(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたエキソソームであって、
（ｉ）単離されたエキソソームが、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５のマーカーを含み；および
（ｉｉ）単離されたエキソソームが、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まず、
エキソソームが、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から単離される、
前記単離されたエキソソーム。
【請求項２】
単離されたエキソソームが、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２のマーカーを含まない、請求項１に記載の単離されたエキソソーム。
【請求項３】
エキソソームが、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、任意に、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない、請求項１または２に記載の単離されたエキソソーム。
【請求項４】
エキソソームが、約１０〜１５０ｎｍの直径を有し、任意に、エキソソームが、約３０〜１００ｎｍの直径を有する、請求項１または２に記載の単離されたエキソソーム。
【請求項５】
ＭＳＣが、ヒトＭＳＣであり、任意に、ＭＳＣが、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離されたエキソソーム。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたエキソソームを含む、炎症性肺疾患の処置のための医薬組成物。
【請求項７】
炎症性肺疾患が、低酸素誘導性肺炎症、肺高血圧、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギーもしくは特発性肺線維症である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
炎症性肺疾患が、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
馴化培地を生産するために間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を培養すること；および
馴化培地からエキソソームを単離すること；
を含む、エキソソームを生産するための方法であって、
（ｉ）単離されたエキソソームが、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５のマーカーを含み；および
（ｉｉ）単離されたエキソソームが、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まず、
培養が、三次元（３Ｄ）培養であり、任意に、３Ｄ培養が、懸滴培養、マトリックス上での培養、マイクロキャリア上での培養、合成細胞外スキャフォールド上での培養、キトサン膜上での培養、磁気浮揚下での培養、回転式バイオリアクター中の懸濁培養または非接触阻害条件下の培養を含み、
培養が、ＴＧＦβ１の使用を含む、前記方法。
【請求項１０】
ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームと比較して、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５のマーカーを含むエキソソームの生産を増大させ、任意に、増大が、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームと比較して、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５のマーカーを含むエキソソームの生産の１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍もしくは５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍または１０．０倍以上の増加を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エキソソームがマーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
エキソソームが、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、任意に、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１３】
エキソソームが、約１０〜１５０ｎｍの直径を有し、任意に、エキソソームが、約３０〜１００ｎｍの直径を有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＳＣが、ヒトＭＳＣであり、任意に、ＭＳＣが、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される、請求項９または１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１４年５月１８日に出願された米国仮特許出願、表題「METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO EXOSOMES」、第６１／９９４，９７４号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）の下で利益を主張し、該出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エキソソームは、血液、尿および細胞培養からの馴化培地を含む、多くの（ことによると全ての）生体液中に存在する、細胞由来の小胞である。エキソソームの報告されている直径は、典型的に、３０〜１００ｎｍであり、比較すると、これはＬＤＬよりも大きいが、赤血球よりも著しく小さい。エキソソームは、多小胞体が細胞膜と融合するとき、またはそれらが細胞膜から直接放出されるときに、細胞から放出されることが知られている。エキソソームは、特殊な機能を有し、例えば、凝集、細胞間シグナル伝達および廃棄物管理において重要な役割を担うことが次第に明らかになってきている。その結果として、細胞由来のエキソソームの側面を再現する合成エキソソームを含むエキソソームの臨床適用への関心が高まっている。エキソソームは、予後、療法ならびに健康および疾患のためのバイオマーカーに潜在的に用いられ得る。
【発明の概要】
【０００３】
発明の要旨
本開示は、エキソソームを含む組成物、ならびに様々な疾患または障害の処置および／または予防におけるそれの使用の方法を提供する。
【０００４】
したがって、本開示の１つの側面は、単離されたエキソソームを提供する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、および／または単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない。単離されたエキソソームは、約１０〜１５０ｎｍの直径を有してもよい。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞またはマクロファージから単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージは、ヒトＭＳＣ、ヒト線維芽細胞またはヒトマクロファージである。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、組成物中に含まれる。いくつかの態様において、組成物は、医薬組成物である。
【０００５】
本開示の別の側面によれば、単離されたエキソソームが提供される。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有し、および／またはネガティブ染色透過型電子顕微鏡において球状形態を有さない、いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約１０〜２５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜２００ｎｍの直径を有する。
【０００６】
別の側面によれば、肺障害、心血管障害、腎障害または虚血性神経障害を処置するための方法が提供される。いくつかの態様において、当該方法は、治療的有効量の単離されたエキソソームを、肺障害、心血管障害、腎障害または虚血性神経障害を有するか、またはそれを有するリスクがある対象に投与することを含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、および／または単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約１０〜１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞またはマクロファージから単離される。
【０００８】
いくつかの態様において、ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージは、ヒトＭＳＣ、ヒト線維芽細胞またはヒトマクロファージである。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される。いくつかの態様において、処置される肺障害は、炎症性肺疾患、肺血管疾患または急性肺損傷である。いくつかの態様において、炎症性肺疾患は、低酸素誘導性肺炎症、肺高血圧、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギーまたは特発性肺線維症である。いくつかの態様において、急性肺損傷は、敗血症と関連するか、または人工呼吸器誘導性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。いくつかの態様において、当該方法にしたがって処置される心血管障害は、心筋梗塞、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症または心不全である。腎障害の処置を含むいくつかの態様において、腎障害は、虚血性腎損傷、急性腎不全または腎線維症である。虚血性神経障害の処置を含む当該方法の態様において、当該障害は、低酸素性虚血性脳症または虚血性脳卒中である。
【０００９】
本開示のさらに別の側面によれば、肺障害、心血管障害、腎障害または虚血性神経障害を処置するための単離されたエキソソームの使用が提供される。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、および／または単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約１０〜１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの直径を有する。
【００１１】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞またはマクロファージから単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージは、ヒトＭＳＣ、ヒト線維芽細胞またはヒトマクロファージである。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される。いくつかの態様において、肺障害は、炎症性肺疾患、肺血管疾患または急性肺損傷である。いくつかの態様において、炎症性肺疾患は、低酸素誘導性肺炎症、肺高血圧、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギーまたは特発性肺線維症である。いくつかの態様において、急性肺損傷は、敗血症と関連するか、または人工呼吸器誘導性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。いくつかの態様において、心血管障害は、心筋梗塞、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症または心不全である。いくつかの態様において、腎障害は、虚血性腎損傷、急性腎不全または腎線維症である。いくつかの態様において、虚血性神経障害は、低酸素性虚血性脳症または虚血性脳卒中である。
【００１２】
別の側面によれば、肺障害、心血管障害、腎障害または虚血性神経障害を処置するための医薬の製造における単離されたエキソソームの使用が提供される。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含む。
【００１３】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し；および／または単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約１０〜１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの直径を有する。
【００１４】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞またはマクロファージから単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージは、ヒトＭＳＣ、ヒト線維芽細胞またはヒトマクロファージである。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される。肺障害の処置のための医薬の製造のためのエキソソームの使用を含むいくつかの態様において、当該障害は、炎症性肺疾患、肺血管疾患または急性肺損傷である。いくつかの態様において、炎症性肺疾患は、低酸素誘導性肺炎症、肺高血圧、喘息、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、アレルギーまたは特発性肺線維症である。いくつかの態様において、急性肺損傷は、敗血症と関連するか、または人工呼吸器誘導性急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）である。いくつかの態様において、心血管障害の処置のための医薬の製造のためのエキソソームの使用が提供され、前記障害は、心筋梗塞、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症または心不全である。腎障害の処置のための医薬の製造のためのエキソソームの使用を含むいくつかの態様において、腎障害は、虚血性腎損傷、急性腎不全または腎線維症である。虚血性神経障害の処置のための医薬の製造のためのエキソソームの使用を含むいくつかの態様において、当該障害は、低酸素性虚血性脳症または虚血性脳卒中である。
