(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを含むリポソーム組成物であって、前記リポソームが、
（ａ）テトラエーテル脂質（ＴＥＬ）と、
（ｂ）細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）と、
を含み、
前記ＣＰＰが、前記リポソームの脂質二重層の一部である化合物に付着される、リポソーム組成物。
【請求項２】
前記ＴＥＬがスルホロブス属の一種に由来する、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】
前記ＴＥＬがスルホロブス・アシドカルダリウスに由来する、請求項２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】
前記ＴＥＬがグリセリルカルジチルテトラエーテル（ＧＣＴＥ）、ジグリセリルテトラエーテル（ＤＧＴＥ）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項５】
前記リポソームが、前記脂質の総量に対して１モル％〜１０モル％の量で前記ＴＥＬを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】
前記ＣＰＰが、直鎖又は環化ペネトラチン（配列番号１）、ＴＡＴ（転写トランス活性化因子）−ペプチド（配列番号２）、ＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）（配列番号３）、Ｒ９（配列番号４）、ｐＶＥＣ（配列番号５）、トランスポータン（配列番号６）及びＭＰＧ（配列番号７）、並びにそれらの組み合わせ及びそれらの二量体からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】
前記リポソームが前記脂質の総量に対して０．１モル％〜１モル％の量で前記ＣＰＰを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項８】
前記ＣＰＰが付着される前記化合物が、コレステロール及びその誘導体、リン脂質、リゾリン脂質、並びにテトラエーテル脂質からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項９】
前記ＣＰＰが共有結合的に付着される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１０】
前記ＣＰＰがリンカーを介して付着される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが二官能性ＰＥＧ−リンカーからなる群より選択される、請求項１０に記載のリポソーム組成物。
【請求項１２】
少なくとも１種の治療剤及び／又は少なくとも１種の診断剤を更に含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１３】
医薬として用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のリポソーム組成物。
【請求項１４】
経口投与用である、請求項１３に記載のリポソーム組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テトラエーテル脂質（ＴＥＬ）と、細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）とを含むリポソームを含むリポソーム組成物であって、上記ＣＰＰがリポソームの脂質二重層の一部である化合物に付着される、リポソーム組成物に関する。さらに、本発明は、治療剤及び／又は診断剤の経口送達のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
経口薬物送達は、特に、長期的で繰り返しの投薬を必要とする、慢性疾患の治療に対して、最も有利な適用方法であるとされている。経口経路は、高い薬物安全性を提供し、簡便であるため患者の間で幅広く受け入れられている。さらに、経口薬物形態の非無菌状態は、生産、保存、及び流通にかかる費用を下げ、第三世界の国々におけるヘルスケア改善に寄与し得る。販売される全薬物製剤の９０％は経口用途向けであると推定される。
【０００３】
しかしながら、多くの薬物、特にペプチド及び他の巨大分子の薬物は、経口投与後、胃の中の酸性条件下で非常に乏しい安定性を示すとともに、胃腸バリアを介した吸収が不十分である（図１）。この課題を克服するため、過去数年に亘って、固体脂質ナノ粒子、ナノエマルジョン若しくはマイクロエマルジョン、又はリポソームを含む、バイオアベイラビリティを改善する種々のアプローチが試験されてきた。しかしながら、従来のリポソーム製剤は、消化管（ＧＩＴ）におけるそれらの不安定性のため、それほど納得のいくものではなかった。
【０００４】
リポソームにおける著しい改善は、従来のリン脂質（ＰＬ）と、古細菌、例えば好極限性古細菌であるスルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）に由来する特定の脂質、いわゆるテトラエーテル脂質との組み合わせによってなされ得る。最近の研究は、これらのＴＥＬがＧＩＴにおけるリポソーム安定性を改善するとともに、粘膜浸透を媒介し得ることを示した。
【０００５】
Ｓ．アシドカルダリウスは、ほとんどが酸性状態下において５０℃〜１００℃の温度で生育し、必然的に安定な細胞膜となる。古細菌膜脂質は、主に、エーテル結合によってグリセロール及び／又はノニトール架橋（nonitol bridge）基（複数の場合がある）に連結される、Ｃ２０〜Ｃ４０のイソプレノイド−サブユニット骨格を含む。架橋基は、非置換であるか、又は多様な極性若しくは非極性の頭部基の１つで置換されている。古細菌細胞膜中のこれらの部分の量は生育条件によって異なり、環境温度とともに増加する。平均４個〜６個のシクロペンチル環を有するＴＥＬであるグリセリルカルジチルテトラエーテル（ＧＣＴＥ）及びジグリセリルテトラエーテル（ＤＧＴＥ）は、Ｓ．アシドカルダリウスから単離され得る。
【０００６】
しかしながら、ＴＥＬを使用しても、上記リポソームの粘膜浸透は多くの場合においてまだ不十分である。したがって、現在も、リポソームの粘膜浸透を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記を考慮して、本発明の根底にある技術的課題は、粘膜浸透が増強された経口経路による薬物送達手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の技術的課題に対する解決は、請求項において特徴付けられる実施の形態によって達成される。
【０００９】
特に、第１の態様において、本発明は、リポソームを含むリポソーム組成物であって、上記リポソームが、
（ａ）テトラエーテル脂質（ＴＥＬ）と、
（ｂ）細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）と、
を含み、
上記ＣＰＰが、リポソームの脂質二重層の一部である化合物に付着される、リポソーム組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】胃における分解及び不十分な粘膜浸透は、生物学的製剤の経口アベイラビリティを妨げる主なハードルであることを示す図である。ＣＰＰを含むＴＥＬ−リポソームを使用すると、両方のハードルを克服することができる。
【図２】リン脂質にカップリングされたＣＰＰを含むリポソームを示す図である。ＣＰＰは、リポソームに組み込まれた巨大分子薬物の粘膜浸透を増強する。
【図３】モノマーＣＰＰで修飾されたリン脂質の構造を示す図である。ＣＰＰは天然起源ペプチドであるペネトラチンであり、リンカーはＳＭＣＣ−リンカーである。
【図４】二量体化ＣＰＰで修飾されたリン脂質の構造を示す図である。ＣＰＰは天然起原ペプチドであるペネトラチンであり、ここでは、２つのペネトラチン分子がトリペプチドＫＡＫによって二量体化される。リンカーは６−マレイミドヘキサン酸リンカーである。
【図５】質量分析によるペネトラチン−レシチン−複合体の分析を示す図である。
【図６】分取放射性ＨＰＬＣによる精製前／精製後の１３１Ｉ放射能標識化バンコマイシンの放射性ＨＰＬＣスペクトルを示す図である。
【図７】ＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームのクライオ電子顕微鏡写真を示す図である。
【図８Ａ】凍結乾燥保護剤として１００ｍＭ〜５００ｍＭのショ糖を使用する凍結乾燥プロセス前／後のリポソームサイズの比較を示す図である。
【図８Ｂ】凍結乾燥保護剤として１００ｍＭ〜５００ｍＭのショ糖を使用する凍結乾燥プロセス前／後のリポソームＰＤＩの比較を示す図である。
【図９】経口投与から１時間後の１３１Ｉバンコマイシンの血液レベルの比較を示す図である。
【図１０】ＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームの血液レベルの比較を示す図である。
【図１１】特定のテトラエーテル脂質とＣＰＰ−リン脂質−複合体（直鎖及び環状）とを含む、新規リポソームを示す図である。
【図１２】経口薬物送達に対するモデル物質及び分子量を示す図である。
【図１３】幾つかの時間点におけるＨＰＬＣ／ＭＳによって検出される人工腸液中のインタクトＣＰＰの回収を示す図である。
