(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記表１に記載された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
下記表１に記載された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
下記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、間葉系幹細胞又は軟骨細胞の、骨組織又は軟骨組織の形成能判定用キット。
【表１】
0006719114.tif 000006
【請求項２】
下記表２及び下記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、
下記表２及び下記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は
下記表２及び下記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を更に備える、請求項１に記載の間葉系幹細胞又は軟骨細胞の、骨組織又は軟骨組織の形成能判定用キット。
【表２】
0006719114.tif 000007
【表３】
0006719114.tif 000008
【請求項３】
ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、及び
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、
を備える、請求項２に記載の間葉系幹細胞又は軟骨細胞の、骨組織又は軟骨組織の形成能判定用キット。
【請求項４】
体性幹細胞又は軟骨細胞における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、請求項１に記載の表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質を含む、間葉系幹細胞又は軟骨細胞の、骨組織又は軟骨組織の形成能の判定方法。
【請求項５】
前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、請求項２に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質を更に含む、請求項４に記載の間葉系幹細胞又は軟骨細胞の、骨組織又は軟骨組織の形成能の判定方法。
【請求項６】
前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質と、前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質とを含み、
間葉系幹細胞又は軟骨細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量が、対照細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量よりも高い場合に、前記間葉系幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織の形成能が高いと判定する、請求項５に記載の判定方法。
【請求項７】
前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質と、前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質とを含み、間葉系幹細胞又は軟骨細胞における前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞における前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも高く、かつ、間葉系幹細胞又は軟骨細胞における、前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞における前記遺伝子又は前記タンパク質の発現量よりも低い場合に、前記間葉系幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織の形成能が高いと判定する、請求項５に記載の判定方法。
【請求項８】
前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の組み合わせを含み、
間葉系幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも高く、かつ、間葉系幹細胞又は軟骨細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも低い場合に、前記間葉系幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織の形成能が高いと判定する、請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の組み合わせであり、
間葉系幹細胞又は軟骨細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比が、対照細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比よりも大きいか、又は
間葉系幹細胞又は軟骨細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量の比が、対照細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量の比よりも大きい場合に、前記間葉系幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織の形成能が高いと判定する、請求項５に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー及びその使用に関する。より詳細には、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー、分化能判定用キット、分化能の判定方法、及び、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体性幹細胞又は軟骨細胞を骨組織又は軟骨組織に分化させ、再生医療に応用することが検討されている。また、幹細胞であることを示すマーカーや、幹細胞が骨組織や軟骨組織等に分化したことを示すマーカー等が見出されている。例えば、特許文献１には、骨髄細胞を培養して間葉系幹細胞を経て骨芽細胞へと分化させる一連の工程をモニタリングするために使用される、遺伝子マーカー及び遺伝子の組み合わせからなる、細胞検出用の遺伝子マーカーが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５２４３０２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能の指標となる有用なマーカーは知られていない。実施例において後述するように、発明者らは、幹細胞の状態によって骨組織又は軟骨組織への分化能に差があることを見出した。幹細胞を再生医療に応用するためには、分化能の高い幹細胞を用いることが効果的な場合がある。そこで、本発明は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の態様を含む。
（１）下記表１に記載された遺伝子又は下記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質を含む、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー。
【表１】
0006719114.tif 000002
（２）下記表２及び下記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は下記表２及び下記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質を更に含む、（１）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー。
【表２】
0006719114.tif 000003
【表３】
0006719114.tif 000004
（３）Ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３５，ｍｅｍｂｅｒ  Ｆ２（ＳＬＣ３５Ｆ２）遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質、及びＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  １１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の組み合わせを含む、（２）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー。
（４）（１）に記載の表１に記載された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、前記表１に記載された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キット。
（５）（２）に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を更に備える、（４）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キット。
（６）ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、及びＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、（５）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キット。
（７）体性幹細胞又は軟骨細胞における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、（１）に記載の表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質を含む、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能の判定方法。
（８）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、（２）に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質を更に含む、（７）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能の判定方法。
