(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料から標的細胞を富化するための方法であって：
ａ）前記試料を、細胞凝集剤、および第一の抗原認識部に結合された０．１ｐｇ〜５０００ｐｇの鉄含量を有する第一の磁性粒子；および第二の抗原認識部に結合された０．０５ｆｇ〜１００ｆｇの鉄含量を有する第二の磁性粒子と接触させることで、混合物ａ）を得ること、
ｂ）第一の磁場勾配を前記混合物ａ）に付与することにより、前記第一の磁性粒子に結合された第一の抗原認識部に結合された細胞を除去して、混合物ｂ）を得て、前記細胞凝集剤に結合された混合物ａ）の細胞を含む凝集体を得ること、
ｃ）第二の磁場勾配を前記混合物ｂ）に付与することにより、第二の磁性粒子に結合された第二の抗原認識部に結合された細胞を静止させること、
ｄ）静止した細胞を第二の磁場勾配から標的細胞として回収すること、
を特徴とする前記方法。
【請求項２】
細胞凝集剤に結合された混合物ａ）の細胞を含む凝集体を、混合物ｂ）から分離することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第二の磁場勾配は、第一の磁場勾配よりも高いことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第一の磁性粒子は、１５％未満の直径のｃｖ値を有することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞凝集試薬は、フィブリノゲンおよび免疫グロブリンのようなタンパク質、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第一の磁性粒子は、複数の異なる第一の抗原認識部に結合されていることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第二の磁性粒子は、複数の異なる第二の抗原認識部に結合されていることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
第一の抗原認識部および／または第二の抗原認識部は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、抗ＩｇＥおよび抗ＴＣＲａｂの群から選択される抗原に対する抗体であることを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
細胞の試料は、全血、バフィコート、または末梢血の試料である、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第一の磁性粒子は、１μｍ〜５μｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第二の磁性粒子は、１０ｎｍ〜２５０ｎｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞凝集剤は、赤血球を凝集させることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞を試料から非標的細胞のディプリーションによって分離する方法であって、凝集させ、第一の磁気的な細胞ソーティングを行い、その後に第二の磁気的な細胞ソーティングステップによって標的細胞を富化することによって行う前記分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分離法は、科学研究所および臨床研究所において調査、診断または臨床的な用途のために一般に普及している。これらの方法のほとんどは、少量の細胞に限られているにすぎない。膨大な数の非標的細胞から細胞を分離するためには、磁気的な細胞ソーティングまたは密度勾配遠心法は確立された技術である。
【０００３】
特に興味深い分離手順は、全血からの細胞の分離、例えば全血からのＴ細胞の分離である。このために、赤血球を、標的細胞の単離または精製の前に取り除く必要がある。赤血球の排除は、例えば密度勾配遠心法、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料調製、赤血球溶解、または例えば多機能抗体、多糖類、ポリビニルピロリドンもしくはポリオキシエチレンによる凝集と引き続いての遠心分離による凝集によって行うことができる。標的細胞を単離する前に赤血球を取り除くことは、特許文献１（欧州特許出願公開第２５９７１５３（Ａ１）号明細書）に開示されている。
【０００４】
