(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から１または複数の標的分子の液体クロマトグラフィー精製を実施するための、
ａ）試料のクロマトグラフィー精製を行い、１または複数の標的分子を含む溶離剤流を得る工程と、
ｂ）前記溶離剤流中の前記１または複数の標的分子の含有量を示す出力パラメータを測定し、出力パラメータデータを保存する工程と、
ｃ）前記溶離剤流を連続した溶離剤画分に分割し、前記出力パラメータデータを対応する連続したデータ画分に分割する工程とを含む方法であって、
前記方法が、
ｄ）各々のデータ画分において、前記工程ｂ）で測定された出力パラメータの特徴的な挙動を示す値を得る工程、
ｅ）前記連続したデータ画分で得られた値に基づいて前記測定された出力パラメータの傾向を識別する工程（２０２）、および
ｆ）前記識別された傾向に基づく、１または複数の溶離剤画分と相関する前記測定された出力パラメータの１または複数のピークを識別する工程（２０３）
をさらに含み、
特徴的な挙動を示す前記値が、工程ｂ）の前記測定された出力パラメータに基づいて、各々のデータ画分の平均出力パラメータレベルを計算すること（２０１）によって得られる、方法。
【請求項２】
工程ｃ）が、各々の連続した溶離剤画分の画分サイズを規定すること（１０８）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶離剤画分サイズが予め設定されたように選択される（３０１）、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１または複数の谷が、前記測定された出力パラメータの傾向を識別するために使用され、工程ｅ）が、ピークの終わりであるデータ画分を識別し、新しいピークの始まりであるデータ画分を識別して、各々の谷を識別することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）が、積分ウィンドウを決定することをさらに含み、工程ｅ）が、
ｅ１）前記積分ウィンドウ内のデータ画分の数が３よりも大きいことを確かめる工程（７０１）、
ｅ２）前記データ画分の前記平均出力パラメータレベルと、隣接するデータ画分の前記平均出力パラメータレベルを比較することによって、各々のデータ画分の導関数符号数を見出す工程（７０３）、および
ｅ３）前記導関数符号数を使用して、ピークの終わりと新しいピークの始まりを識別して、各々の谷を識別する工程（７０４）
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｅ３）が、
−現在のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルが、前のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルに対して低い場合、かつ前記現在のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルが、次のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルに対して低いかまたは等しい場合に、ピークの終わりが前記前のデータ画分であると識別する工程、ならびに
−前記現在のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルが、前記前のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルに対して低いかまたは等しい場合、かつ前記現在のデータ画分の前記平均出力パラメータレベルが前記次のデータ画分に対して低い場合に、前記現在のデータ画分がピークの範囲内にないのであれば、新しいピークの始まりが前記次のデータ画分であると識別する工程、
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記導関数符号数が２つの導関数符号を含み、各々の導関数符号が隣接するデータ画分の平均出力パラメータレベル間の関係を示し、工程ｅ２）が、
−隣接するデータ画分間の平均出力パラメータレベルの違いを判定するための閾値を計算する工程であって、
−前記平均出力パラメータレベルの違いが前記閾値よりも低い場合、導関数符号はゼロであり、
−前記平均出力パラメータレベルの違いが前記閾値よりも高い場合、前記平均出力パラメータレベルが次のデータ画分においてより高いのであれば前記導関数符号は正であり、または前記平均出力パラメータレベルが次のデータ画分においてより低いのであれば前記導関数符号は負である工程をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記閾値が、前記積分ウィンドウ内の前記データ画分について計算された平均出力パラメータレベルの最大値と最小値の差の５％未満であるように選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｆ）が、
−前記積分ウィンドウ内で前記識別されたピークの始まりと前記ピークの終わりとの間に位置する連続したデータ画分に相関する前記１または複数のピークを識別する工程をさらに含む、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ）の前記積分ウィンドウが、
ｂ１）前記積分ウィンドウを、工程ｂ）の前記出力パラメータデータを含むデフォルトの積分ウィンドウであると設定する工程、および
ｂ２）前記積分ウィンドウ内の出力パラメータデータポイントの数を調べ、データポイントの最小数未満であれば、積分ウィンドウを決定することを終了させる工程
によって決定される、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ｂ３）前記積分ウィンドウの始まりを、見出されるならば最初のイベントと同時になるように調節する工程であって、前記最初のイベントが前記溶離剤の１回目の注入として規定される工程、および
ｂ４）前記積分ウィンドウの終わりを、見出されるならば最後のイベントを含むように調節する工程であって、前記最後のイベントが
−最後の連続した溶離剤画分、または見出されない場合は
−最後の出力パラメータデータ
であると規定される工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記積分ウィンドウ内の出力パラメータデータポイントの数を調べ、データポイント最小数未満であれば、前記積分ウィンドウを前記デフォルトの積分ウィンドウと決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程：
