(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非凍結条件下で生体試料中のポリペプチドの貯蔵のための組成物の使用であって、該組成物が、
１）式Ｉ：
【化１】
0006682734.tif 000042
（ＲはＣ１〜１０アルキルであり、
Ｘ−はアニオンを表す）
の少なくとも１つの化合物と、
２）以下の３つの薬剤
（１）少なくとも１つの沈殿剤、
（２）少なくとも１つの低級アルコール、及び
（３）少なくとも１つのカオトロープ
のうちの１つ、２つ又は３つと
を含む、使用。
【請求項２】
組成物が、
（ａ）還元剤、
（ｂ）ポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）ｐＨ緩衝剤、
（ｄ）キレート剤、及び
（ｅ）水
から選択される１つ又は複数の薬剤をさらに含み、
界面活性剤又は洗剤をさらに含んでもよい、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
組成物が、以下の配合：
（ｉ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、沈殿剤、低級アルコール、ポリメラーゼ阻害剤、及びｐＨ緩衝剤、
（ｉｉ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、カオトロープ、低級アルコール、ポリメラーゼ阻害剤、及びｐＨ緩衝剤、
（ｉｉｉ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、沈殿剤、低級アルコール、還元剤、及びｐＨ緩衝剤、並びに
（ｉｖ）請求項１に記載の式Ｉの化合物、カオトロープ、低級アルコール、還元剤、及びｐＨ緩衝剤
のうちの１つを含む、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
式Ｉの化合物は１〜１０％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）の量で含まれ、
カオトロープは２．５〜５Ｍの量で含まれ、
ｐＨ緩衝剤は５０〜４００ｍＭの量で含まれ、
低級アルコールは２０〜５０％（ｖ／ｖ）の量で含まれ、
還元剤は５〜５０ｍＭの量で含まれ、
沈殿剤は２．５〜５Ｍの量で含まれ、
ポリメラーゼ阻害剤は０．１〜０．５ｍＭの量で含まれる、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
アニオンが、臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン、Ｃ１〜１０アルキルスルホン酸基、ヘキサフルオロリン酸基、メチル硫酸基、エチル硫酸基、テトラフルオロホウ酸基、トリフルオロメタンスルホン酸基及びビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミド基からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項６】
式Ｉの化合物が、Ｎ−オクチルピリジニウムブロマイド、及びＮ−ブチルピリジニウムブロマイドからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項７】
組成物が、
（１）沈殿剤が、塩化リチウム、水酸化リチウム、スルホサリチル酸、及び５−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）メチレン）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンから選択されること、
（２）低級アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールから選択されること、及び
（３）カオトロープが、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム及び尿素から選択されること
の少なくとも１つによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項８】
組成物が、
（１）キレート剤が、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、及びニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）から選択されること、
（２）還元剤が、２−メルカプトエタノール、チオ硫酸塩、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール、及びジチオエリスリトールから選択されること、
（３）ｐＨ緩衝剤が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、スルホサリチル酸、５−スルホベンゼン−１，３−ジカルボン酸、シュウ酸、ホウ酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシルプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ジグリシン、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）及び２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールから選択されること、
（４）ポリメラーゼ阻害剤が、リファマイシン−Ｓ、リファマイシン−ＳＶ、アンチマイシン、及びエリスロマイシンのうちの１つ又は複数から選択されること、及び
（５）界面活性剤又は洗剤が、トリトンＸ−１００、ノニデットＰ４０及び非イオン性洗剤Ｂｒｉｊから選択されること
の少なくとも１つによって特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
非凍結条件下で生体試料中のポリペプチドを貯蔵するための方法であって、
１）生体試料を請求項１〜８のいずれか一項に定義された組成物と混合するステップ、及び
２）非凍結条件下でステップ１）において得られる混合物を少なくとも１日、３日、７日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、９０日又は１８０日間貯蔵するステップ
を含む、方法。
【請求項１０】
生体試料が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む、請求項１又は２に記載の使用、或いは、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体試料を貯蔵するための安定化剤、特に非凍結条件下で生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドを貯蔵するための組成物、上記組成物を含むキット、上記組成物と生体試料を含む混合物、並びに非凍結条件下で生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドを貯蔵するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生命科学の分野の研究は生体材料若しくは試料、無機物質又は化学物質の分析に基づいている。その中で、生体材料又は試料には、口腔断片、唾液、痰、血液及び尿などの動物体表又は体液由来の試料；ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ産物、クローンＤＮＡ及びＲＮＡなどの核酸試料；酵素及びポリペプチドなどのタンパク質試料；細菌、古細菌などの原核生物、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、プリオン）を含む微生物；原生動物、及び真菌（例えば、酵母）などの真核生物；藻類などの下等植物；体細胞、幹細胞、生殖細胞（精細胞及び卵細胞）などの種々の細胞を含む高等植物及び動物試料並びに種々の組織試料、等が含まれる。
【０００３】
生体試料は、液体媒体又は緩衝溶液を含有する装置に置かれ貯蔵されることが極めて多く、そのような零度以下の温度（例えば、−２０℃又は−７０℃〜−８０℃）での貯蔵が必要である。いくつかの場合、試料は先ず乾燥させなければならず、次に室温で（国際公開第２００５／１１３１４７号、米国特許出願公開第２００５／０２７６７２８号、米国特許出願公開第２００６／００９９５６７号）、又は４℃若しくは−２０℃若しくは−７０〜−８０℃で貯蔵される。しかし、生体試料が高度に不安定な性質であるため長期間にわたってその生物学的活性を保存することは極めて困難である。核酸及びタンパク質試料の凍結乾燥は貯蔵寿命を延ばすことが可能であるが、液体中で再構成するとその後活性が失われるので凍結乾燥はそれほど理想的な貯蔵技法とはならない。
【０００４】
貯蔵に加えて、生体試料は一般に、輸送する必要がある。生体試料の輸送では、氷、ドライアイス又は他の冷凍装置を使用すれば凍結環境を提供することが可能である。しかし、輸送時間が長すぎる場合、例えば、国際輸送又は大陸間輸送でも、特に冷凍装置及びエネルギーが不十分である場合、低温又は凍結環境でさえ得ることはそれほど容易ではない。
【０００５】
したがって、生体試料を収集する、特に広大な領域にわたる大きな集団から試料を収集する際に、もし大きな冷凍装置なしの室温貯蔵方法を使用することが可能であり、その間、試料の完全性及び安定性を長時間最大程度に保持することが可能であり、それによってその後の分析に対する影響を減らすことができるならば、非常に大きな利点がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、驚くべきことに、多くの創造的研究に資金を費やすことにより繰り返し実験を通じて、非凍結条件下での生体試料の安定な貯蔵のための組成物及び生体試料を貯蔵するための方法を手に入れ、こうして本発明を成し遂げる。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドの貯蔵のための組成物であって、
１）式Ｉ：
【化１】
0006682734.tif 000002
（Ｒはアルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリールホルミルアルキル、及び
【化２】
0006682734.tif 000003
からなる群から選択され、これらのそれぞれが任意選択で、アルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ及びハロゲンからなる群から選択される置換基で置換されており、
ｍ及びｎはそれぞれが独立して０、１、２又は３であり、
Ｘ−はアニオンを表す）
の少なくとも１つの化合物と、
２）以下の３つの薬剤
（１）少なくとも１つの沈殿剤、
（２）少なくとも１つの低級アルコール、及び
（３）少なくとも１つのカオトロープ
のうちの１つ、２つ又は３つと
を含む、組成物に関する。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は
（ａ）還元剤、
（ｂ）ポリメラーゼ阻害剤、
（ｃ）ｐＨ緩衝剤、
（ｄ）キレート剤、及び
（ｅ）水
から選択される１つ又は複数の薬剤をさらに含む。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は、以下の配合：
（ｉ）式Ｉの化合物、沈殿剤、低級アルコール、ポリメラーゼ阻害剤、及びｐＨ緩衝剤、
（ｉｉ）式Ｉの化合物、カオトロープ、低級アルコール、ポリメラーゼ阻害剤、及びｐＨ緩衝剤、
（ｉｉｉ）式Ｉの化合物、沈殿剤、低級アルコール、還元剤、及びｐＨ緩衝剤、並びに
（ｉｖ）式Ｉの化合物、カオトロープ、低級アルコール、還元剤、及びｐＨ緩衝剤
のうちの１つを含む。
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は１〜１０％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）の量で含まれ、カオトロープは２．５〜５Ｍ（ｍｏｌ／Ｌ）の量で含まれ、ｐＨ緩衝剤は５０〜４００ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）の量で含まれ、低級アルコールは２０〜５０％（ｖ／ｖ）の量で含まれ、還元剤は５〜５０ｍＭの量で含まれ、沈殿剤は２．５〜５Ｍの量で含まれ、ポリメラーゼ阻害剤は０．１〜０．５ｍＭの量で含まれる。
【００１１】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、式Ｉの化合物は、例えば、４％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）などの２〜８％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）の量で含まれる。
