(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極触媒として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒として導電性基板に含浸した酵素電極の作製方法であって、
安定化剤である、0.75Mを越える濃度のグルコース、1〜20％の濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールの存在下で前記酵素を前記導電性基板に含浸することによって作製され、
前記酵素はグルコースを基質とする酵素である、酵素電極の作製方法。
【請求項２】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒として導電性基板に含浸した酵素電極の保存方法であって、
前記導電性基板において、前記酵素を、安定化剤である、1〜20％の濃度のグリセロールと共存させて保存し、
前記酵素はグルコースを基質とする酵素である、酵素電極の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極の作製方法、及び、酵素電極の保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、酵素や微生物が持つエネルギー変換システムを利用したバイオ電池の開発が進められている。バイオプロセスを利用するバイオ電池は、緩和な条件かつ高い選択性を有し、燃料として糖やアルコール等の環境中に存在する多様な物質を利用できるという利点を有する。そのため、安全で環境負荷が小さいことから、携帯型機器や体内埋込型機器等の小型電子機器の電源等としての更なる発展が期待されている。近年、バイオ電池の性能向上を目指し、安定性向上、電極素材の最適化、電極／酵素間の電子の移動の効率化等の観点からの研究開発が進められている。特にニーズが増加すると思われる小型電子機器への応用を実現するべく、バイオ電池システム全体を乾電池サイズにまで小型化及び簡便化する技術の構築が求められている。
【０００３】
バイオ電池システム全体の小型化、簡便化、及び取扱い性の向上を図るため、ゲル構造の支持体内に燃料が封入された燃料ゲルを備えたバイオ電池が本発明者らによって報告されている（特許文献１）。特許文献１の技術は、従来の液体燃料を使用したバイオ電池に比べ小型化、及び簡素化を図ることができると共に、燃料ゲルが電極に接触し電極表面を押さえるため、電極表面からの酵素の離脱、及び酵素からの補酵素の離脱を抑制でき、長期間に亘って安定した出力が得られるというものである。更に、液体燃料よりも燃料を高濃度に調製できると共に、燃料の拡散性及び触媒との反応性等を考慮してゲル内の燃料濃度を調節でき、これによっても長期間に亘って安定した出力が得られるとの効果を奏することができる。しかしながら、特許文献１に記載のバイオ電池のセル電圧は最大で0.85Vと低く、そのため電池出力の点では改善の必要があった。
【０００４】
バイオ電池の高出力、高容量化を図るため、燃料から多段階にNADHやNADPH等の還元型補酵素を生成することにより、電子をより多く取り出すことができる酵素電極が報告されている（特許文献２）。特許文献２の技術は、2-ヒドロキシカルボン酸生成酵素、2-オキソ酸生成酵素、2-オキソ酸カルボキシリアーゼ、必要に応じてジヒドロキシエチル基酸化酵素、フォルメートデヒドロゲナーゼを含む酵素電極により、グリセロールやグルコースから、多段階にNADHやNADPH等の還元型補酵素を生成でき、これにより、電池出力の向上が図れるというものである。しかしながら、特許文献２には、酵素電極の耐久性についての言及はなく、電極触媒である酵素の時間経過に伴う劣化に起因する電池出力の低下が予想される。
【０００５】
バイオ電池の膜や触媒として利用可能な強化された拡大性と内部官能基性をもった樹枝状ポリマーが報告されている（特許文献３）。特許文献３の技術は、酵素などのキャリアとして利用することが可能な樹枝状ポリマーに関するものであり、当該樹枝状ポリマーのコア部の構成成分としてグリセロールを用いることができる。しかしながら、特許文献３の技術は、球状のカプセル内に酵素などを包埋するものであることから、導電性基材上に高密度に固定化した酵素の包埋には使用できない。そのため、バイオ電池への適用には制限があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2013-45647号公報（特願2011-182964号）
【特許文献２】特開2009-139257号公報（特願2007-316759号）
【特許文献３】特表2008-507644号公報（特願2008-507644号）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本願発明は、酵素の触媒活性を利用したバイオ電池において、時間経過に伴う酵素の劣化を緩和し、バイオ電池の電池出力を安定的に向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を導電性基材上に固定化する際に、0.75Mを超える濃度のグルコース、又は1〜20％濃度のグリセロール、或いは双方を添加することにより、当該酵素の時間経過に伴う劣化を緩和できることを見出した。このようにして固定化した酵素電極をバイオ電池の負極として構成することにより、バイオ電池の出力を安定化及び向上できることを見出した。これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［６］に示す発明を提供する。
〔１〕ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒として導電性基板上に固定化した酵素電極であって、
前記酵素を、0.75Mを超える濃度のグルコース、1〜20％濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールと共に前記導電性基材上に固定化した酵素電極。
〔２〕前記グルコースの濃度が、0.9〜2Mである。
〔３〕前記酵素が、グルコース脱水素酵素である。
【００１０】
上記〔１〕〜〔３〕の構成によれば、酵素電極作製から当該酵素電極を電極として組み込んだバイオ電池を構築する際に発生する、電極触媒である酵素の劣化に伴う電極機能の低下が緩和された酵素電極を提供することができる。酵素電極は、電極触媒として用いられる酵素の時間経過による劣化に起因して、その電極機能が低下することが知られている。かかる酵素の劣化は、酵素電極を利用したバイオ電池における出力低下の主要因であった。
【００１１】
本発明の酵素電極においては、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド依存性酵素及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒とするものであり、0.75Mを超える濃度のグルコース、1〜20％濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールが当該酵素の安定化剤として働く。これにより、当該酵素の劣化を大幅に緩和することができ、酵素電極の触媒機能を安定的に保持することが可能となる。
【００１２】
酵素は、一般的に溶液状態での安定性は低いが、導電性基材に固定化への酵素の固定化を0.75Mを超える濃度のグルコース、1〜20％濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールの存在下で行うことにより、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中の時間経過による酵素電極の電極機能の劣化を緩和できる。かかる効果はグルコース濃度が0.9〜2.0Mであるときに顕著に現われ、また、グルコースを基質とするグルコース脱水素酵素に対する効果が特に顕著である。かかる酵素電極をバイオ電池の負極として利用することにより当該時間経過に伴う電池出力の低下を緩和することができ、電池出力の安定化及び向上を図ることができる。
【００１３】
また、1〜20％のグリセロールは、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中のみならず、バイオ電池作製後であっても、電極触媒である酵素の劣化を大幅に緩和することができ、本発明の酵素電極はその触媒機能を安定的に保持することが可能となる。
【００１４】
〔４〕上記酵素電極からなる負極、前記負極と隔膜を挟んで対向する正極を有する酵素電極を備えるバイオ電池用セル。
【００１５】
上記〔４〕の構成によれば、酵素電極作製から当該酵素電極を電極として組み込んだバイオ電池を構築する際に発生する、電極触媒である酵素の劣化に伴う電極機能の低下が緩和された本発明の酵素電極を利用した出力が向上されたバイオ電池用セル及びバイオ電池を提供することができる。酵素電極をバイオ電池の電極として用いる場合に、酵素電極の電極触媒である酵素の時間経過に伴う劣化に伴い、バイオ電池の出力が低下することが知られていた。酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中の時間経過による酵素電極の電極機能の劣化を緩和した本発明の酵素電極を利用することにより、当該時間経過に伴う酵素電極の電極機能の劣化によるバイオ電池の出力低下を緩和することができ、電池出力の安定化及び向上を図ることができる。また、上記バイオ電池用セルを1〜12個集積したバイオ電池を構築することができる。
【００１６】
〔５〕電極触媒として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒として導電性基板上に固定化した酵素電極の作製方法であって、
0.75Mを越える濃度のグルコース、1〜20％の濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールの存在下で前記酵素を前記導電性基板上に固定化することによって作製される酵素電極の作製方法。
【００１７】
