(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリレオウイルスの単離シグマＣタンパク質であって、
（ａ）配列番号２と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号４と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｃ）配列番号６と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む、単離シグマＣタンパク質。
【請求項２】
鳥から得られた抗血清サンプルが、請求項１に記載の単離シグマＣタンパク質に特異的に結合することを判定するステップを含んでなる、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
継続出願データ
本出願は、参照により本明細書に援用される、２０１４年１月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／９３２，９９５号明細書の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
トリレオウイルスは、吸収不良症候群およびラントおよび成長阻害症候群（ＲＳＳ）をはじめとする、家禽のいくつかの疾患に関連するが、これらの臨床候群における一次病原体としてのそれらの役割は明らかでない。対照的に、トリレオウイルスとウイルス関節炎／腱滑膜炎臨床例との関連性は、罹患した鳥からレオウイルスが単離されていることから、かなり明確である。レオウイルス誘発性ウイルス関節炎／腱滑膜炎の防除は、生および／または不活性化ワクチンの組み合わせを用いたブロイラー種鶏のワクチン接種によって達成され得て、圃場負荷からの初期防御のために母子免疫が子孫に受け継がれる。ブロイラーでは、孵化当日の使用のために、および卵内使用のために、弱毒生ワクチンが利用できる。現行の市販ワクチン株（数例を挙げれば、Ｓ１１３３、１７３３、２４０８、および２１７７）は、レオウイルスに関連する疾患を防除するために、数十年間にわたり利用されている。しかし、これらの市販ワクチン株は、１９６０〜１９７０年代に単離されており、ウイルス関節炎／腱滑膜炎の確認例から得られた、目下広まっているレオウイルス単離物に対する防御を提供しない。したがって目下広まっているトリレオウイルスの単離および特性決定と、効果的なワクチンの開発に対する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、ニワトリのウイルス関節炎（ＶＡ）／腱滑膜炎の臨床例から単離された、遺伝的および血清学的に区別される、１型および２型トリレオウイルスを含む。
【０００４】
本発明は、単離１型トリレオウイルスを含み、１型トリレオウイルスは、配列番号２および／または配列番号４と少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する、シグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号２と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号４と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号２のアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号４のアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、弱毒化、不活性化、または死滅化されている。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている。
【０００５】
本発明は、単離１型トリレオウイルスを含み、１型トリレオウイルスは、配列番号１および／または配列番号３と、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号１と少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号３と少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号４と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、弱毒化、不活性化、または死滅化されている。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている。
【０００６】
本発明は、単離２型トリレオウイルスを含み、２型トリレオウイルスは、配列番号６と、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性がある、アミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、配列番号６と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、配列番号６のアミノ酸配列を有するシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、弱毒化、不活性化、または死滅化されている。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている。
【０００７】
本発明は、単離１型トリレオウイルスを含み、１型トリレオウイルスは、配列番号５と、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列を含んでなるＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、配列番号５と少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、配列番号５のヌクレオチド配列を有するＳ１遺伝子を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、弱毒化、不活性化、または死滅化されている。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている。
【０００８】
いくつかの態様では、本発明は、１型トリレオウイルスを含み、１型トリレオウイルスは、トリレオウイルス９４５９４株およびその誘導体および子孫を含む。いくつかの態様では、トリレオウイルス９４５９５株は、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって、死滅化、不活性化または弱毒化されている。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、１型トリレオウイルスを含み、１型トリレオウイルスは、トリレオウイルス９４８２６株およびその誘導体および子孫を含む。いくつかの態様では、９４８２６４株は、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって、死滅化、不活性化または弱毒化されている。
【００１０】
いくつかの態様では、本発明は、２型トリレオウイルスを含み、トリレオウイルスは、トリレオウイルス９６１３９株およびその誘導体および子孫を含む。いくつかの態様では、トリレオウイルス９６１３９株は、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって、死滅化、不活性化または弱毒化されている。
【００１１】
本発明に包含されるのは、本明細書に記載されるようなトリレオウイルスの１つまたは複数を含む組成物である。このような組成物は、アジュバントおよび／または家禽に伝染性の追加的な１つまたは複数の病原体からの抗原決定基をさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明に包含されるのは、本明細書に記載されるような本発明のトリレオウイルスの１つまたは複数を含むワクチンである。このようなワクチンは、アジュバントおよび／または家禽に伝染性の追加的な１つまたは複数の病原体からの抗原決定基をさらに含んでもよい。
【００１３】
本発明に包含されるのは、上にそして本明細書に記載されるトリレオウイルスの１つまたは複数を含む、家禽に抗体を生じさせる免疫学的組成物である。このような組成物は、アジュバントおよび／または家禽に伝染性の追加的な１つまたは複数の病原体からの抗原決定基をさらに含んでもよい。
【００１４】
本発明は、上にそして本明細書に記載されるトリレオウイルスの１つまたは複数を含む診断キットを含む。
【００１５】
本発明は、本（ｐｒｅｓｅｔ）発明の単離トリレオウイルス、組成物、またはワクチンを鳥に投与するステップを含む、家禽において抗レオウイルス抗体を生成する方法を含む。
【００１６】
本発明は、本発明の単離トリレオウイルス、組成物、またはワクチンを鳥に投与するステップを含む、トリレオウイルスによって誘発される病変または疾患から、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥を防御する方法を含む。
【００１７】
本発明は、本発明の単離トリレオウイルス、組成物、またはワクチンを鳥に投与するステップを含む、トリレオウイルスによって誘発される病変または疾患に対する、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥の易罹患性を低下させる方法を含む。
【００１８】
本発明は、本発明の単離トリレオウイルス、組成物、またはワクチンを鳥に投与するステップを含む、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥において、ウイルス関節炎および／または腱滑膜炎を低下させる方法を含む。
【００１９】
本発明は、本発明の単離トリレオウイルス、組成物、またはワクチンを鳥に投与するステップを含む、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥において、ウイルス関節炎および／または腱滑膜炎を予防する方法を含む。
【００２０】
本発明の方法のいくつかの態様では、鳥としては、ニワトリまたはシチメンチョウが挙げられる。
【００２１】
本発明の方法のいくつかの態様では、投与としては、孵化前または後の投与が挙げられる。
【００２２】
本発明の方法のいくつかの態様では、投与としては、卵内投与が挙げられる。いくつかの態様では、卵内投与としては、約１３日目、約１４日目、約１５日目、約１６日目、約１７日目、約１８日目、約１９日目、約２０日目、またはそれらの任意の範囲の投与が挙げられる。
【００２３】
本発明の方法のいくつかの態様では、投与としては、種鶏への投与が挙げられる。
【００２４】
本発明は、本明細書に記載されるようなトリレオウイルス１型または２型トリレオウイルスと結合し、トリレオウイルスＳ１１３３、１７３３、２４０８、および／または２１７７株とは結合しない抗体を含む。いくつかの態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００２５】
本発明は、鳥から得られた抗血清サンプルが、本発明のトリレオウイルス、またはその構成要素に特異的に結合することを判定するステップを含む、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法を含む。
【００２６】
本発明は、鳥から得られた抗血清サンプルが、本発明の１型トリレオウイルスまたは２型トリレオウイルスのシグマＣタンパク質に特異的に結合することを判定するステップを含む、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法を含む。
