【手続補正書】
【提出日】平成21年11月5日(2009.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（ａ）及び（ｃ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
［（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程。］
［（ｃ）前記工程（ａ）を経て前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有する反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記機能性分子含有シリカ粒子の表面上に形成する工程。］
【請求項２】
前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の製造方法によって得られたシリカナノ粒子であって、
該シリカナノ粒子は、前記工程（ａ）で調製されたコアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子の部分と、前記工程（ｃ）で調製された最も外側の前記シリカのシェル層とを有し、
該シリカのシェル層は前記工程（ａ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して２０質量部以下の前記機能性分子しか含有しないか、あるいは前記機能性分子を含有しないことを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項４】
前記機能性分子含有シリカ粒子に含まれる機能性分子は、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、はｐＨ感受性色素分子から選ばれる少なくとも１つである請求項３に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項５】
平均粒径が２０〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする請求項３又は４に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を含有する標識試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
上記課題は下記の手段により達成された。
（１）次の工程（ａ）及び（ｂ）を含んでなることを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
［（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させ、機能性分子含有シリカ粒子を調製する工程。］
［（ｃ）前記工程（ａ）を経て前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有する反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換した後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、前記工程（ａ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下の前記機能性分子を含有するあるいは前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層を前記機能性分子含有シリカ粒子の表面上に形成する工程。］

【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（２）前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が、３−アミノプロピルトリエトキシシランのアミノ基と機能性分子のカルボキシル基とをペプチド結合により連結させた化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法。
（３）（１）又は（２）に記載の製造方法によって得られたシリカナノ粒子であって、
該シリカナノ粒子は、前記工程（ａ）で調製されたコアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子の部分と、前記工程（ｃ）で調製された最も外側の前記シリカのシェル層とを有し、
該シリカのシェル層は前記工程（ａ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して２０質量部以下の前記機能性分子しか含有しないか、あるいは前記機能性分子を含有しないことを特徴とする積層構造のシリカナノ粒子。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
（４）前記機能性分子含有シリカ粒子に含まれる機能性分子は、蛍光色素分子、吸光色素分子、磁性分子、放射線標識分子、はｐＨ感受性色素分子から選ばれる少なくとも１つである（３）に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
（５）平均粒径が２０〜５００ｎｍであり、かつ変動係数が１５％以下であることを特徴とする（３）又は（４）に記載の積層構造のシリカナノ粒子。
（６）（３）〜（５）のいずれか１項に記載の積層構造のシリカナノ粒子を含有する標識試薬。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】図１は、０層（対照）、１層、２層、３層のシリカ層を形成してなるシリカナノ粒子それぞれの蛍光強度を示す図である。
【図２】図２は、実施例１で得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図３】図３は、比較試験で得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す図である。
【図４】図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離色素の蛍光強度のグラフを示す図である。
【図５】図５は、実施例４の分子認識試験に用いたストリップの平面図である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
まず、本発明の積層構造のシリカナノ粒子の製造方法（以下、単に「本発明の製造方法」という。）について説明する。
本発明の製造方法は、次の工程（ａ）及び（ｃ）を含んでなる。
（ａ）機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物をテトラアルコキシシランとともにアンモニア水含有溶媒中で加水分解した後、加水分解物を縮重合させシロキサン結合を形成させることにより、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物に由来する機能性分子結合オルガノシロキサン成分を含有するコアとなるシリカ粒子（以下、「機能性分子含有シリカ粒子」という。）を調製する工程。