赤血球または更なる不所望な細胞の排除の後に、標的細胞の単離のために後続のプロセスステップを使用する必要がある。そのような方法は当該技術分野で長いこと知られており、例えば細胞表面抗原に対する親和性を有するモノクローナル抗体を用いるものであり、例えば特許文献２（米国特許第５８４０５０２号明細書）、特許文献３（米国特許第５６４８２２３号明細書）、特許文献４（米国特許第５６４６００４号明細書）、特許文献５（米国特許第５４７４６８７号明細書）、または特許文献６（米国特許第７３１６９３２号明細書）に開示されている。
【０００５】
多機能抗体またはポリマーの凝集剤としての使用は、例えば特許文献７（国際公開第００／７３７９４号パンフレット）または特許文献８（米国特許第７１６０７２３号明細書）に記載されている。開示された技術は、有核細胞および赤血球を含む試料と凝集剤とを接触させることと、凝集された赤血球細胞を遠心分離によって除去することと、更に前記有核細胞を所望の細胞を認識する抗体を使用して、例えば磁気的な細胞ソーティングによって精製することを含む。これらの方法は、時間のかかる面倒な遠心分離ステップを含む幾つかのプロセスステップの欠点を有する。
【０００６】
特許文献９（国際公開第２０１３／０７６０７０号パンフレット）は、複数の非標的細胞を、凝集および磁気的な細胞ソーティングによってディプリーションすることで、ディプリーションカクテルにより影響が及ぼされない細胞の懸濁液を得ることを教示している。該方法で得られた細胞は「手つかず（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）」である一方で、ただ負の選択が行われているにすぎないため、純度はかなり低い。特許文献９（国際公開第２０１３／０７６０７０号パンフレット）によっては標的細胞の特異的で純粋なサブポピュレーションを得ることはできない。磁気的な細胞ソーティングを利用する類似の方法は、特許文献１０（国際公開第０１／１７６８７（Ａ１）号パンフレット）および特許文献１１（国際公開第９６／３１７７６（Ａ１）号パンフレット）に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２５９７１５３（Ａ１）号明細書
【特許文献２】米国特許第５８４０５０２号明細書
【特許文献３】米国特許第５６４８２２３号明細書
【特許文献４】米国特許第５６４６００４号明細書
【特許文献５】米国特許第５４７４６８７号明細書
【特許文献６】米国特許第７３１６９３２号明細書
【特許文献７】国際公開第００／７３７９４号パンフレット
【特許文献８】米国特許第７１６０７２３号明細書
【特許文献９】国際公開第２０１３／０７６０７０号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０１／１７６８７（Ａ１）号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９６／３１７７６（Ａ１）号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、全血のような生物学的試料から、不所望な細胞を除去し、特定の標的細胞を分離するための迅速かつ簡単な方法を提供することであった。
【０００９】
驚くべきことに、試料を１ステップでインキュベートし、引き続き磁気的に分離するステップを行うことによって、異なる直径を有する磁性粒子を利用することにより中間的後処理を行うことなく標的細胞を富化することができることが判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の主題は、細胞試料から標的細胞を富化するための方法であって、少なくとも以下のステップ：
ａ）前記試料を、細胞凝集剤、および第一の抗原認識部に結合された０．１ｐｇ〜５０００ｐｇの鉄含量を有する第一の磁性粒子；および第二の抗原認識部に結合された０．０５ｆｇ〜１００ｆｇの鉄含量を有する第二の磁性粒子と接触させることで、混合物ａ）を得るステップ、
ｂ）第一の磁場勾配を前記混合物ａ）に付与することにより、前記第一の磁性粒子に結合された第一の抗原認識部に結合された細胞を除去して、混合物ｂ）を得て、前記細胞凝集剤に結合された混合物ａ）の細胞を含む凝集体を得るステップ、
ｃ）第二の磁場勾配を前記混合物ｂ）に付与することにより、第二の磁性粒子に結合された第二の抗原認識部に結合された細胞を静止させるステップ、
ｄ）静止した細胞を第二の磁場勾配から標的細胞として回収するステップ、
を特徴とする前記方法である。
【００１１】
本発明の一つの別形において、細胞凝集剤に結合された混合物ａ）の細胞を含む凝集体と、第一の磁性粒子に結合された第一の抗原認識部に結合された細胞とは、第一の磁場勾配に起因して、混合物ｂ）から分離される。