（９）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質と、前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質とを含み、体性幹細胞又は軟骨細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量が、対照細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量よりも高い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（８）に記載の判定方法。
（１０）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質と、前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質とを含み、体性幹細胞又は軟骨細胞における前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞における前記表１に記載された遺伝子又は前記表１に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも高く、かつ、体性幹細胞又は軟骨細胞における、前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞における前記遺伝子又は前記タンパク質の発現量よりも低い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（８）に記載の判定方法。
（１１）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の組み合わせを含み、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも高く、かつ、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも低い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（１０）に記載の判定方法。
（１２）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の組み合わせであり、体性幹細胞又は軟骨細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比が、対照細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比よりも大きいか、又は体性幹細胞又は軟骨細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量の比が、対照細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量の比よりも大きい場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（８）に記載の判定方法。
（１３）骨組織又は軟骨組織への分化能の高い体性幹細胞又は軟骨細胞と、骨組織又は軟骨組織への分化能の低い体性幹細胞又は軟骨細胞とにおける、遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、骨組織又は軟骨組織への分化能の高い体性幹細胞又は軟骨細胞と、骨組織又は軟骨組織への分化能の低い体性幹細胞又は軟骨細胞とで、発現量に差がある遺伝子又はタンパク質が、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーであると判断する工程と、を備える、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーの製造方法。
【０００６】
（Ａ１）（２）に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質からなる、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー。
（Ａ２）Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ  １１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質からなる、（Ａ１）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー。
（Ａ３）（２）に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キット。
（Ａ４）ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質、を備える、（Ａ３）に記載の体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キット。
（Ａ５）体性幹細胞又は軟骨細胞における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、（２）に記載の表２及び表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表２及び前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質である、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能の判定方法。
（Ａ６）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表２に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質であり、体性幹細胞又は軟骨細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量が、対照細胞における前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質の発現量よりも高い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（Ａ５）に記載の判定方法。
（Ａ７）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は前記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質であり、体性幹細胞又は軟骨細胞における前記遺伝子又は前記タンパク質の発現量が、対照細胞における前記遺伝子又は前記タンパク質の発現量よりも低い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（Ａ５）に記載の判定方法。
（Ａ８）前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質であり、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量よりも低い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定する、（Ａ７）に記載の判定方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】（ａ）は、実験例１で測定したＹｕｂ６２２細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例１で骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ６２２細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図２】（ａ）は、実験例１で測定したｈＭＳＣ細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例１で骨組織への分化誘導を行ったｈＭＳＣ細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図３】（ａ）は、実験例１で測定したＢＭ−ＡＴ細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例１で骨組織への分化誘導を行ったＢＭ−ＡＴ細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図４】（ａ）は、実験例１で測定したＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例１で骨組織への分化誘導を行ったＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図５】（ａ）は、実験例２で継代数７（Ｐ７）及び継代数９（Ｐ９）のＹｕｂ６２１ｃ細胞を軟骨組織に分化誘導した試料の、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）及びアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。（ｂ）は、実験例２で継代数５（Ｐ５）及び継代数２２（Ｐ２２）のＹｕｂ６２５細胞を軟骨組織に分化誘導した試料の、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）及びアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【図６Ａ】実験例４でＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】実験例４でＲＢＰ１遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｃ】実験例４でＡＭＰＨ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｄ】実験例４でＥＦＮＢ３遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｅ】実験例４でＮＴＮＧ１遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｆ】実験例４でＮＲＧＮ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｇ】実験例４でＢＡＡＬＣ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｈ】実験例４でＴＭＳＢ１５Ａ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｉ】実験例４でＧＡＬＮＴ１４遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｊ】実験例４でＳＧＯＬ１遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｋ】実験例４でＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｌ】実験例４でＭＤＦＩ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｍ】実験例