(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
定常領域を含むヒトＩｇＧ４免疫グロブリン重鎖であって、ヒンジドメイン内の２３３位〜２３６位がＧＧＧ−、ＧＧ−−、Ｇ−−−、またはすべて−であり、位置がＥＵ番号付けによって番号を付けられ、ここで、−はアミノ酸残基の欠失を表す、前記免疫グロブリン重鎖。
【請求項２】
２２６位〜２２９位がＣＰＰＣである、請求項１に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項３】
前記ヒンジドメインのアミノ酸配列が、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧＧ−ＧＰＳＶＦ（配列番号１）、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ−−ＧＰＳＶＦ（配列番号２）、ＣＰＰＣＰＡＰＧ−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号３）、またはＣＰＰＣＰＡＰ−−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号４）を含む、請求項１または２に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項４】
前記定常領域が、配列番号５、６、７もしくは８、または最大５の欠失、置換もしくは挿入を有するその変異体含むアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項５】
前記定常領域が、配列番号５、６、７または８を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項６】
前記定常領域が、配列番号５、６、７または８から成る、請求項１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項７】
前記定常領域が、配列番号５のアミノ酸配列から成る、請求項６に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項８】
前記定常領域が、配列番号６のアミノ酸配列から成る、請求項６に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項９】
前記定常領域が、配列番号７のアミノ酸配列から成る、請求項６に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１０】
前記定常領域が、配列番号８のアミノ酸配列から成る、請求項６に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１１】
前記定常領域が、プロテインＡへの結合を低下させるように修飾されたＣＨ３ドメインを有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１２】
前記定常領域が、ＥＵ番号付けによるＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆの修飾を含むＣＨ３ドメインを有する、請求項１１に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１３】
重鎖可変領域に前記Ｎ末端で連結される、請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１４】
免疫グロブリン軽鎖と二本鎖を形成する、請求項１３に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１５】
２つの免疫グロブリン重鎖と２つの軽鎖とを含むヘテロ二量体として免疫グロブリン軽鎖と二本鎖を形成する、請求項１３に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１６】
前記２つの重鎖が同一である、請求項１５に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１７】
前記２つの重鎖が異なる、請求項１５に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１８】
前記２つの重鎖がそれぞれ配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列から成る、請求項１７に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項１９】
前記２つの重鎖がそれぞれ配列番号６および配列番号１０のアミノ酸配列から成る、請求項１７に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２０】
前記２つの重鎖がそれぞれ配列番号７および配列番号１１のアミノ酸配列から成る、請求項１７に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２１】
前記２つの重鎖がそれぞれ配列番号８および配列番号１２のアミノ酸配列から成る、請求項１７に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２２】
前記Ｎ末端で結合ポリペプチドに連結される、請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２３】
リンカーを介して前記結合ポリペプチドに連結される、請求項２２に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２４】
前記結合ポリペプチドが細胞外ドメインである、請求項２２または２３に記載の免疫グロブリン重鎖。
【請求項２５】
（ｉ）ヒトＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＩＡのそれぞれに対する結合親和性がバックグラウンドのレベルまで低下し、および／または
（ｉｉ）ＡＤＣＣ活性がバックグラウンドのレベルまで低下する、
請求項１〜２４のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる２０１５年３月３０日に出願されたＵＳ６２／１４０，３５０の本出願である。
【０００２】
本発明は組換えタンパク質操作の分野にあり、免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質のヒンジ変異体の最適化、そのようなＩｇ変異体を操作する方法、及び生物薬剤の実践におけるそのようなＩｇ変異体の適合性に関する。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、２０１６年３月２８日に作成され、７８，８１５バイトを含有するファイル１０１４０ＷＯ０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとしてのコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照によって組み入れる。
【背景技術】
【０００４】
ＩｇＧクラスの抗体は魅力的な治療剤である。ＩｇＧはヒトでは４つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４として存在する。ＩｇＧの重鎖定常（ＣＨ）領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３とＣＨ１及びＣＨ２を連結するヒンジと、を含む。各サブクラスの役割は種間において異なると思われるが、重鎖定常ドメインは種々の生物学的エフェクター機能に関与する。ヒトＩｇＧのサブクラスは、Ｆｃγ（ＦｃγＲ）とのその相互作用を介して、たとえば、細胞の殺傷、貪食作用及びオプソニン作用のような幾つかの細胞性免疫応答に介在する。そのような相互作用には、たとえば、ナチュラルキラー細胞、活性化マクロファージ等のようなエフェクター細胞の表面上でのＦｃγＲに対する重鎖定常領域の少なくとも機能的なＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの結合が関与する。補体介在性の溶解も種々の補体成分とのＦｃ領域の相互作用によってもたらすことができる。
【０００５】
エフェクター機能は、たとえば、一部の癌または病原体の治療のような一部の抗体療法で有用であり、その際、エフェクター機能は主としてまたは少なくとも部分的に癌細胞または病原体を殺傷することに関与する。しかしながら、他の抗体療法には、たとえば、受容体／リガンドの相互作用を阻害することまたは受容体を刺激することのようなエフェクターに無関係なメカニズムが全体としてまたは優勢に介在する。そのような治療法では、抗体のエフェクター機能はほとんど役に立たないまたは有用な目的を果たさないが、望ましくない炎症を生じ得る。そのような状況では、抗体の薬物動態特性、免疫原性ならびに可変領域の特異性及び親和性に実質的に影響を及ぼすことなく、利用できるエフェクターメカニズムの一部またはすべてを阻害するように抗体のＦｃ受容体結合特性を操作することが有利であってもよい。
【０００６】
ＩｇＧの重鎖定常領域は、ＩｇＧ／ＦｃγＲの相互作用に対するアミノ酸の効果を調べるために種々の位置で変異させている（たとえば、非特許文献１；非特許文献２；及び非特許文献３を参照のこと）。重鎖定常領域のヒンジ領域及びＣＨ２ドメインにおける幾つかのアミノ酸残基はＦｃγ受容体との結合に介在すると提案されている（非特許文献４；非特許文献５，非特許文献６，非特許文献７を参照のこと）。ＣＨ２ドメインにおける部位（Ｎ２９７）のグリコシル化及びその糖質の組成における変異もＩｇＧ／ＦｃγＲの相互作用に強く影響を及ぼす（非特許文献７；非特許文献８）。
【０００７】
アラニンは官能基を持たない側鎖を有するので、アラニン残基は機能を低下させるように天然のアミノ酸を非天然のもので置き換えるための好ましい置換基である。たとえば、アラニン走査変異誘発の周知の技法は、タンパク質またはタンパク質ドメインにおけるすべての天然の残基をアラニンで体系的に置き換えてどの天然の残基が主として機能に寄与するのかを特定する。官能基を持つアミノ酸をアラニンで置き換えることは、官能基及び任意の受容体に対する結合へのその寄与を排除するが、アラニン側鎖の存在は立体構造を保ち、免疫原性または立体構造の変化による他の複雑さが生じる可能性を減少させる。代替戦略は、受け入れ難い立体構造の変化及び結果として生じる免疫原性を伴わずに、ＦｃγＲへの結合を減らすように１つのＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域におけるアミノ酸をヒトＩｇＧ２アイソタイプに由来する対応するアミノ酸で置き換える。得られるキメラＦｃ含有抗体には２３２〜２３６位でのＥＦＬＧのＰＶＡによる置換が含まれる（特許文献１を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ１４／１２１０８７
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．７３，１４８３−１４９１（１９９１）
【非特許文献２】Ｃｈａｐｐｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ＪＳＣ，２６８（３３），２５１２４−３１（１９９３）
【非特許文献３】Ａｒｍｏｕｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，２６１３−２４（１９９９）
【非特許文献４】Ｓａｒｍａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９，６３３−９（１９９２）
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３（５），１０９８（１９９３）
【非特許文献６】Ｍｏｒｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５）
【非特許文献７】Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，５７−７２（１９９７）
【非特許文献８】Ｓｉｂｅｒｉｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｔｒｓ．１０６，１１１−１１８（２００６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は定常領域を含む免疫グロブリンの重鎖であって、ヒンジドメイン内の２３３位〜２３６位は、Ｇ、Ｇ、Ｇ及び非占有；Ｇ、Ｇ、非占有及び非占有；Ｇ、非占有、非占有及び非占有；またはすべて非占有であり、位置はＥＵ番号付けによって番号付けされる、免疫グロブリンの重鎖を提供する。任意で、ヒトＩｇＧ４アイソタイプである請求項１の免疫グロブリン重鎖。任意で２２６位〜２２９位はＣＰＰＣである。任意でヒンジドメインのアミノ酸配列は、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧＧ−ＧＰＳＶＦ（配列番号１）、ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ−−ＧＰＳＶＦ（配列番号２）、ＣＰＰＣＰＡＰＧ−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号３）、またはＣＰＰＣＰＡＰ−−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号４）を含む。任意で、定常領域は、配列番号５、６、７もしくは８または最大５の挿入欠失、置換もしくは挿入を有するその変異体を含むアミノ酸配列を有する。任意で、定常領域は配列番号５、６、７または８を含む。任意で定常領域は配列番号５、６、７または８から成る。任意で、免疫グロブリン重鎖はＮ末端からＣ末端までにヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインと、を含む。任意で、免疫グロブリン重鎖はＮ末端からＣ末端までにＣＨ１ドメインとヒンジドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、を含む。任意で、ＣＨ１ドメイン、存在する場合、ヒンジ領域の残り、ある場合ＣＨ２領域及びＣＨ３領域は同じヒトアイソタイプである。任意で、ＣＨ１ドメイン、存在する場合、ヒンジ領域の残り、ある場合ＣＨ２領域及びＣＨ３領域はヒトＩｇＧ１である。任意で、ＣＨ１ドメイン、存在する場合、ヒンジ領域の残り、ある場合ＣＨ２領域及びＣＨ３領域はヒトＩｇＧ２である。任意で、ＣＨ１ドメイン、存在する場合、ヒンジ領域の残り、ある場合ＣＨ２領域及びＣＨ３領域はヒトＩｇＧ４である。任意で、定常領域は、プロテインＡへの結合を減らすように修飾されたＣＨ３ドメインを有する。任意で、Ｎ末端にて重鎖可変領域に連結された先行請求項のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。任意で免疫グロブリン重鎖は免疫グロブリン軽鎖と共に二本鎖を作る。任意で、免疫グロブリン重鎖は、２つの免疫グロブリン重鎖と２つの軽鎖とを含むヘテロ二量体として免疫グロブリン軽鎖と共に二本鎖を作る。２つの重鎖は同じであるかまたは異なり得る。任意で、Ｎ末端にて結合ポリペプチドに連結される先行請求項のいずれかに記載の免疫グロブリン重鎖。任意で、免疫グロブリン重鎖はリンカーを介して結合ポリペプチドに連結される。任意で、結合ポリペプチドは細胞外ドメインである。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のヒンジ領域における番号付けスキームの対応を示す図である。
【図２】ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域への説明を伴ったアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の重鎖定常領域の野生型配列を示す図である。
【図３】ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域への説明を伴ったアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の重鎖定常領域の野生型配列を示す図である。
【図４】ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域への説明を伴ったアイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の重鎖定常領域の野生型配列を示す図である。
【図５】すべてヒトＩｇＧ４アイソタイプのものである、以前記載されたキメラ重鎖定常領域と比べた例示的なヒンジが修飾されたＧＧＧ−（２３３−２３６）、ＧＧ−−（２３３−２３６）、Ｇ−−−（２３３−２３６）及びＧなし（２３３−２３６）の置き換え構成を示す模式図である。