参考工程
（ｂ）前記工程（ａ）により前記コアとなる前記機能性分子含有シリカ粒子を調製した後に、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物が残存する前記アンモニア水含有溶媒に前記テトラアルコキシシランをさらに含有させ、加水分解と縮重合とによるシロキサン結合形成により、前記機能性分子を含有するシリカの層を前記シリカ粒子の表面上に形成し、調製されるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量を増大する工程。なお、本明細書において以下工程（ｂ）について記載する箇所があるが、それらは参考としての説明である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
（ｃ）前記工程（ａ）の反応液を、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を含有しない新たなアンモニア水含有溶媒を用いて溶媒置換処理し上記調製されたシリカ粒子を再分散させた後、テトラアルコキシシランをさらに含有させ加水分解と縮重合とにより、シリカのシェル層を前記シリカ粒子の表面上に形成する工程。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
前記参考工程（ｂ）を、２回以上繰り返すことにより、得られるシリカ粒子１個当たりの前記機能性分子の含有量をさらに増大させることが好ましい。ただし前記工程（ｂ）を何度も繰り返すのは煩雑であり、またそれによって合成されるシリカ粒子の粒度分布が広くなるという弊害もあることから、前記工程（ｂ）の繰り返し回数をいくらでも多くすればよいというわけではない。実際には、前記コアとなる前記シリカ粒子の表面上に１〜６層の前記機能性分子を含有するシリカの層を形成するために、前記工程（ｂ）を１〜６回行うことが好ましい。
前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物は、互いに反応して結合を形成する活性部位を持つ機能性分子とオルガノアルコキシシランとを反応させることで得ることができる。例えば、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）のアミノ基と機能性分子が持つカルボキシル基を脱水縮合させてペプチド結合を形成させる手法がある。カルボキシル基とスクシンイミドを縮合させたＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を持つ機能性分子であれば、ＡＰＳと混合させるだけでアミノ基と反応してペプチド結合でつながれた機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物を得ることができ、好ましい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明の積層構造のシリカナノ粒子は、前述のようにアルカリ溶液耐性を付与する観点から、最も外側のシリカの層が、前記工程（ｃ）により形成された前記機能性分子を含有しないシリカのシェル層である（ただし、前述のようにシェル層は、前記工程（ａ）により調製された前記機能性分子含有シリカ粒子に含有される前記機能性分子１００質量部に対して、２０質量部以下（好ましくは１５質量部以下）の前記機能性分子を含有していてもよい。）。前記機能性分子を含有しない純粋なシリカのシェル層でもゆっくりではあるがアルカリ溶液によって溶かされていく。そのため、前記シェル層が厚いほど長時間、もしくは強いアルカリ溶液に耐えることができる。最も外側の前記機能性分子を含有しないシェル層の厚みは、前述のアルカリ溶液耐性を付与する観点から、７ｎｍ以上が好ましく、１０ｎｍ以上がより好ましく、１０〜２０ｎｍがさらに好ましい。前記シェル層が厚くなるとシリカ粒子の重量が増大し、それによりコロイド重量あたりの蛍光強度が減少することになる。そのため、コロイド重量あたりの蛍光強度を高くするには必要なアルカリ溶液耐性が得られる範囲で前記シェル層を極力薄くすることが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１（積層構造のシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
１４質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈しアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを、前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温（２５℃）にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシフルオレセイン‐ＡＰＳは下記式で表され、前記カルボキシフルオレセイン−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
参考例２（積層構造の吸光型シリカナノ粒子の調製）
１．工程（ａ）
色素を高濃度に含有する吸光型シリカコロイドを合成すべく、２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈してアンモニア水含有溶媒１００ｍｌとし、その中に０．５体積％となる体積５００μｌのＴＥＯＳを前記ＴＥＯＳと同体積のカルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳのＤＭＦ溶液を、それぞれ、添加して室温にて撹拌した。
ここで、前記機能性分子結合オルガノアルコキシシラン化合物としての前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳは下記式で表され、前記５−カルボキシＴＡＭＲＡ−ＮＨＳエステルとＡＰＳとを反応させたものを用いた。前記ＤＭＦ溶液は４０ｍＭの濃度に調整したものを用いた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
２．工程（ｂ）
参考例１の工程（ｂ）と同様な操作によりＴＥＯＳを追加投入し反応させ、反応終了後、参考例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、１層のシリカ層を有するシリカナノ粒子を得た（平均粒径８７ｎｍ）。得られたシリカ粒子を参考例２のシリカナノ粒子とする。
溶液中に前記カルボキシＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳが残存する状態で反応させ、シェルを形成しているので、シェル層の表面近傍ないしは表面にも多くの色素が結合していた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
