(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの照明光源が配置されている照明用ビーム経路と、
少なくとも１つの光電子増倍管（ＰＭＴ）が検出器として用いられている検出用ビーム経路と、
蛍光実験を制御するための制御ユニットとを備えており、
該制御ユニットにより変化しつつ、試料が高い強度で照明され、その後、すぐに試料点および試料領域のうちの少なくとも一方の蛍光減衰挙動が検出される走査型レーザ顕微鏡の動作方法において、
該制御ユニットにより、該ＰＭＴの高電圧供給線内に直接的にスイッチを介して、退色工程のために高電圧を遮断するように該ＰＭＴのスイッチオフが行われ、該退色工程の終了後またはその少し後に該ＰＭＴのスイッチオンが行われて、走査型レーザ顕微鏡が検出光の強度の低い蛍光モードにあるときにのみ該ＰＭＴによる検出が行われるようにすることを特徴とする動作方法。
【請求項２】
前記照明モードの変化に同期して前記スイッチオンおよびオフが行われる、請求項１に記載の動作方法。
【請求項３】
高強度での照明の開始前または開始時にスイッチオフが行われ、かつ該照明のスイッチオフの際またはその後で再スイッチオンが行われる、請求項１または２に記載の動作方法。
【請求項４】
走査型レーザ顕微鏡において使用される光電子増倍管（ＰＭＴ）の高電圧制御のための装置であって、該ＰＭＴの高電圧引込線内に該ＰＭＴ用のオンおよびオフスイッチが、退色工程のために高電圧を遮断するようにオフに切り替えられ、該退色工程の終了後またはその少し後にオンに切り替えられて、走査型レーザ顕微鏡が検出光の強度の低い蛍光モードにあるときにのみ該ＰＭＴによる検出が行われるようにするように設けられている装置。
【請求項５】
少なくとも１つの照明光源が配置されている照明用ビーム経路と、
少なくとも１つの光電子増倍管（ＰＭＴ）が検出器として用いられている検出用ビーム経路と、
ＰＭＴの高電圧制御のための装置とを含む制御ユニットを備えた走査型レーザ顕微鏡において、
該ＰＭＴの高電圧引込線内に、高電圧を選択的に遮断するための該ＰＭＴ用のオンおよびオフスイッチが、退色工程のために高電圧を遮断するようにオフに切り替えられ、該退色工程の終了後またはその少し後にオンに切り替えられて、走査型レーザ顕微鏡が検出光の強度の低い蛍光モードにあるときにのみ該ＰＭＴによる検出が行われるようにするように設けられている走査型レーザ顕微鏡。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の動作方法を実施するための走査型レーザ顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型レーザ顕微鏡の動作方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
走査型レーザ顕微鏡（ＬＳＭ）では様々な出力クラスのレーザが使用される。さらに走査型レーザシステムは、検出器として用いられるかまたは照明に用いられる多数の可変のモジュールを特徴とする。
【０００３】
共焦点走査型顕微鏡はレーザモジュールを含んでおり、このレーザモジュールは異なる波長の照明光を生成する複数のレーザビーム源からなるのが好ましい。照明光が照明ビームとしてカップリングされるスキャン機構は、顕微鏡ユニットの顕微鏡ステージ上にある試料全域に、照明ビームをビーム偏向により案内するため、主カラースプリッタ、ｘ−ｙスキャナ、およびスキャン対物レンズを備えている。これにより生成されて試料から来る測定光線は、主カラースプリッタおよび結像光学系を介し、検出チャネルの少なくとも１つの共焦点検出絞り（検出ピンホール）に向けられる。
【０００４】
図１では、走査型レーザ顕微鏡のこのようなビーム経路を概略的に示している。
ここで示しているモジュールは、光源、スキャンモジュール／検出ユニット、および顕微鏡である。これらのモジュールを以下でさらに詳しく説明する。加えて（特許文献１）およびツァイス（ＺＥＩＳＳ）の走査型レーザ顕微鏡ＬＳＭ  ７１０を参照されたい。
【０００５】
