(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
正しくフォールディングされたエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）を製造するためのかん流方法であって、
（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞及びこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、
（ｂ）該混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに
（ｃ）定期的に又は連続的に、該反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、及び該反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、
該方法において作製されたエタネルセプトを含む該タンパク質は、少なくとも４０重量％、５０重量％、又は６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含み、該培養培地は、グルタミン及び綿実加水分解物からなる群より選択される少なくとも１つの補充物を補充されている、方法。
【請求項２】
培養培地が、ＳＦＭ４ＣＨＯ（登録商標）培地及びＢａｌａｎＣＤ（商標）／Ｈｙｃｅｌｌ（登録商標）培地のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のかん流方法。
【請求項３】
培養培地が、
ガラクトースをさらに含む、請求項１に記載のかん流方法。
【請求項４】
培養培地が、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  １、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  ２、及びＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａから選択される少なくとも１つのフィード補充物をさらに含む、請求項１に記載のかん流方法。
【請求項５】
請求項１に記載のかん流方法であって、
（１）工程（ａ）の前に、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞が、（ｉ）２８℃から３７℃及び（ｉｉ）３５℃から３６℃から選択される温度において増殖相で増殖され、ならびに
（２）エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、（ｉ）３２℃より高く、（ｉｉ）３３℃より高く、（ｉｉｉ）３４℃より高く、（ｉｖ）３５℃より高く、（ｖ）３３℃から３６℃の範囲、（ｖｉ）３５℃から３６℃の範囲、（ｖｉｉ）３２．５℃、（ｖｉｉｉ）３３．５℃、（ｉｘ）３４．５℃及び（ｘ）３５．５℃から選択される温度において実行される、かん流方法。
【請求項６】
産生温度が、３３℃から３６℃の範囲にある、請求項５に記載のかん流方法。
【請求項７】
エタネルセプトを含むタンパク質が、産生相の間に産生された正しくフォールディングされたタンパク質及び正しくフォールディングされなかったタンパク質の総量は、０．２〜１ｇ／Ｌの力価で産生される、請求項６に記載のかん流方法。
【請求項８】
産生温度が、３３．５℃である、請求項７に記載のかん流方法。
【請求項９】
培養培地が、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  １、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  ２、及びＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａから選択される少なくとも１つのフィード補充物をさらに含む、請求項７に記載のかん流方法。
【請求項１０】
交互接線流保持装置が、中空繊維フィルターを過ぎて老廃物及びエタネルセプトを含むタンパク質を含有する培地を再循環させるために使用され、これによって、該老廃物及びエタネルセプトを含むタンパク質が反応容器から取り出される、請求項１に記載のかん流方法。
【請求項１１】
正しくフォールディングされたエタネルセプトを製造するためのかん流方法であって、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞及びこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）該混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的に又は連続的に、該反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、及び該反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、
（１）該培養培地が、グルタミン及び綿実加水分解物からなる群より選択される少なくとも１つの補充物を補充されており、
（２）工程（ａ）の前に、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞が、２８℃から３７℃の温度において増殖相で増殖され、
（３）エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、３３℃から３６℃の温度において実行され、
（４）前記方法において産生されたエタネルセプトを含むタンパク質が、少なくとも４０重量％、５０重量％又は６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含んでおり、産生相の間に産生された正しくフォールディングされたタンパク質と正しくフォールディングされなかったタンパク質の総量は０．２から１ｇ／Ｌの力価で産生される、
かん流方法。
【請求項１２】
生成温度が３３から３４℃であり、エタネルセプトを含むタンパク質が少なくとも６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
培養培地が、ガラクトース、及びＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮの少なくとも１つをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
培養培地が、ガラクトースをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
培養培地が、（ａ）Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  １、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  ２及びＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａの少なくとも１つのフィード補充物をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
商品名Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する正しくフォールディングされたエタネルセプトを産生するためのかん流方法であって、前記方法は、
（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞及びこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、
（ｂ）該混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、及び
（ｃ）定期的に又は連続的に、該反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、ならびに該反応容器に新鮮な培養培地を加える工程
を含み、
該方法において作製されたエタネルセプトを含む該タンパク質は、少なくとも４０重量％、５０重量％、又は６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含み、該培養培地は、グルタミン及び綿実加水分解物からなる群より選択される少なくとも１つの補充物を補充されており、前記グリコシル化プロフィールを達成する、かん流方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載のかん流方法であって、工程（ａ）の前に、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞が、（ｉ）２８℃から３７℃及び（ｉｉ）３５℃から３６℃から選択される温度において増殖相で増殖される、かん流方法。
【請求項１８】
培養培地が、産生相の間に産生される正しくフォールディングされたタンパク質と正しくフォールディングされなかったタンパク質の０．２から１ｇ／Ｌの産生力価を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