４でＨＩＳＴ１Ｈ４Ｌ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｎ】実験例４でＣＯＬＥＣ１２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｏ】実験例４でＧＦＲＡ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｐ】実験例４でＫＣＮＪ８遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｑ】実験例４でＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｒ】実験例４でＳＬＣ４３Ａ３遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図６Ｓ】実験例４でＳＬＣ７Ａ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ａ】実験例４でＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】実験例４でＩＧＦＢＰ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｃ】実験例４でＥＬＮ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｄ】実験例４でＡＣＡＮ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｅ】実験例４でＣＲＹＡＢ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｆ】実験例４でＫＲＴ１６Ｐ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｇ】実験例４でＫＲＴ１６Ｐ６遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図７Ｈ】実験例４でＫＲＴ１４遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図８Ａ】実験例５でＹｕｂ６２２細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図８Ｂ】実験例５でｈＭＳＣ細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図８Ｃ】実験例５でＢＭ−ＡＴ細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図８Ｄ】実験例５でＹｕｂ６２１ｃ細胞及びＹｕｂ６２５細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図９】（ａ）は、実験例６で測定したＹｕｂ２５０５細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例６で骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ２５０５細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図１０】軟骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ２５０５細胞のアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【図１１】（ａ）は、実験例６で測定したＵＤＥ−ＢＭ細胞の増殖曲線である。（ｂ）は、実験例６で骨組織への分化誘導を行ったＵＤＥ−ＢＭ細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。
【図１２】軟骨組織への分化誘導を行ったＵＤＥ−ＢＭ細胞のアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【図１３Ａ】実験例７でＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】実験例７でＲＢＰ１遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｃ】実験例７でＡＭＰＨ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｄ】実験例７でＥＦＮＢ３遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｅ】実験例７でＮＴＮＧ１遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｆ】実験例７でＢＡＡＬＣ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｇ】実験例７でＴＭＳＢ１５Ａ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｈ】実験例７でＧＡＬＮＴ１４遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｉ】実験例７でＭＤＦＩ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｊ】実験例７でＧＦＲＡ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｋ】実験例７でＰＴＧＥＲ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｌ】実験例７でＳＬＣ４３Ａ３遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１３Ｍ】実験例７でＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ａ】実験例８でＭＤＦＩ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ｂ】実験例８でＩＧＦＢＰ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ｃ】実験例８でＥＬＮ遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ｄ】実験例８でＫＲＴ１６Ｐ２遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ｅ】実験例８でＫＲＴ１６Ｐ６遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１４Ｆ】実験例８でＫＲＴ１４遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】実験例９でＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１５Ｂ】実験例９でＹｕｂ２５０５細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１５Ｃ】実験例９でＵＤＥ−ＢＭ細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ａ】実験例１０でＹｕｂ６２２細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】実験例１０でｈＭＳＣ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｃ】実験例１０でＢＭ−ＡＴ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｄ】実験例１０でＹｕｂ６２１ｃ細胞及びＹｕｂ６２５細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｅ】実験例１０でＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｆ】実験例１０でＹｕｂ２５０５細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１６Ｇ】実験例１０でＵＤＥ−ＢＭ細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した結果を示すグラフである。
【図１７Ａ】実験例１１において、さまざまな細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比を測定した結果を示すグラフである。
【図１７Ｂ】実験例１１において、さまざまな細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比を測定した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカー］
１実施形態において、本発明は、上記表１に記載されたＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質（以下、「ＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質」という場合があり、他の遺伝子にコードされたタンパク質についても同様である。）を含む、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーを提供する。
【００１０】
実施例において後述するように、発明者らは、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い間葉系幹細胞が、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子を高発現していることを見出した。また、骨組織又は軟骨組織への分化能とＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量との間には正の相関が認められた。すなわち、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量が高い細胞ほど、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い傾向が認められた。
【００１１】
したがって、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質は、対象細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして利用することができる。ここで、対象細胞とは、骨組織又は軟骨組織への分化能を有する細胞であり、体性幹細胞又は軟骨細胞が挙げられる。すなわち、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量が高い体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い。
【００１２】