【００１２】
言い換えると、混合物ｂ）は、細胞凝集剤および／または第一の抗原認識部／第一の磁性粒子に結合されなかった細胞の懸濁液からなる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の方法を概略的に示している。
【図２】図２は、本発明の方法による制御性Ｔ細胞の富化を示している。
【図３】図３は、本発明の方法による造血幹細胞（ＨＳＣ）の富化を示している。
【図４】図４は、本発明によるものではない制御性Ｔ細胞の富化を示している。
【図５】図５は、本発明によるものではないＣＤ８陽性ＮＫ細胞の富化の結果を示している。
【図６】図６は、本発明の方法によるＣＤ８陽性ＮＫ細胞の富化の結果を示している。
【００１４】
詳細な説明
混合物ｂ）は、細胞凝集剤に結合された混合物ａ）の細胞を含む凝集体から、例えば濾過、沈降、および／または遠心分離によって分離されうる。
【００１５】
沈降は、１×ｇでの重力沈降を意味し、それは、加工されるべき試料を含む容器が何もされない状態、すなわち揺動または遠心分離がされない状態におかれることで起こり、凝集された細胞は前記容器の底に沈降される。遠心分離は、例えば１×ｇ〜２０×ｇで行われる。もう一つの実施形態においては、混合物ａ）は、適切なメッシュサイズを有するフィルタシステムに導通される。好ましくは、前記凝集体は、第一の抗原認識部／第一の磁性粒子に結合された細胞が除去されると同時に、第一の磁場勾配中で沈降物として沈降され、上清が混合物ｂ）として得られる。
【００１６】
用語「抗原認識部」は、細胞内または細胞外で発現された抗原に対する、任意の種類の抗体またはフラグメント化抗体を指す。前記用語は、完全にインタクトな抗体またはフラグメント化抗体誘導体、例えばＦａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａ’ｂ）２、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、ジｓｃＦｖに関連し、それらは、前記の種類の分子を含む共有結合および非共有結合の接合体を含めて組み換え法によって合成されている。
【００１７】
図１は、以下のプロセスステップを有する本発明の方法を概略的に示している：
（ａ）異種起源の細胞試料を、ｉ）赤血球凝集剤、ｉｉ）第一のタイプの抗原認識部に結合された第一のタイプの磁性粒子（小粒子）、およびｉｉｉ）第二のタイプの抗原認識部に結合された第二のタイプの磁性粒子（大粒子）と一緒にインキュベートすることを示している。
（ｂ）混合物ａ）を第一の磁場勾配にさらすことで、第一のタイプの磁性粒子に結合された第一の抗原認識部に結合された細胞が除去される。同時に、細胞凝集剤に結合された細胞は、不要な細胞の沈降物を形成する。上清を回収することで、混合物ｂ）が得られる。
（ｃ）混合物ｂ）を、ＭＡＣＳセパレーター中にＭＡＣＳ（登録商標）カラムを設置することによって第二の磁場勾配にさらすことで、第二のタイプの磁性粒子に結合された第二のタイプの抗原認識部に結合された標的細胞を静止させる。
（ｄ）前記第二の磁場勾配から、静止した標的細胞を回収する。
【００１８】
本発明は、磁気源、例えば永久磁石または電磁石によって発生された磁場勾配を利用する。本発明の範囲内では、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ（ドイツ）により市販されているＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓセパレーター、ＭＡＣＳｉＭＡＧセパレーター、またはＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーターのような、いかなるタイプおよび形態の磁石も使用できる。
【００１９】
用語「磁性粒子」は、強磁性、超常磁性、または常磁性の固相、例えばコロイド粒子、微小球、ナノ粒子、またはビーズを指す。それらの粒子は、懸濁液、または凍結乾燥状態で使用することができる。
【００２０】
磁性粒子の磁化は、前記粒子内にある、マグネタイトまたはマグヘマイトのような鉄酸化物の形で化学的に存在する鉄の含量に左右される。鉄含量における１０００倍以上の差は、低い磁場勾配によって、高い鉄含量を有する第一の磁性粒子を、高い磁場勾配によってしか影響を受けない低い鉄含量を有する第二の磁性粒子から分離することを可能にする。
【００２１】