【００２７】
本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５、またはその断片を含んでなるポリヌクレオチドが、サンプルにハイブリダイゼーションすることを検出するステップを含む、サンプル中のトリレオウイルス感染性因子を検出する方法を含む。
【００２８】
本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５に由来する少なくとも１つのプライマーによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するステップを含む、サンプル中のトリレオウイルスを検出する方法を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４５９４（配列番号１）からのシグマＣタンパク質（塩基対１〜９３１）をコードする、Ｓ１ヌクレオチド配列である。
【図２】１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４５９４（配列番号２）からのシグマＣ（アミノ酸１〜３１０）をコードする、Ｓ１アミノ酸配列である。
【図３】１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４８２６（配列番号３）からのシグマＣタンパク質（塩基対１〜９３１）をコードする、Ｓ１ヌクレオチド配列である。
【図４】１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４８２６（配列番号４）からのシグマＣ（アミノ酸１〜３１０）をコードする、Ｓ１アミノ酸配列である。
【図５】１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９６１３９（配列番号５）からのシグマＣタンパク質（塩基対２〜９３１）をコードする、Ｓ１ヌクレオチド配列である。
【図６】２型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９６１３９（配列番号６）からのシグマＣタンパク質（アミノ酸１〜３１０）をコードする、Ｓ１アミノ酸配列である。
【図７】１０００回のブートストラップ反復試験による、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを使用したシグマＣアミノ酸配列の多重アラインメント、および得られた系統樹である。ブートストラップ信頼水準は、各系統樹ノード上の数字によって示される。
【図８】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用して作成された多重アラインメントに基づく、同一性百分率および多様性である。
【図９】Ｘ軸上に示された日における、ミリメートル単位での平均足蹠測定値である。７日齢に始まって、陰性対照との比較で、Ｓ１１３３および９４２８６攻撃投与群の鳥のサイズに顕著な差が観察された。標準偏差は、各群についてバーで示される。
【図１０】終了日（１４日齢）の平均体重である。標準偏差は、各群についてバーで示される。
【図１１】測定は１０日齢、および終了日の１４日齢において、飛節直下の指屈筋腱上で実施された。１４日目に、９４２８６攻撃投与群で明白な腫脹が観察された。標準偏差は、各群についてバーで示される。
【図１２】終了日に臨床徴候が記録された。６羽の鳥は、跛行があり飼料または水を摂取できなかったため、１０日目にＳ１１３３群から除外されたことに留意されたい。
【図１３】治験終了時（２３日齢）におけるグラム単位での平均体重である。標準偏差は、キャップドラインによって表わされる。
【図１４】１２、１４、１６、１９、２１、および２３日齢における、ミリメートル単位での平均足蹠測定値である。最初の測定は、圃場負荷直前の１２日齢において実施された。
【図１５】１９、２１、および２３日齢における、ミリメートル単位の平均飛節測定値である。飛節１の測定は飛節関節で実施され、飛節２の測定は飛節関節直下の指屈筋腱上で実施された。
【図１６】終了日（２３日目）目における、臨床徴候および病変である。
【図１７】孵化日の血清学的検査である。
【図１８】２型を攻撃投与された鳥における体重である。
【図１９】２型を攻撃投与された鳥における、体重の百分率としての足蹠腫脹の１４日目測定値である。
【図２０】２型を攻撃投与された鳥における、体重の百分率としての腱腫脹測定値である。
【図２１−１】１型および２型単離株のＧｅｎＢａｎｋ受入番号である。灰色で網掛けされた各値は、２型トリレオウイルスを表す。全てのその他の各値は、１型レオウイルスを表す。
【図２１−２】図２１−１の続き。
【図２１−３】図２１−２の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明によって、遺伝的および血清学的に区別される、トリレオウイルスの２つの型が、米国およびカナダの全域でウイルス関節炎（ＶＡ）／腱滑膜炎の臨床症例から単離された。トリレオウイルスシグマＣタンパク質の遺伝解析から、新規の１型および２型遺伝子型は、現行のトリレオウイルスワクチン株と無関係であることが明らかになった。ウイルスの血清学的評価は、現行の市販レオウイルスワクチンに対する既知の抗血清との交差中和が、わずかまたは皆無であることを明らかにした。加えて、病原性および子孫保護試験は、現行の市販ワクチンが、ワクチン接種種鶏からの子孫において、十分な防御を提供しないことを立証する。現行のレオウイルスワクチン株は１９６０年代から１９７０年代にかけて単離されており、ウイルス関節炎／腱滑膜炎の確認例から得られた目下広まっているレオウイルス単離物に対する防御は、提供しない。
【００３１】
トリレオウイルスは、哺乳類レオウイルスと共に、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）内でオルトレオウイルス属（Ｏｒｔｈｏｒｅｏｖｉｒｕｓ）を構成する。これらのウイルスは、およそ８０ｎｍの無エンベロープの正二十面体二重カプシド内に封入された、１０個のｄｓＲＮＡゲノム部分を含有する。ゲノム部分は、電気泳動移動度を基準にして、それぞれ、タンパク質λ１、λ２、λ３、μ１、μ２、μＮＳ、σ３、σ１、σ２、σＮＳをコードする、３つの大型（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、３つの中型（Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３）、および４つの小型（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４）断片に分割され得る。σ２タンパク質は、型特異的中和エピトープを有する外面カプシドタンパク質である。これはまた、二本鎖ＲＮＡを結合して、亜鉛金属タンパク質として同定された。σ１断片によってコードされる微量外側カプシドタンパク質であるシグマＣタンパク質は、トリレオウイルスの分子特性決定のための標的であり、細胞付着、ならびに型特異的中和抗体誘導に関与する。
【００３２】
トリレオウイルスビリオンは、カプシド、コア、および核タンパク質複合体を含む。ウイルスカプシドは、エンベロープに覆われていない。カプシド／ヌクレオカプシドは、等尺性で正二十面体対称性があり、約８０〜８２ｎｍの直径を有する。ビリオンのカプシド殻は、２層から構成される。全ての殻が通常存在し、または外側シェルは、調製中に失われることが多い。カプシドは、丸く見える。カプシド表面構造は、顕著な特徴がある規則的パターンを示す。カプソメア配置は、明確に視認できる。表面突起は、存在しない。内部カプシドコアは、約６０ｎｍの直径を有する。ウイルス調製品は、単一粒子構成要素を含有する。コアは球状であり、直径約４９ｎｍのｄｓＲＮＡゲノムからなる。繊維末端は、ほぼカプシド表面まで突出する。
【００３３】
トリレオウイルスワクチン株Ｓ１１３３では、ｓ１ｍＲＮＡ転写物は、１６４４ヌクレオチド長であり、位相を異にして部分的に重複する３つのシストロンを含有する。第１のシストロン（ＯＲＦ−１、ヌクレオチド２５−３１９）はｐ１０を発現し、第２のシストロン（ＯＲＦ−２、ヌクレオチド２９３−７３１）はｐ１７を発現し、第３のシストロン（ＯＲＦ−３、ヌクレオチド６３０−１６０８）は細胞付着タンパク質Ｃを発現する。
【００３４】
レオウイルスワクチン株Ｓ１１３３、１７３３、２４０８、および２１７７のシグマＣアミノ酸の配列解析は、これらのワクチン株間の＞９９％類似性を明らかにする。レオウイルスの圃場分離株の遺伝子型特性決定は、圃場分離株と、ワクチン株、ならびにパブリックドメインおよびＰＤＲＣデータベースで利用可能な全てのレオウイルス配列との比較を含む。圃場分離株について、圃場分離株またはワクチン株を問わない別の配列との最大類似性百分率として、遺伝子型類似性が報告される。
【００３５】
本発明によれば、トリレオウイルスの２つの遺伝的および血清学的に区別されるグループが、腱滑膜炎臨床症例から単離される。トリレオウイルスシグマＣタンパク質の遺伝解析は、現行のトリレオウイルスワクチン株とは無関係の新規遺伝子型を明らかにした。ウイルスの血清学的評価は、現行の市販レオウイルスワクチンに対する既知の抗血清との交差中和が、わずかまたは皆無であることを明らかにした。さらに、病原性および子孫保護試験が実施されて、現行の市販ワクチンが、ワクチン接種種鶏からの子孫に十分な防御を提供しないことが立証された。
【００３６】
本明細書に記載される圃場分離株の２つの遺伝的／血清学的グループは、１型２０１２ＶＡ変異株（本明細書では「１型トリレオウイルス」とも称される）、および２型２０１２ＶＡ変異株（本明細書では、「２型トリレオウイルス」とも称される）と称される。１型２０１２ＶＡ変異株および／または２型２０１２ＶＡ変異株からのレオウイルスは、弱毒生および死滅化／不活性化ワクチンのいずれで使用されてもよい。いくつかの態様では、このようなワクチンは、自家ワクチンであってもよい。
【００３７】
本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号２と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列がある、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号２のアミノ酸配列を有する、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１型トリレオウイルスは、配列番号２と比較して少なくとも１つの置換修飾がある、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００３８】
本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号４と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列がある、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号４のアミノ酸配列を有する、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１型トリレオウイルスは、配列番号４と比較して少なくとも１つの置換修飾がある、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００３９】
本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号１と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号１を有するヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１型トリレオウイルスは、配列番号１と比較して少なくとも１つの置換修飾があるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００４０】
