(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
in vivoで移植し得る（ready to be implanted）細胞を増殖させ、分離し（detach）及び調製する自動細胞培養及び回収装置であって、以下の構成要素：
装置の様々な構成要素内の細胞培養培地の循環及び流れを可能とする使い捨て可能な配管システム；
細胞がインレットポート（インプット）を通して操作者によってインプットされ、細胞培養チャンバー内での播種、増殖、分離が可能である、使い捨て可能な細胞培養チャンバー；
使い捨て可能な外部新鮮細胞培養培地レザーバー；
使い捨て可能な内部バッファー細胞培養培地レザーバー；
使い捨て可能な外部細胞分離剤レザーバー；
使い捨て可能な内部バッファー細胞培養培地レザーバーに接続する気体混合ボトル；
アウトレットポート（アウトプット）を通して操作者による調製した細胞のアウトプットが可能である使い捨て可能な細胞調製チャンバー；
配管システムと細胞培養チャンバーとを循環させるためのポンプ；
パラメーターモニタリングシステムに接続したパラメーター取得システム、ここでパラメーターモニタリングシステムはパラメーター取得システムから取得したパラメーターデータに基づいてポンプを自動制御するように構成され、それによって装置の操作を自動化する；及び
配管システム及び細胞培養チャンバーへのアクセスを制御するように設計され、それによって細胞、細胞培養培地、バッファー培養培地、気体混合物及び細胞分離剤の配管システム及び細胞培養チャンバー内の流れを制御する複数のバルブであって、パラメーターモニタリングシステムによって開閉するように構成されている複数のバルブ
を含み、
配管システムが細胞培養チャンバー、新鮮細胞培養培地レザーバー、バッファー細胞培養培地レザーバー、細胞分離剤レザーバー、及び細胞調製チャンバーに接続され、それによって装置への挿入のための使い捨て可能なカートリッジを提供し、調製された細胞の汚染を最小化するものであり、
使い捨て可能な細胞培養チャンバーがパラメーターモニタリングシステムによって制御される振動モーターに接続され、該振動モーターが使い捨て可能な細胞培養チャンバーに振動を伝え、使い捨て可能な細胞培養チャンバーに細胞分離剤をポンプによって流し込んだ後の細胞の分離を促進するように構成されており、
使い捨て可能な細胞培養チャンバーがパラメーターモニタリングシステムによって制御されるアクチュエーターモーターに接続され、該アクチュエーターモーターが使い捨て可能な細胞培養チャンバーを回転させて分離した細胞の回収を可能とするように構成されており、
細胞調製チャンバーが、回転した使い捨て可能な細胞培養チャンバーから回収された分離した細胞及び細胞分離剤を受け取るように構成されている、上記装置。
【請求項２】
分離したコンパートメントが異なる温度に調整される、請求項１記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項３】
第1のコンパートメントが約37℃の温度を維持するために温度制御され、かつ細胞培養チャンバーと特定量の循環する細胞培養培地とを含み；第2のコンパートメントが約4℃〜約8℃の間の温度を維持するために温度制御され、かつ新鮮培地レザーバーと特定量の細胞分離剤とを含む、請求項１又は２記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項４】
培地の連続的循環を伴う、請求項１〜３のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項５】
培地交換操作が、装置の第2のコンパートメントからの新鮮培地のインプットと、廃液タンクへの培地の廃棄とを含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項６】
培養チャンバーが、数個の増殖表面（層(layer)）と、層と外部シェルとの間の空きスペースとを有する、請求項１〜５のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項７】
細胞培養チャンバーが、更にフローデフレクター（flow deflector）を有し、細胞培養チャンバー、外部シェル及びフローデフレクターがポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、及びポリオキシ-メチレンからなる群より選択される生体適合性材料によって構成され、内部層がポリスチレン（PS）で構成され、細胞接着の増大のために処理される、請求項１〜６のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項８】
細胞接着のための処理が、
酸素プラズマ表面処理、
ポリ-D-リシン処理、
活性ペプチドアクリレート処理、又は、
接着斑プラーク成分（adhesion focal plaques components、RGD）若しくは分子の添加を含むか含まないアルギネートゲルでの層コーティング
を含む、請求項７記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項９】
