(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する方法：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを創製する段階；
b.  段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロ毒性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエート変種を同定する段階。
【請求項２】
親オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入することによって、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも2箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも3箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーに存在するすべてのホスホロチオエート連結が、立体的に規定された規定のホスホロチオエート連結である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーまたはそのギャップ領域に存在するすべてのヌクレオシド間連結が、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
親ギャップマーオリゴヌクレオチドがLNAギャップマーである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリ、または段階(c）で同定したライブラリ中に存在する1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエート変種のいずれかについて、インビトロでの効力を判定する段階をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
段階c.で同定した立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種が、親の効力の少なくとも25％の、インビトロ（例えば、IC50）効力を保持している、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
段階c.で同定した立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種が、親の効力の少なくとも50％の、インビトロ（例えば、IC50）効力を保持している、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
親ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種のライブラリのメンバーが、ベータ-D-オキシ-LNAおよび6'メチルベータ-D-オキシLNAヌクレオシド（例えば、S(cET)）のリストから選択される少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
親オリゴヌクレオチドが肝毒性であり、かつ段階(c）で同定した1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエート変種が親オリゴヌクレオチドよりも肝毒性が低い、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
段階(b）で実施したライブラリスクリーニングが、初代肝細胞におけるインビトロでの肝毒性のスクリーニングを含む、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
初代肝細胞が、初代哺乳動物肝細胞である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
初代哺乳動物肝細胞が、マウスまたはラット肝細胞である、請求項18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、低減された毒性を有する立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド変種の同定方法であって、立体的に規定されたキラルホスホロチオエート変種のライブラリを創製し、インビトロまたはインビボのいずれかで、低減された毒性を有する化合物について、それらをスクリーニングすることによる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
Koziolkiewicz et al. (NAR 1995 24; 5000-5005)（非特許文献1）は、ホスホロチオエート連結が[全Rp]立体配置、もしくは[全Sp]立体配置、またはジアステレオマーの無作為混合物のいずれかである、15マーのDNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを開示している。ハイブリッドまたは[全Sp]オリゴヌクレオチドに比べて、[全Rp]は、RNアーゼH依存性分解に対して「より感受性である」ことが判明し、より高い二重鎖熱安定性を有することが判明した。実用化のために、[全Rp]オリゴはそれらの3'末端で[Sp]ホスホロチオエートによって保護すべきであることが示唆されている。
【０００３】
Stec et al. (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120; 7156-7167)（非特許文献2）は、オキサチアホスホランアプローチによるPS-オリゴの立体制御された合成における使用のための、5'-DMT-デオキシリボヌクレオシド3'-O-(2-チオ-“スピロ”-4,4-ペンタメチレン-1,2,3-オキサチアホスホラン)の新しいモノマーについて報告している。
【０００４】
Karwowski et al. (Bioorganic & Med. Chem. Letts. 2001 11; 1001-1003)（非特許文献3）は、LNAジヌクレオシドホスホロチオエートの立体制御された合成のためのオキサチアホスホランアプローチを用いている。R立体異性体ジヌクレオチドはヘビ毒ホスホジエステラーゼによって容易に加水分解された。
【０００５】
Krieg et al. (Oligonucleotides 13;491-499)（非特許文献4）は、CpG PS-オリゴによる免疫刺激がそれらのP-キラリティーのキラリティーに依存するかどうかを調査した。CpG PS Rpオリゴは、Spオリゴに比べて、はるかに高いMAPK活性化およびIκB分解の誘導を示した。異なる立体異性体オリゴヌクレオチドの取り込みの差についての証拠はなかった。Rpオリゴヌクレオチドは、急速な分解によると思われる短い持続時間（48時間未満）を有していた。免疫刺激のために、急速な短期使用にはRpキラリティーを有するCpGオリゴ、および長期効果にはSpオリゴが推奨される。
【０００６】
Levin et al. Chapter 7 Antisense Drug Technology 2008; 183-215（非特許文献5）は、ホスホロチオエートのキラリティーについて概観し、特にSp立体異性体のエキソヌクレアーゼ抵抗性により、ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチドのキラリティーがそれらの薬物動態に大いに影響することを確認している。ホスホロチオエートキラリティーのPK効果は、エキソヌクレアーゼ分解を妨げる3'および5'末端での2'修飾により第二世代ASOにおいてあまり著しくないと報告されているが、おそらくはRp末端残基を有する個々の分子はエキソヌクレアーゼに対してより感受性であると考えられ、すなわち、より長い半減期に関して、末端にSp残基を有する分子はより長い半減期を有するであろう。
【０００７】
Wave Life Sciences Poster (TIDES, May 3-6 2014, San Diego)（非特許文献6）: ミポメルセン内の524,288種の可能な異なる立体異性体の計算に基づき、彼らはTm、RNアーゼH動員、親油性、代謝安定性、インビボでの有効性、および特異的活性に関して顕著に異なる7つの立体異性体を例示している。
【０００８】
Wan et al, Nucleic Acids Research, November 14, 2014（非特許文献7）（早期公開）は、ギャップ領域のキラリティーがDNA-オキサザホスホリン（oxazaphospholine）アプローチ（Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037（非特許文献8））を用いて制御された31種のアンチセンスオリゴヌクレオチドを開示し、ギャップマーのギャップ領域におけるPSキラリティーを制御することで、立体的に無作為なPS ASOの混合物に比べて、治療的適用のために著しい利益が提供されることはないと結論付けた。Wanらはさらに、キラルPS ASOの合成および特徴付けに関連するさらなる複雑さおよび費用が、それらの有用性を最小化するとしている。
【０００９】
Swayze et al., 2007, NAR 35(2): 687-700（非特許文献9）は、LNAアンチセンス化合物は動物において効力を改善するが、著しい肝毒性を引き起こすと報告している。WO 2008/049085（特許文献1）は、LNA隣接領域に2'-O-MOEを含むLNA混合ウィングギャップマーについて報告しており、これらは一定のLNA化合物の毒性を明らかに低減するが、効力を著しく低下させる。
【００１０】
WO 2014/012081（特許文献2）およびWO 2014/010250（特許文献3）は、オリゴヌクレオチドの合成のためのキラル試薬を提供している。
【００１１】
WO 2015/107425（特許文献4）は、キラルに規定されたオリゴヌクレオチドのキラルデザインについて報告しており、一定のキラルに規定された化合物はRNアーゼH切断パターンを変更し得ることを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 2008/049085
【特許文献２】WO 2014/012081
【特許文献３】WO 2014/010250
【特許文献４】WO 2015/107425
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Koziolkiewicz et al. (NAR 1995 24; 5000-5005)
【非特許文献２】Stec et al. (J. Am. Chem. Soc. 1998, 120; 7156-7167)
【非特許文献３】Karwowski et al. (Bioorganic & Med. Chem. Letts. 2001 11; 1001-1003)
【非特許文献４】Krieg et al. (Oligonucleotides 13;491-499)
【非特許文献５】Levin et al. Chapter 7 Antisense Drug Technology 2008; 183-215
【非特許文献６】Wave Life Sciences Poster (TIDES, May 3-6 2014, San Diego)
【非特許文献７】Wan et al, Nucleic Acids Research, November 14, 2014
【非特許文献８】Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037
【非特許文献９】Swayze et al., 2007, NAR 35(2): 687-700
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する方法であって：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを創製する段階；
b.  段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含み、ここで、例えば、この方法によって同定した1つまたは複数の立体的に規定された変種をスクリーニング法の次の回で親オリゴヌクレオチドとして用いるために、任意で方法を繰り返す（反復スクリーニング）方法を提供する。立体的に規定されたなる用語は、本明細書において立体的に特定されたなる用語と交換可能である。
【００１５】
本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（親）配列の毒性を低減する方法であって：
a.  インビボまたはインビトロで毒性表現型を有する、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（親）を提供する段階；
b.  親ギャップマーオリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（子）のライブラリを創製する段階；
c.  段階b.で創製したライブラリをインビボまたはインビトロ毒性アッセイでスクリーニングする段階；
d.  立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定する段階
を含む方法を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、本発明の方法を反復的に用いてもよい。
【００１７】
本発明の方法は、低減された毒性を有する1つまたは複数の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを製造する、さらなるその後の段階をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、その後の製造は、1gよりも大きい、例えば10gよりも大きい規模である。いくつかの態様において、インビボまたはインビトロスクリーニング段階（b）のためのオリゴヌクレオチドの合成は、1g未満、例えば0.5g未満、例えば0.1g未満の規模で実施する。
【００１８】
子オリゴヌクレオチド（すなわち、段階bのライブラリのメンバー）またはこの方法によって同定した、毒性を低減された子オリゴヌクレオチドは、親オリゴヌクレオチドの立体的に規定された変種であり、すなわち、これらは親とは異なる少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。
【００１９】
本発明の方法において、段階(b）で創製したライブラリの各メンバーは、親とは異なる少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、方法は、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリ、または段階(c）もしくは(d）で同定したライブラリ中に存在する1つまたは複数の立体的に規定された化合物のいずれかについて、インビトロまたはインビボでの効力を判定する段階をさらに含む。
【００２１】
いくつかの態様において、本発明の方法は、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定されたホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなLNAオリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載のLNAギャップマーであってもよい。立体的に規定されたなる用語は、本明細書において立体的に特定されたなる用語と交換可能である。立体的に規定されたホスホロチオエート連結は、立体選択的または立体特異的ホスホロチオエート連結と呼んでもよい。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは10〜20ヌクレオチド長、例えば10〜16ヌクレオチド長である。
【００２３】
少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドは、本明細書においてLNAオリゴヌクレオチドまたはLNAオリゴマーと呼んでもよい。
【００２４】
本発明は、同じ核酸塩基配列および化学的修飾（立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外）を有する立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、インビボまたはインビトロで毒性が低減されている、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド/立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、LNA-ギャップマーなどのギャップマーであってもよい。毒性の比較のために、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する。
【００２５】
本発明は、本発明のオリゴマーに共有結合された、少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（「結合部分」）を含む、本明細書に記載のオリゴマーを含む結合体をさらに提供する。
【００２６】
本発明は、本明細書に記載のオリゴマーまたは結合体、および薬学的に許容される溶媒（水または食塩水などの）、希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む、薬学的組成物を提供する。
【００２７】
本明細書に記載のオリゴマーを含む薬学的および他の組成物も提供する。さらに提供するのは、細胞または組織中の標的核酸、例えば、mRNAまたはマイクロRNAなどのRNAの発現をダウンレギュレートする方法であって、該細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、本明細書に記載の1つまたは複数のオリゴマー、結合体または組成物の有効量と接触させる段階を含む方法である。
【００２８】
同様に開示するのは、RNAの発現、または過剰発現に関連する疾患または状態を有することが疑われる、またはそれになりやすい動物（非ヒト動物またはヒト）の処置法であって、非ヒト動物またはヒトに本明細書に記載の1つまたは複数のオリゴマー、結合体または薬学的組成物の治療的または予防的有効量を投与することによる方法である。
【００２９】
本発明は、細胞または組織中の標的核酸の発現を阻害する（例えば、ダウンレギュレートすることにより）方法であって、細胞または組織を、インビトロまたはインビボで、1つまたは複数のオリゴマー、結合体、またはその薬学的組成物の有効量と接触させて、標的核酸の発現のダウンレギュレーションに影響をおよぼす段階を含む方法を提供する。
【００３０】
いくつかの態様において、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、本明細書に記載のLNAオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対を含み、ここで立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結はRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつここで立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの少なくとも1つはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対の他のヌクレオシドは、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである。本発明は、オリゴヌクレオチドにおける立体的に特定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の使用も提供し、ここでオリゴヌクレオチドは、立体的に特定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まない同一のオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する。
【００３２】
本発明は、毒性低減オリゴヌクレオチド（立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド）の合成のための、立体制御性（立体特異的とも呼ぶ）ホスホラミダイトモノマー（例えば、ホスホラミダイト）の使用も提供する。
【００３３】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドのインビボ毒性について予測的であることが判明している、インビトロ毒性アッセイも提供する。適切な肝毒性または腎毒性アッセイを提供する。そのようなアッセイの使用は、立体的に規定されたオリゴヌクレオチドに限定されないが、本発明の別の局面において、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドなどの、LNAオリゴヌクレオチド（例えば、ベータ-D-オキシLNAまたは(S)cET）、および2'置換ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド、ギャップマーオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、一般のオリゴヌクレオチドに適用可能であることが理解されよう。
【００３４】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの（例えば、おそらく）肝毒性を判定するための、インビトロ初代肝細胞アッセイの使用を提供する。
【００３５】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの（例えば、おそらく）インビボ肝毒性を予測する方法であって、オリゴヌクレオチドを、マウスもしくはラット初代肝細胞（例えば、肝臓灌流によって得てもよい）、またはヒト初代肝細胞などの、初代肝細胞の集団にインビトロで投与する段階、細胞をオリゴヌクレオチド存在下で、例えば、1〜7日の間、例えば2〜4日、例えば3日の期間インキュベートする段階、ならびに続いて、例えば、培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の量を測定すること、および/または細胞ATPレベルの判定により、本明細書に記載のものなどの、インビトロ細胞毒性の少なくとも1つのバイオマーカーを測定する段階を含む方法を提供する。適切には、細胞ATPレベルの低減は肝毒性オリゴヌクレオチドの指標であり、培地中に放出されたLDHの上昇は肝毒性オリゴヌクレオチドの指標である。
【００３６】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの（例えば、おそらく）肝毒性を判定するための、インビトロアッセイの使用を提供する。
【００３７】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの（例えば、おそらく）腎毒性を判定するための、インビトロアッセイの使用を提供する。適切には、ヒト腎皮質上皮細胞などの、哺乳動物腎皮質上皮細胞を用いてもよく、これらは任意で不死化されていてもよく、例えば、RPTEC/TERT1などのhTERT1を用いてもよい（ATCC、例えば、（ATCC(登録商標)CRL-4031(商標)）またはRPTEC-TERT1（Evercyte GmbH、Austria）から入手可能。
【００３８】
本発明は、LNAオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドの（例えば、おそらく）インビボ腎毒性を予測する方法であって、オリゴヌクレオチドを、RPTEC-TERT1などの、ヒトまたはラット初代近位尿細管上皮細胞細胞などの、哺乳動物腎皮質上皮細胞の集団にインビトロで投与する段階、細胞をオリゴヌクレオチド存在下で、例えば、1〜21日の間、例えば2〜16日、例えば4〜12日、例えば6〜10日、例えば9日の期間インキュベートする段階、ならびに続いて、例えば、細胞ATPレベルの判定により、本明細書に記載のものなどの、インビトロ細胞毒性の少なくとも1つのマーカーを測定する段階を含む方法を提供する。適切には、細胞ATPレベルの低減は腎毒性オリゴヌクレオチドの指標である。
【００３９】
適切には、オリゴヌクレオチドを、例えば、PBS中の細胞培養物に投与して、1〜100μM、例えば5〜50μM、例えば10または30μMの最終濃度を得る。
【００４０】
いくつかの態様において、インビボ毒性（例えば、腎毒性または肝毒性）を予測する方法を用いて、低減されたインビトロまたはインビボ毒性を有する、親オリゴヌクレオチドの立体的に規定された変種を同定してもよいことが理解されよう。
[本発明1001]
以下の段階を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する方法：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを創製する段階；
b.  段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階。
[本発明1002]
親オリゴヌクレオチドがアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、本発明1002の方法。
[本発明1004]
少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する、本発明1002または1003の方法。
[本発明1005]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、少なくとも2箇所、例えば少なくとも3箇所、例えば少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーに存在するすべてのホスホロチオエート連結が、立体的に規定された規定のホスホロチオエート連結である、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーまたはそのギャップ領域に存在するすべてのヌクレオシド間連結が、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーが、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
