(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド(tag oligonucleotide)、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチド(single nucleotide polymorphism-specific oligonucleotide)から構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー；及び、
ｉｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてＰＣＲ産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含み、前記延長ポリヌクレオチドの長さは２０〜２００ｎｔである、一塩基多型検出用キット。
【請求項２】
ｉｖ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項１に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項３】
前記一塩基多型は、野生型又は突然変異型である、請求項１に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項４】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；及び、
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてＰＣＲ産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含み、前記延長ポリヌクレオチドの長さは２０〜２００ｎｔである、一塩基多型検出用キット。
【請求項５】
ｖ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項４に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項６】
前記第１対立遺伝子は野生型であり、前記第２対立遺伝子は突然変異型である、請求項４に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項７】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的塩基配列から構成される野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第１ＰＣＲ産物の長さを延長するための第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；及び、
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり, プライマー延長反応を通じて第２ＰＣＲ産物の長さを延長するための第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；を含み、前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチドの長さは共に２０〜２００ｎｔであり、長さの差が２０〜１８０ｎｔである、一塩基多型検出用キット。
【請求項８】
ｖｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー、及びｖｉｉ）前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含む、請求項７に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項９】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第１ＰＣＲ産物の長さを延長するための第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第２ＰＣＲ産物の長さを延長するための第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；及び、
ｖｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー；を含み、前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチドの長さは共に２０〜２００ｎｔであり、長さの差が２０〜１８０ｎｔである、一塩基多型検出用キット。
【請求項１０】
反応緩衝液、ｄＮＴＰ混合物、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の一塩基多型検出用キット。
【請求項１１】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応を行うステップ；及び、
ｉｉ）前記対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応の産物に対してＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてＰＣＲ産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含み、
前記延長ポリヌクレオチドの長さは２０〜２００ｎｔである、一塩基多型検出方法。
【請求項１２】
ｉｉｉ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記リバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応を実行するステップをさらに含む、請求項１１に記載の一塩基多型検出方法。
【請求項１３】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び、
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じてＰＣＲ産物の長さを延長するための延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ；を含み、
前記延長ポリヌクレオチドの長さは２０〜２００ｎｔである、一塩基多型検出方法。
【請求項１４】
ｉｉｉ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応を実行するステップをさらに含む、請求項１３に記載の一塩基多型検出方法。
【請求項１５】
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び、
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第１ＰＣＲ産物の長さを延長するための第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成された第１延長用プライマー；及び、ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、前記リバースプライマー及びこれらの相補的塩基配列のいずれともハイブリダイズしない塩基配列であり、プライマー延長反応を通じて第２ＰＣＲ産物の長さを延長するための第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマーを用いて、前記一塩基多型特異的ＰＣＲ反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含み、
前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチドの長さは共に２０〜２００ｎｔであり、長さの差が２０〜１８０ｎｔである、一塩基多型検出方法。
【請求項１６】
ｉｉｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー、及び前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマー；及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応ステップをさらに含む、請求項１５に記載の一塩基多型検出方法。
【請求項１７】
前記ステップｉ及びｉｉは、単一反応容器内で実行される、請求項１１、１３及び１５のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
