【手続補正書】
【提出日】平成24年11月22日(2012.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物で発現可能な構成的プロモーター；
ｂ）５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域；
ｃ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｄ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｅ）グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｆ）植物細胞で機能的な３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む、キメラＤＮＡ分子を含む植物細胞または植物。
【請求項２】
前記構成的プロモーターがＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターである、請求項１に記載の植物細胞または植物。
【請求項３】
前記イントロン１が、配列番号９のｎｔ６９２〜１１００もしくはｎｔ２９８４〜３０６４または配列番号１０のｎｔ５５５〜６６８を含む、請求項１または２のいずれか一項に記載の植物細胞または植物。
【請求項４】
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物細胞または植物。
【請求項５】
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む、請求項４に記載の植物細胞または植物。
【請求項６】
以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター配列；
ｂ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードする第２のＤＮＡ領域；
ｃ）トランジットペプチドをコードする第２のＤＮＡ領域；
ｄ）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードする第２のＤＮＡ領域；ならびに
ｅ）植物細胞で機能的な第２の３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む第２のキメラＤＮＡ分子をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物細胞または植物。
【請求項７】
前記ヒストンＨ４プロモーター配列が、配列番号６のｎｔ５９６９〜６８９０を含む、請求項６に記載の植物細胞または植物。
【請求項８】
前記イントロン１が、配列番号９のｎｔ６９２〜１１００もしくはｎｔ２９８４〜３０６４または配列番号１０のｎｔ５５５〜６６８を含む、請求項６または７のいずれか一項に記載の植物細胞または植物。
【請求項９】
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の植物細胞または植物
【請求項１０】
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む、請求項９に記載の植物細胞または植物。
【請求項１１】
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の植物細胞または植物。
【請求項１２】
アブラナである請求項１〜１１のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載されているようなキメラ遺伝子を含む請求項１〜１２のいずれか一項に記載の植物の種子。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載されているようなキメラＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載されているような植物を生育させ、かつ前記植物をＥＰＳＰＳ阻害除草剤で処理することを含む、野外で植物を生育させるための方法。
【請求項１６】
グリホサート耐性植物を作製するための請求項１４に記載のキメラＤＮＡ分子の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】グリホサート耐性が増強された植物を得るための方法および手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤耐性植物、より具体的には、グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の定量的および定性的な発現を指示するキメラＤＮＡ分子を含み、前記キメラＤＮＡ分子が、それによって、前記ＥＰＳＰＳを阻害する除草剤に対する増強された耐性を前記植物に付与する、植物（例えば、アブラナ属の油糧種子植物）の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−ホスホノメチルグリシン（別名、グリホサート）は、広範な植物種に対して活性があるよく知られた除草剤である。芳香族アミノ酸を合成するための前駆体を提供するシキミ酸経路を阻害するので、グリホサートには植物毒性がある。グリホサートは、植物やいくつかの細菌に見られるクラスＩの５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）を阻害する。植物におけるグリホサート耐性は、グリホサートに対するより低い親和性を有するが、グリホサートの存在下でその触媒活性を依然として保持する改変されたクラスＩのＥＰＳＰＳを発現させることによって達成することができる。グリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素をコードする遺伝子は、当技術分野（例えば、特許出願の欧州特許第０８３７９４４号明細書および米国特許第６，５６６，５８７号明細書）において周知である。植物におけるグリホサート耐性は、クラスＩＩまたはクラスＩＩＩのＥＰＳＰＳ酵素を含む、グリホサートに対する耐性を示すＥＰＳＰＳ酵素を発現させることによっても達成し得る。
【０００３】
植物におけるグリホサート耐性の程度は、本質的には、ＥＰＳＰＳ酵素の発現の量と質、すなわち、適切な発生段階での適切な組織における十分な量のＥＰＳＰＳの発現に基づく。発現の質と量に関するこれらのパラメータは、ＥＰＳＰＳ発現を指示する発現カセットに導入された調節エレメントによって一部調節される。発現カセットにとって不可欠な調節エレメントとしては、プロモーター調節配列およびターミネーター調節配列が挙げられる。発現をさらに増強するために、発現カセットは、以下の、リーダー配列もしくは５’ＵＴＲ、シグナルペプチドもしくはトランジットペプチド、または転写アクチベーターエレメントもしくはエンハンサーから選択されるエレメントのうちの１つもしくは複数またはその全てを含むこともできる。植物（特に、アブラナなどの作物植物）におけるグリホサート耐性キメラ遺伝子の発現を改善するために、様々な方法が当技術分野において記載されている。
【０００４】
国際公開第９７／００４１１４号パンフレットには、植物を形質転換するためのキメラ遺伝子が記載されている。この遺伝子は、転写方向に、少なくとも１つのプロモーター領域と、１つの導入遺伝子と、急速に増殖する領域でのタンパク質発現を可能にする植物ヒストン遺伝子の非コード５’領域の少なくとも１つのイントロン１からなる１つの調節領域とを含む。
【０００５】
国際公開第０１／４４４５７号パンフレットには、導入遺伝子（ＥＰＳＰＳを含む）の発現を増強するためのＰｅＦＭＶプロモーターと組み合わせた様々なアクチンイントロン配列を含む、複数の植物発現コンストラクトが開示されている。
【０００６】
国際公開第０７／０９８０４２号パンフレットには、ａ．ｏ．ＥＰＳＰＳ、グリホサートオキシドレダクターゼ（ＧＯＸ）およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼの発現を指示する、単子葉植物プロモーターとＥＦ１、ＡｃｔおよびＡＳＰ遺伝子由来の双子葉植物イントロンとの組合せが記載されている。
【０００７】
ＥＦ１αイントロンと組み合わせたＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターによるＣＰ４  ＥＰＳＰＳの綿における発現の増強は、Ｃｈｅｎら（２００６，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．４（５）：４７７−８７）によって報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
それでもやはり、作物植物（特に、アブラナ植物）におけるグリホサート耐性のさらなる改善が望ましく、耐性の増加を付与する別のキメラ遺伝子またはその組合せが依然として必要である。
【０００９】
本発明は、ＥＰＳＰＳコード領域（例えば、コドン使用頻度がアブラナにおけるコドン使用頻度を反映するように最適化されたＥＰＳＰＳコード領域）に由来するグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の発現を指示する、構成的プロモーターと置換ヒストンイントロンとの組合せを含む植物を提供することによって当技術分野に大きく貢献するものである。特に、本明細書に記載されているようなコドン使用頻度が最適化されたＥＰＳＰＳコード領域と組み合わせて、グリホサート耐性キメラ遺伝子にヒストンイントロンを含めることにより、作物植物（特に、アブラナ植物）における効率的なグリホサート耐性を得るための別のアプローチが提供されている。
【００１０】
この問題は、様々な実施形態、実施例およびクレームで後述されるように解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一般に、本発明は、植物で発現可能な構成的プロモーターと置換ヒストン遺伝子のイントロン１とによって指示されるグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の発現の質と量を増大させることによってグリホサート耐性が増強された植物に関する。本発明はまた、キメラＤＮＡ分子またはキメラ遺伝子、およびグリホサート耐性植物を作製するための本発明の植物の処理方法を提供する。
【００１２】
第１の実施形態では、以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物で発現可能な構成的プロモーター；
ｂ）５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域；
ｃ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｄ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｅ）グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｆ）３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む、キメラＤＮＡ分子を含む植物を提供する。
【００１３】
本発明の別の実施形態によれば、植物で発現可能な構成的プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターを含む。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明による植物は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター配列；
ｂ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｃ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｄ）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｅ）３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む、第２のキメラＤＮＡ分子をさらに含む。
