(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォーム媒介性炎症の治療に用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、治療有効量のＰ５７７９を含み、
前記Ｐ５７７９は四量体ペプチドＦＳＳＥである、医薬組成物。
【請求項２】
前記炎症は、感染、敗血症又は無菌性損傷により引き起こされたものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症は、ウイルス感染又は細菌感染により引き起こされたものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記炎症は、インフルエンザウイルス感染により引き起こされたものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症は、アセトアミノフェン中毒により引き起こされたものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記炎症は、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ニワトリ感染性貧血ウイルス、ヒトパピローマウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、類鼻疽菌、野兎病菌、シュードモナス・アエルギノサ、グラム陰性病原体によって誘発される角膜炎、創傷治癒、関節リウマチ、出血性ショック、又は心筋梗塞により引き起こされたものである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
さらに、感染により引き起こされたＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォーム媒介性炎症の、感染発症後の治療に有効である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記炎症の患者はヒトである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
感染、敗血症又は無菌性損傷により引き起こされたＨＭＧＢ１媒介性炎症の治療に用いられる医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、治療有効量のＰ５７７９を含み、
前記Ｐ５７７９は四量体ペプチドＦＳＳＥである、医薬組成物。
【請求項１１】
前記ＨＭＧＢ１は、ＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォームである請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記感染は、ウイルス感染又は細菌感染である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記感染は、インフルエンザウイルス感染である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記無菌性損傷は、アセトアミノフェン中毒である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記無菌性損傷は、虚血再灌流傷害である請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
人に投与される請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
薬学的に許容可能な担体をさらに含む請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
さらに、感染により引き起こされたＨＭＧＢ１媒介性炎症の、感染発症後の治療に用いられる請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記感染又は無菌性損傷は、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ニワトリ感染性貧血ウイルス、ヒトパピローマウイルス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、類鼻疽菌、野兎病菌、シュードモナス・アエルギノサ、グラム陰性病原体によって誘発される角膜炎、創傷治癒、関節リウマチ、出血性ショック、又は心筋梗塞に引き起こされたものである請求項１０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２０１４年１２月１２日に出願された、シリアル番号が６２／０９０，９３４の米国仮特許出願、及び、２０１５年９月２３日に出願された、シリアル番号が６２／２２２，４８６の米国仮特許出願に基づく優先権を出張し、それらの全文を引用により該当出願に組み込む。
【０００２】
（政府の資金援助）
本発明は、米国国立衛生研究所及び米国国立癌症研究所（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が付与した支援番号がＲＯ１ＧＭ６２５０８、ＲＯ１ＧＭ０９８４４６、５Ｐ５０ＧＭ０５３７８９、ＲＯ１ＧＭ１０７８７６及びＲ０１ＡＴ００５０７６の政府支援によってなされた。よって、政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本願は、ＡＳＣＩＩフォームで電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩのコピーは２０１５年１２月１４日に作成され、ＨＭＧＢ１  ＮＳＬＩＪ−０２４０６２＿ＳＴ２５と命名し、サイズが４０９６バイトである。
【背景技術】
【０００４】
感染又は損傷後、即時型宿主炎症反応は、病原又は損傷関連分子モード（ＰＡＭＰｓ又はＤＡＭＰｓ）を効果的に識別できる自然免疫細胞の受容体により媒介される。たとえば、細菌エンドトキシン（リポ多糖類、ＬＰＳ）に対する哺乳動物応答はＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ）、ＣＤ１４、ＭＤ２及びＴＬＲ４によって媒介される。ＬＰＳを捕捉した後、ＬＢＰはそれをＣＤ１４とＭＤ２に移し、次にＣＤ１４とＭＤ２はＬＰＳをシグナル伝達型高親和性膜貫通Ｔｏｌｌ様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）レセプター４（ＴＬＲ４）に輸送する（Ｎａｇａｉ等，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，３：６６７−６７２，２００２）。ＬＰＳとＴＬＲ４の組み合わせは「早期」（例えばＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ−β）と「後期」前炎症性メディエーター（たとえば、ＨＭＧＢ１）の順次放出を誘発する（Ｗａｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：２４８−２５１，１９９９）。
【０００５】
一般的に存在する核タンパク質として、ＨＭＧＢ１は虚血／再灌流（Ｔｓｕｎｇ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１：１１３５−１１４３，２００５）又は化学的中毒に起因する非菌性組織損傷後に損傷細胞から受動的に放出され得る（Ａｎｔｏｉｎｅ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５８：７７７−７８７，２０１３）。ＨＭＧＢ１は、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ４及び分化クラスター２４（ＣＤ２４）／Ｓｉｇｌｅｃ−１０を含む受容体を介してシグナル伝達することができ、それにより、ＤＡＭＰとして作用して、自然免疫細胞を警告して募集して活性化させて大範囲のサイトカイン及びケモカインを生産する。このように、感染や無菌性損傷等の一見無関係な状態は、共通の過程、すなわち、自然免疫細胞から主動的に分泌されるか又は損傷組織から受動的に放出されるＨＭＧＢ１によって引き起こされる炎症を持っている（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．及びＴｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：１３９−１６２，２０１１）。細胞外ＨＭＧＢ１は感染・損傷誘発炎症性疾患の病原性メディエーターとして確認された（Ｙａｎｇ等，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ，９３：８６５−８７３，２０１３）。
【０００６】
ＨＭＧＢ１は、酸化還元感受性タンパク質であり、２３位、４５位及び１０６位に保存されたシステイン残基を３つ含む。システインの酸化還元状態は、その細胞外ケモカイン又はサイトカインの誘発性質を決定する。具体的には、すべてのシステイン残基が還元されたＨＭＧＢ１（完全還元ＨＭＧＢ１）はＣＸＣＬ１２と結合して、ＣＸＣＲ４受容体を介して免疫細胞浸潤を相乗的に刺激する。Ｃｙｓ２３−Ｃｙｓ４５ジスルフィド結合と還元Ｃｙｓｌ０６（ジスルフィドＨＭＧＢ１）を有する部分的に酸化されたＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４受容体を介して免疫細胞を活性化させることにより、サイトカイン／ケモカインを生産する。一旦すべてのシステインが最終的に酸化されると（スルホニルＨＭＧＢ１）、ＨＭＧＢ１はケモカイン・サイトカイン活性を欠いている。ＨＭＧＢ１はＴＬＲ４／ＭＤ２シグナル伝達経路を介して炎症反応誘導を行い、且つ、ＴＬＲ４／ＭＤ２との相互作用にはチオール含有システイン１０６である特別な原子構造を有する特定ＨＭＧＢｌ酸化還元形態を必要とする（Ｙａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１８：２５０−２５９，２０１２）ことが示された。十分な証拠によれば、活性化された免疫細胞から主動的に分泌されるか又は死亡細胞から受動的に放出されるＨＭＧＢ１は、それぞれ翻訳後修飾を有する複数種のアイソフォームの混合物であることが証明された。逆説的には、免疫系がＴＬＲ４／ＭＤ２受容体系をどのように使用して、ＨＭＧＢ１のそれぞれアイソフォームを区別し、特にジスルフィドＨＭＧＢｌ分子を識別してほかのアイソフォームを排除するかは未知である。
【０００７】
特に注目されているＨＭＧＢ１媒介性炎症はインフルエンザによって引き起こされるものである。インフルエンザは進化し続けており、毎年新しい抗原変異体が出現し、最後のいくつかのインフルエンザシーズンに例示されるように、推薦されるワクチンが予想よりもかなり効果が低い。従って、インフルエンザ感染の影響を緩和するための、現在年々使用されているインフルエンザワクチンと抗ウイルス薬の代替品を開発することが急務である。インフルエンザウイルスは、マウスに作用しないＴＬＲ８とＴＬＲ１０を含む複数種のＰＲＲ（ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８  、ＴＬＲ１０を含む）と細胞内センサー（ＲＩＧ−Ｉ）により感知される。マウスマクロファージによるインフルエンザ誘発サイトカインの発生にはＣＤ１４が必要であるが、ＴＬＲ２とＴＬＲ４に依存しない。また、ＷＴマウスに比べて、ＭｙＤ８８−／−とＭｙＤ８８／ＴＲＩＦの二重欠損マウスでは肺サイトカイン生産の急激減少を示すことは、これらＴＬＲシグナル伝達経路が疾患に対して重要な役割を果たすことを示している。
【０００８】
Ｉｍａｉ等は、化学的又は微生物による傷害が、宿主から誘導される酸化リン脂、すなわち酸化された１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ホスファチジルコリン（ＯｘＰＡＰＣ）を肺で発生させるＮＡＤＰＨ依存性活性酸素種を引き起こすことを示唆している（Ｉｍａｉ等，Ｃｅｌｌ，１３３：２３５−２４９，２００８）。彼らは、病原体識別に係る初期感知に関わらず、ＯｘＰＡＰＣがまずマクロファージにおいてＡＬＩに届く共用するＴＬＲ４、ＴＲＩＦ及びＩＬ−６依存性経路を開始させるという結論を出した。Ｅｒｉｔｏｒａｎ（すなわち、既知の最も有効な合成脂質Ａ類似体（Ｌｉｅｎ等，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，２７６：１８７３−１８８０，２００１））を用いてインフルエンザ感染マウスを治療することによって、インフルエンザによる死亡とＡＬＩをブロックする。５日間、ＷＴマウスに毎日投与する場合は、感染２、４又は６日目から、Ｅｒｉｔｏｒａｎ治療は生存率と臨床症状を大幅に改善するとともに、ＡＬＩ、ＯｘＰＡＰＣの蓄積、サイトカインストーム及び全身性炎症を減少させる（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４９７：４９８−５０２，２０１３）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、必要とする患者に治療有効量のＭＤ２アンタゴニストを投与することによってＨＭＧＢ１媒介性炎症を治療又は予防する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１はＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォームである。いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症を治療するに当たって、感染の発症後、ＭＤ２アンタゴニストを投与する。いくつかの実施形態において、ＭＤ２アンタゴニストを薬学的に許容可能な担体に混入して投与する。
【００１０】
ＨＭＧＢ１媒介性炎症は感染又は無菌性損傷により引き起こされ得る。いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症はインフルエンザ感染のようなウイルス感染によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、ウイルス感染によるＨＭＧＢ１炎症を治療するに当たって、該方法はさらに患者にａｎｖｉｒａｌ剤（例えばオセルタミビル）を投与するステップを含む。ほかの実施形態では、ＨＭＧＢｌ媒体性炎症は細菌感染によって引き起こされる。さらなる実施形態では、ＨＭＧＢｌ媒体性炎症は無菌性損傷（例えばアセトアミノフェン中毒）によって引き起こされる。  
【００１１】
本発明の別の態様は、ＦＳＳＥのアミノ酸配列を有するＭＤ２アンタゴニストを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ＭＤ２アンタゴニスト組成物はさらに薬学的に許容可能な担体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
本発明は以下の図面を参照してより容易に理解され得る。  
【００１３】
図１Ａ−１ＤはジスルフィドＨＭＧＢｌがＭＤ２に結合されることを示すグラフである。（Ａ）それぞれのＨＭＧＢｌアイソフォーム（１μｇ／ｍｌ、１６ｈ）で刺激されたＲＡＷ  ２６４．７細胞でＴＮＦリリースを測定する。＊：ジスルフィドＨＭＧＢ１に対してＰ＜０．０５。Ｎ＝３−５。（Ｂ）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ）分析を行って、ＨＭＧＢ１とＭＤ２又はＴＬＲ４との結合を評定する（チップに塗布）。上行：ＨＭＧＢ１のヒトＭＤ２へ結合；１２ｎＭの見かけＫｄ（左図）でそれぞれＨＭＧＢｌ濃度（１２．５，２５，５０及び１００ｎＭ）で計測した。ヒトＭＤ２（１２．５，２５，５０及び１００ｎＭ）とＨＭＧＢｌの結合（チップに塗布、中間図）、ジスルフィドＨＭＧＢｌ（１００ｎＭ）とＴＬＲ４の結合（チップに塗布、右図）が計測された。下行：非サイトカイン誘導性ＨＭＧＢ１（Ｃ１０６Ａ、Ｈｇ−ＨＭＧＢ１、１μΜ）とＭＤ２の結合（チップに塗布、左図）が計測された。ＨＭＧＢｌアイソフォームとＭＤ２の結合（チップに塗布、右図）が計測された。データは応答単位（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ  ，ＲＵ）又は時間（秒）（Ｔｉｍｅ（Ｓｅｃ））に対する相対ＲＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｉｔ  ）を示し、さらに三回の実験を示す。（Ｃ）カルモジュリンビーズにより、ＭＤ２を発現させた酵母Ｓｆ９細胞上澄みとＣＢＰ標識ＨＭＧＢ１又はＣＢＰの混合物（免疫沈降、ＩＰ）を免疫沈降させ、さらに該混合物を抗ヒトＭＤ２抗体又はＣＢＰ抗体によりイムノブロッティング（ＩＢ）させる。ここで、組換えＭＤ２タンパク質を陽性対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）（右側）とする。示されるデータは３回の繰り返しを示す。（Ｄ）ＨＭＧＢ１とヒトＭＤ２の結合のＳＰＲ分析（チップに塗布）；抗ＨＭＧＢｌ  ｍＡｂモノクローナル抗体（左図）又は示される非関連マウスＩｇＧ（右図）の存在下で行われる。データは３回の繰り返しを示す。
【００１４】
