(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも2重層の細胞凝集塊を作製するためのin vitro法であって、
3〜50個の胚性幹細胞（ES細胞）をマイクロウェルに播種する工程と、
培養培地中においてES細胞を培養し、ES細胞の凝集塊を形成する工程と、
12〜50個の栄養膜幹細胞（TS細胞）を前記マイクロウェルに播種する工程と、
ES細胞の凝集塊とTS細胞とを培養し、少なくとも2重層の細胞凝集塊を得る工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記マイクロウェルに播種されるES細胞の数は、3〜12個であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロウェルに播種されるES細胞の数は、6〜8個であることを特徴とする請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロウェルに播種されるTS細胞の数は、15〜20個であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ES細胞を培養する工程は、1分間〜3日間かかることを特徴とする請求項1〜4のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ES細胞を培養する工程は、18〜30時間かかることを特徴とする請求項1〜5のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも2重層の細胞凝集塊は、Rho/ROCK抑制因子の添加によって得られることを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも2重層の細胞凝集塊を、空洞化、上皮化する、および／または当該細胞凝集塊の多能性を維持する工程をさらに含み、
前記少なくとも2重層の細胞凝集塊の、空洞化、上皮化および／または多能性の維持は、Wnt経路、PKA経路、PKC経路、MAPK経路、STAT経路、Akt経路、Tgf経路および／またはHippo経路の少なくとも1つの活性化によって行われることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記Wnt経路の活性化は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ抑制因子（GSK3抑制因子）の添加によって、またはWntアゴニストの添加によって行われることを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記PKA経路の活性化は、PKA活性化因子を用いて行われることを特徴とする請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記培養培地は、さらに血清を含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記マイクロウェルは、非接着表面を有することを特徴とする請求項1〜11のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロウェルの直径は、100μm〜500μmであることを特徴とする請求項1〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ES細胞、およびTS細胞は、同一種に由来することを特徴とする請求項1〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ES細胞およびTS細胞は、異なる遺伝的起源であることを特徴とする請求項1〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ES細胞およびTS細胞は、異なる種を起源とすることを特徴とする請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
ES細胞およびTS細胞は、非ヒト起源であることを特徴とする請求項1〜16のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
胚を成長させる方法であって、
請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法によって少なくとも2重層の細胞凝集塊を得ることと、
前記少なくとも2重層の細胞凝集塊をin vitroで成長させることとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
胚を成長させる方法であって、
請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法によって少なくとも2重層の非ヒト細胞凝集塊を得ることと、
前記少なくとも2重層の非ヒト細胞凝集塊を非ヒト動物の子宮内で成長させることとを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ライフサイエンスの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、全ての、胎児および成体の、器官および組織に増殖、分化および組織化することが可能である。そのようなものとして、それらは医療の分野において非常に重要である。
【０００３】
幹細胞は、胚盤胞などの胚構造体から採取することによって得ることが可能である。このことは、妊娠動物を犠牲にすることを必要とする。また、胚から幹細胞を採取することは、それらが採取される胚構造体を破壊し、通常この胚構造体が生きた動物になることを妨げる。また、幹細胞は、好適な組織の抽出によって成体動物から得ることも可能である。
【０００４】
代替的に、幹細胞は、細胞リプログラミングと称される方法によって分化した細胞から得ることが可能である。細胞リプログラミングは、細胞の潜在力を増大する。したがって、多くの様々な細胞腫、たとえば皮膚細胞などから幹細胞を作製することが可能である。リプログラミングされた幹細胞は、それらが胚および／または胚外組織に分化する能力を有している点において幹細胞と同様である。
【０００５】
幹細胞は、無期限に in vitro で増殖（「培養」）することが可能であるが、それらの多能性および分化能を保持している。このように、幹細胞は、増殖させ、遺伝子組み換えし、保存することが可能であり、たとえば研究目的などのために細胞のバッチ使用を可能にする。そのような細胞であって、単一細胞または少数の細胞に由来し、生きている細胞は、細胞株と称される。細胞株は、したがって本質的に遺伝的に均一である。
【０００６】
いくつかの幹細胞は、胚または胚外組織に分化する能力を有している。たとえば、胚性幹細胞（「ES細胞」）は、主に胚本体およびいくつかの胚外組織たとえば卵黄嚢などに分化する能力を有し、一方、栄養膜幹細胞（「TS細胞」）は、主に胚盤組織などの胚外組織に分化する能力を有する。ES細胞およびTS細胞は、したがって、多能性幹細胞であると考えられる。
【０００７】
また、胚および胚外組織の両方全ての組織に分化することが可能な幹細胞が存在する。そのような幹細胞は、全能性（または万能性）と称される。3つの古典的な例を以下に挙げる。
Macfarlan TS, Gifford WD, Driscoll S, Lettieri K, Rowe HM, Bonanomi D, Firth A, Singer O, Trono D, Pfaff SL, Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity Nature 2012 Jul 5; 487 (7405): 57-63; doi: 10.1038/nature11244
Morgani SM, Canham MA, Nichols J, Sharov AA, Migueles RP, Ko MS, Brickman JM, Totipotent embryonic stem cells arise in ground-state culture conditions. Cell Rep. 2013 Jun 27;3(6):1945-57. doi: 10.1016/j.celrep.2013.04.034. Epub 2013 Jun 6.)
Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):676-80. doi: 10.1038/nature12969
【０００８】
胚性幹細胞は、遺伝子組み換えされた種を作製するために使用することが可能である。このことは、幹細胞と、天然に形成され、続いて妊娠中の母親から採取された胚構造体とを組み合わせることによって行われる。天然の胚構造体は通常、桑実胚および胚盤胞である。組み合わせられた胚性幹細胞と胚構造体とは、里親の子宮に位置し、発生して動物を形成する。したがって、胚構造体に天然に存在する細胞と、注入された胚性幹細胞との両者は、共に1つの胚に成長し、続いて成体動物に成長する。このことは、2つの異なる遺伝的特性を有する動物をもたらし、1つの特性は胚に由来し、1つの特性は加えられた胚性幹細胞に由来する。したがって、胚盤胞などの天然の胚構造体は、幹細胞の発生を補助する媒体として使用される。胚盤胞、または二重層細胞構造体は、in vitro で形成されない。得られる胚は、in vivo でさらに発生し、出生後、天然の桑実胚／胚盤胞に由来する組織と、結合された細胞に由来する組織とを有する生きた動物をもたらすので、当該動物は、2つの異なる遺伝特性を有する。
【０００９】
2つの異なる遺伝特性を有する動物は、キメラと称される。遺伝子組み換えされた幹細胞と天然の桑実胚または胚盤胞とを組み合わせて得られるキメラは、遺伝子組み換えされた種を形成するために使用される。これは、遺伝子組み換えを含む動物を選択し、遺伝子組み換えを含まない動物を排除し、続いて選択された動物を、遺伝子組み換えがその系統の全ての動物に均一に存在するまで育種することによって得ることが可能である。
【００１０】
遺伝子組み換え体を得るこの方法は、同一の組み換えを有する生存動物の系統を得るために必要である育種計画が原因で、冗長、困難であり、かつ時間と労力とを要するものである。また、膨大な数の動物の命を奪い、天然の桑実胚／胚盤胞を採取するか、または好適なキメラの子を選択する必要がある。
【００１１】
胚性幹細胞は、四倍体胚構造体に組み合わせることも可能である。四倍体胚構造体は、妊娠雌性から採取することによって得られた2細胞期胚構造体に由来する2つの細胞を融合することによって形成される。得られる単一細胞は、内部細胞塊および胚を形成する能力を失う。したがって、子宮への着床によって、四倍体胚構造体は、胎盤を形成することが可能であるが、胚を形成することができない。四倍体胚構造体は、しかしながら、in vitro にて胚性幹細胞で補完することが可能である。得られる胚構造体は子宮に挿入され、さらに発生した胚に成長する。なぜなら、四倍体細胞は胚外組織のみを形成し、加えられた胚性幹細胞は胚全体を形成するからである。
【００１２】
このいわゆる四倍体補完法は、したがって、キメラ形成の中間工程を避けて遺伝子組み換え種を作製することを可能にする。
【００１３】
キメラ育種によって、または四倍体補完法によって得られた遺伝子組み換え動物系統は、特に、発生および疾患を調べるために使用される。
【００１４】
しかしながら、四倍体補完法を用いる動物の作製は、2細胞期の胚構造体などの妊娠雌性から採取される天然媒体を依然として必要とするので、そのような媒体の入手可能性によって制限される。
【００１５】
胚様体（「EB」）は、胚性幹細胞から分化した組織を調べるため、および得るために使用される。胚様体は、胚性幹細胞の凝集を介して得られる200〜4000μmの直径の多細胞球体である。これは通常、培養培地におけるハンギングドロップ（ディッシュのプラスチックカバーからのハンギングドロップ）にES細胞（すなわち、2000個の細胞）を再懸濁することによって得られる。動物への移植後、またはさらなる in vitro 培養後、EBは、分化して非多能性細胞種を形成するが、生物体を組織することはない。EB培養と移植とは、細胞株の分化能の評価、またはより分化の進んだ細胞種の形成に向けての中間段階としてES細胞の分化を惹起することを可能にする。ES細胞を用いて形成された胚様体は、現在のところ胚盤胞または胎盤組織を形成することができないので、それらは胚または生存動物を得るために使用することができない。
【００１６】
体外受精は、in vitro での哺乳類配偶子の組み合わせを含む。配偶子は、染色体対の半分のみを有する生殖細胞（一倍体細胞）である。雌性配偶子（卵母細胞）と、雄性配偶子（精子）との融合後、染色体対の2つの半分の両方が組み合わさり、第1の二倍体細胞、つまり接合子を形成する。in vitro で生じた接合子は、続いて子宮に移される。したがって、この方法は、分化して生存胚盤胞を天然に形成する細胞を得るために一次生殖細胞の融合を使用する。
【００１７】
EP2088191は、cdx2を発現するようにES細胞を遺伝子組み換えすることによって栄養外胚葉を形成するiBLASTの形成を記載している。この方法の欠点は、この方法によって形成される胚が、組み換えESTSi細胞からDNAを何らかの事情で組み入れ得るので、それから得られる生体の遺伝特性が混入し得ることである。
【００１８】
胚は、胚発生における物質の毒性や薬剤の有望性を評価するために有用である。また、それらは、組織の分化、増殖および組織化を観察するために有用である。この目的で、妊娠動物から採取された胚盤胞または他の胚細胞構造体は、in vitro で培養可能であり、さらに発生した胚をもたらす。このことは、特に、（i）細胞分化、組織発生および再生、（ii）そのような分化、発生および再生などの過程における物質の効果、（iii）物質の毒性についての研究および評価を可能にする。しかしながら、そのような研究は、胚構造体が生存動物になることを妨げ、胚発生に使用される母性動物を犠牲にすることを必要とする。
【００１９】
現在、前臨床創薬の有効性および安全性は、適切な in vitro モデルの欠如によって妨げられている。たとえば、欧州代替試験法検証センター（ECVAM）は現在、単一の分化細胞種（すなわち、心筋細胞）へのEBの分化を利用する胚性幹細胞試験（EST）を使用している。この試験は、他の組織および器官における物質の毒性をあまり反映するものではない。
【００２０】
（i）遺伝子組み換え種の作製、（ii）薬剤の開発、（iii）毒性評価の過程は、時間と労力とを要し、多くの妊娠哺乳類の犠牲、重要な資源（空間、食糧、労働力）の消費、および高度な法的要件を必要とする。本発明は、妊娠動物から採取された胚の使用に代えて、細胞株を使用する人工胚盤胞の形成を提供する。
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、細胞株から二重層細胞凝集塊に、続いて人工胚盤胞に組織化することを促進する方法を提供する。この人工胚盤胞は、in vivo または in vitro でさらに成長させることが可能である。用語「ブラストイド」は、空洞形成後の人工胚盤胞（空洞形成された人工胚盤胞）、および人工胚盤胞に由来するさらに発生した胚、胎児の形成までの胚構造体を表す。
【００２２】
幹細胞株はほとんど無期限に増殖することが可能であるので、人工的な胚盤胞を形成する本発明の方法は、in vivo 発生および妊娠雌性から胚を採取する要件に関連する倫理的および実際的な問題を一般的に回避する。多数のブラストイドを作製することが可能であり、現在他の手段によっては作製することができない。この方法は、人工胚盤胞に由来する遺伝子組み換えまたは非遺伝子組み換えされた胚または組織を簡単に利用することを可能にする。また、本発明の方法は、同一種または異なる種のいくつかの細胞株を組み合わせることによって胚および生物を形成することを可能にする。
【００２３】
本発明は、少なくとも二重層の細胞凝集塊、またはブラストイドを作製するin vitro法を提供し、当該方法は、
−  少なくとも１つの栄養芽細胞と、少なくとも１つの多能性および／または全能性細胞とを組み合わせることによって初期細胞凝集塊を形成する工程と、
−  前記初期細胞凝集塊を培養培地で培養し、内側細胞層と外側細胞層とを含む少なくとも二重層の細胞凝集塊を得る工程であって、内側細胞層が、前記少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞に由来し、胚を形成することができる内部細胞を含み、外側細胞層が、前記少なくとも1つの栄養芽細胞に由来し、少なくとも栄養外胚葉を形成することができる外部細胞を含む工程と、
−  好ましくは、前記少なくとも二重層の細胞凝集塊を培養し、ブラストイドを得る工程とを含む。
【００２４】
本発明は、二重層細胞凝集塊、本発明の方法によって取得可能なブラストイド、二重層細胞凝集塊またはブラストイドを含む細胞培養物、および里親の子宮にブラストイドを据えることによって、またはブラストイドを in vitro で成長させることによってブラストイドから胚、胎児または生存動物を成長させる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】in vitro におけるブラストイドの作製および発生（全てのスケールバーは200μm）を示す。図1aは、マイクロウェルアレイチップと12ウェルプレートとを示す。図1bは、マウスES細胞の凝集塊を含むマイクロウェル内に播種された自由に浮遊したマウスTS-細胞（緑）を示す。スケールバーは、200μmである。図1cは、外側の栄養膜幹細胞（緑）と内側の胚性幹細胞（赤）との、層状でない（c  左）、および二重層（c  右）凝集塊としてのES-TS細胞クラスタを示す。画像は、TS細胞の播種の24時間後に取得された。図1dは、栄養外胚葉（d  左、緑）と、異なる内部細胞塊（d  左、赤）とを含むブラストイド、ならびに空洞形成後の胞胚腔（d  右、内部空洞）を示す。画像は、TS細胞の播種の70時間後に取得された。スケールバーは、200μmである。
【図２】ブラストイドの分子的特性を示す（全てのスケールバーは、200μmである）。図2aは、栄養膜幹細胞における核内CDX2発現によって観察されたブラストイドにおける栄養芽細胞の多能性を示す。aaは、DAPI色素とCDX2を特異的に染色する抗体とを用いるDNA染色を示す。abは、CDX2に特異的な抗体染色を示す。図2bは、胚性幹細胞における核内のOct4発現によって観察されたブラストイドにおける内部細胞塊の多能性を示す。baは、DAPI染色を用いるDNA染色を示す。bbは、ES細胞の核内に発現するH2B-RFP分子マーカを示す。bcは、Oct4に対する抗体染色を示す。図2cは、Nanog発現によって観察される胚盤葉上層と、Sox17およびPDGFRaの発現によって観察される原始内胚葉との形成を示す。Caは、ES細胞において発現されたSox17（緑）およびNanog（赤）蛍光レポーターを示す。Cbは、明視野画像に組み合わせて、ES細胞において発現されたSox17（緑）およびNanog（赤）蛍光レポーターを示す。Ccは、ES細胞におけるファロイジン（赤）およびPDGFRa（緑）蛍光レポーターを用いるF-アクチン染色を示す。
【図３】ブラストイドの in vitro および in vivo 発生を示す（全てのスケールバーは、500μmである）。図3aは、胚盤葉上層（Ep．）の伸展、近位内胚葉（V.E．）の形成、および外胚盤円錐（Ect.C）の形成による原腸期へのブラストイドの in vitro 発生を示す。図3bおよび図3cは、さらに発生した胚を含む脱落膜（c）の形成をもたらす子宮（b）内部のブラストイドの in vivo 発生を示す。
【図４】人工胚盤胞の形成のための好適条件の決定を示す。図4aは、24時間培養後のES-TS細胞クラスタの形成の間における包囲の効率に関するY27632の濃度の影響を示す。図4bは、24時間培養後のES-TSクラスタの形成の間における包囲の効率に関するTS細胞数の影響を示す。図4cは、マイクロウェルあたりの平均ES細胞数の関数として空洞化ブラストイドの産生を示す。空洞化ブラストイドの産生は、ES-TS細胞クラスタの割合によって記載され、当該クラスタは、96時間培養後に空洞化されたので、人工の、胚盤胞またはブラストイドを形成した。空洞化は、10μMのCHIR99021を用いて促進された。図4dは、マイクロウェルあたりのES細胞の平均数の関数として内部細胞塊（ICM）の寸法を示す。空洞化ブラストイド内部のES細胞クラスタの投影面積として測定されたICMの寸法は、マイクロウェルあたりの播種されたES細胞数の増加とともに増加する。図4eは、Wnt経路活性化因子CHIR99021の濃度増加は、空洞化ブラストイドの産生における増加に正に相関することを示す。図4fは、1000μMの濃度までの8Br-cAMP添加によるPKA活性化は、ICM寸法の増加に正に相関することを示す。図4gは、IGF2によるAkt活性化と、HB-EGFによるMAPK活性化とは、CDX2免疫染色によって示されるようなCdx2発現の増加に正に相関することを示す。図4hは、GSK3抑制因子CHIR99021（3μM）を用いるWnt経路活性化、またはWntリガンドWnt3aは、空洞化ブラストイドの産生を増加することを示す。Wnt抑制因子XAV939を用いるWntシグナルの抑制は、ブラストイドの空洞化を妨げる。図4iは、ES-TS細胞クラスタの空洞化におけるWnt、PKC、およびPKA経路の影響を示す。コントロール群は、空洞化剤としてCHIR99021  3μMのみを含む。cAMP、Indo.V、およびcAMP + Indo.Vは、ブラストイドの空洞の産生を増加する。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
哺乳類は、雄雌生殖細胞株（すなわち、一倍体細胞、それぞれ精子、および卵子）を融合し、その組み合わせから第1細胞（接合子）が形成されることによって自然に子を産む。胎児の形成まで接合子の連続的な成長によってもたらされる全ての細胞構造体は、胚構造体、または胚細胞構造体と称される。したがって、用語「胚構造体」は、受精から胎児までの発生において生じる全ての構造体を表し、特に、桑実胚、胚盤胞、および原腸胚の発生段階を含む。したがって、胚構造体との用語は、未だ胚盤胞に空洞化されていない構造体も含む。