本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号３と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号３を有するヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１型トリレオウイルスは、配列番号３と比較して少なくとも１つの置換修飾があるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、１型トリレオウイルスは、表２１に示されるものの１つ、またはその子孫または誘導体である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、１型トリレオウイルスは、トリレオウイルスＣＫ／９４５４９４／Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２（本明細書では「１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４５９４」または「９４５９４」とも称される）、またはその子孫または誘導体である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、１型トリレオウイルスは、トリレオウイルスＣＫ／９４８２６／Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２（本明細書では「１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４８２６」または「９４８２６」とも称される）、またはその子孫または誘導体である。
【００４４】
本発明の２型トリレオウイルスは、配列番号６と、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性がある、アミノ酸配列があるＣシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の２型トリレオウイルスは、配列番号６のアミノ酸配列を有する、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、上に記載されるような２型トリレオウイルスは、配列番号６と比較して少なくとも１つの置換修飾がある、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００４５】
本発明の２型トリレオウイルスは、配列番号５と、少なくとも少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性がある、ヌクレオチド配列によってコードされるＣシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの態様では、本発明の１型トリレオウイルスは、配列番号５を有するヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような１型トリレオウイルスは、配列番号５と比較して少なくとも１つの置換修飾があるヌクレオチド配列によってコードされる、Ｃシグマタンパク質を有する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、２型トリレオウイルスは、表２１に示されるものの１つ、またはその子孫または誘導体である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、２型トリレオウイルスは、トリレオウイルスＣＫ／９６１３９／Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２（本明細書では「２型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９６１３９」または「９６１３９」とも称される）、またはその子孫または誘導体である。
【００４８】
本明細書に記載されるようなトリレオウイルスは、またはこのようなウイルスに感染した細胞系は、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ（登録商標）），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託されてもよい。このような寄託は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」に従ってもよい。
【００４９】
本発明によるトリレオウイルスは、本明細書に含まれる実施例セクションのいずれかに記載されるものをはじめとするが、これに限定されるものではない従来法によって調製され得る。手短に述べると、トリレオウイルスの複製を支持できる基質に、本発明のトリレオウイルスが接種され、ウイルスが所望の伝染性力価、または抗原質量含有率に複製されるまで増殖させる。次に、レオウイルスを含有する材料が収集される。適切な基質としては、例えば、ニワトリ胚肝細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、またはニワトリ腎臓細胞などの初代（鳥類）細胞培養物；例えば、ＶＥＲＯ細胞系またはＢＧＭ−７０細胞系などの哺乳類細胞系；または例えば、ＱＴ−３５、ＱＭ−７またはＬＭＨなどの鳥類細胞系が挙げられる。いくつかの用途では、有胚の（ｅｍｂｒｙｎａｔｅｄ）卵が使用されてもよい。
【００５０】
本発明は、鳥から得られた抗血清サンプルが、本発明のウイルス、細胞系、細胞ペレット、上清、および／またはポリペプチドに特異的に結合するかどうかを判定するステップを含む、鳥において、１型および／または２型トリレオウイルスへの曝露を検出する方法を含む。例えば、本発明は、鳥から得られた抗血清サンプルが、本発明のトリレオウイルスに特異的に結合することを判定するステップを含む、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法における、本発明の１つまたは複数のトリレオウイルスの使用を含む。このようなトリレオウイルスとしては、トリレオウイルス９４５９４、９４８２６、または９６１３９株をはじめとするが、これに限定されるものではない、図２１に収載されているトリレオウイルス株のいずれかをはじめとするがこれに限定されるものではない、本明細書に記載されるもののいずれが挙げられる。このようなトリレオウイルスは、不活性化、死滅化、および／または凍結乾燥されていてもよい。本発明はまた、本発明のトリレオウイルスの１つまたは複数を含む診断キットも含む。このようなキットは、例えば、陽性対照ウイルス、陰性対照ウイルス、二次抗体、および／または検出可能マーカーなどの追加的成分を含んでもよい。
【００５１】
本発明は、配列番号２、配列番号４、および／または配列番号６と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を有する、単離シグマＣポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、および／または配列番号６のアミノ酸配列を有する、単離シグマＣポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、および／または配列番号６と比較して、少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）置換修飾がある、アミノ酸配列を有する単離シグマＣポリペプチドを含む。
【００５２】
本発明は、配列番号１、配列番号３、および／または配列番号５と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有する、単離シグマＣポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、および／または配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を有する、単離シグマＣポリペプチドを含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、および／または配列番号５と比較して、少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）置換修飾があるヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列を有する、単離シグマＣポリペプチドを含む。
【００５３】
本発明は、本明細書に記載されるようなポリペプチド、それらのトランケーションおよび断片を含む。トランケーションとしては、その中で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸がアミノ酸配列のアミノ末端から除去された、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のアミノ酸がアミノ酸配列のカルボキシ末端から除去された、アミノ酸配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５４】
断片としては、例えば、本明細書に記載される配列の約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、約５００、約５５０、約６００、約６５０、および約７００の連続アミノ酸残基を有する断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。断片としてはまた、例えば、上記断片サイズの任意の組み合わせのサイズ範囲の断片も挙げられる。
【００５５】
断片としては、例えば、本明細書に記載される配列の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、および少なくとも７００の連続アミノ酸残基を有する断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの断片から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上のアミノ酸変化があるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなアミノ酸変化としては、保存的アミノ酸変化が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
本発明は、鳥におけるトリレオウイルスへの曝露を検出する方法における、本発明のポリペプチドの１つまたは複数の使用を含み、方法は，鳥から得られた抗血清サンプルが、本発明のポリペプチドに特異的に結合することを判定するステップを含む。このようなポリペプチドとしては、配列番号２、配列番号４、および配列番号６、およびそれらの誘導体および断片をはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるもののいずれかが挙げられる。本発明はまた、本発明のポリペプチドの１つまたは複数を含む診断キットも含む。このようなキットは、例えば、陽性対照ポリペプチド、陰性対照ポリペプチド、二次抗体、検出可能マーカーなどの追加的成分を含んでもよい。
【００５８】