図２Ａ−２Ｃは、ＭＤ２がＨＭＧＢｌ依存性ＴＬＲ４シグナル伝達に不可欠であることを示すグラフ及び画像である。（Ａ）上部パネル：ＲＡＷ  ２６４．７細胞に対してＭＤ２（ｓｉＲＮＡ）のノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）を行う。ＷｅｓｔｅｒｎブロッティングによりＭＤ２とＮＦ−κΒレベル（ｐ６５）を評定する。密度測定法によりＮＦ−κＢ（ｐ６５）タンパク質のレベルをβアクチンのレベル（比）に対して正規化させ、未刺激細胞に対する倍数変化として表示する。下部パネル：ＭＤ２阻害作用を有するＲＡＷ  ２６４．７細胞（中空バー）又は対照ｓｉＲＮＡ（中実バー）からの、ＨＭＧＢ１誘導ＴＮＦの放出。＊：ｓｉＲＮＡ対照群に対してＰ＜０．０５である。Ｎ＝４−５。（Ｂ）左パネル：ＨＭＧＢｌ（２μｇ／ｍｌ）又は超純ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて野生型（ＷＴ）又はＭＤ２  ＫＯマウスからの原発性腹膜マクロファージを１６時間刺激し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングにより核抽出物におけるＮＦ−κΒ（ｐ５０とｐ６５）タンパク質のレベルを評定する（左上パネル）。ＮＦ−κＢ活性化はβアクチンに対するｐ５０又はｐ６５として表示され、且つ、未刺激細胞の倍数変化として計算される（左下図）。右パネル：ＨＭＧＢ１でマウスマクロファージを刺激して、マウスサイトカインＡｂアレイ（Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、ＴＮＦ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ｓＴＮＦＲｌ；右上パネル）又はＥＬＩＳＡ（ＴＮＦ用、右下グラフ）を用いて放出したサイトカインを測定する。＊ＷＴ群に対してｐ＜０．０５。Ｎ＝５回の独立した実験。（Ｃ）肝損傷モデルにおいてＷＴ又はＭＤ２  ＫＯマウスにＡＰＡＰを感染させて、２４時間後に安楽死させて、次に肝臓酵素（ＧＬＤＨ、ＡＬＴ及びＡＳＴ；左の列のグラフ）とサイトカイン（ＨＭＧＢ１、ＴＮＦ及びＩＬ−６；右の列のグラフ）の血清レベルを検出する。＊：ＷＴ  ＡＰＡＰ群に対してＰ＜０．０５である。Ｎ＝１群にマウス５−１３匹。これらマウスの肝臓組織の代表的なＨ＆Ｅ染色が示される。Ｎ＝１群にマウス５−８匹（拡大倍数、×２００；矢印は壊死領域を示す；中間パネル）。縮尺＝１００μｍ。ＷＴとＭＤ２  ＫＯマウスについて、致死量のＡＰＡＰを投与した場合の動物の生存率を評定した（生存百分率）。Ｎ＝１群にマウス１５匹。＊：野生型に対してＰ＜０．０５（右パネルのグラフ）。
【００１５】
図３Ａと図３Ｂは、抗ＨＭＧＢ１モノクローナル抗体を投与することによりＡＰＡＰによるマウス肝損傷を緩和させることを示すグラフを示す。（Ａ）マウスにＡＰＡＰを注射し（ｉ．ｐ．）、次に抗ＨＭＧＢ１抗体又は対照ＩｇＧを注射して治療する（ｉ．ｐ．，方法参照）。動物生存率（生存率％）を評定する。Ｎ＝２０匹のマウス／群。＊：ＩｇＧ群に対してＰ＜０．０５。（Ｂ）ＡＰＡＰを投与してから２４ｈ後にマウスの肝臓酵素（ＡＬＴ）とサイトカイン（ＴＮＦとＩＬ−６）の血清レベルをマウスに抗ＨＭＧＢ１  Ａｂ又は対照ＩｇＧの投与下で（方法参照）測定する。Ｎ＝１０匹のマウス／群。＊：ＩｇＧ群に対してＰ＜０．０５である。
【００１６】
図４Ａ−４Ｄは、ＨＭＧＢ１阻害剤のスクリーニング結果を示すグラフ及び写真である。（Ａ）ＭＤ２（チップに塗布）とＰ５７７９（ＦＳＳＥ）及びほかのペプチド（１００ｎＭ）との相互作用を計測するためにＳＰＲ分析を行った。Ｋｄ値は示された。データは３回の実験を示す。（Ｂ）ＨＭＧＢｌ（１μｇ／ｍｌ）とそれぞれのペプチド（５０μｇ／ｍｌ）の組み合わせによりインビトロで初代ヒトマクロファージを１６時間連続刺激し、ＥＬＩＳＡでＴＮＦの放出を測定する。Ｎ＝４−５。＊：ＨＭＧＢ１単独に対してＰ＜０．０５である。（Ｃ）Ｐ５７７９（１２．５，２５，５０及び１００ｎＭ）又はスクランブル対照（ｃｔｒｌ）ペプチド（１００ｎＭ）とヒトＭＤ２（Ｐ５７７９に対して、Ｋｄ＝０．６５μΜ）、ＨＭＧＢｌ又はＴＬＲ４（チップに塗布）との結合を測定するために、ＳＰＲ分析を行った。データは３回の実験を示す。（Ｄ）はＭＤ２と四量体ペプチドＦＳＳＥ（左）とＳＦＳＥ（右）との分子ドッキングを模式的に示す。茶色領域はＭＤ２のペプチド結合ポケットの表面、緑色領域はＴＬＲ４タンパク質の表面を示す。下部パネルは水素結合、及びファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）の相互作用を示す。対照例よりも強いファンデルワールス相互作用を有するＰ５７７９は十分にＭＤ２の疎水性ポケットに伸びてＭＤ２のＴｙｒ１０２と結合された追加の水素結合を形成する。
【００１７】
図５Ａ−５ＥはＭＤ２とＨＭＧＢ１との結合に特異的阻害剤として、四量体ペプチド（Ｐ５７７９）の発展を示すグラフ及び写真を示す。（Ａ）ＳＰＲ分析時に、ＨＭＧＢ１はチップに塗布されて、次に分析物としてのＭＤ２（１μΜ）及びそれぞれ量のＰ５７７９（図示）を流す。Ｐ５７７９（ＩＣ５０＝２９ｎＭ）によるＨＭＧＢ１とＭＤ２の結合の阻害作用を評定した（上図）。逆実験において、ヒトＭＤ２をチップに塗布し、次にＨＭＧＢ１（１μΜ）とそれぞれ量のＰ５７７９を分析物として添加する。Ｐ５７７９（ＩＣ５０＝２ｎＭ）はＨＭＧＢ１とＭＤ２の結合を抑制した（下図）。データは３回の独立した実験を示す。（Ｂ）ＨＭＧＢ１（１μｇ／ｍｌ）又はほかの刺激物（Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ，Ｓ１００Ａ１２，ＬＰＳ，ＰＧＮ及び  ＣｐＧＤＮＡ）に増加量のＰ５７７９（又はスクランブル対照ペプチド）を加えてヒト血液から分離したヒト初代マクロファージについてインビトロで１６時間連続刺激する。ＥＬＩＳＡによりＴＮＦ放出を測定する。Ｎ＝４−５。＊：ＨＭＧＢｌプラス対照ペプチド（ｃｔｒｌ）に対してＰ＜０．０５である。（Ｃ）ＨＭＧＢｌ（１μｇ／ｍｌ）にＰ５７７９又は対照ペプチド（ｃｔｒｌ、５０μｇ／ｍｌ）を加えてチオグリコール酸塩（エステル）による腹膜マウスマクロファージについてインビトロで１６時間連続刺激し、さらにマウスサイトカインＡｂアレイ（左パネル）によって各種サイトカインの細胞外レベルを分析する。データは３−４回の実験を示す。密度測定法により各実験を繰り返して未刺激細胞に対する倍数増加（−ＨＭＧＢ１）として表示する（右表）。＊：＋ＨＭＧＢ１群に対してＰ＜０．０５である。（Ｄ）ＬＰＳ（２ｎｇ／ｍｌ）でＰ５７７９（５０μｇ／ｍｌ）又は対照ペプチド（ｃｔｒｌ）が存在し又は存在しない条件下で血液から分離した初代ヒトマクロファージについてインビトロで１６時間連続刺激し、ヒトサイトカインＡｂアレイ（左パネル）により各種サイトカインの細胞外レベルを分析する。データは３回の繰り返しを示す。（Ｅ）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＬＰＳ（８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）とＰ５７７９又は対照ペプチド（ｃｔｒｌ）の組み合わせを注射する（マウス１匹に５００μｇ、ｉ．ｐ．）。９０分間後に動物を安楽死させる。ＥＬＩＳＡｓによって血清ＴＮＦとＩＬ−６のレベルを測定する。Ｎ＝１群にマウス５匹。
【００１８】
図６Ａ−６Ｃは、ＨＭＧＢ１阻害剤（Ｐ５７７９）で治療することによりインビボＡＰＡＰ媒体性中毒、虚血／再灌流損傷や敗血症の死亡率を低下させることを示すグラフ及び画像を示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡＰＡＰを注射し（ｉ．ｐ．方法）、次にＰ５７７９（示される用量）又は対照ペプチド（ｃｔｒｌ、５００μｇ／マウス；ｉ．ｐ．）を投与する。２４ｈ後にマウスを安楽死させて、ＥＬＩＳＡｓによって血清酵素レベル（ＡＳＬとＡＬＴ）及びサイトカインレベル（ＴＮＦ）を測定する（左上図）。Ｎ＝１群にマウス６−１０匹。生存実験では、マウスにＡＰＡＰを注射し（ｉ．ｐ．）、次にＰ５７７９又は対照ペプチドを投与する（ｃｔｒｌ、ｉ．ｐ．方法参照）。生存率を２週間監視する（百分生存率）。Ｎ＝マウス３０匹／群（左下図）。右パネル：Ｐ５７７９又は対照ペプチドを投与する正常（未処理）又はＡＰＡＰ注射マウスの肝臓組織切片の代表的なＨ＆Ｅ写真を示す。臨床スコアは評定されて右側に示された。肝壊死は矢印により示される（拡大、×２００）。縮尺＝１００μｍ。Ｎ＝マウス６−１０匹／群。＊：対照ペプチド群に対してＰ＜０．０５である。（Ｂ）虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）手術時にＰ５７７９又は対照ペプチド（５００μｇ  ／マウス、ｉ．ｐ．）を投与して、６時間後にマウスを安楽死させて、ＡＬＴとＡＳＴの血清レベルを検出し（左ヒストグラム）、組織肝損傷を評価する。＊：Ｉ／Ｒ群に対してＰ＜０．０５である。Ｎ＝マウス５−７匹／群。代表的なＨ＆Ｅ肝組織切片（右パネル、好中球浸潤：矢印；拡大、×２００）を示す。縮尺＝１００μｍ。Ｎ＝マウス３−５匹／群。（Ｃ）マウスにＣＬＰ手術を実施して、示された量でＰ５７７９又は対照ペプチド（Ｃｔｒｌ）をｉ．ｐ．投与する。動物生存率を２週間監視する（生存率％）。Ｎ＝マウス２０匹／群。＊：対照ペプチド群に対してＰ＜０．０５である。
【００１９】
図７Ａ−７Ｃは、抗ＴＬＲ４  ＩｇＧ処置によりマウスを致命的なインフルエンザチャレンジから保護するグラフを示す。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスはマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．；〜ＬＤ９０）により感染された。マウスに対照ＩｇＧ又は高度特異的抗ＴＬＲ４  ＩｇＧ（２ｍｇ／マウス、ｉ．ｖ．）を一回（２日目だけ）又は二回（２日目と４日目）投与する。毎日、生存率（Ｂ）の監視と臨床スコア（Ｃ）を行う。各図は２回の別々の実験の結果を組み合わせたものを示す（マウス５匹／処置群／実験）。
【００２０】
図８Ａと図８Ｂは、ＥｒｉｔｏｒａｎによるＩＲＡＫ４ＫＤＫＩとＴＲＩＦ−／−マウスへの影響を示すグラフを提供する。ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＡとＢ）、ＩＲＡＫ４ＫＤＫＩ（Ａ）及びＴＲＩＦ−／−（Ｂ）マウスはマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜  ７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．；〜ＬＤ９０）によって感染される。感染後の２日目から、マウスに５日間媒体（生理食塩水；ｉ．ｖ．）又はＥｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４；２００μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を連続投与する。１４日間の生存率を監視する。示されたデータは２−３回の別々の実験（マウス５−１０匹／処置群／実験）の結果を組み合わせたものである。
【００２１】
図９Ａと図９Ｂは、抗ＴＬＲ２  ＩｇＧ処置によりマウスを致命的なインフルエンザのチャレンジから保護することを示すグラフを提供する。（Ａ）実験方法：感染３時間前と感染後の１日目又は感染後の２日目と４日目後に、アイソタイプ対照ＩｇＧ又は抗ＴＬＲ２（Ｔ２．５；１００μｇ／ｍｓ  ｉ．ｖ．）でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを処置する。毎日生存率（Ｂ）を監視する。示されたデータは２回の別々の実験の結果を組み合わせたものである（マウス５匹／処置群／実験）。
【００２２】
図１０Ａと図１０Ｂは、ＴＬＲ２／ＴＬＲ４二重ノックアウトマウスがインフルエンザ感染に対してより感受性が高いことを示すグラフ及び写真を提供する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウス、ＴＬＲ２−／−マウス、ＴＬＲ４−／−  マウス及びＴＬＲ２／ＴＬＲ４二重ノックアウトマウス（ＴＬＲ２／４）はマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜４００００  ｐｆｕ、ｉ．ｎ．；ＷＴマウスの〜ＬＤ１０）により感染された。マウスについて１４日間生存率を毎日監視する。示されたデータは２つの別々の実験を組み合わせたものである（マウス４−１２匹／群／実験）。（Ｂ）：（Ａ）と同様に、ＷＴマウス、ＴＬＲ２−／−マウスとＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスを感染させた。感染後５日目に肺を採取して組織病理学的検査を行う。示されたデータは代表的な肺切片（マウス３−４匹／群）である。
【００２３】
図１１Ａ−１１Ｄは、ＥｒｉｔｏｒａｎでＷＴマウス、ＴＬＲ４−／−マウスを前処置することによりマウスを致命的なインフルエンザチャレンジから保護できないことを示すグラフを提供する。（Ａ）ＷＴマウスとＴＬＲ４−／−マウスをマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．）により感染させて、感染後２日目、４日目及び６日目に安楽死された。肺を採取して、ウイルス力価とＩＦＮ−βｍＲＮＡを分析する。示されたデータは２回の別々の分析（マウス４−５匹／群／実験）の結果を組み合わせたものである。（Ｂ）基本的な実験方法によって、前処置／早期とＥｒｉｔｏｒａｎを用いたＰＲ８感染マウスに対する治療処置を比較する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウス及びＴＬＲ４−／−マウスについては、処置しないか（黒丸）、感染３時間前から４日間前処置を連続する場合の１日目（３ｈ；黒四角；前治療／レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ））、又は５日間連続感染した後の２日目から（白抜き丸；治療方案）、Ｅｒｉｔｏｒａｎで処置する。（ＣとＤ）マウスについて毎日生存率を監視する。示されたデータは２回の別々の実験（マウス５−６匹／処置／実験）の結果を組み合わせたものである。
【００２４】
図１２Ａ−１２Ｄは、ＥｒｉｔｏｒａｎがＨＭＧＢ１誘導性ＴＬＲ４のインビトロシグナル伝達、インビボでインフルエンザ誘導性ＨＭＧＢ１の放出及び致死率を軽減させることを示すグラフである。（Ａ）媒体単独（Ｍ）又はＥｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ；１０ｎｇ／ｍｌ）でチオグリコール酸塩（エステル）により引き起こされたＣ５７ＢＬ／６Ｊマクロファージを１時間連続処理し、次にＬＰＳ（Ｌ；１０ｇ／ｍｌ）又はＨＭＧＢｌ（Ｈ；１μｇ／ｍｌ）で２時間連続処理する。ＴＮＦα又はＩＦＮ−βの発現を検出するために、全ＲＮＡを処理してｑＲＴ−ＰＣＲに供した。（Ｂ）コットンラット（６−８匹／時間点／治療）をｐｄＨｌＮｌＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／０９（１０６  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．）によって感染させ、次に感染後の６ｈからＥｒｉｔｏｒａｎ又はプラセボで処置する。ＥＬＩＳＡによって血清ＨＭＧＢ１レベルを測定する（＊ｐ＜０．０５）。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．；〜ＬＤ９０）を感染させる。感染後２日目から５日間（２日目−６日目）にわたり、マウスに対照ペプチド（５００μｇ／マウス；ｉ．ｐ．）、Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４；２００μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を投与するか、ＨＭＧＢｌペプチドＰ５７７９（５００μｇ／マウス；ｉ．ｐ．）を投与する。生存率（Ｃ）と臨床スコア（Ｄ）を１４日間毎日連続監視する。示されるデータは２回の実験（マウス５−１０匹／処置群／実験）の結果を組み合わせたものである。
【００２５】
図１３Ａ−１３Ｃは、致命的なインフルエンザチャレンジに対するＡＴ−１００１による効果を示すグラフを提供する。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．；〜ＬＤ９０）を感染させる。感染後２日目から５日間（２日間−６日間）にわたり、マウスに媒体（生理食塩水；ｉ．ｖ．）、Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４；２００μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を投与するか、ＡＴ−１００１（１５０μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を投与する。生存率（Ａ）と臨床スコア（Ｂ）を１４日間毎日連続監視する。示されたデータは３回の別々の実験（マウス５匹／処置群／実験）の結果を組み合わせたものである。（Ｃ）肺の湿重量／乾燥重量（Ｗ／Ｄ）の比を感染後の肺水腫の指標とする。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの感染及び治療は以下に示されたとおりである。感染後７日目に、肺を採取して、切除直後に肺重量を測定し、湿重量として記録する。肺組織を、５−６日間空気乾燥を連続して、再び安定した乾燥重量を得るまで再秤量する。湿重量を乾燥重量で割ってＷ／Ｄ重量比を算出する。各群のＮはそれぞれのバーにより示される。それぞれの垂直なバーは平均値（±ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。
【００２６】
図１４Ａと図１４Ｂは、致命的なインフルエンザチャレンジに対するＩＬ−１Ｒａの効果を示すグラフを提供する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにマウス適合インフルエンザウイルス株ＰＲ８（〜７５００  ＴＣＩＤ５０、ｉ．ｎ．；〜ＬＤ９０）を感染させる。感染後２日目から５日間（２日目−６日目）にわたり、マウスに媒体（生理食塩水；ｉ．ｖ．）、Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４；２００μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を投与するか、ＩＬ−１Ｒａ（１５０μｇ／マウス；ｉ．ｖ．）を投与する。生存率（頂部パネル）の監視と臨床スコア（底部パネル）を毎日１４日間連続する。示されたデータは２回の別々の実験（マウス５匹／処置群／実験）の結果を組み合わせたものである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明人は必要とする患者に治療有効量のＭＤ２アンタゴニストを投与することによりＨＭＧＢ１媒介性炎症を治療する方法を開示する。