【００２７】
自然環境における接合子の細胞分割は、8〜20細胞を含む球状の胚細胞構造体である桑実胚をもたらす。桑実胚の細胞は全能性であり、このことは、これらの細胞が全ての種類の胚細胞または胚外細胞に分化することが可能であることを意味する。桑実胚が成熟すると、内部に液体が満ちた空洞が形成される。この現象は、桑実細胞が外層（栄養外胚葉）および内部細胞塊（ICMまたは胚構造）に分化することに関連する。この空洞化細胞構造体は、胚盤胞と名付けられている。したがって、胚盤胞は、哺乳類胚構造体の発生における1つの段階である。
【００２８】
胚盤胞の栄養芽細胞は、内部細胞塊（ICM）と液体に満ちた胚盤胞空洞（胞胚腔）との周囲を囲んでいる。胚盤胞の栄養芽細胞は、さらに発生して、特に外胚盤円錐を形成し、子宮の内壁に組み合わせられることによって最終的には特に胎盤を形成する。胎盤は、発生中の胎児を子宮壁に繋げる器官であり、母親の血液供給を介して、栄養分の取り込み、排泄物の排出、ガス交換を行う。
【００２９】
内部細胞塊は、全ての体組織に分化する能力を有する細胞からなるので、多能性である。また、内部細胞塊は、卵黄嚢のような特定の胚外組織を形成する。
【００３０】
胚盤胞は、栄養外胚葉の細胞とICMの細胞とが増殖し、胚性幹細胞以外の細胞に分化にすることによって自然にさらに発生する。ICMに由来する細胞の発生の第1段階は、胚盤葉上層、つまり動物を最終的に形成する組織と、原始内胚葉、つまり特に卵黄嚢を最終的に形成する組織とをもたらす。
【００３１】
胚盤葉上層において、細胞は3つの組織層、つまり胚葉を形成することによって分化を続ける。集合的に、これらは、成体動物に存在する全ての異なる組織を形成する。3つの胚葉は、内胚葉、外胚葉および中胚葉であり、内胚葉は、特に消化管および気管に発生し、外胚葉は、特に神経系、毛、および爪に発生し、中胚葉は、特に、筋肉、および結合組織に発生する。3つの胚葉の形成後、胚構造体は、原腸胚になる。胚葉のいずれかにおける細胞は、自然に分化して他の胚葉の1つに由来する組織を形成できないので、胚葉における細胞は、多能性であり、全能性ではない。
【００３２】
原腸胚は、胚葉のさらなる分化、増殖および組織化によって、当該技術分野で公知の様々な段階を経て胎児に発生する。本発明の範囲において、「胚」は、胚盤胞として始まり、たとえば原腸胚などの全ての後続の発生段階を含み、胎児の形成に至るまでの、発生構造体の一連のもの全てとして定義される。したがって、この用語は、胚盤胞段階から（自然）発生において生じるそれらの構造体のみを表し、胎児段階までの後の構造体を含む。胚は、全ての器官が初期形成されたとき、胎児になる。
【００３３】
胎児は、胎生期後出生前の、完全に分化したものの、器官がまだ完全に成長していない発生段階における哺乳類である。
【００３４】
したがって、胎児は、用語「胚」または「胚構造体」に含まれない。
【００３５】
本発明によれば、初期細胞凝集塊は、少なくとも2つの細胞を含む細胞凝集塊であり、2つの細胞のうちの1つは栄養芽細胞であり、他方は多能性または全能性細胞である。好ましくは、初期細胞凝集塊は2種類の細胞からなり、そのうちの1つは栄養芽細胞であり、他方は多能性および／または全能性細胞である。より好ましくは、初期細胞凝集塊は、栄養芽細胞と多能性細胞とを含む。最も好ましくは、初期細胞凝集塊は、栄養芽細胞と胚性幹細胞（ES細胞）とを含み、最も好ましくは、栄養膜幹細胞（TS細胞）と、胚性幹細胞（ES細胞）とを含む。
【００３６】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される初期細胞凝集塊は、少なくとも1つの栄養膜幹細胞と少なくとも1つの多能性幹細胞とから形成され、少なくとも1つの栄養膜幹細胞は、栄養外胚葉を形成することができ、少なくとも1つの多能性幹細胞は、内部細胞塊を形成することが可能である。
【００３７】
他の実施形態において、細胞種の1つは、自身の分化能に加えて、たとえば全能性細胞と栄養膜幹細胞とを組み合わせるなど、他の細胞種にも存在する分化能を有することが可能である。
【００３８】
他の実施形態において、栄養外胚葉に分化する能力を有する細胞種は、内部細胞塊に分化する能力を有さず、内部細胞塊に分化する能力を有する細胞種は、栄養外胚葉に分化する能力を有さない。
【００３９】
本発明において、少なくとも二重層の細胞凝集塊は、少なくとも2つの径方向に位置する層を含む層状細胞凝集塊である。好ましくは、それは、内部細胞層と外部細胞層とを含む球状細胞凝集塊であり、内部細胞層は、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞に由来し、胚を形成することができ、外部細胞層は、少なくとも1つの栄養芽細胞に由来する外部細胞を含み、少なくとも栄養外胚葉を形成することが可能である。
【００４０】
異なる種類の細胞の1以上のさらなる層、たとえば第3層などが存在してもよいが、少なくとも二重層の細胞凝集塊は、内部細胞層と外部細胞層とからなる2つの径方向に位置する細胞層からなり、内部細胞層は、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞に由来する内部細胞を含み、胚を形成することが可能であり、外部細胞層は、少なくとも1つの栄養芽細胞に由来する外部細胞を含み、少なくとも栄養外胚葉を形成することができる。これは、二重層細胞凝集塊と称される。
【００４１】
しかしながら、二重層以上の細胞凝集塊は、一般的に、ブラストイドまたは胎児を最終的に形成する細胞が凝集塊の内部に位置する単一クラスタに存在し、一方、栄養芽細胞が外部に存在するように保持する。好ましくは、しかしながら、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊は、二重層細胞凝集塊である。
【００４２】
（少なくとも）二重層の細胞凝集塊の空洞は、ブラストイドと称される人工胚盤胞の形成をもたらし、さらなる培養は、後続のブラストイド段階をもたらす。内部細胞塊を形成することができる1以上の細胞が、栄養外胚葉を形成する能力を有する細胞によって本質的に囲まれる場合が特に好ましい。また、栄養外胚葉を形成することができる周囲の細胞が単一層に存在する場合が特に好ましい。
【００４３】
人工胚盤胞は、胞胚腔と内部細胞塊様組織とを囲む栄養外胚葉様組織を有する胚細胞構造体である。人工胚盤胞は、少なくとも二重層の細胞凝集塊の空洞化によって形成される。内部細胞塊様組織は、原始内胚葉を含み得る。
【００４４】
ブラストイドは、胎児への人工胚盤胞の発生における第１段階であるが、ブラストイドとの用語は、人工胚盤胞に由来する胎児の形成までの、人工ブラストイドのさらなる発生段階をも含む。ブラストイドは、したがって、人工胚とも称することが可能であり、本発明の方法によって得られる人工胚盤胞の全ての発生段階を含み、特に人工胚盤葉上層および人工原腸胚を含む。胎児の形成後は、ブラストイドとの用語は適用されない。
【００４５】
本発明の方法によって得られる人工胚盤胞における栄養外胚葉様組織は、天然に形成された栄養外胚葉として本質的に機能する。栄養外胚葉様組織は、好ましくは、in vitro において、天然の栄養外胚葉と同様に少なくとも外胎盤円錐および胎盤に発生する栄養外胚葉を生じる。栄養外胚葉様組織は、少なくとも部分的に多能性であり得る。
【００４６】
本発明の方法によって得られる人工胚盤胞における内部細胞塊様組織は、天然に形成された内部細胞塊として本質的に機能する組織である。内部細胞塊様（ICM様）組織は、好ましくは in vitro で生成された内部細胞塊であり、天然の内部細胞塊と同じ能力を有し、少なくとも全ての体性組織と、原始内胚葉および卵黄嚢のような特定の胚外組織とに発生する。ICM様組織は、少なくとも部分的に全能性であってもよい。
【００４７】
したがって、本発明は、
−  少なくとも1つの栄養芽細胞と、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを組み合わせることによって初期細胞凝集塊を形成することと、
−  前記細胞凝集塊が少なくとも二重層の細胞凝集塊に組織化することを誘導することと、
−  好ましくは、少なくとも二重層の細胞凝集塊を細胞構造体の形成をすることができるように培養し、栄養外胚葉様組織が内部細胞塊と胞胚腔とを囲むこととによって、in vitro において少なくとも二重層の細胞凝集塊を得るための方法にも関する。
【００４８】
哺乳動物は、胎盤性動物であり、出産まで子宮内部の胎盤の存在下において接合子から自然に発生する。本発明の範囲について、ヒトなどの全ての種を含む哺乳類は、胚盤胞段階を経て子を産む。しかしながら、特に、いくつかの国はヒトの胚に関する発明の保護を認めていないので、好ましくは、哺乳動物はヒトを除く全ての哺乳動物を表す。好ましい哺乳類の種は、たとえば、特にマウスもしくはラットなどのげっ歯類、さらにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、サルまたはヒトなどである。哺乳類の他の好ましい種は、たとえばマウスもしくはラットなどのげっ歯類、さらにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌまたはネコなどである。さらに好ましい動物は、マウスまたはラットであり、最も好ましい動物はマウスである。細胞凝集塊を形成する異なる細胞株を用いる好ましい実施形態において、細胞は、同じ種に由来する。
【００４９】
本発明における使用のための細胞種、たとえば栄養芽細胞、多能性または全能性細胞などは、上述のように任意の哺乳動物の天然の胚構造体から分離することが可能である。好ましくは、しかしながら、本発明における使用のための細胞種の少なくとも1つは、栄養芽細胞の細胞株、多能性細胞の細胞株、または全能性細胞の細胞株などの細胞株から得られる。さらに好ましくは、本発明において使用される全ての細胞種は、細胞株に由来する。細胞株は、当該技術分野で公知である任意の手段によって得られてもよい。
【００５０】
少なくとも二重層の細胞凝集塊、またはブラストイドを細胞株から形成するために細胞株を使用する利点は、細胞株を保存し、無限に増殖させることができるので、生きた動物から細胞を採取することを回避可能であることである。細胞株を用いるさらなる利点は、細胞株を、遺伝子組み換えなどによって容易に改変することができ、同じ種類の細胞であるがその特性を改変する特定の遺伝子組み換えを有する細胞を得ることができることである。
【００５１】
好ましい遺伝子組み換えは、遺伝子組み換えを経た細胞から形成された動物に異なる遺伝的特性をもたらす組み換えである。細胞株を使用するさらなる利点は、少なくとも二重層の細胞凝集塊またはブラストイドを多数得ることができることである。
【００５２】
好ましくは、本発明に係る方法において、細胞凝集塊は、少なくとも1種類の二倍体細胞を用いて形成される。二倍体細胞のみが組み合わされることが非常に好ましい。このことは、使用される細胞種に由来する動物に完全に予想通りに発現する遺伝子組み換えを可能にするが、一倍体細胞を用いると可能ではない。
【００５３】
しかしながら、少なくとも1つの異数体細胞、好ましくは1つの四倍体細胞と、少なくとも1つの二倍体細胞とを組み合わせること、ならびに好ましくは、四倍体胚盤胞に由来する少なくとも1つの四倍体栄養芽細胞と、少なくとも1つの多能性および／または全能性二倍体細胞とを組み合わせることが可能である。少なくとも1つの栄養膜細胞を少なくとも1つの一倍体細胞に組み合わせることも可能である。
【００５４】
本発明に係る方法における使用のための栄養芽細胞は、栄養膜幹細胞、または栄養膜幹細胞と本質的に同様に機能する細胞であってもよい。好ましくは、栄養膜幹細胞（TS細胞）が使用される。非常に好ましいものは、細胞株から得られる栄養膜幹細胞のような栄養芽細胞である。栄養芽細胞は、特に、Eomes、GATA3、Tead4およびTfap2c遺伝子の発現によって特徴付けられる。栄養芽細胞は、栄養外胚葉を形成する能力によってさらに特徴付けられる。
【００５５】
また、栄養芽細胞は、人工栄養芽細胞であってもよく、当該細胞は、さらに分化した細胞から得られる。好ましくは、人工栄養芽細胞も、Eomes、GATA3、Tead4およびTfap2c遺伝子を発現する。さらに好ましくは、栄養芽細胞は、EP2088191に記載されたような、Cdx2を発現するように遺伝子組み換えされた細胞などの人工多能性細胞ではない。また、栄養芽細胞は、全能性細胞であってもよい。
【００５６】
好ましくは、栄養芽細胞は、栄養膜幹細胞（TS細胞）である。TS細胞は、胎盤などの外胚組織を形成する能力を有する細胞として特徴付けられるので、ES細胞とは異なる。  TS細胞は、接合子、つまり2〜128細胞段階胚、桑実胚、胚盤胞または着床後胚（たとえば、胎生期「交尾後5.5日〜6.5日」など）を採取し、たとえば、Science Volume 282, Issue 5396, 11 December 1998, Pages 2072-2075 Promotion to trophoblast stem cell proliferation by FGF4 Tanaka, S.a, Kunath, T.b, Hadjantonakis, A.-K.a, Nagy, A.b, Rossant, J. or as described by Andras Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute; Marina Gertsenstein, Samuel Lunenfeld Research Institute; Kristina Vintersten, European Molecular Biology Laboratory; Richard Behringer, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition), Cold spring harbour laboratory press に記載されたようなTS細胞株培養を確立することによって得ることが可能である。この内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５７】
また、TS細胞は、RNAまたはタンパク質発現レベルが異なる細胞種からTS細胞と本質的に同様の分化能を有する細胞種まで変化するように細胞リプログラミングによって得られてもよい。細胞リプログラミングによって得られるTS細胞は、Chen Y, Wang K, Gong YG, Khoo SK, Leach R. Roles of CDX2 and EOMES in human induced trophoblast progenitor cells Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 8;431(2):197-202. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.12.135. Epub 2013 Jan 8 に記載されている。
【００５８】
好ましくは、栄養芽細胞は、ES細胞の細胞リプログラミングから得られない。ES細胞であって、Cdx2の発現によって栄養外胚葉様構造体を形成する遺伝子組み換えを有するES細胞のような、別の種類の全能性細胞を栄養芽細胞として使用することに対する、少なくとも1つの栄養芽細胞を使用することの利点は、細胞株から採取されるか、またはリプログラミングによって得られる栄養芽細胞は、胚の形成においてこの栄養芽細胞の何らかの事情による加入をもたらさないので、そこから得られる生物体の遺伝的背景の混入をもたらさないことである。
【００５９】
本発明における使用のための、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞は、内部細胞塊様組織を形成する能力を有する細胞である。多能性および／または全能性細胞は、天然の胚構造体から分離した細胞であってもよいが、好ましくは細胞株から得られる。また、内部細胞塊様組織を形成する能力を有する限り、人工の多能性および／または全能性細胞を使用することが可能である。
【００６０】
多能性幹細胞は、生きた動物から、または胚から採取することによって得られてもよい。多能性幹細胞をどのように得ることができるかのさらなる詳細については、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume 78, Issue 12 II, 1981, Pages 7634-7638 Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Martin, G.R. を参照のこと。その内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６１】
また、多能性幹細胞は、RNAおよび／またはタンパク質の発現レベルを、さらに分化した細胞種から、多能性である細胞種、または多能性細胞と本質的に同様の分化能を有する細胞種まで変化させることによる細胞リプログラミングによって得られ得る。この点に関して、Cell Volume 126, Issue 4, 25 August 2006, Pages 663-676 Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Takahashi, K., Yamanaka, S., を参照のこと。その内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。細胞リプログラミングによって得られる多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）と称され、iPS細胞は、本発明に係る細胞凝集塊の形成に非常に適している。
【００６２】
好ましい例として、本発明に係る細胞凝集塊を形成する多能性幹細胞種は、胚性幹細胞（ES細胞）であってもよい。ES細胞は、生きた動物または胚から採取することによって得ることが可能である。好ましくは、しかしながら、ES細胞は、採取された桑実胚または胚盤胞に由来するES細胞株の培養から得られる。また、ES細胞様細胞、つまりES細胞と同様の能力を有する細胞は、RNA、酵素またはタンパク質発現レベルがさらに分化した細胞種とES細胞に本質的に同様の分化能を有する細胞種とで変化するように細胞リプログラミングによって得られ得る。
【００６３】
ラット胚性幹細胞の入手は、Buehr, M., Meek, S., Blair, K., Yang, J., Ure, J., Silva, J., McLay, R., Hall, J., Ying, Q.-L., Smith, A, Cell Volume 135, Issue 7, 26 December 2008, Pages 1287-1298. Capture of Authentic Embryonic Stem Cells from Rat Blastocysts に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６４】
アカゲザル胚性幹細胞の入手は、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Volume 92, Issue 17, 15 August 1995, Pages 7844-7848. Isolation of a primate embryonic stem cell line. Thomson, J.A., Kalishman, J., Golos, T.G., Durning, M., Harris, C.P., Becker, R.A., Hearn, J.P に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
代替的に、または追加して、本発明に係る細胞凝集塊を形成するために使用することができる多能性幹細胞は、全能性細胞であってもよい。全能性細胞は、一般的に、全ての胚および胚外性組織に分化する能力を有する細胞であり、全能性幹細胞と本質的に同等である。全能性細胞は、したがって多能性幹細胞である。本発明において、全能性細胞は、したがって、多能性幹細胞として使用することができる。したがって、一実施形態において、細胞凝集塊は、少なくとも1つの全能性細胞を含む。全能性細胞は、胚または哺乳動物、好ましくは非ヒトの全能性幹細胞などから単離することができ、または以下に記載されたような全能性細胞の培養から得ることができる。Macfarlan TS, Gifford WD, Driscoll S, Lettieri K, Rowe HM, Bonanomi D, Firth A, Singer O, Trono D, Pfaff SL, Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity Nature 2012 Jul 5; 487 (7405): 57-63; doi: 10.1038/nature11244) or by Morgani SM1, Canham MA, Nichols J, Sharov AA, Migueles RP, Ko MS, Brickman JM. Totipotent embryonic stem cells arise in ground-state culture conditions. Cell Rep. 2013 Jun 27;3(6):1945-57. doi: 10.1016/j.celrep.2013.04.034. Epub 2013 Jun 6 or by Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T. Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):676-80. doi: 10.1038/nature12969.