上記〔５〕の構成によれば、酵素電極作製から当該酵素電極を電極として組み込んだバイオ電池を構築する際に発生する、電極触媒である酵素の劣化に伴う電極機能の低下が緩和された上記酵素電極の作製方法を提供することができる。
【００１８】
〔６〕ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸依存性酵素を電極触媒として導電性基板上に固定化した酵素電極からなる負極を備えるバイオ電池の保存方法であって、
前記導電性基板上に固定化した前記酵素を1〜20％の濃度のグリセロールと共存させた状態で保存するバイオ電池の保存方法。
【００１９】
上記〔６〕の構成によれば、酵素電極を負極として備えるバイオ電池用セル、及びバイオ電池用セルを集積したバイオ電池本体の保存方法を提供する。本発明のバイオ電池の保存方法によれば、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中のみならず、バイオ電池作製後であっても、酵素の劣化を大幅に緩和することができ酵素電極はその触媒機能を安定的に保持することが可能となる。
【００２０】
本発明の保存方法は、バイオ電池用セルの構築後の保存中の時間経過に伴う酵素電極の電極機能の劣化によるバイオ電池の出力低下を緩和することに役立ち、バイオ電池の出力を安定的に保持した状態で維持することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の酵素電極の一例を模式的に示す図。
【図２】負極酵素及びメディエータの電位至適化の検討を行った実施例１で着目した、負極内部構成要素の酸化還元電位を示すグラフである。
【図３】負極酵素及びメディエータの電位至適化の検討を行った実施例１の結果を示すグラフである。
【図４】セル積層による電池出力に与える影響を検討した実施例２の結果を示すグラフである。
【図５】セル積層による最大電力低下の要因検証を行った実施例３の結果を示すグラフである。
【図６】緩衝液濃度及びグルコース濃度の影響検証を行った実施例４の結果を示すグラフである。
【図７】負極構成成分と電子の流れを模式的に表す図である。
【図８】負極構成成分の影響検証−１を行った実施例５の結果を示すグラフである。
【図９】負極構成成分の影響検証−２を行った実施例６の結果を示すグラフである。
【図１０】セル作製時間によるグルコース濃度の出力への影響検証を行った実施例７の結果を示すグラフである。
【図１１】セルスタックでの電圧及び電力急降下の改善検証を行った実施例８の結果を示すグラフで、電力（mW/スタック）の改善検証の結果を示す。
【図１２】セルスタックでの電圧及び電力急降下の改善検証を行った実施例８の結果を示すグラフで、電圧（V）の改善検証の結果を示す。
【図１３】高濃度グルコースによる出力改善効果の解明を行った実施例９の結果を示すグラフである。
【図１４】グリセロール濃度による最大電力への影響検証を行った実施例１０の結果を示すグラフである。
【図１５】セル作製時間によるグルコース濃度の出力への影響の詳細検証を行った実施例１１の結果を示すグラフである。
【図１６】セル作製後の保存性検証（一晩）を行った実施例１２の結果を示すグラフである。
【図１７】セル作製後の保存性検証（数日）を行った実施例１３の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本願発明について詳細に説明する。
【００２３】
〔酵素電極、及び酵素電極の作製方法〕
本発明の酵素電極は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、「NAD」、又は「NAD+」と称する場合がある）、又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（「NADP」、又は「NADP+」と称する場合がある）依存性酵素を電極触媒として備え、かつ、前記酵素を、0.75Mを超える濃度のグルコース、1〜20％濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールの組み合わせと共に導電性基材上に固定化したものである。図１に、本発明の酵素電極の構成を模式的に示す。
【００２４】
本発明の酵素電極は、燃料（基質）から生物エネルギーを取り出し電気エネルギーに変換する反応を触媒し、バイオ電池の負極として利用することができる。ここで、電極触媒として備えるNAD依存性酵素及びNADP依存性酵素は、酵素の触媒活性の発揮に補酵素NAD若しくはNADPを要求する酵素であり、燃料（基質）を酸化しNAD又はNADPを還元する反応を触媒する。詳細には、国際生化学・分子生物学連合による酵素番号ではEC.1.1.1に分類される酵素である。例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、キシロース脱水素酵素、グルコン酸脱水素酵素、ピルビル酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素等を挙げることができる。好ましくは、グルコース脱水素酵素である。
【００２５】
しかしながら、NAD依存性酵素及びNADP依存性酵素の由来は特に制限されない。したがって、天然に存在する生物体から適当なタンパク質の単離精製技術により精製された天然由来のものであってよく、また遺伝子工学的手法により組み換え体として製造されたものあるいは化学的に合成されたものあってもよい。更には、市販品を利用することもできる。
【００２６】
遺伝子工学的手法により製造する場合には公知の方法を利用することができる。具体的には、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したDNAをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、生物体由来のゲノムDNA、全RNAから逆転写反応によって合成したcDNA等から所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。ここで用いられるプローブは、所望の酵素と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、常法に基づいて調製することができる。例えば、化学合成法の他、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。
【００２７】
また、所望の酵素遺伝子の塩基配列を基にして作成したプライマーとして用いるPCRによっても同様に、生物体由来のゲノムDNA、cDNAを鋳型として所望の酵素をコードする核酸分子を調製することができる。PCRを利用する場合に用いられるプライマーは、所望の酵素をコードする核酸配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであり、上記プローブと同様にして常法に基づいて調製することができる。化学合成法に基づきプローブ又はプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいてプローブ又はプライマーの設計を行う。
【００２８】
ここで、相補的とは、プローブ又はプライマーと標的核酸分子とが塩基対合則にしたがって特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。ここで、完全な相補性のみならず、プローブ又はプライマーと標的核酸分子が互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。プローブ又はプライマーの長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定される。
【００２９】
更に、常法のホスホルアミダイト法等のDNA合成法を利用して、所望の酵素をコードする核酸分子を化学的に合成することができる。
【００３０】
そして、得られた核酸分子を用いて、当業者に公知の遺伝子組換え技術により所望の酵素を製造することができる。
【００３１】
具体的には、所望の酵素をコードする核酸分子を適当な発現ベクター中に挿入し、これを宿主に導入することによって形質転換体を作製する。ここで、利用可能なベクターとしては、外来ＤＮＡを組み込め、かつ宿主細胞中で自律的に複製可能なものであれば特に制限はない。そして、ベクターは、外来遺伝子がその機能を発現できるように組み込まれ、機能発現に必要な他の既知の塩基配列が含まれていてもよい。例えば、プロモータ配列、リーダー配列、シグナル配列、並びにリボソーム結合配列等が挙げられる。更に、宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。
【００３２】
ベクターへの外来遺伝子の挿入は、例えば、適当な制限酵素で所望の酵素をコードする核酸分子を切断し、適当なベクターの制限酵素部位、又はマルチクローニング部位に挿入して連結する方法などを用いることができるが、これに限定されない。
【００３３】
形質転換体の作製に際して宿主となる細胞としては、外来遺伝子を効率的に発現できる宿主細胞であれば、特に制限はない。原核生物細胞を好適に利用でき、特には大腸菌を利用することができる。その他、枯草菌、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。形質転換法としては、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソームフェクション法、マイクロインジェクション法等を既知の方法を利用することができる。
【００３４】
続いて、得られた形質転換体を、導入された核酸分子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養し、所望の酵素を製造する。培養は、常法に準じて行うことができ、宿主細胞の栄養生理学的性質を勘案して、培養条件を選択すればよい。使用される培地としては、宿主細胞が資化し得る栄養素を含み、形質転換体におけるタンパク質の発現を効率的に行えるものであれば特に制限はない。また、培養形態についても特に制限はないが、大量培養の観点から液体培地が好適に利用できる。
