(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の培養方法であって、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、細胞培養モジュールを適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記細胞培養モジュールへ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記細胞培養モジュールを、浮遊培養用の培養容器にて、第２培地にて培養する工程、
を含み、
ここで、前記細胞培養モジュールが、
ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと、を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
前記ポリマー多孔質膜が、流体によって継続的に波打つ動きを行わない状態で前記ケーシングに収容されていて、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、方法。
【請求項２】
前記培地流出入口の径が、前記細胞の径よりも大きく、かつ、前記ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケーシングが、メッシュ状の構造を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ケーシングが、非可撓性素材からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（２）が、静置、振盪及び／又は攪拌しながら、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（３）における培養において、前記第２培地が、前記培養容器内へ連続的又は間歇的に供給される系で行われる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（３）における培養において、前記ポリマー多孔質膜の一部分が、細胞培養培地の液相と接触しない培養である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（３）における培養において、前記培養容器が、可撓性バッグ型培養容器である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（３）における培養において、前記培養容器が、攪拌培養型容器である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、接着細胞である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びＭＤＣＫ細胞、線維芽細胞からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
懸濁された細胞を死滅させる方法であって、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、ポリマー多孔質膜を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記ポリマー多孔質膜を浮遊培養用の培養容器中の第２培地に浮遊させて、前記培養容器中に空気を注加し、前記ポリマー多孔質膜を継続的に形態変化させて培養する工程、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の培養方法に関する。また、懸濁された細胞の除去方法に関する。また、懸濁された細胞を死滅させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、治療やワクチンに用いられる酵素、ホルモン、抗体、サイトカイン、ウイルス（ウイルスタンパク質）等のタンパク質が培養細胞を用いて工業的に産生されている。しかし、こうしたタンパク質の生産技術はコストが高く、それが医療費を引き上げていた。そのため、大幅なコスト削減を目指して、高密度に細胞を培養する技術や、タンパク質の産生量を増大させるような革新的な技術が求められていた。【０００３】
タンパク質を産生させる細胞として、培養基材に接着する足場依存性の接着細胞が用いられることがある。こうした細胞は、足場依存的に増殖するため、シャーレ、プレート又はチャンバーの表面に接着させて培養する必要がある。従来、こうした接着細胞を大量に培養するためには、接着するための表面積を大きくする必要があった。ところが、培養面積を大きくするには、空間を必然的に増大させる必要があり、それがコストを増大させる要因となっていた。【０００４】
培養空間を小さくしつつ、接着細胞を大量に培養する方法として、微小多孔を有する担体、特に、マイクロキャリアを用いた培養法が開発されている（例えば、特許文献１）。マイクロキャリアを用いた細胞培養系は、マイクロキャリアが互いに凝集しないようにするために十分に攪拌・拡散される必要がある。そのため、マイクロキャリアを分散させた培地を十分に攪拌・拡散することができるだけの容積が必要となるため、培養できる細胞の密度には上限がある。また、マイクロキャリアと培地とを分離するためには、細かな粒子を分別できるフィルターで分離させる必要があり、それがコストを増大させる原因ともなっていた。こうした状況から、高密度の細胞を培養する革新的な細胞培養の方法論が希求されていた。【０００５】
＜ポリイミド多孔質膜＞
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献２〜４は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。【０００６】
細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７４号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０３８８７３号
【特許文献３】特開２０１１−２１９５８５号公報
【特許文献４】特開２０１１−２１９５８６号公報
【特許文献５】国際公開第２０１５／０１２４１５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞の培養方法を提供することを目的とする。また、懸濁された細胞の除去方法を提供することを目的とする。また、懸濁された細胞を死滅させる方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、細胞培養モジュールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、細胞の大量培養及び細胞の除去に適していることを見出した。また、所定の構造を有するポリマー多孔質膜が、所定の条件では、細胞を死滅させることに適していることを見出した。すなわち、限定されるわけではないが、本発明は好ましくは以下の態様を含む。
［１］  細胞の培養方法であって、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、細胞培養モジュールを適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記細胞培養モジュールへ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記細胞培養モジュールを、培養容器にて、第２培地にて培養する工程、
を含み、
ここで、前記細胞培養モジュールが、
ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと、を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されていて、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、方法。
［２］  前記培地流出入口の径が、前記細胞の径よりも大きく、かつ、前記ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい、［１］に記載の方法。
［３］  前記ケーシングが、メッシュ状の構造を有する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  前記ケーシングが、非可撓性素材からなる、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］  前記工程（２）が、静置、振盪及び／又は攪拌しながら、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記工程（３）における培養において、前記細胞培養培地が、前記培養容器内へ連続的又は間歇的に供給される系で行われる、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  前記工程（３）における培養において、前記ポリマー多孔質膜の一部分が、細胞培養培地の液相と接触しない培養である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］  前記工程（３）における培養において、前記培養容器が、可撓性バッグ型培養容器である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  前記工程（３）における培養において、前記培養容器が、攪拌培養型容器である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１４］に記載の方法。
［１６］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１４］又は［１５］に記載の方法。
［１７］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１８］  前記細胞が、接着細胞である、［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の方法。
［１９］  前記細胞が、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、及びＭＤＣＫ細胞、線維芽細胞からなる群より選択される、［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の方法。【００１０】
［２０］  懸濁された細胞の除去方法であって、
（１）懸濁された細胞を含む培地に、ポリマー多孔質膜を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有する、方法。【００１１】
［２１］  懸濁された細胞を死滅させる方法であって、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、ポリマー多孔質膜を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記ポリマー多孔質膜を培養容器中の第２培地に浮遊させて、前記ポリマー多孔質膜を継続的に形態変化させて培養する工程、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、方法。【００１２】
［２２］  ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている、細胞培養モジュール。
［２３］  前記培地流出入口の径が、前記細胞の径よりも大きく、かつ、前記ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい、［２２］に記載の細胞培養モジュール。
［２４］  前記ケーシングが、メッシュ状の構造を有する、［２２］又は［２３］に記載の細胞培養モジュール。
