(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲにより核酸を増幅する工程において、異なる熱変性温度を含む３種類以上の熱サイクルを有し、かつ、核酸増幅工程における後の熱サイクルの熱変性温度が、先の熱サイクルの熱変性温度と同じ温度であるか又は低い温度であることを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
少なくとも以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ａ）及び（ｂ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回であることを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
（ａ）９０℃から１００℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも５回以上繰り返す工程
（ｂ）工程（ａ）に続く熱サイクルであって、工程（ａ）の熱変性温度より２℃から１０℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
【請求項３】
以下の工程（ｃ）をさらに含み、かつ、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回であることを特徴とする請求項２に記載の核酸増幅方法。
（ｃ）工程（ｂ）に続く熱サイクルであって、工程（ｂ）の熱変性温度より１℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
【請求項４】
最も高い熱変性温度と最も低い熱変性温度との差が５℃から１０℃となる熱サイクルを有することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
全熱サイクル数が３５回から４５回であることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
核酸増幅方法がマルチプレックスＰＣＲである請求項１から５のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項７】
核酸増幅の試料が生体由来である請求項１から６のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項８】
核酸増幅の試料が核酸抽出を行うことなく得られた試料である請求項７に記載の核酸増幅法。
【請求項９】
試料が便検体である請求項７又は８に記載の核酸増幅法。
【請求項１０】
サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌からなる群より選択される少なくとも１つの細菌が保有する遺伝子を標的核酸とする請求項１から９のいずれかに記載の核酸増幅法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、従来と比較して、反応時間を大幅に短縮することができる核酸増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化レベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術である。代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００３】
ＰＣＲ技術を用いた検査は遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。ＰＣＲ増幅産物の検出には、電気泳動をすることなく、簡便に微量核酸の検出が可能なリアルタイムＰＣＲ法が広く利用されている。現在、遺伝子診断や衛生検査など、特に多サンプルの処理が必要な産業用途ではＰＣＲ解析に要する時間の短縮が強く望まれている。
【０００４】
反応時間の短縮を達成するため、様々なＰＣＲ機器が開発ならびに改良されている。現在では、温度昇降速度が格段に早いＰＣＲ機器が登場し、ＰＣＲ反応に要する時間が大幅に短縮されている。ＰＣＲ反応時間の短縮は機器の問題ではなく、ＰＣＲの反応自体に制約されることとなっている。例えば、温度昇降速度の速度を上げることにより、非特異的反応や、プライマーダイマ―の増加などが起こりやすくなるといった制約が存在する。そのためＰＣＲの反応特異性高く維持したまま、標的核酸のみを高感度に検出するためにはＰＣＲ反応サイクルを最適化することが依然として必要不可欠である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記事情を背景として、本発明では、検査の正確性を担保するために検出感度や特異性を保ちながら、より短時間で解析を終えるためのＰＣＲにおける熱サイクル条件による核酸増幅方法を得ることを課題とする。
【０００６】
ＰＣＲは熱変性・アニーリング及び伸長反応の各温度ステップを繰り返すことによって進行する。ＰＣＲの熱サイクル時間を決める要因として、各ステップ温度、各ステップの保持時間、各ステップ間の温度昇降速度が挙げられる。本発明では、サイクル内で最も高温ステップである熱変性ステップの温度に着目した。各ステップ間での温度変化のうち、熱変性ステップからアニーリングステップへの温度変化と前サイクルの伸長反応ステップから次サイクルの熱変性ステップへの温度変化は特に大きい。そのため、ＰＣＲサイクルの最大温度である熱変性温度を下げることが熱サイクル時間の短縮に大きく寄与する。