【００６６】
好ましくは、少なくとも1つの多能性細胞が本発明の方法において使用される。全能性細胞種に対して多能性細胞種を用いる利点は、細胞の分化を容易に制御することができることである。より好ましくは、少なくとも1つの多能性細胞は胚性幹細胞（ES細胞）であり、さらに好ましくは、胚性幹細胞は細胞株から得られる。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、初期細胞凝集塊は、少なくとも1つの栄養膜幹細胞（TS細胞）のような栄養芽細胞を、少なくとも1つの胚性幹細胞（ES細胞）に組み合わせることによって形成される。
【００６８】
さらに好ましくは、初期細胞凝集塊は、同種の細胞を組み合わせることによって形成される。
【００６９】
本発明の方法において使用される、栄養芽細胞、または多能性および／もしくは全能性細胞は、たとえば分離された胚などから直接分離されるか、または細胞リプログラミングによって得られてもよいが、好ましくは、少なくとも1つの細胞は、天然の桑実胚、天然の胚盤胞、核移植に由来する桑実胚、核移植に由来する胚盤胞、四倍体接合子に由来する桑実胚、または四倍体接合子に由来する胚盤胞、体外受精から生じる桑実胚、体外受精から生じる胚盤胞に由来する細胞株から得られる。好ましくは、天然の接合子は、本発明の方法において使用されない。さらに好ましい実施形態において、細胞凝集塊は、接合子から形成されない。さらに好ましくは、本発明の方法において使用されるTS細胞は、ES細胞の遺伝子組み換えから得られたものではない。
【００７０】
このことは、本発明の方法が従来の体外受精とは異なることを意味する。体外受精は、動物から分離され、in vitro で融合された2つの初期生殖細胞を使用する。体外受精は、したがって、生殖細胞の融合を使用するが、一方、本発明の方法では、細胞株のみが使用され、生殖細胞などの妊娠雌性から採取された初期天然媒体は使用されない。また、本発明において形成されるような少なくとも二重層の凝集塊は、体外受精の間に形成されない。なぜなら、一般的に体外受精において空洞化する細胞凝集塊は、単一（全能性）細胞種のみを含む細胞凝集塊であり、二重層凝集塊を形成することができないからである。体外受精において、初期細胞分化は、胚盤胞の形成と同時に発生し、少なくとも二重層の細胞凝集塊は形成されない。また、体外受精は、細胞凝集塊の in vitro 空洞化に関与せず、in vitro で胚盤胞を形成する。本発明の方法は、体外受精よりも改良されている。なぜなら、細胞株を使用することができ、これは体外受精では使用することができないからである。
【００７１】
このことは、本発明の方法が四倍体補完法によって胚盤胞を得る方法とも異なることを意味する。四倍体補完法は、妊娠雌性から採取された2細胞期胚から得られる初期四倍体胚盤胞を使用し、その細胞は in vitro で融合される。本発明の方法において、細胞株のみが使用され、四倍体胚盤胞のような、妊娠雌性から採取された一次天然媒体は使用されない。また、本発明の方法は、好ましくは、一倍体細胞のみの組み合わせを含む。
【００７２】
このことは、本発明に係る方法では、キメラの形成を回避することができることも意味する。キメラの形成において、遺伝子組み換えされた細胞が、採取された天然に成長した桑実胚または胚盤胞に注入され、異なる遺伝特性を有する。したがって、発生中の胚は天然のICMと注入された細胞との組み合わせから生じたものであり、遺伝的に均一ではない。本発明の方法では、ブラストイドは、遺伝的に同種、または異種の細胞の集合体からもたらされてもよい。
【００７３】
重要なことに、本発明に係るブラストイドを得るための方法では、妊娠動物に由来する初期胚または胚組織を直接使用する必要はない。本方法は、主に細胞株に基づき、当該細胞株は in vitro で増殖することができる。これらの細胞株は、核リプログラミングによって得られるか、または胎盤、内部細胞塊、もしくはその両者を形成する能力を有する細胞株を作製する任意の他の方法によって得られる初期胚または胚組織に由来してもよい。任意には、本発明における使用のための細胞株は、遺伝的に改変することが可能であり、得られるブラストイドまたは胎児は天然に現れない特徴を示す。
【００７４】
本発明は、したがって、二重層細胞凝集塊、および／または人工胚盤胞、および／またはさらに発生したブラストイドを、動物を犠牲にする必要なく得る方法を提供する。本発明の方法は、さらに、遺伝的に等しい胚、もしくは生きた動物、または制御された遺伝子組み換えを有する種を、キメラを作製し、育種する必要なしに、大量に形成することを可能にする。また、このことは、場所、食糧、労働力および胚の研究に関する法的要件を軽減する。
【００７５】
本発明の方法は、第1工程として、少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを組み合わせることによって初期細胞凝集塊を形成する工程を含む。この初期細胞凝集塊を培養し、少なくとも二重層の細胞凝集塊を得ることは、各種類の細胞の適切な数を、好ましくはRho/Rock抑制因子の存在下において播種することによってもたらされる。
【００７６】
（少なくとも）二重層の凝集塊は通常、自発的に形成されない。たとえば、ES細胞とTS細胞とが共培養されるとき、それらは、内側のTS細胞と外側のES細胞とを有する非ランダムな細胞クラスタを自発的に形成する傾向がある。そのような凝集塊は、付着しており分離していない、TSおよびES細胞の非包囲凝集塊を形成することによって発生する傾向がある（図1c、左側を参照）。
【００７７】
これに対して、本発明の方法では、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊は、少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とから形成され、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞は、少なくとも二重層の細胞凝集塊の内側に位置し、一方、栄養芽細胞は外側に位置する。したがって、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞は栄養芽細胞によって包囲され、このことは、好ましくはRho/Rock抑制因子の存在下において、各種類の細胞の適切な数を播種することによって行われる。栄養芽細胞による、多能性および／または全能性細胞の包囲の1つの利点は、栄養芽細胞が多能性および／または全能性細胞の増殖を制限することである。栄養芽細胞の外層によって生じる空間は、多能性および／または全能性細胞の増殖を制限する。
【００７８】
ES細胞とTS細胞とを使用する場合、ES細胞は、二重層細胞凝集塊の内側に位置し、一方、TS細胞は外側に位置する。この場合、ES細胞は、TS細胞によって包囲され（図1c、右側を参照）、このことは、各種類の細胞の適切な数を、好ましくはRho/Rock抑制因子の存在下において、播種することによって行われる。TS細胞によるES細胞の包囲の1つの利点は、TS細胞がES細胞の増殖を制限することである。TS細胞の外層によって生じる空間は、ES細胞の増殖を制限する。
【００７９】
少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを含む1つの初期細胞凝集塊を得るために必要な細胞の数は、使用される細胞の種類によって変わる。使用される細胞の数は、少なくとも二重層の細胞凝集塊を形成する効率に関する重要な因子である。一般的に、少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを含む1つの細胞凝集塊は、約1〜500個、好ましくは約10〜50個の多能性および／または全能性細胞を含み、加えて、少なくとも1つ、好ましくは1〜250個、より好ましくは8〜200個、およびさらに好ましくは12〜50個の栄養芽細胞を含む。
【００８０】
TS細胞が、たとえばES細胞などのような多能性細胞に組み合わされる場合、1〜250個、好ましくは8〜200個、およびより好ましくは12〜50個のTS細胞が使用され、初期細胞凝集塊を形成し、1〜250個、好ましくは2〜100個、およびより好ましくは3〜50個の多能性細胞が使用され、初期細胞凝集塊を形成する。
【００８１】
具体的には、ES細胞がTS細胞に組み合わせられ、初期細胞凝集塊を形成する場合、マイクロウェルあたりのES細胞の数は、好ましくは1〜25個、好ましくは3〜12個、およびより好ましくは6〜8個である。使用されるES細胞の数は、少なくとも二重層の凝集塊、この場合はES-TS細胞クラスタの形成の効率に対する重要な因子である。この場合におけるマイクロウェルあたりのTS細胞の数は、約3〜70個であり、好ましくは8〜45個であり、より好ましくは15〜20個の栄養芽細胞である。
【００８２】
このことは、たとえば培養培地にES細胞を播種することによって行うことができ、当該培養培地は、ES培地などであり、10μl〜10ml、好ましくは0.5〜3ml中に、好ましくは均一に1000〜100000細胞／チップ、好ましくは約7000細胞／チップである。
【００８３】
細胞の播種は、細胞の種類に適した、または実際的な任意の順番で行うことができる。したがって、全ての種類の細胞は、培養培地の添加の前後に、同時に、またはほぼ同時に加えられてもよい。また、好適な細胞培養培地は、第1に加えられ、次に少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞と、少なくとも1つの栄養芽細胞とを任意の順番で添加されてもよい。また、多能性および／もしくは全能性細胞、ならびに／または栄養芽細胞は、培養培地に懸濁液として加えられてもよく、またはそれらは他の培地に懸濁され、続いて培養培地によって培地を交換されてもよい。ES細胞などの多能性細胞と、TS細胞などの栄養芽細胞とは、最初に組み合わされ、続いて培養培地を補われてもよく、または栄養芽細胞が最初に添加され、続いて培養培地と多能性細胞とが任意の順番で添加されてもよい。
【００８４】
組み合わせの順番は、栄養外胚葉を形成する能力を有する外層と、内部細胞塊を形成する能力を有する核とを有する細胞凝集塊（（少なくとも）二重層の細胞凝集塊）が形成されるような順番である場合が一般的に好ましい。
【００８５】
播種が連続してなされる場合がさらに好ましい。連続的な播種は、最初に播種された細胞種が、第２の細胞種を添加する前、持続的に増殖する間に定着し凝集することを可能にする。したがって、最初に播種された細胞種の凝集塊が形成され、第２の細胞種の添加後、播種された第２の細胞種によって囲まれ始めてもよい。
【００８６】
したがって、連続的な播種において、最初に少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞を播種し、これらの細胞が定着するようにすることが一般的には好ましい。細胞の定着には、1分〜3日、好ましくは6時間〜2日、より好ましくは12時間〜36時間、および最も好ましくは約24時間のような18〜30時間かかってもよい。
【００８７】
定着後、培養物が持続的に増殖する間に、少なくとも1つの栄養芽細胞を添加することができるが、同時に最初の細胞種に凝集し、少なくとも二重層の細胞凝集塊を形成する。少なくとも二重層の細胞凝集塊は、本発明に係るブラストイドの形成に非常に好ましい。
【００８８】
この添加の順番は、ES細胞が多能性および／または全能性細胞として使用され、TS細胞が全能性細胞として使用され、二重層細胞凝集塊を形成する場合において特に好ましい。
【００８９】
初期細胞凝集塊が、Rho/Rock抑制因子の存在下で培養される場合が好ましく、以下にさらに述べられる。Rho/Rock抑制因子の存在下において初期細胞凝集塊を培養することは、少なくとも1つの栄養芽細胞が、少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞の凝集塊上の凝集および／または包囲を促進し、少なくとも二重層の細胞凝集塊の形成をもたらし、実施例に示されるRho/Rock抑制因子であるY27632の高濃度下において包囲（外側の細胞によって内側の細胞を包囲すること）の効率が増加することによって証明される。
【００９０】
（少なくとも）二重層の細胞凝集塊は、1〜100日、好ましくは0.25〜6日、より好ましくは約3日（または約72時間）にわたって培養され、空洞化をもたらす。少なくとも二重層の細胞凝集塊の空洞化は、内部細胞塊様組織と胞胚腔とを形成し、共に栄養外胚葉様組織によって囲まれる。
【００９１】
（少なくとも）二重層の細胞凝集塊は、約10μm〜200μmの直径を有し、約2〜100個、好ましくは4〜50個、さらに好ましくは5〜40個の細胞を含む。
【００９２】
少なくとも１つのTS細胞と、少なくとも１つのES細胞とが組み合わせられることによって初期細胞凝集塊が形成される場合が好ましく、二重層の細胞凝集塊はES-TS細胞クラスタと称される。ES-TS細胞クラスタは、栄養外胚葉、および続いて胎盤を形成する能力を有する細胞の外層の存在によって胚様体と区別することができる。このことは、栄養外胚葉に特異的な生体因子、たとえば転写因子、たとえばcaudalタイプホメオボックス転写因子CDX2などの発現によって評価することが可能である。
【００９３】
ES−およびTS細胞は、2種類のうちの1つが他の種類とは遺伝的に異なる細胞株に由来するように異なる遺伝的起源のものであってもよい。この遺伝的相違は、異なる種に由来する細胞が原因であってもよく、またはES−および／もしくはTS細胞に対する1以上の遺伝子組み換えが原因であってもよい。遺伝子組み換えの場合、ES細胞が目的の組み換えを保持し、一方、両方の種類の細胞が、同一または異なる遺伝子組み換えを保持してもよい。好ましくは、しかしながら、ES-およびTS-細胞は、同一種に由来する。
【００９４】
ES-TS細胞クラスタの培養は、1〜100日、好ましくは0.25〜6日、さらに好ましくは約3日（または約72時間）の期間にわたって実施され、空洞化をもたらすことができる。ES-TS細胞クラスタの空洞化は、ES細胞を本質的に含む内部細胞塊と胞胚腔とを形成し、共に栄養外胚葉によって囲まれる。
【００９５】
少なくとも二重層の凝集塊であって、ES-およびTS細胞を含む好ましい実施形態である凝集塊は、ES-TS細胞クラスタと称され、人工胚盤胞を形成するために非常に好ましい。（少なくとも）二重層の細胞凝集塊において、少なくとも二重層の細胞凝集塊の、空洞化、上皮化および多能性の維持は、人工胚盤胞をもたらす。さらなる培養は、後続のブラストイド段階をもたらす。
【００９６】
空洞化、上皮化および多能性の維持は、少なくとも1つの、Wnt経路、PKA経路およびPKC経路の調節によって行われ、詳細は以下に述べられる。好ましくは、Wnt経路と、PKAおよびPKC経路の1つとが活性化され、最も好ましくは、PKC、PKA、およびPKC経路の全てが以下に述べるように活性化される。
【００９７】
このことは、ES-TS細胞クラスタのような、少なくとも二重層の細胞構造体からブラストイドを高い効率で形成する。特に、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊からのブラストイド形成の効率は、10％を超え、通常20％を超え、多くの場合30％を超える。ブラストイド形成の高い効率は、転写因子CDX2、EomesおよびGATA3を発現する細胞の外層と、転写因子Oct4、Sox2および少なくとも部分的にNanogを発現する細胞の核凝集塊とを有する二重層凝集塊の効率的な形成によって達成される。
【００９８】
ブラストイド形成の効率は、（1）転写因子CDX2、EomesおよびGATA3を発現する外側細胞層と、（2）転写因子Oct4およびSox2および少なくとも部分的にNanogを発現する初期細胞凝集塊とを有する空洞化構造体の割合として測定される。
【００９９】
得られるブラストイドの多能性を維持するために、少なくとも1つの、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路、Tgf-経路およびHippo経路を調節することがさらに好ましい。好ましくは、このことは、少なくとも1つの、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路およびTgf-経路の活性化、および／またはHippo経路の抑制によって達成され、以下に詳述される。
【０１００】