培養培地が、Ｅｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  １、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｆｅｅｄ  ２、及びＣＨＯ  ＣＤ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａ、及びガラクトースの少なくとも１つをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エタネルセプトを製造するためのかん流方法であって、
（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるチャイニーズハムスター卵巣細胞及びこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、
（ｂ）該混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに
（ｃ）定期的に又は連続的に、該反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、及び該反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、
（ｉ）工程（ｂ）は３３℃以上で実行され、（ｉｉ）培養培地は、グルタミン及び綿実加水分解物の少なくとも１つを補充されており、（ｉｉｉ）エタネルセプトを含むタンパク質は、少なくとも６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含み、（ｉｖ）エタネルセプトを含むタンパク質は、０．２から１ｇ／Ｌの力価で産生され、ならびに（ｖ）エタネルセプトは商品名Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する、かん流方法。
【請求項２１】
培養培地が、グルタミン及び綿実加水分解物を含む、請求項２０に記載のかん流方法。
【請求項２２】
グリコシル化プロフィールが、商品名Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるシアリル化の程度によって特徴付けられる、請求項２１に記載のかん流方法。
【請求項２３】
エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、（ｉ）３２℃より高く、（ｉｉ）３３℃より高く、（ｉｉｉ）３４℃より高く、（ｉｖ）３５℃より高く、（ｖ）３３℃から３６℃の範囲、（ｖｉ）３５℃から３６℃の範囲、（ｖｉｉ）３２．５℃、（ｖｉｉｉ）３３．５℃、（ｉｘ）３４．５℃及び（ｘ）３５．５℃から選択される温度において実行される、請求項１６に記載のかん流方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）を製造する方法に関し、より特定には、タンパク質を産生する細胞が、連続的にまたは定期的に、産生が行われている反応容器から取り除かれ、ならびにこの反応容器に加えられる培養培地の存在下で培養されるかん流を使用する、エタネルセプトの製造に関する。開示される方法は、正確にフォールディングされたエタネルセプトの産生を、所望のグリコシル化プロフィールを有する優れた収率で達成する。
【背景技術】
【０００２】
商品名Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）でＡｍｇｅｎから市販されているエタネルセプトの１つの型は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合ポリペプチドであることが知られている。これは９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．）。エタネルセプトのＦｃ成分は、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖２（ＣＨ２）ドメイン、定常重鎖３（ＣＨ３）ドメインおよびヒンジ領域を含有するが、定常重鎖１（ＣＨ１）ドメインは含有しない。Ｆｃドメインは上記のドメインの１つまたはすべてを含有することができる。エタネルセプトは、通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）哺乳動物細胞発現系において、組換えＤＮＡ技術によって産生される。
【０００３】
関節リウマチ、プラーク乾癬、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎および強直性脊椎炎などの特定の型の炎症性疾患に罹患している人は、腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）を過度に発現する免疫系を有している。エタネルセプトの投与は、これがデコイ受容体としてＴＮＦに結合することによって被験体における活性型ＴＮＦのレベルを減少できるので、幾つかの炎症性疾患の治療のために有効であることが見出されてきた。
【０００４】
エタネルセプトは、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）哺乳動物細胞発現系において、組換えＤＮＡ技術によって、公知の技術において産生できる。不運にも、ＣＨＯ細胞によって産生される生成物は、正しくフォールディングされなかったか、もしくはミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ）されたかおよび／または凝集した大量のエタネルセプトを含有する。医薬用途のために、正しくフォールディングされなかった／凝集したタンパク質は、正しくフォールディングされたタンパク質と同じ治療効果を有さないであろうし、患者に対して実際に有害であり得るので、正しくフォールディングされなかったタンパク質および凝集したタンパク質を比較的含まないエタネルセプトを供給することが望ましい。さらに、凝集物またはミスフォールディングされたタンパク質を生じるというエタネルセプトの製造についての公知の傾向は、このタンパク質を製造するために使用される組換えプロセスにおける収率を有意に減少しならびにコストを有意に増大し得る。従って、ミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ）の軽減は、治療の観点から非常に望ましいのみならず、製法の経済性の観点からも非常に望ましい。
【０００５】
エタネルセプトのＴＮＦＲドメインは、ジスルフィド架橋を形成する数個のシステインを含有する。この架橋は、タンパク質が特定の二次構造および三次構造（フォールディング）を取ることに寄与している。潜在的な架橋形成の組み合わせは、利用可能なシステインの数とともに増加する。不適切に形成されたシステイン−システイン架橋は不適切なフォールディング、従って、より低いタンパク質の活性を生じる。ミスフォールディングが、例えば、哺乳動物分泌性発現の場合において、医薬としてのタンパク質の産生の間に無視できると考えられるときでさえ、凝集および何らかのミスフォールディングはなお起こる可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，２００２，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
商業的に魅力的な収率で、適切にフォールディングされたエタネルセプトを産生することが可能である方法についての必要性が存在する。さらに、当該分野において以前に望ましいと考えられていたもの以外の温度において操作できる産生方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、以下の工程、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、および（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、ならびに上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含む、エタネルセプトを製造するためのかん流方法を提供する。開示される方法は、商品名Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する正しくフォールディングされたエタネルセプトを産生することが可能である。さらに、開示されるかん流方法は、エタネルセプトタンパク質を産生することができ、ここで、正しくフォールディングされたエタネルセプトは、このタンパク質の４０重量％、５０重量％または６０重量％より多くを含む。
【０００９】
