(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザAウイルスのセグメント1、2又は3に由来する試験欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAの存在下でインフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産をモニターすることを含む、抗ウイルス剤を同定するための方法であって、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉する欠陥干渉ウイルスRNAが抗ウイルス剤として同定される、前記方法。
【請求項２】
宿主細胞において実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主細胞に、インフルエンザウイルスのセグメント1、2及び3を含む核酸が遺伝子導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記セグメント1、2及び3のそれぞれが、別々のプラスミドにおいて提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産が、別々のアッセイでモニターされる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
RNAがcRNA、mRNA及び／又はvRNAを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
cRNA及びmRNAの両方の生産がモニターされる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
セグメント1、2又は3の一以上が、該セグメントからのRNAの生産の低減がレポーター遺伝子の発現を低減させるように、コードされたレポーター遺伝子を有する構築物として提供される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤を同定するための方法、及び特に抗ウイルス剤を同定するために欠陥干渉ウイルスRNAをアッセイするための方法に関する。本発明はまた、抗ウイルス剤として有効な新規欠陥干渉ウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザAゲノムは、リボヌクレオタンパク質（RNP）の形態で一本鎖ネガティブセンスRNA（vRNA）の8つのセグメントを含む。8つのセグメントのそれぞれを1コピー含むことが、感染性のウイルス粒子を作製するために必要である。
【０００３】
ウイルス複製の過程において、広範な欠失を含む後代ゲノムが生成され得る。かかるトランケートされたゲノムの少なくとも幾つかは、核酸をウイルス粒子にパッケージングするために必要なシグナルを含む。しかしながら、トランケートされたゲノム自身は、感染性のウイルスを生成することができず、したがって機能的に欠損している。幾つかの欠陥ゲノムは、それが由来する親ウイルスの増殖に干渉することができる。かかる欠陥干渉（DI）ゲノムの、ウイルス複製に干渉する能力は、それらが抗ウイルス療法の新規なアプローチの基礎として用いられ得ることを示唆してきた。
【０００４】
インフルエンザウイルスの感染は、ウイルス複製に干渉し得る小さなDI RNAセグメントを生成し得る。大部分のインフルエンザDI RNAは、主な（約80%）内部欠失を有し、複製及びウイルス粒子へのパッケージングに必要なシス作用性シグナルを維持している。DI RNAは、DIウイルス粒子に組込まれるが、生じるDIウイルス粒子は、欠失したRNAが完全長セグメントによって通常コードされるタンパク質を合成することができないため、自律的に複製することができない。したがって、DIウイルスの複製は、感染性ウイルスによる補完を必要とする。
【０００５】
インフルエンザウイルスゲノムの複製は、感染性ウイルスのvRNAセグメントのポジティブセンス（cRNA）コピーの合成により開始され、続いてこれらが新たなvRNAの合成の鋳型として用いられる。vRNAもまた、mRNA転写の鋳型として用いられる。cRNA合成とは異なり、mRNA合成は、宿主mRNAのキャップされた5'末端から切断されたプライマーを用いて開始され、その合成は、ポリアデニル化の前に、鋳型vRNAの末端の前で終わる。したがって、mRNAは、primerに由来する5'伸長を有し、トランケートされ、3'末端がポリアデニル化されている点でcRNAとは異なる。各セグメントの非コード末端は、RNA合成にとって重要であり、3'末端でほぼ正確に補完される、保存された約12ヌクレオチド（nt）の配列を5'末端に含む。
【０００６】
インフルエンザウイルスRNAの合成は、ウイルスヌクレオタンパク質（NP）に強く付随するvRNA又はcRNAからなる各RNA複合体中の、ウイルスによってコードされるRNA依存性RNAポリメラーゼによって行われる。ウイルスRNAポリメラーゼは、vRNAセグメント2、1及び3によってそれぞれコードされる、PB1、PB2及びPAタンパク質のヘテロトリマーを含む。
【０００７】
欠失によって生成するDIウイルスによる干渉のメカニズムの理解については、ほとんど進展がない。中央欠失によって生成するDI RNAについては、RNA合成による干渉は、ウイルス又は宿主因子を制限する、由来となるDI RNAとゲノムRNAにおける特異的な競合、及び／又はその同族ゲノムRNAより競合優位をもたらし得る早い合成速度を有するより短いDI RNAを含み得るが、これを支持する実験的証拠はあまりない。
【０００８】
DIインフルエンザウイルスが媒介する干渉についての多くの研究は、これまで天然の調製物を用いて実施され、幾つかの異なる欠陥RNA配列混合物の存在によって損なわれている。この問題は、最近、分子的に定義されたDI RNAを含むウイルスストックを作製するリバースジェネティクスを用いて解決された（Dimmock et al. 2008）。かかるDI RNAの一つは、トリH7N7インフルエンザAウイルスのセグメント1に由来する1/317である。これは、RNAパッケージングに干渉するが、ウイルスRNA合成に対していかなる認識可能な影響も有さない非クローン化ウイルスに存在していた（Duhaut and McCauley 1996）。インフルエンザウイルス粒子として鼻腔内に送達されたクローン化された1/317 DI RNAは、マウスにおいて防御活性を有し、同じ送達システムにおいて、ヒトH1N1ウイルスのセグメント1由来の1/244 DI RNAより100倍低活性であった（Dimmock et al. 2008）。1/244 DIウイルスのマウスへの接種は、インフルエンザAウイルスの幾つかの異なるサブタイプによる致死性のチャレンジに対して、完全な防御をもたらした（同種防御（homologous protection））（Dimmock et al. 2008）。しかしながら、1/244 DIウイルスによる防御の分子的な基礎は知られていない。インフルエンザAウイルスからの防御に加えて、1/244 DIウイルスは、異種インフルエンザBウイルス及びマウスパラミクソウイルスから用量依存的に防御する（Easton et al. 2011; Scott et al. 2011）。（同種ではなく）異種防御は、I型インターフェロンに依存する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dimmock et al. 2008
【非特許文献２】Duhaut and McCauley 1996
【非特許文献３】Easton et al. 2011
【非特許文献４】Scott et al. 2011
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、DIインフルエンザAウイルスのインフルエンザAウイルスの複製への干渉の有効性が、DIウイルスRNAが由来するセグメントからのRNAの生産に干渉する能力だけでなく、セグメント1、2及び3の全てからのRNAの生産に干渉する能力にも起因し得ることを特定した。したがって、本発明は、有効な抗ウイルス剤として用いられ得る欠陥干渉ウイルスを同定するための新規な方法を提供する。また、本発明者は、新規な欠陥干渉ウイルスを提供する。
【００１１】
本発明は、DIウイルスRNAからのタンパク質の生産が、干渉活性に必要でないこともまた特定した。したがって、本発明は、例えば一以上の開始コドンAUGの欠失又は変異によって、欠失セグメントRNAがタンパク質の発現を防ぐようにさらに変異しているDIウイルスRNAにも関する。
【００１２】
一態様において、本発明は、試験欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAの存在下でインフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産をモニターすることを含む、抗ウイルス剤を同定するための方法であって、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉する欠陥干渉ウイルスRNAが抗ウイルス剤として同定される、前記方法を提供する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、セグメント1、2又は3に由来するRNAを含む、クローン化（cloned）された又は組換え欠陥干渉インフルエンザAウイルスであって、前記RNAが：
（a）300〜600ヌクレオチド長のRNA、
（b）セグメント1、2又は3の5'及び3'末端由来の少なくとも100ヌクレオチド、
（c）前記セグメントのヌクレオチドの中央欠失、
を含み、前記欠陥干渉インフルエンザウイルスがインフルエンザAのセグメント1、2及び3からのRNA生産に干渉することができる、前記ウイルスを提供する。
【００１４】
本発明に従って同定される抗ウイルス剤、又は本発明の欠陥干渉ウイルスもまた、インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のために提供される。
【００１５】
別の態様において、本発明は、RNAが、コードされる任意の（any）タンパク質の発現を防ぐように変異している、例えば、一以上のAUG開始コドンが変異している、欠陥干渉ウイルスRNAを提供する。かかるDIウイルスは、インフルエンザA感染の治療又は予防方法において使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】プラスミドから発現されるインフルエンザDI RNA 1/244及び他のRNAの模式図。数字は、本研究において用いられた欠失ゲノムRNA（ポジティブセンス、5'から3'）における様々な中止点（breakpoint）のヌクレオチド位を示す。実線はcRNA及びmRNA分析のためのプライマー伸長アッセイにおいて用いたプライマーを示し、破線はvRNA分析で用いたプライマーを示す。セグメント1-GFP RNAの黒色のボックスは、レポーターGFP遺伝子の位置を示す。
【図２】インフルエンザ DI RNAの非存在下及び存在下で生産されたインフルエンザウイルスRNAのノーザンブロット分析。293T細胞に増加量の1/244 DI PolIプラスミド（0、0.1、0.5及び1.0 μg）及び感染性A/WSNウイルス（本文参照）の発現に必要な一定量のプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入後、細胞をMDCK細胞と共培養した。RNAを共培養した細胞及び培養液から精製したインフルエンザウイルス粒子から抽出した。（a）共培養の1、2及び3日後に細胞溶解物（上部パネル）及び上清由来のウイルス粒子（下部パネル）から抽出したRNAを、セグメント1 RNA及び1/244 DI RNA、並びにセグメント 7 vRNAに特異的なプローブで分析した。mRNAマーカのサイズを左側に示し、各RNA種のアイデンティティーを右側に示す。（b）マイクロプラークアッセイによって測定した、細胞上清中のA/WSN感染性。共培養の1（黒四角）、2（黒三角）及び3（黒丸）日後の感染性を示す。データは、2回の独立した実験の平均値を、範囲を表すバーと共に示す。（c）3日目に抽出した細胞溶解物RNA及びビリオンRNAもまた、セグメント及びセグメント7 RNAに特異的なプローブで分析した。（d）2日目（黒四角）及び3日目（黒丸）のビリオン：遺伝子導入細胞におけるセグメント1RNAの比、及び3日目（黒下三角）のビリオン：遺伝子導入細胞におけるセグメント2RNAの比の比較。データは、セグメント7のレベルに対して標準化し、ビリオンの割合：1/244 DI RNAの非存在下での細胞RNA比として表した。
【図３ａ】インフルエンザ DI RNA又は他の全長インフルエンザRNAの存在下でのインフルエンザセグメント1の発現を決定するための蛍光アッセイ。293T細胞にセグメント1-GFPプラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びにDI RNA （1/244、2/265又は3/262）又は全長vRNA（セグメント4又は6）を発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、細胞を蛍光について試験した。（a）位相差（左）及び落射蛍光顕微鏡（右）によって得た細胞単層画像の対。推定阻害剤として用いた様々なRNAを発現する各プラスミドの量を、左に示す。対照細胞（上部）には、空ベクター（1 μg）を遺伝子導入した。
【図３ｂ】インフルエンザ DI RNA又は他の全長インフルエンザRNAの存在下でのインフルエンザセグメント1の発現を決定するための蛍光アッセイ。293T細胞にセグメント1-GFPプラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びにDI RNA （1/244、2/265又は3/262）又は全長vRNA（セグメント4又は6）を発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、細胞を蛍光について試験した。（ｂ）1/244 RNA（黒色のカラム）及びセグメント6 RNA（白色のカラム）を発現する遺伝子導入プラスミドの存在下で作製した細胞における蛍光の定量。カラムは、3回の独立した実験の平均値を示し、バーは平均値の標準誤差である。統計分析は、スチューデントの両側t検定を用いて行い、特定の比較におけるp値を示した。
