(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１の化合物：
Ａ−Ｌ−Ｂ
式１
又は薬学的に許容されるその塩。
（式中、
Ａは、式３の置換アリール基であるジカルボニル捕捉部分であり、
【化１】
0006661533.tif 000020
式３
式中、Ｒ７〜Ｒ１１の２個又は３個以上は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１、−ＮＲ’−ＮＨＲ’及び−Ｃ１−６アルキレン−ＮＲ’−ＮＨＲ’から独立に選択され、
残りの基Ｒ７〜Ｒ１１は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−ハロゲン、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＲ１から独立に選択され、
Ｌは、式６のリンカー部分であり、
−（Ｚ１）ｍ−Ｘ１−（Ｚ２）ｔ−
式６
（式中、Ｚ１及びＺ２は、Ｏ、ＮＲ１２、ＮＲ１２−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２、Ｏ−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ及びＳから独立に選択され、
Ｒ１２は、−Ｈ、及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択され、
Ｘ１は、Ｃ１−Ｃ３０アルキレン、Ｃ２−Ｃ３０アルケニレン、Ｃ２−Ｃ３０アルキニレン及びＣ３−Ｃ３０シクロアルキレンから選択され、
ｍ及びｔのそれぞれは、０又は１から独立に選択され、
Ｘ１は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、カルボキシアルキル、シアノ、オキシ、アミノ、アルキルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノ、アルキルカルボニル、ヘテロシクロカルボニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニル、及びヘテロシクロスルホニルからなる群から独立に選択される１個若しくは２個以上の官能基で置換されていてもよい。）
Ｂは、
（ｉ）第四級ホスホニウムカチオンからなるカチオン性ミトコンドリア標的化部分；
（ii）１，４ａ，８−トリアザ−２，３，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフタレン化合物からなるカチオン性ミトコンドリア標的化部分；及び
（iii）式１３のローダミン化合物からなるカチオン性ミトコンドリア標的化部分から選択されるミトコンドリア標的化部分である。
【化２】
0006661533.tif 000021
式１３
（式中、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は、−Ｈ及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ２６及びＲ２７は、−Ｈ又は−ＣＨ３から独立に選択され、
Ｒ２８は、−ＣＯ２Ｒ２９、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２９、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ２９及び−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２９から選択され、
Ｒ２５及びＲ２９の一方は、リンカーＬへの結合であり、Ｒ２５及びＲ２８の他方は、−Ｈ及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択される。）
【請求項２】
式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩が、式１５
【化３】
0006661533.tif 000022
式１５
（式中、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のそれぞれは、置換又は非置換アルキル、ベンジル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択され、前記化合物は、薬学的に許容されるアニオンを含んでいてもよい。）の化合物の塩である請求項１に記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｒ７〜Ｒ１１の１個〜３個は、−Ｈである請求項１又は２に記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
Ｒ７＝−Ｈであり、Ｒ１０＝−Ｈであり、Ｒ１１＝−Ｈであり、Ｒ８及びＲ９は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される請求項１、２又は３に記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
−Ｌ−が、式７
−（Ｚ１）ｍ−（Ｃ１−Ｃ３０）アルキレン−
式７
のリンカー部分である請求項１〜４のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
ｍは、１であり、Ｚ１は、Ｏ及びＣ（Ｏ）ＮＲ１２から選択され、Ｃ１−Ｃ３０アルキレンは、Ｃ３−Ｃ６アルキレンから選択される請求項５に記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
Ｂが、
【化４】
0006661533.tif 000023
式１０
を含む式１０のミトコンドリア標的化部分であり、
式中、
Ｄは、リンであり、
Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のそれぞれは、置換又は非置換アルキル、ベンジル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
Ｂが、トリフェニルホスホニウムカチオンである、請求項１〜７のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項９】
【化５】
0006661533.tif 000024
（式中、Ａｎ−は、任意選択の薬学的に許容されるアニオンを表す）である、請求項１〜８のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、糖尿病の治療剤。
【請求項１３】
糖尿病が、高血糖性糖尿病である、請求項１２に記載の治療剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、外科移植のための器官及び組織の保存剤、又は血液の貯蔵剤。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれかに記載の上記に定義されているような式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、高血糖の予防又は処置剤。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれかに記載の式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、質量分析プローブ剤。
【請求項１７】
質量分析検出のために生物学的分子を標識化する方法であって、前記分子と請求項１〜９のいずれかに記載の化合物とを接触させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
生物学的分子が、ジカルボニル基を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジカルボニル捕捉部分；任意選択のリンカー部分；及びミトコンドリア標的化部分を含む化合物並びに薬学的に許容されるその塩に関する。本発明はまた、このような化合物及び塩を含有する医薬組成物、並びに糖尿病、好ましくは、高血糖性糖尿病を治療するためのこのような化合物及び塩の使用に関する。本発明はまた、質量分析プローブの提供、及び質量分析検出のために生物学的分子を標識化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血糖は、損傷を与える医学的状態である。高血糖は、細胞内の分子の不適当な糖化反応によってその影響を与える。この糖化反応は、反応性１，２−ジカルボニル、例えば、グリオキサール及びメチルグリオキサールの産生に続いて起こる。これらの反応種は細胞中の分子を修飾し、ネガティブな病態をもたらす。
【０００３】
糖タンパク質及び糖ヌクレオチド付加体の非酵素的形成である糖化反応は、細胞機能を撹乱し、一連の病態、例えば、糖尿病、老化及び神経変性における組織の損傷をもたらすことにおいて主要な役割を果たす（Brownlee, M. Negative consequences of glycation. Metabolism-Clin. Experiment. 49:9-13; 2000、Thornalley, P. J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems--role in ageing and disease. Drug Metabol. Drug Interact. 23:125-150; 2008、Pun, P. B.; Murphy, M. P. Pathological significance of mitochondrial glycation. Int. J. Cell Biol. 2012:843505; 2012）。糖化反応は、制御されていない糖尿病において起こるグルコースの上昇に応じて上昇し、糖尿病性合併症の主要な原因である（Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820; 2001、Rabbani, N.; Thornalley, P. J. Glyoxalase in diabetes, obesity and related disorders. Semin. Cell Dev. Biol. 22:309-317; 2011）。細胞内で、過剰なグルコースは、解糖のトリオースリン酸中間体（Brownlee, M. Negative consequences of glycation. Metabolism-Clin. Experiment. 49:9-13; 2000、Phillips, S. A.; Thornalley, P. J. The Formation of methylglyoxal from triose phosphates - investigation using a specific assay for methylglyoxal. Eur. J. Biochem. 212:101-105; 1993）から、又はケトーシスの間に生じるアセトンの代謝（Casazza, J. P.; Felver, M. E.; Veech, R. L. The metabolism of acetone in rat. J. Biol. Chem. 259:231-236; 1984）からの１，２−ジカルボニル化合物、例えば、メチルグリオキサールの形成によって分子の損傷をもたらし得る。これらの反応性１，２−ジカルボニルは、小生体分子、並びにタンパク質及び核酸上の反応性部分を伴う可逆的なヘミアセタール、ヘミチオアセタール及びヘミアミナールを含めて、インサイチュで修飾した化学的形態で存在することが多い（Lo, T. W. C.; Westwood, M. E.; Mclellan, A. C.; Selwood, T.; Thornalley, P. J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions - a kinetic and mechanistic study with N-alpha-acetylarginine, N-alpha-acetylcysteine, and N-alpha-acetyllysine, and bovine serum-albumin. J. Biol. Chem. 269:32299-32305; 1994、Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Evidence of high levels of methylglyoxal in cultured Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5533-5538; 1998）。加えて、これらはタンパク質及び核酸上の遊離アミン官能基と直接反応して、それによって実質的な持続的修飾、例えば、アルギニンに由来するヒドロイミダゾロン、及びタンパク質上のリシン架橋（Thornalley, P. J.; Battah, S.; Ahmed, N.; Karachalias, N.; Agalou, S.; Babaei-Jadidi, R.; Dawnay, A. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochem. J. 375:581-592; 2003）、及びＤＮＡ上のグアニンに由来するイミダゾプリノン（Thornalley, P. J.; Waris, S.; Fleming, T.; Santarius, T.; Larkin, S. J.; Winklhofer-Roob, B. M.; Stratton, M. R.; Rabbani, N. Imidazopurinones are markers of physiological genomic damage linked to DNA instability and glyoxalase 1-associated tumour multidrug resistance. Nucl. Acids Res. 38:5432-5442; 2010）を生じさせることができる。このような修飾は、タンパク質の構造及び活性を変化させることによって、並びにゲノムの変異を誘発することによって、生化学的な機能障害をもたらすと考えられる（Thornalley, P. J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems--role in ageing and disease. Drug Metabol. Drug Interact. 23:125-150; 2008）。糖化反応による損傷のこれらのマーカーは、糖尿病患者からの多く���臨床試料において、及びまた糖尿病及び老化の動物モデルにおいて上昇し（Thornalley, P. J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems--role in ageing and disease. Drug Metabol. Drug Interact. 23:125-150; 2008、Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820; 2001、Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Evidence of high levels of methylglyoxal in cultured Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5533-5538; 1998、Kingkeohoi, S.; Chaplen, F. W. R. Analysis of methylglyoxal metabolism in CHO cells grown in culture. Cytotechnology 48:1-13; 2005、Dhar, A.; Desai, K.; Liu, J. H.; Wu, L. Y. Methylglyoxal, protein binding and biological samples: Are we getting the true measure? J. Chromatog. B 877:1093-1100; 2009）、これは細胞損傷及び病態に対するこれらの反応からの寄与と一致する。病態におけるメチルグリオキサール及びグリオキサールが果たす重要な役割は、これらの２種のジカルボニルを特異的に分解するグリオキサラーゼ酵素系の存在によってさらに支持される（Thornalley, P. J. The glyoxalase system: new developments towards functional characterization of a metabolic pathway fundamental to biological life. Biochem. J. 269:1-11; 1990）。グリオキサラーゼ分解経路の喪失は、生物を糖化反応及びそれに続く損傷に対してより影響されやすくし、一方、その過剰発現はエレガンス線虫（Caenorhabditis elegans）において寿命を延ばす（Morcos, M.; Du, X.; Pfisterer, F.; Hutter, H.; Sayed, A. A.; Thornalley, P.; Ahmed, N.; Baynes, J.; Thorpe, S.; Kukudov, G.; Schlotterer, A.; Bozorgmehr, F.; El Baki, R. A.; Stern, D.; Moehrlen, F.; Ibrahim, Y.; Oikonomou, D.; Hamann, A.; Becker, C.; Zeier, M.; Schwenger, V.; Miftari, N.; Humpert, P.; Hammes, H. P.; Buechler, M.; Bierhaus, A.; Brownlee, M.; Nawroth, P. P. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell 7:260-269; 2008）。このように、タンパク質及び核酸のジカルボニルが関連する糖化反応は、一連の病態、特に、糖尿病又は老化と関連するものにおいて重要な要因である。
【０００４】
高血糖において、病態の一因となるミトコンドリアの損傷及び酸化ストレスの上昇についてのかなりの証拠が存在し、これは部分的にメチルグリオキサール及びグリオキサールによるミトコンドリアの糖化反応のためとされてきた（Green, K.; Brand, M. D.; Murphy, M. P. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes. Diabetes 53 Suppl 1:S110-118; 2004、Yoon, Y.; Galloway, C. A.; Jhun, B. S.; Yu, T. Mitochondrial dynamics in diabetes. Antioxid. Redox Signal. 14:439-457; 2011、Newsholme, P.; Gaudel, C.; Krause, M. Mitochondria and diabetes. An intriguing pathogenetic role. Adv. Exp. Med. Biol. 942:235-247; 2012、Baynes, J. W.; Thorpe, S. R. Role of oxidative stress in diabetic complications - A new perspective on an old paradigm. Diabetes 48:1-9; 1999、Rosca, M. G.; Mustata, T. G.; Kinter, M. T.; Ozdemir, A. M.; Kern, T. S.; Szweda, L. I.; Brownlee, M.; Monnier, V. M.; Weiss, M. F. Glycation of mitochondrial proteins from diabetic rat kidney is associated with excess superoxide formation. Amer. J. Physiol. 289:F420-F430; 2005、Ceriello, A.; Ihnat, M. A.; Thorpe, J. E. The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications? J. Clin. Endocrinol. Metab. 94:410-415; 2009）。さらに、これらの反応性ジカルボニルは、ミトコンドリア機能をインビトロで撹乱する（Ray, S.; Dutta, S.; Halder, J.; Ray, M. Inhibition of electron flow-through complex I of the mitochondrial respiratory-chain of Ehrlich ascites-carcinoma cells by methylglyoxal. Biochem. J. 303:69-72; 1994、Biswas, S.; Ray, M.; Misra, S.; Dutta, D. P.; Ray, S. Selective inhibition of mitochondrial respiration and glycolysis in human leukaemic leucocytes by methylglyoxal. Biochem. J. 323 ( Pt 2):343-348; 1997、Rosca, M. G.; Monnier, V. M.; Szweda, L. I.; Weiss, M. F. Alterations in renal mitochondrial respiration in response to the reactive oxoaldehyde methylglyoxal. Am. J. Physiol. 283:F52-59; 2002）。したがって、反応性ジカルボニルによる糖化反応の損傷が及ぼすミトコンドリア機能障害への寄与を理解することは、高血糖と関連する病態を分析及び理解するために重要である。しかし、機構的な詳細は不確定であり、これらのプロセスの重要性を特に評価することは困難であることが証明されてきた。これは部分的に、細胞質ゾル及びミトコンドリアの間のメチルグリオキサール及びグリオキサールの分布に関する不確実性によるものである。高血糖の影響を抑制する公知のアプローチにおいて、反応性グアニジン基を使用することが試みられてきた。これは、一般化された「モッピング」アプローチを形成する。グアニジン基は、グリオキサール／メチルグリオキサール基と反応する。しかし、このグアニジンアプローチは完全に標的とされていない。これは当技術分野において欠点である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Brownlee, M. Negative consequences of glycation. Metabolism-Clin. Experiment. 49:9-13; 2000
【非特許文献２】Thornalley, P. J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems--role in ageing and disease. Drug Metabol. Drug Interact. 23:125-150; 2008
【非特許文献３】Pun, P. B.; Murphy, M. P. Pathological significance of mitochondrial glycation. Int. J. Cell Biol. 2012:843505; 2012
【非特許文献４】Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature 414:813-820; 2001
【非特許文献５】Rabbani, N.; Thornalley, P. J. Glyoxalase in diabetes, obesity and related disorders. Semin. Cell Dev. Biol. 22:309-317; 2011
【非特許文献６】Phillips, S. A.; Thornalley, P. J. The Formation of methylglyoxal from triose phosphates - investigation using a specific assay for methylglyoxal. Eur. J. Biochem. 212:101-105; 1993
【非特許文献７】Casazza, J. P.; Felver, M. E.; Veech, R. L. The metabolism of acetone in rat. J. Biol. Chem. 259:231-236; 1984
【非特許文献８】Lo, T. W. C.; Westwood, M. E.; Mclellan, A. C.; Selwood, T.; Thornalley, P. J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions - a kinetic and mechanistic study with N-alpha-acetylarginine, N-alpha-acetylcysteine, and N-alpha-acetyllysine, and bovine serum-albumin. J. Biol. Chem. 269:32299-32305; 1994
【非特許文献９】Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Evidence of high levels of methylglyoxal in cultured Chinese hamster ovary cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5533-5538; 1998
【非特許文献１０】Thornalley, P. J.; Battah, S.; Ahmed, N.; Karachalias, N.; Agalou, S.; Babaei-Jadidi, R.; Dawnay, A. Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry. Biochem. J. 375:581-592; 2003
【非特許文献１１】Thornalley, P. J.; Waris, S.; Fleming, T.; Santarius, T.; Larkin, S. J.; Winklhofer-Roob, B. M.; Stratton, M. R.; Rabbani, N. Imidazopurinones are markers of physiological genomic damage linked to DNA instability and glyoxalase 1-associated tumour multidrug resistance. Nucl. Acids Res. 38:5432-5442; 2010
【非特許文献１２】Kingkeohoi, S.; Chaplen, F. W. R. Analysis of methylglyoxal metabolism in CHO cells grown in culture. Cytotechnology 48:1-13; 2005
【非特許文献１３】Dhar, A.; Desai, K.; Liu, J. H.; Wu, L. Y. Methylglyoxal, protein binding and biological samples: Are we getting the true measure? J. Chromatog. B 877:1093-1100; 2009
【非特許文献１４】Thornalley, P. J. The glyoxalase system: new developments towards functional characterization of a metabolic pathway fundamental to biological life. Biochem. J. 269:1-11; 1990
【非特許文献１５】Morcos, M.; Du, X.; Pfisterer, F.; Hutter, H.; Sayed, A. A.; Thornalley, P.; Ahmed, N.; Baynes, J.; Thorpe, S.; Kukudov, G.; Schlotterer, A.; Bozorgmehr, F.; El Baki, R. A.; Stern, D.; Moehrlen, F.; Ibrahim, Y.; Oikonomou, D.; Hamann, A.; Becker, C.; Zeier, M.; Schwenger, V.; Miftari, N.; Humpert, P.; Hammes, H. P.; Buechler, M.; Bierhaus, A.; Brownlee, M.; Nawroth, P. P. Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell 7:260-269; 2008
【非特許文献１６】Green, K.; Brand, M. D.; Murphy, M. P. Prevention of mitochondrial oxidative damage as a therapeutic strategy in diabetes. Diabetes 53 Suppl 1:S110-118; 2004
【非特許文献１７】Yoon, Y.; Galloway, C. A.; Jhun, B. S.; Yu, T. Mitochondrial dynamics in diabetes. Antioxid. Redox Signal. 14:439-457; 2011
【非特許文献１８】Newsholme, P.; Gaudel, C.; Krause, M. Mitochondria and diabetes. An intriguing pathogenetic role. Adv. Exp. Med. Biol. 942:235-247; 2012
【非特許文献１９】Baynes, J. W.; Thorpe, S. R. Role of oxidative stress in diabetic complications - A new perspective on an old paradigm. Diabetes 48:1-9; 1999
【非特許文献２０】Rosca, M. G.; Mustata, T. G.; Kinter, M. T.; Ozdemir, A. M.; Kern, T. S.; Szweda, L. I.; Brownlee, M.; Monnier, V. M.; Weiss, M. F. Glycation of mitochondrial proteins from diabetic rat kidney is associated with excess superoxide formation. Amer. J. Physiol. 289:F420-F430; 2005
【非特許文献２１】Ceriello, A.; Ihnat, M. A.; Thorpe, J. E. The "metabolic memory": is more than just tight glucose control necessary to prevent diabetic complications? J. Clin. Endocrinol. Metab. 94:410-415; 2009
【非特許文献２２】Ray, S.; Dutta, S.; Halder, J.; Ray, M. Inhibition of electron flow-through complex I of the mitochondrial respiratory-chain of Ehrlich ascites-carcinoma cells by methylglyoxal. Biochem. J. 303:69-72; 1994
【非特許文献２３】Biswas, S.; Ray, M.; Misra, S.; Dutta, D. P.; Ray, S. Selective inhibition of mitochondrial respiration and glycolysis in human leukaemic leucocytes by methylglyoxal. Biochem. J. 323 ( Pt 2):343-348; 1997
【非特許文献２４】Rosca, M. G.; Monnier, V. M.; Szweda, L. I.; Weiss, M. F. Alterations in renal mitochondrial respiration in response to the reactive oxoaldehyde methylglyoxal. Am. J. Physiol. 283:F52-59; 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来技術と関連する問題（複数可）の取組みにおいて、本発明者らによって提供される解決策は、高血糖の条件下でミトコンドリア内に見出されるジカルボニルを捕捉することができる分子の群を特異的に標的とする本発明の化合物を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これらの化合物は、標的化部分を捕捉部分にカップリングさせ、その結果、化合物はミトコンドリアにおいて優先的に蓄積し、これらの化合物は、反応性ジカルボニルによってもたらされる損傷を低減及び／又は予防することにおいて最大に有効である。任意選択で、捕捉部分は、リンカー部分を介して標的化部分に結合し得る。ミトコンドリア内の反応性基を捕捉するアプローチは新規であることに留意すべきである。このアプローチは、任意の公知の治療において意図されてこなかった。ミトコンドリア自体内の反応性基を捕捉するという本発明の基礎をなすアプローチは、公知の技術からの脱却であることに留意すべきである。これら及び他の利点は、下記で例示するように本発明から得られる。
