(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写開始部位に対するヌクレオチド-41位および／または-179位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーター。
【請求項２】
SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列からなるプロモーター。
【請求項３】
SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸からなり、SEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸。
【請求項４】
以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
【請求項５】
産生が大規模産生である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である、請求項4〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
核酸が、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含むことを特徴とする、請求項4〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物細胞が、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞であることを特徴とする、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物細胞が、CHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、請求項4〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
選択可能マーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03のプロモーターの使用。
【請求項１４】
請求項1記載のプロモーターまたは請求項3記載の核酸を含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質発現の領域にある。少なくとも1個の点変異を有するプロモーター、およびポリペプチドを産生するためにこのプロモーターを使用する方法が、本明細書に報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質の発現は、生細胞における基本の過程である。タンパク質発現のために必要とされる情報は、全て、単一の核酸によって提供される。この核酸は、タンパク質のアミノ酸配列の情報を含有するのみならず、プロモーター／プロモーター配列を含む、必要とされる制御的情報（例えば、リボソーム結合部位、転写の開始シグナルおよび終結シグナル、スプライスシグナル、エンハンサー要素等）も提供する。
【０００３】
プロモーターとは、機能的に連結された核酸、例えば、ポリペプチドをコードする核酸の、プレmRNAへの転写の量を制御する核酸である。それは、機能的に連結されたコード配列の5'末端のRNAポリメラーゼ開始部位の周辺に位置する転写調節要素である。SV40初期プロモーターの分析から、転写活性化因子のための認識／結合部位は、プロモーター内の7〜20塩基対からなるセグメントに含有されていることが公知である。1個のセグメントは、RNA合成のための開始部位、例えば、周知のTATAボックスである。RNA合成のための開始部位のおよそ30〜110塩基対5'側、即ち、上流に位置する他のセグメントが、転写開始の頻度を規定する。プロモーターは、特定の部位において、規定された方向に、即ち、5'→3'方向にRNA合成を開始する1個のセグメントを少なくとも必要とする。
【０００４】
長期培養における産生量の徐々の減少は、製造細胞株の開発における一般的な問題である（Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639(非特許文献1)）。組換えタンパク質発現の減少は、トランスジーンコピーの減少および／またはトランスジーンプロモーターのサイレンシングによるものであり得る（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365(非特許文献2)；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108(非特許文献3)；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185(非特許文献4)を参照すること）。プロモーターのサイレンシングは、ヒストンの翻訳後修飾およびCpG部位におけるプロモーターDNAの直接メチル化のようなクロマチンのエピジェネティック修飾によって引き起こされる（例えば、Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304(非特許文献5)；De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617(非特許文献6)；Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97(非特許文献7)を参照すること）。メチル化されたプロモーターは、一般に、不活性となる。
【０００５】
ヒトサイトメガロウイルスの主要前初期遺伝子の極めて強力なプロモーターおよびエンハンサー（hCMV-MIE）は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの組換え発現のために使用されている。このプロモーターは、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞においても、安定的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞においても、メチル化によるサイレンシングを受けやすいことが示されている（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365(非特許文献2)；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108(非特許文献3)；Proesch,S.et al.,Biol Chem Heppe Seyler 377(1996):195-201(非特許文献8)；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185(非特許文献4)を参照すること）。
【０００６】
hCMV-MIEプロモーターの直接メチル化は、組換えCHO細胞株の産生不安定性を予測するための初期マーカーとして使用され得ることが、WO 2011/128377(特許文献1)において以前に証明されている。
【０００７】
Osterlehner,A.らは、プロモーターメチル化およびトランスジーンコピー数が、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株における不安定なタンパク質産生を予測することを報告し、異なるCpG部位が異なる頻度でメチル化されることを記載している（Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681(非特許文献9)）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2011/128377
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639
【非特許文献２】Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365
【非特許文献３】Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108
【非特許文献４】Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185
【非特許文献５】Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304
【非特許文献６】De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617
【非特許文献７】Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97
【非特許文献８】Proesch,S.et al.,Biol Chem Heppe Seyler 377(1996):195-201
【非特許文献９】Osterlehner,A.,et al.,Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681
【発明の概要】
【００１０】
hCMV-MIEプロモーターの特定の部位におけるC→G点変異、即ち、単一のC→G変異が、低下したプロモーターサイレンシングをもたらし、改善された産生安定性ももたらすことが見出された。さらに、産生されたポリペプチドのより高い力価が達成され得ることが見出された。転写開始部位に対する-41位および／または-179位におけるC→Gの変異が特に効果的であることが示された。
【００１１】
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-41位（および／）または-179位にヌクレオチドGを有する（SEQ ID NO:01のプロモーターに基づく）ヒトCMVプロモーターである。
【００１２】
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターは、（転写開始部位に対する-41位および／または-179位に、C→G点変異を有しないヒトCMVプロモーターと比較された時）改善された産生安定性および／または改善された産物力価を有する。
【００１３】
