(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種の植物またはその一部からタンパク質濃縮材料を得る方法であって、
ニコチアナ種の植物材料を受け取るステップと；
前記植物材料から１種または複数種のタンパク質を溶媒に抽出して、タンパク質含有抽出液を形成するのに十分な時間と条件下で、前記植物材料を前記溶媒と接触させるステップと；
前記タンパク質含有抽出液から固形の抽出植物材料を分離するステップと；
前記タンパク質含有抽出液を清澄化して、清澄化タンパク質含有抽出物と固形画分とを形成するステップと；
少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質を含むタンパク質濃縮材料をもたらすために、前記清澄化タンパク質含有抽出物を処理するステップと
を含み、
前記処理するステップが、前記清澄化タンパク質含有抽出物のｐＨを約３〜約４．５のｐＨに調整して、酸性抽出物を形成することと、前記酸性抽出物から沈殿物を単離することと、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質とを含有するタンパク質濃縮材料をもたらすために、前記沈殿物を洗浄することとを含み、
前記植物材料は、接触させるステップの前に均質化され、
接触させるステップにおいて使用される前記溶媒は、ｐＨ９〜１１である、方法。
【請求項２】
前記洗浄することが約１μｍ〜約１ｋＤａの細孔径を有するフィルター上で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記沈殿物を洗浄するために用いられる前記溶媒が酸性溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質濃縮材料が少なくとも約８０乾燥重量％のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ニコチアナ種の植物材料が緑色の植物材料、黄色の植物材料、乾燥した植物材料またはそれらの混合物の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質濃縮材料を噴霧乾燥するステップ、凍結乾燥するステップ、または脱水するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
色、臭い、味覚、アルカロイド、金属またはその組み合わせを除去するために、いずれかのステップで１種または複数種の成分を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種または複数種の成分が、活性炭、樹脂、粘土、キレート剤、分子インプリントポリマー、非インプリントポリマーまたはその組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記接触ステップにおいて使用される前記溶媒が緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記清澄化ステップが、フィルタープレスに、または遠心分離機に前記タンパク質含有抽出液を通すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質が、少なくとも約５０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも６０乾燥重量％のタンパク質が少なくとも１０乾燥重量％のＦ２タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記清澄化ステップおよび処理ステップが周囲温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料およびＦ２タンパク質濃縮材料を別々にもたらすために、前記ＲｕＢｉｓＣＯ含有およびＦ２タンパク質含有タンパク質濃縮材料を分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離ステップが、ＲｕＢｉｓＣＯ含有およびＦ２タンパク質含有タンパク質濃縮材料を溶媒に溶解して混合物を得ることと、前記混合物を１または複数のフィルターもしくは膜と接触させて、ＲｕＢｉｓＣＯを含む残留分およびＦ２タンパク質を含む透過物を得ることとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記フィルターまたは膜が５００ｋＤａ限外濾過膜または０．１μｍセラミックフィルターを含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタバコからできている、もしくはタバコ由来の製品、またはタバコを組み込み、ヒトによる消費を意図している製品に関する。特に目的とするのは、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種の植物または植物の部分から得られる、または誘導される成分または組成物である。
【背景技術】
【０００２】
紙巻タバコ、葉巻およびパイプタバコは、タバコを様々な形態で使用する普及している喫煙品である。そのような喫煙品は、タバコを加熱または燃焼させ、喫煙者に吸引され得るエアロゾル（例えば、煙）を発生させることによって使用される。紙巻タバコなどの普及している喫煙品は、実質的に円筒状ロッド形状の構造を有しており、巻紙で取り巻かれた刻みタバコ（例えば、刻み充填材の形態で）などの、一分量、一巻、または一列の喫煙に適した材料を含み、それによっていわゆる「タバコロッド」を形成している。通常、紙巻タバコは、タバコロッドと端と端の関係で配列した円筒状のフィルター要素を有する。一般的に、フィルター要素は、「プラグラップ」として知られている紙材料によって囲まれた、可塑化酢酸セルローストウを含む。特定の紙巻タバコは、複数のセグメントを有するフィルター要素を組み込み、それらのセグメントの一つは、活性炭粒子を含み得る。一般的に、フィルター要素は、「チップペーパー」として知られている、取り囲む巻紙材料を用いて、タバコロッドの一端に取り付けられる。また、引き込んだ主流煙を周囲空気で希釈するために、チップ材料とプラグラップに穿孔することが望ましくなっている。紙巻タバコは、喫煙者がその一端を点火して、タバコロッドを燃焼することによって使用される。次いで、喫煙者は、紙巻タバコの反対側（例えば、フィルター端部）を吸い込むことによって主流煙を喫煙者の口に受け取る。
【０００３】
紙巻タバコ製造で使用されるタバコは、一般的にブレンドした形態で使用される。例えば、一般に「アメリカンブレンド」と呼ばれる、特定の普及しているタバコのブレンドは、熱風乾燥タバコ、バーレータバコおよびオリエンタルタバコの混合物を含み、多くの場合、特定の加工タバコ、例えば再構成タバコと加工タバコ茎を含む。特定の銘柄の紙巻タバコの製造で使用されるタバコのブレンドの各タパコの種類の正確な量は、銘柄間で異なる。しかし、多くのタバコのブレンドの場合、熱風乾燥タバコがブレンドで比較的大きな割合を占め、一方オリエンタルタバコは、ブレンドで比較的小さい割合を占める。例えば、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，Ｖｏｇｅｓ（編）ｐ．  ４４−４５（１９８４），Ｂｒｏｗｎｅ，Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓ，第３版，ｐ．４３（１９９０）およびＴｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓら．（編）ｐ．３４６（１９９９）を参照されたい。
【０００４】
タバコはいわゆる「無煙」形態で楽しむこともできる。特に普及している無煙タバコ製品は、加工タバコまたはタバコを含有する配合物をユーザの口に挿入することによって使用される。例えば、以下に記載の無煙タバコ配合物の種類、成分および処理方法を参照されたい。Ｓｃｈｗａｒｔｚの米国特許第１，３７６，５８６号；Ｌｅｖｉの同第３，６９６，９１７号；Ｐｉｔｔｍａｎらの同第４，５１３，７５６号；Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ，Ｊｒ．らの同第４，５２８，９９３号；Ｓｔｏｒｙらの同第４，６２４，２６９号：Ｔｉｂｂｅｔｔｓの同第４，９９１，５９９号：Ｔｏｗｎｓｅｎｄの同第４，９８７，９０７号；Ｓｐｒｉｎｋｌｅ，ＩＩＩらの同第５，０９２，３５２号；Ｗｈｉｔｅらの同第５，３８７，４１６号；Ｗｉｌｌｉａｍｓの同第６，６６８，８３９号；Ｗｉｌｌｉａｍｓの同第６，８３４，６５４号；Ａｔｃｈｌｅｙらの同第６，９５３，０４０号；Ａｔｃｈｌｅｙらの同第７，０３２，６０１号；およびＡｔｃｈｌｅｙらの同第７，６９４，６８６号；Ｗｉｌｌｉａｍｓの米国特許出願公開第２００４／００２０５０３号；Ｑｕｉｎｔｅｒらの同第２００５／０１１５５８０号；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの同第２００５／０２４４５２１号；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの同第２００６／０１９１５４８号；Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの同第２００７／００６２５４９号；ｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの同第２００７／０１８６９４１号；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの同第２００７／０１８６９４２号；Ｄｕｂｅらの同第２００８／００２９１１０号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの同第２００８／００２９１１６号；Ｍｕａらの同第２００８／００２９１１７号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの同第２００８／０１７３３１７号；Ｅｎｇｓｔｒｏｍらの同第２００８／０１９６７３０号；Ｎｅｉｌｓｅｎらの同第２００８／０２０９５８６号；Ｃｒａｗｆｏｒｄらの同第２００８／０３０５２１６号；Ｍｕａらの同第２００９／００２５７３８号；Ｂｒｉｎｋｌｅｙらの同第２００９／００２５７３９号；Ｅｓｓｅｎらの同第２００９／００６５０１３号；Ｋｕｍａｒらの同第２００９／０２９３８８９号；Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅらの同第２０１０／００１８５４０号；Ｇｅｒａｒｄｉらの同第２０１０／００１８５４１号；Ｇａｏらの同第２０１０／０２９１２４５号；Ｍｕａらの同第２０１１／０１３９１６４号；Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０１７４３２３号；Ｂｅｅｓｏｎらの同第２０１１／０２４７６４０号；Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０２５９３５３号；Ｃａｎｔｒｅｌｌらの同第２０１２／００３７１７５号；Ｈｕｎｔらの同第２０１２／００５５４９４号；Ｓｅｂａｓｔｉａｎらの同第２０１２／０１０３３５３号；Ｂｙｒｄらの同第２０１２／０１２５３５４号；Ｃａｎｔｒｅｌｌらの同第２０１２／０１３８０７３号；およびＣａｒｎｔｒｅｌｌらの同第２０１２／０１３８０７４号；Ａｒｎａｒｐらの国際公開第０４／０９５９５９号；Ａｔｃｈｌｅｙらの同第０５／０６３０６０号；Ｅｎｇｓｔｒｏｍの同第０５／００４４８０号；Ｂｊｏｒｋｈｏｌｍの同第０５／０１６０３６号；Ｑｕｉｎｔｅｒらの同第０５／０４１６９９号；およびＡｔｃｈｌｅｙの同第１０／１３２４４４号；それぞれを参照により本明細書に組み込む。
【０００５】
無煙タバコ製品の１種類は、「嗅ぎタバコ」と呼ばれる。特に、一般に「スヌース」と呼ばれる、湿性嗅ぎタバコ製品の代表的種類は、欧州、特にスウェーデンで、Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍａｔｃｈ  ＡＢ、Ｆｉｅｄｌｅｒ＆Ｌｕｎｄｇｒｅｎ  ＡＢ、Ｇｕｓｔａｖｕｓ  ＡＢ、Ｓｋａｎｄｉｎａｖｉｓｋ  Ｔｏｂａｋｓｋｏｍｐａｇｎｉ  Ａ／ＳおよびＲｏｃｋｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ＡＢなどの会社によって、または会社を通して製造されている。米国で入手可能なスヌース製品は、Ｒ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙによる商標名Ｃａｍｅｌ  Ｓｎｕｓ  Ｆｒｏｓｔ、Ｃａｍｅｌ  Ｓｎｕｓ  ＯｒｉｇｉｎａｌおよびＣａｍｅｌ  Ｓｎｕｓ  Ｓｐｉｃｅが市販されている。例えば、Ｂｒｙｚｇａｌｏｖら，１Ｎ１８００  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｏｏｓｅ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｉｏｎ  Ｓｎｕｓ（２００５）も参照されたい。加えて、スヌース製造に関連した特定の品質基準は、いわゆるＧｏｔｈｉａＴｅｋ基準としてまとめられている。代表的な無煙タバコ製品も、Ｈｏｕｓｅ  ｏｆ  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｔｗｉｓｔ  Ａ／Ｓによる商標名Ｏｌｉｖｅｒ  Ｔｗｉｓｔ；米国Ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏ．による商標名Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ湿式タバコ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎパウチ、Ｓｋｏａｌ  Ｂａｎｄｉｔｓ、Ｓｋｏａｌ  Ｐｏｕｃｈｅｓ、ＳｋｏａｌＤｒｙ、Ｒｏｏｓｔｅｒ、Ｒｅｄ  Ｓｅａｌロングカット、ＨｕｓｋｙおよびＲｅｖｅｌ  Ｍｉｎｔ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐａｃｋｓ；Ｐｈｉｌｉｐ  Ｍｏｒｒｉｓ  ＵＳＡによるＭａｒｌｂｏｒｏ  Ｓｎｕｓと“ｔａｂｏｋａ”；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｎｕｆｆ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＬＬＣによるＬｅｖｉ  Ｇａｒｒｅｔｔ、Ｐｅａｃｈｙ、Ｔａｙｌｏｒ’ｓ  Ｐｒｉｄｅ、Ｋｏｄｉａｋ、Ｈａｗｋｅｎ  Ｗｉｎｔｅｒｇｒｅｅｎ、Ｇｒｉｚｚｌｙ、Ｄｅｎｔａｌ、Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  ＫｉｎｇおよびＭａｍｍｏｔｈ  Ｃａｖｅ；Ｒ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  ＣｏｍｐａｎｙによるＣａｍｅｌ  Ｓｎｕｓ、Ｃａｍｅｌ  Ｏｒｂｓ、Ｃａｍｅｌ  ＳｔｉｃｋｓおよびＣａｍｅｌ  Ｓｔｒｉｐｓが市販されている。市販されている他の例示的な無煙タバコ製品としては、Ｓｗｉｓｈｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．によるＫａｙａｋ湿式嗅ぎタバコおよびＣｈａｔｔａｎｏｏｇａ  Ｃｈｅｗ噛みタバコ；ならびにＰｉｎｋｅｒｔｏｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏ．ＬＰによるＲeｄｍａｎ噛みタバコが挙げられる。
【０００６】
長年の間、種々の処理方法と添加剤が、タバコ製品で利用されるタバコ材料の総合特性または性質を変えるために提案されてきた。例えば、タバコ材料の化学特性または感覚特性を変えるために、または喫煙に適したタバコ材料の場合、タバコ材料を含む喫煙品によって発生する主流煙の化学特性または感覚特性を変えるために、添加剤または処理プロセスが利用されてきた。紙巻タバコの煙の感覚属性は、香味料を紙巻タバコの種々の成分に組み込むことによって高めることができる。例示的な風味付け添加剤は、ピラジン、アミノ糖およびアマドリ化合物などのメイラード反応の方法と製品を含む。米国の紙巻タバコのブレンドは、一般的に、カンゾウまたは粉末ココアなどの香味成分、および異性化糖などの糖源を含む、ケーシング組成物を含有する。Ｌｅｆｆｉｎｇｗｅｌｌら，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｓｍｏｋｉｎｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９７２）も参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。場合によっては、熱の使用を含む処理プロセスは、所望の色または視覚的特性、所望の感覚特性または所望の物理的性質もしくは質感を加工タバコに与えることができる。タバコ組成物用の味わいがあり、かつ香り高い組成物を調製する種々のプロセスは、以下に記載されている：Ｒｏｏｋｅｒの米国特許第３，４２４，１７１号；Ｌｕｔｔｉｃｈの同第３，４７６，１１８号；Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊｒ．らの同第４，１５０，６７７号；Ｒｏｂｅｒｔｓらの同第４，９８６，２８６号；Ｗｈｉｔｅらの同第５，０７４，３１９号；Ｗｈｉｔｅらの同第５，０９９，８６２号；Ｓｅｎｓａｂａｕｇｈ，Ｊｒ．の同第５，２３５，９９２号；Ｒａｙｍｏｎｄらの同第５，３０１，６９４号；Ｃｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩらの同第６，２９８，８５８号；Ｃｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩらの同第６，３２５，８６０号；Ｃｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩらの同第６，４２８，６２４号；Ｄｕｂｅらの同第６，４４０，２２３号；Ｃｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩらの同第６，４９９，４８９号；およびＷｈｉｔｅらの同第６，５９１，８４１号；Ｃｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩの米国特許出願公開第２００４／０１７３２２８号およびＣｏｌｅｍａｎｎ，ＩＩＩらの同第２０１０／００３７９０３号、それぞれを参照により本明細書に組み込む。