【００１５】
本開示のさらに別の側面によれば、エキソソームを生産するための方法が提供される。いくつかの態様において、当該方法は、馴化培地を生産するために細胞を培養すること、および馴化培地からエキソソームを単離することを含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含み、および／または単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームが、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される、２、３、４、５、６、７または８個のマーカーを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５を含む。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される、２、３、４、５、６または７個のマーカーを含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、マーカーＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２を含まない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、球状形態を有し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色において放射線透過性を示し、および／または単離されたエキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡においてカップ状形態を有さない。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約１０〜１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、約３０〜１００ｎｍの直径を有する。
【００１７】
いくつかの態様において、単離されたエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞またはマクロファージから単離される。いくつかの態様において、ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージは、ヒトＭＳＣ、ヒト線維芽細胞またはヒトマクロファージである。いくつかの態様において、ＭＳＣは、ウォートンゼリー、臍帯血、胎盤、末梢血、骨髄または脂肪組織から単離される。いくつかの態様において、培養は、二次元（２Ｄ）または三次元（３Ｄ）培養を含む。いくつかの態様において、３Ｄ培養は、懸滴培養、マトリックス上での培養、マイクロキャリア上での培養、合成細胞外スキャフォールド上での培養、キトサン膜上での培養、磁気浮揚下での培養、回転式バイオリアクター中の懸濁培養または非接触阻害条件下の培養を含む。いくつかの態様において、培養は、ＴＧＦβスーパーファミリー（ＴＧＦβ１、アクチビン、ＢＭＰ、ＧＤＦ、ＧＤＮＦ、インヒビン、Ｎｏｄａｌ、Ｌｅｆｔｙ、ＭＩＳ）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦおよびＦＧＦから選択される１以上の増殖因子の使用を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、当該方法は、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームと比較して、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームの生産を増大させる。いくつかの態様において、増大は、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームと比較して、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５から選択される１個以上のマーカーを含むエキソソームの生産の１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍もしくは５．０倍、６．０倍、７．０倍、８．０倍、９．０倍または１０．０倍以上の増加を含む。
本開示のこれらのおよび他の側面および態様は、本明細書においてより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】間葉系幹細胞エキソソーム（ＭＥＸ）調製物のＩ．Ｖ．注射によるマウスの処置は、血管再構築および肺高血圧に関連するシグナル伝達の低酸素活性化を下方制御し、低酸素誘導性肺炎症を改善する。（Ａ）同齢のＦＶＢ／ｎマウスにヒトＭＥＸ（２００億粒子／マウス）を注射し、２．５日間低酸素に暴露した。ＡＫＴの低酸素誘導性リン酸化およびその下流標的であるｍＴＯＲは、ＭＥＸ処置により低減する。ＤＮＡ結合／分化タンパク質のインヒビターであるＩＤ１、直接的ＳＭＡＤ標的化遺伝子およびＢＭＰＲ２の下流シグナルの肺タンパク質レベルは、低酸素により抑制されるが、ＭＥＸで増加する。アルファチューブリンは、正規化対照として役割を果たす。（Ｂ）早期の炎症マーカーであるＣＣＬ２のｍＲＮＡレベルは、ＭＥＸ処置で抑制される。ＲＮＡレベルを、ＲＰＳ９に正規化する。
【００２０】
【図２】ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸについて富化したエキソソームサブ集団の単離。ＷＪ−ＭＳＣの単層培養により馴化された培地を濃縮し、４５％スクロースに調整した。この前処理物を６０％スクロースクッション上に積層し、３５％〜５％スクロースの段階勾配で重層した。調製物を１８０ｋｘｇで２０時間遠心分離した。勾配を１４ｘ１ｍｌ画分に回収した。各画分中の粒子数をNanosightにより測定した。各画分からの２０μＬをＡＬＩＸ、ＦＬＯＴ１、ＣＡＶ１およびＳＭＡＤ２／３の存在についてウェスタンにより分析した。小胞の２つの別個の集団を異なる沈降速度（ｆ−ＭＥＸおよびａ−ＭＥＸ）ならびに上記のマーカーに基づく異なるマーカー組成で同定した。
【００２１】
【図３】ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸを代表するＷＪ−ＭＳＣ調製物をウェスタンブロッティングにより分析した。ＡｌｉｘおよびＴｓｇ１０１などのエキソソーム生合成マーカーは、ａ−ＭＥＸに優先的に富化され、一方でテトラスパニンＣＤ９およびＣＤ８１ならびにフロチリン１およびカベオリン１などの脂質ラフトマーカーはｆ−ＭＥＸに富化される。ＴＧＦＢＲ２のみならずＣＤ１０５およびＳＭＡＤファミリーのメンバー（ここでは示されない）も、ａ−ＭＥＸに特異的である。ＥＧＦ受容体およびＡＫＴファミリーのメンバー（ここでは示されない）は、ｆ−ＭＥＸに特異的である。
【００２２】
【図４】ネガティブ染色電子顕微鏡は、ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸエキソソームサブ集団間での、サイズ、形状および放射線透過性における違いを示す。倍率：３０，０００Ｘ。
【図５】ＦＶＢ／ｎマウスを、図１におけるように低酸素に暴露し、ａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸのいずれかで富化したＷＪ−ＭＳＣエキソソーム調製物で処置した。低酸素で２．５日後、肺を収穫し、低酸素誘導性炎症マーカーのｍＲＮＡレベルをＲＴ−ＰＣＲにより決定し、正規化群（normalizer）としてＲＰＳ９を用いた。ａ−ＭＥＸでの処置（ｆ−ＭＥＸではない）は、ＣＣＬ２、ＩＬ６およびＡＤＭのｍＲＮＡレベルの減少をもたらす。
【００２３】
【図６】スフェロイド形成のプロセスの概略図。単層培養へのＴＧＦβｂ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加は、スフェロイド形成を加速させる。挿入は、トルイジンブルーで染色されたＷＪ−ＭＳＣのスフェロイドの部分を表す。
【００２４】
【図７】ＷＪ−ＭＳＣスフェロイドは、主にａ−ＭＥＸを分泌する。標準的な単層におけるＷＪ−ＭＳＣをトリプシン処理し、単一の細胞懸濁液を、各１５００万細胞を含有する二つの均等な部分に分けた。一方の部分を、単層（２Ｄ培養）として標準的な培地および容器（vessel）に増殖させた。他方の部分を懸滴方法（それぞれ５００，０００細胞を含有する３０スフェロイド）によるスフェロイド形成（３Ｄ培養）に導入した。２つの培養により馴化された等量の清澄化された培地を、ウェスタンブロッティングにより示されるマーカーの存在についてアッセイした。ａ−ＭＥＸ（ＳＭＡＤ２／３、ＡＬＩＸ）に特異的なマーカーは、スフェロイドにより馴化された培地に富化され、ｆ−ＭＥＸに特異的なＦＬＯＴ１は、単層により馴化された培地に主に観察される。
【００２５】
【図８】独立したドナーからのＭＳＣにより分泌されたｆ−ＭＥＸとａ−ＭＥＸの比は、スフェロイド形成効率と逆相関する。２つの異なるドナー（クローンＤおよびクローンＣ）から単離されたＷＪ−ＭＳＣを、非接着条件（懸滴技術）下で２４時間培養した。（Ａ）各クローンの単層培養により馴化された等量の培地を、ウェスタンブロットによりａ−ＭＥＸマーカーＳＭＡＤ２／３およびｆ−ＭＥＸマーカーＦＬＯＴ１についてアッセイした。ＳＭＡＤ対ＦＬＯＴ１比は、クローンＤが主にｆ−ＭＥＸを生産する一方で、クローンＣのエキソソーム生産は、著しい量のａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸの双方を含むことを示した。（Ｂ）クローンＤの単一の細胞懸濁は、同一に処置されたクローンＣ  ＷＪ−ＭＳＣ懸濁が、光学顕微鏡により試験される場合に、２４時間後にコンパクトなスフェロイドを形成することができる条件下で、スフェロイド形成能を示さなかった。生存率は、トリパンブルーによって評価された場合、２４時間後９５％超であった。馴化培地を懸濁から回収し、（方法に記載されるように）エキソソームを単離した。クローンＡエキソソームがフロチリン１で富化した一方で、クローンＢはＡｌｉｘで富化し、ＣＭ中のエキソソームサブ集団の異なった富化を反映する。
【００２６】
【図９】ＷＪ−ＭＳＣの単層培養へのＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）の添加は、スフェロイド形成のプロセスを加速し、ａ−ＭＥＸマーカー（例えばＳＭＡＤ２／３）とｆ−ＭＥＸマーカー（例えばＦＬＯＴ１）の比の増加をもたらし、分泌された集団におけるａ−ＭＥＸの増加した割合を示す。
【図１０】ａ−ＭＥＸはＴＧＦシグナル伝達の機能性モジュールを含む。（Ａ）ＰＢＳ“Ｃ”、ＴＧＦβ、ＦＧＦまたはＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）をａ−ＭＥＸ調製物の等しいアリコートに添加し、続いて３７℃で３０分インキュベートした。調製物をその後溶解し、ウェスタンブロッティングによる分析に供した。エキソソーム関連ＳＭＡＤ２／３の増加したリン酸化は、機能性ＴＧＦＢ２Ｒ受容体複合体を示唆する。当該効果は、これらの主要なシグナル伝達においてＳＭＡＤ経路を採用しない増殖因子である、ＦＧＦまたはＰＤＧＦでの処置により観察されない。（Ｂ）ａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸ調製物を、ＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置し、インキュベートし、上記のように分析した。ＳＭＡＤリン酸化は、ａ−ＭＥＸにおいて特に観察された。
【００２７】
【図１１】ａ−ＭＥＸ（ｆ−ＭＥＸではない）は、ＴＧＦβ誘導性線維芽細胞の筋線維芽細胞転換およびＬＰＳ仲介線維芽細胞活性化を阻害する。（Ａ）ヒト肺線維芽細胞を、血清飢餓（０．１％ＦＢＳ）の３日後、ＴＧＦβで刺激し、増加したアルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）発現を特徴とする筋線維芽細胞分化を経た。ｈＭＥＸ（２ｕｇ／ｍｌ）での前処置は、ＴＧＦβのアルファ−ＳＭＡタンパク質レベルへの効果を無効にする。（Ｂ）ヒト肺線維芽細胞を、血清飢餓の２４時間後、ＴＧＦβで刺激し、筋線維芽細胞マーカーであるＰＡＩ１を誘導した。ａ−ＭＥＸでの処置はＰＡＩ１上方制御を防ぎ、ｆ−ＭＥＸ処置による効果は観察されなかった。（Ｃ）ａ−ＭＥＸ処置は、in vitroにおけるヒト肺線維芽細胞において、ベースラインＭＣＰ−１およびＩＬ１βｍＲＮＡレベルを下方制御する。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
本開示は、２種のエキソソームが間葉系幹細胞などの細胞に由来し、かつ当該エキソソームは、分子マーカー、サイズ、形態および機能に基づいて識別され得るという驚くべき発見に部分的に基づく。例えば、２つのサブ集団のうちの一方は、別個のマーカーを含み、かつ特定の障害の処置において治療的有効性を有するのに対し、他のサブ集団は、異なる別個の群のマーカーを含み、かつ特定の障害の処置において治療的有効性を欠く。
本開示は、肺障害、心血管障害、腎障害および虚血性神経障害を限定することなく含む特定の疾患または障害の処置および／または予防における、単離されたエキソソームの組成物およびそれの使用の方法に広く関する。
【００２９】
エキソソームおよびエキソソーム調製物
本開示のエキソソームは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、線維芽細胞およびマクロファージなどの細胞から放出される膜（例えば、脂質二重層）小胞である。電子顕微鏡により、エキソソームは、カップ状形態を有するとして典型的に記載されている。しかしながら、本開示の側面は、所与の調製物内のいくつかのエキソソーム（例えば、本明細書に記載される治療的有効性を有するもの）は、カップ状形態とは対照的に球状形態を示し、かつネガティブ染色透過型電子顕微鏡により決定されるように放射線透過性（例えば、半透明）も示す、という新規の発見に関する。エキソソームは約１００，０００ｘｇで沈降し、約１．１０〜約１．２１ｇ／ｍｌのスクロースにおける浮遊密度を有する。エキソソームは、微小小胞またはナノ小胞と言及されてもよい。
【００３０】
本開示のいくつかの側面は、単離されたエキソソームに言及する。本明細書で用いられるように、単離されたエキソソームは、その天然の環境から物理的に分離されるものである。単離されたエキソソームは、ＭＳＣ、線維芽細胞およびマクロファージを含む、それがそれとともに天然に存在する組織または細胞から、全体においてまたは部分的に物理的に分離されてもよい。本開示のいくつかの態様において、単離されたエキソソームの組成物は、ＭＳＣ、線維芽細胞およびマクロファージなどの細胞を含まなくてもよいか、またはそれが馴化培地を含まないか、もしくは実質的に含まなくてもよい。典型的に、単離されたエキソソームは、未操作の馴化培地中に存在するエキソソームよりも高い濃度において提供される。