【請求項１８】
前記ステップｉ〜ｉｉｉは、単一反応容器内で実行される、請求項１２、１４及び１６のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
【請求項１９】
前記一塩基多型特異的ＰＣＲ反応は、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行われる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の一塩基多型検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ検出用キット及び方法に関し、より詳細には、一塩基多型検出用キット及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）マップが完成されて、疾病に対するリスクの測定、疾病の診断又は予診、そして薬物に対する反応の予測をより広範囲にすることができるという可能性が提示され、最近では、様々な遺伝子についての機能が明らかになっている。様々な遺伝子についての機能究明により、例えば、特定人の特定遺伝子に対する変異分析を通じて、疾病に対するリスクがどの程度なのかを予測して疾病を事前に予防するように誘導することができる。また、生命体に感染を引き起こす他の感染体、例えば、ウイルスなどの遺伝子変異分析を通じて、当該ウイルスが特定治療薬に対して耐性を持っているか否かを分析することができ、このような遺伝子型の分析を通じて、感染体の特定治療薬に対する反応、例えば、耐性反応を予測することにより、患者の個人別カスタムメイド治療方法を開発することができる。このような個人カスタムメイド医療及び治療コンパニオン診断の核心基盤技術である一塩基多型性（ＳＮＰ；Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）分析に新しいＰＣＲ技術を用いてＳＮＰを分析して、カスタムメイド医療診断及び患者の遺伝型による薬物の効用性を診断するコンパニオン診断における従来のＰＣＲ及びＮＧＳ（Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の限界と高価分析機器の必要性、そして分析まで長時間かかるなどの問題を解決することができる。具体的には、従来のＰＣＲ（例えばＡＳ−ＰＣＲベース）などは、異型接合型（ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｅ）の点突然変異分析の難しさの限界などがあり、Ｔａｑ−ｍａｎ  Ｐｒｏｂｅなどを用いるＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲは、光源及び蛍光物質の限界による分析チャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）の制限及び現場診断（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ−ｔｅｓｔｉｎｇ、ＰＯＣＴ）機器への開発の難しさが存在する。ＮＧＳを用いたシークエンシング（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）は、その分析コスト及び機器の高価さ、そして複雑なプロセス及び所要時間が長くかかり、また、ＰＯＣＴとして適用が不可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１２、８：３４、２０１２
【非特許文献２】Ｓｌｅｎｔｚ−Ｋｅｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、１０：５４９−５５７、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、前記のような問題点を含めて、複数の問題点を解決するためのものであり、多重ＳＮＰ分析のＰＯＣＴ機器として開発が容易な新しい一塩基多型検出用キット及び方
法を提供することを目的とする。しかし、このような課題は例示的なものであり、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー；及び、
ｉｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【０００６】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；及び
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【０００７】
本発明の他の一観点によると、ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；及び
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【０００８】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；及び
ｖｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー；を含む、一塩基多型検出用キットが提供される。
【０００９】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、ｂ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー、ｃ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びｄ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
【００１０】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ｂ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ｃ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、ｄ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び１）前記第１タグオリゴヌクレオチド及び２）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びｅ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
【００１１】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的塩基配列から構成される野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー、ｂ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー、ｃ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、ｄ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー、ｅ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー、ｆ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー、及びｇ）前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００１２】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応を行うステップ；及び
ｉｉ）前記対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応の産物に対してＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００１３】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ；を含む一塩基多型検出方法が提供される。
