(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え二機能性融合タンパク質であって、
免疫グロブリンのＦｃフラグメントに連結するシグナル調節タンパク質（ＳＩＲＰ）の膜外端にあるＩｇ様ドメインを含み、前記組換え二機能性融合タンパク質とＣＤ４７およびＦｃ受容体との結合によって、ＣＤ４７とマクロファージの表面ＳＩＲＰとの結合を阻害し、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を活性化する組換え二機能性融合タンパク質であって、
前記組換え二機能性融合タンパク質は、前記Ｉｇ様ドメインにおけるグリコシル化部位を除去したものであり、
前記シグナル調節タンパク質は、ヒトのＳＩＲＰαであり、
前記シグナル調節タンパク質の膜外端にある前記Ｉｇ様ドメインは、ＳＩＲＰαＤ１であり、
前記グリコシル化部位は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６の８９番目のアミノ酸残基をＡに変えることで除去された、
組換え二機能性融合タンパク質。
【請求項２】
前記Ｆｃフラグメントは、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントである、請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１はヒトＩｇＧ１である、請求項２に記載の組換え二機能性融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え二機能性融合タンパク質のホモ二量体であって、
１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結する２つの融合タンパク質分子を含むホモ二量体。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：６のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え二機能性融合タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の組換え二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項９】
請求項１から３、および５のいずれか一項に記載の組換え二機能性融合タンパク質および少なくとも１種の医薬アジュバントを含む医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＤ４７の過剰発現によって引き起こされる疾患を治療するための薬品の調製における請求項１に記載の組換え二機能性融合タンパク質または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
前記疾患は、骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性顆粒球性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌、および腎細胞癌から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患は、アレルギー性喘息である、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換え二機能性融合タンパク質およびその調製方法および応用に関し、特に腫瘍療法における応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、自分自身の成長を加速するために、しばしば宿主による腫瘍細胞に対する免疫監視を逃れるように何らかの方法を「発明」した。既知の三つの方法がある。1）Tリンパ球による免疫監視を逃れる。腫瘍細胞は、膜タンパク質であるPD-L1とPD-L2を高度に発現することが多い。PD-L1／PD-L2は、T細胞の表面にあるPD-1に結合して、T細胞のアポトーシスを誘発することができる。2）ナチュラルキラー（NK）細胞による免疫監視を避ける。NK細胞の細胞膜には、NK細胞を活性化できるタンパク質NKG2Dがある。NKG2Dが腫瘍胞膜にあるMICA/MICBに結合すると、NK細胞が腫瘍細胞を殺すことを活性化することができる。しかし、腫瘍細胞自体には、MICA/MICBが細胞膜から剥離することを促進するメカニズムがある。剥離したMICA/MICBは、NK細胞表面にあるNKG2Dに結合することによって、NKG2Dと腫瘍細胞表面のMICA/MICBとの結合を閉鎖する。3）マクロファージ（Mφ）による免疫監視を避ける。ほぼ全ての腫瘍細胞は、その細胞表面でCD47を高度に発現する。CD47は、マクロファージ（Mφ）の膜表面にあるシグナル調節タンパク質（SIRPα）に結合できるので、抑制的シグナルを誘発して、マクロファージ（Mφ）による腫瘍細胞への貪食機能を阻害してしまう。そこで、腫瘍細胞は「スマート」である。急速な増殖と再生をすることができる原因は、「創出」された逃げのメカニズムにより決定されたことである。これに対応して、腫瘍を絶滅させるためには、これらの方法から着手し、他の手段と組み合わせて、有効な薬物を設計する必要がある。
【０００３】
本発明は、シグナル調節タンパク質SIRPαに関するものである。シグナル調節タンパク質（SIRP）は、膜貫通糖タンパク質であり、SIRPα（CD172a）、SIRPβ（CD172b）、SIRPγ（CD172g）という3つのファミリーを含む。その3つのファミリーは、類似の膜外端を有するが、異なる膜内領域を有する（図1A）。膜外端は、共に3つの免疫グロブリン（Ig）様ドメインを含み、うち第1の領域がIg-V領域に属し、第2および第3の領域がIg-C領域に属する。SIRPα（CD172a）の膜内領域は、抑制的シグナルを伝送し、細胞の対応する機能を抑制できる２つの抑制的シグナル領域を含む。SIRPβ（CD172b）とSIRPγ（CD172g）の膜領域は非常に短くシグナル伝送領域がないが、SIRPβ（CD172b）はアダプタータンパク質（Adaptor protein、例えば、DAP12）を介して活性化シグナル（図1）を伝送することができる。SIRPsタンパク質は、主にマクロファージ（Mφ）、樹状細胞（DC）、および神経細胞において発現される。
【０００４】
CD47も、免疫グロブリンスーパーファミリーのファミリーに属し、赤血球を含むほとんど全ての細胞表面上に発現される膜貫通糖タンパク質である。CD47のリガンドには、接着因子（integrins）、トロンボスポンジン-1（thrombospondin-1）、およびシグナル調節タンパク質（SIRP）が含まれる。CD47は、細胞移動、T細胞、樹状細胞活性化、軸索発達を含む様々な生物学的機能を有する。さらに、CD47は、SIRPαと相互作用することによってマクロファージの貪食作用を抑制する。CD47は、いわゆる「私を食べないで」（「私を食べてはいけないDon't eat me」）シグナルをこのように伝送することによって、血液細胞や他の正常細胞をマクロファージにより貪食されないように保護することができる。
【０００５】
研究したところ、正常の組織細胞がCD47を発現すること以外、多くの腫瘍細胞は、CD47を過度に発現し、マクロファージ表面にあるSIRPαに結合することによって、マクロファージによる腫瘍細胞への貪食を阻止する。これは、腫瘍が生体免疫監視を避けるメカニズムとして見なされる。CD47を高度に発現する腫瘍は、急性骨髄性白血病細胞（AML）、慢性顆粒球性白血病細胞（CML）、急性リンパ芽球性白血病細胞（ALL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌などを含む。
【０００６】
研究により、CD47-SIRPαの結合活性を阻害する機能を有するCD47特異的抗体を利用して担癌マウスに注射すると、マウスにおける腫瘍増殖を著しく抑制できる。ヒト白血病細胞を持つマウスに対して同じ抗体を注射すると、腫瘍細胞を完全に除去する効果を達成することができる（Theocharides APA,et al.,2012）。
【０００７】
Fc受容体は、特定の細胞の表面に見られるタンパク質である。上記細胞は、Bリンパ球細胞、濾胞樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球細胞、好酸球細胞、好塩基球細胞、肥満細胞などの免疫系の保護機能に寄与する細胞を含む。Fc受容体は、感染された細胞、侵入した病原体または癌細胞に付着する抗体に結合し、貪食細胞又は細胞毒性細胞を刺激し、抗体媒介の貪食作用または抗体依存性細胞媒介の細胞毒性作用によって、微生物、感染された細胞または癌細胞を破壊する。
【０００８】
