【手続補正書】
【提出日】平成25年10月16日(2013.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞を生成するための方法であって、該方法は：
ａ）凝集物形成を促進する条件下で懸濁培養物中の選択された細胞クローンからの多能性幹細胞をインキュベートするステップと、
ｂ）選択されたバッチの培養培地から調製される心臓分化培地中で該幹細胞を心筋細胞に分化させるステップと
を含み、該培養培地中の１つまたは複数の分化因子のレベルを、該選択された細胞クローンの心臓分化および採用される培養培地バッチに好適であると決定された量に調整することによって、該分化培地は該培養培地から調製された、方法。
【請求項２】
前記選択された細胞クローンが人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞クローンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択された細胞クローンが接着培養物中の単一の多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞増殖を促進する条件下で、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む培地中で前記単一の多能性幹細胞をインキュベートすることを含むプロセスによって、前記選択された細胞クローンが単一の多能性幹細胞に由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約１０６個から約１０１０個の前記多能性幹細胞をステップａ）における前記懸濁培養物中で最初にインキュベートする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
凝集物形成を促進する前記条件が、外部から添加されるＲＯＣＫ阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ミオシンＩＩ阻害剤がブレビスタチンである、請求項４または６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
心臓分化の前に前記多能性幹細胞から形成された前記凝集物が直径約１０ｎｍから４００μｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞に分化させるための前記懸濁培養物が５ミリリットルから２５リットルまでの体積を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞および／または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞が１つまたは複数の導入遺伝子を含有している、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の導入遺伝子が、心筋細胞特異的なプロモーターの制御下の選択マーカーおよび／またはスクリーニング可能マーカーをコードしている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分化した前記心筋細胞を富化または精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記心臓分化培地が、５ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの量の外部から添加された線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記懸濁培養物が約１５ｒｐｍから１００ｒｐｍの速度で回転または振盪される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養培地が、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、ＲＰＭＩ培地、補充ＤＭＥＭ−Ｆ１２またはその希釈物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地中でそのレベルが調整されている前記分化因子が、骨形成タンパク質、アクチビンＡ／ノーダル、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ディックコップホモログ１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のシグナル伝達経路のモジュレーターの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化因子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ１０、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、アクチビンシグナル伝達阻害剤、またはこれらの組合せを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＢＭＰシグナル伝達阻害剤がドルソモルフィンを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アクチビンＡシグナル伝達阻害剤がＳＢ４３１５４２を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも９９％の心筋細胞を含む、約５×１０８から１０１０細胞の単離された細胞集団。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の他の目的、特徴、および利点は以下の発明を実施するための形態から明らかになるであろう。しかし、この発明を実施するための形態から本発明の精神および範囲内で様々な変更および改変が当業者には明らかになるので、発明を実施するための形態および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、例示のみによって示されることを理解されたい。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
心筋細胞の生成を増大するための方法であって、該方法は：
ａ）凝集物形成を促進する条件下で懸濁培養物中の選択された細胞クローンからの多能性幹細胞をインキュベートするステップと、
ｂ）選択されたバッチの培養培地から調製される心臓分化培地中で該幹細胞を心筋細胞に分化させるステップと
を含み、該培養培地中の１つまたは複数の分化因子のレベルを、該選択された細胞クローンの心臓分化および採用される培養培地バッチに好適であると決定された量に調整することによって、該分化培地は該培養培地から調製された、方法。
（項目２）
前記選択された細胞クローンが人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞クローンである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記選択された細胞クローンが接着培養物中の単一の多能性幹細胞に由来する、項目１に記載の方法。
（項目４）
細胞増殖を促進する条件下で、Ｒｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤を含む培地中で前記単一の多能性幹細胞をインキュベートすることを含むプロセスによって、前記選択された細胞クローンが単一の多能性幹細胞に由来する、項目３に記載の方法。
（項目５）
約１０６個から約１０１０個の前記多能性幹細胞をステップａ）における前記懸濁培養物中で最初にインキュベートする、項目１に記載の方法。
（項目６）
凝集物形成を促進する前記条件が、外部から添加されるＲＯＣＫ阻害剤、ミオシンＩＩ阻害剤、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、または肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ミオシンＩＩ阻害剤がブレビスタチンである、項目４または６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
心臓分化の前に前記多能性幹細胞から形成された前記凝集物が直径約１０ｎｍから４００μｍである、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記幹細胞に分化させるための前記懸濁培養物が５ミリリットルから２５リットルまでの体積を有する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記多能性幹細胞および／または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞が１つまたは複数の導入遺伝子を含有している、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記１つまたは複数の導入遺伝子が、心筋細胞特異的なプロモーターの制御下の選択マーカーおよび／またはスクリーニング可能マーカーをコードしている、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
分化した前記心筋細胞を富化または精製するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記心臓分化培地が、５ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの量の外部から添加された線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記懸濁培養物が約１５ｒｐｍから１００ｒｐｍの速度で回転または振盪される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記培養培地が、ＴｅＳＲ、ｍＴｅＳＲ、ＲＰＭＩ培地、補充ＤＭＥＭ−Ｆ１２またはその希釈物である、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記培養培地中でそのレベルが調整されている前記分化因子が、骨形成タンパク質、アクチビンＡ／ノーダル、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ディックコップホモログ１（ＤＫＫ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、および／または上皮増殖因子（ＥＧＦ）のシグナル伝達経路のモジュレーターの１つまたは複数を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記分化因子が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ１０、アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、アクチビンシグナル伝達阻害剤、またはこれらの組合せを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＢＭＰシグナル伝達阻害剤がドルソモルフィンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記アクチビンＡシグナル伝達阻害剤がＳＢ４３１５４２を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
少なくとも９９％の心筋細胞を含む、約５×１０８から１０１０細胞の単離された細胞集団。