(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を生成する自動化された方法であって、以下のステップ：
ａ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む細胞サンプルの提供、
ｂ）遠心分離による細胞サンプルの準備、
ｃ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の磁気分離、
ｄ）調節剤を用いた、濃縮したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の活性化、
ｅ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変、
ｆ）遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の培養チャンバー内での増殖、
ｇ）培養したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の洗浄、を含み、
すべてのステップが、閉鎖型滅菌細胞培養システム内で実施されることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記調節剤が、アゴニスト抗体、サイトカイン、及び組換え共刺激分子（
costimulatory molecules)からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記調節剤が、ビーズ又はナノ構造体に結合している抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、又はその抗原結合ドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ構造体が、ナノマトリックスであり、ナノマトリックスが、ａ）流動性ポリマー鎖のマトリックスと、ｂ）前記流動性ポリマー鎖のマトリックスと結びついた抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はその抗原結合ドメインとを含み、ナノマトリックスのサイズが１〜５００ｎｍである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変が、レンチウイルス、γ−、α−レトロウイルス、若しくはアデノウイルスを用いて前記細胞を形質導入することにより、又は核酸、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ、自己複製型ＲＮＡウイルス、若しくは組込み能欠損レンチウイルスベクターを用いたエレクトロポレーション若しくはトランスフェクションにより実施される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変が、レンチウイルスベクターを用いて前記細胞を形質導入することにより実施される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の磁気分離が、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の表面上の細胞表面マーカーに対して特異的な抗原結合分子を用いて実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の表面上の細胞表面マーカーに対して特異的な前記抗原結合分子が、マーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８  ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、ＣＣＲ７、ＰＤ−１、及びＬａｇ３からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の活性化、遺伝子改変、及び／又は増殖が、振盪条件により実施される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記振盪条件が、前記閉鎖型滅菌細胞培養システムの前記培養チャンバーを回転させることにより実施され、及び前記回転が、１〜１２０秒毎に、０より大きく最大７０×ｇの間の遠心力を用い、１方向又は２方向で定期的に実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記振盪条件が、増殖ステップｆ）中に実施される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化が、活性化中に、細胞０．５ｅ６個／ｍｌ〜細胞４ｅ６個／ｍｌの密度のＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を用いて実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化が、活性化中に、細胞４ｅ６個／ｍｌ〜細胞１ｅ７個／ｍｌの高密度のＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を用いて実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチド配列の導入である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体が、前記ＣＡＲ又はＴＣＲを発現し、及び前記ＣＡＲ又はＴＣＲを発現する前記細胞が、ステップｇ）が実施される前の追加の磁気分離において、前記ＣＡＲ又はＴＣＲを発現しない細胞から分離される、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変したＴ細胞の自動生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子改変型Ｔ細胞の臨床的製造法は、現在のところ、患者の末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）を取得することから一般的に開始する複雑なプロセスである。現行のプロトコールは、白血球アフェレーシスステップを特徴とするが、細胞収率を高めるために、最初により煩雑なプロセス（より小容積の血液採取とは裏腹に）を余儀なくされる。ＰＢＭＣは、多くの場合、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターで遺伝子改変する前に、Ｔ細胞について濃縮され、活性化される。次に、改変したＴ細胞は、処理に必要とされる細胞数まで到達するように増殖され、その後、細胞は、再注入される前に最終的に製剤及び／又は凍結保存される。細胞生成物は、いくつかの品質管理アッセイを経なければならず、またすべての出荷基準及び医薬品製造管理及び品質管理基準（ＧＭＰ）ガイドラインを満たさなければならない。今までは、手元にあるデバイス及びインフラストラクチャーを用いることにより、小規模臨床試験のための製造プロセスを開発してきた研究者により、遺伝子改変型Ｔ細胞を用いた養子細胞移入（ＡＣＴ）が主に実施されてきた。かかる個別化された療法は複雑である：細胞製造プロセスは、幅広い訓練を積んだ専門の熟練オペレーターによる介入を必要とする多くの（開放性の）ハンドリングステップ（例えば、密度勾配細胞処理、遺伝子改変、洗浄、フィーディング等）を含むので、労働集約的である。このような複雑な製品を製造するクリーンルーム従業員に対して高度の技能と時間が必要とされることから、不合格率は高くなる可能性がある。更に、無菌及び滅菌状態の封じ込めを保証するために、クリーンルーム及び必要とされるすべての装置を備えた専用のインフラストラクチャーが整備され、適格性が確認されなければならず、またそれは機能的でなければならない。これらの要件により、かかる臨床的製造は、限られた数の世界的な研究機関に限定される。次に、稼働数が制限され、したがって時期に関わりなくサービス提供が受けられる患者の数も制限される。かかる好ましくない市販モデルは、投資を妨害し、したがってそれを必要とする患者のためのこのような有望な療法の幅広い開発も阻害する（Ｋａｉｓｅｒ  ＡＤ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１５年）、１〜７頁）。
【０００３】
したがって、臨床用途の遺伝子改変型Ｔ細胞の生成法であって、よりロバストでオペレーターの技能に依存しない生成法に対するニーズが、当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一般的に、生物学的プロセスの自動化は、特に遺伝子改変型Ｔ細胞等の複雑な製品を生成するために、複数のプロセスを組み合わせなければならない場合、困難である。
【０００５】
したがって、閉鎖型のＧＭＰ順守環境（閉鎖型滅菌細胞培養システム）内に配置された細胞処理に適するデバイス内で、遺伝子改変したＴ細胞を生成するプロセスを自動化すると、それはロバストであり、また非自動化プロセスと比較して、同等量又はそれより多くの量の臨床用途に適する遺伝子改変したＴ細胞が得られることが判明したのは驚きである。本発明は、自動化に特有なより少数の操作や細胞のより「穏和な」取り扱いによって、より良好な形質導入効率及び臨床的に意義のある数の遺伝子改変型Ｔ細胞のロバストな製造を実現する方法について開示する。
【０００６】
閉鎖型ＧＭＰ順守システム内での細胞処理は、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）及び関連するチューブセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）を用いて実施され得る。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）は、異なる細胞型の磁気分離を可能にする細胞処理の用途のための柔軟なプラットフォーム、並びに細胞処理プロトコールを提供する。サンプル処理システムの詳細は、国際公開第２００９／０７２００３号でも開示されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の方法は、自動化された細胞の準備、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、又はＴ細胞前駆体の選択（分離）、前記細胞の活性化、前記細胞の増殖、前記細胞の形質導入、及び例えば後続する臨床利用のための前記細胞の製剤（洗浄）を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】代表的なＴ細胞の自動濃縮から得られた結果を示す図である。
