(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．１μｍ未満の細孔径を有するアガロース限外濾過膜複合体であって、複合体は多孔性支持膜上の一面のみにアガロース層を有する多孔性支持膜を含み、アガロース層は多孔性支持膜に１〜１５ミクロン浸透し、およびアガロース層は１から１００μｍの範囲の厚さを有し、アガロース層が、ＺｎＣｌ２をさらに含み、そうして標的生成物および／または不純物が細孔内に移行して細孔から出るアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項２】
アガロース層は多孔性支持膜の厚さの少なくとも一部に浸潤する請求項１に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項３】
複合体は剥離に対して耐性である請求項１に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項４】
アガロース層は１から２０μｍの厚さを有する請求項１に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項５】
多孔性支持膜は、織布または不織布ポリマー材料を含む請求項１に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項６】
織布または不織布ポリマー材料は、ポリエステル、ポリアミド、ポリオレフィン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリカプロラクタム、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）、ポリプロピレン、芳香族ポリマー、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテル−エーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ハロゲン化ポリマーおよびフッ素化ポリマーからなる群から選択される請求項５に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項７】
フッ素化ポリマーは、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）から選択される請求項６に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項８】
多孔性支持膜は２０μｍから５００μｍの範囲の平均厚さを有する請求項１に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項９】
アガロースが浸潤する多孔質支持膜の厚さの一部は少なくとも１から１５μｍである請求項２に記載のアガロース限外濾過膜複合体。
【請求項１０】
（ｉ）  ０．０１μｍから１０μｍの範囲の平均細孔径および２０μｍから５００μｍの範囲の平均厚さを有する多孔性支持膜を提供する工程、
（ｉｉ）アガロース溶液を提供する工程、および
（ｉｉｉ）アガロース溶液の層を多孔性支持膜上に流延する工程、および
（ｉｖ）アガロースで被覆された多孔性支持膜を、アガロース溶液のゲル化点未満の温度で水浴に浸漬する工程
を含み、
（ｉｉ）におけるアガロース溶液は、１から１２重量％の範囲の濃度のアガロースを含み、
（ｉｉ）におけるアガロース溶液は、１５重量％以下の濃度のＺｎＣｌ２をさらに含み、
（ｉｉ）におけるアガロース溶液は、０．０１重量％から１重量％の範囲の濃度の架橋剤を含み、
それにより０．１μｍ未満の平均細孔径を有するアガロース限外濾過膜を得る、アガロース限外濾過膜複合体を作製する方法。
【請求項１１】
多孔性支持膜は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカプロラクタム、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）、ポリエチレンテレフタレート、ポリエーテル−エーテルケトン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレンおよびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）からなる群から選択されるポリマーを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
多孔性支持膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷ−ＰＥ）、ポリカプロラクタム、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）、ポリスルホンおよびポリエーテルスルホンからなる群から選択されるポリマーを含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉｉ）におけるアガロース溶液は、１５重量％以下の濃度のＺｎＣｌ２、および架橋剤としてのジビニルスルホン（ＤＶＳ）を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉ）におけるアガロース溶液は、２０℃から９０℃の範囲の温度または４５℃から７５℃の範囲の温度に加熱される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉｉ）における多孔性支持膜は、２０から９０℃の範囲の温度または４５から７５℃の範囲の温度に加熱される請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｖ）において、アガロースで被覆された多孔性支持膜は、５から６０℃の範囲の温度または１０から４０℃の範囲の温度で水浴に浸漬される請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｉ）において、１００μｍから２００μｍの間の平均厚さおよび０．２μｍの平均細孔径を有する多孔性支持膜が提供される請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、出願日２０１５年８月１７日の米国仮特許出願第６２／２０５，８５９号および出願日２０１５年１２月１６日の米国仮特許出願第６２／２６８，２２０号（これらの各々の全内容はそっくりそのまま本明細書に援用される）の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
分野
本明細書に開示された実施形態は、多孔性支持膜上にアガロース層を含む新規な限外濾過複合構造およびこのような限外濾過複合構造を製造する方法に関する。このような限外濾過複合構造を使用して、例えば、バイオ医薬溶液からウイルスを除去するための方法も本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００３】
背景
限外濾過膜は、典型的には、圧力駆動濾過法において使用される。ウイルス除去膜フィルターは、製造された治療用生成物の必要な安全性を提供するために、バイオテクノロジー産業においてますます使用されている。これらのフィルターは、生成物が膜を通って流れる間に、治療用生成物を含有する供給物中に存在し得るウイルスの割合を高く保持することが意図される。
【０００４】
限外濾過（ＵＦ）膜は、主として、タンパク質、ＤＮＡ、ウイルス、デンプンおよび天然または合成ポリマー等の可溶性高分子を濃縮または透析濾過するために使用される。大部分の用途では、限外濾過は、供給物溶液が膜表面を横切って通過し、膜の細孔径よりも小さい分子が通過し（濾液）、残り（保持液）は膜の上流側に残る接線流濾過（ＴＦＦ）モードで行われる。流体が膜を通過するとき、効率的なＴＦＦ操作を維持するために、保持液流にリサイクルまたは添加する必要がある。ＴＦＦアプローチを使用する利点の１つは、流体が膜の表面を絶えず掃引するため、それは膜表面または膜表面近傍の溶質のファウリングおよび分極を低減して膜の寿命を延ばす傾向があることである。
【０００５】
限外濾過膜は、一般に、しばしば膜構造の永久的な部分のままである支持体上の大部分のために作られた、スキンを施した非対称膜である。支持体は、不織布または予め形成された膜であり得る。ＵＦ膜は、浸漬流延法によって製造され、スキンを施され、非対称である。最初の商業的用途はタンパク質の濃縮に関連し、膜はそれらが保持するであろうタンパク質の分子量、即ち、膜の分子量カットオフ評価（ＭＷＣＯ）によって評価された。
【０００６】
タンパク質による試験に基づく限外濾過膜の評価が依然として行われているが、一般的な方法は、多糖類（デキストラン）またはポリエチレングリコール等の狭い分子量分布を有する非タンパク質高分子を使用する（例えば、「Ａ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９  （１９９１）  ９４１−９４３）。
ａ）  浸漬流延による限外濾過膜製造方法は周知である。簡潔な議論は、「Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  （１９９６）；Ｌ．  Ｊ．  ＺｅｍａｎおよびＡ．  Ｊ．  Ｚｙｄｎｅｙ編集」に記載されている。例示的な製造方法は、以下の工程からなると記載されている。
ａ）  特定のよく制御されたポリマー溶液を調製する工程；
ｂ）  基材上へ薄膜の形態でポリマー溶液を流延する工程；
ｃ）  得られたポリマー溶液のフィルムを非溶媒中で凝固させる工程；および
ｄ）  場合により限外濾過膜を乾燥させる工程。
【０００７】
限外濾過膜における細孔径を制御することは、一般的には容易ではない。流延溶液の固形分が膜の多孔性および細孔径に影響するのみならず、非溶媒が流延溶液に入り、溶媒が流延溶液から出る相対速度にも影響する。溶媒が出る前に非溶媒がフィルムに入ると、ポリマーはより大きな体積の溶媒（細孔形成剤として作用する）の周囲に析出し、高い多孔性および大きな細孔径のＵＦ膜をもたらす。非溶媒が入るよりも速く溶媒が膜から出る場合には、逆のことが当てはまり、結果として生じるＵＦ膜はより低い多孔性およびより小さい細孔を有する。流延溶液または非溶媒浴への添加剤ならびに両者への温度調節は、非溶媒の流入および流延フィルムからの溶媒除去の相対速度を制御するためにしばしば用いられる。
【０００８】
