【手続補正書】
【提出日】平成20年12月17日(2008.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】いかなるヨウ素製剤であれ、システインを対応するジスルフィド基に酸化する酸化剤としての役割により殺菌作用を持つが（上述作用機序１）、反面ＳＨ基を持つ生体タンパク質とも無作為的に反応することになる。尚作用機序２のＮへの反応は反応性のあるＮ末端に対してのみ起こり、塩基性のアミノ酸など反応性の高いアミノ基が存在しない限り起きにくいので、すべての生体タンパク質にヨウ素が反応するわけではない。ただ、酵素など重要な活性を持つタンパク質には塩基性アミノ酸が含まれる。結論として、ヨウ素包括体の種類などの存在状態を変えたところで、根本的な解決は困難である。そこで、基材に着目し解決を図り、より有効で安全なＰＶＰ−Ｉを含有した損傷皮膚修復用組成物を提供することが本発明の本質である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】  また、一般にクリーム（乳剤性）基材は浸透性が良く保湿性が高いが潰瘍や糜爛部には禁忌とされる。その理由は乳剤性基材には強力な合成界面活性剤が安定化のために必ずと言っていいほど加えられているからである。本剤も界面においてはもちろん界面活性剤を用いた。しかし有害な恐れのある合成界面活性剤が細胞毒性の一因なのでそれを取り除くとともにヒアルロン酸Ｎａを界面活性目的で使用する。ヒアルロン酸は糖の一種であるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルＤ−グルコサミンの結合した単位が、分岐せずに直線的に繰り返す直鎖構造を持っているので親油性がある。一方で多数の水酸基を持ち高度に親水性であり、両親媒性といえる。疎水性の部分で油脂基材の流動パラフィンやステアリン酸などと疎水結合するので界面活性効果も併せ持つ。    また、ゼラチン（新田ゼラチン製ＧＤＫ−２０）も高分子タンパク質で親水性部分と疎水性部分を併せ持つので界面活性効果を持つ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】外側が油層の乳剤型基材としたことは、ヨウ素のサイトカインや繊維芽細胞などへの直接作用を回避させるためにも必須の剤型である。また、ＰＶＰ−Ｉは強酸性であるから、長時間の皮膚への接触の場合に創傷治癒に不利とならないようにした。これらのことは、ヨウ素が人体をあまり傷害せず、結果的になるべく細菌等のみにシャープに反応するような効果を持ち、極めて画期的である。また、保湿性を向上させ創傷治癒により資するとともに使用感も向上した。かつ、乳化に際し有害な界面活性剤を用いないため、より有効で安全なＰＶＰ−Ｉを含有した損傷皮膚修復用組成物を提供することができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】  そこで、還元型ラノリンを用いた［表１］の上記組成において、重曹の量がどのくらいまでであれば、油層中の重曹が水層中に漏れることなく存在できるかを実験した。結果は、最大０．５％までは配合変化が起きずに存在するが、［００４０］の理由より実際の製剤では０．０３〜０．２％が望ましく、より好ましくは０．０５％程度が良いと考える。もちろん、外見上変化が起きていなくても、滴定に際し油層と水層を混和しなければならないので、一定以上の重層の添加をすると、製剤的に安定でも滴定した場合に2008266276.tif 000001
Ｉ２⇒２ＮａＩとなって有効ヨウ素も低下することになってしまうので、重曹の量は理論上０．２％以下となる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】当発明品（精製ラノリン使用）７ｇを精秤し、５０ｍｌ０．５％ＫＩ水溶液を加えて攪拌してほぐし、３０分後、０．０２Ｎチオ硫酸ナトリウムによる酸化還元滴定により確認試験を行なったが、製造後室温保存７ヶ月後に於いて約３％であった。このため、長期安定にやや問題が生じるため、別途乳化剤適量を添加して安定化を図ることが妥当と思われ、ＫＩ添加も検討すべきである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】そこで、１０％ＰＶＰ−Ｉ溶液で（１）クエン酸クエン酸Ｎａ緩衝液０．１％を加えたとき、（２）クエン酸クエン酸Ｎａ緩衝液０．１％とＫＩ０．７％を加えたとき、（３）ＫＩ０．