産生が実行される培地には、好ましくは、ＳＦＭ４ＣＨＯ（Ｒ）培地、またはＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａ培地とＨｙＣｌｏｎｅ（商標）Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯ培地の混合物（最も好ましくは、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培地の混合物）が含まれ、これには、グルタミン、ＣＨＯＺＮ、Ｆｅｅｄ  １、Ｆｅｅｄ  ２およびＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａなどの細胞増殖および生産性を促進するフィードが補充される（このようなフィードは以下にさらに同定される。）。培養培地中に存在するさらなる補充物は、ガラクトース、デキサメタゾンおよびＭａｎＮａｃからなる群より選択され、これらは、特に、分泌されるタンパク質における高度なシリアル化を達成することを含む、所望のグリコシル化プロフィールを一般的に達成するという観点からの増強を含む、培養効率を改善することが示されている。開示される方法の特に好ましい実施形態において、これらの補充物（ガラクトース、デキサメタゾンおよびＭａｎＮａｃ）の３つすべてが使用される。
【００１０】
エタネルセプトを産生する細胞は、少なくとも１，０００，０００細胞／ｍｌの密度で、好ましくは、少なくとも５，０００，０００の密度で、最も好ましくは少なくとも約１０，０００，０００細胞／ｍｌの密度で容器中に存在する。工程（ａ）の前に、エタネルセプトを発現することが可能である細胞の数を増加させるために実施される増殖相の間（産生相の実質的な開始前）、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能であるこのような細胞は、（ｉ）約２８℃から約３７℃および（ｉｉ）好ましくは約３５℃から約３６℃から選択される温度において増殖させることができる。次の産生相の間、増殖相が実質的に完了した後で、エタネルセプト産生は、（ｉ）約３２℃より高く、（ｉｉ）約３３℃より高く、（ｉｉｉ）約３４℃より高く、（ｉｖ）約３５℃より高く、（ｖ）約３３℃から約３６℃の範囲、（ｖｉ）約３５℃から約３６℃の範囲、（ｖｉｉ）３２．５℃、（ｖｉｉｉ）３３．５℃、（ｉｘ）３４．５℃および（ｘ）３５．５℃から選択される温度において実行される。本発明の方法は、好ましくは、連続的にまたは定期的に、しかし、好ましくは連続的に、エタネルセプトをエタネルセプトの産生の間に収集することを含む。さらに、使用済みの培地の除去および新鮮な培養培地での置き換え、即ち、かん流は、好ましくは連続的に行われる。連続的に引き出される培養培地中に存在するエタネルセプトの収集もまた、好ましくは連続的に実行される。
【００１１】
正しくフォールディングされたエタネルセプトを産生するための特に好ましいかん流方法は、３３℃より上および３３℃から約３６℃の間で、ならびに最も好ましくは、約３３．５℃において、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ混合物（およそ１：１）、ＣＨＯＺＮ、綿実加水分解物、デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃを含む培養培地を使用して産生相を実施することを含む。グルタミン、Ｆｅｅｄ  １、Ｆｅｅｄ  ２、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａおよび塩化マンガンなどの他のフィード補充物が存在してもよい。
【００１２】
記載される製法の容積生産性および生産されたエタネルセプトの品質は、当業者に周知である幾つかの方法を使用することによって評価できる。これらの方法には、全体のおよび活性なタンパク質（力価）を定量し、タンパク質シアリル化のレベルを認定する、等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル、疎水的相互作用クロマトグラフィーなどのようなアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
本発明はさらに、エタネルセプトを含むタンパク質をコードする組換え哺乳動物宿主細胞を培養してこのようなタンパク質を産生する工程を含む、タンパク質のミスフォールディングを減少させるためにエタネルセプトを産生するための方法に向けられており、ここで、産生相の間、宿主細胞は、（ｉ）約３２℃より高く、（ｉｉ）約３３℃より高く、（ｉｉｉ）約３４℃より高く、（ｉｖ）約３５℃より高く、（ｖ）約３３℃から約３６℃の範囲、（ｖｉ）約３５℃から約３６℃の範囲、（ｖｉｉ）３２．５℃、（ｖｉｉｉ）３３．５℃、（ｉｘ）３４．５℃および（ｘ）３５．５℃から選択される温度におけるかん流製法を使用して培養され、好ましくは、ＨＩＣクロマトグラフィーによって決定されるように、少なくとも約４０重量％、好ましくは少なくとも約５０重量％および最も好ましくは少なくとも約６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含むタンパク質産物が得られ、この結果、タンパク質産物（正しくフォールディングされたタンパク質および正しくフォールディングされなかったタンパク質）の総量が少なくとも約０．２から約１ｇ／Ｌの力価で産生される。力価は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ法などの従来の方法を使用して、公知の様式で測定することができる。
【００１４】
さらなる実施形態において、本発明は、以下の工程、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、および上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含む、正しくフォールディングされたエタネルセプトを製造するためのかん流方法を提供し、ここで、（１）上記培養培地はＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ（Ｒ）培地、デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃを含み、（２）工程（ａ）の前に、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞が、２８℃から３７℃の温度において増殖相で増殖され、（３）エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、３３℃から３６℃の温度において実行され、ならびに（４）エタネルセプトを含むタンパク質が、少なくとも４０重量％、５０重量％または６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含んでおり、産生相の間に産生された正しくフォールディングされたタンパク質および正しくフォールディングされなかったタンパク質の総量は約０．２から約１ｇ／Ｌの力価で産生される。
【００１５】
本発明はさらに、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、および上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含むかん流方法によって産生された正しくフォールディングされたエタネルセプトに向けられており、ここで、（１）上記培養培地は上記に参照されるＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培地混合物、デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃを含み、（２）工程（ａ）の前に、エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞が、２８℃から３７℃の温度において増殖相で増殖され、（３）エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、３３℃から３６℃の温度において実行され、ならびに（４）エタネルセプトを含むタンパク質が、少なくとも４０重量％、５０重量％または６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含んでおり、産生相の間に産生された正しくフォールディングされたタンパク質と正しくフォールディングされなかったタンパク質の総量は約０．２から約１ｇ／Ｌの力価で産生される。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、商品名Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する正しくフォールディングされたエタネルセプトを産生するためのかん流方法であって、前記方法は、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、および上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、ここで、デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃは培養培地中に存在して、前記実質的に合致するグリコシル化プロフィールを達成する。さらに好ましい実施形態において、綿実加水分解物のさらなる包含は、グリコプロフィールをさらに増強することが見出されている。