SIRPα-FcおよびSIRPαD1-FcとCD47との結合活性については、以前にそれが報告されている（Lee WY et al,2007）が、それがターゲットであるCD47との親和活性が不足である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、遺伝子組換え融合タンパク質に関する。２種類のメカニズムを介して、腫瘍を破壊する目的を達成できる。一つは、腫瘍細胞により誘発されるマクロファージの抑制的シグナルを阻害することであり、もう一つは、マクロファージによる貪食作用を直接に活性化することである。当該タンパク質は、ヒトシグナル調節タンパク質（Singal-regulatory proteins）alpha（SIRPα）の膜外端にある第１のIg様ドメイン（SIRPαD1）とヒトIgG1のFcフラグメントとを連結することによって形成される（SIRPαD1-Fc）。このタンパク質は、ホモ二量体に属し、90kDaの分子量を有する。SIRPαの膜外端にある第１の領域（Domain1、D1）とヒトIgGのFcフラグメントからなる融合タンパク質（SIRPαD1-Fc）は、全体の膜外端組換えタンパク質（SIRPα-Fc）と比べて、より高いターゲット結合活性を有する。本願の発明者はさらに、SIRPα膜外端D1領域におけるグリコシル化部位（N89A）を除去すれば、ターゲットの結合活性を増加させ、FcとFc受容体との結合活性を維持すれば、SIRPαD1-Fcの抗腫瘍活性を大幅に増加させることができることを見出した。
【００１０】
本発明は、細胞株をスクリーニングすることによって、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）を利用して、当該タンパク質の安定発現細胞を調製し、振盪培養により当該タンパク質を調製した。体外実験によると、当該タンパク質がCD47に結合でき、結合活性がSIRPα-Fcより大幅に増加した。SIRPαD1におけるグリコシル化部位「NIT」を遺伝子改変によって除去する場合（N89A）（SIRPαD1-FC（N89A）、HY03Mと命名）、HY03MとターゲットCD47との結合活性をさらに強化する。Fc領域における192番目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニン（D192A）（SIRPαD1-Fc（N89A/D192A）、HY03MMと命名）に変異させる場合、HY03MMとFc受容体（CD16A、CD32、CD64）との結合活性は大幅に低減される。ヒト急性リンパ芽球性白血病および急性前骨髄球性白血病のマウスモデルを用いて、HY03Mの体内抗腫瘍効力を研究した結果、HY03Mは強力な抗腫瘍活性を有する。HY03M治療後のマウスは、腫瘍細胞の増殖が完全に抑制された。いくつのマウスは、腫瘍が検出されなかった。HY03MのFcが抗腫瘍活性に関与するかどうかを確認するために、ヒトリンパ腫のマウスモデルにおいて、HY03MおよびHY03MMの体内効力を比較研究し、リツキシマブと比較した。その結果によると、陰性対比群と比べて、HY03Mは、リツキシマブよりも優れる顕著な抗腫瘍効果を有することを示した。HY03MMは、顕著な腫瘍増殖抑制活性を有するが、HY03Mと比べて、その活性が大きく低下し、Fc領域がマクロファージのFc受容体に結合することによって、抗腫瘍活性に関与することを示唆した。
【００１１】
一実施形態では、本発明に係る組換えタンパク質はHY03M（SEQ ID No.: 5、SEQ ID NO.:6）である。HY03Mは強力な抗腫瘍活性を有し、その作用原理は2つの側面を含む：1）CD47-SIRPaの相互作用を阻害すること; 2）FcとFc受容体との結合によってマクロファージを活性化すること; HY03Mは、様々なターゲット陽性の腫瘍の治療に用いられる。
【００１２】
本発明は、コーディング組換え二機能性融合タンパク質の核酸分子、当該タンパク質を発現する発現担体、当該タンパク質を調製するための方法、およびCD47を過剰発現する疾患を治療する方法を提供する。
【００１３】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、ヒトIgG1のFcフラグメントに連結するシグナル調節タンパク質（SIRP）の膜外端にあるIg様ドメインを含む。ここで前記タンパク質とCD47との結合によって、CD47とマクロファージの表面SIRPとの結合を阻害し、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を活性化する。
【００１４】
一実施形態では、組換え二機能性融合タンパク質中のシグナル調節タンパク質はSIRPαであり、シグナル調節タンパク質の膜外端にあるIg様ドメインはSIRPαD1である。
【００１５】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、免疫グロブリン分子の一部であるFcフラグメントを含む。Fcフラグメントは抗原結合部位を有さないが、いくつかのエフェクターサブ機能に寄与する。例えば、種々の細胞上に抗体とFc受容体との結合および補体系との結合を補助する。一実施形態では、FcフラグメントはIgG1のFcフラグメントである。
【００１６】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、SEQ ID NO.:6と少なくとも95％の類似性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも98％の類似性を有する。一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも99％の類似性を有する。一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、SEQ ID NO.:6のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
一の実施形態において、本発明は、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。それは、ヒトIgG1のFcフラグメントに連結するシグナル調節タンパク質（SIRP）の膜外端にあるIg様ドメインを含む。前記タンパク質とCD47との結合によって、CD47とマクロファージの表面SIRPとの結合を阻害し、マクロファージによる腫瘍細胞の貪食を活性化する。
【００１８】
一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は、SIRPα、好ましくはSIRPαD1を含む組換え二機能性融合タンパク質をコードする。
【００１９】
一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は、IgのFcフラグメント、好ましくはヒトIgG1のFcフラグメントを含む組換え二機能性融合タンパク質をコードする。
【００２０】
一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO.:6と少なくとも95％の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換え二機能性融合タンパク質をコードする。一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも98％の類似性を有する。一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも99％の類似性を有する。一実施形態では、本発明に係るポリヌクレオチド分子は、SEQ ID NO.:6のアミノ酸配列を含む組換え二機能性融合タンパク質をコードする。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチド分子を含む発現担体を提供し、前記ポリヌクレオチド分子は組換え二機能性融合タンパク質をコードする。
【００２２】
一実施形態では、本発明は、本発明に係る発現担体を含む宿主細胞を提供する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質および少なくとも1つのアジュバントを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
一実施形態では、本発明は、CD47を過剰発現させることによって引き起こされる疾患を治療する方法を提供し、この方法は、患者または被験者に、治療有効量の本発明に係る医薬組成物を投与する工程を含む。一実施形態では、本発明は、CD47を過剰発現させることによって引き起こされる疾患を治療するための組換え二機能性融合タンパク質を提供する。
【００２５】
一実施形態では、本発明に係る方法によって治療される疾患は、骨髄性白血病（AML）、慢性顆粒球性白血病（CML）、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、乳癌、膵臓癌、および腎細胞癌から選択される。一実施形態では、本発明は、クローン病、髄質アレルギー性喘息、および関節リウマチを治療するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、SIRPおよびSIRPαD1-Fcの分子構造および作動模式図である。