ここで、体性幹細胞としては、骨組織又は軟骨組織への分化能を有する幹細胞が挙げられる。より具体的には、脂肪、骨髄、臍帯血、臍帯、羊膜、胎盤、子宮内膜、滑膜、腱、骨、軟骨、歯髄、歯根膜等の間葉由来の幹細胞（すなわち間葉系幹細胞）及び前駆細胞、並びに、血管内皮、皮膚等の間葉以外の組織由来の幹細胞及び前駆細胞が挙げられる。また、軟骨細胞は、軟骨組織から回収したものであってもよい。体性幹細胞又は軟骨細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等から分化誘導させたものであってもよい。
【００１３】
実施例において後述するように、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとしては、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の他にも、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質を利用することができる。
【００１４】
下記表４に、上記表１〜３に記載された遺伝子シンボルにより特定される遺伝子から転写される代表的な転写物のアクセッション番号を示す。表４に示すアクセッション番号で特定される塩基配列は、全米バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で公開された２０１５年１２月２日付けの情報に基づく。
【００１５】
本実施形態のマーカーは、表４に示すアクセッション番号で特定される転写物又はその翻訳物に限定されず、表４に示す遺伝子シンボルにより特定される遺伝子から転写されるスプライシングバリアント若しくは転写開始点の違いによるバリアント等のバリアント又はその翻訳物であってもよい。
【００１６】
また、本実施形態のマーカー遺伝子の塩基配列は、一塩基多型の存在等により変異を含み得る。このため、本実施形態のマーカー遺伝子の塩基配列は、下記表４に示すアクセッション番号で特定される塩基配列と、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有していれば、当該アクセッション番号で特定される塩基配列とは異なる塩基配列を有していてもよい。これは、本実施形態のマーカー遺伝子が下記表４に示すアクセッション番号で特定される塩基配列のスプライシングバリアント若しくは転写開始点の違いによるバリアント等のバリアントである場合についても同様である。
【００１７】
【表４】
0006719114.tif 000005
【００１８】
上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子、又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質は、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と組み合わせて、あるいはＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質とは独立に、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして利用することができる。
【００１９】
体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして、上記の遺伝子又はタンパク質のいずれか１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
実施例において後述するように、上記表１及び上記表２に記載された遺伝子、又は上記表１及び上記表２に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と正の相関を示す傾向にある。すなわち、これらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が高い体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い。
【００２１】
一方、上記表３に記載された遺伝子、又は上記表３に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と負の相関を示す傾向にある。すなわち、これらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が低い体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い。
【００２２】
実施例において後述するように、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質との組み合わせを用いると、より高い精度で体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を評価することができる傾向にある。
【００２３】
したがって、本実施形態のマーカーは、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質との組み合わせであってもよい。
【００２４】
［分化能判定用キット］
１実施形態において、本発明は、上記表１に記載されたＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質に対する特異的結合物質、を備える、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能判定用キットを提供する。
【００２５】
（プライマーセット）
プライマーセットとしては、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるものであれば特に限定されない。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーのセット等が挙げられる。
【００２６】
（プローブ）
プローブとしては、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば特に限定されない。プローブは、担体上に固定されてＤＮＡマイクロアレイ等を構成していてもよい。
【００２７】
（特異的結合物質）
特異的結合物質としては、例えば、抗体、抗体断片、アプタマー等が挙げられる。抗体は、例えば、マウス等の動物に対象タンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫することにより作製してもよい。あるいは、ファージライブラリー等の抗体ライブラリーのスクリーニング等により作製することもできる。また、抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ等が挙げられる。上記の抗体又は抗体断片は、ポリクローナルであってもよく、モノクローナルであってもよい。
【００２８】
アプタマーとは、標識物質に対する特異的結合能を有する物質である。アプタマーとしては、核酸アプタマー、ペプチドアプタマー等が挙げられる。対象タンパク質に特異的結合能を有する核酸アプタマーは、例えば、systematic evolution of ligand by exponential enrichment（ＳＥＬＥＸ）法等により選別することができる。また、対象タンパク質に対する特異的結合能を有するペプチドアプタマーは、例えば酵母を用いたＴｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により選別することができる。
【００２９】
特異的結合物質は、対象タンパク質に特異的に結合することができれば特に制限されず、市販のものであってもよい。また、特異的結合物質は、担体上に固定されてプロテインチップ等を構成していてもよい。
【００３０】
本実施形態の分化能判定用キットを用いることにより、対象の体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量を定性的に又は定量的に測定することができる。体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量が、対照細胞と比較して高い場合、当該体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。
【００３１】
ここで、対照細胞としては、例えば骨組織又は軟骨組織への分化能が低いことが予め確認されている間葉系幹細胞等を利用することができる。より具体的には、例えば継代数が高い間葉系幹細胞が挙げられる。
【００３２】
１実施形態において、分化能判定用キットは、上記表１に記載されたＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質に対する特異的結合物質と、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質とを備えるものであってもよい。
【００３３】
あるいは、本実施形態の分化能判定用キットは、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ、又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質に対する特異的結合物質を備えていてもよい。すなわち、本実施形態の分化能判定用キットは、ＳＬＣ３５Ｆ２以外のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を測定するためのものであってもよい。
【００３４】
本実施形態の分化能判定用キットは、上記表１〜３に記載された遺伝子又は上記表１〜３に記載された遺伝子にコードされたタンパク質のいずれか１種の発現量を単独で測定するものであってもよく、２種以上の発現量を組み合わせて測定するものであってもよい。
【００３５】
実施例において後述するように、上記表１及び上記表２に記載された遺伝子又は上記表１及び上記表２に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と正の相関を示す傾向にある。すなわち、本実施形態の分化能判定用キットにより、これらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が、対照細胞と比較して高いことが確認された体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００３６】
一方、上記表３に記載された遺伝子又は上記表３に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と負の相関を示す傾向にある。すなわち、本実施形態の分化能判定用キットにより、これらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が、対照細胞と比較して低いことが確認された体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００３７】
実施例において後述するように、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質との組み合わせを用いると、より高い精度で体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を評価することができる傾向にある。