標本中の様々な色素を特異的に励起するため、ＬＳＭでは様々な波長のレーザが用いられる。励起波長の選択は、調査すべき色素の吸収特性に基づいて決められる。励起放射線は光源モジュール内で生成される。ここでは様々なレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用される。さらに光源モジュールでは、例えば音響光学結晶（ＡＯＴＦ）の使用により、波長の選別および必要な励起波長の強度調整が行われる。続いてレーザ放射線は、ファイバまたは適切なミラー構成要素を介してスキャンモジュール内に達する。
【０００６】
光源で生成されたレーザ放射線は、スキャナ、スキャン光学系、および結像レンズを介し、対物レンズにより回折限界で標本内に合焦される。焦点は点状で、試料をｘ−ｙ方向にラスタ走査する。試料全域をスキャンする際の１ピクセル滞在時間はたいてい１マイクロ秒未満〜数百マイクロ秒までの範囲内である。
【０００７】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の際、焦点面（Ｓｐｅｃｉｍｅｎ）から、ならびにその上およびその下にある平面から放出される光は、スキャナを介してダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤ）に達する。このビームスプリッタは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、焦点面に対する共役面内に正確に存在する絞り（共焦点の絞り／ピンホール）上に合焦される。これにより、焦点外の蛍光部分が抑制される。絞りサイズの変更により、顕微鏡の光学解像度を調整することができる。絞りの後ろにはもう１つのダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）が存在しており、このダイクロイック・ブロックフィルタが再度、励起放射線を抑制する。ブロックフィルタの通過後、蛍光は点検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【０００８】
多光子吸収を使用する場合、色素の蛍光の励起は、励起強度が特に高い小さな体積内で行われる。この領域は、共焦点構成要素を使用する場合に検出される領域よりほんの少し大きいだけである。したがって、共焦点絞りの使用をやめることができ、かつ検出を対物レンズの直後に行うことができる（非デスキャン検出）。
【０００９】
さらに、多光子吸収によって励起された色素の蛍光を検出するためのもう１つの構成要素では、デスキャン検出が行われ、ただし、ここでは対物レンズの瞳が検出ユニット内に結像される（非共焦点デスキャン検出）。
【００１０】
両方の検出構成要素により、対応する１光子吸収または多光子吸収と関連して、３次元に照らし出された画像から対物レンズの焦点面にある平面（光学的断面）だけが再現される。試料の様々な深さｚのｘ−ｙ平面で複数の光学的断面を撮影することにより、その後、計算機を用いて試料の３次元画像を生じさせることができる。
【００１１】
したがって、ＬＳＭは厚い標本の調査に適している。励起波長は、特異的な吸収特性を有する使用される色素によって決定される。色素の放出特性に合わせたダイクロイック・フィルタが、その時々の色素から発せられる蛍光だけが点検出器によって測定されることを保証する。
【００１２】
中心的な制御ユニットＡは、信号線を介して非常に重要な顕微鏡コンポーネントと接続されている。例えば、レーザ源の後ろに配置された音響光学フィルタ（ＡＯＴＦ）を介し、使用されるレーザおよびその強度の制御を行い、かつ接続されたＰＭＴを介し、試料画像を生成するために検出用部分ビーム経路内で検出光の捕捉および加工を、捕捉されたスキャナ位置およびそれと結びつけられた試料上での照明光の位置に応じて行う。
【００１３】
生物医学的応用においては、複数の様々な細胞領域を様々な色素で同時に標識することもある（マルチ蛍光）。個々の色素は、現況技術により様々な吸収特性または放出特性（スペクトル）に基づいて別々に検出することができる。このために、副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）により追加的に複数の色素の蛍光の分割が行われ、かつ別々の点検出器（ＰＭＴｘ）において個々の色素放出の別々の検出が行われる。
