(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐コアと、非ペプチドリンカーによって前記分岐コアに個別に共有結合している複数のフィブリノゲン結合ペプチドとを含むペプチドデンドリマーであって、前記分岐コアが、
各フィブリノゲン結合ペプチドが、非ペプチドリンカーによって前記分岐コアの多官能性アミノ酸残基に個別に共有結合している２〜１０個の多官能性アミノ酸残基、
１個または複数のフィブリノゲン結合ペプチドが、非ペプチドリンカーによって前記分岐コアの少なくとも２個の隣接する多官能性アミノ酸残基のそれぞれに個別に共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、
２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドが、非ペプチドリンカーによって前記分岐コアの多官能性アミノ酸残基の少なくとも１個に個別に共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、または
２個以上の多官能性アミノ酸残基が、隣接する多官能性残基の側鎖を介して共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、
を含み、
前記多官能性アミノ酸残基が、三官能性もしくは四官能性アミノ酸残基、または三官能性および四官能性アミノ酸残基を含む、
ペプチドデンドリマー。
【請求項２】
前記分岐コアが、連続する複数の多官能性アミノ酸残基を含む、請求項１に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項３】
前記分岐コアが、１０個までの多官能性アミノ酸残基を含む、請求項１または２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項４】
前記複数の多官能性アミノ酸残基がリジン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはシステインの残基を含む、請求項２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドデンドリマーであって、一般式（Ｉ）：
【化１】
0006717747.tif 000028
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドあり、
−（リンカー）−は、任意のリンカーであり、
Ｘは、三官能性アミノ酸残基であり、
Ｙは、−ＦＢＰまたは−ＮＨ２であり、
Ｚは、Ｙが−ＦＢＰであるとき、−（リンカー）−ＦＢＰであり、もしくはＹが−ＮＨ２であるとき、−［−Ｘｎ-(リンカー)−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり、もしくはＹが−ＦＢＰであるとき、−[−Ｘｎ−(リンカー)−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰ]である
（式中、Ｘｎは、三官能性アミノ酸残基であり、およびａは、１〜１０である）］、
のペプチドデンドリマー。
【請求項６】
−（リンカー）−は、非ペプチドリンカーであり、
Ｘは、リジン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはシステイン残基であり、
Ｘｎは、リジン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンまたはシステイン残基であり、
ａは、１〜３である、請求項５に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチドデンドリマーであって、一般式（ＩＩ）：
【化２】
0006717747.tif 000029
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドであり、
−（リンカー）−は、任意のリンカーであり、
Ｙは、−ＦＢＰまたは−ＮＨ２であり、
Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、-R-(リンカー)-FBPであり、または
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化３】
0006717747.tif 000030
であり、もしくは
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化４】
0006717747.tif 000031
であり、もしくは
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化５】
0006717747.tif 000032
であり、または
Ｙが−ＦＢＰであるとき、
【化６】
0006717747.tif 000033
であり、および
ａが１〜１０であり
（式中、Ｒは、−（ＣＨ２）４ＮＨ−、−（ＣＨ２）３ＮＨ−，または−（ＣＨ２）３ＮＨＣＮＨＮＨである）］、
のペプチドデンドリマー。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載のペプチドデンドリマーであって、一般式（ＩＩＩ）：
【化７】
0006717747.tif 000034
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドであり、
−（リンカー）−は、任意のリンカーであり、
Ｙは、−ＦＢＰ、または−ＮＨ２であり、
Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、−（ＣＨ２）４ＮＨ−（リンカー）−ＦＢＰであり、または
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化８】
0006717747.tif 000035
であり、もしくは
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化９】
0006717747.tif 000036
であり、もしくは
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化１０】
0006717747.tif 000037
であり、または、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、
【化１１】
0006717747.tif 000038
であり、および
ａは、１〜１０である］、
のペプチドデンドリマー。
【請求項９】
−（リンカー）−は、−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−を含むリンカーであり、ａは、１〜３である、請求項７または８に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１０】
前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１１】
前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する、請求項１〜９のいずれかに記載のペプチドデンドリマー。  
【請求項１２】
前記リンカーが直鎖リンカーを含む、請求項１に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１３】
前記リンカーが直鎖アルキル基を含む、請求項１２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１４】
前記リンカーが−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−を含み、ｎが１〜１０である、請求項１２または１３に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１５】
以下の化学式：
【化１２】
0006717747.tif 000039
を含まない、請求項１〜１４のいずれかに記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１６】
異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１７】
異なる配列の前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに結合する異なる選択性を有する、請求項１６に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１８】
異なる配列の前記フィブリノゲン結合ペプチドが、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する第１のフィブリノゲン結合ペプチドと、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに、前記第１のフィブリノゲン結合ペプチドよりも高い結合選択性で結合する第２のフィブリノゲン結合ペプチドとを含む、請求項１３もしくは１７に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項１９】
前記第１のフィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を含む、請求項１８に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２０】
前記第２のフィブリノゲン結合ペプチドがそのカルボキシ末端でアミノ酸配列−ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４）を含む、請求項１８もしくは１９に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２１】
異なる配列の前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する第１のフィブリノゲン結合ペプチドと、フィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する第２のフィブリノゲン結合ペプチドとを含む、請求項１６もしくは１７に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２２】
前記第１のフィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を含む、請求項１８に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２３】
前記第２のフィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＨＲＰ−（配列番号１０）を含む、請求項２１もしくは２２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２４】
前記第２のフィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）を含む、請求項２１もしくは２２に記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２５】
【化１３】
0006717747.tif 000040
を有する、請求項１〜２４のいずれかに記載のペプチドデンドリマー。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマーと、２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドコンジュゲートとを含む組成物。
