(57)【要約】      （修正有）【課題】感染・腫瘍等に対する生体防御に重要な役割を担う、ＮＫ細胞の機能（サイトカイン／ケモカイン産生）を調節する、新しい作用機序を持つ薬剤、及びそのスクリーニング方法の提供。【解決手段】ＮＫ細胞の活性化に関与する、ＣＢＭ複合体の構成因子（例、Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０）の発現又は機能を調節し得る物質を含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な調節剤。被験物が、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節するか否かを評価することを含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質の、スクリーニング方法。及びＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能が調節されたＮＫ細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物がＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節するか否かを評価することを含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
該構成因子がＣａｒｍａ１又はＢｃｌ１０である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該サイトカイン及び／又はケモカイン産生が、ＮＫ細胞においてＩＴＡＭ含有分子会合レセプターにより媒介されるサイトカイン及び／又はケモカイン産生である、請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
被験物が該構成因子の発現又は機能を抑制するか否かを評価することを含む、該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に抑制し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項５】
被験物が該構成因子の発現又は機能を調節するか否かの評価が、ａ）被験物がＣＢＭ複合体の形成を調節するか否か、あるいはｂ）被験物がＣａｒｍａ１又はＢｃｌ１０の発現を調節するか否かのいずれかを評価することにより行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
スクリーニング方法がＮＫ細胞を用いて行われる、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質が、感染症、癌、炎症性疾患、免疫疾患、移植片拒絶反応又はアレルギー疾患の予防・治療薬である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に抑制し得る物質が、炎症性疾患、移植片拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の予防・治療薬である、請求項４記載の方法。
【請求項９】
該予防・治療薬が、さらに癌又は感染症に罹患している、又は罹患する危険性がある被験体に対する医薬である、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節し得る物質を含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な調節剤。
【請求項１１】
該構成因子の発現又は機能を抑制し得る物質を含む、該サイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な抑制剤である、請求項１０記載の剤。
【請求項１２】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能が調節されたＮＫ細胞。
【請求項１３】
該ＮＫ細胞が、細胞傷害活性を保持しつつ、サイトカイン及び／又はケモカイン産生能が変更された細胞である、請求項１２記載のＮＫ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞におけるサイトカイン／ケモカイン産生の調節剤及びそのスクリーニング方法、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能が調節されたＮＫ細胞等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＫ細胞は、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、移植片などを直接認識して、細胞傷害性及びサイトカイン産生を示し、生体防御において重要な機能を担っていると考えられている細胞である。ＮＫ細胞は「自己」「非自己」を認識する多様なレセプターを発現しており、これにより標的細胞を認識して傷害する。
【０００３】
ところで、１）免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif：ＩＴＡＭ）を含有する分子に会合するレセプターであるＴ細胞レセプター又はＢ細胞レセプターを介するシグナル伝達が、Ｔ細胞又はＢ細胞の全般的な活性化（例、細胞増殖亢進、液性因子の分泌亢進）の制御に関与し得ること、２）Ｔ細胞レセプター又はＢ細胞レセプターを介するシグナル伝達が、Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０及びＭａｌｔ１を含む複合体（ＣＢＭ複合体）を経由して、上記の全般的な活性化を引き起こし得ることが報告されている（非特許文献１〜６参照）。
【非特許文献１】Gaide O et al., Nat Immunol. 2002 Sep; 3(9): 836-43
【非特許文献２】Wang D et al., Nat Immunol. 2002 Sep; 3(9): 830-5
【非特許文献３】Hara H et al., Immunity. 2003 Jun; 18(6): 763-75
【非特許文献４】Newton K et al., Curr Biol. 2003 Jul 15; 13(14): 1247-51
【非特許文献５】Egawa T et al., Curr Biol. 2003 Jul 15; 13(14): 1252-8
【非特許文献６】Hara H et al., J Exp Med. 2004 Nov 1; 200(9): 1167-77
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、新規作用機序を有する医薬及びそれらを開発し得る種々の手段などを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意検討した結果、予想外なことに、ＣＢＭ複合体を経由するＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介するシグナル伝達が、ＮＫ細胞の特定の機能の制御にのみ関与し得ること、より詳細には、ＮＫ細胞では、ＣＢＭ複合体が、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介するサイトカイン及び／又はケモカイン産生に関与し得るものの、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介する細胞傷害活性に関与し得ないことなどを見出した。従って、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能の調節により、ＮＫ細胞の特定の機能のみを調節することが可能になると考えられる。また、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節する物質のスクリーニングは、ＮＫ細胞の特定の機能のみの調節能を有する医薬等の開発などに有用であると考えられる。
【０００６】
以上に基づき、本発明者らは、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は下記の通りである。
〔１〕被験物がＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節するか否かを評価することを含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質のスクリーニング方法。
〔２〕該構成因子がＣａｒｍａ１又はＢｃｌ１０である、上記〔１〕の方法。
〔３〕該サイトカイン及び／又はケモカイン産生が、ＮＫ細胞においてＩＴＡＭ含有分子会合レセプターにより媒介されるサイトカイン及び／又はケモカイン産生である、上記〔１〕又は〔２〕のスクリーニング方法。
〔４〕被験物が該構成因子の発現又は機能を抑制するか否かを評価することを含む、該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に抑制し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔１〕又は〔２〕の方法。
〔５〕被験物が該構成因子の発現又は機能を調節するか否かの評価が、ａ）被験物がＣＢＭ複合体の形成を調節するか否か、あるいはｂ）被験物がＣａｒｍａ１又はＢｃｌ１０の発現を調節するか否かのいずれかを評価することにより行われる、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの方法。
〔６〕スクリーニング方法がＮＫ細胞を用いて行われる、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質が、感染症、癌、炎症性疾患、免疫疾患、移植片拒絶反応又はアレルギー疾患の予防・治療薬である、上記〔１〕の方法。
〔８〕該サイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に抑制し得る物質が、炎症性疾患、移植片拒絶反応、自己免疫疾患又はアレルギー疾患の予防・治療薬である、上記〔４〕の方法。
〔９〕該予防・治療薬が、さらに癌又は感染症に罹患している、又は罹患する危険性がある被験体に対する医薬である、上記〔７〕又は〔８〕の方法。
〔１０〕ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節し得る物質を含む、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な調節剤。
〔１１〕該構成因子の発現又は機能を抑制し得る物質を含む、該サイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な抑制剤である、上記〔１０〕の剤。
〔１２〕ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能が調節されたＮＫ細胞。