【００１５】
さらなる実施形態では、ヒストンＨ４プロモーター配列は、全長Ｈ４Ａ７４８プロモーター、より具体的には、配列番号６の位置５９６９〜６８９０由来のヌクレオチド（ｎｔ）配列を含む。
【００１６】
別の実施形態によれば、イントロン１をコードするＤＮＡ領域は、ジェンバンク受託番号Ｘ６０４２９．１またはＵ０９４５８．１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態では、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域のヌクレオチド配列は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合している。
【００１８】
さらに別の実施形態では、本発明の植物は、アブラナ属植物、より具体的には、アブラナ、さらにより具体的には、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）である。
【００１９】
本発明はまた、キメラ遺伝子を含む本発明の植物の植物細胞および種子、ならびにキメラＤＮＡ分子それ自体ならびにそれらの遺伝子を含むクローニングベクターおよび／または発現ベクターを提供する。
【００２０】
本発明はまた、ＥＰＳＰＳ阻害除草剤、より具体的には、グリホサートで植物を処理するための方法に関するものであり、ここで、前記植物は、少なくとも２．０ｋｇの活性成分／ｈａの適用に耐性があるが、明らかにより低い濃度の活性成分を適用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】パネルＡ：様々なグリホサート耐性キメラ遺伝子およびその組合せの略図。Ｐ３５Ｓ−２：ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター；ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列；ＴｐｏｔＰｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチド；２ｍＥＰＳＰＳ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子；３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’ＵＴＲ；Ｐｈ４ａ７４８−ＮａｒＩ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーターのＮａｒＩ断片；イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）１ｈ３：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）；３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’ＵＴＲ；Ｐｈ４ａ７４８：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の全長プロモーター。パネルＢ：２．０ｋｇ／ｈａの活性成分のグリホサートを噴霧して１０日後の、本明細書に記載のグリホサート耐性キメラ遺伝子を含むトランスジェニックセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）植物。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、構成的プロモーター（例えば、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター）を含むキメラ遺伝子に、植物由来の置換ヒストン遺伝子のイントロン１を含めると、そのようなイントロン配列を欠く対応するキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物と比較したとき、そのようなキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物のグリホサート耐性が著しく改善したという観察に基づいている。さらに、本発明者らは、アブラナ植物におけるコドン使用頻度に最適化されたＥＰＳＰＳコード領域を使用すると、単子葉植物に由来する同様のＥＰＳＰＳコード領域を使用した植物の場合よりも良好なグリホサート耐性が得られることを観察した。グリホサート耐性は、プロモーター（例えば、ヒストンＨ４プロモーター（Ｈ４Ａ７４８））が置換ヒストン遺伝子のイントロン１およびＥＰＳＰＳコード領域に機能的に連結されている第２のグリホサート耐性キメラ遺伝子を含めることによってさらに改善することができる。Ｈ４Ａ７４８プロモーターの切断されたＮａｒＩ断片と置換ヒストンイントロン１の組合せが、（国際公開第１９９７／００４１１４号パンフレットに記載されているような）全長Ｈ４Ａ７４８プロモータープロモーターと置換ヒストンイントロン１の組合せよりも優れていると記載された以前の観察の科学的報告（Ｃｈａｕｂｅｔ−Ｇｉｇｏｔら、２００１  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４５（１）：１７−３０）とは対照的に、全長バージョンのプロモーターは、ＥＰＳＰＳと組み合わせると、切断されたバージョンよりも良好なグリホサート耐性をそのようなキメラ分子を含む植物に付与することが驚くべきことに見出された。
【００２３】
したがって、一実施形態では、本発明は、以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物で発現可能な構成的プロモーター；
ｂ）５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域；
ｃ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｄ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｅ）グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｆ）３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む、キメラＤＮＡ分子を含むグリホサート耐性植物を提供する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「キメラＤＮＡ分子」は、様々な起源の複数の連結されたＤＮＡ断片からなるＤＮＡ分子を意味することが意図される。例として、キメラＤＮＡ分子は、植物のコード配列に連結されたウイルスプロモーターを含むことができる。キメラ遺伝子またはキメラＤＮＡ分子という用語はまた、導入遺伝子または組換えＤＮＡ分子という用語と互換的に使用される。本明細書で使用する場合、キメラ遺伝子、キメラ分子という用語は、様々なエレメントが、そもそも天然ではこの配置で見出されず、人為的に作られるかまたは人為的に作られたＤＮＡ分子を指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、記載されている特徴、整数、工程または成分の存在を言及されている通りに特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の特徴、整数、工程もしくは成分、またはそれらの群の存在または追加を除外するものではない。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に引用されたものよりも多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてもよく、すなわち、より大きい核酸またはタンパク質に組み込まれていてもよい。機能的または構造的に規定されたＤＮＡ領域を含むキメラ遺伝子は、さらなるＤＮＡ領域などを含んでいてもよい。
【００２６】
「機能的に連結された」という表現は、それらの機能を統合し、コード配列の発現を可能にするような形で、キメラ遺伝子の前記エレメントが互いに連結されていることを意味する。例として、プロモーターは、前記コード配列の転写および最終的な発現を保証することができるとき、コード配列に機能的に連結されている。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「植物で発現可能な構成的プロモーター」は、ほとんどの細胞型において（空間と時間に依存しない様式で）高レベルの発現を指示する、植物細胞および植物で機能することができるプロモーターである。例として、細菌プロモーター、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーターおよびノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーターが挙げられるが、ウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓまたは１９Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５，Ｎａｔｕｒｅ．６；３１３（６００５）：８１０−２）、キャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ；国際公開第９７／４８８１９号パンフレット）のプロモーター、サトウキビ桿菌状バドナウイルス（ＳｃＢＶ）プロモーター（Ｓａｍａｃら、２００４、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１３（４）：３４９−６１）、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）プロモーター（Ｓａｎｇｅｒら、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４（３）：４３３−４３）およびサブタレニアンクローバーウイルスプロモーターＮｏ４またはＮｏ７（国際公開第９６／０６９３２号パンフレット）も挙げられる。植物起源のプロモーターの中では、ＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニットプロモーターのプロモーター（米国特許第４９６２０２８号明細書）、トウモロコシ、イネおよびサトウキビのユビキチンプロモーター、イネのアクチン１プロモーター（Ａｃｔ−１）ならびにトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ１プロモーター（Ａｄｈ−１）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｌｅｎｓ．ｎｅｔ／ｄａｉｓｙ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／２４２．ｈｔｍｌから抜粋）について言及する。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、植物で発現可能な構成的プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、より具体的には、ヌクレオチド（ｎｔ）位置２１５５〜２５７３由来の配列番号２のヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
イントロンは、プレ−ｍＲＮＡ中には存在するが、正確なスプライシング機構によって切除された後の成熟ＲＮＡには存在しない介在配列である。イントロン介在性増強（ＩＭＥ）とも呼ばれる過程である、遺伝子発現を増強する天然イントロンの能力は、哺乳動物、昆虫、線虫および植物を含む様々な生物で知られている（国際公開第０７／０９８０４２号パンフレット、ｐ１１〜１２）。ＩＭＥは、一般に、転写産物の安定化によって遺伝子発現の増大をもたらす転写後機構として記載されている。イントロンは、プロモーターとコード配列の間に通常の配向で位置する必要がある。しかしながら、いくつかのイントロンは、翻訳に影響を及ぼし、プロモーターとしてまたは位置および配向非依存的転写エンハンサーとして機能するとも記載されている（Ｃｈａｕｂｅｔ−Ｇｉｇｏｔら、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４５（１）：１７−３０、ｐ２７−２８）。