【請求項２７】
前記ペプチドコンジュゲートが請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマーである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ペプチドデンドリマーの前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合し、および前記ペプチドコンジュゲートの前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ペプチドデンドリマーの前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合し、および前記ペプチドコンジュゲートの前記フィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマーまたは請求項２６〜２９のいずれかに記載の組成物と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項３１】
前記薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤が水和ゼラチンを含む、直ちに利用可能な止血製剤である、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
滅菌状態である、請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物を滅菌する方法であって、前記ペプチドデンドリマーまたは組成物を、３０ｋＧｙまでのγ線照射に曝露することを含む、方法。
【請求項３４】
フィブリノゲンを重合する方法であって、請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物に、フィブリノゲンを接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
ヒドロゲルを形成するキットであって、請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物、および個別にフィブリノゲンを含む、キット。
【請求項３６】
請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物とフィブリノゲンとのコポリマーを含むヒドロゲル。
【請求項３７】
薬剤として使用するための請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
出血の治療で使用するための、または創傷の治療で使用するための請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
出血の治療で使用するため、または創傷の治療で使用するための薬剤の製造における、請求項１〜２５のいずれかに記載のペプチドデンドリマー、または請求項２６〜３１のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドデントリマーおよび作用剤と、ペプチドデンドリマーまたは作用剤を含む組成物と、フィブリノゲンを重合するため、および止血剤としてのそれらの使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固の最終段階は、不溶性フィブリンポリマーをその可溶性の前駆体であるフィブリノゲンから形成することである。フィブリノゲンのフィブリンへの変換は、３つのステップ、すなわち、トロンビンによるフィブリノゲンのフィブリンモノマーへの限定的タンパク質加水分解；半分子ずれた二本鎖プロトフィブリルへのフィブリンモノマーの凝集；および凝集したフィブリンの架橋によるクロットの強化、で起こる。
【０００３】
フィブリノゲン分子は、ジスルフィド結合によって結合した３対の同一でないポリペプチド鎖、すなわちＡα、Ｂβおよびγ鎖からなる。フィブリノゲン鎖は、３つの別個の構造領域に折り畳まれており、遠位の２個のＤ領域は１個の中心Ｅ領域に結合している。各Ｄ領域は、γ鎖およびＢβ鎖のＣ末端にそれぞれ位置する重合「ａ」ホールおよび「ｂ」ホールを含む。トロンビンは、中心Ｅ領域内のフィブリノゲンのＡα鎖およびＢβ鎖のアミノ末端からの短鎖ペプチド、すなわちフィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）およびＢ（ＦｐＢ）の除去をそれぞれ触媒し、２個の重合部位、すなわちアミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−を有する「ノブＡ」およびアミノ末端配列Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−を有する「ノブＢ」を露出する。１個のフィブリンモノマーの新たに露出した重合ノブは、「Ａ−ａ」および「Ｂ−ｂ」のノブ−ホール相互作用を介して、別のフィブリンモノマーの対応するホールと相互作用し、結果として、フィブリンモノマーの凝集体は、半分子ずれた二本鎖プロトフィブリルとなる。
【０００４】
プロトフィブリルは、側面から凝集して、より密集した線維となり、これらが融合してフィブリンクロットの３次元ネットワークを形成する。ＦｐＡは、ＦｐＢよりも急速にフィブリノゲンから切断される。ＦｐＡの除去により、プロトフィブリルの形成が誘発され、一方、ＦｐＢの除去はそのラテラル凝集と同時に起こる。ＦｐＢの放出は、その反応の開始時には極めて遅いが、ポリマーが形成されると加速される。ＦｐＢ切断のこの遅れは、正常なフィブリン凝集にとって必要であり、異なる種類のクロットの形成とも関連している。ＦｐＡのみが除去されているフィブリンＩは、あまり密集しておらず、プラスミンによって容易に消化されるが、一方、ＦｐＡおよびＦｐＢの両方とも除去されているフィブリンＩＩはより密集しており、線維素溶解に対してより抵抗性がある。
【０００５】
ＦｐＡのみ、または主にＦｐＢを除去するヘビ毒酵素を用いた研究では、フィブリンクロットは相互作用「Ａ−ａ」または「Ｂ−ｂ」のいずれかによって形成され得ることが証明されており、両相互作用がプロトフィブリル形成を媒介することができることを示している。変種組換えフィブリノゲンを用いた実験では、「Ａ−ａ」相互作用が弱まると、「Ｂ−ｂ」相互作用がプロトフィブリル形成において実質的な役割を果たし得ることが示された。他の研究では、「Ｂ」ノブと「ｂ」ホールの両方が利用できるときでも、フィブリン断片がフィブリノゲン分子に結合する間は「Ａ−ａ」相互作用のみが起こり、および「Ａ−ａ」相互作用が除外された場合に限り、「Ｂ−ｂ」ノブ−ホール相互作用が明白となることが証明された。しかし、ペプチド阻害研究では、「Ｂ−ｂ」相互作用は「Ａ−ａ」と同時に起こり得ることが示されている。
【０００６】
フィブリンは、フィブリン線維中の異なる分子の側鎖間で共有結合架橋を形成することによって安定化する。ペプチド結合は、第ＸＩＩＩａ因子によって触媒されるアミド基転移反応中に特定のグルタミン側鎖とリジン側鎖の間で形成される。
【０００７】
フィブリン組織接着剤（ＦＴＡ）は、フィブリンクロットを形成する凝固カスケードの最後のステップを模倣することによって形成された生成物に与えられる名前である。市販のＦＴＡキットは、止血、薬物送達のために、ならびに手術用接着剤および組織シーラントとして用いられる、強力な生分解性ゲルを急速に生成する。フィブリノゲン、第ＸＩＩＩ因子、トロンビンおよびカルシウムイオンは、典型的にシリンジデバイスを介して送達され、このデバイスではカルシウムイオンおよびトロンビンからフィブリノゲンおよび第ＸＩＩＩ因子を隔てて保存する。シリンジデバイスから放出される際にこれらの成分が混合されることで、フィブリノゲンのトロンビンによる分解が生じてフィブリンを生成し、フィブリンは自己凝集してゲルとなり、ゲルはその後、カルシウムイオン活性化第ＸＩＩＩ因子によって架橋される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のＦＴＡは、直ちに利用可能な形態で供給されず、そのためＦＴＡの成分は、創傷に適用する前に混合しなければならないという不利な点を有する。成分の混合後は、ＦＴＡは短時間に使用しなければならない。使用の直前に混合物を調製する必要があることは、例えば、救急でこの生成物が必要とされる場合、特に不利になり得る。
【０００９】
多くのＦＴＡは、ウシ抗原、特にウシ第Ｖ因子が混入しているウシトロンビンを利用している。この抗原に対して生成される抗体は、ヒト第Ｖ因子と交叉反応し、生命を脅かす出血、状況によってはアナフィラキシーおよび死亡を引き起こし得る。ヒトトロンビンは、これらの危険性を最小化する試みの中で、プールしたドナー血漿から単離されているが、血液媒介性病原体、特にウイルスを伝播させる可能性がある。組換えヒトトロンビンが開発され、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって、使用が承認されている。このヒトトロンビンは、抗原性が極めて低いという利点を有し、ウイルス伝播の危険性を有しない。しかし、ヒトトロンビンは、遺伝子組換えしたチャイニーズハムスター卵巣細胞株を使用して作製されており、したがって作製費用は比較的高い。
【００１０】
精製ウシトロンビン調製物および組換えヒトトロンビン調製物は、粉末として室温で保管され、使用前に生理食塩水で溶液へと再構成しなければならない。ＦＤＡが承認した精製ヒトトロンビンは、溶液として包装されているが、室温で保存できるのは２４時間までであり、長期保存には、凍結が必要である（ＬｅｗおよびＷｅａｖｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：Ｔａｒｇｅｔｓ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００８：２（４）５９３−５９９）。トロンビンを使用するさらなる不利な点は、この酵素がフィブリノゲンをフィブリンに変換するには時間がかかり、そのため血液凝固が加速されるまでに遅れが生じることである。
【００１１】
従来のＦＴＡも、非常に大量のフィブリノゲンを使用する。他の止血剤は、クロット形成を促進するために患者自身のフィブリノゲンに依存する。「ＦＬＯＳＥＡＬ」と呼ばれる止血マトリックスは、ウシ由来のゼラチンマトリックス、ヒト由来のトロンビンおよび塩化カルシウムの混合物からなっている。トロンビンは凍結乾燥型で提供され、使用前に塩化カルシウム溶液に溶解させ、次いでゼラチンマトリックスと混合しなければならない。この生成物は調製から８時間以内に使用しなければならない。ここでも、使用直前にこの混合物を調製する必要があることは、例えば、救急でこの生成物が必要とされる場合、特に不利になり得る。
【００１２】
国際公開公報第２００８／０６５３８８号は、トロンビンの非存在下で、フィブリノゲンを重合することができる薬剤を使用するバイオゲルの形成を記載している。この薬剤は、架橋剤スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）を使用して可溶性のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）担体にコンジュゲートさせたいくつかのフィブリノゲン結合ペプチドを含む。米国特許出願第２０１２／０１１４６８２号は、フィブリンポリマーを形成するためのフィブリンノブペプチドのコンジュゲートの使用および創傷修復におけるその使用を記載している。この文書はまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合したフィブリノゲン結合ペプチドＧＰＲＰ（配列番号１）を含むコンジュゲートの生成についても記載している。「ノブ−ＰＥＧ」コンジュゲートは、マレイミド活性化ＰＥＧと、合成ノブペプチドのＣ末端システインとを反応させることによって作製された。