第一の磁性粒子は、粒子当たりに、有利には０．５ｐｇ〜５００ｐｇの、より有利には１ｐｇ〜５０ｐｇの鉄を含有する。第一の磁性粒子としては、ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を使用できる。前記粒子は、例えばＭＡＣＳｉＭＡＧセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のように通常の磁石によって保留できる。例として、ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子は、直径３．５μｍを有し、３％（ｗ／ｗ）から１０％（ｗ／ｗ）の間の鉄を乾燥質量で含有する。
【００２２】
第二の磁性粒子は、粒子当たりに、有利には０．１ｆｇ〜５０ｆｇの、より有利には０．１ｆｇ〜１０ｆｇの鉄を含有する。第二の磁性粒子としては、ＭｉｃｒｏＢｅａｄ粒子を使用できる。前記粒子は、例えばＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手できるＬＳカラムと組み合わせたＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーターのように通常の磁石によって磁気的分離カラムと組み合わせて保留させることができる。使用される前記ＭｉｃｒｏＢｅａｄ粒子は、５０ｎｍ〜１００ｎｍの粒径を有してよく、該粒子は３０％（ｗ／ｗ）から６０％（ｗ／ｗ）の間の鉄を乾燥質量で含有する。
【００２３】
本発明において使用される第一の磁性粒子と第二の磁性粒子は、前記鉄含量に加えて、または前記鉄含量に代えて、直径によって特徴付けることができる。第一の磁性粒子は、１μｍ〜５μｍの、好ましくは２．５μｍ〜３．５μｍの平均直径を示す。本発明の好ましい一実施形態においては、第一の磁性粒子の寸法は、できる限り単分散性であるべきであり、例えば１５％未満の、好ましくは１０％未満の直径のｃｖ値を有する。第二の磁性粒子は、１０ｎｍ〜２５０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜１５０ｎｍの平均直径を有してよく、例えば６０％未満の、好ましくは３０％未満の直径のｃｖ値を有する。
【００２４】
用語「細胞試料」は、種々の表現型またはサブポピュレーションを種々の量で有する細胞の懸濁液または混合物、例えば全血、末梢血、白血球搬出、バフィコート、臍帯血、および骨髄中によくある細胞の懸濁液または混合物を指す。そのような細胞試料は、例えば赤血球、血小板、および白血球、例えばＴ細胞、制御性Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、および／または造血幹細胞を含む。
【００２５】
用語「細胞凝集剤」は、例えば細胞試料内にある赤血球の細胞凝集を惹起する、当該技術分野で公知の任意の化合物を指す。例えば、赤血球は、全血からある特定の試薬によって凝集されて沈殿物を形成し、こうして上清を除去可能にする。例えば、全血と細胞凝集剤の接触により、赤血球のおよび幾らかの血小板（platelet）、すなわち血小板（thrombocyte）の凝集物の形成が惹起され、こうしてこれらの不所望な細胞ポピュレーションの沈降がもたらされる。沈降プロセスは、更に第一の磁性粒子によって増強される。
【００２６】
本発明で使用される細胞凝集剤は、好ましくは、フィブリノゲンおよび免疫グロブリンのようなタンパク質、またはデキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）のようなヒドロキシル基含有ポリマーである。
【００２７】
本発明による方法においては、第二の磁場勾配は、第一の磁場勾配よりも高くてもよいか、さもなくば磁力が高められねばならない。これは、より高い第二の磁場を付与するか、または第一の磁性粒子よりも高い磁性材料の含量を有する第二の磁性粒子を使用するか、のいずれかによって達成できる。
【００２８】
第一の磁性勾配を付与することによって、第一の磁性粒子に結合された本質的に全ての細胞（すなわち８５％〜９９％）は磁石に保持され、一方で、相対的にかなり少ない第二の磁性粒子に結合された本質的に全ての細胞（すなわち８５％〜９９％）は、混合物ｂ）中に留まる。
【００２９】
第一の磁場勾配と第二の磁場勾配は、好ましくは、混合物ｂ）および混合物ｃ）を強磁性分離手段において第一の磁場と第二の磁場に供することによって付与される。そのような強磁性分離手段は、磁気的細胞分離の技術分野で公知であり、例えば粒子、メッシュ、不織布繊維のような磁性材料を詰めた管である。第二の磁場勾配を、第一の磁場勾配よりも高くなるように、同じ磁場において異なる強磁性分離手段を使用することによって調整することができる。
【００３０】
