【手続補正書】
【提出日】平成25年7月25日(2013.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞。
【請求項２】
前記小胞は、
(a)  必要に応じてマレイミド機能化脂質であってもよい機能化脂質；
(b)  ホスホコリン；及び
(c)  ホスホグリセロール、
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の多層状脂質小胞。
【請求項３】
前記小胞は、作用物質を含む、請求項１又は２に記載の多層状脂質小胞。
【請求項４】
前記作用物質は、
(a)  予防薬；
(b)  治療薬；
(c)  診断薬；
(d)  抗原；
(e)  アジュバント；及び
(f)  タンパク質、
からなる群から選択される、請求項３に記載の多層状脂質小胞。
【請求項５】
前記作用物質は、
(a)  前記小胞内に封入されている；又は
(b)  前記脂質二重層間に封入されている、
請求項３又は４に記載の多層状脂質小胞。
【請求項６】
前記小胞は、
(a)  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合している；及び/又は、
(b)  ＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ及びマレイミド機能化脂質を含み、前記マレイミド機能化脂質は必要に応じてマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の多層状脂質小胞。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記多層状脂質小胞及び凍結乾燥に適した賦形剤を含み、前記賦形剤は必要に応じてショ糖を含む凍結乾燥に適した賦形剤である組成物。
【請求項９】
機能化脂質を含むリポソームを二価陽イオンに接触させて融合リポソームを形成すること；及び
前記融合リポソームを架橋剤に接触させて、脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞を形成すること、
を含む方法。
【請求項１０】
前記機能化脂質は、マレイミド機能化脂質である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記リポソームは、ホスホコリン及び／又はホスホグリセロールを含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リポソームは、マレイミド機能化脂質、ホスホコリン及びホスホグリセロールを含み、前記マレイミド機能化脂質は必要に応じてマレイミド機能化ホスホエタノールアミンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記機能化脂質は機能化ホスホエタノールアミンである、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記架橋剤は、ジチオール架橋剤又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）である、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、脂質二重層間に共有結合による架橋を有する前記多層状脂質小胞の表面にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が結合させることを含む、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記二価陽イオンは、Ca2+及び/又はMg2+であり、前記接触をすることは必要に応じて水性緩衝液中で実行される、請求項９〜１５に記載のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソームは作用物質を含み、前記作用物質は必要に応じて予防薬、治療薬、又は診断薬である、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記リポソームは４０：１０：５０のモル比のＤＯＰＣ、ＤＯＰＧ、マレイミド機能化脂質を利用して調製される、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ジチオール架橋剤とマレイミド機能化脂質とのモル比は、１：２である、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
脂質二重層間に共有結合による架橋を有する多層状脂質小胞を形成するために、機能化脂質を含む多層状脂質小胞を架橋剤に接触させることを含む方法。
【請求項２１】
共有結合により架橋した脂質二重層間を有し、有効量の作用物質を含む多層状脂質小胞を含む医薬組成物。
【請求項２２】
前記多層状脂質小胞は
(a)  生分解性脂質；
(b)  リン脂質；
(c)  ホスホコリン；
(d)  ホスホグリセロール；
(e)  ホスホエタノールアミン；及び