【０００７】
無煙タバコの感覚属性も、特定の香味料を取り込むことによって高めることができる。例えば、以下を参照されたい：Ｗｉｌｌｉａｍｓの米国特許出願第２００２／０１６２５６２号；Ｗｉｌｌｉａｍｓの同第２００２／０１６２５６３号；Ａｔｃｈｌｅｙらの同第２００３／００７０６８７号；Ｗｉｌｌｉａｍｓの同第２００４／００２０５０３号；Ｂｒｅｓｌｉｎらの同第２００５／０１７８３９８号；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの同第２００６／０１９１５４８号；Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの同第２００７／００６２５４９号；Ｈｏｌｔｏｎ，Ｊｒ．らの同第２００７／０１８６９４１号；Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄらの同第２００７／０１８６９４２号；Ｄｕｂｅらの同第２００８／００２９１１０号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの同第２００８／００２９１１６号；Ｍｕａらの同第２００８／００２９１１７号；Ｒｏｂｉｎｓｏｎらの同第２００８／０１７３３１７号；およびＮｅｉｌｓｅｎらの同第２００８／０２０９５８６号；それぞれを参照により本明細書に組み込む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第１，３７６，５８６号明細書
【特許文献２】米国特許第３，６９６，９１７号明細書
【特許文献３】米国特許第４，５１３，７５６号明細書
【特許文献４】米国特許第４，５２８，９９３号明細書
【特許文献５】米国特許第４，６２４，２６９号明細書
【特許文献６】米国特許第４，９９１，５９９号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９８７，９０７号明細書
【特許文献８】米国特許第５，０９２，３５２号明細書
【特許文献９】米国特許第５，３８７，４１６号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，６６８，８３９号明細書
【特許文献１１】米国特許第６，８３４，６５４号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，９５３，０４０号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，０３２，６０１号明細書
【特許文献１４】米国特許第７，６９４，６８６号明細書
【特許文献１５】米国特許出願公開第２００４／００２０５０３号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２００５／０１１５５８０号明細書
【特許文献１７】米国特許出願公開第２００５／０２４４５２１号明細書
【特許文献１８】米国特許出願公開第２００６／０１９１５４８号明細書
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００７／００６２５４９号明細書
【特許文献２０】米国特許出願公開第２００７／０１８６９４１号明細書
【特許文献２１】米国特許出願公開第２００７／０１８６９４２号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公開第２００８／００２９１１０号明細書
【特許文献２３】米国特許出願公開第２００８／００２９１１６号明細書
【特許文献２４】米国特許出願公開第２００８／００２９１１７号明細書
【特許文献２５】米国特許出願公開第２００８／０１７３３１７号明細書
【特許文献２６】米国特許出願公開第２００８／０１９６７３０号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２００８／０２０９５８６号明細書
【特許文献２８】米国特許出願公開第２００８／０３０５２１６号明細書
【特許文献２９】米国特許出願公開第２００９／００２５７３８号明細書
【特許文献３０】米国特許出願公開第２００９／００２５７３９号明細書
【特許文献３１】米国特許出願公開第２００９／００６５０１３号明細書
【特許文献３２】米国特許出願公開第２００９／０２９３８８９号明細書
【特許文献３３】米国特許出願公開第２０１０／００１８５４０号明細書
【特許文献３４】米国特許出願公開第２０１０／００１８５４１号明細書
【特許文献３５】米国特許出願公開第２０１０／０２９１２４５号明細書
【特許文献３６】米国特許出願公開第２０１１／０１３９１６４号明細書
【特許文献３７】米国特許出願公開第２０１１／０１７４３２３号明細書
【特許文献３８】米国特許出願公開第２０１１／０２４７６４０号明細書
【特許文献３９】米国特許出願公開第２０１１／０２５９３５３号明細書
【特許文献４０】米国特許出願公開第２０１２／００３７１７５号明細書
【特許文献４１】米国特許出願公開第２０１２／００５５４９４号明細書
【特許文献４２】米国特許出願公開第２０１２／０１０３３５３号明細書
【特許文献４３】米国特許出願公開第２０１２／０１２５３５４号明細書
【特許文献４４】米国特許出願公開第２０１２／０１３８０７３号明細書
【特許文献４５】米国特許出願公開第２０１２／０１３８０７４号明細書
【特許文献４６】国際公開第２００４／０９５９５９号明細書
【特許文献４７】国際公開第２００５／０６３０６０号明細書
【特許文献４８】国際公開第２００５／００４４８０号明細書
【特許文献４９】国際公開第２００５／０１６０３６号明細書
【特許文献５０】国際公開第２００５／０４１６９９号明細書
【特許文献５１】国際公開第２０１０／１３２４４４号明細書
【特許文献５２】米国特許第３，４２４，１７１号明細書
【特許文献５３】米国特許第３，４７６，１１８号明細書
【特許文献５４】米国特許第４，１５０，６７７号明細書
【特許文献５５】米国特許第４，９８６，２８６号明細書
【特許文献５６】米国特許第５，０７４，３１９号明細書
【特許文献５７】米国特許第５，０９９，８６２号明細書
【特許文献５８】米国特許第５，２３５，９９２号明細書
【特許文献５９】米国特許第５，３０１，６９４号明細書
【特許文献６０】米国特許第６，２９８，８５８号明細書
【特許文献６１】米国特許第６，３２５，８６０号明細書
【特許文献６２】米国特許第６，４２８，６２４号明細書
【特許文献６３】米国特許第６，４４０，２２３号明細書
【特許文献６４】米国特許第６，４９９，４８９号明細書
【特許文献６５】米国特許第６，５９１，８４１号明細書
【特許文献６６】米国特許出願公開第２００４／０１７３２２８号明細書
【特許文献６７】米国特許出願公開第２０１０／００３７９０３号明細書
【特許文献６８】米国特許出願公開第２００２／０１６２５６２号明細書
【特許文献６９】米国特許出願公開第２００２／０１６２５６３号明細書
【特許文献７０】米国特許出願公開第２００３／００７０６８７号明細書
【特許文献７１】米国特許出願公開第２００５／０１７８３９８号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ，Ｖｏｇｅｓ（編）ｐ．  ４４−４５（１９８４）
【非特許文献２】Ｂｒｏｗｎｅ，Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓ，第３版，ｐ．４３（１９９０）
【非特許文献３】Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓら（編集）（１９９９）
【非特許文献４】Ｂｒｙｚｇａｌｏｖら，１Ｎ１８００  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｌｏｏｓｅ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｉｏｎ  Ｓｎｕｓ（２００５）
【非特許文献５】Ｌｅｆｆｉｎｇｗｅｌｌら，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｓｍｏｋｉｎｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （１９７２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
喫煙品および／または無煙タバコ製品の製造に有用な、タバコ（およびタバコ組成物と配合物）の特性および性質を変える追加の組成物と方法を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は，喫煙品および無煙タパコ製品などの種々のタバコ製品に使用されているタバコ組成物に組み込むための有用なニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）種の植物から単離した成分を含む、ニコチアナ種からの材料(例えば、タバコ由来材料）を提供する。本発明は、ニコチアナ種から成分（例えば、タバコ材料）を抽出する方法、およびそれらの成分を処理し、タバコ材料をそれらの成分に組み込む方法も提供する。
【００１２】
特に、本発明は、タバコ材料由来の清澄化したタンパク質濃縮材料と、そのようなタンパク質濃縮材料を取得し、および／または誘導する方法と、そのようなタンパク質濃縮材料を種々のタバコ組成物に組み込む方法とを提供する。
【００１３】
特定の態様において、本開示は、ニコチアナ種の植物またはその一部からタンパク質濃縮材料を得る方法を提供し、該方法は、ニコチアナ種の植物材料を受け取ることと；植物材料から１種または複数種のタンパク質を溶媒に抽出して、タンパク質含有抽出液を形成するのに十分な時間と条件下で、植物材料を溶媒と接触させることと；タンパク質含有抽出液から固形の抽出植物材料を分離することと；タンパク質含有抽出液を清澄化して、清澄化タンパク質含有抽出物と固形画分とを形成することと；清澄化タンパク質含有抽出物を処理して、少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質を含むタンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。
【００１４】
本方法の種々のステップで用いられる条件および試薬は、変えることができる。例えば、本明細書に記述したように処理したニコチアナ種の植物材料は、緑色の植物材料、黄色の植物材料、乾燥した植物材料またはそれらの混合物の形態であり得る。特定の実施形態において、溶媒は水を含み、および任意選択で、メタ重亜硫酸ナトリウムバッファ緩衝液（例えば、アスコルビン酸またはグリシン）またはその組み合わせをさらに含み得る。一部の実施形態において、溶媒は塩基性ｐＨを有する。
【００１５】
方法の各ステップは、種々の成分を含み得る。例えば、一部の実施形態において、清澄化ステップは、タンパク質含有抽出液のｐＨを酸性ｐＨに調整することと、抽出物を濾過することとを含む。例えば、清澄化タンパク質含有抽出物は、約４と約６の間のｐＨに調整し得る、または約５もしくは約６のｐＨに調整し得る。一部の実施形態において、清澄化ステップは、タンパク質含有抽出液のｐＨを塩基性ｐＨに調整することと、抽出物を濾過することとを含む。
【００１６】
一部の実施形態において、処理ステップは、清澄化タンパク質含有抽出物のｐＨを約６未満のｐＨに調整して、酸性抽出物を形成することと；酸性抽出物から沈殿物を単離することと；沈殿物を洗浄して、タンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。そのような特定の実施形態において、清澄化タンパク質含有抽出物のｐＨの調整は、約４．５と約６の間で（ＲｕＢｉｓＣＯ含有タンパク質濃縮材料をもたらすために）調整され得る。洗浄は、例えば、約１μｍと約１ｋＤａの間、または約１μｍと約１０μｍの間の細孔径を有するフィルター上で行われ得る。一実施形態において、単離ステップの後に残留している抽出物は、以下のうちの一方または両方でさらに処理することができる：１）１ｋＤａ〜５００ｋＤａの細孔径を有するフィルター上で濾過すること、並びに残留分として第２のタンパク質濃縮材料を単離すること；および２）抽出物を約４．５未満のｐＨに調整すること、並びにそこからの第２のタンパク質濃縮材料を含む第２の沈殿物を単離すること。この場合第２のタンパク質濃縮材料はＦ２タンパク質含有タンパク質濃縮材料である。一部のそのような実施形態において、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２とを含有するタンパク質濃縮材料との混合物をもたらすために、清澄化タンパク質含有抽出物は、約３と約４．５の間のｐＨに調整することができる。
【００１７】
洗浄ステップで用いる溶媒は、例えば、酸性溶液（例えば、クエン酸溶液）であり得る。この沈殿物形成方法によって生成されるタンパク質濃縮材料は、一部の実施形態において、通常、少なくとも約８０乾燥重量％のタンパク質を含む。特定の実施形態において、このように得られるタンパク質は、少なくとも約５０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯである。
【００１８】
他の実施形態において、処理ステップは、残留分と透過液を得るために、セラミックフィルターまたは限外濾過膜上で清澄化タンパク質含有抽出物を濾過することと；残留分を洗浄して、タンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。そのような特定の実施形態において、清澄化ステップは、タンパク質含有抽出液のｐＨを調整することを含み得る。一部の実施形態において、濾過ステップは、約１μｍと約１ｋＤａの間の細孔径および／または分画分子量を有する１または複数のフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含む。一部の実施形態において、約１０ｋＤａおよび／または約２０ｋＤａの分画分子量を有するフィルターを使用することができる。例えば、濾過ステップは、約１μｍと約５００ｋＤａの間の細孔径を有するフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含み、残留分は少なくとも約５０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む。別の例として、濾過ステップは、約１ｋＤａ以上、例えば約１ｋＤａと約５００ｋＤａの間の分画分子量を有するフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含み、残留分はＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質の混合物を含み得る。一部のそのような実施形態において、方法は、Ｆ２画分タンパク質を含む第２のタンパク質濃縮材料残留分を得るために、約５００ｋＤａと１ｋＤａの間の細孔径を有するフィルターに、１ｋＤａの透過物を通すことをさらに含む。
【００１９】
一部の実施形態において、方法は、固形、タンパク質濃縮材料を噴霧乾燥、もしくは凍結乾燥、さもなければ脱水することをさらに含む。さらに、色、臭い、味覚、アルカロイド、金属またはその組み合わせを除去するために、任意のプロセスステップで、種々の成分を任意選択で添加することができる。そのような成分は、例えば、活性炭、樹脂、粘土、キレート剤、分子インプリントポリマー、非インプリントポリマーまたはその組み合わせからなる群から選択されることができる。
【００２０】
本開示の別の態様において、本明細書に記述の方法によって得られるタンパク質濃縮抽出物が提供される。当該別の態様において、本明細書に記述のタンパク質濃縮抽出物を含む製品が提供される。例えば、そのような製品として、栄養補助食品、食品、飲料、パーソナルケア用品、医薬品およびペットフードを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２１】