〔１３〕該ＮＫ細胞が、細胞傷害活性を保持しつつ、サイトカイン及び／又はケモカイン産生能が変更された細胞である、上記〔１２〕のＮＫ細胞。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の調節剤は、例えば、感染症、癌、炎症性疾患、免疫疾患（例、免疫不全症、自己免疫疾患）、移植片拒絶反応、アレルギー疾患等の種々の疾患に対する医薬として有用であり得る。
本発明のスクリーニング方法は、例えば、上述の疾患に対する医薬の開発に有用であり得る。
本発明のＮＫ細胞は、例えば、上述の疾患の予防・治療薬の開発、上述の疾患の予防・治療のための細胞療法、ＮＫ細胞におけるサイトカイン／ケモカイン産生機構の解析、サイトカイン／ケモカイン産生調節遺伝子の探索に有用であり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な調節剤を提供する。
【０００９】
ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の「選択的」な調節とは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を保持しつつ、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を特異的に調節することをいう。同様に、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生の「選択的」な促進又は抑制（あるいは活性化又は阻害）とは、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を特異的に促進又は抑制（あるいは活性化又は阻害）することをいう。
【００１０】
本発明の剤は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節し得る物質を含み得る。
【００１１】
ＣＢＭ複合体とは、その構成因子としてＣａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０及びＭａｌｔ１を含むタンパク質複合体を意味する。従って、ＣＢＭ複合体の構成因子はこれらの因子であり得る。Ｃａｒｍａ１は、ヒトＣａｒｍａ１（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ３２２６４１参照）又はそのオルソログ、あるいはそれらの変異体であり得る。Ｂｃｌ１０は、ヒトＢｃｌ１０（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０８２２８３参照）又はそのオルソログ、あるいはそれらの変異体であり得る。Ｍａｌｔ１は、ヒトＭａｌｔ１（例、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２６１１８参照）又はそのオルソログ、あるいはそれらの変異体であり得る。Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０及びＭａｌｔ１のオルソログは特に限定されず、例えば非ヒト哺乳動物（例、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス）に由来するものであり得る。Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０及びＭａｌｔ１はそれぞれ、ＣＢＭ複合体の形成を通じて、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を調節し得る限り、そのコードするアミノ酸配列において１以上(例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１、２又は３個)のアミノ酸の変異（例、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい（このようなタンパク質が、上記の「変異体」に該当する）。
【００１２】
本発明の剤により選択的に調節され得るサイトカイン及び／又はケモカイン産生は、ＮＫ細胞においてＩＴＡＭ含有分子会合レセプターにより媒介されるサイトカイン及び／又はケモカイン産生であり得る。
【００１３】
ＩＴＡＭ含有分子とは、免疫レセプターチロシンベース活性化モチーフ（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif）を有する分子をいう。ＮＫ細胞は、このようなＩＴＡＭ含有分子を発現している。例えば、ＮＫ細胞に発現しているＩＴＡＭ含有分子としては、ＦｃＲγ、ＤＡＰ１２、ＣＤ３ζが挙げられる。
【００１４】
ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターとは、上述のＩＴＡＭ含有分子との直接的な相互作用を通じてそのシグナルを細胞内に導入し、当該細胞の生理機能を調節し得るレセプターを意味する。本発明では、ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ含有分子会合レセプターが意図される。ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ含有分子会合レセプターとしては、例えば、ヒト及びマウスについては、ＦｃγＲ（ＣＤ１６）（ヒト／マウス）、ＮＫ１．１（マウス）、ＮＫＧ２Ｄ（ヒト／マウス）、Ｌｙ４９Ｄ（マウス）、Ｌｙ４９Ｈ（マウス）、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ（ヒト／マウス）、ＫＩＲ２ＤＳ１−Ｓ５（ヒト）、ＫＩＲ３ＤＳ１（ヒト）、ＮＫｐ３０（ヒト）、ＮＫｐ４４（ヒト）、ＮＫｐ４６（ヒト）が挙げられる。ＦｃγＲ、ＮＫ１．１、ＮＫｐ３０及びＮＫｐ４６は、ＩＴＡＭ含有分子であるＦｃＲγと会合し、ＮＫＧ２Ｄ及びＬｙ４９Ｈ、Ｌｙ４９Ｄ、ＫＩＲ２ＤＳ１−Ｓ５、ＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫｐ４４、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃは、ＤＡＰ１２と会合する。このようなレセプターに対するリガンドとしては、アゴニスト又はアンタゴニストを含む種々のリガンドが知られている。このようなリガンドとしては、例えば、ＩｇＧ（ＣＤ１６に対するリガンド）、抗ＮＫ１．１  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＮＫ１．１に対するリガンド）、Ｒａｅ１β−Ｆｃ（ＮＫＧ２Ｄに対するリガンド）、抗Ｌｙ４９Ｄ（Ｌｙ４９Ｄに対するリガンド）が挙げられる。
【００１５】
ＮＫ細胞において産生されるサイトカイン及び／又はケモカインは、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター又はその他のレセプター（例、ＩＬ−１２レセプター、ＩＬ−１８レセプター）による媒介により産生されるサイトカイン及び／又はケモカインであり得る。このようなサイトカインとしては、例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１３が挙げられる。また、このようなケモカインとしては、例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＡＴＡＣが挙げられる。
【００１６】
一実施形態では、本発明の剤は、サイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な促進剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を促進し得る物質を含み得る。
【００１７】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現とは、ＣＢＭ複合体の構成因子をコードする遺伝子から翻訳産物（即ち、タンパク質）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を促進する物質は、ＣＢＭ複合体の構成因子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書中で使用される場合、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現の促進としては、ＣＢＭ複合体の構成因子（タンパク質）自体の補充をも含むものとする。
【００１８】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を促進する物質としては、例えば、ＣＢＭ複合体の構成因子（即ち、Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０、Ｍａｌｔ１）、ＰＫＣθ、ＰＫＣβ、ＴＡＫ１、及びそれらの発現ベクターなどのＣＢＭ複合体の構成因子の発現を促進する物質、並びにＣＢＭ複合体の形成を促進する物質（例、ＰＭＡ）などのＣＢＭ複合体の構成因子の機能を促進する物質が挙げられる。
【００１９】
ＣＢＭ複合体の構成因子は、天然タンパク質又は組換えタンパク質であり得る。ＣＢＭ複合体の構成因子は、自体公知の方法により調製でき、例えば、ａ）ＣＢＭ複合体の構成因子を含む生体試料から構成因子を回収してもよく、ｂ）宿主細胞（例、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞）に構成因子の発現ベクター（後述）を導入することにより形質転換体を作製し、該形質転換体により産生される構成因子を回収してもよく、ｃ）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系により構成因子を合成してもよい。ＣＢＭ複合体の構成因子は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、ＣＢＭ複合体の構成因子抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
【００２０】
別の実施形態では、本発明の剤は、サイトカイン及び／又はケモカイン産生の選択的な抑制剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を抑制し得る物質を含み得る。ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を抑制する物質は、ＣＢＭ複合体の構成因子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００２１】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を抑制する物質としては、例えば、アンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、あるいはそれらのキメラ分子）、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（細胞内に導入されることによりＲＮＡｉ効果を誘導し得るポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ：例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。