−各々の識別されたピークに対応する分子の吸光係数を設定する工程（１１１）、
−既知吸光係数をもつ分子の目標濃度を設定する工程（８０１）、
−分子と相関するピークを決定し（８０２）、目標濃度を満たすようにピーク内のデータ画分を選択する工程、および
−分子濃度および相関するデータ画分を提示する工程
を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
目標濃度を満たすようにピーク内のデータ画分を選択する場合に、前記ピークの最大の平均出力パラメータレベルの予め設定された百分率よりも少ない平均出力パラメータレベルをもつピーク内の１または複数のデータ画分が除外される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記予め設定された百分率が、前記ピークの前記最大の平均出力パラメータレベルの１〜５％の範囲内であるように選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
最大の平均出力パラメータレベルをもつ、ピーク内の１または複数のデータ画分が最初に選択され、最小の平均出力パラメータレベルを有するか、または前記最大の平均出力パラメータレベルから最も遠く離れているデータ画分が目標濃度を満たすために最後に選択される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程：
ｇ１）前記１または複数の標的分子の１または複数のピークおよび相関する溶離剤画分を提示する工程（１１２）、または
ｇ２）前記測定された出力パラメータデータに基づいて、ピークの分子の含有量を提示する工程（１１５）
をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記出力パラメータが、１またはそれ以上の波長のＵＶ吸光度、導電率、光散乱検出、蛍光発光、質量分析の群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
１または複数の標的分子の液体クロマトグラフィー精製を実施するための系であって、前記系が、
−１または複数の標的分子を含む溶離剤流を得る、前記試料のクロマトグラフィー精製を実施するように適合させたユニットであって、前記溶離剤流が連続した溶離剤画分に分割される、ユニット
−前記溶離剤流中の前記１または複数の標的分子の前記含有量を示す出力パラメータを測定するように適合させた検出器、および
−前記溶離剤画分に対応するデータ画分における出力パラメータデータを保存するためのメモリー
を含み、
前記系が、請求項１〜１８のいずれか一項に従う方法を実施するように適合させた評価ユニットをさらに含む、系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、独立クレーム１のプリアンブルに記載される液体クロマトグラフィー精製を実施するための方法に関する。本発明はまた、液体クロマトグラフィー精製を実施するための系にも関する。
【背景技術】
【０００２】
新規な種類の薬物を調製するためだけでなく研究目的のために、生物工学的な方法は、タンパク質、ペプチド、核酸およびその他の生体分子ならびに化合物の製造において、ますます広範に使用されている。その汎用性および化合物に対する感受性のために、液体クロマトグラフィーは、このような状況で好ましい精製方法である場合が多い。液体クロマトグラフィーという用語は、一群の密接に関連した分離法を包含し、それは全て互いに非混和性の２つの相を接触させるという原理に基づく。より具体的には、標的化合物を移動（液）相に導入し、それを固定相と接触させる。
【０００３】
次に、標的化合物は、移動相によって系を通って運搬される時に固定相と移動相の間の一連の相互作用を受ける。手短に言えば、クロマトグラフィーの概念は、移動相と固定相に対する分子のそれぞれの物理的または化学的性質の違いに基づいて、試料中の他の分子から標的分子を分離することに関する。
【０００４】
慣用されるクロマトグラフィー精製技法の例としては、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲル濾過（ＧＦ）、クロマトフォーカシングなどが挙げられる。時には、精製プロトコールには、同じまたは異なる精製技法を使用する２以上の精製工程が含まれる。
【０００５】
回収した画分の体積は、クロマトグラフィー実行時の異なる工程の間で違っている場合が多い。試料を適用する間、標的タンパク質がカラムを真っ直ぐに通過する場合の安全対策として、大型の画分体積が回収される。通過画分は、適用した試料の体積およびその後の洗浄に対応する１つまたは少数の画分に回収される。溶出の間、小さいほうの画分体積が通例回収され、溶出ピークは、重複ピークから純粋なタンパク質を得るためにいくつかの溶離剤画分に通常分割される。
【０００６】
ピークの異なる部分を分析できるようにするために、溶出の間の画分サイズは、予測されるピーク体積よりも小さい値に通例設定される。ストレート（時には固定と呼ばれる）分別を使用する場合、図１ａに示されるように、フラクションコレクターは分別全体を通して設定容量に従って連続的にチューブを取り換えることになる。回収したタンパク質ピークの純度をさらに高めるために、「ピーク分別」を使用することができる。今度はＵＶ／Ｖｉｓ検出器を使用して、図１ｂに示されるように、ピーク分別をいつ開始し、いつ停止するべきであるかを決定する。ストレート分別およびピーク分別は、実行中に組み合わせることもできる。
【０００７】
分別遅延容量（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ  ｖｏｌｕｍｅ）は、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器のフローセルとフラクションコレクターとの間の容量である。正確な遅延容量がソフトウェアに入ることは重要である。
【０００８】
規定された遅延容量は、時間Ｔ１を計算するために系によって使用され、Ｔ１はピークがフラクションコレクターに達する時である。Ｔ１は、クロマトグラムの分別マークをフラクションコレクターのチューブスイッチと同期させるために使用される（図２参照）。画分の回収の開始時に、遅延容量は、どの系が使用されるかによって廃棄物または最初の分別チューブに向けられる。遅延容量は、流路に含まれる管類および構成部品によって決まり、遅延容量は、理論上または実験的に、吸光度検出器と分別の先端部との間の全ての管類および構成部品からの容量を含めることによって決定される。
