(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＤＭ２ｉを含む、がんの処置のための医薬組成物であって、ＭＤＭ２ｉは、（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オンであり、３週毎に１回投与されるものであり、および、ＭＤＭ２ｉは、３週毎に１回、１００〜８００ｍｇで経口投与されるものである、医薬組成物。
【請求項２】
前記がんが、膀胱、乳房、脳、頭頸部、肝臓、口腔、胆道、急性および慢性リンパ性白血病、急性および慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、結腸直腸、胃、消化管間質、肝細胞、神経膠腫、リンパ腫、黒色腫、多発性黒色腫、骨髄増殖性疾患、神経内分泌、肺、非小細胞肺、膵臓、卵巣、前立腺、腎細胞、肉腫、脂肪肉腫、ならびに甲状腺のがんである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記がんが、黒色腫、肺がんまたは神経芽細胞腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記がんが黒色腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記がんが神経芽細胞腫である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記がんが白血病である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項７】
別の医薬成分をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記別の医薬成分が別の抗腫瘍剤である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
２種以上のさらなる抗腫瘍剤が投与されるものである、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、特定の投与スケジュールにおける使用のためのｍｄｍ２阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ｐ５３は、腫瘍の悪性増殖に対抗するすべて重要な現象である、ＤＮＡ損傷修復、アポトーシスおよび細胞周期停止に関与する多くの標的遺伝子の発現を制御する転写因子である。したがって、ｐ５３は、遺伝安定性の維持および腫瘍発生の予防のために決定的に重要である。ＴＰ５３遺伝子は、ヒトがんにおいて最も頻繁に変異した遺伝子の１つである。すべてのがんのおよそ半分が、直接変異によって引き起こされた、不活性化ｐ５３を有することが報告されている。ｐ５３遺伝子が変異していないがんにおいて、タンパク質レベルでの機能的不活性化が実証されている。記載されたｐ５３不活性化の機構の１つは、ＭＤＭ２（マウスダブルマイニュート２）のヒトホモログとのその相互作用を介している。したがって、Ｍｄｍ２は、ｐ５３腫瘍抑制因子の重要な負の調節因子である。Ｍｄｍ２タンパク質は、ｐ５３のプロテアソーム分解をもたらすＥ３ユビキチンリガーゼとして、およびｐ５３転写活性化の阻害剤としての両方で機能する。Ｍｄｍ２は、ｐ５３野性型腫瘍で増幅されて見出されることが多い。
【０００３】
ｐ５３−ｍｄｍ２相互作用を阻害し、抗腫瘍効果を引き出し得るＭｄｍ２阻害剤が開発されてきた。
【０００４】
米国特許出願公開第１３／０２４５０８９号明細書には、４−｛［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−４−（４−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−３−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−４−シアノ−５−（２，２−ジメチル−プロピル）−ピロリジン−２−カルボニル］−アミノ｝−３−メトキシ−安息香酸を患者に約８００〜約３０００ｍｇ／日の量で２８日処置周期の、１〜７日目に、約７日までの投与期間、続いて、約２１〜約２３日の休止期間で投与することによって、がんに罹っている患者を処置する方法が開示された。
【０００５】
B.Higgins et al. (May 2014)によるClinical Cancer Researchにおける論文には、２８日周期スケジュールが開示され、ここでは、ＲＧ７３８８は週１回で３回投与され、１３日の休止が続く（２８日周期スケジュール）、またはその薬物が２８日スケジュールの５連続日の間投与される。
【０００６】
Ｍｄｍ２阻害剤およびそれらを調製する仕方は、例えば、国際公開第２０１３１１１１０５号パンフレットまたは国際公開第２０１１０７６７８６号パンフレットに開示された。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
Ｍｄｍ２阻害剤（以後、「Ｍｄｍ２ｉ」）のための有利な投与レジメンが、その薬物標的の生物学、ならびにＭｄｍ２ｉ濃度が下流経路のシグナル伝達を変更して、抗腫瘍効力および耐容性に影響を与え得る仕方を理解することによって、設計され得ることが予想外にも発見された。驚くべきことに、十分に強力なＭｄｍ２ｉまたは、代わりに、十分に高い用量のＭｄｍ２ｉが使用される場合、それは、細胞中のはるかにより長く続く抗増殖機構を誘発することによって抗腫瘍効果を引き起こし得ることが見出された。がん細胞が、それぞれのＭｄｍ２ｉの十分に高い濃度に８時間程度の短い（より低い濃度が使用される場合は、比例的により長い）間曝される場合、Ｍｄｍ２ｉは、ｐ２１およびＰｕｍａ  ｍＲＮＡ発現を、次の４８〜７２時間以内にスパイクさせ、カスパーゼ３／７活性の顕著な誘発、したがって、実質的なアポトーシスに導く。皮下に移植されたがん細胞を有する動物では、動物を十分に高い単回用量で処置した後の同じ効果が観察された。これは、実質的な腫瘍収縮をもたらした。Ｍｄｍ２ｉ曝露が、それ未満ではＭｄｍ２ｉのこの第２のモダリティが活性化されない一定の閾値未満である場合、これについて何も検出されなかった。Ｍｄｍ２ｉの第２のモダリティの知識は、薬物のオンターゲット効果のために副作用を減少させるように臨床治験を計画するのに役立つことができる。
【０００８】
興味深いことに、長く続く効果は、単回用量後に数週間持続し得ることが観察され、これにより、毎日の処置の必要がなくなり、薬物を間欠的に投与することが可能になる。薬物の投与がない中断の間に、生命体は、強力なオンターゲット効果または副作用から回復することができ；特に白血球（ＷＢＣ）、好中球および血小板の数が回復することできる。長く続く効果を誘発する用量でのＭｄｍ２ｉの投与は、Ｍｄｍ２ｉがより低い用量で毎日投与される場合と少なくとも同程度に有効であるようにし、より良く耐容され得る。あまり頻繁でない投与も、より良い患者友好性、患者コンプライアンス、および特に薬物が静脈内に投与される場合、顕著な患者利益を有し得る。例えば、局所注射部位刺激は、次の用量が予定されている前に適切に治癒し得る。
【０００９】
持続効果を有するＭｄｍ２ｉの間欠投与は、持続効果を達成するために使用される用量と比較して、より低い用量の毎日の投与を含む投与レジメンと組み合わせ得る。第１の用量の間欠投与と第２の用量の毎日の投与との組合せは、化合物の効力の点で相乗効果をもたらし、これは、例えば、腫瘍収縮または腫瘍退縮として観察される。加えて、間欠的に投与される場合のＭｄｍ２ｉのより良好な耐容性のために、この薬物は他の抗腫瘍剤と組み合わせて使用され得る。Ｍｄｍ２ｉと別の抗腫瘍剤との組合せは、間欠的に投与される場合にＭｄｍ２ｉの改善された耐容性を利用し得、一方で第２の抗腫瘍剤との併用療法の全体的効力を増加させ得る。
【００１０】
具体的には、本開示は、以下の項に列挙されるとおりに、それぞれ単独または組み合わせて、以下の態様、有利な特徴および具体的な実施形態を提供する。
【００１１】
１．がんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉであって、ＭＤＭ２ｉは、対象に少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間は、少なくとも２週である、ＭＤＭ２ｉ。
【００１２】
２．ＭＤＭ２ｉが、対象に間欠的に投与され、各２回の連続投与間の期間は、少なくとも３週かつ６０日以下である、項１に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１３】
３．ＭＤＭ２ｉが、対象に間欠的に投与され、連続投与間の期間は、３週である、項１または２に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１４】
４．ＭＤＭ２ｉが、静脈内投与される、項１から３のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１５】
５．がんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉであって、ＭＤＭ２ｉは、対象に第１および第２の用量で投与され、第１の用量は、第２の用量と同じ日、第２の用量に対して連続する日または異なる日に投与され、第１の用量の２回の連続投与は、少なくとも１週毎、少なくとも２週毎、少なくとも３週毎、少なくとも４週毎、少なくとも６週毎もしくは６０日毎、かつ６０日毎以下で間欠的に投与され、第１および第２の用量は同じでない、がんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１６】
６．第２の用量が、任意選択で中断とともに、毎日投与される、項５に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１７】
７．中断が、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも１週、少なくとも２週、または少なくとも３週長、かつ最大で２６日である、項６に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１８】
８．第２の用量が、第１の用量が投与された１日〜１４日後に投与される、項５から７のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００１９】
９．第２の用量が、２週間投与され、処置なしの２週の期間が続き、次いで、この周期が繰り返される、項５から８のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２０】
１０．第１の用量が、第２の用量よりも高い、項５から９のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２１】