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターは、SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列を有する。
【００１４】
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸配列を有するプロモーターである。
【００１５】
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
【００１６】
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
【００１７】
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
【００１８】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
【００１９】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
【００２０】
この局面の一つの態様において、核酸は選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
【００２１】
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
【００２２】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
【００２３】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
【００２４】
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００２５】
本明細書に報告される一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02のプロモーターの使用である。
【００２６】
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告されるプロモーターまたは本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
【００２７】
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーターである。
【００２８】
本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
【００２９】
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
【００３０】
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
【００３１】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
【００３２】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
【００３３】
この局面の一つの態様において、核酸は選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
【００３４】
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
【００３５】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
【００３６】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
【００３７】
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００３８】
本明細書に報告される一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:03のプロモーターの使用である。
【００３９】
本明細書に報告される一つの局面は、本明細書に報告されるプロモーターまたは本明細書に報告される核酸を含む細胞である。
【００４０】
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-41位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーターである。
【００４１】
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターはヒトCMV主要前初期プロモーターである。
【００４２】
本明細書に報告される一つの局面は、転写開始部位に対するヌクレオチド-179位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーターである。
【００４３】
この局面の一つの態様において、ヒトCMVプロモーターはヒトCMV主要前初期プロモーターである。
[本発明1001]
転写開始部位に対するヌクレオチド-41位および／または-179位にヌクレオチドGを有するヒトCMVプロモーター。
[本発明1002]
SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーター。
[本発明1003]
SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の核酸からなり、SEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸。
[本発明1004]
以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
[本発明1005]
産生が大規模産生である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
ポリペプチドが、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である、本発明1004〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
核酸が、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含むことを特徴とする、本発明1004〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、本発明1004〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
哺乳動物細胞が、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞であることを特徴とする、本発明1008の方法。
[本発明1010]
哺乳動物細胞が、CHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、本発明1009の方法。
[本発明1011]
ポリペプチドが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、本発明1004〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
選択可能マーカーが、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼであることを特徴とする、本発明1008〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03のプロモーターの使用。
[本発明1014]
本発明1001のプロモーターまたは本発明1003の核酸を含む、細胞。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）発現プラスミドp5532のプラスミドマップ。
【図２】高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）発現プラスミドp16111のプラスミドマップ。
【図３】細胞培養上清の希釈の手法。
【図４】未処理の（斜線付きカラム）またはDAC処理された（縦線付きカラム）一過性にトランスフェクトされたCHO細胞懸濁液の標準化されたSEAP発現レベル。トランスフェクションのために使用されたプラスミドが示される。エラーバーは、8（DACなし）または4（DACあり）生物学的反復の標準偏差を表す。モックによってトランスフェクトされたCHO-K1細胞（2生物学的反復）のバックグラウンドシグナルも示される。
【図５】前方散乱光（FSC）／側方散乱光（SSC）ドットプロットにおけるトランスフェクトされていないCHO-K1細胞のリビングゲート（Living gate）。同一のFACSアッセイの全ての試料に、同一のゲートを適用した。
【図６】安定的にトランスフェクトされたCHO細胞の培養物によるeGFP蛍光のリビングゲートヒストグラム。蛍光は、Alexa Fluor 488チャンネルによって励起波長488nmで測定された。eGFP非発現細胞（左ピーク）およびeGFP高発現細胞（右ピーク）の2個の主要な亜集団を表す2個のピークを識別することができる。
【図７】プラスミド16107、16109、または16111のいずれかによる安定的なトランスフェクションの6週間後のCHO細胞の独立のプールのeGFP発現レベル。ドットは、個々のCHOプールの蛍光強度の幾何平均を表す。
【図８】プラスミド16107または16111のいずれかによる安定的なトランスフェクションの6週間後のCHO細胞の独立のプールのeGFP発現レベル。ドットは、個々のCHOプールの蛍光強度の幾何平均を表す。
【図９】IgGクラス抗体発現プラスミドp21504のプラスミドマップ。
【図１０】プラスミド16134（CGG）、16135（CGC）または16136（CCG）または21504（CCC）のいずれかによるトランスフェクションの68日後（A）またはトランスフェクションの134日後（B）の安定的にトランスフェクトされたCHO細胞プールの抗体力価（μg/ml）。ドットは、個々のCHOプールの抗体力価の幾何平均を表す。