親ギャップマーオリゴヌクレオチドがLNAギャップマーである、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリ、または段階(c）で同定したライブラリ中に存在する1つまたは複数の立体的に規定された化合物のいずれかについて、インビトロまたはインビボでの効力を判定する段階をさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親の効力の少なくとも25％、例えば少なくとも50％の、インビトロ（例えば、IC50）またはインビボ（例えば、ED50またはEC50）効力を保持している、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
段階c.で同定した立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種が、親化合物のEC50値の3〜10倍以下のEC50値を保持している、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
親ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリのメンバーが、ベータ-D-オキシ-LNAおよび6'メチルベータ-D-オキシLNAヌクレオシド（例えば、S(cET)）のリストから選択される少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
親オリゴヌクレオチドが肝毒性であり、かつ段階(c）で同定した1つまたは複数の立体的に規定された化合物が親オリゴヌクレオチドよりも肝毒性が低い、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
段階(b）で実施したライブラリスクリーニングがインビトロまたはインビボでの肝毒性のスクリーニングを含む、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
段階(b）で実施したライブラリスクリーニングが、初代肝細胞、例えば初代哺乳動物、例えばマウスまたはラット肝細胞におけるインビトロでの肝毒性のスクリーニングを含む、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
同じ核酸塩基配列および化学的修飾（立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外）を有する立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド。
[本発明1018]
オリゴヌクレオチドにおける立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の使用であって、該オリゴヌクレオチドが、立体的に特定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まない同一のオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、使用。
[本発明1019]
毒性低減オリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマー（例えば、ホスホラミダイト）の使用。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のLNAオリゴヌクレオチドの概略図。図は、15箇所のヌクレオシド間ホスホロチオエート連結を有する3-10-3ギャップマーオリゴヌクレオチドを示す。ウィング領域X'およびY'におけるヌクレオシド間連結は本明細書に記載のとおりであってもよく、例えば、無作為にRpまたはSpホスホロチオエート連結であってもよい。図1の表部分は、ギャップ領域Y'のすべてのヌクレオシド間連結も無作為に組み込まれたRpまたはSpホスホロチオエート連結（M）である親化合物（P）を提供し、化合物1〜10では、ホスホロチオエート連結のうち1箇所がRpホスホロチオエートヌクレオシド間連結（R）として立体的に規定されている。
【図２】化合物1〜10において、ホスホロチオエート連結のうち1箇所がSpホスホロチオエートヌクレオシド間連結（S）として立体的に規定されている以外は、図1のとおり。
【図３】3箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が、S（化合物#10）またはR（化合物#14）立体配置のいずれかに固定されているLNAオリゴヌクレオチドの肝毒性の可能性（ALT）を、すべてのヌクレオシド間連結がRおよびS立体配置の混合物であるジアステレオ異性体の親混合物（化合物#1）のALTと比較した。
【図４ａ】肝臓中のオリゴヌクレオチド含有量。
【図４ｂ】腎臓中のオリゴヌクレオチド含有量。
【図４ｃ】脾臓中のオリゴヌクレオチド含有量。
【図５】それぞれのLNAで3日間処理した細胞の、上清中のLDHレベルおよび細胞内ATPレベルの変化。標的ノックダウン（Myd88）を48時間後に評価した。
【図６】初代肝細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング：それぞれのLNAで3日間処理した細胞の、上清中のLDHレベルおよび細胞内ATPレベルの変化。データは平均値であり、媒体対照に対する割合（％）として表す（#56についてはn=4実験の三つ組で、他のLNAについてはすべてn＝2実験の三つ組）。
【図７】腎臓近位尿細管細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング：10μMおよび30μMのLNA Myd88立体変種で処理したPTEC-TERT1の、9日後に測定した生存度（細胞ATP）。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明の方法は、細胞内で標的核酸を阻害するなどの、調節する際に用いるための立体的に特定されたオリゴマー化合物（本明細書においてオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドとも呼ぶ）を提供する。オリゴマーはアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであってもよい。本発明の方法を用いて同定または製造したオリゴマーは、低減された腎毒性または低減された肝毒性などの、低減されたインビトロまたはインビボ毒性を有する。
【００４３】
本発明の文脈において、「立体的に規定された」なる用語は、オリゴヌクレオチド中に存在する少なくとも1箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が規定された立体化学、すなわち、RpまたはSpのいずれかを有する、オリゴヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド中のすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は立体的に規定されていてもよく、すなわち各ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は独立にRpおよびSpホスホロチオエートヌクレオシド間連結からなる群より選択される。
【００４４】
典型的には、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートをRpおよびSpホスホロチオエート連結の無作為混合物（ラセミ混合物とも呼ぶ）として合成する。本発明において、ギャップ領域オリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のうち少なくとも1箇所が立体的に規定されている、すなわち、少なくとも75％、例えば少なくとも80％、または少なくとも85％、または少なくとも90％、または少なくとも95％、または少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、または（本質的に）オリゴヌクレオチド試料中に存在するオリゴヌクレオチド分子のすべてで、RpまたはSpのいずれかである、ギャップマーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、立体的に規定されている、立体選択的である、または立体的に特定されていると言ってもよい：それらは立体特異的な少なくとも1箇所のホスホロチオエート連結を含む。立体的に規定されたおよび立体的に特定された/立体選択的、なる用語は、本明細書において交換可能に用いてもよい。立体的に規定された、立体選択的および立体的に特定された、なる用語は、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結（RpまたはSp）を記載するために用いてもよく、またはそのようなホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを記載するために用いてもよい。立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、任意の1つの位置で少量の別の立体異性体を含み得ることが理解され、例えば、Wanらは、NAR, November 2014において報告したギャップマーの98％の立体選択性を報告している。
【００４５】
利点
インビボおよびインビトロ最適化
本発明は、インビボ（例えば、薬理学的）有用性のための、遺伝子歩行（gene-walk）により同定したオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドを最適化する方法を提供する。特に、本発明の方法を、オリゴヌクレオチド（配列）のインビトロまたはインビボ毒性を低減するため、ならびに低減された毒性や、任意で他の増強された有益な特性、例えば標的特異性、ミスマッチ識別、血清タンパク質結合、体内分布、RNアーゼH動員、効力、および細胞内取込を有するオリゴマーの合成および製造において用いてもよい。
【００４６】
低減された毒性
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の毒性を低減する方法であって：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを創製する段階；
b.  段階a.で創製したライブラリを、細胞におけるそれらのインビトロまたはインビボ毒性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて細胞における低減された毒性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を提供する。
【００４７】
いくつかの態様において、毒性（段階b）をインビボで判定する。いくつかの態様において、毒性をインビトロで判定する。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、インビトロまたはインビボのいずれかで、肝毒性であると判定されているオリゴヌクレオチドである。本発明の方法によって同定した子オリゴヌクレオチドは、親オリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性、例えば、低減された肝毒性を有する。
【００４８】
いくつかの態様において、低減された毒性は低減された肝毒性である。オリゴヌクレオチドの肝毒性は、インビボで、例えば、マウスにおいて評価してもよい。インビボ肝毒性アッセイは、典型的には、ALT、ASTまたはGGTなどの、肝損傷の血清マーカーの判定に基づく。正常の上限の3倍を超えるレベルをインビボ毒性の指標と考える。インビボ毒性は、マウスで、例えば、30mg/kgの単一用量のオリゴヌクレオチド、および7日後の毒性評価（7日インビボ毒性アッセイ）を用いて評価してもよい。
【００４９】
細胞毒性の適切なマーカーには、LDHの上昇、または細胞ATPの減少が含まれ、これらのマーカーを、例えば、初代細胞または細胞培養物を用いて、インビトロで細胞毒性を判定するために用いてもよい。肝毒性の判定のために、初代肝細胞を含む、マウスまたはラット肝細胞を用いてもよい。肝細胞における毒性の適切なマーカーには、LDHの上昇、または細胞ATPの減少が含まれる。入手可能であれば、ヒト肝細胞などの初代霊長類肝細胞を用いてもよい。マウスなどの哺乳動物肝細胞において、LDHの上昇は毒性の指標である。細胞ATPの低減は、肝毒性などの毒性の指標である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、初代マウス肝細胞において、例えば、実施例8において提供するアッセイを用いて判定して、低減されたインビトロ肝毒性を有する。
【００５０】
いくつかの態様において、低減された毒性は低減された腎毒性である。腎毒性は、血清クレアチニンレベルの上昇、またはkim-1（kidney injury marker-1）mRNAおよび/またはタンパク質の上昇を含む、腎損傷マーカーの使用により、インビボで評価してもよい。適切には、マウスまたは齧歯類を用いてもよい。
【００５１】
インビトロ腎傷害アッセイを用いて腎毒性を評価してもよく、kim-1 mRNA/タンパク質の上昇、または細胞ATPの変化（減少）を含んでもよい。いくつかの態様において、PTEC-TERT1細胞を用いて、例えば、細胞ATPレベルを測定することにより、インビトロで腎毒性を判定してもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、実施例9において提供するアッセイを用いて、PTEC-TERT1細胞で判定して、低減されたインビトロ腎毒性を有する。
【００５２】
毒性を評価するために用い得る、他のインビトロ毒性アッセイには、カスパーゼアッセイ、および細胞生存度アッセイ、例えば、MTSアッセイが含まれる。いくつかの態様において、本発明の毒性低減オリゴヌクレオチドは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結、例えば少なくとも2、3、または4箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結を含む。実施例は、インビトロおよびインビボで低減された肝毒性を有する、立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結を含む化合物を例示する。いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたRpヌクレオチド間連結は、LNAギャップマーのギャップ領域内に存在する。いくつかの態様において、本発明の毒性低減オリゴヌクレオチドは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結、例えば少なくとも2、3、または4箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結を含む。実施例は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオシド間連結を含む、低減された腎毒性を有する化合物を例示する。いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたSpヌクレオチド間連結は、LNAギャップマーのギャップ領域内に存在する。
【００５３】
本発明は、毒性低減オリゴヌクレオチド、例えば、肝毒性低減または腎毒性低減オリゴヌクレオチドの合成のための立体制御された（立体特異的、または立体的に特定していると呼んでもよい）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーはLNA立体制御ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーはDNA立体制御ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御されたホスホラミダイトモノマーは2'修飾立体制御ホスホラミダイトモノマー、例えば、2'メトキシエチル立体制御ホスホラミダイトRNAモノマーである。立体制御されたホスホラミダイトモノマーは、いくつかの態様において、オキサザホスホリンモノマー、例えば、DNA-オキサザホスホリンLNA-オキサザホスホリンモノマーであってもよい。
【００５４】
本発明のモノマーを、インビトロまたはインビボでLNAオリゴヌクレオチドの肝毒性を低減するために用いてもよい。
【００５５】
LNA肝毒性はモデルマウス系を用いて判定してもよく、例えば、EP 1 984 381を参照されたい。本発明のモノマーを、LNAオリゴヌクレオチドの腎毒性を低減するために用いてもよい。LNA腎毒性はモデルラット系を用いて判定してもよく、Kim-1バイオマーカーを用いて判定することが多い（例えば、WO 2014118267参照）。本発明のモノマーを、インビボでLNAオリゴマーの免疫原性を低減するために用いてもよい。EP 1 984 381によれば、4'-CH2-O-2'基を有するLNAは特に毒性である。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性、生体内安定性、標的親和性、RNアーゼH活性、および/または親油性を有し得る。したがって、本発明は、インビボでのオリゴマーの活性を増強するための方法ならびにオリゴマーの薬理学的および/または毒物学的側面を改善するための方法の両方を提供する。
【００５７】
いくつかの態様において、LNAオリゴヌクレオチドは、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチドに比べて、例えば実施例6において提供するアッセイを用いて測定した、低減されたインビボ肝毒性、または例えば実施例8において提供するアッセイを用いて測定した、低減されたインビトロ肝毒性、または例えば実施例9において提供するアッセイを用いて測定した、低減された腎毒性などの、低減された毒性を有する。低減された毒性は、当技術分野において公知の他の方法、例えば、カスパーゼアッセイおよび初代肝細胞毒性アッセイ（例えば、実施例8）を用いて評価してもよい。
【００５８】
RNアーゼH動員
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド（親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する。事実、本発明者らは、一般に、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、親（立体的に規定されていない）の活性の最大30倍までの、増強されたRNアーゼH動員活性をもたらすことを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、RNアーゼH動員活性が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御された（立体特異的とも呼ぶ）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。
【００５９】
本発明は、RNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH動員活性を増強するための方法であって：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階；
b.  段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらのインビトロRNアーゼH動員活性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階；
d.  任意で、段階c.で同定した立体的に規定された変種のうち少なくとも1つを製造する段階
を含む方法をさらに含み得る。
【００６０】
この方法を、本発明のオリゴヌクレオチドの毒性を低減する方法と組み合わせ得ることが理解されるであろう。
【００６１】
本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたRNアーゼH動員活性を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。増強されたRNアーゼH動員活性を有するLNAオリゴヌクレオチドは、低減された肝毒性または低減された腎毒性などの、低減されたインビトロまたはインビボ毒性をさらに有し得る。
【００６２】
それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（例えば、親オリゴヌクレオチド）は、同じ核酸塩基配列および立体的に規定されたホスホロチオエート連結以外の化学的修飾を有する、立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである。立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結以外の化合物の部分、例えば、ヌクレオシド内に、立体的に規定された中心を含んでもよい。
【００６３】
LNAオリゴヌクレオチドにおけるキラルに規定されたホスホロチオエート連結の使用は、驚くことに、RNアーゼH活性の増大をもたらす。これは、ギャップ領域が立体的に規定されたRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含む場合に見られると考えられる。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、少なくとも2箇所のRpおよび少なくとも2箇所のSpの、立体的に規定されたヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、そのギャップ領域内の立体的に規定されたヌクレオシド間連結（ウィング領域に隣接するヌクレオシド間連結を含む）のRp対Spの比率は、約0.25〜約0.75の間である。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、立体的に規定されたRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかである、少なくとも2箇所の連続ヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドのギャップ領域は、立体的に規定されたRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかである、少なくとも3箇所の連続ヌクレオシド間連結を含む。
【００６４】
いくつかの態様において、例えば、実施例7において提供するRNアーゼH動員アッセイを用いて、LNAオリゴヌクレオチドは、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチドに比べて、増強されたヒトRNアーゼH動員活性を有する。いくつかの態様において、RNアーゼH活性の増大は、同等の非立体選択的LNAオリゴヌクレオチド（例えば、親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH活性の少なくとも2×、例えば少なくとも5×、例えば少なくとも10×である。実施例7は、RNアーゼH活性（RNアーゼH動員とも呼ぶ）を評価するために用い得る、適切なRNアーゼHアッセイを提供する。
【００６５】
RNアーゼH活性の、活性における顕著な改善は、ギャップ領域がRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含み、かついくつかの態様において、ギャップ領域が少なくとも2箇所のRpヌクレオシド間連結および少なくとも2箇所のSpヌクレオシド間連結、例えば少なくとも3箇所のRpヌクレオシド間連結および/または少なくとも3箇所のSpヌクレオシド間連結を含んでもよい、LNAギャップマー化合物で見出されることが明らかにされている。
【００６６】
RNアーゼH活性の、活性における顕著な改善は、ギャップ領域のヌクレオシド間連結が立体的に規定されているLNAギャップマー化合物で見出されることが明らかにされている。したがって、いくつかの態様において、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、少なくとも1つの立体選択的ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドがある。いくつかの態様において、領域X'および/またはZ'内のヌクレオシド間連結のうち少なくとも1箇所はRpヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中または領域X'中の最も5'端のヌクレオシド間連結はSpヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、隣接領域X'およびZ'は少なくとも1箇所のSpヌクレオシド間連結および少なくとも1箇所のRpヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、オリゴマーまたは領域Z'の3'ヌクレオシド間連結はSpヌクレオシド間連結である。
【００６７】
いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドまたは親オリゴヌクレオチドに比べて、改善された効力を有する。
【００６８】
特異性およびミスマッチ識別力
実施例に示すとおり、いくつかの態様において、本発明の立体的に規定されたオリゴヌクレオチドは、そうではなく立体的に規定されていないオリゴヌクレオチド（親オリゴヌクレオチド）に比べて、増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有する。事実、本発明者らは、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の、RNアーゼH動員LNAオリゴヌクレオチド、例えば、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドへの導入が、増強されたミスマッチ識別力（または標的特異性）をもたらし得ることを見出して驚いた。したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、ミスマッチ識別力（または標的特異性）が増強されたオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性ホスホロチオエートモノマーの使用を提供する。
【００６９】
したがって、本発明は、細胞中のRNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のミスマッチ識別力（または標的特異性）を増強するための方法であって：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを作製する段階；