【００３１】
エキソソームは、ＭＳＣ、線維芽細胞およびマクロファージを限定することなく含む細胞の培養からの馴化培地から単離してもよい。ＭＳＣからのエキソソームの収穫のための方法は、例に提供される。手短に述べると、かかる方法は、まず、それらが約７０％コンフルエンシーに達するまで標準的な条件下でＭＳＣを培養すること、その後２４時間無血清培地中で細胞を培養すること、それに続いて馴化培地を回収し、細胞および細胞デブリを除去するために４００ｘｇで１０分間および１２０００ｘｇで１０分間、分画遠心に供することを含む。清澄化された馴化培地を、その後100kDa MWCO filter（Millipore）を用いて限外濾過により濃縮し、その後再度１２０００ｘｇで１０分間遠心分離する。エキソソームは、その後サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、ＰＢＳ平衡化Chroma S-200 column（Clontech）上に濃縮された馴化培地をロードし、ＰＢＳで溶出させ、そして３５０〜５５０μＬの画分を回収することにより単離する。エキソソームを含有する画分を同定し、潜在的にプールする。タンパク質濃度を標準的なブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad）を用いて測定する。富化されたエキソソーム調製物のアリコートは、−８０℃で保存することができる。
【００３２】
エキソソームはまた、１００，０００ｘｇにおける清澄化された馴化培地の超遠心分離により精製することができる。それらはまた、スクロースクッション中への超遠心分離により精製することができる。樹状細胞からのエキソソーム精製のためのＧＭＰ法は、J Immunol Methods. 2002;270:211-226に記載されている。
【００３３】
エキソソームはまた、規定の孔サイズのナイロン膜フィルターを通しての分別濾過により精製することができる。大きな孔サイズを通す第１の濾過は、細胞のフラグメントおよびデブリを保持する。より小さい孔サイズを通すその後の濾過は、エキソソームを保持し、それらをより小さなサイズの混入物から精製する。
【００３４】
いくつかの態様において、エキソソームは、本明細書に記載される特定のマーカーについて富化された２つのサブ集団に分画される。２つのサブ集団を分画するための方法は、例に記載され、例えば、スクロース（５％〜６０％）、イオジキサノール（Optiprep（商標）、０〜６０パーセント）または同様の単離溶媒の段階勾配における速度超遠心を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、本開示は、分子マーカー、サイズ、形態および機能に基づいて識別される、２つの別個の種類のエキソソームを提供する。２つの別個の種類は、本開示を通して「ａ型」および「ｆ型」と言及され、ＭＳＣに由来する場合、互換的に、「ａ−ＭＥＸ」（ａ型ＭＳＣ由来エキソソームについて）または「ｆ−ＭＥＸ」（ｆ型ＭＳＣ由来エキソソームについて）と言及される。驚くべきことに、ａ型エキソソームは、特定の障害、例えば肺障害の処置において治療的有効性を示すのに対し、ｆ型エキソソームは、同一の処置パラダイムにおいて、何らの治療的有効性を示さない。任意の特定のメカニズムにより拘束されないが、それぞれの種類のエキソソームの分子署名は、標的細胞または組織に関するその効果または機能を特定すると考えられる。
【００３６】
例えば、いくつかの態様において、ａ型の単離されたエキソソームは、ＡＬＩＸ（別名「プログラム細胞死６相互作用タンパク質」またはＰＤＣＤ６ＩＰ；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２２６１４；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001155901.1）、ＴＳＧ１０１（腫瘍感受性遺伝子１０１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：４５８４；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_006283.1）、ＴＧＦＢＲ２（形質転換増殖因子、ベータ受容体ＩＩ；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２４３５；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001020018.1）、ＳＭＡＤ１（ＳＭＡＤファミリーメンバー１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２１１９６；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001003688.1）、ＳＭＡＤ２（ＳＭＡＤファミリーメンバー２；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２１１９７；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001003652.1）、ＳＭＡＤ３（ＳＭＡＤファミリーメンバー３；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：５５９３７；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001138574.1）、ＳＭＡＤ５（ＳＭＡＤファミリーメンバー５；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：４３１３；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001001419.1）およびＣＤ１０５（別名エンドグリンまたはＥＮＧ；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：９２；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_000109.1；NP_001108225.1；NP_001265067.1）からなる群から選択される１以上のマーカー（例えば、タンパク質）を含む。
【００３７】
いくつかの態様において、ａ型は、２、３、４、５、６、７または８個のこれらのマーカーを含む。いくつかの態様において、エキソソームは、特定のマーカーを「含む」場合、これはエキソソームが、マーカーの（例えば、ウェスタンブロッティングにより決定されるような）検出可能なレベル、および／または本明細書に記載される処置の方法の文脈において、標的細胞もしくは組織における特定の応答を引き出すか、または対象における特定の応答を引き出すのに十分なレベルを含有することを意味する。ａ型エキソソーム中に発見される場合があるこれらのマーカー（例えば、タンパク質）のいくつかは、それらの機能および治療的効果に寄与すると考えられる増殖因子のＴＧＦ／ＢＭＰスーパーファミリーの一部を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、ａ型の単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１（フロチリン１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：３１３３７；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_005794.1）、ＣＤ９（ＣＤ９分子；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０４２０；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001760.1）、ＣＤ８１（ＣＤ８１分子；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：２０９１５；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_004347.1）、ＣＡＶ１（カベオリン１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：１３３０；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001166366.1）、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：７４５４５；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_005219.2；NP_958439.1；NP_958440.1；NP_958441.1）、ＡＫＴ１（ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：３７８５；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001014431.1）およびＡＫＴ２（ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ２；ＨｏｍｏｌｏＧｅｎｅ：４８７７３；例えば、ＮＣＢＩ参照配列：NP_001229956.1）からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。
【００３９】
いくつかの態様において、ａ型は、２、３、４、５、６または７個のこれらのマーカーを含まない。いくつかの態様において、エキソソームが、特定のマーカーを「含まない」場合、これはエキソソームが、特定のマーカーを含有しないか、または有意でない量のみを含有することを意味する。例えば、有意でない量は、検出可能でない量であるか、または微量でのみ検出可能である量でもよい。
【００４０】
いくつかの態様において、ａ型エキソソームは、形態に基づいて、ｆ型エキソソームと識別可能であってもよい。エキソソームは、典型的に、カップ状形態を有するとして記載されている。驚くべきことに、本開示は、カップ状形態とは対照的に球状形態を有するエキソソーム（ａ型）を提供する。エキソソーム形態を評価するための方法は、当該分野で公知であり、透過型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色を含む。さらに、ａ型エキソソームは、透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色を用いて、放射線透過性（例えば、半透明）であることが発見された。反対に、ｆ型エキソソームは、カップ状形態を示し、かつ透過型電子顕微鏡におけるネガティブ染色により決定される放射線透過性を有さない。
【００４１】
いくつかの態様において、ａ型エキソソームは、サイズに基づいてｆ型エキソソームと識別可能である。例えば、いくつかの態様において、ａ型エキソソームは、約１０〜１５０ｎｍ、約２０〜１２０ｎｍまたは約３０〜１００ｎｍの直径を有する。
【００４２】
他の側面において、本開示は、ｆ型の単離されたエキソソームを提供する。いくつかの態様において、ｆ型の単離されたエキソソームは、ＦＬＯＴ１、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２からなる群から選択される１個以上のマーカー（例えば、タンパク質）を含む。いくつかの態様において、ｆ型の単離されたエキソソームは、２、３、４、５、６または７個のこれらのマーカーを含む。いくつかの態様において、エキソソームが特定のマーカーを「含む」場合、これはエキソソームが、マーカーの（例えば、ウェスタンブロッティングにより決定されるような）検出可能なレベル、および／または本明細書に記載される処置の方法の文脈において、標的細胞もしくは組織における特定の応答を引き出すか、または対象における特定の応答を引き出すのに十分なレベルを含有することを意味する。ｆ型エキソソーム中に発見され場合があるこれらのマーカー（例えば、タンパク質）のいくつかは、増殖因子のＦＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーの一部を含む。ＦＧＦ／ＰＤＧＦシグナル伝達経路は、血管新生に関与する。したがって、ｆ型エキソソーム（例えば、それの組成物）は、血管新生を増強するために有用であると考えられる。
【００４３】
いくつかの態様において、単離されたｆ型エキソソームは、ＡＬＩＸ、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦＢＲ２、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５およびＣＤ１０５からなる群から選択される１個以上のマーカーを含まない。いくつかの態様において、ｆ型エキソソームは、２、３、４、５、６、７または８個のこれらのマーカーを含まない。いくつかの態様において、エキソソームが特定のマーカーを「含まない」場合、これはエキソソームが、特定のマーカーを含有しないか、または有意でない量のみを含有することを意味する。例えば、有意でない量は、検出可能でない量であるか、または微量でのみ検出可能である量でもよい。
【００４４】
上記および例において記載されるように、ｆ型エキソソームは、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡により決定される場合、カップ状形態を示す。いくつかの態様において、ｆ型エキソソームは、約１０〜２５０ｎｍ、約２０〜２３０ｎｍまたは約３０〜２００ｎｍの直径を有する。いくつかの態様において、ｆ型エキソソームは、１００ｎｍ以上の直径を有する。
ａ型およびｆ型エキソソームの双方を含むエキソソームは、ＭＳＣ、線維芽細胞およびマクロファージを限定することなく含む多数の異なる細胞種により生産される。かかる細胞を得るための方法は、当該分野において公知である。ＭＳＣのソースは、本明細書においてより詳細に記載される。
【００４５】
本開示はまた、本明細書において記載される単離されたエキソソームのいくつかのまたは全ての特徴を有する合成エキソソームの使用を企図する。これらの合成エキソソームは、（細胞または馴化培地から誘導および単離されるよりもむしろ）in vitroで合成される。それらは、本明細書で提供されるタンパク質の１個以上（２、３、４、５、６、７、８個以上を含む）を有する合成リポソームであってもよい。それらは、これらのタンパク質の１個以上（２、３、４、５、６、７、８個以上を含む）をコードする核酸を含んでも含まなくともよい。リポソーム合成は、当該分野において公知であり、リポソームは、商業的ソースから購入してもよい。ＭＳＣ、線維芽細胞またはマクロファージなどの細胞（または細胞からの馴化培地）から誘導および単離されるエキソソームに関する本明細書において記載される様々な組成物、製剤、方法および使用は、合成エキソソームの文脈においても企図されることが理解されるべきである。
【００４６】
