して、氷中で５分間超音波処理して、注入バイアルに移した。
【００９１】
中性およびアミノ糖標準と、シアル酸標準との、既知モル数の混合物を、試料と同じ手法で同じ時間に加水分解した。４種の濃度の標準混合物（中性およびアミノ糖とシアル酸）を調製して、較正式を作成した。試料中の各単糖のモル数を、残基エリア単位を較正式に線形補間することにより、定量した。
【００９２】
勾配ポンプ、電気化学的検出器、およびオートサンプラーを具備したジオネックス  ＩＣＳ３０００システムを用いたＨＰＡＥＣにより、単糖を分析した。個々の中性およびアミノ糖、ならびにシアル酸を、アミノトラップを有するジオネックス・カルボパックＰＡ２０（３×１５０ｍｍ）分析カラムにより分離した。勾配プログラムは、以下の移動相溶離液を用いた：中性およびアミノ糖の場合、脱気したナノピュア水、および２００ｍＭ  ＮａＯＨ；シアル酸の場合、１００ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  酢酸ナトリウム。注入は、中性およびアミノ糖の場合４０分ごとに、シアル酸の場合３５分ごとに実施した。以下の表１１に、分析結果を示している。
【表１１】
0006689742.tif 000013
【００９３】
四量体生成物を開裂した後、Ｎ−グリカンをさらに分析した。そのようなＮ−グリカン開裂物は、ＰＮＧａｓｅ  Ａの溶液による３７℃、２４時間の、そしてその後、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによりさらに３７℃、２４時間の酵素活性により作製した。放出されたＮ−グリカンを、その後、Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジで精製した。炭水化物画分を５％酢酸で溶出させて、凍結乾燥により乾燥させた。Ｎ−結合オリゴ糖をさらに完全メチル化した（Ａｎｕｍｕｌａ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，１９９２に記載された方法に基づく）。グリカンを窒素ガスにより乾燥させて、先に記載された通りＮＳＩ−ＦＴＭＳによりプロファイリングした。
【００９４】
上記の通り、そのような分析は、ナノスプレーイオン源を具備したＬＴＱ  オービトラップＸＬ質量分析装置（サーモフィッシャー）を用いて測定した。完全メチル化Ｎ−結合グリカンを５０％メタノール中の１ｍＭ  ＮａＯＨに溶解し、その後、０．５μＬ／分の一定流速で機器に直接注入した。フルＦＴＭＳスペクトルを、分解能３００００および３マイクロスキャンで回収した。キャピラリー温度を２１０℃に設定し、ＭＳ分析を陽イオンモードで実施した。総イオンマッピング（自動ＭＳ／ＭＳ分析）の場合、２００〜２０００のｍ／ｚ範囲で、有効な２つの質量単位窓においてＩＴＭＳモードでスキャンした。
【００９５】
数多くのＮ−グリカンが、試料中に見出された。これらは主として、より少量の高マンノースグリコシル化およびハイブリッド型グリコシル化を有する二分岐複合型グリカンであった。以下の表１２に、提案された構造を含むこの試料中に見出されたグリカンの概要と、トータルイオンマッピング（ＴＩＭ）の一部としてのＭＳ／ＭＳ分析の結果をしている。
【００９６】
試料中に見出された切断または損傷したグリカンを、表１２に太字で示している。試料中に見出された多数のＮ−グリカンを、最初、通例通り割り付け、その後、ＴＩＭマッピングの結果に従って異なる切断構造として再度割り付けた。
【表１２】
0006689742.tif 000014
【００９７】
遺伝子導入によりシアリル化されたｒＢｕＣｈＥ生成物のグリカン分析の促進のために、更なるテストを実施した。最初、そのような活性には、単糖同定および測定のために試料の加水分解および分析が含まれた。この目的のために、各試料のアリコットを中性およびアミノ糖分析用とシアル酸分析用に配分し、乾燥させて計量し、分析に用いられる試料の実際の量を測定した。中性およびアミノ糖用のアリコットは、２．０Ｎトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で加水分解したが、シアル酸用のアリコットは、２Ｍ酢酸で加水分解した。加水分解の後、消化物を窒素気流の下で乾燥させ、Ｈ２Ｏに溶解して、氷中で５分間超音波処理して、注入バイアルに移した。
【００９８】
中性およびアミノ糖標準と、シアル酸標準との、既知モル数の混合物を、試料と同じ手法で同じ時間に加水分解した。４種の濃度の標準混合物（中性およびアミノ糖とシアル酸）を調製して、較正式を作成した。試料中の各単糖の量およびモル数を、残基エリア単位を較正式に線形補間することにより、定量した。
【００９９】