【００３５】
所望の組換えベクターを保持する宿主細胞の選別は、例えば、マーキング配列の発現の有無により行なうことができる。例えば、マーキング配列として薬剤耐性遺伝子を利用する場合には、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤含有培地で培養することによって行うことができる。
【００３６】
形質転換体の培養物から、所望の酵素を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いることができる。精製は、上記形質転換体の培養物から、所望の酵素の存在する画分に応じて、一般的なタンパク質の単離精製方法に準じた手法を適用すればよい。具体的には、所望の酵素が宿主細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を除去して培養上清を得る。続いて、培養上清に、公知のタンパク質精製方法を適宜選択することにより、単離精製することができる。
【００３７】
また、所望の酵素が宿主細胞内で産生される場合には、培養物を遠心分離、濾過等の手段により宿主細胞を回収する。続いて、酵素的破砕方法、又は超音波処理、凍結融解、浸透圧ショック等の物理的破砕方法等により、宿主細胞を破砕する。破砕後、遠心分離、濾過等の手段により可溶化画分を収集する。得られた可溶化画分を、前述の細胞外に生産できる場合と同様に処理することにより単離精製することができる。
【００３８】
また、アミノ酸配列が公知である酵素については、化学的合成技術によっても製造することができる。例えば、所望の酵素のアミノ酸配列の全部、又は一部を、ペプチド合成機を用いて合成し、得られるポリペプチドを適当な条件の下で、再作製することにより調製することもできる。
【００３９】
NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素は、一種類のみを単独で、若しくは複数種類の酵素を組み合わせて利用することができる。複数種類の酵素を組み合わせる場合には、少なくとも一種類がNAD依存性酵素又はNADP依存性酵素であれば足りる。したがって、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素と、当該酵素に共役する他の任意の種類の酵素を組み合わせて用いることによって共役系を作製したものであってもよい。
【００４０】
更に、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素としては、NAD及びNADPに依存して、燃料（基質）が持つ化学エネルギーを取り出し電気エネルギーに変換可能な触媒活性を有する限り、微生物、細胞小器官及び細胞等の生物体自体であってもよい。また、これらの生物体からの粗精製物であってもよい。
【００４１】
本発明の酵素電極において、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素は、所定濃度のグルコース、又は所定濃度のグリセロール、或いは双方と共に導電性基材上に固定化されている。グルコースは、0.75Mを超える濃度、好ましくは、0.9〜2Mの濃度に調製される。通常、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素のD-グルコースに対するKm（最大速度の1/2の速度を与える基質濃度）は3.1〜80mMであり（BRENDAデータベース：EC1.1.1.47）、本発明の酵素電極におけるグルコースの濃度は非常に高いものである。グリセロールは、1〜20％の濃度、好ましくは、5〜20％の濃度に調製される。そして、上記濃度範囲のグルコースと上記濃度範囲のグリセロールを共存させてもよい。ここで、グルコース、若しくはグリセロールの一方が上記所定濃度範囲内にあればよく、上記濃度範囲のグルコースと上記濃度範囲外のグリセロールとの共存、及び上記濃度範囲外のグルコースと上記濃度範囲外のグリセロールとの共存を排除するものではない。
【００４２】
ここで、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素は、好ましくは、1〜100mg/mlの濃度で固定化される。
【００４３】
上記濃度範囲のグルコース及び／又は上記濃度範囲のグリセロールは、NAD依存性酵素及びNADP依存性酵素の安定化剤として作用し、時間経過などによる当該酵素の劣化を防止することができる。
【００４４】
本発明の酵素電極において、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素を固定化する導電性基材は、外部回路に接続可能で電子を伝達できる基材であれば特に制限はない。グラファイト、グラッシーカーボン、カーボンペーパー等のカーボン材、アルミニウム、銅、金、白金、銀、ニッケル、パラジウム等の金属又は合金、SnO2、In2O3、WO3、TiO2等の導電性酸化物等が例示できるが、これらに限定するものではない。従来公知の材質の導電性基材を使用することができる。
【００４５】
また、これを単層又は２種以上の積層構造をもって構成してもよい。また、導電性向上のため、市販のケッチェンブラック等のカーボンブラック、活性炭粉末等の導電性カーボン微粒子を基材に塗布してもよい。その際に、PVDF等のバインダーを使用してもよい、そして、導電性基材の大きさ及び形状等は特に限定されるものではなく、使用目的に応じて適宜調整することができる。マイクロメートルオーダーに電極面積を小さくした微小電極として構成することができる。
【００４６】
本発明の酵素電極には、更に、上記したNAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の触媒活性を発揮するのに必要な物質を固定化してもよい。例えば、酵素の触媒活性の発揮に要求される補酵素であるNAD又はNADPが挙げられる。そして、NAD又はNADPは、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の燃料の酸化に伴い還元され還元型であるNADH又はNADPHを生成する。したがって、このNADH又はNADPHを酸化して酸化型であるNAD又はNADPに戻すと共に、電子メディエータとの電子の授受を媒介するジアホラーゼ等のNADH酸化酵素又はNADPH酸化酵素、及び電極に電子を伝達する電子メディエータを固定化してもよい。
【００４７】
電子メディエータとしては、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素による触媒反応と電極との間の電子授受を媒介できるものであれば特に限定されない。例えば、フェロセン、フェリシアン化物、キノン類、シトクロム類、ビオロゲン類、フェナジン類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェレドキシン類及びその誘導体等が例示されるが、電極触媒の種類に応じて最適な物質を選択すればよい。特に、好ましくは、2-アミノ-3-クロロ-1,4-ナフトキノン（以下、「ACNQ」と称する）を用いることができる。
【００４８】
本発明の酵素電極の作製方法は、好ましくは、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素を含む酵素溶液の作製、導電性基材への酵素溶液の接触、酵素溶液の導電性基材への含浸からなり、導電性基材への当該酵素の固定化により作製される。NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素を、上記濃度範囲のグルコース、又は上記濃度範囲のグリセロール、或いは双方と共に導電性基材上に固定化することによって作製することが好ましい。つまり、当該酵素の導電性基材上への固定化に際して、当該酵素に、上記濃度範囲のグルコース、又は上記濃度範囲のグリセロール、或いは双方を添加する。
【００４９】
NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の固定化は、公知の方法の何れをも利用して行うことができる。例えば、共有結合、物理的吸着、イオン結合、抗体等の生物化学的特異的結合による担体結合法、２以上の官能基をもつ試薬による架橋法、ゲル内に封入する包括法等によって固定化することができる。また、これらを組み合わせてもよく、各々の酵素に最適化な酵素固定化法を適宜選択することが望ましい。
【００５０】
包括法としては、種々の天然高分子や合成系高分子等の網目状の三次元構造を持つゲル内に封入する格子型を利用することができる。ゲルとしては、アガロース、アガロペクチン、アラビアゴム、カラーギナン、コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子、ポリアクリルアミド系重合体、ポリビニルアルコール系重合体、ポリビニルピロリドン系重合体、ポリビニルエーテル系重合体等の合成高分子などを好適に利用することができ、親水性のポリマーの利用が好ましい。
【００５１】
また、透析膜等の半透性膜によって封入するマイクロカプセル型、リン脂質のような液体膜によって封入するリポソーム型等を利用することができる。更に、酵素は結晶状態で固定化してもよい。
【００５２】
特に好ましくは、物理的吸着であり、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素を適当な溶媒に溶解又は分散した酵素溶液を導電性基材表面に接触させることにより行うことができる。接触は噴霧、滴下、含浸などの公知の方法で行うことができる。また、スピンコート、スプレー法、スクリーン法、ディップコート、ブレード法等の塗布方法を利用することができる。
【００５３】
NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の導電性基材上への固定化に際しての上記濃度範囲のグルコース及び／又はグリセロールの添加のタイミングは、グルコース及び／又はグリセロールの当該酵素の安定化剤として効果を発揮することができる限り、特に制限はない。好ましくは、当該酵素は、上記濃度範囲のグルコース、又は上記濃度範囲のグリセロール、或いは双方と同時に固定化される。例えば、グルコースを0.75Mを超える濃度、好ましくは、0.9〜2.0Mの濃度となるように調製された適当な溶媒、又はグリセロールを1〜20％の濃度、好ましくは5〜20％の濃度となるように調製された適当な溶媒中に当該酵素を混合した酵素溶液を作製し、かかる酵素溶液を導電性基材に接触させることによって本発明の酵素電極を作製することができる。
【００５４】
また、グルコースを0.75Mを超える濃度、好ましくは、0.9〜2.0Mの濃度となるように調製すると共に、グリセロールを1〜20％の濃度、好ましくは5〜20％の濃度となるように調製された適当な溶媒中に当該酵素を混合した酵素溶液により固定化してもよい。上記濃度範囲のグルコース及び／又はグリセロールと当該酵素を混合した酵素溶液を作製する際には、グルコース及び／又はグリセロールの添加後に当該酵素を添加し混合することが、当該酵素の劣化緩和の観点から好ましい。
【００５５】
更に、グルコース及び／又はグリセロール溶液を予め導電性基材表面に接触させた後に、当該酵素を含む酵素溶液を接触させてもよい。このとき、酵素溶液の接触後のグルコース及びグリセロールが上記濃度範囲内になるように、グルコース及び／又はグリセロール溶液の濃度を予め調製しておくことが必要となる。
【００５６】
補酵素であるNAD又はNADP、ジアホラーゼ等のNADH酸化酵素又はNADPH酸化酵素、及び電子メディエータについても酵素と混合した酵素溶液として固定化してもよい。酵素溶液に混合して固定化する場合には、当該混合溶液は、上記濃度範囲内のグルコース及び／又はグリセロールも含んで調製することが好ましい。また、補酵素であるNAD又はNADP、ジアホラーゼ等のNADH酸化酵素又はNADPH酸化酵素、及び電子メディエータを、酵素溶液とは別の適当な溶媒に溶解又は分散させた溶液として調製し、別々に固定化してもよい。この場合には、酵素溶液の接触後のグルコース及びグリセロールが上記濃度範囲内になるように、グルコース及び／又はグリセロール溶液を含めた各溶液の濃度を予め調製しておくことが必要となる。
【００５７】
ここで、溶媒は水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝成分としては、例えば、イミダゾール、炭酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（TRIS）、4-（2-ヒドロキシエチル）−ピペラジン-1-エタン スルホン酸（HEPES）、3-モルフォリノプロパン スルホン酸（MOPS）等を例示することができる。これらは単独で用いてもよいが、２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００５８】
本発明の酵素電極の作用機構は、導電性基材上に固定化されたNAD依存性酵素又はNADPH依存性酵素は、燃料などの当該酵素の基質を酸化すると同時に、補酵素NAD又はNADPを還元し、NADH又はNADPHを生成する。続いて、NADH又はNADPHがジアホラーゼ等のNADH又はNADPH酸化酵素によって酸化されNAD又はNADPにもどる過程で、電子及びプロトンを生成する。そして、電子メディエータを介して導電性基材にこの電子が伝達されることによって、NAD依存性酵素又はNADPH依存性酵素によって基質から取り出された燃料の持つ化学エネルギーが電気エネルギーに変換される。したがって、本発明の酵素電極は、バイオセンサーやバイオ電池の負極として利用することができる。
【００５９】
本発明の酵素電極において、0.75Mを超える濃度のグルコース、1〜20％濃度のグリセロール、又は0.75Mを超える濃度のグルコース及び1〜20％濃度のグリセロールがNAD依存性酵素及びNADP依存性酵素の安定化剤として働く。上記濃度範囲のグルコース及び／又はグリセロールが当該酵素の劣化を大幅に緩和することができ、酵素電極の触媒機能を安定的に保持することが可能となる。これにより、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びにそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中の時間経過による酵素電極の電極機能の劣化を緩和できる。かかる効果はグルコース濃度が0.9〜2.0Mであるときに顕著に現われ、また、グルコースを基質とするグルコース脱水素酵素に対する効果が特に顕著である。かかる酵素電極をバイオ電池の負極として利用することにより当該時間経過に伴う電池出力の低下を緩和することができ、電池出力の安定化及び向上を図ることができる。
【００６０】
また、1〜20％濃度のグリセロールは、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びにそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中のみならず、バイオ電池作製後であっても、酵素の劣化を大幅に緩和することができ、本発明の酵素電極はその触媒機能を安定的に保持することが可能となる。
【００６１】
〔バイオ電池用セル〕
本発明のバイオ電池用セルは、本発明の酵素電極からなる負極、正極、及び隔膜を１組含んで構成される。セルは、バイオ電池の最小単位であり、これを積層することによりセルスタックを形成することができ、これによりバイオ電池の電池出力を高めることができる。
【００６２】
本発明のバイオ電池用セルは、本発明の酵素電極からなる負極と正極とが、隔膜を挟んで対向するように配置され、負極と正極は外部回路によって接続されている。負極側は、負極に燃料を供給できるように燃料タンクが取り付けられ、正極側は、大気中の酸素を取り入れられるように構成されている。例えば、セルは、セパレーター、燃料タンク、負極、隔膜、正極、セパレーターの順で積層される。
【００６３】
本発明のバイオ電池用セルの正極は、酸素の還元反応を行えるものであることが好ましい。正極ではオキシダーゼ等の酸素の還元反応を行う酵素を選択することが好ましい。正極は、適当な導電性基材上の少なくとも一部に生体触媒を含んだ生物電極の他、金属の触媒反応を利用する白金等の金属電極等として構成しても良い。ここで、生体触媒とは、生物体内に存在する物質変換能を有する物質である。生体由来の天然物質のほか、それを模した人工の物質をも含む。例えば、酵素、微生物、細胞小器官及び細胞等が含まれる。生物電極として正極を構成する場合には、適当な導電性基材上に酵素を固定化した酵素電極することが好ましい。
【００６４】
酵素としては、ビリルビンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ等の酸化還元酵素の利用が好ましく、酵素は単独で、若しくは複数組み合わせて利用することができる。ここで、ビリルビンオキシダーゼは、銅イオンを活性中心に持つマルチ銅オキシダーゼであり、ビリルビンからビルベルジンへの酸化反応を触媒する酵素である。基質から取り出した電子を用いて分子状酸素を電子還元し水分子を生成する反応を触媒するという性質を有することから、バイオ電池の正極触媒としての利用価値が高い酵素である。補酵素及び補因子要求性の有無についても特に制限はない。
【００６５】
補因子を要求する酵素については、アポ形態、ホロ形態の別をも問わないが、電極反応に際しては活性を発揮できるように構成する。したがって、アポ形態として電極上に保持した場合には、補因子を供給する手段を設ける等、活性型に変換するための手段を設けることが必要となる。また、補酵素などの正極反応に必要な物質を供給する手段を設けてもよい。
【００６６】
本発明のバイオ電池用セルの隔膜は、プロトン等を透過できるイオン伝導性を有すると共に、プロトンなどのイオン以外の負極構成成分及び正極構成成分を透過させないという性質を有する限り、その素材及び形状等に制限はない。例えば、固体電解質膜を利用することができる。固体電解質膜としては、スルホン基、リン酸基、ホスホン基、及びホスフィン基等の強酸基、カルボキシル基等の弱酸基、及び極性基を有する有機高分子等のイオン交換機能を有する固体膜等が例示されるが、これらに限定するものではない。具体的にはセルロース膜、及びテトラフルオロエチレンとパーフルオロ〔２−（フルオロスルフォニルエトキシ）プロピルビニルエーテル〕：tetrafluoroethyleneとperfluoro[2-(fluorosulfonylethoxy)propylvinyl ether]の共重合体であるナフィオン（登録商標）等のパーフルオロカーボンスルホン酸（ＰＦＳ）系の樹脂膜を利用することができる。
【００６７】
燃料タンクには、燃料が充填されている。燃料としては、負極上でNAD依存性酵素又はNADP依存性酵素によって進められる酸化還元反応により電子を放出可能な物質であれば特に制限はない。したがって、燃料は、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の基質と成り得る物質であり、当該酵素の種類に応じて適宜選択することができる。好ましくは、バイオマス燃料である。バイオマスとは生物由来の資源を意味し、これら自体でもよいが、これらを加工したものが好ましい。
【００６８】
例えば、糖類としては、単糖類、二糖類、多糖類などを使用することができる。単糖類としては、炭素数４のエリトロース、トレオース、エリトルロース、炭素数５のアラビノース、キシロース、リボース、リキソース、リブロース、炭素数６のグルコース、ガラクトース、タロース、マンノース、ソルボース、フルクトース、タガソース、ソルボース等が挙げられる。二糖類としては、マルトース、ラクトース、スクロース等を、また、多糖類としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース等を例示できる。糖類以外にも、ピルビン酸、オキサロ酢酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、グルタル酸、グルコン酸、フタル酸、乳酸、マロン酸、酢酸、プロピオン酸、グルコース−６−リン酸、フルクトース-6-リン酸、フルクトース-1,6-ビスリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、1,3-ビスホスホグリセリン酸、3-ホスホグリセリン酸、2-ホスホグリセリン酸等の有機酸、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、脂肪類、ペプチド、タンパク質等のポリアミノ酸類、アミン類等を用いることができる。NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素としてグルコース脱水素酵素を用いた場合には、グルコースを燃料とすることが好ましい。