【図６】ヒトＩｇＧ４アイソタイプの種々のヒンジを修飾した抗体（及び野生型ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）のヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、及びヒトＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図７】ヒトＩｇＧ４アイソタイプの種々のヒンジを修飾した抗体（及び野生型ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）のヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、及びヒトＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図８】ヒトＩｇＧ４アイソタイプの種々のヒンジを修飾した抗体（及び野生型ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）のヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、及びヒトＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図９】ヒトＩｇＧ４アイソタイプの種々のヒンジを修飾した抗体（及び野生型ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）のヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、及びヒトＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図１０】ヒトＩｇＧ４アイソタイプの種々のヒンジを修飾した抗体（及び野生型ＩｇＧ１アイソタイプ抗体）のヒトＦｃγＲＩ、ヒトＦｃγＲＩＩＡ、ヒトＦｃγＲＩＩＢ、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ、及びヒトＦｃＲｎへの結合を示す図である。
【図１１Ａ】ヒンジを修飾した抗体（細胞培養上清から回収されたような）は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡを持つＵ９３７細胞を溶解するヒトＴ細胞を動員できないことを示す図である。
【図１１Ｂ】完全に精製されている、且つＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡを持つＵ９３７細胞を溶解するヒトＴ細胞を動員できないヒンジを修飾した抗体を示す図である。
【図１２Ａ】活性化がＦｃγＲＩＩＡ（図１２Ａ、図１２Ｂ）またはＦｃγＲＩＩＢ（図１２Ｃ、図１２Ｄ）で形質転換したＨＥＫ細胞への抗体の係留に依存する場合、種々のヒンジを修飾した抗体はルシフェラーゼマーカーを持つＪｕｒｋａｔ細胞の有意な活性化を示さないことを示す図である。図１２Ａ及び図１２Ｃにおける陽性対照抗体による活性化は、図１２Ｂ及び図１２Ｄのように阻止抗体との競合によって大きく低下する。
【図１２Ｂ】活性化がＦｃγＲＩＩＡ（図１２Ａ、図１２Ｂ）またはＦｃγＲＩＩＢ（図１２Ｃ、図１２Ｄ）で形質転換したＨＥＫ細胞への抗体の係留に依存する場合、種々のヒンジを修飾した抗体はルシフェラーゼマーカーを持つＪｕｒｋａｔ細胞の有意な活性化を示さないことを示す図である。図１２Ａ及び図１２Ｃにおける陽性対照抗体による活性化は、図１２Ｂ及び図１２Ｄのように阻止抗体との競合によって大きく低下する。
【図１２Ｃ】活性化がＦｃγＲＩＩＡ（図１２Ａ、図１２Ｂ）またはＦｃγＲＩＩＢ（図１２Ｃ、図１２Ｄ）で形質転換したＨＥＫ細胞への抗体の係留に依存する場合、種々のヒンジを修飾した抗体はルシフェラーゼマーカーを持つＪｕｒｋａｔ細胞の有意な活性化を示さないことを示す図である。図１２Ａ及び図１２Ｃにおける陽性対照抗体による活性化は、図１２Ｂ及び図１２Ｄのように阻止抗体との競合によって大きく低下する。
【図１２Ｄ】活性化がＦｃγＲＩＩＡ（図１２Ａ、図１２Ｂ）またはＦｃγＲＩＩＢ（図１２Ｃ、図１２Ｄ）で形質転換したＨＥＫ細胞への抗体の係留に依存する場合、種々のヒンジを修飾した抗体はルシフェラーゼマーカーを持つＪｕｒｋａｔ細胞の有意な活性化を示さないことを示す図である。図１２Ａ及び図１２Ｃにおける陽性対照抗体による活性化は、図１２Ｂ及び図１２Ｄのように阻止抗体との競合によって大きく低下する。
【図１３】ＨＥＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢ受容体への結合を試みる代わりに抗体をプレート表面に係留すると、ルシフェラーゼマーカーを持つＪｕｒｋａｔ細胞を活性化するヒンジを修飾した抗体を示す図である。
【図１４】ＣＤ２０を結合する可変領域を有するヒンジを修飾した抗体は、ＦｃγＩＩＩａの高親和性Ｖ対立遺伝子を発現するように操作されたＮＫ細胞及びＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉ細胞の存在下で抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の低下を示すことを示す図である。
【００１２】
定義
抗体または融合タンパク質は通常単離された形態で提供される。このことは、抗体または融合タンパク質が妨害タンパク質及びその製造または精製から生じる他の混入物に関して通常少なくとも５０％ｗ／ｗ純粋であるが、抗体または融合タンパク質がその使用を円滑にするように意図された薬学上許容できる過剰のキャリア（複数可）または他のビヒクルと組み合わされる可能性を排除しないことを意味する。抗体または融合タンパク質は時には妨害タンパク質及びその製造または精製に由来する他の混入物に関して少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％ｗ／ｗ純粋である。抗体または融合タンパク質はその精製の後残っている優勢な高分子種であることが多い。
【００１３】
抗体の基本構造単位はサブユニットの四量体である。各四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖を含み、各対は１つの「軽」（約２５ｋＤａ）鎖と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。この可変領域は当初、切断可能なシグナルペプチドに連結されて発現される。シグナルペプチドのない可変領域は成熟可変領域と呼ばれることがある。したがって、たとえば、軽鎖成熟可変領域は軽鎖シグナルペプチドのない軽鎖可変領域を意味する。しかしながら、可変領域への参照はシグナル配列が必ず存在することを意味するものではなく；実際、シグナル配列がいったん切断されると、本発明の抗体または融合タンパク質は発現され、分泌されている。重鎖及び軽鎖の可変領域の対は抗体の結合領域を定義する。軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれ軽鎖及び重鎖の定常領域を定義する。重鎖定常領域は主としてエフェクター機能に関与する。ＩｇＧ抗体では、重鎖定常領域はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３の領域に分けられる。ＩｇＡでは、重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３に分けられる。ＣＨ１領域はジスルフィド非共有結合によって軽鎖定常領域に結合する。ヒンジ領域は、抗体の結合領域とエフェクター領域の間で柔軟性を提供し、且つ四量体サブユニットにおける２つの重鎖定常領域間での分子間ジスルフィド結合のための部位も提供する。ＣＨ２及びＣＨ３の領域はエフェクター機能及びＦｃＲｎ結合の主要な部位である。
【００１４】
軽鎖はカッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、γ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを定義する。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」セグメントによって連結され、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」セグメントも含む（一般に、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），Ｃｈ．７を参照のこと）（あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる）。
【００１５】
各重鎖／軽鎖の対の成熟可変領域は抗体の結合部位を形成する。したがって、インタクトな抗体は２つの結合部位を有し、すなわち、二価である。天然の抗体では、結合部位は同一である。しかしながら、２つの結合部位が異なる二重特異性の抗体を作製することができる（たとえば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−５３（１９９２）を参照のこと）。可変領域はすべて、相補性決定領域またはＣＤＲとも呼ばれる３つの超可変領域によって連結される相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同一の一般構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲがフレームワーク領域によって整列され、特異的なエピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端へ、軽鎖及び重鎖の双方はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当てはＫａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９８７及び１９９１）、またはＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。Ｋａｂａｔはまた、異なる重鎖可変領域間または異なる軽鎖可変領域間の対応する残基は同じ番号が割り当てられる、広く用いられている番号付け規則（Ｋａｂａｔの番号付け）も提供している。Ｋａｂａｔの番号付けは抗体の定常領域に使用することができるが、本出願の場合と同様にＥＵ指標がさらに一般的に使用されている。
【００１６】
本発明の抗体または融合タンパク質は、その抗原（リガンド）結合領域のすべてが同一の特異性を有するのであれば、単一特異性である。抗体または融合タンパク質は、その抗原結合領域が少なくとも２つの異なる特異性を含むのであれば、多重特異性である。
【００１７】
ヒンジは、免疫グロブリンのＣＨ１のＣ末端をＣＨ２ドメインのＮ末端に接続する連続するアミノ酸残基の領域である。ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４では、ヒンジ領域はＥＵ番号付けによる残基２１６から２３６までに及ぶ。残基２３１〜２３６は下部ヒンジを形成し、残基２１６〜２３０は上部及び中部（またはコア）ヒンジを形成する。上部と中部の境界はアイソタイプによって異なる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の上部及び中部のヒンジは異なるヒンジのエクソンによってコードされる１２〜１５の連続するアミノ酸である。下部ヒンジにはＣＨ２ドメイン（ＣＨ２のエクソンによってコードされる）の幾つかのＮ末端アミノ酸が含まれる（Ｂｒｅｋｋｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１６（２）：８５−９０（１９９５））。ＩｇＧ３は、４つのセグメント：ＩｇＧ１のヒンジ領域に類似する１つの上部セグメントとＩｇＧ３に独特の同一アミノ酸の反復である３つのセグメントから成るヒンジ領域を含む。
【００１８】
用語「抗体」には、一価の断片、２つの重鎖及び軽鎖の二価の四量体単位、及びこれらのいずれかのさらに高次の複合体を含む少なくとも１つの結合領域を伴った任意の形態の抗体が含まれる。抗体は、結合領域すべてが同一特異性を有する単一特異性、または結合部位が少なくとも２つの特異性を有する多重特異性であることができる。抗体断片は通常、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、且つ軽鎖可変領域も含んでもよい。たとえば、抗体断片は、Ｎ末端からＣ末端までに、本発明の軽鎖可変領域、ペプチドスペーサー、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含むことができる。別の断片は重鎖可変領域（結合領域）及び重鎖定常領域を含み、軽鎖を含まない（すなわち、Ｄａｂまたはナノボディ）。同様に、融合タンパク質は単量体または二量体の融合タンパク質単位、またはさらに高次の複合体を含む。
【００１９】
「モノクローナル抗体」は同一抗体分子から本質的に成る単一クローンの増殖の結果生じる抗体分子の調製物を指す。培養及び翻訳後プロセッシングで生じる自然突然変異の結果生じる軽微な差異が存在してもよい。モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。したがって、用語「マウスまたはマウス類のモノクローナル抗体」は、マウス類またはマウスの生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。
【００２０】
多重特異性抗体は通常、複数の異なる可変ドメイン（二重特異性抗体の場合は２つ）を含み、その際、各可変ドメインは別々の抗原または同一抗原の異なるエピトープに特異的に結合することができる。開示されている定常領域と共に使用することができる例示的な二重特異性の形式には、たとえば、ｓｃＦｖに基づく二重特異性の形式、ＩｇＧ−ｓｃＦｖの融合体、二重可変ドメイン（ＤＶＤ）−Ｉｇ、クアドローマ、ノブ−イントゥ−ホール、共通の軽鎖（たとえば、ノブ−イントゥ−ホール等を伴った共通の軽鎖）、クロスＭａｂ、クロスＦａｂ、（ＳＥＥＤ）ボディ、二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）−ＩｇＧ及びＭａｂ２二重特異性の形式（たとえば、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１２，ｍＡｂｓ４：６，１−１１、及び前述の形式の概説についてはその中で引用された参考文献を参照のこと）が挙げられる。二重特異性抗体はペプチド／核酸の抱合を用いても構築することができ、たとえば、その際、直交性化学反応性を持つ非天然のアミノ酸を用いて、部位特異的な抗体−オリゴヌクレオチドの抱合体を生成し、次いでそれは定義された組成、価数及び配置を伴った多量体複合体に自己集合する（たとえば、Ｋａｚａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９；１３５（１）：３４０−６［Ｅｐｕｂ：Ｄｅｃ．２１，２０１２］を参照のこと）。開示されている定常領域と共に使用することができる別の例示的な多重特異性の形式には、標的分子を特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び内部移行エフェクタータンパク質を特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが挙げられ、その際、そのような第２の抗原結合ドメインはエフェクタータンパク質、たとえば、受容体を活性化し、内部移行させることができる（ＵＳ２０１３／０２４３７７５Ａ１を参照のこと）。
【００２１】
結合することは、少なくとも２つの実体または分子構造の間での相互作用、たとえば、抗体−抗原の相互作用、またはＦｃγＲに対するＦｃ含有タンパク質を指す（Ｆｃ含有タンパク質は抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ融合タンパク質、たとえば、受容体−Ｆｃ融合体である）。たとえば、リガンドとしての抗原またはＦｃＲ及び検体（または抗リガンド）としての抗体、Ｉｇ、抗体結合断片、またはＦｃ含有タンパク質を用いてＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器にて表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定すると、結合親和性は通常、約１０−７Ｍ以下、たとえば、約１０−８Ｍ以下、たとえば、約１０−９Ｍ以下のＫＤ値に相当する。したがって、非特異的な抗原（たとえば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性の少なくとも１０分の１、たとえば、少なくとも１００分の１、たとえば、少なくとも１，０００分の１、たとえば、少なくとも１０，０００分の１、たとえば、少なくとも１００，０００分の１のＫＤ値に相当する親和性で抗体または融合タンパク質は標的の抗原または受容体に結合する。ＫＤと結合親和性は逆相関関係にあるので、ＫＤ値が小さくなるほど、親和性は高くなる。したがって、用語「低い親和性」は相互作用を形成する低い能力に関係するので、大きなＫＤ値に関係する。
【００２２】
エピトープは抗体への特異的な結合が可能である抗原決定基である。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の表面でのグループ分けから成り、通常、特定の三次元構造の特徴及び特定の電荷の特徴を有する。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる）及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、たとえば、特異的な抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基（言い換えれば、アミノ酸残基は特異的な抗原結合ペプチドのフットプリントの中にある）を含んでもよい。
【００２３】
