(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を含む、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬であって、
前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーが、1つ又は複数のフラボノイドと、前記フラボノイドのA環のC6及び/若しくはC8位又はB環のC2及び/若しくはC6位にてコンジュゲーションされており、
前記関節病態が、変形性関節炎、関節リウマチ、痛風性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎から成る群から選択され、
前記関節病態の治療的及び/又は予防的処置が軟骨修復をもたらし、
前記ポリマーが、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェラン、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン及びキシログルカンから成る群から選択される多糖である、医薬。
【請求項２】
1つ又は複数のフラボノイドが、前記ポリマーとコンジュゲーションされている、請求項1に記載の医薬。
【請求項３】
前記ポリマーが、前記1つ又は複数のフラボノイドと、リンカーを介してコンジュゲーションされている、請求項1又は2に記載の医薬。
【請求項４】
前記1つ又は複数のフラボノイドが、モノマー型フラボノイド又はダイマー型フラボノイドである、請求項1から3のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項５】
前記ポリマーが、前記フラボノイドと、前記フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位にてコンジュゲーションされている、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
前記ポリマーが、遊離アルデヒド、又は、酸の存在下で遊離アルデヒドに変換できる基を含有し、前記ポリマーが、前記フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位にて、前記遊離アルデヒド基と前記フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位との反応によって前記ポリマーが結び付くことによりコンジュゲーションされている、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項７】
前記ポリマーが、前記フラボノイドと、前記フラボノイドのB環のC2及び/又はC6位にてコンジュゲーションされている、請求項1から4いずれか一項に記載の医薬。
【請求項８】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を含む、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬であって、
前記ポリマーが、フラボノイドと、前記フラボノイドのB環のC2及び/又はC6位にてコンジュゲーションされており、
前記関節病態が、変形性関節炎、関節リウマチ、痛風性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎から成る群から選択され、
前記ポリマーが、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェラン、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン及びキシログルカンから成る群から選択される多糖である、医薬。
【請求項９】
前記ポリマーが、前記フラボノイドと、チオールリンカーを介してコンジュゲーションされている、請求項7又は8に記載の医薬。
【請求項１０】
前記フラボノイドが、フラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジン及びアントシアニジンから成る群から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１１】
前記フラボノイドが、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、フィセチニドール、ガロカテキン、没食子酸ガロカテキン、メスキトール及びロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシン、並びにこれらの混合物から成る群から選択される、請求項1から10のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１２】
チオールリンカーが、前記ポリマーと結合される部分をさらに含み、前記部分が、アミド、アミン、アルキル、アルケニル、アリール、エステル、カーボネート、エーテル、アミド(amido)、アミド(amido)エステル、カルバメート及びアセタール基から成る群から選択される、請求項9から11のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１３】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を含む、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬であって、
前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーが、1つ又は複数のフラボノイドと、前記フラボノイドのA環のC6及び/若しくはC8位又はB環のC2及び/若しくはC6位にてコンジュゲーションされており、
前記関節病態が、変形性関節炎、関節リウマチ、痛風性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎から成る群から選択され、
前記ポリマーが、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェラン、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン及びキシログルカンから成る群から選択される多糖であり、前記フラボノイドが没食子酸エピガロカテキンである、医薬。
【請求項１４】
多糖が、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンとコンジュゲーションされている、請求項1から12のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１５】
多糖が、2つの没食子酸エピガロカテキンとコンジュゲーションされている、請求項13又は14に記載の医薬。
【請求項１６】
多糖が、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンと、チオールリンカーを介してコンジュゲーションされている、請求項13又は14に記載の医薬。
【請求項１７】
多糖が、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンと、前記没食子酸エピガロカテキンのB環のC2及び/又はC6位にてコンジュゲーションされている、請求項13から15のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１８】
多糖が、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンと、前記没食子酸エピガロカテキンのA環のC6及び/又はC8位にてコンジュゲーションされている、請求項13から15のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１９】
前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートが、式1:
【化１】
0006661546.tif 000006
[式中、
各nは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、各mは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、ここで、nは0ではない]
のものである、請求項1から4、7から14、16及び17のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２０】
前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートが、式2:
【化２】
0006661546.tif 000007
[式中、
各nは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、各mは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、ここで、nは0ではない]
のものである、請求項1から6、10、11、13から15及び18のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２１】
式1:
【化３】
0006661546.tif 000008
[式中、
各nは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、各mは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、ここで、nは0ではない]
のポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を含む、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬であって、
前記関節病態の治療的及び/又は予防的処置が軟骨修復をもたらす、医薬。
【請求項２２】
式1又は式2のポリマー-フラボノイドコンジュゲートのコンジュゲーション度が0.1から50%までである、請求項19から21のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２３】
(a)アミン含有化合物を1つ又は複数のフラボノイドと連結して、それにより、遊離アミン基をもつフラボノイドを形成する工程、及び
(b)(a)の生成物を求核付加によってポリマーとコンジュゲーションする工程
を含む、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法であって、
前記ポリマーが、ヒアルロン酸、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェラン、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン及びキシログルカンから成る群から選択される多糖である、方法。
【請求項２４】
工程(a)が、アミン含有化合物を2つのフラボノイドと連結して、それにより、アミン含有橋架けフラボノイドダイマーを形成する工程を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
工程(b)が、カップリング剤の存在下で実施される、請求項23又は24に記載の方法。
【請求項２６】
カップリング剤が、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド(EDC.HCl)、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、カルボニルジイミダゾール、アジプイミド酸ジメチル、N-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェニルクロロホルメート及び1-(p-トルエンスルホニル)イミダゾールから成る群から選択される、請求項25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ポリマー-フラボノイドコンジュゲート、その使用、及びそれを作製する方法に関する。本ポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において有用でありうる。
【背景技術】
【０００２】
変形性関節炎は、世界中の数百万名の人々、とりわけ高齢者集団に属する人々が罹患している一般的な変性関節疾患である。変形性関節炎の症状としては、軟骨損傷、軟骨下骨硬化、骨棘形成及び滑膜炎症が挙げられる。これらの症状は、時間の経過に伴い悪化して、罹患関節での疼痛及び身体的障害を引き起こす。そのため、変形性関節炎は、患者のクオリティー・オブ・ライフに大きな影響を及ぼす。変形性関節炎の病因は複雑であり、十分に解明されていない。関節にかかる機械的応力が原因となって時間の経過に伴い軟骨変性が生じる(摩耗)可能性があることは、認識されている。遺伝因子は軟骨の内因的性質として変形性関節炎発病の一因となり、関節の解剖学的構造が、より損傷しやすい状態で発達する可能性がある。炎症も、変形性関節炎の発現に関わっている。炎症促進性サイトカイン、例えばインターロイキン-1β(IL-1β)及び腫瘍壊死因子-α(TNF-α)は、変形性関節炎の軟骨、滑液、滑膜及び軟骨下骨では増加している。これらのサイトカインは、軟骨の細胞外マトリックス(ECM)の合成を抑制し、軟骨中のII型コラーゲンを分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)の産生を増大させる。滑膜の炎症、すなわち滑膜炎は、より多くの炎症促進性サイトカインを分泌する炎症細胞の浸潤を引き起こすことから、MMP産生をさらに増大させることにより病的状態を増悪させる。現在、変形性関節炎の治癒法はない。既存の処置法は、非薬理学的及び/又は薬理学的な様式を通して、疼痛を緩和し関節機能を改善することを目的としている。患者が非薬理学的(non-pharmalogical)及び薬理学的(pharmalogical)処置の組合せから利益を得られない場合には、関節置換手術を検討することがある。
【０００３】
近年、フラボノイドは、生物学的及び薬理学的特性を有すると認識されていることから大きな注目を集めている。しかし、フラボノイドの活性半減期は、体内では数時間に限定されている。そのため、フラボノイドには望ましい特性があるにもかかわらず、量的な制約が内在することから、直接大量摂取することによって体の中でこの化合物の治療レベルを達成することは非現実的である。つまり、食事のみを通じてフラボノイドから治療的又は薬理学的利益を得るためには、実際的な消費量より多くの量の食品及び飲料を摂ることが必要になる。
【０００４】
フラボノイドを食品及び飲料の経口摂取によって消費する場合、フラボノイドは、消化の際の酸化的損傷から消化管を保護する抗酸化剤としての役割を果たしうる。しかし、フラボノイドは消化管中にのみ留まると予想され、したがって、その有益な生理学的活性が組織において利用される可能性は低い。その上、強い疎水性に加え、タンパク質と複合体を形成する傾向を有することから、これらの化合物の非経口送達は困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、先述の病態のうち1つ又は複数を克服する又は少なくとも改善させる処置法を提供することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において有用なポリマー-フラボノイドコンジュゲートを提供する。本開示は、さらに、前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法を提供する。
【０００７】
本開示の第1の態様によれば、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の製造におけるポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【０００８】
本開示の第2の態様では、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において使用するためのポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【０００９】
本開示の第3の態様では、治療有効量のポリマー-フラボノイドコンジュゲートを対象に投与する工程を含む、関節病態を処置又は予防する方法が提供される。
【００１０】
有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、変形性関節炎の処置において使用されうる。第1の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、有利なことに、関節機能を改善し、疼痛を軽減しうる。
【００１１】
さらに有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、軟骨欠損を復元し、それにより軟骨を修復しうる。
【００１２】
有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートの使用は、フラボノイドの治療成果を潜在的に高めうる。さらに有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートの注射は、経口投与時のフラボノイドの低いバイオアベイラビリティーを克服しうる。さらに有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートの注射は、低頻度で行いうる。
【００１３】
本開示の第4の態様では、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法であって、
(a)アミン含有化合物を1つ又は複数のフラボノイドと連結して、それにより、遊離アミン基をもつフラボノイドを形成する工程、及び
(b)(a)の生成物を求核付加によってポリマーとコンジュゲーションする工程
を含む方法が提供される。
【００１４】
有利なことに、第4の態様の本開示の方法は、効率的且つ費用対効果の高い方法を通したポリマーとフラボノイドとのコンジュゲーションを可能にしうる。
【００１５】
添付の図面は、本開示の実施形態を例証するものであり、本開示の実施形態の原理を説明するために役立つ。但し、これらの図面は例証のみを目的としてデザインされたものであり、本発明の限定を定義するものではないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ヒト変形性関節炎軟骨細胞を用いた場合のEGCG及びHA-EGCG1コンジュゲートの細胞生存率を示すグラフである(HA-EGCG1濃度:0.1、0.5、及び1.1mg/ml。それぞれ、10、50、及び100μMのEGCGを含有した)。
【図２】EGCG、HA(90kDa)、及びHA-EGCG1コンジュゲートがOA軟骨細胞におけるIL-1βでの誘導によるIL-6及びTNF-αの発現に及ぼす効果を示すグラフである。細胞は、IL-1β(5ng/ml)の存在下で、EGCG(10μM)、HA(0.1及び1.1mg/ml)、又はHA-EGCG1コンジュゲート(0.1及び1.1mg/ml。それぞれ、10及び100μMのEGCGを含有する)で処理した。遺伝子発現(上段)についてはRT-PCRを使用して解析し、培養培地中のタンパク質濃度(下段)についてはELISAにより測定した。