【００１２】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、カオトロープは、例えば、３．５〜４Ｍなどの３〜４Ｍの量で含まれる。
【００１３】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、例えば、２００〜３００ｍＭなどの１００〜４００ｍＭの量で含まれる。
【００１４】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、低級アルコールは、例えば、２５〜３５％（ｖ／ｖ）、３０％（ｖ／ｖ）などの２０〜４０％（ｖ／ｖ）の量で含まれる。
【００１５】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、還元剤は、例えば、１５〜４０ｍＭ、例えば、２０〜２５ｍＭなどの１０〜５０ｍＭの量で含まれる。
【００１６】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、沈殿剤は３．５〜４．２Ｍなどの３〜４．５Ｍの量で含まれる。
【００１７】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、ポリメラーゼ阻害剤は、例えば、０．２〜０．３ｍＭの量で含まれる。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＲはＣ１〜１０アルキル、Ｃ２〜１０アルケニル、Ｃ３〜１０シクロアルキル、Ｃ３〜１０シクロアルケニル、アリールホルミルＣ１〜１０アルキル、及び
【化３】
0006682734.tif 000004
からなる群から選択され、これらのそれぞれが任意選択で、Ｃ１〜１０アルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ及びハロゲンからなる群から選択される置換基で置換されており、
ｍ及びｎはそれぞれが独立して０、１、２又は３である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、アニオンは、臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン、Ｃ１〜１０アルキルスルホン酸、ヘキサフルオロリン酸、メチル硫酸、エチル硫酸、テトラフルオロホウ酸、トリフルオロメタンスルホン酸及びビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドからなる群から選択される。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、ＲはＣ１〜１０アルキル、及びベンゾイルＣ１〜１０アルキルからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、Ｎ−オクチルピリジニウムブロマイド、Ｎ−ブチルピリジニウムブロマイド、及びＮ−フェナシルピリジニウムブロマイドからなる群から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態では、沈殿剤は、塩化リチウム、水酸化リチウム、スルホサリチル酸、及び５−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）メチレン）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンから選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態では、低級アルコールはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール及びイソブタノールから選択される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態では、カオトロープは、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム及び尿素から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態では、キレート剤は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）から選択される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、還元剤は、２−メルカプトエタノール、チオ硫酸塩、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール、及びジチオエリスリトールから選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、ｐＨ緩衝剤は、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、スルホサリチル酸、５−スルホベンゼン−１，３−ジカルボン酸、シュウ酸、ホウ酸、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシル−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシルプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、ジグリシン、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）及び２−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールから選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態では、ポリメラーゼ阻害剤は、リファマイシン−Ｓ、リファマイシン−ＳＶ、アンチマイシン、及びエリスロマイシンのうちの１つ又は複数から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態では、組成物は界面活性剤又は洗剤をさらに含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態では、界面活性剤又は洗剤は、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０及び非イオン性洗剤Ｂｒｉｊから選択される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態では、核酸は１つ又は複数のＤＮＡ及び／又はＲＮＡ分子を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体（ａｂｄｏｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む。
【００３３】
第２の態様では、本発明は本発明の第１の態様に従った組成物を生体試料と混合することにより得られる混合物に関する。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の第２の態様に従った混合物は少なくとも１日、３日、７日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、９０日又は１８０日間非凍結条件下で貯蔵される。
【００３６】
本発明は、非凍結条件下で生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドを貯蔵するための本発明の第１の態様に従った組成物を含むキットにさらに関する。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む。
【００３８】
本発明は、非凍結条件下で生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドを貯蔵するための方法であって、
１）生体試料を本発明の第１の態様に従った組成物と混合するステップ、及び
２）非凍結条件下でステップ１）において得られる混合物を少なくとも１日、３日、７日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、９０日又は１８０日間貯蔵するステップ
を含む、方法に関する。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む。
【００４０】
本発明は、非凍結条件下で生体試料中の核酸及び／又はポリペプチドを貯蔵するための、本発明の第１の態様に従った組成物の使用にさらに関する。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、全血、全血のバフィーコート、尿、糞便、血清、漿液、血漿、リンパ液、脳脊髄液、唾液、粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸水、心膜液、腹腔液、腹部の液体、細胞培養培地、組織培養培地、頬側細胞、細菌、ウイルス、酵母細胞、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク質、オリゴ糖、多糖、ワクチン、細胞、組織、細胞溶解物、ホモジネート又は抽出物、組織溶解物、生検標本、血液試料、組織外植片、器官培養物及び生物学的液体から選択される１つ又は複数を含む。
【００４２】
本発明は生体試料を貯蔵するための安定化剤組成物及び生体試料を貯蔵するための方法を提供し、これらの組成物及び方法は先行技術に対して以下の利点、１．室温での貯蔵、脱水処理なし、大きな冷凍及び乾燥装置とは無関係である；２．試料の完全性及び安定性を長時間最大限に保持し、その後の分析に対する影響を減少させることができる；３．貯蔵方法は使用及び輸送に都合がよく、特に広大な領域にわたる大きな集団から試料採取するのに適している、並びに４．既存の安定化剤よりも優れた効果がある、を有する。
【００４３】
本発明及び本発明において使用される用語は以下の通りにさらに説明される。
【００４４】
本明細書で使用される用語「アルキル」とは、飽和直鎖又は分岐一価炭化水素、例えば、Ｃ１〜１０アルキル、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ１〜３アルキルのことである。「Ｃ１〜１０アルキル」とは、１〜１０の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ペンチル、２−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、３−メチルペンチル、へプチル、オクチル、等のことである。用語「Ｃ１〜６アルキル」とは、１〜６炭素原子、すなわち、１、２、３、４、５又は６炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル、典型的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、等のことである。同様に、用語「Ｃ１〜３アルキル」とは、１、２又は３炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル、すなわち、メチル、エチル、ｎ−プロピル、及びイソプロピルのことである。
【００４５】
本発明で使用される用語「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する直鎖又は分岐不飽和炭化水素のことである。Ｃ２〜１０アルケニルとは、ビニル、プロペニル、１−ブタ−３−エニル、１−ペンタ−３−エニル、１−ヘキソ−５−エニル、等を含む２〜１０炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を有するアルケニル、さらに好ましくは、３〜５炭素原子を有する低級アルケニルのことである。
【００４６】
本発明で使用される用語「ハロゲン」とはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ原子のことである。
【００４７】
本発明で使用される用語「シクロアルキル」とは、３、４、５、６、７、８、９又は１０炭素原子を有する飽和環状炭素基のことである。この基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、等を含む。
【００４８】