【図４】インフルエンザDI RNA又はセグメント6 RNAの存在下でのプライマー伸長によるインフルエンザセグメント1依存性RNA合成の分析。遺伝子導入を図3について記載した通りに行った。1/244 DI RNA（a）又はゲノムセグメント6 vRNA（c）をコードするプラスミドの非存在下又は増加量の存在下における、セグメント 1-GFPによるウイルスRNAレベルのプライマー伸長分析。同じRNA調製物から検出された5S rRNAもまた示し、内部対照として用いた。プライマー伸長産物を、各パネルの左側で特定した。3回の独立した実験由来のウイルスRNAレベルの蛍光画像分析による定量を、（b）及び（d）に示す。バンドの濃さの値を、関連する5SrRNAに対して標準化し、分析した各RNAの最大値の割合として表す。標的プラスミドから生成されたvRNAの基礎レベルを合計から引いた。エラーバーは、少なくとも3つの反復の平均値の標準誤差を示す。vRNA（黒四角）、mRNA（黒上向き三角）及びcRNA（黒下向き三角）。
【図５】インフルエンザ1/244DI RNAの存在下でのプライマー伸長によるインフルエンザセグメント6依存性RNA合成の分析。（a）1/244 DI RNA又の非存在下又は増加量の存在下における、ゲノムセグメント6から転写されたRNAレベルの分析。3回の独立した実験由来のウイルスRNAレベルの蛍光画像分析による定量を、（b）に示す。バンドの濃さの値を、関連する5SrRNAに対して標準化し、分析した各RNAの最大値の割合として表す。標的プラスミドから生成されたvRNAの基礎レベルを合計から引いた。エラーバーは、3つの独立した実験の平均値の標準誤差を示す。vRNA（黒四角）、mRNA（黒上向き三角）及びcRNA（黒下向き三角）。
【図６】インフルエンザゲノムセグメント2及び3から転写されるRNAのレベルに対するインフルエンザ1/244 DI RNAの効果。増加量の1/244 DI RNAの存在下でのセグメント2（パネルa）及びセグメント3（パネルc）由来のRNAの分析を、図4について記載した通りに行った。2つの独立した実験のウイルスRNAレベルの定量を（b）及び（d）に示す。エラーバーは、2つの実験のデータの範囲を示す。vRNA（黒四角）、mRNA（黒上向き三角）及びcRNA（黒下向き三角）。
【図７】セグメント1-GFPの存在下又は非存在下における、1/244 DI RNAの、自身のRNAレベルに対する効果。1.0 μgのセグメント1-GFPの存在下（a）、又は他の任意のゲノムRNAの非存在下（b）における1/244 DI RNAから転写されるRNAのレベルの分析を、図4について記載した通りに行った。（*）で示した薄いバンドは、遺伝子導入において用いたpcDNA PB2発現プラスミド由来の伸長産物である。3つの独立した実験由来のウイルスRNAレベルの定量、又はセグメント1-GFPプラスミドを添加していない遺伝子導入の2反復の範囲を（b）及び（d）に示す。エラーバーは、平均値（b）又は範囲（d）の標準誤差を示す。vRNA（黒四角）、ポジティブセンスRNA（cRNA＋mRNA）（黒三角）。
【図８】全長セグメント1又は2又は3によってなされるRNA合成の、セグメント1又は2又は3由来の欠陥干渉インフルエンザRNAによる特異的な阻害の模式図。全長セグメント4（示さず）又は6によって行われるRNA合成は阻害されなかった。DI RNA1、2及び3における中身のあるボックスは、共通の相互作用エレメントを示し、全長セグメント1、2及び3における開いたボックスは、その対応物を示す。後者は、全長RNA6には存在しない。
【図９】（a）インフルエンザゲノムセグメント1RNA及びセグメント1 244 DI RNAの関係を示す図。数字は、ポジティブセンスのインフルエンザPR8ゲノムセグメント1の配列に基づくヌクレオチド位を示す。DI RNAゲノムにおける中止点のヌクレオチド位を示す。RNAの下の数字は、全長セグメント1及び244 DI RNAから転写されるmRNAによってコードされるアミノ酸の開始及び終止コドンの最初のヌクレオチドのヌクレオチド位を示す。灰色の網掛けはPB2コード配列を示し、黒色の網掛けは244 DI RNAの中止点の後に利用される新たな読み枠を示す。（b）オープンリーディングフレームを示すcRNAセンスにおける244 DI RNAの配列、及び一文字アミノ酸コードにおける予測されるタンパク質配列。PB2の35残基PB1結合ドメインを暗い灰色のボックスで示し、PB2の22残基のミトコンドリア相互作用ドメインを明るい灰色のボックスで示す。中央欠失から下流に新たに出現した枠で囲んだアミノ酸配列は、244 DI RNAをもたらす。この配列は、PB2 ORFから生じなかった。インフレームのAUG開始コドンを変異させるために用いたヌクレオチド位30、60及び111における3つのG→C変異を、太線かつ下線で示す。
【図１０】A．ゲノムセグメント1から転写されるポジティブセンスのインフルエンザRNAを検出するための、244 DIウイルスを感染させた細胞から抽出したRNAのノーザンブロット。レーン1は、全細胞RNAを含む。レーン2は、非ポリアデニル化RNAを含む。レーン3は、ポリアデニル化mRNAを含む。サイズマーカーの位置（nt）を示す。B．244 AUGノックアウトDI RNA及び244 DI RNAによって合成されたウイルスRNA。プラスミドの遺伝子導入の48時間後、RNAを細胞からTrizolで抽出し、プライマー伸長分析を行った。転写産物をTBEバッファー中に7Mの尿素を含む6%（w/v）ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光画像によって検出した。レーン1は100 ntサイズラダーを示し、レーン2は244 DI RNAの存在下で作製されたRNAを示し、レーン3は244 AUGノックアウトDI RNAの存在下で作製されたRNAを示す。vRNA及びmRNAの位置を示す。5SリボソームRNAを、同程度の量の全RNAを用いたことを確かめるための対照として用いた。
【図１１】GFP発現インフルエンザセグメント1RNAによる蛍光の発現の阻害に基づく、244 AUGノックアウトDI RNA及び244 DI RNAの干渉活性についてのアッセイ。（a）293T細胞にセグメント1-GFP RNAを発現するプラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びに244 AUGノックアウトDI RNA又は244 DI RNAを発現する増加量のプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、細胞を蛍光について試験した。細胞単層画像を、位相差顕微鏡（各カラムの左）及び落射蛍光顕微鏡（右）によって記録した。DI RNAを発現するプラスミドの量を左に示す。対照細胞（上部）には、空DIベクター（1 μg）を遺伝子導入した。（b）244 AUGノックアウトDI RNA（灰色）及び親の野生型（wt）244 DI RNA（白色）を発現する遺伝子導入プラスミドの存在下で細胞において生成された蛍光の定量。2つの独立した実験の範囲を示す。
【図１２】244 AUGノックアウトDIウイルス又は244 DIウイルス（それぞれ1 μg）の処置によるインフルエンザからのマウスの防御。マウスに、A/WSN単独（10 LD50、1000 ffu）、A/WSN＋244 AUGノックアウトDIウイルス、A/WSN＋244 DIウイルス、A/WSN＋不活性化（inactivated）244AUGノックアウトDIウイルス、A/WSN＋不活性化244 DIウイルス、又は生理食塩水単独を鼻腔内に接種した（パネルa、b）。感染の3週間後に、マウスの免疫状態を決定するために、マウスに高用量のA/WSN（10,000 LD50）をチャレンジした（パネルc、d）。パネル（a）、（c）、平均臨床スコア；パネル（b）、（d）、平均体重変化。（a）では、244 DI + A/WSN、ノックアウトDIのみ、244 DIのみ、及びモックは全て臨床スコア1を有するノックアウトDI＋A/WSNを下回った。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、DIインフルエンザAウイルスのウイルス複製への干渉の有効性が、インフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉するDIウイルスRNAの能力に起因し得ることを特定した。したがって、本発明は、抗ウイルス剤として有効なDIウイルスを同定するための方法を提供する。したがって、本発明は、欠陥干渉インフルエンザRNAが、インフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉し得るかを決定することによって、抗ウイルス剤を同定するための方法を提供する。セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉することができる欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAは、抗ウイルス剤へ含まれるものとして同定される。
【００１８】
本発明の方法は、インフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産の分析を可能とするアッセイについて、任意の好適な形態を用いて実施され得る。本発明の方法に従って、アッセイは、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産をモニターするための単独アッセイにおいて実施され得る。あるいは、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産をモニターするために、複数のアッセイが別々に、又は任意の組み合わせで実施され得る。例えば、アッセイはセグメント1及び2からのRNAの生産をモニターするための第一のアッセイと共に、セグメント3からのRNAの生産をモニターするために実施される別のアッセイを含み得る。同様に、セグメント2及び3からのRNAの生産を一緒にアッセイすると共に、セグメント1からのRNAの生産を別にアッセイし得るか、又はセグメント1及び3からのRNAの生産を一緒にアッセイすると共に、セグメント2からのRNAの生産を別にアッセイし得る。典型的には、細胞に分析するセグメントからvRNAを発現する一以上のプラスミド、例えばセグメント1、2及び3からvRNAを発現するプラスミドを用いて遺伝子導入する。
【００１９】
アッセイは、セグメント1、2及び3からのRNAの生産を可能にする適切なウイルス及び／又は宿主細胞機構の存在下で実施される。典型的には、本発明の方法は、宿主細胞を用いて実施される。宿主細胞は、ウイルスRNA合成を可能にするために不可欠な成分を提供する。典型的には、これはインフルエンザAポリメラーゼタンパク質及びウイルスヌクレオタンパク質、及び特にインフルエンザAのPB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現する好適なベクター又はプラスミドを細胞に遺伝子導入することによって達成され得る。上記の通り、細胞は典型的にはセグメント1、2及び3からvRNAを発現するさらなるプラスミドによって遺伝子導入される。
【００２０】
インフルエンザAの構造タンパク質がコードされず、提供されない場合、ウイルス粒子は生産されないだろう。しかしながら、セグメントからのRNAの生産のレベルは容易にモニターし得る。これは、各セグメントに関連するvRNA、cRNA又はmRNAの直接検出を介してなされ得る。あるいは、例えば、セグメント−レポーター遺伝子構築物等のネガティブセンス標的RNAをコードする、緑色蛍光タンパク質等のレポーターをコードする、レポーター構築物が提供され得る。セグメント1、2及び3が、二つ以上のセグメントが同時にモニターされるように組み合わせて評価され、レポーター遺伝子が用いられる場合、好ましくは、異なるレポーター遺伝子が各セグメントに対して用いられる。レポーター遺伝子が用いられる場合、アッセイはレポーター遺伝子の発現をモニターすることを含む。例えば蛍光の低減によって示されるレポーター遺伝子の発現の低減は、セグメント−レポーター構築物からのRNAの生産が低減したことを示す。
【００２１】
本発明のアッセイにおける分析のための欠陥干渉ウイルスRNAは、典型的にインフルエンザA由来の欠陥干渉ウイルスRNAである。典型的には、DIウイルスRNAは、インフルエンザAのセグメント1、2又は3に由来する。本発明の一態様では、DIウイルスRNAは、例えばDIウイルスRNAをコードするベクター又はプラスミドを提供することによって細胞に導入される。別の態様では、アッセイは、細胞にDIウイルス粒子を感染させることによって実施され得る。本発明の好ましい態様では、本発明に従ってアッセイされるDIウイルスは、クローン化されたDIウイルスである。あるいは、本方法は、DIウイルスの不均一な集団をアッセイし、後のクローン化及び分析のために、目的のDIウイルスを含むプールを同定するために用いられ得る。
【００２２】
阻害への言及は、典型的に各セグメントからのウイルスRNA、cRNA又はmRNAの生産の少なくとも10%の低減、典型的にはウイルスRNA、cRNA又はmRNAの生産の少なくとも20%、30%、40%又は50%の低減、好ましくはウイルスRNA、cRNA又はmRNAの生産の少なくとも60%、70%、80%又は90%、好ましくは少なくとも95%、97%、98%又は99%の低減を指す。最も高いレベルのウイルス合成の阻害を示す欠陥干渉ウイルスRNAは、抗ウイルス剤として最も好ましく用いられる。
【００２３】