【図３】EGCG、HA(90kDa)、及びHA-EGCG1コンジュゲートが変形性関節炎軟骨細胞におけるIL-IBでの誘導によるMMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現に及ぼす効果を示すグラフである。細胞は、IL-1β(5ng/ml)の存在下で、EGCG(10μM)、HA(0.1及び1.1mg/ml)、又はHA-EGCG1コンジュゲート(0.1及び1.1mg/ml。それぞれ、10及び100μMのEGCGを含有する)で処理した。遺伝子発現(上段)についてはRT-PCRを使用して解析し、培養培地中のタンパク質濃度(下段)についてはELISAにより測定した。
【図４】ヒト関節リウマチ線維芽細胞様滑膜細胞を用いた場合のEGCG及びHA-EGCG2コンジュゲートの細胞生存率を示すグラフである(HA-EGCG2濃度:0.2、0.9、及び1.8mg/ml。それぞれ、12.5、50、及び100μMのEGCGを含有した)。
【図５】EGCG、HA(800kDa)、及びHA-EGCG2コンジュゲートがOA軟骨細胞におけるIL-1βでの誘導によるIL-6及びTNF-αの発現に及ぼす効果を示すグラフである。細胞は、IL-1β(5ng/ml)の存在下で、EGCG(10μM)、HA(0.2及び2.2mg/ml)、又はHA-EGCG1コンジュゲート(0.2及び2.2mg/ml。それぞれ、10及び100μMのEGCGを含有する)で処理した。遺伝子発現(上段)についてはRT-PCRを使用して解析し、培養培地中のタンパク質濃度(下段)についてはELISAにより測定した。
【図６】EGCG、HA(800kDa)、及びHA-EGCG2コンジュゲートがOA軟骨細胞におけるIL-1βでの誘導によるMMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現に及ぼす効果を示すグラフである。細胞は、IL-1β(5ng/ml)の存在下で、EGCG(10μM)、HA(0.2及び2.2mg/ml)、又はHA-EGCG1コンジュゲート(0.2及び2.2mg/ml。それぞれ、10及び100μMのEGCGを含有する)で処理した。遺伝子発現(上段)についてはRT-PCRを使用して解析し、培養培地中のタンパク質濃度(下段)についてはELISAにより測定した。
【図７】変形性関節炎のラット前十字靭帯離断(ACLT)モデルの写真であり、生理食塩水、HA(800kDa)、及びHA-EGCG2コンジュゲートの関節内注射が脛骨内側顆の構造に及ぼす効果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書において使用する以下の語及び用語は、以下に示す意味を有するものとする。
【００１８】
本明細書において使用する場合、用語「関節病態」は、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)、インターロイキン-6(IL-6)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-1(MMP-1)、マトリックスメタロプロテイナーゼ-3(MMP-3)及び/又はマトリックスメタロプロテイナーゼ-13(MMP-13)の発現の変調を伴う病態を指す。例えば、用語「関節病態」は、対象の関節及び結合組織に関連する病態を指し、これには、関節炎、軟骨損傷、関節痛、関節炎症、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythematous)、混合性結合組織疾患、軟骨下(subchondrol)骨硬化、滑膜炎症及び骨棘形成などの病態が含まれうる。
【００１９】
本明細書において使用する場合、用語「関節炎」は、例えば、変形性関節炎、関節リウマチ、痛風性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎を指す。
【００２０】
本明細書において使用する場合、用語「関節痛」には、例えば、骨関節炎性の関節痛、関節リウマチ性の関節痛、炎症性関節痛、急性関節痛及び慢性関節痛が含まれる。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「関節炎症」には、例えば、関節炎性の関節炎症、骨関節炎性の関節炎症、及び関節リウマチ性の関節炎症が含まれる。
【００２２】
本明細書において使用する場合、用語「軟骨損傷」には、例えば、骨関節炎の関節又は関節リウマチの関節における損傷が含まれる。
【００２３】
本明細書において使用する場合、用語「軟骨修復」には、例えば、軟骨の傷害、断裂、変形又は欠損の治癒及び再生、並びに、軟骨組織の損傷を防ぐ際の予防的な使用が含まれる。軟骨傷害は、関節において生じている場合もある。
【００２４】
本明細書において使用する場合、用語「アミド」(amide)は、式「-C(O)NRxRy」(式中、Rx及びRyは、独立に、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロ環でありうる)の基を指す。
【００２５】
本明細書において使用する場合、用語「アミド(amido)」は、式「-C(O)NRx-」(式中、Rxは、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロ環でありうる)の基を指す。アミド(amido)基は、カルボニル基又はアミノ基を介して親分子部分と結び付きうる。
【００２６】
本明細書において使用する場合、用語「対象」は、ヒトと非ヒト動物の両方を指す。
【００２７】
本明細書において使用する場合、用語「リンカー」は、ポリマーとフラボノイドとを連結しうる任意の化学基を指し、これには例えば1つ又は複数の多様な原子団を含む分子が含まれ、このような原子団としては、任意選択で置換されているヘテロアルキル、メチレン基(-CH2-)、直鎖状アルキレン基、分枝状アルキレン基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂環式基、ポリアルキレングリコール基(例えば、酸化エチレン基、すなわち-O-CH2-CH2-など)、アミド基(-CONH-)、アミン基(-NH-)、アミド基[-NHC(O)-又は-C(O)NH-]、エーテル基(-O-)、カルバメート基、アセタール基、アミド(amido)エステル基、アルケニル基、及びこれらの組合せが挙げられる。本明細書において使用する場合、用語「チオールリンカー」は、1つ又は複数の連結原子を介して共有結合性に結び合わされた1つ又は複数のチオール基(-SH)が含まれている分子を指す。チオールリンカーのチオール基は、1つ又は複数の多様な原子団を介して結び合わされていてよく、このような原子団としては、メチレン基(-CH2-)、直鎖状アルキレン基、分枝状アルキレン基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、脂環式基、ポリアルキレングリコール基(例えば、酸化エチレン基、すなわち-O-CH2-CH2-など)、アミド基(-CONH-)、アミン基(-NH-)、アミド基[-NHC(O)-又は-C(O)NH-]、エーテル基(-O-)、カルバメート基、アセタール基、アミド(amido)エステル基、アルケニル基、及びこれらの組合せが挙げられる。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「アミン含有化合物」は、1つ又は複数のアミン基[-NR2(式中、Rは、独立に、水素、アルキル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロ環でありうる)]を含有する化合物を指す。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「ヘテロアルキル」は、先に定義したアルキル部分のうち、1つ又は複数の炭素原子、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個の炭素原子が1つ又は複数のヘテロ原子(同じものでも異なるものでもよい)で置きかえられているアルキル部分を指し、ここで、分子の残りの部分との結合点は、ヘテロアルキル基の炭素原子、又はヘテロ原子を介している。好適なヘテロ原子としては、O、S及びNが挙げられる。非限定的な例としては、エーテル、チオエーテル、アミン、ヒドロキシメチル、3-ヒドロキシプロピル、1,2-ジヒドロキシエチル、2-メトキシエチル、2-アミノエチル、2-ジメチルアミノエチルなどが挙げられる。ヘテロアルキル基は、任意選択で置換されていてもよい。
【００３０】
用語「任意選択で置換されている」は、本明細書において使用する場合、この用語が指す基は無置換であってもよく、又は水素以外の1つ若しくは複数の基で置換されていてもよいことを意味する。但し、示されている原子の通常の原子価は超過されないこと、及び、置換により安定な化合物となることが条件である。そのような基は、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、オキソ、シアノ、ニトロ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール4アルコキシ(aryl4alkoxy)、アルキルチオ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルコキシ、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルオキシ、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニル、アリールスルホニルオキシ、アリールスルホニルアルキル、アルキルスルホンアミド(amido)、アルキルアミド(amido)、アルキルスルホンアミドアルキル、アルキルアミドアルキル、アリールスルホンアミド(amido)、アリールカルボキサミド、アリールスルホンアミドアルキル、アリールカルボキサミドアルキル、アロイル、アロイル4アルキル(aroyl4alkyl)、アリールアルカノイル、アシル、アリール、アリールアルキル、アルキルアミノアルキル、RxRyN-、RxOCO(CH2)m、RxCON(Ry)(CH2)m、RxRyNCO(CH2)m、RxRyNSO2(CH2)m又はRxSO2NRy(CH2)m基(式中、Rx及びRyは、それぞれが水素若しくはアルキルから独立に選択されるか、又は、適切な場合にはRxRyが炭素環若しくはヘテロ環の一部分を形成し、mは、0、1、2、3又は4である)、RxRyN(CH2)p-又はRxRyN(CH2)pO-基(式中、pは、1、2、3又は4である)でありえ、ここで、置換基がRxRyN(CH2)p-又はRxRyN(CH2)pOであるとき、Rxは、基の(CH2)p部の少なくとも1つのCH2と共にカルボシクリル又はヘテロシクリル基を形成することもあり、Ryは、水素、アルキルでありうる。
