(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む検体を固定化した標本において、複数の抗体を用いて検出する多重染色法であって、
特定の分子の存在を検出するための抗体と
前記特定の分子の変化を検出するための抗体とを用いることを特徴とする多重染色法。
【請求項２】
前記特定の分子が治療薬の標的となる細胞抗原タンパク質であって、
当該治療薬の効果を判定するために用いることを特徴とする請求項１記載の多重染色法。
【請求項３】
細胞を含む検体を固定化した標本において、分子の変化を検出するためのキットであって、
特定の分子の存在を検出する抗体と
前記特定の分子の変化を検出するための少なくとも１つ以上の抗体と、
前記特定の分子の存在を検出する抗体と前記特定の分子の変化を検出するための少なくとも１つ以上の抗体とを、夫々識別可能に標識する標識を含むことを特徴とする多重染色キット。
【請求項４】
前記特定の分子が治療薬の標的になる細胞抗原タンパク質であって、
当該治療薬の効果を判定するために用いることを特徴とする請求項３記載の多重染色キット。
【請求項５】
前記特定の分子がＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２であって、
ＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２の存在を検出するための抗体と、
ＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２のＣ末領域の変化に伴って認識されない抗体とを含むことを特徴とする請求項３又は４記載の多重染色キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫染色における多重染色法に関する。特に病理診断の際に、容易に診断を行うことが可能な染色方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理診断は、手術組織、生検標本、体腔液など様々な試料を用いて、腫瘍分類、悪性度推測、特定のウイルスや細菌の検索など、様々な検査に用いられている。臨床症状と併せて、病巣部位の重症度や悪性度を判定し、治療方針や治療法の選択を担う必須の検査診断技術である。また、近年は分子標的療法の適応を決定するための診断技術として、極めて重要な役割を担うようになってきている。【０００３】
病理診断においては、従来からヘマトキシリンとエオジンの２種類の色素を用い、細胞核と核以外の部分を染め分けるヘマトキシリン・エオジン染色のような細胞や組織の形態を観察する検査方法が用いられている。これに加え近年では標的分子に結合する特異抗体を用いて疾患関連抗原分子を検出する免疫染色法が広く用いられるようになってきている。【０００４】
特異抗体を用いた免疫染色法は、病理診断や病巣組織の分子学的研究において重要な解析方法となっている。特に、多重免疫染色法は、異なる抗原を異なる標識化抗体を用いて染色し、同一標本上で分子の局在を解析することができるため、非常に多くの情報を得ることができる。例えば、同一病理組織切片上でＢ細胞とＴ細胞のように異なる細胞を染め分けたり、正常細胞とがん抗原を発現するがん細胞を染め分けたり、あるいは同一細胞内で複数の抗原の局在を同時に検出して、抗原の相互関係を観察、解析することができる。【０００５】
上述のように、免疫染色は医療や研究の現場で重要な役割を担ってきたが、分子標的薬が使用されるようになって以来、より重要な診断技術になってきている。すなわち、分子標的薬の投与に先立ちその有効性を確認するために、標的となる分子の発現レベルや遺伝子変異を確認する診断に利用されるようになってきている。このように治療薬とペアで使用する「コンパニオン診断」と呼ばれる診断方法は、個別化医療の実施に不可欠な検査法となってきている。【０００６】