１１．第１または第２の用量の少なくとも一方が、静脈内投与される、項５から１０のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２２】
１２．第１の用量の２回の連続投与が、少なくとも２週毎に間欠的に投与される、項５から１１のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２３】
１３．第１の用量の２回の連続投与が、少なくとも３週毎に間欠的に投与される、項５から１１のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２４】
１４．がんが、膀胱、乳房、脳、頭頸部、肝臓、口腔、胆道、急性および慢性リンパ性白血病、急性および慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、結腸直腸、胃、消化管間質、幹細胞、神経膠腫、リンパ腫、黒色腫、多発性黒色腫、骨髄増殖性疾患、神経内分泌、肺、非小細胞肺、膵臓、卵巣、前立腺、腎細胞、肉腫、脂肪肉腫、および甲状腺のがんである、項１から１３のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２５】
１５．がんが、黒色腫、肺がんまたは神経芽細胞腫である、項１から１３のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２６】
１６．がんが、黒色腫である、項１から１３のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ。
【００２７】
１７．がんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用であって、ＭＤＭ２ｉは、対象に少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間は、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも６週または６０日、かつ６０日以下である、使用。
【００２８】
１８．がんを処置する方法であって、ＭＤＭ２ｉは、それを必要としている対象に少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間は、少なくとも２週、３週、少なくとも４週、少なくとも６週または６０日、かつ６０日以下である、方法。
【００２９】
１９．ＭＤＭ２ｉが、ヒトに投与される、項１から１６のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８に記載のがんを処置する方法。
【００３０】
２０．ＭＤＭ２ｉが、
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（６−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピリジン−３−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（６−｛メチル−［４−（３−メチル−４−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピリジン−３−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（５−｛メチル−［４−（３−メチル−４−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピラジン−２−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン、
（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン
４−［（Ｓ）−５−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−３−イソプロピル−６−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］−ベンゾニトリル
（Ｓ）−５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン
（Ｓ）−５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（（Ｒ）−１−メトキシプロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン、
【００３１】
【化１】
0006728072.tif 000002
および
（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ｄ６−ピリミジン−５−イル）−１−（（Ｒ）−１−メトキシプロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン
からなる群から選択される、項１から１６、もしくは１９のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７もしくは１９に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８もしくは１９に記載のがんを処置する方法。
【００３２】
２１．ＭＤＭ２ｉが、（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オンまたは（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンである、項１から１６、もしくは１９のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７もしくは１９に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８もしくは１９に記載のがんを処置する方法。
【００３３】
２２．ＭＤＭ２ｉが、（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オンである、項１から１６、もしくは１９のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７もしくは１９に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８もしくは１９に記載のがんを処置する方法。
【００３４】
２３．がんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、またはがんを処置する方法が、患者に投与される別の医薬成分をさらに含む、項１から１６、もしくは１９から２２のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７、もしくは１９から２２に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８、もしくは１９から２２のいずれか一項に記載のがんを処置する方法。
【００３５】
２４．別の医薬成分が、別の抗腫瘍剤である、項２３に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項２３に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項２３に記載のがんを処置する方法。
【００３６】
２５．２種以上のさらなる抗腫瘍剤が、投与される、項２４に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項２４に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項２４に記載のがんを処置する方法。
【００３７】
２６．ＭＤＭ２ｉが、少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間が、少なくとも１週である、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項２３から２５のいずれか一項に記載のがんを処置する方法。
【００３８】
２７．ＭＤＭ２ｉが、少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間が、少なくとも２週である、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項２３から２５のいずれか一項に記載のがんを処置する方法。
【００３９】
２８．ＭＤＭ２ｉが、少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与され、各２回の連続用量間の期間が、少なくとも３週である、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項２３から２５のいずれか一項に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項２３から２５のいずれか一項に記載のがんを処置する方法。
【００４０】
２９．ＭＤＭ２ｉが、（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オンである、項１から１６、もしくは１９から２８のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７、もしくは１９から２８のいずれか一項に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８、もしくは１９から２８に記載のがんを処置する方法。
【００４１】
３０．ＭＤＭ２ｉが、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−トランス−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オンである、項１から１６、もしくは１９から２８のいずれか一項に記載のがんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉ、項１７、もしくは１９から２８のいずれか一項に記載のがんの処置のための医薬の調製のためのＭＤＭ２ｉの使用、または項１８、もしくは１９から２８に記載のがんを処置する方法。
【００４２】