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体に由来するＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体の配列に移植される遺伝子操作された抗体である（たとえば、Ｑｕｅｅｎ，ＵＳ５，５３０，１０１及び５，５８５，０８９；Ｗｉｎｔｅｒ，ＵＳ５，２２５，５３９，Ｃａｒｔｅｒ，ＵＳ６，４０７，２１３，Ａｄａｉｒ，ＵＳ５，８５９，２０５、６，８８１，５５７，Ｆｏｏｔｅ，ＵＳ６，８８１，５５７を参照のこと）。アクセプター抗体の配列は、たとえば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖細胞系列領域の配列であることができる。したがって、ヒト化抗体は、ドナー抗体に全体としてまたは実質的に由来するＣＤＲの一部または全部、ならびに存在する場合、ヒト抗体配列に全体としてまたは実質的に由来する可変領域フレームワーク配列及び定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、ドナー抗体重鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも１、２、通常は３つのすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域の配列に実質的に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列及び重鎖定常領域を有する。同様にヒト軽鎖は、ドナー抗体軽鎖に全体としてまたは実質的に由来する少なくとも１、２、通常は３つのすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列及び定常領域の配列に実質的に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列及び軽鎖定常領域を有する。ナノボディ及びｄＡｂ以外で、ヒト化抗体はヒト化された重鎖及びヒト化された軽鎖を含む。ヒト化抗体におけるＣＤＲは、対応する残基（Ｋａｂａｔによって定義されるような）の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が各ＣＤＲ間で同一である場合、非ヒト抗体における対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一である場合、それぞれヒトの可変領域フレームワーク配列またはヒトの定常領域に実質的に由来する。
【００２４】
ヒト化抗体はマウス抗体に由来する６つのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔによって定義されるような）すべてを組み込むことが多いが、それらはまたすべてに満たないＣＤＲで作製することもできる（たとえば、マウス抗体由来の少なくとも３、４または５のＣＤＲ）（たとえば、Ｐａｓｃａｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６，２００２；Ｖａｊｄｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３２０：４１５−４２８，２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９−１０９１，１９９９；Ｔａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６４：１４３２−１４４１，２０００）。
【００２５】
キメラ抗体は、非ヒト抗体（たとえば、マウス）の軽鎖及び重鎖の成熟可変領域がヒトの軽鎖及び重鎖の定常領域に組み合わされる抗体である。そのような抗体は実質的にまたは全体としてマウス抗体の結合特異性を保持し、約３分の２がヒト配列である。
【００２６】
ベニヤ抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲの一部、通常はすべて、及び非ヒト抗体の非ヒト可変領域フレームワーク残基の一部を保持するが、Ｂ細胞またはＴ細胞のエピトープ、たとえば、露出した残基に寄与することができる他の可変領域フレームワーク残基（Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９，１９９１）をヒト抗体配列の対応する位置に由来する残基で置き換えるある種のヒト化抗体である。結果は、ＣＤＲが全体としてまたは実質的に非ヒト抗体に由来し、且つ非ヒト抗体の可変領域フレームワークが置換によってさらにヒト様となる抗体である。
【００２７】
ヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を指す。そのような抗体は、ヒトもしくはヒトのＢ細胞、またはヒト免疫グロブリンを持つトランスジェニックマウスによって、またはファージディスプレイ、レトロウイルスディスプレイ、リボソームディスプレイ等によって産生されるものであることができる（たとえば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，３８１（１９９１）（ファージディスプレイ）、Ｖａｕｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４，３０９（１９９６）（ファージディスプレイ）、Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｔｈａｕ，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９４，４９３７−４９４２（１９９７）（リボソームディスプレイ）、Ｐａｒｍｌｅｙ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ，７３，３０５−３１８（１９８８）（ファージディスプレイ）、Ｓｃｏｔｔ．ＴＩＢＳ，１７，２４１−２４５（１９９２）、Ｃｗｉｒｌａ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８７，６３７８−６３８２（１９９０）、Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１，１０８１−１０８５（１９９３）、Ｈｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，１３０，４３−６８（１９９２）、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ，１０，８０−８４（１９９２）、ならびにＵＳ５，７３３，７４３を参照のこと）。ヒト抗体は、たとえば、体細胞変異または生体内での遺伝子再構成のような生体内での成熟によって導入されるヒト生殖細胞系列の免疫グロブリンによってコードされていないアミノ酸残基を含むことができる。ヒト抗体は、試験管内での無作為変異誘発または部位特異的変異誘発によって導入される少数の突然変異（たとえば、重鎖または軽鎖当たり１０までの）も含むことができる。
【００２８】
ヒト抗体を産生させるためのトランスジェニック動物は、１以上のヒト重鎖及び／または軽鎖の導入遺伝子もしくは導入染色体（動物の天然のゲノムＤＮＡに組み込まれているまたは組み込まれていない）を含むゲノムを有し、且つ完全なヒト抗体または少なくとも完全なヒト可変領域を持つ抗体を発現することができる非ヒト動物を指す。たとえば、トランスジェニックマウスは、ヒト軽鎖導入遺伝子及びヒト重鎖導入遺伝子またはヒト重鎖導入染色体を有することができるので、マウスは標的抗原及び／または標的抗原を発現している細胞で免疫されるとヒト抗体を産生する。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、たとえば、ＨＣｏ７もしくはＨＣｏｌ２マウスのようなＨｕＭＡｂマウスの場合と同様にマウスの染色体ＤＮＡに組み込まれてもよく、またはヒト重鎖導入遺伝子は、ＷＯ０２／４３４７８にて記載されたような導入染色体ＫＭマウスの場合と同様に、染色体外で維持されてもよい。そのような導入遺伝子及び導入染色体のマウス（まとめて「トランスジェニックマウス」と呼ぶ）は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによって所与の抗原に対する複数のアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及び／またはＩｇＥ）のヒトモノクローナル抗体を産生することができる。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）で遺伝子操作されたマウスは、内在性のマウス遺伝子座にて再構成されていないＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントのヒトＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントでの置き換えを含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスはヒト可変ドメインとマウス定常ドメインとを有するキメラ抗体を発現する（たとえば、米国特許第７，６０５，２３７号を参照のこと）。ほとんどの他の報告は、機能しない内在性の免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスにて完全なヒト導入遺伝子から完全なヒト抗体を発現するマウスに関する。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスには一部において、マウスが抗原刺激に応答してヒト重鎖可変領域とマウス重鎖定常領域とを含む抗体を産生するように内在性のマウス定常領域遺伝子座に操作可能に連結されたヒト可変領域を含むゲノムを有するものが含まれる。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、本発明のヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに操作可能に連結することができる。次いで、抗体の完全なヒト重鎖を発現することができる細胞にてＤＮＡを発現させることができる。
【００２９】
幾つかの抗体のエフェクター機能には少なくとも部分的にＦｃ受容体（ＦｃＲ）が介在し、それは典型的な免疫グロブリンの定常領域（具体的にはＣＨ２及びＣＨ３のドメイン）における抗体のＦｃ領域を結合する。異なるクラスの免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤに特異的である多数のＦｃ受容体がある。ヒトＩｇＧのＦｃ受容体ファミリーは３つの群：高親和性でＩｇＧを結合することができるＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、低親和性受容体であるＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分けられる。各ＦｃγＲサブクラスは２または３の遺伝子によってコードされ、選択的ＲＮＡスプライシングが複数の転写物をもたらすので、ＦｃγＲアイソフォームでの広い多様性が存在する（たとえば、ＦｃγＲＩＡ（ＣＤ６４；ＦＣＧＲ１Ａ、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ１２３１４）、ＦｃγＲＩＢ（ＣＤ６４；ＦＣＲＧ１  Ｂ）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２；ＦＣＧＲ２Ａ、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ１２３１８）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２；ＦＣＧＲ２Ｂ、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ３１９９４）、ＦｃγＲＩＩＣ（ＣＤ３２；ＦＣＧＲ２Ｃ）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ；ＦＣＧＲ３Ａ、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ  Ｐ０８６３７）、及びＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ；ＦＣＧＲ３Ｂ））。さらに、Ｆｃ受容体は、たとえば、Ｂ細胞、単球、樹状細胞、好中球、及び特定のリンパ球を含む種々の細胞で発現されている。たとえば、ヒト単球細胞株であるＵ９３７細胞はＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡの双方を発現する（たとえば、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（５）：３３４８−５３（１９８５）；及びＢｒｏｏｋｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０：１３６９−８５（Ｏｃｔｏｂｅｒ，１９８９を参照のこと）。
【００３０】
抗体依存性細胞性細胞傷害性またはＡＤＣＣは、Ｆｃγ受容体を持つ細胞（免疫細胞等）がＦｃγ受容体を介して特異抗体のＦｃ部分に結合すると、特異抗体が標的細胞の細胞表面抗原に結合している場合、標的細胞を損傷する活性である。したがって、ＡＤＣＣは、付着性の抗原特異的分子を有する標的細胞をＦｃ受容体陽性のエフェクター細胞が溶解することができるメカニズムである。ＡＤＣＣ活性は、たとえば、カルセインＡＭ（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．，３４９−０７２０１）のような蛍光色素を用いて蛍光強度を測定することによって評価することができる。このアプローチを採用する場合、細胞傷害性活性（％細胞溶解）は方程式：（Ａ−Ｃ）／（Ｂ−Ｃ）×１００（式中、Ａは各試料における蛍光の値であり、Ｂは１％の最終濃度を有するＮｏｎｉｄｅｔＰ−４０を伴った培地にて溶解され、放出された細胞の平均蛍光の値であり、Ｃは培地のみを添加した場合の平均蛍光の値である）に従って得られる値を用いて算出することができる。
【００３１】
「抗体依存性細胞性貪食作用」または「ＡＤＣＰ」は、細胞溶解を誘導するのではなく、標的細胞を飲み込むことによって標的細胞を排除する（または殺傷する）エフェクター機能に関係する。ＡＤＣＰは腫瘍細胞を殺傷するための重要な生体内メカニズムであってもよい。ＡＤＣＰは、二色蛍光フローサイトメトリー法、たとえば、異なる細胞表面タンパク質に対するＰＫＨ２（緑色蛍光色素）及びフィコエリスリン（赤）を結合したモノクローナル抗体を利用して試験細胞を識別することにより、貪食活性及び貪食の速度を決定する方法によって測定することができる。ＦｃγＩＩｂに比べてＦｃγＩＩａを選択的に活性化する治療戦略はマクロファージの貪食活性を高めてもよい（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．７（８）：２５１７−２７）。
【００３２】
補体依存性細胞傷害性またはＣＤＣは、補体系による細胞傷害活性を指す。ＣＤＣ活性は測定することができ、たとえば、標準のプロトコール（ＮＩＡＩＤ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９７９−１９８０，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊ．Ｇ．Ｒａｙ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．ＮＩＨ−８３−５４５．）に従って、標的細胞、抗体及び補体溶液（たとえば、幼若ウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））をインキュベートし、反応させる。細胞傷害活性は、ＡＤＣＣ活性の測定と同じ方法で算出することができる。細胞傷害活性はまた、ＡＤＣＣに関する上記に類似して蛍光色素（たとえば、カルセイン）または放射性色素を用いて測定することもできる。
【００３３】
用語「対象」には、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳類対象が含まれる。
【００３４】
１以上の引用された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物及び方法は具体的に引用されていない他の要素を含んでもよい。たとえば、抗体を含む組成物は抗体を単独で、または他の成分との組み合わせで含有してもよい。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
Ｉ．概要
本発明は、Ｆｃγ受容体への結合を減らすように修飾されたヒンジ領域を伴う抗体重鎖定常領域を提供する。修飾は、天然の残基のグリシン（複数可）による置換及び／または欠失（複数可）によってＥＵ番号付けの２３３位〜２３６位の範囲内に存在する。本発明者らは予想外に、抗体のヒンジ領域におけるそのような修飾がこの領域における以前の修飾よりも大きな程度にそのような抗体のＦｃγ受容体への結合を有効に減らすことができ、特にＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＩＡのいずれかまたはすべてについて結合をバックグランドのレベルまで減らすことができることを見いだした。これらの修飾された免疫グロブリン定常領域を実際上任意の形式の抗体またはＦｃ融合タンパク質に組み込むことができる。そのような抗体または融合タンパク質は、治療の方法、特に、抗体が受容体−リガンドの相互作用を阻害するまたは受容体を刺激する場合と同様に、抗体またはＦｃ融合タンパク質の作用のメカニズムが主としてまたは全くエフェクター機能に依存しないもので使用することができる。
【００３６】
ＩＩ．重鎖定常領域