【００６９】
燃料は、適当な溶媒に溶解させた形態で供給する、若しくはゲルに燃料を封入させる等、バイオ電池の構造に応じてその供給形態は適宜選択される。溶媒は、水性媒体であり、蒸留水の他、適当な緩衝液であってもよい。緩衝液に含まれる緩衝成分については、本発明酵素電極の作製の際に用いたものを使用することができる。ゲルとしては、アガロース、アガロペクチン、アラビアゴム、カラーギナン、コラーゲン、ゼラチン等の天然高分子、ポリアクリルアミド系重合体、ポリビニルアルコール系重合体、ポリビニルピロリドン系重合体、ポリビニルエーテル系重合体等の合成高分子などを好適に利用することができる。燃料には、必要に応じて、補酵素NAD又はNADP、ジアホラーゼ等のNADH又はNADPH酸化酵素、電子メディエータを含んで構成することができる。
【００７０】
本発明のバイオ電地用セルは、本発明の酵素電極を負極として含んで作製される。酵素電極の作製工程は、上述した通り、好ましくは、酵素溶液の作製、導電性基材への酵素溶液の接触、酵素溶液の導電性基材への含浸からなる。そして、バイオ電池用セルは、本発明の酵素電極からなる負極、隔膜、正極を順に積層することにより作製される。
【００７１】
本発明のバイオ電池用セルの発電機構を説明すると、燃料が負極側に供給されると、負極上のNAD又はNADP依存性酵素の触媒作用によって、燃料が酸化される。このとき、NAD又はNADP依存性酵素としてグルコース脱水素酵素を用いる場合には、燃料グルコースを酸化しグルコノラクトンが生じる。燃料の酸化反応に伴い、補酵素NAD又はNADPが、それぞれNADH又はNADPHに還元される。NADH又はNADPHは、ジアホラーゼ等のNADH又はNADPH酸化酵素により酸化される。NADH又はNADPHの酸化に伴って生じる電子を電子メディエータが受け取り導電性基板に伝達する。
【００７２】
続いて、電子は、負極から外部回路を通って正極に伝達され、電流が発生する。NADH又はNADPHの酸化反応に伴い電子と共に生じたプロトンは隔膜を通って正極側に移行する。正極上で、プロトンは大気から取り込んだ酸素と外部回路を通して移動してきた電子との反応により水を生成する。
【００７３】
本発明のバイオ電池用セルは、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、及びそれに続くバイオ電池用セルの作製中の時間経過による酵素電極の電極機能の劣化を緩和した本発明の酵素電極を利用することにより、当該時間経過に伴う酵素電極の電極機能の劣化によるバイオ電池用セルの出力低下を緩和することができ、セルの出力の安定化及び向上を図ることができる。
【００７４】
〔バイオ電池〕
本発明のバイオ電池は、本発明のバイオ電池用セルを複数個直列に電気的に接続して集積させるセルスタックを形成することにより作製することができる。好ましくは、1〜12個のセルで作製される。セルスタックの形状は、平面状にセルを配列した平面形状であってもよいし、セルを積み重ねる積層形状であってもよい。これにより、バイオ電池の出力を高めることができる。
【００７５】
本発明のバイオ電池は、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びにそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中の時間経過による酵素電極の電極機能の劣化を緩和した本発明の酵素電極を利用することにより、当該時間経過に伴う酵素電極の電極機能の劣化によるバイオ電池の出力低下を緩和することができ、電池出力の安定化及び向上を図ることができる。
【００７６】
〔バイオ電池の保存方法〕
本発明のバイオ電池の保存方法は、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素を電極触媒として導電性基板上に固定化した酵素電極からなる負極を備えるバイオ電池用セル、及びバイオ電池用セルを集積したバイオ電池本体の保存方法に関するものである。バイオ電池の負極触媒として利用した当該酵素電極において、NAD依存性酵素又はNADP依存性酵素に1〜20％の濃度のグリセロールを接触させて共存させた状態で保存する。1〜20％の濃度のグリセロールはNAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の導電性基板上への固定化の際に添加することが好ましく、1〜20％の濃度のグリセロールを含んでNAD依存性酵素又はNADP依存性酵素の固定化用の酵素溶液を作製し、かかる酵素溶液を導電性基材上に固定化することが好ましい。このとき、グルコースに関しては、0.75M以下に調製するか、グルコースを含まないように調製することが好ましい。
【００７７】
本発明のバイオ電池の保存方法は、酵素固定化を含めた酵素電極の作製、並びにそれに続くバイオ電池用セル、及びバイオ電池本体の作製中のみならず、バイオ電池作製後であっても、電極触媒である酵素の劣化を大幅に緩和することができ、酵素電極はその触媒機能を安定的に保持することが可能となる。このように保存中の時間経過に伴う酵素電極の電極機能の劣化に起因するバイオ電池の出力低下を緩和することができ、バイオ電池の出力を安定的に保持した状態で保存することが可能となる。
【００７８】
上述した通り、0.75Mを超える濃度、好ましくは0.9〜2Mのグルコースは、酵素溶液作製から電極上へ酵素溶液を固定化する酵素の固定化工程に際して発生する酵素の劣化を緩和することができる。一方、1〜20％濃度、好ましくは5〜20％濃度のグリセロールは、上記固定化工程のみならず、バイオ電池作製後から実際のバイオ電池の出力までにおける酵素の劣化を緩和することも可能である。
【００７９】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
〔実施例１〕負極酵素及びメディエータの電位至適化の検討
本実施例では、バイオ電池の高出力化を達成するために、セル電圧の向上を負極内部構成要素の側面から検討した。
【００８１】
１．概要
バイオ電池の出力を向上させる方策の一つに、セル電圧の向上がある。本実施例では、負極内部構成要素の酸化還元電位に着目し（図２を参照のこと）、セル電圧の向上を負極内部構成要素の側面、具体的には、負極酵素及びメディエータについて検討した。負極酵素及びそのメディエータとしては、本発明者らが従来開発した特開2013-45647号に記載のバイオ電池で使用したピロロキノリンキノン依存性グルコース脱水素（以下、「PQQGDH」と称する）と1-メトキシ-5-フェナジンメトサルフェート（以下、「mPMS」と称する）の組み合わせ（比較例：PQQGDH-mPMS系）、PQQGDH-mPMS系に比べて電位ロスの少ないNAD依存性グルコース脱水素酵素（以下、「NADGDH」と称する）と2-アミノ-3-クロロ-1,4-ナフトキノン（以下、「ACNQ」と称する）の組み合わせ（実施例：NADGDH-ACNQ系）を用いて比較検討した。
【００８２】
２．手順
２−１．正極
正極触媒として、天野エンザイムから入手したビリルビンオキシダーゼ（Bilirubin Oxidase：BOアマノ3、以下「BO-3」と略する。）を用いた。BO-3を100mg/ml、及びフェ
リシアン化カリウムを50mMとなるように、1Mのイミダゾール（pH4.6）に1.5mlエッペンチューブ内で溶解し正極酵素溶液とした。かかる正極酵素溶液を導電性基材1枚当たり51μl塗布し指腹で該基材内に含浸（電極内部に酵素溶液を染み込ませた状態）して、正極（2枚）を作製した。ここでは、導電性基材としては、カーボン電極を用いることができ、導電助剤としてケッチェンブラック及びバインダー樹脂としてPVDFを用いてもよい。
【００８３】
２−２．隔膜
正極と負極間の隔膜としては、セルロース膜を用いた。
【００８４】
２−３．負極
２−３−１．PQQGDH-mPMS系（比較例）
負極酵素として、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus）NBRC12552株由来のPQQGDHを用いた。かかる酵素の作製方法及び配列情報は、特開2013-45647号に開示されている。メディエータとして、同仁化学から入手したmPMS(1-Methoxy PMS：同仁化学341-04003)を用いた。グルコースを1M、PQQGDHを1mg/ml、及びmPMSを30mMとなるように、1Mのイミダゾール（pH8.0）に1.5mlのエッペンチューブ内で溶解し負極酵素溶液とした。かかる負極酵素溶液を、導電性基材1枚当たり51μl塗布し指腹で該基材内に含浸して、負極（2枚）を作製した。導電性基材については、上記2-1.正極の項で説明した通りである。これらの工程は時間を置かずに進められた。なお、PQQGDH-mPMS系は、本発明者らが従来開発した特開2013-45647号に記載のバイオ電池の負極構成である。
【００８５】
２−３−２．NADGDH-ACNQ系（実施例）
負極酵素として、天野エンザイムから入手したNADGDH（GLUCDH“Amano"2）を用いた。メディエータとして、東京化成から入手したACNQ（2-アミノ-3-クロロ-1,4-ナフトキノン：東京化成A1288）を用いた。グルコースを0.75M、NADGDHを10mg/ml、ジアホラーゼ(東洋紡DAD301)を20mg/ml、及びNADH（和光純薬工業β-Nicotinamide-adenine dinucl