本発明で使用される用語「アリール」とは、好ましくは６〜１０炭素原子、すなわち、６、７、８、９又は１０炭素原子を有する少なくとも１つの不飽和芳香環を含む任意選択で置換された単環式又は二環式不飽和芳香族系のことである。本発明のアリールの例は、フェニル、ナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、インデニル及び同類のものを含む。
【００４９】
本発明では、アリールホルミルアルキルとは、
【化４】
0006682734.tif 000005
例えば、
【化５】
0006682734.tif 000006
例えば、
【化６】
0006682734.tif 000007
のことであり、アルキル又はＣ１〜１０アルキルの定義は上記の通りである。
【００５０】
本発明では、
【化７】
0006682734.tif 000008
は、例えば、
【化８】
0006682734.tif 000009
であり、ｍ及びｎはそれぞれが独立して０、１、２、又は３である。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は全血試料、胚腎臓細胞試料、脳組織試料、腫瘍組織試料（例えば、乳がんの腫瘍組織試料）、尿試料、及び唾液試料から選択される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料は脊椎動物、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、サル、及び同類のものなどの哺乳動物に由来する。
【００５３】
本発明では、核酸は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含み、ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、等を含むがこれらに限定されず、ＲＮＡはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等を含むがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明では、ポリペプチドとは一般には、１０を超えるアミノ酸分子の脱水縮合により形成される化合物のことであり、アミノ酸の数が５０又は１００よりも多い場合にはタンパク質とも呼ばれる。
【００５５】
本発明では、沈殿剤とは核酸及び／又はポリペプチド分子の溶解性に影響を及ぼす化合物のことである。本発明のいくつかの実施形態では、沈殿剤は塩化リチウム、水酸化リチウム、スルホサリチル酸、及び５−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）メチレン）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを含むがこれらに限定されない、生体試料から核酸及び／又はポリペプチド分子の沈殿を促進することが可能な物質のことであり、その濃度は、例えば、０．１、０．５、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、及び５．０Ｍなどの０．０５〜５Ｍである。
【００５６】
本発明では、低級アルコールは比較的短い直鎖又は分岐炭素鎖を有し、例えば、炭素鎖の長さは８、７、６、５、４、又は３炭素原子以下であり、低級アルコールの濃度は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、及び５０％（ｖ／ｖ）などの５〜５０％（ｖ／ｖ）である。
【００５７】
本発明では、カオトロープの種類は当技術分野では周知であり、生物学的巨大分子を妨げる、例えば、ポリペプチド、タンパク質、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む）及び同類のものの二次、三次若しくは四次構造の形成を妨げる、又は生物学的巨大分子を変性させることが可能な物質のことであり、当業者であれば特定の生体試料に応じて特定のカオトロープを選択することが可能であり、カオトロープの濃度は、例えば、０．１、０．５、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０Ｍなどの０．０５〜５Ｍである。
【００５８】
本発明では、式Ｉの化合物は、例えば、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％、５．０％、５．５％、６．０％、６．５％、７．０％、７．５％、８．０％、８．５％、９．０％、９．５％、１０．０％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）などの０．１％〜１０％（ｗ／ｖ又はｖ／ｖ）の量で含まれる。
【００５９】
本発明では、式Ｉの化合物は、液体、固体又は強粘液状態でもよく、したがって、その量又は濃度を表す単位はｗ／ｖ又はｖ／ｖである。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料を貯蔵するための組成物と生体試料の体積比は、例えば、６対１、５対１、４対１、３対１、２対１、１対１、１対２、１対３、１対４、１対５、１対６などの１０対１〜１対１０である。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料を貯蔵するための組成物のｐＨ値は、生体試料に応じて調整することが可能であり、その調整方法は当業者には周知であり、例えば、ｐＨは３〜１０であり、ＲＮＡの貯蔵の場合は、ｐＨは３．０〜８．０、例えば、３．２、３．５、３．７、４．０、４．２、４．５、４．７、５．０、５．３、５．５、５．８、６．０、６．３、６．５でもよく、ＤＮＡを貯蔵する場合は、ｐＨは５．０〜１０．０、例えば、６．０〜９．０、例えば、６．３、６．５、６．８、７．０、７．４、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０でもよい。
【００６２】
本発明の実施形態では、本発明に従った組成物が生体試料を貯蔵するのに使用される場合、この組成物は生体試料を非凍結条件下で、例えば、長時間安定的に貯蔵することが可能であり、貯蔵期間は、例えば、１日、３日、７日、１０日、２０日、３０日、４０日、５０日、６０日、７０日、９０日若しくは１８０日よりも長く、又は少なくとも１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４カ月、又は、例えば、少なくとも１、２、３、４、５年である。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態では、生体試料が本発明に従った組成物と一緒に前記期間貯蔵された場合には、生体試料中のＤＮＡ分子は、−２０℃又は−８０℃で貯蔵された試料中のＤＮＡ分子と比べた場合、少なくとも７０％を超える、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の完全性を有し、生体試料中のＲＮＡ分子は、−８０℃で貯蔵された試料中のＲＮＡ分子と比べた場合、少なくとも７０％を超える、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の完全性を有し、生体試料中のポリペプチド分子は、−２０℃又は−８０℃で貯蔵された試料中のポリペプチド分子と比べた場合、少なくとも７０％を超える、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の完全性を有する。
【００６４】
本発明では、凍結条件とは、０℃未満の条件、すなわち、−１０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−７０℃、及び−８０℃などの当業者であれば一般に使用している生体試料の貯蔵のための温度条件のことである。
【００６５】
本発明の実施形態では、非凍結条件とは室温、例えば、２０〜２７℃のことであるが、この温度は、地理的位置、季節及び周囲の環境に応じて、例えば、１５〜１９℃又は１８〜２３℃から２２〜２９℃又は２８〜３２℃と変えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】アガロースゲル電気泳動図を示す図である。
【図２】アガロースゲル電気泳動図を示す図である。
【図３】は１６Ｓ  ｒＤＮＡ分析方法の流れ図を示す図である。
【図４】属レベルでのそれぞれの２つの試料間の相関を示す図である（Ｅｘｃｅｌ  ＣＯＲＲＥＬ機能を用いて）。属レベルでのそれぞれの種の相対的存在量（表５−１、５−２、５−３）に従えば、それぞれの２つの試料間の相関係数が計算され、表６−１、６−２、６−３における計算された相関係数を比較することによりグレースケールが高くなるに従って、相関係数も高くなり、これとは対照的に、グレースケールが低くなるに従って、相関係数は低くなる。限定された細胞サイズのせいで、値は「１」又は「０」で示され、相関係数が≧０．５の場合、「１」で表され、相関係数が＜０．５の場合、「０」で表される。
【図５】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料は先ず３つの異なる比で配合１．１若しくは配合１．３の安定化剤と混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１０日後、Ｑｉａ  Ａｍｐ精製ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用することによりＤＮＡを試料から抽出し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。
【図６】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料は先ず３つの異なる比で配合１．１若しくは配合１．３の安定化剤と混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。２０日後、ＤＮＡを試料から抽出し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。
【図７】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡの総量を示す図である。ヒト全血試料は先ず特定の比で配合１．１若しくは配合１．３の安定化剤と混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。２０日後、ＤＮＡを試料から抽出し、ＤＮＡ濃度は分光光度計により決定した。
【図８】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料は先ず特定の比で配合１．１又は配合１．３の安定化剤と混合し、次に模擬輸送過程後１０日間室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで模擬輸送過程後１０日間室温で貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。貯蔵後、ＤＮＡを試料から抽出し、０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。
【図９】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡの総量を示す図である。ヒト全血試料は先ず特定の比で配合１．１若しくは配合１．３の安定化剤と混合し、次に模擬輸送過程後１０日間室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで模擬輸送過程後１０日間室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。貯蔵後、ＤＮＡを試料から抽出し、ＤＮＡ濃度は分光光度計により決定した。