【０００９】
液体クロマトグラフィーを使用する、１または複数の標的分子を含有する試料の分析的ピーク積分および分取的ピーク積分は、当分野で周知である。分析的ピーク積分、または分析的実行の間、試料中の１または複数の標的分子の総量または標的分子の比は、各々の標的分子との関係で完全なピークを推定し、前記ピークを積分することによって求められる。分取的ピーク積分、または分取的実行の間、本目的は１または複数の分子の純粋な部分をできるだけ回収することである。
【００１０】
従来、ユーザーは試料が精製される前にピーク積分の種類を決定するよう強いられてきた。分析的ピーク積分が選択されると、積分ウィンドウが選択され、ベースラインが確立される。異なる技法を使用してベースラインを確立し、さらに積分ウィンドウ内でピークを識別することもできる。
【００１１】
分取的ピーク積分において、溶離剤流（すなわち、液体クロマトグラフィー精製からの精製試料の出力液体流）は、溶離剤画分に分割され、分取的実行の後に回収される。出力パラメータデータは、検出器（最も一般的な型はＵＶ吸光度検出器である）によって測定され、データは曲線として提示される（クロマトグラムとしても公知である）。各々のピークは、分析的ピーク積分と同様に明確に定められる。ユーザーは、調査するのが興味深い、すなわち適量の標的分子を含む、識別されたピーク内の溶離剤画分を手動で選択してよい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１３６１８４号パンフレット
【発明の概要】
【００１３】
本発明による一目的は、試料から１または複数の標的分子を精製するための、先行技術と比較して改善されたプロセスをもつ方法を提供することである。
【００１４】
この目的は、独立クレーム１に記載の試料から１または複数の標的分子の液体クロマトグラフィー精製を実施するための方法によって達成することができる。本方法は、試料のクロマトグラフィー精製を行い、１または複数の標的分子を含む溶離剤流を得る工程；溶離剤流中の１または複数の標的分子の含有量を示す出力パラメータを測定し、出力パラメータデータを保存する工程；および溶離剤流を連続した溶離剤画分に分割し、出力パラメータデータを対応するデータ画分に分割する工程を含む。本方法は、各々のデータ画分において、測定された出力パラメータの特徴的な挙動を示す値を得る工程、連続したデータ画分で得られた値に基づいて測定出力パラメータの傾向を識別する工程、および識別された傾向に基づいて、溶離剤画分と相互関係を示す測定出力パラメータの１または複数のピークを識別する工程（２０３）をさらに含み、それにより、識別された１または複数のピークと、相関する１または複数の溶離剤画分の情報を提示することができ、溶離剤からの１または複数の精製試料を回収することができる。
【００１５】
本発明に関する利点は、特異的標的分子に相関する溶離剤画分が、先行技術の方法と比較してより高い純度で測定されることである。
【００１６】
本発明に関する別の利点は、ユーザーが自分たちの仕事をどのように続けるか、例えば次の工程にどの溶離剤画分を回収するかについて、より素早く決断を下すことである。
【００１７】
本発明の代替実施形態では、吸光係数を各々の識別されたピークに設定し、既知の吸光係数をもつ選択された分子に目標濃度を設定することによって、選択された分子の目標濃度が得られる。データ画分に対して平均出力パラメータレベルを使用する分取的ピーク積分を実施し、分子と相関するピークを求め、ピーク内のデータ画分を目標濃度に合うように選択すると、分子濃度および相関するデータ画分がその後に提示される。
【００１８】
代替実施形態に関する利点は、先行技術の方法と比較してより高い濃度の標的分子を回収することができることである。
【００１９】
さらなる目的および利点は、詳細な説明および図面から当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１ａ】先行技術によるストレート分別を示す図である。
【図１ｂ】先行技術によるピーク分別を示す図である。
【図２】先行技術の系における検出器とフラクションコレクターとの間の溶離剤流の遅延を示す図である。
【図３】本発明による液体精製を実施するためのプロセスを説明するフローチャートを示す図である。
【図４】図３に関連して説明されるプロセスにおける分取的ピーク積分の工程を説明するフローチャートを示す図である。
【図５】図４に記載される分取的ピーク積分の第１の実施形態を示す図である。
【図６】測定出力パラメータ、例えばＵＶ吸光度などの谷を識別するための導関数符号数の概念を示す図である。
【図７ａ】分析的ピーク積分と分取的ピーク積分との間の違いを示す図である。
【図７ｂ】分析的ピーク積分と分取的ピーク積分との間の違いを示す図である。
【図８】分取的ピーク積分の代替実施形態を示す図である。
【図９】積分ウィンドウ中のピーク間の谷を識別するプロセスを説明するフローチャートを示す図である。
【図１０】既知標的分子の目標濃度を達成するために溶離剤画分を選択するプロセスのフローチャートを示す図である。
【図１１】本発明の方法を実施するように適合させた、液体クロマトグラフィー精製を実施するための系を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲を通して、以下の用語は、以下の限定されない定義に従って使用される：
液体クロマトグラフィー精製／精製：液体クロマトグラフィー精製という用語は（本明細書中ではただ「精製」と呼ぶこともある）、例えば不純物および／または他の非標的分子を除去することによって、試料から１または複数の標的分子を精製する、現在または将来のクロマトグラフィーに基づく行為またはプロセスをさす。液体クロマトグラフィー精製の例としては、限定されるものではないが：アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、クロマトフォーカシングが挙げられる。しかし、精製すること、精製する、精製された、純粋な、等の関連する用語の範囲は決してこの定義によって範囲を制限されない。
【００２２】