【図２】Ｔ細胞の自動活性化を示す図である。
【図３】遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造を可能にするソフトウェアアーキテクチャーを示す略図である。
【図４Ａ】遺伝子操作されたＴ細胞の製造中に培養物を振盪したときの、振盪の影響を示す図である。
【図４Ｂ】遺伝子操作されたＴ細胞の製造中に培養物を振盪したときの、振盪の影響を示す図である。
【図４Ｃ】遺伝子操作されたＴ細胞の製造中に培養物を振盪したときの、振盪の影響を示す図である。
【図５】細胞培養の密度と培養物に適用される振盪タイプの効果との間の関係を示す図である。
【図６】自動製造稼働における工程内モニタリングを示す図である。
【図７Ａ】手動条件と自動化条件の形質導入効率を示す図である。
【図７Ｂ】手動条件と自動化条件の形質導入効率を示す図である。
【図８】Ｔ細胞自動製造のロバスト性を示す図である。
【図９Ａ】振盪条件を用いた、０日目の自動製造を示す図である。
【図９Ｂ】振盪条件を用いた、０日目の自動製造を示す図である。
【図１０】自動製造中の細胞培養物の組成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
遺伝子改変型Ｔ細胞の製造に関する現在の最新技術は、遺伝子改変型Ｔ細胞の製造の小さなステップを実施するために多数のデバイスを用いることにある。多くのステップは手動介入を必要とし、過誤のリスクを増大させる。本明細書では、すべてのステップが、単一のデバイス内で実施され、例示的には、単回使用閉鎖型滅菌チューブセット及びプログラム化されたソフトウェアを用いるＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）を使用する。驚くべきことに、手動プロセスと比較して、本発明の方法では、製造されたＴ細胞の形質導入効率はより高く、また遺伝子改変型Ｔ細胞による導入遺伝子発現量もより多くなる（図８）。更に、多数の高度に生存性のＴ細胞を２週間未満にわたってロバストに生成することができる（図８及び６）。本明細書に開示する本発明の方法と関連するこれらの長所は、例えばサンプリングのために、細胞をインキュベータから取り出す必要がない（そうでなければ、培養物の大幅な温度低下を引き起こす）ためにプロセス全期間にわたり高度に維持された環境（温度及び気体）に依り、また、チューブセット内での細胞の処理や取り扱いが穏和である一方、手動によるピペッティング操作がないこと、及び／又は強さの制御や標準化が困難であり、また細胞やプロセスにとって有害な剪断力を引き起こすシリンジが使用されないことによる。
【００１０】
１つの態様では、本発明は、遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を生成する自動化プロセス（方法）であって、以下のステップ：
ａ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む細胞サンプルの提供、
ｂ）遠心分離による細胞サンプルの準備、
ｃ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の磁気分離、
ｄ）調節剤を用いた、濃縮したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の活性化、
ｅ）Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変、
ｆ）遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の培養チャンバー内での増殖、
ｇ）培養したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の洗浄、
を含み、すべてのステップが、閉鎖型滅菌細胞培養システム内で実施されることを特徴とする、方法を提供する。
【００１１】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を磁気分離するステップは、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の表面上の細胞表面マーカー、例えばマーカーＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、ＣＣＲ７、ＰＤ−１、又はＬａｇ３等に対して特異的な抗原結合分子を用いて実施され得る。
【００１２】
前記調節剤は、アゴニスト抗体、サイトカイン、組換え共刺激分子（
costimulatory molecules)、及び小型の薬物阻害剤からなる群から選択され得る。好ましくは、前記調節剤は、ビーズ又はナノ構造体に結合している抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそのフラグメントである。より好ましくは、調節剤は、ナノマトリックスであり、該ナノマトリックスは、ａ）流動性ポリマー鎖のマトリックス、及びｂ）前記流動性ポリマー鎖のマトリックスと結びついた抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそのフラグメントを含み、該ナノマトリックスのサイズは１〜５００ｎｍである。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそのフラグメントは、流動性ポリマー鎖の同一のマトリックス又は異なるマトリックスと結びつけることができる。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体、又はそのフラグメントが異なる流動性ポリマー鎖のマトリックスに結びつける場合には、Ｔ細胞の刺激のためのナノマトリックスを細かく調製することができる。ナノマトリックスは、生分解性であり得る。
【００１３】
更に、前記小型のナノマトリックスの滅菌濾過は、例えば国際公開第２０１４／０４８９２０Ａ１号に開示されているように可能であるが、これは、厳格なＧＭＰ標準を順守する条件下で、すなわち、閉鎖型滅菌細胞培養システムにおいて、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期的に増殖させるのに重要な特徴である。
【００１４】
前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を遺伝子改変するステップは、形質導入、トランスフェクション、又はエレクトロポレーションにより実施され得る。
【００１５】
好ましくは、形質導入は、レンチウイルス、γ−、α−レトロウイルス、若しくはアデノウイルスを用いて、又は核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンタゴｍｉｒ、ＯＤＮ）、タンパク質、部位特異的ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰ／Ｒ）、自己複製ＲＮＡウイルス（例えば、ウマエンセファロパシーウイルス）、若しくは組込み能欠損レンチウイルスベクターによるエレクトロポレーション若しくはトランスフェクションを用いて実施される。
【００１６】
より好ましくは、前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変は、レンチウイルスベクターで前記細胞を形質導入することにより実施され得る。
【００１７】
前記遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を増殖させるステップは、細胞培養物増殖用に適した細胞培地、例えばＴｅｘＭＡＣＳ  ＧＭＰ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）等を前記培養チャンバーに添加することにより実施され得る。
【００１８】
Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の前記活性化、遺伝子改変、及び／又は前記増殖は、振盪条件により実施され得る。好ましくは、振盪は、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の増殖中に実施される。好ましくは、培養チャンバー内の振盪（回転）は、培養チャンバー（遠心分離チャンバー）を、１〜１２０秒毎に、より好ましくは１５〜６０秒毎に、及び最も好ましくは３０秒毎に回転させることにより、０より大きく（＞）最大７０×ｇ（半径が６ｃｍのチャンバー内で１〜１０００ｒｐｍ）の間の遠心力、及び１方向又は２方向で、より好ましくは、０．２〜１７×ｇ（半径が６ｃｍのチャンバー内で５０〜５００ｒｐｍ）、１方向又は２方向で、最も好ましくは、６×ｇ（半径が６ｃｍのチャンバー内で３００ｒｐｍ）、２方向で、単発的に又は定期的に行われる。重要なこととして、振盪条件は、Ｔ細胞増殖を最良に支援するために、培養中に修正可能である（一般的に、細胞密度が高いほど強い）。
【００１９】
前記活性化は、活性化される細胞が０．２ｅ6個／ｍｌ〜４ｅ6個／ｍｌの間の、好ましくは細胞０．５ｅ6個／ｍｌ〜２ｅ6個／ｍｌの間の、及び最も好ましくは、細胞１ｅ6個／ｍｌである細胞密度を用いて実施され得る。或いは、前記活性化は、活性化される細胞が４ｅ6個／ｍｌ〜２ｅ7個／ｍｌ、好ましくは、細胞４ｅ6個／ｍｌ〜１ｅ7個／ｍｌの間である、高細胞密度を用いて実施され得る。
【００２０】
従来の方式では、Ｔ細胞密度が低い（すなわち、＜１ｅ6個／ｍｌのＴ細胞、又は＜２ｅ6個／ｍｌのＰＢＭＣ細胞）低密度において、Ｔ細胞を活性化し、増殖させる。通常は、高いＴ細胞密度（＞３ｅ6個／ｍｌのＴ細胞、又は５ｅ6個／ｍｌのＰＢＭＣ細胞）では、適切に活性化できない。したがって、本発明のプロセスにおいて、高密度のＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を活性化させ、次に振盪条件下において増殖させた場合（おそらくは、前記細胞の遺伝子改変前又は後において）、相乗的効果を認めることができるのは驚きである。これは、非常に多数の遺伝子改変した細胞を迅速に実現する（図９を参照）。多数の細胞を例えば上記のような可溶性ナノマトリックスで活性化することと、増殖中の振盪条件との組み合わせのこの予期せぬ相乗的効果に起因して、自動化プロセスは、当技術分野において公知の方法と比較して短時間（すなわち、１４〜２８日間ではなく、８日間）で、治療で用いられる多数の改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を生成できる。