本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５と、少なくとも約５０％の配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５、トランケーション、またはその断片を有する、単離ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５と比較して、少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）置換修飾がある、本明細書に記載されるような単離ポリヌクレオチド配列を含む。
【００５９】
本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６をコードするヌクレオチド配列と、少なくとも約５０％配列同一性、少なくとも約５５％の配列同一性、少なくとも約６０％の配列同一性、少なくとも約６５％の配列同一性、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する単離ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６を有する、単離ポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本発明は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６と比較して、少なくとも１つの（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）置換修飾があるアミノ酸配列をコードする、本明細書に記載されるような単離ポリヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
本発明は、様々な条件下で、本明細書に記載されるヌクレオチド配列およびそれらの断片とハイブリダイズする、ポリヌクレオチド配列を含む。ストリンジェンシー条件としては、中程度および高ストリンジェンシーが挙げられるが、これに限定されるものではない。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、６×ＳＳＣ、５×デンハート、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１００μｇ／ｍｌ断片化変性サケ精子ＤＮＡ、６５℃で一晩のハイブリダイズ、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で約１０分間の少なくとも１回の洗浄と、それに続く６５℃で約１５分間の少なくとも１回の洗浄と、それに続く０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、室温で少なくとも３〜５分間の少なくとも１回の洗浄であってもよい。
【００６１】
本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０以上のヌクレオチド置換を有する、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明は、その中でコドン使用頻度が、所与の宿主細胞内における発現の最適化のために適応されている、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列もまた含む。例えば、コドン使用頻度は、バキュロウイルス、酵母、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、家禽、またはヒト細胞をはじめとするが、これに限定されるものではない、宿主細胞内における発現のために最適化されるように適応されてもよい。このような適応は、当該技術分野で公知の技術（ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｋｎｏｗ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔ）によって実施され得る。
【００６２】
本発明は、本明細書に記載されるプライマーのいずれか、およびＰＣＲ反応で本明細書に記載される配列またはその断片を作成するのに使用され得るプライマーをはじめとするが、これに限定されるものではない、プライマーを含む。いくつかの実施形態では、プライマーは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、または少なくとも４０のヌクレオチド残基を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、５５以下、または６０以下のヌクレオチド残基を含んでもよい。このようなヌクレオチド残基は、連続的配列またはその補体であってもよい。本明細書に記載されるプライマーの少なくとも１つ、それらの補体、またはこのような配列に由来するプライマーを含む、プライマー対もまた含まれる。このようなプライマーによって産生された増幅産物もまた、本発明に包含される。
【００６３】
本発明は、本発明のポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。いくつかの態様では、ベクターは、ワクチンベクターである。本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる、単離ポリペプチドを含む。
【００６４】
本発明は、サンプル中のトリレオウイルス感染性因子を検出する方法における、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチド配列の使用を含む。このような方法としては、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のサンプルへのハイブリダイゼーションを検出するステップを含む方法、および本発明のポリヌクレオチド配列に由来する少なくとも１つのプライマーによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を作成するステップを含む方法が挙げられる。このようなポリヌクレオチド配列としては、配列番号１、配列番号３、および配列番号５をはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるもののいずれかが挙げられる。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド配列の１つまたは複数を含む、診断キットも含む。本発明は、本発明のウイルス、細胞系、細胞ペレット、上清、ポリヌクレオチド配列、ベクター、および／またはポリペプチドの１つまたは複数を含む、診断キットを含む。
【００６５】
本明細書に記載されるようなトリレオウイルスは、不活性化または死滅化ウイルスであってもよい。ウイルス不活性化の目的は、ウイルスが複製するのを防止することであり、一般に、これは化学的または物理的手段によって達成され得る。化学的不活性化は、例えば、酵素、ホルムアルデヒド、ｓ−プロピオラクトン、エチレンイミンまたはその誘導体で、ウイルスを処理することでもたらされ得る。物理的不活性化は、例えば、ウイルスをＵＶ光などのエネルギー放射の対象とすることで実施され得る。
【００６６】
本明細書に記載されるようなトリレオウイルスは、低下した病原性を示して、ワクチン接種の目的のために弱毒生ウイルスの役割を果たしてもよい。本発明の実施において有用なトリレオウイルスの弱毒化は、この目的のために当該技術分野で周知の方法によって達成され得る。例えば、本発明による単離トリレオウイルスは、有胚の（ｅｍｂｒｙｎａｔｅｄ）鶏卵、生きた動物または適切な細胞系（ｃｅｌｌｓ  ｌｉｎｅｓ）内で継代することで弱毒化させ得る。このような細胞系としては、例えば、ニワトリ胚肝細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、またはニワトリ腎臓細胞などの初代（鳥類）細胞培養物；例えば、ＶＥＲＯ細胞系またはＢＧＭ−７０細胞系などの哺乳類細胞系；または例えば、ＱＴ−３５、ＱＭ−７またはＬＭＨなどの鳥類細胞系が挙げられる。このような戻し継代ウイルスは、例えば、約１０〜約１００継代によって得られてもよい。このような戻し継代ウイルスは、例えば、１回または複数回の戻し継代、２回以上の戻し継代、３回以上の戻し継代、４回以上の戻し継代、５回以上の戻し継代、１０回以上の戻し継代、１５回以上の戻し継代、２０回以上の戻し継代、２５回以上の戻し継代、５０回以上の継代、７５回以上の継代、または１００回以上の継代によって得られてもよい。このような戻し継代ウイルスは、例えば、約１回の戻し継代、約２回の戻し継代、約３回の戻し継代、約４回の戻し継代、約５回の戻し継代、約１０回の戻し継代、約１５回の戻し継代、約２０回の戻し継代、約２５回の戻し継代、約５０回の継代、約７５回、約１００回の継代、またはそれらの任意の範囲によって得られてもよい。
【００６７】
例えば、本発明は、溶菌斑精製に続いて、初代ニワトリ胚線維芽細胞内の継代によって弱毒化された、トリレオウイルスを含む。この過程は、ウイルス弱毒化するために、例えば、約１０〜約１００回繰り返されてもよい。病原性試験が、例えば、２５継代、５０継代、７５継代、１００継代、および追加的な時点などの様々な時点で実施されてもよい。
【００６８】
本発明は、本発明の単離ウイルス、細胞系、細胞ペレット、上清、ポリヌクレオチド配列、ベクター、および／またはポリペプチドを投与するステップを含む、家禽において、抗１型および／または２型トリレオウイルス免疫応答を生じさせる方法を含む。いくつかの態様では、免疫としては、体液性および／または細胞性免疫が挙げられる。いくつかの態様では、免疫としては、粘膜性免疫が挙げられる。
【００６９】
本発明は、本発明の単離ウイルス、細胞系、細胞ペレット、上清、ポリヌクレオチド配列、ベクター、および／またはポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、家禽においてトリレオウイルス感染症を予防する方法を含む。
【００７０】
本発明の方法のいくつかの態様では、投与としては、注射、噴霧、経口投与、または呼吸器投与が挙げられる。本発明の方法のいくつかの態様では、投与は、粘膜性免疫を誘導する。本発明の方法のいくつかの態様では、投与としては、卵内投与が挙げられる。いくつかの態様では、卵内投与としては、約１３日目、約１４日目、約１５日目、約１６日目、約１７日目、約１８日目、約１９日目、約２０日目、またはそれらの任意の範囲の投与が挙げられる。
【００７１】
本発明は、本明細書に記載される単離ウイルス、ポリヌクレオチド配列、ベクター、および／またはポリペプチドの１つまたは複数を含む、免疫原性組成物およびワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスは、生きている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、弱毒化または不活性化されている。いくつかの実施形態では、ウイルスは、不活性化または死滅化されている。いくつかの実施形態では、ウイルス、組成物、またはワクチンは、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、ウイルス、組成物、またはワクチンは、凍結されている。
【００７２】