【００２７】
【図２】図２は、SIRPα-Fcヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【００２８】
【図３】図３は、SIRPαD1-Fcヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【００２９】
【図４】図４は、HY03Mヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【００３０】
【図５】図５は、HY03MMヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【００３１】
【図６】図６は、4種類の融合タンパク質のSDS-PAGE電泳ダイアグラムである。
【００３２】
【図７】図７は、SIRPα-Fc、SIRPαD1-FcおよびPC-3の細胞ターゲットの結合活性の分析結果である。
【００３３】
【図８】図８は、非標識タンパク質の蛍光標識SIRPα-Fcに対するターゲット阻害活性分析である。
【００３４】
【図９】図９は、Fc受容体の結合活性およびマクロファージ誘発して腫瘍細胞に対する貪食活性である。
【００３５】
【図１０】図１０は、4種類の融合タンパク質の腫瘍に対する体内薬効である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、遺伝子組換え融合タンパク質に関する。２種類のメカニズムを介して、腫瘍を破壊する目的を達成できる。一つは、腫瘍細胞により誘発されるマクロファージの抑制的シグナルを阻害することであり、もう一つは、マクロファージによる貪食作用を直接に活性化することである。当該タンパク質は、ヒトシグナル調節タンパク質（Singal-regulatory proteins）alpha（SIRPα）の膜外端にある第１のIg様ドメイン（SIRPαD1）とヒトIgG1のFcフラグメントとを連結することによって形成される（SIRPαD1-Fc）。このタンパク質は、ホモ二量体に属し、90kDaの分子量を有する。細胞株をスクリーニングした後、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）を用いて当該タンパク質の安定な発現細胞株を調製し、振盪培養により100mgのタンパク質を調製した。 体外実験によると、当該タンパク質はCD47に結合できる。結合活性はSIRPα-Fcより著しく増加した。SIRPαD1におけるグリコシル化部位「NIT」を遺伝子改変によって除去する場合（N89A）（SIRPαD1-FC（N89A）、HY03Mと命名）、HY03MとターゲットCD47との結合活性をさらに強化する。Fc領域における211目のアミノ酸をアスパラギン酸からアラニン（D192A）（SIRPαD1-Fc（N89A/D192A）、HY03MMと命名）に変異させる場合、HY03MMとFc受容体（CD16A、CD32、CD64）との結合活性は大幅に低減される。ヒト急性リンパ芽球性白血病および急性前骨髄球性白血病のマウスモデルを用いて、HY03Mの体内抗腫瘍効力を研究した結果、HY03Mは強力な抗腫瘍活性を有する。HY03M治療後のマウスは、腫瘍細胞の増殖が完全に抑制された。いくつのマウスは、腫瘍が検出されなかった。HY03MのFcが抗腫瘍活性に関与するかどうかを確認するために、ヒトリンパ腫のマウスモデルにおいて、HY03MおよびHY03MMの体内効力を比較研究し、リツキシマブと比較した。その結果によると、陰性対比群と比べて、HY03Mは、リツキシマブよりも優れる顕著な抗腫瘍効果を有することを示した。HY03MMは、顕著な腫瘍増殖抑制活性を有するが、HY03Mと比べて、その活性が大きく低下し、Fc領域がマクロファージのFc受容体に結合することによって、抗腫瘍活性に関与することを示唆した。
【００３７】
本発明に係る融合タンパク質は、2つの部分、ターゲット結合フラグメント（即ち、SIRPαD1）およびFcフラグメントを含む。
【００３８】
本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質はまた、非ポリペプチド分子に結合して、分解の減少および/または半減期(half-life)の増加、毒性の低減、免疫原性の低下および/または生物学的活性の改善などの望ましい特性を達成することができる。そのような分子の例には、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリリジン、デキストランなどのポリマー；脂質;コレステロール基（例えば、ホルモン）;炭水化物またはオリゴ糖分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
Fcフラグメントは、ヒンジ領域における1つのシステイン、CH2領域における2つのシステイン、およびCH3領域における2つのシステインを含む232のアミノ酸であってもよい。ヒンジ領域におけるシステインは、2つのモノマー間のジスルフィド結合を形成して二量体を生成することに用いられる。CH2領域およびCH3領域におけるシスチンは、結合内のジスルフィド結合を形成してタンパク質を安定化することができる。
【００４０】
例えば、融合タンパク質において、CD47に結合できるSIPR（SIRPα、SIRPγ）膜の外端にあるIg領域を使用することができる。
【００４１】
好ましくは、非ヒト動物由来のタンパク質またはペプチドは強い免疫原性を有し、アレルギーおよび他の副作用をもたらすので、ヒト由来配列はヒトの癌の治療に使用することができる。しかしながら、他の動物性タンパク質またはペプチドも本発明の他の目的に使用することができる。
【００４２】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質における上記シグナル調節タンパク質は、SIRPαである。上記シグナル調節タンパク質の膜外端にあるIg様ドメインは、SIRPαD1である。
【００４３】
本発明は、任意の免疫グロブリンのFcフラグメントを使用することができる。免疫グロブリンにはIgG、IgA、IgM、IgD、およびIgAが含まれ、うちIgGは最も豊富で比較的安定である。 好ましくは、IgGのFcフラグメント、IgG1のFcフラグメント、およびヒトIgG1のFcフラグメントである。その原因は、これらのFcフラグメントがブドウ球菌タンパク質A(staphylococcus Protein A)との結合が最も高く、容易に精製されるためである。
【００４４】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、ヒトSIRPαの膜外端にある第1のIg様ドメインを含み、ヒトIgG1のFcフラグメントを介して連結する。
【００４５】
一実施形態では、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質のアミノ酸配列を図4B（SEQ ID NO.:6）に示す。別の実施形態では、上記組換え二機能性融合タンパク質は、SEQ ID NO.:6に記載の配列のポリペプチドを含む。別の実施形態では、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％または99％の類似性を有し、うち上記ポリペプチドはCD47に結合し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
【００４６】
本発明の別の態様では、単離された核酸分子を提供する。それは番号組換え二機能性融合タンパク質のポリヌクレオチドを含む。上記タンパク質は、SEQ ID NO.:6に記載の配列のポリペプチドを含む。一実施形態では、上記ポリペプチドのアミノ酸配列は、SEQ ID NO.:6と少なくとも80％、85％、90％、95％、98％または99％の類似性を有し、うち上記ポリペプチドはCD47に結合して、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
【００４７】
本発明はまた、前記組換え二機能性融合タンパク質および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、必要に応じて、１つ以上の担体または賦形剤をさらに含んでもよい。担体には、医薬品に一般的に見られる希釈剤、賦形剤、エキスパンダー、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、界面活性剤、吸着担体、潤滑剤などが含まれる。
【００４８】
