【手続補正書】
【提出日】平成24年12月6日(2012.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異した糖質プロセシング酵素を含む化合物であって、該酵素が、
（i）該酵素の触媒活性を消失させ；かつ
（ii）不活性化された酵素のその基質に対する親和性を野生型酵素と比較して高める
1つまたは複数の突然変異を有する、化合物。
【請求項２】
突然変異した糖質プロセシング酵素が、その基質に対して、野生型酵素と実質的に同じ特異性を有する、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
突然変異した酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも1.2倍高い、少なくとも2倍高い、少なくとも10倍高い、少なくとも100倍高い、少なくとも1,000倍高い、少なくとも10,000倍高い、または少なくとも100,000倍高い、請求項1〜2のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４】
糖質プロセシング酵素が、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、多糖リアーゼ、糖質エステラーゼ、スルファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、リガーゼ、エピメラーゼ、および糖質基質に対して作用する他の任意の酵素からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
糖質プロセシング酵素が、好熱性生物由来または超好熱性生物由来の遺伝子によってコードされる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
糖質プロセシング酵素が原核生物由来、真核生物由来、または他の生物由来の遺伝子によってコードされる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
糖質プロセシング酵素が反転型グリコシダーゼまたは保持型グリコシダーゼである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
糖質プロセシング酵素が、PNGアーゼF（PNGase F）β-O-GlcNAcアーゼ（β-O-GlcNAcase）、およびノイラミニダーゼからなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
1つまたは複数の突然変異がさらに、酵素の速度論的オフ速度（kinetic off-rate）を、野生型酵素と比較して少なくとも1.2倍低下させる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物を作製するための方法であって、
（a）糖質プロセシング酵素の配列を、突然変異した場合に該酵素を不活性化しうる1つまたは複数のアミノ酸残基に関して解析する段階；
（b）段階（a）で同定された少なくとも1つの突然変異したアミノ酸を有する酵素と基質との複合体の結合エネルギーを予測するための計算シミュレーションを行う段階；
（c）残基を、それらの予測される相互作用エネルギーに基づいて、酵素の特異性を規定するのに必須である第1の残基群、および基質に近接するが特異性を規定するのに必須ではない第2の残基群という2つの群に細分類する段階；
（d）段階（a）および（b）および（c）で同定された突然変異を含む糖質プロセシング酵素を、それらが酵素-基質複合体を形成する能力に関して検査する段階；ならびに
（e）基質に対する結合親和性が野生型の糖質プロセシング酵素のそれよりも少なくとも1.2倍高い、段階（d）による突然変異体を同定する段階、
を含む、方法。
【請求項１１】
糖質プロセシング酵素の配列を、計算による突然変異誘発、ΔGの直接算出、残基ごとの相互作用エネルギーの計算、熱力学的積分算出、および自由エネルギー摂動計算からなる群より選択される少なくとも1つの手法を用いて解析する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物に生体試料を触れさせる段階を含む、生体試料を調べる方法。
【請求項１３】
糖質、糖タンパク質、糖ペプチドまたは他の糖質含有分子の、親和性に基づく精製、濃縮またはモニタリングをさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の化合物を含む、異常グリコシル化を呈する疾患を診断または治療するための組成物。
【請求項１５】
糖質結合タンパク質を含む新規生体分子を作製するための方法であって、該タンパク質が、
（i）タンパク質のその糖質リガンドに対する親和性を野生型タンパク質と比較して高め；
（ii）タンパク質の特異性の変化を実質的に全く有しない
1つまたは複数の突然変異を有しており；
該方法が、
（a）糖質-タンパク質複合体の結合エネルギーを予測するために計算シミュレーションを行う段階；
（b）残基を、それらの予測される相互作用エネルギーに基づいて、タンパク質の特異性を規定するのに必須である第1の残基群、および糖質リガンドに近接するが特異性を規定するのに必須ではない第2の残基群という2つの群に細分類する段階；
（c）段階（a）および（b）で同定された突然変異を含むタンパク質を、それらがタンパク質-糖質複合体を形成する能力に関して検査する段階；ならびに
（d）リガンドに対する結合親和性がWTタンパク質のそれよりも少なくとも1.2倍高い、段階（c）による突然変異体を同定する段階、
を含む、方法。
【請求項１６】
フォーカストバイオコンビナトリアルライブラリーを作製するために用いられる、請求10、11、または15のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
