(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵プロセスにおける１，２−プロパンジオールの製造方法であって、
・１，２−プロパンジオールの製造のために遺伝的に改変された従属栄養性微生物を炭素の供給源として炭水化物を含んでなる適当な培養培地中で培養すること、および
・前記培養培地から１，２−プロパンジオールを回収すること
を含んでなり、
前記遺伝的に改変された微生物において、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が過剰発現しており、前記ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)由来のａｄｈ遺伝子によりコードされているタンパク質と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、かつ
前記遺伝的に改変された微生物が、ＮＡＤＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするｇｌｄＡ遺伝子の欠失、および／またはメチルグリオキサールレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子の欠失をさらに含んでなる、
方法。
【請求項２】
以下の遺伝的改変：
・ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするｐｎｔＡＢ遺伝子オペロンが過剰発現している、かつ／または
・ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子が減弱している、かつ／または
・ホスホフルクトキナーゼをコードするｐｆｋＡ遺伝子が減弱している、かつ／または
・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子が過剰発現している、かつ／または
・ＡＤＰ依存性デヒドラターゼをコードするｙｊｅＦ遺伝子が過剰発現している、かつ／または
・ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐＮ遺伝子が過剰発現している、かつ／または
・置換Ａ５５Ｖ、Ｇ１８５Ａ、Ｇ１８９Ａ、Ｅ２０３Ｖ、Ｍ２０４Ｒ、Ｆ２０５Ｋ、Ｄ２０６Ｈ、およびＰ２１０Ｒを含んでなるＮＡＤＰ依存性リポアミドデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｌｐｄ＊遺伝子が過剰発現している
のうち少なくとも１つによって、前記微生物においてＮＡＤＰＨ利用度が増大している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物が腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、バチルス科(Bacillaceae)、クロストリジウム科(Clostridiaceae)、ストレプトミセス科(Streptomycetaceae)および酵母からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が大腸菌である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
炭素の供給源としての炭水化物からの１，２−プロパンジオールの製造のために遺伝的に改変された従属栄養性微生物であって、前記微生物において、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼをコードする少なくとも１つの遺伝子が過剰発現しており、前記ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈ遺伝子によりコードされているタンパク質と少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有し、かつ、前記遺伝的に改変された微生物が、ＮＡＤＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするｇｌｄＡ遺伝子の欠失およびメチルグリオキサールレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子の欠失をさらに含んでなる、微生物。
【請求項７】
以下の遺伝的改変：
・ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子の欠失、および／または
・ホスホフルクトキナーゼをコードするｐｆｋＡ遺伝子の欠失、および／または
・ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするｐｎｔＡＢ遺伝子の過剰発現、および／または
・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子の過剰発現、および／または
・ＡＤＰ依存性デヒドラターゼをコードするｙｊｅＦ遺伝子の過剰発現、および／または・ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐＮ遺伝子の過剰発現、および／または
・置換Ａ５５Ｖ、Ｇ１８５Ａ、Ｇ１８９Ａ、Ｅ２０３Ｖ、Ｍ２０４Ｒ、Ｆ２０５Ｋ、Ｄ２０６Ｈ、およびＰ２１０Ｒを含んでなるＮＡＤＰ依存性リポアミドデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｌｐｄ＊遺伝子の過剰発現
のうち少なくとも１つをさらに含んでなる、請求項６に記載の微生物。
【請求項８】
腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科、コリネバクテリア科、および酵母からなる群から選択される、請求項６または７に記載の微生物。
【請求項９】
大腸菌、肺炎桿菌、サーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム、クロストリジウム・スフェノイデス、およびサッカロミセス・セレビシエからなる群から選択される、請求項８に記載の微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，２−プロパンジオールの製造に有用な組換え微生物および１，２−プロパンジオールの製造方法に関する。本発明の微生物は、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ(acetol reductase)を増強することにより１，２−プロパンジオールの製造が改善されるように改変されている。
【背景技術】
【０００２】
式Ｃ３Ｈ８Ｏ２またはＨＯ−ＣＨ２−ＣＨＯＨ−ＣＨ３を有するＣ３ジアルコールである１，２−プロパンジオールまたはプロピレングリコールは、広く用いられている化学物質である。そのＣＡＳ番号は５７−５５−６である。これは、無色、ほぼ無臭、透明で、かすかに甘みがあり、吸湿性で、水、アセトン、およびクロロホルムと混和性の粘稠な液体である。これは不飽和ポリエステル樹脂、液体洗剤、冷却剤、不凍剤および航空機の徐氷液の成分である。プロピレングリコールは、プロピレン誘導体より有毒であると認識されているエチレン誘導体の代替として１９９３〜１９９４年以来、使用が増えてきた。
【０００３】
１，２−プロパンジオールは現在、大量の水を消費し、毒性の高い物質を使用し、ｔｅｒｔ−ブタノールおよび１−フェニルエタノールなどの副生成物を生じる、プロピレンオキシド水和法を用いた化学的手段により製造されている。
【０００４】
１，２−プロパンジオールの製造のための化学的方法の欠点は、生物学的合成を魅力ある代替法とする。微生物による糖からの１，２−プロパンジオールの発酵製造のために２つの経路が特徴付けられている。
【０００５】
第１の経路では、６−デオキシ糖（例えば、Ｌ−ラムノースまたはＬ−フコース）がリン酸ジヒドロキシアセトンと（Ｓ）−ラクトアルデヒドに開裂される、これを（Ｓ）−１，２−プロパンジオールへとさらに還元することができる(Badia et al., 1985)。この経路は大腸菌(E. coli)で機能的であるが、デオキシヘキソースのコストの高騰のために経済的に実現可能な方法とはなり得ない。
【０００６】
第２の経路は、解糖経路、次いで、メチルグリオキサール経路を介した汎用糖（例えば、グルコースまたはキシロース）の代謝である。リン酸ジヒドロキシアセトンはメチルグリオキサールへ変換され、これがラクトアルデヒドまたはヒドロキシアセトン（アセトール）のいずれかに還元され得る。これら２つの化合物は次に１，２−プロパンジオールに変換される。この経路はクロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)およびサーモアナエロバクター・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacter thermosaccharolyticum)などの（Ｒ）−１，２−プロパンジオールの天然生産株によって使用されている。しかしながら、これらの生物で得られる性能の改善は、利用可能な遺伝的ツールが無いためにおそらく限られていると思われる。
【０００７】
従来技術
メチルグリオキサール経路は大腸菌または他の腸内細菌科(Enterobacteriaceae)で機能的であり、単純炭素源を用いて１，２−プロパンジオール生産株を得るための大腸菌の遺伝的改変に関するいくつかの検討が先導されている（ＷＯ９８／３７２０４； Cameron et al., 1998; Altaras and Cameron, 1999; Huang et al., 1999; Altaras and Cameron, 2000; Berrios-Rivera et al., 2003; Jarboe, 2011）。合理的設計と進化の組合せにより得られた改良型の１，２−プロパンジオール生産大腸菌株が特許出願ＷＯ２００５／０７３３６４、ＷＯ２００８／１１６８４８、ＷＯ２００８／１１６８５２、ＷＯ２００８／１１６８５３、ＷＯ２０１０／０５１８４９、ＷＯ２０１１／０１２６９３、ＷＯ２０１１／０１２６９７およびＷＯ２０１１／０１２７０２に記載されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００８】
大腸菌１，２−プロパンジオール生産株では、ヒドロキシアセトンの１，２−プロパンジオールへの還元は、補因子としてＮＡＤＨを用いるグリセロールデヒドロゲナーゼＧｌｙＤＨにより行われ、好気性条件下での細胞の内部酸化還元状態のために完全ではない。好気的には、ＮＡＤＨの主要な役割は、酸化的リン酸化を介した呼吸的ＡＴＰの生成であり、この結果として、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は著しくＮＡＤ＋に有利となる。これに対して、化学的に極めて類似するＮＡＤＰＨは、同化的還元を駆動し、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が高くなる(Fuhrer and Sauer、2009)。
【０００９】
従って、本発明の目的は、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ活性を増強すること、およびＮＡＤＰＨ供給を改善することにより１，２−プロパンジオールの製造を改善することである。
【００１０】
好熱性細菌バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)由来のＧｌｙＤＨの三次元構造が確立され、ＮＡＤ＋結合部位が完全に同定された(Ruzheinikov et al., 2001)。ＮＡＤＰＨを産生できるＢ．ステアロサーモフィルス変異型グリセルアルデヒド−３−リン酸が構築および特性決定されている(Clermont et al.,1993)。
【００１１】
クロストリジウム・ベイジェリンキ(Clostridium beijerinckii)由来のＮＡＤＰＨ依存性第２級アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｓａｄｈ）は、アセトンのイソプロパノールへの還元を天然に触媒する(Ismaiel et al., 1993)。Ｍｉｔｓｕｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．からの特許出願ＥＰ２５４６３３１では、イソプロピルアルコールがクロストリジウム・ベイジェリンキ由来のｓａｄｈ遺伝子を発現する大腸菌株で生産される。
【００１２】