第一の磁性粒子および第二の磁性粒子は、非標的細胞と標的細胞のそれぞれにある少なくとも１つの抗原に結合する、少なくとも１種の抗原認識部に結合される。前記抗原認識部は、単一特異的、および／または多重特異的であってよい。好ましくは、第一の磁性粒子および／または第二の磁性粒子は、複数の異なる第一の抗原認識部に結合される。本発明において使用される磁性粒子は、１種以上の、例えば２、３、４、６、８、１０または１２種の異なる抗原認識部に結合させることができる。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、前記細胞凝集剤は、ＨＰＭＣ−１５であり、また、この粒子の特異性は、それぞれの抗原認識部によって定義付けられる。第一の抗原認識部および／または第二の抗原認識部は、例えばＣＤ１ｃ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１９３、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ３３５、ＣＤ３０４を含むある特定の細胞表面マーカーに対する抗体、抗Ｆｃ＿ε、抗Ｔ細胞受容体α／β、抗Ｔ細胞受容体γ／δ、抗ビオチン、抗ＩｇＥ、抗ＨＬＡ−ＤＲおよびそれらの組み合わせから選択されうる。
【００３２】
標的細胞の富化のための第二の磁性粒子としては、抗体が接合された粒子、例えば抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ３４抗体を有する粒子が使用される。従って、ステップｄ）において、これらの抗体に対する抗原を提示する細胞が標的細胞として回収されうる。
【００３３】
細胞凝集剤に結合された細胞と、第一の磁性粒子に結合された第一の抗原認識部に結合された細胞を除去した後に、第一の粒子を実質的に含まず、かつ望まれない殆どの細胞がディプリーションされた混合物または細胞懸濁液ｂ）が得られる。
【００３４】
ステップｃ）において、第二の磁場勾配は、こうして得られた混合物ｂ）に付与される。第一の磁場勾配とは異なり、第二の磁場勾配は、相対的にかなり少ない第二の磁性粒子に結合された細胞を保持し、それにより標的細胞と不所望の細胞とが分離される。
【００３５】
本発明の方法のステップｄ）は、好ましくは、例えば強磁性分離手段を磁場勾配から外して、バッファー溶液によって該強磁性分離手段から細胞を溶出させることによって、静止させられた細胞を除去することによって行われる。
【００３６】
本発明の更なる課題は、末梢血、臍帯血、および／または骨髄のような細胞試料から治療的に、診断的に、または科学的に有益な細胞を単離、富化、および／または回収するための組成物を提供することである。
【００３７】
本発明による組成物は、細胞凝集剤と、第一の抗原認識部に結合された１μｍ〜５μｍの平均直径を有する第一の磁性粒子と、第二の抗原認識部に結合された１０ｎｍ〜２５０ｎｍの平均直径を有する第二の磁性粒子とを含む。
【００３８】
挙げられる細胞分離成分は、キットとして提供するのに適している。それぞれのキットは、本明細書に記載される方法によって、所望の細胞を細胞含有試料から分離することを行うのに必要な成分を含んでいる。
【００３９】
該キットの必須成分は、本明細書に挙げられるような、細胞凝集試薬と、第一の磁性粒子および第二の磁性粒子である。該粒子は、キットにおいて、例えば液体中、バッファー中で、または凍結乾燥された形で利用可能であってよく、制御性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性ＮＫ細胞、および／または造血幹細胞の単離のために使用することができる。
【００４０】
磁性粒子（乾燥材料）の鉄含量の測定は、その鉄酸化物を、酸、例えばリン酸で分解し、そして溶解された鉄イオンを分析手段、例えば呈色する錯体の測光測定、例えば鉄試験用のＭｅｒｃｋ社製のＳｐｅｃｔｒｏｑｕａｎｔ試験キットを用いた測光測定によって定量化することによって行われる。ビーズ懸濁液の粒子計数は、粒子計数器またはノイバウエル計算板で顕微鏡により決定できる。同じビーズ懸濁液中の物質濃度は、定義された容量のビーズ懸濁液のビーズ材料を水中に移すことによって、洗浄し、前記水を乾燥により除去し、そして固体残分を秤量することによって測定することができる。粒子の鉄含量を計算することで、乾燥ビーズ材料の既知の物質濃度および前記乾燥されたビーズ材料の既知の鉄含量を用いてビーズ懸濁液の粒子計数を知ることができる。例えば、ＭＡＣＳｉＢｅａｄは、４４．５ｍｇ／ｍｌのビーズの乾燥質量を有し、１ｍｇ当たり１．３６×１０9個の粒子を有し、乾燥ビーズ材料中に４．６１％（ｗ／ｗ）の鉄含量を有し、該材料は１粒子当たりに１．５１ｐｇの鉄を含有する。