【００１４】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成された第１延長用プライマー；及びＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、前記第１延長ポリヌクレオチドと、電気泳動ゲル上で、区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマーを用いて前記一塩基多型特異的ＰＣＲ反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の一実施例によると、特定遺伝子の一塩基多型の有無及び種類を正確かつ迅速に検出することが可能である。したがって、本発明の一実施例による一塩基多型検出用キット及び方法は、癌をはじめとする各種疾病の診断、特に特定薬物に対する反応性の有無及び代替薬物の選択に重要な情報を提供するコンパニオン診断（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に非常に有用に用いることができる。もちろん、このような効果により、本発明の範囲が限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施例による一塩基多型検出キットの検出対象の一塩基多型と、これを増幅するための各種プライマーを概略的に示した概要図である。
【図２】本発明の一実施例による一塩基多型検出キットによって実行される対立遺伝子特異的核酸増幅反応を例示的に示した概要図である。
【図３】本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な非対称プライマー延長反応及び前記対立遺伝子特異的な非対称プライマー延長産物の増幅反応を例示的に示した概要図である。
【図４】本発明の一実施例による一塩基多型検出キットの検出対象の一塩基多型と、これを増幅するための各種プライマーを概略的に示した概要図である。
【図５】本発明の一実施例による一塩基多型検出キットによって実行される対立遺伝子特異的な核酸増幅反応を概略的に示した概要図である。
【図６】前記図５に示した対立遺伝子特異的な核酸増幅反応後、対立遺伝子特異的な延長プライマーを用いて実行される、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応を概略的に示した概要図である。
【図７】前記対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応の産物をＰＣＲ反応で増幅する核酸増幅反応を概略的に示した概要図である。
【図８】通常の対立遺伝子特異的なＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）、及び本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー増幅反応物又はこれを増幅した増幅産物に対するアガロースゲル電気泳動の結果を例示的に示した概要図である。
【図９】本発明の一実施例により実行された対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応の結果を示す写真である。
【図１０】本発明の一実施例により実行された対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ反応の結果を示す写真である。
【図１１】本発明の一実施例により実行されたマルチプレックス対立遺伝子特異的なＰＣＲ（上段）及びマルチプレックス対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ反応（下段）の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
用語の定義：
以下、本文書で使用される用語を定義する：
本文書で使用される用語「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、核酸を構成する単量体分子で、塩基、五炭糖及びリン酸から構成されており、前記塩基は、ＤＮＡの場合アデニン（ａｄｅｎｉｎｅ）、グアニン（ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎ
ｅ）、及びチミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）の４つが存在し、ＲＮＡの場合には前記チミンの代わりにウラシル（ｕｒａｃｉｌ）が用いられる。前記五炭糖は、ＤＮＡの場合２’−デオキシリボース（２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）、ＲＮＡの場合リボース（ｒｉｂｏｓｅ）が用いられる。
【００１８】
本文書で使用される用語「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、前記ヌクレオチド単量体分子の重合体であり、一般的に１３〜２５個までのヌクレオチドから構成された、短い一本鎖核酸鎖を意味するが、場合によっては６−ｍｅｒ、７−ｍｅｒ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ、１１−ｍｅｒ及び１２−ｍｅｒなど１３個未満のヌクレオチドから構成されたり、２５個を超えるヌクレオチドから構成された核酸鎖を指すこともある。
【００１９】
本文書で使用される用語「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、通常、前記オリゴヌクレオチドよりもさらに長いヌクレオチド単量体の重合体鎖を意味するが、前記オリゴヌクレオチドと混用されて使用もされる。ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖核酸鎖の両方を含む。
【００２０】
本文書で使用される用語「センス鎖」は、二本鎖ＤＮＡ分子中の遺伝子のコードの進行方向と同じ方向の一本鎖核酸分子を意味し、「アンチセンス鎖」は、前記センス鎖と相補結合をする他の一本鎖核酸分子を意味するが、遺伝子のコード進行方向とは無関係に、最初に塩基配列が究明された鎖を「センス鎖」と定義し、その相補鎖を「アンチセンス鎖」と定義してもかまわない。
【００２１】
本文書で使用される用語「ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」又は「核酸増幅反応」は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、特定の標的核酸分子を増幅する反応を意味する。ＰＣＲには、ＤＮＡポリメラーゼのほか、標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドであるプライマー（フォワードプライマー、リバースプライマー）、ジオキシヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ）、Ｍｇ２＋などの２価イオンを含む反応緩衝液などが使用される。前記ＰＣＲ反応によって生成されたＤＮＡ分子を、本文書では「増幅産物」と指称した。
【００２２】
本文書で使用される用語「プライマー延長反応（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」は、ＤＮＡポリメラーゼが、限られた長さの鋳型核酸に相補的にハイブリダイズされたプライマーを延長させて前記鋳型核酸の５’末端で終了となる非連鎖反応を意味する。前記プライマー延長反応によって生成されたＤＮＡ分子を、本文書では「延長産物」と指称した。
【００２３】
本文書で使用される用語「プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）」は、ＰＣＲ反応又はプライマー延長反応（ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の開始のために使用される、鋳型ＤＮＡに相補的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを意味する。ＰＣＲ反応のためのプライマーは、増幅される核酸分子の遺伝子コード進行方向と同じセンス鎖から選択されるフォワードプライマー（又はセンスプライマー）及び前記センス鎖に相補的なアンチセンス鎖から選択されるリバースプライマー（又はアンチセンスプライマー）の対が使用され、プライマー延長反応の場合、通常、単一の延長用プライマーが用いられる。
【００２４】