好ましくは、少なくとも2つの、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路、Tgf-経路およびHippo経路が調節される。より好ましくは、少なくとも3つの、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路、Tgf-経路および／またはHippo経路が調節され、さらに好ましくは、少なくとも4つの、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路、Tgf-経路および／またはHippo経路が調節され、最も好ましくは、MAPK-経路、STAT-経路、Akt-経路、Tgf-経路および／またはHippo経路の全てが調節され、以下に詳述される。
【０１０１】
ブラストイドの多能性の維持は、胎児の形成までの後続のブラストイド状態へのさらなるブラストイドの培養を容易にする。初期細胞凝集塊、少なくとも二重層の細胞凝集塊、および最終的なブラストイドの形成は、少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを当該技術分野で公知である任意の手段で組み合わせることによって行うことが可能である。そのような組み合わせは、懸滴装置において、ビーカー、エルレンマイヤまたはエッペンドルフカップのような好適な寸法のカップにおいて行うことが可能である。
【０１０２】
好ましくは、本発明に係る細胞凝集塊の形成は、好適な容器内において、上述されたような好適な種類の細胞を組み合わせることによって実施することができる。好適な容器は、好ましくは非接着性の表面を有する。非接着性の表面は、細胞が置かれる表面であり、細胞に対してほとんどまたは全く接着しない。したがって、細胞は、この表面に本質的に接着しない。理論に束縛されるものではないが、非接着表面の使用は、駆動力を細胞にもたらし、当該細胞は表面に接着せず、お互いに接着するので本発明における使用のための細胞凝集塊を形成する。
【０１０３】
非接着性表面は、非接着性の生物学的もしくは人工材料で材料を覆うことによって形成されてもよく、または非接着性表面は、非接着性材料の好適な形成によって、もしくは当該技術分野で公知である他の手段によって得られてもよい。容器であって、その上またはその中に細胞凝集塊を形成することができる容器は、本明細書において足場と称される。
【０１０４】
非接着性表面を有する足場は、たとえば、エチレンオキサイド、プロピレンオキサイド、ポリエチレングリコール、（PEG）-（コ）ポリマー（たとえばPLL-g-（PEG））、ポリ（エチレンオキサイド）（PEO）（コ）ポリマー、アガロースヒドロゲル、下限臨界溶解温度（LCST）未満の温度反応性材料（たとえば、ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド））、疎水性材料（たとえば、オレフィンポリマー）、細胞忌避性マイクロおよびナノトポグラフィーなどで作製されるか、または覆われる。
【０１０５】
したがって、本発明に係る細胞凝集塊の形成は、好ましくは非接着性足場において行われる。非接着性足場は、少なくとも1つの表面を有し、当該表面は、本質的に細胞に接着しない。好ましくは、これは、凝集塊を形成するために細胞が置かれる面である。非接着性足場は、非接着性材料から形成することができるか、または非接着性材料で覆われた別の材料から形成することができる。たとえば、非接着性の、ペトリ皿または管が足場として使用されてもよいが、好ましくは、足場は、たとえばおおよそ六角形、五角形、正方形、長方形、三角形、楕円、または円形などの平面様形状を有する。
【０１０６】
さらに好ましくは、足場は、少なくとも1つの好適な、キャビティ、またはチャネルを含む。好ましくは、複数の、キャビティまたはチャネルが足場に存在する。これらのキャビティまたはチャネルが、形成される細胞凝集塊の寸法よりもいくらか大きい場合が好ましい。好ましいキャビティおよびチャネルは小さく、たとえば直径20〜5000μm、より好ましくは100〜1000μm、および最も好ましくは100〜500μmのキャビティ、特に約200μmの直径である。好適なキャビティまたはチャネルは、当該技術分野で公知である任意の手段によって得られてもよい。直径は、キャビティまたはチャネルの開口部の周囲における2つの対向する任意点の間における可能な最長の直線距離として定義される。チャネルまたはキャビティは、閉じた底を有し、キャビティまたはチャネルの内部の少なくとも1つの表面は、非接着性材料を含む。
【０１０７】
好ましくは、キャビティは、長さおよび幅がほぼ同様の大きさである形状を有する。深さも、ほぼ同様の大きさである。そのようなキャビティは、マイクロウェルと称される。本発明において、非接着性の足場がマイクロウェルを含む場合が好ましい。マイクロウェルは、好ましくはその長さが、その幅よりも最大で約5倍、好ましくは3倍、より好ましくはほぼ等しく、その深さは、その幅の、10倍未満、好ましくは5倍未満、より好ましくは最大3倍であるキャビティである。
【０１０８】
マイクロウェルの長さは、マイクロウェルの周囲における対向する任意の2つの点の間の可能な最長直線距離として規定される。したがって、マイクロウェルの長さは、その直径であると考えられ、好ましくは20〜5000μm、より好ましくは100〜1000μm、および最も好ましくは100〜500μm、特に約200μmである。マイクロウェルの幅は、その長さに垂直な、マイクロウェルの開口部の周囲における対向する任意の2つの点の間の最長の直線距離として規定される。
【０１０９】
マイクロウェルの様々な断面積、特に足場の表面に垂直および平行なものは、不規則な形状などの任意の形状であってもよいが、マイクロウェルの適切な断面積は、独立して、正方形もしくは略正方形、長方形もしくは略長方形、三角形もしくは略三角形、楕円もしくは略楕円、または円もしくは略円である。しかしながら、マイクロウェルが円筒状であり、ほぼ円形の開口部を足場の表面に有する場合が好ましい。好ましいマイクロウェルは、たとえば当技術分野において一般的に使用されるようなマイクロウェルプレートなどに存在する。
【０１１０】
本発明において特に好ましく使用できるものは、アガロースチップ上に存在し得るマイクロウェルであり、当該チップは、たとえば2、4、6、8、12、18、または24、48、96、384ウェルプレート（WP）に組み入れられてもよい。好適な、製造方法およびそのようなアガロースマイクロウェルの使用は、以前に記載されており、当該記載は、Rivron NC, Vrij EJ, Rouwkema J, Le Gac S, van den Berg A, TruckenmRK, van Blitterswijk CA, Tissue deformation spatially modulates VEGF signaling and angiogenesis,Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 May 1;109(18):6886-91 によって記載され、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
5〜25mm、特に11mmのアガロースチップであって、100〜10000マイクロウェル、より好ましくは約1000マイクロウェルを含むマイクロウェルが好ましく使用され、たとえば12ウェルプレートと共に使用されてもよい。
【０１１２】
非接着性足場がマイクロウェルを含む場合、単一の足場上に配置される複数のマイクロウェルを有することが有利である。好ましくは、これらのマイクロウェルは、規則的なパターンで配列される。このことは、大量のブラストイドのハイスループット製造を可能にする。
【０１１３】
非接着足場における、本発明の方法に従った細胞凝集塊の形成について、上述されたような、足場上に存在する1以上の種類の細胞を有することが有利である。足場が、たとえばマイクロウェルのキャビティを含む場合、1種以上の細胞がマイクロウェル内に存在することが好ましい。全てのマイクロウェルが、本発明の方法において使用される種類の細胞を含み得る。好ましくは、少なくとも1つの細胞凝集塊を形成するために必要な数の細胞が1つのマイクロウェル内に存在し、より好ましくは、マイクロウェルに存在する細胞の量は、少なくとも1つの栄養芽細胞と少なくとも1つの多能性および／または全能性細胞とを含む細胞凝集塊を得るために必要な量である。
【０１１４】
Rho/ROCK経路において、Rhoは、Rasファミリーの小さいGTP結合タンパク質メンバーである。Rhoおよびその下流エフェクターROCKは、アクチン細胞骨格の組織化、接着斑とアクチンストレスファイバーとの集合、FAKの活性化、微小管の動態、遺伝子の転写および細胞サイクルの進行において中心的役割を果たしている。Rhoタンパク質は、活性なGTP結合状態と不活性なGDP結合状態との間を循環している。哺乳類のGTPアーゼRhoファミリーは現在のところ、３つのサブファミリー、Rho（RhoA、RhoB、およびRhoC）、Rac（Rac1、Rac2、およびRac3）、ならびにCDC42（細胞分裂周期42）（CDC42HsおよびG25K）からなる。
【０１１５】
Rho/ROCKの活性化状態は、GEF（グアニン交換因子）などの調節性タンパク質によって制御される。RhoAの標的タンパク質は、PAK（p21活性化キナーゼ）ファミリー、Rhoキナーゼ/ROK/ROCK（Rho関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ）またはMBS（ミオシン結合サブユニット）を含む。経路の活性化および抑制状態は、たとえばフローサイトメトリー、免疫化学、ポリメラーゼ連鎖反応またはウエスタンブロットを用いて相対的Fアクチン含有量を測定することによって評価することができる。
【０１１６】
本発明において、Rho/ROCK経路は、好ましくは調節され、調節は、好ましくは抑制である。本明細書において記載されたようなRho/ROCK抑制因子は、当該技術分野で公知である任意の手段によって得ることができる。Rho/ROCK抑制の1つの好ましい方法は、以下に限定されるものではないが、ファスジル塩酸塩、GSK269962、GSK429286、H1152ジヒドロクロライド、グリシル-H1152ジヒドロクロライド、HA1100ハイドロクロライド、SB772077Bジヒドロクロライド、SR3677ジヒドロクロライド、またはY-27632など多数の化合物の1以上を添加することによって行われる。これらの化合物は、1〜1000μMの濃度で使用することができる。
【０１１７】
好ましくは、Y27632、好ましくはそのジヒドロクロライドが使用され、たとえば1〜400μMの範囲、好ましくは20μMの濃度で使用される。本発明におけるRho/ROCK経路の抑制は、初期細胞凝集塊から少なくとも二重層の細胞凝集塊の形成を増加させる利点を有する。
【０１１８】
Wnt経路は、細胞シグナル経路であり、細胞の増殖と分化とを制御する。Wnt経路の活性化は、限定されるものではないがWntタンパク質（たとえばWnt3a）を含むリガンドの、限定されるものではないがFrizzledなどの膜受容体への結合によって天然に起こる。この結合は、たとえばAPC/AxinをGSK-3βに置換することによって特徴付けられる経路の活性化をもたらし、β-カテニンの核移行とそれに続いて転写の共活性化因子としてLEF/TCF DNA結合因子の漸増とをもたらす。
【０１１９】
Wnt経路の活性化は、レチノイン酸、FGF、TGF-βおよびBMPなどの他の経路からのシグナルを統合し、細胞の増殖および分化を調節する。また、Wntリガンドの結合は、たとえば、Rho、Rac、PKCまたはCamK2シグナル経路などに働く非標準経路を活性化することができる。
【０１２０】
Wnt経路の活性化は、たとえば、GSK3のリン酸化、ならびに／またはベータカテニンのリン酸化および／もしくは核移行、ならびに／または当該技術分野において公知の転写標的遺伝子（たとえば、TCF、AP-1、Snail、フィブロネクチン）の発現によって評価される。Wnt活性化は、ウエスタンブロット、免疫細胞化学または当該技術分野で公知である他の方法によって評価することができる。
【０１２１】
本発明において、Wnt経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、調節は、当該技術分野で公知である任意の手段によって、Wnt経路を活性化することによって行われる。WntリガンドWnt3aの、またはGSK3抑制因子CHIR99021の添加は、Wnt経路を活性化する好ましい方法であり、好ましくは1〜10μM、より好ましくは約3μMである。
【０１２２】
また、Wnt経路は、LiClなどのリチウム塩、または当該技術分野において公知の化学分子、以下に限定されるものではないが、2-アミノ-4-［3,4-（メチレンジオキシ）ベンジル-アミノ]-6-（3-メトキシフェニル）ピリミジン、6-ブロモインジルビン-3’-オキシムおよび／もしくはデオキシコール酸6-［［2-［［4-（2,4-ジクロロフェニル）-5-（5-メチル-1H-イミダゾール-2-イル）-2ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］-3-ピリジンカーボンニトリルなどの添加によって活性化することができる。
【０１２３】
本発明におけるWnt経路の活性化は、少なくとも二重層の細胞凝集塊の空洞化の産生を増加させるという利点を有する。CHIR99021などのWnt経路活性化因子の濃度増加は、たとえばES-TS細胞クラスタの空洞化成功率などを増加させる。20μMにおいて、CHIR99021は、ほぼ30％のブラストイド産生をもたらすが、3μMにおいて、ブラストイド産生は10％である。
【０１２４】
PKA経路は、Gタンパク質共役受容体によって制御され、細胞間情報伝達において使用される。PKAシグナル経路の活性化後、活性化されたGsアルファサブユニットは、ATPを環状アデノシン一リン酸（cAMP）に変換することを触媒する酵素アデニリルシクラーゼに結合し、活性化させる。cAMPの濃度上昇は、たとえば、環状ヌクレオチド感受性イオンチャネル、cAMPによって活性化される交換タンパク質（EPAC）、タンパク質キナーゼA酵素の活性化をもたらす。PKA活性化は、たとえば、当該技術分野において知られているように、ウエスタンブロットまたは免疫蛍光法によってCREBリン酸化または他のPKA特異的タンパク質を測定することによって評価することができる。
【０１２５】
本発明において、PKA経路が好ましくは調節される。より好ましくは、調節は、当該技術分野で公知である任意の手段によって、たとえばPKA活性化因子の使用、または遺伝子組み換えによって、PKA経路を活性化することによって行われる。たとえば8Br-cAMPのPKA活性化因子を用いるPKA経路の活性化は、0.1〜10mMの濃度、たとえば1mMの濃度において、空洞産生を増加させる。
【０１２６】
PKCとしても知られるタンパク質キナーゼCは、上皮化、細胞間結合、および細胞の頂膜−基底膜分極化の制御に関するプロテインキナーゼ酵素のファミリーである。PKC酵素は、ジアシルグリセロール（DAG）、またはカルシウムイオン（Ca2+）の濃度上昇などのシグナルによって活性化される。活性化後、タンパク質キナーゼCは、RACKタンパク質（活性化タンパク質キナーゼCタンパク質の膜結合受容体）によって原形質膜に移動させられる。
【０１２７】
PKC経路の活性化は、免疫細胞化学によって、PKCタンパク質の膜局在、または細胞間接着、またはZO-1などの頂膜−基底膜分極タンパク質によって評価することができる。
【０１２８】
本発明において、PKC経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によって、PKC経路を活性化することによって行われる。たとえばインドラクタムVなどを用いるPKC経路の活性化は、たとえば0.1〜10μM、たとえば1μMなどの濃度において、空洞産生を増加させる。
【０１２９】
MAPK経路は、増殖および分化を調節する細胞シグナル経路である。MAPK経路は、受容体チロシンキナーゼ（RTKs）、インテグリン、およびイオンチャネルなどの多様な受容体によって調節される。これらに限定されるものではないが、繊維芽細胞増殖因子、上皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インターフェロンガンマ、腫瘍壊死因子、インターロイキン、形質転換増殖因子、ヘパリン結合性EGF様増殖因子、神経増殖因子、脳由来神経栄養因子、および／またはFASリガンド（CD95Lとしても知られている）は、受容体を、SOSおよびC3Gなどのグアニンヌクレオチド交換因子に結合させ、シグナルを小さなGTP結合タンパク質（たとえばRas、Rap1）に変換する、Shc、GRB2、およびCrkなどのアダプターを調節する。これらの小さなGTP結合タンパク質は、MAPKKK（Raf）、MAPKK（MEK1/2）、およびMAPK（Erk）からなるカスケードのコアユニットを活性化する。活性化されたErkダイマーは、細胞質内における標的を調節し、核に転位させ、遺伝子発現を調節する様々な転写因子をリン酸化する。