本開示は、エキソソームの即時使用、または代替的にエキソソームの短期および／または長期保存、例えば使用前に凍結保存状態にあることを企図する。それらが、長期保存の間のエキソソームの完全性を提供するように、典型的に、プロテイナーゼインヒビターは凍結用溶媒中に含まれる。−２０℃における凍結は、エキソソームの活性の喪失の増加と関連するので、好ましくない。−８０℃における急速凍結は、活性を保存するので、より好ましい（例えば、Kidney International (2006) 69, 1471-1476を参照）。エキソソームの生物学的活性の保存を増大させるために、凍結用溶媒への添加物を用いてもよい。かかる添加物は、完全な細胞の凍結保存のために用いられるものと同様であり、ＤＭＳＯ、グリセロールおよびポリエチレングリコールを限定することなく含んでもよい。
【００４７】
細胞
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、神経細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、筋細胞、心臓組織、ならびに他の内皮および上皮細胞へ分化する能力を有する前駆細胞である（例えば、Wang, Stem Cells 2004;22(7);1330-7; McElreavey;1991 Biochem Soc Trans (1);29s; Takechi, Placenta 1993 March/April; 14 (2); 235-45; Takechi, 1993; Kobayashi; Early Human Development;1998; July 10; 51 (3); 223-33; Yen; Stem Cells; 2005; 23 (1) 3-9.を参照）。これらの細胞は、遺伝子またはタンパク質発現による表現型により、定義することができる。これらの細胞は、１以上のＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４９ａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、ＣＤ５１、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０２、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤｗ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１６６、Ｐ７５、ＴＧＦ−ｂＩＲ、ＴＧＦ−ｂＩＩＲ、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｄ７およびＰＤ−Ｌ１を発現する（およびしたがってそれについて陽性である）ことに特徴づけられる。これらの細胞はまた、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５０、ＣＤ６２Ｅ、Ｌ、Ｓ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＳＳＥＡ−１およびＡＢＯを発現しない（およびしたがってそれについて陰性である）ことに特徴づけられている。したがって、ＭＳＣは、その分化能力により、表現型的におよび／または機能的に特徴づけられてもよい。
【００４８】
ＭＳＣを、骨髄、血液、骨膜、真皮、臍帯血および／またはマトリックス（例えば、ウォートンゼリー）ならびに胎盤を限定することなく含む多数のソースから収穫してもよい。ＭＳＣの収穫のための方法は、例においてより詳細に記載される。本開示において用いることができる他の収穫方法については、米国特許第５４８６３５９号を参照することができる。
【００４９】
線維芽細胞は、細胞外マトリックスおよびコラーゲン、動物組織についての構造フレームワーク（例えば、ストローマ）を合成する細胞の１種であり、創傷治癒において重要な役割を担う。線維芽細胞は、動物の結合組織の最も一般的な細胞である。線維芽細胞は、典型的に、２以上の核小体を有する楕円形のまだらな（speckled）核を囲む分岐した細胞質を有する。活性の線維芽細胞は、それらの豊富な粗面小胞体により認識することができる。線維細胞とも呼ばれる不活性の線維芽細胞は、小さく、紡錘の形状を有する。それらは、低減した粗面小胞体を有する。
【００５０】
線維芽細胞のソースは、疎性結合組織、密生結合組織、弾性結合組織、細網結合組織および脂肪結合組織などの結合組織を含む。加えて、胚性結合組織のみならず骨、軟骨および血液を含む特殊結合組織がある。他のソースは皮膚を含む。線維芽細胞を単離および培養するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Weber et al., “Isolation and Culture of Fibroblasts, Vascular Smooth Muscle, and Endothelial Cells From the Fetal Rat Ductus Arteriosus.”  Pediatric Research. 2011; 70, 236-241; Huschtscha et al., “Enhanced isolation of fibroblasts from human skin explants.” Biotechniques. 2012;53(4):239-44を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５１】
いくつかの態様において、線維芽細胞または線維芽細胞馴化培地は、本明細書に記載されるように、エキソソームの生産および単離のために用いられる。線維芽細胞からエキソソームを生産および単離するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Luga et al., “Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP signaling in breast cancer cell migration.”  Cell. 2012;151(7):1542-56; Bang et al., “Cardiac fibroblasts-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy.” J Clin Invest. 2014;124(5):2136-46; Hoffman, “Stromal-cell and cancer-cell exosomes leading the metastatic exodus for the promised niche.” Breast Cancer Research, 2013; 15:310を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５２】
マクロファージは、組織中の単球の分化により生産される細胞である。マクロファージは、非特異的防御（先天免疫）において機能するのみならず、脊椎動物の初期の特異的防御メカニズム（適応免疫）を助ける。これらは、破壊および摂取を通して、異物、感染性微生物およびガン細胞を攻撃する特殊な食細胞である。これらは、全ての生体組織に存在し、そして再生における機能を有する。マクロファージは、フローサイトメトリー、免疫組織化学染色または他の好適な方法による、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６４、Ｆ４／８０（マウス）／ＥＭＲ１（ヒト）、リゾチームＭ、ＭＡＣ−１／ＭＡＣ−３およびＣＤ６８を含む多数のタンパク質の特異的な発現により同定することができる。
【００５３】
マクロファージのソースは、ほとんどの任意の組織を含み、血液および骨髄から容易に供給される。マクロファージを単離および培養するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Bennet, “Isolation and cultivation in vitro of macrophages from various sources in the mouse.” Am J Pathol. Jan 1966; 48(1): 165-181; Davies and Gordon, “Isolation and culture of murine macrophages.” Methods Mol Biol. 2005;290:91-103; Weischenfeldt and Porse, “Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.” CSH Protoc. 2008:pdb.prot5080. doi: 10.1101/pdb.prot5080を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
いくつかの態様において、マクロファージまたはマクロファージ馴化培地は、本明細書に記載されるように、エキソソームの生産および単離のために用いられる。マクロファージからエキソソームを生産および単離するための方法は、当該分野において公知である（例えば、Lee et al., “Exosomes derived from human macrophages suppress endothelial 細胞 migration by controlling integrin trafficking.” Eur J Immunol. 2014; 44(4):1156-69; Yang et al., “Microvesicles secreted by macrophage s shuttle invasion-potentiating microRNAs into breast cancer cells.” Mol Cancer. 2011; 10:117; Lee et al., “Exosome release of ADAM15 and the functional implications of human macrophage-derived ADAM15 exosomes.” FASEB J. 2012;26(7):3084-95を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
本開示の方法において使用のために企図されるＭＳＣ、線維芽細胞および／またはマクロファージ、ならびにしたがってそれらに由来するエキソソームは、処置される同一の対象に由来してもよく（およびそれゆえ、対象への自家（autologous）として言及される）、あるいはそれらは、好ましくは同一種の異なる対象に由来してもよい（およびそれゆえ、対象と同種（allogeneic）として言及される）。
【００５６】
本明細書で用いられるように、本開示の側面および態様は、他に示されない限り、細胞のみならず細胞集団に関することが理解される。したがって、細胞が述べられる場合、他に示されない限り、細胞集団もまた企図されることが理解される。
【００５７】
本明細書で用いられるように、単離された細胞（例えば、ＭＳＣ、線維芽細胞および／またはマクロファージ）は、その天然の環境の１以上の成分からの物理的な分離を含む、その天然の環境から物理的に分離されている細胞である。したがって、単離された細胞または細胞集団は、in vitroまたはex vivoで操作されている細胞または細胞集団を包含する。例として、単離された細胞（例えば、ＭＳＣ、線維芽細胞および／またはマクロファージ）は、それらから細胞が収穫される組織中の細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、およびさらにより好ましくは少なくとも８０％から物理的に分離されている細胞でもよい。いくつかの例において、単離された細胞は、本明細書で表現型的および／または機能的に定義されるように、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の細胞である集団中に存在する。好ましくは、ＭＳＣ、線維芽細胞および／またはマクロファージと他の細胞の比は、細胞の出発集団と比較して、単離された調製物中に増加する。
【００５８】
ＭＳＣは、例えば骨髄単核細胞、臍帯血、脂肪組織、胎盤組織から、組織培養プラスチックに対するそれらの粘着性に基づいて、当該分野において公知の方法を用いて単離することができる。例えば、ＭＳＣは、市販の骨髄吸引液から単離することができる。細胞の集団内でのＭＳＣの富化は、ＦＡＣＳを限定することなく含む当該分野において公知の方法を用いて達成することができる。
【００５９】
ＭＳＣ、線維芽細胞およびマクロファージの増殖、培養および維持のために、市販の培地を用いてもよい。かかる培地は、限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む。ＭＳＣ、維芽細胞およびマクロファージの増殖、培養および維持のために有用であるかかる培地中の成分は、限定されないが、アミノ酸、ビタミン、炭素源（天然および非天然）、塩、糖、植物由来加水分解物、ピルビン酸ナトリウム、界面活性剤、アンモニア、脂質、ホルモンまたは増殖因子、緩衝化剤、非天然のアミノ酸、糖前駆体、指示薬、ヌクレオシドおよび／またはヌクレオチド、酪酸または有機物、ＤＭＳＯ、動物由来生成物、遺伝子誘導剤、非天然の糖、細胞内ｐＨの調節剤、ベタインまたは浸透圧保護剤、微量元素、鉱物、非天然のビタミンを含む。市販の組織培養培地を補うために用いることができるさらなる成分として、例えば、動物血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ））、抗生物質（例えば、限定されないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン硫酸塩、アンホテリシンＢ、ブラストサイジン、クロラムフェニコール、アモキシシリン、バシトラシン、ブレオマイシン、セファロスポリン、クロルテトラサイクリン、ゼオシンおよびピューロマイシンを含む）、ならびにグルタミン（例えば、Ｌ−グルタミン）を含む。間葉系幹細胞の生存および増殖はまた、適切な好気的環境、ｐＨおよび温度の維持に依存する。ＭＳＣは、当該分野において公知の方法を用いて維持することができる（例えば、Pittenger et al., Science, 284:143-147 (1999)を参照）。
【００６０】