【００３０】
そのようなイントロンを含む遺伝子の例としては、トウモロコシのスクロースシンターゼ遺伝子（Ｃｌａｎｃｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｎａｈ、２００２、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１３０（２）：９１８−２９）、トウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ−１（Ａｄｈ−１）遺伝子およびブロンズ−１遺伝子（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１（１０）：１１８３−２００；Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓら、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１５（６）：９１３−２０）、アルファルファ由来の置換ヒストンＨ３遺伝子（Ｋｅｌｅｍａｎら、２００２  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１１（１）：６９−７２）ならびにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のどれか１つの置換ヒストンＨ３（ヒストンＨ３．３様）遺伝子（Ｃｈａｕｂｅｔ−Ｇｉｇｏｔら、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４５（１）：１７−３０）が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１」は、置換ヒストンをコードする遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）中のイントロンに関する。複製ヒストンとは対照的に、置換ヒストンは、転写される遺伝子全域のヌクレオソームのクロマチン構造を修復するよう働く（Ｗａｔｅｒｂｏｒｇら、１９９３、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．５；２６８（７）：４９１２−７）。複製ヒストンは、Ｓ期の細胞におけるヌクレオソームの会合を仲介し、そのようなヒストン遺伝子の転写活性化はＳ期に制限されている（Ａｔａｎａｓｓｏｖａら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９２  ２（３）：２９１−３００）。
【００３２】
本発明の別の実施形態によれば、ヒストン置換遺伝子のイントロン１をコードするヌクレオチド配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体遺伝子またはムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）のヒストンＨ３．２遺伝子に由来する。より具体的には、イントロン１をコードするＤＮＡ領域は、ジェンバンク受託番号Ｘ６０４２９．１またはＵ０９４５８．１（参照により本明細書に組み込まれる）からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでいてもよい。より具体的には、イントロン１をコードするＤＮＡ領域は、配列番号９のｎｔ６９２〜１１００もしくはｎｔ２９８４〜３０６４または配列番号１０のｎｔ５５５〜６６８を含む。
【００３３】
本発明によれば、「ＥＰＳＰＳ」という用語は、その酵素活性が、ホスホエノールピルバート（ＰＥＰ）および３−ホスホシキマートから５−Ｏ−（１−カルボキシビニル）−３−ホスホシキマートを合成することのうちに存在する、任意の天然のまたは突然変異した５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ酵素を意味することが意図される（ＥＣ２．５．１．１９；Ｍｏｒｅｌｌら、１９６７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２：８２−９０）。特に、前記ＥＰＳＰＳ酵素は、どの種類の生物が起源であってもよい。本発明に好適なＥＰＳＰＳ酵素は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対して（特に、グリホサートに対して）耐性があるという特性も有する。
【００３４】
ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤（特に、グリホサート）に対して天然に耐性があるか、またはそのようなものとして使用される、ＥＰＳＰＳをコードする配列が知られている。例として、細菌のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｃｏｍａｉら、１９８３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２１：３７０−３７１）のＡｒｏＡ遺伝子の配列、細菌のアグロバクテリウム属の種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）のＣＰ４遺伝子の配列（国際公開第９２／０４４４９号パンフレット）、またはペチュニアのＥＰＳＰＳ（Ｓｈａｈら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１）、トマトのＥＰＳＰＳ（Ｇａｓｓｅｒら、１９８８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：４２８０−４２８９）、もしくはオシヒバ属のＥＰＳＰＳ（国際公開第０１／６６７０４号パンフレット）をコードする遺伝子の配列について言及し得る。
【００３５】
突然変異によりグリホサートに対する耐性を持つようになったＥＰＳＰＳをコードする配列も知られている。例として、突然変異したＡｒｏＡ  ＥＰＳＰＳ（Ｓｔａｌｋｅｒら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（８）：４７２４−４７２８）、または突然変異した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＳＰＳ（Ｋａｈｒｉｚｉら、２００７、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２６（１）：９５−１０４）をコードする遺伝子の配列について言及し得る。植物起源の突然変異したＥＰＳＰＳ酵素の例としては、位置８０と位置１２０の間でのアラニンからグリシンへの置換および位置１７０と位置２１０の間でのトレオニンからアラニンへの置換を含む二重突然変異体（２ｍ）ＥＰＳＰＳ（例えば、欧州特許第０２９３３５８号明細書、国際公開第９２／０６２０１号パンフレット）と、位置１０２および位置１０６にアミノ酸置換を有する様々な二重突然変異体（例えば、米国特許第６５６６５８７号明細書、国際公開第０４／０７４４４３号パンフレット）とが挙げられる。
【００３６】
グリホサートに耐性のあるＥＰＳＰＳをコードする配列としては、国際公開第２００８／１００３５３号パンフレット、国際公開第２００８／００２９６４号パンフレット、国際公開第２００８／００２９６２号パンフレット、国際公開第２００７／１４６９８０号パンフレット、国際公開第２００７／１４６７６５号パンフレット、国際公開第２００７／０８２２６９号パンフレット、国際公開第２００７／０６４８２８号パンフレットまたは国際公開第２００６／１１０５８６号パンフレットに記載されている配列がさらに挙げられる。
【００３７】
本発明の別の実施形態によれば、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子の配列は、位置１０２のトレオニンアミノ酸をイソロイシンと置換する第１の突然変異と、位置１０６のプロリンアミノ酸をセリンと置換する第２の突然変異とを含む、特許出願の欧州特許第０８３７９４４号明細書に記載されているトウモロコシＥＰＳＰＳをコードする配列であってもよい。より具体的には、前記ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域は、配列番号８のアミノ酸配列をコードする。ＥＰＳＰＳ間に、およびより特には、植物ＥＰＳＰＳ間に、強い配列相同性があるため、同じ突然変異を有するイネのＥＰＳＰＳも、特許出願の国際公開第００／６６７４６号パンフレットおよび国際公開第００／６６７４７号パンフレットに記載されている。一般に、任意のＥＰＳＰＳ、ならびにそれらをコードし、上記のトレオニン／イソロイシン突然変異およびプロリン／セリン突然変異を有する遺伝子（トウモロコシＥＰＳＰＳの位置１０２および位置１０６に対するこれらのアミノ酸の相対的な位置はどうであってもよい）を本発明において使用することができる。この原理を適用するために、当業者であれば、標準的な配列アラインメントの手法を用いて、これらの２つのアミノ酸が任意のＥＰＳＰＳ配列中で突然変異していることを容易に見出すことができるであろう。
【００３８】
様々な生物が、しばしば、同じアミノ酸をコードするいくつかのコドンのうちの１つを特に選好することがよく知られている。最適なコドンの存在は、より速い翻訳速度や高い精度を達成するのに役立ち得ると考えられる。Ｌｕｔｚら（２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２５（４）：１５８５−９０）は、コドンを最適化した細菌ｂａｒ遺伝子のタバコでの発現の増強を報告している。Ｐｅｎｇら（２００６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２５（２）：１２４−３２）は、クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来の導入遺伝子のキャノーラでの発現を、アブラナ属のコドン使用頻度に従って配列を適合させることによって改善することができることを示している。とはいえ、そのような戦略が特定の状況で機能するかどうかは依然として予測不可能である。例えば、国際公開第０８／０２４３７２号パンフレットには、バシルス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）由来のプルラナーゼコード領域のコドンを最適化しても、バシルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）でのプルラナーゼ産生は増加しないと報告されている。さらに、Ｇｒｅｇｅｒｓｅｎら（２００５、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１４（６）：８８７−９０５）には、コムギでの発現のためにＡ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）フィターゼ遺伝子のコドンを最適化しても、全体的な遺伝子発現に大した効果はなかったと記載されている。
【００３９】
しかしながら、本明細書に記載されているように、発現しようとするタンパク質をコードする配列を、過剰発現を目的とした植物のコドン使用頻度に従って最適化することにより、植物（例えば、アブラナ植物）におけるグリホサート耐性キメラ遺伝子発現のさらなる改善を達成することができる。
【００４０】
したがって、別の実施形態では、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするヌクレオチド配列は、以下の基準を満たすために、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に最適化されている：
ａ）各アミノ酸のコドン使用頻度の全体的な割合は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）で見られるような割合に相当する；
ｂ）ヌクレオチド配列は、５４％を上回るＡＴ含量を有する；
ｃ）ヌクレオチド配列は、５’もしくは３’の隠れたスプライス部位またはＡＡＧＧＴＡＡＧＴ、ＡＡＧＧＴＡＡ、ＡＧＧＴＡＡもしくはＴＧＣＡＧからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含まない；ならびに