【図１１】プラスミド16134（CGG）、16135（CGC）または16136（CCG）または21504（CCC）のいずれかによるトランスフェクションの68日後（A）またはトランスフェクションの131日後（B）の安定的にトランスフェクトされたCHO細胞プールの比産生量（qP）。ドットは、個々のCHOプールの比産生量の幾何平均を表す。
【図１２】変異体と対照とのチューキーのHSD検定による平均の比較（ΔqP平均値）。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な説明
分泌型タンパク質、細胞内レポータータンパク質、または細胞表面マーカーのような組換えポリペプチドの産生／発現のために安定的にトランスフェクトされた真核細胞株を使用する時、長期培養における産生量の徐々の減少は、製造細胞株の開発における一般的な問題である（Barnes,L.M.,et al.Biotechnol.Bioeng.81(2003)631-639）。産生細胞株／細胞クローン、即ち、例えば、抗体のようなポリペプチドの大規模組換え産生のために使用される細胞クローン／細胞株について、細胞クローン／細胞株の産生安定性、即ち、世代毎の産生量の減少は、重要である。従って、組換えタンパク質産生のための哺乳動物細胞株は、長期の培養時間にわたり産生量を維持する必要がある。一般に、細胞クローン／細胞株の産生安定性は、長期間にわたり細胞クローン／細胞株を培養することによって決定される。定期的な間隔で、培地を新鮮な培地で希釈し、産物力価および生存細胞密度に基づき、1細胞当たりの比産生量を決定する。比産生量の変化（通常、低下）は、細胞クローン／細胞株の長期産生安定性の指標となる。
【００４６】
組換えタンパク質発現の減少は、トランスジーンコピーの減少および／またはトランスジーンプロモーターのサイレンシングによるものであり得る（例えば、Escher,G.,et al.J.Lipid Res.46(2005)356-365；Krishnan,M.,et al.,FASEB J.20(2006)106-108；Yang,Y.,et al.,J.Biotechnol.147(2010)180-185を参照すること）。プロモーターのサイレンシングは、ヒストンの翻訳後修飾およびCpG部位におけるプロモーターDNAの直接メチル化のようなクロマチンのエピジェネティック修飾によって引き起こされる（例えば、Cedar,H.and Bergman,Y.,Nat.Rev.Genet.10(2009)295-304；De Carvalho,D.D.et al.,Trends Cell Biol 20(2010):609-617；Klose;R.J.and Bird,A.P.,Trends Biochem Sci 31(2006):89-97を参照すること）。メチル化されたプロモーターは、一般に、不活性となる。
【００４７】
Osterlehner,A.らは、プロモーターメチル化およびトランスジーンコピー数が、組換えチャイニーズハムスター卵巣細胞株において不安定なタンパク質産生を予測することを以前に示し、異なるCpG部位が異なる頻度でメチル化されることを記載している（Biotechnol.Bioeng.108(2011)2670-2681）。
【００４８】
本発明において、異なるCpG部位を、単独で、または組み合わせて、調査した。ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー内にCpG点変異を含有している様々な細胞株を生成し、長期産生量について試験した。
【００４９】
プロモーターにおける変異が遺伝子発現の効力に有意に影響を及ぼさないこと、即ち、プロモーター強度が影響を受けないことは、重要である。
【００５０】
本明細書に報告されるようになされた点変異によって、hCMV-MIEプロモーターにおけるプロモーター強度は影響を受けないことが、本発明において見出された。ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片に点変異を有するプラスミドと、非変異型対照プラスミドとの間に、有意差を検出することはできなかった。
【００５１】
本発明は、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサーの特定のCpG部位におけるCからGへの点変異によって、プロモーターのサイレンシングを低下させることができるという発見に少なくとも一部分基づく。それによって、細胞株の長期産生安定性を改善することができ、高い／より高い収量で、長期間にわたり、組換えポリペプチドを産生することができる。
【００５２】
例示的なCHO細胞に、（点変異C-179→Gを有する）プラスミド16107または（点変異C-41→Gを有する）プラスミド16109を安定的にトランスフェクトし、これを培養した。各プラスミドについて8〜10の独立の安定的にトランスフェクトされた細胞プールのeGFP強度を、長期の培養時間にわたり決定した。
【００５３】
プラスミド16109または対照プラスミド16111のいずれかをトランスフェクトされた細胞の間に、トランスフェクトされた細胞の長期産生量の統計的に有意な差が検出された（p値＜0.05；下記表を参照すること）。
【００５４】
転写開始部位に対する-41位にC→Gの点変異が導入される時、即ち、メチル化部位が排除される時、レポーター遺伝子発現の安定性に対する正の効果が達成され得ることが見出された。
【００５５】
（表）プラスミド16107、16109、または16111をトランスフェクトされたCHO細胞プールの蛍光幾何平均の最小有意差（LSD）についてのp値
0006661549.tif 000002
【００５６】
従って、本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸配列を有するプロモーター、即ち、C-41→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーターである。一つの態様において、プロモーターは、少なくとも1個のC→Gの点変異を有する。一つの態様において、プロモーターは、2個のC→Gの点変異を有する。一つの態様において、プロモーターは、3個のC→Gの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、単一のCからGへの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、転写開始部位に対する-41位に単一のCからGへの点変異を有する。一つの好ましい態様において、プロモーターは、転写開始部位に対する-179位に単一のCからGへの点変異を有する。
【００５７】
本明細書に報告されるもう一つの局面は、SEQ ID NO:02の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
【００５８】
本明細書に報告される一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:02の第1の核酸（即ち、C-41→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター）を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
【００５９】
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
【００６０】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
【００６１】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。完全な免疫グロブリン分子を産生すべき場合には、それぞれの他方の免疫グロブリン鎖をコードする核酸を有するさらなる発現カセットを含める必要があることが理解される。例えば、ポリペプチドが免疫グロブリン軽鎖である場合には、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸を有するさらなる発現カセットが導入される。この局面の一つの態様において、核酸は、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖をコードするさらなる発現カセットを含む。
【００６２】
この局面の一つの態様において、核酸は、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。本明細書に報告されるもう一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:02のプロモーターの使用である。
【００６３】
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
【００６４】
さらに、細胞株16107および16111を直接比較した。細胞株16107の、対照細胞株16111と比較して、より高いeGFP発現の傾向は、転写開始部位に対するC-179位におけるC→G点変異の、eGFP発現遺伝子の安定性に対する正の効果を示す。
【００６５】
転写開始部位に対する-41位は、SEQ ID NO:01の561位に相当する。転写開始部位に対する-179位は、SEQ ID NO:01の423位に相当する。
【００６６】
従って、本明細書に報告される一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸配列を有するプロモーター、即ち、C-179→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーターである。
【００６７】
本明細書に報告されるもう一つの局面は、SEQ ID NO:03の核酸からなり、高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）をコードするSEQ ID NO:04の核酸と機能的に連結された時、SEQ ID NO:01のヒトCMV主要前初期プロモーターの少なくとも80％のプロモーター強度を有することを特徴とする核酸である。
【００６８】
本明細書に報告されるもう一つの局面は、以下の工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドの産生の方法である：