【００１７】
本発明の別の実施形態は、商品名Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する正しくフォールディングされたエタネルセプトを産生するためのかん流方法であって、前記方法は、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、および上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含み、ここで、
（ｉ）デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃは、前記実質的に合致するグリコシル化プロフィールを達成するために十分な量で上記培養培地中に存在し、ならびに
（ｉｉ）上記培養培地は、産生相の間に産生される正しくフォールディングされたタンパク質と正しくフォールディングされなかったタンパク質の約０．２から約１ｇ／Ｌの産生力価を達成するために十分な量の、上述のＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌベースの培地混合物、ＣＨＯＺＮ、グルタミンおよび任意に綿実加水分解物を含むフィード培地を含み、ならびに
（ｉｉｉ）エタネルセプトを含むタンパク質の産生が、（ｉ）約３２℃より高く、（ｉｉ）約３３℃より高く、（ｉｉｉ）約３４℃より高く、（ｉｖ）約３５℃より高く、（ｖ）約３３℃から約３６℃の範囲、（ｖｉ）約３５℃から約３６℃の範囲、（ｖｉｉ）３２．５℃、（ｖｉｉｉ）３３．５℃、（ｉｘ）３４．５℃および（ｘ）３５．５℃から選択される温度において実行される。
【００１８】
なおさらなる実施形態において、開示される方法は、以下の工程、（ａ）エタネルセプトを含むタンパク質を発現することが可能である細胞およびこのような発現を実施するために適切な培養培地を含む混合物を調製する工程、（ｂ）上記混合物を含有する適切な容器中で、エタネルセプトを含むタンパク質を細胞に産生させる工程、ならびに（ｃ）定期的にまたは連続的に、上記反応容器から使用済みの培養培地を取り除き、および上記反応容器に新鮮な培養培地を加える工程を含むエタネルセプトを製造するためのかん流方法であって、ここで、（ｉ）工程（ｂ）は３３℃以上で実行され、（ｉｉ）培養培地はデキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃの少なくとも１つを含み、（ｉｉｉ）エタネルセプトを含むタンパク質は少なくとも６０重量％の正しくフォールディングされたエタネルセプトを含み、（ｉｖ）エタネルセプトを含むタンパク質は０．２から約１ｇ／Ｌの力価で産生され、ならびに（ｖ）エタネルセプトは商品名Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）で販売されている市販のエタネルセプトと実質的に同様であるグリコシル化プロフィールを有する。好ましくは、ガラクトース、デキサメタゾンおよびＭａｎＮＡｃの３つすべての補充物が培養培地に存在する。特に好ましい産生温度は３３℃から３４℃の範囲にある。
【００１９】
本発明は、治療効果のために必要である所望のグリコシル化プロフィールを有する、正しくフォールディングされたエタネルセプトを優れた収率で、好ましくは、当該分野において必要であるかまたは所望されると以前に考えられていたものよりも高い産生温度で産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の製法を示す。
【図２】本発明の製法を使用して産生されたエタネルセプトサンプルについての電荷プロフィールを伴うＩＥＦゲルを示す。
【図３】本発明の製法を使用して産生されたエタネルセプトサンプルのＮ−グリカン分析を示す。
【図４】本発明の製法を示す。
【図５】本発明の製法を使用して産生されたエタネルセプトサンプルについての電荷プロフィールを伴うＩＥＦゲルを示す。
【図６】本発明の製法を使用して産生されたエタネルセプトサンプルについての電荷プロフィールを伴うＩＥＦゲルを示す。
【図７】本発明の製法を使用して産生されたエタネルセプトサンプルのＮ−グリカン分析を示す。
【図８】ＨＩＣクロマトグラフィーによって決定されるような、実施例において産生された正しくフォールディングされたエタネルセプトのパーセントを提示する棒グラフである（Ｅｎｂｒｅｌコントロールを含む。）。
【図９】トレースＡがＥｎｂｒｅｌコントールであり、トレースＢがＳＦ１、図８からの培地交換３であるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１０】トレースＣがＳＦ２、図８からの培地交換３であり、およびトレースＤがＳＦ３である図８からの培地交換１であるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１１】トレースＥがＳＦ３、図８からの培地交換３であり、およびトレースＦがＳＦ３である図８からの収集であるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１２】トレースＧがＳＦ４、図８からの培地交換３であり、およびトレースＨがＳＦ５である図８からの培地交換３であるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１３】トレースＩがＳＦ６、図８からの培地交換３であり、およびトレースＪが、図８に表されるような培地交換３時点でサンプリングされたコントロール振盪フラスコである。
【図１４】実施例３のかん流バイオリアクターからの生細胞密度、かん流速度および比かん流速度を含有する。
【図１５】実施例３のかん流培養の力価および比生産性を含有する。
【図１６−１】トレースＡがＥｎｂｒｅｌコントールであり、トレースＢがフィードバッチバイオリアクターの収集からのサンプルであり、トレースＣが図１４におけるかん流バイオリアクターの９日目からであり、およびトレースＤが図１４におけるかん流バイオリアクターの１２日目からであるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１６−２】トレースＡがＥｎｂｒｅｌコントールであり、トレースＢがフィードバッチバイオリアクターの収集からのサンプルであり、トレースＣが図１４におけるかん流バイオリアクターの９日目からであり、およびトレースＤが図１４におけるかん流バイオリアクターの１２日目からであるＨＩＣヒストグラムを含有する。
【図１７】Ｅｎｂｒｅｌ参照（Ａ）、かん流バイオリアクターの９日目からのＣＨＳ−０２１４のサンプル（Ｂ）、および図１４に示されるかん流サンプルの１２日目からのＣＨＳ−０２１４サンプル（Ｃ）のＮグリカンクロマトグラムを含有する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
定義
本明細書で使用される用語は、一般的に、当該分野において、本明細書の文脈において、および各用語が使用される特定の状況においての通常の意味を有する。本発明を説明するために使用される特定の用語は以下において、または本明細書中の別の箇所において議論され、本発明の説明に関する実務者にさらなる指針を提供する。特定の用語についての同義語が提供される。１つ以上の同義語の列挙は他の同義語の使用を排除するものではない。本明細書に議論される任意の用語の例を含む本明細書中の別の箇所での例の使用は例示のみであって、いかなる場合においても、本発明または任意の例示された用語の範囲および意味を限定するものではない。本発明は、本明細書に与えられる様々な実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【００２３】
「エタネルセプト」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体融合ポリペプチドであるポリペプチドをいう。これは、９３４アミノ酸からなり、およそ１５０キロダルトンの見かけの分子量を有する。本願の目的のために、「エタネルセプト」という用語はまた、エタネルセプトの機能、効力、または結合力に有意な影響を与えないアミノ酸構造のマイナーな修飾（アミノ酸の欠失、付加および／または置換を含む。）を伴うエタネルセプトも包含する。「エタネルセプト」という用語は、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）のすべての型および製剤を包含し、これには、濃縮製剤、注射用即時使用製剤、水、アルコールおよび／または他の成分で再構成される製剤などが含まれるがこれらに限定されない。エタネルセプトという用語はまた、市販のＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）において使用されているエタネルセプトの生物学的に同様のまたは生物学的に良好なバリアントを含むことが意図される。例えば、生物学的に同様のまたは生物学的に良好なエタネルセプトは、市販のＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）とはわずかに異なるグリコシル化プロフィールを有し得る。加えて、市販のＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）において見い出されるエタネルセプト調製物の生物学的に同様のまたは生物学的に良好なバリアントは、活性で適切にフォールディングされたエタネルセプト成分とともに存在する凝集物／ミスフォールディングの量の減少を示す可能性がある。