液体クロマトグラフィープロトコール：用語「液体クロマトグラフィープロトコール」とは、クロマトグラフィー精製プロセスの実験パラメータの設定を規定するプロトコールをさす。液体クロマトグラフィープロトコールは、１または複数のクロマトグラフィー精製工程を含んでよく、さらに濾過などのその他の工程と組み合わせてもよい。
【００２３】
標的分子：用語「標的分子」とは、移動相および固定相に対する分子のそれぞれの物理的または化学的性質の違いに基づいて精製され、したがって試料中の１または複数の他の分子から分離される分子をさす。標的分子は、生体分子、例えばタンパク質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたは同種のものであってよい。
【００２４】
試料：用語「試料」とは、分離され、したがって精製された標的分子を少なくとも含む液体試料をさす。試料は、標的分子を含む任意の液体、例えば生体由来の試料液（例えば細胞培養、生存生物、体液または同種のものに由来するもの）であってよい。
【００２５】
クロマトグラム：用語「クロマトグラム」とは、クロマトグラフィー精製の少なくとも一部の間に登録された１またはそれ以上の出力パラメータのグラフをさす。クロマトグラムは、出力パラメータを、時間、累積体積またはクロマトグラフィー精製に関係する任意のその他のパラメータの関数として提示することがある。
【００２６】
溶離剤流：用語「溶離剤流」とは、液体クロマトグラフィー精製から精製された１または複数の標的分子を含む出力液体流をさす。
【００２７】
出力パラメータ：用語「出力パラメータ」とは、液体クロマトグラフィー精製の溶離剤流中の標的分子の濃度または量を示す登録可能なパラメータをさす。出力パラメータは、例えば、クロマトグラフィー精製からの出力流における１またはそれ以上の性質の測定値であってよく、１または複数の出力パラメータは、限定されるものではないが：１またはそれ以上の波長のＵＶ吸光度、導電率、光散乱検出、蛍光発光、質量分析または同種のものから選択されてよい。
【００２８】
溶離剤画分：溶離剤画分は、フラクションコレクターに回収される溶離剤流からの部分である。
【００２９】
データ画分：データ画分は、標的分子の含有量を示す出力パラメータの測定値から保存されたデータを含み、溶離剤画分と相関する。
【００３０】
分析的実行：分析的実行または分析的ピーク積分の目的は、試料中のあらゆる存在分子の総量を求めることである。
【００３１】
分取的実行：分取的実行、または分取的ピーク積分の目的は、試料から１または複数の分子のできる限り純粋な部分を回収することである。
【００３２】
含有量：用語「標的分子の含有量」は、この説明中で、標的分子の濃度および／または量を含めるために使用される。
【００３３】
この説明を通して、本発明の特徴はＵＶ吸収検出器を使用して例証されるが、本発明の概念は、これに限定されない。その他の種類の検出器を使用して標的分子の含有量を示す出力パラメータを測定することができる。
【００３４】
分取的精製を行う場合、主な目的は、さらなる作業、例えば研究、プロセス最適化または製造のために精製された試料を回収することである。それは常に純度と量との間のトレードオフである。
【００３５】
液体クロマトグラフィー精製結果の分析は、多くの場合、１または複数の標的分子を有する溶離剤流の分析的または分取的ピーク積分を含む。溶離剤流中の１または複数の標的分子／タンパク質の濃度を示す出力パラメータ、例えば吸光度などが測定され、出力パラメータデータが保存される。保存された出力データポイントはクロマトグラムを規定する。
【００３６】
クロマトグラムのピーク面積は、精製された分子の含有量に比例するので、分析的ピーク積分は、測定出力パラメータ、例えばＵＶ吸光度を示すＵＶシグナルに基づいて実施される。しかし、分取的ピーク積分との関係で、溶離剤流は、連続した溶離剤画分に分割され、出力パラメータデータは、対応するデータ画分に分割される。分取的ピーク積分の主な焦点は、ピークに含まれる精製された溶離剤画分を回収することにある。これらの溶離剤画分中の精製された分子の量は非常に重要であり、分析的ピーク積分から得ることはできない。
【００３７】
本発明は、分取的ピーク積分が予め規定され、１または複数の標的分子に対応する１または複数のピークを識別するためにクロマトグラムが分析され、前記１または複数の標的分子を含む溶離剤画分に相関する、クロマトグラフィー精製が分取的性質である、自動識別に基づく「ワンクリック分取評価」の手段を提供する。一実施形態では、ピーク−画分−選択が提示され、対応する溶離剤画分中の対応する体積の１または複数の標的分子が計算されて提示される。その結果として、各々の溶離剤画分中の分子／タンパク質の量を推定することができ、ユーザーは、自分たちの仕事の次の工程にどの溶離剤画分を使用するべきかについての決定を補助される。しかし、分取的実行から提示される結果は、ピークと相関した溶離剤画分の推定である。図７ａ〜７ｄを参照してより詳細に考察されるように、ユーザーはピークと溶離剤画分との間の相関を変更可能である、すなわちピーク内で溶離剤画分を添加または除去することが可能であり、したがって標的分子の含有量を変えることができる。
【００３８】
本発明の方法の基本的な概念は、分取的ピーク積分を実施した場合に溶離剤画分と相関するピークを検出することである。一実施形態では、ピーク検出は、測定出力パラメータ自体の代わりに各々のデータ画分において特徴的な挙動を示す値に基づく。この値は、一実施形態では、下でより詳細に記載されるように各々のデータ画分の出力パラメータの平均値として実行される。溶離剤流は予め設定された画分に回収されるので、標的分子を含む（すなわち出力パラメータのクロマトグラムでピークに属している）１または複数の画分の選択は、画分の境界に制限される。したがって、検出されたピーク限界、ピークの始まりおよびピークの終わりは、溶離剤画分境界にスナップするように構成される。
【００３９】
さらなる実施形態では、本方法には、分析的または分取的ピーク積分が溶離剤画分の存在に基づいて実施されるべきであるか否かの自動識別が含まれる。溶離剤流が溶離剤画分に分割されていない場合、分析的ピーク積分が選択され、そうでなければ分取的ピーク積分が行われる。しかし、図７ａ〜７ｄを参照してより詳細に考察されるように、ユーザーインターフェースによって、溶離剤流が溶離剤画分に分割される場合にも、ユーザーが動作モードを分取的から分析的な積分に変更することが可能になる。
【００４０】
図３は、本発明による液体精製を実施するためのプロセスの一実施形態を説明するフローチャートを示す。本発明を説明するために、ＵＶ検出器で測定されるＵＶ吸光度が、試料由来の１または複数の標的分子の濃度を示すために使用される。試料をクロマトグラフィー精製に供して、１または複数の標的分子を含む溶離剤流を得る。