【０００７】
しかし、熱変性温度を下げることで二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの乖離不足やプライマー伸長生成物の乖離不足による、特異性の低下と検出感度の低下を招くことがある。また、さらにマルチプレックスＰＣＲで行うと、投入するプライマーの種類が増加すること、プライマー伸長生成物の乖離温度が異なることから検出感度の低下が起こりやすくなるという側面がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、ＰＣＲにおける熱サイクルにおける熱変性温度を段階的に下げていくことによって、特異性と検出感度を維持したまま反応時間を短縮することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明の概要は以下の通りである。
〔項１〕ＰＣＲにより核酸を増幅する工程において、異なる熱変性温度を含む２種類以上の熱サイクルを有し、かつ、核酸増幅工程における後の熱サイクルの熱変性温度が、先の熱サイクルの熱変性温度と同じ温度であるか又は低い温度であることを特徴とする核酸増幅方法。
〔項２〕以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ａ）及び（ｂ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回であることを特徴とする項１に記載の核酸増幅方法。
（ａ）９０℃から１００℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも５回以上繰り返す工程
（ｂ）工程（ａ）続く熱サイクルであって、工程（ａ）の熱変性温度より２℃から１０℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
〔項３〕以下の工程（ｃ）をさらに含み、かつ、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回であることを特徴とする項２に記載の核酸増幅方法。
（ｃ）工程（ｂ）に続く熱サイクルであって、工程（ｂ）の熱変性温度より１℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
〔項４〕最も高い熱変性温度と最も低い熱変性温度との差が５℃から１０℃となる熱サイクルを有することを特徴とする項１から３のいずれかに記載の核酸増幅方法。
〔項５〕核酸増幅方法がマルチプレックスＰＣＲである項１から４のいずれかに記載の核酸増幅法。
〔項６〕核酸増幅の試料が生体由来である項１から５のいずれかに記載の核酸増幅法。
〔項７〕核酸増幅の試料が核酸抽出を行うことなく得られた試料である項６に記載の核酸増幅法。
〔項８〕試料が便検体である項６又は７に記載の核酸増幅法。
〔項９〕サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌からなる群より選択される少なくとも１つの細菌が保有する遺伝子を標的核酸とする項１から８のいずれかに記載の核酸増幅法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の熱サイクル条件を適用することにより、高い検出感度を維持したまま、ＰＣＲに要する全反応時間を、従来よりも大幅に短縮させることを実現することができた。
【００１１】
ＰＣＲ反応時間の短縮は、一日に処理可能な検体数を増やすことに直結する。例えば、検査センターなどでの勤務時間を８時間であると仮定した場合、ＰＣＲに１２０分間必要であると、１日に４回のＰＣＲ解析の実施が可能である。しかし、ＰＣＲ解析に必要な時間が９０分であると５回、８０分であると６回、７０分であると７回の実施が可能となる。１台のサーマルサイクラ―における１回のＰＣＲ解析あたり、おおよそ９６サンプルの解析が可能なため、ＰＣＲ解析時間の短縮には解析数の増加に大きな効果がある。すなわち、１日に解析可能な回数がｎ回増えることで、処理可能な検体数としては（９６×ｎ）個増えることになる。
また、例えば検便検査では５０検体を１プールとして解析を行うため、実質的には（９６×５０×ｎ）個、すなわち（４８００×ｎ）個も処理可能な検体数が増えることになる。また、複数台のサーマルサイクラ―を保有している検査センターでは、さらに効率化に顕著な効果ができる。例えば、３台のサーマルサイクラ―を保有している場合、（９６×３×ｎ）個、すなわち（２８８×ｎ）個の処理数が増分となり、５０検体をプールした場合に、実質的には（４８００×３×ｎ）個、すなわち（１４４００×ｎ）個も処理可能な検体数が増えることになる。
【００１２】