【図１０】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出された全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料は先ず特定の比でそれぞれ配合１．１〜１．４の安定化剤のうちの１つと混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１５日後、Ａｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）血液キットを使用することにより全ＲＮＡを試料から抽出し、１％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図１１】異なる条件下で貯蔵されたヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞試料から抽出された全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞試料は先ず特定の比で配合２．５又は配合２．６の安定化剤と混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１５日後、全ＲＮＡを試料から抽出し、１．２％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図１２】異なる条件下で貯蔵されたヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト胚腎臓２９３Ｔ細胞試料は先ず特定の比で配合２．５又は配合２．６の安定化剤と混合し、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１５日後、ＤＮＡを試料から抽出し、１．２％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図１３】異なる条件下で貯蔵されたマウス脳組織試料から抽出された全ＲＮＡの完全性（ＲＩＮ）を示す図である。マウス脳組織試料（約２５ｍｇ）は配合２．４の安定化剤（１００μＬ）を添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１５又は２４日後、全ＲＮＡは試料から抽出され、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００ナノキット及びＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することによりＲＮＡ完全性について評価した。
【図１４】異なる条件下で貯蔵されたマウス脳組織試料中のＧＡＰＤＨ、Ｐ２３及びＣｄｋ２遺伝子の転写レベルを示す図である。マウス脳組織試料（約２５ｍｇ）は配合２．４の安定化剤（１００μＬ）を添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１５日後、全ＲＮＡは試料から抽出され、ＧＡＰＤＨ、Ｐ２３及びＣｄｋ２遺伝子の転写レベルはＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定された。
【図１５】異なる条件下で貯蔵されたマウス脳組織試料から抽出された全タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す図である。先ず、マウス脳組織試料（約２５ｍｇ）を調製した。試料はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織ＦＩＸ容器（５０ｍｌ）に移し固定し、続いてＰＡＸｇｅｎｅ組織ＦＩＸを取り除き、同じ容器にＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を添加し、次に室温で貯蔵した。又は、試料を直接収集管に移し、配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（表２）、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。７日後、全タンパク質はＳｕｒｅＰｒｅｐ（商標）キットを使用することにより試料から抽出し、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。
【図１６】異なる条件下で貯蔵されたマウス脳組織試料から抽出された全タンパク質のウェスタンブロット結果を示す図である。先ず、マウス脳組織試料（約２５ｍｇ）を調製した。試料はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織ＦＩＸ容器（５０ｍｌ）に移し固定し、続いてＰＡＸｇｅｎｅ組織ＦＩＸを取り除き、同じ容器にＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を添加し、次に室温で貯蔵した。又は、試料を直接収集管に移し、配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（表２）、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。７日後、全タンパク質は試料から抽出し、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。電気泳動後、タンパク質はニトロセルロース膜上に電気泳動で転写させ、マウスダイニン及びβアクチンに対する抗体を使用することによりウェスタンブロット分析を実行した。
【図１７】異なる条件下で貯蔵された乳がんの腫瘍組織試料から抽出された全タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す図である。先ず、乳がんの腫瘍組織試料（約２５ｍｇ）を調製した。試料はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織ＦＩＸ容器（５０ｍｌ）に移し固定し、続いてＰＡＸｇｅｎｅ組織ＦＩＸを取り除き、同じ容器にＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を添加し、次に室温で貯蔵した。又は、試料を直接収集管に移し、配合１．３７の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（表１）、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。７日後、全タンパク質は試料から抽出し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけた。
【図１８】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料は先ず２つの異なる比でそれぞれ配合２．１〜２．３の安定化剤のうちの１つと混合させ、次に室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。６０日後、ＤＮＡは試料から抽出し、０．８％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図１９】異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中のＦＯＳ遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。試料収集の時点で（すなわち、０日目）、及び１、３及び７日間の貯蔵後、全ＲＮＡを試料から抽出し、ＦＯＳ遺伝子の転写レベルをＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定した。
【図２０】異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中のＩＬ−１β遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。試料収集の時点で（すなわち、０日目）、及び１、３及び７日間の貯蔵後、全ＲＮＡを試料から抽出し、ＩＬ−１β遺伝子の転写レベルをＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定した。
【図２１−Ａ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２１−Ｂ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２１−Ｃ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２１−Ｄ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２１−Ｅ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２１−Ｆ】貯蔵前の試料と比べた異なる期間異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料中の３６の遺伝子の転写レベルの変化を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した（図２１−Ｃ、図２１−Ｄ）、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した（図２１−Ｅ、図２１−Ｆ）、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（図２１−Ａ）、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した（図２１−Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部標準として使用し、試料収集の時点でのレベルと比べて３６の遺伝子の発現レベルの変化をΔΔＣｑ方法により決定した。
【図２２】異なる条件下で貯蔵したヒト全血試料から抽出した全ＲＮＡの完全性（ＲＩＮ）を示す図である。ヒト全血試料は３日間又は７日間配合２．４の安定化剤を添加して室温で貯蔵した、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより３日間又は７日間室温で貯蔵した、又は３日間安定化剤なしで室温で直接貯蔵した、又は７日間安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。貯蔵後、全ＲＮＡを試料から抽出し、ＲＮＡ完全性について評価した。
【図２３】異なる条件下で貯蔵したヒト全血試料中のＦＯＳ及びＩＬ−１β遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析結果を示す図である。ヒト全血試料はそれぞれ配合２．１０〜２．１４の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。７日後、時間「０」での（すなわち、試料収集の時点での）レベルと比べたＦＯＳ及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルの変化はＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定した。
【図２４】異なる条件下で貯蔵したヒト全血試料中のＦＯＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１６及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＲＴ−ｑＰＣＲ分析結果を示す図である。ヒト全血試料はそれぞれ配合２．１０〜２．１４の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１４日後、時間「０」での（すなわち、試料収集の時点での）レベルと比べたＦＯＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１６及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の転写レベルの変化はＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定した。
【図２５】異なる条件下で貯蔵されたヒト全血試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト全血試料はそれぞれ配合２．９〜２．２０の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。１８６日後、ＤＮＡは試料から抽出し、０．８％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図２６】異なる条件下で貯蔵されたヒト尿試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト尿試料はそれぞれ配合２．６〜２．８の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。３０日後、ＤＮＡは試料から抽出し、１．２％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図２７】異なる条件下で貯蔵されたヒト尿試料から抽出された全ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト尿試料はそれぞれ配合２．６〜２．８の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。３０日後、全ＲＮＡは試料から抽出し、１．２％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図２８】異なる条件下で貯蔵されたヒト唾液試料から抽出されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。ヒト唾液試料はそれぞれ配合２．５〜２．８の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。３０日後、ＤＮＡは試料から抽出し、１．２％アガロースゲルで電気泳動にかけた。
