(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロにおける心不全疾患（ＨＦ）に罹患している患者の予後を判定するための方法であって、前記患者の検査試料中の可溶性ネプリライシン（ＮＥＰ）レベルを測定するステップを含む、インビトロでの方法。
【請求項２】
前記可溶性ＮＥＰレベルが基準値より高い場合、予後不良を示す、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項３】
前記可溶性ＮＥＰレベルが、イムノアッセイ技術によって測定される、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項４】
前記イムノアッセイ技術が、サンドイッチアッセイである、請求項３に記載のインビトロでの方法。
【請求項５】
前記サンドイッチアッセイが、ＥＬＩＳＡである、請求項４に記載のインビトロでの方法。
【請求項６】
前記検査試料が、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、および細胞上清液からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載のインビトロでの方法。
【請求項７】
前記検査試料が、血清または血漿である、請求項６に記載のインビトロでの方法。
【請求項８】
前記予後不良が、心不全の増悪または代償不全および死亡からなる群から選択される心血管事象のリスクである、請求項１または２に記載のインビトロでの方法。
【請求項９】
前記心血管事象のリスクが、可溶性ＮＥＰレベルとともに比例的に増加する、請求項８に記載のインビトロでの方法。
【請求項１０】
前記患者が慢性ＨＦに罹患している、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項１１】
可溶性ＮＥＰの存在の検出は、前記試料を、可溶性ＮＥＰと特異的に結合する抗体またはその断片と接触させることにより行われる、請求項１に記載のインビトロでの方法。
【請求項１２】
前記抗体またはその断片が、キットの一部を構成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対象者においてＮＥＰ阻害剤に基づく医療レジメンを開始することを決断するまたは推奨するために、可溶性ＮＥＰの量を基準値と比較する方法であって、
（ａ）請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法により、前記対象者の検査試料中の可溶性ＮＥＰの量をインビトロで測定するステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）で得たレベルと基準値を比較するステップ
を含み、      
ステップ（ａ）で検出された可溶性ＮＥＰの量が、前記基準値より高い場合、それが、前記対象者がＮＥＰ阻害剤に基づく医療レジメンの恩恵を受けることになることを示すものである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床予後の分野に存する。詳細には、本発明は、心不全（ＨＦ（Heart Failure））患者の有害事象（例えば新血管死亡）の予後に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全（ＨＦ）は、うっ血性ＨＦ（ＣＨＦ）とも呼ばれ、心臓の構造または機能に関する問題によって身体の要求を満たすのに十分な血流を供給するその能力が損なわれたときに起こる心臓の状態である。心不全は、多種多様な症状、特に、安静時または労作および／もしくは疲労しているときの息切れ（ＳＯＢ（shortness of breath））、体液貯留の兆候、例えば肺うっ血またはくるぶし腫脹、ならびに安静時の心臓の構造または機能の異常の客観的証拠の原因になりうる。しかし、一部の患者には全く症候がないこともあり、心臓の無症候性構造または機能異常は、症候性心不全の前兆であり、高い死亡率を伴う。
【０００３】
心不全は、よく見られる疾患であり、米国人口の２％より多くが、またはほぼ５百万人が罹患しており、患者の３０〜４０％は、診断を受けた後１年以内に心不全がもとで死亡する。
【０００４】
心不全は、普遍的に合意された定義がなく、特に早期の場合、確定診断が困難であるため、診断されないことが多い。適切な治療法で大多数の患者の心不全は管理することができるが、心不全は生命を脅かす可能性があり、進行性疾患は１０％という年間全死亡率を伴う。加えて、心不全は、６５歳より上の高齢者の入院の主因である。結果として、欧州諸国では心不全の管理に医療費の１〜２％が費やされている。
【０００５】
慢性ＨＦは、治療される症状（symptomatology）が通常は安定している、何ヶ月にも、何年にもわたって発症する長期にわたる状態である。この状態は、心臓の適応応答に関連づけられるが、この適応応答は、長期的には有害であり、状態の悪化につながることがある。急性ＨＦ（ＡＨＦ）は、心不全兆候および症状の変化があり、その結果、緊急治療または入院が必要であると患者を特徴づけることができるエピソードを指す、心不全増悪または非代償性心不全を記述するために使用される用語である。ＡＨＦは、数時間または数日のうちに急に発症し、代償適応する時間が心臓にないため直ちに生命を脅かすことがある。慢性ＨＦもまた非代償性であることがあり、併発する病気（例えば肺炎）、心筋梗塞、不整脈、管理不良高血圧、または患者の水分制限、食事制限もしくは薬物療法の維持の失敗の結果として生じることが最も一般的である。