勾配ポンプ、電気化学的検出器、およびオートサンプラーを具備したジオネックス  ＩＣＳ３０００システムを用いたＨＰＡＥＣにより、単糖を分析した。個々の中性およびアミノ糖、ならびにシアル酸を、アミノトラップを有するジオネックス・カルボパックＰＡ２０（３×１５０ｍｍ）分析カラムにより分離した。勾配プログラムは、以下の移動相溶離液を用いた：中性およびアミノ糖の場合、脱気したナノピュア水、および２００ｍＭ  ＮａＯＨ；シアル酸の場合、１００ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００ｍＭ  ＮａＯＨ中の１Ｍ  酢酸ナトリウム。注入は、中性およびアミノ糖の場合４０分ごとに、シアル酸の場合３５分ごとに実施した。結果を、２つの試料（ロット４および５）について表１３に示している。
【表１３】
0006689742.tif 000015
【０１００】
これらの結果から、分析された残渣のうち、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースおよびマンノースが、両方の試料（ロット）において検出された。シアル酸のＮＡＮＡもまた、両方の試料において検出された。
【０１０１】
一過性に、そして遺伝子導入によりシアリル化されたｒＢｕＣｈＥ生成物（四量体化、または非四量体化）に関するそのような全体的データから、以下の観察がなされた：
・分析された４つの遺伝子導入での生成のｒＢｕＣｈＥバッチのうち、３つは、７０〜７３％末端シアル酸占有率を示し、１つは５０％を示している。糖は全て、適度なモル比で存在する。１つが低い占有率で存在した理由については、決定されなかった。
・一過性の試料は、１００％シアル酸占有率で、非天然の糖モル比であり、それはことによると糖の開裂および不安定性が原因の可能性がある（過去のデータでは、７０％の占有率が示された）。
・プールされたトランスジェニックＴ２種子ロットのシアリル化物は、一過性の系と類似のレベルであることが見出された。
・一過性方策は、９つの可能な部位のうち６つで占有を示しているが、遺伝子導入でのアプローチは、９部位のうち８つで占有を示し、最後に部位には問題がある。したがって遺伝子導入アプローチは、優れていて、グリコシル化に関してより完璧であると思われる。
【０１０２】
したがって総括すると、本発明者らの植物を基にしたｒＢｕＣｈＥ生成法が哺乳動物体内で（静脈内送達または筋肉内送達にかかわらず）高度に有効なＯＰ防御だけでなく、その四量体形態および高度にシアリル化された構造を確実に、そして必要な拡大可能なレベルまで生成する能力をもたらすのに適することが明白であるが、そのような生成物は、連続した信頼性のある供給のために種子系統から提供することもできる。
【０１０３】
実施例１１：植物系において産生されたｒＢｕＣｈＥの薬物動態予備試験および本試験
２種のＰＫ試験を、雄ハートレー系モルモットにおいて実施して、ｒＢｕＣｈＥの特徴を評価した。これらの試験の完全な詳細を、付録ＩＶおよびＶに示されたＳＲＩ試験番号Ｂ６１６−１３およびＢ６１８−１３の最終報告に表している。最初に、ｒＢｕＣｈＥの３種の異なる形態：静脈内（ＩＶ）経路で投与された、純粋な単量体（ロット１３Ｂ００１）、シアリル化単量体・二量体（ロット１３Ｂ００２）、およびシアリル化四量体（ロット１３Ｂ００３）を比較するパイロット試験を実施した。表１４に、パイロット試験（ＳＲＩ  試験番号Ｂ６１６−１３）の計画を表している（適切なパイロット試験の結果がより確定的なテスト方策をもたらすとの予測から）。
【表１４】
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【０１０４】
次に、ＰＫの本試験を、ＩＶおよび筋肉内（ＩＭ）経路の両方により投与されたシアリル化四量体（ロット１３Ｂ００５）を使用して実施した。この本試験においてシアリル化四量体を評価するための判断は、パイロット試験において決定されたＰＫ特性、および連続工程の開発作業を通してＫＢＰで実施された生理化学的特性分析の評価に基づいている。表１５に、本試験の計画を表している（ＳＲＩ試験番号Ｂ６１８−１３）。
【表１５】
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【０１０５】
実施された基本的テスト系は以下の通りであった：
【０１０６】