【０００８】
このように、広範な態様において、本発明は、式１の化合物：
Ａ−Ｌ−Ｂ
式１
又は薬学的に許容されるその塩に関し、式中、
Ａは、置換アリール基又は置換ヘテロアリール基を含むジカルボニル捕捉部分であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
Ｂは、ミトコンドリア標的化部分であり、
置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨ２、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−１Ｘ−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−ＮＨＣＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含み、
置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−ハロゲン、−１Ｘ−ＯＨ、−１Ｘ−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−１Ｘ−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−１Ｘ−ＣＯ２Ｒ１、−１Ｘ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−１Ｘ−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＲ１から選択される１個又は２個以上の任意選択の置換基を含んでいてもよく、
各Ｒ１は、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、及び式２
【０００９】
【化１】
0006661533.tif 000002
式2
【００１０】
から独立に選択され、
式中、各基Ｒ２〜Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−ハロゲン、−ＯＨ、−１Ｘ−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−１Ｘ−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＲ’Ｒ’、−１Ｘ−ＮＲ’Ｒ’、−１Ｘ−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨ２、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−１Ｘ−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−１Ｘ−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−１Ｘ−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−１Ｘ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−１Ｘ−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１−６アルキル、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＣ１−６アルキルから独立に選択され、
各Ｒ’は、−Ｈ及び−Ｃ１−６アルキルから独立に選択され、
各１Ｘは、Ｃ１−６アルキレン、Ｃ２−６アルケニレン及びＣ２−６アルキニレンから独立に選択される。
【００１１】
一態様において、本発明は、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、医薬として使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、糖尿病、好ましくは、高血糖性糖尿病の治療において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、糖尿病、好ましくは、高血糖性糖尿病の処置のための医薬の調製のための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、対象において疾患又は状態を治療する方法であって、対象に有効量の上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を投与することを含み、疾患又は状態は、糖尿病、好ましくは、高血糖性糖尿病である、方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、外科移植のための器官及び組織の保存において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１７】
本発明のさらなる態様は、血液の貯蔵において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、高血糖の予防又は治療において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、質量分析プローブとして使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様は、質量分析検出のための生物学的分子を標識化する方法であって、前記分子と式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩とを接触させることを含む、方法を提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
「置換された」は、化学的置換基又は部分（例えば、アルキル基）と関連して使用されるとき、置換基又は部分の１個又は２個以上の水素原子が、１個又は２個以上の非水素原子又は基で置き換えられているが、ただし、原子価の必要条件が満たされており、化学的に安定的な化合物が置換からもたらされることを意味する。
【００２２】
「アルキル」は、特定の数の炭素原子を一般に有する直鎖及び分岐状の飽和炭化水素基を指す（例えば、Ｃ１−３アルキルは、１〜３個の炭素原子を有するアルキル基を指し、Ｃ１−６アルキルは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を指す、など）。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンタ−１−イル、ペンタ−２−イル、ペンタ−３−イル、３−メチルブタ−１−イル、３−メチルブタ−２−イル、２−メチルブタ−２−イル、２，２，２−トリメチルエタ−１−イル、ｎ−ヘキシルなどが含まれる。
【００２３】
「アルキレン」は、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−によって例示されるような、直鎖又は分岐状であり得るアルカンに由来する二価ラジカルを指す。
【００２４】
用語「シクロアルキル」は、それ自体で又は他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、「アルキル」の環状バージョンを表す。シクロアルキルの例には、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが含まれる。
【００２５】
用語「アルケニル」は、本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、エテニル、プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニルなどを含めた、少なくとも１個の二重結合を有する炭化水素ラジカルを意味する。
【００２６】
用語「アルケニレン」は、−ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ−、又は−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−によって例示されるような、１個又は２個以上の二重結合を含有する直鎖又は分岐状でよいアルケニルに由来する二価ラジカルを指す。
【００２７】
用語「アルキニル」は、本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、エチニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニルなどを含めた、少なくとも１個の三重結合を有する炭化水素ラジカルを意味する。
【００２８】
用語「アルキニレン」は、エチン−１，２−ジイルによって例示されるような、１個又は２個以上の炭素−炭素三重結合を含有する直鎖状又は分岐状であり得る二価不飽和炭化水素基を指す。
【００２９】
「アリール」は、単独で、又は他の用語と組み合わせて用いられて（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）、完全不飽和単環式芳香族炭化水素、及び少なくとも１個の芳香族環を有する多環式炭化水素を指し、単環式及び多環式の両方のアリール基は一般に、これらの環員を構成する特定の数の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−１４アリールは、環員として６〜１４個の炭素原子を有するアリール基を指す）。アリール基は、このような結合又は置換が原子価の必要条件に違反しない限り、親基に、又は任意の環原子における基質に結合してもよく、且つ１個又は２個以上の非水素置換基を含み得る。アリール基の例には、フェニル、ビフェニル、シクロブタベンゼニル、インデニル、ナフタレニル、ベンゾシクロヘプテニル、ビフェニレニル、フルオレニル、シクロヘプタトリエンカチオンに由来する基などが含まれる。
【００３０】
「アリーレン」は、アリール基に由来する二価ラジカルを指す。
【００３１】
用語「アルコキシ」は、本明細書において使用する場合、Ｏ−アルキル基を意味し、「アルキル」は上記で定義する。
【００３２】
用語「アラルキル」又は「アリールアルキル」は、アリール−アルキル基を意味し、ここで、アリール及びアルキルは従前に記載した通りである。好ましいアラルキルは、アリール基に結合した低級アルキル基を含む。適切なアラルキル基の非限定的例には、フェニルメチレン、２−フェネチル及びナフタレニルメチルが含まれる。親部分への結合は、アルキルを介してである。
【００３３】
「シクロアルキル」は、環（複数可）を構成する特定の数の炭素原子を一般に有する飽和単環式及び二環式炭化水素基を指す（例えば、Ｃ３−８シクロアルキルは、環員として３〜８個の炭素原子を有するシクロアルキル基を指す）。二環式炭化水素基は、分離した環（炭素原子を共有しない２個の環）、スピロ環（１個の炭素原子を共有する２個の環）、縮合環（２個の炭素原子、及び２個の共通の炭素原子の間の結合を共有する２個の環）、及び架橋環（２個の炭素原子を共有するが、共通の結合を共有しない２個の環）を含み得る。シクロアルキル基は、このような結合が原子価の必要条件に違反しない限り、親基に、又は任意の環原子における基質に結合してもよい。さらに、シクロアルキル基は、このような置換が原子価の必要条件に違反しない限り、１個又は２個以上の非水素置換基を含み得る。
【００３４】
単環式シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが含まれる。縮合二環式シクロアルキル基の例には、ビシクロ［２．１．０］ペンタニル（すなわち、ビシクロ［２．１．０］ペンタン−１−イル、ビシクロ［２．１．０］ペンタン−２−イル、及びビシクロ［２．１．０］ペンタン−５−イル）、ビシクロ［３．１．０］ヘキサニル、ビシクロ［３．２．０］ヘプタニル、ビシクロ［４．１．０］ヘプタニル、ビシクロ［３．３．０］オクタニル、ビシクロ［４．２．０］オクタニル、ビシクロ［４．３．０］ノナニル、ビシクロ［４．４．０］デカニルなどが含まれる。架橋シクロアルキル基の例には、ビシクロ［２．１．１］ヘキサニル、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル、ビシクロ［３．１．１］ヘプタニル、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、ビシクロ［３．２．１］オクタニル、ビシクロ［４．１．１］オクタニル、ビシクロ［３．３．１］ノナニル、ビシクロ［４．２．１］ノナニル、ビシクロ［３．３．２］デカニル、ビシクロ［４．２．２］デカニル、ビシクロ［４．３．１］デカニル、ビシクロ［３．３．３］ウンデカニル、ビシクロ［４．３．２］ウンデカニル、ビシクロ［４．３．３］ドデカニルなどが含まれる。スピロシクロアルキル基の例には、スピロ［３．３］ヘプタニル、スピロ［２．４］ヘプタニル、スピロ［３．４］オクタニル、スピロ［２．５］オクタニル、スピロ［３．５］ノナニルなどが含まれる。単離した二環式シクロアルキル基の例には、ビ（シクロブタン）、シクロブタンシクロペンタン、ビ（シクロペンタン）、シクロブタンシクロヘキサン、シクロペンタンシクロヘキサン、ビ（シクロヘキサン）などに由来するものが含まれる。
【００３５】
「薬物」、「薬物物質」、「活性医薬成分」などは、治療を必要とする対象を治療するために使用し得る化合物（例えば、式１の化合物及び上で特に名前を挙げた化合物）を指す。
【００３６】
「賦形剤」は、薬物の生物学的利用能に影響を与え得るが、その他の点で薬理学的に不活性である任意の物質を指す。
【００３７】
「ハロ」、「ハロゲン」及び「ハロゲノ」は互換的に使用されてもよく、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。さらに、「フルオロアルキル」などの用語は、モノフルオロアルキル及びポリフルオロアルキルを含むことを意味する。
【００３８】
「ヘテロアリール」は、不飽和単環式芳香族基、及び少なくとも１個の芳香族環を有する多環式基を指し、基のそれぞれは、炭素原子、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子からなる環原子を有する。単環式及び多環式基の両方は一般に、環員として特定の数の炭素原子を有し（例えば、Ｃ１−９ヘテロアリールは、環員として１〜９個の炭素原子及び１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロアリール基を指す）、且つ任意の二環式基を含んでもよく、ここでは上で挙げた単環式複素環のいずれかがベンゼン環に縮合している。ヘテロアリール基は、このような結合又は置換が、原子価の必要条件に違反し、又は化学的に不安定な化合物をもたらさない限り、親基に、又は任意の環原子における基質に結合してもよく、且つ１個又は２個以上の非水素置換基を含み得る。ヘテロアリール基の例には、単環式基、例えば、ピロリル（例えば、ピロール−１−イル、ピロール−２−イル、及びピロール−３−イル）、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、イソオキサゾリル、オキサゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、１−オキサ−２，３−ジアゾリル、１−オキサ−２，４−ジアゾリル、１−オキサ−２，５−ジアゾリル、１−オキサ−３，４−ジアゾリル、１−チア−２，３−ジアゾリル、１−チア−２，４−ジアゾリル、１−チア−２，５−ジアゾリル、１−チア−３，４−ジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、及びピラジニルが含まれる。
【００３９】
ヘテロアリール基の例にはまた、二環式基、例えば、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾ［ｃ］チオフェニル、インドリル、３Ｈ−インドリル、イソインドリル、１Ｈ−イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、ベンゾイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、クロマニル、２−フェニルクロマニル、３−フェニルクロマニル、４−フェニルクロマニル、クロメン−４−オニル、２−フェニルクロメン−４−オニル、３−フェニルクロメン−４−オニル、クマリニル、３−フェニルクマリニル、４−フェニルクマリニル、１，８−ビス［２−クロマニル］−６−ベンゾ［７］アヌレオニル、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジニル、１Ｈ−ピロロ［２，３−ｃ］ピリジニル、１Ｈ−ピロロ［３，２−ｃ］ピリジニル、１Ｈ−ピロロ［３，２−ｂ］ピリジニル、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジニル、３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジニル、１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｂ］ピリジニル、１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジニル、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジニル、１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジニル、７Ｈ−プリニル、インドリジニル、イミダゾ［１，２−ｃ］ピリジニル、イミダゾ［１，５−ｃ］ピリジニル、ピラゾロ［１，５−ｃ］ピリジニル、ピロロ［１，２−ｂ］ピリダジニル、イミダゾ［１，２−ｃ］ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、フタラジニル、１，６−ナフチリジニル、１，７−ナフチリジニル、１，８−ナフチリジニル、１，５−ナフチリジニル、２，６−ナフチリジニル、２，７−ナフチリジニル、ピリド［３，２−ｃ］ピリミジニル、ピリド［４，３−ｃ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｃ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｃ］ピリミジニル、ピリド［２，３−ｂ］ピラジニル、ピリド［３，４−ｂ］ピラジニル、ピリミド［５，４−ｃ］ピリミジニル、ピラジノ［２，３−ｂ］ピラジニル、及びピリミド［４，５−ｃ］ピリミジニルが含まれる。
【００４０】
「複素環」及び「ヘテロシクリル」は、互換的に使用してもよく、炭素原子、並びに窒素、酸素、及び硫黄から独立に選択される１〜４個のヘテロ原子からなる環原子を有する、飽和又は部分不飽和の単環式又は二環式基を指す。単環式及び二環式基の両方は一般に、これらの環（複数可）中に特定の数の炭素原子を有する（例えば、Ｃ２−５ヘテロシクリルは、環員として２〜５個の炭素原子及び１〜４個のヘテロ原子を有するヘテロシクリル基を指す）。二環式シクロアルキル基と同様に、二環式ヘテロシクリル基は、分離した環、スピロ環、縮合環、及び架橋環を含み得る。ヘテロシクリル基は、このような結合又は置換が原子価の必要条件に違反しない限り、又は化学的に不安定な化合物をもたらさない限り、親基に、又は任意の環原子における基質に結合してもよく、且つ１個又は２個以上の非水素置換基を含み得る。単環式ヘテロシクリル基の例には、オキシラニル、チアラニル、アジリジニル（例えば、アジリジン−１−イル及びアジリジン−２−イル）、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、ピロリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペリジニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル、１，４−ジチアニル、ピペラジニル、１，４−アザチアニル、オキセパニル、チエパニル、アゼパニル、１，４−ジオキセパニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキサアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チアゼパニル、１，４−ジアゼパニル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、１，２，３，４−テトラヒドロピリジニル、及び１，２，５，６−テトラヒドロピリジニルが含まれる。
【００４１】
「薬学的に許容される」物質は、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などを伴わず、合理的な利益対リスク比と釣り合っており、且つこれらの使用目的のために有効である、対象の組織と接触させて使用するのに適した正しい医学的判断の範囲内であるこれらの物質を指す。
【００４２】
「医薬組成物」は、１種又は２種以上の薬物物質及び１種又は２種以上の賦形剤の組合せを指す。
【００４３】
用語「スルホニル」は、ラジカル−Ｓ（Ｏ）２Ｒを指し、Ｒは、本明細書に定義されているようなアルキル、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、又は置換ヘテロアリール基である。代表的な例には、これらに限定されないが、メチルスルホニル、エチルスルホニル、プロピルスルホニル、ブチルスルホニルなどが含まれる。
【００４４】
用語「スルフィニル」は、ラジカル−Ｓ（Ｏ）Ｒを指し、Ｒは、本明細書に定義されているようなアルキル、置換アルキル、置換シクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、置換アリール、又は置換ヘテロアリール基である。代表的な例には、これらに限定されないが、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、プロピルスルフィニル、ブチルスルフィニルなどが含まれる。
【００４５】
用語「対象」は、本明細書において使用する場合、ヒト又は非ヒト哺乳動物を指す。非ヒト哺乳動物の例には、家畜動物、例えば、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、シカ、ダチョウ及びエミュー；並びにペット動物、例えば、ネコ、イヌ、げっ歯類、及びウマが含まれる。
【００４６】
薬物の「治療有効量」は、対象を治療するために使用し得る薬物の量を指し、他の事項の中でも対象の体重及び年齢、並びに投与経路によって決まり得る。
【００４７】
「治療する」は、このような用語に適用する障害、疾患若しくは状態を回復させるか、軽減するか、その進行を阻害するか、又は予防するか、或いはこのような障害、疾患若しくは状態の１つ若しくは２以上の症状を回復させるか、軽減するか、その進行を阻害するか、又は予防することを指す。
【００４８】
「治療」は、直前に定義したような「治療する」行為を指す。
【００４９】
本明細書において使用する場合、用語「含むこと」は、「から少なくとも部分的になること」を意味する。用語「含むこと」を含む本明細書における各記述を解釈するとき、この用語が前置きされたもの（複数可）以外の特徴がまた存在し得る。関連する用語、例えば、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」は、同じ様式で解釈される。
【００５０】
ジカルボニル捕捉部分
ジカルボニル捕捉部分Ａは、置換アリール基又は置換ヘテロアリール基を含む。ジカルボニル捕捉部分は、ジカルボニル分子、適切には、１，２−ジカルボニル分子と安定的な化合物、例えば、キノキサリン化合物を形成する部分である。ジカルボニル捕捉部分を使用して、生物系、例えば、細胞中に見出される希薄溶液中のジカルボニル分子を捕捉する。ジカルボニル捕捉部分が細胞中で見出される条件下でジカルボニル分子と安定的な化合物を形成するために、ジカルボニル捕捉部分は、水中において体温で低濃度にてジカルボニル分子と自然発生的に付加体を形成するように十分に求核性でなければならない。生物系の希薄溶液、例えば、細胞中に見出されるものにおいて、ジカルボニル化合物と安定的な化合物を生成する第１のステップは、ヘミアセタール、ヘミアミナール又はヘミチオアセタールを形成することであり、これは平衡状態が出発材料を優先する可逆反応である。
【００５１】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨ２、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−１Ｘ−ＮＲ’−ＮＨＲ’及び−ＮＨＣＯＲ１から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００５２】
適切には、置換アリール基又は置換ヘテロアリール基は、２〜９個の置換基を含む。さらに適切には、置換アリール基又は置換ヘテロアリール基は、２〜８個の置換基；２〜７個の置換基；２〜６個の置換基；又は２〜５個の置換基を含む。
【００５３】
適切には、置換アリール基又は置換ヘテロアリール基は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨ２、−１Ｘ−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−１Ｘ−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−ＮＨＣＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される２〜９個の置換基を含む。
【００５４】
このように、置換基は、ヒドラジン誘導体、例えば、−ＮＨ−ＮＨ２、−ＮＨ−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−１Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨ−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）、−１Ｘ−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−ＮＨ２及び−１Ｘ−Ｎ（Ｃ１−６アルキル）−ＮＨ（Ｃ１−６アルキル）を含み得る。
【００５５】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００５６】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−１Ｘ−ＮＨ２、−１Ｘ−ＮＨＲ１及び−ＮＨＣＯＲ１から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００５７】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１、及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００５８】
より適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２及び−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００５９】
より適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−ＮＨ２及び−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２から独立に選択される２個又は３個以上の置換基を含む。
【００６０】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、任意選択の置換基の１〜７個；任意選択の置換基の１〜６個；任意選択の置換基の１〜５個；任意選択の置換基の１〜４個；任意選択の置換基の１〜３個を含む。
【００６１】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−ハロゲン、−１Ｘ−ＯＨ、−１Ｘ−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−１Ｘ−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−１Ｘ−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＲ１から選択される任意選択の置換基の１個又は２個以上を含む。
【００６２】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−Ｃ１−６アルキル、−ハロゲン、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨＯ及び−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＲ１から選択される任意選択の置換基の１個又は２個以上を含む。
【００６３】
適切には、置換アリール基、又は置換ヘテロアリール基は、−Ｃ１−６アルキル、−ハロゲン、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１から選択される任意選択の置換基の１個又は２個以上を含む。
【００６４】
さらに適切には、Ｒ１は、−Ｃ１−６アルキルである。さらに適切には、Ｒ１は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル及びｔ−ブチルから選択される。
【００６５】
さらに適切には、Ｒ１は、式２の構造を有し、
【００６６】
【化２】
0006661533.tif 000003
式2
【００６７】
式中、各基Ｒ２〜Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−ハロゲン、−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＮＨ２、−（Ｃ１−Ｃ６）アルキレン−ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ及び−ＣＯ２Ｃ１−６アルキルから独立に選択される。
【００６８】
さらに適切には、Ｒ２〜Ｒ６の２個又は３個以上は、−Ｈである。
【００６９】
さらに適切には、Ｒ２及びＲ６は、−Ｈである。
【００７０】
さらに適切には、Ｒ２及びＲ６は、−Ｈであり、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５は、−ＯＨである。
【００７１】
適切には、Ａは、置換フェニル、ビフェニル及びナフタレニルから選択される置換アリール基；又は置換ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、クロマニル、２−フェニルクロマニル、３−フェニルクロマニル、４−フェニルクロマニル、クロメン−４−オンリ、２−フェニルクロメン−４−オンリ、３−フェニルクロメン−４−オンリ、クマリニル、３−フェニルクマリニル、４−フェニルクマリニル及び１，８−ビス［２−クロマニル］−６−ベンゾ［７］アンヌレオニルから選択される置換ヘテロアリール基を含むジカルボニル捕捉部分である。
【００７２】
さらに適切には、Ａは、置換フェニル及びナフタレニルから選択される置換アリール基；又は置換ピリジニル、クロマニル、２−フェニルクロマニル、３−フェニルクロマニル、４−フェニルクロマニル、クロメン−４−オンリ、２−フェニルクロメン−４−オンリ、３−フェニルクロメン−４−オンリ、クマリニル、３−フェニルクマリニル、４−フェニルクマリニル及び１，８−ビス［２−クロマニル］−６−ベンゾ［７］アンヌレオニルから選択される置換ヘテロアリール基を含むジカルボニル捕捉部分である。
【００７３】
さらに適切には、Ａは、置換フェニル及びナフタレニルから選択される置換アリール基；又は置換ピリジニルから選択される置換ヘテロアリール基を含むジカルボニル捕捉部分である。
【００７４】
さらに適切には、ジカルボニル捕捉部分Ａは、置換フェニルである。
【００７５】
さらに適切には、ジカルボニル捕捉部分Ａは、２〜５個の置換基；さらに適切には、２〜４個の置換基；さらに適切には、２〜３個の置換基を含む置換フェニルである。
【００７６】
さらに適切には、ジカルボニル捕捉部分Ａは、式３を含む置換アリール基であり、
【００７７】
【化３】
0006661533.tif 000004
式3
【００７８】
式中、Ｒ７〜Ｒ１１の２個又は３個以上は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−ＮＲ１Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＮＲ’−ＮＨＲ’、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＲ’−ＮＨＲ’から独立に選択され、
残りの基Ｒ７〜Ｒ１１は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ２−６アルキニル、−ハロゲン、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＯ２Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−ＣＨＯ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１、−ＳＯ２ＮＨ２及び−ＳＯ２ＮＨＲ１から独立に選択される。
【００７９】
より適切には、Ｒ７〜Ｒ１１の２個又は３個以上は、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から独立に選択される。
【００８０】
より適切には、Ｒ７〜Ｒ１１の２個又は３個以上は、−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ２及び−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から独立に選択され、残りの基Ｒ７〜Ｒ１１は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｃ１−６アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−６アルキル、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−６アルキル及び−ＣＨＯから独立に選択される。
