(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体結合タンパク質及び抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質を含む組成物であって、
前記抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、Ｂｃｌ−ｘＬであり、  前記インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体結合タンパク質は、Ｉ型又はＩＩ型ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）への結合に対して選択的な変異体ＩＬ−４であり、
当該融合タンパク質は、Ｉ型又はＩＩ型ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）を発現している標的細胞の、細胞生存を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、又は細胞死に対して保護することができる、
組成物（但し、アルブミンを含む組成物を除く）。
【請求項２】
前記インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体結合タンパク質は、環状順列置換されている（ｃｐ）、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＩＩ型ＩＬ−４Ｒへの結合に対して選択的な前記変異体ＩＬ−４は、ＫＦＲ変異形若しくはＫＦ変異形を含み、又はＩ型ＩＬ−４Ｒへの結合に対して選択的な前記変異体ＩＬ−４は、ＲＧＡ変異形を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記融合タンパク質がリンカーをさらに含む、請求項１から請求項３のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５】
前記リンカーが配列ＧＳを有するか、又はユビキチン若しくはユビキチン変異形分子である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記融合タンパク質が配列番号１８及び２０〜２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか一項記載の融合タンパク質をエンコードする核酸分子を含む組成物（但し、アルブミンを含む組成物を除く）。
【請求項８】
配列番号３０又は３１のいずれか１つの核酸配列を含む核酸分子を含む組成物（但し、アルブミンを含む組成物を除く）。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の核酸分子を含むベクターを含む組成物（但し、アルブミンを含む組成物を除く）。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞を含む組成物（但し、アルブミンを含む組成物を除く）。
【請求項１１】
医薬組成物である、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−４受容体結合タンパク質融合体に関する。より詳細には、本発明は一つには、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質部分に連結されたインターロイキン−４又はインターロイキン−１３タンパク質部分を含む融合タンパク質を提供する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−４（ＩＬ−４）は、活性化Ｔ細胞によって産生される多面的なサイトカインであって、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）に結合することもできるＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）に対するリガンドである。ＩＬ−４は、多くのサイトカインのように、先ず高親和性受容体鎖（「α」と表す）に結合し、次いでそのＩＬ−４−α鎖複合体は、「γｃ」と表される第２の低親和性受容体鎖と結合する。したがって、ＩＬ−４に対する一次結合鎖はＩＬ−４受容体アルファ（ＩＬ−４Ｒα）であり、これは高い親和性（ＫＤ＝〜１０−１０Ｍ）をもって結合する。ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体は次いで、ＩＬ−４受容体の第２成分、γｃ（「Ｉ型」受容体）と比較的低い親和性をもって結合することができる。さらに、ＩＬ−４／ＩＬ−４Ｒα複合体は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）受容体α１（ＩＬ−１３Ｒα１）（「ＩＩ型」受容体）と結合することもできる。  
【０００３】
異なる細胞型は、異なる量のＩ型及びＩＩ型受容体鎖を発現する。例えば、ＩＬ−４Ｒαはほとんどの細胞上に存在するが、γｃは一般に造血細胞上に発現され、ＩＬ−１３Ｒα１は一般に非造血細胞上に発現される。従って、γｃは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好塩基球、マスト細胞、及びほとんどのマウスＢ細胞上に認められる（ほとんどのヒトＢ細胞はγｃ及びＩＬ−１３Ｒα１の双方を発現する）が、ＩＬ−１３Ｒα１はそうではない。  
【０００４】
マクロファージ及び樹状細胞を含むいくつかの骨髄由来細胞は、γｃ及びＩＬ−１３Ｒα１を発現し、その結果ＩＬ−４及びＩＬ−１３の双方に応答する。ＩＬ−１３Ｒα１は、平滑筋及び上皮細胞を含めほとんどの非骨髄由来細胞上に認められるが、γｃはないに等しい。
【０００５】
Ｉ型及びＩＩ型受容体に対して差動的選択性を有する変異形（バリアント）ＩＬ−４分子が提案されている（Junttila et al. Nature Chemical Biology 8:990-998, 2012）。
【０００６】
環状順列置換された（circularly permuted）分子は、線状分子（例えばリガンド）の末端が、直接か又はリンカーを介して繋ぎ合わせられて環状の分子を形成し、その後当該環状の分子は別の位置で開環されて、元の分子の末端とは異なる末端を持つ新しい線状分子を形成するものである。ＩＬ−４の環状順列置換された変異形は、例えば２０００年１月４日にPastanらに発行された米国特許第６，０１１，００２号に記載されている。
【０００７】
プログラム細胞死すなわち「アポトーシス」は、動物細胞の発生において共通の現象であり、正及び負の双方に制御される。神経（neuronal）細胞系及びリンパ系発生並びに細胞集団全体の恒常性維持（ホメオスタシス）における関与に加えて、アポトーシスは、アポトーシス経路の異常な制御に起因する種々の疾患及び傷害で重要な役割も果たす。例えば、アポトーシスによる神経細胞死の異常な活性化は、アルツハイマー疾患（Barinaga, Science 281 : 1303-1304）、ハンチントン病、脊髄性筋萎縮症、発作時に引き起こされる神経細胞損傷（Rubin, British Med. Bulle., 53(3):617-631, 1997に概説；及びBarinaga, Science 281: 1302-1303）、一過性虚血性神経細胞損傷（例えば脊髄傷害）などの多くの神経変性疾患及び状態に関わっている。逆に、アポトーシスの異常な抑制の結果、細胞の過増殖を引き起こす可能性があり、これは癌及び他の過増殖性障害につながる。
【０００８】
アポトーシスは、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーを含むいくつかのタンパク質によって制御されている。Ｂｃｌ−２は、アポトーシスを制御するものとして同定された最初のタンパク質の１つであった（Cleary et al., Cell 47: 19-28, 1986; Tsujimoto and Croce, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :5214-5218, 1986）。その発見以降、いくつかのＢｃｌ−２関連タンパク質（「Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質」又は「Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー」）が、アポトーシスの制御因子として同定されている（White, Genes Dev. 10: 1-15, 1996; Yang et al., Cell 80:285-291, 1995）。
【０００９】
神経変性疾患、癌などの処置のためのいくつかの治療薬が検討されているが、臨床におけるそれらの使用を制限する限定事項を示すものである。例えば、多くの化学療法剤は、増殖している新生物性細胞においてアポトーシスを誘導することによって作用するが、それらの治療的価値は、正常細胞に対するそれらの毒性の程度によって限定される。標準的なアポトーシス阻害分子、例えばペプチド型カスパーゼ阻害剤（例えばＤＥＶＤ型）での処置は、これらの阻害剤の膜透過性が低いために臨床的作業には不要であることが分かっている。
【００１０】
癌細胞を選択的に排除しようと企図して、標的指向化された免疫毒素（例えば細菌性毒素などの毒性分子と、標的指向化ドメイン由来の、典型的には抗体からの分子との間の遺伝的又は生化学的融合体）が提案されている。例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）変異形が作製され、癌細胞を選択的に死滅させるそれらの能力について試験されている（Thorpe et al., Nature 271 :752-755, 1978; Laske et al, Nature Medicine 3 : 1362-1368, 1997）。同様に、緑膿菌（シュードモナス）外毒素（ＰＥ）融合タンパク質が、可能性のある癌療法として研究されている（Kreitman and Pastan, Blood 90:252-259, 1997; Shimamura et al. Cancer Res. 67:9903-9912; 2007）。ＤＴ−ＢｃｌｘＬ融合タンパク質は、様々な細胞型においてスタウロスポリン、γ−照射及びポリオウイルスにより誘導されるアポトーシスを阻止するそれらの能力について検証されている（Youle et al, Proc Natl Acad Sci. 96:9563-9567）。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＢｃｌｘＬ（ＧＭ−ＣＳＦ−ＢｃｌｘＬ）融合タンパク質は、ヒト単球の増殖を高め、また誘導された細胞死から細胞を保護することが示されている（Youle et al, JBC 282(15): 11246-11254）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、インターロイキン−４融合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、一つには、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバータンパク質部分に連結された、インターロイキン−４又はインターロイキン−１３などのインターロイキン−４受容体結合タンパク質部分を含む融合タンパク質、及びその使用を提供する。
【００１２】
１つの態様では、本発明は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体結合タンパク質及びＢｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４受容体結合タンパク質は、環状順列置換（ｃｐ）されていてよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチド（Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ又はＢｃｌ−２など）であってよい。当該融合タンパク質は、細胞生存を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、細胞死に対して保護すること、細胞活性化を高めること又はＩＬ−４Ｒを発現している標的細胞の細胞成熟を促進することができてよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４受容体結合タンパク質は、Ｉ型又はＩＩ型ＩＬ−４受容体（ＩＬ−４Ｒ）への結合に対して選択的な変異体ＩＬ−４又はＩＬ−１３であってよい。ＩＩ型ＩＬ−４Ｒへの結合に対して選択的な変異体ＩＬ−４は、ＫＦＲ変異形又はＫＦ変異形を含んでよい。Ｉ型ＩＬ−４Ｒへの結合に対して選択的な変異体ＩＬ−４は、ＲＧＡ変異形を含んでよい。変異体ＩＬ−１３は、Ａ１１変異形又はＤＮ変異形であってよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はさらにリンカーを含んでよい。リンカーは、配列ＧＳを有するか、又はユビキチン又はユビキチン変異形分子であってよい。
【００１７】
いくつかの態様では、本願明細書に記載されるような融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００１８】
いくつかの態様では、本願明細書に記載されるような融合タンパク質を、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞含む医薬組成物が提供される。
【００１９】
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激する、細胞生存を増強する、細胞死若しくはアポトーシスを阻害する、細胞死に対して保護する、細胞活性化を高める又は細胞成熟を促進する方法であって、それを必要とする被験者に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することにより細胞増殖を刺激する、細胞生存を増強する、細胞死若しくはアポトーシスを阻害する、細胞死に対して保護する、細胞活性化を高める又は細胞成熟を促進する方法が提供される。
【００２０】
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激する、細胞生存を増強する、細胞死若しくはアポトーシスを阻害する、細胞死に対して保護する、細胞活性化を高める又は細胞成熟を促進する方法であって、ＩＬ−４Ｒを発現する標的細胞を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターと接触させることにより細胞増殖を刺激する、細胞生存を増強する、細胞死若しくはアポトーシスを阻害する、細胞死に対して保護する、細胞活性化を高める又は細胞成熟を促進する方法が提供される。
【００２１】
