(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定のためのＤＮＡ鎖の製造方法であって、
ａ）第１標的ＤＮＡ配列に対して３′側の第１アダプターと、第１標的ＤＮＡ配列に対して５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列を含む、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドを提供する工程、ここで該鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは支持体上に固定されている；
ｂ）第１プライマーと、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドとを組合し、そして前記第１アダプターにおける第１プライマー結合配列に対して前記第１プライマーをハイブリダイズする工程、ここで前記第１プライマーは、固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドと組合される場合、支持体上に固定されていない；
ｃ）第２鎖を生成するために、１つ以上のＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第１プライマーを延伸する工程、ここで前記第２鎖は、前記第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列、及び前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的な配列を含む；
ｄ）第２プライマーと、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドとを組合し、そして第２プライマー結合配列に対して第２プライマーをハイブリダイズする工程、ここで前記第２プライマー結合配列は前記第１プライマー結合配列に対して３′側に存在し、前記第２プライマーは、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドと組合される場合、支持体上に固定されていない；そして
ｅ）第３鎖を生成するために、前記第２プライマーを延伸する工程、ここで前記延伸が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第２鎖を部分的に置換し、それにより、
（ｉ）前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされる、ハイブリダイズされた部分、及び
（ｉｉ）前記第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列、及び前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列を含む未ハイブリダイズオーバーハング部分（該未ハイブリダイズ部分は前記ハイブリダイズされた部分に対して第２鎖において５′側に存在する）、
を有する部分的にハイブリダイズされた第２鎖を生成することを含み、ここで前記延伸が、第３鎖が第２鎖を完全には置換しないようにコントロールされた条件下で行われる；
を含む方法。
【請求項２】
ｆ）前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第２鎖における配列に対して配列決定オリゴヌクレオチドをハイブリダイズする工程；及び
ｇ）前記第１標的ＤＮＡに対して相補的である配列の少なくとも一部を決定する工程；
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鋳型ＤＮＡ鎖が、工程ｃ）において第１アダプターとハイブリダイズされる第１プライマーを延伸することによってシークエンシングされる、請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記鋳型ＤＮＡが、更に、第１アダプターに対し３´側に第３アダプター、及び第１アダプターと第３アダプターとの間に割り込んだ第２標的ＤＮＡ配列を有し、前記第１アダプター、第２アダプター、及び第３アダプターは、同じヌクレオチド配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のＤＮＡポリメラーゼ、及び鎖置換活性を有する前記ＤＮＡポリメラーゼが、同じポリメラーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２プライマーがハイブリダイズされる前記第２プライマー結合配列が、前記第１アダプターに存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドが前記第３アダプターを含み、そして前記第２プライマー結合配列が前記第３アダプターに存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡコンカテマーを含み、そして前記第１標的ＤＮＡ配列及び第２標的ＤＮＡが同じヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１プライマー及び第２プライマーが同じ反応においてハイブリダイズされるか、又は延伸される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡコンカテマーを含み、そして前記第１プライマー及び第２プライマーが同じヌクレオチド配列を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）において、複数の第２プライマー結合配列に対して複数の第２プライマーをハイブリダイズし、ここで前記複数の第２プライマーが延伸可能及び延伸不可能プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２プライマーの延伸が５、１０、２０、３０、４０又は６０分の固定時間間隔で終結され、そして延伸が化学的終結及び／又はｄｄＮＴＰの付加により終結される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第３鎖を生成するためへの第２プライマーの延伸が、温度、酵素濃度、及びプライマー濃度により制御される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
各鋳型ＤＮＡがアレイ、ビーズ、ウェル又は液滴上に付着される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記配列決定が、合成、パイロシーケンシング、又は連結による配列決定により配列決定される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
個別領域のアレイを含む支持体である、ＤＮＡ複合体のアレイであって、
（ａ）複数の前記個別領域が、一本鎖ＤＮＡコンカテマーを含み、各コンカテマーは複数のモノマーを含み、各モノマーは標的配列及びアダプター配列を含み；
（ｂ）（ａ）におけるＤＮＡコンカテマーの少なくとも一つのサブセットの複数のモノマーの個々が、
（ｉ）部分的にハイブリダイズされた第２ＤＮＡ鎖、ここで各第２鎖ＤＮＡは標的配列に対して相補的な部分及びアダプター配列の少なくとも一部に対して相補的な部分を含み、そして第２鎖の一部がコンカテマーにハイブリダイズされず、そしてアダプター配列の少なくとも一部に対して相補的な第２鎖の一部がアダプター配列にハイブリダイズされる、及び
（ｉｉ）標的配列に対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分を含む第３ＤＮＡ鎖、
を含み；そして
（ｃ）（ｂ）の複数のモノマーの少なくとも一つのサブセットの個々がハイブリダイゼーション部位で第２ＤＮＡ鎖に対してハイブリダイズされた第４ＤＮＡ鎖を含み、ここで前記第４ＤＮＡ鎖がアダプターの配列の少なくとも一部を含み、そして前記ハイブリダイゼーション部位がアダプター配列の少なくとも一部に対して相補的である；
ＤＮＡ複合体のアレイ。
【請求項１７】
個別領域のアレイを含む支持体である、ＤＮＡ複合体のアレイであって、
（ａ）複数の前記個別領域が、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡのクローンクラスターを含み、各ＤＮＡは、第１アダプター及び第２アダプターを端に有する標的配列を含み；
（ｂ）（ａ）におけるクラスターの少なくとも一つのサブセットの複数のＤＮＡの個々が、
（ｉ）部分的にハイブリダイズされた第２ＤＮＡ鎖、ここで各第２鎖ＤＮＡは標的配列に対して相補的な部分及び第１アダプター配列の少なくとも一部に対して相補的な部分を含み、そして標的配列に対して相補的な第２鎖の一部がＤＮＡにハイブリダイズされず、そして前記第１アダプターの少なくとも一部に対して相補的な第２鎖の一部がＤＮＡにハイブリダイズされる、及び
（ｉｉ）標的配列に対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分、及び前記第２アダプターに対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分を含む第３ＤＮＡ鎖、
を含み；そして
（ｃ）（ｂ）の複数のＤＮＡの少なくとも一つのサブセットの個々がハイブリダイゼーション部位で第２ＤＮＡ鎖に対してハイブリダイズされた第４ＤＮＡ鎖を含み、ここで前記第４ＤＮＡ鎖が、前記第２アダプターの配列の少なくとも一部を含み、そして前記ハイブリダイゼーション部位が、第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である；
ＤＮＡ複合体のアレイ。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載のアレイ、並びにＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される酵素を含み、ここで該ＤＮＡポリメラーゼは鎖置換活性を有する、組成物又はシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／１１７、３９１号（２０１５年２月１７日に出願された）及び第６２／１９４、７４１号（２０１５年９月２０日に出願された）に対する優先権を主張する。上記仮出願のそれぞれの全内容は、参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＤＮＡ配列決定、ゲノミクス及び分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
核酸配列決定及び再配列決定のための低コストで高スループットの方法の必要性が、「超並列配列決定（massively parallel sequencing）」（ＭＰＳ）技法の開発につながっている。そのような配列決定法の改善は、化学、医学、農業において大きな価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、核酸配列決定（例えば、ゲノムＤＮＡ配列決定）に関する。１つの側面によれば、一本鎖ＤＮＡ、例えばＤＮＡコンカテマー（例えば、ＤＮＡナノボール又はＤＮＢ）のペアエンドシーケンシング法が提供される。典型的には、配列決定されるＤＮＡは、標的配列、及び少なくとも１つのアダプター配列を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、支持体上に固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して相補的なＤＮＡ鎖の生成方法に関し、ここで前記鋳型ＤＮＡは、第１標的ＤＮＡ配列の３′側の第１アダプターと５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列を含む。前記方法は、第１アダプターにおける第１プライマー結合配列に対して第１プライマーをハイブリダイズし；第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列、及び第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的な配列を含む第２鎖を生成するために、第１ＤＮＡポリメラーゼを用いて第１プライマーを延伸し；第２プライマー結合配列に対して第２プライマーをハイブリダイズし；そして第３鎖を生成するために鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて第２プライマーを延伸することを含む。前記第３鎖は、前記第２鎖を部分的に置換し、そして部分的にハイブリダイズされた第２鎖を生成し、ここで前記部分的にハイブリダイズされた第２鎖は、１）前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされる、ハイブリダイズされた部分、及び２）前記第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列、及び前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列を含む末ハイブリダイズオーバーハンク部分を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ鋳型ポリヌクレオチドは、第１アダプターの３′側にある追加のアダプター、すなわち第３アダプター；及び追加の標的ＤＮＡ配列、すなわち第１アダプターと第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡを含む。１つの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは第３アダプターを含み、そして第２プライマー結合配列は第３アダプターに存在する。別の実施形態によれば、第２プライマー結合配列は、第１アダプターに存在し、前記アダプターはまた、第１プライマーも含む。