［２５］  前記ケーシングが、非可撓性素材からなる、［２２］〜［２４］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［２６］  前記ポリマー多孔質膜が、平均孔径０．０１〜１００μｍの複数の細孔を有する、［２２］〜［２５］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［２７］  前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［２２］〜［２６］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［２８］  前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［２２］〜［２７］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［２９］  前記ポリマー多孔質膜の総膜厚が、５〜５００μｍである、［２２］〜［２８］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［３０］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリイミド多孔質膜である、［２２］〜［２９］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
［３１］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［３０］に記載の細胞培養モジュール。
［３２］  前記ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［３０］又は［３１］に記載の細胞培養モジュール。
［３３］  前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である、［２２］〜［２９］のいずれか１項に記載の細胞培養モジュール。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、懸濁された細胞を効率的に吸着し、従来の浮遊培養容器を用いて、安定的に培養可能となる。また、本発明によって、従来のようなフィルター膜を用いることなく、簡便に細胞を除去することが可能となる。さらに、本発明のポリマー多孔質膜を用いて、懸濁された細胞を吸着させた後、ポリマー多孔質膜を継続的に形態変化する状態で培養すると、簡便に細胞を死滅させ、細胞内に発現したタンパク質を遊離させた培地を得ることが可能となる。さらに、ケーシングに収容され、モジュール化されたポリマー多孔質膜を用いることで、懸濁された細胞が簡単に吸着され、簡便かつ安定的に細胞を培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。ケーシング内にポリマー多孔質膜が収容されている。
【図２】図２は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。ケーシング内にポリマー多孔質膜が収容されている。
【図３】図３は、細胞培養モジュールの一実施態様を示す。（Ａ）メッシュ状のケーシング内にポリマー多孔質膜が収容されている。（Ｂ）メッシュ状のネットと、骨組みとからなるケーシングの一実施態様を示す。
【図４】図４は、スピナーフラスコ内で細胞培養モジュールを適用する際に併用するデバイスの実施態様を示す。（Ａ）回転型デバイス。細胞培養モジュールを適用した該デバイスをスピナーフラスコ内に設置し、該回転型デバイス自体を回転させて使用する。（Ｂ）固定型デバイス。細胞培養モジュールを適用した該デバイスをスピナーフラスコの底部を設置する。デバイス中央の空間でスピナーフラスコのスターラーを回転させて使用する。
【図５】図５は、可撓性バッグ型培養容器に細胞培養モジュールを適用して培養した一実施態様を示す。培養開始（左）から１時間で培養液のフェノールレッドが黄色へと変化した（右）。
【図６】図６は、振盪培養時のメッシュモジュール使用の一実施態様を示す。
【図７】図７は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。
【図８】図８は、実施例１において使用した細胞培養モジュールの一実施態様を示す。
【図９】図９は、実施例２において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。
【図１０】図１０は、実施例４において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）細胞培養装置の構成を示す図である。（Ｂ）（Ａ）における、細胞培養デバイスを載置する細胞培養部を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例６において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。基本的な構成は図１０と共通であるが、各段の培地排出口が３０度ずつ反時計回りにずれており、培地が排出されやすい構造となっている。
【図１２】図１２は、実施例７において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。
【図１３】図１３は、実施例９において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）細胞培養装置の構成を示す。（Ｂ）実施例９にて使用した円筒形容器（螺旋状流路無し）を示す図である。
【図１４】図１４は、実施例１０において使用した細胞培養装置の一実施態様を示す。（Ａ）実施例１０にて使用した円筒形容器（螺旋状流路有り）を示す模式図である。（Ｂ）実施例１０にて使用した円筒形容器（螺旋状流路有り）を示す図である。
【図１５】図１５は、実施例１１において使用した細胞培養モジュールのいくつかの実施態様を示す。
【図１６】図１６は、実施例１２において使用したポリイミド多孔質膜の蛍光顕微鏡像を示す図である。ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞を播種して培養２日後の蛍光顕微鏡像を示す。（Ａ）静置培養２日後、（Ｂ）振盪培養２日後（メッシュ無し）。
【図１７】図１７は、実施例１３において実施した細胞培養の一実施態様を示す。
【図１８】図１８は、一実施形態における本発明の細胞培養モジュールを適用したＷＡＶＥ型バイオリアクター示す図である。（Ａ）細胞培養モジュールが封入されたバッグ、（Ｂ）ＷＡＶＥ２５を用いた細胞培養モジュールへの細胞吸着工程、を示している。
【図１９】図１９は、一実施態様において、本発明を適用して培養した抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞から産生される抗体産生量及びグルコース濃度の経時的変化を示したグラフである。
【図２０】図２０は、本発明の一実施形態における細胞培養装置を示す図である。（Ａ）細胞培養モジュール、（Ｂ）細胞培養部、（Ｃ）一実施形態における細胞培養装置、を示す。
【図２１】図２１は、一実施形態における細胞培養装置を示す図である。
【図２２】図２２は、一実施形態の細胞培養装置における、液滴化培地供給手段から滴下される培地の様式を示す概念図である。（Ａ）ドロップ型、（Ｂ）メッシュ型、（Ｃ）シャワー型を示す。（Ｄ）ドロップ型及びメッシュ型の液滴を供給するために使用される、一実施形態の細胞培養装置に適用される蓋体を示す図である。蓋体の培地供給口には、ステンレス鋼製のメッシュを巻いて形成したメッシュ束が挿入される。
【図２３】図２３は、一実施態様において、本発明の細胞培養装置を使用した場合の、ヒト皮膚線維芽細胞から産生されるフィブロネクチンの量を示したグラフである。
【図２４】図２４は、一実施形態における乾熱滅菌型サイフォン式細胞培養装置（耐熱サイフォン型リアクター）を示す図である。
【図２５】図２５は、一実施態様において、本発明の細胞培養装置を使用した場合の、ヒト皮膚線維芽細胞から産生されるフィブロネクチンの量を示したグラフである。コントロールとして、通常の培養皿でヒト皮膚線維芽細胞を培養することにより産生されたフィブロネクチンの量を示している（ｄｉｓｈ  ｄａｙ８）。
【図２６】図２６は、本発明の一実施形態において用いられる培養基材（ポリイミド多孔質膜）及びそれを用いた細胞培養装置を示す。（Ａ）短冊状ポリイミド多孔質膜、（Ｂ）一端を融着固定したポリイミド多孔質膜、を示す。（Ｃ）培養バックに封入して振盪培養中の（Ａ）及び（Ｂ）のポリイミド多孔質膜を示す。
【図２７】図２７は、図２６（Ａ）：表９の方法（１）及び図２６（Ｂ）：表９の方法（２）のポリイミド多孔質膜に適用した培養した抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞の細胞密度の変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．細胞培養モジュール
【００１６】
本発明の一態様は、
ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている、細胞培養モジュールに関する。該細胞培養モジュールを、以下で、「本発明の細胞培養モジュール」とも呼ぶ。なお、本明細書において、「細胞培養モジュール」との記載は、単に「モジュール」と記載することができ、相互に変更しても同一のことを意味する。
【００１７】
本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システム、特に浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材をいう。細胞培養モジュールのいくつかの実施態様を図１〜３、図８、図２０（Ａ）に示す。本発明の細胞培養モジュールは、図４〜６、９〜１４、１７、１８、２０、２１及び２４のような実施態様によって使用することができる。また、後述する実施例に示す態様によっても使用することができる。
【００１８】
本発明の細胞培養モジュールは、ポリマー多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリマー多孔質膜がケーシング内で、継続的に形態が変形することが防止される。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。
【００１９】
本発明の細胞培養モジュールが備えるケーシングは、２以上の培地流出入口を有することで、細胞培地がケーシングの内部へ供給及び外部へ排出される。該ケーシングの培地流出入口の径は、ケーシングの内部へ細胞が流入可能であるように、前記細胞の径よりも大きいことが好ましい。また、培地流出入口の径が、該培地流出入口よりポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さいことが好ましい。ポリマー多孔質膜が流出する径よりも小さい径は、ケーシングに収容されたポリマー多孔質膜の形状、大きさによって適宜選択可能である。例えば、ポリマー多孔質膜がひも状である場合、該ポリマー多孔質膜の短辺の幅より小さく、該ポリマー多孔質膜が流出しない適度の径であれば特に限定されない。該培地流出入口の数は、細胞培地がケーシング内外へ供給及び／又は排出されやすいように、出来るだけ多く設けられていることが好ましい。好ましくは、５以上、好ましくは１０以上、好ましくは２０以上、好ましくは５０以上、好ましくは１００以上である。培地流出入口は、ケーシングの一部又は全部が、メッシュ状の構造を有していてもよい。また、該ケーシング自体がメッシュ状であってもよい。本発明において、メッシュ形状の構造とは、例えば、縦、横、及び／又は斜めの格子状の構造を有するものであって、各目開きが、流体が通過出来る程度に培地流出入口を形成するものであるが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の細胞培養モジュールが備えるケーシングは、通常の培養条件、例えば、攪拌培養、振とう培養条件における培地の動きによって変形しない程度に強度を有することが好ましく、非可撓性素材から形成されていることが好ましい。また、ケーシングは、細胞培養において、細胞の生育に影響を与えない素材によって形成されていることが好ましい。このような材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート等のポリマー、ステンレス綱、チタンなどの金属が挙げられるが、これに限定されない。ケーシングにある程度強度があることにより、ケーシング内部のポリマー多孔質膜の形状が継続的に変更することが防止され、本発明の効果がより発揮される。本明細書において、「ケーシングが変形しない」とは、通常の培養環境下で受ける負荷において変形しないことを意味するものであり、絶対的に変形しないことを意味するものではない。