【図１４】幾つかのリポソーム製剤を、放射能標識化バンコマイシン又は免疫アッセイのいずれかにより試験し、幾つかの時間点においてバンコマイシンの血液レベルを特定した図である。
【図１５】静脈内適用と比較した経口リラグルチド（１モル％の環状ＣＰＰ−複合体）のバイオアベイラビリティを示す図である。
【図１６】雄性ウィスターラットにおける抗体アダリムマブ（ヒュミラ（商標））のバイオアベイラビリティを示す図である。
【図１７】様々なＰＥＧ−リンカー（種々の量のＰＥＧ単位）を使用する、３つのペプチド薬物の組み込み効率の特定を示す図である。
【図１８】様々な濃度のＰＥＧ単位の量が異なるリンカーを含むリポソーム製剤のサイズ／ＰＤＩを示す図である。
【図１９】標準リポソームと比較したＣＰＰ−リン脂質−複合体（１モル％）を有するリポソームのゼータ電位を示す図である。
【図２０】標準リポソームと比較した、１モル％の環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソームの細胞結合アッセイを示す図である。
【図２１】静脈内適用と比較した経口バンコマイシン（１モル％の環状ＣＰＰ−複合体）のバイオアベイラビリティを示す図である。
【図２２】２つの抗体アダリムマブ及びセツキシマブの組み込み効率を示す図である。
【図２３】Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける抗体セツキシマブの腫瘍蓄積を示す図である。
【図２４】リポソーム中へのＭＡＰ−リン脂質−複合体の組み込み後の粒子の特性評価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書で使用される「リポソーム組成物」の用語は、リポソームを含む組成物に関する。本明細書で使用される「リポソーム」の用語は、脂質二重層で構成される人工的に作製された小胞を指す。リポソームは、疎水性膜の内側に水溶液の領域を封入するそれらの特有の性質により、薬剤の送達に使用され得る。溶解した親水性の溶質は、容易に脂質二重層を通り抜けることができない。疎水性化合物は脂質二重層に溶解可能であり、このようにしてリポソームは疎水性と親水性の両方の化合物を運ぶことができる。作用部位へと分子を送達するため、脂質二重層は、細胞膜等の他の二重層と融合して、リポソームの内容物を送達することができる。薬剤の溶液中でリポソームを作製することにより、薬剤をリポソームの内腔（inner lumen）に送達することができる。
【００１２】
リポソームの形成に使用することができるＴＥＬは、特に限定されず、当該技術分野において知られている。特定の実施形態では、上記ＴＥＬはスルホロブス属の古細菌の種、例えば、Ｓ．イスランディカス（S. islandicus）又はＳ．アシドカルダリウスに由来し、後者が特に好ましい。好ましい実施形態において、ＴＥＬは、グリセリルカルジチルテトラエーテル（ＧＣＴＥ）、ジグリセリルテトラエーテル（ＤＧＴＥ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１３】
本発明の組成物で使用されるリポソームは、脂質の総量に対して、１モル％〜２５モル％、好ましくは１モル％〜１０モル％、より好ましくは３モル％〜７モル％、より好ましくは４モル％〜６モル％の量で上記ＴＥＬを含むことが好ましい。特定の実施形態において、上記リポソームは、脂質の総量に対して約５モル％の量で上記ＴＥＬを含む。
【００１４】
上に記載されるＴＥＬの存在の他に、本発明による組成物で使用されるリポソームは、特定の脂質に特に限定されない。特に、上記リポソームの生成に使用される脂質は当該技術分野において知られている任意の好適な脂質であってもよい。これらの脂質として、限定されないが、コレステロール若しくはその誘導体、リン脂質、リゾリン脂質又は更なるテトラエーテル脂質が挙げられる。したがって、好ましい実施形態では、上記リポソームは、コレステロール及びその誘導体、リン脂質、リゾリン脂質、並びにテトラエーテル脂質からなる群から選択される１以上の脂質を含む。本発明で好ましいコレステロール誘導体はステロイド、及び基本的なステロイド分子構造を有する化合物である。上記リポソームはリン脂質を含むことが好ましく、ここで、上記リン脂質は合成リン脂質、半合成リン脂質又は天然リン脂質であってもよい。一般に、好適な脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシット（phosphatidylinosites）、ホスファチジルセリン、セファリン、ホスファチジルグリセロール及びリゾリン脂質からなる群から選択され得る。本発明の特定の実施形態では、リポソームは卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ；レシチン）及びコレステロールを含み、約８５モル％のＥ−ＰＣ及び約１０モル％のコレステロールの量で含むことが好ましい。本発明に従って使用されるリポソームは、例えば、酵素阻害剤、浸透促進剤、又はリポソームの安定化若しくはリポソーム特性の変更に使用され得る他の脂肪親和性若しくは親水性の物質等の任意の更なる好適な薬剤を更に含んでもよい。かかる脂肪親和性又は親水性の物質は特に限定されず、当該技術分野において知られている。それらの物質として、例えば、ビタミンＥ、脂肪酸、ワックス、並びにモノ−、ジ−及びトリグリセリドが挙げられる。さらに、酵素阻害剤、タイトジャンクション調節剤又はキレート剤のような封入された活性剤のバイオアベイラビリティを増強する物質を添加してもよい。
【００１５】
本発明と関連して使用され得るＣＰＰは特に限定されず、当該技術分野において知られている。ＣＰＰは正の全電荷を有するＣＰＰであることが好ましい。各ＣＰＰは当該技術分野において知られている。ＣＰＰは、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）に由来する直鎖の又は環化されたペネトラチン（配列番号１；ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ＨＩＶ−１に由来するＴＡＴ（転写トランス活性化因子）−ペプチド（配列番号２；ＣＧＲＫＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ）、人工ペプチドであるＭＡＰ（モデル両親媒性ペプチド）（配列番号３；ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ）、人工ペプチドであるＲ９（配列番号４；ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ネズミ科血管内皮カドヘリンに由来するＣＰＰであるｐＶＥＣ（配列番号５；ＬＬＩＩＬＲＲＲＩＲＫＱＡＨＡＨＳＫ−アミド）、ヒト神経ペプチドガラニンに由来するトランスポータン（配列番号６；ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＩＳＩＬ−アミド）、及びＨＩＶに由来するＭＰＧ（配列番号７；ＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＳＫＲＫＶ）、それらの組み合わせ、並びにそれらの二量体からなる群から選択されることがより好ましい。ここで、上記のペプチドはいずれも、直鎖形態又は環化形態で存在してもよく、環化形態が好ましい。さらに、本発明のＣＰＰは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、又はそれらの混合物で構成されてもよく、直鎖ＣＰＰについてはＤ−アミノ酸が好ましい。
【００１６】
本発明によれば、ＣＰＰは、リポソームの脂質二重層の一部である化合物に付着される。ここで、「リポソームの脂質二重層の一部である」の用語は、上記リン脂質が上記脂質二重層へ統合されるという事実を示すことを意図する。付着は共有結合的な付着であることが好ましい。ＣＰＰが付着され、リポソームの脂質二重層の一部である化合物は、上に定義される好適な脂質、例えば、コレステロール及びその誘導体、リン脂質、リゾリン脂質、並びにテトラエーテル脂質からなる群から選択される脂質であることが好ましく、リン脂質が好ましく、上記脂質は修飾された脂質及び／又は活性化された脂質であってもよい。ＣＰＰはリンカーを介して上記化合物に付着されることが好ましい。ここでは、単量体ＣＰＰはリンカーを介してリン脂質に共有結合的に付着されてもよく（図３）、又はホモ二量体及びヘテロ二量体が可能である二量体化ＣＰＰがリンカーを介してリン脂質に共有結合的に付着される（図４）。ＣＰＰの二量体化は当該技術分野で知られている任意の手段によってなされ得る。特定の実施形態では、ＣＰＰはトリペプチドＫＡＫによって二量体化される。しかしながら、例えば、マレイミド修飾頭部基を有するリン脂質等の修飾された及び／又は活性化された脂質を使用する場合、リンカーによらない付着も可能である。
【００１７】
本発明のリポソーム組成物に含まれるリポソームは、脂質の総量に対して０．０５モル％〜５モル％、好ましくは０．１モル％〜１モル％の量で上記ＣＰＰを含むことが好ましい。単量体ＣＰＰの場合、これらは、脂質の総量に対して０．０５モル％〜２モル％、好ましくは０．１モル％〜１モル％の量で含まれることが好ましい。二量体化ＣＰＰの場合、これらは、脂質の総量に対して０．０５モル％〜０．５モル％、好ましくは０．１モル％の量で含まれることが好ましい。
【００１８】