いくつかの態様では、免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することにより免疫応答を増強する方法が提供される。
【００２２】
いくつかの態様では、免疫応答を増強する方法であって、ＩＬ−４Ｒを発現する標的細胞を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターと接触させることにより免疫応答を増強する方法が提供される。
【００２３】
いくつかの態様では、神経障害若しくは病態又は自己免疫障害を処置する方法であって、それを必要とする被験者に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクター、又は当該ベクターを含む宿主細胞を投与することにより神経障害若しくは病態又は自己免疫障害を処置する方法が提供される。
【００２４】
いくつかの態様では、神経障害又は病態を処置する方法であって、ＩＬ−４Ｒを発現する神経細胞又は幹細胞を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより神経障害又は病態を処置する方法が提供される。
【００２５】
いくつかの態様では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質を含む組成物であって、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質をさらに含む組成物が提供される。
【００２６】
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激する方法であってＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質をさらに投与すること、又は細胞をＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質に接触させることにより細胞増殖を刺激する方法が提供される。
【００２７】
いくつかの態様では、細胞増殖を刺激するため、免疫応答を増強するため又は神経障害若しくは自己免疫障害を処置するための、それを必要とする被験者における、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターの使用が提供される。
【００２８】
他に採用しうる態様の種々の実施形態では、前記被験者はヒトであってよい。
【００２９】
いくつかの態様では、養子細胞移入療法又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法において使用するための、設計操作されたＴ細胞を増殖又は拡張する方法であって、設計操作されたＴ細胞を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドを含む融合タンパク質、当該融合タンパク質をエンコードする核酸分子、又は当該核酸分子を含むベクターに接触させることにより、前記設計操作されたＴ細胞を増殖又は拡張する方法が提供される。
【００３０】
本要約は必ずしも、本発明のすべての特徴を記載するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴は、添付の図面を参照する以下の説明からさらに明らかになるであろう。
【００３２】
【図１】図１は、GSNOでの浸襲後の神経系（neural）細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）生存に対するｃｐＩＬ−４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬ又はｒｈＩＬ−４の効果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＳＴＳでの浸襲後の神経系細胞（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ）生存に対するｃｐＩＬ−４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬ又はｒｈＩＬ−４の効果を示すグラフである。
【図３】図３Ａ〜Ｅは、ヒト樹状細胞導出（derivation）に対するＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ及びｃｐＩＬ−４−Ｂｃｌ−ＸＬの効果を示すグラフである。
【図４】図４Ａ〜Ｂは、ｃｐＩＬ４−ＢｃｌｘＬ（Ａ〜Ｂ）及びｃｐＩＬ４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬ（Ｃ〜Ｄ）融合構築体の核酸（配列番号３０及び３１）及びアミノ配列（配列番号１８及び２０）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、一つには、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に連結されたＩＬ−４Ｒ結合タンパク質を含む融合タンパク質、及びその使用を提供する。
【００３４】
ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質
【００３５】
ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質は、ＩＬ−４及びＩＬ−１３を含む。
【００３６】
ＩＬ−４タンパク質又はＩＬ−４「タンパク質部分」は、未変性ＩＬ−４タンパク質と、さらには変異形ＩＬ−４タンパク質を包含する。「未変性」又は「野生型」ＩＬ−４配列とは、本願明細書で使用する場合、天然源から精製されたか又は組み換え技術を用いて作製されたかのヒトＩＬ−４配列を称し、以下のとおりのアミノ酸配列（Ｎ末端に追加のメチオニンあり）を含む。
【００３７】
【化１】
0006661530.tif 000002
【００３８】
他に採用しうるヒトＩＬ−４配列は、以下のとおりのアミノ酸配列（Ｎ末端に追加のメチオニンあり）を含む。
【００３９】
【化２】
0006661530.tif 000003
【００４０】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−４タンパク質は、例えばJunttilaら（Nature Chemical Biology 8:990-998, 2012）に記載される、ＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に比してγｃ（Ｉ型受容体）に対する選択性が増強されている変異形ＩＬ−４タンパク質、又はその逆のものである。いくつかの実施形態では、γｃ（Ｉ型受容体）に対する選択性が増強されている変異形ＩＬ−４タンパク質は、例えばJunttilaら（Nature Chemical Biology 8:990-998, 2012）に記載される、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）の配列又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）に対して以下の変異：Ｒ１２１Ｑ／Ｙ１２４Ｗ／Ｓ１２５Ｆ（「ＲＧＡ」又は「ｓｕｐｅｒ−４」又は「Ｓ４」変異形）を含むＩＬ−４タンパク質である。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に対する選択性が増強されている変異形ＩＬ−４タンパク質は、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）の配列又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）に対して以下の変異：Ｒ１２１Ｋ／Ｙ１２４Ｆ／Ｓ１２５Ｒ（「ＫＦＲ」又は「ＫＦＲ４」変異形）又はＲ１２１Ｋ／Ｙ１２４Ｆ（「ＫＦ」変異形）を含むＩＬ−４タンパク質である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−４タンパク質は、例えば、２０００年１月４日にPastanらに発行された米国特許第６，０１１，００２号に記載のように、環状順列置換されている（ｃｐ）。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−４タンパク質は、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）の残基３８〜１２９（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）が、以下のとおり残基１〜３７にGGNGGリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−４タンパク質を含む。
【００４３】
【化３】
0006661530.tif 000004
【００４４】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−４タンパク質は、「ＲＧＡ」又は「ｓｕｐｅｒ−４」又は「Ｓ４」変異形に関連して、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）の残基３８〜１２９（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）が、以下のとおり残基１〜３７にGGNGGリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−４タンパク質を含む。
【００４５】
【化４】
0006661530.tif 000005
【００４６】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−４タンパク質は、「ＫＦＲ」変異形に関連して、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）の残基３８〜１２９（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）が、以下のとおり残基１〜３７にGGNGGリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−４タンパク質を含む。
【００４７】
【化５】
0006661530.tif 000006
【００４８】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−４タンパク質は、「ＫＦ」変異形に関連して、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）の残基３８〜１２９（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）が、以下のとおり残基１〜３７にGGNGGリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−４タンパク質を含む。
【００４９】
【化６】
0006661530.tif 000007
【００５０】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−４タンパク質は、未変性ヒトＩＬ−４（例えば配列番号１）又は他に採用しうるＩＬ−４配列（例えば配列番号２）の残基１０５〜１２９（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）が、例えば、２０００年１月４日にPastanらに発行された米国特許第６，０１１，００２号に記載のように、残基１〜１０４にGGNGGリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−４タンパク質を含む。
【００５１】
本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−４タンパク質の例としては、本願明細書に記載されるもの、さらには、変異形ＩＬ−４タンパク質がＩＬ−４受容体に結合する能力を保持するか、又は例えばJunttilaら（Nature Chemical Biology 8:990-998, 2012）に記載されるようにＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に比してγｃ（Ｉ型受容体）に対する選択性の増強又はその逆を保持するか、又は所望の生物活性を保持する限りにおいて、未変性ＩＬ−４（「変異形ＩＬ−４タンパク質」）と少なくとも８０％の配列一致度（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも９９％の配列一致度）を有する配列が挙げられる。
【００５２】
本開示のＩＬ−４タンパク質には、１２９アミノ酸の未変性ＩＬ−４タンパク質よりも小さいものでありうる断片であって、当該ＩＬ−４タンパク質断片はＩＬ−４受容体に結合する能力を保持するか、又は例えばJunttilaら（Nature Chemical Biology 8:990-998, 2012）に記載されるようにＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に比してγｃ（Ｉ型受容体）に対する選択性の増強又はその逆を保持するか、又は所望の生物活性を保持するかの条件付きであり、未変性配列の断片として、又はｃｐフォーム若しくはその断片として含まれるということを理解されたい。
【００５３】
本開示に包含されるのは、本願明細書に記載されるような、又は当該技術分野で公知のＩＬ−４タンパク質を、エンコードする核酸分子であって、本願明細書に記載されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を含むが、これらに限定されないということも理解されたい。
【００５４】
ＩＬ−４核酸分子の例として以下のものが挙げられる。
【００５５】
【化７】
0006661530.tif 000008
【００５６】
ＩＬ−１３タンパク質又はＩＬ−１３「タンパク質部分」は、未変性ＩＬ−１３タンパク質と、さらには変異形ＩＬ−１３タンパク質を包含する。「未変性」又は「野生型」ＩＬ−１３配列とは、本願明細書で使用する場合、天然源から精製されたか又は組み換え技術を用いて作製されたかのヒトＩＬ−１３配列を称し、以下のとおりのアミノ酸配列（Ｎ末端に追加のメチオニンあり）を含む。
【００５７】
【化８】
0006661530.tif 000009
【００５８】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−１３タンパク質は、野生型ＩＬ−１３タンパク質に比してＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に対する選択性が増強されている変異形ＩＬ−１３タンパク質である。例えば、ＩＬ−１３変異形配列は、以下のとおりのアミノ酸配列（Ｎ末端に追加のメチオニンあり）を含んでよい。
【００５９】
【化９】
0006661530.tif 000010
【００６０】