特にマルチプレックスＰＣＲ法では、本発明の効果はさらに顕著である。複数のプライマーを反応系に添加するマルチプレックスＰＣＲ法ではプライマーダイマ―が形成されやすく、非特異的増幅も起こりやすい。また、熱変性温度を低下させることでプライマーダイマ―の形成と非特異的増幅が増加しやすいという問題もある。しかしながら、本発明のように、熱変性温度を段階的に低下させることで、プライマーダイマ―の形成と非特異的増幅を抑制することができるので、短時間での高感度なマルチプレックスＰＣＲ法による高速検出を可能とした。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】サルモネラ菌遺伝子、腸内出血性大腸菌遺伝子、赤痢菌遺伝子をターゲットとしたマルチプレックスＰＣＲの結果を示す写真である。各ゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として添加し増幅を実施し、増幅産物を融解曲線解析により解析した。内部標準は７２℃、サルモネラ菌陽性は７７℃、腸管出血性大腸菌陽性は８０℃、赤痢菌陽性は８４℃にピークを与える。ＰＣＲ反応条件は通常サイクル（９４℃  ２０秒、９４℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ４０サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐ）で実施した。
【図２】陰性検体である糞便検体５０個をプールした検体の熱処理後の遠心上清液を糞便サンプルとし、糞便サンプルに各ゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として使用した。通常サイクルによるマルチプレックスＰＣＲ増幅を実施し、各増幅産物を融解曲線解析により解析した。
【図３】サルモネラ菌遺伝子、腸内出血性大腸菌遺伝子、赤痢菌遺伝子をターゲットとしたマルチプレックスＰＣＲの結果を示す写真である。各ゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として添加し増幅を実施し、各増幅産物を融解曲線解析により解析した。ＰＣＲ反応条件は本発明である熱変性を段階的に下げるサイクル（９４℃  ２０秒、９４℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ５サイクル、８７℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ３５サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐ）にて実施した。
【図４】糞便サンプルに各ゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として使用した。本発明である熱変性を段階的に下げるサイクルによるマルチプレックスＰＣＲ増幅を実施し、各増幅産物を融解曲線解析により解析した。
【図５】サルモネラ菌遺伝子、腸内出血性大腸菌遺伝子、赤痢菌遺伝子をターゲットとしたマルチプレックスＰＣＲの結果を示す写真である。各ゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として添加し増幅を実施した。各増幅産物を融解曲線解析により解析した。ＰＣＲ反応条件は低温熱変性サイクル（８７℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ４０サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐ）にて実施した。
【図６】検体として水を添加した。低温熱変性サイクルによるマルチプレックスＰＣＲ増幅を実施し、各増幅産物を融解曲線解析により解析した。
【図７】本発明における熱サイクルのパターンの一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ＰＣＲは熱変性、アニーリング及び伸長の工程からなるサイクルで構成される。以下に例を挙げて説明する。
【００１５】
本発明の核酸増幅法は、ＰＣＲにより核酸を増幅する工程において、異なる熱変性温度を含む２種類以上の熱サイクルを有し、かつ、核酸増幅工程における後の熱サイクルの熱変性温度が、先の熱サイクルの熱変性温度と同じ温度であるか又は低い温度であることを特徴とするものである。例えば、図７に示すような熱サイクルが挙げられる。同じ熱変性温度を有するサイクルを複数回、好ましくは５回以上繰り返した後、それよりも低い熱変性温度を有するサイクルを複数回、好ましくは５回以上繰り返すことが好ましい。すべての熱サイクル数としては、２０回から６０回が好ましく、より好ましくは３０回から５０回，さらに好ましくは３５回から４５回である。
【００１６】
本発明の核酸増幅法においては、最初のサイクルの熱変性における温度（以下、「熱変性温度」という。）は二本鎖ＤＮＡを解離させるのに十分な温度であれば特に限定されず、好ましい熱変性温度の下限は８０℃、より好ましくは８５℃、さらに好ましくは９０℃である。また、好ましい上限温度については１００℃であり、より好ましくは９８℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜２０秒間、さらに好ましくは１〜５秒間である。最終サイクルの熱変性温度は特に限定されないが、好ましくは（Ｔｍ―２℃）であり、ここでいうＴｍとは、ＰＣＲの増幅産物であるプライマー伸長生成物の乖離温度である。
【００１７】
アニーリングは解離したＤＮＡにプライマーをアニーリングするステップで、その際の温度（以下、「アニーリング温度」という。）は特に限定されないが、好ましいアニーリング温度の下限は４５℃であり、さらに好ましくは５０℃である。一方、好ましい上限は７５℃であり、さらに好ましくは７０℃、特に好ましくは６５℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜２０秒間、さらに好ましくは１〜１０秒間、特に好ましくは１〜５秒間である。また、アニーリング温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。