例えば、同じ臓器、組織に由来するがんであっても、標的抗原分子の発現が同じであるとは限らない。標的抗原分子が発現している患者に対しては、当該分子に対する小分子医薬品や抗体医薬品は治療効果が期待できるが、当該分子を発現しないがん細胞を有する患者に対しては治療効果は期待できず、副作用だけの不利益を被る結果になってしまう恐れがある。このように、治療標的分子の発現を免疫染色して検出したり、あるいは遺伝子変異の有無を検出したうえで治療を行うことは、患者利益や医療経済上の利点が大きいことから、近年、急速に普及してきている。例えば、リツキシマブに見られるような抵抗性を有する患者の存在や、トラスツズマブに見られるような奏効率の低さから、抗体医薬品の投与に先立ち当該治療薬が有効に作用するかを診断する方法が開示されている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００８／０４１５９４号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０３５７０５号
【特許文献３】国際公開第２０１２／１３３０４７号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Kataoka,K. et al., 2016, Nature, doi:10.1038/nature18294
【非特許文献２】Chong,L. C. et al., 2016, Blood, doi.org/10.1182/blood-2015-11-683003
【非特許文献３】Correia,C. et al., 2015 Blood, Vol.125(4), pp.658-667.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、従来の病理学的検査に利用される多重免疫染色は異なる分子を識別して染色する方法であり、特定の分子における変化を同時に検出する方法ではなかった。例えば、遺伝子の変異によって引き起こされるがんなどの疾患の場合、対象となる組織では変異体、野生型が混在して発現していることが多い。それゆえ、原因遺伝子の発現と変異は連続切片を用いて、片方で特定の遺伝子の発現、一方で変異体の発現を別々に染色し、両者を見比べて判断するという作業が必要である。これは、検査自体に非常に時間がかかるともに、診断に熟練を要する。そのため、分子標的薬である小分子医薬品や抗体医薬品の標的となるタンパク質の発現とそのタンパク質の変異の検査は、当該医薬品の有効性を確認するためには必要な検査であるにもかかわらず、通常は行われていないのが現状である。【００１０】
また、従来、タンパク質分子の変異や修飾による高次構造上の変化は、円二色性や紫外波長吸収性などの分光学的測定法や核磁気共鳴法などの物理化学的手法が一般的に用いられてきた。さらには、タンパク質を結晶化しＸ線構造解析によって解析することもある。しかし、これらは、対象とするタンパク質を細胞外に抽出単離して溶液中で計測するという方法であり、細胞膜に埋め込まれたタンパク質や細胞表面に発現したタンパク質をそのまま計測する手法ではない。ましてや、細胞そのものを測定対象として、発現しているタンパク質を直接観察する手法でもなく、病理学的検査に用いられる手法でもない。【００１１】
一方、タンパク質の高次構造上の変化を抗体で検出する方法自体は知られている。この方法は単離したタンパク質を電気泳動で分離したり、膜へ転写した形でタンパク質を調製し、部位特異的な抗体との結合の有無で高次構造変化を検出する手法である。しかしながら、このようにタンパク質を抽出分離して、部位特異的抗体の結合能によって変異体が有する高次構造変化を解析する手法は、病巣部位のタンパク質の構造変化や修飾状況を観察する病理学的検査方法にはそのまま適用できない。ましてや病理検査用のプレパラートに固定化された細胞に存在するタンパク質を直接観察することは不可能である。【００１２】
上記のような既存の分光学的手法やタンパク質抽出を伴う手法は、相当量の材料が必要で、測定手技に時間を要し、かつ計測装置も大がかりになる場合もあることから、病理診断のような迅速性を求められる分野には適用しがたいのが実情である。【００１３】