（a）ポリペプチドをコードする第2の核酸と機能的に連結されたSEQ ID NO:03の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程、
（b）工程（a）においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程、
（c）工程（b）の選択された細胞を（ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で）培養する工程、
（d）細胞または培養培地からポリペプチドを回収し、それによって、ポリペプチドを産生する工程。
【００６９】
この局面の一つの態様において、産生は大規模産生である。一つの態様において、産生は、500l以上、一つの態様において、500l〜10,000lの最終培養体積でなされる。
【００７０】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。
【００７１】
この局面の一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖または免疫グロブリン重鎖またはそれらのバリアントまたはそれらの断片またはそれらの融合物である。
【００７２】
この局面の一つの態様において、核酸は、選択可能マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。
【００７３】
この局面の一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。
【００７４】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6（登録商標）細胞である。
【００７５】
この局面の一つの態様において、哺乳動物細胞は、CHO細胞またはHEK細胞である。
【００７６】
この局面の一つの態様において、選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼである。
【００７７】
本明細書に報告されるもう一つの局面は、ポリペプチドの産生のためのSEQ ID NO:03のプロモーターの使用である。
【００７８】
定義
「プロモーター」とは、機能的に連結された核酸の転写を調節する核酸、即ち、ポリヌクレオチド配列をさす。プロモーターは、RNAポリメラーゼ結合および転写開始のためのシグナルを含み得る。使用されるプロモーターは、機能的に連結された核酸の発現が企図される宿主細胞の細胞型において機能性のものであろう。多様な異なる起源に由来する構成性プロモーター、誘導可能プロモーター、および抑制可能プロモーターを含む多数のプロモーターが、当技術分野において周知である（GenBankのようなデータベースにおいて同定される）。それらは、（例えば、ATCCのような寄託機関、および商業的または個人的な供給元から）クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチドの中に、入手可能である。「プロモーター」は、例えば、機能的に連結された構造遺伝子の転写を指図するヌクレオチド配列を含む。典型的には、プロモーターは、構造遺伝子の転写開始部位の近位の遺伝子の5'非コード領域または5'非翻訳領域（5'UTR）に位置する。転写の開始において機能するプロモーター内の配列要素は、しばしば、コンセンサスヌクレオチド配列を特徴とする。これらの配列要素には、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、CAAT配列、分化特異的要素（DSE；McGehee,R.E.,et al.,Mol.Endocrinol.7(1993)551）、サイクリックAMP応答要素（CRE）、血清応答要素（SRE；Treisman,R .,Seminars in Cancer Biol.1(1990)47）、グルココルチコイド応答要素（GRE）、ならびにCRE/ATF（O'Reilly,M.A.,et al.,J.Biol.Chem.267(1992)19938）、AP2（Ye,J.,et al.,J.Biol.Chem.269(1994)25728）、SP1、cAMP応答要素結合タンパク質（CREB；Loeken,M.R.,Gene Expr.3(1993)253-264）、およびオクタマー因子のような他の転写因子のための結合部位（一般に、Watson et al.,eds.,Molecular Biology of the Gene,4th ed.,The Benjamin/Cummings Publishing Company,Inc.1987およびLemaigre,F.P.and Rousseau,G.G.,Biochem.J.303(1994)1-14を参照すること）が含まれる。プロモーターが誘導可能プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤に応答して増加する。対照的に、プロモーターが構成性プロモーターである場合、転写の速度は、誘導剤によって制御されない。抑制可能プロモーターも公知である。例えば、c-fosプロモーターは、成長ホルモンが細胞表面上の受容体に結合することによって特異的に活性化される。テトラサイクリン（tet）によって制御される発現は、例えば、CMVプロモーターに2個のTetオペレーター部位が後続するものからなる人工ハイブリッドプロモーターによって達成され得る。Tetリプレッサーが2個のTetオペレーター部位に結合し、転写を阻止する。誘導剤テトラサイクリンが添加されると、TetリプレッサーがTetオペレーター部位から放出され、転写が進行する（Gossen,M.and Bujard,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)5547-5551）。メタロチオネインプロモーターおよび熱ショックプロモーターを含むその他の誘導可能プロモーターについては、例えば、Sambrook,et al.（前記）およびGossen,M.,et al.,Curr.Opin.Biotech.5(1994)516-520を参照すること。高レベル発現のための強力なプロモーターとして同定されている真核生物プロモーターには、SV40初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネインIプロモーター、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列、チャイニーズハムスター伸長因子1α（CHEF-1、例えば、US 5,888,809を参照すること）、ヒトEF-1α、ユビキチン、およびヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（CMV-MIE）が含まれる。「エンハンサー」（即ち、転写を増加させるためにプロモーターに作用するシス作用性のDNA要素）は、プロモーター単独で入手される発現のレベルを増加させるため、プロモーターと協力して機能するよう必要とされる場合があり、転写制御要素として含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントは、エンハンサー配列も含むであろう（例えば、CMVまたはSV40）。
【００７９】
「CpG部位」という用語は、細胞のメチル化酵素によって認識され、シトシンが5-メチルシトシンに変換され得る、核酸内のジヌクレオチドCGを示す。一つの態様において、CpG部位はプロモーター核酸内にある。
【００８０】
「核酸」という用語は、本明細書において使用されるように、個々のヌクレオチドからなるポリマー、即ち、ポリヌクレオチドである。それは、例えば、組換え産生され得るポリペプチドをコードする、天然に存在する核酸、または部分的にもしくは完全に天然には存在しない核酸をさす。核酸は、化学的手段によって単離されるかまたは合成されるDNA断片の集まりであり得る。核酸は、もう一つの核酸、例えば、発現プラスミドまたは宿主細胞のゲノム／染色体へ組み込まれていてもよい。プラスミドには、シャトルベクターおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミドは、それぞれ、細菌におけるベクターの複製および選択のための、複製起点（例えば、ColE1複製起点）および選択可能マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子）を含む原核生物繁殖単位も含むであろう。
【００８１】
「プロモーター強度」という用語およびその文法上の相当語句は、本発明において使用されるように、機能的に連結された核酸の転写におけるプロモーターの効力を示す。プロモーターのプロモーター強度は、SEQ ID NO:01の野生型hCMV-MIEプロモーターのプロモーター強度と比較した場合、高く、即ち、75％から100％超であるか、または中程度、即ち、40％から75％未満であるか、または低く、即ち、40％未満であり得る。この値は、同一の細胞型において、当該プロモーターに機能的に連結された異種ポリペプチドの発現の量を、野生型SV40プロモーターに機能的に連結された異種ポリペプチドの発現の量と比較することによって決定され得る。これは、例えば、ELISAアッセイによって、異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された当該プロモーターからなる発現カセットをトランスフェクトされたCHO細胞またはHEK細胞において、異種ポリペプチドの発現の量を決定することによって行われ得る。この量を、同一のELISAアッセイによって決定された、異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結された野生型SV40プロモーターからなる発現カセットをトランスフェクトされた同一の細胞株における同一の異種ポリペプチドの発現の量と比較することによって、即ち、プロモーターのみを変化させた、同一の発現プラスミドを有する同一の細胞において、異種ポリペプチドの量を比較することによって、相対的なプロモーター強度を決定することができる。
【００８２】
