(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９からなる群より選択される配列を含む核酸分子であって、ここでＷが５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）であり、その長さが３２〜約１００個のヌクレオチドであり、黄色ブドウ球菌のＳｐＡタンパク質に特異的に結合可能である、前記核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記核酸分子。
【請求項３】
配列番号１０〜１２からなる群より選択される配列を含む核酸分子であって、ここでＷが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）であり、その長さが４０〜約１００個のヌクレオチドであり、黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡタンパク質に特異的に結合可能である、前記核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子を含む試料中の微生物の有無の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
〔０００１〕  本出願は、２０１４年２月１８日に出願された米国仮特許出願第６１/９４０，９５５号及び２０１４年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１/９４７，６２７号に対する利益を主張するものであり、参照により、そのそれぞれの全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
〔０００２〕  本開示は通常、試料中の微生物の存在を検出するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本開示は微生物タンパク質に結合可能である核酸アプタマー、並びに核酸アプタマーを用いて試料中の微生物を捕捉及び検出するための方法に関する。
【０００３】
〔０００３〕  「配列表ＳＴ２５（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５）」と題して２０１５年２月１３日に作製した１６キロバイトのサイズの配列表は、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
〔０００４〕  食品や水の汚染は、先進国の国々や第三世界の国々の両方に主要な健康リスクをもたらし、毎年何百万もの人々の死や病気の原因であると考えられる。食品や水の汚染はさらに家畜や水生生物の生態系を含む動物の健康をも脅かす。
【０００５】
〔０００５〕  こうした病気は通常、細菌、寄生虫、またはウイルス等の微生物汚染によって引き起こされる。食品生産に関しては、関与する当事者の複雑さや数のために、多数の意図しない汚染機会や、テロリズムと食品供給の望ましくない相互作用といった可能性が提供される。地表水や地下水は通常、水源内またはその近くに排泄するペット、家畜または野生動物によって汚染される一方で、埋立地、汚水浄化場、下水管渠及び農地からの流出もまた水の汚染に寄与する。汚染タイプや汚染源にかかわらず、見た目や味には問題が無いが疾患や最終的には死をももたらすような食品や水が汚染されているかどうかを個人が判断するのは難しい。したがって、食品、水、非殺菌製品の微生物汚染または環境のモニタリングは、公衆衛生にとって地球規模で極めて重要である。
【０００６】
〔０００６〕  したがって、より改善された、低コストで効率的な、食品と水の両方における微生物汚染のモニタリングのための代替的な組成物及び方法が引き続き必要とされている。本開示は、低細胞密度で存在する微生物の捕捉及び濃縮、並びに、培養または細胞溶解を要しない直接検出（例えば、ｑＰＣＲまたは蛍光染色による）のために、微生物の細胞表面エピトープに高い特異性と親和性を有する新規アプタマー試薬を提供して、こうした必要に答えるものである。
【発明の概要】
【０００７】
〔０００７〕  本開示は、精製した組換または天然タンパク質を用いる多重修飾ＤＮＡライブラリでのＳＥＬＥＸによる、いくつかの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）細胞表面関連タンパク質に対する新規の遅いオフ速度の修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）試薬の生成について記載する。ｎＭ未満のＫｄを有する高親和性結合剤を、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）、クランピング因子（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ）及び鉄調節表面決定因子（Ｉｓｄ）について取得した。いくつかのアプタマーは、試験した全ての株からの黄色ブドウ球菌細胞に特異的に結合したが、他のブドウ球菌や他の細菌には結合しなかった。ＳｐＡ及びＣｌｆＡアプタマーが、低細胞密度マトリクスからの黄色ブドウ球菌細胞の選択的捕捉及び濃縮に有用であることが培養やＰＣＲに示されるように証明され、ＰＣＲ阻害剤の検出限界の改善及び効率的な除去につながった。黄色ブドウ球菌細胞の検出は、細菌細胞表面をアプタマーで被覆し次いでアプタマーのｑＰＣＲを行った場合にゲノムＰＣＲと比べて桁違いに強化された。
【０００８】
〔０００８〕  本開示は試料中の微生物の有無の検出方法を記載し、該方法が、ａ）試料と第一アプタマーを接触させ混合物を形成し、ここで該第一アプタマーは微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、かつ第一タグを含み、ここで該第一タグは固体支持体に結合可能であり、ｂ）該第一タグの該固体支持体への結合を可能にする条件下で、該混合物と該固体支持体を接触させ、ｃ）該固体支持体を洗浄して該複合体に関して混合物を濃縮し、及び／または該固体支持体を洗浄して未結合物質を実質的に除去し、ｃ）該混合物と第二アプタマーを接触させ、ここで該第二アプタマーは該微生物の該第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、及びｄ）アッセイを行って該第二アプタマーを検出し、ここで該第二アプタマーの検出は該微生物が該試料中に存在することを示し、該第二アプタマーの未検出は該微生物が該試料中に存在しないことを示す、ことを含む。
【０００９】
〔０００９〕  本開示はさらに試料中の微生物の有無の検出方法を提供し、該方法が、以下のことを含む：
〔００１０〕  ａ）該試料を固体支持体に接触させ、ここで第一アプタマーは第一タグを介して該固体支持体に結合し、及びここで該第一アプタマーは微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり；ｂ）該固体支持体を洗浄して該複合体に関して混合物を濃縮し、及び／または該固体支持体を洗浄して未結合材料を実質的に除去し；ｃ）該混合物を第二アプタマーと接触させ、ここで該第二アプタマーは該微生物の該第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、かつ第二タグを含み、及びｄ）アッセイを行って該第二アプタマーを検出し、ここで該第二アプタマーの検出は該微生物が該試料中に存在することを示し、該第二アプタマーの未検出は該微生物が該試料中に存在しないことを示す、こと。
【００１０】
〔００１１〕  別の態様において、該第一アプタマー及び該第二アプタマーの該少なくとも１つはさらに少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジンを含む。関連の態様において、該Ｃ−５修飾ピリミジンは５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される。
【００１１】
〔００１２〕  別の態様において、該第二アプタマーは増幅可能である。関連の態様において、該第二アプタマーは酵素的増幅（例えばＰＣＲまたはｑＰＣＲによる）用テンプレートである。さらに別の関連の態様において、該第二アプタマーは、該第二アプタマーまたは該第二アプタマーの１以上の領域にハイブリダイズ可能なＰＣＲプライマーによって増幅される。
【００１２】
〔００１３〕  別の態様において、該第二アプタマーは第二タグを含み、ここで該第二タグは、染料、量子ドット、放射標識、ＰＣＲプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質からなる群より選択される。
【００１３】
〔００１４〕  別の態様において、該第一タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、またはこれら構造物の断片もしくは誘導体のいずれかからなる群より選択される。
【００１４】
〔００１５〕  別の態様において、固体支持体はビーズ及び基材からなる群より選択される。関連の態様において、該ビーズは、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔性ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、マイクロビーズ、及び制御細孔ビーズからなる群より選択される。さらに別の関連の態様において、該基材は、マイクロタイターウェル、シクロオレフィン共重合体基材、膜、プラスチック基材、ナイロン、ラングミュア−ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム基材、シリコン基材、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、ナノ粒子、ポリテトラフルオロエチレン基材、ポリスチレン基材、ヒ化ガリウム基材、金基材及び銀基材からなる群より選択される。
【００１５】
〔００１６〕  別の態様において、該アッセイは、限定されないが、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、質量分析、配列決定ハイブリダイゼーション等を含む群より選択される。関連の態様において、該アッセイはＰＣＲ及びｑＰＣＲからなる群より選択される。
【００１６】
〔００１７〕  別の態様において、該微生物は、限定されないが、細菌細胞、寄生虫及びウイルスを含む群より選択される。
〔００１８〕  別の態様において、該微生物は、細菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は病原性である。さらに別の関連の態様において、該細菌細胞はブドウ球菌細胞である。別の関連の態様において、該細菌細胞は黄色ブドウ球菌細胞である。
【００１７】
〔００１９〕  別の態様において、該第一細胞表面タンパク質及び該第二細胞表面タンパク質は同じタンパク質であるかまたは異なるタンパク質である。
〔００２０〕  別の態様において、該第一細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。
【００１８】
〔００２１〕  別の態様において、該第二細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。
〔００２２〕  別の態様において、該第一細胞表面タンパク質はＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される。関連の態様において、該第一細胞表面タンパク質はＳＰＡ及びＣｌｆＡからなる群より選択される。
【００１９】
〔００２３〕  別の態様において、該第二細胞表面タンパク質は、ＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される。関連の態様において、該第二細胞表面タンパク質はＳＰＡ及びＣｌｆＡからなる群より選択される。
【００２０】
〔００２４〕  別の態様において、該第一アプタマーはＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４または５である。関連の態様において、ｎは２である。関連の態様において、該第一アプタマーの長さが少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。さらに別の関連の態様において、該第一アプタマーの長さが約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００２１】
〔００２５〕  別の態様において、該第一アプタマーがＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。関連の態様において、ｎは５〜２０（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）である。別の態様において、ｎは１０〜１８（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８）である。関連の態様において、ｎは約１６である。さらに別の関連の態様において、該第一アプタマーの長さが少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。
【００２２】
〔００２６〕  別の態様において、該第一アプタマーの長さが約１８〜約１００個のヌクレオチド（または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００２３】
〔００２７〕  別の態様において、該第一アプタマーが配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがＣ−５修飾ピリミジンである。
【００２４】
〔００２８〕  別の態様において、該第二アプタマーがＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、または５である。関連の態様において、ｎは２である。関連の態様において、該第二アプタマーの長さが少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。さらに別の関連の態様において、該第二アプタマーの長さが約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００２５】
〔００２９〕  別の態様において、該第二アプタマーがＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷが、それぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。関連の態様において、ｎは５〜２０（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）である。別の態様において、ｎは１０〜１８（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８）である。関連の態様において、ｎは約１６である。
【００２６】
〔００３０〕  別の態様において、該第二アプタマーの長さが少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。
【００２７】
〔００３１〕  別の態様において、該第二アプタマーの長さが約１８〜約１００個のヌクレオチド（または長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００２８】
〔００３２〕  別の態様において、該第二アプタマーが配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがＣ−５修飾ピリミジンである。
【００２９】
〔００３３〕  別の態様において、該Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される。
【００３０】
〔００３４〕  別の態様において、該試料が、限定されないが、水性試料、土壌試料、食品試料、細胞試料、培養試料、組織試料、細胞片試料、生物試料等を含む群より選択される。
【００３１】
〔００３５〕  別の態様及びここに開示の実施形態のいずれかにおいて、該第一アプタマーの濃度が約０．５ｎｍｏｌ  ｌ−１〜約６０ｎｍｏｌ  ｌ−１（または０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．２、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８.５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１.５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９もしくは６０ｎｍｏｌ  ｌ−１）である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は約１ｎｍｏｌ  ｌ−１〜約４０ｎｍｏｌ  ｌ−１（または１、１．５、２、２．５、３、３．２、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１.５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０ｎｍｏｌ  ｌ−１）である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は約２ｎｍｏｌ  ｌ−１〜約３５ｎｍｏｌ  ｌ−１（または、２、２．５、３、３．２、３．５、４、４．５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５もしくは３５ｎｍｏｌ  ｌ−１）である。
【００３２】
〔００３６〕  関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも０．５ｎｍｏｌ  ｌ−１、１ｎｍｏｌ  ｌ−１、２ｎｍｏｌ  ｌ−１、３ｎｍｏｌ  ｌ−１、３．２ｎｍｏｌ  ｌ−１、４ｎｍｏｌ  ｌ−１、５ｎｍｏｌ  ｌ−１、６ｎｍｏｌ  ｌ−１、７ｎｍｏｌ  ｌ−１、８ｎｍｏｌ  ｌ−１、９ｎｍｏｌ  ｌ−１、１０ｎｍｏｌ  ｌ−１、１１ｎｍｏｌ  ｌ−１、１２ｎｍｏｌ  ｌ−１、１３ｎｍｏｌ  ｌ−１、１４ｎｍｏｌ  ｌ−１、１５ｎｍｏｌ  ｌ−１、１６ｎｍｏｌ  ｌ−１、１７ｎｍｏｌ  ｌ−１、１８ｎｍｏｌ  ｌ−１、１９ｎｍｏｌ  ｌ−１、２０ｎｍｏｌ  ｌ−１、２１ｎｍｏｌ  ｌ−１、２２ｎｍｏｌ  ｌ−１、２３ｎｍｏｌ  ｌ−１、２４ｎｍｏｌ  ｌ−１、２５ｎｍｏｌ  ｌ−１、２６ｎｍｏｌ  ｌ−１、２７ｎｍｏｌ  ｌ−１、２８ｎｍｏｌ  ｌ−１、２９ｎｍｏｌ  ｌ−１、３０ｎｍｏｌ  ｌ−１、３１ｎｍｏｌ  ｌ−１、３２ｎｍｏｌ  ｌ−１、３３ｎｍｏｌ  ｌ−１、３４ｎｍｏｌ  ｌ−１、３５ｎｍｏｌ  ｌ−１、３６ｎｍｏｌ  ｌ−１、３７ｎｍｏｌ  ｌ−１、３８ｎｍｏｌ  ｌ−１、３９ｎｍｏｌ  ｌ−１、または４０ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも１ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも３ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも５ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも１０ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも２０ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも３０ｎｍｏｌ  ｌ−１である。関連の態様において、該第一アプタマーの濃度は少なくとも３２ｎｍｏｌ  ｌ−１である。
【００３３】
〔００３７〕  別の態様及びここに開示の実施形態のいずれかにおいて、該第二アプタマーの濃度が約５ｎＭ〜約２００ｎｍ（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５もしくは２００ｎＭ）である。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は約２．５ｎＭ〜約１００ｎＭ（または２．５、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭ）である。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は約１０ｎＭ〜約１００ｎＭ（または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５もしくは１００ｎＭ）である。
【００３４】
〔００３８〕  関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも２．５ｎＭ、３ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、３５ｎＭ、４０ｎＭ、４５ｎＭ、５０ｎＭ、５５ｎＭ、６０ｎＭ、６５ｎＭ、７０ｎＭ、７５ｎＭ、８０ｎＭ、８５ｎＭ、９０ｎＭ、９５ｎＭまたは１００ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも２ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも２．５ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも５ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも１０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも２０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも３０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも４０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも５０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも６０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも７０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも８０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも９０ｎＭである。関連の態様において、該第二アプタマーの濃度は少なくとも１００ｎＭである。
【００３５】
〔００３９〕  本開示はさらに少なくとも約１５〜少なくとも約１００個のヌクレオチド（または少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）、少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジンを含み、かつ微生物の細胞表面タンパク質に結合可能な核酸分子について記載する。
【００３６】
〔００４０〕  別の態様において、該核酸分子は約１５〜約５０個のヌクレオチド（または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個のヌクレオチド）を含む。
【００３７】
〔００４１〕  別の態様において、該核酸分子は少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個のＣ−５修飾ピリミジンを含む。
【００３８】
〔００４２〕  別の態様において、該核酸分子はＣ−５修飾ピリミジンを少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上含む。
〔００４３〕  別の態様において、該核酸分子は約０．０３ｎＭ〜約４．７ｎＭ（または０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０.４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７ｎＭ）の平衡結合定数（Ｋｄ）で細胞表面タンパク質に結合可能である。
【００３９】
〔００４４〕  別の態様において、該核酸分子は少なくとも約０．０３、０．０７、０．０８、０．１４、０．１５、０．１６、０．２２、０．３５、０．４７、０．６３、０．７３、０．７９、０．８４、１．３、１．３５、１．９８、２．１７、３．９及び４．７３ｎＭの平衡結合定数（Ｋｄ）で細胞表面タンパク質に結合可能である。
【００４０】