【００２２】
ＣＢＭ複合体の構成因子の機能を抑制する物質としては、例えば、ＣＢＭ複合体の形成を抑制する物質（例、抗体若しくはドミナントネガティブ変異体又はそれらの発現ベクター、あるいは低分子化合物）が挙げられる。
【００２３】
ＣＢＭ複合体の構成因子に対する抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製できる。また、該抗体は、抗体のフラグメント（例、Fab、F(ab’)2）、組換え抗体（例、単鎖抗体）であってもよい。
【００２４】
例えば、ポリクローナル抗体は、ＣＢＭ複合体の構成因子あるいはそのフラグメント（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアタンパク質に架橋した複合体とすることもできる）を抗原として、市販のアジュバント（例、完全又は不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜約１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
【００２５】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法（例、渡邊武、細胞融合法の原理とモノクローナル抗体の作成、谷内昭、高橋利忠編、「モノクローナル抗体とがん―基礎と臨床―」、第2-14頁、サイエンスフォーラム出版、1985年）により作成することができる。例えば、マウスに該因子を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例、NS-1、P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法［J. Immunol. Methods,81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得できる。
【００２６】
しかしながら、ヒトにおける治療効果と安全性を考慮すると、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化又はヒト型抗体であってもよい。キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を、ヒト化抗体は、例えば特表平4-506458号公報、特開昭62-296890号公報等を、ヒト抗体は、例えば「Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997」、「Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994」、特表平4-504365号公報、国際出願公開WO94/25585号公報、「日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1995年」、「Nature, Vol.368, p.856-859, 1994」、特表平6-500233号公報等を参考にそれぞれ作製することができる。
【００２７】
ＣＢＭ複合体の構成因子のドミナントネガティブ変異体は、ＣＢＭ複合体の構成因子に対する変異の導入によりその活性が低減したものである。該ドミナントネガティブ変異体は、天然のＣＢＭ複合体の構成因子と競合することで間接的にその機能を阻害することができる。変異としては、例えば、機能性部位における、当該部位が担う機能の低下をもたらすようなアミノ酸の変異（例、１以上のアミノ酸の欠失、置換、付加）が挙げられる。例えば、ＣＢＭ複合体の構成因子のドミナントネガティブ変異体としては、既報のものを使用することができる（例、Bertin J et al., J. Biol. Chem., vol.276, p.11877-11882, 2001; Pomerantz JL et al., EMBO J., vol.21, p.5184-5194, 2002; Lucas PC et al., J. Biol. Chem., vol.276, 19012-19012, 2002参照）。
【００２８】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節する物質が、核酸分子又はタンパク質分子である場合、本発明の剤は、核酸分子又はタンパク質分子をコードする核酸分子を含む発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターは、上記の核酸分子をコードするオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されていなければならない。本発明の発現ベクターが含み得るプロモーターは、その制御下にある因子の発現を可能とする限り特に限定されず、因子の種類により適宜選択され得るが、例えば、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。また、使用されるプロモーターとしては、ＮＫ細胞に特異的なプロモーター（例、ｌｃｋプロモーター、Ｐｍｅｄ１プロモーター）を用いてもよい。
【００２９】
発現ベクターは、好ましくは核酸分子をコードするオリゴ（ポリ）ヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含む。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含むこともできる。
【００３０】
発現ベクターとして使用される基本骨格のベクターは、プラスミド又はウイルスベクターであり得るが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００３１】
本発明の剤は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００３２】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００３３】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００３４】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇである。
【００３５】
本発明の剤は、例えば、医薬として有用である。本発明の剤が医薬として使用される場合、感染症、癌、炎症性疾患、免疫疾患（例、免疫不全症、自己免疫疾患）、移植片拒絶反応、アレルギー疾患等の種々の疾患の予防・治療に使用し得る。
【００３６】
詳細には、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を促進する物質を含む本発明の促進剤は、サイトカイン及び／又はケモカイン産生の促進が所望される疾患の予防・治療、又は状態の改善に使用され得る。サイトカイン及び／又はケモカイン産生の促進が所望される疾患又は状態としては、例えば、感染症（例、エイズ、Ｃ型肝炎等のウイルス感染症、寄生虫感染症、脳脊髄膜炎等の細菌感染症）、癌、免疫不全症が挙げられる。本発明の促進剤はまた、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を保持しつつ、サイトカイン及び／又はケモカイン産生を促進することが所望される被験体に好適に使用し得る。このような被験体としては、例えば、上記疾患又は状態の２以上を併発している、又は併発する危険性がある被験体が挙げられる。以下、必要に応じて、本発明の促進剤が対象とする疾患又は状態を「疾患又は状態Ｉ」と省略する。
【００３７】
一方、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を抑制する物質を含む本発明の抑制剤は、サイトカイン及び／又はケモカイン産生の抑制が所望される疾患の予防・治療、又は状態の改善に使用され得る。サイトカイン及び／又はケモカイン産生の抑制が所望される疾患又は状態としては、例えば、炎症性疾患（例、乾癬、リウマチ性関節炎等の慢性炎症性疾患：例、Ottaviani C. et al., Eur. J. Immunol., 36: 118 (2006)参照）、肝臓移植等の移植における移植片拒絶反応（例、Obara H. et al., American Jouanal of Transplantation, 5: 2094 (2005)参照）、自己免疫疾患、アレルギー疾患が挙げられる。本発明の抑制剤はまた、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を保持しつつ、サイトカイン及び／又はケモカイン産生を抑制することが所望される被験体に好適に使用し得る。このような被験体としては、例えば、上記疾患又は状態に加え、癌又は感染症（例、上述の感染症）を併発している、又は併発する危険性がある被験体が挙げられる。以下、必要に応じて、本発明の抑制剤が対象とする疾患又は状態を「疾患又は状態ＩＩ」と省略する。
【００３８】
本発明はまた、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及び／又はケモカイン産生を選択的に調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。
【００３９】
スクリーニング方法に供される被験物は、いかなる化合物又は組成物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）、あるいは食品、飲料水等が挙げられる。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法は、被験物がＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法では、細胞、動物又は再構成系を用いて、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能が評価され得る。本発明のスクリーニング方法では、必要に応じて、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターに対するリガンド（例、上述のリガンド）で処理された細胞、動物が用いられ得る（後述の方法論でも同様）。
【００４１】
より詳細には、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を評価するスクリーニング方法（方法論Ｉ）は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物をＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量を測定する工程；