b.  段階a.で作製したライブラリを、RNA標的に対するそれらの活性および存在する少なくとも1つの他のRNAに対するそれらの活性についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて、少なくとも1つの他のRNAに対する低減された活性を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階
を含む方法を、さらに含み得る。
【００７０】
この方法を、本発明のオリゴヌクレオチドの毒性を低減する方法と組み合わせ得ることが理解されるであろう。
【００７１】
少なくとも1つの他のRNAに対する低減された活性は、意図する標的/意図しない標的（少なくとも1つの他のRNA）の活性の比として判定してもよい。この方法は、増強されたRNアーゼH動員活性および増強されたミスマッチ識別力（すなわち、増強された標的指向特異性）、ならびに低減されたインビトロもしくはインビボ毒性の両方を有する本発明のオリゴヌクレオチドを同定するために、RNA標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）のRNアーゼH動員活性を増強する方法ともまた組み合わせてもよい。
【００７２】
本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、減少されたインビボまたはインビトロ毒性、および増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。増強されたミスマッチ認識力（または増強された標的特異性）を有するLNAオリゴヌクレオチドは、低減された肝毒性または低減された腎毒性などの、低減されたインビトロまたはインビボ毒性、および任意で増強されたRNアーゼH動員活性をさらに有し得る。
【００７３】
本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないLNAオリゴヌクレオチド（または親オリゴヌクレオチド）に比べて、減少された毒性、増強されたRNアーゼH動員活性および増強されたミスマッチ識別力（または増強された標的特異性）を有するLNAオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７４】
したがって、本発明は、それ以外は同一の、立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドに比べて、増強されたミスマッチ識別力（または標的特異性）および増強されたRNアーゼH動員活性を有するオリゴヌクレオチドの合成のための、立体制御性/立体制御された（立体的に規定された、または立体特異的と呼ぶこともできる）ホスホラミダイトモノマーの使用を提供する。
【００７５】
いくつかの態様において、立体制御性ホスホラミダイトモノマーはLNA立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御性ホスホラミダイトモノマーはDNA立体制御性ホスホラミダイトモノマーである。いくつかの態様において、立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトモノマーは2'修飾立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトモノマー、例えば、2'メトキシエチル立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトRNAモノマーである。立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトモノマーは、いくつかの態様において、オキサザホスホリンモノマー、例えば、DNA-オキサザホスホリンLNA-オキサザホスホリンモノマーであってもよい。いくつかの態様において、立体制御性（立体特異的）ホスホラミダイトモノマーは、A、T、U、C、5-メチル-CまたはG核酸塩基からなる群より選択される核酸塩基を含んでもよい。
【００７６】
体内分布
本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列（親オリゴヌクレオチド）の体内分布を変更する方法であって：
a.  親オリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種（子オリゴヌクレオチド）のライブラリを創製する段階；
b.  段階a.で創製したライブラリを、それらの体内分布についてスクリーニングする段階；
c.  親オリゴヌクレオチドに比べて、変更された（好ましいなどの）体内分布を有する、ライブラリに存在する1つまたは複数の立体的に規定された変種を同定する段階；
d.  任意で段階c.で同定した1つまたは複数の立体的に規定された変種を製造する段階
を含む方法を提供する。
【００７７】
前記方法を、本明細書において開示する毒性を低減する方法と共に用いてもよい。
【００７８】
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは異なる立体異性体の混合物であってもよく、したがって本発明の方法は、親オリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性、および任意で増強された特異性、変更された体内分布、増強された効力などの、1つまたは複数の他の改善された特性を有する、個々の立体的に規定されたオリゴヌクレオチド、または個々の立体異性体（子オリゴヌクレオチド）を同定する方法を含んでもよいことが理解される。
【００７９】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、肝臓への増強された体内分布を有する。
【００８０】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、増強された肝臓/腎臓体内分布比を有する。
【００８１】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、増強された腎臓/肝臓体内分布比を有する。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、腎臓への増強された体内分布を有する。
【００８３】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、肝細胞における増強された細胞取込を有する。
【００８４】
いくつかの態様において、本発明の化合物、または本発明の方法によって同定された化合物は、腎細胞における増強された細胞取込を有する。
【００８５】
増強された機能特性を有する化合物に言及する場合、増強は、それ以外は同一の立体的に規定されていないオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに関してなされていてもよい。
【００８６】
体内分布試験は典型的にはインビボで実施するが、例えば、異なる種類の細胞において、例えば、インビトロでの肝細胞（例えば、初代肝細胞）または腎細胞（例えば、PTEC-TERT1細胞などの腎上皮細胞）中の細胞取込を比較することにより、インビトロ系で実施してもよい。
【００８７】
オリゴヌクレオチド
本発明の文脈における「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー化合物」なる用語は、複数のヌクレオチドの共有結合により生成される分子（すなわち、オリゴヌクレオチド）を意味する。本明細書において、1つのヌクレオチド（ユニット）をモノマーまたはユニットと呼んでもよい。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「ユニット」および「モノマー」なる用語は交換可能に用いられる。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する場合、言及されるものは、A、T、G、CまたはUなどの、塩基の配列であることが理解されよう。オリゴヌクレオチドなる用語は本明細書において、オリゴマー化合物およびオリゴマーなる用語と交換可能に用いられる。
【００８８】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは10〜20ヌクレオチド長、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20ヌクレオチドである。いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドはLNAオリゴマーである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、少なくとも1つの立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対を含み、ここで立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオチド対のヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結はRp立体配置またはRs立体配置のいずれかであり、かつここでヌクレオチド対のヌクレオシドの少なくとも1個はLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、ヌクレオチド対の他のヌクレオチドは、DNA以外、例えばヌクレオシド類縁体、例えばさらなるLNAヌクレオシドまたは2'置換ヌクレオシドである。
【００８９】
いくつかの態様において、オリゴマーは、LNAヌクレオシドとそれに続く(3')ヌクレオシドとの間の少なくとも1箇所の立体選択的ホスホロチオエート連結を含む、立体的に規定された（立体選択的）ホスホロチオエートLNAオリゴヌクレオチドである。そのようなLNAオリゴヌクレオチドは、例えば、本明細書において記載のLNAギャップマーであってもよい。
【００９０】
いくつかの態様において、少なくとも個以上の連続ヌクレオシドの中心領域（Y'）、ならびに1〜6個のLNAヌクレオシドを含む5'ウィング領域（X'）および1〜6個のLNAヌクレオシドを含む3'ウィング領域（Z'）を含むオリゴヌクレオチドであって、中心領域のヌクレオシド間連結の少なくとも1箇所は立体的に規定されており、かつ中心領域はRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含む。
【００９１】
親オリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは立体的に規定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、すなわち、ホスホロチオエート連結のキラリティーが規定されていない個々の分子の混合物、例えば、ラセミ混合物を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。すなわち、いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、立体的に特定されていないホスホロチオエートヌクレオシド間連結だけを有してもよい（すなわち、立体的に特定されていないオリゴヌクレオチド）。
【００９２】
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、立体的に規定されていないホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチド中に存在するすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されていないヌクレオシド間ホスホロチオエート連結などの、立体的に規定されていないヌクレオシド間連結である。
【００９３】
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、1箇所または複数箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含んでもよい。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドのすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドは、本発明の方法の前述の反復により同定する。
【００９４】
変種のライブラリ
本発明の方法は、親オリゴヌクレオチドの変種のライブラリを創製する段階を含み、ここで変種は親オリゴヌクレオチドとは異なる少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する。適切には、変種のライブラリの各メンバーは、親とは異なる規定の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結の別のパターンを有する。
【００９５】
いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチド（立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種）のライブラリの各メンバーは、少なくとも2箇所、例えば少なくとも3箇所、例えば少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい。適切には、子オリゴヌクレオチド中に存在する前記少なくとも2箇所、少なくとも3箇所または少なくとも4箇所の立体的に特定されたホスホロチオエート連結は、親とは異なる（例えば、親は立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含まないか、あるいは親は異なる立体的に規定されたホスホロチオエート連結、または異なるパターンもしくは立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む）。
【００９６】
いくつかの態様において、（例えば、子）オリゴマー中の連結の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、（例えば、子）オリゴマー中のすべてのホスホロチオエート連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、（例えば、子）オリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。立体的に規定された（立体特異性）とは、規定されたヌクレオシド間連結におけるRpまたはSpヌクレオシド間連結のいずれかの高い比率、すなわち、少なくとも75％の組み込みを意味することが理解されるべきである。
【００９７】
本発明の方法の段階(b）のいくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を親ギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製してもよい。適切には、挿入した立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結は親の同等のヌクレオシド間連結とは異なるか、または親は同等の位置に立体的に規定されたヌクレオシド間連結を含まないかのいずれかである。
【００９８】
いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する。
【００９９】
いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する。
【０１００】
いくつかの態様において、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーの一方または両方のウィング領域に挿入し、かつ少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結をギャップマーのギャップ領域に挿入することによって、立体的に規定されたオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーを創製する。
【０１０１】
いくつかの態様において、ギャップマー化合物のギャップ領域の残りのヌクレオシド間連結などの、子オリゴヌクレオチドの残りのヌクレオシド間連結は、親と同じであってもよく、または、いくつかの態様において、親と異なっていてもよいことが理解されよう。
【０１０２】
いくつかの態様において、段階(b）で創製した子オリゴヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20箇所の独立に立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。いくつかの態様において、段階(b）で創製した子オリゴヌクレオチドのすべてのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、段階(b）で創製した子オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０１０３】
いくつかの態様において、立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーは、少なくとも2箇所、例えば少なくとも3箇所、例えば少なくとも4箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含み、ここで残りの連結は任意で立体的に規定されていない規定のホスホロチオエート連結であってもよい。
【０１０４】
いくつかの態様において、立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーに存在するすべてのホスホロチオエート連結は、立体的に規定された規定のホスホロチオエート連結である。
【０１０５】
いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチドのライブラリの各メンバーまたはそのギャップ領域に存在するすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。
【０１０６】
いくつかの態様において、立体的に規定された規定のオリゴヌクレオチド変種のライブラリの各メンバーは、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、親オリゴヌクレオチドに存在する修飾および未修飾ヌクレオシドのパターンを保持する。いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド修飾の同じパターンを共有し、例えば、親オリゴヌクレオチドの（例えば）ギャップマー設計は、子オリゴヌクレオチド、または少なくともある比率の子オリゴヌクレオチドで保持される。しかし、変種のライブラリは、子オリゴヌクレオチドであって、親オリゴヌクレオチドの全般的ギャップマー設計を保持しているが、親の糖化学も、例えば、ウィングにおける代わりのヌクレオシドの使用、例えば、ウィング領域における代わりの高親和性ヌクレオシドの使用によって、またはギャップ領域における増大もしくは低減もしくはシフトによって変動している、1または2または3または4個などの少数のヌクレオシドを含んでもよい、子オリゴヌクレオチドを含んでもよいことが理解される。
【０１０７】
いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドはLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１０８】
中心的核酸塩基配列の保持
子オリゴヌクレオチドのライブラリは、親化合物の中心的核酸塩基配列を保持する、2個以上の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。
【０１０９】
いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチドは、親オリゴヌクレオチドと同じ長さであってもよく、同じ核酸塩基配列を保持してもよい。しかし、いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチドは、5'および/もしくは3'末端ヌクレオチドの除去などにより、切断されていてもよく、または、いくつかの態様において、5'および/もしくは3'末端にさらなるヌクレオチドを有してもよいことが考えられる。1つまたは複数のLNAヌクレオシドのギャップ領域への挿入はRNA標的への親和性を増大させるため、LNAヌクレオシドなどの、1つまたは複数の末端高親和性ヌクレオシドの除去により、RNA標的へのオリゴヌクレオチドの親和性を維持することが可能となる。いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチドのライブラリは、いくつかは切断され、いくつかはさらなるヌクレオシドを有し、いくつかは1または2ヌクレオシドシフトした配列を有し（RNA標的に対して測定して）、いくつかは側部にさらなる高親和性ヌクレオシドを有する、異なる隣接領域を有する変種を含んでもよく、したがってライブラリは不均一なホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの複雑なライブラリであって、それにより親に比べて低減された毒性を有する子オリゴヌクレオチドの同時選択が可能となることが考えられる。
【０１１０】
親および子オリゴヌクレオチドは、共通の中心的核酸塩基配列を有する。共通の中心的核酸塩基配列は、典型的には、少なくとも10核酸塩基長、例えば少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、または少なくとも16核酸塩基長であり、かついくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドと同じ核酸塩基配列であってもよい。いくつかの態様において、親および（少なくともある比率の）子オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの全体にわたって同じ核酸塩基配列を有する。しかし、ある比率の子オリゴヌクレオチドは、いくつかの態様において、さらなる1、2または3個の5'または3'ヌクレオチドなどの、さらなる5'または3'ヌクレオチドを含んでもよいと考えられる。加えて、または代わりに、いくつかの態様において、ある比率の子オリゴヌクレオチドは、親に比べて切断されていてもよく、例えば、5'または3'末端で1、2または3ntの切断を含んでもよい。いくつかの態様において、（ある比率の）子オリゴヌクレオチドのさらなる核酸塩基または核酸塩基配列の切断は、1つの核酸塩基の付加または切断である。いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチド、またはそのある比率は、標的配列に対して整列させた場合、親オリゴヌクレオチドと比較して、1個の核酸塩基、または2もしくは3個の核酸塩基だけシフトしていてもよい（要するに、一方の末端での切断、および他方での付加）。さらなるヌクレオチドは標的核酸配列との相補性を保持する。
【０１１１】
ギャップマーオリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドおよび子オリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチドである。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、アンチセンスメカニズムにより、mRNAまたはウイルスRNAなどの、細胞中の標的RNAを阻害するために広く用いられる（したがって、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドと呼んでもよい）。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、LNAまたは2'置換ヌクレオチドなどの親和性増強修飾ヌクレオシドを含む領域が5'および3'に隣接する、DNAヌクレオチド、例えば、6〜14個のDNAヌクレオチドの領域などの、RNアーゼHを動員することができる少なくとも5個の連続ヌクレオチドの領域（ギャップ領域）を含む。いくつかの態様において、隣接領域は1〜8ヌクレオチド長であってもよい。
【０１１２】
いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドは、少なくとも5個以上の連続DNAヌクレオシドなどの、少なくとも5個以上の連続ヌクレオシドの中心領域（Y'）、ならびにLNAヌクレオシドなどの、1〜6個の高親和性ヌクレオシド類縁体を含む5'ウィング領域（X'）および1〜6個のLNAヌクレオシドなどの、1〜6個の高親和性ヌクレオシド類縁体を含むを含む3'ウィング領域（Z'）を含むギャップマーオリゴヌクレオチドである。LNAギャップマーオリゴヌクレオチドは、ウィング領域に少なくとも1個のLNAヌクレオシドを含み、例えば、5'および3'ウィング領域の両方に少なくとも1個のLNAを含んでもよい、オリゴヌクレオチドである。
【０１１３】
いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチドは、中心領域のヌクレオシド間連結の少なくとも1箇所が立体的に規定されており、かつ中心領域がRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含むギャップマーである。
【０１１４】
ギャップマーオリゴヌクレオチドは、RNアーゼHを動員することができる少なくとも5個以上の連続ヌクレオシドの中心領域（Y'）、ならびに1〜6個のLNAヌクレオシドを含む5'ウィング領域（X'）および1〜6個のLNAヌクレオシドを含むを含む3'ウィング領域（Z'）を含んでもよい。適切には、領域Y'は6、7、8、9、10、11、12、13または14個（例えば、6〜12個）の連続ヌクレオチド、例えばDNAヌクレオチドを有してもよく、かつ領域Y'に隣接する領域X'およびZ'のヌクレオチドはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、領域X'およびZ'は1〜6個のヌクレオチドを有し、各側部（X'およびZ'）におけるその少なくとも1個はLNAである。いくつかの態様において、領域X'および領域Z'におけるすべてのヌクレオチドはLNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドはLNAおよびDNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、混合ウィングLNAギャップマーであってもよく、ここでウィング領域の1つにおけるLNAヌクレオシドの少なくとも1個（または各ウィングにおける少なくとも1個のLNA）は2'置換ヌクレオシド、例えば2'MOEヌクレオシドで置き換えられている。いくつかの態様において、LNAギャップマーはウィング領域において2'置換ヌクレオシドを含まない。領域X'-Y'-Z'のヌクレオチドの連続配列におけるヌクレオチドの間のヌクレオシド間連結はすべて、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結であってもよい。