【００１４】
その際、ＰＭＴには広い範囲での高い感度が必要である。
これに関し、たいていの方法におけるダイナミックレンジは検出器の適合性の範囲をはるかに超えている。このようなケースは、例えばＦＲＡＰ実験で起こる（例えば非特許文献１を参照）。ここでは、試料が蛍光において、つまり非常に少ない光が、検出器上で観察され、したがって、加工可能な信号を得るために大きな高電圧による高い増幅が必要になる。これとは対照的に非常に多くの光により、試料に作用する退色工程が短い間隔で隣接する。その後、すぐに再び蛍光モードにおいて測定される。退色工程に対し、検出器を非常に多くの光から保護しなければならない。そうしなければ、破損（曇り）または次の測定のための検出器のための長い回復時間という結果になるからである。この過程は非常に頻繁に繰り返される。検出器を保護するには、退色工程の前にその都度、検出器の前で機械的なシャッタを用いることができ、または高電圧を制御電圧により低い値に降下させる。これらのやり方で検出器の保護は確実にされるが、切替え工程の間の待機時間が約０．５秒〜１秒と長すぎる。機械的なシャッタは追加的な設置空間を必要とし、かつ追加的な費用を発生させる。この転換はしばしば数千回行われ、したがって機器の生産性要素になる。大規模な実験を短い時間で終えられるよう、測定工程と退色工程の間の待機時間は減らされるのが望ましい。
【００１５】
これまでは制御可能な高電圧発生器が使用されており、高電圧発生器は、このような実験のためにまずは降下させなければならない。これは事情によっては数百ミリ秒かかる。高電圧発生器を改めて上昇させるのにも半秒以上かかる。図２では、このような高電圧発生器のスイッチオン時の起動曲線（Ｕ（ｔ））の例を示している。同様にＰＭＴを保護するために、ＰＭＴの個々のダイノードの転極、短絡、および遮断（特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６）または陽極信号に応じた高電圧の的確な調節（特許文献７、特許文献８、特許文献９）がしばしば利用される。これは確かに陽極の迅速な保護を保証するが、この時点では依然としてダイノードまたは陰極に高電圧が印加しているので、その際、陰極は常に十分には保護されない。ＰＭＴ内の真空は理想的な真空ではないので、ダイノード／陰極に引き続き当たる光により残留ガスがイオン化される可能性があり、これにより、陰極が老朽化する可能性があり、専門家の間ではイオンフィードバックと呼ばれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】独国特許出願公開第１９７０２７５３号明細書
【特許文献２】米国特許第３８２１５４６号明細書
【特許文献３】米国特許第４３６７４０４号明細書
【特許文献４】独国特許第４１０５３７６号明細書
【特許文献５】独国特許出願公開第１０２００７００４５９８号明細書
【特許文献６】独国特許出願公開第１０２００９０６０３０９号明細書
【特許文献７】米国特許第３６９４６５９号明細書
【特許文献８】独国特許第３２７８２９５号明細書
【特許文献９】独国特許第４４１７５２９号明細書
【特許文献１０】特表２０１４−５２２９９５号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】ツァイス（ＺＥＩＳＳ）社  ＬＳＭ  ７１０ＮＬＯ、ＬＳＭ  ７８０ＮＬＯのパンフレット、２０１０年３月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明によって解決すべき問題は、できるだけ短い実験時間の場合に、例えばＦＲＡＰ実験の際に、非常に短い時間での高い反復率を達成するため、少ない手間でＰＭＴの最大限の保護を保証することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は独立請求項の特徴によって特徴づけられる。
好ましい変形形態は従属請求項の対象である。