【００２４】
「正しくフォールディングされたエタネルセプト」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）における活性成分のコンホメーションおよび生物学的活性と同じかまたは実質的に同じであるＴＮＦの阻害についての生物学的活性およびコンホメーションを有するエタネルセプトホモ二量体（上記に定義されるようなもの）フォールディングコンホメーションを示すことが意図される。
【００２５】
「正しくフォールディングされなかったエタネルセプト」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）エタネルセプト（上記に定義されるようなもの）と同じアミノ酸配列を有するが、正しくフォールディングされたエタネルセプトのコンホメーションとは異なるコンホメーションを有するホモ二量体タンパク質であって、ここで、前記異なるコンホメーションが、タンパク質を、ＴＮＦ阻害剤としての生物学的活性を欠いているかまたは実質的に欠いているようにする、タンパク質、ならびに／または（ｉｉ）正しくフォールディングされたエタネルセプトおよび／または正しくフォールディングされなかったエタネルセプトのホモ二量体の２つ以上が、正しくフォールディングされたエタネルセプトよりも高分子量を有する種を形成するような様式で、結合するようになっている凝集物、ならびに／または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の混合物、ならびに／または（ｉｖ）凝集した、即ち、正しくフォールディングされたエタネルセプトと同じかまたは本質的に同じ配列または同じ配列の部分を含むが、正しくフォールディングされたエタネルセプトと比較した場合に、ＨＩＣカラム上で溶出位置の低下を示す（より高い疎水性に起因する。）凝集塊タンパク質組成物を包含することが意図される。
【００２６】
「増殖相」という用語は、エタネルセプトを発現することが可能な細胞が、産生相に入る前に、細胞の指数対数的増殖を促進する温度において一般的に最初に培養される相を示す。増殖相のための適切な温度は、一般的には、米国特許第７，２９４，４８１号明細書に記載されているように、３４℃から約３８℃の範囲にある。
【００２７】
「産生相」という用語は、この全体が参照により援用される米国特許第７，２９４，４８１号明細書に属すると見なされるものと同じ意味を有すると理解される。特に、この用語は、細胞増殖がプラトーに達している、即ち、細胞の対数増殖が完了し、タンパク質産生が初期である間の期間をいう。本発明に従うと、産生相は、かん流条件下で、好ましくは、約３２．５℃から約３７℃の範囲、および好ましくは、約３３．５℃から約３５．５℃の範囲の温度において実行される。
【００２８】
かん流は、一般的に、以下に説明される意味を有し、また、老廃物培地（使用済み培地）が培養から除去され、置き換えられた培地が新鮮な培地で再補充される培養の方法として簡潔に理解できる。これはまた、好ましくは、連続的な様式で行われてもよいが、産生相の完了前に所望の間隔で使用済み培地が新鮮な培地で置き換えられる、段階的な非連続的様式で実施されてもよい。新鮮な培地の添加および老廃物の排除は、より高い生産性で高い細胞濃度を達成および維持するためにより良好に適している環境を細胞に提供する。
【００２９】
「治療」という用語は、哺乳動物における疾患のための療法の任意の投与または適用をいい、これには、疾患を阻害すること、疾患の発症を停止すること、疾患を軽減すること（例えば、退行を引き起こすこと、または失われたか、欠けたか、もしくは欠損した機能を回復もしくは修復することによる）、または非効率的なプロセスを刺激することが含まれる。この用語には、哺乳動物において、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ること、ならびに病理学的状態または障害の任意の治療を扱うことが含まれる。この効果は、障害または障害の徴候を完全にまたは部分的に防ぐことによって予防的であり得、ならびに／または、障害および／もしくは障害に帰する有害な効果の部分的なまたは完全な治癒によって治療的であり得る。これには、（１）障害に対する素因があり得るが、まだ徴候性ではない被験体において障害が発症または再発することを予防すること、（２）障害を阻害すること、例えば、障害の発症を停止すること、（３）宿主が障害または障害の徴候にもはや罹患しないように、障害または少なくとも障害に関連する徴候を止めるかまたは終結させること、例えば、失われたか、欠けたか、もしくは欠損した機能を回復もしくは修復すること、または非効率的なプロセスを刺激することによって、障害または障害の徴候の退行を引き起こすことなど、もしくは（４）障害または障害に関連する徴候を軽減、緩和、または改善させることであって、ここで改善とは、炎症、痛みおよび／または腫瘍サイズなどのパラメーターの大きさの少なくとも減少をいうために最も広い意味で使用される、軽減、緩和、または改善させることが含まれる。
【００３０】
「医薬として許容されるキャリア」とは、任意の従来型の非毒性の固体、半固体、または液体の、フィラー、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、または賦形剤をいう。医薬として許容されるキャリアは、利用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合可能である。
【００３１】
「組成物」または「製剤」という用語は、当該分野において従来的であり、治療的、診断的、または予防的な目的のために、被験体への投与のために適切である、医薬として許容されるキャリアまたは賦形剤などのキャリアを通常含有する混合物をいう。これは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが細胞または培養培地に存在する細胞培養を含んでもよい。例えば、経口投与のための組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出製剤、経口リンスまたは散剤を形成することができる。
【００３２】
「ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ」という用語は、以下の表において引用されるような、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＡおよびＨｙＣｌｏｎｅ（商標）Ｈｙｃｅｌｌ  ＣＨＯとして販売されている商業的に入手可能なフィードの混合物（およそ１：１）を示す。
【００３３】
以下の表は、本発明において有用である、商業的に利用可能なフィードおよびフィード補充物のリストである。
【００３４】
【表１】
0006689189.tif 000002
【００３５】
エタネルセプトのかん流ベースの製造
本発明は、かん流の使用を包含する、エタネルセプトを製造する方法を提供する。「かん流」という用語は、本明細書で使用される場合、一般的に、バイオリアクターに含まれる生成物が連続的に収集され、ならびに使用済み培地中に存在する老廃物および毒性材料がバイオリアクターから除去できるように、連続的にまたは定期的に、最も好ましくは連続的に、使用済み培養培地が連続的に除去されながら、即ち、（好ましくは、生成物とともに）収集されながら、懸濁細胞培養に、バイオリアクターへの新鮮な培地が供給される製法を示すことが意図される。次いで、当該分野において周知である適切なろ過手段を使用して、細胞は連続的に収集ストリームからろ過され、一定の培養容量を維持するためにバイオリアクターに戻される。このような製法は、典型的には、連続的に実行され、細胞が高密度に到達することを可能にする。従って、１５００万から２０００万細胞／ｍＬまでの高密度に日常的に到達でき、一定の長時間、例えば、少なくとも２週間の間、維持できる。これは、バッチ培養またはフィードバッチ培養とは反対に、より長い時間の間に産生できる非常に高度に生産的な細胞培養製法を生じることができる。または、除去された使用済み培地から連続して収集される製法とは異なり、この生成物は、培養中で維持および濃縮でき、次いで、定期的、または培養の最後に収集できる。適切なサイズのフィルターの利用は、バイオリアクター培養中の組換え生成物の保持とともに、老廃物のみの除去を許容することができる。時折、「超高密度」またはＸＤ製法と呼ばれる、このような製法において、生成物は、定期的に、または培養の最後に収集できる。
【００３６】