本開示の特定の側面は、培養条件が、エキソソーム種の生産を偏らせることができるという予期しない発見に関連する。例えば、例において記載されるように、培養条件は、ｆ型エキソソームに対するａ型エキソソームの生産を偏らせることができる。いくつかの態様において、三次元（３Ｄ）培養は、従前の二次元（例えば、単層）培養と比較して、ｆ型エキソソームと比べてａ型エキソソームの生産を増大させる。３Ｄ培養についての方法は、当該分野において公知であり、懸滴培養、マトリックス上での培養、マイクロキャリア上での培養、合成細胞外スキャフォールド上での培養、キトサン膜上での培養、磁気浮揚下での培養、回転式バイオリアクター中の懸濁培養または非接触阻害条件下の培養を限定することなく含む。例えば、Haycock JW. (2011). “3D cell culture: a review of current approaches and techniques.”. Methods Mol Biol. 695: 1-15; Lee, J; Cuddihy MJ, Kotov NA. (14 March 2008). Three-dimensional cell culture matrices: state of the art.. doi:10.1089/teb.2007.0150; Pampaloni, Francesco (October 2007). “The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue”. Nature Reviews 8: 839-845; and Souza, Glauco (14 March 2010). “Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation”. Nature Nanotechnology: 291-296を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。加えて、特定の増殖因子の添加は、ｆ型エキソソームと比べてａ型エキソソームの生産を増大させることも、予測しないことに、発見された。例えば、ＴＧＦβスーパーファミリー（ＴＧＦβ１、アクチビン、ＢＭＰ、ＧＤＦ、ＧＤＮＦ、インヒビン、Ｎｏｄａｌ、Ｌｅｆｔｙ、ＭＩＳ）、ＥＧＦ、ＰＤＧＦまたはＦＧＦから選択されるより多くの増殖因子の添加は、ｆ型エキソソームと比べてａ型エキソソームの生産を増大させることができる。
【００６１】
いくつかの態様において、（例えば、３Ｄ培養および／または増殖因子添加の文脈において）増大は、ｆ型エキソソームと比較して、ａ型エキソソームの１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１２．０倍、１５．０倍または２０．０倍以上の増加を含む。
【００６２】
対象
本開示の方法は、それから利益を引き出す可能性がある任意の対象において実施してもよく、これは、ヒト対象、農業用家畜（例えばウシ、ブタなど）、珍重される動物（例えばウマ）、愛玩動物（例えばイヌ、ネコなど）などを含む。本開示の様々な側面において、ヒト対象が好ましい。いくつかの側面において、ヒト対象およびヒトＭＳＣエキソソームが用いられる。
【００６３】
対象は、本開示に記載されるエキソソームを用いる処置を受け入れることができる、本明細書に記載される疾患（または状態）を有する対象であっても、またはかかる疾患（または状態）を発症するリスクがある対象であってもよい。かかる対象は、新生児、および特に短い在胎期間で出生した新生児を含む。本明細書において用いられる場合、ヒト新生児とは、出生の時点から約４週齢までのヒトを指す。本明細書において用いられる場合、ヒト乳児とは、約４週齢から約３歳までのヒトを指す。本明細書において用いられる場合、短い在胎期間とは、所与の種についての正常な在胎期間よりも前に起こる出生（または出産）を指す。ヒトにおいては、完全な在胎期間は約４０週間であり、３７週間から４０週間より長い範囲であってもよい。短い在胎期間とは、ヒトにおいては、早産と類似し、妊娠３７週より前に起きる出生として定義される。本開示は、したがって、妊娠３７週より前（さらにより短い在胎期間（例えば、妊娠３６週より前、３５週より前、３４週より前、３３週より前、３２週より前、３１週より前、３０週より前、２９週より前、２８週より前、２７週より前、２６週より前または２５週より前）を含む）に出生した対象の予防および／または処置を企図する。典型的には、かかる早産児は、新生児として処置されるが、しかしながら、本開示は、新生児を越えて小児および／または成人期までものそれらの処置を企図する。特定の対象は、例えば肺高血圧症などの本明細書に記載される特定の形態の疾患（または状態）に対する遺伝的素因を有してもよく、これらの対象もまた、本開示により処置してもよい。
【００６４】
疾患を予防および処置する方法
本開示は、特定の疾患または障害を予防および処置することを企図する。疾患を予防するとは、疾患が顕在化する可能性を低減すること、および／または疾患の発症を遅延させることを意味する。疾患を処置するとは、疾患の症状を低減または除去することを意味する。本明細書に記載されるように、ａ型のエキソソームは、ＴＧＦ／ＢＭＰ経路の機能性シグナル伝達成分を含み、この経路に関与する障害の処置に治療的に有効である。かかる障害は、本明細書に記載されるように、特定の肺および血管障害を含む（例えば、Cai et al., “BMP signaling in vascular diseases” FEBS Lett. 2012 (14):1993-2002.; Davies et al., “TGF-β/BMP Signaling in Pulmonary Vascular Disease.” Vascular Complications in Human Disease. Springer, 2008, pp 46-59; Alejandre-Alcazar et al., “Hyperoxia modulates TGF-beta/BMP signaling in a mouse model of bronchopulmonary dysplasia.” Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007; 292(2):L537-49; Stumm et al., “Lung Remodeling in a Mouse Model of Asthma Involves a Balance between TGF-β1 and BMP-7.” PLoS One. 2014; DOI: 10.1371/journal.pone.0095959を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。実際に、例に例証されるように、ａ型エキソソーム調製物のＩ．Ｖ．注射によるマウスの処置は、血管再構築および肺高血圧に関連するシグナル伝達の低酸素性活性化を下方制御し、かつ低酸素誘導性肺炎症を改善した。
【００６５】
したがって、本開示の側面は、多数の肺（lung）（または肺（pulmonary））疾患を予防および／または処置するための組成物および方法を提供する。これらの疾患は、限定することなく、肺動脈高血圧（ＰＡＨ）とも言及される肺高血圧症（ＰＨ）、喘息、気管支肺異形成症（ＢＤＰ）、アレルギー、サルコイドーシスおよび特発性肺線維症などの炎症性肺疾患を含む。これらの疾患はまた、炎症成分を有しない場合もある肺血管疾患を含む。本開示により処置されてもよい、さらに他の肺の状態は、敗血症または人工呼吸に関連してもよい急性肺損傷を含む。この後者の状態の例は、急性呼吸窮迫症候群であり、これは、より年長の小児および成人において起こる。
【００６６】
肺高血圧症は、肺動脈における血圧が正常レベルよりもはるかに高いことにより特徴づけられる肺疾患である。症状は、息切れ、特に身体活動中の胸部痛、脱力感、疲労感、失神、特に運動中の意識朦朧、眩暈、異常な心音および心雑音、頚静脈の怒張、腹部、脚および足首における体液の貯留、ならびに爪床が青色になることを含む。
【００６７】
気管支肺異形成症は、酸素を投与されているか、もしくは人工呼吸器を付けられている新生児、または未熟に出生した新生児、特に非常に未熟に出生した新生児（例えば妊娠３２週より前に出生した新生児）が罹患する状態である。それは、新生児慢性肺疾患としても言及される。ＢＤＰの原因は、例えば、人工呼吸の結果としての機械的損傷、例えば酸素治療および結果としての酸素中毒、ならびに感染を含む。疾患は、非炎症性から炎症性へと時間と共に進行する場合がある。症状は、青みを帯びた皮膚、慢性の咳、呼吸促迫および息切れを含む。ＢＤＰを有する対象は、呼吸器多核体ウイルス感染などの感染症に対してより感受性である。ＢＤＰを有する対象は、肺高血圧症を発症する場合がある。
【００６８】
急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、別名、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）または成人呼吸窮迫症候群は、肺に対する損傷または急性の疾病の結果として生じる状態である。肺に対する損傷は、人工呼吸、外傷、熱傷および／または吸引の結果である場合がある。急性の疾病は、感染性肺炎または敗血症である場合がある。それは、急性肺損傷の重篤な形態であると考えられ、しばしば致死性である。それは、肺の炎症、ガス交換の障害、および炎症メディエーターの放出、低酸素血症、および多発性臓器不全により特徴づけられる。ＡＲＤＳはまた、胸部Ｘ線上での両側性浸潤の存在下における２００ｍｍＨｇより低い呼気中酸素の割合（ＦｉＯ２）としての、動脈の酸素分圧（ＰａＯ２）の比として定義することができる。両側性浸潤を伴う３００ｍｍＨｇより低いＰａＯ２／ＦｉＯ２比は、急性肺損傷を示し、これはしばしば、ＡＲＤＳの前駆型である。ＡＲＤＳの症状は、息切れ、頻呼吸、および低酸素レベルに起因する精神錯乱を含む。
【００６９】
特発性肺線維症は、既知の原因を伴わない肺の瘢痕または肥大により特徴づけられる。それは、最も頻繁には、５０〜７０歳の人々において起こる。その症状は、息切れ、定期的な咳（典型的には乾性咳嗽）、胸部痛、および活動レベルの低下を含む。
【００７０】
アレルギーは、赤目、そう痒および鼻水、湿疹、蕁麻疹または喘息発作を含む症状を伴う免疫系の過敏性障害である。アレルギーは、喘息などの状態において重要な役割を果たす。環境もしくは飲食物のアレルゲンまたは薬物治療に対する重篤なアレルギーは、アナフィラキシーと呼ばれる生命を脅かす反応をもたらす場合がある。アレルギー反応は、人の免疫系が、環境中の通常は有害である物質であるものに反応するときに生じ得る。アレルギーは、過敏症の４つの形態のうちの１つであり、時としてＩ型（または即時の）過敏症と呼ばれる。アレルギー反応は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）による特定の白血球（マスト細胞および好塩基球）の過剰な活性化により区別される。この反応は、軽度の不快から危険な範囲までにおよび得る炎症反応をもたらす。アレルギー状態を診断するための様々なテストが存在する。テストは、皮膚上に可能性のあるアレルゲンを置き、腫れなどの反応を探すこと、およびアレルゲン特異的なＩｇＥを探すための血液テストを含む。
【００７１】
低酸素誘導性肺炎症は、炎症反応が低酸素性状態への長期の暴露により生じる、急性肺損傷および／またはＡＲＤＳからしばしば生じる状態である。かかる炎症反応は、低圧の低酸素に暴露されたヒトの気管支肺胞洗浄液中の増加したマクロファージ、好中球ならびにＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインを含む。
【００７２】
例えば、ＴＧＦ／ＢＭＰ経路を増強させることにより、ａ型エキソソームを用いた処置を受けることができる他の障害は、心血管障害、例えば心筋梗塞、心血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症および心不全を含む（例えば、Pardali et al., “TGFβ Signaling and Cardiovascular Diseases.” Int J Biol Sci 2012; 8(2):195-213; Garside et al., “Coordinating Notch, BMP, and TGF-β signaling during heart valve development.” Cell Mol Life Sci. 2013; 70(16):2899-917; Wang et al., “Bmp Signaling in Congenital Heart Disease: New Developments and Future Directions.” Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 2011; 91(6): 441-448; Ruiz-Ortega et al., “TGF-beta signaling in vascular fibrosis.” Cardiovasc Res. 2007; 1;74(2):196-206; Bujak et al., “The role of TGF-β Signaling in Myocardial Infarction and Cardiac Remodeling.” Cardiovasc Res. 2007; 74(2): 184-195; Chang et al., “Impact of myocardial infarct proteins and oscillating pressure on the differentiation of mesenchymal stem cells: effect of acute myocardial infarction on stem cell differentiation.” Stem Cells. 2008; 26(7):1901-12; Koitabashi et al., “Pivotal role of cardiomyocyte TGF-β signaling in the murine pathological response to sustained pressure overload.”  J Clin Invest. 2011;121(6):2301-2312; and Blann et al., “Serum levels of the TGF-beta receptor are increased in atherosclerosis.” Atherosclerosis. 1996;120(1-2):221-6を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７３】
心筋梗塞は、心臓発作として一般的に知られている事象についての医学用語である。心筋梗塞は、心臓の部分への血液の適切な流れが止まり、十分な酸素を受け取ることができなかったことに起因して、心筋が損傷するときに生じる。これは、通常、心臓へ血液を供給する冠動脈の１つに、白血球、コレステロールおよび脂肪の不安定な蓄積に起因して閉塞が生じたときに引き起される。当該事象は、それが突然かつ深刻である場合、「急性」と呼ばれる。急性心筋梗塞の症状は、胸骨の裏側に感じ、時として左腕または首の左側に伝わる、突然の胸部痛を含む。加えて、当該個人は、息切れ、発汗、吐き気、嘔吐、異常な心拍および不安を有する場合がある。女性は、男性よりも少ないこれらの症状を経験するが、通常、息切れ、脱力感、消化不良感および疲労感を有する。
【００７４】