このような組成物およびワクチンは、鳥を免疫化する活性成分として投与されて、１型および／または２型トリレオウイルスに対する免疫応答が引き起こされ、および／またはこのようなトリレオウイルスに対する免疫が誘導されてもよい。免疫は、ワクチン接種を受けていない群との比較で、ワクチン接種後に、鳥集団におけるより高レベルの防御の誘導を含んでもよい。免疫応答は、防御免疫を与えてもよく、または与えなくてもよい。免疫応答は、例えば、抗原への曝露に応答したリンパ球産生を伴う細胞媒介性免疫応答、および／または抗原曝露に応答した血漿リンパ球（Ｂ細胞）産生と引き続く抗体産生を伴う体液性免疫応答の１つまたは複数を含んでもよい。免疫化は、トリレオウイルス関連ウイルス関節炎（ＶＡ）／腱滑膜炎症状の１つまたは複数の低下、阻害、または予防をもたらしてもよい。このような症状としては、体重抑制、産卵数低下、斃死率、巨視的病変（腱腫脹、腱滑膜炎（ｔｅｎｏｓｙｎｏｖｉｔｉｔｓ）、腱断裂、および心膜水腫をはじめとするが、これに限定されるものではない）、および組織学的変化（リンパ球性腱滑膜炎、リンパ球性心外膜炎、およびリンパ球性心筋炎をはじめとするが、これに限定されるものではない）の１つまたは複数が挙げられる。
【００７３】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、アジュバント活性がある１つまたは複数の化合物もまた含んでもよい。この目的のために適切な化合物または組成物としては、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、植物油、動物油、例えば、Ｂａｙｏｌ  Ｆ（商標）またはＭａｒｃｏｌ  ５２（登録商標）などの鉱物油ベースの水中油型または油中水型エマルション、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、またはビタミンＥ酢酸エステルなどの植物油、およびサポニンが挙げられる。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、１つまたは複数の適切な薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含んでもよい。本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、１つまたは複数の安定剤もまた含有してもよい。ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストリン、またはグルコースなどの炭水化物；アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質；およびアルカリ性金属リン酸塩などの緩衝液をはじめとする任意の適切な安定剤が使用され得る。安定剤は、凍結乾燥によって乾燥ワクチン製剤が調製される場合に、特に有利である。
【００７５】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、家禽に対して伝染性のその他の病原体に由来する、１つまたは複数の免疫原をさらに含んでもよい。このような免疫原は、例えば、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、産卵低下症候群（ＥＤＳ）ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴＶ）、ポックスウイルス、レオウイルス、ニワトリパルボウイルス、および鳥類腎炎ウイルス（ＡＮＶ−１およびＡＮＶ−２をはじめとするが、これに限定されるものではない）から誘導されてもよい。
【００７６】
本発明の免疫原性組成物またはワクチンは、経鼻、点眼、注射、飲料水中、飼料中、曝露、卵内、母系性、呼吸吸入などをはじめとする、家禽接種の任意の適切な公知の方法によって投与されてもよい。免疫原性組成物またはワクチンは、ワクチンを飲料水に入れまたは環境噴霧するなどの集団投与技術によって投与されてもよい。注射投与される場合、免疫原性組成物またはワクチンは、非経口的に投与されてもよい。非経口投与としては、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、または腹腔内注射による投与が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、生ワクチンは、１羽あたり１０２抗体価単位以上の用量で投与されてもよく（抗体価単位は、連邦規則集の第９編１１３．３３２条で定義される）、不活性化ワクチンは、１羽あたり１０４〜１０１０ＴＣＩＤ５０抗原当量を含有してもよい（ＴＣＩＤは組織培養感染量の略語である）。
【００７８】
本発明の組成物およびワクチンは、実質的に純粋であってもよい。本明細書の用法では、「実質的に純粋」は、自然界に普通に見られるいかなる類似巨大分子またはその他の生物学的実体も、本質的に含まない素材を意味する。
【００７９】
本発明の組成物およびワクチンは、家禽、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥、および外来鳥類をはじめとするが、これに限定されるものではない、トリレオウイルスによる感染症に罹患し易い多様な鳥類のいずれかの鳥に投与されてもよい。キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ライチョウ、ウズラ、およびキジが挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、家禽には、それらの卵を採取し、または肉および／または羽毛のために屠殺する目的で飼育される、家畜化された鳥が含まれる。これらは、最も典型的には、上目キジカモ類（Ｇａｌｌｏａｎｓｅｒａｅ）（鳥類）、特にキジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、およびライチョウをはじめとする）、および一般に「水鳥」として知られているカモ科（Ａｎａｔｉｄａｅ）（カモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ））（例えば、カモ、ガチョウ、およびハクチョウをはじめとする）の構成員である。家禽にはまた、ハト（ｐｉｇｅｏｎｓ）またはハト（ｄｏｖｅｓ）などのそれらの肉のために屠殺されるその他の鳥、またはキジなどの狩猟対象と見なされる鳥が含まれてもよい。ニワトリとしては、雌鶏、雄鶏、ブロイラー、ロースター、産卵鶏、種鶏、種鶏の子孫、および産卵鶏が挙げられるが、これに限定されるものではない。本明細書の用法では、「罹患し易い」という用語は、罹患し難い個体または集団と比較して、例えば、活力低下または成長障害などの言及される微生物に対する有害な反応の可能性または現実性、および／またはトリウイルス感染症の指標となる１つまたは複数の病的状態を意味する。
【００８０】
本発明のワクチンは、孵化前または孵化後に家禽に投与されてもよい。家禽は、多様な齢数でワクチンを投与されてもよい。例えば、ブロイラーは、卵内で、１日齢で、または２〜３週齢で、ワクチン接種されてもよい。産卵用系統または繁殖用系統は、例えば、約６〜１２週齢でワクチン接種され、約１６〜２０週齢で追加免疫されてもよい。このような産卵用系統または繁殖用系統は、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２週齢でワクチン接種されてもよい。このような産卵用系統または繁殖用系統は、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０週齢で追加免疫されてもよい。このような産卵用系統または繁殖用系統の子孫は、本明細書に記載されるようなポリペプチドに対する抗体力価を示してもよく、それは、子孫において、トリレオウイルス感染症の症状を予防または軽減してもよい。卵内でワクチン接種は、例えば、約１３日目、約１４日目、約１５日目、約１６日目、約１７日目、約１８日目、約１９日目、約２０日目、またはそれらの任意の範囲で行われてもよい。
【００８１】
ニワトリは、任意の適切な齢数でワクチン接種されてもよく、通常は、最初のワクチン接種前に約１〜３日齢である。ニワトリは、１回のみワクチン接種されてもよい。あるいは２回のワクチン投与が使用される場合、１回目は、例えば、ニワトリが３日齢から１週齢の時点で投与され、引き続いてさらに１〜１０週間後に投与される。
【００８２】
組成物の複数回投与は、ニワトリの生涯を通じて投与され得る。母子免疫がブロイラー子孫に防御を提供する主要な供給源であることから、種鶏ニワトリが典型的にワクチン接種されるが、所望であれば、ブロイラー鶏もワクチン接種され得る。
【００８３】
１型トリレオウイルスおよび／または２型トリレオウイルスに結合する抗血清および抗体もまた、本発明に包含される。いくつかの態様では、抗血清または抗体は、例えば、トリレオウイルスＳ１１３３、１７３３、２４０８、および／または２１７７株などのトリレオウイルスの現行の市販ワクチン株に、しない（ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｔｏ）。本発明の実施において有用な抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、またはそれらの断片が挙げられ、また二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）２、またはｓｃＦｖ断片などの抗体断片、一本鎖抗体、またはこれらのいずれかの化学修飾誘導体もまた含まれる。このような抗体は、診断法および診断キットで使用されてもよい。いくつかの態様では、抗トリレオウイルス抗体は、固体基質に付着してもよい。
【００８４】
本発明は、鳥から得られるサンプル中の１型または２型トリレオウイルスの量を検出および／または測定する方法を提供する。いくつかの態様では、１型トリレオウイルスは、配列番号２または配列番号４、またはその断片または誘導体を有するシグマＣタンパク質をはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列があるシグマＣタンパク質を含む。いくつかの態様では、２型トリレオウイルスは、配列番号６またはその断片または誘導体を有するシグマＣタンパク質をはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列があるシグマＣタンパク質を含む。このような方法は、本明細書に記載されるようなトリレオウイルスおよび／または本明細書に記載されるようなシグマＣタンパクと、質選択的に結合にする抗体に、サンプルを接触させて、サンプル中のウイルスまたはタンパク質への抗体結合量を測定するステップを含んでもよい。サンプルは、組織、骨、血液、尿または糞便などの任意の生物学的材料であってもよい。本発明のこの態様の方法は、例えば、家禽が、本発明のトリレオウイルスに感染しているかどうかを判定するのに有用である。感染動物は、他の動物へのレオウイルスの拡散を防止するために殺処分され得る。
【００８５】
本明細書の用法では、「単離された」は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合は天然環境）から取り出された物質を指し、したがって「人の手によって」その天然状態から改変されている。
【００８６】
「および／または」という用語は、１つまたは全ての列挙された要素、または任意の２つ以上の列挙された要素の組み合わせを意味する。
【００８７】
「好ましい」および「好ましくは」という語は、特定状況下で、特定の利点をもたらしてもよい本発明の実施形態を指す。しかし、同一またはその他の状況において、その他の実施形態もまた、好適であってもよい。さらに、１つまたは複数の好ましい実施形態の列挙は、その他の実施形態が有用でないことを暗示せず、本発明の範囲からその他の実施形態を排除することは意図されない。
【００８８】
「含んでなる」という用語およびそのバリエーションは、これらの用語が説明および特許請求の範囲に出現した場合、限定的意味を有しない。
【００８９】
特に断りのない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「少なくとも１つ」は、同義的に使用されて、１つまたは２つ以上を意味する。
【００９０】
また本明細書では、終点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、などを含む）。