アガロースは、多孔性ビーズを製造するために広範に使用されてきた天然多糖類である。これらのビーズは、クロマトグラフィー分離において多数の用途を見出している。アガロースビーズ（クロマトグラフィー用途用）の形成を記述している最古の技術は、アガロースが冷却によるゲル形成前に乳化される温かい非水性溶媒を使用した。例えば、Ｈｊｅｒｔｅｎ、Ｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ。  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９６４、７９：３９３−３９８およびＢｅｎｇｔｓｓｏｎら、Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９６４、７９：３９９を参照されたい。アガロースビーズ形成のための別の方法は、米国特許第４，６４７，５３６号に開示されているように、冷却した油にアガロースエマルジョンを滴下している。このような方法は、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１３５巻Ｂ部４０１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７にも記載されている。ポリマーは約９２℃であるその溶融温度を超えて加熱され、水の存在下で溶解されなければならない。その温度以上で、ポリマーは溶融し、溶融ポリマーは水で溶媒和されて溶液が形成される。温度が約４３℃であるポリマーのゲル点を上回る限り、ポリマーは水に可溶性のままである。ゲル点以下では、ポリマー相は分離し、溶液がゲル化する直前にあったどのような形状も取るヒドロゲルになる。さらに、アガロースがそのゲル点に近づくにつれて、ヒドロゲルが形成し始めるにつれて、溶液の粘度がどんどん高くなる。
【０００９】
伝統的に、クロマトグラフィー媒体に使用されるような多糖類ビーズについては、加熱された溶液はそのゲル点より上に保たれ、鉱物または植物性油等の非混和性の加熱された流体中で攪拌されてビーズを形成する。次いで、２相材料（非混和性流体中のアガロースのビーズ）が冷却されて、ビーズが回収される。ビーズ自体は拡散的に多孔性であり、サイズ排除クロマトグラフィー用に作製されたものとして使用することができる。さらに、それらは架橋、親和性化学物質またはリガンド等の様々な捕捉化学物質の添加、正または負電荷、疎水性等、または架橋とそれらの捕捉能力を増強するための化学物質との組み合わせによってさらに処理することができる。
【００１０】
アガロースは、標的生成物および／または不純物が拡散駆動法において細孔内に移行して細孔から出る多孔性ビーズを形成するために広範に使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，６４７，５３６号明細書
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「Ａ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｔｅｓｔ  ｆｏｒ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９  （１９９１）  ９４１−９４３
【非特許文献２】Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  （１９９６）；Ｌ．  Ｊ．  ＺｅｍａｎおよびＡ．  Ｊ．  Ｚｙｄｎｅｙ編集
【非特許文献３】Ｈｊｅｒｔｅｎ、Ｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ。  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９６４、７９：３９３−３９８
【非特許文献４】Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、Ｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １９６４、７９：３９９
【非特許文献５】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１３５巻Ｂ部４０１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
概要
本明細書に記載の実施形態は、アガロースを含む新規の限外濾過複合構造に関する。アガロースビーズは先行技術で見出すことができるが、アガロースは、以前には、標的生成物および／または不純物が、本明細書に記載したように、圧力駆動法において細孔内に移行して細孔を通過するように、濾過膜として使用することができる連続した平らな多孔性構造を作製するためには使用されてこなかった。
【００１４】
「アガロース限外濾過複合構造」および「アガロース限外濾過膜複合体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。用語「複合体」、「複合構造」および「膜複合体」は、本明細書において互換的に使用されるように、少なくとも１つの支持多孔性膜（基材とも称される）および膜上に堆積された多孔性アガロースの層を含む多相多孔性構造を記載する。
【００１５】
本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、現在利用可能である限外濾過膜よりもいくつかの利点を提供する。具体的には、本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、製造方法中に有害な有機溶媒の使用を避ける。これは、製造方法をより簡単に、より安全に、より安価に、より環境にやさしくするのに役立つ。さらに、膜形成後にこれらの溶媒を抽出する必要はない。形成方法は、より少ない方法の工程およびアガロース濃度を操作することによって限外濾過膜の細孔径を容易に制御する能力のために簡素化される。さらに、本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、高ｐＨ条件下での低いタンパク質結合性、安定性を示し、多孔性構造を形成するための抽出可能および／または放出可能な組成物の存在に依存しない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された限外濾過膜は、本質的にセルロース系である。いくつかの実施形態では、アガロース限外濾過膜複合体を作製する方法であって、以下の工程、即ち、ａ）０．０１μｍから１μｍの範囲の平均細孔径および１０μｍから５００μｍの範囲の平均厚さを有する多孔性支持膜（基材とも呼ばれる）であって、多孔性支持膜はポリエステル、ポリオレフィン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテル−エーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、芳香族ポリマーならびにポリテトラフルオロエチレンおよびポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）のようなフッ素化ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む該多孔性支持膜を提供する工程；ｂ）アガロース溶液を提供する工程；ｃ）アガロース溶液の層を２０から９０℃の範囲の温度で多孔性支持膜上に流延し、それによりアガロースで被覆された多孔性支持膜を形成する工程；ｄ）アガロースで被覆された多孔性支持膜を、アガロース溶液のゲル点未満の温度で水浴に浸漬して、それによりアガロース限外濾過膜を形成する工程を含む該方法が提供される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、アガロース限外濾過膜複合体は、０．１μｍ未満の細孔径を有する。いくつかの実施形態では、水浴は氷水を含む。
【００１８】
本明細書に記載された方法は、多孔性支持体を有するアガロース限外濾過膜複合体であって、膜複合体が１０から１０００ｋＤａ（Ｒ９０）の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）値を有する該アガロース限外濾過膜複合体の製造に有用である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、アガロース限外濾過膜複合体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン（ＰＥ）、およびポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）からなる群から選択されるポリマーから作製される多孔性支持体を含む。特定の実施形態では、多孔性支持体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）または超高分子量ポリエチレン（ＵＨＭＷ−ＰＥ）を含む。本明細書に記載された方法によるいくつかの実施形態では、１から１２重量％の範囲のアガロース濃度を有するアガロース溶液が使用される。他の実施形態では、５から１１重量％の範囲のアガロース濃度を有するアガロース溶液が使用される。特定の実施形態では、この方法は、１５重量％までの濃度の安定剤としてのＺｎＣｌ２を含むアガロース溶液を提供することによって実施される。
【００２０】
本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、架橋剤がアガロース溶液に添加されて、膜の上下の圧力間の圧力差を意味する正の膜間圧力（ＴＭＰ）下でアガロース層を安定化させる。従って、いくつかの実施形態では、０．０１重量％から１重量％の範囲の濃度の架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒまたはｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含むアガロース溶液が、本明細書に記載の方法で使用される。例示的な架橋剤は、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）である。本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、アガロース溶液は、例えば、２０から９０℃の範囲または４５から７５℃の範囲の温度に加熱される。特定の実施形態では、アガロース溶液は７０℃の温度に加熱される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、加熱されたアガロース溶液は、本明細書に記載されているように、例えば、２０から９０℃の範囲または４５から７５℃の範囲の温度に加熱された多孔性支持膜に塗布される。特定の実施形態では、多孔性支持膜は７０℃の温度に加熱される。アガロース溶液および支持膜が加熱される温度は、同じ温度または異なる温度であってもよい。
【００２２】