本文書で使用される用語「タグ（ｔａｇ）」は、特定の一塩基多型を特異的に区分するために対立遺伝子特異的プライマーの５’末端に付加されるオリゴヌクレオチドを意味し、前記タグは、対応する一塩基多型ヌクレオチドによる固有の塩基配列を有しており、前記塩基配列は、増幅対象の塩基配列を含む核酸と、延長用プライマーを除いた他のプライマーとの相同性が存在しておらず非特異的増幅反応を最小化するように考案する。
【００２５】
本文書で使用される用語「一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ」は、ＤＮＡ塩基配列で１つの塩基配列（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）の差異を示す遺伝的変化又は変異を意味する。通常、人口集団で１％以上の頻度で存在する２つ以上の対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）が発生する位置をＳＮＰというが、対立遺伝子型が５％以上の頻度で存在する場合、通常、多型（ｃｏｍｍｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）といい、１〜５％である場合、希薄多型（ｒａｒｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）と分類する。
【００２６】
本文書で使用される用語「対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）」とは、同一遺伝子又は同一遺伝学的座位（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｌｏｃｕｓ）における一群の選択的な形態のうちのいずれか１つを意味する。時々異なる対立遺伝子らは、他の観察可能な表現型的特性を生じさせることがある。しかし、ほとんどの遺伝学的変異は観察可能な変異をほとんど誘発しない。本文書で使用される「一塩基多型の第１対立遺伝子」及び「一塩基多型の第２対立遺伝子」は、一塩基多型部位の塩基の変異によって発生する複数の対立遺伝子を任意の順序で区分したものであり、いずれか１つが主な対立遺伝子（頻度が高い対立遺伝子又は野生型）の場合、他の１つは少数の対立遺伝子（頻度が低い対立遺伝子又は突然変異型）でありうる。
【００２７】
本文書で使用される用語「ＡＳＢＰＥ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」は、ＳＮＰ上の変異の有無及び種類を確認することができる対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応を意味し、前記延長反応によって延長された核酸分子を延長に使用した延長用プライマー内から選択されるプライマー対により増幅することにより、ＳＮＰ上の変異の有無及び種類を確認することが可能である。
【００２８】
本発明の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー；及び
ｉｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【００２９】
前記一塩基多型検出用キットは、ｉｖ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含むことができる。
【００３０】
前記一塩基多型検出用キットにおいて、前記一塩基多型は、野生型又は突然変異型であってもよい。
【００３１】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；及び
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【００３２】
前記一塩基多型検出用キットは、ｖ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含むことができる。
【００３３】
前記延長ポリヌクレオチドの長さは、２０〜２００ｎｔ、３０〜１５０ｎｔ、又は４０〜１００ｎｔであってもよい。
【００３４】
前記一塩基多型検出用キットにおいて、前記第１対立遺伝子は野生型であり、前記第２対立遺伝子は突然変異型であってもよい。又は前記第１対立遺伝子は突然変異型であり、前記第２対立遺伝子は野生型であってもよい。
【００３５】
本発明の他の一観点によれば、ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；及び
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；を含む一塩基多型検出用キットが提供される。
【００３６】
前記一塩基多型検出用キットは、ｖｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー及びｖｉｉ）前記第
２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマーをさらに含むことができる。
【００３７】
前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチドは、電気泳動後のサイズを区分することができるほどに、その長さが異なることがある。例えば、前記第１延長ポリヌクレオチドのサイズが２０〜５０ｎｔの場合、前記第２延長ポリヌクレオチドのサイズは７０〜２００ｎｔでありうる。
【００３８】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；
ｉｉｉ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー；
ｉｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー；
ｖ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー；及び
ｖｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される共通の塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー；を含む、一塩基多型検出用キットが提供される。
【００３９】
前記一塩基多型検出用キットは、反応緩衝液、ｄＮＴＰ混合物、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含むことができる。
【００４０】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、ｂ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマー、ｃ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びｄ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００４１】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ｂ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ｃ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、ｄ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び１）前記第１タグオリゴヌクレオチド及び２）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマー、及びｅ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００４２】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ａ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型特異的オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー、ｂ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型特異的オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー、ｃ）前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマー、ｄ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成される第１延長用プライマー、ｅ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、電気泳動ゲル上で、前記第１延長ポリヌクレオチドと区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマー、ｆ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー；及びｇ）前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマーを、増幅対象の塩基配列を含む核酸が含まれた試料、ｄＮＴＰ混合物、熱安定ＤＮＡポリメラーゼ及び反応緩衝液が含まれた反応液に混合するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲを実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００４３】