ｄ）ヌクレオチド配列は、ポリアデニル化シグナルまたはＣＡＴＡＡＡ、ＡＡＣＣＡＡ、ＡＴＴＡＡＴ、ＡＡＡＡＴＡ、ＡＡＴＴＡＡ、ＡＡＴＡＣＡからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含まない。
【００４１】
クローニング目的で、上述の基準を依然として満たしながらも、ヌクレオチド配列を特定の制限酵素の認識配列の有無に関して修飾し得ることが当業者には明白となるであろう。
【００４２】
特定の実施形態によれば、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む。
【００４３】
上述の基準を依然として満たし、１００ｎｔ、７５ｎｔ、５０ｎｔ、４０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔ、１０ｎｔまたは５ｎｔ違いでグリホサート耐性ＥＰＳＰＳ酵素を依然としてコードしながらも、例示されたヌクレオチド配列をさらに修飾し得ることが当業者には明白となるであろう。
【００４４】
したがって、別の実施形態では、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするヌクレオチド配列は、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に最適化されている。
【００４５】
より具体的には、前記ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域は、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む。
【００４６】
別の実施形態では、本発明の植物は、機能的に連結されたそのキメラＤＮＡ分子中に、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードするＤＮＡ領域をさらに含む。
【００４７】
本明細書で使用する場合、５’ＵＴＲ（リーダー配列とも呼ばれる）は、転写開始部位とコード領域の開始コドンの間に位置する、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の特定の領域である。５’ＵＴＲは、ｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に関与する。例えば、３５Ｓ転写開始部位の下流にあるペチュニアのクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子の５’非翻訳リーダーを利用して、レポーター遺伝子発現の定常状態レベルを増大させることができる（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２１２（１）：１８２−９０）。国際公開第９５／００６７４２号パンフレットには、導入遺伝子発現を増加させるための、熱ショックタンパク質をコードする遺伝子に由来する５’非翻訳リーダー配列の使用が記載されている。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態では、５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域は、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列、より具体的には、配列番号２のｎｔ２０８６〜２１５４を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明によれば、キメラＤＮＡ分子は、トランジットペプチドまたはシグナルペプチドをコードする細胞内アドレス指定配列も含む。ＥＰＳＰＳをコードする核酸配列の上流または下流にあるそのような配列によって、前記ＥＰＳＰＳを宿主生物の細胞区画に特異的に向けることが可能になる。
【００５０】
特定の実施形態によれば、トランジットペプチドは、転写の方向に、プラスチドへのポリペプチドの輸送を指示するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の少なくとも１つのシグナルペプチド配列と、第１のシグナルペプチドがタンパク質分解酵素によって切断されたときに産生される植物遺伝子の成熟Ｎ末端部分の配列の一部と、次に、プラスチドの亜区画へのポリペプチドの輸送を指示するシグナルペプチドをコードする植物遺伝子の第２のシグナルペプチドとを含む。シグナルペプチド配列は、好ましくは、欧州特許第０５０８９０９号明細書によるリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）の小サブユニットの遺伝子に由来する。より具体的には、トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする。
【００５１】
さらに別の実施形態によれば、トランジットペプチドをコードするヌクレオチド配列も、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に最適化されており、より具体的には、配列番号１のｎｔ２１３８〜２５０９を含む。
【００５２】
本発明に従って使用することができる特定の転写終結およびポリアデニル化領域は重要ではなく、同様の効果を伴って、当技術分野で公知の任意のそのような配列を使用し得ると考えられる。非限定的な例として、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼをコードする遺伝子のｎｏｓターミネーター配列（Ｂｅｖａｎら、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１（２）；３６９−３８５）、または出願の欧州特許第０６３３３１７号明細書に記載されているようなヒストン遺伝子のｈｉｓターミネーター配列が言及されている。
【００５３】
本発明はまた、以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片；
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター配列；
ｂ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｃ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｄ）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｅ）３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む、第２のキメラＤＮＡ分子をさらに含む植物に関する。
【００５４】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子（Ｈ４Ａ７４８）のプロモーターは、Ｓ期および分裂組織に特異的なパターンで強く選択的な発現を駆動する一方、非分裂細胞では基本的発現を維持する（Ａｔａｎａｓｓｏｖａら、１９９２、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１９９２  ２（３）：２９１−３００）。しかしながら、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のどれか１つの置換ヒストンＨ３遺伝子の５’ＵＴＲイントロンをこの細胞周期依存的プロモーターに付加すると、高く、分裂組織非依存的なレポーター遺伝子発現が生じる。特に、このプロモーターの切断されたＮａｒＩ断片をイントロン１と組み合わせると、このイントロンを有する全長Ｈ４Ａ７４８プロモーターよりも３〜４倍も高いレポーター遺伝子発現レベルが芽および根で誘導される（Ｃｈａｕｂｅｔ−Ｇｉｇｏｔら、２００１  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４５（１）：１７−３０、図４）。
【００５５】
別の実施形態によれば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター配列は、全長Ｈ４Ａ７４８配列、より具体的には、配列番号６のｎｔ５９６９〜６８９０を含む。
【００５６】
さらなる実施形態では、第２のキメラＤＮＡ分子はまた、植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域と、トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域と、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域と、３’転写終結およびポリアデニル化領域とを含む。これらのＤＮＡ領域は、本出願中の別の場所に記載されているものと同様である。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明の植物は、アブラナ属植物、より好ましくは、アブラナ植物である。本明細書で使用する場合、「アブラナ」とは、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）のうちのいずれか１つの種を指す。
【００５８】
しかしながら、本明細書に記載の方法および手段は、全ての植物細胞および植物、すなわち、限定するものではないが、綿、アブラナ属野菜、アブラナ、コムギ、トウキビまたはトウモロコシ、オオムギ、アルファルファ、ラッカセイ、サンフラワー、イネ、オートムギ、サトウキビ、ダイズ、シバクサ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、サトウキビ、野菜（チコリ、レタス、トマト、ズッキーニ、ピーマン、ナス、キュウリ、メロン、タマネギ、ニラネギを含む）、タバコ、ジャガイモ、テンサイ、パパイヤ、パイナップル、マンゴー、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）をはじめとする、双子葉植物細胞と単子葉植物細胞の両方および双子葉植物と単子葉植物の両方、それだけでなく、園芸、草花栽培または林業で使用される植物（ポプラ、モミ、ユーカリなど）にも好適であると考えられることが当業者には明白となるであろう。
【００５９】
本発明によるキメラＤＮＡ分子を含む植物細胞を提供することも本発明の実施形態である。本発明のキメラＤＮＡ分子を含む植物の配偶子、種子、胚（接合胚または体細胞胚のいずれか）、子孫または交配種は、伝統的な育種方法で産生されるが、これらもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
本発明の別の目的は、本明細書に記載されるようなキメラＤＮＡ分子またはそのようなキメラＤＮＡ分子を含む、植物の形質転換用のクローニングベクターおよび／もしくは発現ベクターである。
【００６１】