【００２１】
本発明の細胞培養モジュールは、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている。
【００２２】
本明細書において、「ケーシング内に２以上の独立した該ポリマー多孔質膜が集約されて収容されている」とは、互いに独立した２以上のポリマー多孔性膜が、ケーシングで囲まれた一定空間内に集約されて収容されている状態を指す。本発明において、２以上の独立した該ポリマー多孔質膜は、該ポリマー多孔質膜の少なくとも１カ所と該ケーシング内の少なくとも１カ所とを任意の方法によって固定され、該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態に固定されたものであってもよい。また、２以上の独立したポリマー多孔質膜は、小片であってもよい。小片の形状は、例えば、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など、任意の形をとりうるが、好ましくは、略正方形が好ましい。本発明において、小片の大きさは、任意の大きさをとりうるが、略正方形である場合、長さは任意の長さでよいが、例えば、８０ｍｍ以下がよく、好ましくは５０ｍｍ以下がよく、より好ましくは３０ｍｍ以下がよく、さらにより好ましくは２０ｍｍ以下がよく、１０ｍｍ以下であってもよい。また、ポリマー多孔性膜の小片が略正方形である場合、その一辺の長さは、ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態となるように、ケーシングの内壁に沿って、又は内壁の一辺の長さより短く（例えば、０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度短い）形成されたものであってもよい。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。なお、ひも状のポリマー多孔質膜の場合、後述するように、（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、該ケーシングに収容されてもよい。また、ケーシング内に２以上の独立したポリマー多孔質膜を集約して収容するために、任意の枚数のポリマー多孔質膜を積層させてもよい。この場合、ポリマー多孔質膜とポリマー多孔質膜の間には中敷が設けられてもよい。中敷が設けられることにより、積層されたポリマー多孔質膜の間に効率的に培地を供給させることができる。中敷は、積層されたポリマー多孔質膜の間に任意の空間を形成し、効率的に培地を供給させる機能を有するものであれば特に限定されないが、例えば、メッシュ構造を有する平面構造体を用いることができる。中敷の材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ステンレス鋼製のメッシュを用いることができるが、これに限定されない。メッシュ構造を有する中敷を有する場合、積層されたポリマー多孔質膜の間に培地を供給できる程度の目開きを有していればよく、適宜選択することができる。
【００２３】
本明細書において、「折り畳まれたポリマー多孔質膜」とは、該ケーシング内にて折り畳まれていることで、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔質膜である。本明細書において、「折り畳まれた」とは、ポリマー多孔膜に折り目がついた状態であってもよく、折り目がついていない状態であってもよい。
【００２４】
本明細書において、「ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜」とは、ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、ポリマー多孔質膜の各面及び／又はケーシング内の表面との摩擦力によってケーシング内で動かない状態となったポリマー多孔性膜をいう。また、本発明おいて、縄状に編み込まれたポリマー多孔質膜とは、例えば短冊状の複数のポリマー多孔質膜を、任意の方法によって縄状に編み込み、ポリマー多孔質膜同士の摩擦力によって互いに動かない状態のポリマー多孔質膜をいう。（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が集約されたポリマー多孔質膜、（ｉｉ）折り畳まれたポリマー多孔質膜、（ｉｉｉ）ロール状に巻き込まれたポリマー多孔質膜、及び（ｉｖ）縄状に結ばれたポリマー多孔質膜、が、組み合わせられてケーシング内に収容されていてもよい。
【００２５】
本明細書において、「該ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態」とは、該細胞培養モジュールを細胞培養培地中で培養する場合に、該ポリマー多孔質膜が継続的に形態変化しない状態になるようにケーシング内に収容されている状態をいう。換言すれば、該ポリマー多孔質膜自体が、流体によって、継続的に波打つ動きを行わないように抑制された状態である。ポリマー多孔質膜がケーシング内で動かない状態を保つため、ポリマー多孔質膜内で生育されている細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等による細胞が死滅されることなく安定的に細胞が培養可能となる。
【００２６】
本発明の細胞培養モジュールは、細胞を培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性のバッグからなる培養装置にも適用可能であり、当該培養容器内に浮遊させた状態で使用することが可能である。また、本発明の細胞培養モジュールは、例えば、スピナーフラスコ等の攪拌培養型容器に適用し、培養することが可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。
【００２７】
２．細胞培養装置への細胞培養モジュールの適用
本明細書において、「細胞培養装置」とは、一般に、細胞培養システム、バイオリアクター、又はリアクターと同義に扱われる用語であって、相互に入れ替えても同一の意味を有する。本発明の細胞培養モジュールは、以下に例示する細胞培養装置に適用することができる。また、以下に例示する装置以外の市販の装置においても適用可能である。
【００２８】
（１）サイフォン式培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図９及び図２４に示す、サイフォン式培養装置において適用可能である。サイフォン式培養装置とは、ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、前記細胞培養部を内部に格納した液溜め部と、前記液溜め部の上部に配置された培地供給手段と、前記液溜め部の底部で連通された逆Ｕ字管と、前記逆Ｕ字管の他端の下部に設置された培地回収手段と、前記培地回収手段に配置された培地排出手段とを備え、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、ここで、前記培地供給手段から前記液溜め部に供給された培地の液面が前記逆Ｕ字管の頂上部に達したとき、サイフォンの原理により培地が前記培地回収手段に間歇的に吐出されることを特徴とする、細胞培養装置である。当該装置において、ポリマー多孔質膜を細胞培養モジュールに置き換えて使用することが可能である。
【００２９】
（２）筒型気相培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１０、図１１及び図２１に示す、筒型気相培養装置において適用可能である。一実施形態において、筒型気相培養装置とは、ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、を備え、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、ここで、前記細胞培養部が、１以上の培地排出口を有する底部と、前記底部に略垂直に配置された側部とを備えた、細胞培養装置である。また、一実施形態において、筒型気相培養装置とは、ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が収容された細胞培養部と、前記細胞培養部の上部に配置された培地供給手段と、前記細胞培養部の下部に配置された培地回収手段と、を備え、ここで、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、ここで、前記培地回収手段が、前記細胞培養部を収容する外筒の一部である、細胞培養装置である。当該装置において、ポリマー多孔質膜を細胞培養モジュールに置き換えて使用することが可能である。
【００３０】
（３）ミスト及びシャワー型培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１２に示す、ミスト及びシャワー型培養装置において適用可能である。ミスト及びシャワー型培養装置とは、
ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜が載置されたポリマー多孔質膜載置部と、前記ポリマー多孔質膜載置部が収容された筐体と、前記筐体の内部に配置された液滴化培地供給部と、前記液滴化培地供給部と連通した培地供給ラインと、前記培地供給ラインに連通した培地貯留部と、前記培地供給ラインの一部に設けられたポンプと、
を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
ここで、前記ポリマー多孔質膜載置部が、スリット状又はメッシュ状の複数の培地排出口を備えた、細胞培養装置である。当該装置において、ポリマー多孔質膜を細胞培養モジュールに置き換えて使用することが可能である。
【００３１】
（４）気相露出型回転培養装置
本発明の細胞培養モジュールは、図１３、１４及び図２０に示す、回転培養装置において適用可能である。気相露出型回転培養装置とは、
ポリマー多孔質膜と、前記ポリマー多孔質膜を有する細胞培養部と、前記細胞培養部を貫通した軸と、前記軸を回転するための回転モータと、前記細胞培養部の少なくとも一部を浸漬する培地槽と、を備え、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、
前記軸を中心として前記細胞培養部が回転し、前記ポリマー多孔質膜に担持された細胞が気相及び液相において交互に培養されることを特徴とする、細胞培養装置である。当該装置において、ポリマー多孔質膜を細胞培養モジュールに置き換えて使用することが可能である。
【００３２】
３．ポリマー多孔質膜
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。
【００３３】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。
【００３４】
ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
【数１】
0006773117.tif 000002
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）
【００３５】
表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。
【００３６】
ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。
【００３７】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜表面の総膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。
【００３８】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。
【００３９】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。
【００４０】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
【数２】
0006773117.tif 000003
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは総膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ3とする。）