「機能的に連結された」とは、そのように記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にある2個以上の成分の並置をさす。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結されたコード配列の転写を調節するかまたはモジュレートするためにシス作用する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。一般に、必ずではないが、「機能的に連結された」DNA配列は、連続しており、分泌リーダー／シグナル配列およびポリペプチドのような2個のタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、連続しておりかつリーディングフレーム内にある。しかしながら、機能的に連結されたプロモーターは、一般に、コード配列の上流に位置するが、必ずしも隣接していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合、そのエンハンサーはそのコード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部、または下流に、プロモーターからの相当な距離に位置し得る。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通ってポリアデニル化配列へと進行するよう、コード配列の下流末端に位置する場合、そのコード配列に機能的に連結されている。連結は、当技術分野において公知の組換え法によって、例えば、PCR方法論を使用して、かつ／または便利な制限部位でのライゲーションによって達成される。便利な制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、慣習的な実務に従って使用される。
【００８３】
本発明の範囲内で、トランスフェクトされた細胞は、当技術分野において公知の実質的に任意の種類のトランスフェクション法によって入手され得る。例えば、核酸は電気穿孔または微量注入によって細胞へ導入され得る。あるいは、FuGENE 6（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、X-tremeGENE（Roche Diagnostics GmbH,Germany）、およびLipofectAmine（Invitrogen Corp.,USA）のようなリポフェクション試薬が使用されてもよい。あるいは、核酸は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスに基づく適切なウイルスベクター系によっても細胞へ導入され得る（Singer,O.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)5313-5314）。
【００８４】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、核酸、例えば、異種ポリペプチドをコードする核酸またはshRNAを構成する核酸が、導入／トランスフェクトされ得る細胞、または導入／トランスフェクトされた細胞をさす。宿主細胞には、ベクター／プラスミドの繁殖のために使用される原核細胞および核酸の発現のために使用される真核細胞の両方が含まれる。一つの態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。もう一つの態様において、哺乳動物宿主細胞は、CHO細胞（例えば、CHO K1またはCHO DG44）、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293 EBNA細胞、PER.C6細胞、およびCOS細胞を含む哺乳動物細胞より選択される。さらなる態様において、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞、骨髄腫細胞、および齧歯類細胞を含む群より選択される。骨髄腫細胞には、ラット骨髄腫細胞（例えば、YB2）およびマウス骨髄腫細胞（例えば、NS0、SP2/0）が含まれる。薬学的適用において使用するためのポリペプチドは、一つの態様において、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（登録商標）細胞等のような哺乳動物細胞において産生される。宿主細胞の発酵のため、従って、関心対象のポリペプチドの発現のため、培養培地が使用される。現在、CHO細胞は、実験室において小規模にも、産生過程において大規模にも、薬学的ポリペプチドの発現のために広く使用されている。広い流通および使用のため、CHO細胞の特徴的特性および遺伝的背景は周知である。従って、CHO細胞は、ヒトへ適用するための治療用タンパク質の産生のため、規制機関によって承認されている。一つの態様において、哺乳動物細胞はCHO細胞である。
【００８５】
「発現カセット」とは、少なくとも含有されている構造遺伝子の宿主細胞における発現および分泌のために必要な要素を含有している核酸をさす。核酸は、個々のヌクレオチドからなる配列、または核酸分子によってコードされたアミノ酸配列によっても特徴決定される。
【００８６】
「遺伝子」とは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の発現を達成することができる、例えば、染色体上またはプラスミド上の、セグメントである核酸を示す。コード領域、即ち、構造遺伝子の他に、遺伝子は、他の機能的要素、例えば、シグナル配列、プロモーター、イントロン、および／またはターミネーターを含む。
【００８７】
「構造遺伝子」とは、シグナル配列なしの遺伝子の領域、即ち、コード領域を示す。
【００８８】
「発現」という用語は、本明細書において使用されるように、細胞内で起こる転写および／または翻訳をさす。宿主細胞における所望の産物の転写のレベルは、細胞に存在する対応するmRNAの量に基づき決定され得る。例えば、選択された核酸から転写されたmRNA を、PCRまたはノーザンハイブリダイゼーションによって定量化することができる（Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)を参照すること）。選択された核酸によってコードされたタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ELISAによって、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることによって、またはウエスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイのようなそのような活性とは無関係のアッセイを利用することによって、タンパク質を認識しそれに結合する抗体を使用することによって、定量化され得る（Sambrook,et al.,1989（前記）を参照すること）。
【００８９】
「ポリペプチド」とは、天然に産生されたものであってもよいしまたは合成的に産生されたものであってもよい、ペプチド結合によって接合されたアミノ酸残基のポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」とも呼ばれる。2本以上のアミノ酸鎖を含むか、または100アミノ酸以上の長さのアミノ酸鎖を含むポリペプチドは、「タンパク質」とも呼ばれる。ポリペプチドまたはタンパク質は、炭水化物基または金属イオンのような非ペプチド成分も含み得る。炭水化物およびその他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加され、細胞の型によって変動し得る。タンパク質およびポリペプチドは、アミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義され；炭水化物基のような付加は、一般に明示されないが、にも関わらず存在し得る。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片または免疫グロブリンコンジュゲートである。一つの態様において、ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖、またはそれらの断片、融合物、もしくはコンジュゲートである。
【００９０】
「選択可能マーカー」という用語は、対応する「選択剤」の存在下で、この核酸を保持する細胞が特異的にポジティブにまたはネガティブに選択されることを可能にする核酸を示す。有用なポジティブ選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。選択可能マーカーは、それによって形質転換された細胞が、対応する選択剤の存在下でポジティブに選択されることを可能にし；非形質転換細胞は、選択培養条件の下で、即ち、選択剤の存在下で、増殖するかまたは生存することができない。選択可能マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択可能マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にし、ネガティブ選択可能マーカーは、マーカーを保持する細胞が選択的に排除されることを可能にする。典型的には、選択可能マーカーは、薬物に対する耐性を付与するか、または細胞における代謝もしくは異化の欠陥を補うであろう。真核細胞において有用な選択可能マーカーには、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HYG）、ネオマイシンAPH、およびG418 APHのようなアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、チミジンキナーゼ（TK）、グルタミン合成酵素（GS）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（選択剤インドール）、ヒスチジノール脱水素酵素（選択剤ヒスチジノールD）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性を提供する遺伝子が含まれる。さらに、選択可能マーカーは、WO 92/08796およびWO 94/28143に報告されている。
【００９１】