定義
【００２８】
本明細書に使用されている用語は、実施形態を説明するためのものであり、発明全体を制限するものと理解すべきではない。文脈から判断して矛盾しない限り、本発明の明細書及び添付した請求項に使用される単数形「一」及び「前記」はその複数形式も含む。
【００２９】
本明細書に使用されている「治療」、「処置」等とは、ＨＭＧＢ１媒介性炎症に罹患した患者に有用な任意の操作を指し、少なくとも１種の症状の減少又は抑制、疾患進行・病状発展の遅延等の改善が挙げられる。
【００３０】
本明細書では互換的に使用される用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」とはアミノ酸のポリマーを指す。特定の長さを有するアミノ酸ポリマーを意味するものではない。従って、遺伝子組換え技術により生産されるか、化学又は酵素法により合成されるか、又は自然に存在するかを問わず、たとえば、オリゴペプチド、タンパク質及び酵素のいずれもポリペプチド又はペプチドの定義内に含まれる。該用語はさらに、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等のような修飾又は誘導を行ったポリペプチドも含む。
【００３１】
本明細書に使用されている「アミノ酸」とは一般式ＮＨ２−ＣＲＨ−ＣＯＯＨで表れる化合物を意味し、但し、側鎖ＲはＨ又は有機基である。Ｒが有機基である場合は、Ｒは変化可能であり、且つ極性でも非極性（すなわち疎水性）でもよい。本発明のアミノ酸は天然に生成するものでも、合成するものでもよい（一般的に、ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃと呼ばれる）。
【００３２】
以下の略語は本発明を通して使用される：Ａ＝Ａｌａ＝アラニン、Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン、Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン、Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン、Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン、Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン、Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン、Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン、Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン、Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン、Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン、Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸、Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン、Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸、Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン、Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン、Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン、Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン、Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン、Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン。
【００３３】
本明細書に使用されている「薬学的に許容可能な」とは、該化合物又は組成物が、疾患の重篤度及び治療の必要性に照らして過度に有害な副作用無しに本明細書の前記方法により患者に投与することに適していることを意味する。
【００３４】
用語「治療上有効」は、疾患の重篤度を低下させるとともに、典型的に代謝療法に関連する有害な副作用を回避する各薬剤の用量を意味する。治療有効量は一回又は一回以上の用量で投与できる。一方、有効用量は、特定の効果（例えば酵素阻害作用）を与えるのに十分な量であり、治療有効量であっても治療有効量でなくてもよい。
ＨＭＧＢ１媒介性炎症の治療方法
【００３５】
一態様では、本発明は、必要とする患者に治療有効量のＭＤ２アンタゴニストを投与することによって、ＨＭＧＢ１媒介性炎症を治療する方法を提供する。高移動度群タンパク質１（ＨＭＧＢ１）は、感染と損傷による炎症性疾患及び病状の両方のメディエーターである。活性化されたマクロファージ及び単球は炎症のサイトカインメディエーターとしてＨＭＧＢ１を分泌する。ＨＭＧＢ１は高移動度群タンパク質１（ＨＭＧ−１）、アムホテリン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ）としても知られており、ＨＭＧＢ１遺伝子によってコードされる。それぞれ翻訳後修飾を有する複数のＨＭＧＢ１アイソフォームは炎症反応に関与する。従って、いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性疾患は１つ又は複数のＨＭＧＢ１アイソフォームにより媒介される。たとえば、いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１はＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォームである。
【００３６】
本明細書で定義されるＨＭＧＢ１媒介性炎症は、ＨＭＧＢ１が疾患の病理において重要な役割を果たす病態又は病症である。後記したとおり、ＨＭＧＢ１はマクロファージ、単球及び樹状細胞等の免疫細胞により炎症のサイトカインメディエーターとして分泌されるものである。ＨＭＧＢ１はＴＬＲ４と結合して形成されたＴＬＲ４／ＭＤ２シグナル伝達経路を介して炎症反応を誘導し、それにより、ＨＭＧＢ１依存的なマクロファージサイトカイン放出の活性化を媒介する。従って、ＨＭＧＢ１は滅菌性及び感染性炎症反応の両方に関与する。
【００３７】
炎症性疾患には、組織病理学的炎症を特徴とする様々な障害が含まれる。病原体に対する宿主防御システムとして進化した免疫活性化は、調節不能になり、病因が既知か未知の多様な疾患の発病メカニズムを促進する可能性がある。免疫活性化及び関連炎症は、病因の「共同特性（ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ）」又は一般的なメカニズムであるようであり、ほかの無関係なヒト疾患間の病理学的関連性や類似性を説明できる（Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ．，１２８（６）：５６２−６，２０１５）。炎症性疾患の例として、尋常性ざ瘡、敗血症、喘息、セリアック病、慢性前立腺炎、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、骨盤内炎症性疾患、虚血再灌流障害、関節リウマチ、サルコイドーシス、血管炎、ハウスダストダニ誘発気道炎症及び間質性膀胱炎が含まれる。ＨＭＧＢ１はこれら疾患の炎症反応において重要な役割を果たす（Ｙａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２１：Ｓ６−Ｓ１２，２０１５；Ｋａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．，１−１１６，２０１４；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：１３９−６２，２０１１）。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症は感染によって引き起こされる。炎症は感染からの保護に対し重要な役割を果たし、細胞損傷の初期病因を排除すること、元の傷害部位及び炎症過程において壊死細胞と損傷組織を除去すること、組織修復を開始させることなどを含む。しかし、場合によって、感染は過度、さらに潜在的な危険性を有する炎症を引き起こす可能性がある。たとえば、サイトカイン媒介性肺炎症のウイルス誘発は感染の病原性において重要な役割を果たす。同様に、細菌感染に起因するエンドトキシンはＨＭＧＢ１媒介性炎症の一種の形態として敗血症を引き起こし得る。
【００３９】
ＨＭＧＢ１媒介性炎症は各種感染に起因し得る。たとえば、いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症はウイルス感染によって引き起こされる。病的炎症を引き起こし得るウイルスの例として、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｃａｏ等，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．，５：１４２４０−５，２０１５）、インフルエンザＡウイルス（Ｈ１Ｎ１）（Ｎｏｓａｋａ等，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，１９：２４９−２５８，２０１５）、ニワトリ感染性貧血ウイルス（Ｓａｗａｎｔ等，Ｖａｃｃｉｎｅ，３３：３３３−４０，２０１５）、ヒトパピローマウイルス（Ｗｅｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｒｅｐ，１０：１７６５−７１，２０１４）が含まれる。いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症はインフルエンザウイルス感染によって引き起こされるものであり、病的炎症を引き起こす可能性が高い。
【００４０】
ほかの実施形態では、ＨＭＧＢ１媒介性炎症は細菌感染によって引き起こされる。病的炎症は様々なタイプの細菌による感染の結果として起こり得る。病的炎症反応を引き起こし得る細菌の例として、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、類鼻疽菌、野兎病菌（Ｋａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．，１−１１６，２０１４；Ｌａｗｓ等，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ  Ｊ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，４０：１−８，２０１５；Ｄ’Ｅｌｉａ  ＲＶ等，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，６月期号ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３７５４２９２，２０１３）、シュードモナス・アエルギノサ、グラム陰性病原体によって誘発される角膜炎（ＭｃＣｌｅｌｌａｎ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９４：１７７６−１７８７，２０１５）が含まれる。
【００４１】
あるいは、いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症は感染以外の因子によって引き起こされる。感染以外の因子による炎症は本明細書では「無菌性損傷」による炎症と呼ばれる。無菌性損傷は関節リウマチ、肺繊維症及び急性肝不全を含むいくつかの疾患の病因となる急性炎症反応を引き起こす恐れがある。無菌性炎症の例として、アセトアミノフェン中毒、創傷治癒、関節リウマチ、出血性ショック、心筋梗塞、虚血再灌流傷害および移植、脳虚血および損傷（Ｋａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．，１−１１６，２０１４；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ等，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２９：１３９−６２，２０１１；Ｙａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２１：Ｓ６−Ｓ１２，２０１５）が含まれる。いくつかの実施形態において、ＨＭＧＢ１媒介性炎症はアセトアミノフェン中毒によるものである。
ＭＤ２アンタゴニスト
【００４２】
患者のＨＭＧＢ１媒介性炎症を治療する好ましい方法としては、患者に治療有効量の骨髄分化タンパク質２（ＭＤ２）アンタゴニストを投与する。他の多数の炎症治療方法に比べて、ＭＤ２アンタゴニストによる治療は、抗微生物免疫応答性を実質的に低下させないことを利点の１つとする。
【００４３】
ＭＤ２アンタゴニストはＭＤ２活性を妨害する化合物である。たとえば、ＭＤ２アンタゴニストはＭＤ２と別のペプチド（たとえばＴＬＲ４又はＨＭＧＢ１）との結合を妨害できる。Ｈａｗｋｉｎｓ等はＥｒｉｔｏｒａｎと関連化合物（脂質に基づく化合物）がＭＤ２アンタゴニストとして使用できることを開示した（Ｈａｗｋｉｎｓ等，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，４（１１）：  １１４７−７１，２００４）。発明人により同定された別のＭＤ２アンタゴニストはＰ５７７９であり、ＦＳＳＥのアミノ酸配列を有するテトラペプチドである。もう一つのＭＤ２アンタゴニストはペプチドＭＤ２−Ｉである（Ｓｌｉｖｋａ等，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，１０（４）：６４５−６４９，２００９）。
【００４４】
候補ＭＤ２アンタゴニストは動物モデルで試験できる。その動物モデルは、たとえば、炎症を検討するための動物モデルの検討に用いられ得るものであってもよい。動物モデル（たとえばマウス）の炎症検討は公知する手技である。たとえば、Ｃｈｅｎ等はヒトと鼠モデルとの敗血症評定についての差異を検討した（Ｃｈｅｎ等，Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．，９４（６）：  １１３５−４９，２０１４）。候補薬剤で処置した対照動物と処置を受けなかった対照同腹仔との計測結果を代表として比較した。遺伝子組換え動物モデルも利用可能であり、且つ、一般的にヒト疾患モデルとして使用される（たとえば：Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ等，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，９２：３４３９−３４４３，１９９５参照）。候補薬剤は、これら動物モデルにおいて用いることにより、候補薬剤が炎症関連の１つ又は複数の症状を減少させるか否かを調査する。
【００４５】
候補薬剤については、ＭＤ２アンタゴニストとしての有効性を直接計測することによっても評価できる。たとえば、ＥＬＩＳＡはＭＤ２との結合の特性評価特徴付けに用いられ得る。ＭＤ２拮抗活性を特徴付けできる適合な方法は、本明細書に記載の実施例において更に説明する。
【００４６】
本発明の方法は予防的及び／又は治療的処置を提供できる。たとえば、ＨＭＧＢ１媒介性炎症の発展に先立って、ＭＤ２アンタゴニストを患者に投与できる。予防的投与は患者の以降のＨＭＧＢ１媒介性炎症に罹患する可能性を効果的に減少させ、又はその後起こるＨＭＧＢ１媒介性炎症の重症度を効果的に低下させることができる。ＨＭＧＢ１媒介性炎症を発症するリスクの高い患者（例えばＨＭＧＢ１媒介性炎症の家族歴のある患者）に予防的処置を提供できる。
【００４７】
あるいは、本発明の化合物はＨＭＧＢ１媒介性炎症に罹患した患者に治療的に投与できる。このような方法で、炎症又は感染の発症後にＭＤ２アンタゴニストが投与される。治療的投与の一実施形態において、該化合物の投与はＨＭＧＢ１媒介性炎症を効果的に解消し、別の実施形態では、該化合物の投与はＨＭＧＢ１媒介性炎症の重篤度を低下させ又は罹患した患者の寿命を延ばすのに有効である。
【００４８】
本発明の方法は必要とする患者にＭＤ２アンタゴニストを投与するステップを含む。該患者は好ましくは哺乳動物、例えば飼いならされた家畜（例えば牛、馬、豚）又はペット（例えば犬、猫）である。より好ましくは、患者はヒトである。患者がＨＭＧＢ１媒介性炎症に罹患しているように見える場合は、必要により特徴付けできる。いくつかの実施形態において、診断により、患者がＨＭＧＢ１媒介性炎症に罹患しているようであると判断できる。
【００４９】