【００４１】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。
【００４２】
本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。
【００４３】
本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド多孔質膜、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜である。
【００４４】
３−１．ポリイミド多孔質膜
ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。
【００４５】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。
【００４６】
一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００４７】
ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。
【００４８】
ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。
【００４９】
ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。
【００５０】
本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。
【００５１】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。
【００５２】
着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。
【００５３】
炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。
【００５４】
また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。
【００５５】
着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。
【００５６】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００５７】
これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。
【００５８】
上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。
【００５９】
これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。
【００６０】
これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。
【００６１】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。
【００６２】
本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
【００６３】
本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。
【００６４】
例えば、国際公開第２０１０／０３８８７３号、特開２０１１−２１９５８５号公報、又は特開２０１１−２１９５８６号公報に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。
【００６５】
３−２．ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）多孔質膜
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。
【００６６】
アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。
【００６７】
二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。
【００６８】
ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。
【００６９】
ポリエーテルスルホンの対数粘度は、多孔質ポリエーテルスルホン膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。
【００７０】
また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。
【００７１】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
【００７２】
本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。
【００７３】
４．細胞培養モジュールを用いた細胞培養方法
【００７４】
本発明の一態様は、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、細胞培養モジュールに適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記細胞培養モジュールへ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記細胞培養モジュールを、培養容器中で、第２培地にて培養する工程、
を含み、
ここで、細胞培養モジュールが、
ポリマー多孔質膜と、
２以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと、を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、
ここで、前記ケーシング内に
（ｉ）２以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
（ｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
（ｉｉｉ）前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び／又は、
（ｉｖ）前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されていて、
ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、細胞の培養方法に関する。本発明の細胞の培養方法を、以下で、「本発明の細胞の培養方法」とも呼ぶ。
【００７５】
本発明に利用し得る細胞の種類は、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌及び細菌からなる群から選択される。動物細胞は、脊椎動物門に属する動物由来の細胞と無脊椎動物（脊椎動物門に属する動物以外の動物）由来の細胞とに大別される。本明細書における、動物細胞の由来は特に限定されない。好ましくは、脊椎動物門に属する動物由来の細胞を意味する。脊椎動物門は、無顎上綱と顎口上綱を含み、顎口上綱は、哺乳綱、鳥綱、両生綱、爬虫綱などを含む。好ましくは、一般に、哺乳動物と言われる哺乳綱に属する動物由来の細胞である。哺乳動物は、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどを含む。
【００７６】
本発明に利用しうる動物細胞の種類は、限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、及び生殖細胞からなる群から選択される。
【００７７】
本明細書において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。限定されるわけではないが、多能性幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等を含む。好ましくは、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開第２００９／１２３３４９号（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
【００７８】
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。
【００７９】
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。有性生殖においては次世代へは受け継がれない。好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、線維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
【００８０】
「生殖細胞」は、生殖において遺伝情報を次世代へ伝える役割を持つ細胞を意味する。例えば、有性生殖のための配偶子、即ち卵子、卵細胞、精子、精細胞、無性生殖のための胞子などを含む。
【００８１】
細胞は、肉腫細胞、株化細胞及び形質転換細胞からなる群から選択してもよい。「肉腫」とは、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血液等の非上皮性細胞由来の結合組織細胞に発生する癌で、軟部肉腫、悪性骨腫瘍などを含む。肉腫細胞は、肉腫に由来する細胞である。「株化細胞」とは、長期間にわたって体外で維持され、一定の安定した性質をもつに至り、半永久的な継代培養が可能になった培養細胞を意味する。ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）、ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来）、ＨＬ−６０細胞（ヒト白血球細胞由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞由来）、ＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来）、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝癌由来細胞株）、ＢＨＫ細胞（新生児ハムスター腎臓細胞）、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（マウス胎児線維芽細胞由来）などヒトを含む様々な生物種の様々な組織に由来する細胞株が存在する。「形質転換細胞」は、細胞外部から核酸（ＤＮＡ等）を導入し、遺伝的性質を変化させた細胞を意味する。
【００８２】
本明細書において、「接着細胞」とは、一般に、増殖のために適切な表面に自身を接着させる必要がある細胞であって、付着細胞又は足場依存性細胞ともいわれる。本発明のいくつかの実施形態では、使用する細胞は接着細胞である。本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、より好ましくは、培地中に懸濁した状態でも培養可能な細胞である。懸濁培養可能な接着細胞とは、公知の方法によって、接着細胞を懸濁培養に適した状態へ馴化させることによって得ることが可能であり、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などや、これらの細胞から派生して得られた細胞株が挙げられる。ここに挙げられないものであっても、本発明に用いられる細胞は、接着細胞であって、馴化によって懸濁培養可能な細胞であれば、特に限定されない。
【００８３】
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図７に示す。図７は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の細胞の培養方法では、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の細胞が生育するため、大量の細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の細胞の培養方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の細胞を培養することが可能となる。例えば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