本発明の別の態様に従って、抗ウイルス剤としての使用のための欠陥干渉ウイルスが提供される。本発明の欠陥干渉ウイルスRNAは、インフルエンザAに由来する。欠陥干渉インフルエンザA RNAは、セグメント1、2又は3に由来し得る。配列番号2、3及び4は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント1の配列を記載する。配列番号5、6及び7は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント2を示す。配列番号8、9及び10は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント3の配列を示す。全ての場合において、これらの配列は5'から3’のポジティブ（アンチゲノムセンス）において示される。また、配列はDNAとして表される。
【００２４】
配列番号2〜10の配列は、本発明に従うDI RNAを生産するために用いられ得るセグメント1、2及び3の代表的な配列を提供する。欠失は、先により詳細に記載した通り、セグメントに導入される。各株のセグメントの間には高度の配列同一性が存在する。任意のインフルエンザA株由来のセグメント1、2又は3は、DIウイルスを設計及び生産するために用いられ得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント1は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号2、3又は4に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する変異配列を有し得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント2は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号5、6又は7に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有し得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント3は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号8、9又は10に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有し得る。
【００２５】
本分野の標準的な方法が、相同性を決定するために用いられ得る。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために用いられ得る、例えばそのデフォルト設定で用いられるBESTFITプログラムを提供する（Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。PILEUP及びBLASTアルゴリズムが、相同性又はラインアップ配列（line up sequence）を計算する（例えば、典型的にはデフォルトセッティングにおいて、同等の残基または対応する配列を同定する）ために、例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300; Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、使用され得る。
【００２６】
BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードとアライメントさせた場合、ある程度の陽性値の閾値スコアTにマッチするか、又はこれを満足する、クエリー配列における長さWの短いワードを同定することによってハイスコアリング配列対（high scoring sequence pairs）（HSP）を最初に特定することを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むHSPを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限りは、両方の方向に、各々の配列に沿って伸長される。各々の方向におけるワードヒットについての伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からX量ずつ低下する場合；累積スコアが一以上の負のスコアリング残基アラインメント（negative-scoring residue alignments）の累積に起因して0以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして11のワード長（W）、50のBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919を参照されたい）アラインメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=4及び両方の鎖の比較を用いる。
【００２７】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う；例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定値は、最小合計確率（P（N））であり、これによって、2つのアミノ酸配列の間のマッチが偶然に生じる確率の指標が提供される。例えば、配列は、第二の配列に対する第一の配列の比較における最小合計確率が、約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、そして最も好ましくは約0.001未満である場合、別の配列と類似しているとみなされる。
【００２８】
欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAは、少なくともセグメントの5'領域の一部及び3'領域の一部を含み、セグメントの中央部に一以上の欠失を有するセグメント1、2又は3由来の配列を含む。セグメントの5'末端及び3'末端の配列は、好ましくはセグメントの5'及び3'末端由来の連続配列を表すインタクトである。5'末端及び3'末端の領域は、複製及びウイルス粒子へのパッケージングに必要なシス作用性シグナルを保持するように選択される。典型的には、欠陥干渉ウイルスRNAは、セグメントの5'末端からの少なくとも100ヌクレオチド及び最大500ヌクレオチド長、好ましくは最大400ヌクレオチド長、好ましくは最大300ヌクレオチド長、好ましくは最大250ヌクレオチド長、例えば100〜250ヌクレオチド長、100〜220ヌクレオチド長又は120〜220ヌクレオチド長、例えばセグメントの5'末端から150〜220ヌクレオチド長を含むであろう。
【００２９】
同様に、典型的には欠陥干渉ウイルスRNAは、3’末端の連続配列を含む、典型的にはセグメントの3'末端の少なくとも100ヌクレオチド及び最大500ヌクレオチド、好ましくは150ヌクレオチド〜400ヌクレオチド、例えばセグメントの3'末端の150ヌクレオチド〜280ヌクレオチドを含む、セグメントの3'末端を含む。欠失は、セグメントの中央部の欠失を、典型的には最大2000ヌクレオチド長、典型的には少なくとも1,000ヌクレオチド長、少なくとも1,500ヌクレオチド長、1,800ヌクレオチド長、2,000ヌクレオチド長含む。
【００３０】
したがって、本発明に従う欠陥干渉ウイルスRNAは、典型的には300ヌクレオチド〜600ヌクレオチド、典型的には300ヌクレオチド〜500ヌクレオチド、好ましくは380ヌクレオチド〜480ヌクレオチド長の全長を有する。
【００３１】
本発明に従う欠陥干渉ウイルスは、インフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産に干渉する能力によって特徴づけられる。本ウイルスの本活性についてのアッセイは、本明細書に記載の方法に従って実施され得る。
【００３２】
典型的には、ウイルス粒子に含めるための欠陥干渉ウイルスRNAは、組換え手段によって生産される。標準的な組換え技術が、セグメント1、2又は3RNAに欠失を導入するために、用いられ得る。
【００３３】
あるいは、本願の欠陥干渉ウイルスは、例えば天然の欠陥干渉ウイルスに基づくクローン化された又は組換え調製物を提供するためのクローン化された又は組換えウイルスであり得る。例えば、サンプルを、感染した個体、動物から、又は欠陥干渉ウイルス粒子の存在を細胞について同定するために採取し得る。かかるDIウイルスは、セグメント1、2及び3のそれぞれからのウイルス複製を阻害する欠陥干渉ウイルスの存在を同定するために選抜され得る。その後、ウイルスのDI RNAは、本願請求項に係る特徴を有する欠陥干渉ウイルスのクローン化された調製物を提供するために、組換え技術によって単離及びクローン化される。
【００３４】
本明細書に記載のDIウイルスRNAは、抗ウイルス剤としての使用のためのDIウイルスを生産するために、ウイルス粒子に組込まれ得る。かかるウイルス粒子は、DIウイルスRNAを発現するプラスミド又はベクター、及びインフルエンザAのRNAセグメント1〜8を組み合わせて発現するプラスミド又はベクターを細胞に遺伝子導入することによって生産され得る。RNA及びタンパク質発現は、DIウイルスRNAを含むウイルス粒子を作製するために用いられ得る。クローン化されたDIインフルエンザウイルスを作製する方法は、例えばWO2007/135420に記載されている。
【００３５】
本発明の好ましい態様に従えば、本願のDIウイルスは1/244ではない。
【００３６】
抗ウイルス剤として同定されるDIウイルス、又は本発明に従うDIウイルスは、被験体におけるウイルス感染を治療するための、及び特に、被験体におけるインフルエンザA感染を治療するための方法において用いられ得る。本発明はまた、被験体におけるインフルエンザA感染の予防又は治療方法であって、有効量の本発明に従って同定されるDIウイルス、又は上記本発明のDIウイルスを被験体に投与することを含む方法も提供する。
【００３７】
本発明はまた、インフルエンザA感染の予防又は治療方法における使用のための、本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスも提供する。本発明はさらに、インフルエンザA感染の予防又は治療のための薬剤の製造における、本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスの使用を提供する。
【００３８】
インフルエンザAに由来するDIウイルスはまた、他のウイルス、特に呼吸器ウイルス感染によって引き起こされるウイルス感染の治療において有効であることも示された。したがって、本発明に従うDIウイルスは、他の呼吸器ウイルス感染、例えばニューモウイルス又はメタニューモウイルス（metanpeurovirus）等のパラミクソウイルス科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染、及びオルトミクソウイルス科（orthomyoviridae）のウイルスによって引き起こされるウイルスの治療のためにも用いられ得る。本発明に従って治療され得る呼吸器ウイルスの例として、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザB又はインフルエンザCウイルスが挙げられる。
【００３９】
典型的には、個体はヒトである。被験体は典型的には患者であるが、感染のリスクがある個体でもあり得る。
【００４０】
本発明のDIウイルスは、インフルエンザA感染を治療するために用いられ得る。治療の場合には、被験体は典型的にインフルエンザA感染を有し、すなわちインフルエンザA感染を有すると診断されているか、又はインフルエンザA感染を有する疑いがあり、すなわちインフルエンザA感染の症状を示す。個体は感染のリスクがあるものであり得、DIウイルスは、インフルエンザAへの曝露の最大2週間、典型的には最大1週間前に、投与によって予防的に感染を予防又は治療するために用いられる。被験体は、典型的には症候的であるが、無症候的でもあり得る。本明細書で使用される用語「治療」は、以下：インフルエンザA感染又はインフルエンザA感染に関連する一以上の症状の予防；インフルエンザA感染又は症状の発症又は進行の低減又は予防；及び存在するインフルエンザA感染又は症状の低減又は排除、のいずれかを含む。
【００４１】
療法及び予防は、限定するものではないが、インフルエンザA感染の結果として生じる、又はこれに関連する症状及び／又は合併症を、緩和、低減、治癒、又は少なくとも部分的に抑止することを含む。治療的に提供される場合、療法は典型的にインフルエンザA感染の症状の開始と同時に又は直後に提供される。かかる治療的投与は、典型的に感染の進行又は感染の症状を予防又は緩和するために、又はかかる症状又は感染の重篤度を低減するためのものである。予防的に提供される場合、治療は典型的にインフルエンザA感染の症状の開始の前に提供される。かかる予防的投与は、典型的に感染の症状の開始を予防するためのものである。本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスは、感染を治療又は予防するために、個体がインフルエンザAウイルスと接触する疑いがあるか、接触する可能性が高い場合に、個体が感染する前に投与され得る。例えば、本発明のDIウイルスは、インフルエンザAへの曝露の1日、3日、1週間又は最大2週間前に投与され得る。
【００４２】
本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスの投与の具体的な経路、用量及び方法は、医師によって日常的に決定され得る。これらは、以下でより詳細に論じられる。典型的には、治療有効量又は予防有効量の本発明のDIウイルスが被験体に投与される。予防有効量は、インフルエンザA感染、及び／又はインフルエンザA感染の一以上の症状の開始を予防する量である。治療有効量は、インフルエンザA感染の一以上の症状を緩和するのに有効な量である。治療有効量は、好ましくは疾患の一以上の症状を消失させる。典型的には、かかる量は、インフルエンザA感染又は被験体におけるウイルス力価を低減する。
【００４３】
本発明のDIウイルスは、同じ被験体を治療することを意図する他の一以上の療法と組み合わせて用いられ得る。組み合わせは、被験体に対して、その療法が同時に、又は組み合わせて又は別々の形態で投与され得ることを意味する。療法は、同じ治療又は予防計画の一部として、被験体に別々に又は連続的に投与され得る。例えば、本発明のDIウイルスは、インフルエンザA感染を阻害するか又はその症状を処置することを意図する他の療法と組み合わせて用いられ得る。他の療法は、インフルエンザA感染を有する被験体の症状を治療又は改善することを目的とする一般的な療法であり得る。