【００２１】
前記遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、又は任意のアクセサリー分子をその細胞表面上で発現するように、遺伝子改変され得る。
【００２２】
最終的に製剤する場合、増殖させ、遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を、遠心分離、及び生成した細胞組成物を患者に注入すること等の後続の用途に適するバッファーを用いた培養培地交換により洗浄する。
【００２３】
必要な場合には、遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体は、例えば用いられる閉鎖型滅菌細胞培養システムに組み込まれた磁気分離技術を再度用いて、改変されていないＴ細胞から分離することができる。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本発明の方法により得られる遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の実質的に純粋な組成物を提供する（図１０を参照）。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、本発明の方法により得られる遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の医薬組成物を提供する。
【００２６】
例示的に、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）及び関連するチューブセット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）が、閉鎖型細胞サンプル処理システムとして本明細書で用いられ、そのようなシステム上で自動化プロセスを実施した。このシステムは、国際公開第２００９／０７２００３号に詳細に開示されている。但し、本発明の方法の使用を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムに限定するつもりはない。
【００２７】
ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムは、細胞製品製造プロセス全体を自動化及び標準化するように設計されている。同システムは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）分離技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）を、広範なセンサー制御式細胞処理能力と組み合わせる。該デバイスの際立った特徴として下記事項が挙げられる：
・細胞の処理及び培養の標準化を可能にする使い捨て型ＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔ（商標）チャンバー
・単独で、又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）と併用して細胞を濃縮する及び枯渇させる能力
・温度及びＣＯ２気体交換制御による細胞培養物及び細胞増殖能力
・事前に定義された培地及び容積での最終生成物の製剤
・柔軟なプログラミングスイート（ＦＰＳ）及び細胞処理をカスタマイズ化するためのＧＡＭＰ５適合プログラミング言語を用いた、デバイスプログラミングの可能性
・様々な用途のオーダーメードチューブセット
【００２８】
Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を分離するステップは、１つ又はいくつかの（２つ又はそれ以上）陽性濃縮ステップ、又はその組み合わせ、すなわちＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の分離を含み得る（直接磁気標識）。Ｔ細胞は、粒子、例えばＣＤ４及びＣＤ８に対してそれぞれ特異的な磁気ビーズ等に結合している抗原結合分子を用いて、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞について選択され得る。Ｔ細胞の部分母集団、例えばナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞等は、マーカーＣＤ６２Ｌを用いるなどして分離され得る。
【００２９】
Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を分離するステップは、Ｔ細胞の陰性濃縮（非Ｔ細胞の直接標識）、又は前処理物から除去される細胞のサブセットの枯渇も含み得る。例えば、Ｂ細胞は、ＣＤ１９マーカーによりリンパ腫患者物質から除去され得る。阻止細胞、例えば調節性Ｔ細胞（ＣＤ２５  ｈｉｇｈ）、単球（ＣＤ１４）等も、マーカーＣＤ２５及びＣＤ１４を用いて、それぞれ除去可能である。
【００３０】
Ｔ細胞のウイルス形質導入は、形質導入エンハンサー試薬、特にポリカチオン性試薬（正の正味電荷を有するポリブレン、硫酸プロタミン、ポリ−Ｌ−リシン、ペプチド）、ポロキサマー、接着分子、例えばフィブロネクチン又は修飾フィブロネクチン（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ）等、又はタンパク質標的ドメイン、例えば抗体、抗体複合体、磁性粒子等の群から選択される形質導入エンハンサー試薬の使用により増強できる。
【００３１】
形質導入エンハンサーは、溶液状態で提供する、培養チャンバー上にコーティングする、又は培養チャンバー内の懸濁物／溶液中に存在する担体物質上にコーティングすることができる。
【００３２】
遠心分離チャンバー及び培養チャンバーは同一であってもよい。遠心分離チャンバー及び培養チャンバーは、様々な条件で利用可能である：例えば、分離又は形質導入の場合、高速回転スピード（すなわち、高ｇ力）が適用可能であるが、一方、例えば、培養ステップは、低速回転で、又は停止状態でさえも実施され得る。本発明の別の変形形態では、チャンバーは、回転方向を揺動的に変更し、その結果、チャンバーの振盪及び懸濁物内の細胞の維持を実現する。
【００３３】
したがって、本発明のプロセスでは、Ｔ細胞の活性化、遺伝子の改変、及び／又は培養ステップは、遠心分離又は培養チャンバーの安定した条件又は振盪する条件の下で実施可能である。
【００３４】
図１は、代表的なＴ細胞自動濃縮から得られた結果を示す。総細胞数８ｅ9個の白血球アフェレーシスが、無菌溶接により、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に取り付けられたチューブセットに接続されている。細胞を洗浄し、ＣＤ４及びＣＤ８  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ試薬で標識する。標識されたＴ細胞を、磁性濃縮により残りの細胞から特異的に単離する。濃縮前及び後の細胞を、ＣＤ３、ＣＤ１４、及びＣＤ２０に対する蛍光色素結合型抗体で標識し、フローサイトメトリー法により分析する。上段のドットプロットは、濃縮前の細胞の組成を示し、下段のドットプロットは、濃縮後のＴ細胞の純度（９４．７％）を表す。
【００３５】
図２は、自動化されたＴ細胞活性化を示す。０日目、１ｅ8個の濃縮されたＴ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイス上のチューブセットのチャンバー内に自動的にサンプル採取する。同日、初期の活性化マーカーであるＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションを引き起こす、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）の活性化試薬と共にＴ細胞をインキュベートする。図は、活性化前（上段）、及び活性化試薬添加後２４時間（下段）の生存Ｔ細胞についてふるい分けた代表的フローサイトメトリー分析の結果を表し、ＣＤ２５及びＣＤ６９の強いアップレギュレーションを示す。
【００３６】
図３は、遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造を可能にするソフトウェアアーキテクチャーの略図を示す：遺伝子操作されたＴ細胞の自動製造を実施するためには、すなわち複雑な生物学的プロセスを自動化可能にするためには、パラメーター、例えば細胞数、流速、容積、温度、ＣＯ2濃度（％）、培養物の動き、インキュベーション時間、培地交換等を受け取る能力を有するソフトウェアを作成することが重要である。開発目的の場合、プログラムは柔軟でなければならないが、臨床用途の場合、インプットパラメーターの数は減少させる必要があり、またプロセス変更は控えなければならない。したがって、本発明者らはプログラムを記述するが、その中では培養パラメーター、行為が実施されなければならない日時が、いわゆるアクティビティーマトリックス内で最初に設定される。アクティビティーマトリックスは、バックグラウンドで稼働するプログラムに対してガイダンスを提供する。バックグラウンドプログラムは、培養物の基本的な機能を制御する培養ループ（セントラルボックス）として機能し、この培養ループにおいて、「サテライトプログラム、例えば「形質導入」、「試薬洗浄」、「フィード」等が、規定された時刻において起動可能である。サテライトプログラムが完了したら、セントラル培養ループが再開する。培養ループ及びサテライトプログラムパラメーターは、製造プロセス開始時に、アクティビティーマトリックスに規定される（インプット部分は図示せず）。本明細書に開示するようなプロセスの自動化された手順を実施するために、プログラムの作成は重要であるものの、かかるプログラムを実施するには、本発明上のインプットがなくても当業者により実施可能である。しかし、パラメーターインプット及びプログラムの開発（例えば、振盪モード、時間、及び頻度等）は、ロバストで機能的な自動化プロセス（高度に変動性のインプット物質、例えば医療適用が異なる患者から得られた細胞等について、信頼性及び再現性のある結果を生成する能力を有するプロセスを意味する）を得るために、特別に実施されなければならない。
【００３７】