本発明者らは、培養培地がデキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃの少なくとも１つを含むとき、および最も好ましくは、３つすべてが培養培地中に存在するとき、かん流製法において産生されるエタネルセプトの所定のグリコプロフィールが達成できることを今回見い出した。適切な量は以下の実施例において言及される。本発明者らはまた、このようなかん流製法において綿実加水分解物のさらなる存在が、グリコプロフィールをさらに増強できることもまた発見した。「グリコプロフィール」または「グリコシル化プロフィール」という用語は、当該分野においてよく理解されており、エタネルセプトタンパク質に結合されたグリカン基上に存在するシアリル化のレベルまたは程度を含むものと理解されるべきである。
【実施例】
【００３７】
［実施例１］
かん流製法と同様のおよびこれと比較し得る製法条件を調べるために、振盪フラスコ形式が使用される。高密度振盪フラスコ培養（５００万細胞／ミリリットルから２０００万細胞／ミリリットル）が、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５フィードおよび約０．５μＭから１μＭ  デキサメタゾンを補充されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中で、約３５℃から３７℃の範囲の温度に拡大された培養で確立される。
【００３８】
実施例１  培地処方
【００３９】
【表２】
0006689189.tif 000003
【００４０】
３２℃から３５．５℃の範囲の温度に維持された各培養は、培地が次のラウンドの産生のために完全に交換される前２日間の間、エタネルセプトタンパク質を産生することが許容された。これらの２日間の収集間隔は、１日あたり０．５バイオリアクター容積のかん流速度と比較し得るものである。培地交換は４回反復される（４サイクル）。収集された培地は−８０℃で凍結される。力価はＦｏｒｔｅＢｉｏおよびＴＮＦ結合ＥＬＩＳＡによって分析される。加えて、各サンプルは、Ｎ−連結グリコプロフィール、ＩＥＦゲルによるタンパク質電荷分布および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によるタンパク質フォールディングについて評価される。
【００４１】
かん流製法において典型的に達成される高密度産生培養の接種のために必要な多くの細胞数をサポートするために、シードトレインは、３５℃または３７℃、５％  ＣＯ２レベルに維持された大容量振盪フラスコで実施され、および軌道シェーカーの速度は１２５ｒｐｍに調整される。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５フィードおよび０．５μＭ  デキサメタゾンが補充されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地を含有する産生相振盪フラスコは、１０００万細胞／ミリリットルまたは２０００万細胞／ミリリットルのいずれかの細胞密度で接種される。産生相は、約３２℃から約３６℃の範囲の温度で実施され、他の点では、すべての他の培養条件は同じである。生細胞密度および生存度について、培養は毎日モニターされる。０．５バイオリアクター容量／日のかん流速度と比較し得るリアクター容量交換条件を調べるために、各培養における培地は４８時間ごとに完全に交換された。精製され清澄化された培地は−８０℃で凍結される。各使用済み培地の収集後、細胞は新鮮な培地に再懸濁され、およびさらに４８時間の間、組換え生成物を蓄積することが許容され、上述の製法が全体で４サイクル反復される。実験の完了時に、すべてのサンプルは解凍され、電荷プロフィール（等電点電気泳動ゲル、ＩＥＦによる）、Ｎ−グリカンプロフィールおよび力価に関して分析される。コントロール実験は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５フィードおよび０．５μＭデキサメタゾンが補充されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中４０万細胞／ミリリットルで接種されたフィードバッチ培養を使用して実施された。コントロール実験のための条件は、３５℃における拡大相および５日目に開始された３２℃における産生相を含んだ。コントロール実験において産生されたエタネルセプトタンパク質は、実験の長さの間、培地の交換なしで蓄積することが許容される。コントロール培養からのサンプルは、産生相の間、４８時間ごとに引き出され、−８０℃で凍結されおよび残りの実験サンプルとともに分析される。この実施例１に従って実施される実験の実験設計は図Ｉに描写されている。この実施例において産生されるエタネルセプトの電荷プロフィールは図２に示される。図３は、図２のゲル番号７およびゲル番号１０のＮ−グリカン分析を示す。かん流処理をシミュレートするように設計された培地交換技術を使用するこの実施例において産生されるエタネルセプトタンパク質は、ＩＥＦゲルおよび力価によって評価される電荷プロフィールに基づいて、イノベーターと同様のプロフィールを誘発する（図２）。図３におけるクロマトグラムによって示されるＮ−グリカン分布はまた、参照基準と同様のプロフィールを有する。１０００万細胞／ミリリットルの細胞密度で、培養からおよそ０．３ｇ／Ｌであることが決定された生産性に基づいて、本発明者らは、５０００万細胞／ミリリットルの最小限の密度の予測における培養に基づいて、開示された方法が、およそ０．７５から１ｇ／Ｌ／日の産生を達成することを予想する。
【００４２】
［実施例２］
かん流製法に特徴的な高密度産生培養の接種のために必要な多い細胞数をサポートするために、シードトレインが、３５℃または３７℃、５％  ＣＯ２レベルに維持された大容量振盪フラスコ中で実施され、軌道シェーカーの速度は１２５ｒｐｍに調整される。Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５  フィードおよび０．５μＭデキサメタゾンが補充されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地を含有する産生相振盪フラスコは、５００万細胞／ミリリットルまたは８００万細胞／ミリリットルのいずれかの細胞密度で接種される。以下の培地処方が使用される。
【００４３】
実施例２  培地処方
【００４４】
【表３】
0006689189.tif 000004
【００４５】
産生相は、３３．５℃または３５．５℃の温度で実施され、他の点では、すべての他の培養条件は同じである。生細胞密度および生存度について、培養は毎日モニターされる。０．５バイオリアクター容量／日のかん流速度の等価物を達成するために、各培養における培地は４８時間ごとに完全に交換される。収集され清澄化された使用済み培地は−８０℃で凍結される。各使用済み培地の収集後、細胞は新鮮な培地に再懸濁されおよびさらに４８時間の間、組換え生成物を蓄積することが許容され、上述の製法が全体で５サイクル反復される。実験の完了時に、すべてのサンプルは解凍され、力価、電荷プロフィール（等電点電気泳動ゲル、ＩＥＦによる）、Ｎ−グリカンプロフィールおよびフォールディングに関して分析された。コントロール条件は、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５フィードおよび０．５μＭデキサメタゾンが補充されたＳＦＭ４ＣＨＯ培地中４０万細胞／ミリリットルで接種されたフィードバッチ培養を含んだ。コントロール実験は、３５℃において実施された拡大相および５日目に開始された３５．５℃における産生相を含んだ。エタネルセプトタンパク質は、実験の長さの間、培地の交換なしで蓄積することが許容された。コントロール培養からのサンプルは、産生相の間、４８時間ごとに引き出され、−８０℃で凍結されおよび残りの実験サンプルとともに分析された。この実施例２に従って実施される実験の実験設計は図４に描写されている。図５は、培地交換番号１の後で収集されたエタネルセプトのＩＥＦゲルを示す（即ち、産生相開始後２日目）。図５におけるＩＥＦゲルは、最初の培地交換後（連続かん流の２日目と等価である。）に産生されたエタネルセプトタンパク質の電荷プロフィールを示し、これはＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）の電荷プロフィールと同様である。この時点でまだ低細胞密度であるコントロールサンプルは同様のプロフィールを示す。図６は、培地交換番号３（産生相の開始後６日目）の後で収集されたエタネルセプトについてのＩＥＦゲルを示す。３回目の培地交換後（連続かん流の６日目と等価）に産生されたエタネルセプトタンパク質の電荷プロフィールは、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）の電荷プロフィールと同様である。所望のアイソフォームは赤いボックスで囲まれている。コントロールサンプルは、シリアル化が少ない、より高いｐＩタンパク質種のより高い含量によって示されるような、何らかの生成物品質の悪化を示す。この実施例におけるデータは、かん流システムがフィードバッチ培養よりもより良好なタンパク質品質を提供できるという結論に対するサポートに役立つ。各培地交換からのサンプルは、Ｎ−グリカン分析に供される（Ｍｅｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ（２０１０）３９８：９０５−９１４，ＨＩＬＩＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。手短に述べると、グリカンは、試験材料から遊離され、検出を可能にするために蛍光部分で標識されおよび順相ＨＰＬＣによって分画される。イノベータータンパク質のクロマトグラム（パネルＡ）、振盪フラスコ３の３回目の培地交換（パネ��Ｂ）およびフィードバッチコントロールフラスコからの適切な収集（パネルＣ）は図７において示される。