【００３８】
したがって、本実施形態の分化能判定用キットは、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質に対する特異的結合物質と、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡを増幅するためのプライマーセット、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブ又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質に対する特異的結合物質とを備えるものであってもよい。
【００３９】
［分化能の判定方法］
１実施形態において、本発明は、体性幹細胞又は軟骨細胞における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、上記表１に記載されたＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質を含む、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能の判定方法を提供する。
【００４０】
ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量の定量は、例えば上述した分化能判定用キットを用いることにより行うことができる。より具体的には、例えば、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡを増幅することができるプライマーセットを用いた定量的ＰＣＲ、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブが固定されたマイクロアレイを用いた遺伝子発現解析、ＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質に対する抗体を用いた免疫染色等により、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量を定量することができる。
【００４１】
上述したように、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量が、対照細胞と比較して高い場合、当該体性幹細胞又は軟骨細胞は、骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００４２】
１実施形態において、分化能の判定方法は、体性幹細胞又は軟骨細胞における、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質の発現量を定量する工程を備え、前記マーカー遺伝子又は前記マーカータンパク質が、上記表１に記載されたＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質との組み合わせであってもよい。
【００４３】
あるいは、本実施形態の分化能の判定方法において、発現量を定量するマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子又は上記表２及び上記表３に記載された遺伝子からなる群より選択された遺伝子にコードされたタンパク質であってもよい。すなわち、発現量を定量するマーカー遺伝子又はマーカータンパク質がＳＬＣ３５Ｆ２以外のマーカー遺伝子又はマーカータンパク質であってもよい。
【００４４】
本実施形態の分化能の判定方法において、発現量を定量するマーカー遺伝子又はマーカータンパク質は、上記表１〜３に記載された遺伝子又は上記表１〜３に記載された遺伝子にコードされたタンパク質のいずれか１種単独であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。
【００４５】
上述したように、上記表１及び上記表２に記載された遺伝子又は上記表１及び上記表２に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と正の相関を示す傾向にある。すなわち、本実施形態の分化能判定方法において、対象の体性幹細胞又は軟骨細胞におけるこれらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が、対照細胞における当該遺伝子又はタンパク質の発現量よりも高い場合には、対象の体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００４６】
また、上述したように、上記表３に記載された遺伝子又は上記表３に記載された遺伝子にコードされたタンパク質の発現量は、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能と負の相関を示す傾向にある。すなわち、本実施形態の分化能判定方法において、対象の体性幹細胞又は軟骨細胞におけるこれらのいずれかの遺伝子又はタンパク質の発現量が、対照細胞における当該遺伝子又はタンパク質の発現量よりも低い場合には、対象の体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００４７】
実施例において後述するように、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーとして、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質と、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質との組み合わせを用いると、より高い精度で体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を評価することができる傾向にある。
【００４８】
したがって、本実施形態の分化能の判定方法は、体性幹細胞又は軟骨細胞における、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量を定量する工程を備えるものであってもよい。
【００４９】
そして、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量が、対照細胞におけるＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量よりも高く、かつ、体性幹細胞又は軟骨細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量が、対照細胞におけるＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量よりも低い場合に、前記体性幹細胞又は前記軟骨細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定するものであってもよい。
【００５０】
これにより、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能をより高い精度で判定することができる。
【００５１】
あるいは、実施例において後述するように、本実施形態の分化能の判定方法は、体性幹細胞又は軟骨細胞における、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量、及び、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量を定量する工程を備えており、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量とＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比、又は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量とＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量の比に基づいて、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を判定するものであってもよい。
【００５２】
そして、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比、又は、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量の比が、対照細胞における、それらの比と比較して大きい場合に、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定するものであってもよい。なお、対照細胞としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００５３】
このような方法によっても、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能をより高い精度で判定することができる。
【００５４】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はタンパク質の発現量の比に基づいて分化能を判定する場合、より具体的には、下記式（Ｆ２）又は下記式（Ｆ３）に基づいて算出される比が、例えば０．５以上、好ましくは１以上、より好ましくは１．５以上、更に好ましくは、２以上であれば、対象細胞は骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することができる。
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比＝（ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量）÷（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量）…（Ｆ２）
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量の比＝（ＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の発現量）÷（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質の発現量）…（Ｆ３）
【００５５】
ここで、遺伝子の発現量としては、例えばＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子から転写されたｍＲＮＡ又はＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子から転写されたｍＲＮＡのコピー数を測定し、当該コピー数を発現量として判定してもよい。あるいは、各遺伝子について、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子等のハウスキーピング遺伝子の発現量を基準とした発現量の相対値をそれぞれ測定し、測定された相対値を発現量として判定してもよい。また、タンパク質の発現量としては、例えばＴＮＦＲＳＦ１１Ｂタンパク質又はＳＬＣ３５Ｆ２タンパク質の分子数を算出し、当該分子数を発現量として判定してもよい。