アガロース溶液を多孔性支持膜上に塗布した後、アガロースで被覆された多孔性支持膜はアガロース溶液のゲル点未満の温度の水浴中に浸漬される。アガロースのゲル点は、当該技術分野における既知の方法および本明細書に記載の方法を用いて予め決定することができる。アガロース溶液のゲル点をどのように決定するかについては、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、水浴は室温より低い温度に冷却される。いくつかの実施形態では、温度は５から６０℃の範囲である。他の実施形態では、温度は１０から４０℃の範囲である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、多孔性支持膜は、１００μｍから２００μｍの範囲の平均厚さおよび０．２μｍ未満の平均細孔径を有する。いくつかの実施形態では、多孔性支持膜は、１０μｍから５００μｍの範囲の厚さを有する。
【００２４】
本明細書に記載された方法は、多孔性支持膜上にアガロースの層を含む限外濾過膜複合体を製造するのに有用である。いくつかの実施形態では、アガロース層が多孔性支持膜に浸透または浸潤し、それにより、層間剥離に対する抵抗性が高い膜複合体が得られる。１から１５μｍの浸透深さによって、ろ過に適した、層間剥離に対する抵抗性が高い膜がもたらされることが見出された。
【００２５】
本明細書中に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、一般に、１μｍから１００μｍの範囲または１μｍから２０μｍの範囲の厚さを有するアガロース層を含む。特定の実施形態では、アガロース層の厚さは、１０μｍから２０μｍの範囲である。様々な実施形態では、アガロース層は、多孔性支持膜上に堆積される。いくつかの実施形態では、多孔性支持膜上へのアガロース層の堆積は、下にある多孔性支持膜へのアガロース溶液の浸透または浸潤、冷却によるアガロース溶液のゲル化およびその後の凝固を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、多孔性支持膜は、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテル−エーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、およびポリテトラフルオロエチレンまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等のフッ素化ポリマーからなる群から選択されるポリマーから製造された織布または不織布である。いくつかの実施形態では、多孔性支持膜は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）ならびにポリカプロラクタムおよびポリ（ヘキサメチレンアジパミド）をはじめとするポリアミドからなる群から選択されるポリマーから製造される織布または不織ポリマー繊維からなる。
【００２７】
本明細書で提供される実験データによって立証されるように、本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、１０μｍを超える平均厚さを有する多孔性支持膜を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、２０μｍから５００μｍの範囲の厚さを有する多孔性支持膜を含む。特定の実施形態では、多孔性支持膜は、１００μｍの平均厚さを有する。
【００２８】
本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体を使用する方法も本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された膜複合体は、目的のタンパク質を含む試料からウイルス粒子を除去するのに有用である。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は組換えタンパク質である。特定の実施形態では、目的のタンパク質はモノクローナル抗体である。
【００２９】
本明細書に記載された膜複合体は、ノーマルフロー濾過条件または接線流濾過条件下で使用することができ、タンパク質溶液の精製および／または濃縮のためのこのような方法で使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された膜複合体は、適切な濾過装置に実装される。
【００３０】
様々な実施形態では、本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、サイズに基づく分離に使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された膜複合体は、例えば、サイズに基づく分離またはサイズ排除によって、目的のタンパク質を含む溶液からウイルスまたはウイルス様粒子を除去するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】本明細書に記載されたアガロース膜複合体の調製に利用される装置の描写を含む。図１Ａは、７０℃のホットプレートまたは加熱プレート（３０）上に置かれたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）から製造された微孔性基材（２０）（即ち、多孔性支持膜）を有する装置（１０）を示す。アガロース流延溶液は、ガラスプレート（５０）上のテープ（４０）によって保持された基材（２０）上に注がれる。図１Ｂは、７０℃のホットプレートまたは加熱プレート（３０）上に置かれ、シム（８０）とプラスチックシート（７０）との間に挟まれた微孔性基材（ＰＶＤＦ）（即ち、多孔性支持膜）（２０）を含む装置（６０）を示す。シム（８０）は、アガロース流延溶液を広げるために使用されるマイクロメートルの調節が可能なナイフ（９０）に隙間を作るために使用されるが、それはアガロース流延溶液が基材（２０）とプラスチックシート（７０）との間に注がれる前に除去され、続いて隙間が空けられたマイクロメートルの調節が可能なナイフ（９０）を用いてアガロースが広げられる。得られたアガロース膜複合体はホットプレートから素早く剥がされ、少なくとも２分間氷と接触させた後、プラスチックシート（７０）を注意深く剥がしながら２０℃に維持された水浴に浸漬される。
【図１Ｂ】本明細書に記載されたアガロース膜複合体の調製に利用される装置の描写を含む。図１Ａは、７０℃のホットプレートまたは加熱プレート（３０）上に置かれたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）から製造された微孔性基材（２０）（即ち、多孔性支持膜）を有する装置（１０）を示す。アガロース流延溶液は、ガラスプレート（５０）上のテープ（４０）によって保持された基材（２０）上に注がれる。図１Ｂは、７０℃のホットプレートまたは加熱プレート（３０）上に置かれ、シム（８０）とプラスチックシート（７０）との間に挟まれた微孔性基材（ＰＶＤＦ）（即ち、多孔性支持膜）（２０）を含む装置（６０）を示す。シム（８０）は、アガロース流延溶液を広げるために使用されるマイクロメートルの調節が可能なナイフ（９０）に隙間を作るために使用されるが、それはアガロース流延溶液が基材（２０）とプラスチックシート（７０）との間に注がれる前に除去され、続いて隙間が空けられたマイクロメートルの調節が可能なナイフ（９０）を用いてアガロースが広げられる。得られたアガロース膜複合体はホットプレートから素早く剥がされ、少なくとも２分間氷と接触させた後、プラスチックシート（７０）を注意深く剥がしながら２０℃に維持された水浴に浸漬される。
【図２Ａ】実施例５に記載したように調製したアガロース限外濾過膜複合体の高倍率ＳＥＭ顕微鏡写真（電界放出走査電子顕微鏡）を示す。ＳＥＭは、細孔構造を保存するために低温条件下で実施され、分析された試料は、１５０℃未満の温度に冷却される。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、膜複合体の上部および底部を示す断面図（即ち、微孔性基材およびアガロース層の界面）である。図２Ｃは表面画像を示す。膜は、上面が底面よりも開いている、わずかに非対称であるように見える。
【図２Ｂ】実施例５に記載したように調製したアガロース限外濾過膜複合体の高倍率ＳＥＭ顕微鏡写真（電界放出走査電子顕微鏡）を示す。ＳＥＭは、細孔構造を保存するために低温条件下で実施され、分析された試料は、１５０℃未満の温度に冷却される。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、膜複合体の上部および底部を示す断面図（即ち、微孔性基材およびアガロース層の界面）である。図２Ｃは表面画像を示す。膜は、上面が底面よりも開いている、わずかに非対称であるように見える。
【図２Ｃ】実施例５に記載したように調製したアガロース限外濾過膜複合体の高倍率ＳＥＭ顕微鏡写真（電界放出走査電子顕微鏡）を示す。ＳＥＭは、細孔構造を保存するために低温条件下で実施され、分析された試料は、１５０℃未満の温度に冷却される。図２Ａおよび図２Ｂは、それぞれ、膜複合体の上部および底部を示す断面図（即ち、微孔性基材およびアガロース層の界面）である。図２Ｃは表面画像を示す。膜は、上面が底面よりも開いている、わずかに非対称であるように見える。
【図３】本明細書に記載された代表的なアガロース膜複合体の分子量カットオフを示す排除曲線を示す。Ｘ軸は分子量カットオフを示し、Ｙ軸は排除を示す。分析は、実施例４に概説されるように実施される。
【図４】用いたアガロース流延溶液の濃度に対するアガロース膜複合体の分子量カットオフおよび透過流束の依存性を示すグラフである。Ｒ９０および水透過流束データは、実施例３および４に記載されるように決定される。Ｘ軸は、アガロース濃度を示し、右のＹ軸はＬＭＨ／ＰＳＩで示される透過流束を示し、左のＹ軸はＲ９０を示す。
【図５】使用されるアガロース流延溶液のイオン強度に対する、本明細書に記載されたアガロース膜複合体の分子量カットオフの依存性を示すグラフである。Ｒ９０の数字は、実施例７に記載されるように決定された。Ｘ軸は使用したＺｎＣｌ２の濃度を示し、右のＹ軸および左のＹ軸はそれぞれ７重量％および１０重量％のアガロース溶液のＲ９０値を示す。流延溶液中のアガロースの濃度に関わらず、流延溶液のイオン強度が高いほど、より隙間があいた限外濾過膜が得られた。予想されるように、任意の所定のイオン強度で、より低いアガロース流延溶液濃度で、より隙間があいた限外濾過膜が得られる。
【図６】アガロース層が加圧下で圧縮されないようにするための、ＤＶＳによるアガロース層の架橋を示すグラフである。アガロース層を０．１％ＤＶＳ溶液で架橋することにより、１５ｐｓｉでの透過流束の２０％の損失を回避できることが示された。Ｘ軸はＰＳＩで表わされる圧力を示し、Ｙ軸はＬＭＨ／ＰＳＩで表される正規化された透過流束を示す。
【図７】（水中の）２０％グリセリン溶液中にある湿ったアガロース膜複合体の乾燥が、膜の分子量カットオフに負の影響を及ぼさない、即ち、乾燥工程はアガロース層の細孔構造を崩壊させないことを示すグラフである。