(f)  機能化脂質、
からなる群から選択される少なくともいずれか１つを含み、前記機能化脂質は必要に応じてマレイミド機能化脂質であり、さらに前記マレイミド機能化脂質は必要に応じてマレイミド機能化脂質ホスホエタノールアミンである、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記作用物質は、
(a)  予防薬；
(b)  治療薬；
(c)  抗原；及び
(d)  アジュバント、
からなる群から選択される少なくともいずれか１つを含む、請求項２１又は２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記多層状脂質小胞は１以上の作用物質を含み、必要に応じて２つの作用物質を含み、さらに必要に応じて抗原及びアジュバントを含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記多層状脂質小胞は、その外表面上でＰＥＧと結合する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
共有結合により架橋した脂質二重層を有し、作用物質を含む多重層脂質小胞を、in vitroで細胞に接触させることを含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
キット
本発明は、本発明の小胞を含むキットをさらに想定している。小胞は、１つ又は複数の関係する作用物質を含むことができる。キットには、小胞に取り込まれる１つ又は複数の関係する作用物質をさらに含めることができる。キットには小胞の使用指示などの書類も含めることができる。小胞は好ましくはショ糖を含有した賦形剤とともに、緩衝剤に入れて、又は凍結乾燥形態で提供することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
粒子の直径／多分散性は、これらの粒子を内部移行できる細胞タイプを決定し33、小胞壁を含む二重層の数は、小胞の安定性、及び血清の存在下でカーゴを保持／徐放する能力に影響すると予想される。これらの特性を評価し、ＩＣＭＶの形成プロセスをよりよく理解するために、合成の各ステップで生成物を特徴付けた。音波処理（ステップ（ｉ））によって形成された初期のリポソームは、約１９０ｎｍの流体力学的径を有し、サイズは、Ｍｇ２＋が媒介した小胞融合（ステップ（ｉｉ））、及びその後の二重層のＤＴＴ「ステープリング」（ステップ（ｉｉｉ））の後、約２４０ｎｍまで増加した（表２）。その結果のＩＣＭＶは、（一般的な脂質小胞又はポリマーナノ粒子の薬剤12,21と比較して）単一モードで比較的狭いサイズ分布を示し、架橋ステップ中に動的光散乱法（ＤＬＳ）又は低温電子顕微鏡検査法で粒子のバルク凝集の証拠はなかった（図２Ａ、図２Ｂ及び表２）。チオール末端ＰＥＧをＤＴＴで処理した小胞に添加すると、ＭＬＶの表面上に残っていた検出可能なマレイミド基が反応停止し、粒子の径を大幅に変化させずに、ＩＣＭＶの約２ｍｏｌ％の表面露出脂質上にＰＥＧ鎖を導入した（表２及び表示のないデータ）。４℃で、又はＰＢＳ中で３７℃で保存したＰＥＧ化ＩＣＭＶは、７日間安定したままであり、賦形剤として添加された３％ショ糖での凍結乾燥に適していたが34、このことは、長期保存状態への適合性を協調した（表２及び表示のないデータ）。最初のリポソーム、Ｍｇ２＋融合ＭＬＶ、及び最終的なＩＣＭＶを低温電子顕微鏡検査で撮像すると（図２Ａ）、ＤＴＴで架橋すると、密に積み重なって、約４〜５ｎｍの高電子密度条痕として解像された二重層から構成される厚い多層状壁を有する小胞の形成につながることが判明した。粒子当たりの二重層の中央値は４．４（四分位数間範囲［ＩＱＲ］３．３〜６．９）であり、粒子半径中央値と脂質壁の厚さとの比率は３．８（ＩＱＲ、２．４〜６．８）であった（図２Ｃ、図２Ｄ）。興味深いことに、ＩＣＭＶの大部分は同心状の二重層から構成される小胞壁を有していたが、不完全な脂質外層の形態で表面欠陥があるＩＣＭＶのわずかな例も見られた（データは表示せず）。陽イオンで媒介した融合及びＤＴＴ架橋の後に電子顕微鏡での撮像で観察された小胞の層状性増大と矛盾せず、小胞の外面に露出した脂質の画分は、バルク染料反応停止層状性検定35で測定し、合成のステップ（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）で減少した（表２）。ＤＴＴ処理後にマレイミド脂質間が架橋された化学的証拠は、ＩＣＭＶの薄層クロマトグラフィ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定で判明した（データは表示せず）。重要なことは、粒子サイズと個々の層状性分布が両方とも単モードであり、粒子の機能的特性（例えばタンパク質の放出）を歪曲するような汚染性の単層小胞は３％未満で、大きい凝集はなかったことである。ＩＣＭＶは、単核細胞及び樹状細胞によって貪食されるに違いないサイズ36、及び従来の単層又は多層状リポソームと比較してタンパク質の取り込みを安定化させる架橋多層状壁構造を有している。