【０００６】
リスクを早期に認識することは、有害事象の発生の予防に役立つ対策を開始するための必要条件であるので、患者の受診時に有害事象を予測できることは重要である。これに関連して、正確な予後情報を提供することができるマーカーを発見するための試みがいくつかなされている。
【０００７】
臨床的には、いくつかのバイオマーカーがＨＦの予後の予測因子として大きな注目を集めており、ナトリウム利尿ペプチドが最も広範に使用されているが、他のもの、例えばＳＴ２および高感度トロポニンＴも、ナトリウム利尿ペプチドに相加的な形で、有望な結果を示している。バイオマーカーのレベルを測定するとき、臨床医が、その検査の精度を弱めるまたは未確定にする可能性のある交絡因子を承知していることも非常に重要である。この古典的な例は、ＨＦの際のナトリウム利尿ペプチドの血中濃度に対するボディー・マス・インデックスまたは腎機能障害の影響の仕方である。
【０００８】
したがって、なされた努力にもかかわらず、ＨＦ疾患を管理する上で有用な情報を与えることができるさらなる予後マーカーがなお必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ  Ａ、ｄｅ  Ａｎｔｏｎｉｏ  Ｍ、Ｇａｌａｎ  Ａ、Ｓａｎｚ  Ｈ、Ｕｒｒｕｔｉａ  Ａ、Ｃａｂａｎｅｓ  Ｒら、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＳＴ２  ａｎｄ  ＮＴｐｒｏＢＮＰ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｅａｔｈ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  ２０１２年、１４巻、３２〜８頁。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、ＨＦに罹患している患者の試料において循環可溶性ネプリライシン（本明細書では以降「ＮＥＰ」とも呼ぶ）レベルを発見した。特に、循環可溶性ＮＥＰレベルが慢性ＨＦ患者の血清において広範に検出された。加えて、下で例証するように、ＮＥＰと心血管アウトカムの明らかな関連性が見つかった。ＮＥＰは、下で詳細に説明するように、大きい細胞外触媒ドメインと、単一の膜貫通領域と、短い（２７アミノ酸）細胞質側Ｎ末端ドメインとを有する、膜結合型酵素である。この酵素は、従来技術では知られている、いくつかのタイプの癌または腎疾患に関する診断または予後マーカーとして開示されている。
【００１１】
驚くべきことに、本発明者らは、この酵素がＨＦの予後マーカーとして有用であることを見いだした。
【００１２】
その一方で、いくつかの以前の報告は、生体液中でＮＥＰの存在を確認している。しかし、ＨＦ患者における病理生物学的サロゲート（pathobiological surrogate）としての循環可溶性ＮＥＰの証拠は存在しない。
【００１３】
したがって、第一の態様では、本発明は、インビトロで心不全疾患に罹患している患者の予後を判定するための方法であって、この患者の検査試料中の可溶性ネプリライシン（ＮＥＰ）レベルを判定するステップを含むインビトロでの方法を提供する。
【００１４】
下で詳細に説明するように、患者１０６９名の大規模実生活継続コホートを３３５の複合エンドポイント事象に関して平均４．１年間経過観察し、ＨＦ予後に関してより広範に使用されているバイオマーカーの１つであるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む予後に有意義な１２の変数を含む、非常に包括的な多変量モデルでの補正後でさえ、ＮＥＰがＣＶ死亡および罹患の良好な病理生物学的サロゲートであることを見いだした。その多変量解析の結果を要約する表２に示すように、ＮＥＰによって提供される予後情報は（ｐ値が０．０５未満であるため）有意であり、そのような解析中に考慮に入れた他のパラメータから独立している。多変量解析を行うとき、最初に見たときは疾患の診断または予後に適切であるように思われるバイオマーカーが、他のバイオマーカーによってまたは他のパラメータ（例えば、数ある中でも年齢もしくは性別）を考慮することによって統計的に負の干渉を受けるため、最後には無視されることは、当業者には既知である。別の多変量統計解析である下の表３は、可溶性ＮＥＰによって提供される予後情報が、他の予後ＨＦマーカー、ＳＴ２および高感度トロポニンＴ、をその解析に含めたとき、その統計的有意性を失うＮＴｐｒｏＢＮＰとは対照的に影響を受けないことを例証するものである。
【００１５】
したがって、表２および表３からのデータから、可溶性ＮＥＰが、アッセイにおいて考慮されるパラメータおよび他のバイオマーカーから独立して予後情報を提供すると結論づけることができる。また、その結果として、下で提供するデータは、ＨＦ患者の予後ツールとしてのＮＥＰの大きな価値を裏づける。
【００１６】
第二の態様では、本発明は、ＨＦの予後マーカーとしての可溶性ＮＥＰの使用を提供する。