【０１３０】
MAPK経路の活性化は、MEK、ERK、および／もしくはP38MAPKのリン酸化によって、ならびに／またはER、ETS、Elk1、TIF1A、および当該技術分野で公知である他のものなどの転写標的の活性化によって評価される。このことは、ポリメラーゼ連鎖反応、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、または当該技術分野で公知である任意の他の方法によって評価することができる。
【０１３１】
本発明において、MAPK経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によるMAPK経路の活性化によって行われる。MAPK経路は、以下に限定されるものではないが、（i）ML099（CID-888706）、ML098（CID-7345532）、およびML097（CID-2160985）、およびC6セラミドなどの小さな化学分子を用いるRAS、（ii）ホルボール12-ミリステート13-アセテートまたはインドラクタムVなどの小さな化学分子を用いるRAF1、（iii）SB203580などの小さな化学分子を用いるp38、（iv）203695bpV（phen）、オカダ酸、479775α-ナフチル酸リン酸塩などの小さな化学分子を用いるホスホチロシンホスファターゼなどのシグナルカスケードメンバーの活性化／抑制によって細胞内で活性化することができる。
【０１３２】
MAPK経路の活性化は、好ましくは、リガンドである、繊維芽細胞増殖因子4（FGF4）またはヘパリン結合性EGF様増殖因子（HB-EGF）を用いて、より好ましくは1.5〜500ng/mlのタンパク質FGF4およびHB-EGFを培地に添加することによって、さらに好ましくは15ng/mlのFGF4および50ng/mlのHB-EGFを添加することによって行われる。
【０１３３】
本発明におけるMAPK経路の活性化は、転写因子Cdx2の発現によって評価されるような栄養外胚葉の多能性を維持するという利点を有する。
【０１３４】
STAT経路は、細胞の、増殖、生存、および分化を制御する。限定されるものではないが、LIF、Il6、およびIl11などのサイトカインは、結合して、たとえばGP130などの受容体の二量体化を誘導するので、随伴性のJaksタンパク質を活性化し、それら自身と受容体とをリン酸化する。受容体のリン酸化部位とJaksとは、Stat3などのSH2-含有Statに対する結合部位、ならびに受容体をMAPキナーゼ、PI3K/Akt、および他の細胞経路に繋げるSH2-含有タンパク質とアダプターとに対する結合部位として機能する。リン酸化Statは、二量体化して核に移動し、標的遺伝子の転写を制御する。
【０１３５】
経路の活性化は、たとえばウエスタンブロットによって観察されるように、たとえばSTATのリン酸化によって評価することができる。
【０１３６】
本発明において、STAT経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によるSTAT経路の活性化によって行われる。この経路は、JAK/STAT経路を刺激する、サイトカイン、ホルモン、および増殖因子、ならびにそれらの受容体などの様々なリガンドによって活性化することができる。リガンド結合が受容体サブユニットの多量体化を誘導するとき、内部細胞活性化が起こる。Epo（エリスロポエチン）、およびGH（成長ホルモン）などのいくつかのリガンドについて、受容体サブユニットはホモダイマーとして結合するが、一方、Ifns（インターフェロン）、およびILs（インターロイキン）のような他のものについて、受容体サブユニットはヘテロダイマーである。Il11は、たとえば1〜100ng/mlの範囲内の濃度で、好ましくは10ng/mlの濃度で使用することができる。Il6は、たとえば、30〜3000ng/mlの範囲内の濃度で、好ましくは300ng/mlの濃度で使用することができる。
【０１３７】
本発明におけるSTAT経路の活性化は、ICMの寸法によって評価されるようなICMの多能性および生存力と、たとえば、Oct4、Sox2およびNanogの発現と、Cdx2の発現によって評価されるような栄養外胚葉の多能性とを維持するという利点を有する。
【０１３８】
プロテインキナーゼB（PKB）経路としても知られるAkt経路は、転写、転位、増殖、タンパク質合成、グルコース／インスリン代謝、成長、および生存を調節する細胞シグナル経路である。これらに限定されるものではないが、インスリン様増殖因子、上皮増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ヘパリン結合性EGF様増殖因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、およびインスリンなどのリガンドの、膜結合受容体チロシンキナーゼ（RTK）への結合は、PI3Kアイソフォームを刺激する。PI3Kは、細胞膜において、ホスファチジルイノシトール-3,4,5-トリホスフェート（PIP3）の産生を触媒する。PIP3は、次に、二次メッセンジャーとして機能し、Aktの活性化を補助する。
【０１３９】
一度活性化すれば、Aktは、アポトーシス、タンパク質合成、代謝、および細胞周期に関するリン酸化基質によって主要な細胞プロセスを制御する。Akt経路の活性化は、Aktのリン酸化によって評価される。このことは、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、または当該技術分野で公知である任意の他の方法によって評価することができる。
【０１４０】
本発明において、Akt経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によるAkt経路の活性化によって行われる。インテグリン、BおよびT細胞受容体、サイトカイン受容体、G-タンパク質共役受容体（GPCR）、および他の刺激は、Akt経路を活性化することが知られている。
【０１４１】
Akt経路は、小さな分子を用いることによって細胞内で活性化することができる。たとえば、Akt経路は、（PDK1としても知られる）3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ-1を調節することによって、またはPS48およびVO−OH picなどの小さな化学分子を用いるホスファターゼテンシンホモログ（PTEN）を抑制することによって直接に活性化することができる。
【０１４２】
Akt経路は、浸透圧衝撃、炎症性サイトカイン、リポポリサッカライド（LPS）、および紫外線によってp38MAPK経路を介して活性化することができる。Akt経路の活性化は、好ましくは、リガンドであるインスリンまたはインスリン様増殖因子2（IGF2）を用いて、より好ましくは、1〜100ng/mlのIGF2を培地に添加することによって、さらに好ましくは10ng/mlのIGF2を添加することによって行われる。
【０１４３】
Akt経路の活性化は、Cdx2の発現によって評価されるような栄養外胚葉の多能性と、ICMの寸法によって評価されるようなICMの生存力とを維持するという利点を有する。転写因子CDX2、EomesおよびGATA3の発現は、ポリメラーゼ連鎖反応、または免疫細胞化学によって評価される。ポリメラーゼ連鎖反応を用いると、転写因子の発現レベルは、当該技術分野において知られているように、ポリスチレンプレート上に播種された胚性繊維芽細胞層の上部で培養された栄養膜幹細胞に比べて、好ましくは、5倍未満上方制御されるか、または下方制御される。
【０１４４】
転写因子CDX2、EomesおよびGATA3の発現も、免疫組織化学によって評価することができる。転写因子に特異的な蛍光抗体の最大強度は、核内に位置しなければならず、当該技術分野において知られているように、ポリスチレンプレート上に播種された胚性繊維芽細胞の層上で培養された栄養膜幹細胞に比べて、5倍未満上方制御されるか、または下方制御されなければならない。
【０１４５】
Akt経路の活性化は、in vitro 培養の間にブラストイドの多能性を維持することを補助する。
【０１４６】
Tgf経路は、細胞増殖、分化、および発生を調節する細胞シグナル経路である。限定されないが、形質転換増殖因子、骨形成タンパク質、アクチビンおよび／または Nodal などのリガンドの結合は、セリン／スレオニン受容体キナーゼのオリゴマー化、およびTGF-β／アクチビン経路に関する、細胞質シグナル分子Smad2およびSmad3、または骨形成タンパク質（BMP）経路に関するSmad1/5/8のリン酸化を誘導する。これらのsmad2、3、1/5/8のリン酸化は、共通のシグナルトランスデューサSmad4とのタンパク質複合体の形成、およびそれらの核への移動を誘導する。
【０１４７】
一度活性化されれば、Tgf経路は、細胞増殖、分化、および発生を導く、転写因子である、AP-1、bZIP、RUNX、FoxおよびbHLHなどの標的遺伝子を活性化する。Tgf経路の活性化は、Smad2, 3, 4, 1,5, 8のリン酸化によって、ならびにAP-1、bZIP、RUNX、Fox、bHLHおよび当該技術分野で公知である他のものなどの転写標的の活性化によって評価される。このことは、ポリメラーゼ連鎖反応、ウエスタンブロット、免疫細胞化学、または当該技術分野で公知である任意の他の方法によって評価することができる。
【０１４８】
本発明において、Tgf経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によるTgf経路の活性化によって行われる。本発明におけるTgf経路の活性化は、栄養外胚葉の多能性を維持するという利点を有し、このことは、Cdx2の発現によって、および／または凝集塊の空洞化を誘導することによって評価することができる。
【０１４９】
Tgf経路の活性化は、好ましくはリガンドTGFb1を用いて、より好ましくは0.5〜50ng/mlのリガンドTgfb1を添加することによって、さらに好ましくは5ng/mlのTgfb1を添加することによって行われる。また、Tgfb1経路の活性化は、リガンドアクチビンを用いてなされ、好ましくは0.1〜100ng/ml、さらに好ましくは約10ng/mlのアクチビンAを添加することによって行われる。
【０１５０】
Hippo経路は、細胞増殖、アポトーシスおよび幹細胞再生を調節する細胞シグナル経路である。Hippo経路は、細胞接触阻害に関し、Mst1/2およびLATS1/2、マーリン、KIBRA、RASSFs、およびAjuba；14-3-3、α-カテニン、AMOT、およびZO-2を介して調節される。Hippo活性化は、核と細胞質との間を往復するYAP/TAZによって評価される。Hippoシグナルを調節する上流シグナルは、細胞間接着、および極性複合体、細胞骨格、およびGPCRリガンドを含む。
【０１５１】
本発明において、Hippo経路は、好ましくは調節される。より好ましくは、このことは、当該技術分野で公知である任意の手段によるHippo経路の抑制によって行われる。少なくとも二重層の細胞凝集塊、および／またはブラストイドの形成のために、細胞外リガンドが存在することが好ましく、たとえば、1〜35ng/ml、好ましくは10ng/mlのエストラジオール、1〜35μM、好ましくは約10μMのタモキシフェン、または0.1〜10μM、好ましくは1μMのG-1（CAS  881639-98-1）において、Hippoシグナル、より具体的にはGPCRリガンド、さらに具体的には特にGPR30リガンドを調節する。
【０１５２】
本明細書において記載されるようなHippo経路の調節は、細胞凝集塊の、空洞化、上皮化、および多能性の維持をもたらす利点を有する。
【０１５３】
本発明は、記載されたような少なくとも二重層の細胞凝集塊を得るための方法を開示しており、上述の経路の１つの調節（活性化、または抑制）の任意の組み合わせが適用される。
【０１５４】
本発明は、記載されたようなブラストイドを得るための方法も開示しており、上述の経路の１つの調節（活性化、または抑制）の任意の組み合わせが適用される。好ましくは、各化合物について記載された調節（活性化または抑制）の好ましい方法は、示されたように適用される。
【０１５５】
また、本発明は、1以上のRho/ROCK抑制因子、Wnt経路調節因子、PKA経路調節因子、PKC経路調節因子、MAPK経路調節因子、STAT経路調節因子、Akt経路調節因子、Tgf経路調節因子、Hippo経路調節因子の1以上を含み、および（少なくとも）二重層の細胞凝集塊をさらに含む in vitro 細胞培養、またはこれらの調節因子の1以上と、二重層細胞凝集塊との任意の組み合わせの細胞培養を開示している。
【０１５６】
また、本発明は、1以上のRho/ROCK抑制因子、Wnt経路調節因子、PKA経路調節因子、PKC経路調節因子、MAPK経路調節因子、STAT経路調節因子、Akt経路調節因子、Tgf経路調節因子、Hippo経路調節因子を含み、さらにブラストイドを含む in vitro 細胞培養、またはこれらの調節因子の1以上とブラストイドとの任意の組み合わせの細胞培養を開示している。
【０１５７】
ブラストイド産生の増加は、好ましくはマイクロウェルを含む非接着性足場を用いる適切な空間的制限によって、ならびに特定の化合物の添加による少なくとも二重層の凝集塊の好適な形成と、空洞化および上皮化工程、および細胞凝集塊の多能性の維持に関するシグナル経路の好適な調節とによってもたらされる。
【０１５８】
組織化の誘導は、上記に規定された方法によって、すなわち、好ましくはマイクロウェルを含む非接着性足場を用いる空間的制限によって、少なくとも二重層の凝集塊の形成を誘導することによって、ならびに／または空洞化および上皮化処理、および多能性の維持に関するシグナル経路を調節することによって行われる。
【０１５９】
人工胚盤胞に由来する胚細胞構造体が胎児に発生したとき、ブラストイドとの用語は、もはや適用されない。これに代えて、胎児は「人工胎児」と称され、in vitro または in vivoで発生し得る。in vivo で発生した人工胎児は、哺乳類の子宮内部におけるブラストイドのさらなる発生に由来する胎児である。そのようなさらなる発生が in vitro で生じる場合、in vitro で発生した人工胎児と称される。
【０１６０】
好ましくは、二重層細胞凝集塊、またはブラストイドは、里親に挿入される。より好ましくは、本発明に係る細胞凝集塊は、空洞化後に（すなわち、ブラストイドとして）挿入され、さらに好ましくは栄養芽細胞の播種の1〜1000時間後、好ましくは48〜300時間後、たとえば約110時間後に挿入される。さらに好ましくは、ブラストイドは、当該技術分野で公知である任意の手段によって評価することができるように原始内胚葉の形成後に挿入される。
【０１６１】
本発明の細胞凝集塊を形成するための細胞株は、当該技術分野で公知の遺伝子操作法を用いて、またはタンパク質、酵素、もしくは化学物質などの生物学的、もしくは化学的因子を用いて、遺伝的、および後成的に改変することが可能である。そのような改変された細胞株は、胚、または胚外組織の形成に寄与する能力を有し得る。このことは、たとえば Macfarlan TS, Gifford WD, Driscoll S, Lettieri K, Rowe HM, Bonanomi D, Firth A, Singer O, Trono D, Pfaff SL, Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity Nature 2012 Jul 5; 487 (7405): 57-63; doi: 10.1038/nature11244; 
Morgani SM, Canham MA, Nichols J, Sharov AA, Migueles RP, Ko MS, Brickman JM, Totipotent embryonic stem cells arise in ground-state culture conditions. Cell Rep. 2013 Jun 27;3(6):1945-57. doi: 10.1016/j.celrep.2013.04.034. Epub 2013 Jun 6.)
Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):676-80. doi: 10.1038/nature12969 に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６２】
細胞凝集塊の形成において使用するための細胞株は、本発明に係るブラストイドの形成の前、または形成の間に遺伝子組み換えをすることができる。遺伝子組み換えは、内在性配列の組み換え、追加配列の挿入、部分的もしくは全体的な配列の除去、またはこれらの手段の任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１６３】
また、本発明の方法において使用される1以上の細胞は、公知の方法によって任意に組み換えられ、マーカ付けされた細胞をもたらす。そのようなマーカは、蛍光タンパク質、たとえば蛍光タンパク質であって、その発現が標的遺伝子の発現を調節および反映する蛍光タンパク質であってもよい。
【０１６４】
本発明に係る細胞凝集塊を形成する細胞株は、当該技術分野で公知であるようにほぼ無期限に保存することが可能である。保存細胞とは、培養培地と共に容器に挿入される細胞を意味する。培養培地は、細胞を生存させたまま保持し、それらの分裂を促進し、それらの分化を妨げるように機能する。したがって、培地における細胞数は、細胞の一部を反復して継代することが必要であるように増える。この部分は、続いて培養培地に組み合わせて容器に導入されるが、一方、細胞の非選択残部は、廃棄されるか、異なる容器で培養されるか、または保存のために凍結される。
【０１６５】
細胞の保持は、一般的な用語であり、特に保存および増殖を含み、細胞の生存および増殖を保持するが、未分化のままであるとの基本的な一般的意味を有する。このことは通常、好適な培養培地を必要とする。本発明の細胞凝集塊を形成するための細胞培養のための好適な培養培地は、細胞にとって好適な任意の細胞培養培地であり、細胞にとって好適な細胞培養培地は、当該技術分野において公知である。
【０１６６】
一般的に、細胞に好適な細胞培養培地は、たとえば、ビタミン、アミノ酸、および無機塩などを含む。しかしながら、細胞培養培地の的確な組成は、細胞の種類によって変化してもよく、当業者は、本発明において使用される各細胞の種類に適した細胞培養培地をどのようにして得るのか知っている。
【０１６７】
たとえば、多能性および／または全能性細胞のため、特にES細胞のための塩基性培地は、たとえばダルベッコ改変イーグル培地であり、ウシ胎児血清（FBS）（10％v/v）、L-グルタミン（2mM）、ベータ−メルカプトエタノール（50mM）、ペニシリン／ストレプトマイシン（50μg/ml）、非必須アミノ酸（1％v/v）、および白血病阻害因子（10μg/L）を含む。第２の例として、TS細胞のための塩基性培地は、炭酸水素緩衝システムを使用するRPMI1640であり、アミノ酸およびビタミン（77％v/v）、FBS（20％v/v）、ペニシリン／ストレプトマイシン（50μg/ml）、ピルビン酸ナトリウム（100mM）、L-グルタミン（2mM）、ベータ−メルカプトエタノール  50mM、FGF-4（25ng/ml）、ヘパリン（1μg/ml）の量を改変したものである。
【０１６８】
多能性および／または全能性細胞、特にES細胞の保存、増殖および保持のための別の好適な培地は、B27およびN2成分を含む無血清培地であり、当該培地は当該技術分野において公知であり、たとえば、所定の量で以下の化合物を組み合わせることによって作製することができる。DMEM/F12培地（48％v/v）、Neurobasal培地（48％v/v）、L-グルタミン（2mM）、N2サプリメント（1％v/v）、B27サプリメント（2％v/v）、ピルビン酸ナトリウム（100mM）、非必須アミノ酸（1％v/v）、ベータ−メルカプトエタノール（0.1mM）、ペニシリン／ストレプトマイシン（50μg/ml）、BSA（5mg/ml）。そのような培地は、Ying QL, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 2008 May 22;453(7194):519-23. doi: 10.1038/nature06968 に記載されている。
【０１６９】
多能性および／または全能性細胞、特にES細胞の保存、増殖および保持のための好適な別の培地は、E8培地として当該技術分野において公知の無血清培地であり、Chen G1, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, Smuga-Otto K, Howden SE, Diol NR, Propson NE, Wagner R, Lee GO, Antosiewicz-Bourget J, Teng JM, Thomson JA.Nat. Methods. 2011, “Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture”に記載されている。
【０１７０】
細胞株として、収集および／または培養することによって得られる全能性幹細胞などの、本発明に係る細胞凝集塊の形成おける使用のためのマウス全能性細胞と、たとえば多能性幹細胞のリプログラミングによって得られる、またはさらに分化した細胞種から得られる全能性細胞とは、たとえばES細胞用の塩基性培地において保持することができる。このことは、上述され、または Macfarlan TS, Gifford WD, Driscoll S, Lettieri K, Rowe HM, Bonanomi D, Firth A, Singer O, Trono D, Pfaff SL, Embryonic stem cell potency fluctuates with endogenous retrovirus activity Nature 2012 Jul 5; 487 (7405): 57-63; doi: 10.1038/nature11244) or Morgani SM1, Canham MA, Nichols J, Sharov AA, Migueles RP, Ko MS, Brickman JM. Totipotent embryonic stem cells arise in ground-state culture conditions. Cell Rep. 2013 Jun 27;3(6):1945-57. doi: 10.1016/j.celrep.2013.04.034. Epub 2013 Jun 6 or Bidirectional developmental potential in reprogrammed cells with acquired pluripotency. Obokata H, Sasai Y, Niwa H, Kadota M, Andrabi M, Takata N, Tokoro M, Terashita Y, Yonemura S, Vacanti CA, Wakayama T. Nature. 2014 Jan 30;505(7485):676-80. doi: 10.1038/nature12969 に記載されており、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
本発明に係る初期細胞凝集塊を好適に形成するために好ましい多能性細胞は、胚性幹細胞（ES細胞）である。たとえば、マウスES細胞は、上述の培養培地の1つにおいて保持することができる。具体的には、ES細胞は、当該技術分野で公知であるように、胚繊維芽（「mEF」）細胞の細胞層上に細胞を播種することによって増殖させることができる。mEF細胞の層は、mEF細胞を、1000〜50000細胞/cm2の密度、好ましくは10000〜25000細胞/cm2の密度で組織培養プレートに播種し、続いて増殖させることよって得られる。mEF細胞の付着は、上述の培養培地の1つにおいて実施することができる。これは、数時間から数日、好ましくは約1日を要し得る。この手順は、EF層をもたらし、その上にES細胞を播種することが可能である。マウスES細胞は、1〜50000細胞/cm2の密度、好ましくは10000〜25000細胞/cm2の密度で、好ましい培養培地中のEF細胞層上に播種される。mEF細胞上に播種されるマウスES細胞は、たとえば、1〜1000μg/Lの濃度で使用することができる白血病阻害因子などのシグナル伝達兼転写タンパク質シグナル活性化因子（STATタンパク質シグナル活性化因子）の存在下において好ましく増殖する。また、ES細胞は、たとえば支持細胞層なしに、たとえば、ゼラチンの被覆、または細胞外マトリックス、または当該技術分野で公知のミクロビーズの上で、たとえばmEF条件培地を用いて、たとえば、1μMの化学物質PD0325901、3μMのCHIR99021を用いて培養することが可能である。このことは、Nature. 2008 May 22;453(7194):519-23. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Ying QL, Wray J, Nichols J, Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A に記載されている。
【０１７２】
第２の例として、マウスTS細胞は、当該技術分野において知られているように、たとえば、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition). Andras Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute; Marina Gertsenstein, Samuel Lunenfeld Research Institute; Kristina Vintersten, European Molecular Biology Laboratory; Richard Behringer, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Cold spring harbour laboratory press に記載されているように、または無血清条件、たとえばKubaczka C, Senner C, AraMJ, Sharma N, Kuckenberg P, Becker A, Zimmer A, BrO, Peitz M, Hemberger M, Schorle H. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Reports. 2014 Jan 30;2(2):232-42. doi: 10.1016/j.stemcr.2013.12.013. eCollection 2014 Feb 11 によって記載されているTX培地中で培養することができる。
【０１７３】
たとえば、TS細胞は、上述されたように、1〜50,000細胞/cm2、好ましくは3,000〜10,000細胞/cm2の密度でEF細胞層上に播種され、好適な培地中で培養される（以下を参照）。マウスTS細胞は、任意に、マイトジェン−活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）および／または細胞外制御受容体チロシンキナーゼを活性化するタンパク質、たとえば繊維芽細胞増殖因子4（25ng/ml）および／または形質転換増殖因子スーパーファミリーのタンパク質部分、たとえばアクチビン（好ましくは約10ng/ml）および／またはtgfb1（好ましくは1〜10ng/ml）または機能的に同様の化合物の存在下において、好ましくはEF細胞上で維持される。
【０１７４】
mEF細胞層から増殖された、ESまたはTS細胞の分離は、公知の酵素的、または非酵素的方法によって好都合に実施され、トリプシン酵素は、細胞層、または凝集塊をほぐすために添加される。その後、支持層が使用された場合、mEF細胞は、好ましくはポリスチレンなどのプラスチック製の新しいプレートにおいて、5〜60分間、好ましくは約20分間培養することによって増殖させられ、mEF細胞を新しいプレートに接着させる。ESまたはTS細胞は、mEF細胞ほど速く接着しないので、ESまたはTS細胞をmEF細胞から分離することができる。この手法は、有利に繰り返されてもよく、ESまたはTS細胞からmEF細胞を分離し、培養培地中に純粋なESまたはTS細胞をもたらす。酵素的および非酵素的な細胞の分離方法は、当該技術分野で周知であるトリプシン処理法を含む。たとえば、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition). Andras Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute; Marina Gertsenstein, Samuel Lunenfeld Research Institute; Kristina Vintersten, European Molecular Biology Laboratory; Richard Behringer, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Cold spring harbour laboratory press を参照のこと。この内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
したがって、TS細胞は、トリプシン処理され、EFから除去され、TS細胞培養培地において再懸濁される。この懸濁液は、ES細胞クラスタを含むマイクロウェルに、マイクロウェル毎に、約3〜70個、好ましくは8〜45個、およびより好ましくは15〜20個の栄養膜幹細胞を播種される。TS細胞は、約15分から1時間で定着し、その後、以下に記載される、当該技術分野で公知の従来技術によって明視野顕微鏡下で数えることが可能である。このことは、たとえば、TS培地などの培養培地中にTS細胞を、好ましくは均一に、10μl〜10ml、好ましくは0.5〜3ml中に、1000〜100000細胞／チップ、好ましくは約17000細胞／チップで播種することによって行うことが可能である。
【０１７６】
本発明の方法における使用のために、保存、または保持する目的の細胞培養は、細胞種に適した温度、10〜60℃、好ましくは25〜45℃、より好ましくは35〜40℃で、好ましくは培養器中で実施される。
【０１７７】
本発明の方法の細胞凝集塊、たとえば初期細胞凝集塊、（少なくとも）二重層の凝集塊、または人工胚盤胞などを形成するための細胞培養は、好ましくは培養器において、細胞種に適した温度、一般的には10〜60℃、好ましくは25〜45℃、より好ましくは35〜45℃で実施される。
【０１７８】
本発明の初期細胞凝集塊は、栄養外胚葉様組織と、内部細胞塊様組織とに分化する能力を有する。内部細胞塊は、たとえばSox17およびPDGFRaの発現によって示されるように原始内胚葉に分化する能力を有する。したがって、本発明において使用される初期細胞凝集塊は、栄養外胚葉と内部細胞塊とに分化する能力を有する単一の細胞種を含み得る。このことは、たとえば、1以上の全能性細胞を含む細胞凝集塊における場合、好ましくは細胞凝集塊が本質的に全能性細胞種のみを含む場合である。あまり好ましくないが、本発明のこの実施形態は、本発明に包含される。
【０１７９】
初期細胞凝集塊を形成するためにES細胞をTS細胞に組み合わせる好ましい実施形態において、TS細胞の添加前に初期ES細胞クラスタを形成させるために、ES細胞培養について数時間から数日の培養期間、特に約１日が好ましい。
【０１８０】
好ましくは、少なくとも1つの栄養膜幹細胞およびES細胞が、上述されたような少なくとも1つの多能性幹細胞として使用される場合、ES細胞は、TS細胞の添加前に定着し凝集させられる。ES細胞の定着は、TS細胞の添加後と、たとえばRho/ROCK抑制因子、たとえばp160ROCK抑制因子Y27632などの細胞骨格制御因子の添加後とにおいて、たとえば1〜100μM、好ましくは2〜50μM、たとえば20μMの濃度で初期細胞クラスタ形成を可能にする。
【０１８１】
Rho/ROCK抑制因子のような細胞内張力抑制因子、または上述されたような、Wnt調節因子、好ましくはWnt活性化因子、PKA調節因子、好ましくはPKA活性化因子、PKC活性化因子、MAPK調節因子、好ましくはMAPK活性化因子、STAT調節因子、好ましくはSTAT活性化因子、Akt調節因子、好ましくはAkt活性化因子、Tga調節因子、好ましくはTga活性化因子、および／またはHippo調節因子、好ましくはHippo抑制因子を適切に補われたB27N2、TXまたはE8培地などの培養培地は、計数の前後、または計数の間に有利に添加されてもよい。
【０１８２】
E8培地は、当該技術分野において公知であり、Nat. Methods. 2011, “Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture” Chen G1, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, Smuga-Otto K, Howden SE, Diol NR, Propson NE, Wagner R, Lee GO, Antosiewicz-Bourget J, Teng JM, Thomson JA に記載されている。
【０１８３】
また、本発明の場合、他の部分に記載されたように、細胞の播種は均一に実施されることが好ましい。また、TS細胞は、培地の添加後に定着させることが好ましい。
【０１８４】
概して、本発明に係る、（少なくとも）二重層の初期細胞凝集塊と、それに続くESおよびTS細胞からのブラストイドとの形成のために、1つのマイクロウェルであって、有利には、約200μmの直径を有し、好ましくは単一の細胞クラスタとして約9個のES細胞を含み、約17個のTS細胞と20μMのRho/ROCK抑制因子、たとえばY27632とが添加されるマイクロウェルが好ましい。これは、本発明に係る、人工の胚盤胞と後続のブラストイドとを形成することが可能なES-TS細胞クラスタをもたらす。
【０１８５】