【図８】微孔質ＰＶＤＦ基材の上部層へのアガロース層の浸透深さを示すグラフである。元素分析データは、ＳＥＭ−ＥＤＳ装置（ＩＮＣＡ３００、オクスフォード・インストルメンツ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、英国）を用いて得られ、ミクロ領域の組成分析（ＳＥＭインサート上の星によって表される）は、微孔性基材の表面から開始して基材に４０μｍ延びるＺ方向に５μｍの間隔で実施される。フッ素シグナルはＰＶＤＦ微孔性基材に起因し、酸素シグナルはアガロースに起因する。アガロースの大部分は、第１の層に微孔性基材の深さ１０μｍまで局在している。Ｘ軸はミクロンで表される深さを示し、Ｙ軸は比（Ｏ／Ｆ）を示す。
【図９】ゲル点に達したときの代表的なアガロース溶液（７重量％）の粘度の増加を示すグラフである。回転粘度計を使用して、本明細書に記載された分析を実施する。Ｘ軸は摂氏で表される温度を示し、Ｙ軸は粘度を示す。
【図１０】アガロース限外濾過膜複合体およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（Ｒ）  Ｐｒｏ膜の特徴的な透過流束減衰を示すグラフである。ウイルスを添加した細胞培養培地は、各装置を１０ｐｓｉの一定の圧力で流れ、膜透過流束が測定される。処理量は、様々な時点で透過液量を測定することによって監視される。Ｘ軸は処理量を示し、Ｙ軸はＪ／Ｊｏ値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
詳細な説明
本明細書に記載された実施形態は、アガロース限外濾過膜複合体、およびその製造および使用方法に関する。具体的には、本明細書に記載された限外濾過膜複合体は、多孔性支持膜（基材とも呼ばれる）上にアガロース溶液の層を流延することによって製造される。アガロース溶液は多孔性支持膜に浸透し、それにより剥離に対する抵抗性が高いアガロース限外濾過膜複合体が得られる。
【００３３】
本明細書で使用される「限外濾過膜」または「ＵＦ膜」という用語は、Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．、（１９９６）、６８、１４７９に公開されている膜および膜処理に関する国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の用語の定義に基づいている。それによれば、ミクロ濾過は、０．１μｍより大きい粒子および溶解した高分子が排除される圧力駆動の膜に基づく分離方法として定義され、限外濾過は、０．１μｍより小さく、約２ｎｍよりも大きい粒子および溶解した高分子が排除される圧力駆動の膜に基づくの分離方法として定義される。
【００３４】
従って、限外濾過膜は、約０．１μｍ未満の溶液中のサイズを有する可溶性高分子を濃縮または透析濾過することができると定義され、長期間、通常は４時間を超え、最大２４時間まで接線流モードで連続的に操作することができる。対照的に、微孔性膜は、０．１μｍより大きな粒子を除去し、デッドエンド濾過用途に使用することができる。微孔性膜は、一般に可溶性高分子が膜を通過することを可能にする。
【００３５】
本明細書に記載された方法は、溶液技術および熱相反転技術を組み合わせ、流延溶液中の有機溶媒または非溶媒浴の使用を排除する。本明細書に記載された方法はまた、細孔径を制御するためのより簡単なアプローチを可能にする。これは、架橋デキストランまたはポリアクリルアミドゲル等の他の化合物のゲルと比較して、アガロースゲルの細孔径を制御することが一般に容易であるという事実に少なくとも部分的に起因する。例えば、米国特許第３，５２７，７１２号によれば、アガロースゲルの細孔径はゲル中のアガロース濃度に依存する。当業界では、アガロースの濃度が低下するにつれて、ゲルの有効細孔径が増加することが知られている。従って、アガロースの特定の濃度に依存して、１０Ｄａから７００ｋＤａの間の分子量を有する分子の選別を行うことが可能になる。アガロースを処理するためには、アガロースポリマーは、水の存在下で約９２℃であるその溶融温度を超えて加熱しなければならない。ポリマーはその温度で溶融し、次いで溶融ポリマーは水によって溶媒和されて溶液を形成する。使用されるアガロースの種類および濃度に依存して、温度がポリマーのゲル点（２０から４３℃の範囲内にある）を上回る限り、ポリマーは水に可溶性のままである。ゲル点以下では、ポリマー相は分離してヒドロゲルになる。本明細書に記載された膜複合体を調製するために使用されるアガロースの種類は、約３５から４０℃の範囲、または３７から３９℃の範囲のゲル点を示す。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜は、多孔性支持膜およびアガロースの高温溶液を、（ａ）フィルムを有するまたは有しない加熱されたステンレス鋼ロールと（ｂ）回転シリンダとの間に形成された２つのニップロールの間に通すことによって形成される。
【００３７】
アガロース層の厚さおよび多孔性支持膜へのアガロースの浸透度は、ニップロール間の空間への入口での溶液圧力、ジュロメーター（硬度）およびロールの直径、溶液粘度および処理速度によって制御される。
【００３８】
別の実施形態では、アガロース溶液は、従来のナイフオーバーロールまたはスロットダイコーティング法によって多孔性支持膜に塗布することができる。
【００３９】
次いで、多孔性支持膜を、そのゲル化温度以下の温度で、水等のアガロースの非溶媒と接触させる。いくつかの実施形態では、アガロース層は、架橋、官能性化学物質を用いた化学誘導体化等の追加の工程に供することができる。
【００４０】
さらに他の実施形態では、アガロース限外濾過膜複合体は、多孔性支持膜と非粘着性の非ポリマーシートとの間にアガロース溶液を拡げることによって形成される。アガロース溶液を拡げることは、任意の適切な手段によって達成することができる。非限定的な例には、ゴムローラまたはバードナイフ、ドクターブレード等を使用することが含まれる。拡げ工程は、アガロース溶液のゲル点を上回る温度を有するホットプレート上で実施することができ、それによって熱相反転を用いて多孔性支持膜の幅および長さに沿って全面に限外濾過層を形成する。次いで、アガロースで被覆された多孔性支持膜を水と接触させ、非粘着性ポリマーシートを除去しながらアガロース層の損傷を防ぎ、限界濾過範囲にあるアガロースの薄層で被覆された多孔性支持膜を残す。場合により、形成されたアガロース層は、その後、架橋、官能性化学物質を用いた化学的誘導体化等の追加の工程に供されてもよい。
【００４１】
本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体を作製するために利用することができる多孔性支持膜（本明細書で基材とも呼ばれる）は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦおよびＮＭＰのような種々の溶媒の存在下で使用できるポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエーテル−エーテルケトン（ＰＥＥＫ）等のポリマーから製造することができる。
【００４２】
多孔性支持膜または基材は、流れのための多孔性、機械的強度、可撓性および有機溶媒による膨潤または溶解に対する耐性を有することが望ましい。多孔性支持膜は、ポリエステル、ポリアミド、ポリカプロラクタム、ポリ（ヘキサメチレンアジパミド）、ポリオレフィン、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン、芳香族ポリマー、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエーテル−エーテルケトン（ＰＥＥＫ）、またはポリテトラフルオロエチレンもしくはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等のフッ素化ポリマー、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリテトラフルオロエチレンもしくはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）等のハロゲン化ポリマーもしくはフッ素化ポリマーのようなポリマーから製造された不織布または織布を含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、微孔性である多孔性支持膜が使用される。そのような微孔性膜は、米国特許第４，７７８，６０１Ａ号に開示されているような超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）で作ることができる。これらの微孔性膜は、一般に、超高分子量ポリエチレンから製造される。この方法は、ＵＨＭＷ−ＰＥおよびポロゲンの溶液を成形染料を介して押し出し、続いてポリマーとポロゲンの熱相分離を行う。続いてポロゲンを除去することによって微孔構造が形成される。
【００４４】
このような微孔性膜の製造は、典型的には、超高分子量ポリエチレンとポロゲンとの混合物を形成する工程を含む。この混合物を高温に加熱して溶液を形成する。溶液を中程度の剪断下で成形染料を通して押し出し、それによって膜を形成する。押出物を冷却して、ポリマーが豊富でポロゲンが乏しい相と、ポリマーが乏しくポロゲンが豊富な相とに相分離させ、ポロゲンを除去することにより膜中に微孔構造を生成させる。次いで、得られた微多孔膜を乾燥させる。この方法の詳細な説明は、例えば、米国特許第４，７７８，６０１号に見出すことができ、その全内容は参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、これらの微孔性膜は、本明細書に記載された層状限外濾過膜の製造のための基材または支持膜として適している。
【００４５】