この酵素ならびにサーモアナエロバクター・ブロッキー(Thermoanaerobacter brockii)由来のそのホモログは、ヒドロキシアセトンの１，２−プロパンジオールへの還元を触媒することが示されており、炭素源として非炭水化物ＣＯ２から１，２−プロパンジオールを生産するために偏性光合成自己栄養性シアノ細菌シネココッカス・エロンガツス(Synechococcus elongatus)で過剰発現された(Li and Liao, 2013)。
【００１３】
予期しないことに、発明者らは、ｓａｄｈ遺伝子を単独でまたはＮＡＤＰＨ供給を改善するための他の手段と組み合わせて過剰発現させることで炭素源としての炭水化物からの１，２−プロパンジオール製造が有意に改善されることを見出した。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、１，２−プロパンジオールの製造を最適化するための組換え微生物および前記微生物を使用する方法に関し、前記微生物において、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ（ＨＡＲ）活性が増強されている。より詳しくは、前記組換え微生物では、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ活性をコードする少なくとも１つの遺伝子またはＮＡＤＰＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする変異型遺伝子ｇｌｄＡ＊が過剰発現しており、前記ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈ遺伝子またはサーモアナエロバクター・ブロッキー由来のａｄｈ遺伝子または赤痢アメーバー(Entamoeba histolytica)由来のａｄｈ１遺伝子またはグルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)由来のＧＯＸ１６１５遺伝子またはヒポクレア・ジェコリナ(Hypocrea jecorina)由来のｇｌｄ２遺伝子または枯草菌(Bacillus subtilis)由来のｙｈｄＮ遺伝子によりコードされているタンパク質と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有する。
【００１５】
本発明で使用される組換え微生物はまた、
・ＮＡＤＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするｇｌｄＡ遺伝子の発現の減弱、
・アルデヒドレダクターゼをコードするｙｑｈＤ遺伝子の発現の減弱、
・ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするｐｎｔＡＢ遺伝子オペロンの発現の増強、
・ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子の発現の減弱、
・ホスホフルクトキナーゼをコードするｐｆｋＡ遺伝子の発現の減弱、
・グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子の発現の増強、
・ＡＤＰ依存性デヒドラターゼをコードするｙｊｅＦ遺伝子の発現の増強、
・ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐＮ遺伝子の発現の増強、
・ＮＡＤＰ依存性リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするｌｐｄ＊変異型遺伝子の発現の増強
などの他の遺伝的改変も含んでなり得る。
【００１６】
好ましくは、前記微生物は、大腸菌(Escherichia coli)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)またはサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特に例示される方法に限定されず、当然のことながら変更可能であると理解されるべきである。また、本明細書で使用する用語は単に本発明の特定の実施態様を記載するためのものであり、限定することを意図せず、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されると理解されるべきである。
【００１８】
以上のものであれ以下のものであれ、本明細書に引用されている総ての刊行物、特許および特許出願は、引用することによりそれらの全内容が本明細書の一部とされる。
【００１９】
さらに、本発明の実施は、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内の従来の微生物学的技術および分子生物学的技術を採用する。このような技術は当業者に周知であり、文献で十分説明されている。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つ(a)」、「１つ(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかにそうではないことを示さない限り、複数形の指示語を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、「微生物」という場合には複数のこのような微生物を含み、「内因性遺伝子」という場合には１以上の内因性の遺伝子を示すなどである。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の熟練者により共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または等価のいずれの材料および方法も本発明を実施または試験するために使用可能であり、以下、好ましい材料および方法を記載する。
【００２１】
下記の特許請求の範囲および本発明の続いての記載において、言語の表現または必要な改良のために文脈がそれ以外のことを必要とする場合を除き、「含んでなる(comprise)」、「含有する(contain)」、「含む(involve)」もしくは「包含する(include)」または「含んでなる(comprises)」、「含んでなる(comprising)」、「含む(involved)」、「包含する(includes)」、「包含する(including)」などの変形は包含の意味で、すなわち、示された特徴の存在を明示し、本発明の種々の実施態様においてさらなる特徴の存在または付加を排除しないことを意図して使用される。
【００２２】
本発明は、発酵プロセスにおける１，２−プロパンジオールの製造方法であって、１，２−プロパンジオールの製造のために遺伝的に改変された微生物を炭素の供給源として炭水化物を含んでなる適当な培養培地中で培養する工程、および前記培養培地から１，２−プロパンジオール回収する工程を含んでなり、前記遺伝的に改変された微生物ではＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ活性が増強されている方法に関する。本発明の特に好ましい実施態様をさらに以下に記載する。
【００２３】
用語「アセトールレダクターゼ」および「ヒドロキシアセトンレダクターゼ」または「ＨＡＲ」は互換的に使用され、アセトール（またはヒドロキシアセトン）の１，２−プロパンジオールへの還元の酵素活性を表す。この活性はＮＡＤＰＨ依存性またはＮＡＤＨ依存性であり得る。
【００２４】
用語「微生物」は、本明細書で使用する場合、人工的に改変されていない細菌、酵母または真菌を意味する。優先的には、微生物は、腸内細菌科、バチルス科、クロストリジウム科、ストレプトミセス科、および酵母から選択される。より優先的には、微生物は、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、サーモアナエロバクテリウム属(Thermoanaerobacterium)、クロストリジウム属(Clostridium)またはサッカロミセス属(Saccharomyces)の種である。いっそうより優先的には、微生物は、大腸菌、肺炎桿菌、サーモアナエロバクテリウム・サーモサッカロリチカム、クロストリジウム・スフェノイデスまたはサッカロミセス・セレビシエから選択される。優先的には、微生物は、従属栄養性微生物、すなわち、大気中の炭素を固定することができず、代わりにその成長に有機炭素源を用いる。いっそうより好ましくは、本発明の従属栄養性微生物は大腸菌である。
【００２５】
用語「組換え微生物」または「遺伝的に改変された微生物」は、本明細書で使用する場合、自然界には見られず、自然界に見られるその等価物とは遺伝的に異なる細菌、酵母または真菌を意味する。この用語は、それが遺伝要素の導入または欠失または改変のいずれかにより改変されていることを意味する。この用語は定方向突然変異誘発と特定の選択圧下での進化を組み合わせることにより新たな代謝経路の発達および進化を促すことと言い換えることもできる（例えば、ＷＯ２００５／０７３３６４またはＷＯ２００８／１１６８５２参照）。
【００２６】
微生物は、外因性遺伝子が宿主微生物内でのそれらの発現を可能とする総ての要素とともに微生物に導入される場合には、これらの遺伝子を発現するように改変され得る。外因性ＤＮＡを用いた微生物の改変または「形質転換」は、当業者には慣例の作業である。
【００２７】
微生物は、内因性遺伝子の発現レベルを調節するように改変してもよい。
【００２８】
用語「内因性遺伝子」は、その遺伝子が遺伝的改変前に微生物に存在していたことを意味する。内因性遺伝子は、内因性調節要素に加えてもしくは替えて異種配列を導入することにより、または染色体またはプラスミドにその遺伝子の１以上の補助的コピーを導入することにより過剰発現させうる。内因性遺伝子はまた、それらの発現および／または活性を調節するように改変されてもよい。例えば、遺伝子産物を改変するためにコード配列に突然変異を導入してもよく、または内因性調節要素に加えてもしくは替えて異種配列を導入してもよい。内因性遺伝子の調節は、その遺伝子産物の活性のアップレギュレーションおよび／または増強をもたらし得るか、あるいはまた、内因性の遺伝子産物の活性をダウンレギュレートおよび／または低下させ得る。
【００２９】
それらの発現を調節するための別法は、内因性遺伝子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために遺伝子の内因性プロモーター（例えば、野生型プロモーター）をより強いまたは弱いプロモーターと交換することである。これらのプロモーターは相同であっても異種であってもよい。適当なプロモーターを選択することは十分に当業者の能力の範囲内である。
【００３０】
これに対して、「外因性遺伝子」は、この遺伝子はその微生物には天然には存在しないが、当業者に周知の手段によってその遺伝子が微生物に導入されたことを意味する。外因性遺伝子は、宿主染色体に組み込まれてもよく、またはプラスミドまたはベクターにより染色体外で発現されてもよい。複製起点および細胞内でのコピー数が異なる多様なプラスミドが当技術分野で周知である。これらの遺伝子は相同であり得る。「過剰発現」または「過剰発現する」も、それらの微生物内での外因性遺伝子の発現を示すために使用される。
【００３１】
本発明に関して、用語「相同遺伝子」は、理論上共通の遺伝的祖先を有する遺伝子を示すことに限定されず、遺伝的に無関連であるが、それにもかかわらず類似の機能を遂行するおよび／または類似の構造を有するタンパク質をコードするように進化を遂げた遺伝子も含む。従って、用語「機能的ホモログ」は、本発明の目的で、特定の酵素活性は、定義されたアミノ酸配列の特定のタンパク質によるだけでなく、他の（無）関連の微生物由来の類似の配列のタンパク質によっても提供され得るという事実に関する。
【００３２】
既知タンパク質に関してはＵｎｉｐｒｏｔまたは既知遺伝子に関してはＧｅｎｂａｎｋで与えられる参照を用い、当業者ならば、タンパク質配列および／または遺伝子配列を入手し、他の生物、細菌株、酵母、真菌、哺乳動物、植物などにおける等価遺伝子を決定することができる。この通常の作業は、有利には、他の微生物に由来する遺伝子との配列アラインメントを行い、別の生物における対応する遺伝子をクローニングするための縮重プローブを設計することにより決定可能なコンセンサス配列を用いて実行される。これらの分子生物学の慣例法は当業者に周知である。
【００３３】
本発明によれば、用語「発酵プロセス」、「発酵」または「培養」は、微生物の成長を表すために互換的に使用される。この成長は一般に、使用する微生物に適合された適当な増殖培地を含む発酵槽で行われる。
【００３４】
「適当な培養培地」は、炭素源または炭素基質、窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出物、食肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびリン酸アンモニウム；リン源、例えば、リン酸一カリウムまたはリン酸二カリウム；微量要素（例えば、金属塩）、例えば、マグネシウム塩、コバルト塩および／またはマンガン塩；ならびにアミノ酸およびビタミンなどの増殖因子などの細胞の維持および／または成長に必須のまたは有益な栄養素を含んでなる培地（例えば、無菌液体培地）を表す。