ＣＰＰの共有結合的な付着に適したリン脂質は、特定のリン脂質に特に限定されない。特に、ＣＰＰの共有結合的な付着に使用されるリン脂質は、当該技術分野において知られている任意の好適なリン脂質であってもよく、上記リン脂質は合成リン脂質、半合成リン脂質又は天然リン脂質であってもよい。一般に、好適なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシット、ホスファチジルセリン、セファリン、ホスファチジルグリセロール、及びリゾリン脂質からなる群から選択され得る。この点で特定のリン脂質は、卵ホスファチジルコリン（Ｅ−ＰＣ；レシチン）である。さらに、この点で適したリン脂質として、上記リン脂質のＰＥＧ修飾形態、例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）マレイミド（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩））が挙げられる。
【００１９】
リン脂質へのＣＰＰの共有結合的な付着に適したリンカーは特に限定されず、当該技術分野において知られている。それらのリンカーとして、例えば、一般に、二官能性ＰＥＧ−リンカー、例えばＳＭ（ＰＥＧ）２４（ＰＥＧ化、長鎖ＳＭＣＣ架橋リンカー）が挙げられる。この点で特定の例示的なリンカーは、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）−リンカー、及び６−マレイミドヘキサン酸リンカーである。ここでは、かかるリンカー中のＰＥＧ部分の長さは、本発明のリポソーム組成物に含まれるリポソームに組み込まれる薬物の封入効率に影響を及ぼす。したがって、上記ＰＥＧ部分は、８個〜５０個の個別のＰＥＧ単位の長さを有することが好ましい。さらに、リンカーを介してＣＰＰをリン脂質に共有結合で連結する方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。
【００２０】
また、本発明の組成物中に含まれるリポソームの作製に使用される脂質は、ペプチド配列、抗体、受容体リガンド及び界面活性剤等の標的探索構造（target seeking structures）に付着され得る。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の組成物に含まれるリポソームは、水性媒質中に希釈後、動的光散乱によって測定される高くても３５０ｎｍのＺ平均、及び高くても０．３の多分散性指数（ＰＤＩ）を示し、Ｚ平均１００ｎｍ〜２００ｎｍと、多分散性指数０．１〜０．３、好ましくは約０．２とが特に好ましい。
【００２２】
リポソームを生成する方法は特に限定されず、当該技術分野において知られている。それらの方法として、例えば、高圧均質化、押し出し及び二重非対称遠心分離（ＤＡＣ：dual asymmetric centrifugation）が挙げられる。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明のリポソーム組成物は、少なくとも１種の更なる治療剤及び／又は少なくとも１種の診断剤を更に含むことができる。
【００２４】
各治療剤としては、特に限定されず、経口送達を目的とし得る任意の薬剤が挙げられる。治療剤として、例えば、ペプチド薬物（例えばオクトレオチド、酢酸グラチラマー、バンコマイシン、ミルクルデックスＢ、あらゆる種類のインスリン及びリラグルチド、並びにエキセナチド、リキシセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、タスポグルチド及びセマグルチド等のＧＬＰ（グルカゴン様ペプチド）−アナログ）、及びタンパク質又は抗体（例えばエタネルセプト；ペグフィルグラスチム；アダリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ、エポエチンアルファ、トラスツズマブ、ラニビズマブ、ベータ−インターフェロン、オマリズマブ）等の巨大分子が挙げられる。他の例として、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー阻害剤、細胞壊死糖タンパク質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移増殖因子、アルファ−１抗トリプシン、アルブミン及びそのフラグメントポリペプチド、アポリポタンパク質−Ｅ、エリスロポイエチン、血液凝固第ＶＩＩ因子、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、血液凝固第ＩＸ因子、プラスミノゲン活性化因子、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤、スーパーオキシドジスムターゼ、血小板由来増殖因子、表皮増殖因子、骨形成増殖因子、骨刺激タンパク質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、結合組織活性化因子、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子、副甲状腺ホルモン、リラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様増殖因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、様々なウイルス、細菌又は毒素に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、ウイルス由来ワクチン抗原、オクトレオチド、シクロスポリン、リファンピシン）、ロピナビル、リトナビル、バンコマイシン、テラバンシン、オリタバンシン、ダルババンシン、ビスホスホネート、イトラコナゾール、ダナゾール、パクリタキセル、シクロスポリン、ナプロキセン、カプサイシン、硫酸アルブテロール、硫酸テルブタリン、塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、塩酸ロラタジン、塩酸フェキソフェナジン、フェニルブタゾン、ニフェジピン、カルバマゼピン、ナプロキセン、シクロスポリン、ベタメタゾン、ダナゾール、デキサメタゾン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、１７ベータ−エストラジオール、ケトコナゾール、メフェナム酸、ベクロメタゾン、アルプラゾラム、ミダゾラム、ミコナゾール、イブプロフェン、ケトプロフェン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾン（methylprednisone）、フェニトイン、テストステロン、フルニソリド、ジフルニサール、ブデソニド、フルチカゾン、インスリン、グルカゴン様ペプチド、Ｃ−ペプチド、エリスロポイエチン、カルシトニン、��体形成ホルモン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン、リュープロリド、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンベータ−Ｉａ、サルグラモスチム、アルデスロイキン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−ｎ３、アルファ−プロテイナーゼ阻害剤、エチドロネート、ナファレリン、絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン、プロスタグランジンＥ２、エポプロステノール、アカルボース、メトホルミン、デスモプレシン、シクロデキストリン、抗生物質、抗真菌薬、ステロイド、抗癌剤、鎮痛剤、抗炎症剤、駆虫剤、抗不整脈薬、ペニシリン、抗凝血薬、抗鬱薬、抗糖尿病薬、抗てんかん薬、抗ヒスタミン薬、血圧降下薬、抗ムスカリン剤、抗マイコバクテリア剤（antimycobacterial agents）、抗腫瘍剤、ＣＮＳ活性剤、免疫抑制剤、抗甲状腺薬、抗ウイルス剤、抗不安鎮静剤、催眠薬、神経遮断薬、収斂薬、ベータ−アドレナリン受容体遮断薬、血液製剤及び代用血液、心臓変力薬（cardiacinotropic agents）、造影剤、副腎皮質ステロイド、鎮咳薬、去痰剤、粘液溶解薬、利尿薬、ドーパミン作動薬、抗パーキンソン病薬、止血薬、免疫学的薬剤、脂質調節剤、筋弛緩薬、副交感神経作用薬、甲状腺カルシトニン、プロスタグランジン、放射性医薬品、性ホルモン、ステロイド、抗アレルギー剤、賦活薬、食思減退薬、交感神経作用薬、甲状腺薬、血管拡張剤、キサンチン、ヘパリン、治療用オリゴヌクレオチド、ソマトスタチン及びそれらのアナログ、並びにそれらの薬理学的に許容可能な有機塩及び無機塩、又は金属錯体からなる群から選択される薬学的活性剤が挙げられる。
【００２５】
さらに、各診断用剤は特に限定されず、経口送達を目的とし得る任意の薬剤を含む。
【００２６】
上記の薬剤は、例えば、上記薬剤が親水性であるか、又はリポソーム膜へ統合される場合、例えば、上記薬剤が脂肪親和性である場合、リポソームに封入された本発明のリポソーム組成物中、すなわち上記リポソームの内腔に存在してもよい。ここでは、治療剤及び／又は診断剤の封入は、上記薬剤の親水性及びリポソーム作製方法に依存する。
【００２７】
好ましい実施形態では、本発明によるリポソーム組成物中の治療剤及び／又は診断剤の含有量は、薬剤の使用量に関して０％超であり、多くても５０％（重量／重量）である。