【００４４】
本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスは、任意の好適な手段によって被験体に投与され得る。典型的には、DIウイルスは、呼吸器気道に、典型的に鼻腔内又は頬内投与、吸入又は滴下によって投与される。
【００４５】
本発明のDIウイルスは、医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、一つの上記DIウイルスに加えて、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み得る。かかる組成物は、他の賦形剤、バッファー、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。かかる材料は非毒性であるべきであり、DIウイルスの有効性に干渉するべきでない。担体又は希釈剤の正確な性質は、投与経路、例えば口腔、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。
【００４６】
口腔製剤は、かかる通常使用される賦形剤として、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は粉剤の形態をとり、10%〜95%、好ましくは25%〜70%の活性成分を含む。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は、投与の前に例えば懸濁液に再構成され得る。再構成は、好ましくは水で行われる。典型的には、製剤は鼻腔内送達に好適であり、経鼻スプレー、経鼻ドロップ、ゲル又は粉剤の形態で提供され得る。
【００４７】
有効量、例えば治療有効量又は予防有効量のDIウイルスが投与される。用量は、様々なパラメーターに従って、特に用いられるDIウイルス；治療される被験体の年齢、体重及び症状；投与経路；及び必要とされる計画に従って決定され得る。また、医師は任意の特定の被験体に必要な投与経路及び用量を決定することができるだろう。
【００４８】
本発明の他の態様において、DIウイルスRNAがタンパク質を生産することができないDIウイルスが提供される。典型的には、これはタンパク質発現に必要なシグナル配列を除去するようにDIウイルスRNAを変異させることによって達成される。本発明の一態様では、これは一以上のAUG開始コドンを欠失又は置換することによって行われる。例えば、開始コドンは一以上の位置で変異させられ得る。一態様では、本発明者は一以上の開始コドンのAUCへの変異を記載し、典型的に全ての開始コドンがAUCに変異される。
【００４９】
本発明のDIウイルスRNAは、公知のDIウイルスであり得る。本発明の好ましい態様において、DIウイルスRNAは、AUG開始コドンの変異を含む1/244である。DIウイルスは、DIウイルスの一、二以上、又は全てのAUG開始コドンが変異するように、一以上の変異を含み得る。244 DI RNAの場合、AUGは28〜30、58〜60及び109〜111位のAUG開始コドンに導入される。好適な変異として、例えば244 DI RNAの30、60及び111位のGからCへの変異が挙げられる。
【００５０】
同様の変異が、他のDI RNA、特にインフルエンザAウイルス由来のDI RNAに導入され得る。かかるDI RNAは、上記のものであり得る。特に、欠陥干渉インフルエンザA RNAは、セグメント1、2又は3に由来し得る。配列番号2、3及び4は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント1の配列を記載する。配列番号5、6及び7は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント2を示す。配列番号8、9及び10は、それぞれA/プエルトリコ/8/34（H1N1）株、A/ニューヨーク/463/2005（H3N2）株及びA/オランダ/178/1995（H3N2）株のインフルエンザAウイルスセグメント3の配列を示す。全ての場合において、これらの配列は5'から3’のポジティブ（アンチゲノムセンス）において示される。また、配列はDNAとして表される。
【００５１】
配列番号2〜10の配列は、本発明に従うDI RNAを生産するために用いられ得るセグメント1、2及び3の代表的な配列を提供する。欠失は、先により詳細に記載した通り、セグメントに導入される。各株のセグメントの間には高度の配列同一性が存在する。任意のインフルエンザA株由来のセグメント1、2又は3は、DIウイルスを設計及び生産するために用いられ得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント1は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号2、3又は4に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有する変異配列を有し得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント2は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号5、6又は7に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有し得る。DIウイルスを生産するための、本発明に従う使用のためのセグメント3は、全配列にわたるヌクレオチド同一性に基づいて配列番号8、9又は10に対して少なくとも80%、85%、90%又は95%の相同性を有し得る。
【００５２】
本分野の標準的な方法が、相同性を決定するために用いられ得る。例えば、UWGCGパッケージは、相同性を計算するために用いられ得る、例えばそのデフォルト設定で用いられるBESTFITプログラムを提供する（Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。PILEUP及びBLASTアルゴリズムが、相同性又はラインアップ配列（line up sequence）を計算する（例えば、典型的にはデフォルトセッティングにおいて、同等の残基または対応する配列を同定する）ために、例えば、Altschul S.F.(1993)J Mol Evol 36:290-300; Altschul,S,F et al(1990)J Mol Biol 215:403-10に記載されるように、使用され得る。
【００５３】
BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードとアライメントさせた場合、ある程度の陽性値の閾値スコアTにマッチするか、又はこれを満足する、クエリー配列における長さWの短いワードを同定することによってハイスコアリング配列対（high scoring sequence pairs）（HSP）を最初に特定することを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al、前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むHSPを見出すために検索を開始するためのシードとして機能する。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限りは、両方の方向に、各々の配列に沿って伸長される。各々の方向におけるワードヒットについての伸長は、以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値からX量ずつ低下する場合；累積スコアが一以上の負のスコアリング残基アラインメント（negative-scoring residue alignments）の累積に起因して0以下になる場合；又はいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして11のワード長（W）、50のBLOSUM62スコアリングマトリックス（Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919を参照されたい）アラインメント（B）、10の期待値（E）、M=5、N=4及び両方の鎖の比較を用いる。
【００５４】
BLASTアルゴリズムは、2つの配列の間の類似性の統計学的分析を行う；例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの測定値は、最小合計確率（P（N））であり、これによって、2つのアミノ酸配列の間のマッチが偶然に生じる確率の指標が提供される。例えば、配列は、第二の配列に対する第一の配列の比較における最小合計確率が、約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、そして最も好ましくは約0.001未満である場合、別の配列と類似しているとみなされる。
【００５５】
欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAは、少なくともセグメントの5'領域の一部及び3'領域の一部を含み、セグメントの中央部に一以上の欠失を有するセグメント1、2又は3由来の配列を含む。セグメントの5'末端及び3'末端の配列は、好ましくはセグメントの5'及び3'末端由来の連続配列を表すインタクトである。5'末端及び3'末端の領域は、複製及びウイルス粒子へのパッケージングに必要なシス作用性シグナルを保持するように選択される。典型的には、欠陥干渉ウイルスRNAは、セグメントの5'末端からの少なくとも100ヌクレオチド及び最大500ヌクレオチド長、好ましくは最大400ヌクレオチド長、好ましくは最大300ヌクレオチド長、好ましくは最大250ヌクレオチド長、例えば100〜250ヌクレオチド長、100〜220ヌクレオチド長又は120〜220ヌクレオチド長、例えばセグメントの5'末端から150〜220ヌクレオチド長を含むであろう。
【００５６】
同様に、典型的には欠陥干渉ウイルスRNAは、3’末端の連続配列を含む、典型的にはセグメントの3'末端の少なくとも100ヌクレオチド及び最大500ヌクレオチド、好ましくは150ヌクレオチド〜400ヌクレオチド、例えばセグメントの3'末端の150ヌクレオチド〜280ヌクレオチドを含む、セグメントの3'末端を含む。欠失は、セグメントの中央部の欠失を、典型的には最大2000ヌクレオチド長、典型的には少なくとも1,000ヌクレオチド長、少なくとも1,500ヌクレオチド長、1,800ヌクレオチド長、2,000ヌクレオチド長含む。
【００５７】
したがって、本発明に従う欠陥干渉ウイルスRNAは、典型的には300ヌクレオチド〜600ヌクレオチド、典型的には300ヌクレオチド〜500ヌクレオチド、好ましくは380ヌクレオチド〜480ヌクレオチド長の全長を有する。
【００５８】
典型的には、ウイルス粒子に含めるための欠陥干渉ウイルスRNAは、組換え手段によって生産される。標準的な組換え技術が、上記の様な一以上の開始コドンへの更なる変異と共に、セグメント1、2又は3RNAに欠失を導入するために、用いられ得る。
【００５９】
本明細書に記載のDIウイルスRNAは、抗ウイルス剤としての使用のためのDIウイルスを生産するために、ウイルス粒子に組込まれ得る。かかるウイルス粒子は、DIウイルスRNAを発現するプラスミド又はベクター、及びインフルエンザAのRNAセグメント1〜8を組み合わせて発現するプラスミド又はベクターを細胞に遺伝子導入することによって生産され得る。RNA及びタンパク質発現は、DIウイルスRNAを含むウイルス粒子を作製するために用いられ得る。
【００６０】
本発明のこの態様に従うDIウイルスは、被験体におけるウイルス感染を治療するための、例えば、被験体におけるインフルエンザA感染を治療するための方法において用いられ得る。本発明はまた、被験体におけるインフルエンザA感染の予防又は治療方法であって、有効量の本明細書に記載の本発明のDIウイルスを被験体に投与することを含む方法も提供する。本発明のこの態様に従うDIウイルスは、他のウイルス感染を治療するためにも用いられ得る。
【００６１】
本発明はまた、インフルエンザA感染の予防又は治療方法における使用のための、本発明のこの態様のDIウイルスも提供する。本発明はさらに、インフルエンザA感染の予防又は治療のための薬剤の製造における、本発明のこの態様のDIウイルスの使用を提供する。
【００６２】
インフルエンザAに由来するDIウイルスはまた、他のウイルス、特に呼吸器ウイルス感染によって引き起こされるウイルス感染の治療において有効であることも示された。したがって、本発明に従うDIウイルスは、他の呼吸器ウイルス感染、例えばニューモウイルス又はメタニューモウイルス（metanpeurovirus）等のパラミクソウイルス科のウイルスによって引き起こされるウイルス感染、及びオルトミクソウイルス科（orthomyoviridae）のウイルスによって引き起こされるウイルスの治療のためにも用いられ得る。本発明に従って治療され得る呼吸器ウイルスの例として、ヒト呼吸器多核体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、インフルエンザB又はインフルエンザCウイルスが挙げられる。
【００６３】
典型的には、個体はヒトである。被験体は典型的には患者であるが、感染のリスクがある個体でもあり得る。
【００６４】
本発明のDIウイルスは、インフルエンザA感染を治療するために用いられ得る。治療の場合には、被験体は典型的にインフルエンザA感染を有し、すなわちインフルエンザA感染を有すると診断されているか、又はインフルエンザA感染を有する疑いがあり、すなわちインフルエンザA感染の症状を示す。個体は感染のリスクがあるものであり得、DIウイルスは、インフルエンザAへの曝露の最大2週間、典型的には最大1週間前に、投与によって予防的に感染を予防又は治療するために用いられる。被験体は、典型的には症候的であるが、無症候的でもあり得る。本明細書で使用される用語「治療」は、以下：インフルエンザA感染又はインフルエンザA感染に関連する一以上の症状の予防；インフルエンザA感染又は症状の発症又は進行の低減又は予防；及び存在するインフルエンザA感染又は症状の低減又は排除、のいずれかを含む。