本発明は、ＥＵ番号による２３３位〜２３６位のそれぞれがＧによって占有されるまたは占有されない修飾された免疫グロブリン重鎖領域を提供する。２３６位は基準のヒトＩｇＧ２では占有されないが、他の基準のヒトＩｇＧアイソタイプでは占有される。２３３位〜２３５位は４つのヒトアイソタイプすべてにおいてＧ以外の残基によって占有されている（図１を参照）。２３３位はＦｃγ受容体と直接相互作用するとは考えられていないが、他の変異と組み合わせてＩｇＧ１及びＩｇＧ４における野生型Ｇｌｕ残基またはＩｇＧ２におけるＰｒｏ残基を取り除き、置き換えることは免疫原性を減らすことになるので変異誘発に含めた。４つの例示的な修飾された定常領域では、２３３位〜２３６位はＧｌｙＧｌｙＧｌｙ非占有、ＧｌｙＧｌｙ非占有非占有、Ｇｌｙ非占有非占有非占有、及びすべて非占有である（図５を参照）。これらのセグメントは、ＧＧＧ−、ＧＧ−−、Ｇ−−−、また−−−−として表すことができ、「−」は非占有の位置を表す。
【００３７】
２３３位〜２３６位の範囲内でのヒンジの修飾は、Ｐによって占有されている２２８位と組み合わせることができる。２２８位はヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２ではＰによって天然に占有されているが、ヒトＩｇＧ４ではＳによって、ヒトＩｇＧ３ではＲによって占有されている。ＩｇＧ４におけるＳ２２８Ｐの変異はＩｇＧ４抗体を安定化させること及び外来性の抗体と内在性の抗体との間での重鎖軽鎖の対の交換を減らすことにおいて有利である。
【００３８】
好ましくは、２２６位〜２２９位はそれぞれ、Ｃ、Ｐ、Ｐ、及びＣによって占有される。
【００３９】
例示的なヒンジ領域は、中部（またはコア）及び下部のヒンジと呼ばれることがあり、ＧＧＧ−（２３３〜２３６）、ＧＧ−−（２３３〜２３６）、Ｇ−−−（２３３〜２３６）、及びＧなし（２３３〜２３６）と名付けられた修飾されたヒンジ配列によって占有された残基２２６〜２３６を有する。
ｈＩｇＧ１    ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦ
ｈＩｇＧ２    ＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ−ＧＰＳＶＦ
ｈＩｇＧ４    ＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦ
ＧＧＧ−（２３３−２３６）    ＣＰＰＣＰＡＰＧＧＧ−ＧＰＳＶＦ（配列番号１）
ＧＧ−−（２３３−２３６）    ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ−−ＧＰＳＶＦ（配列番号２）
Ｇ−−−（２３３−２３６）    ＣＰＰＣＰＡＰＧ−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号３）
Ｇなし（２３３−２３６）      ＣＰＰＣＰＡＰ−−−−ＧＰＳＶＦ（配列番号４）
【００４０】
上述の修飾されたヒンジ領域は、通常ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、且つ指定された領域及びＣＨ１領域に隣接する追加のヒンジセグメント（たとえば、上部ヒンジ）を有してもよい重鎖定常領域に組み込むことができる。存在するそのような追加の定常領域セグメントは、異なるアイソタイプのハイブリッドであることができるが、通常、同一アイソタイプ、好ましくはヒトのアイソタイプのものである。そのような追加のヒト定常領域セグメントのアイソタイプは好ましくはヒトＩｇＧ４であるが、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、もしくはＩｇＧ３、またはドメインが異なるアイソタイプのものであるそれらのハイブリッドであることもできる。ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４の例示的な配列は図２〜４にて示す。ＣＨ１ドメインは上部ヒンジ領域のように全体として省けることを除いて、定常領域は、それが１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以下の置換、欠失または内部挿入によって指定されたアイソタイプと異なるのであれば、そのアイソタイプのものであると見なされる。ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３のドメインは、１、２、３、４または５以下の置換、欠失または内部挿入によって例示された配列のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の領域と異なるのであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプのものであると見なされる。上記２２６〜２３６の領域の配列の外側のヒンジの残りは、１または２以下の置換、欠失または内部挿入によって例示的なヒンジ配列のヒンジ領域の対応する部分と異なるのであれば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４のアイソタイプのものであると見なされる。
【００４１】
一部の好ましい重鎖定常領域は配列番号５、６、７及び８から成るまたはそれを含むアミノ酸配列を有する。これらの重鎖定常領域は、他の点ではヒトＩｇＧ４アイソタイプにおいて上記の残基２２６〜２３６にてセグメント配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４を組み込む。他の好ましい定常領域は、１、２、２、４、５、６、７、８、９または１０までの位置にて指定された配列番号とは異なるが、ＥＵの２３２位〜２３６位にて少なくともＧＧＧ−、ＧＧ−−、Ｇ−−−、または−−−−及び２２８位にてＰを保持し、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４について上記の残基２２６〜２３６を保持する。指定された配列番号からの変異は、１もしくは数個の天然のアロタイプまたはイソアロタイプの変異、補体介在性細胞傷害活性もしくはＡＤＣＣのようなエフェクター機能を高めるもしくは下げる変異（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，６２４，８２１号；Ｔｓｏ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８３４，５９７号；及びＬａｚａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：４００５，２００６を参照のこと）、またはヒトにおける半減期を延ばす変異（たとえば、Ｈｉｎｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照のこと）を表すことができ、そのための例示的な置換には２５０位でのＧｌｎ及び／または４２８位でのＬｅｕ（ＥＵ番号付け）が挙げられる。他の変異は、たとえば、Ｎ−Ｘ−Ｓ／ＴモチーフでのＮ結合型グリコシル化のような翻訳後修飾の部位を加えることができ、または取り除くことができる。変異はまた、ノブ（すなわち、１以上のアミノ酸のさらに大きなアミノ酸による置き換え）またはホール（すなわち、１以上のアミノ酸のさらに小さなアミノ酸による置き換え）の導入を含んで二重特異性抗体の産生のための異なる重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進することができる。ノブとホールの対を形成する例示的な置換はそれぞれＴ３３６ＹとＹ４０７Ｔである（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．９，ｎｏ．７，ｐｐ．６１７−６２１，１９９６）。変異はまたＥＵ番号付け方式にてプロテインＡの相互作用を減らす突然変異（たとえば、Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆ）を含むこともできる。一方の重鎖がそのような変異を有し、もう１つは有さない二重特異性抗体はプロテインＡアフィニティクロマトグラフィによってその親抗体から分離することができる。たとえば、配列番号９〜１２はＨ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆの突然変異の存在を除いて配列番号５〜８と同じである。定常領域のＣ末端に由来する１以上の残基、特に重鎖上のＣ末端リジンは翻訳後修飾の結果失われ得る。
【００４２】
他の重鎖定常領域は配列番号１６〜１９及び２０〜２３を含み、またはそれらから成り、これらは、前者がＩｇＧ４アイソタイプではなくヒトＩｇＧ１のものであることを除いて、それぞれ配列番号５〜８及び９〜１２に相当する。他の重鎖定常領域は配列番号２４〜２７及び２８〜３１を含み、またはそれらから成り、これらは、前者がＩｇＧ４アイソタイプではなくヒトＩｇＧ２のものであることを除いて、それぞれ配列番号５〜８及び９〜１２に相当する。
【００４３】
他の好ましい定常領域は、１、２、２、４、５、６、７、８、９または１０までの位置にて上記の指定された配列番号のいずれかとは異なるが、ＥＵの２３２位〜２３６位にて少なくともＧＧＧ−、ＧＧ−−、Ｇ−−−、または−−−−及び２２８位にてＰを保持し、好ましくは、ＩｇＧ４アイソタイプの定常領域で考察されたのと同じ方法で配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４について上記で示された残基２２６〜２３６を保持する。
【００４４】
修飾された定常領域及びそのような定常領域を組み込んでいる抗体または融合タンパク質は、アイソタイプが一致した対照（野生型定常領域またはそれを組み込んでいる抗体もしくは融合タンパク質）と比べてＦｃγ受容体に対する低下した親和性を特徴とする。結合親和性（Ｋａ）は好ましくは、アイソタイプが一致した対照と比べて少なくとも９０、９５または９９％低下する。好ましくは、結合親和性はバックグランドのレベル（すなわち、任意の定常領域を欠くｓｃＦｖ断片との対照の反応またはＦｃγの代わりに無関係の受容体が使用される対照の反応におけるような実験誤差の範囲内での同じシグナル）まで低下する。好ましくは、親和性は、ヒトＦｃγ受容体、γＲＩ、γＲＩＩＡ、γＲＩＩＢ及びγＲＩＩＩＡのそれぞれについてバックグランドのレベルまで、または少なくとも９０、９５もしくは９９％低下する。
【００４５】
同様に、たとえば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣＰのようなＦｃγ受容体の結合に依存するエフェクター機能は好ましくは９０、９５もしくは９９％低下し、またはさらに好ましくは、バックグランドのレベルまで低下する。そのような機能には、細胞の殺傷または貪食作用、Ｂ細胞の活性化、及びサイトカインのような炎症性メディエータの放出が挙げられる。一部のそのような効果はＥＣ５０の測定によって定量することができ、ＥＣ５０は、特定の曝露時間の後のベースラインと最大の間での中間の応答を誘導する抗体の最大半量の有効濃度を指す。ＥＣ５０は最大効果の５０％が観察される抗体の濃度を本質的に表す。本発明の修飾された重鎖定常領域を含む一部の抗体または融合タンパク質は、野生型の定常領域を持つ好適なアイソタイプが一致した対照抗体と比べて試験管内または生体外での細胞殺傷アッセイにて測定されたとき、任意で１０ｎＭの抗体または融合タンパク質の濃度で測定されたとき、２０％未満の細胞溶解（すなわち、％細胞傷害性）、または１０％、もしくは５％、４％、３％、２％未満、もしくはさらに０％または検出できない細胞溶解（細胞傷害性）の細胞傷害性を示す。
【００４６】
しかしながら、そのような重鎖定常領域を組み込んでいる抗体または融合タンパク質の結合親和性は、好ましくは修飾された定常領域によって実質的に影響を受けない。すなわち、結合親和性は通常、実験誤差の範囲内で同じであり、またはアイソタイプが一致した野生型の定常領域を持つ好適な対照抗体の２または３の倍数の少なくとも範囲内である。受容体−リガンドの結合を阻害する能力（たとえば、ＥＣ５０）または受容体を刺激する能力のようなＦｃγＲ結合に依存しない機能的特性についての場合も同様である。
【００４７】
アイソタイプが一致した対照と比べた修飾された定常領域または修飾された定常領域を組み込んだ抗体または融合タンパク質の免疫原性は、投与の際（Ｇａｉｔｏｎｄｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１１；７１６：２６７−８０）の樹状細胞の成熟もしくはＴ細胞の増殖から試験管内で評価することができ、または投与された抗体に対する反応性抗体の発生を集団間で比較することによって生体内で評価することができる。修飾された定常領域または修飾された定常領域を組み込んでいる抗体または融合タンパク質の免疫原性は好ましくは、アイソタイプが一致した対照とは有意に異ならない、またはアイソタイプが一致した対照よりも２、３または５倍を超えて悪くない。同様に、たとえば、Ｃｍａｘ、Ｃａｖｅｒａｇｅ、曲線下面積及び半減期のような薬物動態パラメータは好ましくは有意に異ならない、またはアイソタイプが一致した対照よりも２、３または５以下の倍数で少なくとも低下しない。そのようなパラメータは実施例で記載されているようなマウスにおいて、他の動物モデルまたはヒトにおいて測定することができる。そのようなＰＫパラメータの実質的な保持は、修飾された定常領域またはそれを組み込んでいる抗体もしくは融合タンパク質が向上した除去メカニズムをもたらす実質的な立体構造の変化を受けていないという指標を提供する。
【００４８】
ＩＩＩ．抗体及び融合タンパク質
上述の修飾された重鎖定常領域は抗体または他の融合タンパク質に組み込むことができる。たとえば、単一特異性抗体の発現については、修飾された重鎖定常領域は、軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを含む軽鎖と一緒に重鎖可変領域に融合させて発現させる。重鎖及び軽鎖は重鎖のＣＨ１領域及び軽鎖の定常領域を介して互いに結合し、ヘテロ二量体を形成する。次いでＩｇＧ重鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３の領域の会合によって２つのヘテロ二量体が対合し、従来の抗体の場合と同様に四量体単位を形成する。二重特異性抗体の発現については、修飾された重鎖定常領域は異なる標的特異性の２つの重鎖可変領域のそれぞれに融合されて発現される。重鎖は同時発現させた軽鎖と共にそれぞれ集合することができ、重鎖−軽鎖の複合体は双方の重鎖が存在するヘテロ二量体を形成する。軽鎖可変領域は単位の範囲内で同一であることができ（たとえば、ＵＳ２０１００３３１５２７Ａ１を参照のこと）、または異なることができる。
【００４９】
修飾された定常領域は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ベニヤ抗体またはヒト抗体を含む任意の種類の操作された抗体とともに使用することができる。抗体はモノクローナル抗体または遺伝子操作されたポリクローナル抗体の調製物であることができる（ＵＳ６，９８６，９８６を参照のこと）。
【００５０】
融合タンパク質のタンパク質については、修飾された定常領域は異種ポリペプチドに連結されて発現させる。融合タンパク質における異種ポリペプチドは免疫グロブリンの定常領域に天然では連結されないポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、完全長のタンパク質、または完全長のタンパク質によって結合される抗原への特異的な結合を保持するのに十分な長さのその断片であることができる。たとえば、異種ポリペプチドは受容体の細胞外ドメインまたはそれに対するリガンドであることができる。異種ポリペプチドは定常領域のＮ末端で結合領域を提供し、単に結合領域と呼ばれることがある。ＩｇＧのＣＨ１領域は通常、融合タンパク質についての定常領域には含まれない。上部ヒンジ領域は省かれる、または合成のリンカーペプチドによって置き換えられることがある。その細胞外ドメインを本発明の修飾された重鎖定常領域と組み合わせることができる例示的な受容体タンパク質は、当該技術で既知である（たとえば、Ｋｌｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７２（２）：１６３−８（１９９７）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１０（１７）：１９８９−２００１  （２００４）；及びＳｃｈｗａｃｈｅ  ＆  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｎｅｗｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９１（６−７）：４２８−３４（２０１２），ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｃｂ．２０１１．０７．００８．Ｅｐｕｂ，２０１１，Ｓｅｐ．２９を参照のこと）。
【００５１】
融合タンパク質の結合領域は、（とりわけ）今までに製造された他の融合タンパク質で使用された結合領域の種類のいずれかであることができる。
【００５２】
多重特異性の抗体または融合タンパク質は、標的（たとえば、癌細胞または病原体）上の抗原及びエフェクター細胞上の抗原（Ｔ細胞上のＣＤ３）に対する結合特異性を含むことができる。そのような多重特異性の複合体は標的細胞とエフェクター細胞との間で架橋を形成し、エフェクター細胞の細胞傷害活性またはオプソニン活性を促進する。多重特異性の抗体または融合タンパク質はさらにまたは代わりに、同一標的（たとえば、癌細胞または病原体）上の２つの異なる抗原に対する結合特異性を含むことができる。そのような抗体または融合タンパク質は、単一抗原に対する特異性を持つ抗体または融合タンパク質よりも標的細胞に対する大きな選択的毒性を有することができる。他の多重特異性の抗体または融合タンパク質は、受容体及びそのリガンドの双方または対抗受容体のための結合領域を含む。そのような抗体または融合タンパク質は、受容体またはリガンド／対抗受容体にのみ結合する抗体または融合タンパク質よりも大きな阻害を発揮することができる。これらの特異性及びその他のいずれかを同じ多重特異性の複合体にて組み合わせることができる。