【００１７】
第三の態様では、本発明は、本発明の第一の態様で定義の方法における心不全疾患の予後のための単離された試料中の可溶性ＮＥＰの存在を検出する手段の使用を提供する。
【００１８】
第四の態様では、本発明は、ＮＥＰ阻害剤に基づく医療レジメンを開始するかどうかを決断するまたは推奨する方法であって、
（ａ）  患者の検査試料中の可溶性ＮＥＰの量をインビトロで判定するステップ、および
（ｂ）  ステップ（ａ）で得たレベルと基準値を比較するステップ
を含み、ステップ（ａ）で検出された可溶性ＮＥＰの量が、この基準値より高い場合、それが、この患者がＮＥＰ阻害剤に基づく医療レジメン（medical regimen、医療上の計画又は処方）の恩恵を受けることになることを示すものである方法を提供する。
【００１９】
検査試料中の可溶性ＮＥＰレベルを判定することにより、当業者は、推奨することができる最も好適な治療法はどれであるのかをさらに確証（establish）することができる。なぜなら、この試料中の検出されるレベルは、症状の拡大（すなわち重症度）を反映しうるからである。検査試料中で判定される可溶性ＮＥＰレベルが高いほど、ＨＦ患者へのＮＥＰ阻害剤の投与は有益でありうる。
【００２０】
さらに、対象（対象者、被験者）がＨＦ症候群に罹患しているため（本発明の第二の態様で定義した方法に従って）医療レジメンを開始する決断をしたら、そのレジメンにどの程度効果があるのかをモニターすることができる。正常な可溶性ＮＥＰレベルに低下するまたは戻ることは、そのＨＦ患者が、この医療レジメンに好適に反応したこと、したがって、このレジメンが有効であることを示すことができ、可溶性ＮＥＰレベルが有意に変化しなかった場合、または増加した場合、これは、この医療レジメンが有効でないことを示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】年齢調整コックス回帰曲線を示す図である。Ａ図はＣＶ死またはＨＦ入院の主要複合エンドポイントについての無再発生存率を示す図である。Ｂ図はＣＶ死についての生存率曲線を示す図である。ＮＥＰの中央値＝０．６４２ｎｇ／ｍＬ。黒線＝ネプリライシン＜中央値、灰色線＝ネプリライシン≧中央値。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
上で述べたように、本発明は、ＨＦに罹患している患者の予後を判定する方法を提供する。
【００２３】
「予後」は、心不全患者の有害事象（例えば、死亡）の予測に関する。これは、この患者の回復の可能性または死の可能性の推定を含む。「有害事象」は、心不全の増悪または代償不全、および死亡と定義する。「死亡」は、新血管死（例えば、心筋虚血および梗塞、心不全、心停止または脳血管発作に起因しうる）および非血管死亡（他のすべての死因、例えば感染症、悪性腫瘍を含む）と定義する。そのため、一実施形態では、「予後不良」は、心不全の増悪または代償不全、および血管死亡からなる群から選択される。別の実施形態では、予後不良は、死亡のリスクである。
【００２４】
ＨＦは、ＣＨＦとも呼ばれ、心臓の構造または機能に関する問題によって身体の要求を満たすのに十分な血流を供給するその能力が損なわれたときに起こる心臓の状態である。
【００２５】
一実施形態では、患者は、慢性ＨＦに罹患している。
【００２６】
「慢性ＨＦ」は、増悪原因に対する心臓の適応応答（例えば、拡張、肥大）に関連づけられる、治療される総体症状が通常は安定している長期にわたる状態（数ヶ月／数年）である。しかし、これらの適応応答は、長期的には有害であり、状態の悪化につながることがある。慢性ＨＦの患者は、安定期、増悪期および非代償期慢性ＨＦ患者に分類することができる。慢性ＨＦ患者の代償不全は、併発する病気（例えば肺炎）、心筋梗塞、不整脈、管理不良高血圧、または患者の水分制限、ダイエットもしくは薬物療法の維持の失敗の結果として生じることが最も一般的である。増悪期または非代償期である慢性ＨＦは、ＨＦ兆候および症状の変化があり、その結果、緊急治療または治療調整が必要となり、入院を要することを特徴とする。
【００２７】
心不全での入院を誘発する一般的な要因は、例えば、急性心筋虚血、医療レジメン（ナトリウムおよび／または水分制限）の非遵守、高血圧未修正、心房細動および他の不整脈、肺塞栓症または併発感染症である。
【００２８】
ネプリライシン（ＮＥＰ）は、大きい細胞外触媒ドメインと、単一の膜貫通領域と、短い（２７アミノ酸）細胞質側Ｎ末端ドメインとを有する、膜結合型酵素である。その配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース（バージョン１８０、最終更新日２０１４年７月９日）において参照コードＰ０８４７３で入手することができる。この酵素は、ナトリウム利尿ペプチドをはじめとする多数の血管拡張ペプチドの分解を触媒し、アンジオテンシンＩＩの分解にも寄与する。
【００２９】
本発明の方法で検出されるものである、ＮＥＰの可溶性形態は、膜と結合していないＮＥＰの形態である。一実施形態では、可溶性ＮＥＰ形態は、参照コードＰ０８４７３を有する野生型とは膜貫通および細胞内ドメインがない点で異なり、配列番号１に対応する。
【００３０】