【００６５】
療法及び予防は、限定するものではないが、インフルエンザA感染の結果として生じる、又はこれに関連する症状及び／又は合併症を、緩和、低減、治癒、又は少なくとも部分的に抑止することを含む。治療的に提供される場合、療法は典型的にインフルエンザA感染の症状の開始と同時に又は直後に提供される。かかる治療的投与は、典型的に感染の進行又は感染の症状を予防又は緩和するために、又はかかる症状又は感染の重篤度を低減するためのものである。予防的に提供される場合、治療は典型的にインフルエンザA感染の症状の開始の前に提供される。かかる予防的投与は、典型的に感染の症状の開始を予防するためのものである。本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスは、感染を治療又は予防するために、個体がインフルエンザAウイルスと接触する疑いがあるか、接触する可能性が高い場合に、個体が感染する前に投与され得る。例えば、本発明のDIウイルスは、インフルエンザAへの曝露の1日、3日、1週間又は最大2週間前に投与され得る。
【００６６】
本発明に従って同定される、又は本発明のDIウイルスの投与の具体的な経路、用量及び方法は、医師によって日常的に決定され得る。これらは、以下でより詳細に論じられる。典型的には、治療有効量又は予防有効量の本発明のDIウイルスが被験体に投与される。予防有効量は、インフルエンザA感染、及び／又はインフルエンザA感染の一以上の症状の開始を予防する量である。治療有効量は、インフルエンザA感染の一以上の症状を緩和するのに有効な量である。治療有効量は、好ましくは疾患の一以上の症状を消失させる。典型的には、かかる量は、インフルエンザA感染又は被験体におけるウイルス力価を低減する。
【００６７】
本発明のDIウイルスは、同じ被験体を治療することを意図する他の一以上の療法と組み合わせて用いられ得る。組み合わせは、被験体に対して、その療法が同時に、又は組み合わせて又は別々の形態で投与され得ることを意味する。療法は、同じ治療又は予防計画の一部として、被験体に別々に又は連続的に投与され得る。例えば、本発明のDIウイルスは、インフルエンザA感染を阻害するか又はその症状を処置することを意図する他の療法と組み合わせて用いられ得る。他の療法は、インフルエンザA感染を有する被験体の症状を治療又は改善することを目的とする一般的な療法であり得る。
【００６８】
本発明のDIウイルスは、任意の好適な手段によって被験体に投与され得る。典型的には、DIウイルスは、呼吸器気道に、典型的に鼻腔内又は頬内投与、吸入又は滴下によって投与される。
【００６９】
本発明のDIウイルスは、医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、一つの上記DIウイルスに加えて、薬学的に許容される担体又は希釈剤を含み得る。かかる組成物は、他の賦形剤、バッファー、安定化剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。かかる材料は非毒性であるべきであり、DIウイルスの有効性に干渉するべきでない。担体又は希釈剤の正確な性質は、投与経路、例えば口腔、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に依存し得る。
【００７０】
口腔製剤は、かかる通常使用される賦形剤として、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、及び炭酸マグネシウム等を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は粉剤の形態をとり、10%〜95%、好ましくは25%〜70%の活性成分を含む。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は、投与の前に例えば懸濁液に再構成され得る。再構成は、好ましくは水で行われる。典型的には、製剤は鼻腔内送達に好適であり、経鼻スプレー、経鼻ドロップ、ゲル又は粉剤の形態で提供され得る。
【００７１】
有効量、例えば治療有効量又は予防有効量のDIウイルスが投与される。用量は、様々なパラメーターに従って、特に用いられるDIウイルス；治療される被験体の年齢、体重及び症状；投与経路；及び必要とされる計画に従って決定され得る。また、医師は任意の特定の被験体に必要な投与経路及び用量を決定することができるだろう。
本発明の様々な態様を以下に示す。
１．RNAが、コードされる任意のタンパク質の発現を防ぐように変異している、欠陥干渉ウイルスRNA。
２．一以上のAUG開始コドンが変異している、１に記載のDIウイルスRNA。
３．全てのAUG開始コドンが変異している、２に記載のDIウイルスRNA。
４．一以上のAUGがAUCに変異している、２又は３に記載のDIウイルスRNA。
５．DIウイルスが1/244である、１〜４のいずれかに記載のDIウイルスRNA。
６．１〜５のいずれかに記載のDIウイルスRNAを含む、DIウイルス。
７．インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、６に記載のDIウイルス。
８．試験欠陥干渉インフルエンザウイルスRNAの存在下でインフルエンザAウイルスのセグメント1、2及び3からのRNAの生産をモニターすることを含む、抗ウイルス剤を同定するための方法であって、セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産に干渉する欠陥干渉ウイルスRNAが抗ウイルス剤として同定される、前記方法。
９．宿主細胞において実施される、８に記載の方法。
１０．宿主細胞に、インフルエンザウイルスのセグメント1、2及び3を含む核酸が遺伝子導入される、９に記載の方法。
１１．前記セグメント1、2及び3のそれぞれが、別々のプラスミドにおいて提供される、１０に記載の方法。
１２．セグメント1、2及び3のそれぞれからのRNAの生産が、別々のアッセイでモニターされる、８又は９に記載の方法。
１３．RNAがcRNA、mRNA及び／又はvRNAを含む、８〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．cRNA及びmRNAの両方の生産がモニターされる、１３に記載の方法。
１５．セグメント1、2又は3の一以上が、該セグメントからのRNAの生産の低減がレポーター遺伝子の発現を低減させるように、コードされたレポーター遺伝子を有する構築物として提供される、８〜１２のいずれかに記載の方法。
１６．８〜１５のいずれかに記載の方法により同定される、インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、抗ウイルス剤。
１７．セグメント1、2又は3に由来するRNAを含む、クローン化された又は組換え欠陥干渉インフルエンザAウイルスであって、前記RNAが：
（a）300〜600ヌクレオチド長のRNA、
（b）セグメント1、2又は3の5'及び3'末端由来の少なくとも100ヌクレオチド、
（c）前記セグメントのヌクレオチドの中央欠失、
を含み、前記欠陥干渉インフルエンザウイルスがインフルエンザAのセグメント1、2及び3からのRNA生産に干渉することができる、前記ウイルス。
１８．DIウイルスが1/244ではない、１７に記載の欠陥干渉ウイルス。
１９．インフルエンザA感染の治療又は予防方法における使用のための、１７又は１８に記載の欠陥干渉ウイルス。
【実施例】
【００７２】
実施例１−DI RNAは、セグメント1、2及び3からのRNAの生産を阻害する
材料及び方法
プラスミド
A/WSN株及びA/WS/33の8つの遺伝子セグメントをコードするプラスミド、及びポリメラーゼタンパク質及びNPを発現するプラスミド（Neumann et al. 1999）、並びに1/244 DI RNA（図1）を発現するベクターは、以前記載した通り（Duhaut and Dimmock 2002；Dimmock et al. 2008）である。1/244 RNAは、395 ntを含み、A/プエルトリコ/8/34（H1N1）に由来した。セグメント1標的、セグメント1-GFPは、プライマー5'ATGGTCTCTACTGATGGTGAGCAAGGGCGAG及び5'ATGAAGACAATCTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAを用いて、pEGFP-N1（Clontech）からのPCRによるGFP OCRの増幅によって作製した。産物を、GFP ORFがPB2 ORFとインフレームであるようにpPolI-220（Duhaut and Dimmock 2000）のBpiI及びEco31Iサイトの間に挿入し、セグメント1-GFP RNAを発現するプラスミドseg 1-GFPを得た（図1）。GFPレポーターは、セグメント1の正確な5'末端（220 nt）及び3'末端（48 nt）を維持し、1/244 DI RNAに対しコグネート（cognate）である。セグメント2 DI（2/265；ネガティブセンスコグネートRNAの5'末端の265 nt及び3'末端の187 ntを有する全長452 ntを含む）を、RT-PCR増幅によってDI A/ウマ/ニューマーケット/7339/79（H3N8）ウイルス調製物（図1）から単離し（(Mann et al. 2006）、続いてpPolI-SapIT発現ベクターにクローニングした（Subbarao et al. 2003）。セグメント3 DI RNA（3/262；ネガティブセンスコグネートRNAの5'末端の262 nt及び3'末端の207 ntを有する全長469 ntを含む）をDI A/WSN調製物から単離し、増幅して上記の通りクローニングした（図1）。様々なプラスミドによってコードされるDI RNAは、それらが由来するウイルスのゲノムセグメントの末端の正確なヌクレオチド配列を維持し、複製又はパッケージングに影響を与えることが知られている位置にいかなる変異も含まない。
【００７３】
遺伝子導入
ヒト293T細胞に、以前記載した通りに遺伝子導入した（Dimmock et al. 2008）。手短には、ノーザンブロット分析については、12ウェルプレート中の70%コンフルエントの293T細胞に、TransIT LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を用いて、ウイルスセンスRNAコードする8 PolI発現プラスミド、及びPB2、PB1、PA及びNPタンパク質の発現のためのcRNAプラスミドを、pPolI-244と共に、又はpPolI-244なしで遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を、25 cm2フラスコでMDCK細胞と共培養する前に、37℃で一晩インキュベートした。全細胞RNAを、共培養の1、2、及び3日後にサンプルごとに2 mlのTrizol試薬（Invitrogen）で抽出し、同時に組織培養液をウイルス力価測定及びRNA抽出のために回収した。ビリオンを、限外濾過によって精製した。RNAを、フェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈殿させた。遺伝子導入については、70%コンフルエントの293T細胞を含む6ウェルプレートの各ウェルに、PB2、PB1、PA及びNP cDNA発現プラスミド各1 μgと、様々な量のDIプラスミド又はpPolI-NAを、1 μgの標的プラスミド共に遺伝子導入した。37℃での2日間のインキュベーション後、上清を捨て、RNAをTrizolで抽出した。
【００７４】
感染性アッセイ
96ウェルプレートのMDCK細胞単層に、先に記載した通りにレスキューしたA/WSNを含む上清を感染させた（Scott et al. 2011）。ウイルスの付着の1時間後、単層をPBSで洗浄し、維持培地において33℃で一晩インキュベートした。その後、細胞を4%（v/v）ホルムアルデヒドで固定し、PBS中の5%（w/v）ミルク粉末でブロッキングした。感染した細胞を、0.1 % Tween 20を含むPBS中で、A/WSNのHAに特異的なモノクローナル抗体でプローブした。洗浄後、0.1 % Tween 20を含むPBS中のヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート（Sigma）を添加し、感染細胞をトリスバッファー塩化マグネシウム及び塩化ナトリウム（0.1 M、pH 9.5）中で、ニトロテトラゾリウムブルークロリド/BCIP（Sigma）により検出した。感染力価を、三つ組のウェルのそれぞれにおいて、適切な希釈で少なくとも50の陽性染色細胞（フォーカス）を数えることによって決定した。カウントの平均値を、フォーカス形成単位（f.f.u.）ml-1で力価を表すために決定した。
【００７５】
プライマー伸長
全細胞RNAを、遺伝子導入の48時間後にTrizolにより細胞から抽出し、プライマー伸長分析に用いた（Rehwinkel et al. 2010）。2 μgの全RNAを、13 μlの全容量で[32P]5'末端標識プライマー及びdNTPと混合した。混合物を65℃で5分間加熱し、1分間氷上に置いた。2×ファーストストランドバッファー、20 mM DTT、及び100 UのSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）を添加し、55℃でさらに1時間インキュベートした。反応を、ゲルローディングダイII（Ambion）と共に95℃で5分間加熱することによって終了させた。転写産物を、TBEバッファー中に7M尿素を含む6％（w/v）ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光画像によって検出した。用いたプライマーを表1に示し、様々な標的RNAに対するこれらの位置を、図1に示す。
【表１】
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【００７６】
ノーザンブロッティング