ある態様において、糖質プロセシング酵素はグリコシダーゼ酵素である。他の態様において、糖質プロセシング酵素はグリコシルトランスフェラーゼ酵素である。他の態様において、糖質プロセシング酵素は多糖リアーゼ酵素である。他の態様において、糖質プロセシング酵素はスルファターゼ酵素である。他の態様において、糖質プロセシング酵素はスルホトランスフェラーゼ酵素である。他の態様において、糖質プロセシング酵素はリガーゼ酵素である。さらなる態様において、糖質プロセシング酵素はアミダーゼ酵素である。さらに別の態様において、糖質プロセシング酵素はエピメラーゼ酵素である。
[本発明1001]
糖質プロセシング酵素を含むレクテンズ（lectenz）であって、該酵素が、
（i）該酵素の触媒活性を消失させ；かつ
（ii）不活性化された酵素のその基質に対する親和性を野生型酵素と比較して高める
1つまたは複数の突然変異を有する、レクテンズ。
[本発明1002]
突然変異した糖質プロセシング酵素が、酵素の特異性の変化を実質的に全く有しない、本発明1001のレクテンズ。
[本発明1003]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約1.2倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1004]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約2倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1005]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約10倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1006]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約100倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1007]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約1,000倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1008]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約10,000倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1009]
酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約100,000倍高い、本発明1001〜1002のいずれかのレクテンズ。
[本発明1010]
糖質プロセシング酵素が、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、多糖リアーゼ、糖質エステラーゼ、スルファターゼ、スルホトランスフェラーゼ、リガーゼ、エピメラーゼ、および糖質基質に対して作用する他の任意の酵素からなる群より選択される、本発明1001〜1009のいずれかのレクテンズ。
[本発明1011]
糖質プロセシング酵素が原核生物由来の遺伝子によってコードされる、本発明1001〜1010のいずれかのレクテンズ。
[本発明1012]
糖質プロセシング酵素が真核生物由来の遺伝子によってコードされる、本発明1001〜1010のいずれかのレクテンズ。
[本発明1013]
糖質プロセシング酵素が反転型グリコシダーゼである、本発明1001〜1012のいずれかのレクテンズ。
[本発明1014]
糖質プロセシング酵素が保持型グリコシダーゼである、本発明1001〜1012のいずれかのレクテンズ。
[本発明1015]
糖質プロセシング酵素がPNGアーゼF（PNGase F）である、本発明1001〜1014のいずれかのレクテンズ。
[本発明1016]
PNGアーゼFが、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）由来の遺伝子によってコードされる、本発明1015のレクテンズ。
[本発明1017]
糖質プロセシング酵素がβ-O-GlcNAcアーゼ（β-O-GlcNAcase）である、本発明1001〜1012のいずれかのレクテンズ。
[本発明1018]
β-O-GlcNAcアーゼが、B.テタイオタオミクロン（B. thetaiotaomicron）由来の遺伝子によってコードされる、本発明1017のレクテンズ。
[本発明1019]
糖質プロセシング酵素がノイラミニダーゼである、本発明1001〜1012のいずれかのレクテンズ。
[本発明1020]
ノイラミニダーゼが、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来の遺伝子によってコードされる、本発明1019のレクテンズ。
[本発明1021]
1つまたは複数の突然変異がさらに、酵素の速度論的オフ速度（kinetic off-rate）を、野生型酵素と比較して少なくとも1.2倍低下させる、本発明1001〜1020のいずれかのレクテンズ。
[本発明1022]
触媒的に不活性な糖質プロセシング酵素を含むレクテンズであって、該酵素のその基質に対する親和性が、野生型酵素と比較して少なくとも約1.2倍高く、かつ該酵素が、該酵素の特異性の低下を実質的に全く有しない、レクテンズ。
[本発明1023]
1つまたは複数の残基が水素結合によって基質と相互作用することができる、本発明1022のレクテンズ。
[本発明1024]
1つまたは複数の残基が基質とファンデルワールス接触を形成することができる、本発明1022〜1023のいずれかのレクテンズ。