〔００４５〕  別の態様において、該Ｃ−５修飾ピリミジンは５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される。
【００４１】
〔００４６〕  別の態様において、該微生物は細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される。
〔００４７〕  別の態様において、該微生物は細菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は病原性である。
【００４２】
〔００４８〕  別の態様において、該細菌細胞はブドウ球菌細胞である。関連の態様において、該細菌細胞は黄色ブドウ球菌細胞である。
〔００４９〕  別の態様において、該細胞表面タンパク質は細菌細胞表面タンパク質である。
【００４３】
〔００５０〕  別の態様において、該細胞表面タンパク質はＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される。
【００４４】
〔００５１〕  別の態様において、該第一細胞表面タンパク質はＳＰＡ及びＣｌｆＡからなる群より選択される。
〔００５２〕  別の態様において、該核酸分子はＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４または５である。関連の態様においてｎは２である。
【００４５】
〔００５３〕  別の態様において、該核酸分子の長さは少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。
【００４６】
〔００５４〕  別の態様において、該核酸分子の長さは約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００４７】
〔００５５〕  別の態様において、該核酸分子はＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。関連の態様において、ｎは５〜２０（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）である。別の態様において、ｎは１０〜１８（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８）である。関連の態様において、ｎは約１６である。
【００４８】
〔００５６〕  別の態様において、該核酸分子の長さは少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである。
【００４９】
〔００５７〕  別の態様において、該核酸分子の長さは約１８〜約１００個のヌクレオチド（または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である。
【００５０】
〔００５８〕  別の態様において、該核酸分子は配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷはＣ−５修飾ピリミジンである。
【００５１】
〔００５９〕  別の態様において、該Ｃ−５修飾ピリミジンは５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される。
【００５２】
〔００６０〕  本開示はさらに前述の核酸分子を含む試料中の微生物の有無の検出キットについて記載する。
〔００６１〕  本発明の前述及び他の目的、特徴、及び有利な点は、添付図面を参照しながら進められる以下の詳細な記載からさらに明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】図１は、常磁性ビーズ上に固定したＳｐＡアプタマーでの黄色ブドウ球菌の捕捉を示す。菌体捕捉効率を、ビーズの定量培養により算出した。図１Ａにおいて、アプタマー濃度は２０ｎｍｏｌ  ｌ−１に固定して０．１ｍｌ試料中の菌体を捕捉した。
【化１】
0006689758.tif 000002
【図１Ｂ】図１Ｂにおいて、細胞密度は０．１ｍｌ試料中６６００ＣＦＵに固定し、また捕捉アプタマー濃度は変化させた。
【化２】
0006689758.tif 000003
捕捉効率は、定量培養によって算出した。
【図２】図２は、アプタマーに基づく黄色ブドウ球菌の捕捉及び、シングルゲノムコピーのｑＰＣＲと比べて非常に多数の細胞表面成分に結合したアプタマーのｑＰＣＲによる信号増幅を示す。増幅不可能、ビオチン化ＣｌｆＡアプタマー４５２２−５または４５０３−７３を黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌（陰性対照）の捕捉に用い、続いて、増幅可能ＳｐＡアプタマー４５２０−８を用いて検出を行った。ランダムアプタマーライブラリを検出用陰性対照として用いた。参照のため同じ細胞力価（１０８細胞ｍｌ−１）を用いてゲノム標的（ｓａｓＤ遺伝子）のＰＣＲ増幅を行った。
【図３】図３は、大腸菌において組換型として過剰発現させ、さらにＮｉ−ＮＴＡアガロース及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上の親和性クロマトグラフィーで精製した、黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図４Ａ】図４は、ＳＥＬＥＸプール４５２０ＮａｐｄＵ及び４５３１ＴｒｐｄＵからの個々のアプタマーでの放射標識親和性結合アッセイを示し、ここでは０．００１〜１００ｎｍｏｌ  ｌ−１に段階希釈した精製ＳｐＡタンパク質を用いた（図４Ａ）及び１０７、１０６、１０５、及び１０４ＣＦＵ  ｍｌ−１に希釈した細胞全体（図４Ｂ）を用いた。
【図４Ｂ】図４は、ＳＥＬＥＸプール４５２０ＮａｐｄＵ及び４５３１ＴｒｐｄＵからの個々のアプタマーでの放射標識親和性結合アッセイを示し、ここでは０．００１〜１００ｎｍｏｌ  ｌ−１に段階希釈した精製ＳｐＡタンパク質を用いた（図４Ａ）及び１０７、１０６、１０５、及び１０４ＣＦＵ  ｍｌ−１に希釈した細胞全体（図４Ｂ）を用いた。
【図５Ａ】図５は、常磁性ストレプトアビジンビーズ上に固定したＳｐＡ及びＣｌｆＡアプタマーでの細菌細胞の捕捉を示す。捕捉効率は、低細胞密度での半定量培養（図５Ａ）または高細胞密度での濁り度の減少（図５Ｂ）によってモニターした。
【図５Ｂ】図５は、常磁性ストレプトアビジンビーズ上に固定したＳｐＡ及びＣｌｆＡアプタマーでの細菌細胞の捕捉を示す。捕捉効率は、低細胞密度での半定量培養（図５Ａ）または高細胞密度での濁り度の減少（図５Ｂ）によってモニターした。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
Ｉ．用語及び方法
〔００６７〕  別途指定されない限り、本明細書で使用する技術用語は、従来の用法にしたがって用いられる。分子生物学における一般的用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、  Ｇｅｎｅｓ  Ｖ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行、  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．発行、  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．）、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、  Ｉｎｃ．発行、  １９９５  （ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００５５】
〔００６８〕  本開示の各種実施形態を評価しやすくするため、特定の用語について以下に説明する。
〔００６９〕  アプタマー：本明細書で用いる際、「アプタマー」という用語は、標的分子に望ましい作用を有する非天然核酸を指す。望ましい作用には、限定するものではないが、標的の結合、標的の触媒的変化、標的または標的の機能的活性を修正あるいは変化させるような標的との反応、（自殺阻害剤におけるような）標的への共有結合的付着、及び標的と別の分子の間の反応促進が含まれる。
【００５６】
〔００７０〕  アプタマー親和性複合体：本明細書で用いる際、「アプタマー標的親和性複合体」、「アプタマー親和性複合体」または「アプタマー複合体」または「複合体」という用語は、アプタマーとその標的分子との相互作用によって形成される非共有結合複合体を指す。「アプタマー標的親和性複合体」、「アプタマー親和性複合体」または「アプタマー複合体」または「複合体」は、１より多いそのような複合体のセットを指す。アプタマー標的親和性複合体、アプタマー親和性複合体またはアプタマー複合体もしくは複合体は、一般的に、環境条件の変化、例えば、温度の上昇、塩濃度の増加、または変性剤の添加によって、逆行または分離させることができる。しかしながら、所望であれば、そのような複合体は共有結合的な相互作用であり得る。
【００５７】
〔００７１〕  増幅可能：増幅可能という用語は、本明細書で用いる際、複製またはコピー可能でより多くのそのコピーを作製できる分子（例えば、核酸分子またはアプタマー）を指す。
【００５８】
〔００７２〕  類似体：類似体という用語は、本明細書で用いる際、構造的化学類似体並びに機能的化学類似体を指す。構造的化学類似体は、別の化学化合物と同様な構造を有するが、１以上の原子または官能基が異なる化合物である。この違いは、原子または官能基の添加、原子または官能基の不在、原子または官能基の置換、またはその組合せによるものであり得る。機能的化学類似体は、同様の化学的、生化学的及び／または薬理学的特性を有する化合物である。類似体という用語は、化合物のＳ及びＲ立体異性体をも含んでよい。
【００５９】
〔００７３〕  生物活性：生物活性という用語は、本明細書で用いる際、生理学的または病態生理学的プロセスに影響し得る１以上の細胞間、細胞内または細胞外プロセス（例えば、細胞‐細胞結合、リガンド‐受容体結合、細胞シグナリング等）を指す。
【００６０】
〔００７４〕  生物試料：生物試料は、本明細書で用いる際、「試料」及び「テスト試料」を指し、これらは交換可能に用いられ、あらゆる材料、生物学的液体、組織または個体から取得する細胞もしくはその他個体に由来するものを指す。この例として、血液（全血、白血球、末梢血単核細胞、バフィーコート、血漿、及び血清を含む）痰、涙、粘液、鼻の洗浄液、鼻の息、息、尿、精液、唾液、髄膜液、羊水、腺液、リンパ液、乳頭吸引液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄液があげられる。例としてはさらに、上記の全ての実験的に分離された画分もあげられる。例えば、血液試料は血清または血液細胞の特定のタイプを含有する、赤血球細胞や白血球細胞（白血球）等の画分に分画できる。必要であれば、試料は、組織及び液体試料の組合せ等の、個体由来の試料の組合せであることができる。「生物試料」という用語はまた、例えば、糞便試料、組織試料、または組織生検等に由来する、ホモジナイズされた固形材料を含有する、材料も含む。「生物試料」という用語はまた、組織培養または細胞培養に由来する材料も含む。生物試料の取得に適切な方法であればいずれも採用可能であり、その代表例としては静脈切開、スワブ（例えば、口腔スワブ）、及び穿刺吸引細胞診手法などがあげられる。穿刺吸引が可能な組織の代表例としてはリンパ節、肺、肺洗浄、ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）、甲状腺、胸、及び肝臓があげられる。試料は、顕微解剖（例えば、レーザーキャプチャー顕微解剖（ＬＣＭ）またはレーザー顕微解剖（ＬＭＤ））、膀胱洗浄、スメアー（例えば、ＰＡＰスメアー）、もしくは管洗浄等によってさらに回収可能である。個体から取得または個体に由来する「生物試料」には、個体から取得後に任意の適切な方式で処理したあらゆる試料が含まれる。
【００６１】
〔００７５〕  Ｃ−５修飾ピリミジン：Ｃ−５修飾ピリミジン（またはＣ−５修飾ヌクレオチド）は、本明細書で用いる際、Ｃ−５位に修飾があるピリミジンを指す。Ｃ−５修飾ピリミジンの例として、米国特許第５，７１９，２７３号及び同第５、９４５、５２７号、並びに、「ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と題して２０１０年１２月１４日に出願の米国仮特許出願第６１/４２２，９５７号に記載のものがあげられる。追加例をここに記載する。
【００６２】
〔００７６〕  細胞表面タンパク質：細胞表面タンパク質は、本明細書で用いる際、細胞の表面、細胞膜、細胞壁エンベロープ上に発現されるか、または、細胞膜もしくは細胞壁エンベロープ及び／または細胞の細胞内スペース内に発現されたタンパク質の１部分またはドメインを有する細胞の外部表面上、細胞膜の外部上もしくは細胞壁エンベロープ上に、露出するドメインを有するタンパク質を指す。
【００６３】
〔００７７〕  コンセンサス配列：コンセンサス配列は、本明細書で用いる際、配列アライメントを行った一連の核酸配列の各位置で、最も高頻度に見られたヌクレオチドを表すヌクレオチド配列を指す。
【００６４】
〔００７８〕  共有結合：共有結合または相互作用は、原子間の少なくとも一対の電子の共有に関与する化学結合を指す。
〔００７９〕  濃縮：濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）（濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））という用語は、本明細書で用いる際、少なくとも１つの成分（例えば、複合体またはアプタマー‐標的複合体）または成分群が比例で表した場合に結果的に別の成分または成分群と比べて増加するようなプロセスに、試料をかけることを意味する。濃縮は、１つの成分が別の成分と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％増加することを意味してよい。
【００６５】
〔００８０〕  阻害：阻害という用語は、本明細書で用いる際、ペプチドまたはポリペプチドの発現を、該ペプチドまたはポリペプチドがもはや測定可能な活性または生物活性を有しない程度に防ぐかまたは低減させる、または、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を低減、及び／またはその活性を、該ペプチドまたはポリペプチドが測定可能な活性または生物活性をもはや有しない程度に低減または防ぐことを意味する。
【００６６】
〔００８１〕  微生物：微生物という用語は、本明細書で用いる際、単細胞または多細胞生物を指し、細菌、古細菌、原生動物、菌類、藻類、微小植物、輪虫類、渦虫類、ウイルス等を含み得る。
【００６７】
〔００８２〕  修飾：修飾される（または修飾するもしくは修飾）という用語及びそのいずれかのバリエーションは、オリゴヌクレオチドに関して用いる場合、オリゴヌクレオチドの４つの構成要素であるヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ/Ｕ、及びＣ）の少なくとも１つが、天然に生じるヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。
【００６８】
〔００８３〕  調節：調節という用語は、本明細書で用いる際、基準発現量に対してペプチド、タンパク質またはポリペプチドの発現量を増加または減少させることによって、その発現量を変化させること、及び／または、基準安定性及び／または活性レベルに対してペプチド、タンパク質またはポリペプチドの安定性及び／または活性レベルを増強または低減させることによって、その安定性及び／または活性を変化させることを意味する。
【００６９】
〔００８４〕  非共有結合：非共有結合または非共有相互作用は、原子間の電子対の共有を含まない、化学結合または相互作用を指す。非共有結合または相互作用の例としては、水素結合、イオン結合（静電結合）、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用があげられる。
【００７０】
〔００８５〕  核酸：核酸は、本明細書で用いる際、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはその類似体を含有するあらゆる核酸配列を指し、またこれは一本鎖、二本鎖及び複数鎖の形を含んでよい。「核酸」、「オリゴ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、交換可能に使用してよい。
【００７１】
〔００８６〕  医薬的に許容される：医薬的に許容されるとは、本明細書で用いる際、動物及びとりわけ人間における使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局により認可される、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められる薬局方に記載されていることを意味する。
【００７２】
〔００８７〕  医薬的に許容される塩：医薬的に許容される塩または化合物（例えば、アプタマー）の塩は、本明細書で用いる際、イオン結合を含有する生成物を指し、代表的には化合物を、個体への投与に好適な酸または塩基のどちらかと反応させて生成する。医薬的に許容される塩の例としては、限定するものではないが、酸付加塩類、例えば、塩酸塩、臭化水素酸、リン酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、アルキルスルホン酸塩、アリールスルホン酸塩、アリールアルキルスルホン酸塩、酢酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、乳酸塩、及び酒石酸塩；アルカリ金属カチオン、例えば、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、アルカリ土類金属塩、例えばＭｇもしくはＣａ、または有機アミン塩があげられる。
【００７３】
〔００８８〕医薬組成物：医薬組成物は、本明細書で用いる際、個体投与に好適な形態のアプタマーを含む製剤を指す。医薬組成物は、典型的にはその意図する投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例としては、限定するものではないが、経口及び非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、吸入、局所、経皮、経粘膜、及び直腸投与があげられる。
【００７４】
〔００８９〕  ＳＥＬＥＸ：ＳＥＬＥＸという用語は、本明細書で用いる際、通常、望ましい方式にて標的分子と相互作用する核酸についての選択を指し、例えば、高親和性でのタンパク質との結合及び選択した核酸の増幅があげられる。ＳＥＬＥＸは、特定の標的分子に高親和性を有するアプタマーの同定に用いてもよい。ＳＥＬＥＸ及び「ＳＥＬＥＸプロセス」という用語は交換可能に用いてよい。
【００７５】
〔００９０〕  配列同一性：配列同一性は、本明細書で用いる際、２つ以上の核酸配列との関連で、ギャップ数及び２つ以上の配列のアライメントを最適にするのに導入を要する各ギャップの長さを考慮した、これら配列で共有する同一のヌクレオチド位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／全位置の数ｘ１００）。配列比較及び２つ以上の配列間の％同一性の決定は、そのデフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴやＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラム等の数学的アルゴリズムを用いて行うことができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３，  １９９０；ＢＬＡＳＴＮ  ａｔ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照）。配列比較に関しては、典型的には１つの配列が、試験配列と比較する基準配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び基準配列をコンピュータに入力、必要に応じてサブ配列座標を指定、さらに配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで配列比較アルゴリズムによって、試験配列（または複数の試験配列）の基準配列に対する％配列同一性が、指定したプログラムパラメーターに基づいて、算出される。比較に最適な配列のアライメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２，  １９８１）の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３，  １９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４，  １９８８）の類似性のサーチ法、これらアルゴリズムのコンピュータ化された実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）、または目視検査（通常、Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂ．  ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （１９８７）を参照）によって実施できる。本明細書で用いる際、核酸の％同一性を記載する場合、例えばＳｐａ（またはＳＰＡ）アプタマー、その配列が少なくとも、例えば、基準ヌクレオチド配列に約９５％同一であれば、当該核酸配列が基準核酸配列の１００ヌクレオチドにつき５つまでの点突然変異を有する場合を除き、この核酸配列は基準配列と同一であることを意味する。換言すれば、望ましい核酸配列を取得するには、その配列の少なくとも約９５％が基準核酸配列に同一であれば、その基準配列中の５％までのヌクレオチドを検出または別のヌクレオチドと置換してよいか、またはこの基準配列中のヌクレオチドの全数の５％までのヌクレオチドの数をこの基準配列（ここで挿入配列と称する）に挿入してよい。望ましい配列生成のための基準配列のこうした突然変異は、基準ヌクレオチド配列の５’��しくは３’末端位置または、これら末端位置間のいずれかの位置であって、該基準配列中ヌクレオチド間に別個にかもしくは該基準配列内の１以上の隣接基間のどちらかに挿入され点在する位置にて発生し得る。
【００７６】
〔００９１〕  固体支持体：固体支持体は、分子が、直接もしくは間接的に、共有かまたは非共有結合を介して付着し得る表面を有するあらゆる基材を指す。固体支持体の例には、その表面に付加する捕捉要素またはプローブに物理的な支持を提供可能なあらゆる基材材料が含まれる。材料は通常、捕捉要素またはプローブのその表面への付着、並びに、あらゆる後続処理、取扱、またはアッセイ実行中に遭遇する加工に関連する条件に耐えうる。材料は、天然に生じる材料、合成材料、または天然に生じる材料を修飾した材料であってよい。適当な固体支持体材料は、シリコン、シリコンウェーハチップ、グラファイト、鏡面、積層、膜、セラミック、プラスチック（例えば、ポリ（ビニルクロライド）、シクロオレフィン共重合体、アガロースゲルもしくはビーズ、ポリアクリルアミド、ポリアクリラート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥまたはＴｅｆｌｏｎ（登録商標））、ナイロン、ポリ（ビニルブチラート）等のポリマーを含む）、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、金、銀、ラングミュア‐ブロジェット膜、フロースルーチップ等の、それ自身で用いるかまたは他の材料と併用するものを含んでよい。シリカを含み、かつ、例えば、バイオガラスとして利用可能なガラスをさらに含む、ガラス等のさらなる硬質材料も考慮してよい。利用してよい他の材料は、例えば、制御孔ガラスビーズ、架橋ビーズＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、もしくはアガロース樹脂等の多孔質材料、または架橋ビス−アクリルアミド及びアザラクトンのコポリマーを含む。他のビーズは、ナノ粒子、ポリマービーズ、固体コアビーズ、常磁性ビーズ、またはマイクロビーズを含む。例えば、表面上に取り込まれた、１つ以上の官能基、例えば、アミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシル官能基のいずれかを有することができる、当該技術分野で既知の任意の他の材料も企図される。
【００７７】
〔００９２〕  固体支持体に用いられる材料は、単純から複雑までの範囲に及ぶ多様な構成のうちのいずれをとってもよい。固体支持体は、ストリップ、プレート、ディスク、ロッド、粒子、ビーズ、チューブ、ウェル（マイクロタイター）等を含む、多くの形状のうちのいずれか１つを有することができる。固体支持体は、多孔質または非多孔質、磁性、常磁性または非磁性、多分散または単分散、親水性または疎水性であってもよい。固体支持体はまた、密接に充填された（カラムマトリックスにおけるように）または緩やかに充填された粒子のゲルまたはスラリーの形態であってもよい。