【００１３】
コンジュゲーション方法は、しばしば複雑で、複数のステップを必要とし、そのうちのいくつかを、異なる場所で行う必要があり得て、所望の生成物が比較的低い収率になることが多い。コンジュゲート生成物のさらなる不利な点は、その合成で使用される担体および／またはリンカーの材料により、生成物が放射線滅菌に対して感受性となり得ることである。
【００１４】
したがって、フィブリノゲンを急速に重合させることができ、免疫原性の試薬を使用することなく容易に生成することができ、放射線滅菌に対して抵抗性があり、および直ちに利用可能な形態で供給することができる止血剤を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の第１の態様によれば、分岐コアと、分岐コアに個別に共有結合している複数のフィブリノゲン結合ペプチドとを含むペプチドデンドリマーであって、分岐コアが、
各フィブリノゲン結合ペプチドが分岐コアの多官能性アミノ酸残基に個別に共有結合している２〜１０個の多官能性アミノ酸残基、
１個または複数のフィブリノゲン結合ペプチドが分岐コアの少なくとも２個の隣接する多官能性アミノ酸残基のそれぞれに個別に共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、
２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドが分岐コアの多官能性アミノ酸残基の少なくとも１個に個別に共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、
２個以上の多官能性アミノ酸残基が、隣接する多官能性アミノ酸残基の側鎖を介して共有結合している複数の多官能性アミノ酸残基、または
１個の多官能性アミノ酸残基
を含み、およびフィブリノゲン結合ペプチドが前記多官能性アミノ酸残基の各官能基に個別に共有結合しており、
多官能性アミノ酸残基が三官能性もしくは四官能性アミノ酸残基、または三官能性および四官能性アミノ酸残基を含み、または１個の多官能性アミノ酸残基が三官能性もしくは四官能性アミノ酸残基である、ペプチドデンドリマーが提供される。
【００１６】
各フィブリノゲン結合ペプチドは、分岐コアに対して異なる結合点を有し、そのためフィブリノゲン結合ペプチドは本明細書では分岐コアに「個別に共有結合されている」と言う。
【００１７】
分岐コアは、任意の好適なアミノ酸配列を含む。分岐コアは、１０個までの多官能性アミノ酸残基、例えば２〜１０個、または２〜６個の多官能性アミノ酸残基を含み得る。
【００１８】
分岐コアは、複数の連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。分岐コアは、１０個まで
の連続した多官能性アミノ酸残基を含み得る。
【００１９】
本明細書では、「三官能性アミノ酸」という用語は、アミン（−ＮＨ２）である第１の官能基と、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基と、第３の官能基とを有する任意の有機化合物を指すのに用いる。本明細書では、「四官能性アミノ酸」という用語は、アミン（−ＮＨ２）である第１の官能基と、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）である第２の官能基と、第３の官能基と、第４の官能基とを有する任意の有機化合物を指すのに用いる。第３および第４の官能基は、フィブリノゲン結合ペプチドのカルボキシ末端、またはフィブリノゲン結合ペプチドのカルボキシ末端に結合したリンカーの官能基と反応することができる任意の官能基であり得る。
【００２０】
多官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、およびさらに１個の官能基（それによって三官能性アミノ酸をもたらす）、またはさらに２個の官能基（それによって四官能性アミノ酸をもたらす）を有する側鎖を有する中心炭素原子（α−または２−）を含み得る。
【００２１】
多官能性アミノ酸残基またはそれぞれの多官能性アミノ酸残基は、タンパク新生もしくは非タンパク新生多官能性アミノ酸の残基、または天然もしくは非天然の多官能性アミノ酸の残基であり得る。
【００２２】
タンパク新生三官能性アミノ酸は、アミノ基、カルボキシル基、側鎖およびα−水素左旋性立体配座を有する中心炭素原子（α−または２−）を有する。好適な三官能性タンパク新生アミノ酸の例としては、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンおよびＬ−システインが挙げられる。
【００２３】
好適な三官能性非タンパク新生アミノ酸残基の例としては、Ｄ−リジン、β−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチンおよびＤ−アルギニン残基が挙げられる。
【００２４】
このように、本発明のペプチドデンドリマーでの使用に好適な三官能性アミノ酸残基の例としては、リジン、オルニチン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミンおよびシステイン、例えばＬ−リジン、Ｄ−リジン、β−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｄ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｄ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン、Ｌ−システインおよびＤ−システイン残基が挙げられる。
【００２５】
本発明のペプチドデンドリマーでの使用に適している好適な非天然の多官能性アミノ酸の例としては、シトルリン、２，４−ジアミノイソ酪酸、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸およびシス−４−アミノ−Ｌ−プロリンが挙げられる。非天然の多官能性アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。
【００２６】
一部の実施形態において、分岐コアは、２〜１０個または２〜６個の連続したリジン、アルギニンもしくはオルニチン残基を含む分岐コアのように、ホモポリマー多官能性アミノ酸配列、例えばポリリジン、ポリアルギニンまたはポリオルニチン配列を含み得る。
別の実施形態において、分岐コアは、異なる多官能性アミノ酸残基、例えば１個または複数のリジン残基、１個または複数のアルギニン残基および／または１個または複数のオルニチン残基を含み得る。
【００２７】
別の実施形態において、分岐コアは、複数の多官能性アミノ酸残基および１個または複数の他のアミノ酸残基を含み得る。
【００２８】
分岐コアが複数の多官能性アミノ酸残基を含む場合、隣接する多官能性アミノ酸残基がアミノ酸側鎖の結合によって、ペプチド結合によって共に結合してもよく、または一部の隣接する多官能性アミノ酸残基が側鎖の結合によって結合し、他の隣接する多官能性アミノ酸残基がペプチド結合によって結合してもよい。
【００２９】
さらなる実施形態において、分岐コアは２個以上の多官能性アミノ酸残基を含んでもよく、少なくとも１個のフィブリノゲン結合ペプチドが２個以上の多官能性アミノ酸残基のそれぞれに個別に結合して、および２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドが分岐コアの多官能性アミノ酸残基の少なくとも１個に個別に結合する。
【００３０】
別の実施形態によれば、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが、分岐コアの末端の多官能性アミノ酸残基に個別に結合する。
【００３１】
本発明のペプチドデンドリマーの構造の例としては、その中で
・分岐コアが、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基とを含む；
・分岐コアが、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基と、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基とを含む；
・分岐コアが、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基とを含む；または
・分岐コアが、２個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第１の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第２の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第３の三官能性アミノ酸残基と、１個のフィブリノゲン結合ペプチドが結合している第４の三官能性アミノ酸残基とを含む、
ペプチドデンドリマーが挙げられる。
【００３２】
本発明のペプチドデンドリマーは、以下の一般式（Ｉ）を含み得る。
【化１】
0006717747.tif 000002
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドあり、
−（リンカー）−は、任意のリンカー、好ましくは非ペプチドリンカーであり、
Ｘは、三官能性アミノ酸残基、好ましくはリジン、オルニチンまたはアルギニン残基であり、
Ｙは、−ＦＢＰまたは−ＮＨ２であり、
Ｚは、Ｙが−ＦＢＰであるとき、−（リンカー）−ＦＢＰであり、またはＹが−ＮＨ２であるとき、−［−Ｘｎ-(リンカー)−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰである
（式中、Ｘｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくはリジン、Ｌ−オルニチンまたはアルギニンであり、および
ａは、１〜１０、好ましくは１〜３である）。］
【００３３】
例えば、ＹがＮＨ２であり、Ｚが−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰであるとき、デンドリマーの構造は以下の通りである。
【化２】
0006717747.tif 000003
【００３４】
あるいは、Ｙが−ＦＢＰであるとき、Ｚは、−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰである。
［式中、
Ｘｎは、三官能性アミノ酸残基、好ましくはリジン、Ｌ−オルニチンまたはアルギニンであり、および
ａは１〜１０、好ましくは１〜３である。］
【００３５】
例えば、Ｙが−ＦＢＰであり、Ｚが、−［−Ｘｎ−（リンカー）−ＦＢＰ］ａ−（リンカー）−ＦＢＰであり、およびａが１であるとき、デンドリマーの構造は以下の通りである。
【化３】
0006717747.tif 000004
【００３６】
本発明のペプチドデンドリマーは、以下の一般式（ＩＩ）を含み得る。
【化４】
0006717747.tif 000005
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドであり、