【００４１】
粒子計数は直接的に得ずに、球形と想定した単独の粒子の質量を計算し、ＤＬＳ測定によって得られた流体力学的径および２．５ｍｇ／ｍＬの粒子密度を用いて推定される（Ａａｒｏｎ  Ｂ．Ｋａｎｔｏｒ、Ｉａｎ  Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｓｔｅｆａｎ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、およびＪｕｅｒｇｅｎ  Ｓｃｈｍｉｔｚにより、「細胞分離法および応用（Ｃｅｌｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」，Ｄｉｅｔｈｅｒ  Ｒｅｃｋｔｅｎｗａｌｄ、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ編集，ニューヨーク，１９９８，第１５３頁〜第１７１頁において）。例えば、１００ｎｍの寸法、１０ｍｇ／ｍＬの乾燥質量、および乾燥ビーズ材料中に４０％（ｗ／ｗ）の鉄含量を有するＭｉｃｒｏＢｅａｄは、１粒子当たりに０．５３ｆｇの鉄を含有する。
【実施例】
【００４２】
異なるプロセスパラメータで磁性ビーズを製造することで、異なる寸法の粒子が得られた。粒径は、Ｂｅｃｋｍａｎ社製のＣｏｕｌｔｅｒ  Ｄｅｌｓａ  ＮａｎｏおよびＣｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｚ２機器によって特徴付けられた。実施例においては、第一の磁性粒子を「大磁性粒子」と呼び、それは３．５μｍの直径および１．５１ｐｇの鉄含量を有し、かつ第二の磁性粒子を「小磁性粒子」と呼び、それは０．３μｍの直径および１４．３ｆｇの鉄含量を有する（特に規定がない限り）。大磁性粒子は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨから、例えば「ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＭＡＣＳｉＢｅａｄ」として市販されている。小磁性粒子は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨから、例えば「ＣＤ２５  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ」として市販されている。
【００４３】
例１：  制御性Ｔ細胞の単離
大磁性粒子は、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７を認識する抗体に接合させた。小磁性粒子は、ＣＤ２５を認識する抗体に接合させた。抗体ビーズ接合体をヒト全血で滴定して、最適な濃度を決定した。
【００４４】
前記磁性ビーズ抗体接合体を、１５ｍＬのＨＰＭＣ（０．７５％のＨＰＭＣ１５ストック溶液）を含めて予め決められた量で混ぜてカクテルとした。そのカクテルを、３０ｍＬのヒト全血に加え、かき混ぜて、ＭＡＣＳｍｉｘ（商品名）チューブローテーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１０分にわたりインキュベートし、そしてＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１５分にわたり置いた。上清を直接的にＭＡＣＳ技術で、ＬＳカラムおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用することによって更に処理した。不要な細胞は該カラムを通過する。磁気的に標識された細胞は、該カラム中にブランジャーをしっかりと押し込むことによって流出されることになる。単離された制御性Ｔ細胞は、ＭＡＣＳｑｕａｎｔアナライザーフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）において蛍光色素が接合された抗体の組み合わせを使用して分析されることになる。
【００４５】
図２は、例１に従い、制御性Ｔ細胞は、４５分以内で非常に素早く富化することができ、本発明の標識を組み合わせる方策を用いて約９１％の純度を有することを示している。
【００４６】
例２：  造血幹細胞（ＨＳＣ）の単離
大磁性粒子は、ＣＤ６１を認識する抗体に接合させ、小磁性粒子は、ＣＤ３４を認識する抗体に接合させた。抗体ビーズ接合体をヒト全血で滴定して、最適な濃度を決定した。
【００４７】