この組成物は、治療又は予防上の有効な量のポリペプチドまたはタンパク質を含み、さらに薬学的に許容される物質および生理学的に許容される製剤材料が混入される。上記医薬組成物は、例えば、pH、浸透圧、粘度、透明度、色、臭気、無菌性、秩序、安定性、溶解または放出速度、組成物の吸着と浸透などの修飾、維持または保存のための製剤材料材料を含む。適切な製剤としては、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリジン）;抗微生物剤;酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは重亜硫酸ナトリウム）; 緩衝剤（例えば、ボロン酸、重炭酸アンモニウム、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸）；膨張剤（例えば、マンニトール、グリシン）、キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン）;充填剤;単糖類; 二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）; タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）;着色剤;調味料および希釈剤;乳化剤; 親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）;低分子量ペプチド;塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェニルエチルアルコール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）;溶剤（グリセロール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）;糖アルコール（マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、PLURONICS、PEG、ソルベート、ポリソルベート20やポリソルベート80などのポリソルベート類、トリトン（Triton）、トロメタミン（tromethamine）、レシチン（lecithin）、コレステロール（cholesterol）、tyloxapal）;安定性増強剤（スクロースおよびソルビトール）;張力性増強剤（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムおよび塩化カリウム、マンニトールソルビトール）;担体;希釈剤; 賦形剤および/または薬用補助材を含んでよい。
【００４９】
当業者は、計画された投与経路、伝送形態、および所望の投薬量に従って所望の医薬組成物を選択することができる。例えば、上記のRemington's Pharmaceutical Sciences,supraを参照されたい。これらの医薬組成物は、物理的状態、安定性、ポリペプチドの体内放出速度、および体内クリアランスに影響を及ぼす。例えば、適切な組成物は、注射用水、生理食塩水であってもよい。
【００５０】
医薬組成物中の主な担体は、水性であっても非水性であってもよい。例えば、適切な担体は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であり、他の一般的な注射可能な材料によって補充されてもよい。例えば、担体は中性緩衝液または生理食塩水と血清アルブミンとの混合物であってもよい。別の典型的な薬学的組成物は、Tris緩衝液または酢酸緩衝液を含み、それはソルビトールまたは適切な代替物をさらに含んでもよい。本発明の一実施形態では、保存を容易にするために、組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、選択可能な製剤（Remington's Pharmaceutical Sciences,supra）と混合することによって、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で調製することができる。さらに、治療用組成物は、スクロースのような適切な補助材を用いて凍結乾燥物として製剤化することができる。
【００５１】
上記製剤は、様々な方法で、例えば、吸入、経口または注射によって伝送することができる。非経口投与を考慮するとき、本発明に係る医薬組成物は、薬学的に許容される担体中に所望のポリペプチドを含む非経口的に許容される水溶液であってもよい。特に適切な非経口注射担体は、滅菌蒸留水であり、うちポリペプチドは保存に適した滅菌、等張溶液の態様で調製される。別の調製物は、マイクロスフェア、生物学的微粒子、ポリマー（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの製剤と所望の分子を含む。それは、製品のスローリリースおよび持続放出に用いられ、その後、デポー注入(depot injection)によって輸送される。また、ヒアルロン酸を使用することもできる。ヒアルロン酸は、血液循環中のスローリリース期間を促進する。所望の分子を導入するための他の適切な手段としては、移植可能な薬物伝送装置が挙げられる。
【００５２】
別の態様では、注射による投与に適した医薬製剤は、水性形態、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液、例えばハンクス液(Hanks'solution)、リンゲル液(Ringer's solution)、または生理学的緩衝液により調製される。注入水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。さらに、当該活性化合物懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な脂溶性溶媒または担体には、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどの合成脂肪酸エステルが含まれる。非脂質カチオン性アミノポリマーも伝送に使用することができる。場合により、懸濁液はまた、化合物の水溶性を増加させ、高濃度溶液の調製を可能にするために、適切な安定剤または製剤を含有してもよい。別の実施形態では、医薬組成物は、吸入用に製剤化することができる。吸入溶液はまた、エアロゾル伝送のための噴射剤の形態で調製されてもよい。別の実施形態では、溶液は噴霧されてもよい。肺の投与は、化学的に修飾されたタンパク質の肺の投与を記載しているPCT出願番号PCT/US94/001875にさらに説明されている。
【００５３】
特定の製剤が経口形態で投与されることが考えられる。本発明に係る一実施形態では、このように投与される分子は、錠剤およびカプセルに通常使用される担体のような固体剤形で調製されてもよく、または上記担体を含まなくてもよい。例えば、バイオアベイラビリティを最大限にし、プレシステムの分解を最小限にすることが望ましい場合に、胃腸管内の活性物質を放出するようにカプセルを設計することができる。アジュバントを含むことができ、それによって治療用分子の吸収が促進される。希釈剤、香料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、崩壊剤および錠剤用結合剤も使用することができる。経口医薬組成物は、当該分野で公知の医薬的に許容される適切な経口担体を用いて調製することができる。そのような担体は、錠剤、丸剤、顆粒カプセル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、シロップ、懸濁液などの形態で医薬組成物を投与させてもよい。
【００５４】
経口製剤は、活性化合物を固体賦形剤と（場合により、粉砕後に）混合し、粒子の混合物を処理して錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。必要に応じて、適切な添加物を加えることができる。適切な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質充填剤が挙げられる。例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖;トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモデンプンまたは他の植物;メチルセルロース、プロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース;アラビアゴムを含むビスコース;ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天およびアルギン酸またはその塩（例えばアルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤または溶解剤を添加することができる。
【００５５】
糖衣錠コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボマー、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタンを含むことができる濃縮糖溶液などの適切なコーティングと組み合わせてもよく、適切な有機溶媒または溶媒混合物。染料または顔料は、製品を識別または活性化合物の量すなわち投与量のを区別するために、錠剤または糖衣錠コアに添加されてもよい。