分離剤の自動投与が、細胞培養チャンバーの回転及び振動と共に細胞分離段階で生じる、請求項１〜８のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１０】
細胞調製チャンバーが、細胞の速やかな回収のためにシリンジ又は他の抽出デバイスに接続されている、請求項１〜９のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１１】
播種、増殖、調製及び回収される細胞が非胚性幹非生殖細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１２】
細胞培養チャンバー内に注入される細胞が、in vitroで接着して生存及び増殖できる細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１３】
哺乳動物におけるin vivo細胞療法のために間葉系幹細胞を増殖及び調製するための方法であって、以下のステップ：
請求項１〜１２のいずれか１項記載の自動細胞培養及び回収装置を準備し；
該装置に新鮮細胞培養培地を提供し；
該装置の使い捨て可能な細胞培養チャンバーに細胞を播種し；
該細胞を十分な時間増殖させ；そして
増殖した細胞を回収する
を含む、上記方法。
【請求項１４】
使い捨て可能な細胞培養チャンバーに播種する細胞が、免疫修飾のための細胞、又は組織修復のための細胞である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
非胚性幹非生殖細胞が、骨髄、脂肪組織、臍帯血、臍帯マトリクス、末梢血、胎盤、胎盤血、筋肉、脳、腎臓及び他の固形臓器又は排出された液体である、請求項１１記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１６】
注入される細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞（AD-MSC）又は骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）である、請求項１２記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１７】
配管システム及び細胞培養チャンバー内で予め設定されたパラメーターをモニタリングし、パラメーターデータをパラメーター取得システムに送るセンサーを更に含む、請求項１記載の自動細胞培養及び回収装置。
【請求項１８】
細胞調製チャンバーが、細胞分離剤の通過を可能とするが、回収された分離した細胞の通過は遮断するように設計されているフィルターを備える、請求項１記載の自動細胞培養及び回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、in vivoにおける移植（transplantation or implantation）のための細胞培養及び回収装置に関する。より具体的には、本発明は、細胞培養物の完全に自動化され、制御された増殖を確実にし、かつin vivoで移植される細胞懸濁物の完全に自動化され、制御された調製を確実にする装置に関する。細胞は単層として培養される。細胞はまた、培養表面を増大させるために三次元（3D）構造物上に、又は好適なラフト（raft）若しくはビーズ上で培養することもできる。
【背景技術】
【０００２】
3D構造物又は足場上等の三次元（3D）環境中での細胞の増殖に関心が高まっている。3D足場上での細胞培養は、移植可能な組織構造物の作製のための組織操作（tissue engineering）において有用である。
【０００３】
WO 2011/073261A1号には、循環システム、培養装置、液体貯留層及びポンプを含む、in vivoにおける移植のための三次元構造上に接着する哺乳動物細胞の培養のための細胞プロセシングデバイス（バイオリアクター）が記載されている。
【０００４】
EP0402272B1号には、その分子単位中に窒素含有複素環を有するα,β-エチレン性不飽和モノマーの（コ）ポリマーから構成される合成高分子膜の層によってその反対面の少なくとも一部が被覆された高分子物質からなる微生物又は細胞培養物質が記載されている。
【０００５】
US2013/0058907号には、使い捨て培養基材モジュール（cultureware module）及び再利用可能なコンパクトな計測基材デバイス（instrumentation base device）を組み込んだ、初代細胞及び細胞株並びに患者特有の細胞又は細胞株を含む細胞を自動化された混入物質のない方法で増殖させることができる細胞培養システムが記載されている。
【０００６】
WO 2010/048417号には、インレットポートとアウトレットポートを有するハウジング、及び細胞増殖マトリクスを含み、細胞増殖マトリクスが平面状、ひだ状、又は中央コアの周りをらせん状に巻いたものであるかん流バイオリアクターが記載されている。
【０００７】
US 2008/0032398A1号には、複数の細胞培養かん流用の流路組み立てカートリッジを支持するためのインキュベーターラックが記載されており、このラックは、流路組み立てカートリッジを支持するためにそれぞれが適合した複数の溝を有する表面を有する水平面；該ラックと該複数のカートリッジとの間の送信データのための複数のデータインターフェース接続部；及び該ラック及び外部コンピューターとの間の通信のための少なくとも1つの制御インターフェースを含む。