用語「Ｍｄｍ２阻害剤」または「Ｍｄｍ２ｉ」は、本明細書で、時間分割蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイによって測定された、１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、好ましくはｎＭの範囲のＩＣ５０でＨＤＭ−２／ｐ５３またはＨＤＭ−４／ｐ５３相互作用を阻害する任意の化合物を意味する。ｐ５３−Ｈｄｍ２およびｐ５３−Ｈｄｍ４相互作用の阻害は、時間分割蛍光エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）によって測定される。蛍光エネルギー移動（またはＦｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動）は、ドナーおよびアクセプターの５蛍光分子間のエネルギー移動を記述する。このアッセイの場合、Ｃ−末端ビオチン部分でタグ付された、ＭＤＭ２タンパク質（アミノ酸２−１８８）およびＭＤＭ４タンパク質（アミノ酸２−１８５）が、ドナーフルオロフォアとして機能するユーロピウム標識ストレプトアビジン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）と組み合わせて使用される。ｐ５３由来の、Ｃｙ５標識ペプチドｄＣｙ５−ＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（ｐ５３  ａａ１８−２６）は、エネルギーアクセプターである。３４０ｎｍでのドナー１０分子の励起後、ＭＤＭ２またはＭＤＭ４とｐ５３ペプチドとの間の結合性相互作用は、エネルギー移動および６６５ｎｍのアクセプター発光波長での増強された応答を誘導する。ＭＤＭ２またはＭＤＭ４のｐ５３結合部位に結合する阻害剤分子のために、ｐ５３−ＭＤＭ２またはｐ５３−ＭＤＭ４複合体の形成の崩壊は、６１５ｎｍでのドナー発光の増大をもたらす。レシオメトリックＦＲＥＴアッセイの読み取りは、時間分割モードで測定された２つの異なる蛍光シグナルの１５生データから計算される（計数率６６５ｎｍ／計数率６１５ｎｍ×１０００）。アッセイは、以下の手順に従って行うことができる。試験は、総体積３．１μｌで、１５３６ウェルの白色マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ  ＧｍｂＨ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において、９０％ＤＭＳＯ／１０％Ｈ２Ｏ中で希釈された１００ｎｌの化合物（３．２％最終ＤＭＳＯ濃度）と、反応緩衝液（ＰＢＳ、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００１％Ｎｏｖｅｘｉｎ（タンパク質の溶解性および安定性を増加させるように設計された、炭水化物ポリマー（Ｎｏｖｅｘｉｎポリマー）からなる；Ｎｏｖｅｘｉｎ  Ｌｔｄ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ゼラチン０．０１％、０．２％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドからのブロックコポリマー、ＢＡＳＦ、Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍＭ  ＤＴＴ）中の２μｌのユーロピウム２０標識ストレプトアビジン（最終濃度２．５ｎＭ）とを組み合わせ、その後、アッセイ緩衝液中で希釈された０．５μｌのＭＤＭ２−ＢｉｏまたはＭＤＭ４−Ｂｉｏ（最終濃度１０ｎＭ）を添加することによって行う。溶液を、室温で１５分間プレインキュベートさせ、その後、アッセイ緩衝液中の０．５μｌのＣｙ５−ｐ５３ペプチド（最終濃度２０ｎＭ）を添加する。室温で１０分間インキュベートした後、プレートを読む。試料の測定のために、以下の設定３０のＡｎａｌｙｓｔ  ＧＴマルチモードマイクロ���レートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用する：ダイクロイックミラー３８０ｎｍ、励起３３０ｎｍ、発光ドナー６１５ｎｍ、および発光アクセプター６６５ｎｍ。ＩＣ５０値は、ＸＬｆｉｔを使用して曲線当てはめにより計算する。特定されない場合、試薬は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡから購入する。
【００４３】
一実施形態によれば、Ｍｄｍ２阻害剤は、例えば、以下の式：
Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（６−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピリジン−３−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（６−｛メチル−［４−（３−メチル−４−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピリジン−３−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（５−｛メチル−［４−（３−メチル−４−オキソ−イミダゾリジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−ピラジン−２−イル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−ｔｒａｎｓ−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン、
（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン
４−［（Ｓ）−５−（３−クロロ−２−フルオロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−３−イソプロピル−６−オキソ−３，４，５，６−テトラヒドロ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−イル］−ベンゾニトリル
（Ｓ）−５−（５−クロロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン
（Ｓ）−５−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシピリミジン−５−イル）−１−（（Ｒ）−１−メトキシプロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン、
【００４４】
【化２】
0006728072.tif 000003
または
（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジン−３−イル）−６−（４−クロロフェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ｄ６−ピリミジン−５−イル）−１−（（Ｒ）−１−メトキシプロパン−２−イル）−５，６−ジヒドロピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４（１Ｈ）−オン
のいずれかの化合物であり得る。
【００４５】
特定の一実施形態において、ＭＤＭ２ｉは、（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン（以後、化合物Ａ）、または薬学的に許容されるその塩である。
【００４６】
別の一実施形態において、ＭＤＭ２ｉは、（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−トランス−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（以後、化合物Ｂ）である。
【００４７】
本明細書で使用される場合の用語「対象」または「患者」は、がん、またはがんを直接もしくは間接的に伴う任意の障害に罹るまたは苦しむことができる動物を包含する。対象の例には、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。好ましい一実施形態において、対象は、ヒト、例えば、がんに罹っている、罹るリスクにある、または潜在的に罹ることができるヒトである。特定の一実施形態において、対象または患者はヒトである。
【００４８】
本明細書で使用される場合の用語「処置する」または「処置」は、発症（すなわち、疾患の臨床的顕現の前の期間）を停止し、遅延させ、および／または疾患の進展もしくは悪化のリスクを減少させること、あるいは対象における少なくとも１つの症状を緩和、減少もしくは改善すること、または疾患の進行の遅延をもたらすことを含む。例えば、処置は、障害の１つもしくはいくつかの症状の縮小、または障害、例えば、がんの完全な撲滅であり得る。
【００４９】
用語「抗腫瘍剤」は、抗増殖または抗がん活性を示す医薬活性成分である。組合せ処置に適した可能な抗腫瘍剤には、限定されないが、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、（Ｓ）−メチル−１−（４−（３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメート、またはベムラフェニブ）；未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害剤（例えば、セリチニブ、ＡＥ６８４、アレクチニブ、クリゾチニブ、ＡＰ２６１１３、ＡＳＰ３０２６、ＡＤＺ３４６３）；アロマターゼ阻害剤（例えば、アタメスタン、エグゼメスタンおよびホルメスタン、アミノグルテチミド、ログレチミド、ピリドグルテチミド、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾールまたはレトロゾール）；抗エストロゲン（タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンまたはラロキシフェン塩酸塩）；抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド）；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、トポテカン、ギマテカン、イリノテカン、カンプトテシンおよびそのアナログ、９−ニトロカンプトテシンおよび巨大分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８（国際公開第９９／１７８０４号パンフレット中の化合物Ａ１）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ネモルビシン、ミトキサントロン、ロソキサントロン、エトポシドまたはテニポシド）；微小管活性化合物（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンブラスチン、ビンブラスチンスルフェート、ビンクリスチン、ビンクリスチンスルフェート、ビノレルビン、ジスコデルモリデス、コチシン）；アルキル化化合物（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファランまたはニトロソ尿素）；ヒストン脱アセチラーゼ阻害剤；細胞分化過程を誘導する化合物；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