【００８１】
適切には、Ｒ７〜Ｒ１１の１個〜３個は、−Ｈである。
【００８２】
より適切には、Ｒ７〜Ｒ１１の２個又は３個以上は、−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ２及び−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から独立に選択され、残りの基Ｒ７〜Ｒ１１は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ及び−Ｃ１−６アルキレン−ＯＣ１−６アルキルから独立に選択される。
【００８３】
さらに適切には、Ｒ７＝−Ｈであり、Ｒ１０＝−Ｈであり、Ｒ１１＝−Ｈであり、Ｒ８及びＲ９は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−ＮＨＲ１、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｏ−ＮＨＲ１、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨ２、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−ＮＨＲ１、−ＮＨＣＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される。
【００８４】
さらに適切には、Ｒ７＝−Ｈであり、Ｒ１０＝−Ｈであり、Ｒ１１＝−Ｈであり、Ｒ８及びＲ９は、ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ６アルキル、−ＮＨ２、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ２及び−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）から独立に選択される。
【００８５】
さらに適切には、Ｒ７＝−Ｈであり、Ｒ１０＝−Ｈであり、Ｒ１１＝−Ｈであり、Ｒ８及びＲ９は、−ＯＨ、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＯＨ、−ＮＨ２及び−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ＮＨ２から独立に選択される。
【００８６】
さらに適切には、Ｒ７＝−Ｈであり、Ｒ８＝−ＮＨ２であり、Ｒ９＝−ＮＨ２であり、Ｒ１０＝−Ｈであり、Ｒ１１＝−Ｈである。これは、式４のジカルボニル捕捉部分Ａをもたらす。
【００８７】
【化４】
0006661533.tif 000005
式4
【００８８】
一態様において、ジカルボニル捕捉部分Ａは、置換クロマニル、２−フェニルクロマニル、３−フェニルクロマニル、４−フェニルクロマニル、クロメン−４−オンリ、２−フェニルクロメン−４−オンリ、３−フェニルクロメン−４−オンリ、クマリニル、３−フェニルクマリニル、４−フェニルクマリニル及び１，８−ビス［２−クロマニル］−６−ベンゾ［７］アンヌレオニルから選択されるヘテロアリール基を含む、置換フラボノイド又はテアフラビン化合物を含む。
【００８９】
様々なフラボノイド又はテアフラビン化合物による、グリオキサール及びメチルグリオキサールなどの種のトラップが記載されてきた（Wu C.H.; Yen G.C.; Inhibitory effect of naturally occurring flavonoids on the formation of advanced glycation endproducts. J Agric Food Chem., 53, 3167-73; 2005、Lo C.T.; Li S.; Tan D.; Pan M.H.; Ho C.T.; Trapping reactions of reactive carbonyl species with tea polyphenols in simulated physiological conditions. Mol Nutr Food Res., 50, 1118-28; 2006. 、Tan D.; Wang Y.; Lo C.Y.; Ho C.T.; Methylglyoxal: its presence and potential scavengers）。
【００９０】
さらに適切には、置換フラボノイド又はテアフラビン化合物は、−ＯＨ、−ＯＲ１、−ＮＨＣＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される１個又は２個以上の置換基を含み、−Ｃ１−６アルキル、−ハロゲン、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｒ１、−ＣＨ（ＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１及び−ＣＨＯから選択される１個又は２個以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｒ１は、−Ｃ１−６アルキルであるか、又は式２を有し、
【００９１】
【化５】
0006661533.tif 000006
式2
【００９２】
式中、各基Ｒ２〜Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル、−ハロゲン、−ＯＨ及び−Ｏ−Ｃ１−６アルキルから独立に選択される。
【００９３】
さらに適切には、置換フラボノイド化合物は、−ＯＨ、−ＯＲ１及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ１から独立に選択される１個又は２個以上の置換基を含み、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ１−６アルキレン−ＯＨ、−Ｃ１−６アルキレン−Ｏ−Ｒ１、−ＣＯ２Ｈ及び−ＣＯ２Ｒ１から選択される１個又は２個以上の置換基を含んでいてもよく、
Ｒ１は、−Ｃ１−６アルキルであるか、又は式２を有し、
【００９４】
【化６】
0006661533.tif 000007
式2
【００９５】
式中、各基Ｒ２〜Ｒ６は、−Ｈ、−Ｃ１−６アルキル及び−ＯＨから独立に選択される。
【００９６】
いくつかの態様において、Ａは、ベンゾキノン部分を含まないジカルボニル捕捉部分である。
【００９７】
適切には、１Ｘは、Ｃ１−６アルキレン及びＣ２−６アルケニレンから選択される。
【００９８】
さらに適切には、１Ｘは、Ｃ１−６アルキレンである。
【００９９】
ジカルボニル捕捉部分がジカルボニル分子、例えば、メチルグリオキサールと安定的な化合物を形成する能力は、検出システムによる競合アッセイを行うことによって試験することができ（Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal. Biochem. 238:171-178; 1996）、メチルグリオキサールは、ＨＰＬＣによって検出することができる蛍光性産物を生成する。
【０１００】
リンカー部分
リンカー部分−Ｌ−は、二価であり、任意の化学的に非活性の間隔を生じさせる基（スペーサー）でよく、これは、ミトコンドリア標的化部分をジカルボニル捕捉部分に接合し、且つ２つの部分が、形質膜及びミトコンドリア膜を通過するとき、一緒に結合し続けることを可能とする。特に、−Ｌ−は、生理学的条件下で安定的であり、薬学的に許容されなければならない。
【０１０１】
適切には、−Ｌ−は、式５
−（Ｚ１）ｍ−Ｘ１−Ｙｎ−［Ｘ２］ｓ−（Ｚ２）ｔ−
式５
のリンカー部分であり、
式中、
Ｚ１及びＺ２は、Ｏ、ＮＲ１２、ＮＲ１２−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２、Ｏ−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ及びＳから独立に選択され、
Ｙは、Ｏ、ＮＲ１２、ＮＲ１２−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２、Ｏ−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）−Ｏ、Ｓ及びアリーレンから選択され、
Ｒ１２は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル及び−アリールから選択され、
Ｘ１は、Ｃ１−Ｃｐアルキレン、Ｃ２−Ｃｐアルケニレン、Ｃ２−Ｃｐアルキニレン及びＣ３−Ｃｐシクロアルキレンから選択され、
Ｘ２は、Ｃ１−Ｃｑアルキレン、Ｃ２−Ｃｑアルケニレン、Ｃ２−Ｃｑアルキニレン及びＣ３−Ｃｑシクロアルキレンから選択され、
ｍ、ｎ、ｓ及びｔのそれぞれは、０又は１から独立に選択され、
ｐ＋ｑ＝３０であり、Ｘ１及びＸ２は、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、アリール、アミノアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、カルボキシアルキル、シアノ、オキシ、アミノ、アルキルアミノ、アミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノ、アルキルカルボニル、ヘテロシクロカルボニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、アルキルスルホニル、及びヘテロシクロスルホニルからなる群から独立に選択される１個若しくは２個以上の官能基で置換されていてもよいか、又はリンカー基中の隣接する炭素原子の置換基は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、炭素環又は複素環を形成することができる。
【０１０２】
適切には、Ｚ１は、ジカルボニル捕捉部分に隣接しており、Ｚ２は、ミトコンドリア標的化部分に隣接している。
【０１０３】
さらに適切には、Ｘ１は、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ及びアリールカルボニルアミノからなる群から独立に選択される１個又は２個以上の官能基で置換されている。
【０１０４】
さらに適切には、Ｘ２は、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ及びアリールカルボニルアミノからなる群から独立に選択される１個又は２個以上の官能基で置換されている。
【０１０５】
さらに適切には、リンカー部分は、式５のものであり、
Ｚ１及びＺ２は、上記の通りであり、
Ｘ１及びＸ２は、上記の通りであり、
Ｙは、ＮＲ１２−Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＲ１２及びＯ−Ｃ（Ｏ）から選択され、
Ｒ１２は、上記の通りであり、
ｐ＝１２であり、
ｑ＝５であり、
ｍ、ｎ、ｓ及びｔは、上記の通りであり、
Ｘ１及びＸ２は、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ及びアリールカルボニルアミノからなる群から独立に選択される１個又は２個以上の官能基で置換されていてもよい。
【０１０６】
さらに適切には、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃｐアルキレンから選択される。
【０１０７】
さらに適切には、Ｘ２は、Ｃ１−Ｃｐアルキレンから選択される。
【０１０８】
さらに適切には、ｍは、１である。
【０１０９】
さらに適切には、−Ｌ−は、式６
−（Ｚ１）ｍ−Ｘ１−（Ｚ２）ｔ−
式６
のリンカー部分であり、
式中、Ｚ１、ｍ、Ｚ２及びｔは、上記に定義されているのと同じ意味を有し、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃｐアルキレン、Ｃ２−Ｃｐアルケニレン、Ｃ２−Ｃｐアルキニレン及びＣ３−Ｃｐシクロアルキレンから選択され、Ｃｐ＝３０である。
【０１１０】
さらに適切には、−Ｌ−は、式６のリンカー部分であり、Ｚ１及びＺ２は、Ｏ、ＮＲ１２、ＮＲ１２−Ｃ（＝Ｏ）及びＣ（＝Ｏ）ＮＲ１２から独立に選択される。
【０１１１】
さらに適切には、Ｘ１は、Ｃ１−Ｃｐアルキレンから選択される。
【０１１２】
さらに適切には、−Ｌ−は、式６のリンカー部分であり、Ｃｐ＝２５であり、さらに適切には、Ｃｐ＝２０であり、さらに適切には、Ｃｐ＝１５であり、さらに適切には、Ｃｐ＝１２であり、さらに適切には、Ｃｐ＝１０であり、さらに適切には、Ｃｐ＝９であり、さらに適切には、Ｃｐ＝８であり、さらに適切には、Ｃｐ＝７であり、さらに適切には、Ｃｐ＝６である。
【０１１３】
より適切には、−Ｌ−は、式７
−（Ｚ１）ｍ−（Ｃ１−Ｃｐ）アルキレン−
式７
のリンカー部分であり、
式中、Ｚ１及びｍは、上記に定義されているのと同じ意味を有し、Ｃｐ＝３０である。
【０１１４】
適切には、Ｚ１は、ジカルボニル捕捉部分に隣接しており、Ｃ１−Ｃｐアルキレンは、ミトコンドリア標的化部分に隣接している。
【０１１５】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、ｍは、１であり、Ｚ１は、Ｏ及びＣ（Ｏ）ＮＲ１２から選択される。
【０１１６】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、Ｒ１２は、−Ｈ及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択される。
【０１１７】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、ｍは、１であり、Ｚ１は、Ｃ（Ｏ）ＮＨである。
【０１１８】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、Ｃｐ＝２５であり、さらに適切には、Ｃｐ＝２０であり、さらに適切には、Ｃｐ＝１５であり、さらに適切には、Ｃｐ＝１０であり、さらに適切には、Ｃｐ＝９であり、さらに適切には、Ｃｐ＝８であり、さらに適切には、Ｃｐ＝７であり、さらに適切には、Ｃｐ＝６である。
【０１１９】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、Ｃ１−Ｃｐアルキレンは、Ｃ３−Ｃ６アルキレンである。
【０１２０】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、式中、ｍは、１であり、Ｚ１は、Ｏ及びＣ（Ｏ）ＮＲ１２から選択され、Ｃ１−Ｃｐアルキレンは、Ｃ３−Ｃ６アルキレンから選択される。
【０１２１】
さらに適切には、−Ｌ−は、式７のリンカー部分であり、式中、ｍは、１であり、Ｚ１は、Ｃ（Ｏ）ＮＨであり、Ｃ１−Ｃｐアルキレンは、Ｃ３−Ｃ６アルキレンから選択される。
【０１２２】
一態様において、−Ｌ−は、式８
【０１２３】
【化７】
0006661533.tif 000008
式8
【０１２４】
のリンカー部分であり、
式中、Ｒ１３は、Ｃ１−Ｃ６アルキレンであり、Ｒ１４は、Ｃ１−Ｃ６アルキレンである。
【０１２５】
一態様において、−Ｌ−は、式９
【０１２６】
【化８】
0006661533.tif 000009
式9
【０１２７】
のリンカー部分であり、
式中、Ｒ１３は、Ｃ１−Ｃ６アルキレンであり、Ｒ１４は、Ｃ１−Ｃ６アルキレンである。
【０１２８】
さらに適切には、式８又は９について、Ｒ１３は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１２９】
さらに適切には、式８又は９について、Ｒ１４は、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【０１３０】
式８又は９のリンカー部分は、米国特許出願公開第２００９／００９９０８０号明細書に記載されている。
【０１３１】
ミトコンドリア標的化部分
多くのミトコンドリア標的化部分は、当技術分野において公知である。ミトコンドリア標的化部分を含む化合物は、投与に続いて、高濃度でミトコンドリア内に蓄積する。
【０１３２】
ミトコンドリア標的化部分を含む化合物のミトコンドリア内の蓄積は、例えば、形質膜電位及び／又はミトコンドリア膜電位によって推進し得る。このような蓄積は、ネルンスト式によって適正に説明することができることが多く、例えば、トリフェニルホスホニウムカチオンを含む化合物について、典型的な生物学的条件下で、６０ｍＶの膜電位毎に１０倍であり得る（Murphy, M. P. Development of lipophilic cations as therapies for disorders due to mitochondrial dysfunction. Expert Opin. Biol. Ther. 1:753-764; 2001、Smith, R. A.; Hartley, R. C.; Cocheme, H. M.; Murphy, M. P. Mitochondrial pharmacology. Trends Pharmacol. Sci. 33:341-352; 2012、Smith, R. A. J.; Porteous, C. M.; Gane, A. M.; Murphy, M. P. Delivery of bioactive molecules to mitochondria in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5407-5412; 2003）。その結果、ミトコンドリア標的化部分、例えば、トリフェニルホスホニウムカチオンを含む化合物は、それぞれ、３０ｍＶ及び１６０ｍＶの形質膜及びミトコンドリア膜の電位であると仮定すると、ミトコンドリア内でインビボにて数百倍又はそれ超蓄積し得る（Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal. Biochem. 238:171-178; 1996、Yamaguchi, M.; Hara, S.; Nakamura, M. Determination of methylglyoxal in mouse blood by liquid chromatography with fluorescence detection Anal. Chim. Acta 221:163-166; 1989）。
【０１３３】
適切には、ミトコンドリア標的化部分Ｂは、カチオン性ミトコンドリア標的化部分又はミトコンドリア標的化ペプチドである。
【０１３４】
一連のミトコンドリア標的化ペプチドは当技術分野において公知である。適切な例は、米国特許出願公開第２００９／００９９０８０号明細書に開示されている。
【０１３５】
適切には、ミトコンドリア標的化部分Ｂは、カチオン性ミトコンドリア標的化部分である。カチオン性ミトコンドリア標的化部分はまた、薬学的に許容されるアニオンと会合している。
【０１３６】
適切には、アニオンは、酢酸塩、塩酸塩／クロリド、臭化水素酸塩／ブロミド、ヨウ化水素酸塩／ヨージド、重硫酸塩、硫酸塩、メチルスルホン酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩及びトリフルオロ酢酸塩から選択される。
【０１３７】
適切には、ミトコンドリア標的化部分Ｂは、親油性カチオンである。
【０１３８】
親油性カチオンは、大きなエネルギー障壁を克服する必要がないか、又は特異的な取込み機序を必要とすることなしに、リン脂質二重層を容易に直接通過することができ、且つ大きな膜電位によってミトコンドリア内に実質的に蓄積するため、適切なミトコンドリア標的化部分である。
【０１３９】
１つの理論に束縛されるものではないが、親油性カチオンは、十分に大きな濃度勾配が積み重なり、２つのコンパートメント中の分子の電気化学ポテンシャルが同じになるまで、正に帯電している細胞のコンパートメントから負に帯電しているコンパートメント中に取り込まれると考えられる。膜電位が６０ｍＶ増加する毎に、ミトコンドリア内の親油性カチオンは概ね１０倍蓄積する。形質膜は内側で３０〜６０ｍＶの負電位を有するため、親油性カチオンは、細胞質ゾル中で５〜１０倍蓄積する。ミトコンドリア膜電位は典型的には約１４０〜１８０ｍＶであるため、細胞質ゾル内の親油性カチオンは、ミトコンドリア中に蓄積する。
【０１４０】
適切には、ミトコンドリア標的化部分Ｂは、
（ｉ）第四級アンモニウム又はホスホニウムカチオンを含むカチオン性ミトコンドリア標的化部分；
（ii）１，４ａ，８−トリアザ−２，３，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフタレン化合物を含むカチオン性ミトコンドリア標的化部分；及び
（iii）ローダミン化合物を含むカチオン性ミトコンドリア標的化部分
から選択される。
【０１４１】
より適切には、Ｂは、式１０の第四級アンモニウム又はホスホニウムカチオンを含む（ｉ）カチオン性ミトコンドリア標的化部分であり、
【０１４２】
【化９】
0006661533.tif 000010
式10
【０１４３】
式中、
Ｄは、リン、窒素又はヒ素であり、
Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のそれぞれは、置換又は非置換アルキル、ベンジル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。
【０１４４】
より適切には、Ｄは、リンである。
【０１４５】
さらに適切には、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のそれぞれは、置換又は非置換アルキル、ベンジル、フェニル、ナフチル、フラニル、ピリジル及びチオフェニルから独立に選択される。
【０１４６】
さらに適切には、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のいずれかが置換されている場合、置換アルキル、ベンジル、アリール又はヘテロアリールは、−ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＯＣ１−６アルキル、−ＳＣ１−６アルキル、−ＳＰｈ、−Ｃ１−６アルキル、−Ｃ２−６アルケニル、−Ｃ１−６アルキニル、−Ｃ１−６ヒドロキシアルキル、−Ｃ１−６アミノアルキル、−Ｃ６−１８アラルキル、−Ｃ６−１２アリール、−Ｃ３−８シクロアルキル、−Ｃ１−１２ヘテロアリール及び−Ｃ１−１２ヘテロシクリルからなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されている。
【０１４７】
適切には、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７の１個又は２個以上が、置換又は非置換アルキルから独立に選択される場合、各アルキル基は、置換又は非置換Ｃ１−３０アルキルから独立に選択される。さらに適切には、各アルキル基は、置換又は非置換Ｃ１−２５アルキル；置換又は非置換Ｃ１−２０アルキル；置換又は非置換Ｃ１−１５アルキル；置換又は非置換Ｃ１−１０アルキルから独立に選択される。
【０１４８】
より適切には、Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７のそれぞれは、同じである。
【０１４９】
より適切には、各Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は、非置換又は置換アリール基である。
【０１５０】
より適切には、各Ｒ１５、Ｒ１６及びＲ１７は、非置換アリール基である。
【０１５１】
より適切には、各アリール基は、フェニルである。
【０１５２】
最も適切には、Ｂは、式１１を有するトリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）カチオンである。
【０１５３】
【化１０】
0006661533.tif 000011
式11
【０１５４】
ＴＰＰカチオンの疎水性の大きな半径によって、これは他のカチオンに対してリン脂質二重層を容易に通過することが可能となる。
【０１５５】
親油性トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ、triphenylphosphonium）カチオン官能基は、ミトコンドリアを標的とするのに適しており、静脈内、経口又は腹腔内投与に続いて、細胞、動物モデル及び患者におけるミトコンドリアへと多種多様の抗酸化剤、プローブ及び生理活性分子を方向付けることが示されてきた（Murphy, M. P. Development of lipophilic cations as therapies for disorders due to mitochondrial dysfunction. Expert Opin. Biol. Ther. 1:753-764; 2001、Smith, R. A.; Hartley, R. C.; Cocheme, H. M.; Murphy, M. P. Mitochondrial pharmacology. Trends Pharmacol. Sci. 33:341-352; 2012、Smith, R. A. J.; Porteous, C. M.; Gane, A. M.; Murphy, M. P. Delivery of bioactive molecules to mitochondria in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5407-5412; 2003）。取込みはリン脂質二重層を通して直接起こり、タンパク質担体を必要とせず、一方、ミトコンドリア中への蓄積の程度は膜電位によって決定される。
【０１５６】
さらに適切には、Ｂは、（ii）式１２の１，４ａ，８−トリアザ−２，３，４，５，６，７−ヘキサヒドロ−１Ｈ−ナフタレン化合物を含むカチオン性ミトコンドリア標的化部分であり、
【０１５７】
【化１１】
0006661533.tif 000012
式12
【０１５８】
式中、Ｒ１８は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ１−Ｃ６アルケニル、−Ｃ１−Ｃ６アルキニル、−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−ハロゲン、−アリール、−アリール−Ｃ１−Ｃ６アルキル又はＲ１９Ｒ２０Ｒ２１Ｓｉであり、Ｒ１９、Ｒ２０及びＲ２１は、−Ｃ１−Ｃ６アルキル及び−アリールから独立に選択され、ｖは、１、２又は３である。このようなカチオン性ミトコンドリア標的化部分は、米国特許出願公開第２００９／０９９０８０号明細書に記載されている。
【０１５９】
米国特許出願公開第２００９／０９９０８０号明細書において開示されるように、式９のリンカー部分は、式１２のカチオン性ミトコンドリア標的化部分と共に使用するのに適している。
【０１６０】
さらに適切には、Ｂは、（iii）式１３のローダミン化合物を含むカチオン性ミトコンドリア標的化部分であり、
【０１６１】
【化１２】
0006661533.tif 000013
式13
【０１６２】
式中、Ｒ２２、Ｒ２３及びＲ２４は、−Ｈ及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから独立に選択され、
Ｒ２６及びＲ２７は、−Ｈ又は−ＣＨ３から独立に選択され、
Ｒ２８は、−ＣＯ２Ｒ２９、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２９、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲ２９及び−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２９から選択され、
Ｒ２５及びＲ２９の一方は、リンカーＬへの結合であり、Ｒ２５及びＲ２８の他方は、−Ｈ及び−Ｃ１−Ｃ６アルキルから選択される。
【０１６３】
多数のローダミン誘導体、例えば、ローダミン１２３、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１９、ローダミン１１０、及びローダミン１１６は、供給業者、例えば、Acos Organics社、Aldrich社及びFluka社から市販されている。ローダミン誘導体の合成はまた概説されてきた（Beia, M; Afonso, C. A. M.; Martinho, J. M. G.; Synthesis and applications of Rhodamine derivaties as fluorescent probes. Chem. Soc. Rev., 38, 2410-2433, 2009）。
【０１６４】
さらなる式１の化合物
適切には、式１の化合物又は薬学的に許容される塩は、式１４の塩であり、
【０１６５】
【化１３】
0006661533.tif 000014
式14
【０１６６】
式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｚ１、Ｘ１、Ｙ、Ｘ２、Ｚ２、Ｄ、ｍ、ｎ、ｓ及びｔは、上記と同じ意味を有する。式１４の塩は、薬学的に許容されるアニオンをさらに含んでいてもよい。
【０１６７】
さらに適切には、式１の化合物又は薬学的に許容される塩は、式１５の塩であり、
【０１６８】
【化１４】
0006661533.tif 000015
式15
【０１６９】
式中、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｚ１、Ｘ１、Ｚ２、ｍ及びｔは、上記と同じ意味を有する。式１５の塩は、薬学的に許容されるアニオンをさらに含んでいてもよい。
【０１７０】
さらに適切には、式１の化合物は、式１６に示される構造を有するＭｉｔｏＧであり、
【０１７１】
【化１５】
0006661533.tif 000016
式16
【０１７２】
式中、Ａｎ−は、任意選択の薬学的に許容されるアニオンを表す。
【０１７３】
式１の化合物の別の例は、式１７に示される構造を有するＭｉｔｏＧアミド、（３−（３，４−ジアミノベノイルアミノ）プロピル）トリフェニルホスホニウム塩であり、
【０１７４】
【化１６】
0006661533.tif 000017
式17
【０１７５】
式中、Ａｎ−は、任意選択の薬学的に許容されるアニオンを表す。
【０１７６】
適切には、アニオンＡｎ−は、酢酸塩、塩酸塩／クロリド、臭化水素酸塩／ブロミド、ヨウ化水素酸塩／ヨージド、重硫酸塩、硫酸塩、メチルスルホン酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩及びトリフルオロ酢酸塩から選択される。
【０１７７】
さらに適切には、アニオンＡｎ−は、塩化物塩である。
【０１７８】
これらの分子は、捕捉基、例えば、メチルグリオキサール及びグリオキサールと選択的に反応する、ｏ−フェニレンジアミンへ酸素原子を介して連結しているミトコンドリア標的化基、例えば、トリフェニルホスホニウムイオン（ＴＰＰ）を含む。アルコキシ−置換フェニレンジアミンは、電子供与アルコキシ置換基による増強された反応性のために、１，２−ジカルボニルを検出するために使用されてきた（Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal. Biochem. 238:171-178; 1996、Yamaguchi, M.; Hara, S.; Nakamura, M. Determination of methylglyoxal in mouse blood by liquid chromatography with fluorescence detection Anal. Chim. Acta 221:163-166; 1989）。これらは、反応して安定的なキノキサリン産物を形成するジカルボニルの検出のための誘導体化剤として使用されてきた（Kingkeohoi, S.; Chaplen, F. W. R. Analysis of methylglyoxal metabolism in CHO cells grown in culture. Cytotechnology 48:1-13; 2005、Dhar, A.; Desai, K.; Liu, J. H.; Wu, L. Y. Methylglyoxal, protein binding and biological samples: Are we getting the true measure? J. Chromatog. B 877:1093-1100; 2009、Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal. Biochem. 238:171-178; 1996）。
【０１７９】
化合物、例えば、ＭｉｔｏＧは、実施例セクションにおいて示されるように、保護的であることが示される。
【０１８０】
化合物、例えば、ＭｉｔｏＧアミドはまた保護的であり、増加した安定性を示す。
【０１８１】
ＭｉｔｏＧ化合物、例えば、ＭｉｔｏＧアミドの設計において、本発明の治療上の利点を引き起こすのに必要とされる特徴を考察した。電子を分子構造の別々の部分中に引き寄せる必要性を特定した。本発明者らは、ジアミン基の反応性を調節するために置換することができる分子の群を特定した。この問題への解決策は、式１の化合物によって実現される。好ましい解決策は、増強された安定性を含めた利益を実現するＭｉｔｏＧアミド分子を含む。
【０１８２】