【０００８】
US 2008/0220523A1号には、中空のファイバー基質上に細胞をまいて細胞を基質に接着させ、基質上で接着した細胞を増殖させ、増殖した細胞を基質から除去することを含み、細胞は非胚性幹細胞、非生殖細胞であり、細胞はテロメラーゼを発現し、形質転換されておらず、かつ正常の核型（karotype）を有している、ex vivoで細胞を増殖させる方法が記載されている。
【０００９】
US 2013/0210130A1号には、1つのバイオリアクターを含む閉鎖系である1つの閉じた細胞培養モジュール、及び、1つのポンプと1つの更なるツールモジュールを含む複数のツールモジュールを含み、更なるツールモジュールの少なくとも1つは上記閉じた細胞培養モジュールに対して、又は閉じた細胞培養モジュールの1又は数個の構成要素に対して可動であり、閉じた細胞培養モジュールを開けることなく、又は閉じた細胞培養モジュールを自動細胞培養配置から外すことなく、バイオリアクターの内容物に作用するか又はこれをモニタリングするように設定され、あるいは設定可能である、自動細胞培養配置が記載されている。
【００１０】
US 2013/0244322A1号には、培養培地のタンク、増殖因子及び培養すべき細胞、細胞培養若しくは増殖のための容器が収納される恒温槽（enclosure）を備えたインキュベーター、及び槽内の培養条件を制御し、既定の順序で液体を分配するためのバルブを管理することを意図する、データの入力及び記録のための手段を有する制御コンピューターシステム、を含む、細胞培養の自動装置であって、該装置は、上記コンピューターシステムによって制御され、上記槽内に収納される、細胞培養又は増殖用容器を支持し、撹拌するためのデバイスを含み、上記容器は上記タンクに接続した少なくとも1つのインレットポートと、培養後の細胞の回収及び保管のための手段に接続した1つのアウトレットポートを有する細胞増殖用の袋によって形成され、これらの回収及び保管のための手段及び上記タンクは槽外に設置され、該細胞増殖用の袋と共に該槽内に配置され予め組み立てられたモジュールを形成し、該槽の壁を通過する水路によって上記細胞増殖用の袋の上記ポートに接続されており、細胞増殖用の袋に該培養培地、増殖因子及び培養すべき細胞を供給し、かつ槽を閉じたままで細胞増殖用の袋の中身を回収及び保管手段内に回収することを可能とする、上記装置が記載されている。
【００１１】
US 2012/0315693A1号には、それぞれが気体透過性・液体不透過性の膜、反対面、及び気体透過性・液体不透過性の膜及び反対面の少なくとも一方に接続する少なくとも1つの側壁を有する複数の細胞増殖チャンバー；少なくとも1つの細胞増殖チャンバーの少なくとも1つの気体透過性・液体不透過性の膜と連通する少なくとも1つの導管スペース；及び複数の細胞増殖チャンバーの少なくとも１つへの接近を可能とする連結管（マニホールド）を含む細胞増殖装置であって、少なくとも1つの導管スペースは該導管スペースの周辺端部上に周辺サポートを含み、導管スペースの周辺端部上のサポートは、複数の隙間を形成するように離れて設置され、周辺サポート間の複数の隙間を通して外部環境から導管スペースに気体が流入することが可能である、上記装置が記載されている。
【００１２】
US 2009/191620号には、3つの細胞培養チャンバー及び2つの統合する気管様チャンバーを含み、各細胞培養チャンバーが少なくとも1つのポートを有し、各ポートがポートカバーを有し、各ポートが解除式の液密性密封をもたらすヒンジ付きのポートカバーとかみ合うように構成及び配置された、複数層の細胞培養装置が記載されている。
【００１３】
WO 08/112845A2号には、細胞増殖領域と供給領域とを有する少なくとも1つのバイオリアクターを有し、細胞増殖領域がプレートに隣接し、膜によって該供給領域から分離されている、細胞増殖のための使い捨て可能な装置が記載されている。バイオリアクターは、粗面又は波状面を有する複数のプレートを含む。少なくとも1枚の膜が隣接するプレートを分離する。隣接するプレート間の2枚のシートがメッシュによって分離されていても良い。
【発明の概要】
【００１４】
従って、細胞培養装置に関連する課題は、人間による操作のために、また異なる細胞培養物に同じ装置を使用するために生じる汚染である。
【００１５】
人間による操作及び汚染を回避し、異なる細胞株間での相互汚染を防止するために使い捨て可能な部品でできた装置を提供する目的で、in vivoで移植される細胞の高度に自動化された培養及び調製のための方法を提供する必要性がある。
【００１６】
本発明者等は今回、in vivoで移植することができる細胞を自動的に増殖し、分離し、調製する自動細胞培養及び回収装置であって、相互汚染を回避し、安全性を向上させるために、細胞及び培養培地に接触する構成要素が完全に使い捨て可能な「カートリッジ」を構成する、上記装置を見出した。
【００１７】
従って、本発明の目的は、in vivoで移植できる状態の細胞を自動的に増殖し、分離し、調製する自動細胞培養装置であって、細胞及び培養培地と接触する構成要素が完全に使い捨て可能な「カートリッジ」を構成する装置である。