【００４１】
図３では、プロセスはスタートし１０１、ＵＶ検出器のセル長が決定される１０２。ＵＶ検出器以外の検出器を使用する場合には、この工程は省いてもよい。これは、手動で必要なパラメータを入力することによって達成することもできるし、当業者に公知のように自動で達成することもできる。セル長は、下に説明されるように、１または複数の標的分子の濃度を推定するために必要とされる。
【００４２】
Ａ＝ｆ（ｃｏｎｃ．）＝ε・ｌＵＶ・ｃｏｎｃ．
Ａは、吸光度であり、ｃｏｎｃ．は分子の濃度であり、εは分子の吸光係数であり、ｌＵＶは、ＵＶ検出器で照射された長さである。
【００４３】
溶離剤流の１または複数の標的分子を示す、出力パラメータデータ（この例ではＵＶ吸光度シグナル）が測定されて保存され、随意に１０３で積分ウィンドウが決定される。積分ウィンドウが選択される場合、それは手動で選択されてもよいし、以下の工程に従って自動的に設定されてもよい：
１）例えば、デフォルトの積分ウィンドウの始まりが最初の測定出力パラメータと同時になるように、そしてデフォルトの積分ウィンドウの終わりが最後の測定出力パラメータを含むように設定することによって、デフォルトの積分ウィンドウが測定出力パラメータデータを含むように設定する。
【００４４】
２）デフォルトの積分ウィンドウ内の出力パラメータデータポイントの数を調べ、データポイントの最小数、例えば２０よりも少ない場合は、プロセスを終了させる。
【００４５】
３）溶離剤の１回目の注入が保持されていることを見出す。１回目の注入は、クロマトグラムの最初のイベントと規定されるので、１回目の注入が見出されると、積分ウィンドウの始まりは最初のイベントと同時になるように調節される。
【００４６】
４）最後の溶離剤画分が保持されていることを見出し、見出されるならば、積分ウィンドウの終わりが最後のイベントを含むように調節する。最後の溶離剤画分は、廃棄位置でない連続した溶離剤画分の最後のイベントと規定される。
【００４７】
５）「最後の溶離剤画分」が見出されない場合、溶出相の終わりを見出し、見出されるならば、積分ウィンドウの終わりが溶出相の終わりを含むように調節する。溶出相の終わりは、非廃棄物を含む最後の出力パラメータデータと規定される。
【００４８】
６）調節された積分ウィンドウ内の出力パラメータデータポイントの数を調べ、データポイントの最小数未満であれば、積分ウィンドウをデフォルトの積分ウィンドウと決定する。
【００４９】
ベースラインを、当業者に公知の試料／標的分子に関連しないシグナルを償うために積分ウィンドウに設定する。
【００５０】
次に、自動判定が行われて１０４、溶離剤画分が見出せない場合は分析的ピーク積分を実施する。ピークは識別され、１０５で各々のピーク内に分子／タンパク質の吸光係数εを設定し、各々のピークでの分子／タンパク質の濃度を、保存した出力パラメータデータに基づいて提示する。これは図７ａの図表に類似している。このプロセスは当技術分野で確立されているので、より詳細には記載されない。
【００５１】
しかし、溶離剤流が溶離剤画分に分割された場合、フローは１０８に続き、そこで各々の連続した溶離剤画分の画分サイズが規定される。図１ａおよび１ｂに関して例示されるように、全ての溶離剤画分に対して、予め設定されたサイズをもつ溶離剤画分が通常選択され、１１０で分取的ピーク積分を計算する場合に使用される。等しい画分サイズに代わるものとして、動的画分サイズを使用することができ、１０９で動的画分の手順が規定される。
【００５２】
動的画分サイズは、いくつかの方法で規定することができる。１つの変形形態は図８に関連して記載される。動的画分の手順の基本的原理は、様々なサイズの連続した溶離剤画分の経過を追うことであり、このことは、：前もって測定された出力パラメータに基づいて１または複数のｔｒｉｇ開始位置および１または複数のｔｒｉｇ停止位置を決定すること、および、各々のｔｒｉｇ開始位置の溶離剤画分サイズを変更し、各々のｔｒｉｇ停止位置の画分サイズを元へ戻すことによって達成される。
【００５３】
図６に例示されるように、溶離剤画分サイズは、（図８）各々のｔｒｉｇ開始位置で減少することがある。動的画分サイズを使用することによる目的は、標的分子を汚染する危険性なく分解を増やす（溶離剤画分サイズを低下させる）ことによって、各々の識別されたピークで各々の標的分子の量を増加させることである。
【００５４】
動的画分の手順が１０９で規定されると、分取的ピーク積分（分取的実行としても公知）を計算するプロセスが１１０で実施される。詳細については、図４に関する説明を参照されたい。
【００５５】
ＵＶ検出器を使用する場合に分子／タンパク質の濃度を計算することができるように、各々の分子／タンパク質の吸光係数は、識別されたピークに割り当てられなければならない１１１。分取的実行の結果、すなわちピークの分子／タンパク質の含有量および相関する溶離剤画分は、その後に提示される１１２（それぞれ図７ｂ、７ｃおよび７ｄに例示される）。
【００５６】
本発明の方法による利点は、図７ａに例示されるように、選択された積分ウィンドウ内の分析的ピーク積分の結果を提示するのに必要な全ての情報が利用できるので１１５、必要に応じて分取的実行から分析的実行に切り替えることができることである１１３。提示は、測定出力パラメータデータに基づく、ピークの分子含有量を含む。ユーザーが分析的実行の結果を見たくない場合は、プロセスは終了する１１４。
【００５７】
分析的実行から直ちに結果が提示される場合１０６と対照的に、１１８に示されるように、分析的ピーク積分の結果の提示１１５から戻って、必要に応じて分取的ピーク積分１１２の結果に切り替えること１１６が可能である。プロセスが１１７で終わらない場合である。
【００５８】
図４では、分取的ピーク積分を計算するためのプロセス１１０が記載される。説明する目的で、出力パラメータは吸光度であるように選択される。本発明の概念は、各々のデータ画分において測定された吸光度の特徴的な挙動を示す値を得ることを含む。本明細書の全体にわたって、この特徴は、測定された吸光度に基づいて各々の規定されたデータ画分の平均吸光度レベルを計算すること２０１によって例証される。
【００５９】
次に、測定された吸光度の傾向、例えばピーク間の１または複数の谷などを、計算した平均吸光度レベルに基づいて識別する２０２。傾向を識別する１つの方法は、ピークの終わりであるデータ画分を決定し、新しいピークの始まりであるデータ画分を決定することによる。傾向（例えば谷）を識別するプロセスは、図９に関連してより詳細に説明されている。