ＮＭＰ阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤、抗腫瘍抗代謝物；プラチン化合物；タンパク質または脂質キナーゼ活性を標的にする／低下させる化合物；抗血管形成化合物；タンパク質または脂質脱リン酸化酵素の活性を標的にし、低下させ、または阻害する化合物；ゴナドレリンアゴニスト（例えば、アバレリックス、ゴセレリンおよびゴセレリンアセテート）；メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；ビスホスホネート；生物学的応答修飾剤；抗増殖性抗体；ヘパラナーゼ阻害剤；Ｒａｓ発がん性アイソフォームの阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；血液悪性腫瘍の処置に使用される化合物；Ｆｌｔ−３の活性を標的にし、低下させ、または阻害する化合物；Ｈｓｐ９０阻害剤；キネシン紡錘体タンパク質阻害剤；ＭＥＫ阻害剤；ロイコボリン；ＥＤＧ結合剤；抗白血病化合物；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｓ−アデノシルメチオニン脱カルボキシラーゼ阻害剤；血管新生抑制ステロイド；コルチコステロイド；他の化学療法化合物（以下に規定されるとおりの）；光感作化合物（例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥおよびポリフィメルナトリウム）が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】単回静脈内（ｉ．ｖ．）処置後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物ＡのＰＫである。
【図２】単回ｉ．ｖ．処置後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物ＡのＰＫおよびＰＤである。
【図３】化合物ＡによるＳＪＳＡ−１腫瘍保有ヌードラットの単回ｉ．ｖ．処置後の腫瘍増殖である。
【図４】化合物ＡによるＳＪＳＡ−１腫瘍保有ヌードラットの単回ｉ．ｖ．処置後の体重（ＢＷ）の変化である。
【図５】ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ヌードラットの単回ｉ．ｖ．処置後の化合物Ａの効力−個別データである。
【図６】単回ｉ．ｖ．処置後の骨髄回復である。
【図７】血液中および胸骨からの骨髄切片上の白血球数間の相関である。
【図８】ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ヌードラットのｉ．ｖ．（ｑ３ｗ、すなわち、３週毎に１回）処置後の４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。
【図９】白血球（ＷＢＣ）数、好中球数および血小板数に対するｉ．ｖ．処置（ｑ３ｗ）の効果である。
【図１０】１３．７および１８．２ｍｇ／ｋｇでの化合物Ａによるｑ３ｗ  ｉ．ｖ．処置の４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。
【図１１】白血球（ＷＢＣ）数、好中球数および血小板数に対する、１３．７および１８．２ｍｇ／ｋｇでの化合物Ａによるｉ．ｖ．処置（ｑ３ｗ）の効果である。
【図１２】経口での化合物Ａによる単回処置後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに関するＰＫ研究である。
【図１３】経口での化合物Ａの単回投与後の腫瘍における薬物濃度およびＰＤ応答を示す。
【図１４】化合物Ａによるｑ３ｗ  ｐ．ｏ．処置の４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。
【図１５】化合物Ａによるｑ３ｗ  ｐ．ｏ．処置の４２日にわたる白血球数および血小板数を示す。
【図１６】Ｍｄｍ２ｉの低用量は、高用量ほどには同じ生物化学的効果を誘発しない。
【図１７】Ｍｄｍ２ｉの間欠およびより頻繁な投与レジメンの組合せは、効力に対して相乗効果を示す。
【図１８】化合物Ａを高用量で間欠的に、低用量で毎日、および両方の投与スケジュールの組合せで投与後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する効力である。
【図１９】化合物Ａを高用量で間欠的に、低用量で毎日、および両方の投与スケジュールの組合せで投与後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する耐容性である。
【図２０】黒色腫ＰＴＸ保有ラットにおける経口でのｑ３ｗ  ２７ｍｇ／ｋｇでのＭｄｍ２ｉの効力である。「Ｃｍｐ  Ａ」は、「化合物Ａ」の略語である。
【図２１】黒色腫ＰＴＸ保有ラットにおける経口でのｑ３ｗ  ２７ｍｇ／ｋｇでのＭｄｍ２ｉの耐容性である。
【図２２】ＳＨＳＹ５Ｙ腫瘍保有マウスにおけるセリチニブとの組合せで間欠的に投与された化合物Ａの効力である。「Ｃｍｐ  Ａ」は、「化合物Ａ」の略語である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
現在、Ｍｄｍ２阻害剤は、任意選択で薬物休日とともに、毎日投与される。Ｍｄｍ２ｉによる一連の毎日の処置後の中断は、耐容性の問題のために一定の場合に延長されたことがあり得る。例外的に、Ｍｄｍ２阻害剤は、週間隔で投与される。今や、静脈内または経口で投与されたより高い単回用量での（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン（化合物Ａ）が、以前に化合物Ａまたは（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−トランス−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）のより低い経口（ｐ．ｏ．）用量によっては決して達せられなかった、強いＰｕｍａ  ｍＲＮＡ誘導（Ｅｍａｘ≧７０倍の誘導）を初めて可能にすることが見出された。ｐ５３の阻害剤である、Ｍｄｍ２が、最低のｍＲＮＡ誘導を示したことは興味深い。腫瘍におけるこのような高いＰｕｍａ  ｍＲＮＡ誘導に、処置２４時間後の強いカスパーゼ−３活性化が続き、これは、処置４８時間および７２時間後の腫瘍細胞密度の劇的な減少に変わった。アポトーシス経路の強い誘導は、高用量での単回処置により誘導された衝撃的かつ予想外の腫瘍退縮の主たる駆動因子として明らかに特定された。実に、２０ｍｇ／ｋｇでの化合物Ａによる単回ｉ．ｖ．処置は、４２日間処置されたラットの８２％（９／１１）で完全なＳＪＳＡ−１腫瘍応答（１００％退縮）を誘導した。さらに、２７ｍｇ／ｋｇでの化合物Ａによる３週毎１回（ｑ３ｗ）ｐ．ｏ．処置は、それぞれ、１周期および２周期後に８８％および２７％のＳＪＳＡ−１腫瘍退縮を誘導した。
【００５２】
本発明者らは、強いＰｕｍａ誘導（すなわち、非処置がん細胞のｍＲＮＡ発現と比較して少なくとも２０倍のｍＲＮＡ発現の誘導）を有する遅延アポトーシスまたは持続抗増殖効果を誘発するために、化合物Ａは、十分に高い用量で投与されなければならないことを見出した。前記用量は、効力を顕著には失わず、かつ耐容性を潜在的に改善して、薬物が間欠的に投与されることを可能にした。化合物Ａの単回用量は、２週毎に投与することができる。また、３週、４週、６週の中断、またはさらには６０日の間欠も、腫瘍に対する顕著な効果を依然として示すことができる。前記高用量未満では、化合物Ａは、約５〜６倍までのＰｕｍａ  ｍＲＮＡ発現を誘導するだけであり、結果として、連続的な抗増殖効果を達成するために、連続的に、例えば、毎日投与されることを必要とする。比較的低い用量でさえも、薬物が十分長く投与されると、処置からの中断を行うことができるが、処置周期は、少なくとも約２週で繰り返されなければならず、そうでなければ、抗増殖効果は、もはや認められない。
【００５３】
一実施形態において、本開示によれば、がんの処置のために使用されるＭｄｍ２ｉが提供され、ここで、Ｍｄｍ２ｉの単回用量は、少なくとも２週毎、かつ６０日毎以下で投与される。別の一実施形態において、Ｍｄｍ２ｉの単回用量は、少なくとも３週毎、かつ６０日毎以下で投与される。
【００５４】
化合物Ａ以外のＭｄｍ２ｉも、強いＰｕｍａ誘導を達成し得るが、使用されるべき用量は、その化合物の効能に依存する。いずれの理論にも拘束されることを望まないが、非常に顕著なＰｕｍａ誘導による長期効果をもたらすＭｄｍ２ｉの用量は、Ｍｄｍ２ｉがより効能のある場合により低いことを必要とする。しかし、原則としてまた、低い効能のＭｄｍ２ｉも、十分な血漿曝露に達する用量で投与されさえすれば、長く続く効果に導くこの第２レベルのモダリティを活性化し得る。Ｍｄｍ２ｉ曝露が、少なくとも８時間ＧＩ８０−濃度を超える場合は、約２６％、Ｍｄｍ２ｉ曝露が少なくとも１７時間ＧＩ８０を超えて持続する場合は、９０％超の腫瘍退縮が達成され得る。ＧＩ−８０は、８０％の腫瘍細胞増殖阻害を引き起こすのに必要な用量である。したがって、一般的に、Ｍｄｍ２ｉの高い用量またはより高い用量は、少なくとも、そうでなければ、Ｍｄｍ２ｉにインビトロで腫瘍細胞を８時間曝露する場合にＧＩ−８０を生じさせる濃度で、インビボで血漿中、Ｍｄｍ２ｉを少なくとも８時間、好ましくは少なくとも１０時間持続させる用量である。ＧＩ−８０濃度は、いずれの増殖試験によっても測定され得る。例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイが使用される。例えば、インビトロでの細胞をＭｄｍ２ｉで８時間処置し、次いで、細胞を洗浄して、培地中の化合物を除去し、生存細胞の数の決定を７２時間後に行う。これを様々な濃度で繰り返して、ＧＩ−８０濃度を特定する。高用量は、インビボでＭｄｍ２ｉの前記ＧＩ−８０濃度に少なくとも８時間で達するか、またはそれにとって代わらなければならない。低用量は、最低の高用量よりも低い。残念なことに、Ｍｄｍ２ｉのより高い用量の投与は、特に経口で投与される場合、単に化合物の特異的な薬物動態のために十分な血漿曝露に常につながるとは限らず、その理由は、例えば、低い生物学的利用能が、薬物が十分に高い血漿中レベルを達成することを妨げ得るからである。経口投与のこの欠点は、Ｍｄｍ２ｉが静脈内に投与される場合に克服される。
【００５５】
投与される用量の文脈において本明細書で言及される場合の「用量」はまた、強度を意味し得る。
【００５６】