さらなる態様において、ニコチアナ種の植物またはその一部に由来するタンパク質濃縮材料が提供され、該材料は少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質を含む。タンパク質濃縮材料の組成は、変えることができ、例えば、ＲｕＢｉＣＯ、Ｆ２タンパク質またはその組み合わせを含み得る。特定の実施形態において、タンパク質濃縮材料中のタンパク質は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％のＲｕＢｉＣＯを含む。特定の実施形態において、タンパク質濃縮材料中のタンパク質は、少なくとも約５０重量％、少なくとも約６０重量％、少なくとも約７０重量％、少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％のＦ２タンパク質を含む。
【００２２】
本発明は、以下の実施形態を含むが、これに限定されるものではない。
【００２３】
実施形態１：ニコチアナ種の植物またはその一部からタンパク質濃縮材料を得る方法であって、ニコチアナ種の植物材料を受け取ることと；植物材料から１種または複数種のタンパク質を溶媒に抽出し、タンパク質含有抽出液を形成するのに十分な時間と条件下で、植物材料を溶媒と接触させることと；タンパク質含有抽出液から固形の抽出植物材料を分離することと；タンパク質含有抽出液を清澄化して、清澄化タンパク質含有抽出物と固形画分とを形成することと；清澄化タンパク質含有抽出物を処理して、少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質を含むタンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。
【００２４】
実施形態２：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、処理ステップは、清澄化タンパク質含有抽出物のｐＨを約６未満のｐＨに調整して、酸性抽出物を形成することと；酸性抽出物から沈殿物を単離することと；沈殿物を洗浄して、タンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。
【００２５】
実施形態３：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、清澄化タンパク質含有抽出物のｐＨの調整を約４．５と約６の間に調整して、ＲｕＢｉｓＣＯ含有タンパク質濃縮材料をもたらす。
【００２６】
実施形態４：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、単離ステップの後に残留する抽出物は、以下のうちの一方または両方でさらに処理する：１）１ｋＤａ〜５００ｋＤａの細孔径を有するフィルター上で濾過すること、並びに残留分として第２のタンパク質濃縮材料を単離すること；および２）抽出物を約４．５未満のｐＨに調整すること、並びにそこからの第２のタンパク質濃縮材料を含む第２の沈殿物を単離すること。この場合第２のタンパク質濃縮材料はＦ２タンパク質含有タンパク質濃縮材料である。
【００２７】
実施形態５：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、洗浄は、約１μｍと約１ｋＤａの間の細孔径を有するフィルター上で行われる。
【００２８】
実施形態６：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２とを含有するタンパク質濃縮材料をもたらすために、清澄化タンパク質含有抽出物は、約３と約４．５の間のｐＨに調整することができる。
【００２９】
実施形態７：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、沈殿物を洗浄するのに用いられる溶媒は酸性液である。
【００３０】
実施形態８：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、タンパク質濃縮材料は少なくとも約８０乾燥重量％のタンパク質を含む。
【００３１】
実施形態９：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、処理ステップは、残留物と透過液とを得るために、セラミックフィルターまたは限外濾過膜上で清澄化タンパク質含有抽出物を濾過することと；残留分を洗浄して、タンパク質濃縮材料をもたらすこととを含む。
【００３２】
実施形態１０：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、清澄化ステップは、タンパク質含有抽出液のｐＨを調整することを含む。
【００３３】
実施形態１１：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、濾過ステップは、約１μｍと約１ｋＤａの間の細孔径を有する１または複数のフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含む。
【００３４】
実施形態１２：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、濾過ステップは、約１μｍと約５００ｋＤａの間の細孔径を有するフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含み、残留分は少なくとも約５０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む。
【００３５】
実施形態１３：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、濾過ステップは、約１ｋＤａと約５００ｋＤａの間の細孔径を有するフィルターに、清澄化タンパク質含有抽出物を通すことを含み、残留分はＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質の混合物を含む。
【００３６】
実施形態１４：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、第２のタンパク質濃縮材料は、Ｆ２画分タンパク質を含む残留分として第２のタンパク質濃縮材料を得るために、約５００ｋＤａと１ｋＤａの間の細孔径を有するフィルターに、透過物を通すことをさらに含む。
【００３７】
実施形態１５：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、ニコチアナ種の植物材料は、緑色の植物材料、黄色の植物材料、乾燥した植物材料またはそれらの混合物の形態である。
【００３８】
実施形態１６：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、タンパク質濃縮材料を噴霧乾燥、凍結乾燥、もしくは脱水することをさらに含む。
【００３９】
実施形態１７：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、色、臭い、味覚、アルカロイド、金属またはその組み合わせを除去するために、任意のプロセスステップで、１種または複数種の成分を添加することをさらに含む。
【００４０】
実施形態１８：任意の前述または以降の実施形態の方法であって、１種または複数種の成分が、活性炭、樹脂、粘土、キレート剤、分子インプリントポリマー、非インプリントポリマーまたはその組み合わせからなる群から選択される。
【００４１】
実施形態１９：任意の前述または以降の実施形態の方法により得られるタンパク質濃縮抽出物。
【００４２】
実施形態２０：任意の前述または以降の実施形態の方法により得られるタンパク質濃縮抽出物を含む栄養補助食品、食品、飲料、パーソナルケア用品、医薬品またはペットフード。
【００４３】
本開示のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、下記に簡単に記述した添付の図面とともに以下の詳細な説明の解釈から明らかであろう。本発明は、そのような特徴または要素が本明細書の特定の実施形態の説明において明示的に組み合わせられているかどうかにかかわらず、上述の実施形態のうちの２つ、３つ、４つまたはそれ以上の任意の組み合わせ、ならびに本開示に記載の特徴または要素のうちの任意の２つ、３つまたはそれ以上の組み合わせを含む。本開示は、相対的に解釈されることを意図しており、したがって開示する本発明のいずれの分離可能な特徴または要素が、任意のその種々の態様および実施形態において、文脈上別段の明確な指示がない限り、組み合わせが可能であることを意図すると見なされる必要がある。本発明の他の態様および利点は、以下から明らかになろう。
【００４４】
本発明の実施形態の理解を提供するために、添付の図面を参照するが、該図面は必ずしも縮尺にしたがって描かれてはおらず、図面中の参照番号は本発明の例示的な実施形態の成分を指す。図面は例示のためだけのものであり、本発明を限定すると解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】タバコ材料に由来するタンパク質の一プロセス実施形態の概略を示す。
【図２】タバコ材料に由来するタンパク質の別のプロセス実施形態の概略を示す。
【図３】紙巻タバコの形状を有し、喫煙に適した材料、巻紙材料成分および紙巻タバコのフィルター要素を示す喫煙品の分解斜視図である。
【図４】無煙タバコ製品の実施形態を製品の幅方向に切った横断面図であり、外側のパウチが本発明の無煙タバコ組成物で充填されていることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
ここで、本発明を以下でより詳細に説明する。しかし、本発明は、多数の異なる形態で実施されてもよく、および本明細書に記載の諸実施形態に限定されると解釈されてはならなく、むしろ、本開示が綿密かつ完全になり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるようにこれらの実施形態は提供される。本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単数形「一つ（ａ）」、「一つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別段の明確な指示がない限り、複数の指示物を含む。「乾燥重量パーセント」または「乾燥重量ベース」とは、乾燥成分に基づいた（すなわち、水以外のすべての成分）重量を指す。
【００４７】
本開示は、植物材料（例えばタバコ）などのバイオマスからタンパク質を単離する、分離する、さもなければ抽出するプロセスを提供する。本開示は、主にタバコからのタンパク質の抽出に焦点を合わせているが、これらの方法は一般的にタバコ以外の植物材料にも適用可能であり得ることに留意されたい。一部の実施形態において、プロセスは、１種または複数の特定のタンパク質の種類の抽出の目的に合わせることができ、または溶解度、化合物の種類、化合物の化学特性、化合物の物性などに基づいてタンパク質の抽出を一般化することができる。一般に、植物バイオマスの水溶性部分は、２つの画分からなる。一つの画分は、主にＲｕＢｉｓＣＯを含み、そのサブユニット分子量は、約５５０ｋＤ（一般的に「画分１タンパク質」すなわち「Ｆ１タンパク質」と呼ばれる）である。ＲｕＢｉｓＣＯは、葉の総タンパク含有量の最高約２５％まで、および葉の固形物の最高約１０％までを含む。第２の画分（「画分２タンパク質」すなわち「Ｆ２タンパク質」）は、通常、タンパク質とペプチドとの混合物を約３ｋＤ〜約１００ｋＤの範囲の分子量で含有し、糖、ビタミン、アルカロイド、香料およびアミノ酸を含む、他の化合物も含有し得る。
【００４８】
本明細書に記述のプロセスによる抽出用の例示的な一タンパク質は、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（一般にＲｕＢｉｓＣＯと呼ばれる）である。ＲｕＢｉｓＣＯは、光合成を受けるあらゆる植物中に存在しているので、世界で最も豊富に存在すると考えられている。ＲｕＢｉｓＣＯは、リブロース−１，５−二リン酸のカルボキシル化および／または酸素化を触媒するための機能と、二酸化炭素の光合成定着の最初の段階に必須である。多くの用途（例えば、食品、飼育製品および産業製品）の場合、特定の動物性タンパク質を植物性タンパク質に置き換えることが望ましい場合もある。さらに、一部の用途において、特定の他の植物性タンパク（例えば、大豆タンパク質および／または遺伝子組み換えタンパク質）を置き換えることが望ましい場合もある。ＲｕＢiｓＣＯは、良好な栄養特性を示すことが判明しており、無色、無味、無臭である。さらに、ＲｕＢｉｓＣＯは、結合、ゲル化、溶解度および乳化の挙動が優れているので、その物性はそのような製品での使用に適するものである。
【００４９】
多様な植物材料抽出からのＲｕＢｉｓＣＯの抽出のために種々の方法が提案されてきた。例えば、Ｗｉｌｄｍａｎらの米国特許第４，２６８，６３２号；Ｂｏｕｒｋｅの同第４，３４０，６７６号；Ｊｏｈａｌの同第４，４００，４７１号；Ｊｏｈａｌの同第４，５８８，６９１号；およびＧａｒｇｅｒらの同第６，０３３，８９５号を参照されたい。それぞれを参照により本明細書に組み込む。しかし、かなりの（工業）規模でのＲｕＢｉｓＣＯの抽出および精製プロセスは、まだ実証されていない。
【００５０】
本開示は、ニコチアナ種の植物またはその一部から特定のタンパク質を抽出および／または単離する方法を提供する。したがって、本明細書に開示する方法は、一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料、例えば、少なくとも約５０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約７０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約８０乾燥重量％のタンパク質、または少なくとも約８５乾燥重量％のタンパク質を含む材料をもたらし得る。一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料は、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質の混合物を含む。一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料中のタンパク質は、主にＲｕＢｉｓＣＯを含む。一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料中のタンパク質は、主にＦ２タンパク質を含む。
【００５１】
一部の実施形態において、タンパク質は、少なくとも約６０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ，少なくとも約７０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯまたは少なくとも約８０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ，少なくとも約９０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ，少なくとも約９５乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ，少なくとも約９８乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯまたは少なくとも約９９乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む。本明細書で「タンパク質濃縮」という用語が使用される場合、一部の実施形態において、後述するように「ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮」を指し得ることに注意されたい。
【００５２】
一部の実施形態において、本開示は特に、ニコチアナ種の植物またはその一部からＲｕＢｉｓＣＯを抽出および／または単離する方法を提供する。したがって、本明細書に開示する方法は、一部の実施形態において、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、例えば、少なくとも約５０乾燥重量％、少なくとも約６０乾燥重量％、少なくとも約７０乾燥重量％、少なくとも約８０乾燥重量％または少なくとも約８５乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む材料をもたらし得る。
【００５３】
特定の実施形態において、本開示はさらに、ニコチアナ種の植物またはその一部からＦ２タンパク質を抽出および／または単離する方法を提供する。したがって、本明細書に開示する方法は、一部の実施形態において、Ｆ２タンパク質濃縮材料、例えば、少なくとも約１０乾燥重量％、少なくとも約２０乾燥重量％、少なくとも約３０乾燥重量％、少なくとも約４０乾燥重量％、少なくとも約５０乾燥重量％または少なくとも約６０乾燥重量％のＦ２タンパク質を含む材料をもたらし得る。
【００５４】
本開示は、一部の実施形態において、大規模生産に適用可能であり、この場合、大規模生産という用語は、大量生産レベルで大量のバイオマス（例えばタバコ）を処理することを指す。「バイオマス」という用語および関連する「バイオマター」および「植物源」という用語は、それから目的の成分を抽出、分離、または単離するように処理され得る収穫した植物の任意の部分を指すと理解される。処理は、種々の植物またはその部分、例えば、植物の種子、花、葉柄、茎、根、塊茎、葉または任意のさらなる部分に関して行われ得る。
【００５５】