【００７８】
〔００９３〕  一実施形態において、捕捉要素が付着した固体支持体を用いて、タグ付アプタマー−標的親和性複合体またはアプタマー−標的共有結合複合体を試験混合物から捕捉する。１つの具体例において、タグがビオチン部分である場合、固体支持体は、ストレプトアビジンを被覆したビーズまたは樹脂、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジン、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０ストレプトアビジン（インビトロジェン）、ストレプトアビジンアガロース樹脂（ピアス）、ストレプトアビジンＵｌｔｒａｌｉｎｋ樹脂、ＭａｇｎａＢｉｎｄストレプトアビジンビーズ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＢｉｏＭａｇストレプトアビジン、ＰｒｏＭａｇストレプトアビジン、シリカストレプトアビジン（バングズラボラトリーズ）、ストレプトアビジンセファロースＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ＧＥヘルスケア）、ストレプトアビジンポリスチレンミクロスフェア（ミクロスフェア‐ナノスフェア）、ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子（スフェロテック）、またはビオチンタグ付き分子を捕捉するために当業者によって一般的に用いられる任意の他のストレプトアビジンを被覆したビーズもしくは樹脂であってもよい。
【００７９】
〔００９４〕  本発明の１つの目的は、タンパク質シグナルをアプタマーシグナルに変換することである。その結果として、収集／検出されたアプタマーの量は、結合した標的分子量及び試料中の標的分子量の指標となり、またそれらに直接比例し得る。第２分配またはキャッチの後に、第二固体支持体からアプタマー−標的親和性またはアプタマー−標的共有結合複合体を溶出させることなく、多くの検出スキームを用いることができる。以下の検出法の実施形態に加えて、他の検出法が当業者に既知である。
【００８０】
〔００９５〕  多くの検出法は、検出の前にアプタマーに取り込まれる明示的な標識を必要とする。これらの実施形態において、核酸合成のための標準技術を用いて、合成中または合成後のいずれかに、例えば、蛍光色素または化学発光色素等の標識をアプタマー内に取り込むことができる。適切な試薬とともに標準的な酵素反応を用いて、合成中または合成後のいずれかに、放射性標識を取り込むことができる。標識化はまた、好適な酵素技術を用いることによって、第２分配及び溶出の後に行うことができる。例えば、上述の標識を有するプライマーを用いて、ＰＣＲにより、溶出したアプタマーの増幅産物内に標識が取り込まれる。定量化のためにゲル技術を用いる場合、同様にＰＣＲを用いて異なるサイズの質量標識を取り込むことができる。これらの質量標識はまた、さらなる多重化能力のために、異なる蛍光色素または化学発光色素も取り込むことができる。合成中または合成後のいずれかにアプタマーに取り込まれる特異的タグを用い、次いで、タグと会合し、かつ標識を担持するプローブを添加することによって、標識を間接的にアプタマーに添加してもよい。標識は、上述のもの、及び、例えば、比色読み取りのための標準的なアッセイに使用される酵素を含む。これらの酵素は、酵素基質と合わさって作用し、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）等の酵素を含む。標識は、電気化学的検出のための電気化学的官能基である材料または化合物も含んでよい。
【００８１】
〔００９６〕  例えば、アプタマーは、試験試料と接触させる前に、上述のように３２Ｐ等の放射性同位元素で標識してもよい。４つの基本的アッセイ、及び上述のようなそのバリエーションのうちのいずれか１つを利用して、アッセイ終了時に第二固体支持体上の放射活性を定量するだけで、アプタマーを検出し得る。放射活性のカウントは、元の試験試料中の標的の量に正比例する。同様に、試験試料と接触させる前に、アプタマーを上述のように蛍光色素で標識すると、第二固体支持体上で直接、単純な蛍光読み取りが可能となる。同様に、アプタマーの溶出を必要とせずに、第二固体支持体からの直接的な読み取りのために、化学発光標識または量子ドットを利用することができる。
【００８２】
〔００９７〕  別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、複製プロセス中に「分子ビーコン」を用いて決定される（例えば、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｊ．  ６：４９  ５３，  １９９８；米国特許第５，９２５，５１７号を参照）。分子ビーコンは、折り畳まれてヘアピンループになり、ヘアピンが形成された時に、フルオロフォアによってほとんどまたはまったくシグナルが発生しないように、ヘアピン構造の一方の端にフルオロフォアを、他方の端に消光剤を含有する、特異的核酸プローブである。ループ配列は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的であり、アプタマー配列にハイブリダイズすると、ヘアピンの折り畳み構造がほどけ、それによって蛍光シグナルを発生する。
【００８３】
〔００９８〕  第二固体支持体になおも結合する少数のアプタマーの多重化検出のために、異なる励起／発光スペクトルを有する蛍光色素を用いて、２つ、または３つ、または５つ、または最大１０個の個々のアプタマーを検出及び定量できる。同様に、多重化読み取りのために、異なるサイズの量子ドットを用いることができる。第二固体支持体から遊離アプタマーを分配した後で量子ドットを導入できる。固有の量子ドットに付着したアプタマー特異的ハイブリダイゼーション配列を用いることにより、２、３、４、５、及び最大１０個のアプタマーの多重化読み取りを行うことができる。個々に検出され得る異なる放射性同位体、例えば、３２Ｐ、３Ｈ、１３Ｃ、及び３５Ｓ等を用いた異なるアプタマーの標識化も、限定された多重化読み取りに用いることができる。
【００８４】
〔００９９〕  一実施形態において、スライドまたはチップ（アジレントのアレイ、イルミナのＢｅａｄＣｈｉｐアレイ、ニンブルジェンのアレイ、またはカスタムプリントしたアレイ等）に固定された固有のプローブまたは一連の固有のプローブに各アプタマーまたは光アプタマーをハイブリダイズさせるために、標準的なＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、またはチップが用いられる。それぞれの固有のプローブは、アプタマー上の配列に相補的である。相補配列は、アプタマーに取り込まれた固有のハイブリダイゼーションタグ、またはアプタマー配列の一部、または全アプタマー配列であってもよい。第二分配またはキャッチ後に固体支持体から放出されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なハイブリダイゼーション法を用いて処理される。例えば、アプタマー溶液をＤＮＡハイブリダイゼーションアレイとともに約６０℃で１２時間インキュベートして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。アレイを洗浄し、次いで、蛍光スライドスキャナで走査して、アレイの各特徴についてアプタマーハイブリダイゼーション強度の画像を生成する。画像のセグメント化及び定量化は、ＡｒｒａｙＶｉｓｉｏｎ等の画像処理ソフトウェアを使用して達成される。一実施形態において、多重化アプタマーアッセイは、最大２５個のアプタマー、最大５０個のアプタマー、最大１００個のアプタマー、最大２００個のアプタマー、最大５００個のアプタマー、最大１０００個のアプタマー、及び、最大１０，０００個のアプタマーを用いて検出できる。
【００８５】
〔００１００〕  一実施形態において、上述のようなアプタマーに相補的な固有のＤＮＡプローブを有するアドレス可能マイクロビーズが、ハイブリダイゼーションに用いられる。マイクロビーズは、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ技術等の固有の蛍光色素を用いてアドレス可能であり得るか、または、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＶｅｒａＣｏｄｅ技術におけるようなバーコード標識、もしくはレーザ方式のトランスポンダーを用いる。一実施形態において、第二固体支持体から放出されたアプタマーは、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に添加され、標準的なマイクロビーズハイブリダイゼーション法を用いて処理される。例えば、アプタマー溶液をマイクロビーズのセットとともに約６０℃で２時間インキュベートして、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを確保する。次いで、個々のビーズの種類を数えてアプタマー蛍光シグナルを定量するＬｕｍｉｎｅｘ機器で溶液を処理する。別の実施形態において、ＶｅｒａＣｏｄｅビーズをアプタマー溶液と接触させ、約６０℃で２時間ハイブリダイズさせ、次いで、グリッド入りの表面に沈着させて、同定及び蛍光定量化のためにスライドスキャナを使用して走査する。別の実施形態において、トランスポンダー用マイクロビーズをアプタマー試料とともに約６０℃でインキュベートし、次いでトランスポンダー用マイクロビーズに適切なデバイスを使用して定量する。一実施形態において、多重化アプタマーアッセイは、最大２５個のアプタマー、最大５０個のアプタマー、最大１００個のアプタマー、最大２００個のアプタマー、及び、最大５００個のアプタマーを用いたマイクロビーズへのハイブリダイゼーションによって検出できる。
【００８６】
〔００１０１〕  溶出したアプタマーを含有する試料は、上述のような蛍光標識とともに固有の質量タグを取り込むように処理できる。次いで、質量標識アプタマーを、本質的にはＤＮＡシーケンサーであるＣＧＥ機器に注入し、それらの固有の質量によってアプタマーを同定し、標識反応中に取り込まれた色素からの蛍光を用いて定量する。この技術の１つの代表的な例が、アルテアテクノロジーズによって開発されている。
【００８７】
〔００１０２〕  上述の方法の多くにおいて、アプタマーの溶液は、増幅することができ、任意に、定量化前にタグ付けできる。標準的なＰＣＲ増幅が、第二固体支持体から溶出したアプタマーの溶液と共に使用できる。そのような増幅は、ＤＮＡアレイハイブリダイゼーション、マイクロビーズハイブリダイゼーション、及びＣＧＥ読み取りの前に用いることができる。
【００８８】
〔００１０３〕  別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）は、Ｑ−ＰＣＲを用いて検出及び／または定量される。本明細書において使用される場合、「Ｑ−ＰＣＲ」は、アッセイの結果が定量的である、すなわち、アッセイが、試験試料中に存在するアプタマーの量または濃度を定量できるような方式で、また、そのような制御条件下で行われるＰＣＲ反応を指す。
【００８９】
〔００１０４〕  一実施形態において、試験試料中のアプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲを用いて決定される。この技術は、一般的に、標的配列からシグナルを発生させるために、オリゴヌクレオチド複製酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に依存する。ＴａｑＭａｎプローブは、定量されるアプタマーの配列に基づいて選択され、一般的に、例えば、６−カルボキシフルオレセイン等の５’末端フルオロフォア、及び、例えば、６−カルボキシテトラメチルフルオレセイン等の３’末端消光剤を含み、アプタマー配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅されるとシグナルを発生する。ポリメラーゼがアプタマー配列をコピーすると、ＰＣＲプライマーから下流にアニーリングされたプローブからエキソヌクレアーゼ活性によりフルオロフォアが遊離され、それによってシグナルを発生する。複製産物が生成されるとシグナルが増加する。ＰＣＲ産物の量は、行われる複製サイクル数、及びアプタマーの出発濃度の両方に依存する。
【００９０】
〔００１０５〕  別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）の量または濃度は、複製プロセス中に挿入蛍光色素を用いて決定される。例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）グリーン等の挿入色素は、一本鎖ＤＮＡの存在下で発生する蛍光シグナルと比較して、二本鎖ＤＮＡの存在下で大きな蛍光シグナルを発生する。ＰＣＲ中に二本鎖ＤＮＡ産物が形成されると、色素によって生成されるシグナルが増加する。生成されるシグナルの大きさは、ＰＣＲサイクル数及びアプタマーの出発濃度の両方に依存する。
【００９１】
〔００１０６〕  別の実施形態において、アプタマー−標的親和性複合体（またはアプタマー−標的共有結合複合体）は、質量分析を用いて検出及び／または定量される。上述の酵素技術を用いて固有の質量タグを導入できる。質量分析による読み取りに、検出標識は必要なく、むしろ質量自体を用いて、同定、及び、当業者に一般的に用いられる技術を用いて、質量分析法による分析中に生じる質量ピークの位置及び質量ピーク下面積に基づいた定量の両方を行った。質量分析を使用した例は、Ｓｅｑｕｅｎｏｍによって開発されたＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システムである。
【００９２】
〔００１０７〕  ＳＯＭＡｍｅｒ：ＳＯＭＡｍｅｒ（またはＳＯＭＡｍｅｒ試薬）という用語は、本明細書で用いる際、そのオフ速度の特徴が改良されているアプタマーを指す。ＳＯＭＡｍｅｒ試薬は、あるいは、遅いオフ速度の（Ｓｌｏｗ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅ）修飾アプタマーとも称され、ここにその全体を参照として組み入れる、「改良されたＯｆｆ−Ｒａｔｅを有するアプタマー生成方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ）」と題する米国特許出願公開第２００９０００４６６７号に記載の改良されたＳＥＬＥＸ法により選択されてよい。遅いオフ速度の修飾アプタマーは、３０分以上、６０分以上、９０分以上、１２０分以上、１５０分以上、１８０分以上、２１０分以上、または２４０分以上のオフ速度（ｔ1/2）を有するアプタマー（疎水性修飾を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むアプタマーを含む）を指す。
【００９３】
〔００１０８〕  スペーサー配列：スペーサー配列は、本明細書で用いる際、アプタマーの核酸配列の５’末端、３’末端または５’及び３’末端の両端に共有的に結合した小分子（または複数の小分子）を含むあらゆる配列を指す。スペーサー配列の代表例としては、限定するものではないが、ポリエチレングリコール、炭化水素鎖、及び標的−アプタマー結合活性を保持する一方でコンセンサス領域を接続する共有結合の分子足場を提供する他のポリマーまたはコポリマーがあげられる。ある特定の態様においては、このスペーサー配列は、例えば末端３’または５’ヒドロキシル、２’炭素、またはピリミジンのＣ５位もしくはプリンのＣ８位等の塩基修飾といった標準的な結合を介して、アプタマーに共有結合的に付着させてよい。
【００９４】
〔００１０９〕  実質的に除去：実質的に除去とは、本明細書で用いる際、別の１成分（例えば、固体支持体またはアプタマー‐標的複合体に結合した材料）と比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上の１成分または複数の成分（例えば、固体支持体に結合していない材料）を除去することを意味する。
【００９５】
〔００１１０〕  タグ：本明細書に開示されるように、アプタマーは、「タグ」をさらに含むことができ、それは、固体支持体にアプタマー（及びそれに結合した任意の標的分子）を付着させるかまたは固定するための手段、及び／または、アプタマーまたは複合体（アプタマー−標的複合体）を検出するための手段を提供する成分を指す。「タグ」は、「捕捉要素」と会合することができる部分である。「タグ」または「捕捉要素」は、１つより多くのそのような成分のセットを指す。タグは、任意の好適な方法によって、アプタマーに付着させることができるか、または含めることができる。一般的に、タグは、アプタマーが、固体支持体に付着した捕捉要素または受容体と、直接的または間接的のいずれかで会合できるようにする。捕捉要素は、典型的には、タグとの相互作用において非常に特異的であり、かつ、それに続く処理ステップまたは手順の間に、その会合を保持するように選択（または設計）される。タグは、固体支持体上の空間的に定義されたアドレスへの、アプタマー−標的親和性複合体（または共有結合アプタマー−標的親和性複合体）の局在化を可能にすることができる。したがって、異なるタグが、固体支持体上の空間的に定義された異なるアドレスへの異なるアプタマー−標的共有結合複合体の局在化を可能にすることができる。タグは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、またはこれらの構造のあらゆる断片もしくは誘導体、上記の任意の組み合わせ、または捕捉要素（もしくは後に記載するようなリンカー分子）が特異性を持って結合するかさもなければ会合するように設計もしくは設定できる任意の他の構造であることができる。検出を目的とするタグという文脈では、タグは色素、量子ドット、放射標識、ＰＣＲプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質であってよい。タグは、アプタマーに付着する２つの異なるドメインまたは領域を含んでもよく、これによってアプタマーを検出可能とする（例えば、ＰＣＲプライマー部位がアプタマーの５’または３’末端に付着し得る２つの異なる核酸配列を含むか、または、場合によっては１つのＰＣＲプライマー部位がアプタマーの５’末端に付着し、第二ＰＣＲプライマーセット（１対の）がアプタマーの３’末端に付着する）。
【００９６】
〔００１１１〕  通常、タグはＳＥＬＥＸ前またはＳＥＬＥＸ後のどちらかにアプタマーに加えてよい。一実施形態において、タグはアプタマーの５’末端に含まれる。別の実施形態において、タグはアプタマーの３’末端に含まれる。また別の実施形態において、タグはアプタマーの５’末端と３’末端の両方に含まれてもよい。別の実施形態において、タグはアプタマーの内部セグメントであってよい。
【００９７】
〔００１１２〕  標的分子：標的分子（または標的）は、本明細書で用いる際、核酸が所望の様式で作用し得るあらゆる化合物または分子を指す（例えば、標的の結合、標的を触媒的に変化させる、標的と反応して標的またはその機能的活性を修飾もしくは変性させる、標的に共有結合的に付着（自殺阻害剤におけるように）、及び標的と別の分子間の反応を促進）。標的分子の例としては、限定するものではないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、ウイルス、病原体、有害物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、前述のいずれかのいずれかの部分または断片等があげられる。実質的にあらゆる化学的または生物学的エフェクターは、好適な標的であってよい。あらゆるサイズの分子が標的としての役割を果たし得る。また、標的は、標的と核酸との間の相互作用の可能性または強度を高めるようにある特定の方法で修飾することもできる。また、標的の例としては、特定化合物もしくは分子にわずかな変更を加えたバリエーション、例えば、タンパク質の場合、例えば、そのアミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化におけるバリエーション、または、他のあらゆる操作もしくは修飾、例えば、分子の同一性を実質的に変性させない、標識成分とのコンジュゲーションがあげられる。「標的分子」または「標的」は、あるタイプの分子もしくは分子種のコピー１セット、または、アプタマーに結合可能な多分子構造を指す。「標的分子」または「標的」は、こうした２セット以上の分子を指す。
【００９８】
〔００１１３〕  本明細書で用いる際、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチド、またはそれらの修飾形態、及びその類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、ならびにその誘導体及び類似体）、ならびにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、ならびにその誘導体及び類似体）を含む種を含む。
【００９９】
〔００１１４〕  本明細書で用いる際、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指して交換可能に使用され、これらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及び修飾型を含み、種々の実体または部分の任意の位置におけるヌクレオチド単位への付着が含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖分子、及び三重らせん分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広義の用語であるため、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーであるヌクレオチドのポリマーを含むが、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーに限定されない。
【０１００】
〔００１１５〕  本明細書で用いる際、「修飾する」、「修飾された」、「修飾」、及びそのバリエーションのいずれかは、オリゴヌクレオチドに関して用いる場合は、オリゴヌクレオチドの４つの構成成分であるヌクレオチド塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｔ/Ｕ、及びＣ）の少なくとも１つが天然に生じるヌクレオチドの類似体またはエステルであることを意味する。いくつかの実施形態において、この修飾ヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに付与する。いくつかの実施形態において、この修飾ヌクレオチドは、主にアプタマーとタンパク質標的との疎水的相互作用をもたらし、高結合効率と安定的な共結晶複合体が得られる。Ｃ−５位における置換を有するピリミジンは、修飾ヌクレオチドの１例である。修飾例としては、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等の異例の塩基対の組合せ等があげられる。修飾としてはさらに、キャッピング等の３’及び５’修飾があげられる。他の修飾としては、１つ以上の天然に生じるヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾等、例えば、無荷電連結（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅｓ）、カルバメート等）を有するもの、荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、干渉物質（例えば、アクリジン、ソラーレン等）を有するもの、キレーター（例えば、金属類、放射性金属類、ホウ素、酸化的金属類等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸等）を有するものがあげられる。さらに、通常ヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかはホスホン酸基またはリン酸基で置換してよく；標準的な保護基で保護してよく；または活性化してさらに別のヌクレオチドまたは固体支持体への追加連結を調製してよい。５’及び３’末端ＯＨ基はリン酸化またはアミン、約１〜約２０炭素原子の有機キャッピング基部分、いくつかの実施形態では約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、いくつかの実施形態では約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーでリン酸化または置換可能である。いくつかの実施形態において、修飾は、ピリミジンのＣ−５位の修飾である。これら修飾は、直接Ｃ−５位におけるアミド連結または他のタイプの連結を介してなされ得る。