【図２９】異なる条件下で貯蔵されたヒト唾液試料から抽出された全ＲＮＡの完全性（ＲＩＮ）を示す図である。この唾液試料はそれぞれ配合２．５〜２．８の安定化剤のうちの１つを添加して室温で貯蔵した、又は安定化剤なしで室温で直接貯蔵した（ＮＰ）、又は安定化剤なしで−８０℃で貯蔵した。３０日後、全ＲＮＡは試料から抽出し、ＲＮＡ完全性について評価した。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本発明の実施形態は以下の実施例を組み合わせることにより説明される。しかし、当業者であれば、以下の実施例は、本発明を説明することのみを目的としており、本発明の範囲を限定するとは見なされないことを理解している。実施例において具体的条件が示されていない場合には、実施例は従来の条件又は製造業者が推奨する条件に従って実行される。試薬又は装置は、その製造元を示してはいないが、市販されている従来製品である。
【００６８】
以下の実施例では、標準的細胞及び分子生物学技術が使用され、この技術は実質的に公知の方法に基づいている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ、１．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００３；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、２００３）。他の方法で明記されていなければ、以下の実施例において使用される試薬はすべてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【００６９】
生体試料中の核酸及びポリペプチド分子の貯蔵のための安定化剤の配合は以下の表１及び表２に例示されており、配合番号は実施例において使用される安定化剤の配合番号と一致している。
【表１】
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【表２】
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【実施例】
【００７０】
実施例１
１．糞便試料：新鮮な糞便試料は健康なボランティアにより提供され、同一片の糞便試料は３０アリコートに分割し、それぞれのアリコートの湿重量は約０．２ｇであった。
【００７１】
２．貯蔵方法：３アリコートを冷蔵庫に−８０℃で直接貯蔵した（対照群）；９アリコートは、アリコートごとに５００μＬのＳｔｏｏｌ  ＤＮＡ安定化剤（市販の安定化剤）を添加して貯蔵した（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙより購入）（群１）；９アリコートは、アリコートごとに配合２．３７（表２）の安定化剤を５００μＬ添加して貯蔵し（群２）；９アリコートは安定化剤なしで貯蔵した（群３）。
【００７２】
群１、２及び３の試料は３つの温度（室温／２５℃、４℃、−２０℃）でそれぞれ１日間、３日間、及び７日間貯蔵し、次に−８０℃の冷蔵庫に置いた。
【００７３】
試料はこのＡ−Ｂ−Ｃの様式で命名され、Ａは安定化剤の配合番号（Ｎ：安定化剤なし、４：Ｓｔｏｏｌ  ＤＮＡ安定化剤（市販の安定化剤）、６：配合２．３７）であり、Ｂは貯蔵温度（Ｎ：室温、４：４℃、２０：−２０℃）であり、Ｃは貯蔵期間（単位：日）である。対照群は−８０℃で貯蔵される。
【００７４】
３．糞便からの全ゲノムＤＮＡの抽出：全ての試料の貯蔵後、糞便からの全ゲノムＤＮＡの抽出を同時に実行し、ＤＮＡ抽出方法は上記と同じであった（Ｍａｎｉｃｈａｎｈ，Ｃ．ら、Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｆｅｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｉｎ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ａ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｇｕｔ  ５５、２０５〜２１１頁、ｄｏｉ：ｇｕｔ．２００５．０７３８１７［ｐｉｉ］１０．１１３６／ｇｕｔ．２００５．０７３８１７（２００６）、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
４．ＤＮＡ濃度の決定：ＤＮＡ濃度は蛍光定量化器具（Ｑｕｂｉｔ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）及び検査キット（Ｑｕｂｉｔ（登録商標）  ｄｓＤＮＡ  ＢＲ）を使用することにより決定し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施し、結果を表３に示す。
【表３】
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【００７６】
５．試料完全性の判定：試料完全性はアガロースゲル電気泳動により判定し、試料は分離のために１％アガロースゲルに充填し（決定濃度×充填量＝１００±１．５ｎｇ、表４参照）、１５０Ｖの定電圧で４０分間のゲル電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理システムにより写真を撮った。電気泳動図は図１及び図２に示されている。
【００７７】
安定化剤を添加した群（群１、群２）から抽出されＤＮＡと安定化剤なしの群（群３）から抽出されたＤＮＡの間の電気泳動図には有意差があることを見出すことができ、安定化剤なしの試料から抽出されたＤＮＡ（試料ウェル番号１９〜２７）の電気泳動バンドは、比較的にじんでおり、尾部が小さい断片方向に向かっていることから、安定化剤なしの試料中でのＤＮＡが比較的激しく分解したことが示される。主電気泳動バンドのシグナル強度に照らして、安定化剤のある群での試料から抽出されたＤＮＡ（試料ウェル番号１〜１８）の主バンドは強い強度を有している一方、安定化剤なしの群での主バンドは強度が弱く、特に、その強度は試料Ｎ−Ｎ−７（試料ウェル番号２１）では消えていく傾向があり、これは安定化剤により試料中のより多くのＤＮＡが未分解である長鎖状態を維持することができることも明らかにしていた。上記結果によれば、本発明の安定化剤は試料完全性を有意に保持することが可能であることが示されている。
【表４】
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【００７８】
実施例２
実施例１において得られたそれぞれの試料から抽出したＤＮＡについてのライブラリーを構築し（インサートサイズ≦８００ｂｐ）、次に試料あたり８Ｍｂの塩基配列決定データを用いてＩｏｎ  ＰＧＭ及び３１８−ｖ２チップを使用して、１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＶ４及びＶ５領域のメタゲノミクス塩基配列決定を実行し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。
【００７９】
塩基配列決定結果に基づいて、試料のそれぞれは微生物構成（パーセンテージ）について分析され、試料間の相関は属レベルで計算された（Ｅｘｃｅｌ  ＣＯＲＲＥＬ機能を使用して）。
【００８０】
１６Ｓ  ｒＤＮＡ分析方法：
１．配列決定装置
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ）
２．塩基配列決定戦略
１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子のＶ４〜Ｖ５領域の配向塩基配列決定（逆方向：Ｖ５→Ｖ４）
３．ソフトウェア
ｍｏｔｈｕｒ  ｖ．１．３３．３（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｔｈｕｒ．ｏｒｇ）
４．１６Ｓ  ｒＤＮＡデータベース
ＲＤＰ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ、ｈｔｔｐ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）
Ｓｉｌｖａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒｂ−ｓｉｌｖａ．ｄｅ／）
５．分析過程
１６Ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の高頻度可変性領域についての塩基配列決定技術を使用することにより、１６Ｓ  ｒＤＮＡのＶ４〜Ｖ５領域のＰＣＲ産物を塩基配列決定した。塩基配列決定によって得られるフィルター処理された読取りデータは１６Ｓ  ｒＤＮＡデータベースＳｉｌｖａに整列させ、次に、整列させた読取りデータはＯＴＵクラスタリングにかけ、種分類に関する情報はＲＤＰデータベースアノテーションに従って得られ、続いて多様性分析などの他の分析を行った。分析過程は図３に示されている。図４は属レベルでのそれぞれの２つの試料間の相関を示している（表６−１、６−２、６−３参照）。属レベルでのそれぞれの種の相対的存在量に従って（表５−１、５−２、５−３）、それぞれの２つの試料間の相関係数を計算した。
６．結果分析
属レベルでのそれぞれの２つの試料間の相関に照らして、Ｓｔｏｏｌ  ＤＮＡ安定化剤（市販の安定化剤）と一緒に貯蔵された群と比べると、配合２．３７の安定化剤と一緒に貯蔵された群は対照群とより類似しており（平均で０．９８２９対０．９６７６）、属レベルでの結果と貯蔵温度又は期間の間の相関はこの群内でのほうが高い（平均で０．９９３７対０．９８６２）。安定化剤なしの負の対照群（群３）が対処群と相関関係を保つことが可能なのは−２０℃の貯蔵条件でのみである（平均で０．９９６６）。したがって、上記結果によれば、本発明の安定化剤は生体試料（糞便）中のＤＮＡ分子の完全性及び安定性を長時間保持することが可能であり、貯蔵において先行技術の製品よりも優れた効果を有することが示されている。
【００８１】
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００８２】
実施例３  血液試料の貯蔵
新鮮な血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する遠心管に収集し、それぞれ配合１．１又は配合１．３の安定化剤（表１）と特定の比で混合した。例えば、比が２対１である場合、１００μＬの血液と５０μＬの安定化剤をマイクロ遠心管に添加し、ボルテックス下で混合した。例えば、比が４対１である場合、１００μＬの血液と２５μＬの安定化剤をボルテックス下で混合した。例えば、比が８対１である場合、１００μＬの血液と１２．５μＬの安定化剤をボルテックス下で混合した。複数の混合試料を検出時点毎に調製し、室温で貯蔵した。室温で貯蔵した１００μＬの血液試料を無防備対照試料（ＮＰ）として使用し、−８０℃で貯蔵した１００μＬの血液試料を凍結対照試料として使用した。１０日後、ＤＮＡはＱＩＡａｍｐ（商標）精製ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用することにより抽出し、詳細なステップは血液試料の製造業者の説明書に従って実施した。さらに、実験はすべて２通り実施した。最後に、抽出により得られたゲノムＤＮＡは１００μＬの溶出剤を用いて溶出した。溶出後、１０μＬの溶出液を臭化エチジウム含有０．８％アガロースゲルの試料ウェル中に充填した。１２０Ｖでの４０分間の電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理装置により写真を撮った。電気泳動図は図５に示されている。
【００８３】
結果によれば、異なる比で安定化剤と混合され室温で貯蔵された血液試料から得られたＤＮＡのほうが電気泳動図において明確に分離されたバンドを示しており、安定化剤なしで室温で貯蔵された試料から得られたＤＮＡでは、電気泳動のバンドはぼやけておりわずかににじんでいたことが示されている。
【００８４】
実施例４  室温で２０日間貯蔵された血液試料中のＤＮＡの安定性