【０１１５】
子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、中心領域のヌクレオシド間連結の少なくとも1箇所は立体的に規定されており、ここで中心領域はRpおよびSpヌクレオシド間連結の両方を含む。
【０１１６】
子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、領域Y'内のヌクレオシド間連結はすべて、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、領域X'およびY'内のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、領域X'とY'との間および領域Y'とZ'との間のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、領域X'-Y'-Z'の連続ヌクレオシド内のすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドのギャップ領域における少なくとも1つの立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入を用いて、オリゴヌクレオチドの生物学的側面を調節してもよく、例えば、毒性側面を調節してもよい。いくつかの態様において、子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のギャップ領域におけるホスホロチオエート連結の2、3、4または5箇所は立体的に規定されている。いくつかの態様において、ギャップ領域における残りのヌクレオシド間連結は立体的に規定されていない：それらはオリゴヌクレオチド種の集団においてRpおよびSpのラセミ混合物として存在する。子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、オリゴヌクレオチドにおける残りのヌクレオシド間連結は立体的に規定されていない。子オリゴヌクレオチド（および任意で親）のいくつかの態様において、ギャップ領域におけるすべてのヌクレオシド間連結は立体的に規定されている。本明細書におけるギャップ領域（Y'と呼ぶ）は、RNアーゼHを動員することができるヌクレオチドの領域であり、かつ、例えば、少なくとも5個の連続DNAヌクレオシドの領域であってもよい。
【０１１８】
いくつかの態様において、オリゴマーのギャップ領域における連結の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14箇所は、立体選択的ホスホロチオエート連結である。
【０１１９】
いくつかの態様において、オリゴマー（例えば、ギャップマー）中の連結の5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％は、立体選択的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマー中のすべてのホスホロチオエート連結は、立体選択的ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、オリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結である。
【０１２０】
有効性
本発明の方法によって同定した子オリゴヌクレオチドを、本発明の方法の一部として試験して、それらがその標的核酸を阻害することができるなどの、それらが有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドであることを判定してもよい。したがって、本発明の方法は、子オリゴヌクレオチドのライブラリを、それらの標的を調節する、例えば、阻害する際のその有効性について、スクリーニングする（例えば、段階bの前、最中または後に）さらなる段階を含んでもよい。または、本発明の方法は、低減された毒性を有する選択した立体的に規定された変種のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての有効性を判定するために、それらを試験するさらなる段階を含んでもよい。いくつかの態様において、有効性は、RNアーゼHを動員するオリゴヌクレオチドの能力によって判定するか、またはいくつかの態様において、インビトロ、もしくはいくつかの態様において、インビボで、細胞中の標的の発現を調節する能力であってもよい。
【０１２１】
低減された毒性を有する選択した子オリゴヌクレオチドが親オリゴヌクレオチドのインビトロまたはインビボでの効力を維持することは必須ではないが、それらが低減された毒性を有する有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドであることが好ましいことが理解される。適切には、インビボで評価する場合、オリゴヌクレオチドの治療指数が増強されてもよい。治療指数は、典型的には、最大耐用量（MTD）（例えば、肝毒性の場合、正常の上限の3倍）をED50で除したものとして計算する。実験的目的のために、標的配列がマウスに存在すると仮定して、MTDおよびED50をマウスで7日間のマウス試験において判定してもよい。マウスにおける配列保存が好ましくない場合、他のモデル種、例えば、ラット、サル、イヌまたはブタを用いてもよい。
【０１２２】
いくつかの態様において、段階c.で同定した選択した子オリゴヌクレオチドは、親の効力の少なくとも25％、例えば少なくとも50％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも90％の、インビトロ（例えば、IC50）またはインビボ（例えば、ED50またはEC50）効力を保持する。いくつかの態様において、段階c.で同定した選択した子オリゴヌクレオチドは親と類似のインビトロ（例えば、IC50）またはインビボ（例えば、ED50またはEC50）効力（すなわち、+/-10％）を有するか、または親よりも増強されたインビトロ（例えば、IC50）またはインビボ（例えば、ED50またはEC50）効力を有する。IC50またはED50は、所期の標的を発現している標的細胞中で評価すべきである。
【０１２３】
いくつかの態様において、段階c.で同定した子オリゴヌクレオチドは、親化合物よりも改善されたEC50値を有する。いくつかの態様において、段階c.で同定した子オリゴヌクレオチドは、親化合物と類似のEC50値（すなわち、+/-10％）を保持する。いくつかの態様において、段階c.で同定した子オリゴヌクレオチドは、親化合物よりも改善されたEC50値を有する。
【０１２４】
いくつかの態様において、段階c.で同定した子オリゴヌクレオチドは、親化合物の2倍（2×）、またはいくつかの態様において、3倍（3×）以下のEC50値（すなわち、+/-10％）を有する。いくつかの態様において、段階c.で同定した子オリゴヌクレオチドは、親化合物の3〜10倍以下のEC50値を保持する。
【０１２５】
LNA
いくつかの態様において、親および子オリゴヌクレオチドはLNAオリゴヌクレオチドであり、すなわち、それらは少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含む。
【０１２６】
LNAモノマー（二環式核酸、BNAとも呼ぶ）は、リボース環の2'位と4'位との間にビラジカルがあるヌクレオシドである。2'−4'ビラジカルは架橋とも呼ぶ。LNAモノマーは、オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、典型的にはオリゴヌクレオチド/標的二重鎖を融解するために必要な温度（Tm）の上昇として測定または計算しての、オリゴヌクレオチドの相補的DNAまたはRNA配列への結合親和性を増強することが公知である。
【０１２７】
LNAオリゴマーは、少なくとも1つの「ロックド核酸」（LNA）ヌクレオシド、例えば2'位と4'位との間に共有結合架橋（ラジカルとも呼ぶ）（2'−4'架橋）を含むヌクレオシドを含む。LNAヌクレオシドは「二環式ヌクレオシド」とも呼ぶ。LNAオリゴマーは、典型的には、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１２８】
いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ギャップマーを含むか、またはギャップマーである。いくつかの態様において、オリゴマー中に存在するヌクレオシド類縁体はすべてLNAである。
【０１２９】
様々な態様において、本発明の化合物はRNA（ユニット）を含まない。いくつかの態様において、オリゴマーは、線状分子であるか、または線状分子として合成される、単一の連続配列を有する。したがって、オリゴマーは、一本鎖分子であってもよい。いくつかの態様において、オリゴマーは、同じオリゴマー内の同等の領域に相補的な、例えば、少なくとも3、4または5個の連続ヌクレオチドの短い領域（すなわち、二重鎖）を含まない。いくつかの態様において、オリゴマーは（本質的に）二本鎖でなくてもよい。いくつかの態様において、オリゴマーは本質的に二本鎖ではなく、例えばsiRNAではない。いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、（実質的に）相補的オリゴヌクレオチドとの二重鎖の形ではなく−例えば、siRNAではない。
【０１３０】
標的
オリゴヌクレオチドの標的は、典型的には、生理的条件下でオリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能な選択された核酸である。アンチセンス療法に関しては、医学的疾患において標的核酸が指示される。標的核酸は、例えば、mRNAまたはマイクロRNAであってもよい（標的遺伝子なる用語に含まれる）。そのようなオリゴヌクレオチドを、アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ぶ。
【０１３１】
適切には、本発明の方法で使用される、または本発明の方法によって作製されるオリゴヌクレオチド（オリゴマー）は、標的核酸（標的遺伝子とも呼ばれる）の発現をダウンレギュレート（例えば、低減または除去）可能である。これに関して、これらは、典型的には、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中の標的遺伝子の阻害に影響をおよぼし得る。いくつかの態様において、オリゴマーは、標的核酸に結合し、正常な発現レベルに比べて少なくとも10％または20％、より好ましくは正常な発現レベル（オリゴマーまたは結合体非存在下での発現レベルなどの）に比べて少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％または95％の発現の阻害に影響をおよぼす。いくつかの態様において、そのような調節は、0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの濃度の本発明の化合物を用いる場合に見られる。同じまたは異なる態様において、発現の阻害は100％未満、例えば98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば70％未満の阻害である。発現レベルの調節は、タンパク質レベルを測定することにより、例えば、標的タンパク質に対して産生させた適切な抗体を用いてのSDS-PAGEと、それに続くウェスタンブロッティングなどの方法により、判定してもよい。または、発現レベルの調節は、mRNAのレベルを測定することにより、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRにより判定することもできる。mRNAレベルにより測定する場合、適切な用量、例えば0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの濃度を用いる場合のダウンレギュレーションのレベルは、いくつかの態様において、典型的には、本発明の化合物、結合体または組成物非存在下での正常レベルの10〜20％のレベルまでである。
【０１３２】
したがって、本オリゴヌクレオチドは、標的タンパク質および/またはRNAを発現している細胞中の標的タンパク質および/または標的RNAの発現をダウンレギュレートまたは阻害ために用いることができ、該細胞に本発明のオリゴマーまたは結合体を投与して、該細胞中の標的タンパク質またはRNAの発現をダウンレギュレートまたは阻害する段階を含む。適切には、細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。投与は、いくつかの態様において、インビトロで行ってもよい。投与は、いくつかの態様において、インビボで行ってもよい。
【０１３３】
オリゴマーは、標的核酸中に存在するヌクレオチド配列の逆相補体に対応する、連続ヌクレオチド配列を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
【０１３４】
本発明のオリゴマー（またはその領域）と核酸の標的領域との間の「相補性」の程度を判定する際に、「相補性」（同様に「相同性」または「同一性」）の程度は、オリゴマー（またはその領域）の配列と、それと最もよく整列する標的領域（または標的領域の逆相補体）の配列との間の同一性パーセンテージ（または相同性パーセンテージ）として表す。パーセンテージは、2つの配列間で同一の整列した塩基の数を計数し、オリゴマー中の連続モノマーの総数で除し、かつ100をかけることよって算出する。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、本発明のオリゴマーと標的領域との間でギャップ内のモノマーの数が異なる区域であるよりも、単なるミスマッチであることが好ましい。
【０１３５】
本明細書において用いられる「相同」および「相同性」なる用語は、「同一性」および「同一」なる用語と交換可能である。
【０１３６】
「対応の」および「対応する」なる用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列（すなわち、核酸塩基または塩基配列）または連続ヌクレオチド配列（第1領域）と、i）標的タンパク質をコードするmRNAなどの、核酸標的の逆相補体の部分配列のいずれかから選択されるさらなる配列の同等の連続ヌクレオチド配列との間の比較を意味する。WO2014/118267は、治療的に関連する多くの標的mRNA、ならびに本発明を用いて最適化し得るオリゴマー配列を提供する（例えば、表３を参照されたく、NCBI Genbank標準はWO2014/118257に開示されるとおりである）。
【０１３７】
（表３）
0006689279.tif 000002
0006689279.tif 000003
【０１３８】
「対応するヌクレオチド類縁体」および「対応するヌクレオチド」なる用語は、ヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド中のヌクレオチドが同一であることを示すことが意図される。例えば、ヌクレオチドの2-デキシリボースユニットがアデニンに連結されている場合、「対応するヌクレオチド類縁体」はアデニンに連結されたペントースユニット（2-デオキシリボースとは異なる）を含む。
【０１３９】
本明細書において用いられる「逆相補体」、「逆相補的」および「逆相補性」なる用語は、「相補体」、「相補的」および「相補性」なる用語と交換可能である。
【０１４０】
長さ
オリゴマーは、長さが7〜30、例えば7〜26または8〜25、例えば9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25ヌクレオチド、例えば長さが10〜20ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、LNAオリゴマーの長さは10〜16ヌクレオチド、例えば12、13または14ヌクレオシドである。
【０１４１】
いくつかの態様において、オリゴマーは、長さが合計10〜22、例えば12〜18、例えば13〜17または12〜16、例えば13、14、15、16連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【０１４２】
いくつかの態様において、オリゴマーは、長さが合計10、11、12、13、または14連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【０１４３】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば15、16または17ヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、20未満のヌクレオチドを含む。オリゴマー、または連続ヌクレオチド配列の長さの範囲が示される場合、それは範囲に示される下限および上限の長さを含む、例えば、10〜30（またはその間）は、10および30の両方を含むことが理解されるべきである。
【０１４４】
いくつかの態様において、オリゴマーは、20未満、例えば18未満、例えば16以下または15もしくは14以下の長さを有する。LNAオリゴマーは20未満の長さを有することが多い。
【０１４５】
いくつかの態様において、オリゴマーは、長さが合計10、11、12、13、または14連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【０１４６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、22以下のヌクレオチド、例えば20以下のヌクレオチド、例えば18以下のヌクレオチド、例えば15、16または17ヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、20未満のヌクレオチドを含む。オリゴマー、または連続ヌクレオチド配列の長さの範囲が示される場合、それは範囲に示される下限および上限の長さを含む、例えば、10〜30（またはその間）は、10および30の両方を含むことが理解されるべきである。
【０１４７】
スクリーニング法
本発明は、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド配列の毒性を低減する方法であって：
a.  インビボまたはインビトロで毒性表現型を有する、立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（親）を提供する段階；
b.  親ギャップマーオリゴヌクレオチドの中心的核酸塩基配列を保持している、立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（子）のライブラリを作製する段階；
c.  段階b.で作製したライブラリをインビボまたはインビトロ毒性アッセイでスクリーニングする段階；
d.  立体的に特定されていないホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに比べて、低減された毒性を有する、1つまたは複数の立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを同定する段階
を含む方法を提供する。
【０１４８】
立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、本明細書において開示する、本発明のオリゴヌクレオチドのとおりであってもよい。いくつかの態様において、親オリゴヌクレオチドはギャップマーオリゴヌクレオチド、例えば本明細書において開示するLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、立体的に特定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのライブラリは、少なくとも2、例えば少なくとも5または少なくとも10または少なくとも15または少なくとも20の立体的に規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを含む。
【０１４９】
スクリーニング法は、少なくとも1つの他の機能パラメーター、例えば、RNアーゼH動員活性、RNアーゼH切断特異性、標的特異性、標的結合親和性、および/またはインビボもしくはインビトロ効力の1つまたは複数について、子オリゴヌクレオチドをスクリーニングする段階をさらに含んでもよい。
【０１５０】
したがって、本発明の方法を用いて、親オリゴヌクレオチドに関連する毒性を低減してもよい。オリゴヌクレオチドの毒性はインビトロまたはインビボで評価してもよい。インビトロアッセイには、カスパーゼアッセイ（例えば、WO2005/023995に開示されているカスパーゼアッセイ参照）または肝細胞毒性アッセイ（例えば、Soldatow et al., Toxicol Res (Camb). 2013 Jan 1; 2(1): 23-39.参照）が含まれる。インビボ毒性は、多くの場合、前臨床スクリーニングで、例えば、マウスまたはラットにおいて同定される。インビボ毒性は肝毒性であり、これは典型的には血清中の肝臓トランスアミナーゼレベル、例えば、ALTおよび/もしくはASTを分析することにより測定し、または、例えば、腎毒性であってもよく、これは腎毒性の分子マーカー、例えば、血清クレアチニンレベル、もしくは腎傷害マーカーmRNA、kim-1のレベルを測定することによりアッセイしてもよい。
【０１５１】
スクリーニング法により同定した、選択した子オリゴヌクレオチドは、したがって、より安全で有効なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１５２】
立体的に規定されたホスホロチオエート連結を有するギャップ領域
Wanらにおいて報告されたとおり、ホスホロチオエート連結の無作為ラセミ混合物に比べて、ギャップマー中に全てがRpであるまたは全てがSpであるギャップ領域を導入することに利点はほとんどない。本発明は、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結の導入がオリゴヌクレオチドの生物学的特性を実質的に改善し得るという、驚くべき利点、例えば低減された毒性、に基づいている。これは、ギャップ領域中に1箇所またはいくつか、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を導入すること、あるいはすべてのホスホロチオエート連結を立体的に特定することのいずれかによって達成し得る。
【０１５３】
いくつかの態様において、中心領域（Y'）のヌクレオシド間連結の1、2、3、4または5箇所だけが立体選択的ホスホロチオエート連結であり、残りのヌクレオシド間連結は無作為にRpまたはSpである。
【０１５４】
いくつかの態様において、中心領域（Y'）のヌクレオシド間連結のすべては立体選択的ホスホロチオエート連結である。
【０１５５】
いくつかの態様において、中心領域（Y'）は少なくとも5個の、ホスホロチオエート連結した連続DNAヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも8または9 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも10または11 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも12または13 DNAヌクレオシド長である。いくつかの態様において、中心領域は少なくとも14または15 DNAヌクレオシド長である。
【０１５６】
立体選択的DNAモチーフ
本発明者らは以前、あるDNAジヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの毒性側面に寄与し得ることを特定した（Hagedorn et al., Nucleic Acid Therapeutics 2013, 23; 302-310）。本発明のいくつかの態様において、本明細書に記載のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、アンチセンスオリゴヌクレオチド中のDNAジヌクレオチドの毒性は、DNAジヌクレオチド、特に毒性、例えば、肝毒性に寄与することが公知のジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間に立体選択的ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を導入することにより調節してもよい。いくつかの態様において、本発明の方法によって同定されたオリゴヌクレオチドは、cc、tg、tc、ac、tt、gt、caおよびgcからなる群より選択されるDNAジヌクレオチドモチーフを含み、ここでジヌクレオチドのDNAヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結は、立体的に規定されたホスホロチオエート連結、例えばSpまたはRpホスホロチオエートヌクレオシド間連結のいずれかである。典型的には、そのようなジヌクレオチドは、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドなどの、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内にあってもよい。いくつかの態様において、本方法によって同定されたオリゴヌクレオチドは、前述のDNAジヌクレオチドモチーフのリストから、独立せずにまたは独立して選択される少なくとも2つ、例えば少なくとも3つのジヌクレオチドを含む。
【０１５７】
RNアーゼ動員
オリゴマー化合物は、翻訳の立体障害、または他の方法などによる、標的mRNAの非RNアーゼ仲介性分解を介して機能し得ることが理解され、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、RNアーゼHなどのエンドリボヌクレアーゼ（RNアーゼ）を動員することが可能である。
【０１５８】