【００８４】
本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図７参照）。そして、ポリマー多孔質膜に細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。
【００８５】
本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、細胞を長期にわたって良好に培養することができる。
【００８６】
つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。
【００８７】
本発明の細胞の培養方法において、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数が、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０5個以上、１．０×１０6個以上、２．０×１０6個以上、５．０×１０6個以上、１．０×１０7個以上、２．０×１０7個以上、５．０×１０7個以上、１．０×１０8個以上、２．０×１０8個以上、５．０×１０8個以上、１．０×１０9個以上、２．０×１０9個以上、または５．０×１０9個以上となるまで培養することをいう。
【００８８】
なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる細胞の数を、細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。例えば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。
【００８９】
また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、例えば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０５個以上、２．０×１０５個以上、１．０×１０６個以上、２．０×１０６個以上、５．０×１０６個以上、１．０×１０７個以上、２．０×１０７個以上、５．０×１０７個以上、１．０×１０８個以上、２．０×１０８個以上、または５．０×１０８個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。
【００９０】
本明細書において、「懸濁された細胞」とは、例えば、トリプシン等のタンパク質分解酵素によって、接着細胞を強制的に浮遊させて培地中に懸濁して得られた細胞や、上述の馴化工程によって培地中に浮遊培養可能となった細胞などを含んでいる。
【００９１】
本明細書において、「培地」とは、細胞、特に動物細胞を培養するための細胞培養培地のことを指す。培地は、細胞培養液と同義の意味として用いられる。そのため、本発明において用いられる培地とは、液体培地のことを指す。培地の種類は、通常使用される培地を使用することが可能であり、培養する細胞の種類によって適宜決定される。
【００９２】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、ＪＸエネルギー製ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａを用いることができる。
【００９３】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞が細胞培養モジュールに吸着可能な温度であればよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。また、本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは１５分〜５００分である。
【００９４】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）は、振盪及び／又は攪拌しながら、該細胞培養モジュールの該ポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよく、静置して該細胞培養モジュールの該ポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよい。振盪する方法は特に限定されないが、例えば、市販の振盪装置上に、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを含む培養容器を載置し、振盪してもよい。振盪は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、振盪と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。攪拌する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを市販のスピナーフラスコ内に入れ、スターラーを回転させることで攪拌してもよい。攪拌は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、攪拌と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。
【００９５】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）で用いられる第２培地は、接着細胞の培養に用いられる培地が選択され、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２などを用いることができるが、これに限定されない。第２培地は、細胞が基材へ接着するのを阻害する成分、例えば、界面活性剤が含まれない培地が好ましい。使用される第２培地は、細胞の種類によって適宜選択される。該工程（３）において、第２培地で培養することで、該工程（２）でポリマー多孔質膜に吸着された細胞が、該ポリマー多孔性膜内に接着することを促進する。これによって、細胞が該ポリマー多孔質膜から脱落することなく安定的に培養可能である。また、本発明の細胞の培養方法は、前述のポリマー多孔質膜を備えた細胞培養モジュールを使用する。本発明の細胞の培養方法で用いられる細胞培養モジュールは、ポリマー多孔質膜がケーシングに収容されていることによって、膜状のポリマー多孔質膜がケーシング内で継続的に形態が変形することが防止されている。これによって、ポリマー多孔質膜内で生育される細胞にストレスが加えられることが防止され、アポトーシス等が抑制されて安定的かつ大量の細胞を培養することが可能となる。
【００９６】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、細胞を培養する培養装置及びシステム等であれば、市販のものを適用することが可能である。例えば、培養容器が可撓性バッグ型培養容器であってもよく、また、攪拌型培養容器、例えばスピナーフラスコ等の培養容器で培養することも可能である。その他、培養容器としては、開放容器にも適用可能であり、閉鎖容器にも適用可能である。例えば、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ  セルファクトリー等が含まれる。また、の細胞の培養方法において、細胞培養モジュールを用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能となる。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、該工程（３）は、本明細書に記載の細胞培養装置で実施してもよい。
【００９７】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、該細胞培養モジュールを含む培養容器に連続的に培地を添加し回収するような連続循環型の装置を用いて実行することも可能である。
【００９８】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）は、該細胞培養モジュールを含む培養容器の外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系であってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系とすることができる。
【００９９】
５．懸濁された細胞の除去方法
【０１００】
本発明の一態様は、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、ポリマー多孔質膜を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有する、懸濁された細胞の除去方法に関する。本発明の細胞の除去方法を、以下で、「本発明の細胞の除去方法」とも呼ぶ。
【０１０１】
本発明の細胞の除去方法において使用されるポリマー多孔質膜は、前述のポリマー多孔質膜を使用することができる。該ポリマー多孔質膜は、前述の細胞培養モジュールであってもよく、ケーシングに収容されていないポリマー多孔質膜であってもよい。
【０１０２】
本発明の細胞の培養方法において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、ＪＸエネルギー製ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａを用いることができる。
【０１０３】
本発明の細胞の除去方法において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞が細胞培養モジュールに吸着可能な温度であればよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。また、本発明の細胞の培養方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは１５分〜５００分である。
【０１０４】
本発明の細胞の除去方法において、該工程（２）は、振盪及び／又は攪拌しながら、該細胞培養モジュールの該ポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよく、静置して該細胞培養モジュールの該ポリマー多孔質膜へ細胞を吸着させてもよい。振盪する方法は特に限定されないが、例えば、市販の振盪装置上に、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを含む培養容器を載置し、振盪してもよい。振盪は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、振盪と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。攪拌する方法は特に限定されないが、例えば、本発明の細胞培養モジュールと細胞とを市販のスピナーフラスコ内に入れ、スターラーを回転させることで攪拌してもよい。攪拌は、継続的又は断続的に行ってもよく、例えば、攪拌と静置を交互に繰り返してもよく、適宜調整すればよい。
【０１０５】
本発明の細胞の除去方法によって、従来は、細胞を含む培地から細胞を除去するためには、遠心分離処理やフィルターによる処理を行うなどの操作が必要であった。本発明の方法によれば、フィルター等を用いることなく、培地から細胞を除去可能することが可能となる。
【０１０６】
６．懸濁された細胞を死滅させる方法
【０１０７】
本発明の一態様は、
（１）懸濁された細胞を含む第１培地に、ポリマー多孔質膜を適用する工程、
（２）細胞培養可能な温度に維持し、前記ポリマー多孔質膜へ前記細胞を吸着させる工程、及び、
（３）前記細胞を吸着させた前記ポリマー多孔質膜を培養容器中の第２培地に浮遊させて、前記ポリマー多孔質膜を継続的に形態変化させて培養する工程、
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通し、ここで、前記第２培地が、界面活性剤を含まない、懸濁された細胞を死滅させる方法に関する。本発明の細胞を死滅させる方法を、以下で、「本発明の細胞の死滅方法」とも呼ぶ。
【０１０８】