用語「患者」は、本明細書で使用する場合、疾患のため診療受けているまたは診療を受けるべきである、生存しているヒトまたは非ヒト生物を指す。これは、病態の兆候について調査されることになる、定義された病気のない人物を含む。したがって、本明細書に記載する方法およびアッセイは、ヒト疾患にも獣医学的疾患にも適用可能である。
【００３１】
本発明の第一の態様の一実施形態では、可溶性ＮＥＰレベルが基準値より高い場合、それは予後不良を示す。
【００３２】
下に示す結果から導出できるように、有害事象疾患に罹患するリスクは、ＮＥＰレベルの増加に伴って比例的に増加する。ＮＥＰ対数変換の１標準偏差につき、有害事象に罹患するリスクが約１８％増加する。
【００３３】
第一の態様の方法の中で言及した用語「基準値」は、分子マーカー可溶性ＮＥＰの被定義値であって、試料または試料群におけるこの分子マーカーのレベルから導出される値であると解されたい。この試料は、何らかの有害アウトカムを示した／いかなる有害アウトカムもまだ示していない対象または対象群から採取される。当業者は、一般知識を用いて、基準値を得るためにより適切な対象または対象群を選択することができる。
【００３４】
一実施形態では、基準値は、そのような状況で、ＨＦに罹患している患者集団から決定され、可溶性ＮＥＰレベルが基準値と比較して増加された場合、それはその患者が悪化していることを示すことになる。また、このデータから、臨床医は、患者を治療して彼を延命するための適切な決断を下すことができる。
【００３５】
別の実施形態では、ＨＦに罹患している患者が臨床医によって日常的にモニターされている場合、「基準値」は、患者のモニタリングの開始時の可溶性ＮＥＰレベルに対応することもあり、または最後の検診で判定された可溶性ＮＥＰレベルに対応することもある。または代替的に、基準値は、上で述べたような、いかなる有害アウトカムもまだ示していない、ＨＦに罹患している患者集団から決定されることもある。このようにして、可溶性ＮＥＰレベルの増加を見つけた場合、それは、患者が悪化していること、および有害アウトカムが発生する可能性が高いことを示すことになる。この情報によって、臨床医は、患者の治療を最適化することが可能になる。
【００３６】
従来技術では、選択された対象の群から基準値を得る方法は周知である。
【００３７】
例えば、下の実施例では、基準値、０．６４２ｎｇ／ｍＬは、外来環境でＨＦ患者集団から判定された可溶性ＮＥＰレベルの中央値に対応する。可溶性ＮＥＰレベルがこの基準値より高いＨＦ患者は、有害事象のリスクが３７％増加したと判定することができるだろう。
【００３８】
本発明の実施形態では、試料は、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液からなる群から、および細胞上清の中で選択される。別の実施形態では、試料は、血液、血漿または血清である。さらに別の実施形態では、試料は血清である。
【００３９】
本発明の第一の態様の方法の別の実施形態では、可溶性ＮＥＰの濃度が判定される。
【００４０】
一実施形態では、可能性ＮＥＰレベルは、イムノアッセイ技術によって判定される。
【００４１】
「イムノアッセイ」は、抗体、免疫グロブリン、またはその断片の使用によって溶液中の高分子の存在または濃度を測定する生化学的検定である。イムノアッセイは、多くの異なる形式および変形形態で行われる。イムノアッセイは、アッセイ中の異なる時点で添加および洗浄除去または分離される試薬を用いて複数のステップで実行されうる。マルチステップアッセイは、分離イムノアッセイまたは不均一イムノアッセイと呼ばれることが多い。一部のイムノアッセイは、単に、試薬と試料を混合し、物理的測定を行うことによって、行うことができる。そのようなアッセイは、均一イムノアッセイまたは低頻度非分離イムノアッセイと呼ばれる。標準物質の使用が採用されることがイムノアッセイでは多い。標準物質は、問題の分析物を含有することが分かっている溶液であって、その分析物の濃度も一般に分かっている溶液である。実際の試料に対するアッセイ応答と標準物質によって生ずるアッセイ応答の比較によって、該試料中の分析物の存在または濃度の観点からシグナル強度を解釈することが可能になる。
【００４２】
有利なこととして、タンパク質の濃度を判定することによって、試料中のＮＥＰの総量が、それが活性であるか否かに関係なく判定されるため、体液中で循環している実際の可溶性ＮＥＰレベルについてのより正確な情報が得られ、結果として疾患の適切な予後に有利になる。
【００４３】
有利なこととして、イムノアッセイは、基質に起因するのはもちろん、酵素の触媒部位が異なる病期中に変更されうることにも起因する脆弱性などの、酵素的方法によって示される欠点の一部を克服する。
【００４４】
イムノアッセイは、一般に、競合的均一イムノアッセイ、競合的不均一イムノアッセイ、１サイト非競合イムノアッセイおよび２サイト非競合イムノアッセイとして分類することができる。
【００４５】
一実施形態では、イムノアッセイは、競合的均一イムノアッセイである。別の実施形態では、イムノアッセイは、ＥＬＩＳＡである。
【００４６】
可溶性ＮＥＰの濃度を判定するための市販のいくつかのＥＬＩＳＡキット、例えば、数あるなかでも、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＲａｙｂｉｏｔｅｃｈまたはＡｖｉｓｃｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって販売されているものが利用可能である。