雄ハートレー系モルモットを、運搬の前に供給業者によりシングル頸静脈カテーテル（ＪＶＣ）またはデュアルＪＶＣと共にチャールズリバー（ノースカロライナ州ローリー）から購入した。動物は、５〜６週齢で、体重３２０〜４０９グラムであった。動物のケアおよび飼育の一般的手順は、１９９１年の９ＣＦＲ  Ｐａｒｔ  ３に組入れられたＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＮＲＣ）  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）およびＡｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄを遵守した。硬材チップの床敷きを入れた吊り下げ式ポリカルボナートケージで、動物を１２時間明／１２時間暗の明暗スケジュール、７２〜７３°Ｆおよび湿度３３〜４６％を利用してで１ケージに１匹ずつ飼育した。動物室は、空気の再循環を行わずに、１時間に少なくとも１０部屋分の換気を有した。ハーラン・テクラッド社公認モルモット飼料（＃２０４０Ｃ）が、随意に提供された。飼料を定期的に分析し、試験を妨害し得ることが公知でそのような飼料中の存在が合理的に予測される混入物が、試験に影響を及ぼすレベルで存在しないことを確認した。試料分析の記述は、試験記録中に保持されている。水（逆浸透精製水）は、随意に提供された。過去の報告に基づけば、試験を妨害して試験結果に影響を及ぼす可能性がある混入物はいずれも、水中に存在しないと予測された。動物分析報告のコピーは、参照のためにＳＲＩに保持されている。動物は、耳標により個別に識別した。
【０１０７】
試験手順およびエンドポイント
投与はＩＶ経路（ＳＲＩ試験番号Ｂ６１６−１３およびＢ６１８−１３）またはＩＭ経路（ＳＲＩ試験番号Ｂ６１８−１３）によるものであった。致死率および罹患率を１日に少なくとも１回確認し、臨床観察は、投与日なら投与直後に、それ以後は１日１回、または臨床兆候について必要のある場合はより頻繁に記録した。動物を、粗大運動および行動をはじめとする臨床兆候の任意の変化、ならびに外観の観察可能な変化について検査した。体重は、無作為化のために試験開始の１日前と、用量計算のために投与１日目だけ測定した。血液をＪＶＣポート、またはＳＲＩのＩＡＣＵＣおよびＡＣＵＲＯにより認可された他の部位から、Ｋ３ＥＤＴＡを含む試験管に採取して血漿に処理し、その後、−７０±１０℃で凍結貯蔵した。全血の合計およそ１００μＬ（血漿約５０μＬ）を、投与前、および投与後５、１０、２０、３０、６０分目、２、４、８、２４、３６、４８、７２、１２０および１６８時間目に各モルモットから採取した。
【０１０８】
薬物動態分析の手順：
データをＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）モデル２００（血管外投与の場合）またはモデル２０１（ＩＶボーラス投与の場合）を用いてノンコンパートメント解析に供し、均一な加重因子を各データセットに加えた。ＴｍａｘおよびＣｍａｘ値は、データから直接決定した。ＡＵＣｌａｓｔ値は、ログ／リニア台形法（ＩＶ投与）またはリニアアップ／ログダウン台形法（ＩＭ投与）を利用して計算した。各モルモット個体で、値を計算した。投与された用量をＵ／ｋｇとしてプログラムに入力し、その結果、動物の各体重に追加の修正を加える必要はなかった。投与前に採取された試料から各動物で測定されたＢｕＣｈＥのバックグランドレベルを、測定された血漿濃度から差し引かなかった。試料採取で記録された実際の時間を、計算では最初の４時間内で使用した。以下のパラメータおよび定数を、ＩＶおよびＩＭ群について決定した：観察された最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、最大血漿濃度までの時間（Ｔｍａｘ）、最終時点までの血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔ）、無限大まで外挿された血漿濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）、最終相消失半減期（ｔ１／２）、外挿された無限時間までの平均滞留時間（ＭＲＴｉｎｆ）。定常状態（Ｖｓｓ）およびクリアランス（Ｃｌ）での分布容量は、ＩＶ群のみで決定した。ＩＭ投与後の生物学的利用度（Ｆ）を、ＩＶおよびＩＭ群の両方でＡＵＣｌａｓｔ値を利用して計算した。
【０１０９】
臨床観察：
臨床観察から、四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ投与群の動物１匹が１日目にわずかに活動低下であることが示された。他の動物は全て、試験期間中、正常と見なされた
【０１１０】
血漿中薬物レベル