−（リンカー）−は、任意のリンカーであり、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−を含み、
Ｙは、−ＦＢＰまたは−ＮＨ２であり、
Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、
−Ｒ−（リンカー）−ＦＢＰであり、または
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化５】
0006717747.tif 000006
【００３７】
したがって、一実施形態において、Ｚは、
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化６】
0006717747.tif 000007
【００３８】
別の実施形態において、Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰのとき、
【化７】
0006717747.tif 000008
［式中、
Ｒは、−（ＣＨ２）４ＮＨ−、−（ＣＨ２）３ＮＨ−、または−（ＣＨ２）３ＮＨＣＮＨＮＨ−である
(式中、ａは１〜１０であり、好ましくは１〜３である)］。
【００３９】
例えば、Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであり、およびａが１のとき、
【化８】
0006717747.tif 000009
【００４０】
本発明のペプチドデンドリマーは、以下の一般式（ＩＩＩ）を含み得る。
【化９】
0006717747.tif 000010
［式中、
ＦＢＰは、フィブリノゲン結合ペプチドであり、
−（リンカー）−は、任意のリンカーであり、好ましくは−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−を含み、
Ｙは、−ＦＢＰまたは−ＮＨ２であり、
Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、
−（ＣＨ２）４ＮＨ−（リンカー）−ＦＢＰであり、または
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化１０】
0006717747.tif 000011
【００４１】
したがって、一実施形態において、Ｚは、
Ｙが−ＮＨ２であるとき、
【化１１】
0006717747.tif 000012
［式中、
ａは１〜３であり、
あるいは、ａは４〜１０であり、または１〜１０であってもよい。］
【００４２】
別の実施形態において、Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであるとき、
【化１２】
0006717747.tif 000013
［式中、ａは１〜１０、好ましくは１〜３である］。
【００４３】
例えば、Ｚは、
Ｙが−ＦＢＰであり、およびａが１であるとき、
【化１３】
0006717747.tif 000014
【００４４】
一実施形態において、ペプチドデンドリマーは以下の構造を含まない。
【００４５】
【化１４】
0006717747.tif 000015
【００４６】
いかなる好適なフィブリノゲン結合ペプチド（ＦＢＰ）でも、用いることができる。例えば、ペプチドは、自然にフィブリンに結合している、または血小板膜糖タンパク質ＧｐＩＩｂ−ＩＩＩａによって結合しているフィブリノゲンの領域に結合してもよい。フィブリノゲンに対するフィブリンの結合は、Ｍｏｓｅｓｓｏｎら，２００１，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，１１−３０に考察されている。フィブリノゲンに対するＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａの結合は、Ｂｅｎｎｅｔｔ，２００１，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３６，３４０−３５４に考察されている。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「ペプチド」という用語は、ペプチド類似体も含める。いくつかのペプチド類似体が、当業者に既知である。フィブリノゲンがフィブリノゲン結合ペプチドに結合することができる限り、いかなる好適な類似体を使用してよい。
【００４８】
好適なフィブリノゲン結合ペプチドの例およびそれらが同定され得る方法は、国際公開公報第２００５／０３５００２号、同２００７／０１５１０７号および同２００８／０６５３８８号に提供されている。
【００４９】
好ましくは、フィブリノゲン結合ペプチドはそれぞれ、長さがアミノ酸残基３〜６０個、好ましくは３〜３０個、より好ましくは３〜１０個である。
【００５０】
好ましくは、各フィブリノゲン結合ペプチドは、１０−９〜１０−６Ｍの解離定数（ＫＤ）、例えばおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００ｎＭまたはそれ以上でフィブリノゲンに結合する。およそ１００ｎＭのＫＤが好ましい。解離定数は、平衡状態で測定することができる。例えば、既知濃度の放射標識フィブリノゲンを、フィブリノゲン結合部分が架橋されているマイクロスフェアとともにインキュベートすることができる。典型的に、５μＭペプチドはマイクロスフェア１ｇｍに架橋し、または１５〜４０μモルのペプチドがマイクロスフェア１ｇｍに架橋する。ペプチドに結合したマイクロスフェアを、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ｐＨ７．４の等張緩衝液(例えば、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．０１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液）中で、０．０５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度の放射標識フィブリノゲンとともに２０℃で１時間までインキュベートする。マイクロスフェア上のフィブリノゲン結合部分に結合したフィブリノゲンを、遠心分離によって遊離のフィブリノゲンから分離させ、遊離および結合したフィブリノゲンの量を測定することができる。次いで、結合フィブリノゲン：遊離フィブリノゲンの濃度比に対して結合フィブリノゲンの濃度をプロットすることによって、解離定数を、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析により算出することができる。曲線の勾配はＫＤを表す。
【００５１】
一部の実施形態によれば、本発明のペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する。フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合する好適なフィブリノゲンペプチドの配列の例としては、ＧＰＲ−；ＧＰＲＰ−（配列番号１）；ＧＰＲＶ−（配列番号２）；ＧＰＲＰＦＰＡ−（配列番号３）；ＧＰＲＶＶＡＡ−（配列番号４）；ＧＰＲＰＶＶＥＲ−（配列番号５）；ＧＰＲＰＡＡ−（配列番号６）；ＧＰＲＰＰＥＣ−（配列番号７）；ＧＰＲＰＰＥＲ−（配列番号８）；ＧＰＳＰＡＡ−（配列番号９）が挙げられる。
【００５２】
別の実施形態によれば、本発明のペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する。フィブリノゲンの「ａ」ホールよりも「ｂ」ホールに優先的に結合するフィブリノゲン結合ペプチドの配列の例としては、ＧＨＲ−、ＧＨＲＰ−（配列番号１０）、ＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）、ＧＨＲＰＬ−（配列番号１２）、ＧＨＲＰＹアミド−（配列番号１３）が挙げられる。
【００５３】
本発明のペプチドデンドリマーの各フィブリノゲン結合ペプチドは、独立して、そのカルボキシ末端で（任意選択でリンカーを介して）、またはそのアミノ末端で（任意選択でリンカーを介して）デンドリマーの分岐コアに結合し得る。フィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端で結合している場合、ペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含むことができる。ペプチドの露出したカルボキシ末端で、カルボキシル基（または陰性荷電のカルボキシレートイオン）ではなくてアミド基が存在すると、フィブリノゲン結合ペプチドのフィブリノゲンに対する結合を最適化するために役立ち得る。
【００５４】
一部の実施形態において、各フィブリノゲン結合ペプチドは、そのカルボキシ末端でデンドリマーの分岐コアに（任意選択でリンカーを介して）結合する。別の実施形態において、少なくとも１個のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端で、デンドリマーの分岐コアに（任意選択でリンカーを介して）結合する。例えば、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合する少なくとも１個のフィブリノゲン結合ペプチド、例えば配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４）を含むペプチドは、そのアミノ末端で、デンドリマーの分岐コアに（任意選択でリンカーを介して）結合し得る。
【００５５】
本発明のペプチドデンドリマーは、異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを含むことが好ましい（本明細書では「キメラ」ペプチドデンドリマーと呼ぶ）。
例えば、一部の実施形態において、本発明のペプチドデンドリマーは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに結合する異なる選択性を有するフィブリノゲン結合ペプチドを含む。
【００５６】
本発明の第２の態様によれば、複数の担体を含み、各担体が担体に結合した複数のフィブリノゲン結合ペプチドを有し、各担体に結合したフィブリノゲン結合ペプチドが異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを含む、作用剤が提供される。
【００５７】
本発明の第２の態様の一部の実施形態において、複数の担体は、第１の複数の担体と、第２の複数の担体とを含み、第１の複数の担体に結合しているフィブリノゲン結合ペプチドは、第２の複数の担体に結合しているフィブリノゲン結合ペプチドとは異なる配列のペプチドである。
【００５８】
本発明の第２の態様の別の実施形態において、各担体は、それに結合した異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを有する。
【００５９】
担体は可溶性または不溶性の担体であり得るが、好ましくは血小板でない。担体は、対象の組織部位、例えば、出血している創傷部位または粘膜部位への局所投与にとって好適であり得る。可溶性担体は、局所投与よりも静脈内投与にとって好適であり得る。担体は、可溶性または不溶性タンパク質、治療薬、ポリマー（例えばポリエチレングリコールなどの生体適合性ポリマー）またはこれらのうちの任意の組み合わせを含み得る。タンパク質担体の例としては、酵素または酵素でないタンパク質、例えばヒト血清アルブミンがある。
【００６０】