【００５６】
経口医薬製剤はまた、軟質の閉じたプッシュインカプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングでできたゼラチンを含む。プッシュインカプセルは、活性成分を含み、充填剤および結合剤（例えば、ラクトースおよびデンプン）、潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム）、および任意の安定剤と混合される。ソフトカプセルでは、活性化合物は、安定剤の添加の有無にかかわらず、脂肪油、液体または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁されてもよい。
【００５７】
スローリリースおよび持続放出製剤のためのポリペプチドを含む、追加の医薬組成物が含まれてもよいことは、当業者には容易に理解されるべきである。当業者はまた、リポソーム担体、生物学的微粒子または多孔性ビーズおよび長時間作用性注射などの、スローリリースおよび持続放出製剤の様々な他の手段にも精通している。例えば、PCT/US93/00829には、医薬組成物の伝送を制御するための多孔性ポリマー微粒子の放出が記載されている。スローリリース製剤のさらなる例には、物品の形状、粒子の形態のフィルムまたはマイクロカプセルのような半透膜ポリマーマトリックスが含まれる。スローリリースマトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（Langer et al., J. Biomed. Mater.Res., 15:167-277,(1981)；Langer et al., Chem.Tech., 12:98-105(1982)), エチレンビニルアセテート(Langer et al.,supra) またはpoly-D(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 133,988)、エチレンビニルアセテート（Langer et al.,supra）ポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）を含むことができる。スローリリース組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法によって調製することができるリポソームを含む。例えば、Eppstein et al.,PNAS(USA),82:3688(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949を参照されたい。
【００５８】
体内投与のための医薬組成物は、通常無菌である。これは、滅菌濾過膜による濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法は、滅菌または凍結乾燥の前または後に実施されてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液の形態で保存することができる。さらに、非経口組成物は、典型的には、皮下注射針によって穿孔することができるプラグを有する静脈注入バッグまたはボトルのような滅菌付属品を有する容器に入れられる。
【００５９】
医薬組成物が調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水または凍結乾燥粉末の形態で滅菌瓶に保存することができる。そのような製剤は、前投与の形態で、または再構成（例えば、凍結乾燥）の形態で保存されることができる。
【００６０】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を調製するためのキットに関する。上記キットは、乾燥タンパク質を有する第1の容器と、水性製剤を有する第2の容器とを含むことができる。本発明はまた、単一、複数チャンバの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびlyosyringes）を包含する。
【００６１】
治療のために使用される医薬組成物の有効量は、例えば、治療環境および対象に依存する。当業者にとって、治療のための適切な投与量レベルは、分子の伝送、ポリペプチドの使用の指標、投与経路、および患者の体格（体重、体表面または器官のサイズ）および状態（年齢および全般的健康状態）によって、部分的に異なることが理解される。したがって、臨床医は、最高の治療効果を達成するために用量を滴定し、投与経路を変更することができる。典型的な用量範囲は、上記要素に応じて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である。ポリペプチド組成物は、好ましくは、静脈内に注射または投与されてもよい。長時間作用性医薬組成物は、半減期および特定の製剤クリアランス速度に依存して、3〜4日ごと、毎週または2週間ごとに投与することができる。投与の頻度は、使用されるポリペプチドの薬物動態パラメータに依存する。典型的には、組成物は、所望の効果を達成するために達成される量まで投与される。したがって、組成物は、経時的に、または持続注入として、単一用量または複数用量（同一または異なる濃度/用量で）として投与されてもよい。適切な用量をさらに調節することができる。適切な用量は、適切な用量応答データを使用することによって決定することができる。
【００６２】
医薬組成物の投与経路は、例えば静脈内、腹腔内、脳（実質）、側脳室、筋肉内、眼内動脈、門脈、膀胱内経路、髄腔内、クモ膜下腔内を経由して注射し；経皮、皮下、または腹腔内を経由して注射し;および鼻腔内、腸、局所、舌下、尿道、膣または直腸手段がスローリリースシステムまたはインプラント装置を介することが挙げられる。所望であれば、上記組成物は、単一の急速静脈内または連続注入によって、または注入装置によって投与されることができる。代替的または追加的に、当該組成物は、局所的に投与され、膜、スポンジ移植、または所望の分子の吸着またはカプセル化のための他の適切な材料によって投与されることができる。任意の適切な組織または器官に移植することができ、拡散、タイミング放出、または連続投与によって所望の分子を伝送することができる移植デバイスを使用することができる。
【００６３】
いくつかの場合において、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質は、特定の細胞を移植することによって伝送することができる。上記細胞は、ポリペプチドを発現および分泌するように、ここに記載の方法によってトランスジェニックされる。これらの細胞は、自己、同種または異種で発現し得る動物またはヒト細胞である。あるいは、不死化細胞であってもよい。免疫応答の機会を減らすために、これらの細胞を閉鎖して周囲の組織の浸潤を回避する。閉鎖用材料は、典型的には、生体適合性の半透性ポリマーシェルまたは膜である。それは、ポリペプチド生成物の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織を取り囲む他の破壊因子による細胞への損傷を防ぐことができる。
【００６４】
また、本発明に係る組換え2機能性融合タンパク質またはその誘発体をコードする核酸分子を被験体に直接導入する体内遺伝子治療を行うことも可能である。例えば、一つの核酸は、一つの二機能性融合タンパク質をコードする。必要に応じて、アデノ随伴ウイルス担体のような伝送担体を使用して、核酸の局所注射によって、本発明に係る組換え二機能性融合タンパク質をコードする核酸配列をターゲット細胞に導入する。別のウイルス担体としては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルス担体が挙げられるが、これらに限定されない。当該ウイルス担体の体内物理伝送は、所望の核酸構築物または所望の核酸配列、リポソーム媒介性移入、直接注射（裸のDNA）または粒子銃（遺伝子銃）を含む他の伝送担体の局所注射によって、達成することができる。
【００６５】
本発明に係る組成物は、有効性を改善するか、または潜在的な副作用を低減するために、単独で、または他の治療剤と組み合わせて使用することができる。
【００６６】
本発明の別の目的は、上記組換え二機能性融合タンパク質を調製する方法およびそれを含む医薬組成物を提供することである。一実施形態では、この方法は、（1）コードに用いるポリヌクレオチド分子を提供すること;（2）（1）に記載のポリヌクレオチド分子を含む発現担体を構築すること; 3）適切な宿主細胞を（2）に記載の発現担体でトランスフェクションまたは形質転換し、宿主細胞で培養してタンパク質を発現させること;および（4）前記タンパク質を精製することを含む。この調製は、当業者の技法によって行うことができる。
【００６７】