【００４６】
［実施例３］
シードトレインは、ＳＦＭ４ＣＨＯ中、３５℃にて、大容量振盪フラスコ中で拡大される。産生バイオリアクターは、Ｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５  ０．５μＭ  デキサメタゾンを含有するＳＦＭ４ＣＨＯ（表１）において１から５×１０６細胞／ｍＬの播種密度で接種され、３３．５℃から３５℃の温度で維持される。培地処方は以下の通りであった。
【００４７】
実施例３  培地処方
【００４８】
【表４】
0006689189.tif 000005
【００４９】
ＡＴＦ（商標）細胞保持装置（Ｒｅｆｉｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、中空ファイバーフィルターを過ぎて培地（老廃物生成物および所望の生成物を含有する。）を再循環させるために使用され、０．１から２．０の作業培養容量／分の循環速度である。培養は０から２日間拡大され、次いで、かん流は０．２から２培養容量／日の速度で開始される。生成物を含有する使用済み培地が０．２μＭ細孔径中空ファイバーフィルターを通して収集されるとき、新たな培地が加えられる。収集された液体は２から８℃に冷却され、プロテインＡ樹脂上での捕捉によって精製される。実施例１および２について記載されたのと同様に、アリコートが、力価およびＮ−グリカン分布について分析される。ＨＩＣ分析は、適切にフォールディングされたエタネルセプト対不適切にフォールディングされた／凝集した（不活性な）物質の相対量を評価するために使用されてもよい。
【００５０】
図１４はＶＣＤを示し、これは、かん流産生相の間に１２×１０６細胞／ｍＬ近くに達した。かん流速度は、バイオリアクター容量あたり１日あたりに加えられた培地の０．５容量（ＶＶＤ）で開始し、ＶＣＤがプラトーに達したときには１．０ＶＶＤまで増加した。比かん流速度（１００万細胞あたり１日あたりの培地のｍＬ）は、産生相の間に０．０６から０．０８の範囲であった。毎日取られるサンプル中の力価は２５０から３５０ｍｇ／Ｌであったのに対して、比生産性は１５から３０ｐｇ／細胞／日であった（図１５）。
【００５１】
正しいフォールディングの分析は、ＨＩＣを使用して、かん流バイオリアクターからのエタネルセプト−含有材料が、フィードバッチ培養において産生されたものよりも、正しくフォールディングされたエタネルセプトの割合がより高いことを示す（図１６、パネルＢのフィードパッチを、パネルＣおよびＤのかん流と比較されたい。）。
【００５２】
Ｎ−グリカン分析は、図１７におけるクロマトグラムに示されるように、かん流バイオリアクターにおいて産生されたエタネルセプトとＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）参照において産生されたエタネルセプトとの間の密接な一致を示す。
【００５３】
［実施例４］
細胞は、各々最終濃度１０％または２０％のＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ（ＳＦＭ４ＣＨＯの場合）またはＣＨＯＺＮフィード（ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌの場合）が補充された２つの異なる基本培地、ＳＦＭ４ＣＨＯまたはＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌに、２５００万細胞／ミリリットル培地で接種された。これらのフィードは、シアリル化を促進できる他の補充物、即ち、デキサメタゾン、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃもまた含んだ。綿実加水分解物およびガラクトースもまた、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ含有培地に加えられた（処方は以下に要約される。）。
【００５４】
実施例４（ＳＦ１）
【００５５】
【表５】
0006689189.tif 000006
【００５６】
実施例４（ＳＦ２）
【００５７】
【表６】
0006689189.tif 000007
【００５８】
実施例４（ＳＦ３）
【００５９】
【表７】
0006689189.tif 000008
【００６０】
実施例４（ＳＦ４）
【００６１】
【表８】
0006689189.tif 000009
【００６２】
かん流が４８時間ごとに培地を交換することによって実行されながら、培養は３３．５℃の温度に維持された。各培地交換からのサンプルは力価、ＩＥＦゲルによるアイソフォームプロフィールおよびアミノ酸欠乏プロフィールに関して分析された（使用済み培地分析）。培養生細胞密度（ＶＣＤ）および生存度はＶＣＤ／生存度プロフィール番号１に示されるのに対して（以下を参照のこと）、シアリル酸含量のレベルと相関するアイソフォームプロフィールは実施例４についてのＩＥＦゲルにおいて示されている。力価はＦｏｒｔｅＢｉｏ分析によって評価された。これは、実施例４についての力価グラフにおいて示されている（以下を参照のこと）。
【００６３】
実施例４の培地処方についてのＶＣＤ／生存度
【００６４】
【表９】
0006689189.tif 000010
【００６５】
この実施例４についてのＶＣＤ／生存度プロフィール（上記）は、上記に言及された４つの培地処方（ＳＦ１からＳＦ４）において維持された培養の生細胞密度（ＶＣＤ）および生存度プロフィールを示す。ＣＨＯＺＮ（１０％または２０％）および綿実加水分解物、ガラクトースおよびＭａｎＮＡｃが補充されたＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培地は、優れた生存度、ＶＣＤ、生成物の品質（実施例４についてのＩＥＦゲルを参照のこと）および力価（実施例４についての力価グラフを参照のこと）を生じる、良好な栄養をサポートする。
【００６６】
実施例４についてのＩＥＦゲル
【００６７】
【化１】
0006689189.tif 000011
【００６８】
実施例４（上記）についてのＩＥＦゲルは、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地（レーン２、３、７、８）またはＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培地（レーン４、５、９、１０）において培養された培養物から単離されたタンパク質のアイソフォームプロフィールを示す。ＳＦＭ４ＣＨＯ培養から単離されたタンパク質は、参照標準（レーン６）と比較してシアリル化の減少を示すのに対して、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培養から単離されたタンパク質は、参照標準と密接に合致するシアリル酸含量に基づくアイソフォームプロフィールを示す。
【００６９】
実施例４についての力価グラフ
【００７０】
【表１０】
0006689189.tif 000012
【００７１】
実施例４についての力価グラフ（上記）は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地からの培養（Ｐ１−１、Ｐ１−２、Ｐ２−１、Ｐ２−２）が、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌの１：１混合物の培地（Ｐ１−３、Ｐ１−４、Ｐ２−３、Ｐ２−４）において培養されたものよりも低い生産性を示したことを示す。
【００７２】
［実施例５］
高密度かん流製法をサポートするであろうフィードを開発するという本発明者らの欲求を考えて、この実施例は、３０００万細胞／ミリリットルを超える培養についての栄養学的サポート、好ましくは、５０００万細胞／ミリリットルの培養におけるかん流の実行をサポートすることを提供するものを同定するために、様々なフィードおよびフィードの組み合わせを評価することからの実験結果を含有する。培養は、ＣＨＯＺＮ（１０％）およびＦｅｅｄ  １（１０％）を補充した、上記の実施例４において報告されたＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ基本培地に、４０００万細胞／ミリリットルで接種された。培養の１つは、７．５％  綿実加水分解物でさらに補充された。培地組成は以下に提供される。
【００７３】
実施例５  培地１
【００７４】
【表１１】
0006689189.tif 000013
【００７５】
実施例５  培地２
【００７６】
【表１２】
0006689189.tif 000014
【００７７】