本発明の細胞の死滅方法で使用されるポリマー多孔質膜は上述と同様である。本発明の細胞の死滅方法で使用される、該ポリマー多孔質膜は、前述の細胞培養モジュール及び細胞の培養方法とは異なり、ケーシングに収容されていないポリマー多孔質膜である。
【０１０９】
本発明の細胞の死滅方法において、該工程（１）で用いられる第１培地は、細胞を培養できる培地であれば特に限定されないが、例えば、ＣＨＯ細胞を培養する場合であれば、ＪＸエネルギー製ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａを用いることができる。
【０１１０】
本発明の細胞の死滅方法において、該工程（２）の細胞培養可能な温度とは、細胞がポリマー多孔質膜に吸着可能な温度であればよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。また、本発明の細胞の死滅方法において、該工程（２）の細胞を吸着させる時間は、例えば、５分〜２４時間、好ましくは１０分〜１２時間、より好ましくは１５分〜５００分である。
【０１１１】
本発明の細胞の死滅方法において、（３）前記細胞を吸着させた前記ポリマー多孔質膜を培養容器中の第２培地に浮遊させて、前記ポリマー多孔質膜を継続的に形態変化させて培養する工程、を含むことにより、該ポリマー多孔質膜内の細胞がアポトーシス等によって死滅する。本発明の細胞の培養方法において、該工程（３）で用いられる第２培地は、接着細胞の培養に用いられる培地が選択され、例えば、Ｄ−ＭＥＭ、Ｅ−ＭＥＭ、ＩＭＤＭ、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２などを用いることができるが、これに限定されない。第２培地は、細胞が基材へ接着するのを阻害する成分、例えば、界面活性剤が含まれない培地が好ましい。使用される第２培地は、細胞の種類によって適宜選択される。該工程（３）において、第２培地で培養することで、該工程（２）でポリマー多孔質膜に吸着された細胞が、該ポリマー多孔性膜内に接着することを促進する。
【０１１２】
本発明の細胞の死滅方法において該工程（３）は、任意の温度であってもよく、１０℃〜４５℃、好ましくは、１５℃〜４２℃、より好ましくは２０℃〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３９℃である。本発明の細胞の死滅方法は、従来の細胞を死滅させる方法、特に、細胞膜を破壊する方法で用いられる界面活性剤等を用いることなく、細胞を破壊することが可能となる。
【実施例】
【０１１３】
以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１４】
以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。【０１１５】
（実施例１）
バッグ型モジュールリアクターを用いた細胞培養【０１１６】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．６×１０６になるまで培養を継続した。ボックス型モジュール（図８）を用意し、以下の様な組み合わせで、滅菌的に２５μｍポリイミド多孔質膜をモジュール内に据え付け、ボックスの蓋部分を溶着してモジュールの準備を完了した。各実験の構成を表１に示す。尚、使用したポリイミド多孔質膜のサイズは、１．５×１．５ｃｍである。【０１１７】
【表１】
0006773117.tif 000004
【０１１８】
振盪培養向け酸素透過バッグにモジュールを表１に記載の通り１〜３個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。翌日、各振盪バッグより細胞を含む培地液を排出し、細胞数をカウントした。各実験の細胞回収結果を以下の表２に示す。ポリイミド多孔質膜のシート面積及び集積状況によって付着細胞数が変化する事を確認した。【０１１９】
【表２】
0006773117.tif 000005
【０１２０】
新たな培地を２０ｍｌ注加し、ＣＯ２インキュベータ内で振盪培養を継続した。２〜３日に一回培地交換を実施し、適宜、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ  Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）による比色定量法で細胞数を確認し、ＨＰＬＣ法にて抗体産生量を確認した。培地は清澄な状態を維持していた。懸濁液除去から６日目と８日目の培養結果を表３及び表４に示す。何れも、培地量は２０ｍｌであった。培地は２％のＦＢＳを加えたＩＭＤＭを使用した。【０１２１】
【表３】
0006773117.tif 000006
【０１２２】
【表４】
0006773117.tif 000007
【０１２３】
この後、培養９日目より培地量を２０ｍｌから４０ｍｌに変更し、更に１０日間、合計で１９日間、実験１〜５のそれぞれの培養を継続した。１９日目に培養バッグを解体し、それぞれのモジュールを１つのバッグに集積させて、４０ｍｌの培地を加え、ＣＯ２インキュベータ内で振盪培養を実行した。１時間程度で培地のｐＨ低下が観測される為（図５）、１時間に１回ずつ、０．５モル水酸化ナトリウムと４５％グルコースを注加して、６時間培養した。培養実施後、培養液を回収してＣＣＫ８による比色定量法で細胞数を確認し、ＨＰＬＣ法にて抗体産生量を確認した。細胞密度は１平方センチメートルあたり４．７×１０５個であり、総細胞数は１．９×１０８個であり、一日当りに換算した抗体産生量は５５ｍｇ／Ｌ／ｄａｙであった。【０１２４】
（実施例２）
サイフォン式培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１２５】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、３．９×１０６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ１枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套を形成し、滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１２個を同シャーレに加えた。モジュールを細胞懸濁液で湿潤した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した。【０１２６】
翌日、モジュールを取り出し、図９に示すサイフォン式細胞培養装置のステージ部分にモジュール１０個を設置し、液溜めには、３５０ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。２日後に培養を終了した。細胞密度５．５×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．２×１０７個の細胞が観察された。【０１２７】
（実施例３）
サイフォン式培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１２８】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。【０１２９】
翌日、振盪バッグよりモジュールを取り出し、実施例２と同様の条件で、サイフォン式培養装置による細胞培養を行った。液溜めには、３５０ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度１．０×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数２．１×１０７個の細胞が観察された。【０１３０】
（実施例４）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１３１】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。【０１３２】
翌日、モジュールを取り出し、図１０に示す筒型気相培養装置のステージ部分にモジュール１０個を設置し、液溜めには、３５０ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度２．５×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．０×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。【０１３３】
（実施例５）
筒型気相培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１３４】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、２．４×１０６になるまで培養を継続した。ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール３０個を酸素透過型培養バッグに滅菌的に封入し、上記培養液３０ｍｌを注加した。ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した後、翌日、モジュールを取り出し、図１１に示す筒型気相培養装置のステージ部分にモジュール３０個を設置し、液溜めには、３００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し、同培地をチューブポンプ経由で毎分２０ｍｌの速度で循環させた。【０１３５】
４日後に培養を終了した所、細胞密度７．１×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数５．８×１０７個の細胞が観察された。酸素供給装置を使用せず、コンパクトかつ簡便な設備で、大量の抗体産生細胞を培養出来る事実が示された。【０１３６】
（実施例６）
ミスト及びシャワー型培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１３７】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、３．９×１０６になるまで培養を継続した。１０ｃｍ径シャーレ１枚に上記浮遊培養液を夫々１２ｍｌ注加した後、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套を形成し、滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１２個を同シャーレに加えた。モジュールを細胞懸濁液で湿潤した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した。【０１３８】
翌日、モジュールを取り出し、図１２に示すミスト及びシャワー型培養装置の内部にモジュール１２個を設置し、液溜めには、２００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。【０１３９】
２日後に培養を終了した所、細胞密度３．４×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数８．２×１０６個の細胞が観察された。【０１４０】
（実施例７）
ミスト及びシャワー型培養装置によるポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養法【０１４１】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、９．９×１０６になるまで培養を継続した。振盪培養向け酸素透過バッグにモジュール１０個を入れ、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。【０１４２】
翌日、振盪バッグよりモジュールを取り出し、実施例７と同様の条件で、ミスト及びシャワー型培養装置による細胞培養を行った。液溜めには、２００ｍｌの培地（コージンバイオ製ＫＢＭ２７０）を貯留し同培地をチューブポンプ経由で毎分６０ｍｌの速度で循環させた。４日後に培養を終了した所、細胞密度８．８×１０４Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．８×１０７個の細胞が観察された。【０１４３】
（実施例８）