【００５６】
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子又はタンパク質と、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はタンパク質との比を算出する場合においては、いずれの遺伝子を基準としてもよい。例えば、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子又はタンパク質を基準とした場合には、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量に対するＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量の比、又は、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子にコードされたタンパク質の発現量に対するＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子にコードされたタンパク質の発現量の比が、対照細胞における、それらの比と比較して小さい場合に、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能が高いと判定することになる。
【００５７】
［体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーの製造方法］
１実施形態において、本発明は、骨組織又は軟骨組織への分化能の高い体性幹細胞又は軟骨細胞と、骨組織又は軟骨組織への分化能の低い体性幹細胞又は軟骨細胞とにおける、遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する工程と、骨組織又は軟骨組織への分化能の高い体性幹細胞又は軟骨細胞と、骨組織又は軟骨組織への分化能の低い体性幹細胞又は軟骨細胞とで、発現量に差がある遺伝子又はタンパク質が、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーであると判断する工程と、を備える、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーの製造方法を提供する。
【００５８】
実施例において後述するように、本実施形態の方法により、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーを得ることが可能である。本実施形態の「マーカーの製造方法」は、「マーカーのスクリーニング方法」、「マーカー取得方法」、「マーカーであるか否かの判定方法」等といい換えることもできる。
【００５９】
本実施形態のマーカーの製造方法において、遺伝子又はタンパク質の発現量の測定は、例えばＤＮＡマイクロアレイ、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）等により網羅的に行うと効率的である。
【００６０】
また、骨組織又は軟骨組織への分化能の高い体性幹細胞又は軟骨細胞としては、例えば継代数の低い体性幹細胞又は軟骨細胞を用いてもよい。また、骨組織又は軟骨組織への分化能の低い体性幹細胞又は軟骨細胞としては、例えば継代数の高い体性幹細胞又は軟骨細胞を用いてもよい。骨組織又は軟骨組織への分化能の高さは、実際に体性幹細胞又は軟骨細胞を骨組織又は軟骨組織に分化誘導し、その分化能を確認して決定することが好ましい。
【実施例】
【００６１】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
［実験例１］
（間葉系幹細胞の継代数と骨組織への分化能との関連性の検討）
間葉系幹細胞を継代し、経時的に骨組織に分化誘導し、各継代時点における骨組織への分化能を検討した。間葉系幹細胞としては、多指症指骨髄由来間葉系幹細胞であるＹｕｂ６２２（理研バイオリソースセンター）、成人骨髄由来間葉系幹細胞であるｈＭＳＣ（Ｌｏｎｚａ社）、成人骨髄由来間葉系幹細胞であるＢｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；Ｎｏｒｍａｌ，Ｈｕｍａｎ（ＢＭ−ＡＴ）（ＡＴＣＣ）及び成人脂肪由来間葉系幹細胞であるＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いた。
【００６３】
各細胞の継代時に、下記式（Ｆ１）により計算される細胞の分裂回数（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ、ＰＤＬ）を積算することにより、積算ＰＤＬを算出した。
ＰＤＬ＝ｌｏｇ１０（培養終了時の細胞数／培養開始時の細胞数）×３．３３  …（Ｆ１）
【００６４】
また、各継代時に一部の細胞を新しいディッシュに移し、市販の培地（型式「ＰＴ−３００２」、商品名「ｈＭＳＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ−ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ」、Ｌｏｎｚａ社）を用いて２週間（Ｙｕｂ６２２、ｈＭＳＣ、ＢＭ−ＡＴ）又は４週間（ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ）培養することにより、骨組織に分化誘導した。また対照として、分化誘導を行わないで同じ期間培養した細胞を用意した。
【００６５】
続いて、骨組織への分化誘導後の細胞をアリザリンレッド染色することにより骨組織に分化誘導したか否かを確認した。なお、細胞が骨組織に分化していた場合には、赤橙色に染色される。
【００６６】
図１〜４は、実験結果を示すグラフ及び写真である。図１（ａ）は、Ｙｕｂ６２２細胞の増殖曲線である。グラフ中の数字は、継代数を示す。図１（ｂ）は、骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ６２２細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。図中、「骨分化誘導（＋）」は、骨組織への分化誘導を行った結果を示し、「骨分化誘導（−）」は、対照細胞の結果を示す。また、「Ｐ６」は６回継代した細胞を骨組織に分化誘導したことを意味し、「Ｐ７」は７回継代した細胞を骨組織に分化誘導したことを意味し、以下同様である。
【００６７】
また、図２（ａ）及び（ｂ）は、細胞としてｈＭＳＣを用いた以外は図１（ａ）及び（ｂ）と同様の実験を行った結果を示す。また、図３（ａ）及び（ｂ）は、細胞としてＢＭ−ＡＴを用いた以外は、図１（ａ）及び（ｂ）と同様の実験を行った結果を示す。また、図４（ａ）及び（ｂ）は、細胞としてＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣを用いた以外は、図１（ａ）及び（ｂ）と同様の実験を行った結果を示す。図中、「ＡＤＳＣ」はＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞を用いた結果であることを示す。
【００６８】
その結果、いずれの間葉系幹細胞においても、継代数が少ない程骨組織への分化能が高く、継代数が増加するにつれて骨組織への分化能が低下する傾向が認められた。
【００６９】
［実験例２］
（間葉系幹細胞の継代数と軟骨組織への分化能との関連性の検討）
間葉系幹細胞を継代して軟骨組織に分化誘導し、継代数と軟骨組織への分化能との関連性を検討した。間葉系幹細胞としては、多指症指骨髄由来間葉系幹細胞であるＹｕｂ６２１ｃ（理研バイオリソースセンター）及びＹｕｂ６２５（理研バイオリソースセンター）を用いた。
【００７０】
継代数７及び９のＹｕｂ６２１ｃ細胞、並びに継代数５及び２２のＹｕｂ６２５細胞を、市販の培地キット（型式「ＰＴ−３００３」、商品名「ｈＭＳＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ−ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ」、Ｌｏｎｚａ社）にＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β３（ＴＧＦβ３）とｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２（ＢＭＰ２）を添加した培地を用いて、２ｘ１０５細胞を１ペレットとして、２８〜２９日間ペレット培養することにより、軟骨組織に分化誘導した。
【００７１】
続いて、分化誘導後の各細胞隗をホルマリン固定し、パラフィン切片を作製した。続いて、作製した各切片をヘマトキシリン−エオシン染色及びアルシアンブルー染色した。なお、軟骨組織はアルシアンブルー染色により染色される。
【００７２】
図５（ａ）及び（ｂ）は、実験結果を示す写真である。図５（ａ）は、継代数７（Ｐ７）及び継代数９（Ｐ９）のＹｕｂ６２１ｃ細胞を軟骨組織に分化誘導した試料の、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）及びアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【００７３】
また、図５（ｂ）は、継代数５（Ｐ５）及び継代数２２（Ｐ２２）のＹｕｂ６２５細胞を軟骨組織に分化誘導した試料の、ヘマトキシリン−エオシン染色（ＨＥ）及びアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【００７４】
その結果、継代数７及び９のＹｕｂ６２１ｃ細胞並びに継代数５のＹｕｂ６２５細胞は、軟骨組織に分化したことが確認された。一方、継代数２２のＹｕｂ６２５細胞では、軟骨組織が形成されていないことが明らかとなった。
【００７５】
この結果は、継代数が少ない間葉系幹細胞は軟骨組織への分化能が高いが、継代数が増加すると軟骨組織への分化能が低下することを示す。
【００７６】
［実験例３］
（マイクロアレイ解析１）
骨組織への分化能が高いＹｕｂ６２２細胞及びｈＭＳＣ細胞、並びに骨組織への分化能が低いＹｕｂ６２２細胞及びｈＭＳＣ細胞から全ＲＮＡを抽出してマイクロアレイ解析を行い、骨組織への分化能と相関がある遺伝子を抽出した。骨組織への分化能が高い細胞としては、継代数が５〜９のＹｕｂ６２２細胞を使用した。また、骨組織への分化能が中程度の細胞としては、継代数が１０のＹｕｂ６２２細胞及び継代数が５〜８，１０のｈＭＳＣ細胞を使用した。また、骨組織への分化能が低い細胞としては、継代数が１１〜１６のＹｕｂ６２２細胞及び継代数が９，１１〜１６のｈＭＳＣ細胞を使用した。その結果、骨組織への分化能と正の相関がある遺伝子として、上記表１及び表２に記載された遺伝子が見出された。
【００７７】
また、骨組織への分化能と負の相関がある遺伝子として、上記表３に記載された遺伝子が見出された。
【００７８】
［実験例４］