したがって、本開示の１つの目的は、がんの処置における使用のためのＭＤＭ２ｉを提供することであり、ここで、ＭＤＭ２ｉは、対象に間欠的に投与されなければならず、少なくとも３回の連続用量間の期間は、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも６週または６０日、かつ６０日以下である。ＭＤＭ２ｉは、対象に少なくとも３回の連続用量で間欠的に投与されるものであり、３回の用量の各２回の連続用量間の期間は、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも６週または６０日である。上限は、利用可能なデータに基づいて設定されるが、本発明者らは、さらによりまれな投与が臨床的に許容される転帰をもたらすことがあり、有用であり得るという可能性を考慮に入れている。患者の服薬コンプライアンスを改善するために、Ｍｄｍ２ｉのための投与レジメンは、３週毎または４週毎に１回、特には３週毎に１回であり得る。
【００５７】
本発明者らは、身体におけるＭｄｍ２ｉの次善の曝露の問題が、特にそれが１μＭ超の細胞増殖ＩＣ５０を有する場合、その薬物を静脈内に投与することによって解決され得ることを見出した。一例として、本発明者らは、化合物Ａのより低い用量（２０ｍｇ／ｋｇ）は、間欠的に投与することができ、一方で２７ｍｇ／ｋｇは同じ応答を刺激するために経口で必要とされることを見出した。したがって、Ｍｄｍ２ｉを静脈内に投与することは、より低い効能のＭｄｍ２ｉが、延長された抗増殖効果を有する反応性の上述の第２段階を達成する機会を開く。このように、薬物をすくない頻度で投与する機会があり、その理由は、静脈内投与のみが必要とされる曝露をもたらすからである。さらに、経口投与に必要とされる用量と比較してより低い用量でＭｄｍ２ｉを静脈内に投与することは、いくつかの耐容性の利点を少なくとも与えることができる。
【００５８】
したがって、一実施形態において、本発明者らは、がんの処置における使用のためのＭｄｍ２ｉであって、ＭＤＭ２ｉは静脈内に投与されるものであるＭｄｍ２ｉを提供する。
【００５９】
別の一実施形態において、ＭＤＭ２ｉの間欠投与は、単回用量の間欠投与で使用される用量と異なるＭＤＭ２ｉの第２の用量の別の投与レジメンによって補足され得る。間欠投与スケジュールを別のより頻繁なスケジュールと組み合わせることは、スケジュールのそれぞれにおいて使用されるＭｄｍ２ｉの用量を減少させることを可能にし、したがって、耐容性をさらに改善する。Ｍｄｍ２ｉの高用量を間欠的に投与し、一方でまたＭｄｍ２ｉをより低い用量でより頻繁に、例えば、毎日投与することは、両方のスケジュールについて用量を、そうでなれば、前記投与スケジュールが単独で使用される場合、少なくとも２つの投与スケジュールの一方で、効果的でないレベルまで減少させることを可能にする。この処置を、異なるスケジュールでの高い用量および低い用量と組み合わせることもまた、相乗的に有効であることがわかった。一実施形態において、Ｍｄｍ２ｉが少なくとも２週毎に投与される間欠投与、Ｍｄｍ２ｉの毎日の処置を重ね合わせることができる。本発明者らは、化合物Ａの２つの投与レジメン、すなわち、より高い用量による３週毎１回の処置を、２８日周期毎に２週の中断とともに、より低い用量による２週の毎日処置と組み合わせることが、両方の処置の相乗的抗腫瘍効果をもたらすことを見出した。間欠処置に追加される第２の投与レジメンは、同じ、連続の、または他の日に開始し得る。第２の投与レジメンは、例えば、任意選択で中断とともに、毎日であり得る。一連の毎日の処置後の中断は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも１週、少なくとも２週、または少なくとも３週、かつ最大で２６日であり得る。一実施形態において、第２の投与レジメンの用量は、第１の用量が投与された１日〜１４日後に投与される。特定の一実施形態において、Ｍｄｍ２ｉのより低い用量による第２の投与スケジュールは、単回の高い用量が投与された翌日に開始する。毎日投与される用量は、２週間投与することができ、処置なしの２週の期間が続き、次いで、この処置周期を繰り返すことができる。一般的に、間欠投与のために使用される用量は、間欠投与に追加されるより頻繁な投与で使用される第２の用量よりも高い。Ｍｄｍ２ｉは、経口もしくは静脈内のいずれか、またはそれらの組合せで投与され得る。例えば、少なくとも２週毎、少なくとも３週毎、少なくとも４週毎、少なくとも６週毎、または少なくとも６０日毎での間欠用量は、静脈内に投与され得るが、一方で第２の毎日用量は、経口で投与され得る。しかしながら、両方の用量が静脈内に、または両方が経口的に投与され得る。一実施形態において、間欠的に投与される第１の用量は、少なくとも２週の２回の連続投与間の期間によって投与され得る。
【００６０】
一態様において、間欠投与スケジュールに追加される第２の投与スケジュールは、患者が異なる用量で間欠的にＭｄｍ２ｉによって処置される間に、Ｍｄｍ２ｉを少なくとも５日の期間、続いて、１日以上の期間投与し、この周期を繰り返すことを含み得る。しかしながら、追加の第２の投与スケジュールは、例えば、２週オン、１または２週オフ；３週オン、１、２または３週オフ；４週オン、１、２、３または４週オフ；１週オン、３週オフ；３週オン、１週オフ；４週オン、１週オフの周期を含む。
【００６１】
間欠投与に第２の投与スケジュールを追加することに加えて、間欠投与によるＭＤＭ２ｉ処置の臨床転帰は、対象にさらなる医薬成分を投与することによって改善され得る。さらなる医薬成分は、別のＭｄｍ２ｉであり得るが、ほとんどの場合、作用の異なる機構を有する薬物である。間欠的に投与されるＭｄ２ｍｉに加えて別の抗腫瘍剤を投与することは、抗腫瘍効果の改善を達成し得ることが本明細書で企図される。さらに、間欠投与は、Ｍｄｍ２ｉ投与の頻度を減少させることによるように、Ｍｄｍ２ｉを別の抗腫瘍剤と組み合わせることに対してより柔軟性を広げ、耐容性を改善することができ、したがって、別の抗がん薬を追加するより多くの選択肢を可能にする。一実施形態において、Ｍｄｍ２ｉは、ＢＲＡＦ阻害剤またはＡＬＫ阻害剤と組み合わせて本明細書で記載されるとおりに間欠的に投与される。具体的には、別の医薬成分は、（Ｓ）−メチル−１−（４−（３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメートである。別の一実施形態において、組合せは、セリチニブとなされる。Ｍｄｍ２ｉが別の医薬成分と組み合わされる場合、Ｍｄｍ２ｉは、間欠的に投与することができ、単回用量間の期間は、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも６週、または６０日、かつ６０日以下である。
【００６２】
本開示は、処置における使用のための化合物Ａも提供し、ここで、化合物Ａは、間欠的に投与され、例えば、少なくとも３回の用量の各２回の用量間の期間は、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも３週、少なくとも４週、少なくとも６週、または６０日、かつ６０日以下であり、（Ｓ）−メチル−１−（４−（３−（５−クロロ−２−フルオロ−３−（メチルスルホンアミド）フェニル）−１−イソプロピル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）プロパン−２−イルカルバメートまたはセリチニブも使用される。特に、化合物Ａは、少なくとも１週毎、または少なくとも３週毎で単回用量として投与される。
【００６３】
Ｍｄｍ２ｉおよび追加の医薬成分は、組み合わせられた使用についてのもしくは組合せ製品についての使用説明書とともに、またはそれなしで、好ましくはそれとともに、別個のパートナーについて適用または製剤化され得る。したがって、組合せにおける化合物は、完全に別個に投与されても、または完全に別個の医薬剤形であってもよい。組合せパートナーは、互いに独立して販売もされる医薬組成物であってもよく、ここで、ちょうどそれらの組合せ使用についての使用説明書は、パッケージ備品、例えば、小冊子など、または、例えば、共同で活性であるための同時もしくは逐次使用について、医師および医療スタッフに提供される他の情報（例えば、口頭伝達、書面での伝達など）で提供される。Ｍｄｍ２ｉおよび別の活性医薬成分は、活性成分の固定または非固定組合せとして提供され得る。用語「固定組合せ」は、活性成分、例えば、Ｍｄｍ２阻害剤および抗腫瘍剤が、両方とも単一の実体または投与量の形態で患者に同時に投与されることを意味する。他の用語において、すなわち、活性成分は、１個の剤形、例えば、１個の錠剤または１個のカプセル中に存在する。用語「非固定組合せ」は、活性成分が、両方とも患者に別個の実体として、特定の時間制限なしに、同時に、共にまたは逐次的にのいずれかで投与されることを意味し、ここで、このような投与は、患者の身体に治療有効レベルの２種の化合物を与える。
【００６４】
本明細書で記載されるとおりのＭｄｍ２ｉの使用によって処置されるがんには、限定されないが、膀胱、乳房、脳、頭頸部、肝臓、口腔、胆道、急性および慢性リンパ性白血病、急性および慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、結腸直腸、胃、消化管間質、肝細胞、神経膠腫、リンパ腫、黒色腫、多発性黒色腫、骨髄増殖性疾患、神経内分泌、肺、非小細胞肺、膵臓、卵巣、前立腺、腎細胞、肉腫、脂肪肉腫、ならびに甲状腺のがんが含まれる。特定の一実施形態において、がんは黒色腫である。別の一実施形態において、がんは神経芽細胞腫である。さらに別の一実施形態において、がんは白血病である。
【００６５】
化合物Ａによって得られたデータに基づいて、および（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−トランス−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン（化合物Ｂ）の生化学的応答も知って、本発明者らは、提案された投与レジメンが、上に列挙された少なくともＭｄｍ２ｉによって有利な効力または耐容性を与えるために使用され得ることを予期することができる。
【００６６】
Ｍｄｍ２ｉは、対象に医薬組成物で送達され得る。使用されるべき経口剤形は、例えば、錠剤、カプセル剤、小袋（sachet）、マイクロペレット、顆粒剤などである。経口剤形は、Ｍｄｍ２ｉに加えて、医薬品に使用されるさらなる従来の担体（carrier）または添加剤（excipient）を含み得る。このような担体または添加剤の例には、限定されないが、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、流動促進剤、安定剤、ならびに充填剤、希釈剤、着色剤、香味剤、および保存剤が含まれる。当業者は、日常的な実験によって、および何らの過度の負担なしに剤形の特定の望ましい特性に関して上述の担体の１種または複数を選択してもよい。使用される各担体の量は、当技術分野で慣用的な範囲内で変わってもよい。以下の参考文献は、経口剤形を製剤化するために使用される技術および添加剤を開示している。The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th edition, Rower et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003)；およびRemington: the Science and Practice of Pharmacy, 20thedition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2003)を参照されたい。剤形は、例えば、ブレンディング、造粒、圧縮（compressing）、緻密化（compacting）、充填、篩分け、混合、および／または錠剤化によって調製される。