【００５３】
抗体または融合タンパク質をポリマーへの共有結合によって化学的に修飾して、たとえば、循環半減期をさらに増やすこともできる。例示的なポリマー及びそれらをペプチドに連結する方法は、たとえば、ＵＳ４，７６６，１０６、ＵＳ４，１７９，３３７、ＵＳ４，４９５，２８５及びＵＳ４，６０９，５４６にて説明されている。追加の例示的なポリマーにはポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（たとえば、約１，０００〜約４０，０００、たとえば、約２，０００〜約２０，０００、たとえば、約３，０００〜１２，０００ｇ／モルの分子量を持つＰＥＧ）が挙げられる。
【００５４】
抗体または融合タンパク質は診断目的または治療目的の放射性標識された抗体であることができる。放射性同位元素の例には、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、及び１２５ｌ、１３１１、１８６Ｒｅ、及び２２５Ａｃが挙げられる。放射性標識されたアミノ酸及びそれを含有する抗体または融合タンパク質を調製する方法は既知である（たとえば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，６５５−６８６（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ，ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｒａｖｅｎ（１９９６））及びＵＳ４，６８１，５８１、ＵＳ４，７３５，２１０、ＵＳ５，１０１，８２７、ＵＳ５，１０２，９９０（ＵＳＲＥ３５，５００）、ＵＳ５，６４８，４７１及びＵＳ５，６９７，９０２を参照のこと）。たとえば、クロラミンＴ法によって放射性同位元素が結合されてもよい。他の検出可能なマーカーには、酵素、発色団、または蛍光の標識が挙げられる。
【００５５】
抗体または融合タンパク質を毒物に結合することができる。毒物は細胞傷害性または細胞増殖抑制性であることができる。毒物の一部の例には、抗チューブリン剤、アウリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（たとえば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）及びトリ核白金複合体及びカルボプラチンのような白金複合体）、アントラサイクリン、抗生剤、抗葉酸、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、カンプトテシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、予備形成化合物、プリン、代謝拮抗物質、プロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等が挙げられる。
【００５６】
ＩＶ．抗体の発現
抗体鎖または融合タンパク質をコードする核酸は、固相合成、重複するオリゴヌクレオチド断片のＰＣＲ増幅または既存の核酸の部位特異的変異誘発によって作製することができる。そのような核酸を発現ベクターにて発現させる。ベクターは、それらが挿入される重鎖及び軽鎖の可変領域または異種ポリペプチドとの融合体として発現され得るように修飾された重鎖定常領域及び／またはヒト軽鎖定常領域をコードするように構成することができる。
【００５７】
ベクターにおける複製開始点及び発現制御要素（プロモータ、エンハンサ、シグナルペプチド等）を、細菌、酵母または他の真菌、昆虫細胞及び哺乳類細胞のような異なる細胞型で使用するために構成することができる。哺乳類細胞は、本発明の抗体または融合タンパク質をコードするヌクレオチドセグメントを発現させるために好ましい宿主である（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８７を参照のこと）。インタクトな異種タンパク質を分泌することができる多数の好適な宿主細胞株が当該技術で開発されており、それらには、ＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｌ細胞、ならびにＳｐ２／０及びＮＳ０を含む非抗体産生細胞が挙げられる。好ましくは、細胞は非ヒトである。好ましくは、本発明の抗体または融合タンパク質はモノクローナル細胞株から発現される。
【００５８】
これらの細胞のための発現ベクターは、たとえば、複製開始点、プロモータ、エンハンサのような発現制御配列（Ｑｕｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９  （１９８６））、及びたとえば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写ターミネータ配列のような必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。好ましい発現制御配列は、内在性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモータである。Ｃｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照のこと。
【００５９】
発現させる抗体または融合タンパク質をコードする１以上のベクターによって細胞に形質移入する。多重鎖抗体については、重鎖及び軽鎖は同一または別々のベクターで発現させることができる。多重特異性の複合体の発現については、複合体の成分（すなわち、異なる抗体または融合タンパク質）をコードするＤＮＡは同一ベクターまたは異なるベクターに存在することができる。
【００６０】
抗体または融合タンパク質の鎖を発現させ、処理してシグナルペプチドを取り除き、集合させて、宿主細胞から分泌させる。抗体または融合タンパク質は、従来の抗体精製法によって細胞培養上清から精製することができる。ハイブリッド定常領域がＩｇＧ部分を含む場合、精製は親和性試薬としてプロテインＡまたはプロテインＧを用いたクロマトグラフィ工程を含むことができる。たとえば、イオン交換、ハイドロアパタイトクロマトグラフまたはＨＰＬＣのような従来の抗体精製手順も使用することができる（一般にＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９８２を参照のこと）。
【００６１】
Ｖ．適用
本発明の修飾された重鎖定常領域を組み込んでいる抗体または融合タンパク質は一般に治療または診断の方法で使用することができるが、それらは、抗体または融合タンパク質の作用のメカニズムが全体的にまたは少なくとも優勢にエフェクター機能とは無関係である状況で特に有用である。そのことは、たとえば、治療目的が標的細胞を殺傷することではなく、細胞傷害性をもたらすことなくその表面における細胞表面分子を阻害するまたは活性化することである場合も同様である。Ｆｃ受容体への低下した結合が望ましい別の設定は、抗体が二重特異性であり、その所望の治療特性が異なる結合特異性から生じる場合である。たとえば、二重特異性抗体の一般的な用途は、腫瘍標的化特異性をＴ細胞活性化特異性と組み合わせて腫瘍特異的なＴ細胞殺傷をもたらすことである。この場合、Ｆｃ部分がＦｃ受容体と結合する場合、潜在的にそれが、Ｆｃ受容体を持つ細胞のＴ細胞による望ましくない殺傷、またはナチュラルキラー細胞もしくはマクロファージのようなＦｃ受容体を持つ細胞によるＴ細胞の殺傷をもたらし得る。エフェクター機能の欠乏が有利であり得る別の設定は、アミロイド生成性疾患のような病態形成に寄与するペプチドの凝集を阻害することである。さらなる設定は生体内診断であり、この場合、抗体または融合タンパク質は標的に結合するように意図されるが、標的または標的を運ぶ細胞の除去は生じない。
【００６２】
ＶＩ．標的
修飾された重鎖定常領域を組み込んでいる抗体または融合タンパク質は幾つもの細胞性標的タンパク質を対象としてもよい。抗体または融合タンパク質は表面結合の標的タンパク質に特に有用である。所望の応答は、たとえば、標的もしくはそれを運ぶ細胞もしくはウイルスの除去すること、受容体を介したシグナル伝達、たとえば、アポトーシスを誘導すること、リガンドもしくは対抗受容体への受容体の結合を阻害すること、または毒物に結合された抗体または融合タンパク質を内部移行することであってよい。抗体または融合タンパク質は、既存の市販の抗体もしくは融合タンパク質と同じ標的に対して作製することができ、または既存の定常領域が本発明の修飾された定常領域で置き換えられている市販の抗体または融合タンパク質の誘導体化型であることができる。
【００６３】
対象とする標的には、増殖因子の受容体（たとえば、ＦＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＦＧＲ、ＮＧＦＲ、及びＶＥＧＦＲ）及びそのリガンドが挙げられる。他の標的はＧタンパク質受容体であり、それにはサブスタンスＫ受容体、アンギオテンシン受容体、α及びβアドレナリン受容体、セロトニン受容体、ならびにＰＡＦ受容体が挙げられる。たとえば、Ｇｉｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：６２５−６４９（１９８７）を参照のこと。他の標的はＣＤ（分化マーカーの群）である。他の標的には、イオンチャンネル（たとえば、カルシウム、ナトリウム及びカリウムのチャンネル）、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、及びドーパミン受容体が挙げられる（Ｈａｒｐｏｌｄ，米国特許第５，４０１，６２９号及び米国特許第５，４３６，１２８号を参照のこと）。他の標的は、たとえば、インテグリン、セレクチン、及び免疫グロブリンのスーパーファミリーメンバーのような接着タンパク質である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３４６：４２５−４３３（１９９０）．Ｏｓｂｏｒｎ，Ｃｅｌｌ，６２：３（１９９０）；Ｈｙｎｅｓ，Ｃｅｌｌ，６９：１１（１９９２）を参照のこと）。他の標的は、たとえば、今までのインターロイキンＩＬ−１〜ほぼＩＬ−３７、腫瘍壊死因子、インターフェロン、腫瘍増殖因子ベータ、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のようなサイトカインである。ヒトのサイトカイン：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｆｏｒ  Ｂａｓｉｃ  ＆ａｍｐ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．（１９９１）を参照のこと。他の標的は、たとえば、βアミロイド、アルファ−シヌクレインまたはプリオンペプチドのようなアミロイド生成性ペプチドである。他の標的は、ホルモン、酵素ならびに、たとえば、アデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ及びホスホリパーゼＣのような細胞内及び細胞間のメッセンジャーである。標的分子はヒト、哺乳類または細菌であることができる。他の標的は、たとえば、ウイルス及び細菌双方の微生物性病原体に由来するタンパク質、糖タンパク質、及び糖質、ならびに腫瘍のような抗原である。
【００６４】
市販の抗体及びその標的の一部の例には、アレムツズマブ（ＣＤ５２）；リツキシマブ（ＣＤ２０）；トラツズマブ（Ｈｅｒ／ｎｅｕ）；ニモツズマブ、セツキシマブ（ＥＧＦＲ）；ベバシズマブ（ＶＥＧＦ）；パリビズマブ（ＲＳＶ）；アブシキマブ（ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）；インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ（ＴＮＦ−アルファ）；バシリキシマブ、ダクリズマブ（ＩＬ−２）；オマリズマブ（ＩｇＥ）；ゲムツズマブ（ＣＤ３３）；ナタリズマブ（ＶＬＡ−４）；ベドリズマブ（アルファ４ベータ７）；ベリムマブ（ＢＡＦＦ）；オテリキシズマブ、テプリズマブ（ＣＤ３）；オファツムマブ、オクレリズマブ（ＣＤ２０）；エプラツズマブ（ＣＤ２２）；アレムツズマブ（ＣＤ５２）；エクリズマブ（Ｃ５）；カナキムマブ（ＩＬ−１ベータ）；メポリズマブ（ＩＬ−５）；レスリズマブ、トシリズマブ（ＩＬ−６Ｒ）；ウステキヌマブ、ブリアキヌマブ（ＩＬ−１２、２３）が挙げられる。市販の融合タンパク質の例には、ＴＮＦ−アルファを結合するエタネルセプト、アレファセプト（ＣＤ２を結合するＬＦＡ３−Ｆｃ融合体）、ＢＡＦＦとＡＰＲＩＬを結合するＴＡＣｌ−Ｆｃ融合体、アバタセプト（ＣＤ８０とＣＤ８６を結合するＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合体）、及びロミプロスチム（Ｆｃに融合したトロンボポイエチンのペプチド類似体）が挙げられる。既存の重鎖定常領域を本発明の修飾された重鎖定常領域で置き換えるために市販の抗体または融合タンパク質のいずれかを修飾することができる。或いは、修飾された重鎖定常領域を、上記の市販の抗体または融合タンパク質のいずれかと同じ標的特異性（たとえば、競合アッセイによって判定されるような）を持つ他の抗体に連結することができる。
【００６５】
ＶＩＩ．治療の方法及び医薬組成物
上述の市販の抗体が使用されている同じ治療法に対するものを含む種々の望ましくない免疫応答を抑制するのに本発明の抗体及び融合タンパク質を使用することもできる。
【００６６】
本発明の抗体または融合タンパク質によって治療できる免疫疾患のカテゴリーの１つは移植拒絶である。同種の細胞または臓器（たとえば、皮膚、腎臓、肝臓、心臓、肺、膵臓及び骨髄）を宿主に移植すると（すなわち、供与者と受入者が同じ種に由来する異なる個体である）、宿主の免疫系が移植片における外来抗原に対する免疫応答（移植片対宿主病）を開始し、移植された組織の破壊をもたらす可能性がある。抗体または融合タンパク質はとりわけ、受入者における同種抗原が誘導する免疫応答を阻止するのに有用である。
【００６７】
本発明の抗体または融合タンパク質の関連する使用は、「移植片対宿主」病（ＧＶＨＤ）に関与する免疫応答を調節することにある。ＧＶＨＤは、免疫的に能力のある細胞が同種レシピエントに移されると発生する潜在的には致命的な疾患である。この状況では、ドナーの免疫担当細胞がレシピエントにおける組織を攻撃し得る。皮膚の組織、消化管の上皮及び肝臓は標的であることが多く、ＧＶＨＤの経過の間に破壊され得る。疾患は、免疫組織が移植されている場合、たとえば、骨髄移植の場合、特に重大な問題を呈するが、心臓及び肝臓の移植を含む他の事例の場合にも、あまり重篤ではないＧＶＨＤも報告されている。
【００６８】
免疫抑制が望ましいさらなる状況は、たとえば、１型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、全身硬直症候群、関節リウマチ、重症筋無力症、及び紅斑性狼瘡のような自己免疫疾患の治療にある。これらの疾患では、身体は自身の抗原の１つに対して細胞性及び／または液性の免疫応答を発生し、その抗原の破壊をもたらし、障害が残るかつ／または致死的な結末をもたらす可能性がある。自己免疫疾患は本発明の抗体または融合タンパク質の１つを投与することによって治療される。本発明の修飾された定常領域を含む抗体または融合タンパク質によって治療できる他の免疫疾患には、喘息、アレルギー、セリアック病、乾癬及びブドウ膜炎が挙げられる。セリアック病、乾癬及びブドウ膜炎は自己免疫疾患である。
【００６９】
抗体または融合タンパク質に対する標的抗原が発現されている癌を治療するのに本発明の抗体または融合タンパク質を使用することができる。本方法を用いて、固形腫瘍、及び特に、たとえば、白血病（たとえば、Ｔ細胞大顆粒リンパ球白血病）、リンパ腫（ホジキンまたは非ホジキン）または多発性骨髄腫のような血液悪性腫瘍を治療することができる。固形腫瘍には、皮膚（たとえば、黒色腫）、卵巣、子宮内膜、膀胱、乳腺、直腸、結腸、胃、膵臓、肺、胸腺、腎臓及び脳の腫瘍が挙げられる。癌細胞の殺傷は、ＦｃγＲ結合とは無関係なメカニズムから生じ、たとえば、アポトーシスの誘導、受容体−リガンドの相互作用の阻害、または結合させた細胞傷害性部分の作用によって生じ得る。
【００７０】
抗体または融合タンパク質は、たとえば、ウイルス、細菌、原虫または真菌の感染のような病原性感染の治療にも使用することができる。同様に、殺傷は、ＦｃγＲ結合とは無関係なメカニズムによって生じ、たとえば、病原体と免疫系の他の要素に病原体を殺傷する機会を与える細胞との間の相互作用を阻害することによって、または連結された放射性核種もしくは毒素の作用によって生じ得る。
【００７１】
抗体または融合タンパク質は、発症を遅らせる、重症度を軽減する、さらなる悪化を抑制する、かつ／または疾患の少なくとも１つの兆候もしくは症状を改善する投与量、投与の経路及び投与の頻度を意味する有効な投薬計画にて投与される。対象がすでに疾患を患っている場合は、投薬計画は治療上有効な投薬計画と呼ばれ得る。対象が一般集団に比べて疾患のリスクが高いが、未だに症状を経験していない場合は、投薬計画は予防上有効な投薬計画と呼ばれ得る。場合によっては、治療上または予防上の有効性は同一対象における歴史的対照または過去の経験に比べて個々の対象で観察することができる。他の例では、治療上または予防上の有効性は未治療の対象の対照集団に比べて治療された対象の集団における前臨床試験または臨床試験にて実証することができる。
【００７２】