キャビティ毎の細胞の平均数は、公知の方法によって数えることができる。好適な数の細胞を播種するための１つの好適な方法は、血球計算器を使用して単一細胞懸濁液の細胞濃度を評価し、それに続いて好適な数の細胞を播種することである。単一キャビティにおいて、ブラストイドの形成の成功は、存在する細胞の数および種類に部分的に依存することを考えれば、使用される様々なキャビティにおいて可能な限り均一に細胞を播種することが現実的である。
【０１８６】
本発明によれば、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊、好ましくはES-TS細胞クラスタの培養は、好ましくは、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊の空洞化をもたらすように実施される。空洞化は、細胞の分化と増殖とによって、（少なくとも）二重層の細胞構造体から球形の構造体を形成する工程である。胞胚腔と称される、内部に液体を満たした空洞は、栄養外胚葉細胞の層によって取り囲まれ、胎盤を形成するそれらの能力によって特徴付けられる。また、栄養外胚葉は、転写因子である、CDX2、EomesおよびGATA3を発現する細胞によって特徴付けられる。また、空洞化工程は、内部細胞塊と、栄養外胚葉によって囲まれる胞胚腔とをもたらす。
【０１８７】
空洞化は、好適な培養条件を選択することによって行われてもよく、または自発的に起こってもよい。後者の場合、空洞化した凝集塊は、全ての培養された凝集塊から選択されてもよい。この場合における培養は、当該技術分野において公知の、および／または上述された任意の好適な培養培地において実施することができる。
【０１８８】
一実施形態において、空洞化は、任意の培養培地において細胞凝集塊を培養し、空洞化を起こさせることによって行われてもよい。このことは、しかしながら、たとえば、1000回あたり5回などの低い成功率で起こる。したがって、この方法によってブラストイドを得るためには、培養された細胞凝集塊の集団から適切に空洞化された細胞凝集塊を選択しなければならない。選択は、従来の顕微鏡下において胞胚腔の形成を可視化することによって実施することが可能である。
【０１８９】
しかしながら、ブラストイドは、空洞化を誘導する上述の成分を有する培養培地において細胞凝集塊を培養することによって、本発明に従って好ましく得ることが可能である。空洞化誘導成分は、固体として、または溶液で細胞培養に供給することができるが、好ましくは、それらは、B27N2、E8またはTXなどの公知の培養培地に添加され、細胞凝集塊を形成する細胞を培養するため、および／または細胞凝集塊を培養し人工胚盤胞を得るために使用される精密な培養培地を得る。
【０１９０】
1つの好ましい実施形態において、細胞凝集塊の空洞化は、Wnt経路、PKC経路、および／またはPKA経路の少なくとも1つ、ならびに好ましくは、MAPK経路、STAT経路、Akt経路、Tgf経路、および／またはHippo経路の少なくとも1つの調節によって行われる。
【０１９１】
最も好ましい実施形態において、細胞凝集塊の空洞化は、Wnt経路、PKC経路およびPKA経路の調節によって行われる。細胞凝集塊の空洞化におけるWnt、PKC、およびPKA経路の影響は、図4に記載されている。
【０１９２】
内部細胞塊（ICM）の寸法は、播種されたES細胞の平均数依存し、図4に記載されるように、マイクロウェル毎に播種されたES細胞の数とともに増加する。その投射面積によって規定される寸法は、一般的に1000〜5000μm2、好ましくは2000〜4500μm2である。寸法は、明視野顕微鏡によってICMの投射面積（μm2）を決定することによって簡便に表わされる。
【０１９３】
また、内部細胞塊（ICM）の寸法は、培地に含まれる特定の生物学的因子の濃度に依存する。たとえば、ICMの寸法は、PKA調節因子の濃度、たとえばcAMPの濃度などに依存する。ICMの寸法は、たとえばIGF2の濃度などのAkt調節因子の濃度に依存する。また、ICMの寸法は、たとえば、Il6、LIF、またはIl11の濃度などのSTAT調節因子の濃度に依存する。
【０１９４】
さらに代替的に、Wnt経路、PKC経路、PKA、MAPK経路、Hippo経路、形質転換増殖因子（Tgf）経路、およびAkt経路は、当該技術分野で知られているように遺伝的活性化によって調節することが可能である。
【０１９５】
したがって、本発明に係る方法において、細胞凝集塊を培養し、ブラストイドを得ることは、細胞培養培地において実施され、当該細胞培養培地は、好ましくは、Wnt経路、PKC経路、PKA経路、MAPK経路、STAT経路、Akt経路、Tgf経路、およびHippo経路調節因子からなる群の少なくとも１つ、好ましくはそれ以上を含む。
【０１９６】
ES-TS細胞クラスタを得るために、ES細胞は、白血病阻害因子（至適には9個のES細胞／マイクロウェル）を含むES培地におけるマイクロウェルアレイ上に最初に播種されることが非常に好ましい。ES細胞は、24時間培養され、凝集塊を形成する。TS細胞は、続いて、B27N2培地における同一のマイクロウェルアレイ上に播種される（至適には、17個のTS細胞／マイクロウェル）。Rho/ROCK経路および細胞骨格張力の抑制因子が添加され、ES細胞の凝集上へのTS細胞の凝集と、二重層凝集塊の形成とを促進することが非常に好ましい。これは、たとえば、約1〜100μM、好ましくは約20μMの、たとえばY27632などのp160ROCKの抑制因子であってもよい。
【０１９７】
ブラストイドを得るために、細胞凝集塊は、内部空洞を形成するべきである。このことを行う非常に好ましい手段は、Wntシグナル経路、PKC経路およびPKA経路を活性化することである。
【０１９８】
このことは、好ましくは、GSK3抑制因子、および／またはWntタンパク質を培地に添加することによって達成することができる。このことは、より好ましくは、GSK3抑制因子CHIR99021を、好ましくは0.3〜30μM、さらに好ましくは3μMで培地に添加することによって行われる。また、PKA活性化因子8Br-cAMPを、好ましくは0.1〜10mM、より好ましくは1mMで培地に添加し、PKC調節因子インドラクタムVを、好ましくは0.1〜10μM、より好ましくは1μMで培地に添加することが好ましい。
【０１９９】
空洞形成は、細胞核によって占められない凝集塊内の体積形成によって評価される。空洞形成は、好ましくは、核特異的色素（たとえば、DAPI）で細胞凝集塊を染色した横断薄片を用いて評価される。空洞形成は、より好ましくは細胞凝集塊の断面内における、細胞核を含まず、細胞凝集塊の総表面積の5％を超えて覆う表面の存在によって評価される。
【０２００】
ブラストイドを得るために、空洞化の間に、少なくとも1つの多能性幹細胞に由来し、胚を形成する能力を有する層状化された細胞凝集塊の内部細胞の少なくとも1つの集団の全能性または多能性が維持されることが非常に好ましい。このことは、MAPK、STAT、Akt、Tgf、および／またはHippo経路を調節することによって行うことが可能であり、好ましくはMAPK、STAT、Akt、Tgf経路の活性化によって、ならびにHippo経路の抑制によって行うことが可能である。
【０２０１】
このことは、より好ましくは、MAPK経路調節因子FGF4リガンドを、好ましくは1〜150ng/ml、より好ましくは15ng/mlで培地に添加することによって、および／またはSTAT経路調節因子HB-EGFリガンドを、好ましくは5〜500ng/ml、より好ましくは50ng/mlで培地に添加することによって、および／またはTgf経路調節因子Tgfbリガンドを、好ましくは0.5〜50ng/ml、より好ましくは5ng/mlで培地に添加することによって、および／またはAkt経路調節因子IGF2リガンドを、好ましくは1〜100ng/ml、より好ましくは10ng/mlで培地に添加することによって、および／またはSTAT経路調節因子Il6リガンドを、好ましくは3〜3000ng/ml、より好ましくは300ng/mlで培地に添加することによって行われる。
【０２０２】
ICMの多能性の維持は、POU5FI（POUドメイン、クラス5、転写因子1）としても知られるオクタマー結合転写因子4（Oct4）、性別決定領域Y-box2（Sox2）、およびNanogの発現によって評価される。これらの転写因子の発現は、当該技術分野において公知の、ポリメラーゼ連鎖反応、および／または免疫細胞化学によって評価される。
【０２０３】
転写因子の発現レベルは、当該技術分野において知られたように、ポリスチレンプレート上で培養された胚性幹細胞に比べて、5倍未満上方制御、または下方制御されなければならない。これらの転写因子の発現は、免疫組織化学によって評価することができる。転写因子に特異的な蛍光抗体の最大強度は、核内に位置しなければならず、当該技術分野において知られているように、ポリスチレンプレート上に播種された胚性繊維芽細胞層の上面で培養された胚性幹細胞に比べて、5倍未満上方制御または下方制御されなければならない。
【０２０４】
好ましくは、Wnt調節因子とMAPK調節因子とは、培養培地に存在する。両方の種類の調節因子の存在は、空洞化を誘導する有利な効果を有するが、細胞の生存力および多能性を維持する。
【０２０５】
より好ましくは、WntおよびMAPK調節因子のこの組み合わせは、PKAおよびTgfb調節因子の存在で増大する。この調節因子を添加する効果は、空洞の増加と、栄養外胚葉およびICMの生存力および多能性の維持とである。
【０２０６】
さらに好ましくは、Wnt、MAPK、PKAおよびTgfb調節因子の上述の組み合わせは、Akt、STAT、およびPKC調節因子の存在で増大する。このことは、細胞の多能性と生存力とを増加する有利な効果を有する。
【０２０７】
好ましい実施形態において、細胞凝集塊を培養し、ブラストイドを得ることは、Wnt経路活性化因子、MAPK経路活性化因子、PKA経路活性化因子、PKC経路調節因子、Tgf経路活性化因子、Akt経路活性化因子、STAT経路活性化因子およびHippo経路抑制因子を含む培養培地中で実施される。
【０２０８】
非常に好ましい実施形態において、ブラストイドを得るための培養は、B27N2培養培地において実施され、当該培養培地は、Y27632、CHIR99021、FGF4、8Br-cAMP、TGFb1、IGF2、インドラクタムV、Il6、およびエストラジオールを追加で含む。  より好ましくは、この培養培地において、Y27632は、約1〜100μM、好ましくは約20μMで存在し、CHIR99021は、約1〜25μM、好ましくは3μMで存在し、FGF4は、約2〜50ng/ml、好ましくは約15ng/mlで存在し、8Br-cAMPは、0.1〜10mM、好ましくは約1mMで存在し、TGFb1は、約1〜15ng/ml、好ましくは約5ng/mlで存在し、IGF2は、1〜15ng/ml、好ましくは約5ng/mlで存在し、インドラクタムVは、0.1〜10μM、好ましくは約1μMで存在し、Il6は、50〜900ng/ml、好ましくは約300ng/mlで存在し、エストラジオールは、1〜50ng/ml、好ましくは約10ng/mlで存在する。
【０２０９】
いくつかの化合物が、言及された２つ以上のクラスに該当することが知られており、その場合、２つ以上のクラスにおける機能性を有する単一化合物の使用は、単一化合物に割り当てられる各クラスにおける別の化合物の使用に置き換えられてもよい。
【０２１０】
上記に加えて、たとえばウシ胎児血清（FBS）のような血清、鉱物、ビタミン、ならびに培地中の細胞の生存維持、増殖および分化に役立つ他の化合物などの他の化合物を培養培地に含めることが有利である。
【０２１１】
本発明を実施するための最良の態様として記載の時点で知られていた細胞凝集塊を形成するための好ましい培養培地の例は、上記に規定されたように、B27N2培地を含み、以下の成分を補われた（おおよその最終濃度として）。
・20μM Y27632
・3μM CHIR99021
・10ng/ml IGF2
・1mM 8Br-cAMP
・5ng/ml TGFb1 
・15ng/ml FGF4 
・1nM 007-AM
・1μM  インドラクタムV
・300ng/ml Il6
・10％ウシ胎児血清（FBS）
【０２１２】
また、本発明は、本発明に従って得ることができるブラストイドに関する。
【０２１３】
また、本発明は、本発明の方法に従って得ることができる人工胚盤胞などのブラストイドに関する。
【０２１４】
また、本発明は、少なくとも二重層の細胞凝集塊であって、本発明の方法に従って得ることができる細胞凝集塊、好ましくは二重層細胞凝集塊、最も好ましくは上述されたようなES-TS細胞クラスタに関する。
【０２１５】
本発明に係る、空洞化、上皮化、および多能性の維持を含む培養培地を用いるさらなる利点は、遺伝的修飾を含むか、または含まない、多様なESおよびTS細胞株を使用することができることである。
【０２１６】
一般的に、空洞化後、本発明に係るブラストイドは、細胞凝集塊から形成される。初期の人工胚盤胞は、単離され、in vitro または in vivo でさらに成長させられてもよい。好ましくは、ブラストイドは、少なくとも空洞化が終わるまで培養される。空洞化は、従来の明視野顕微鏡によって観察することが可能であり、このことは空洞化の最終段階の決定を可能にする。
【０２１７】
人工胚盤胞を得た後、これは、他のブラストイド段階まで in vitro でさらに培養することができる。好ましくは、これは、当該技術分野において知られているように、細胞培養物を接着表面に移動させることによって行われる（Development of Mouse Embryos in vitro: Preimplantation to the Limb Bud StageAuthor(s): L. T. Chen and Y. C. HsuReviewed work(s):Source: Science, New Series, Vol. 218, No. 4567 (Oct. 1, 1982), pp. 66-68)を参照のこと）。これは、本明細書にその全体が組み込まれる。
【０２１８】
ブラストイドの空洞化が終了した後、人工胚盤胞は、細胞が生存することができる限り培養することができる（図3を参照）。
【０２１９】
第２の選択肢として、人工胚盤胞、または任意の直前の、もしくはさらに発生したブラストイド段階は、胚盤胞を哺乳類の卵管漏斗および／または子宮、好ましくは、胚盤胞の細胞が由来する同一、もしくは同様の種の哺乳類の子宮に胚盤胞を着床させることによって in vivo でさらに増殖させることができる。このことは、当該技術分野で従来知られたように行われる（Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Third Edition). Andras Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute; Marina Gertsenstein, Samuel Lunenfeld Research Institute; Kristina Vintersten, European Molecular Biology Laboratory; Richard Behringer, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, Cold spring harbour laboratory press を参照のこと）。この方法は、ブラストイドの胎児または生存動物への成長が意図される場合に好ましい（図3を参照）。
【０２２０】
しかしながら、その空洞化前に細胞凝集塊を移植すること、つまり、（少なくとも）二重層の細胞凝集塊であって、子宮内で空洞化することができる細胞凝集塊として移植することが可能である。
【０２２１】
しかしながら、本発明に係るブラストイドの in vivo 成長のために、いくらかのさらなる in vitro 発生後にブラストイドのみを着床させることが可能である。したがって、原腸胚、胚盤葉上層、または胎児として子宮への着床も可能であり、このことは、一般的に、in vitro における人工胚盤胞の培養が、形成後、約1〜30日、より好ましくは子宮への着床前の1〜10日にわたって継続されることを意味する。人工胚盤胞、またはさらに発生した in vitro で成長したブラストイド、またはそれから得られる胎児を子宮に据え、さらに本発明において in vivo で成長させることに関する任意の選択枝は、ブラストイドの in vivo 成長と称される。
【０２２２】
in vivo で成長するブラストイドによって得られる生存哺乳類は、遺伝的修飾を有してもよい。このことは、上述されたように、細胞を遺伝的に組み換え、細胞凝集塊を形成させることによって容易に行うことが可能である。細胞の1つの遺伝子組み換えは、同一の遺伝的背景と、同一の遺伝子組み換えとを有する単一の細胞株を得るために公知であるように、そのような細胞を増殖することによって増幅することが可能である。
【０２２３】
代替的に、生存キメラは、たとえば、異なる種に由来する細胞株に起因するキメラ、または異なる遺伝子組み換えを有する細胞株に由来するキメラなどの、異なる遺伝的背景を有する細胞株から細胞凝集塊を形成することによって得ることが可能である。好ましくは、しかしながら、細胞凝集塊を形成するために、異なる遺伝的背景は、遺伝子組み換えを含む、同一の細胞種の1つ以上の遺伝的変異に起因し、同一種内の2以上の遺伝的変異を有する生存キメラをもたらす。
【０２２４】
異なる遺伝子組み換えを有する複数の細胞株を1つの元来由来細胞株から作製することは、当業者によって理解されるように、同一の「基本」遺伝的背景を有するが、異なる遺伝子組み換えを有する遺伝子ライブラリをもたらす。そのような細胞株は、本発明において、ブラストイド、胎児、または生存哺乳類の、遺伝的に均一な、または遺伝的に多様なライブラリをもたらす。したがって、本発明は、後続のキメラの育種および異種交配の必要なしに、遺伝子組み換えされた哺乳類に簡便に至ることを可能にする。同時に、高い遺伝的均一性、または1つの遺伝的背景内で制御された遺伝的変異を得ることができる。
【０２２５】