「ポリペプチドの発現のために適当な条件の下で」という用語は、異種ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞の培養のために使用され、当業者に公知であるかまたは当業者によって容易に決定され得る条件を示す。これらの条件が、培養される哺乳動物細胞の型および発現されるタンパク質の型に依って変動し得ることも、当業者に公知である。一般に、哺乳動物細胞は、例えば、20℃〜40℃の温度で、効果的なタンパク質産生を可能にするのに十分な期間、例えば、4〜28日間、0.1リットル〜107リットルの体積で培養される。
【００９２】
「ポリペプチドの回収」という用語は、本願において使用されるように、沈殿、塩析、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、濃縮溶液を入手するための溶媒体積減少、またはクロマトグラフィを示す。一般に、クロマトグラフィ過程が、ポリペプチドの分離および精製のために使用される。微生物タンパク質によるアフィニティクロマトグラフィ（例えば、プロテインAアフィニティクロマトグラフィまたはプロテインGアフィニティクロマトグラフィ）、イオン交換クロマトグラフィ（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合型交換）、（例えば、βメルカプトエタノールおよびその他のSHリガンドによる）チオフィリック（thiophilic）吸着、（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸による）疎水性相互作用クロマトグラフィまたは芳香族吸着クロマトグラフィ、（例えば、Ni(II)アフィニティ材料およびCu(II)アフィニティ材料による）金属キレートアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、ならびに（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動のような）電気泳動法のような、種々の方法が、十分に確立され、タンパク質の回収および精製のために広範囲に使用されている（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。
【００９３】
「免疫グロブリン」という用語は、少なくとも2本のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および2本のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む分子を示す。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、各々、抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般に、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、各々、定常領域（一般に、カルボキシ末端部分）も含む。重鎖の定常領域は、（i）食細胞のようなFcγ受容体（FcγR）を保持する細胞または（ii）ブランベル（Brambell）受容体としても公知の新生児型Fc受容体（FcRn）を保持する細胞との免疫グロブリンの結合を媒介する。それは、成分（C1q）のような古典的補体系の因子を含むいくつかの因子との結合も媒介する。
【００９４】
「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において、最も広義に使用され、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および免疫グロブリン断片を含むが、これらに限定されない、様々な免疫グロブリン構造を包含する。
【００９５】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依って、免疫グロブリンは、異なるクラス：IgAクラス、IgDクラス、IgEクラス、IgGクラス、およびIgMクラスに分類される。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）へさらに分類され、即ち、IgGは、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に、またはIgAは、IgA1およびIgA2に分類される。免疫グロブリンが属するクラスに依って、重鎖定常領域は、それぞれ、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、およびμ（IgM）と呼ばれる。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgGクラスの免疫グロブリンである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域またはヒト起源に由来する定常領域である。さらなる態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラス、またはFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）結合および／もしくはC1q結合が検出され得ないよう修飾されたIgG1サブクラス、IgG2サブクラス、もしくはIgG3サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、ヒトIgG4サブクラスまたは変異型ヒトIgG1サブクラスのものである。一つの態様において、免疫グロブリンは、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラスのものである。もう一つの態様において、免疫グロブリンは、Fcγ受容体結合に関して、IgG4サブクラスのものであるか、またはL234、L235、および／もしくはD265に変異を有するIgG1サブクラスもしくはIgG2サブクラスのものであり、かつ／またはPVA236変異を含有している。さらなる態様において、免疫グロブリンは、S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE（S228PおよびL235E）、ならびに／またはPVA236（PVA236とは、IgG1のアミノ酸233〜236位の（一文字アミノ酸コードで与えられた）アミノ酸配列ELLGまたはIgG4のEFLGがPVAに置換されていることを意味する）より選択される変異を有する。一つの態様において、免疫グロブリンは、IgG4サブクラスのものであり、IgG4の変異S228Pを有するか、または免疫グロブリンは、IgG1サブクラスのものであり、変異L234AおよびL235Aを有する。
【００９６】
次に、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、即ち、4個のフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（CDR）を含む。
【００９７】
「免疫グロブリン断片」とは、免疫グロブリンの重鎖の可変ドメイン、CH1ドメイン、ヒンジ領域、CH2ドメイン、CH3ドメイン、CH4ドメイン、または免疫グロブリンの軽鎖の可変ドメインもしくはCLドメインを含むドメインの群の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを示す。それらの誘導体およびバリアントも含まれる。さらに、1個以上のアミノ酸またはアミノ酸領域が欠失している可変ドメインが存在してもよい。
【００９８】
「免疫グロブリンコンジュゲート」とは、ペプチド結合を介してさらなるポリペプチドにコンジュゲートされた免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の少なくとも1個のドメインを含むポリペプチドを示す。さらなるポリペプチドは、ホルモン、増殖受容体、抗融合性（antifusogenic）ペプチド等のような非免疫グロブリンペプチドである。
【００９９】
以下の実施例、図面、および配列表は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の本旨から逸脱することなく、示された手法に修飾を施し得ることが理解される。
【０１００】
配列表の説明
SEQ ID NO:01  ヒトCMV主要前初期（hCMV-MIE）プロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:02  転写開始部位に対する-41位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:03  転写開始部位に対する-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
SEQ ID NO:04  不安定化PEST配列を含む高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:05  シグナルペプチドを含む分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）のヌクレオチド配列
SEQ ID NO:06  転写開始部位に対する-41位および-179位にC→G点変異を有するhCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのヌクレオチド配列
【実施例】
【０１０１】
実施例1
一般的な技術
組換えDNA技術
Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y,(1989)に記載されるような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。製造業者の説明書に従って分子生物学用試薬を使用した。
【０１０２】
DNA配列決定
DNA配列決定は、SequiServe GmbH（Vaterstetten,Germany）で実施された。
【０１０３】
DNAおよびタンパク質の配列分析および配列データ管理
EMBOSS（European Molecular Biology Open Software Suite）ソフトウェアパッケージおよびInvitrogenのVector NTIバージョン9.1を、配列の作成、マッピング、分析、アノテーション、および図示のために使用した。