不溶性担体は、微粒子（固形微粒子、中空微粒子または多孔質微粒子、好ましくは実質的に球状の微粒子）であり得る。微粒子は、任意の好適な物質、例えば架橋タンパク質で形成され得る。好適なタンパク質は、アルブミン（血清由来もしくは組換え、ヒトもしくは非ヒトのアルブミンの順に）またはゼラチンである。本発明で不溶性担体としての使用に好適な微粒子は、周知の噴霧乾燥技術、例えば国際公開公報第９２／１８１６４号において見られるような技術を用いて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を噴霧乾燥させることによって形成することができる。担体として使用する微粒子の代替物としては、リポソーム、合成ポリマー粒子（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸／グリコール酸）、または細胞膜断片が挙げられる。
【００６１】
少なくとも大多数の担体は、６μｍ未満の最大寸法を有し得る。本発明の作用剤が静脈内投与用である場合、これは好ましい。
【００６２】
あるいは、少なくとも大多数の担体は、６μｍを超える最大寸法を有し得る。本発明の作用剤が局所投与用である場合、これは好ましい。
【００６３】
理論的には、担体分子当たりのフィブリノゲン結合ペプチドの数には上限がない。最適数は、多くの要因、例えば担体の性質、およびフィブリノゲン結合ペプチドを結合するための各担体上の反応基の数に依存する可能性がある。しかし、平均して、担体分子当たり１００個までのフィブリノゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。平均して、担体分子当たり少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個または５個のフィブリノゲン結合ペプチドが存在することが好ましい。好ましい範囲は、担体分子当たり１０〜２０個のフィブリノゲン結合ペプチドである。
【００６４】
担体は、フィブリノゲン結合ペプチドを担体に結合させる複数の基を含み得る。例えば、担体はその表面にチオール部分またはアミン部分を含み得る。担体がタンパク質性である場合、チオール部分またはアミン部分は、アミノ酸、例えばシステインまたはリジンの側鎖によってもたらされ得る。非ペプチド基を、担体に付加してもよい。これは、担体がタンパク質、例えばＨＳＡから形成される場合、特に有利である。例えば、チオール基は、担体上で第１級アミン基と反応することができる２−イミノチオラン（２−ＩＴ）などの試薬を使用して担体に付加することができる。
【００６５】
異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合する第１のフィブリノゲン結合ペプチドと、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに対して第１のフィブリノゲン結合ペプチドよりも高い選択性で結合する第２のフィブリノゲン結合ペプチドとを含み得る。そのようなペプチドデンドリマーは、比較的広い範囲のペプチドデンドリマー濃度にわたり急速にフィブリノゲンを重合することが見いだされている。
【００６６】
例えば、第１のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を含み得て、および／または第２のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのカルボキシ末端でアミノ酸配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４）を含み得る。これらの配列中のアミノ酸残基はアミノ−からカルボキシ−の順に表示され、「−」はペプチドデンドリマーの分岐コアまたは担体に結合した配列の末端を表す。そのカルボキシ末端で配列−ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４）を有するフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端で配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を有するフィブリノゲン結合ペプチドよりも、フィブリノゲンの「ｂ」ホールより「ａ」ホールに対して高い選択性で結合する。
【００６７】
別の実施形態において、異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合する第１のフィブリノゲン結合ペプチドと、フィブリノゲンの「ａ」ホールよりも「ｂ」ホールに優先的に結合する第２のフィブリノゲン結合ペプチドとを含み得る。そのようなペプチドデンドリマーは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに選択的に結合するフィブリノゲン結合ペプチドのみを含有する同等のペプチドデンドリマーと比較して、フィブリノゲンと重合し、比較的高密度のヒドロゲルを形成することが見いだされている。形成されたヒドロゲルの密度の増加は、デンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドがフィブリノゲンの「ａ」ホールおよび「ｂ」ホールに結合し、それによって重合フィブリノゲンのネットワークが強化されることによると考えられる。
【００６８】
例えば、第１のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を含み得て、および／または第２のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端でアミノ酸配列ＧＨＲＰ−(配列番号１０）もしくはアミノ酸配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）を含み得る。アミノ末端で配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）を有するフィブリノゲン結合ペプチドは、いくらかの選択性でフィブリノゲンの「ａ」ホールに結合する。アミノ末端で配列ＧＨＲＰ−（配列番号１０）またはＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）を有するフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する。
【００６９】
１つまたは複数のフィブリノゲン結合ペプチド、もしくはそれぞれのフィブリノゲン結合ペプチドを、非ペプチドリンカーによって本発明のペプチドデンドリマーの分岐コアに共有結合してもよい。リンカーは、ペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドに対するフィブリノゲンの結合を妨害しない任意の好適なリンカーであり得る。リンカーは、可撓性の直鎖リンカー、好適には直鎖アルキル基を含み得る。そのようなリンカーによって、ペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドが互いに離れるように伸長することができる。例えば、リンカーは−ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＯ−基を含んでもよく、式中のｎは任意の数であり、１〜１０、例えば５が好適である。−ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯ−基を含むリンカーは、ε−アミノ酸６−アミノヘキサン酸（εＡｈｘ）を用いて形成され得る。
【００７０】
理論的には、本発明のペプチドデンドリマー中に存在し得るフィブリノゲン結合ペプチドの総数には限度がない。しかし、実際には、いかなる特定の構造の場合も、フィブリノゲン結合ペプチドの数を変化させて試験し、所望のフィブリノゲンの重合特性、例えば、フィブリノゲン重合速度またはフィブリノゲンの重合で生成されるヒドロゲルの密度について最適な数値を決定することができる。ペプチドデンドリマーは、デンドリマー当たり合計２０個までのフィブリノゲン結合ペプチド、例えば、デンドリマー当たり１０個までのフィブリノゲン結合ペプチド、またはデンドリマー当たり５個までのフィブリノゲン結合ペプチドを含んでもよい。
【００７１】
驚くべきことに、２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドを含む、本発明のペプチドデンドリマーとペプチドコンジュゲートとの混合物が、単独のペプチドデンドリマーまたはペプチドコンジュゲートのいずれかよりも急速にフィブリノゲンを重合できることを本出願者は見出した。
【００７２】
本発明によれば、本発明のペプチドデンドリマーと、２個以上のフィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドコンジュゲートとを含む組成物が提供される。
【００７３】
ペプチドコンジュゲートは、同じ配列、または異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを含み得る。例えば、ペプチドコンジュゲートは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合するフィブリノゲン結合ペプチドのみ、もしくはフィブリノゲンの「ａ」ホールよりも「ｂ」ホールに優先的に結合するフィブリノゲン結合ペプチドのみ、もしくはフィブリノゲンの「ｂ」ホールよりも「ａ」ホールに優先的に結合する１個または複数のフィブリノゲン結合ペプチド、およびフィブリノゲンの「ａ」ホールよりも「ｂ」ホールに優先的に結合する１個または複数のフィブリノゲン結合ペプチドを含み得る。
【００７４】
ペプチドコンジュゲートは、フィブリノゲン結合ペプチドが結合した担体を含み得る。好適な担体は、１個または複数のアミノ酸残基、例えば、リジンアミノ酸残基などの単一のアミノ酸残基を含み得る。１個または複数のアミノ酸残基を含む担体を含むコンジュゲートの利点は、該コンジュゲートを、固相ペプチド合成方法を使用して容易に作製できることである。
【００７５】
ペプチドコンジュゲートの各フィブリノゲン結合ペプチドは、独立して、そのカルボキシ末端で（任意選択でリンカーを介して）、またはそのアミノ末端で（任意選択でリンカーを介して）、担体に結合し得る。フィブリノゲン結合ペプチドがそのアミノ末端で結合する場合、そのペプチドのカルボキシ末端はアミド基を含み得る。
【００７６】
一部の実施形態において、ペプチドコンジュゲートは本発明のペプチドデンドリマーであり得る。
【００７７】
本発明の組成物のペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合することができ、およびペプチドコンジュゲートのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合することができる。
【００７８】
そのような組成物は、単独でのペプチドデンドリマーまたはペプチドコンジュゲートのいずかよりも急速にフィブリノゲンを重合できるという点で相乗効果を有することが見いだされている。この相乗効果の機序は完全には理解されておらず、理論に束縛されるものではないが、組成物がより多くの「Ａ」および「Ｂ」フィブリノゲン重合部位を提供することから、この相乗効果が起こり得ると考えられる。
【００７９】
あるいは、本発明の組成物のペプチドデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ａ」ホールよりもフィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合することができ、ペプチドコンジュゲートのフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールよりもフィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する。