【００３５】
本発明に従った用語「炭素の供給源」、「炭素源」または「炭素基質」は、微生物により代謝可能であり、基質が少なくとも１個の炭素原子を含有するいずれの炭素源も意味する。
【００３６】
用語「炭水化物」は、微生物により代謝可能で、かつ、少なくとも１個の炭素原子、２個の水素原子および１個の酸素原子を含有するいずれの炭素源も意味する。ＣＯ２は水素を含有しないので炭水化物ではない。
【００３７】
炭水化物は、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、およびガラクトースなどの単糖類、スクロース、セロビオース、およびマルトース、ラクトースなどの二糖類、ラフィノース、スタキオース(stacchyose）、およびマルトデキストリンなどのオリゴ糖類、セルロース、ヘミセルロース、およびデンプンなどの多糖類、メタノール、ホルムアルデヒドおよびグリセロールからなる群から選択される。特に好ましい炭素源は、アラビノース、フルクトース、ガラクトース、グルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、キシロースまたはそれらの混合物である。より好ましくは、炭素源はスクロースである。
【００３８】
本発明の特定の実施態様では、炭素源は再生可能な原料に由来する。再生可能な原料は、短い遅延でかつその目的生成物への変換を許容するのに十分な量で再生できる特定の工業工程に必要な原料と定義される。処理済みまたは未処理の植物バイオマスは注目される再生可能な炭素源である。
【００３９】
当業者ならば、本発明による微生物のための培養条件を定義することができる。特に、細菌は、大腸菌では２０℃〜５５℃、優先的には２５℃〜４０℃の間、より具体的には、約３０℃〜３７℃の間の温度で発酵される。
【００４０】
このプロセスはバッチ法、フェドバッチ法または連続法のいずれかで行うことができる。発酵は、好気性、微好気性または嫌気性条件下で行うことができる。
【００４１】
「好気性条件下」とは、液相に気体を溶解させることにより培養物に酸素を供給することを意味する。これは、（１）酸素含有気体（例えば、空気）を液相に散布するか、または（２）ヘッドスペースに含まれる酸素を液相に移行させるために培養培地を含む容器を振盪することにより得ることができる。好気性条件下での発酵の主な利点は、電子受容体としての酸素の存在がその株の、細胞プロセスのためにより多くのエネルギーをＡＴＰの形態で製造する能力を高めるということである。従って、この株はその一般代謝が改善されている。
【００４２】
微好気性条件は、低パーセンテージの酸素（例えば、０．１〜１０％の間の酸素を含有し、窒素で１００％とした混合物を使用）を液相に溶解させる培養条件として定義される。
【００４３】
嫌気性条件は、酸素が培養培地に供給されない培養条件として定義される。厳密には、嫌気性条件は、微量の他の気体を除去するために培養培地に窒素などの不活性ガスを散布することにより得られる。株によるＡＴＰ生産を高め、その代謝を高めるために電子受容体として硝酸塩が使用できる。
【００４４】
「培養培地から１，２−プロパンジオールを回収すること」という句は、製造された１，２−プロパンジオールを当業者に既知の方法を用いて精製するプロセスを表す。このような方法は特に特許出願ＷＯ２０１１／０７６６９０およびＷＯ２０１２／１３０３１６に開示される。
【００４５】
用語「１，２−プロパンジオールの製造のために遺伝的に改変された微生物」は、遺伝的要素の導入または欠失のいずれかによって、または特許出願ＷＯ２００５／０７３３６４に記載の進化工程(step of evolution)によって改変された微生物を意味する。特に、遺伝的改変の無い対応する野生型微生物の固有の製造に比べて１，２−プロパンジオール製造の改善を示す遺伝的に改変された微生物を意味する。このような微生物は、例えば、引用することにより本明細書の一部とされる特許出願ＷＯ２００８／１１６８４８、ＷＯ２００８／１１６８５３、ＷＯ２０１１／０１２６９３、ＷＯ２０１１／０１２６９７、ＷＯ２０１１／０１２７０２またはＥＰ２５３２７５１に記載されている。好ましい遺伝的改変は、下記である：
・メチルグリオキサールシンターゼをコードするｍｇｓＡ遺伝子、メチルグリオキサールレダクターゼをコードするｙｑｈＤ、ｙａｆＢ、ｙｃｄＷ、ｙｑｈＥ、ｙｅａＥ、ｙｇｈＺ、ｙａｊＯ、ｔａｓ、ｙｄｊＧまたはｙｄｂＣ遺伝子、グリセロールデヒドロゲナーゼをコードするｇｌｄＡ遺伝子およびラクトアルデヒドレダクターゼをコードするｆｕｃＯ遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現の増強；
・ホスホグルコン酸デヒドラターゼ(phosphphogluconate dehydratase)をコードするｅｄｄ遺伝子または２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａ遺伝子のいずれかまたは両方の欠失；
・メチルグリオキサール（グリオキサラーゼＩをコードするｇｌｏＡ遺伝子、アルデヒドデヒドロゲナーゼＡをコードするａｌｄＡ遺伝子、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするａｌｄＢ遺伝子など）、ピルビン酸（乳酸デヒドロゲナーゼをコードするｌｄｈＡ遺伝子）、ギ酸（ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＡ遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＢ遺伝子）、エタノール（アルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥ遺伝子）および酢酸（酢酸キナーゼをコードするａｃｋＡ遺伝子、リン酸アセチルトランスフェラーゼをコードするｐｔａ遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ遺伝子）からの乳酸の合成に関与する酵素をコードする遺伝子の欠失による望ましくない副生成物の合成の減弱；
・ピルビン酸キナーゼ（ｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされている）などのＰＥＰを消費する経路の排除および／または例えばＰＥＰシンターゼをコードするｐｐｓＡ遺伝子を過剰発現させることによるＰＥＰ合成の促進；
・リポアミドデヒドロゲナーゼをコードするｌｐｄ遺伝子における特定の突然変異；
・ＡｒｃＡ転写二重レギュレーターをコードするａｒｃＡ遺伝子およびＮＡＤＨをコードするｎｄｈ遺伝子：ユビキノンオキシドレダクターゼＩＩを欠失させることができる；
・グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｇａｐＡ遺伝子は温度誘導プロモーターの制御下にある；
・スクロースの移入(importation)および代謝に関与する遺伝子（スクロース透過酵素をコードするｃｓｃＢ遺伝子、スクロースヒドロラーゼをコードするｃｓｃＡ遺伝子、フルクトキナーゼをコードするｃｓｃＫ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系の酵素ＩＩをコードするｓｃｒＡ遺伝子、ＡＴＰ依存性フルクトキナーゼをコードするｓｃｒＫ遺伝子、スクロース６−リン酸ヒドロラーゼ（インベルターゼ）をコードするｓｃｒＢ遺伝子、スクロースポリンをコードするｓｃｒＹ遺伝子）が付加されるか、またはそれらの発現が増強される。
【００４６】
好ましい遺伝的改変は、遺伝子ｙｑｈＤ＊（Ｇ１４９Ｅ）の発現の増強により得られるメチルグリオキサールレダクターゼ活性の改善である。
【００４７】
別の好ましい遺伝的改変は、遺伝子ｍｇｓＡ＊（Ｈ２１Ｑ）の発現の増強により得られるメチルグリオキサールシンターゼ活性の改変である。
【００４８】
別の好ましい遺伝子的改変は、遺伝子ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の発現の増強により得られるヒドロキシアセトンレダクターゼ活性の改善である。このＨＡＲ変異型は、以下に開示されるＨＡＲ変異型ＮＡＤＰＨ依存性とは異なり、ＮＡＤＨ依存性である。
【００４９】
ヒドロキシアセトンレダクターゼ（ＨＡＲ）は、１，２−プロパンジオールの製造に関与する最後の酵素である。ＨＡＲは、以下の反応を触媒する：
ヒドロキシアセトン＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→１，２−プロパンジオール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【００５０】
ｇｌｄＡ遺伝子が欠失された１，２−プロパンジオール生産株は、もはや１，２−プロパンジオールを生産できず、ヒドロキシアセトンを蓄積する（ＷＯ２００８／１１６８５１）。ＧｌｄＡタンパク質は均質となるまで精製され、補因子としてＮＡＤＨを使用する(Kelley and Dekker, 1984)。好気性条件で、ヒドロキシアセトンの１，２−プロパンジオールへの変換は、細胞の内部酸化還元状態のために完全ではなく、このような条件下で、ＮＡＤＨの主要な役割は酸化的リン酸化を介した呼吸的ＡＴＰの生成であり、この結果として、ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋比は著しくＮＡＤ＋に有利となる。これに対して、化学的に極めて類似するＮＡＤＰＨは、同化的還元を駆動し、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ＋比が高くなる(Fuhrer and Sauer, 2009)。
【００５１】
この所見に従えば、本発明の目的は、ＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシアセトンレダクターゼ活性を増強することにより１，２−プロパンジオールの製造を改善することである。
【００５２】
活性の増強は、タンパク質触媒効率を改善すること、またはタンパク質の代謝回転(turnover)を低下させること、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の代謝回転を低下させること、または遺伝子の転写を増大させること、またはｍＲＮＡの翻訳を増大させることによって得ることができる。
【００５３】
タンパク質触媒効率の改善は、所与の基質および／または所与の補因子に関するｋｃａｔを増大させることおよび／またはＫｍを低下させること、および／または所与の阻害剤に関するＫｉを増大させることを意味する。ｋｃａｔ、ＫｍおよびＫｉは、当業者が決定することができるミカエリス−メンテン定数である(Segel, 1993)。タンパク質代謝回転を低下させることは、タンパク質を安定化させることを意味する。タンパク質触媒効率を改善し、かつ／またはタンパク質代謝回転を低下させるための方法は当業者に周知である。それらは、配列および／もしくは構造分析と定方向突然変異誘発を伴う合理的操作、ならびにランダム突然変異誘発およびスクリーニングを含む。突然変異は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの通常の方法による部位特異的突然変異誘発、または突然変異誘発物質（紫外線もしくはニトロソグアニジン（ＮＴＧ）もしくはエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）などの化学薬剤）の使用またはＰＣＲ技術（ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲ）の使用といったランダム突然変異誘発技術により導入することができる。タンパク質の安定化はまた、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに「タグ」と呼ばれるペプチド配列を付加することによって達成できる。タグは当業者に周知である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いてタンパク質を安定化させることができる。
【００５４】
ｍＲＮＡ代謝回転の低下は、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）および／またはコード領域、および／または３’−ＵＴＲの遺伝子配列を改変することよって達成することができる(Carry and Keasling, 1999)。
【００５５】