本発明は、欠失、点突然変異などの遺伝子の変異による変異タンパク質の発現や、リン酸化などの修飾や立体構造の変化などのタンパク質の変化を病理組織の同一切片上で、元のタンパク質と同時に識別可能に染色する方法、及び染色キットを提供することを課題とする。【００１４】
さらに、臨床的な治療法の選択に有用なタンパク質の高次構造の変化を病理診断にも適用できるように迅速に検出する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、細胞を含む検体を同一標本上で多重染色する方法、及びキットに関する。
（１）細胞を含む検体を固定化した標本において、複数の抗体を用いて検出する多重染色法であって、特定の分子の存在を検出するための抗体と前記特定の分子の変化を検出するための抗体とを用いることを特徴とする多重染色法。
（２）前記特定の分子が治療薬の標的となる細胞抗原タンパク質であって、当該治療薬の効果を判定するために用いることを特徴とする（１）記載の多重染色法。
（３）細胞を含む検体を固定化した標本において、分子の変化を検出するためのキットであって、特定の分子の存在を検出する抗体と前記特定の分子の変化を検出するための少なくとも１つ以上の抗体と、前記特定の分子の存在を検出する抗体と前記特定の分子の変化を検出するための少なくとも１つ以上の抗体とを、夫々識別可能に標識する標識を含むことを特徴とする多重染色キット。
（４）前記特定の分子が治療薬の標的になる細胞抗原タンパク質であって、当該治療薬の効果を判定するために用いることを特徴とする（３）記載の多重染色キット。
（５）前記特定の分子がＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２であって、ＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２の存在を検出するための抗体と、ＰＤ-Ｌ１又はＰＤ-Ｌ２のＣ末領域の変化に伴って認識されない抗体とを含むことを特徴とする（３）又は（４）記載の多重染色キット。
【発明の効果】
【００１６】
同一標本上で、多重染色を行い、分子の変化を識別することができるため、迅速に診断結果が得られるだけではなく、正確な診断を行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の二重染色法を模式的に示す図。
【図２】３種以上の抗体を用いた識別方法を模式的に示す図。
【図３】ＰＤ−Ｌ１の変異を同一標本上で検出した免疫組織染色像。
【図４】ＢＣＬ２変異の有無を同一標本上で検出した免疫組織染色像。上の写真は強拡大像。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、プレパラートに固定化された臨床検体において、抗原タンパク質分子を認識し、その存在を検出するとともに、欠失変異、点突然変異によるタンパク質の変化、リン酸化、糖付加などの修飾、分子間の相互作用、立体構造の変化など分子の変化を同時に検出する方法である。したがって、同一の標本で、野生型のタンパク質と変異したタンパク質、又は活性化型タンパク質と活性化されていないタンパク質など、タンパク質の構造上の変化の有無を検出することができる。
【００１９】
例えば、以下の実施例に示すように、病理学的検査用にプレパラートに固定化された細胞を含む臨床検体標本において、検査対象とするタンパク質に対する複数の部位特異的抗体を用いて、そのまま抗原タンパク質分子の構造変化を検出することができる。したがって、細胞表面および細胞内に発現するすべてのタンパク質を対象とすることができ、しかも同一の標本上で、野生型のタンパク質と変異したタンパク質、又は活性化型タンパク質と活性化されていないタンパク質など、タンパク質の構造上の変化の有無や程度を検出することができる。また、同一タンパク質に対する部位特異的抗体による免疫染色であることから、目的タンパク質の細胞膜、細胞質、核、細胞内構造体など、細胞内における存在部位も同時に検出することができる。さらに、細胞内の局在部位、集積度、高次構造変化の有無、高次構造変化の部位などの異なるパラメーターを同時に染色して解析できる。
【００２０】