本発明の別の目的は、本発明に係る医薬組成物を用いて癌を治療する方法を提供することであり、患者または対象に上記医薬組成物の有効量を投与することを含む。一の実施形態において、上記医薬組成物は、CD47の発現に関連する腫瘍または癌を治療する。急性骨髄性白血病（AML）、慢性顆粒球性白血病（CML）、急性リンパ性白血病（ALL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、多発性骨髄腫（MM）、膀胱癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸癌、乳癌、膵臓癌および腎臓癌を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
一実施形態では、CD47の過剰発現に関連する疾患は、クローン病、アレルギー性喘息、関節リウマチを含むが、これらに限定されない。
【００６９】
一方、本発明は、組換え二機能性融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、および該組換え二機能性融合タンパク質を発現する発現担体を提供する。担体の例には、プラスミド、ウイルス担体、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、人工染色体（TAC）、哺乳動物人工染色体（MAC）および追加の人工染色体（HAEC）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明は、上記発現担体を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、発現担体で形質転換またはトランスフェクトすることができる。適切な宿主細胞には、大腸菌、酵母および他の真核生物が含まれる。好ましくは、大腸菌、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、COSまたはCHO）を使用する。
【００７１】
本発明は、非限定的な例として、さらに詳細に記載される。
【００７２】
実施例
実施例１：
実験材料および方法
【００７３】
1.1、SIRPα-FcおよびSIRPαD1-Fc発現担体の構築
【００７４】
発現担体はpIg-Tail（R＆D Systems）であった。プライマー1（SEQ ID No.: 9）およびプライマー2（SEQ ID No.: 10）、プライマー1（SEQ ID No.: 9）およびプライマー3（SEQ ID No.: 11）を使って、SIRPαの膜外端およびSIRPαD1の遺伝子番号配列をTHP-1（ATCC（登録商標） TIB-202TM）から増幅した。PCR産物は、改変済のpIg-Tail担体のHindIII/EcoRI部位にそれぞれクローニングし、pSIRPα-FcおよびpSIRPαD1-Fc担体を形成した。
【００７５】
1.2、HY03MおよびHY03MM発現担体の構築
【００７６】
N89A変異体を持つSIRPαD1遺伝子配列は、南京合成GenScript社（商品番号：7009323‐1）に送られ、合成された遺伝子は、pIg-Tail担体のHindIII/EcoRI部位にそれぞれクローニングし、HY03M発現担体を形成する。プライマー4（SEQ ID No.: 12）およびプライマー5（SEQ ID No.: 13）を使って、固定部位突然変異PCRによって、HY03MのFc端192部位でコードされたアスパラギン酸の遺伝子配列（GAC）をアラニンコーディング配列（GCC）に突然変異させた。よって、HY03MM発現担体を得た。
【００７７】
表1、PCRプライマー
【００７８】
【表１】
0006682554.tif 000002
【００７９】
注：斜体は遺伝子特異的配列を表し、下線はエンドヌクレアーゼ認識配列を表す。
【００８０】
2、タンパク質の発現および精製
【００８１】
CHO細胞を含有する完全培地（DMEM、10％FBS）を24ウェル培養プレートに加え、ウェル当たり0.5mlで、培養プレートを細胞インキュベーター内で24時間インキュベートした。トランスフェクトされると、
0.5μgのプラスミドDNAおよび2μlのリポソーム2000（Cat＃11668-027、Invitrogen）を50μlの無血清培地に溶解し、一緒に混合し、室温で20分間放置し、次いで細胞ウェルにゆっくりと加え、細胞培養プレートを細胞インキュベーターに戻して24時間インキュベートした。2日目に、タンパク質発現は、100μlの酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によって検出された。
【００８２】
3、タンパク質発現の検出
【００８３】
タンパク質の発現はELISAによって検出した。具体的なステップは：ヒトIgGヤギ抗体F（ab'）の2つのフラグメント（Biosource International Inc）をPBSリン酸緩衝液に溶解し、次いでウェルあたり20ngで96ウェルELISAアッセイプレートに添加し、次いでELISAプレートを4度の冷蔵庫に入れて一晩置いた。測定の時、封鎖液（PBS、0.05％トゥイーン20,3％無脂肪乳）で１時間封鎖し、次いで希釈した上清を添加して室温で1時間インキュベートし、洗浄液（PBS、0.05％トゥイーン20）で５回洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で標識したヒトIgG Fcフラグメントに対するサギ抗体（Jackson ImmunoResearch Lab）を添加して室温で1時間インキュベートし、5回洗浄した後にHRP基質を添加し、2分間の反応後、停止溶液（1N H2SO4）の添加により反応を停止させ、450nmの波長で光密度を測定した。
【００８４】
4、安定した細胞株の選択
【００８５】
遺伝子トランスフェクト細胞は、濃度増加した抗生物質の圧力増加選択（Genetinin、Cat＃10131035、Invitrogen）によって、不安点な細胞が徐々に殺された。残りの生存細胞は、希釈後に5個の96ウェル細胞培養プレートに添加された。各ウェルは0.5〜1個の細胞を含む。プレートを細胞培養インキュベーターに入れて10-15日間培養し、次いでELISAで単一細胞クローンを含むウェルを測定し、その後、陽性発現された細胞を拡大培養し、無血清Ex-CELL CD CHO培地(Cat＃14361C-1000ML,SIGMA)を使って徐々に馴化培養した。さらなる選択の後、最も高い発現レベルを有する細胞株を凍結保存のために選択した。
【００８６】
5、タンパク質の生産と精製
【００８７】
発現された細胞株（3×105/ml）を無血清培地300mlを含む2リットルの振盪瓶に接種し、振盪瓶をシェーカーに入れて培養し、細胞の密度が5x106/mlまで成長した後に培養上清を取得した。 Protein Aカラムによって精製を行い、精製したタンパク質が透析を経てPBS（pH7.0）に置換された。タンパク質電気泳動分析の後、タンパク質純度が98％以上であることを確保する。
【００８８】
6、ターゲット結合活性：
【００８９】
フローサイトメトリーによって、SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03MのターゲットCD47との結合活性をそれぞれ測定した。
【００９０】
CD47との結合活性の測定は、それぞれ2種類の細胞であるPC-3細胞とJurkat細胞を用いた。前者はヒト前立腺癌細胞に属し、後者はTリンパ球性白血病細胞である。細胞は、PBSで洗浄した後にPBSに懸濁させ、細胞濃度を1×106/mlに調整し、細胞懸濁液にHIgG（1μg/ml）を添加し、4度の冷蔵庫で1時間インキュベートし、PBSで洗浄した後、ウェルあたり100μlで細胞を96ウェルU形の細胞培養プレート（Cat#163320，NUNC）に移行し、次いで異なる濃度の精製タンパク質を添加し、4度の冷蔵庫で1時間インキュベートし、PBSで洗浄した後にPBSに懸濁させ、FITC標識した抗ヒトIgG-Fc抗体（Cat#F9512,Sigma）とインキュベートし、1時間後にフローサイトメトリー（Guava easyCyte 6HT-2L、Millipore）で分析測定した。
【００９１】
7、ターゲットブロックテスト
【００９２】
結合各精製タンパク質がCD47-SIRPαの結合に対して阻害する効果があるかどうかを検出するために、FITC標識したSIRPα-FC（Cat#4546-SA-050、R＆D Systems）タンパク質（100nM）を利用して、標識されていない、異なる濃度を有するSIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03M、HY03MMおよびhIgG-Fcタンパク質と一緒に混合し、次いでJurkat細胞を含有する96ウェルU形の細胞培養プレートに添加し、4度の冷蔵庫で1時間インキュベートし、PBSで洗浄した後に200mlのPBSに再懸濁させ、異なる濃度条件下の蛍光陽性細胞の割合をフローサイトメトリーで分析した。