いくつかの実施形態では、野生型ＩＬ−１３タンパク質に比してＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に対する選択性が増強されている変異形ＩＬ−１３タンパク質は、未変性ヒトＩＬ−１３（配列番号７）の配列に対して以下の変異：Ｌ１０Ｖ／Ｅ１２Ａ／Ｖ１８Ｉ／Ｒ６５Ｄ／Ｄ８７Ｓ／Ｔ８８Ｓ／Ｌ１０１Ｆ／Ｋ１０４Ｒ／Ｋ１０５Ｔ（「ＤＮ」変異形）を含む（ナンバリングはＮ末端のメチオニンを除外）ＩＬ−１３タンパク質である。例えば、ＩＬ−１３変異形配列は、以下のとおりのアミノ酸配列（Ｎ末端に追加のメチオニンあり）を含んでよい。
【００６１】
【化１０】
0006661530.tif 000011
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−１３タンパク質は環状順列置換された（ｃｐ）。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−１３タンパク質は、未変性ヒトＩＬ−１３（配列番号７）の残基４４〜１１４が、以下のとおり残基１〜４３にリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−１３タンパク質を含む。
【００６３】
【化１１】
0006661530.tif 000012
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができる変異形ｃｐＩＬ−１３タンパク質は、以下のとおりである。
【００６５】
【化１２】
0006661530.tif 000013
【００６６】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−１３タンパク質は、「Ａ１１」変異形に関連して、未変性ヒトＩＬ−１３（配列番号７）の残基４４〜１１４が、以下のとおり残基１〜４３にリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−１３タンパク質を含む。
【００６７】
【化１３】
0006661530.tif 000014
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができる変異形ｃｐＩＬ−１３タンパク質は、以下のとおりである。
【００６９】
【化１４】
0006661530.tif 000015
【００７０】
他に採用しうる実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができるｃｐＩＬ−１３タンパク質は、「ＤＮ」変異形に関連して、未変性ヒトＩＬ−１３（配列番号７）の残基４４〜１１４が、以下のとおり残基１〜４３にリンカー及び最初のメチオニン残基で連結されたＩＬ−１３タンパク質を含む。
【００７１】
【化１５】
0006661530.tif 000016
【００７２】
いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質において使用することができる変異形ｃｐＩＬ−１３タンパク質は、以下のとおりである。
【００７３】
【化１６】
0006661530.tif 000017
【００７４】
本開示の融合タンパク質において使用することができるＩＬ−１３タンパク質の例としては、本願明細書に記載されるもの、さらには、変異形ＩＬ−１３タンパク質がＩＬ−１３受容体に結合する能力を保持するか、又は野生型ＩＬ−１３タンパク質に比してＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に対する選択性の増強を保持するか、又は所望の生物活性を保持する限りにおいて、未変性ＩＬ−１３（「変異形ＩＬ−１３タンパク質」）と少なくとも８０％の配列一致度（少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はさらに少なくとも９９％の配列一致度）を有する配列が挙げられる。
【００７５】
本開示にかかるＩＬ−１３タンパク質には、１１４アミノ酸の未変性ＩＬ−１３タンパク質よりも小さいものでありうる断片であって、当該ＩＬ−１３タンパク質断片はＩＬ−１３受容体に結合する能力を保持するか、又は野生型ＩＬ−１３タンパク質に比してＩＬ−１３Ｒα１（ＩＩ型受容体）に対する選択性の増強を保持するか、又は所望の生物活性を保持するかの条件付きであるということを理解されたい。
【００７６】
本開示に包含されるのは、本願明細書に記載されるような、又は当該技術分野で公知のＩＬ−１３タンパク質を、エンコードする核酸分子（ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列を含むが、これらに限定されない）であるということも理解されたい。
【００７７】
ＢＣＬ−２ファミリータンパク質
【００７８】
Ｂｃｌ−２関連タンパク質又はポリペプチド（「Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質」又は「Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー」）は、アポトーシスの制御に関わっている。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、２つの別異のカテゴリー、すなわち、細胞死を阻害するもの（「抗アポトーシス性」Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質）、及び細胞死を増強するもの（「アポトーシス促進性」Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質）に属する。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３、及びＢＨ４と表される、１から４の保存されたＢｃｌ−２相同性（ＢＨ）ドメインを共有する。
【００７９】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質には、Ｂｃｌ−２自体、Ｂｃｌ−ｘＬ（Boise et al., Cell 74:597-608, 1993; 例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ０７８１７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２３１１５）、Ｂｃｌ−ｗなどが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質において使用することができるＢｃｌ−ｘＬタンパク質は、以下のとおりの配列を含む。
【００８０】
【化１７】
0006661530.tif 000018
【００８１】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は、Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの少なくとも断片を含み、ここで抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又は断片は、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。「細胞生存を増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を増強すること」とは、細胞の成長又は増殖を増加させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を低下させる（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。細胞生存の増強、細胞増殖の増強、又は細胞死若しくはアポトーシスの阻害を測定するための好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
【００８２】
本開示に包含されるのは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのタンパク質をエンコードする核酸分子又はその断片であって、本願明細書に記載されるようなもの又は当該技術分野で公知のものであるということも理解されたい。
【００８３】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの核酸分子の例としては、以下のものが挙げられる。
【００８４】
【化１８】
0006661530.tif 000019
【００８５】
ＩＬ−４Ｒ受容体結合タンパク質／抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質
【００８６】
本開示にかかる「融合タンパク質」は、本願明細書に記載されるような、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに、任意の付加的配列又は部分（リンカーなど）で連結されたＩＬ−４及びＩＬ−１３などのＩＬ−４Ｒ結合タンパク質、さらにはこのような融合タンパク質をエンコードする核酸分子を含む。さらに含まれるのは、融合タンパク質をエンコードする核酸配列がプロモーターに作動可能に連結された組み換え核酸分子、このような分子を含むベクター、及びこのような分子を含む遺伝子導入細胞である。
【００８７】
ＩＬ−４（ｃｐＩＬ−４及びＩＬ−４断片及び変異形を含む）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗにより例示されるような抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチド、又はその断片若しくは変異形に、得られる融合タンパク質が抗アポトーシス活性を保持する限り連結可能である。
【００８８】
いずれの型のＩＬ−４又は誘導体も使用できる。例えば、ＩＬ−４、又はＩＬ−４受容体に結合するＩＬ−４の断片を使用できる。加えて、複数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形を単数のＩＬ−４タンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能であり、又は複数のＩＬ−４タンパク質又はその断片若しくは変異形を単数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能であり、又は複数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形を複数のＩＬ−４タンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能である。
【００８９】
ＩＬ−１３（ＩＬ−１３断片又は変異形を含む）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗにより例示されるような抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチド、又はその断片若しくは変異形に、得られる融合タンパク質が抗アポトーシス活性を有する限り連結可能である。いずれの型のＩＬ−１３又は誘導体も使用できる。例えば、ＩＬ−１３、又はＩＬ−１３受容体に結合するＩＬ−４の断片を使用できる。加えて、複数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形をＩＬ−１３タンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能であり、又は複数のＩＬ−１３タンパク質又はその断片若しくは変異形を抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質又はその断片若しくは変異形に連結可能である。
【００９０】
本願明細書で論じられるように又は当該技術分野で公知のように、ｃｐＩＬ−４は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ又はＢｃｌ−ｗにより例示されるような抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーポリペプチドに、その融合タンパク質が抗アポトーシス活性を保持する限り連結可能である。いずれの型のｃｐＩＬ−４又は誘導体も使用できる。加えて、複数のｃｐＩＬ−４タンパク質を単数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に連結可能であり、又は複数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質をｃｐＩＬ−４タンパク質に連結可能であり、又は複数のｃｐＩＬ−４タンパク質を複数の抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質に連結可能である。
【００９１】
融合タンパク質の例を表１に示す。
【００９２】
【表１−Ａ】
0006661530.tif 000020
【００９３】
【表１−Ｂ】
0006661530.tif 000021
【００９４】
【表１−Ｃ】
0006661530.tif 000022
【００９５】
ＩＬ−４又はＩＬ−１３のようなＩＬ−４Ｒ結合タンパク質の、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーへの連結又は「融合」は、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質の一部分が抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの一部分に直接付着するように直接であってよい。例えば、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質のアミノ酸配列の一端を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのアミノ酸配列の端に直接付着させることができる。例えば、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質のＣ末端を抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのＮ末端に連結させることができ、又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーのＣ末端をＩＬ−４Ｒ結合タンパク質のＮ末端に連結させることができる。このような融合タンパク質を作製する方法は当該技術分野で通例のものであり、例えば組み換え分子生物学的方法を用いる。
【００９６】
リンカー