気相露出型回転培養装置【０１４４】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．３×１０６になるまで培養を継続した。図１３に示す気相露出型回転培養装置（竪ドラム式、螺旋状流路無し）内部にナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１８個を据え付け、回転可能な状態に準備する。上記浮遊培養液を上部液溜めに４０ｍｌ注加した後、毎分６回転のゆっくりした速度で浮遊培養液に湿潤させた。この回転部を含む機器全体を、ＣＯ２インキュベータ内で５時間放置した後、上部液溜めの浮遊培養液を排除し、モジュールの回転は継続させたまま、５００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留した下部液溜めより、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。７日間培養した時点で、細胞密度３．２×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数１．０×１０８個の細胞が観察された。【０１４５】
（実施例９）
気相露出型回転培養装置【０１４６】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．３×１０６になるまで培養を継続した。図１４に示す気相回転培養装置（切れ込みドラム式、螺旋状流路有り）内部にナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール１８個を据え付け、回転可能な状態に準備する。上記浮遊培養液を上部液溜めに４０ｍｌ注加した後、毎分６回転のゆっくりした速度で浮遊培養液に湿潤させた。この回転部を含む機器全体を、ＣＯ２インキュベータ内で終夜放置した後、上部液溜めの浮遊培養液を排除し、モジュールの回転は継続させたまま、５００ｍｌの培地を（ＦＢＳ２％を含むＩＭＤＭ）貯留した下部液溜めより、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。７日間培養した時点で、細胞密度２．４×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数８．５×１０７個の細胞が観察された。【０１４７】
（実施例１０）
様々なモジュールによるＣＨＯ−ＤＰ１２細胞のバッグ培養【０１４８】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．１×１０６になるまで培養を継続した。ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じた、あるいは一部を固定してポリイミド多孔質膜を露出させた各種モジュール６種（図１５；モジュール写真）を用意し、表１に示す様な組み合わせで、滅菌的に２５μｍポリイミド多孔質膜を酸素透過型培養バッグ内部に据え付け、開口部を溶着してモジュール装備型培養バッグの準備を完了した。各実験の構成を図１５に示す。【０１４９】
これらの培養バッグに、上記細胞懸濁液６ｍｌを注加し、２時間及び５．５時間後に、未吸着で浮遊している細胞数を測定した。モジュール形状及びポリイミド多孔質膜の形状に呼応して、未吸着細胞数が観測される事実を見出した。結果を表５に示す。【０１５０】
【表５】
0006773117.tif 000008
【０１５１】
吸着工程終了後、２０ｍｌの培地を供給後、ＣＯ２インキュベータ内で振盪培養を行った。毎日、水酸化ナトリウム溶液およびフィード培地を加えながら週２回程度培地交換を行った。培地交換を行う際、ＣＣＫ８による比色定量法で細胞数を行い、細胞の増殖を確認した。モジュールの形状に依存して、細胞の増殖挙動が大きく変化する事実が見出された。４日、７日及び１１日時点での細胞数に関して、表６に纏めた。【０１５２】
【表６】
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【０１５３】
（実施例１１）
培地交換型新規培養法【０１５４】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの細胞数が、２．０×１０６になるまで培養を継続した。０．３ｃｍ×２．５ｃｍの細長い形状をしたポリイミド多孔質膜を準備して乾熱滅菌を行なった後、２０ｃｍ２シャーレ内に１１〜１２片を設置し、上記浮遊培養液４ｍｌを注加して十分にポリイミド多孔質膜を細胞懸濁液で湿潤させた後、ＣＯ２インキュベータ内に放置する。２時間後、シャーレをインキュベータから取り出し、細胞懸濁液を吸引除去した後に培地（２％ＦＢＳ添加ＩＭＤＭ）４ｍｌを加えて更にＣＯ２インキュベータ内で培養を継続する。培地は、２日に一回のペースで交換を行なった。【０１５５】
培養開、始から７日後、ＣＣＫ８を用いて培養された３枚のシャーレ内におけるポリイミド多孔質膜上の細胞数を、面積あたりの細胞数として算出した。翌日、３つのシャーレの内１つはそのまま培養を続ける一方で、残り２つのうち１つでは、培養液ごとニプロ製の酸素透過型培養バッグに細胞の生育したポリイミド多孔質膜を移し、ヒートシーラーで滅菌的に密閉した。更に残りのシャーレ１つに関しては、ポリイミド多孔質膜をハサミにて、凡そ０．３ｃｍ×０．３ｃｍ細片に滅菌的に細断した後、３０＃ナイロンメッシュの外袋を用意し、１ｃｍ×１ｃｍ程度の大きさの袋をヒートシーラーで滅菌的に形成し、そのメッシュ外膜ごと、先のニプロ製の酸素透過型培養バッグに培地ごと移送して、ヒートシーラーで滅菌的に密閉した。【０１５６】
静置培養はこれまでと同様に継続する一方で、ポリイミド多孔質膜を直接入れた培養バッグと、ナイロンメッシュで外套を作成して培養バッグに入れたものを、それぞれＣＯ２インキュベータ内に設置したシェーカーで１分間に２０〜３０回のゆれを生じる設定を行い、振盪培養を２日間実施した。静置培養、及び２種の振盪培養を行った後の細胞密度を、実施前と同様のＣＣＫ８法にて算出した。結果を表７に示す。直接バッグに入れた振盪培養のケースのみ、著しい細胞数の減少が観察された。【０１５７】
直接ポリイミド多孔質膜を入れたバッグからポリイミド多孔質膜を取り出し、培地１ｍｌを加え、更に、ＣｅｌｌＭａｓｋ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔａｉｎ（１μＬ）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＰｒｏｍｏＫｉｎｅ社製）（１μＬ）を加えてインキュベータ内に５分静置した。その後、染色試薬の入った培地を除去し、新しい培地を加えて、染色を完了した。ライブセルイメージングを蛍光顕微鏡にて行なった。同様に、静置培養を継続したポリイミド多孔質膜も、同様の条件で、イメージング測定を実施した。静置培養に於いて大量の細胞が確認される（図１６（Ａ））。一方、直接、振盪バッグに入れたポリイミド多孔質膜では、極めて少量の細胞しか視認されなかった（図１６（Ｂ））。蛍光顕微鏡写真を、図１６に示す。【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
（実施例１２）
ヒト間葉系幹細胞のポリイミド多孔質膜を含むモジュールを用いた細胞培養法【０１６０】
Ｌｏｎｚａ社製、ヒト間葉系幹細胞をシャーレにて継代・増殖させ、トリプシン処理により、５．０×１０６個の細胞を培地２０ｍｌに懸濁させた。酸素透過性培養バッグに、ナイロンメッシュ（３０＃、目開き５４７μｍ）にて外套（ケーシング）を形成し滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり２０ｃｍ２）加えて封じたモジュール３０個を据え付けておき、そこへ上記懸濁液を注加した後、ＣＯ２インキュベータ内で終夜振盪培養を行った。翌日、バッグ内の液を破棄した後、滅菌的にスピナーフラスコにモジュール保持機能を付与した容器（図４（Ａ））に移送し、８０ｍｌの間葉系幹細胞専用培地を加えて攪拌培養をＣＯ２インキュベータ内で実行した（図１７）。１週間の攪拌培養の後、ＣＣＫ８を用いた比色定量法で細胞数を求めた所、５．５×１０７個の細胞が確認された。スピナー培養法により大量のヒト間葉系幹細胞が容易に培養可能である事が示された。【０１６１】
（実施例１３）
ポリイミド多孔質膜を含むモジュールとＷＡＶＥ型バイオリアクターを用いた物質産生法【０１６２】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、２．１×１０６になるまで培養を継続した。【０１６３】
くればぁ社製交点融着ポリプロピレンメッシュ（２５＃、目開き６７０μｍ）にてケーシングを形成し、滅菌的にポリイミド多孔質膜を一定量（１モジュールあたり１０ｃｍ２）及び交点融着ポリプロピレンメッシュ製中敷（１０＃、目開き２１４５μｍ）２枚を加えて封じたモジュールを３００個用意し、ＧＥヘルスケア製バイオリアクター；ＲｅａｄｙＴｏＰｒｏｃｅｓｓ  ＷＡＶＥ  ２５（以降、ＷＡＶＥ２５と表記）用バッグに、バッグに付属したキャップを通じて滅菌的に封入した。バッグを、ＷＡＶＥ２５に設置し、空気・ＣＯ２濃度・温度等を設定して、準備を完了した。そこへ、上記浮遊培養液５００ｍｌをチューブ経由で滅菌的に注加し、３７℃５％ＣＯ２濃度にて振動を開始し、ポリイミド多孔質膜への細胞吸着を実行した。図１８に、リアクター及びモジュール入りバッグ等を示す。２４時間後、注加した培地をバッグから排出し、そこへコージンバイオ製ＣＨＯ培地ＫＢＭ２７０を５００ｍｌ加えた。バッグ内から排出した液をセルカウントしたところ、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．１×１０６であった。４８％の生細胞が吸着した計算となる。【０１６４】
バッグ内の状況変化を解析する為、定期的に培地をサンプリングし、ロッシュ社製Ｃｅｄｅｘ  Ｂｉｏを用いてグルコース量、乳酸産生量、抗体産生量等の各種成分組成分析を実行した。培地は、１日〜２日に一度、間歇的に交換し、約４０日間連続的に細胞培養を実行した。また、後半の実験では、図１９に示す通り、１日に数回培地交換を実施し、効果等の検証を行なった。図１９に、抗体産生量及びグルコース濃度の経時的結果を示す。徐々にグルコース消費量や抗体産生量が上昇する様子が示されると共に、連続的かつ高効率に抗体産生され得る事実を見出した。培養全期間を通じた一日当りの抗体産生効率は、６４ｍｇ／Ｌであった。【０１６５】
（実施例１４）
＜ステンレス綱製ケーシングを有するモジュール化ポリマー多孔質膜（以下、「メタルモジュール」という）及びステンレス綱製細胞培養部（以下、「メタルドラム」という）の作製＞
ポリイミド多孔質膜の有する耐熱性を最大限に活用し、簡単な全体乾熱滅菌で滅菌作業を完了すべく、ステンレス鋼メッシュ製のケーシング、中敷、及びポリイミド多孔質膜で構成されるメタルモジュールを作製した（図２０（Ａ）を参照）。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍのポリイミド多孔質膜及びポリイミド多孔質膜と同面積のステンレス鋼メッシュ（「中敷」という。図示しない）を積層したもの（ポリイミド多孔質３枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質４枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質３枚、の順番で積層）を、ステンレスメッシュ製のケーシングで封止して、メタルモジュールを作製した（図２０（Ａ））。作業は、開放空間下で非滅菌的に実施した。このメタルモジュールを運用するためのメタルドラムも、同様にステンレス綱メッシュにて作製し（図２０（Ｂ））、内部にメタルモジュール２０個を入れた状態で、非滅菌的に組み立てた。その後、メタルモジュールを含むメタルドラムをアルミホイルで包み、摂氏１９０度にて８０分間乾熱滅菌し、放冷した。【０１６６】
＜気相露出型回転培養装置＞