【００１８】
本発明の細胞培養及び回収装置の細胞及び細胞培養培地と接触する構成要素の全ては、
装置の任意の構成要素の洗浄、又は定置洗浄（cleaning-in-place）の必要なしに1つの培養と別の培養とでの相互汚染（cross contamination）を完全に防止するために、完全に使い捨て可能な（単回使用の）ものである。
【００１９】
本発明の細胞培養及び回収装置は、細胞及び細胞培養培地と接触していない構成要素群（バルブ、ポンプ、センサー、アクチュエーターモーター、温度制御システム、非侵襲的パラメーター制御センサー）によって構成される。この構成要素群は装置の「ハードウェア」部を構成する。
【００２０】
細胞及び培養培地と接触する構成要素群（配管システム、細胞培養チャンバー、細胞調製チャンバー、レザーバー、廃液タンク）は、装置の使い捨て可能な部分、すなわち「カートリッジシステム」又は「カートリッジ」を構成し得る。
【００２１】
本発明の装置は、好ましくは異なる温度に調整された分離したコンパートメントによって構成される。
【００２２】
好ましくは、細胞の播種及び増殖を行う第1のコンパートメントは、約37℃の温度を維持するために温度制御され、例えば培養チャンバー及び特定量の循環する細胞培養培地等の細胞培養の重要な構成要素を含み得る。
【００２３】
好ましくは、第2のコンパートメントは、約4℃から約8℃の間の温度を維持するために温度制御され、新鮮培地のレザーバー、及び操作の最終段階で細胞分離のために使用する特定量の細胞分離剤を含み得る。
【００２４】
新鮮な培地と分離剤は、その重要な構成要素の生物活性を保つために好ましくは低温で維持される。
【００２５】
好ましくは、本発明の装置は、細胞培養チャンバー内の栄養物の分配を確実にし、またpHを約7に維持するための効率的な気体交換のために、培地の連続的な循環を備える。更に、培地交換（すなわち使い尽くされた培地の廃棄と新鮮な培地の再充填）は、最適な栄養物濃度を維持するために、かつ細胞数の増加後の異化生成物濃度を低下させるために重要である。
【００２６】
「栄養物」又は「栄養液」との用語は、哺乳動物又は脊椎動物細胞の培養に必須の栄養物質を含有する溶液を含むことが意図される。栄養液はまた、培養される細胞の表現型に特定の変化をもたらし得る。本発明のために使用可能な好適な栄養物は当分野で知られており、ウシ胎児血清、ヒト自己血清、L-アスコルビン酸、抗生物質、アミノ酸補給剤、抗酸化剤、ミネラル、細胞調整剤、活性化剤又は阻害剤を含み得る。
【００２７】
本発明の装置において、栄養物及び異化生成物濃度のモニタリングによって、栄養物の濃度は特定の閾値以下に下がらないようにすべきであり、異化生成物濃度は特定の値を越えないようにすべきであるという当分野で公知の原理に従った培地交換の自動的排出が可能となる。
【００２８】
好ましくは、培地交換操作は、本発明の装置の第2のコンパートメントからの新鮮培地の流入（インプット）、及び廃液タンクへの培地の廃棄を含む。
【００２９】
表面に接着して増殖する細胞を培養する場合、細胞培養チャンバー内の均一な細胞播種が自動化装置におけるよくある課題である。播種される細胞の適切な分配を確実にするために、本発明の装置の細胞培養チャンバーは、好ましくはいくつかの増殖表面（層）及び層と外部シェルとの間の空きスペースを有するように設計される。
【００３０】
本発明の装置における播種段階の操作の間、細胞培養チャンバーの回転及び空きスペースの存在によって、播種表面上への細胞の均一な分配を確実にし得る。
自動細胞培養装置において当分野で公知のもう一つの課題は、細胞の分離及び回収である。
【００３１】
本発明の別の目的は、接着細胞を自動的に分離してそれらを体内への移植のために調製することもできる自動細胞培養装置を提供することである。
本発明の装置は、分離剤の自動投与、並びに効率的かつ均質な細胞回収を確実にする細胞分離段階での細胞培養チャンバーの回転及び振動を特徴とする。
【００３２】
細胞調製チャンバーにおいて、細胞は濃縮され、分離剤は廃棄される。
細胞培養チャンバーは、好ましくは任意の生体適合性物質で構成され、好ましくは外部シェル及び偏光器（deflectors）はポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、ポリオキシ-メチレンから選択され、内層はポリスチレン（PS）で構成され、最終的には細胞接着性の増大のために処理される。
【００３３】
好ましくは、細胞接着のための処理は、酸素プラズマ表面処理、ポリ-D-リシン処理、活性ペプチドアクリレート処理を含む。あるいはまた、層は、後の細胞分離のために好適な物質でコートされていても良い。好ましくは、層は、接着斑プラーク成分（adhesion focal plaques components、RGD）又は細胞表面接着分子を添加した又は添加しないアルギネートゲルでコートされる。
【００３４】
細胞調製チャンバーは、好ましくはシリンジ又は細胞（「アウトプット細胞」）の即時（immediate）回収のための当分野で公知の他の抽出デバイスに接続される。「アウトプット細胞」とは、装置内で増殖された後に装置から回収される細胞をいう。アウトプット細胞は、好ましくは臨床又は他の目的、例えば研究、臨床試験等に使用される。