【００９３】
8、FcγR結合テスト
【００９４】
異なるFcγRタンパク質との結合活性は、ELISA法によって検出した。具体的な方法は次のとおりです。
【００９５】
コーティング緩衝液CBS（Sigma-Aldrich Co.,Product code:1001329288 C3041-100CAP）を使って、CD64（FcγRI）（Cat：1257-FC-050, R＆D Systems）、CD32a（FcγRIIa）（Cat：1330-CD-050/CF, R＆D Systems）、CD32b（FcγRIIbと）（Cat：1875-CD-050, R＆D Systems）、CD16a（FcγRIIIa）（Cat：4325-FC-050, R＆D Systems）を1000ngに希釈し、ウェルあたり100ngで100μlをELISAプレート（Cat＃442404, NuncTM）に添加し、コーティングプレートを4度冷蔵の冷蔵庫で一晩置いた。測定する時、コーティングプレートを0.05％のPBS-Tで1回洗浄し、室温で3％スキムミルクで1時間封鎖した。希釈済のHY03MおよびHY03MMタンパク質（800,400,200nM）をウェルあたり100μlでコーティングプレートに添加した。室温で1時間インキュベーションした後、試料を廃棄し、0.05％PBS-Tで5回洗浄し、次いで希釈（1:20000）した100ulのHRP-Rabbit Anti-Human IgG Fc(Cat#:309-036-008,Jackson ImmunoResearch Lab)を添加し、室温で1時間インキュベートし、洗浄溶液で5回洗浄し、HRP基質を添加し、暗室で10〜20分間発色反応をした後、1NH2SO4で発色反応を停止させ、マイクロプレートリーダーでOD450値を読み取る。
【００９６】
9、マクロファージ貪食テスト
【００９７】
マウスマクロファージ（Raw264.7）をウェルあたり5万個の細胞で96ウェル細胞培養プレートに添加し、37度のインキュベーターで2時間培養した。CFSE（2.25uM）で標識したJurkat細胞を、2.5ug/mlのHY03M、HY03MM、およびIgG-Fcと一緒に、37℃で30分間インキュベートし、次いで、RAW264.7細胞を含有するプレートに移し、引き続き37度でインキュベーションし、PBSでの3回洗浄を経て、遊離しているJurkat細胞を洗い流し、フローサイトメトリーでRaw264.7細胞中のCFSEシグナルを分析した。
【００９８】
10、抗腫瘍テスト
【００９９】
HL60皮下腫瘍モデルを用いて、先ずはHY03Mの抗腫瘍活性を研究した。20匹のBalb/cヌードマウスに白血病（HL60）細胞を皮下注射した。各マウスに4×106個の細胞を注射した。腫瘍が100-150mm3まで成長した時、ランダムに3群に分けた。第1の群に対してはPBSを腹腔内注射し、第2の群に対してはVEGF阻害剤（VEGF inhibitor）を注入し、第3の群に対してはHY03Mを腹腔内注射した。各群の用量は共に10mg/kgで、週2回で、継続的に6回投与した。腫瘍体積と体重を週2回測定した。
【０１００】
Fc端が抗腫瘍活性に関与するかどうかを分析するために、リンパ腫モデルを使用してHY03MとHY03MMの抗腫瘍活性を分析し、セラリツキシマブ（Rituximab）と比較した。38匹のBalb/cヌードマウスにリンパ腫細胞（Daudi）を皮下注射した。各マウスに1×107個の細胞を注射した。腫瘍が100-150mm3まで成長した時、ランダムに5群に分けた。第1の群に対してはPBSを腹腔内注射し、第2の群に対してはHY03Mを腹腔内注射し、第3の群に対してはHY03MMを腹腔内注射し、第4の群に対してセラリツキシマブを腹腔内注射し、第5の群に対してはHY03MMおよびセラリツキシマブを腹腔内注射した。各群の用量は共に5mg/kgで、週2回で、継続的に8回投与した。腫瘍体積と体重を週2回測定した。
【０１０１】
実験結果
1、発現担体の構築
【０１０２】
図１Ｂ及び図１Ｄに示すSIRPαD1-Fcの設計構造は、分子クローニング技術によって、SIRPαD1をヒトIgG1-Fcのアミノ末端に連結さした。各タンパク質のDNAおよびアミノ酸配列を図２−５に示す。そのうち、SIRPα-Fcの遺伝子コーディング配列は、1752個のヌクレオチドからなる（図２Ａ）（SEQ ID No.: 1）。583個のアミノ酸をコードし（図２Ｂ）（SEQ ID No.: 2）、そのうち、1047個のヌクレオチドがSIRPαをコードし、696個のヌクレオチドがFcをコードし、6個のヌクレオチドがEcoRI酵素の切断部位である。SIRPαD1-Fcの遺伝子コーディング配列は、1131個のヌクレオチドからなる（図３Ａ）（SEQ ID No.: 3）。合計、376個のアミノ酸をコードした（図３Ｂ）（SEQ ID No.:4)。426個のヌクレオチドがSIRPαD1をコードし、696個のヌクレオチドがFcをコードし、6個のヌクレオチドがEcoRI酵素の切断部位である。HY03MとHY03MMは、共に1125個のヌクレオチドを含む。そのうち、HY03MはN89A変異を含み（図４Ａ、４Ｂ）（SEQ ID No.:5&No.:6）、HY03MMはN89AおよびD192A二重変異を含む（図５Ａ、５Ｂ）（SEQ ID No.:7&No.:8）。
【０１０３】
2、タンパク質発現の分析
【０１０４】
4種類のタンパク質の理論的分子量は、それぞれSIRPα-Fc：〜128kDa、SIRPαD1-のFc：〜82.7kD、HY03M：〜82.3kDa、HY03MM：〜82.3kDaである。タンパク質電気泳動（SDS-PAGE）により分析を行ったところ、非還元条件下で、タンパク質の分子量は、共に理論分子量より大きい（図6）。これはタンパク質のグリコシル化により起因されるかもしれない。その原因は、SIRPαD1領域においてアスパラギンにリンクされたグリコシル化部位があるためである。不規則なグリコシル化された当該部位は、SIRPα-Fcが還元条件下でSDS-PAGEゲル上に二つのバンドを現れる原因となる可能性が高い（図6B）。グリコシル化された当該部位を除去した後、（HY03MおよびHY03MM）という二つのバンドが一つのバンドになったからである（図6C、6D）。
【０１０５】
3、ターゲット結合活性の分析
【０１０６】
フローサイトメトリーを利用して、先ずはSIRPα-FcおよびSIRPαD1-FcとPC-3細胞との結合活性を比較分析した（図7A）。SIRPαD1-Fcの結合活性（EC50 = 12.63nM）が著しくSIRPα-Fc（EC50=6.57nM）より高いことが分かった。以前の研究によると、D1領域がグリコシル化されるか否かがD1とCD47との結合に影響しない（Lee WY et al.,2007）。D1領域におけるN89をN89A（変異体をHY03Mと命名）に変異させて、HY03MおよびSIRPαD1-FcとCD47との結合活性を比較分析したところ（図7B）、グリコシル化された部位を除去した後、HY03Mのターゲット結合活性（EC50=0.5nM）は、顕著にSIRPαD1-FC（EC50=1.0nM）よりも高いことが分かった。結論：この研究により、D1領域のみを含有するタンパク質は、全体の膜外端を含有するタンパク質と比べて、ターゲット活性がより優れる。グリコシル化された部位を除去した後のD1領域は、ターゲット活性がより優れる（ターゲット活性：HY03M>SIRPαD1-Fc>SIRPα-Fc）。
【０１０７】
4、ターゲット阻害活性の分析
【０１０８】
フローサイトメトリーによって、非標識タンパク質（SIRPα-Fc、SIRPαD1-Fc、HY03M、HY03MM）の蛍光標識されたSIRPα-Fcタンパク質とターゲットとの結合活性への影響を分析した。結果によると（図8）、4種類のタンパク質が用量依存的に、蛍光標識タンパク質とターゲット細胞（Jurkat）との結合を阻害することができる。そのうち、SIRPαD1-Fcおよび好ましくHY03Mによる阻害効果が最も優れる（図8下表）。
【０１０９】
5、HY03MおよびHY03MMとFcγRsとの結合活性がマクロファージの貪食活性への影響
【０１１０】
ヒトIgG1-Fc領域における265目部位にアスパラギン酸（D）があり、抗体が機能する過程で重要な役割を果たす。アスパラギン酸をアラニン（D265A）に変異させた場合、IgGは、FcγR（FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA）との結合活性（Shields RL,et al.,2001）および対応するADCC、CDC等の活性がほぼ完全損失してまう。HY03MにおけるFcが抗腫瘍活性に関与するかどうかを試験するために、Fc領域における対応する部位にあるアスパラギン酸をアラニン（HY03MM、D192A）に変異させ（図5B）、HY03MおよびHY03MMとFcyRs（FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA）との結合活性を比較分析した。結果によると（図9A）、変異後のタンパク質（HY03MM）とFcγRとの結合活性は、著しくは降下し、特にFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAとの結合活性は、顕著に降下した。