前記一塩基多型検出方法において、
前記ＰＣＲを実行するステップは、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行うことができる。
【００４４】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端のタグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型特異的フォワードプライマー、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するためのリバースプライマーを用いて増幅対象の塩基配列を含む核酸の対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応を実行するステップ；及び
ｉｉ）前記対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応の産物に対してＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及び前記タグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いてプライマー延長反応を実行するステップを含む、一塩基多型検出方法が提供される。
【００４５】
前記一塩基多型検出方法は、
ｉｉｉ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記リバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応を実行するステップをさらに含むことができる。
【００４６】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の第１対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第１対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の第２対立遺伝子特異的ヌクレオチドを３’末端に含む一塩基多型の第２対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドから構成される一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記一塩基多型の第１対立遺伝子特異的フォワードプライマー、前記一塩基多型の第２対立遺伝子特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である延長ポリヌクレオチド、及びａ）前記第１タグオリゴヌクレオチド及びｂ）前記第２タグオリゴヌクレオチドのいずれか１つのタグオリゴヌクレオチドから構成される延長用プライマーを用いて前記一塩基多型の対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップ；を含む一塩基多型検出方法が提供される。
【００４７】
前記一塩基多型検出方法は、
ｉｉｉ）前記延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される延長産物増幅用フォワードプライマー及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応を実行するステップをさらに含むことができる。
【００４８】
本発明の他の一観点によると、
ｉ）ＰＣＲ条件で、増幅対象の塩基配列を含む核酸とハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第１タグオリゴヌクレオチド、及び増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、一塩基多型部位の野生型ヌクレオチドを３’末端に含む野生型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される野生型特異的フォワードプライマー；ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸及び前記第１タグオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしない塩基配列から構成される５’末端の第２タグオリゴヌクレオチド、及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸と特異的にハイブリダイズが可能であり、前記一塩基多型部位の突然変異型ヌクレオチドを３’末端に含む突然変異型配列増幅用オリゴヌクレオチドから構成される突然変異型特異的フォワードプライマー；及び前記増幅対象の塩基配列を含む核酸を増幅するための共通のリバースプライマーを用いて、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に対して一塩基多型特異的ＰＣＲ反応を実行するステップ；及び
ｉｉ）ＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列である第１延長ポリヌクレオチド、及び前記第１タグオリゴヌクレオチドから構成された第１延長用プライマー；及びＰＣＲ条件で、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸、前記野生型特異的フォワードプライマー、前記突然変異型特異的フォワードプライマー、及び前記リバースプライマーのいずれともハイブリダイズしない塩基配列であって、前記第１延長ポリヌクレオチドと、電気泳動ゲル上で、区分される長さを有する第２延長ポリヌクレオチド、及び前記第２タグオリゴヌクレオチドから構成される第２延長用プライマーを用いて前記一塩基多型特異的ＰＣＲ反応の反応産物に対するプライマー延長反応を実行するステップを含む一塩基多型検出方法が提供される。
【００４９】
前記一塩基多型検出方法は、
ｉｉｉ）前記第１延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第１延長産物増幅用フォワードプライマー、前記第２延長ポリヌクレオチド内から選択される塩基配列から構成される第２延長産物増幅用フォワードプライマー、及び前記共通のリバースプライマーを用いて前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応ステップをさらに含むことができる。
【００５０】
前記一塩基多型検出方法において、
前記ステップｉ及びｉｉは、単一反応容器内で、単一ステップで実行されてもよく、  前記ステップｉ〜ｉｉｉは、単一反応容器内で、単一ステップで実行されてもよい。
【００５１】
前記一塩基多型検出方法において、
前記一塩基多型特異的ＰＣＲ反応は、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応で行うことができる。
【００５２】
前記一塩基多型検出方法は、前記プライマー延長反応の産物、又は前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応の産物をゲル上にロードし、電気泳動を行った後、バンドパターンを確認するステップをさらに含むことができる。
【００５３】