eotide reduced form、305-50451）を10mMとなるように、1Mのイミダゾール（pH8.7）に1.5mlのエッペンチューブ内で溶解し負極酵素溶液とした。かかる負極極酵素溶液を、導電性基材1枚当たり51μl塗布し指腹で該基材内に含浸して、負極（2枚）を作製した。なお、ACNQは60mMを負極酵素溶液の塗布前に予め導電性基材に塗布しておいた。導電性基材については、上記2-1.正極の項で説明した通りである。これらの工程は時間を置かずに進められた。
【００８６】
２−４．セルの組み立て
上記の通り作製した1組の2枚の正極、隔膜、及び2枚の負極順に組み合わせてセルを作製した。負極の酵素及びメディエータの種類に応じて、PQQGDH-mPMS系（比較例）及びNADGDH-ACNQ系（実施例）の２種類のセルを作製した。
【００８７】
２−５．測定条件
正極、隔膜、負極の順に積層して作製したセルの出力を電子負荷装置（菊水電子、電子負荷装置、PLZ164WA）を用いて測定した。特に、特記がない限り、セル作製後、すぐ（約1分程度）に測定した。
【００８８】
３．結果
結果を図３に示す。図３は、縦軸が電圧（V）、横軸が負荷電流（mA/セルスタック）を示す。PQQGDH-mPMS系（比較例）では0.87Vであったセル電圧が、NADGDH-ACNQ系（実施例）では1.0Vにまで向上し、電池出力も向上することが判明した。
【００８９】
〔実施例２〕セル積層が電池出力に与える影響の検討
本実施例では、バイオ電池の出力を、電池の最小単位であるセルを積層したセルスタックで検討した。
【００９０】
１．概要
バイオ電池は、一般的に高い電圧を得るために1組の負極、隔膜、正極を含んで構成されるセルを、電気的に直列に接続して集積したセルスタックという構造をとる。ここでは、セルの積層による電池出力への影響を検討するため、セルを1〜4個積層したセルスタックの電圧を測定した。
【００９１】
２．手順
実施例１と同様に、正極、隔膜、及びNADGDH-ACNQ系の負極を作製し、これらを順に組み合わせてセルを作製した。続いて、１〜４組のセルを正極と負極が交互に積層し、正極及び負極を直列に積層しセルスタックを作製し、実施例１と同様の測定手順で出力を測定した。
【００９２】
３．結果
結果を図４及び表１に示す。図４は、縦軸が電圧（V）、横軸が負荷電流（mA/セルスタック）を示す。3組のセルを積層した3セルスタック、4組のセルを積層した4セルスタックで電圧の急低下が発生した。セルの積層数が増えることで電圧急低下が起こっていることが判明した。表１に示す通り、電圧急低下に伴い、最大電力も2セルで頭打ち状態となった。これらの結果から、セル積層数が増え、負荷電流を上げると電圧の急低下が起き、最大電力が低下することが判明した。
【００９３】
【表１】
0006728589.tif 000002
【００９４】
〔実施例３〕セル積層による最大電力低下の要因検証
本実施例では、実施例２で観察されたセルの積層により発生する電圧急低下及び最大電力低下の要因を検証した。
【００９５】
１．概要
実施例２において、セル積層数が増え、負荷電流を上げると電圧の急低下が発生し、最大電力が低下することが判明した。かかる事象の要因として、以下の３つが考えられた。
（１）積層したセル内部の正極に大気が供給されないことによるO2供給不足
（２）積層したセル内部の負極に燃料液の添加ができないことによる燃料液供給不足
（３）セル積層数が増えることによるセル作製時間の延長
本実施例では、何れの要因が、電圧急低下及び最大電力低下を招いているのか検証した。
【００９６】
２．手順
各要因につき、１セルで検証を行った。要因（１）については、正極にふたをして、大気O2の供給をセルスタックと同様にしたもの（以下、「正極にふた」と称する）で検証した。さらに要因（１）についてのポンプによる大気送気を行わず、要因（２）についての燃料液の添加を行わないもの（以下、「送気なし・液添加なし」と称する）で検証した。要因（３）については、導電性基材上に負極酵素溶液を載せ（電極内部まで酵素溶液が染み込んでいない状態）、15分後にセルを作製したもの（以下、「セル作製時間」と称する）で検証した。上記検証箇所に施した改変を除いては、実施例１と同様に、正極、隔膜、及びNADGDH-ACNQ系の負極を作製し、これらを積層しセルを作製し、実施例１と同様の手順により出力を測定した。実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、実施例２の1セルスタック）をコントロールとし、上記各セルと比較検証した。
【００９７】
３．結果
結果を図５に示す。図５は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。上記検証したセルのうち、「送気なし・液添加なし」、「正極にふた」のセルでは、最大電力の低下は確認されなかった。一方、「セル作製時間」のセルでは、最大電力の低下が確認された。この結果から、セル作製時間が長くなることが、最大電力低下の要因であることが判明した。
【００９８】
〔実施例４〕緩衝液濃度及びグルコース濃度の影響検証
本実施例では、実施例３で確認した最大電力低下の要因であるセル作製時間について、緩衝液濃度及びグルコース濃度に焦点を当て検証した。
【００９９】
１．概要
実施例３で、最大電力低下の要因がセル作製時間にあることが判明した。本実施例では、負極酵素溶液の作製の際に用いた緩衝液の濃度及びpH、並びに負極酵素溶液に含まれるグルコース濃度が最大電力に与える影響を検証した。
【０１００】
２．手順
緩衝液濃度及びpH、並びにグルコース濃度の影響を検証するべく、緩衝液濃度及びpH、並びにグルコース濃度を下記（１）〜（５）の通りに設定すると共に、この設定した濃度及びpHに調製することを除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。なお、（１）はイミダゾール緩衝液の濃度及びpHを従来の1Mイミダゾール（pH8.7）と調製したものであり、（２）はイミダゾール緩衝液濃度を0.5Mに調製し、（３）はpHを7.0に調製したものである。（４）はグルコース濃度を従来の0.75Mに対して0.5Mに、（５）は1.0Mに調製したものである。
（１）1Mイミダゾール（pH8.7）‐0.75Mグルコース（以下、「1Mイミダゾール（pH8.7）」と称する）
（２）0.5Mイミダゾール（pH8.7）‐0.75Mグルコース（以下、「0.5Mイミダゾール（pH8.7）」と称する）
（３）1Mイミダゾール（pH7.0）‐0.75Mグルコース（以下、「1Mイミダゾール（pH7.0）」と称する）
（４）1Mイミダゾール（pH8.7）‐0.5Mグルコース（以下、「0.5Mグルコース）」と称する）
（５）1Mイミダゾール（pH8.7）‐1Mグルコース（以下、「1Mグルコース）」と称する）
【０１０１】
上記の通り緩衝液濃度及びpH並びにグルコース濃度を設定したNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を、導電性基材上に載せ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製しセルの出力を測定した。実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、1Mイミダゾール（pH8.7）及び0.75Mグルコースを含んで調製した負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロールとし、上記各セルと比較検証した。
【０１０２】
３．結果
結果を図６に示す。図６は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。上記検証した何れのセルの場合にも、コントロールに比較して最大電力が低下した。なかでも、グルコース濃度を低くすることにより、顕著な最大電力の低下が確認された。この結果から、最大電力の低下が、グルコース濃度と関係があることが判明した。
【０１０３】
〔実施例５〕負極構成成分の影響検証−１
実施例２で確認されたセル積層により発生する電圧急低下及び最大電力低下の要因について実施例３及び４に続き検証した。本実施例では負極構成成分が与える影響について検証した。
【０１０４】
１．概要
正極構成成分は、本発明者らが従来開発した特開2013-45647号に記載のバイオ電池から変更していないため、電圧急低下及び最大電力低下は負極構成成分が関係していると考えた。そこで、本実施例では、負極構成成分が電力に与える影響を検証した。図７に、負極構成成分、及び当該負極構成成分における電子の流れを模式的に表す。本実施例では、負極構成成分のうち、水溶性でないため予め電極に塗布しているメディエータ（med）であるACNQ以外の4種類の負極構成成分(NADGDH、ジアホラーゼ、NADH、グルコース)について検証した。
【０１０５】
２．手順
上記各負極構成成分のうち1成分（NADGDH、ジアホラーゼ、NADH、グルコース）を除くこと以外は実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。作製15分後に、除いた成分を加え、実施例１と同様にして、各負極酵素溶液を用いて負極を作製した。作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製し出力を測定した。コントロールとしては、実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、全ての負極構成成分を含めて調製した負極酵素溶液を調整直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロールとし、上記各セルと比較した。
【０１０６】
３．結果
結果を図８に示す。図８は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示し、横軸に負極酵素溶液の調製に際して当初除いていた成分を示す。その結果、15分後にNADGDHを加えたものだけ、コントロールと同等の最大電力を保持していた。これにより、NADGDHが、セル作製時間が長くなった影響を受けて失活したことが、電圧急低下及び最大電力低下の要因の一つであることが判明した。