【０１０１】
〔００１１６〕  ポリヌクレオチドは当技術分野において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型を含有することもでき、それには２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノースもしくはキシロース類、リキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上記で言及したように、１以上のホスホジエステル連結を代わりの連結基により置換してよい。これらの代わりの連結基には、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置換されている態様が含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は独立してＨまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖類、プリン類、及びピリミジン類の類似型の置換は最終産物の設計において好都合であり得、例えばポリアミド主鎖のような代わりの主鎖構造も好都合であり得る。
【０１０２】
〔００１１７〕  本明細書で用いる際、「ヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間の燐酸ジエステル結合を切断可能である酵素を指す。本明細書で用いる際、「エンドヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの内部の部位における１以上の燐酸ジエステル結合を切断する酵素を指す。本明細書で用いる際、「エキソヌクレアーゼ」という用語は、オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドを連結する１以上の燐酸ジエステル結合を切断する酵素を指す。生物学的液体は典型的にはエンドヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼの混合物を含有する。
【０１０３】
〔００１１８〕  本明細書で用いる際、「ヌクレアーゼ耐性の」及び「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、エンドまたはエキソヌクレアーゼの基質として能力が低下したオリゴヌクレオチドを指し、例えばこうした酵素と接触すると、このオリゴヌクレオチドは分解されないか、または非修飾ヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと分解される。
【０１０４】
〔００１１９〕  本明細書で用いる際、「少なくとも１つのピリミジン」という用語は、核酸の修飾に関してであれば、核酸内の１つ、数個、または全てのピリミジンを指し、核酸内のＣ、Ｔ、またはＵのいずれかまたは全ての、どちらかの発生または全ての発生が修飾か非修飾であり得ることを示す。
【０１０５】
〔００１２０〕  本明細書で用いる際、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ及びＴはそれぞれ、別途明記しない限りｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＵ及びｄＴを示す。
〔００１２１〕  本明細書で用いる際、「核酸リガンド」、「アプタマー」、及び「クローン」は、標的分子に対する望ましい作用を有する非天然の核酸を指して交換可能に用いられる。望ましい作用は、限定するものではないが、標的の結合、標的を触媒的に変化させ、標的または標的の機能活性を修飾または変更するように標的と反応させ、共有結合的に標的に付着させること（自殺阻害剤におけるように）、及び標的と別の分子との間の反応を促進することを含む。いくつかの実施形態において、作用は、標的分子に対する特異的結合親和性であり、そのような標的分子は、Ｗａｔｓｏｎ／Ｃｒｉｃｋ塩基対形成または三重らせん形成とは無関係な機構を介して核酸リガンドに結合するポリヌクレオチド以外の三次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子によって結合されるといった既知の生理学的機能を有する核酸ではない。所与の標的に対するアプタマーは、（ａ）候補混合物を標的と接触させ、候補混合物中の他の核酸と比較して標的に対する高い親和性を有する核酸を、候補混合物の残りから分配可能であり、（ｂ）候補混合物の残りからより高い親和性の核酸を分配し、（ｃ）リガンドが豊富な核酸混合物を得るようにより高い親和性の核酸を増殖させ、それによって標的分子のアプタマーが同定される、ことを含む方法によって、核酸の候補混合物から同定される核酸を含む（アプタマーは標的のリガンドである）。親和性相互作用が程度の問題であることは認識されているが、この文脈において、アプタマーのその標的に対する「特異的結合親和性」とは、アプタマーが、混合物または試料中の、他の標的以外の成分に結合するよりもはるかに高い程度の親和性でその標的に結合することを意味する。「アプタマー」または「核酸リガンド」は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子のタイプまたは種のコピー１セットである。アプタマーは、任意の好適な数のヌクレオチドを含むことができる。「アプタマー」は、１つより多くのそのような分子のセットを指す。異なるアプタマーが、同じかまたは異なる数のヌクレオチドを有することができる。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、かつ一本鎖、二本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは三本鎖領域を含有してもよい。
【０１０６】
〔００１２２〕  本明細書で用いる際、「タンパク質」は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「ペプチド断片」と同義的に用いられる。「精製（された）」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、またはペプチド断片は、そのアミノ酸配列を取得する細胞、組織、または無細胞供給源に由来する細胞材料も他の混在タンパク質をも実質的に含まないかまたは、化学的に合成される際は、化学前駆体も他の化学品も実質的に含まない。
【０１０７】
〔００１２３〕  「ＳＰＡアプタマー」は、ＳＰＡタンパク質に結合可能なアプタマーである。「ＳｐＡ」、「ＳＰＡ」または「Ｓｐａ」という用語は、交換可能に用いてＳＰＡタンパク質またはＳＰＡアプタマーを指してよい。
【０１０８】
〔００１２４〕  「ＣｌｆＡアプタマー」は、ＣｌｆＡタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔００１２５〕  「ＣｌｆＢアプタマー」は、ＣｌｆＢタンパク質に結合可能なアプタマーである。
【０１０９】
〔００１２６〕  「ＦｎｂＡアプタマー」は、ＦｎｂＡタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔００１２７〕  「ＦｎｂＢアプタマー」は、ＦｎｂＢタンパク質に結合可能なアプタマーである。
【０１１０】
〔００１２８〕  「ＩｓｄＡアプタマー」は、ＩｓｄＡタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔００１２９〕  「ＩｓｄＢアプタマー」は、ＩｓｄＢタンパク質に結合可能なアプタマーである。
【０１１１】
〔００１３０〕  「ＩｓｄＣアプタマー」は、ＩｓｄＣタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔００１３１〕  「ＩｓｄＨアプタマー」は、ＩｓｄＨ多ンパク質に結合可能なアプタマーである。
【０１１２】
〔００１３２〕  「ＳａｓＤアプタマー」は、ＳａｓＤタンパク質に結合可能なアプタマーである。
〔００１３３〕  別途説明のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途文脈上明確な指示のない限り、複数形の指示対象を含むものとする。「ＡまたはＢを含む」は、ＡまたはＢ、またはＡ及びＢを含むことを意味する。さらに、核酸またはポリペプチドに付す全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、及び全ての分子量または分子質量値はおおよその値であり、説明を目的として付与されることを理解されたい。
【０１１３】
〔０１１３４〕  さらに、ここに記載の範囲は、範囲内の値全てについて簡潔にしてあると理解される。例えば、１〜５０の範囲は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０（並びに、別途文脈上明記の無い限り、その分数）からなる群からのあらゆる数、数の組合せ、または部分的範囲の数を含むよう理解される。あらゆる濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、または整数の範囲は、別途指示のない限り、列挙の範囲内のあらゆる整数、及び、適宜、その分数（例えば、ある整数の１０分の１や１００分の１）を含むものと理解されたい。さらに、あらゆる物理的特性、例えばポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関連してここに列挙するあらゆる数の範囲は、別途指示のない限り、列挙範囲内の全ての整数を含むものと理解されたい。本明細書で用いる際、「約」または「実質的に〜から成る」は、別途指示のない限り、指示した範囲、値、または構造のプラスマイナス２０％を意味する。本明細書で用いる際、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、制限的ではなく、同義的に用いられる。冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で用いる際、列挙される成分の「１（つ）以上」を指す。択一（例えば、「または（もしくは）」）の使用は、どちらか１つ、両方、またはその選択肢のいずれかの組合せを意味すると理解されたい。
【０１１４】
〔００１３５〕  ここに記載のものに同様かまたは匹敵する方法や材料を本開示の実践または試験に用いることは可能であるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。本開示で引用するすべての刊行物、特許出願、特許、及びここに記載のその他参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるものとする。矛盾が生じる場合には、用語の説明を含む本明細書が優先される。また、材料、方法及び実施例は例示をのみ目的とするものであり、限定することは意図しない。
【０１１５】
概説
〔００１３６〕  微生物の表面上の特定成分への結合剤は、異なる検出プラットフォームのための有用な価値ある診断ツールであり得る。
【０１１６】
ＳＥＬＥＸ
〔００１３７〕  ＳＥＬＥＸには、一般に、核酸の候補混合物を調製すること、この候補混合物を所望の標的分子へ結合させて親和性複合体を生成すること、この親和性複合体を未結合の候補核酸より分離させること、この親和性複合体より結合核酸を分離して単離すること、その核酸を精製すること、及び特異的なアプタマー配列を同定することが含まれる。この方法には、選択されるアプタマーの親和性をさらに純化させるために、多数のラウンドを含めてよい。この方法には、この方法中の１以上の時点で増幅工程を含めることができる。例えば、「核酸リガンド（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）」と題した米国特許第５，４７５，０９６号を参照のこと。ＳＥＬＥＸ法を使用して、その標的へ共有結合するアプタマーだけでなく、その標的へ非共有的に結合するアプタマーも産生できる。例えば、「指数的濃縮による核酸リガンドの系統進化法：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ）」と題した、米国特許第５，７０５，３３７号を参照のこと。
【０１１７】
〔００１３８〕  ＳＥＬＥＸ法を使用して、例えば、改善されたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性または改善された送達特性のような改善された特性をアプタマーに付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性アプタマーを同定できる。そのような修飾例には、リボース及び／またはリン酸塩及び／または塩基の位置での化学的な置換が含まれる。修飾ヌクレオチドを含有する、ＳＥＬＥＸ法で同定されるアプタマーについては、ピリミジンの５’及び２’位で化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載する、「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と題した米国特許第５，６６０，９８５号に記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾された１以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーについて記載する。拡張された物理及び化学特性を有する核酸ライブラリとＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるそれらの使用について記載する、「ＳＥＬＥＸと光ＳＥＬＥＸ（ＳＥＬＥＸ  ａｎｄ  ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ）」と題した米国特許出願公開第２００９００９８５４９号も参照のこと。
【０１１８】
〔００１３９〕  ＳＥＬＥＸはまた、所望のオフ速度特性を有するアプタマーを同定するために使用することができる。標的分子へ結合し得るアプタマーを生成するための改善されたＳＥＬＥＸ法について記載する、「オフ速度が改善されたアプタマーを生成するための方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ）」と題した米国特許出願公開第２００９０００４６６７号を参照のこと。上述のように、遅いオフ速度のアプタマーは、「ＳＯＭＡｍｅｒ」として知られる。そのそれぞれの標的分子からの解離速度がより遅いアプタマーもしくはＳＯＭＡｍｅｒ試薬及び光アプタマーもしくはＳＯＭＡｍｅｒ試薬を産生するための方法が記載されている。この方法は、候補混合物を標的分子と接触させ、核酸−標的複合体の形成が生じることを可能にし、及び遅いオフ速度濃縮法を実施することを含むが、ここでは解離速度が速い核酸−標的複合体が解離して再形成されない一方で、解離速度が遅い複合体はそのまま残存する。その上、この方法には、オフ速度性能が改善されたアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬を生成する、候補核酸混合物の産生における修飾ヌクレオチドの使用が含まれる。
【０１１９】
〔００１４０〕  アッセイのバリエーションでは、その標的分子にアプタマーが共有結合もしくは「光架橋」できるようにする光反応官能基を含むアプタマーを用いる。例えば、「核酸リガンド診断バイオチップ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｉｐ）」と題した米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応アプタマーは光アプタマーとも称する。例えば、それぞれ「指数関数的濃縮による核酸リガンドの系統的進化（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）：核酸リガンドの光選択と溶液ＳＥＬＥＸ（Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＳＥＬＥＸ）」と題した、米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び米国特許第６，２９１，１８４号；また、例えば、「核酸リガンドの光選択（Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ）」と題した米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイを試料に接触させると、光アプタマーはその標的分子に結合する機会を得て、当該光アプタマーが光活性化され、固体支持体を洗浄して、非特異的に結合した分子を除去する。光アプタマー上で光活性化された官能基による共有結合のため、光アプタマーに結合する標的分子は通常除去されないので、厳格な洗浄条件を採用してよい。
【０１２０】
〔００１４１〕  これらアッセイフォーマットの両方において、試料に接触させる前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬を固体支持体上に固定する。ある特定の状況下では、しかしながら、試料と接触させる前にアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬を固定しても、最適なアッセイは行えない可能性がある。例えば、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬の前もっての固定は、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬と標的分子との、固体支持体表面上において、例えば反応時間が長引き、結果としてアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬のその標的分子への効率的な結合に要するインキュベーション期間が延長する、といった非効率的な混合をもたらし得る。さらに、光アプタマーまたは光アプタマーをアッセイに用い、また固体支持体として利用する材料次第では、この固体支持体が、光アプタマーまたは光アプタマー及びその標的分子間の共有結合形成を引き起こすために用いた光を散乱または吸収しがちであり得る。さらに、採用した方法次第では、固体支持体の表面もまた使用した全ての標識剤に曝露され影響を受けるため、そのアプタマーまたは光アプタマーに結合した標的分子の検出が不正確なものとなり得る。最後に、固体支持体上へのアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬の固定は一般的には、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬を試料に曝露する前に、アプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬−調製ステップ（すなわち、固定）を含み、この調製ステップはアプタマーまたはＳＯＭＡｍｅｒ試薬の活性または機能性に影響し得る。
【０１２１】
〔００１４２〕  アプタマーがその標的を溶液中にて捕捉、次いで、検出前にアプタマー−標的混合物の特定の成分を除去するよう設計された分離ステップの採用を可能にするアプタマーアッセイについても記載がある（「試験試料の多重化分析（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｅｓｔ  ｓａｍｐｌｅｓ）」と題した米国特許出願公開第２００９００４２２０６号を参照）。記載のアプタマーアッセイ法によって、核酸（すなわち、アプタマー）を検出及び定量することによる試験試料中の非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化が可能になる。記載の方法によって非核酸標的の検出及び定量用の核酸代用物（すなわち、アプタマー）が作製され、それにより、増幅を含む広範囲の核酸技術を、タンパク質標的を含むより広い範囲の所望の標的に適用することが可能になる。
【０１２２】
〔００１４３〕  標的がペプチドであるＳＥＬＥＸ法の実施形態については、「精製タンパク質無しの修飾ＳＥＬＥＸ法（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＬＥＸ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）」と題した米国特許第６，３７６，１９０号に記載がある。
【０１２３】
アプタマーへの化学修飾
〔００１４４〕  アプタマーは、その特性及び特徴を改善する修飾ヌクレオチドを含有してよい。こうした改善の非制限的な例として、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、分解に対する安定性、その標的に対する結合親和性、及び／または改善された送達特徴があげられる。
【０１２４】
〔００１４５〕  こうした修飾の例として、リボース及び／またはリン酸塩及び／またはヌクレオチドの塩基位置での化学的置換があげられる。修飾ヌクレオチドを含有するＳＥＬＥＸ法で同定されたアプタマーは、「修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンド（Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」と題した米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、ピリミジンの５’−及び２’−位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドについて記載されている。米国特許第５，５８０，７３７号、（上述を参照）では、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾した１以上のヌクレオチドを含有する高度に特異的なアプタマーについて記載されている。さらに、拡大した物理的及び化学的特性を有する核酸ライブラリ、並びにＳＥＬＥＸ及び光ＳＥＬＥＸにおけるその使用について記載されている「ＳＥＬＥＸ及びＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」と題した米国特許出願公開第２００９００９８５４９号をも参照されたい。
【０１２５】
〔００１４６〕  Ｃ−５修飾の具体例としては、下記に例示のベンジルカルボキシアミド（あるいはベンジルアミノカルボニル）（Ｂｎ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（あるいはナフチルメチルアミノカルボニル）（Ｎａｐ）、トリプタミノカルボキシアミド（あるいはトリプタミノカルボニル）（Ｔｒｐ）、及びイソブチルカルボキシアミド（あるいはイソブチルアミノカルボニル）（ｉＢｕ）から独立して選択される置換基を有する、Ｃ−５位でのデオキシウリジンの置換があげられる。
【０１２６】
【化３】
0006689758.tif 000004
【０１２７】
〔００１４７〕  Ｃ−５修飾の具体例としては、デオキシウリジンの置換があげられる。Ｃ−５修飾ピリミジンの化学修飾はさらに、単独でまたはあらゆる組み合わせで、２’−位糖修飾、環外アミンでの修飾、及び４−チオウリジンの置換等と組み合わせることもできる。
【０１２８】
〔００１４８〕  代表的なＣ−５修飾ピリミジンとしては、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジン、５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−フルオロウリジンまたは５−（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン）があげられる。
【０１２９】
〔００１４９〕  存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に付与できる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で分断され得る。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーション等によって、重合後にさらに修飾できる。
【０１３０】
〔００１５０〕  本開示の核酸配列中に組み込んでよい修飾ヌクレオチド（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン）のさらなる非制限の例としては、下記があげられる。
【０１３１】
【化４】
0006689758.tif 000005
【０１３２】
式中、Ｒ’は下記のように定義される：
【０１３３】