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質部分は、リンカーによって間接的に、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー部分に連結させることができる。リンカーは、例えば、単純に２つの部分を連結する簡便な方法として、２つの部分を空間的に分離する手段として、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質若しくは抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー、又はこれらの組み合わせに付加的な機能性を提供するうえで役立つことができる。
【００９８】
一般に、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質部分と抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー部分とを連結させるリンカーは、（１）２つの分子を折り重ねて互いに独立に作用させ、（２）２つの部分の機能性ドメインを干渉しうる規則二次構造を生じる傾向を有さず、（３）機能性タンパク質ドメインと相互作用しうる疎水性若しくは荷電特性を最低限とし、且つ／又は（４）２つの領域の空間的分離をもたらすように設計可能である。例えば、ある例では、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質と抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーとを空間的に分離して、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質が抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの活性を干渉し、且つ／又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーがＩＬ−４Ｒ結合タンパク質の活性を干渉することを防止するのが望ましいことがある。リンカーは、例えば、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質と抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーとの間の結合に不安定性を、酵素切断部位（例えば、プロテアーゼに対する切断部位）を、安定性配列を、分子タグを、検出可能なラベルを、又は種々のこれらの組み合わせを提供するのにも使用可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質（ｃｐ分子内など）又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの２つのドメインの間に存在することができる。
【００９９】
リンカーは、二官能性又は多官能性であることができ、すなわち、少なくとも概ね、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質に結合することができるか又は結合するように修飾されているリンカーの第一端部に、又はその近傍に第一の反応性官能基と、修飾されている抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに結合することができるか又は結合するように修飾されているリンカーの反対側の端部に、又はその近傍に第二の反応性官能基とを含む。当該２つ以上の反応性官能基は、同じ（すなわちリンカーがホモの二官能性である）か、又はそれらは異なる（すなわちリンカーがヘテロの二官能性である）ことができる。
【０１００】
リンカーの長さ及び組成は、かなり変動可能である。リンカーの長さ及び組成は一般に、リンカーの意図された機能と、任意に、合成の容易さ、安定性、特定の化学物質及び／又は温度パラメータに対する耐性並びに生体適合性などの他の因子とを考慮して選択される。例えば、リンカーは、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質及び／又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーの活性を有意に干渉すべきではない。
【０１０１】
本開示にかかる融合タンパク質での使用に好適なリンカーには、ペプチドが含まれる。リンカーは、組み換えＤＮＡ技術を用いてＩＬ−４Ｒ結合部分及び／又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー部分に付着させることができる。このような方法は当該技術分野で周知であり、本技術の詳細は例えば、Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989若しくはAusubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1994、又はその更新版に見出される。
【０１０２】
リンカーペプチドは、１〜５００アミノ酸残基（１〜１００、１〜５０、６〜３０、１〜４０、１〜２０、又は３０アミノ酸未満若しくは５〜１０アミノ酸など）の鎖長を有することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７若しくは８アミノ酸の長さでありえ、又は約１０、２０、３０、４０又は５０アミノ酸の長さであることができる。
【０１０３】
典型的には、可撓性タンパク質領域内の表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれ、このようなアミノ酸はリンカー配列内で使用することができる。Ｔｈｒ及びＡｌａなどの他の中性アミノ酸もまた、リンカー配列内で使用することができる。追加のアミノ酸を、リンカー内に入れて特有の制限酵素部位をリンカー配列にもたらし、融合体の構築を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、例えばアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）を含むものでも、又はアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＳ）であっても、又はユビキチン配列：
GGGSMQIFVRTLTGRTITLEVEPSDTIENVRARIQDREGIPPDQQRLIFAGRQLEDGRTLSDYNIQRESTLHLVLRLRGGGS（配列番号１９）若しくはその変異形を含むものでもよい。リンカーとしての使用に好適なユビキチン分子は、例えば、Bachran, Cら、"Anthrax toxin-mediated delivery of the Pseudomonas exotoxin A enzymatic domain to the cytosol of tumor cells via cleavable ubiquitin fusions MBio. 2013 Apr 30; 4(3): e00201-13、又はＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１２／１３９１１２号に記載されている。
【０１０４】
１つの例では、補体系の酵素、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素による切断を受けやすいペプチドリンカーが使用されてもよい。別の例によれば、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質は、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、プラスミン、トロンビン又はトリプシンなどのタンパク質分解活性を有する酵素による切断を受けやすいリンカーを介して付着させることができる。加えて、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介して抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーに付着させることができる。
【０１０５】
リンカーは、当該技術分野で公知のような日常的な技術を用いて、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質部分及び／又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバー部分に付着させることができる。
【０１０６】
ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質／抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質の調製
【０１０７】
融合タンパク質は、当該技術分野で公知のような日常的な方法を用いて調製することができる。融合タンパク質、さらにはそれに対する修飾体は、例えば、組換えＤＮＡ技術を用いて当該融合タンパク質をエンコードする核酸を設計操作することによって、又はペプチド合成によって作製可能である。融合タンパク質に対する修飾体は、例えば、化学修飾及び／又は限定タンパク質分解を用いて融合タンパク質ポリペプチド自体を修飾することにより作製してよい。これらの方法の組み合わせも、融合タンパク質を調製するのに使用してよい。
【０１０８】
クローニング及びタンパク質発現の方法は、当該技術分野で周知であり、組み換えタンパク質の発現のための技術及び系の詳細な説明は、例えばCurrent Protocols in Protein Science（Coligan, J. E., et al, Wiley & Sons, New York）に見出すことができる。当業者であれば、組み換えタンパク質を提供するために実に様々な発現系を使用できることを理解するであろう。したがって、融合タンパク質は原核生物宿主（例えば、大腸菌、エロモナス・サルモニシダ（A. salmonicida）又は枯草菌）又は真核生物宿主（例えば、酵母菌属（サッカロマイセス属）若しくはピキア属；哺乳類細胞、例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、若しくはＨｅＬａ細胞；又は昆虫細胞（バキュロウイルス））にて生成できる。融合タンパク質は、当該技術分野で公知の標準的な技術を用いて宿主細胞から精製することができる。
【０１０９】
種々の融合タンパク質の例に対する配列を表１に示す。これらの配列の変異形及び相同体は、他に採用しうる配列が所望であれば、標準的な技術（例えば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, NY (1997及び更新版); Sambrook et al., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989、又はその更新版を参照のこと）を用いてクローニングできる。例えば、核酸配列は、エロモナス・ヒドロフィラ（Aeromonas hydrophila）などの好適な生物から直接、ｍＲＮＡを抽出し、次いでｍＲＮＡ鋳型から（例えばＲＴ−ＰＣＲにより）、又はゲノムＤＮＡからの遺伝子をＰＣＲ増幅することにより、ｃＤＮＡを合成することによって得ることができる。あるいは、ＩＬ−４Ｒ結合部分又は抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー部分をエンコードする核酸配列は、標準的な手法によって適切なｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。単離されたｃＤＮＡは次いで、クローニングベクター又は発現ベクターなどの好適なベクターに挿入される。
【０１１０】
変異を（所望に応じて）当該技術分野で周知のインビトロ部位特異的変異誘発技術により、特定の、事前に選択した位置に導入することができる。変異は、コード配列を作り上げている適切なヌクレオチドの１つ以上の欠失、挿入、置換、反転、又はこれらの組み合わせによって導入することができる。
【０１１１】
発現ベクターはさらに、融合タンパク質をエンコードする配列の効率的な転写のために必要とされる転写エレメントなどの制御エレメントを含むことができる。ベクターに取り込ませることができる制御エレメントの例としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子改変された融合タンパク質をエンコードする核酸配列に作動可能に連結された制御エレメントを含むベクターを、融合タンパク質を作製するために使用することができる。
【０１１２】
発現ベクターは、親和性タグ（例えば、金属親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンをエンコードする配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（転移酵素）（ＧＳＴ）をエンコードする配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をエンコードする配列及びビオチンをエンコードする配列）などの、発現された融合タンパク質の精製を容易にする異種核酸配列を付加的に含んでよい。１つの例では、このようなタグは、融合タンパク質のＮ−又はＣ−末端に付着され、又は融合タンパク質内に位置させることもできる。タグは、当該技術分野で公知の方法に従い、発現された融合タンパク質から使用に先立って除去することができる。あるいは、タグが融合タンパク質の所望の活性の能力を干渉することがないのであれば、融合タンパク質に保持させておくことができる。
【０１１３】
融合タンパク質は、１以上のリンカー、さらには他の部分を、所望のとおりに及び／又は本願明細書で論じられるとおりに含むことができる。これらには、アビジン若しくはエピトープなどの結合領域、又はポリヒスチジンタグなどのタグであって、融合タンパク質の精製及び加工に有用でありうるもの、さらには本願明細書に記載されるような他のリンカーを含むことができる。加えて、身体又は細胞での融合タンパク質の行き来を簡便にモニターすることが可能となるように、検出可能なマーカーを融合タンパク質に付着させることができる。このようなマーカーには、放射性核種、酵素、フルオロフォア、発色団などが含まれる。
【０１１４】
当業者は、エンコードされるタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことなく数々の方法でＤＮＡが変更されうるということはわかるであろう。例えば、融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列における変化を生み出すために、ＰＣＲを使用することができる。融合タンパク質をエンコードするＤＮＡ配列におけるこのような変化は、タンパク質を発現するのに用いられる宿主細胞におけるコドン選好（preference）を至適化するために使用することができ、又は発現を促進する他の配列変化を含んでもよい。