【００９１】
個別のステップを含む本明細書で開示される任意の方法では、ステップは、任意の実行可能な順序で実施されてもよい。そして、必要に応じて、２つ以上のステップの任意の組み合わせが同時に実施されてもよい。
【００９２】
特に断りのない限り、明細書および特許請求の範囲で使用される、成分量、分子量などを示す全ての数は、いかなる場合でも「約」という用語によって修飾されるものと理解される。したがって、特にそうでないという断りのない限り、明細書および特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる、所望の性質次第で変動してもよい近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の制限の試みとしてではなく、各数値パラメータは、少なくとも報告された有効桁数の観点から、通常の丸め技術を適用して解釈されるべきである。
【００９３】
本発明の広範囲で示される数値的範囲及びパラメータは、近似値であるが、具体例に記載の数値は可能な限り正確に報告される。しかし、全ての数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的にもたらされる範囲を本質的に含有する。
【００９４】
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、そのように明記されない限り、見出しに続く本文の意味を制限するために利用されるべきではない。
【００９５】
出願書全体を通じていくつかの箇所で、実施例の一覧を通じて指標が提供され、その実施例は様々な組み合わせで使用され得る。それぞれの場合において、列挙された一覧は、典型的なグループとしての役割のみを果たし、排他的一覧として解釈されるべきではない。特定の実施例、物質、量、および手順は、本明細書に記載される発明の範囲と精神に従って広義に解釈されるものと理解される。
【００９６】
本発明は以下の実施形態を包含する：
１．（ａ）配列番号２および／または配列番号４と、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなるシグマＣタンパク質；
（ｂ）配列番号１および／または配列番号３と、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含んでなるＳ１遺伝子；
（ｃ）配列番号６と、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなるシグマＣタンパク質；または
（ｄ）配列番号５と、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９６％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性があるヌクレオチド配列を含んでなるＳ１遺伝子
を含んでなる、単離トリレオウイルス。
２．実施形態１（ａ）または１（ｂ）に記載の単離トリレオウイルスを含んでなる、１型トリレオウイルス。
３．前記トリレオウイルスが、配列番号２と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなるシグマＣタンパク質を含んでなる、実施形態２に記載の１型トリレオウイルス。
３．前記トリレオウイルスが、配列番号４と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなるシグマＣタンパク質を含んでなる、実施形態２に記載の１型トリレオウイルス。
４．実施形態１（ｃ）または１（ｄ）に記載の単離トリレオウイルスを含んでなる、２型トリレオウイルス。
５．前記トリレオウイルスが、配列番号６と少なくとも約９９％の配列同一性があるアミノ酸配列を含んでなるシグマＣタンパク質を含んでなる、実施形態４に記載の２型トリレオウイルス。
６．前記トリレオウイルスが、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている、実施形態１〜５のいずれかに記載の１型または２型トリレオウイルス。
７．前記１型トリレオウイルスが、トリレオウイルス９４５９４株およびその誘導体および子孫を含んでなる、実施形態２に記載の１型トリレオウイルス。
８．前記トリレオウイルス９４５９４株が、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている、実施形態７に記載のトリレオウイルス９４５９４株。
９．前記１型トリレオウイルスが、トリレオウイルス９４８２６株およびその誘導体および子孫を含んでなる、実施形態２に記載の１型トリレオウイルス。
１０．前記トリレオウイルス９４８２６４株が、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている、実施形態９に記載のトリレオウイルス９４８２６４株。
１１．前記トリレオウイルスが、トリレオウイルス９６１３９株およびその誘導体および子孫を含んでなる、実施形態４に記載の２型トリレオウイルス。
１２．前記トリレオウイルスが、卵または宿主細胞系における少なくとも２５継代によって弱毒化されている、実施形態１１に記載のトリレオウイルス９６１３９株。
１３．前記トリレオウイルスが、弱毒化、不活性化、または死滅化されている、実施形態１〜１２のいずれかに記載のトリレオウイルス。
１４．前記トリレオウイルスが、不活性化または死滅化トリレオウイルス９４５９４株を含んでなる、実施形態１３に記載のトリレオウイルス。
１５．前記トリレオウイルスが、不活性化または死滅化トリレオウイルス９４８２６株を含んでなる、実施形態１３に記載のトリレオウイルス。
１６．前記トリレオウイルスが、不活性化または死滅化トリレオウイルス９６１３９株を含んでなる、実施形態１３に記載のトリレオウイルス。
１７．実施形態１〜１６のいずれかに記載のトリレオウイルスを含んでなる、組成物。
１８．実施形態１〜１６のいずれかに記載のトリレオウイルスを含んでなる、ワクチン。
１９．実施形態１〜１６のいずれかに記載のトリレオウイルスを含んでなる、家禽に抗体を生じさせるための免疫学的組成物。
２０．アジュバントをさらに含んでなる、実施形態１７〜１９のいずれかに記載の組成物またはワクチン。
２１．家禽に伝染性の１つまたは複数の追加的な病原体からの抗原決定基をさらに含んでなる、実施形態１７〜２０のいずれかに記載の組成物またはワクチン。
２２．実施形態１〜１６のいずれかに記載のウイルスを含んでなる、診断キット。
２３．実施形態１〜１６のいずれかに記載の単離トリレオウイルスまたは実施形態１７〜２１のいずれかに記載の組成物またはワクチンを鳥に投与するステップを含んでなる、家禽において抗レオウイルス抗体を生成する方法。
２４．実施形態１〜１６のいずれかに記載の単離トリレオウイルスまたは実施形態１７〜２１のいずれかに記載の組成物またはワクチンを鳥に投与するステップを含んでなる、トリレオウイルスによって誘発される病変または疾患に対する、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥を防御する方法。
２５．実施形態１〜１６のいずれかに記載の単離トリレオウイルスまたは実施形態１７〜２１のいずれかに記載の組成物またはワクチンを鳥に投与するステップを含んでなる、トリレオウイルスによって誘発される病変または疾患に対する、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥の易罹患性を低下させる方法。
２６．実施形態１〜１６のいずれかに記載の単離トリレオウイルスまたは実施形態１７〜２１のいずれかに記載の組成物またはワクチンを鳥に投与するステップを含んでなる、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥において、ウイルス関節炎および／または腱滑膜炎を低下させる方法。
２７．実施形態１〜１６のいずれかに記載の単離トリレオウイルスまたは実施形態１７〜２１のいずれかに記載の組成物またはワクチンを鳥に投与するステップを含んでなる、キジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）の鳥において、ウイルス関節炎および／または腱滑膜炎を予防する方法。
２８．前記鳥が、ニワトリまたはシチメンチョウである、実施形態２３〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．投与が、孵化前または後の投与を含んでなる、実施形態２３〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．投与が、卵内投与を含んでなる、実施形態２３〜２８のいずれかに記載の方法。
３１．卵内投与が、約１３日目、約１４日目、約１５日目、約１６日目、約１７日目、約１８日目、約１９日目、約２０日目、またはそれらの任意の範囲における投与を含んでなる、実施形態２９に記載の方法。
３２．投与が、種鶏への投与を含んでなる、実施形態２３〜２８のいずれかに記載の方法。
３３．実施形態１〜１６のいずれかに記載のトリレオウイルスと結合し、トリレオウイルスＳ１１３３、１７３３、２４０８、および／または２１７７株とは結合しない、抗体。
３４．前記抗体がモノクローナル抗体である、実施形態３３に記載の抗体。
３５．鳥から得られた抗血清サンプルが、実施形態１〜１６のいずれかに記載のトリレオウイルスまたはその構成要素に特異的に結合することを判定するステップを含んでなる、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法。
３６．実施形態１に記載のトリレオウイルスの単離シグマＣタンパク質、またはその断片。
３７．鳥から得られた抗血清サンプルが、実施形態３６に記載の単離シグマＣタンパク質またはその断片に特異的に結合することを判定するステップを含んでなる、鳥においてトリレオウイルスへの曝露を検出する方法。
３８．配列番号１、配列番号３、または配列番号５、またはその断片を含んでなるポリヌクレオチドが、サンプルにハイブリダイゼーションすることを検出するステップを含んでなる、サンプル中のトリレオウイルス感染性因子を検出する方法。
３９．配列番号１、配列番号３、または配列番号５に由来する少なくとも１つのプライマーによって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物を生成するステップを含んでなる、サンプル中のトリレオウイルスを検出する方法。
本発明を以下の実施例によって例示する。特定の実施例、物質、量、および手順は、本明細書に記載される発明の範囲と精神に従って広義に解釈されるものと理解される。
【実施例】
【００９７】
実施例１
変異レオウイルス株の単離および特性決定
本実施例は、家禽疾病診断研究センター（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）に提出された、２．５〜８週齢の範囲のブロイラーにおける、腱滑膜炎および／または跛行の多数の臨床症例の腱からの変異レオウイルス株の単離を説明する。トリレオウイルスは、シグマＣタンパク質の配列決定、および血清学的アッセイによって、特性決定された。
【００９８】
材料と方法