新鮮な血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する遠心管に収集し、それぞれ配合１．１又は配合１．３の安定化剤（表１）と特定の比で混合した。室温での２０日間の貯蔵後、ＤＮＡ抽出を実行した。さらに、安定化剤なしで室温で貯蔵された試料（ＮＰ）及び安定化剤なしで−８０℃で貯蔵された試料は対照試料として使用した。すべての試料から抽出したＤＮＡは１００μＬの溶出剤を用いて溶出した。溶出後、１０μＬの溶出液を臭化エチジウム含有０．８％アガロースゲルの試料ウェル中に充填した。１２０Ｖでの４０分間の電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理システムにより写真を撮った。電気泳動図は図６に示されている。結果によれば、それぞれ配合１．１又は配合１．３の安定化剤と特定の比で混合され、室温で２０日間貯蔵された血液試料から得られたＤＮＡのほうが電気泳動図において明確に分離されたバンドをまだ示しており、安定化剤なしで貯蔵された試料から得られたＤＮＡでは電気泳動のバンドは激しくにじんでいたことが示されており、ＤＮＡが激しく分解されていることを示していた。
【００８５】
ＤＮＡ濃度はＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２  Ｒｅａｄｅｒにより２６０ｎｍでの紫外線スペクトルから決定した。４対１の比で安定化剤と一緒に貯蔵された試料の結果は対照試料の結果と比較され、図７及び表７に示されている。結果によれば、室温で安定化剤と一緒に貯蔵された試料から得られたＤＮＡの総量は−８０℃で貯蔵された試料から得られたＤＮＡの総量に匹敵して有意差はなく、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料から得られたＤＮＡの総量は有意に低かったことが示されている。
【表１１】
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【００８６】
実施例５  非冷凍貯蔵血液試料中のＤＮＡの安定性
新鮮な血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する遠心管に収集し、それぞれ配合１．１又は配合１．３の安定化剤（表１）と異なる比で混合した。さらに、安定化剤なしで室温で貯蔵された試料（ＮＰ）及び安定化剤なしで−８０℃で貯蔵された試料は対照試料として使用した。次に、模擬輸送過程を実施し、そのステップは以下の通りであった。
ａ）室温で２日間貯蔵した；
ｂ）４５℃で２日間貯蔵した；
ｃ）室温で３日間貯蔵した；
ｄ）−２０℃で２日間貯蔵した；
ｅ）室温で３日間貯蔵した、及び
ｆ）４５℃で２日間貯蔵した。
【００８７】
上記ステップで処理後、血液試料は室温で１０日間さらに貯蔵され、続いてＤＮＡを抽出した。全ての試料由来のＤＮＡは１００μＬの溶出剤を用いて溶出した。溶出後、１０μＬの溶出液を臭化エチジウム含有０．８％アガロースゲルの試料ウェル中に充填した。１２０Ｖでの５０分間の電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理システムにより写真を撮った。電気泳動図は図８に示されている。ＤＮＡ濃度はＢｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２  Ｒｅａｄｅｒにより２６０ｎｍでの紫外線スペクトルから決定した。４対１の比で安定化剤と一緒に貯蔵された試料の結果は対照試料の結果と比較され、図９及び表８に示されている。
【００８８】
結果によれば、それぞれ配合１．１又は配合１．３の安定化剤（表１）と異なる比で混合され、模擬輸送過程を経た血液試料から得られたＤＮＡのほうが電気泳動図においてはっきりと分離されたバンドを示し、その総量は−８０℃で貯蔵された対照試料において得られたＤＮＡの総量に匹敵しており、安定化剤なしで室温で貯蔵された試料から得られたＤＮＡでは電気泳動バンドは激しくにじんでおり、ＤＮＡの総量も比較的低いことが示されており、ＤＮＡが激しく分解されていることを示している。
【表１２】
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【００８９】
実施例６  室温で１５日間貯蔵された血液試料中のＲＮＡの安定性
ボランティアから収集した血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に入れ、それぞれ配合１．１〜１．４の安定化剤（表１）のうちの１つと２対１又は４対１の比で混合した。ボルテックス下での混合後、試料は室温で貯蔵した。室温で貯蔵された３００μＬの血液試料は無防備対照試料（ＮＰ）として使用し、−８０℃で貯蔵された３００μＬの血液試料は凍結対照試料として使用した。室温での１５日間の貯蔵後、試料は１４０００ｇの遠心力で５分間遠心分離し、上澄みを取り除いた。沈殿物をＡｍｂｉｏｎ  ＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）血液キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）由来の溶解緩衝液（８００μＬ）及び酢酸ナトリウム溶液（５０μＬ）に十分に混合させることにより溶解させ、次にキットの説明書に従って、ＲＮＡを血液試料から抽出した。ＲＮＡ抽出は、試料を解凍後−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した試料において及び室温で安定化剤なしで貯蔵した試料においても実行した。抽出されたＲＮＡは臭化エチジウム含有１％アガロースゲルの試料ウェルに充填した。１５０Ｖで３５分間の電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理システムにより写真を撮った。電気泳動図は図１０に示されている。
【００９０】
結果によれば、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料から得られたＲＮＡが完全に分解しており、このＲＮＡはレーンにおいて激しくにじんでおり、ＲＮＡバンドは観察されなかったことが示されている。これとは対照的に、室温で安定化剤と一緒に貯蔵された試料から得られたＲＮＡは電気泳動図において明瞭なバンド（１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの２つの主要バンドを含む）を示しており、比較的高い完全性であった。
【００９１】
実施例８  ２９３Ｔ細胞におけるゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの安定性
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）を標準細胞培養方法により培養し、こうして得られた細胞は洗浄した。細胞はそれぞれ配合２．５又は配合２．６の安定化剤（表２）と２対１、４対１及び８対１の比で混合させ、室温で貯蔵した。さらに、安定化剤なしで等量の細胞を含有する２つの試料を対照として使用し、１つは室温で貯蔵され（ＮＰ）、もう１つは−８０℃で貯蔵された。全ての試料の１５日間の貯蔵後、ゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を使用することにより抽出され、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。得られた核酸試料は１．２％アガロースゲル電気泳動により検出された。ＲＮＡ電気泳動図（図１１）は、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料ではＲＮＡは完全に分解しており、独立したＲＮＡバンドは観察されず、これとは対照的に、室温で配合２．５又は配合２．６の安定化剤と一緒に貯蔵された試料の電気泳動図では、ＲＮＡは比較的明瞭なバンド（１８Ｓ及び２８Ｓ  ｒＲＮＡの２つの主要バンドを含む）を有しており、その完全性は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵された試料中のＲＮＡの完全性に匹敵するか、それよりもずっとよいことを示している。ＤＮＡ電気泳動図（図１２）は、室温で配合２．５又は配合２．６の安定化剤と一緒に貯蔵された試料の電気泳動図では、ＤＮＡはより明瞭に分離された強力なバンドを有しており、このバンドは−８０℃で貯蔵された試料中のＤＮＡのバンドと同程度に良好であり、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中では、ＤＮＡは激しく分解しており、バンドは激しくにじんでいたことを示している。
【００９２】
実施例９  室温で貯蔵されたマウス脳組織の試料中のＲＮＡ及びタンパク質の安定性
実験動物組織の収集のための既存の過程に従って、マウス脳組織の新鮮な試料（試料ごとに約２５ｍｇ）を入手し、別々に遠心管に貯蔵し、それぞれ４つの方法で貯蔵した。１つはいかなる安定化剤もない貯蔵を指し、１つは配合２．５の安定化剤を１００μＬ添加した貯蔵を指し、１つは配合２．６の安定化剤を１００μＬ添加した貯蔵を指し（表２）、３つの方法により処理された試料は室温で貯蔵され、最後の１つは対照として−８０℃でのいかなる安定化剤もない貯蔵を指した。全ての処理は２通り実施され、試料は一致する条件下で１５日間又は２４日間貯蔵した。貯蔵後、全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を使用することにより前記試料のそれぞれから抽出され、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施された。ＲＮＡ完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノキット及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することにより評価し、結果はＲＩＮ（ＲＮＡ完全性）として表された。
【００９３】
１５日後、ＲＩＮの平均値は、室温で配合２．５及び配合２．６の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のＲＮＡについてそれぞれ８．１及び８．３であり、これらの値は、−８０℃で貯蔵された試料中のＲＮＡについてのＲＩＮの平均値（８．６）よりもわずかに低く、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中のＲＮＡについてはＲＩＮの平均値はわずか３．２であった。２４日後、ＲＩＮの平均値は、室温で配合２．５及び配合２．６の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のＲＮＡについてそれぞれ７．４及び７．７であり、これらの値は、−８０℃で貯蔵された試料中のＲＮＡについてのＲＩＮの平均値（８．０）に近く、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中のＲＮＡについてはＲＩＮの値はわずか２．６であった。
【００９４】
上記の方法により調製されたマウス脳組織の試料（試料ごとに約２５ｍｇ）を室温で配合２．４の安定化剤（表２）と一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。１５日後、全ＲＮＡは試料のそれぞれから抽出した。マウスＧＡＰＤＨ、Ｐ２３及びＣｄｋ２のｃＤＮＡ断片を使用して特異的プライマーを設計し、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析を実施した。２５０ｐｇ、２．５ｎｇ又は２５ｎｇを逆転写において使用し、標準定量的ＰＣＲ方法により増幅させ、ＲＮＡ試料に対して比較分析を実施した。結果（図１４）によれば、室温での配合２．４の安定化剤と一緒の１５日間の貯蔵後、３つの遺伝子の転写レベルは−８０℃で貯蔵された対照の転写レベルに匹敵し、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料では、３つの遺伝子の転写レベルは大いに増強されていたことが示されている。
【００９５】