（マイクロアレイ解析２）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、実験例３で抽出した各遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した。
【００７９】
間葉系幹細胞としては、上述した、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞、ＢＭ−ＡＴ細胞、Ｙｕｂ６２２細胞及びｈＭＳＣ細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には、市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、マイクロアレイには市販のもの（型式「Ｇ４８５１Ａ」、商品名「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８×６０Ｋ」、アジレント・テクノロジー社）を使用した。
【００８０】
図６Ａ〜図６Ｓ及び図７Ａ〜図７Ｈは、マイクロアレイ解析の結果を示すグラフである。図中、「ＡＤＳＣ」はＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞を用いた結果であることを示す。また、「Ｐ４」は継代数４の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【００８１】
その結果、上記表１及び表２に記載された遺伝子は、骨組織への分化能が高い細胞で発現量が高い傾向が確認された。
【００８２】
また、上記表３に記載された遺伝子は、骨組織への分化能が高い細胞で発現量が低い傾向が確認された。
【００８３】
［実験例５］
（リアルタイムＰＣＲ解析１）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した。
【００８４】
間葉系幹細胞としては、上述した、Ｙｕｂ６２２細胞、ｈＭＳＣ細胞、ＢＭ−ＡＴ細胞、Ｙｕｂ６２１ｃ細胞及びＹｕｂ６２５細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、リアルタイムＰＣＲ反応は、市販のキット（型式「ＲＲ０９６Ａ」、商品名「Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ」、タカラバイオ社）及びリアルタイムＰＣＲ装置（商品名「ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム」、アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。
【００８５】
また、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号１に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。また、対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のリアルタイムＰＣＲを行い、測定されたＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に基づいてＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量を補正した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号３に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。
【００８６】
図８Ａ〜図８Ｄは、リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。図８ＡはＹｕｂ６２２細胞の解析結果であり、図８ＢはｈＭＳＣ細胞の解析結果であり、図８ＣはＢＭ−ＡＴ細胞の解析結果であり、図８ＤはＹｕｂ６２１ｃ細胞及びＹｕｂ６２５細胞の解析結果である。図中、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ６」は継代数６の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【００８７】
その結果、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子は、骨組織及び軟骨組織への分化能が高い細胞で発現量が高く、骨組織及び軟骨組織への分化能が低い細胞で発現量が低い傾向が確認された。
【００８８】
［実験例６］
（間葉系幹細胞の継代数と骨組織及び軟骨組織への分化能との関連性の検討）
間葉系幹細胞を継代し、継時的に骨組織及び軟骨組織に分化誘導し、各継代時点における骨組織及び軟骨組織への分化能を検討した。間葉系幹細胞としては、多指症指軟骨由来間葉系幹細胞Ｙｕｂ２５０５（成育バイオリソース提供）及び多腕症上腕骨髄由来間葉系幹細胞であるＵＤＥ−ＢＭ（成育バイオリソース提供）を用いた。
【００８９】
各細胞の継代時に、上記式（Ｆ１）により計算される細胞の分裂回数（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ、ＰＤＬ）を積算することにより、積算ＰＤＬを算出した。
【００９０】
また、各継代時に一部の細胞を新しいディッシュに移し、市販の培地（型式「ＰＴ−３００２」、商品名「ｈＭＳＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ−ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ」、Ｌｏｎｚａ社）を用いて、２週間培養することにより、骨組織に分化誘導した。また対照として、分化誘導を行わないで同じ期間培養した細胞を用意した。
【００９１】
続いて、骨組織への分化誘導後の細胞をアリザリンレッド染色することにより骨組織に分化誘導されたか否かを確認した。なお、細胞が骨組織に分化していた場合には、赤橙色に染色される。
【００９２】
また、各継代時に一部の細胞を、市販の培地キット（型式「ＰＴ−３００３」、商品名「ｈＭＳＣ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ−ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ」、Ｌｏｎｚａ社）にＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β３（ＴＧＦｂｅｔａ３）とｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ２（ＢＭＰ２）を添加した培地を用いて、２．５×１０５細胞を１ペレットとして、２週間ペレット培養することにより、軟骨組織に分化誘導した。
【００９３】
続いて、分化誘導後の各細胞隗をホルマリン固定し、パラフィン切片を作製した。続いて、作製した各切片をアルシアンブルー染色した。なお、軟骨組織はアルシアンブルー染色により染色される。
【００９４】
図９（ａ）及び（ｂ）、図１０、図１１（ａ）及び（ｂ）、図１２は、実験結果を示すグラフ及び写真である。図９（ａ）は、Ｙｕｂ２５０５細胞の増殖曲線である。グラフ中の数字は、継代数を示す。図９（ｂ）は、骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ２５０５細胞のアリザリンレッド染色の結果を示す写真である。図中、「骨分化誘導（＋）」は、骨組織への分化誘導を行った結果を示し、「骨分化誘導（−）」は、対照細胞の結果を示す。また、「Ｐ６」は６回継代した細胞を骨組織に分化誘導したことを意味し、「Ｐ７」は７回継代した細胞を骨組織に分化誘導したことを意味し、以下同様である。図１０は、軟骨組織への分化誘導を行ったＹｕｂ２５０５細胞のアルシアンブルー染色（ＡＢ）の結果を示す写真である。
【００９５】
また、図１１（ａ）及び（ｂ）、図１２は、細胞としてＵＤＥ−ＢＭを用いた点以外は図９（ａ）及び（ｂ）、図１０と同様の実験を行った結果を示す。
【００９６】
その結果、いずれの間葉系幹細胞においても、継代数が少ない程、骨組織及び軟骨組織への分化能が高く、継代数が増加するにつれて骨組織及び軟骨組織への分化能が低下する傾向が認められた。この結果は、継代数が少ない間葉系幹細胞は軟骨組織への分化能が高いが、継代数が増加すると軟骨組織への分化能が低下することを更に支持するものである。
【００９７】
［実験例７］
（マイクロアレイ解析３）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、実験例３で見出した、上記表１〜３に記載した各遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した。
【００９８】
間葉系幹細胞としては、上述した、Ｙｕｂ２５０５細胞、ＵＤＥ−ＢＭ細胞及びＹｕｂ６２２細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には、市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、マイクロアレイには市販のもの（型式「Ｇ４８５１Ａ」、商品名「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８×６０Ｋ」、アジレント・テクノロジー社）を使用した。
【００９９】
図１３Ａ〜Ｍは、マイクロアレイ解析の結果を示すグラフである。図中、「Ｐ４」は継代数４の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【０１００】
その結果、上記表１及び表２に記載された遺伝子は、骨組織及び軟骨組織への分化能が高い細胞で発現量が高い傾向が確認された。
【０１０１】
また、上記表３に記載された遺伝子は、骨組織への分化能が高い細胞で発現量が低い傾向が確認された。
【０１０２】
［実験例８］
（マイクロアレイ解析４）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、実験例３で見出した、上記表１〜３に記載した各遺伝子の発現量をマイクロアレイ解析により検討した。
【０１０３】
間葉系幹細胞としては、上述した、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞、ＢＭ−ＡＴ細胞及びＹｕｂ６２２細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には、市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、マイクロアレイには市販のもの（型式「Ｇ４８５１Ａ」、商品名「ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｈｕｍａｎ  ＧＥ  ８×６０Ｋ」、アジレント・テクノロジー社）を使用した。
【０１０４】
図１４Ａ〜Ｆは、マイクロアレイ解析の結果を示すグラフである。図中、「Ｐ４」は継代数４の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【０１０５】
その結果、上記表１及び表２に記載された遺伝子は、骨組織および軟骨組織への分化能が高い細胞で発現量が高い傾向が確認された。