本開示より使用される例示的なタバコ材料は、ニコチアナ種植物の一部の形状であり得る。ニコチアナ種からの植物の選択は、変えることができ、特に、タバコまたはタバコ（複数可）の種類は、変えることができる。使用することができるタバコとしては、熱風乾燥またはＶｉｒｇｉｎｉａ（例えば、Ｋ３２６）、バーレー、日光乾燥（例えば、Ｋａｔｅｒｉｎｉ、Ｐｒｅｌｉｐ、Ｋｏｍｏｔｉｎｉ、ＸａｎｔｈｉおよびＹａｍｂｏｌタバコを含むＩｎｄｉａｎ  ＫｕｒｎｏｏｌとＯｒｉｅｎｔａｌタバコ）、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ダーク、ダーク直火乾燥、ダーク風乾燥（例えば、Ｐａｓｓａｎｄａ、Ｃｕｂａｎｏ、ＪａｔｉｎおよびＢｅｚｕｋｉタバコ）、自然乾燥（例えば、Ｎｏｒｔｈ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎおよびＧａｌｐａｏタバコ）、Ｉｎｄｉａｎ空気乾燥、Ｒｅｄ  ＲｕｓｓｉａｎおよびＲｕｓｔｉｃａタバコ、並びに様々な他の珍しいタバコまたは特製品タバコが挙げられる。種々のタバコの種類、栽培の実務および収穫の実務についての説明は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓら（編集）（１９９９）に記載されている。これを参照により本明細書に組み込む。ニコチアナ種は、遺伝子修飾または交雑技法（例えば、タバコ植物を遺伝子改変または交雑させて、特定成分、特性または特質を増加もしくは減少させる、または変えることができる）を用いて得ることができる。本発明の使用に好適なニコチアナ種の種類に関するさらなる情報は、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１９２８８０号に見出すことができる。これを参照により本明細書に組み込む。タバコ植物は、温室、栽培室でもしくは屋外の畑で栽培する、または水耕法で栽培することができる。
【００５６】
ニコチアナ種は、それに存在する種々の化合物の含有量で選択することができる。例えば、タバコ植物は、それらの植物がそれから単離することが望ましい１種または複数種の化合物（例えばタンパク質）を比較的高い量で生成するということに基づいて選択することができる。特定の実施形態において、ニコチアナ種の植物（例えば、Ｇａｌｐａｏ  ｃｏｍｍｕｎタバコ）は、それらの葉面化合物が特に豊富なために栽培されている。
【００５７】
本発明により用いられるニコチアナ種の植物の一部または様々な部分は、変えることができる。例えば、実質的に、植物のすべて（例えば、全草）を収穫して、その状態で用いることができる。あるいは、植物の様々な部分または断片を収穫し、または収穫後、さらなる使用のために分離することができる。例えば、葉、茎、葉柄、根、葉身、花、種子と種々の部分およびその組み合わせを、さらなる使用または処理のために単離することができる。このように、本発明の植物材料は、ニコチアナ種の植物全体または任意の部分を含み得る。例えば、Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの米国特許出願公開第２０１１／０１７４３２３号およびＤｕｂｅらの同第２０１２／０１９２８８０号に記載のタバコ植物の部分を参照されたい。これらを参照により本明細書に組み込む。
【００５８】
ニコチアナ種の植物は、Ｄｕｂｅらの特許出願公開第２０１２／０１９２８８０（参照により本明細書に組み込む）に記述されているように、未熟または成熟のいずれかの形態で用いることができる。
【００５９】
タバコ材料は、例えば、冷凍、凍結、乾燥（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）、照射、黄変、加熱、調理（例えば、ロースト、フライまたはボイル）、発酵、漂白等の種々の処理プロセスにかけることができ、さもなければ後の使用のために、貯蔵または処理にかけることができる。一部の実施形態において、本明細書に記述するさらなる処理の前に、緑色植物を渇変から防止するために、収穫したタバコに緩衝液または抗酸化剤（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム緩衝液）を噴霧することができる。他の例示的な処理技法は、例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙらの米国特許公開第２００９／００２５７３９号およびＣｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０１７４４￥３２３号に記述されている。これらを参照により本明細書に組み込む。２０１２年４月１１日出願のＭａｒｓｈａｌｌらの米国特許出願第１３／４４，２７２号、２０１２年７月１９日出願のＭｏｌｄｏｖｅａｎｕの米国特許出願第１３／５５３，２２２号（これらを参照により本明細書に組み込む）に述べられているように、収穫の前後に、ニコチアナ種の植物の少なくとも一部を酵素および／またはプロバイオテクスで処理することができる。
【００６０】
収穫したニコチアナ種の植物の一部または様々な部分は、物理的に処理することができる。ニコチアナ種の植物の一部または様々な部分は、個々の部分または断片に分離することができる（例えば、根は葉柄から取ることができる；茎は葉柄から取ることができる；葉は葉柄および／または茎から取ることができ、花弁は花の残余部分から取ることができる）。タバコ植物の任意の単一部分またはタバコ植物の複数の部分は、本発明により用いることができるが、タバコ葉柄、タバコ葉、またはタバコ葉柄とタバコ葉の両方を用いることが好ましい。収穫された植物の一部または様々な部分は、さらに部分または断片に細別することができる（例えば、充填材型の断片、顆粒、粒子または微粉として特徴付けることができる断片または部分に、細かく刻み、切断し、細かく砕き、粉砕し、または粉々にする）。収穫した植物の一部または部分には、外力または圧力（例えば、押圧される、またはロール処理にかけることによって）をかけることができる。例えば、特定の実施形態において、タバコ葉柄は、単独または植物の他の部分と組み合わせて（例えば、葉柄と葉を一緒に）用いることができ、および一部の実施形態において、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１５２２６５号（これを参照により本明細書に組み込む）に記述されている種類の処理にかけることができる。
【００６１】
そのような処理条件で実施するとき、収穫した植物の一部または部分は、その天然の含水量（例えば、収獲直後のその含水量）に近い含水量、収穫した植物の一部または部分に水分を加えることによって達成される含水量、または収穫した植物の一部または部分を乾燥させることから生じる含水量を有し得る。
したがって、収穫した植物の一部または部分は、タバコ製品の成分などとして用いられ、またはさらに処理され得る。
【００６２】
本発明によれば、ニコチアナ種の植物の一部または部分は、それに含まれる１種または複数種の成分（例えばタンパク質）を、より有用な（例えば、さらに濃縮された）形態でもたらすように処理される。ニコチアナ植物またはその部分由来の種々の化合物または化合物の混合物は、本明細書に提示する方法によって抽出および／または単離することができる。本明細書で用いる場合、「単離された成分」または「単離した植物」とは、ニコチアナ種の植物またはその一部から分離された化合物または化合物の複合混合物である。単離した成分は、単一化合物、類似した化合物の同種混合物（例えば、化合物の異性体）、または異なる化合物の異種混合物（例えば、異なる種類の種々の化合物の複合混合物）であり得る。例えば、単離したタバコ成分および単離技法についての説明は、Ｔａｙｌｏｒらの米国特許出願公開第２００７／０１３７６６３号；Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０１７４３２３号；Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０２５９３５３号；Ｍｏｒｔｏｎらの同第２０１２／０１４１６４８号；Ｄｕｂｅらの同第２０１２／０１９２８８０号；Ｄｕｂｅらの同第２０１２／０１９２８８２号；Ｂｙｒｄらの同２０１２／０２７２９７６号；Ｂｙｒｄ，Ｊｒ．らの同２０１２／０２１１０１６号、およびＧｅｒａｒｄｉらの米国特許出願第１３／６４７，６７０号を参照されたい。これらを参照により本明細書に組み込む。
【００６３】
本発明の一実施形態により、タバコ植物またはその一部からＲｕＢｉｓＣＯ濃縮抽出物を得るために実施されることができる例示的な一連の処理ステップの例を図１に示す。図１に示す一連の特定のステップは、本発明を限定すると解釈されてはならない。本明細書に開示する方法および条件と機能的に同等である、本開示へのいかなる変更も、本発明の範囲内である。例えば、一般的な分離プロセスは、１または複数のプロセスステップ、例えば、溶媒抽出（例えば、極性溶媒、有機溶媒または超臨界流体を使用する）、クロマトグラフィー（例えば、分取液体クロマトグラフィー）、清澄化、蒸留、濾過（例えば、限外濾過）、再結晶および／または溶媒−溶媒分配を含み得る。
一部の実施形態において、タバコ植物またはその一部は、所望の化合物をより効果的な分離で利用可能にするために、例えば、特定の化合物を遊離させるように前処理することができる。一部の実施形態において、複数の方法を用いて、所望の化合物を得る。
【００６４】
図１に示すプロセスは、一部の実施形態において、タバコ植物またはその部分から特定のタンパク質を得るために個々に実施することができる一群のプロセス１００を含むとみなされ得る。特定の実施形態において、個々のプロセスステップが、同じバッチ内のいずれの他の植物成分の単離または抽出を妨げない方法で具体的に所望の植物成分の単離または抽出を提供するので、本発明によって用いられるプロセスは、植物成分の単離および抽出の全体的なプロセスとみなされ得る。実行されることができる特定の処理の種類についでの例示的な詳細は、Ｍｏｒｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１２／０１４１６４８号を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【００６５】
図１に示す実施形態に示すように、タバコ材料を均質にして（１１０）、固形パルプ１２０と、タンパク質含有抽出液１３０とをもたらす。抽出物１３０を清澄化して（１４０）、それから固形物を取り除き、固形画分１５０と、清澄化タンパク質含有抽出物１６０とを得る。抽出物１６０は、ｐＨを調整し（１７０）、次いで液体成分１８０と、固形タンパク質含有沈殿物１９０とに分離する。沈殿物１９０を濾過にかけて、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料２１０を得る。任意選択で、液体成分１８０を処理して、Ｆ２タンパク質濃縮材料を得ることができる。
【００６６】
均質化ステップ１１０は、植物材料の処理のいずれの種類にも含まれ、植物材料を分解して、その構成成分を放出するのに効果的である。具体的には、均質化とは、植物細胞壁を破壊するまたは分解して、植物細胞内に含まれている液体および他の物質を放出するのに効果的ないずれの処理をも指すことができる。そのような処理は、例えば、グラインダー、エクストルーダー、ハンマーミル、コロイドミル、フレンチプレス等の装置の使用を含み得、Ｍｏｒｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１２／０１４１６４８号により詳細に記述されている。これを参照により本明細書に組み込む。
【００６７】
均質化ステップ１１０は、一部の実施形態において、抽出溶媒の存在下で行われ得る。この点については、植物材料を粉砕作用にかけ、同時に植物材料を抽出溶媒と接触させる、粉砕と抽出の組み合わせプロセスに植物材料をかけることができる。あるいは、均質化ステップが行われ、続いて粉砕された材料を抽出溶媒と接触することができる。このように、植物材料は、粉砕ステップの前、ステップ中、またはその後に、抽出溶媒と結合させてもよい。
【００６８】
ニコチアナ種から成分を抽出するのに有用な例示的な技法は、Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの米国特許出願公開第２０１１／０２５９３５３号およびＢｙｒｄ，Ｊｒ．らの同第２０１２／０２１１０１６号に記述され、参照されている。これらを参照により本明細書に組み込む。本明細書に提示する方法によってタバコからタンパク質を抽出するための抽出溶媒は、水（すなわち、水性溶媒）が好ましい。他の例示的な抽出および分離溶媒または担体としては、アルコール（例えば、メタノールまたはエタノール）、炭化水素（例えば、ヘプタンとヘキサン）、ジエチルエーテル、塩化メチレン、超臨界二酸化炭素およびその組み合わせが挙げられる。
【００６９】
一部の実施形態において、溶媒は、植物材料から１種または複数種の特定の成分の抽出を容易にするために有用な種々の化合物のうちの任意の１種または複数種を含んでもよい。例えば、一部の実施形態において、抽出溶媒は、共存溶媒、洗剤、界面活性剤、抗酸化剤、アミノ酸、緩衝剤、タンパク質抽出剤、酵素、鉱酸およびその組み合わせからなる群から選択される１種または複数種の材料を含み得る。一部の実施形態において、抽出溶媒は以下を含み得る：グリシン、リン酸の１種または複数種の塩（例えば、緩衝材として）、Ｉ族またはＩＩ族ハロゲン塩のうちの１つまたは複数（ＮａＣｌを含む。例えばタンパク質抽出剤として）、および／または抗酸化剤／還元剤（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、重硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸）。
【００７０】
一部の実施形態において、抽出溶媒は、所定の一定のレベルまでの均質化ステップの間、植物液体成分のｐＨを維持する、さもなければ調整するのに特に有用であり得る緩衝液を含んでもよい。有利には、１種または複数種の抗酸化剤および／または緩衝剤（例えば、メタ重亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸および／またはグリシン）は、例えば、好ましくない酸化を抑制するために、抽出溶媒に含まれる。抽出溶媒が緩衝液として機能するとき、抽出溶媒が例えばリン酸ナトリウムなどの１種または複数種の中和剤を含むことは有用であり得る。均質混合は抽出溶媒の存在下で、均質化中に起こるので、タンパク質含有抽出液１３０は植物材料由来の液体成分だけでなく、若干の抽出溶媒も含み得ることを理解されたい。
【００７１】
一部の実施形態によれば、このようにしてもたらされるタンパク質含有抽出液中の特定の植物成分（例えばタンパク質）の量を最大にするために、抽出溶媒のｐＨは調整されてもよい。例えば、塩基性範囲内または酸性範囲内でｐＨを維持することは有用であり得る。例として、一部の実施形態において、抽出溶媒のｐＨは、例えば、約７〜１４の範囲内、あるいは、例えば約９〜１１（例えば約１０．５）のように約８〜１２の範囲内で塩基性であり得る。そのような範囲は、特に、タンパク質含有抽出液のタンパク含有量を最大にすることが望ましい実施形態に関して、特に有用となり得る。
【００７２】
抽出溶媒は、所望の成分の抽出を達成するために、特定の割合で植物材料と組み合わることができることが好ましい。一部の実施形態において、抽出溶媒および植物材料は、１ｋｇのバイオマス当たり約０．１Ｌ〜約５Ｌの抽出溶媒の割合で組み合わせてもよい。他の実施形態において、割合は、１ｋｇのバイオマス当たり約０．１Ｌ〜約４Ｌ、約０．１Ｌ〜約３Ｌ、約０．１Ｌ〜約２Ｌ、約０．１Ｌ〜約１Ｌ、約０２Ｌ〜約０．８Ｌ、約０．３Ｌ〜約０．７Ｌ、または約０．４Ｌ〜約０．６Ｌの抽出溶媒であってもよい。さらなる実施形態において、プロセスは、１ｋｇのバイオマス当たり少なくとも約０．１Ｌ、少なくとも約０．２Ｌ、少なくとも約０．３Ｌ、または少なくとも約０．４Ｌの抽出溶媒を使用してもよい。一実施形態において、プロセスは、１ｋｇのバイオマス当たり約０．５Ｌの抽出溶媒を組み合わせることを含み得る。
【００７３】
抽出プロセスの条件は、変えることができる。一部の実施形態において、ニコチアナ種の植物を溶媒と組み合わせて、材料（例えば、懸濁液またはスラリーの形態で）を形成する。特定の実施形態において、湿性材料を形成するために加えられる溶媒の量は、材料の総重量に基づいて少なくとも約５０重量％、または少なくとも約６０重量％、または少なくとも約７０重量％であり得る。場合によっては、溶媒の量は、少なくとも約８０重量％、または少なくとも約９０重量％と記述し得る。有利には、抽出は加熱なしで行われる。しかし、均質化ステップ１１０でのタバコ材料は、一部の実施形態において、種々の温度と圧力で加熱され得る。特定の実施形態において、材料は、粒子状材料中の化合物の抽出をもたらすために、高温（例えば、室温を上回る）まで加熱する。例えば、湿性材料は、約５０℃を超える、約６０℃を超える、約７０℃を超える、約８０℃を超える、約９０℃を超える、約１００℃を超える、約１２５℃を超える、約１５０℃を超える、約１７５℃を超える、または約２００℃を超えるまで加熱し得る。特定の実施形態において、湿性材料の温度が大気圧で水（または他の溶媒）の沸点と比較して上昇するように、圧力および温度は調整できる。液体の沸点がその圧力に関連し、したがって材料を沸騰させるように圧力および温度を調整することができることを当業者は、認識するであろう。
【００７４】