【００４７】
一実施形態では、ＥＬＩＳＡ分析が行われる場合、試料は、インキュベーション前に１／１０〜１／２希釈される。別の実施形態では、試料は、インキュベーション前に１／４希釈される。
【００４８】
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡが行われる場合、インキュベーションステップは、２５〜３７℃からなる温度範囲から選択される一定温度で、１０００ｒｐｍで混合しながら行われる。別の実施形態では、インキュベーションステップの一定温度は３０℃である。
【００４９】
別の実施形態では、ＥＬＩＳＡが行われる場合のインキュベーションステップは、１２０〜１８０時間からなる。別の実施形態では、インキュベーションステップは、１５０分のステップである。
【００５０】
さらに別の実施形態では、（ａ）インキュベーション前に血清試料を１／４希釈し、１５０分間、３０℃で、１０００ｒｐｍで混合物をインキュベートする、ＥＬＩＳＡ検出が行われる。そのような条件下で、本発明者らは、感度の向上が達成されることを見いだした。
【００５１】
第三の態様では、本発明は、本発明の第一の態様の方法のいずれか１つを行うための手段の使用を提供する。
【００５２】
本発明では、「可溶性ＮＥＰと結合する能力がある抗体または断片」という用語は、可溶性ＮＥＰによって規定される抗原に結合することができるあらゆる免疫グロブリンまたはその断片と解するものとする。この用語は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。「その断片」という用語は、ＮＥＰのエピトープへの結合に好適なサイズおよび高次構造を有する、抗体のあらゆる部分を包含する。好適な断片としては、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）およびＦｖが挙げられる。「エピトープ」は、免疫系（Ｂ細胞、Ｔ細胞または抗体）によって認識される、抗原の一部分である。
【００５３】
従来技術で、抗体を調製および特性づけするための周知の手段がある。従来技術では、ポリクローナル抗体を産生する方法は周知である。簡単に言うと、ポリクローナル抗体は、動物を免疫原性組成物で免疫し、免疫された動物から血清を採取することによって調製される。広範な動物種を抗血清の産生に使用することができる。抗血清の産生に典型的に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギでありうる。
【００５４】
その一方で、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、周知の技術を使用して容易に調製することができる。モノクローナル抗体を調製するための手順は、一般に、ポリクローナル抗体の調製と同じように開始される。上で示したような抗原を動物に注射する。抗原をフロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントと混合することができる。同じ抗原でワクチン接種をおおよそ２週間ごとに反復する。免疫処置後、抗体産生の可能性がある体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）をＭＡｂ産生プロトコルでの使用のために選択する。これらの細胞は、生検脾臓、リンパ節もしくは扁桃から、または末梢血試料から得ることができる。その後、免疫動物からの抗体産生Ｂリンパ球を、一般には免疫動物と同じ種からの、不死骨髄腫細胞株からの細胞からの細胞と融合させる。ハイブリドーマ産生のための融合手順での使用に適切である骨髄腫細胞株は、好ましくは抗体産生細胞ではなく、高い融合効率および酵素欠損を有し、この酵素欠損のため、それらは、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）の増殖のみを支持する特定の培養培地では増殖できない。
【００５５】
一実施形態では、可溶性ＮＥＰは、数ある中でもＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅｓｐａｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓまたはＲａｙＢｉｏｔｅｃｈによって提供されているものなどの、ポリクローナル抗体を使用して検出される。
【００５６】
一実施形態では、この手段は、可溶性ＮＥＰと特異的に結合する抗体またはその断片である。
【００５７】
さらに別の実施形態では、この手段は、キットの一部を構成する。
【００５８】
このキットは、相互作用を可視化するためのさらなる手段（添加剤、溶媒）をさらに含む（尿試験紙、化学発光試薬、比濁試薬等）。抗原−抗体相互作用の可視化のための好適な添加剤、溶媒および試薬は、実施例で開示する。
【００５９】
本発明の方法は、インビトロで予後情報を提供するものである。一実施形態では、予後情報は、好適なデータ記憶媒体に収集することができる。好適なデータ記憶媒体の例は、紙、ＣＤ、ＵＳＢ、ＰＣのコンピュータアーカイブ、または同情報の音声登録である。
【００６０】