７％を加えたとき、（４）何も加えなかったときでの１ヶ月後の有効ヨウ素の減少を調べた（いずれもプラスチックボトルで保存）。結果は有効ヨウ素減少率は（１）０．９６％、（２）０．０４％、（３）０％、（４）０．４７％であり、  特に緩衝液のみを加えた場合に減少率が大きいことがわかった。尚、ＰＶＰ−Ｉ純粋品であれば、ＰＶＰ−Ｉの素早い反応性を生かすために、そのまま製品化できればより望ましいと考えるが、本発明品においても長期安定性の観点から、ＫＩ添加が望ましい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】（１）発明品（製造後１ヶ月経過、成分は下記参照表２）と、（２）ＰＶＰ−Ｉシュガー先発品ユーパスタ（興和登録商標）、（３）後発品ドルミジンパスタ（岩城製薬登録商標）、（４）対象品として当発明品に準ずるがＫＩを０．７％添加したもの（組成は日局精製水５．８７％、日局グリセリン４．９０％、日局ゼラチン０．４％、ＫＩ０．７％とした以外は参照表２と同じ）及び（５）ヨウ素カデキソマーａ（カデックス  スミス＆ネヒュー登録商標）、（６）ヨウ素カデキソマーｂ（ヨードコート日本新薬登録商標）の６種類それぞれヨウ素に換算して３００ｍｇ相当を精製水１０ｍｌに溶かし、同一人同一時の便０．５ｇを混入させ放置させ大腸菌等試験液とした。［参照表２］2008266276.tif 000002
７時間後に上記試験液中に残存する大腸菌及び大腸菌群をシート培地「サニ太くん」（チッソ株式会社登録商標）にて検査した。測定方法は、シート培地上に試験液をよく攪拌した後、１ｍｌをスポイトで滴下し、カバーをして３５℃２４時間培養する。原理は大腸菌群が産生するβガラクシダーゼにより大腸菌は藍色の集落として、大腸菌群は青〜青緑に指示薬が発色する。判定は、生育コロニー数を判定する。結果は、（１）では、大腸菌コロニーは観測されず、大腸菌群コロニーは４４個であった。（４）でも大腸菌コロニーは観測されず、大腸菌群コロニーは８３個であった。（５）のカデックスで大腸菌コロニーが９９個観察され、大腸菌群コロニーは２０個観察された。それ以外では大腸菌コロニー大腸菌群コロニーとも非常に多数でコロニー同士が合体し計測不可能であった。本実施例の結果、油中水型の乳剤性基材である限りＰＶＰ−Ｉ原型のものとＫＩを添加したものとの間で、殺菌力はＰＶＰ−Ｉ原型の方がわずかに有利なだけで、ＫＩ添加をしても殺菌力にほとんど問題はないと言える。また、いずれも既存のＰＶＰ−Ｉ製剤のみならずカデキソマーヨウ素製剤と比較しても殺菌力に優れている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】乳化剤及びＫＩを加えた当発明品［参照表３］をポリプロピレンボトルに充填し、温度４０℃湿度７５％の条件で加速機に１か月保存した後、７ｇを精秤し、５０ｍｌ０．５％ＫＩ水溶液を加えて攪拌してほぐし、３０分後、０．０２Ｎチオ硫酸ナトリウムによる酸化還元滴定により確認試験を行なったが、有効ヨウ素の減少は全くなかった。水溶液を加えて攪拌する操作で、重曹や精製ラノリンが有効ヨウ素と反応する懸案事項があるものの、実際、これらの反応は常温では遅く、滴定には影響を与えていない。他方ユーパスタ後発のスクロードパスタ（共和薬品登録商標）は同様の加速試験の結果、約２．３％有効ヨウ素が減少した（共和薬品社内資料より）。［参照表３］2008266276.tif 000003
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】自己乳化型モノステアリン酸グリセリンは、Ｗ／Ｏ型乳化剤として界面活性剤中もっとも古くから用いられステアリン酸のグリセリンモノエステルに非イオン性界面活性剤を加えて親水性を増強したもので、広く乳化剤として用いられているがほとんど毒性は報告されていない。そこで、左上腕屈側にガムテープを５０回ほど「張っては剥がす」行為を繰り返して角層を破壊し，ここに自己乳化型モノステアリン酸グリセリンを塗布してテガダームで密封したが、時間を経過しても痛みは全く感じられなかった。一方毒性が報告されているポリオキシエチレンエーテルではわずかにピリピリ感を感じた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】  次に、（１）当発明品（製造後６ヶ月経過、［００５１］の（４））と、（２）ＰＶＰ−Ｉシュガー先発品ユーパスタ（興和登録商標）、（３）後発品ドルミジンパスタ（岩城製薬登録商標）、（４）対象品として３％ＰＶＰ−Ｉシュガー添加物除去品（組成はＰＶＰ−Ｉ３％、白糖７０％、グリセリン５％、マクロゴール４００  １２％、マクロゴール４０００  １０％）及び（５）ヨウ素カデキソマーａ（カデックス  スミス＆ネヒュー登録商標）、（６）ヨウ素カデキソマーｂ（ヨードコート日本新薬登録商標）の６種類それぞれヨウ素に換算して３ｍｇ相当に、ほぼ反応当量のＬ−システイン２．