そのようなオリゴマーは、相補的標的RNAと共に二重鎖に形成されるとRNアーゼを動員することができる、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16個の連続ヌクレオチドを含む、少なくとも6個、例えば少なくとも7個の連続ヌクレオチドユニット、例えば少なくとも8個または少なくとも9個の連続ヌクレオチドユニット（残基）の領域からなる、連続ヌクレオチド配列（領域Y'）を含むことが好ましい。RNアーゼを動員することができる連続配列は、本明細書に記載のギャップマーの文脈において言及する領域Y'であってもよい。いくつかの態様において、領域Y'などの、RNアーゼを動員することができる連続配列のサイズは、より大きい、例えば10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20ヌクレオチドのユニットであってもよい。
【０１５９】
EP 1 222 309は、RNアーゼH活性を判定するためのインビトロでの方法を提供しており、これを用いてRNアーゼHを動員する能力を判定してもよい。オリゴマーは、相補的RNA標的と共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、同じ塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含み、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマーの間にホスホロチオエート連結基を有する、DNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の少なくとも1％、例えば少なくとも5％、例えば少なくとも10％または20％を超える初期速度を有するならば、RNアーゼHを動員することができると見なされる。
【０１６０】
いくつかの態様において、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNアーゼHと共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、RNアーゼHの初期速度が、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する、等価のDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の1％未満、例えば5％未満、例えば10％未満または20％未満であれば、RNアーゼHを動員することが基本的にできないと見なされる。
【０１６１】
他の態様において、オリゴマーは、相補的RNA標的、およびRNアーゼHと共に提供された場合に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法を用い、pmol/l/分で測定して、RNアーゼHの初期速度が、2'置換はなく、オリゴヌクレオチド中のすべてのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する、等価のDNAのみのオリゴヌクレオチドを用いて判定した初期速度の少なくとも20％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも80％であれば、RNアーゼHを動員することができると見なされる。
【０１６２】
典型的には、相補的標的RNAと共に二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる、連続ヌクレオチドユニットを形成するオリゴマーの領域は、RNA標的と共にDNA/RNA様二重鎖を形成するヌクレオチドユニットからなる。第1の領域などの、本発明のオリゴマーは、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類縁体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでもよく、かつ、例えば、ギャップマー、ヘッドマーまたはテールマーの形であってもよい。
【０１６３】
「ヘッドマー」は、領域X'およびそれに連続する領域Y'を含むオリゴマーと定義され、領域Y'の最も5'端のモノマーが領域X'の最も3'端のモノマーに連結されている。領域X'は非RNアーゼ動員ヌクレオシド類縁体の連続配列を含み、領域Y'はRNアーゼによって認識可能かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類縁体モノマーの連続配列（少なくとも7つの連続モノマーなどの）を含む。
【０１６４】
「テールマー」は、領域X'およびそれに連続する領域Y'を含むオリゴマーと定義され、領域Yの最も5'端のモノマーが領域X'の最も3'端のモノマーに連結されている。領域X'はRNアーゼによって認識可能かつ切断可能なDNAモノマーまたはヌクレオシド類縁体モノマーの連続配列（少なくとも7つの連続モノマーなどの）を含み、領域X'は非RNアーゼ動員ヌクレオシド類縁体の連続配列を含む。
【０１６５】
いくつかの態様において、オリゴマーの標的領域に対する親和性を増強することに加えて、いくつかのヌクレオシド類縁体はRNアーゼ（例えば、RNアーゼH）結合および切断も仲介する。α-L-LNA（BNA）モノマーはRNアーゼH活性をある程度まで動員するため、いくつかの態様において、α-L-LNAモノマーを含むオリゴマーのギャップ領域（例えば、本明細書において言及する領域Y'）は、RNアーゼHによって認識可能かつ切断可能なより少数のモノマーからなり、ミックスマー構造により高い柔軟性が導入される。
【０１６６】
ギャップマー設計
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、LNAギャップマーを含むか、またはLNAギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNアーゼHなどのRNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列、例えば本明細書において領域Y'（Y'）と呼ぶ、少なくとも5、6または7個のDNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、ここで領域Y'は5'および3'の両方で、親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体の領域（これらの領域はそれぞれ領域X'（X'）およびZ'（Z'）と呼ばれる）が、（RNアーゼを動員することができるヌクレオチドの連続配列の5'および3'で）隣接している。ギャップマーの例はWO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。本発明のLNAギャップマーオリゴマーは、領域X'またはZ'に少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、領域X'に少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび領域Z'に少なくとも1つのLNAヌクレオチドを含む。
【０１６７】
いくつかの態様において、RNアーゼを動員することができるモノマーは、DNAモノマー、アルファ-L-LNAモノマー、C4'アルキル化DNAモノマー（PCT/EP2009/050349およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）、およびUNA（非連結核酸）ヌクレオチド（Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）からなる群より選択される。UNAは、典型的には、リボースのC2-C3 C-C結合が除去されて、非ロックド「糖」残基を形成する、非ロックド核酸である。好ましくは、ギャップマーは、式（5'から3'）、X'-Y'-Z'の（ポリ）ヌクレオチド配列を含み、ここで：領域X'（X'）（5'領域ウィング）は少なくとも1個の高親和性ヌクレオチド類縁体、例えば少なくとも1個のLNAユニット、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットからなるか、またはそれらを含み、かつ；領域Y'（Y'）はRNアーゼを動員することができる（mRNA標的などの、相補的RNA分子との二重鎖に形成されると）少なくとも5個の連続ヌクレオチド、例えばDNAヌクレオチドからなるか、またはそれらを含み、かつ；領域Z'（Z'）（3'領域）は少なくとも1個の高親和性ヌクレオチド類縁体、例えば少なくとも1個のLNAユニット、例えば1〜6個の親和性増強ヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットからなるか、またはそれらを含む。
【０１６８】
いくつかの態様において、領域X'は1、2、3、4、5もしくは6個のLNAユニット、例えば2〜5個のLNAユニット、例えば3個もしくは4個のLNAユニットを含むか、もしくはそれらからなり；かつ/または領域Z'は1、2、3、4、5もしくは6個のLNAユニット、例えば2〜5個のLNAユニット、例えば3個もしくは4個のLNAユニットからなるか、もしくはそれらを含む。
【０１６９】
いくつかの態様において、領域X'は1、2、3、4、5もしくは6個の2'置換ヌクレオチド類縁体、例えば2'MOEを含み；かつ/または領域Z'は1、2、3、4、5もしくは6個の2'置換ヌクレオチド類縁体、例えば2'MOEユニットを含む。
【０１７０】
いくつかの態様において、2'位の置換基はF；CF3、CN、N3、NO、NO2、O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-もしくはNアルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル、O-アルキル-N-アルキルもしくはN-アルキル-O-アルキルからなる群より選択され、ここでアルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換または無置換C1-C10アルキルまたはC2-C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。2'置換基の例には、nが1〜約10である、O(CH2)OCH3、およびO(CH2)NH2、例えば、MOE、DMAOE、DMAEOEが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７１】
いくつかの態様において、Y'はRNアーゼを動員することができる5、6、7、8、9、10、11もしくは12個の連続ヌクレオチド、またはRNアーゼを動員することができる6〜10個、もしくは7〜9個、例えば8個の連続ヌクレオチドからなるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、領域Y'は少なくとも1個のDNAヌクレオチドユニット、例えば1〜12個のDNAユニット、好ましくは4〜12個のDNAユニット、より好ましくは6〜10個のDNAユニット、例えば7〜10のDNAユニット、例えば8、9または10個のDNAユニットからなるか、またはそれらを含む。
【０１７２】
いくつかの態様において、領域X'は3個または4個のヌクレオチド類縁体、例えばLNAからなり、領域X'は7、8、9または10個のDNAユニットからなり、かつ領域Z'は3個または4個のヌクレオチド類縁体、例えばLNAからなる。そのような設計には（X'-Y'-Z'）3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3が含まれる。
【０１７３】
さらなるギャップマー設計はWO2004/046160において開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。WO2008/113832は、参照により本明細書に組み入れられている米国特許仮出願第60/977,409号からの優先権を主張し、「ショートマー」ギャップマーオリゴマーに言及している。いくつかの態様において、本明細書において提示するオリゴマーは、そのようなショートマーギャップマーであってもよい。
【０１７４】
いくつかの態様において、オリゴマー、例えば、領域X'は、合計10、11、12、13または14ヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列からなり、ここで連続ヌクレオチド配列は式（5'-3'）、X'-Y'-Z'を含むか、またはこの式のものであり、ここで：X'は1、2または3個の親和性増強ヌクレオチド類縁体ユニット、例えばLNAユニットからなり；Y'は、相補的RNA分子（mRNA標的などの）との二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる7、8または9個の連続ヌクレオチドユニットからなり；かつZ'は1、2または3個の親和性増強ヌクレオチド類縁体ユニット、例えばLNAユニットからなる。
【０１７５】
いくつかの態様においてオリゴマーは、合計10、11、12、13、14、15または16ヌクレオチドユニットの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は式（5'-3'）、X'-Y'-Z'を含むか、またはこの式のものであり、ここで：X'は1、2、3または4個のLNAユニットを含み；Y'は、相補的RNA分子（mRNA標的などの）との二重鎖に形成されると、RNアーゼを動員することができる7、8、9または10個の連続ヌクレオチドユニット、例えば、DNAヌクレオチドからなり；かつZ'は1、2、3または4個のLNAユニットを含む。
【０１７６】
いくつかの態様において、X'は1個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、X'は2個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、X'は3個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は1個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は2個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Z'は3個のLNAユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は7個のヌクレオチドユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は8個のヌクレオチドユニットからなる。いくつかの態様において、Y'は9個のヌクレオチドユニットからなる。一定の態様において、領域Y'は10個のヌクレオシドモノマーからなる。一定の態様において、領域Y'は1〜10個のDNAモノマーからなるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、Y'は1〜9個のDNAユニット、例えば2、3、4、5、6、7、8または9個のDNAユニットを含む。いくつかの態様において、Y'はDNAユニットからなる。いくつかの態様において、Y'はアルファ-L立体配置の少なくとも1個のLNAユニット、例えばアルファ-L立体配置の2、3、4、5、6、7、8または9個のLNAユニットを含む。いくつかの態様において、Y'は少なくとも1個のアルファ-L-オキシLNAユニットを含み、またはここでアルファ-L立体配置のすべてのLNAユニットはアルファ-L-オキシLNAユニットである。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'中に存在するヌクレオチドの数は（ヌクレオチド類縁体ユニット-領域Y'-ヌクレオチド類縁体ユニット）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1からなる群より選択される。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'中のヌクレオチドの数は：2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択される。一定の態様において、領域X'およびY'のそれぞれは3個のLNAモノマーからなり、かつ領域Y'は8または9または10個のヌクレオシドモノマー、好ましくはDNAモノマーからなる。いくつかの態様において、X'およびZ'はいずれも、それぞれ2個のLNAユニットからなり、かつY'は8または9個のヌクレオチドユニット、好ましくはDNAユニットからなる。様々な態様において、他のギャップマー設計には、領域X'および/またはZ'が3、4、5または6個のヌクレオシド類縁体、例えば2'-O-メトキシエチル-リボース糖（2'-MOE）を含むモノマーまたは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含むモノマーからなり、かつ領域Y'が8、9、10、11または12個のヌクレオシド、例えばDNAモノマーからなるものであって、領域X'-Y'-Z'は3-9-3、3-10-3、5-10-5または4-12-4モノマーを有するものが含まれる。さらなるギャップマー設計はWO 2007/146511A2に開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７７】
本明細書において報告するギャップマー設計において、ギャップ領域（Y'）は1箇所または複数箇所の立体特異的ホスホロチオエート連結を含んでもよく、かつギャップ領域の残りのヌクレオシド間連結は、例えば、非立体特異的ヌクレオシド間連結であってもよく、または立体的に規定されたホスホロチオエート連結であってもよい。
【０１７８】
ヌクレオチド間連結
本発明の方法によって同定されるオリゴマーは、少なくとも1箇所の立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。治療のために用いられる化合物の大多数はホスホロチオエートヌクレオチド間連結を用いるが、他のヌクレオシド間連結を用いることもできる。しかし、いくつかの態様において、本発明のオリゴマーのすべてのヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。いくつかの態様において、ギャップ領域中の連結はすべてホスホロチオエートであり、かつウィング領域のヌクレオシド間連結はホスホロチオエートまたはホスホジエステル連結のいずれであってもよい。
【０１７９】
本明細書に記載のオリゴマーのヌクレオシドモノマーは［ヌクレオシド間］連結基を介して一緒に結合される。適切には、各モノマーは3'隣接モノマーに連結基を介して連結される。
【０１８０】
当業者であれば、本発明の文脈において、オリゴマーの末端の5'モノマーは5'連結基を含まないが、5'末端基を含んでもよく、または含まなくてもよいことを理解するであろう。
【０１８１】
「連結基」または「ヌクレオチド間連結」なる用語は、2個のヌクレオチドを一緒に共有結合することができる基を意味することが意図される。具体的かつ好ましい例には、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が含まれる。
【０１８２】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を、連結基を介して一緒に結合する。適切には、各ヌクレオチドを、連結基を介して3'隣接ヌクレオチドに連結する。
【０１８３】
適切なヌクレオチド間連結には、WO2007/031091内に挙げられているもの、例えば、WO2007/031091（参照により本明細書に組み入れられる）の34ページの最初のパラグラフに挙げられているヌクレオチド間連結が含まれる。
【０１８４】
いくつかの態様において、ヌクレオチド間連結をその通常のホスホジエステルからヌクレアーゼの攻撃に対してより抵抗性のもの、例えばホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへと修飾することが望ましく−これら2種類の連結はRNアーゼHによって切断可能であり、標的遺伝子の発現を低減する際のアンチセンス阻害の経路も可能にする。
【０１８５】
本明細書において提供される適切な硫黄（S）含有ヌクレオチド間連結、例えばホスホロチオエートまたはホスホジチオエートが好ましいこともある。
【０１８６】
ギャップマーのために、オリゴマー中のヌクレオチド間連結は、標的化RNAのRNアーゼH切断を可能にするために、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであってもよい。ヌクレアーゼ抵抗性の改善、および製造の容易さなどの他の理由のために、ホスホロチオエートが通常は好ましい。
【０１８７】
WO09124238は、中性ヌクレオシド間連結により3'または5'末端に連結された少なくとも1個の二環式ヌクレオシド（LNA）を有するオリゴマー化合物に言及している。したがって、本発明のオリゴマーは、1つまたは複数のホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタールまたはチオホルムアセタールなどの、中性ヌクレオシド間連結により3'または5'末端に連結された少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有してもよい。残りの連結はホスホロチオエートであってもよい。
【０１８８】
立体制御されたモノマー
立体制御されたモノマーは、オリゴヌクレオチド中の立体的に規定されたホスホロチオエートヌクレオシド間連結、すなわちSpまたはRpのいずれかを付与する、オリゴヌクレオチド合成において用いられるモノマーである。いくつかの態様において、モノマーはホスホラミダイトなどのアミダイトであってもよい。したがって、モノマーは、いくつかの態様において、立体制御性/制御されたホスホラミダイトなどの、立体制御性/制御されたアミダイトであってもよい。適切なモノマーは実施例、またはOka et al., J. AM. CHEM. SOC. 2008, 130, 16031-16037 9 16031において提供される。同様に、WO 10064146、WO 11005761、WO 13012758、WO 14010250、WO 14010718、WO 14012081、およびWO 15107425も参照されたい。立体制御された/立体制御性なる用語は本明細書において交換可能に用いられ、立体特異的/立体的に特定されたまたは立体的に規定されたモノマーと呼んでもよい。
【０１８９】
立体制御されたモノマーは、したがって、立体制御された「ホスホロチオエート」モノマーと呼んでもよいため。立体制御された、および立体制御性、なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。いくつかの態様において、立体制御性モノマーは、オリゴヌクレオチド合成中に硫化剤と共に用いる場合、新しく組み込んだヌクレオシドの3'側（または伸長したオリゴヌクレオチド鎖の5'側）に立体的に規定されたヌクレオシド間連結を生成する。
【０１９０】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類縁体
いくつかの態様において、「ヌクレオシド類縁体」および「ヌクレオチド類縁体」なる用語は、交換可能に用いられる。
【０１９１】
本明細書において用いられる「ヌクレオチド」なる用語は、糖部分、塩基部分およびホスフェートまたはホスホロチオエートヌクレオチド間連結基などの共有結合された基（連結基）を含むグリコシドを意味し、DNAまたはRNAなどの天然ヌクレオチド、および本明細書において「ヌクレオチド類縁体」とも呼ぶ、修飾された糖および/または塩基部分を含む非天然ヌクレオチドの両方を含む。本明細書において、単一ヌクレオチド（ユニット）はモノマーまたは核酸ユニットと呼んでもよい。
【０１９２】
生化学の分野において、「ヌクレオシド」なる用語は一般に、糖部分および塩基部分を含むグリコシドを指すために用い、したがってオリゴマーのヌクレオチドの間でヌクレオチド間連結により共有結合されているヌクレオチドユニットを指す場合に用いてもよい。バイオテクノロジーの分野において、「ヌクレオチド」なる用語は、核酸モノマーまたはユニットを指すために用いることが多く、したがって、オリゴヌクレオチドの文脈において、塩基を指すこともあり−例えば、「ヌクレオチド配列」は、典型的には核酸塩基配列を意味する（すなわち、糖骨格およびヌクレオシド間連結の存在が暗に示される）。同様に、特にヌクレオシド間連結基の1つまたは複数が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」なる用語は「ヌクレオシド」を指すこともあり、例えば、ヌクレオシド間の連結の存在または性質を明記している場合であっても、「ヌクレオチド」なる用語を用いてもよい。
【０１９３】
当業者であれば理解するであろうとおり、オリゴヌクレオチドの5'末端ヌクレオチドは5'ヌクレオチド間連結基を含まないが、5'末端基を含んでもよく、または含まなくてもよい。
【０１９４】
非天然ヌクレオチドには、二環式ヌクレオチドなどの修飾糖部分を有するヌクレオチド、または2'置換ヌクレオチドなどの2'修飾ヌクレオチドが含まれる。
【０１９５】
「ヌクレオチド類縁体」は、糖および/または塩基部分の修飾による、DNAまたはRNAヌクレオチドなどの天然ヌクレオチドの変種である。類縁体は、原理的には、オリゴヌクレオチドの文脈において、天然ヌクレオチドに対して単に「サイレント」または「等価」であり得、すなわち、オリゴヌクレオチドが標的遺伝子発現を阻害するようはたらくやり方に、機能的効果を持たない。そのような「等価」の類縁体は、それにもかかわらず、例えば、製造がより容易もしくは安価である、または保存もしくは製造条件に対してより安定である、またはタグもしくは標識に相当するならば、有用であり得る。しかし、好ましくは、類縁体は、例えば、標的に対する高い結合親和性および/または細胞内ヌクレアーゼに対する高い抵抗性および/または細胞への輸送の高い容易さを生じることにより、オリゴマーが発現を阻害するようはたらくやり方に機能的効果を有する。ヌクレオシド類縁体の具体例は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213によって記載され、以下のスキーム1に示される。
0006689279.tif 000004
【０１９６】
したがって、オリゴマーは、天然ヌクレオチド−好ましくは2'-デオキシヌクレオチド（本明細書において一般に「DNA」と呼ぶ）であるが、おそらくはリボヌクレオチド（本明細書において一般に「RNA」と呼ぶ）、またはそのような天然ヌクレオチドと、1つもしくは複数の非天然ヌクレオチド、すなわちヌクレオチド類縁体との組み合わせの単純な配列を含むか、またはそれからなってもよい。そのようなヌクレオチド類縁体はオリゴマーの標的配列に対する親和性を適切に増強し得る。
【０１９７】