【００６７】
Ｍｄｍ２ｉは、例えば、溶液として、静脈内にインビボで適用され得る。一般的に、剤形は、投与前に他のプロセスを使用して、加圧滅菌器で処理されるか、または滅菌される。この薬物は、注射または注入によって静脈内に投与され得る。好ましくは、Ｍｄｍ２ｉは、３時間未満の期間にわたって、より好ましくは２時間までで、特には約１時間で静脈内に注入される。
【００６８】
Ｍｄｍ２ｉは、医薬の調製のために使用することができ、ここで、剤形が調製される。後者は、さらにパッケージ化し、患者情報小冊子によって補足することができる。
【００６９】
Ｍｄｍ２ｉは、治療有効量で投与される。Ｍｄｍ２ｉの「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的応答を引き出す、例えば、症状を改善する、状態を緩和する、疾患進行を遅延（slow)または遅延（delay)させる、腫瘍増殖を遅らせる（slow down)、または腫瘍退縮を引き起こす、などする化合物の量を指す。一実施形態において、インビボで有効量は、約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇの間、または約１〜１００ｍｇ／ｋｇの間で、投与の経路に依存して変わってもよい。例えば、化合物Ａについて、インビボ有効量は、経口で投与される場合、３週毎１００〜１５００ｍｇの間、特には３週毎１００〜８００ｍｇの間、または毎日５０〜６００ｍｇの間である。化合物Ｂについて、その有効量は、経口で投与される場合、５００〜４０００ｍｇ、特には１５００〜４０００ｍｇである。静脈内用量は、したがって低くすることが必要である。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例により、本開示が例証される。
【００７１】
実施例で使用される方法および材料
化合物Ａ−（Ｓ）−５−（５−クロロ−１−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−ピリジン−３−イル）−６−（４−クロロ−フェニル）−２−（２，４−ジメトキシ−ピリミジン−５−イル）−１−イソプロピル−５，６−ジヒドロ−１Ｈ−ピロロ［３，４−ｄ］イミダゾール−４−オン
化合物Ｂ−（Ｓ）−１−（４−クロロ−フェニル）−７−イソプロポキシ−６−メトキシ−２−（４−｛メチル−［４−（４−メチル−３−オキソ−ピペラジン−１−イル）−トランス−シクロヘキシルメチル］−アミノ｝−フェニル）−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−イソキノリン−３−オン
【００７２】
細胞培養
ＳＪＳＡ−１  骨肉腫細胞（ＣＲＬ−２０９８、ＡＴＣＣ）は、ｐ５３についての野性型であり、Ｍｄｍ２で増幅するが（１６．９コピー、ＳＮＰ  ６．０）、Ｍｄｍ４では増幅しない。それらを、１０％ＦＣＳ（＃２−０１Ｆ１６−Ｉ、ＡＭＩＭＥＤ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（＃５−１０Ｋ００−Ｈ，ＡＭＩＭＥＤ）で補充した、ＲＰＭＩ１６４０（＃１−４１Ｆ０１−Ｉ、ＡＭＩＭＥＤ）中で培養した。細胞を、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なしのＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（＃３−０５Ｆ２９−Ｉ、ＡＭＩＭＥＤ）で最初に洗浄することによって継代し、細胞を、ＥＤＴＡと一緒のＰＢＳ（＃５−５１Ｆ００−Ｈ、ＡＭＩＭＥＤ）中Ｔｒｉｐｓｉｎ０．０５％でトリプシン処理し、それぞれの培養培地で遠心分離にかけ、細胞を、１週当たり２回、１：８の比で新鮮培地中に分けた。
【００７３】
動物
すべてのヌードラット（Ｈｓｄ：ＲＨ−Ｆｏｘｔｍｕ、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、ＳＦ４８０）を４日間適応させ、病原体が制御された環境で食物および水は自由に与えて飼育した（５匹／タイプＩＩＩケージ）。動物をトランスポンダーで識別した。この報告で記載される研究は、Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｎｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔにより発行された許可番号１９７５にカバーされた手順に従い、Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｃｈｅｓ  ＴｉｅｒｓｈｕｔｚｇｅｓｅｔｚおよびＥｉｄｇｅｎｏｓｓｉｓｈｅ  Ｔｉｅｒｓｈｕｔｚｖｅｒｖｏｒｄｕｎｇを厳格に順守して行った。すべての実験は、４〜７匹のラットで行った。マウスは、化合物の組合せによる実験のために使用した。
【００７４】
腫瘍モデル
１．０×１０７  ＳＪＳＡ−１細胞を５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）中で濃縮し、Ｈａｒｌａｎヌードラットの右脇腹に注射することによって、皮下腫瘍を誘導した。効力実験は、細胞注射１４日後に開始できた。化合物Ａは、各投与について新たに作製した。ｉ．ｖ．注射（４ｍｌ／ｋｇ）について、化合物Ａを、３０％ＰＥＧ３００、１０％Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５、６％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８および５４％水に溶解させた。経口（ｐ．ｏ．）注射（５ｍｌ／ｋｇ）について、化合物Ａを、リン酸緩衝液ｐＨ６．８  ５０ｍＭ中メチルセルロース０．５ｗ／Ｖ％に溶解させた。３週毎１回（ｑ３ｗ）で高用量（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．もしくは２７ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．）、または高用量（１５ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．）、続いて２４時間後、毎日の低用量処置（３ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．、２週オン／２週オフ）のいずれかで、動物を処置した。
【００７５】
動物の腫瘍体積（ＴＶｏｌ）および体重（ＢＷ）を、１週当たり３回測定し、処置の開始の日（０日目）に対して任意の特定の時点でＴｖｏｌの変化パーセント（Δ％ＴＶｏｌ）の計算を可能にした。腫瘍応答は、Ｔ／Ｃ、すなわち、
【００７６】
【数１】
0006728072.tif 000004
として、腫瘍体積の変化（ｍｍ３単位で終点値マイナス開始値）により定量化した。腫瘍退縮の場合、またはＴＶｏｌの変化パーセントを評価するために、腫瘍応答を、開始ＴＶｏｌの退縮パーセント、すなわち、
【００７７】
【数２】
0006728072.tif 000005
により定量化した。
【００７８】
同様に、動物の体重（ＢＷ）を１週当たり３回測定し、処置の開始の日（０日目）に対する任意の特定の時点でＢＷの変化パーセント（Δ％ＢＷ）の計算を可能にした。
【００７９】
白血球（ＷＢＣ）、好中球および血小板を、Ｓｙｓｍｅｘ（ＸＴ−２０００ｉ）を使用して計数した。血液を、商業的に調製されたＥＤＴＡコーテッドマイクロチューブ（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ、カタログ番号３６５９７５）中に収集した。
【００８０】
薬物動態（ＰＫ）および薬力学（ＰＤ）
示された時間で、動物を、医療用酸素中イソフルオラン２〜３ｖ／ｖ％に曝露することにより麻酔した：
・動物を血液採取後に麻酔から回復することなく殺した。血漿を抽出するために、血液を、商業的に調製されたＥＤＴＡコーテッドマイクロチューブ（Ｍｉｌｉａｎ、カタログ番号ＴＯＭ−１４Ｃ）中に収集した。組織を切除し、秤量し、液体窒素で急速凍結した。
・または、生検銃を使用し、Ｂａｒｎｅｙラブルチューブ（rubble tube）（Ｃｏｖａｒｉｓ、カタログ番号５２００４８）中ＲＬＴ緩衝液で針をフラッシュすることによって、腫瘍生検を収集した。さらに、２０μｌの血液は、尾静脈から収集し、２０μｌの水に希釈していてもよい。麻酔から回復後、動物をそれらのそれぞれのケージに移した。
組織、血液および血漿の試料を、分析まで−８０℃で凍結保存した。
【００８１】
組織の調製
凍結組織を、低温乾燥微粉化し、ＣｏｖａｒｉｓからのＣｒｙｏＰｒｅｐ（商標）システム（モデルＣＰ−０２）を使用して生検を超音波処理した。より具体的には、凍結組織を、ＴｉｓｓｕｅＴｕｂｅｓ（商標）と呼ばれる使い捨てチューブに移し、ＣｒｙｏＰｒｅｐ（商標）システムに入れ、次いで、適切な衝撃設定を使用して微粉化した。得られた粉末を、さらなる処理（ｍＲＮＡ精製、または組織中の化合物の定量化）のために、へらで収集し、秤量した。生検を、３５０μｌのＲＬＴ緩衝液でＢａｒｎｅｙラブルガラスチューブ中でフラッシュし、超音波処理のためにＣｏｖａｒｉｓに入れた（生検当たり１分）。得られた溶解物を、ＲＮＡ抽出のためにＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（７９６５４、Ｑｉａｇｅｎ）カラム中に移した。
【００８２】
薬力学（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
ＤＮＡ消化をまったく行わなかったことを除いて、製造業者の使用説明書に従ってＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（７９６５４、Ｑｉａｇｅｎ）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（７４１０６、Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡを細胞ペレットから精製した。総ＲＮＡを５０μＬのＲＮａｓｅを含まない水で溶出させた。分光光度計ＮＤ−１０００Ｎａｎｏｄｒｏｐ（登録商標）を使用して、総ＲＮＡを定量化した。対照プライマーおよび標的用のプライマーのいずれかとともに、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｐｌｕｓ（ＲＴ−ＱＰＲＴ−０３２Ｘ、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）、すなわち、表１に列挙されたＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイ（２０×プローブ色素ＦＡＭ（商標）（またはＶＩＣ）−ＴＡＭＲＡ（またはＭＧＢ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲ（定量的逆転写酵素ポリメラーゼ鎖反応）を試料当たり３通りで設定した。