遺伝子の転写の増大は、遺伝子のコピー数を増やすことおよび／またはより高レベルの遺伝子発現をもたらすプロモーターを使用することによって達成することができる。「過剰発現」または「過剰発現する」はまた、微生物における遺伝子の転写の増大を表すためにも使用される。
【００５６】
微生物における遺伝子のコピー数の増大のために、その遺伝子は染色体にまたは染色体外にコードされる。遺伝子が染色体に存在する場合、当業者に公知の組換えの方法（遺伝子置換を含む）により染色体に数コピーの遺伝子を導入することができる。遺伝子が染色体外に位置する場合、それはそれらの複製起点および従って細胞におけるそれらのコピー数が異なる種々のタイプのプラスミドにより運ばれ得る。これらのプラスミドはプラスミドの性質によって１〜５コピー、または約２０コピー、または最大５００コピー、すなわち、厳格な複製の低コピー数プラスミド（例えば、大腸菌の場合、ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（例えば、大腸菌の場合、ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（例えば、大腸菌の場合、ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）で微生物に存在する。
【００５７】
高レベルの遺伝子発現をもたらすプロモーターに使用に関して、当業者にはどのプロモーターは最も便利かが分かり、例えば、プロモーターＰｔｒｃ、Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ、またはλプロモーターｃＩが広く使用される。これらのプロモーターは、特定の化合物によりまたは温度もしくは光などの特定の外部条件により「誘導」され得る。これらのプロモーターは、同種であっても異種であってもよい。
【００５８】
ｍＲＮＡの翻訳の増大は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を改変することにより達成することができる。ＲＢＳは、タンパク質翻訳を誘導する場合にリボソームが結合するｍＲＮＡ上の配列である。ＲＢＳは、真核生物のｍＲＮＡの５’キャップ、原核生物の開始コドンＡＵＧの６〜７ヌクレオチド上流の領域（シャイン・ダルガノ(Shine-Dalgarno)配列と呼ばれる）、またはウイルスの内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）のいずれかであり得る。この配列を改変することにより、タンパク質翻訳開始速度を変化させ、比例的にその生産速度を変化させ、細胞内でのその活性を制御することができる。同じＲＢＳ配列でもｍＲＮＡの性質によって同じ影響を有するわけではない。ソフトウエアＲＢＳ  ＣＡＬＣＵＬＡＴＯＲ(Salis, 2011)を使用することにより目的の翻訳開始速度を達成するためにＲＢＳ配列の強度を最適化することができる。
【００５９】
本発明の第１の面において、１，２−プロパンジオールの製造は、改変された微生物におけるＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ）活性を増強することにより改善される。
【００６０】
本発明の第１の実施態様では、ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ活性は、改変微生物内でＮＡＤＰＨ  ＨＡＲをコードする遺伝子（ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子）を過剰発現させることによって増強される。
【００６１】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のＡｄｈは、自然状態でアセトンのイソプロパノールへの還元を触媒する(Ismaiel et al., 1993)。この酵素ならびにサーモアナエロバクター・ブロッキー由来のそのホモログはヒドロキシアセトンの１，２−プロパンジオールへの還元を触媒することが示されており、偏性光合成自己栄養性シアノ細菌シネココッカス・エロンガツス(Synechococcus elongatus)において炭素源としてのＣＯ２から１，２−プロパンジオールを製造するために過剰発現された(Li and Liao, 2013)。
【００６２】
いくつかの候補相同酵素およびそのような酵素をコードする遺伝子を決定するためにデーターマイニングおよび配列分析が使用されてきた。これらの候補を下表１に開示する。
【００６３】
相同配列およびそれらの相同性パーセンテージを特定する手段は当業者に周知であり、特に、ＢＬＡＳＴプログラムを含む。次に、得られた配列を、例えば、プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷまたはＭＵＬＴＡＬＩＮを用いて活用する（例えば、アラインする）ことができる。タンパク質ホモログを同定する別法としては、当業者に周知のバイオインフォマティクスプログラムを用いた系統樹の構築によるものがある。
【００６４】
【表１】
0006728064.tif 000002
0006728064.tif 000003
0006728064.tif 000004
【００６５】
本発明のこの実施態様では、組換え微生物において過剰発現されるＮＡＤＰＨ  ＨＡＲをコードする遺伝子は、上記に挙げたタンパク質の中から選択されるＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼをコードする。Ｕｎｉｐｒｏｔ番号から、当業者は対応する遺伝子の番号および配列を得ることができる。優先的には、本発明の微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈまたはサーモアナエロバクター・ブロッキー由来のａｄｈまたは赤痢アメーバー由来のａｄｈ１またはグルコノバクター・オキシダンス由来のＧＯＸ１６１５またはヒポクレア・ジェコリナ由来のｇｌｄ２または枯草菌由来のｙｈｄＮ遺伝子によりコードされている完全なタンパク質と少なくとも６０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８５％、いっそうより好ましくは、少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子）をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現する。より優先的には、本発明の微生物は、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈまたはサーモアナエロバクター・ブロッキー由来のａｄｈまたは赤痢アメーバー由来のａｄｈ１またはグルコノバクター・オキシダンス由来のＧＯＸ１６１５またはヒポクレア・ジェコリナ由来のｇｌｄ２または枯草菌由来のｙｈｄＮ（すなわち、前記遺伝子によりコードされているタンパク質配列と１００％のアミノ酸配列同一性）から選択される遺伝子を発現する。いっそうより優先的には、ＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼは、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈ遺伝子によりコードされている。
【００６６】
アミノ酸配列間の配列同一性は、比較の目的でアラインされ得る配列のそれぞれの位置を比較することにより決定することができる。比較配列の位置が同じアミノ酸で占められていれば、それらの配列はその位置において同一である。タンパク質間の配列同一性の程度は、前記タンパク質の配列により共有される位置の同一のアミノ酸残基の数の関数である。
【００６７】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセンテージを決定するためには、これらの配列を最適な比較のためにアラインする。例えば、第２のアミノ酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸配列の配列にギャップを導入することができる。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列のある位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基で占められている場合、それらの分子はその位置で同一である。
【００６８】
２配列間の同一性パーセンテージは、それらの配列により共有される同一の位置の数の関数である。従って、同一性％＝同一の位置の数／重なる位置の総数×１００である。
【００６９】
配列の最適なアラインメントは、Needleman and Wunsch (1970)のグローバルホモロジーアラインメントアルゴリズムにより、このアルゴリズムのコンピューター実装形態により、または目視検査により実行され得る。種々の方法により生成された最良のアラインメント（すなわち、比較配列間で最高の同一性パーセンテージとなる）が選択される。
【００７０】
言い換えれば、配列同一性パーセンテージは、最適にアラインされた２配列を比較すること、両配列で同一のタンパク質が見られる位置の数を求めて一致する位置の数を得ること、一致する位置の数を位置の総数で割ること、およびその商に１００をかけて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。
【００７１】
本発明の別の好ましい実施態様では、ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ活性は、上記のようにＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ活性を増強することにより、かつ／またはＮＡＤＨ依存性ＨＡＲ活性を低下させることにより増強される。
【００７２】
酵素の活性を低下させることは、アミノ酸配列を変化させるために遺伝子を変異させることによりその特定の触媒活性を低下させること、および／またはヌクレオチド配列の突然変異もしくは遺伝子のコード領域の欠失により細胞中のタンパク質の濃度を低下させることのいずれかを意味する。
【００７３】
本発明では、ＮＡＤＨ依存性ＨＡＲ活性の低下は、ｇｌｄＡ遺伝子を欠失させることにより、またはＧｌｄＡ酵素上での補因子操作を行うことにより実行され、これはＮＡＤＨ依存性ＨＡＲ  活性の低下とＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ活性の増強の両方をもたらした。
【００７４】
従って、本発明の微生物は好ましくは、ＮＡＤＰＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｇｌｄＡ＊遺伝子を過剰発現し、かつ、／または内因性ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している。
【００７５】
補因子操作は、ＧｌｄＡタンパク質のいくつかの特定のアミノ酸残基を置換することにより酵素の補因子特異性を変化させることを意味する。これらの結果として得られる突然変異体（ＧｌｄＡ＊  ＮＡＤＰＨ）はＮＡＤＰＨ依存性であり、ＮＡＤＨ依存性であると上記に開示されたＧｌｄＡ＊変異型（ＧｌｄＡ＊  Ａ１６０Ｔ）とは異なる。「ロスマンフォールド(Ro ssman fold)」として知られる補因子結合ポケット内で補因子特異性を支配する残基が詳細に研究されており(Scrutton et al., 1990; Clermont et al., 1993; Corbier et al., 1990; Wu et al., 2012)、当業者ならば、補因子特異性を変化させるためにどのアミノ酸残基を改変するかを定義することができる。補因子操作は最近、補因子としてＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨを選ぶようの酵素を変化させることに成功した。一例が、低いＮＡＤＰＨ依存性と高いＮＡＤＨ親和性を有するように定方向突然変異誘発により改変されたサッカロミセス・セレビシエに見られるＮＡＤＰＨ指向性デヒドロゲナーゼである酵素Ｇｒｅ２ｐである(Katzberg et al., 2010)。
【００７６】
本発明において、大腸菌由来のＧｌｄＡの三次元構造モデルが、バチルス・ステアロサーモフィルス由来の酵素の三次元構造から構築された(Ruzheinikov et al., 2001)。当業者ならば、例えば、Ｄｉｓｃｏｖａｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）などのソフトウエアを用いて、三次元ホモロジーモデルをどのように構築するかを知っている。このようなモデルは、補因子特異性に所望の変化を達成するためにどのアミノ酸残基を変異させるかを決定するために有用である。本発明者らは、大腸菌由来のＧｌｄＡの三次元構造から、いくつかの位置における種々のアミノ酸残基：