上記のポリマーに加えて、本明細書に記載された限外濾過膜複合体の製造のための他の織布または不織ポリマーから製造された多孔性膜を使用することも可能である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された多孔性アガロース膜複合体の調製に有用な適切な多孔性支持膜は、１０μｍを超える平均層厚さを有する。他の実施形態では、これらの多孔性支持膜は、２０μｍから５００μｍの範囲の厚さを有する。他の実施形態では、１２０μｍまでの厚さを有する多孔性支持膜が使用される。特定の実施形態では、多孔性支持膜は、１００μｍの平均厚さおよび約０．２μｍの平均細孔径を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、例えば、図１ａ）および１ｂ）に示すように調製することができる。多孔性支持膜とアガロースとの良好な接着を達成するために、ポリマー支持膜をアガロース溶液と接触させる前にポリマー支持膜を高温に加熱することが有利であることが見出された。いくつかの実施形態では、多孔性支持膜は、約２０から９０℃の範囲の温度、または４５から７５℃の範囲の温度に加熱される。特定の実施形態では、多孔性支持膜は７０℃に加熱される。アガロース溶液を多孔性支持膜と接触させる前に、例えば、２０から９０℃の範囲の温度、または４５から７５℃の範囲の温度にそれを加熱する。アガロース溶液を流延して多孔性支持膜の表面上に拡げる場合、その下にある支持膜へのアガロース溶液の浸透深さを制御することが望ましい。従って、アガロースで処理された多孔性支持膜は、できるだけ早く冷却され、固体状態に移行される。冷却工程のために、アガロースで被覆された多孔性支持膜を、氷浴、次いでゲル化を実施するために２５℃未満の温度に維持された水浴と接触させることができる。アガロースで被覆された膜は、氷を含まない水と直ちに接触させることもできる。いくつかの実施形態では、水浴の温度は５から６０℃の範囲である。いくつかの実施形態では、水の温度は１０から４０℃の範囲の温度に維持される。
【００４８】
アガロース層の調製のために、典型的には、１から１２重量％の範囲、または５から１１重量％の範囲の濃度のアガロースを含むアガロース溶液が調製される。いくつかの実施形態では、市販のアガロース種類、例えば、ＨＤ２、ＨＲ、ＥＳ３：１またはＬＥ等が使用される。アガロースの商業的供給源の例は、スペインのヒスパナガル（Ｈｉｓｐａｎａｇａｒ）である。アガロース粉末を室温で水と混合し、次いでアガロース溶液が形成されるまで高温に加熱する。アガロース溶液がアガロースの融点である約９２℃の温度に達すると、溶液は撹拌され、遠心分離により脱気される。
【００４９】
一般に、脱気は、３５００ｒｐｍでの遠心分離によって、および２０から９０℃の範囲の温度、または４５から７５℃の範囲の温度に冷却した後に行われる。特定の実施形態では、温度は約７０℃である。アガロースフィルムを流延するのにアガロース溶液を使用するまで、アガロース溶液はこの温度で保持される。
【００５０】
塗布されるアガロース溶液はまた、例えば、安定剤としての塩化亜鉛のようなさらなる添加剤を含んでもよい。安定剤をアガロース粉末と一緒に混合し、適切な比率で水溶液に加えることができる。このようにして、１５重量％までの濃度の塩化亜鉛等の安定剤を含む流延溶液を調製することができる。いくつかの実施形態では、アガロース溶液は、１０重量％の濃度のＺｎＣｌ２を含む。しかし、５重量％未満のＺｎＣｌ２を含む溶液を使用することもできる。
【００５１】
多孔性支持膜へのアガロース溶液の浸透を確実にするために、アガロース溶液を膜上に流延する前に、多孔性支持膜は約２０から９０℃の温度に加熱される。いくつかの実施形態では、多孔性質支持膜は、４５から７５℃の範囲の温度、または約７０℃の温度に加熱される。
【００５２】
アガロース溶液を多孔性支持膜に塗布する場合、適切な量のアガロース溶液のみが多孔性支持膜に浸透することを確実にすることが重要である。さらに、アガロース溶液による多孔性支持膜の孔の目詰まりは望ましくない。アガロース溶液を多孔性支持膜上に流延する場合、それを適切な手段によって膜の表面上に均一に回す。適切な手段には、例えば、バードナイフの使用、または隙間を有するドクターブレードの使用が含まれるが、これに限定されない。続いて、被覆膜は加熱源からすぐに取り出され、アガロース溶液は冷却され、ゲル化される。これを達成するために、被覆膜は水浴に浸漬され、１５から２０℃の範囲、または１８から２０℃の範囲の温度に維持される。特定の実施形態では、温度は約２０℃である。冷却は、氷浴を使用することによっておよび／または引き続いて水浴中に浸漬することによっても達成され得る。
【００５３】
アガロース層はまた、耐圧性を高めるために架橋されてもよい。さらに、例えば，イオン交換膜として使用するために、そのような膜の所望の用途に応じて、アガロースで被覆された膜の表面改質を行ってもよい。
【００５４】
アガロース層を架橋するために、調製されたアガロースで被覆された膜を、架橋剤を含む溶液と適切な方法で接触させることができる。別の実施形態では、アガロース層が多孔性膜支持体上に流延される前に架橋剤をアガロース溶液に添加することができる。いくつかの実施形態では、架橋剤は、０．０１重量％から１重量％の範囲の濃度でアガロース溶液に含まれる。架橋剤の直接添加により、アガロースの均一な架橋が起こることが確実にされる。当技術分野で既知の様々な架橋方法および本明細書に記載の架橋方法を使用することができる。
【００５５】
上記のように、架橋反応はまた、溶解した架橋剤と膜複合体のアガロース層との間の反応を伴い得る。適切な反応溶液は、水性または有機溶媒、または水性−有機混合物に基づくことができる。有機溶媒の非限定的な例としては、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよび類似の溶媒が挙げられる。
【００５６】
例示的な架橋剤には、例えば、エピクロロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＵＤＧＥ）、エチレンジオールジグリシジルエーテル（ＥＤＧＥ）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテルおよびブタンジエポキシド等の二官能性または多官能性エポキシドが含まれる。多官能性Ｎ−メチルメトキシ化合物も架橋試薬として使用することができる。例としてはニュージャージー州ウエストパターソンのサイテック・インダストリーズ（Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）から入手可能なＣｙｍｅｌ  ３８５およびＰｏｗｅｒｌｉｎｋ  １１７４が挙げられる。架橋反応は架橋剤が約５重量％から約６０重量％または約１０重量％から約４０重量％の範囲の濃度で存在する溶液で起こり得ることがわかった。
【００５７】
特定の実施形態では、ジビニルスルホン、即ち、ＤＶＳが架橋剤として使用される。ＤＶＳは、本明細書に開示されたアガロース層の架橋に特に適していることが実証された。ＤＶＳは、アガロース層を流延する前にアガロース溶液に添加することができ、これは、上で議論した典型的に使用される架橋剤の濃度に対してはるかに低い濃度で塗布することができる。
【００５８】
当業者は、使用する適切な反応条件、例えば、適切な濃度、温度、圧力および使用する装置の構成を容易に決定することができる。一般に、反応はより高い温度ではより速い速度で起こることが期待される。しかし、反応温度は、本明細書に記載された複合材料ができるだけ穏やかに改質されるように選択されるべきである。さらに、当業者は反応規模の影響を容易に決定することもできる。例えば、より大きな反応容器は、反応温度に達したり、冷却したりするのにより多くの時間を必要とする。また、より高い圧力を使用して反応速度を上げることができる。反応容器に依存して、実施者は、膜への反応物の接触を改善し、それによって反応を制御するために、連続流反応器または他の適切な手段を使用することができる。より高い濃度は一般に反応速度を上げる。適用される架橋剤の種類および選択された溶媒はまた、必要とされる反応時間を決定する際に役割を果たすことができる。ヒドロキシルイオン活性は別の重要な反応条件である。
【００５９】
一般に、使用される反応時間は約２から約１００時間の範囲であるが、約４から約２４時間の反応時間が最も典型的である。反応は、室温でおよび約６０℃までで行うことができる。いくつかの実施形態では、反応は２５℃から約５０℃の範囲の温度で行われる。当業者は、例えば、物質移動速度を増加させることによって、連続ロール・ツー・ロール法を使用することによって、または温度、濃度または他の任意のパラメータを調整することによって反応速度をさらに増加させることによって、この時間を変更または減少させることができる。
【００６０】
多官能性エポキシ化合物が架橋剤として使用される場合、反応は塩基性条件で行われる。例としては、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムが挙げられる。典型的には、約０．１Ｍから約１Ｍ水酸化物溶液が使用される。当業者は、反応をアガロースのアルカリ性劣化とどのように釣り合わせるかを容易に決定することができる。より高い水酸化物濃度およびより高い反応温度は、一般にアルカリ性劣化を加速する；一方、より低い濃度の水酸化物およびより低い温度は一般に、架橋反応速度と同様に劣化速度を遅くする。
【００６１】
Ｐｏｗｄｅｒｌｉｎｋ  １１７４、Ｃｙｍｅｌ  ３８５および類似の架橋剤（多官能性Ｎ−メチルメトキシ化合物）は、アガロース上のヒドロキシルを介してトルエンスルホン酸等の酸触媒でアガロースを架橋する。他の類似の酸触媒は、有機スルホン酸および非酸化性鉱酸である。ｐＨが約２から４の弱酸性または中程度の酸性条件が一般に適切である。好ましい触媒はサイテック・インダストリーズから入手可能なＣｙｃｙｔ  ４０４０、即ち、スルホン酸触媒である。強酸性条件が膜の劣化を引き起こし、推奨されない可能性があることは、当業者には非常に明らかであろう。
【００６２】
アガロース膜と架橋反応物との間の反応は、水溶液、例えば、１００％の水またはメチルエチルケトン、メチルペンタンジオール、アセトンまたは他のケトンのような溶媒と混合した水中で行うことができる。しかし、この水溶液のリストは限定的ではない。特定の実施形態では、架橋工程はアルカリ性環境で行われる。
【００６３】
本明細書に記載された限外濾過アガロース膜複合体は、当該分野で既知の任意の適切な技術または本明細書に記載の技術を用いて改質することができる。いくつかの実施形態では、イオン交換材料として適切な膜を作製することができる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「イオン交換材料」という用語は、その上に固定化された共有結合した荷電置換基を有する高分子量マトリックスを指す。全体的な電荷の中性のために、非共有結合した対イオンは、イオン相互作用によって荷電置換基に結合する。「イオン交換材料」は、非共有結合した対イオンを同様に荷電した結合相手または周囲の溶液のイオンと交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に依存して、「イオン交換材料」は「陽イオン交換材料」または「陰イオン交換材料」と呼ばれる。荷電基（置換基）の性質に依存して、「イオン交換材料」は、例えば、陽イオン交換材料の場合、スルホン酸またはスルホプロピルまたはカルボキシメチル樹脂と呼ばれる。さらに、荷電基／置換基の化学的性質に依存して、「イオン交換材料」は、例えば、共有結合した荷電置換基の強度に基づいて、強イオンまたは弱イオン交換材料としてさらに分類することができる。例えば、いくつかの実施形態では、強陽イオン交換材料は、荷電置換基としてスルホン酸基（例えば、スルホプロピル基）を含むことができる。典型的な弱陽イオン交換材料は、荷電置換基としてカルボン酸基（例えば、カルボキシメチル基）を含む。典型的な強陰イオン交換材料には、第四級アンモニウム基が含まれる。一方、典型的な弱陰イオン交換材料は、荷電した置換基としてジエチルアミノエチル基を含む。