【００３５】
全ての操作は、細胞又は細胞培養培地と外部環境との接触を含まず、従って汚染の可能性を防止する。更に、操作は自動アクチュエーターで完全に制御され、従って人間による誤操作の可能性を防止する。
【００３６】
本発明の装置で播種され、増殖され、調製され、そして回収される細胞の好ましい種類としては、限定されるものではないが、骨髄、脂肪組織、臍帯血、臍帯マトリクス、末梢血、胎盤、胎盤血、筋肉、脳、腎臓及び他の固形臓器又は排出された液体を含むがこれらに限定されない任意の所望の組織から調製される非胚性幹非生殖細胞が挙げられる。
【００３７】
好ましくは、本発明の装置で播種され、増殖され、調製され、そして回収される細胞は、in vitroで接着して生存及び増殖できる細胞、より好ましくは脂肪由来間葉系幹細胞（AD-MSC）、骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）である。
【００３８】
本発明の装置の好ましい用途は、変形性関節症（osteoarthritis、OA）（変性性関節炎又は変形性関節疾患又は変形性関節症(osteoarthrosis)としても知られる）又は免疫調節及び／若しくは組織修復が必要とされる他の疾患の治療等で、注入される懸濁液中に接着依存性細胞が必要とされる全ての適用のための、in vivo細胞療法のための間葉系幹細胞の増殖である。
【００３９】
従って、本発明の別の目的は、哺乳動物におけるin vivo細胞療法のための、好ましくは注入される懸濁液中に接着依存性細胞が必要とされる全ての適用のための、より好ましくは変形性関節症または免疫調節及び／若しくは組織修復が必要とされる他の疾患の治療のための細胞の製造のための、間葉系幹細胞の増殖及び調製のための自動細胞培養装置の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の好ましい実施形態の自動細胞培養及び回収装置を示す全体的なブロック図を表す。
【図２】4層の培養チャンバーを表す（A:上面図；B:縦断面図）。
【図３】本発明の好ましい実施形態の自動細胞培養及び回収装置の主要構成要素を示す詳細な図を表す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図面の詳細な説明
図１は、装置の様々な構成要素内の細胞培養培地の循環及び流れを可能とする配管システム（tubing system）１；細胞がまかれ、増殖し、分離され、インレットポート（インプット）を通して操作者による細胞のインプットが可能である細胞培養チャンバー５；外部新鮮細胞培養培地レザーバー２；内部バッファー細胞培養培地レザーバー３；外部細胞分離剤レザーバー７；内部バッファーレザーバー３に接続する気体混合ボトル６；廃液タンク４；アウトレットポート（アウトプット）を通して操作者による調製した細胞のアウトプットが可能である細胞調製チャンバー８；パラメーターモニタリングシステム１０に接続したパラメーター取得システム９、を含む。細胞は細胞培養チャンバー５中にインレットポートによって注入され；細胞培養培地は内部バッファーレザーバー３から細胞培養チャンバー５まで配管システム１内を連続的に流れ、パラメーター制御システム９を通過して同じバッファーレザーバー３に循環して戻り；定期的に、パラメーター取得システム９及びモニタリングシステム１０による特定のパラメーター値において、外部新鮮培地レザーバー２から内部バッファー培地レザーバー３に規定量の新鮮な細胞培養培地が取り込まれ、一方で同量が廃液タンク４に廃棄され；細胞培養終了時に規定量の細胞分離剤が外部細胞分離剤レザーバー７から細胞培養チャンバー５に取り込まれ；細胞分離操作に必要な規定の時間の後、分離した細胞を細胞調製チャンバー８に取出し；そこで、過剰量の分離剤を廃液タンク４に廃棄しながら、所望の量の調製した細胞をアウトレットポートを通して取り出すことができる。
【００４２】
図２は、チャンバーの一側面から細胞培養培地１ａを取り込み、他方の側面１ｂによってチャンバー外に流出させるように配管システムに接続された細胞培養チャンバーを表す。細胞が接着して増殖する数個の層３がシェル２内に含まれ、多数のアンカー４を介してこれに接続されている。これにより、後の操作段階において細胞及び培地のより良好な分配を可能とする空きスペース５が規定される。各層３は円形の隙間６を中心に有する平面で形成される。シェル２並びに偏流板（flow deflectors）７は、任意の生体適合性材料で構成され得る。好適な材料の非排除的な例は、ポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、ポリオキシメチレン等である。層３は、細胞培養に適した任意の生体適合性材料で構成され、最終的に細胞接着増大のために処理され得る。好適な材料の非排除的な例はポリスチレン（PS）である。細胞接着のための処理の非排除的な例は、酸素プラズマ表面処理、ポリ-D-リシン処理、活性ペプチドアクリレート処理である。あるいはまた、層は、後の細胞分離のために適した物質でコーティングされていても良い。コーティングの非排除的な例は、接着斑プラーク成分（アルギニン-グリシン-アスパラギン酸）又は他の分子の添加を含むか含まないアルギネートゲルである。