・Ｄ３７
・Ｆ３９
・Ｖ４０
・Ｆ４３
・Ｔ１１６
・Ｐ１６１
・Ｌ１６４
で置換されるべきアミノ酸残基を特定した。
【００７７】
本発明によれば、ＧｌｄＡ補因子特異性の変化は、位置Ｄ３７における少なくとも１つの突然変異により媒介される。好ましい実施態様では、位置Ｄ３７におけるアミノ酸残基が、グリシン（Ｄ３７Ｇ）、アラニン（Ｄ３７Ａ）またはバリン（Ｄ３７Ｖ）で置換される。最も好ましい実施態様では、位置Ｄ３７のアミノ酸残基が、グリシン（Ｄ３７Ｇ）で置換される。
【００７８】
好ましい実施態様では、ＧｌｄＡ補因子特異性の変化は、位置Ｄ３７における突然変異と位置Ｐ１６１における少なくとも１つの突然変異を組み合わせることによって改善される。優先的には、位置Ｐ１６１のアミノ酸残基がセリン（Ｐ１６１Ｓ）またはトレオニン（Ｐ１６１Ｔ）で置換される。より優先的には、位置Ｐ１６１のアミノ酸残基がセリンで置換される（Ｐ１６１Ｓ）。
【００７９】
最も好ましい実施態様では、ＧｌｄＡ補因子特異性の変化は、位置Ｄ３７およびＰ１６１の突然変異と位置Ｌ１６４の少なくとも１つの突然変異を組み合わせることによって改善される。優先的には、位置Ｌ１６４のアミノ酸残基がアラニン（Ｌ１６４Ａ）、グリシン（Ｌ１６４Ｇ）またはバリン（Ｌ１６４Ｖ）で置換される。より優先的には、位置Ｌ１６４のアミノ酸残基がアラニンで置換される（Ｌ１６４Ａ）。
【００８０】
特定の実施態様では、本発明の微生物は、少なくとも以下の突然変異：Ｄ３７Ｇ、Ｐ１６１ＳおよびＬ１６４Ａを含有するＧｌｄＡ＊突然変異体をコードする変異型ｇｌｄＡ＊を過剰発現する。
【００８１】
本発明の好ましい実施態様では、これらの突然変異は、従前に構築され、突然変異Ａ１６０Ｔを含有するＧｌｄＡ＊突然変異体に導入できる。
【００８２】
大腸菌（Ｋ１２株）により発現されるグリセロールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢデータベースで参照番号Ｐ０Ａ９Ｓ５として公開されている。
【００８３】
従って、ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ依存性活性を増強するために、本発明の微生物は、好ましくは、上記のようなＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ（ＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ）をコードする少なくとも１つの遺伝子または上記のようなＮＡＤＰＨ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｇｌｄＡ＊遺伝子を過剰発現する。
【００８４】
本発明の他の特定の実施態様では、本発明の改変微生物は、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子を過剰発現することが可能であり、ｇｌｄＡ遺伝子に欠失を有してもよい、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子とｇｌｄＡ＊ＮＡＤＰＨ突然変異体を過剰発現することが可能である、または
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子とｇｌｄＡ＊ＮＡＤＰＨ突然変異体を過剰発現することが可能であり、ｇｌｄＡ遺伝子に欠失を有してもよい。
【００８５】
本発明の別の面では、１，２−プロパンジオールの製造は、上記のようなＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ活性の増強と細胞のＮＡＤＰＨ利用度の増大を組み合わせることによりさらに改善される。
【００８６】
細胞のＮＡＤＰＨ利用度の増大のための戦略は、当業者に周知である（Lee et al., 2013で総説）。本発明において、細胞のＮＡＤＰＨ利用度は、
・膜結合トランスヒドロゲナーゼをコードするｐｎｔＡＢオペロンを過剰発現させること（ＷＯ２０１２／０５５７９８Ａ１）、および／または
・ホスホグルコースイソメラーゼをコードするｐｇｉ遺伝子を減弱すること、および／または
・ｐｆｋＡ遺伝子によりコードされているホスホフルクトキナーゼの活性を低下させること（ＷＯ２００５／０４７４９８）およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするｚｗｆ遺伝子を過剰発現させること(Shin et al., 2002)によりペントースリン酸経路を介する流量を増大させること、および／または
・ＮＡＤＰＨ生成グリセルアルデヒド−３−リン酸をコードする生成するストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)由来のｇａｐＮ遺伝子を過剰発現させること(Centeno-Leija et al., 2013)、および／または
・ＮＡＤＰＨを生成できるリポアミドデヒドロゲナーゼをコードする変異型ｌｐｄ＊遺伝子を過剰発現させること(Bocanegra et al., 1993)、および／または
・酵素または熱依存性水和により産生されたＮＡＤＨ（Ｘ）およびＮＡＤＰＨ（Ｘ）を再活性化するＡＤＰ依存性デヒドラターゼをコードするｙｊｅＦ遺伝子を過剰発現させること(Marbaix et al., 2011)．
により増大される。
【００８７】
本発明のさらなる面において、本発明の微生物がＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子を過剰発現する場合、メチルグリオキサールレダクターゼ（ＭＧＲ）をコードするｙｑｈＤ遺伝子が欠失されている。このような条件下で、ＨＡＲタンパク質は、ＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ酵素としてだけでなく、ＮＡＤＰＨ依存性ＭＧＲ酵素としても働き、メチルグリオキサールの１，２−プロパンジオールへの二段階ＮＡＤＰＨ依存性還元を遂行する。このような活性は、上記に挙げられたＮＡＤＰＨ依存性ＨＡＲ酵素候補のいずれかによって行われ得る。
【００８８】
本発明のより好ましい実施態様では、上記の改変のいずれかに従ってＮＡＤＰＨ依存性アセトールレダクターゼ活性が増強された組換え微生物による、炭素源としての炭水化物からの発酵プロセスにおける１，２−プロパンジオールの製造は、前記微生物における上記で述べた改変の組合せによって達成され得る、例えば
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｐｎｔＡＢ遺伝子の発現が増強している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子が増強しており、かつ、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｐｎｔＡＢの発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｙｊｅＦの発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子の発現が増強しており、かつ、ｐｇｉの発現が減弱しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｚｗｆの発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子およびｐｆｋＡ遺伝子が減弱している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｇａｐＮの発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｌｐｄ＊変異型の発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・変異型ＧｌｄＡ＊  ＮＡＤＰＨコード遺伝子の発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・変異型ＧｌｄＡ＊  ＮＡＤＰＨコード遺伝子およびｐｎｔＡＢ遺伝子の発現が増強している、
・変異型ＧｌｄＡ＊  ＮＡＤＰＨコード遺伝子およびｐｎｔＡＢ遺伝子の発現が増強しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子の発現が増強しており、ｙｑｈＤ遺伝子が減弱しており、ｇｌｄＡ遺伝子が欠失している、
・少なくとも１つのＮＡＤＰＨ  ＨＡＲ遺伝子およびｐｎｔＡＢ遺伝子の発現が増強しており、ｙｑｈＤ遺伝子およびｇｌｄＡ遺伝子が欠失している。
【実施例】
【００８９】
実施例１：方法
以下に示される実施例では、複製ベクターおよび／または種々の染色体欠失、および大腸菌に関してDatsenko & Wanner, (2000)により十分に記載されている相同組換えを用いた置換を含有する大腸菌株を構築するために当技術分野で周知の方法を使用した。同様に、組換え微生物内で１または複数の遺伝子を発現または過剰発現するためのプラスミドまたはベクターの使用も当業者に周知である。好適な大腸菌発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ、ｐＡＣＹＣ１８４ｎ  ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６などが含まれる。
【００９０】
いくつかのプロトコールが以下の例で使用された。本発明で使用されたプロトコール１（相同組換えによる染色体の改変、組換えの選択）、プロトコール２（ファージＰ１の形質導入）およびプロトコール３（抗生物質カセットの切り出し、必要があれば耐性遺伝子が除去された）は、特許出願ＥＰ２５３２７５１に十分に記載されている。染色体改変は、当業者が設計できる適当なオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲ分析により確認できる。
【００９１】
プロトコール４：組換えプラスミドの構築
組換えＤＮＡ技術は当技術分野で十分に記載されている。ＤＮＡ断片および選択されたプラスミドを適合する制限酵素（当業者が定義可能）で消化した後、連結させ、コンピテント細胞に形質転換した。形質転換体を分析し、対象とする組換えプラスミドをＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００９２】
【表２】
0006728064.tif 000005
0006728064.tif 000006
0006728064.tif 000007
【００９３】
プロトコール５：１，２−プロパンジオール生産株の評価
１，２−プロパンジオール生産株を、２０ｇ／Ｌグルコースまたはスクロースおよび４０ｇ／Ｌ  ＭＯＰＳを使用したこと以外は特許出願ＥＰ２５３２７５１に記載の通りにフラスコ培養で培養した。必要であれば、１００μＭ  ＩＰＴＧを培地に加えた。１，２−プロパンジオール（ＰＧ）およびヒドロキシアセトン（ＨＡ）をＨＰＬＣにより定量した。ＰＧの生産（ｇＰＧ／Ｌ）およびＨＡのＰＧへの変換率（ｇＰＧ／Ｌ／（ｇＨＡ／Ｌ＋ｇＰＧ／Ｌ））を、１，２−プロパンジオール生産の株性能の評価値とする。
【００９４】
プロトコール６：組換えタンパク質の生産のためのフラスコ培養
組換えタンパク質の生産のためのフラスコ培養は、ＬＢ培養液に５，０ｇ／Ｌグルコースを添加したこと以外は特許出願ＷＯ２０１０／０７６３２４に記載の通りに行った。
【００９５】
実施例２：株１、２、３および４の構築物
株１の構築
ｆｒｄＡＢＣＤオペロンによりコードされているフマル酸レダクターゼフラボタンパク質複合体およびｐｔｓＧ遺伝子によりコードされているグルコースホスホトランスフェラーゼ酵素ＩＩＢＣ（Ｇｌｃ）を不活化するために、相同組換え法を用いた（プロトコール１および３に従う）。ＤｆｒｄＡＢＣＤ：配列番号１および２（表２に列挙）、およびＤｐｔｓＧ：配列番号３および４（表２に列挙）のオリゴヌクレオチドを用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｆｒｄＡＢＣＤ：：ＣｍおよびＭＧ１６５５  ＤｐｔｓＧ：：Ｋｍと呼称した。最後に、このＤｆｒｄＡＢＣＤ：：Ｃｍ欠失およびＤｐｔｓＧ：：Ｋｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により、特許出願ＷＯ２００８／１１６８５２に記載されている進化した株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ＤｔｐｉＡ  ＤｐｆｌＡＢ  ＤａｄｈＥ  ＤｌｄｈＡ  ＤｇｌｏＡ  ＤａｌｄＡ  ＤａｌｄＢ  Ｄｅｄｄ  ＤａｒｃＡ  Ｄｎｄｈに導入し、株１を得た。
