(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導性免疫抗がん成分を含有する末梢血のアリコートを含むサンプルから濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物を形成する方法であって、
前記サンプルは、がん腫瘍組織が腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテンと接触させられている宿主動物であって、前記宿主動物の免疫系を誘導して前記腫瘍に対する誘導性免疫抗がん成分を産生させるのに十分な時間にわたって維持されている前記宿主動物から採取されており、
前記方法は、前記サンプル中に存在する前記誘導性免疫抗がん成分をインビトロで培養及び選択的に拡張して、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物を形成するステップを更に含み、前記濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物は、前記選択的拡張前よりも統計的に有意に濃度が上昇した、前記ハロゲン化キサンテンにより誘導された前記誘導性免疫抗がん成分を含有し、前記誘導性免疫抗がん成分は、ａ）ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＨＭＧＢ１からなる群より選択されるリンパ可溶性サイトカイン、ｂ）末梢血単核細胞である免疫細胞、及びｃ）完全な腫瘍細胞又はケモアブレーションされた細胞の破片上に提示される抗原に結合する抗体、のうちの１以上を含む、方法。
【請求項２】
前記誘導性免疫抗がん成分は、前記宿主動物から得られる免疫細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫細胞はＮＫ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫細胞はＴ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫細胞は樹状細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫細胞はＢ細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記採取された誘導性免疫抗がん成分は、抗腫瘍抗体及びサイトカインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記サイトカインはＨＭＧＢ１を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サイトカインはＩＦＮ−γを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された免疫学的有効濃度の濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤を含有する、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤を形成するために調整され、前記組成物は、ペアレンタル注射に適した塩分、浸透圧、及びｐＨ値も有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルからＴ細胞が分離され、選択的に拡張される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記インビトロで培養及び選択的に拡張するステップの前に、前記サンプルを貯蔵するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インビトロで培養及び選択的に拡張するステップの後に、前記サンプルを貯蔵するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ハロゲン化キサンテンは、下記の化学式１又は化学式２の化合物であり、これらの化学式中、Ｒ１は、独立的にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立的にＣｌ、Ｈ、又はＩであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つの置換基はＩであるとともに、少なくとも１つの置換基はＣｌ又はＨであり、Ｒ６は独立的にＨ又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ１１はＨ又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ１２はＨ又はＣ１−Ｃ７のアシル基である、請求項１に記載の方法。
【化１】
0006773788.tif 000005
【化２】
0006773788.tif 000006
【請求項１５】
前記接触させられるがん腫瘍組織は、黒色腫、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、胆嚢がん、原発性または転移性肝がん、及び小細胞並びに非小細胞肺がんからなる群のうちの１以上から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記接触させられるがん腫瘍組織は黒色腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
宿主動物内のがん腫瘍の処置における使用のための、請求項１０に記載の方法によって得られる免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項１８】
前記免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞のうちの１以上を含む、請求項１７に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項１９】
前記免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤は、ＨＭＧＢ１及びＩＦＮ−γの一方又は両方を含む、請求項１７に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２０】
前記免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤内の前記濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤は、前記宿主動物にとって自己由来のものである、請求項１７に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２１】
前記使用は、１以上の免疫系下方制御に対する全身性阻害剤を前記宿主動物に投与するステップを更に含む、請求項１７に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２２】
前記免疫系下方制御に対する全身性阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２のうちの１以上と免疫反応するモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２３】
複数のがん腫瘍を有する宿主動物の処置における使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤であって、前記使用は、
（Ａ）前記宿主動物内の第１のがん腫瘍の組織を腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテンと接触させるステップと、
（Ｂ）前記宿主動物の免疫系を誘導して前記腫瘍に対する誘導性免疫抗がん成分を産生させるのに十分な時間にわたって、前記宿主動物を維持するステップと、
（Ｃ）前記誘導性免疫抗がん成分を含有する末梢血のアリコートを含むサンプルを、前記宿主動物から採取するステップと、
（Ｄ）前記採取したサンプル中に存在する前記誘導性免疫抗がん成分をインビトロで培養及び選択的に拡張して、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物を形成するステップであって、前記濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物は、前記選択的拡張前よりも統計的に有意に濃度が上昇した、前記ハロゲン化キサンテンにより誘導された前記誘導性免疫抗がん成分を含有し、前記誘導性免疫抗がん成分は、ａ）ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＨＭＧＢ１からなる群より選択されるリンパ可溶性サイトカイン、ｂ）末梢血単核細胞である免疫細胞、及びｃ）完全な腫瘍細胞又はケモアブレーションされた細胞の破片上に提示される抗原に結合する抗体、のうちの１以上を含むステップと、
（Ｅ）前記宿主動物内の第２のがん腫瘍の組織を、前記濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物と接触させるステップと、
を含む、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２４】
前記使用は更に、
（Ｆ）前記宿主動物の免疫系を誘導して前記腫瘍に対する第２の誘導性免疫抗がん成分を産生させるのに十分な第２の時間にわたって、前記宿主動物を維持するステップと、
（Ｇ）前記第２の誘導性免疫抗がん成分を含有する末梢血のアリコートを含む第２のサンプルを、前記宿主動物から採取するステップと、
（Ｈ）前記サンプル中に存在する前記誘導性免疫抗がん成分をインビトロで培養及び選択的に拡張して、第２の濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物を形成するステップと、
を追加的に含む、請求項２３に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２５】
免疫系下方制御に対する全身性阻害剤が、前記腫瘍アブレーション量の前記ハロゲン化キサンテンを投与した後、且つ、前記誘導性免疫抗がん成分を含有する前記サンプルを前記宿主動物から採取する前に前記宿主動物に投与される、請求項２３に記載の使用のための免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２６】
腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテン化合物を宿主動物の固形がん腫瘍内へ病巣内（ＩＬ）投与することによって誘導され、前記投与の約４日後から約９０日後の間に前記宿主動物から採取され、そしてインビトロで培養及び選択的に拡張された免疫抗がん成分からなる免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤であって、
前記抗がん成分は、末梢血のアリコートから採取され、前記抗がん成分は、１種類以上の免疫細胞、抗腫瘍抗体、抗原タンパク質、及びサイトカインタンパク質からなる群より選択され、
前記免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤は、前記選択的拡張前よりも統計的に有意に濃度が上昇した、前記ハロゲン化キサンテン化合物により誘導された前記免疫抗がん成分を含有し、前記免疫抗がん成分は、ａ）ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＨＭＧＢ１からなる群より選択されるリンパ可溶性サイトカイン、ｂ）末梢血単核細胞である免疫細胞、及びｃ）完全な腫瘍細胞又はケモアブレーションされた細胞の破片上に提示される抗原に結合する抗体、のうちの１以上を含む、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２７】
組成成分が、前記宿主動物から得られる免疫細胞を含む、請求項２６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２８】
前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、及びＢ細胞からなる群より選択される、請求項２７に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項２９】
前記誘導された免疫抗がん成分は、抗腫瘍抗体、抗原タンパク質、及びサイトカインタンパク質を含む、請求項２６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３０】
前記サイトカインは、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＦＮ−γ、及びＨＭＧＢ１のうちの１以上からなる群より選択される、請求項２９に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３１】
更なる使用のために貯蔵される、請求項２６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３２】
前記接触させられるがん腫瘍組織は、黒色腫、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、胆嚢がん、原発性または転移性肝がん、及び小細胞並びに非小細胞肺がんからなる群のうちの１以上から選択される、請求項２６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３３】
前記接触させられるがん腫瘍組織は黒色腫である、請求項３２に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３４】
ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２のうちの１以上と免疫反応する、免疫系下方制御に対する全身性阻害剤である治療有効量のモノクローナル抗体が、前記腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテンを投与した後、且つ、前記免疫抗がん成分を採取する前に前記宿主動物に投与される、請求項２６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３５】
前記モノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１のうちの１以上と免疫反応する、請求項３４に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３６】
薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、免疫学的有効濃度の請求項２６に記載の前記免疫抗がん成分を含有する、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤であって、ペアレンタル注射に適したｐＨ値、塩分、及び浸透圧を有する、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３７】
ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び樹状細胞のうちの１以上を含む、請求項３６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３８】
ＨＭＧＢ１及びＩＦＮ−γの一方又は両方を含む、請求項３６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤。