（ｃ）該発現量を、被験物を接触させない対照細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現量を調節する被験物を選択する工程。
【００４２】
方法論Ｉの工程（ａ）では、被験物がＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞と接触条件下におかれる。ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞に対する被験物の接触は、培地中で行われ得る。
【００４３】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞とは、ＣＢＭ複合体の構成因子の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＣＢＭ複合体の構成因子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現細胞であり得、一方、ＣＢＭ複合体の構成因子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＣＢＭ複合体の構成因子遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。
【００４４】
ＣＢＭ複合体の構成因子の発現細胞は、ＣＢＭ複合体の構成因子を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、例えば、免疫細胞（例、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞）が挙げられるが、ＮＫ細胞が好ましい。
【００４５】
ＣＢＭ複合体の構成因子をコードする遺伝子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＣＢＭ複合体の構成因子をコードする遺伝子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＣＢＭ複合体の構成因子遺伝子の転写調節領域は、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、各ＣＢＭ複合体の構成因子をコードする遺伝子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つこれらのＣＢＭ複合体の構成因子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００４６】
ＣＢＭ複合体の構成因子遺伝子の転写調節領域、及び当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＣＢＭ複合体の構成因子遺伝子の転写調節機能を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＣＢＭ複合体の構成因子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現細胞が好ましい。
【００４７】
被験物とＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００４８】
方法論Ｉの工程（ｂ）では、被験物を接触させた細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量が測定される。発現量の測定は、用いた細胞の種類などを考慮し、上述した自体公知の方法により行われ得る。また、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を解析可能な細胞として、ＣＢＭ複合体の構成因子転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞を用いた場合、発現量は、レポーターのシグナル強度に基づき測定され得る。
【００４９】
方法論Ｉの工程（ｃ）では、被験物を接触させた細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量が、被験物を接触させない対照細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量と比較される。発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被験物を接触させない対照細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量は、被験物を接触させた細胞におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。
【００５０】
方法論Ｉの工程（ｄ）では、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を調節する被験物が選択される。例えば、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を促進する（発現量を増加させる）被験物は、上述の「疾患又は状態Ｉ」の予防、治療又は改善に有用である。一方、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現を抑制する（発現量を減少させる）被験物は、例えば、上述の「疾患又は状態ＩＩ」の予防、治療又は改善に有用である。
【００５１】
ＣＢＭ複合体の構成因子の機能を評価するスクリーニング方法（方法論ＩＩ）は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物をＣＢＭ複合体の２以上の構成因子に接触させる工程；
（ｂ）被験物を接触させた場合に形成されたＣＢＭ複合体量を測定する工程；
（ｃ）該複合体量を、被験物を接触させない場合に形成されたＣＢＭ複合体量と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、ＣＢＭ複合体量を調節する被験物を選択する工程。
【００５２】
方法論ＩＩの工程（ａ）では、被験物がＣＢＭ複合体の２以上の構成因子と接触条件下におかれる。本工程では、ＣＢＭ複合体のうち、互いに結合能を有する２以上の因子（例、Ｃａｒｍａ１、Ｂｃｌ１０）、又は３つの因子が再構成系において用いられ得る。ＣＢＭ複合体の構成因子は自体公知の方法により調製できる。例えば、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現組織から単離・精製できる。しかしながら、迅速、容易かつ大量に構成因子を調製し、また、ヒト構成因子を調製するためには、遺伝子組換え技術により組換えタンパク質を調製するのが好ましい。組換えタンパク質は、細胞系、無細胞系のいずれで調製したものでもよい。
【００５３】
方法論ＩＩの工程（ａ）はまた、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現細胞に被験物質を接触させることにより行われ得る。この場合、発現細胞としては、ＣＢＭ複合体の２以上の構成因子がそれぞれ異なる蛍光タンパク質と融合したタンパク質を発現するものが好適に使用され得る。
【００５４】
方法論ＩＩの工程（ｂ）では、複合体量の測定は、自体公知の方法により行われ得る。例えば、測定は、表面プラズモン共鳴を利用する方法（例、Ｂｉａｃｏｒｅの使用）、免疫沈降法などにより行われ得る。あるいは、測定は、共焦点顕微鏡下で行われ得る。
【００５５】
方法論ＩＩの工程（ｃ）では、被験物を接触させた場合に形成されたＣＢＭ複合体量が、被験物を接触させない場合に形成されたＣＢＭ複合体量と比較される。複合体量の比較は、例えば、方法論Ｉで上述したような有意差の有無に基づいて行なわれる。
【００５６】
方法論ＩＩの工程（ｄ）では、ＣＢＭ複合体量を調節する被験物が選択される。例えば、ＣＢＭ複合体量を増加させる（ＣＢＭ複合体の構成因子の機能を促進する）被験物は、例えば、上述の「疾患又は状態Ｉ」の予防、治療又は改善に有用である。一方、ＣＢＭ複合体量を減少させる（ＣＢＭ複合体の構成因子の機能を抑制する）被験物は、例えば、上述の「疾患又は状態ＩＩ」の予防、治療又は改善に有用である。
【００５７】
また、本発明のスクリーニング方法は、以下の工程を含むものであり得る（方法論ＩＩＩ）：
（ａ）被験物を動物に投与する工程；
（ｂ）被験物を投与した動物におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を測定する工程；
（ｃ）該発現又は機能を、被験物を投与しない対象動物におけるＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、ＣＢＭ複合体量を調節する被験物を選択する工程。
【００５８】
方法論ＩＩＩで用いられ得る動物は、上述の哺乳動物であり得る。方法論ＩＩＩの工程（ａ）における被験物の動物への投与は、自体公知の方法により行うことができる。また、方法論ＩＩＩの工程（ｂ）〜（ｄ）は、方法論Ｉ及びＩＩと同様にして行うことができる。
【００５９】
本発明はまた、ＣＢＭ複合体の１以上の構成因子の発現又は機能が調節されたＮＫ細胞を提供する。
【００６０】
本発明の細胞は、単離及び／又は精製されたものであり得る。本発明の細胞は、ＣＢＭ複合体の１以上（例、１、２又は３）の構成因子の発現又は機能の調節（例、促進、抑制）により、サイトカイン及び／又はケモカイン産生が選択的に調節された細胞であり得る。本発明の細胞は、ＣＢＭ複合体の１以上の構成因子の発現が一過的に調節された細胞、又は当該発現が恒常的に調節された細胞（例、ホモ接合性又はヘテロ接合性欠損細胞、あるいはゲノムに遺伝子が導入された細胞等のゲノム改変細胞）であり得る。本発明の細胞は形質転換体又は非形質転換体であり得る。本発明の細胞はまた、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターに対するリガンドで処理された、又は処理されていない細胞であり得る。
【００６１】
本発明の細胞は、例えば、ＣＢＭ複合体の構成因子の発現又は機能を調節し得る物質でＮＫ細胞を処理することにより作製できる。本発明の細胞はまた、遺伝子導入動物又は遺伝子欠損（いわゆるノックアウト）動物からＮＫ細胞を単離及び／又は精製することにより、あるいはＮＫ細胞の前駆細胞を単離及び／又は精製し、次いでこの前駆細胞をＮＫ細胞に分化させることにより作製できる。例えば、Ｃａｒｍａ１ノックアウト動物（例、Hara H et al., Immunity, vol.18, p.763-775, 2003参照）、Ｂｃｌ１０ノックアウト動物（例、Ruland J et al. Cell, vol.104, p.33-42, 2001参照）、Ｍａｌｔ１ノックウアウト動物（例、Ruefli-Brasse et al., Science, vol. 302, p.1581-1584, 2003参照）が公知であるので、本発明では、このような動物から本発明の細胞を調製できる。また、これらの動物を交配させ、多重ノックアウト動物を作出した後、この多重ノックアウト動物からＮＫ細胞を得ることもできる。
【００６２】