上記で特に名前を挙げた化合物を含む式１の化合物は、薬学的に許容される塩を形成し得る。これらの塩は、酸付加塩（二酸を含めた）及び塩基性塩を含む。薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、フッ化水素酸、及び亜リン酸に由来する無毒性の塩、並びに有機酸、例えば、脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル−置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、アルカン二酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸に由来する無毒性の塩などを含む。このような塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、炭酸水素塩、炭酸塩、重硫酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、カンシル酸塩、クエン酸塩、シクラミン酸塩、エジシル酸塩、エシル酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／クロリド、臭化水素酸塩／ブロミド、ヨウ化水素酸塩／ヨージド、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチルスルホン酸塩、ナフチル酸塩、２−ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロト酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、リン酸二水素塩、ピログルタミン酸塩、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリフルオロ酢酸塩及びキシナホ酸塩が含まれる。
【０１８３】
薬学的に許容される塩基性塩は、金属カチオン、例えば、アルカリ又はアルカリ土類金属カチオン、及びアミンを含めた、塩基に由来する無毒性の塩を含む。適切な金属カチオンの例には、ナトリウム（Ｎａ＋）カリウム（Ｋ＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、亜鉛（Ｚｎ２＋）、及びアルミニウム（Ａｌ３＋）が含まれる。適切なアミンの例には、アルギニン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエチルアミン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、グリシン、リシン、Ｎ−メチルグルカミン、オラミン、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール、及びプロカインが含まれる。有用な酸付加塩及び塩基性塩の考察について、S. M. Berge et al., J. Pharm. Sci. (1977) 66:1-19を参照されたい。またStahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (2002)を参照されたい。
【０１８４】
薬学的に許容される塩は、様々な方法を使用して調製し得る。例えば、式１の化合物と適当な酸又は塩基とを反応させて、所望の塩を得てもよい。式１の化合物の前駆体と、酸又は塩基とをまた反応させて、酸若しくは塩基に不安定な保護基を除去するか、又は前駆体のラクトン若しくはラクタム基を開環し得る。さらに、適当な酸若しくは塩基による処理によって、又はイオン交換樹脂との接触によって、式１の化合物の塩を別の塩に変換し得る。次いで、反応に続いて、溶液から沈殿させる場合、濾過によって、又は蒸発によって塩を単離して、塩を回収し得る。塩の電離の程度は、完全に電離されているものから殆ど電離されていないものまで変化し得る。
【０１８５】
式１の化合物はまた、非溶媒和及び溶媒和形態で存在し得る。用語「溶媒和物」は、化合物及び１個又は２個以上の薬学的に許容される溶媒分子（例えば、ＥｔＯＨ）を含む分子錯体を説明する。用語「水和物」は、溶媒が水である溶媒和物である。薬学的に許容される溶媒和物は、溶媒が同位体的に置換し得るものを含む（例えば、Ｄ２Ｏ、アセトン−ｄ６、ＤＭＳＯ−ｄ６）。
【０１８６】
有機化合物の溶媒和物及び水和物についての現在一般に認められている分類体系は、単離部位、チャネル、及び金属イオン配位溶媒和物及び水和物を区別するものである。例えば、K. R. Morris (H. G. Brittain ed.) Polymorphism in Pharmaceutical Solids (1995)を参照されたい。単離部位溶媒和物及び水和物は、溶媒（例えば、水）分子が有機化合物の介在する分子によって互いに直接接触することから分離されているものである。チャネル溶媒和物において、溶媒分子は格子チャネルにおいて存在し、ここで溶媒分子は他の溶媒分子の隣にある。金属イオン配位溶媒和物において、溶媒分子は、金属イオンに結合している。
【０１８７】
溶媒又は水が密接に結合しているとき、錯体は、湿度と無関係に、詳細に明らかにされた化学量を有する。しかし、チャネル溶媒和物及び吸湿性化合物におけるように、溶媒又は水が弱く結合しているとき、水又は溶媒含量は、湿度及び乾燥条件によって決まる。このような場合において、非化学量が典型的には観察される。
【０１８８】
式１の化合物はまた、（塩及び溶媒和物以外の）多構成要素錯体として存在してもよく、ここでは化合物（薬物）及び少なくとも１種の他の構成要素が化学量論量又は非化学量論量で存在する。このタイプの錯体は、クラスレート（薬物−ホスト包接錯体）及び共結晶を含む。後者は典型的には、非共有結合性相互作用を介して一緒に結合している中性分子構成物の結晶錯体として定義されるが、また中性分子と塩との錯体でよい。共結晶は、溶融結晶化によって、溶媒からの再結晶化によって、又は構成要素を一緒に物理的に摩砕することによって調製し得る。例えば、O. Almarsson and M. J. Zaworotko, Chem. Commun. (2004) 17:1889-1896を参照されたい。多構成要素錯体の一般の概説について、J. K. Haleblian, J. Pharm. Sci. (1975) 64(8):1269-88を参照されたい。
【０１８９】
合成法
本発明の化合物の化学合成のための方法は、本明細書に記載されている。これらの方法は、本発明の範囲内のさらなる化合物の合成を促進するために、公知の方法で修飾及び／又は適応し得る。所与の反応物の量は、ガイダンスのためである。本発明の化合物の調製のために有用な一般の実験室的方法及び手順の記載は、Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry (5th edition, Ed. Furniss, B. S., Hannaford, A. J., Smith, P. W. G., Tatchell, A. R., Longmann, UK)に記載されている。
【０１９０】
本発明の化合物の合成は、３つの重要なステップ：
（ｉ）ジカルボニル捕捉部分の形成；
（ii）ジカルボニル捕捉部分への連結基の結合；及び
（iii）ミトコンドリア標的化部分への連結基の結合
を有し得る。
【０１９１】
場合によって、ジカルボニル捕捉部分の形成のための出発材料は、連結基の部分又は全てを既に含み得る。連結基の全てが含まれている場合、ステップ（ii）は省略される。
【０１９２】
これらの３つのステップは任意の順序で行うことができ、これは使用される方法及び３つの基のそれぞれの性質によって決まる。ジカルボニル捕捉部分の形成は、前駆体を連結基に連結することによって阻止され得る。必要に応じて、保護基を用いて、合成の間に起こる任意の望まれない反応を回避することができる。
【０１９３】
ジカルボニル捕捉部分の形成：これは、ジカルボニル捕捉部分の性質によって決まり、通常、その部分を形成するための開示されている経路に基づくことができる。ジカルボニル捕捉部分がリンカー部分に結合するのに望ましい位置においてジカルボニル捕捉部分に既に結合しているヘテロ原子（Ｏ、Ｓ又はＮＨ）を有するジカルボニル捕捉部分を合成することが都合がよいことがある。このようなヘテロ原子は、ジカルボニル捕捉部分への連結基の接合を助けることができる。ジカルボニル捕捉部分はまた、さらなる官能基化に適している存在する官能基、例えば、カルボン酸と共に合成し得る。
【０１９４】
ミトコンドリア標的化部分への連結基の連結：時折、適当な溶媒中で２〜３当量のミトコンドリア標的化部分前駆体と共にアルゴン下で数日まで、ハロゲン化前駆体、好ましくはヨウ化若しくはブロム化前駆体（ＲＢｒ若しくはＲＩ）、又は強力な脱離基、例えば、メシレートを有する前駆体を加熱することによって、このステップを行うことが一般に好ましい。Ｒは、連結基、ジカルボニル捕捉部分に既に結合した連結基、又はジカルボニル捕捉部分の前駆体に結合した連結基でよい。ハロゲン化前駆体が反応において使用される場合、次いで、生成化合物を、そのブロミド又はヨージド塩として単離する。これを行うために、（必要に応じて）溶媒を除去し、次いで、生成物を、固体が残るまで化合物、例えば、ジエチルエーテルで繰り返し粉砕する。次いで、これを溶媒、例えば、ジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させ、過剰な未反応の材料を除去することができる。これは繰り返すことができる。精製は、例えば、塩化メチレン／ジエチルエーテルからの再結晶化、又はジクロロメタン／エタノール混合物で溶出するシリカゲル上のクロマトグラフィーが関与し得る。
【０１９５】
ジカルボニル捕捉部分への連結基の連結：これはジカルボニル捕捉部分の性質によって決まる。この連結を達成する１つの方法は、ジカルボニル捕捉部分の部分として連結基を合成することである。この場合、連結基は、ミトコンドリア標的化部分に結合する連結基の末端において官能基を適切に有する。このような官能基は、例えば、良好な脱離基、例えば、メシレート基でよく、これは次いで、ミトコンドリア標的化部分の前駆体と反応することができる。代わりに、ジカルボニル捕捉部分が代わりに適切な官能基と共に合成された場合（上記を参照されたい）、これは、カップリング剤を使用するか、又はハロゲン化スルホニル若しくは酸ハロゲン化物として１つのパートナーの活性化に続いて、合わせたミトコンドリア標的化−リンカー前駆体部分と反応し得る。合わせたミトコンドリア標的化−リンカー前駆体部分は、リンカー上の適当な官能基、例えば、アミンを有する。このように、カルボジイミド又は他のカップリング剤を使用して、これらの部分からアミドを形成し得る。例えば、ＭｉｔｏＧアミドの合成において、カルボン酸を備えているジカルボニル捕捉基は、カップリング剤を使用してＴＰＰ−リンカー−アミンと反応させ、アミドを形成することができる。理論的には、ジカルボニル捕捉基−アミンは、カップリング剤を使用してＴＰＰ−リンカー−カルボン酸と反応させることができるが、ただし、反応アミンは、ジカルボニル捕捉単位より求核性であるか、又は後者は保護されている。同様に、塩化スルホニルは、アミンと急速に反応し、相対的に弱い塩基の存在下でスルホンアミドを形成してＨＣｌを除去し、再び捕捉基は、塩化スルホニルと反応することを回避するための保護を必要とし得る。
【０１９６】
式１の化合物は、下記の技術を使用して調製し得る。スキーム及び実施例のいくつかは、有機化学の当業者には公知の、酸化、還元など、分離技術（抽出、蒸発、沈殿、クロマトグラフィー、濾過、粉砕、結晶化など）、及び分析手順を含めた、一般の反応の詳細を省略し得る。このような反応及び技術の詳細は、Richard Larock, Comprehensive Organic Transformations, A Guide to Functional Group Preparations, 2nd Ed (2010)、及びMichael B. Smith及びその他により編集された数巻からなるシリーズであるCompendium of Organic Synthetic Methods (1974 et seq.)を含めていくつかの専門書に見出すことができる。出発材料及び試薬は、市販の源から得てもよいか、又は文献の方法を使用して調製し得る。反応スキームのいくつかは、化学変換から生じる微量の生成物（例えば、エステルの加水分解からのアルコール、二酸の脱カルボキシル化からのＣＯ２など）を省略し得る。さらに、場合によって、反応中間体は、単離又は精製をせずにそれに続くステップにおいて使用し得る（すなわち、インサイチュ）。
【０１９７】
下記の反応スキーム及び実施例のいくつかにおいて、特定の化合物は、さもなければ反応部位において望ましくない化学反応を防止する保護基を使用して調製することができる。保護基をまた使用して、溶解性を増強するか、又は化合物の物理的特性をその他の点で修飾し得る。保護基戦略の考察、保護基を組込み及び除去するための材料及び方法、並びにアミン、カルボン酸、アルコール、ケトン、アルデヒドなどを含めた一般の官能基のための有用な保護基の編集の説明について、T. W. Greene and P. G. Wuts, Protecting Groups in Organic Chemistry, 4th Edition, (2006)及びP. Kocienski, Protective Groups, 3rd Edition (2005)を参照されたい。
【０１９８】
一般に、明細書を通して記載する化学変換は、実質的に化学量論量の反応物を使用して行い得るが、特定の反応は、過剰な反応物の１つ又は２つ以上を使用することから利益を受け得る。さらに、明細書を通して開示する反応の多くは、概ね室温（ＲＴ、room temperature）及び周囲圧力で行い得るが、反応動態学、収率などによって、いくつかの反応は高圧で行われるか、又はより高い温度（例えば、還流条件）若しくはより低い温度（例えば、−７８℃〜０℃）を用いてもよい。開示において化学量論的範囲、温度範囲、ｐＨ範囲などへの参照はまた、単語「範囲」を明確に使用していても、又は使用していなくても、示したエンドポイントを含む。
【０１９９】
化学変換の多くはまた、反応速度及び収率に影響を与え得る、１種又は２種以上の適合性の溶媒を用い得る。反応物の性質によって、１種又は２種以上の溶媒は、極性プロトン性溶媒（水を含めた）、極性非プロトン性溶媒、無極性溶媒、又はいくつかの組合せでよい。代表的な溶媒は、飽和脂肪族炭化水素（例えば、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン）；芳香族炭化水素（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン）；ハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素）；脂肪族アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ペンタン−１−オール、３−メチル−ブタン−１−オール、ヘキサン−１−オール、２−メトキシ−エタノール、２−エトキシ−エタノール、２−ブトキシ−エタノール、２−（２−メトキシ−エトキシ）−エタノール、２−（２−エトキシ−エトキシ）−エタノール、２−（２−ブトキシ−エトキシ）−エタノール）；エーテル（例えば、ジエチルエーテル、ジ−イソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、１，２−ジメトキシ−エタン、１，２−ジエトキシ−エタン、１−メトキシ−２−（２−メトキシ−エトキシ）−エタン、１−エトキシ−２−（２−エトキシ−エトキシ）−エタン、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン）；ケトン（例えば、アセトン、メチルエチルケトン）；エステル（酢酸メチル、酢酸エチル）；窒素含有溶媒（例えば、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、Ｎ−メチル−ピロリドン、ピリジン、キノリン、ニトロベンゼン）；硫黄含有溶媒（例えば、二硫化炭素、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロ−チオフェン−１，１−ジオキシド）；及びリン含有溶媒（例えば、ヘキサメチルリン酸トリアミド）を含む。
【０２００】
用途
本発明の重要な態様は、高血糖によってもたらされる損傷の遮断又は寛解である。本発明は、高血糖の下流の帰結の治療又は予防において用途を見出す。
【０２０１】
上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩についての１つの用途は、高血糖の予防又は治療における使用のためである。
【０２０２】
高血糖は、年齢が関連する症候群として起こり得る。高血糖は、敗血症において、及び／又は集中治療／救急治療室への入院において起こり得る。高血糖は、妊娠の合併症として起こり得る。
【０２０３】
このように、高血糖の予防は、高血糖の危険性を増加させる健康状態を有さない正常な健康の対象と比較して、この健康状態を有する対象のために重要であり得る。適切には、敗血症、妊娠又は救命医療を必要とする健康状態から選択される健康状態を有する対象において高血糖の予防又は治療において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供し得る。
【０２０４】
最も具体的には、本発明は、糖尿病、例えば、高血糖性糖尿病において適用される。本発明は、例えば、任意の適切な器官及び組織、例えば、目、心臓、腎臓、神経系及び／又は膵臓への損傷を予防又は低減させる、高血糖及び糖尿病（例えば、高血糖性糖尿病）の下流の帰結の治療又は予防において用途を見出す。
【０２０５】
本発明は、血糖コントロールの機能障害又は調節不全と関連するミトコンドリアの損傷、例えば、高血糖と関連するミトコンドリアの損傷の治療又は予防に適用される。
【０２０６】
最も適切には、本発明は、高血糖の分子の帰結の治療又は予防に適用される。
【０２０７】
一態様において、本発明は、対象における老化の有害作用を遅延させることにおける使用のための、式１の化合物又はその医薬塩に関する。
【０２０８】
別の態様において、本発明は、糖化反応によって誘発される毒性の予防又は低減において使用するための、式１の化合物又はその医薬塩に関する。
【０２０９】
別の態様において、本発明は、呼吸抑制、特に、ジカルボニルによって誘発される呼吸抑制の予防又は低減において使用するための、式１の化合物又はその医薬塩に関する。
【０２１０】
別の態様において、本発明は、細胞死から保護し、特に、糖化反応により誘発される細胞死から保護する使用のための、式１の化合物又はその医薬塩に関する。
【０２１１】
本発明のさらなる態様は、外科移植のための器官及び組織の保存において使用するための、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。このような用途において、式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩は、組織保存液の構成要素として適切に投与し得る。この態様において、外科移植のための任意の適切な器官及び組織は、保存し得る。例示的な器官移植は、目（例えば、角膜）、心臓、腎臓、神経細胞及び膵臓を含む。
【０２１２】
本発明のさらなる態様は、血液の貯蔵における使用のために、上記に定義されているような式１の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。このような用途において、式１の化合物又は薬学的に許容されるその塩は、保存液の構成要素として適切に投与し得る。
【０２１３】
適切には、本発明は、哺乳動物、最も適切にはヒトに適用される。
【０２１４】
本発明は、網膜変性に適用し得る。網膜変性は、糖尿病性合併症の相関物である。本発明は、糖尿病、特に、高血糖性糖尿病の任意の他の合併症に有用に適用し得る。
【０２１５】
投与
本発明の化合物は、固体又は液体形態、例えば、錠剤、散剤、カプセル剤、ペレット剤、液剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、又は直腸及び尿道の坐剤を含めた坐剤で投与することができる。
【０２１６】
適切には、本発明の化合物は、ヒトを治療するために使用し得る。
【０２１７】
適切には、ヒトのための用量は、経口投与される。
【０２１８】
適切には、ヒトのための用量は、１日１回である。
【０２１９】
適切には、ヒトのための用量は、錠剤形態で提供される。
【０２２０】
本発明の化合物又は組成物は、非経口投与によって投与し得る。
【０２２１】
本発明の化合物は、静脈内に投与し得る。
【０２２２】
本発明の化合物は、１日当たり概ね２０〜４０ｍｇの用量で投与することができる。適切には、ヒトのための用量は、１日当たり概ね８０ｍｇである。
【０２２３】
投与情報は、特に明記しない限り、平均の成人のヒトについて提供する。治療される患者の特徴、例えば、年齢、体重、性別などによって用量を変化させるのは、十分に医師の技量の範囲内である。
【０２２４】
本発明の化合物は、眼球内に投与し得る。
【０２２５】
本発明の化合物は、静脈内に投与し得る。
【０２２６】
本発明の化合物は、腹腔内に投与し得る。
【０２２７】
本発明の化合物は、点眼薬として投与し得る。
【０２２８】
投与は、任意の適切な組織又は器官に対してでよく、例えば、本発明の化合物又は組成物は、目、心臓、腎臓、神経系及び／又は膵臓に投与し得る。
【０２２９】
本発明の化合物は、１種又は２種以上の薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤と組み合わせて投与し得る。
【０２３０】
適切な賦形剤、担体及び希釈剤は、標準的な医薬のテキストにおいて見出すことができる。例えば、参照により本明細書中に組み込まれている、Handbook for Pharmaceutical Additives, 3rd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2007 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA)及びRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition (ed. D. B. Troy) 2006 (Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia, USA)を参照されたい。
【０２３１】
本発明の組成物において使用するための賦形剤には、これらに限定されないが、微結晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシンが含まれ、顆粒化結合剤、例えば、ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン及びアカシアと一緒に、様々な崩壊剤、例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ又はタピオカデンプン）、アルギン酸及び特定の複合ケイ酸塩と共に用いてもよい。さらに、滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクは、打錠の目的のために非常に有用であることが多い。同様のタイプの固体組成物はまた、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いてもよい。この関連における好ましい材料はまた、ラクトース又は乳糖及び高分子量ポリエチレングリコールを含む。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤が経口投与のために望ましいとき、活性成分は、希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及び様々な同様のこれらの組合せと一緒に、様々な甘味剤又は香味剤、着色剤又は色素、並びに、そのように所望である場合、同様に乳化剤及び／又は懸濁化剤と合わせてもよい。
【０２３２】
医薬担体には、固体希釈剤又は充填剤、無菌の水性媒体及び様々な無毒性の有機溶媒などが含まれる。
【０２３３】
薬学的に許容される担体には、ガム、デンプン、糖、セルロース系材料、及びこれらの混合物が含まれる。化合物は、例えば、ペレットの皮下移植によって対象に投与することができる。調製物はまた、液体調製物の静脈内、動脈内、若しくは筋肉内注射、液体若しくは固体調製物の経口投与によって、又は局所適用によって投与することができる。投与はまた、直腸の坐剤又は尿道の坐剤を使用することによって達成することができる。
【０２３４】
さらに、本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は当業者には周知であり、これらに限定されないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液又は０．９％食塩水が含まれる。さらに、このような薬学的に許容される担体は、水溶液又は非水溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油、例えば、オリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。水性担体には、食塩水及び緩衝化した媒体を含めた、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれる。
【０２３５】
薬学的に許容される非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル及び不揮発性油が含まれる。静脈内媒体には、体液及び栄養素補充液、電解質補充液、例えば、リンゲルのデキストロースをベースとするものなどが含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなど保存剤及び他の添加物がまた存在し得る。
【０２３６】
本発明によって投与可能な制御放出組成物又は持続放出組成物のための薬学的に許容される担体は、親油性デポー中の配合物（例えば、脂肪酸、ワックス、油）を含む。本発明によってまた包含されるのは、ポリマー（例えば、ポロキサマー又はポロキサミン）でコーティングされた粒状の組成物、及び組織特異的受容体、リガンド若しくは抗原を対象とする抗体にカップリングした、又は組織特異的受容体のリガンドにカップリングした化合物である。
【０２３７】
薬学的に許容される担体は、静脈内注射に続いて、対応する未修飾の化合物より血液中の実質的により長い半減期を示すことが知られる、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン又はポリプロリンの共有結合的結合によって修飾される化合物を含む（Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, N.Y., (1981), pp 367-383；及び（Katre, N. V.; Knauf, M. J.; Laird, W. J.; Chemical Modification of Recombinant Interleukin 2 by Polyethylene Glycol Increases its Potency in the Murine Meth A Sarcoma Model, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 1487-1491; 1987））。このような修飾はまた、水溶液中の化合物の溶解性を増加させ、凝集を排除し、化合物の物理的及び化学的安定性を増強し、化合物の免疫原性及び反応性を非常に低減し得る。その結果、所望のインビボでの生物活性は、未修飾の化合物によるよりも、より頻繁ではなく又はより低い用量でのこのようなポリマー−化合物付加体の投与によって達成し得る。
【０２３８】
質量分析法
本発明はまた、反応性ジカルボニルの検出のための質量分析プローブとしての用途を見出す。
【０２３９】
これらの質量分析方法は、メチルグリオキサール及びグリオキサールによってもたらされるミトコンドリアの損傷の重大さのアセスメントを可能とする。したがって、式１の化合物、例えば、ミトコンドリア選択的分子であるＭｉｔｏＧを使用して、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内のこれらの損傷を与える種のレベルの相対的変化を評価し得る。
【０２４０】
ＭｉｔｏＧの作用様式を、図１Ｂにおいて示す。ＭｉｔｏＧとメチルグリオキサール及びグリオキサールとのインサイチュでの反応からのキノキサリン産物の蓄積を定量化する能力は、細胞中及びインビボでのミトコンドリア中のこれらの化合物のレベルの変化を評価する機会を提供する。これは最近開発されたアプローチの延長によって行って、ミトコンドリアを標的とするペルオキシド反応性化合物であるＭｉｔｏＢの使用によって、インビボでのミトコンドリアの過酸化水素のレベルを評価することができる（Cocheme, H. M.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Using the mitochondria-targeted ratiometric mass spectrometry probe MitoB to measure H2O2in living Drosophila. Nat. Protocols 7:946-958; 2012、Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2 within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）。この方法論において、診断用のエキソマーカー産物であるＭｉｔｏＰはＭｉｔｏＢから形成され、そのレベルは、組織ホモジネートの液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、liquid chromatography-tandem mass spectrometry）によって重水素化された内部標準に対してエキソビボで決定した（Cocheme, H. M.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Using the mitochondria-targeted ratiometric mass spectrometry probe MitoB to measure H2O2in living Drosophila. Nat. Protocols 7:946-958; 2012、Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2 within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）。このようなアプローチの感受性は、質量分析法（ＭＳ、mass spectrometry）による検出についての閾値を減少させ、化合物のフェムトモル／組織湿重量のｇの分析を可能とする、ＴＰＰ部分の固有の正の電荷によって非常に増強される（Cocheme, H. M.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Using the mitochondria-targeted ratiometric mass spectrometry probe MitoB to measure H2O2in living Drosophila. Nat. Protocols 7:946-958; 2012、Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2 within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）。このように、ミトコンドリア内のメチルグリオキサール及びグリオキサールレベルの相対的変化は、ＭｉｔｏＧ−ジカルボニルキノキサリン反応産物の蓄積の程度に基づいて評価することができる（図１Ｂ）。したがって、化合物、例えば、ＭｉｔｏＧは、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内の１，２−ジカルボニルの産生の評価のために使用することができる、メチルグリオキサール及びグリオキサールのためのミトコンドリアを標的としたプローブを実現する。これらの知見は、糖尿病及び関連する障害における高血糖の根底にある病態の一因となるミトコンドリアの糖化反応と一致する。
【０２４１】
さらなる特定及び好ましい態様を、添付の独立請求項及び従属請求項において示す。従属請求項の特徴は、必要に応じて独立請求項の特徴と合わせてもよく、特許請求の範囲において明確に示すもの以外の組合せであり得る。
【０２４２】
装置の特徴がある機能を実現するように作動すると記載されている場合、これは、その機能を実現するか、又はその機能を実現するように適応若しくは構成されている装置の特徴を含むことを認識されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２４３】
本発明の実施形態を、添付図面を参照してこれからさらに記載する。
【図１】ミトコンドリア内のジカルボニルの検出についての理論的根拠及び機序を示す。（Ａ）ミトコンドリア標的化ＴＰＰ部分、及び１，２−ジカルボニルと反応するフェニレンジアミン基からなる、ミトコンドリアを標的とするグリオキサール及びメチルグリオキサールのトラップであるＭｉｔｏＧ。ＭｉｔｏＧのＴＰＰ部分は、組織中へのその取込みをもたらし、これは形質膜及びミトコンドリア膜の電位の両方によって駆動されてミトコンドリア内で蓄積する。（Ｂ）次いでミトコンドリア内で、ＭｉｔｏＧは、グリオキサール又はメチルグリオキサールと反応して、キノキサリン産物であるキノキサリンエーテル（ＱＥ、quinoxaline ether）及びメチルキノキサリンエーテル（ＭＱＥ、methylquinoxaline ether）（２種の異性体であるＭＱＥ１及びＭＱＥ２として存在）を形成することができる。次いで、これらの産物は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって重水素化された内部標準（ＩＳ、internal standard）に対して定量化することができ、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内に存在する遊離グリオキサール及びメチルグリオキサールの量の尺度を提供する。
【図２】ＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥの合成を示す。