高電圧線に直接的にスイッチを取り付けることにより、高電圧源を一定に保つことができ、変化させることがないので、高電圧源を直接的に変調するよりかなり速いスイッチオンおよびオフ時間が実現可能である。これに加え、高電圧線内の高電圧スイッチにより、高電圧が即座に遮断されるのでＰＭＴの光電陰極を包括的に保護することができる。これによりイオンフィードバック効果が最小限に減らされる。したがって、例えば機械的なシャッタのような面倒で遅い解決策をやめることができる。その上、本発明は製造費用を低下させ、かつＬＳＭ内の機械的なシャッタの廃止により所要スペースを減少させ、かつ例えばＦＲＡＰ実験のような、顧客のためのより高速で確実な実験を可能にする。ダイノード接点がスイッチングのために導出されている改変されたＰＭＴフレームも必要ない。したがって、これまでのすべてのＰＭＴを使用することができ、追加的な手間は必要ない。
【００２０】
特に有利な１つの実施形態では、高電圧線内のスイッチの作動が、走査型レーザ顕微鏡の制御ユニットにより直接的に、時間的に制御され、制御ユニットは上で詳述したように、照明要素および検出要素のようなすべての制御可能な顕微鏡コンポーネントとも接続されている。この時間的な制御は、高いレーザ強度での退色工程のために高電圧をスイッチオフし、それから退色工程の終了時またはその少し後に高電圧を再びスイッチオンし、したがって、用いられているＰＭＴにより、検出光の強度の低い上述の蛍光モードに高電圧が対応するように行われる。
【００２１】
つまり、ＰＭＴを上で言及した欠点に対して完全に保護することができ、それにもかかわらず、例えば複数のＦＲＡＰ測定の一連を高速に次々と行えることが有利である。
このために、用いられるレーザ波長およびその強度を制御する顕微鏡の制御ユニットと高電圧スイッチを接続する信号線が設けられている。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】走査型レーザ顕微鏡のビーム経路の概略図。
【図２】高電圧発生器のスイッチオン時の起動曲線（Ｕ（ｔ））の例を示す図。
【図３】一般的に使用されているＰＭＴを示す図。
【図４ａ】印加高電圧を生成する高電圧モジュールＨＸを示す図。
【図４ｂ】印加高電圧を生成する高電圧モジュールＨＸを示す図。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、図３および図４に基づいて本発明をさらに説明する。
図３には、一般的に使用されているＰＭＴを示している。光子ｐが陰極層Ｋに達し、この陰極層上で生成された光電子が、抵抗カスケードＲと接続している複数のダイノードＤによって増幅されてＰＭＴの測定出力部ＭＡに達する。
【００２４】
たいていの市販のＰＭＴはそのハウジングＧの外では、ハウジングＧの内部に配置されたダイノードチェーンによる増幅のために印加される高電圧のためのプラス端子およびマイナス端子だけを備えており、ダイノードチェーンにはたいてい外からはアクセスできない。
【００２５】
本発明により、いまや高電圧線内で、ここでは陰極に至るライン内で、有利なオンおよびオフスイッチＳＣＨが配置されており、高電圧線は信号線Ｓを介し、使用される顕微鏡の図１に示した制御ユニットと接続されており、これにより制御ユニットは、高強度のレーザ光による試料への作用に依存する顕微鏡の測定工程の時間的な状況に対応して、高電圧をスイッチオンおよびオフすることができる。
【００２６】
さらに図４ａおよび図４ｂでは、印加高電圧を生成する高電圧モジュールＨＸを示している。
図４ａでは、高電圧スイッチ、例えばリード・リレー（ＲＲ）が、ＨＶの出力部で、ＰＭＴ（図３を参照）の方向への高電圧リレー（例えばＧｉｇａｖａｃ社のＧＲ２ＤＮＡ）として設けられている。
【００２７】
図４ｂではスイッチ機能が、高電圧に適した半導体スイッチＨＬＳによって実現されている（例えばＶｏｌｔａｇｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒｓ社のＯＣ０２５）。
本発明は、ＰＭＴ検出器を使用するすべての顕微鏡システムにおいて効力を生じ得ることが有利である。
【符号の説明】
【００２８】
Ａ…制御ユニット、ＳＣＨ…スイッチ、Ｓ…信号線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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