【００４３】
チャンバーの両側面上のフローデフレクター（flow deflector）７は、流入する細胞培養培地の流れ１ａと、流出する細胞培養培地の流れ１ｂを分けるために、そして各層３への培地の正確な分配をもたらすために、多数のパイプ（層当たり１本のパイプ８）によって構成されている。チャンバー頂部上で、一連の円形の隙間６の上に配置されたシリンジプラグ１１は、層上に播種される細胞の最初の注入を可能とする。細胞は、シリンジ針によって、又はプラグに接続され、無菌条件のチャンバー内に侵入するのに好適な任意の他の手段によって注入することができる。円形の隙間の存在によって、播種段階の細胞のより均一な分配を確実にするために、シリンジ針（又は任意の他の好適な手段）を上部の層だけでなく、チャンバーの最も内部の空間にも到達させることができる。
【００４４】
チャンバー内への細胞の注入後、播種段階は、回転のためのアクチュエーターモーターと一体となった回転ギア９によって培養チャンバー全体の穏やかな回転状態にある。回転によって、また回転中にチャンバーの内壁に沿った培地と細胞の循環を可能とするシェルと層との間の空きスペース５の存在のために、細胞のより一層精密な分配が確実なものとなる。自由回転ジョイント１０がチャンバーの両側面上に存在するために、配管システムによって、チャンバーの回転が支持される。注入直後の短い規定の時間、及び24時間まで持続する播種段階のより遅い時期の短い規定の時間、穏やかな回転を行い得る。この時間に、細胞は層の上部表面及び下部表面の双方に接着するであろう。播種段階の後、細胞培養培地の流れは、チャンバーの回転と共に、チャンバー外の非接着細胞の流れを可能とする。
【００４５】
図３は、シリンジ１による、又は任意の他の好適な手段による、プラグ３を通した細胞培養チャンバー２への細胞の注入で操作が開始する細胞培養及び回収装置を表す。非排除的な例において、プラグはシリコン隔壁、又は注入中の無菌性を確保できる任意の他の手段から構成され得る。播種は、回転のためのギアシステム４及びそのアクチュエーターモーター５によって可能となる細胞培養チャンバー２の数回の短く穏やかな回転と、層を水平位に保ってチャンバーが静的状態にある数回の長時間の休止期（interval）からなる。播種段階の間、細胞培養チャンバーを通る培地の流れはない。播種段階の合計時間の非排除的な例は6〜24時間である。播種段階中に作動される回転の回数の非排除的な例は1〜12回である。各回転の持続時間の非排除的な例は1〜5分間である。上記の操作を「播種段階」と呼ぶことができる。
【００４６】
配管システム１４は、内部の細胞培養培地バッファーレザーバー６を細胞培養チャンバー２及び装置の他の構成要素と接続し、蠕動ポンプ１５の作用、又は他の任意の手段によって駆動される細胞培養培地を運ぶ。配管システムは、任意の好適な生体適合性材料によって作製され得る。生体適合性配管材料の非排除的な例はシリコーン、ポリ塩化ビニル（PVC）、Pharmed（登録商標）BPTである。レザーバーボトル６はまた、細胞培養培地のガス交換を行うために、また細胞培養培地内に存在するのが炭酸塩バッファーの場合にはpHを維持するために、気体混合ボトル２５に接続される。この例において、１０ｂ、１１ｂ及び１２ｂは通常は閉じたバルブ（例えば電気式バルブ）であり、１０、１１及び１２は通常開いているバルブ（例えば電気式バルブ）である。上記のバルブ構造の結果、ポンプ１５の作用によって細胞培養培地９がレザーバーボトル６から細胞培養チャンバー２に流され、１４ｂの配管部を通ってレザーバーボトル６に戻る。培養培地の上記の流れを「循環段階」と呼ぶことができる。
【００４７】
播種段階の後、細胞培養チャンバーを通る培地の動員によって、非接着細胞の除去、及び細胞培養チャンバー内の細胞培養培地の交換が確実となるであろう。通常は開いているバルブ１１を閉じ、通常は閉じているバルブ１１ｂを開けることによって、培地は細胞培養チャンバーから廃液タンク１３に流れるであろう。培養培地の上記の流れは「洗浄段階」と呼ぶことができ、特定量の緩衝化された細胞培養培地を利用することができる。
【００４８】
洗浄段階の後、廃液タンク１３に廃棄された細胞培養培地の量は、同量の新鮮な細胞培養培地で置き換えられるべきである。この目的のために、ポンプ７（又は任意の他の好適な手段）の作用、及びレザーバーボトル６と外部新鮮培地レザーバー８を接続する配管システムによって、レザーバーボトルへの新鮮な培地の取り込みが確実となる。上記の新鮮な培養培地の流れは「再充填（refill）段階」と呼ぶことができる。
【００４９】
細胞培養チャンバー内の接着細胞の成長（あるいは「増殖」と示す）は、所望の数の細胞を得るために必要な時間、すなわち層表面に対して利用できる最大数の細胞を得るために必要な時間、持続させる。細胞成長の間、循環段階を数回の洗浄段階及び再充填段階と交互に実施する。洗浄段階及び再充填段階の回数並びにタイミングは、循環する細胞培養培地を特徴づけるいくつかのパラメーターの値に依存する。循環する培養培地の組成をモニタリングし、記録し、そして制御するために、いくつかのパラメーターセンサー（本実施形態における２８及び２９）を使用することができる。特定のパラメーター値及び特定の閾値に設定したセンサーのデータに従って、循環する培養培地の適切な組成を回復させるために、循環段階の後に洗浄及び再充填段階を行うことができる。この操作は、バルブ１１、１１ｂ及びポンプ７に対して上記のように自動的に作用するパラメーター制御ユニットによって自動的に制御される。モニタリングし、記録し、そして制御すべきパラメーターの非排除的な例は、pH、グルコース濃度、溶存酸素濃度、乳酸濃度である。特に、非排除的な例において、グルコース消費速度を細胞増殖段階のグルコース濃度速度論から導くことができ、チャンバー内の細胞濃度の間接的な指標として使用することができる。すなわち、細胞増殖段階の終了は、装置によって自動的に決定され得る。