【０００７】
１つの実施形態によれば、第２鎖を生成するために使用される第１ＤＮＡポリメラーゼ、及び第３鎖を生成するために使用される、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、同じポリメラーゼである。１つの実施形態によれば、第１プライマー及び第２プライマーは、それらのそれぞれのプライマー結合配列にハイブリダイズされるか、又は同じ反応において延伸される。
【０００８】
１つの実施形態によれば、前記方法はさらに、第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列に対して配列決定オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、そして第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定することも含む。
【０００９】
１つの実施形態によれば、第１アダプター、第２アダプター、及び存在するなら、第３アダプターは、同じヌクレオチド配列を有する。
【００１０】
１つの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡコンカテマーを含み、そして第１標的ＤＮＡ配列及び第２標的ＤＮＡ配列は同じヌクレオチド配列を有する。
【００１１】
１つの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドはＤＮＡコンカテマーを含み、そして第１プライマー及び第２プライマーは同じヌクレオチド配列を有する。
【００１２】
１つの実施形態によれば、複数の第３鎖は、複数の第２プライマー結合配列に対して、延長可能及び延長不可能プライマーを含む複数第２プライマーをハイブリダイズすることにより生成される。
【００１３】
１つの実施形態によれば、第３鎖を生成するためへの第２プライマーの延伸は、５、１０、２０、３０、４０又は６０分の固定時間間隔で終結される。１つの実施形態によれば、終結は、化学的終結により、すなわち化学物質の添加により達成される。１つの実施形態によれば、反応を終結するために使用される化学物質は、１．５ＭのＮａＣｌを含むトリス緩衝液である。別の実施形態によれば、終結は、鎖終結ヌクレオチド類似体、例えばｄｄＮＴＰの取り込みにより達成される。いくつかの実施形態によれば、ｄｄＮＴＰは、化学的終結剤の添加の後に添加される。
【００１４】
１つの実施形態によれば、第２プライマーを延伸する反応は、第２鎖の相補的置換が回避されるように、温度、酵素濃度及びプライマー濃度を選択することによって制御される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、配列決定のためのＤＮＡ鎖を製造するための方法に使用される工程を例示する。
【００１６】
【図２】図２は、配列決定のためのＤＮＡ鎖を製造するための関連方法に使用される工程を例示する。
【００１７】
【図３】図３は、ＤＮＡ鎖からの配列の決定に使用される工程を例示する。
【００１８】
【図４】図４は、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を用いてＤＮＢ上に相補的鎖（一連の後続フラグメント）を生成するための典型的な延伸プライマーの使用方法を例示する。
【００１９】
【図５】図５は、ＤＮＢに対して相補的なＤＮＡ鎖の生成及び配列決定のための典型的なアダプター及びプライマー配列を示す。
【００２０】
【図６】図６は、固定された適合ＤＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖の生成のための典型的な方法の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．概要
特定の第１の側面によれば、本発明は、配列決定のためのＤＮＡ鎖の生成方法、並びにそれらの方法に従って生成されるＤＮＡ鎖を用いての遺伝子コンストラクト、ライブラリー及びアレイを提供する。特定の第２の側面によれば、本発明は、第１の側面に従って生成されるＤＮＡ鎖、遺伝子コンストラクト、ライブラリー及びアレイを用いての配列決定法を提供する。
【００２２】
配列決定のためのＤＮＡ鎖の製造
１つのアプローチによれば、配列決定のためのＤＮＡ鎖は、
【００２３】
ａ）第１標的ＤＮＡ配列に対して３′側の第１アダプターと、第１標的ＤＮＡ配列に対して５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列を含み、そして任意には、前記第１アダプターに対して３′側の第３アダプター、及び第１アダプターと第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡ配列を含む、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド（該鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは支持体上に固定されている）を提供し；
【００２４】
ｂ）第１プライマーと、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドとを組合し、そして前記第１アダプターにおける第１プライマー結合配列に対して前記第１プライマーをハイブリダイズし、ここで前記第１プライマーは、固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドと組合される場合、支持体上に固定されておらず；
【００２５】
ｃ）第２鎖を生成するために、第１ＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第１プライマーを延伸し、ここで前記第２鎖は前記第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列、及び前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的な配列を含み；
【００２６】
ｄ）第２プライマーと、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドとを組合し、そして第２プライマー結合配列に対して第２プライマーをハイブリダイズし、ここで前記第２プライマー結合配列は前記第１プライマー結合配列に対して３′側に存在し、前記第２プライマーは、前記固定された鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドと組合される場合、支持体上に固定されておらず；そして
【００２７】
ｅ）第３鎖を生成するために、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて前記第２プライマーを延伸することにより生成され、
【００２８】
ここで、前記第３鎖を生成するためへの第２鎖の延伸が前記第２鎖を部分的に置換し、それにより、
【００２９】
（ｉ）前記鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされる、ハイブリダイズされた部分、及び
【００３０】
（ｉｉ）前記第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列、及び前記第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列を含む末ハイブリダイズオーバーハンク部分（該末ハイブリダイズ部分は前記ハイブリダイズされた部分に対して第２鎖において５′側に存在する）を有する部分的にハイブリダイズされた第２鎖を生成する。
【００３１】
図１は、上記工程（ａ）−（ｅ）を例示する。
【００３２】
パネル１．１は、第１標的ＤＮＡ配列に対して３′側の第１アダプターと、第１標的ＤＮＡ配列に対して５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列を含む鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドを示す。
【００３３】
パネル１．２は、第１アダプターにおいて第１プライマー結合配列１に対してハイブリダイズされる第１プライマーを示す。
【００３４】
パネル１．３は、第１プライマーが第２鎖を生成するために第１ＤＮＡポリメラーゼを用いて延伸されることを示し、ここで前記第２鎖は、（ｉ）第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列２及び（ｉｉ）第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的な配列３を含む。
【００３５】
パネル１．４は、第２プライマー結合配列４に対して第２プライマーをハイブリダイズすることを示し、ここで前記第２プライマー結合配列は、前記第１プライマー結合配列に対して３′側に存在する。図１に示される例においては、第２プライマー結合配列は、３′側（第１プライマー結合に対して）の第１アダプターに含まれる。（第２プライマー結合配列が第３アダプターに存在する、図２、パネル２．４に比較すること）。
【００３６】
パネル１．５は、第３鎖を生成するために鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いての第２プライマーの延伸を示す。パネル１．５に示されるように、第３鎖の延伸は、第２鎖を部分的に置換する。この部分的置換は、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して部分的にハイブリダイズされる第２鎖（又は「第１鎖」）をもたらす。部分的にハイブリダイズされた第２鎖は、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされるハイブリダイズされた部分（５）、及び第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列２及び第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列７を含むハイブリダイズされていないオーバーハング部分６を有する。
【００３７】
図２は、上記工程（ａ）−（ｅ）を例示するための第２スキームを示す。
【００３８】
パネル２．１は、（ｉ）第１標的ＤＮＡ配列に対して３′側の第１アダプターと、第１標的ＤＮＡ配列に対して５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列、及び（ｉｉ）第１アダプターと第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡ配列を含む鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドを示す。
【００３９】
パネル２．２は、第１アダプターにおける第１プライマー結合配列１に対してハイブリダイズされる第１プライマーを示す。
【００４０】