【化５】
0006689758.tif 000006
【０１３４】
式中、
Ｒ’’’’は、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル（ＯＨ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’）；第一アミド（ＣＯＮＨ２）；第二アミド（ＣＯＮＨＲ’’）；第三アミド（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲ’’）；からなる群より選択され、
式中、
Ｒ’’、Ｒ’’’は独立して、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２））；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；Ｒ’’’’置換フェニル環（Ｒ’’’’Ｃ６Ｈ４）；式中、Ｒ’’’’は上記に定義される；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’’’’）；式中、Ｒ’’’’’が分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；及びシクロアルキル；式中、Ｒ’’＝Ｒ’’’＝ＣＨ２）ｎ；からなる群より選択され、
式中、ｎ＝２〜１０である。
【０１３５】
〔００１５１〕  さらに、Ｃ−５修飾ピリミジンヌクレオチドは以下を含む：
【０１３６】
【化６】
0006689758.tif 000007
【０１３７】
〔００１５２〕  いくつかの実施形態において、該修飾ヌクレオチドが、ヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに付与する。Ｃ−５位に置換を有するピリミジンは修飾ヌクレオチドの１例である。修飾例としては、主鎖修飾、メチル化、イソ塩基、イソシチジン及びイソグアニジン等の異例の塩基対の組合せ等があげられる。修飾としてはさらに、キャッピング等の３’及び５’修飾があげられる。他の修飾としては、１以上の天然ヌクレオチドと類似体との置換、ヌクレオチド間修飾等、例えば、無荷電連結（例えば、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅｓ）、カルバメート等）を有するもの、荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、干渉物質（例えば、アクリジン、ソラーレン等）を有するもの、キレーター（例えば、金属類、放射性金属類、ホウ素、酸化的金属類等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、及び修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸等）を有するものがあげられる。さらに、通常ヌクレオチドの糖上に存在するヒドロキシル基のいずれかはホスホン酸基またはリン酸基で置換してよく；標準的な保護基で保護してよく；または活性化してさらに別のヌクレオチドまたは固体支持体への追加連結を調製してよい。５’及び３’末端ＯＨ基はリン酸化またはアミン、約１〜約２０炭素原子の有機キャッピング基部分、１実施形態において約１０〜約８０ｋＤａの範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、別の実施形態で約２０〜約６０ｋＤａの範囲のＰＥＧポリマー、または他の親水性もしくは疎水性生物学的もしくは合成ポリマーで置換可能である。１実施形態において、修飾は、ピリミジンのＣ−５位の修飾である。これら修飾は、直接Ｃ−５位におけるアミド連結または他のタイプの連結を介してなされ得る。
【０１３８】
〔００１５３〕  ポリヌクレオチドは当該技術分野において一般的に知られているリボースまたはデオキシリボース糖類の類似型を含有することもでき、それには２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、ａ−アノマー糖類、エピマー糖類、例えばアラビノース、キシロース類またはリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体及び脱塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。上記で言及したように、１以上のホスホジエステル連結を代わりの連結基により置換してよい。これらの代わりの連結基には、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）により置換されている実施形態が含まれ、ここでそれぞれのＲまたはＲ’は独立してＨまたは場合によりエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有する置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）である。ポリヌクレオチド中の全ての連結が同一である必要はない。糖類、プリン類、及びピリミジン類の類似型の置換は最終産物の設計において好都合であり得、例えばポリアミド主鎖のような代わりの主鎖構造も好都合であり得る。
【０１３９】
〔００１５４〕  以下の実施例は、ある特定の特性及び／または実施形態の例示を目的として提供される。これらの実施例は、本開示をここに記載の実施形態の特定の特性に限定するものとして理解すべきではない。
【０１４０】
黄色ブドウ球菌（本明細書にてＳ．  ａｕｒｅｕｓとも称する）
〔００１５５〕  免疫蛍光顕微法用の表面抗原の染色は抗体−蛍光団コンジュゲートを用い、ｉｎ  ｖｉｖｏ感染モデル内で比較的少数の黄色ブドウ球菌細胞を経時検出することが実証されている（Ｔｉｍｏｆｅｙｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４）。黄色ブドウ球菌細胞表面に対して特異的なリガンドとしての短いペプチドはファージディスプレイによって同定されており、また、合成コンセンサスペプチド（ＳＡ５−１）は、添加した生物試料中、蛍光量子ドットを用いて約１００ＣＦＵ  ｍｌ−１を検出可能であった（Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
【０１４１】
〔００１５６〕  主要グループとして、ＭＳＣＲＡＭＭ（微生物表面成分認識接着マトリクス分子（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ））、ＳＥＲＡＭ（分泌エキスパンドレパートリー接着分子（ｓｅｃｒｅｔａｂｌｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ））、並びにその他細胞外毒素及び免疫回避因子（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５；  Ｓｐｅｚｉａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）があげられる。細菌細胞全体をＳＥＬＥＸのために（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）、またはＬｉＣｌ、リゾスタフィン、または２％ＳＤＳで細胞から抽出した表面関連タンパク質、（Ｐａｌｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；  Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）、またはトリプシンシェービングで放出させたもの（Ｙｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）を、用いることができる。しかしながら、インビトロの表面プロテオームの組成は異なる株間で異なり、また培地や増殖期に依存する。さらに、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌は密接に関連したタンパク質を発現し、このことは、周到なカウンターセレクション無しでの種に特異的な試薬の単離を妨げ得る。したがって、我々は、ほとんどの増殖条件下で豊富に発現される、よく保存された、黄色ブドウ球菌に特異的な細胞表面タンパク質に注力を傾けることを選択し、これら組換型ＳＥＬＥＸ標的を産生した。
【０１４２】
〔００１５７〕  黄色ブドウ球菌細胞表面上に露出されるタンパク質は、細胞外分子と直接相互作用可能であり、これには薬物及び抗体が含まれ、さらにこれら接着または免疫回避タンパク質は、ワクチン候補標的を表す（Ｓｔｒａｎｇｅｒ−Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  ＭｃＣａｒｔｈｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｓａｙ、  ２０１０；  Ｄｒｅｉｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。黄色ブドウ球菌細胞エンベロープ、細胞壁関連タンパク質、及びタンパク質付着のためのメカニズム、は極めてよく理解されている（Ｄｒｅｉｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１）。５８の黄色ブドウ球菌株の全ゲノム配列比較は、しかし、接着もしくは免疫応答回避に関係するタンパク質のバリエーション、または特定株におけるタンパク質の欠損もしくは切断を明らかにした（ＭｃＣａｒｔｈｙ及びＬｉｎｄｓａｙ、２０１０）。アドヘシンは、保存ＬＰＸＴＧモチーフを介してペプチドグリカンへ共有結合的に付着した表面タンパク質のファミリーを含む（Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。表面タンパク質のプロテオーム及びトランスクリプトームプロファイリングにより、黄色ブドウ球菌において表面タンパク質が粘着表現型とよく相関することが示された（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｙｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。
【０１４３】
〔００１５８〕  我々がアプタマーを生成した１０個の表面関連タンパク質は、ＳｐＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＳａｓＤ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、及びＩｓｄＨを含む。これらのタンパク質は全て、ＬＰＸＴＧソルターゼモチーフのトレオニン及びグリシン間のソルターゼ媒介による切断によって細胞壁に付着し、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋鎖にアミド連結する（Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。我々の目的は、黄色ブドウ球菌細胞に対する結合剤の取得であったので、表面露出ドメインを表すが、シグナル配列及び細胞壁埋込ドメインの繰返し領域を欠いた組換タンパク質を産生した。黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）は細菌表面上に存在し、並びに細胞外環境に分泌される。ＳｐＡは有力な免疫回避因子であり、抗体のＦｃ領域及びＢ細胞受容体（ＩｇＭ）のＦａｂ領域に結合するため、オプソニン化貪食作用をブロックし、さらにＢ細胞死をもたらす（Ｆａｌｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３；  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｄｅｌｅｏ，  ２０１３）。ＳｐＡは黄色ブドウ球菌でよく保存されているが、表皮ブドウ球菌やスタフィロコッカス・ヘモリチカスなどの非病原性ブドウ球菌においては不在であるため、このタンパク質は、魅力的な診断標的を表す。切断ＳｐＡ変異体を有する臨床分離株は、Ｃ末端局在化シグナルを有するＸＣ領域を欠き、したがって主に細胞外で見られることが記載されている（Ｓｏｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢは構造的に関連したフィブリノゲン結合タンパク質である（ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｎｉ  Ｅｉｄｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＣｌｆＢは、前鼻孔の剥離上皮細胞への粘着について役割を果たす鍵となる因子の一つであり、典型的には増殖の対数期初期にて産生される（Ｎｉ  Ｅｉｄｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。ＦｎｂＡ及びＦｎｂＢは、細胞外マトリクス、フィブロネクチン及びエラスチンの両方の成分に接着し、感染の間、ホスト組織のコロニー形成に重要である（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。ＳａｓＤは未知の生理学的役割を持つ接着タンパク質であると推定される（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｙｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。うち４つのタンパク質は、鉄分が制限された条件下で黄色ブドウ球菌にて誘導される鉄応答表面決定因子（ｉｒｏｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）（Ｉｓｄ）系に属し、ヘモグロビンからのヘムの捕捉（ＩｓｄＢ、ＩｓｄＨ）及びその細胞壁を介した運搬（ＩｓｄＡ、ＩｓｄＣ）のために重要である（Ｍａｚｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；  Ｇｒｉｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１４４】
〔００１５９〕  概念証明として及びその効率評価のため、黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質に対して生成したこれらアプタマーを、ｑＰＣＲを使用した黄色ブドウ球菌の捕捉及び検出、またさらにフローサイトメトリーによってその細胞を直接検出するために用いた。
【０１４５】
〔００１６０〕  ＳＯＭＡｍｅｒ（遅いオフ速度の修飾アプタマー）試薬は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）からできており、アミノ酸側鎖の模倣物を備えるその５−プライム位置にて修飾されたピリミジン残基を含有し、またきわめて遅い（長い（３０分超））解離速度を有する（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。こうした特性は、標準的なＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーと比べて、アプタマーのより良い親和性及びより良い運動特性につながる。実質的にはあらゆるタンパク質をＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統進化法）に用いて、キネティックチャレンジ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）、分配（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）、及び修飾ｓｓＤＮＡのランダムライブラリからの増幅を用いた選択を複数回行うことにより、特異的な高親和性アプタマーを生成可能である（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；  Ｖａｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。抗体と比べてアプタマーが有利な点としては、溶液中の例外的な温度安定性、低分子量、より高い多重化能力、熱、乾燥、溶剤に対する化学的安定性、可逆的再生性、試薬製造の簡易化、一貫したロット性能及びより低いコストがあげられる。アプタマーは、１０００個超のヒトタンパク質に対して生成されており、ＳｏｍａＬｏｇｉｃが開発した、これらのタンパク質を少ない（０．１ｍｌ）血液試料において同時にかつ高い精度をもって測定するためのＳＯＭＡｓｃａｎ（商標）プロテオミックプラットフォームの基盤となっている。この高度多重化アッセイの適用は、医療の様々な領域におけるバイオマーカーの発見につながった（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。微生物タンパク質に関しては、我々は以前にクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のためのアプタマーの特性について報告し、これら結合剤の広範囲にわたる利用可能性を示した（Ｏｃｈｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。
【０１４６】
〔００１６１〕  遅いオフ速度の修飾アプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ試薬）試薬を、精製組み換えまたは天然タンパク質を使用する多重修飾ＤＮＡライブラリでのＳＥＬＥＸによって、いくつかの黄色ブドウ球菌細胞表面関連タンパク質に対して生成した。ｎＭ未満のＫｄを有する高親和性結合剤を、ブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）、クランピング因子（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ）、フィブロネクチン結合タンパク質（ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ）及び鉄調節表面決定因子（Ｉｓｄ）について取得した。さらにスクリーニングを行ったところ、いくつかのアプタマーは試験した全株の黄色ブドウ球菌細胞に特異的に結合するが、他のブドウ球菌または他の細菌には特異的に結合しないことが明らかになった。培養及びＰＣＲで示されたようにＳｐＡ及びＣｌｆＡアプタマーは、低細胞密度マトリクスからの黄色ブドウ球菌細胞の選択的捕捉及び濃縮に有用であることが実証され、このことは、ＰＣＲ阻害剤の検出限界の改善及び効率的な除去につながった。細菌細胞表面をアプタマーで被覆し、次いでこのアプタマーにｑＰＣＲを行った場合に、黄色ブドウ球菌細胞の検出は桁違いに増強された。また、蛍光標識したＳｐＡアプタマーも、フローサイトメトリーにおけるその直接的検出剤としての有用性が実証された。
【０１４７】
アプタマー組成物を含むキット
〔００１６２〕  本開示は、ここに記載のアプタマーのいずれかを含むキットを提供する。例えば、このキットは、（１）標的に結合する少なくとも１つのアプタマー、（２）少なくとも１つの医薬的に許容される担体、例えば溶剤または溶液、を含み得る。追加のキット成分例としては任意で（１）ここで同定されるいずれかの医薬的に許容される賦形剤、例えば安定剤、緩衝剤等、（２）キット成分を保持及び／または混合するための少なくとも１つの容器、バイアルまたは同様の装置、及び（３）送達装置をあげることができる。
【０１４８】
〔００１６３〕  別の態様において、本開示は、配列番号９で表すＳＰＡタンパク質に結合するアプタマー配列を提供する。該ヌクレオチド配列はさらに下記配列に一般化してもよい：
ＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）
ここで配列中「Ｗ」がＣ−５修飾ピリミジンで占めてよい位置を表し、及び「Ｎ」が非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれかで占めてよい位置を表し、及びｎが０〜２（または０、１もしくは２）である。
【０１４９】
〔００１６４〕  別の態様において、ＮはＣ、Ｔ、ＧまたはＡである。別の態様において、ＮはＣ、ＴまたはＡである。
〔００１６５〕  別の態様において、ヌクレオチド配列は最大約１００個のヌクレオチド、最大約９５個のヌクレオチド、最大約９０個のヌクレオチド、最大約８５個のヌクレオチド、最大約８０個のヌクレオチド、最大約７５個のヌクレオチド、最大約７０個のヌクレオチド、最大約６５個のヌクレオチド、最大約６０個のヌクレオチド、最大約５５個のヌクレオチド、最大約５０個のヌクレオチド、最大約４５個のヌクレオチド、最大約４０個のヌクレオチドを含んでよい。
【０１５０】
〔００１６６〕  本開示の別の態様において、アプタマーは、配列番号１４のいずれかに、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約７５％同一であってよい。別の実施形態において、アプタマーは配列番号１４の配列断片を含む。
【０１５１】
〔００１６７〕  別の態様において、アプタマーは、１〜５０（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０）個のＣ−５修飾ピリミジンを含む。別の態様において、アプタマーは５〜３０（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０）個のＣ−５修飾ピリミジンを含む。別の態様において、アプタマーは１０〜１５（または１０、１１、１２、１３、１４もしくは１５）個のＣ−５修飾ピリミジンを含む。
【０１５２】
〔００１６８〕  別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約１％〜１００％（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約１０％〜約５０％（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２０％〜約４０％（または２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２５％〜約３５％（または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２７％〜約３３％（または２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約３７％〜約４３％（または３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３％）含む。
【０１５３】
〔００１６９〕  別の態様において、ＷはＣ−５修飾ウリジンまたはシチジンを表してよい。
〔００１７０〕  別の態様において、Ｗは下記に例示するＣ−５修飾ピリミジンを表してよい。
【０１５４】
【化７】
0006689758.tif 000008
【０１５５】
式中、Ｒ’は下記に定義する通りであり：
【０１５６】
【化８】
0006689758.tif 000009
【０１５７】
式中、
Ｒ’’’’が、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル（ＯＨ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’）；第一アミド（ＣＯＮＨ２）；第二アミド（ＣＯＮＨＲ’’）；第三アミド（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲ’’）；からなる群より選択され、
式中、
Ｒ’’、Ｒ’’’が独立して、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２））；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；Ｒ’’’’置換フェニル環（Ｒ’’’’Ｃ６Ｈ４）（ここでＲ’’’’は上記に定義する通りであり）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’’’’）（ここで、Ｒ’’’’’が分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）であり）；及びシクロアルキル（ここでＲ’’＝Ｒ’’’＝（ＣＨ２）ｎ）；からなる群より選択され、
ここで、ｎ＝２〜１０である。
【０１５８】
〔００１７１〕  別の態様において、Ｗは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びその組合せからなる群より選択されるＣ−５修飾ピリミジンを表してよい。
【０１５９】
〔００１７２〕  別の態様において、Ｗは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びその組合せからなる群より選択されるＣ−５修飾ピリミジンを表す。
