【手続補正書】
【提出日】平成25年8月21日(2013.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己発光植物を作る方法であって、
前記方法は、
（ａ）  以下の工程によって、プラスチド形質転換ベクターを準備する工程、
（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４で示されるヌクレオチド配列を有する短縮Ｐｒｒｎプロモーターを含む骨格ベクターへとＬＵＸオペロンをクローン化し、それによって、８−１０ｋｂよりも大きなベクターを生成する工程であって、前記ＬＵＸオペロンは前記短縮Ｐｒｒｎプロモーターに動作可能に連結している、工程、
（ｉｉ）別のＤＮＡ断片とのライゲーション用の消化したベクターを準備するために、制限酵素反応混合物内で、工程（ａ）の（ｉ）の８−１０ｋｂの大きさの前記ベクターを消化し、随意に、自己ライゲーションを防ぐために、消化した前記ベクターを脱リン酸化し、その後、前記制限酵素反応混合物を熱不活性化する工程、
（ｉｉｉ）ＴｒｎＩまたはＴｒｎＡ相同組換え配列を含むＤＮＡ断片と随意に１以上の所望の他のＤＮＡ断片とで、消化した前記ベクターを動作可能にライゲートするために、精製することなく、かつ、アガロースゲル上でおよび／またはカラム精製を介して、消化した前記ベクターを溶解することなく、工程（ａ）の（ｉｉ）の熱不活性化された制限酵素反応混合物を直接用いる工程であって、それによって、発現カセットを含むライゲーション産物を生成する、工程、
（ｉｖ）工程（ａ）の（ｉｉｉ）で生成された前記ライゲーション産物を、大きなＤＮＡコンストラクトの形質転換に適切な菌種へと形質転換し、陽性の形質転換体を分離する工程、および、
（ｖ）すべての所望のＤＮＡ断片が前記ライゲーション産物に動作可能に組み込まれるまで、工程（ａ）の（ｉｉ）から（ｉｖ）を繰り返す工程であって、それによって、前記プラスチド形質転換ベクターを生成する、工程と、
（ｂ）以下の工程によって、自己発光植物を生成する工程、
（ｉ）工程（ａ）の（ｉ）から（ｖ）の工程の方法によって準備された前記プラスチド形質転換ベクターを用いて植物組織を形質転換する工程であって、前記プラスチド形質転換ベクターの前記発現カセットはプラスチドゲノムのＴｒｎＩ／ＴｒｎＡ領域に組み込まれるようになる、工程
（ｉｉ）選択的な培地で工程（ｂ）の（ｉ）の形質転換した組織からトランスプラストミック植物を選択する工程、および、
（ｉｉｉ）光検出装置または写真フィルムを採用することによって、工程（ｂ）の（ｉｉ）の前記選択的な培地上で生き残る自己発光植物をさらに選択し、特徴付ける工程、
を含むことと特徴とする方法。
【請求項２】
工程（ａ）の（ｉｉｉ）の前記１以上の所望の他のＤＮＡ断片は、選別マーカーをコードするヌクレオチド配列、蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列、フラビンリダクターゼをコードするヌクレオチド配列、植物の自己発光を改善および改良するように機能する遺伝子またはヌクレオチドコード配列、および、ターミネーター配列からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の（ｉｉ）の前記選択的培地はスペクチノマイシンを含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法によって生成される自己発光植物。
【請求項５】
自己発光植物は観賞植物である、ことを特徴とする請求項４に記載の自己発光植物。
【請求項６】
前記観賞植物は、バラ、ペチュニア、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ種、カーネーション、菊、百合、ガーベラ、キンギョソウ、チューリップ、ヒナギク、グラニウム、キク属、ベゴニア、コリウス、グラジオラス、ヒエンソウ、トルコギキョウ、アヤメ、蘭、および、アルストロメリアからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項５に記載の自己発光植物。
【請求項７】
請求項５に記載の前記自己発光植物の一部分。
【請求項８】
前記自己発光植物の一部分は、細胞、挿し木、器官、および、種からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項７に記載の自己発光植物の一部分。
【請求項９】
前記器官は、胚、花粉、胚珠、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、および、葯からなる群から選択される、ことを特徴とする請求項８に記載の自己発光植物の一部分。