【００３１】
「実質的に」という語は、「まったく」を排除しない。例えば、Yを「実質的に含まない」組成物は、Yをまったく含まないことがありうる。必要に応じて、「実質的に」という語は本発明の定義から省略されることがある。
【００３２】
特に明記しない限り、用語「含む」(comprising)及び「含む」(comprise)並びにその文法的な変化形は、「オープンな」又は「包含的な」ことばを表し、それにより、これらの用語には、記載されている要素が含まれるだけでなくそれ以外の記載されていない要素が含まれることも認められるようにすることを意図している。
【００３３】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、製剤の成分の濃度に関する場合、典型的には、書かれている値の+/-5%、より典型的には、書かれている値の+/-4%、より典型的には、書かれている値の+/-3%、より典型的には、書かれている値の+/-2%、さらにより典型的には、書かれている値の+/-1%、さらにより典型的には、書かれている値の+/-0.5%を意味する。
【００３４】
本開示を通じて、一部の実施形態は、範囲形式で開示されることがある。範囲形式での記載は、単に便利及び簡潔のためであり、開示される範囲の及ぶ有効範囲について柔軟性のない制限を設けるものと解釈されるべきでないことは理解されるべきである。したがって、範囲の記載には、明確に開示されているすべての可能な部分範囲(sub-range)に加え、その範囲内の個々の数値も含まれていると考えられるべきである。例として、例えば「1から6まで」という範囲の記載には、明確に開示されている部分範囲、例えば、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどに加え、その範囲内の個々の数、例えば、1、2、3、4、5及び6も含まれていると考えられるべきである。このことは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【００３５】
一部の実施形態は、本明細書においては、広範且つ属レベルで記載されていることもある。属レベルの開示内に入る、より狭い種及び属未満のグループも各々、本開示の一部を形成する。これには、属から任意の発明の主題を除外する条件又は否定的限定を有する実施形態の属レベルでの記載が含まれ、この場合、削除される事項が本明細書に明確に記載されているか否かを問わない。
【００３６】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲート、その使用、及びそれを作製するための方法の例示的な非限定的実施形態を以下に開示する。
【００３７】
本開示は、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において有用なポリマー-フラボノイドコンジュゲートを提供する。本開示は、さらに、前記ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法を提供する。
【００３８】
一態様において、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置のための医薬の製造におけるポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩の使用が提供される。
【００３９】
別の態様において、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において使用するためのポリマー-フラボノイドコンジュゲート又はその薬学的に許容される塩が提供される。
【００４０】
さらなる態様において、治療有効量のポリマー-フラボノイドコンジュゲートを対象に投与する工程を含む、関節病態を処置又は予防する方法が提供される。
【００４１】
関節病態は、関節炎、軟骨損傷、関節痛、関節炎症、全身性エリテマトーデス、混合性結合組織疾患、軟骨下骨硬化、滑膜炎症及び骨棘形成から成る群から選択されうる。
【００４２】
関節炎は、変形性関節炎、関節リウマチ、痛風性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎から成る群から選択されうる。
【００４３】
関節病態の治療的及び/又は予防的処置は、軟骨修復をもたらしうる。
【００４４】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、対象における関節病態を処置又は予防する方法において有用である。
【００４５】
ポリマー
ポリマーは、遊離アルデヒド、又は、酸の存在下で遊離アルデヒドに変換できる基を含有でき、このポリマーは、フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位にて、該遊離アルデヒド基と前記フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位との反応によってポリマーが結び付くことによりコンジュゲーションされている。
【００４６】
ポリマーは、多糖、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、合成ポリマー、及びこれらの混合物から成る群から選択されうる。
【００４７】
前記多糖は、ヒアルロン酸(HA)、デキストラン、セルロース、アミロース、デンプン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、カラギーナン、シクロデキストリン、硫酸デキストラン、フィコール、ジェラン、グアーガム、ペクチン、ポリスクロース、プルラン、スクレログルカン、キサンタン及びキシログルカンから成る群から選択されうる。
【００４８】
多糖は、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンとコンジュゲーションされうる。多糖は、1つの没食子酸エピガロカテキン又は2つの没食子酸エピガロカテキンとコンジュゲーションされうる。
【００４９】
多糖は、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンと、チオールリンカーを介してコンジュゲーションされうる。
【００５０】
多糖は、少なくとも1つの没食子酸エピガロカテキンと、前記没食子酸エピガロカテキンのA環のC6及び/又はC8位にてコンジュゲーションされうる。
【００５１】
ポリヌクレオチドは、アプタマー、DNA、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA、ペプチド核酸(PNA)及び低分子ヘアピン型RNA(shRNA)から成る群から選択されうる。
【００５２】
ポリペプチドは、タンパク質、抗体、抗体断片、アプチド(aptide)、ペプチド及びポリ(アミノ酸)から成る群から選択されうる。
【００５３】
合成ポリマーは、アルケン、エーテル、カルボン酸、イミン、アミド、アミン、無水物、カーボネート、エステル、オルトエステル及びウレタンから成る群から選択されるモノマーを含みうる。
【００５４】
合成ポリマーは、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(アリルアミン)、ポリ無水物、ポリ(β-アミノエステル)、ポリ(ブチレンスクシネート)、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリジオキサノン、ポリエチレンイミン、ポリ(グリセロール)、ポリグリコール酸、ポリ(3-ヒドロキシプロピオン酸)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、ポリ(オルトエステル)、ポリ(2-オキサゾリン)、ポリ(セバシン酸)、ポリ(テレフタレート-co-ホスフェート)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、及びこれらの組合せから成る群から選択されうる。
【００５５】
フラボノイド
フラボノイドは、コアフェニルベンジルピロン構造から誘導された一般的クラスの分子の任意のフラボノイドであってよい。フラボノイドのA、B及びC環の簡略図を以下に示す:
【００５６】
【化１】
0006661546.tif 000002
【００５７】
用語「フラボノイド」とは、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン-3-オール、カテキン、アントシアニジン及びカルコンが含まれるように意図したものである。特定の実施形態において、フラボノイドは、カテキン又はカテキン系フラボノイドである。カテキン又はカテキン系フラボノイドは、カテキン類(又はフラバン-3-オール誘導体)として一般に知られるクラスに属する任意のフラボノイドであり、これには、エピカテキン、エピガロカテキン、カテキン、没食子酸エピカテキン及び没食子酸エピガロカテキンなど、並びに、カテキン類又はカテキン系フラボノイドのすべての可能な立体異性体などの、カテキン及びカテキン誘導体が含まれる。特定の実施形態において、カテキン系フラボノイドは、(+)-カテキン又は(-)-没食子酸エピガロカテキンである。本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートのフラボノイドは、フラボン、イソフラボン、フラバン、プロアントシアニジン及びアントシアニジンから成る群から選択されうる。