前記磁性ビーズ抗体接合体を、４ｍＬのＨＰＭＣ（０．７５％のＨＰＭＣ１５ストック溶液）を含めて予め決められた量で混ぜてカクテルとした。そのカクテルを、８ｍＬのヒト全血に加え、かき混ぜて、ＭＡＣＳｍｉｘ（商品名）チューブローテーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１０分にわたりインキュベートし、そしてＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１５分にわたり置いた。上清を直接的にＭＡＣＳ技術で、ＬＳカラムおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用し、引き続き第二のＭＳカラムを使用することによって更に処理した。不要な細胞は該カラムを通過する。磁気的に標識された細胞は、該カラム中にブランジャーをしっかりと押し込むことによって流出される。単離されたＨＳＣは、ＭＡＣＳｑｕａｎｔアナライザーフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）において蛍光色素が接合された抗体の組み合わせを使用して分析されることになる。
【００４８】
図３は、例２に従い、ＨＳＣは、５０分以内で全血から直接的に非常に素早く富化することができ、本発明の標識を組み合わせる方策を用いて約６７％の純度を有することを示している。
【００４９】
比較例１：  赤血球凝集試薬を用いない制御性Ｔ細胞の単離
大磁性粒子は、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９を認識する抗体に接合させており、小磁性粒子は、ＣＤ２５を認識する抗体に接合させた。抗体ビーズ接合体をヒト全血で滴定して、最適な濃度を決定した。
【００５０】
前記磁性ビーズ抗体接合体を、４ｍＬのＨＰＭＣ（０．７５％のＨＰＭＣ１５ストック溶液）を用いずに予め決められた量で混ぜて最終容量４．５ｍＬでカクテルとした。そのカクテルを、８ｍＬのヒト全血に加え、かき混ぜて、ＭＡＣＳｍｉｘ（商品名）チューブローテーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１０分にわたりインキュベートし、そしてＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１５分にわたり置いた。上清を、ＬＳカラムおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用することによって、ＭＡＣＳ技術で直接、更に処理した。不要な細胞は該カラムを通過する。磁気的に標識された細胞は、該カラム中にブランジャーをしっかりと押し込むことによって流出される。単離された制御性Ｔ細胞は、ＭＡＣＳｑｕａｎｔアナライザーフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）において蛍光色素が接合された抗体の組み合わせを使用して分析されることになる。
【００５１】
図４は、比較例１（ＨＰＭＣ１５を用いない）に従い、制御性Ｔ細胞が４２％の純度および６．９Ｅ＋０４の回収量で得られることを示している。
【００５２】
比較例１を、ＨＰＭＣ１５を用いて繰り返すと、制御性Ｔ細胞は、９０％の純度および２．１Ｅ＋０５の回収量で得ることができた。
【００５３】
例３：  逐次的な磁気的標識によるＣＤ８陽性ＮＫ細胞の単離
３μｍおよび３００ｎｍを有する大磁性粒子を別々に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＩｇＥ、およびＴＣＲａｂを認識する抗体に接合させた。小磁性粒子は、ＣＤ８を認識する抗体に接合させた。抗体ビーズ接合体をヒト全血で滴定して、最適な濃度を決定した。
【００５４】
大磁性ビーズ抗体接合体を、予め決められた量で混ぜてカクテルとした。前記カクテルを、８ｍＬのヒト全血と一緒に４ｍＬの０．７５％ＨＰＭＣ１５ストック溶液と組み合わせてインキュベートした。該混合物をかき混ぜて、ＭＡＣＳｍｉｘ（商品名）チューブローテーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１０分にわたりインキュベートし、そしてＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１５分にわたり置いた。その後に、上清を凝集物から、新しいチューブへとピペッティングすることによって除去する。
【００５５】