ＭＤ２アンタゴニストを投与することによりＨＭＧＢｌ媒介性炎症を治療する時、１種又は複数種のほかの化合物を投与することも炎症又は炎症の病因の治療に有用である。たとえば、感染による炎症を治療する場合は、抗ウイルス剤又は抗菌剤等の抗微生物剤を患者に併用できる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、抗ウイルス剤も患者に投与される。選択される抗ウイルス剤は特定のウイルスや患者の症状の重篤度に応じて異なる。抗ウイルス剤の例として、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリジェン、アルビドール、アタザナビル、アトプリプラ、バラビア、ボセプレビルト、シドフォビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドキサジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、ファムシクロビル、ホミビルセン、フォサプレナビル、フォスカネット、フォスフォネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモッド、インジナビル、イノシン、インターフェロンＩ−ＩＩＩ型、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロック、モロキシジン、メシザゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、オセルタミビル（タミフル）、ペグインターフェロンｏｃ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、ＰＦ−４２９２４２、プレコナリル、ポドフィロトキシン、ラルテグラビル、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピリミジン（pyramidine）、サキナビル、ソフォスビル、スタビジン、ティーツリー油、テラプレビル、テノフォビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロンタジン、ツルバダ、ｔｒａｐｏｒｖｅｄ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビリビコフ、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ）及びジドブジンが含まれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、患者に抗菌剤が併用できる。選択される抗菌剤は特定の細菌や患者の病症の重篤度に応じて異なる。抗菌剤の例として、キノロン類薬物、例えばシプロフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、メトキシフロキサシン、ペフロキサシン、ノルフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン；ペニシリン類、例えばクロキサシリン、ベンジルペニシリン及びフェノキシメチルペニシリン；アミノグリコシド、例えばエリスロマイシン及びそのほかのマクロライド；及び抗結核薬、例えばリファンピシン及びリファペンチンが含まれる。
投与及び製剤
【００５２】
前記１種又は複数種の化合物（たとえば、ＭＤ２アンタゴニスト）は薬学的に許容可能な塩として投与できる。薬学的に許容可能な塩は、化合物の比較的非毒性の、無機及び有機酸の付加塩を指す。これら塩は、化合物の最後の分離・精製過程において、in situ製造、又は、精製した化合物と適切な対イオンを反応させ（該化合物の性質に依存する）、次に形成された塩を分離して製造することができる。対イオンの代表として、塩素イオン、臭素イオン、硝酸イオン、硫酸イオン、トシル酸イオン、リン酸イオン、酒石酸イオン、エチレンジアミン及びマレイン酸塩等が含まれる。（たとえば、Ｈａｙｎｅｓ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，９４：２１１１−  ２１２０，２００５参照）。
【００５３】
本発明の医薬組成物は、ＭＤ２アンタゴニストと、当業者に公知の様々な希釈剤又は賦形剤を含む１種又は複数種の薬学的に許容可能な患者への送達用の担体とを含む。たとえば、腸管外投与の場合は、等張性生理食塩水が好ましい。局所投与の場合は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の担体を含むクリーム、又は、局所クリームにペプチドの活性を遮断又は抑制しない典型的なほかの薬剤を使用できる。その適切な担体は、アルコール、リン酸塩緩衝液、及びほかの平衡塩溶液が含まれるが、これらに制限されない。
【００５４】
便宜上、製剤は、都合よい単位投与用投薬製剤形態として、且つ、薬学分野で周知の任意の方法によって製造できる。好ましくは、このような方法は、活性剤と１種又は複数種の補助成分を構成する担体とを結合するステップを含む。一般的には、製剤は活性剤と、液体担体、微細に分散させた固体担体又は両方とを均一且つ密接に結合させて製造されるものであり、次に、必要に応じて、それを所望した製剤に成形する。本発明の方法は、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくは人間に所望効果を奏する量の本発明の組成物を投与するステップを含む。ＭＤ２アンタゴニストは単回投与しても複数回投与してもよい。ＭＤ２アンタゴニストの有用な用量は動物モデルでのインビトロ活性及びインビボ活性を比較することによって決定できる。マウス及びほかの動物の有効用量に基づいて人間の有効用量を推定する外挿方法は本分野で公知することである（たとえば米国特許Ｎｏ．  ４９３８９４９参照）。
【００５５】
ＭＤ２アンタゴニストは、好ましくは、医薬組成物に製剤されて、次に本発明の方法によって、選択された投与経路に適した各種形式で対象（患者）に投与する。製剤は、経口、吸入、直腸、膣、局所、経鼻、眼又は腸管外（皮下、筋肉内、腹腔内及び静脈内投与）投与に適合した製剤を含むが、これらに制限されない。
【００５６】
経口投与に適合した本発明の製剤は、錠剤、トローチ、カプセル、ロゼンジ、ウェハ又はカシェのような個別の単位として投与してもよく、いずれも所定量の活性剤を含む。活性剤は、粉末又は粒子、又は活性化合物を含有する脂質体、又は水性液体又は非水性液体溶解した溶液又は懸濁液（例えばシロップ、エリキシル、エマルジョン、ドラフト）としてもよい。このような組成物及び製剤は、典型的に少なくとも約０．１ｗｔ％の活性剤を含有する。ＭＤ２アンタゴニストの量は、患者において所望の結果を達成させるのに有効である計測量である。
【００５７】
吸入製剤は、吸入器装置から投与するために設計される製剤である。吸入又は注入組成物は、薬学的に許容可能な溶液と懸濁液、水性又は有機溶剤、その混合物、エアロゾル及び粉末を含む。好ましくは、組成物は局所的または全身的効果のために、経口または鼻の呼吸経路によって投与される。好ましくは薬学的に許容可能な溶媒における組成物は不活性ガスを用いて噴霧できる。溶液、懸濁液又は粉末組成物は、好ましくは製剤を送達する装置から、適切な方式により経口又は経鼻投与する。経鼻スプレー製剤には、活性剤と防腐剤、等張剤との精製水溶液が含まれる。こうした製剤は好ましくは鼻粘膜に適合したｐＨと等張性の状態に調整される。
【００５８】
直腸又は膣投与製剤は、カカオバター又は硬化脂肪又は硬化脂肪カルボン酸のような適切な担体を含む座薬として提供され得る。眼科用製剤は、ｐＨと等張性因子が好ましくは眼球に適合するように調整される以外、鼻スプレーと同様の方法によって製造される。局所製剤は、鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール又は局所薬物製剤用のほかの基剤等の１種又は複数種の媒体に溶解又は懸濁した活性剤を含む。
【００５９】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤等にも、結合剤、例えばトラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン；賦形剤、例えば第二リン酸カルシウム；崩壊剤、例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム；及び天然又は人工香味料から選ばれた１種又は複数種を含む。単位投与用剤型がカプセル剤である場合、液体担体、例えば植物油又はポリエチレングリコールを更に含んでもよい。各種のほかの材料は被覆物として存在してもよく、又は、ほかの方式で固体単位投与用剤型の物理的形態を変化してもよい。たとえば、錠剤、丸剤又はカプセル剤にはゼラチン、ワックス、ジェラック、砂糖等がコーティングされることができる。シロップ又はエリキシルは１種又は複数種の甘い味剤、防腐剤（例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン）、糖の結晶化を遅延させる薬剤、ほかの成分の溶解性を高める薬剤（例えばグリセリン又はソルビトールのようなポリオール、染料及び香味剤）を含む。任意の単位投与用剤型を製造するための材料は使用量下で実質的に無毒である。ＭＤ２アンタゴニストは徐放性製剤や装置に組み込んでもよい。
【００６０】
以下の示例によって本発明を説明する。なお、特定の実施例、材料、量及びステップは本明細書に記載された発明の範囲と精神に基づいて理解すべきである。
実施例
実施例１：ＭＤ２はジスルフィドＨＭＧＢ１依存性ＴＬＲ４シグナル伝達の必須条件である
【００６１】
病原体及び損傷関連分子モード（ＰＡＭＰとＤＡＭＰ）の自然免疫受容体は感染と損傷に対する炎症性応答を調整する。活性化された免疫細胞から分泌される又は損傷細胞から受動的に放出されるＨＭＧＢ１は、その細胞外機能に顕著に影響を及ぼす酸化還元修飾を受けている。今まで、ＴＬＲ４シグナルソームがどのようにしてＨＭＧＢ１アイソフォームを区別するかは不明であった。骨髄性分化因子２（ＭＤ２）は、ＬＰＳと結合するための２つの逆方向平行βシートを折り畳んでなる疎水性ポケットを有し、ＬＰＳ相互作用及びＴＬＲ４シグナル伝達に分子特異性を付与する（Ｍｅｎｇ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２８５：８６９５−８７０２，２０１０）。従って、ＭＤ２が同様にそれぞれのＨＭＧＢ１アイソフォームを区別して、ＴＬＲ４依存性シグナル伝達を促進できると推定される。
【００６２】
ここで、細胞外ＴＬＲ４アダプターＭＤ２が、ほかのアイソフォームではなく、サイトカイン誘導性ＨＭＧＢ１ジスルフィドアイソフォームに特異的に結合することを示す。ＭＤ２欠損マウス及びマクロファージにおけるＭＤ２サイレンシングにより、ＨＭＧＢ１依存性ＴＬＲ４シグナル伝達の要件を明らかにした。ＨＭＧＢ１ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、本発明者らは、特異的ＭＤ２アンタゴニストとして、ＭＤ２／ＨＭＧＢ１相互作用とＴＬＲ４シグナル伝達を妨げる四量体（ＦＳＳＥ、Ｐ５７７９と命名）を見出す。Ｐ５７７９は、ＬＰＳ誘発性サイトカイン／ケモカインの発生を妨げず、それにより、ＰＡＭＰ媒介性ＴＬＲ４／ＭＤ２応答を保持できる。また、Ｐ５７７９はマウスを肝臓虚血／再灌流損傷、化学的中毒や敗血症から保護できる。これらの知見は、自然的システムが特異的ＨＭＧＢ１アイソフォームを選択的に識別する新しいメカニズムを明らかにしている。該結果は、ＤＡＭＰ媒介性炎症を軽減させるとともに抗微生物免疫応答を維持することを目的とする方法に直接的に応用できる。
結果及び検討
サイトカイン誘導性（ジスルフィド）ＨＭＧＢ１とＭＤ２の効果的な結合
【００６３】
ＨＭＧＢｌは、三種類の酸化還元感受性システイン残基を有して、それらが酸化還元反応により修飾され、細胞外で発現するか又はケモカイン又はサイトカイン活性を欠く複数種のＨＭＧＢｌアイソフォームに形成する。その基本的な分子機構を解明するために、ＭＤ２（ＴＬＲ４シグナルソームの細胞外アダプター受容体）がそれぞれ炎症特性を有する各種ＨＭＧＢ１アイソフォームを識別できるかどうかを検討した。水銀チオレート又は還元剤のジチオスレイトールに暴露することによって点突然変異又は化学修飾を発生させることで、それぞれ形式のＨＭＧＢ１を形成して、これらのＭＤ２結合特性を計測した。以前の報道（Ｖｅｎｅｒｅａｕ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０９：１５１９−１５２８  ，２０１２；  Ｙａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１８：２５０−２５９，２０１２）と同様に、ジスルフィドＨＭＧＢ１アイソフォームだけがＴＮＦ分泌を誘導する（図１Ａ）。バイオセンサーに基づく表面プラズモン共鳴分析（ＢＩＡｃｏｒｅ）により、ＭＤ２かＨＭＧＢｌがセンサチップに固定されているに関わらず（図１Ｂ）、ジスルフィドＨＭＧＢ１だけが高親和力でＭＤ２と結合する（見かけＫｄ＝１２ｎＭ）ことを証明する。それに対して、ＭＤ２欠失の場合は、ＢＩＡｃｏｒｅにおいてＭＤ２との結合についてＴＬＲ４がより活発であるものの、ＨＭＧＢｌはＴＬＲ４に直接結合できず（図１Ｂ）、それはＭＤ２はＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４シグナル伝達経路に不可欠なものであることを示す。ＨＭＧＢｌのジスルフィドアイソフォームと異なり、Ｈ２Ｓ修飾された完全還元又はスルホニルＨＭＧＢ１は、マクロファージ培養物ではＴＮＦリリース（図１Ａ）を誘導できず、ジスルフィドＨＭＧＢ１に比べて、ＭＤ２結合について１０００倍以上減少する（図１Ｂ）。特に、ジスルフィドＨＭＧＢ１のシステイン１０６が化学修飾された場合、ＴＮＦ刺激とＭＤ２結合の特性がなくなり、これから分かるように、メルカプトシステイン１０６はＨＭＧＢ１サイトカイン活性の調整において重要な役割を果たす（図１Ａ−Ｂ）。
【００６４】
更にＨＭＧＢ１−ＭＤ２相互作用を検討するために、免疫沈降分析法を用いて、ＨＭＧＢ１発現細胞溶解物からＭＤ２をプルダウンした。カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）標識のジスルフィドＨＭＧＢ１（ＣＢＰ標識単独ではない）と共培養して、ＭＤ２発現構築物でトランスフェクトされた酵母細胞からＭＤ２（図１Ｃ）をプルダウンし、それによって、ＭＤ２がジスルフィドＨＭＧＢ１に結合されることを確認した。また、この相互作用は、無関係なＩｇＧではなく、抗HMGB１モノクローナル抗体によってブロックされ、それは、ＨＭＧＢ１−ＭＤ２相互作用がアンタゴニストに対して特異的且つ標的であることを実証する（図１Ｄ）。
ＭＤ２はＨＭＧＢ１媒介性炎症反応に必要である
【００６５】
ＨＭＧＢ１媒介性サイトカイン誘導におけるＭＤ２の重要性をさらに評価するために、ｓｉＲＮＡを用いてマウスマクロファージ様ＲＡＷ  ２６４．７細胞又はヒト（ＴＨＰ−１）単球中のＭＤ２発現をノックダウンした。ＭＤ２発現のサイレンシング（８０−９０％）は、マウスマクロファージ及びヒト単球でのＨＭＧＢ１刺激媒介性ＮＦ−κΒ活性化とＴＮＦ放出の有意な低下を伴う（図２Ａ）。ＨＭＧＢ１誘導型自然免疫活性化におけるＭＤ２の必要性を確認するために、チオグリコール酸塩による腹膜マクロファージを野生型のＭＤ２遺伝子ノックアウト（ＫＯ）マウスから分離して、ジスルフィドＨＭＧＢ１により刺激した。ＭＤ２発現の破壊は、ＮＦ−κＢのＬＰＳ誘導及びＨＭＧＢ１誘導の活性化、サイトカイン（ＴＮＦとＩＬ−６）及びケモカイン（たとえば、ＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−１）分泌の完全な障害（図２Ｂ）を引き起こす。ＨＭＧＢ１により刺激されたＩＬ−１２／ｐ４０の放出は、おそらくその他の受容体を介したシグナル伝達に起因してＭＤ２非依存性メカニズムによるものである。
【００６６】
ＨＭＧＢ１は、アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発性肝中毒の重要なメディエーター（Ａｎｔｏｉｎｅ等，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ，５６：１０７０−１０７９，２０１２）である。ＨＭＧＢ１誘導炎症反応におけるＭＤ２のインビボ重要性を評価するために、本発明者らは、ＡＰＡＰ中毒モデルを用いて、ＭＤ２欠損による無菌性炎症への影響を検討した。肝壊死性損傷の肝臓酵素放出（ＧＬＤＨ、ＡＳＴ及びＡＬＴ）と組織学的分析によって評価されるように、ＡＰＡＰを注射した野生型（ＷＴ）マウス（図２Ｃ、矢印）に比べて、ＭＤ２発現の破壊は急性肝損傷の有意な減少をもたらす。また、ＭＤ２  ＫＯマウスの肝損傷軽減は、サイトカイン（ＴＮＦとＩＬ−６）放出及びＡＰＡＰ誘発による動物致死率の有意な低下を伴い、それにより、無菌性炎症及び損傷におけるＭＤ２の大切な役割が確認された（図２Ｃ）。特に、ＡＰＡＰを投与してから２４時間後、野生型マウスとＭＤ２  ＫＯマウスの血清ＨＭＧＢ１レベルは向上する（図２Ｃ）。ＨＭＧＢ１中和モノクローナル抗体を用いて、ＡＰＡＰ誘導による肝臓酵素（ＡＬＴ）と前炎症性サイトカイン（ＴＮＦとＩＬ−６）の放出を有意に阻害するとともに生存率（図３）を向上させるというＡＰＡＰ誘導性肝中毒におけるＨＭＧＢｌの中心的な役割は更に確認された。要するに、これらインビボ実験のデータはＭＤ２とＨＭＧＢ１の無菌性損傷の発症メカニズムにおける重要な役割を示す。
ＨＭＧＢ１特異的阻害剤としての新規ＭＤ２結合ペプチドの開発
【００６７】
ＨＭＧＢ１のシステイン１０６領域のＨＭＧＢ１／ＭＤ２相互作用とＨＭＧＢ１／ＴＬＲ４シグナル伝達における重要な関与作用が認められたため、合理的な方法によって、模倣ペプチド阻害剤をスクリーニングした。ＢＩＡｃｏｒｅ技術及び分子ドッキング技術によって、ＭＤ２結合特性について、システイン１０６領域に渡るシステイン同族体を組み込んだ一連の三量体と四量体ペプチドをスクリーニングした（図４Ａ、Ｃ−Ｄ）。大部分のペプチドはＭＤ２結合能力を欠いていたが、本発明者らは、有効なＨＭＧＢ１特異的阻害剤として作用するＨＭＧＢ１  Ｂ  ｂｏｘドメイン内の１つのエピトープを同定した。分子ドッキングシミュレートから示されるように、ＦＳＳＥ（Ｐ５７７９）四量体はＭＤ２の疎水性ポケットに完全に伸びており、周囲の疎水性残基との最大ファンデルワールス相互作用とともにＴｙｒ１０２との付加的な水素結合（図４Ｄ）を形成する。その結果、０．６５μΜのＫｄ値でＭＤ２に結合し、且つヒトマクロファージからのＨＭＧＢ１誘導性ＴＮＦの放出を有意に抑制した（図４Ａ−Ｂ）。この相互作用について、Ｐ５７７９がＭＤ２の非存在下でほかのタンパク質（ＨＭＧＢ１とＴＬＲ４）に結合できないので、特異的である（図４Ｃ）。同様に、ＢＩＡｃｏｒｅ実験（図４Ｃ）及び分子ドッキング分析（図４Ｄ）では、Ｐ５７７９のアミノ酸配列をスクランブリングさせたもの（対照ペプチド）はＭＤ２結合能力を失わせた。