心血管疾患とは、心血管系に影響を及ぼす任意の疾患、主に心臓疾患、脳および腎臓の血管疾患および末梢動脈疾患を指す。心血管疾患の原因は多様であるが、アテローム性動脈硬化症および／または高血圧が最も一般的である。加えて、加齢とともに、健康で無症状の個人においてさえ、心血管機能を変化させ、心血管疾患の増加したリスクを導く多数の生理学的および形態的変化が生じる。
【００７５】
アテローム性動脈硬化症は、白血球の侵入および蓄積、ならびに生体活性ＷＢＣ（炎症）ならびに最外かつ最古のプラーク内にコレステロールおよびトリグリセリド、最終的にはカルシウムおよび他の結晶化した材料を含む死細胞の残余物の双方を含有することの結果として動脈壁が厚くなった、動脈硬化症の特定の形態である。これらの変化は、動脈壁の弾性を低減するが、動脈筋壁はプラークの位置において拡大するので、数１０年間、血流に影響を与えない。しかしながら、当該壁の硬直は、脈圧を最終的に増加させる場合があり；広がった脈圧は、主な動脈内の進行した疾患の１つの可能性のある結果である。症状は、心臓への酸素化された血液の運搬を担っている冠動脈の著しい狭窄から生じ得、狭心症の胸部痛および息切れ、発汗、吐き気、目眩もしくは意識朦朧、呼吸困難または動悸などの症状を生じる。頸動脈の著しい狭窄は、脱力感、理路整然と考えられなくなること（not being able to think straight）、発話困難、目眩がし始めること、および歩行または直立困難、霧視、顔、腕および脚の痺れ、重篤な頭痛ならびに意識喪失などの症状も呈し得る。これらの症状はまた、脳卒中、すなわち脳細胞の死滅に関する。脳卒中は、脳に向かう動脈の著しい狭窄／閉塞により引き起され；十分な血液供給の不足が、影響を受ける組織の細胞の死滅を導く。脚、腕および骨盤に血液を供給する末梢動脈はまた、プラーク破裂および凝血により著しい狭窄を経験する。著しい狭窄についての症状は、腕または脚の痺れのみならず疼痛である。プラーク形成の別の著しい位置は、腎臓に血液を供給する腎動脈である。プラーク出現および蓄積は、減少した腎臓血流および慢性腎臓疾患を導き、全ての他の領域と同様に、これらは、典型的に、後期のステージまで無症状である。
【００７６】
高血圧（hypertension）または高血圧（high blood pressure）（時おり動脈高血圧とよばれる）は、動脈の血圧が上昇した慢性的な医学的状態である。高血圧は、一次性（本態性）高血圧または二次性高血圧のいずれかに分類され；約９０〜９５％の症例が、潜在する医学的原因が明らかでない高血圧を意味する、「一次性高血圧」としてカテゴライズされる。残りの５〜１０％の症例（二次性高血圧）は、腎臓、動脈、心臓または内分泌系に影響を与える他の状態により引き起される。高血圧は心臓に負担をかけ、処置されない場合、高血圧性心臓疾患および冠動脈疾患を導く。高血圧はまた、脳卒中、動脈の瘤（例えば、大動脈瘤）、末梢動脈疾患についての主要なリスク因子であり、慢性腎臓疾患の原因である。高血圧は、まれに任意の症状を伴い、その鑑別は、通常、スクリーニングを通じて、または関連しない問題についての健康管理を求めるときである。高血圧を有する一部の人は、（特に後頭部における、および朝の）頭痛のみならず、意識朦朧、空間識失調、耳鳴り（耳の中でブンブンいう音がなること（buzzing）またはシューッという音がたつこと（hissing））、変化した視覚または失神発作を報告する。
【００７７】
しばしば慢性心不全を意味するために用いられる心不全は、心臓が、身体の要求を満たす血流を維持するために十分なポンプ作用を提供することができないときに引き起される。上記に加えて浮腫が存在する場合、それは鬱血性心不全（congestive heart failure）（ＣＨＦ）または鬱血性心不全（congestive cardiac failure）（ＣＣＦ）と呼ばれる。心不全は、息切れ、脚の腫脹および運動不耐性を含む多数の症状を引き起し得る。心不全の一般的な原因は、心筋梗塞（心臓発作）および冠動脈疾患の他の形態、高血圧、弁膜心疾患および心筋症を含む。心不全なる用語は、時おり心筋梗塞（それが心不全を引き起こす場合があるが、それ自身において心不全ではない）または心停止（血流が事実上完全に停止する）について不正確に用いられる。
【００７８】
例えば、ＴＧＦ／ＢＭＰ経路を増強することにより、ａ型エキソソームを用いた処置を受けることができるさらに他の障害は、腎障害、例えば虚血性腎損傷、急性腎不全および腎線維症を含む（例えば、Meng et al., “Role of the TGF-β/BMP-7/Smad pathways in renal diseases.” Clin Sci (Lond). 2013;124(4):243-54; Zerisberg et al., “BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury.” Nat Med. 2003 ;9(7):964-8; and Yanagita, “Inhibitors/antagonists of TGF-β system in kidney fibrosis.”  Nephrol Dial Transplant. 2012; 27(10):3686-91を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７９】
虚血性腎損傷または虚血性ネフロパシーは、腎臓への不十分な血流（低潅流）が存在するときに引き起される。低潅流は、腎臓機能の喪失および腎臓萎縮（縮小）をもたらす。腎不全は、このプロセスが、双方の腎臓に損害を与えるときに生じる。以下の臨床的状況：両側腎動脈狭窄（ＲＡＳ；双方の腎臓に供給する大動脈の狭窄）；１つの機能する腎臓しか有しない人における片側ＲＡＳ；または他の腎臓に対する高血圧性（hypertensive）（高血圧（high blood pressure））損害を有する片側ＲＡＳの１つは、しばしば虚血性ネフロパシーに存在する。虚血性腎損傷の症状は、尿毒症（尿などの生成物によるタンパク質の高血中レベル）；肺における体液の突然の蓄積により引き起される呼吸困難（努力呼吸または困難な呼吸）の急性発作を含み；かつ高血圧は、損傷の重篤度に依存して存在してもよい。動脈内の血液の乱流により引き起される血管雑音（聴診器で聞きとれる音または心雑音）は、頸部（頸動脈雑音）、腹部（腎動脈の狭窄を反映する場合がある）および鼠径部（大腿動脈雑音）において検出される場合がある。
【００８０】
急性腎不全または急性腎臓損傷（ＡＫＩ）は、典型的に７日以内に発症する、不意の腎臓機能の損失である。それは、一般的に、任意の原因（例えば低血圧）により減少した腎血流（腎虚血）、腎臓に有害な物質への暴露、腎臓における炎症プロセス、または尿の流れを妨げる尿路の妨害により引き起される腎臓組織への損害の結果として引き起される。急性腎不全は、上昇した血液尿窒素およびクレアチニン、または十分な量の尿を生産する腎臓の能力がないことなどの特徴的検査所見に基づいて診断される。急性腎不全は、代謝性アシドーシス、高カリウムレベル、尿毒症、体液平衡の変化を含む、多数の合併症を導く場合があり、他の臓器系に影響を与える。急性腎臓損傷の症状は、尿の蓄積を含み、血流中の他の窒素含有物質は、疲労感、食欲の喪失、頭痛、吐き気および嘔吐などの多数の症状を導く。カリウムレベルの増加は、重篤で、生命を脅かし得る心臓の鼓動の不整を導き得る。もっとも高血圧はまれであるが、体液平衡はしばしば影響を受ける。脇腹における疼痛は、いくつかの状態（例えば、腎血管の血栓症または腎臓の炎症）で遭遇し；これは腎臓を包囲する線維組織被膜の引き伸ばしの結果である。腎臓損傷が脱水症状の結果である場合、渇きのみならず健康診断における体液枯渇のエビデンスが存在してもよい。健康診断はまた、間質性腎炎における発疹および触診できる（palpable）膀胱などの腎臓の問題の潜在する原因に関して、他の手がかりを提供してもよい。十分な体液を排出する減少した能力は、肢（末梢性浮腫）および肺（肺浮腫）における液体の蓄積のみならず、液体流出の結果としての心タンポナーデを引き起し得る。
【００８１】
腎線維症は、実質的に全ての種類の慢性腎臓疾患に生じる細胞外マトリックスの過剰な蓄積から生じる。腎線維症の発病は、典型的に、末期の腎不全を導く進行性プロセスである。いくつかの側面において、腎線維症は、慢性の持続した損傷後の、腎臓組織の失敗した創傷治癒プロセスを代表する。多くの細胞経路、例えば、糸球体間質および線維芽細胞活性化のみならず、尿細管上皮間葉−上皮転換は、病的状態においてマトリックス生産細胞の生成のための主要な原因として同定されている。形質転換増殖因子（ＴＧＦ）などの腎線維化プロセスを制御する線維形成因子は、当該状態に寄与する。内因性抗線維化因子に関する近年の発見は、ＴＧＦ−／Ｓｍａｄシグナル伝達の線維形成作用と拮抗することを目指す新たな戦略を展開している。
【００８２】
例えば、ＴＧＦ／ＢＭＰ経路を増強させることによる、ａ型エキソソームを用いた処置を受けることができるさらに他の障害は、低酸素性虚血性脳症または虚血性脳卒中などの虚血性神経障害を含む（例えば、Harvey et al., “Stroke and TGF-beta proteins: glial cell line-derived neurotrophic factor and bone morphogenetic protein.” Pharmacol Ther. 2005;105(2):113-25; Krampert et al., “Smad7 regulates the adult neural stem/progenitor cell pool in a transforming growth factor beta- and bone morphogenetic protein-independent manner.” Mol Cell Biol. 2010; 30(14):3685-94; and Yin et al., “Effect of hyperbaric oxygen on neurological recovery of neonatal rats following hypoxic-ischemic brain damage and its underlying mechanism.” Int J Clin Exp Pathol. 2013; 6(1): 66-75を参照；その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）または周産期窒息は、窒素に起因する、急性または亜急性の脳損傷の臨床的および実験的エビデンスにより特徴づけられる。この状態の主な原因は、全身性低酸素血症および／または低減した脳血流である。出生時窒息は、世界で８４０，０００件起こっており、全新生児死亡の２３％を占める。軽度の低酸素性虚血性脳症の兆候および症状は、わずかに増加した筋緊張を含み；一過性の行動異常（乏しい摂食、短気または過度の号泣もしくは眠気など）が観察される場合がある。やや重篤な低酸素性虚血性脳症の症状は、著しい筋緊張低下および減少した深部腱反射を有する不活発な乳児を含み；把握、モローおよび吸引反射は不活性または不存在でもよく；当該乳児は、時折の期間の無呼吸を経験してもよく；発作が生後の最初の２４時間以内の早期に生じてもよい。重篤な低酸素性虚血性脳症の症状とは、遅延したおよび重篤な発作を含み、継続的な処置に対する耐性を最初に有してもよい。当該発作は、通常全身性であり、その頻度は、発症の２４〜４８時間後の間に増加してもよく、再潅流損傷のフェーズと相互に関連する。他の症状は、昏迷または昏睡（乳児は、最も有害なものを除いて、任意の物理的刺激に反応しなくてもよい）；不規則な呼吸；全身性筋緊張低下および減少した深部腱反射；新生児反射（例えば、吸引、嚥下、把握、モロー）の不在；眼球運動（例えば、眼の斜偏位、眼振、上下運動）の妨害；瞳孔散大、光への固定のまたは乏しい反応性；ならびに心拍数および血圧の不整を含む。
【００８４】
虚血性脳卒中は、脳への血液供給の妨害に起因する脳機能の喪失である。虚血は、血栓症もしくは動脈塞栓症による血管の閉塞、または脳低潅流のいずれかにより引き起こされる。結果として、影響を受けた脳の領域は、正常に機能できず、身体の片側の１以上の肢の動作不能、言語の不理解もしくは構成不能（failure to understand or formulate speech）または片側の視野の視力欠損をもたらす場合がある。
【００８５】
予防および／または処置は、いくつかの例において、単独または１以上の第２の剤と共のａ型エキソソームの使用を含む。対象はまた、外因的な酸素投与を伴うか、または伴わない人工呼吸などの機械的介入を受けてもよい。
【００８６】
新生児、および特に短い妊娠期間の新生児に関して、本開示は、生後４週間、３週間、２週間、１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日間、１２時間、６時間、３時間または１時間以内のａ型エキソソームの投与を企図する。いくつかの重要な例において、ａ型エキソソームは、生後１時間以内に投与される。
本開示はさらに、本明細書に記載されるような疾患または障害の指標となる症状の不在下においてすらの、ａ型エキソソームの投与を企図する。
【００８７】
本開示はまた、ａ型エキソソームの２回、３回、４回、５回以上の投与を含む、ａ型エキソソームの繰り返し投与を企図する。いくつかの例において、ａ型エキソソームを持続的に投与してもよい。繰り返しまたは持続的な投与は、処置されている状態の重篤度に依存して、数時間（例えば、１〜２、１〜３、１〜６、１〜１２、１〜１８もしくは１〜２４時間）、数日間（例えば、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６日間もしくは１〜７日間）または数週間（例えば、１〜２週間、１〜３週間もしくは１〜４週間）の期間毎に行ってもよい。投与が繰り返されるが持続的ではない場合、投与の間の時間は、数時間（例えば、４時間、６時間もしくは１２時間）、数日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間もしくは６日間）、または数週間（例えば、１週間、２週間、３週間もしくは４週間）であってよい。投与の間の時間は、同一であっても異なっていてもよい。例として、疾患の症状が悪化していると考えられる場合、ａ型エキソソームをより頻繁に投与し、次いで、症状が安定化するかまたは軽減したら、ａ型エキソソームをより低い頻度で投与してもよい。
【００８８】
いくつかの重要な例において、ａ型エキソソームを、生後２４時間以内に少なくとも１回、次いで、生後１週間以内に少なくとももう１回投与する。さらにより好ましくは、ａ型エキソソームを、生後１時間以内に少なくとも１回、次いで生後３〜４日間以内に少なくとももう１回投与する。
【００８９】
いくつかの例において、低用量のａ型エキソソームの繰り返しの静脈内投与を行ってもよい。したがって、本開示は、低い投薬形態のａ型エキソソームの繰り返しの投与のみならず、高い投薬形態のａ型エキソソームの単回投与を企図する。低い投薬形態は、限定することなく、１〜５０μｇ／ｋｇの範囲であってもよく、一方、高い投薬形態は、限定することなく、５１〜１０００μｇ／ｋｇの範囲であってもよい。疾患の重篤度、対象の健康状態、および特には投与の経路に依存して、低いまたは高い用量のａ型エキソソームの単回のまたは繰り返しの投与が、本開示により企図されることが理解される。