抗体または融合タンパク質の例示的な投与量は、０．０１〜２０、または０．５〜５、または０．０１〜１、または０．０１〜０．５または０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重（たとえば、０．１、０．５、１、２、３、４または５ｍｇ／ｋｇ）、または固定投与量として１０〜１５００ｍｇである。治療が予防的であれ、または治療的であれ、かつ疾患が因子の中で特に急性であれ、または慢性であれ、投与量は対象の状態及びあれば以前の治療への応答によって決定される。
【００７３】
投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、クモ膜下、腹腔内、局所、鼻内、または筋肉内投与であってよい。静脈内投与または皮下投与による体循環への投与が好ましい。静脈内投与は、たとえば、点滴によって３０〜９０分の時間をかけて行われてもよい。
【００７４】
投与の頻度は、因子の中で特に、循環における抗体または融合タンパク質の半減期、対象の状態及び投与の経路によって決定される。頻度は、対象の状態または治療される疾患の進行の変化に対応して１日１回、１週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回または不定期の間隔で行うことができる。静脈内投与の例示的な頻度は、一連の期間中に１週間に１回〜３カ月に１回であるが、さらに投与の頻度を高くする、または低くすることもできる。皮下投与については、多かれ少なかれ頻繁な投薬も可能ではあるけれども、例示的な投与頻度は１日１回〜１カ月に１回であるが、さらに投与の頻度を高くする、または低くすることもできる。
【００７５】
投与回数は、疾患が急性であるか慢性であるか及び治療に対する疾患の応答によって決定される。急性疾患または慢性疾患の急性増悪については、１〜１０の投薬が十分であることが多い。任意で分割形態での単一ボーラス投薬が急性疾患または慢性疾患の急性増悪に対して十分な場合がある。急性疾患または急性増悪の再発には治療を繰り返すことができる。慢性疾患については、抗体は、定期的な間隔、たとえば、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、少なくとも１、５年もしくは１０年間、または対象の生涯にわたって投与することができる。
【００７６】
非経口投与のための医薬組成物は好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、ＧＭＰ条件下で製造される。医薬組成物は単位剤形（すなわち、単回投与のための投与量）で提供され得る。医薬組成物は、１以上の生理的に許容できるキャリア、希釈剤、賦形剤または補助剤を用いて製剤化することができる。製剤化は選択される投与の経路によって決定される。注射については、水溶液にて、好ましくはハンクス溶液、リンガー溶液、または生理的生理食塩水もしくは酢酸緩衝液（注射の部位での不快感を減らすために）のような生理的に適合性の緩衝液にて抗体を製剤化することができる。溶液は、たとえば、懸濁剤、安定剤及び／または分散剤のような調合剤を含有することができる。或いは、抗体は、使用前に好適なビヒクル、たとえば、無菌の発熱物質を含まない水によって構成するための凍結乾燥された形態であることができる。
【００７７】
本発明の抗体による治療は、治療される疾患に対して有効な他の治療と併用することができる。免疫疾患の治療については、従来の治療には、肥満細胞の脱顆粒阻害剤、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、ならびにたとえば、アザチオプリン、サイクロホスファミド、リューケラン、ＦＫ５０６及びシクロスポリンのような強力な抗炎症剤が挙げられる。たとえば、Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）（ナタリズマブ）またはＨｕｍｉｒａ（登録商標）（アダリムマブ）のような生物抗炎症剤を使用することもできる。癌を治療することで使用される場合、本発明の抗体は、化学療法、放射線、幹細胞治療、手術、またはＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、たとえば、（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）、セツキシマブ）、及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）のような他の生物製剤による治療と併用することができる。化学療法剤には、クロラムブシル、サイクロホスファミドまたはメルファラン、カルボ白金、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、及びミトキサントロン、メソトレキセート、フルダラビン、及びシタラビン、エトポシドまたはトポテカン、ビンクリスチン及びビンブラスチンが挙げられる。感染については、治療は抗生剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤または抗原虫剤等と併用することができる。
【００７８】
ＶＩＩＩ．他の適用
抗体または融合タンパク質は、臨床診断もしくは治療または研究に関連してその標的分子を検出するのに使用することができる。たとえば、抗体を使用して、対象が治療に適している免疫が介在する疾患を患っている指標として癌関連抗原を検出することができる。標的及び種々の刺激へのその応答を検出する実験室研究用の研究試薬として抗体を販売することもできる。そのような使用では、抗体または融合タンパク質は蛍光分子、スピン標識分子、酵素または放射性同位元素によって標識することができ、アッセイを行うのに必要な試薬すべてと共にキットの形態で提供することができる。抗体または融合タンパク質は、たとえば、アフィニティクロマトグラフィによって標的抗原を精製するのにも使用することができる。
【００７９】
標識された抗体または融合体の存在は診断目的のために生体内で検出されてもよい。一実施形態では、診断は、（ａ）有効量の標識された抗体または融合タンパク質を対象に投与することと、（ｂ）投与後、抗原が検出されてもよい部位で標識された抗体または融合タンパク質を濃縮させ、未結合の標識された抗体がバックグランドのレベルまで除かれる間待つことと、（ｃ）バックグランドのレベルを決定することと、（ｄ）対象における標識された抗体または融合タンパク質を検出することと、を含むので、バックグランドのレベルを上回る標識された抗体の検出は対象が疾患もしくは障害を有すること、または疾患もしくは障害の重症度を示す。そのような実施形態によれば、抗体または融合タンパク質は、当業者に既知の特定の画像システムを用いた検出に好適な画像化部分で標識される。バックグランドのレベルは、特定の画像システムで以前決定された基準値と検出された標識抗体の量とを比べることを含む、当該技術で既知の種々の方法によって決定されてもよい。本発明の診断法で使用されてもよい方法及びシステムには、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、たとえば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）のような全身走査、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、及び超音波検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
以上及び以下で引用されている特許の知見、ウェブサイト、他の出版物、受入番号等はすべて、各個々の項目が具体的に且つ個々に参照によって組み込まれて示されているのと同じ程度に、あらゆる目的でその全体が参照によって組み入れられる。配列の異なるバージョンが異なる時期で受入番号に関連する場合、本出願の有効な出願日時点での受入番号に関連するバージョンが重要である。有効な出願日は、実際の出願日または該当する場合、受入番号を指す優先権出願の出願日のいずれか早い方を意味する。同様に、出版物、ウェブサイト等の異なるバージョンが異なる時期で公開されているのであれば、指示されない限り、本出願の有効な出願日で最も直近に公開されたバージョンが重要である。本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、または態様は、特に指示されない限り、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解の目的で説明及び実施例を手段としてかなり詳細に記載されているが、特定の変更及び改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実践されてもよいことは明らかであろう。
【実施例】
【００８１】
実施例１：ヒンジを修飾した抗体の発現
以下の実施例で記載されている抗体の幾つかは、一方のアームが抗ｈＣＤ３抗体のものであり、他方のアームがＷＯ２０１４０４７２３１によって記載されたような抗ｈＣＤ２０抗体に由来する二重特異性抗体である。
【００８２】
抗体１、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＧＧＧ−（２３３−２３６）は、製造元のプロトコールに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２１０５１８）を用いた部位特異的変異誘発によって、キメラＩｇＧ４のＣＨ領域（修飾Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ含有した；ＷＯ２０１４０４７２３１を参照のこと）で出発して作製した。配列確認の後、Ｘｈｏ１−Ｎｏｔ１制限部位を用いてコーディング領域を親ベクターに移動させて非コーディング領域における突然変異を回避し、その後、配列番号１のヒンジの修飾を有するヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨを持つベクター構築物を生成した。
【００８３】
抗ＣＤ３（９Ｆ７  ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０に基づく「Ｌ２Ｋ」を参照のこと）可変領域の核酸配列を増幅し、ヒンジを修飾したＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ、ＧＧＧ−（２３３〜２３６）と同じプラスミドに導入し、ＰＣＲを用いて配列を確認した。最終的なプラスミドを用い、抗体を単離するための標準の細胞培養法を用いて抗体１を産生した。
【００８４】
抗体２、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＧＧ−−（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧＧ−−（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号２）を持つベクター構築物を生成することによって抗体１と同様に作製した。抗ＣＤ３（９Ｆ７  ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）可変領域の核酸配列を増幅し、標準の分子生物学的方法を用いて同じプラスミドに導入した。標準の方法を用いて抗体２を単離した。
【００８５】
抗体３、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿Ｇ−−−（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧ−−−（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号３）を持つベクター構築物を生成することによって抗体１と同様に作製した。抗ＣＤ３（９Ｆ７  ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）可変領域の核酸配列を増幅し、標準の分子生物学的方法を用いて同じプラスミドに導入した。標準の方法を用いて抗体３を単離した。
【００８６】
抗体４、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿Ｇなし（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧなし（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号４）を持つベクター構築物を生成することによって抗体１と同様に作製した。抗ＣＤ３（９Ｆ７  ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）可変領域の核酸配列を増幅し、標準の分子生物学的方法を用いて同じプラスミドに導入した。標準の方法を用いて抗体４を単離した。
【００８７】
抗体５、３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＧＧＧ−（２３３−２３６）は、製造元のプロトコールに従ってＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；カタログ番号２１０５１８）を用いた部位特異的変異誘発によって、キメラＩｇＧ４のＣＨ領域（修飾Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ含有した；ＷＯ２０１４０４７２３１を参照のこと）で出発して作製した。抗体５は単一特異性で二価の抗ＣＤ２０抗体であり、ＷＯ２０１４０４７２３１にて記載されたような標準の方法を用いて抗ＣＤ２０可変領域の核酸配列（３Ｂ９ＶＨ）を単離した。
【００８８】
抗体６、３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＧＧ−−（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧＧ−−（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号２）を持つベクター構築物を生成することによって抗体５と同様に作製した。標準の方法を用いて抗ＣＤ２０（３Ｂ９ＶＨ；ＷＯ２０１４０４７２３１を参照のこと）可変領域の核酸配列を単離した。
【００８９】
抗体７、３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿Ｇ−−−（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧ−−−（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号３）を持つベクター構築物を生成することによって抗体５と同様に作製した。標準の方法を用いて抗ＣＤ２０（３Ｂ９ＶＨ；ＷＯ２０１４０４７２３１を参照のこと）可変領域の核酸配列を単離した。
【００９０】
抗体８、３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿Ｇなし（２３３−２３６）は、部位特異的変異誘発を用いてＧなし（２３３〜２３６）を伴ったヒンジを修飾したＩｇＧ４のＣＨ（配列番号４）を持つベクター構築物を生成することによって抗体５と同様に作製した。標準の方法を用いて抗ＣＤ２０（３Ｂ９ＶＨ；ＷＯ２０１４０４７２３１を参照のこと）可変領域の核酸配列を単離した。
【００９１】
抗体９、抗膜貫通（ＴＭ）タンパク質可変ドメイン（Ｂ６Ｈ１２．２、ＢｉｏＸＣｅｌｌ，カタログ番号ＢＥ００１９−１から得た）は、上記抗体１について記載された方法と同様の方法によって、ヒンジを修飾したＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ、ＧＧＧ−（２３３〜２３６）核酸を含有するプラスミドにクローニングした。
【００９２】
抗体１０、Ｂ６Ｈ１２．２＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＰＶＡは本明細書に記載されているプロトコールに従って作製されたが、キメラＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）Ｆｃドメインを有する。
【００９３】
抗体１１、抗ＦＥＬＤ１＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＰＶＡ抗体は抗体１０とアイソタイプが一致し、キメラＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）Ｆｃドメインを有する。
【００９４】
対照抗体Ａ（ロット−Ｌ２）、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４は、抗ＣＤ３（９Ｆ７ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体（星型突然変異と呼ばれるＣＨ３＊突然変異４３５Ｒ及び４３６Ｆを有することを除く−ＵＳ２０１００３３１５２７Ａ１を参照のこと）である。
【００９５】
対照抗体Ｂ（ロット−Ｌ２）、９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ１は抗ＣＤ３（９Ｆ７ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。
【００９６】
対照抗体Ｃ：９Ｆ７＿ＶＬｘ３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４はＷＯ２０１４０４７２３１に記載されたプロトコールに従って作製された。対照ＡｂＣは、野生型ＩｇＧ４重鎖（二重特異性抗体の単離を容易にするためにＣＨ３領域にて一方のアームが星型突然変異を有することを除く）を有する二重特異性の抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００９７】