【００９６】
株２の構築
ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）遺伝子を特許出願ＥＰ２５３２７５１に記載の通りにｐＭＥ１０１ＶＢ０６プラスミドにクローニングした。ｐＰＧ００７８と呼称するこのプラスミドを株１に形質転換し、株２を得た。
【００９７】
株３の構築
ｔｐｉＡ遺伝子によりコードされているトリオースリン酸イソメラーゼを発現させ、ｇａｐＡ遺伝子によりコードされているグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節するために、相同組換え法を使用した（プロトコール１および３に従う）。ｔｐｉＡ遺伝子を特許ＷＯ２００８／１１６８５２に記載の通りに、進化した株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ＤｔｐｉＡ  ＤｐｆｌＡＢ  ＤａｄｈＥ  ＤｌｄｈＡ  ＤｇｌｏＡ  ＤａｌｄＡ  ＤａｌｄＢ  Ｄｅｄｄ  ＤａｒｃＡ  Ｄｎｄｈ  ＤｆｒｄＡＢＣＤに導入した。次に、  ｇａｐＡ発現を調節するためのゲノム改変「ＣＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ１１−ｇａｐＡ」を、特許ＥＰ２５３２７５１に記載の通りに従前の株に導入し、株３を得た。
【００９８】
株４の構築
スクロースでの大腸菌の成長を可能とするため、プラスミドｐＵＲ４００(Schmid et al., 1982)由来の遺伝子ｓｃｒＫ、ｓｃｒＹＡＢおよびｓｃｒＲを、プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ３上のそれらの天然プロモーター下にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０２３１と呼称した。プラスミドｐＰＧ００７８およびｐＰＧ０２３１を株３に形質転換し、株４を得た。
【００９９】
実施例３：１，２−プロパンジオールの生産はクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼａｄｈを過剰発現する株で改善される
株５の構築
クロストリジウム・ベイジェリンキ(Hanai et al., 2007)由来のａｄｈ遺伝子を特許出願ＷＯ２００８／１１６８５３に記載のｐＭＥ１０１ＶＢ０１プラスミドにクローニングした。ｐＰＧ０４６８と呼称するこのプラスミドを株１に形質転換し、株５を得た。
【０１００】
株６の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を不活化するために、相同組換え法を使用した（プロトコール１および３に従う）。ＤｇｌｄＡのオリゴヌクレオチド：配列番号５および６（表２に列挙）を用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｇｌｄＡ：：Ｃｍと呼称した。このＤｇｌｄＡ：：Ｃｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株５に導入し、株６を得た。
【０１０１】
株７の構築
プラスミドｐＰＧ０４６８およびｐＰＧ０２３１を株３に形質転換し、株７を得た。
【０１０２】
株８の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を不活化するために、従前に記載したＤｇｌｄＡ：：Ｃｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株７に導入し、株８を得た。
【０１０３】
プロトコール５に記載のように評価されたクロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈを発現する株５、６、７および８は、それらの各対照株２および４に比べてより多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産し、より良好な変換率および収量を有していた（表３）。
【０１０４】
【表３】
0006728064.tif 000008
【０１０５】
実施例４：１，２−プロパンジオールの生産はクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼａｄｈを過剰発現する株においてをピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼｐｎｔＡＢ過剰発現させることにより改善される
株９の構築
相同組換え法（プロトコール１および３に従う）を用い、ｐｎｔＡＢの天然プロモーター領域を、誘導型ｔｒｃプロモーター（プラスミドｐＴＲＣ９９Ａ由来、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）および確定(define)リボソーム結合部位ＲＢＳ１２０（ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅから）（表２に列挙した配列番号７）で置換した。染色体組込みのために、どちらも標的組込み遺伝子座ｐｎｔＡＢと相同なＤＮＡ配列が隣接した人工プロモーター領域および耐性マーカーを有する断片を、オーバーラッピングＰＣＲ技術（オーバーラッピングオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅した。ｐｎｔＡＢへの組換えための配列を配列番号８および９と呼称した（表２に列挙）。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションにより株ＭＧ１６５５に導入した（ｐＫＤ４６）。保持された株をＭＧ１６５５  Ｐｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ１２０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍと呼称した。次に、このＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ１２０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ改変をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株６に導入し、株９を得た。
【０１０６】
株１０の構築
従前に記載したＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ１２０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ改変をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株８に導入し、株１０を得た。
【０１０７】
プロトコール５に記載のように評価されたｐｎｔＡＢを過剰発現する株９および１０は、それぞれ株６および８に比べてより多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産し、より良好な変換率および収量を有していた（表４）。
【０１０８】
【表４】
0006728064.tif 000009
【０１０９】
実施例５：クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の第２級アルコールデヒドロゲナーゼａｄｈを過剰発現する株において１，２−プロパンジオール生産を改善するためのｐｎｔＡＢの過剰発現の別法
株１１の構築
大腸菌由来のｙｊｅＦ遺伝子を、実施例３に記載のｐＰＧ０４６８プラスミドの確定リボソーム結合部位ＲＢＳ１２１（ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅから）（表２に列挙した配列番号１０）下、オペロン内にａｄｈとともにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５１８と呼称した。最後に、プラスミドｐＰＧ０５１８およびｐＰＧ０２３１を中間株８（プラスミド不含）に形質転換し、株１１を得た。
【０１１０】
株１２の構築
ｐｇｉ遺伝子を不活化するために、相同組換え法を使用した（プロトコール１および３に従う）。Ｄｐｇｉのオリゴヌクレオチド：配列番号１１および１２（表２に列挙）を用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  Ｄｐｇｉ：：Ｃｍと呼称した。このＤｐｇｉ：：Ｃｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株８の導入し、株１２を得た。
【０１１１】
株１３の構築
相同組換え法（プロトコール１および３に従う）を用い、天然ｐｆｋＡ遺伝子を変異型ｐｆｋＡ＊（Ｌ９８Ｑ）遺伝子で置換した。まず、耐性カセットのＰＣＲ増幅を行うため、オリゴヌクレオチド配列番号１３および１４（表２に列挙）を用いてｐｆｋＡ遺伝子を欠失させた。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｐｆｋＡ：：Ｋｍと呼称した。次に、染色体組込みのため、どちらも標的組込み遺伝子座ｐｆｋＡと相同なＤＮＡ配列が隣接した変異型ｐｆｋＡ＊（Ｌ９８Ｑ）領域および耐性マーカーを有する断片を、オーバーラッピングＰＣＲ技術（オーバーラッピングオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅した。ｐｆｋＡへの組換えのための配列を配列番号１５および１６（表２に列挙）と呼称した。得られたＰＣＲ産物を次にエレクトロポレーションにより株ＭＧ１６５５  ＤｐｆｋＡ：：Ｋｍに導入した（ｐＫＤ４６）。保持された株をＭＧ１６５５  ｐｆｋＡ＊（Ｌ９８Ｑ）：：Ｃｍと呼称した。このｐｆｋＡ＊（Ｌ９８Ｑ）：：Ｃｍ改変を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により中間株８（プラスミド不含株）に導入した。大腸菌由来のｚｗｆ遺伝子を、実施例３に記載のｐＰＧ０４６８プラスミドの確定リボソーム結合部位ＲＢＳ１１３（ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅから）（表２に列挙した配列番号１７）下、オペロン内にａｄｈとともにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５３２と呼称した。最後に、プラスミドｐＰＧ０５３２およびｐＰＧ０２３１を従前の株に形質転換し、株１２を得た。
【０１１２】
株１４の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を不活化するために、従前に記載したＤｇｌｄＡ：：Ｃｍ欠失を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により中間進化株(intermediate evolved strain)３（ｇａｐＡ調節無し）に導入した。ｇａｐＮ遺伝子によりコードされているストレプトコッカス・ミュータンス由来のＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼを発現させるために、相同組換え法を使用した（プロトコール１および３に従う）。大腸菌由来のｇａｐＡ遺伝子を、Centeno-Leija et al. (2013)に記載されているようにストレプトコッカス・ミュータンス由来のｇａｐＮ遺伝子で置換した。得られたＰＣＲ産物をエレクトロポレーションにより株ＭＧ１６５５に導入した（ｐＫＤ４６）。保持された株をＭＧ１６５５  ｇａｐＮ：：Ｃｍと呼称した。このｇａｐＮ：：Ｃｍ改変をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により従前の株に導入した。遺伝子ｓｃｒＫ、ｓｃｒＹＡＢおよびｓｃｒＲを染色体で発現させるために、Datsenko & Wanner, 2000に記載の相同組換え法（プロトコール１および３に従う）を使用した。染色体組込みのため、耐性マーカーに連結された、それらの天然プロモーター下で発現された遺伝子ｓｃｒＫ、ｓｃｒＹＡＢおよびｓｃｒＲを有する断片（どちらも標的組込み遺伝子座ｙｋｉＡと相同なＤＮＡ配列が隣接している）を、オーバーラッピングＰＣＲ技術（オーバーラッピングオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅した。ｙｋｉＡへの組換えのための配列を配列番号１８および１９（表２に列挙）と呼称する。得られたＰＣＲ産物「ＤｙｋｉＡ：：ｓｃｒＫＹＡＢＲ」を次に、エレクトロポレーションにより株ＭＧ１６５５に導入した（ｐＫＤ４６）。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｙｋｉＡ：：ｓｃｒＫＹＡＢＲ：：Ｃｍと呼称した。このＤｙｋｉＡ：：ｓｃｒＫＹＡＢＲ：：Ｃｍ改変を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により、従前の株に導入した。ストレプトコッカス・ミュータンス由来のＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの過剰生産を可能とするため、Centeno-Leija et al. (2013)により記載されているように、ｇａｐＮ遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４プラスミドにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５４８と呼称した。最後に、これらのプラスミドｐＰＧ０４６８およびｐＰＧ０５４８を従前の株に形質転換し、株１３を得た。