【０１６０】
〔００１７３〕  別の態様において、Ｗは、式Ｉで示す構造を含む化合物を表してよく：
【０１６１】
【化９】
0006689758.tif 000010
【０１６２】
式中、
Ｒが独立して−（ＣＨ２）ｎ−、ここでｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり；
ＲＸ１が独立して：
【０１６３】
【化１０】
0006689758.tif 000011
【０１６４】
【化１１】
0006689758.tif 000012
【０１６５】
からなる群より選択され、
式中、
【０１６６】
【化１２】
0006689758.tif 000013
【０１６７】
がＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
式中、
ＲＸ４が独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第一アミド（ＣＯＮＨ２）；第二アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第三アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）；からなる群より選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３がそれぞれの存在について独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４置換フェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）（ここで、ＲＸ４は上記に定義する通りであり）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）（ここで、ＲＸ５は分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；及びシクロアルキル（ここで、ＲＸ２及びＲＸ３は共に置換または非置換の５または６員環を形成する）；からなる群より選択され、
Ｘが独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジド；からなる群より選択され、
Ｒ’が独立して−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕ；からなる群より選択され、
Ｒ’’が独立して水素、４、４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び三リン酸塩（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはその塩；からなる群より選択され、
Ｚが独立して−Ｈ、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）；
及びその塩；からなる群より選択され、
ただし以下の例外を伴う：
ｎ＝４であれば、ＲＸ１はＨではありえない；
ｎ＝３であれば、ＲＸ１はＣＨ３ではありえない; 
ｎ＝０であれば、ＲＸ１は-ＣＨ（ＣＨ３）２ではありえない；及び
ｎ＝２、ＲＸ１が
【０１６８】
【化１３】
0006689758.tif 000014
【０１６９】
及びＲＸ４がヒドロキシルであれば、ＲＸ１は
【０１７０】
【化１４】
0006689758.tif 000015
【０１７１】
ではありえない。
〔００１７４〕  関連の態様において、ｎは１、２または３から選択される整数である。
【０１７２】
〔００１７５〕関連の態様において、ＲＸ１は：
【０１７３】
【化１５】
0006689758.tif 000016
【０１７４】
からなる群より選択され、
式中、
【０１７５】
【化１６】
0006689758.tif 000017
【０１７６】
は、ＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示し；及び
Ｚは独立して−Ｈ、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）からなる群より選択される。
【０１７７】
〔００１７６〕  関連の態様において、ＲＸ４は独立して分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）からなる群より選択される。
〔００１７７〕  関連の態様において、Ｘは独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆからなる群より選択される。
【０１７８】
〔００１７８〕  関連の態様において、Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）からなる群より選択される。
〔００１７９〕  関連の態様において、Ｒ’’は三リン酸塩（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である。
【０１７９】
〔００１８０〕  別の態様において、本開示は、式ＩＩ（ＢｎｄＣ）、ＩＩＩ（ＰＥｄＣ）、ＩＶ（ＰＰｄＣ）、Ｖ（ＮａｐｄＣ）、ＶＩ（２ＮａｐｄＣ）、ＶＩＩ（ＮＥｄＣ）及びＶＩＩＩ（２ＮＥｄＣ）からなる群より選択される構造を含む化合物を提供し:
【０１８０】
【化１７】
0006689758.tif 000018
【０１８１】
式中、
Ｘが独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジドからなる群より選択される。
【０１８２】
〔００１８１〕  本開示の別の態様において、アプタマーはその標的に関して約１０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有してよい。別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約１５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約２５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約４０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約４５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約５０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３〜１０ｎＭ（または３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｎＭ０）の範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。好適な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、式ｙ＝（最大−最小）（タンパク質）／（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小をあてはめる結合アッセイで決定できる。解離定数の決定が、その測定条件に高度に依存すること、したがって数値が平衡時間等のファクターによって著しく変化し得ることを理解されたい。他の実施形態において、アプタマーは配列番号１〜１５から選択されるアプタマーのＫｄ未満かまたはこれと等しいＫｄを有する。
【０１８３】
〔００１８２〕  ＣｌｆＡタンパク質に結合するアプタマー配列のモチーフを、配列番号１３で表す。この配列モチーフはさらに、下記配列に一般化してもよい：
ＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）。
【０１８４】
〔００１８３〕  該配列中「Ｗ」がＣ−５修飾ピリミジンが占めてよい位置を表し、及び「Ｎ」が非修飾または修飾ヌクレオチドまたはスペーサー配列またはリンカーのいずれかで占めてよい位置を表す。さらに、ｎが１〜３０（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０）、または２〜２０（または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）、または５〜１８（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８）、または１０〜１６（または１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６）の数であってよく、またはＮは約１６である。
【０１８５】
〔００１８４〕  別の態様において、ヌクレオチド配列は最大約１００個のヌクレオチド、最大約９５個のヌクレオチド、最大約９０個のヌクレオチド、最大約８５個のヌクレオチド、最大約８０個のヌクレオチド、最大約７５個のヌクレオチド、最大約７０個のヌクレオチド、最大約６５個のヌクレオチド、最大約６０個のヌクレオチド、最大約５５個のヌクレオチド、最大約５０個のヌクレオチド、最大約４５個のヌクレオチド、最大約４０個のヌクレオチド、最大約３５個のヌクレオチド、最大約３０個のヌクレオチド、最大約２５個のヌクレオチド、及び最大約２０個のヌクレオチドを含んでよい。
【０１８６】
〔００１８５〕  本開示の別の態様において、アプタマーは、配列番号１５のいずれかに、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約７５％同一であってよい。別の実施形態において、アプタマーは配列番号１５の配列断片を含む。
【０１８７】
〔００１８６〕  別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約１％〜１００％（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約１０％〜約５０％（または１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２０％〜約４０％（または２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２５％〜約３５％（または２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約２７％〜約３３％（または２７、２８、２９、３０、３１、３２もしくは３３％）含む。別の態様において、アプタマーはＣ−５修飾ピリミジンを約３７％〜約４３％（または３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３％）含む。
【０１８８】
〔００１８７〕  別の態様において、ＷはＣ−５修飾ウリジンまたはシチジンを表してよい。
〔００１８８〕  別の態様において、Ｗは下記に例示のＣ−５修飾ピリミジンを表してよい：
【０１８９】
【化１８】
0006689758.tif 000019
【０１９０】
式中、Ｒ’は下記に定義する通りであり：
【０１９１】
【化１９】
0006689758.tif 000020
【０１９２】
式中、
Ｒ’’’’は、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル（ＯＨ）、ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）：カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’）；第一アミド（ＣＯＮＨ２）：第二アミド（ＣＯＮＨＲ’’）；第三アミド（ＣＯＮＲ’’Ｒ’’’）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲ’’）；からなる群より選択され、
式中
Ｒ’’、Ｒ’’’は独立して、分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２））；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；Ｒ’’’’置換フェニル環（Ｒ’’’’Ｃ６Ｈ４）（ここでＲ’’’’は上記に定義する通りであり）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲ’’’’’）（ここでＲ’’’’’は分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；及びシクロアルキル（ここでＲ’’＝Ｒ’’’＝（ＣＨ２）ｎ）；からなる群より選択され、
ここでｎ＝２〜１０である。
【０１９３】
〔００１８９〕  別の態様において、Ｗは、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びその組合せからなる群より選択されるＣ−５修飾ピリミジンを表してよい。
【０１９４】
〔００１９０〕  別の態様において、Ｗは、５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）及びその組合せからなる群より選択される、Ｃ−５修飾ピリミジンを表してよい。
【０１９５】
別の態様において、Ｗは式Ｉに示す構造を含む化合物を表してよく：
【０１９６】
【化２０】
0006689758.tif 000021
【０１９７】
式中、
Ｒが独立して−（ＣＨ２）ｎ−であり、ここでｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０から選択される整数であり；
ＲＸ１が独立して：
【０１９８】
【化２１】
0006689758.tif 000022
【０１９９】
【化２２】
0006689758.tif 000023
【０２００】
からなる群より選択され、
式中、
【０２０１】
【化２３】
0006689758.tif 000024
【０２０２】
はＲＸ１基の（ＣＨ２）ｎ基への結合点を示す；及び
式中、
ＲＸ４が独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；ヒドロキシル基；ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）；ニトリル（ＣＮ）；ボロン酸（ＢＯ２Ｈ２）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ２）；第一アミド（ＣＯＮＨ２）；第二アミド（ＣＯＮＨＲＸ２）；第三アミド（ＣＯＮＲＸ２ＲＸ３）；スルホンアミド（ＳＯ２ＮＨ２）；Ｎ−アルキルスルホンアミド（ＳＯＮＨＲＸ２）；からなる群より選択され、
ＲＸ２及びＲＸ３はそれぞれの存在について独立して、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）；フェニル（Ｃ６Ｈ５）；ＲＸ４置換フェニル環（ＲＸ４Ｃ６Ｈ４）（ここでＲＸ４は上記に定義するとおり）；カルボン酸（ＣＯＯＨ）；カルボン酸エステル（ＣＯＯＲＸ５）（ここでＲＸ５が分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ２０）であり）：及びシクロアルキル（ここでＲＸ２及びＲＸ３が共に置換または非置換の５または６員環を形成する）、からなる群より選択され、
Ｘが独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジド；からなる群より選択され、
Ｒ’が独立して−Ｈ、−ＯＡｃ；−ＯＢｚ；−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）；及び−ＯＳｉＭｅ２ｔＢｕ；からなる群より選択され、
Ｒ’’が独立して水素、４、４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）及び三リン酸塩（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）またはその塩；からなる群より選択され、
Ｚが独立して−Ｈ、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）；及びその塩；からなる群より選択され、
ただし以下の例外を伴う：
ｎ＝４であれば、ＲＸ１はＨではありえない；
ｎ＝３であれば、ＲＸ１はＣＨ３ではありえない;
ｎ＝０であれば、ＲＸ１は−ＣＨ（ＣＨ３）２ではありえない；及び
ｎ＝２、ＲＸ１が
【０２０３】
【化２４】
0006689758.tif 000025
【０２０４】
及びＲＸ４がヒドロキシルであれば、ＲＸ１は
【０２０５】
【化２５】
0006689758.tif 000026
【０２０６】
ではありえない。
〔００１９１〕  関連の態様においてｎは１、２または３より選択される整数である。
〔００１９２〕  関連の態様において、ＲＸ１は：
【０２０７】
【化２６】
0006689758.tif 000027
【０２０８】
からなる群より選択され、
式中、
【０２０９】
【化２７】
0006689758.tif 000028
【０２１０】
がＲＸ１基の−（ＣＨ２）ｎ−基への結合点を示す；及び
Ｚが独立して、−Ｈ、置換または非置換の分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）からなる群より選択される。
【０２１１】
関連の態様において、ＲＸ４は独立して分岐または直鎖低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）；−ＯＨ；−Ｆ及びカルボン酸（ＣＯＯＨ）からなる群より選択される。
〔００１９３〕  関連の態様において、Ｘが独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ及び−Ｆからなる群より選択される。
【０２１２】
〔００１９４〕  関連の態様において、Ｒ’は−Ｈ、−ＯＡｃ及び−Ｐ（ＮｉＰｒ２）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）からなる群より選択される。
〔００１９５〕  関連の態様において、Ｒ’’は三リン酸塩（−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２）である。
【０２１３】
〔００１９６〕  別の態様において、本開示は、式ＩＩ（ＢｎｄＣ）、ＩＩＩ（ＰＥｄＣ）、ＩＶ（ＰＰｄＣ）、Ｖ（ＮａｐｄＣ）、ＶＩ（２ＮａｐｄＣ）、ＶＩＩ（ＮＥｄＣ）及びＶＩＩＩ（２ＮＥｄＣ）からなる群より選択される構造を含む化合物を提供し：
【０２１４】
【化２８】
0006689758.tif 000029
【０２１５】
式中、
Ｘが独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＭｅ、−Ｏ−アリル、−Ｆ、−ＯＥｔ、−ＯＰｒ、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、−ＮＨ２及び−アジドからなる群より選択される。
【０２１６】
〔００１９７〕  本開示の別の態様において、アプタマーはその標的に関して約１０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有してよい。別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約１５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約２０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約２５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約４０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約４５ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約５０ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。さらに別の典型的な実施形態において、アプタマーはその標的タンパク質に関して約３〜１０ｎＭ（または３、４、５、６、７、８、９もしくは１０ｎＭ０の範囲の解離定数（Ｋｄ）を有する。好適な解離定数は、マルチポイント滴定を使用し、式ｙ＝（最大−最小）（タンパク質）/（Ｋｄ＋タンパク質）＋最小をあてはめる結合アッセイで決定できる。解離定数の決定が、その測定条件に高度に依存し、そのため数値が平衡時間等のファクターによって著しく変化することを理解されたい。他の実施形態において、アプタマーは配列番号１〜１５から選択されるアプタマーのＫｄ未満かまたはこれと等しいＫｄを有する。
【０２１７】
〔００１９８〕  本開示はさらに試料中の微生物の有無の検出方法を提供し、該方法は試料をアプタマーに接触させ、アッセイを行ってアプタマーを検出することを含み、ここで、第二アプタマーの検出は微生物が試料中に存在することを示し、第二アプタマーの未検出は微生物が試料中に存在しないことを示し、アプタマーがＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｘＧＷＣ（配列番号１４）及びＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｙＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、Ｗがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｘが０、１、２、３、４または５、及びｙが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である。
【０２１８】
〔００１９９〕  別の態様において、Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される。
【０２１９】
〔００２００〕  別の態様において、アプタマーは増幅可能である。
〔００２０１〕  別の態様において、アッセイは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、質量分析、配列決定及びハイブリダイゼーションからなる群より選択される。
【０２２０】
〔００２０２〕  別の態様において、微生物は細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される。関連の態様において、微生物が細菌細胞である。さらに別の関連の態様において、細菌細胞は病原性である。
【０２２１】
〔００２０３〕  別の態様において、細菌細胞はブドウ球菌細胞である。
〔００２０４〕  別の態様において、細菌細胞は黄色ブドウ球菌細胞である。
〔００２０５〕  別の態様において、アプタマーは配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷはＣ−５修飾ピリミジンである。
【０２２２】
〔００２０６〕  別の態様において、本開示は、配列番号１〜１５を含む組成物を提供する。
国際出願時の特許請求の範囲は以下のとおりである。
〔項１〕
試料中の微生物の有無の検出方法であって、
ａ）前記試料と第一アプタマーを接触させ混合物を形成し、ここで前記第一アプタマーは前記微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、かつ第一タグを含み、ここで前記第一タグは固体支持体に結合可能であり、
ｂ）前記第一タグの前記固体支持体への結合を可能にする条件下で、前記混合物と前記固体支持体を接触させ、
ｃ）前記固体支持体を洗浄して前記複合体に関して前記混合物を濃縮し、及び／または前記固体支持体を洗浄して未結合物質を実質的に除去し、
ｄ）前記混合物と第二アプタマーを接触させ、ここで前記第二アプタマーは前記微生物の前記第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、及び
ｅ）アッセイを行って前記第二アプタマーを検出し、ここで前記第二アプタマーの検出は前記微生物が前記試料中に存在することを示し、前記第二アプタマーの未検出は前記微生物が前記試料中に存在しないことを示す、ことを含む、検出方法。
〔項２〕
試料中の微生物の有無の検出方法であって、
ａ）前記試料を固体支持体に接触させ、ここで第一アプタマーは第一タグを介して前記固体支持体に結合し、及びここで前記第一アプタマーは前記微生物の第一細胞表面タンパク質に結合して複合体を形成可能であり、
ｂ）前記固体支持体を洗浄して前記複合体に関して前記混合物を濃縮し、及び／または前記固体支持体を洗浄して未結合材料を実質的に除去し、
ｃ）前記混合物を第二アプタマーと接触させ、ここで前記第二アプタマーは前記微生物の前記第一細胞表面タンパク質または第二細胞表面タンパク質に結合可能であり、かつ第二タグを含み、及び