この手法は、特に肉眼的に一塊のがんでもそれぞれのがん細胞の抗原発現が異なり、多様であるという「がん細胞の不均一性」を調べるのに非常に有用である。その結果、どのような治療用抗体を抗がん薬として適用可能であるかの分子病理学的診断を行うことができる。検出手法の時間的、設備的な要件についても、医療機関の通常の病理検査業務に適用できるレベルであり、実用上の利点が大きい。
【００２１】
本発明で分子の検出に用いる抗体は、標的分子内の特定のエピトープを検出することができ、結合性を有するものであればどのようなものを用いてもよい。モノクローナル抗体であることが好ましいが、ポリクローナル抗体であっても、抗ペプチド抗体のように、分子内の特定の領域のみを検出することができるものであれば好適に使用することができる。
【００２２】
ここで用いる複数種の抗体は、変異が生じる部分を認識する抗体と、野生型を認識する抗体とが、それぞれ結合時に立体障害が生じない程度に、位置的に離れて存在するものを使用すれば、タンパク質の発現と変異を同時に検出することができる。あるいは、同一部位の野生型抗原、変異型抗原を認識する抗体を使用し、相互排他的に染色を行うことにより、野生型、変異型を発現している細胞を同時に検出することができる。
【００２３】
本発明で用いる標識は、識別可能な２種以上の標識であれば、どのようなものを用いてもよい。ここで、識別可能とは、観察者が通常の顕微鏡観察によって識別することができるものだけではなく、肉眼では識別することができなくとも機械的なシグナルとして識別可能なものも含む。標識としては、公知の標識の中から選択すればよく、色素、量子ドット、コロイドなど通常標識として用いられているものの中から選択される。また、色素としては、具体的には、酵素抗体法や、蛍光抗体法に適用される色素を含む。
【００２４】
蛍光色素であれば、例えば、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、シアニン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、スクアリリウム系色素分子、オキサジン系色素分子、芳香環系色素分子、カルボピロニン系色素分子などを用いることができる。
【００２５】
また、標識は複数の分子種を最終的に識別することができれば、どのようなものを用いてもよい。具体的には、検出に用いる抗体に標識を直接結合させた標識抗体を用いてもよいし、二次抗体、三次抗体を用いて最終的に検出を行ってもよい。さらに、アビジン、ビオチン等、免疫染色法で通常用いられている標識を用いてもよい。また、酵素抗体法により識別する場合は、異なる色に呈色する試薬を用いればよい。
【００２６】
本発明の検出キットは、分子の存在を検出する抗体と、その分子の欠失変異、点突然変異、修飾、相互作用、立体構造の変化など、分子の変化を検出する抗体と、夫々の抗体を識別することのできる標識を含む。各抗体は市販の抗体を用いてもよいし、分子の変化を検出する抗体を作製して用いてもよい。また、酵素抗体法に必要な試薬や、洗浄液など通常の免疫染色法に必要な試薬を含むことができる。以下、実施形態を詳細に説明するが、本発明の技術範囲はこれらに限定されるものではない。
【００２７】
［実施形態１］欠失変異を有する分子の検出
野生型の分子Ａと欠失変異を有する分子Ａ’とを同一切片上で同時に染色する方法について説明する（図１、欠失変異体）。野生型の分子Ａと欠失変異体Ａ’を発現する細胞を識別する場合には、野生型分子Ａ、変異体分子Ａ’、どちらの分子も確実に認識することのできる抗体ａと欠失変異が生じることの多い領域を認識する抗体ｂを検出に用いれば良い。
【００２８】
抗体ａは、野生型、欠失変異体どちらの分子も認識する。一方、抗体ｂは欠失が生じた場合には結合することができない。したがって、欠失変異体Ａ’には結合しないから、野生型分子Ａのみを認識する。すなわち、野生型分子Ａにはａ抗体とｂ抗体が、欠失変異体には、ａ抗体のみが結合する。例えば、明視野での染色の場合、ａ抗体を茶色、ｂ抗体は茶色をマスクするような黒で呈色するように標識すれば、野生型分子Ａが発現している細胞は黒、欠失変異体Ａ’が発現している細胞は茶色に染め分けることができる。また、蛍光顕微鏡を用いる場合であれば、多重に染色されたことが容易に識別可能な標識を用いればよい。