【００１８】
伸長はＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成するステップで、その際の温度（以下、「伸長温度」という。）は特に限定されないが、好ましい伸長温度の下限は５０℃であり、より好ましくは６０℃、さらに好ましくは６５℃である。好ましい上限温度については８０℃であり、より好ましくは７５℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１〜２０秒間、さらに好ましくは１〜１０秒間、特に好ましくは１〜５秒間である。また、伸長温度はすべてのサイクルで同一温度であっても良いし、異なっていても良い。アニーリング温度は伸長反応温度と同一温度であってもよいが、伸長反応温度よりも高く設定することはしない。
【００１９】
本発明におけるＰＣＲの熱サイクルについて、さらに詳述する。
本発明における熱サイクルは、初期のサイクル反応では熱変性温度を比較的高く設定して行い、サイクルが進行するにしたがって、熱変性温度を段階的に下げていくことを特徴とする方法である。
【００２０】
熱変性温度を下げるパターンの一つは、数サイクルごとにブロックを分けて順次下げていく方法である。例えば、１から５サイクル目の熱変性温度をＴ０℃、５から１０サイクル目の熱変性温度Ｔ０−２℃、１０から１５サイクル目の熱変性温度Ｔ０−４℃、とする方法である。この場合の温度の下がり幅は１℃以上である必要があり、２℃以上が好ましい。ブロックごとのサイクル数は任意である。最も低い熱変性温度と最も高い熱変性温度との差が少なくとも５℃以上あることが好ましく、７℃以上であることがより好ましい。全熱サイクル数としては２０回から６０回が好ましく、より好ましくは３０回から５０回，さらに好ましくは３５回から４５回である。
【００２１】
また他のパターンとしては、全熱サイクルを２つのブロックに分ける方法である。例えば、１から５サイクル目の第１ブロックの熱変性をＴ１℃で行い、６サイクル目以降の第２のブロックの熱変性をＴ１−５℃で行う方法である。このときブロックごとのサイクル数は任意である。この場合のブロック間の温度の下がり幅は５℃以上が好ましく、７℃以上であることがより好ましい。全サイクル数としては２０回から６０回が好ましく、より好ましくは３０回から５０回，さらに好ましくは３５回から４５回である。
【００２２】
最も高い熱変性温度を有する熱サイクルだけで全サイクルを行ったときと比較し、本発明である熱変性温度を段階的に下げる熱サイクル条件にてＰＣＲ反応を実施した時に、ＰＣＲに要する時間が５分以上短くなることが好ましい。より好ましくは１０分以上、さらに好ましくは１５分以上短くなることである。
【００２３】
より具体的には、以下の工程（ａ）及び（ｂ）を含み、かつ、工程（ａ）及び（ｂ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回、より好ましくは３５回から４５回である核酸増幅方法が例示される。
（ａ）９０℃から１００℃、より好ましくは９４℃から９８℃の間の変性温度を含む熱サイクルを少なくとも５回以上繰り返す工程
（ｂ）工程（ａ）続く熱サイクルであって、工程（ａ）の熱変性温度より２℃から１０℃、
より好ましくは３℃から７℃低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
【００２４】
上記工程（ｂ）の後に、以下の工程（ｃ）を、さらに含み、かつ、工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を併せた熱サイクル数が３０回から５０回、より好ましくは３５回から４５回である核酸増幅方法であってもよい。
（ｃ）工程（ｂ）に続く熱サイクルであって、工程（ｂ）の熱変性温度より１℃以上、好ましくは２℃以上、より好ましくは３℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返す工程
また、工程（ｃ）の後に、工程（ｃ）の熱変性温度より１℃以上低い熱変性温度を含む熱サイクルを５回以上繰り返してもよい。
【００２５】
さらには、最も高い熱変性温度と最も低い熱変性温度との差が５℃から１０℃、より好ましくは７℃から１０℃となる熱サイクルを有することが好ましい。
【００２６】
本発明の核酸増幅法が適用される試料は、標的ＤＮＡが含まれる可能性のある材料であればその由来は特に限定されないが、例えば、患者サンプル（例えば、尿、糞便、全血、血漿、唾液、口腔内擦過物、鼻腔液、鼻腔ぬぐい液、膣ぬぐい液、尿道擦過物など）、食品サンプルや環境サンプル（例えば、吐しゃ物、ふき取りサンプル、河川水、海水、土壌、空気からの補集物など）などが挙げられるが、これらに限定されない。より好ましくは、便検体を使用することである。例えば、検便検体を使用することができる。便検体の採取方法等は特に限定されないが、例えば、便の一部を掻き取ることによって得ることができる。検便検体は、検便のために採取されたものを用いることができる。
【００２７】
本発明に適用される便検体は特に限定されない。例えば、哺乳類の便から採取された便検体が挙げられる。また、本発明が適用される便検体は、保存などの目的で、ＤＮＡの破壊が抑えられていることを前提に、希釈・濾過・その他物理化学的処理が施されたものであってもよい。