本発明によるキメラＤＮＡ分子を従来の方法で単一の植物細胞の核ゲノムに安定に挿入することができ、また、そのように形質転換された植物細胞を従来の方法で用いて、グリホサート耐性が増強した形質転換植物を産生することができる。この点について、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中の、キメラＤＮＡ分子を含むＴ−ＤＮＡベクターを用いて植物細胞を形質転換し、その後、例えば、欧州特許第０１１６７１８号明細書、欧州特許第０２７０８２２号明細書、国際公開第８４／０２９１３号パンフレットおよび公開されている欧州特許出願の欧州特許第０２４２２４６号明細書ならびにＧｏｕｌｄら（１９９１、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５（２）：４２６−４３４）に記載されている手順を用いて、形質転換植物を形質転換植物細胞から再生させることができる。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介する植物形質転換用のＴ−ＤＮＡベクターの構築は当技術分野で周知である。Ｔ−ＤＮＡベクターは、欧州特許第０１２０５６１号明細書および欧州特許第０１２０５１５号明細書に記載されているようなバイナリーベクターまたはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ−プラスミドに相同組換えによって組み込むことができる、欧州特許第０１１６７１８号明細書に記載されているようなコインテグレートベクターのいずれかであってもよい。好ましいＴ−ＤＮＡベクターは、各々、Ｔ−ＤＮＡの境界配列と境界配列の間の転写されるＤＮＡ領域に機能的に連結されているかまたは少なくとも右側の境界配列の左側にあるプロモーターを含む。境界配列は、Ｇｉｅｌｅｎら（１９８４、ＥＭＢＯ  Ｊ．３（４）：８３５−４６）に記載されている。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）へのＴ−ＤＮＡベクターの導入は、既知の方法（例えば、エレクトロポレーションまたは三親接合）を用いて行なうことができる。当然ながら、他の種類のベクターを用いて、直接的な遺伝子転移（例えば、欧州特許第０２２３２４７号明細書に記載されているもの）、花粉を介する形質転換（例えば、欧州特許第０２７０３５６号明細書および国際公開第８５／０１８５６号パンフレットに記載されているもの）、プロトプラスト形質転換（例えば、米国特許第４６８４６１１号明細書に記載されているもの）、植物ＲＮＡウイルスを介する形質転換（例えば、欧州特許第００６７５５３号明細書および米国特許第４４０７９５６号明細書に記載されているもの）、リポソームを介する形質転換（例えば、米国特許第４５３６４７５号明細書に記載されているもの）、ならびに他の方法（例えば、最近記載された、トウキビ（例えば、米国特許第６１４０５５３号明細書；Ｆｒｏｍｍら、１９９０、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）．８（９）：８３３−９；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．１９９０  ２（７）：６０３−６１８）およびイネ（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、１９８９、Ｔａｎｐａｋｕｓｈｉｔｓｕ  Ｋａｋｕｓａｎ  Ｋｏｓｏ．３４（１４）：１８７３−８）の特定の系統を形質転換するための方法および一般に単子葉植物を形質転換するための方法（国際���開第９２／０９６９６号パンフレット））などの手順を用いて、植物細胞を形質転換することができる。綿の形質転換については、ＰＣＴ国際公開第００／７１７３３号パンフレットに記載されている方法が特に好ましい。イネの形質転換については、国際公開第９２／０９６９６号パンフレット、国際公開第９４／００９７７号パンフレットおよび国際公開第９５／０６７２２号パンフレットに記載されている方法を参照されたい。得られる形質転換植物を従来の植物育種スキームで用いて、グリホサート耐性が増大したより多くの形質転換植物を産生することができる。
【００６２】
別の実施形態では、ＥＰＳＰＳ阻害除草剤、より具体的には、グリホサートで本発明の植物を処理するための方法を提供する。さらにより具体的には、本方法の植物は、２．０ｋｇ／ｈａのグリホサートの適用に対して耐性がある。
【００６３】
別の実施形態では、グリホサート耐性植物を得るための本発明のキメラＤＮＡ分子の使用を提供する。
【００６４】
本発明による植物を以下の化学的化合物のうちの少なくとも１つで処理し得る。本発明による植物および種子を以下のリストから選択される化学的化合物などの化学的化合物でさらに処理し得る：
ａ．果実／野菜除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、ミトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシナート、ハロスルフロン・ゴーワン（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ  Ｇｏｗａｎ）、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム
ｂ．果実／野菜用殺虫剤：アルジカルブ、バシルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ）、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／β−シフルトリン、エスフェンバレラート、λ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナザート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、シアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロール、シフルメトフェン、シアノピラフェン、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ
ｃ．果実／野菜用殺菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、キャプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェナミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、ホルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシムメチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファナートメチル、トリフロキシストロビン
ｄ．穀物用除草剤：２．４−ｄ、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−ｅ、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−ｐ、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−ｍ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−ｎａ、フルフェナセット、フルピルスルフロン−ｍ、フルロキシピル、フルルタモン、グリホサート、ヨードスルフロン、イオキシニル、イソプロチュロン、ｍｃｐａ、メソスルフロン、メツルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロキシスラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン
ｅ．穀物用殺菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェナミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシムメチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファナートメチル、トリフロキシストロビン
ｆ．穀物用殺虫剤：ジメトアート、λ−シハルトリン、デルタメトリン、α−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロール
ｇ．トウモロコシ用除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロール、ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルフォシナート、グリホサート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン
ｈ．トウモロコシ用殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、λ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリンホス、エチプロール、シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン
ｉ．トウモロコシ用殺菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン
ｊ．イネ用除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメホン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン
ｋ．イネ用殺虫剤：ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロール
ｌ．イネ用殺菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、カルプロパミド、ジクロシメット、ジフェノコナゾール、エジフェンホス、フェリムゾン、ゲンタマイシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファナートメチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン
ｍ．綿用除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバックナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルフォシナート、フルミオキサジン、チジアズロン
ｎ．綿用殺虫剤：アセファート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、λ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、γ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、β−シフルトリン、スピロテトラマト
ｏ．クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、γ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロール
ｐ．綿用殺菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェナミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マンネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファナートメチル、トリフロキシストロビン
ｑ．ダイズ用除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロンエチル、クロランスラムメチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロール、ミトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルフォシナート
ｒ．ダイズ用殺虫剤：λ−シハロトリン、メソミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ−シハロトリンおよびλ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、β−シフルトリン
ｓ．ダイズ用殺菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マンネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファナートメチル、トリフロキシストロビン
ｔ．テンサイ用除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメサート、フェンメジファム、トリアラート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ
ｕ．テンサイ用殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、γ／λ−シハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シアキシピル、フィプロニル、カルボフラン