実施例５の処方は、終点としての培養の長さを使用して、バッチモードで試験された。生存度がほぼ８０％に低下するまで、培養はさらなるフィードなしで３３．５℃において維持された。培養の生細胞密度および生存度は、以下のＶＣＤ／生存度グラフにおいて示される。
【００７８】
実施例５についてのＶＣＤ／生存度  プロフィール
【００７９】
【表１３】
0006689189.tif 000015
【００８０】
この実施例５についてのＶＣＤ／生存度プロフィール（上記）は、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ  １：１混合物の基本培地の２つの異なる培地処方において維持された、培養の生細胞密度（ＶＣＤ）および生存度プロフィールを描写する。両方のフィード処方は、４日間のバッチ培養の長さを生じた（細胞密度のいくらかの減少は、小容量培養からの集中的なサンプリングおよび高密度培養で培養された細胞のピペットへの付着に起因した。）。
【００８１】
実施例５は、ここに記載されるＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ培地処方が高密度かん流の実行をサポートするために十分に豊富であること、およびさらに、かん流速度が、おそらく、栄養の欠乏のリスクの減少により低減され得ることを実証する。
【００８２】
［実施例６］
シミュレートされたかん流モード培養における生成物品質に対する、実施例５に記載された培地処方のさらなる性能の探究は、１０％  ＣＨＯＺＮ、１０％  Ｆｅｅｄ  １、１０ｍＭ  ガラクトースおよび７．５％  綿実加水分解物が補充された、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ基本培地において、４０００万から５０００万細胞／ミリリットルに設定された。加えて、３つの培養のうちの２つは、０．８μＭ  デキサメタゾンおよび２０ｍＭ  ＭａｎＮａｃが補充された。これらの２つの培養のうちの１つは０．０１μＭ  塩化マグネシウムを受容した。培地組成は、実施例６培地１から３において提供される（以下の表を参照のこと）。
【００８３】
実施例６  培地１
【００８４】
【表１４】
0006689189.tif 000016
【００８５】
実施例６  培地２
【００８６】
【表１５】
0006689189.tif 000017
【００８７】
実施例６  培地３
【００８８】
【表１６】
0006689189.tif 000018
【００８９】
培養は３３．５℃で培養された。かん流は、２４時間ごとに培地交換を実施することによって実行された。
【００９０】
サンプルは、増殖（生細胞密度および生存度）、力価およびＩＥＦゲルを使用するアイソフォームプロフィールに関して分析された。培養生細胞密度（ＶＣＤ）および生存度はこの実施例６についてのＶＣＤ／生存度プロフィールにおいて示されるのに対して（下記）、シアリル酸含量のレベルと相関しているアイソフォームプロフィールはこの実施例についてのＩＥＦゲルにおいて示されている。
【００９１】
実施例６についてのＶＣＤ／生存度プロフィール
【００９２】
【表１７】
0006689189.tif 000019
【００９３】
ＶＣＤ／生存度  プロフィール（上記）は、ＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ基本培地の３つの異なる培地処方において維持された培養の生細胞密度（ＶＣＤ）および生存度プロフィールを示す。すべてのフィード処方は、２４時間ごとに実施された４回の培地交換を伴って５日間の間試験された。培養のより後期の段階における細胞密度の減少は、激しいサンプル試験とピペットに付着した細胞の結果であった。
【００９４】
実施例６についてのＩＥＦゲル
【００９５】
【化２】
0006689189.tif 000020
【００９６】
実施例６についてのＩＥＦゲル（上記）は、培地１（レーン６）、培地２（レーン７）および培地３（レーン８）から構成される収集培養（４日目、４回目培地交換）からのサンプルのアイソフォームプロフィールを示す。レーン５および９は参照標準に対応する。
【００９７】
実施例６に記載される実験から生成されるデータは、生存度および生細胞密度に関する同様の培養性能にも関わらず、生成物品質は、培地２および培地３の処方によってさらに改善される。
【００９８】
［実施例７］
所定の時間間隔での反復する培地交換を含むかん流製法において試験される高密度培養のなおさらなる実施例において、本発明者らは、４０００万から５０００万細胞／ミリリットルの細胞を、４つの異なるＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ  １：１混合物に接種した。混合物１はＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＦｅｅｄおよびＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ１で補充され、混合物２はＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｆｅｅｄ、ＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ１およびＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ２で補充され、混合物３はＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ＦｅｅｄおよびＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａで補充され、ならびに混合物４はＥｘ−Ｃｅｌｌ  ＣＨＯＺＮ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｆｅｅｄ、ＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ１、ＢａｌａｎＣＤ  Ｆｅｅｄ２およびＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ａで補充された。４つすべてのＢａｌａｎＣＤ／Ｈｙｃｅｌｌ  １：１混合物が、８ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ガラクトース、７．５％  綿実加水分解物、０．８μＭ  デキサメタゾンおよび２０ｍＭ  ＭａｎＮＡｃのさらなる補充を含有した。
【００９９】
実施例７−培地１
【０１００】
【表１８】
0006689189.tif 000021
【０１０１】
実施例７−培地２
【０１０２】
【表１９】
0006689189.tif 000022
【０１０３】
実施例７−培地３
【０１０４】
【表２０】
0006689189.tif 000023
【０１０５】
実施例７−培地４
【０１０６】
【表２１】
0006689189.tif 000024
【０１０７】
培養は３３．５℃で維持された。かん流条件は、２４時間ごとに培地を置き換えることによって達成された（合計で５回の交換）。生成物品質は、４回の連続する培地交換の間のＩＥＦゲル分析によって測定された（ＩＥＦゲル−実施例７、以下を参照のこと）。
【０１０８】
ＩＥＦゲル−実施例７
【０１０９】
【化３】
0006689189.tif 000025
【０１１０】
ＩＥＦゲル（上記）は５回の培地交換の最後（５日目）からのサンプルを示し、標準はレーン４であり、培地１、培地２、培地３、培地４からのサンプル（それぞれ、レーン５から８）である。このデータは、４つすべての培地処方が、１バイオリアクター容量／日のシミュレートされたかん流速度を用いる高い細胞密度かん流をサポートすること、およびこれらの条件が、参照標準（市販されているＥｎｂｒｅｌ（Ｒ））と実質的に同様のアイソフォーム分布を生じるシアリル酸含量を有するエタネルセプトタンパク質の産生を可能にすることを示す。連続的な様式で、定常的な培地流が栄養を送達し、老廃物を除去するかん流モードにおいて、生成物の品質は、なおさらに改善されることが期待できる。
【図１】
0006689189.tif 000026
【図２】
0006689189.tif 000027
【図３】
0006689189.tif 000028
【図４】
0006689189.tif 000029
【図５】
0006689189.tif 000030
【図６】
0006689189.tif 000031
【図７】
0006689189.tif 000032
【図８】
0006689189.tif 000033
【図９】
0006689189.tif 000034
【図１０】
0006689189.tif 000035
【図１１】
0006689189.tif 000036
【図１２】
0006689189.tif 000037
【図１３】
0006689189.tif 000038
【図１４】
0006689189.tif 000039
【図１５】
0006689189.tif 000040
【図１６−１】
0006689189.tif 000041
【図１６−２】
0006689189.tif 000042
【図１７】
0006689189.tif 000043