【００８０】
本発明によれば、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物、および薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤を含む医薬組成物も提供される。
【００８１】
好適な薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤は、当業者に周知である。薬学的に許容される担体、賦形剤および希釈剤は、本発明のペプチドデンドリマー、作用剤または組成物の創傷部位への局所投与に適したものを含む。好適な薬学的に許容される担体の例としては、好ましくは流動性の担体、例えばゼラチン、フィブリン、キトサン、フィブロネクチン、コラーゲン、デンプン、ヒアルロン酸が挙げられる。好適な薬学的に許容される希釈剤または賦形剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、アセテートもしくはリン酸緩衝液などの緩衝液；界面活性剤もしくは可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ  ８０、ポリソルベート８０）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えばメタクレゾール、パラベン（メチル、プロピルもしくはまたはブチル）、クロロブタノール、フェニル水銀塩（例えば酢酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩）、ソルビン酸、ベンジルアルコール）などの添加剤；および増量物質（例えばラクトース、マンニトール）、等張化剤（例えば糖、塩化ナトリウム）、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸の高分子化合物が挙げられる。
【００８２】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤および組成物の特定の利点は、これらが、ペプチドデンドリマーまたは組成物がフィブリノゲンを重合する能力を著しく失うことなく、例えば放射線照射、適切にはγ線照射への曝露によって容易に滅菌できることである。
【００８３】
本発明によれば、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物を滅菌する方法が提供され、滅菌方法は、ペプチドデンドリマー、作用剤または組成物を、好ましくは３０ｋＧｙまでのγ線照射に曝露することを含む。ペプチドデンドリマー、作用剤または組成物は、乾燥型、湿潤型、または溶媒型であり得る。
【００８４】
本発明によれば、滅菌状態の本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物も提供される。
【００８５】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤または組成物は、好ましくは、滅菌の、直ちに利用可能な製剤として、特に、滅菌の、直ちに利用可能な止血剤または創傷治療製剤として提供され得る。
【００８６】
一部の実施形態において、本発明のペプチドデンドリマーを、水和した流動性のゼラチンに製剤化して、シリンジに充填してもよく、これを放射線滅菌することで、滅菌の直ちに利用可能な流動性製品を提供することができる。
【００８７】
本発明によれば、フィブリノゲンを本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物と接触させることを含む、フィブリノゲンを重合する方法も提供される。
【００８８】
重合で使用されるデンドリマーおよびフィブリノゲンの相対濃度は、デンドリマーの性質、例えば、存在するフィブリノゲン結合ペプチドの数、およびフィブリノゲン結合ペプチドの配列に依存する。本出願者は、本発明のペプチドデンドリマーを０．００５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で、生理的濃度（３ｍｇ／ｍＬ）のフィブリノゲンとともに用いると、重合時間が急速になることを観察した。
【００８９】
本発明の一部のペプチドデンドリマーの場合、デンドリマーの濃度が増加すると、フィブリノゲン重合の速度（すなわち、「凝固時間」）が減少する。理論に束縛されるものではないが、これは、フィブリノゲン分子の「ａ」および／または「ｂ」ホールがデンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドによって飽和することによると考えられる。これらの高いデンドリマー濃度では、遊離フィブリノゲン結合ホール（すなわち、空の「ａ」ホールおよび／または「ｂ」ホール）に関して競合するフィブリノゲン結合ペプチドが過剰に存在し、この競合は重合が起こる速度を減少させると考えられる。
【００９０】
本発明によれば、ヒドロゲルを生成するためのキットも提供され、キットは本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物、およびそれとは別にフィブリノゲンを含む。
【００９１】
本発明によれば、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物のコポリマーと、フィブリノゲンとを含むヒドロゲルがさらに提供される。
【００９２】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤および組成物は、例えば、出血を治療するため、または創傷を治療するための止血剤として使用され得る。
【００９３】
本発明によれば、出血を治療する、または創傷を治療する方法が提供され、方法は、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物を、出血部位または創傷に投与することを含む。
【００９４】
ペプチドデンドリマー、作用剤または組成物は、出血部位または創傷に存在する内在性（すなわち、宿主の）フィブリノゲンを重合し得る。一部の実施形態において、外因性フィブリノゲンは、本発明のペプチドデンドリマー、作用剤または組成物と同様に、出血部位または創傷に投与され得る。
【００９５】
本明細書で用いる「フィブリノゲン」という用語は、トロンビンによって変換されてフィブリン（例えば、天然もしくは組換えフィブリンモノマー、または自然凝集することができてもできなくてもよいフィブリンモノマーの誘導体）を形成することができる、天然のフィブリノゲン、組換えフィブリノゲン、またはフィブリノゲン誘導体を包含する。フィブリノゲンは、少なくとも２個のフィブリノゲン結合ペプチドに結合することができるはずである。フィブリノゲンは、任意の供給源および任意の種（例えばウシフィブリノゲン）から得てもよいが、ヒトフィブリノゲンが好ましい。ヒトフィブリノゲンは、自己血液またはドナー血液から得てもよい。対象に投与される場合、自己フィブリノゲンまたは組換えフィブリノゲンは、感染症の危険性が減少することから好ましい。
【００９６】
ヒト対象への投与のためのペプチドデンドリマーの適切な量は、例えばデンドリマーの種類、例えば、デンドリマー分子当たり存在するフィブリノゲン結合ペプチドの数、および創傷または出血部位の種類もしくは大きさに依存する。しかし、デンドリマーの一般的な量は、デンドリマーを０．００５〜２５ｍｇ／ｍＬの濃度で含有する調製物（例えば、水性調製物）の０．１ｍＬ〜５０ｍＬ、例えば０．１ｍＬ〜５ｍＬ、または１〜５０ｍＬである。
【００９７】
ヒト対象への投与のための外因性フィブリノゲンの適切な量は、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、例えば３ｍｇ〜２００ｍｇである。
【００９８】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤または組成物は、創傷に直接投与するための液剤として提供しても、または塗布する前に任意選択でフィブリノゲンとともにスポンジもしくは布に（例えば含浸もしくは被覆させて）塗布してもよい。あるいは、本発明のペプチドデンドリマー、作用剤または組成物は、シリンジによる投与のために流動性のペーストと混合してもよい。
【００９９】
本発明によれば、薬剤として使用するための、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤または本発明の組成物も提供される。
【０１００】
本発明によれば、出血の治療に使用するまたは創傷の治療に使用するための、本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤または本発明の組成物がさらに提供される。
【０１０１】
本発明によれば、出血の治療に使用するまたは創傷の治療に使用するための薬剤の製造における本発明のペプチドデンドリマー、本発明の作用剤、または本発明の組成物の使用も提供される。
【０１０２】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤および組成物には、いくつかの重要な利点がある。特に、特定の実施形態において、ペプチドデンドリマー、作用剤および組成物は、従来の固相ペプチド合成手順を用いて、容易に製造することができる。最適な濃度であれば、本発明のペプチドデンドリマー、作用剤および組成物は、トロンビンの非存在下で、１秒未満でフィブリノゲンを重合することができる。本発明のペプチドデンドリマーおよび作用剤は、ヒト血漿中でフィブリノゲンを１秒未満で重合させることもできる。
【０１０３】
本発明のペプチドデンドリマーまたは作用剤の構造は、デンドリマーの意図される用途に関してその特性を最適化するように選択することができる。例えば、フィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する同じ配列のフィブリノゲン結合ペプチドを５個含むペプチドデンドリマーは、ほぼ瞬時にフィブリノゲンを重合させることができる。対照的に、フィブリノゲンの「ａ」ホールに優先的に結合する１個または複数のフィブリノゲン結合ペプチドと、フィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する１個または複数の異なるフィブリノゲン結合ペプチドとを有する「キメラ」ペプチドデンドリマーは、フィブリノゲンをよりゆっくりと重合することができるが、密度が高く、より大きいヒドロゲルを形成する。
【０１０４】
本発明のペプチドデンドリマー、作用剤および組成物は、フィビリノゲン重合活性を失わずに滅菌することができる。これは、ペプチドデンドリマー、作用剤および組成物が、滅菌状態の、直ちに利用可能な製剤、例えば、直ちに利用可能な止血もしくは創傷治療製剤として提供することを可能にするために、重要な利点である。
【０１０５】
ここで、本発明の実施形態を、添付の図面を参照して、単に例として述べる。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】好ましい実施形態のペプチドデンドリマーが種々の濃度でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。
【図２】いくつかの異なるペプチドデンドリマーが種々の濃度でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。番号は、ペプチドデンドリマーの識別番号を指す。
【図３】いくつかの異なるペプチドデンドリマーが種々の濃度でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。番号は、ペプチドデンドリマーの識別番号を指す。