【００２９】
下記に詳述するが、Ｃ末端領域が欠損しているＰＤ-Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １）を高発現しているがんは、この方法により欠失変異体を検出することができる。ＰＤ-Ｌ１のＣ末領域が欠損するとＰＤ-Ｌ１を高発現するにもかかわらず（非特許文献１）、欠損部を認識する抗体を用いた場合にはその発現を検出することができない。そのようなＣ末端領域欠損型ＰＤ-Ｌ１を高発現する患者は、抗ＰＤ-Ｌ１抗体医薬に対して著効を認める患者（スーパーレスポンダー）である可能性がある。しかし、現状の検査ではＣ末端領域欠損型ＰＤ-Ｌ１の発現を検出できない場合があり、抗ＰＤ-Ｌ１抗体医薬を適用されない可能性がある。実施形態１に示す染色方法を用いることにより、このような危険性を排除することが可能である。また、最近ＰＤ-Ｌ２についても同様の事象が報告されており（非特許文献２）、ＰＤ-Ｌ２の変異、及び発現も確実に認識することが求められている。
【００３０】
［実施形態２］染色体転座を有する分子の検出
染色体に転座が生じ、遺伝子の一部が他の遺伝子と転座により置き換わったことによる融合タンパク質Ｂ’を発現する場合について説明する（図１、染色体転座）。抗体ｃは、転座の有無に関わらず、タンパク質Ｂ、Ｂ’を認識する抗体を示す。抗体ｄは野生型タンパク質Ｂのみ検出し、転座が生じた場合には認識しない抗体を示す。
【００３１】
野生型のみを認識する抗体ｄと、野生型Ｂ、染色体転座による変異体タンパク質Ｂ’両方を認識する抗体ｃが結合した場合（Ｂ）と、抗体ｃのみが結合した場合（Ｂ’）とを識別可能になるように標識を選択することにより、野生型Ｂ、染色体転座による変異体タンパク質Ｂ’を区別して染色することが可能である。
【００３２】
［実施形態３］点突然変異を有する分子の検出
次に、野生型Ｃと点突然変異（図中●で示す。）を有する分子Ｃ’を区別して染色する方法について説明する（図１、点突然変異）。抗体ｅは野生型Ｃ、点突然変異体Ｃ’に関わらず認識する抗体を示す。抗体ｆは野生型Ｃのみを認識し、点突然変異体Ｃ’は認識しない抗体を示す。
【００３３】
野生型Ｃ、変異体Ｃ’両方を認識する抗体ｅの標識を、野生型のみを認識する抗体ｆが結合した場合に識別可能になるように標識を選択することにより、野生型Ｃ、点突然変異体Ｃ’を区別して染色することが可能である。同一の箇所に異なる点突然変異が入った場合でも、野生型Ｃのみを検出する抗体ｆの結合の有無により該当箇所に点突然変異が入ったことを確認することができる。
【００３４】
例えば、イソクエン酸脱水素酵素（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｉｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＩＤＨ）をコードする遺伝子ＩＤＨ２の１７２位のアルギニン（Ｒ１７２）は点突然変異により複数種のアミノ酸に置換されるが、その変異は脳腫瘍などの予測因子として知られている。従来は、変異毎にそれぞれの特異抗体を作製して、その変異を確認することが行われていたが、本実施形態の方法を用いれば、野生型Ｒ１７２を特異的に認識する抗体を用いればよい。このような、遺伝子変異のホットスポットとしては他にもＩＤＨ１の１３２位、ＫＲＡＳの１２位、１３位、６１位のアミノ酸などが知られている。
【００３５】
また、ここでは、抗体ｆとして、点突然変異Ｃ’を認識しない抗体を例に挙げたが、点突然変異を認識し、野生型を認識しない抗体を用いてもよい。
【００３６】
［実施形態４］修飾の有無の検出
次に、修飾の有無を区別して染色する方法を示す（図１、修飾の有無（リン酸化、糖付加等））。分子によっては活性化に伴ってリン酸化などの修飾を受ける場合がある。また、糖鎖の有無が生体反応に重要な役割をはたしている場合もある。ここでは、リン酸化を受けた分子について説明するが、糖鎖による修飾も同様に検出することができる。
【００３７】