図４は、培養物の振盪が、遺伝子操作されたＴ細胞の製造中に及ぼす影響を示す。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上で、ＣＤ６２Ｌ陽性細胞の自動濃縮を行った後、１ｅ8個の濃縮後のＴ細胞をチャンバーに導入し、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）で活性化し、ＣＤ２０を標的とするキメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターで遺伝子改変した。最初の４〜５日間は、定常状態の培養条件下で実施した。培養物を、次に３つの異なるタイプの単発式振盪モードで処理した。Ａ）タイプ１、３０秒毎、１００ｒｐｍ、１方向で２秒間、Ｂ）５日目〜９日目はタイプ１。９日目にタイプ２を起動する（３０秒毎、３００ｒｐｍ、１方向で２秒間）、又はＣ）５日目〜９日目はタイプ１。９日目にタイプ３を起動する（３０秒毎、３００ｒｐｍ、２方向で２秒間）。Ｘ軸は、培養日数を表す。左側のｙ軸は、Ｔ細胞の増殖（四角）、細胞密度（円、１ｍｌ当たり１ｅ6個の細胞）、及び総細胞数（三角、×細胞１ｅ8個）を示す。右側のｙ軸は、表示のタイプの振盪スピードを示す。Ｃ）で認められるように、振盪条件のパラメーターを変化させることにより、細胞生成量も増加する。
【００３８】
図５は、細胞培養物の密度と、培養物に適用した振盪タイプの効果との間の関連性を示す。図４に記載の条件と類似した条件で実施したいくつかの実験から得られた結果より、よりロバストな振盪タイプ（例えば、タイプ３）は、細胞２ｅ6個／ｍｌより高い、好ましくは細胞４ｅ6個／ｍｌより高い密度の培養物に適用すると、より良好な結果をもたらすことが観察可能である。Ｘ軸は、培養物を２５０ｍｌに設定し、いずれのケースも、培養を開始し、最初のＴ細胞活性化を行った後、８日間経過した後の日数を表す。ｙ軸はＴ細胞密度を表す（細胞１ｅ6個／ｍｌ）。
【００３９】
図６は、自動製造稼働における工程内モニタリングを示す。Ｔ細胞が最適な条件で培養されるのを保証するためには、製造稼働中に培養物をサンプリングできるようにして、重要なパラメーターをモニタリングすることが重要である。本明細書に記載の自動化プロセスは、ユーザーが、培養培地のサンプルを、時期を問わず、専用のサンプリングパウチ内に採取できるようにする。パラメーター、例えば細胞密度、グルコース、ｐＨ等は、次に遠隔的に測定可能である。図は、ＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）を用いて、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）内で実施された代表的な稼働の工程内モニタリング値を表す。Ｘ軸は、日数表示の時間を表す。左側ｙ軸は、グルコースの値（三角、ｇ／ｍｌ）、ｐＨ値（白抜きのひし形）を示す。右側Ｙ軸は、生存率（塗りつぶしたひし形、％）、及び実験の振盪スピード（点線、ｒｐｍ）を表す。
【００４０】
図７は、手動条件と自動化条件の形質導入効率を示す。図４に記載の条件と類似した条件では、１ｅ8個の濃縮したＴ細胞を、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キットで刺激し、１日目に、抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体をコードするレンチウイルスベクターを、形質導入ユニット１ｅ8個用いて形質導入した。自動製造プロセスと並行して、手動製造稼働を実施した。形質導入の７日後に、サンプルをフローサイトメトリー法により分析して、Ａ）形質導入されたＴ細胞の頻度、及びＢ）ＣＡＲ発現の平均蛍光強度を求めた。以上のように、導入遺伝子を発現する細胞の割合（％）、並びに導入遺伝子発現レベルは、自動製造プロセス中に形質導入されたＴ細胞の方がより高い。
【００４１】
図８は、Ｔ細胞自動製造のロバスト性を示す。すべての線は、異なるドナーについて実施した、独立した自動製造稼働を表す。実験は、図４の記載に従い実施する。Ｘ軸は、日数による時間を表し、またＹ軸は、異なる日に求めた絶対的な細胞数である。以上のように、自動製造プロセスは、非常にロバストであり、また個々の稼働について非常に類似した結果をもたらす。
【００４２】
図９は、０日目に振盪条件を用いる自動製造を示す。ＣＤ４／ＣＤ８陽性細胞を、アフェレーシスから単離し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）プラットフォームにおいて、異なる設定で培養した。細胞４ｅ8個のより高い密度を有する濃縮後のＴ細胞を、０日目に総容積１００ｍｌ（Ａ）又は２００ｍｌ（Ｂ）に播種し、タイプ３の振盪条件下で培養を速やかに実施した。１００ｍｌ中の細胞を２日目に希釈し、培地交換を４日目に開始して、培養終了まで毎日実施した。６日目に、２００ｍｌ（Ｂ）で開始した培養を停止し、１００ｍｌ（Ａ）で開始した培養は、８日目に終了した。驚くべきことに、結果は、培養開始時の活性化中に定常状態が存在しなくても、Ｔ細胞を活性化及び増殖させることが可能であることを示している。かかる動的条件では、極めて急速に、多数のＴ細胞を生成することが可能である（すなわち、図９Ａの８日目では、Ｔ細胞は２．８ｅ9個であり、これに対して図４Ｃの８日目では、総細胞は１．８ｅ9個である）。
【００４３】
図１０は、自動製造中の細胞培養の組成物を示す。健康なドナーから得たバフィーコートを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に据付けられたチューブセットＴＳ５２０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）と結合させ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ６２Ｌ試薬を用いて、ナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞サブセットを濃縮した。１ｅ8個のＣＤ６２Ｌ濃縮細胞を培養チャンバー内に配置、活性化し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクターで１日目に形質導入し、本発明に記載する方法を用いて増殖させた。図は、表示した細胞サブセットの頻度を表す（バーの最下部から最上部に向かって：Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、及び果粒球）。以上のように、１１日間の培養後、最終的な採集サンプルにおいて、細胞生成物は、９５％を超えるＴ細胞から構成されている。
【００４４】
実施形態
本発明の１つの実施形態では、例えば、対象とするＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む患者サンプルを閉鎖型滅菌培養システム、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）等のチャンバーに導入する。サンプルを遠心分離し、好ましくは、光学濃度式相検出法を用いて過剰の赤血球を除去し、細胞の凝集を避けるために、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）を用いて細胞サンプルを洗浄し、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４及びＣＤ８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）等の磁気細胞分離試薬で磁気的に標識する。標識後、細胞を洗浄し、一体型磁気細胞選択カラムにより磁気的に濃縮し、次に細胞培養チャンバーに戻す。
【００４５】
細胞培養チャンバー内で、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の増殖を誘発する能力を有する試薬、例えばアゴニスト抗体（例えば抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８）、サイトカイン（例えばＩＬ−ｌｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３５、ＴＧＦ−ｂ、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）組換えタンパク質、共刺激分子、レクチン、イオノフォア、合成分子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、人工ＡＰＣ、又はフィーダー等のうちの１つ又はその組み合わせを用いて、安定した条件又は振盪培養条件において活性化できる。これらの活性化試薬は、溶液で提供する、培養チャンバー上にコーティングする、又は培養チャンバー内の懸濁物／溶液中に存在する担体物質上、若しくは大型の粒子上にコーティングすることができる。
【００４６】
Ｔ細胞は、安定した条件又は振盪培養条件において培養可能である。培養期間の後、ウイルスベクターを培養チャンバーに添加し、細胞を形質導入させる。更なる細胞培養期間の後、細胞を再度形質導入でき、又はよく洗浄し、採集（製剤）することができる。遺伝子改変型Ｔ細胞生成物のｉｎ  ｖｉｖｏ変換前に、細胞を洗浄し、濃縮し、ｉｎ  ｖｉｖｏ輸液に関する臨床的要求事項に適合するバッファーに再懸濁することができる。上記のすべてのステップは、自動的に実施される。
【００４７】
本発明の１つの実施形態では、抗体が結合した磁気ビーズをＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の表面上に存在する細胞表面マーカーに結合させ、標識された細胞を磁気分離により濃縮すること（陽性濃縮）によって、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を標識する。
【００４８】
本発明の別の実施形態では、抗体が結合した磁気ビーズをＴ細胞又は定義された細胞サブセットの表面上に存在しない細胞表面マーカーに結合させ、標識された細胞を磁気分離により枯渇させること（陰性濃縮）によって、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を濃縮する。
【００４９】