【図３】ＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥのインビトロでの特性決定を示す。（Ａ）１００μＭのＭｉｔｏＧの紫外線／可視（ＵＶ／Ｖ、Ultra Violet/ Visible）走査スペクトルは、その構成要素であるＴＰＰ及び４−ヘキシルオキシフェニレン−１，２−ジアミン（ＨＰ、4-hexyloxyphenylene-1,2-diamine）部分の特徴を示す。（Ｂ）１００μＭのＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥのＵＶ／Ｖｉｓ走査スペクトル。（Ｃ）１０μＭのＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥの蛍光励起スペクトル（発光４３３ｎｍ）及び発光スペクトル（励起３４４ｎｍ）。ＭｉｔｏＧは蛍光性でなかった。ＭＱＥ及びＱＥは、それぞれ、３４４ｎｍ及び４３３ｎｍのピーク励起波長及び発光波長を有した。（Ｄ）それぞれ１０ｎｍｏｌのＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥの逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ、Reverse Phase-High Performance Liquid Chromatography）プロファイル。２２０ｎｍでの吸光度（赤色）、蛍光（青色）を、それぞれ、３４４ｎｍ及び４３３ｎｍの励起波長及び発光波長で観察した。（Ｅ）３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＫＣｌ緩衝液中の１００μＭのＭｉｔｏＧ及び１ｍＭのメチルグリオキサール又はグリオキサールのＵＶ／Ｖｉｓ走査スペクトル。（Ｆ）３７℃で２時間のインキュベーション後の、ＫＣｌ緩衝液中の１０μＭのＭｉｔｏＧ及び２０μＭのメチルグリオキサール、又は２０μＭのＭｉｔｏＧ及び４０μＭのグリオキサールの蛍光励起及び発光スペクトル。（Ｇ）ＭｉｔｏＧ（５ｍＭ）及び１０ｍＭのメチルグリオキサールを、１０μｌのＫＣｌ緩衝液中で３７℃にて２時間インキュベートし、次いで、１μｌの混合物をＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。（Ｈ）産物ピークのアイデンティティーを、反応混合物を１０ｎｍｏｌのＭＱＥ標準でスパイクすることによって確認した。グリオキサールによる実験によって、同様の結果を得た（データは示さず）。
【図４】ＭｉｔｏＧとメチルグリオキサール及びグリオキサールとのインビトロでの反応を示す。（Ａ）３７℃でのＭｉｔｏＧ（１００μＭ）及び１，２−ジカルボニル（２５μＭ）の間の反応は、３４５ｎｍでのキノキサリン産物の形成からフォローした。（Ｂ）ＭｉｔｏＧ及びメチルグリオキサール（それぞれ、４０μＭ）の間、及びＭｉｔｏＧ及びグリオキサール（それぞれ、２００μＭ）の間の反応の蛍光定量的検出を、それぞれ、３４４及び４３３ｎｍの励起波長及び発光波長でキノキサリン産物をモニターすることによって観察した。ＭＱＥ及びＱＥ形成によってもたらされる蛍光の変化を、既知の量のいずれかのキノキサリンに対して蛍光（それぞれ、３４４及び４３３ｎｍの励起波長及び発光波長）をプロットすることによって構築した較正曲線から定量化したが、少なくとも２０μＭまで直線状であった。
【図５】単離したミトコンドリアによるＭｉｔｏＧの取込みを示す。ＴＰＰ−選択的電極を、３７℃にて４μｇ／ｍｌのロテノンを補充した１ｍｌのＫＣｌ緩衝液を含有する撹拌したチャンバー中に置いた。１μＭのＭｉｔｏＧの５回の添加（矢印）による較正に続いて、ＲＬＭ（１ｍｇのタンパク質／ｍｌ）、それに続いて示した場所で、１０ｍＭのコハク酸及び５００ｎＭのＦＣＣＰ（カルボニルシアニドｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン）を加えた。このトレースは、３つの独立した実験の典型的なものである。
【図６】ミトコンドリア及び細胞機能に対するＭｉｔｏＧの効果を示す。（Ａ、Ｂ）３７℃にてグルタミン酸／リンゴ酸上で呼吸するＲＬＭを、酸素電極中で様々な濃度のＭｉｔｏＧと共に７分間インキュベートし、共役呼吸を測定し（Ａ）、その後、ＡＤＰを加えてリン酸化呼吸を測定した（Ｂ）。データは、未処理対照の呼吸数の百分率である（破線）。（Ｃ及びＤ）Ｃ２Ｃ１２細胞（Ｃ）又はウシ大動脈内皮細胞［ＢＡＥＣ、Bovine Aortic Endothelial Cell；Cell Applications Inc社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ］（Ｄ）を、ＭｉｔｏＧと共に２４時間インキュベートし、次いで、ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存を決定した。データは、未処理の対照の百分率として表す（破線）。（Ｅ〜Ｈ）ＢＡＥＣを、３７℃にてＭｉｔｏＧと共に２時間インキュベートし、次いで、Seahorse XF24分析計を使用してオリゴマイシン、ＦＣＣＰ及びアンチマイシンＡ／ロテノンの逐次的添加の後の細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ、oxygen consumption rate）を測定した。（Ｅ）ＡＴＰ合成によるＯＣＲ、（Ｆ）プロトンリークによるＯＣＲ、（Ｇ）予備容量及び（Ｈ）非ミトコンドリアの酸素消費。結果は、３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。未処置の対照に対して、＊は、Ｐが０．０５未満、又は＊＊は、Ｐが０．０１未満。
【図７】タンデム質量分析法によるＭＱＥ及びＱＥのフラグメンテーションを示す。化合物（２０％アセトニトリル中１μＭ）を、２μｌ／分でトリプル四重極型質量分析計中に注入した。ＭＱＥ及びＱＥ並びにこれらの対応するｄ１５−バリアントの示した親イオンをフラグメント化し、示した娘イオンを生じさせた。
【図８】ＭＱＥ及びＱＥのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。（Ａ）ＱＥ、及びＭＱＥの両方のアイソフォームは、フラグメント化して特徴的な娘イオンを形成する、特有のｍ／ｚ比を有する親イオンを有する。（Ｂ）対応する重水素化されたＩＳに対する、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるＭＱＥ及びＱＥの分析に基づいた標準曲線。
【図９】細胞におけるＭＱＥ及びＱＥの定量化を示す。（Ａ）及び（Ｂ）ＢＡＥＣを、２μＭのＭｉｔｏＧと共に１時間インキュベートし、時折１０ｍＭのＡＧ又は２μＭのＦＣＣＰを補充した。次いで、メチルグリオキサール（Ａ）又はグリオキサール（Ｂ）を加え、さらなる３時間のインキュベーション後、細胞層中のＭＱＥ及びＱＥのレベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって重水素化されたＩＳに対して決定した。（Ｃ、Ｄ）ＢＡＥＣを、２μＭのＭｉｔｏＧを有する低（５ｍＭ）又は高（３０ｍＭ）Ｄ−グルコースを含有する媒体中で示した時間インキュベートした。細胞層におけるＭＱＥ（Ｃ）及びＱＥ（Ｄ）のレベルを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって重水素化されたＩＳに対して決定した。結果は、４つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。（Ｅ）ＢＡＥＣを、５ｍＭのＤ−グルコース（低）、３０ｍＭのＤ−グルコース（高）、５ｍＭのＤ−グルコース／２５ｍＭのＬ−グルコース（Ｌ−グルコース）、又は３０ｍＭのＤ−グルコース／１０ｍＭのアミノグアニジニウムを含有する媒体中の２μＭのＭｉｔｏＧの存在下で４時間インキュベートした。細胞層中のＭＱＥのレベルは、重水素化されたＩＳに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。細胞層中のＭＱＥのレベルを、重水素化されたＩＳに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。（Ｆ）ＢＡＥＣを、２μＭのＭｉｔｏＧを有する高（３０ｍＭ）Ｄ−グルコースを含有する媒体中で、示した濃度のグリオキサラーゼＩ阻害剤であるブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルと共に４時間インキュベートした。次いで、細胞層中のＭＱＥ及びＱＥのレベルを、重水素化されたＩＳに対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって決定した。結果は、３つの決定の平均±Ｓ．Ｅ．である。結果は、３つ（Ａ、Ｂ）又は４つ（Ｃ〜Ｅ）の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．である。未処理（Ａ、Ｂ）又は示した（Ｃ〜Ｅ）対照に対して、＊は、はＰが０．０５未満、又は＊＊は、Ｐが０．０１未満；２５０μＭの１，２−ジカルボニルで処理された細胞に対して、＃＃は、Ｐが０．０１未満。
【図１０】インビボでのミトコンドリアのジカルボニルの定量化を示す。ＭＱＥ（Ａ）及びＱＥ（Ｂ）のレベルを、野性型及びＡｋｉｔａマウスの尿中でクレアチニンに対して定量化し、これらのマウスの血中グルコースレベルと比較した。プロットの右側のデータは、２つの条件の平均±Ｓ．Ｅ．である。＊＊は、Ｐが０．０１未満。
【図１１】酸化的条件下でのＭｉｔｏＧの安定性を示す。
【図１２】ジカルボニルによって誘発される呼吸抑制及び細胞死に対するＭｉｔｏＧの保護を示す。
【図１３】心臓における糖尿病性合併症に対するＭｉｔｏＧ−アミドの効果を研究するために使用されるＩ型真性糖尿病の実験用マウスモデルの図を示す。
【図１４】マウス心臓の典型的な磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ、magnetic resonance imaging）像を示す。
【図１５】マウス心臓の典型的な圧力［ｍｍＨＧ］／容量［μｌ］（Ｐ／Ｖ）ループ測定を示す。
【図１６】体重、血中グルコース及び心拍数に対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ、streptozotocin）及びＭｉｔｏＧアミドの効果を示す。
【図１７】平均ＰＶ−ループの結果に対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）；並びにＳＴＺ及びＭｉｔｏＧアミドの効果を示す。
【図１８】拡張末期容量（μｌ）；駆出分画（％）；左心室拡張期時定数（Ｔａｕ  Ｗｅｉｓｓ、ｍｓ）、拡張期スティフネス（１／μｌ）及び拡張末期圧（ｍｍＨｇ）に対するストレプトゾトシン（ＳＴＺ）；及びＳＴＺ及びＭｉｔｏＧアミドの効果を示す。
【図１９】酸化ストレスマーカーである４−ヒドロキシノネナール（４ＨＮＥ、4-hydroxynonenal）に対するＭｉｔｏＧアミドの効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２４４】
本発明の例示的実施形態を本明細書において添付図面を参照して詳細に開示してきたが、本発明は正確な実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲及びこれらの同等物によって定義されるような本発明の範囲から逸脱することなく、当業者は様々な変更及び修正をその中で行うことができることが理解される。
【０２４５】
実験
材料及び方法
化学合成
ＭｉｔｏＧ、キノキサリンエーテル（ＱＥ）並びにメチルキノキサリンエーテル１及び２（ＭＱＥ１／ＭＱＥ２）の合成の略図を図２に示す。要約すれば、６−（４−アミノフェノキシ）ヘキサノール（１）を、報告されている方法を使用して合成した（Carrigan, C. N.; Bartlett, R. D.; Esslinger, C. S.; Cybulski, K. A.; Tongcharoensirikul, P.; Bridges, R. J.; Thompson, C. M. Synthesis and in vitro pharmacology of substituted quinoline-2,4-dicarboxylic acids as inhibitors of vesicular  glutamate transport. J. Med. Chem. 45:2260-2276; 2002）。１のニトロ化は記載されているように達成され（Fanta, P. E.; Tarbell, D. S. 2-Nitro-4-methoxyaniline. Organic Synth. 25:78-80; 1945）、アセトアミドへの１の変換、それに続く、濃硝酸によるニトロ化が関与し、２が得られた。次いで、脱保護によって、ニトロアニリン（３）を４８％全収率で１から得た。基本的なｏ−フェニレンジアミン骨格は、パラジウム担持カーボン上のニトロアニリン３の接触水素化によって得た。空気及び光に感受性のジアミン（４）を、テトラヒドロフラン中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートによる処理によってｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基で直ちに保護した（Barton, J. K.; Shao, F.; Elias, B.; Lu, W. Synthesis and characterization of iridium(III) cyclometalated complexes with oligonucleotides: insights into redox reactions with DNA. Inorg. Chem. 46:10187-10199; 2007）。５中の第一級アルコールをメシル化して６を得て、次いで、アセトニトリル中のトリフェニルホスフィン及びヨウ化ナトリウムとの反応によってホスホニウム官能基に変換した。生成物７は、エーテルからの沈殿及びカラムクロマトグラフィーによって得て、白色の固体を８０％収率で得た。ロバストな分析試料を得るために、テトラフェニルボレートへの陰イオン交換は、ジクロロメタン中のナトリウムテトラフェニルボレートによる７の処理によって行った。ＭｉｔｏＧを得るアミノ基の脱保護は、９．８Ｍの塩酸による１，４−ジオキサン中の７の処理によって達成された。次いで、ＭｉｔｏＧを、グリオキサールと反応させて、キノキサリンＱＥを得るか、又はメチルグリオキサールと反応させて、２種のメチルキノキサリン産物であるＭＱＥ１及びＭＱＥ２（これらは単一のＨＰＬＣピークを得たが、１０：１の比で形成された（１Ｈ  ＮＭＲによる））を得た。データは、主要な異性体について引用する。
【０２４６】
Ｎ−（４−（６−ヒドロキシヘキシルオキシ）−２−ニトロフェニル）アセトアミド（２）
氷（３．７０ｇ）を有する６−（４−アミノフェノキシ）ヘキサン−１−オール１（２．１２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の氷酢酸（３．２０ｍＬ）及び水（２．４０ｍＬ）溶液に、０〜５℃にて無水酢酸（１．２０ｍＬ）を急速に撹拌しながら加えた。このように得られた結晶性混合物を、水浴中で加熱することによって溶解した。次いで、反応混合物を約４５℃に冷却し、その後濃硝酸（１．１０ｍＬ）を撹拌しながら加えた。反応混合物を６５℃にて１０分間加熱し、室温に冷却し、氷浴中に１８時間置き、水で希釈し、ジクロロメタン中に抽出した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で蒸発させ、中間体アセテートと一緒の２の混合物を黄色の油として得た（２．９８ｇ）。ジエチルエーテルで溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、２を黄色の結晶性固体として得た（１．２７９ｇ、４３％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．０３（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、８．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．６４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．２１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、３．９９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．６７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２ＯＨ）、２．２６（３Ｈ，ｓ，Ａｃ）、１．７９−１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．５８−１．６４（２Ｈ，ｍ）、１．４１−１．５４（４Ｈ，ｍ）、１．３０（１Ｈ，ｂｓ，ＯＨ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６８．８、１５４．５、１３７．１、１２８．４、１２３．９、１２３．８、１０９．２、６８．７（ＣＨ２Ｏ）、６２．９（ＣＨ２ＯＨ）、３２．７、２９．０、２５．９、２５．６、２５．５ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：３１９．１２６１、Ｃ１４Ｈ２０Ｎ２Ｏ５．Ｎａ＋の計算値、３１９．１２６４。
【０２４７】
６−（４−アミノ−３−ニトロフェノキシ）ヘキサン−１−オール（３）
クライゼンアルカリ（０．４５ｍＬ）を、２からの総粗生成物（０．５２７ｇ、１．７８ｍｍｏｌ）に加え、撹拌しながら１５分間７０℃に加熱した。次いで、熱水（０．４５ｍＬ）を撹拌しながら反応混合物に加え、これをさらに１５分間加熱した。反応混合物を氷浴中で０〜５℃に冷却し、水で希釈し、ジクロロメタン中に抽出した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で蒸発させ、オレンジ色／赤色の固体を得た（０．３９０ｇ）。ジエチルエーテルで溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、３をオレンジ色／赤色の固体として得た（０．２３６ｇ、５２％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、５．８８（２Ｈ，ｂｓ，ＮＨ２）、３．９２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．６６（２Ｈ，ｂｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２ＯＨ）、１．７６−１．８１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．５８−１．６５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、１．４０−１．５２（４Ｈ，ｍ）、１．３０（１Ｈ，ｂｓ，ＯＨ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５０．３、１３９．９、１３１．６、１２７．１、１２０．１、１０７．２、６８．７（ＣＨ２Ｏ）、６２．９（ＣＨ２ＯＨ）、３２．７、２９．１、２５．９、２５．６；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：２７７．１１６１、Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ４．Ｎａ＋の計算値：２７７．１１５９；微量分析実測値：Ｃ、５６．８３、Ｈ、６．９４、Ｎ、１０．９９、Ｃ１２Ｈ１８Ｎ２Ｏ４の計算値：Ｃ、５６．６８、Ｈ、７．１３、Ｎ、１１．０２。
【０２４８】
６−（３，４−ジアミノフェノキシ）ヘキサン−１−オール（４）
パラジウム担持カーボン（０．２０ｇ）を、ニトロアニリン（３）（２．２２ｇ、８．７ｍｍｏｌ）の乾燥エタノール（２００ｍＬ）溶液に加え、混合物を水素雰囲気下にて１８時間撹拌した。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）を通して反応混合物を濾過し、真空中で蒸発させ、４を赤色の固体として得た（１．８３ｇ、９３％）。粗生成物をそれ以上精製することなく使用した。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ６．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、６．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、６．２５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、３．８７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３，６５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２ＯＨ）、１．７２−１．７７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．５５−１．６５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、１．３８−１．５１（４Ｈ，ｍ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５４．０、１３７．１、１２７．３、１１８．４、１０５．１、１０３．８、６８．３（ＣＨ２Ｏ）、６３．０（ＣＨ２ＯＨ）、３２．８、２９．４、２６．０、２５．６；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：２２５．１５９２、Ｃ１２Ｈ２１Ｎ２Ｏ２＋の計算値、２２５．１５９６；微量分析実測値：Ｃ、６４．１５、Ｈ、８．９４、１２．２９、Ｃ１２Ｈ２０Ｎ２Ｏ２の計算値：Ｃ、６４．２６、Ｈ、８．９９、Ｎ、１２．４９。
【０２４９】
ｔｅｒｔ−ブチル−４−（６−ヒドロキシヘキシルオキシ）−１，２−フェニレンジカルバメート（５）
ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（０．４８ｇ、２．２ｍｍｏｌ）を４（０．１６ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（５ｍＬ）溶液に加え、アルゴン雰囲気下で室温にて１８時間撹拌した。炭酸水素ナトリウム（０．３１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、これをさらに３０分間撹拌した。反応混合物を濾過し、真空中で蒸発させ、黄色の油を得た（０．６２１ｇ）。ジエチルエーテル中の１％トリエチルアミンで溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、５を黄色の油として得た（０．２２８ｇ、７４％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２９（１Ｈ，ｂｓ）、７．１４（１Ｈ，ｍ）、６．９１（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、６．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、６．３５（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、３．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２ＯＨ）、１．７２−１．７８（２Ｈ，ｍ）、１．５４−１．６３（２Ｈ，ｍ）、１．５０（９Ｈ，ｓ）、１．４９（９Ｈ，ｓ）、１．３６−１．４７（４Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５７．６（Ｃ４）、１５４．６、１５３．３、１３３．６（Ｃ２）、１２６．７（Ｃ６）、１２１．０（Ｃ１）、１１０．８（Ｃ５）、１０８．４（Ｃ３）、８０．８、８０．７、６８．１（ＣＨ２Ｏ）、６２．９（ＣＨ２ＯＨ）、３２．７（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、２９．２（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、２８．４、２８．３、２５．９、２５．５；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：４４７．２４５１、Ｃ２２Ｈ３６Ｎ２Ｏ６．Ｎａ＋の計算値：４４７．２４６６；微量分析実測値：Ｃ、６２．５０、Ｈ、８．８６、Ｎ、６．３５、Ｃ２２Ｈ３６Ｎ２Ｏ６の計算値：Ｃ、６２．２４、Ｈ、８．８６、Ｎ、６．３５。
【０２５０】
６−（３，４−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェノキシ）ヘキシルメタンスルホネート（６）
５（０．２３ｇ、０．５３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１５０μＬ、０．１１０ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液を、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中で室温にて撹拌した。メタンスルホニルクロリド（５０μＬ、０．０７４ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、水及び炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、真空中で蒸発させ、６を黄色の油として得た（０．２１３ｇ、８０％）。粗生成物をそれ以上精製することなく使用した。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（１Ｈ，ｂｓ）、７．１５（１Ｈ，ｍ）、６．８９（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、６．５９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、６．２９（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、４．２３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，ＣＨ２ＯＭｓ）、３．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、２．９９（３Ｈ，ｓ，Ｍｓ）、１．７４−１．８０（４Ｈ，ｍ）、１．４６−１．５１（２２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５７．６、１５４．６、１５３．３、１３３．６、１２６．８、１２１．０、１１０．８、１０８．３、８０．８、８０．７、７０．０（ＣＨ２ＯＭｓ）、６７．９（ＣＨ２Ｏ）、３７．４、２９．１、２９．０、２８．４、２８．３、２５．６、２５．３ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：５２５．２２４０、Ｃ２３Ｈ３８Ｎ２Ｏ８Ｓ．Ｎａ＋の計算値：５２５．２２４１。
【０２５１】
（６−（３，４−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェノキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムヨージド（７）
メシレート６（０．５９ｇ、１．１７ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（０．３４ｇ、１．２９ｍｍｏｌ）及びヨウ化ナトリウム（０．２６０ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１００ｍＬ）溶液を、撹拌しながら８０℃に４８時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、白色の固体を濾過によって除去し、アセトニトリルで洗浄した。次いで、溶媒を約３０ｍＬに減少させ、エーテル（４００ｍＬ）を撹拌しながらゆっくりと加え、産物が沈殿した。エーテルを油状固体からデカントし、プロセスを繰り返した。油状固体を０．５ｍｍ  Ｈｇ未満で１時間乾燥させ、黄色の固体を得た（０．６８０ｇ）。クロロホルム中の５〜１５％メタノールで溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、７を白色の固体として得た（０．５８５ｇ、６３％）。
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ７．８４−７．８０（３Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．７３−７．６７（１２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．５４（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、７．２５（１Ｈ，ｂｓ）、７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、６．９４（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、６．５５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、３．９１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．３１（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、１．５９−１．７２（６Ｈ，ｍ）、１．２６−１．４７（２０Ｈ，ｍ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１５７．３、１５４．８、１５３．８、１３５．６（ｄ，ＪＣ４Ｐ＝３Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）、１３３．９（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝１０Ｈｚ，ｏ−Ｐｈ）、１３０．９（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１３Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ）、１２６．９、１２２．４、１１８．５（ｄ，ＪＣＰ＝８６Ｈｚ，ｉ−Ｐｈ）、１１０．７、１０９．０、８０．５、８０．４、６８．１（ＣＨ２Ｏ）、３０．２（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１６Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２８．９、２８．４、２８．３、２５．６、２２．７（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２２．６（ｄ，ＪＣＰ＝５１Ｈｚ，ＣＨ２Ｐ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ２４．４ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：６６９．３５０６、Ｃ４０Ｈ５０Ｎ２Ｈ５Ｐ＋の計算値：６６９．３４５２；
【０２５２】
分析のための７のテトラフェニルホウ酸塩の試料を、ジクロロメタン中のナトリウムテトラフェニルボレートによる陰イオン交換によって調製した。生成物をエタノールから−７８℃にて再結晶化し、濾過し、真空中で４０℃にて４日間乾燥させ、（６−（３，４−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェノキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムテトラフェニルボレートを白色の結晶として得た。
微量分析実測値：Ｃ、７７．４３、Ｈ、７．３５、Ｎ、２．８０、Ｃ６４Ｈ７０Ｎ２Ｏ５ＢＰの計算値：Ｃ、７７．７２、Ｈ、７．１３、Ｎ、２．８３；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：６６９．３４４２、Ｃ４０Ｈ５０Ｎ２Ｈ５Ｐ＋の計算値：６６９．３４５２，実測値：３１９．１６８０、Ｃ２４Ｈ２０Ｂ−の計算値：３１９．１６６４。１Ｈ及び３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルが７と一致していた。
【０２５３】
（６−（３，４−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェノキシ）ヘキシル）−Ｄ１５−トリフェニルホスホニウムヨージド（ｄ１５−７）
同様に、メシレート（６）（２９０ｍｇ）とヨウ化ナトリウム（１１０ｍｇ）及びｄ１５標識化されたトリフェニルホスフィン（１００ｍｇ）とによって、ｄ１５−７をオフホワイト色のガムとして得た（０．２７４ｇ、９０％）。
ＨＰＬＣ  １３．２４分、９９＋％純度。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２５（１Ｈ，ｂｓ）、７．１６（１Ｈ，ｂｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、６．９６（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、６．５７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、６．３８（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、３．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．７４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、１．５９−１．７２（６Ｈ，ｍ）、１．５５（６Ｈ，ｓ）及び１．３８−１．４８（１４Ｈ，ｍ）。ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：６８４．３９６、Ｃ４０Ｈ３５Ｄ１５Ｎ２Ｏ５Ｐ＋の計算値：６８４．４３９３。