【０１０７】
〔実施例６〕負極構成成分の影響検証−２
実施例２で確認されたセル積層により発生する電圧急低下及び最大電力低下の要因について、実施例５に続き負極構成成分が与える影響について検証した。本実施例では、実施例５の結果を受け、NADGDHが与える影響について検証した。
【０１０８】
１．概要
本発明者らが従来開発した特開2013-45647号に記載のバイオ電池であるPQQGDH-mPMS系では、最大電流密度向上に効果があるとして、電極作製の際に導電性基材に含浸させる負極酵素溶液にグルコースを添加している。そこで、実施例４に続いて本実施例においても、グルコースが負極酵素NADGDHに与える影響を検証した。
【０１０９】
２．手順
NADGDHに対して、mPMSとACNQの2種類のメディエータを用いた。グルコースを含ませた負極酵素溶液を用いて作製した負極を用いてセルを作製した場合（以下、「電極含浸」と称する）と、グルコースを含まずに調製した負極酵素溶液を用いて負極を作製し、セルを作製した後にグルコースを添加した場合（以下、「作製後添加」と称する）との、セルの最大電力を比較した。
【０１１０】
電極含浸により作製されたセルにおいてメディエータとしてACNQを用いたものは、実施例１と同様に、正極、隔膜、及びNADGDH-ACNQ系の負極を作製し、これらを積層することにより作製した。電極含浸により作製されたセルにおいて、メディエータとしてmPMSを用いたものは、ACNQにかえて、30 mM のmPMS を用いたことを除いては上記と同様に作製した。
【０１１１】
作製後添加により作製されたセルにおいてメディエータとしてACNQを用いたものは、グルコースを除いたこと以外は実施例１と同様に負極酵素溶液を導電性基材に含浸させて負極を作製した。作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製し、セル作製後に0.75 Mグルコースを含んだ1 Mイミダゾール（pH 8.7）を170 μl添加した。作製後添加により作製されたセルにおいてメディエータとしてmPMSを用いたものは、ACNQにかえて、30 mM のmPMS を用いたことを除いては上記と同様に作製した。
【０１１２】
上記のように作製した各セルを、実施例１と同様の手順により出力を測定した。このとき、各メディエータにつき、電極含浸の場合をコントロールとした。
【０１１３】
３．結果
結果を図９に示す。図９は、コントロールの最大電力を100％とし、それに対する相対値（％）を縦軸に示す。電極含浸の場合をコントロールとしているので、作製後添加の場合の相対値（％）を各メディエータ毎に示している。両メディエータともに、電極含浸の場合には最大電力は高くなった。mPMSでは、電極含浸と作製後添加の場合の出力差は小さかった。一方、ACNQでは、電極含浸の場合には最大電力は高いものの、作製後添加の場合には最大電力は著しく低下した。この結果から、負極構成成分としてNADGDH-ACNQ系を採用した場合には、グルコースがNADGDHの活性に与える影響が大きいことが判明した。
【０１１４】
〔実施例７〕セル作製時間によるグルコース濃度の出力への影響検証
実施例４及び６の結果を受け、負極構成成分としてNADGDH-ACNQ系を採用した場合には、グルコースが電圧及び最大電力に与える影響が大きいと考え、グルコース濃度が与える影響について検証した。
【０１１５】
１．概要
実施例４の結果より、グルコース濃度が0.5 Mではセル作製時間の影響を受け、最大電力が従来の0.75 Mより低いことが判明し、実施例６の結果よりグルコースを負極酵素溶液の導電性基材への含浸時に共存させないと最大電力が著しく低くなることが判明した。これらの結果より、負極構成成分としてNADGDH-ACNQ系を採用した場合には、グルコースが最大電力に与える影響が大きいと考え、最大電力低下の改善策として、グルコース濃度に着目し検証した。
【０１１６】
２．手順
実施例１のNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液において、グルコース濃度を従来の0.75 M、及び負極酵素溶液の構成で最大限添加することができる1.35 Mの各濃度に調製した負極酵素溶液を作製した。調製した負極酵素溶液を導電性基材上に載せ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層して各セルを作製し出力を測定した（以下、「電極上１５分」と称する）。また、実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロール（以下、「直後」と称する）とし、上記各セルと比較検証した。
【０１１７】
３．結果
結果を図１０に示す。図１０は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。グルコース濃度を1.35 Mにすることで、負極酵素溶液を作製してから15分置いた後に作製したセルであっても、15分置かずにセルを作製したものと同程度の最大電力を保持することができることが判明した。この結果から、グルコースが時間経過によるNADGDHの失活を防ぎ、最大電力低下の改善に効果があることが判明した。
【０１１８】
〔実施例８〕セルスタックでの電圧及び最大電力急低下の改善検証
実施例７の結果より、負極溶液に含まれるグルコースがNADGDHの失活を防ぎ、電圧急低下及び最大電力低下の改善に効果があることが判明したことから、本実施例では、セルスタックでの電圧及び電力への影響を検証した。
【０１１９】
１．概要
実施例７において、負極溶液に含まれるグルコース濃度を1.35Mにすることで、セル作製時間に起因する電圧急低下及び最大電力低下が改善されることが判明した。本実施例では、セルを積層したセルスタックでの電圧及び電力にグルコース濃度が与える影響を検証した。
【０１２０】
２．手順
実施例１のNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液において、従来の0.75 M、及び1.35 Mの各濃度のグルコースを含む負極酵素溶液を作製した。作製した負極酵素溶液を導電性基材上に載せ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層して各セルを作製した。続いて、実施例2の手順で各セルを直列に４つ積層し４セルスタックを作製し、実施例１の手順で出力を測定した。
【０１２１】
3．結果
結果を図１１及び１２に示す。図１１は、負荷電流（mA/セルスタック）に対するセルスタックの電力（mW/スタック）を示し、図１２は、負荷電流（mA/セルスタック）に対するセルスタックの電圧（V）を示す。グルコース濃度0.75 Mで起こっていた負荷電流5 mA付近での電圧の急低下は、グルコース濃度1.35 Mでは改善し、最大電力は26 mW/スタックまで向上した。この結果から、セルスタックとして構築した場合においても、グルコース濃度は電圧急低下及び最大電力低下に影響を与えることが判明した。
【０１２２】
〔実施例９〕高濃度グルコースによる出力改善効果の解明
実施例７及び８により、負極溶液に含まれるグルコース濃度を1.35Mにすることで電圧及び電力急低下が改善されることが判明したことから、本実施例では、かかる改善効果の詳細検証を行った。
【０１２３】
１.概要
実施例７及び８の結果から、グルコース濃度を1.35 Mにすることでセル作製時間起因する電圧急低下が改善し、最大電力を向上できることが判明した。高濃度グルコースによる電圧及び最大電力改善効果がグルコースに起因するものであり、グルコースがNADGDHの安定化剤として寄与している可能性が考えられた。そこで、本実施例では、水溶液中で酵素の安定化に効果があることが知られているグリセロールを添加し、最大電力への影響を検証した。
【０１２４】
２．手順
グルコース及びグリセロールの影響を検証するべく、グルコース及びグリセロール濃度を下記の条件に設定すると共に、この設定した条件を除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。グルコースを従来の0.75M含むように調製した負極酵素溶液、及びグルコースを1.35M含むように調製した負極酵素溶液、グルコースを従来の0.75M及びグリセロールを10％含むように調製した負極酵素溶液、及びグルコースを含まずグリセロールを10％含むように調製した負極酵素溶液を作製した。作製した各負極酵素溶液を導電性基材上に載せ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製し出力を測定した。実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、0.75Mのグルコースを含むように調製された負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロールとし、上記各セルと比較検証した。
【０１２５】
３．結果
結果を図１３に示す。図１３は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。グルコース0.75 Mにグリセロールを10%添加することによっても、グルコース1.35 Mと同様にセル作製時間に起因する最大電力の低下を抑制できることが明らかとなった。なお、グリセロール10%のみでは基質であるグルコースが存在せず、グリセロールがNADGDHと反応せず出力が著しく低かった。この結果より、高濃度グルコースがNADGDHの安定化剤として寄与していることが確認できた。
【０１２６】
〔実施例１０〕グリセロール濃度による最大電力への影響検証
実施例９の結果より、高濃度グルコースはNADGDHの安定化剤として寄与することに加えて、グリセロールでも高濃度グルコースと同様の効果があることが判明したことから、本実施例ではグリセロールの影響を検証した。
【０１２７】
１．概要
実施例９の結果より、高濃度グルコースはNADGDHの安定化剤として寄与することに加えて、グリセロールでも高濃度グルコースと同様の効果があることが判明した。このことから、高濃度グルコースが有するNADGDHに対する安定化機能はグリセロールにより代替可能であることが理解できる。そこで、本実施例では、グリセロール濃度に焦点を当て電圧及び最大電力に与える影響を検証した。