対照抗体Ｄ（ロット−Ｌ５）：９Ｆ７＿ＶＬｘ３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＰＶＡは、ＷＯ２０１４０４７２３１に記載されたプロトコールに従って作製された。対照ＡｂＤは、修飾されたＩｇＧ４重鎖［キメラＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）、一方の重鎖が二重特異性抗体の単離を容易にするためにＣＨ３領域にて星型突然変異を有することを除く］を有する二重特異性の抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００９８】
対照抗体Ｅ：抗ＦｅｌＤ１モノクローナル抗体は、ヒトのＣＤ２０またはＣＤ３に対する交差反応を示さずにネコの抗原を結合する。このＩｇＧ１非特異的抗体対照は、２０１３年１１月７日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１６６２３６にて記載された方法によって得られた。
【００９９】
対照抗体Ｆ：は、キメラＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）（ＷＯ２０１４０４７２３１も参照のこと）を伴った９Ｆ７（抗ＣＤ３）の小さなバッチ（上清）調製物である。
【０１００】
対照ＡｂＧ：９Ｆ７＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＰＶＡはＷＯ２０１４０４７２３１に記載されたプロトコールに従って作製された（ロット番号２、精製済）。対照ＡｂＧは、修飾されたＩｇＧ４重鎖［キメラＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）、二重特異性抗体の単離を容易にするためにＣＨ３領域にて一方の重鎖が星型突然変異を有することを除く］を有する単一特異性の抗ＣＤ３モノクローナル抗体である。
【０１０１】
対照ＡｂＨ（ロット番号０２−０９１２１０）：３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ１は、抗ＣＤ２０（３Ｂ９ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照のこと）ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体である。
【０１０２】
対照ＡｂＩ（ロット番号０１−１１０６０７）：３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４は抗ＣＤ２０（３Ｂ９ＶＨ；ＷＯ２００４／１０６３８０を参照）ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体である。
【０１０３】
対照ＡｂＪ（ロット番号Ｌ１）：９Ｆ７＿ＶＫｘ３Ｂ９＿ＶＨ＿ＩｇＧ４＿ＰＶＡはＷＯ２０１４０４７２３１に記載されたプロトコールに従って作製された。対照ＡｂＪは、修飾されたＩｇＧ４重鎖［キメラＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＬＧ２３３−２３６ＰＶＡ）、二重特異性抗体の単離を容易にするためにＣＨ３領域にて一方の重鎖が星型突然変異を有することを除く］を有する二重特異性抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【０１０４】
実施例２：Ｆｃγ受容体に対する親和性の喪失
ヒンジを修飾した抗体（すなわち、ＧＧＧ−、ＧＧ−−、Ｇ−−−またはＧなしヒンジの置き換え；抗体１〜４）及び種々の対照抗体を表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）によってＦｃγ受容体に対する結合親和性について試験した。対照には、対照ＡｂＤ（抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０−ｓＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ及びＥＬＦＧ２３３−２３６ＰＶＡ）、対照ＡｂＢ（抗ＣＤ３、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ）、及び対照ＡｂＡ（抗ＣＤ３、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ）が含まれた。
【０１０５】
簡潔に、カルボキシメチルデキストランを被覆した（ＣＭ−５）チップを採用するＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器にて２５℃でＳＰＲ実験を行った。標準のアミンカップリング化学反応を用いてＣＭ−５センサーチップの表面上にマウスモノクローナル抗ペンタヒスチジン抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を固定化した。抗ペンタヒスチジンアミンをカップリングしたＣＭ−５チップ上で１４０ＲＵ〜３７６ＲＵのＨｉｓタグを付けたヒトまたはサルのＦｃγＲタンパク質を捕捉し（またはＦｃＲｎの場合、約１５５〜２９９ＲＵのＦｃＲｎ変異構築物を高密度抗ｍｙｃで被覆したＢｉａｃｏｒｅチップに固定化した）、抗体のストック溶液を２０μｌ／分で２．５分間、捕捉されたタンパク質上に注入し、連続希釈した。ｍＡｂの結合反応をモニターし、低親和性の受容体については、定常状態の結合平衡を算出した。動的な会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）の速度定数は、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２．０曲線適合ソフトウエアを用いてデータを処理し、１：１の結合モデルに適合させることによって決定した。結合解離平衡定数（ＫＤ）及び解離半減期（ｔ１／２）はＫＤ（Ｍ）＝ｋｄ／ｋａ；及びｔ１／２（分）＝（Ｉｎ２／（６０＊ｋｄ）としての動的速度定数から算出した。一部のＫＤは定常状態の平衡解離定数を用いて導出した；ＮＢ＝結合は観察されなかった。
【０１０６】
残基２２６〜２３６にてヒトＩｇＧ４アイソタイプの配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４と命名されたヒンジセグメントを含む重鎖定常領域を有する９Ｆ７と名付けられた抗ＣＤ３抗体を、ヒトＦｃγＲＩ、ＲＩＩＡ、ＲＩＩＢ及びＲＩＩＩに対する結合親和性について試験した。対照には、野生型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを持つ同じ抗体、及びヒンジ領域の異なる修飾（すなわち、ヒンジの修飾がヒトＩｇＧ２と同じ配列であるＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡ−によって占有された２２６位〜２３６位を有するので、キメラＦｃと呼ばれる）を伴ったＩｇＧ４アイソタイプを持つ同じ抗体が含まれた。ＩｇＧ４キメラＦｃ形式では、定常領域の残りのセグメントはヒトＩｇＧ４である。ＩｇＧ１キメラＦｃ形式では、ＣＨ１及びＣＨ３のセグメントはヒトＩｇＧ１であり、ＣＨ２はヒトＩｇＧ４である。
【０１０７】
データは、ヒンジを修飾した抗体１〜４のすべてにおいてヒトＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ及びＩＩＩのそれぞれに対する結合がバックグランドのレベルに低下すること示している。対照的に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４キメラＦｃ抗体の結合は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＩＩＩについてはバックグランドのレベルに低下するが、ＦｃγＲＩＩＡ及びＲＩＩＢに対しては依然として有意である。ヒンジを修飾した抗体１〜４はすべて、ＩｇＧ４及びキメラヒンジＩｇＧ４の形式と同程度にＦｃＲｎに対する結合を維持する。図６〜１０を参照のこと。
【０１０８】
実施例３：細胞傷害性の解析
Ｕ９３７細胞はＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡを発現している単球細胞株である。以下の細胞傷害性アッセイにて陽性のキラーエフェクター対照としてＵ９３７細胞を用いた。したがって、キメラＣＨ領域を持つ抗体のＦｃ／ＦｃγＲ相互作用を介してＵ９３７細胞を殺傷する能力を試験した。以下のプロトコールを用いてカルセイン殺傷アッセイを行った：ヒト及びカニクイザルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をそれぞれＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、またはリンパ球−哺乳類密度細胞分離媒体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を介して単離した。組換えヒトＩＬ−２（３００Ｕ／ｍｌ）及びＴ細胞活性化ビーズ（ヒトＰＢＭＣには抗ＣＤ３／ＣＤ２８、カニクイザルＰＢＭＣには抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８）を含有する培地で数日にわたって単離されたＰＢＭＣを活性化した。遠心分離によって活性化Ｔ細胞をＰＢＭＣから単離し、次いで１ｍｌの培地に再浮遊させた。磁気ビーズをＴ細胞から取り除いた。標的細胞（Ｕ９３７）をカルセインで標識し、次いで洗浄し、精製したＡｂ／ｓｕｐの１５倍連続希釈及び不死化ＣＤ８＋ヒトＴ細胞（１００，０００個の細胞／ウェル）と共に３７Ｃで３時間インキュベート（ウェル当たり１０，０００個の細胞）した（エフェクター：標的の比−１０：１）。インキュベートに続いて、プレートを遠心し、蛍光解析のために上清を黒色透明底のプレートに移した。５０％細胞傷害性を誘導する抗体のモル濃度として定義された各ＥＣ５０はＰｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて決定した。４パラメータ非線形回帰解析を用いて値を算出した（図１１Ａ）。
【０１０９】
細胞培養上清における抗体の粗抽出物で上記の実験を実施した（図１１Ａ）。標準のアフィニティカラムで、または二重特異性抗体のためのＤａｖｉｓ，ｅｔ  ａｌにより記載された方法（ＵＳ２０１０／０３３１５２７を参照）（図１１Ｂ）を用いて精製された同じ抗体で類似の実験を行った。
【０１１０】
データは、ヒンジを修飾した抗体１〜４すべてが、ＩｇＧ４キメラＦｃ抗体の場合と同様に、バックグランドのレベルの細胞傷害性しか有さなかったことを示している。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４野生型抗体は、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩＡと相互作用するその能力のゆえに強力な細胞傷害性を示した。図１１Ａ及び１１Ｂを参照のこと。
【０１１１】
実施例４：Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化
この実施例では、活性化のマーカーとして作用するＮＦＡＴ−ルシフェラーゼ構築物で形質転換されたＪｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞白血病細胞株）を抗体が活性化することができるかどうかを試験する。活性化には、ＦｃγＲＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢを発現しているＨＥＫ２９３細胞上で抗体が係留することが必要とされる。
【０１１２】
無関係な抗原に対する抗体（ＦｅｌＤ１）（１．５ｍｇ／ｍｌ）と共に（図１２Ｂ、１２Ｄ）またはそれを伴わずに（図１２Ａ、１２Ｃ）連続希釈の様々な抗体の存在下でＪｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ細胞（５０，０００個／ウェル）を標的細胞（５０，０００個／ウェル）と共に３７Ｃで４時間インキュベートした。Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１１３】
データは、ヒンジを修飾した抗体１〜４はすべてバックグランドレベルの活性化しか有さなかったことを示している。図１２Ａ〜１２Ｄを参照のこと。したがって、ヒンジを修飾した抗体１〜４はＨＥＣ細胞上のＦｃγＲＩＩＡまたはＩＩＢに結合する能力を欠いている。
【０１１４】
野生型ヒトＩｇＧ４抗体の陽性対照抗体は、ＨＥＫ２９３上の係留部位について競合する抗ＦｅｌＤ１抗体によってほぼバックグランドのレベルまで低下する強力な活性化を示した。
【０１１５】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化の喪失が、そのＣＤ３標的を結合する抗体の能力の損傷ではなくヒンジを修飾した抗体のＦｃγＲ結合能を抑制することがら生じることを示すために、プレート表面に架橋した抗体でアッセイを行った。１０ｎＭで出発した様々なＡｂの２倍連続希釈によってＭａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一晩被覆した。翌日ウェル当たり５０，０００個のＪｕｒｋａｔＮＦＡＴ  Ｌｕｃ細胞を加え、培地で総容量を１００ｕ／ウェルにして３７℃で５時間インキュベートした。１００ｕｌのＯｎｅ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えてルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性値を読み取る前に不透明な白色Ｎｕｎｃプレートに移す。この実験では、ヒンジを修飾した抗体１〜４はすべて、ＩｇＧ４アイソタイプが一致した対照と類似の活性化を示した。図１３を参照のこと。
【０１１６】
実施例５：ＡＤＣＣアッセイ
このアッセイでは、ヒンジを修飾した抗体は、細胞表面標的抗原ＣＤ２０を結合する可変領域（３Ｂ９＿ＶＨ）を有する（上述の抗体５〜８）。ＣＤ２０陽性の標的細胞（Ｄａｕｄｉ）をカルセインで標識し、次いで洗浄し、その後、６倍連続希釈の精製抗体及びＮＫ９２＿ＣＤ１６Ｖ細胞（５０，０００個／ウェルで、ＦｃγＲＩＩＩａの高親和性Ｖ対立遺伝子を発現するように操作されたＮＫ９２細胞）と共に３７Ｃで４時間インキュベートした（ウェル当たり１０，０００個）（エフェクター：標的の比−５：１）。標的細胞の溶解は上清にてカルセインの蛍光を測定することによって決定した。細胞傷害活性及びＥＣ５０の百分率は実施例３にて記載されたものと同様に算出した。図１４はヒンジを修飾した抗体がＤａｕｄｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性（図１４）に介在しないことを示している。
【０１１７】
実施例６：修飾されたヒンジを伴った抗ＴＭモノクローナル抗体のＰＫの評価
正常組織で広く発現され、種々の癌で上方調節される複数回貫通型膜（ＴＭ）タンパク質に結合する可変ドメインを有する抗体を、既知の技法（ＵＳ５，０５７，６０４；ＷＯ２０１１／１４３６２４；及びＷＯ９７／２７８７３を参照のこと）を用いて産生した。
【０１１８】
薬物動態（ＰＫ）クリアランス速度の評価：修飾されたヒンジ（抗体９）及びキメラＩｇＧ４Ｆｃ（抗体１０）を有する抗ＴＭ抗体、ならびにキメラＩｇＧ４Ｆｃ（抗体１１）を持つアイソタイプ対照をＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウスにて評価した。抗ＴＭｍＡｂまたはアイソタイプ対照のそれぞれについては、３匹のマウスのコホートに１ｍｇ／ｋｇで皮下（ｓ．ｃ．）投与した。投薬に先立ってマウスで採血し、血清試料を予備採血またはゼロ時点と名付けた。ＰＫ解析のために注射後６時間、１、３、７、１０及び１４日目にマウスすべてで採血した。採血の血清分画を分離し、解析が行われるまで−８０℃で凍結した。
【０１１９】
ＥＬＩＳＡによる血清における全薬物レベルの決定：ＥＬＩＳＡ免疫アッセイを用いたヒト全抗体解析によって循環している抗ＴＭ抗体のレベルを決定した。簡潔に、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌでのヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９−００５−０９８）を９６穴プレートに一晩固定化し、プレートを５％ＢＳＡでブロックした。６用量の連続希釈での薬物含有血清試料及び１２用量の連続希釈での各抗体の参照標準を用意したプレートに移し、１時間インキュベートした。次いで西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，＃１０９−０３５−０９８）を用いて、プレートに結合した抗ＴＭ抗体を検出した。製造元が推奨したプロトコールに従ってＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，＃５１−２６０６ＫＣ，＃１５−２６０７ＫＣ）によってプレートを発色させ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ４  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）のシグナルを記録した。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウエアを用いて生成した参照標準較正曲線に基づいて血清における抗ＴＭ抗体の濃度を算出した。
【０１２０】
１ｍｇ／ｋｇの抗体９、抗体１０またはアイソタイプ対照（Ａｂ１１）のＣ５７ＢＬ／６ＷＴマウスに皮下投与した。１４日間にわたる６時点で全抗体の濃度を測定した。各抗体についての抗ＴＭ抗体の総濃度を表１に要約する。
【０１２１】
【表１】
0006773679.tif 000002