【００６８】
ＭＤ２結合ペプチドの治療可能性を評価するために、Ｐ５７７９がＭＤ２／ＨＭＧＢ１相互作用をブロックすることによって、ＨＭＧＢ１誘導型サイトカインの生産を阻害できるかどうかを検討した。ＭＤ２又はＨＭＧＢ１がＢＩＡｃｏｒｅセンサチップに塗布された場合は、Ｐ５７７９は濃度依存的にＭＤ２／ＨＭＧＢ１相互作用を抑制した（図５Ａ）。また、Ｐ５７７９は濃度依存的に初代ヒトマクロファージ中のＨＭＧＢ１誘導型ＴＮＦの放出を抑制した（図５Ｂ）。１μｇ／ｍＬのＨＭＧＢ１が存在する条件下で、５０％のＴＮＦ放出を抑制するＰ５７７９有効濃度（ＩＣ５０）は約５μｇ／ｍＬである。Ｐ５７７９のアミノ酸配列をスクランブリングすると、ＨＭＧＢ１誘導型ＴＮＦの放出を抑制する能力が無効になった（図５Ｂ）。マクロファージのＰ５７７９への暴露は、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、Ｓ１００Ａ１２、ＬＰＳ、ＰＧＮ及びＣｐＧ  ＤＮＡによって媒介されるＴＮＦ放出を抑制しなかった（図５Ｂ）。Ｐ５７７９はさらに、ほかのサイトカイン（ＩＬ−６とＩＬ−１２ｐ４０／ｐ７０を含む）及びケモカイン（例えばＲＡＮＴＥＳとＭＣＰ−１）のＨＭＧＢ１誘導型放出を有意に減少させる（図５Ｃ）。Ｐ５７７９は、マクロファージ中のＬＰＳ刺激型サイトカイン／ケモカインのインビトロ放出を抑制せず（図５Ｄ）、さらにマウスに高用量（８ｍｇ／ｋｇ）で投与した場合もＬＰＳ誘導型全身性サイトカインのインビボレベルを減弱させなかった（図５Ｅ）。従って、Ｐ５７７９は、ＰＡＭＰｓに応答したマクロファージ活性化を阻害することなく、ＨＭＧＢ１−ＭＤ２−ＴＬＲ４シグナル伝達を選択的に減弱させる。
ＭＤ２標的Ｐ５７７９によるアセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）中毒、虚血及び敗血症の治療効果
【００６９】
ＡＰＡＰ誘導型肝中毒モデルでは、Ｐ５７７９は肝血清酵素（ＡＳＴ、ＡＬＴ）、前炎症性サイトカイン（ＴＮＦ）及び肝壊死のＡＰＡＰ誘導型上昇を用量依存的に低下させるとともに、生存率を向上させた（図６Ａ、矢印）。肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）により媒介される無菌性損傷でも、Ｐ５７７９は肝血清酵素放出（ＡＳＴ、ＡＬＴ）及び好中球浸潤を有意に減弱させた（図６Ｂ、矢印）。また、盲腸結紮や穿刺（ＣＬＰ）により誘発された敗血症モデルでは、対照としてスクランブルされたペプチド処理に比べて、Ｐ５７７９による処置は、有意且つ用量依存的に生存率を向上させた（図６Ｃ）。重要なことは、既知のＨＭＧＢ１による敗血症後遺症に対する遅延病原性の役割と一致するように、Ｐ５７７９は腹膜炎の発症２４時間後に投与しても有効である。要するに、これら結果から明らかなように、Ｐ５７７９はジスルフィドＨＭＧＢ１とＭＤ２の結合をブロックすることにより、ＨＭＧＢ１媒介性臓器不全及び死亡を減弱させる。
【００７０】
これら結果は、ＨＭＧＢ１アイソフォーム識別可能なＭＤ２により、ＨＭＧＢ１に対する自然免疫細胞選択的な識別の新規なメカニズムを明らかにする。ＨＭＧＢ１ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、自然免疫細胞中のＭＤ２／ＬＰＳ／ＴＬＲ４シグナル伝達を損なうことなくＭＤ２−ＨＭＧＢ１相互作用を特異的に遮断する新規四量体ペプチド（ＦＳＳＥ、Ｐ５７７９）を見出した。このペプチドは、無菌性損傷による炎症性疾患に罹患した動物モデルを保護するだけでなく、致命的感染チャレンジ後にも保護を与え、それにより、ＰＡＭＰ誘発自然免疫を抑制することなくＤＡＭＰ媒介性阻害性炎症反応を減弱させる新規治療ストラテジを開発する可能性を開拓した。
【００７１】
ＭＤ２は、ＬＰＳと結合するための大きな疎水性ポケットを形成する２つの逆平行βシートからなるβカップ折り畳み構造を有する。推定されたＭＤ２とＨＭＧＢ１（１２ｎＭ）の結合親和力は、ＭＤ２とＬＰＳ（６５ｎｍ）との結合親和力に相当する（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５（１０）：６４６５−７２，２００５）。ＭＤ２におけるジスルフィドＨＭＧＢ１との結合部位を明らかにするために、さらなる構造分析が必要である。
【００７２】
ＨＭＧＢ１中和抗体は、無菌性損傷を予防することができ（Ｔｓｕｎｇ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１：１１３５−１１４３，２００５）、また、ＨＭＧＢ１放出及びその細胞外活性を抑制できる薬剤（Ｗａｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：２４８−２５１，１９９９）であり、敗血症から保護できる。敗血症の初期段階において、ＰＡＭＰ媒介性炎症反応は宿主防御に不可欠なことである。後期段階においては、ＤＡＭＰ放出はサイトカインストームと器官機能不全を深刻にする（Ｗａｎｇ等，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１８：２５７−２６８，２０１４）。この考え方は、敗血症の末期では、初期感染が終了してもＨＭＧＢ１レベルが持続的に上昇するという最近の検討結果によって裏付けられ、この考え方も敗血症の長期病理学的結果に繋がるを解釈できる（Ｖａｌｄｅｓ−Ｆｅｒｒｅｒ等，Ｓｈｏｃｋ，４０：４９２−４９５，２０１３）。微生物誘発敗血症は、無菌性損傷による全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）と臨床的に区別できない（Ｓｕｒｓａｌ等，Ｓｈｏｃｋ，３９：５５−６２，２０１３）。ＴＬＲ４／ＭＤ２がジスルフィドＨＭＧＢ１の相互に排他的なシグナル伝達受容体複合体として作用するという知見に基づいて、ＰＡＭＰ媒介性シグナル伝達を保存すると同時に、ＤＡＭＰ媒介性炎症反応を選択的に弱めるストラテジを開発することが可能になる。
【００７３】
大量の証拠により、微生物感染に抵抗するための早期ＰＡＭＰ媒介性天然免疫応答を残す必要があることをサポートする。たとえば、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスにおける欠陥のあるＴＬＲ４シグナル伝達は、感染動物モデルの疾患の重症化度及び死亡率の増加に繋がる（Ｋｈａｎｏｌｋａｒ等，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，８３：８９４６−８９５６，２００９）。ＬＰＳは、ＴＬＲ４によってマクロファージの貪食活性を強化させ、骨髄細胞おけるＴＬＲ４の選択的欠失はＣＬＰモデルにおける細菌クリアランスを損なう（Ｄｅｎｇ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９０：５１５２−５１６０，２０１３）。これら知見は、生理学的防御免疫応答を保存しながら、媒介性炎症を選択的に弱める治療アプローチの重要性を強調している。ＰＡＭＰ誘発炎症応答ではなくＤＡＭＰ誘発炎症応答に対するＭＤ２標的選択的阻害剤としてのＰ５７７９の発見は、そのような新規治療ツールを提供する。
材料及び方法
【００７４】
薬剤
ヒトＴＬＲ４／ＭＤ２複合体、ヒトＭＤ２、ＴＬＲ２及び可溶性ＲＡＧＥはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。リポ多糖類（ＬＰＳ，Ｅ．  ｃｏｌｉ．  ０１１１  ：Ｂ４）、アセトアミノフェン、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、枯草菌由来のペプチドグリカン、ブラストサイジンＳ．，ＮａＳＨ、マウスＩｇＧ及びヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）のいずれもＳｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。タンパク質Ａ／Ｇアガロース及びイソプロピル−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）はＰｉｅｒｃｅ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）製である。ＮＨＳ活性化セファロース４高速フロービーズはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｃａｔ  ＃１７−０９０６−０１，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から入手した。チオグリコール酸塩培地はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社（Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）から購入した。超純ＬＰＳ（Ｃａｔ  ＃  ｔｌｒｌ−ｐｅｌｐｓ）、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ）及びＢタイプのＣｐＧオリゴヌクレオチドはＩｎＶｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手した。ヒトＳ１００  Ａ１２はＣｉｒｃｕｌｅｘ社（Ｂａｎｇｋｏｋ，Ｔｈａｉｌａｎｄ）から入手した。抗ヒト及びマウスＭＤ２抗体はＩｍｇｅｎｅｘ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。抗ＣＢＰ標識抗体はＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手した。抗ｐ５０抗体（Ｅ３８１）と抗ｐ６５抗体（ｓｃ−３７２）のそれぞれはＥｐｉｔｏｍｉｃｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （Ｄａｌｌａｓ，Ｔｅｘａｓ）から入手した。ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）製のカラーエンドポイントアッセイキットを用いて血清ＡＬＴとＡＳＴのレベルを測定する。
【００７５】
ＨＭＧＢ１タンパク質、抗体及びペプチドの製造
前記したとおり、組換えＨＭＧＢ１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させて同質性になるまで精製した（Ｌｉ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９：２１１−２２３，２００４）。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって特徴付けを行ったところ、このようなサイトカインを誘起するＨＭＧＢ１は、システイン２３と４５の間にジスルフィド結合を有し、さらにシステイン１０６上のメルカプトが無くなった（Ｙａｎｇ等，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，１８：２５０−２５９，２０１２）。水銀チオレートをシステイン１０６に合成形成することにより、酸化還元修飾されたＨＭＧＢ１（Ｈｇ−ＨＭＧＢ１）を化学合成し、Ｓ−硫黄水和化（Ｈ２Ｓ）によりシステインメルカプト（−ＳＨ）基を−ＳＳＨに変換するか、又はシステイン１０６の突然変異によりそれをアラニン（Ｃ１０６Ａ  ＨＭＧＢ１）に変換した（Ｙａｎｇ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０７：１１９４２−１１９４７，２０１０）。ＨＭＧＢ１とＮａＳＨ（５ｍＭ）を室温で３時間共培養して、Ｈ２Ｓで修飾されたシステインを有するＨＭＧＢ１を生産した。酸化された又はＤＴＴ還元されたＨＭＧＢ１の製造は前記のものと同様である（Ｙａｎｇ等，２０１２）。発色リムルスアメーバサイトライセート試薬を用いてＨＭＧＢ１中のＬＰＳ含有量を測定した（Ｌｏｎｚａ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）。前記したとおり、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４でＨＭＧＢ１を抽出して、任意の汚染ＬＰＳを除去した（Ｌｉ等，２００４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、クマシーブルー染色によりすべての組換えタンパク質の純度と完全性を検証したところ、純度は一般的に８５％より高かった。リムルスアッセイにより測定したところ、すべてのＨＭＧＢ１タンパク質製剤において、ＬＰＳ含有量は検出できないか、又は、１０ｐｇ／ｍｇタンパク質未満である。以前に報道したように、抗HMGB１モノクローナル抗体（２ｇ７）が生成された（Ｑｉｎ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０３：  １６３７−１６４２，２００６）。三量体ペプチド又は四量体ペプチド（ＦＳＳＥ、ＦＳＳＥＹ、ＦＥＥＥ、ＦＥＥＤ、ＳＳＥ、ＳＦＳＥ）及びカルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）は全てＧｅｎｅＭｅｄ株式会社（Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ）からカスタマイズされるものである。高速液体クロマトグラフィーＨＰＬＣによって、ペプチドは純度９０％になるまで精製されたことが確認された。リムルスアッセイによって測定したところ、合成ペプチド製剤におけるＥｎｄｏｔｏｘｉｎが検出できなかった。これらペプチドは、まずＤＭＳＯに溶解して、次に生産者の取扱い書に従ってＰＢＳで希釈し、また、使用直前に新しく調製した。ｍｉｎｉ−ｐｒｏｔｅａｎ  Ｔｒｉｓ−ＴｒｉｃｉｎｅゲルはＢｉｏＲａｄ実験室（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から入手した。
【００７６】
細胞分離及び培養
前記のとおり、チオグリコール酸塩により誘発された腹腔マクロファージは、２ｍｌの無菌４％チオグリコール酸塩ブロスを腹腔内に注射したマウス（Ｃ５７ＢＬ／６又は遺伝子ノックアウト、雄、１０−１２週齢）から得た（Ｙａｎｇ等，２０１０）。マウスマクロファージ様ＲＡＷ  ２６４．７（ＴＩＢ−７１）とヒト白血病単球ＴＨＰ−１（ＴＩＢ−２０２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。以前に報道したように、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離法によって、正常個体によって供与された血液からヒト初代単球（Ｙａｎｇ等、２０１０）を精製した。ＨＭＧＢ１（１μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ４アゴニストＬＰＳ（４ｎｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ３アゴニストｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ（５０μｇ／ｍｌ）、ＴＬＲ２アゴニストペプチドグリカン（ＰＧＮ）（５μｇ／ｍｌ）、ＲＡＧＥアゴニストＳ１００Ａ１２（５０μｇ／ｍｌ）及びＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ−ＤＮＡ（１μΜ）で９６ウェルプレートにおけるヒト初代マクロファージを刺激し、指示されたように、Ｐ５７７９（又はスクランブル対照ペプチド）の使用量を１６時間かけて徐々に増加した。ＥＬＩＳＡ法によりＴＮＦ放出を測定した。
【００７７】
免疫沈降分析
カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）標識の組換えマウスＨＭＧＢ１又はＣＢＰペプチド単独（１０μＧ）と、ヒトＭＤ２上澄み液（５０μｌ、カルモジュリンビーズで予備洗浄）とを４℃で穏やかに振とうしながら、一晩培養した。ヒトＭＤ２上澄み液はヒトＭＤ２でトランスフェクトしたｓｆ９昆虫細胞（Ｔｅｇｈａｎｅｍｔ等，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２８３：２１８８１−２１８８９，２００８）から得た。リムルスアッセイによって測定したところ、ＨＭＧＢｌとＭＤ２の上澄み液は全て検出不能な量のＬＰＳを含む。次に、ＣＢＰ−ＨＭＧＢ  １混合物又はＣＢＰとＭＤ２との混合物をカルモジュリンビーズ（３０μｌ排出ビーズ（ｄｒａｉｎｅｄ  ｂｅａｄｓ））とともに４℃で１時間培養した。ＰＢＳ含有０．１％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００で強く洗浄した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ実験法により抗ヒトＭＤ２又は抗ＣＢＰ抗体をプローブとして、ビーズに結合したタンパク質を分析した。
【００７８】
サイトカイン及びＮＦ−κΒの測定
ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ社，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、細胞培養液又はマウス血清中のＴＮＦとＩＬ−６の放出レベルを測定した。ＥＬＩＳＡキットを用いて血清ＨＭＧＢ１レベル（ＩＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｈａｍｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を測定した。マウス又はヒトサイトカインアレイＣＩ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）を用いて、生産者の指示に従って、チオグリコール酸塩によるマウス腹膜マクロファージ又は初代ヒトマクロファージのサイトカイン発現プロファイルを測定した。同時に、２２種類のサイトカイン又はケモカインを測定した。Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法によって、核断片中のｐ５０とｐ６５の発現を検出することによってＮＦ−κΒ活性化を分析した。βアクチンの発現もサンプル等量添加対照として測定された。Ｓｉｌｖｅｒイメージスキャナー（Ｓｉｌｖｅｒ−ｓｃａｎｎｅｒ  ＩＩ、Ｌａｃｉｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）でＷｅｓｔｅｒｎブロットを走査して、ＩｍａｇｅＪソフトウェア  （ｖｌ．５９，国立衛生研究）によって相対バンド強度を定量化し、βアクチンに対応した量との比として表示した。
【００７９】
表面プラズモン共鳴分析
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を用いてリアルタイム結合相互作用を検討した。ＨＭＧＢ１−ＭＤ２結合分析のために、ヒトＭＤ２をＣＭ５シリーズチップ（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に固定した。参照物として１つのフローセルを１Ｍエタノールアミン（ｐＨ  ８．５）で活性化させた直後にブロックした。２５℃で、１０μＬ／ｍｉｎの流速でサンプルフローセルにジスルフィドＨＭＧＢ１（又はアイソフォーム）（１０ｍＭの酢酸塩緩衝液、ｐＨ５．２中）を７分間かけて注射した。濃度を増加していくジスルフィドＨＭＧＢ１又はＨＭＧＢ１アイソフォーム（Ｃ１０６Ａ、スルホニル基、完全に還元、水銀又はＨ２Ｓ修飾ＨＭＧＢ１、１μΜ）を固定されたＭＤ２に流させた。それに対して、ＨＭＧＢ１をチップに塗布して、各種量のＭＤ２を分析物として添加した。Ｄ．  Ｇｏｌｅｎｂｏｃｋ博士（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）及びＴｉｍｏｔｈｙ  Ｂｉｌｌｉａｒ博士（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からの２種の別のヒトＭＤ２タンパク質を用いて結果を確認した。ＴＬＲ４−ＨＭＧＢ１結合実験については、ヒトＴＬＲ４をチップにコーティングしてジスルフィドＨＭＧＢ１（１００ｎＭ）を分析物として添加した。ペプチドのスクリーニング実験については、ヒトＭＤ２をセンサチップに塗布して、各種のオリゴペプチド（ＦＳＳＥ（配列番号：１）、ＦＳＳＥＹ（配列番号：２）、ＦＥＥＥ（配列番号：３）、ＦＥＥＤ（配列番号：４）、ＳＳＥ、ＳＦＳＥ（配列番号：５）、１００ｎＭ）を分析物として添加した。分離時間は２分間に設定し、次に、１０ｎＭ水酸化ナトリウム溶液を用いて１分間再生した。ＢＩＡｃｏｒｅ評定ソフトウェアを用いてＫｄを評定した。ＨＭＧＢ１抗体によりＭＤ２−ＨＭＧＢ１相互作用をブロックする実験では、ヒトＭＤ２をチップに塗布して分析物としてＨＭＧＢ  １（１００ｎＭ）を添加するとともに、ＨＭＧＢ１  ｍＡｂ又は対照ＩｇＧの量を増加させ、応答単位を記録した。
【００８０】
ＭＤ２とペプチドの分子ドッキング
前記したとおり、タンパク質データベース（ＰＤＢ、コード：３ＶＱ２）からＭＤ２／ＴＬＲ４の結晶構造を取得し、ＭＯＥソフトウェアを用いて分子ドッキングを行った（Ｚａｎ等，Ｍｏｌ  Ｓｉｍ，６：４９８−５０８，２０１２）。分子可視化システムＰｙｍｏｌ  ０．９９によって三次元グラフを構築した。
【００８１】
ｓｉＲＮＡによるＲＡＷ  ２６４．７とＴＨＰ−１細胞中のＭＤ２のノックダウン
ＲＡＷ  ２６４．７細胞中のＭＤ２ノックダウンについては、トランスフェクト試薬ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ１（５０ｎＭ、名称：ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｐｌｕｓ  ｓｍａｒｔ  ｐｏｏｌ、原産地：Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、生産者：Ｌａｆａｙｅｔｔ、ＣＯ）を用いて、細胞にマウスＭＤ２又は対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ＴＨＰ−１細胞中のＭＤ２をノックダウンするために、ＭＤ２に対する特異的ｓｉＲＮＡのトランスフェクトはＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットによって行った。トランスフェクトの４８時間後、抗ＭＤ２抗体を用いて、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングによりノックダウン効果を確認した。トランスフェクト後の４８時間から、ＨＭＧＢ  １（１μｇ／ｍｌ）で細胞を１６時間連続刺激した。細胞溶解物と上澄み液を収集して、収集した細胞溶解物と上澄み液についてＷｅｓｔｅｒｎブロッティング又はＥＬＩＳＡ法によって検出した。ＮＥ−ＰＥＲタンパク質抽出キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈｕｄｓｏｎ、ＮＨ）を用いて、ＲＡＷ  ２６４．７、ＴＨＰ−１又はＭＤ２遺伝子ノックアウトマウスからの初代マウスマクロファージに対してＮＦ−κＢ測定を行った。
【００８２】
動物
Ｊａｃｋｓｏｎ実験室（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを得た。ＭＤ２遺伝子ノックアウト（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）マウスをＲｉｋｅｎ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（茨城、日本）から購入した。全ての動物は、標準温度と光照サイクル条件下でＦｅｉｎｓｔｅｉｎ医学研究所又はピッツバーグ大学で置かれており、且つすべての動物についての操作ステップは動物実験委員会ＩＡＣＵＣ  （ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【００８３】
ＭＤ２  ＫＯマウスの尾スニップからの遺伝子タイピング
ＰＣＲプライマーはＲｉｋｅｎ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにより設計されてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。同一プライマーで遺伝子タイピングのうちの野生型（ＰＣＲ産物＝２０００ｂｐ）の識別とＭＤ２遺伝子のノックアウト（ＰＣＲ産物＝８００ｂｐ）を行う。
【００８４】
ネズミ肝臓温虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）については、前記７０％温肝臓Ｉ／Ｒモデル（Ｔｓｕｎｇ等，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１：１１３５−１１４３，２００５）の実施と同様である。手術際に、マウスにＰ５７７９（５００μｇ／匹）又は媒体を腹腔内注射して、以降の６時間後に安楽死させた。心穿刺によって全血を採血して、肝臓を採取し、分析のために１０％ホルマリンに固定した。
【００８５】
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）については、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、８−１２週齢）に前記ＣＬＰステップを実施した（Ｙａｎｇ等，２００４）。ＣＬＰ手術の２４時間後から、５０又は５００μｇ／匹の量でＰ５７７９又はスクランブル対照ペプチドを腹腔内注射するように、１日に１回処置を行い、４日間持続した。生存率を２週間モニターした。
【００８６】
アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）肝中毒モデルについては、３組の実験を行った。全ての実験において、マウスを一般的に絶食させて一晩放置し、ＡＰＡＰ（生存率検討の場合は３５０ｍｇ／ｋｇ、血清測定の場合は４００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内（ＩＰ）注射し、前記したように（Ａｎｔｏｉｎｅ等，Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ，５６：  １０７０−１０７９、２０１２）、ＡＰＡＰ注射２４時間後にマウスを安楽死させた。第一組の実験には、雄ＭＤ２  ＫＯ又はＣ５７／ＢＬ６マウス（８−１２週齢）を用いて行った。マウスにＡＰＡＰを注射して２４時間後に安楽死させ（血清測定の場合）又は２週間監視した（生存率検討の場合）。第二組の実験は野生型雄（Ｃ５７／ＢＬ６）マウスのＡＰＡＰモデルに抗ＨＭＧＢ１抗体を投与して行った。生存率実験では、マウスにＡＰＡＰを注射するとともに抗ＨＭＧＢ１抗体を投与した（５μｇ／匹、ＩＰ、１日に１回、４日間持続、ＡＰＡＰ注射２時間後から１日間置きに２つのさらなる用量を投与）。無関係な非免疫ＩｇＧを対照群とした。血清測定では、マウスにＡＰＡＰとともに抗HMGB１モノクローナル抗体を注射し（５μｇ／匹、ＡＰＡＰ注射後の２時間と７時間に腹腔内注射）、ＡＰＡＰ注射２４時間後に安楽死させた。第三組の実験はＰ５７７９の野生型マウスのＡＰＡＰモデルに対する効果を評定した。雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡＰＡＰを注射するとともに、Ｐ５７７９（５０又は５００μｇ／匹）又はスクランブル対照ペプチド（５００μｇ／マウス、ＡＰＡＰ注射後の２時間と７時間にｉ．ｐ．注射）を投与し、ＡＰＡＰ注射２４時間後に安楽死させた。生存率実験では、マウスにＡＰＡＰを注射するとともに、Ｐ５７７９又は対照ペプチド（５００μｇ／匹、ｉ．ｐ．、ＡＰＡＰ注射２時間後から１日に１回、５日間持続）による処置を実施し、生存率を２週間監視した。前記したとおり、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血清レベルによって肝中毒を測定した（Ａｎｔｏｉｎｅ等，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，５８：７７７−７８７，２０１３）。
【００８７】
組織評価
肝臓を採取して１０％ホルマリンに固定し、次にパラフィンに包埋した。ヘマトキシリンとエオシンで５−μΜの切片を染色した。肝臓のＨ＆Ｅ染色はＡＭＬ実験室（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で行われた。盲検法によって肝組織学を評定し、以前に報道した修飾方法で、壊死と炎症（細胞の腫脹、組織構造の喪失、鬱血）量に基づいて臨床スコアを計算した（Ｄｅｓｍｅｔ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３８：３８２−３８６，２００３）。０点＝３−４個の代表的な切片に壊死又は炎症の迹象はない；１点＝軽度の壊死又は炎症＜全検査面積の２５％、２点＝顕著な壊死と炎症（全面積の２５−５０％）；３＝重度の壊死と炎症（＞５０％面積）。
【００８８】
統計分析
別段の記載がない限り、データは平均値＋ＳＥＭとして示す。処置群間の差異はスチューデントｔ検定、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びそれに次ぐ最小有意差検定によって測定された。両側フィッシャーの正確確率計測によって、動物生存率検討における各群間の差異を測定した。サイトカインアレイの検討分析はＳｉｌｋ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｏｒｅｍ，Ｕｔａｈ）のＵＮ−Ｓｃａｎ−ｉｔソフトウェアを用いて行われた。ｐ値が０．０５より小さいと、統計的に有意であると考えられる。
実施例２：インフルエンザを標的とする自然免疫応答の新しいストラテジ
【００８９】
本発明者らは、ＴＬＲ４−／−マウスがマウス適合Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８）インフルエンザによる致死に対して不応性であり、逆には、ＴＬＲ４アンタゴニスト（Ｅｒｉｔｏｒａｎ）の治療的投与がＰＲ８による死亡と急性肺損傷（ＡＬＩ）をブロックしたことを報道した。本明細書において、抗ＴＬＲ４治療又はＴＬＲ２特異的ＩｇＧ治療も野生型（ＷＴ）マウスを致死的ＰＲ８感染から保護できること、ＰＲ８感染３時間前から、４日間持続して投与すると、ＥｒｉｔｏｒａｎはＷＴマウスとＴＬＲ４−／−マウスを死亡から保護できないことは、Ｅｒｉｔｏｒａｎがウイルスによって引き起こされた、保護に必要な非ＴＲＬ４シグナルをブロックする必要があることを示したこと、の知見を見出した。機械的には、（ｉ）ＥｒｉｔｏｒａｎはＨＭＧＢ１によって媒介された、ＴＬＲ４依存性インビトロシグナル伝達及びインビボで循環するＨＭＧＢ１をブロックし、且つ、ＨＭＧＢ１阻害剤はＰＲ８に対する保護を提供すること、（ｉｉ）ＥｒｉｔｏｒａｎはＡＬＩに関連する肺水腫を抑制すること、（ｉｉｉ）ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）治療による部分的な保護によって証明されるように、ＩＬ−ΙβはＰＲ８誘導型致死に有意に寄与することが考えられる。感染後の４日目からＥｒｉｔｏｒａｎとオセルタミビルを投与する場合は、ＰＲ８による致死から保護する効果を奏する。Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置は後続のＰＲ８チャレンジに対する適応性免疫応答を遮断できない。要するに、本発明者らのデータは、インフルエンザ感染に対する宿主標的治療アプローチを裏付けるものである。
結果
【００９０】
以前に報道したように、ＴＬＲ４−／−マウスがマウス適応インフルエンザＰＲ８（（Ｎｈｕ等，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２９−３９，２０１０）に対して不応性であり、ここでは、ＴＬＲ４−／−マウスが病原性マウス適応Ｈ１Ｎ１ウイルス株ｍａ．Ｃａ／０４に対しても不応性であることが証明された（Ｙｅ等，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．，６：ｅ１００１１４５，２０１０）。本発明者らは、ＴＬＲ４アンタゴニストＥｒｉｔｏｒａｎを用いてＰＲ８が感染されたＷＴマウスに対して治療的処置を行うことにより致死から有意的に保護を与えるとともにＡＬＩを阻害することを明示したことがあり、これら知見は、ｍａ．ｃａ／０４ウイルス株が感染されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて実証された。ＥｒｉｔｏｒａｎはさらにＰＲ８が感染されたＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する（データに示されていない）。最後に、感染後の４日目から、さらなる用量のＥｒｉｔｏｒａｎ（すなわち、１日に１回投与と１日に２回投与を比較）を投与しても、１日の単回投与による保護効果の向上に役立てない（データに示されていない）。要するに、これらデータは以前の観察、すなわち、Ｅｒｉｔｏｒａｎによるマウスへの治療的処置が、それぞれ感染条件下でより多くのインフルエンザウイルス株による致死から保護できることを強調している。以下の実験は、Ｅｒｉｔｏｒａｎ媒介性保護に対する機械論的な洞察力を提供し、さらに、Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置による影響を受けるインフルエンザ誘発性疾患に有用な新経路を識別するように設計された。
インフルエンザに起因する致死性とＥｒｉｔｏｒａｎによる保護の基盤となるシグナル伝達の要件の解明
【００９１】
Ｅｒｉｔｏｒａｎは、その共受容体ＭＤ２の深い疎水性ポケットに結合されることによって、ＴＬＲ４シグナル伝達をブロックし、さらにリガンドにより誘導された二量体化をブロックした（Ｋｉｍ等，Ｃｅｌｌ，１３０：９０６−９１７，２００７）。ＰＲ８誘導致死におけるＴＬＲ４の役割を確認するために、高度に特異的な抗ＴＬＲ４抗体でマウスを処置した（Ｒｏｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０６：２３４８−２３５２，２００９）（図７Ａ）。ＰＲ８のｉ．ｖ．により感染された後の２日目と４日目に、抗ＴＬＲ４  ＩｇＧ（アイソタイプマッチングする対照ＩｇＧ）を投与すると、マウスを致死性感染から保護し（図７Ｂ）、有意に向上している臨床スコアを取得した（ｐ＜０．００４、図７Ｃ）。この結果から、ＴＬＲ４シグナル伝達はインフルエンザによる致死と臨床症状のコアであることが明らかなになった。
【００９２】