【００６５】
さらに、本明細書に記載された方法に従って調製された膜複合体の表面は、一段階または二段階法によって導入された負電荷を含むことができる。一段階法の場合、電荷調整反応物を架橋溶液に添加する。二段階法の場合、架橋反応の前または後に電荷付加反応が実施される。
【００６６】
負に帯電した膜複合体を形成するための適した反応物には、例えば、構造Ｘ（ＣＨ２）ｍＡの化合物またはそのアルカリ金属塩が含まれ、Ｘはハロゲン、好ましくは塩化物または臭化物であり；Ａはカルボキシルまたはスルホネートである。例えば、反応時間、反応物濃度、ｐＨおよび温度のうちの１つ以上を制御して、膜の表面に添加される負電荷の量を制御することができる。
【００６７】
本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、ジビニルスルホンは、参照により本明細書に援用される米国特許第４，５９１，６４０号に記載されるような反応条件下で架橋剤として使用される。いくつかの実施形態では、架橋反応は、還元剤の存在下、ｐＨ＞１１で室温で実施され、未反応ビニル基は、いくつかのヒドロキシル基を含む中性の親水性失活物質によって失活される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、グリシジル第四級アンモニウム化合物または第四級アンモニウムアルキルハライドを使用して、正電荷が膜に付与される。いくつかの実施形態では、ハロゲン化物分子はＹ（ＣＨ２）ｍＢ（Ｙはハロゲンであり、Ｂは正電荷部分である）の構造を有するであろう。
【００６９】
本明細書に記載された実施形態のいくつかの場合、膜に荷電基を付加する前に架橋反応が行われる。荷電基を付加する前に架橋反応を行うことにより、同様に荷電した基同士の電荷反発が回避され、ポリマーおよび膜の膨潤を防止することができる。他の実施形態では、電荷付与と同時に架橋が行われる。この場合、電荷が添加されたときに膨潤を回避する速度で架橋反応を制御することが望ましい。
【００７０】
本出願の教示と結びついた当該技術分野の教示に基づいて、当業者は、所望の細孔径、電荷および他の材料特性を有する本明細書に記載された耐溶媒性アガロース限外濾過膜複合体を製造することができるであろうことが理解されよう。
【００７１】
本明細書に記載された方法を使用して、アガロース層と多孔性支持膜とを含み、アガロースが多孔性支持膜の厚さの少なくとも一部に浸透し、それにより得られたアガロース限外ろ過膜複合体は、剥離に対する抵抗性が高い限外濾過膜複合体が得られる。例えば、本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、アガロースが多孔性支持膜に浸透し、それによって１から１５μｍの浸透深さに達する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、アガロース層は、１μｍから１００μｍの範囲、または１μｍから４０μｍの範囲の厚さを有する。特定の実施形態では、アガロース層は、１０μｍから２０μｍの範囲、または１５μｍから２０μｍの範囲の厚さを有する。アガロース層の厚さは、多孔性支持膜の上にあるアガロースと同様に、多孔性支持膜の中に浸透するアガロースを含むことが理解される。本明細書に記載の様々な実施形態では、アガロース層は、多孔性支持膜の少なくとも一部の厚さに浸透し、続いてアガロースを冷却することによってゲル化し、固化する。
【００７３】
本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、いくつかの用途を有する。この膜複合体は、工業的規模での生物学的製剤の製造と同様に分析用途にも使用することができる。いくつかの実施形態では、膜複合体は装置に組み込まれる。
【００７４】
本明細書に記載されているように、本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、一定の大きさの分子の濾過にはよく適するだけでなく、ノーマルフローまたは接線流フォーマットでのウイルス精製に有用である。
【００７５】
本明細書に記載された膜複合体は、組換えタンパク質含有溶液からウイルスを除去するのに有用な高分解能である。ウイルス除去へのこのような膜複合体の使用には、例えば、高い容量（例えば、膜複合体の単位面積を介して処理される目的のタンパク質の量によって測定される）および高効率（例えば、対数減少値、ＬＲＶによって測定される）等のいくつかの利点を有する。
【００７６】
例えば、ウイルスを除去するために膜を介してタンパク質水溶液を濾過する場合、膜は、目的のタンパク質が膜を通過することを可能にする間に、ウイルスを保持するのに十分小さい細孔径を典型的に有する。このような膜は高いウイルス保持率と同時に高い処理量を有することが一般に望ましい。
【００７７】
ウイルス保持率は、濾液中のウイルス濃度に対する供給物中のウイルス濃度（力価）の比の対数として定義される対数減少値（ＬＲＶ）として定義される。処理量は、完全なファウリングが生じる前に膜の所与の面積を通過することができるタンパク質溶液の体積として定義される。本明細書で使用される「完全なファウリング」という用語は、ＬＲＶが３．５以上のウイルス保持率を達成するために膜による濾過を実施するときに、膜の元の透過流束の１０％未満が観察される膜の状態を指す。一般に、膜を通るより高い透過流束および膜表面の低タンパク質結合は、両者ともより高い処理量をもたらすことが観察される。所与の膜の処理量の値は、タンパク質溶液の種類および濃度、圧力、イオン強度ならびに他の試験条件によって大きく異なる。典型的な処理条件下では、満足のいく限外濾過膜は、約１０００Ｌ／ｍ２以上の処理量を有する。
【００７８】
ウイルス保持性膜のより代表的な性能の判定基準は、Ｖｍａｘ法に従って計算される膜面積である。この方法に関するさらなる詳細は、ＥＰ１７７５０１６Ｂ１号に見ることができ、その教示は参照により本明細書に援用される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ウイルスの除去は、組換えタンパク質含有溶液を、適切な条件下で本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体を含む濾過装置に流して、組み換えタンパク質に膜複合体を通過させ、膜複合体を通るウイルスの通過を防止することを含む。
【００８０】
本明細書に記載されたいくつかの実施形態では、ウイルスの除去に使用されるアガロース限外濾過膜複合体は本質的に、実質的に親水性であり、即ち、水で容易に濡れる。本明細書に記載された様々な実施形態では、膜を親水性にするのは膜中のアガロース層である。上記で議論したように、ウイルス除去のために使用される場合、アガロース限外濾過膜複合体は、膜複合体を通るウイルスの通過を防止し、目的のタンパク質の通過を可能にすることが望ましい。これは、塗布されたアガロース層の細孔が、ウイルスを保持するのに十分に小さく、膜を通る目的のタンパク質の通過を可能にするので、多孔性支持膜上にアガロース層を有することによって少なくとも部分的に達成される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された膜複合体は、装置に実装される。いくつかの実施形態では、本装置は、本明細書に記載された１つ、２つまたは３つのアガロース限外濾過膜複合体から形成されたプリーツチューブを含む濾過カプセルである。いくつかの実施形態では、このような装置はウイルスの除去に使用される。しかし、理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に記載された膜複合体を具現化する任意の適切な装置形式を使用することができると考えられる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された膜複合体（単独でまたは適切な装置に組み込まれた）は、比較的大きなウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス）の場合には６より大きいＬＲＶで、比較的小さいウイルス（例えば、パルボウイルス）から４より大きいＬＲＶで効果的にウイルスを除去するために使用することができる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、タンパク質含有溶液からウイルスを除去するための装置は、本明細書に記載された膜複合濾過材料を収容するのに適したハウジングを含み、濾過すべき流体を受けるための入口および濾液を除去するための出口をさらに含み、濾過材料は、１つ、２つまたは３つのボイドのない複合体膜を含み、上流層はその最も密な面が下流に向くように配向される。
【００８４】
一般に、膜が「タイト・サイド・ダウンストリーム」の配向でプリーツ状に配置された複数の非対称限外濾過膜を組み込むことにより、得られるフィルターカプセルは良好な透過流束を維持しながら、良好なウイルス保持能力を有する。
【００８５】
特定の実施形態では、ウイルスを除去するために使用される濾過カプセルは、管状ハウジングと、このハウジング内に実質的に同軸に封入されたプリーツ状濾過チューブとを含む。濾過カプセルの管状ハウジングは、流体処理流を収容して流すように構成することができ、従って、流体入口および濾液出口を備える。プリーツ状濾過チューブの上流の流体処理流は、流体入口を通って濾過カプセルに導入される。プリーツ状の濾過チューブの下流では、流体処理流は濾液出口を通って濾過カプセルから放出される。
【００８６】
このような装置の構成および動作に関するさらなる詳細については、その教示が参照により本明細書に援用される、ＥＰ２１６３２９６Ａ１号およびＵＳ５，７３６，０４４Ａ１号を参照することができる。具体的には、本明細書に記載された本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された膜複合体を組み込んだフィルターカプセルの構成にフィルタカートリッジの態様を用いることができる。
【００８７】
タンパク質溶液からウイルスを除去するために、目的の１つ以上のタンパク質および１種以上のウイルスを含有する溶液を、１つ以上のアガロース限外濾過膜複合体を利用する濾過工程に供し、ＴＦＦモードまたはＮＦＦモードのいずれかで濾過することができる。どちらのモードにおいても、ろ過は、一般に２０から１００ナノメートル（ｎｍ）の直径を有するウイルスを保持し、一方で１つ以上のタンパク質が膜複合体を通過することを可能にする条件下で行われる。さらに、溶液の濾過が完了したら、膜を水または緩衝水溶液でフラッシュして、保持されたあらゆるタンパク質を除去する。フラッシング工程の使用により、ウイルスを実質的に含まない高収率のタンパク質溶液を得ることが可能になる。