８ｍｇを溶かした生食７ｍｌを加えたとき、２０℃でいずれが早く、ヨウ素の消失が起きるかを、実験した。  消失時間は対象品が最も早く（約３時間４５分）、次いでユーパスタ及びドルミジンパスタが早く（約５時間１０分）、その次に、カデックス（約６時間３０分）、その次が当発明品（約７時間３０分）、最後まで残ったのはヨードコート（約１０時間）、であった。尚ヨードコートは特殊なポリマーの基材を用いている。ＰＶＰ−Ｉは同じヨウ素包括体であるヨウ素カデキソマーに比べヨウ素原子が外にむき出しになっている分、消失が早いと考えられるが、油層で覆うことにより、ヨウ素カデキソマーと同等かそれ以上に徐放性を担保できた。この実験は、ヨードホールの性質もさることながら、基材の性質も重要であることを示している。  本発明品は、油層でＳＨ基を含む多くのサイトカインなどの生体タンパク質をコーティングすることにより、急激な反応によって消失することを妨げるが、見方を変えれば乳剤性基材となった分だけ白糖の持つ内向きの浸透圧が緩やかになり、急激な水分の吸収を防ぎ、中のＰＶＰ−Ｉの流出を妨げることができると言える。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】［００３３］で、当製剤では水溶性基材に対しＰＶＰ−Ｉは２０％以上の濃度にすることにより、ＰＶＰ−Ｉを安定させている趣旨を述べたが、本発明のＰＶＰ−Ｉを含む水溶性基材（ＫＩ無添加）のみ１０ｍｌに流動パラフィン１０ｍｌを加えると、油層に移動した遊離ヨウ素は、１ヶ月間放置しても肉眼では確認できず（遊離ヨウ素が分離されると、水にほとんど溶けず、油中に移動しピンク色になる）、安定である。参考までに、３％ＰＶＰ−Ｉ水溶液（ＫＩ０．７％添加）は、７２時間後の時点で油層がピンク色に変化し、その後次第にピンク色が濃くなった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】臨床での使用成績もやや改善以上が７５％（４５／６０）であり、既存の薬剤に比べ効果が高かった。これは、本発明品を千葉県Ｅ病院において、院内製剤品として製剤し臨床成績を得たものである。  この成績は、市販品の添付文書に書かれている数字（約６５％）より若干良い程度と思われるが、同病院の患者の大半が、ベッド上での自力移動も困難な終末期でかつ複雑な基礎疾患に罹患し、褥瘡も極めて難治性で、治療半ばで他界されるケースが多いことを考えれば、実質的にはかなり優位な数字である。また、同病院ではドレッシング療法が主体であり、通常、感染がなくなれば治療法が移行するので、原則的には当発明品の役割は最終的完治までというより感染期から肉芽形成期においての治療成績であることが念頭にある。本発明品の臨床成績の詳細を表４に示す（表３還元型ラノリン使用品と精製ラノリン使用品、参照表２（ＫＩ無添加及び添加））。また表４以外の実施例を含めると、著効（著しく改善した事例）となる確率がユーパスタ２４％（２３／９６  インタビューフォームより）であるのに対し、当発明品の◎の評価は（表３還元型ラノリン使用品と精製ラノリン使用品、参照表２（ＫＩ無添加及び添加）及び参照表３）、４５％（４４／９７）であった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】当発明品の製剤上の工夫により、外側の油層は細胞から放出されたサイトカインをコーティングする形になるので、強酸性のＰＶＰ−Ｉによる細胞の刺激と遊離ヨウ素によるサイトカインの持つＳＨ基の酸化などの変性を防ぐことができるのではないかという仮説を実証すべく、本発明品（組成は［００４７］精製ラノリン使用）使用中の患者から、実際に滲出液を採取し、ＳＨ基を持つｂ−ＦＧＦ（［非特許文献７］動脈硬化２３（１１）：６７３−６７７，１９９６；ｂ−ＦＧＦにおいては４つのシステインが存在しこのうちＣｙｓ−２５とＣｙｓ−９２とは他のＦＧＦファミリーメンバーにも保存されているため、これらシステインが分子内Ｓ−Ｓ結合に関わっていると想定されていたが、三次元構造の解析からは否定された）のたんぱく量当たりの含量を定量した［表５］。