上記の方法により調製されたマウス脳組織の試料（試料ごとに約２５ｍｇ）はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織ＦＩＸ容器（５０ｍｌ）に移して固定し、続いてＰＡＸｇｅｎｅ組織ＦＩＸを取り除いてＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を同じ容器に添加し、次に室温で貯蔵した。又は、試料は直接収集管に移し、室温で配合２．４の安定化剤（表２）と一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。７日後、ＳｕｒｅＰｒｅｐ（商標）キット（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用することにより前記試料のそれぞれからタンパク質を抽出し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。タンパク質濃度はＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）により決定した。等量のタンパク質抽出物を４〜２０％勾配トリスグリシンポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で電気泳動にかけた。電気泳動後、タンパク質はニトロセルロース膜に電気泳動で転写させ、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ溶液で染色した。ウェスタンブロット分析は、マウスダイニン及びβアクチンについて抗体を使用することにより実行した。
【００９６】
Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓで染色することにより、電気泳動図では、配合２．４の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のタンパク質抽出物を表すバンドは、安定化剤ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤濃縮物と一緒に貯蔵した試料中のバンドよりもはっきりして明瞭であり（図１５）、電気泳動図では、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料中のタンパク質を表すバンドは弱く、にじんでいた。ウェスタンブロット分析（図１６）によれば、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のタンパク質抽出物中のダイニンの含有量は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した試料中のタンパク質抽出物中のダイニンの含有量と実質的に一致しており、そのバンドの強度は匹敵していたが、室温で安定化剤ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤濃縮物と一緒に貯蔵した試料中のタンパク質抽出物では、ダイニンの含有量は低くバンドの強度は低く、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料中のタンパク質抽出物では、ダイニンの含有量ははるかに低くバンドは明白ではなかったことが示されている。３つの条件下で貯蔵された試料由来のタンパク質抽出物では、アクチンを表すバンドはウェスタンブロットにおいてはっきりと検出することができた。その上、配合２．４の安定化剤は組織試料中のタンパク質の貯蔵では安定化剤ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤濃縮物よりも優れた効果があったが、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中のタンパク質抽出物を表すバンドのほうは弱く、貯蔵における効果は最悪であった。
【００９７】
実施例１０  室温でのヒト乳がんの腫瘍試料中のタンパク質の安定性
上記の方法により調製されたヒト乳がんの試料（試料ごとに約２５ｍｇ）はＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織ＦＩＸ容器（５０ｍｌ）に移して固定し、続いてＰＡＸｇｅｎｅ組織ＦＩＸを取り除いてＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を同じ容器に添加し、次に室温で貯蔵した。又は、試料は直接収集管に移し、室温で配合１．３７の安定化剤（表１）と一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。７日間の貯蔵後、タンパク質を上記の方法によって抽出し、タンパク質抽出物は電気泳動による分離にかけた。ニトロセルロース膜への電気泳動による転写後、アミノブラックを染色のために使用した。結果は図１７に示されている。結果によれば、室温で配合１．３７の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のタンパク質抽出物は電気泳動図では複数の明瞭なバンドを有していたことが示されている。比較すると、配合１．３７の安定化剤と一緒に貯蔵した試料を表すバンドのほうが、安定化剤ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）組織安定化剤濃縮物と一緒に貯蔵した試料を表すバンドよりもはっきりしていて明瞭であり、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中のタンパク質を表す電気泳動図では、バンドは強度が弱く比較的にじんでいた。
【００９８】
実施例１１  長時間室温で貯蔵したヒト血液試料中のＲＮＡ及びＤＮＡの安定性
ボランティアから収集した血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に添加し、それぞれ配合２．１〜２．３の安定化剤（表２）のうちの１つと２対１又は８対１の比で混合し、室温で貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。６０日後、ゲノムＤＮＡをＱＩＡａｍｐ（商標）ミニＤＮＡキットを使用することにより試料から抽出し、精製後アガロースゲル電気泳動にかけた。結果は図１８に示されている。それぞれ配合２．１〜２．３の安定化剤と一緒に貯蔵した試料を表すＤＮＡバンドは、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料を表すＤＮＡバンドよりもはるかに明るくはっきりと分離していたことが電気泳動図から見て取ることができる。
【００９９】
ボランティアから収集した血液（全血）試料を抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に添加し、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。０、１、３、及び７日目、アクチン遺伝子を内部基準として使用し、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルをＲＴ−ｑＰＣＲ方法により決定した。結果（図１９、図２０）によれば、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のＦＯＳ遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルは−８０℃で貯蔵された対照試料のＦＯＳ遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルに検出時点のそれぞれにおいて匹敵しており、これとは対照的に、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料では、ＦＯＳ遺伝子の転写レベルは徐々に増加し、ＩＬ−１β遺伝子の転写レベルは広く変動していた。
【０１００】
実施例１２  非冷凍貯蔵血液試料中のＲＮＡの安定性
ボランティアから収集した血液（全血）試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管に添加し、室温（ＲＴ）で３日間若しくは７日間貯蔵した、又は試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に収集し、室温（ＲＴ）で配合２．４の安定化剤と一緒に３日間若しくは７日間貯蔵した、又は室温（ＲＴ）で安定化剤なしで３日間貯蔵した、又は−８０℃で安定化剤なしで７日間貯蔵した。試料収集時の発現レベルと比べた３６の遺伝子の発現レベルの変化は、ΔΔＣｑ方法により決定され（表９）、ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部基準として使用し、実験はすべて３通り実施した。「０」時の遺伝子は同じ発現レベルを有しており、検出の特定の時点での発現レベルは対応する線形状の曲線（図２１Ａ〜Ｆ）に示された。対角線に平行な散布図における真っ直ぐな境界線は２倍ボーダーラインを表し、遺伝子を表すのに描かれている１つの点が上の境界線よりも有意に高い場合は、それは遺伝子発現レベルの上方調節と見なされ、これとは対照的に、遺伝子を表すのに描かれている１つの点が下の境界線よりも有意に低い場合は、それは遺伝子発現レベルの下方調節と見なされる。
【表１３】
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【０１０１】
表１０はＲＴ−ｑＰＣＲ方法により分析された室温での貯蔵後の血液試料中の複数の遺伝子の発現安定性の結果をまとめている。ボランティアから収集した血液（全血）試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管に添加し、室温で３日間若しくは７日間貯蔵した、又は試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に収集し、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に３日間若しくは７日間貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで３日間貯蔵した、又は−８０℃で安定化剤なしで７日間貯蔵した。試料収集時の発現レベルと比べた３６の遺伝子の発現レベルの変化は、ΔΔＣｑ方法により決定され、ハウスキーピング遺伝子ＰＲＬ１３Ａ及びＧＡＰＤＨは内部基準として使用し、実験はすべて３通り実施した。結果によれば、室温で安定化剤なしで３日間貯蔵した試料では、上方調節された遺伝子の数は７に達し、下方調節された遺伝子の数は１０に達し、その合計は試験した全ての遺伝子の４７％を占め、−８０℃で貯蔵した試料では、上方調節された遺伝子及び下方調節された遺伝子の数はそれぞれ１及び２であり、その合計は全数の８％を占めただけであったことが示されている。これとは対照的に、試料を室温で配合２．４の安定化剤と一緒に３日間貯蔵した後、上方調節された遺伝子及び下方調節された遺伝子の数はそれぞれ２及び１であり、その合計は全数の８％を占め、７日間の貯蔵後、下方調節された遺伝子の数は１つ増え、その合計は全数の１１％を占め、この結果は−８０℃での貯蔵の結果と類似していた。さらに、配合２．４の安定化剤のほうがＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管よりも貯蔵では優れた効果を有することが比較によって分かった。
【表１４】
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【０１０２】
別の実験では、ボランティアから収集した血液（全血）試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管に添加し、室温で３日間若しくは７日間貯蔵した、又は試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に収集し、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に３日間若しくは７日間貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで３日間貯蔵した、又は−８０℃で安定化剤なしで７日間貯蔵した。全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用することにより血液試料から抽出し、ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）はＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー及びＲＮＡ６０００ナノキットを使用することにより分析した。結果は図２２に示されている。結果によれば、室温で配合２．４の安定化剤と一緒に３日間貯蔵した試料中のＲＮＡでは、ＲＩＮの平均値は８．５であり、この値は室温で安定化剤なしで３日間貯蔵した試料から得られたＲＮＡのＲＩＮ値（２．９５）よりもはるかに高かったことが示されている。室温で配合２．４の安定化剤と一緒に７日間貯蔵した試料中のＲＮＡでは、ＲＩＮの平均値は８．３であり、この値は−８０℃で貯蔵した試料由来のＲＮＡについてのＲＩＮの平均値（８．６）よりもわずかに低かった。さらに、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより室温で３日間又は７日間貯蔵した試料から得られたＲＮＡについてのＲＩＮ値は、配合２．４の安定化剤と一緒に貯蔵した試料から得られたＲＮＡについてのＲＩＮ値よりも低かったことが分かり、配合２．４の安定化剤のほうが貯蔵において優れた効果を有することを示していた。