【請求項３９】
請求項３６に記載の免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤を含む、がんの処置における使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小分子ハロゲン化キサンテン腫瘍アブレーション化合物を病巣内注射して、哺乳動物の末梢血、腫瘍組織、又はリンパ系組織内に免疫系成分を誘導することを含む、免疫細胞活性の増強方法に関する。誘導された免疫系成分のメンバーは、採取され、エクスビボで拡張された後に、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物として、当該免疫系成分が発生した哺乳動物内に再誘導される。
【背景技術】
【０００２】
病巣内（ＩＬ）治療を取り入れて腫瘍特異的な免疫反応を惹起する免疫療法ストラテジは、皮膚新生物のための非外科的選択肢としての役割を果たすことができる。これらのストラテジは、局所的な腫瘍退縮及び全身性の腫瘍退縮の双方を引き起こすことが証明されている。樹状細胞（ＤＣ：dendritic cells）、ＩＬ−２、及びＧＭ−ＣＳＦの腫瘍内注射、並びに、アジュバントであるカルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ：Bacille Calmette-Guerin）又はトール様受容体（ＴＬＲ：toll-like receptor）作用薬を用いた処置は、黒色腫の腫瘍を保有するマウス及び進行性黒色腫に罹患した患者の双方において、全身性の抗腫瘍免疫性を増強することが証明されている［Triozzi他、Cancer 89：2646-2654（2000）；Pilon-Thomas他、J Immunother 29：381-387（2006）；Guo他、Int J Cancer 120：2418-2425（2007）；Kaufman他、Ann Surg Oncol 17：718-730（2010）；Kinder他、J Immunother 35：716-720（2012）］。樹状細胞は、最も強力な抗原提示細胞（ＡＰＣ：antigen presenting cells）であり、抗原に曝露されたことのないＴ細胞によって免疫反応を引き起こすことができる［Small他、J Clin Oncol 18：3894-3903（2000）］。
【０００３】
２０世紀には、フルオレセイン類似体の幾つかの使用方法が出現した。この化合物は、繊維染料、生体染色剤、不揮発性メモリデバイスの構成要素、熱撮像用基質、並びに、食品用及び化粧品用着色料として使用されている。例えば、エリスロシン（ＦＤ＆Ｃ  ３号）及び部分ヨウ素化エリスロシン（Ｄ＆Ｃ  １１号及び１２号）は、食品、薬品及び化粧品用の染料として使用される。特定のテトラヨードキサンテン、ローズベンガルは、眼疾患の可視化のために使用されるとともに、１９６５年の米国薬局方に記載された肝機能の医療用診断として、放射標識された形態で使用されている。
【０００４】
眼科医による、及び、肝機能の研究における、生体染色剤としてのローズベンガル（ＲＢ：rose bengal）の使用は、２０世紀に一般的となった［Norn、Acta Ophthalmol 48：546-559（1970）；Delprat Arch. Int. Med. 32：401-410（1923）］。ＲＢは、転移性黒色腫及び卵巣がんに対し、光力学的増感剤として、あるいは、レーザ活性化を行わない場合であっても、微生物及びがん細胞の双方を殺傷できる［Banks他、J Appl Bact 58：391-400（1985）；Koevary、Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol 4：99-107（2012）；Thompson他、Melanoma Res 18：405-411（2008）；Wachter他、Proc. SPIE 4620：143-147（2002）］。
【０００５】
ＲＢは、細胞膜を通過して腫瘍細胞のリソソーム内に蓄積し、腫瘍細胞を３０〜６０分以内に自己分解させることができる一方で、正常な細胞からは排除される［Wachter他、Proc. SPIE 4620：143-147（2002）］。特に、ＰＶ−１０（ＰＢＳ内にローズベンガルを１０％含有；プロヴェクタス  バイオファーマスーティカルズ，インク．、テネシー州、ノックスヴィル）のＩＬ治療は、人での研究において腫瘍特異的な免疫を惹起することが証明されており［Thompson他、Melanoma Res 18：405-411（2008）；及びThompson他、Ann Surg Oncology 22：2135-2142（2015）］、注射を行っていないバイスタンダー病変の退縮が示された。更なる研究により、ＭＴ９０１乳がん及びＢ１６黒色腫マウスモデルにおいて、ＩＬ  ＰＶ−１０処置を行うことで、Ｔ細胞媒介性の腫瘍特異的な免疫反応を引き起こすことができることが明らかとなった［Toomey他、PloS one 8：e68561（2013）］。しかしながら、その発現機序は不明のままである。
【０００６】
従って、ローズベンガルは、腫瘍破壊について特許を受けたアブレーション用薬剤として開示されている（特許文献１）。ローズベンガルによるアブレーションの後の新規の作用は、処置された哺乳動物内において腫瘍組織をインサイチュで認識するという、免疫系成分の能力である。これらの免疫系成分は、アブレーション処置された哺乳動物内において、全身性の免疫系反応を引き起こすことが分かっている。
【０００７】
がんの治療ストラテジとして、免疫反応を引き起こすストラテジが数多く提案されている。これらのアプローチは通常、宿主から患部組織を取り出すことと、有用な免疫系成分を宿主に再投与する前に、取り出した患部組織を操作して、当該免疫系成分を狙う、扱う、あるいはその大きさ又は数を拡張することとから構成される。
【０００８】
例えば、エクスビボで腫瘍抗原でパルスされた樹状細胞と、ナチュラルキラー細胞の拡張とから構成されるワクチンが研究されている（特許文献２）。腫瘍組織を標的とするために、抗原ベース及び非抗原ベースの抗体が製造され、エクスビボで操作されている（特許文献３、特許文献４）。特に、骨髄非破壊的化学療法と、拡張されたＴ細胞の養子移植との組み合わせにより、末期がん患者において持続的な臨床反応がもたらされることが報告されている［Pilon-Thomas、J. Immunother 35(8)：615-620（2012）］。これらのストラテジは、内因性の免疫組織からは独立しており、患者への投与のために、抽出された腫瘍組織又は末梢血からエクスビボで製造される。加えて、骨髄非破壊的化学療法の使用は、治療に係る時間及び費用を増加させるとともに、治療に基づく死亡率の上昇の可能性を高め得る。
【０００９】
瀕死のがん細胞は、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ：damage-associated molecular pattern molecules）として知られる可溶性分子を放出する可能性があり、これらは主に、パターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptors）によって認識される［Zitvogel他、Cell 140：798-804（2010）］。特定のＤＡＭＰは、がん治療のための強力な免疫学的アジュバントとしての役割を果たすことができる［Kroemer他、Ann Rev Immunol 31：51-72（2013）；Krysko他、Nature Rev Cancer 12：860-875（2012）］。このようなＤＡＭＰには、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ：heat shock protein）ファミリーの幾つかのメンバー、Ｓ１００タンパク質、ＡＴＰ、ＩＬ−１α、及び、アンフォテリンとしても知られる高移動度群ボックス１（ＨＭＧＢ１：high mobility group box 1）が含まれる［Panzarini他により調査された、PloS One 9：e105778（2013）］。
【００１０】
ＨＭＧＢ１は、ほぼ全ての真核細胞のＤＮＡと結合する豊富タンパク質である。その推定受容体には、終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ：receptor for advanced glycation end-products）、トール様受容体−２（ＴＬＲ２：Toll-like Receptor-2）、ＴＬＲ４、及びＴ細胞免疫グロブリン−３（ＴＩＭ−３：T cell immunoglobulin-3）が含まれる［Taguchi他、Nature 405：354-360（2000）；Park他、J Biol Chem 279：7370-7377（2004）；Chiba他、Nature Immunol 13：832-842（2012）］。ＨＭＧＢ１は、膜結合形状を有し、サイトカイン様因子として細胞外空間に分泌されることも可能である。ＨＭＧＢ１は、アセチル化を受けた後にマクロファージや樹状細胞（ＤＣ）等の活性化された免疫細胞から分泌されるか、又はＤＡＭＰとして、ネクローシス性、アポトーシス性、及びオートファジー性のがん細胞から放出される可能性がある［Scaffidi他、Nature 418：191-195（2002）；Bonaldi他、EMBO J 22：5551-5560（2003）；Kazama他、Immunity 29：21-32（2008）；Thorburn他、Cell Death Differ 16：175-183（2009）］。
【００１１】
ＨＭＧＢ１は、内皮細胞の活性化、血管形成の促進、免疫細胞の遊走、及び炎症の開始において、重要な役割を果たしている［Lotze他、Nature Rev Immunol 5：331-342（2005）］。ＨＭＧＢ１は、腫瘍転移及び血管新生に寄与することが証明されているが、瀕死の腫瘍細胞から放出されることで、ＤＣを活性化させ、腫瘍進行を防止することができる［Apetoh他、Nature Med 13：1050-1059（2007）；Curtin他、PloS Med 6：e10（2009）］。
【００１２】
がん患者から、免疫系の抗腫瘍活性を刺激するように設計された組織を分離し、貯蔵し、拡張し、狙い、そして当該組織でがん患者を再処置する方法が多く知られている。プロベンジ（PROVENGE）（登録商標）（SIPULEUCEL-T）や養子移植等の幾つかのストラテジは、患者の末梢血、リンパ系組織又は腫瘍組織に端を発する。しかしながら、これらのストラテジの内のいずれにおいても、内因性の免疫成分を患者から取り出す前に、腫瘍組織の病巣内アブレーションを利用して、当該免疫成分の質をインサイチュで高めることは行われていない。取り出した後の処置ストラテジは、個別治療のために患者固有のものとすることができる。
【００１３】
より多くの患者群において腫瘍処置に対する免疫反応を増強するために、免疫グロブリン（抗体）、及び、時には一般的な疾患に対するワクチンが使用されている。このような抗体及びワクチンは、必ずしも患者から分離する必要はなく、患者へのより高い汎用性を有する。例えば、内因性リガンドを使用した抗体設計は、様々な患者に対して広く使用可能であり、これらのリガンドは、より汎用性のある抗体を解明するために刺激を用いてシステムを調査した後に発見されることが多い。
【００１４】
同様に、抗体は、がんに対する内因性の免疫反応において自然に生じる事象と似た事象を起こすように操作されることが可能である。例えば、抗ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）モノクローナル抗体であるイピリムマブおよびトレメリムマブは、ＣＴＬＡ−４の活性をブロックすることにより免疫系の下方制御に対抗し、がんに対するＴ細胞の反応を増強するように設計されている。同様に、ピディリズマブ、ニボルマブ、ランブロリズマブ、及びペンブロリズマブ等のモノクローナル抗体は、ＰＤ−１（プログラム死１）受容体と結合して免疫系の下方制御に対抗し、がん腫瘍に対するＴ細胞の反応を増強する。ＰＤ−Ｌ１に対するＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、及びアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）等の、ＰＤ−１リガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２に対する抗体を用いた最初の作業も、免疫系の下方制御の阻害、及び、がんに対するＴ細胞の反応の増強を示している。
【００１５】
代替的なアプローチでは、（インターロイキン−１、−２、または−１２、「ＩＬ−１」、「ＩＬ−２」、または「ＩＬ−１２」；インターフェロン−アルファまたはガンマ、「ＩＦＮ−α」、「ＩＦＮ−γ」；および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子「ＧＭ−ＣＳＦ」などの）非特異的サイトカインの投与を含む、免疫系の特定の要素を刺激する（即ち、上方制御又は下方制御する）物質、または、腫瘍特異的な免疫反応を引き起こそうとする物質が使用される。
【００１６】
以下に開示する通り、ＰＶ−１０に含有されるローズベンガル等のハロゲン化キサンタンで処置された宿主又は腫瘍細胞からの、免疫細胞を含む組織の除去は、汎用抗体又は個別治療を作成するのに使用可能であると考えられる。これらの成分は、アブレーション化合物への曝露後に分離され得る。
【００１７】
腫瘍組織へのハロゲン化キサンテン（ＰＶ−１０に含有されているもの等）の病巣内投与により、アブレーション後の末梢血、局所リンパ系組織、又は腫瘍組織において発見されるが、プラセボ処置群のこれらの組織においては有意なレベルで存在していない腫瘍特異的な免疫細胞を刺激する腫瘍抗原が放出される。これにより、腫瘍の破片が局所抗原提示細胞内に予め取り込まれ、局所抗原提示細胞は、それ自体で疾患を治療する際に有益なものとなることができる。
【００１８】
以下の開示は、例示的な黒色腫の患者及び黒色腫を保有するマウスにおいて、ＰＶ−１０のＩＬ注射が腫瘍特異的な免疫反応を惹起できることを示している。更に、この発現機序は、黒色腫の腫瘍内へのＰＶ−１０のＩＬ注射によって、ＨＭＧＢ１の放出及び免疫細胞の活性化が引き起こされ、腫瘍特異的な免疫が誘導されることであると判明している。インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）及びインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で誘導された腫瘍反応は、腫瘍及び免疫系組織内で連鎖的に発生し、これらの腫瘍及び免疫系組織内の活性化された細胞は、がんの更なる発症を治療又は阻害するために、当該技術分野において既知の技術を用いて貯蔵され、再誘導されるか、または拡張された後に再誘導されることができる。
【００１９】
加えて、これらの局所的に使用されたアブレーション用薬剤は、哺乳動物の研究又はインビトロでの研究において、アブレーションが行われた細胞に特異的な抗体を特定するためのツール、又は、がんの治療に有用な生物由来物質を複製する前に特定するためのツールとして使用することができる。これらの抗体は、単体で使用する場合、又は、当該技術分野において既知の技術に従って複製及び製造された後に使用する場合のいずれにおいても、より一般的ながんの治療として有用なものとなり得る。このようにして生成され、末梢血、脾臓、腫瘍、又はリンパ節から分離された免疫成分は、マウス及び人の両方において腫瘍に反応することが可能であり、また、病巣内注射の後約１日またはそれ以上の内に検出され得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第８５５７２９８号