【０１１３】
株１５の構築
ｌｐｄ遺伝子によりコードされているＮＡＤ＋依存性リポアミドデヒドロゲナーゼを不活化するために、相同組換え法（プロトコール１および３に従う）を使用した。従って、Ｄｌｐｄのオリゴヌクレオチド：配列番号２０および２１（表２に列挙）を用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  Ｄｌｐｄ：：Ｃｍと呼称した。最後に、このＤｌｐｄ：：Ｃｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により中間株８（プラスミド不含株）に導入した。大腸菌由来の変異型ｌｐｄ＊（Ａ５５Ｖ／Ｇ１８５Ａ／Ｇ１８９Ａ／Ｅ２０３Ｖ／Ｍ２０４Ｒ／Ｆ２０５Ｋ／Ｄ２０６Ｈ／Ｐ２１０Ｒ）遺伝子をオーバーラッピングＰＣＲ技術（オーバーラッピングオリゴヌクレオチド）によりＰＣＲ増幅し、実施例３に記載のｐＰＧ０４６８プラスミドの確定リボソーム結合部位ＲＢＳ１３１（ＲＢＳ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅから）（配列番号２２  表２に列挙）下、オペロン内にａｄｈとともにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５２３と呼称した。最後に、これらのプラスミドｐＰＧ０２３１およびｐＰＧ０５２３を従前の株に形質転換し、株１４を得た。
【０１１４】
プロトコール５に記載の通りに評価された株１１、１２、１３、１４および１５は、株８に比べてより多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産し、より良好な変換率を有していた（表５）。
【０１１５】
【表５】
0006728064.tif 000010
【０１１６】
実施例６：クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のａｄｈの代替
相同配列の同定および系統樹の構築
配列セットからの系統樹の構築はウェブサイトhttp://www.phylogeny.fr/で利用可能なバイオインフォマティクスプログラムを用いて行い、ソフトウエアはDereeper et al. (2008)およびDereeper et al. (2010)に記載されている。
【０１１７】
工程１：相同配列の同定
ＢＬＡＳＴソフトウエアを用い、以下のパラメーター：データベース（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＵＮＩＰＲＯＴ）、ｅ値＝０．０１および低複雑性配列用フィルターを設定することにより、第２級アルコールデヒドロゲナーゼファミリーおよびアルデヒド／ケトンレダクターゼファミリーから類似配列の同定を行った。
【０１１８】
工程２：系統樹の構築
ＭＵＳＣＬＥソフトウエアを用いて配列をアラインし、Ｇｂｌｏｃｋｓプログラムを用いて不明瞭な領域を除去した。次に、ＰｈｙＭＬプログラムに実装されている最大尤度法を用いて系統樹を再構築した。系統樹のグラフ表示および編集はＴｒｅｅＤｙｎを用いて行った。
【０１１９】
【表６】
0006728064.tif 000011
0006728064.tif 000012
【０１２０】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のＡｄｈは、サーモアナエロバクテリウム・ブロッキー、赤痢アメーバーおよび肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)酵素に最も近縁であった。次に良好な一致は、真核生物に見られるアルコールデヒドロゲナーゼとのものであった。グルコノバクター・オキシダンス、ヒポクレア・ジェコリナ、赤痢アメーバーおよび枯草菌由来の酵素をクローニングし、精製し、ＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシアセトンレダクターゼ活性に関してアッセイした。
【０１２１】
株１６の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を不活化するために、相同組換え法を使用した（プロトコール１および３に従う）。ＤｇｌｄＡのオリゴヌクレオチド：配列番号５および６（表２に列挙）を用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｇｌｄＡ：：Ｋｍと呼称した。最後に、このＤｇｌｄＡ：：Ｋｍ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターに導入した。グルコノバクター・オキシダンス由来のグリセロールデヒドロゲナーゼを同定するために、大腸菌に対して最適化した合成遺伝子ｇｌｄ（表２に列挙した配列番号２３）を発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（商標））にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０３８１と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターＤｇｌｄＡ：：Ｋｍに形質転換し、株１６を得た。
【０１２２】
株１７の構築
ヒポクレア・ジェコリナ由来のグリセロールデヒドロゲナーゼを同定するために、大腸菌に対して最適化した合成遺伝子ｇｌｄ２（表２に列挙した配列番号２４）を発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（商標））にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０４１８と呼称し、従前に記載した株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターＤｇｌｄＡ：：Ｋｍに形質転換し、株１７を得た。
【０１２３】
株１８の構築
赤痢アメーバー由来のアルコールデヒドロゲナーゼを同定するために、大腸菌に対して最適化した合成遺伝子ａｄｈ１（表２に列挙した配列番号２５）を発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（商標））にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５３９と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラスに形質転換し、株１８を得た。
【０１２４】
株１９の構築
枯草菌由来のアルドケトレダクターゼ(aldo keto reductase)を同定するために、枯草菌由来の遺伝子ｙｈｄＮを発現プラスミドｐＰＡＬ７（Ｂｉｏｒａｄ（商標））にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０３５７と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、株１９を得た。
【０１２５】
組換えタンパク質の精製
株１６、１７、１８および１９はプロトコール６に記載の通りに培養した。細胞（乾燥重量３５０〜５００ｍｇ）プロテアーゼ阻害剤カクテルとともに抽出バッファー（６０〜９０ｍｌ）に再懸濁させた。懸濁細胞を氷上で３０秒６回の音波処理サイクル（Ｂｒａｎｓｏｎ超音波発生装置、７０Ｗ）により破砕した後、室温で１時間、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。細胞残渣を４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により除去した。上清を粗細胞抽出液として維持した。組換えタンパク質をこの粗抽出液から、スブチリシン(subtilisine)アフィニティークロマトグラフィー（ＰＲＯｆｉｎｉｔｙ  ＥＸａｃｔカートリッジ５ｍｌ、ＢＩＯＲＡＤ）を製造者の説明書に従って使用することにより精製した。前記タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、ゲル濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
【０１２６】
精製酵素のＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシアセトンレダクターゼ（ＨＡＲ  ＮＡＤＰＨ）
ＨＡＲ  ＮＡＤＰＨ活性は、分光光度計（ε３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）にて３４０ｎｍ、３０℃で、ＮＡＤＰＨの消費を測定することにより決定した。アッセイバッファー０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよび精製タンパク質を含有する反応混合物（１ｍＬ）を３０℃で５分間インキュベートした。次に、３０ｍＭのヒドロキシアセトンを加えて反応を開始させた。１単位の酵素活性は、１分当たり１μｍｏｌのＮＡＤＰＨを触媒する酵素の量と定義した。特異的酵素活性をタンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性の単位として表した。ヒドロキシアセトン無しで測定された活性値を差し引いた。
【０１２７】
【表７】
0006728064.tif 000013
【０１２８】
株２０の構築
赤痢アメーバー由来の最適化されたａｄｈ１遺伝子を特許出願ＷＯ２００８／１１６８５３に記載されているｐＭＥ１０１ＶＢ０１プラスミドにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０５４４と呼称した。プラスミドｐＰＧ０５４４およびｐＰＧ０２３１を実施例２に記載の株３に形質転換した後、ｇｌｄＡ遺伝子を実施例３に記載の通りに不活化し、ｐｎｔＡＢオペロンを実施例４に記載の通りに過剰発現させ、株１９を得た。
【０１２９】
プロトコール５に記載の通りに評価された株２０は、株４に比べてより多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産し、より良好な変換率を有してした（表８）。
【０１３０】
【表８】
0006728064.tif 000014
【０１３１】
実施例７：ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の補因子リファクタリング(refactoring)
酵素設計および構造解析
ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の相同モデルを、バチルス・ステアロサーモフィルスのグリセロールデヒドロゲナーゼのＸ線構造から構築した。これらのモデルを、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用することにより計算した。これらのモデルを少なくとも３０％の同一性を有し、その構造が知られているＮＡＤおよびＮＡＤＰ依存性酵素の構造と比較した。
【０１３２】
補因子の特異性に関与するアミノ酸を、ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の配列と数種のＮＡＤおよびＮＡＤＰ依存性デヒドロゲナーゼの間の配列アラインメント、ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の相同モデルとＲＣＳＢタンパク質データバンクに存在するグリセロールデヒドロゲナーゼの間の重畳、およびClermont et al. (1993), Ruzheinikov et al. (2001), Corbier et al. (1990)およびWu et al. (2012)に見られるデータとの比較によって同定した。
【０１３３】