【００９０】
投与、医薬組成物、有効量
ａ型エキソソームは、薬学的に許容し得る調製物（または薬学的に許容し得る組成物）において、典型的には、薬学的に許容し得るキャリアと組み合わされた場合に、用いて（例えば、投与して）もよい。かかる調製物は、慣用的に薬学的に許容し得る濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合可能なキャリアを含有してもよく、任意に、他の（すなわち第２の）治療剤を含んでもよい。
【００９１】
薬学的に許容し得るキャリアは、予防的または治療的に活性な剤を担持または輸送することに関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入用材料などの薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクルである。それぞれのキャリアは、製剤の他の成分との適合しかつ対象にとって有害でないという意味において、「許容し得」なければならない。薬学的に許容し得るキャリアとして役立ち得る材料のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝化剤；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；ならびに医薬製剤において採用される他の非毒性の適合性物質を含む。
【００９２】
第２の治療剤。エキソソームを、１以上の第２の治療剤と共に投与してもよい。本明細書において用いられる場合、治療剤は、本明細書において議論されるものなどの肺疾患の予防、処置および／または管理に用いることができる任意の剤を指す。これらとして、限定されないが、界面活性剤、吸入一酸化窒素、ビスメシル酸アルミトリン、免疫モジュレーター、および抗酸化剤を含む。免疫モジュレーターの例は、メチルプレドニゾロンを含むがこれに限定されないステロイドおよび副腎皮質ステロイドを含む。抗酸化剤の例は、限定されないが、スーパーオキシドジスムターゼを含む。
【００９３】
肺高血圧症を含むがこれに限定されない特定の肺および血管疾患の処置または管理において用いられる特定の第２の治療剤は、酸素、ワルファリン（クマジン）などの抗凝固剤；フロセミド（（Lasix（登録商標））またはスピロノラクトン（Aldactone（登録商標））などの利尿剤；カルシウムチャネル遮断剤；K-dur（登録商標）などのカリウム；ジゴキシンなどの変力剤（inotropic agent）；ニフェジピン（Procardia（登録商標））またはジルチアゼム（Cardizem（登録商標））などの血管拡張剤；ボセンタン（Tracleer（登録商標））およびアンブリセンタン（Letairis（登録商標））などのエンドセリン受容体アンタゴニスト；エポプロステノール（Flolan（登録商標））、トレプロスチニルナトリウム（Remodulin（登録商標）、Tyvaso（登録商標））、およびイロプロスト（Ventavis（登録商標））などのプロスタサイクリン類縁体；ならびに、シルデナフィル（Revatio（登録商標））およびタダラフィル（Adcirca（登録商標））などのＰＤＥ−５インヒビターを含む。
【００９４】
界面活性剤。ａ型エキソソームは、肺界面活性剤と共に投与してもよい。肺界面活性剤は、肺の気道を開いておく（例えば、肺胞壁の互いへの接着を予防することにより）上で有用なリポタンパク質混合物である。肺界面活性剤は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスホチジルコリン（ＰＣ）、ホスホチジルグリセロール（ＰＧ）などのリン脂質；コレステロール；およびＳＰ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤなどのタンパク質からなってもよい。肺界面活性剤は、ウシまたはブタ肺組織などの天然に存在するソースに由来してもよい。例は、Alveofact（商標）（ウシ肺洗浄液から）、Curosurf（商標）（刻んだブタ肺から）、Infasurf（商標）（仔ウシ肺洗浄液から）、およびSurvanta（商標）（刻んだウシ肺から；ＤＰＰＣ、パルミチン酸およびトリパルミチンを含む付加成分を含む）を含む。肺界面活性剤はまた、合成であってもよい。例は、Exosurf（商標）（ヘキサデカノールおよびチロキサポールとともにＤＰＰＣからなる）、Pumactant（商標）または人工肺拡張化合物（Artificial Lung Expanding Compound：ALEC）（ＤＰＰＣおよびＰＧからなる）、ＫＬ−４（ＤＰＰＣ、パルミトイル−オレイルホスファチジルグリセロール、パルミチン酸およびＳＰ−Ｂを模倣する合成ペプチドからなる）、Venticute（商標）（ＤＰＰＣ、ＰＧ、パルミチン酸および組換えＳＰ−Ｃからなる）を含む。肺界面活性剤は、商業的な供給者から入手してもよい。
【００９５】
有効量。本開示の調製物は、有効量において投与される。有効量とは、ある剤が単独で所望の結果を刺激する量である。絶対量は、投与のために選択される材料、投与が単回用量であるか複数回用量であるか、ならびに、年齢、身体的状態、サイズ、体重および疾患のステージを含む個々の患者のパラメーターを含む、多様な因子に依存するであろう。これらの因子は、当業者に周知であり、慣用的な実験のみにより取り組むことができる。
【００９６】
投与経路。ａ型エキソソームは、肺または他の組織への送達をもたらす任意の経路により投与することができる。静脈内ボーラス注射または持続注入などの全身投与経路は好適である。鼻内投与、気管内投与（例えば挿管を介して）、および吸入（例えば、口腔または鼻を通すエアロゾルを介して）などのより直接的な経路もまた、本開示により企図され、特に迅速な作用が必要であるいくつかの例においては、より適切である場合がある。本明細書において用いられる場合、エアロゾルは、気体中に小さい粒子として分散した液体の懸濁液であり、かかる粒子を含む微細な霧またはスプレーを含む。本明細書において用いられる場合、エアロゾル化は、液体懸濁液を小さい粒子または液滴へと変換させることによるエアロゾルの生成のプロセスである。これは、加圧パックまたはネブライザーなどのエアロゾル送達系を用いて行われてもよい。ネブライザーは、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体などを含むがこれらに限定されない好適な噴霧剤の使用とあわせて、エア・ジェット（すなわち、含気性の）、超音波の、および振動メッシュのネブライザーを含む。ネブライザーに加えて、肺送達のための他のデバイスは、限定されないが、定量吸入器（ＭＤＩ）およびドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）を含む。吸入器（inhaler）または吸入器（insufflator）における使用のための例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、凍結乾燥されたエキソソームおよびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤を含有して処方されてもよい。
【００９７】
エキソソームは、それを全身送達することが望ましい場合、注射（ボーラス注射または持続注入によるものを含む）による非経口投与のために処方することができる。注射のための製剤は、単位投薬形態において、例えば、アンプルにおいて、または複数用量容器において、添加する保存剤を含めて、または含めずに提供することができる。
【００９８】
組成物は、水溶性の懸濁液、溶液、または油性または水性のビヒクル中の乳液の形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方用の剤を含んでもよい。好適な親油性の溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成の脂肪酸エステルを含む。水溶性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁液の粘性を増大させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、好適な安定化剤、または可溶性を増大させる剤を含有してもよい。あるいは、エキソソームは、好適なビヒクル、例えば滅菌されたパイロジェンフリー水による、使用の前の構成のための、凍結乾燥または他の粉末または固体の形態にあってもよい。
【００９９】
本開示により処置されている対象に投与されるべき他の剤は、経口投与、鼻内投与、気管内投与、吸入、静脈内投与などの任意の好適の経路により投与してもよいことが理解されるべきである。当業者は、かかる第２の剤のための投与の慣用的な経路を知っているであろう。
【０１００】
キット
本開示はまた、包装されてラベルされた医薬品を包含する。この製品またはキットは、ガラスバイアルまたはプラスチックのアンプルなどの適切な容器（vessel）もしくは容器（container）または密封される他の容器中の、適切な単位投薬形態を含む。単位投薬形態は、例えばエアロゾルによる肺送達のために好適であるべきである。好ましくは、製品またはキットはさらに、当該医薬製品を投与する方法を含む使用方法についての説明書を含む。説明書はさらに、医師、技術者または対象に、問題の疾患または障害を適切に予防または処置するための方法について助言する情報材料を含んでもよい。言い換えると、当該製品は、使用のための投与レジメン（実際の用量、モニタリング手順、および他のモニタリング情報を含むが、これらに限定されない）を指示または示唆する説明書を含む。
【０１０１】
任意の医薬製品について、包装用の材料および容器は、保存および輸送の間の製品の安定性を保護するように設計される。
キットは、直接用いることができる無菌の水性懸濁液中のエキソソームを含んでも、静脈注射またはネブライザーにおける使用のために通常の食塩水で希釈しても、あるいは気管内投与のために界面活性剤により希釈するかまたはこれと組み合わせてもよい。キットは、したがってまた、食塩水または界面活性剤などの希釈用の溶液または剤を含有してもよい。キットはまた、ネブライザーなどの肺送達デバイス、またはディスポーザブルの成分、すなわちマウスピース、ノーズピースもしくはマスクなどを含んでもよい。
【０１０２】
例
材料および方法
ヒト臍帯ウォートンゼリーからのヒトＭＳＣの単離。ヒト臍帯ウォートンゼリー由来ＭＳＣ（ｈＵＣ−ＭＳＣ）を、僅かな改変を伴う公開されている方法（Mitchell, K. E. et al., 2003, Stem Cells 21:50-60; and Penolazzi, L. et al., 2011, J Cell Physiol）に従って、単離した。臍帯を冷たい無菌ＰＢＳで２回リンスし、長軸方向に切断し、動脈および静脈を除去した。軟性のゲル状組織を掻爬し、細かく刻み（２〜３ｍｍ２）、１０％ウシ胎児血清（Hyclone）、２ｍＭのＬ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）（Invitrogen）と共に、１００ｍｍディッシュ上に直接播種し（１５片／ディッシュ）、３７℃で５日間、加湿した５％ＣＯ２の大気中でインキュベートした。組織および培地を除去した後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、接着した細胞を培養し、週３回新たな培地に交換した。７０〜８０％のコンフルエンシーにおいて、細胞を回収し、ＣＤ３４（Miltenybiotec）およびＣＤ４５（Miltenybiotec）に対するＰＥ共役抗体で染色した。抗ＰＥマイクロビーズ（Miltenybiotec）およびＭＳＣＳカラム（Miltenybiotec）を用いて、製造者の説明書に従って、免疫枯渇法を行った。ＣＤ３４およびＣＤ４５陰性の集団をさらに増殖させ、ＭＳＣマーカー（ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４およびＣＤ７３）の発現、ならびにＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲの不在について、ヒトＭＳＣの特徴に特異的な蛍光標識抗体のセット（BD Biosciences）を用いて、MoFloフローサイトメトリー（Beckman Coulter）を用いて選択した。
【０１０３】
馴化培地の調製。血清由来の微小小胞の混入を排除するために、細胞培養物の増殖のために用いられた血清および馴化培地の回収物を、１００，０００ｘｇで１８時間の超遠心分離法により清澄化した。ＭＳＣを、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Hyclone）、１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清（Hyclone）および５ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco）を補充したα−ＭＥＭ培地中で培養した。７０％コンフルエンシーの培養物を、ＰＢＳで２回洗浄し、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充した無血清培地により２４時間、標準的な培養条件下においてインキュベートした。馴化培地を、２４〜４８時間または３〜４日の期間（マイクロ粒子枯渇ＦＢＳ培地において）にわたりヒトＭＳＣのほぼコンフルエントな培養物から回収し、細胞およびデブリを、４００ｘｇで５分間、２，０００ｘｇで１０分間、および１３，０００ｘｇで３０分間の分画遠心法により、除去した。清澄化した馴化培地を、その後、０．２μｍのフィルターユニットを通して濾過し、１００ｋＤまたは３００ｋＤまたは５００ｋＤカットオフを用いる接線流濾過システムを用いて、少なくとも１０倍に濃縮した。馴化培地中のタンパク質レベルをブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad）により決定した。
【０１０４】
エキソソームの単離。ＭＳＣエキソソームを１００ｋ  ｘｇで３．５時間の遠心分離によりイオジキサノールの１０％〜６０％の段階勾配上にバンディング（banding）することにより濃縮された馴化培地から単離した。分画遠心、時折続いて３０％スクロースクッションまたはスクロース速度勾配により、エキソソームを馴化培地からさらに単離した。単離されたエキソソーム調製物の粒子数をNanosightにより決定した。
【０１０５】
