【手続補正書】
【提出日】平成25年10月30日(2013.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｄ）前記糖化発酵混合物中で前記原核生物エタノール産生体を培養するステップであって、前記糖化発酵混合物中の投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり、前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
【請求項２】
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる、粒度が約１００μｍ以下または粒度が約６００μｍ以上の前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記原核生物エタノール産生体を前記糖化発酵混合物中で培養するステップであって、
１）前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり；
２）前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
【請求項３】
ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマス；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素；および
ｃ）原核生物エタノール産生体
を含んでなる糖化発酵システムであって、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、前記エタノール産生体が糖化発酵混合物中で組み合わされて、総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％である、糖化発酵システム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
図９に提示する結果は、異なる微生物を用いたＳＳＦ中の４８時間目における、エタノール力価に対するＲＰＭの影響を示す。実施例１の図１にも示されるように、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｓ）ＺＷ７０５を用いたＳＳＦ中のエタノール力価は混合に対して感受性であり、１００ＲＰＭでの実施が５０ｇ／Ｌを超えるエタノール力価をもたらすのに対し、２００ＲＰＭでの実施は１０ｇ／Ｌに達しなかった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もまた混合に対して感受性であるが、Ｚ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）と同程度ではなく、１００ＲＰＭでは２００ＲＰＭよりも５０％多いエタノールを産生し（それぞれ１１．８対７．７ｇ／Ｌ）、残留グルコースがより少なくなった。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は双方の混合実施において２５〜３０ｇ／Ｌのエタノールを産生し、力価は２００ｒｐｍの実施でわずかにより高かった。したがって試験された原核生物エタノール産生体にはＲＰＭの増大は悪影響を及ぼす一方で、真菌エタノール産生体には悪影響がなかった。
本発明のその他の実施態様を例示的に以下に列挙する。
（１）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｄ）前記糖化発酵混合物中で前記原核生物エタノール産生体を培養するステップであって、前記糖化発酵混合物中の投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり、前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
（２）総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり約０．２ワット以下の出力を提供する、（１）に記載の方法。
（３）原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、（１）に記載の方法。
（４）撹拌手段が少なくとも１つのインペラを含んでなる、（１）に記載の方法。
（５）ｃ）の前記エタノール産生体が、ｂ）の前記糖化酵素の添加後、部分的糖化が起きた時に添加される、（１）に記載の方法。
（６）前処理バイオマスが、合わせて、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％の総投入不溶性固形物濃度を与える、少なくとも２つの部分として添加される、（１）に記載の方法。
（７）糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約２０％である、（１）に記載の方法。
（８）原核生物エタノール産生体が、糖化発酵混合物中の酢酸濃度に耐性である、（１）に記載の方法。
（９）バイオマスが、スイッチグラス、古紙、製紙汚泥、トウモロコシ穂軸、トウモロコシ苞葉、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦わら、干し草、大麦のわら、稲わら、サトウキビバガス、ソルガム、穀物加工から得られる構成要素、樹木、枝、根、葉、木くず、おがくず、灌木および低木、野菜、果物、花、および家畜糞尿からなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１０）前処理バイオマスが、セルロース性バイオマスをアンモニアで処理することにより生成される、（１）に記載の方法。
（１１）アンモニアが、バイオマスの乾燥質量に対して約１２質量％少ない、（１０）に記載の方法。
（１２）少なくとも１つの糖化酵素が、セルロース加水分解グリコシダーゼおよびヘミセルロース加水分解グリコシダーゼからなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（１３）少なくとも１つの糖化酵素が、酵素共同体の一員である、（１）に記載の方法。
（１４）糖化酵素共同体が、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、エンドキシラナーゼ、エキソキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、アラビノ−キシラナーゼ、マンナーゼ、ガラクターゼ、ペクチナーゼ、グルクロニダーゼ、アミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、イソアミラーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、リグニナーゼ、およびフェルロイルエステラーゼからなる群から選択される酵素を含んでなる、（１３）に記載の方法。
（１５）多糖類が、キシランおよびグルカンを含んでなる、（１）に記載の方法。
（１６）発酵性糖類が、キシロースおよびグルコースを含んでなる、（１）に記載の方法。
（１７）生成されるエタノール濃度が少なくとも約４０ｇ／Ｌである、（１）に記載の方法。
（１８）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる、粒度が約１００μｍ以下または粒度が約６００μｍ以上の前処理バイオマスを提供するステップと；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素を提供するステップと；
ｃ）原核生物エタノール産生体を提供するステップと；
ｄ）撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内で、ａ）の前記前処理バイオマス、ｂ）の前記糖化酵素、およびｃ）の前記原核生物エタノール産生体を含んでなる糖化発酵混合物を調製するステップと；
ｅ）前記原核生物エタノール産生体を前記糖化発酵混合物中で培養するステップであって、
１）前記糖化発酵混合物中の総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％であり；
２）前記原核生物エタノール産生体がエタノールを産生する、ステップと
を含んでなる、エタノールを製造する方法。
（１９）原核生物エタノール産生体（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｙ）が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される属の一員である、（１８）に記載の方法。
（２０）ａ）不溶性固形物および多糖類を含んでなる前処理バイオマス；
ｂ）多糖類を発酵性糖類に変換するための少なくとも１つの糖化酵素；および
ｃ）原核生物エタノール産生体
を含んでなる糖化発酵システムであって、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、前記エタノール産生体が糖化発酵混合物中で組み合わされて、総投入不溶性固形物濃度が、乾燥質量を基準にして１リットル当たり少なくとも約１６％である、糖化発酵システム。
（２１）（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）の前記バイオマス、前記酵素、および前記エタノール産生体が、総糖化発酵混合物１ｋｇ当たり約０．２ワット以下の出力を提供する機能的撹拌手段を含んでなるバイオリアクター内に収容される、（２０）に記載のシステム。
（２２）前記原核生物エタノール産生体が、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ザイモバクター（Ｚｙｍｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される、（２０）に記載の糖化発酵システム。