ｄ）アッセイを行って前記第二アプタマーを検出し、ここで前記第二アプタマーの検出は前記微生物が前記試料中に存在することを示し、前記第二アプタマーの未検出は前記微生物が前記試料中に存在しないことを示すことを含む、検出方法。
〔項３〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一アプタマー及び前記第二アプタマーの少なくとも１つはさらに少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジンを含む、前記方法。
〔項４〕
請求項３に記載の方法であって、前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される、前記方法。
〔項５〕
前記第二アプタマーが増幅可能である、請求項１及び２に記載の方法。
〔項６〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第二アプタマーが第二タグを含み、ここで前記第二タグは、染料、量子ドット、放射標識、ＰＣＲプライマー部位、電気化学官能基、及び酵素に加えて検出可能な酵素基質からなる群より選択される、前記方法。
〔項７〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一タグが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ロックド核酸、オリゴ糖、多糖、抗体、アフィボディ、抗体模倣物、細胞受容体、リガンド、脂質、ビオチン、ポリヒスチジン、またはこれら構造物の断片もしくは誘導体のいずれかからなる群より選択される、前記方法。
〔項８〕
固体支持体はビーズ及び基材からなる群より選択される、請求項１及び２に記載の方法。
〔項９〕
請求項８に記載の方法であって、前記ビーズが、ポリマービーズ、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、アクリルアミドビーズ、固体コアビーズ、多孔性ビーズ、常磁性ビーズ、ガラスビーズ、マイクロビーズ、及び制御細孔ビーズからなる群より選択される、前記方法。
〔項１０〕
請求項８に記載の方法であって、前記基材が、マイクロタイターウェル、シクロオレフィン共重合体基材、膜、プラスチック基材、ナイロン、ラングミュア−ブロジェット膜、ガラス、ゲルマニウム基材、シリコン基材、シリコンウェーハチップ、フロースルーチップ、ナノ粒子、ポリテトラフルオロエチレン基材、ポリスチレン基材、ヒ化ガリウム基材、金基材及び銀基材からなる群より選択される、前記方法。
〔項１１〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記アッセイが、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、質量分析、配列決定、及びハイブリダイゼーションからなる群より選択される、前記方法。
〔項１２〕
前記微生物が、細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される、請求項１及び２に記載の方法。
〔項１３〕
前記微生物が細菌細胞である、請求項１及び２に記載の方法。
〔項１４〕
前記細菌細胞が病原性である、請求項１３に記載の方法。
〔項１５〕
前記細菌細胞がブドウ球菌細胞である、請求項１３に記載の方法。
〔項１６〕
前記細菌細胞が黄色ブドウ球菌細胞である、請求項１３に記載の方法。
〔項１７〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一細胞表面タンパク質及び前記第二細胞表面タンパク質が同じタンパク質であるかまたは異なるタンパク質である、前記方法。
〔項１８〕
前記第一細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項１及び２に記載の方法。
〔項１９〕
前記第二細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項１及び２に記載の方法。
〔項２０〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される、前記方法。
〔項２１〕
前記第一細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ及びＣｌｆＡからなる群より選択される、請求項１及び２に記載の方法。
〔項２２〕
前記第二細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される、請求項１及び２に記載の方法。
〔項２３〕
前記第二細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ及びＣｌｆＡからなる群より選択される、請求項１及び２に記載の方法。
〔項２４〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一アプタマーがＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４または５である、前記方法。
〔項２５〕
請求項２４に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記方法。
〔項２６〕
請求項２４に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記方法。
〔項２７〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一アプタマーが、ＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を有する核酸分子を含み、
ここでＷがそれぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である、前記方法。
〔項２８〕
請求項２７に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが、少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記方法。
〔項２９〕
請求項２７に記載の方法であって、前記第一アプタマーの長さが、約１８〜約１００個のヌクレオチド（または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記方法。
〔項３０〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第一アプタマーが配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがＣ−５修飾ピリミジンである、前記方法。
〔項３１〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第二アプタマーがＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、または５である、前記方法。
〔項３２〕
請求項３１に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記方法。
〔項３３〕
請求項３１に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記方法。
〔項３４〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第二アプタマーがＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を有する核酸分子を含み、ここでＷが、それぞれの存在について独立して、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である、前記方法。
〔項３５〕
請求項３４に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記方法。
〔項３６〕
請求項３４に記載の方法であって、前記第二アプタマーの長さが、約１８〜約１００個のヌクレオチド（または長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記方法。
〔項３７〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記第二アプタマーが、配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがＣ−５修飾ピリミジンである、前記方法。
〔項３８〕
請求項２４、２７、３０、３１、３４及び３７に記載の方法であって、前記Ｃ−５修飾ピリミジンが、５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される、前記方法。
〔項３９〕
請求項１及び２に記載の方法であって、前記試料が、水性試料、土壌試料、食品試料、細胞試料、培養試料、組織試料、細胞片試料、生物試料等からなる群より選択される、前記方法。
〔項４０〕
少なくとも約１５〜少なくとも約１００個のヌクレオチド（または少なくとも約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）、少なくとも１つのＣ−５修飾ピリミジン、を含み、微生物の細胞表面タンパク質に結合可能である、核酸分子。
〔項４１〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、約１５〜約５０個のヌクレオチド（または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９もしくは５０個のヌクレオチド）を含む
、前記核酸分子。
〔項４２〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個のＣ−５修飾ピリミジンを含む、前記核酸分子。
〔項４３〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、Ｃ−５修飾ピリミジンを少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上含む、前記核酸分子。
〔項４４〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、約０．０３ｎＭ〜約４．７ｎＭ（または０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０.４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７ｎＭ）の平衡結合定数（Ｋｄ）で前記細胞表面タンパク質に結合
可能である、前記核酸分子。
〔項４５〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、少なくとも約０．０３、０．０７、０．０８、０．１４、０．１５、０．１６、０．２２、０．３５、０．４７、０．６３、０．７３、０．７９、０．８４、１．３、１．３５、１．９８、２．１７、３．９及び４．７３ｎＭの平衡結合定数（Ｋｄ）で前記細胞表面タンパク質に結合可能である、前記核酸分子。
〔項４６〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、前記Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される、前記核酸分子。
〔項４７〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、前記微生物が、細菌細胞、寄生虫及びウイルスからなる群より選択される、前記核酸分子。
〔項４８〕
前記微生物が細菌細胞である、請求項４０に記載の核酸分子。
〔項４９〕
前記細菌細胞が病原性である、請求項４８に記載の核酸分子。
〔項５０〕
前記細菌細胞がブドウ球菌細胞である、請求項４８に記載の核酸分子。
〔項５１〕
前記細菌細胞が黄色ブドウ球菌細胞である、請求項４８に記載の核酸分子。
〔項５２〕
前記細胞表面タンパク質が細菌細胞表面タンパク質である、請求項４０に記載の核酸分子。
〔項５３〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、前記細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ、ＩｓｄＨ及びＳａｓＤからなる群より選択される、前記核酸分子。
〔項５４〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、前記第一細胞表面タンパク質が、ＳＰＡ及びＣ
ｌｆＡからなる群より選択される、前記核酸分子。
〔項５５〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、ＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ（配列番号１４）の配列を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４または５である、前記核酸分子。
〔項５６〕
請求項５５に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも約３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記核酸分子。
〔項５７〕
請求項５５に記載の核酸分子であって、その長さが、約３２〜約１００個のヌクレオチド（または３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記核酸分子。
〔項５８〕
請求項４０に記載の方法であって、前記核酸分子が、ＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）の配列を含み、ここでＷがそれぞれの存在について独立してＣ−５修飾ピリミジン、Ｎが非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれか、及びｎが０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０である、前記核酸分子。
〔項５９〕
請求項５８に記載の核酸分子であって、その長さが少なくとも約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個のヌクレオチドである、前記核酸分子。
〔項６０〕
請求項５８に記載の核酸分子であって、その長さが、約１８〜約１００個のヌクレオチド（または１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９もしくは１００個のヌクレオチド）である、前記核酸分子。
〔項６１〕
請求項４０に記載の核酸分子であって、配列番号１〜８及び１０〜１２からなる群より選択される配列を有する核酸分子を含み、ここでＷがＣ−５修飾ピリミジンである、前記核酸分子。
〔項６２〕
請求項５５〜６１に記載の核酸分子であって、前記Ｃ−５修飾ピリミジンが５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＢｎｄＣ）；５−（Ｎ−２−フェニルエチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＥｄＣ）；５−（Ｎ−３−フェニルプロピルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＰＰｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮａｐｄＣ）；５−（Ｎ−１−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−２−ナフチル−２−エチルカルボキシアミド）−２’−デオキシシチジン（２ＮＥｄＣ）；５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＢｎｄＵ）；５−（Ｎ−イソブチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ｉＢｕｄＵ）；５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＴｒｐｄＵ）；５−（Ｎ−［１−（３−トリメチルアモニウム（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｏｎｉｕｍ）プロピル］カルボキシアミド）−２’−デオキシウリジンクロライド及び５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（ＮａｐｄＵ）からなる群より選択される、前記核酸分子。
〔項６３〕
請求項４０〜６１のいずれかに記載の核酸分子を含む試料中の微生物の有無の検出キット。
〔００２０７〕  以下の実施例は、特定の特性及び／または実施形態の例示目的で提供
される。これらの実施例は、本開示をここに記載の実施形態の特定の特性または実施形態
に限定するものとして理解すべきではない。
【実施例】
【０２２３】
実施例１：黄色ブドウ球菌タンパク質に結合特異性を有するアプタマーの選択及び同定
〔００２０８〕  本実施例では、以下の１０個の黄色ブドウ球菌表面関連タンパク質：ＳｐＡ、ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＦｎｂＡ、ＦｎｂＢ、ＳａｓＤ、ＩｓｄＡ、ＩｓｄＢ、ＩｓｄＣ及びＩｓｄＨに結合特異性を有するアプタマーの選択及び産生のための代表的な方法を提供する。
【０２２４】
黄色ブドウ球菌標的の精製
〔００２０９〕  所望の標的または標的ドメインをコードする遺伝子の当該部分を黄色ブドウ球菌ＮＲＳ３８４（ＵＳＡ３００）ゲノムＤＮＡからプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（ストラタジーン）にクローニングした。ｃｌｆＡ、ｃｌｆＢ、ｆｎｂＡ、ｓａｓＤ、ｉｓｄＡ、ｉｓｄＢ、ｉｓｄＣ、及びｉｓｄＨ遺伝子を、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩカセットとしてアミノ末端Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ及びカルボキシ末端Ｈｉｓ１０−ｔａｇを擁する発現ベクターｐＥＴ−５１ｂ（ＥＭＤ−ノバジェン）に移した。標的の１つ、ｆｎｂＢは、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片としてアミノ末端Ｈｉｓ１０−ｔａｇを擁するｐＥＴ−１４ｂ（ＥＭＤ−ノバジェン）にクローニングした。プラスミドの配列決定を行い、クローニングしたＤＮＡ断片と、Ｈｉｓ−ｔａｇ及びＳｔｒｅｐ  ｔａｇについてベクターがコードする配列との遺伝子同一性及び適切な遺伝子融合を検証した。
【０２２５】
〔００２１０〕  組換タンパク質は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＥ（ＥＭＤ/ノバジェン）にて過剰発現させた。可溶性タンパク質の最適な発現のための条件として、増殖温度（２５〜３７℃）及び誘導時間（４〜１５時間）を最適化した。０．１〜０．８  ｌの培養物からの細胞を１０ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ/Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ試薬（ＥＭＤミリポア）を用いて溶解した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース及びＳｔｒｅｐ・Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（商標）アガロース（ＥＭＤミリポア）上での連続親和性クロマトグラフィーによって組換え体、Ｈｉｓ１０/Ｓｔｒｅｐ標識したタンパク質を、可溶性画分から精製した。天然ブドウ球菌タンパク質Ａは、ＶＷＲから購入し、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチン（ピアスバイオテクノロジー）でビオチン化した。タンパク質濃度は、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキット（バイオラッド）を用いて測定した。
【０２２６】
〔００２１１〕  大腸菌にて過剰発現させたところ、１０個全ての組換え黄色ブドウ球菌細胞表面タンパク質が可溶性画分に見られた。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上の連続親和性クロマトグラフィーにより０．１〜１．５ｍｇの各タンパク質が９５％超の純度で生じた（図３を参照）。
【０２２７】
アプタマー選択
〔００２１２〕  ５−（Ｎ−ベンジルカルボキシアミド）−ｄＵ（ＢｎｄＵ）、５−（Ｎ−ナフチルメチルカルボキシアミド）−ｄＵ（ＮａｐｄＵ）、及び５−（Ｎ−トリプタミノカルボキシアミド）−ｄＵ（ＴｒｐｄＵ）を有する別個のライブラリを、黄色ブドウ球菌タンパク質を用いるＳＥＬＥＸに使用した。各選択は、ＰＣＲ増幅に要する固定配列で挟んだ４０個の連続ランダム化位置を含有する１ｎｍｏｌの（１０１４〜１０１５）配列から開始した。ＳＥＬＥＸは実質的に記載のように行った（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｖａｕｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０；  Ｏｃｈｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。緩衝液ＳＢ１８ＴをＳＥＬＥＸを通して用い、続いて４０ｍｍｏｌ  ｌ−１  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、０．１ｍｏｌ  ｌ−１ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ  ｌ−１  ＫＣｌ、５ｍｍｏｌ  ｌ−１ＭｇＣｌ２、及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０からなる結合アッセイを行った。選択は８ラウンド行い、また、ラウンド２から、１０  ｍｍｏｌ  ｌ−１デキストラン硫酸を用いたキネティックチャレンジ（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）を開始し、遅いオフ速度を支持した。組換えタンパク質上のＨｉｓ１０−タグに結合する常磁性Ｔａｌｏｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｔａｌｏｎ（登録商標）（インビトロジェン）、またはビオチン化ＳＰＡ用ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（ライフテクノロジーズ）を用いてアプタマー標的複合体の分配を行った。選択した配列を、８０μｌの４０ｍｍｏｌ  ｌ−１  ＮａＯＨを用いてビーズが結合した標的から溶出、２０μｌの１６０ｍｍｏｌ  ｌ−１  ＨＣｌを用いて中和、次いでＫＯＤ  ＥＸ  ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン―ライフテクノロジーズ）を用いてＰＣＲ増幅した。次のラウンド用の修飾ＤＮＡを、ＫＯＤ  ＥＸ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、プライマー伸長法によってＰＣＲ産物のアンチセンス鎖から調製、記載のように精製した（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【０２２８】
〔００２１３〕  ラウンド３〜８における選択ＤＮＡのＤＮＡ再会合キネティック分析（Ｃ０ｔ）を、後のラウンドにおける配列収束評価に使用したところ、いくつかの配列または配列ファミリーの存在度の増加が示された。溶液結合放射能分析試験（下記を参照）において良好な親和性（Ｋｄ≦１０ｎｍｏｌ  ｌ−１）を示したアプタマープールをクローニングし、１プールにつき４８個のクローンの配列を決定した。最高１２個の個別アプタマーを配列パターン並びに多様性に基づいて選び、さらに特性評価のため酵素的に調製した。
【０２２９】
〔００２１４〕  合成アプタマーを標準的なホスホラミダイト法により１μｍｏｌスケールで４８〜５０マー（ｍｅｒ）にて調製し、ＨＰＬＣ精製を行った。アプタマーは５’ビオチン−ｄＡまたは５’フルオレセイン−ビオチン−ｄＡ、及び３’〜５’エキソヌクレアーゼに対する安定性を高めるため、３’末端（３’ｉｄＴ）に逆方向ｄＴヌクレオチドを含有させた。
【０２３０】