本発明の更なる実施形態では、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の第１の濃縮に加えて、遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の磁気標識と培養前後の磁気分離による第２の濃縮ステップにおいて、本方法により得られた最終到達後の細胞組成物内において、より高い頻度の遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体が得られるように、遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を濃縮する。例えば、遺伝子改変した細胞がＣＡＲ又はＴＣＲを発現するＴ細胞である場合には、次に第２の分離ステップは、遺伝子改変したＴ細胞の細胞表面上で、組換え発現したＣＡＲ又はＴＣＲに対して特異的な磁性粒子に結合した抗原結合分子を用いて実施され得る。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む細胞サンプル、例えば患者由来の全血が提供される。前記サンプルは、閉鎖型滅菌細胞培養システムと接続しており、例えば、サンプルは、チューブセットを介してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスと接続している。細胞サンプルは、デバイスの遠心分離チャンバー内で、遠心分離により準備され、その結果、赤血球及び血小板が、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含むその他の細胞から分離される。Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の磁気分離は、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体のマーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８  ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＤ１２７、ＣＤ１３７、α／βＴＣＲ、γ／δＴＣＲ、ＣＣＲ７、ＰＤ−１、又はＬａｇ３等に対して特異的な、磁性粒子に結合している抗体を用いて実施される。標識された細胞を、デバイスの分離カラムを備えたマグネットユニットに通過させることにより、前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の濃縮を引き起こす。分離したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を、デバイスの培養チャンバー（遠心分離チャンバーと同一であり得る）に移した後に、前記細胞は、細胞０．５ｅ6個／ｍｌ〜２ｅ6個／ｍｌの所定の密度に設定されるが、この細胞は、調節剤、例えば流動性ポリマー鎖から構成されており、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体又はそのフラグメントが同ポリマー鎖と結びついた、サイズが１〜５００ｎｍのナノマトリックスを用いて活性化される。前記Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の活性化後、前記細胞は、デバイスの培養チャンバー内で遺伝子改変され、例えば前記細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを用いて形質導入される。Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変後、前記細胞を振盪条件下での培養により増殖させる。振盪は、細胞が懸濁状態になるのを可能にする条件下で（及び本明細書に開示するように）、培養チャンバー（この場合、培養チャンバーは、遠心分離チャンバーと同一である）の単発的又は定期的な遠心分離により実施され得る。最終的に、培養した細胞を遠心分離により洗浄し、これにより培養培地は、後続の用途、例えば生成した細胞組成物を患者に輸液することに適するバッファーと交換可能となる。
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、より高純度の形質導入済みＴ細胞、例えば細胞表面上でＣＡＲ又はＴＣＲ等の導入遺伝子を発現するＴ細胞は、遺伝子改変型Ｔ細胞を特異的に濃縮する追加の細胞選択ステップにより、製造プロセスの終了時に得られるが、これは、導入遺伝子によりコードされる表面分子を標的とする抗体でコーティングされた磁性粒子を用いて実施するのが好ましい。濃縮のステップは、デバイスの磁気分離ユニットを再度用いて自動的に実施し、また最終的な製剤の前に行うのが好ましい。
【００５２】
好ましくは、この第２の濃縮後、及び患者に適用する前、又は下流で使用する前に、選択された細胞の表面から完全に除去可能である選択剤が用いられる。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、懸濁条件下でＴ細胞を活性化させることにより、細胞密度がより高い自動製造プロセスを開始することが可能である。十分な数の標的Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体が出発材料から取得可能である場合、培養を開始する際に細胞が活性化するように細胞が懸濁状態となるのを可能にする条件の下では、Ｔ細胞４ｅ6〜１ｅ7個という細胞密度が高い状態であっても、振盪条件下に直接置いて、例えば培養チャンバー（この場合、培養チャンバーは、遠心分離チャンバーと同一である）の単発的又は定期的な遠心分離を用いて、自動製造プロセスを開始することができる。Ｔ細胞は、レンチウイルスベクターを用いて更に改変可能、及び懸濁状態で増殖可能である。本発明の本実施形態では、好ましくは、高密度の細胞培養が懸濁状態を保つように、本明細書に開示するようなプロセスの活性化、遺伝子改変、及び増殖の各ステップを実施する間、振盪条件が維持される。かかる代替法の長所は、より短期間（一般的に１０〜１４日間に対して１週間）に、多数の細胞を取得できることである。
【００５４】
本発明の１つの実施形態では、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の遺伝子改変ステップは、レンチウイルスベクターを用いて実施され得る。ＶＳＶＧ偽型を有するレンチウイルスベクターは、自動製造法において効率的な形質導入を可能にする。しかし、同法は、任意の種類のレンチウイルスベクター（例えば、はしかウイルス（ＭＬ−ＬＶ）、テネガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ネコ内因性レトロウイルス（ＲＤ１１４）、ヒヒ内因性レトロウイルス（ＢａＥＶ）由来の偽型化エンベロープを有する）を用いる場合に、完全に適合する。その他のウイルスベクター、例えばγ又はαレトロウイルスベクターが利用可能である。形質導入エンハンサー試薬が、必要な場合には、本発明に記載する自動製造法を用いて添加可能である。
【００５５】
定義
別途規定しない限り、本明細書で用いる技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。
【００５６】
用語「閉鎖型細胞サンプル処理システム」及び「閉鎖型滅菌（細胞培養）システム」は、区別なく利用可能である。
【００５７】
用語「閉鎖型細胞サンプル処理システム」は、本明細書で用いる場合、培養プロセス、例えば形質導入等による新規物質の導入を実施している間、及び細胞培養ステップ、例えば増殖、分化、活性化、及び／又は細胞の分離を実施している間、細胞培養汚染のリスクを低減するあらゆる閉鎖型システムを意味する。かかるシステムは、ＧＭＰ又はＧＭＰ類似条件下（「滅菌状態」）での稼働を可能にし、臨床適用可能な細胞組成物をもたらす。本明細書では、例示的にＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）が、閉鎖型細胞サンプル処理システムとして用いられる。このシステムは、国際公開第２００９／０７２００３号に開示されている。但し、本発明の方法の使用をＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に限定するつもりはない。
【００５８】
本発明のプロセスは、シリンダー、ポンプ、バルブ、磁気細胞分離カラム、及びチューブセットが接続されているベースプレート及びカバープレートを含む遠心分離チャンバーを備える閉鎖型滅菌システム（閉鎖型細胞サンプル処理システム）内で実施され得る。Ｔ細胞、Ｔ細胞部分母集団、及び／又はＴ細胞前駆体を含む血液サンプル又はその他の試料源は、無菌ドッキング又は無菌溶接によりチューブセットに及びチューブセットから移動可能である。適するシステムは、国際公開第２００９／０７２００３号に開示されている。
【００５９】
閉鎖型細胞サンプル処理システムは、複数のチューブセット（ＴＳ）を含む場合があり、細胞は無菌ドッキング又は無菌溶接によりＴＳの間を移動する。
【００６０】
１つのチューブセット内で生成した、１つのモジュールの生成物（細胞）を、滅菌手段によって別のチューブセットに移すことにより、プロセスの異なるモジュールが、機能的に閉鎖した異なるＴＳ内で実施され得る。例えば、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体は、第１のチューブセット（ＴＳ）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製ＴＳ１００内で磁気的に濃縮可能であり、また濃縮したＴ細胞を含有する陽性分画は、ＴＳ１００から溶接切断され、第２のチューブセット、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社製ＴＳ７３０に、更に活性化、改変、培養、及び洗浄するために溶接接合される。
【００６１】
用語「自動化法」又は「自動化プロセス」は、本明細書で用いる場合、デバイス及び／又はコンピューター、及びコンピューターソフトウェアの使用を通じて自動化されるあらゆるプロセスを意味する。自動化された方法（プロセス）は、ヒトの介入及びヒトの時間をそれほど多くは必要としない。いくつかの事例では、本方法の少なくとも１つのステップが、ヒトの支援又は介入が一切用いられずに実施される場合に、本発明の方法は自動化される。好ましくは、本明細書に開示する方法のすべてのステップが、新しい試薬をシステムに接続する以外、ヒトの支援又は介入なくして実施される場合に、本発明の方法は自動化される。好ましくは、自動化プロセスは、閉鎖型細胞サンプル処理システム、例えば本明細書に開示するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）の上で実施される。
【００６２】