【００５０】
適切な細胞成長の後、上記の通り、チャンバー内の層上に増殖した接着細胞の分離が必要である。この目的のために、バルブ１０及び１１を閉じ、バルブ１１ｂを開けることによって（バルブ１０ｂ及び１２ｂは閉じたままである）、細胞培養培地が廃液タンク１３に送られるために、ポンプ１５の作用で培養チャンバーが空になるであろう。培養培地の上記の廃棄は「排出段階（emptying phase）」と呼ぶことができる。
【００５１】
細胞培養チャンバーが空になると（すなわち細胞培養培地が内部に存在しない）、バルブ１０ａを開け（上記の通りバルブ１０は閉じたままである）、ポンプ１５によって特定量の分離剤１６を細胞培養チャンバー内に流し込む。分離剤の量は予め決められており、細胞培養チャンバーを満たすのに十分なものである。分離剤の非排除的な例は、クエン酸（細胞培養層がアルギネートゲルでコーティングされている場合）、トリプシン／EDTA、コラゲナーゼ（細胞がプラスティック上に接着している場合）である。
【００５２】
接着細胞に対する分離剤の分離効果と合わせて、分離効率を向上させるために、細胞培養チャンバーの高速回転を実施しても良い。上記の通り、回転は回転のためのギアシステム４及びそのアクチュエーターモーター５によって行われる。更に、細胞分離効率を更に向上させるために、細胞培養チャンバーを、振動モーター１７によって作動される振動運動に付すことができる。振動の時間の非排除的な例はおよそ30秒間であり、振動強度は0.1〜10ヘルツである。上記の細胞の分離は、「分離段階」と呼ぶことができる。
【００５３】
細胞の分離後、バルブ１２を閉じ、一方でバルブ１２ｂを開ける。そうすることで、ポンプ１５が分離した細胞を分離剤と共に細胞培養チャンバー外に流し出し、細胞調製チャンバー１９に到達させる。細胞調製チャンバーは、その円錐形の底部にフィルター２０を備える。このフィルターの孔は、分離剤及び任意の他の液状物質の通過を可能とし、細胞の通過は遮断するように設計されている。フィルター２０の孔の大きさの非排除的な例は1μmである。細胞調製チャンバーが分離した細胞及び分離剤で満たされると、ポンプ１８がフィルター２０を通して廃液タンク１３に向けて液体を流し、濃縮された細胞２１を調製チャンバーの円錐形の底部に残す。上記の細胞の濃縮及び分離剤の廃棄は「調製段階」と呼ぶことができる。
【００５４】
濃縮された細胞を回収するために、シリンジ２３（又は任意の他の好適な手段）をプラグ２２に接続することができる。非排除的な例において、プラグはシリコン隔壁、又は注入中の無菌性を確保できる任意の他の手段から構成され得る。シリンジピストン２３ｂはピストンアクチュエーターモーター２４に取り付けられていても良い。アクチュエーターモーターは、シリンジを分離した濃縮細胞で満たすためにピストンを引き上げる。非排除的な例において、アクチュエーターモーターは、濃縮された細胞の均一な再懸濁を確実にするためにピストンを数回上下させることもできる。シリンジはまた、希釈剤、防腐剤、キャリア剤等の1種以上の適切な物質を含むことができる。これらの物質の非排除的な例は、ヒアルロン酸溶液、生理溶液、緩衝塩溶液、コラーゲン溶液、多血小板血漿（PRP）である。上記の細胞調製チャンバーからの細胞の最終的な回収は、「回収段階」と呼ぶことができる。
【００５５】
回収された細胞、及び最終的には上記の通り他の希釈剤を含むシリンジ２３（又は任意の他の好適な手段）は、取り外され、細胞を体内に直接移植するために使用することができる。移植部位の非排除的な例は、関節、乳房組織、心臓、肝臓、脳脊髄液（CSF）、血液である。
【００５６】
細胞培養チャンバー２、バッファー培地レザーバー６、配管システム１４及び関連する構成要素を含む、記載した構成要素は全て、適切な温度制御システム２６によって温度制御されるコンパートメント（図３に示す）内に含まれる。細胞の播種及び増殖のための最適温度は37℃である。気体交換ボトル２５、廃液タンク１３、細胞調製チャンバー１９及び関連する構成要素は温度制御されていなくても良く、室温で作動することができる。外部新鮮培地レザーバー８及び分離剤１６は、適切な温度制御システム２７によって温度制御される別個のコンパートメント（図３に示す）内に含まれている。培地レザーバー及び分離剤は約4℃〜約8℃の間の温度に維持される。
【００５７】
図３において、使い捨て可能な「カートリッジ」システムを構成する要素は、２、３、６、１４、１９、２０、２２、２３、２３ｂである。要素８、１３及び１６も使い捨て可能であり、配管システムによって「カートリッジ」システムに適切に接続される。
本発明は、以下を提供する。