加熱は圧力調整および加圧環境で行うことができるが、ベント式タンク内の気圧を、本発明から逸脱することなく用いることができる。好ましい圧力容器は、外部加熱源を備え、およびインペラーなど撹拌手段も備えることができる。他の実施形態において、熱処理プロセスは、電子レンジ、コンベクションオーブンに配置された、または赤外線加熱によって加熱された密閉容器を用いて行う。圧力調節環境をもたらす容器の例は、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１９２８８０号に記載されている。これを参照により本明細書に組み込む。加熱プロセス中、反応混合物に対して適用される一般的な圧力は、約１０ｐｓｉｇ〜約１，０００ｐｓｉｇ、通常、約２０ｐｓｉｇ〜約500pｓｉgの範囲であることが多い。
【００７５】
加熱は、大気中すなわち周囲雰囲気中、または全体的に不活性雰囲気などの調節雰囲気内で行われ得る。窒素、アルゴンおよび二酸化炭素などのガスを使用することができる。あるいは、処理条件と所望の反応生成物に応じて、特定の実施形態において、炭化水素ガス(例えばメタン、エタンまたはブタン）、またはフルオロカーボンガスも調節雰囲気の少なくとも一部をもたらすことができる。
【００７６】
抽出を達成するのに必要とされる時間は、抽出が行われる温度と圧力に部分的に依存している。例えば、一部の実施形態において、材料を高温まで加熱、および／または材料を加圧すると、抽出速度が上がる。抽出プロセスの時間範囲は、一般的に少なくとも約３０分間（例えば、少なくとも約１時間または少なくとも約２時間）および一般的には約２４時間未満（例えば、約１２時間未満または約８時間未満）であるが、とはいえ他の期間も、本発明から逸脱することなく用いることができる。一部の実施形態において、多回抽出は、そこからさらなる化合物を抽出するように行われることができる。例えば、Ｈａｖｋｉｎ−Ｆｒｅｎｋｅｌの米国特許出願公開第２００８／０２５４１４９号を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【００７７】
タバコ材料が均質してから、前述の材料は、固形パルプ１２０と、タンパク質含有抽出液（すなわち、本開示により処理された植物材料から抽出された液体）１３０とに分離することができる。分離は、任意の手段、例えば、粗濾過、または均質混合物から液体成分を回収する他の方法によって行われ得る。固形パルプ１２０は、通常、主に植物繊維（すなわちセルロース）とペクチンを含有し、一部の実施形態において、Ｍｏｒｔｏｎらの米国特許出願公開第２０１２／０１４１６４８号に記載のように、別々に処理され得る。これを参照により本明細書に組み込む。
【００７８】
タンパク質含有抽出液１３０は、種々の実施形態において、緑色液または褐色液の形態であり得るが、しかし、抽出液体の色に関係なく、「タンパク質含有抽出液」という用語は、植物材料またはバイオマターから抽出されるいずれの液体をも指すことができることを理解すべきである。抽出物１３０は、一部の実施形態において、タンパク質、ペプチド、糖、および／またはアルカロイドを含み得るがこれに限定されない。タンパク質含有抽出液は、一般的に、液体中に混入したある程度の固形（不溶性）材料を含む。抽出物は、特定の実施形態に応じて、スラリー、懸濁液、または溶液として特徴付けることができる。これは、用いられる植物材料の種類、用いられる特定の抽出溶媒および所望の単離成分に基づいて決定することができる。
【００７９】
固形パルプ１２０の均質化および分離に続いて、タンパク質含有抽出物１３０を、図１のスッテプ１４０に示すように、液体を清澄化するように処理することができる。清澄化は、通常、タンパク質含有抽出物の抽出溶媒から不溶な植物材料の一部またはすべてを除去することになる。一部の実施形態において、清澄化は、抽出物１３０から高分子量成分をさらに除去することになり得る。清澄化ステップは、固形画分１５０と、清澄化タンパク質含有抽出物１６０とをもたらす。清澄化は、可溶性画分中の特定の所望の植物成分（例えば、タンパク質）の所望の濃度を達成する重要なステップであり得る。例えば、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１５２２６５号に記載されている清澄化技法を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【００８０】
特定の実施形態において、清澄化は、１または複数の化学処理ステップ、１または複数の加熱ステップ、１または複数の濾過ステップ、１または複数の他の種類の分離ステップ（例えば、遠心分離および／または沈降）、またはそれらの組み合わせを含む、複数ステップを含むが、これらに限定されない。清澄化は複数のステップを含むが、これらの複数のステップは任意の順序で行われ得ることを理解されたい。
【００８１】
清澄化ステップ１４０は、一部の実施形態において、種々の材料（すなわち、清澄化剤）を抽出液に添加することを含み得る。例えば、抽出原液に添加し得る特定の清澄化剤としては、液体を安定させる、または清澄化するための種々の塩、石灰、硫黄および他の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、抽出物のｐＨは、例えば、適切な量の酸または塩基を添加することによって変更することができる。この目的のために有用な例示的な酸性または塩基性材料としては、クエン酸、塩酸、リン酸、および／または水酸化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、抽出物のｐＨを調整することにより、液体を安定させる、または清澄化することができる。一部の実施形態において、抽出物のｐＨを調整することにより、そこからの特定の成分（望ましい、または望ましくない）の沈殿を容易にすることができ、続いて沈殿物を除去することができる。特定の実施形態において、抽出物が弱酸性（例えば、約５と約７の間のｐＨを有する）になるように、ｐＨを調整する。他の実施形態において、抽出物が塩基性（例えば、約７と約１２の間のｐＨを有する）になるように、ｐＨを調整する。
【００８２】
一部の実施形態において、添加した清澄化剤は、１種または複数種の不純物の除去を容易することができる凝集剤として機能する。例えば、凝集剤および／または濾過助剤は、懸濁粒子および／または溶質分子、またはイオンを除去し得る。一部の一般的で例示的な濾過助剤としては、セルロース繊維、パーライト、ベントナイト、ケイ藻土、および他のケイ酸含有物質が挙げられる。ケイ酸含有物質および／または濾過助剤は、続いて、任意の手段(例えば、濾過、沈降、遠心分離など)によって液体から除去することができる。特定の実施形態において、活性炭を抽出物に加えて、そこから色、臭い、および／または味覚を除去する。活性炭の代わりに、またはそれに加えて、種々の他の種類の物質は、色、臭い、および／または味覚を除去するために用いることができ、および本明細書に記述する方法の範囲に包含することを意図する。
【００８３】
有利には、本開示による清澄化は、タンパク質含有抽出物の温度を周囲温度以上に上げずに（すなわち、加熱しないで）行う。しかし、特定の実施形態において、清澄化ステップ１４０は、抽出物を加熱することを含み得る。一部の実施形態において、液体は、清澄化のための所望の反応を開始しおよび／または抽出物の特定の成分を可溶化する、または不溶化するように加熱することができる。抽出物を加熱する温度および時間は、変えることができる。一部の実施形態において、抽出物１３０は、沸騰するまで加熱する。これにより、さらなる固形物の形成が生じ得る、続いて、本明細書に記述する任意の方法によって固体物を除去することができる。一部の実施形態において、抽出物を加熱して、一部の溶媒を除去する（すなわち、抽出物を濃縮するため）ことが望ましいこともある。例えば、一実施形態において、抽出された液体をベント式容器中で加熱して、一部の水を蒸発させることができる。液体が加熱される温度および圧力は、変えてもよい。例えば、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１５２２６５号に記載の溶媒除去技法を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【００８４】
一部の実施形態において、清澄化ステップ１４０は、タンパク質含有抽出物１３０を、デカンターまたは遠心分離機（例えば、デカンター型遠心分離機）などの分離装置に導入することを含む。一部の実施形態において、清澄化ステップ１４０は、抽出物をフィルタープレスに通すことを含む。このように、抽出物を処理して、抽出物を可溶性液画分（透過物）（すなわち、清澄化タンパク質含有抽出物１６０）と固形画分１５０とに分離することができる。代表的な遠心分離システムは、例えば、Ｂｅｒｉｔらの米国特許第６，８１７，９７０号、Ｋｏｈｌｓｔｅｔｔｅらの同第５，８９９，８４５号、Ｚｅｔｔｉｅｒらの同第５，２６７，９３７号、Ｓｃｈｕｌｔｚらの同第４，９６６，５７６号、およびＤｒｏｓｔｅらの同５，８６５，７１９号に記載されている。各々その全体を参照により本明細書に組み込む。遠心分離の好適な条件は、例えば、時間間隔、送り速度、固体ペレット材料の圧出のための滞留時間、操作速度およびＧ力に基づき得る。代表的なフィルタープレスは、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎの米国特許第２，８４３，２６７号：Ｄａｖｉｓの同第３，２０４，７６９号；Ｋｏｈｏｎｅｎの同第４，３５４，９３４号；Ｎｏｄａらの同第４，５１２，８８９号；Ｌｉｎｔｕｎｅｎの同第４，５４４，４４８号；およびＰｉｅｒｓｏｎの同第５，４８２，６２３号に記載されている。これらを参照により本明細書に組み込む。
【００８５】
図１に示す実施形態において、清澄化の後、清澄化タンパク質含有抽出物１６０のｐＨを調整する（図１のステップ１７０）。原液のｐＨは、クエン酸、塩酸、リン酸、または水酸化ナトリウムなどの適量の酸性物質または塩基性物質を添加することによって調整し得る。特定の実施形態において、抽出物１６０のｐＨを調整して、抽出物が酸性（すなわち、７未満のｐＨを有する）または塩基性（すなわち、７を超えるｐＨを有する）であることを確実にする。一部の実施形態において、抽出物を酸性化することは、好ましくは、約４〜約７、約４．５〜約６．５、または約５〜約６の範囲内のｐＨを有する、例えば約５のｐＨを有する抽出物を得ることである。特定の実施形態において、ｐＨを約６に調整することによって、清澄化抽出物になる。特定の実施形態において、ｐＨを約５に調整することによって、ＲｕＢｉｓＣＯの沈殿物をもたらす。これを単離し（例えば、濾過によって、または残留液をデカントすることによって）、続いて洗浄することができる。特定の実施形態において、これらの値以下のｐＨは、ＲｕＢｉｓＣＯに加えてさらなる固形物（例えば、他のタンパク質、糖および／またはデンプンなど）が沈殿し得るので、約４を超える、または約４．５を超えるｐＨを維持することは有利である。
【００８６】
しかし、他の実施形態において、さらなるタンパク質（例えば、Ｆ２画分タンパク質）を沈殿させることが、望ましい場合がある。そのような実施形態において、ｐＨは、例えば、約４．５未満（例えば、約３と約４．５の間、例えば約４）に調整する。ｐＨ調整ステップ１７０は、通常、清澄化抽出物のうちの１種または複数種の成分の沈殿をもたらすので、固形物の適切な沈殿および／または沈降をもたらすのに十分な時間と温度で、ｐＨを調整した抽出物を維持することは有利であり得る。
【００８７】
固形物の沈殿および／または沈降に続いて、液体と固体成分とを分離して、液体成分１８０と、固形のタンパク質含有沈殿物１９０とを得る。固形成分と液体成分の分離は、種々の方法で、例えば、液体をデカントすることによって、および／または混合物を濾過することによって達成することができる。特定の実施形態において、沈殿物１９０は白色である。一部の実施形態において、液体成分１８０から分離後、沈殿物１９０は、例えば、クエン酸溶液で洗浄する。クエン酸溶液の濃度は、変えることができ、例えば、特定の実施形態において、約５ｍＭである。クエン酸に加えて、またはクエン酸の代わりに種々の溶液を用いることができ、そのような溶液は、食品グレードの成分のみを含む。この洗浄ステップで用いることができる他の例示的な溶液としては、アスコルビン酸および／または酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
沈殿物１９０は、通常、ＲｕＢｉｓＣｏならびに種々の添加成分を含む。
沈殿物１９０の含有量は、その前のステップで用いられたｐＨにある程度依存し得ることに留意されたい。例えば、ｐＨが約４．５と約６の間であった場合、沈殿物１９０はより多くのＲｕＢｉｓＣＯを含み得るが、ｐＨが約４．５未満であった場合、沈殿物１９０はさらに、例えば、相当量のＦ２タンパク質を含み得る。
【００８９】
沈殿物１９０は、いずれの残留する成分（例えば、他のタンパク質、脂肪および脂質）からＲｕＢｉｓＣＯを単離するために、濾過ステップ２００に１回または複数回かけることができる。濾過プロセスは、沈殿物１９０を溶解する（例えば、クエン酸水溶液に）ことと、選択した粒径の粒子状物質および／または特定の閾値を超える分子量を有する液体成分を除去するために、この溶解液を１または複数の濾過網および／または膜を通す（濾材上または濾材中に残る残留分、および濾材を通過した透過物を得る）こととを含み得る。ＲｕＢｉｓＣＯは、通常、沈殿物１９０中で最も大きい成分なので、ＲｕＢｉｓＣＯを保持できるが、一方残留する成分が通過できる、フィルターまたはフィルター膜を用いると有利である。特定の実施形態において、セラミックフィルターを用いて、ＲｕＢｉｓＣＯを単離することができる。
【００９０】
一部の実施形態において、精密濾過を使用し、溶解した沈殿物１９０は半透膜と接触する。精密濾過膜は、例えば、プレート＆フレーム膜（多くの膜と支持プレートとを有する）、スパイラル膜（連続する膜の層と、管に巻き取られた支持材とを有する）、チューブラ膜（その中を供給原料が流れる膜が規定するコアと、外側ハウジングと、透過物が収集される管状ハウジングとを有する）、または中空糸膜（いくつかの小径管または繊維を有し、繊維を囲んでいるカートリッジ部位に透過物が収集される）の任意の種類であり得る。精密濾過膜は、任意の材料から構築され得る。例えばポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリドおよび酢酸セルロース膜が一般的に用いられているが、本明細書に記載の本発明から逸脱することなく、他の材料を用いることができる。例えば、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１５２２６５号に記載の限外濾過技法（精密濾過にも適用することができる）を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【００９１】
精密濾過膜は、広範囲にわたる細孔径（一般的には、約０．０５ミクロンまたは０．１〜約１０ミクロンの範囲にある）で利用可能である。実際には、細孔径を上回る分子量の化合物は、残留分中に保持され、細孔径を下回る分子量の化合物はフィルターを通過して透過物になる。精密濾過法は、一般的に、低分子量有機化合物とイオンを除去することができない。
【００９２】
精密濾過は、一般的にクロスフロー分離プロセスである。処理される（供給原料）液体流は、膜表面に沿って接線方向に流れ、膜を通過する（透過物）一つの流れと、膜を通過しない（残留分または濃縮物）別の流れとに分離する。精密濾過システムの作動パラメータを変えて、所望の結果を達成することができる。例えば、濾過する供給混合物は、加圧力によって膜と接触することができる。膜を横切る透過速度は、加圧と正比例するが、しかし、最高圧力は限定され得る。膜表面を横切る混合物の流速は、調整することができる。温度も変えることができる。一般的に、透過速度は、温度の上昇とともに増加する。
【００９３】
市販の精密濾過システムは、容易に利用でき、本発明の精密濾過法のために用いることができる。