各サンプルから、10 μgの全細胞RNA又は精製されたウイルスRNAの産物の50%を、グリオキサール−アガロースゲル電気泳動のために用いた。RNAを、20×SSCを用いて、一晩ハイボンドNメンブレン（Hybond-N membrane）（GE Healthcare）に移した。その後、膜を80℃で2時間乾燥させ、ジゴキシゲニン（DIG）標識プローブを一晩ハイブリダイズした。全長ポジティブセンスDIG標識セグメント1、セグメント2及びセグメント7プローブを、T7プロモーターを含むPCR産物から、DIG-UTP（Roche）の存在下でin vitroで転写した。ジオキシゲニン特異的アルカリホスファターゼコンジュゲートFAb抗体フラグメント及び化学発光CSPD基質を有するRocheの系を検出に用いた。ブロットを、望ましい強度が達成されるまでFuji X線フィルムに暴露し、バンドを、Image Jを使用するデンシトメトリー（NIH）によって定量した。
【００７７】
GFP発現細胞の定量
293T細胞にセグメント1-GFP RNA発現プラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びにDI RNA （1/244、2/265及び3/262）又は全長RNA（セグメント4又は6）を発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、培養物をGFP発現について試験した。位相差及び落射蛍光顕微鏡によって、細胞単層のデジタル画像を得た。GFPを発現する可視化エリアの部分について、HCイメージソフトウェア（Hamamatsu）を用いて5つの視野の蛍光画像を無作為に選択及び分析した。可視化によって、様々なレベルのレポータープラスミドを遺伝子導入され得た細胞を含む、ある範囲のGFPレベルを発現する細胞を検出する。単層ごとにGFP陽性エリアの割合を得るために、平均値を計算した。
【００７８】
結果
1/244 DI RNAは、セグメント1のパッケージングに干渉する
1/244 DI RNAが存在する唯一のDI RNAであったインフルエンザウイルス調製物を作製するために、本発明者はプラスミドレスキューシステムを用いた（Dimmock et al. 2008）。セグメント1からのDI RNA 1/244の誘導を、図1に示す。これを、感染細胞及び共培養の1〜3日後の精製されたウイルス粒子におけるセグメント1、2及び7のvRNAのレベルに対する増加量の1/244 DI DNAの効果を調べるために用いた。以前に、全てのウイルスRNAポリメラーゼ成分が存在する場合にのみインフルエンザvRNAが検出可能であることが示されており、これはvRNAがウイルスポリメラーゼによって作製されることを示している（Duhaut and Dimmock 2002）。1/244 DI RNA（395 nt）は、1/244プラスミドを遺伝子導入した培養物においてのみ観察され、実験中他のセグメント1 DI RNA配列が生成されなかったことを確認している（図2a）。遺伝子導入における1/244 DIプラスミドDNAの量が増加するにしたがって、試験した3日間のそれぞれで細胞において検出されるセグメント7 vRNAのレベルの漸減が認められた。3日間のそれぞれで増加する1/244プラスミドと共に観察されたウイルス感染力価の低下により、1/244 DI RNA媒介干渉が起こっていたことを確認した（図2b）。1/244 DIプラスミドの入力が増加するにしたがって、ウイルス粒子中のセグメント1 vRNAのレベルは劇的に低下し、1 μgの1/244プラスミドが遺伝子導入された場合検出不可能であった（図2a、下部パネル）。定量により、1/244 RNAの存在下で、セグメント1：セグメント7 vRNAの比が、細胞抽出物におけるものよりもビリオンにおいてかなり低かったことが示された。これは、（セグメント1に由来する）1/244 DI RNAが、少なくとも部分的に、後代ウイルス粒子からの全長セグメント1 vRNAを選択的に排除することによって作用することを証明した。ビリオンのセグメント2 vRNAの量は、増加量の遺伝子導入1/244プラスミドの存在下で低減されず（図2c、d）、これにより1/244 RNAによるセグメント1のパッケージングの阻害が特異的であることが確認され、他のポリメラーゼ成分にコードされるRNAセグメントには拡張されなかった。
【００７９】
セグメント1、2又は3 DI RNAは、セグメント1からの遺伝子発現を阻害する
DI RNAの、RNAパッケージング由来のウイルスRNA合成への潜在的な影響を分けるために、本発明者は、GFPコードネガティブセンス標的RNA（セグメント 1-GFP；図1）の転写及び複製が、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドの共遺伝子導入によって可能となったGFP発現アッセイを考案した。このシステムは、重要な構造タンパク質（HA、NA、M1及びM2）をコードするプラスミドが除かれたため、ウイルスRNA合成を可能とするが、ウイルス粒子形成を可能としない。共遺伝子導入したDI RNAをコードするプラスミドの効果を、GFP蛍光をモニターすることによって評価した。PB2タンパク質をコードするプラスミドの非存在下では、GFP発現は全く検出されなかった（データ示さず）。図3aは、1 μgの空ベクターを遺伝子導入した培養物に比べて、1/244 DIプラスミドが、用量依存的に蛍光を強く阻害したことを示す。阻害は、細胞に全長セグメント4又はセグメント6 vRNAを合成するプラスミドを遺伝子導入した場合、あまり顕著でなかった。定量により、0.1 μgの1/244 DIプラスミドがGFP蛍光を70%阻害した一方、同様の阻害レベル（61〜69%）を達成するために約10倍より多いセグメント6プラスミドが必要であったことが示された（図3b）。統計分析は、1/244 DI RNAの阻害効果が、セグメント6 RNAの効果に対して高度に有意に異なることを示した（図3b）。したがって、1/244 DI RNAは、セグメント1標的RNAからの発現を強く阻害する。さらに、アッセイは、セグメント2由来のDI RNA（2/265）及びセグメント3由来のDI RNA（3/262）（3/262）もまたセグメント1由来標的からのGFP蛍光を強く阻害した一方で、全長セグメント4 vRNAが、セグメント6 vRNAと同様に、弱い阻害性のみであったことを示した（図3a）。用いたプラスミドDNAの最も高い濃度で（1 μg）、セグメント4 vRNAは、セグメント1由来遺伝子発現を対照レベルの75%まで低減させ、2/265及び3/262 DI RNAは、それぞれ対照の2%及び6%まで発現を低減させた。
【００８０】
1/244 DI RNAは、ゲノムセグメント6ではなく、セグメント1、2及び3からのポジティブセンスRNA合成を差次的に阻害する
セグメント1-GFP PolIプラスミドからのGFPの発現は、ネガティブセンスv RNAのmRNAへの転写に依存する。しかしながら、vRNAはまた、次にさらなるvRNAの生産のための鋳型として作用するcRNAの鋳型でもある。インフルエンザウイルスmRNAは、宿主mRNAから切断された約12ntの5'伸長を有するため（Palese and Shaw 2007）、mRNA及びcRNA産物はサイズによって識別され得る。vRNA、mRNA及びcRNAのレベルを検出するプライマー伸長アッセイを用いて、本発明者は、1/244 DI RNAが干渉する標的RNA合成のステージを同定した（図4a、c）。遺伝子導入されたプラスミドDNAから直接合成されたvRNAの基礎レベルは、図4のパネルb及びdに示されるデータにおいて提示される値から差し引いた。まとめると、図3及び4のデータは、増加量のDI RNAの存在下でのセグメント1-GFPコードmRNAのレベルの低減が、GFP蛍光の低減と強く正に相関していたことを示し（R2 = 0.90；データ示さず）、これにより蛍光がmRNA合成の正確なマーカーであることを確認した。これらのデータの定量により、mRNA及びcRNAのレベルが、0.1 μg〜0.5 μgの1/244プラスミドDNAの存在下でvRNAよりかなり大きく影響されたことが示された（図4b）。0.1 μgの1/244プラスミドDNAの添加は、対照の13%及び10%までmRNA及びcRNAのレベルをそれぞれ低減した一方、vRNAのレベルは61%までしか低減されなかった。しかしながら、1 μgの1/244 DI RNAでは、セグメント1から合成される全ての新規なRNAのレベルが>99%低減された。したがって、1/244 DI RNAは、セグメント1標的から合成される全てのRNAに顕著な効果を有するが、ポジティブ鎖及びネガティブ鎖RNAのレベルに差次的に影響を与える。
【００８１】
阻害RNAの作用の特異性を制御するため、本発明者はDI RNAプラスミドの代わりに（NA遺伝子をコードする）セグメント6プラスミドを遺伝子導入した。図4c及び4dは、セグメント6 RNAが、1/244RNAよりも、セグメント1標的によるmRNA、cRNA及びvRNAの阻害について有効でないことを示している。これは、セグメント6 RNAによって達成されるより低いレベルの蛍光阻害とも一致する（図3a）。したがって、1/244 DI RNAは、mRNA、cRNA及びvRNAを特異的に低減したが、セグメント6はそうではなかった。
【００８２】
標的RNAが、RNA合成及び蓄積のDI RNA媒介阻害の特異性にどのように影響を与えるかを決定するために、本発明者はセグメント6を標的として用いた。図5aは、セグメント6によるmRNA生産が、遺伝子導入した1/244 DIの最高量でさえも1/244 DI RNAによって影響されなかったのに対し、cRNA及びvRNAレベルが低減されたことを示す。3回の別々のアッセイの定量により、0.5 μgの1/244 DI RNAが、対照値に対してセグメント6コードvRNAを23%まで、cRNAを32%まで低減したことが示された（図5b）。
【００８３】
上記データは、セグメント1由来1/244 DI RNAが、ゲノムセグメント1及びセグメント6から生産されるRNAのレベルに、差次的に影響を与えたことを示している。セグメント1-GFPによるGFP発現とDI RNA 2/265 又は3/262間の交差セグメント干渉も存在したため（図3a）、本発明者は、セグメント2及び3から転写されるRNAレベルに対する1/244 DI RNAの効果も調べた。細胞に異なる量の1/244 DIプラスミドDNA、ウイルスポリメラーゼ及びNPタンパク質をコードするヘルパープラスミド、及び全長セグメント2又はセグメント3 vRNAのいずれかの合成に関するプラスミドを遺伝子導入した。図6（a）及び（c）は、1/244 DI RNAがセグメント2又は3によって合成された3つのRNAの全てのレベルを低減させたことを示す。セグメント2由来RNAの阻害は、セグメント6標的RNA（図5a）よりもセグメント1標的（図4a）において見られたものとよく似ていた。セグメント2のcRNA及びmRNAレベルにおいて、vRNAレベルよりも大きな低減が認められた。しかしながら、対照の13%までセグメント2 mRNAレベルを低減するためには、セグメント1標的RNAで必要であったものの4倍より多い1/244プラスミドDNAが必要であった。セグメント3標的よりも顕著でないmRNA、cRNA及びvRNAレベルの低減が認められた。データは、1/244 DI RNAがセグメント1、2及び3から合成されるmRNAのレベルを低減することを明確に示している。
【００８４】
1/244 DI RNAは、自身のネガティブセンスvRNAの合成を阻害するが、自身のポジティブセンスRNAを阻害しない
1/244 DI RNAのセグメント1コードRNAのレベルを差次的に低減する能力を考慮して、本発明者は同じシステムにおける1/244 DI RNAから合成されるポジティブ及びネガティブセンスRNAのレベルもまた影響を受けたかを調べた。これらのRNAを分析するために用いたゲルは、共移動するcRNA及びmRNAを分離することはできなかった。図7（a）及び（b）は、セグメント1-GFP標的の存在下で、遺伝子導入した1/244DIプラスミドの量が増加するにつれて、1/244 DIポジティブセンスRNAレベルが増加したことを示す。したがって、セグメント1-GFP mRNA及びcRNAレベルが最小となるサンプルの最大値があった（図4a、b）。これは、1/244 DI RNAがインフルエンザポリメラーゼ依存性転写の全てを阻害しないことを明確に示している。しかしながら、1/244 DI特異的vRNAのレベルは、0.1 μgの1/244プラスミドDNAで再現よく最大であり、0.5 μgのプラスミドで最大値の13%まで、1 μgのプラスミドで4%まで低減され（図7b）、これは高濃度の1/244 DI RNAが自身の新規生産vRNAのレベルを低減することを示している。1/244プラスミドDNAが、任意の標的RNAの非存在下で細胞において力価測定された場合、得られる1/244ポジティブセンスRNA及びvRNAのレベルは、セグメント1標的RNAの存在下におけるものと同様であった（図7c、d）。
【００８５】
考察
DIインフルエンザウイルスを研究するのに費やされた多くの年月にもかかわらず、in vitroでの干渉作用のメカニズム、及びin vivoでの疾患からの防御の理解は、未解明のままである。広く提唱されている仮説は、小さなサイズのDI RNAがより速い複製速度のために全長ゲノムを打ち負かすことを可能とし、DIゲノムを含むウイルス粒子の割合が、単純に感染細胞中に存在するDI及びインタクトなゲノムの相対的なレベルを反映しているというものである（Roux et al. 1991; Marriott and Dimmock 2010）。第二の仮説は、DI RNAが、ウイルス又は宿主因子の制限について競合する上で利点を有することである。しかしながら、一般的に、DIゲノムについてこれらの仮説のいずれかを指示する実験的証拠はあまりなく、インフルエンザDIウイルスについては全くない。より最近では、第三の仮説が、インフルエンザウイルスDI RNAが、ゲノムRNAをビリオンにパッケージングするレベルにおいて干渉することを示唆している（(Duhaut and McCauley 1996）。さらに、この根底には、異なるインフルエンザDI配列が、異なる生物学的特徴を有するという疑いがある（Duhaut 1998；Dimmock et al. 2008）。干渉プロセスを理解することは、DIゲノムに基づく新規な抗ウイルス剤（antiviral）の開発の新規なアプローチを提供する可能性を有し、以下の考察は、本報告において提示されたデータがどのようにDIインフルエンザウイルスの理解を進めたかを示すものである。