ｖ．キャノーラ用除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルフォシナート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリン、エタメツルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム
ｗ．キャノーラ用殺菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコートクロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファナートメチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン
ｘ．キャノーラ用殺虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、γ−シハロトリンおよびλ−シハロトリン、タウ−フルバレリアート、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン。
【００６５】
特に、アブラナ属植物を、上記のリストでキャノーラ用除草剤、キャノーラ用殺菌剤またはキャノーラ用殺虫剤として示された化合物のうちの少なくとも１つを適用することによって処理し得る。
【００６６】
本発明はさらに、グリホサート抵抗性アブラナ属植物およびその種子を産生するプロセスであって、本明細書に記載されているような１つまたは２つのキメラＤＮＡ分子を含む植物細胞から本質的になる植物を、別の植物またはそれ自身と交配する工程を含むプロセスを提供し、ここで、このプロセスは、本発明によるキメラ遺伝子を含む子孫植物もしくは種子を同定もしくは選択すること、および／または有効量のＥＰＳＰＳ阻害化合物（例えば、グリホサート）を適用すること、ならびに種子を収穫することをさらに含み得る。
【００６７】
また、本発明によるキメラ遺伝子を含むアブラナ属植物から油または種子ミールを産生する方法であって、アブラナ植物の種子から油を抽出し、処理するための当技術分野で公知の工程を含む方法を提供する。
【００６８】
本発明はまた、植物（特に、アブラナ属植物）におけるグリホサート耐性を増大させるためのプロセスであって、本出願の別の場所に記載されているようなキメラ遺伝子を含むアブラナ属植物を得る工程、および前記アブラナ属植物を野外で植える工程を含むプロセスを提供する。
【００６９】
以下の非限定的な実施例には、本発明による植物における除草剤耐性を増大させるための方法および手段が記載されている。実施例において特に明記しない限り、全ての組換えＤＮＡ技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹならびにＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＵＳＡの第１巻および第２巻に記載されているような標準的なプロトコルに従って行なわれる。植物分子研究のための標準的な材料および方法は、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）とＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＵＫによって共同出版された、Ｒ．Ｄ．Ｄ．Ｃｒｏｙ著、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）に記載されている。標準的な分子生物学の技術についての他の参考文献としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、Ｂｒｏｗｎ（１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＬａｂＦａｘ、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＵＫ）の第Ｉ巻および第ＩＩ巻が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応のための標準的な材料および方法は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（１９９５）  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（２０００）  ＰＣＲ−Ｂａｓｉｃｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｂｅｎｃｈ、初版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｇｅｒｍａｎｙに見出すことができる。
【００７０】
説明および実施例を通して、以下の配列を参照する：
配列番号１：ベクターｐＴＪＮ４７のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号２：ベクターｐＴＪＮ５０のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号３：ベクターｐＴＪＮ５１のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号４：ベクターｐＴＪＮ４８のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号５：ベクターｐＴＪＮ４９のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号６：ベクターｐＴＪＮ７５のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列
配列番号７：最適化されたトランジットペプチドＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃのアミノ酸配列
配列番号８：２ｍＥＰＳＰＳ−１Ｐａのアミノ酸配列
配列番号９：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＨ３．３様ヒストン変異体のＨ３遺伝子１およびＨ３遺伝子２のヌクレオチド配列（Ｘ６０４２９．１）
配列番号１０：ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）の栽培品種の主要なヒストンＨ３．２遺伝子のヌクレオチド配列（Ｕ０９４５８．１）
【実施例】
【００７１】
実施例１：キメラＤＮＡ分子の構築
図１Ａに、本発明によるキメラＤＮＡ分子の例を示す。これらの分子は、アセンブルすることができる唯一のコンストラクトとみなされるべきものではなく、当業者に対する例としてのみ役立つものである。
【００７２】
従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片を含む以下のＴ−ＤＮＡ発現ベクター（ｐＴＪＮ４７、ｐＴＪＮ５０、ｐＴＪＮ５１、ｐＴＪＮ４８、ｐＴＪＮ４９、ｐＴＪＮ７５）を構築した。
【００７３】
ｐＴＪＮ４７
ａ）Ｐｈ４ａ７４８−ＮａｒＩ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８、１７９−１９１）
ｂ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２５：５６９−５７４）
ｃ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６、米国特許第５，５１０，４７１号明細書）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｄ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７、国際公開第９７０４１０３号パンフレット）
ｅ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７、前掲）
【００７４】
ベクターｐＴＪＮ４７のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１に示されている。
【００７５】
ｐＴＪＮ５０
ａ）Ｐ３５Ｓ２：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーター領域を含む配列（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）
ｂ）５’ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む配列（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８）
ｃ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｄ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｅ）３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）
【００７６】
ベクターｐＴＪＮ５０のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号２に示されている。
【００７７】
ｐＴＪＮ４８
ａ）Ｐｈ４ａ７４８−ＮａｒＩ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｃ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｄ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｅ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｆ）Ｐ３５Ｓ２：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーター領域を含む配列（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）
ｇ）５’ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む配列（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８）
ｈ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｉ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｊ）３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）
【００７８】
ベクターｐＴＪＮ４８のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号３に示されている。
【００７９】
ｐＴＪＮ５１
ａ）Ｐ３５Ｓ２：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーター領域を含む配列（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）
ｂ）５’ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む配列（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８）
ｃ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｄ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｅ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｆ）３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）
【００８０】
ベクターｐＴＪＮ５１のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号４に示されている。