最後に、第四の態様では、本発明は、ＨＦに罹患している患者のＮＥＰ阻害剤に基づく医療レジメンを開始するかどうかを決断または推奨する方法を提供する。
【００６１】
本発明の第四の態様の一実施形態では、対象は、ＨＦに罹患している患者である。
【００６２】
本発明の第四の態様の別の実施形態では、対象は、ＨＦに罹患している患者であり、基準値と比較して高い可溶性ＮＥＰレベルが予後不良を示す。
【００６３】
ＮＥＰ阻害剤の説明に役立つ非限定的な例は、ＡＨＵ−３７７、ＬＣＺ６９６の成分；Ｏｍａｐａｔｒｉｌａｔ；ＲＢ−１０１；およびＵＫ−４１４．４９５である。
【００６４】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」という語およびこの語の語尾変化形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素またはステップを除外しないことを意図したものである。さらに「含む」という語は、「からなる」の場合を包含する。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、本明細書を検討することによって当業者に明らかになり、本発明を実施することで知ることができるだろう。以下の実施例および図面は、実例として提供するものであり、本発明の限定を意図したものではない。図面に関するおよび請求項で丸括弧に入っている参照符号は、単に請求項の理解度を増そうとするためのものであり、請求項の範囲を限定するものと解釈してはならない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定のおよび好ましい実施形態の可能なすべての組合せを包含する。
【００６５】
＜実施例＞
＜１．方法＞
＜研究対象集団＞
２００６年５月から２０１３年５月まで、総合ＨＦクリニック（multidisciplinary HF clinic）で治療を受けた外来患者を継続的にこの研究に組み入れた。照会組み入れ基準および血液試料採取は、Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ  Ａ．ら（Ｂａｙｅｓ−Ｇｅｎｉｓ  Ａ．ら、２０１２年）による記載の通りに行った。要約すると、患者は、心臓科または内科によって、およびより少ない程度に、救急科または病院の他の科から、ＨＦクリニックに照会された。主要照会基準は、病因に関係なくヨーロッパ心臓病学会ガイドラインによるＨＦ、少なくとも１回のＨＦ入院、または左室駆出率（ＬＶＥＦ）低下であった。以前に凍結融解サイクルに付されていない−８０℃で保存された同じ血液試料からＮＥＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを分析した。すべての試料は、０９：００ａｍ〜１２：００ｐｍに採取した。
【００６６】
すべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提出し、地方倫理委員会がこの研究を承認した。すべての研究手順は、１９８３年改正の１９７５年のヘルシンキ宣言で概要が述べられた倫理基準に従った。
【００６７】
＜経過観察およびアウトカム＞
すべての患者を、前もって定義した規則的な間隔で経過観察し、患者は、代償不全の場合、必要に応じて来診した。定期面会スケジュールは、最低年４回の看護師との面会、年２回の内科医との面会、および老年科医、精神科医およびリハビリテーション科医との随意面会を含んだ。定期面会に参加しなかった患者には電話で連絡を取った。
【００６８】
主要アウトカムは、新血管（ＣＶ）死またはＨＦ入院の複合アウトカムであった。ＣＶ死および原因を問わない死も副次アウトカムとして調査した。死は、次のことによって起こる場合、ＣＶ由来と考えた。すなわち、心不全（別の原因の不在下での、非代償性心不全または治療抵抗性心不全）、突然死（心不全増悪の証拠もいずれの他の死因もない、以前は安定していた患者の、目撃者が存在するまたはしない、予想外の死）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）（器質的な合併症に起因しようと、血行動態の合併症に起因しようと、または不整脈の合併症に起因しようと、いずれはＡＭＩと直接関係づけられるもの）、脳卒中（急性神経障害の最近の出現に関連づけられるもの）、手技に関わるもの（診断後のまたは治療手技による死）、および他の心血管の原因（例えば、動脈瘤破裂、末梢性虚血、または大動脈解離）によって起こる場合、ＣＶ由来と考えた。入院は、ＨＦ臨床記録、他の病棟から、およびカタルーニャ州病歴電子記録から特定した。致命的事象は、ＨＦ臨床記録、他の病棟、緊急治療室、一般開業医から、および患者の親類に問い合わせることによって特定した。さらに、カタルーニャ州およびスペインの医療システムのデータベースからのデータを検証した。
【００６９】
＜ネプリライシンアッセイ＞
改良型サンドイッチイムノアッセイ（ＨＵＭＡＮ  ＮＥＰ／ＣＤ１０  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、Ａｖｉｓｃｅｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＵＳＡ、参照番号ＳＫ００７２４−０１、ロット番号：２０１１１８９３）を使用してヒトＮＥＰを測定した。この方法の分析感度を向上させるために、および試料定量の下限を得るために、いくつかの改良を行った。