リン酸化を生じていないタンパク質Ｄとリン酸化を受けた活性化型タンパク質Ｄ’を区別して染色する方法について説明する。抗体ｇは活性化の有無に関わらず認識する抗体を示す。抗体ｈはリン酸化を生じていないタンパク質Ｄのみを認識し、リン酸化しているエピトープは認識しない抗体である。
【００３８】
リン酸化を生じていないタンパク質を認識する抗体ｈと、活性化の有無に関わらず認識する抗体ｇが結合した場合（Ｄ）と、抗体ｇのみが結合した場合（Ｄ’）とを識別可能になるように標識を選択することにより、リン酸化の有無を区別して染色することが可能である。
【００３９】
また、リン酸化部位のリン酸化状態のみを認識する抗体、すなわち活性化型を認識する抗体と、活性化の有無に関わらず認識する抗体を用いて、上記と同様に染色を行ってもよい。そのような場合には、リン酸化型を認識する抗体は、特定のタンパク質のリン酸化を特異的に認識する抗体だけではなく、リン酸化したチロシン、スレオニンやセリンを特異的に認識する抗体を用いてもよい。
【００４０】
糖鎖の有無を検出する場合には、糖鎖が付加していないアミノ酸配列を認識する抗体を用いることによって検出してもよい。また、リン酸化、糖鎖の付加だけではなく、アセチル化、ユビキチン化などの翻訳後修飾は同様の方法によって検出することが可能である。
【００４１】
［実施形態５］相互作用の検出
分子によっては、活性化等に伴って、他のタンパク質との相互作用に変化が生じる場合がある。タンパク質Ｅが単独で存在する場合と、他の分子Ｘと複合体を形成している場合とを区別して染色する方法について説明する（図１、相互作用（タンパク質等））。
【００４２】
抗体ｉは複合体形成の有無に関わらず認識する抗体を示す。抗体ｊは、タンパク質Ｘとの複合体が形成されることによりタンパク質Ｅを認識できなくなる抗体である。
【００４３】
複合体を形成していないＥタンパク質を認識する抗体ｊと、複合体形成の有無に関わらず認識する抗体ｉが結合した場合（Ｅ）と、抗体ｉのみが結合した場合（Ｅ複合体）とを識別可能になるような標識を選択することにより、複合体形成の有無を区別して染色することが可能である。ここではタンパク質Ｅと異なるタンパク質Ｘが複合体を形成する例を挙げているが、同じタンパク質の二量体、三量体についても同様の手法で区別して染色することができる。
【００４４】
［実施形態６］立体構造変化の検出
タンパク質は修飾、あるいは複合体形成によって、立体構造自体が大きく変化する場合もある。本実施形態の染色方法で立体構造の変化を捉えることも可能である（図１、立体構造の変化）。
【００４５】
抗体ｋは立体構造の変化に関わらず認識する抗体を示す。抗体ｌは、立体構造が変化したタンパク質Ｆ’には結合しない抗体である。
【００４６】
立体構造の変化していないタンパク質Ｆを認識する抗体ｌと、立体構造の変化に関わらずタンパク質Ｆ、Ｆ’を認識する抗体ｋが結合した場合（Ｆ）と、抗体ｋのみが結合した場合（Ｆ’）とを識別可能になるように標識を選択することにより、立体構造の変化を区別して染色することが可能である。
【００４７】
ここでは、立体構造の変化により認識しなくなる抗体を使用する例を挙げたが、立体構造の変化を認識する抗体を用いて立体構造の変化を識別することも可能である。
【００４８】
［実施形態７］三種以上の抗体を用いる検出方法
がん細胞では、点突然変異、あるいは欠失変異など複数の変異が同一タンパク質に生じることも多い。本発明の方法は２つの異なる抗体を用いた二重染色だけではなく、３つ以上の変異を区別して染色することも可能である。
【００４９】
図２では、２か所に点突然変異が生じる例を示しているが、同一タンパク質上に生じる複数の変化はどのような変化の組合せであっても構わない。抗体ｍはタンパク質Ｇの変化に関わらず認識する抗体を示す。抗体ｎは点突然変異ｙが生じることにより認識できなくなる抗体を示す。抗体ｎは点突然変異ｙが単独で生じているタンパク質Ｇ’’及び点突然変異ｚとの二重に変異が生じているタンパク質Ｇ’’’を認識することができない。抗体ｏは点突然変異ｚが生じると認識できない抗体を示す。すなわち抗体ｏは点突然変異ｚが単独で生じているタンパク質Ｇ’、及び二重に変異が生じているタンパク質Ｇ’’’を認識することができない。