【００２８】
上記の態様に従って、本発明のリポソーム組成物は医薬として用いられるものであってもよい。上記リポソーム組成物は、敗血症、糖尿病、リウマチ、先端巨大症、あらゆる種類の肝炎、あらゆる種類の癌、及び貧血の治療に使用されることが好ましい。好ましくは、本発明の用途限定リポソーム組成物は、経口投与用である。
【００２９】
最近の研究は、プロトンポンプ阻害剤であるオメプラゾールによる前処理が、リポソーム中へのプロトンの拡散を減少させ、結果的に胃の中のｐＨを引き上げることによってタンパク質等の封入された薬剤の変性を減少させることを示した。したがって、本発明の用途限定リポソーム組成物の好ましい実施形態では、被験体はプロトンポンプ阻害剤で事前に治療され、ここで上記プロトンポンプ阻害剤は、オメプラゾール（６−メトキシ−２−［（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イル）メタンスルフィニル］−１Ｈ−１，３−ベンゾジアゾール）、パントプラゾール（（ＲＳ）−６−（ジフルオロメトキシ）−２−［（３，４−ジメトキシピリジン−２−イル）メチルスルフィニル］−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール）、エソメプラゾール（（Ｓ）−５−メトキシ−２−［（４−メトキシ−３，５−ジメチルピリジン−２−イル）メチルスルフィニル］−３Ｈ−ベンゾイミダゾール）、ランソプラゾール（（ＲＳ）−２−（［３−メチル−４−（２，２，２−トリフルオロエトキシ）ピリジン−２−イル］メチルスルフィニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール）、及び／又はラベプラゾール（（ＲＳ）−２−（［４−（３−メトキシプロポキシ）−３−メチルピリジン−２−イル］メチルスルフィニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール）であることが好ましい。
【００３０】
有利には、本発明のリポソーム組成物を、例えば、上記組成物の長期保存を可能にする凍結乾燥保護剤として３００ｍＭ〜５００ｍＭのショ糖を使用して、凍結乾燥することができる。
【００３１】
関連の第２の態様において、本発明は、少なくとも１種の治療剤及び／又は少なくとも１種の診断剤を経口送達するための、本発明のリポソーム組成物の使用に関する。
【００３２】
ここで、「経口送達」の用語は、上記薬剤の経口投与による１以上の薬剤の送達に関する。
【００３３】
この態様では、本発明の第１の態様に対して与えられる全ての関連する限定及び定義が同じように適用される。特に、リポソーム組成物、治療剤、及び診断剤は上に定義される通りである。
【００３４】
更に関連する態様では、本発明は、被験体に本発明のリポソーム組成物を投与する工程、好ましくは経口投与する工程を含む、少なくとも１種の治療剤及び／又は少なくとも１種の診断剤を上記被験体に送達する方法に関する。
【００３５】
この態様では、本発明の第１の態様に対して与えられる全ての関連する限定及び定義が同じように適用される。特に、リポソーム組成物、治療剤、及び診断剤は上に定義される通りである。
【００３６】
本明細書で使用される、「約」の用語は、明示される値の±１０％の修飾語であることが意図される。例として、「約５％」の用語は、４．５％〜５．５％の範囲を包含することが意図される。
【００３７】
「含んでいる／含む」、「からなっている／からなる」、及び「から本質的になっている／から本質的になる」の用語は、本明細書で置き換え可能に使用され、すなわち、上記用語は各々、他の２つの用語のうちの１つと明確に交換可能である。
【００３８】
「組成物」及び「製剤」の用語は本明細書で等価に使用され、互いに置き換え可能であることが明確に意図される。
【００３９】
本発明は、上記リポソームの粘膜浸透を有利に増加させるためにリポソームに共有結合的に付着されるＣＰＰを利用する（図２）。
【００４０】
本発明を以下の実施例により更に説明するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【００４１】
実施例
材料及び方法
材料
Egg Bio Chemica（ドイツ国ダルムシュタットのAppliChem GmbH）製レシチン；コレステロール（ドイツ国タウフキルヘンのSigma Aldrich）；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチオエタノール（チオール修飾レシチン；米国アラバマ州のAvanti（商標） polar lipids）；以下に記載されるようにＳ．アシドカルダリウスから単離したテトラエーテル脂質（ＴＥＬ）；ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（英国のlife technologies（商標）によるｇｉｂｃｏ（商標））；ガラスビーズ（０．７５ｍｍ〜１．０ｍｍ；カールスルーエのCarl Roth GmbH + Co. KG）；ＮＡＰ（商標）−５カラム（英国バッキンガムシャーのGE Healthcare）；Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（ドイツ国タウフキルヘンのSigma Aldrich）；クロロホルム（ドイツ国タウフキルヘンのSigma Aldrich）；メタノール（ドイツ国タウフキルヘンのSigma Aldrich）；Ａｎｔｒａ  ＭＵＰＳ（オメプラゾール、ヴェーデルのAstra Zeneca GmbH）；シリカゲル６０（０．０６３ｍｍ〜０．２００ｍｍ、ドイツ国ゲルンスハイムのMerck）；放射性ヨウ素（米国ボストンのPerkin Elmer（商標））。
【００４２】
ＴＥＬの単離
当該技術分野において知られている通りに細胞の生育及び脂質抽出を行った。Ｓ．アシドカルダリウスを培地から分離し、Christ製のＤｅｌｔａ  １−２０  ＫＤを使用して凍結乾燥した。当該技術分野において知られている通りにクロロホルム／メタノール（２：１）を用いるソックスレー抽出によって脂質を単離した。抽出した溶媒をロータリーエバポレーション（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ−Ｒ、スイス国フラヴィルのBuchi Labortechnik AG）によって除去した。その後、脂質混合物をクロロホルム、メタノール及び塩酸（８：３：１）の混合物に溶解した。脂質頭部基を開裂するために該混合物を３日間加熱した。最後に、脂質を水相からクロロホルム／メタノール（２：１）で抽出した。グリセリルカルジチルテトラエーテル脂質（ＧＣＴＥ）は第１の溶離液（カラムの予備洗浄用）として水／メタノール（１：１）でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離した後、望ましくない脂質及びメタノール／クロロホルム（１：１）を除去するために水／メタノール／クロロホルム（１：２．５：１）によって分離し、ＧＣＴＥ画分を得た。
【００４３】
ＣＰＰ（ペネトラチン）−リン脂質−複合体の合成
１．ＣＰＰペネトラチンの合成
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａペプチド合成機でフルオレニルメトキシカルボニル／ｔ−ブチル（Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ）化学を使用し、固相合成によって、ペネトラチンを産生した。カップリング条件の残りは記載の通り行う。Ｒｅｐｒｏｓｉｌ（商標）Ｇｏｌｄ  １２０Ｃ−１８カラム（４μｍ、１５０ｍｍ×２０ｍｍ）を備えるＬａＰｒｅｐ  Ｐ１１０（VWR International）ＨＰＬＣシステムで精製を行った。０．１％のＴＦＡを含む水及びアセトニトリルを、２０ｍｌ／分の流速で溶離液として使用した。分離条件は１５分で６０％〜９０％のアセトニトリルの直線濃度勾配であった。溶離液として、水中の０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（溶離液Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ｂ）を使用した。合成したペプチドのアイデンティティーは、ＨＰＬＣ−ＭＳ（質量分析）分析（Ｅｘａｃｔｉｖｅ、Thermo Fisher Scientific）によって検証した。
【００４４】
２．ＣＰＰ（ペネトラチン）−リン脂質−複合体の合成