ａ）  インキュベーション前に血清アリコートをその製造業者によって提供された希釈バッファー（ＤＢ０９）で１／４希釈した。
ｂ）  キットを自動ロボットプラットフォーム（Ｂａｓｉｃ  Ｒａｄｉｍ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  ２［ＢＲＩＯ  ２］、Ｒａｄｉｍ  ｓｐａ、Ｐｏｍｅｚｉａ、Ｉｔａｌｙ）に移して、すべてのインキュベーションを３０℃の一定温度で、１０００ｒｐｍで混合しながら行った。
ｃ）  最初の試料インキュベーションを１５０分に延長することによって、校正曲線のより大きい傾きおよびより良好なアッセイ感度を達成した。この改良プロトコルは、０．２５０〜１６ｎｇ／ｍＬの分析測定範囲を示した。アッセイ内およびアッセイ間変動係数は、それぞれ、３．７％および８．９％であった。
【００７０】
＜ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰアッセイ＞
Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｅ  １７０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）での免疫電気化学発光アッセイを使用して、血清からＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルを判定した。このアッセイには生体活性ＢＮＰとの０．００１％未満の交差反応性があり、この報告の構成研究では、このアッセイは、０．９％〜５．５％の範囲の実験間変動係数を有した。
【００７１】
＜ｈｓ−ｃＴｎＴアッセイ＞
製造業者の説明書を使用するＭｏｄｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｅ１７０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）でのｈｓ−ｃＴｎＴアッセイを使用して、電気化学発光イムノアッセイによって血清からトロポニンレベルを測定した。このｈｓ−ｃＴｎＴアッセイは、３〜１０，０００ｎｇ／Ｌの分析範囲を有した。１３ｎｇ／Ｌの９９パーセンタイル値で、変動係数は９％であった。このアッセイの分析性能を心筋壊死の診断における使用についての特別委員会の推奨基準で検証し、このアッセイの分析性能は、その推奨基準に適合した。
【００７２】
＜ｈｓ−ＳＴ２アッセイ＞
高感度サンドイッチモノクローナルイムノアッセイ（Ｐｒｅｓａｇｅ（商標）ｓＳＴ２  ａｓｓａｙ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、血清試料からＳＴ２を測定した。このｈｓ−ＳＴ２アッセイは、２．５％未満の実験内係数、および４％の全変動係数を有した。
【００７３】
＜統計解析＞
カテゴリー変数を百分率として表した。連続変数を、正規分布か非正規分布かによって平均±標準偏差または中央値（Ｑ１〜Ｑ３）として表した。正規分布は、正規Ｑ−Ｑプロットで評定した。ＮＥＰレベルと、年齢、左室駆出率（ＬＶＥＦ）、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび推定糸状態濾過率（ＣＫＤ−ＥＰＩ）との相関を、スピアマン係数を使用して解析した。性別および病因群間のＮＥＰ濃度の差をマン・ホイットニーＵ検定で評定した。ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）機能クラス群についてのＮＥＰレベルの統計的差異（傾向性のＰ値）を、スピアマン検定を使用して計算した。年齢調整コックス回帰分析を行い、ＮＥＰ中央値に対する複合主要エンドポイントについてのおよびＣＶ死亡についての生存率曲線をプロットした。コックス回帰モデルを使用して多変量生存率解析も行った。ＮＥＰ値をｌｏｇ変換し、１ＳＤをハザード比（ＨＲ）算定に使用した。次の変数をモデルに組み入れた：年齢、性別、ＨＦの虚血性病因、ＬＶＥＦ、ＮＹＨＡ機能クラス、糖尿病の存在、ヘモグロビン（ｇ／ｄＬ）、血清ナトリウム（ｍｍｏｌ／Ｌ）、推定糸状態濾過率、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、βブロッカー治療、アンジオテンシン転換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）またはアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（ＡＲＢ）治療、ならびにＮＥＰ。ＳＰＳＳ  １５（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して統計解析を行った。両側Ｐ＜０．０５を有意と見なした。
【００７４】
＜結果＞