【０１１１】
変異体がマクロファージ活性への影響を分析するために、蛍光（CFSE）標識したターゲット細胞(Jurkat)とマクロファージ細胞（Raw264.7）をそれぞれHY03MおよびHY03MMと共に培養した。結果によると（図9B）、隠性対比（IgG）に比べて、HY03Mはマクロファージの貪食活性を顕著に促進した一方、変異体HY03MMは当該活性を失っていた。IgGにより誘発された貪食活性との差異がない。
【０１１２】
上記研究によると、単にCD47とSIRPαとの相互作用（例えばHY03MM）を阻害するのが、マクロファージによるターゲット細胞への貪食活性の誘発には不十分である。マクロファージの貪食活性を完全に活性化するには、Fcとクロファージの細胞膜表面のFcγRsとの相互作用に同時に頼らなければならない。
【０１１３】
6、HY03MおよびHY03MMの体内抗腫瘍活性
【０１１４】
HL60皮下腫瘍モデルを用いて、まずはHY03Mタンパク質の体内抗腫瘍活性を研究した。図10Aに示すように、VEGFの阻害剤で処置された腫瘍を有するマウスは、腫瘍増殖が顕著に抑制されなかった。HY03M治療群では、腫瘍増殖が顕著に抑制された。腫瘍サイズは、治療開始時の100mm3から徐々に収縮し、実験終了までにほぼ完全に消えた。陰性対比群におけるマウスの腫瘍体積は、経時的に徐々に増加し、実験終了までに腫瘍体積が1000mm3と高かった。当該実験結果は、単にVEGFの活性を抑制するのが、HL60腫瘍への有意な治療作用がないこと、VEGFに対するHL60腫瘍の増殖依存性が強いことを示す。しかし、腫瘍細胞により誘発されたマクロファージの貪食活性の抑制機能を阻害すれば、マクロファージにより腫瘍細胞への貪食を増強し、ひいては腫瘍細胞を破壊する。
【０１１５】
Fc領域がHY03Mの抗腫瘍活性に関与するかどうかを調べるために、リンパ腫（Daudi）モデルを利用して、HY03M、HY03MM、及びリツキシマブ（Rituximab）によるリンパ腫への治療作用を研究した。結果によると（図10B）、HY03Mの治療を経た群では、腫瘍増殖が顕著に抑制された（TGI=72.5%）。抑制効果は、明らかにリツキシマブよりも優れた（TGI=45.6%）。一方、Fc突然変異を持つHY03MMによる腫瘍増殖への抑制活性は、大いに削減されてしまった（TGI=26.4％）。Fc領域が実際にHY03Mタンパク質の抗腫瘍活性に関与していることが示された。
【０１１６】
当該実験によると、HY03Mによる腫瘍への治療原理は２つの側面を含む。一側面では、CD47とSIRPαとの結合を阻害することによって、SIRPαにより伝達された抑制性シグナルを阻害して受動的にマクロファージを活性化した。他側面では、FcとFcγRとの結合によって、能動的にマクロファージを活性化した。
【０１１７】
結論
この研究によると、遺伝子組換えFc融合タンパク質SIRPαD1-Fcは、良好なターゲット結合活性を有し、その活性がSIRPα-Fcよりも顕著に優れた。グリコシル化部位（HY03M）の除去後、ターゲット活性はさらに改善された。体内研究によると、HY03Mタンパク質が強い抗腫瘍活性を有し、HL60モデルについて、腫瘍を完全に排除する効果を達成した。当該タンパク質の主な抗腫瘍メカニズムは、２つの側面を含む。一側面では、FcとFcγRsとの結合を阻害することによって、SIRPαにより伝達された抑制的シグナルを阻害して受動的にマクロファージを活性化した。他側面では、CD47とSIRPαとの結合によって、能動的にマクロファージを活性化した。これら２つのメカニズムは、互いに協力して、マクロファージによる腫瘍細胞への貪食を完全に活性化し、クロファージがさらに腫瘍抗原をTリンパ細胞（Tseng D,et al.,2013）に交差伝達して、最終的には腫瘍細胞を破壊した。
【０１１８】
上述したように、SIRPα-FcおよびSIRPαD1-FcとCD47との結合活性については、以前に報告されたことがある（Lee WY et al，2007）。しかし、両者とターゲットCD47との親和活性には差異がない。本願の研究結果によると、SIRPαD1-FcとCD47との親和活性（PC-3細胞）（EC50=6.57nM）は、SIRPα-FC（EC50=12.63nM）より著しく高かった。アミノ酸配列を分析したところ、Lee WY et alにより構築された担体と比べて、本願のSIRPαD1-Fcタンパク質は、アミノ末端において9個のアミノ酸（SCAWSGVAG）が増加した。これは、ターゲット活性が増加した原因の一つかもしれない。さらに研究したところ、D1領域におけるグリコシル化部位（N89A）の除去後に、ターゲット活性がさらに増強されることを見出した。さらに、Fc領域における固定部位を突然変異（D192A）によって、Fcがタンパク質の精製（プロテインAによるアフィニティーおよびクロマトグラフィーにより）およびタンパク質の安定性に役立つだけではなく、HY03Mの抗腫瘍活性にも関与するため、D192A突然変異体による抗腫瘍活性は大幅に減少した。
【０１１９】
本発明は、1つ以上の実施形態によって説明したが、本発明は実施例に限定されるものではない、この説明は、添付した特許請求の範囲に含まれる全ての代替、改変および均等物をカバーする意図が理解される。すべての参考文献および文字で言及された特許および文献は、その全体が参照により本発明に組み込まれる。
【０１２０】
参考文献
【０１２１】
1.Gardai SJ,McPhillips KA,Frasch SC,Janssen WJ,Starefeldt A,Murphy-Ullrich JE,Bratton DL,Oldenborg PA,Michalak M,Henson PM.Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte.Cell.2005；123:321−334.
【０１２２】
2.Obeid M,Panaretakis T,Joza N,Tufi R,Tesniere A,van Endert P,Zitvogel L,Kroemer G.Calreticulin exposure is required for the immunogenicity of gamma-irradiation and UVC lightinduced apoptosis.Cell Death Differ.2007；14:1848−1850.
【０１２３】
3.Orr AW,Pedraza CE,Pallero MA,Elzie CA,Goicoechea S,Strickland DK,Murphy-Ullrich JE.Low density lipoprotein receptor-related protein is a calreticulin coreceptor that signals focal adhesion disassembly.J Cell Biol.2003；161:1179−1189.
【０１２４】
4.Theocharides,A.P.A.；Jin,L.Q.；Cheng,P.Y.；Prasolava,T.K.；Malko,A.V.；Ho,J.M.；Poeppl,A.G.；Rooijen,N.van；Minden,M.D.；Danska,J.S.；Dick,J.；Wang,J.C.Y.J.Exp.Med.2012 Vol.209 No.10 1883-1899
【０１２５】
5.Lee WY et al.Novel Structural Determinants on SIRPa that Mediate Binding to CD47.J Immunol 2007；179:7741-7750.
【０１２６】
6.Shields RL et al.High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for Fc RI,Fc RII,Fc RIII,and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcgR.JBC.2001,276:6591-6604.
【０１２７】
7.Tseng D,et al.Anti-CD47antibody−mediated phagocytosis of cancer by macrophages primes an effective antitumor T-cell response.PNAS.2013,110:11103−11108
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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