【００８８】
当該技術分野の知識と結合された本明細書により、当業者が本明細書に記載された方法を包括的に実施することが可能になる。
【００８９】
さらに、当業者には言うまでもなく、与えられた実施例および残りの記載の両方において、組成物中に存在する成分の量は、全体としての組成物を基準にして、常に合計して１００重量％または１００モル％にしかならず、たとえ示されたパーセントの範囲からより高い値が生じ得るとしても、これを超えることはできない。特定の体積比の溶媒を混合物中で使用する調製のための、溶離液のような体積データに示された比を除き、別段の指示がない限り、％データは重量％またはモル％である。
【００９０】
実施例および明細書および請求項に示される温度は、常に℃で表される。
【００９１】
実施形態は、限定するものとして解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明される。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許および公開された特許出願ならびに図面の内容は、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【００９２】
［実施例１：アガロース溶液の調製］
これは、１０重量％アガロース溶液を調製するための代表的な例である。９０ｇの水に１０ｇのアガロース粉末（ヒスパナガルから得たタイプＨＤ２、およびアクアポア（Ａｑｕａｐｏｒ）から得たタイプＨＲ、ＥＳ、３：１およびＬＥ）を加え、室温で３０分間混合する。次いで、水和したアガロース混合物を、アガロース溶液が形成されるまでマイクロ波中で加熱する。この溶液を、３５００ｒｐｍおよび７０℃で５分間の遠心分離によって実質的に脱気する。溶液の自由流動特性はこの温度で保持される。この溶液を、薄いアガロースフィルムまたは層を流延するのに使用されるまで、ハイブリダイザー内で７０℃で保持する。他のアガロース溶液濃度は、アガロースと水の適切な相対比を用いて同様の方法で調製する。
【００９３】
［実施例２：他の添加剤を有するアガロース溶液の調製］
これは、１０重量％の塩化亜鉛を含む１０重量％アガロース溶液（タイプＨＲ）を調製するための代表的な例である。
【００９４】
アガロース溶液を最初に実施例１に記載されたように調製する。１０ｇの塩化亜鉛（９８％、アクロス（Ａｃｒｏｓ）から入手）を１０重量％アガロース溶液に加え、ハイブリダイザー内で７０℃で混合し、塩を溶解する。溶液の自由流動特性は、これらの条件下で保持される。次に、薄いアガロースフィルムを流延するのに使用されるまで、溶液を７０℃でハイブリダイザー内に保持する。異なる塩化亜鉛濃度を含む他のアガロース溶液濃度は、アガロース、塩化亜鉛および水の適切な相対比を用いて同様の方法で調製する。
【００９５】
［実施例３：アガロース限外濾過膜複合体の水透過流束の測定］
水透過流束の測定は、Ａｍｉｃｏｎ（ＥＭＤミリポア社.、ビレリカ）撹拌セルを用いて実施する。湿らせた膜（５０：５０のＩＰＡ：水混合物中）をセルに入れる。セルを脱イオン水で満たし、加圧空気供給源に接続し、２５ｐｓｉｇまで加圧する。流出液を標準試験時間にわたって回収し、透過流束を既知の膜面積を用いて計算する。あるいは、自動透過流束試験装置を用いて膜複合体を試験することができる。
【００９６】
［実施例４：アガロース限外濾過膜複合体の分子量カットオフの決定］
モデル溶質の排除は、限外濾過膜の性能を評価するための最も一般的な方法である。従って、公称分子量限界（ＮＭＷＬ）を様々な溶質を用いて決定することができ、しばしばタンパク質を使用する。ＵＦ膜のＮＭＷＬは、典型的には、選択されたレベルまたは排除、通常９０から９５％で膜が排除する最小のタンパク質の分子量である。ＵＦ膜を特徴付けるために使用することができる他の溶質には、広い範囲の分子量で利用可能なデキストランが含まれる。約１０００Ｄａの分子量の分子から約２，０００，０００Ｄａまでの分子の全排除スペクトルを、単一の試験で測定することができる。
【００９７】
分子量カットオフの決定は、とりわけ、Ｌ．ＺｅｍａｎおよびＭ．Ｗａｌｅｓ、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６（３０）、ｐ．２７５−２９０（１９８１）に公開された方法に基づく。特徴付けられる膜複合体を、適切な装置中で１０００から２，０００，０００Ｄａの範囲の分子量を有する多分散デキストランを含有する溶液でチャレンジする。濃度分極を最小にするために、試験中の透過速度を低透過流束で制御する。供給物流および透過流をサンプリングし、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、クロマトグラフィーデータを使用してデキストラン分子量の関数として排除を計算する。
【００９８】
デキストラン分子量による排除（Ｒ）は、Ｒ＝１−Ｃｐ／Ｃｆであり、式中、ＣｐおよびＣｆは、それぞれ、供給物および透過液中の所与の分子量のデキストラン濃度である。膜がデキストラン供給物の９０％を保持する分子量は９０％デキストラン排除値（Ｒ９０）である。
【００９９】
代表的なアガロース膜複合体についてのこの分析から得られた典型的なＮＭＷＬデータを図３に示す。
［実施例５：６５ｋＤａ、１２０ｋＤａおよび２５０ｋＤａのＮＭＷＬアガロース限外濾過膜複合体の作製方法］
【０１００】
この実施例は、６５ｋＤａの公称分子量カットアガロース限外濾過膜複合体を作製する方法を説明する。
【０１０１】
微孔性膜基材としては、平均細孔径０．２μｍおよび平均厚さ１００μｍを有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）微孔性膜を用いた。 微孔性基材をホットプレートに取り付け、７０℃の温度に維持した。
【０１０２】
実施例１に記載したように調製した１０重量％アガロース（タイプＥＳ）を含有するポリマー溶液を、２５μｍのギャップを有するマイクロメートルの調節が可能なナイフを用いて加熱した微孔性ＰＶＤＦ膜上に流延した。次いで、アガロースで被覆された膜を加熱プレートから迅速に取り外し、（図１Ａに示すように）２０℃の温度に維持された水浴に浸漬した。
【０１０３】
膜の画像形成を、Ｇａｔａｎ、モデルＡｌｔｏ  ２５００によって製造された低温ステージで実施した。Ａｌｔｏ  ２５００は、高分解能走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）に直接取り付けられる専用の調製チャンバを有する。チャンバは、制御された深さの破壊を確実にする冷却された破壊ナイフを含む。別の２ポットの急速冷凍ステーションを用いて試料を凍結させる。製造された膜複合体の断面を図２Ａから図２Ｃに示す。微孔性基材の表面上のアガロースコーティングの厚さは約１５μｍである。
【０１０４】
膜複合体は、欠陥がなく、表１に列挙された透過流束および保持特性（実施例３および４に記載の通りに決定される）を有する。
【０１０５】
１２０ｋＤａのＮＭＷＬアガロース限外濾過膜複合体を以下のように作製した。微孔性膜基材としては、平均細孔径０．２μｍおよび平均厚さ１００μｍのポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）微孔性膜を用いる。微孔性基材をホットプレートに取り付け、７０℃の温度に維持する。
【０１０６】
実施例１に記載されたように調製した１０重量％のアガロース（タイプ３：１）を含有するポリマー溶液を、２５μｍのギャップを有するバードナイフまたはマイクロメートルの調節が可能なナイフを用いて加熱した微孔性ＰＶＤＦ膜上に流延する。次いで、アガロースで被覆された膜をホットプレートから迅速に取り外し、２０℃の温度に維持された水浴に浸漬する。
【０１０７】
微孔性基材の表面上のアガロースコーティングの厚さは、ＳＥＭで決定したように、約１８μｍである。膜複合体は欠陥がなく、表１に列挙された透過流束および保持特性（実施例３および４に記載のように決定される）を有する。最後に、２５０ｋＤａのＮＭＷＬのアガロース限外濾過膜複合体を以下のように作製する。
【０１０８】
平均細孔径０．２ミクロンおよび平均厚さ１００μｍを有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）微孔性膜を微孔性膜基材として使用する。微孔性基材をホットプレートに取り付け、７０℃の温度に維持する。
【０１０９】
実施例１に記載されたように調製した１０重量％のアガロース（タイプＨＲ）を含むポリマー溶液を、２５μｍのギャップを有するバーナイフを用いて加熱した微孔性ＰＶＤＦ膜上に流延する。次いで、被覆膜をホットプレートから迅速に取り外し、２０℃の温度に維持された水浴中に浸漬する。
【０１１０】
微孔性基材の表面上のアガロースコーティングの厚さは、ＳＥＭで決定したように、約１５μｍである。膜複合体は欠陥がなく、表１に列挙された透過流束および保持特性（実施例３および４に記載のように測定される）を有する。
表１：異なるアガロース限外濾過膜複合体の透過流束および保持特性
【表１】
0006717926.tif 000002
【０１１１】
［実施例６：流延溶液中のアガロース濃度に対するアガロース膜複合体の分子量カットオフおよび水透過流束の依存性］
アガロース膜複合体を調製するために使用される装置は、図１に強調されている。非多孔性プラスチックシート（７０）を、先ず、７０℃に維持されたホットプレートまたは加熱プレート（３０）にテープ留めする。ＰＶＤＦ微孔性膜基材（２０）（細孔径評価０．２μｍ）をプラスチックシート（７０）の上に置き、プラスチックシート（７０）にテープ留めすることにより適所で硬化させる。実施例１に記載されたように調製した５、７および１０重量％のアガロース（タイプＥＳ）を含むポリマー溶液を、ＰＶＤＦ膜基材（２０）とプラスチックシート（７０）との間に、約３５μｍのギャップを有するマイクロメートルの調製が可能なナイフ（９０）を用いて薄層として拡げる。次いで、アガロースで被覆された膜−シート対をホットプレートまたは加熱プレート（３０）から取り外し、氷浴上に置き、アガロースのゲル化を行い、熱相反転によって限外濾過層を形成する。次いで、プラスチックシート（７０）を除去する間にアガロース限外濾過層の損傷を防ぐために、膜シート対を水と接触させ（２０℃に維持した浴内で）、アガロースの薄い限外濾過層で被覆された微孔性基材を残す。
【０１１２】
図４に示すように、膜の分子量カットオフおよび透過流束は、流延溶液中のアガロース濃度の関数である。１０、７および５重量％のアガロース溶液濃度で、それぞれ２５ｋＤａ（１．２ＬＭＨ／ＰＳＩ）、４７ｋＤａ（３．７ＬＭＨ／Ｐｓｉ）および１２００ｋＤａ（５．４ＬＭＨ／ＰＳＩ）のＲ９０（透過流束）を得る。