ＤＣＭ／ＤＭＳＯの２：１混合物中のチオール修飾リン脂質の１ｍＭの溶液５ｍｌに対して、２００μｌのＤＭＳＯに予め溶解した２０ｍｇのペネトラチン−Ｃｙｓを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物を２０ｍｌのＡＣＮ／Ｈ２Ｏの４：１混合物に溶解した。Ｒｅｐｒｏｓｉｌ（商標）Ｇｏｌｄ  １２０Ｃ−１８カラム（４μｍ、１５０ｍｍ×２０ｍｍ）を備えるＬａＰｒｅｐ  Ｐ１１０（VWR International）ＨＰＬＣシステムで精製を行った。０．１％のＴＦＡを含む水及びアセトニトリルを２０ｍｌ／分の流速で溶離液として使用した。Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（商標）  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−Ｃ１８ｅカラム（１００ｍｍ×４．６ｍｍ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで分析的分析を行った。０．１％のＴＦＡを含む水及びアセトニトリルを２ｍｌ／分の流速で溶離液として使用した。Ｗａｔｅｒｓ（商標）Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  ａｑカラム（２００ｍｍ×２．１ｍｍ）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステム、続いてＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計でＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行った。０．０５％のＴＦＡを含む水及びアセトニトリルを２００μｌ／分の流速で溶離液として使用した。
【００４５】
バンコマイシンの１３１Ｉ放射能標識化
１３１Ｉ放射能標識化のため、ＰＢＳ中にモデル物質であるバンコマイシンの１ｍｍｏｌ原液を用意した。必要量の放射性ヨウ素−１３１を２５μｌの原液に添加し、当該技術分野において知られているクロラミンＴ法を使用して標識化を行った。当該技術分野において知られている半分取（semi-preparative）ＨＰＬＣによって反応混合物を精製した。その後、５分以内；流量２ｍｌ／分；ＵＶ吸光度λ＝２１４；γ−検出で、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ｂ）に対する水中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ａ）の直線勾配を適用して、Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−Ｃ１８（１００ｍｍ−３ｍｍ）カラムを使用する放射性ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）によって放射能標識の純度を特定した。
【００４６】
リポソームの作製
ＳｐｅｅｄＭｉｘｅｒ（商標）（ＤＡＣ１５０ＦＶＺ  ドイツ国ハムのHauschild Engineering GmbH & Co. KG）を使用するＤＡＣ法によりリポソームを作製した。最初に、脂質をクロロホルム／メタノール９：１に溶解して１００ｍｍｏｌの原液を得る一方で、クロロホルム／メタノール１：１（１ｍｍｏｌ原液）にＣＰＰを溶解した。必要量のＣＰＰ原液（０．１モル％〜１．０モル％）を脂質混合物（８５モル％のＥＰＣ、１０モル％のコレステロール及び５モル％のＴＥＬ）に添加し、窒素流（nitrogen stream）によって有機溶媒を蒸発させた。その後、得られた脂質フィルムを真空チャンバーで１時間乾燥した。スピード混合プロセスを開始する前に、２０ｍｇの０．０７５ｍｍ〜１．００ｍｍのガラスビーズを添加した。スピード混合、及び総容積２５０μｌ（表１を参照されたい）までの３回の実行で種々の量の組み込み物質（例えば、バンコマイシン−ＰＢＳに溶解した１ｍｍｏｌ原液−；１回目）又はＰＢＳ（２回目／３回目）の添加によって、リポソームを作製した。比較のため、標準リポソーム（８５モル％のＥＰＣ；１５モル％のコレステロール）を同じように作製した。
【００４７】
【表１】
0006689378.tif 000002
【００４８】
封入効率
５分以内；流量２ｍｌ／分；ＵＶ吸光度λ＝２１４ｎｍで、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ｂ）に対する水中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ａ）の直線勾配を適用して、Ｃ１８カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ、１００ｍｍ−３ｍｍ）を使用する逆相（ｒｐ）ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）によってバンコマイシンの封入効率を特定した。スピード混合プロセスの後、リポソームを１００μｌずつ２つの部分に分割した。５０μｌの１０％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００の添加によってリポソームを破壊し、ｒｐＨＰＬＣによってバンコマイシンのＡＵＣを特定することにより、部分１（Part 1）を使用して１００％の値を計算した。部分２をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラフィー（ＮＡＰ（商標）−５カラム）によって精製した後、部分１と同じように処理した。封入効率Ｅ（％）を、部分２の希釈の補正後に以下の方程式によって特定した。
Ｅ（％）＝［ＡＵＣ］バンコマイシン部分２／［ＡＵＣ］バンコマイシン部分１×１００％
【００４９】
［ＡＵＣ］バンコマイシン部分２が精製されたリポソーム画分であり、［ＡＵＣ］バンコマイシン部分１はリポソーム作製後の１００％の値である。
【００５０】
粒子の特性評価
１．粒子径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位
全てのリポソーム製剤の粒子径、ＰＤＩ及びゼータ電位を、Malvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して、室温で特定した。サイズ及びＰＤＩをＰＢＳで０．０７６ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した後に測定し、一方、ゼータ電位を５０ｍｍｏｌリン酸バッファーによって０．９５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した後に特定した。測定は自動モード及び３回の測定の平均を使用して行った。サイズをｎｍで、ゼータ電位をｍＶで明示するが、ＰＤＩは無次元値である。
【００５１】
２．クライオ電子顕微鏡写真（ＥＭ）
当該技術分野で知られているように、ＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームのサイズ及びラメラ構造を特定するため、試料を２／２  ＱｕａｎｔｉｆｏｉｌグリッドでＦＥＩ  Ｖｉｔｒｏｂｏｔを使用して凍結した。その後、各サンプルを３秒間グロー放電させ、８秒間〜１０秒間４℃及び１００％湿度でブロットした。グリッドを２００ｋＶ及び液体窒素温度にて操作したクライオス（Krios）顕微鏡で観察した。ＣＰＰ−リポソーム試料の写真を倍率６４０００倍で撮影した。
【００５２】
長期保存安定性
１．種々のモル比で凍結乾燥保護剤としてショ糖を使用する凍結乾燥
全てのリポソーム製剤をChrist製のＤｅｌｔａ  １−２０  ＫＤで凍結乾燥した。主な乾燥を−２０℃で２日間行い、続いて少なくとも６時間に亘って０℃で二次乾燥を行った。以前より、ショ糖が良好な凍結乾燥保護剤であることがわかっていたため、１００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲で凍結乾燥保護剤としてショ糖を使用した。簡潔には、３回の実行の間にＰＢＳバッファーに代えて所望の濃度のＰＢＤ中のショ糖を添加する点で異なるが、上に記載されるようにリポソームを作製した。リポソーム懸濁液をエッペンドルフ管１本当たり５０μｌに分割して凍結乾燥した。凍結乾燥リポソームを５０μｌのＰＢＳによって再水和し、サイズ及びＰＤＩを上に記載されるMalvern（商標）製Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して特定した。
【００５３】
２．凍結乾燥物の残留水分（residual moisture）
９０秒で１２０℃まで加熱することにより凍結乾燥されたリポソーム１００ｍｇを使用して、水分計（ドイツ国バーリンゲンのKern&Sohn）によってＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームの残留水分を特定した。
【００５４】
実証実験：動物研究
１．種々の製剤の１３１Ｉ標識化バンコマイシンの血液レベル
体重約２２０ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを用いて、地方自治体（local authorities）に従い、動物研究を行った。種々の製剤の血液レベルを特定するため、バンコマイシンを１３１Ｉによって放射能標識化し、幾つかのリポソーム製剤に組み込んだ。経口投与から１時間後のバンコマイシンの血液レベルを、標準と比較して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用して、放射能を直接計数することにより測定した。簡潔には、５群（ｎ＝６）のウィスターラットを形成した。プロトンポンプ阻害剤であるオメプラゾールによる前処理がリポソーム中へのプロトンの拡散を減少させ、結果的に胃のｐＨを引き上げることによって封入された薬剤の変性を減少させることが最近の研究により示されたため、実験の前日に強制投与によって懸濁したＡｎｔｒａ  ＭＵＰＳ（商標）（オメプラゾール）（ラット１匹当たり１０ｍｇ）でラットを前処理した。実験前１２時間に亘り給餌せず、自由飲水でラットを維持した。経口適用を強制投与によって実施した。１時間後にラットを屠殺し、血液試料を採取して計量し、血液試料中の放射能を、標準と比較して、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用して測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）と関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ）として表した。その後、総血液レベル（％ＩＤ）を計算した。