ウイルス単離。レオウイルス圃場分離株Ｃｋ／９４５９４  Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２、Ｃｋ／９４８２６  Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２ａｎｄＣｋ／９６１３９  Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２が、ジョージア大学家禽疾病診断研究センターにおいて、ウイルス関節炎および腱滑膜炎の臨床徴候を示す商業的ブロイラーの腱から単離された。臨床的に罹患したニワトリからの腱および滑液吸引液は、抗生物質を添加したウイルス輸送媒体中で個別に均質化された。均質化組織は、０．４５ミクロンシリンジフィルターを通して濾過された。濾液は、レオウイルスＳ１１３３抗血清（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，ＳＰＡＦＡＳ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）と共に３７℃で１時間インキュベートされた。中和に続いて、０．２ｍｌのホモジネートが、合計４回の継代で、初代ニワトリ胚肝細胞に接種された。合胞体形成として観察される７０〜８０％の細胞変性効果が生じたら、細胞培養物は冷凍され、−８０℃で保存された。細胞培養物は、後続の細胞培養継代前に、３回、冷凍され解凍された。
【００９９】
ＲＮＡ抽出物。製造業者の推奨に従って、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、全ウイルスＲＮＡが、初代ニワトリ胚肝細胞継代から抽出された。簡単に述べると、製造業者によって推奨されるように、感染の４８時間後に、細胞培養液がデカントされ、０．１４３Ｍのβ−メルカプトエタノールを含有する３００μｌのＲＬＴ緩衝液が単層に重ね合わされて、細胞スクレーパーで掻き取られた。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＲ。Ｓ１遺伝子に対応するｃＤＮＡは、以前公開されたＰ１（ＡＧＴＡＴＴＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＡＴＴＧ（配列番号７））およびＰ４（ＧＧＣＧＣＣＡＣＡＣＣＴＴＡＧＧＴ（配列番号８））プライマー（Ｋａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｖｅｔ  Ｒｅｓ；３４：２０３−２１２）を用いて、ＳＵＰＥＲＳＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ−逆転写酵素およびＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用した逆転写およびＰＣＲによって、作成された。１．１ｋｂの増幅産物は、１．０％アガロースゲル上で分離され、臭化エチジウムで染色されて、ＵＶトランスイルミネーターによって視覚化された。断片が切除されてＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製され、ジエチルピロ炭酸（ＤＥＰＣ）処理水中で溶出され、−８０℃で保存された。
【０１０１】
増幅産物およびＳ１クローンのヌクレオチド配列決定。ゲル精製ＰＣＲ産物は、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドおよびＴａｑポリメラーゼを用いて、ＡＢＩ９７００自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で実施される二本鎖ＤＮＡ配列決定を使用して、直接配列決定された。配列決定のためにＰＣＲプライマーＰ１およびＰ４が使用され、ならびに配列決定を完了するために必要に応じて、保存内部Ｓ１遺伝子プライマーが使用された。配列決定のために使用されるプライマー配列は、要求に応じて利用できる。さらに、ゲル精製製品は、製造業者の推奨に従って、プラスミドｐＣＲ２ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換された。１．１ｋｂの挿入物があるプラスミドを含有する各単離物からのいくつかのクローンは、Ｍ１３順方向および逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって同定された。クローンは伸長され、プラスミドは、製造業者の方法に従って、プラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して精製された。配列決定のためにＭ１３ユニバーサル順方向および逆方向プライマーが使用され、ならびに配列決定を完了するために必要に応じて、内部Ｓ１プライマーが使用された。Ｓ１遺伝子を含有する３回の増幅からの少なくとも３つのクローンまたはＰＣＲ産物が、両方向で配列決定されて、共通配列を得るために使用された。単離株９４５９４、９４８２６、および９６１３９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、図１〜６で同定される。
【０１０２】
配列解析。Ｓ１遺伝子およびシグマＣタンパク質のヌクレオチド、予測アミノ酸配列分析、および多重アラインメントは、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，ｖ．５．０，ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して実施された。以前公開されたトリレオウイルスのＳ１遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手された。
【０１０３】
系統発生解析を使用するＰａｒｓｉｍｏｎｙ  ｖ  ４．１０ｂソフトウェア（ＰＡＵＰ）を使用した発見的探索で、近隣結合クラスタリングおよび１０００ブートストラップ反復試を使用して、整合配列が比較され系統樹が作成された（信頼水準は括弧内に列挙される）。
【０１０４】
ＧｅｎＢａｎｋ受入番号。ニワトリ単離株９４５９４、９４８２６、および９６１３９について得られた配列はＧｅｎＢａｎｋに提出され、それぞれＫＪ８０３９６６、ＫＪ８０３９６７、およびＫＪ８０３９９０の受入番号が与えられた。
【０１０５】
結果と考察
今までに、ＶＡ／腱滑膜炎の臨床症例から、レオウイルス圃場分離株の２つの主要な変異遺伝子型が浮上しており、データベース中の現行のレオウイルスワクチン株（Ｓ１１３３、１７３３、２４０８、２１７７）およびその他のウイルスとの類似性の欠如のために、変異遺伝子型として特徴付けられる（図７）。圃場分離株の大部分は、１型（１型２０１２ＶＡ変異株として同定される）に属する。この遺伝子型に属するレオウイルスのシグマＣアミノ酸配列は、互いに＞９９％類似し、パブリックドメインおよびＰＤＲＣデータベース中の配列との比較で、ワクチン株と＜５０％類似する（図８）。２型（２型２０１２ＶＡ変異株として同定される）中のレオウイルスは、互いに＞９９％類似し、１型２０１２ＶＡ変異株と＜５０％と類似する（図８）。２型２０１２ＶＡ変異株およびワクチン株の間のシグマＣ類似性は、８０％である（図８）。この型は、より高い配列類似性を共有するが、８０％の類似性が、現行のワクチン株とのいくらかのレベルの交差防御につながるがどうかは、明らかでない。ウイルスの血清学的関連性に関する必要な情報を提供するために、双方の型からの圃場分離株の血清学的評価が実施された。
【０１０６】
１型および２型変異株からの典型的なウイルスは、Ｓ１１３３、２４０８に対する抗血清、および１型２０１２ＶＡ変異株に対して調製された過免疫血清を使用して、一方向性交差中和アッセイで評価された。圃場分離株および血清パネルの間のＶＮ力価は２〜１６であり、圃場分離株が、Ｓ１１３３、２４０８と、または相互に、血清学的に関連していない証拠が提供される。
【０１０７】
実施例２
１型変異レオウイルス株の病原性および子孫保護試験
本実施例は、ニワトリにおける、レオウイルス変異株１型２０１２ＶＡ単離株９４８２６および９４５９４の病原性を判定した。
【０１０８】
実験＃１
この実験は、Ａ社の種鶏ワクチン接種プログラムが、レオウイルス圃場分離株９４８２６を攻撃投与された子孫において、変異株１型２０１２ＶＡ単離株に対する適切な防御を提供するかどうかを判定するためのものであった。
【０１０９】
ニワトリ。Ａ社のワクチン接種種鶏からの８０羽の１日齢市販ブロイラーが使用された。
【０１１０】
【表１】
0006682441.tif 000002
【０１１１】
ウイルス。圃場分離株９４８２６が、初代ニワトリ胚肝細胞内で増殖され力価測定されて、負荷用量１０３ＴＣＩＤ５０／羽で、１日齢の雛の足蹠に接種するために使用された。初代ニワトリ胚肝細胞内で力価測定されたＳ１１３３原液もまた、１０３ＴＣＩＤ５０／羽の用量で、１日齢雛を足蹠接種するために使用される。陰性対照は、滅菌ＰＢＳによる足蹠を介した模擬攻撃投与である。
【０１１２】
レオウイルス負荷。６０羽の市販のブロイラーは、孵化当日に投与されて、２０羽毎の３群に分割されて、Ｈｏｒｓｆａｌｌ  Ｂａｕｅｒ隔離ユニットに入れられた。第１群からの雛は、レオウイルスＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）のために採血され、殺処分された。２〜４群の雛には、足蹠を介して、１）滅菌ＰＢＳ、２）Ｓ１１３３、または３）９４８２６が接種された。これは、表１に詳述される。鳥は毎日観察され、飛節の腫脹は、各処置群においてデジタル式キャリパーによって隔日で測定され記録された。１４日目に、全ての鳥を安楽死させて、計量し解剖した。鳥類は、任意の巨視的な病変について検査され、飛節関節は、腫脹、出血および／または断裂について検査された。防御のパラメータには、孵化当日血清学、臨床徴候、斃死率、体重、巨視的病変、および試験全体を通じた飛節腫脹評価／測定値が含まれた。
【０１１３】
実験＃２
この実験は、Ｂ社の種鶏ワクチン接種プログラムが、最近のＢ農場のレオウイルス圃場分離株を攻撃投与された子孫において、ウイルス関節炎に対する適切な防御を提供するかどうか、そして１日齢における市販レオウイルスワクチンの使用が、何らかの防御を提供するかどうかを判定するためのものであった。
【０１１４】
ニワトリ。Ｂ社ワクチン接種種鶏からの１００羽の１日齢市販ブロイラーが使用された。
【０１１５】
【表２】
0006682441.tif 000003
【０１１６】
ウイルス。レオウイルス圃場分離株９４５９４は、試験前に、初代ニワトリ胚肝細胞内で増殖され力価測定された。孵化日のワクチン接種のために、製造業者の推奨に従って、ＶＡ  ＣｈｉｃｋＶａｃ（Ｚｏｅｔｉｓ）が使用された。陰性対照は、滅菌ＰＢＳを模擬攻撃投与された。
【０１１７】
レオウイルス負荷。１００羽の市販の雛羽は、孵化当日に投与されて、２０羽毎の等しい５群に分割された。第１群は、レオウイルスＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）のために採血された。残る４群の雛は、強制空気陽圧下のＨｏｒｓｆａｌｌ  Ｂａｕｅｒ隔離ユニットに入れられた。孵化当日に、第３群には、皮下投与により全用量のＶＡ  ＣｈｉｃｋＶａｃがワクチン接種された一方で、第４群には、皮下投与により半用量のＶＡ  ＣｈｉｃｋＶａｃがワクチン接種された。これは、表２に詳述される。１０日目に、全ての雛について足蹠測定値が得られた。１０日目に、第２群には、０．１ｍｌの滅菌リン酸緩衝食塩水が、足蹠を介して接種された一方で、第３〜５群の雛には、１羽当たり１０３ＴＣＩＤ５０の圃場分離株９４５９４が、足蹠接種を介して攻撃投与された。鳥は毎日モニターされて、飛節測定値は、１０日齢に始まって隔日で得られた。２２日齢で、試験が終了された。防御のために使用されたパラメータは、孵化当日血清学、臨床徴候、斃死率、体重、巨視的病変であった。
【０１１８】
結果と考察