【００８６】
1/244 DI RNAは、コグネートセグメント1ビリオンRNAのパッケージングに干渉する
図2は、1/244 DI RNAが、そのコグネート全長セグメント1RNAの新生ビリオンへのパッケージングに特異的に干渉することを示している。したがって、1/244 DI RNAは、限界希釈継代によって濃縮された非クローン化ウイルス集団におけるセグメント1由来317 DI RNAについて（Duhaut and McCauley 1996）、又はクローン化された317 DIウイルスについて（Duhaut and Dimmock 2002）報告されたのと同様のセグメント特異的様式で作用する。これは、インフルエンザウイルスゲノムセグメントのパッケージングが、各ゲノムセグメントの単一コピーからなるアレイ又は複合体の形成を必要とすること、及びこれらのアレイが新たなウイルス粒子にパッケージングされる単一の構造として作用することを示す現在のモデルと一致する（Harris et al. 2006；Noda et al. 2006）。本発明者のデータは、コグネート全長ゲノムRNAとのパッケージングの競合が、全てのインフルエンザウイルスDI RNAの共通の特徴である可能性が高いことを示し、DI RNAの優先的なパッケージングが感染性ウイルスを犠牲にしてDIウイルス粒子の集団を濃縮することを示している。
【００８７】
1/244 DI RNAは、セグメント2及び3ウイルスRNAと共に、コグネートセグメント1の発現に干渉する
ウイルス粒子合成の非存在下における、直接的に、又はレポーター遺伝子の発現をモニターすることによって測定した、DIゲノムのセグメント1標的ゲノムRNAからのmRNA合成に対する効果の分析は、1/244 DI RNAが、セグメント1由来標的によって指示されるRNA合成に干渉したことを示す（図3a、b）。全長セグメント4（図3a）又はセグメント6 vRNA（図3a、b）によって媒介されるかなり弱いレベルの阻害によって、この効果がDI RNAに特異的であることが確認された。ゲノムセグメント4及び6を発現する増加レベルのプラスミドにより認められたDNA阻害は、遺伝子導入細胞におけるウイルスポリメラーゼ複合体などの制限因子について競合する高レベルのこれらのRNAによるものであり得る。したがって、インフルエンザDI RNAは、セグメント特異的パッケージング以外の、及びこれに加えたメカニズムによって干渉し得る。
【００８８】
DI RNAは、標的RNAによって発現される異なるRNAの定常状態レベルに差次的に影響を与え得る
ポジティブ（mRNA及びcRNA）及びネガティブセンス（vRNA）ウイルスRNAの合成は、一方又は他方の機能を消失する特異的な変異体の効果によって実証される様に、異なるプロセスであり（Jorba et al. 2009；Yuan et al. 2009）、本明細書で提示されるデータは、1/244 DI RNAが、その標的によって発現される異なるRNA産物の標準状態レベルに差次的に影響を与えることを示している。増加量の遺伝子導入1/244 DI RNAは、vRNAレベルにはあまり効果を有さず、全長セグメント1由来mRNA及びcRNAレベルの劇的な低減をもたらした；mRNA及びcRNAと同じレベルまでvRNAを低減するためには、4倍より多いプラスミドDNAが必要であった（図4a、b）。したがって、セグメント1由来1/244 DI RNAは、ネガティブセンスvRNAにはかなり低い効果を有し、コグネート標的から作製されるポジティブセンスRNAのレベルを特異的及び優先的に低減した。先の報告に由来するこの相違は、セグメント1由来317 DIウイルスがRNA合成を阻害しなかったということであるが、この研究は分子的にクローン化されたDIウイルスを用いなかった（Duhaut and McCauley 1996）。驚くべきことに、1/244 DI RNAはまた、セグメント2及び3からのmRNA合成を強く阻害し（図6）、これは（ウイルスRNAポリメラーゼの成分をコードする）ゲノムセグメント1〜3が、セグメント1 DI RNAの阻害作用を可能とする共通の特徴を有することを示唆している。これは、DI RNA 2/265及び3/262もまたセグメント1標的からのGFP発現を阻害したことから（図3a）、相互的であると思われる。これは、インフルエンザDI RNAが、その由来となったゲノムセグメント以外のゲノムセグメントからの遺伝子発現に劇的に影響を与え得ることの、初めての証明である。セグメント1からの標的mRNAのレベルを強く低減した1/244 DI RNAのレベルで、それ自身のポジティブセンスRNAレベルは最大であった（図7a、b）。したがって、用量依存的に、1/244 DI RNAは標的セグメント1 RNAからの合成を抑制しながら自身からの転写を優先的に可能とする。
【００８９】
図4及び7のデータは、DI RNAの濃縮の初めての証拠を提供する。遺伝子導入1/244 DNAの量が増加するにつれて、セグメント1標的RNAにより合成される3つのRNAの全ての比例的な低下が認められた一方、0.1 μgの1/244 DNAの遺伝子導入では、1/244 DI RNA鋳型から転写される全てのRNAが増加した（図7）。しかしながら、高レベルのプラスミドがDI vRNAの量の低減をもたらすため、状況は複雑である。この低減は、本発明者がまだ理解していない因子の特徴であると考えられる。DIプラスミドのインプット増加に伴って観察されたDI vRNAの低下は、DI cRNAを鋳型とし、したがってDI cRNAに依存するvRNAが少ないという3つのDI RNAの合成における不均衡があり得たことを示唆している。これは、DIウイルス系についてはこれまでに記載されていない自己制限現象であるようである。全体として、これらのデータは、全長レベルにおいて逆の関係を示し、DIウイルスが感染性ウイルスに対して優勢になるプロセスについての説明を提供し始めるものである。
【００９０】
1/244 DI RNAによるmRNAレベルの低減は、セグメント4又は6が標的として用いられた場合観察されず、これは1/244 DIが全てのゲノムセグメントには干渉せず、セグメント1、2及び3からのポジティブセンスRNAの合成に選択的に作用することを示している（図3a及び5a）。セグメント1、2及び3は、他のゲノムセグメントと比べて、vRNAに対しかなり低いレベルのmRNAの合成を指示する。さらに、セグメント1〜3のmRNAは、一次転写物よりも、新たに合成されたvRNAによって生産されることが示唆されている（Smith and Hay 1982; Hatada et al. 1989）。したがって、3つの最大ゲノムセグメントからの転写物は、他のセグメントからの転写物とは異なるようであり、本明細書に示されるデータは、セグメント1、2又は3由来のDI RNAがこれらの異なる転写プロセスに影響を与えることによって、3つのセグメント全てからの転写を抑制し得ることを示唆する。svRNA又はleRNAと呼ばれる多量の短いRNA分子が、インフルエンザ感染の間に生産され（Perez et al. 2010; Umbach et al. 2010）、これらは転写から複製への切り替えにおいて役割を果たし得る（Perez et al. 2010）。正しければ、これはDI RNAがsvRNAの生産のための鋳型としてはたらき得、次に複製産物vRNA、cRNA、及びmRNAの生産を調節し得る可能性を提起する。セグメント1、2及び3においてこれらの異なる合成プロセスに影響を与えるメカニズムは知られておらず、複製産物を調節する能力が全てのDI RNAに共通であるか、特定のDI RNAのみの特徴であるのか調べることは、興味深いであろう。これは、インフルエンザウイルスの感染中に多数のDI RNAが生産され得、その干渉有効性において異なることを意味し得る。さらなる調査が、インフルエンザゲノムセグメントの転写の差次的な調節への洞察をもたらすであろう。
【００９１】
1/244 DI RNAによる干渉のモデル
主要なオープンリーディングフレームのAUG開始コドンを維持するDI mRNAは、幾つかのセグメント1由来DI RNAについて示されているように（Akkina et al. 1984）、トランケートされたPB2ペプチドに翻訳される可能性を有し、PB1のPAタンパク質結合ドメインを含む同様の短いポリペプチドは、ウイルスRNAポリメラーゼ活性を強く阻害した（(Wunderlich et al. 2009; Manz et al. 2011）。したがって、原則として、1/244 DI RNAに由来するトランケートされたPB2関連ポリペプチドもまた、ウイルスポリメラーゼ活性に支配的な負の効果を発揮し得る。しかしながら、本発明者は、PB2のAUG開始コドン、及びPB2 ORFからの短いポリペプチドの合成を指示し得るさらに下流の2つのインフレームAUGコドンを変異させた1/244 DI RNAの形態を作製することによってこの可能性を除外した（Meng et al、論文投稿済）。本発明者は、この1/244 AUGノックアウトDI RNAが、効果において親1/244 DI RNAのものと区別不能であることを確かめた。それは1/244 DI RNAと同等のレベルのvRNA及びmRNAを生成し、1/244 DI RNAで認められたのと同様にセグメント1からのGFPの発現を阻害した。さらに、1/244 AUGノックアウトRNAを含むDIウイルスは、インフルエンザウイルスのチャレンジ後の疾患から、1/244 DIウイルスと同様にマウスを防御した。これらのデータは、1/244 DIの活性がもっぱらRNAに基づく現象であることを示す。
【００９２】
インフルエンザウイルスDI RNAのパッケージングプロセス中にそのコグネートゲノムセグメントにとって代わる能力は、ウイルス調製物におけるその増幅を説明する。しかしながら、上記データは細胞中の干渉メカニズムが、DI RNAのより長いコグネート全長RNAよりも早く増殖する能力に単に由来するという広く提唱された見解を排除するものである。むしろ、DI RNAは特異的にウイルスRNA合成を標的とする。本明細書で示したデータは、細胞中の1/244 DI RNA媒介干渉の一次的結果が、全長RNAセグメント1、2及び3によるRNA合成の標的化された阻害であること、及びセグメント2及び3に由来するDI RNAもまた全長セグメント1からのRNA合成を阻害することを示している。
【００９３】
実施例2−DI RNAによってコードされるタンパク質発現は、干渉に必要ではない
材料及び方法
リバースジェネティックスによるプラスミド及び感染性ウイルスの生産
A/WSN株及びA/WS/33の8つの遺伝子セグメントをコードするプラスミド、及びポリメラーゼ及びNPタンパク質を発現するプラスミド（Neumann et al. 1999）、並びにPolI プロモーターから1/244 DI RNAを発現するベクターは、以前に記載した（Dimmock et al. 2008；Duhaut and Dimmock 2002）。244 RNAは、395 ntであり、A/プエルトリコ/8/34（H1N1）のセグメント1に由来した。セグメント1標的、セグメント1-GFPは、PCRによってGFP OCRを増幅し、これを、GFP ORFがPB2 ORFとインフレームであるようにpPolI-220（Duhaut and Dimmock, 2000）に挿入することによって作製し、セグメント1-GFP RNAを発現するプラスミドseg 1-GFPを得た（Meng et al. 2012）。GFPレポーターは、セグメント1の正確な5'末端（220 nt）及び3'末端（48 nt）を維持している。ヒト293T細胞に、以前記載した通りにプラスミドを遺伝子導入した（Dimmock et al. 2008）。手短には、12ウェルプレート中の70%コンフルエントの293T細胞に、TransIT LT1トランスフェクション試薬（Mirus）を用いて、ウイルスセンスRNAをコードする8 PolI発現プラスミド、及びPB2、PB1、PA及びNPタンパク質の発現のためのcDNAプラスミドを、pPolI-244又はpPolI-244ノックアウトと共に又はなしで遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を、25 cm2フラスコでMDCK細胞と共培養する前に、37℃で一晩インキュベートした。最後に、組織培養液中のウイルスを、有胚鶏卵に一度継代し、ウイルスストックを生産するために尿膜液を回収した（Dimmock et al. 2008）。
【００９４】
有胚鶏卵で生産されたウイルスは、A/WSNビリオンタンパク質及び感染性ヘルパーA/WSNウイルスにパッケージされた244 DIウイルス又は244 AUGノックアウトDIウイルスの混合物である。これらを、スクロースを介する分画遠心分離により精製し、PBSに再懸濁した。ストックを、その赤血球凝集力価に応じて標準化し、液体窒素中で保存した。DIウイルスストックを、253.7 nmのUV照射の短いバースト（40秒）を用いてUV照射し（0.64 mW/cm2）、ヘルパーウイルスの感染性を除いた。これは「活性DIウイルス」である。UVの標的はウイルスRNAであるが、UVは、感染性ウイルスの13,600 ntに対して395 ntという小さな標的サイズのため、DI RNAには比較的あまり影響を有さない。より長いUV照射（8分）は、マウスに対する防御活性を不活性化するが、赤血球凝集素又はノイラミニダーゼの活性に影響を与えないため、244 DI ウイルス粒子のいずれかの免疫系刺激又は受容体阻害効果を制御する（「不活性化（inactivated）DIウイルス」）。244 AUGノックアウトDI A/WSNウイルスの収量及び精製におけるその挙動は、244 DI A/WSNと酷似していた（データ示さず）。
【００９５】
変異