【０１０４】
抗体分析のための試料調製
細胞濃度を計算し、各試料2mlを遠心分離した（500g、5分、20〜30℃）。上清を新しい96穴ディープウェルプレートに移し、使用まで-20℃で保管した。凍結上清を、4℃で一晩解凍し、6回反転させ、遠心分離した（4000rpm、30分、20〜30℃）。バーコード付き96穴丸型ウェルプレート上のマルチスクリーンMilliporeプレートで、遠心分離（1200rpm、3分、20〜30℃）によって、310μlをろ過した。
【０１０５】
実施例2
組換えCHO細胞株の生成
野生型（SEQ ID NO:01）であるかまたはC→G点変異を含むヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下で、レポーター遺伝子、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP：図1；SEQ ID NO:05）または高感度緑色蛍光タンパク質（eGFP：図2）またはクラスIgGのヒト抗体構築物（WO 2014023752に報告されたようなIgGサイトカイン（IL2）融合タンパク質；図9）のいずれかを保持するベクターを、一過性にまたは安定的にCHO-K1懸濁細胞にトランスフェクトした。長期安定性を増加させるため、hCMV-MIE断片内のCpGジヌクレオチドのC→G変異C-508、C-179、およびC-41を、単独でまたは様々に組み合わせて挿入した（表1）。C→G変異は、転写開始部位（TSS）との距離によって同定される。QuikChange Multi-Site-Directed Mutagnesis Kit（Agilent Technologies,Waldbronn,Germany）によって、変異を挿入した。ベクターは、マウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）をコードする核酸配列をさらに含んでいた（図1、2、および9）。Amaxaヌクレオフェクション系（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）によって、細胞のトランスフェクションを実施した。
【０１０６】
（表１）ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内のCpGジヌクレオチドのC→G点変異の組み合わせ
0006661549.tif 000003
【０１０７】
例えば、製造業者のプロトコルに従って、Nucleofector Kit V（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）と組み合わせてNucleofector装置を使用して、SEAPの一過性発現のための環状プラスミドDNA、またはeGFPの安定的発現のための直鎖化されたプラスミドDNA、またはIgGクラス抗体融合タンパク質の安定的発現のための適切なプラスミドを、CHO-K1細胞にトランスフェクトした。一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、96穴プレートに播種し、5日間インキュベートした。SEAP濃度を、化学反応の色変化によって、Tecan-Reader SECTRAFluor Plus（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）において調査した。
【０１０８】
安定的にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、選択剤として250〜1600nMメトトレキサート（MTX）を含むチミジン不含培地を含有している384穴プレートまたは6穴プレートに播種した。3〜4週間後、eGFP発現細胞プールまたは抗体発現細胞プールを、1〜3ヶ月の期間にわたる長期安定性について調査した。eGFP発現の強度をフローサイトメトリーによって調査した。抗体発現単細胞クローンを384穴プレートおよび96穴プレートに播種した。3週間後、抗体発現細胞株を、ELISAによって培養培地中の抗体力価を測定することによって同定した。増殖中のウェルをランダムに選び、長期安定性アッセイのため、細胞クローンをより高い体積で増大させ（6穴プレートにおいて1ウェル当たり3ml）、各継代の終わりにプロテインA HPLCおよびELISAによって抗体濃度を決定した。
【０１０９】
120rpm/分〜150rpm/分の一定の撹拌速度で、標準的な加湿条件（95％rH、37℃、および5％〜8％CO2）の下で、使い捨て125mlベント付き振とうフラスコにおいて細胞を繁殖させた。3〜4日毎に細胞を新鮮な培地に分割した。培養物の密度および生存率を、Cedex HiResセルカウンター（Roche Innovates AG,Bielefeld,Germany）を使用して決定した。さらに、例えば、Current Protocols in Cell Biology,Binifacino,J.S.et al.(eds),John Wiley & Sons,Inc.,New York(2000)に記載されるような、標準的な細胞培養技術を適用した。
【０１１０】
実施例3
長期の培養および産生
実施例2に従って入手された、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内のCpG点変異（表1）を含有している様々なCHO細胞プールを、長期産生量について調査した。
【０１１１】
選択剤MTXの存在下で、トランスフェクション後、2〜3ヶ月間、産生安定性について細胞を試験した。細胞を、選択剤を含む20〜40mlの培地を含有しているベント付き125ml振とうフラスコにおいて連続的に培養し、週2回、新鮮な培地で希釈した。播種密度は2〜3×105細胞/mlであった。継代前に生存細胞密度および生存率を決定した。
【０１１２】
各継代の終わりにプロテインA HPLCおよびELISAによって上清の抗体濃度（抗体力価）を決定した。これらのデータから、各継代についての細胞比産生量（qP）を、以下の式を使用して計算した：
0006661549.tif 000004
qP[pg/細胞/d]：細胞比産生量、
P1[μg/ml]：継代の最初の抗体力価、
P2[μg/ml]：継代の最後の抗体力価、
D1[細胞/ml]：継代の最初の生存細胞密度、
D2[細胞/ml]：継代の最後の生存細胞密度、
Δt[d]：継代の期間。
【０１１３】
世代毎にそれぞれの継代の最後に培養齢に対してqP値をプロットした。線形傾向線を全てのqPデータ点において計算し、期間中のqP（％）の相対変動を、以下の方程式に従って社内で計算した：
0006661549.tif 000005
ΔqP[％]：qPの変動率（％）、
m[pg/細胞/d/世代]：線形傾向線、
[世代の番号]：培養齢、
qP0：線形傾向線のy軸切片。
【０１１４】
hCMV-MIEプロモーターバリアントの安定性アッセイにおいて入手されたデータ点の数は比較的少なかったため、各試料について、最後の3つのqP値の平均値を、最初の2つのQp値の平均値によって割り、ΔqPを入手するため、パーセントで示した。
0006661549.tif 000006
平均qP EOS：最後の3つのqP値の平均値
平均qP PSB：最初の2つのqP値の平均値
【０１１５】
実施例4
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのレポーター遺伝子発現の定量化
（a）異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのSEAP発現の定量化
製造業者のプロトコルに従って、Amaxa Shuttle 96穴プレートにおいて、Nucleofector Kit V（Lonza Cologne GmbH,Cologne,Germany）と組み合わせてNucleofector装置を使用して、SEAPの一過性発現のための環状プラスミドDNAを、CHO-K1細胞にトランスフェクトした。各プラスミド12を一過性にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、96穴プレートに播種し、5日間インキュベートした。2日目、DNAを脱メチルするため、5'-アザ-2'-デオキシシチジン（DAC）を1μMの最終濃度で各プラスミド4反復で添加した。SEAP濃度をTecan-Reader SECTRAFluor Plus（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）で調査した。
【０１１６】
以下のプロトコルに従って、pNPP（パラニトロフェニルホスフェート）のpNP（パラニトロフェノール）への代謝速度によって、SEAPの相対濃度を調査した。
【０１１７】
（表２）SEAPアッセイのための溶液
0006661549.tif 000007
【０１１８】
150μlの遠心分離された細胞培養上清を1:3で段階希釈した（図3）。
【０１１９】
50μlの希釈物を新しい96穴プレートに添加し、50μlの基質溶液と合わせた。5分後、405nmの波長での光学濃度を、SECTRAFluor Plus光度計（Tecan Deutschland GmbH,Crailsheim,Germany）を使用して測定した。
【０１２０】
DAC処理なしのプラスミドについては8反復の平均値、DAC処理されたプラスミドについては4反復の平均値（表1）を、点変異なしの対照プラスミド（p5532）に対して標準化した（図4）。
【０１２１】
ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片内の点変異を含むプラスミドと、非変異型対照プラスミド5532との間に、有意差は検出されなかった。さらに、DAC処理された試料と、DAC処理なしの試料との間に、有意差は観察されず、このことから、トランスフェクション後5日以内に有意なプロモーターサイレンシングが起こらないことが示された。従って、ヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片へ導入された点変異は、プロモーター強度に影響を与えない（点変異は、ヒトCMV前初期プロモーター／エンハンサー断片の直接の効力に対して影響を及ぼさない）と、結論付けられる。