【０２５４】
（６−（３，４−ジアミノフェノキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムクロリド（ＭｉｔｏＧ）
塩酸（９．８Ｍ、１．０ｍＬ）を７（０．０５０ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（１ｍＬ）溶液に加え、室温にてアルゴン下で１時間静置した。反応混合物を減圧下（０．５ｍｍＨｇ未満）で濃縮し、ＭｉｔｏＧを淡黄色の固体として得た（０．０３５ｇ、９８％）。
ＨＰＬＣ  ８．９分、９５％純度、１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）：δ７．８６−７．９０（３Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．７３−７．８０（１２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、６．１２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、５．９２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、４．４７（４Ｈ，ｂｓ，ＮＨ２）、３．７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．５７（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、１．４５−１．５８（６Ｈ，ｍ）、１．３４−１．４０（２Ｈ，ｍ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）：δ１５１．６、１３６．７、１３４．８（ｄ，ＪＣ４Ｐ＝３Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）、１３３．５（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝１０Ｈｚ，ｏ−Ｐｈ）、１３０．２（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１２Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ）、１２７．８、１１８．５（ｄ，ＪＣＰ＝８６Ｈｚ，ｉ−Ｐｈ）、１１５．５、１０２．４、１０１．９、６７．２（ＣＨ２Ｏ）、２９．６（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１７Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２８．６、２４．８、２１．７（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２０．２（ｄ，ＪＣＰ＝５０Ｈｚ，ＣＨ２Ｐ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ２３．８ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：４６９．２４０４、Ｃ３０Ｈ３４Ｎ２ＯＰ＋の計算値：４６９．２４０３。
【０２５５】
（６−（３，４−ジアミノフェノキシ）ヘキシル）−Ｄ１５−トリフェニルホスホニウムクロリド（ｄ１５−ＭｉｔｏＧ）
同様に、（６−（３，４−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）フェノキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムヨージド（ｄ１５−７）（０．０２１ｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）によって、ｄ１５−ＭｉｔｏＧを淡黄色の固体として得た。粗生成物をそれ以上精製することなく使用した。
ＨＰＬＣ：９．０分、８９％純度。ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：４８４．３３３２、Ｃ３０Ｈ１９Ｄ１５Ｎ２ＯＰ＋の計算値：４８４．３３４５。
【０２５６】
（６−（６−キノキサリニルオキシ）ヘキシル）トリフェニルホスホニウムトリフルオロアセテート（ＱＥ）
トリエチルアミン（５０μＬ）を、撹拌した８（０．００７ｇ、１４μｍｏｌ）のエタノール（９６％、１ｍＬ）溶液にアルゴン下で室温にて加えた。５分後、グリオキサール（４０％、５０μＬ）のエタノール（９６％、０．５ｍＬ）溶液を加え、混合物をアルゴン下で２時間撹拌した。反応混合物を真空中で蒸発させ、産物を淡黄色のガムとして得た。水（０．１％ＴＦＡ）中の１０〜１００％アセトニトリルで段階的に溶出するSPE C18シリカカラム（１０ｇ）上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、ＱＥを５０％画分で茶色のガムとして得た（５ｍｇ、６８％）。
ＨＰＬＣ  １１．２分、９９＋％純度；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ８．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、８．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．９６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．７７−７．８４（３Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．６９−７．７６（１２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．４０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．４８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、１．８５（２Ｈ，ｍ）、１．７２（４Ｈ，ｍ）、１．５６（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ１６０．６、１４４．９、１４４．６、１４２．７、１３９．６、１３５．６（ｄ，ＪＣ４Ｐ＝３Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）、１３４．０（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝１０Ｈｚ，ｏ−Ｐｈ）、１３０．９（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１３Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ）、１３０．７、１２３．９、１１８．４（ｄ，ＪＣＰ＝８６Ｈｚ，ｉ−Ｐｈ）、１０７．５、６８．８（ＣＨ２Ｏ）、３０．６（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１６Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２９．０、２５．９、２３．５（ｄ，ＪＣＰ＝５１Ｈｚ，ＣＨ２Ｐ）、２２．９（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ２３．８ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：４９１．２２３８、Ｃ３２Ｈ３２Ｎ２ＯＰ＋の計算値：４９１．２２４７。
【０２５７】
６−（６−キノキサリニルオキシ）ヘキシル）−ｄ１５−トリフェニルホスホニウムトリフルオロアセテート（ｄ１５−ＱＥ）
同様に、ジアミン（ｄ１５−ＭｉｔｏＧ）（０．０３６ｇ、７１μｍｏｌ）とグリオキサール（４０％、２００μＬ）とによって、ｄ１５−ＱＥを５０％画分で茶色のガムとして得た（１４ｍｇ、３７％）。
ＨＰＬＣ  １１．０分、９９＋％純度；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、８．７４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、８．０５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．４３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、４．１２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．３８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、１．８２（２Ｈ，ｍ）、１．６６（４Ｈ，ｍ）、１．５３（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：５０６．３２０１、Ｃ３２Ｈ１７Ｄ１５Ｎ２ＯＰ＋の計算値：５０６．３１８８。
【０２５８】
（６−（６−（２−メチル−キノキサリニルオキシ））ヘキシル）トリフェニルホスホニウムトリフルオロアセテート（ＭＱＥ１／ＭＱＥ２）
同様に、ＭｉｔｏＧ（０．００７ｇ、１４μｍｏｌ）とメチルグリオキサール（４０％、５０μＬ）との反応によって、メチルキノキサリン（ＭＱＥ１／ＭＱＥ２）を５０％画分で茶色のガムとして得た（５ｍｇ、６８％）。
ＨＰＬＣ：１１．１分。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ８．７８（１Ｈ，ｓ）、８．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．７７−７．８４（３Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．６９−７．７６（１２Ｈ，ｍ，Ａｒ）、７．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．４４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、４．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．１４（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｐ）、２．８３（３Ｈ，ｓ，Ｃ−Ｍｅ）、１．８８（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．７５（２Ｈ，ｍ）、１．６７（２Ｈ，ｍ）及び１．５８（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ１６１．９１、１６０．２５（ｑ，ＪＣＦ＝３０Ｈｚ，ＣＦ３ＣＯ）、１５２．７４、１４３．２０、１４１．１０、１３７．４３、１３５．８０（ｄ，ＪＣ４Ｐ＝３Ｈｚ，ｐ−Ｐｈ）、１３３．５８（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝１０Ｈｚ，ｏ−Ｐｈ）、１３０．９２（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１３Ｈｚ，ｍ−Ｐｈ）、１３０．０８、１２３．８３、１１７．８８（ｄ，ＪＣＰ＝８６Ｈｚ，ｉ−Ｐｈ）、１１６．２１（ｄ，ＪＣＦ＝２３０Ｈｚ，ＣＦ３）１０５．０１、６８．８８（ＣＨ２Ｏ）、３０．５０（ｄ，ＪＣ３Ｐ＝１６．０Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２８．７１、２５．５８、２３．２０（ｄ，ＪＣＰ＝５１Ｈｚ，ＣＨ２Ｐ）、２２．６９（ｄ，ＪＣ２Ｐ＝４Ｈｚ，ＣＨ２ＣＨ２Ｐ）、２１．０６（ＣＭｅ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ２Ｃｌ２）：δ２３．８ｐｐｍ。ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：５０５．２４１９、Ｃ３３Ｈ３４Ｎ２ＯＰ＋の計算値：５０５．２４０３。
【０２５９】
（６−（６−（２−メチル−キノキサリニルオキシ））ヘキシル）−ｄ１５−トリフェニルホスホニウムトリフルオロアセテート（ｄ１５−ＭＱＥ１／ＭＱＥ２）
同様に、ｄ１５−ＭｉｔｏＧ（０．０３６ｇ、７１μｍｏｌ）とメチルグリオキサール（４０％、２００μＬ）とによって、ｄ１５−ＭＱＥ１／ＭＱＥ２を５０％画分で茶色のガムとして得た（１６ｍｇ、４３％）。
ＨＰＬＣ：１１．１分  ９９％＋。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ８．６１（２Ｈ，ｂｓ）、７．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、７．３１（１Ｈ，ｓ）、４．０７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、３．５０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２Ｏ）、２．７５（３Ｈ，ｓ，ＣＭｅ）、１．８２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．６６（４Ｈ，ｍ）、１．５１（２Ｈ，ｍ）ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：５２０．３３６６、Ｃ３３Ｈ１９Ｄ１５Ｎ２ＯＰ＋の計算値：５２０．３３４５。
【０２６０】
４−ヘキシルオキシベンゼン−１，２−ジアミン（ＨＰ）
対照化合物（ＨＰ）を、ＭｉｔｏＧのために上記のように作製した。化合物は、文字ｂを加えることによって、図２において使用される付番したスキームに関連している。手短に言えば、Ｎ−（４−（６−ヘキシルオキシ）−２−ニトロフェニル）アセトアミド（２ｂ）（Adachi, K.; Shishido, T.; Hirose, T. Benzotriazole derivatives. Jpn. Kokai Tokkyo Koho 1977. Japanese Patent JP 52093771 A 19770806）は、アミン４−（ヘキシルオキシ）アニリン１ｂ（Carrigan, C. N.; Bartlett, R. D.; Esslinger, C. S.; Cybulski, K. A.; Tongcharoensirikul, P.; Bridges, R. J.; Thompson, C. M. Synthesis and in vitro pharmacology of substituted quinoline-2,4-dicarboxylic acids as inhibitors of vesicular  glutamate transport. J. Med. Chem. 45:2260-2276; 2002）（１．５７ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）から作製し、２ｂを黄色の油として得た（２．０５ｇ）。ジクロロメタン／ジエチルエーテルで溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによる精製によって、２ｂを黄色の固体として得た（１．５６ｇ、７５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．０４（１Ｈ，ｂｓ）、８．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、７．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、７．２２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、３．９９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、２．２６（３Ｈ，ｓ，Ａｃ）、１．８０（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．４６（２Ｈ，ｍ）、１．３５（４Ｈ，ｍ）及び０．９１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ３）ｐｐｍ。次いで、２ｂ（０．４２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）の反応によって、４−（ヘキシルオキシ）−２−ニトロアニリン３ｂを、次いで、４−ヘキシルオキシ−１，２−フェニレンジアミン４ｂ（Tetraazaannulene cobalt complexes. In: Koho, J. K. T., ed.; 1983）を赤色の固体として得た（０．２２４ｇ、７２％）。これを下記の反応において直接使用した。このために、ジアミン４ｂ（０．３４ｇ、１．５ｍｍｏｌ）から、３，４−ビスｔｅｒｔ−ブチル−４−（ヘキシルオキシ）−１，２−フェニレンジカルバメート５ｂを黄色の油として得た（０．４３０ｇ、７１％）。ＨＰＬＣ：１７．７分、＞９９％純度。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．３１（１Ｈ，ｂｓ）、７．１６（１Ｈ，ｍ）、６．８４（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、６．６２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、６．２５（１Ｈ，ｂｓ，ＮＨ）、３．９３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、１．７５（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．５２（９Ｈ，ｓ）、１．５０（９Ｈ，ｓ）、１．４６（２Ｈ，ｍ）、１．３３（４Ｈ，ｍ）及び０．９０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ３）；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：４０７．２６１８、Ｃ２２Ｈ３５Ｎ２Ｏ５−の計算値：４０７．２５４６。
【０２６１】
４−ヘキシルオキシベンゼン−１，２−ジアミン（ＨＰ）を作製するために、５ｂ（０．０２２ｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）を塩酸と反応させ、ＨＰを淡黄色の固体として得た。ＨＰＬＣ：９．６７分、＞９９％純度。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）：δ７．１９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）、６．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）、６．３７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２，８Ｈｚ）、５．６０（４Ｈ，ｂｓ，ＮＨ２）、３．９５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ２Ｏ）、１．７９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）、１．５０（２Ｈ，ｍ）、１．４１（４Ｈ，ｍ）、１．５１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，ＣＨ３）ｐｐｍ。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）：δ１５９．２４、１４２．８３、１２５．１７、１１１．５０、１０４．３０、１０３．０１、６７．８７（ＣＨ２Ｏ）、３１．４４、２９．０４、２５．６１、２２．５２及び１４．３６（ＣＨ３）ｐｐｍ；ＭＳ  ｍ／ｚ実測値：２０９．１７０１、Ｃ１２Ｈ２１Ｎ２Ｏ＋の計算値：２０９．１６５４。
【０２６２】
［３−（３’，４’−ジアミノベンゾイルアミノ）−プロパ−１−イル］トリフェニルホスホニウムメシレート（ＭｉｔｏＧ−アミド）
【０２６３】
【化１７】
0006661533.tif 000018
【０２６４】
（３−アミノプロピル）トリフェニルホスホニウムヨージド（１．３４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、２，４−ジアミノ安息香酸（４４５ｍｇ、２．９ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルカルボジイミド（４００μｌ、２．６ｍｍｏｌ）の乾燥ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）溶液を、３５℃にてＡｒ下で４８時間撹拌した。この後、沈殿物をＭｅＣＮで洗浄した（３×１０ｍＬ）。固体を集め、残留溶媒を高真空下にて除去した。このように得られた茶色の固体（１．２５ｇ）をエタノールから２回再結晶化し、ヨージド塩を茶色の粉末として得た（７９０ｍｇ、５３％）。ヨージドの試料をＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（５０：５０）に溶解し、イオン交換カラム（アンバーライトＩＲＡ−４００、メシレート対イオン）を２回通過させた。溶媒を真空下で除去し、ホスホニウムメシレートをアモルファスの茶色の固体として得た（２３８ｍｇ、４４％）。δＨ（ＣＤ３ＯＤ，４００ＭＨｚ）：７．９２−７．８７（ｍ，３×ｐ−Ｈ  ＰＰｈ３）、７．８２−７．７１（１２Ｈ，ｍ，６×ｏ−Ｈ  ＰＰｈ３，６×ｍ−Ｈ  ＰＰｈ３）、７．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｈ−２’）、７．１４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．０Ｈｚ，Ｈ−６’）、６．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−５’）、３．５３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＮＣＨ２）、３．５０−３．４４（２Ｈ，ｍ，ＰＣＨ２）、２．７０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＳＯ３）２．０２−１．９２（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）．δＣ（ＣＤ３ＯＤ，１２５ＭＨｚ）：１７０．９９（Ｃ）、１４１．１４（Ｃ）、１３６．３４（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ）、１３４．８０（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ，ＣＨ）、１３１．５９（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ，ＣＨ）、１２４．４２（Ｃ）、１２０．５２（ＣＨ）、１１９．７８（ｄ，Ｊ＝８６Ｈｚ，Ｃ）、１１６．４４（ＣＨ）、１１５．５５（ＣＨ）、４０．８１（ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ，ＣＨ２）、３９．５５（ＣＨ３）、２４．０３（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，ＣＨ２）、２０．６８（ｄ，Ｊ＝５２Ｈｚ，ＣＨ２）（１つのＣは推定するところ、別のシグナルと一致する）。
【０２６５】
グリオキサラーゼＩ阻害剤であるブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルを、グルタチオンのアルキル化Thornalley, P. J.; Edwards, L. G.; Kang, Y.; Wyatt, C.; Davies, N.; Ladan, M. J.; Double, J. Antitumour activity of S-p-bromobenzylglutathione cyclopentyl diester in vitro and in vivo. Inhibition of glyoxalase I and induction of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 51:1365-1372; 1996、それに続く、標準的なＢｏｃ−保護、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートを使用したシクロペンタノールとのカップリングTwibanire, J. D.; Grindley, T. B. Efficient and controllably selective preparation of esters using uronium-based coupling agents. Org. Lett. 13:2988-2991; 2011、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、trifluoroacetic acid）によるＢｏｃ基の除去、及び炭酸水素ナトリウムによる処理によって合成し、遊離塩基を得た。他の試薬は、特に明記しない限り、Sigma-Aldrich社から得た。１Ｈ、１３Ｃ及び３１Ｐのスペクトルは、Varian INOVA-400又はVarian INOVA-500分光計で得た。化学シフトは、溶媒の残留シグナルに対してＴＭＳより低磁場で報告する。この研究の化学合成の構成要素について、高分解能質量スペクトルをBruker microTOFエレクトロスプレー質量分析計で記録し、ＨＰＬＣ分析は、Agilent HP1100：カラムPhenomenex Prodigy、２５０×３ｍｍで行った。０．５ｍＬ  ｍｉｎ−１で２１０及び２５４ｎｍで検出を行う１２．５分に亘る１０％アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ）から１００％アセトニトリルの勾配溶離。
【０２６６】
化合物特性のアセスメント
ＴＰＰコンジュゲート化合物をＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液として作製し、アルゴンでフラッシュし、一定分量として−２０℃にて貯蔵した。ＵＶ／可視スペクトル及び動態学的分析を、ＫＣｌ緩衝液［１２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．２（ＫＯＨ）］を含有する１ｍｌ−キュベットにおいてShimadzu UV-2501PC分光光度計を使用して行った。公知の濃度の溶液についての化合物について、モル吸光係数は、最大吸収（λｍａｘ）における吸光度から計算した。ＭｉｔｏＧ及び１，２−ジカルボニルの間の反応速度は、関連性のあるキノキサリンの形成についてλｍａｘにて最初の３０秒に亘り最初の直線状スロープから決定した。蛍光スペクトルは、３ｎｍのスリット幅を有するShimadzu RF-301PC蛍光計を使用して２．５ｍｌのＫＣｌ緩衝液中で得た。動態学的アッセイは、それぞれ、３４４及び４３３ｎｍの励起波長及び発光波長を使用し、発光スペクトルは、３４４ｎｍの励起波長を使用し、励起スペクトルは、４３３ｎｍの発光波長を使用した。ＲＰ−ＨＰＬＣを、Widepore C18ガードカラム（Phenomenex社）を有するＣ１８カラム（Jupiter300Å、Phenomenex社）を伴うGilson321ポンプを使用して行った。試料（１ｍｌ）を、０．２２μｍのＰＶＤＦフィルター（Millex、Millipore社）を通して注入した。ＨＰＬＣ緩衝液Ａ［水中０．１％ＴＦＡ］及びＨＰＬＣ緩衝液Ｂ（９０％アセトニトリル及び０．１％ＴＦＡ）を使用し、勾配は１ｍｌ／分で室温にて下記のように行った。０〜２分−５％Ｂ；２〜１７分−５〜１００％Ｂ；１７〜１９分−１００％Ｂ；１９〜２２分−１００〜５％Ｂ。２２０ｎｍでの吸光度（ＵＶ／Ｖｉｓ１５１、Gilson社）によって、並びに蛍光（３４４及び４３３ｎｍの励起波長及び発光波長；RF-10AXL、Shimdzu社）によってピークを検出した。ＰＢＳ及びオクタン−１−オールの間の分配係数は、従前に記載されているように決定した（Kelso, G. F.; Porteous, C. M.; Coulter, C. V.; Hughes, G.; Porteous, W. K.; Ledgerwood, E. C.; Smith, R. A. J.; Murphy, M. P. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells - Antioxidant and antiapoptotic properties. J. Biol. Chem. 276:4588-4596; 2001）。
【０２６７】
ミトコンドリアの調製及びインキュベーション
ラット肝臓ミトコンドリア（ＲＬＭ、Rat liver mitochondria）は、均質化及び分画遠心分離によって４℃にてＳＴＥ緩衝液［２５０ｍＭのスクロース、５ｍＭのＴｒｉｓ及び１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ７．４（ＨＣｌ）］中で調製した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、bovine serum albumin）に対してビウレットアッセイを使用して決定し、典型的には４０〜６０ｍｇ／ｍｌであった。Ｐｏｗｅｒｌａｂ２／２０データ収集システム（AD Instruments社、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）に接続したクラーク型酸素電極（Rank Brothers社、Ｂｏｔｔｉｓｈａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して呼吸数を測定し、空気飽和水（２１０ｎｍｏｌのＯ２／ｍｌ、３７℃）で較正した。ＲＬＭ（２ｍｇのタンパク質／ｍｌ）を、恒温装置のある１ｍｌ−電極チャンバー中で撹拌しながら１２０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２（ＫＯＨ）に懸濁させた。次いで、ＭｉｔｏＧを加え、５分後、グルタミン酸及びリンゴ酸（それぞれ５ｍＭ）を、３分後に４００μＭのＡＤＰを加えた。酸素消費速度は、Ｍａｃ用Chart v5.5.6.（AD Instruments社、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を使用してスロープから決定した。ＭｉｔｏＧのＴＰＰ部分について選択性の電極を、従前に記載されているように構築し、使用した（Asin-Cayuela, J.; Manas, A. R.; James, A. M.; Smith, R. A.; Murphy, M. P. Fine-tuning the hydrophobicity of a mitochondria-targeted antioxidant. FEBS Lett. 571:9-16; 2004）。
【０２６８】
細胞培養
全ての細胞を３７℃にて９５％空気及び５％ＣＯ２の加湿雰囲気下インキュベートし、使用した培養培地は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ、fetal calf serum）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充した。Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス筋芽細胞株；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を、低グルコース（１０００ｍｇ／ｌのＤ−グルコース）ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Dulbecco’s modified Eagle’s medium；Invitrogen社）中で培養した。細胞をサブコンフルエンス（８０％未満）に維持し、分化を防止した。ＢＡＥＣ（ウシ大動脈内皮細胞；Cell Applications Inc社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、５ｍＭのＤ−グルコースを含有するα−最小必須培地（αＭＥＭ、α-minimum essential medium；Invitrogen社）中に維持した。実験のために使用した全ての培養フラスコ及びアッセイプレートは、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Hank’s balanced salt solution；Cell Applications社）中のフィブロネクチン（（２５μｇ／ｍｌ：Sigma社）で１〜４μｇのフィブロネクチン／ｃｍ２にて事前コーティングした。１時間後、ＲＴで、過剰なコーティング溶液を除去し、次いで、フラスコ及びプレートに実験のための細胞を播種した。ＢＡＥＣを、４〜６代継代で実験のために使用した。
【０２６９】
細胞生存率を評価するために、Ｃ２Ｃ１２細胞又はＢＡＥＣを、９６ウェルプレートにおいて、それぞれ、１０，０００個の細胞／ウェル及び４０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。一晩のインキュベーション後、媒体を、試験化合物を含有する新鮮な媒体で置き換え、２４時間インキュベートした。細胞生存を決定するために、細胞を媒体で２回洗浄し、次いで、新鮮な媒体（ウェル毎に１００μｌ）を加え、２０μｌの［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］／フェナジンメトスルフェート（ＭＴＳ／ＰＭＳ）（Promega社、ＵＳＡ）と混合した。２時間後、プレートリーダー（SpectraMax Plus384、Molecular Devices社）で吸光度を４９０ｎｍにて読み取った。全ての処置は三連ウェルにおいて行った。