【００２８】
前記試料は、採取したものを核酸抽出の工程を経ることなくそのまま用いても良いし、核酸抽出および物理化学的な前処理のうち少なくともいずれかを施したものであっても良い。簡便性・迅速性の観点から、ＤＮＡの分離精製を行っていない便検体を使用することが特に好ましい。例えば、便検体をそのまま懸濁させた溶液を熱処理後、遠心分離後、上清をテンプレートとする方法が挙げられる。ＰＣＲに用いる便検体の添加割合は、適切にＰＣＲを行われる範囲であればよく、特に限定されない。例えば１〜２０容量％の範囲で適宜調整することができる。
【００２９】
本発明の核酸増幅法においては、前記試料に含まれるＤＮＡの少なくとも一部の配列部分をＰＣＲによって増幅する。本発明の核酸増幅法におけるＰＣＲは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで触媒されることが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなど種々のものが挙げられるが、特にこれらに限定されない。
【００３０】
前記ＰＣＲにおけるプライマーは、標的ＤＮＡに特異的なプライマーが使用される。複数のＤＮＡ領域を同時かつ迅速に検出するためにマルチプレックスＰＣＲを行うことが好ましい。例えば、２以上の標的核酸に対応するＤＮＡを、対応する２以上のプライマーペアを含む反応液中で増幅させる。また、フォワード又はリバースのいずれかのプライマーを共通とすることもできる。
【００３１】
本発明の核酸増幅法における反応液には、ＰＣＲを行うために必須な組成が含まれていれば、その組成は特に限定されない。すなわち、反応液には、ＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成を含んでいれば良い。すなわち、反応液に含まれるものの一例としては、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、２価イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなど）、１価イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオンなど）及び緩衝液（例えば、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファーなど）を含む反応液が挙げられる。
【００３２】
本発明の核酸増幅法における反応液には、これらに加え、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトンなど）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸など）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、TritonX-100など）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トリプトファンなど）、糖（例えば、グルコース、キシロース、ガラクトースなど）、ＤＮＡ結合タンパク質などが添加剤として含まれることもある。
【００３３】
本発明の核酸増幅法における反応液には、上記のほかに、キャリーオーバー汚染を防止するための組成として、ウラシルグリコシダーゼ、ｄＵＴＰが含まれていてもよい。ウラシルグリコシダーゼはＤＮＡ配列中に存在するウラシルを特異的に切り出し、ＤＮＡの分解を起こす酵素である。反応液にｄＵＴＰが含まれる組成でＰＣＲを行い得られるＤＮＡ断片はウラシルを含んでおり、ウラシルグリコシダーゼで分解される。一方、天然のＤＮＡはウラシルを含まないため、分解されない。これを利用したキャリーオーバー汚染を防止する方法が知られている。
【００３４】
本発明において用いられる反応液には、ＰＣＲの反応内部標準となる鋳型とプライマーを含んでいても良い。材料から核酸を分離精製せずに反応液に添加した場合、脂質、多糖類、タンパク質などＰＣＲを阻害する物質も同時に添加される場合がある。これらによりＰＣＲが阻害された場合、真に標的となる核酸が含まれなかった場合との区別ができない。これを回避するため、反応が正常に進行すれば標的核酸がなくても増幅産物が得られる内部標準核酸とそのプライマーを反応液に添加する方法が知られている。本発明においてもこの方法を適用しうる。
【００３５】
本発明において、２以上の標的核酸には内部標準核酸も含まれうる。例えば、内部標準核酸は、標的ＤＮＡが含まれる可能性のある材料に予め添加され、そのようにして得られた試料が本発明の核酸増幅法に供される。または、内部標準は反応液に予め含ませておいても良い。このように、本発明におけるマルチプレックスＰＣＲには、標的となる核酸が１種類、内部標準核酸が１種類、合計２種類の核酸を標的とする場合も包含される。
【００３６】
本発明の核酸増幅法における反応液には、上記のほかにキャリーオーバー汚染を防止するための組成として、ウラシルグリコシダーゼ、ｄＵＴＰが含まれていてもよい。ウラシルグリコシダーゼはＤＮＡ配列中に存在するウラシルを特異的に切り出し、ＤＮＡの分解を起こす酵素である。反応液にｄＵＴＰが含まれる組成でＰＣＲを行い得られるＤＮＡ断片はウラシルを含んでおり、ウラシルグリコシダーゼで分解される。一方、天然のＤＮＡはウラシルを含まないため、分解されない。これを利用したキャリーオーバー汚染を防止する方法が知られている。