パネル２．３は、第１プライマーが、第２鎖を生成するために第１ＤＮＡポリメラーゼを用いて延伸されることを示し、ここで前記第２鎖は、（ｉ）第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列２、及び第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的な配列３を含む。
【００４１】
パネル２．４は、第２プライマー結合配列４への第２プライマーのハイブリダイゼーションを示し、ここで前記第２プライマー結合配列は、第１プライマー結合配列に対して３′側に存在する。図２に示されるように、第２プライマー結合配列は、第３アダプターに含まれる。
【００４２】
パネル２．５は、第３鎖を生成するために鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いての第２プライマーの延伸を示す。パネル２．５に示されるように、第３鎖の延伸は、第２鎖を部分的に置換する。この部分的置換は、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対して部分的にハイブリダイズされる第２鎖（又は「第１鎖」をもたらす。部分的にハイブリダイズされた第２鎖は、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドに対してハイブリダイズされる、ハイブリダイズされた部分５、及び第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列２及び第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列７を含むハイブリダイズされていないオーバーハング部分６を有する。
【００４３】
ＤＮＡ鎖の配列決定
ＤＮＡ配列決定は、配列決定鋳型として、部分的にハイブリダイズされた第２鎖を用いて適用され得る。第２鎖は、第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列を含むので、この方法は、第１標的ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を決定するために使用され得る。
【００４４】
１つのアプローチによれば、配列決定工程は：
【００４５】
ｆ）第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第３鎖における配列に対して配列決定オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、そして
【００４６】
ｇ）第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列の少なくとも一部を決定することを含む。配列決定法は例えば、合成による配列決定（配列決定オリゴヌクレオチドの延伸を含む）、及び／又は連結による配列決定（配列決定オリゴヌクレオチドへのプローブの連結を含む）を包含し（但し、それらだけには限定されない）、又は他の方法も含むことができる。
【００４７】
図３は、上記工程（ｆ）−（ｇ）を例示するためのスキームを示す。
【００４８】
パネル３．１は、第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第２鎖に対する配列決定オリゴヌクレオチド８のハイブリダイゼーションを示す。
【００４９】
パネル３．２は、配列決定オリゴヌクレオチドが延伸生成物９を生成するためにプライマー延伸のためのプライマーとして作用する合成方法による配列決定を用いて、第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列の少なくとも一部を決定するための配列決定オリゴヌクレオチドの延伸（及びそれによる第１標的配列の決定）を示す。
【００５０】
パネル３．３は、配列決定オリゴヌクレオチドへのプローブ１０の連結、それにより、第２鎖配列に対して相補的な配列を含む連結生成物の生成、それにより、連結方法による配列決定を用いての第２鎖の配列の決定（及びそれにより、第１標的配列の決定）を示す。
【００５１】
それらの要素及び工程の個々が、より詳細に記載されている。本発明の側面は特定の実施形態又は図解を参照して記載されているが、本開示を読むと、当業者には他の実施形態が明白であり、そしてそのような実施形態は本発明の範囲内にあると考えられることが理解されるであろう。
【００５２】
２．鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド
本記載に使用される場合、「鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド（template DNA polynucleotide）」とは、標的ＤＮＡ配列に対して３′側の「第１アダプター」及び標的ＤＮＡ配列に対して５′側の「第２アダプター」として本明細書において言及される２種のアダプター配列間に介在する標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡコンストラクトである。本明細書において使用される場合、「介在する（interposed）」とは、標的ＤＮＡ配列がアダプター配列間にあることを意味する。いくつかの実施形態によれば、標的ＤＮＡ配列は、アダプター配列と連続しており、そして他の塩基又は配列は存在しない（例えば、標的ＤＮＡ配列とアダプター配列との間に存在する）が、しかしこれはすべての実施形態においては必要とされない。アダプター間に介在する配列はまた、アダプターを端に有する配列としても言及され得る。
【００５３】
本発明の方法を用いて、標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部が決定される。標的ＤＮＡは、以下に記載されるように、任意の数の源由来であり得る。
【００５４】
鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、フランキングアダプターと目的の標的ＤＮＡ配列とを会合するための任意の方法を用いて生成され得る。例えば、目的の標的ＤＮＡは、生物学的源、例えば、細胞、組織、生物、又は細胞又は生物集団から得られ、そしてフランキングアダプターは、連結、増幅、転位、挿入、等により付加され得る。例えば米国特許第８４４５１９４号（アダプター及び標的配列を含むＤＮＡナノボールを記載する）、国際特許公開第ＷＯ００／１８９５７号（アダプターを端に有する配列決定標的配列を記載する）、及び米国特許公開番号ＵＳ２０１０／０１２００９８号（断片化を記載する）（それらの個々は、すべての目的のためにその全体が組み込まれる）を参照のこと。
【００５５】
３．鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドのライブラリー
多くの超並列シーケンシング（ＭＰＳ）技法によれば、配列決定鋳型のライブラリーが生成され、そしてライブラリー中の個々の種が並行して配列決定される。例えば、Drmanacなどにより開発されたＤＮＡナノボールアプローチによれば、ゲノムＤＮＡが断片化され、そして個々のフラグメントが用いられ、プラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターがゲノムＤＮＡ配列を分離する環状ＤＮＡが生成される（前記分離されたゲノムＤＮＡ配列はゲノムにおいて連続的であり得る）。環状ＤＮＡは、支持体上に固定され得る一本鎖コンカテマー（「ＤＮＡナノボール」）を生成するために増幅される。「Solexa」タイプの配列決定によれば、ゲノムＤＮＡが断片化され、そして次に、ＤＮＡフラグメントがプラットフォーム特異的オリゴヌクレオチドアダプターに連結される。アダプターは、支持体上に個々のフラグメントを固定するために使用され、ここでそれらは、配列決定のためのクローン的にクラスター化されたアンプリコンを生成するために現場生成される。多くの他のＭＰＳ配列決定アプローチが知られている。
【００５６】
従って、本発明は時々、標的ＤＮＡ（例えば、単一のＤＮＢ鋳型ＤＮＡ）に関して記載されているが、ＭＰＳ配列決定は、典型的には、多くの異なった標的配列（例えば、異なったゲノムＤＮＡフラグメント）を含むが、しかし共通するアダプター配列を共有するコンストラクトのアレイ（例えばＤＮＡコンカテマー、又は鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドのクローンコピーを含むアレイ）上で、配列の大きなライブラリーを用いて実施されることが理解されるであろう。
【００５７】
ＭＰＳ配列決定ライブラリーの製造方法、及びそのようなライブラリーを用いての配列決定方法は、当業界において良く知られており、そしてそのような方法を読者が熟知していることが前提である。例えば、以下を参照のこと：Shendure, J. and H. Ji. "Next-generation DNA sequencing." Nature biotechnology 26.10 (2008): 1135-1145; Shendure, J., et al. “Advanced sequencing technologies: methods and goals”. Nat. Rev. Genet. 5, 335-344 (2004); Metzker, Michael L. "Sequencing technologies-the next generation." Nature Reviews Genetics 11.1 (2010): 31-46; Drmanac, R. et al. "Accurate Whole Genome Sequencing as the Ultimate Genetic Test." Clinical Chemistry 61.1 (2015): 305-306; Drmanac, R. et al. "Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays." Science 327.5961 (2010): 78-81; Drmanac, S. et al. “Accurate sequencing by hybridization for DNA diagnostics and individual genomics.” Nat. Biotechnol. 16, 54-58 (1998); Margulies, M. et al. "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors." Nature 437.7057 (2005): 376-380; Ng, S. et al. "Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes." Nature 461.7261 (2009): 272-276; Meng, H-M et al. "DNA dendrimer: an efficient nanocarrier of functional nucleic acids for intracellular molecular sensing." ACS Nano 8.6 (2014): 6171-6181; Head, S. et al. "Practical Guide"; Head, S. et al. "Practical Guide."; Shendure, J. et al. Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome. Science 309, 1728-1732 (2005); Brenner, S. et al. “Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays” Nat. Biotechnol. 18, 630-634 (2000); Ronaghi et al. “Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release” Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996); McKernan, K. et al. “Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing,” 米国特許出願第20080003571 号(2006); Adessi, C. et al. “Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms” Nucleic Acids Res. 28, e87 (2000)、それらの個々は、ＤＮＡ配列決定ライブラリーの調製、及びＭＰＳ配列決定プラットフォーム及び技法を教示することを含むすべての目的のために完全に組み込まれる。