閉鎖型細胞サンプル処理システムは、ａ）少なくとも１つのサンプルチャンバーを有する回転式容器（又は遠心分離チャンバー）に結合しているインプットポート及びアウトプットポートを備えるサンプル処理ユニットであって、チャンバー内に堆積したサンプルに遠心力を負荷し、堆積したサンプルの少なくとも第１の成分と第２の成分とを分離するために、第１の処理ステップをサンプルに提供するように、又は容器を回転させるように構成されたサンプル処理ユニット；及びｂ）サンプル処理ユニットのアウトプットポートに結合しているサンプル分離ユニットであって、分離カラムホルダー、ポンプ、並びにホルダー内に配置された流路及び分離カラムを通じて流体流を少なくとも部分的に制御するように構成された複数のバルブを含み、該分離カラムが、カラムを通じて流通するサンプルの標識成分と非標識成分とを分離するように構成されている、サンプル分離ユニットを含み得る。
【００６３】
前記回転式容器は、温度制御式細胞インキュベーション及び培養チャンバー（ＣｅｎｔｒｉＣｕｌｔユニット＝ＣＣＵ）としても利用可能である。このチャンバーは、付属の気体混合ユニットにより提供される定義された気体混合物で充気され得る（例えば、加圧した空気／Ｎ２／ＣＯ２又はＮ２／ＣＯ２／Ｏ２の使用）。
【００６４】
すべての薬剤が、プロセス開始前に閉鎖システムと接続され得る。この薬剤は、閉鎖システム内での細胞の洗浄、移転、懸濁化、培養、採集、又は免疫磁気細胞選別で用いられる、すべてのバッファー、溶液、培養培地、及びサプリメント、ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを含む。或いは、かかる薬剤は、プロセス中の時期を問わず、滅菌手段により溶接される、又は接続される。
【００６５】
Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む細胞サンプルは、閉鎖システムと滅菌手段により接続可能な移送用バッグ又はその他の適するコンテナーに提供され得る。
【００６６】
用語「Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含む細胞サンプルの提供」とは、細胞サンプル、好ましくは血液学的起源のヒト細胞サンプルの準備を意味する。通常、細胞サンプルは、ドナー又は患者から得られた血液学的細胞より構成され得る。かかる血液産物は、全血、バフィーコート、白血球アフェレーシス、ＰＢＭＣの形態、又は血液産物の任意の臨床的サンプリング物であり得る。血液産物は、新鮮な又は凍結された起源に由来し得る。
【００６７】
用語「遠心分離による細胞サンプルの準備」とは、本明細書で用いる場合、遠心分離により提供される細胞サンプルのその他の成分（例えば、非細胞成分）から細胞を分離することを意味する。遠心ステップは、次の態様：グラジエント分離、赤血球の低減、血小板除去、及び細胞洗浄のうちの１つ、それ以上、又はすべてを含み得る。
【００６８】
用語「洗浄」とは、細胞が維持される培地又はバッファーの交換を意味する。上清の交換は、部分的であり得（例えば、培地が５０％除去され、新鮮な培地が５０％添加される）、これは、多くの場合、希釈又はフィーディングを目的として適用されるが、或いは全体的であり得る。いくつかの洗浄ステップが、細胞が維持されるオリジナルの培地について、より徹底した交換を実現するために、組み合わせ可能である。洗浄ステップは、多くの場合、遠心力及び上清の除去により、細胞をペレット化するステップと関係する。本発明の方法では、細胞はチャンバーの回転、例えば３００×ｇによりペレット化され、また上清はチャンバーの回転中に除去される。培地は、回転中に、又は定常状態において添加される。
【００６９】
用語「振盪条件」とは、本明細書で用いる場合、細胞培養物の細胞を懸濁状態に保つことを可能にするあらゆる手段を意味する。振盪は、閉鎖型滅菌細胞培養システムの培養チャンバーを回転させること（又は単発的な遠心分離）により実施され得、前記回転は、本明細書に開示するように定期的に実施される。振盪は、例えば起泡装置、推進装置、又は用いられる閉鎖型滅菌細胞培養システムに組み込まれた、細胞の沈降を防止する液体の流れ（例えば、チャンネル）を用いても、実施され得る。
【００７０】
用語「マーカー」とは、本明細書で用いる場合、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー、例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、及び／又はＣＤ６２Ｌであり得る、或いは陰性選択マーカー（例えば、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ５６を発現する細胞の枯渇）であり得る。
【００７１】
用語「発現」とは、本明細書で用いる場合、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００７２】
用語「粒子」とは、本明細書で用いる場合、固相表面、例えばコロイド状粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、又はビーズを意味する。かかる粒子の生成法は、当技術分野において周知されている。粒子は、磁性粒子であり得る。粒子は、溶液若しくは懸濁状態であり得る、又は粒子は、本発明で使用する前は凍結乾燥状態であり得る。凍結乾燥された粒子は、次に本発明に関係する処理対象サンプルと接触する前に好都合なバッファーに再溶解される。
【００７３】
用語「ナノ構造体」とは、本明細書で用いる場合、用語「粒子」の範疇に収まらないが、調節剤、例えば抗ＣＤ３抗体、及び／又は抗ＣＤ２８抗体、若しくはそのフラグメントに結合するとＴ細胞のポリクロナール刺激を可能にする、ナノサイズの構造物を意味する。
【００７４】
国際公開第２０１４／０４８９２０Ａ１号で開示される、又はＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、注文番号１７０−０７６−１４０）で提供されるようなナノマトリックスは、特別なナノ構造体である。
【００７５】
用語「ナノマトリックス」とは、本明細書で用いる場合、
ａ）流動性ポリマー鎖のマトリックス；及び
ｂ）前記流動性ポリマー鎖のマトリックスと結びついた、Ｔ細胞に活性化シグナルを提供し、これによりＴ細胞を活性化させ、増殖するように誘発する１つ又は複数の刺激剤；
を含むナノマトリックスを意味し、該ナノマトリックスは、１〜５００ｎｍ、好ましくは１０〜２００ｎｍのサイズである。刺激剤は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体又はそのフラグメントであり得る。
【００７６】
これらのポリマーは、流動性（運動性）、好ましくは高度に流動性（運動性）の鎖から構成され、したがってマトリックスは、抗体等の刺激剤を結びつけるポイントとしての固体表面が存在しないことにより特徴づけられ、剛直性の硬い表面を規則的に有するような、現在用いられているビーズ又はミクロスフェアとは極めて対照的である。
【００７７】
マトリックスは、ポリマー性、好ましくは生分解性又は生体適合性の、細胞に対して無毒性の不活性な材料から構成される。好ましくは、マトリックスは、親水性ポリマー鎖から構成され、鎖の水和に起因して、水溶液中で最大の流動性を獲得する。流動性マトリックスは、薬剤がこれと結びついている、いないに関わらず、ナノマトリックスの唯一の成分又は少なくとも主要な成分である。
【００７８】
流動性マトリックスは、コラーゲン、精製されたタンパク質、精製されたペプチド、多糖類、グリコサミノグリカン、又は細胞外マトリックス組成物からなり得る。多糖類として、例えばセルロースエーテル、スターチ、アラビアゴム、アガロース、デキストラン、キトサン、ヒアルロン酸、ペクチン、キサンタン、グアーガム、又はアルギン酸塩を挙げることができる。その他のポリマーとして、ポリエステル、ポリエーテル、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、ポリアミン、ポリエチレンイミン、ポリクォータニウムポリマー、ポリホスファゼン、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、ポリビニルピロリドン、ブロックコポリマー、又はポリウレタンを挙げることができる。好ましくは、流動性マトリックスは、デキストランのポリマーである。
【００７９】
Ｅｘｐａｍｅｒｓ（Ｓｔａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社、ドイツ）は、ナノ構造体の別の事例である。この場合、可溶性ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎタンパク質オリゴマーが、Ｔ細胞をポリクロナール刺激するために、活性化一次リガンド、例えば抗ＣＤ３及びＣＤ２８  Ｆａｂフラグメントにより機能化されている。ＳｔｒｅｐｔＴａｃｔｉｎ骨格は、低アフィニティーＦａｂフラグメントの会合によるリバーシブルでモジュラー的な機能化を可能にする。
【００８０】
用語「抗原結合分子」とは、本明細書で用いる場合、細胞の望ましい標的分子、すなわち抗原に対して選好的に結合する又は特異的なあるあらゆる分子を意味する。用語「抗原結合分子」には、例えば抗体又は抗体フラグメントが該当する。用語「抗体」とは、本明細書で用いる場合、ポリクロナール又はモノクロナール抗体を意味し、当業者にとって周知の方法により生成可能である。抗体は、任意の種、例えばマウス、ラット、ヒツジ、ヒトからなり得る。治療目的では、非ヒト抗原結合フラグメントが用いられる場合には、これらは、当技術分野において公知の任意の方法によりヒト化することができる。抗体は、改変型抗体（例えば、オリゴマー、還元型、酸化型、及び標識抗体）であってもよい。
【００８１】
用語「抗体」は、天然の分子並びに抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及び一本鎖抗体の両方を含む。更に、用語「抗原結合分子」には、細胞の望ましい標的分子に優先的に結合する抗体又は抗体フラグメント以外の任意の分子が含まれる。適する分子としてオリゴヌクレオチドが非限定的に挙げられ、所望の標的分子、炭水化物、レクチン、又は任意のその他の抗原結合タンパク質に結合するアプタマーとして知られている（例えば、受容体−リガンド相互作用）。抗体と粒子又はナノ構造体との間の結合（カップリング）は、共有結合であっても、また非共有結合であってもよい。共有結合は、例えばポリスチレンビーズ上のカルボキシル基への結合、又は修飾ビーズ上のＮＨ２若しくはＳＨ２基への結合であり得る。非共有結合は、例えばビオチン−アビジン、又は抗蛍光物質抗体と結合した蛍光物質結合型粒子による。
【００８２】