【０２７０】
Seahorse XF24細胞外流動分析計を使用して、細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）を評価した（Choi, S. W.; Gerencser, A. A.; Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J. Neurochem. 109:1179-1191; 2009、Dranka, B. P.; Benavides, G. A.; Diers, A. R.; Giordano, S.; Zelickson, B. R.; Reily, C.; Zou, L.; Chatham, J. C.; Hill, B. G.; Zhang, J.; Landar, A.; Darley-Usmar, V. M. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51:1621-1635; 2011、Hill, B. G.; Benavides, G. A.; Lancaster, J. R., Jr.; Ballinger, S.; Dell'Italia, L.; Jianhua, Z.; Darley-Usmar, V. M. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol. Chem. 393:1485-1512; 2012）。細胞（４０，０００個のＢＡＥＣ／ウェル）を培養し、上記のようなフィブロネクチンでコーティングしたSeahorse XF24V7アッセイプレートにおいて実験的処理に供した。ＯＣＲは下記のように決定した。細胞をアッセイ培地［４．１５ｇ／ｌのＤＭＥＭ塩基、１．８５ｇ／ｌのＮａＣｌ、１×glutamax（Invitrogen社）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＤ−グルコース、１５ｍｇ／ｌのフェノールレッド、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び０．４％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、ｐＨ７．４］中で２回洗浄し、３７℃にて空気中６３０μｌのアッセイ培地中で１時間インキュベートした。２０分の平衡化後、基本的ＯＣＲを決定し、ＭｉｔｏＧとの３時間のインキュベーション後、オリゴマイシン（１μｇ／ｍｌ）、ＦＣＣＰ（２μＭ）及びロテノン／アンチマイシンＡ（それぞれ、４μｇ／ｍｌ及び５μＭ）を逐次で注射した。ＯＣＲは、下記のようなスルホローダミンＢ（ＳＲＢ、sulphorhodamine B）アッセイを使用して測定するように、細胞数に規準化した。細胞を固定し（２００μｌの５％トリクロロ酢酸、４℃にて１時間）、水で洗浄し（×３）、１％（ｖ／ｖ）酢酸中の５０μｌの０．４％（ｗ／ｖ）ＳＲＢで２０分間染色し、洗浄し（３×１％酢酸）、組み込まれているＳＲＢ色素を１００μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基に５分間可溶化させた。次いで、５０μｌの各試料を２連で９６ウェルプレートに移し、５０μｌの１０ｍＭの緩衝化していないＴｒｉｓ塩基と混合し、吸光度をプレートリーダー（SpectraMax Plus384、Molecular Devices社）で５６５ｎｍにて読み取った。標準曲線を、四連ウェル中に既知の数の細胞を播種し、固定し、これらを染色することによって試料ウェルと平行して構築した。プロトンリーク及び予備容量に起因する酸素消費の割合を計算するために、オリゴマイシン、ＦＣＣＰ及びロテノン／アンチマイシンＡの注射に続くＯＣＲは、基本的総ＯＣＲの百分率として表した（Brand, M. D.; Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435:297-312; 2011、Dranka, B. P.; Benavides, G. A.; Diers, A. R.; Giordano, S.; Zelickson, B. R.; Reily, C.; Zou, L.; Chatham, J. C.; Hill, B. G.; Zhang, J.; Landar, A.; Darley-Usmar, V. M. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic. Biol. Med. 51:1621-1635; 2011）。
【０２７１】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる細胞中の総メチルグリオキサール形成を評価するために、細胞層を、ＰＢＳ（１ｍｌ）中で洗浄し、１．５ｍｌのＰＢＳ中にこすり取り、遠心分離（１６，０００ｇ、２分間）によってペレット化した。細胞ペレットを５００μｌのＫＣｌ緩衝液に再懸濁し、５００μｌの０．１％ギ酸を加え、タンパク質を上記のように遠心分離によってペレット化し、上清を集めた。次いで、１００μＭのｏ−フェニレンジアミンを加えることによってメチルグリオキサールを２−メチルキノキサリンに誘導体化し、それに続いて３７℃にて４時間インキュベートした。試料を真空下で乾燥し、従前に記載されているように２−メチルキノキサリンについて評価した（Chaplen, F. W.; Fahl, W. E.; Cameron, D. C. Method for determination of free intracellular and extracellular methylglyoxal in animal cells grown in culture. Anal. Biochem. 238:171-178; 1996）。手短に言えば、乾燥した試料を、１ｍｌのＨＰＬＣ緩衝液［６８％（ｖ／ｖ）１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．５及び３２％アセトニトリル］に再懸濁し、濾過し（０．２２μｍのＰＶＤＦ；Millex、Millipore社）、Ｃ１８カラム（Jupiter300Å、Phenomenex社）及びWidepore C18ガードカラム（Phenomenex社）を有するＧｉｌｓｏｎ３２１ポンプを使用して２ｍｌ／分の流量で室温にて上記のＨＰＬＣ緩衝液中の定組成ＲＰ−ＨＰＬＣによって分離した。ピークを蛍光定量的に検出した（それぞれ、３５２及び３８５ｎｍの励起波長及び発光波長；RF-10AXL、Shimadzu）。
【０２７２】
ＭｉｔｏＧ反応産物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、細胞を、２μＭのＭｉｔｏＧを有するＴ２５フラスコ（Ｎｕｎｃ）中で３７℃にてインキュベートした。細胞単層を洗浄し（１ｍｌのＰＢＳ）、１．５ｍｌのＰＢＳ中にこすり取り、遠心分離（１６，０００ｇ、２分間）によってペレット化した。ペレットを重水素化された内部標準（ＩＳ）（それぞれ１００ｐｍｏｌのｄ１５−ＭＱＥ及びｄ１５−ＱＥ）でスパイクした２５０μｌの１００％アセトニトリル／０．１％に再懸濁し、ボルテックスし、遠心分離した（１５分間２×１６，０００ｇ）。試料を真空下で乾燥させ（Savant SpeedVac）、１００μｌの２０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に再懸濁し、ボルテックスし、遠心分離し（１０分間１６，０００ｇ）、シラン処理したオートサンプラーバイアル［Chromacol#1.5HRRV(S)］に移し、フラッシュし、アルゴン下で密封し、次いで、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃にて貯蔵した。特定される場合、細胞を急性の血糖処理に供し、低グルコース（５ｍＭのＤ−グルコース）、高グルコース（３０ｍＭのＤ−グルコース）、又は浸透圧制御媒体（５ｍＭのＤ−グルコース＋２５ｍＭのＬ−グルコース）中で４時間インキュベートした。
【０２７３】
マウス実験
Ｉ型糖尿病のＡｋｉｔａマウスモデル（Ｉｎｓ２＋／−ＡｋｉｔａＪ）（Yoshioka, M.; Kayo, T.; Ikeda, T.; Koizumi, A. A novel locus, Mody4, distal to D7Mit189 on chromosome 7 determines early-onset NIDDM in nonobese C57BL/6 (Akita) mutant mice. Diabetes 46:887-894; 1997、Izumi, T.; Yokota-Hashimoto, H.; Zhao, S.; Wang, J.; Halban, P. A.; Takeuchi, T. Dominant negative pathogenesis by mutant proinsulin in the Akita diabetic mouse. Diabetes 52:409-416; 2003、Chacko, B. K.; Reily, C.; Srivastava, A.; Johnson, M. S.; Ye, Y.; Ulasova, E.; Agarwal, A.; Zinn, K. R.; Murphy, M. P.; Kalyanaraman, B.; Darley-Usmar, V. Prevention of diabetic nephropathy in Ins2(+/)(AkitaJ) mice by the mitochondria-targeted therapy MitoQ. Biochem. J. 432:9-19; 2010）を、アラバマ大学、ＵＳＡにおいて評価した。全ての手順は「The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals」によって行い、アラバマ大学、バーミングハムの動物実験委員会によって承認された。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）からの雄性Ｉｎｓ２＋／−ＡｋｉｔａＪ及び野性型（Ｃ５７ＢＬ／６）マウス（４〜８週齢）を、実験のために使用するときに１４週齢まで実験室用固形飼料及び水を自由に摂取させた。このために、ＭｉｔｏＧ（１００μｌの食塩水中１００ｎｍｏｌ）を尾静脈注射によって投与した。４〜６時間後、マウスを屠殺し、尿試料を採取し、ＭＱＥ／ＱＥ含量のそれに続く分析のために急速冷凍した。血中グルコース値を、Accu-Chek Advantage血中グルコースメーター（Roche Diagnostics社）を使用して測定した。尿クレアチニンレベルを、Ｃｏｒｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌアッセイ実験室（Ａｄｄｅｎｂｒｏｏｋｅ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）において決定した。ＭＱＥ及びＱＥを抽出するために、２０μｌの尿を５００μｌの６０％アセトニトリル／０．１％ギ酸と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、抽出物を重水素化されたＩＳ（それぞれ１００ｐｍｏｌのｄ１５−ＭＱＥ及びｄ１５−ＱＥ）でスパイクし、３０秒間ボルテックスし、氷上で３０分間１０分毎にボルテックスしながらインキュベートし、次いで、遠心分離した（１０分間１６，０００ｇ）。上清を集め、濾過し（０．２２μｍのＰＶＤＦ、Millex、Millipore社）、真空下で乾燥させた（Savant SpeedVac）。乾燥した試料を、５分間ボルテックスすることによって１５０μｌの２０％アセトニトリル／０．１％ギ酸に再懸濁させ、それに続いて１６，０００ｇにて１０分間遠心分離した。次いで、試料をシラン処理したオートサンプラーバイアル［Chromacol #1.5HRRV(S)］に移し、フラッシュし、アルゴン下で密封し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析まで−８０℃にて貯蔵した。
【０２７４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＴＰＰ化合物のＭＳフラグメンテーションパターンは、トリプル四重極型質量分析計（Waters Quattro Ultima）中への２μｌ／分での化合物［２０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）中１μＭ］の直接の注入によって決定した。陽イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化を下記の設定で使用した。ソーススプレー電圧−３ｋＶ；コーン電圧−１００Ｖ；イオンソース温度−８０℃；衝突エネルギー−５０Ｖ。窒素及びアルゴンを、それぞれ、カーテンガス及び衝突ガスとして使用した。
【０２７５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、結合したI-class Aquity LCシステム（Waters社）を有するトリプル四重極型質量分析計（Waters Xevo TQ-S）を使用して行った。１５μｌのフロースルーニードル中への１０μｌのオートサンプラーによる注射、及びフェニル−ヘキシルガードカラム（２×４ｍｍ；Phenomenex社）を有するＬｕｎａ５μフェニル−ヘキシルカラム（１×５０ｍｍ、５μｍ；Phenomenex社）を使用した３０℃でのＲＰ−ＨＰＬＣの前に、試料は４℃にて保持した。使用した緩衝液は、ＭＳ緩衝液Ａ［水中の０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸］及びＭＳ緩衝液Ｂ［９５％アセトニトリル／０．１％ギ酸（両方ともｖ／ｖ）］であった。勾配は下記のように５０μｌ／分で操作した。０〜２分−５％Ｂ；２〜３分−５〜２５％Ｂ；３〜５分−２５〜７５％Ｂ；５〜７分−７５〜１００％Ｂ；７〜１０分−１００％Ｂ；１０〜１２分−１００〜５％Ｂ；１２〜２０分−５％Ｂ。溶離液を、０〜５分及び１６〜２０分の獲得時間においてインライン流路切替バルブを使用して、質量分析計からの廃物に流路切替した。ＭＳ分析のために、陽イオンモードでのエレクトロスプレーイオン化を使用した。ソーススプレー電圧−２．５ｋＶ；コーン電圧−２５Ｖ；イオンソース温度−１００℃；衝突エネルギー−３８Ｖ。窒素及びアルゴンを、それぞれ、カーテンガス及び衝突ガスとして使用した。陽イオンモードでの複数の反応モニタリングを、化合物検出のために使用した。定量化のために使用する転移は下記の通りであった。ＭＱＥ、５０６は２６２を超える；ｄ１５−ＭＱＥ、５２１は２７７を超える；ＱＥ、４９２は２６２を超え、及びｄ１５−ＱＥ、５０７は２７７を超える。各実験について、標準曲線を、ＩＳでスパイクし、試料と並行して抽出した既知の量のＭＱＥ及びＱＥを使用して調製した。標準物質及び試料は、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェアを使用して定量化し、ＭＱＥ、ＱＥ及びＩＳについてのピーク面積を決定し、標準曲線を使用して、試料中に存在するＭＱＥ及びＱＥの量を決定した。
【０２７６】
統計
データ分析は、統計学的計算及びグラフィックスのためのＲソフトウェア環境（R Foundation for Statistical Computing、Ｗｉｅｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）で行った。全てのデータはｔ検定又は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、analysis of variance）、それに続いて必要に応じて事後ダネット検定を使用して分析し、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表した。０．０５と等しい、又はこれ未満のＰ値は、統計的に有意であると受け取った。
【０２７７】
結果及び考察
ＭｉｔｏＧ及びその反応産物の合成及び特性決定
ＭｉｔｏＧ、メチルグリオキサール及びグリオキサールとの反応によるその予想されるキノキサリン産物、並びにこれらの重水素化されたバージョンの合成を、図２において要約する。ＭｉｔｏＧ及びその構成要素であるＴＰＰ及びフェニレンジアミン部分のＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを、図３Ａにおいて示す。予想どおりに、ＭｉｔｏＧのスペクトルは、フェニレンジアミン、ヘキシルオキシフェニレンジアミン（ＨＰ）、及び単純なアルキルＴＰＰ塩のスペクトルの合計であった。ｏ−フェニレンジアミンは酸化的分解を受けるため（Thornalley, P. J. Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems--role in ageing and disease. Drug Metabol. Drug Interact. 23:125-150; 2008）、及びアルコキシ−置換フェニレンジアミンのさらなる反応性についての文献の先例が存在したため、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＭｉｔｏＧの安定性を評価し、ストック溶液は−２０℃での貯蔵下で安定的であったことが見出された。生物学的に関連性のある条件下でのその安定性を評価するために、３７℃でのＭｉｔｏＧの希薄溶液の分解を測定し、４時間まで最小の喪失、及び２４時間まで有意な喪失が観察されたが、したがって、ＭｉｔｏＧは、生物学的実験について、約４時間まで持続して十分に安定的である。
【０２７８】
ＭｉｔｏＧとメチルグリオキサール（ＭＱＥ）及びグリオキサール（ＱＥ）との反応の予想される産物を合成したが、ＭｉｔｏＧのＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルとは別個のＵＶ／Ｖｉｓ吸収スペクトルを有する（図３Ｂ）。ＱＥ及びＭＱＥの両方は蛍光性であり、一方、ＭｉｔｏＧはそうでなかった（図３Ｃ）。３種の化合物をＲＰ−ＨＰＬＣ（図３Ｄ）によって分解したが、ＭＱＥの位置異性体（ＭＱＥ１、ＭＱＥ２；図１Ｂ）は区別されなかった。ＭＱＥ及びＱＥの両方は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価するように、１週間後に３７℃にて安定的であった（データは示さず）。ＭｉｔｏＧ、ＭＱＥ及びＱＥの特性を表１に要約する。ＭｉｔｏＧは、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内のグリオキサール及びメチルグリオキサールのトラップが関与する生物学的実験について十分に安定的であり、反応産物であるＭＱＥ及びＱＥは、化学的単離及びそれに続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析について両方ともロバストに安定的であったと結論付けた。
【０２７９】
【表１】
0006661533.tif 000019
【０２８０】
グリオキサール及びメチルグリオキサールとＭｉｔｏＧの反応性
ＭｉｔｏＧは、メチルグリオキサール及びグリオキサールと反応して、独立して合成及び特性決定されたＭＱＥ又はＱＥの吸収、蛍光及びＲＰ−ＨＰＬＣ特性（図３Ｂ、Ｃ及びＤ）と同一の吸収、蛍光及びＲＰ−ＨＰＬＣ特性（図３Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨ）を有する産物を形成する。生物学的に重要で反応性のアルデヒドである４−ヒドロキシノネナール（ＨＮＥ）又はアクロレインとのＭｉｔｏＧのインキュベーション、それに続く、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、ＭｉｔｏＧが反応した一方で、いくつかの産物が形成され、これらのいくつかは不安定であった（データは示さず）ことを示した。このように、安定的な主要な産物を生じさせるＭｉｔｏＧと１，２−ジカルボニルとの反応と対照的に、ＭｉｔｏＧとこれらのアルデヒドとの反応は診断的に有用ではない。
【０２８１】
ＭｉｔｏＧ及びメチルグリオキサールの間の反応の進行は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度法によって観察することができたが、ＭｉｔｏＧとグリオキサールとの反応は遅すぎた（図４Ａ）。しかし、両方の反応は、より感受性である蛍光定量的方法を使用して評価することができた（図４Ｂ）。ｏ−フェニレンジアミンとの、グリオキサールを超えるメチルグリオキサールのより大きな反応性は、メチルグリオキサールの増強された毒性と一致する（Murata-Kamiya, N.; Kamiya, H. Methylglyoxal, an endogenous aldehyde, crosslinks DNA polymerase and the substrate DNA. Nucl. Acids Res. 29:3433-3438; 2001、Murata-Kamiya, N.; Kamiya, H.; Kaji, H.; Kasai, H. Mutations induced by glyoxal and methylglyoxal in mammalian cells. Nucl. Acids Symp. Ser:3-4; 2000、Pampati, P. K.; Suravajjala, S.; Dain, J. A. Monitoring nonenzymatic glycation of human immunoglobulin G by methylglyoxal and glyoxal: A spectroscopic study. Anal. Biochem. 408:59-63; 2011）。水性グリオキサールは、非反応性テトラオールである二水和物として主に存在し、一方では、メチルグリオキサールは、主に一水和物であり、アルデヒドのみが１，１−ジオールに変換される。これは、高度に反応性のジカルボニルを生じさせるために単一の脱水のみを必要とするメチルグリオキサールのより大きな反応性を説明する（Lo, T. W.; Westwood, M. E.; McLellan, A. C.; Selwood, T.; Thornalley, P. J. Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions. A kinetic and mechanistic study with N-alpha-acetylarginine, N-alpha-acetylcysteine, and N alpha-acetyllysine, and bovine serum albumin. J. Biol. Chem. 269:32299-32305; 1994）。ＭｉｔｏＧ−メチルグリオキサール及びＭｉｔｏＧ−グリオキサール反応についての速度定数は、２５℃でのメチルグリオキサールとｏ−フェニレンジアミンとの反応についての１．７±０．３Ｍ−１ｓ−１の報告された値と比較して、それぞれ、３７℃にて１９±１Ｍ−１ｓ−１及び０．６±０．３Ｍ−１ｓ−１（平均±ＳＥ、ｎ＝３）であった（Fedoronko, M.; Konigstein, J.; Linek, K. Determination of dl-glyceraldehyde, dihydroxyacetone and methylglyoxal in a mixture. J. Electroanalytical Chem. Interfacial Electrochem. 14:357-367; 1967）。１Ｈ  ＮＭＲ（０．１２ｍＭ、ＤＭＳＯ、２５℃）によってモニターしたＭｉｔｏＧ及びｏ−フェニレンジアミンの間のメチルグリオキサールについての競合速度実験は、ＭｉｔｏＧが、ｏ−フェニレンジアミンより約１．８倍反応性であったことを示し、一方、４−メトキシ−フェニレン−１，２−ジアミン及びｏ−フェニレンジアミンの間のグリオキサールについての同様の競合は、４−メトキシ−置換が反応性を約３．８倍に増強したことを示した。一緒に、これらのデータは、ＭｉｔｏＧが１，２−ジカルボニルと反応して、安定的な診断用産物を形成し、且つＭｉｔｏＧ中の電子供与エーテル連結が、非置換ｏ−フェニレンジアミンと比較して反応性を増強させることが確認される。
【０２８２】
エネルギー付与ミトコンドリア内のＭｉｔｏＧの蓄積
細胞内及びインビボで１，２−ジカルボニルにつてのミトコンドリア選択的プローブとなるために、ＭｉｔｏＧのＴＰＰ部分はミトコンドリア内のその取込みを促進するはずである。ＭｉｔｏＧのＴＰＰ部分について選択的な電極を使用した単離したミトコンドリアによるＭｉｔｏＧの取込みを測定した（図５）。電極反応を較正するためのＭｉｔｏＧの添加の後、ミトコンドリアのそれに続く添加は、エネルギー付与されていないミトコンドリアへのＭｉｔｏＧの予想される吸着によって、ＭｉｔｏＧ濃度の小さな減少をもたらした（Asin-Cayuela, J.; Manas, A. R.; James, A. M.; Smith, R. A.; Murphy, M. P. Fine-tuning the hydrophobicity of a mitochondria-targeted antioxidant. FEBS Lett. 571:9-16; 2004）。呼吸基質であるコハク酸の添加は、膜電位を生じさせ、外側の濃度の減少によって示されるように、ＭｉｔｏＧのかなりの取込みをもたらした。脱共役剤であるカルボニルシアニド（ＦＣＣＰ）による膜電位の散逸は、ミトコンドリアからのＭｉｔｏＧの放出をもたらした。ミトコンドリアへのＭｉｔｏＧの膜電位依存的な取込みは、約２ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質であったが、これは０．５μｌ／ｍｇのタンパク質のミトコンドリアのマトリックス容量と仮定すれば（Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）、約４ｍＭのミトコンドリア内のＭｉｔｏＧの濃度を与え、一方、外側のＭｉｔｏＧ濃度は約２μＭであった。ＭｉｔｏＧのこの約２０００倍の蓄積は、ＭｉｔｏＧが、他のＴＰＰコンジュゲート化合物と同様に、膜電位依存的な様式でミトコンドリアによって選択的に蓄積されることを示す。
【０２８３】
ＭｉｔｏＧが有用であるために、これは使用する濃度で、ミトコンドリア機能を撹乱するか、又は細胞毒性をもたらすべきではない。これを試験するために、ＭｉｔｏＧを、単離したミトコンドリアと共にインキュベートし、異なる条件下での呼吸に対するその効果を評価した。共役呼吸の増加によって示されるように、５μＭのＭｉｔｏＧで、プロトンリークにおける僅かな増加があった（図６Ａ）。生体膜内の高レベルのＴＰＰカチオンがプロトンリークの増加を最終的にもたらすため、これは予想される。対照的に、酸化的リン酸化錯体自体は、リン酸化呼吸に対して効果がなかったため、ＭｉｔｏＧに対して５μＭまで非感受性であった（図６Ｂ）。ＭｉｔｏＧのみは、それぞれ、１０及び５０μＭ超の濃度においてＣ２Ｃ１２及びＢＡＥＣ細胞の生存率を減少させた（図６Ｃ、Ｄ）。細胞内のミトコンドリア機能に対するＭｉｔｏＧの効果を評価するために、酸素消費速度（ＯＣＲ）をSeahorse XF24流動分析計を使用して測定した（図６Ｅ〜Ｈ）。１０μＭ超のＭｉｔｏＧの濃度は、ＡＴＰ合成によってＯＣＲを僅かに減少させ、２〜５μＭの範囲のより低い濃度は、プロトンリーク及び呼吸の予備容量の減少によってＯＣＲの増加へのトレンドを示した。したがって、２μＭのＭｉｔｏＧ濃度は、大部分の細胞実験のために通常使用した。
【０２８４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるＭｉｔｏＧと１，２−ジカルボニルとの反応の定量化
ＭｉｔｏＧを使用して、メチルグリオキサール及びグリオキサールの局所濃度をプローブするために、反応産物（ＭＱＥ、ＱＥ）の量を重水素化された内部標準に対してＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって測定することが必要であった（Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）。タンデムＭＳの間にＭＱＥ及びＱＥ並びにこれらの重水素化されたバージョンのフラグメンテーションを決定した（図７）が、ＴＰＰ化合物について予想される通りであった（Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）。トリフェニルリンカチオンに対する（図８Ａ）このフラグメンテーションパターンを使用して、ＭｉｔｏＧと１，２−ジカルボニルとの反応の産物についてのＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイを確立したが、典型的な標準曲線を図８Ｂにおいて示す。ＭｉｔｏＧ反応産物は非常に感度良く検出することができ、細胞中及びインビボでのミトコンドリアのメチルグリオキサール及びグリオキサールを評価するＭｉｔｏＧの使用を促進することが結論付けられた。
【０２８５】
細胞中のミトコンドリアのメチルグリオキサール及びグリオキサールのためのプローブとしてのＭｉｔｏＧ
ＭｉｔｏＧが有効なプローブであるために、これは生物系内のメチルグリオキサール及びグリオキサールと反応して、診断用産物であるＭＱＥ及びＱＥを生じるべきであり、これを次いで抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析することができる。これが細胞において可能であったかを評価するために、ＢＡＥＣをＭｉｔｏＧと共に１時間プレインキュベートし、次いで、メチルグリオキサール又はグリオキサールを加え、さらに３時間後、細胞層を抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、ＭＱＥ（図９Ａ）及びＱＥ（図９Ｂ）の量を評価した。ＭｉｔｏＧに由来する産物であるＭＱＥ及びＱＥの両方のレベルは、外来性１，２−ジカルボニルの濃度が加えられると超生理学的な１，２−ジカルボニル濃度で飽和を示す前に最初は増加したが、ＭｉｔｏＧが律速となった（図９Ａ及びＢ）。１，２−ジカルボニルのスカベンジャーであるアミノグアニジン（ＡＧ、aminoguanidine）による処置、又は脱共役剤であるＦＣＣＰを使用したＭｉｔｏＧのミトコンドリアの取込みの減少は、検出したＭＱＥ及びＱＥの量を低減させた（図９Ａ及びＢ）。いくらかのＭｉｔｏＧが培養培地中に存在するため、上清中のＭＱＥ／ＱＥ形成からの寄与がまた存在し、これはそれに続いて細胞によって蓄積される。これらの知見は、ＭＱＥ／ＱＥを形成させるＭｉｔｏＧと細胞内のメチルグリオキサール及びグリオキサールとの反応と一致し、この反応は、ＡＧによって、又は膜電位を散逸させることによって細胞内のミトコンドリア中へのＭｉｔｏＧ取込みの程度を低下させることによって減少する。ＭｉｔｏＧは、生物学的状況中のメチルグリオキサール又はグリオキサールと反応してＭＱＥ及びＱＥを形成し、これらの産物は、細胞から抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化することができることが結論付けられた。
【０２８６】
次に、ＭｉｔｏＧを利用して、１，２ジカルボニルによる損傷を与える糖化反応が寄与していると考えられる条件である高血糖下でのメチルグリオキサール及びグリオキサールの相対的なミトコンドリアのレベルを決定した。最初に、高血糖が本発明者らの系において細胞のメチルグリオキサールの産生を増加させたことが確認された。これを行うために、ＢＡＥＣ細胞を、高（３０ｍＭ）及び低（５ｍＭ）グルコースの条件下で４時間インキュベートし、次いで、ｏ−フェニレンジアミンによる誘導体化によるメチルグリオキサールの形成を測定し、２−メチルキノキサリンを生じさせ、これをＲＰ−ＨＰＬＣによって評価した。この分析は、ＢＡＥＣ中の高血糖が実際、対照と比較してメチルグリオキサールの形成を約２倍に増加させたことを示した（データは示さず、ｎ＝３）。ＭｉｔｏＧが高血糖条件下でミトコンドリアのメチルグリオキサール／グリオキサールの変化を評価することができるかを見出すために、低（５ｍＭ）グルコース又は高（２５ｍＭ）グルコースとの４時間のインキュベーションに続いて、細胞中のＭＱＥ及びＱＥの形成を次に比較した（図９Ｃ及びＤ）。経時的に検出されるＭＱＥの量が徐々に増加し、これは低グルコースから高グルコースへとなるにつれ実質的に増加し、これは、高血糖の条件下でのミトコンドリア内のメチルグリオキサールの増加と一致した。ＭＱＥ／ＱＥのこの形成は脱共役剤であるＦＣＣＰによってブロックされ（図９Ｃ、Ｄ）、ＭＱＥの形成はまたメチルグリオキサールのトラップであるＡＧによって減少した（図９Ｅ）。高濃度のＤ−グルコースを、２５ｍＭの非生理学的Ｌ−グルコースで置き換えたときに、高血糖によるＭＱＥの増加は起こらなかった（細胞生存率を維持するための５ｍＭのＤ−グルコースと共に）。これは、高濃度のＤ−グルコースによってもたらされるＭＱＥの増加が、メチルグリオキサールを生じさせるグルコースの代謝を必要とし、培養培地中の高い炭水化物濃度の非特異的効果のためではないことを示唆する（図９Ｅ）。ＭｉｔｏＧ及びメチルグリオキサール／グリオキサールの間の反応はまた、ミトコンドリア外で起こり得、それに続いてミトコンドリア内にＭＱＥ／ＱＥが取り込まれる。しかし、ＭｉｔｏＧ及びジカルボニルの間の反応は二次反応であるため、ミトコンドリア内のＭＱＥ／ＱＥ形成の速度は、メチルグリオキサール及びグリオキサール濃度が同じであったとしても、他のコンパートメント中より約５００〜１，０００倍高いことが予想される。したがって、これらのデータは、ミトコンドリア内で主に起こるＭＱＥ／ＱＥの形成と一致している。
【０２８７】