【実施例】
【００３７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載は、本発明を特に限定するものではない。
【００３８】
実施例１．通常サイクルにおけるゲノムＤＮＡと糞便検体からの腸内細菌遺伝子の検出
サルモネラ菌遺伝子、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のゲノムＤＮＡをそれぞれ用いた。また陰性検体である糞便検体を１０％程度となるように水で懸濁し、５０個をプールした。プールした検体を９５℃、５分間熱処理、遠心分離後の上清液を糞便サンプルとして以下の検討に用いた。
【００３９】
本実施例ではＰＣＲ反応液を２０μＬ系にて調製した。この２０μＬの反応液にサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌のゲノムＤＮＡ１０コピーを鋳型として２μＬ添加し増幅を実施した。また、上記糞便サンプルにゲノムＤＮＡを１０コピー添加したものを鋳型として２μＬ添加し増幅を実施した。
【００４０】
マルチプレックスＰＣＲ用の試薬組成として、腸内細菌遺伝子検出キット-高速蛍光検出-（東洋紡製）を使用した。内部標準は７２℃、サルモネラ菌陽性は７７℃、腸管出血性大腸菌陽性は８０℃、赤痢菌陽性は８４℃にピークを与える。
調製したサンプルをＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＩＩ（タカラバイオ製）にて通常サイクル（９４℃  ２０秒、９４℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ４０サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐ）で解析を実施した。
【００４１】
ゲノムＤＮＡのみの増幅結果を図１に、糞便サンプルにゲノムＤＮＡを添加した増幅結果を図２にそれぞれ示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の検出が可能であり、ゲノムＤＮＡをそれぞれ分離検出することができた。融解曲線解析まで含めた解析時間は１時間３０分であった。
【００４２】
実施例２．本発明サイクルによるゲノムＤＮＡと糞便検体からの腸内細菌遺伝子の検出
実施例１と同じ検体、ＰＣＲ反応組成を用い、本発明の特徴である熱変性を段階的に下げるサイクルにて検出を行った。反応サイクルは本発明の熱変性温度を段階的に下げるサイクル（９４℃  ２０秒、９４℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ５サイクル、８７℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ３５サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐ）にて解析を実施した。
【００４３】
ゲノムＤＮＡのみの増幅結果を図３に、糞便サンプルにゲノムＤＮＡを添加した増幅結果を図４にそれぞれ示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の検出が可能であり、ゲノムＤＮＡをそれぞれ分離検出することができた。融解曲線解析まで含めた解析時間は１時間１０分であり、高い検出感度と特異性を維持したまま、実施例１と比較して、反応時間を大きく短縮することができた。例えば、実施例１の条件により６回の解析を行おうとすると９時間を要することになるが、実施例２の条件であると７時間で６回の解析が可能となり、解析効率が大幅に改善されるものである。
【００４４】
実施例３．低温熱変性サイクルによるゲノムＤＮＡと糞便検体からの腸内細菌遺伝子の検出
実施例１と同じＰＣＲ組成を用い、低温熱変性サイクルにて検出を行った。検体は、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌のゲノムＤＮＡと、検体の代わりに水を用いたものを対象として行った。反応サイクルは８７℃  ２０秒、９４℃  ２秒−５５℃  ５秒−６８℃  ５秒  ４０サイクル、融解曲線解析  ０．５℃／Ｓｔｅｐにて解析を実施した。
【００４５】
ゲノムＤＮＡのみの増幅結果を図５に、ゲノムＤＮＡの代わりに水を用いた増幅結果を図６にそれぞれ示す。サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の検出が可能であり、ゲノムＤＮＡをそれぞれ分離検出することができたが、水をテンプレートとした系にてプライマーダイマ―と思われるピークが多数検出された。融解曲線解析まで含めた解析時間は１時間５分であった。しかしながら、熱変性温度を低温にて実施するだけでは高い特異性を維持することはできず、熱変性温度を段階的に下げていく本発明のような熱サイクルが高い検出感度と特異性を維持したまま、反応時間を短縮するために必要であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、特に多数のサンプルを迅速に検査することが求められている分野において非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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