【０１１５】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーへのＩＬ−４Ｒ結合タンパク質の直接的な共有結合、又はリンカーを介した結合は、当該技術分野で公知のとおりの種々の形態をとってよい。例えば、共有結合は、ジスルフィド結合の形態であってよい。成分の１つをエンコードするＤＮＡを、特有のシステインコドンを含むように設計操作することができる。第２成分は、第１成分のシステインと反応性であるスルフヒドリル基で誘導化させることができる。あるいは、スルフヒドリル基を、それ自体か、又はシステイン残基の一部としてかのいずれかにて、固相ポリペプチド技術を用いて導入することができる。例えば、ペプチド内へのスルフヒドリル基の導入は、Hiskey（Peptides 3 : 137, 1981）によって報告されている。  
【０１１６】
アッセイ
【０１１７】
融合タンパク質は、当該技術分野で公知であるか又は本願明細書に記載される標準的な技術を用いてアッセイされうる。
【０１１８】
例えば、融合タンパク質が細胞生存増強するか又は細胞増殖を増強する能力は、好適な細胞、典型的には標的又は癌細胞を発現している細胞系を用いてインビトロでアッセイされうる。一般に、選択された試験細胞系の細胞が適切な密度まで生育されて、候補融合タンパク質が添加される。融合タンパク質は、培養物におよそ少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１μｇ／ｍＬ、又は少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０１μｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬ、約０．１０μｇ／ｍＬ〜約０．５ｍｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約０．４ｍｇ／ｍＬ添加できる。いくつかの例では、段階希釈が調べられる。適切なインキュベーション時間（例えば、約４８〜７２時間）の後、細胞生存、増殖又は成長を評定する。細胞生存、増殖又は成長を判定する方法は、当該技術分野で周知であって、レサズリン還元試験（Fields & Lancaster Am. Biotechnol. Lab., 11 :48-50, 1993; O'Brien et al, Eur. J. Biochem., 267:5421-5426, 2000又は米国特許第５，５０１，９５９号参照）、スルホローダミンアッセイ（Rubinstein et al, J. Natl. Cancer Inst., 82: 113-118, 1999）又は中性赤色染料試験（Kitano et al, Euro. J. Clin. Investg., 21 :53-58, 1991; West et al, J. Investigative Derm., 99:95-100, 1992）又はトリパンブルーアッセイが含まれるが、これらに限定されない。例えばCellTiter 96（登録商標）AQueous One 溶液細胞増殖アッセイ（Promega）など、数多くの市販のキットも使用してよい。増殖は、処置培養物における細胞生存の、１以上の対照培養物における細胞生存との比較によって判定され、当該対照培養物の例としては、未処置の培養物及び／若しくは対照化合物（典型的には、既知の治療薬）で前処置された培養物、又は他の適切な対照が挙げられる。
【０１１９】
さらなるアッセイは、例えば、Crouchら（J. Immunol. Meth. 160, 81-8）；Kangasら(Med. Biol. 62, 338-43, 1984）；Lundinら（Meth. Enzymol. 133, 27-42, 1986）；Pettyら（Comparison of J. Biolum. Chemilum. 10, 29-34, 1995）；及びCreeら（Anticancer Drugs 6: 398-404, 1995）に記載されている。細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を含めた様々な方法を用いてアッセイすることができる（Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1 : 611, 1991; Cory et al, Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988）。細胞生存率に対するアッセイもまた、市販のものを利用できる。これらのアッセイには、ルシフェラーゼ技術を用いてＡＴＰを検出し、健全性（health）又は培養物における細胞数を定量する、CELLTITER-GLO（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（Promega）、及び乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ（Promega）であるCellTiter-Glo（登録商標）Luminescent Cell Viability Assayが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
細胞アポトーシスを測定するためのアッセイが、当該技術分野で公知である。アポトーシスを起こした細胞は、クロマチン凝縮、細胞収縮及び膜小疱形成（blebbing）を含む特徴的な形態学的変化によって特徴付けられ、光学顕微鏡法を用いて明確に観察することができる。アポトーシスの生化学的特徴には、ＤＮＡ断片化、特定の位置でのタンパク質切断、ミトコンドリア膜透過性の増加、及び細胞膜表面上へのホスファチジルセリンの出現が含まれる。アッセイの例としてはＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニックエンドラベリング）アッセイ、カスパーゼ活性（具体的にはカスパーゼ−３）アッセイ、並びにｆａｓ−リガンド及びアネキシンＶに対するアッセイが挙げられる。アポトーシスを検出するための市販の製品には、例えば、Apo-ONE（登録商標）Homogeneous Caspase-3/7 Assay, FragEL TUNELキット（ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS, San Diego, Calif）、ApoBrdU DNA Fragmentation Assay（BIO VISION, Mountain View, Calif）、及びQuick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit（BIO VISION, Mountain View, Calif）が含まれる。
【０１２１】
候補融合タンパク質を試験するのに好適な様々な細胞系が、当該技術分野で公知であり、多くが市販されている（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）、Manassas, Vaより）。同様に、動物モデルが当該技術分野で公知であり、多くが市販されている。
【０１２２】
治療指標及び使用
【０１２３】
本願明細書に記載されるような、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質と抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーとを含む融合タンパク質は、様々な治療目的に使用することができる。一般に、本願明細書に記載される融合タンパク質は、ＩＬ−４Ｒを発現する細胞が関わっており、且つ細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、細胞死に対して保護すること、細胞活性化を高めること又は細胞成熟を促進することが有益であろうような何れの疾患、障害又は病態の治療又は予防にも使用することができる。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載される融合タンパク質は、Ｉ型又はＩＩ型ＩＬ−４Ｒを発現する細胞が関わっており、そして受容体の一方の型を他方の型を凌いで選択することが有用であって、且つ細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、細胞死に対して保護すること、細胞活性化を高めること又は細胞成熟を促進することが有益であろうような何れの疾患、障害又は病態の治療又は予防にも使用することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、細胞増殖を増強するために、又は例えば、低酸素症、虚血、再灌流、神経変性障害若しくは中枢神経系に影響を及ぼす病態（「ＣＮＳ障害」例えば、発作、アルツハイマー疾患、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症や、脊髄傷害、外傷性脳損傷等の一過性虚血性神経細胞損傷など）、自己免疫障害（例えば、アジソン病、セリアック病、皮膚筋炎、グレーブス病、橋本病、多発性硬化症、重症筋無力症、悪性貧血、反応性関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病など）、細胞、組織若しくは臓器移植を受けること、細胞毒性薬物での処置、化学療法を受けること、若しくは放射線療法を受けること、などの細胞死若しくはアポトーシスと関連する疾患、障害若しくは病態を処置するために、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を使用することができる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、脂質細胞代謝を刺激して、その必要がある被験者において肥満症を低減するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、ミトコンドリア疾患を処置するために使用することができる。
【０１２５】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を用いて処置できる増殖性及び／又は分化障害の他の例としては、皮膚障害、炎症性障害などが挙げられる。
【０１２６】
皮膚障害には、細胞若しくは細胞の群又は真皮、上皮、若しくは皮下組織の層の異常な活性、又は真皮−上皮性接合部における異常が関わりうる。皮膚障害には例えば、角化細胞（例えば、過剰増殖性の基底細胞及び基底直上角化細胞）、メラニン形成細胞、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞、免疫細胞、及び上皮層の１以上に認められる他の細胞、例えば、基底層、有棘層、顆粒層、透明層又は角質層の、異常な活性が関わりうる。他の実施形態では、障害には、真皮細胞、例えば、真皮層に認められる真皮内皮、線維芽細胞、免疫細胞（例えば、マスト細胞又はマクロファージ）、例えば、乳頭層又は網状層、の異常な活性が関わりうる。
【０１２７】
皮膚障害の例としては、乾癬、乾癬性関節炎、皮膚炎（湿疹）、例えば、剥脱性皮膚炎若しくはアトピー性皮膚炎、毛孔性紅色粃糠疹（pityriasis rubra pilaris）、粃糠疹酒さ（pityriasis rosacea）、類乾癬（parapsoriasis）、苔癬状粃糠疹（pityriasis lichenoiders）、扁平苔癬、光沢苔癬、魚鱗病皮膚症（ichthyosiform dermatosis）、魚鱗癬、皮膚症、円形脱毛症、壊疽性膿皮症、白斑、類天疱瘡（例えば、眼部瘢痕性類天疱瘡又は水胞性類天疱瘡）、蕁麻疹、汗孔角化症（prokeratosis）、関節包の内部を覆っている上皮関連細胞の過増殖及び炎症に伴って生じる関節リウマチ；脂漏性皮膚炎及び日光性皮膚炎などの皮膚炎；脂漏性角化症、老人性角化症、日光角化症、光誘発角化症、及び毛包性角化症などの角化症；尋常性ざ瘡；ケロイド、及びケロイド形成に対する予防；母斑；いぼ、コンジローム又は尖圭コンジローム、及び性病性疣贅などのヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）感染を含む疣贅；白板症；扁平苔癬；及び角膜炎が挙げられる。皮膚障害は、皮膚炎、例えば、アトピー性皮膚炎又はアレルギー性皮膚炎、又は乾癬でありうる。
【０１２８】
処置に適合する患者には、乾癬があってよい。「乾癬」という用語は、医学的な意味を有することが意図され、すなわち、主に皮膚で罹るものであって、隆起し、肥厚し、落屑し、非瘢痕性の病変を生じる疾患である。その病変は通常、光沢のある折り重なった鱗屑片で覆われた、境界の極めて明瞭な紅斑性丘疹である。その鱗屑片は、典型的には銀色又はわずかに乳白色である。爪にも障害が及ぶことが多く、その結果陥凹、爪の剥離、肥厚及び変退色が引き起こされる。乾癬は関節炎と関連する場合があり、手足が不自由になることもある。角化細胞の過増殖は、上皮性炎症に伴う乾癬性上皮過形成、及び角化細胞の分化の低下の重要な特徴である。乾癬を特徴付ける角化細胞過増殖を説明するために、複数の機構が想起されている。障害を受けた細胞性免疫も、乾癬の病変形成に関わっている。乾癬性の障害の例として、慢性定常性乾癬、尋常性乾癬、発疹性（滴状（gluttate））乾癬、乾癬性紅皮症、汎発性膿疱性乾癬（Von Zumbusch）、輪状膿疱性乾癬、及び局所膿疱性乾癬が挙げられる。
【０１２９】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を用いて処置されうる障害又は病態の他の例としては、膀胱炎、創傷修復、腱修復、肝臓再生、肝臓移植、重症筋無力症、ブドウ膜炎、ベーチェット病、住血吸虫症、リーシュマニア症、結核症、トキソプラズマ脳炎、又はマラリアが挙げられる。
【０１３０】
抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を用いて処置されうる障害又は病態の他の例としては、ＣＮＳ変性疾患、癲癇、筋萎縮性側策硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳虚血、血管性認知症、発作、多発性硬化症、脊髄傷害、脊髄性筋萎縮症、眼の疾患若しくは傷害、ミトコンドリア疾患、自己免疫疾患、関節リウマチ、変形性関節症、骨粗鬆症、クローン病、アトピー性皮膚炎、乾癬、炎症性（inflamatory）腸疾患、膵島炎、１型糖尿病、肝臓移植、又は狼瘡が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質を用いて処置されうる障害又は病態には、ＣＮＳ変性疾患、癲癇、筋萎縮性側策硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脳虚血、血管性認知症、発作、多発性硬化症、脊髄傷害、脊髄性筋萎縮症等の神経障害及び病態などが含まれる。
【０１３１】
他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、感染症を処置するために用いられるワクチン用アジュバントして、膵島細胞のエキソビボでの保存及び拡張のため、臓器の保存用のエキソビボでの使用、樹状細胞療法のため、癌免疫療法のため、ワクチンの免疫モデュレーションのため、樹状細胞成熟のため、又は例えば、養子細胞移入療法及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）療法（ＣＡＲ−Ｔ）など、設計操作されたＴ細胞の増殖及び拡張のために、使用可能である。