【００５８】
フラボノイドは、(-)-エピカテキン、(+)-エピカテキン、(-)-カテキン、(+)-カテキン、没食子酸エピカテキン、エピガロカテキン、没食子酸エピガロカテキン、フィセチニドール、ガロカテキン、没食子酸ガロカテキン、メスキトール及びロビネチニドール、エラジタンニン、ガロタンニン、ウーロンテアニン、フロロタンニン、タンニン、テアシトリン、テアジベンゾトロポロン、テアフラビン、テアナフトキノン、テアルビジン、テアシネンシン、並びにこれらの混合物から成る群から選択されうる。
【００５９】
フラボノイドは、フラボノイドの単一のモノマー単位であってもよく、又は、1つ若しくは複数のフラボノイドのダイマー若しくはオリゴマーであってもよい。フラボノイドのオリゴマーは、2つ以上のモノマー単位が連結されて一緒になっているものであってもよい。
【００６０】
一実施形態において、フラボノイドは、没食子酸エピガロカテキン(EGCG):
【００６１】
【化２】
0006661546.tif 000003
【００６２】
でありうる。
【００６３】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲート
少なくとも1つのフラボノイドが、前記ポリマーと結合されうる。少なくとも2つのフラボノイドが、前記ポリマーと結合されうる。
【００６４】
ポリマーは、前記フラボノイドと、リンカーを介して結合されうる。リンカーは、ポリマーとフラボノイドとを連結しうる任意の化学基であってよい。リンカーは、チオール、アミド、チオエーテル、イミン、アミン、アゾ及び/又は1,2,3-トリアゾール基を含む群から選択されうる。リンカーは、ポリマーの任意の箇所とフラボノイドの任意の箇所との間に存在しうる。リンカーは、ポリマーの末端とフラボノイドの任意の箇所との間に存在しうる。
【００６５】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、ポリマーとコンジュゲーションされている1つ又は複数のフラボノイドを有しうる。フラボノイドは、モノマー型フラボノイド又はダイマー型フラボノイドから成る群から選択されうる。モノマー型フラボノイドは、1個のフラボノイド分子を含みうる。ダイマー型フラボノイドは、リンカーにより連結されて一緒になっている2個のフラボノイド分子を含みうる。ダイマー型フラボノイドのフラボノイド分子のうち一方が、ポリマーと連結されていてもよい。ダイマー型フラボノイドのフラボノイド分子の両方が、独立に、ポリマーと連結されていてもよい。1つのフラボノイドが前記コンジュゲート中に存在するとき、フラボノイドは、B環を介して前記ポリマーと結合されうる。2つのフラボノイドが前記コンジュゲート中に存在するとき、フラボノイドは、A環を介して前記ポリマーと結合されうる。
【００６６】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、フラボノイドと、前記フラボノイドのA環にてコンジュゲーションされうる。ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、フラボノイドと、前記フラボノイドのA環のC6及び/又はC8位にてコンジュゲーションされうる。
【００６７】
ポリマー上の遊離アルデヒド基は、ポリマーを、フラボノイド構造のA環のC6又はC8位のいずれか又はその両方と、制御された様式でコンジュゲーションさせ、それにより、フラボノイド構造、特にフラボノイドのB及びC環の破壊を防止し、ひいてはフラボノイドの有益な生物学的及び薬理学的特性を保存することを可能にしうる。
【００６８】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、フラボノイドと、前記フラボノイドのB環にてコンジュゲーションされうる。ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、フラボノイドと、前記フラボノイドのB環のC2及び/又はC6位にてコンジュゲーションされうる。
【００６９】
ポリマーは、フラボノイドと、チオールリンカーを介してコンジュゲーションされうる。
【００７０】
別の実施形態において、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートのポリマーは、フラボノイドと、チオールリンカーを介してコンジュゲーションされる。チオールリンカーは、ポリマーと結合される部分をさらに含むことができ、その場合、前記部分は、アミド、アミン、アルキル、アルケニル、アリール、エステル、カーボネート、エーテル、アミド(amido)、アミド-エステル、カルバメート及びアセタール基から成る群から選択される。アルキル基は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個の炭素原子を有しうる。アルケニル基は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個又は10個の炭素原子を有しうる。アリール基は、6個、7個、8個、9個又は10個の炭素原子を有しうる。
【００７１】
チオールリンカーは、ポリマーと結合される部分をさらに含むことができ、その場合、前記部分は、アミド、アミン、アルキル、アルケニル、アリール、エステル、カーボネート、エーテル、アミド(amido)、アミド-エステル、カルバメート及びアセタール基から成る群から選択される。
【００７２】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、式1:
【００７３】
【化３】
0006661546.tif 000004
【００７４】
[式中、
各nは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、各mは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、ここで、n又はmのうち少なくとも一方は0ではない]
のものでありうる。
【００７５】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、式2:
【００７６】
【化４】
0006661546.tif 000005
【００７７】
[式中、
各nは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、各mは、独立に、0以上50,000以下の整数であり、ここで、n又はmのうち少なくとも一方は0ではない]
のものでありうる。
【００７８】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートのコンジュゲーション度は、0.1から100%まで、若しくは0.1から90%まで、若しくは0.1から80%まで、若しくは0.1から70%まで、若しくは0.1から60%まで、若しくは0.1から50%まで、若しくは0.1から40%まで、若しくは0.1から30%まで、若しくは0.1から20%まで、若しくは0.1から10%まで、若しくは10から100%まで、若しくは20から100%まで、若しくは30から100%まで、若しくは40から100%まで、若しくは50から100%まで、若しくは60から100%まで、若しくは70から100%まで、若しくは80から100%まで、若しくは90から100%まで、又は、0.1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%若しくは100%でありうる。
【００７９】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、関節病態の処置において、例えば変形性関節炎の処置において、有用である。
【００８０】
驚くべきことに、細胞は、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートの存在下の方がフラボノイド単独の場合と比較して生存率が高いことが見出された。このことから、フラボノイドとポリマーとのコンジュゲーションによりフラボノイドの毒性が低下することが示唆された。変形性関節炎軟骨細胞をIL-1βで刺激すると、炎症性サイトカイン及びMMPのmRNA及びタンパク質の発現が増大した。フラボノイドはIL-1βでの誘導による遺伝子及びタンパク質の発現を有効に阻害しうるのに対し、ポリマー単独もポリマー-フラボノイドコンジュゲートもIL-6及びTNF-αの発現を下方制御できない、ということが示された。しかし、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、驚くべきことに、MMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現の下方制御において、ポリマー単独より、特にタンパク質レベルで有効であることが見出された。ポリマー-フラボノイドコンジュゲートによるMMPタンパク質発現の阻害は、濃度依存性であることが示された。有利なことに、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、変形性関節炎の処置のための効果的な治療剤でありうることが示されている。
【００８１】
ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法
(a)アミン含有化合物を1つ又は複数のフラボノイドと連結して、それにより、遊離アミン基をもつフラボノイドを形成する工程、及び
(b)(a)の生成物を求核付加によってポリマーとコンジュゲーションする工程
を含む、ポリマー-フラボノイドコンジュゲートを形成するための方法も提供される。
【００８２】
工程(a)は、アミン含有化合物を2つのフラボノイドと連結して、それにより、アミン含有橋架けフラボノイドダイマーを形成することを含みうる。
【００８３】