[本発明1025]
1つまたは複数の残基が水媒介接触（water mediated contact）によって基質と相互作用することができる、本発明1023〜1023のいずれかのレクテンズ。
[本発明1026]
1つまたは複数の残基が、非特異的な非結合性相互作用によって基質と相互作用することができる、本発明1022〜1025のいずれかのレクテンズ。
[本発明1027]
1つまたは複数の残基の、気相（ΔEMM）相互作用エネルギーに対する寄与が、少なくとも約-0.5kcal／mol未満である、本発明1022〜1026のいずれかのレクテンズ。
[本発明1028]
1つまたは複数の残基の、全（ΔG）相互作用エネルギーに対する寄与が、少なくとも約-0.5kcal／mol未満である、本発明1022〜1027のいずれかのレクテンズ。
[本発明1029]
糖質プロセシング酵素を含むレクテンズを作製するための方法であって、該酵素が、
（i）該酵素の触媒活性を消失させ；かつ
（ii）酵素のその基質に対する親和性を野生型酵素と比較して高める
1つまたは複数の突然変異を有しており、
該方法が、
（a）糖質プロセシング酵素の配列を、突然変異した場合に該酵素を不活性化しうる1つまたは複数のアミノ酸残基に関して解析する段階；
（b）段階（a）で同定された少なくとも1つの突然変異したアミノ酸を有するグリコシダーゼとグリカンとの複合体の結合エネルギーを予測するための計算シミュレーションを行う段階；
（c）残基を、それらの予測される相互作用エネルギーに基づいて、酵素の特異性を規定するのに必須である第1の残基群、および基質に近接するが特異性を規定するのに必須ではない第2の残基群という2つの群に細分類する段階；
（d）段階（a）および（b）および（c）で同定された突然変異を含むグリコシダーゼを、それらがグリコシダーゼ-グリカン複合体を形成する能力に関して検査する段階；ならびに
（e）グリカンに対する結合親和性がWTグリコシダーゼのそれよりも少なくとも1.2倍高い、段階（d）による突然変異体を同定する段階、
を含む、方法。
[本発明1030]
突然変異した糖質プロセシング酵素が、酵素の特異性の変化を実質的に全く有しない、本発明1029の方法。
[本発明1031]
糖質プロセシング酵素の配列を、計算によるアラニンスキャニング突然変異誘発を用いて解析する、本発明1029〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
糖質プロセシング酵素の配列を、ΔGの直接算出を用いて解析する、本発明1029〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
糖質プロセシング酵素の配列を、熱力学的積分算出を用いて解析する、本発明1029〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
コンフォメーションサンプリングを実行するために計算シミュレーションを行う、本発明1029〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
コンフォメーションサンプリングが、分子動力学シミュレーション、モンテカルロシミュレーション、または側鎖回転異性体の検索を含む、本発明1029〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
計算による力場（computational force field）を用いてシミュレーションを行う、本発明1029〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
糖質プロセシング酵素を含むレクテンズに生体試料を触れさせる段階を含む、生体試料を調べる方法であって、該酵素が、
（i）酵素の触媒活性を消失させ；かつ
（ii）酵素のその基質に対する親和性を野生型酵素と比較して高める
1つまたは複数の突然変異を有する、方法。
[本発明1038]
酵素の特異性の変化を実質的に全く有しない突然変異した糖質プロセシング酵素をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
異常グリコシル化を呈する疾患を診断または治療する段階をさらに含む、本発明1037〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
糖質、糖タンパク質、糖ペプチドまたは他の糖質含有分子の、親和性に基づく精製、濃縮またはモニタリングをさらに含む、本発明1037〜1038のいずれかの方法。
[本発明1041]
糖質結合タンパク質を含む新規生体分子を作製するための方法であって、該タンパク質が、
（i）タンパク質のその基質に対する親和性を野生型タンパク質と比較して高め；
（iii）タンパク質の特異性の変化を実質的に全く有しない
1つまたは複数の突然変異を有しており；
該方法が、
（a）糖質-タンパク質複合体の結合エネルギーを予測するために計算シミュレーションを行う段階であって、該タンパク質が；
（b）残基を、それらの予測される相互作用エネルギーに基づいて、タンパク質の特異性を規定するのに必須である第1の残基群、および糖質リガンドに近接するが特異性を規定するのに必須ではない第2の残基群という2つの群に細分類する段階；
（c）段階（a）および（b）で同定された突然変異を含むタンパク質を、それらがタンパク質-グリカン複合体を形成する能力に関して検査する段階；ならびに
（d）グリカンに対する結合親和性がWTタンパク質のそれよりも少なくとも1.2倍高い、段階（c）による突然変異体を同定する段階、
を含む、方法。
[本発明1042]
フォーカストバイオコンビナトリアルライブラリーを作製するために用いられる、請求41記載の方法。
[本発明1043]
フォーカストバイオコンビナトリアルライブラリーを作製するために用いられる、本発明1029の方法。