ＴＬＲ４はＭｙＤ８８依存性とＴＲＩＦ依存性シグナル伝達経路を活性化させる唯一のＴＬＲである。Ｉｍａｉ等の中心的な結論の一つとしては、不活性化されたＨ５Ｎ１インフルエンザウイルス又は宿主から誘導された酸化リン脂（ＯｘＰＡＰＣ）により誘導されたＴＬＲ４媒介性ＡＬＩは完全にＴＲＩＦ依存性である。ただし、ＭｙＤ８８はインフルエンザに対する宿主応答に強く関与している（Ｔｅｉｊａｒｏ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８２：６８３４−４３，２００９）。ＩＲＡＫ４（ＭｙＤ８８に募集された第一酵素）はシグナル伝達を開始させて、ΙΚΚα／β／γ複合活性化、ΙκΒαリン酸化及び結局としてＮＦ−κΒ活性化を引き起こす。ＴＲＩＦ経路はＩＲＦ３活性化を駆動するとともにＮＦ−κΒ活性化の遅延を引き起こすが、この後者の経路はＩＲＡＫ４を介してＩＫＫ複合体を活性化させるものではない。インフルエンザに対する宿主応答とＥｒｉｔｏｒａｎの保護メカニズムの基盤となる（一本又は複数本）下流経路を説明するために、ＰＲ８致死性とＥｒｉｔｏｒａｎのＩＲＡＫ４キナーゼデッドノックイン（ＩＲＡＫ４ＫＤＫＤＩ）マウスにおける効果を評価した。ＴＲＩＦ−／−マウスに比べて、このようなマウスはＭｙＤ８８依存性シグナル伝達をブロックしたＩＲＡＫ４の触媒的に不活性な形態を有する。ＩＲＡＫ４ＫＤＫＩマウスは、野生型マウスよりも僅か遅延した平均死亡時間を示し、Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置では、ＷＴマウスの９０％生存率に対して約６０％の生存率を有する（図８Ａ）。興味深いことに、ＴＲＩＦ−／−マウスは、ＷＴマウス又はＩＲＡＫ４ＫＤＫＩマウス（５０％生存率）よりもＰＲ８感染に対して抵抗性がより高いものの、ＴＬＲ４−／−マウスのように不応性ではなかった（Ｎｈｕ等，Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎ．，１８：１９３−２０３，２０１２）。しかしながら、Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置は生存率をＷＴレベルに有意に向上させた（ｐ＜０．００１；図８Ｂ）。ＶＩＰＥＲは１１個のアミノ酸を有するペプチドであり、ＴＲＩＦに結合されてＴＲＩＦ依存性シグナル伝達をブロックするように示されたワクシニアウイルスのＡ４６タンパク質から誘導された（Ｌｙｓａｋｏｖａ−Ｄｅｖｉｎｅ  等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８５：４２６１−７１，２０１０）。ＷＴマウスがＰＲ８に感染された後、細胞浸透ＶＩＰＥＲペプチド（９Ｒ−ＶＩＰＥＲ）又はＥｒｉｔｏｒａｎで治療的処置を行った結果、ＴＲＩＦ−／−マウスでの保護度と同様に、９Ｒ−ＶＩＰＥＲ処置は部分的な保護（約５０％）を発生させた（図８Ｂ）。要するに、ＭｙＤ８８依存性経路とＴＲＩＦ依存性経路は全てインフルエンザ媒介性疾患とＥｒｉｔｏｒａｎ誘導型保護に寄与する。
【００９３】
ＰＲ８誘発性致死について、ＷＴマウスよりもＴＬＲ２−／−マウスは感受性が高いことを報告した。しかしながら、ＷＴマウスと異なり、Ｅｒｉｔｏｒａｎ治療法はＴＬＲ２−／−マウスを保護することができなかった。従って、ＴＬＲ２はＥｒｉｔｏｒａｎの直接又は間接的なターゲットであると推定される。ＴＬＲ２のインフルエンザによる疾患における役割を確認するために、インビボでのシグナル伝達をブロックするＴＬＲ２（クローンＴ２．５）に対するモノクローナル抗体が使用された（Ｍｅｎｇ等，Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，１１３：１４７３−１４８１，２００４）。ＰＲ８感染の３時間前とＰＲ８感染後の１日目から、各群のマウスについて、一群を抗ＴＬＲ２抗体で処置し、一群をアイソタイプ対照抗体で処置し、残りの２群にはＰＲ８感染後の２日目と４日目に抗ＴＬＲ２抗体又は対照抗体を投与した（図９Ａ）。抗ＴＬＲ４  ＩｇＧが奏する保護効果（図７）と同様に、感染後の２日目と４日目に投与された場合は、抗ＴＬＲ２抗体によるＰＲ８感染ＷＴマウスに対する処置は、マウスを死亡から有意に保護し（ｐ＜０．００１；図９Ｂ）、それに対して、初期に投与された場合は、抗ＴＬＲ２処置は有効ではなかった。これら結果から明らかなように、ＴＬＲ２アゴニストは致死性に寄与するＰＲ８の感染後に発生する。
【００９４】
これら知見を拡張するために、ＷＴ、ＴＬＲ２−／−、ＴＬＲ４−／−及びＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスに致死量以下のＰＲ８を感染させて１４日間モニターした。ＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスは、ＷＴマウス又はシングルノックアウトマウスよりも感染させやすい（図８Ａ）。具体的には、ＡＬＩはＷＴマウスよりもＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスにおいて顕著に悪化し、実質および肺胞空間（好中球とリンパ球からなる）全体にわたって炎症性浸潤を示した（図１０Ｂ）。これら知見から明らかなように、ウイルス感染に、初期に誘導されたＴＬＲ２アゴニストはＴＬＲ４−／−マウスの致死性ＰＲ８感染に対する抵抗力にとって必要である。
Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置のタイミングは保護にとって大切なことである。
【００９５】
ディファレンシャルなインフルエンザウイルスのコピーも誘導可能なＩＦＮ−β  ｍＲＮＡのレベルもＴＬＲ４−／−マウスのＰＲ８感染に対する抵抗力の原因でない（図１１Ａ）。以前に報道したように、Ｅｒｉｔｏｒａｎ治療法は、ＰＲ８感染ＷＴマウスを保護したが（図１１Ｂと図１１Ｃ、白抜き丸、左パネル）、ＴＬＲ４−／−マウスの抵抗力に作用しなかった（図１１Ｂと図１１Ｄ；白抜き丸、右パネル）（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４９７：４９８−５０２，２０１３）。しかし、最初に予防的なＥｒｉｔｏｒａｎ処置（ＰＲ８感染の３時間前）を行い、次にＥｒｉｔｏｒａｎを４日間連続投与すると（図１１Ｂ、前治療／レジメン；黒四角）、ＷＴマウスは死亡から保護されなかった（図１１Ｃ、黒四角、左側パネル）。それは、死亡とＡＬＩの、早期にインフルエンザを誘発できるが末期に作用するメディエーターがＷＴマウスにおいてＥｒｉｔｏｒａｎのターゲットであることを意味する。驚くべきことに、同じレジメンでは、ＴＬＲ４−／−マウスがＰＲ８に感染されやすくなり（図１１Ｂと図１１Ｄ、黒四角、右パネル）、それは、ＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスによるデータと一致するように、Ｅｒｉｔｏｒａｎの非ＴＬＲ４ターゲットがＴＬＲ４−／−マウスのＰＲ８感染に対する抵抗力にとって必要であることを示す。前処置／早期ＥｒｉｔｏｒａｎはＣＤ１４−／−マウス又はＴＬＲ２−／−マウスの感受性に影響を及ぼさない。
Ｐ５７７９（ＭＤ２アンタゴニスト）はインフルエンザ媒介性致死を阻止する。
【００９６】
Ｅｒｉｔｏｒａｎで処置する場合、ＰＲ８感染マウスの肺（図７Ａ参照）には、サイトカイン誘導の不活化及びＯｘＰＡＰＣ（Ｉｍａｉ等により示されたＤＡＭＰ）の蓄積を示し、それにより、ＴＬＲ４を介してマクロファージに対する作用を果たすことでＡＬＩを媒介することが以前に報道した（Ｉｍａｉ等，Ｃｅｌｌ，１３３：２３５−２４９，２００８）。報道によると、内毒性とグラム陰性敗血症に最も密接に関連するＤＡＭＰである高移動度群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）は、重度のインフルエンザ感染の間に放出され（Ａｌｌｅｖａ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８１：１４５４−１４５９，２００８）、ＴＬＲ４共受容体（ＭＤ２）と結合することによりＴＬＲ４を活性化させた（Ｙａｎｇ等，Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．，９３：８６５−８７３，２０１３）。ＨＭＧＢ１に刺激されたＷＴネズミマクロファージは、インビトロでＥｒｉｔｏｒａｎによって阻害されたＭｙＤ８８依存性とＴＲＩＦ依存性の遺伝子発現を誘導した（図１２Ａ）。ＰＲ８に感染されたマウスと非適合ヒトインフルエンザｐｄＨ１Ｎ１ウイルス株に感染されたコットンラットは、インビボでのＥｒｉｔｏｒａｎ処置により阻害された循環ＨＭＧＢ１の増加を示した（図１２Ｂ）。従って、ＯｘＰＡＰＣと同様に、ＨＭＧＢ１は、ＴＬＲ４活性化を通じてインフルエンザにより誘導されたＡＬＩに寄与する感染後、比較的遅く放出するＤＡＭＰを示す。Ｐ５７７９はＨＭＧＢ１の小分子阻害剤であり、ＭＤ２／ＨＭＧＢ１相互作用を阻止し、ＨＭＧＢ１誘導型ＴＬＲ４シグナル伝達をブロックすると同時に、ＬＰＳ誘導型サイトカイン／ケモカイン誘導を妨害しないことが最近示された。Ｐ５７７９はマウスを肝臓虚血／再灌流損傷、化学的中毒及び敗血症から保護した（Ｙａｎｇ等，Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，２１２：５−１４，２０１５）。Ｐ５７７９のインフルエンザ感染に対する有効性を評定するために、ＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＰＲ８を感染させてから２日後、Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４）（不活性化対照ペプチド）又はＰ５７７９でマウスを５日間連続処置した。マウスのＥｒｉｔｏｒａｎ処置とＰ５５７９処置のいずれも有意に向上した生存率と低下した臨床スコアを示し、対照阻害剤で処置するマウスは、臨床スコアが高く、感染により死亡した（図１２Ｃと図１２Ｄ）。
ＰＡＲ２アンタゴニストはインフルエンザ誘発致死と肺リークを阻止する。
【００９７】
最初にゾヌリン（現在はプレハプトグロビン２（ｐｒｅ−ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ  ２）として知られている）と呼ばれる宿主誘導タンパク質は、タイトジャンクションタンパク質のリン酸化によって腸管の透過性を向上させることが判明した（Ｇｏｌｄｂｌｕｍ等，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２５：１４４−１５８  （２０１１）。シグナル伝達は、ＴＬＲ４と物理的及び機能的に相互作用できることが示されたシグナル伝達タンパク質であるプロテアーゼ活性化受容体２（ＰＡＲ２）に依存していた。ＡＴ−１００１（酢酸ララゾン）は、ゾヌリン類似体ペプチドアンタゴニストとして、ヒトの耐性に優れるとともに、セリアック病に関連する腸炎症を軽減できる。近来、ＡＴ−１００１は、ＺＯ−１リン酸化の抑制と気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の白血球数とミエロペルオキシダーゼ活性の低下により、ＩｇＧ免疫複合体又はＬＰＳの肺内沈着によって誘導されたマウスにおけるＡＬＩを減弱させることについての報告があった（Ｒｉｔｔｉｒｓｃｈ等，Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３０４：Ｌ８６３−７２，２０１３）。ＰＡＲ２−／−とＴＬＲ４−／−マウスのいずれも致命的なＰＲ８感染に対して不応性であることから、致命的なインフルエンザチャレンジの間のＡＴ−１００１処置とＥｒｉｔｏｒａｎ処置の効果の差異を比較した。ＷＴマウスにＰＲ８を感染させて、感染後の２日目から、ビヒクル（生理食塩水）、Ｅｒｉｔｏｒａｎ又はＡＴ−１００１で５日間連続処置した。Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置に比べて、マウスのＡＴ−１００１処置は、有意な保護と低下した臨床スコアを示した（図１３Ａと図１３Ｂ）。ＡＴ−１００１はＬＰＳ又は免疫複合体により誘導されたＡＬＩに関する肺水腫を減少させるため、ＥｒｉｔｏｒａｎとＡＴ−１００１がＰＲ８感染に起因する肺水腫の減少を引き起こすかどうかを計測し、湿／乾燥（Ｗ／Ｄ）重量比率で測定を行った。ＰＲ８感染後にＥｒｉｔｏｒａｎ又はＡＴ−１００１で処置したマウスに比べて、ＰＲ８感染後、ビヒクルで処置したマウスは高いＷ／Ｄ比を示し（図１３Ｃ）、それは、インフルエンザ感染期間に、Ｅｒｉｔｏｒａｎの付加的な保護作用は、肺水腫を軽減させることによりＡＬＩを減弱させることにあることを示す。
インフルエンザによる致死性に対するＩＬ−１βの寄与
【００９８】
ＰＲ８に感染されてＥｒｉｔｏｒａｎで処置したマウスの肺にはＩＬ−１β  ｍＲＮＡが強く阻害されることが示された。続いて、Ｔｅｉｊｅｒｏ等は、インフルエンザに感染されたＩＬ−１Ｒ−／−マウスが、ｐ．ｉ．２日間後、ＢＡＬＦにおけるサイトカインレベルの減少を示すことを報道していた（Ｔｅｉｊａｒｏ  Ｊ．Ｒ．等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８２：６８３４−４３，２００９）。ただし、ＡＬＩにも致死性にも評定しなかった。ｒＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−ＩＲａ；ａ．ｋ．ａ．  Ｋｉｎｅｒｅｔ，ａｎａｋｉｎｒａ）は高炎症性疾患（例えば関節リウマチ、クリオピリン関連周期性症候群）の治療に臨床的に使用される（Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ等，Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．，１１：６３３−６５２、２０１２）。Ｅｒｉｔｏｒａｎの保護効果に比べて、ｒＩＬ−１Ｒａで処置したＰＲ８感染Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウスは、有意ながら中等の生存率（図８Ａ）と臨床スコア（図８Ｂ）を示す。それは、ＩＬ−１βがインフルエンザによる疾患の媒介に関与するが、Ｅｒｉｔｏｒａｎにより作用が阻害されたほかのメディエーターも関与することを示す。
Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置はインフルエンザに対するオセルタミビル治療法の治療効果を改善する。
【００９９】
単独で、又は、承認されたノイラミニダーゼ阻害剤である抗ウイルス療法（登録商標Ｔａｍｉｆｌｕ（オセルタミビル））と併用して投与されたＥｒｉｔｏｒａｎの効果を評定した。有効性を実現するために、発症後の２日間内で、オセルタミビル処置が推薦される（Ｋｈａｚｅｎｉ等，Ａｎｎ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．，１５１：４６４−４７３，２００９）。モデルでは、感染後３日目に、マウスは臨床症状を示すので、感染後２日目、４日目又は６日目からビヒクル、Ｅｒｉｔｏｒａｎ単独、オセルタミビル単独、又はＥｒｉｔｏｒａｎとオセルタミビルの組み合わせを用いて５日間連続処置したマウスを比較した。感染後２日目から処置し始める場合は、この２種の薬剤は全て高保護性を有し、併用することによるさらなる効果がなかった。しかしながら、感染後４日目又は６日目から投与して処置する場合は、オセルタミビル単独で治療すれば、有意な保護効果はなく（特に６日目から投与する場合）、それに対して、Ｅｒｉｔｏｒａｎは、以前に報道したように、致死からの大きな保護効果を果たす。重要なことに、４日目から投与し始める場合は、Ｅｒｉｔｏｒａｎ／オセルタミビルの組み合わせによる処置は生存率を有意に向上させる。それは、セレコキシブ（ＣＯＸ−２阻害剤）とザナミビルを同時共投すると、ザナミビル単独で投与する場合よりもインフルエンザ感染マウスの生存率を向上できるというＺｈｅｎｇ等による結果と一致する（Ｚｈｅｎｇ等，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ、１０５：８０９１−８０９６，２００８）。以前の検討から明らかなように、インフルエンザ感染期間に、ＥｒｉｔｏｒａｎはＣＯＸ−２誘導を減少させる。
Ｅｒｉｔｏｒａｎ処置後、ＰＲ８感染の生存者では適応免疫を形成した。
【０１００】
重要なことに、２週間後、ＥｒｉｔｏｒａｎによってＰＲ８から保護されたマウスは、追加したＥｒｉｔｏｒａｎ処置をせずに二次ＰＲ８チャレンジした場合、生存した。従って、一次感染中のＥｒｉｔｏｒａｎによる抗炎症作用は、インフルエンザに対する適応性免疫応答の発達を損なわない。
検討
【０１０１】
インフルエンザは世界的に健康上の懸念である。ウイルスが迅速に突然変異して、抗ウイルス耐性や免疫原性抗原エピトープの発現が変化することによって、従来のワクチンが無効になる。従来の検討（Ｎｈｕ等，Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：２９−３９，２０１０）に基づき、耐性に優れた合成ＴＬＲ４アンタゴニスト（Ｋａｌｉｌ等，Ｓｈｏｃｋ，３６：３２７−３３１，２０１１）であるＥｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４）は、宿主誘導型ＤＡＭＰの応答中のＴＬＲ媒介性シグナル伝達をブロックすることによりインフルエンザ誘発ＡＬＩを低減させる新規な治療方法である。本明細書では、細胞レベル及び分子レベルから、ＡＬＩ誘導及びＥｒｉｔｏｒａｎ処置によるその低減の機構を更に詳細に説明する。
【０１０２】
我々のデータにより示すように、Ｅｒｉｔｏｒａｎ療法は、ＴＬＲ４−／−マウスのインフルエンザ感染に対する耐性を変えない。Ｅｒｉｔｏｒａｎ療法と抗ＴＬＲ４抗体療法のいずれもＷＴマウスを保護し、ＥｒｉｔｏｒａｎはＴＬＲ４シグナル伝達に必要なＣＤ１４とＭＤ２にインビトロで結合する（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４９７：４９８−５０２，２０１３）。要するに、これら知見は、ＴＬＲ４のインフルエンザ誘発性疾患へ関与すること、及びＥｒｉｔｏｒａｎにより媒介される保護のターゲットとすることを強力に示唆する。Ｅｒｉｔｏｒａｎ前治療／レジメンは、ＴＬＲ４−／−マウスを感染しやすくするので、Ｅｒｉｔｏｒａｎは、耐病性の誘導の早期に必要な非ＴＬＲ４  ＰＲＲとも相互作用しなければならない。ＣＤ１４はＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９の共受容体として作用でき、且つ、後者の３つがインフルエンザに対する宿主応答に関与し（Ｌｅｕｎｇ等，Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．，９５：１８７０−１８７９，２０１４）、ＩＦＮ−βを誘導できるので（Ｋａｗａｉ等，Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１  ３７３−３８４、２０１０）、前治療／初期レジメンによって投与されるＥｒｉｔｏｒａｎは、ＣＤ  １４に結合するとともに、特異的ＰＡＭＰ又はＤＡＭＰのこれらＴＬＲのうちの１つ又は複数への転移を抑制することによって、ＩＦＮ−βを誘導すると仮定している。この仮説は、初期レジメンによってＥｒｉｔｏｒａｎを投与したＷＴマウスとＴＬＲ４−／−  マウスがＩＦＮ−β−／−マウスのようにＰＲ８により感染されやすく、また、ＣＤ１４−／−マウスがＥｒｉｔｏｒａｎ前治療／早期又は治療レジメンにより保護できないという観察によってサポートされる。Ｐａｕｌｉｇｋ等が提出したように、サイトカインを発生できないためであるかもしれない（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０９：３−１０，２００４）。