実施例１（機能性分子脱離防止用シェル層を有するシリカナノ粒子の調製）
１．工程（ｃ）
参考例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、工程（ｂ）を行うことなく、アルカリ水溶液耐性を付与するための前記ＴＡＭＲＡを含有しないシェル層を形成するため、以下の工程（ｃ）に供した。
工程（ａ）終了後、得られたシリカ粒子を前記洗浄操作に供することなく、前記ＴＡＭＲＡ‐ＡＰＳを含有しない新たなアンモニア水含有溶媒で溶媒置換処理を行った。具体的には、１，０００×ｇ、１０分の条件で遠心分離により粒子を沈降させた後、直ちに上清液を除去後、得られた沈殿物を２質量％のアンモニア水をさらにエタノールで５倍に希釈して得た新たなアンモニア水含有溶媒１００ｍｌに再分散させ溶媒置換した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
次に、工程（ａ）における投入量と等量のＴＥＯＳを投入し室温２時間反応させ、反応終了後、参考例１と同様な洗浄操作を行った。その結果、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素をほとんど含有しない１層のシリカのシェル層を有するシリカナノ粒子を得た（収量１７０ｍｇ分；コロイド乾燥重量、収率６３％）。得られたシリカ粒子を実施例１のシリカナノ粒子とする。
図２に得られたシリカナノ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図２中のスケールバーは６００ｎｍを示す（倍率５万倍）。図中、白く見える球状物質が、得られた積層構造のシリカナノ粒子である。粒子同士が融合するような不具合が生じていないことがわかる。
ＳＥＭ画像に写っている各粒子（２００個以上）の直径を測定し、その粒度分布を算出したところ、変動係数１４．７％で平均粒径８８ｎｍであった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
２．比較試験
参考例２の工程（ａ）と同様な操作により得たシリカ粒子を、アルカリ水溶液耐性を付与するシェル層を形成するための前記工程（ｃ）に供する前に、参考例１と同様な洗浄操作を行った後、工程（ｃ）を行うことを試みた。
工程（ａ）終了後、参考例１と同様な洗浄操作を行ったシリカ粒子を再度シリカ粒子合成液に分散させて新たにＴＥＯＳを投入したところ、反応に供したシリカ粒子同士が融合してしまった。
図３に得られたシリカ粒子のＳＥＭ画像を示す。なお、図３中のスケールバーは１．０μｍを示す（倍率３万倍）。図中、白く見える物質が、得られたシリカ粒子である。図３から明らかなように、粒子の多くがいびつな形状をしており、反応に供したシリカ粒子同士の融合が頻繁に発生したことがわかる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
３．アンモニア水溶液によるエッチング試験
前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する参考例２のシリカナノ粒子、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例１のシリカナノ粒子を、それぞれ、２．８質量％のアンモニア水溶液中に分散させ、アンモニア水溶液によるエッチング試験を行い、アルカリ水溶液に対する耐性を評価した。
色素の脱離量は、遠心分離によって前記アンモニア水溶液からシリカ粒子を除去した残りの溶媒を回収し、その中に遊離している色素がシリカ粒子から脱離した色素とみなし、その蛍光強度を測定することで、その評価を行った。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
図４は、エッチング処理１時間後、２時間後それぞれの脱離カルボキシＴＡＭＲＡ色素による蛍光強度のグラフを示す図である。図４から明らかなように、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有する１層のシリカ層を有する参考例２のシリカナノ粒子については、１時間後には、蛍光強度にして４０００ａｕ以上の大量の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素がシリカ粒子から脱離してしまったことがわかる。２時間後にも同様に約１８０００ａｕの蛍光強度が検出され、大量の脱離が起こっていることがわかる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
一方、前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素を含有しない１層のシリカのシェル層を有する実施例１のシリカナノ粒子については、１時間後の前記カルボキシＴＡＭＲＡ色素の脱離量は、蛍光強度にして５００ａｕ未満の僅かな量にとどまったことがわかる。
参考例２のシリカナノ粒子の結果との比較から、実施例１のシリカナノ粒子についてはアルカリ溶液に対して耐性があるといえる。
２時間後についてはアンモニア水溶液中に約１４０００ａｕの蛍光強度が検出されたが、前記シェル層を越えてエッチングが進行したため、工程（ａ）で得られた粒子のコア部分から脱離したといえる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
参考例３
（積層構造のシリカナノ粒子のコロイドへの抗体の吸着）
遠心管に５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ６．５）を１ｍＬと、参考例２の積層構造のシリカナノ粒子のコロイド（１０ｍｇ／ｍＬ）９ｍＬを加えて軽く撹拌した。遠心管に抗ｈＣＧ抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ  ｃｌｏｎｅ  ｃｏｄｅｓ／５００８，  Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）１ｍＬ（６０μｇ／ｍＬ）を撹拌しながら加え、室温で１時間静置した。これに１質量％のＰＥＧ（ポリエチレングリコール、分子量２００００、和光純薬工業社製）を０．５５ｍＬ加え軽く撹拌し、更に１０％ＢＳＡを１．１ｍＬ加え軽く撹拌した。
混合液を１２，０００×Ｇで１５分間遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。この分散液に保存用バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．２），  ０．０５％  ＰＥＧ２０，０００，  １％ＢＳＡ，  ０．１％ＮａＮ３）を２０ｍＬ加え、再度遠心分離し、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた（コロイドＡ）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2009222718.tif 000001