病原性および子孫保護試験が、１型２０１２ＶＡ変異遺伝子型からの代表株を使用して、市販のブロイラーにおいて実施された。第１の試験では、孵化日の雛に、足蹠を介して、Ｓ１１３３または１型２０１２ＶＡ変異株単離株のどちらかが攻撃投与され、１つの群は陰性対照とされた。さらに、２０羽の孵化当日雛の別の群は、レオウイルスＥＬＩＳＡのために採血された。全ての雛は、新鮮なかんな屑上の別個の隔離ハウス内の床式畜舎に入れられて、飼料および水を自由摂取で与えられた。足蹠測定値は、隔日で得られ、鳥は１４日目の実験終了時まで、臨床徴候について毎日モニターされた（図９）。群れのレオウイルスＥＬＩＳＡ幾何平均力価（ＧＭＴ）は１，２１２であり、これは孵化当日雛では低いと見なされる。臨床腱滑膜炎および有意な体重抑制は、Ｓ１１３３および変異レオウイルス株攻撃投与群の双方で観察された（図１０および１２）。Ｓ１１３３雛が、変異株で攻撃投与された雛よりも、より重度に跛行に冒された一方で、変異株攻撃投与群では、指屈筋腱周囲の腫脹の発生率がより高かった（図１１）。攻撃投与群で観察されたその他の臨床徴候には、心膜水腫および飛節炎症が含まれた（図１２）。レオウイルスの孵化当日力価は低く、したがってＡ社のワクチン接種プログラムからの母親由来抗体は、１型変異株の負荷に対する十分な防御を提供しなかった。加えて、圃場分離株は、圃場で観察された臨床疾患を再現し、疾患の病原体であることが確認された。
【０１１９】
第２の試験では、１２日齢時に、市販のブロイラー雛に、足蹠を介して１型変異株が攻撃投与され、試験は２３日齢で終了した。孵化当日に採取された血清から得られたレオウイルスＥＬＩＳＡ  ＧＭＴは、４，９００であった。この試験では、平均体重は、陰性対照との比較で、攻撃投与群においてわずかにより低いだけであった（図１３）。しかし、攻撃投与群は、ウイルス関節炎／腱滑膜炎に特徴的な臨床徴候および巨視的病変を示した（図１４）。第１の試験と同様に、指屈筋腱周囲の腫脹ならびに心膜水腫が、攻撃投与された鳥で観察された（図１２および１３）。この試験から、より高レベルの母親由来レオウイルス抗体がある雛は、１型変異株の負荷に対して、防御されないことが結論づけられ得る。
【０１２０】
さらに、孵化当日の市販のブロイラーに全用量および半用量で皮下投与され、１２日齢での１型変異株による負荷がそれに続く、市販のレオウイルスワクチンの使用が評価された。先の試験と同じパラメータを使用して、本発明者らは、全ての攻撃投与群で、ＶＡ／腱滑膜炎に特徴的な臨床徴候および巨視的病変を観察した。興味深いことに、心膜水腫および腫脹飛節の発生率は、負荷のみの群と比較して、ワクチン接種され攻撃投与された群で、用量にかかわりなくより高かった（図１４）。
【０１２１】
要約すると、変異レオウイルス株が、ウイルス関節炎／腱滑膜炎の臨床症例から単離されて、現行のレオウイルスワクチン株と遺伝的および抗原的に異なった。２つの特徴的なグループは、遺伝的および血清学的特性決定に基づいて、１型および２型２０１２変異株ＶＡレオウイルスとして同定された。生体内試験は、現行の市販ワクチンが、母親由来レオウイルス抗体がある雛において、１型２０１２変異株の負荷に対する防御を提供しないことを示唆する。典型的な２型単離株の生体内試験は、実施例３で下述される。１型および２型変異レオウイルス株が、米国の多数の州から、およびカナダからの腱滑膜炎の臨床症例から単離または検出され、１型に属する単離株の数は２型を超えていた。これらのウイルスの起源は、不明である。
【０１２２】
実施例３
２型変異レオウイルス株の病原性試験
実施例２でより詳細に記載される手順を使用して、市販のブロイラーにおいて２型変異レオウイルス株の病原性が特性決定された。２型２０１２ＶＡ変異遺伝子型からの典型的な株（Ｃｋ／９６１３９  Ｔｅｎｄｏｎ／ＧＡ／２０１２）が使用された。処置群は、表３に記載されるようである。
【０１２３】
【表３】
0006682441.tif 000004
【０１２４】
雛に、足蹠を介して、０．１ｍｌの滅菌リン酸緩衝食塩水または１羽あたり１０３ＴＣＩＤ５０の圃場分離株９９６１３９が接種された。防御のために使用されたパラメータは、孵化当日血清学、臨床徴候、斃死率、体重、および巨視的病変であった。足蹠腫脹および腱腫脹が、試験全体を通じて評価され測定された。
【０１２５】
結果と考察
レオウイルスＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）による孵化日の血清学的検査は、図（Ｆｉｇｕｒｅｄ）１７に示される。具体的には、平均値は５１１であり、ＧＭＴは３８５であり、ＳＤは３４３であり、％ＣＶは６６．８％である。
【０１２６】
図１８に示されるように、２型負荷は体重を低下させる。具体的には、２型攻撃投与された鳥で８％の体重抑制が観察された。
【０１２７】
図１９は、体重の百分率としての足蹠腫脹の１４日目の測定値を示す一方で、図２０は、２型攻撃投与された鳥について、体重の百分率としての腱腫脹の測定値を示す。
【０１２８】
２型攻撃投与された鳥の剖検および組織学的知見は、次のとおりである：２／１０の鳥に破裂した腱；５／１０の鳥にリンパ球性腱滑膜炎（腱鞘）；２／１０の鳥に心膜水腫；および２／１０の鳥にリンパ球性心外膜炎および心筋炎がある。肝臓または十二指腸では、顕著な病変は観察されはなかった。
【０１２９】
したがって、２型負荷は、わずかな体重抑制をもたらした。２型攻撃投与された鳥では、心膜水腫、腫脹腱、および少数の破裂した腱が観察された。そしてレオウイルスに一致する組織学的病変が、心臓および腱で観察された。
【０１３０】
結論として、１型および基２型変異株の双方が、市販のブロイラーにおけるウイルス関節炎の臨床症例から単離された。１型および２型変異株の双方が、巨視的に観察される心膜水腫および腱腫脹をはじめとする、腱滑膜炎を再現し、レオウイルスに一致する組織学的変化が心臓および腱で観察された。１型変異株の方が、より蔓延している。現行の市販ワクチンは、ブロイラーにおいて適切な防御を提供しないようである。したがって、自家ワクチンが、防除のための現行の唯一の選択肢のようである。
【０１３１】
実施例４
トリレオウイルスの溶菌斑アッセイ
ニワトリ胚肝細胞を３５ｍｍプレートに播種する：
−  アッセイ前日に、ニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬｉＣ）を３５枚のペトリ皿（２ｍｌ／ペトリ皿）に添加する。
−  ３５ｍｍプレートを３７℃のインキュベーターに入れる（一晩、少なくとも１２時間より長く）。
【０１３２】
溶菌斑アッセイ手順：
−  コンフルエントなＣＥＬｉＣから、培地（Ｍ１９９／Ｆ１０＋１０％ＦＢＳ）を除去する。
−  ２００μｌのウイルス（１０２ＴＣＩＤ５０）をプレートに添加する。
−  ３０分間後、希釈ウイルスと共に２ｍｌのＭ１９９／Ｆ１０＋２％ＣＳをプレートに添加し、プレート穏やかに旋回させる。
−  プレートを３７℃で３〜４時間培養する。
−  その間に、プレートあたり２ｍｌで次を調製する：細胞等級Ｈ２Ｏ中の１ｍｌ（２×濃度のＭ１９９／Ｆ１０＋５％ＣＳ）＋および１ｍｌの３％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロース。
−  ３〜４時間後、プレートをインキュベーターから取り出して、上清（１，２００μｌ）を除去する。
−  この時点で、２ｍｌ／ウェルで調製物を重ねて、３７℃で２〜３日目培養する。
【０１３３】
２〜３日後に染色する（通常、接種の２日後に染色を試みる、３日を超えると細胞は死滅し始めて溶菌斑が良好でなくなることもある）：
−  細胞培養等級水で希釈した１０％の濾過ニュートラルレッドを調製する。
−  １ｍｌ／プレートで添加する。
−  インキュベーター内で少なくとも２時間（２〜４時間）インキュベートする。
−  ２〜３時間後、溶菌斑が明確に出現する。
【０１３４】
結果：生細胞は、赤色に染色される。溶菌斑は、未染色のままである。
【０１３５】
実施例５
Ｉ型および２型シグマＣタンパク質配列
実施例１でより詳細に記載される手順に従って、１２２の１型および基２型変異トリレオウイルス株のシグマＣタンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびコードされるシグマＣアミノ酸配列が決定された。図２１は、１２２の単離株について、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号、配列ＩＤ、単離株名称、ウイルスがそれから単離された組織型、採取日、単離された国および州、および単離源を示す。ニワトリ胚肝細胞は、全ての１２２単離株で、研究室宿主の役割を果たす。
【０１３６】
実施例５
Ｉ型および２型トリレオウイルス変異株の弱毒化
９４８２６および９４５９４単離株（どちらも１型単離株）および９６１３９単離株（２型単離株）をはじめとするが、これに限定されるものではない、図２１に列挙されるＩ型および２型トリレオウイルス単離株は、卵または例えば、ニワトリ胚肝細胞（ＣＥＬｉＣ）などの細胞系における継代によって弱毒化される。クローン溶菌斑精製ウイルス調製品が、各継代後に調製されて、続く弱毒化ラウンドのために使用される。単離株の病原性およびワクチン有効性は、例えば、約２５、約５０、約７５、約１００、および約１２５継代後など、約２５継代毎に試験される。弱毒型株について、Ｃシグマタンパク質のアミノ酸配列が得られてもよい。
【０１３７】
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、および文献、および電子的に利用できる情報（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑ中のヌクレオチド配列登録、および例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢなどのアミノ酸配列登録、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑ中の注釈付きコード領域からの翻訳物をはじめとする）の完全な開示は、参照により援用される。本出願の開示と、参照により本明細書に援用される任意の文献の開示との間に何らかの矛盾が存在する場合、本出願の開示が効力を持つものとする。前述詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためにのみ示された。不要な制限が、それから解釈されるべきではない。本発明は、示されて説明される正確な詳細に限定されず、当業者には明白である多様性は、特許請求の範囲によって定義される本発明に含まれる。
【０１３８】
配列なしの一覧
配列番号１
１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４５９４からのシグマＣタンパク質（塩基対１〜９３１）をコードするＳ１ヌクレオチド配列
配列番号２
１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４５９４からのシグマＣ（アミノ酸１〜３１０）のＳ１アミノ酸配列
配列番号３
１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４８２６からのシグマＣタンパク質（塩基対１〜９３１）をコードするＳ１ヌクレオチド配列
配列番号４
１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９４８２６からのシグマＣ（アミノ酸１〜３１０）のＳ１アミノ酸配列
配列番号５
１型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９６１３９からのシグマＣタンパク質（塩基対１〜９３１）をコードするＳ２ヌクレオチド配列
配列番号６
２型２０１２ＶＡ変異株の圃場分離株９６１３９からのシグマＣタンパク質（アミノ酸１〜３１０）のＳ１アミノ酸配列
配列番号７Ｐ１ＰＣＲプライマー
配列番号８Ｐ４ＰＣＲプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【配列表】
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