抗原結合分子、例えば抗体又はそのフラグメントに関して「特異的に結合する」又は「に対して特異的な」という用語は、サンプル中の特異的抗原、例えばＣＤ４を認識し、これと結合するが、前記サンプル中のその他の抗原を実質的に認識しない、又はこれと結合しない抗原結合分子（抗体又はそのフラグメントの場合、抗原結合ドメイン）を意味する。１つの種に由来する抗原と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの抗原結合ドメインは、別の種に由来するそのような抗原とも、やはり結合する可能性がある。この種交差的反応性は、本明細書で用いる場合、「に対して特異的な」の定義と矛盾しない。抗原、例えばＣＤ４抗原と特異的に結合する抗体又はそのフラグメントの抗原結合ドメインは、前記抗原の異なる変異体（対立遺伝子変異体、スプライスバリアント、アイソフォーム等）とも、やはり実質的に結合する可能性がある。この交差反応性は、抗原、例えばＣＤ４に対して特異的なそのような抗原結合ドメインの定義と矛盾しない。
【００８３】
強力な選別技術として、磁気細胞選別法が挙げられる。磁気的に細胞を分離する方法が、例えばシアトルのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｃｅｌｌｐｒｏ社、又はボストンのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社から市販されている。例えば、モノクロナール抗体は、Ｄｙｎａｌ  Ｍ４５０のような磁性ポリスチレン粒子、又は類似した磁性粒子に直接結合可能であり、例えば細胞分離で用いられる。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ技術はカラムに基づくものではなく、代わりに、このような細胞と結びついた磁気ビーズは、サンプルチューブ内で液相動力学を享受し、細胞は、チューブを磁性ラック上に配置することにより単離される。しかし、好ましい実施形態では、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を細胞サンプルから濃縮、選別、及び／又は検出する場合、モノクロナール抗体が、例えば多糖類（磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ（登録商標））技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ））により、有機コーティング物を有するコロイド状の超常磁性微粒子と組み合わせて用いられる。この粒子（ナノビーズ又はＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）は、モノクロナール抗体に直接結合可能、又は抗免疫グロブリン、アビジン、若しくは抗ハプテン特異的ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓと併用可能である。ＭＡＣＳ（登録商標）技術は、特定の表面抗原を標的とする抗体でコーティングされた磁性ナノ粒子と共に、細胞をインキュベートすることにより、細胞分離を可能にする。これにより、この抗原を発現する細胞と磁性ナノ粒子との結びつきが生じる。その後に、細胞溶液は強磁場内に配置されたカラムに移される。このステップでは、細胞（抗原を発現する）はナノ粒子と結びついてカラム上に留まる一方、その他の細胞（抗原を発現しない）は通過する。この方法により、細胞は、特定の抗原（複数可）に関して陽性又は陰性分離可能である。陽性選択の場合、対象とする抗原（複数可）を発現する細胞は、磁性カラムと結びついているが、この細胞は、カラムを磁場から除去した後、別の容器に洗い出される。陰性選択の場合、用いられる抗体は、対象外の細胞上に存在することが知られている表面抗原（複数可）を標的とする。細胞／磁性ナノ粒子溶液をカラムに適用した後、このような抗原を発現する細胞はカラムに結合し、通過画分は対象とする細胞を含有するので収集される。このような細胞は、ナノ粒子に結合している抗体によって標識されないので、「手つかず」のままである。手順は、直接磁気標識法又は間接磁気標識法を用いて実施可能である。直接標識法では、特異的抗体が磁性粒子に直接結合している。間接標識法は、直接磁気標識法が不可能である又は望ましくない場合、好都合な代替法である。任意の細胞表面マーカーを標的とする一次抗体、特異的モノクロナール、又はポリクロナール抗体、一次抗体の併用は、この標識戦略に利用可能である。一次抗体は、非結合型、ビオチン化型、又は蛍光体結合型であり得る。磁気標識は、次に抗免疫グロブリンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、抗ビオチンＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ、又は抗蛍光体ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓで実現される。上記プロセスは、閉鎖型細胞サンプル処理システム、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社、ドイツ）等においても実施可能である。
【００８４】
用語「遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の実質的に純粋な細胞組成物」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を、本発明の方法により得られる細胞組成物内に含む細胞組成物を意味する。細胞生成物の形質導入頻度は、遺伝子改変を実施するのに用いられるベクターの種類、並びに導入遺伝子の性質に依存する。導入遺伝子の少なくとも一部分を標的とする追加の選択ステップを含めることにより、より高頻度の遺伝子改変型Ｔ細胞が取得可能である。
【００８５】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、工学的に作出された受容体を意味し、細胞、例えばＴ細胞上に抗原特異性を植え付ける。本発明のＣＡＲは、抗原標的領域としても知られている抗原結合ドメイン、細胞外スペーサードメイン又はヒンジ領域、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内シグナリングドメイン、又は少なくとも１つの共刺激ドメイン並びに少なくとも１つの細胞内シグナリングドメインを含む。
【００８６】
用語「遺伝子改変した細胞」とは、外来の遺伝子又は核酸配列を含有する及び／又は発現する細胞を意味し、外来の遺伝子又は核酸配列は、次に細胞の遺伝子型若しくは表現型、又はその子孫を改変する。特に、該用語は、ペプチド又はタンパク質、例えば天然の状態では、そのような細胞において発現されないＣＡＲを安定的に、又は一時的に発現させるために、細胞は、当技術分野において周知の組換え方法により操作可能であるという事実を意味する。細胞の遺伝子改変には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、非組込み型レトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクター、トランスポゾン、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓを含むデザイナーヌクレアーゼを用いたトランスフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、形質導入が含まれ得るが、但しこれらに限定されない。
【００８７】
本明細書に開示の方法により得られる遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体は、後続するステップ、例えば当業者にとって公知の研究、診断、薬理学的又は臨床的用途で利用可能である。
【００８８】
遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体は、療法、例えば細胞療法、又は疾患の予防における医薬組成物としても利用可能である。医薬組成物は、動物又はヒト、好ましくはヒト患者に移植され得る。医薬組成物は、哺乳動物、特にヒトを対象として、疾患の治療及び／又は予防に利用可能であり、薬学的に有効な量の医薬組成物を哺乳動物に投与するステップを含むと考えられる。本開示の医薬組成物は、治療（又は予防）の対象となる疾患に適する方法で投与され得る。適する用量は臨床試験により決定され得るが、投与量及び投与頻度は、患者の状態、及び患者の疾患の種類や重症度等の要因により決定される。
【００８９】
用語「治療上有効な量」とは、患者に治療ベネフィットをもたらす量を意味する。
【００９０】
本発明の方法により得られる遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体の組成物は、単独で、或いは賦形剤及び／又はその他の成分、例えばサイトカイン又は細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与され得る。要するに、本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の薬学的又は生理学的に許容される担体、賦形剤、又は添加剤と組み合わせて、本明細書に記載するような、本発明の遺伝子改変したＴ細胞、Ｔ細胞サブセット、及び／又はＴ細胞前駆体を含み得る。かかる組成物は、バッファー、例えば中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロース、又はデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド、又はアミノ酸、例えばグリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；及び防腐剤を含み得る。
【実施例】
【００９１】
実施例１：いくつかの閉鎖滅菌型チューブセットを用いた、遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造