【０１３２】
他に採用しうる実施形態では、a抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、樹状細胞又は細胞ベースのワクチンを刺激するために使用することができる。他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、例えば癌治療又は感染症の処置のためのワクチンアジュバントとして使用可能である。他に採用しうる実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、例えば、感染症の処置又は移植において免疫系を刺激するために使用することができる。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質-抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質は、ＩＬ−４単独、非抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質等に連結されたＩＬ−４などの好適な対照と比較して、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することすることができる。好適な対照は、これまでに確立された標準も含みうる。したがって、ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質−抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリー融合タンパク質の活性又は有効性を判定するための何れの試験又はアッセイでも、確立された標準と比較されればよく、そのたびごとに比較用の対照を含める必要はなくてよい。「細胞生存を増強すること」とは、細胞死のリスクにある細胞が生存することになる蓋然性を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞増殖を増強すること」とは、細胞の成長又は増殖を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること」又は「細胞死に対して保護すること」とは、細胞死のリスクにある細胞がアポトーシス、ネクローシス又はその他の何らかの型の細胞死に至ることになる蓋然性を低減する（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞活性化を高めること」とは、細胞の活性化を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。「細胞成熟を促進すること」とは、細胞の、より成熟した細胞型への分化を高める（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も）という意味である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、同様の条件下であるが前記融合タンパク質と接触させずに培養された細胞と比較して、少なくとも２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％若しくは９０％以上も、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、又は細胞死若しくはアポトーシスを阻害することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度、又はそれらの間の何れかの数値、例えば、約２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、３０００ｎｇ／ｍＬ、３５００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、４５００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、５５００ｎｇ／ｍＬ、６０００ｎｇ／ｍＬ、６５００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、７５００ｎｇ／ｍＬ、８０００ｎｇ／ｍＬ、８５００ｎｇ／ｍＬ、９０００ｎｇ／ｍＬ、９５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００００ｎｇ／ｍＬを投与された場合、未変性ＩＬ−４と比較して少なくとも２０％、３０％まで、又は５０％、７５％、８５％、又は９０％以上も、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、細胞死に対して保護すること、細胞活性化を高めること又は細胞成熟を促進することができる。
【０１３６】
細胞生存の増強、細胞増殖の増強、細胞死若しくはアポトーシスの阻害、細胞死に対する保護、細胞活性化の増加又は細胞成熟の促進を測定するための好適なアッセイは、本願明細書に記載されるか、又は当該技術分野で公知のものである。
【０１３７】
「標的細胞」には、ニューロン、リンパ球、幹細胞、上皮細胞、免疫細胞、骨細胞、アポトーシスを起こした細胞、壊死細胞、脂質細胞、及びアポトーシス若しくは壊死を起こしている細胞又はアポトーシス若しくは壊死を起こすリスクにある細胞などのその他の細胞が含まれるが、これらに限定されない。選択される標的細胞は、前記融合タンパク質で処置することが意図される疾患又は傷害又は状態次第であろう。
【０１３８】
医薬組成物、投薬量及び投与
【０１３９】
本開示にかかる医薬組成物は、１以上の融合タンパク質及び１以上の無毒な、医薬的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤及び／又は佐剤を含むことができる。このような組成物は、本願明細書に記載されるような治療指標の処置での使用に好適でありうる。
【０１４０】
所望に応じて、組成物に他の有効成分が含まれてもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、細胞生存を増強すること、細胞増殖を増強すること、細胞死若しくはアポトーシスを阻害すること、細胞死に対して保護すること、細胞活性化を高めること又は細胞成熟を促進することに対して有用である。したがって、このような融合タンパク質を含む組成物は所望に応じて、過剰の細胞死によって特徴付けられる疾患又は障害を処置するために典型的に用いられる標準的な療法のいずれかと組み合わせられてよい。１つの実施形態では、標準的な療法は、低酸素症、虚血、再灌流、発作、アルツハイマー病、パーキンソン病、ルー・ゲーリック病、ハンチントン舞踏病、脊髄性筋萎縮症、脊髄傷害、細胞、組織若しくは臓器移植を受けること、化学療法を受けること、又は放射線療法を受けることと関連する、細胞死又はアポトーシスの処置に有用なものである。特に、パーキンソン病など、ドーパミン作動性細胞の死によって特徴付けられる疾患に対しては、ドーパミン生成を増強する薬剤又はドーパミン模倣物と組み合わせて、アマンタジン又は抗コリン薬などの抗運動障害剤と共に融合タンパク質を投与してもよい。血栓症の存在に関連する虚血性傷害に対しては、抗血栓症又は血小板溶解薬と組み合わせて融合タンパク質を投与する。このような方法は、当業者により公知であり、E. W. MartinのRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。 
【０１４２】
いくつかの実施形態では、中枢神経系に影響を及ぼす疾患又は障害の処置のために、血液脳関門を越える輸送を増強する薬剤と組み合わせて、前記融合タンパク質を提供することができる。かかる薬剤は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２００５００２７１１０号、２００２００６８０８０号、及び２００３００９１６４０号に記載されている。血液脳関門を越える活性薬剤の送達を増強する他の組成物及び方法は、以下の出版物に記載されている：Batrakova et al., Bioconjug Chem. 2005 July-August; 16(4):793-802; Borlongan et al., Brain Res Bull. 2003 May 15; 60(3):297-306; Kreuter et al, Pharm Res. 2003 March; 20(3):409-16; and Lee et al, J Drug Target. 2002 September; 10(6):463-7。血液脳関門輸送を増強するための他の方法は、浸透圧崩壊又は生化学的開放を介して密着結合を透過させる薬剤の使用を含み、このような薬剤には、ＲＭＰ−７（Alkermes）、及び血管作用性化合物（例えば、ヒスタミン）が含まれる。血液脳関門を越える輸送を増強する他の薬剤は、内皮細胞を越えて下にある脳細胞へのトランスサイトーシスを増強する。トランスサイトーシスの増強は、注目する薬物を積み込んだリポソーム又はナノ粒子を用いてエンドサイトーシスを増加させる（すなわち、細胞外小分子の内部移行）ことにより成し遂げることができる。他に採用しうる実施形態では、前記融合タンパク質は、血液脳関門を越える輸送を増強する薬剤の不存在下で投与することができる。
【０１４３】
あるいは、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、化学療法と組み合わせて投与して、典型的にその化学療法に伴う毒性効果を融合タンパク質が低減するようにすることができる。例えば、化学療法と融合タンパク質とを受ける患者は、その化学療法のみを受ける患者よりも正常細胞のアポトーシスと関連する副作用（例えば、好中球数減少）に見舞われにくい。以下のいずれか１以上の投与前、投与中又は投与後に、本発明の組成物は投与される：化学療法剤、放射線剤、ホルモン剤、生物学的製剤、抗炎症剤、癌ワクチンアジュバント。化学療法剤の例としては、タモキシフェン、トラスツズマブ（trastuzamab）、ラロキシフェン、ドキソルビシン、フルオロウラシル／５−ｆｕ、パミドロン酸二ナトリウム、アナストロゾール、エクセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、レトロゾール、トレミフェン、フルベストラント、フルオキシメステロン、トラスツズマブ、メトトレキセート、メゲストロール（megastrol）アセテート、ドセタキセル、パクリタキセル、テストラクトン、アジリジン、ビンブラスチン、カペシタビン、ゴセレリン（goselerin）アセテート、ゾレドロン酸、タキソール、ビンブラスチン、及びビンクリスチンが挙げられる。
【０１４４】
融合タンパク質に対する全身性免疫応答を必要に応じて低減するために、免疫抑制療法剤を、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質と組み合わせて投与することができる。免疫抑制療法剤の例としては、全身性又は局所性副腎皮質ステロイド（コルチコステロイド）（Suga et al., Ann. Thorac. Surg., 73 : 1092-7, 2002）、シクロスポリンＡ（Fang et al, Hum. Gene Ther, 6: 1039-44, 1995）、シクロホスファミド（Smith et al., Gene Ther, 3 :496-502, 1996）、デオキシスパガリン（Kaplan et al., Hum. Gene Ther, 8: 1095-1104, 1997）、及び抗ＣＤ４０リガンド、抗ＣＤ４抗体、又は抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）などの、Ｔ及び／又はＢ細胞に対する抗体（Manning et al., Hum. Gene Ther, 9:477-85, 1998）が挙げられるが、これらに限定されない。融合タンパク質の投与前、投与中又は投与後に、このような薬剤を投与することができる。このような薬剤は、約１０ｍｇ／週から約１０００ｍｇ／週まで、約４０ｍｇ／週から約７００ｍｇ／週まで、又は約２００ｍｇ／週〜約５００ｍｇ／週までを、２、３、４、５、６、又は７週間、投与可能である。一連の処置は、被験者が応答性のまま（例えば、癌の症候が静的又は減少中）であれば、必要に応じ繰り返すことができる。
【０１４５】
「被験者」は、処置を必要とする、ヒト、又は獣医の患者（例えば、マウス若しくはラットなどの齧歯動物、ネコ、イヌ、乳牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又は他の家畜）などの哺乳動物であることができる。いくつかの実施形態では、「被験者」は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などであってよい。被験者は、本願明細書に記載されるように、細胞死によって特徴付けられる状態を有するか又は有するリスクがあることが疑われるものでも、細胞死によって特徴付けられる状態であると診断されるものでも、又は細胞死によって特徴付けられる状態を有しないことが確認されている対照被験者であってもよい。細胞死によって特徴付けられる状態に対する診断方法、及びこのような診断の臨床的描写は、当業者に公知である。
【０１４６】
組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、徐放性製剤、又は粉末であることができ、薬学的に許容できる担体を用いて製剤化することができる。組成物は、トリグリセリドなどの従前の担体及び結合剤を用い、座薬として製剤化されうる。「医薬的に許容できる担体」という用語は、有効成分の生物活性の有効性に干渉せず、且つ宿主又は被験者に毒性ではない分散媒（carrier medium）又は媒体（vehicle）をいう。
【０１４７】
融合タンパク質は、医薬的に許容できる媒体と一緒に送達することができる。１つの例では、媒体は、安定性及び／又は送達特性を増強しうる。このため、本開示はまた、人工的膜小胞（リポソーム、ノイソーム（noisome）、ナノソーム（nanosome）などを含む）、微小粒子又はマイクロカプセルなどの好適な媒体を、融合タンパク質の製剤に与え、又は薬学的に許容できるポリマーを含むコロイド状製剤として提供する。このような媒体/ポリマーの使用は、徐放性融合タンパク質の徐放性を達成するのに有益でありうる。あるいは、又は加えて、融合タンパク質製剤は、ヒト血清アルブミンなどのタンパク質をインビボで安定化させる添加剤、又は当該技術分野で公知の、タンパク質治療剤のための他の安定剤を含みうる。融合タンパク質製剤は、例えば、注射によって、又はカテーテルを介して投与された場合に製剤の逆流を防ぐ作用をする１以上の粘度増強剤も含むことができる。このような粘度増強剤には、生体適合性グリコール及びスクロースが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