【００８１】
ｐＴＪＮ４９
ａ）Ｐｈ４ａ７４８−ＮａｒＩ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｃ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｄ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｅ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｆ）Ｐ３５Ｓ２：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーター領域を含む配列（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）
ｇ）５’ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む配列（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８、上掲）
ｈ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｉ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｊ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｋ）３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）
【００８２】
ベクターｐＴＪＮ４９のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号５に示されている。
【００８３】
ｐＴＪＮ７５
ａ）Ｐｈ４ａ７４８：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｃ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｄ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｅ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｆ）Ｐ３５Ｓ２：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写産物のプロモーター領域を含む配列（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）
ｇ）５’ｃａｂ２２Ｌ：ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む配列（Ｈａｒｐｓｔｅｒら、１９８８）
ｈ）イントロン１  ｈ３Ａｔ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ３．ＩＩＩ変異体の遺伝子ＩＩの第１イントロンを含む配列（Ｃｈａｕｂｅｔら、１９９２）
ｉ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｊ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｋ）３’ｎｏｓ：ｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡ由来のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら、１９８２）
【００８４】
ベクターｐＴＪＮ７５のＴ−ＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号６に示されている。
【００８５】
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン最適化は、Ｌｅｔｏ  １．０遺伝子最適化ソフトウェア（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行なった。
【００８６】
実施例２：アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介する実施例１のＴ−ＤＮＡベクターによるセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の形質転換
得られたＴ−ＤＮＡベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ（ｐＧＶ４０００）に導入し、形質転換体を、当技術分野で公知の方法に従って、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンを用いて選択した。
【００８７】
これらのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を用いて、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）の変種ＰＰＳ０２−１４４Ｂを、当技術分野で公知の方法に従って形質転換し、トランスジェニック植物をグリホサート耐性（０．４ｋｇ  ａ．ｉ．／ｈａ）について選択し、サザンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲを用いて、単一コピー数かどうかを確認した。Ｔ０植物を野生型植物と戻し交配し、得られたＴ１世代を温室でのグリホサート耐性試験に用いた。
【００８８】
実施例３：グリホサート耐性の測定
グリホサート耐性を解析するために、各々の形質転換事象について、５１個のＴ１種子を温室で播き、温室で用いられる従来の用量の５倍に相当する、２．０ｋｇ  ａ．ｉ．／ｈａの用量のグリホサートを用いて、２〜４葉期での出芽後処理を行なった。噴霧して１０日後、１つのコンストラクトにつき１つの代表的な事象の生き残った植物の写真を撮影し（図１Ａ）、生き残った集団を以下のパラメータについてスコア化した。
【００８９】
活力を評価するために、植物を１〜９の等級（ここで、１＝枯れている、３＝育ちが悪い、６＝何らかの異常な表現型および９＝活力がある）で評価した。１つのコンストラクトにつき５つの代表的な事象の平均値（Ａｖ）および標準偏差（ｓｄ）を表１に示す。
【００９０】
ＰＰＴＯＸを評価するために、植物を１〜９の等級（ここで、１＝完全に黄変している、５＝植物の５０％が黄変しているおよび９＝黄変していない）で評価した。１つのコンストラクトにつき５つの代表的な事象の平均値（Ａｖ）および標準偏差（ｓｄ）を表１に示す。
【００９１】
【表１】
2012531216.tif 000001
【００９２】
図１Ｂに示すような植物の外観を表１の値と比較したとき、活力の測定値は、グリホサート耐性のレベルと最も良く相関するように思われる。Ｐ３５Ｓ２プロモーターの制御下の２ｍＥＰＳＰＳをイントロン１ｈ３とともに含むキメラＤＮＡ分子を有するｐＴＪＮ５１植物は、活力に関して、イントロン１ｈ３を含まない類似のｐＴＪＮ５０植物よりも有意に良好なスコアを付けた。イントロン１ｈ３の導入による有意により高い活力スコアは、Ｐ３５Ｓ２プロモーターをイントロン１ｈ３とともに含むｐＴＪＮ４９植物をイントロン１ｈ３を欠くｐＴＪＮ４８植物と比較したときにも観察された。切断されたｐＨ４ａ７４８−ＮａｒＩプロモーターの制御下の２ｍＥＰＳＰＳをイントロン１ｈ３とともに含む第２のキメラＤＮＡ分子の導入は、それぞれ、この追加の分子を欠く植物であるｐＴＪＮ５０およびｐＴＪＮ５１と比較したときに、ｐＴＪＮ４８植物またはｐＴＪＮ４９植物の活力を増大させなかった。驚くべきことに、Ｐ３５Ｓ２をイントロン１ｈ３とともに含むキメラＤＮＡ分子に加えて、全長ｐＨ４ａ７４８プロモーターをイントロン１ｈ３とともに含む第２のキメラＤＮＡ分子を有するｐＴＪＮ７５植物は、第２のキメラＤＮＡ分子を含まないｐＴＪＮ５１植物と比較したとき、そしてまた、切断されたｐＨ４ａ７４８−ＮａｒＩプロモーターを含む類似の植物（ｐＴＪＮ４９）と比較したとき、より高い活力を示した。特筆すべきことに、切断されたｐＨ４ａ７４８−ＮａｒＩプロモーターの制御下の２ｍＥＰＳＰＳとイントロン１ｈ３とを含むキメラＤＮＡ分子のみを有するｐＴＪＮ４７植物は、一次形質転換体に０．４ｋｇ  ａ．ｉ．／ｈａのグリホサートを噴霧したときに種子を作らず、この切断されたｐＨ４ａ７４８−ＮａｒＩプロモーター−イントロン１ｈ３の組合せでは、適用されたグリホサート投薬量に耐えるのに十分なＥＰＳＰＳ発現が誘導されないことを示している。
【００９３】
コドンが最適化されていない２ｍＥＰＳＰＳを用いた過去の同様の実験では、０．４ｋｇ  ａ．ｉ．／ｈａのグリホサートを２回噴霧した後に、活力スコアが高くとも４．７（０．５）の、グリホサート耐性が制限された植物が得られた。
【００９４】
したがって、これらのデータは、グリホサート耐性が増大した植物を得るために、置換ヒストンＨ３イントロンを構成的３５Ｓプロモーターおよび全長Ｈ４ａ７４８プロモーターと組み合わせて用いて、グリホサート耐性ＥＰＳＰＳの定量的および定性的な発現を駆動することによりもたらされる改善を明確に示している。
【００９５】
実施例４．さらなるキメラＤＮＡ分子の構築
従来の組換えＤＮＡ技術を用いて、以下のＤＮＡ断片を機能的に連結することによって、以下のＴ−ＤＮＡ発現ベクターを構築した。
【００９６】
ｐＴＪＲ２
ａ）Ｐｈ４ａ−７４８−ＮａｒＩ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｃ）２ｍｅｐｓｐｓ：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノール−ピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｄ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
【００９７】
ｐＴＪＮ７３
ａ）Ｐｈ４ａ−７４８：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｃ）２ｍｅｐｓｐｓ−１Ｐａ：セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合させた、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノール−ピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｄ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
【００９８】
ｐＴＥＭ２
ａ）Ｐｈ４ａ−７４８：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
ｂ）ＴＰｏｔｐ  Ｃ−１Ｐｃ：Ｌｅｂｒｕｎら（１９９６）によって記載されているような、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）（サンフラワー）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、最適化されたトランジットペプチドのコード配列
ｃ）２ｍｅｐｓｐｓ：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）（Ｌｅｂｒｕｎら、１９９７）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列
ｄ）３’ｈｉｓ：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子の３’非翻訳領域を含む配列（Ｃｈａｂｏｕｔｅら、１９８７）
【００９９】
実施例５．様々なＴ−ＤＮＡベクターの形質転換効率の比較