エキソソームのウェスタンブロット。エキソソーム調製物を、１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後０．４５μｍ  ＰＶＤＦ膜（Millipore）上に移した。ヤギポリクローナル抗ＣＤ６３（１：１，０００；Santa Cruz）抗体、ポリクローナルウサギ抗ＣＤ８１（１：１，０００、Santa Cruz）、およびモノクローナル抗Dicer（１：１，０００、Abcam）を用いた。ＡＬＩＸ、ＦＬＯＴ−１、ＴＳＧ１０１、ＴＧＦβＲ２、ＳＭＡＤ、ＣＤ１０５、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＡＶ１、ＥＦＧＲおよびＡＫＴに対する一次抗体も、エキソソームのサブ集団を同定するために用いた。ペルオキシダーゼ共役抗ウサギ二次抗体（Santa Cruz）を、１：２０，０００希釈において用い、増大した化学発光試薬（Pierce）またはLumi-LightPLUS（Roche）のいずれかにより、免疫活性バンドを視覚化した。適切なバックグラウンド除去の後、デンシメトリー分析を通した定量のために、ＮＩＨのImageJプログラムを用いた。
【０１０６】
ｍｉｃｒｏＲＮＡの定量。全エキソソームＲＮＡを、Chomczynski & Sacchi（1987 Anal Biochem 162:156-159）の方法により抽出し、７５０ｎｇを、各標的ｍｉｃｒｏＲＮＡについての特異的プライマー（TaqMan Reverse Transcription Kit, Applied Biosystems, Foster City, CA）による逆転写のための鋳型として用いた。各逆転写反応はまた、核小体低分子ＲＮＡであるｓｎｏ２０２についてのプライマーを含み、これを内部対照として用いた。３７．５ｎｇのｃＤＮＡを、示されたｍｉｃｒｏＲＮＡおよび内部対照について特異的なプローブ（TaqMan microRNA assay, Applied Biosystems）の存在下において、TaqMan universal master mix II with no UNG（Applied Biosystems）と共に、各２０μｌのｑＰＣＲ反応に用いた。StepOne Plus platform（Applied Biosystems）上で、５０℃で２分間、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の４０サイクルで増幅を行った。
【０１０７】
動物および低酸素性暴露。８週齢のＦＶＢ雄性マウスをCharles River Laboratories（Wilmington, MA）から得たか、またはChildren’s Hospital Bostonの動物施設において生育した。各群中のマウスを可変の実験期間、Plexiglas chamber（OxyCycler, BioSpherix, Redfield, NY）中で８．５％酸素に暴露した。ＣＯ２が５，０００ｐｐｍ（０．５％）を超えないように（平均範囲１，０００〜３，０００ｐｐｍ）、換気を調節し、ＣＯ２を除去した。アンモニアを換気および空気清浄機を通した活性炭濾過により除去した。全ての動物プロトコールは、Children’s Hospital Animal Care and Use Committeeにより承認された。
【０１０８】
例１
間葉系幹細胞由来エキソソームの２つの別個の集団の同定および特徴づけ
蓄積されたエビデンスは、肺の恒常性および修復においてＭＳＣについての重要な役割を支持する。ＭＳＣエキソソーム（ＭＥＸ）が、低酸素誘導性肺高血圧に関して間葉系幹細胞の細胞保護効果を仲介することは、以前より報告されている。静脈内マウスＭＥＸ送達は、マクロファージの低酸素性肺流入ならびに炎症誘発性および増殖誘発性メディエーターの誘導を支持し、マウスＰＨモデルにおける血管再構築および低酸素性肺高血圧を最終的に阻害した。
この研究の目標は、ヒト臍帯ストローマから単離されたＭＳＣが同様の保護特性を示す微小小胞を分泌することを調査すること、治療的ＭＳＣエキソソームの生化学的特性を特徴づけること、および肺血管再構築を開始するシグナルによりトリガーされる血管細胞表現型変化に関するその効果を研究することである。
【０１０９】
ＭＥＸの単離
エキソソーム（ＭＥＸ）をヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）により馴化された組織培養培地から単離した。ここで、ヒトＭＳＣのソースは、ウォートンゼリー（ＷＪ）であるが、他の可能性のあるソースは、臍帯血、骨髄、脂肪または他の組織である。ＭＳＣを単離し、免疫選択し、培養し、そしてそれらの分化能を評価した。ヒトＷＪ−ＭＳＣについての陰性選択は、ＣＤ３４およびＣＤ４５を含む。ＭＳＣは、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ４４について陽性であった。
【０１１０】
ＭＥＸでのマウスの処置
ＭＥＸの１用量を、尾静脈注射を通して動物に送達し、レシピエントマウスを常圧の低酸素（８〜１０％、Ｏ２）に２．５日間暴露した。低酸素誘導性炎症マーカー（例えば、ＣＣＬ２、ＩＬ６）の減少を調製物の有効性のための指標として用いた。用いられる投薬量は、NanoSightにより測定される場合、おおよそ１００〜２００億粒子相当であるか、２４時間にわたる単層培養においておおよそ１０００〜２０００万ＭＳＣにより生産される全エキソソームに相当した。
【０１１１】
結果
ＭＥＸ調製物のＩ．Ｖ．注射によるマウスの処置は、血管再構築および肺高血圧に関連するシグナル伝達の低酸素性活性化を下方制御し（図１Ａ）、かつ低酸素誘導性肺炎症を改善した（図１Ｂ）。図１Ａは、ＡＫＴの低酸素誘導性リン酸化およびその下流標的であるｍＴＯＲが、ＷＪ−ＭＥＸ処置により減少することを示す。図１Ｂに例証されるように、ＤＮＡ結合／分化タンパク質ＩＤ１のインヒビター、直接的ＳＭＡＤ標的化遺伝子およびＢＭＰＲ２の下流シグナルの肺タンパク質レベルは、低酸素により抑制されるが、ＭＥＸにより増加する。アルファチューブリンは、正規化対照として役割を果たす。
【０１１２】
ＭＥＸサブタイプの集団の１超の存在を、密度および速度超遠心法により調査した。密度および速度超遠心法によるＭＥＸ調製物の分析は、ＭＳＣにより生産される細胞外微小小胞の集団が、分子マーカーに基づく２つの種類により構成されることを明らかにした（図２および図３）。２つの種類は、ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸと名付けられている。ＡＬＩＸおよびＴＳＧ１０１などのエキソソーム生合成マーカーは、画分１２〜１４（ａ−ＭＥＸ）に主に富化される一方で、テトラスパニンＣＤ９およびＣＤ８１ならびにフロチリン１（ＦＬＯＴ１）およびカベオリン１（ＣＡＶ１）などの脂質ラフトマーカーは、画分５〜８（ｆ−ＭＥＸ）に富化される。表１に、ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸ特異的マーカーを示す。
【０１１３】
【表１】
0006773563.tif 000002
【０１１４】
ａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸの調製物は、ＥＭ（図４）により別個の形態を明らかにする。ｆ−ＭＥＸは、直径３０〜２００ｎｍであり、典型的な深いカップ状形態のエキソソームを示す一方で、ａ−ＭＥＸは、３０〜１００ｎｍであり、半透明および球状形態を有する。
【０１１５】
単層培養において増殖したＭＳＣから得られたバルクのエキソソーム調製物からａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸにおいて高度に富化されたエキソソームサブ集団を調製するために、バルクのエキソソーム調製物を４５％スクロースに調整し、６０％スクロースクッション上に積層し、３５％〜５％スクロース勾配の段階勾配で重層した。調製物を１８０ｋ  ｘｇで２０時間遠心分離し、ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸサブ集団を分離した。ａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸを含有する勾配画分を超遠心（１００ｋ  ｘｇ、３時間）およびＰＢＳ中への再懸濁を通して、または接線流濾過を通して濃縮した。
【０１１６】
低酸素に暴露したマウスへの単離されたａ−ＭＥＸまたはｆ−ＭＥＸの投与は、ＭＥＸの免疫抑制特性が、ａ−ＭＥＸ種に排他的に存在することを明らかにした（図５）。ａ−ＭＥＸでの処置は、ＣＣＬ２、ＩＬ６およびＡＤＭを含む低酸素誘導性炎症マーカーのｍＲＮＡレベルの著しい減少を引き起こす。
【０１１７】
ａ−ＭＥＸの生産は、３Ｄ培養において増強される
ＭＳＣおよび特定の他の細胞種は、スフェロイドと名付けられる細胞凝集体を形成することができる。図６は、２Ｄおよび３Ｄ培養条件双方からのＭＳＣスフェロイドの形成を表す顕微鏡イメージを提供する。スフェロイド形成は、２次元単層培養よりもより生理的条件を代表することが想定される。ＭＳＣについて、スフェロイド状態は、より未分化の幹様状態を代表することが想定される。スフェロイドを形成する傾向を増大させる３次元培養システムは、市販される（特定の膜）。ＭＳＣは、高密度の単層培養から増殖して脱した（outgrowing）スフェロイドを自発的に形成し、培養培地中に懸濁される場合（懸滴技術）、スフェロイド形成を誘導することができる。
【０１１８】
懸滴技術は、多くの細胞種のための培養の公知の方法である。手短に述べると、単層培養中で増殖したＭＳＣを、トリプシン処理し、単一の細胞懸濁液を生産した。５００，０００細胞を含有するこの懸濁液の３０μＬをペトリディッシュカバーの内側表面にアプライし、当該カバーを少量のＰＢＳを含有するディッシュの上に置いて湿度を保存した。ＭＳＣがスフェロイドに凝集する間、懸滴を含むディッシュを組織培養インキュベーター中に１〜２日間置いた。典型的なスフェロイド調製物は、３０滴中に分けられる１５００万細胞からなった。
【０１１９】
データは、３Ｄ培養において増殖したＭＳＣ（スフェロイド）が、２Ｄ培養において増殖した同一の継代における同一のＭＳＣクローン（単層）と比較して、著しく多くのａ−ＭＥＸを生産することを示す（図７）。ａ−ＭＥＸ生産の増加は、図７に示されるように、ＳＭＡＤ２／３およびＡＬＩＸ抗体（ＦＬＯＴ１ではない）に対するサンプルの強い免疫活性により立証される。
【０１２０】
ａ−ＭＥＸの生産は、異なるＭＳＣクローン間で可変であり、生産する細胞は、３Ｄ培養および／または増殖因子補充を通して富化することができることも発見された。様々な独立した由来のＭＳＣクローンは、それらの相対的なａ−ＭＥＸ生産について特徴づけられた（２Ｄ培養におけるそれらの馴化培地中のＦＬＯＴ１対ＡＬＩＸ（またはＳＭＡＤ）マーカーの比を決定し、実質的な変動に注目する）（図８Ａ）。クローンＤなどの特定のクローンは、有意な量のＳＭＡＤ（ＦＬＯＴ１（ｆ−ＭＥＸマーカー）と比較されるａ−ＭＥＸマーカー）を生産しない。クローンＤのこの特性は、懸滴技術を用いた、非常に非効率なスフェロイド形成に関連する（図８Ｂ）。
【０１２１】
意義深いことには、クローンＤ細胞により形成される稀なスフェロイドが単層に広がった場合、結果として生じる２Ｄ培養物は、高い比率でａ−ＭＥＸを生産し、高い効率でスフェロイドを形成した。これらの観察は、それらの幹細胞性を保持し、かつ高い比率におけるａ−ＭＥＸを生産する細胞のサブ集団についての非効率なＭＳＣクローンを富化するためのツールとして、スフェロイド形成を通した選択を用いることができることを示す。この目標に向けて、ＴＧＦβ１などの増殖因子の濃度の操作は、スフェロイド形成を加速し、かつａ−ＭＥＸ生産を増大させることができることが観察された（図９）。ＴＧＦβ１刺激は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度において達成された。
【０１２２】
ａ−ＭＥＸおよびｆ−ＭＥＸは、特異的な増殖因子についての別個のシグナル伝達モジュールを担持する。
ａ−ＭＥＸは、ＴＧＦ受容体および下流の転写因子ＳＭＡＤを含む（図２および図３）。ａ−ＭＥＸ内のＳＭＡＤ分子が、効率的かつ特異的にin vitroでリン酸化されるので、ａ−ＭＥＸの単離された調製物へのＴＧＦβ１の添加は、シグナル伝達モジュールが機能的であることを明らかにする（図１０Ａ）。この特性は、ａ−ＭＥＸに特異的である（図１０Ｂ）。ｆ−ＭＥＸは、ＥＧＦ受容体を含有し、in vitroで内因性ＡＴＫをリン酸化することができる（示されない）。
【０１２３】
データは、ＭＳＣが２つの異なる種類のエキソソームを生産し：ａ−ＭＥＸ種が、増殖因子のＴＧＦ／ＢＭＰスーパーファミリーについての機能性シグナル伝達モジュールを担持するのに対し、ｆ−ＭＥＸが、ＦＧＦ／ＰＤＧＦスーパーファミリーについての対応するモジュールを担持することを示唆する。これらのエキソソームは、モジュールを標的細胞に移し、対応するシグナル伝達経路を増大させ、それらの相対的な分泌比は、それらを生産するＭＳＣ集団の増殖に依存する。
【０１２４】
さらに、ａ−ＭＥＸ（ｆ−ＭＥＸではない）は、図１１に示されるように、ヒト肺細胞において、ＴＧＦβ誘導性線維芽細胞の筋線維芽細胞転換を阻害することができることが発見された。ヒト肺線維芽細胞を、血清飢餓（０．１％ＦＢＳ）の３日後、ＴＧＦβで刺激し、増加したアルファ−平滑筋アクチン（ＳＭＡ）発現を特徴とする筋線維芽細胞分化を経る。図１１Ａは、ｈＭＥＸ（２ｕｇ／ｍｌ）での前処理が、アルファ−ＳＭＡタンパク質レベルに関するＴＧＦβの効果を無効化することを例証する。この発見をさらに試験するために、ヒト肺線維芽細胞を、血清飢餓の２４時間後、ＴＧＦβで刺激し、筋線維芽細胞マーカーであるＰＡＩ１を誘導した。ａ−ＭＥＸでの処置は、ＰＡＩ１の上方制御を防ぎ、効果はｆ−ＭＥＸ処置により観察されなかった（図１１Ｂ）。ａ−ＭＥＸ処置が、in vitroで、ヒト肺線維芽細胞におけるベースラインＭＣＰ−１およびＩＬ１β  ｍＲＮＡレベルを下方制御することも発見された（図１１Ｃ）。
【０１２５】
均等物
本開示は、その適用において、以下の明細書において記載されるまたは図面において説明される成分の構成および配置の詳細に限定されない。本開示は、他の態様、および多様な方法において実施されることまたは実行されることが可能である。また、本明細書において用いられる表現および用語は、説明を目的とするものであり、限定的なものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する（having）」、「含有する（containing）」、「含む（involving）」およびこれらの変化形の使用は、その後に列記される項目およびそれらの均等物ならびにさらなる項目を包含することを意図する。
【０１２６】
このようにして、本開示の少なくとも１つの態様のいくつかの側面を記載することにより、様々な改変、修飾および改善が、当業者には容易に想起されるであろう。かかる改変、修飾および改善は、本開示の一部であるものと意図され、本開示の精神および範囲の内にあることが意図される。したがって、前述の明細書および図面は、単に例示的なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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