実験方法は滲出液を採取した試験管にＰＢＳ（リン酸緩衝液）３５０μＬ添加し、希釈混和したものを測定試料とした。各サイトカインは酵素免疫測定法で測定した。これは、特定のサイトカインのみを感知する抗体を標的（＝活性のある官能基）に吸着させ、不純物を洗い落とした後にそのサイトカインを測定する。ｂ−ＦＧＦにおける活性のある官能基にはＳＨ基のほか、活性のあるアミノ基もあると考えられるが、いずれにしてもヨウ素と反応性のある基である。タンパク質量はＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。実験結果は、本発明品がｂ−ＦＧＦを少なくとも不活性化させていないことを表している。当発明品使用に際し、洗浄に１０％ＰＶＰ−Ｉ液（ネグミン液  メルクホエイ登録商標）原液を併用した群（１名１部位延べ２回採取）としなかった群（７名１０部位延べ１４回採取、一部消毒使用した可能性あり）及びユーパスタ使用群（１名１部位延べ４回採取）、ゲーベン軟膏（スルファジアジン銀、三菱ウェルファーマ登録商標）使用群（２名２部位延べ４回採取）、さらにラップ療法により全く薬剤を用いていない群（７名１１部位延べ２０回採取）の滲出液から採取したｂ−ＦＧＦ値比較の実施例を以下に示す（同一患部が多使用群にまたがる）。もちろん個人差や他の因子があるものの、明らかに、当発明品のｂ−ＦＧＦに与える影響は極めて小さいと考えられる一方、ネグミン液やユーパスタなどの薬剤によりＰＶＰ−Ｉが直接創部に触れる影響が大きく、当発明品を使用し消毒を併用しなかったと思われる（生理食塩水で洗浄）群は消毒を併用した群や他の薬剤を併用した群に比べｂ−ＦＧＦが維持されていると考えられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【表５】
2008266276.tif 000004
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】［００６１］のうちの二人をモニタリングした結果、症例２では、３月８日以来使用し続けていたが、創の大きさも３月１０日の１６．５×８ｃｍから、７月１日では１４×６ｃｍに縮小し、壊死組織もほぼ消滅した。いずれの症例でも、少なくともｂ−ＦＧＦ消失は認められず、本発明品においては、ヨウ素による直接的不活性化を回避できていると考えられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【表６】
2008266276.tif 000005
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】実際の臨床例において、ユーパスタ（興和登録商標）使用後に当発明品（組成は［参照表２］を同一患者同一部位に使用し、ｂ−ＦＧＦの量と創の様子を観察したところ、ユーパスタ使用時よりも当発明品使用時の方が、相対的にｂ−ＦＧＦの量が高く、創の色も赤みが多くなり、良性の肉芽が形成され、創の大きさもかなり縮小した（［表７参照］）。本発明を整理すると、水中での溶解が遅い本発明による油中水型の乳剤性基材のＰＶＰ−Ｉシュガーが、生体タンパク質を保護しながらも水溶性基材に比べ殺菌力がむしろ優れる理由は、［００２３］でも仮説的に論じたように、油層が外側にあることにより疎水性のたんぱく質同士が油層表面に凝集しやすくなり、ヨウ素からの攻撃を受けにくくなる一方、基本的に好気的な病原菌は油層中では生体を維持しにくく、浸透圧により水層に吸引する白糖と基材の性質（乳剤性基材となった分だけ白糖の持つ内向きの浸透圧が緩やかになっている）のみならず、特に鞭毛を持つ大腸菌が水層に能動的に流入することが考えられるからである。また、［００４４］で述べたように、当然のことながら顕微鏡で見ると水溶性基材に比べ、白糖の周りのＰＶＰ−Ｉ密度が濃くなっているため、他剤に比べより効率的に殺菌ができると考えられる。  本発明の最も重要なコンセプトは、［請求項１］にあるように、有効成分が、白糖とＰＶＰ−Ｉを含有する油中水型の乳剤性基材である組成物であることであり、［請求項２］［請求項３］の組成の内容が異なっている場合であっても、また結局は、ＫＩや緩衝液や界面活性剤（強い毒性が報告されるものを除く）の添加の有無にあまり関係なく、細胞毒性や組織障害性が極力なく殺菌力のある外用剤という発明の主要な目的を果たすことができる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【表７】
2008266276.tif 000006