再生医療は、疾患または外傷後の組織または器官を交換または再生することを目的とする。後の成人期において、組織再生は、胚プログラムの一過的な再構成によって行うことができる。したがって、in vitro ブラストイドは、機構、または再生、および所望の組織、または適切な分化能の容易な利用を提供する。このことは、胚の採取のために生存動物を使用することなく行われる。本発明に係るブラストイドは、したがって、適切な分化能を有する細胞が形成されるまでブラストイドを培養することによって、再生医療における使用に好適に分化した組織を得るために使用することが可能である。そのような細胞は、この組織を修復する目的で、抽出され、生存組織に移植されてもよい。特に、ブラストイドが、同一個体から得られる人工多能性幹細胞を用いることなどによって、修復される組織と同一の遺伝的背景の細胞に由来する場合、この手法は、修復が必要な組織を修復することが可能な遺伝的に等しい細胞をもたらす。
【０２２６】
ブラストイドにおける多能性幹細胞の被包化を介する、多能性幹細胞の微小環境ニッチの再生は、遺伝的および／または後成的な変化を誘導してもよく、遺伝子編集（たとえば、相同組み換え）を行う向上した能力のような、現行の幹細胞培養を超える好ましい特性をもたらす。
【０２２７】
毒性学の分野において、試験物質の胚毒性の予測は、胚性幹細胞試験（EST）を使用して欧州代替試験法検証センター（ECVAM）によってなされる。この試験法は、in vitro における、心筋細胞へのマウス胚性幹細胞の分化を利用する。in vitro 生成された人工の胚盤胞または組織、それから成長した胚または胎児は、そのような毒性試験のための有用な代替モデルを提供する。
【０２２８】
創薬の分野において、前臨床創薬の効率性と安全性とは、適切な in vitro モデルの欠如によって阻まれている。候補医薬は通常、組織の生理学的背景を不十分にしか反映しない細胞の単層で試験される。生存組織の複雑な in vitro モデルは、疾患の病態生理学を模倣するために非常に重要である。したがって、ブラストイドを得るための本発明の方法は、新規の薬剤標的を特定する高い見込みを有し、新規薬剤の臨床的成功の可能性を向上させる。
【０２２９】
また、臨床的な薬剤試験は、多くの場合、研究において疾患を有する動物を容易に取り扱うために特定の遺伝子が不活性化または変更された「ノックアウト」動物を必要とする。本発明に関して、そのような研究に使用される多くの動物は、上述のように、遺伝的に均一な、または制御された遺伝子組み換えを有するように育てられてもよい。このことは、動物モデルにおける新規薬剤の試験を促進し、より高い統計的関連性をもたらす。
【０２３０】
遺伝的疾患の分野において、遺伝子組み換えされた動物は、有望な治療を特定するために使用される。上述されたように、そのような動物は、多くの母性動物を犠牲にすることなく、キメラの作製、さらなる異種交配および育種を必要とすることなく、本発明の方法によって容易に得られる。
【０２３１】
また、未知の起源の遺伝的欠陥は、単一細胞を採取し、続いて本発明に係る凝集塊を形成するために好適な細胞株に in vitro 増殖することによって増幅されてもよい。したがって、遺伝的欠陥が生物学的に作り出されるときに通例のようなさらなる遺伝的変異なしに、研究中の遺伝的欠陥を有する多数の動物を得ることができる。
【０２３２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０２３３】
化合物および略語
・B27N2培地＝当該技術分野において公知の細胞培養培地であり、その組成は上述された。
・E8培地＝市販の細胞培養培地であり、その組成はNat. Methods. 2011,“Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture”・Chen G1, Gulbranson DR, Hou Z, Bolin JM, Ruotti V, Probasco MD, Smuga-Otto K, Howden SE, Diol NR, Propson NE, Wagner R, Lee GO, Antosiewicz-Bourget J, Teng JM, Thomson JA に記載されている。
・TX培地＝細胞培養培地であり、その組成は、Kubaczka C, Senner C, Arauo-Bravo MJ, Sharma N, Kuckenberg P, Becker A, Zimmer A, Br・tle O, Peitz M, Hemberger M, Schorle H. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions.Stem Cell Reports. 2014 Jan 30;2(2):232-42. doi: 10.1016/j.stemcr.2013.12.013. eCollection 2014 Feb 11 に記載されている。
・ES培地＝市販の細胞培養培地であり、その組成は上述された。
・CHIR99021＝GSK3aおよびGSK3βを抑制する化合物であり、化学名は、6-｛2-[4-（2,4-ジクロロフェニル）-5-（4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル）-ピリミジン-2-イルアミノ]‐エチルアミノ｝-ニコチンニトリル（CAS 252917-06-9）である。
・LIF：白血病阻害因子は、当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、マウスおよびラット胚性幹細胞の多能性を維持する。
・Y27632＝（1R,4r）-4-（（R）-1-アミノエチル）-N-（ピリミジン-4-イル）シクロヘキサンカルボキシアミドである。当該技術分野において公知の分子であり、Rho/ROCK経路を抑制する（CAS146986-50-7）。
・アクチビン＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、TGFシグナル経路を活性化する。
・形質転換増殖因子ベータ1（TGFb1）＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、TGFシグナル経路を活性化する。
・インドラクタムV＝当該技術分野で公知の分子であり、PKC経路を調節する（90365-57-4）。
・Il6＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、STATシグナル経路を活性化する。
・繊維芽細胞増殖因子4（FGF4）＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、MAPKシグナル経路を活性化する。
・ヘパリン結合EGF様増殖因子（HB-EGF）＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、MAPKシグナル経路を活性化する。
・インスリン様増殖因子2（IGF2）＝当該技術分野で公知のタンパク質および増殖因子であり、Akt経路を活性化する。
・インスリン＝当該技術分野で公知のタンパク質およびホルモンであり、AKTシグナル経路を活性化する。
・17β-エストラジオール＝当該技術分野で公知のホルモンであり、エストロゲン受容体とGPR30とを介してHippo経路を調節する（CAS79037-37-9）。
・タモキシフェン＝当該技術分野で公知の分子であり、エストロゲン受容体とGPR30とを介してHippo経路を調節する（CAS10540-29-1）。
・G-1＝当該技術分野で公知の分子であり、GPR30を介してHippo経路を調節する（CAS881639-98-1）。
【０２３４】
ES培地は、以下を含む。
・Pen/Strep  50μg/ml（Invitrogen社から入手可能である抗生物質、カタログ番号15070-063）
・L-グルタミン  1mM
・5ml  非必須アミノ酸（Invitrogen社 #11140-035、×100）
・ベータ-メルカプトエタノール  0.1mM
・75ml（=15％）  FBS  75ml
・500mlまでのDMEM
・白血病阻害因子、500〜1000ユニット/ml
【０２３５】
上述のES培地を含む、使用された「2i」培地は以下の追加の成分を有する。
・1μM  PD0325901  CAS番号  39210-10-9
・3μM  CHIR99021  CAS番号  252917-06-9
【０２３６】
TS培地は、以下を含む。
・250mlのRPMI培地1640（Invitrogen 61870または11875）
・65mlのウシ胎児血清
・Pen/Strep，50μg/ml
・ピルビン酸ナトリウム  1mM
・L-グルタミン，2mM
・ベータ-メルカプトエタノール  0.1mM
・FGF-4，25ng/ml
・ヘパリン，1μg/ml
【０２３７】
B27N2培地
・234ml  DMEM/F12（Invitrogen社  #11320-074，[-]  L-グルタミン）
・234ml  Neurobasal（Invitrogen社  #21103-049，［+］  L-グルタミン）
・2.5ml  （-1mM）  L-グルタミン（Invitrogen社  #25030，×100）
・5ml  非必須アミノ酸（Invitrogen社  #11140-035，×100）
・5ml  Pen/Strep（Invitrogen社  #15140）
・5mg/ml  BSA（Sigma社）
・5ml  ピルビン酸ナトリウム、最終濃度1mM（Invitrogen社  #11360-039，×100）
・2.3μl（=0.1mM）  ベータ-メルカプトエタノール（Sigma社）
・5ml  N2サプリメント（Invitrogen社）
・10ml  B27サプリメント（Invitrogen社）
【０２３８】
ブラストイド形成のための培養培地の調製
培養培地に好ましい成分を供給するための保存液は、
・10%FBS（Greiner Bio one社）
・Y27632：20μM
・CHIR99021（Axon Medchem社、axon 1386）  3μM
・8Br-cAMP（8Br-cAMP  エコノミーグレード、Biolog社、B007-50E）  1mM
・007-AM（Biolog社  C051）  1nM
・IGF2（R&D system社、292-G2-050）  10ng/ml
・TGFb1（R&D system社  338-AC-010）、10ng/ml
・FGF4（R&D system社  235-F4-025）、15ng/ml
・HB-EGF（R&D system社  259-HE-050）、50ng/ml
・17βエストラジオール（491187  Aldrich社）、10ng/ml
・インドラクタムV（3651  Tocris社）、1μM
【０２３９】
実施例１：ブラストイドの獲得
-4日目
マウス胚性繊維芽細胞（EF）-細胞は、組織培養ポリスチレンプレートにおけるES培地中に15,000細胞/cm2で播種された。細胞は、37℃に設定された培養器において1日間増殖させられた。
【０２４０】
-3日目
マウスES細胞は、LIF（500ユニット/ml）を含む「2i」培地中に15,000細胞/cm2でマウスEF層上に播種された。マウスES細胞は、37℃に設定された培養器において2日間培養された。
【０２４１】
-2日目
マウスTS細胞は、37℃に設定された培養器において、TS培地中に10000細胞/cm2の密度でマウスEF細胞層上に播種された。
【０２４２】
-1日目
マウスES細胞は、トリプシン処理され、マウスEF細胞は、4mlのES培地を用いて1つの15cmディッシュにおいて2×20分間培養することによって除去された。マウスES細胞は、150μLのES培地において7細胞／マイクロウェルで播種された。ES細胞は、20分間定着させられ、その後1mlのES培地を添加され、培養物は、37℃の培養器に静置され、マウスES細胞を1日間凝集させた。
【０２４３】
0日目
上述のように得られたマウスTS細胞培養物はトリプシン処理され、マウスEF細胞は、4mlのTS培地を用いて1つの15cmディシュにおいて2×20分間培養することによって除去された。得られたマウスTS細胞は、B27N2培地中に再懸濁された。
【０２４４】
マウスTS細胞は、150μLのB27N2培地中に17細胞／マイクロウェルで播種された。20分後、1mlのB27N2培地が添加され、当該培地は、10％FBS、Y27632  20μM、8Br-cAMP（1mM）、007-AM（1nM）、およびCHIR  3μM、FGF4  15ng/ml、Tgfb1  5ng/ml、IGF2  10ng/ml、エストラジオール10ng/mlを含んでいた。細胞は、37℃の培養器中で静置され、ES-TS細胞クラスタを形成させられた。
【０２４５】
次の日以降、以下の成分が添加され、これらの化合物の在り得る残余に関わらずゼロ初期濃度と仮定して、示される最終濃度をもたら。
【０２４６】
3日目（65時間）
B27N2培地は、以下の成分を添加され取り換えられる。
・FGF4（15ng/ml）
・TGFb1（5ng/ml）
アガロースチップを有する12ウェルプレートは、約110時間後に培養器から取り出された。これまでに人工胚盤胞がES-TS細胞クラスタの空洞化によって形成されていた。この時点で、非接着性足場を接着性足場（たとえば、ポリスチレン組織培養プレート）に置き換えることが可能であり、ブラストイドを in vitro で増やし続けるか、またはブラストイドを偽妊娠マウスの子宮に移植することが可能である。
【０２４７】
実施例２：可視化
二重層形成：TS細胞の外層とES細胞の内層とを有する（少なくとも）二重層の細胞凝集塊は、遺伝子導入された細胞株を用いて評価される。特に、ES細胞は、サイトメガロウイルスプロモータの制御下でヒストン2Bと赤色蛍光タンパク質とを導入され、クローンに由来する。H2B-RFP ES細胞は、したがって、それらの核内に赤色蛍光を恒常的に発現し、それらの追跡を可能にする。TS細胞は、全ての細胞でサイトメガロウイルスプロモータの制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を恒常的に発現するマウスに由来するものであった。GFP TS細胞は、したがって、それらの細胞質において緑色蛍光を発現し、それらの追跡を可能にする。二重層凝集塊の形成は、したがって、細胞の緑色外層と、細胞の赤色内層との観察によって評価される。取り囲みの効率性は、ES-TS細胞クラスタ培養の24時間後、赤色投影面積（ES細胞の内部凝集塊を表す）の周囲に描かれる人工的な3ピクセル幅の環と重複する緑色投影面積（TS細胞層を表す）の割合として測定される。図4に記載された、上述の取り囲みの効率性は、約200個のES-TS細胞クラスタから得られた平均値を表す。
空洞化：空洞形成は、細胞核によって占められていない凝集塊内の体積形成によって評価される。空洞形成は、核特異的色素（たとえば、DAPI）によって染色された細胞凝集塊の横断面切片を用いて好ましく評価される。空洞形成は、細胞核を含まず、細胞凝集塊の総表面積の20％以上を覆う、細胞凝集塊の横断面内の表面の存在によってより好ましく評価される。
CDX2、Oct4、Nanog発現：転写因子CDX2の発現は、GFP発現TS細胞を含むES-TS凝集塊において従来の免疫細胞化学によって評価される。cdx2の発現は、10μmの顕微鏡切片あたりのcdx2陽性の核を有するGFP陽性細胞の数として評価される。転写因子Oct4とNanogとの発現は、H2B-RFPを発現するES細胞を含むES-TS凝集塊において従来の免疫細胞染色によって評価される。Oct4とNanogとの発現は、10μmの顕微鏡切片あたりのOct4またはNanog陽性核を有するH2B-REP陽性細胞の数として評価される。
【０２４８】
ブラストイド形成のための手順の図式概要：自由に遊離した多能性マウスES細胞は、12ウェルプレートに静置されるアガロースチップに位置する200μmのマイクロウェルに挿入され（図1a）、ES培養培地において凝集させられる。これらのクラスタに対して、自由に浮遊したマウスTS細胞と（図1b）、培地とが添加される。培養培地における記載された化合物、特にRho/ROCK抑制因子の影響下において、細胞は、栄養膜幹細胞の二重層凝集塊（図1c、緑）と、胚性幹細胞（図1c、赤）とを形成し、続いて、培地中に存在する、特にWnt経路調節因子、PKA経路調節因子およびPKC経路調節因子の影響下において、空洞化し、栄養外胚葉（d、緑）と、異なる内部細胞塊（図1d、赤）とを形成し、ブラストイドをもたらす。
【０２４９】
栄養外胚葉は、MAPK経路活性化因子、STAT経路活性化因子、Akt経路活性化因子、Tgf経路活性化因子およびHippo経路抑制因子の包含によって栄養膜幹細胞（図2a）におけるCDX2発現によって観察されるように多能性を維持している。内部細胞塊は、H2B-RFP標識された胚性幹細胞におけるOct4発現によって観察されるように多能性を維持している（図2b）。内部細胞塊は、Nanog、Sox17およびPDGFRa発現によって分かるように、胚盤葉上層と、原始内胚葉とに分離する（図2c）。
【０２５０】
接着足場への接着後、ブラストイドは、天然に形成された胚盤胞と同様に、胚盤葉上層（Ep．）の伸長、近位内胚葉（V.E.）の形成、および外胎盤円錐（Ect.C．）の形成によってさらに発生する（図3a）。
【０２５１】
子宮への移植後（図3b）、ブラストイドは、脱落膜の形成を誘導し（図3c）、それらはさらに胎児、または生存動物に発生する（図3d）。
【０２５２】
結論：
in vitro で増殖されたマウスES細胞と、培養培地における細胞株に由来するマウスTS細胞とを組み合わせた後、当該培養培地は、好ましくは、Rho/ROCKシグナル調節因子、Wntシグナル調節因子、PKAシグナル調節因子、PKCシグナル調節因子、MAPKシグナル調節因子、STATシグナル調節因子、Aktシグナル調節因子、Tgfシグナル調節因子、Hippoシグナル調節因子およびEPAC1シグナル活性化因子の群から１つ以上を含み、ES細胞とTS細胞とはES-TS細胞クラスタに組み合わされ、約110時間後に空洞化、上皮化、多能性の維持、および原始内胚葉の分化を示す。したがって、ブラストイドが形成される。
【０２５３】
人工胚盤胞は、分離され、任意に子宮に固定または着床させることが可能である。また、それは、in vitro でさらに培養することが可能であり、さらに発生したブラストイドをもたらす。これは、分離し、任意に固定することも可能であるが、それは in vivo でさらに増殖させるために子宮に移植されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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