図１５に、３つのｒＢｕＣｈＥ変異体の血漿プロファイルを示しているが、それらは著しく変動している。データは、Ｕ／ｍＬ血漿として表されている。変異体Ａ（純粋な単量体）は、結晶から非常に急速にクリアランスされ、濃度は４時間後のＢｕＣｈＥがバックグランド未満であった。変異体Ｂ（単量体・二量体シアリル化物）は、２４時間の間、バックグランド（１．０５±０．１８５Ｕ／ｍＬ）を超える血漿中レベルを維持した。変異体Ｃ（四量体シアリル化物）は、約４〜８時間の急速な分布相と、それに続く試験の全時間経過に及ぶ長い排出相を含む、二相血漿プロファイルを呈した。ｒＢｕＣｈＥの血漿中濃度は、最終時点の１６８時間目に、変異体Ｃ群においてバックグランドをわずかに超えていた。
【０１１１】
薬物動態分析の結果：
ＰＫ分析の結果を、表１６に示す。排出半減期の値（ｔ１／２）は、ｒＢｕＣｈＥの３つの形態の間で著しく変動した。純粋な単量体は、１時間未満（０．３７時間）のｔ１／２で血漿から排出され、単量体・二量体シアリル化物は、７．５時間と約２０倍長いｔ１／２を有した。最も長いｔ１／２は、四量体シアリル化形態で観察された６０時間であった。ＭＲＴもまた、０．５９時間（変異体Ａ）〜７３時間（変異体Ｃ）で、投与形態により変動した。Ｃｌは、変異体Ａが最も高く（７６．６ｍｌ／時／ｋｇ）変異体Ｃが最も低かった（６．２７ｍＬ／時／ｋｇ）。ｒＢｕＣｈＥの最高濃度は、投与直後に観察され、バックグランドよりも約８０〜１００倍高かった。純粋な単量体および単量体・二量体シアリル化変異体は、類似のＣｍａｘ値で、それぞれ９８．８±２．８Ｕ／ｍＬおよび９１．３±１６．２Ｕ／ｍＬを有した。四量体シアリル化変異体は、他の２種の変異体よりも高活性の用量を投与されたにもかかわらず、より低い平均Ｃｍａｘ  ７８．７±３．０Ｕ／ｍＬを有した。この差は、３種のｒＢｕＣｈＥ形態の最高Ｖｓｓにより示された通り、四量体シアリル化物のより高い分布を原因とする可能性がある。四量体シアリル化物により示されたより好適なパラメータは、ＡＵＣ１７０４時間・Ｕ／ｍＬにより示された通り最高の暴露をもたらし、それは純粋な単量体および単量体・二量体シアリル化物のＡＵＣｍａｘよりもそれぞれ約１８および７倍高かった。
【表１６】
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【０１１２】
パイロット試験の結論：
ｒＢｕＣｈＥの３つの変異体を、ＩＶ経路により雄モルモットに投与した。２５ｍｇ／ｋｇ用量は、良好に耐容された。血漿プロファイルおよび薬物動態パラメータは、３種のタンパク質の間で著しく変動した。最高の初期血漿中濃度は、変異体Ａ（純粋な単量体）で観察されたが、この形態のｒＢｕＣｈＥは、１時間未満のｔ１／２およびＭＲＴと、非常に急速なＣｌで血漿から急速に排出され、低い血漿暴露となった。ヒト血清由来ＢｕＣｈＥのものと最も密接に近似した薬物動態特性は、四量体シアリル化形態で観察され、それは二相性の血漿プロファイル、該タンパク質のより大きな分布を示唆する最高のＶｓｓ、最低のクリアランス（Ｃｌ）、ｔ１／２  ６０時間、および３種のｒＢｕＣｈＥ変異体のＡＵＣ値に基づく最高暴露を有した。
【０１１３】
これらの見込みのある結果から、より確定的な試験で血漿由来ｒＢｕＣｈＥ生成物の潜在的利益を分析する価値があると決定された。
【０１１４】
本試験の実施：
同じ型のモルモットを、先の通り使用、飼育およびテストし、最大量のｒＢｕＣｈＥを投与し、実際に処理された対象に様々なＯＰ剤を暴露した。
【０１１５】
致死率／罹患率および臨床観察：
臨床観察を実施し、全ての動物が試験期間中、正常と見なされた。
【０１１６】
血漿中薬物レベル：
図１６および１７に、それぞれＩＶおよびＩＭ経路で投与されたｒＢｕＣｈＥの血漿プロファイルをＵ／ｍＬおよびμｇ／ｍｌで示している。ＩＶ処置群において、ｒＢｕＣｈＥは、約４〜８時間の急速な分布相と、それに続く試験の全時間経過に及ぶ長い排出相を含む、二相血漿プロファイルを呈した。ＩＭ投与後に、血漿中のｒＢｕＣｈＥ活性は、最初の時点でバックグランドをわずかに超え、その後、用量注射後３６時間目にピークに達するまで、安定的に増加した。その後、ｒＢｕＣｈＥは、緩やかに排出された。血漿中ｒＢｕＣｈＥ濃度は、ＩＭおよびＩＶの両方の投与後１６８時間目の最終採血時点までバックグランドレベルの０．９１１±０．１９７Ｕ／ｍＬを超えていた。
【０１１７】
薬物動態分析：
薬物動態分析の結果を、表１７に示す。ＩＶ群において、観察されたＣｍａｘ値は、６３．５Ｕ／ｍＬ、またはバックグランドレベルの約７０倍高かった。ｒＢｕＣｈＥは、血漿から緩やかに排出され、ＩＶ群ではｔ１／２６３．４時間およびＭＲＴｉｎｆ８３．５時間であり、これはＣｌ  ９．８ｍＬ／時間／ｋｇに対応した。Ｖｓｓは、８３６ｍＬ／ｋｇと中等度であり、広範囲の細胞外分布が示唆された。ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆは、それぞれ１１２４時間・Ｕ／ｍＬおよび１３６８時間・Ｕ／ｍＬであった。ＩＭ群において、観察されたＣｍａｘ値は、６３．５Ｕ／ｍＬで、バックグランドの約８倍高く、それがＴｍａｘ  ３６時間で観察された。ｔ１／２およびＭＲＴｉｎｆの両者とも、ＩＶ群よりも長く、それぞれ８６．５時間および１４２時間であった。ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆ値により示された暴露は、それぞれ６８９時間・Ｕ／ｍＬおよび１００５時間・Ｕ／ｍＬであった。ＡＵＣｌａｓｔを利用して決定された生物学的利用度（Ｆ）は、６１．６±１．８％と計算された。