【０１０３】
ＰＲ８感染マウスのＥｒｉｔｏｒａｎ媒介性保護におけるＴＬＲ２の役割はより謎めいたものである。実際には、治療的に投与される場合は、抗ＴＬＲ２  ＭＡｂ（対照ＩｇＧではなく）はマウスにＰＲ８からの保護を提供することが観察されたにもかかわらず、ＰＲ８感染３時間前とＰＲ８感染後１日目に投与される場合は、同一抗ＴＬＲ２  ＭＡｂは最低限の保護しか提供できなかった。それは、ＴＬＲ２が、ＴＬＲ４と同様に、感染後期に有害な役割を果たすことの強力な証拠となっている。ＯｘＰＡＰＣ（Ｋａｄｌ等，Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，５１：１９０３−１９０９，２０１１）とＨＭＧＢ１（Ｙａｎｇ等，Ｊ．  Ｌｅｕｋｏｃ．  Ｂｉｏｌ．，９３：８６５−８７３，２０１３）は全て感染後に誘導されるＴＬＲ２とＴＬＲ４アゴニストであると報道した。これらＤＡＭＰは、ＴＬＲ２の発現及び／又はＴＬＲ２依存性シグナルを相乗的に強化できる。ＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスが亜致死ＰＲ８により非常に感染されやすいという知見は、ＴＬＲ２とＴＬＲ４の欠失によって、ＩＬ−１とＩＬ−１８シグナルがＭｙＤ８８をより容易に取得できるようになることを示唆している。また、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ４−／−マウスのＰＲ８抵抗性を媒介する物質の生産に必要であることを示唆している。
【０１０４】
Ｅｒｉｔｏｒａｎは、インフルエンザにより誘導された「サイトカインストーム」とＯｘＰＡＰＣ累積（酸化されたリン脂ＴＬＲ４  ＤＡＭＰ）を軽減させる。メカニズム的には、これら知見は、Ｅｒｉｔｏｒａｎは、（ｉ）ＨＭＧＢ１により媒介されたＴＬＲ４依存性インビトロシグナル伝達、血清へのＨＭＧＢ１のインビボ放出をブロックして、保護効果がＰ５７７９（高選択的ＨＭＧＢ１阻害剤）に相当すること、及び（ｉｉｉ）肺水腫抑制作用がＡＴ−１００１（ゾヌリンにより誘導された肺水腫の阻害剤）に相当することを示すことによって、拡張されている。Ｅｒｉｔｏｒａｎ療法の後者の効果は、前記した未治療インフルエンザ感染マウスに比べて向上している肺機能に関連する。最近の検討によれば、腸上皮における傍細胞透過性向上により肺損傷を引き起こすことを示唆することによって、腸管においてトラウマ／出血性ショックに起因するＴＬＲ４活性化とＡＬＩの発展との可能な相関が示される（Ｓｏｄｈｉ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９４：４９３１−４９３９，２０１５）。また、ＰＲ８感染マウスに対する治療により得られた部分的な保護効果は、ＩＬ−１シグナル伝達のＰＲ８誘導型致死での役割をサポートするものの、ＰＲ８による疾患等のほかの炎症メディエーターのＰＲ８誘導型疾患での作用をもサポートする。Ｅｒｉｔｏｒａｎ誘導型保護が適応性免疫応答の進行を阻止できないという知見に基づいて、Ｅｒｉｔｏｒａｎの、インフルエンザによる二次細菌感染に対する強化された感度に対する効果評定のために、さらなる検討が必要である。全体として、本発明者らの発見は、侵入するウイルスに応答する宿主の能力を制御する微生物−宿主炎症細胞の相互作用の複雑さを強調している。示された証拠から明らかなように、自然免疫細胞における複数の受容体が関与する可能性が高く、しかしながら、微生物及び宿主リガンドに応答するこれら受容体間の未知の相互作用が、宿主応答に質的及び量的に有意に影響を及ぼす可能性も高い。
方法
試薬
【０１０５】
Ｅｒｉｔｏｒａｎ（Ｅ５５６４）はＥｉｓａｉ社（Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）により提供されるものであり，前記のように製造された（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｎａｔｕｒｅ，４９７：４９８−５０２，２０１３）。大腸菌Ｋ２３５  ＬＰＳの製造は前記のとおりである（Ｍｃｌｎｔｉｒｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：２３６３−２３７６，１９６７）。抗ＴＬＲ２  ＩｇＧとアイソタイプ対照ＩｇＧはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から購入する。組換えＨＭＧＢ１はＫｅｖｉｎ  Ｔｒａｃｅｙにより提供される（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍａｎｈａｓｓｅｔ，ＮＹ）。９Ｒ−ＶＩＰＥＲはＡｎｄｒｅｗ  Ｂｏｗｉｅ（Ｔｒｉｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）により提供される。Ｐ５７７９と対照ペプチドはＹｏｕｓｅｆ  Ａｌ  Ａｂｅｄ（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍａｎｈａｓｓｅｔ，ＮＹ）により提供される。抗ＴＬＲ４  ＩｇＧとアイソタイプ対照ＩｇＧはＴｈｉｅｒｒｙ  Ｒｏｇｅｒ  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｃａｌａｎｄｒａ（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｐｓｉｌａｌｉｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  Ｖａｕｄｏｉｓ  ａｎｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供される。Ａｔ−１００１はＡｌｅｓｓｉｏ  Ｆａｓｓａｎｏ（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ＭＧＨ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）により提供される。ＩＬ−１ＲａはＣｈａｒｌｅｓ  Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＣＯ）により提供される。
マウス及びコットンラット
【０１０６】
６−８週齢のＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは購入された（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）。標的突然変異を有する全てのマウスはＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドになるように飼育されるか、又は直接Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドから直接得た。ＴＬＲ４−／−マウス（最初、Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａ（大阪、日本）により提供）は、ＵＭＢ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）とＵｎｉｖ．  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）で飼育）、ＩＲＡＫ４ＫＤＫＩ（Ｌｉｌｌｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより提供、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＭＢで飼育）、ＴＬＲ２−／−マウス（Ｓｈｉｚｕｏ  Ａｋｉｒａにより提供、Ｕ．Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌで飼育）、及びＴＬＲ２／ＴＬＲ４二重ノックアウトマウス（Ｕ．Ｍａｓｓ．  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  （Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）で飼育）。ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入する。すべてのマウス系統は特定の無病原体条件において飼育している。実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＢａｌｔｉｍｏｒｅとＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの規定に従って行われ、各研究所の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て行った。
【０１０７】
近交系の若齢成体（４−８週齢）コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）はＳｉｇｍｏｖｉｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で飼育した。全てのコットンラット実験は、動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）の承認を得て行った。
ウイルス
【０１０８】
マウス適合Ｈ１Ｎ１インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス（「ＰＲ８」）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、前記したように（Ｔｅｉｊａｒｏ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８２：６８３４−４３，２００９）、１０日齢の孵化鶏卵の尿膜腔液で成長し、Ｄｏｎｎａ  Ｆａｒｂｅｒ博士（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮＹ）により提供される。マウス適合Ｈ１Ｎ１インフルエンザｍａＣａ．０４はＤａｎｉｅｌ  Ｐｅｒｅｚ（Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）により提供される。非適合ヒトインフルエンザウイルス株ｐＨｌＮｌの入手及び増殖は前記のとおりである（Ｂｌａｎｃｏ等，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，８７：２０３６−  ４５，２０１３）。
ウイルスチャレンジ与治療
【０１０９】
マウスにマウス適合インフルエンザウイルス株Ａ／ＰＲ／８／３４（ＰＲ８；〜７５００  ＴＣＩＤ５０，ｉ．ｎ．，２５  μｌ／鼻孔）又はｍａＣａ．０４（〜２２００  ＴＣＩＤ５０，ｉ．ｎ．）を感染させた。感染後２日目に、マウスにプラセボ又はＥ５５６４（Ｅｒｉｔｏｒａｎ；１００  μｌで２００  μｇ／匹  ，ｉ．ｖ．）、抗ＴＬＲ４  ＩｇＧ（２ｍｇ／匹，ｉ．ｖ．）又はそのアイソタイプ対照ＩｇＧ、抗ＴＬＲ２（Ｔ２．４クローン；１００μｇ／匹，ｉ．ｖ．）又はそのアイソタイプ対照ＩｇＧ、Ｐ５７７９又はその対照ペプチド（５００μｇ／匹，ｉ．ｐ．）、ＡＴ−１００１（１５０μｇ／匹，ｉ．ｖ．）、ＩＬ−１Ｒａ（１５０μｇ／匹，ｉ．ｖ．）、又はオセルタミビル（１ｍｇ／匹，ｐ．ｏ．）を投与した。いくつかの実験では、感染後４日目又は６日目から、処置群マウスにＥｒｉｔｏｒａｎ又はオセルタミビルを投与し且つ５日間連続投与する。いくつかの実験では、一部の処置群マウスについて、ＰＲ８感染３時間前に、Ｅ５５６４（２００ｍｇ／匹，ｉ．ｖ．）を投与し、次に、感染後１日目から、４日間（１日目−５日目）を連続処置する。いくつかの実験では、処置群マウスについて、ＰＲ８感染３時間前に、抗ＴＬＲ２（Ｔ２．５クローン，１００μｇ／匹，ｉ．ｖ．）又はその対照アイソタイプＩｇＧで処置し、次に、感染後１日目に再び１回処置し、合計で２回処置する。毎日、マウスの生存率、体重減少及び臨床症状（例えば無気力、立毛、フリル毛皮、猫背の姿勢、急速な浅い呼吸、聞こえるくちばし）を１４日間連続監視する。毎日、マウスについて０（症状無し）−５（垂死）の範囲内で採点する。
ＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスの検討
【０１１０】
感染際に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴ、ＴＬＲ４−／−、ＴＬＲ２−／−及びＴＬＲ２／４二重ノックアウトマウスは８−１２週齢である。インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）ウイルス原液を無菌リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で希釈し、使用まで氷で保存している。マウスをイソフルランで麻酔して、マウスを１匹ずつ４００００ｐｆｕ（３０μｌ，ｉ．ｎ．）感染させる。２つの試験において、毎日、マウスの感染後の生存率を１４日間連続監視する。別の試験において、感染後５日目に、マウスを安楽死させて、肺を採取して病理学的検査を行う。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅからの１ｍｌホルマリン（１０％ホルムアルデヒド）で肺をインシチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）膨脹させる。膨脹させた肺をＰＢＳに入れて２４−４８時間固定する。次に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅによって、肺を垂直に二等分してパラフィンで包埋処理を行う。スライドを製造して、Ｈ＆Ｅ染色をして、組織学的分析に用いる。
肺の湿重量／乾燥重量比率
【０１１１】
未処置又はＥ５５６４又はＡＴ−１００１のいずれかで処置したマウスにおいて、肺湿／乾燥（Ｗ／Ｄ）重量比をインフルエンザ感染後のマウス肺水腫の指数とする。感染後７日目に、マウスを安楽死させ、解剖して全肺を採取し、切除直後に肺の重量（湿重量）を測定する。次に、肺組織を５−６日間空気乾燥させ、乾燥重量が変化しないまで、毎日再秤量し、安定した乾燥重量を最終乾燥重量とする。湿重量を最終乾燥重量で割ってＷ／Ｄ重量比を算出した。
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
【０１１２】
全ＲＮＡの分離とｑＲＴ−ＰＣＲは前記のように行われる（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１：４１５９−４１６７，２００８）。特定遺伝子のｍＲＮＡレベルは、偽感染肺を基準とする相対遺伝子発現として示された。
マクロファージの培養及び処置
【０１１３】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ＷＴマウスからのチオグリコール酸塩により誘発された腹膜マクロファージを１２ウェル（２×１０６）組織培養板に入れて、前記したように濃縮させる（Ｓｈｉｒｅｙ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８１：４１５９−４１６７，２００８）。Ｅｒｉｔｏｒａｎを用いて、マクロファージについて１時間前処置を連続して（１０ｎｇ／ｍｌ）、次にＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）又はＨＭＧＢ１（１μｇ／ｍｌ）で２時間刺激する。
ＨＭＧＢ１血清レベル
【０１１４】
０日目に、９×１０４  ＴＣＩＤ５０のｐＨｌＮｌをコットンラットに鼻腔内接種する。感染後２日目に、１日に１回、生理食塩水で処理（モック）し又は３７．３３ｍｇ／ｋｇのＥｒｉｔｏｒａｎで処理する。感染後４日目と６日目に、血液サンプルを収集して、ＥＬＩＳＡキットを用いて生産者（ＩＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）が提供する方法によって、血清についてＨＭＧＢ１を測定する。
統計
【０１１５】
不対両側スチューデントｔ検定により、２組間の有意差を測定し、且つ、有意差をｐ＜０．０５に設定する。３組間以上の比較を行うために、一元配置ＡＮＯＶＡにより分析し、次に有意性をｐ＜０．０５に設定したテューキー多重比較検定を行う。生存率検討については、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ  Ｃｏｘ）が使用される。
【０１１６】
本明細書に引用されるすべての特許、特許出願、出版物及び電子的に入手可能な材料は全て参照として援用される。前述の詳細な説明及び実施例は理解を明確にするためにのみ示したものである。なお、以上は不必要な制限が理解されるべきではない。特に、化合物が有効であるという可能性のあるメカニズムを説明する理論を示す可能性があるが、発明者は本明細書に記載の理論に制限されない。本発明は、図示及び説明した具体的な詳細に制限されるものではなく、当業者にとって自明な変形は請求項により定義される発明に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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