１以上の融合タンパク質を含有する医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法により、好適な１以上の分散若しくは湿潤剤及び／又は懸濁剤であって前記したようなものを用いて、滅菌注射用の水性又は油性懸濁液として製剤化されうる。滅菌注射用調製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、無毒な非経口的に（parentally）許容できる希釈剤又は溶剤中の滅菌注射用注射剤又は懸濁液でありうる。採用可能な許容できる媒体及び溶剤には、水、リンゲル液、乳酸リンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液が含まれるが、これらに限定されない。他の例として、滅菌不揮発性油で、溶剤又は懸濁媒体として従来より採用されているもの、及び例えば合成モノ又はジグリセリドを含む、様々なブランド（bland）不揮発性油が挙げられる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製に使用することができる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は水溶性ポリマーに接合されて、例えば安定性若しくは循環半減期を高め、又は免疫原性を低減する。臨床的に許容できる、水溶性のポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（例えば、グリセロール）及び他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、又はポリオキシエチル化グルコース、及び他の炭水化物ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ＰＥＧなどの水溶性ポリマーにポリペプチドを接合させるための方法は、例えば、米国特許公開第２００５０１０６１４８号及びその引用文献に記載されている。１つの例ではポリマーは、酸性エンドソーム区画から細胞質への薬物の遊離を増強するように設計されたｐＨ感受性ポリマーである（例えば、Henry et ah, Biomacromolecules 7(8):2407-14, 2006参照）。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーポリペプチドを含む融合タンパク質のポリペプチド（ｃｐＩＬ４−Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質など）は、治療又は予防ワクチンの製造時にアポトーシスを阻害すること、又は樹状細胞の増殖を促進するために使用することができる。いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーポリペプチドを含む融合タンパク質のポリペプチド（ｃｐＩＬ４−Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質など）は、ＧＭ−ＣＳＦ Ｂｃｌ−ｘＬ融合タンパク質と組み合わせて使用される。一般に、当該ワクチンは、ワクチン接種を必要とする被験者由来の細胞（例えば、樹状細胞）を含む。一般に、その細胞は、血液試料又は骨髄試料など、被験者の生物試料から得られる。好ましくは、樹状細胞又は樹状幹細胞を被験者から得て、この細胞をインビトロで培養し、樹状細胞の一集団を得る。培養細胞を本発明の融合タンパク質の存在下でに抗原（例えば、癌抗原）と接触させる。望ましくは、融合タンパク質の存在下に抗原と接触される樹状細胞は、その融合タンパク質の不存在化に接触される樹状細胞に比してアポトーシスのリスクが低減している。任意に、接触後の細胞の数を、インビトロで増加させる。次いで細胞を被験者に再導入し、それら細胞は、注目する抗原（例えば、癌抗原）に対する免疫応答を増強するか又は引き出す。このようなワクチンを製造するための方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Zhuら、J Neurooncol. 2005 August；74(1):9-17; Nairら、Int. J. Cancer. 1997; 70:706-715；及びFongら、Annu. Rev. Immunol. 2000; 18:245-273に記載されている。
【０１５１】
典型的には、ワクチンは、溶液として又は懸濁液としてのいずれかの注射剤型に調製される。注射に好適な固体形態もまた、エマルションとして、又はリポソームに封入されたポリペプチドを用いて調製されうる。細胞は、当該技術分野で公知の何れか好適な担体中にて注射される。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、リピド凝集体、及び不活性ウイルス粒子などの、ゆっくりと代謝される巨大高分子を含む。このような担体は、当業者にとっては周知である。これらの担体は、アジュバントとしても機能しうる。
【０１５２】
アジュバントは、ワクチンの有効性を増強する免疫賦活剤である。有効なアジュバントには、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、ムラミルペプチド、バクテリア細胞壁成分、サポニンアジュバント、及び免疫賦活剤として作用して組成物の有効性を増強する他の物質が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
ワクチンは、用量剤形に適合するように投与される。有効量とは、疾患又は障害の治療又は予防に有効な、単回投与量、複数回投与スケジュールにて投与されるワクチンを意味する。好ましくは、かかる用量は、新生物の成長を阻害するのに有効である。投与される用量は、処置すべき被験者、被験者の健康及び身体状態、被験者の免疫系が抗体を産生する潜在能力、望まれる保護の度合い、及び他の関連因子に応じて変化するであろう。必要とされる有効成分の正確な量は、医師の判断によるものとされよう。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーポリペプチドを含む融合タンパク質のポリペプチドは、要望に応じ、エキソビボ法において使用することができる。例えば、細胞（例えば、末梢血リンパ球、又は患者から単離して置いておいたもの若しくは培養して維持したものであるリンパ球の精製された集団）を培地中にてインビトロで培養でき、そして培地にＩＬ−４Ｒ融合タンパク質を添加することによって接触工程が影響を受けることができる。培養工程には、例えば、増殖を刺激若しくは低減すべく、又は細胞の一集団（例えば、ＴＨ２細胞）を増加又は枯渇させるべく、他の薬剤で細胞を刺激又は処置する工程をさらに含むことができる。その後、細胞は患者に投与される。
【０１５５】
本願明細書に記載される医薬組成物は、意図された目的を成し遂げるのに有効な量の、１以上の融合タンパク質を含む。典型的には、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーを含有する融合タンパク質を含む組成物は、細胞死によって特徴付けられる疾患、障害若しくは状態に既に罹患しているか、又は疾患、障害若しくは状態などのリスクにある患者に、細胞死と関連する症候を治癒若しくは少なくとも部分的に停止させるのに、又は細胞成長、生存、活性化若しくは成熟を増強するのに十分な量で投与される。
【０１５６】
当業者はしたがって、投与すべき投薬量は規定される限定に支配されるものでないことを認識するであろう。治療目的のために投与する前に、融合タンパク質の投薬量は、加減するか、又は特定の目的のために改める必要があるかもしれず、例えば全身投与のために必要な融合タンパク質の濃度は、局所投与に使用される場合と異なりうる。同様に、治療剤の毒性は投与方法及び使用される組成物全体（例えば、緩衝液、希釈剤、さらなる化学療法剤など）によって変化しうる。
【０１５７】
本発明に係る医薬組成物の「有効量」には、治療上有効量又は予防上有効量が含まれる。「治療上有効量」とは、投薬量及び必要な期間で、疾患、障害又は治療されるべき状態の症候を寛解させるのに有効な融合タンパク質の量をいう。化合物の治療上有効量は、被験者の病状、年齢、性別、及び体重などの因子、並びにその化合物が被験者において所望の応答を引き出す能力に応じて変動しうる。投薬治療方式は、最適の治療反応をもたらすように調整されてよい。治療上有効量はまた、融合タンパク質の何らかの毒性又は有害な効果よりも治療上有益な効果が上回るものである。当業者の潜在能力をもってすれば充分に、化合物の治療上有効な用量の決定はなされる。例えば、治療上有効な用量は当初、本願明細書に記載されるものなどの細胞培養液アッセイ、又は動物モデルのいずれかにて、見積もることができる。「予防上有効量」とは、投薬量及び必要な期間で、神経障害の症候の発症の遅延、又は癌の寛解の継続などの、所望の予防的結果を成し遂げるのに有効な融合タンパク質の量をいう。適切な濃度範囲及び投与経路を決定するために、動物モデルも使用することができる。このような情報は次いで、ヒトを含む他の動物における投与のための有用な用量及び経路を、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定するために使用することができる。
【０１５８】
最終的な製剤中の融合タンパク質の濃度は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬで、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ又は少なくとも１μｇ／ｍＬ又は少なくとも１ｍｇ／ｍＬなどとすることができる。例えば、最終的な製剤中の濃度は、約０．０１μｇ／ｍＬと約１，０００μｇ／ｍＬの間であることができる。１つの例では、最終的な製剤中の濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬと約１００ｍｇ／ｍＬの間である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、抗アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質、又はその断片を含む融合タンパク質は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの範囲の濃度で、又は、約２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、７５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２５０ｎｇ／ｍＬ、３００ｎｇ／ｍＬ、３５０ｎｇ／ｍＬ、４００ｎｇ／ｍＬ、４５０ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ、５５０ｎｇ／ｍＬ、６００ｎｇ／ｍＬ、６５０ｎｇ／ｍＬ、７００ｎｇ／ｍＬ、７５０ｎｇ／ｍＬ、８００ｎｇ／ｍＬ、８５０ｎｇ／ｍＬ、９００ｎｇ／ｍＬ、９５０ｎｇ／ｍＬ、１０００ｎｇ／ｍＬ、１５００ｎｇ／ｍＬ、２０００ｎｇ／ｍＬ、２５００ｎｇ／ｍＬ、３０００ｎｇ／ｍＬ、３５００ｎｇ／ｍＬ、４０００ｎｇ／ｍＬ、４５００ｎｇ／ｍＬ、５０００ｎｇ／ｍＬ、５５００ｎｇ／ｍＬ、６０００ｎｇ／ｍＬ、６５００ｎｇ／ｍＬ、７０００ｎｇ／ｍＬ、７５００ｎｇ／ｍＬ、８０００ｎｇ／ｍＬ、８５００ｎｇ／ｍＬ、９０００ｎｇ／ｍＬ、９５００ｎｇ／ｍＬ、又は１００００ｎｇ／ｍＬなど、その間のいずれかの値で投与される。
【０１６０】
しかしながら、投与されるべき化合物（１種以上）の実際の量は、治療されるべき状態、選択された投与経路、実際に投与される化合物、個々の患者の年齢、体重、及び応答性、並びに患者の症候の重症度を含む関連状況を考慮して、医師により決定されることになる点は理解されるであろう。前記投薬量範囲は、例として示すに過ぎず、発明の範囲を限定することは何ら意図されない。場合によって、前記範囲の下限を下回る投薬量レベルで充分すぎることがあり、一方他の場合にあっては、有害な副作用を起こすことなくさらに多くの用量を用いうるが、これは例えば、１日全体にわたる投与のために先ず、当該さらに多くの用量をいくつかの少ない容量に分割することにより行なわれうる。
【０１６１】
当業者は、前記投薬量がとりわけ、使用される融合タンパク質の型、及び処置される障害又は状態の型に依存することになるとわかるであろう。
【０１６２】
一般に、本開示にかかる融合タンパク質は、実質的にヒト配列を含み、したがって、例えば、非ヒト配列を含む他の分子又は免疫毒素よりも抗原性が低い。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質は、少なくとも８０％、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のヒト配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示にかかる融合タンパク質は、例えば、免疫毒素、又はＩＬ−４又はＩＬ−１３などの未変性ＩＬ−４Ｒ結合タンパク質よりも実質的に低用量で投与することができる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、被験者に投与されると、あるレベルの抗体応答を誘発することがあり、ある場合にはこれが望ましくない副作用を導きうる。したがって、必要に応じて、融合タンパク質の抗原性を当該技術分野で公知のように、及び／又は本願明細書に記載されるように評定することができる。例えば、融合タンパク質のインビボ毒性効果は、処置中の動物体重に対するそれらの効果を測定すること、及びその動物の死亡後に血液学的プロファイル及び肝臓酵素分析を実施することによって評価することができる。融合タンパク質の一般的な毒性は、当該技術分野で公知の方法によって試験することができる。例えば、融合タンパク質の全体としての全身毒性は、単回静脈内注射後にマウスの１００％（すなわちＬＤ１００）又はマウスの５０％（すなわちＬＤ５０）が死亡する用量を求めることによって調べることができる。そのＬＤ１００又はＬＤ５０の少なくとも約２、５、又は１０倍未満の用量を、ヒトなどの他の哺乳動物への投与に対して選択することができる。
【０１６４】
本願明細書に記載される融合タンパク質に対する抗体応答の反応速度論及び大きさを、免疫が保たれているマウスにおいて求めることができ、それらは免疫が保たれているヒトにおいて使用される可能性のある投薬計画の開発を容易にするために使用できる。Ｃ５７−ＢＬ６系統などの免疫が保たれているマウスに融合タンパク質の静脈内用量が投与される。種々の間隔で（例えば、単回投与後、複数回投与後）マウスを屠殺して、血清を得る。抗融合タンパク質抗体の存在を検出するために、ＥＬＩＳＡによるアッセイを使用することができる。
【０１６５】