本発明の細胞は、例えば、ａ）上述の疾患又は状態の予防、治療及び／又は改善薬の開発（例、本発明のスクリーニング方法での使用）、ｂ）上述の疾患又は状態の予防、治療及び／又は改善のための細胞療法、ｃ）ＮＫ細胞におけるサイトカイン／ケモカイン産生機構の解析、ｄ）サイトカイン／ケモカイン産生調節遺伝子の探索などに有用であり得る。
【００６３】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６４】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：Ｃａｒｍａ１はＮＫ細胞分化に重要ではない
本発明者らは、野生型（Ｗｔ）及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＮＫ細胞の分化及び表現型を調べた。Ｃａｒｍａ１−／−マウスの骨髄、肝臓及び脾臓における成熟ＮＫ１．１＋ＤＸ５＋ＮＫ細胞の百分率（図１Ａ、左）、並びに脾臓におけるＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞の絶対数（図１Ｂ）は、Ｗｔコントロールマウスと比較して有意に変化しなかった。成熟ＮＫ細胞は、インテグリン、Ｌｙ４９、Ｃ型レクチンファミリーレセプター、ＮＫＧ２ファミリーレセプター、ＣＤ４３、２Ｂ４及びＣＤ１２２を含む、種々の表面レセプターを発現する。幾つかのレセプター（例、Ｍａｃ１及びＬｙ４９）は、ＮＫ細胞の成熟プロセスの間に調節される。図１Ａに示されるように、脾臓ＣＤ３−ＮＫ１．１＋ＮＫ細胞内のＭａｃ１ｈｉｇｈ細胞の百分率及び数は、ＷｔマウスとＣａｒｍａ１−／−マウスとの間で同等であった（図１Ａ、右）。さらに、Ｌｙ−４９レセプター及びＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｄ、並びに他の７つの異なるＮＫマーカーの発現は、Ｃａｒｍａ１欠損により有意に影響されなかった（表１）。これらの結果は、Ｃａｒｍａ１がＮＫ細胞の分化及び表現型の成熟に必須でないことを示す。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
実施例２：Ｃａｒｍａ１は、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターにより誘導されるＮＫ細胞の細胞傷害性に重要ではない
ＮＫ細胞機能におけるＣａｒｍａ１の役割は全くの未知である。先ず、本発明者らは、ＷｔＮＫ細胞とＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞（Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞からの濃縮ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５を用いて７日間増殖させたものを使用）との間のパーフォリン及びグランザイムの発現レベルをＲＴ−ＰＣＲ解析により比較した。Ｃａｒｍａ１−／−マウスにおける正常なＮＫ細胞の分化の結果と一致して、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞のパーフォリン及びグランザイムＢの転写レベルは、ＷｔＮＫ細胞のものと同等であった（図２Ａ）。次に、本発明者らは、ＮＫ感受性標的Ｙａｃ１細胞及びＮＫ耐性標的Ｐ８１５細胞に対するＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞の天然の細胞傷害性を５１Ｃｒ放出アッセイにより調べた。本発明者らは、Ｃａｒｍａ１の欠落がこれらの標的に対する細胞傷害性に影響しないことを見出した（図２Ｂ）。同様の結果が、新鮮に単離されたＮＫ細胞を用いて得られた（データ示さず）。Ｃａｒｍａ１は、「ＩＴＡＭ含有分子」に会合するＴＣＲ及びＢＣＲを介するシグナル伝達に必須である。ＮＫ細胞は、リガンド発現標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を誘導し得る種々のＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを発現することから、本発明者らは、これらのレセプターにより媒介されるＮＫ細胞の細胞傷害性を調べた。本発明者らが試験したレセプターは、ＦｃＲγと会合するＦｃγＲ（ＣＤ１６）及びＮＫ１．１、並びにＤＡＰ１２及び／又はＤＡＰ１０と会合するＬｙ４９Ｈ及びＮＫＧ２Ｄであった。ＦｃγＲ誘導性細胞傷害性を、表面ビオチン化され、かつ抗ビオチンＡｂでコーティングされているＢａ／Ｆ３細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を用いて５１Ｃｒ放出アッセイにより調べた。また、ＮＫ１．１媒介細胞傷害性を、抗ＮＫ１．１ｍＡｂによるＦｃＲ＋Ｐ８１５細胞に対する逆ＡＤＣＣを用いて５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。さらに、Ｌｙ４９Ｈ及びＮＫＧ２Ｄ媒介細胞傷害性を、標的細胞としてそれらの各リガンドｍ１５７及びＲａｅ１βを発現しているＢａ／Ｆ３細胞を用いて５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。全ての場合において、これらのレセプターにより誘導されるＩＬ−１５増殖性Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＷｔＮＫ細胞と比較して、有意に損なわれなかった（図２Ｃ〜Ｆ）。これらの結果は、Ｃａｒｍａ１がこれらのＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介する刺激によるＮＫ細胞の細胞傷害性の誘導に必須ではないことを示す。
【００６８】
実施例３：Ｃａｒｍａ１は、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介サイトカイン／ケモカイン産生に必須である
本発明者らは以前に、Ｃａｒｍａ１がＴリンパ球におけるＴＣＲ誘導性ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ産生に必須であることを報告した。ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介するＮＫ細胞による標的細胞の認識は、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−αを含む炎症性サイトカインを誘導する。従って、本発明者らは、Ｃａｒｍａ１の損失がＮＫ細胞のサイトカイン産生に影響するかどうかを試験した。ＣＤ１６及びＮＫ１．１がＦｃＲγと会合するのに対し、ＮＫＧ２Ｄ及びＬｙ４９ＤがＩＴＡＭ含有分子としてＤＡＰ１２と会合し、そしてＮＫＧ２Ｄもまた、ＰＩ３Ｋ結合についてのＹｘｘＭモチーフを含有するＤＡＰ１０と会合する。Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞からの精製ＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞を、ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在又は不在下において示された量の固定化マウスＩｇＧ、抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、あるいはＦｃＲブロッカーの存在下において固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧ、あるいはＦｃＲブロッカーの存在下において２０μｇ／ｍｌの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧ、あるいはＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）を用いて刺激した。刺激２４時間後に、培養上清中のＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦを、ＥＬＩＳＡにより測定した。また、抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（５μｇ／ｍｌ）による３時間刺激後に、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦの転写物のリアルタイムＰＣＲを行った。さらに、ＮＫ細胞をＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）、又はＩＬ−１２＋ＩＬ−１８で刺激した。刺激２４時間後の上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、固定化されたマウスＩｇＧ（ＣＤ１６に対するリガンド、図３Ａ）、抗ＮＫ１．１  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（図３Ｂ）、Ｒａｅ１β−Ｆｃ（図３Ｃ）又は抗Ｌｙ４９Ｄ（図３Ｄ）を用いた刺激は、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びＧＭ−ＣＳＦ産生における劇的な低下を示した。これらの欠陥は、高用量の活性化刺激でさえも克服され得なかった。このことは、Ｃａｒｍａ１がＮＫ細胞におけるＦｃＲγ並びにＤａｐ１２又は／及びＤＡＰ１０媒介サイトカイン産生に重要であることを示唆する。さらに、ＰＭＡ＋カルシウムイオノフォアに応答するサイトカイン産生もまた、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞において損なわれた（図３Ｅ）。このことは、Ｃａｒｍａ１がＰＫＣの下流で機能することを示す。定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析は、ＮＫ１．１刺激後のサイトカインのｍＲＮＡ発現が、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞では著明に減少することを示した。このことは、サイトカイン産生の不全が転写レベルで調節されることを示唆する（図３Ｆ）。ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター刺激とは対照的に、ＩＬ−１２及びＩＬ−１８誘導性サイトカン産生は、ＷｔＮＫ細胞とＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞との間で同等であった（図３Ｇ）。このことは、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞がサイトカンを産生し得ること、並びにこの欠陥がＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介して特異的���誘導されることを示す。
【００６９】