２００６年５月から２０１３年５月まで継続的に参加したＨＦ患者１０６９名で循環可溶性ＮＥＰを測定した。表１は、全試料についての、およびＰＡＲＡＤＩＧＭ−ＨＦ研究組み入れ基準を満たした患者のサブグループ（ＮＹＨＡクラスＩＩ〜ＩＶ、ＬＶＥＦ≦３５％、ＮＴｐｒｏＢＮＰ≧６００ｎｇ／Ｌ、または前年にＨＦ入院した場合はＮＴｐｒｏＢＮＰ≧４００ｎｇ／Ｌ、忌避の場合または耐容されない場合を除きＡＣＥＩまたはＡＲＢでおよびβブロッカーでの治療を受けた；ＰＡＲＡＤＩＧＭ様コホート、Ｎ＝４８０）についての、ベースライン特性を示すものである。４．１±２．４年の平均経過観察期間中に、ＣＶ原因で２４７名、非ＣＶ原因で１６９名（３７．６％）および原因不明の３３名（７．３％）の、患者４４９名が死亡した。既知ＣＶ死因のうち、難治性ＨＦは患者１２８名（５１．８％）における原因であり、突然死は患者５３名（２１．４％）における原因であり、急性心筋梗塞は患者２３名（９．３％）における原因であった。患者２３５名は、経過観察中にＨＦ入院し、患者３３５名は、ＣＶ死またはＨＦ入院の主要エンドポイントを満たした。患者５名は、経過観察不能であり、不適切に打ち切られた。
【００７５】
＜循環可溶性ＮＥＰ＞
中央値可溶性ＮＥＰレベルは、０．６４２ｎｇ／ｍＬ（Ｑ１〜Ｑ３  ０．３８５〜１．２１９ｎｇ／ｍＬ）であった。患者１５６名（１４．６％）は、分析測定範囲未満のＮＥＰレベルを有した。ＮＥＰレベルは、中等度に、しかし有意に年齢と相関し（ρ  ０．１６、ｐ＜０．００１）、対照的に、ＮＥＴとＬＶＥＦの間（ρ  ０．０２、ｐ＝０．３５）にも、推定糸状態濾過率の間（ρ  ０．０５、ｐ＝０．１）にも、ＮＴｐｒｏＢＮＰの間（ρ＝−０．０１、ｐ＝０．６８）にも、ＮＹＨＡ機能クラスの間（傾向性のｐ値  ０．７２）にも、相関は見いだされなかった。ＮＥＰレベルには性別差はなかった（ｐ＝０．２８）が、非虚血患者におけるＮＥＰレベルは、虚血患者におけるＮＥＰレベルに対して有意に高かった（それぞれ、０．６９０ｎｇ／ｍＬ［０．４５０〜１．４０１］対０．６１１ｎｇ／ｍＬ［０．３２８〜１．０４６］、ｐ＝０．００２）。
【００７６】
＜ＮＥＰおよびアウトカム＞
中央値に対する年齢調整ＮＥＰ値は、ＣＶ死またはＨＦ入院の複合主要エンドポイント（ＨＲ  １．３７［９５％ＣＩ  １．１１〜１．６９］、ｐ＝０．００３）、ＣＶ死（ＨＲ  １．６０［９５％ＣＩ  １．２４〜２．０６］、ｐ＜０．００１）および原因を問わない死（ＨＲ  １．２７［９５％ＣＩ  １．０６〜１．５３］、ｐ＝０．０１）と有意に関連していた。図１は、ＮＥＰ中央値に対する複合エンドポイントについてのおよびＣＶ死についての分岐している生存率曲線を示す。
【００７７】
連続変数として、年齢調整ＮＥＰ値も、ＣＶ死またはＨＦ入院の複合主要エンドポイント（ＨＲ  １．１７［９５％ＣＩ  １．０６〜１．２９］、ｐ＝０．００１）およびＣＶ死（ＨＲ  １．１９［９５％ＣＩ  １．０６〜１．３２］、ｐ＝０．００２）と有意に関連しており、原因を問わない死には有意性傾向があった（ＨＲ  １．０９［９５％ＣＩ  １．００〜１．１９］、ｐ＝０．０６）。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む包括的多変量解析において、可溶性ＮＥＰは、複合主要エンドポイント（ＨＲ  １．１８［９５％ＣＩ  １．０７〜１．３１］、ｐ＝０．００１）およびＣＶ死亡（ＨＲ  １．１８［９５％ＣＩ  １．０５〜１．３２］、ｐ＝０．００６）との有意な関連性を維持した（表２）。
【００７８】
この実生活ＨＦシリーズのうちのＰＡＲＡＤＩＧＭ様コホートも調査し、循環ＮＥＰレベルは、包括的多変量解析でのＣＶ死またはＨＦ入院の複合主要エンドポイントと有意な関連性を維持した（ＨＲ  １．２３［９５％ＣＩ  １．０５〜１．４３］、ｐ＝０．００８）。
【００７９】
結論として、ＨＦは、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系およびナトリウム利尿ペプチドをはじめとする複数の神経ホルモン経路のアップレギュレーションと特徴とする臨床疾患である。ナトリウム利尿ペプチドの中で、軸ＮＥＰは、極めて重要な酵素である。本発明者らは、高いＮＥＰレベルがＨＦ患者の血行路で見いだされること、およびＮＥＰ濃度が、有害アウトカム、ＣＶ死亡および罹患の両方、の指標であることを初めて立証した。
【００８０】
加えて、報告するデータは、ＡＲＮｉ  ＬＣＺ６９６中に既に存在するＮＥＰ阻害剤が、ＨＦの新規病理生物学的寄与因子の標的化に必要であり、患者アウトカムを向上させるために極めて重要であることを示す。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
＜表１欄外に記載の注釈＞
【表１Ａ】
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【００８３】
【表２】
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【００８４】
【表３】
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【００８５】
＜表３欄外に記載の注釈＞
【表３Ａ】
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【図１】
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【配列表】
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