〔００２１５〕  これらタンパク質でのＳＥＬＥＸを、３つの別々のｓｓＤＮＡライブラリを用いて８ラウンド行い、またＣ０ｔ再会合キネティックによって、配列複雑性の低減が示された。プール親和性アッセイによって、ｓｓＤＮＡ  Ｃ−５修飾ヌクレオチド、ＢｎｄＵ、ＮａｐｄＵ、またはＴｒｐｄＵで得られた合計２２個のプールについて、０．１３〜８．９０ｎｍｏｌ  ｌ−１の範囲のプール親和性を有するアプタマーの選択に成功したことが確認された。黄色ブドウ球菌細胞への特異的結合は観察されたが、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、化膿性連鎖球菌、大便連鎖球菌、大腸菌、または緑膿菌への特異的結合は観察されなかった。
【０２３１】
〔００２１６〕  各プールから４８個のクローンについて決定した配列のアライメントにより、共通配列パターンを有する多コピークローン及びファミリーが示された。代表的なクローンを親和性アッセイにてスクリーニングにかけたところ、アプタマーのＫｄは０．０３〜２．１７ｎｍｏｌ  ｌ−１の範囲であった（表１）。
【０２３２】
【表１】
0006689758.tif 000030
【０２３３】
〔００２１７〕  表１のアプタマーの長さは、通常、３９〜４０個のヌクレオチドであり、Ｃ−５修飾ピリミジン（例えば、ＢｎｄＵ、ＴｒｐｄＵまたはＮａｐｄＵ）を含む。さらに、これら表１のアプタマーは、約８〜約２１個のＣ−５修飾ピリミジン（８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９または２１個のＣ−５修飾ピリミジン）を含むか、または、Ｃ−５修飾ピリミジンを約２０％〜約５３％（または２０％、２２．５％、２５％、２７．５％、３０％、３０．８％、３２．５％、３５％、３７．５％、４０％、４５％、４７．５％もしくは５２．５％）含む。表１のアプタマーは、通常、約０．０３ｎＭ〜約４．７ｎＭ（または０．０３、０．０７、０．０８、０．１４、０．１５、０．１６、０．２２、０．３５、０．４７、０．６３、０．７３、０．７９、０．８４、１．３、１．３５、１．９８、２．１７、３．９及び４．７３ｎＭ）のＫｄを有する。
【０２３４】
〔００２１８〕  ＳＰＡタンパク質及び別個にＣｌｆＡタンパク質を標的とする選択したクローンのヌクレオチド配列を下表２にあるように同定する。
【０２３５】
【表２】
0006689758.tif 000031
【０２３６】
＊は、ＳＰＡタンパク質を標的とする配列中のヌクレオチド「Ｗ（下線付き）」がＣ−５修飾ヌクレオチド（特にＮａｐｄＵ）であることを示す。
+は、ＣｌｆＡタンパク質を標的とする配列中のヌクレオチド「Ｗ（下線付き）」がＣ−５修飾ヌクレオチド（特にＢｎｄＵ）であることを示す。
【０２３７】
〔００２１９〕  ＳＰＡタンパク質に結合するアプタマー配列のためのモチーフ（４５２０）を、配列番号９で表す。この配列モチーフはさらに下記配列に一般化してもよい。：
ＧＧＣＷＷＣＧＧＧＷＡＣＣＷＡＷＷＡＷＮＧＧＷＷＷＡＧＣＣ（Ｎ）ｎＧＷＣ
（配列番号１４）
〔００２２０〕  この配列中「Ｗ」は、Ｃ−５修飾ピリミジンが占めてよい位置を表し、及び「Ｎ」は、非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれかが占めてよい位置を表し、及びｎは０〜２（または０、１もしくは２）である。
【０２３８】
〔００２２１〕  ＣｌｆＡタンパク質に結合するアプタマー配列のためのモチーフ（４５０３）を配列番号１３で表す。この配列モチーフはさらに下記配列に一般化してもよい。：
ＡＷＣＷＧＧＷＷＣ（Ｎ）ｎＡＷＣＷＧＧＷＷＷＷＷＡＡＧ（配列番号１５）
〔００２２２〕  この配列中「Ｗ」は、Ｃ−５修飾ピリミジンが占めてよい位置を表し、及び「Ｎ」は、非修飾または修飾ヌクレオチドのいずれかが占めてよい位置を表す。さらに、ｎは１〜３０（または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは）、または２〜２０（または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０）、または５〜１８（または５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７もしくは１８）、または１０〜１６（または１０、１１、１２、１３、１４、１５もしくは１６）の数であってよい。
【０２３９】
実施例２：アプタマーによる細菌細胞の結合及び選択的捕捉
〔００２２３〕  本実施例では、黄色ブドウ球菌細胞表面タンパク質に結合するために選択及び同定されたアプタマーがさらに細胞全体に結合し、混合細菌培養において黄色ブドウ球菌細胞を選択的に捕捉可能であることを示す。
【０２４０】
アプタマー平衡及び細胞全体の放射標識結合アッセイ
〔００２２４〕  結合アッセイ前に、アプタマーを９５℃で５分間加熱、次いで１０〜１５分の間、室温まで冷やして適切に折畳む。
【０２４１】
〔００２２５〕  親和性（Ｋｄ）は、段階希釈したタンパク質（０．００１〜１００ｎｍｏｌ  ｌ−１）及び先述のようにフィルタープレート上に分配するためのＺｏｒｂａｘ  ＰＳＭ−３００Ａ（アジレントテクノロジー）樹脂を用いて、放射標識したアプタマー（１０〜２０ｐｍｏｌ  ｌ−１）の平衡溶液中結合アッセイにより決定した（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０）。
【０２４２】
〔００２２６〕  クローニング前に、このアプタマープールをさらに黄色ブドウ球菌への特異的結合について、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、化膿性連鎖球菌、大便連鎖球菌、大腸菌、及び緑膿菌を対照として用い、２時間の平衡結合アッセイにて試験した。細胞密度は１０５〜１０８ＣＦＵ  ｍＬ−１の範囲であり、また０．１  ｍｍｏｌ  ｌ−１のデキストラン硫酸及び０．３５ｍｏｌ  ｌ−１ＮａＣｌを結合緩衝液に添加し、非特異的バックグラウンドを削減した。さらに、個々のアプタマーを、異なる系統に属する８つの異なる黄色ブドウ球菌株、ＮＲＳ３８２、ＮＲＳ３８３、ＮＲＳ３８４、ＮＲＳ１２３、ＮＲＳ３８５、ＮＲＳ３８６、ＮＲＳ１０３（ＮＡＲＳＡ）、及びＡＴＣＣ２９２１３（ＡＴＣＣ）への結合に関してスクリーニングした。
【０２４３】
〔００２２７〕  精製黄色ブドウ球菌タンパク質へのアプタマー結合親和性は、観察された全細菌への結合とよく相関した。２つのＳｐＡ−ＮａｐｄＵクローン（４５２０−８及び４５２０−９）及び３つのＳｐＡ−ＴｒｐｄＵクローン（４５３１−５５、４５３１−５６、４５３１−９４）は、試験した全黄色ブドウ球菌株の細胞全体に、放射標識フィルター結合アッセイにおける検出限界約１０４細胞／ウェル（１０５〜１０６細胞ｍｌ−１）で結合可能であった。表皮ブドウ球菌またはスタフィロコッカス・ヘモリチカス細胞への結合は観察されず、アプタマーの優れた特異性が示された（図４Ｂ参照）。同様の結合特性が、ＣｌｆＡ及びＣｌｆＢアプタマーについて観察された。対照的に、黄色ブドウ球菌に強力に結合したＦｎｂＡ及びＦｎｂＢアプタマーのほとんどは、表皮ブドウ球菌及びスタフィロコッカス・ヘモリチカスにいくらかの親和性を有していた。Ｉｓｄタンパク質、とりわけＩｓｄＣ向けのアプタマーは、黄色ブドウ球菌細胞に強力かつ特異的な結合を示し、また、鉄分を制限する条件下でこの細菌を増殖させると、信号が増強された。ＳａｓＤアプタマーは全ての細胞への結合に失敗したが、このことが低めの親和性によるものなのか、それともその表面タンパク質の低発現量によるものなのか定かではない。
【０２４４】
細胞表面タンパク質向けのアプタマーによる黄色ブドウ球菌細胞の捕捉
〔００２２８〕  ビオチン化アプタマーを、ＰＢＤＣプライマー（５’光切断ビオチン、Ｄ−スペーサー及びｃｙ３）を用いるプライマー伸長法によって、酵素的に調製した。固定のため、１ｐｍｏｌのＰＢＤＣアプタマーを２０μｌのＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（１０ｍｇ  ｍｌ−１）に添加し、１５分間振とうし、非捕捉上清画分中ｃｙ３測定に基づいて約９０％効率の固定を行った。細菌は、ＬＢブロス培養または５％ヒツジ血液及び０．１ｍｍｏｌ  ｌ−１ジピリジルを含むトリプシンソイ寒天にて１６時間３５℃で増殖させ、鉄分制限条件を作り出した。５０μｌのＳＢ１８Ｔ中１０６細菌まで含有する細胞懸濁液を捕捉ビーズに添加した。振とうしながら１時間３７℃でインキュベーションした後、ビーズを洗浄し、５０μｌのＳＢ１８Ｔに再懸濁した。非捕捉上清中の細胞、洗浄画分、及びビーズ上細胞を、段階希釈物を定量的にＬＢアガーへ播種して計数した。定量培養による捕捉効率を混合集団及びある範囲の細胞密度（１０１〜１０７ＣＦＵ  ｍｌ−１）について決定した。
【０２４５】
〔００２２９〕  細胞あたりの標的分子の数は、これら表面タンパク質のいずれについても未知であり発現量は増殖条件及び増殖期に依存して変化し得る。しかし、細胞あたり１０００コピーと想定して１０７ＣＦＵ  ｍｌ−１を用いると、アプタマーの典型的なＫｄ以下である、２０ｐｍｏｌ  ｌ−１の標的濃度が考えられる。したがって、アプタマーが低濃度の１０〜２０ｐｍｏｌ  ｌ−１で存在する、放射標識フィルター結合アッセイは比較的高細胞密度に限られる。結合反応を行うにあたり、我々はより高濃度（２０ｎｍｏｌ  ｌ−１）のビオチン化ＳｐＡアプタマーを、ビーズに付着した捕捉試薬として用い、０．１ｍＬの試料中のわずか５０細胞を検出できた（図１Ａ）。こうした低細胞密度で効率的な黄色ブドウ球菌捕捉を行うのには、アプタマー濃度１０ｎｍｏｌ  ｌ−１以上を要した（図１Ｂ）。アプタマーは、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、及び大腸菌をそれぞれ１０５〜１０６ＣＦＵ  ｍｌ−１で含有する混合培養物中の黄色ブドウ球菌細胞に選択的に結合可能であった。最も優れた性能を示した結合剤は、ＳｐＡ  ４５２０−８及びＣｌｆＡ  ４５０３−７３であり、ランダム配列修飾アプタマー対照と比べて、低い非特異的結合を示した。黄色ブドウ球菌は常磁性アプタマービーズに、５ｘ１０２〜５ｘ１０９ＣＦＵ  ｍｌ−１と広範囲の細胞密度で効率的に捕捉された（図５）。
【０２４６】
実施例３：アプタマーに基づいた濃縮を用いて強化した黄色ブドウ球菌検出
〔００２３０〕  本実施例では、試料中の微生物（例えば、黄色ブドウ球菌）の検出を、試料中の微生物をアプタマーに基づく捕捉とこれに続く検出方法（例えば、ＰＣＲ）によって濃縮することで強化する典型的な方法を提供する。
【０２４７】
〔００２３１〕  黄色ブドウ球菌細胞はまた、常磁性ＳＡビーズ（１５分、３７℃、断続的な振とう）に付着させた２５ｎｍｏｌ  ｌ−１の合成ビオチン化アプタマー（５０マー（ｍｅｒ））を用いて捕捉した。ビーズは１００μｌのＳＢ１８を用いて２回洗浄してあらゆる未結合細胞を除去し、さらに５０μｌのＳＢ１８に再懸濁した。増幅可能な全長アプタマーを添加（２０ｎｍｏｌ  ｌ−１を５０μｌ）、及びビーズを１５分、３７℃で断続的に振とうしながらインキュベートし、細胞を表面成分に特異的なアプタマーで被覆した。洗浄を１００μｌのＳＢ１８／１ｍｍｏｌ  ｌ−１デキストラン硫酸／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０で各２分ずつ５回行い、次いで、１００μｌのＳＢ１８で２回行った後、結合アプタマーを溶出、プライマー捕捉ビーズ上でクリーンアップし、さらに記載のように（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）５’及び３’固定領域に特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲに使用した。
【０２４８】
〔００２３２〕  黄色ブドウ球菌細胞の捕捉が、細胞密度が低い場合の試料の濃縮またはＰＣＲ阻害剤除去のための、ＰＣＲによる下流検出に有用であることが実証された。黄色ブドウ球菌細胞表面を全長の増幅可能アプタマーで被覆することで、ゲノム標的のｑＰＣＲと比べてアプタマーのｑＰＣＲによるより速い検出が可能になったが、これは、単一ゲノムと比べて、各細胞が検出用標的表面成分の数百コピーを含有するためである。図２に示す本実施例では、黄色ブドウ球菌細胞を非増幅可能ＣｌｆＡアプタマーを用いて捕捉し、増幅可能ＳｐＡアプタマーまたはランダム配列アプタマー対照で被覆し、次いでアプタマー特異的プライマーを用いてｑＰＣＲを行った。別途、この細胞を溶解し、黄色ブドウ球菌特異的ゲノムプライマーを用いるｑＰＣＲを行ったが、結合アプタマーのｑＰＣＲと比べて明らかに効率性が劣った。アプタマーの１０サイクルのｑＰＣＲから、ゲノムｑＰＣＲの１８サイクルのｑＰＣＲと、ｑＰＣＲ検出において最大８サイクルのずれが観察され、これは数百コピー（２８＝２５６）の表面結合アプタマーとわずか一ゲノムとの比と一致する。ＣｌｆＡまたはＳｐＡを欠く表皮ブドウ球菌細胞ではバックグラウンドを上回るアプタマー増幅とはならず、ＣｌｆＡアプタマー捕捉及びＳｐＡアプタマー検出方法は黄色ブドウ球菌細胞に特異的であった。細菌のビーズへの捕捉とこれに続くアプタマーを用いた検出は、低細胞密度懸濁からの濃縮を可能にしただけでなく効率的なＰＣＲ阻害剤の除去をも可能にした。細胞が過剰な塩（例えば、１ｍｏｌ  ｌ−１ＮａＣｌまたは０．５ｍｏｌ  ｌ−１ＫＣｌ）または低レベルの溶剤（例えば、５％イソプロパノール）を含有するマトリクス中にあった場合には、細胞をまず捕捉しこれら既知のＰＣＲ阻害剤を除去しない限り、直接ゲノムＰＣＲは成功しなかった（Ａｂｕ  Ａｌ−Ｓｏｕｄ及びＲａｄｓｔｒｏｍ、１９９８；  Ｓｃｈｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２４９】
参考文献
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Ｇｉｌｌ，  Ｓ．Ｒ．，  Ｆｏｕｔｓ，  Ｄ．Ｅ．，  Ａｒｃｈｅｒ，  Ｇ．Ｌ．，  Ｍｏｎｇｏｄｉｎ，  Ｅ．Ｆ．，  Ｄｅｂｏｙ，  Ｒ．Ｔ．，  Ｒａｖｅｌ，  Ｊ．，  Ｐａｕｌｓｅｎ，  Ｉ．Ｔ．，  Ｋｏｌｏｎａｙ，  Ｊ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎ  ａｎｄ  ａ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｓｔｒａｉｎ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８７，  ２４２６−２４３８．
Ｇｏｌｄ，  Ｌ．，  Ａｙｅｒｓ，  Ｄ．，  Ｂｅｒｔｉｎｏ，  Ｊ．，  Ｂｏｃｋ，  Ｃ．，  Ｂｏｃｋ，  Ａ．，  Ｂｒｏｄｙ，  Ｅ．Ｎ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｄａｌｂｙ，  Ａ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ａｐｔａｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ１５００４．
Ｇｏｌｄ，  Ｌ．，  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｗｉｌｃｏｘ，  Ｓ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｓ．  （２０１２）  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｓｃａｌｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＳＯＭＡｓｃａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．  Ｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，  ５４３−５４９．
Ｇｒｉｇｇ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｕｋｐａｂｉ，  Ｇ．，  Ｇａｕｄｉｎ，  Ｃ．Ｆ．  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｍ．Ｅ．  （２０１０）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｉｓｄ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ  Ｉｎｏｒｇ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １０４，  ３４１−３４８．
Ｈｕｓｓａｉｎ，  Ｍ．，  Ｂｅｃｋｅｒ，  Ｋ．，  ｖｏｎ  Ｅｉｆｆ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｒｅｎｚｅｌ，  Ｊ．，  Ｐｅｔｅｒｓ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｍ．  （２００１）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ３８．５−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８３，  ６７７８−６７８６．
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Ｒｏｃｈｅ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｍａｓｓｅｙ，  Ｒ．，  Ｐｅａｃｏｃｋ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｄａｙ，  Ｎ．Ｐ．，  Ｖｉｓａｉ，  Ｌ．，  Ｓｐｅｚｉａｌｅ，  Ｐ．，  Ｌａｍ，  Ａ．，  Ｐａｌｌｅｎ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｔ．Ｊ．  （２００３）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ＬＰＸＴＧ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９，  ６４３−６５４．
Ｒｏｃｈｅ，  Ｆ．Ｍ．，  Ｄｏｗｎｅｒ，  Ｒ．，  Ｋｅａｎｅ，  Ｆ．，  Ｓｐｅｚｉａｌｅ，  Ｐ．，  Ｐａｒｋ，  Ｐ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ，  Ｔ．Ｊ．  （２００４）  Ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｔｏ  ｅｌａｓｔｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，  ３８４３３−３８４４０．
Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，  Ｏ．，  Ｆｏｗｌｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｆａｕｌｌ，  Ｋ．Ｆ．  （１９９５）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｎｃｈｏｒ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８，  １０３−１０６．
Ｓｃｈｒａｄｅｒ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｉｅｌｋｅ，  Ａ．，  Ｅｌｌｅｒｂｒｏｅｋ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｅ，  Ｒ．  （２０１２）  ＰＣＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  −  ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｖａｌ．  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１３，  １０１４−１０２６．
Ｓｏｒｕｍ，  Ｍ．，  Ｓａｎｇｖｉｋ，  Ｍ．，  Ｓｔｅｇｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｏｌｓｅｎ，  Ｒ．Ｓ．，  Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，  Ｍ．，  Ｓｋｏｖ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｓｏｌｌｉｄ，  Ｊ．Ｕ．  （２０１３）  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ−ｂｏｕｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｏｕｎｄ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒａｅｍｉａ，  ＭＲＳＡ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｎａｓａｌ  ｃａｒｒｉｅｒ．  Ｐａｔｈｏｇ  Ｄｉｓ  ６７，  １９−２４．
Ｓｐｅｚｉａｌｅ，  Ｐ．，  Ｐｉｅｔｒｏｃｏｌａ，  Ｇ．，  Ｒｉｎｄｉ，  Ｓ．，  Ｐｒｏｖｅｎｚａｎｏ，  Ｍ．，  Ｐｒｏｖｅｎｚａ，  Ｇ．，  Ｄｉ  Ｐｏｔｏ，  Ａ．，  Ｖｉｓａｉ，  Ｌ．  ａｎｄ  Ａｒｃｉｏｌａ，  Ｃ．Ｒ．  （２００９）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ．  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４，  １３３７−１３５２．
Ｓｔｒａｎｇｅｒ−Ｊｏｎｅｓ，  Ｙ．Ｋ．，  Ｂａｅ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ，  Ｏ．  （２００６）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｆｒｏｍ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０３，  １６９４２−１６９４７．
Ｔｉｍｏｆｅｙｅｖａ，  Ｙ．，  Ｓｃｕｌｌｙ，  Ｉ．Ｌ．  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ａ．Ｓ．  （２０１４）  Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  （ＭＲＳＡ）．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０８５，  ８５−９５．
Ｖａｕｇｈｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｂｏｃｋ，  Ｃ．，  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｆｉｔｚｗａｔｅｒ，  Ｔ．，  Ｏｔｉｓ，  Ｍ．，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｄ．，  Ｒｏｌａｎｄｏ，  Ｊ．，  Ｗａｕｇｈ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．    （２０１０）  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２，  ４１４１−４１５１．
Ｙｔｈｉｅｒ，  Ｍ．，  Ｒｅｓｃｈ，  Ｇ．，  Ｗａｒｉｄｅｌ，  Ｐ．，  Ｐａｎｃｈａｕｄ，  Ａ．，  Ｇｆｅｌｌｅｒ，  Ａ．，  Ｍａｊｃｈｅｒｃｚｙｋ，  Ｐ．，  Ｑｕａｄｒｏｎｉ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｅｉｌｌｏｎ，  Ｐ．  （２０１２）  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ＬＰＸＴＧ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇｒ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ａｄｈｅｒｅｎｃｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １１，  １１２３−１１３９．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【配列表】
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