【００５５】
２．免疫アッセイによるバンコマイシン血液レベルの特定
放射性血液試料の測定によって得られた値を検証するため、ＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソーム製剤のバンコマイシン免疫アッセイ（米国タリータウンのSiemens、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ（商標）ＶＡＮＣ  ＲｅａｄｙＰａｃｋ（商標））を行った。放射能標識化による研究と同様、５００μｌのＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームを強制投与によって２５０ｇの雄性ウィスターラット（ｎ＝６）に投与した。実験の前日、強制投与によって懸濁したＡｎｔｒａ  ＭＵＰＳ（商標）（オメプラゾール）（ラット１匹当たり１０ｍｇ）でラットを前処理した。経口投与の１時間後、ラットを屠殺し、血液試料を得て、血漿を分離し、バンコマイシンの量を上に記載される免疫アッセイによって特定した。
【００５６】
実施例１：
ＴＥＬの単離
単離処理は、質量分析及び薄層クロマトグラフィーによって特定される脂肪親和性鎖中のペンチル環の数がほんのわずかに変化する（３個〜５個）精製形態のテトラエーテル脂質をもたらした。環の数は古細菌の培養中の温度によって影響を受ける。４００ｇの湿質量の細胞（wet cell mass）当たり、平均１ｇのテトラエーテル脂質を得ることができた。
【００５７】
実施例２：
ＣＰＰ−リン脂質−複合体の合成及び特性評価
質量分析によって特定されるように、高純度でＣＰＰ（ペネトラチン）−リン脂質−複合体を得ることができた（図５）。生成物の全収率は分取ＨＰＬＣによる精製の後、約５９％であった。
【００５８】
実施例３：
バンコマイシンの１３１Ｉ放射能標識化
バンコマイシンの１３１Ｉ放射能標識化は、放射性ＨＰＬＣによって特定されるように高純度（９５％超）の所望の生成物をもたらした（図６）。クロラミンＴ法を使用する標識化効率は、適用された放射能の約６０％であった。
【００５９】
実施例４：
封入効率
ＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームは、標準リポソームの特定された値（３８．７３±１．２３％）に匹敵する３５．３８±１．６５％の封入効率を示した。
【００６０】
実施例５：
粒子の特性評価
１．粒子径、多分散性指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位
応用ＤＡＣ法は、サイズ、ＰＤＩ及び組み込み効率（表２を参照されたい）において高い均一性を有するＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームをもたらした。標準リポソームと比較して、サイズ及びＰＤＩはわずかな増加を示したのに対し、ＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームは標準リポソームより高い正のゼータ電位を特徴とする。
【００６１】
【表２】
0006689378.tif 000003
【００６２】
２．クライオ電子顕微鏡写真（ＥＭ）
クライオ電子顕微鏡写真（図７）は、８５モル％レシチン；１０モル％コレステロール；５モル％ＴＥＬ及び０．１モル％ペネトラチンを含むＣＰＰ−ＴＥＬ−バンコマイシン−リポソームのサイズ及びラメラ構造を示す。撮影されたリポソームの大半は、単層から最大３層までのラメラ層をそれぞれ示す。
【００６３】
実施例６：
長期保存安定性
１．種々のモル比で凍結乾燥保護剤としてショ糖を使用する凍結乾燥
凍結乾燥保護剤として種々のモル比でショ糖を含むＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームを凍結乾燥することは、凍結乾燥プロセスの前に測定したデータと比較して、或る特定のモル比について匹敵するサイズ及びＰＤＩをもたらした（図８Ａ、図８Ｂ）。このリポソーム製剤に関し、ショ糖の下限は３００ｍｍｏｌであるが、最良の結果は５００ｍＭの濃度のショ糖を使用して得られた。凍結乾燥保護剤の濃度の更なる増加（５００ｍｍｏｌ超のショ糖）は、リポソームのサイズ及びＰＤＩに関してより良好な結果を提供しない。
【００６４】
２．凍結乾燥プロセス後の残留水分
リポソーム懸濁液の非常に不十分な安定性のため、凍結乾燥リポソームの長期安定性を保証するためには、非常に低い残留水分を示す凍結乾燥物を得ることが望ましいであろう。凍結乾燥保護剤として５００ｍｍｏｌのショ糖を含むＣＰＰ−ＴＥＬリポソーム組成物の残留水分は、２．８８％±０．７９％であった。
【００６５】
実施例７：
実証実験：動物研究
１．種々の製剤の１３１Ｉ標識化バンコマイシンの血液レベル
実証実験の研究は、ＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームについて、標準リポソームと比較してバンコマイシン血液レベルの３倍の増加を示した。１種の追加成分（ＣＰＰ又はＴＥＬのいずれか）のみの添加は、バンコマイシン血液レベルのわずかな増加を示したに過ぎない。これは、巨大分子の経口送達手段を提供するため、１つのリポソーム組成物において両方の成分の必要性を強調する（図９）。
【００６６】
２．免疫アッセイによるバンコマイシン血液レベルの特定
免疫アッセイによるバンコマイシン血液レベルの特定は、放射能標識化研究に匹敵する結果（７．８３％対８．６８％）を示した（図１０）。
【００６７】
実施例８：
本発明では、新規クラスのＣＰＰ−リン脂質−複合体を確立した。１つが直鎖ＣＰＰ（モデルＣＰＰペネトラチン、ｄ／ｌ−形態）で、もう１つが環状ＣＰＰ（環状Ｒ９誘導体）の異なる２つのＣＰＰ変異体を使用した（図１１）。質量分析によって検出される腸液中でのより高い酵素安定性のため、環状ＣＰＰを使用した（図１３）。さらに、直鎖ＣＰＰペネトラチンは、Ｄ−アミノ酸で構成される場合、より安定であることがわかった。
【００６８】
図１２は４つのモデル物質バンコマイシン、インスリン、リラグルチド及び抗体アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を示す。これらの物質は、巨大分子薬物の分子量全般を包含し、本発明の新規リポソーム製剤が巨大分子薬物一般に対するプラットフォームとして役立つ可能性があることを実証する。
【００６９】
腸液中のＣＰＰの安定性アッセイに対する方法−人工腸液中のＣＰＰの安定性
全てのＣＰＰ（水中１ｍｇ／ｍｌ）を人工腸液で１：１（容積／容積）に希釈し、当該技術分野で知られているように、常に振蕩しながら３７℃でインキュベートした。０分後、１５分後、３０分後及び６０分後、無傷のＣＰＰの回復を検出するため試料をＨＰＬＣ／ＭＳで分析し、初期の溶液との関係で比較した。
【００７０】
実施例９：
雄性ウィスターラット（２００ｇ〜２５０ｇ）において、モデル物質であるバンコマイシンを用いて様々なリポソーム製剤を試験した。バンコマイシンの放射能標識化血液レベルの測定は、１モル％の直鎖ＣＰＰ−リン脂質複合体を含むリポソーム製剤を使用することでバンコマイシンの経口アベイラビリティの著しい増加を示した。それにもかかわらず、わずか０．１モル％しか環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含まない別の製剤は、複合体を必要としても微量であるという利益を伴って、バンコマイシン血液レベルのより高い増加を示した。得られた結果は、バンコマイシンの免疫アッセイによって確認され、同様の血液レベルを測定することができた（図１４）。
【００７１】
モデル物質として糖ペプチド薬物であるバンコマイシンを使用する動物試験に対する方法
体重約２００ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを使用し、地方自治体に従って動物研究を行った。実証実験の研究では、先に記載される通り、バンコマイシンを１３１Ｉで放射能標識化し、様々なリポソーム製剤に組み込んだ。経口投与から１時間後、放射能標識化した試料を直接計数することによりバンコマイシンの血液レベルを測定した。簡潔には、雄性ウィスターラット群（ｎ≧３）を形成した。実験前１２時間に亘りラットを給餌せず、自由飲水で維持した。リポソーム及び遊離ペプチドの経口適用を強制投与によって実施した。血液を除去して計量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能を測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）に関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。統計学的データをＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（米国カリフォルニア州サンディエゴのGraphPad Software）を使用して処理し、平均±平均値の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として提示した。Ｐｒｉｓｍ（商標）ソフトウェアを使用する一元配置分散分析検定によって種々の動物実験群を比較し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１で有意とした（図１４）。