適切かつ好ましいヌクレオチド類縁体の例は、WO2007/031091により提供されるか、またはその中で言及される。
【０１９８】
オリゴマー、例えばLNAまたは2'-置換糖における親和性増強ヌクレオチド類縁体の組み込みは、特異的に結合するオリゴマーのサイズ低下を可能にし得、非特異的または異常な結合が起こる前のオリゴマーのサイズの上限も低下させ得る。本発明の方法のオリゴマーは、親および子のオリゴヌクレオチドである。
【０１９９】
いくつかの態様において、親および子のオリゴヌクレオチドは少なくとも1個のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの態様において、親および子のオリゴヌクレオチドは少なくとも2個のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの態様において、親および子のオリゴヌクレオチドは3〜8個のヌクレオチド類縁体、例えば、6または7個のヌクレオチド類縁体を含む。いくつかの態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1個はロックド核酸（LNA）であり；例えば、ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも3個、または少なくとも4個、または少なくとも5個、または少なくとも6個、または少なくとも7個、または8個はLNAであり得る。いくつかの態様において、すべてのヌクレオチド類縁体はLNAであり得る。
【０２００】
ヌクレオチドだけからなる、好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する場合、その配列によって規定されるオリゴマーは、該配列中に存在するヌクレオチドの1つまたは複数の代わりに、オリゴマー/標的二重鎖の二重鎖安定性/Tmを上げる、対応するヌクレオチド類縁体、例えばLNAユニットまたは他のヌクレオチド類縁体（すなわち、親和性増強ヌクレオチド類縁体）を含んでもよいことが理解されるであろう。
【０２０１】
ヌクレオチドのそのような修飾の例には、糖部分を修飾して、結合親和性を増強し、同時にヌクレアーゼ抵抗性の増大を提供し得る、2'置換基を提供すること、または架橋（ロックド核酸）構造を生じることが含まれる。
【０２０２】
好ましいヌクレオチド類縁体は、LNA、例えばオキシ-LNA（ベータ-D-オキシ-LNA、およびアルファ-L-オキシ-LNAなどの）、および/またはアミノ-LNA（ベータ-D-アミノ-LNAおよびアルファ-L-アミノ-LNAなどの）および/またはチオ-LNA（ベータ-D-チオ-LNAおよびアルファ-L-チオ-LNAなどの）および/またはENA（ベータ-D-ENAおよびアルファ-L-ENAなどの）である。最も好ましいのはベータ-D-オキシ-LNAである。
【０２０３】
いくつかの態様において、本発明の方法のオリゴマー内（本明細書において言及する領域X'およびY'内などの）に存在するヌクレオチド類縁体は、独立に、例えば：2'-O-アルキル-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、アラビノ核酸（ANA）ユニット、2'-フルオロ-ANAユニット、HNAユニット、INA（インターカレーティング核酸−Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30: 4918-4925、参照により本明細書に組み入れられる）ユニットおよび2'MOEユニットから選択される。いくつかの態様において、本発明の方法のオリゴマー内には前述のヌクレオチド類縁体の型の1つ、またはその連続ヌクレオチド配列だけが存在する。
【０２０４】
いくつかの態様において、ヌクレオチド類縁体は2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマーまたはLNAヌクレオチド類縁体であり、したがって本発明のオリゴヌクレオチドは、これら3つの型の類縁体から独立に選択されるヌクレオチド類縁体を含んでもよく、または3つの型から選択される類縁体の1つの型だけを含んでもよい。いくつかの態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1つは2'-MOE-RNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-MOE-RNAヌクレオチドユニットである。いくつかの態様において、前記ヌクレオチド類縁体のうち少なくとも1つは2'-フルオロDNA、例えば2、3、4、5、6、7、8、9または10個の2'-フルオロ-DNAヌクレオチドユニットである。
【０２０５】
いくつかの態様において、本発明の方法のオリゴマーは、少なくとも1個のロックド核酸（LNA）ユニット、例えば1、2、3、4、5、6、7、または8個のLNAユニット、例えば3〜7個、もしくは4〜8個のLNAユニット、または3、4、5、6もしくは7個のLNAユニットを含む。いくつかの態様において、すべてのヌクレオチド類縁体はLNAである。いくつかの態様において、オリゴマーはベータ-D-オキシ-LNA、および以下のLNAユニットの1つまたは複数の両方を含んでもよい：ベータ-Dもしくはアルファ-L配置のいずれか、またはその組み合わせのチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および/またはENA。いくつかの態様において、すべてのLNAシトシンユニットは5'メチル-シトシンである。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーはLNAおよびDNAユニットの両方を含んでもよい。好ましくは、LNAおよびDNAユニットを合わせた合計は10〜25個、例えば10〜24個、好ましくは10〜20個、例えば10〜18個、さらにより好ましくは12〜16個である。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオチド配列、例えば連続ヌクレオチド配列は、少なくとも1個のLNAからなり、残りのヌクレオチドユニットはDNAユニットである。いくつかの態様において、オリゴマーは、任意でホスホロチオエートなどの修飾ヌクレオチド間連結を有する、LNAヌクレオチド類縁体および天然ヌクレオチド（例えばRNAまたはDNA、最も好ましくはDNAヌクレオチド）だけを含む。
【０２０６】
「核酸塩基」なる用語は、ヌクレオチドの塩基部分を意味し、天然ならびに非天然変種の両方を含む。したがって「核酸塩基」は、公知のプリンおよびピリミジン複素環のみならず、その複素環式類縁体および互変異性体も含む。
【０２０７】
核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンが含まれるが、それらに限定されない。
【０２０８】
いくつかの態様において、オリゴマー内に存在する核酸塩基のうち少なくとも1つは、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾核酸塩基である。
【０２０９】
LNA
「LNA」なる用語は、「ロックド核酸」として公知の、二環式ヌクレオシド類縁体を意味する。これはLNAモノマーを指してもよく、または、「LNAオリゴヌクレオチド」の文脈で用いる場合、LNAは1つまたは複数のそのような二環式ヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチドを指す。LNAヌクレオチドは、例えば、以下に記載するビラジカルR4* - R2*として示す、リボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基（架橋などの）の存在によって特徴付けられる。
【０２１０】
本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いられるLNAは、好ましくは、一般式Iの構造、ならびにその塩基性塩および酸付加塩を有する：
0006689279.tif 000005
ここで、すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく；
式中、Xは-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-から選択され、例えば、いくつかの態様において、-O-であり；
Bは水素、置換されていてもよいC1-4-アルコキシ、置換されていてもよいC1-4-アルキル、置換されていてもよいC1-4-アシルオキシ、天然および核酸塩基類縁体を含む核酸塩基、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され；好ましくは、Bは核酸塩基または核酸塩基類縁体であり；
Pは、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または5'末端基を示し、そのようなヌクレオチド間連結または5'末端基は任意で置換基R5または同等に適用可能な置換基R5*を含み；
P*は、隣接モノマーへのヌクレオチド間連結、または3'末端基を示し；
R4*およびR2*は一緒に、-C(RaRb)-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-、および>C=Zから選択される1〜4つの基/原子からなる二価のリンカー基を示し、ここでZは-O-、-S-、および-N(Ra)-から選択され、かつRaおよびRbはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、置換されていてもよいC1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく、ここですべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、かつ；
存在する置換基R1*、R2、R3、R5、R5*、R6およびR6*はそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基は一緒に、オキソ、チオキソ、イミノ、または置換されていてもよいメチレンを示してもよく；；ここでRNは水素およびC1-4-アルキルから選択され、かつここで2つの隣接（非ジェミナル）置換基はさらなる結合を示して二重結合をもたらしてもよく；かつRN*は、存在し、ビラジカルに関与しない場合、水素およびC1-4-アルキルから選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
【０２１１】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、C(RaRb)-C(RaRb)-、C(RaRb)-O-、C(RaRb)-NRa-、C(RaRb)-S-、およびC(RaRb)-C(RaRb)-O-からなる群より選択される基からなるビラジカルを示し、ここで各RaおよびRbは任意で独立に選択されてもよい。いくつかの態様において、RaおよびRbは、任意で独立に水素およびC1-6アルキルからなる群より選択されてもよく、例えばメチル、例えば水素である。
【０２１２】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH2OCH3)-（2'O-メトキシエチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０２１３】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH2CH3)-（2'O-エチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０２１４】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、R-またはS-配置のいずれかの、ビラジカル-O-CH(CH3)-を示す。いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカル-O-CH2-O-CH2-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０２１５】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカル-O-NR-CH3-（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）を示す。
【０２１６】
いくつかの態様において、LNAユニットは以下の群：
0006689279.tif 000006
から選択される構造を有する。
【０２１７】
いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
【０２１８】
いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。
【０２１９】
いくつかの態様において、R1*、R2、R3は独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
【０２２０】
いくつかの態様において、R1*、R2、R3は水素である。
【０２２１】
いくつかの態様において、R5およびR5*はそれぞれ独立にH、-CH3、-CH2-CH3、-CH2-O-CH3、および-CH=CH2からなる群より選択される。適切には、いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかは水素であるが、他の基（それぞれR5またはR5*）はC1-5アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C1-6アルキル、置換C2-6アルケニル、置換C2-6アルキニルまたは置換アシル（-C(=O)-）からなる群より選択され；ここで各置換された基はハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C2-6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ,J2またはN(H)C(=X)N(H)J2から独立に選択される置換基で一または多置換されており、ここでXはOまたはSであり；かつ各J1およびJ2は、独立に、H、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキル、置換C1-6アミノアルキルまたは保護基である。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかは置換C1-6アルキルである。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかは置換メチレンであり、ここで好ましい置換基にはF、NJ1J2、N3、CN、OJ1、SJ1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ,J2またはN(H)C(O)N(H)J2から独立に選択される1つまたは複数の基が含まれる。いくつかの態様において、各J1およびJ2は、独立にHまたはC1-6アルキルである。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかはメチル、エチルまたはメトキシメチルである。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかはメチルである。さらなる態様において、R5またはR5*のいずれかはエチレニルである。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかは置換アシルである。いくつかの態様において、R5またはR5*のいずれかはC(=O)NJ1J2である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような5'修飾二環式ヌクレオチドはWO 2007/134181に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２２】
いくつかの態様において、Bは、核酸塩基類縁体および天然核酸塩基、例えばプリンもしくはピリミジン、または置換プリンもしくは置換ピリミジン、例えば本明細書において言及する核酸塩基、例えばアデニン、シトシン、チミン、アデニン、ウラシルからなる群より選択される核酸塩基、および/または修飾もしくは置換核酸塩基、例えば5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、5-プロピニル-ウラシル、2'チオ-チミン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、および2,6-ジアミノプリンを含む、核酸塩基である。
【０２２３】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、-C(RaRb)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-O-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-、-C(RaRb)-O-C(RcRd)-O-、-C(RaRb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-C(ReRf)-、-C(Ra)=C(Rb)-C(RcRd)-、-C(RaRb)-N(Rc)-、-C(RaRb)-C(RcRd)-N(Re)-、-C(RaRb)-N(Rc)-O-、および-C(RaRb)-S-、-C(RaRb)-C(RcRd)-S-から選択されるビラジカルを示し、ここでRa、Rb、Rc、Rd、Re、およびRfはそれぞれ独立に水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドから選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつ2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよい。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
【０２２４】
さらなる態様において、R4*およびR2*は一緒に、-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-NH-、-CH2-N(CH3)-、-CH2-CH2-O-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-CH2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH(CH3)-、-CH=CH-CH2-、-CH2-O-CH2-O-、-CH2-NH-O-、-CH2-N(CH3)-O-、-CH2-O-CH2-、-CH(CH3)-O-、および-CH(CH2-O-CH3)-O-、ならびに/または、-CH2-CH2-、および-CH=CH-から選択されるビラジカル（二価の基）を示す。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。
【０２２５】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカルC(RaRb)-N(Rc)-O-を示し、ここでRaおよびRbは独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素であり、かつ；ここでRcは水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。
【０２２６】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカルC(RaRb)-O-C(RcRd)-O-を示し、ここでRa、Rb、Rc、およびRdは独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され、例えば水素である。
【０２２７】
いくつかの態様において、R4*およびR2*はビラジカル-CH(Z)-O-を形成し、ここでZはC1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、置換C1-6アルキル、置換C2-6アルケニル、置換C2-6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオールまたは置換チオからなる群より選択され；かつここで置換された基はそれぞれ独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2およびCNから独立に選択される、任意で保護された置換基で一または多置換されており、ここで各J1、J2およびJ3は、独立に、HまたはC1-6アルキルであり、かつXはO、SまたはNJ1である。いくつかの態様において、ZはC1-6アルキルまたは置換C1-6アルキルである。いくつかの態様において、Zはメチルである。いくつかの態様において、Zは置換C1-6アルキルである。いくつかの態様において、前記置換基はC1-6アルコキシである。いくつかの態様において、ZはCH3OCH2-である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはUS 7,399,845において開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの態様において、R1*、R2、R3 *は水素であり、かつR5、R5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181に記載のとおり、水素以外であってもよい。
【０２２８】
いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、架橋中に置換アミノ基を含むビラジカルを示し、例えばビラジカル-CH2-N(Rc)-からなるか、またはそれを含み、ここでRcはC1-12アルキルオキシである。いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカル-Cq3q4-NOR-を示し、ここでq3およびq4は独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択され；ここで各置換された基は、独立に、ハロゲン、OJ1、SJ1、NJ1J2、COOJ1、CN、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2またはN(H)C(=X=N(H)J2から独立に選択される置換基で一または多置換されており、ここでXはOまたはSであり；かつJ1およびJ2は、それぞれ独立に、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルまたは保護基である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはWO2008/150729に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの態様において、R1*、R2、R3は水素であり、かつR5、R5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181に記載のとおり、水素以外であってもよい。いくつかの態様において、R4*およびR2*は一緒に、ビラジカル（二価の基）C(RaRb)-O-を示し、ここでRaおよびRbはそれぞれ独立にハロゲン、C1-C12アルキル、置換C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換C1-C12アルコキシ、OJ1 SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2であり；またはRaおよびRbは一緒に、=C(q3)(q4)であり；q3およびq4はそれぞれ、独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキルまたは置換C1-C12アルキルであり；各置換された基は、独立に、ハロゲン、C1-C6アルキル、置換C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換C2-C6アルキニル、OJ1、SJ1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)NJ1J2、C(=O)J1、O-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2から独立に選択される置換基で一または多置換されており、かつ；各J1およびJ2は、独立に、H、C1-C6アルキル、置換C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換C2-C6アルキニル、C1-C6アミノアルキル、置換C1-C6アミノアルキルまたは保護基である。そのような化合物はWO2009006478Aに開示されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２９】
いくつかの態様において、R4*およびR2*はビラジカル-Q-を形成し、ここでQはC(q1)(q2)C(q3)(q4)、C(q1)=C(q3)、C[=C(q1)(q2)]-C(q3)(q4)またはC(q1)(q2)-C[=C(q3)(q4)]であり；q1、q2、q3、q4はそれぞれ独立に、H、ハロゲン、C1-12アルキル、置換C1-12アルキル、C2-12アルケニル、置換C1-12アルコキシ、OJ1、SJ1、SOJ1、SO2J1、NJ1J2、N3、CN、C(=O)OJ1、C(=O)-NJ1J2、C(=O)J1、-C(=O)NJ1J2、N(H)C(=NH)NJ1J2、N(H)C(=O)NJ1J2またはN(H)C(=S)NJ1J2であり；各J1およびJ2は、独立に、H、C1-6アルキル、C2-6アルケニル、C2-6アルキニル、C1-6アミノアルキルまたは保護基であり；かつ、任意で、ここでQがQC(q1)(q2)(q3)(q4)であり、かつq3またはq4の1つがCH3である場合、q3もしくはq4の他方またはq1およびq2の1つのうち少なくとも1つはH以外である。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよい。そのような二環式ヌクレオチドはWO2008/154401に開示されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は独立に水素、ハロゲン、C1-6アルキル、置換C1-6アルキル、C2-6アルケニル、置換C2-6アルケニル、C2-6アルキニルまたは置換C2-6アルキニル、C1-6アルコキシル、置換C1-6アルコキシル、アシル、置換アシル、C1-6アミノアルキルまたは置換C1-6アミノアルキルからなる群より選択される。いくつかの態様において、R1*、R2、R3、R5、R5*は水素である。いくつかの態様において、R1*、R2、R3は水素であり、かつR5、R5*の1つまたは両方は、前述およびWO 2007/134181またはWO2009/067647に記載（アルファ-L-二環式核酸類縁体）のとおり、水素以外であってもよい。