【０１２２】
時間プロファイルに対する平均濃度は、３つの抗体すべてが１日目に最高血清濃度（Ｃｍａｘ）を達成したことを示している。抗体９、抗体１０、及びアイソタイプ対照はそれぞれ１３、１４及び１２μｇ／ｍＬの同程度のＣｍａｘ値を有した。３つの抗体はすべて重複するＰＫプロファイルと共に線形の消失を示した。これらのＰＫプロファイルは、ＩｇＧ１及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）アイソタイプ対照についての以前の試験で見られたものに類似する（データは示さず）。１４日目では、抗体９及びアイソタイプ対照はおよそ５μｇ／ｍＬの平均薬物レベルを有する一方で、抗体１０はおよそ６μｇ／ｍＬの平均薬物レベルを有した。
【０１２３】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施形態による範囲に限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の改変が、上記説明及び添付の図面から当業者に明らかになるであろう。そのような改変は添付の特許請求の範囲の範囲内のものであることが意図される。
【０１２４】
〔配列表〕
配列番号１    ＧＧＧ−（２３３−２３６）
ＰＰＣＰＡＰＧＧＧ−ＧＰＳＶＦ
配列番号２    ＧＧ−−（２３３−２３６）
ＣＰＰＣＰＡＰＧＧ−−ＧＰＳＶＦ
配列番号３    Ｇ−−−（２３３−２３６）  
ＣＰＰＣＰＡＰＧ−−−ＧＰＳＶＦ
配列番号４    Ｎｏ＿Ｇ−（２３３−２３６）
ＣＰＰＣＰＡＰ−−−−ＧＰＳＶＦ
配列番号５    ＩｇＧ４＿ＧＧＧ−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号６    ＩｇＧ４＿ＧＧ−−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号７    ＩｇＧ４＿Ｇ−−−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ
ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ
ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号８    ＩｇＧ４＿Ｎｏ＿Ｇ−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号９    ＩｇＧ４＊＿ＧＧＧ−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１０  ＩｇＧ４＊＿ＧＧ−−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１１  ＩｇＧ４＊＿Ｇ−−−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ
ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰ
ＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ
ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号１２  ＩｇＧ４＊＿Ｎｏ＿Ｇ−（２３３−２３６）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳ  ＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴ  ＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴ  ＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤ  ＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤ  ＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫ  ＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨ  ＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫ  ＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳ  ＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫ  ＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴ  ＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫ  ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ  ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥ  ＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮ  ＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳ  ＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬ  ＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥ  ＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳ  ＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号Ｓ１３〜１５は図２〜４にて示されるように野生型のヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４である。
配列番号１６  ＩｇＧ１  ＧＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ
ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号１７  ＩｇＧ１  ＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号１８  ＩｇＧ１  Ｇ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳ
ＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号１９  ＩｇＧ１  Ｇなし
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ
ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２０  ＩｇＧ１＊  ＧＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ
ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２１  ＩｇＧ１＊  ＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２  ＩｇＧ１＊  Ｇ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ  ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２３  ＩｇＧ１＊  Ｇなし
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧ  ＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶ
ＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴ  ＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰ  ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ  ＡＰＧ  ＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰ  ＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰ  ＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳ
ＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷ  ＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡ  ＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮ  ＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴ  ＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ  ＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡ  ＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳ  ＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱ  ＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥ  ＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣ  ＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩ  ＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰ  ＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶ  ＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹ  ＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷ  ＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶ  ＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴ  ＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２４  ＩｇＧ２  ＧＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２５  ＩｇＧ２  ＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ
ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  
ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２６  ＩｇＧ２  Ｇ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２７  ＩｇＧ２  Ｇなし
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  Ｑ
ＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２８  ＩｇＧ２＊  ＧＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号２９  ＩｇＧ２＊  ＧＧ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ
ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号３０  ＩｇＧ２＊  Ｇ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ  
配列番号３１  ＩｇＧ２＊  Ｇなし
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰ  ＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥ  ＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ  ＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳ  ＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶ  ＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳ  ＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴ  ＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴ  ＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳ  ＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲ  ＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ
ＡＰＧＰＳＶＦ  ＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬ  ＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣ  ＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰ  ＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧ  ＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰ  ＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲ  ＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱ  ＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣ  ＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰ  ＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧ  ＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬ  ＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮ  ＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧ  ＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷ  ＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹ  ＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤ  ＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴ  ＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮ  ＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡ  ＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬ  ＳＬＳＰＧＫ
【図１】
0006773679.tif 000003
【図２】
0006773679.tif 000004
【図３】
0006773679.tif 000005
【図４】
0006773679.tif 000006
【図５】
0006773679.tif 000007
【図６】
0006773679.tif 000008
【図７】
0006773679.tif 000009
【図８】
0006773679.tif 000010
【図９】
0006773679.tif 000011
【図１０】
0006773679.tif 000012
【図１１Ａ】
0006773679.tif 000013
【図１１Ｂ】
0006773679.tif 000014
【図１２Ａ】
0006773679.tif 000015
【図１２Ｂ】
0006773679.tif 000016
【図１２Ｃ】
0006773679.tif 000017
【図１２Ｄ】
0006773679.tif 000018
【図１３】
0006773679.tif 000019
【図１４】
0006773679.tif 000020
【配列表】
0006773679000001.app