【特許文献２】米国特許第８５９７９４６号
【特許文献３】米国特許第８１５３１２０号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４／０１６１４１３号
【特許文献５】米国特許第８５４０９８２号
【特許文献６】米国特許第５９７６５４６号
【特許文献７】米国特許第６０８０４０９号
【特許文献８】米国特許第６２１０６６２号
【特許文献９】米国特許第４９２７７４９号
【特許文献１０】米国特許第９１０７８８７号
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、ローズベンガル二ナトリウム等のハロゲン化キサンテン腫瘍アブレーション化合物を宿主動物の固形がん腫瘍内へ病巣内（ＩＬ）投与することによって当該宿主動物内に誘導された後に分離された、１種類以上の免疫細胞、免疫グロブリン、抗原等のタンパク質、サイトカイン、及びその他の免疫成分等の「誘導性免疫抗がん成分」由来の「濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物」を用いた免疫治療の方法を企図する。ハロゲン化キサンテン腫瘍アブレーションによって生成された誘導性免疫抗がん成分のサンプルは、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を形成するために、腫瘍を保有する宿主から除去（採取）され、所望により貯蔵されるか、又は培養されるとともに選択的に拡張される。濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物もまた、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を形成するために、所望により貯蔵されるか、又は調整されることが可能であり、前身である誘導性免疫抗がん成分が取り出された宿主内へ再誘導される（自己移植）か、この濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を必要としている別の免疫学的に適切な宿主内へ再誘導される（同種移植）。
【００２２】
これらの誘導性免疫抗がん成分は、末梢血のアリコート、腫瘍組織、又は、流入領域リンパ節、胸腺細胞、及び脾細胞等のリンパ系（リンパ球含有）組織のうちの１以上を含むサンプルを取り出すことによって採取される。誘導性免疫抗がん剤は、ＩＬアブレーション又は連続したアブレーションの、好ましくは約１日後から約３６５日後の間、好ましくは約４日後から約９０日後の間、最も好ましくは約７日後から約１４日後の間に採取される。誘導性免疫抗がん成分は、凍結、約１．０℃〜約８．０℃の温度への冷却、又は凍結乾燥などであるがこれらに限定されない公知の血液貯蔵技術によって、更なる行動が取られるまで貯蔵されることが可能である。
【００２３】
末梢血、腫瘍組織、及び／又はリンパ系組織のサンプル中に存在する誘導性免疫抗がん成分は、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を形成するために、既知の細胞培養方法によってインビトロで培養される。濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物自体を、後で使用するために、上述の通りに凍結、凍結乾燥、又はその他の方法で保管する（貯蔵する）ことが可能である。
【００２４】
好適な実施形態において、腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された免疫学的有効濃度の濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤を含有する、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤を形成するために調整される。当該製剤は、ペアレンタル注射に適した塩分、浸透圧、及びｐＨ値も有している。当該製剤は、誘導性免疫抗がん成分が取り出された元の宿主動物内へ非経口的に再誘導される（自己投与）か、別の免疫学的に適切な動物へ投与される（同種投与）か、あるいは更なる免疫抗がん剤を提供するために、更に培養される。
【００２５】
更なる実施形態において、誘導性免疫抗がん成分は、取得されるとともに、前述のアブレーションが行われた腫瘍の位置とは異なる位置の腫瘍に投与される。この投与は、病巣内に行うか、あるいは、静脈内、皮下、又は腹腔内投与等の、その他の公知の非経口投与の手段によって行うことが可能である。
【００２６】
この投与は、誘導性免疫抗がん成分を腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物へ拡張することなく行われる。誘導性免疫抗がん成分は、宿主動物へ再誘導されるまで貯蔵されることが可能である。
【００２７】
別の実施形態において、本方法は、例えばローズベンガル等のハロゲン化キサンテンの腫瘍組織内への病巣内注射を利用して、内因性の腫瘍組織へ標的化されたインターフェロン陽性Ｔ細胞を誘導する。更なる実施形態において、本方法は、同じく腫瘍組織のローズベンガルへのアブレーションのための曝露を利用して、樹状細胞を誘導し、腫瘍抗原を曝露し、抗体、及び、患者固有の又は患者非依存性の細胞治療法及びサイトカインを誘導する。
【００２８】
本発明は、複数の利益及び利点を有する。
本発明の利益の１つは、後に使用される濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の原料として使用可能な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を規定している点にある。
本発明の利点は、様々な固形がん腫瘍に対して施される、増強された、免疫学に基づいた処置方法を提供している点にある。
本発明の更なる利益及び利点は、以下の開示から当業者に明らかとなるであろう。
本開示の一部を構成する図面は、下記の通りある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】臨床研究デザインを示す概念図である。
【図１Ｂ】ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の前及び処置の７〜１４日後にヒト患者の腫瘍から採取された生検サンプルの顕微鏡写真を左側に示すとともに、同時期にバイスタンダー腫瘍（未注射）から採取された生検サンプルの顕微鏡写真を右側に示す図である。黒色腫細胞の存在を判定するために、免疫組織化学（ＩＨＣ：immunohistochemistry）により、ｍｅｌＡに対する抗体を用いて細胞が染色された。処置された病変及びバイスタンダー病変において、腫瘍細胞の大幅な減少が認められ、これは病理医による検査によっても確認された。
【図１Ｃ】注射された腫瘍（ｉｎｊ）及びバイスタンダーである注射されていない腫瘍（ｕｎｉ）における腫瘍退縮を示すグラフである。
【図１Ｄ】ヒト患者（ｎ＝１４）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cells）中のＣＤ８＋Ｔ細胞が処置後に増加したことを示す図である。各図中の数字は、中央の棒と共にｐ値を示している。ｐ値は、ウィルコクソンの符号付順位和検定によって判定された。*は、ｐ＜０．０５水準で処置前に対して統計的に有意であることを示し、**は、ｐ＜０．０１水準で処置前に対して統計的に有意であることを示し、***は、ｐ＜０．００１水準で処置前に対して統計的に有意であることを示し、ｎ．ｓ．は、非有意であることを示す。
【図１Ｅ】ヒト患者（ｎ＝１４）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＣＤ４＋Ｔ細胞が処置後に増加したことを示す図である。
【図１Ｆ】ヒト患者（ｎ＝１４）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中のＮＫＴ細胞が処置後に増加したことを示す図である。
【図１Ｇ】ＰＢＭＣから精製され、自己の黒色腫細胞５２６又は６２４又はその両方で再刺激された様々な患者のＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の産生の増加を示す図である。投与前（ｐｒｅ）、投与後７〜１４日（Ｄ７−１４）、及び投与後２１〜２８日（Ｄ２１−２８）の値についてのデータを示す。Ｐ値は、スチューデントの対応の無いｔ検定によって判定された。ｎ．ｓ．は、非有意であることを示す。
【図１Ｈ】ＰＢＭＣから精製され、ＨＬＡ適合６２４黒色腫細胞で再刺激された様々な患者のＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の産生の増加を示す図である。
【図１Ｉ】ＰＢＭＣから精製され、ＨＬＡ適合黒色腫細胞で再刺激された様々な患者のＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−ｇ）の産生の増加を示す図である。
【図２Ａ】０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの一方の脇腹にＯＶＡ発現黒色腫Ｂ１６（Ｍ０５）細胞を３×１０５個注射した後の、腫瘍の増殖を示す図である。その後、７日目及び１７日目に、５０μｌのＰＶ−１０又はＰＢＳをＩＬ注射した（ｎ＝４）。
【図２Ｂ】フローサイトメトリによって測定された、注射の８日後の流入領域リンパ節からのＣＤ８＋及びＯＶＡテトラマー陽性細胞の割合を示す図である。
【図２Ｃ】７日目に反対側の脇腹に皮下注射した３×１０５個のＭ０５細胞で再チャレンジしたマウスからの、ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ｇ）の分泌を示すグラフである。２３日目に、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、ＩＬ−２１、及び１μｇ／ｍｌのＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを用いて７日間脾細胞を増殖させ、その後Ｍ０５細胞でチャレンジした。ＩＦＮ−γ（ＩＦＮ−ｇとも言う）の産生は、４８時間後に測定した。データは、３つの独立した研究からの平均±ＳＥＭとして表示される。*は、ｐ＜０．０５水準で対照群に対して統計的に有意であることを示し、**は、ｐ＜０．０１水準で対照群に対して統計的に有意であることを示す。Ｐ値は、スチューデントの対応の無いｔ検定によって判定された。
【図３Ａ】０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの一方の脇腹にＯＶＡ発現黒色腫Ｂ１６（Ｍ０５）細胞が３×１０５個注射され、１３日目に、反対側の脇腹へ５０μｌのＰＶ−１０がＩＬ注射されるか、又は５０μｌのＰＢＳが注射され、その４時間後に、Celltracker（登録商標）によって紫色に標識されたＣＤ４５．１  ＯＴ−１Ｔ細胞が２×１０６個静脈内注射された後、ＩＬ  ＰＶ−１０が腫瘍特異的阻害免疫反応を惹起することを示す図である。スチューデントの対応の無いｔ検定に基づき、ＰＶ−１０＋ＯＴ−１の群は、２３日目にｐ＜０．０５水準においてＰＶ−１０の群に対して統計的に有意である。
【図３Ｂ】観察対象のマウスの生存率を示す図である。*はｐ＜０．０５水準であり、**はｐ＜０．０１水準である。Ｐ値は、ログ・ランク検定によって判定された。
【図３Ｃ】４日後に、脾臓からの細胞をＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２抗体で染色した際の図である。紫色色素希釈の代表的なヒストグラムは、少なくとも１度分裂したＣＤ４５．１＋Ｔ細胞の子孫（娘）を死細胞の識別後に示している。データは、３つの独立した実験からの平均±ＳＥＭとして表示される（ｎ＝５マウス／群）。*は、ｐ＜０．０５水準で対照群に対して統計的に有意であることを示し、**は、ｐ＜０．０１水準で対照群に対して統計的に有意であることを示す。
【図３Ｄ】４日後に、脾臓からの細胞をＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２抗体で染色した際の図である。
【図３Ｅ】４日後に、腫瘍からの細胞をＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２抗体で染色した際の図である。
【図３Ｆ】４日後に、遠位ＬＮからの細胞をＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２抗体で染色した際の図である。
【図４Ａ】３×１０５個のＭ０５細胞が注射された後、７日目に５０μｌのＰＶ−１０又はＰＢＳがＩＬ注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍流入領域ＬＮ（ＤＬＮ）又は非流入領域ＬＮ（ＮＤＬＮ）からの、ＩＬ注射の１８時間後にフローサイトメトリによって測定された、樹状細胞（ＤＣ；ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ  ＩＩ＋）の数を示すグラフである。
【図４Ｂ】ＰＶ−１０処置の４時間後にＦＩＴＣ−ＯＶＡが腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射された後、１８時間後にフローサイトメトリによって測定された、ＤＬＮ又はＮＤＬＮからのＦＩＴＣ＋ＤＣの結果を示すグラフである。これらのデータは、３つの独立した研究からの平均±ＳＥＭとして表示される(ｎ＝４マウス／群)。
【図４Ｃ】完全培地（ＣＭ：complete medium）、あるいは、ＩＬ  ＰＶ−１０又はＰＢＳで処置されたＢ１６黒色腫保有マウスからの腫瘍上清（ＴＳ：tumor supernatants）と共に２日間インキュベートされた後、ＯＶＡタンパク質でパルスされ、異なる比率でＯＴ−１Ｔ細胞と３日間共培養された血液単核細胞由来（ＢＭ由来）ＤＣのインキュベーションの最後の１６時間の間に、［３Ｈ］チミジン取込みによって測定された、ＯＴ−１Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。
【図４Ｄ】１００μＭのＰＶ−１０又はＰＢＳと共にプレインキュベートされたＢ１６細胞からの腫瘍溶解物と共にインキュベートされ、ＯＶＡタンパク質でパルスされ、そして前述の比率でＯＴ−１Ｔ細胞と３日間共培養されたＢＭ由来ＤＣの数を比較したグラフである。細胞の増殖は、培養の最後の１６時間において、［３Ｈ］チミジン取込みによって三連で測定された。データは、平均±ＳＥＭとして表示されると共に、２つの独立した研究の代表である。*は、ｐ＜０．０５水準で対照群に対して統計的に有意であることを示し、**は、ｐ＜０．０１水準で対照群に対して統計的に有意であることを示し、***は、ｐ＜０．００１水準で対照群に対して統計的に有意であることを示す。
【図５Ａ】４８時間後のＩＣ５０が６０μＭである、マウス黒色腫Ｂ１６細胞のＰＶ−１０濃度に対する細胞死と、また、４８時間後のＩＣ５０が１１０μＭである、３Ｔ３線維芽細胞のＰＶ−１０濃度に対する細胞死とを示すグラフである。
【図５Ｂ】５０μＭのＰＶ−１０で４８時間処置された、Ｂ１６細胞、３Ｔ３線維芽細胞、ヒト原発性黒色腫細胞（Ｐ）、及びヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリ解析を示すグラフである。