工程(b)は、カップリング剤の存在下で実施されうる。
【００８４】
カップリング剤は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド(EDC.HCl)、塩酸1-エチル-3-(3-ジメチルジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、カルボニルジイミダゾール、アジプイミド酸ジメチル、N-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェニルクロロホルメート及び1-(p-トルエンスルホニル)イミダゾールから成る群から選択されうる。
【００８５】
コンジュゲートは、ポリマーのアルデヒド基をカテキン系フラボノイドと縮合させる酸触媒作用を用いるか、又は、酸を使用してポリマー上の官能基を遊離アルデヒドに変換してからアルデヒド基をカテキン系フラボノイドと縮合させることで、合成されうる。
【００８６】
ポリマーとフラボノイドとをコンジュゲーションさせるために、ポリマーとフラボノイドとを好適な溶媒に別々に溶解してもよい。遊離アルデヒドを有するポリマーを、フラボノイドを含有する溶液に、酸の存在下で例えば滴下により加える。反応は、完了するまで進行させる。コンジュゲーション反応に続いて、余剰の未反応ポリマー又はフラボノイドを、例えば透析により又は分子篩を用いることにより、コンジュゲート組成物から除去することができる。
【００８７】
フラボノイドのポリマーに対する比を変化させて、ポリマーのフラボノイド部と結び付いているポリマー部分が1つのみであるようにするか、又は、フラボノイド部がポリマー上の2つ以上の位置で結び付いているようにするか、又は、フラボノイド部に2つのポリマー部がフラボノイドのC6位及びC8位のいずれかにて1つずつ結び付いているようにすることができる。
【００８８】
最終組成物におけるポリマーのフラボノイドに対する比は、開始時の反応剤(reagent)の比を通して制御することができる。例えば、ポリマー部分のフラボノイド部分に対するモル比が約1であるとき、単一のポリマー部分は単一のフラボノイド部分(モノマー型又はオリゴマー型のいずれを用いてもよい)と結び付けられよう。しかし、より高いポリマー濃度では、例えば、ポリマー対フラボノイドのモル比が10:1である場合は、ポリマー-フラボノイド-ポリマーというトリブロック構造を有する組成物が得られる可能性がある。
【００８９】
送達ビヒクル
ポリマーをコンジュゲーションすることで、フラボノイドを多様な組成物又はビヒクルに組み込むことも可能になる。遊離アルデヒド基を含有する特定のポリマーをポリマーの物理的性質に基づいて選択することによって、フラボノイドをさまざまな異なるビヒクルタイプに組み込むことが可能であり、これにより、高濃度のフラボノイドを、さまざまな場面で体の多様な標的化領域に送達することが可能になる。
【００９０】
したがって、本明細書で開示するポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、コンジュゲートのポリマー部の性質に応じて、送達ビヒクルの形態にしうる。送達ビヒクルは、フラボノイドを、送達ビヒクルの性質に応じて、体に、例えば、体の特定の標的化部位などに送達するために使用しうる。場合によっては生物活性剤を送達ビヒクル中に含ませてもよく、こうすれば、生物活性剤を体の部位に同時に送達することができる。したがって、ポリマー上の遊離アルデヒド基を介してポリマーとコンジュゲーションされているフラボノイドを含む組成物を含む送達ビヒクルであって、任意選択で生物活性剤をさらに含む送達ビヒクルが提供される。生物活性剤は、体において生物学的、薬理学的又は治療的な効果を有する任意の作用剤であってよく、その例としては、タンパク質、核酸、小分子又は薬物が挙げられる。タンパク質である生物活性剤は、ペプチド、抗体、ホルモン、酵素、成長因子、又はサイトカインでありうる。核酸である生物活性剤は、一本鎖若しくは二本鎖のDNA若しくはRNA、短鎖ヘアピン型RNA、siRNAであってもよく、又は、治療用製品をコードする遺伝子を含むこともできる。加えて、生物活性剤の範囲には、抗生物質、化学療法剤及び降圧剤も含まれる。特定の一実施形態では、送達ビヒクルはミセル状ナノ複合体であり、これは、フラボノイド及び任意選択で生物活性剤を体内の特定の部位に非経口送達するのに適している。ポリマーは、組成物のフラボノイド部と共に集合してフラボノイドを溶液環境から保護することが可能な特性を有するように選ばれる。コンジュゲートのポリマー部がその中で可溶且つフラボノイドよりよく溶ける、好適な溶媒を選べば、コンジュゲートは自己集合してフラボノイドコアから溶液を排除し、これによりミセル状複合体の集合を可能にすることができる。
【００９１】
生物活性剤の濃度は、体の特定の部位に送達されることになる生物活性剤の合計量に応じて、且つ、ミセル構造を不安定化させることなくミセル状ナノ複合体中に含ませることができる生物活性剤の量に応じて、選ばれる。一部の実施形態において、ミセル状複合体の50%w/wまで又は40%w/wまで、生物活性剤を含みうる。
【００９２】
別の特定の実施形態において、送達ビヒクルはハイドロゲルであり、これは、創傷若しくは熱傷用の包帯として、又は生物活性剤の持続放出送達のために、又は組織再生のための支持体として、又は関節炎の処置のために、又はフェイシャルマスクなどの美容用途に、使用することができる。
【００９３】
ポリマーは、良好な膨潤性という特徴と、ポリマー部分の架橋に利用可能なだけでなく無毒且つ生体適合性であり、いくつかの実施形態においては生分解性の、適切な基とを有しうる。
【００９４】
ハイドロゲルの特定の実施形態において、ポリマーは、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸、若しくはヒアルロン酸の誘導体、例えばヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジアルキルアセタールコンジュゲート、又は、アルデヒド誘導体化ヒアルロン酸若しくはヒアルロン酸アミノアセチルアルデヒドジアルキルアセタールコンジュゲートのチラミン誘導体である。アミノアセチルアルデヒドジアルキルアセタールコンジュゲートの例としては、例えば、アミノアセチルアルデヒドジメチルアセタール、アミノアセチルアルデヒドジエチルアセタールコンジュゲート、アミノアセチルアルデヒドジプロピルアセタール及びアミノアセチルアルデヒドジブチルアセタールが挙げられる。
【００９５】
ヒアルロン酸-フラボノイドを含むコンジュゲートは、容易に架橋して、フラボノイドの生物学的又は薬理学的特性を損なうことなくハイドロゲルを形成することができる。そのようなハイドロゲルは、ハイドロゲルが施用された部位で生物活性剤を放出するように、先述のような生物活性剤を任意選択で含むこともできる。
【００９６】
ヒアルロン酸-フラボノイドコンジュゲートは、ヒアルロン酸を酸性条件下、例えばpH約1でフラボノイドと反応させることにより合成しうる。コンジュゲーションされたポリマー-フラボノイドは、次いで、例えば透析などにより精製され、次いで、生物活性剤及び架橋剤、例えば過酸化水素と混合される。架橋触媒、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼを加え、次いでハイドロゲルを素早く型に注ぎ入れて所望の形状を形成した後に架橋反応を完了させてもよい。例えば、ハイドロゲルは、創傷包帯としての用途に適したスラブの形態にすることができる。
【００９７】
ハイドロゲルの成分を注射し反応させることによりin vivoでハイドロゲルを形成することもでき、その場合の手段は、例えば、任意選択で生物活性剤を含んでいる未架橋のコンジュゲートと、過酸化水素などの架橋剤及びセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの架橋触媒とを一緒に注射することによる。そのようなハイドロゲルは、体の特定の部位への薬物送達又は組織工学にとって有用である。
【００９８】
ヒアルロン酸は、コンジュゲーション反応の際にフラボノイドと反応しうる複数の部位を有することから、開始反応時のフラボノイドの濃度を変化させることにより、ヒアルロン酸ポリマーとフラボノイドとの間のコンジュゲーション度を変化させることが可能である。例えば、反応物の比は、結果として得られるコンジュゲートはポリマー上の約1%から約10%までの部位がフラボノイドとコンジュゲーションされているように、調節されうる。代替的には、コンジュゲーションされていない追加のヒアルロン酸を混合物に加えてからハイドロゲルを架橋することで、ハイドロゲル中のポリマー分子の一部がフラボノイドとコンジュゲーションされないようにすることもできる。
【００９９】
先述の組成物及び送達ビヒクルは、体内の特定の部位へのフラボノイドの制御送達及び標的化送達に大変好適である。フラボノイドは、標的化部位で、抗菌性、抗新生物性、抗血栓性、血管拡張性、抗酸化性、抗変異原性、抗発癌性、高コレステロール血症性、抗ウイルス性及び抗炎症性の活性をもたらすことができる。そのため、先のコンジュゲート及び送達ビヒクルは、さまざまな処置用途に有用である。加えて、送達ビヒクルに追加の生物活性剤を含ませて、広範な障害又は疾患の処置に有用な送達ビヒクルとすることもできる。例えば、サイトカイン及び成長因子など免疫調節性のペプチド及びタンパク質は、がん、骨髄機能低下(myelodepresssion)及び感染性疾患の処置のための重要な薬物クラスとして浮上してきている。
【０１００】
したがって、本明細書では、フラボノイドを対象に送達する方法であって、先述のような、遊離アルデヒドを含有するポリマーとフラボノイドとのコンジュゲートであり、ポリマーがフラボノイドのA環のC6及び/又はC8位にてコンジュゲーションされているコンジュゲートを投与する工程を含む方法も企図される。一部の実施形態において、コンジュゲートは、先述のような送達ビヒクル、例えばミセル状ナノ複合体又はハイドロゲルに形成される。