【００５８】
４．標的ＤＮＡ配列
鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドの標的ＤＮＡ部分は、任意の源、例えば天然に存在する配列（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、無細胞ＤＮＡ、等）、人工配列、例えば、合成配列、遺伝子シャフリング又は分子進化の生成物、等）、又はそれらの組合せからであり得る。標的ＤＮＡは、源、例えば生物又は細胞（例えば、植物、動物、ウィルス、細菌、菌類、ヒト、哺乳類、昆虫）、法医学的源、等に由来することができる。標的ＤＮＡ配列は、生物集団、例えば、腸内細菌集団からであり得る。標的ＤＮＡ配列は、サンプルから直接的に入手され得るか、又は増幅反応、断片化反応、等の生成物であり得る。
【００５９】
標的ＤＮＡは、特定のサイズ範囲内の長さ、例えば５０−６００個の長さのヌクレオチドを有することができる。他の典型的なサイズ範囲は、２５−２０００、５０−１０００、１００−６００、５０−１００、５０−３００、１００−３００及び１００−４００個の長さのヌクレオチドを包含する。複数の異なった標的ＤＮＡを有する鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドにおいては、標的ＤＮＡは、同じ長さであっても又は異なった長さであり得る。鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドのライブラリーにおいては、ライブラリーのメンバーは、いくつかの実施形態によれば、類似する長さ（例えば、すべて、２５−２０００個のヌクレオチドの範囲、又は別の範囲）を有することができる。
【００６０】
１つのアプローチにおいては、標的ＤＮＡは、より大きな源のＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を断片化することにより調製され、所望するサイズ範囲でのフラグメントが生成され得る。いくつかのアプローチによれば、サイズ選択工程を用いて、特定サイズ範囲内のフラグメントのプールが得られる。
【００６１】
５．アダプター
鋳型ＤＮＡ又は鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、本明細書の開示方法に使用される場合、複数のアダプターを含む。アダプターは、支持体上に鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドを固定するための要素、配列決定に使用されるオリゴヌクレオチドを結合する要素（合成方法による配列決定において延伸されるプライマーのための結合部位、及び/又はｃＰＡＬ又は他の連結ベースの配列決定方法のためのプローブ、及び同様のもの）、又は固定化及び配列決定のための両要素を含むことができる。アダプターは以下の追加の特徴を含むことができる：反応エンドヌクレアーゼ認識部位、延伸プライマーハイブリダイゼーション部位（分析における使用のための）、バーコード配列、ユニーク分子識別子配列、及びポリメラーゼ認識配列。
【００６２】
アダプター配列は、特定の配列決定プラットフォーム及び意図される使用のために適切な長さ、構造及び他の性質を有することができる。例えば、アダプターは、一本鎖、二本鎖又は部分的二本鎖であり得、そして意図される使用のために適切な長さのものであり得る。例えば、アダプターは、１０−２００個のヌクレオチド、２０−１００個のヌクレオチド、４０−１００個のヌクレオチド又は５０−８０個のヌクレオチドの範囲の長さを有することができる。いくつかの実施形態によれば、アダプターは、塩基、糖及び／又はリン酸部分への修飾を含む１又は２以上の修飾されたヌクレオチドを含むことができる。
【００６３】
ライブラリー中の異なった種又は亜属はユニーク特徴、例えば亜属特異的バーコードを有するが、ライブラリーの異なったメンバーは、典型的には、共通のアダプター配列を含むであろうことが当業者により理解されるであろう。
【００６４】
個々のアダプター配列は、複数の機能的に異なる副配列を含むことができる。例えば、本開示に詳細に論じられるように、単一のアダプター配列は、２つのさらなるプライマー結合配列（異なった相補的プライマー又はプローブにより認識され得る）を含むことができる。アダプター内の機能的に異なった配列は、重複しても又は重複していなくてもよい。例示のために、４０塩基長のアダプターの場合、１つの実施形態によれば、塩基１−２０は、第１プライマー結合部分であり、そして塩基２１−４０は、第２プライマー結合部位である。異なった実施形態によれば、塩基１−１５は第１プライマー結合部位であり、そして塩基２１−４０は第２プライマー結合部位である。異なった実施形態によれば、塩基５−２５は第１プライマー結合部位であり、そして塩基１５−３０は第２プライマー結合部位である。同様に、４０塩基長のアダプターの場合、塩基１−２０は固定された配列であり得、そして塩基２１−４０はプライマー結合部位であり得る。アダプター（又は鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドの異なったアダプター）における異なったプライマー結合配列は、同じ長さを有しても又は異なった長さを有してもより。
【００６５】
アダプター（例えば、第１アダプター、第２アダプター、第３アダプター、等）は、１、２又は２以上のプライマー結合配列を含むことができる。プライマー結合配列は、プライマー（又はオリゴヌクレオチド）が特異的に結合する部位又は配列として、機能的には定義される。例えば、２つのプライマー結合配列を有するアダプターは、２つの異なったプライマーにより特異的に結合され得る。１つのアプローチにおいては、同じアダプター中の２つのプライマー結合配列は、オーバーラップし、すなわちヌクレオチド配列の一部を共有する。いくつかの実施形態によれば、オーバーラップされた領域は、２つのオーバーラップするプライマー結合配列の何れかの５０％、又は４０％、又は３０％、又は２０％、又は１０％、又は５％以下である。１つのアプローチによれば、２つ以上のプライマー結合配列はオーバーラッピンしない。いくつかの実施形態によれば、非オーバーラッピングプライマー結合配列は、お互いに直接隣接しており；いくつかの他の実施形態によれば、非オーバーラッピングプライマー結合配列は、１−１０、１０−２０、３０−４０又は４０−５０個のヌクレオチドにより分離される。
【００６６】
プライマー結合配列は、プライマーの意図される機能（例えば、延伸プライマー、連結支持体、インデックス配列、等）に依存して、正確な長さ及び配列を有するプライマーのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さのものであろう。プライマー結合配列はしばしば、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５又は少なくとも１８の長さの塩基である。
【００６７】
所定の鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド内では、異なったアダプターが同じ配列又は異なった配列を有することができ、そして同じプライマー結合配列、又は異なったプライマー結合配列を有することができることは明らかであろう。例えば、下記セクション７を参照のこと。特定の図面は本発明を説明するために提供されているが、類似するクロスハッチング等を使用するアダプターの表現は、配列の同一性を示すものとして構成されるべきではない。
【００６８】
６．プライマー
用語「プライマー（primer）」及び「プローブ（probe）」とは、交換可能的に使用され得、そしてＤＮＡのプライマー又はプローブ結合部位に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを言及する。それらのプライマーは、「延伸プライマー」又は「配列決定オリゴヌクレオチド」であり得る。「延伸プライマー」は、上記に記載される「第２」及び「第３」[ＤＮＡ]鎖を生成するためにプライマー延伸反応に使用される。従って、延伸プライマーは、ヌクレオチドの付加により延伸できる、ＤＮＡポリメラーゼのための支持体である。
【００６９】
本発明での使用のためのプライマー及びプローブ（例えば、配列決定アッセイ条件下で延伸又は連結できるプライマー）を選択するか又は企画することは、当業者の能力の十分の範囲内であろう。本発明を制限するものではないが、延伸プライマーはしばしば、１０−１００個のヌクレオチド、しばしば１２−８０個のヌクレオチド、及びしばしば１５−８０個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。
【００７０】
プライマー及びプローブは、それがハイブリダイズするアダプターにおける結合配列に対して完全に又は部分的に相補的であり得ることは理解されるであろう。例えば、プライマーは、それがハイブリダイズする配列に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。
【００７１】
プライマーはまた、アダプターにおけるプライマー結合に対して相補的でないプライマーの５′末端で追加の配列も含むことができる。プライマーの非相補的部分は、プライマーと、そのプライマー結合配列との間のハイブリダイゼーションを妨げない長さであり得る。一般的に、非相補的部分は、１−１００個の長さのヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、非相補的部分は、４−８個の長さのヌクレオチドである。プライマーはＤＮＡ及び／又はＲＮＡ部分を含むことができ、そしていくつかのアプローチによれば、本発明に使用されるプライマーはまた、塩基、糖及び／又はリン酸部分への修飾を含む１又は２以上の修飾されたヌクレオチドも有することができる。
【００７２】
「配列決定オリゴヌクレオチド（sequencing oligonucleotide）」は、合成反応による配列決定（また、[延伸による配列決定]とも呼ばれる）に使用される延伸プライマーであり得る。「配列決定オリゴヌクレオチド」は、すべての目的のために参照により本明細書に組込まれる米国特許公開第２０１４０２１３４６１号に記載されるように、連結による配列決定法、例えば「組合せプローブ−アンカー連結反応」（ｃＰＡＬ）（単一、二つ及び複数のｃＰＡＬを包含する）に使用されるオリゴヌクレオチドであり得る。手短に言及すれば、ｃＰＡＬは以下の工程のサイクルを含む：第1に、「配列決定オリゴヌクレオチド」（又は「アンカー」）が、上記第３ＤＮＡ鎖のアダプターにおける相補的配列にハイブリダイズされる。次に、酵素連結反応が、例えば蛍光色素により標識される、例えば８マーの完全に縮重したプローブ集団に対して、アンカーを用いて実施する。プローブは、例えば約６−約２０個の塩基長、約７−約１２個の塩基長を含むことができる。任意の所定のサイクルで、使用される８マープローブ集団は、その１又は２以上の位置の同一性がそれに結合される蛍光団、例えば８マープローブの同一性と相関するよう構築される。当業界において良く知られている基本的ｃＰＡＬの変形、例えば複数のｃＰＡＬにおいては、部分的に又は完全に縮重した第２アンカーが、読み取り可能な配列を増加させるために使用される。
【００７３】
７・標的配列及びアダプター配列の関係
上記のように、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、第1標的ＤＮＡ配列に対して３′側の第1アダプターと、第1標的ＤＮＡ配列に対して５′側の第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列を含む。
【００７４】
鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、複数の標的ＤＮＡ配列（例えば、２５以上又は５０以上；時々、２−１０００、５０−８００又は３００−６００コピーの範囲）を含むことができ、それらの個々は１対のアダプターを端に有することができる。従って、１つの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、第1アダプターに対して３′側の第３アダプター、及び第1アダプターと、第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡ配列を含む。いくつかの場合、標的ＤＮＡ配列は、一本鎖ＤＮＡナノボールに含まれる。例えば、セクション７．１、及び４を参照のこと。
【００７５】
鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、2つのアダプターを端に有する単一標的ＤＮＡ配列（時々、［適合された標的配列］）とも呼ばれる）を含むことができる。例えば、セクション７．２、及び図１及び６を参照のこと。
【００７６】
７．１鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド：コンカテマー及びＤＮＢ
いくつかの実施形態によれば、本発明に使用される鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡコンカテマーである。本明細書において使用される場合、用語「コンカテマー（concatemer）」とは、同じＤＮＡ配列（連続して連結される「モノマー」又は「モノマー配列」）の複数コピーを含む長い連続的ＤＮＡ分子を言及する。「ＤＮＡコンカテマー」は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも１０、少なくとも２５のモノマー、少なくとも５０のモノマー、少なくとも２００のモノマー、又は少なくとも５００のモノマーを含むことができる。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡコンカテマーは、２５−１０００のモノマー、例えば５０−８００又は３００−６００のモノマーを含む。各モノマーは、少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む。本発明の方法に使用されるＤＮＡコンカテマーは、ＤＮＡナノボール又は「ＤＮＢ」であり得る。いかなる形でも本発明を制限するものではないが、ＤＮＡナノボールは、以下に記載されている：Drmanac et al., 2010, "Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays." Science 327:5961:78-81; Dahl et al. "Methods and oligonucleotide designs for insertion of multiple adaptors into library constructs."米国特許第7,897,344号 (March 1, 2011); Drmanac et al. “Single Molecule Arrays for Genetic and Chemical Analysis” U.S. Patent No. 8,445,194 (May 21, 2013); and Drmanac et al. “Methods and compositions for long fragment read sequencing” 米国特許第8,592,150号 (Nov. 26. 2013)（それらの個々は、参照、及び本明細書に記載される他の参照により、本明細書に組込まれる）。「ＤＮＡナノボール」又は「ＤＮＢ」は、溶液（例えば、室温でのＳＳＣ緩衝液）中でほぼ球形の容積を満たすランダムコイルを形成するために十分な長さの一本鎖ＤＮＡコンカテマーである。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡナノボールは典型的には、約１００−３００ｎｍの直径を有する。ＤＮＢに存在する鋳型ＤＮＡは、「ＤＮＢ鋳型鎖」として言及され得る。
【００７７】
１つの実施形態によれば、コンカテマーのモノマーは、１つのアダプター配列及び１つの標的ＤＮＡ配列を含む。モノマーは連続して連結されるので、標的ＤＮＡ配列は、２つのアダプター配列を端に有するであろう。
【００７８】
いくつかのアプローチによれば、モノマー中の標的ＤＮＡ配列は、コンカテマー中の連続して連結される各標的配列が２つのアダプターを端に有するように、２つの「半アダプター」配列を端に有する。
【００７９】
いくつかのアプローチによれば、モノマーユニットは、１、２、３又は４、又はそれ以上のアダプターを含む。いくつかの実施形態によれば、モノマー（及びコンカテマー）中のすべてのアダプターは、同じ配列を有する。他の実施形態によれば、アダプターは、異なった配列、例えば２、３又は４個の異なった配列を有することができる。
【００８０】
個々のモノマーは、複数の鋳型ＤＮＡを含むことは認識されるであろう。例えば、モノマーは構造A1-T1-A2-T2を含むことができ、ここでＴ１及びＴ２は、同じか又は異なった配列を有する鋳型ＤＮＡであり、そしてＡ１及びＡ２は、同じか又は異なった配列を有するアダプターである。その対応するコンカテマーは構造A1-T1-A2-T2 -A1-T1-A2-T2-A1-T1-A2-T2 . . . .を有するであろう。関連する実施形態によれば、モノマーは構造A1-T1-A2-T2-A3を含むことができ、ここでＴ１及びＴ２は同じか又は異なった配列を有する鋳型ＤＮＡであり、Ａ２はアダプターであり、そしてＡ１及びＡ３は「半アダプター」である。その対応するコンカテマーは、構造A2-T2-A3 A1-T1-A2-T2-A3 A1-T1-A2-T2-A3 A1 . . .を含み、ここでＡ３Ａ１半アダプターはアダプタとして一緒に機能する。限定的ではなく例示のために、表１は典型的なコンカテマー構造を示す。表１においては、Ｎは１より大きい。通常、Ｎは少なくとも３、しばしば少なくとも４、少なくとも１０、少なくとも２５のモノマー、少なくとも５０のモノマー、少なくとも３００のモノマー、又は少なくとも５００のモノマーである。いくつかの実施形態によれば、Ｎは、２５−ｌ０００、例えば５０−８００又は３００−６００の範囲である。鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドがＤＮＡナノボールである場合、Ｎは少なくとも２５、通常少なくとも５０、及びしばしば５０−８００又は３００−６００の範囲である。
【表１】
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【００８１】
ＤＮＡコンカテマー(ＤＮＡナノボールを包含する)は、任意の適切な方法により製造され得る。１つのアプローチによれば、単一のゲノムフラグメントは、ゲノム内で隣接しているか、又は接近している標的配列間に介在するアダプターを有する一本鎖環状ＤＮＡを生成するために使用される。環状ＤＮＡコンストラクトは、例えばローリングサークル（rolling circle）複製により、又はお互いへのモノマーの連結により、酵素的に増幅され得る。制限ではなく例示のためには、ＤＮＡナノボールが、米国特許第８，４４５，１９４号及び米国特許第８，５９２，１５０号に記載される方法に従って調製され得る。
【００８２】
７．２鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド：適応された標的配列
他方では、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、２つのアダプターを端に有する単一標的ＤＮＡ配列を含むことができる。単一標的ＤＮＡ及び１対のフランキングアダプターを有する鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドが、Solexa型配列決定において特に有用であり得る。例えば、図６を参照のこと。
【００８３】
いくつかの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡは、少なくとも１つの標的ＤＮＡ配列及び少なくとも２つのアダプターを含む非コンカテマーＤＮＡコンストラクトである。いくつかの実施形態によれば、前記コンストラクトは、２つ以上のアダプター及び／又は複数の標的ＤＮＡ配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態によれば、相補的鎖は、最初に、二本鎖ＤＮＡを形成するために、1又は２以上のアダプター及び１又は２以上の標的ＤＮＡ配列を含む一本鎖ＤＮＡから合成される。二本鎖ＤＮＡの２本の鎖の１つ又は両者が、鋳型ＤＮＡとして使用され得る。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、非コンカテマーのクローンコピーは、本発明に従って、生成され、そして鋳型ＤＮＡとして使用される。非コンカテマーを含む、ＤＮＡ配列のクローンコピーを生成するための方法は、当業界において良く知られている。上記セクション３で引用された参考文献を参照のこと。
【００８６】
８．支持体及びコンパートメント
いくつかの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、支持体上に固定される。一般的に、固定化は、上記で論じられた「第２」及び「第３」鎖の合成の前、生じる。いくつかの場合、固定化は、上記で論じられた「第３」鎖の合成の前、生じる。典型的な支持体は、実質的に平面（例えば、スライド）又は非平面及び一体であり得るか、又は複数の個別のユニット（例えば、ビーズ）から形成されても良い。典型的な材料は、ガラス、セラミック、シリカ、シリコン、金属、エラストマー（例えば、シリコーン）、ポリアクリルアミド（例えば、ポリアクリルアミドヒドロゲル；国際公開第２００５／０６５８１４号を参照のこと）を包含する。いくつかの実施形態によれば、支持体は、固定化部位又はウェルの順序付けされたか、又は順序付けされていないアレイを含む。いくつかの実施形態によれば、標的ＤＮＡポリヌクレオチドは、実質的に平面の支持体、例えば固定化部位又はウェルの順序付けされたか、又は順序付けされていないアレイを含む支持体上に固定される。いくつかのアプローチによれば、標的ＤＮＡポリヌクレオチドは、ビーズ上に固定される。
【００８７】
ポリヌクレオチドは、共有及び非共有結合を包含する種々の技法により支持体上に固定され得る。ポリヌクレオチドは、種々の技法により支持体に固定され得る。１つの実施形態によれば、表面は、ポリヌクレオチド分子、例えばアダプターオリゴヌクレオチドの成分との複合体、例えば二本鎖重複体を形成する捕捉プローブを含むことができる。別の実施形態によれば、表面は、共有結合を形成するためにポリヌクレオチド分子上の相補的官能基と反応する反応性官能基を有することができる。長いＤＮＡ分子、例えばいくつかのヌクレオチド又はそれ以上のヌクレオチドはまた、疎水性表面、例えば低濃度の種々の反応性観官能基、例えば−ＯＨ基を有する清浄なガラス表面に対して効果的に結合され得る。さらなる別の実施形態によれば、ポリヌクレオチド分子は、表面との非特異的相互作用を通して、又は非共有相互作用、例えば水素結合、ファンデルワールス力及び同様のものを通して、表面に吸着され得る。
【００８８】
例えば、ＤＮＡナノボールは、Drmanacなどの米国特許第８，６０９，３３５号に記載されるように、個別の離隔領域（discrete spaced apart region）に固定され得る。１つのアプローチによれば、適応されたＤＮＡは、固定されたプローブ配列に対してのハイブリダイゼーションにより支持体上に固定され、そして固相核酸増幅法が、ＤＮＡ鋳型ポリヌクレオチドを含むクローンクラスターを生成するために使用される。国際公開第９８／４４１５１号及び００／１８９５７号を参照のこと。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡ鋳型ポリヌクレオチドは、プライマー延伸工程の前、エマルジョン、液滴に、ビーズ上に及び／又はマイクロウェル（Margulies et al. "Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors." Nature 437:7057 (2005); Shendure et al. “Accurate multiplex polony sequencing of an evolved bacterial genome” Science 309, 1728-1732 (2005)）に、区画化される。
【００９０】
９．ＤＮＡポリメラーゼ
本発明の方法は、核酸ポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素）、ホスファターゼ及びホスホリラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及び同様のものを包含する、分子生物学及びＭＰＳ配列決定の当業者に良く知られている方法、ツール及び試薬を用いて実施され得る。特に、一定のプライマー延伸工程は、１又は２以上のＤＮＡポリメラーゼを用いて実施され得る。一定の延伸工程は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。
【００９１】