【図５Ｃ】ＰＢＳと比較して、ＰＶ−１０で処置された黒色腫細胞においては、初期アポトーシス（アネキシンＶ＋ＤＡＰＩ−）よりもネクローシス（ＤＡＰＩ＋）の有意な増加が観察された、フローサイトメトリ解析を示すグラフである。
【図６Ａ】記載された用量のＰＶ−１０を用いてＢ１６細胞及び３Ｔ３細胞を４８時間処置した後に、ウェスタンブロット法によって検出された、細胞上清（Ｓ）中に放出されたＨＭＧＢ１のデンシトメトリ密度を示すグラフである。
【図６Ｂ】記載された用量のＰＶ−１０を用いてヒト８８８黒色腫細胞を４８時間処置した後に、ウェスタンブロット法によって検出された、細胞上清（Ｓ）中に放出されたＨＭＧＢ１のデンシトメトリ密度を示すグラフである。細胞溶解物（Ｌ）中において、ＨＭＧＢ１の発現の増加が確認された。
【図６Ｃ】ＣＭ、あるいは、ＨＭＧＢ１中和抗体又はアイソタイプコントロールの存在下で１００μＭのＰＶ−１０と共に２日間プレインキューベートされたＢ１６細胞の腫瘍上清（ＴＳ）と共にインキュベートされた、ＢＭ由来ＤＣを示すグラフである。細胞は、ＣＤ４０及びＣＤ１１ｃに対する抗体を用いて染色され、フローサイトメトリによって解析された。ＤＣのＣＤ４０の相対平均蛍光強度（ＭＦＩ：mean fluorescence intensity）が示されている。データは、平均±ＳＥＭとして表示されると共に、３つの独立した研究の代表である。*はｐ＜０．０５水準であり、**はｐ＜０．０１水準である。
【図６Ｄ】ＩＬ  ＰＶ−１０で２日間処置されたＭ０５黒色腫保有マウスからの腫瘍上清と共にインキュベートされ、ＯＶＡタンパク質でパルスされ、そして細胞対細胞培養比率でＯＴ−１Ｔ細胞と３日間共培養されたＢＭ由来ＤＣにおける、当該比率に対する計数を示すグラフである。ＯＴ−１Ｔ細胞の増殖は、培養の最後の１６時間の間に［３Ｈ］チミジン取込みによって検査された。データは、平均±ＳＥＭとして表示されると共に、２つの独立した実験の代表である。*はｐ＜０．０５水準であり、**はｐ＜０．０１水準である。
【図７】病巣内ＰＶ−１０（１０％ローズベンガル水溶液；プロヴェクタス  バイオファーマスーティカルズ，インク．、テネシー州、ノックスヴィル）処置治療後の７〜１４日目及び２１〜２８日目において黒色腫の患者の血清中に存在するＨＭＧＢ１レベルを、処置前に存在する血清量に対して示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭとして表示される（ｎ＝１４）。*は、ｐ＜０．０５水準であり、ｎ．ｓ．は、非有意であることを示す。Ｐ値は、ウィルコクソンの符号付順位和検定によって判定された。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、後で免疫治療的に使用可能な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん成分の製剤を形成及び使用する方法を企図する。本方法は、以下のステップを含む。（Ａ）宿主動物内の腫瘍組織を、好ましくは医薬組成物中に溶解又は分散された腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテン化合物を含むケモアブレーション用医薬組成物と接触させるステップ。ケモアブレーション用医薬組成物の詳細については、以降で別途説明する。（Ｂ）宿主動物の免疫系が当該腫瘍に対する腫瘍特異的免疫抗がん剤を産生するのに十分な時間、即ち、腫瘍特異的免疫抗がん剤の誘導に十分な時間（約１日〜約３０日間）にわたって、宿主動物を維持するステップ。（Ｃ）腫瘍特異的免疫抗がん成分を含有する末梢血のアリコート、腫瘍組織、又はリンパ系組織のうちの１以上を含むサンプルを、宿主動物から採取する（取り出す）ステップ。（Ｄ）末梢血、腫瘍組織、及び／又はリンパ系組織の当該サンプル中に存在する腫瘍特異的免疫抗がん成分をインビトロで培養及び選択的に拡張して、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物を形成するステップ。
【００３１】
腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテンを含有する医薬組成物が、宿主動物の固形腫瘍に投与されてがん細胞と接触した後、宿主動物は、当該宿主動物の免疫系を誘導して前述の腫瘍に対する腫瘍特異的免疫抗がん剤を産生させるのに十分な時間にわたって、少なくとも維持される。典型的な維持時間は、医薬組成物のアブレーション投与後約１日〜約３０日間である。
【００３２】
この状況での維持とは、動物が、前述の処置に続いて必要とされる通常の医学的／獣医学的観察及び／又は介入を伴う、普段の生活を送ることを単に許可することである。例えば、病巣内注射用に製剤された１０％ローズベンガルの水性組成物（ＰＶ−１０；プロヴェクタス  バイオファーマスーティカルズ，インク．、テネシー州、ノックスヴィル）を腫瘍内に注射した、ステージＩＩＩＢ−ＩＶの黒色腫を有する８０人の患者の第２相ヒト臨床試験において、当該処置は、主に注射部位に限定された有害事象を伴うものであって、ＰＶ−１０の使用に関連したグレード４又は５の有害事象は伴わない、良好な忍容性を有するものであることが判明した。
【００３３】
維持期間の終了後は、腫瘍特異的免疫抗がん成分を含有する（１）末梢血のアリコート、（２）腫瘍組織、及び（３）リンパ系組織のうちの１以上を含む生体サンプルを、宿主動物から採取する（取り出す）。このサンプルは、以降で述べる通り、培養及び選択的に拡張するまで貯蔵（保管）することができる。代替的に、腫瘍特異的免疫抗がん成分は、固体成分を適切にサイジングし、これらの成分を非経口投与のための適切な賦形剤中に分散させた後、同一の宿主動物の別の腫瘍内に導入することができる。前述の通り、このような非経口投与は、病巣内、静脈内、皮下、又は腹腔内投与、あるいは類似の投与によって行うことができる。このような分散に適した賦形剤については、以降で述べる。
【００３４】
好適な腫瘍特異的免疫抗がん成分は、２つの一般的な種類のものである。
【００３５】
第１の種類の腫瘍特異的免疫抗がん成分は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＮＫ細胞、又は単球（マクロファージ）等の免疫細胞である。このような細胞は、腫瘍細胞抗原またはアブレーションされた腫瘍細胞の破片を認識し、無傷のがん細胞又はハロゲン化キサンテンによってアブレーションされたがん細胞の破片上に存在する抗原／免疫原の存在下で、腫瘍細胞抗原に結合すること、増殖すること、サイトカインを分泌すること、又は他の方法によって活性化することで、この認識に応答する。
【００３６】
第２の種類の腫瘍特異的免疫抗がん成分は、ハロゲン化キサンテンによる腫瘍アブレーション及び維持時間の後の宿主の血漿又はリンパ中に存在する、リンパ可溶性サイトカイン、又は、完全な腫瘍細胞又はケモアブレーションされた細胞の破片上に提示される抗原に結合する抗体等の他のタンパク質、あるいは、ペプチド又は糖である。
【００３７】
維持時間の後、腫瘍特異的免疫抗がん成分は、宿主動物の腫瘍へのハロゲン化キサンテンケモアブレーション用医薬組成物の病巣内投与前よりも有意に多い量で、処置された宿主中に存在している。ハロゲン化キサンテンによる腫瘍アブレーション及び維持の後の、上述の免疫細胞種類のＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＨＭＧＢ１等のリンパ可溶性サイトカイン、又はその他の腫瘍特異的免疫抗がん成分の濃度の有意な上昇は、文献に報告されている標準的な技術によって、血液、リンパ、又はリンパ系組織において容易に測定され、ハロゲン化キサンテンによる腫瘍アブレーション前の血液、リンパ、又はリンパ系組織にそれぞれ存在する量と比較され得る。リンパ可溶性サイトカイン又は免疫細胞種類の濃度の有意な上昇は、少なくとも９０％信頼水準（ｐ＜０．１）、好ましくは９５％信頼水準（ｐ＜０．０５）で統計的に有意な増加によって判定される。
【００３８】
末梢全血は、一般的に、培養及び選択的に濃縮する白血球を提供するために利用される。従って、末梢全血は、一般的にはFicoll（登録商標）勾配遠心分離によって画分に分離される。血漿の上部層（サイトカインおよび抗体を含む）、それに続く白血球の軟膜層、並びに、多形核細胞（好中球及び好酸球など）及び赤血球（ＲＢＣ：red blood cells）の底部画分からなる３つの層が一般的には形成される。
【００３９】
白血球のうち、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、（分葉核とは対照的である）丸核を有する血球、又は血小板のような核を有さない血球は、ここで特に重要である。例示的なＰＢＭＣには、リンパ球および単球（マクロファージ）が含まれる。リンパ球集団は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞、約７５％）、Ｂ細胞及びＮＫ細胞（合わせて約２５％）からなる。Stroncek他、Transfusion 51(12)：2647-2655(2011)によると、５％ＤＭＳＯ及び６％ペンタスターチ（約５０％ヒドロキシエチル化デンプン）中で凍結保存した白血球は、少なくとも７年間保存することができる。
【００４０】
全血分離後、ＰＢＭＣを採取し、培養し、増殖させることが可能であり、また、血漿を使用して、アブレーション前のバイオマーカ濃度に対する、抗体及び／又はサイトカインのバイオマーカ濃度の分析を提供することができる。好適なリンパ系組織は、好ましくはケモアブレーションした腫瘍の部位に近位である１つ以上のリンパ節からの細胞、脾臓組織又は胸腺由来の組織からの細胞、あるいは、アブレーションされた、又は未処置の腫瘍病変からの細胞である。
【００４１】
リンパ系組織サンプル等のサンプル中に存在する誘導性免疫抗がん成分をインビトロで培養すると共に選択的に拡張することで、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の組成物がもたらされる。これらの濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤は、アブレーションされた腫瘍組織に対する宿主動物の免疫反応を増強させるのに使用可能な、増大された数の、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞）、単球（マクロファージ）、及びＮＫ細胞等のＰＢＭＣを主に含むことができる。通常の細胞増殖技術では、サイトカインおよび抗体を含む増殖培地可溶性部分から細胞部分を分離し、前者はしばしば廃棄される。
【００４２】
Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及びその他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の培養及び選択的な拡張は、抗体およびサイトカインの産生の増強をもたらし得る。増殖細胞によって産生された、免疫反応を増強可能な、増大された量のＩＬ−２、ＴＮＦα、ＬＴ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＦＮ−γ等のサイトカイン、並びにＨＭＧＢ１等の他のタンパク質は、必要に応じて、カラムクロマトグラフィ及び／又はアフィニティークロマトグラフィ等の既知の分離技術を用いて、増殖培地から得ることができる。
【００４３】
腫瘍組織サンプル中に存在する腫瘍特異的免疫抗がん成分の等価群をインビトロで培養及び選択的に拡張する際に、同様の工程を適用可能である。
【００４４】
「選択的に拡張する」との語句、及びその文法上適切な類似の語句は、本明細書では、数を増加させない他の細胞の種類に対して、１つ以上の特定の細胞の種類の数を増加させることを説明するために使用される。この選択的な拡張（濃縮）という語句は、腫瘍特異的免疫抗がん細胞によって分泌される、サイトカイン又は抗腫瘍抗体などの抗がんタンパク質性化合物の相対濃度の上昇に関しても使用される。細胞数及びサイトカイン濃度の一方または両方におけるこの拡張（濃縮）は、宿主動物の体内（インビボ）ではなく、インビトロ又はエクスビボで行われる。
【００４５】
これらの免疫細胞の数の増加、及び／又は、サイトカイン又は抗体などの抗がんタンパク質性化合物の濃度の上昇は、本明細書に例示されるような周知の検査によって容易に測定することができる。インビトロ（エクスビボ）での選択的な拡張後の免疫細胞数の増加及び／又はサイトカイン濃度の上昇は、取り出された生体サンプル中の濃度と比較して統計的に有意である。選択的拡張によってもたらされる組成物を、本明細書では、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物と称する。
【００４６】
濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物の製剤は、通常、不適切な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤の濃度、塩分、浸透圧、ｐＨ値、又は異種マイトジェンの存在等の他の因子によって、「そのままの状態」では、元の宿主動物への再導入又は別の動物への導入に有用ではない。従って、濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物は、免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤を形成するために調整される。
【００４７】
企図された免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤は、薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、適切且つ免疫学的に有効な濃度の濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤を有する。この組成物はまた、ペアレンタル注射に適した塩分、浸透圧、及びｐＨ値も有し、異種マイトジェンのような望ましくない成分は含まない。このような注射可能な組成物の詳細は、Hoover、John E.、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania；1975、及び、Liberman、H.A. and Lachman、L.、Eds.、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker、New York、N.Y.、1980などの文献に記載されており、また、腫瘍アブレーション有効量の企図されたハロゲン化キサンテン化合物を含有するケモアブレーション用医薬組成物について以下に記載するものを含む。
【００４８】
免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物は、病巣内処置を免疫学的に促進するために、生体サンプルが得られた元の動物に再投与する（再導入する）ことができる。このような免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物は、通常、骨髄破壊的化学療法を受けた後の、別の（第２の）免疫学的に適切な同系動物宿主に投与することもできる。
【００４９】
このような濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤組成物又は免疫学的に有効な濃縮腫瘍特異的免疫抗がん剤製剤は、血液貯蔵及び細胞保存の技術分野において周知の通り、冷却や凍結等によって後の使用のために保管（貯蔵）することができる。この組成物又は製剤中に存在する腫瘍特異的免疫抗がん剤は、例えばリンホカイン等の所望のサイトカイン、抗体、又は細胞製剤中で産生される他の免疫抗がん剤を産生するために、更に培養することもできる。