ＮＫ細胞は、炎症性サイトカインの強力な供給源である。ＮＫ細胞上のＩＴＡＭ含有分子会合レセプターの架橋によって、エフェクター細胞を免疫応答の部位にリクルートするために重要である、ＣＣ−ケモカイン（マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β及びＲＡＮＴＥＳを含む）の豊富な産生を誘導することが報告されている。従って、本発明者らは、Ｃａｒｍａ１の損失がＮＫ細胞のＣＣ−ケモカイン産生に影響するかどうかを試験した。Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞からの精製及びＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞を、示された量の固定化マウスＩｇＧ、抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、あるいはＦｃＲブロッカー（可溶性α−ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧ、あるいはＦｃＲブロッカーの存在下において２０μｇ／ｍｌの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧ、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）、あるいはＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて刺激した。刺激２４時間後に、培養上清中のＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びＲＡＮＴＥＳをＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、サイトカイン産生と同様に、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞は、ＦｃＲγ会合レセプターであるＣＤ１６及びＮＫ１．１（それぞれ、図４Ａ及びＢ）、ＤＡＰ１２／ＤＡＰ−１０会合レセプターであるＮＫＧ２Ｄ及びＬｙ４９Ｄ（それぞれ、図４Ｃ及びＤ）、並びにＰＫＣ活性化（ＰＭＡ＋カルシウムイオノフォア、図４Ｅ）を介する刺激後に、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＴＡＮＴＥＳの産生の重篤な不全を示した。対照的に、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞によるこれらのケモカイン産生は、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８（データ示さず）、あるいはＩＬ−１２＋ＩＬ−１８（図４Ｆ）により正常に誘導された。
【００７０】
まとめると、これらの結果は、Ｃａｒｍａ１が、ＰＫＣ活性化の「下流」で機能すること、並びにＮＫ細胞において、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介する刺激の際のサイトカイン及びケモカイン産生に重要であり、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒによるサイトカイン及びケモカイン産生には重要でないことを示す。
【００７１】
実施例４：Ｃａｒｄ９ではなく、Ｂｃｌ１０が、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導性サイトカイン／ケモカイン産生に必須である
Ｂｃｌ１０との複合体形成は、Ｃａｒｍａ１がリンパ球における抗原レセプターシグナル伝達で機能するために重要である。しかしながら、ＮＫ細胞におけるＣａｒｍａ１媒介シグナル伝達経路におけるＢｃｌ１０の関与は未知である。従って、本発明者らは、Ｂｃｌ１０−／−マウスのＮＫ細胞の機能を解析した。Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウスの脾細胞からの濃縮ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５を用いて７日間増殖させ、そして５１Ｃｒ放出アッセイにより、Ｙａｃ１又はＰ８１５標的細胞に対する細胞溶解活性について、並びに抗ビオチンＡｂ又はコントロールＩｇＧの存在下における表面ビオチン化ＢａＦ３標的細胞に対するＡＤＣＣについて試験した。また、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウスからのＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞を、１０μｇ／ｍｌの固定化抗ＣＤ１６（２．４Ｇ２）、抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（１０μｇ／ｍｌ）、ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において１０μｇ／ｍｌの固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧ、ＦｃＲ−ブロッカーの存在下において２０μｇの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧ、ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）、あるいは１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８を用いて刺激した。２４時間の刺激後、培養上清中のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１βを、ＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、Ｙａｃ−１及びＰ８１５標的細胞に対する細胞傷害性（図５Ａ）、並びにＡｂコーティングＢａ／Ｆ３細胞に対するＡＤＣＣ（図５Ｂ）は、Ｂｃｌ１０−／−ＮＫ細胞とＢｃｌ１０＋／−ＮＫ細胞との間で同等であった。対照的に、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターであるＣＤ１６、ＮＫ１．１、ＮＫＧ２Ｄ及びＬｙ４９Ｄ（それぞれ、図５Ｃ〜Ｆ）、あるいはＰＭＡ＋カルシウムイオノフォア（図５Ｇ）の刺激の際のサイトカイン及びケモカイン産生は、Ｂｃｌ１０−／−マウスにより著しく損なわれた。この不全は、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター特異的であるようである。なぜなら、ＩＬ−１８媒介ＩＦＮ−γ産生は、Ｂｃｌ１０欠損により影響されないからである（図５Ｈ）。従って、Ｂｃｌ１０は、ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介サイトカイン及びケモカイン産生に重要に関与し、細胞傷害性に重要に関与しない。
【００７２】
デクチン−１（ＩＴＡＭ含有レセプター：それ自身がＩＴＡＭを保有）は、真菌成分であるザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）に対する主要な哺乳動物パターン認識レセプターである。最近、別のＣＡＲＤファミリータンパク質であるＣａｒｄ９がＢｃｌ１０とカップリングし、サイトカイン産生及び自然（innate）な抗真菌免疫のために、骨髄細胞のデクチン−１媒介活性化を制御することが示された。従って、Ｃａｒｄ９は、Ｃａｒｍａ１及びＢｃｌ１０と共に、ＮＫ細胞のＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介活性化に関与するのかもしれない。この疑問に注目するため、本発明者らは、Ｃａｒｄ９欠損（Ｃａｒｄ９−／−）マウスを作出した。Ｃａｒｄ９のヌル変異を、Ｃａｒｄ９タンパク質の欠落により確認した（データ示さず）。ＮＫ細胞の分化は、Ｃａｒｄ９−／−マウスにおいて正常であるようであった（データ示さず）。図５Ｉに示されるように、Ｃａｒｄ９−／−マウス由来のＮＫ細胞は、抗ＣＤ１６並びにＩＬ−１２＋ＩＬ−１８での刺激後にＩＦＮ−γ産生を正常に誘導した。
【００７３】
これらの結果は、Ｃａｒｍａ１／Ｂｃｌ１０複合体が、ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ媒介シグナルをサイトカイン及びケモカイン遺伝子発現に中継することを示唆する。
【００７４】
実施例５：Ｃａｒｍａ１は、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介ＮＦ−κＢ活性化を調節する
Ｃａｒｍａ１−／−及びＢｃｌ１０−／−ＮＫ細胞におけるケモカイン／サイトカイン産生の機能的欠陥についての分子機構を同定するため、本発明者らは、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターの下流のシグナル伝達経路を解析した。先ず、細胞傷害性を誘導するシグナル経路を試験するため、抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋により刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞における総チロシンリン酸化及びＶａｖ１のリン酸化レベルを測定した。また、Ｉｎｄｏ−１−ＡＭロードＮＫ細胞を抗ＮＫ１．１ｍＡｂ又は抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂで刺激し、ＦＬ５／ＦＬ４蛍光を２００秒間モニターした。さらに、ＮＫ細胞をＹａｃ１細胞を用いて１時間インキュベートし、脱顆粒細胞におけるＬＡＭＰ１／２の表面発現をフローサイトメトリにより検出した。その結果、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞は、α−ＣＤ１６刺激後に同等の総チロシンリン酸化を示した（図６Ａ）。細胞内カルシウム動員は、パーフォリン依存性のＮＫ細胞の細胞傷害性につながる初期事象であり、Ｖａｖ１はＣＤ１６及びＮＫＧ２Ｄの双方の刺激後にリン酸化され、ＮＫ細胞におけるＥＲＫの活性化及び細胞傷害性顆粒のエキソサイトーシスを制御する。本発明者らは、Ｖａｖ１リン酸化（図６Ｂ）及び抗ＣＤ１６刺激後のカルシウム動員（図６Ｃ）もまたＷｔＮＫ細胞とＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞との間で同等であることを見出した。さらに、リソソームタンパク質ＬＡＭＰ−１／２の細胞表面発現の誘導はＮＫ細胞の脱顆粒と相関することが知られており、それは、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＹａｃ１標的細胞とのインキュベーション後に正常に誘導された（図６Ｄ）。従って、Ｃａｒｍａ１の損失は、ＮＫ細胞の細胞傷害性に必要とされるＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導性近位シグナル伝達事象に影響しない。これは、実施例２の結果を支持する。