【表１７】
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【０１１８】
本試験の結論：
単一用量２５ｍｇ／ｋｇ（１３１２５Ｕ／ｍＬ）のｒＢｕＣｈＥのシアリル化四量体変異体を、雄ハートレー系モルモットにＩＶおよびＩＭ経路により投与した。処置は良好に耐容され、動物は全て投与後１６８時間の試験期間全体で正常と見なされた。酵素は、このプロジェクトにおいて開発された他の組換え部分に比較すると、ヒト血清由来ＢｕＣｈＥにより密接に同等なＰＫパラメータを呈した。ＩＭ投与の後、ｒＢｕＣｈＥは、最初の血液採取時点でバックグランドをわずかに超えるレベルで検出され、濃度が注射後３６時間目のピークまで安定的に上昇した。Ｔ１／２値は、６３．４時間（ＩＶ）および８６．５時間（ＩＭ）であり、それは細胞外分布と一致する緩やかなＣｌ  ９．８ｍＬ／時間／ｋｇおよびＶｓｓ８３６ｍｌ／ｋｇに相当した。ＩＭ投与後のｒＢｕＣｈＥの生物学的利用度は、約６０％であった。
【０１１９】
実施例１２：シアリル化ｒＢｕＣｈＥ四量体の有効性テスト
有効性試験を、３種の異なる神経剤を用い、防御のための短い時点のＩＶモデルを使用して実施した。
【０１２０】
・ＧＤおよびＶＸ神経剤
これらの薬剤については、本発明の植物由来四量体シアリル化ＢｕＣｈＥを雄ハートレー系モルモット（３００〜３５０グラム）に２６．１５ｍｇ／ｋｇで各対象にＩＶカロチドカテーテルを介して投与した。
【０１２１】
１５分後に、２６．１５ｍｇ／ｋｇ投与された動物は、ｓ．ｃ．注射を介してＧＤまたはＶＸのＬＤ５０の３倍量に暴露された（それぞれｎ＝６）。
【０１２２】
・ＧＢ神経剤
この薬剤については、植物由来四量体シアリル化ＢｕＣｈＥを雄ハートレー系モルモット（３００〜３５０グラム）に５２．３ｍｇ／ｋｇでＩＶカロチドカテーテルを介して投与された。
【０１２３】
１５分後に、５２．３ｍｇ／ｋｇ投与された動物は、ｓ．ｃ．注射を介してＧＢのＬＤ５０の３倍量に暴露された（それぞれｎ＝６）。
【０１２４】
各状況において、テストの対象動物全てが、任意のＯＰ中毒の兆候を有さずに２４時間生存した。
【０１２５】
これらのデータから、シアリル化四量体ｒＢｕＣｈＥによる、致死性神経剤暴露からの哺乳動物防御の潜在的有効性が実証された。この魅力的なＰＫデータによって、この防御が、シアリル化および四量体化の効率を改善することにより最適化されて、非常に拮抗的に機能する生成物をもたらし得ることが示唆される。
【０１２６】
先に言及された通り、そのような四量体化およびシアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物はまた、神経疾病（アルツハイマー病）、中毒治療（例えばコカイン中毒の処置の場合）、および任意の複数の遺伝子または他の障害によるＢｕＣｈＥ欠損を克服するための同等な酵素補充療法など、他の哺乳動物処置にも用いられ得る。特に高レベルのシアリル化グリカンおよび四量体形態を用いた、信頼性のある方式による製造の実行可能性が、さらに効果的哺乳動物（ヒトを含む）処置の可能性にもつながり得る。
【０１２７】
したがって、この新たに発見された四量体シアリル化ｒＢｕＣｈＥ生成物の全体的効果は、この業界において顕著な改善を与える。遺伝子導入的手段、トランスフェクション工程、および他のタイプの遺伝子発現方法論によりそのような新しい生成物を生成するさらなる可能性が、それによりＯＰ防御のみならず、従来はどちらかといえば限定されていたヒトおよび他の哺乳動物への他の処置についても注目に値する領域を開拓する。
【０１２８】
本発明の範囲における様々な改良が、その主旨を逸脱することなく当業者によってなされ得ることが、理解されるべきである。それゆえ、本発明は、先行技術が許容したのと同程度に広範囲に、そして必要に応じて本明細書を考慮しながら、添付の特許請求の範囲により定義されるものと切望する。
【０１２９】
先に引用された参考資料は、以下の通りである：
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２．Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１５９２３−３０；