【００５０】
米国では、各血液製品の採取及び処理に一定の基準が設定されている。「全血」（ＷＢ：Whole Blood）は、１つの定義された製品、具体的には、認可された防腐剤が添加された分離されていない静脈血の適切な名称である。輸血のためのほとんどの血液は、全血として採取される。自己によって提供された血液は、更なる変更を加えずに輸血されることがある。しかしながら、一般的には、全血は（遠心分離により）各成分に分離され、溶液中に懸濁された赤血球（ＲＢＣ）が最も一般的に使用される製品である。
【００５１】
ＷＢのユニット及びＲＢＣのユニットは、いずれも３３．８〜４２．８°Ｆ（１．０〜６．０℃）で冷蔵保存され、最大保管可能期間（保存可能期間）はそれぞれ３５日と４２日である。ＲＢＣユニットは、グリセロールで緩衝する場合には凍結することも可能であるが、これは滅多に行われない。凍結した赤血球には最大１０年間の有効期限が付与され、−８５°Ｆ（−６５℃）で保管される。
【００５２】
低密度の血漿は様々な凍結成分へと加工され、凍結された日時と製品の用途に基づいて別々にラベル付けされる。血漿は、抗体及びサイトカイン、並びに、その他の分散したタンパク質、ペプチド、糖、及び塩を含有する。
【００５３】
血漿が直ちに凍結され、またそれが輸血を目的としたものである場合、一般的には、新鮮凍結血漿としてラベル付けされる。また、これが他の製品へと加工される予定のものである場合には、一般的に、分画用回収血漿又は分画用血漿としてラベル付けされる。
【００５４】
Sheikh他による特許文献３及びその分割出願である特許文献５に記載されているように、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）は、当技術分野において容易に利用可能な通常の手法によって分離することができる。ＤＣを分離するための例示的な適切な手法は、特許文献６、特許文献７、及び特許文献８に開示されている。
【００５５】
簡潔に述べると、軟膜細胞は、末梢血から調製することができる。細胞は、遠心分離管または装置中で、密度１．０７７０ｇ/ｍｌ、ｐＨ７．４、２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの（Domによる特許文献９に記載されているように調製された）オルガノシラン化コロイドシリカ（ＯＣＳ：organosilanized colloidal silica）分離媒体のカラム上に積層されたロイコパック（leukopacs）から収穫することができる。ＯＣＳ媒体は、好ましくは、コロイドシリカ（直径約１０〜２０ｎｍの粒子）のシラノール基をアルキルトリメトキシシラン試薬と反応させ、それによりシラノール基をブロックすることによって調製される。
【００５６】
同様に、Mule他の特許文献２は、アフェレーシス装置からＤＣを調製し、続いてFicoll-Hypaque（登録商標）勾配で遠心分離して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を提供することを教示している。これらの細胞は、次に、７０％ヒトＡＢ血清、２０％X-VIVO（登録商標）１５造血培地（Lonza America Inc.、Allendale、NJ）、及び１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存された。次いで、新鮮な又は凍結保存されたＰＢＭＣは、ＧＭ−ＣＳＦの存在下、続いて（照射された腫瘍細胞から調製された）腫瘍溶解物及び抗ＭＡＲＣＯ抗体の存在下で、インビトロで培養された。
【００５７】
本発明の一実施形態において、企図された方法は、腫瘍組織内へのハロゲン化キサンテンの病巣内（ＩＬ）注射を利用して、内因性の腫瘍組織へ標的化されたインターフェロン陽性Ｔ細胞を誘導する。誘導されたＴ細胞は、好ましくは、循環ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、抗がん細胞はＮＫ細胞である。別の実施形態において、本方法は、同じく腫瘍組織のローズベンガルへの曝露を利用して、樹状細胞を誘導し、腫瘍抗原を曝露し、抗体、及び、サイトカイン等の患者固有の又は患者非依存性の治療法を誘導する。
【００５８】
腫瘍アブレーション産生物及び腫瘍細胞抗原（免疫原）が近傍の（近位の）流入領域リンパ節（ＤＬＮ）に移動するように、末梢血のアリコート、腫瘍組織、及び／又はリンパ系組織は、腫瘍アブレーション処置後に除去（採取）される。従って、移動及びアブレーションに対する免疫反応を可能にするために、血液、腫瘍組織、及び／又はリンパ組織の除去は、好ましくは、アブレーション用量投与の約１〜約３０日後、より好ましくは腫瘍アブレーションの約４〜約９０日後、最も好ましくはアブレーション用量投与の約７〜約１４日後に行われる。
【００５９】
別の好適な実施形態において、１以上の免疫系下方制御に対する全身性阻害剤が宿主動物に投与される。好ましくは、免疫系下方制御に対する全身性阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２のうちの１以上と免疫反応するモノクローナル抗体である。これらのモノクローナル抗体は、例えば、ＣＴＬＡ−４に結合するイピリムマブ及びトレメリムマブと命名されたもの、ＰＤ−１に結合するピディリズマブ、ニボルマブ、ランブロリズマブ、及びペンブロリズマブ、並びに、ＰＤ−Ｌ１に結合するＢＭＳ−９３６５５９、ＭＥＤＩ４７３６、及びアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。
【００６０】
免疫系下方制御に対する全身性阻害剤は、腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテンの投与前、投与後、又は投与と同時に、宿主動物へ投与することができる。好ましくは、この阻害剤の投与は、腫瘍アブレーションの後、且つ、誘導性免疫抗がん成分を含有するサンプルを宿主動物から採取する前に行われる。
【００６１】
免疫系下方制御阻害剤の投与は、サンプルを採取する前に複数回行うことができる。初期段階の研究において、２〜４回の投与が良好に使用されている。これらの投与は、一般的に、約１日〜約７日間で区切られる。
【００６２】
毎回投与されるモノクローナル抗体阻害剤の用量は、各特定の製品について製造元によって最大用量として示唆された用量であり、より一般的には、最大用量の約２５〜約７５％の用量が投与される。別々に投与される場合、腫瘍アブレーション用キサンテン化合物の非存在下で、モノクローナル抗体阻害剤は例示的に以下のように投与される。即ち、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）は、医師用卓上参考書、６９版、ＰＤＲネットワーク、Montvale、NJ (2014)［PDR］において、３週毎に３ｍｇ／ｋｇで合計４回投与されることが示唆されている。また、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）は、３週毎に２ｍｇ／ｋｇ投与されることが示唆されている［PDR］。また、第Ｉ相／第ＩＩ相用量漸増研究では、９６週の間、２週毎に０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ投与されるニボルマブ（抗ＰＤ−１）を使用している［Topalian他、J Clin Oncol 32：1020 (2014)］。各投与は、以下に述べるものと同様の水性組成物中で静脈を通して行われた。
【００６３】
医薬組成物
薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、腫瘍アブレーション有効量の企図されたハロゲン化キサンテン化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含有する医薬組成物が、企図された方法において使用されている。本明細書ではしばしばケモアブレーション用組成物と称されるこのような組成物は、哺乳類の宿主動物の免疫系を誘導して誘導性免疫抗がん成分を産生させるために、当該宿主動物の腫瘍内にインビボで（病巣内）投与される。
【００６４】
この医薬組成物は、好ましくは、ローズベンガル等のハロゲン化キサンテンを約１％以上含む、病巣内注射に適した水性組成物（即ち、ＰＶ−１０）、又は別のハロゲン化キサンテンの類似の溶液、又はそれらの混合物である。この組成物中において、二ナトリウム塩又は二カリウム塩等の、ハロゲン化キサンテンの薬学的に許容可能な塩を使用することができる。
【００６５】
約１％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）を超えるハロゲン化キサンテンの量は、ケモアブレーションの用途において特に有用である。なぜなら、それより低い濃度は、標的組織の破壊（アブレーション）を直接的に惹起するには一般に不十分であるためである。従って、好適な実施形態において、ハロゲン化キサンテンの濃度は、約３％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは、約３％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）である。別の実施形態において、ハロゲン化キサンテンの濃度は、約１０％（ｗ／ｖ）〜約２０％（ｗ／ｖ）である。更に別の実施形態において、ハロゲン化キサンテンの濃度は、約１０％（ｗ／ｖ）である。
【００６６】
ＩＬ又はその他の非経口投与によって投与される、ケモアブレーション用医薬組成物の一般的な用量は、約０．１ｍＬ／ｃｃ病変体積（ｌｅｓｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）〜約２ｍＬ／ｃｃ病変体積であり、より好ましくは約０．２５ｍＬ／ｃｃ〜約０．７５ｍＬ／ｃｃ病変体積であり、最も好ましくは約０．５ｍＬ／ｃｃ病変体積である。このような用量は、一般的に、約１０ｍｇ〜約１５００ｍｇのハロゲン化キサンテンによる患者用量（ｐａｔｉｅｎｔ  ｄｏｓｅ）（肝臓の診断試験に使用される用量よりも大幅に高用量である）に相当する。
【００６７】
企図された医薬組成物は、安定性も高く、製造および使用の双方において容易に取り扱うことができる。これらの好ましい濃度は、重量対体積（ｗ／ｖ）で表現されるが、重量対重量（ｗ／ｗ）で表現しても実質的には同等である。
【００６８】
本明細書において有用である好適なハロゲン化キサンテンは、下記の化学式１の化合物であり、化学式１中、Ｒ１は、独立的にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、独立的にＣｌ、Ｈ、又はＩであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうち少なくとも１つの置換基はＩであるとともに、少なくとも１つの置換基はＣｌ又はＨであり、Ｒ６は独立的にＨ又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ１１はＨ又はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒ１２はＨ又はＣ１−Ｃ７のアシル基である。また、好適なハロゲン化キサンテンは、（ａ）互変異性形態、（ｂ）アトロプ異性体、（ｃ）下記の化学式２に示される閉鎖したラクトン形態、（ｄ）化学式２に示されるラクトン形態の鏡像異性体、及び（ｅ）それらの薬学的に許容可能な塩の全てである。
【００６９】
【化１】
0006773788.tif 000002
【００７０】
【化２】
0006773788.tif 000003
【００７１】
使用される好適なケモアブレーション用ハロゲン化キサンテンは、好ましくは、薬学的に許容可能な希釈剤に溶解又は分散された、ローズベンガル（４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン）、エリスロシンＢ、フロキシンＢ、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’，７’−テトラヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７−ペンタクロロ−４’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，４’，５，６，７−ペンタクロロ−２’，５’，７’−トリヨードフルオレセイン、２’，４，５，６，７，７’−ヘキサクロロ−４’，５’−ジヨードフルオレセイン、４，４’，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−２’，７’−ジヨードフルオレセイン、２’，４，５，５’，６，７−ヘキサクロロ−４’，７’−ジヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラクロロ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセイン、４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，５’−トリヨードフルオレセイン、及び４，５，６，７−テトラブロモ−２’，４’，７’−トリヨードフルオレセインの内の１つ以上である。ローズベンガルは、特に好適なハロゲン化キサンテンである。
【００７２】
企図されたケモアブレーション用医薬組成物は、一般的には、腫瘍への注射［病巣内（ＩＬ）投与］のような非経口投与を意図したものであるため、このような組成物は電解質を含有するべきであり、好ましくはほぼ生理的な浸透圧及びｐＨ値を有する。ケモアブレーション用医薬組成物中の一価電解質イオンの濃度は、好ましくは約０．５〜約１．５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは約０．８〜約１．２％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは約０．９％（ｗ／ｖ）である。約０．９％（ｗ／ｖ）の濃度は、ほぼ等張液に相当するため、特に好適である。更なる好適な実施形態において、ケモアブレーション用医薬組成物中の電解質は塩化ナトリウムである。
【００７３】
このような電解質レベルでは、ＩＬケモアブレーション用医薬組成物の浸透圧が増大する。従って、電解質濃度の範囲を特定するかわりに、浸透圧を用いて組成物の電解質レベルをある程度特徴付けることができる。好ましくは、組成物の浸透圧は約１００ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、より好ましくは組成物の浸透圧は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇより大きく、最も好ましくは約３００〜約５００ｍＯｓｍ／ｋｇである。
【００７４】
ハロゲン化キサンテンの水性賦形剤への溶解度を最大化し、生体組織への親和性を確保するには、ケモアブレーション用医薬組成物のｐＨ値は、約４〜約９であることが好ましい。特に好ましいｐＨ値は、約５〜約８であり、より好ましくは約６〜約７．５の間である。これらのｐＨ値において、ハロゲン化キサンテンは通常、ｐＨ値が低いときに形成される水不溶性ラクトンではなく、二塩基性形態のままである。
【００７５】
ケモアブレーション用医薬組成物のｐＨ値は、当業者に周知のあらゆる適切な手段によって制御又は調整することができる。酸又は塩基などの追加により、組成物を中和するか、またはｐＨ値を調整することができる。ハロゲン化キサンテン又はその生理的に許容可能な塩は弱酸であるから、ハロゲン化キサンテンの濃度及び／又は電解質の濃度によっては、組成物のｐＨ値のために中和剤及び／又はｐＨ調整剤を使用せずにすむ可能性がある。しかしながら、組成物は、投与されてから生体環境に適合できるよう、いかなる中和剤も含まないことが特に好ましい。