【０１１３】
［実施例７：流延溶液中の塩化亜鉛濃度に対するアガロース膜複合体の分子量カットオフの依存性］
代表的な膜複合体を、実施例２に記載されたように調製したアガロース流延溶液（７および１０重量％ＨＲタイプのアガロース）の使用のみが異なる以外は、実施例６に記載されたように調製する。図５に示すように、流延溶液中の塩濃度が高いほど、より隙間が空いたＵＦ膜が得られる。０、５、１０、１２および１４重量％のＺｎＣｌ２を含む７重量％のアガロース流延溶液濃度で、以下、即ち、３５ｋＤａ、３１ｋＤａ、４４ｋＤａ、７０ｋＤａおよび３００ｋＤａのそれぞれのＲ９０を得る。０、５、１０、１５重量％のＺｎＣｌ２を含む１０重量％のアガロース流延溶液濃度で、以下、即ち、１５ｋＤａ、１６ｋＤａ、２６ｋＤａおよび１３５０ｋＤａのそれぞれのＲ９０を得た。
【０１１４】
［実施例８：加圧下でのアガロース層圧縮を防止するための、ＤＶＳによるアガロース膜複合体の架橋］
代表的なアガロース膜複合体を実施例５に記載されたように調製する。３つの膜複合膜ディスク（それぞれ２５ｍｍの直径）をＤＩ水中に０．１、０．５および１％のメルカプトエタノール溶液（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手）を含む２０ｍｌの炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ１１で０．５Ｍ）に浸漬し（一度にそろって）、６時間混合した。次いで、膜を実施例３に記載されたように試験する。
【０１１５】
図６に示されるように、調製された複合膜は圧力下で圧縮可能であるため、１５ｐｓｉで２０％の水透過流束が失われる。ＤＶＳによる架橋により、アガロースゲル層の機械的特性が改善され、圧力下でのその崩壊が防止される。わずか０．１重量％のＤＶＳ溶液が必要である。
【０１１６】
［実施例９：アガロース膜複合体の乾燥］
この実施例は、２０％グリセリン溶液（水中）中にあるアガロース膜複合体の乾燥を説明する。
【０１１７】
代表的なアガロース膜複合体を、上記の実施例に記載されたように調製する。膜複合体の分子量カットオフおよび透過流束を、実施例３および４に記載されたように決定する。膜複合体を試験攪拌セルから取り出し、水洗し、湿潤剤として作用する水溶液中の２０容量％のグリセリンで処理する。続いて、膜複合体を周囲条件下で３日間乾燥させる。
【０１１８】
図７に示すように、膜複合体の分子量カットオフは乾燥後も変化しない。乾燥前後の膜複合体の透過流束は、０．７ＬＭＨ／ｐｓｉで変化しないままである。
【０１１９】
［実施例１０：基材へのアガロースの浸潤の評価］
この実施例は、微孔性ＰＶＤＦ基材へのアガロースの浸潤の深さの評価を説明する。
【０１２０】
基材と限外濾過アガロース層との間に十分に強い結合を得て、アガロース膜複合体を剥離に対し高度に耐性にするためには、微孔性基材へのアガロースのいくらかの浸透が必要である。浸潤深さの分析は、走査電子顕微鏡−エネルギー分散分光法（ＳＥＭ−ＥＤＳ）装置（ＩＮＣＡ３００、オクスフォード・インストルメンツ、英国）を用いて実施する。微小領域の組成分析を、微孔性基材の表面から始まり、基材の中に４０μｍまで伸びるＺ方向において５μｍの間隔で行う。
【０１２１】
代表的なアガロース膜複合体を実施例５に記載されたように調製する。ＳＥＭ−ＥＤＳから得られた元素分析データを用いて、試料中に存在する酸素原子およびフッ素原子の相対濃度を決定する。フッ素シグナルはＰＶＤＦ微孔性基材に起因し、酸素シグナルはアガロースに起因する。図８に示すように、ＰＶＤＦ基材へのアガロースの浸潤深さは約１０μｍである。
【０１２２】
［実施例１１：異なるグレードのアガロースのゲル点の決定］
この実施例は、回転粘度計を使用して異なるグレードのアガロースのゲル点の決定を示した。
【０１２３】
代表的な７重量％のアガロース溶液を実施例１に記載されたように調製し、７０℃でハイブリダイザーに保存する。ブルックフィールド粘度標準（Ｌｏｔ＃１１２３０５）を使用して機器の較正をチェックする：報告／観測、４８９／５０２±６ｃｐ。（境界条件、５０ＲＰＭ速度、ＬＶ２スピンドルを確立するためにレッグガードを使用する）。
【０１２４】
１６ｍｌのアガロース溶液を、ブルックフィールド粘度計モデルＤＶ−ＩＩ＋Ｐｒｏ（ブルックフィールド・エンジニアリング・ラボ社）に取り付けられたウォータージャケットに適合する試料チャンバに注ぐ。循環温度浴（水を含む、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｍｏｄｅｌ＃１１３０−１）を使用して試料チャンバの温度を５５℃に設定し、ＤＶ−ＩＩ−Ｐｒｏ粘度計に接続された内蔵ＲＴＤセンサーを使用してチャンバ温度の直接読み取りを行う。アガロース溶液の各試料を、データポイントの収集を開始する前に、温度制御チャンバ内で５５℃で１０分間平衡化させる。測定値は、回転速度２ｒｐｍ、開始トルク２％のＳＣ４−２５スピンドルを備えたＷｉｎｇａｔｈｅｒ  Ｖ３．０ソフトウェア（ブルックフィールド・エンジニアリング・ラボ社）を用いて取得する。
【０１２５】
図９に示すように、ゲル点に達するまで（粘度の一次増加によって証明される）、循環温度浴に氷を連続的に添加することによって、アガロース溶液を収容したチャンバの温度を低下させる。トルクが９５％伸びると、データ収集を停止し、粘度計をオフにする。ゲル化の開始温度を７重量％での異なるアガロースグレードの代表的な組について表２に記録する。
表２：回転粘度計を用いて測定した異なるアガロースグレード溶液（７重量％）についてのゲル化の開始温度
【表２】
0006717926.tif 000003
【０１２６】
［実施例１２：細胞培養培地を含む溶液を用いたアガロース限外濾過膜複合体の処理量およびウイルス保持特性
細胞培養培地による処理量およびウイルス保持研究のために、７重量％アガロース（タイプ３：１）および微孔性基材としてＧＥＨＰ（０．２μ疎水性ＰＥＳ）を用いて、実施例１に記載されたようにアガロース限外濾過膜複合体を調製する。膜複合体は４８５ｋＤａのＲ９０および４ＬＭＨ／ｐｓｉの水透過性を有する。膜複合ディスク（２５ｍｍ）を切り出し、４．５ｃｍ２の濾過面積を有するＳｗｉｎｎｅｘ（Ｒ）フィルターホルダー装置に入れる。ポリエステル不織布の１つの層を装置の底部／出口側で使用する。２５ｍｍのＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（Ｒ）  Ｐｒｏ装置を対照として使用する。膜複合体は１００ｋＤａのＲ９０および１４ＬＭＨ／ｐｓｉの水透過性を有する。
【０１２７】
水透過性、細胞培養培地の処理量およびウイルス保持を、ロードセルを備えた一定の圧力装置で試験する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の増殖のためのＥＭＤミリポア社独自の化学的に定義された細胞培養培地を研究に使用する。
【０１２８】
モデルウイルスであるバクテリオファージＰｈｉＸ−１７４を、ｐＨ５、導電率１３．５ｍＳ／ｃｍで、濃度１．４×１０７ＰＦＵ／ｍｌまで酢酸緩衝液に添加する。装置を緩衝液で１０分間フラッシュし、ウイルスを添加した容器に供給を切り替え、ウイルスを添加した細胞培養培地を各装置に１０ｐｓｉの一定圧力で流した。様々な時点での透過液量を測定することによって、処理量を監視した。
【０１２９】
ウイルスアッセイのための試料を様々な処理量（１５、２５０および５００Ｌ／ｍ２）で収集し、ＬＲＶ結果を表３に示す。図１０は、アガロース限外濾過膜複合体およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（Ｒ）  Ｐｒｏ膜の透過流束の減衰を示す。本明細書に記載されたアガロース限外濾過膜複合体は、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ（Ｒ）  Ｐｒｏ（膜容量に達する前に透過流束がより速く減衰する）とは異なる閉塞挙動を示す。
表３：モデルウイルス供給流によりチャレンジされたアガロース限外濾過膜複合体およびＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（Ｒ）  Ｐｒｏ膜のＬＲＶ結果
【表３】
0006717926.tif 000004
【０１３０】
明細書は、本明細書に引用された参考文献（参照により本明細書に援用される）の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書の実施形態は、実施形態の例示を提供するものであり、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本開示に包含されることを容易に認識する。全ての刊行物および参考資料は、その全体が参照により援用される。参照により援用される資料が本明細書と矛盾するか、または一致しない程度まで、本明細書はそのような資料に優先する。本明細書における全ての参考文献の引用は、そのような参考文献が先行技術であることを認めるものではない。
【０１３１】
他に指示がない限り、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される成分の量、細胞培養、処理条件等を表す全ての数字は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。それとは反対の指示がない限り、数値パラメータは近似値であり、本明細書に開示された実施形態によって得ようとする所望の特性に応じて変化し得る。別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の要素の全てを指すと理解されるべきである。当業者であれば、日常的な実験のみを用いて、本明細書に記載された特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【０１３２】
当業者には明らかであるように、本明細書に開示された実施形態の多くの改変および変形が、その精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載された特定の実施形態は、単なる例示として提供され、決して限定的であることが意図されない。本明細書および実施例は、例示のみとして考慮され、本開示の真の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって示されることが意図される。
【図１Ａ】
0006717926.tif 000005
【図１Ｂ】
0006717926.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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