【図４】いくつかの異なるペプチドデンドリマーが種々の濃度でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。番号は、ペプチドデンドリマーの識別番号を指す。
【図５】本発明の異なるペプチドデンドリマーを用いてフィブリノゲンを重合させることにより形成されたヒドロゲルの写真である。
【図６】本発明のペプチドデンドリマーとペプチドコンジュゲートの異なる組み合わせが、種々の濃度でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。
【図７】本発明のいくつかの異なるペプチドデンドリマーがヒト血漿中でフィブリノゲンを重合させる能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１０７】
ペプチドデンドリマーおよびペプチドコンジュゲートの合成
ペプチドは、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて標準Ｆｍｏｃペプチド合成により、リンクアミド低ロードＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、０．３６ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成した。
【０１０８】
全体的に、合成を通してシングルカップリングサイクルを用い、ＨＢＴＵ活性化化学を使用した（ＨＢＴＵおよびＰｙＢＯＰ（ＡＧＴＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）をカップリング剤として用いた）。しかし、一部の位置では、カップリングは想定したほど効率的ではなく、ダブルカップリングが必要であった。
【０１０９】
ペプチドはは、分岐点までは自動ペプチドシンセサイザーとＨＢＴＵを用いて構築し、ペプチド分岐はＰｙＢＯＰを用いて手動ペプチド合成によって構築した。
【０１１０】
自動合成では、各カップリングでアミノ酸とＨＢＴＵを３倍過剰に使用し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、Ｓｉｇｍａ）に溶解したジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を９倍過剰に使用した。
【０１１１】
手動合成では、各カップリングでアミノ酸とＰｙＢＯＰを３倍過剰に使用し、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ、Ｓｉｇｍａ）に溶解したＤＩＰＥＡを９倍過剰に使用した。
【０１１２】
ＤＭＦに溶解した２０％ピペリジン（Ｓｉｇｍａ）を用いる成長ペプチド鎖の脱保護（Ｆｍｏｃ基の除去）は、同様に必ずしも効率的はなく、二重の脱保護が必要であり得る。
【０１１３】
分岐は、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨまたはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを使用して行った。
【０１１４】
最終の脱保護および固相支持体からのペプチドの切断は、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ、Ｓｉｇｍａ）、水およびアニソール（Ｓｉｇｍａ）（１：１：１，５％）を含む９５％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ）で該樹脂を２〜３時間処理することで行った。
【０１１５】
切断されたペプチドを、冷ジメチルエーテル（Ｓｉｇｍａ）中で沈殿させ、遠心沈降によりペレット化し、次いで凍結乾燥した。このペレットを水（１０〜１５ｍＬ）に再溶解させ、濾過し、Ｃ−１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、流速２０ｍＬ／分）において０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水の勾配を用いた逆相ＨＰＬＣで精製した。精製生成物を凍結乾燥して、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳおよび分析的ＨＰＬＣで分析し、純粋（＞９５％）であることを証明した。質量分析の結果はすべて計算値と一致した。
ペプチドデンドリマーおよびペプチドコンジュゲート
【０１１６】
前述の方法を用いて合成したペプチドデンドリマーおよびペプチドコンジュゲートの構造を、以下に示す。
【０１１７】
ペプチド配列端部の「ＮＨ２−」基は、配列のアミノ末端のアミノ基を示す。ペプチド配列端部の「−ａｍ」基は、配列のカルボキシ末端のアミド基を示す。
ペプチドコンジュゲート＃１：
【０１１８】
【化１５】
0006717747.tif 000016
ペプチドコンジュゲート＃２：
【０１１９】
【化１６】
0006717747.tif 000017
ペプチドデンドリマー＃３：
【０１２０】
【化１７】
0006717747.tif 000018
ペプチドデンドリマー＃４：
【０１２１】
【化１８】
0006717747.tif 000019
ペプチドデンドリマー＃５：
【０１２２】
【化１９】
0006717747.tif 000020
ペプチドデンドリマー＃８：
【０１２３】
【化２０】
0006717747.tif 000021
ペプチドデンドリマー＃９：
【０１２４】
【化２１】
0006717747.tif 000022
ペプチドデンドリマー＃１０：
【０１２５】
【化２２】
0006717747.tif 000023
ペプチドデンドリマー＃１１：
【０１２６】
【化２３】
0006717747.tif 000024
ペプチドデンドリマー＃１２：
【０１２７】
【化２４】
0006717747.tif 000025
ペプチドデンドリマー＃１３：
【０１２８】
【化２５】
0006717747.tif 000026
【実施例２】
【０１２９】
フィブリノゲンとのペプチドデンドリマーの共重合
デンドリマー＃１２は、連続する５個のリジン残基を有する分岐コアを含む。リジン残基は、隣接するリジン残基の側鎖を介して共有結合する。
【０１３０】
フィブリノゲンを重合するペプチドデンドリマー＃１２の能力を評価した。濃度が０．００５〜２ｍｇ／ｍＬの範囲のデンドリマー溶液３０μＬを、３ｍｇ／ｍＬの精製ヒトフィブリノゲン（血中に見られるフィブリノゲンの濃度）１００μＬに加えた。フィブリノゲンの重合は、Ｓｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析器を使用して分析した。図１は、デンドリマーの濃度を増加させることによる重合（凝固）時間(秒）のプロットを示す。
【０１３１】
結果は、デンドリマーが、極めて低い濃度でもほぼ瞬時にフィブリノゲンと共重合することができることを示している。０．５ｍｇ／ｍＬを超えるデンドリマー濃度での凝固時間の増加は、フィブリノゲン中の遊離結合ポケットの数と比較して、フィブリノゲン結合ペプチドが過剰であることによって説明されると考えられる。濃度が高くなると、デンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドはフィブリノゲン結合ポケットを飽和させ、結果としてフィブリノゲンと共重合することができない過剰なデンドリマー分子がかなりの数になり得る。
【実施例３】
【０１３２】
デンドリマー当たりのフィブリノゲン結合ペプチドの数を変化させることがフィブリノゲンとの共重合の速度に及ぼす効果
本実施例では、ペプチドデンドリマー当たりのフィブリノゲン結合ペプチドの数を変化させることが、フィブリノゲンとの共重合の速度に及ぼす効果を検討する。
【０１３３】
フィブリノゲンと共重合するペプチドデンドリマー＃４、５、１０、１１および１２の能力を実施例２に記載したものと同じ方法を用いて評価した。各デンドリマーの濃度を、０．００５から０．５ｍｇ／ｍＬまで変化させた。図２は、異なる各デンドリマーの濃度を増加させることによる凝固時間(秒）のプロットを示す。
【０１３４】
結果は、デンドリマー＃５（デンドリマーあたりのフィブリノゲン結合ペプチドがわずか２個）がフィブリノゲンと共重合できなかったことを示している。約０．１２５〜約０．２７５ｍｇ／ｍＬのデンドリマー濃度では、フィブリノゲン結合ペプチドの数が３から５個に増えると、共重合の速度が増加した。約０．１２５ｍｇ／ｍＬ未満のデンドリマー濃度では、デンドリマー＃１０（デンドリマーあたりのフィビリノゲン結合ペプチドが３個）は、デンドリマー＃４（デンドリマーあたりのフィブリノゲン結合ペプチドが４個）より早い凝固時間を示した。約０．０２〜０．５ｍｇ／ｍＬの範囲内では、デンドリマー＃１２（デンドリマーあたりのフィブリノゲン結合ペプチドが５個）は、ほぼ瞬時に凝固をもたらした。約０．０５〜０．３ｍｇ／ｍＬの範囲内では、デンドリマー＃１１（デンドリマーあたりのフィブリノゲン結合ペプチドが４個）も、ほぼ瞬時に凝固をもたらした。
【０１３５】
デンドリマー当たりのフィブリノゲン結合ペプチドの数が増加すると、フィブリノゲンが本発明のデンドリマーによって重合される速度は通常、増加すると結論づけられる。
【実施例４】
【０１３６】
フィブリノゲンとの共重合速度に及ぼすフィブリノゲン結合ペプチドの方向性および異なるフィブリノゲン結合ペプチド配列の効果
フィブリノゲン結合ペプチドの方向性がフィブリノゲンと共重合するペプチドデンドリマーの能力に影響を及ぼし得るか否かを評価するために、１個の三官能性アミノ酸残基（リジン）に結合した３個のフィブリノゲン結合ペプチドを含むペプチドデンドリマーを合成した（「３分岐」デンドリマーと呼ぶ）が、フィブリノゲン結合ペプチドの１個は分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向き、そのカルボキシ末端でアミド化された。異なるフィブリノゲン結合ペプチド配列を含むペプチドデンドリマーがフィブリノゲンと共重合する能力も同様に試験した。
【０１３７】
ペプチドデンドリマー＃３および１０のフィブリノゲン結合ペプチドは、それぞれ、配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１５）のペプチドである。ペプチドデンドリマー＃１０の各フィブリノゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのカルボキシ末端の方向を向いている。ペプチドデンドリマー＃３のフィブリノゲン結合ペプチドの１個は、分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向いている。そのペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を１個含む。
【０１３８】
ペプチドデンドリマー＃８のフィブリノゲン結合ペプチドの２個は配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１５）のペプチドであり、３番目のフィブリノゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向く配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４のペプチド）である。そのペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を１個含む。
【０１３９】