【００７６】
本明細書に参照により組み込まれた特許文献１０に開示されている通り、ケモアブレーション用医薬組成物は、好ましくは、黒色腫、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、結腸がん、大腸がん、胆嚢がん、原発性または転移性肝がん（肝細胞がん）、及び小細胞並びに非小細胞肺がん等の少なくとも１つのがん性固形腫瘍内へ病巣内（ＩＬ）投与される。本明細書では、本発明の好適な実施形態を、特に黒色腫と関連づけて例示的に説明する。
【００７７】
企図された医薬組成物は体内（非経口）ルートであるＩＬ投与用であるから、さらに好ましくは、米国薬局方（ＵＳＰ：U.S. Pharmacopeia）＜７１＞の適合に求められるように滅菌されており、さらに含有される発熱性物質のレベルは、ＵＳＰ＜８５＞（リムルス変形細胞溶解物分析）、またはＵＳＰ＜１５１＞（ウサギ発熱性試験）、またはこれらと実質的に同等な要件に適合するような無視できるレベルであり、発熱物質またはエンドトキシンのレベルは１ｍＬあたり１０エンドトキシン単位（ＥＵ）以下（ＮＭＴ：not more than）である。更に、医薬組成物は、ＵＳＰ＜７８８＞に規定される粒子状物質含有量の制限要件（即ち、容器当たり、１０ミクロンを超える大きさの粒子が３０００個以下、２５ミクロンを超える大きさの粒子が３００個以下）または実質的に同等の要件に適合すべきである。ＵＳＰからのこれらの参照情報はそれぞれ、本明細書に参照により組み込まれる。
【００７８】
企図されたハロゲン化キサンテン化合物を含有する医薬組成物が投与される（処置が必要な）がん腫瘍を有し、誘導性免疫抗がん成分を含有する末梢血のアリコート、腫瘍組織、又はリンパ系組織のうちの１以上を含むサンプルが取り出される宿主動物は、概ね任意の哺乳動物とすることができる。例示的な哺乳類の宿主動物には、ヒトなどの霊長類、チンパンジーまたはゴリラなどの類人猿、カニクイザルまたはマカクなどの猿、ラット、マウスまたはウサギなどの実験動物、犬、猫、馬などのコンパニオン動物、あるいは、雌牛又は去勢雄牛、羊、子羊、ブタ、ヤギ、ラマなどの食用動物が含まれる。
【００７９】
培養及び選択的な拡張等において、インビトロでの哺乳動物細胞の接触が企図される場合、以下に示すように、例示的な哺乳類由来のがん細胞の組織培養が頻繁に利用される。
【００８０】
所望であれば、宿主動物から切除された腫瘍に、医薬組成物中に溶解又は分散された腫瘍アブレーション量のハロゲン化キサンテン化合物を含有するケモアブレーション用医薬組成物をインビトロで投与した後、後に更なる免疫反応を惹起するために宿主動物内の腫瘍に投与される誘導性免疫抗がん成分を形成するために、前述の通りにインビトロで培養（維持）することができる。
【００８１】
企図された組成物は、所与の腫瘍に１回のみ投与されればよいことが多いものの、数日間、数週間、又は数ヶ月間にわたって当該腫瘍に複数回投与されることが可能である。宿主動物内の別個の腫瘍は、それぞれ１回以上の投与を受けることができる。
【００８２】
企図されたハロゲン化キサンテン化合物の医薬組成物は、好ましくは、処置対象のがん腫瘍内へ直接注射されることにより、非経口的に投与される。本明細書で使用される非経口という用語には、血管内および病巣内の注射又は注入技術、並びに、皮下投与、腹腔内投与、又は類似の投与様式が含まれる。薬品の製剤については、例えば、Hoover、John E.、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania；1975、及び、Liberman、H.A. and Lachman、L.、Eds.、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker、New York、N.Y.、1980において述べられている。
【００８３】
注射可能製剤として、例えば、適切な分散化合物又は湿潤化合物及び懸濁物質を用いて、公知の技術に従い滅菌注射可能水性懸濁液を製剤化することができる。滅菌注射可能製剤はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射可能溶液又は懸濁液であり得る。使用することができる許容可能な賦形剤及び溶媒には、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液、リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。液体医薬組成物には、例えば、非経口投与に適した溶液が含まれる。活性成分の滅菌水溶液、あるいは、水、エタノール、ＤＭＳＯ又はプロピレングリコールを含む溶媒中の活性成分の滅菌溶液は、非経口投与に適した液体組成物の例である。
【００８４】
滅菌溶液は、活性成分を所望の溶媒系に溶解し、次いで得られた溶液をメンブレンフィルタに通して滅菌するか、あるいは無菌条件下で事前に滅菌した溶媒に滅菌化合物を溶解することによって調製することができる。
【００８５】
好ましくは、医薬組成物は単位用量形態である。そのような形態では、組成物は、適切な量のハロゲン化キサンテン腫瘍アブレーション化合物を含有する単位用量に分割される。単位用量形態は、パッケージ化された製剤であってもよく、パッケージは、例えば、バイアル又はアンプル中に別個の量の製剤を含有する。
【００８６】
考察
ＩＬ治療は、例示的な黒色腫の患者に対する外科的介入に代わるものである。しかしながら、全身性の反応及びバイスタンダーである未処置の病変の退縮を誘導した病巣内の化合物は、ごく僅かである。ＩＬ治療に組み込まれているいくつかの既存の化合物は、理想的でない。
【００８７】
例えば、ＢＣＧは、アナフィラキシー反応、セロコンバージョン、及び全身性感染症を含む多数の合併症と関連している［Abbott他、Surg Clin North Am 94：1003-1015、viii（2014）］。ＢＣＧはまた、黒色腫の処置における最大の研究の１つにおいても有効性を示すことができなかった［Agarwala他、Cancer 100：1692-1698（2004）］。病巣内ＩＬ−２は、処置された黒色腫患者の６２．５％において完全奏功（complete response）をもたらしたが、全身性の腫瘍特異的反応を惹起することはできなかった［Radny他、Br J Cancer 89：1620-1626（2003）］。
【００８８】
ＩＬ治療の新しい候補として、ＰＶ−１０は、重大な副作用を引き起こさずに腫瘍細胞を溶解する能力を実証している。最近行われた転移性黒色腫の処置のためのＰＶ−１０の第２相臨床試験では、最大１０個の標的病変において、中等度の副作用を伴う、５０％の全奏効（overall response）率及び２６％の完全奏功率が示された［Thompson他、Ann Surg Oncol.（2014）］。処置された患者のうちの８％は、５２週間後に無病生存状態（no evidence of disease）であった。
【００８９】
第１相試験では、９１．７％の全病変奏功が示された（注射された病変１１個のうち、１０個が処置後１４日以内に退縮した）。これらの両方の試験において、未処置の病変も退縮することが実証された（それぞれ２３％及び８３％）。これらのデータは、ＩＬ  ＰＶ−１０によって誘発された、バイスタンダー腫瘍の腫瘍特異的全身反応が存在することを示唆している。
【００９０】
ＰＶ−１０誘導性腫瘍特異的免疫の機序は、その多くが不明のままである。以前のＢ１６及びＭＴ−９０１保有マウスの研究では、ＰＶ−１０のＩＬ注射後の腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化が実証された［Toomey他、PloS One 8：e68561（2013）］。別の研究では、ＩＬ  ＰＶ−１０で処置した患者の黒色腫病変内へのリンパ球の浸潤が調査された。しかしながら、ＩＬ  ＰＶ−１０後に病変が減少した一部の患者のアブレーションされた病変中において、リンパ球は検出されなかった。［Sarnaik他、ASCO Annual Meeting、Abstract 9028、2014年6月2日発表］。これは、ＰＶ−１０の細胞毒性又は処置後の腫瘍サイズの縮小が原因となっている可能性がある。予期せぬことに、これらの同一の患者の末梢血中において、循環ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加、並びに、自己腫瘍又はＨＬＡ適合腫瘍に対するＩＦＮ−γ反応の増加が測定された。
【００９１】
ＩＬ  ＰＶ−１０処置後に腫瘍特異的Ｔ細胞（ＯＴ−１Ｔ細胞）が増加し、記憶特性を有するＴ細胞がより多く存在することを、ＯＶＡ発現Ｍ０５黒色腫を保有するマウスを用いて以下に示す。ＰＶ−１０処置後のＭ０５保有マウスへのＯＴ−１Ｔ細胞の養子移植では、ＯＴ−１Ｔ細胞が腫瘍抗原に反応してより急速に増殖することが示された。これらの効果は、腫瘍から流入領域リンパ節（ＤＬＮ）への樹状細胞（ＤＣ）の浸潤の増加及びＤＣの活性化によって部分的に説明することができる（図４）。
【００９２】
ＨＭＧＢ１タンパク質は、腫瘍発生及びがん治療の間に、腫瘍促進及び腫瘍抑制の両方の役割を果たしている。一方では、ＨＭＧＢ１の機能不全は、がんの各特徴に関連し、抗腫瘍免疫を低下させる可能性がある［Kusume他、Pathobiology 76：155-162（2009）；Liu他、Leukemia 25：23-31（2011）］。分泌されたＨＭＧＢ１のレベルの増加及び膜結合ＨＭＧＢ１の発現は、腫瘍微小環境において検出される［Tang他、Biochim Biophys Acta 1799：131-140（2010）］。
【００９３】
他方で、ＨＭＧＢ１は、腫瘍抑制因子−網膜芽細胞腫タンパク質との関連［Jiao他、Acta Pharmacol Sin 28：1957-1967（2007）］又はゲノムの安定化［Giavara他、Curr Biol 15、68-72（2005）］により、抗腫瘍の役割を果たす。多形性膠芽腫を保有するマウスにおいて、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）及びチミジンキナーゼの局所送達は、瀕死の腫瘍細胞からのＨＭＧＢ１の放出によって腫瘍浸潤ＤＣが活性化されることで、腫瘍退縮をもたらす［Curtin他、PLoS Med 6、el0（2009）］。ＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４経路の遮断は、ＤＣの抗原処理及び交差提示能力の干渉を介して、化学療法及び放射線療法の際の腫瘍特異的免疫反応を無効にする［Apetoh他、Nature Med 13：1050-1059（2007）］。加えて、ＴＩＭ−３は、ＤＣ中のＨＭＧＢ１媒介核酸センサー系を阻害するため、ＤＮＡワクチン及び化学療法の効力を低下させる可能性がある［Chiba他、Nature Immunol 13：832-842（2012）］。
【００９４】
後述の研究では、ＰＶ−１０とのインキュベーション後の黒色腫細胞の上清中におけるＨＭＧＢ１の放出の増加を測定した。これらのデータは、光線力学的照射後に１時間ローズベンガルアセテート（rose bengal acetate）で処置されたヒーラ細胞から、ＨＭＧＢ１が受動的に放出されたという知見と一致する［Panzarini他、PloS One 9：el05778（2014）］。
【００９５】
Panzarini他の研究では、ローズベンガルアセテートで処置することにより、光増感されたヒーラ細胞がアポトーシス性及びオートファジー性の細胞となるとともに、当該細胞からＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０及びＨＭＧＢ１が分泌された。対照的に、今回の研究の結果では、ＰＶ−１０とのインキュベーション後にＨＳＰ９０のレベルが変化しておらず、且つ、ＨＳＰ７０の分泌が減少したことが示された。この相違は、細胞の処置方法の違い、及び、使用されたローズベンガルの類似体の違いに起因している可能性がある。
【００９６】
更に、患者の血清中のＨＭＧＢ１レベルは、ＩＬ  ＰＶ−１０後に増加した。これらの結果は、化学放射線療法後のがん患者の血清中のＨＭＧＢ１レベルの増加を示す別の研究と一致する［Suzuki他、Cancer Res 72：3967-3976（2012）］。従って、Suzukiと彼の同僚は、抗原特異的Ｔ細胞反応を有する患者のＨＭＧＢ１レベルが、抗原特異的Ｔ細胞反応を有さない患者のＨＭＧＢ１レベルよりも有意に高いことを見出した。彼らの研究において、ＨＭＧＢ１の免疫組織化学分析は、切除された腫瘍サンプルにおけるＨＭＧＢ１のより高い発現が、患者のより良好な生存率と相関することを示した。
【００９７】
以下の研究は、ＰＶ−１０で処置した腫瘍細胞の上清中のＨＭＧＢ１が、ＢＭ由来ＤＣ上のＣＤ４０発現の上方制御、及び、ＤＣによる抗原提示の増加に関与していることを示した。これは、ＨＭＧＢ１がヒト骨髄性ＤＣ及び形質細胞様ＤＣの活性化にとって重要であるという知見と一致する［Dumitriu他、J Immunol 174：7506-7515（2005）；Messmer他、J Immunol 173：307-313（2004）］。
【００９８】
ＣＤ４０シグナル伝達を伴うＤＣの成熟は、腫瘍抗原の提示、及び、腫瘍組織への移動後の細胞傷害活性のためのＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングに不可欠である［Watanabe他、J Immunol 171：5828-5836（2003）］。Watanabeは、ＤＣにおける短期間のＣＤ４０シグナル伝達が、腫瘍ＤＬＮへのＤＣの移動を増大させ、防御免疫を首尾よく誘導することを見出した。さらに、ＨＭＧＢ１は、ケモカインリガンド９（ＣＣＬ９）及びケモカインＣＸＣモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）に対するＤＣの反応を誘導することが示されており［Dumitriu他、J. Leuk Biol 81：84-91（2007）］、また、ＨＭＧＢ１／ＲＡＧＥ間の相互作用は、皮下注射されたＤＣのＤＬＮへの移動を２４時間後に誘導することができる［Manfredi他、J Immunol 180：2270-2275（2008）］。これは、ＩＬ  ＰＶ−１０が腫瘍部位からＤＬＮに移動するＤＣ数の増加を誘導したという我々のデータと一致する。ＨＭＧＢ１とＲＡＧＥ受容体との相互作用もこの過程に関与している可能性がある。
【００９９】
がんにおけるＨＭＧＢ１の２つの役割は、それが作用する標的細胞、腫瘍細胞又は免疫細胞、それが相互作用する受容体、及びサイトカインとの相乗作用に左右される。これは、ＨＭＧＢ１の酸化還元状態によって部分的に説明することができる：アポトーシス細胞からの酸化ＨＭＧＢ１は、免疫寛容を誘導する［Kazama他、Immunity 29：21-32（2008）］。ＰＶ−１０で処置した腫瘍によって分泌されたＨＭＧＢ１の酸化還元状態、並びに、本発明の基礎を成す研究に含まれていない、尿酸やカルレティキュリンのような他のＤＡＭＰについては、調査が進められていくであろう。
【０１００】
本研究は、ＩＬ  ＰＶ−１０治療が、黒色腫の患者において、増強された腫瘍特異的免疫反応を惹起できることを示している。黒色腫保有マウスにおいて、ＩＬ  ＰＶ−１０は腫瘍細胞のネクローシスを誘導して、ＤＣの活性化及びＤＣのＤＬＮへの浸潤に不可欠なＨＭＧＢ１を放出させ、それによって腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化する。抗腫瘍免疫の誘導におけるＩＬ  ＰＶ−１０の役割はまた、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２等の免疫チェックポイント分子の阻害との組み合わせにおいて、腫瘍特異的免疫反応を増強する可能性も示唆している。