３．Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．２１：８１３−８２；
４．Ｃａｓｔｉｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．２８：２４０．
５．Ｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２００９，４：ｅ４２４１
６．米国特許第８，７２９，２４５号
７．Ｄｕｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ａ３２８Ｗ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｈａｖｅ  ａ  １６−ｈｏｕｒ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｃｏｃａｉｎｅ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００２  ３０２：７５１−８．
８．Ｅｌｌｍａｎ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．［１９６１］，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７：８８−９５
９．Ｅｎｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，３，ｅ３６４７２００８
１０．Ｇｉｒｉｔｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０３：１４７０１−１４７０６  
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１３．Ｇｌｅｂａ，Ｙ．，Ｋｌｉｍｙｕｋ，Ｖ．＆  Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ，Ｓ．，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１３４−１４１
１４．Ｉｌｙｕｓｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｏｌｙｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｕｔｙｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ａ  ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ  ｂｉｏｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｆｏｒ  ｎｅｒｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３．１１０：１２４３−８
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１６．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｍａｒ  １１．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｐｂｉ．１２１８４；
１７．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１４  Ａｐｒ：９（４）５０１−１０
１８．Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，６，ｅ１６７６５
１９．Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｅｎｇ  Ｂｕｇｓ  ３，３８−４３
２０．Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｃａｉｎｅ−ｄｅｔｏｘｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ．ＮＡＴＵＲＥ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ｜５：３４５７｜ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ４４５７
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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