【００５０】
この場合も抗体ｍのみで認識される分子（Ｇ’’’）と、抗体ｍと抗体ｎ、又は抗体ｍと抗体ｏとの２つの抗体で認識される分子（Ｇ’、Ｇ’’）、抗体ｍ、ｎ、ｏと３つの抗体で認識される分子（Ｇ）を区別できるような標識を用いればよい。蛍光標識、あるいは量子ドット等による標識を選択することにより、３種の抗体を識別可能に標識することが可能であるから、同一切片上のすべての分子の態様を区別することができる。
【００５１】
ここでは２つの変異を有する場合の４つの分子のパターンの識別を示したが、肉眼での識別が困難な標識であっても、機械で識別可能な蛍光色素や、バーコード標識を用いることによって、より多数の変異であっても識別することができる。
【００５２】
３種以上の抗体を使用することにより有効な検査を行うことのできる例としては、イソクエン酸脱水素酵素（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ  ｄｅｈｉｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＩＤＨ）がある。イソクエン酸脱水素酵素は、ヒトではＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＤＨ３の３つのサブタイプがあることが知られている酵素である。グリオーマや急性骨髄性白血病などをはじめとするいくつかのがんで、ＩＤＨ１／２に複数の点突然変異が生じていることが報告されている。ＩＤＨ１／２に見られる点突然変異は予後診断マーカーとして知られていることから、これらの分子の変異を区別して識別することにより予後診断を簡便に行うことができる。
以下に本発明の多重染色法を適用した例を実施例として示す。
【実施例１】
【００５３】
ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １）はＴ細胞表面に発現しているＴ細胞の制御分子であり、リガンドであるＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２とともに免疫チェックポイントタンパク質として機能する。がん細胞では、しばしば免疫細胞の攻撃を免れることが知られている。これは、がん細胞に発現するＰＤ−Ｌ１やＰＤ−Ｌ２抗原が、ＰＤ-１に結合して細胞障害性Ｔ細胞を抑制し免疫チェックポイント機構に作用するためと考えられている。【００５４】
卵巣がんや乳がん、また、黒色腫、肺がん、大腸がん、膀胱がん、子宮頸がんなどから単離されたヒトがん細胞でＰＤ-Ｌ１の過剰発現が認められており、ＰＤ−１との相互作用による免疫応答の抑制を引き起こし、がん細胞の生存にとって有利に作用しているものと考えられている。ＰＤ-Ｌ１の高発現が認められるがんでは、抗ＰＤ-Ｌ１抗体医薬に対して反応性が高いことから、臨床的にはコンパニオン診断薬によって、ＰＤ-Ｌ１の発現の確認を行ったうえで抗ＰＤ-Ｌ１抗体医薬が使用されている。【００５５】
ＰＤ-Ｌ１の過剰発現が認められているがんでは、ＰＤ-Ｌ１高発現の機構として、遺伝子増幅や染色体転座による異所性プロモーターを原因とする機構が知られていたが、最近ＰＤ-Ｌ１遺伝子の３´領域を途絶する構造変異に起因する転写産物の著しい上昇が報告された（非特許文献１）。３´領域の異常は成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、胃の腺癌など、複数のがんに見られ、ＰＤ-Ｌ１の高発現の原因であることが明らかにされた。【００５６】
３´領域の異常には、ＵＴＲの異常だけではなく、Ｃ末が欠失している変異も含まれており、コンパニオン診断薬の候補とされている抗体の中にはこの領域に結合する抗体も含まれている。この領域に結合する抗体をコンパニオン診断薬として用いた場合には、ＰＤ-Ｌ１が高発現であるにも関わらず、３´を欠失している変異型ＰＤ-Ｌ１を認識することができない。そのため、このコンパニオン診断薬を使用した場合には、抗ＰＤ-Ｌ１抗体医薬が非常に良く効くスーパーレスポンダーを見逃してしまう。しかしながら、実施例１に示す二重染色法を用いれば、従来法のうちＣ末以外を認識する抗体によって得られる情報、すなわちＰＤ-Ｌ１の発現量が確認できるのみならず、加えてその群のうち、Ｃ末が欠失している変異を有するスーパーレスポンダーをも同時に同定できる。【００５７】