【請求項１０】
請求項５に記載の前記自己発光植物から生成された苗。
【請求項１１】
請求項５に記載の前記自己発光植物から生成された細胞培養物または組織培養物。
【請求項１２】
そのプラスチドがゲノム内にＬＵＸオペロンを含む、自己発光植物であって、
前記ＬＵＸオペロンは発現され、光を放ち、
前記自己発光植物の前記ＬＵＸオペロンによって放たれた光の色は、前記ＬＵＸオペロンの細菌性ルシフェラーゼによって通常放たれる自然な光の色とは異なる、ことを特徴とする、自己発光植物。
【請求項１３】
前記自己発光植物によって放たれた異なる前記光の色は、前記ＬＵＸオペロンの発現に連動した細菌の黄色蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現による、ことを特徴とする請求項１１に記載の自己発光植物。
【請求項１４】
前記自己発光植物によって放たれた異なる前記光の色は黄色である、ことを特徴とする請求項１２に記載の自己発光植物。
【請求項１５】
そのプラスチドがゲノム内にＬＵＸオペロンを含む、自己発光植物であって、
前記ＬＵＸオペロンは発現され、光を放ち、
前記自己発光植物は、前記自己発光植物を生殖不可能にする不稔オペロンまたは毒素を含む、ことを特徴とする自己発光植物。
【請求項１６】
自己発光植物であって、
ａ）第一プロモーターに発現するために動作可能に連結し、かつ、プラスチドゲノムに組み込まれる、ＬＵＸ遺伝子ＬＵＸ  Ａ、ＬＵＸ  Ｂ、ＬＵＸ  Ｃ、ＬＵＸ  Ｄ、ＬＵＸ  Ｅ、および、ＬＵＸ  Ｇのすべてではないがいずれか１つ以上を含む、第一異種ヌクレオチド配列、
ｂ）１つ以上のＬｕｘ遺伝子が前記第一異種ヌクレオチド配列にあるかどうかに依存して、必要に応じて１つ以上のＬｕｘ遺伝子を含む第二異種ヌクレオチド配列であって、第二プロモーターに発現するために動作可能に連結し、かつ、前記自己発光植物の核ゲノムに組み込まれる、第二異種ヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とする自己発光植物。
【請求項１７】
前記第一異種ヌクレオチド配列にはない前記１つ以上のＬＵＸ遺伝子によって各々コードされた１つ以上のＬＵＸタンパク質は、プラスチド運搬ペプチドを介してプラスチドを標的とする、ことを特徴とする請求項１６に記載の自己発光植物。
【請求項１８】
ベクターシステムであって、
ａ）第一のプロモーターに発現のために動作可能に連結され、プラスチドゲノムに組み込まれることが可能な、ＬＵＸ遺伝子ＬＵＸ  Ａ、ＬＵＸ  Ｂ、ＬＵＸ  Ｃ、ＬＵＸ  Ｄ、ＬＵＸ  Ｅ、および、ＬＵＸ  Ｇのすべてではないがいずれか１つ以上を含む、第一異種ヌクレオチド配列を含むプラスチド形質転換ベクターと、
ｂ）ａ）の前記プラスチド形質転換ベクターの前記第一異種ヌクレオチド配列にはない１つ以上のＬｕｘ遺伝子を含む第二異種ヌクレオチド配列を含む植物核形質転換ベクターを含み、第二異種ヌクレオチド配列は、第二プロモーターに発現するために動作可能に連結し、かつ、植物細胞核ゲノムに組み込まれることが可能である、ことを特徴とするベクターシステム。
【請求項１９】
前記第一異種ヌクレオチド配列は、ＬＵＸ  Ｂ、ＬＵＸ  Ｃ、ＬＵＸ  Ｄ、ＬＵＸ  Ｅ、および、ＬＵＸ  Ｇ遺伝子を含むか、あるいは、ＬＵＸ  Ｂ、ＬＵＸ  Ｃ、ＬＵＸ  Ｄ、および、ＬＵＸ  Ｅ遺伝子を含み、前記第二異種ヌクレオチド配列は、ＬＵＸ  Ａ遺伝子を含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の自己発光植物、または、請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項２０】
前記第二異種ヌクレオチド配列は、前記第二異種ヌクレオチド配列中に存在する前記ＬＵＸ遺伝子の各々に動作可能に連結したプラスチド標的化配列をさらに含む、ことを特徴とする請求項１６に記載の自己発光植物、または、請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項２１】
ｂ）の前記第二プロモーターは、誘導可能プロモーター、植物組織−特異的プロモーター、サーカディアンリズムプロモーター、および、構成的プロモーターからなる群から選択される、ことを特徴とする請求項１６に記載の自己発光植物、または、請求項１８に記載のベクターシステム。
【請求項２２】
前記プラスチド標的化配列は、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット運搬ペプチド（ＲｂｃＳＴＰ）である、ことを特徴とする請求項２０に記載の自己発光植物、または、ベクターシステム。