本明細書に開示される方法は、鋳型ＤＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖を生成するために、ポリメラーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性を用いる。１つのアプローチによれば、本発明は、強い５′→３′鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いる。好ましくは、ポリメラーゼは、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有さない。しかしながら、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、その活性が、例えばエキソヌクレアーゼ活性を阻害する反応条件を用いることにより、本発明の方法の実現を妨げない場合に使用され得る。
【００９２】
用語「鎖置換活性（strand displacement activity）」とは、合成中に遭遇する下流のＤＮＡを置換する能力を記載する。鎖置換活性は、参照により本明細書に組込まれる米国特許公開番号２０１２０１１５１４５号に、次の通りに記載されている：「鎖置換活性」は、生物学的、化学的又は物理的剤、例えばＤＮＡポリメラーゼが、鋳型依存性核酸合成に関連して、及びそれに近い形で、対になった核酸のその相補鎖からの５′方向から３′方向への解離を引起す現象を示す。鎖置換は、対になった核酸配列の５′末端で開始し、そして従って、酵素は置換部位の５′側において核酸合成を直ちに行う。新合成された核酸及び置換された核酸は一般的に、鋳型核酸鎖に対して相補的である同じヌクレオチド配列を有する。鎖置換活性は、核酸合成及び特にＤＮＡ合成の活性を与える同じ分子上に位置してもよく、又は別個の独立した活性であってもよい。ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７又はＴ５バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、及びＨＩＶウィルス逆転写酵素は、ポリメラーゼ活性及び鎖置換活性の両者を有する酵素である。剤、例えばヘリカーゼは、鎖置換効果、すなわち同じ配列の核酸の合成にカップリングされる核酸の置換を生成するために、鎖置換活性を有さない誘導剤と組合して使用され得る。同様に、タンパク質、例えばＥ．コリ又は別の生物からのＰｅｃ  Ａ又は一本鎖結合タンパク質が、鎖置換を生成するか又は促進するために、他の誘発剤と組合して使用され得る（Kornberg and Baker, 1992, DNA Replication, 2nd Edition, pp 113-225, Freeman, N.Y.）。
【００９３】
１つのアプローチによれば、ポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９ポリメラーゼである。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、中位の温度（例えば、２０−３７℃）で強い置換活性を有する。
【００９４】
１つのアプローチによれば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、すなわちラージフラグメント（ＮＥＢ＃Ｍ０２７５）が使用される。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、温度（約６５℃）で活性である。
【００９５】
１つのアプローチによれば、ポリメラーゼは、Deep-VentR DNAポリメラーゼ(NEB #M0258) (Hommelsheim et al., Scientific Reports 4:5052 (2014))である。
【００９６】
１０．相補鎖の製造
このセクションは、第２及び第３ＤＮＡ鎖を生成する工程の特定の側面を記載する。
【００９７】
鋳型ＤＮＡ又は標的ＤＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ鎖（「第１鎖」）の生成は、鋳型ＤＮＡ中の第１アダプター中の第１プライマー結合配列への第１プライマーのハイブリダイゼーションにより開始する。図１、パネル１．２及び図２、パネル２．２を参照のこと。次に、第１プライマーが第１ＤＮＡポリメラーゼにより延伸され、第２鎖が生成される。図１、パネル１．３及び図２、パネル２．３を参照のこと。第１ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有するか、又は鎖置換活性を有さないポリメラーゼであり得る。
【００９８】
第３鎖は、鋳型ＤＮＡにおける第１プライマー結合配列に対して３′側の第２プライマー結合配列に対してハイブリダイズされる第２プライマーを延伸することにより生成される。第２プライマー結合配列は、存在するなら、第３アダプターに存在することができる。図２プライマー結合配列は、存在するなら、第３アダプターに存在することができる。図２、パネル２．４を参照のこと。第２プライマー結合配列はまた、第１プライマー結合配列に対して３′側第１プライマー結合配列と同じアダプターにも存在することができる。図１、パネル１．４を参照のこと。第３鎖を生成するためへの第２プライマーの延伸は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて実施される。図１、パネル１．５及び図２、パネル２．５を参照のこと。第３鎖は、延伸工程の間、遭遇し、そして鎖型ＤＮＡ及びオーバーハングからの第２鎖の部分的解離を引起す、第２鎖の５′部分を置換する。図１、パネル１．５及び図２、パネル２．５を参照のこと。
【００９９】
延伸−置換反応は、第２鎖が、完全に置換されるよりもむしろ、鋳型ＤＮＡに部分的にハイブリダイズされるよう、そして部分的にハイブリダイズされないよう制御される。ハイブリダイズされていない部分（オーバーハング）は、第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的である第１アダプターの少なくとも一部に対して相補的である配列、及び第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第３配列を含み、ここで前記第１配列は、第２及び第３配列を端に有する。従って、１つの実施形態によれば、オーバーハンクは、アダプター配列（又はその相補体）、又はその一部を端に有する。
【０１００】
第１アダプターと第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列の例は、図１に例示される。第１アダプターと第２アダプターとの間に介在する第１標的ＤＮＡ配列の別の例が、図２に例示される。図２の実施形態は、第１アダプターと第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡ配列を示す。この場合、第１及び第２標的ＤＮＡ配列は、下記で論じられるように、同じであっても、異なっていても、又はゲノムにおいて連結されてもより。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、表１の項目３、５、６及び７、及び図２に示されるように、鋳型ＤＮＡは、第１アダプターに対して３′側の追加のアダプター（例えば、第３アダプター）、及び第１アダプターと第３アダプターとの間に介在する第２標的ＤＮＡ配列を含む。
【０１０２】
この実施形態によれば、第１アダプターは、第１プライマーを結合できる第１プライマー結合配列を含み；そして第３アダプターは、第２プライアーを結合できる第２プタイマー結合配列を含む。いくつかの実施形態によれば、第１標的ＤＮＡ及び第２標的ＤＮＡは、同じヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態によれば、第１標的ＤＮＡは、異なったヌクレオチド配列を有する。第１、第２及び第３アダプターは、同じか又は異なったヌクレオチド配列を有することができる。
【０１０３】
１つの実施形態によれば、図２に示されるように、第１アダプターは、第１プライマーを結合できる第１プライマー結合配列、及び第２プライマーを結合できる第２プライマー結合配列の両者を含む。第２プライマー結合配列は、第１プライマー結合配列に対して３′側に依存する。第１及び第２アダプターは、同じか又は異なったヌクレオチド配列を有することができる。１つの特定の実施形態によれば、第１及び第２アダプターは、同じヌクレオチド配列を有し、そして各アダプターは、それぞれ、第１及び第２プライマーのための２つの結合配列を含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡ中の第２アダプターは、１又は２以上の配列決定オリゴヌクレオチドのための１又は２以上のプライマー結合配列を含む。図３を参照のこと。
【０１０５】
１０．１ ＤＮＢプライマーを用いての具体的例
１つのアプローチによれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、ＤＮＡコンカテマー、例えば図１又は２に示される構造を有するＤＮＡ配列のモノマーユニットを含むＤＮＢである。図４は、そのようなＤＮＢからの相補的鎖の生成の例を示す。特定の例によれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、図２、パネル２．１に示されるようなＤＮＡ構造のモノマーユニットを含むＤＮＢであり得る。ＤＮＢは、複数のアダプターを含み、前記アダプターは同じヌクレオチド配列を有する。（Ａ）においては、ＤＮＢ、すなわちアダプター配列及び挿入されたＤＮＡ配列を含む各モノマーユニットは、相補的プライマーによりハイブリダイズされる。１つのアプローチによれば、プライマーは、鋳型ＤＮＡ鎖上のアダプター（例えば、アダプター配列のすべて又は一部）にハイブリダイズされる。（Ｂ）においては、重合が実施され、複数の相補鎖又は後続フラグメントが生成される。（Ｃ）においては、新たに合成された鎖（第３鎖）の３′末端が下流の続く鎖（第２鎖）の５′末端に達すると、続くＤＮＡ鎖（第２鎖）の５′部分がＤＮＡポリメラーゼにより置換され、オーバーハングが生成される。各コンカテマーの１又は２以上のモノマーユニットが、この態様で置換され得る。
【０１０６】
延伸−置換反応条件は、相補鎖配列決定のために最適化された合計長及びオーバーハング長を有する第２鎖を生成するために制御される。１つのアプローチによれば、反応は、所望する生成物を提供することが決定される時間で、ｄｄＮＴＰの組込み（又は当業者に知られている他の手段）により終結される。下記セクション１２を参照のこと。（Ｄ）においては、オーバーハングフラグメントの生成の後、配列決定オリゴヌクレオチドは、各オーバーハングフラグメントにおけるアダプター（すなわち、鋳型のアダプター配列の相補体）にハイブリダイズ（オーバーハング）され得る。１つの実施形態によれば、後続フラグメントが、延伸プライマーが結合するアダプター配列に加えて、ＤＮＢ鋳型鎖にアニーリングされる後続フラグメントを保持するために十分な長さのハイブリダイズされた（二重）部分と共に、少なくとも１つのアダプター配列を含むのに十分に長いオーバーハング部分を含むことは理解されるであろう。これに続いて、合成による配列決定（ＳＢＳ）又は他の配列決定化学であってもよい配列決定化を実施する。生成される配列は、アダプターに隣接し、及びアダプターの上流の挿入された（例えば、ゲノム）ＤＮＡであろう。この配列情報は、鋳型鎖の配列決定から生成される配列と対にされ得る。典型的には、鋳型鎖の配列決定は、アダプターの下流の配列を提供する。
【０１０７】
図５は、本発明の方法に従って相補鎖を生成するために使用され得るプライマーを例示する。アダプター「Ａｄ１４１−２」がゲノムＤＮＡフラグメントと連結され（示されていない）、そして単鎖ＤＮＡ環を生成するために使用される。生成されるＤＮＡ環は、アダプター「Ａｄ１４１−２」の上部鎖の配列（５′−３′方向に示される）、及び短い標的ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）の配列を含む。次に、ＤＮＢが、ローリングサークル増幅により前記ＤＮＡ環から生成される。従って、そのようにして生成されたＤＮＢは、「Ａｄ１４１−２」の下部鎖の配列（３′−５′方向に示される）を含み、そして鋳型ＤＮＡポリヌクレオチド（第１鎖）として使用され得る。
【０１０８】