【０２３０】
さらなる二環式ヌクレオシド類縁体およびそれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドにおける使用は、WO2011 115818、WO2011/085102、WO2011/017521、WO09100320、WO10036698、WO09124295およびWO09006478に開示されている。そのようなヌクレオシド類縁体は、いくつかの局面において、本発明の化合物において有用であり得る。
【０２３１】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において用いるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する：
0006689279.tif 000007
式中、Yは-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)および/または-CH2-からなる群より選択され；ZおよびZ*は独立にヌクレオチド間連結、RH、末端基または保護基の間で選択され；Bは天然または非天然ヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択され；Ra、Rb Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性基、熱化学的活性基、キレート化基、レポーター基、およびリガンドからなる群より選択され、ここでアリールおよびヘテロアリールは置換されていてもよく、かつここで2つのジェミナルな置換基RaおよびRbは一緒に、置換されていてもよいメチレン（=CH2）を示してもよく；かつRHは水素およびC1-4-アルキルから選択される。いくつかの態様において、Ra、Rb、Rc、RdおよびReは、任意で、独立に、水素およびC1-6アルキルからなる群より選択され、例えばメチルである。すべてのキラル中心について、不斉基はRまたはS配向のいずれで見出されてもよく、例えば、2つの例示的な立体化学異性体にはベータ-Dおよびアルファ-Lイソ型が含まれ、これらは以下のとおりに例示されうる。
0006689279.tif 000008
【０２３２】
具体的な例示的LNAユニットを以下に示す。
0006689279.tif 000009
【０２３３】
「チオ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYがSまたは-CH2-S-から選択される、ロックドヌクレオチドを含む。チオ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。
【０２３４】
「アミノ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-から選択される、ロックドヌクレオチドを含み、ここでRは水素およびC1-4-アルキルから選択される。アミノ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。
【０２３５】
「オキシ-LNA」なる用語は、上の一般式中のYが-O-を表す、ロックドヌクレオチドを含む。オキシ-LNAは、ベータ-Dおよびアルファ-L配置の両方であり得る。
【０２３６】
「ENA」なる用語は、上の一般式中のYが-CH2-O-（ここで-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'位に連結している）である、ロックドヌクレオチドを含む。Reは水素またはメチルである。
【０２３７】
いくつかの例示的態様において、LNAはベータ-D-オキシ-LNA、アルファ-L-オキシ-LNA、ベータ-D-アミノ-LNAおよびベータ-D-チオ-LNAから選択され、特にベータ-D-オキシ-LNAである。
【０２３８】
結合体
この文脈において、「結合体」なる用語は、本明細書に記載のオリゴマーの1つまたは複数の非ヌクレオチド、または非ポリヌクレオチド部分への共有結合（「結合」）によって形成される、不均一分子を示すことが意図される。非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分の例には、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー、またはその組み合わせなどの、高分子作用物質が含まれる。典型的には、タンパク質は標的タンパク質に対する抗体であり得る。典型的ポリマーはポリエチレングリコールであり得る。
【０２３９】
したがって、様々な態様において、本発明のオリゴマーは、典型的にはヌクレオチドの連続配列からなるポリヌクレオチド領域、およびさらなる非ヌクレオチド領域の両方を含んでもよい。連続ヌクレオチド配列からなる本発明のオリゴマーに言及する場合、化合物は、結合成分などの、非ヌクレオチド成分を含んでもよい。
【０２４０】
本発明の様々な態様において、オリゴマー化合物は、例えば、オリゴマー化合物の細胞への取込を増大させるために用い得る、リガンド/結合体に連結する。WO2007/031091は適切なリガンドおよび結合体を提供し、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４１】
本発明は、本明細書に記載の本発明の化合物、および該化合物と共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分を含む結合体も提供する。したがって、本発明の化合物が本明細書において開示する特定された核酸またはヌクレオチド配列からなる、様々な態様において、化合物は該化合物と共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（例えば、1つまたは複数のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体を含まない）を含んでもよい。
【０２４２】
結合（結合部分への）は、本発明のオリゴマーの活性、細胞分布または細胞への取込を増強させ得る。そのような部分には、抗体、ポリペプチド、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えば、ヘキシル-s-トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えば、ジ-ヘキサデシル-rac-グリセロールまたは1,2-ジ-o-ヘキサデシル-rac-グリセロ-3-h-ホスホン酸トリエチルアンモニウム、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ-カルボニル-オキシコレステロール部分が含まれるが、それらに限定されない。
【０２４３】
本発明のオリゴマーは、活性薬物物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ薬、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質に結合してもよい。
【０２４４】
一定の態様において、結合部分はステロール、例えばコレステロールである。
【０２４５】
様々な態様において、結合部分は、長さが、例えば、1〜50、例えば2〜20、例えば3〜10アミノ酸残基の正に荷電したペプチド、および/またはポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドなどの、正に荷電したポリマーを含むか、またはそれらからなる−WO 2008/034123を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる。適切には、ポリアルキレンオキシドなどの正に荷電したポリマーは、本発明のオリゴマーに、WO 2008/034123に記載の遊離可能なリンカーなどのリンカーを介して連結してもよい。
【０２４６】
例として、以下のGalNAc結合部分を本発明の結合体において用いてもよい。
0006689279.tif 000010
【０２４７】
本発明は、本発明のオリゴマーを含む結合体をさらに提供し、これは本発明のオリゴマーに共有結合した少なくとも1つの非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分（「結合部分」）を含む。いくつかの態様において、本発明の結合体はオリゴマーに、生体切断可能なリンカーを介して共有結合し、リンカーは、例えば、ホスホジエステル連結ヌクレオチド、例えば1〜5個のPO連結DNAヌクレオシドの領域であってもよい（WO2014/076195、参照により本明細書に組み入れられる）。好ましい結合基には、炭水化物結合体、例えばGalNAc結合体、例えば三価GalNAc結合体（例えば、WO2014/118267を参照されたく、参照により本明細書に組み入れられる）または親油性結合体、例えばステロール、例えばコレステロール（WO2014/076195、参照により本明細書に組み入れられる）が含まれる。
【０２４８】
活性化オリゴマー
本明細書において用いられる「活性化オリゴマー」なる用語は、オリゴマーの1つまたは複数の結合部分、すなわち、それ自体は核酸またはモノマーではない部分への共有結合を可能にして、本明細書に記載の結合体を形成する、少なくとも1つの官能性部分に共有結合した（すなわち、官能基化した）、本発明のオリゴマーを意味する。典型的には、官能性部分は、例えば、3'-ヒドロキシル基またはアデニン塩基の環外NH2基を介してオリゴマーに共有結合することができる化学基、好ましくは親油性であるスペーサー、および結合部分に結合することができる末端基（例えば、アミノ、スルフヒドリルまたはヒドロキシル基）を含む。いくつかの態様において、この末端基は保護されておらず、例えば、NH2基である。他の態様において、末端基は、例えば、“Protective Groups in Organic Synthesis” by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)に記載のものなどの、任意の適切な保護基で保護されている。適切なヒドロキシル保護基の例には、酢酸エステルなどのエステル、ベンジル、ジフェニルメチル、またはトリフェニルメチルなどのアラルキル基、およびテトラヒドロピラニルが含まれる。適切なアミノ保護基の例には、ベンジル、アルファ-メチルベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、およびトリクロロアセチルまたはトリフルオロアセチルなどのアシル基が含まれる。いくつかの態様において、官能性部分は自己切断性である。他の態様において、官能性部分は生体分解性である。例えば、米国特許第7,087,229号を参照されたく、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４９】
いくつかの態様において、オリゴマーの5'末端への結合部分の共有結合を可能にするために、本発明のオリゴマーを5'末端で官能基化する。他の態様において、本発明のオリゴマーを3'末端で官能基化することもできる。さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを骨格に沿って、または複素環塩基部分で官能基化することもできる。さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを、5'末端、3'末端、骨格および塩基から独立に選択される複数の位置で官能基化することもできる。
【０２５０】
いくつかの態様において、本発明の活性化オリゴマーは、官能性部分に共有結合される1つまたは複数のモノマーを合成中に組み込むことにより合成する。他の態様において、本発明の活性化オリゴマーは、官能基化していないモノマーで合成し、合成完了後にオリゴマーを官能基化する。いくつかの態様において、オリゴマーを、アミノアルキルリンカーを含むヒンダードエステルで官能基化し、ここでアルキル部分は式(CH2)wを有し、ここでwは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であり得、かつここで官能基はオリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH2)2NH）を介して連結している。
【０２５１】
他の態様において、オリゴマーを(CH2)2-スルフヒドリル（SH）リンカーを含むヒンダードエステルで官能基化し、ここでwは1〜10の範囲の整数、好ましくは約6であり、ここでアルキルアミノ基のアルキル部分は直鎖または分枝鎖であり得、かつここで官能基はオリゴマーにエステル基（-O-C(O)-(CH2)2SH）を介して連結している。
【０２５２】
いくつかの態様において、スルフヒドリル活性化オリゴヌクレオチドを、ポリエチレングリコールまたはペプチドなどのポリマー部分と結合する（ジスルフィド結合の形成を介して）。
【０２５３】
前述のヒンダードエステルを含む活性化オリゴマーは、当技術分野において公知の任意の方法により、特にPCT公報WO 2008/034122に開示される方法およびその中の実施例により合成することができ、この開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２５４】
さらに他の態様において、本発明のオリゴマーを、スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基をオリゴマー中に、実質的に米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能基化試薬、すなわち、一端にホスホラミダイトを有し、親油性スペーサー鎖を通じて保護または無保護スルフヒドリル、アミノまたはヒドロキシル基を含む他端に連結された、実質的に直鎖の試薬によって導入することにより官能基化する。そのような試薬は主にオリゴマーのヒドロキシル基と反応する。いくつかの態様において、そのような活性化オリゴマーは、オリゴマーの5'-ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。他の態様において、活性化オリゴマーは、3'-ヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。さらに他の態様において、本発明の活性化オリゴマーは、オリゴマーの骨格上のヒドロキシル基に結合した官能基化試薬を有する。さらなる態様において、本発明のオリゴマーは、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に記載の官能基化試薬の複数で官能基化し、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。そのような官能基化試薬を合成し、それらをモノマーまたはオリゴマーに組み込む方法は、米国特許第4,962,029号および第4,914,210号に開示されている。
【０２５５】
いくつかの態様において、固相結合オリゴマーの5'末端をジエニルホスホラミダイト誘導体で官能基化し、続いて脱保護したオリゴマーを、例えば、アミノ酸またはペプチドと、ディールス-アルダー付加環化反応により結合させる。
【０２５６】
様々な態様において、2'-カルバメート置換糖または2'-(O-ペンチル-N-フタルイミド)-デオキシリボース糖などの2'-糖修飾を含むモノマーの、オリゴマー中への組み込みは、オリゴマーの糖への結合部分の共有結合を容易にする。他の態様において、1つまたは複数のモノマーの2'位にアミノ含有リンカーを有するオリゴマーを、例えば、5'-ジメトキシトリチル-2'-O-(e-フタルイミジルアミノペンチル)-2'-デオキシアデノシン-3'--N,N-ジイソプロピル-シアノエトキシホスホラミダイトなどの、試薬を用いて調製する。例えば、Manoharan, et al., Tetrahedron Letters, 1991, 34, 7171参照。
【０２５７】
さらなる態様において、本発明のオリゴマーは、N6プリンアミノ基上、グアニンの環外N2上、またはシトシンのN4もしくは5位上を含む、核酸塩基上のアミン含有官能性部分を有し得る。様々な態様において、そのような官能基化は、オリゴマー合成においてすでに官能基化されている市販の試薬を用いることにより達成してもよい。
【０２５８】
いくつかの官能性部分は市販されており、例えば、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分がPierce Co.（Rockford、Ill.）から入手可能である。他の市販の連結基は5'-アミノ-修飾試薬C6および3'-アミノ修飾試薬で、いずれもGlen Research Corporation（Sterling、Va.）から入手可能である。5'-アミノ-修飾試薬C6はABI（Applied Biosystems Inc.、Foster City、Calif.）からもAminolink-2として入手可能で、3'-アミノ-修飾試薬はClontech Laboratories Inc.（Palo Alto、Calif.）からも入手可能である。いくつかの態様においていくつかの態様において。
【０２５９】
組成物
本発明のオリゴマーを、薬学的製剤および組成物中で用いてもよい。適切には、そのような組成物は薬学的に許容される希釈剤、担体、塩またはアジュバントを含む。PCT/DK2006/000512は、適切かつ好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントを提供しており−これは参照により本明細書に組み入れられる。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もPCT/DK2006/000512において提供され−これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０２６０】
適用
本発明のオリゴマーを、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として用いてもよい。
【０２６１】
研究において、そのようなオリゴマーを用いて、細胞および実験動物における標的タンパク質の合成を特異的に阻害し（典型的には、mRNAを分解または阻害し、それによりタンパク質生成を防止することにより）、それにより標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にしてもよい。
【０２６２】
診断において、オリゴマーを用いて、細胞および組織における標的の発現を、ノーザンブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーションまたは同様の技術により検出および定量してもよい。
【０２６３】
治療のために、標的の発現を調節することにより処置し得る疾患または障害を有することが疑われる動物またはヒトを、本発明のオリゴマー化合物を投与することにより処置する。さらに提供するのは、標的の発現に関連する疾患または障害を有する、または罹りやすいことが疑われる、ヒトの処置法などの、哺乳動物の処置法であって、本発明の1つまたは複数のオリゴマーまたは組成物の治療的または予防的有効量を投与することによる方法である。典型的には、本発明の結合体または薬学的組成物を有効量で投与する。
【０２６４】
本発明は、本明細書において言及する障害の処置用薬剤の製造のため、または本明細書において言及する障害の処置法のための、前述の本発明の化合物または結合体の使用も提供する。
【０２６５】
本発明は、本明細書において言及する障害の処置法であって、本明細書に記載の本発明の化合物、および/または本発明の結合体、および/または本発明の薬学的組成物を、それを必要としている患者に投与する段階を含む方法も提供する。
【０２６６】
医学的適応
本発明のオリゴマーおよび他の組成物を、標的の変異体の過剰発現または発現に関連する状態の処置のために用いることができる。
【０２６７】
本発明は、本明細書において言及する疾患、障害または状態の処置用薬剤の製造における、本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０２６８】
一般的には、本発明の1つの局面は、異常なレベルの標的に関連する状態を患っている、またはそれに罹りやすい哺乳動物の処置法であって、その哺乳動物に、1つまたは複数のLNAユニットを含む標的指向オリゴマーの治療的有効量を投与する段階を含む方法を目的とする。本発明のオリゴマー、結合体または薬学的組成物を、典型的には、有効量で投与する。
【実施例】
【０２６９】
配列
本明細書において用いる化合物は、以下の核酸塩基配列を有する。
0006689279.tif 000011
【０２７０】
実施例1
DNA 3'-O-オキサザホスホリジンモノマーの合成を、以前に記載された通りに実施した（Oka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008 130: 16031 - 16037、およびWan et al., NAR 2014, November, online publication）。
【０２７１】
LNA 3'-O-オキサザホスホリジンモノマーの合成
合成スキーム
0006689279.tif 000012
【０２７２】
α-フェニル-2-ピロリジンメタノール（P5-LおよびP5-D）を文献（Oka et al., JACS, 2008, 16031-16037.）に記載の通りに合成した。
【０２７３】
3-OAP-LNA T
0006689279.tif 000013
L-3-OAP-LNA Tの合成：
PCl3（735μL、6.30mmol）をトルエン（7mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（7mL）中のP5-L（1.12g、6.30mmol）およびNMM（1.38mL、12.6mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン（4mL）で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（8mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２７４】
THF（16mL）中の5'-ODMT-LNA-T（2.40g、4.20mmol）の溶液に、NEt3（4.10mL、29.4mmol）を加えた。反応混合物を-74℃まで冷却し、THF中の2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3（2回）、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt3 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.00g（収率30％）として単離した。
0006689279.tif 000014
【０２７５】
D-3-OAP-LNA Tの合成
PCl3（1.05mL、9.0mmol）をトルエン（12mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12mL）中のP5-D（1.13g、12mmol）およびNMM（2.06mL、24mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で1時間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（18mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２７６】
THF（30mL）中の5'-ODMT-LNA-T（3.44g、6.0mmol）の溶液に、NEt3（5.82mL、42mmol）を加えた。反応混合物を-74℃まで冷却し、THF中の2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3（2回）、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt3 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.86g（収率36％）として単離した。
0006689279.tif 000015
【０２７７】
3-OAP-LNA MeC
0006689279.tif 000016
L-3-OAP-LNA MeCの合成
PCl3（110μL、1.25mmol）をトルエン（3mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（3mL）中のP5-L（222mg、1.25mmol）およびNMM（275μL、2.5mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（5mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２７８】
THF（2.5mL）中の5'-ODMT-LNA-C（338mg、0.50mmol）の溶液に、NEt3（485μL、3.6mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、次いで蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で1.45時間撹拌した。EtOAc（30mL）を加え、反応混合物を飽和NaHCO3（2×20mL）、食塩水（20mL）で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン中EtOAc 20％〜30％＋トルエン10％＋NEt3 7％）で精製した。生成物を白色泡状物228mg（収率47％）として単離した。
0006689279.tif 000017
【０２７９】
D-3-OAP-LNA MeCの合成
PCl3（1.10mL、12.3mmol）をトルエン（10mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（10mL）中のP5-D（2.17g、12.3mmol）およびNMM（2.70mL、2.5mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（10mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２８０】