選択的に前記一塩基多型検出方法において、前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応は、通常のＰＣＲ又はリアルタイムＰＣＲにより行うことができる。前記リアルタイムＰＣＲはプライマー対の他に、前記第１延長ポリヌクレオチド及び前記第２延長ポリヌクレオチドにそれぞれ特異的に結合するＴａｑＭａｎプローブを用いて実行されたり、ＳｙＢｒ  Ｇｒｅｅｎのような蛍光挿入剤（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｔｅｒｃｈｅｌａｔｅ）を用いて実行されてもよい。この場合、蛍光種類によって前記延長反応の産物を特異的に検出することができる。
【００５４】
前記方法において、前記プライマー延長反応の産物を増幅するＰＣＲ反応は、最適のハイブリダイズ条件を探索するために、アニーリング温度の勾配を置いた複数の反応により行うこと
ができる。
【００５５】
本発明で特に言及されない限り、複数のオリゴヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドから構成された核酸分子は、５’末端から３’末端の順で説明される。
【００５６】
以下、本発明の一実施形態によるキット及び方法を添付の図面によって、より詳細に説明する。
【００５７】
図１〜３は、本発明の一実施例による一塩基多型検出キットの検出対象の一塩基多型と、これを増幅するための各種プライマー（図１）、本発明の一実施例による一塩基多型検出キットによって実行される対立遺伝子特異的な核酸増幅反応（図２）、及び対立遺伝子特異的な非対称プライマー延長反応及び前記対立遺伝子特異的な非対称プライマー延長産物の増幅反応（図３）を例示的に示した概要図である。図１に示すように、ゲノム内に特定遺伝子の特定一塩基多型部位において野生型と突然変異型が共に存在する異型接合体の場合を想定することができる。図１に例示されたように、野生型対立遺伝子にはＣ：Ｇ塩基対が、突然変異型対立遺伝子にはＣ＞Ａ（相補鎖面ではＧ＞Ｔ）変異が存在する場合、通常の対立遺伝子特異的ＰＣＲ方法を用いて、プライマーの使用及び対立遺伝子特異的な蛍光プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを介して、ＳＮＰの有無を確認することができる。この場合、高価な蛍光プローブとリアルタイムＰＣＲ機器を使用するという面で、コスト上、不利である。一方、本発明の一実施例によると、対立遺伝子特異的プライマー１１０、１２０を使用するという点では、通常の対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）と類似するが、本発明の一実施例では、対立遺伝子特異的プライマーの５’末端に増幅対象の塩基配列を含む核酸に存在しない固有の識別タグ１１２、１２２を使用することにより、蛍光プローブやリアルタイムＰＣＲの使用がなくても、ＳＮＰの有無及び種類まで確認することができる。野生型特異的フォワードプライマー１１０及び突然変異型特異的フォワードプライマー１２０の場合、それぞれ３’末端が、前記一塩基多型において野生型及び突然変異型のヌクレオチドであるため、実際の野生型特異的フォワードプライマー１１０は、野生型対立遺伝子のみを選択的に増幅することができ、突然変異型特異的フォワードプライマー１２０は、突然変異型対立遺伝子のみを選択的に増幅することができる（図２）。このとき、共通のリバースプライマー１３０は、野生型対立遺伝子及び突然変異型対立遺伝子を共に増幅することができるようにする。一方、従来のＡＳ−ＰＣＲの場合、野生型特異的プライマー又は突然変異型特異的プライマーのみを使用して、単一反応でＰＣＲを実行するため、野生型一塩基多型を持っているか、それとも突然変異型一塩基多型を持っているかを区分するためにＰＣＲ反応を分離して行わなければならず、単一反応で、当該一塩基多型部位に対して同型接合であるか異型接合であるかを確認することができなかった。図２及び図３に示すように、本発明の一実施例によるキットでは、二つの対立遺伝子特異的フォワードプライマー１１０、１２０のいずれか（図１では野生型特異的プライマー１１０）の５’末端の識別塩基配列であるタグオリゴヌクレオチド１１２（前記タグオリゴヌクレオチドは、増幅対象の塩基配列を含む核酸を含むゲノムＤＮＡ及びリバースプライマーとは相補結合をしない）を３’末端に含み、前記ＡＳ−ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物の長さを延長するための延長オリゴヌクレオチド１６１を５’末端に含む延長用プライマー１６０をさらに含むことを特徴とする。延長プライマー１６０のタグオリゴヌクレオチドと、対立遺伝子特異的なＰＣＲ反応産物のうち野生型増幅産物のアンチセンス鎖１４１の前記タグオリゴヌクレオチドの相補的配列との間の相補結合後、プライマー延長反応を行う場合、対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応（ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、ＡＳＢＰＥ）が行われる（図３の上段）。前記対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応が完了すると、これをすぐにアガロースゲル電気泳動によって確認することが可能である。選択的に延長オリゴヌクレオチド１６１の５’末端の固有の塩基配列のうちから選択される延長産物増幅用フォワードプライマー２００と、前記対立遺伝子特異的な
増幅に用いられたリバースプライマー１３０を用いて、延長産物を増幅する場合、前記ＡＳＢＰＥ産物に対する増幅によって、より確実に特定の対立遺伝子特異的な延長産物を検出することができる。このとき、ＡＳＢＰＥ反応だけで検出する場合と延長産物の増幅反応まで実行して検出する場合、用いられるプライマーの濃度を適切に調節することにより、最適な検出条件を樹立することができる。
【００５８】
実際、前記図１〜３に示された本発明の一実施例の方法により異型接合である一塩基多型部位を特異的に増幅した実験結果が図９に示されている。図９に示すように、野生型対立遺伝子は、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）により増幅され（１１５ｂｐ）、突然変異型対立遺伝子は、本発明の対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ反応により増幅された（１１５＋１１７ｂｐ）。又は突然変異型対立遺伝子が対立遺伝子特異的なＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）により増幅され、野生型対立遺伝子が、本発明の対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ反応により増幅されうることは言うまでもない。
【００５９】
図４〜７は、本発明の他の一実施態様を示すものである。図４は、図１と異なる点は延長用プライマーが野生型だけでなく、突然変異型にも適用され、２つの延長用プライマーが用いられているという点である。したがって、野生型及び突然変異型が共に対立遺伝子特異的なＰＣＲの後、対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲを介して増幅されるという点である。図５は、対立遺伝子特異的なＰＣＲの過程を図式的に示した概要図であり、図６は、対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応の過程を図式的に示した概要図であり、図７は、前記対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応の産物に対するＰＣＲ過程を図式的に示した概要図である。図８は、ＡＳ−ＰＣＲと、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲにより、野生型及び突然変異型対立遺伝子を増幅した後、アガロースゲル電気泳動を行う場合、予想されるバンドパターンを図式的に示したものである。
【００６０】