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．１×１０６になるまで培養を継続した。図２０（Ｃ）に示す様にメタルモジュールを含むメタルドラムを滅菌的に据え付け、クリーン環境下で回転可能な状態に準備した（図２０（Ｃ））。上記のように細胞を浮遊培養して得た培地３４ｍｌと、新鮮な培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）６ｍｌを培養槽（図１３（Ａ）の培養槽に相当）に注加した後、メタルドラムを毎分１回転の速度で回転させ、ポリイミド多孔質膜に培地を湿潤させた。この装置全体を、ＣＯ２インキュベータ内で２１時間放置した後、上部液溜めの培地を排除し、メタルドラムの回転は継続させたまま、２００ｍｌの培地（ＫＢＭ−２７０）を貯留した培地排出槽（図１３（Ａ）の培地排出槽に相当）より、同培地をチューブポンプ経由で毎分１０ｍｌの速度で循環させた。４日間培養した時点で、細胞密度３．９×１０５Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２で総細胞数７．８×１０７個の細胞が観察された。その後、上部液溜め及び下部液溜め全量の培地を新鮮な培地（ＫＢＭ−２７０）に交換し、更に２日間同条件で培養を継続した。その時点で細胞密度１．３×１０６Ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２、総細胞数２．６×１０８個の細胞が観察された。【０１６７】
（実施例１５）
ステンレス綱製ケーシングを有するモジュール化ポリマー多孔質膜（以下、「メタルモジュール」という）による筒型気相培養装置（以下、「気筒型バイオリアクター」という）の準備及びそれを使用した細胞培養【０１６８】
ポリイミド多孔質膜の有する耐熱性を最大限に活用し、簡単な全体乾熱滅菌で滅菌作業を完了すべく、ステンレス鋼メッシュ製のケーシング、中敷、及びポリイミド多孔質膜で構成されるメタルモジュールを作製した（図２０（Ａ）に相当）。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍのポリイミド多孔質膜及びポリイミド多孔質膜と同面積のステンレス鋼メッシュ（「中敷」という。図示しない）を積層したもの（ポリイミド多孔質３枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質４枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質３枚、の順番で積層）を、ステンレスメッシュ製のケーシングで封止して、メタルモジュールを作製した（図２０（Ａ））。作業は、開放空間下で非滅菌的に実施した。【０１６９】
このメタルモジュールを運用するためのガラス製耐熱気筒型リアクターは、ガラスチャンバ内にメタルモジュールが据付けられ、液滴下により、培地を気筒内に供給可能である。メタルモジュールを備えた気筒型バイオリアクターは、耐熱素材のみで作製されているため、滅菌は簡便な乾熱滅菌のみで実行可能となる。メタルモジュール３０個を耐熱気筒内に設置後、非滅菌的に組み立てられた装置をアルミホイルで包み、摂氏１９０度にて８０分間乾熱滅菌し、放冷した事で滅菌作業を完結した。【０１７０】
作製した気筒型バイオリアクターを用いて、ヒト皮膚線維芽細胞の培養実験に着手した。【０１７１】
上述に示す通り、気筒型リアクター全体を滅菌的に組み立て、ＣＯ２インキュベータ内に装置全体を設置した（図２１）。シャーレで培養していたヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン処理にて剥離させ、図２２（Ａ）〜（Ｃ）に示す各反応形式に対し、７０ｍｌずつの細胞懸濁液を準備した。その時の細胞密度は、１ｍｌあたりの生細胞数が、１．４×１０５であった。吸着後の細胞増殖挙動に関して、表８にて説明する。
【表８】
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【０１７２】
※１：液中残留細胞密度とは、ポリイミド多孔質膜に細胞を吸着させた後の、細胞懸濁液中に残存した細胞数（密度）を示している。
※２：細胞吸着率とは、播種に使用した細胞懸濁液中の細胞がどれだけポリイミド多孔質膜に吸着したかを示している。
※３：初期予想成熟度とは、ポリイミド多孔質膜での細胞の最大生息数を１００％とした場合の、実際の細胞の吸着細胞数を％として表したものである。
※４：※３と同じものを示している（培養５日目を測定して算出した）。上部；最上部のモジュール、下部；最上部のモジュール、の値をそれぞれ示している。【０１７３】
なお、ドロップ型の液滴は、図２２（Ｄ）に示すように、巻き取ったステンレス鋼メッシュ（久宝金属製作所製、品番Ｅ９１０３，２０＃）（図２２（Ｄ）のメッシュ束に相当）を蓋体に設けられた培地供給口に挿入することにより実現させた。メッシュ型の液滴は、ドロップ型の方法に加え、メッシュ束の直下に、平面状のステンレス鋼メッシュ（久宝金属製作所製、品番Ｅ９１０３，２０＃）を設けて、モジュールをカバーすることにより実現させた。シャワー型の液滴は、いけうち社製、品番１／８ＭＶＶＰ６５０３ＰＰ−ＩＮ番のノズルを用いることにより実現させた。【０１７４】
その後、ポンプを用いて連続的に培地（コージンバイオ株式会社製＿ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔを使用）を供給する事で培地循環が開始され、連続培養を進めた。３日に一回培地交換を実施しながら、培養を継続した。細胞数の評価に関しては、３０個あるモジュールの内、１〜２個を取り出し、それらのモジュールに生育するヒト皮膚線維芽細胞を、ＣＣＫ８の呈色反応を用いて細胞数を測定した。この実験結果から明らかな様に、本実験に於いては、培地液の注加方法がその後の各システムに於けるモジュール内細胞数を決定付ける事となる事実が判明した。また、興味深い事に、メッシュによる液浸透平準化の効果は非常に大きく、しっかりと細胞が増殖する結果が観察された。一方で、ドロップの添加方式では培地がリアクター内部全体に広がらず、偏流が生じる事で細胞生育領域が限定されて細胞数の減少を招いたと思われる。シャワー式に培地を注加する方法もある程度の液平準化効果に寄与すると思われる。【０１７５】
引き続き、本培養方法のバイオリアクターとしての効率を検証すべく、物質産生能の評価を進めた。タカラバイオ製ヒトフィブロネクチン測定用Ｅｌｉｓａ  ｋｉｔを用いて、産生されたフィブロネクチン量を測定した。図２３に測定結果を示す。【０１７６】
図１１からも自明な様に、この物質産生評価に於いても、メッシュ培養法が圧倒的に優位を示しており、フィブロネクチン産生力を着実に伸ばしつつある。１ヶ月の安定運転を実現する事が出来た。一方で、シャワー型及びドロップ型においても、安定的な物質は達成されたが、産生力の向上を見出す事は出来なかった。非常に簡便な装置で、気相暴露型培養にてヒト初代細胞を安定的に培養し、高効率で有用物質の産生を実現し得る事を実証する事が出来た。【０１７７】
（実施例１６）
メタルモジュール及びガラス製耐熱サイフォンリアクター
ポリイミド多孔質膜の有する耐熱性を最大限に活用し、簡単な全体乾熱滅菌で滅菌作業を完了すべく、ステンレス鋼メッシュ製のケーシング、中敷、及びポリイミド多孔質膜で構成されるメタルモジュールを作製した（図２０（Ａ））。具体的には、１ｃｍ×１ｃｍのポリイミド多孔質膜及びポリイミド多孔質膜と同面積のステンレス鋼メッシュ（「中敷」という。図示しない）を積層したもの（ポリイミド多孔質３枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質４枚、中敷１枚、ポリイミド多孔質３枚、の順番で積層）を、ステンレスメッシュ製のケーシングで封止して、メタルモジュールを作製した（図２０（Ａ））。作業は、開放空間下で非滅菌的に実施した。【０１７８】
このメタルモジュールを運用するためのガラス製耐熱サイフォンリアクターは、ソックスレー抽出器をベースにデザインし、耐熱性を持たせるため、ガラスと金属のみで作製した（図２４（Ａ））。メタルモジュール（図２０（Ａ））を入れたガラス製耐熱サイフォンリアクターを示す。このリアクター、内部にステンレスモジュール３０個を非滅菌的に積層させて装置を組み立てた。その後、リアクター部分をアルミホイルで包み、摂氏１９０度にて８０分間乾熱滅菌し、放冷した。【０１７９】
次に、耐熱型サンフォンリアクターによるヒト皮膚線維芽細胞の干満培養を実施した。図２４（Ａ）に示す通り、リアクター全体を滅菌的に組み立て、ＣＯ２インキュベータ内に装置全体を設置した（図２４（Ｂ））。シャーレで培養していたヒト皮膚線維芽細胞をトリプシン処理にて剥離させ、細胞懸濁液７０ｍｌを準備した。セルカウントすると、１ｍｌあたりの生細胞数は１．４×１０５であった。懸濁液７０ｍｌを、メタルモジュールを設置したソックスレー管内部に注加し、３０分間静置させた。静置後、内部液を滅菌的に排出し、排出された液を再度サイフォンリアクター内部に注加する。この作業を３回繰り返し、その後、液部をサンプリングして細胞数を測定したところ、細胞数は８．０×１０３であった。９４％の細胞がこの静置条件での自然接触で吸着したといえる。次に、ポンプを用いて連続的に培地（コージンバイオ株式会社製＿ＫＢＭ  Ｆｉｂｒｏ  Ａｓｓｉｓｔを使用）を供給する事でサイフォン機能が発現し、メタルモジュール内部に安定的かつ循環的に培地と空気（酸素）が供給される。３日に一回培地交換を実施しながら、培養を継続した。安定的かつ大量のフィブロネクチンが産生された事を、タカラバイオ製ヒトフィブロネクチン測定用Ｅｌｉｓａ−ｋｉｔにて測定し、高効率な物質産生が簡便かつ継続的に達成されている事を確認した（図２５）。【０１８０】
図から示される通り、単位体積あたりの一日の物質産生量が優れている上に、通常のシャーレ培養とは異なり、スケールアップが非常に容易である為、コンパクトな装置で生産性を向上し得る。ヒト初代細胞を物質産生の基盤として、連続産生系を作製し、酸素供給等の手段を有する複雑な装置を使用する事無く、希少物質や有用物質を製造する方法が示された。【０１８１】
（実施例１７）
ポリイミド多孔質膜の可撓性を利用した動物細胞の除去方法【０１８２】
抗ヒトＩＬ−８抗体産生ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１２４４５）を馴化・浮遊化した細胞を、培地（ＢａｌａｎＣＤ（商標）  ＣＨＯ  ＧＲＯＷＴＨ  Ａ）を用いて浮遊培養し、１ｍｌあたりの生細胞数が、６．９×１０５になるまで培養を継続した。次に使用する培養基材に関して、表９に示す（図２６（Ａ）及び（Ｂ））。形状変化を高効率に惹起させて効率的に細胞死を起こさせるために、通常の培養で使用する正方形等のポリイミド多孔質膜とは異なり、細長い形状のポリイミド多孔質膜を選択した。
【表９】
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【０１８３】
表９に示す条件にて、同面積・異形状のポリイミド多孔質膜を滅菌的に包埋させた培養バッグに、上記の細胞懸濁液を１０ｍｌ注加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１日間静置し、細胞をポリイミド多孔質膜に吸着させた（図２６（Ｃ））。次に各バックから細胞吸着後の懸濁液を抜き取り、ＣＨＯ細胞培養用培地（コージンバイオ社製ＫＢＭ２７０）を各２０ｍｌずつ注加し、同インキュベータ内で２日間静置した。細胞増殖挙動に関して表１０に示す。
【表１０】
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表１０に示された通り、静置培養においては、それぞれの培養基材特性に従い、順調に細胞が培養基材入り培養バッグ内で増殖している事が確認された。次にＣＯ２インキュベータ内部にエル・エム・エス社製シェーキングミキサー（ＳＨＭ−２００２）を設置し、培養バッグを同ミキサー上に設置して、振盪を開始した（〜２０ｒｐｍ）。２日後に、部材変形を強化する為、空気を５０ｍｌ注加して、振動を続けた。更に、１０日後からは、培地を５０ｍｌに増量して振盪を強化させた（〜４５ｒｐｍ）。定期的にＣＣＫ８を用いて各バッグの生細胞数を計測した。細胞数の変化を図２７に示す。静置培養での細胞増殖とは異なり、培養基材形状依存的に細胞数の減少が惹起され、時間が経過するに従って細胞数の減少が進行し、２３日後には細胞が死滅している実が示された。形状変化が一部抑制された方法（２）（短冊固定型）においても、振盪速度の変化で細胞数が更に減少する事実も見出された。振盪条件及び培養基材形状依存的に、非薬剤的に動物細胞を死滅させる方法論が確立された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006773117.tif 000024
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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