【０１０１】
結果
ＩＬ  ＰＶ−１０は、黒色腫の患者において全身性免疫反応を引き起こす。
【０１０２】
転移性黒色腫の処置におけるＰＶ−１０のＩＬ注射の潜在的機序を調べるために、真皮内及び／又は皮下転移性黒色腫を有する１４人のヒト患者を含むパイロット臨床試験を行った（以下の表１）。研究の概要を図１Ａに示す。各患者の２つの研究対象病変を生検前処理によってサンプリングした。
【０１０３】
【表１】
0006773788.tif 000004
【０１０４】
７日後［試験ゼロ日目（Ｄ０）］、２つの病変の内の１つにＩＬ  ＰＶ−１０を注射した。ＰＶ−１０注射の７〜１４日後に、両方の部位を完全に切除した。生検標本を固定し、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して、病理医による評価を行った。ＩＬ  ＰＶ−１０注射の前後で、処置された標本及び未処置の標本における病理学的完全奏功（ｐＣＲ）の比較を行い、その結果を黒色腫抗原Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１（ｍｅｌＡ）に対する免疫組織化学的染色で確認した。
【０１０５】
図１Ｂ及び図１Ｃに示す通り、ＰＶ−１０処置された病変及びバイスタンダー病変の両方において、腫瘍は完全に退縮した。この退縮は、１２人の患者のうち４人に認められた。加えて、１２人の患者のうち１１人は、注射された病変の少なくとも部分的な退縮を示し、ｍｅｌＡ＋細胞の頻度が４分の１に低下した（平均値：２６．８±３．６対６．４±２．８）。さらに、１２人の患者のうち１０人は、バイスタンダー病変の部分的な退縮を示し、ｍｅｌＡ＋細胞の割合が３分の１に減少した（平均値：３７．５±６．７対１２．２±４．１）。
【０１０６】
これらの結果は、ＩＬ  ＰＶ−１０が、ＩＬ  ＰＶ−１０の注射による直接的なアブレーションに続発する全身反応を誘導可能であることを示している。免疫細胞の役割を調べるために、ＰＶ−１０で処置された病変及びバイスタンダー病変中のＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を、ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の前後に比較した。しかしながら、腫瘍が完全に退縮した際に、病変中においてこれらの浸潤はほとんど検出されず、有意な変化は測定されなかった。
【０１０７】
次に、ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の前後で末梢血中の免疫細胞を調べた。ＰＶ−１０処置後に、循環ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＮＫＴ細胞は有意に増加した（図１Ｄ〜１Ｆ）。
【０１０８】
ＣＤ８＋Ｔ細胞が黒色腫腫瘍を認識できるか否かを判定するために、循環ＣＤ８＋Ｔ細胞を精製し、インビトロで自己腫瘍細胞と共培養した。ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の後にインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生が有意に増加し（図１Ｇ）、ＰＶ−１０処置が腫瘍特異的免疫反応を増強することが示された。
【０１０９】
自己腫瘍は全ての患者に対して使用可能ではなかったため、ＨＬＡ適合腫瘍細胞株も使用した。試験を行った６人の患者のうち４人において、ＩＬ  ＰＶ−１０注射後に、循環ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ−γレベルが増加した。ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ不適合細胞株と共培養した場合、変化は測定されなかった。総合すると、これらの研究は、ＩＬ  ＰＶ−１０注射が黒色腫患者において腫瘍特異的免疫反応を増強することを実証している。
【０１１０】
Ｍ０５保有マウスにおけるＩＬ  ＰＶ−１０は、腫瘍特異的免疫反応を惹起する。
【０１１１】
ＰＶ−１０によって惹起された腫瘍特異的免疫反応の発現機序を調査するために、Ｍ０５腫瘍細胞を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスを使用した。Ｍ０５腫瘍細胞は、オボアルブミン（ＯＶＡ）タンパク質を発現するＢ１６黒色腫細胞である。Ｂ１６モデル［Toomey他、PloS one 8：e68561（2013）］における研究結果と同様に、ＰＶ−１０のＩＬ注射は腫瘍の増殖を直接的に阻害した（図２Ａ）。ＩＬ  ＰＶ−１０治療は、ＰＢＳ処置群と比較して、ＰＶ−１０処置マウスの流入領域リンパ節（ＤＬＮ）におけるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加をもたらした（図２Ｂ）。
【０１１２】
ＰＶ−１０のＩＬ注射が記憶特性を有するＴ細胞を誘導したか否かを判定するために、ＩＬ  ＰＶ−１０で２回処置したマウスからの脾細胞を、ＯＶＡペプチド、並びに、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の維持に必要とされるサイトカインＩＬ−１５及びＩＬ−２１を添加した培地の存在下において、インビトロで培養した［Nguyen他、J Leukocyte Biol 87：43-49（2010）］。ＰＶ−１０処置マウスからのＴ細胞は、ＰＢＳ処置マウスから分離されたＴ細胞と比較して、Ｍ０５細胞に対するＩＦＮ−γの分泌が約２倍多いことが実証された。これは、ＩＬ  ＰＶ−１０が、Ｍ０５黒色腫保有マウスにおいて、記憶特性を有する腫瘍特異的Ｔ細胞を誘導できることを示している。
【０１１３】
ＩＬ  ＰＶ−１０の後のＣＤ８＋Ｔ細胞の反応をモニターするために、１３日目にＰＶ−１０又はＰＢＳをＭ０５黒色腫保有マウスに注射し、Celltracker（登録商標）の紫色色素で標識したＯＴ−１Ｔ細胞を養子移植した。ＯＴ−１Ｔ細胞は、ＯＶＡタンパク質由来のＯＶＡ  ２５７−２６４ペプチドを特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞である［Rotzschke他、Eur J Immunol 21（11）：2891-2894（1991）；Lipford他、J Immunol. 150（4）：1212-1222（1993）］。ＰＶ−１０のＩＬ注射とＯＴ−１細胞の養子移植との組み合わせは、腫瘍進行を有意に妨げると共に、生存率を有意に向上させた（図３Ａ及び３Ｂ）。
【０１１４】
平均腫瘍サイズが５２ｍｍ２である１３日目に処置が開始された際、ＯＴ−１細胞の養子移植のみ、又は、ＩＬ  ＰＶ−１０による処置のみでは、腫瘍の進行を防止するのに十分ではなかった。腫瘍、リンパ節（ＬＮ）、及び脾臓におけるＯＴ−１Ｔ細胞の増殖を、注射したＣＤ４５．１＋ＯＴ−１Ｔ細胞の色素希釈の測定により、ＩＬ  ＰＶ−１０注射後に調べた（図３Ｃ）。ＯＴ−１細胞は、移植後４日目にＰＶ−１０処置マウス又はＰＢＳ処置マウスの腫瘍部位及び近位リンパ節の両方で活発に増殖し、７０％を超える細胞が少なくとも１度更に分裂していた（移植前の細胞と比較して、以下、「分裂後の」Ｔ細胞と呼ぶ）（図３Ｄ）。
【０１１５】
ＰＢＳで処置したマウスと比較して、ＩＬ  ＰＶ−１０で処置したマウスの脾臓、腫瘍、及び遠位ＬＮでは、より多くの数の分裂後のＴ細胞が測定された（図３Ｃ〜Ｆ）。近位ＬＮにおいて変化は見られなかったが（データは示さず）、これは、流入領域ＬＮにおけるＯＴ−１Ｔ細胞反応があまりにも強いために、処置マウスと非処置マウスとの間の差異を測定できなかった可能性があることを示している。総合すると、これらのデータは、ＰＶ−１０のＩＬ注射が、Ｍ０５保有マウスにおいて腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を増強可能であり、それによって腫瘍進行を防止できることを示している。
【０１１６】
ＩＬ  ＰＶ−１０は、樹状細胞（ＤＣ）の活性化をもたらす。
【０１１７】
ＤＣは、Ｔ細胞をプライミング可能なプロフェッショナル抗原提示細胞であるため、ＩＬ  ＰＶ−１０処置後に脾臓及びＬＮ中のＤＣの存在を調べた。ＰＶ−１０注射後７日目において、脾臓中のＤＣの絶対数およびパーセンテージに変化はなかった。以前の知見と一貫して、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を含む他の免疫サブセットについても変化はなかった（データは示さず）［Toomey他、PloS one 8：e68561（2013）］。
【０１１８】
しかしながら、ＰＶ−１０処置の２４時間後（即ち、約１日後）に、非流入領域ＬＮ（ＮＤＬＮ）中の浸潤ＤＣの数は増加しなかったが、流入領域ＬＮ（ＤＬＮ）中の浸潤ＤＣの数は増加した（図４Ａ）。ＤＬＮ中の細胞の全総数は、処置後に有意に変化しなかった。７２時間後、ＰＶ−１０処置マウスのＤＬＮ中の浸潤ＤＣの数は、ＰＢＳ処置マウスにおけるレベルと同様のベースレベルまで低下し、ＤＣの浸潤が一時的であることが示唆された。
【０１１９】
ＤＣが腫瘍部位から浸潤したか否かを調べるために、ＰＶ−１０又はＰＢＳのＩＬ注射の４時間後に、ＦＩＴＣで標識されたＯＶＡタンパク質（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）をＩＬ注射した。ＰＶ−１０処置マウスのＤＬＮにおいてＦＩＴＣ＋ＤＣの増加が測定されたが、ＮＤＬＮでは測定されず（図４Ｂ）、ＩＬ  ＰＶ−１０が、抗原を取り込むと共に腫瘍部位からＤＬＮに浸潤するようにＤＣを誘導可能であることが示唆された。
【０１２０】
ＩＬ  ＰＶ−１０処置後にＤＬＮにおいてＯＴ−１Ｔ細胞の増殖の増強及びＤＣの浸潤の増加が測定されたため、ＰＶ−１０のＩＬ注射は腫瘍特異的反応に必要とされるＤＣの活性化を引き起こすという仮説がたてられた。この仮説を検証するために、ＢＭ由来ＤＣを、事前にＩＬ  ＰＶ−１０又はＰＢＳが注射されたＢ１６腫瘍からの上清と共培養した。
【０１２１】
ＤＣをＯＶＡタンパク質でパルスした後、ＤＣをＯＴ−１Ｔ細胞と共培養した。ＰＶ−１０処置マウスからのＢ１６腫瘍由来の上清と培養したＤＣは、ＰＢＳ処置マウスからのＢ１６腫瘍由来の上清と培養したＤＣと比較して、ＯＴ−１Ｔ細胞の増殖を増加させた（図４Ｃ）。加えて、ＰＶ−１０処置細胞の細胞溶解物でパルスしたＤＣは、ＰＢＳ処置細胞の細胞溶解物でパルスしたＤＣよりも、ＯＴ−１Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をより良好に刺激することができた（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、ＤＣの活性化及び腫瘍部位からＤＬＮへのＤＣの浸潤の増加におけるＩＬ  ＰＶ−１０の役割を裏付けている。
【０１２２】
ＰＶ−１０処置はＨＭＧＢ１を介してＤＣの活性化を増加させる。
【０１２３】
ＩＬ  ＰＶ−１０によって誘導された腫瘍の死がＤＣの活性化とどのように関連している可能性があるのかを調べるために、腫瘍細胞によって放出されるＤＣの活性化に寄与することが可能な潜在因子と同様に、ＰＶ−１０媒介性細胞死を調査した。
【０１２４】
第１に、ＰＶ−１０によって媒介されたマウス黒色腫Ｂ１６細胞の細胞毒性をインビトロで調査した。図５Ａに示す通り、ＰＶ−１０はＢ１６細胞において用量依存性の細胞毒性を示し、４８時間処置した後のＩＣ５０値は６０μＭであった。マウス胚性ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞においては、細胞毒性はより低く、ＰＶ−１０で４８時間処置した後のＩＣ５０値は１１０μＭであった（図５Ａ）。６、１２、及び２４時間の場合においても、Ｂ１６細胞及び３Ｔ３細胞におけるＰＶ−１０のＩＣ５０値は同様であった。
【０１２５】
５０μＭのＰＶ−１０で４８時間処置した後、３Ｔ３細胞又はヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞にはほとんど影響がなかったが、Ｂ１６細胞及びヒト原発性黒色腫（Ｐ）細胞のネクローシス（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジラクテート染色；ＤＡＰＩ＋）は有意に増加した（図５Ｂ）。しかしながら、比較的少ない割合の細胞が、アネキシンＶ＋（登録商標）ＤＡＰＩ−（BioVision, Inc.、Milpitas CA；図５Ｃ）によって証明される初期アポトーシス段階であった。これは、処置の６、１２、及び２４時間後にも生じた。この結果は、５０μＭのＰＶ−１０による処置が、アポトーシスよりもむしろネクローシスによる細胞死をもたらすことを示している。同じ用量のＰＶ−１０の存在下において、ネクローシス性又はアポトーシス性である３Ｔ３線維芽細胞及びヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞は極僅かであった（図５Ｂ及び５Ｃ）。これらの研究は、ＰＶ−１０が、非腫瘍細胞に対しては有毒でない特定の用量で腫瘍細胞を死滅させることができることを示している。
【０１２６】
ネクローシスは、細胞膜の完全性の損失、及び細胞外空間への細胞質内容物の無制御な放出と関連し得ることが以前に示されている。ＰＶ−１０で処置した腫瘍細胞が、何らかのダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）を放出したか否かを次に調べた。
【０１２７】
ＨＭＧＢ１、ＩＬ−１ａ、及びＨＳＰタンパク質などのＤＡＭＰは、ネクローシス及びＤＣの活性化による刺激の既知の副産物である。Ｂ１６、８８８黒色腫細胞及び３Ｔ３線維芽細胞を、０、１００又は２００μＭのＰＶ−１０で４８時間処置した。等量の上清を、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０又はＩＬ−１ａについて免疫ブロットした。ＰＶ−１０で処置を行うことにより、Ｂ１６細胞及びヒト黒色腫８８８細胞からＨＭＧＢ１が用量依存的に上清中に放出されたが、３Ｔ３細胞からは放出されなかった（図６Ａ及び６Ｂ）。ＨＳＰ７０及びＩＬ−１αは検出されず、ＨＳＰ９０はＰＶ−１０による処置後も変化しなかった（データは示さず）。
【０１２８】
分泌されたＨＭＧＢ１がＤＣの活性化に寄与したか否かを判定するために、骨髄（ＢＭ）由来ＤＣを、ＨＭＧＢ１中和抗体又はアイソタイプコントロール抗体の存在下で２日間ＰＶ−１０によって処置されたＢ１６細胞からの１０％上清（ＴＳ）と共にインキュベートした。ＨＭＧＢ１中和抗体は、ＲＡＷ２６４．７マクロファージからのＴＮＦ−αの分泌の遮断によって有効性が確認された。
【０１２９】
ＰＶ−１０処置細胞からの腫瘍上清は、表面ＣＤ４０が上方制御されたＤＣの成熟をもたらした。ＨＭＧＢ１の中和は、ＣＤ４０の発現を有意に減少させた（図６Ｃ）。ＰＶ−１０で直接ＤＣを処置した場合には、ＣＤ４０の発現は変化せず、ＰＶ−１０自体はＤＣの成熟に影響を与えないことが示唆された。ＣＤ８６及びＣＤ８０を含むＤＣ上の他の共刺激マーカは、上方制御されなかった。
【０１３０】
ＤＣの抗原提示能力を比較するために、ＢＭ由来ＤＣを、ＨＭＧＢ１中和抗体又はアイソタイプコントロール抗体の存在下で２日間ＩＬ  ＰＶ−１０によって処置されたＭ０５腫瘍からの上清と共にインキュベートした。前処置されたＤＣをＯＶＡタンパク質でパルスし、次いでＯＴ−１細胞と共培養して、ＯＴ−１Ｔ細胞の増殖を調べた。ＨＭＧＢ１の遮断は、［３Ｈ］チミジン取込みによって判定されるように、ＯＴ−１Ｔ細胞の増殖を刺激するＤＣの能力を低下させた（図６Ｄ）。この結果は、黒色腫細胞などの腫瘍細胞をＰＶ−１０で処置することによって、ＤＣの活性化に不可欠なＨＭＧＢ１の放出がもたらされることを示している。