【０１２２】
（b）FACSによる異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下でのeGFP発現の定量化
eGFPを発現する安定的にトランスフェクトされた細胞懸濁液を、1〜3ヶ月の期間にわたり培養した。BD FACS Canto IIまたはBD FACS Calibur（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、eGFP発現の強度を測定した。BD FACS Diva Software v6.12またはCell Quest Pro Software（BD,Heidelberg,Germany）を使用して、データ収集を実施した。FlowJo 7.6.5 ENソフトウェア（TreeStar,Olten,Switzerland）によって、一次データ分析を実施した。
【０１２３】
例えば、CHO細胞懸濁液16105、16106、16107、16108、16109、16110、および16111を、eGFP発現を検出するため、多数の時点で、BD FACS Caliburによって調査した。全ての試料を3〜4生物学的反復で調査した。各試料10000イベントを測定した。生細胞のためのゲートを、トランスフェクトされていないCHO-K1細胞によって規定し、同一のFACS実験の全ての試料に適用した（図8）。
【０１２４】
生細胞のeGFP蛍光を、488nmの励起波長（Alexa Fluor 488チャンネル）およびおよそ516nmの放射波長で測定した。図6は、リビングゲートイベントの蛍光強度のヒストグラムを示す。
【０１２５】
蛍光データをFlowJo 7.6.5 ENソフトウェアによって分析した。リビングゲート内のeGFP発現の幾何平均、平均、およびメジアンを、FlowJoにおいて計算した。さらなる統計分析を、JMPソフトウェアバージョン10（SAS,Boblingen,Germany）で行った。
【０１２６】
実施例5
eGFP発現とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
実施例2に記載されるように、安定的にトランスフェクトされたCHO細胞の8（プラスミド16107）または10（プラスミド16109もしくは16111）のプールを生成し培養した。実施例4に記載されるように、eGFP強度を測定した。
【０１２７】
eGFP強度の幾何平均を相関研究のために使用し、図に示した（図7＆8）。対照プラスミド16111と比較したプラスミド16107および16109の有意差を決定するため、ダネット検定を使用した。
【０１２８】
eGFP強度の幾何平均のP値を、長期培養中の異なる時点について計算した（表3）。有意差の限界はp＜0.005に設定された。
【０１２９】
（表３）プラスミド16107、16109、または16111のいずれかをトランスフェクトされたCHOプールの幾何平均のp値
0006661549.tif 000008
【０１３０】
例えば、プラスミド16109と対照プラスミド16111との間の有意差は、トランスフェクションの6週間後〜8週間後（サンプリング日03-14〜03-25）に検出された（表3を参照すること）。SEAPアッセイの結果と合わせた、長期安定性アッセイの結果は、C→G点変異C-41が、プロモーター強度に影響を与えることなく、レポーター遺伝子発現の安定性に対して正の効果を及ぼすことを示している。
【０１３１】
プラスミド16107および16111を、第2の計算において対比較した。蛍光強度の幾何平均をプロットし、p値をダネット検定を使用して計算した（表4を参照すること）。
【０１３２】
（表４）CHO細胞株16107および16111の幾何平均のp値
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【０１３３】
プラスミド16107は、対照プラスミドと比較して増加した産生安定性を示す。即ち、C→G点変異C-179は、プロモーター強度に影響を与えることなく、レポーター遺伝子発現の安定性を増加させる。
【０１３４】
実施例6
異なるヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片の調節下での抗体産生の定量化
（a）HPLCによる抗体産生の定量化：
試料中に存在する抗体の量を定量化するため、クロマトグラフィ法を使用した。抗体のFc領域に結合するPorosAカラムを使用した。抗体は、カラムに結合し、その後、低pH条件によって溶出する。アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、320nmの参照波長で、280nmでの光学濃度（OD）を決定することによって、タンパク質濃度を確立した。
【０１３５】
（b）ELISAによる抗体産生の定量化：
ELISA（酵素連結免疫吸着アッセイ）技術は、抗体サンドイッチ原理に基づく。関心対象の分析物、例えば、IgGのFc部分に特異的なキャプチャー抗体を、固相を作出するため、マイクロタイタープレート（Maxisorp、社内、Roche）に結合させる。次いで、ブロッキングおよび洗浄の工程の後、試料、標準物（参照Abの段階希釈物）、および対照を、固相抗体と共にインキュベートし、抗体に分析物を捕獲させる。未結合の分析物を洗浄した後、コンジュゲートされた検出抗体（例えば、PODコンジュゲート）を添加する。この検出抗体は測定されている分子の異なるエピトープに結合し、サンドイッチを完成させる。BM Chemiluminescence ELISA Substrate POD（Roche,Penzberg,Germany）が、ペルオキシダーゼに基づく（POD、HRP）二次検出系の基質溶液を提供している。イムノアッセイにおけるシグナル生成の速度は、固相に結合したマーカー酵素の量に直接比例する。
【０１３６】
実施例7
抗体産生／力価とヒトCMV主要前初期プロモーター／エンハンサー断片のC→G点変異との相関
抗体（IgG-IL2融合タンパク質）濃度をELISAテクノロジーを使用することによって調査し、抗体力価（ug/ml）および1細胞当たり1日当たりの比産生量（qP）を計算した。変異体と対照との差および培養中の発現の変動を可視化するため、培養期の最初および最後の測定を示した。それによって、培養期の最初および最後の力価は、対照と比較した、全ての変異体における抗体産生の改善を示す（図10AおよびB）。
【０１３７】
クローン細胞株の力価をチューキーのHSD検定によって比較した（表5）。変異型プロモーターバリアントと非変異型プロモーターバリアントとの力価差のP値を計算した。培養期の間、力価を比較した。有意水準は0.05（5％）に設定された。
【０１３８】
（表５）
0006661549.tif 000010
【０１３９】
例えば、CGC変異体は、トランスフェクション後127日目を除き、培養期の間中、対照と有意に異なっていた。
【０１４０】
力価の比較は、全ての変異型細胞懸濁液が、対照より高い体積当たりの抗体産生量を有することを示した。
【０１４１】
力価差の主要なエフェクターが発現強度であるかそれとも細胞濃度であるかを解明する必要があった。
【０１４２】
この目的のため、変異体および対照の1細胞当たり1日当たりの抗体発現（qP）を、培養期の間中、比較した。培養期の最初（図11A）および最後（図11B）のqP値のパフォーマンスは力価値と比較可能であり、対照との差は比較的不明瞭であった。
【０１４３】
CGC変異体およびCGG変異体については、培養の最初に、より高い力価が入手された。培養の最後に、CCG変異体およびCGG変異体は、対照よりわずかに高いqPを入手した。CGC変異型細胞は、培養期の最後に、より高いqP値を有した。
【０１４４】
変異型細胞株および非変異型細胞株の比産生量を、チューキーのHSD検定によって比較した（表6）。それによって、CGC変異体の非変異型対照との差は次第に増加する。CCG変異についても、qP値の増加が入手された。
【０１４５】
（表６）非変異型対照と比較されたhCMV-MIEプロモーター変異体のqPのチューキーのHSD検定によって計算されたP値
0006661549.tif 000011
【０１４６】
有意水準は0.05（5％）に設定された。
【０１４７】
非変異型細胞株と比較された単一の変異型細胞株についてのqP値の差の時間依存的な増加を考慮すると、より高い安定性が提唱された。この仮説を試験するため、比産生量の相対変動を計算した。
【０１４８】
最初に、最初の2つ（PSB＝68日目＆83日目）および最後の3つ（EOS＝124日目、127日目、＆131日目）のqP値を平均化することによって、日および分裂に依存性の比産生量の変動を安定化した。第2工程で、qPの変動を、安定化された終点と安定化された始点との比（％）として定義した。
0006661549.tif 000012
平均qP EOS：最後の3つのqPの平均
平均qP PSB：最初の2つのqPの平均
【０１４９】
CGCプロモーター変異体およびCCGプロモーター変異体を含むモノクローナル細胞株の長期安定性は、非変異型対照と比較して、より高かった（図12）。G-41プロモーター変異体は、培養期の間中、安定していたが、G-179点変異は、次第に増加するIgG発現（平均％ΔqP）をもたらす。二重変異CGGは、最初に高い発現値を有したが、次第に減少する。
【０１５０】
（表７）
0006661549.tif 000013
【０１５１】
クローン細胞株の％ΔqPを、0.05（5％）の有意水準で比較した。
【０１５２】
hCMV-MIEプロモーターバリアントCGC（16135）およびCCG（16136）を含むモノクローナル細胞株は、非変異型対照（21504）より有意に安定している。
【図１】
0006661549.tif 000014
【図２】
0006661549.tif 000015
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
0006661549.tif 000023
【図１１】
0006661549.tif 000024
【図１２】
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【配列表】
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