【０１２８】
２．手順
負極酵素溶液として、実施例１のNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液において、セル作製時間に起因して最大電力が低下することが実施例２等で確認されている従来の0.75 M濃度のグルコースを含み、更にグリセロールを0〜20％含む負極酵素溶液を作製した。詳細には、0.75 M濃度のグルコースに加えてグリセロールを0、1、5、10及び15％含むことを除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。そして、各負極酵素溶液を導電性基材上に載せ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製し出力を測定した。実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、0.75Mのグルコースを含みグリセロールを含まないように調製された負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロールとした。
【０１２９】
３．結果
結果を図１４に示す。図１４は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示し、横軸はグリセロール濃度（％）を示す。その結果、何れの濃度においてもグリセロールを添加したことでセル作製時間に起因する最大電力の低下が改善された。このところからグリセロールによってNADGDHが安定化し、最大電力は向上したことが理解できる。また、グリセロール濃度1%ではその効果は小さく、5％以上添加することで効果は大きくなることが判明した。
【０１３０】
〔実施例１１〕セル作製時間によるグルコース濃度の出力への影響の詳細検証
実施例７〜９より、負極構成成分としてNADGDH-ACNQ系を採用した場合に、グルコースが最大電力に与える影響が大きいことが判明したことから、本実施例では、グルコース濃度が与える影響について詳細検証した。
【０１３１】
１．概要
実施例７〜９の結果より、グルコース濃度を1.35 Mにすることでセル作製時間に起因する電圧の急低下が改善し、最大電力を向上できることが判明した。最大電力の改善効果の検証として、グルコースがNADGDHの安定化剤として寄与している可能性が考えられたため、本実施例ではグルコース濃度に着目し、更に広範囲の濃度について検証した。
【０１３２】
２．手順
負極酵素溶液として、実施例１のNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液において、グルコース濃度を所定濃度に調製した負極酵素溶液を作製した。詳細には、0.1M、0.5M、0.75M、0.9M、１M、1.2M、1.35M、1.5M、2Mの各濃度に調製したことを除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。そして、各負極酵素溶液を導電性基材上に含浸させ15分放置し負極を作製した。ここで作製した負極、及び実施例１と同様にして作製した正極及び隔膜を用いて、実施例１と同様に積層してセルを作製した。また、実施例１と同様に、負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセルを作製した。これらのセルの出力を実施例１と同様の手順により測定した。実施例１で作製したNADGDH-ACNQ系の負極を含むセル（つまり、0.75Mのグルコースを含むように調製された負極酵素溶液を作製直後に導電性基材上に含浸させ、その直後に作製したセル）をコントロールとした。
【０１３３】
３．結果
結果を図１５に示す。図１５は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示し、横軸はグルコース濃度（M）を示す。その結果、0.75M以下では15分間の放置により明らかな最大電力の低下が確認されたが、グルコースを0.75Mを超える高濃度にすることで、低濃度グルコース存在下で15分間の放置を行った場合に生じる最大電力の低下は緩和できることが判明した。
【０１３４】
〔実施例１２〕セル作製後の保存性検証（一晩）
セル作製中での負極酵素NADGDHの失活は、燃料であるグルコースの高濃度化又はグリセロールを所定濃度以上添加することで緩和することができることが判明した。本実施では、セル作製後の保存性も同じ条件で向上できるのかを検証した。
【０１３５】
１．概要
実施例７、８、１０及び１１の結果より、セル作製時間（負極酵素溶液を作製後に導電性基材に含浸させてからセル作製するまでの15分間）に生じる負極酵素NADGDHの失活は、燃料であるグルコースの0.75M以上への高濃度化、又はグリセロールを1％以上添加することで緩和することができることが判明した。本実施では、セル作製後の保存性も同じ条件で向上できるのかを検証した。
【０１３６】
２．手順
グルコース及びグリセロール濃度を下記の条件に設定すると共に、この条件を除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。グルコース及びグリセロールを含まない負極酵素溶液、グルコースを含まずグリセロールのみを10％含むように調製した負極酵素溶液、グルコースを従来の0.75Mを含みグリセロールを含まない負極酵素溶液、グルコースを従来の0.75Mを含みグリセロールを10％含むように調製した負極酵素溶液、グルコースを1.35Ｍ含みグリセロールを含まない負極酵素溶液、グルコースを含まずグリセロールを10％含むように調製した負極酵素溶液を作製した。そして、かかる負極酵素溶液を用いてセルを作製した。
【０１３７】
セルの作製は以下の３通りの方法により行った。
（１）上記で作製した各負極酵素溶液を、実施例１と同様に導電性基材上に含浸させた直後にセルを作製し、燃料液（グルコース1.35M）を添加し、５分後に、実施例１と同様にして出力を測定した（以下、「直後」と称する）。
（２）上記で作製した各負極酵素溶液を、導電性基材上に含浸させ15分間放置した後、実施例１と同様にセルを作製し、燃料液（グルコース1.35M）を添加し、５分後に、実施例１と同様にして出力を測定した（以下、「15分」と称する）。
（３）上記で作製した各負極酵素溶液を、導電性基材上に含浸させ15分間放置した後、実施例１と同様にセルを作製し、一晩4℃にてO/N保存。続いて、燃料液（グルコース1.35M）を添加し、15分後に、実施例１と同様にして出力を測定した（以下、「O/N」と称する）。
また、各負極酵素溶液における直後のセルをコントロールとし、比較検証した。
【０１３８】
３．結果
結果を図１６に示す。図１６は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。その結果、セル作製時間に起因して出力低下の緩和効果があったグルコース1.35Mやグルコース0.75Mにグリセロール10%を添加したものでは、O/N保存後には電池出力は大幅に低下し、セル作製直後の約2割〜3割となった。グリセロールを10%添加したものではO/N保存後であっても出力が9割以上保持していた。グルコースの添加による出力の低下の要因は酵素反応の進行によるものであるのか、グルコースがACNQに直接影響を与えているのか、詳細には解明できなかった。この結果から、セル作製中に生じる出力低下の緩和条件と、O/N保存性の向上に適した条件が一部異なることが判明した。
【０１３９】
〔実施例１３〕セル作製後の保存性検証（数日）
実施例１２に続き、本実施では、セル作製後の保存性を検証した。
【０１４０】
１．概要
実施例１２では、セル作製後一晩における保存性を検証したが、本実施例では数日間でのセルの保存性を検証した。
【０１４１】
２．手順
グルコース及びグリセロール濃度を下記の条件に設定すると共に、この条件を除いては実施例１と同様にしてNADGDH-ACNQ系の負極酵素溶液を作製した。グルコース及びグリセロールを含まない負極酵素溶液、グルコースを含まずグリセロールのみを10％含むように調製した負極酵素溶液を作製した。そして、かかる負極酵素溶液を用いてセルを作製した。
【０１４２】
セルの作製は以下の３通りの方法により行った。
（１）上記で作製した各負極酵素溶液を、実施例１と同様に導電性基材上に含浸させた直後にセルを作製し、燃料液（グルコース1.35M）を添加し、５分後に、実施例１と同様にして出力を測定した（以下、「直後」と称する）。
（２）上記で作製した各負極酵素溶液を、導電性基材上に含浸させ15分間放置した後、実施例１と同様にセルを作製し、3日、5日、7日間4℃にてO/N保存。続いて、燃料液（グルコース1.35M）を添加し、15分後に、実施例１と同様にして出力を測定した（以下、それぞれ「3日後」、「5日後」、「7日後」と称する）。
また、各負極酵素溶液における直後のセルをコントロールとし、比較検証した。
【０１４３】
３．結果
結果を図１７に示す。図１７は、コントロールの最大電力を100%とし、それ対する相対値（％）を縦軸に示す。その結果、グルコースもグリセロールも添加しない(無添加)ものでは、3日保存後の出力はセル作製直後の4割まで低下していたが、グリセロールを10%添加したものでは3日保存後でも7割、5日後保存後でも5割の出力を保持していた。この結果から、グリセロールを添加することで、数日間の保存性向上効果が確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明は、バイオ電池に関し、バイオ電池が要求されるあらゆる分野、特に、電子、医療、食品、環境分野等の産業分野において利用可能である。特に卓上電卓等の携帯型機器や心臓ペースメーカー等の体内埋め込み式機器等の小型電子機器の電源等への応用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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