部位特異的変異誘発の2つの連続的ステップを、244 DI RNAの3つの開始コドンを変異させるために行った。pPolI-244プラスミドを鋳型として、及びpfu DNAポリメラーゼ（Promega）を用いた最初のAUGをAUCに変換するための部位特異的変異誘発のために、一対のプライマーを用いた。変異をシーケンシングにより確認した。部位特異的変異誘発の第一ラウンドで生産された構築物を用いて、第二及び第三の開始コドンを変更するプライマーを用いて、部位特異的変異誘発の第二ラウンドを行った。得られた構築物を再びシーケンシングにより確認した。
【００９６】
ノーザンブロット分析
全細胞RNAを、Trizolを用いてDI感染細胞から単離した。ポリAを含むmRNAを、製造業者の指示に従って、GenElute Direct mRNA調製キット（Sigma）を用いて選択した。mRNA調製中にカラムに結合しなかった非ポリアデニル化RNAを保持した。全RNA、mRNA及び非ポリアデニル化RNAの一定量をギリオキサール−アガロースゲル電気泳動により分離した。電気泳動後、RNAを、20×SSCを用いて、一晩ハイボンドNメンブレン（Hybond-N membrane）（GE Healthcare）に移した。その後、膜を80℃で2時間乾燥させた。全長ネガティブセンスセグメント1プローブを、バクテリオファージT7プロモーターを含むPCR産物から、DIG-UTP（Roche）の存在下でin vitro転写により調製した。膜を、DIG標識プローブで一晩ハイブリダイズし、シグナルを、ジオキシゲニン特異的AP FAb抗体フラグメント及びCSPD基質（Roche）を用いて検出した。
【００９７】
プライマー伸長分析
全細胞RNAについてプライマー伸長分析を行った（Rehwinkel et al. 2010）。全RNA（2 μg）を13 μlの全容量で[32P]5'末端標識プライマー及びdNTPと混合した。混合物を65℃で5分間加熱し、1分間氷上に置いた。2×ファーストストランドバッファー、20 mM DTT、及び100 UのSuperScript III逆転写酵素（Invitrogen）を添加し、55℃でさらに1時間インキュベートした。反応を、ゲルローディングダイII（Ambion）と共に95℃で5分間加熱することによって終了させた。転写産物を、TBEバッファー中に7M尿素を含む6%（w/v）ポリアクリルアミドゲルで分離し、蛍光画像によって検出した。
【００９８】
GFPの阻害によって測定された干渉
293T細胞にセグメント1-GFP RNA発現プラスミド、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミド、並びに244 DI又は244 AUGノックアウトDI RNAを発現する追加の増加量のPolIプラスミドを遺伝子導入した。遺伝子導入2日後、培養物をGFP発現について試験した。位相差及び落射蛍光顕微鏡によって、細胞単層のデジタル画像を得た。GFPを発現する可視化エリアの部分について、HCイメージソフトウェア（Hamamatsu）を用いて5つの視野の蛍光画像を無作為に選択及び分析した。可視化によって、様々なレベルのレポータープラスミドを遺伝子導入され得た細胞を含む、ある範囲のGFPレベルを発現する細胞を検出する。単層ごとにGFP陽性エリアの割合を得るために、平均値を計算した。
【００９９】
DIウイルスによるインフルエンザからのマウスの防御
DIウイルスにより提供される防御の程度を評価するため、C3H/He-mgマウスに、A/WSN単独（10 LD50又は1000 ffu）、A/WSN＋活性DIウイルス、又はA/WSN＋不活性化DIウイルスの混合物を、エーテル麻酔（light ether anaesthesia）下で鼻腔内接種した。次に、マウスを、本発明者の標準的なプロトコルに従って臨床疾患について、及び以前記載した通りに体重減少についてモニターした（Dimmock et al. 2008）。感染の3週間後に、生存マウスに、高用量のA/WSN（10,000 LD50）をチャレンジし、その免疫状態を決定した。
【０１００】
結果
244 DI RNAのコードポテンシャル
395ヌクレオチドの分子の244 DI RNAは、PR8のセグメント1から、ポジティブセンスRNAの3'末端の244ヌクレオチド及び5'末端の151ヌクレオチドを残す一以上の欠失イベントのの結果として生じた（Dimmock et al. 2008）。244 RNAは、mRNAの転写を指示するゲノムセグメントの末端のシグナルを維持する（図1a）。複製中、インフルエンザウイルスは、二つの形態のポジティブセンスRNAを作製する。複製は、感染性ウイルスのゲノムvRNAのポジティブセンス（cRNA）コピーの合成を含み、これが続いて新たなvRNAの合成の鋳型として用いられる（Palese and Shaw, 2007）。インフルエンザウイルスmRNA合成は、インフルエンザウイルスmRNA合成は、宿主mRNAのキャップされた5'末端から切断されたプライマーを用いて開始され、その合成は、ポリアデニル化の前に、鋳型vRNAの末端の前で終わる（Dias et al. 2009；Fechter et al. 2003；Guilligay et al. 2008；Plotch et al. 1981）。したがって、mRNAは、primerに由来する5'伸長を有し、トランケートされ、3'末端がポリアデニル化されている点でポジティブセンス複製中間体であるcRNAとは異なる。244 DI RNAがmRNAの合成を指示し得ることを確かめるために、244 DIウイルスを感染させた細胞に存在するRNAを調べた。ポジティブセンスRNAを検出する、セグメント1特異的プローブを用いるノーザンブロット分析により、感染細胞中に二つのポリアデニル化ウイルスmRNAを同定した（図2a）。約2.3 kbのより大きなmRNAは、ヘルパーウイルスによって提供される全長ゲノムセグメント1由来のmRNAと一致する。約500塩基のより小さなmRNAは、244 DI RNAがmRNAの合成を指示することを示す。非ポリアデニル化RNA画分で見られたポジティブセンスRNAはcRNAであり、予測される通り、これは244 DI由来mRNAよりもわずかに小さいように見られた。244 DI RNAによって転写されるmRNAは、PB2オープンリーディングフレーム1（ORF-1）の転写開始コドンを含み、これは欠失の結果として作製される異なるリーディングフレームから翻訳される21アミノ酸残基に融合されるPB2の最初の41アミノ酸残基を含むタンパク質をコードする能力を244 DI RNAに与え、全長62残基のタンパク質が作製される（図9b）。この予測タンパク質は、残基1〜35の全PB1結合ドメイン（Sugiyama et al. 2009）及び残基1〜22のミトコンドリア局在ドメインを含む（Carr et al. 2006）。PB2 ORFは、3つの考えられるAUG開始コドンを有する。第一のAUG（PB2の真正の開始コドン）の配列文脈は非常に良いが、第二及び第三は不十分である。しかしながら、翻訳開始が起こらないことを確実にするために、本発明者は3つの考えられる開始コドンの全てを（AUCに）変異させ；その後その配列を確認した。新たなRNAは、244 AUGノックアウトDI RNAとして知られる。
【０１０１】
244 AUGノックアウトDI RNA及び244 DI RNAは、細胞培養においてセグメント1 RNAの発現に同程度干渉する
PB2、PB1、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドと一緒に、244 DI RNA又は244 AUGノックアウトDI RNAのいずれかをコードするプラスミドを293T細胞に遺伝子導入した2日後に、RNAを回収した。プライマー伸長分析は、同程度の量のmRNA及びvRNAが、244及び244 AUGノックアウトDI RNAにより合成されたことを示し、これにより転写が244 AUGノックアウトDI RNAにおける変異によって影響されなかったことを確認した（図10b）。
【０１０２】
244 AUGノックアウトRNAの干渉能力を調べるために、本発明者は、PB2コーディング領域の大部分がGFPに置換されたセグメント1 RNA（セグメント1-GFP）の転写及び複製が、PB1、PB2、PA及びNPタンパク質を発現するプラスミドの293T細胞への共遺伝子導入によって可能となったGFP発現アッセイを用いた。このシステムは、重要な構造タンパク質（HA、NA、M1及びM2）をコードするプラスミドが含まれないため、ウイルスRNA合成を可能とするが、ウイルス粒子形成を可能としない。共遺伝子導入したDI RNAをコードするプラスミドの効果を、GFP蛍光をモニターすることによって評価した。図11aではいずれかのDI RNAの非存在下での、様々な量の244プラスミド又は244 AUGノックアウトプラスミドを遺伝子導入した培養物と、陽性対照培養物における蛍光発現を比較する。これは、両方のプラスミドが蛍光を用量依存的に強く阻害したことを示し、例えば0.5 μgの244プラスミド又は244 AUGノックアウトプラスミドは、いずれも90%より強くGFP蛍光を阻害した。
【０１０３】
244 AUGノックアウトDIウイルスは致死的なインフルエンザAウイルスからマウスを防御する
本発明者は、チャレンジウイルスとしてA/WSNを用いる本発明者のC3H/He-mgマウスモデル（Dimmock et al. 2008）において244 DI及び244 AUGノックアウトDI RNAの防御活性を比較した。マウスに、A/WSN単独、又はA/WSN＋244 DIウイルス、又はA/WSN＋244 AUGノックアウトDIウイルスを、エーテル麻酔（light ether anaesthesia）下で鼻腔内接種した。他の感染グループには、DI防御活性を破壊し、DIウイルス接種のあらゆる非特異的効果を制御するために8分間UV照射を行ったDIウイルスを供した。マウスを、臨床疾患及び体重減少についてモニターした。図12a、bは、ウイルス感染対照マウスは、全て実質的な体重減少を伴う深刻な病気になり、淘汰されるべきであったことを示す。対照的に、244 DIウイルス又は244 AUGノックアウトDIウイルスで処置したいずれのマウスも、いかなる臨床疾患のサインも発症しなかった。244 DIウイルス及び244 AUGノックアウトDIウイルスで処置したマウスは、両方とも体重の一過的な減少を示した（図12b）。体重減少は、疾患のより敏感な基準であり、いずれかの臨床疾患の非存在下でこの範囲のばらつきが見られることはまれである。以前のデータから予測される通り（Dimmock et al. 2008）、UV不活性化DIウイルスで処置したマウスは防御されなかった。本発明者は、これまでに、感染性ウイルスと同時に244 DIウイルスで処置した動物が、さらなるDIウイルスによる処置の非存在下で高用量の同じウイルスの後のチャレンジ後の疾患を防ぐ防御免疫を生じさせることを示している（Dimmock et al. 2008）。244ノックアウトDIウイルスで処置した動物は、高用量のA/WSNによるさらなるチャレンジに対し十分に免疫的であり、それらが臨床疾患のいかなるサインも発症しないにも関わらず、感染していたことを示す（図12c、d）。
【０１０４】
考察
DIインフルエンザウイルスは60年以上もの間知られていたが、そのin vitroでの干渉活性又はin vivoでの防御活性が機能する分子メカニズムについては、あまり示唆がなかった。最初、天然のDIウイルス調製物が多様な欠陥RNA配列を含み、したがって個々のDI配列の生物学的特徴が解析できなかったため、この課題は解決できなかった。しかしながら、リバースジェネティクスを用いて作製されたクローン化されたウイルスの使用により、本発明者がこの課題を解決することが可能となった。本発明者の最近の研究は、ゲノムセグメント1に由来する244 DI RNAが、3つの方法、すなわち：コグネート全長セグメントとのパッケージングの競合、ポリメラーゼコード全長ウイルスRNAセグメント1、2及び3の合成及び／又は蓄積への干渉、並びにin vivoでのI型インターフェロンの刺激、によって干渉することを示している。本明細書では、本発明者は、インフルエンザ 244 DI RNAがポリアデニル化mRNAの合成を指示することを示した（図10a）。mRNAは、全てのインフルエンザウイルスmRNAについて予期された通り、ポジティブセンスcRNAより大きく、これはDI RNAが転写の鋳型であることを示している。したがって、244 DI RNAから生産されるmRNAは、5'キャップ及びポリAテイルを含み、タンパク質への翻訳に潜在的に利用可能である。244 DI RNAの配列は、DI mRNAがPB2のアミノ末端41アミノ酸残基を共有するタンパク質に翻訳され得ることを予測する。PB2のこの領域は、ポリメラーゼ複合体のPB1タンパク質に結合することが示されており、宿主細胞ミトコンドリアにも局在する（Carr et al. 2006；Sugiyama et al. 2009）。
【０１０５】
PB2 ORFの3つのインフレームAUG翻訳開始コドンの全てがAUCに変換され、したがってPB2関連タンパク質を発現することができない変異244 DI RNAは、元の244 DI RNAの性質を維持していた。244 AUGノックアウトDI RNAは、244 DI RNAで認められたのと同程度にin vitroでインフルエンザウイルスセグメント1からの遺伝子発現に干渉することができた（図10b及び図11）。最も重要なことに、244 AUGノックアウトDI RNAは、致死的用量のインフルエンザウイルスの投与後の疾患からマウスを防御する能力を維持していた（図12）。したがって、本変異は、244 DI RNAによるin vitroでの干渉及びin vivoでの防御に全く影響がなかった。
【０１０６】
本発明者は、インフルエンザウイルス疾患に対するin vitroでの干渉及びin vivoでの防御が、244 DI RNAによってコードされ、合成され得るトランケートされたPB2ペプチドによって媒介されないこと、したがってこれらのプロセスがDI RNA分子自身によって制御されることを結論付けた。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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