ドナーから取得した白血球アフェレーシスバッグ（１００〜２００ｍｌ）を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに据付けられたチューブセットＴＳ  １００（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）に、無菌溶接により接続する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー並びにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４及びＣＤ８試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）も同一のチューブセットに接続する。濃縮プログラムを立ち上げる。チューブセットはバッファーで自動的にプライミングされ、次に白血球アフェレーシス生成物をチューブセットのチャンバーに移し、そこでは、血清及び血小板を除去するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファーを用いて３回洗浄する。過剰の赤血球を除去するために、赤血球の低減も実施する。ＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞を磁気標識するために、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ４及びＣＤ８試薬を、チャンバー内の細胞に移す。室温で３０分間インキュベーション後、磁気標識された細胞を、磁場中に配置されたカラムに自動的に移動させる。標識された細胞をトラップし、標識されていない細胞を、非標的細胞分画バッグ内に溶離する。標識された細胞を含むカラムを数回リンスし、その後、標識された細胞を、標的細胞分画バッグ内に溶離する。チューブセットに組み込まれたサンプルパウチは、１〜２ｍｌのサンプルの取得を可能にするが、同サンプルは、細胞数及び細胞純度についてフローサイトメトリー法により遠隔的に分析される（図１２）。濃縮後の細胞の一部を（無菌溶接接続により）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに新規に据付けられた別のチューブセット（ＴＳ７３０）に移す。チューブセットは、ＩＬ−２が補充されたＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）及び１ｅ8個の濃縮後のＴ細胞とも接続している。活性化プログラムを開始する。濃縮後の細胞を洗浄し、培地内で再懸濁し、培養物を５％のＣＯ２ガスを供給しながら３７℃にセットする。培養物が平衡に達したら、活性化試薬を培養物に自動添加する。２４時間後、サンプルを活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９のアップレギュレーションについて分析する（図２）。ウイルスベクターを含有するバッグを、例えばテルモ社製無菌ウェルダーを用いて、チューブセットに無菌溶接し、ユーザーは、ウイルスベクターが接続され、ウイルスベクターが活性化したＴ細胞を含有するチャンバーに移動したことを確認するように求めるソフトウェア内のプロンプトを認識する。５日間の培養後、Ｔ細胞を５リットルバッグ内に移し、Ｔ細胞増殖を可能にする別のデバイスであるＷａｖｅ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に移す。細胞を更に７日間、懸濁状態で培養する。増殖した細胞のバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上の新しいチューブセットに再度接続する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）は、５Ｌから１００ｍｌまでの細胞の自動濃縮、及びヒト輸液に適する溶液内での細胞の再緩衝化を可能にする。
【００９２】
実施例２：単一の閉鎖滅菌型チューブセットを用いた、遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造
ドナーから取得した１００〜２００ｍｌのバフィーコートバッグを、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）デバイスに据付けられたチューブセットＴＳ５２０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍＢＨ社）に無菌溶接により接続する。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー並びにＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ６２Ｌ試薬、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７とＩＬ−１５を含有するＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳ培地も、ＴＳ５２０と接続する（すべてＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社）。次に、アクティビティーマトリックスに、アクティビティー（例えば、形質導入、フィード、洗浄、最終的製剤）、及びそれらの自動製造稼働パラメーター（例えば、日、容積、温度）を入力する。プログラム済みのソフトウェアを、次に立ち上げる（図３）。実施例１と同様に、白血球アフェレーシスを洗浄する。４〜８℃で標識を行う（ＣＤ６２Ｌは、室温で細胞の表面から放出されるので、ＣＤ６２Ｌ陽性細胞を濃縮する上で、この温度は重要である）。標識された細胞を濃縮し、チューブセットの一部であるリアプリケーションバッグ内に溶離させる。プログラムは、サンプルを採取するように求める（チューブセットに含まれるサンプリングパウチを用いて）。細胞密度を求めたら、この情報並びにチャンバーに戻されるべき細胞の必要数（例えば、１ｅ8個）が、プログラムに表示される。濃縮後の細胞、１ｅ8個を含有する濃縮後の細胞の必要とされる容積が、次に培養チャンバーに自動的に移動する。活性化試薬が、次に培養物に添加される。１日目に、１０ｍｌのレンチウイルスベクターを含有するバッグを、チューブセットと接続する（これは、ウイルスベクターの半減期が短いことから、すぐに実施される）。ウイルスベクター、この場合ＣＤ２０  ＣＡＲ（４−ＩＢＢ及びＣＤ３ｚｅｔａシグナリングドメインを含む）をコードするレンチウイルスベクターを、次に活性化Ｔ細胞上に移す。Ｔ細胞は、３７℃の培養物及び５％のＣＯ２に富んだ雰囲気中に、更に２日間留まる。５日目に、使用済み培養培地は、自動的に洗い流され、新鮮な培地と置き換わる。チャンバーの単発的な低速振盪法を用いて、Ｔ細胞を軽く再懸濁するために、培養物を、今度はタイプ１振盪法（低振盪法）にセットする。新鮮な培地で細胞をフィードするために、培養培地の半分を１日おきに交換する。９日目に、振盪スピードをタイプ３振盪法（より激しい再懸濁法）まで高める。１１〜１３日では、製造プロセスは、最終段階に達し、細胞をヒト輸液に適する溶液（すなわち、最終製剤用のバッファー）で数回洗浄し、更に臨床的に取り扱うために、バッグ内に採集する（図４及び６）。直接輸液用又は凍結保存用のいずれか。製造された遺伝子改変型Ｔ細胞を、その細胞組成物（図１０）、その形質導入された細胞の割合（％）及び形質導入された細胞毎の導入遺伝子発現レベル（それぞれ図７Ａ及びＢ）について分析した。
【００９３】
実施例３：振盪条件下で活性化させた高密度培養物から開始する遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造
１００〜２００ｍｌの白血球アフェレーシスから開始し、実施例２と同様に、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）に据付けられたチューブセットＴＳ５２０を用いて、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞を濃縮する。但し、この実施例では、４ｅ6個／ｍｌという高密度の濃縮Ｔ細胞が、閉鎖滅菌型チューブセットのチャンバーに移される。０日目に濃縮後のＴ細胞を１００ｍｌに播種した（図９Ａ）、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｒａｎｓＡｃｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８キット及びＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳ培地中の２００ＩＵ  ＩＬ−２を用いて、タイプ３振盪条件下で速やかに活性化を実施した。１００ｍｌ中の細胞を２日目に希釈し、培地交換を４日目に開始して培養終了まで、毎日実施した。培養は、８日目で終了した。驚くべきことに、結果は、培養開始時の活性化中に定常状態が存在しなくてもＴ細胞を活性化させ、増殖させることが可能であることを示している。かかる動的な条件では、多数のＴ細胞を非常に急速に生成させることが可能である（すなわち図８Ａの、８日目における２．８ｅ9個のＴ細胞と、図４Ｃの８日目における１．８ｅ9個の総細胞）。
【００９４】
実施例４：凍結した白血球アフェレーシスから開始した遺伝子改変型Ｔ細胞の自動製造
ドナーから取得した白血球アフェレーシスの１００ｍｌ凍結バッグを解凍し、３Ｌ  ＭＡＣＳ  ＧＭＰ細胞分化用バッグ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ社の製品）に移し、ＭＡＣＳ  ＧＭＰ  ＴｅｘＭＡＣＳ培地で２Ｌに希釈した。解凍した細胞を、５％のＣＯ２中、３７℃で４８時間休ませ、次に、自動細胞濃縮を行うために、細胞のバッグをＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）上に据付けられた閉鎖滅菌型チューブセットに接続した。次に、実施例２に記載されているプロセスと類似した製造プロセスを実施した（ＣＤ６２Ｌ濃縮後のＴ細胞を用いて）。１２日目に、遺伝子改変型Ｔ細胞を、１００ｍｌのＣｌｉｎｉＭＡＣＳバッファー中で最終的に製剤し、採集バッグに移した。バッグ全体を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ上に据付けられた閉鎖滅菌型チューブセットＴＳ１００に、無菌溶接により接続した。この場合、非改変型Ｔ細胞からの遺伝子改変型Ｔ細胞の単離可能とするために、遺伝子改変型Ｔ細胞を抗ＩｇＧ１ミクロビーズで標識した。希釈した休眠解凍細胞から遺伝子改変型Ｔ細胞の製造及び単離までのすべてのステップを、いくつかの異なるチューブセット及びいくつかの異なる種類のプログラムを用いて、自動化された方法で実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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