THF（20mL）中の5'-ODMT-LNA-C（3.38g、5mmol）の溶液に、NEt3（4.85mL、35mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で1.45時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3（2回）、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン中EtOAc 20％〜30％＋トルエン10％＋NEt3 7％）で精製した。生成物を白色泡状物1.09g（収率23％）として単離した。
0006689279.tif 000018
【０２８１】
3-OAP-LNA A
0006689279.tif 000019
L-3-OAP-LNA Aの合成
PCl3（184μL、2.1mmol）をトルエン（5mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（5mL）中のP5-L（373mg、2.10mmol）およびNMM（463μL、4.20mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエン（4mL）で洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（5mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２８２】
THF（7mL）中の5'-ODMT-LNA-A（960mg、1.40mmol）の溶液に、NEt3（1.36mL、9.80mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAc（50mL）を加え、反応混合物を飽和NaHCO3（2×30mL）、食塩水（30mL）で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt3 6〜7％）で精製した。生成物を白色泡状物455mg（収率35％）として単離した。
0006689279.tif 000020
【０２８３】
D-3-OAP-LNA Aの合成
PCl3（0.84mL、9.63mmol）をトルエン（12mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12mL）中のP5-D（1.70g、9.63mmol）およびNMM（2.12mL、19.3mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（12mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２８４】
THF（20mL）中の5'-ODMT-LNA-A（3.77、5.50mmol）の溶液に、NEt3（5.30mL、38.5mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で4時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤ヘキサン/EtOAc 30/70＋NEt3 6〜7％）で精製した。生成物を白色泡状物1.86g（収率36％）として単離した。
0006689279.tif 000021
【０２８５】
3-OAP-LNA G
0006689279.tif 000022
D-3-OAP-LNA Gの合成
PCl3（1.09mL、12.4mmol）をトルエン（12.5mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（12.5mL）中のP5-D（2.20g、12.4mmol）およびNMM（2.73mL、27.8mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（19mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２８６】
合成前に、5'-ODMT-LNA-Gをトルエンと、次いでピリジン（順序は必須）と共に同時蒸発させた。THF（15mL）およびピリジン（8mL）中の5'-ODMT-LNA-G（3.26g、5.0mmol）の溶液に、NEt3（4.85mL、35.0mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc中THF 10％〜20％＋NEt3 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.49g（収率33％）として単離した。
0006689279.tif 000023
【０２８７】
L-3-OAP-LNA Gの合成
PCl3（1.00mL、11.4mmol）をトルエン（10mL）に溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン（10mL）中のP5-L（2.02g、11.4mmol）およびNMM（2.50mL、22.7mmol）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で45分間撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHF（7mL）に溶解し、次の段階で用いた。
【０２８８】
合成前に、5'-ODMT-LNA-Gをトルエンと、次いでピリジン（順序は必須）と共に同時蒸発させた。THF（20mL）およびピリジン（12mL）中の5'-ODMT-LNA-G（2.86g、4.54mmol）の溶液に、NEt3（4.40mL、31.8mmol）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの溶液を滴加した。反応混合物を室温で2.5時間撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィ（溶離剤EtOAc中THF 10％〜20％＋NEt3 6％）で精製した。生成物を白色泡状物1.44g（収率34％）として単離した。
0006689279.tif 000024
【０２８９】
一般的合成の説明
蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジンの合成：PCl3（1当量）をトルエンに溶解し、0℃（氷浴）まで冷却し、トルエン中のP5-L（1当量）およびNMM（2.1当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で撹拌し、次いで-72℃まで冷却した。沈澱をアルゴン雰囲気下でろ過し、トルエンで洗浄し、ろ液を40℃、減圧下（シュレンク法）で濃縮した。残渣をTHFに溶解し、次の段階で用いた。
【０２９０】
THF（およびGヌクレオシドの場合はピリジン）中の5'-ODMT-LNAヌクレオシド（1当量）の溶液に、NEt3（7当量）を加えた。反応混合物を-70℃まで冷却し、蛍光体2-クロロ-1,3,2-オキサザホスホリジン（2.5当量）の溶液を滴加した。反応混合物を室温で撹拌した。EtOAcを加え、反応混合物を飽和NaHCO3、食塩水で抽出し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィで精製した。
【０２９１】
LNAモノマーの構造の図
0006689279.tif 000025
【０２９２】
以下のLNA-オキサザホスホリンLNAモノマーをOka et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 16031-16037に開示されている方法を用いて合成した。
0006689279.tif 000026
0006689279.tif 000027
前記LNAモノマーをオリゴヌクレオチド合成において用い、HPLCにより判定して、立体制御ホスホラミダイトLNAオリゴヌクレオチドを生じたことが示された。
【０２９３】
実施例2
Myd88を標的とする以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。
0006689279.tif 000028
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x＝RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s＝Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r＝Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
【０２９４】
実施例3
親化合物#1はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#1〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する：1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。
【０２９５】
実施例4
Seth et al J. Med. Chem 2009, 52, 10-13において毒性であると同定された以下のLNAオリゴヌクレオチドを合成する。
0006689279.tif 000029
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x＝RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s＝Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r＝Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
【０２９６】
実施例5
親化合物#28はマウスにおいて肝毒性があることがわかっている。化合物#28〜27#をインビボアッセイでそれらの肝毒性について評価する：1群につき5匹のNMRI雌マウスを用い、15mg/kgの化合物を各マウスに第0、3、7、10および14日に投与し、第16日に屠殺する。血清ALTを測定する。肝毒性は、NMRIマウスを用いる以外は、EP 1 984 381、実施例41に記載の通りに測定してもよく、またはインビトロ肝細胞毒性アッセイを用いて測定してもよい。
【０２９７】
実施例6.  3箇所の固定PSヌクレオシド間連結を有する化合物ライブラリの、インビボでの耐容性および組織含有量
C57BL6/Jマウス（5匹/群）に、単一用量の食塩水または食塩水中の30mg/kg LNA-アンチセンスオリゴヌクレオチド（seq ID # 1、10、または14）を第0日に静脈内注射し、第8日に屠殺した。
【０２９８】
すべての群について、血清を採取し、ALTを測定した。オリゴヌクレオチド含有量を、LNA投与群でELISA法を用いて測定した。
【０２９９】
結論：
3箇所のホスホロチオエートヌクレオシド間連結が、S（化合物#10）またはR（化合物#14）配置のいずれかに固定されている、LNAオリゴヌクレオチドの部分群の肝毒性の可能性（ALT）を、すべてのヌクレオシド間連結がRおよびS配置の混合物であるジアステレオ異性体の親混合物（化合物#1）のALTと比較した。1つの部分群（化合物#14）で、ALT読み出し値は親混合物（化合物#1）よりも有意に低く、他の化合物部分群（化合物#10）では、ALT読み出し値は親とほぼ同等であると認められる（図3）。さらに、肝臓取込の特徴（図4a）は、ALT読み出し値が低いLNAオリゴヌクレオチドの部分群（化合物#14）は、親LNA混合物（化合物#1）と同程度に肝臓に取り込まれるが、ALTが親混合物（化合物#1）と同等の他の部分群（化合物#10）は、肝臓への取込が少ないことを示している。腎臓取込（図4b）は、親LNA（化合物#1）および1つの部分群（化合物#10）でほぼ同等であり、他のLNAオリゴヌクレオチドの部分群（化合物#14）では高い。脾臓への取込は3つの化合物群すべてでほぼ同等である（図4c）。一般に、いくつかの位置において立体化学を固定し、それによりLNAオリゴヌクレオチドの部分群を生じることで、LNAオリゴヌクレオチドの親混合物に比べて、取込および肝毒性の可能性などの特性の相違が誘導されることがわかる。
【０３００】
材料と方法：
実験設計：
（表２）
0006689279.tif 000030
【０３０１】
投与。表2に従って、受け取り時約20gのC57BL/6JBom雌動物に、10ml/kg BW（第0日の体重による）の食塩水中で製剤した化合物または食塩水単独を静脈内投与した。
【０３０２】
肝および腎組織の採取。表2に従って、動物を70％CO2−30％O2で麻酔し、頚椎脱臼により屠殺した。肝臓の半分および腎臓を凍結し、組織分析のために用いた。
【０３０３】
肝臓および腎臓中のオリゴヌクレオチド含有量をサンドイッチELISA法により測定した。
【０３０４】
ALTレベルを測定した。
【０３０５】
実施例7  キラルに規定されたホスホロチオエートLNAギャップマーのRNアーゼH活性
用いた親化合物、3833を用いた：
0006689279.tif 000031
ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、下付き文字sは無作為sまたはrホスホロチオエート連結（オリゴヌクレオチド合成中にキラルに規定されていない）を表し、かつCの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
【０３０６】
一連の完全にキラルに規定された3833の変種を、SまたはRのいずれかで例示するとおり、12箇所のヌクレオシド間の位置それぞれにおいてRおよびSの独特のパターンで設計した。RNアーゼH動員活性および切断パターンを、ヒトRNアーゼHを用いて判定し、親化合物3833（キラリティー混合物）ならびに3833の完全ホスホジエステル連結変種（完全PO）、および中心DNAギャップ領域内にホスホジエステル連結を含みLNA側部に無作為PS連結を含む、3833化合物（POギャップ）と比較した。
【０３０７】
化合物
0006689279.tif 000032
0006689279.tif 000033
【０３０８】
すべての化合物を単一の実験で評価したが、*印を付けたものは例外で、別の実験を行った。
【０３０９】
実験：
RNアーゼH1（組換えヒト）によるRNAのLNAオリゴヌクレオチド仲介性切断
LNAオリゴヌクレオチド15pmolおよび5'fam標識RNA 45pmolを13μLの水に加えた。アニーリング緩衝液6μL（200mM KCl、2mM EDTA、pH7.5）を加え、温度を90℃まで2分間上昇させた。試料を室温に戻し、3μLの750mM KCl、500mM トリス-HCl、30mM MgCl2、100mMジチオスレイトール、pH8.3中のRNアーゼH酵素（0,15U）を加えた。試料を37℃で30分間維持し、EDTA溶液4μL（0.25M）を加えて反応を停止した。
【０３１０】
切断したRNA試料のAIE-HPLC
試料15μLを200μLの緩衝液A（10mM NaClO4、1mM EDTA、20mM トリス-HCL pH7.8）に加えた。試料をAIE−HPLCにかけた：注入量50μL（カラム：DNA pac 100 2×250、勾配：0分、0.25mL/分、100％A、22分、22％B（1mM NaClO4、1mM EDTA、20mMトリス-HCL pH7.8）、25分、0.25mL/分、100％B、30分、0.25mL/min、100％B、31分、0.5mL/分、0％B、35分、0.25mL/分、0％B、40分、0.25mL/分、0％B。シグナル検出：蛍光発光518nm、励起494nm。
【０３１１】
結果
すべてのリン連結がチオール化された、配列GmCattggtatTmCAを有するLNAオリゴヌクレオチド。連結中のチオホスフェートの特定のキラリティーを記す。何も記していない場合、キラリティーはRおよびSの混合である。AIE-HPLC保持時間の下に、すべてのピーク面積合計に対するピーク面積のパーセンテージを示す。異なるLNAオリゴヌクレオチドの活性の順位を、キラリティー混合LNAオリゴヌクレオチド3833の酵素反応後に残った全長RNAを、他のLNAオリゴヌクレオチドでの残ったRNAで除した％から計算する。
0006689279.tif 000034
0006689279.tif 000035
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【０３１２】
結論
Sキラリティーが選択された最後の5'連結およびスポットキラリティーが選択されたLNAオリゴヌクレオチド17298〜17301を除いて、LNAオリゴヌクレオチドのホスホロチオエート連結のキラリティーは無作為に選択されている。LNAオリゴヌクレオチドの完全ジエステルおよびギャップにおいてジエステルのみの変種は、混合キラル変種3833よりも低い活性を有する。キラル配列はRNAの活性化および切断を増強する。特定のキラルLNAオリゴヌクレオチドのほとんどについて、RNアーゼH1の活性化はキラリティー混合3833のものよりも良好にはたらいた。特定の配列のうち最良のものは、3833よりも実質的に多くのRNA切断を開始した（30分後に98.4％対47.7％）。特定のLNAオリゴヌクレオチドそれぞれの特徴は、1ヶ所から数ヶ所の切断点まで変動する、それらの独特なRNA切断パターンである。
【０３１３】
実施例8  初代肝細胞におけるインビトロ毒性スクリーニング
マウス肝臓灌流
初代マウス肝細胞を、10〜13週齢雄C57B16マウスから、逆行性2段階コラゲナーゼ肝臓灌流により単離した。簡単に言うと、餌を与えたマウスをペントバルビタールナトリウム（120mg/kg、i.p.）で麻酔した。灌流チューブを右心室から尾大静脈中に挿入した。総腸骨静脈遠位の尾大静脈の結紮後、門脈を切開し、2段階肝臓灌流および細胞単離を行った。肝臓をまず、カルシウム無し、EGTA（0.5mM）を補充したHEPES（20mM）緩衝化ハンクス平衡塩溶液からなる前灌流溶液で5分間灌流し、続いてCaCl2（5mM）およびコラゲナーゼ（0.2U/ml；II型コラゲナーゼ、Worthington）を含むNaHCO3（25mM）補充ハンクス液で12分間灌流した。流速は7ml/分に維持し、すべての溶液を37℃に維持した。インサイチュー灌流後、肝臓を摘出し、肝臓被膜を機械的に切開し、フェノールレッドを含まないウィリアム培地E（WME）（Sigma W-1878）に細胞を懸濁し、1組のナイロンセルストレーナー（40および70メッシュ）を通してろ過した。死滅細胞をパーコール（Sigma P-4937）遠心分離段階（パーコール密度：1.06g/ml、50g、10分）およびWME中での追加の遠心分離（50xg、3分）により除去した。
【０３１４】
用いた化合物
0006689279.tif 000037
大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである。
下付き文字x＝RpおよびSpモノマーのラセミ混合物から無作為に組み込まれたホスホロチオエート連結。
下付き文字s＝Spモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
下付き文字r＝Rpモノマーによる立体制御ホスホラミダイト連結。
大文字Cの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
【０３１５】
肝細胞培養
細胞培養のために、初代マウス肝細胞を、10％ウシ胎仔血清、ペニシリン（100U/mL）、ストレプトマイシン（0.1mg/mL）を補充したWMEに、約5×106細胞/mlの密度で懸濁し、コラーゲンコーティングした96穴プレート（Becton Dickinson AG、Allschwil、Switzerland）中に0.25×106細胞/ウェルの密度で播種した。細胞を3〜4時間予備培養して細胞培養プレートに接着させた後、オリゴヌクレオチド処理を開始した。PBSに溶解したオリゴヌクレオチドを細胞培養物に加え、細胞上に3日間放置した。細胞毒性レベルを、細胞毒性検出キット（Roche 11644793001、Roche Diagnostics GmbH Roche Applied Science Mannheim、Germany）を製造者のプロトコル通りに用いて、培地中に放出された乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の量を測定することにより判定した。細胞ATPレベルの判定のために、本発明者らはCellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay（G9242、Promega Corporation、Madison WI、USA）を製造者のプロトコル通りに用いた。各試料を三つ組で試験した。
【０３１６】
標的ノックダウン分析
マウス肝細胞からのmRNA精製  製造者の指示に従ってのRNアーゼなしのDNアーゼIを含むRNeasy 96 Kit（Qiagen、Hombrechtikon、Switzerland）処理。cDNAをiScript一本鎖cDNA合成キット（Bio-Rad Laboratories AG、Reinach、Switzerland）を用いて合成した。定量的リアルタイムPCRアッセイ（qRT-PCR）を、Roche SYBR Green I PCR KitおよびLight Cycler 480（Roche Diagnostics、Rotkreuz、Switzerland）を、特異的DNAプライマーと共に用いて実施した。分析をΔCt閾値法により行って、RPS12 mRNAに比べての発現を判定した。各分析反応を、条件毎に2試料を用い、二つ組で実施した。結果を図5および6に示す。化合物#58および#60は、標的（Myd88）に対する有効なアンチセンス活性を保持しているが、有意に低減された毒性を有する。これらの化合物はRpの立体的に規定されたホスホロチオエート連結を含む。
【０３１７】
実施例9  腎毒性スクリーニングアッセイ
実施例6および8で用いたのと同じ化合物を、以下のRPTEC-TERT1培養、オリゴヌクレオチド処理および生存度アッセイで用いた。
【０３１８】
RPTEC-TERT1（Evercyte GmbH、Austria）を、製造者の指示に従い、PTEC培地（1％Pen/Strep、10mM Hepes、5.0μg/mlヒトインスリン、5.0μg/mlヒトトランスフェリン、8.65ng/ml亜セレン酸ナトリウム、0.1μMヒドロコルチゾン、10ng/mlヒト組換え上皮成長因子、3.5μg/mlアスコルビン酸、25ng/mlプロスタグランジンE1、3.2pg/ml トリヨード-L-サイロニンおよび100μg/mlジェネテシンを含むDMEM/F12）中で培養した。生存度アッセイのために、PTEC-TERT1を96穴プレート（Falcon、353219）中にPTEC培地中2×104細胞/ウェルの密度で播種し、コンフルエントになるまで増殖させた後、オリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチドをPBSに溶解し、細胞培養物に10または30μMの最終濃度で加えた。培地を交換し、オリゴヌクレオチドを3日ごとに新しく加えた。9日間のオリゴヌクレオチド処理後、細胞生存度を、CellTiter-Glo(登録商標) Luminescent Cell Viability Assay（G7571、Promega Corporation、Madison WI、USA）を製造者のプロトコル通りに用いての細胞ATPレベルの測定により判定した。三つ組ウェルの平均ATP濃度および標準偏差を計算した。PBSを媒体対照とした。
【０３１９】
結果を図8に示す。化合物#10は、立体的に特定されていない化合物#1および化合物#14に比べて低減された腎毒性を示す。立体的に特定された化合物#57、#58、#60は、親化合物（#56）に比べて有意に低減された腎毒性を示す。
【０３２０】
実施例10  キラルに規定されたホスホロチオエートLNAギャップマーのミスマッチ特異性
用いた実験手順は、親3833化合物と比べて様々な位置にミスマッチを導入した代替RNA基質を用いた以外は、実施例7に記載の通りであった。完全マッチRNA基質およびミスマッチRNA基質に対するRNアーゼH活性を判定した。
【０３２１】
（表３）3833のRNアーゼH活性に対するミスマッチの影響
0006689279.tif 000038
ミスマッチを大きいフォントサイズを用いて示す。RNアーゼH切断は30分後に分析した。切断生成物はミスマッチの位置によって変化する。
【０３２２】
（表４）3833の立体的に規定された変種のRNアーゼH活性に対するミスマッチの影響
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【０３２３】
完全マッチRNA基質に対して、キラルに規定されたホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、混合キラリティーを有するASOよりも著しくRNアーゼH仲介性RNA切断を活性化する傾向がある。しかし、ミスマッチRNAの顕著に低減されたRNアーゼH切断を有する、選択したホスホロチオエート（ASO）配置のキラルに規定されたオリゴヌクレオチドを見出すことができ、改善されたミスマッチ選択性を有する個々の立体的に規定された化合物を同定するための、オリゴヌクレオチドのキラルに規定された変種のライブラリをスクリーニングする能力が強調されている。
【０３２４】
実施例11
用いた親化合物、4358を用いた：
0006689279.tif 000040
ここで、大文字はベータ-D-オキシ-LNAヌクレオシドを表し、小文字はDNAヌクレオシドを表し、下付き文字sは無作為sまたはrホスホロチオエート連結（オリゴヌクレオチド合成中にキラルに規定されていない）を表し、かつCの前の上付き文字mは5-メチルシトシンLNAヌクレオシドを表す。
【０３２５】
一連の完全にキラルに規定された4358の変種を、SまたはRのいずれかで例示するとおり、11箇所のヌクレオシド間の位置それぞれにおいてRおよびSの独特のパターンで設計した。RNアーゼH動員活性および切断パターンを、ヒトRNアーゼHを用いて判定し、親化合物4358（キラリティー混合物）と比較した。得られた結果は以下のとおりであった。
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【図１】
0006689279.tif 000042
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
0006689279.tif 000049
【図７】
0006689279.tif 000050
【配列表】
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