【０１３１】
ＨＭＧＢ１の放出がＩＬ  ＰＶ−１０で処置された患者に関連していたか否かを判定するために、ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の前後の患者の血清中のＨＭＧＢ１のレベルを、患者の血清中のＩＦＮ−γを測定することで比較した。患者の血清中のＨＭＧＢ１の濃度は、ＩＬ  ＰＶ−１０による処置の７〜１４日後に採取したサンプルにおいて有意に上昇した（図７）。従って、ＨＭＧＢ１の分泌は、ＰＶ−１０でＩＬ処置された転移性黒色腫等の腫瘍を有する患者においてバイスタンダー効果に寄与すると考えられる。
【０１３２】
実施例
以下の実施例は、例示を目的としたものであって、限定を目的としたものではなく、また、本発明の特定の実施形態を示すものである。
【０１３３】
一般的な方法
ヒト被験者
真皮内及び／又は皮下転移性黒色腫を有する１４人の患者が、第１相臨床試験に登録された。（NCT01760499）。１４人の患者のうち６人が、以前のイピリムマブ、抗ＰＤ−１及び／又はベムラフェニブ治療に対して抵抗性の転移性疾患を有していた（表１）。各患者の２つの腫瘍病変を生検前処理によってサンプリングした。２つの病変のうちの１つにＩＬ  ＰＶ−１０を注射した後、７〜１４日後に両方の残存部位を完全に切除した。生検標本をホルマリン中に固定し、パラフィンに包埋した。標本を厚さ５〜８μｍの切片にして、病理学的完全奏功の判定のためにヘマトキシリン及びエオシン染色で染色した。
【０１３４】
ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ５６及びｍｅｌＡを用いて免疫組織化学を行った。末梢血及び血清を、ＩＬ  ＰＶ−１０注射の前、ＩＬ  ＰＶ−１０注射の７〜１４日後、及びＩＬ  ＰＶ−１０注射の２１〜２８日後に分析のために採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ficoll-Paque（登録商標）Plus（GE Healthcare、Pittsburgh、PA）によって分離した。血液を室温で１時間インキュベートし、１０００×ｇで遠心分離を行った後、上清を回収することによって血清を調製した。
【０１３５】
動物
雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）をHarlan Laboratories（Indianapolis、IN）から購入した。マウスは、H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Instituteの動物研究施設に収容された。マウスは、米国獣医学会（American Veterinary Medical Association）のガイドラインに従って、ＣＯ２吸入により人道的に安楽死させられた。マウスを毎日観察し、孤立性皮下腫瘍の面積が２００ｍｍ２を超えた場合、又はマウスが転移性がんに似た兆候を示した場合には、マウスを人道的に安楽死させた。全ての動物実験は、動物実験委員会の承認を得て、米国公衆衛生局の方針及び米国研究評議会のガイドラインに従って実施された。
【０１３６】
細胞株及び細胞培養
ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３Ｔ細胞及び黒色腫Ｂ１６細胞は、ＡＴＣＣ（Manassas、VA）から入手した。ヒト黒色腫細胞５２６、６２４及び８８８は、ＮＩＨ（Bethesda、MD）から入手した。これらの細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ新鮮Ｌ−グルタミン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．５ｍｇ／ｍｌファンギゾン（全てLife Technologies、Rockville、MDから入手）、及び０．０５ｍＭ  ２−ＭＥ（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）を添加したＲＰＭＩ培地（ｃＲＰＭＩ）中で培養された。ＯＶＡタンパク質を発現するＭ０５細胞［Falo他、Nature Med 1：649-653（1995）］は、０．８ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を添加したｃＲＰＭＩ中で維持された。細胞株は、マイコプラズマ汚染の検査において陰性と判定された。全ての細胞株は、凍結されたストックからの最初の復活後に１０回未満継代された。
【０１３７】
インビトロでの研究のために、腫瘍細胞を、指定された時間、異なる用量のＰＶ−１０とともにインキュベートした。機能分析又はウェスタンブロットのために、細胞上清を回収した。ＰＶ−１０は、テネシー州ノックスヴィルのプロヴェクタス  バイオファーマスーティカルズ，インク．から入手した。
【０１３８】
インビボでの研究のために、３×１０５個の腫瘍細胞をマウスの一方の脇腹に皮下（ｓ．ｃ）注射し、７日目又は１３日目にＰＶ−１０又はＰＢＳを病巣内（ＩＬ）注射した。１８時間後にマウスから腫瘍を分離し、腫瘍解離キット（Miltenyi Biotec、San Diego、CA）及びGentleMACS（登録商標）（Miltenyi Biotec）で当該腫瘍を消化した。生細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度でｃＲＰＭＩに再懸濁した。２日後、機能分析のために細胞上清を回収した。
【０１３９】
ＦＡＣＳ及びテトラマー染色
細胞を７０μｍの細胞ストレーナーに通すことによって、指定された組織からの単細胞懸濁液を調製した。ＡＣＫ緩衝液を用いたＲＢＣ溶解の後、フローサイトメトリ解析のために、次の抗体を用いてＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を染色した：抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ５６；抗マウスＣＤ１１ｃ、Ｉ−Ａｂ、ＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２、ＣＤ８６、ＣＤ８０及びＣＤ４０（全てBD Biosciences、San Diego、CAから入手）。テトラマー染色のために、細胞を室温で２０分間、Ｈ−２  Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー（MBL international、Woburn、MA）で染色し、次いで、製造元の指示に従って氷上で更なる抗体と共に更に２０分間インキュベートした。生／死固定可能（Live/dead fixable）近赤外光線（near-IR）又はアクア蛍光反応性染料（aqua fluorescent reactive dyes）（Invitrogen（登録商標））を使用して、解析前に死細胞を除外した。４つのレーザーを備えたLSR II（BD Biosciences）により細胞を獲得し、データをFlowJo（登録商標）ソフトウェア（Tree Star、Ashland、OR）で解析した。
【０１４０】
ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ−γ及びＨＭＧＢ１の評価
ヒトサンプルからのＩＦＮ−γを検出するために、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞分離キット（Miltenyi Biotec）を用いて、ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。１×１０５個の細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて、腫瘍細胞と１：１の比で三連で共培養した。４８時間後、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（R＆D Systems、Minneapolis、MN）を製造元の指示に従って使用し、細胞上清中のＩＦＮ−γレベルを測定した。
【０１４１】
患者血清中のＨＭＧＢ１を検出するために、IBL international（Toronto、Canada）のＨＭＧＢ１  ＥＬＩＳＡキットを製造元の指示に従って使用した。
【０１４２】
マウスサンプル中のＩＦＮ−γを検出するために、マウスに３×１０５個のＭ０５細胞を皮下注射した。最初の腫瘍細胞の注射後７日目に、マウスの反対側の脇腹へ２回目の３×１０５個のＭ０５細胞の皮下注射を行った。７日目及び１７日目に、最初のＭ０５腫瘍病変へＰＶ−１０又はＰＢＳ（５０μＬ）をＩＬ注射した。２３日目に、脾細胞を採取し、１μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２１（R＆D Systems）を添加したｃＲＰＭＩ中で７日間培養した（Cheng他、J Exp Med 205：2235-2249（2008））。増殖した細胞を、照射されたＭ０５細胞と１０：１の比で混合し、４８時間後に製造元の指示に従ってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキット（BD Biosciences）を使用して、上清中のＩＦＮ−γ産生を測定した。
【０１４３】
Ｔ細胞の養子移植
ＣＤ４５．１  ＯＴ−１Ｔ細胞を、Ｔ細胞濃縮カラム（R＆D Systems）で精製し、CellTracker（登録商標）バイオレット（Life Technologies、現在のThermo Fisher Scientific、Inc. Waltham、MA）と共に３７℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、３×１０５個の標識された細胞を１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、Ｍ０５腫瘍保有マウスに静脈内注射した。４日後、脾臓、リンパ節（ＬＮ）及び腫瘍を採取し、ＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２に対する抗体で染色した。少なくとも１度分裂したＣＤ４５．１＋ＣＤ４５．２−細胞を「分裂後の細胞」とみなした。
【０１４４】
ＤＣの機能分析
Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得た骨髄を、ＲＢＣ溶解後に、２０ｎｇ／ｍｌのリコンビナントマウスＧＭ−ＣＳＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのリコンビナントマウスＩＬ−４（R＆D Systems、Minneapolis、MN）と共に培養した［Liu他、J Immunol 191：1916-1926（2013）］。５日目に、Opti-prep（登録商標）勾配（Axis-Shield、Oslo、Norway）を製造元の指示に従って使用してＤＣを精製し、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下において、５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度で培養した［Vohra他、Cancer Immunol Immun CII 59：729-736 （2010）］。
【０１４５】
ＨＭＧＢ１に対するアンタゴニスト抗体（IBL international、Toronto、Canada）又は関連アイソタイプの存在下で１００μＭのＰＶ−１０と２日間インキュベートしたＢ１６細胞からの１０％上清と共に、ＤＣを培養した。次に、１０μｇ／ｍｌのＯＶＡタンパク質（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO）でＤＣを２時間パルスした。複数回洗浄した後、ＤＣを、Ｕ底９６ウェルプレート中において、異なるスティミュレータ対レスポンダ比率で、１ｅ５レスポンダＯＴ−１Ｔ細胞と３日間三連で共培養した。細胞回収の１８時間前に、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）を各ウェルに添加した。Ｔ細胞の増殖を、液体シンチレーションカウンタであるMicrobeta（登録商標）Trilux（PerkinElmer、Waltham、MA）を用いて、３Ｈ−チミジン取込みによって測定した。
【０１４６】
ＩＣ５０の判定
１２ウェルプレート中において、細胞を、１２．５、２５、５０、１００、又は２００μＭのＰＶ−１０又はＰＢＳと共に、６、１２、２４及び４８時間インキュベートした。全てのウェルは、回収され、計数用ビーズと混合され、LSR IIによって獲得された。ＤＡＰＩを使用して、解析前に死細胞を除外した。生細胞の絶対数は、細胞イベントに対するビーズイベントの比率を比較することによって算出した。GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェア（GraphPad Software, Inc.、La Jolla、CA）を使用して、細胞増殖に対するＰＶ−１０の半最大阻害をＩＣ５０として判定した。
【０１４７】
ウェスタンブロット法
細胞の破片を除去するために、細胞上清を１４，０００×ｇで遠心分離した。各サンプルのタンパク質濃度を判定した。等量のタンパク質をNuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）4-12％ Bis-Trisゲル（Life Technologies）上で分離し、次いで二フッ化ポリビニリデン膜（Millipore）上に転写した。膜を5％BSA(ｗ/ｖ) in PBSで１時間ブロッキングし、ＨＭＧＢ１（カタログ番号３９３５）抗体、ＨＳＰ７０（Ｄ６９）抗体又はＨＳＰ９０（Ｃ４５Ｇ５）抗体を用いて４℃で一晩プロービングした（全てCell Signaling Technology、Danvers、MAから入手）。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とのインキュベーション、及び、増強化学発光試薬を用いた処理によって、免疫反応性を可視化した。
【０１４８】
統計的解析
データは、GraphPad Prism（登録商標）ソフトウェアを用いたスチューデントの両側ｔ検定、又はウィルコクソンの符号付順位和検定によって解析された。０．０５未満のｐ値は統計的に有意であるとみなされた。
【０１４９】
本明細書で引用した特許、特許出願及び論文の各々は、参照により組み込まれる。前述の説明および実施例は、例示を目的としたものであり、限定として解釈されるべきではない。本発明の要旨及び範囲内で更に他の変更が可能であり、当業者はこれらの変更に容易に想到するであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0006773788.tif 000008
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
0006773788.tif 000024
【図４Ａ】
0006773788.tif 000025
【図４Ｂ】
0006773788.tif 000026
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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