【００７２】
実施例１０：
或る１つの更なる研究では、ペプチド薬物であるリラグルチドのバイオアベイラビリティを検討した。このため、薬物を静脈内注射し、血液レベルを１モル％の環状ＣＰＰ−リポソームを含む経口リポソーム製剤と比較した。このペプチド薬物に関し、本発明者らのリポソーム製剤の使用によるバイオアベイラビリティは、リラグルチドの静脈内適用と比較して５０％超である（図１５）。
【００７３】
バイオアベイラビリティ特定用のモデル物質としてリラグルチドを使用する動物実験に対する方法
体重約２００ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを使用し、地方自治体に従って動物研究を行った。バイオアベイラビリティの特定のため、抗糖尿病薬であるリラグルチドを１３１Ｉで放射能標識化し、１モル％の環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソーム製剤に組み込み、先に記載される通り、リラグルチド静脈内注射と比較した。幾つかの時間点において、放射能標識化した試料を直接計数することによりリラグルチドの血液レベルを測定した。簡潔には、雄性ウィスターラット群（ｎ≧３）を形成した。実験前１２時間に亘りラットを給餌せず、自由飲水で維持した。リポソームの経口適用を強制投与によって実施した。血液を除去して計量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能を測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）に関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。統計学的データをＰｒｉｓｍ（商標）ソフトウェア（米国カリフォルニア州サンディエゴのGraphPad Software）を使用して処理し、平均±平均値の標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として提示した（図１５）。
【００７４】
実施例１１：
或る１つの更なるパイロット試験では、アダリムマブ（ヒュミラ（商標））の経口アベイラビリティを検討した。このため、抗体を１３１Ｉで放射能標識化し、１モル％の環状ＣＰＰ−複合体を含むリポソームに組み込み、経口投与して、放射能標識化した遊離ペプチドと比較した。精製前及びその後の放射能標識化抗体の直接測定によって検出されるように、リポソーム中への抗体の組み込み効率は約６０％であった。ここでも、アダリムマブの経口アベイラビリティの強い増加を検出することができた（図１６）。したがって、この新規のリポソーム製剤もまた、抗体等の１００ｋＤａ超の分子量を有する巨大分子薬物に適していると主張することができた。
【００７５】
バイオアベイラビリティ（絶対）の特定用モデル物質として抗体アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を使用する動物実験に対する方法
体重約２００ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを使用し、地方自治体に従って動物研究を行った。バイオアベイラビリティ（絶対）の特定のため、抗体アダリムマブ（ヒュミラ（商標））を１３１Ｉで放射能標識化し、１モル％の環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソーム製剤に組み込み、先に記載される通り、遊離抗体と比較した。６時間後、放射能標識化した試料を直接計数することにより血液レベルを測定した。実験前１２時間に亘りラットを給餌せず、自由飲水で維持した。リポソーム及び放射能標識化した遊離抗体の経口適用を強制投与によって実施した。血液を除去して計量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能を測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）に関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した（図１６）。
【００７６】
実施例１２：
別の研究では、頭部基修飾リン脂質へのＣＰＰのカップリングに使用されるリンカーの影響を検討し、ペプチド薬物の組み込み効率は、リンカーのＰＥＧ単位の量に依存することがわかった（図１７）。図１８では、様々なリンカーを使用する幾つかの量（０モル％〜３モル％）のＣＰＰ−リン脂質複合体をリポソームに組み込み、その後、リポソームのサイズ及びＰＤＩを特定した。ＰＥＧ−リンカーが最も良好な結果を示し、８個〜５０個の個別のＰＥＧ単位からなるＰＥＧ−リンカーが好ましいことがわかった。
【００７７】
種々のＰＥＧ−リンカーの検討に対する方法
５分以内（流量２ｍｌ／分；ＵＶ吸光度λ＝２１４ｎｍ）で、アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ｂ）に対して水中の０．１％ＴＦＡ（溶離液Ａ）の直線勾配を適用し、Ｃ１８カラム（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈｅ（商標）Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅ、１００ｍｍ−３ｍｍ）を使用する、逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）によってペプチド薬物の封入効率を特定した。スピード混合プロセスの後、リポソームを１００μｌずつ２つの部分に分割した。５０μｌの１％Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００の添加によってリポソームを破壊し、ＨＰＬＣによってペプチド薬物の曲線下面積（ＡＵＣ）を特定することにより、部分１を使用して１００％の値を計算して得た。部分２をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５ゲル濾過クロマトグラフィー（ＮＡＰ（商標）−５カラム）によって精製し、部分１のように定量した。部分２の精製中におけるＮＡＰ（商標）−５カラム上での脂質の潜在的喪失を特定するため、スピード混合プロセスの後、及びＮＡＰ（商標）−５カラムを使用する精製の後、リポソーム懸濁液中のコレステロール濃度を直接測定した。両測定に対してリポソームをメタノールに１：１０（容積／容積）で溶解した。ＲＰ−１８カラム上、１５分以内（流速２ｍｌ／分；ＵＶ吸光度λ＝２０８ｎｍ）でアセトニトリル／メタノール（８０：２０容積／容積）の無勾配（isocratic gradient）を適用するＨＰＬＣによってコレステロールを定量した。封入効率の計算にＮＡＰ（商標）−５カラム上での脂質喪失を含めるため、精製工程前及びその後のコレステロール濃度を比較し、補正係数Ｃを決定した。以下の方程式を使用して封入効率Ｅ（％）を計算した。
Ｅ（％）＝（［ＡＵＣ］ペプチド薬物部分２）／（［ＡＵＣ］ペプチド薬物部分１）×１００％×Ｃ
【００７８】
［ＡＵＣ］ペプチド薬物部分２は精製されたリポソーム画分中のペプチド薬物の濃度であり、［ＡＵＣ］ペプチド薬物部分１はリポソーム懸濁液中のペプチド薬物の濃度である。ＣはＮＡＰ（商標）−５カラム上での脂質の喪失を考慮する補正係数である。
【００７９】
実施例１３：
サイズ排除クロマトグラフィーによるリポソーム懸濁液の精製後、ＣＰＰ修飾リポソームのゼータ電位は、ＣＰＰの正に帯電したアミノ酸により、未修飾のリポソームと比較して強い増加を示し（図１９）、リポソーム中への複合体の組み込みの成功を確認した。
【００８０】
ゼータ電位測定に対する方法
リポソームのゼータ電位を、Malvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳの自動モードを使用して、室温で特定した。リポソーム製剤の粒子径、ＰＤＩ及びゼータ電位を、いずれもMalvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して室温で特定した。自動モードを使用して、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸バッファーで０．０７６ｍｇ／ｍｌの脂質濃度に希釈した後、サイズ及びＰＤＩを測定した。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸バッファーで０．９５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度に希釈した後、ゼータ電位を特定した。Malvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳの自動モードのデフォルト設定は次の通りであった：測定回数＝３；実行時間＝１０秒；実行回数＝１０；平衡化時間＝６０秒；溶媒の屈折率１．３３０；ポリスチレンキュベットの屈折率１．５９０；粘度＝０．８８７２ｍＰａ  ｓ；温度＝２５℃；誘電率＝７８．５Ｆ／ｍ；後方散乱モード（１７３°）；自動電圧選択；スモルコフスキー（Smoluchowski）方程式、リン酸バッファーｐＨ７．４。