【００６０】
測定された吸光度の傾向（谷）が識別されれば、識別された傾向に基づいて各々の溶離剤画分に相関するピークが識別される２０３。
【００６１】
図５は、図４に関連して記載されるように、分取的ピーク積分の第１の実施形態を示す。溶離剤流中の標的分子の濃度を示す吸光度が測定され、保存した吸光度データに基づいてクロマトグラム３０１がプロットされた。溶離剤流は、積分ウィンドウ内で予め設定されたサイズをもつ溶離剤画分に分割された。吸光度データは、対応するデータ画分に分割される。溶離剤画分「１」〜「１２」が積分ウィンドウに含まれる（破線で示される）。
【００６２】
データ画分２および６に対応する識別された傾向（例えば谷）に基づいて、３つのピーク、ピークＡ、ピークＢおよびピークＣが識別された。ピークＡは、溶離剤画分１と相関し、ピークＢは、溶離剤画分３〜５と相関し、ピークＣは溶離剤画分７〜１２と相関する。谷を識別するプロセスは、導関数符号数と呼ばれる特徴の導入を必要とし、それにより、図６に関連して記載されるように、隣接するデータ画分間の短期の傾向を決定することが可能になる。
【００６３】
図６は、測定出力パラメータ、例えばＵＶ吸光度などの傾向を識別する導関数符号数の概念を示す。「導関数符号」と呼ばれる３つの異なる記号（０、＋、−）を使用して、各々の画分の「導関数符号数」を示す。導関数符号数は、各々の画分で登録されたクロマトグラムの傾きの相対的な符号数である。導関数符号数は、２つの導関数符号からなり、一番目の符号は、前の画分に関する画分の傾きを表し、二番目の符号は次の画分との関係で示される。閾値も、隣接するデータ画分間の平均出力パラメータレベルの違いを判定するために計算される：
０平均出力パラメータレベルの差が閾値よりも小さい場合、２つの隣接するデータ画分間の導関数符号は、ゼロである。
【００６４】
隣接するデータ画分間の平均出力パラメータレベルの違いが前記閾値よりも高い場合は、
＋平均出力パラメータレベルが、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルと比較して、次のデータ画分において高い場合、導関数符号は正である。
【００６５】
−平均出力パラメータレベルが、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルと比較して、次のデータ画分において低い場合、導関数符号は負である。
【００６６】
閾値は任意に選択されてよく、１つの選択肢は、前記積分ウィンドウ内のデータ画分について計算された最大の平均出力パラメータレベルと最小の平均出力パラメータレベルとの間の差が５％未満、例えば１％、０．５％または０．１％であるように閾値を選択することである。
【００６７】
図６は、連続したデータ画分の導関数符号数を決定する際に使用する３つの記号の９つの可能性のある配置をさらに示す。中央のデータ画分は現在のデータ画分であると考えられ、左側のデータ画分は前のデータ画分、右側のデータ画分は次のデータ画分であると考えられる。
【００６８】
導関数符号数は、２つの記号を含み、それらは３つの異なる状態：「ピークの終わり」、「新しいピークの始まり」および「それ以外」を示すことができる。
【００６９】
ピークの終わり
１番目が−と等しく、前者が−と等しくない（−０および−＋）、２つの異なる導関数符号からなる導関数符号数は、「ピークの終わり」を示す。主な実施形態では、現在のデータ画分の導関数符号が前のデータ画分との関係で負であり、導関数符号が次のデータ画分との関係で正またはゼロである（すなわち負でない）場合に、前のデータ画分はピークの最後のデータ画分である。すなわち、「ピークの終わり」は、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルが前のデータ画分の平均出力パラメータレベルに対して低く、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルが次のデータ画分の平均出力パラメータレベルに対して低いかまたは等しい場合に検出される。
【００７０】
主な実施形態は図５に例示され、図中、データ画分「２」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「１」はピークＡの最後のデータ画分であり、データ画分「６」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「５」はピークＢの最後のデータ画分である。
【００７１】
代替実施形態では、現在のデータ画分の導関数符号が前のデータ画分との関係で負であり、導関数符号が次のデータ画分との関係で正またはゼロである（すなわち負でない）場合に、現在の画分はピークの最後のデータ画分である。
【００７２】
代替実施形態は、図５に関連して例示されることができ、図中、データ画分「２」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「２」はピークＡの最後のデータ画分であると考えるべきであり、データ画分「６」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「６」はピークＢの最後のデータ画分であると考えるべきである。
【００７３】
新しいピークの始まり
後者が＋に等しく、前者が＋と等しくない（０＋および−＋）、２つの異なる導関数符号からなる導関数符号数は、「新しいピークの始まり」を示す。現在のデータ画分の導関数符号が前のデータ画分との関係でゼロまたは負であり（すなわち正でなく）、現在のデータ画分の導関数符号が次のデータ画分との関係で正である場合に、現在のデータ画分がピークの範囲内にないのであれば、次のデータ画分は、新しいピークの第１のデータ画分である。すなわち、「新しいピークの始まり」は、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルが前のデータ画分の平均出力パラメータレベルに対して低いかまたは等しく、現在のデータ画分の平均出力パラメータレベルが次のデータ画分に対して低い場合に検出される。
【００７４】
これは図５に例示され、図中、データ画分「２」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「３」はピークＢの最初のデータ画分であり、データ画分「６」の導関数符号数は−＋であり、データ画分「７」はピークＣの最初のデータ画分である。