マウスからの血清試料は、当該技術分野で公知のとおりに抗融合タンパク質抗体の存在について評定できる。別の例として、Sticklerら、J. Immunotherapy, 23 :654-660, 2000に記載のとおりに、タンパク質の抗原性を決定するためにエピトープマッピングも使用できる。手短に言えば、樹状細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞として知られる免疫細胞を、注目するタンパク質に曝されていないドナー群（community donors）からの血液より単離する。当該タンパク質長にかかる合成小ペプチドを次いで、培養中の細胞に添加する。特定のペプチドの存在に応答した増殖が、Ｔ細胞エピトープは当該配列に包含されていることを示唆する。このペプチド配列はその後、前記融合タンパク質において削除または修飾して、これによりその抗原性を低下させることができる。
【０１６６】
治療的有効性及び毒性も、例えば、半有効量、つまりＥＤ５０（すなわち集団の５０％で治療上有効な用量）及び半致死量、つまりＬＤ５０（すなわち集団の５０％に対して致死的な用量）の決定によるなど、標準的な薬剤手段によって決定することができる。治療的用量と毒性効果量との用量比は、「治療指数」として知られており、比、ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現できる。細胞培養液アッセイ及び動物試験から得られたデータを、ヒト又は動物での使用のための広範な投薬量を製剤化するのに使用できる。このような組成物に含有される投薬量は通常、ＥＤ５０を含む濃度の範囲内にあり、低毒性又は無毒性を示す。その投薬量は、採用される剤形、被験者の感受性、及び投与の経路などに応じてこの範囲内で変動する。
【０１６７】
動物への投与のために、様々な経路による投与用に医薬組成物を製剤化できる。例えば、組成物を局所、直腸若しくは非経口投与用に、又は吸入若しくはスプレーによる投与用に製剤化できる。本願明細書で使用する場合、「非経口」の用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、髄腔内、胸骨内注射又は注入技術を含む。対流強化送達もまた、融合タンパク質を投与するのに使用することができる。
【０１６８】
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバーを含む融合タンパク質は、中枢神経系（ＣＮＳ）において細胞生存又は増殖を増強するのに使用できる。送達の部位が脳である場合、融合タンパク質は脳に送達することができなければならない。血液脳関門は、大循環から脳及び脊髄内への多くの治療薬の取り込みを制限する。血液脳関門を越える分子は、２つの主要機構すなわち、自由拡散及び促通輸送を使用する。血液脳関門の存在がゆえに、ＣＮＳ内の特定の融合タンパク質が有益な濃度に達するのに、特定の薬物送達方略の使用が必要となりうる。ＣＮＳへの融合タンパク質の送達は、いくつかの方法によって成し遂げることができる。
【０１６９】
一つの方法は、神経外科的技術に基づくものである。例えば、心室内、病巣内、又は髄腔内注射など、ＣＮＳ内への直接の物理的導入によって融合タンパク質を送達することができる。心室内注射は、例えば、オマヤレザバー（Ommaya reservoir）などのリザーバに付着させた心室内カテーテルによって容易に行うことができる。導入の方法はまた、再充電可能又は生分解性のデバイスによっても提供される。別のアプローチは、血液脳関門の透過性を高める物質による、血液脳関門の破壊である。例として、マンニトールなどの低拡散性物質、エトポシドなどの脳血管透過性を高める医薬品、若しくはロイコトリエンなどの血管作用薬の動脈内注入、又はカテーテルによる対流強化送達（ＣＥＤ）が挙げられる。さらに、組成物を処置を必要とする領域に局所的に投与することが望ましい場合があり、これは例えば、外科手術の間の局所注入により、注射により、カテーテルの使用により、又は埋没物（implant）の使用（埋没物は、多孔質、非多孔質、又はゲル状の材料のものであり、サイラスティック膜などの膜、又は繊維を含む）によって成し遂げることができる。好適な膜は、Gliadel（登録商標）（Eisai Inc.）である。
【０１７０】
抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリーメンバー（例えば、ａＩＬ−４Ｒ結合タンパク質−Ｂｃｌ−ＸＬ融合タンパク質）又はその断片を含む融合タンパク質のインビボ又はインビトロ発現は、細胞死を起こすリスクにある細胞の、生存又は増殖を促進するための別の治療的アプローチである。このような融合タンパク質をエンコードしている核酸分子を、アポトーシスのリスクがある被験者の細胞に送達することができる。細胞における融合タンパク質の発現は、増殖を促進するか、アポトーシスを防止するか、又はその細胞におけるか又は標的細胞若しくは組織におけるアポトーシスのリスクを低減する。治療上有効なレベルの融合タンパク質が産生できるように、核酸分子は、それらの取り込みが可能な形態で被験者の細胞へ送達されなければならない。形質導入ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス）ベクターは、とりわけそれらの感染が高効率であって組込み及び発現が安定であるがゆえに、体細胞の細胞遺伝子療法用に使用することができる（例えば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71 :6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; and Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 10319, 1997参照）。例えば、融合タンパク質をエンコーディングするポリヌクレオチド、変異形、又はその断片をレトロウイルスベクターにクローニングして、その内在性プロモーターから、当該レトロウイルス末端反復配列から、又は注目する標的細胞型に特異的なプロモーターから発現を推進させることができる。使用することのできる他のウイルスベクターには、例えば、牛痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はエプスタイン・バール・ウイルスなどのヘルペスウイルスが含まれる（また、Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244: 1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1 :55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337: 1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; and Johnson, Chest 107:77 S-83S, 1995のベクターも参照されたい）。レトロウイルスベクターは特によく開発されており、臨床現場で使用されている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323 :370, 1990; Anderson et al., U.S. Pat. No. 5,399,346）。ウイルスベクターを使用して、キメラポリヌクレオチドを標的細胞、組織に、又は全身に与えるのが最も好ましい。
【０１７１】
細胞死のモデュレーションを必要としている細胞（例えば、患者の細胞）への治療剤の導入のために、非ウイルスのアプローチを採用することができる。例えば、リポフェクション（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101 :512, 1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリジン接合（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263 : 14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264: 16985, 1989）の存在下に細胞内へ核酸分子を投与することによって、又は外科的条件下にマイクロインジェクションすることによって（Wolff et al., Science 247: 1465, 1990）、当該核酸分子を導入することができる。好ましくは核酸は、リポソーム及びプロタミンと組み合わせて投与される。
【０１７２】
遺伝子導入は、インビトロ形質移入を含む日ウイルスの手段を用いて成し遂げることもできる。このような方法には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔、及びプロトプラスト融合の使用が含まれる。リポソームも、細胞内へのＤＮＡの送達に対して潜在的に有益でありうる。患者の病変組織内への融合タンパク質の移植は、培養可能細胞型内にエキソビボで正常核酸を導入し（例えば、自家又は異種の初代細胞又はその後代細胞）、次いでその細胞（またはその子孫）を標的指向化組織内に注射することによって成し遂げることもできる。
【０１７３】
ポリヌクレオチド療法において使用するためのｃＤＮＡ発現は、好適なプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）の何れかから導かれ、適切な哺乳類の制御エレメントの何れかによって制御されることができる。例えば、所望に応じて、特定の細胞型において遺伝子発現を優先的に導くことが知られているエンハンサーを、核酸の発現を導くために使用することができる。使用されるエンハンサーとしては、組織特異的又は細胞特異的エンハンサーとして特徴付けられるものを挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンが治療的構築体として使用されるのであれば、同族の制御配列によって、又は所望に応じ、前記プロモーター又は制御エレメントのいずれかを含め異種供給源に由来する制御配列によって、制御を媒介させることができる。
【０１７４】
本発明を、以下の実施例にてさらに説明する。
【実施例】
【０１７５】
実施例１
【０１７６】
ｃｐＩＬ−４−ＢｃｌｘＬ融合タンパク質は、市販の組み換えヒトＩＬ−４を参照として用い標準的な技術を使用して調製した。ＧＳＮＯ又はＳＴＳでの浸襲後の神経系細胞生存に対する、組み換えヒトＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）及びｃｐＩＬ−４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬの効果を判定した。いくつかの試験の結果は、融合タンパク質がより保護的であることを示唆していた。
【０１７７】
１つの試験では、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を融合体タンパク質又は組み換えＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）と共に２時間、無血清培地中でインキュベーションした。ＧＳＮＯ（０．２５ｍＭ）は、ＤＭＥＭ及び１０％血清中に２２時間添加した。細胞の生存率は、２〜３回の実験でのＣＦＤＡアッセイによって評定した。融合体タンパク質は、Ｔｗｅｅｎ８０を含むＴｒｉｓ緩衝液中（図１Ａ）、及び尿素を含むＰＢＳ緩衝液中（図１Ｂ）で試験した。ｃｐＩＬ−４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬ（５００ｎｇ）は、ＧＳＮＯ処理後の細胞生存を約２５〜４０％増加させ、一方ｒｈＩＬ−４（５００ｎｇ）は細胞生存率を約１５％だけしか増加させなかった（図１Ｃ）。
【０１７８】
ＳＴＳで誘発される細胞死に呼応した神経系細胞生存に対する融合タンパク質の効果を調べるために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を融合タンパク質又は組み換えＩＬ−４（ｒｈＩＬ−４）と２時間、無血清培地中でインキュベーションした。ＳＴＳ（５０ｎＭ）をＤＭＥＭ及び１０％血清中に添加して２２時間インキュベーションした。細胞生存率は、２回の実験でのＣＦＤＡアッセイによって評定した。融合体タンパク質は、Ｔｗｅｅｎ８０を含むＴｒｉｓ緩衝液中（図２Ａ）、及び尿素を含むＰＢＳ緩衝液中（図２Ｂ）で試験した。ｃｐＩＬ−４−Ｕｂ−ＢｃｌｘＬ（５００ｎｇ）は、ＳＴＳ処理後の細胞生存を約２０〜２５％増加させ、一方ｒｈＩＬ−４（５００ｎｇ）は、ＳＴＳで誘発される細胞死に対して有意な保護を示さなかった（図２Ｃ）。
【０１７９】
実施例２
【０１８０】
標準的な技術を用い、ヒト樹状細胞（ＤＣ）は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びインターロイキン−４（ＩＬ−４）中で末梢血由来単球を培養することにより作製し（図３Ａ）、未成熟ＤＣｓ（ｉＤＣｓ）を得て（図３Ｂ）、これはさらに付加的因子及びサイトカインを用いて成熟ＤＣｓへと成熟させた（ｍＤＣｓ）（図３Ｃ）。ＧＭ−ＣＳＦ−Ｂｃｌ−ＸＬ及びｃｐＩＬ−４−Ｂｃｌ−ＸＬを用いてヒトＤＣｓを作製した場合（図３Ｄ）、ｉＤＣｓの収率は野生型ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦ単独を用いて作製したＤＣｓよりも１．８倍高かった。両方の条件で作製したｉＤＣｓの表現型は類似していた。Ｂｃｌ−ＸＬを融合させたサイトカインを用いてｉＤＣｓをｍＤＣｓに成熟させても（図３Ｅ）ｍＤＣｓの収率は未変性サイトカインと比較して、高いままであった。全ゲノムトランスクリプトーム・マイクロアレイ（〜３５，０００プローブ）を用いた遺伝子発現プロファイリングでＢｃｌ−ＸＬサイトカインにより作製したＤＣｓの特徴を調べると、単球がｉＤＣｓに分化した場合、それらは転写物制御因子、運搬装置、膜貫通型の受容体、ペプチダーゼ及びホスファターゼに関連して劇的に遺伝子発現が増加し、そしてｉＤＣｓがｍＤＣｓに分化した場合、Ｔｈ２誘引物質よりむしろサイトカイン及びケモカインをエンコードする遺伝子並びにＴｈ１が上方制御されることが示された。これらの変化に関わらず、Ｂｃｌ−ＸＬ−ｉＤＣｓとｉＤＣｓとの間、Ｂｃｌ−ＸＬ−ｍＤＣとｍＤＣとの間で、遺伝子発現に統計的有意差はなかった（基準ＦＤＲ：０．０１及び変化倍率１．５）。これらの結果、Ｂｃｌ−ＸＬサイトカインで作製されたＤＣｓは、表現型又は全遺伝子発現プロファイルに何ら相違はなく、収率がより高いため、癌治療に有用であることが示される。
【０１８１】
すべての引用文献は、参照により本願明細書に援用する。 
【０１８２】
本発明を１以上の実施形態に関して説明している。しかしながら当業者には、請求項に定義する本発明の範囲から逸脱せずに、いくらかの変更及び修飾を施しうることが明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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