小磁性粒子を単離されたＮＫ細胞に加え、かき混ぜて、１０分にわたりインキュベートした。それらの細胞を、ＭＳカラムおよびＯｃｔｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用することによって処理した。不要な細胞は該カラムを通過する。磁気的に標識された細胞は、該カラム中にブランジャーをしっかりと押し込むことによって流出される。単離されたＣＤ８陽性ＮＫ細胞は、ＭＡＣＳｑｕａｎｔアナライザーフローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）において蛍光色素が接合された抗体の組み合わせを使用して分析されることになる。
【００５６】
比較例３
例３を、３μｍ直径を有する「大磁性粒子」に代えて３００ｎｍ直径を有する磁性粒子を使用したことを除き同様に繰り返した。
【００５７】
例３においては、ＣＤ８陽性ＮＫ細胞を約９３％の高純度で得ることができた。比較例３によって示されるように、３μｍ直径を有する大磁性粒子に代えて３００ｎｍの粒子を有する磁性粒子を使用することによって、純度は７３％にまで低減された。
【００５８】
図５は、例３および比較例３による、全血から直接的に何らかの非磁気的な予備富化を行わずに単離されたＣＤ８陽性ＮＫ細胞を示している。直径３００ｎｍを有する磁性粒子を使用することによって、陽性のフラクションは、第一の磁気的富化の間に引き留められなかった非ＮＫ細胞に標識された磁性粒子に起因して、２７％の不要な細胞を示す（図５の左側）。図５の右側に示されるように、本発明により標識された直径３μｍを有する大磁性粒子を使用することによって、非ＮＫ細胞は、第一の磁気的ステップの間にほぼ完全に残留できた。
【００５９】
従って、本発明の方法を用いると、３μｍの直径を有する大磁性粒子を使用することによって第二の単離ステップの後に、相対的にかなり高い純度のＣＤ８陽性ＮＫ細胞に至ることができる。
【００６０】
例４：  同時の磁気的標識によるＣＤ８陽性ＮＫ細胞の単離
３μｍを有する大磁性粒子を別々に、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ６１、ＣＤ１２３、ＣＤ１９３、ＩｇＥ、およびＴＣＲａｂを認識する抗体に接合させた。小磁性粒子は、ＣＤ８を認識する抗体に接合させた。抗体ビーズ接合体をヒト全血で滴定して、最適な濃度を決定した。
【００６１】
大磁性ビーズ抗体接合体および小磁性ビーズ抗体接合体を、予め決められた量で混ぜてカクテルとした。前記カクテルを、４ｍＬのヒト全血と一緒に２ｍＬの０．７５％ＨＰＭＣ１５ストック溶液と組み合わせてインキュベートした。該混合物をかき混ぜて、ＭＡＣＳｍｉｘ（商品名）チューブローテーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１０分にわたりインキュベートし、そしてＭＡＣＳｘｐｒｅｓｓ（登録商標）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）中で１５分にわたり置いた。その後に、上清を直接的にＭＡＣＳ技術で、ＬＳカラムおよびＱｕａｄｒｏＭＡＣＳ（商品名）セパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ）を使用することによって更に処理した。不要な細胞は該カラムを通過する。磁気的に標識された細胞は、該カラム中にブランジャーをしっかりと押し込むことによって流出される。
【００６２】
比較例４
例４を、３μｍ直径を有する「大磁性粒子」に代えて３００ｎｍ直径を有する磁性粒子を使用したことを除き同様に繰り返した。
【００６３】
例４においては、ＣＤ８陽性ＮＫ細胞を、大磁性粒子を使用することによって約８０％の高純度で得ることができた。比較例４によって示されるように、３μｍ直径を有する大磁性粒子に代えて３００ｎｍの粒子を有する磁性粒子を使用することによって、純度は６．７％にまで低減された。
【００６４】
図６は、例４および比較例４による、全血から直接的に何らかの予備富化を行わずに単離されたＣＤ８陽性ＮＫ細胞を示している。「大磁性粒子」に代えて直径３００ｎｍを有する磁性粒子を使用することによって、陽性のフラクションは、第一の磁気的富化の間に引き留められなかった非ＮＫ細胞に標識された磁性粒子に起因して、９３％の不要な細胞を示す（図６の左側）。図６の右側に示されるように、非ＮＫ細胞に標識された直径３μｍを有する大磁性粒子は、第一の磁気的ステップの間にほぼ完全に残留できた。
【００６５】
従って、本発明の方法を用いると、３μｍの直径を有する大磁性粒子を使用することによって第二の単離ステップの後に、相対的に明らかに高い純度のＣＤ８陽性ＮＫ細胞に至りうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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