アダプターは、それぞれ、ＣＸ１１７（第２プライマー）及びＡＤ１２０＿３Ｔ＿２１ｂ（第１プライマー）を結合する２つのプライアー結合配列を有する。ＣＸ１１７及びＡＤ１２０＿３Ｔ＿２１ｂはまた、図５においてＤＮＢプライマーとしても言及されている。Ａｄ１２０＿３Ｔの延伸は第２鎖を生成し、そしてＣＸ１１７プライマーの延伸は第３鎖を生成する。第３鎖の延伸は、セクションＢに論じられるように、第２鎖を置換し、これが第２鎖のオーバーハング部分を生成する。補体鎖プライマー（「ＡＤ４１＿５Ｔ」及び「ＡＤ０４１＿ヘルパー」）は配列決定オリゴヌクレオチドであり、これが第２鎖のオーバーハング部分の合成による配列決定（ＳＢＳ）を実施するために使用され得る。
【０１０９】
１０．２適応されたＤＮＡフラグメントに対する相補的な鎖の生成
１つのアプローチによれば、鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドは、非コンカテマーＤＮＡ（例えば、モノマー）である。非コンカテマーＤＮＡは、図１、パネル１．１に示されるような構造を有することができる。
【０１１０】
図６は、１つのアプローチを示す。図６（Ａ）におては、４種の固定された単鎖ポリヌクレオチドが示されている。白丸は標的配列を表し、そして黒丸は、３′及び５′アダプター配列（同じであっても又は異なっていてもより）を表す。４種の固定された単鎖ポリヌクレオチドは異なっていてもよく、又は鋳型ＤＮＡポリヌクレオチドのクローンコピーを含むクラスターであってもよい。単鎖モノマーＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）のクローンコピーが支持体上に固定されている例が、図６に示される。各鋳型ＤＮＡは、５′で第１アダプター及び３′で第２アダプターを端に有する標的ＤＮＡを含む。
【０１１１】
図６（Ａ）：第１プライマー（オープン矢頭を有する矢印により示される）は、第１アダプター上の第１プライマー結合配列にハイブリダイズされる。
【０１１２】
図６（Ｂ）：第１プライマーは、第２鎖を生成するためにＤＮＡポリメラーゼにより延伸される。そのようにして生成された第２鎖は、標的ＤＮＡ配列に対して相補的である配列、及び第２アダプターに対して相補的である配列を含む。
【０１１３】
図６（Ｃ）：第２プライマー（黒矢頭を有する矢印により示される）は、第１アダプターにおける第１プライマー結合配列に対して３′側にある第２プライマー結合配列にハイブリダイズされる。第２プライマーは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより第３鎖を生成するよう延伸される。
【０１１４】
図６（Ｄ）：第３鎖の延伸は、第２鎖が部分的に置換されるよう、すなわち第２アダプターへのハイブリダイゼーションを通して鋳型ＤＮＡに結合されたままであるように制御される。
【０１１５】
１１．プライマーの添加の順序
延伸プライマー（例えば、第１プライマー、第２プライマー）の添加の順序は変えることができる。例えば、いくつかの実施形態によれば、第１プライマー及びポリメラーゼが添加され、そして第２鎖の合成が、第２プライマーの添加の前、行われる（少なくとも一部）。別のアプローチによれば、第１及び第２プライマーが、ほぼ同じ時間で添加される（例えば、下記実施例を参照のこと）。例えば、それらは同じ組成物中に一緒に添加されてもよく、又はお互い約１分以内に、又はお互い約５分以内に、別々に添加されてもよい。第１及び第２延伸プライマーは、任意の順序で添加され得る。
【０１１６】
プライマーの逐次的添加は、第３鎖は置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて生成されるが、第２鎖は、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼを用いて生成されるアプローチにおいては必要である。
【０１１７】
単一オリゴヌクレオチドは、第２鎖及び／又は第３鎖を生成するための延伸プライマーとして機能できることは理解されるであろう。
【０１１８】
さらに、複数の異なった第１プライマー、及び／又は複数の異なった第２プライマー、及び／又は複数の異なった配列決定オリゴヌクレオチドが同じ配列決定反応に使用され得ることは理解されるであろう。
【０１１９】
第２鎖のための配列決定オリゴヌクレオチドは典型的には、第２鎖の延伸−置換が本明細書に開示される方法を用いて終結された後、添加される。セクション標記「制御する延伸−置換反応の制御；鎖長及び完全な置換の回避」（下記）を参照のこと。
【０１２０】
配列決定オリゴヌクレオチドは、第２鎖のオーバーハング部分にハイブリダイズする。いくつかの実施形態によれば、配列決定オリゴヌクレオチドは、相補的である配列も有し、そして従って、第１標的配列内の既知配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態によれば、配列決定オリゴヌクレオチドは、第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第２鎖中の配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態によれば、配列決定オリゴヌクレオチドは、第１又は第２プライマーに対して部分的に又は完全に相補的である。
【０１２１】
１２．制御する延伸−置換反応の制御；鎖長及び完全な置換の回避
鋳型ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＢ  ＤＮＡ鎖）に結合されるオーバーハング及び二本鎖部分の両者を有する部分的に置換された第２鎖（後続フラグメント）を生成するために、第３鎖を生成する延伸反応が制御され、第２鎖の完全な置換（すなわち、「続く鎖」又は「後続フラグメント」）が回避され、そして配列決定のために適切な長さを有する第２及び第３鎖が生成される。これは、適切な重合速度又は他の性質を有するポリメラーゼを選択することにより、及び種々の反応パラメーター、例えば反応温度、反応の持続時間、プライマー組成物、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー及びデント濃度、添加剤及び緩衝液組成物（但し、それらだけには制限されない）を用いることにより、反応の進行を制御することにより達成され得る。最適条件は、経験的に決定され得る。
【０１２２】
１２．１ＤＮＡポリメラーゼの選択
延伸−置換反応を制御する１つのアプローチは、第３鎖を生成するための適切な鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することである。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、及びＤｅｅｐ−ＶｅｎｔＲ ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ＃Ｍ０２５８）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。それらのＤＮＡポリメラーゼは、異なった強さの鎖置換活性を有することが知られている。Kornberg and Baker (1992, DNA Replication, Second Edition, pp. 113-225, Freeman, N.Y.)を参照のこと。本発明のために適切なＤＮＡポリメラーゼを選択することは、当業者の範囲内である。
【０１２３】
１２．２ポリメラーゼ、プライマー及びｄＮＴＰ濃度
延伸−置換反応を制御するための別のアプローチは、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、又はｄＮＴＰ、又は第２プライマーの適切な濃度を用いることである。
１２．３添加剤
【０１２４】
いくつかの実施形態によれば、延伸反応は、延伸プライマーと鋳型ＤＮＡとの間での二重体形成に影響を及ぼす剤、例えば反応緩衝液にＤＭＳＯ（例えば１％−２％）、ベタイン（例えば０．５Ｍ）、グリセロール（例えば１０％−２０％）、Ｔ４ Ｇ３２ ＳＳＢ（例えば１０−２０ｎｇ /μｌ）を含むことにより制御される。
【０１２５】
１２．４温度
反応温度はまた、適切な重合及び鎖置換を可能にするように制御され得る。より高い温度が、典型的には、より高い程度の鎖置換をもたらす。いくつかの実施形態によれば、反応温度は、完全な置換を回避するために、２０−３７℃の範囲内にあるよう、例えば３２℃、３３℃、２４℃、３５℃、３６℃又は３７℃で維持される。
【０１２６】
いくつかのアプローチによれば、延伸反応は、従来の（延伸できる）プライマー及び非延伸可能プライマー、すなわち３′末端ブロックプライマーの混合物を用いることにより制御される。非延伸可能プライマーは例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる重合を妨げる化学的遮断基を介して延伸を阻止する。それらの２つの異なったプライマーを異なった割合で混合することにより、新たに合成された相補的ＤＮＡ鎖（後続フラグメント）の二量体（ハイブリダイズされた）部分の長さが制御され得る。例えば、１つのアプローチによれば、５０−７０％が非延伸可能であり（「ブロックされた」）及び３０−５０％が延伸され得る（「非ブロックされた」）、第１プライマーの混合物が使用される。多くのタイプの非延伸可能プライマーが当業界において知られており、そして本発明のために適切であろう。
【０１２７】
１２．５反応時間
いくつかの実施形態によれば、延伸−置換反応は、第２鎖の所望する長さが達成される間、一定の期間の後、反応を終結することにより制御される。いくつかの実施形態によれば、反応は、開始から５分、１０分、２０分、３０分、４０分又は６０分後に終結される。ｄｄＮＴＰの組込みにより、又は化学溶液、例えば１．５ＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液の添加により、反応を終結する方法は、当業界において良く知られている。１つの好ましい実施形態によれば、終結は、反応に、１．５ＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝液を添加した後、ｄｄＮＴＰを組込むことにより達成される。
【０１２８】
１３．配列決定
いくつかの実施形態によれば、本発明は、上記のようにして生成される第２鎖の配列を決定するための方法を提供する。この方法は、第２アダプターの少なくとも一部に対して相補的である第２鎖における配列に、配列決定オリゴヌクレオチドをハイブリダイズし（図３、パネル３．１を参照のこと）、そして第１標的ＤＮＡ配列に対して相補的な配列の少なくとも一部のヌクレオチド配列を決定することを包含する。配列決定は、合成による配列決定法（図３、パネル３．２）又は連結による配列決定法（図３、パネル３．３）、又は両者を用いて実施され得る。
【０１２９】
１つの実施形態によれば、鋳型ＤＮＡに対して相補的な、生成されたＤＮＡ鎖は、標的ＤＮＡの配列決定のために使用される。第２鎖のオーバーハングは、例えば図３に示されるように、第２アダプターの相補的配列にハイブリダイズされるプライマーを延伸することにより配列決定される。
【０１３０】
別の実施形態によれば、鋳型ＤＮＡ鎖はまた、第１アダプターにハイブリダイズされるプライマーを用いても配列決定される。相補鎖からの配列情報は、鋳型ＤＮＡの配列決定から生成される配列と対になって、標的ＤＮＡ配列全体を決定する。
【０１３１】
本明細書に概説される特定の実施形態の変形が使用され得ることは、読者に明らかであろう。１つのアプローチによれば、延伸プライマー及び配列決定オリゴヌクレオチドは、アダプター配列の異なった部分に結合する。１つのアプローチによれば、延伸プライマー及び配列決定オリゴヌクレオチドは、アダプター配列の同じ部分（例えば、延伸のためのアダプター配列の部分及び配列決定のためのアダプター配列の同じ部分の相補体)に結合する。
【０１３２】
任意の適切な配列決定法、例えばＳＢＳ、パイロシーケンシング、連結による配列決定及び他の方法が、オーバーハングの配列を決定するために使用され得る。いくつかの実施形態によれば、複数の配列決定アプローチが使用される。例えば、鋳型ＤＮＡ鎖は、１つの方法（例えば、ｃＰＡＬ）を用いて配列決定され得、そして第３鎖は、異なった方法（例えば、ＳＢＳ）を用いて配列決定される。
【０１３３】