図４に示すように、野生型特異的フォワードプライマー１１０及び突然変異型特異的フォワードプライマー１２０の５’末端配列は、前記増幅対象の塩基配列を含む核酸に存在しない固有の塩基配列であり、野生型特異的増幅産物及び突然変異型特異的増幅産物固有のタグの役割を果たす。便宜上、前記野生型特異的フォワードプライマーに含まれたタグは、第１タグオリゴヌクレオチド１１２と定義し、前記突然変異型特異的フォワードプライマーに含まれたタグは、第２タグオリゴヌクレオチド１２２と定義する。もし当該一塩基多型部位に複数の突然変異が存在する場合、第３タグオリゴヌクレオチド（図示せず）及び／又は第４タグオリゴヌクレオチド（図示せず）がそれぞれ追加されてもよく、前記第３タグオリゴヌクレオチドが含まれた突然変異型特異的フォワードプライマーは、前記突然変異型特異的フォワードプライマーと区分するため、便宜上、第２突然変異型特異的フォワードプライマー（図示せず）、前記第４タグオリゴヌクレオチドが含まれた突然変異型特異的フォワードプライマーは、第３突然変異型特異的フォワードプライマー（図示せず）と定義する。図５に示すように、第１タグオリゴヌクレオチド１１２及び第２タグオリゴヌクレオチド１２２をそれぞれ含む野生型特異的フォワードプライマー１１０及び突然変異型特異的フォワードプライマー１２０と、共通のリバースプライマー１３０によるＰＣＲ反応によって、野生型増幅産物１４０及び突然変異型増幅産物１５０が算出される（このステップでの２つのＰＣＲ 産物はサイズが同じであり、電気泳動ゲル上でバンドが重なり区分ができない）。第１タグオリゴヌクレオチド１１２及び第２タグオリゴヌクレオチド１２２は、それぞれプライマー延長反応のために用いられる第１延長用プライマー及び第２延長用プライマーの３’末端配列で用いられる。したがって、図６に示すように、変性されて一本鎖化された野生型増幅産物のアンチセンス鎖１４１は、第１延長用プライマー１６０の３’末端に位置する第１タグオリゴヌクレオチド１１２と特異的にハイブリダイズされ、突然変異型増幅産物のアンチセンス鎖１５１は、第２延長用プライマー１７０の３’末端に位置する第２タグオリゴヌクレオチド１２２と特異的にハイブリダイズされることによって、それぞれ第１延長産物１８０及び第２延長産物１９０を生成する。この場合、第１延長用プライマー１６０と第２延長用プライマー１７０は、その長さが異なるため、第１延長産物１８０と第２延長産物１９０は、ゲル電気泳動によりバンドパターンを確認することにより、区分が可能になる。本発明者は、このような対立遺伝子特異的なプライマー延長反応を対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ、ＡＳＢＰＥ）と命名した。前記ＡＳＢＰＥのみでも一塩基多型を検出することができるが、鋳型核酸分子の濃度が低い場合、プライマー延長反応のみでは対立遺伝子特異的核酸分子の検出が困難なことがある。この場合、図４に示すように、第１延長用プライマー及び第２延長用プライマーからそれぞれ選択される固有の塩基配列を用いて作製された延長産物増幅用フォワードプライマー２００と、前述した共通のリバースプライマー１３０を用いて、第１延長産物及び第２延長産物を増幅することにより、より確実な一塩基多型の検出を可能にすることができる。この場合、用いられる延長産物増幅用フォワードプライマー２００は、第１延長用プライマー及び第２延長用プライマーに共通して存在する配列を用いて作製することができ、区分される固有の塩基配列を用いて作製されてもよい。本発明の一実施例を例示的に示している図４及び図７には、第１延長用プライマー１６０及び第２延長用プライマー１７０に共通して存在する配列を用いて作製された延長産物増幅用フォワードプライマー２００のみが図示されている。
【００６１】
前記実施例による実際の実験結果は図１０に示されている。図１０に示すように、同型接合又は異型接合のＵＧＴ１Ａ１＊２８を対象に、本発明の対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ反応を行った結果、野生型特異的フォワードプライマー及び延長プライマーでは、野生型（１８１ｂｐ）のみが検出され、突然変異型特異的フォワードプライマー及び延長プライマーでは、突然変異型（２３１ｂｐ）のみが検出され、異型接合である場合には、両方の対立遺伝子が共に検出された。
【００６２】
図１１は、本発明の一実施例により、複数の対立遺伝子を同時に検出したマルチプレックスＰＣＲの結果を示したものである。ＵＧＴ１Ａ１＊６とＵＧＴ１Ａ１＊２８を、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲにより増幅した結果、両方の対立遺伝子が共に野生型と突然変異型を正確に区分して増幅することができた。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を介して本発明を詳細に説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、異なる多様な形態で具現されうるものであり、以下の実施例は、本発明の開示が完全であるようにし、当該技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付された特許請求の範囲の技術的思想によって定められなければならない。
【００６４】
実施例１：増幅対象の塩基配列を含む核酸分子の対立遺伝子特異的増幅
本発明者は、上述した対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応によって、一塩基多型（ＳＮＰ）の有無及び種類を迅速に判定することができるかどうか調査するために、まずＳＮＰがあるとよく知られているＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子を鋳型にして対立遺伝子特異的ＰＣＲがきちんと遂行されるかを調査した。
【００６５】
具体的には、配列番号１で表される鋳型ＤＮＡ（ヒトｃ−ａｂｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）の３１８番目のヌクレオチドに該当するＳＮＰ（Ｃ＞Ｔ）を検出するために、対立遺伝子特異的プライマーで配列番号２で表されるＣ特異的プライマー及び配列番号３で表されるＴ特異的プライマーと、配列番号４で表されるリバースプライマーを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲ反応を介して１１５ｂｐサイズの増幅産物を生成した。この時、前記２つのフォワードプライマーは、共に３’末端から３番目の塩基に意図的なミスマッチ（Ｃ＞Ａ）を導入した。これは、対立遺伝子特異的プライマーの増幅をより安定的に遂行するようにしてくれることが知られている（非特許文献１）。併せて、プライマーのアニーリング温度の最適化のために、複数の反応物のアニーリング温度を順次調整した温度勾配ＰＣＲ反応を行った。前記反応は三回行われた。ＰＣＲ反応液の組成及び反応条件は、表１及び２にそれぞれ示されている。
【００６６】
【表１】
0006728556.tif 000002
【００６７】
【表２】
0006728556.tif 000003
【００６８】
前記温度勾配ＡＳ−ＰＣＲの結果、Ｃ特異的フォワードプライマー及びＴ特異的フォワードプライマーは、それぞれ野生型及び突然変異型でのみ特異的な増幅産物を形成した（図９参照）。したがって、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的プライマーは、きちんと作動していることを確認した。一方、最適のアニーリング温度を調査するためにアニーリング温度に対して温度勾配ＰＣＲ反応を行った結果、５７℃程度の温度が野生型及び突然変異型共に最適であることが確認できた。
【００６９】
実施例２：延長用プライマーの作製
本発明者は、対立遺伝子特異的なＰＣＲに続く対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応に用いられる延長用プライマーを製造した。具体的には、ヒトゲノムＤＮＡと配列相同性が低い配列番号５で表されるｐＢＲ３２２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）を鋳型にして配列番号６で表されるフォワードプライマー及び配列番号７で表されるリバースプライマーを用いて増幅することにより、１１７ｂｐの増幅産物を生成した。この時、前記フォワードプライマーは、前記ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡに存在する相同配列と、その５’末端に付加される、後述する第２タグオリゴヌクレオチドと相補的な配列である第２タグ相補オリゴヌクレオチド（配列番号８）とから構成される。
【００７０】
実施例３：タグを含むプライマーの作製及びそれを用いたＡＳＢＰＥ反応