【００８３】
【表１】
0006728072.tif 000006
【００８４】
薬物動態学
試料調製および生物学的分析法
血漿および組織中の化合物Ａの濃度を、ＵＰＬＣ／ＭＳ−ＭＳアッセイにより同時に決定した。Ｆａｓｔ  Ｐｒｅｐ（登録商標）−２４システム（Ｍ．Ｐ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、組織を等容量のＨＰＬＣ−水（クロマトグラフィー用水、Ｍｅｒｃｋ）中でホモジナイズした。２５μｌの内部標準混合物（１μｇ／ｍｌ）を血漿または組織ホモジネートの分析用アリコート（２５μｌ）に添加後、２００μｌのアセトニトリルの添加によりタンパク質を沈殿させた。上清を新鮮バイアルに移した。蒸発乾固後、試料を６０μｌのアセトニトリル／水（１／１ｖ／ｖ）に再溶解させた。この溶液のアリコート（５μｌ）を、水中０．１％ギ酸（溶媒Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）の混合物からなる移動相でＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ（商標）１．７μｍ粒径、２．１×５０ｍｍ）上で分離させた。６００μｌ／分の流量で勾配プログラミングを使用した。９５％溶媒Ａと平衡化後、５μｌの試料を注入した。０．２５分の潜伏期後、５〜１００％溶媒Ｂの線形勾配で０．６５分の期間にわたって、続いて０．３５分保持して、試料を溶出させた。開始状態に０．２５分にわたって再平衡化することによって、カラムを次の試料のために準備した。Ｍａｓｓｌｙｎｘ（商標）４．１ソフトウェアにより制御された三連四重極質量分析計ＴＱＤ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）のイオン源中に、カラム溶出液を直接導入した。エレクトロスプレー陽イオン化（ＥＳＩ＋）多重反応モニタリングを、被分析物のＭＳ／ＭＳ検出のために使用した。化合物Ａについてｍ／ｚ５５５．３−−ｍ／ｚ３２９．２の前駆体から生成物へのイオン遷移を使用した。化合物についての定量化（ＬＯＱ）の限界は、０．７ｎｇ／ｍＬに設定した（ＣＶ、および３０％未満の全体的偏り）。ＱｕａｎＬｙｎｘ（商標）４．１（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）およびＥｘｃｅｌ（商標）２００７（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用して、回帰分析およびさらなる計算を行った。未知試料の濃度は、ビヒクルで処理した動物から得たブランクの血漿または組織にスパイクされた校正試料を使用して構築された校正曲線からの被分析物／ＩＳのピーク面積比に基づいて逆算した。
【００８５】
薬物動態パラメータの計算
時間曲線に対する血漿濃度下の面積（ＡＵＣ）を、線形台形則による平均値から計算し、血管外投与のための非コンパートメントモデル（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  バージョン５．２、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  ｃｏｒｐ．、ＣＡ、ＵＳ）を使用することによってさらなる関連パラメータを計算した。
【００８６】
免疫組織化学法
日常的手順に従って、すべての組織をＦＦＰＥに処理し、固定後、２４時間毎の緩衝液交換によって、ラット胸骨をクエン酸／ＥＤＴＡ緩衝液中５日間脱灰した。ミクロトームを使用して、切片を３μｍで切断した。ＯｍｎｉＭａｐ  ａｎｔｉ  ＭｏｕｓｅまたはＲａｂｂｉｔ  ＨＲＰ二次試薬およびＣｈｒｏｍｏＭａｐ  ＤＡＢ発色システム（chromogen system）を使用する、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ自動免疫染色器（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ｐ２１および切断カスパーゼ−３免疫組織化学法を行った。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＣＣ１（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を温和条件（切断カスパーゼ−３に対して、９５°  ８分＋１００°  ２０分）または標準条件（ｐ２１に対して、９５°  ８分＋１００°  ３６分）で使用して、抗原回復を行った。一次抗体を、Ｄａｋｏ抗体希釈液中所望の希釈で手作業によって適用し、続いて、室温で１時間インキュベートした。対応する負対照をＡｂＤのみでインキュベートした。ヘマトキシリン（Ｖｅｎｔａｎａ／Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、切片の対比染色を行った。自動染色運転後、スライドを段階的な一連のエタノール中で脱水し、キシレン中で清浄し、Ｐａｒｔｅｘ封入剤を取り付けた。
【００８７】
免疫組織化学法のために使用した一次抗体を表２に記載する。
【００８８】
【表２】
0006728072.tif 000007
【００８９】
ｍＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション
製造業者のプロトコルに従って、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ  ＦＦＰＥアッセイキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｐａｎｏｍｉｃｓ）を使用して、インサイチューハイブリダイゼーションを行った。ラットＵｂｃ（Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｃ）およびＢｂｃ３（ＰＵＭＡ）ｍＲＮＡのための遺伝子特異的プローブセットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが特注設計し、合成した。Ｂｂｃ３プローブをタイプ１／Ｆａｓｔ  Ｒｅｄで使用し、Ｕｂｃプローブをタイプ６／Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅで使用した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅプロトコルに厳格に従って、スライドを処理した。プレハイブリダイゼーション条件は、前処理溶液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中沸騰１０分、および４０℃でプロテアーゼＱＦ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）消化１０分で最適であることがわかった。簡潔には、５つのマイクロメートル切片を切断し、１０％ホルムアルデヒド中で固定し、脱パラフィン化し、再脱水した。ｍＲＮＡへの接近可能性を増大させるために、次いで、スライドを、最適条件でプレトリートメント溶液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中で沸騰させ、プロテアーゼＱＦ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で消化した。次いで、Ｂｂｃ３および対照遺伝子Ｕｂｃに対して特注設計ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡプローブによって、切片を４０℃で３時間ハイブリダイズさせた。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマニュアルの推奨によって、非プローブ試料を負対照として用いた。ハイブリダイゼーション後、次いで、非結合プローブを洗浄緩衝液（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）でフラッシュして除き、次いで、一方で結合プローブを、ＰｒｅＡｍｐ（４０℃で２５分）、次いでＡｍｐ分子（４０℃で１５分）および最後にアルカリ性ホスファターゼにコンジュゲートした多重標識プローブオリゴヌクレオチド（ＬＰ−ＡＰ）を４０℃で１５分使用して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘからのプロトコル（分岐ＤＮＡ増幅）によって増幅した。シグナルのＬＰ−ＡＰタイプ６プローブ検出を、Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ基質（青色ドット、Ｃｙ５蛍光）によって暗所中室温で３０分間、続いて、シグナルのＬＰ−ＡＰタイプ１プローブ検出を、ＦＡｓｔ  Ｒｅｄ基質（赤色ドット、Ｃｙ３蛍光）によって４０℃で３０分間行った。シグナル検出後、次いで、スライドを、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色し、すすぎ洗いし、Ｕｌｔｒａｍｏｕｎｔ水性封入剤（ＤＡＫＯ）を使用することによって取り付け／カバーガラスをかけた（mounted/coversliped）。ＣｏｌｏｒｖｉｅｗＩＩＩカラーカメラ（Ｓｏｆｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡で画像を撮影した。
【００９０】
ｍＲＮＡ  ＩＳＨに使用したプローブを表３に記載する。
【００９１】
【表３】
0006728072.tif 000008
【実施例１】
【００９２】
２０ｍｇ／ｋｇでの単回ｉ．ｖ．注射後の化合物Ａの薬物動態学（ＰＫ）
図１は、単回ｉ．ｖ．注射後１４４時間にわたる血漿、腫瘍および肝臓中の化合物Ａ濃度を示す。化合物についてのＴｍａｘは、血漿および肝臓で５分ならびに腫瘍で１時間であった。化合物Ａは、血漿（ＡＵＣ０〜１４４時間  ｄｎ＝８．１時間．μＭ）と比較して腫瘍（ＡＵＣ０〜１４４時間  ｄｎ＝１６．５時間．ｎｍｏｌ／ｇ）で２倍高い曝露を示した。図２は、腫瘍中の化合物Ａ濃度および腫瘍における薬力学（ＰＤ）応答を示す。Ｐｕｍａおよびｐ２１は、それぞれ、処置２４時間後に１８０倍および２００倍の発現最大値に達する非常に同様のｍＲＮＡ誘導を示した。
【実施例２】
【００９３】
ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物Ａ（ｉ．ｖ．、１回）のＰＫ、ＰＤ、効力および耐容性
図３および図４は、それぞれ、４２日間にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。２０ｍｇ／ｋｇ（より高い用量）での化合物Ａによる単回ｉ．ｖ．処置は、処置１４日後に９２％の腫瘍退縮を誘導した。１匹のラットは、過剰な体重（ＢＷ）減少のために、処置後９日目に犠牲にしなければならなかった。その他のすべてのラットについて処置３日後のＢＷのわずかな減少にもかかわらず、それらは、急速に回復し、全実験の間にＢＷを増加させた。１１の腫瘍の中で２つだけが不完全な応答を示し、再増殖した（図５）。これらの２匹の動物を１５ｍｇ／ｋｇにてｉ．ｖ．で再処置し、腫瘍はなお感受性であった。しかしながら、腫瘍退縮は弱められ、これは、より大きい腫瘍サイズのためであり得た。第１の処置後、腫瘍におけるｐ２１およびＰｕｍａ  ｍＲＮＡの発現は、ｍＲＮＡ発現の増加の５０倍超に達した。Ｍｄｍ２は、はるかにより低いｍＲＮＡ誘導を示した（Ｅｍａｘ＝１０倍）。第１の処置後５９日目に、すべてのラットを２０ｍｇ／ｋｇにてｉ．ｖ．で処置して、宿主に対する薬物の効果を評価した。化合物Ａの曝露は、心臓、空腸、脾臓、肝臓および骨髄においては同様であったが、血漿においては２倍程度高かった（Ｃｍａｘは知られていない）。空腸および骨髄（胸骨）におけるｐ２１、Ｍｄｍ２および切断カスパーゼ−３の最大増加は、常に処置３時間後に観察された。すべての染色は、処置７日後に基準値に戻っていた。空腸切片での切断カスパーゼ−３の増加は、ｍＲＮＡ  ＩＳＨにより検出されたＰｕｍａ（Ｂｂｃ３）ｍＲＮＡ誘導と強い相関を示した。事実、Ｐｕｍａの最大増加は、処置７日後の基準値への復帰とともに、最後の処置３日後に観察された。ＲＮＡ  ＩＳＨは、腺窩細胞だけが空腸切片で染色されることを明らかに示した。同じことが、脾臓および心臓で当てはまった。最後に、重度な骨髄減少を、処置１４日後に観察することができ、２２日目に一部回復した（図６）。白血球数は、骨髄減少と有意に相関していることを示した（Ｒ２＝０．５９、Ｐ＝０．００６、図７）。これは、間欠投与が、骨髄を回復させることによって耐容性を改善し得ることを示す。
【実施例３】
【００９４】
ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物Ａ（ｉ．ｖ．、ｑ３ｗ）のＰＫ、ＰＤ、効力および耐容性
図８は、４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。２０ｍｇ／ｋｇでの第１の処置３週後に、化合物Ａは、平均で６％の腫瘍退縮を誘導した。しかしながら、個別のデータは、３匹のラットが完全応答（１００％退縮）を示し、２匹が部分的応答（５０％超退縮）を示し、１匹が安定な疾患を示し、および１匹が、処置１週後の早期８０％退縮にもかかわらず進行性疾患を示したことを示す。第２の処置後、化合物Ａは、１００％腫瘍退縮を誘導したが、２／７の動物だけが、２回の完全周期を生き残った。事実、５匹のラットは、過剰なＢＷ減少のために第２の処置後に犠牲にしなければならなった：最初の１匹は第２の処置１０日後、その他の４匹はその８日後。図９は、実験の４２日にわたる白血球（ＷＢＣ）数、好中球数および血小板数を示す。化合物Ａは、第１の処置後にＷＢＣ、好中球および血小板の劇的な減少を誘導し、ほとんどのラットは、処置後２１日目に部分的に回復しただけであった。結果として、第２の処置は、ＷＢＣ、好中球および血小板を０に近い極度に低いレベルにした。
【実施例４】
【００９５】
ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物Ａ（ｉ．ｖ．、ｑ３ｗ）のＰＫ、ＰＤ、効力および耐容性
図１０は、４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。１３．７および１８．２ｍｇ／ｋｇでの化合物Ａによる処置は、処置１週後に平均で６６および８８％の腫瘍退縮を誘導することができた。２週後、１３．７ｍｇ／ｋｇで処置された腫瘍のすべては、再増殖しており、本発明者らは、この処置群を中止することを決定した。１８．２ｍｇ／ｋｇでの処置３週後、腫瘍は、２つの完全応答とともに、３６％だけなお退縮していた。平均で腫瘍は１１８％進行していた（表４）ので、腫瘍増殖に対する効果は、第２の処置後により小さい傾向があり、２つの同じ腫瘍は完全応答を示した。結果として、第２の処置は完全応答の数を増加させなかった。耐容性の点で、ラットは、処置３日後にＢＷのわずかな減少を示したが、それらは急速に回復し、次の処置によってＢＷを増加させた。実際に、１匹のラットだけが、実験の最終日の間にＢＷの劇的な減少を示したが、それが処置関連であったかは決定することができない。図１１は、実験の４２日にわたる白血球数、好中球数および血小板数を示す。化合物Ａは、第１の処置後にＷＢＣ、好中球および血小板の強い減少を誘導したが、すべての測定ラットは、処置後２１日目に完全に回復した。第２の処置は、細胞数に対して同様の効果を示したが、ラットは、第２の処置後２１日目に一部が回復しただけであった。
【００９６】
【表４】
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【実施例５】
【００９７】
単回経口投与（２７ｍｇ／ｋｇ）後のＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する化合物ＡによるＰＫおよびＰＤ
図１２は、化合物Ａの単回経口注射後の１４４時間にわたる、血漿、腫瘍および肝臓中の薬物濃度を示す。化合物についてのＴｍａｘは、すべてのマトリックスにおいて３時間（ｈ）であった。化合物Ａは、血漿（ＡＵＣ０〜１４４時間＝１１１．５時間．μＭ）と比較して、腫瘍（ＡＵＣ０〜１４４時間＝２７７．７時間．ｎｍｏｌ／ｇ）でより高い曝露を示した。図１３は、腫瘍における薬物濃度およびＰＤ応答を示す。Ｐｕｍａおよびｐ２１は、処置４８時間後に１６２倍および１８０倍のＥｍａｘに達する同様のｍＲＮＡ誘導を示した。このようなｐ．ｏ．用量で、Ｍｄｍ２は、はるかにより低いＥｍａｘ（３４倍）を示した。
【実施例６】
【００９８】
３ｑｗ投与レジメン（ｐ．ｏ．）によるＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する効力
図１４は、化合物Ａによるｑ３ｗ  ｐ．ｏ．処置の４２日にわたるヌードラットの腫瘍増殖、および体重の変化を示す。第１の処置３週後、両方の用量は、腫瘍退縮を誘導することができた（用量２０ｍｇ／ｋｇおよび２７ｍｇ／ｋｇについて、それぞれ、２７％および８８％）。しかしながら、腫瘍増殖に対する効果は、最高用量だけがなお腫瘍退縮を誘導することができたので（２７ｍｇ／ｋｇで２７％）、第２の処置後に軽減される傾向があった。第１の処置後、血液中の化合物ＡのＣｍａｘおよびＡＵＣ０〜２４時間、ならびに腫瘍におけるｐ２１およびＰｕｍａ  ｍＲＮＡの発現は、うまくかつ用量依存的に増加した。両方の用量は、各処置３日後に体重（ＢＷ）のわずかな減少を誘導したが、すべての動物は、急速に回復し、処置３週後にＢＷの増加を示した。図１５は、実験の４２日にわたる白血球数および血小板数を示す。化合物Ａは、ＷＢＣ、好中球および血小板の用量依存性減少を誘導した。ＷＢＣおよび血小板は、２０ｍｇ／ｋｇでの第２の処置前に完全に回復した。２７ｍｇ／ｋｇでの処置について、血小板も完全に回復したが、ＷＢＣは部分的に回復しただけであった。
【実施例７】
【００９９】
高用量に対しての低用量の効果
高用量および低用量の応答を評価するために実験を行った。動物を、５ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．の低用量、または２７ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．もしくは２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．の高用量で処置した。Ｍｄｍ２ｉの低用量は、高用量が誘発するのと同じ生化学的効果を誘発しない（図１６）。
【実施例８】
【０１００】
高用量および低用量処置の組合せは、高度に相乗的である
化合物Ａの２つの投与スケジュール、間欠のもの（１５ｍｇ／ｋｇ  １回）と毎日の投与（１．５ｍｇ／ｋｇ）とを組み合わせて、実験をＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対して繰り返した。本発明者らは、図１７で、この２つの投与レジメンの組合せが、高度に相乗効果を有することを示す。これは、多重実験の概略の提示である。さらなる明らかな相乗性が、図１８および図１９でも見られる。ＳＪＳＡ−１腫瘍保有ラットに対する効力（図１８）および耐容性（図１９）は、他の用量および異なる投与スケジュール（１５ｍｇ／ｋｇ  ｑ４ｗ（０日目）＋３ｍｇ／ｋｇ  ｑ２４ｈ  ２ｗオン／２ｗオフ（１日目）；２１ｍｇ／ｋｇ  ｑ４ｗ（０日目）＋１．５ｍｇ／ｋｇ  ｑ２４ｈ  ３ｗオン／１ｗオフ（１日目））でさらに試験した。投与スケジュールの組合せは、効力を向上することが示され、特により低い用量をより良好な腫瘍収縮をなお達成するために使用し得るので、耐容性を増加させ得る。
【実施例９】
【０１０１】
黒色腫患者由来異種移植（ＰＤＸ）保有ラットにおける効力および耐容性（経口）
同じ実験を、黒色腫ＰＴＸ保有ラットによって繰り返した。化合物Ａの効力（図２０）および耐容性（図２１）を、２７ｍｇ／ｋｇ  ｑ３ｗで試験した。間欠投与は、黒色腫モデルにおいても効力を示した。
【実施例１０】
【０１０２】
ＳＨＳＹ５Ｙ腫瘍保有マウスにおけるセリチニブと組み合わせて間欠的に投与された化合物Ａの効力
セリチニブと化合物Ａの組合せをマウスに投与することによって、同様の実験を行った。実験は、化合物Ａが、別の化合物と組み合わされる場合、１週毎に投与され得ることを示した（図２２）。１２０ｍｇ／ｋｇで毎週（４０ｍｇ／ｋｇ×３時間毎３回）の化合物Ａと一緒のセリチニブは、セリチニブ単独、または２０ｍｇ／ｋｇで毎日のセリチニブ＋化合物Ａの組合せ（ｎ＝５）に比較して、より良好な抗腫瘍効果をもたらした。マウスは、ラットと異なる薬物動態を示した。したがって、この用量は、必要な曝露を達成するために３時間毎３回投与されなければならなかった。マウスモデルのこの特異性、特にはるかにより高いクリアランスを考慮に入れると、マウスに対する実験は、ラットおよび他の対象に外挿することができ、マウスモデルは、化合物Ａが少なくとも３週毎に投与される場合でも、少なくとも同じ効果が、ラットまたは他の対象、特にヒトで達成することができることを証明すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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