［１］in vivoで移植し得る（ready to be implanted）細胞を増殖させ、分離し（detach）及び調製する自動細胞培養及び回収装置であって、細胞及び培養培地に接触する構成要素が完全に使い捨て可能な「カートリッジ」を構成する、上記装置。
［２］装置の様々な構成要素内の細胞培養培地の循環及び流れを可能とする配管システム１；細胞が播種され、増殖し、分離され、インレットポート（インプット）を通して操作者による細胞のインプットが可能である、細胞培養チャンバー５；外部新鮮細胞培養培地レザーバー２；内部バッファー細胞培養培地レザーバー３；外部細胞分離剤レザーバー７；内部バッファーレザーバー３に接続する気体混合ボトル６；廃液タンク４；アウトレットポート（アウトプット）を通して操作者による調製した細胞のアウトプットが可能である細胞調製チャンバー８；及びパラメーターモニタリングシステム１０に接続したパラメーター取得システム９、を含む、上記１記載の自動細胞培養及び回収装置。
［３］異なる温度に調整された分離したコンパートメントによって構成される、上記１又は２記載の自動細胞培養及び回収装置。
［４］第1のコンパートメントが約37℃の温度を維持するために温度制御され、かつ細胞培養チャンバーと特定量の循環する細胞培養培地とを含み；第2のコンパートメントが約4℃〜約8℃の間の温度を維持するために温度制御され、かつ新鮮培地レザーバーと特定量の細胞分離剤とを含む、上記１〜３のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［５］培地の連続的循環を伴う、上記１〜４のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［６］培地交換操作が、装置の第2のコンパートメントからの新鮮培地のインプットと、廃液タンクへの培地の廃棄とを含む、上記１〜５のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［７］培養チャンバーが、数個の増殖表面（層(layer)）と、層と外部シェルとの間の空きスペースとを有する、上記１〜６のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［８］細胞培養チャンバーが、任意の生体適合性材料によって構成され、好ましくは外部シェルとデフレクター（deflector）がポリスチレン（PS）、ポリカーボネート（PC）、ポリオキシ-メチレンから選択され、内部層がポリスチレン（PS）で構成され、最終的に細胞接着の増大のために処理される、上記１〜７のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［９］細胞接着のための処理が、酸素プラズマ表面処理、ポリ-D-リシン処理、活性ペプチドアクリレート処理、又は、後の細胞分離のために適した物質での、好ましくは接着斑プラーク成分（adhesion focal plaques components、RGD）若しくは分子の添加を含むか含まないアルギネートゲルでの層コーティングを含む、上記１〜８のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［１０］分離剤の自動投与が、細胞培養チャンバーの回転及び振動と共に細胞分離段階で生じる、上記１〜９のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［１１］細胞調製チャンバーが、好ましくは臨床又は他の目的、例えば研究、臨床試験等において使用される細胞の速やかな回収のためにシリンジ又は他の抽出デバイスに接続されている、上記１〜１０のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［１２］播種、増殖、調製及び回収される細胞が、任意の所望の組織から調製される非胚性幹非生殖細胞、好ましくは骨髄、脂肪組織、臍帯血、臍帯マトリクス、末梢血、胎盤、胎盤血、筋肉、脳、腎臓及び他の固形臓器又は排出された液体である、上記１〜１１のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［１３］細胞培養チャンバー内に注入することができる細胞が、in vitroで接着して生存及び増殖できる細胞、好ましくは脂肪由来間葉系幹細胞（AD-MSC）又は骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）である、上記１〜１２のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置。
［１４］哺乳動物におけるin vivo細胞療法のために間葉系幹細胞を増殖及び調製するための、上記１〜１３のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置の使用。
［１５］免疫修飾及び／又は組織修復が必要な変形性関節症又は他の疾患の治療のための細胞の製造のための、上記１〜１３のいずれか記載の自動細胞培養及び回収装置の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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