【０１０１】
コンジュゲートは公知の方法を用いて投与することができ、その方法は、コンジュゲートの形態によって決まることになる。経口以外の経路は、とりわけ、生物活性剤を同一剤形でコンジュゲートと同時に投与しようとする場合に好ましい。コンジュゲートが溶液剤として又はミセル状ナノ粒子の形態で製剤化される場合は、コンジュゲートは、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内に、又は、標的化組織若しくは器官への直接注射によって、送達してもよい。コンジュゲートがハイドロゲルとして製剤化される場合は、コンジュゲートは、局所的に、又は、創傷部位での外科的挿入によって、施用してもよい。
【０１０２】
投与
コンジュゲートは、とりわけ、コンジュゲートが先述のような送達ビヒクルとして製剤化される場合には、生物活性剤と組み合わせて投与されうる。
【０１０３】
患者に投与する際、コンジュゲートは、有効な量で、且つ、所望の結果を達成する投与量で、且つ、それを達成するのに十分な期間にわたって、投与される。例えば、コンジュゲートは、感染症、疾患又は障害を緩和する、改善する、軽減する、和らげる、安定化させる、その拡大を防止する、その進行を低速化若しくは遅延させる、若しくは治癒するように、又は、疾患関連酵素の活性を阻害する、低減させる若しくは妨げるように機能しうるフラボノイドを送達するのに必要な量及び投与量で投与しうる。疾患関連酵素とは、代謝的又は生化学的経路に関わる酵素であり、このような経路が妨害された場合、又は、酵素若しくは経路の調節制御が妨害若しくは阻害された場合にはその活性が疾患又は障害の発症又は進行に関わる、酵素である。
【０１０４】
対象に投与されることになるコンジュゲートの有効量は、ポリマー部分及びカテキン系フラボノイド部分を含めたコンジュゲートの薬力学的特性、投与様式、対象の年齢、健康状態及び体重、障害又は疾患状態の性質及び程度、処置の頻度及び併用処置がある場合にはそのタイプ、並びにコンジュゲートの濃度及び形態などの多くの因子に応じて変化させることができる。
【０１０５】
当業者は、先述の因子に基づいて適切な量を決定することができる。コンジュゲートは、最初は適当な量で投与して、対象の臨床応答に応じて必要であればこれを調節できるようにしてもよい。コンジュゲートの有効量は、経験的に決定することができ、安全に投与できるコンジュゲートの最大量に依存する。但し、投与されるコンジュゲートの量は、所望の結果を生む最小量にすべきである。
【実施例】
【０１０６】
本発明の非限定的な例及び比較例について、具体的な実施例を参照しながらさらにより詳細に記載することとするが、本実施例は、何らかの形で本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１０７】
材料
ヒアルロン酸(HA)(90kDa及び800kDa)は、JNC株式会社(東京、日本)から入手した。トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンヒドロクロリド、塩酸システアミン、メタンスルホン酸(MSA)、2,2-ジエトキシエチルアミン(DA)、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)、ジメチルスルホキシド(DMSO)及び塩化ナトリウム(NaCl)は、Sigma社(シンガポール)から入手した。2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)は、Merck社(シンガポール)から購入した。ダルベッコ変法イーグル培地:Nutrient Mixture F-12は、Biopolis社(シンガポール)の培地調製施設により供給された。
【０１０８】
(実施例1)
HA-EGCG1コンジュゲートの合成
チオール化HA誘導体を、HA骨格中のカルボキシル基をチオール基で修飾することにより合成した。典型的には、1gのHA(90kDa、2.5mmol、-COOH)を、窒素雰囲気下で蒸留水100mLに溶解した。この溶液に、塩酸システアミン(136mg、1.2mmol)を加えた。次いで、EDC・HCl(485mg、2.5mmol)及びNHS(290mg、2.5mmol)を加えてコンジュゲーション反応を開始させた。反応が進行するのに伴い、1M NaOHを用いて混合物のpHを4.7に維持した。反応混合物を25℃で一晩撹拌し、次いで、pHを7.0にした。溶液を、分画分子量3,500Daの透析チューブに移した。精製した溶液を凍結乾燥してHA-システアミンコンジュゲート(0.84g)を得た。置換度(DS)は、HA中の反復二糖100単位当たりの置換基の数と定義する。DSは、エルマンアッセイにより、7と決定した。乾燥したHA-システアミンコンジュゲート(0.5g、87.5μmol、-SH)を、0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)24.5mLに溶解した。この溶液に、0.5M TCEP溶液1.5mLを加えた。EGCG(3.45mmol、1.567g)を、プレミックス溶媒[0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)25mL、DMSO 5mL、及び100mMピルビン酸ナトリウム1mL]に溶解した。次いで、この溶液を、HA-システアミンコンジュゲートの撹拌溶液に加えた。反応混合物を、撹拌しながら25℃で3時間インキュベートした。次いで、DMSO 5mLを加え、25℃で一晩撹拌した。混合物のpHを、1%酢酸を加えることにより5にした後、この溶液を、分画分子量3,500Daの透析チューブに移した。チューブを、窒素雰囲気下で蒸留水に対して3日間透析した。精製した溶液を凍結乾燥させて、EGCGグラフト化HA(0.48g)を得た。DSを、273nmでのEGCGの吸光度を測定することにより決定した。DSは3.72であった。生成物の構造を、1H NMR分光法により確定した。1H NMR (D2O):  δ  2.0 (s、HA由来の-C=OCH3), 3.3-4.0 (m, HAのプロトン), 4.51及び4.54 (d, HAアノマープロトン), 5.60-5.85 (s, C環のH-2及びH-3), 6.7 (s, B環のH-6'), 6.98 (s, D環のH-2"及びH-6").
【０１０９】
(実施例2)
HA-EGCG2コンジュゲートの合成
まず、エチルアミン橋架けEGCGダイマーを合成した。冷温のMSA:THF(1:5、v/v)混合物1.2mlに、DA 145μl(1mmol)を加えた。その結果得られた混合物を、滴下によりEGCG(2.29g、5mmol)に移し、これをTHF 3.8ml及びMSA 1.7μlに溶解した。反応を暗所にて室温で一晩進行させた。翌日、溶媒を蒸発により除去し、真空下で一晩さらに乾燥した。乾燥した生成物をH2O 10mlに溶解した。未反応のEGCGを、分離漏斗を使用して酢酸エチル10mlで抽出することにより除去した。この抽出手順は、Waters Acuity UPLC-MSを使用して、水性相中で遊離EGCGが検出されなくなるまで繰り返した。エチルアミン橋架けEGCGダイマーを、カルボジイミド/活性エステルが媒介するカップリング反応によりHAとコンジュゲーションした。HA(800kDA、250mg、0.62mmol)を、DMF2.5mlを添加した0.4M MES緩衝液(pH5.2)20.2mlに、撹拌により溶解した。次に、NHS(89mg、0.78mmol)及びエチルアミン橋架けダイマー(0.205mmol、H2O 2.33ml中)を加えた。次いで、EDC-HCl(150mg、0.78mmol)を加え、反応物のpHを4.7に調整した。反応混合物をN2で10分間激しくパージし、次いで、暗所にて一晩、N2下、室温でインキュベートした。HA-EGCG2コンジュゲートを沈殿により精製した。簡潔に言えば、H2O 125ml及び5M NaCl溶液16.7mlを反応混合物に加え、10M HCl溶液を用いてpHを3に低下させた。次いで、撹拌しながら、エタノール310mlを加えた。沈殿物を遠心分離(6000rcf、5分)により収集した。上清をデカンティングした後、沈殿物を水250mlに再溶解した。5M NaCl溶液33mlを加え、pHを3に調整した後、エタノール620mlを加えた。沈殿物を遠心分離により収集し、H2O 500mlに再溶解した。5M NaCl溶液67mlを加えてpHを3に低下させた後、エタノール1.24Lを加えた。沈殿物を遠心分離により再度収集し、H2O 300mlに再溶解した。次いで、コンジュゲートを、N2下で一晩、H2Oに対して透析した(Spectra/Por 7、MWCO=3500Da)。精製したHA-EGCG2コンジュゲートを凍結乾燥した。収量は185mg(74%)であった。置換度(二糖100単位につきコンジュゲーションされているEGCGダイマーの数)を決定するために、コンジュゲートを0.5mg/mlで水に溶解し、吸光度スペクトルを記録した。コンジュゲート中に含有されているEGCGの量を273nmでの吸光度により決定したところ、DSは1であった。
【０１１０】
(実施例3)
ヒト変形性関節炎軟骨細胞の培養