配列解析および構造解析からＤ３７ＧおよびＤ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａの２つの突然変異体が定義された。
【０１３４】
株２１の構築
大腸菌      由来の変異型１，２−プロパンジオール：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼを同定するために、まず、遺伝子ｇｌｄＡを発現プラスミドｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））にクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ００２９と呼称した。変異型ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）遺伝子を過剰発現させるために、ｐＰＧ００２９での部位特異的突然変異誘発を用いた。このプラスミドをｐＰＧ０３９４と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターＤｇｌｄＡ：：Ｋｍに形質転換し、株２１を得た。
【０１３５】
株２２の構築
変異型ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ）遺伝子を過剰発現させるために、ｐＥＴＴＯＰＯ−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）に対する部位特異的突然変異誘発を使用した。このプラスミドをｐＰＧ０４２５と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターＤｇｌｄＡ：：Ｋｍに形質転換し、株２２を得た。
【０１３６】
株２３の構築
変異型ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａ）遺伝子を過剰発現させるために、ｐＰＧ０４２５に対する部位特異的突然変異誘発を使用した。このプラスミドをｐＰＧ０４３８と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）スターＤｇｌｄＡ：：Ｋｍに形質転換し、株２３を得た。
【０１３７】
ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）、ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ）およびＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａ）の精製
株２１、２２および２３をプロトコール６に記載の通りに培養した。細胞（乾燥重量５００ｍｇ）を９０ｍＬの抽出バッファー（１００ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．６、２０ｍＭイミダゾールおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁させた。懸濁細胞を氷上で３０秒８回の音波処理サイクル（Ｂｒａｎｓｏｎ超音波発生装置、７０Ｗ）により破砕した後、室温で４５分間、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ＵＩ／ｍｌのＤＮアーゼＩとともにインキュベートした。細胞残渣を４℃、１２０００ｇで３０分の遠心分離により除去した。上清を粗細胞抽出液として維持した。酵素をこの粗抽出液から、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐＦＦ  １ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の説明書に従って使用することにより精製した。酵素を、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）中イミダゾール（２０から５００ｍＭへ）の直線勾配を用いて溶出させた１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５）で平衡化したゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １０／３００  ＧＬ  ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による脱塩工程の後に、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
【０１３８】
ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）、ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ）およびＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａ）の同定
ＮＡＤＰＨ依存性ヒドロキシアセトンレダクターゼ活性（ＨＡＲ  ＮＡＤＰＨ）を、分光光度計（□３４０ｎｍ＝６２９０Ｍ−１ｃｍ−１）にて３４０ｎｍ、３０℃で、ＮＡＤＰＨの消費を測定することにより決定した。１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ６．５）、０．１ｍＭ  ＦｅＳＯ４、３０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．０５〜０．４ｍＭ  ＮＡＤＰＨおよび精製酵素を含有する反応混合物（１ｍＬ）を３０℃で５分間インキュベートした。次に、０．１〜１０ｍＭヒドロキシアセトンを加えて反応を開始させた。ＮＡＤＨ依存性ヒドロキシアセトンレダクターゼ（ＨＡＲ  ＮＡＤＨ）アッセイは、反応混合物においてＮＡＤＰＨをＮＡＤＨに置き換えたこと以外はＨＡＲ  ＮＡＤＰＨと同じ条件下で行い、ＮＡＤＨの消費を３４０ｎｍで測定することにより活性を決定した。動態パラメーターは、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔを用いてミカエリス・メンテンの式に当てはめることにより決定した。
【０１３９】
ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ）およびＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａ）酵素は、ＧｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）に比べて、ＮＡＤ触媒効率の上昇を、ＮＡＤＨの場合には触媒効率の低下を示した（表９）。
【０１４０】
【表９】
0006728064.tif 000015
【０１４１】
株２４の構築
変異型ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ／Ｄ３７Ｇ／Ｐ１６１Ｓ／Ｌ１６４Ａ）遺伝子を、特許出願ＥＰ２５３２７５１でｐＭＥ１０１ＶＢ０６−ｇｌｄＡ＊（Ａ１６０Ｔ）の構築に関して記載されているように、ｐＭＥ１０１由来プラスミドにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０４６７と呼称した。最後に、プラスミドｐＰＧ０４６７およびｐＰＧ０２３１を実施例２に記載の中間株８（プラスミド不含株）に形質転換し、株２４を得た。
【０１４２】
プロトコール５に記載の通りに評価された株２４は、株４に比べてより多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産し、より良好な変換率を有していた（表１０）。
【０１４３】
【表１０】
0006728064.tif 000016
【０１４４】
実施例８：クロストリジウム・ベイジェリンキ由来のＡｄｈによるＭＧ＝＞ＰＧ活性
株２５の構築
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の最適化されたａｄｈ遺伝子(Hanai, Atsumi and Liaso, 2007)を発現プラスミドｐＥＴ２８ａにクローニングした。このプラスミドをｐＰＧ０４４５と呼称し、株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、株２５を得た。
【０１４５】
クロストリジウム・ベイジェリンキ由来Ａｄｈの精製
株２５をプロトコール６に記載の通りに培養した。細胞（乾燥重量３１５ｍｇ）を５０ｍＬの抽出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．３、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ベンズアミジン、１０％グリセロール、０．０２％アジ化ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁させた。懸濁細胞を氷上で３０秒８回の音波処理サイクル（Ｂｒａｎｓｏｎ超音波発生装置、７０Ｗ）により破砕した。細胞残渣を４℃、１２０００ｇで３０分間の遠心分離により除去した。上清を加熱し（６５℃５分間）、次いで、４℃、１２０００ｇで３０分間、再び遠心分離した。タンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐＦＦ  １ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の説明書に従って使用することにより精製した。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中、イミダゾール（２０から５００ｍＭへ）の直線勾配を使用することにより溶出させた。前記タンパク質を含有する画分をプールし、濃縮し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）に対して透析した。タンパク質濃度は、ブラッドフォードアッセイを用いて決定した。
【０１４６】
メチルグリオキサールから生産された１，２−プロパンジオールの定量
５〜１０μｇの精製酵素を３０℃で３０分間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭメチルグリオキサールおよび５ｍＭ  ＮＡＤＰＨ中でインキュベートした。メチルグリオキサールからＡｄｈにより生産された１，２−プロパンジオールの量を直接ＧＣ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。
【０１４７】
このような条件下で４．６ｍＭの１，２−プロパンジオールが生産されたが、メチルグリオキサールまたは酵素を除いた場合には１，２−プロパンジオールは生産されなかった。
【０１４８】
株２６、２７および２８の構築
ｇｌｄＡ遺伝子を不活化するために、従前に記載したＤｇｌｄＡ：：Ｋｍ欠失およびｔｐｉＡ遺伝子を、Ｐ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により、特許出願ＷＯ２００８／１１６８５２に記載されている株ＭＧ１６５５  ｌｐｄ＊  ＤｔｐｉＡ  ＤｐｆｌＡＢ  ＤａｄｈＥ  ＤｌｄｈＡ  ＤｇｌｏＡ  ＤａｌｄＡ  ＤａｌｄＢ  Ｄｅｄｄに共導入した。ｇａｐＡ発現を調節するためのゲノム改変「ＣＩ８５７−ＰＲ０１／ＲＢＳ１１−ｇａｐＡ」を特許ＥＰ２５３２７５１に記載の通りに従前の株に導入した。ｙｑｈＤ遺伝子によりコードされているアルデヒドレダクターゼおよびｙｑｈＥ遺伝子によりコードされているグリオキサールレダクターゼを不活化するために、相同組換え法（プロトコール１および３に従う）を使用した。ＤｙｑｈＤＥのオリゴヌクレオチド：配列番号２６および２７（表２に列挙）を用いて耐性カセットのＰＣＲ増幅を行った。保持された株をＭＧ１６５５  ＤｙｑｈＤＥ：：Ｂｓと呼称した。このＤｙｑｈＤＥ：：Ｂｓ欠失をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により従前の株に導入し、株２６を得た。次に、プラスミドｐＰＧ０４６８をこの株に形質転換し、株２７を得た。最後に、従前に記載したＰｔｒｃ０１／ＯＰ０１／ＲＢＳ１２０−ｐｎｔＡＢ：：Ｃｍ改変をＰ１ファージ形質導入（プロトコール２に従う）により株２７に導入し、株２８を得た。
【０１４９】
プロトコール５に記載の通りに評価したところ、株２７および２８は株２６よりも多くの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）を生産した。
【０１５０】
参考文献
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0006728064.tif 000018
【配列表】
0006728064000001.app