例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）およびＰｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎなどの市販供給元は、種々のフィルター膜とカートリッジ、および／または濾過システム（たとえば、タンジェンシャルフロー濾過システム）を製造している。例示的な膜としては、Ｍｅｍｔｅｋ（登録商標）Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍｓおよびＦｏｒｔｙ−Ｘ（商標）ディスクフィルター  （Ｓｉｅｍｅｎｓから）、ＭＦＫシリーズ、Ｗｉｎｅｆｉｌｔｅｒ（商標）シリーズ、およびＳｕｐｅｒ−Ｃｏｒ（商標）ＭＦシリーズ膜（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）、Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜とＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬカセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）、Ｍｉｃｒｏｋｒｏｓ（登録商標）、Ｍｉｎｉｋｒｏｓ（登録商標）、およびＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）  Ｌａｂｓから）、Ｃｙｃｌｏｐｏｒｅ膜（Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）から）Ｓｃｅｐｔｅｒ（登録商標）膜（Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＴｏｒａｙｆｉｌ（登録商標）精密濾過膜（Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、精密濾過膜はセラミック膜であり、Ｍｅｍｂｒａｌｏｘ（登録商標）膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから）、ＭＦ膜（ＣｌｅａＮＳｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍｓから）、セラミック膜  （Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製），  ＩｎｓｉｄｅＣｅＲＡＭ（商標）膜、Ｆｉｌｔａｎｉｕｍ（商標）膜、およびＩｓｏｆｌｕｘ（商標）膜（Ｔａｍｉ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓから）、およびＣｅｒａＭｅｍ（登録商標）セラミック膜（Ｖｅｏｌｉａ  Ｗａｔｅｒから）が挙げられるが、これらに限定されない。市販の濾過システムとしては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＬａｂｓｃａｌｅ（商標）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）システムおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｓ社のＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）とＭｉｎｉＫｒｏｓ（登録商標）タンジェンシャルフロー濾過システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
特定の実施形態において、多段の濾過プロセスを用いることができる。そのような実施形態は、異なる分画分子量（一般的に低下する）の複数のフィルターおよび／または膜を使用する。本発明により任意の数のフィルターおよび／または膜を連続して用いることができる。濾過が望ましい場合、本発明の種々の実施形態においての使用に適しているさらなる濾過手段としては、Ｃｌａｐｐらの米国特許第４，９４１，４８４号に開示されているものが挙げられる。この開示を参照に本明細書に組み込む。場合によっては、本実施形態における精密濾過ステップは、本明細書に記載の１または複数の限外濾過ステップと置き換える、または組み合わせることができる。
【００９５】
フィルターまたは一連のフィルター（例えば、単一、１．４μｍセラミックフィルター）は、有利に、残留分として固形のＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料を保持し、および好ましくは、沈殿物１９０のさらなる成分の大半がフィルターを通って透過物になるようにする。次いで、残留分を洗浄して（例えば、５ｍＭクエン酸を用いて）、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料２１０を得る。上述のように、種々の溶液（例えば、酢酸および／またはアスコルビン酸などの食品グレードの成分を含む溶液）をクエン酸に追加してまたはクエン酸の代わりに用いることができる。図１の方法によってもたらされるＲｕＢｉｓＣＯ濃縮抽出物は、一部の実施形態において、少なくとも約６０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約７０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約８０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９５乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９８乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、または少なくとも約９９乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む。ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮抽出物は、例えば、半固体形状または固体形状を含む種々の形状でもたらすことができる。一部の実施形態において、抽出物を脱水させて、真の固体形状を生成することができる。有利には、図１の方法は、工業規模で適用できる。種々の植物からのＲｕＢｉｓＣＯの単離について、これまでに種々のプロセスが報告されているが、このように大規模で適用できることを示したものはなかった。有利には、本明細書に記述するプロセスは、所望の生成物を容易にスケーラブルな方法でもたらすために、主にセラミック濾過の使用に依存する。対照的に、従来の方法は、一般に、１または複数の遠心分離ステップを用いており、これは工業規模に転換するのが困難である。
【００９６】
図１に示すように、液体成分１８０を任意選択で処理して、Ｆ２タンパク質濃縮材料を生成することができる。前述のように、一部の実施形態において、適切なｐＨ選択によって、タンパク質含有沈殿物１９０は、主にＲｕＢｉｓＣＯを含むことができる。そのような実施形態において、相当量のＦ２画分が一般的に液体成分中に含まれる。その液体成分は、例えば、濾過によって（例えば、通常、その上にＦ２タンパク質は保持されるが、特定の残留成分は通過可能なフィルターまたは膜を介して）、または沈殿によって（例えば、液体成分１８０のｐＨをＦ２タンパク質を沈殿させるのに十分なｐＨ、例えば約４．５未満、好ましくは約３と約４．５の間に調整することによって）処理することができる。
【００９７】
図２に例示する実施形態で示すように、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料およびＦ２タンパク質濃縮材料の生成のための代替プロセス２２０は、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料および／またはＦ２タンパク質濃縮材料が以下のステップを含む。タバコ材料を均質化して（１１０）、固形パルプ１２０と、タンパク質含有抽出液１３０とをもたらすことができる。抽出物１３０を清澄化して（１４０）、それから固形物を除去し、固形画分１５０と、清澄化タンパク質抽出物１６０とを得る。抽出物１６０を濾過して（２３０）、洗浄し、固形ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料２４０と、透過物２５０とを得る。特定の実施形態において、透過物は、Ｆ２タンパク質を含むこともあり、透過物を任意選択で処理して、Ｆ２タンパク質濃縮材料２６０を得ることができる。
【００９８】
図２のステップと材料（すなわち、抽出物１６０を通すステップ１１０）は、図１の方法に関して、上述のように行うことができる。図２に示す方法によって、清澄化ステップ１４０は酸性または塩基性の清澄化タンパク質含有抽出物をもたらすために、ｐＨ調整ステップを含むことが好ましい。
【００９９】
図２に示す方法において、清澄化（酸性または塩基性）タンパク質含有抽出物１６０は、濾過（２３０）にかける。
【０１００】
濾過プロセスは、選択した粒径の粒子状物質および／または特定の閾値を超える分子量を有する抽出物の成分を除去するために、この濾液を１または複数のセラミックフィルターまたは半透膜に通す（濾材上または濾材中に残る残留分、および濾材を通過した透過物を得る）ことを含む。膜は、プレート＆フレーム膜（多くの膜と支持プレートとを有する）、スパイラル膜（連続する膜の層と、管に巻き取られた支持材とを有する）、チューブラ膜（その中を供給原料が流れる膜が規定するコアと、外側ハウジングと、透過物が収集される管状ハウジングとを有する）、または中空糸膜（いくつかの小径管または繊維を有し、繊維を囲んでいるカートリッジ部位に透過物が収集される）の任意の種類であり得る。精密濾過膜は、任意の材料から構築することができる。例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリビニリデンフルオリドおよび酢酸セルロース膜が一般的に用いられているが、本明細書に記載の本発明から逸脱することなく、他の材料を用いることができる。例えば、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１５２２６５号に記載の限外濾過技法を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【０１０１】
限外濾過膜は、広範囲にわたる細孔径（一般的には、約０．１〜約０．００１ミクロンの範囲にある）で利用可能である。膜は、より一般的には、それらの分画分子量によって記述される。限外濾過膜は、一般的に、約１０３Ｄａ〜約１０５Ｄａの平均分画分子量の数で膜を分類する。実際には、分画分子量を超える分子量を有する化合物は、残留分中に保持され、分画分子量未満の分子量を有する化合物は、フィルターを通って透過物に濾過される。限外濾過方法は、一般的に低分子量有機化合物とイオンを除去することができない。
【０１０２】
限外濾過は、一般的にクロスフロー分離プロセスである。処理される（供給原料）液体流は、膜表面に沿って接線方向に流れ、膜を通過する（透過物）一つの流れと、膜を通過しない（残留分または濃縮物）別の流れとに分離する。限外濾過システムの作動パラメータを変えて、所望の結果を達成することができる。例えば、濾過する供給混合物は、加圧力によって膜と接触することができる。膜を横切る透過速度は、加圧と正比例するが、しかし、最高圧力は限定され得る。膜表面を横切る混合物の流速は、調整することができる。温度も変えることができる。一般的に、透過速度は、温度の上昇とともに増加する。
【０１０３】
市販の限外濾過システムは、容易に利用でき、本発明の限外濾過法のために用いることができる。例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｓ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｐｏｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、およびＳｎｙｄｅｒ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎなどの市販供給元は、種々のフィルター膜とカートリッジ、および／または濾過システム（たとえば、タンジェンシャルフロー濾過システム）を製造している。例示的な膜としては、Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）とＵｌｔｒａｃｅｌ（登録商標）膜およびＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）ＸＬカセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから）、Ｍｉｃｒｏｋｒｏｓ（登録商標）、Ｍｉｎｉｋｒｏｓ（登録商標）、および  ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｈｏｌｌｏｗ  Ｆｉｂｅｒ  Ｍｏｄｕｌｅｓ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｓから）、およびＭｉｃｒｏｚａフィルターとＣｅｎｔｒａｍａｔｅ（商標）、Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ（商標）、Ｍａｘｉｍａｔｅ（商標）、およびＭａｘｉｓｅｔｔｅ（商標）タンジェンシャルフロー濾過膜カセットが挙げられるが、これらに限定されない。市販の濾過システムとしては、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＬａｂｓｃａｌｅ（商標）タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）系およびＳｐｅｃｔｒｕｍ（登録商標）Ｌａｂｓ社の  ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）とＭｉｎｉＫｒｏｓ（登録商標）タンジェンシャルフロー濾過系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明により有用であり得るフィルターおよび／または膜としては、約５００，０００未満の分画分子量、約２５０，０００未満の分画分子量、約１００，０００未満の分画分子量、約７５，０００未満の分画分子量、約５０，０００未満の分画分子量、約２５，０００未満の分画分子量、約２０，０００未満の分画分子量、約１５，０００未満の分画分子量、約１０，０００未満の分画分子量、約５，０００未満の分画分子量、および約１，０００Ｄａの分画分子量を有するものが挙げられる。特定の実施形態において、多段の濾過プロセスを用いる。そのような実施形態は、異なる分画分子量（一般的に減少する）の複数のフィルターおよび／または膜を使用する。本発明により任意の数のフィルターおよび／または膜を連続して用いることができる。例えば、第１の濾過は５００，０００Ｄａの分画分子量のフィルターを用いて行われてもよく、および第２の濾過は１，０００Ｄａの分画分子量のフィルターを用いて行われてもよいが、種々の他の分画分子量および／または細孔を有するフィルターを用いることができる。濾過が望ましい場合、本発明の種々の実施形態においての使用に適しているさらなる濾過手段としては、Ｃｌａｐｐらの米国特許第４，９４１，４８４号に開示されているものが挙げられる。この開示を参照に本明細書に組み込む。
【０１０５】
濾過に続いて、タンパク質は有利に、濾過膜（またはフィルター）の上に保持される。残留分は有利に、洗浄され（例えば、グリシン緩衝液またはヒスチジン溶液、クエン酸ナトリウム溶液、リン酸カルシウム溶液またはリン酸ナトリウム溶液を用いて）、次いで乾燥させて(例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥）、タンパク質濃縮材料２４０をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料２４０は、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料または総合的タンパク質濃縮材料（ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２画分タンパク質の両方を含んでいる）であり得る。特定の膜カットオフは、図２の方法２２０によってもたらされるタンパク質濃縮製品２４０の組成を調節することに役立つことができる。
【０１０６】
例えば、特定の実施形態において、濾過ステップ２３０は５００ｋＤａの限外濾過膜を使用し、これによりＦ２タンパク質からＦ１（ＲｕＢｉｓＣＯ）の分離をもたらし得る。ＲｕＢｉｓＣＯは、通常、５００ｋＤａ限外濾過膜を通過しないが、Ｆ２タンパク質は通過し、したがって、５００ｋＤａ膜上の残留分は、本質的にＲｕＢｉｓＣＯタンパク質からなるはずであり、残留分にはＦ２タンパク質は皆無かそれに近い。そのような実施形態において、Ｆ２タンパク質は透過物２５０中に存在するはずであり、透過物を任意選択でさらに精製して（例えば、糖、脂肪および脂質の除去によって）、Ｆ２タンパク質濃縮材料２６０を得ることができる。このさらなる処理は、一部の実施形態において、さらに限外濾過ステップ（複数可）（例えば、透過物２５０を１ｋＤａ膜、１０ｋＤａ膜、または２０ｋＤａ膜）を通過させること、およびもたらされた残留分を乾燥させること（例えば噴霧乾燥または凍結乾燥によって）からなる。特定の実施形態では液体形状または半固体形状で有用であり得るので、一部の実施形態において、残留分を乾燥させることは不要であり得る。
【０１０７】
特定の実施形態において、限外濾過ステップ２３０は、１ｋＤａ膜を用いる。これにより、通常、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質は共に残留分中に維持され、抽出物の他の成分（例えば、糖、脂肪および脂質）が通過することが可能になる。そのような実施形態において、生じた固形残留分（タンパク質濃縮材料２４０）は、ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質の混合物を含む。ＲｕＢｉｓＣＯ対Ｆ２タンパク質の割合は、このようにもたらされる試料中で変えることができる。もちろん、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料とＦ２タンパク質濃縮材料を別々にもたらすことを所望する場合、本明細書に提示するように、この混合物は、任意選択でさらに分離できることを理解されたい。特定の実施形態において、タンパク質濃縮材料２４０を適切な溶媒に溶解すること、およびそれを５００ｋＤａ限外濾過膜に通過させることにより、ＲｕＢｉｓＣＯは膜の上に保持され、洗浄してＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料２７０を得ることができるので、Ｆ２タンパク質からのＦ１（ＲｕＢｉｓＣＯ）の分離がもたらされる。透過物を任意選択で濃縮し、乾燥させてＦ２タンパク質濃縮材料２６０を得ることができる。