凍結保存されたヒト変形性関節炎軟骨細胞(1継体)は、Cell Applications, INC.社(米国)から入手した。細胞を解凍し、完全成長培地(10%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM/F12培地)を使用して、T75細胞培養フラスコ中で培養した。細胞は、37℃にて5%CO2雰囲気下で維持した。成長培地は2〜3日ごとに交換し、細胞は80%コンフルエントの時点で継代培養した。2継代及び3継代の細胞のみを、この試験では使用した。細胞は、規模拡大後、これまでに確立されているプロトコールにいくらか改変を加えたものに従って、アルギン酸塩ビーズ中で再分化させた。簡潔に言えば、細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、0.15M NaCl中の1.2%(w/v)アルギン酸ナトリウムに再懸濁させた。細胞懸濁液を、210針を通して滴下することよりゲル化溶液(102mM CaCl2、10mM HEPES及び0.0005%Tween20、pH7.4)中に分配した。およそ15個のアルギン酸塩ビーズを、6ウェルプレートに入ったゲル化溶液5ml中に分配した。10分間ゲル化した後、ゲル化溶液を除去し、アルギン酸塩ビーズを5mlの0.15M NaClで2回洗浄した。次いで、完全成長培地(5ml)を加え、細胞をアルギン酸塩ビーズ中で8日間再分化させた。培地は2〜3日ごとに取り替えた。8日後、アルギン酸塩ビーズを溶解溶液(55mM EDTA及び10mM HEPES、pH7.4)に可溶化した。回収した細胞をペレット化し、完全成長培地に0.5×106細胞/mlで再懸濁させた。細胞生存率アッセイのために、96ウェルプレートの1ウェル当たり細胞懸濁液100μlを加えた。遺伝子及びタンパク質の発現試験のために、48ウェルプレートの1ウェル当たり細胞懸濁液200μlを加えた。一晩インキュベーションの後、細胞を、血清飢餓状態に12時間置いてから、IL-1βでの刺激及び/又はHA-EGCGコンジュゲートでの処置に供した。
【０１１１】
(実施例4)
細胞生存率アッセイ
血清飢餓の後、使用済みの培地を除去し、EGCG、HA、HA-EGCG1又はHA-EGCG2コンジュゲートを無血清培地100μlに加えた。薬物なしの細胞を対照とした。24時間インキュベーションの後、alamarBlue(登録商標)をメーカーの取扱説明書に従って用いることにより、細胞生存率をアセスメントした。ヒトOA軟骨細胞を使用して、HA-EGCG1コンジュゲートの存在下での細胞生存率を決定した。ヒト関節リウマチ線維芽細胞様滑膜細胞を使用して、HA-EGCG2コンジュゲートの存在下での細胞生存率を決定した。滑膜細胞は、10%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したRMPI培地にて培養した。細胞を播種し、変形性関節炎軟骨細胞の場合と同じプロトコールに従って血清飢餓を行ってから細胞生存率アッセイを実施した。
【０１１２】
驚くべきことに、細胞は、HA-EGCG1コンジュゲートの存在下の方がEGCGの場合と比較して生存率が高いことが見出された。このことから、EGCGとHAとのコンジュゲーションによりEGCGの毒性が低下することが示唆された(図1)。変形性関節炎軟骨細胞をIL-1βで刺激すると、炎症性サイトカイン(図2)及びMMP(図3)のmRNA及びタンパク質の発現が増大した。EGCG(10μM)はIL-1βでの誘導による遺伝子及びタンパク質の発現を有効に阻害したのに対し、HA(90kDa)もHA-EGCG1コンジュゲートもIL-6及びTNF-αの発現を下方制御できなかった(図2)。しかし、HA-EGCG1コンジュゲートは、驚くべきことに、MMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現の下方制御において、HA(90kDA)より、特にタンパク質レベルで有効であることが見出された(図3)。HA-EGCG1コンジュゲートによるMMPタンパク質発現の阻害は、濃度依存性であることが示された。同様に、HA-EGCG2コンジュゲートは、同じEGCG濃度では、EGCG単独の場合と比較して細胞毒性が低いことを実証した(図4)。HA-EGCG2コンジュゲートは、IL-1βで刺激したOA軟骨細胞におけるIL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現の下方制御において、HA(800kDa)より、遺伝子レベルでもタンパク質レベルでも有効であった(図5及び図6)。HA-EGCG2濃度を増大させると、遺伝子及びタンパク質の発現はさらに低減した。総合すると、この結果から、HA-EGCG1コンジュゲート及びHA-EGCG2コンジュゲートは変形性関節炎の処置のための効果的な治療剤であることが実証された。
【０１１３】
(実施例5)
遺伝子発現解析
血清飢餓の後、使用済みの培地を除去し、EGCG、HA、HA-EGCG1又はHA-EGCG2コンジュゲートを無血清培地に加えた。2時間後にIL-1β(5ng/ml)を加え、細胞をさらに24時間インキュベートした。薬物及びIL-1β刺激なしの細胞を対照とした。翌日、使用済みの培地を収集し、-80℃で保存した。Direct-zol(商標)RNA MiniPrep(Zymo Research社)をメーカーの取扱説明書に従って用いることにより、RNAを細胞から単離した。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific社)をメーカーの取扱説明書に従って用いることにより、第一鎖cDNAを合成した。iQ5 Real-Time PCR System (BioRad社)を使用し、SensiFAST(商標) Probe No-ROX Kit (Bioline社)をメーカーのプロトコールに従って用いることにより、リアルタイムPCR(RT-PCR)を実施した。RT-PCRにて、TaqMan(登録商標)Gene Expressionアッセイを使用して増幅を行い、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3及びMMP-13の発現を検出した。GAPDHを内部対照として使用した。閾値サイクル(CT)値をMicrosoft Excelにエクスポートし、GAPDHを参照遺伝子として用いてΔΔCTを計算した。
【０１１４】
(実施例6)
酵素結合免疫吸着測定法
培養培地中のIL-6、MMP-1、MMP-3及びMMP-13の濃度は、ELISAキット(Abeam社、香港)をメーカーの取扱説明書に従って使用して決定した。TNF-αの濃度も、ELISA(Life Technologies社)により決定した。各アッセイに必要な希釈係数を決定するための予備的実験を実施して、タンパク質の濃度が検出可能範囲内であることを確認した。
【０１１５】
(実施例7)
前十字靭帯離断(ACLT)モデル
雄のWistarラット(220〜260g)に、キシラジン/ケタミン(10/75mg/kg)の腹腔内投与により麻酔をかけた。右膝を剃毛し、ヨウ素/クロルヘキシジン及び70%アルコールを3回交互に用いて消毒した。皮膚を切開した後、関節包を開いた。前十字靭帯(ACL)の位置を確認し、ハサミで切断した。次いで、皮膚を縫合糸(4-0、結節縫合)で閉じた。sham手術の場合は、ACLを曝露させたが離断は行わなかった。予防的な感染制御及び疼痛緩和のために、Baytril(10mg/kg、SID)及びブプレノルフィン(0.05〜2mg/kg、S.C.、BID)を、それぞれ手術後5日間及び3日間にわたって与えた。ラットには、外科手術後、無拘束でのケージ内活動を毎日させておき、外科手術後最初の24〜72時間にわたり綿密に観察を行った。
【０１１６】
関節内(i.a.)注射を、外科手術後4週間にわたり実施した。動物にイソフルランで麻酔をかけ(3%で誘導及び2%で維持)、次いで、生理食塩水50マイクロリットル、HA(800kDa、10mg/ml、生理食塩水中)、HA-EGCG2コンジュゲート(10mg/ml、生理食塩水中)を右膝内にi.a.注射した。注射は、週1回、5週連続で実施した。sham群には、生理食塩水を注射した。外科手術の10週間後、CO2により動物を安楽死させ、右関節を摘出した。関節を10%中性緩衝ホルマリン中で固定し、5%ギ酸中で脱灰し、続いて、パラフィルム中に埋め込んだ。冠状切片(7μm)を調製し、サフラニンO及びファストグリーンで染色した。スライドを、ヘマトキシリンで対比染色した。図7に示すように、すべての処置群の脛骨内側顆においてプロテオグリカン及び軟骨細胞の減少が観察されたものの、HA-EGCG2コンジュゲートで処置した関節は、軟骨の縁でも軟骨細胞が存在することを示した(白色の矢印)。軟骨細胞が存在することから、膝関節の軟骨は修復されていることが示される。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、対象における関節病態の治療的及び/又は予防的処置において有用でありうる。
【０１１８】
有利なことに、本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、変形性関節炎の処置において使用されうる。本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートは、有利なことに、関節機能を改善し、疼痛を軽減しうる。
【０１１９】
有利なことに、本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートの使用は、フラボノイドの治療成果を潜在的に高めうる。さらに有利なことに、第1から第3の態様の本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートの注射は、経口投与時のフラボノイドの低いバイオアベイラビリティーを克服しうる。
【０１２０】
本開示のポリマー-フラボノイドコンジュゲートを作製するための方法も提供される。
【０１２１】
有利なことに、本開示の方法は、効率的且つ費用対効果の高い方法を通したポリマーとフラボノイドとのコンジュゲーションを可能にしうる。本発明の多様なその他の改変及び適合化は、前述の開示を読めば、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく当業者には明らかになるであろうこと、また、そのような改変及び適合化はすべて、添付の「特許請求の範囲」の及ぶ範囲内に入ることを意図するものであることは、明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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