図３に示すのは、ホジキンリンパ腫の症例であり、野生型、及び欠損が生じているＰＤ−Ｌ１分子を発現している細胞を染色した結果を示す。野生型、欠失変異体に関わらずＰＤ−Ｌ１を発現している場合にＰＤ−Ｌ１分子を認識する抗体の標識は茶色で、また、野生型ＰＤ−Ｌ１のみに存在する領域を認識する抗体の標識は黒で呈色するようなものを選択している。【００５８】
抗ＰＤ-Ｌ１抗体として、ＰＤ-Ｌ１の細胞外ドメインを認識するクローンＥ１Ｊ２Ｊ（ＣＳＴ社製）、Ｃ末領域を認識するクローンＳＰ１４２（ＳＰＲＩＮＧ社製）、及び抗ＣＤ６８抗体（ＤＡＫＯ社製）を用い、それぞれ茶、黒、赤で発色を行っている。なお、免疫染色は定法にしたがって行っている。【００５９】
茶色は黒によってマスクされるので、野生型ＰＤ−Ｌ１分子が発現している細胞は黒く、Ｃ末領域欠失変異体が発現している細胞（図３中▲で示す。）は茶色に染色される。同一切片上で２つの異なる色に染色されることから、ＰＤ−Ｌ１発現細胞での欠失変異体の割合が簡単に把握できる。【００６０】
この症例はＰＤ-Ｌ１が高発現しているにも関わらず、現在コンパニオン診断薬として用いられている抗体（例えばＳＰ１４２はＦＤＡに承認されているコンパニオン診断薬である。）では見逃すこととなる。実施例１に示す二重染色法を用いることにより、本来は抗体医薬が適用されるべき患者を見逃すリスクを低減することができるとともに、スーパーレスポンダーを同時に同定できる。本発明の染色法によれば、抗体医薬品の投与に先立って、欠失変異体の存在とともに、野生型タンパク質の発現を把握することができるので、当該抗体医薬品の有効性を確実に判断することができる。
【実施例２】
【００６１】
リンパ濾胞の胚中心に存在するＢ細胞はＢＣＬ２の発現が認められないが、濾胞性リンパ腫ではＢＣＬ２と免疫グロブリン重鎖遺伝子が相互転座しており、恒常的にＢＣＬ２の発現が認められる。したがって、腫瘍性の胚中心ではＢＣＬ２の発現が認められることになる。しかし、濾胞性リンパ腫では、ＢＣＬ２に変異が頻繁に生じることが知られており、用いる抗体によっては発現が確認できないこともある。【００６２】
図４は、濾胞性リンパ腫の組織を２種の抗ＢＣＬ２抗体、クローン１２４（Ｄａｋｏ社製）、クローンＣ−２（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社製）で二重染色を行い、それぞれ青、茶で発色したものである。この症例の場合、ＢＣＬ２の４１−５４位のアミノ酸のいずれかに変異が生じているものと考えられ、一般的に広く用いられている同部を認識するローン１２４抗体では陽性とならない。したがって、濾胞性リンパ腫であるという診断に疑義が生じる。【００６３】
一方、２種の異なる部位を認識するＢＣＬ２抗体で染色すれば、正常細胞が発現する野生型ＢＣＬ２の発現は、クローン１２４を単独で用いた場合と同様に確認でき（茶と青が混ざり灰青色となっている）、さらに腫瘍性の細胞がＢＣＬ２を発現していること、およびそのＢＣＬ２が変異を有していることがｉｎ  ｓｉｔｕで局在情報を保持した上で認識できる。すなわち、濾胞性リンパ腫であるという診断確定が可能となるのみならず、悪性転化および予後予測の因子とされているＢＣＬ２変異の有無をも日常診断レベルで簡便に確認できる（非特許文献３）。【００６４】
以上示してきたように、本発明の方法を用いれば、同一標本上で分子の変化を捉えることができるため、連続切片を比較検討する必要がなく短時間で検査を行うことができるようになる。したがって、分子標的薬の投与の是非、あるいは予後予測などを簡便にかつ正確に行うことが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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