本発明者は、前記ＡＳ−ＰＣＲに使用されたフォワードプライマーの５’末端に、ヒトゲノム内のいかなる配列とも相同性が低下して偽陽性を示さない固有の塩基配列を有するタグオリゴヌクレオチドをデザインして対立遺伝子特異的なＰＣＲを行った。前記タグオリゴヌクレオチドは、本技術分野でＺＩＰコード（ＺＩＰ  Ｃｏｄｅ）配列でも知られているが、前記ＺＩＰコード配列は、ゲノムＤＮＡの塩基配列にない配列を有するヌクレオチドオリゴマーであり、ゲノムＤＮＡと非特異的にハイブリダイズされないように設計された配列である。本発明が属する技術分野の当業者であれば、後述する実施例で使用されたＺＩＰコード配列以外にも、当業界で知られている様々なコード配列を用いてプライマーを変形させられることを容易に理解するだろう（非特許文献２）。
【００７１】
具体的には、本発明者は、突然変異型対立遺伝子特異的プライマー（配列番号９）は、前記実施例１で用いられた突然変異特異的フォワードプライマー（配列番号３）の５’末端に前記配列番号８で表される第２タグ相補オリゴヌクレオチドの相補配列である配列番号１０で表される前記突然変異型対立遺伝子を識別することができる固有のタグオリゴヌクレオチド（第２タグオリゴヌクレオチド）を付加することにより製造した。実施例１で製造された野生型特異的フォワードプライマー、前記で製造された突然変異対立遺伝子特異的プライマー、前記実施例２で延長用プライマー作製のために用いられた配列番号７で表されるリバースプライマー（本ＰＣＲでは、延長産物の増幅のためのフォワードプライマーとして作用する）、及び前記実施例１で用いられた共通のリバースプライマーを用いて、アニーリング温度が５７℃に固定されたことを除いては、前記実施例１と同一の条件でＰＣＲ反応を行った。その結果、図９に示されたように、野生型特異的フォワードプライマーと共通のリバースプライマーにより対立遺伝子特異的なＰＣＲにより増幅された１１５ｂｐサイズの断片と、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応によって生成された２３２ｂｐサイズの断片が共に検出された。
【００７２】
実施例４：ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のＳＮＰ分析
本発明者は、抗がん剤であるイリノテカンの副作用と相関関係があることが知られているＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ系列１メンバーＡ１（ＵＧＴ１Ａ１）のＳＮＰであるＵＧＴ１Ａ１＊２８の遺伝子型を、本発明の一実施例によるＡＳＢＰＥキットで分析した。
【００７３】
具体的には、ＵＧＴ１Ａ１＊２８に対する野生型特異的フォワードプライマー（配列番号１１）及び突然変異型特異的フォワードプライマー（配列番号１２）そしてＵＧＴ１Ａ１＊２８に対するリバースプライマー（配列番号１３）を用いて、対立遺伝子特異的なＰＣＲを行った。
【００７４】
次に、野生型対立遺伝子及び突然変異型対立遺伝子に対して、それぞれ野生型特異的延長プライマー（配列番号１４）及び突然変異型特異的延長プライマー（配列番号１５）を用いて、プライマー延長反応を行った。
【００７５】
最後に、前記野生型延長産物及び突然変異型延長産物を対象に、共通の延長産物増幅用フォワードプライマー（配列番号１６）及び前記リバースプライマー（配列番号１３）を用いて延長産物の増幅を行った。
【００７６】
しかし、前記３つの反応は、順次実行するのでなく、１つの反応チューブ内で１つのステップとして下記の条件を用いて行われた。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
その結果、図１０に示すように、本発明の一実施例によるＡＳＢＰＥキットを用いて、突然変異型対立遺伝子を増幅することができ、ＡＳ−ＰＣＲを用いて、野生型対立遺伝子を同時に増幅しながら、この両方を明確に区分できることが確認できた。
【００７９】
実施例５：ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のＳＮＰマルチプレックス分析
さらに、本発明者は、本発明の一実施例によるＡＳＢＰＥキットで２つの対立遺伝子の遺伝子型を同時に検出することができるマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）分析が可能であるかを確認するために、ＵＧＴ１Ａ１＊６及びＵＧＴ１Ａ１＊２８の野生型ゲノムＤＮＡを単独又は混合して対立遺伝子特異的なＰＣＲを単独又はマルチプレックスで実行し、ＵＧＴ１Ａ１＊６及びＵＧＴ１Ａ１＊２８の突然変異型ゲノムＤＮＡを単独又は混合して、本発明の一実施例によるＡＳＢＰＥキットを用いたＰＣＲをマルチプレックスで行った。
【００８０】
具体的には、ＵＧＴ１Ａ１＊６野生型及びＵＧＴ１Ａ１＊２８野生型ゲノムＤＮＡを単独又は混合した後、それぞれの野生型対立遺伝子特異的フォワードプライマー（配列番号１７及び配列番号１１）とリバースプライマー（配列番号１８及び配列番号１３）で表３に記載された条件を用いて、対立遺伝子特異的なＰＣＲを行った。その結果、図１１の上段に示すように、ＡＳ−ＰＣＲでもＵＧＴ１Ａ１＊６野生型及びＵＧＴ１Ａ１＊２８野生型ゲノムＤＮＡを特異的に増幅することができた。さらに、本発明者は、ＵＧＴ１Ａ１＊６突然変異型及びＵＧＴ１Ａ１＊２８突然変異型ゲノムＤＮＡを単独又は混合した後、それぞれの突然変異型対立遺伝子特異的フォワードプライマー（配列番号１９及び配列番号１２）、共通のリバースプライマー（配列番号１３）、ＵＧＴ１Ａ１＊６突然変異型及びＵＧＴ１Ａ１＊２８突然変異型特異的延長用プライマー（配列番号２０及び配列番号１５）、及び前記ＵＧＴ１Ａ１＊６及びＵＧＴ１Ａ１＊２８のそれぞれの突然変異型対立遺伝子特異的延長用プライマーの５’末端に共通して存在する共通配列を用いた延長産物増幅用フォワードプライマー（配列番号１６）を用いて、突然変異型対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲ（ＡＳＢＰＥ−ＰＣＲ）反応を前記表３に示された条件を用いて行った。
【００８１】
その結果、図１１の下段に示すように、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長ＰＣＲキットは、単独又はマルチプレックスの両方でＵＧＴ１Ａ１＊６及びＵＧＴ１Ａ１＊２８のそれぞれの突然変異型対立遺伝子を明確に検出することができた。また、前記結果は、対立遺伝子特異的なＰＣＲ、対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応、及び前記延長反応の産物に対するＰＣＲ増幅を、１つのＰＣＲ工程によって得られたものであり、本発明の一実施例による方法及びキットが、従来のＡＳ−ＰＣＲと同じ時間にマルチプレックスで野生型と突然変異型を区分することができるだけでなく、様々なＳＮＰを同時に検出するために使用できることを立証した。
【００８２】
したがって、本発明の一実施例による対立遺伝子特異的な双方向プライマー延長反応は、特定の増幅対象の塩基配列を含む核酸分子内の特定位置のＳＮＰの存在有無及び種類を正確に判定するのに効果的に使用することができる。また、本発明の一実施例による方法は、単一のチューブ内で単一の反応で実行することができるだけでなく、高価な機器を使用しなくても、簡単なゲル電気泳動後、バンドパターンを確認することにより、容易かつ安価に用いることがという点で非常に経済的な方法である。
【００８３】
本発明は、前述した実施例を参照して説明したが、これは例示的なものにすぎず、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、それから様々な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解するだろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付された特許請求の範囲の技術的思想によって定められるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の一実施形態による方法及びキットは、様々な動植物、特にヒトにおけるＳＮＰ検出に用いることができるだけでなく、それを用いた疾患の診断、薬物反応性の予測などに用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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