ＢＡＥＣを、グリオキサール及びメチルグリオキサールの分解を抑制するために高グルコースの条件下でグリオキサラーゼＩ阻害剤であるブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルジエステルの存在下でインキュベートしたとき（Thornalley, P. J.; Edwards, L. G.; Kang, Y.; Wyatt, C.; Davies, N.; Ladan, M. J.; Double, J. Antitumour activity of S-p-bromobenzylglutathione cyclopentyl diester in vitro and in vivo. Inhibition of glyoxalase I and induction of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 51:1365-1372; 1996）、ＭＱＥ及びＱＥの量は増加した（図９Ｆ）。一緒に、これらのデータは、ＭｉｔｏＧが、細胞内のミトコンドリアの１，２−ジカルボニル産生の変化を評価するために有効なプローブであることを示す。さらに、これらの知見は、ミトコンドリアのメチルグリオキサール濃度が、高血糖下で約３倍増加することを示す。したがって、上昇した反応性ジカルボニルによるミトコンドリアの糖化反応は、病的高血糖の間に起こるミトコンドリア機能への撹乱の一因となる強力な候補である。
【０２８８】
インビボでのメチルグリオキサール及びグリオキサールのミトコンドリアのレベルについてのプローブとしてのＭｉｔｏＧ
従前に、ミトコンドリアを標的とする過酸化水素質量分析法プローブであるＭｉｔｏＢを使用して、生きているショウジョウバエ（Cocheme, H. M.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Using the mitochondria-targeted ratiometric mass spectrometry probe MitoB to measure H2O2in living Drosophila. Nat. Protocols 7:946-958; 2012、Cocheme, H. M.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Cabreiro, F.; Logan, A.; Prime, T. A.; Abakumova, I.; Patel, J. V.; Fearnley, I. M.; James, A. M.; Porteous, C. M.; Smith, R. A. J.; Saeed, S.; Carre, J. E.; Singer, M.; Gems, D.; Hartley, R. C.; Partridge, L.; Murphy, M. P. Measurement of H2O2 within living Drosophila during aging using a ratiometric mass spectrometry probe targeted to the mitochondrial matrix. Cell Metab. 13:340-350; 2011）］及びマウス（Chouchani, E. T.; Methner, C.; Nadtochiy, S. M.; Logan, A.; Pell, V. R.; Ding, S.; James, A. M.; Cocheme, H. M.; Reinhold, J.; Lilley, K. S.; Partridge, L.; Fearnley, I.M.; Robinson, A. J.; Hartley, R. C.; Smith, R. A. J.; Krieg, T.; Brookes, P.S.; Murphy, M.P. Cardioprotection by S-nitrosation of a cysteine switch on mitochondrial complex I Nat. Med. 19: 753-759; 2013）においてミトコンドリア内の過酸化水素の産生を評価することができることが示されてきた。これにおいて、ＭｉｔｏＢは、実験動物に投与されたとき、エクスビボで評価することができ、且つ生きている生物内での反応種の産生を推測するために使用することができる診断マーカーに変換される外来性プローブ化合物である、エキソマーカーＭｉｔｏＰ（Logan, A.; Cocheme, H. M.; Boon Li Pun, P.; Apostolova, N.; Smith, R. A. J.; Larsen, L.; Larsen, D. S.; James, A. M.; Fearnley, I. M.; Rogatti, S.; Prime, T. A.; Finichiu, P.; Dare, A.; Chouchani, E. T.; Pell, V. R.; Methner, C.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Krieg, T.; Hartley, R. C.; Murphy, M. P. Using exomarkers to assess mitochondrial reactive species in vivo. Biochim. Biophys. Acta In press; 2013）を生じさせるプローブとしての役割を果たす（Logan, A.; Cocheme, H. M.; Boon Li Pun, P.; Apostolova, N.; Smith, R. A. J.; Larsen, L.; Larsen, D. S.; James, A. M.; Fearnley, I. M.; Rogatti, S.; Prime, T. A.; Finichiu, P.; Dare, A.; Chouchani, E. T.; Pell, V. R.; Methner, C.; Quin, C.; McQuaker, S. J.; Krieg, T.; Hartley, R. C.; Murphy, M. P. Using exomarkers to assess mitochondrial reactive species in vivo. Biochim. Biophys. Acta In press; 2013）。したがって、次に、研究を行って、インビボでミトコンドリア内のメチルグリオキサール／グリオキサールの形成を評価するために、ＭｉｔｏＧをまた使用して、エキソマーカーであるＭＱＥ及びＱＥを生じさせることができるかを理解した。静脈内注射に続いて、ＴＰＰ化合物は血液から組織内のミトコンドリアに急速に分布し、次いで、ゆっくりと数時間に亘り尿及び胆汁中に排泄されることが公知であるため、ＭｉｔｏＧのＴＰＰ構成要素は、このゴールを容易にする（Smith, R. A. J.; Porteous, C. M.; Gane, A. M.; Murphy, M. P. Delivery of bioactive molecules to mitochondria in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5407-5412; 2003、Porteous, C. M.; Logan, A.; Evans, C.; Ledgerwood, E. C.; Menon, D. K.; Aigbirhio, F.; Smith, R. A.; Murphy, M. P. Rapid uptake of lipophilic triphenylphosphonium cations by mitochondria in vivo following intravenous injection: implications for mitochondria-specific therapies and probes. Biochim. Biophys. Acta 1800:1009-1017; 2010、Li, Y.; Zhang, H.; Fawcett, J. P.; Tucker, I. G. Effect of cyclosporin A on the pharmacokinetics of mitoquinone (MitoQ10), a mitochondria-targeted antioxidant, in rat. Asian J. Pharmaceut. Sci. 5:106-113; 2010）。したがって、ＭｉｔｏＧをマウスに投与し、次いで、特定の条件下でＭＱＥ／ＱＥ産物の産生が上昇するかを見るために尿を分析し、インビボでのミトコンドリア内の反応性ジカルボニルの上昇を示すことは可能である。
【０２８９】
これを行うために、Ａｋｉｔａマウスモデル（Ｉｎｓ２＋／−ＡｋｉｔａＪ）を使用したが、ここではプロインスリンにおける変異は、慢性高血糖及び結果として起こるＩ型糖尿病において見出されるものと同様の病理学的合併症をもたらす。（Yoshioka, M.; Kayo, T.; Ikeda, T.; Koizumi, A. A novel locus, Mody4, distal to D7Mit189 on chromosome 7 determines early-onset NIDDM in nonobese C57BL/6 (Akita) mutant mice. Diabetes 46:887-894; 1997、Izumi, T.; Yokota-Hashimoto, H.; Zhao, S.; Wang, J.; Halban, P. A.; Takeuchi, T. Dominant negative pathogenesis by mutant proinsulin in the Akita diabetic mouse. Diabetes 52:409-416; 2003、Chacko, B. K.; Reily, C.; Srivastava, A.; Johnson, M. S.; Ye, Y.; Ulasova, E.; Agarwal, A.; Zinn, K. R.; Murphy, M. P.; Kalyanaraman, B.; Darley-Usmar, V. Prevention of diabetic nephropathy in Ins2(+/)(AkitaJ) mice by the mitochondria-targeted therapy MitoQ. Biochem. J. 432:9-19; 2010）。野性型マウスと比較して、Ａｋｉｔａマウスにおいてミトコンドリアのメチルグリオキサール／グリオキサールにおける変化が存在するかどうかを評価するために、ＭｉｔｏＧ（１００ｎｍｏｌ）を尾静脈注射として投与し、４〜６時間後、尿試料を単離し、ＭＱＥ及びＱＥ含量をクレアチニンに対して測定した。これらのデータを個々のマウスについての血中グルコース値の関数として示す（図１０Ａ及びＢ）。予想どおりに、血中グルコースは野性型マウスにおけるよりＡｋｉｔａマウスにおいて非常により高く、血中グルコースにおけるこの増加は、クレアチニンに規準化したＭＱＥ及びＱＥ両方のＭｉｔｏＧ付加体における有意な増加と相関する（図１０Ａ及びＢ）。これらのデータは、ＭｉｔｏＧを、インビボでの病理学的に関連性のある高血糖の条件下でのメチルグリオキサール及びグリオキサールの形成についてのプローブとして使用することができることを示唆する。
【０２９０】
ＭｉｔｏＧの安定性
１００μＭのＭｉｔｏＧを、室温にて１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）及び０．５％（ｗ／ｖ）過酸化水素を含有する１ｍｌキュベット中で０．０７Ｕの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と混合した。ＭｉｔｏＧの代わりにＤＭＳＯと共に、参照キュベット及びブランクを同様に設定した。次いで、分光光度計（Shimadzu UV-2501PC）を使用して、走査ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを混合の１分後、５分後及び１０分後に得た。ＭｉｔｏＧ含有混合物のスペクトルを、ブランクのスペクトルに対して比較した。観察される任意の反応がＨＲＰ阻害剤であるＮａＮ３によって防止することができるかを決定するために（Brill, A.S.; Weinryb, I.; Reactions of horseradish peroxidase with azide.  Evidence for a methionine residue at the active site. Biochemistry, 6, 3528-3535; 1967、Ortiz de Montellano, P.R.; David, S.K.; Ator, M.A.; Tew, D.; Mechanism-based inactivation of orseradish-peroxidase by sodium azide - Formation of meso-azidoprotophorphyrin-IX; Biochemistry, 27, 5470-5476; 1988）、上記のように別々のインキュベーションを設定したが、その上８ｍｇ／ｍｌのＮａＮ３を含有した。
【０２９１】
ｏ−フェニレンジアミンの酸化的分解は、メチルグリオキサール及びグリオキサールの産生をもたらすことは公知である（Thornalley, P.J.; Protein and nucleotide damage by glyoxal and methylglyoxal in physiological systems - Role in ageing and disease. Drug Metabol Drug Interact, 23, 125-150; 2008）。ｏ−フェニレンジアミンが使用されて、生体試料中のメチルグリオキサール及びグリオキサールのレベルを定量化することが試みられる場合、この酸化的分解は、試料におけるジカルボニルレベルの過剰評価をもたらし得る。ＭｉｔｏＧがメチルグリオキサール及びグリオキサールへの同様の酸化的分解を受けることができるかを決定するために、ＭｉｔｏＧを、ＨＲＰ及び過酸化水素と共にインビトロでインキュベートした。反応混合物の走査ＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを、ＨＲＰの添加の前及び後に得た。ＨＲＰを、細胞の環境中の酸化的分解を触媒することができる代表的なペルオキシダーゼとして使用した。図１１に示すように、ＭｉｔｏＧによるλ＝２９９ｎｍでの吸収ピークは、ＨＲＰとのインキュベーション後に消滅し、一方、λ＝４３０ｎｍの新規なピークが出現する。これらの変化は、ＨＲＰ阻害剤であるＮａＮ３によって防止される。これらの結果は、ＭｉｔｏＧがＨＲＰの存在下で分解し、λ＝４３０ｎｍで吸収する産物を形成することを示す。
【０２９２】
吸収プロファイルの差異に基づいて（図３Ｂを図１１と比較する）、この産物は、ＭＱＥでもＱＥでもなく、これは、ＭｉｔｏＧは酸化的分解を受けて、メチルグリオキサール及びグリオキサールを形成しないことを示唆する。したがって、ＭｉｔｏＧとペルオキシダーゼとの反応はメチルグリオキサール及びグリオキサールの形成をもたらさず、ＭｉｔｏＧがプローブとして使用されるとき、ｏ−フェニレンジアミンとは異なり、生体試料中でミトコンドリアのジカルボニルレベルの人為的な過剰評価をもたらさない。
【０２９３】
ジカルボニルによって誘発される呼吸抑制及び細胞死に対するＭｉｔｏＧによる保護
グルタミン酸／リンゴ酸上で呼吸する単離したＲＬＭを、ＭｉｔｏＧ、メトキシフェニレンジアミン（ＭＰ）又はブチルＴＰＰと共に２分間、それに続いて０．５ｍＭのメチルグリオキサール又は５ｍＭのグリオキサールと共に５分間インキュベートした。次いで、ＡＤＰを加え、酸素消費の速度を３７℃にてモニターした（図１２Ａ及び１２Ｂを参照されたい）。Ｃ２Ｃ１２細胞を、１ｍＭのメチルグリオキサール又は５ｍＭのグリオキサールへの曝露の前に、ＭｉｔｏＧ、メトキシフェニレンジアミン（ＭＰ）又はブチルＴＰＰで１時間事前処理した（図１２Ｃ及び１２Ｄを参照されたい）。一晩のインキュベーションに続き、ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存を決定した。ＭｉｔｏＧ、ＭＰ又はブチルＴＰＰで事前処理したＢＡＥＣにおいて同様の実験を行った。全ての実験のために、使用するメチルグリオキサール及びグリオキサールの濃度は、保護アッセイの前に行なった研究からの結果に基づいて選択した。これらの従前の研究において、ＲＬＭ又は細胞を一連のジカルボニル濃度に曝露させ、呼吸又は細胞生存のリン酸化速度を評価した。これらの従前の実験の結果を挿入図において示し、有意な呼吸抑制又は細胞死をもたらしたジカルボニル濃度を保護アッセイにおいて使用するために選択した。全ての群についてのデータは未処置の対照に対して規準化した。ＲＬＭについて、未処置の対照による呼吸の速度は、１００％であるとした。細胞について、未処置の対照の細胞生存は、１００％であるとした。結果は３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．として表す。ＭｉｔｏＧは、Ｃ２Ｃ１２細胞及びＢＡＥＣにおいてメチルグリオキサールによって誘発される呼吸抑制、並びにメチルグリオキサール及びグリオキサールによって誘発される細胞死の両方に対して保護的であった。ブチルＴＰＰ、ＭＰ及びＨＰは、全ての実験において有意に保護的ではなかった。図１２において、シンボル＊、＊＊はそれぞれ、ジカルボニルのみの群に対して、Ｐは０．０５未満又はＰは０．０１未満を示し、シンボル＋、＋＋はそれぞれ、未処置の対照に対してＰは０．０５未満又はＰは０．０１未満を示す。
【０２９４】
糖化反応によって誘発される毒性に対するミトコンドリアを標的とするアプローチの有用性を評価するために、α，β−ジカルボニル曝露の前にＭｉｔｏＧで処理した単離したＲＬＭによる酸素消費を測定した。図１２Ａに示すように、ＭｉｔｏＧは、単離したＲＬＭにおいて用量依存的様式でメチルグリオキサールによって誘発される呼吸抑制に対して保護したが、この系においてグリオキサール損傷を防止しなかった（図１２Ｂ）。類似の実験をまた培養細胞において行った。Ｃ２Ｃ１２細胞又はＢＡＥＣをＭｉｔｏＧで１時間事前処理し、次いで、外来性メチルグリオキサール又はグリオキサールに曝露させた。細胞生存を、一晩のインキュベーションの後に評価した。これらの実験において、ＭｉｔｏＧは、両方のα，β−ジカルボニルに対して保護的であり、両方の細胞型において細胞生存を有意に増加させた（図１２Ｃ〜Ｆ）。ブチルＴＰＰは、いずれのジカルボニルに対して有意な効果を有さなかったが、これはＭｉｔｏＧで観察される保護がＴＰＰ部分の非特異的効果によるものではなかったことを示す。等モル濃度の構造的に同様ではあるが標的とされない化合物であるＭＰ及びＨＰは、ＭｉｔｏＧより少ない保護を与えたが、これはミトコンドリア内のジカルボニルの特異的スカベンジングが、これらの糖化剤の無差別の除去より有効な治療戦略であることを示唆する。
【０２９５】
したがって、ＭｉｔｏＧは、メチルグリオキサールによって誘発される呼吸抑制、並びにメチルグリオキサール及びグリオキサールの両方によって誘発される細胞毒性を改善することが示されてきた。フェニレンジアミンの標的とされない誘導体であるＭＰ及びＨＰは、単離したミトコンドリア及び細胞培養物の両方において有意に保護的ではなかった。このように、ＭｉｔｏＧによる保護は、これらの反応性カルボニル種の特異的なミトコンドリアのスカベンジングに関すると思われる。
【０２９６】
心臓における糖尿病性合併症に対するＭｉｔｏＧ−アミドの効果の研究
心臓における糖尿病性合併症に対するＭｉｔｏＧ−アミドの効果を決定するために、ベータ細胞毒素ストレプトゾトシン（ＳＴＺ；Selleck Chemicals社、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙから得ることができる）の投与による膵臓中のベータ細胞の破壊をベースとするＩ型糖尿病の確立したマウスモデルを使用した。６〜７週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（２０ｇ超）であったマウスに、ＳＴＺ（腹腔内注射によって５０ｍｇ／ｋｇ）を連続５日で投与した。ベータ細胞の死滅及びＩ型糖尿病と関連する高血中グルコースの誘発を、血中グルコース試験によってマウス尾静脈血液試料で毎週確認した。血中グルコース値１７ｍｍｏｌ／ｌ超は、糖尿病であると考えた。実験のために、マウスを３つの群に分割した。（ａ）対照；（ｂ）ＳＴＺによって誘発されるＩ型糖尿病；及び（ｃ）ＭｉｔｏＧ−アミド（１０ｍｇ／ｋｇ体重、胃管補給によって１日１回）で処置されたＳＴＺによって誘発されるＩ型糖尿病動物。これを１２週間繰り返した（図１３）。プロトコルの終わりに、マウスは心臓の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）測定（図１４）、それに続く左心室カテーテルをベースとする圧力／容量（Ｐ／Ｖ）測定（図１５）を受けた。ＭＲＩ及びＰ／Ｖループ測定を同じ日に行い、ＭＲＩ容量測定を、Ｐ／Ｖループについての補正として使用した。
【０２９７】
心臓の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）測定のために、4.7T Bruker BioSpecシステムによる標準的な心臓のＭＲＩプロトコルを手術の２４時間後に行った。麻酔を酸素中の３％イソフルランで誘発し、酸素中の１．２５％イソフルランで維持した。温度を直腸のプローブでモニターし、加熱したウォーターブランケットによって一定に維持し、圧電変換器に接続した受け台を使用して呼吸をモニターした。心電図（ＥＣＧ、electrocardiogram）シグナルを、左の前足及び右の後足上に置いた新生児用黒鉛（３Ｍ）電極でモニターした。
【０２９８】
１２ｃｍ直径のバードケージを使用してシグナルを伝達し、４チャンネル心臓用アレイコイルをシグナル受信のために使用した。イメージングプロトコルは、全心臓をカバーする長軸及び短軸における、スカウトスキャン、それに続く、定常状態精度を有するＥＣＧゲート型高速イメージング（ＦＩＳＰ、fast imaging with steady state precision）スライス（繰返し時間／エコー時間ＴＲ／ＴＥ６／２．４ｍｓ１３〜２０フレーム、３．５ｃｍ視野（ＦＯＶ、field of view）、２５６マトリックス、１ｍｍのスライス厚さ、帯域幅６４．１ｋＨｚ、フリップ角（ＦＡ、flip angle）２０°、２サンプリング平均［励起の数、ＮＥＸ（number of excitation）］）からなった。加工後において、ＥＣＧの異なる相の間の容量を、シンプソンの公式を使用して全心臓に亘って概説及び統合した。１回の心拍動の間に循環中に排出される血液の画分である駆出分画を含めたグローバル機能パラメーターを得た。
【０２９９】
圧力／容量（Ｐ／Ｖ）測定のために、右頸動脈を介した左心室カテーテル法を、１．２Ｆ圧力−カテーテル（Scisense Inc.社、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｃａｎａｄａ）を使用して行った。
【０３００】
体重、血中グルコース及び心拍数に対する、ＭｉｔｏＧアミドを投与されたＳＴＺによって誘発されるＩ型糖尿病の長期間の処置の結果を、プラセボ処置したＳＴＺマウス及び対照と比較した（図１６）。血中グルコースを、Johnson and Johnson社のＯｎｅＴｏｕｃｈ（登録商標）Ultra Blood Glucose Monitoring Systemを使用して全血で測定した。心拍数を、Ｐ／Ｖループカテーテルの使用の間に測定し、記録した。これは、ＳＴＺ処置が、体重の減少及び血中グルコースの増加をもたらしたが、これらのいずれもＭｉｔｏＧアミド処置によって影響されなかったことを示した。さらに、ＳＴＺ処置もＭｉｔｏＧアミド処置も、予想されるようにマウスにおいて心拍数に影響を与えなかった。
【０３０１】
Ｉ型糖尿病における高血糖に対するＭｉｔｏＧ−アミドの効果の研究
Ｉ型糖尿病における長期間の高血糖の周知の有害な影響に対するＭｉｔｏＧアミドの効果を評価するために、心臓機能をＭＲＩ及びＰ／Ｖループ測定によって測定した（図１７）。６〜７週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウス（２０ｇ超）であったマウスに、ＳＴＺ（腹腔内注射によって５０ｍｇ／ｋｇ）を連続５日で投与した。ベータ細胞の死滅、及びＩ型糖尿病と関連する高血中グルコースの誘発は、マウス尾静脈血液試料で血中グルコース試験によって毎週確認した。血中グルコース値１７ｍｍｏｌ／ｌ超は、糖尿病であると考えた。実験のために、マウスを３つの群に分割した。（ａ）対照；（ｂ）ＳＴＺによって誘発されるＩ型糖尿病；及び（ｃ）ＭｉｔｏＧ−アミド（１０ｍｇ／ｋｇ体重、胃管補給によって１日１回）で処置されたＳＴＺによって誘発されるＩ型糖尿病動物。プロトコルの終わりに、マウスは、心臓の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）測定、それに続く、左心室カテーテルをベースとする圧力／容量（Ｐ／Ｖ）測定（上記のような）を受けた。
【０３０２】
収縮期駆出分画及び拡張末期容量は、"Functional assessment of the mouse heart by MRI with a 1-min acquisition", Buonincontri, G.; Methner, C.; Krieg, T.; Carpenter, T.A. and Sawiak, S.J.; NMR Biomed (2014), Vol. 27; pages 733-7に示される手順によってＭＲＩで測定した。
【０３０３】
左心室拡張期時定数（Ｔａｕ  Ｗｅｉｓｓ）及び拡張末期圧は、対応するソフトウェアLifeScribe2を伴うTransonic ADV500を使用してＰ／Ｖループ系から測定した。
【０３０４】
拡張期スティフネスは、ＭＲＩ−補正したＰ／Ｖループから測定した。
【０３０５】
これから、ＳＴＺとＭｉｔｏＧアミドのどちらも収縮期駆出分画に対していかなる効果を有さなかったことが見出された。予想どおりに、ＳＴＺ処置は拡張末期容量及び左心室拡張期時定数（Ｔａｕ  Ｗｅｉｓｓ）を損なったが、これらはＭｉｔｏＧアミドによって回復しなかった（図１８）。しかし、糖尿病のマウスにおける拡張期スティフネス及び拡張末期圧の予想される増加は、ＭｉｔｏＧアミドによって防止された（図１８）が、これは化合物の保護効果を示す。ＭＲＩ容量尺度を、Ｐ／Ｖループについての補正として使用した。ＭＲＩ−補正した拡張期スティフネスは、指数関数を充填相にフィットさせることによって得るが、容量及び圧力依存的な様式でコンプライアンス曲線を表す。単位は１／μｌである。拡張期スティフネス測定は、早期糖尿病によって誘発される心筋損傷を示す最も感受性のパラメーターであり、糖尿病を有する患者に見られる変化の代表的なものである。
【０３０６】
最後に、分析の終わりに、心臓を切除し、ホルマリンで固定し、組織学的検査のために加工し、次いで、１０μｍのスライスに切断し、Optimal Cutting Temperature（ＯＣＴ）に包埋した。組織への酸化損傷を評価するために、酸化損傷のマーカーである４−ヒドロキシノネナールに対する抗体（抗体ａｂ４８５０６ＨＮＥ−Ｊ−２、ブロッキング緩衝液中１：５；Abcam plc社から入手可能）を使用した。これらの実験は、二次ＡＢヤギ抗マウス（Invitrogen F2761、Thermo Fischer Scientific Inc.社から入手可能）＋フルオレセイン（molecular probes、Sigma-Aldrich社から入手可能）及び１０μＭのＨｏｅｃｈｓｔ染色３３３４２（Sigma B2261、Sigma-Aldrich社から入手可能）を室温にて二次抗体溶液として使用したこと以外は、Kaludercic, N.; et al. (2014) "Monoamine oxidase B prompts mitochondrial and cardiac dysfunction in pressure overloaded hearts" Antioxidants & Redox Signaling, Vol. 20, pages 267-80に記載されているように行った。
【０３０７】
染色の程度を定量化し、データを図１９において提示する。これらのデータは、ＭｉｔｏＧアミドが、糖尿病性合併症を起こしている心臓において酸化損傷を減少させたことを示す。
【０３０８】
結論
ミトコンドリア機能への撹乱が、高血糖と関連する病態において役割を果たすことが提唱されてきた。これが起こり得る１つの信憑性のある経路は、反応性１，２−ジカルボニルメチルグリオキサール及びグリオキサールによるミトコンドリアの構成要素への損傷を与える糖化反応を介したものである。しかし、この経路の重要性は、高血糖の間にミトコンドリア内で発生するメチルグリオキサール及びグリオキサールのレベルについての不確実性によって、細胞中及びインビボで評価することが困難であった。これらの問題を軽減するために、質量分析アプローチが開発され、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内のこれらの反応性１，２−ジカルボニルのレベルの変化を測定してきた。
【０３０９】
特に、ｏ−フェニレンジアミンとＴＰＰ部分との組合せが、ミトコンドリア内で蓄積し、ここでメチルグリオキサール及びグリオキサールと反応し、安定的な産物を形成する分子をもたらしたことが見出された。次いで、これらの産物は細胞及び体液から抽出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって安定的な同位体内部標準に対して分析することができた。メチルグリオキサール及びグリオキサールについてのこのアセスメントの選択性は、タンデム質量分析法による産物の同定に基づいており、これはグリオキサラーゼ系の薬理学的阻害に対するこれらのレベルにおける変化によって、及びジカルボニルトラップのアミノグアニジンの添加によってさらに示された。ＴＰＰ部分が細胞中及びインビボでミトコンドリアへと化合物を位置付ける能力は確立されており、これは、ＭＱＥ／ＱＥの形成がミトコンドリアのマトリックス内のメチルグリオキサール／グリオキサールとの反応によって主に起こることを示唆する。これは、ミトコンドリア中へのＭｉｔｏＧの取込みを減少させる脱共役剤であるＦＣＣＰの添加によるＭＱＥ／ＱＥの形成の阻害によって支持される。さらに、ＭｉｔｏＧ及びメチルグリオキサール／グリオキサールの間の反応は二次反応であるため、ミトコンドリア内の約１，０００倍濃度のＭｉｔｏＧは、ＭＱＥ／ＱＥの形成の速度が同様の要因によってミトコンドリアの内側でより大きいことを意味する。このように、細胞又は組織内のＭＱＥ／ＱＥの形成は、ミトコンドリア内のメチルグリオキサール／グリオキサールの量の変化に大きく起因する。しかし、生物系内の他の反応種、例えば、一酸化窒素又は反応性アルデヒド、例えば、４−ヒドロキシノネナールはまた、ＭｉｔｏＧと反応し、枯渇し得るが、これらの反応はグリオキサール／メチルグリオキサールとの反応から形成される診断用産物を産生しない。さらに、このアプローチはミトコンドリアのジカルボニル曝露について報告する一方で、これはメチルグリオキサール／グリオキサールの細胞の源について示さず、これらは細胞質ゾル中で殆ど産生され、それに続いてミトコンドリア中に拡散し得る。
【０３１０】
生きているマウス内のＭｉｔｏＧを使用し、Ｉ型糖尿病のモデル内で起こったジカルボニルの変化を評価するエキソマーカーとしてＭＱＥ／ＱＥを生じさせる能力は、重要なステップであった。したがって、このアプローチは、糖尿病と関連するミトコンドリアの損傷における反応性ジカルボニルの役割を評価することにおいて、及び特定の治療を開発することにおいて有用である。
【０３１１】
図９及び１０における知見は、ＭｉｔｏＧからのＭＱＥ及びＱＥの形成が、細胞中及びインビボでの両方において高血糖の条件下で劇的に増加したことを示し、これはこのような条件下においてミトコンドリア中のメチルグリオキサール／グリオキサールの量が大きく増加することを示す。これは、高血糖において見られるミトコンドリアの撹乱の一因となる、マトリックス中のメチルグリオキサール／グリオキサールの蓄積によるミトコンドリアの糖化反応と一致する。結論として、新規なミトコンドリアを標的とする質量分析アプローチを開発して、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内の反応性ジカルボニルのレベルを評価してきた。これは糖尿病及び老化におけるミトコンドリア機能障害に対するこれらの損傷を与える種の寄与を評価することにおいて有用である。さらに、細胞中及びインビボでのミトコンドリア内のメチルグリオキサール／グリオキサールと反応し、メチルグリオキサール／グリオキサールについてのスカベンジャーの機能を果たす化合物が開発されてきた。
【０３１２】
糖尿病のマウスにおける拡張期スティフネス及び拡張末期圧について図１８に示す結果は、ＭｉｔｏＧアミドが、保護効果を実現したことを示した。さらに、図１９に示す結果は、ＭｉｔｏＧアミドが、糖尿病性合併症を起こしている心臓において酸化損傷を減少させたことを示した。
【０３１３】
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【０３１４】
上記の明細書に記載されている全ての公開資料は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定すべきではないことを理解すべきである。実際、化学又は関連する分野における当業者には明らかな本発明を行うための記載したモードの様々な修正は、下記の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
0006661533.tif 000025
【図２】
0006661533.tif 000026
【図３Ａ−Ｄ】
0006661533.tif 000027
【図３Ｅ−Ｈ】
0006661533.tif 000028
【図４】
0006661533.tif 000029
【図５】
0006661533.tif 000030
【図６】
0006661533.tif 000031
【図７】
0006661533.tif 000032
【図８】
0006661533.tif 000033
【図９】
0006661533.tif 000034
【図１０】
0006661533.tif 000035
【図１１】
0006661533.tif 000036
【図１２】
0006661533.tif 000037
【図１３】
0006661533.tif 000038
【図１４】
0006661533.tif 000039
【図１５】
0006661533.tif 000040
【図１６】
0006661533.tif 000041
【図１７】
0006661533.tif 000042
【図１８】
0006661533.tif 000043
【図１９】
0006661533.tif 000044