合成による配列決定（ＳＢＳ）は、配列決定反応工程の間、鎖延伸を実施するためにＤＮＡポリメラーゼ活性に頼る。ＳＢＳは当業者において良く知られている。例えば、米国特許第6,210,891号;第 6,828,100号, 第6,833,246号; 第6,911,345号; 第6,969,488号; 第6,897,023号; 第6,833,246号;及び第 6,787,308号; 特許公開番号第20040106130号; 第20030064398号;及び第20030022207号; Margulies et al., 2005, Nature 437:376-380; Ronaghi et al., 1996, Anal. Biochem. 242:84-89; Constans, A, 2003, The Scientist 17(13):36; and Bentley et al., 2008,  Nature 456(7218): 53-59を参照のこと。他の配列決定法（例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定）が当業界において良く知られており、そして使用され得る。ヌクレオチド配列を決定するための他の方法もまた、本発明のために使用され得る。例えば、連結による配列決定（国際公開第1999019341号, 第2005082098号,第2006073504 号、及び Shendure et al., 2005, Science, 309: 1728-1739）、パイロシーケンシング（例えば、Ronaghi et al., 1996, Anal. Biochem. 242:84-89を参照のこと）も使用され得る。
【０１３４】
１４．ＤＮＡ複合体の組成物及びアレイ
１４．１ ＤＮＢ
１つの側面によれば、本発明は、個別領域のアレイを含む支持体である、ＤＮＡ複合体のアレイを含み、ここで
（ａ）複数の前記領域が、一本鎖ＤＮＡコンカテマーを含み、各コンカテマーは複数のモノマーを含み、各モノマーは標的配列及びアダプター配列を含み；
（ｂ）（ａ）におけるＤＮＡコンカテマーの少なくとも一つのサブセットの複数のモノマーの個々が、
（ｉ）部分的にハイブリダイズされた第２ＤＮＡ鎖、ここで各第２鎖ＤＮＡは標的配列に対して相補的な部分及びアダプター配列の少なくとも一部に対して相補的な部分を含み、そして第２鎖の一部がコンカテマーにハイブリダイズされず、そしてアダプターの少なくとも一部に対して相補的な第２鎖の一部がアダプターにハイブリダイズされ、及び
（ｉｉ）標的配列に対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分を含む第３ＤＮＡ鎖、
を含み；そして
（ｃ）（ｂ）の複数のモノマーの少なくとも一つのサブセットの個々がハイブリダイゼーション部位で第３ＤＮＡ鎖に対してハイブリダイズされた第４ＤＮＡ鎖を含み、ここで前記第４ＤＮＡ鎖がアダプターの配列の少なくとも一部を含み、そして前記ハイブリダイゼーション部位が第２アダプター配列の少なくとも一部に対して相補的である。
【０１３５】
上記のようなアレイは、一本鎖ＤＮＡコンカテマーが、（ｉ）捕捉オリゴヌクレオチドと塩基対合できる魅力的な非共有結合相互作用、又は（ii）個別の離隔領域との共有結合相互作用を介して、前記個別の離隔領域上に固定されている。
【０１３６】
アレイ中のＤＮＡ複合体が、本明細書に記載される複合体の何れかの性質を含むことができるか、又は本明細書に記載される方法に従って製造され得ることは理解されるであろう。さらに、複合体は、１又は２以上の以下の特徴の任意の組合せを有することができる：（ｉ）アレイは少なくとも１０６の個別の領域を含み、（ii）コンカテマーは、少なくとも５０、より多くの場合、少なくとも１００、より多くの場合、少なくとも５００のモノマーを含み、（iii）一本鎖ＤＮＡコンカテマーは、二本鎖コンカテマーを現場変性をすることにより生成され、（iv）第４ＤＮＡは、アダプターの配列の少なくとも１０の塩基、好ましくは少なくとも１２の塩基及び任意には、少なくとも１５の塩基を含み、（ｖ）第４ＤＮＡ鎖は、それがハイブリダイズされる第２ＤＮＡ鎖に対して完全に相補的である。
【０１３７】
いくつかの実施形態によれば、第４ＤＮＡ鎖は、プライマー延伸（例えば、合成反応による配列決定）のためのプライマーとして活性化できるオリゴヌクレオチドであるか、又はそのようなプライマーの延伸生成物であるか、又は連結による配列決定のためのアンカーとして活性化できるオリゴヌクレオチドであるか、又はそのようなオリゴヌクレオチド及び標識されたプローブ（例えば、標識されたｃＰＡＬプローブ）の連結生成物である。１つのアプローチによれば、第４鎖は、アダプター配列に対して相補的な部分、及び標的配列に対して相補的な部分を含む。
【０１３８】
１４．２  クラスター
１つの側面によれば、本発明は、個別領域のアレイを含む支持体である、ＤＮＡ複合体のアレイを含み、ここで
（ａ）複数の前記領域が、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡのクローンクラスターを含み、各ＤＮＡは、第１アダプター及び第２アダプターを端に有する標的配列を含み；
（ｂ）（ａ）におけるクラスターの少なくとも一つのサブセットの複数のＤＮＡの個々が、
（ｉ）部分的にハイブリダイズされた第２ＤＮＡ鎖、ここで各第２鎖ＤＮＡは標的配列に対して相補的な部分及び第１アダプター配列の少なくとも一部に対して相補的な部分を含み、そして標的配列に対して相補的な第２鎖の一部がＤＮＡにハイブリダイズされず、そして前記第１アダプターの少なくとも一部に対して相補的な第２鎖の一部がＤＮＡにハイブリダイズされ、及び
（ｉｉ）標的配列に対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分、及び前記第２アダプター配列に対して相補的であり、且つそれにハイブリダイズされた部分を含む第３ＤＮＡ鎖、
を含み；そして
（ｃ）（ｂ）の複数のＤＮＡの少なくとも一つのサブセットの個々がハイブリダイゼーション部位で第３ＤＮＡ鎖に対してハイブリダイズされた第４ＤＮＡ鎖を含み、ここで前記第４ＤＮＡ鎖が前記第２アダプターの配列の少なくとも一部を含み、そして前記ハイブリダイゼーション部位が第２アダプター配列の少なくとも一部に対して相補的である。
【０１３９】
アレイ中のＤＮＡ複合体が、本明細書に記載される複合体の何れかの性質を含むことができるか、又は本明細書に記載される方法に従って製造され得ることは理解されるであろう。さらに、複合体は、１又は２以上の以下の特徴の任意の組合せを有することができる：（ｉ）アレイは少なくとも１０６の個別の領域を含み、（ii）ＤＮＡは一本鎖であり、（iii）第４ＤＮＡは、アダプターの配列の少なくとも１０の塩基、好ましくは少なくとも１２の塩基及び任意には、少なくとも１５の塩基を含み、（iｖ）第４ＤＮＡ鎖は、それがハイブリダイズされる第２ＤＮＡ鎖に対して完全に相補的である。
【０１４０】
いくつかの実施形態によれば、第４ＤＮＡ鎖は、プライマー延伸（例えば、合成反応による配列決定）のためのプライマーとして活性化できるオリゴヌクレオチドであるか、又はそのようなプライマーの延伸生成物であるか、又は連結による配列決定のためのアンカーとして活性化できるオリゴヌクレオチドであるか、又はそのようなオリゴヌクレオチド及び標識されたプローブ（例えば、標識されたｃＰＡＬプローブ）の連結生成物である。１つのアプローチによれば、第４鎖は、アダプター配列に対して相補的な部分、及び標的配列に対して相補的な部分を含む。
【０１４１】
１４．３組成物
１つの側面によれば、本発明は、上記セクション１４．１又は１４．２に記載されるようなアレイ、及びＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼから選択された酵素（ＤＮＡポリメラーゼ鎖置換活性を有する）を含む組成物を提供する。１つの実施形態によれば、組成物はさらに、蛍光標識されたｄＮＴＰ（例えば、ｄＮＴＰ類似体）、及び／又は標識されたオリゴヌクレオチドプローブのプールを含む。
【実施例】
【０１４２】
１５．実施例
１５．１実施例１：ペアエンド配列決定のためのＤＮＢ上の相補的オーバーハングの生成
この実施例においては、既知アダプター配列の合成による配列決定を、Complete Genomics（CGI's）DNBアレイチップ（DNB Nanoball（登録商標）Array）を用いて実施した。ＤＮＢを、ヒトゲノムＤＮＡフラグメント及びアダプター２：5’-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAAGCT CGAGCTCGAGCGATCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’（配列番号１；図５を参照のこと）を含む一本鎖環のライブラリーを用いて、ローリングサークル増幅により生成した。１μＭの延伸プライマーＡｄ１２０＿３Ｔ＿２１ｂｐ: 5’-GAT CGG GCT TCG ACT GGA GAC-3’（配列番号２；「第１延伸プライマー」）及び１μＭの延伸プライマーＣＸ１１７：5’-AAG TCG GAG GCC AAG-3’（配列番号３；「第２延伸プライマー」）（図５を参照のこと）を、３５℃で３０分間、ＤＮＢのアレイにハイブリダイズした。この実験においては、プライマーを、アダプター配列中の２１個の塩基が決定されるよう、選択した（従って、アレイ中のＤＮＢのすべては、同じ配列読み取り値を与える）。
【０１４３】
次に、プライマーを、１×Ｐｈｉ２９緩衝液中、１０Ｕ／μｌのＰｈｉ２９ポリメラーゼ、０．１ mg/ml ＢＳＡ、２０％ のグルセロール、 ２％の ＤＭＳＯ、２５ ｕＭの ｄＮＴＰを含む延伸混合物において延伸し（第２及び第３鎖合成）、３５℃で２０分間、相補鎖（後続フラグメント）を合成した。次に、延伸を、２５０μＭのｄｄＮＴＰの添加により終結した。
【０１４４】
次に配列決定オリゴヌクレオチド（４μＭ）のＡＤ０４１＿ヘルパー又はＡＤ０４１＿５Ｔ（図５）を、後続フラグメント（第３鎖）の一本鎖オーバーハング部分にハイブリダイズした。これに続いて、３５℃でCicadaを用いて、Hot MyChem #2で３０分間、ＳＢＳを３５サイクル実施した。４種の異なった蛍光色素により標識された可逆的ターミネーターヌクレオチド（ＲＴ）を、配列決定反応に使用した。ＴｘＲはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄを表し；ＦＩＴはフルオレセインを表し；Ｃｙ５はシアニン５を表し；そしてＣｙ３はシアニン３を表す。表２に示されるシグナルの平均は、同定された塩基特異的色素を有する塩基を組込むアレイ上のすべてのＤＮＢの平均を表す。最高値は、特定の位置に対して必要とされる塩基を表す。例えば、位置１においては、塩基Ａに関連するＣｙ３色素は、Ａと呼ばれる最高のシグナル平均値を有する。
【０１４５】
結果：配列決定された領域は、アダプター領域ＣＸ１１７に対する相補配列である、AGA CCG CTT GGC CTC CGA CTT,であるので、すべての２１の塩基は正しく呼ばれる。異なった延伸時間は、異なったシグナル強度を生成した（データは示されていない）。アダプター領域ＣＸ１１７に対する相補体の２１の塩基からのシグナルを決定した。表２を参照のこと。
【表２】
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【０１４６】
１５．２実施例２：ゲノム配列の配列決定
ゲノム配列を含む多くのＤＮＢは、本明細書に記載される方法を用いて配列決定されている。この表は、ゲノムに完全に一意的にマッピングされたComplete Genomics（CGI's）DNBアレイチップ（DNB Nanoball（登録商標） アレイ）上のＤＮＢの存在を表し；Ｌ０１＆Ｌ０８：最初に、第１鎖のマッピングを表し；Ｌ０２：アダプター配列決定（ゲノム配列決定ではない）；及びＬ０３−Ｌ０７：第２鎖ゲノム配列決定。ラインＬ０３−Ｌ０７は、ゲノムへの完全に一意的にマッピングされたＤＮＢのより高い割合（正確に１回）を有する。パーセントは、アレイ上に配列されたすべてのＤＮＢを用いて計算される。
【表３】
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【０１４７】
本出願は、２０１５年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／１１７，３９１号に関連し、その全体が参照により本明細書に組込まれる。
【０１４８】
本明細書に引用される全ての出版物及び特許文書は、そのような出版物又は文書の個々が参照により本明細書に組込まれるように具体的且つ個々に示されているかのように、参照により本明細書に組込まれる。本発明は、主として特定の実施形態を参照して説明されるが、本開示を読むことにより他の実施形態が当業者に明らかとなり、そのような実施形態が本発明の方法に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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