【０１０６】
また、上記表３に記載された遺伝子は、骨組織への分化能が高い細胞で発現量が低い傾向が確認された。
【０１０７】
［実験例９］
（リアルタイムＰＣＲ解析２）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した。
【０１０８】
間葉系幹細胞としては、上述した、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞、Ｙｕｂ２５０５細胞、及びＵＤＥ−ＢＭ細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、リアルタイムＰＣＲ反応は、市販のキット（型式「ＲＲ０９６Ａ」、商品名「Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ」、タカラバイオ社）及びリアルタイムＰＣＲ装置（商品名「ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム」、アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。
【０１０９】
また、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号１に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号２に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。また、対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のリアルタイムＰＣＲを行い、測定されたＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に基づいてＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量を補正した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号３に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。
【０１１０】
図１５Ａ〜Ｃは、リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。図１５ＡはＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞の解析結果であり、図１５ＢはＹｕｂ２５０５細胞の解析結果であり、図１５ＣはＵＤＥ−ＢＭ細胞の解析結果である。図中、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ６」は継代数６の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【０１１１】
その結果、ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子は、骨組織及び軟骨組織への分化能が高い細胞で発現量が高く、骨組織及び軟骨組織への分化能が低い細胞で発現量が低い傾向が確認された。
【０１１２】
［実験例１０］
（リアルタイムＰＣＲ解析３）
さまざまな継代数の間葉系幹細胞から全ＲＮＡを抽出し、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲ解析により検討した。
【０１１３】
間葉系幹細胞としては、上述した、Ｙｕｂ６２２細胞、ｈＭＳＣ細胞、ＢＭ−ＡＴ細胞、Ｙｕｂ６２１ｃ細胞、Ｙｕｂ６２５細胞、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞、Ｙｕｂ２５０５細胞、及びＵＤＥ−ＢＭ細胞を用いた。また、全ＲＮＡの抽出には市販のキット（型式「３１１−０２５０１」、商品名「Ｉｓｏｇｅｎ」、ニッポンジーン社）を使用した。また、リアルタイムＰＣＲ反応は、市販のキット（型式「ＲＲ０９６Ａ」、商品名「Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＰＬＵＳ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ」、タカラバイオ社）及びリアルタイムＰＣＲ装置（商品名「ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム」、アプライドバイオシステムズ社）を用いて行った。
【０１１４】
また、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号５に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号６に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。また、対照としてグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のリアルタイムＰＣＲを行い、測定されたＧＡＰＤＨ遺伝子の発現量に基づいてＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量を補正した。ＧＡＰＤＨ遺伝子のｃＤＮＡのＰＣＲは、配列番号３に示す塩基配列からなるセンスプライマー及び配列番号４に示す塩基配列からなるアンチセンスプライマーを用いて行った。
【０１１５】
図１６Ａ〜Ｇは、リアルタイムＰＣＲ解析の結果を示すグラフである。図１６ＡはＹｕｂ６２２細胞の解析結果であり、図１６ＢはｈＭＳＣ細胞の解析結果であり、図１６ＣはＢＭ−ＡＴ細胞の解析結果であり、図１６ＤはＹｕｂ６２１ｃ細胞及びＹｕｂ６２５細胞の解析結果であり、図１６ＥはＳｔｅｍＰｒｏ  ｈｕｍａｎ  ＡＤＳＣ細胞の解析結果であり、図１６ＦはＹｕｂ２５０５細胞の解析結果であり、図１６ＧはＵＤＥ−ＢＭ細胞の解析結果である。図中、「Ｐ５」は継代数５の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、「Ｐ６」は継代数６の細胞から抽出した全ＲＮＡの解析結果であることを示し、以下、同様である。
【０１１６】
その結果、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子は、骨組織及び軟骨組織への分化能が高い細胞で発現量が低く、骨組織及び軟骨組織への分化能が低い細胞で発現量が高い傾向が確認された。
【０１１７】
［実験例１１］
（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子及びＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比の検討）
実験例５、９、１０のリアルタイムＰＣＲにより解析した各細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量及びＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子発現量の比を算出し、骨組織又は軟骨組織への分化能との相関を検討した。
【０１１８】
具体的には、下記式（Ｆ２）に基づいて、各細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比を算出した。
ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比＝（ＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量）÷（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量）…（Ｆ２）
【０１１９】
図１７Ａ及び図１７Ｂは、各細胞における、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比を示すグラフである。また、図１７Ａ及び図１７Ｂには、各細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能も示す。図中、「＋＋」、「＋」、「＋／−」、「−」は骨組織又は軟骨組織への分化能の高さを示す。「＋＋」が最も分化能が高かったことを示し、「−」は分化能が認められなかったことを示す。また、「ＮＤ」は分化能を試験していないことを示す。
【０１２０】
その結果、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ遺伝子の発現量に対するＳＬＣ３５Ｆ２遺伝子の発現量の比が高い細胞ほど、骨組織又は軟骨組織への分化能が高い傾向にあることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明によれば、体性幹細胞又は軟骨細胞の骨組織又は軟骨組織への分化能を示すマーカーを提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
0006719114.tif 000015
【図６Ｃ】
0006719114.tif 000016
【図６Ｄ】
0006719114.tif 000017
【図６Ｅ】
0006719114.tif 000018
【図６Ｆ】
0006719114.tif 000019
【図６Ｇ】
0006719114.tif 000020
【図６Ｈ】
0006719114.tif 000021
【図６Ｉ】
0006719114.tif 000022
【図６Ｊ】
0006719114.tif 000023
【図６Ｋ】
0006719114.tif 000024
【図６Ｌ】
0006719114.tif 000025
【図６Ｍ】
0006719114.tif 000026
【図６Ｎ】
0006719114.tif 000027
【図６Ｏ】
0006719114.tif 000028
【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
0006719114.tif 000032
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
0006719114.tif 000039
【図７Ｈ】
0006719114.tif 000040
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0006719114.tif 000042
【図８Ｃ】
0006719114.tif 000043
【図８Ｄ】
0006719114.tif 000044
【図９】
0006719114.tif 000045
【図１０】
0006719114.tif 000046
【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
0006719114.tif 000050
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【配列表】
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