【００７５】
それ以外
その他の可能性のある配置に関して、「ピークの終わり」または「新しいピークの始まり」は検出されることができない。「新しいピークの始まり」と「ピークの終わり」の間に位置するデータ画分は、同じピークに属すると考えられている。これは、図５において次の通り例証される：データ画分「３」は、新しいピークの始まりであり（上記の通り）、データ画分「５」は、ピークの終わりである（上記の通り）。これにより、データ画分「４」が同じピークに属していること、したがってピークＢが溶離剤画分「３」、「４」および「５」と相関することが得られる。
【００７６】
最初のデータ画分「１」および最後のデータ画分「１２」に関して、特に配慮する必要がある。データ画分「１」の完全な導関数符号数を計算するために利用できるデータがないので、現在のデータ画分と前のデータ画分との間の違いはゼロであると仮定する（図５中で積分ウィンドウの始まりの左側の点線によって示される通り）。
【００７７】
同じことは、データ画分「１２」の完全な導関数符号数を計算するために利用できるデータのない、最後のデータ画分「１２」にも当てはる。現在のデータ画分と次のデータ画分との間の違いはゼロであると仮定される（図５中で積分ウィンドウの終わりの右側の点線によって示される通り）。
【００７８】
図５においてピークを識別するためのプロセスを表１に示す。
【００７９】
【表１】
0006656711.tif 000002
【００８０】
図９は、積分ウィンドウ２０２内の傾向、例えばピーク間の谷を識別するプロセスを説明する、より詳細なフローチャートを示す。最初に画分の数が調査される７０１。データ画分の数が３以下である場合（データ画分の数≦３）、全てのデータ画分は同じピークに属すると考えられる７０２。しかし、７０１において積分ウィンドウ内のデータ画分の数が３よりも大きいことが確実である場合、各々のデータ画分の導関数符号数を見出すプロセスは、データ画分の平均出力パラメータレベルと、隣接するデータ画分の平均出力パラメータレベルを比較すること７０３、およびピークの終わりおよび新しいピークの始まりを判定するために導関数符号数を使用して、各々の谷を識別すること７０４により開始される。
【００８１】
連続したデータ画分「ｋ」の導関数符号数を見出すプロセスは、以下の工程で説明されることができる。この際、最初のデータ画分は「１」であり、最後のデータ画分は「ｎ」である（１≦ｋ≦ｎ）：
１）最初のピークが最初のデータ画分「１」から始まると仮定する。
【００８２】
２）次のデータ画分「２」の導関数符号数が−０または−＋であるならば、データ画分「１」は最初のピークの最後のデータ画分であるが、次のデータ画分「２」の導関数符号数が０＋であるならば、最初のピークの始まりはデータ画分「２」である。
【００８３】
３）導関数符号数０＋は、現在のデータ画分が既にピークの中にないならば、次のデータ画分が新しいピークの始まりであることを示す。
【００８４】
４）導関数符号数−０は、前のデータ画分がピークの最後であることを示す。
【００８５】
５）導関数符号数−＋は、前のデータ画分がピークの最後であったこと（あるいは、現在のデータ画分がピークの最後であること）および次のデータ画分が新しいピークの最初のデータ画分であることを示す。
【００８６】
６）最後のデータ画分に関して、最終チェックを行う。最後のデータ画分「ｎ」がピーク内にある場合、データ画分「ｎ」はピークの最後のデータ画分であると考えられる。
【００８７】
１または複数のピークが識別され、「新しいピークの始まり」と「ピークの終わり」の間で、積分ウィンドウ内に位置する連続したデータ画分と相関する。
【００８８】
図７ａおよび７ｂは、ワークフローを容易にし、本発明の概念を説明するために実装されるグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）の一例を示す。図７ａは、左上隅の「分析」ボタンが強調されている状態で示される「分析」モードのＧＵＩを示す。分析モードでは、谷の最も低いポイントからｘ軸まで伸びる垂直線によって示されるように、ピーク境界はそれぞれの谷の最も低いポイントで識別する。ピーク境界がｘ軸上の画分表示と並ばないことに留意する必要がある。次に、前記ピーク境界を用いて、下の表２ａに示される試料の分析組成を計算する。図７ｂは、左上隅の「分取」ボタンが強調されている状態で示される「分取」モードのＧＵＩを示す。分取モードでは、ピーク境界は、本開示において開示されるように識別され、クロマトグラムからｘ軸まで伸びる垂直線によって示される。分取モードのピーク境界がｘ軸上の画分表示と並ぶことに留意する必要がある。前述のように、次に、前記ピーク境界を用いて、下の表２ｂに示される試料の分取組成を計算する。３つのピーク、Ａ、ＢおよびＣはグラフで見て明らかであり、グラフのデータは下の表２ａおよび２ｂに示される。
【００８９】
【表２】
0006656711.tif 000003
【００９０】
【表３】
0006656711.tif 000004
【００９１】
ここで重要な違いは、分取的ピーク積分において、各々のピークが少ない体積および少ない量のそれぞれの分子を含むが、濃度は高いことである。
【００９２】
図７ｃおよび７ｄは、本発明の概念が実行される、代わりとなるＧＵＩを開示する。図７ｃでは、完全なクロマトグラフィー精製プロセスが例示され、陰影のついていない中央部分は、上記に従って決定された積分ウィンドウを例示する。積分ウィンドウの境界線は、例えばポインタ装置または同種のものを用いて境界を調節するために使用することのできる調整ハンドルを含むことに留意する必要がある。図７ｃは、溶出勾配プロフィール、例えば塩プロフィール、および対応する導電率測定値を例示するグラフをさらに示す。図７ｃおよび７ｄでは、左上隅のボタン「ピークと画分を整列」が選択され強調されていることによって示されるように、分取モードのＧＵＩが示される。図７ｄは、積分ウィンドウによって範囲を限定される図７ｃのクロマトグラムの部分の拡大図である。図７ｄでは、図７ｃの完全なクロマトグラムは、クロマトグラムの右上部分の小型のグラフとして開示される。
【００９３】