【００７５】
第２に、本発明者らは、ＭＡＰＫ活性化を解析した。なぜなら、ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８は、ＮＫ細胞におけるサイトカイン及びケモカイン遺伝子発現の調節に関与することが示されているからである。本発明者らの以前の報告は、ＴＣＲ及びＢＣＲ媒介ＪＮＫ活性化がＣａｒｍａ１−／−Ｔ及びＢリンパ球で損なわれることを示した。そこで、本発明者らは、抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋による刺激の際のＷｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＭＡＰＫ（ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８）の活性化を試験した。しかしながら、α−ＣＤ１６によるＣａｒｍａ１＋／＋及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞の刺激は、ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８のリン酸化に如何なるみかけ上の差異も示さなかった（図７Ａ）。このことは、Ｃａｒｍａ１がＮＫ細胞におけるＭＡＰＫ活性化に関与しないことを示す。
【００７６】
第３に、Ｃａｒｍａ１／Ｂｃｌ１０複合体は、Ｔ及びＢリンパ球において抗原レセプターをＮＦ−κＢ活性化にカップリングするために必須であるため、本発明者らは、ＮＫ細胞において、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導ＮＦ−κＢシグナル伝達におけるＣａｒｍａ１の役割を、ＩκＢ分解及びＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を解析することにより調べた。ＮＦ−κＢの結合活性は以下の通り調べた。即ち、核抽出液を、固定化抗ＣＤ１６ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）を用いて示された期間にわたり、あるいはＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて８時間にわたり刺激されたＷｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞から調製し、ＮＦ−κＢの結合活性を、核因子ＮＦ−κＢ  ｐ６５キット（ＢＤ）を用いて評価した。その結果、Ｉ−κＢαの分解は、α−ＣＤ１６刺激に応答するＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞では損なわれた（図７Ｂ）。同様の不全が、Ｂｃｌ１０−／−ＮＫ細胞において観察された（データ示さず）。一致して、ｐ６５含有ＮＦ−κＢ複合体のＤＮＡ結合活性が、α−ＣＤ１６刺激後のＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞の核において著明に減少した（図７Ｃ）。対照的に、ＩκＢα分解及びＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性の不全は、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞をＴＮＦα又はＩＬ−１８で刺激した場合に観察されなかった（図７Ｄ〜Ｇ）。従って、Ｃａｒｍａ１は、他のＮＦ−κＢ活性化レセプターではなくＩＴＡＭ含有分子会合レセプターを介する刺激の際にＮＦ−κＢ活性化を選択的に誘導する。
【００７７】
以前に、本発明者らは、Ｃａｒｍａ１がＴ及びＢ細胞においてＰＫＣの下流で作用し、ＰＫＣ刺激をＮＦ−κＢ活性化へと媒介することを示した。興味深いことに、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞は、ＰＭＡ＋イオノフォア刺激により誘導されるサイトカイン及びケモカイン産生の不全さえも示した。さらに、ＰＭＡ＋イオノフォアでの刺激の際のＩκＢα分解は、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞において重篤に損なわれ（図７Ｃ）、一方、ＥＲＫ活性化は影響されなかった。このことは、Ｃａｒｍａ１が、ＴＣＲ及びＢＣＲと同様に、ＮＫ細胞においてＩＴＡＭ含有分子会合レセプターシグナル伝達におけるＰＫＣの下流で機能することを示唆する（図８）。
【００７８】
ＣＢＭ複合体は、ＮＫ細胞におけるサイトカイン／ケモカイン産生のうち、ＩＴＡＭ媒介レセプターシグナル伝達を介するサイトカイン／ケモカイン産生に特異的に関与し得る。ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８誘導性サイトカイン／ケモカイン産生（ＩＴＡＭ媒介レセプターシグナル伝達を介さないもの）とＩＴＡＭ媒介レセプターシグナル伝達を介するサイトカイン／ケモカイン産生との間の生物学的意義の相違点は、以下の通りである。ＩＬ−１２／１８は、感染性微生物などの異物に反応したマクロファージや樹状細胞から多量に産生されるため、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８誘導性サイトカイン／ケモカイン産生は主に感染に対応し得る。一方、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターのリガンドとなるものは、癌化や感染によるストレスにより細胞が発現する分子、自己／非自己のＭＨＣ分子、ウイルス産物などの多岐にわたるため、ＩＴＡＭ媒介レセプターシグナル伝達を介するサイトカイン／ケモカイン産生は、感染のみならず、腫瘍細胞の排除や移植片拒絶などでも働く可能性がある。
【００７９】
以上より、概略すれば、本発明者らの研究成果は、下記１）〜６）を提示するものである：
１）Ｃａｒｍａ１がＮＫ細胞分化に重要ではない（例、Ｃａｍａ１−／−マウスにおけるＮＫ細胞の正常な分化を支持する図１Ａ及びＢ参照）；
２）Ｃａｒｍａ１がＮＫ細胞の細胞傷害性に重要ではない（例、図２Ａ〜Ｆ参照）；
３）Ｃａｒｍａ１がＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介サイトカイン／ケモカイン産生に必須であり得る（例、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導サイトカイン産生の不全を支持する図３Ａ〜Ｇ、及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導性ケモカイン産生の不全を支持する図４Ａ〜Ｆ参照）；
４）Ｂｃｌ１０がＩＴＡＭ含有分子会合レセプター誘導性サイトカイン／ケモカイン産生に必須であり得る（例、図５Ａ〜Ｉ参照）；
５）Ｃａｒｍａ１がＩＴＡＭ含有分子会合レセプター媒介ＮＦ−κＢ活性化を調節し得る（例、Ｃａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるカルシウム動員、Ｖａｖ１活性化及び溶解性顆粒のエキソサイトーシスの正常な誘導を支持する、図６Ａ〜Ｄ、並びに図７Ａ〜Ｇ参照）。
６）Ｃａｒｍａ１及びＢｃｌ１０は、おそらくＭａｌｔ１との複合体の形成を通じて、その機能を発揮し得る。従って、本発明者らは、ＮＫ細胞における殺傷活性及びサイトカイン／ケモカイン産生について図８に示されるような機構を提唱する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】野生型（Ｗｔ）及びＣａｒｍａ１−／−マウスの骨髄、脾臓及び肝臓におけるＮＫ細胞のフローサイトメトリを示す図である。四分割部における数は、領域中の陽性細胞の百分率を示す。結果は、５つの異なる実験を表したものである。
【図１Ｂ】Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾臓における成熟ＮＫ細胞の百分率（左）及び総数（右）を示す図である。データは、５匹のマウスからの結果の平均±ｓ．ｄ．である。
【図２Ａ】グランザイムＢのｍＲＮＡレベルの半定量的ＲＴ−ＰＣＲによる解析結果を示す図である。Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞からの濃縮ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５を用いて７日間増殖させた後（以下の図２Ｂ〜Ｆでも同様）、アッセイに供した。
【図２Ｂ】Ｙａｃ１又はＰ８１５標的細胞に対する天然の細胞傷害性を示す図である（ｎ＝３）。細胞溶解活性を５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。縦軸の単位：％、横軸のＥ：ＴはEffector：Target比を示す（図２Ｃ〜Ｆも同様）。
【図２Ｃ】抗ビオチンＡｂ又はコントロールＩｇＧの存在下における表面ビオチン化ＢａＦ３標的細胞に対するＡＤＣＣを示す図である（ｎ＝３）。細胞溶解活性を５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。
【図２Ｄ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂ又はコントロールＩｇＧでコーティングされたＰ８１５細胞に対する逆ＡＤＣＣを示す図である（ｎ＝３）。細胞溶解活性を５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。
【図２Ｅ】ＢａＦ３又はｍ１５７発現ＢａＦ３標的細胞に対する細胞傷害性を示す図である（ｎ＝３）。細胞溶解活性を５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。
【図２Ｆ】ＢａＦ３又はＲａｅ１β発現ＢａＦ３標的細胞に対する細胞傷害性を示す図である（ｎ＝３）。細胞溶解活性を５１Ｃｒ放出アッセイにより試験した。
【図３Ａ】ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ：２．４Ｇ２、１０μｇ／ｍｌ）の存在又は不在下において固定化マウスＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図３Ｂ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図３Ｃ】ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ：２．４Ｇ２、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図３Ｄ】ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ：２．４Ｇ２、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において２０μｇ／ｍｌの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図３Ｅ】ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）で刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のサイトカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。Ｐ：ＰＭＡ、Ｉ：カルシウムイオノフォア