ペプチドデンドリマー＃９のフィブリノゲン結合ペプチドの２個は配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号３）のペプチドであり、３番目のフィブリノゲン結合ペプチドは、分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向く配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４）のペプチドである。そのペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を１個含む。
【０１４０】
配列ＧＰＲＰＧ（配列番号１５）は、フィブリノゲンの「ａ」ホールと「ｂ」ホールに結合するが、「ａ」ホールにいくらか優先的に結合する。配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号３）は、フィブリノゲンの「ａ」ホールに高い優先度で結合する。配列Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏは、ペプチド鎖の骨格を安定させ、ノブ−ホール相互作用の親和性を高める（Ｓｔａｂｅｎｆｅｌｄら，ＢＬＯＯＤ，２０１０，１１６：１３５２−１３５９）。
【０１４１】
フィブリノゲンと共重合するデンドリマーの能力を、実施例２に記載のものと同じ方法を用いて、各デンドリマーの０．００５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で評価した。図３は、異なる各デンドリマーの濃度を増加させて得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１４２】
結果は、ペプチドが分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向く（すなわちデンドリマー＃３）ように、３分岐デンドリマーのフィブリノゲン結合ペプチドの１個の方向性を変えることで、フィブリノゲンと共重合するデンドリマーの能力が（デンドリマー＃３の凝固時間をデンドリマー＃１０の凝固時間と比較すると）減少したことを示している。しかし、より高いフィブリノゲン濃度では、デンドリマー＃３は、フィブリノゲンと共重合できた（データは図示せず）。
【０１４３】
分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向く異なる配列のフィブリノゲン結合ペプチドを有する３分岐デンドリマーは、フィブリノゲンと共重合することができた（デンドリマー＃８の結果を参照されたい）。
【０１４４】
フィブリノゲン結合ペプチドの２個が、フィブリノゲンの「ｂ」ホールに優先的に結合する配列（配列ＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号３））を含み、これらのペプチドが分岐コアに結合したそれらのカルボキシ末端の方向を向き、逆の配列（すなわち、配列ＡＰＦＰＲＰＧ（配列番号１４））を含む残りのペプチドが分岐コアに結合したそのアミノ末端の方向を向く、３分岐デンドリマー（デンドリマー＃９）も、フィブリノゲンとの共重合において非常に活性であった、
【実施例５】
【０１４５】
異なるフィブリノゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマーがフィブリノゲンと共重合する能力
ＧＰＲＰＧ（配列番号１５）およびＧＰＲＰＦＰＡ（配列番号３）モチーフは主にフィブリノゲン上の「ａ」ホ−ルに結合する。本実施例では、キメラペプチドデンドリマー（すなわち、同じ分岐コアに結合した、異なるフィブリノゲン結合ペプチド配列を有するペプチドデンドリマー）がフィブリノゲンと共重合する能力の評価を述べる。
【０１４６】
ペプチドデンドリマー＃１３は、キメラ４分岐ペプチドデンドリマーであり、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１５）を有するフィブリノゲン結合ペプチド（「ａ」ホールに選択的に結合する）を２個および配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）を有するフィブリノゲン結合ペプチド（「ｂ」ホールに選択的に結合する）を２個含む。非キメラペプチドデンドリマー＃１１と１２は、それぞれ４分岐ペプチドデンドリマーと５分岐ペプチドデンドリマーである。これらのデンドリマーの各フィブリノゲン結合ペプチドは、配列ＧＰＲＰＧ−（配列番号１５）を有する。デンドリマー＃１１、１２および１３の各フィブリノゲン結合ペプチドは、そのカルボキシ末端で分岐コアに結合している。
【０１４７】
デンドリマーがフィブリノゲンと共重合する能力を、実施例２に記載のものと同じ方法を用いて、各デンドリマーの０．００５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で評価した。図４は、各異なるデンドリマーの濃度を増加させて得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１４８】
結果は、キメラデンドリマーを用いた凝固速度が、０．３ｍｇ／ｍＬ未満の濃度で、非キメラデンドリマーより遅かったことを示している。一方、図５は、異なるデンドリマーを用いて得られたヒドロゲルの写真を示す。ゲルは、用いたペプチドデンドリマーの番号（１１、１２および１３）で示し、「Ｐ」は、いくつかのフィブリノゲン結合ペプチドが可溶性のヒト血清アルブミンに結合している生成物を用いて形成されたヒドロゲルを示す。キメラデンドリマーで形成されたヒドロゲルは、デンドリマー＃１１および１２を用いて（３ｍｇ／ｍＬのフィブリノゲンまたはより高濃度のフィブリノゲンで）形成されたヒドロゲルと比較して、より密度が高く、液体含量が少なかった。このように、キメラデンドリマーを用いると、凝固時間は遅かったが、このデンドリマーを用いて形成されたヒドロゲルはより密度が高かった。
【実施例６】
【０１４９】
ペプチドデンドリマーとペプチドコンジュゲートの混合物がフィブリノゲンと共重合する能力
配列ＧＰＲＰ−（配列番号１）のフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ａ」ホールに強く、かつ優先的に結合する（Ｌａｕｄａｎｏら，１９７８  ＰＮＡＳ  ７Ｓ）。ペプチドコンジュゲート＃１は、この配列を有するフィブリノゲン結合ペプチドを２個含み、各ペプチドはリジン残基に結合している。第１のペプチドは、そのカルボキシ末端がリンカーによってリジン残基に結合しており、第２のペプチドは、そのアミノ末端がリンカーによってリジン残基に結合している。第２のペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を含む。
【０１５０】
配列ＧＨＲＰＹ−（配列番号１１）のフィブリノゲン結合ペプチドは、フィブリノゲンの「ｂ」ホールに強く、かつ優先的に結合する（ＤｏｏｌｉｔｔｌｅおよびＰａｎｄｉ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６，４５，２６５７−２６６７）。ペプチドコンジュゲート＃２は、この配列を有し、そのカルボキシ末端でリンカーによってリジン残基に結合している第１のフィブリノゲン結合ペプチドを含む。逆の配列（ＹＰＲＨＧ（配列番号１６））を有する第２のフィブリノゲン結合ペプチドは、そのアミノ末端でリンカーによってリジン残基に結合している。第２のペプチドのカルボキシ末端は、アミド基を含む。
【０１５１】
このリンカーにより、各ペプチドは互いから離れるように伸長することができる。
【０１５２】
ペプチドコンジュゲート＃１または２（２ｍｇ／ｍＬ）をペプチドデンドリマー＃３または４、およびフィブリノゲンと混合し、次いでこの混合物がフィブリノゲンと共重合する能力を、実施例２に記載のものと同じ方法を用いて、各デンドリマーの０．０２５〜０．５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で評価した。図６は、各異なるデンドリマーの濃度を増加させて得られた凝固時間（秒）のプロットを示す。
【０１５３】
結果は、意外にも、ペプチドコンジュゲート＃２（すなわち、Ｂノブペプチドを有する）とデンドリマーペプチドとを含む混合物のみが相乗的で活性を増加させたが、一方、ペプチドコンジュゲート＃１（Ａノブペプチド）を含有する混合物は、ペプチドコンジュゲート＃２またはペプチドデンドリマーのいずれに加えても、活性がなかったことを示している。
【実施例７】
【０１５４】
ペプチドデンドリマーがヒト血漿中でフィブリノゲンを重合する能力
いくつかの異なるペプチドデンドリマー（＃４、５、８、９、１０、１１、１２、１３）がヒト血漿中でフィブリノゲンを重合する能力を試験した。
【０１５５】
各デンドリマー（０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で）３０μＬを３７℃でヒト血漿１００μＬに加え、フィブリノゲンの重合をＳｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析器を用いて決定した。
【０１５６】
各デンドリマーの凝固時間を図７に示す。ペプチドデンドリマー＃１０、１１、４、１２および１３はヒト血漿中でフィブリノゲンを重合することができ、特に、デンドリマー＃１２は有効（凝固時間が１秒未満）であった。しかし、ペプチドデンドリマー＃５、８および９は、ヒト血漿中でフィブリノゲンを重合することができなかった。
【実施例８】
【０１５７】
直ちに利用可能なペプチドデンドリマー製剤に及ぼす滅菌の効果
本実施例では、水和ゼラチンを用いて直ちに利用可能なペースト剤として製剤化されたペプチドデントリマーの止血活性に及ぼすγ線照射の効果について述べる。
【０１５８】
ペプチドデンドリマー＃１２または１３の溶液２ｍＬをＳＵＲＧＩＦＬＯ  Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｃ  Ｍａｔｒｉｘ（水和流動性ゼラチンマトリックス）と混合して、各ペプチドのペーストを形成した。各ペーストを、６０Ｃｏγ線を３０ｋＧｙの線量で照射することで滅菌し、次いで室温で保存した。２週間および４週間保存した後、滅菌した各ペーストの試料を試験に使用した。
【０１５９】
保存後、ペプチドデンドリマーを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して、各ペーストから抽出した。各抽出物（約０．２５ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度で）３０μＬを３ｍｇ／ｍＬのヒトフィブリノゲン１００μＬに加え、各デンドリマーが３７℃でフィブリノゲンを重合する（「凝固」活性）能力をＳｉｇｍａ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ４  Ｄｅｌｔａ凝固分析器を用いて決定した。非照射対照試料の重合活性も決定した。結果を以下の表にまとめる。
【０１６０】
【表１】
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【０１６１】
これらの結果は、水和ゼラチンを用いて直ちに利用可能なペーストとして製剤化した、本発明のペプチドデンドリマーが放射線照射による滅菌後もフィブリノゲンを重合する能力を保持していることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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