図５、７ｂ〜７ｄおよび関連する開示では、本発明に従う方法によって谷に相当すると決定された画分は、ピークに属していないと示されると仮定される。これは多くの場合妥当な仮定であり、そのために本発明の一実施形態に従って予め選択された選択肢として実装されることがある。しかし一部の状況では、前記「谷の画分」は、識別されたように隣接するピークのいずれか一方に含めることが望ましいことがある。一実施形態では、ユーザーは、そのような状況に対処し、ピーク境界を手で動かすことがあるが、既に述べたように、ピーク境界は、好ましくは画分境界にスナップするように配置される。一実施形態では、本方法は、上記工程によって決定される中間の「谷の画分」の組成を評価する工程を含み、前記画分が隣接するピークのいずれか一方に割り当てられるべきであるかどうか、またはそれが谷の画分として排除されるべきであるかどうかを自動的に判定する。前記判定は、分析的ピーク境界を見出し、分析的ピーク境界に基づいて画分の対応する相対組成を計算し、得られる組成を予め設定された閾値と比較することによって実施されてよい。前記閾値は、画分が望ましい標的分子のかなりの割合、例えば７５％などを含むことを示す任意の値であってよい。
【００９４】
図８は、動的溶離剤画分サイズをリアルタイムで決定する場合に、プロセスが溶離剤流に等しいデータ画分サイズを使用することに基づく、動的な溶離剤画分を使用する分取的ピーク積分の代替実施形態を例示する。データ画分サイズは、画分と相関したピークを識別することができるように、動的な溶離剤画分サイズに適合させなければならない。この例では、溶離剤画分の数を、ピーク間の谷に関して二倍にして、分取的ピーク積分を計算する時の分解および正確さを増加させ、それによって標的分子のより純粋な試料を収集する可能性を増加させている。
【００９５】
より多くの溶離剤画分を各々の谷に使用することによる利点は、隣接するピークで他の分子からの汚染の危険性なく、各々の識別されたピークついて各々の標的分子の量を最大化することができることである。下の表３に示されるように、この例で「新しいピークの始まり」と同時であるｔｒｉｇ開始位置が決定され、この例で「ピークの終わり」と同時であるｔｒｉｇ停止位置が決定される。
【００９６】
【表４】
0006656711.tif 000005
【００９７】
この例では、残りのデータ画分の半分のサイズの各々のデータ画分「２」〜「５」および「８」〜「１１」は、上の表中で灰色で示される。
【００９８】
図１０は、既知標的分子の目標濃度を達成するために溶離剤画分を選択するプロセスのフローチャートを示す。このプロセスは、（図３に関連して記載される）１１２に提示される番号と比較して目標濃度を増加させる特定の目的をもつ代替実施形態である。全ての溶離剤画分は既知量の流体を含むが、標的分子の量は溶離剤画分間で変動する。
【００９９】
特定条件下で、例として既知吸光係数をもつ既知分子を精製する際に、目標濃度の分子を達成することが可能である。目標濃度が分子に対して規定される場合、目標濃度への到達を可能にする溶離剤画分だけを含むようにピークを自動的に調節することが可能である。例えば、ピークの一部であるとして識別された溶離剤画分のうちの幾らかを含めて、なお目標濃度に達することも可能である。
【０１００】
一例として、特定の濃度レベルに達するためにピークＣから図８の溶離剤画分１４〜１５を排除することが望ましいであろう。
【０１０１】
本プロセスは、各々の識別されたピークについて吸光係数を設定することを仮定する１１１。これは、手動でまたは自動でデータベースから実施することができる。その後、既知吸光係数をもつ分子の目標濃度８０１を設定し、分子と相関したピーク８０２を決定する。ピーク内のデータ画分を、目標濃度を満たすように選択し８０３、分子濃度および相関するデータ画分を提示する８０４。
【０１０２】
目標濃度を満たすためにピーク内の１または複数のデータ画分を選択するプロセスの第１の実施形態では、ピークの最大の平均出力パラメータレベルの予め設定された百分率よりも少ない平均出力パラメータレベルをもつデータ画分が除外される。
【０１０３】
一例として、予め設定された百分率は、ピークの最大の平均出力パラメータレベルの１〜５％の範囲内であるように選択されてよい。
【０１０４】
目標濃度を満たすためにピーク内の１または複数のデータ画分を選択するプロセスの第２の実施形態では、最大の平均出力パラメータレベルをもつ、ピーク内の１または複数のデータ画分が最初に選択され、最小の平均出力パラメータレベルを有するか、または最大の平均出力パラメータレベルから最も遠く離れているデータ画分が目標濃度を満たすために最後に選択される。
【０１０５】
図１１は、図３〜１０に関連して記載される本発明の方法を使用するように適合させた、１または複数の標的分子の液体クロマトグラフィー精製を実施するための系９０１を示す。この系は、以下を含む：
・１または複数の標的分子を含む溶離剤流を提供する、試料のクロマトグラフィー精製を実施するように適合させたユニット９０２。溶離剤流は、連続した溶離剤画分に分割され、フラクションコレクター９０６に保存される、
・溶離剤中の１または複数の標的分子の含有量を示す出力パラメータを測定するように適合させた検出器９０３、および
・前記溶離剤画分に対応するデータ画分に出力パラメータデータを保存するためのメモリー９０４、
・以下のように適合させた評価ユニット９０５：
−各々のデータ画分において、測定出力パラメータの特徴的な挙動を示す値を得、
−連続したデータ画分において入手した値に基づいて測定出力パラメータの傾向を識別し、かつ
−識別された傾向に基づいて、溶離剤画分と相関する測定出力パラメータの１または複数のピークを識別する
・識別された１または複数のピークと、相関する１または複数の溶離剤画分の情報を提示することができ、溶離剤からの１または複数の精製試料をフラクションコレクター９０６から回収することのあるディスプレイ９０７
0006656711.tif 000006
【図１ａ】
0006656711.tif 000007
【図１ｂ】
0006656711.tif 000008
【図２】
0006656711.tif 000009
【図３】
0006656711.tif 000010
【図４】
0006656711.tif 000011
【図５】
0006656711.tif 000012
【図６】
0006656711.tif 000013
【図７ａ】
0006656711.tif 000014
【図７ｂ】
0006656711.tif 000015
【図７ｃ】
0006656711.tif 000016
【図７ｄ】
0006656711.tif 000017
【図８】
0006656711.tif 000018
【図９】
0006656711.tif 000019
【図１０】
0006656711.tif 000020
【図１１】
0006656711.tif 000021