【００８１】
実施例１４：
抗体マツズマブの放射能標識化により標準リポソームと比較した環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソームの結合能を試験した。新規な複合体を含むリポソームは、標準リポソームよりも有意に高い結合能を示した（図２０）。
【００８２】
結合アッセイに対する方法
Ｃａｃｏ−２細胞を６ウェルプレートに蒔いた。２週間の分化の後、増殖培地を除去した後に１ｍｌのリポソーム試料を添加した。細胞を３７℃で１５分間、３０分間及び６０分間インキュベーションした後、リン酸バッファーで洗浄した。その後、細胞を１ｍｌの１ｍｏｌグリシンバッファーｐＨ２．２と共に５分間インキュベートした。０．３ｍｏｌのＮａＯＨを添加し、０．２５％ＳＤＳによって細胞溶解を行った。グリシンバッファー及び細胞溶解画分を収集し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能の量を測定した。
【００８３】
実施例１５：
或る１つの更なる研究では、ペプチド薬物であるバンコマイシンのバイオアベイラビリティ（絶対）を検討した。このため、薬物を静脈内注射し、血液レベルを１モル％の環状ＣＰＰ−リポソームを含む経口リポソーム製剤と比較した。このペプチド薬物に関し、本発明者らのリポソーム製剤の使用によるバイオアベイラビリティは、バンコマイシンの静脈内適用と比較して最大５０％である（図２１）。
【００８４】
バイオアベイラビリティ（絶対）の特定用モデル物質としてバンコマイシンを使用する動物実験に対する方法
体重約２００ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを使用し、地方自治体に従って動物研究を行った。バイオアベイラビリティ（絶対）の特定のため、糖ペプチド抗生物質であるバンコマイシンを１３１Ｉで放射能標識化し、１モル％の環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソーム製剤に組み込み、先に記載される通り、バンコマイシン静脈内注射と比較した。幾つかの時間点において、放射能標識化した試料を直接計数することによりバンコマイシンの血液レベルを測定した。簡潔には、雄性ウィスターラット群（ｎ≧３）を形成した。実験前１２時間に亘りラットを給餌せず、自由飲水で維持した。リポソームの経口適用を強制投与によって実施した。血液を除去して計量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能を測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）に関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ）として表した。
【００８５】
実施例１６：
別の研究では、２つの抗体、すなわちアダリムマブ及びセツキシマブの組み込み効率を先に記載される通り特定した（図２２）。両抗体もまた、ペプチド薬物に匹敵する高い組み込み効率（約５０％〜７０％）を示すことがわかった。
【００８６】
実施例１７：
１モル％の環状ＣＰＰ−複合体を含むリポソームに組み込まれたセツキシマブの腫瘍濃縮を特定するため、腫瘍を持つマウスに各リポソームを投与した。これらのマウスを得るため、細胞株Ａ４３１をＢａｌｂ／ｃマウス（ＥＧＦＲ過剰発現）に注射した。抗体セツキシマブを放射能標識化し、リポソームに組み込んだ後、マウスに経口適用した。リポソーム製剤を使用することで、遊離ペプチドと比較した腫瘍蓄積の有意な増加がわかった（図２３）。
【００８７】
抗体セツキシマブの腫瘍蓄積の特定に対する方法
体重約２００ｇ〜２５０ｇの雄性ウィスターラットを使用し、地方自治体に従って動物研究を行った。セツキシマブの腫瘍濃縮の特定のため、抗体を１３１Ｉで放射能標識化し、１モル％の環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体を含むリポソーム製剤に組み込み、先に記載される通り、セツキシマブ遊離／静脈内注射と比較した。幾つかの時間点において、放射能標識化した試料を直接計数することにより腫瘍濃縮を測定した。簡潔には、雄性ウィスターラット群（ｎ≧３）を形成した。実験前１２時間に亘りラットを給餌せず、自由飲水で維持した。リポソームの経口適用を強制投与によって実施した。血液を除去して計量し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ  ９５１  Ｇカウンターを使用し、標準と比較して放射能を測定した。血液関連活性は総注入用量（ＩＤ）に関連し、組織１グラム当たりの総注入用量の割合（％ＩＤ／ｇ腫瘍）として表した。
【００８８】
実施例１８：
或る１つの更なる研究は、粒子の特徴を特定するため、別のＣＰＰ（ＭＡＰ）を検討した。複合体を合成し、０モル％〜１モル％の範囲でリポソームへと組み込んだ。粒子径は標準リポソームに類似し、ゼータ電位は増加を示し、リポソームへの複合体の組み込みが成功したことを実証した（図２４）。
【００８９】
粒子の特性評価に対する方法
リポソーム製剤の粒子径、ＰＤＩ及びゼータ電位を、いずれもMalvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳを使用して室温で特定した。自動モードを使用して、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸バッファーで０．０７６ｍｇ／ｍｌの脂質濃度に希釈した後、サイズ及びＰＤＩを測定した。ｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸バッファーで０．９５ｍｇ／ｍｌの脂質濃度に希釈した後、ゼータ電位を特定した。Malvern（商標）（英国ウースタシャーのMalvern Instruments Ltd.）製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳの自動モードのデフォルト設定は次の通りであった：測定回数＝３；実行時間＝１０秒；実行回数＝１０；平衡化時間＝６０秒；溶媒の屈折率１．３３０；ポリスチレンキュベットの屈折率１．５９０；粘性＝０．８８７２ｍＰａ  ｓ；温度＝２５℃；誘電率＝７８．５Ｆ／ｍ；後方散乱モード（１７３°）；自動電圧選択；スモルコフスキー方程式。
【００９０】
結論：
本発明では、多様なＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームの使用により、例えば、バンコマイシン、リラグルチド、インスリン等の様々なペプチド薬物、及びアダリムマブ又はセツキシマブ等の様々な抗体に対する有望で新規な経口送達システムを確立することができた。これらの結果（非常に増強された粘膜取り込み）は、一般に巨大分子薬物（ペプチド、タンパク質及び抗体）に対するプラットフォーム技術としてこの新規技術が役立つ可能性があることを実証する。ＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームはいずれも、サイズ、ＰＤＩ及び組み込み効率（５０％超）において高い均一性を示した。人工腸液中での安定性アッセイは、環状ＣＰＰ−リン脂質−複合体が直鎖のものより安定し、直鎖ＣＰＰに関してＤ−アミノ酸の組み込みが好ましいことを示した。ＰＥＧ単位の量が異なる幾つかのリンカーに関して、８個〜５０個のＰＥＧ単位を有するＰＥＧ−リンカーが使用される場合、封入効率がより高いことがわかった。リポソームの特徴を他のＣＰＰに伝達可能であることを実証するため、他のＣＰＰに類似する特徴を示したＣＰＰ  ＭＡＰをリポソームに組み込んだ。リポソーム製剤はいずれも、全ての試験した濃度で細胞毒性を示さなかった。さらに、凍結乾燥保護剤としてショ糖を使用する凍結乾燥によってＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソームの長期保存をもたらすことができた。雄性ウィスターラット（ｎ＝６）を使用する実証実験の研究では、標準リポソームと比較して、１３１Ｉで放射能標識化したバンコマイシンの３倍高い血中濃度を検出することができた。また、これらの結果を確認するため、血中濃度を免疫アッセイによって特定したところ、これもまたＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソーム製剤を使用するバンコマイシン血液レベルに匹敵する濃縮（７．８３％ＩＤ対８．６８％ＩＤ）を示した。リラグルチド；インスリン；アダリムマブ及びセツキシマブ等の更なる物質を放射能標識化して、経口適用後の特定の時間点において放射能を特定することにより、これらの物質に対し、これらの結果（リポソーム製剤による非常に増強された粘膜の取り込み）を確認することができた。
【００９１】
総合すると、上記結果は、プラットフォーム技術としてあらゆる巨大分子薬物の経口適用に対する本発明によるＣＰＰ−ＴＥＬ−リポソーム製剤の可能性を実証する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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