ヒストンＨ４遺伝子の短いプロモーター領域またはその長いバージョンのどちらかを含み、かつトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（トウキビ）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子のコード配列またはセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合されているトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）の二重突然変異体５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子をコードするコードのどちらかをさらに含むＴ−ＤＮＡベクター（ｐＴＪＮ４７、ｐＴＪＲ２、ｐＴＪＮ７３またはｐＴＥＭ２）を用いて、これらのそれぞれのＴ−ＤＮＡベクターを含むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）との共栽培によって、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のプロトプラストを形質転換した。各ベクターを用いて３回の独立した実験を行なった（各実験について１０枚の選択プレート）。ｐＴＪＮ４７の場合、２回の独立した実験しか行なわなかった。０．２５ｍＭのグリホサートで選択した３週間後に、形質転換コロニーの数をカウントした。
【０１００】
【表２】
2012531216.tif 000002
【０１０１】
長いヒストンプロモーターを含むベクターと短いヒストンプロモーター含むベクターとの間に形質転換効率の明確な違いを認めることができる。
【０１０２】
実施例６：野外試験
ｐＴＪＮ４９およびｐＴＪＮ７５で形質転換したセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）株について選択された４つの最良の事象に野外試験を受けさせた。
【０１０３】
【表３】
2012531216.tif 000003
【０１０４】
【表４】
2012531216.tif 000004
【０１０５】
したがって、本発明の様々な実施形態を以下のパラグラフに見られるように要約することができる。
【０１０６】
パラグラフ１．
以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）植物で発現可能な構成的プロモーター；
ｂ）５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域；
ｃ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｄ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｅ）グリホサート耐性５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｆ）植物で機能的な３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含むキメラＤＮＡ分子を含む植物。
【０１０７】
パラグラフ２．
前記構成的プロモーターがＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターである、パラグラフ１に記載の植物。
【０１０８】
パラグラフ３．
前記構成的プロモーターが、配列番号２のｎｔ２１５５〜２５７３を含む、パラグラフ１または２に記載の植物。
【０１０９】
パラグラフ４．
前記イントロン１が、ジェンバンク受託番号Ｘ６０４２９．１またはＵ０９４５８．１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１〜３のいずれか一項に記載の植物。
【０１１０】
パラグラフ５．
前記イントロン１が、配列番号９のｎｔ６９２〜１１００もしくはｎｔ２９８４〜３０６４または配列番号１０のｎｔ５５５〜６６８を含む、パラグラフ１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【０１１１】
パラグラフ６．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）の２ｍＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１〜５のいずれか一項に記載の植物。
【０１１２】
パラグラフ７．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、パラグラフ１〜５のいずれか一項に記載の植物。
【０１１３】
パラグラフ８．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合している、パラグラフ７に記載の植物。
【０１１４】
パラグラフ９．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む、パラグラフ７または８に記載の植物。
【０１１５】
パラグラフ１０．
前記５’ＵＴＲが、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）由来のクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のリーダー配列を含む、パラグラフ１〜９のいずれか一項に記載の植物。
【０１１６】
パラグラフ１１．
前記５’ＵＴＲをコードするＤＮＡ領域が、配列番号２のｎｔ２０８６〜２１５４を含む、パラグラフ１０に記載の植物。
【０１１７】
パラグラフ１２．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、パラグラフ１〜１１のいずれか一項に記載の植物。
【０１１８】
パラグラフ１３．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、配列番号７のアミノ酸配列をコードする、パラグラフ１〜１１のいずれか一項に記載の植物。
【０１１９】
パラグラフ１４．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合している、パラグラフ１３に記載の植物。
【０１２０】
パラグラフ１５．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ２１３８〜２５０９を含む、パラグラフ１３または１４に記載の植物。
【０１２１】
パラグラフ１６．
前記３’転写終結およびポリアデニル化領域が、配列番号７のｎｔ３０７〜５７２またはｎｔ３２５２〜３９６６を含む、パラグラフ１〜１５のいずれか一項に記載の植物。
【０１２２】
パラグラフ１７．
以下の機能的に連結されたＤＮＡ断片：
ａ）シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のヒストンＨ４遺伝子のプロモーター配列；
ｂ）植物置換ヒストン遺伝子のイントロン１をコードするＤＮＡ領域；
ｃ）トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域；
ｄ）グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域；ならびに
ｅ）３’転写終結およびポリアデニル化領域
を含む第２のキメラＤＮＡ分子をさらに含む、パラグラフ１〜１６のいずれか一項に記載の植物。
【０１２３】
パラグラフ１８．
前記ヒストンＨ４プロモーター配列が、配列番号６のｎｔ５９６９〜６８９０を含む、パラグラフ１７に記載の植物。
【０１２４】
パラグラフ１９．
前記イントロン１が、ジェンバンク受託番号Ｘ６０４２９．１またはＵ０９４５８．１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、パラグラフ１７または１８に記載の植物。
【０１２５】
パラグラフ２０．
前記イントロン１が、配列番号９のｎｔ６９２〜１１００もしくはｎｔ２９８４〜３０６４または配列番号１０のｎｔ５５５〜６６８を含む、パラグラフ１７〜１９のいずれか一項に記載の植物。
【０１２６】
パラグラフ２１．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）のｄｍＥＰＳＰＳ遺伝子のコード配列を含む、パラグラフ１７〜２０のいずれか一項に記載の植物。
【０１２７】
パラグラフ２２．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号８のアミノ酸配列をコードする、パラグラフ１７〜２０のいずれか一項に記載の植物。
【０１２８】
パラグラフ２３．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合している、パラグラフ２２に記載の植物。
【０１２９】
パラグラフ２４．
前記グリホサート耐性ＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ８００〜２１３７を含む、パラグラフ２２または２３に記載の植物。
【０１３０】
パラグラフ２５．
前記トランジットペプチドをコードする配列が、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）のＲｕＢｉｓＣＯ小サブユニット遺伝子の配列を含む、パラグラフ１７〜２４のいずれか一項に記載の植物。
【０１３１】
パラグラフ２６．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、配列番号７アミノ酸配列をコードする、パラグラフ１７〜２４のいずれか一項に記載の植物。
【０１３２】
パラグラフ２７．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のコドン使用頻度に適合している、パラグラフ２６に記載の植物。
【０１３３】
パラグラフ２８．
前記トランジットペプチドをコードするＤＮＡ領域が、配列番号１のｎｔ２１３８〜２５０９を含む、パラグラフ２６または２７に記載の植物。
【０１３４】
パラグラフ２９．
前記３’転写終結およびポリアデニル化領域が、配列番号７のｎｔ３０７〜５７２またはｎｔ３２５２〜３９６６を含む、パラグラフ１７〜２８のいずれか一項に記載の植物。
【０１３５】
パラグラフ３０．
アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物であるパラグラフ１〜２９のいずれか一項に記載の植物。
【０１３６】
パラグラフ３１．
アブラナであるパラグラフ１〜３０のいずれか一項に記載の植物。
【０１３７】
パラグラフ３２．
セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、カブ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ）、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）またはカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）であるパラグラフ１〜３１のいずれか一項に記載の植物。
【０１３８】
パラグラフ３３．
パラグラフ１〜２９のいずれかに記載されているようなキメラ遺伝子を含むパラグラフ１〜３２のいずれか一項に記載の植物の植物細胞。
【０１３９】
パラグラフ３４．
パラグラフ１〜２９のいずれかに記載されているようなキメラ遺伝子を含むパラグラフ１〜３２のいずれか一項に記載の植物の種子。
【０１４０】
パラグラフ３５．
パラグラフ１〜２９のいずれか一項に記載されているようなキメラＤＮＡ分子。
【０１４１】
パラグラフ３６．
パラグラフ３５に記載のキメラＤＮＡ分子のうちの少なくとも１つを含む、植物の形質転換用のクローニングベクターおよび／または発現ベクター。
【０１４２】
パラグラフ３７．
前記植物をＥＰＳＰＳ阻害除草剤で処理することを特徴とする、パラグラフ１〜３２のいずれか一項に記載されているような植物を処理するための方法。
【０１４３】
パラグラフ３８．
前記ＥＰＳＰＳ阻害除草剤がグリホサートである、パラグラフ３７に記載の方法。
【０１４４】
パラグラフ３９．
前記植物が少なくとも２．０ｋｇ／ｈａの適用に対して耐性がある、パラグラフ３８に記載の方法。
【０１４５】
パラグラフ４０．
グリホサート耐性植物を作製するためのパラグラフ３５に記載のキメラＤＮＡ分子の使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2012531216000001.app