【０１０８】
一部の実施形態において、本明細書に開示する方法は、タンパク質濃縮材料、例えば、少なくとも約５０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約６０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約７０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約８０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約９０乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約９５乾燥重量％のタンパク質、少なくとも約９８乾燥重量％のタンパク質、または少なくとも約９９乾燥重量％のタンパク質を含む材料をもたらし得る。一部の実施形態において、タンパク質濃縮材料中のタンパク質は、少なくとも約６０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約７０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約８０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９０乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９５乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、少なくとも約９８乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯ、または少なくとも約９９乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む。
【０１０９】
一部の実施形態において、本開示は特に、ニコチアナ種の植物またはその一部からＲｕＢｉＣＯを抽出するおよび／または単離する方法を提供する。したがって、本明細書に開示する方法は、一部の実施形態において、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、例えば、少なくとも約５０乾燥重量％、少なくとも約６０乾燥重量％、少なくとも約７０乾燥重量％、少なくとも約８０乾燥重量％、少なくとも約９０乾燥重量％、少なくとも約９５乾燥重量％、少なくとも約９８乾燥重量％、または少なくとも約９９乾燥重量％のＲｕＢｉｓＣＯを含む材料をもたらし得る。一部の実施形態において、本開示はさらに、ニコチアナ種の植物またはその一部からＦ２タンパク質を抽出するおよび／または単離する方法を提供する。したがって、本明細書に開示する方法は、一部の実施形態において、Ｆ２タンパク質濃縮材料、例えば、少なくとも約１０乾燥重量％、少なくとも約２０乾燥重量％、少なくとも約３０乾燥重量％、少なくとも約５０乾燥重量％、少なくとも約６０乾燥重量％、少なくとも約７０乾燥重量％、少なくとも約８０乾燥重量％、少なくとも約９０乾燥重量％、少なくとも約９５乾燥重量％、少なくとも約９８乾燥重量％、または少なくとも約９９乾燥重量％のＦ２タンパク質を含む材料をもたらし得る。
【０１１０】
一部の実施形態において、本明細書に記述するタンパク質濃縮材料は、直接用いることができるが、例えば、この材料を低温殺菌するため、あるいはこの材料を化学的に変えるために、熱処理することが望ましいことがある。ニコチアナ種の植物から１種または複数種の成分の単離のために、この熱処理は、本明細書に記述したプロセスのいずれかの前後（例えば、図１のプロセス１００中および／または図２のプロセス２２０中のいずれかのステップの前後）に行うことができる。例えば、タバコ材料は、湿式タバコ混合物を形成するために、タバコ材料と、水と、リジン、グリシン、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、プロリン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、二価陽イオンと三価陽イオン、アスパラギナーゼ、サッカリド、フェノール化合物、還元剤、遊離チオール基を有する化合物、酸化薬（例えば、過酸化水素）、酸化触媒、植物抽出物およびその組み合わせからなる群から選択される添加剤とを混合し；熱処理タバコ混合物を形成するために、この湿式タバコ混合物を少なくとも約６０℃の温度で加熱することによって熱処理することができる。一実施形態において、処理したタバコ抽出物は、水，ＮａＯＨおよび添加剤（例えばリジン）の存在下で、約８８℃で、約６０分間熱処理する。そのような熱処理は、タバコ材料中の還元糖とアスパラギンの反応から生じるアクリルアミド生成を防止するのに役立つことができ、かつある程度の低温殺気をもたらすことができる。例えば、Ｃｈｅｎらの米国特許出願公開第２０１０／０３００４６３号を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。熱処理タバコ由来材料が本発明の無煙タバコ製品で用いられる特定の実施形態において、無煙タバコ製品は、アクリルアミド含有量が極めて低いことにより特徴付けることができる。例えば、一部の実施形態において、無煙タバコ製品は、約５００ｐｐｂ（ｎｇ／ｇ）未満、約４００ｐｐｂ未満、約３００ｐｐｂ未満、約２００ｐｐｂ未満、または約１００ｐｐｂ未満のアクリルアミド含有量によって特徴付けられる。一部の実施形態において、任意選択の熱処理に加えて、または、それの代わりに、タバコ材料は、照射され得る（例えば、処理したタンパク質濃縮材料と結合する微生物が確実にないようにするため）。
【０１１１】
ニコチアナ種の植物からの１種または複数種の成分の単離のために、本明細書で開示する１または複数の方法に続いて、このように得た液体材料は、必要に応じて、さらに処理することができる。例えば、タバコ材料は、本明細書に記述の他の単離ステップの代わりに、または追加して用いることができる、さらなる処理ステップにかけることができる。一部の実施形態において、抽出物（例えば、タンパク質含有抽出液１３０、清澄化タンパク質含有抽出物１６０または透過物２５０）は、例えば、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａらの米国特許出願公開第２００７／０１８６９４０号、Ｒｅｅｓらの同第２０１１／００４１８５９号、および２０１１年５月１９日出願のＢｙｒｄらの米国特許出願第１３／１１１，３３０号（これらを参照により本明細書に組み込む）に記載のインプリントポリマーまたは非インプリントポリマーと接触する。分子インプリントポリマーまたは非インプリントポリマーによる処置を用いて、抽出物の特定の成分、例えば、Ｎ  ＯＥ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）、（４−メチルニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ）、Ｎ  ＯＥ−ニトロゾアナタビン（ＮＡＴ）およびＮ  ＯＥ−ニトロソアナバシン（ＮＡＢ）を含むタバコ特異的ニトロゾアミン（ＴＳＮＡ）；ベンゾ［ａ］アントラセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ベンゾ［ｂ］フルオランテン、ベンゾ［ｋ］フルオランテン、クリセン、ジベンズ［ａ，ｈ］アントラセンおよびインデノ［１，２，３−ｃｄ］ピレンを含むポリ芳香族多環式炭化水素（ＰＡＨ）；または他のホフマン分析物を除去することができる。一部の実施形態において、分子インプリントポリマーまたは非インプリントポリマーを用いて、抽出物からニコチンを除去することができる。
【０１１２】
一部の実施形態において、本明細書に記述の材料（例えば、抽出物または固形物）のうちの１または複数は、そのような材料に含まれる化合物に化学的変換を起こすために、条件にかけることができる。例えば、ニコチアナ種の植物またはその一部から取得したタバコ材料は、化学的変換を起こすよう、または他の成分と混合されるように処理することができる。一部の実施形態において、そこから取得したタバコ由来抽出物（液体画分と固形画分を含む）は、化学的変換を起こすよう、または他の成分と混合されるように処理することができる。タバコ材料またはその抽出物の化学的変換または修飾は、タバコ材料または抽出物の特定の化学特性および物性(例えば、その感覚属性)の変化を生じ得る。例示的な化学的修飾プロセスは、酸／塩基反応、加水分解、酸化、加熱および／または酵素処理によって実施されることができ；およびこのように、化合物は種々の分解反応を受け得る。例示的な化学的変換技法は、Ｃｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの米国特許出願公開第２０１１／０１７４３２３号およびＣｏｌｅｍａｎ，ＩＩＩらの同第２０１１／０２５９３５３号に記載されている。これらを参照により本明細書に組み込む。
【０１１３】
特定の実施形態において、タバコ材料またはその抽出物(液体画分および／または固形画分を含んでいる)を処理して、分解生成物をもたらす。分解生成物は、本発明によって抽出および／または単離された化合物から生成される、いずれかの化合物である。分解生成物は、そのような化合物から天然に形成されることができるか、または分解促進プロセス（例えば、化合物の分解を速めるために加熱および／または化学薬品を添加することによって）によって生成されてもよい。これらの化合物は、例えば、酸化の手段（例えば、Ｈ２Ｏ２または他の酸化剤を用いる処置によって）および／または加水分解反応によって分解することができる。
【０１１４】
本開示の方法によって得られるタンパク質濃縮材料（すなわち、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、ＲｕＢｉｓＣＯ／Ｆ２タンパク質濃縮材料の組み合わせ、および／またはＦ２タンパク質濃縮材料）の形状は、変えることができる。一般的に、これらの材料は、固形形状、液体形状または半固体形状またはゲル形状である。もたらされる配合物は、具体的な形態、絶対的形態またはそのまままの形態で用いることができる。本明細書に記述するタバコ由来材料の固形形態は、噴霧乾燥形態および凍結乾燥形態を含むことができる。本明細書に記述するタバコ由来材料の液体形態は、水性または有機性溶媒担体内に含まれる配合物を含むことができる。
【０１１５】
タンパク質濃縮材料（すなわち、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、ＲｕＢｉｓＣＯタンパク質濃縮／Ｆ２タンパク質濃縮組み合わせ材料、および／またはＦ２タンパク質濃縮材料）は種々の組成物用の材料として有用である。例えば、一部の実施形態において、本明細書に記述のタバコ由来材料は、タバコ組成物、特に、喫煙品または無煙タバコ製品に組み込まれたタバコ組成物内に組み込まれる。本発明に従って、タバコ製品は、本発明により１または複数のタバコ由来材料（すなわち、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、ＲｕＢｉｓＣＯ／Ｆ２タンパク質濃縮組み合わせ材料、および／またはＦ２タンパク質濃縮材料）と組み合わせたタバコに組み込む。すなわち、タバコ製品の一部は、本開示によって調製されたある形態のタンパク質濃縮タバコ材料配合物で構成され得る。
【０１１６】
タバコ由来材料の性質およびタバコ組成物の種類に応じて、タバコ由来材料または本明細書に記述の材料をタバコ組成物に添加することにより、種々の方法でタバコ組成物を高めることができる。例示的なタンパク質濃縮抽出物、固形画分およびその組み合わせは、タバコ製品に香りおよび／または芳香をもたらすのに役立ち得る（例えば、タバコ組成物は、タバコ組成物またはそれに由来する煙の感覚特性を変えることができる）。他のタンパク質濃縮抽出物、固形画分およびその組み合わせは、結合剤または充填剤の機能などの、タバコ組成物内の機能的な目的に役立ち得る。他のタンパク質濃縮抽出物、固形画分およびその組み合わせは、タバコ製品の１または複数の従来の成分の代替物として役立ち得る。
【０１１７】
本開示のタバコ由来材料を添加するタバコ製品は、変えることができ、タバコまたはその一部の成分をユーザの製品に届けるように構成されたまたは適応されたいずれの生成物も含むことができる。例示的なタバコ製品としては、喫煙品（例えば、紙巻タバコ）と、無煙タバコ製品と、ニコチンおよび／またはタバコ材料または使用中に燃焼しない他の植物材料を含むエアロゾル発生装置とが挙げられる。本発明のタンパク質濃縮、タバコ由来材料のタバコ製品への組込みは、例えば、タバコ由来、タンパク質濃縮材料（例えば、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮材料、ＲｕＢｉｓＣＯ／Ｆ２タンパク質濃縮組み合わせ材料、および／またはＦ２タンパク質濃縮材料）をタバコ材料または他の植物材料に吸収することによって、さもなければタバコ由来、タンパク質濃縮材料を担体材料と結合することによって配合物のための担体としてタバコ材料または非タバコ植物材料を用いることを含み得る。本発明の配合物のための担体として役立つことができるタバコの種類は変えることができ、および種々の乾燥タバコ材料（例えば、熱風乾燥または空気乾燥タバコ）またはその部分(例えば、タバコ葉身またはタバコ茎）を含み、本明細書に述べるタバコの種類のいずれも含むことができる。また、配合物が添付されるタバコ材料の物理的形状は、変えることができ、刻み形状もしくは粒子形状、またはシート形状（例えば、再構成タバコシート）、または全葉形状のタバコ材料を含むことができる。
【０１１８】
したがって、本明細書に提示するタンパク質濃縮、タバコ由来材料は、一部の実施形態において、喫煙品の製造における組成物として用いることができる。例えば、本発明によって調製される配合物は、ケーシング材料と混合することができ、およびケーシング成分またはトップドレッシングとしてタバコに加えることができる。またさらに、本発明の配合物は、紙巻タバコの製造プロセス中、（例えば、フィルタープラグ、プラグラップまたはチップペーパーで）紙巻タバコフィルターに組み込まれることができ、または紙巻タバコ巻紙に、好ましくは内側面上に組み込まれることができる。喫煙品中で用いられるタバコ単離物に関連する説明および参考文献については、例えば、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１９２８８０号を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。体表的なタバコブレンド、非タバコ成分およびそれから製造される代表的な紙巻タバコも、上記のＤｕｂｅらの参考文献に記載されている。
【０１１９】
図３を参照して、紙巻タバコの形状で、本発明の配合物を含み得る喫煙品のいくつかの代表的な成分を有する喫煙品１０を示す。紙巻タバコ１０は、取り囲む包装材料１６内に含有された、一分量または一巻の喫煙に適した充填材料（タバコ材料などの、例えば、約０．３〜約１．０ｇの喫煙に適した充填材料）の略円筒状ロッド１２を含む。ロッド１２は、「タバコロッド」と従来は呼ばれている。タバコロッド１２の端部は、喫煙に適した充填材料を露出させるようにあいている。紙巻タバコ１０は、包装材料１６に加えられた１つの任意のバンド２２（例えば、デンプン、エチルセルロースまたはアルギン酸ナトリウムなどの薄膜形成剤を含む、印刷したコーティング）を有し、およびそのバンドは紙巻タバコの縦軸に対して横方向に紙巻タバコロッドを取り囲んでいる。バンド２２は、巻紙材料の内側面に（すなわち、喫煙に適した充填材料に面して）、またはあまり好ましくないが、包装材料の外側面に印刷することができる。
【０１２０】
点火端１８は、タバコロッド１２の一端部であり、フィルター要素２６は吸い口端部２０に配置される。フィルター要素２６は、フィルター要素とタバコロッドが端と端の関係になるように軸方向に配列し、好ましくは互いに接して、タバコロッド１２の一端に隣接して配置されている。フィルター要素２６は、略円筒形を有してもよく、その直径は、基本的にタバコロッドの直径と等しくてもよい。フィルター要素２６の両端部は、空気と煙がそこを通る通過を可能にする。
【０１２１】
換気または空気希釈された喫煙品には、そのそれぞれがチップ材およびプラグラップを通って延在する一連の穿孔３０などの任意の空気希釈手段が設けられ得る。任意の穿孔３０は、レーザー穿孔技術などの、当業者に既知の種々の技法によって行うことができる。あるいは、いわゆるオフライン空気希釈技法を使うことができる（例えば、多孔質のペーパープラグラップおよび事前穿孔したチップペーパーを用いることにより）。本発明の配合物は、これに限定されないが、タバコ充填の成分として、巻紙の成分（例えば、巻紙内に含まれた、または巻紙の外側もしくは内側にコーティングされた）として、接着剤として、フィルター要素成分として喫煙品のいずれの成分内に、および／または喫煙品の任意の領域に位置するカプセル内に組み込まれることができる。
【０１２２】