【図３Ｆ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（５μｇ／ｍｌ）による３時間刺激後のサイトカインの転写物のリアルタイムＰＣＲを示す図である（ｎ＝３）。
【図３Ｇ】ＩＬ−１８又は／及びＩＬ−１２で刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ａ】固定化マウスＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ｂ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメントで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ｃ】ＦｃＲブロッカー（可溶性α−ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ｄ】ＦｃＲブロッカー（可溶性α−ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において２０μｇ／ｍｌの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧで刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ｅ】ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）で刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図４Ｆ】ＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）で刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウスの脾細胞由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のケモカイン産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ａ】５１Ｃｒ放出アッセイによる、Ｙａｃ１又はＰ８１５標的細胞に対するＢｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＮＫ細胞の細胞溶解活性を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｂ】抗ビオチンＡｂ又はコントロールＩｇＧの存在下における表面ビオチン化ＢａＦ３標的細胞に対する、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＮＫ細胞のＡＤＣＣを示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｃ】１０μｇ／ｍｌの固定化抗ＣＤ１６（２．４Ｇ２）で刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１β産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｄ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂの固定化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（１０μｇ／ｍｌ）で刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１β産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｅ】ＦｃＲブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において１０μｇ／ｍｌの固定化Ｒａｅ１β−Ｆｃ又はコントロールヒトＩｇＧで刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１β産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｆ】ＦｃＲ−ブロッカー（可溶性抗ＣＤ１６ｍＡｂ、１０μｇ／ｍｌ）の存在下において２０μｇの固定化抗Ｌｙ４９ＤｍＡｂ又はコントロールラットＩｇＧで刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１β産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｇ】ＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋カルシウムイオノフォア（１μＭ）で刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ及びＭＩＰ−１β産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｈ】１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１８で刺激された、Ｂｃｌ１０＋／−及びＢｃｌ１０−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図５Ｉ】示された量の抗ＣＤ１６（左）、又はＩＬ−１２（１ｎｇ／ｍｌ）＋ＩＬ−１８（５ｎｇ／ｍｌ）（右）で刺激された、Ｃａｒｄ９＋／＋及びＣａｒｄ９−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ産生を示す図である（ｎ＝３）。
【図６Ａ】抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋により刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞における総チロシンリン酸化レベルを示す図である。
【図６Ｂ】抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋により刺激された、Ｗｔ及びＣａｒｍａ１−／−マウス由来のＩＬ−１５増殖性ＮＫ細胞におけるＶａｖ１リン酸化レベルを示す図である。
【図６Ｃ】抗ＮＫ１．１ｍＡｂ又は抗ＮＫＧ２ＤｍＡｂで刺激したＮＫ細胞のカルシウム動員を示す図である。
【図６Ｄ】Ｙａｃ１細胞とインキュベートされた脱顆粒ＮＫ細胞におけるＬＡＭＰ１／２の表面発現を示す図である。
【図７Ａ】抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋による刺激の際のＷｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＭＡＰＫ（ＥＲＫ、ＪＮＫ及びｐ３８）の活性化を示す図である。
【図７Ｂ】抗ＣＤ１６ｍＡｂを用いたＦｃγＲの架橋による刺激の際のＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞における欠陥的ＩκＢα分解を示す図である。
【図７Ｃ】ＰＭＡ＋カルシウムイオノフォアによる刺激の際のＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞における欠陥的ＩκＢα分解（ＥＲＫ活性化ではない）を示す図である。
【図７Ｄ】ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）による刺激の際のＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞における正常なＩκＢα分解を示す図である。
【図７Ｅ】ＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）による刺激の際のＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞における正常なＩκＢα分解を示す図である。
【図７Ｆ】固定化抗ＣＤ１６ｍＡｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）で刺激されたＷｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＮＦ−κＢ結合活性を示す図である（ｎ＝３）。
【図７Ｇ】ＩＬ−１８（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激されたＷｔ及びＣａｒｍａ１−／−ＮＫ細胞におけるＮＦ−κＢ結合活性を示す図である（ｎ＝３）。
【図８】ＮＫ細胞における殺傷活性及びサイトカイン／ケモカイン産生に対するＣａｒｍａ１／Ｂｃｌ１０媒介シグナルの差示的要件を示す図である。ＮＫ細胞上のＩＴＡＭ含有分子会合レセプター（例、ＣＤ１６、ＮＫ１．１、ＮＫＧ２Ｄ、Ｌｙ４９Ｄ及びＬｙ４９Ｈ）を介する刺激は、標的細胞の溶解並びに炎症性サイトカイン及びケモカインの産生を生じる。ＮＫ細胞の細胞傷害性並びにサイトカイン及びケモカインの産生に必要とされるシグナルは、異なって調節されているようである。Ｃａｒｍａ１は、サイトカイン及びケモカイン産生に必要とされるシグナルに関与するが、ＮＫ細胞の細胞傷害性に関連するシグナル（例、カルシウム動員、Ｖａｖ１活性化、及び溶解性顆粒のエキソサイトーシス）に重要ではない。Ｃａｒｍａ１は、Ｂｃｌ１０にカップリングし、ＩＴＡＭ含有分子会合レセプターにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を制御するが、他のＮＦ−κＢ活性化レセプター（例、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ及びＴＮＦＲ１）により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を制御しない。ＰＫＣは、おそらくリンパ球における抗原レセプターシグナル伝達と類似の様式において、ＩＴＡＭ誘導シグナルをＣａｒｍａ１／Ｂｃｌ１０媒介ＮＦ−κＢ活性化に中継し得る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図８】
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【図２Ａ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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