【０１０３】
別の研究では、ボランティアから収集した血液（全血）試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管に添加し、室温で貯蔵した、又は試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に収集し、室温でそれぞれ配合２．１０〜２．１４の安定化剤（表２）のうちの１つと一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。全ＲＮＡは、試料を収集した時（「０」時に）及び特定の条件下での７日間の貯蔵後に試料のそれぞれから抽出した。上記の方法を使用することにより、「０」時での転写レベルと比べた貯蔵後の血液中のＦＯＳ及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルの変化をＲＴ−ｑＰＣＲ技術により分析し、ヒトβアクチン遺伝子は内部推定（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ）として使用した。結果は図２３に示されている。結果によれば、室温でそれぞれ配合２．１０〜２．１１の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のＦＯＳ遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルは−８０℃で貯蔵した対照試料中のＦＯＳ遺伝子及びＩＬ−１β遺伝子の転写レベルに匹敵していてほとんど差はなく、ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管を利用することにより室温で貯蔵した試料中のこれらの２つの遺伝子の転写レベルは−８０℃で貯蔵した対照試料における転写レベルに比べて大幅に減少しており、これとは対照的に、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料中のこれら２つの遺伝子の転写レベルは大きく変化しており、ＦＯＳ遺伝子の転写レベルは有意に減少しており、ＩＬ−１β遺伝子の転写レベルは大いに増加していたことが示されている。
【０１０４】
さらに、発明者らは類似する分析も行い、ただし、貯蔵期間が７日間の代わりに１４日間であり、分析する遺伝子の種類も増え、ＩＬ−１６及び１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子がさらに含まれた。ボランティアから収集した血液（全血）試料をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管に添加し、室温で貯蔵した、又は試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に収集し、室温でそれぞれ配合２．１０〜２．１４の安定化剤（表２）のうちの１つと一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。全ＲＮＡは、試料を収集した時（「０」時に）及び特定の条件下での１４日間の貯蔵後に試料のそれぞれから抽出した。上記の方法を使用することにより、「０」時での転写レベルと比べた貯蔵後の血液中のＦＯＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１６及び１８Ｓ  ｒＲＮＡをコードする遺伝子の転写レベルの変化をＲＴ−ｑＰＣＲ技術により分析し、ヒトβアクチン遺伝子は内部推定として使用した。結果は図２４に示されている。結果によれば、室温でそれぞれ配合２．１０〜２．１１の安定化剤と一緒に貯蔵した試料中の４つの遺伝子の転写レベルは−８０℃で貯蔵した対照試料中の４つの遺伝子の転写レベルに匹敵していてほとんど差はなく、配合２．１０〜２．１１の安定化剤のほうがＰＡＸｇｅｎｅ（商標）血液ＲＮＡ管よりも貯蔵において優れた効果を有しており、室温で安定化剤なしで貯蔵された試料中の４つの遺伝子の転写レベルは大いに変化しており、大幅に減少していたことが示されている。
【０１０５】
実施例１３  ６カ月を超える間非凍結条件下で貯蔵された血液試料中のＤＮＡの安定性
ボランティアから収集した血液（全血）試料は抗凝固剤Ｋ２−ＥＤＴＡを含有する真空採血管に添加し、室温で配合２．９〜２．２０の安定化剤（表２）のうちの１つと一緒に貯蔵した、又は室温で安定化剤なしで貯蔵した（ＮＰ）、又は−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した。
【０１０６】
室温で貯蔵された試料は実験台に置いた。１８６日後、説明書に従って、ゲノムＤＮＡはＱｉａＡｍｐ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用することにより抽出した。抽出したＤＮＡは臭化エチジウム含有０．８％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。結果（図２５）によれば、安定化剤と一緒に貯蔵した試料中のＤＮＡのバンドは−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した試料中のＤＮＡのバンドよりも明瞭で明るく、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料中のＤＮＡのバンドは激しくにじんでおり、テイルが小さい断片のほうに向かって後退していたことが示されており、激しく分解されていることを示していた。
【０１０７】
実施例１４  非冷凍貯蔵尿試料中のＲＮＡ及びＤＮＡの安定性
ボランティアから収集した尿試料はさらなる使用のために氷上で貯蔵した。２００μＬの尿試料は、配合２．６〜２．８の安定化剤（表２）のうちの１つの等量と十分に混合させた。安定化剤なしの２つの対照試料を調製し、−８０℃で貯蔵した１つの対照試料は凍結対照として使用し、もう一方の対照試料（ＮＰ）は安定化剤と一緒に貯蔵した試料と共に室温で暗所に置いた。処理はすべて２通り実施した。３０日間の貯蔵後、ゲノムＤＮＡ及び全ＲＮＡはそれぞれ前記ＤＮＡ及びＲＮＡ抽出キットを使用することにより前記試料から抽出し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。得られた核酸試料は１．２％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡ電気泳動図（図２６）によれば、室温で安定化剤と一緒に貯蔵した試料由来のＤＮＡは電気泳動図において明るいバンドを有し、このバンドは−８０℃で貯蔵した対照試料由来のＤＮＡのバンドに匹敵していたことが示されている。しかし、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料では、ＤＮＡは激しく分解されており、そのバンドはぼやけており強度は非常に低かった。ＲＮＡ電気泳動図（図２７）によれば、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料では、そのＲＮＡは完全に分解されており、独立したＲＮＡバンドは観察されなかったことが示されている。これとは対照的に、室温で安定化剤と一緒に貯蔵した試料では、ＲＮＡを表す比較的明瞭なバンドを電気泳動図において検出することが可能であり、２８Ｓバンドと１８Ｓバンドの強度の比は２対１に近く、得られたＲＮＡが高品質を有していることを示していた。
【０１０８】
実施例１５  非冷凍唾液試料中のＲＮＡ及びＤＮＡの安定性
ボランティアから収集した唾液試料はさらなる使用のために氷上で貯蔵した。唾液試料は十分に混合させた。２００μＬの唾液試料は、ネジ口付のポリプロピレンビン中で配合２．５〜２．８の安定化剤（表２）のうちの１つの等量と混合させた。安定化剤なしの２つの対照試料を調製し、−８０℃で貯蔵した１つの対照試料は凍結対照として使用し、もう一方の対照試料（ＮＰ）は安定化剤と一緒に貯蔵した試料と共に室温で暗所に置いた。処理はすべて２通り実施した。３０日間の貯蔵後、ＤＮＡはＱＩＡａｍｐ精製ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用することにより３００μＬのそれぞれの試料から抽出し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。最後に、抽出されたゲノムＤＮＡは１００μＬのＡＥ溶出剤を用いて溶出させ、１０μＬの溶出液は臭化エチジウム含有１．２％アガロースゲルの試料ウェル内に充填した。１２０Ｖでの４０分間のゲル電気泳動後、紫外線（ＵＶＩ）画像処理システムにより写真を撮った。電気泳動図は図２８に示されている。
【０１０９】
結果によれば、−８０℃で安定化剤なしで貯蔵した試料由来のＤＮＡのバンドと比べた場合、安定化剤と一緒に貯蔵した試料由来のＤＮＡのバンドも明瞭で明るく、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料由来のＤＮＡのバンドはぼやけており強度は低かったことが示されている。
【０１１０】
唾液試料はボランティアから収集し、唾液試料は十分に混合させた。２００μＬの試料は、ネジ口付のポリプロピレンビン中でそれぞれ配合２．５〜２．８の安定化剤のうちの１つの等量と混合させた。安定化剤なしの２つの対照試料を調製し、−８０℃で貯蔵した１つの対照試料は凍結対照として使用し、もう一方の対照試料（ＮＰ）は安定化剤と一緒に貯蔵した試料と共に室温で暗所に置いた。処理はすべて２通り実施し、試料は対応する条件下で３０日間貯蔵した。貯蔵後、全ＲＮＡはＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を使用することにより試料のそれぞれから抽出し、詳細なステップは製造業者の説明書に従って実施した。ＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）はＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００ナノキット及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用することにより評価し、結果はＲＩＮ（ＲＮＡ完全性）として表した。
【０１１１】
結果（図２９）によれば、３０日間の貯蔵後、室温で配合２．５〜２．８の安定化剤と一緒に貯蔵した試料由来のＲＮＡでは、ＲＩＮの平均値はそれぞれ８．４５、８．５５、８．３及び８．４５であり（図１３）、これらの値は−８０℃で貯蔵した試料由来のＲＮＡについてのＲＩＮの平均値（８．６５）と実質的に一致しており、室温で安定化剤なしで貯蔵した試料由来のＲＮＡについてのＲＩＮの平均値はわずか２．８５であったことが示されている。
【０１１２】
本発明の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者であれば、その中に開示されたあらゆる教唆に従って詳細な点に種々の改変及び置き換えを実施することが可能であり、そのような変更はすべて本発明の保護範囲に含まれることは理解すると考えられる。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその任意の等価物により定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−Ａ】
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【図２１−Ｂ】
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【図２１−Ｃ】
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【図２１−Ｄ】
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【図２１−Ｅ】
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【図２１−Ｆ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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