本発明の配合物は、いわゆる「電子タバコ」を含み、使用中に燃焼することを意図しないニコチンおよび／またはタバコ材料（またはその一部もしくはその成分）を含むエアロゾル発生装置に組み込むこともできる。これらの種類の喫煙品の一部は、エアロゾルをもたらすため、および／またはエアロゾル形成材料を加熱するために燃焼される可燃性燃料源を使用する。他は、エアロゾル形成組成物を加熱するために、電池式加熱要素を使用する。風味を付けた蒸気および目に見えるエアロゾル、または風味を付けた蒸気と目に見えるエアロゾルの混合物を発生する種類の喫煙品を記載する例示的な参照文献は、Ｄｕｂｅらの米国特許出願公開第２０１２／０１９２８８０号に記載のものを含む。これを参照により本明細書に組み込む。
【０１２３】
本発明の配合物は、無煙タバコ製品、例えば、固まっていない湿性嗅ぎタバコ（例えば、スヌース）；固まっていない乾燥嗅ぎタバコ；噛みタバコ；ペレット化タバコ断片；押出または成形タバコストリップ、断片、ロッド、円筒またはスティック；微粉砕粉末；粉末断片および成分からなる微細または微粉砕集塊物；フレーク様断片；成形タバコ断片；ガム；テープ状フィルムのロール；容易に水に溶解するまたは水に分散するフィルムまたはストリップ；溶ける組成物；ロゼンジ；パステル；または外殻と内側領域を有するカプセル様材料に組み込むことができる。種々の種類の無煙タバコ製品は、Ｄｕｂｅらの米国特許公開第２０１２／０１５２２６５号に記載され、または参照されている。これを参照により本明細書に組み込む。
【０１２４】
図４を参照して、本発明の配合物を含む代表的なスヌースタイプのタバコ製品を示す。特に、図４は、無煙タバコ製品４４を含んでいる水分浸透性外側パウチ４２を有する無煙タバコ製品４０を示す。タバコ製品のいずれの成分も、本明細書に記載のタバコ由来材料（例えば、パウチライニングの内側もしくは外側またはそれに含まれる無煙タバコ組成物の一部）を含むことができる
【０１２５】
本発明の配合物の使用により効果を得ることができる多くの例示的な無煙タバコ組成物は、本発明のタンパク質濃縮、タバコ由来材料のための担体として役立つことができる、刻みまたは粒状タバコ材料を含む。
本発明の無煙タバコ組成物は、使用の間、口腔でゆっくり崩壊する溶解性組成物を提供する水溶性高分子結合剤と任意選択で他の成分を含むこともできる。特定の実施形態において、無煙タバコ組成物は、Ｃａｎｔｒｅｌｌらの米国特許公開第２０１２／００３７１７５号（これを参照により本明細書に組み込む）に記載の組成物などの、口腔内で溶ける（単に溶解するとは対照的に）、溶解可能な組成物をもたらす脂質成分を含むことができる。
【０１２６】
特定の無煙タバコ製品の一実施形態において、本発明の組成物は、ジャガイモン、ビート（例えばテンサイ）、穀物、エンドウ、リンゴなどから選択される植物材料などの非タバコ植物材料に添加される。非タバコ材料は、処理された形状で用いることができる。特定の好適な実施形態において、非タバコ材料は、抽出形状で用いることができ、そのようなものとして、特定の溶媒に溶解する成分の少なくとも一部は、その材料から除去される。非タバコ抽出植物材料は、一般的に、高度に抽出され、植物材料の相当量の水溶性部分は除去されている。例えば、Ｂｅｅｓｏｎらの米国特許公開第２０１１／０２４７６４０号を参照されたい。これを参照により本明細書に組み込む。
【０１２７】
さらなる成分は、本発明により無煙タバコ組成物と混合することができるか、さもなければ無煙タバコ組成物に組み込むことができる。成分は人工的なものであり得、または薬草源もしくは生物源から採取したものまたは由来するものであり得る。成分の例示的な種類としては、塩類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなど）、天然甘味料（例えば、フルクトース、ショ糖、グルコース、マルトース、バニリン、エチルバニリングルコシド、マンノース、ガラクトース、ラクトースなど）、人工甘味剤（例えば、スクラロース、サッカリン、アスパルテーム、アセスルファムＫ、ネオテームなど）、有機および無機充填剤（例えば、穀物、加工穀物、膨化穀物、バクガデキストリン、デキストロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ラクトース、マニトール、キシリトール、ソルビトール、微粉砕セルロースなど）、結合剤（例えば、ポビドン、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび他の変性セルロース型結合剤、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、デンプン系結合剤、アラビアゴム、レシチンなど）、ｐＨ調整剤または緩衝剤（例えば、金属水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムと水酸化カリウムなどのアルカリ金属水酸化物、および金属炭酸塩など、好ましくは炭酸カリウムまたは炭酸ナトリウムなど他のアルカリ金属バッファ、または炭酸水素ナトリウムなどの金属炭酸水素塩）、着色剤（例えば、キャラメル着色剤および二酸化チタンなどを含む染料と色素）、湿潤剤（例えば、グリセリン、プロピレングリコールなど）、特定の酸／塩基の組み合わせなどの起泡材料、口腔ケア添加剤（例えば、タイム油、ユーカリ油および亜鉛）、保存剤（例えば、ソルビン酸カリウムなど）、シロップ（例えば、蜂蜜、異性化糖など）、崩壊助剤（例えば、微結晶性セルロース、クロスカルメロース・ナトリウム、クロスポビドン、デンプングリコール酸ナトリウム、アルファコーンスターチなど）、フレーバー剤と香味料の混合物、抗酸化剤、ならびにそれらの混合物が挙げられる。例示的なカプセル化された添加剤は、例えば、Ａｔｃｈｌｅｙの国際公開第２０１０／１３２４４４号に記載されており、すでに、これを参照により本明細書に組み込んでいる。また、Ｈｕｎｔらの米国特許公開第２０１２／００５５４９４号およびＢｙｒｄらの同第２０１２／０１９９１４５号に記載の無煙タバコ成分を参照されたい。これらを参照により本明細書に組み込む。
【０１２８】
タバコ組成物またはタバコ製品に組み込んだ本発明のタンパク質濃縮、タバコ由来材料の量は、タンパク質濃縮、タバコ由来材料の所望の機能；タンパク質濃縮、タバコ由来材料の化学組成；およびタンパク質濃縮、タバコ由来材料を添加するタバコ組成物の種類に依存し得る。タバコ組成物に添加するタンパク質濃縮、タバコ由来材料の量は変えることができるが、一般的には、該組成物を添加するタバコ組成物の総乾燥重量に基づいて、約５０重量％を超えない。例えば、タバコ組成物に添加するタンパク質濃縮、タバコ由来材料の量は、タバコ組成物の総乾燥重量に基づいて、約０．２５〜約２５重量％または約１〜約１０重量％の範囲内であってよい。
【０１２９】
そのようなタンパク質濃縮、タバコ由来材料の用途は、通常、タバコ組成物と関連して記述されているが、そのような配合物は多くの他の種類の組成物に応用できることを留意されたい。例えば、本発明のタンパク質濃縮タバコ材料は、食品または飲料で使用されることができるか、さもなければＤｉｅｔａｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ａｃｔ  ｏｆ  １９９４（ＤＳＨＥＡ）に定義されている栄養補助食品などの経口摂取を意図する栄養補助食品に組み込むことができる。タンパク質濃縮タバコ材料は、特に動物（例えば、ペットフード）のために設計される食品に組み込まれることもできる。さらなる用途としては、化粧品組成物および医薬組成物が挙げられる。
【０１３０】
本発明のタンパク質含有栄養補助食品は、粉末、液体、棒などを含む種々の形態とることができる。そのような栄養補助剤は、一般的に、甘味料、充填剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン、ミネラルなどの添加成分および賦形剤を含む。本発明のタンパク質濃縮材料は、例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎの米国特許公開第２００６／０２８０８４０号；Ｈｅｒｚｏｇの同第２００８／０２６８０９５号；Ｒｏｔｅｍらの同第２００９／０３１７５３０号；Ｖｅｒｂｉｅｓｔらの同第２０１１／００２０５０１号；Ｓｃｈｅｅｌｅの同第２０１１／０２４５１５８号；Ｃａｖａｌｌｏらの同第２０１２／００６４０５８号；Ｈｏｉｊｅｒらの同第２０１２／０３０１５９９号；およびＲｏｍｅｒｏらの同第２０１３／００４６０１８号に記載の組成物および配合物で用いることもできる。これらを参照により本明細書に組み込む。
【実施例】
【０１３１】
本発明の態様は、以下の実施例によってさらに十分に例示される。実施例は本発明の特定の態様を例示するために記載され、それを限定するものとして解釈されないものとする。
【０１３２】
実施例１−ＲｕＢｉｓＣＯを得るための酸性清澄化および沈殿
タバコ植物を収穫し、茎から葉を取り、葉をディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが８．６の緑色液である。このタンパク質含有抽出物は、まず抽出物をデカンターに通すことによって清澄化する。タンパク質含有抽出物のｐＨを、塩酸を用いて５．９に調整する。任意選択で、抽出物にケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスに通す。
【０１３３】
生じた清澄化タンパク質含有抽出物をクエン酸と塩酸を用いて、ｐＨ４．９２に調整する。ｐＨを調整した抽出物は、４７時間、そのまま放置しておく。混合物の上部から液体をデカントし、混合物の底にたまった固形物を採取し、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、１．４μｍのセラミックフィルター上で処理する。そこからの残留分を濃縮して、タンパク質濃縮タバコ由来材料を得る。このように得られた材料は、タンパク質を約８５重量％と約９９重量％の間で含む。
【０１３４】
実施例２−ＲｕＢｉｓＣＯを得るための酸性清澄化
タバコ植物を収穫し、茎から葉を取り、次いで葉をディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが８．４の緑色液である。このタンパク質含有抽出物は、まず抽出物をデカンターに通すことによって清澄化する。タンパク質含有抽出物のｐＨを、塩酸を用いて５．９に調整する。任意選択で、抽出物にケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスに通す。濾過物を水で洗浄し、ｐＨを５．９に調整して、タンパク質の回収率を高める。
【０１３５】
もたらされた清澄化タンパク質含有抽出物を、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、５００ｋＤａの逆浸透フィルター上で処理する。残留分をグリシン溶液（７５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）で洗浄して、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮タバコ由来材料残留分（約７５〜８５重量％のタンパク質を含む）を得る。透過物を８℃まで冷却し、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、１ｋＤａ逆浸透フィルター上で処理する。１ｋＤａの残留分をグリシン溶液で洗浄し、濃縮してＦ２タンパク質濃縮タバコ由来材料（約３０〜４０％のＦ２タンパク質を含むが、より高いパーセンテージ、例えば６５％は、代替濾過方法、例えば１ｋＤａフィルターの代わりに１０ｋＤａおよび／または２０ｋＤａフィルターを用いる）を得る。
【０１３６】
実施例３−ＲｕＢｉｓＣＯを得るための酸性清澄化および沈殿
タバコ植物を収穫し、茎から葉を取り、次いで葉をディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが８．７の緑色液である。このタンパク質含有抽出物は、まず抽出物をデカンターに通すことによって清澄化する。タンパク質含有抽出物のｐＨを、塩酸を用いて５．９に調整する。抽出物にケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスに通す。
【０１３７】
生じた清澄化タンパク質含有抽出物を、塩酸を用いて、ｐＨ４．９８に調整する。ｐＨを調整した抽出物は、６０時間、そのまま放置しておく。混合物の上部から液体をデカントし、混合物の底にたまった固形物を採取し、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、１．４μｍのセラミックフィルター上で処理する。そこからの残留分を濃縮して、タンパク質濃縮タバコ由来材料を得る。このようにして得られた材料は、タンパク質を約８５重量％と約９９重量％の間で含む。
【０１３８】
実施例４−ＲｕＢｉｓＣＯおよびＦ２画分を得るための塩基性清澄化
タバコ植物は収穫し、茎から葉を取り、次いで葉をディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが８．５の緑色液である。このタンパク質含有抽出物は、まず抽出物をデカンターに通すことによって清澄化する。タンパク質含有抽出物のｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて１０．５に調整する。抽出物に活性炭を加え、次いでケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスと接触させる。混合物はフィルタープレスを通過していなかったので、混合物のｐＨを、塩酸を用いて５．９に調整し、次いでフィルタープレスに通す。
【０１３９】
生じた清澄化タンパク質含有透過物を、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、５００ｋＤａの逆浸透フィルター上で処理する。残留分をグリシン溶液（７５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）で洗浄して、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮タバコ由来材料残留分（約７５〜８５重量％のタンパク質を含む）を得、これを貯蔵する。透過物を８℃まで冷却し、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、１ｋＤａ逆浸透フィルター上で処理する。残留分をグリシン溶液で洗浄し、濃縮してＦ２画分タンパク質濃縮タバコ由来材料（約３０〜４０％のＦ２タンパク質を含むが、より高いパーセンテージ、例えば６５％は、代替濾過方法、例えば１ｋＤａフィルターの代わりに１０ｋＤａおよび／または２０ｋＤａフィルターを用いて得られた）を得る。
【０１４０】
実施例５−ＲｕＢｉｓＣＯおよびＦ２画分を得るための酸性清澄化
タバコ植物は収穫し、茎から葉を取り、次いで葉をディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが８．４の緑色液である。このタンパク質含有抽出物は、まず抽出物をデカンターに通すことによって清澄化する。タンパク質含有抽出物のｐＨを、塩酸を用いて５．９に調整する。抽出物に活性炭を加え、ケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスを通す。生じた清澄化タンパク質含有透過物を、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、５００ｋＤａの逆浸透フィルター上で処理する。残留分をグリシン溶液（７５ｍＭグリシン、ｐＨ１０．５）で洗浄して、ＲｕＢｉｓＣＯ濃縮タバコ由来材料残留分（約７５〜８５重量％のタンパク質を含む）を得、これを貯蔵する。透過物を８℃まで冷却し、タンジェンシャルフロー濾過を用いて、１ｋＤａ逆浸透フィルター上で処理する。残留分をグリシン溶液で洗浄し、濃縮してＦ２画分タンパク質濃縮タバコ由来材料（約３０〜４０％のＦ２タンパク質を含むが、より高いパーセンテージ、例えば６５％は、代替濾過方法、例えば１ｋＤａフィルターの代わりに１０ｋＤａおよび／または２０ｋＤａフィルターを用いて得られた）を得る。
【０１４１】
実施例６−ＲｕＢｉｓＣＯとＦ２の混合タンパク質の単離、それに続く分離
タバコ植物は収穫し、刻み、ディスインテグレーター中でそれに水を加えて均質化し、次いでこの材料を液体抽出用の水平スクリュープレスに通す。このようにして得られたタンパク質含有抽出液は、ｐＨが５．６の緑色液である。タンパク質含有抽出物のｐＨを、水酸化ナトリウムを用いて７．１０に調整する。抽出物にケイ藻土を加え、混合物を１５分間撹拌し、次いでフィルタープレスに通す。生じた清澄化タンパク質含有透過物をタンジェンシャルフロー濾過を用いて、１ｋＤａの逆浸透フィルター上で処理する。残留分はＲｕＢｉｓＣＯとＦ２タンパク質の混合物を含み、および約５０％のタンパク質を含む。
【０１４２】
本発明が前述の説明において提示した教示の利点を有する、本発明の多くの変更および他の実施形態が、本発明が関連する技術分野の当業者には容易に想定されるであろう。したがって、本発明が、開示した特定の実施形態に限定されるものではなく、これらの変更および他の実施形態が添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図していることを理解されたい。本明細書で特定の用語が使用されているが、それらは、一般的かつ記述的な意味でのみ用いられており、限定を目的としたものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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