【手続補正書】
【提出日】平成25年5月27日(2013.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養のためのマイクロキャリアであって、
（ｉ）ヒドロキシル基を有する親水性（メタ）アクリレートモノマーまたはヒドロキシル基を有する親水性（メタ）アクリルアミドモノマーから選択されるヒドロキシル基を有する非荷電性の親水性不飽和モノマー、
（ｉｉ）アクリル酸２−カルボキシエチルを含む親水性のカルボン酸含有不飽和モノマー、および
（ｉｉｉ）親水性の多官能性（メタ）アクリレートモノマーまたは親水性の多官能性（メタ）アクリルアミドモノマーから選択される第１の親水性の多官能性不飽和モノマー
を含む、モノマーの混合物の共重合から形成されたポリマー性マイクロキャリアベースと、
前記マイクロキャリアベースに共役したＲＧＤ配列を含むポリペプチドと
を備え、
前記マイクロキャリアベースが７５％を超える平衡含水率を有する、
マイクロキャリア。
【請求項２】
前記モノマーの混合物が、
（ｉ）３０〜７０重量部の、前記ヒドロキシル基を有する非荷電性の親水性不飽和モノマー；
（ｉｉ）２０〜６０重量部の、前記親水性のカルボン酸含有不飽和モノマー；および
（ｉｉｉ）１〜１５重量部の、前記第１の親水性の多官能性不飽和モノマー
を含むことを特徴とする請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項３】
前記ヒドロキシル基を有する非荷電性の親水性不飽和モノマーが、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に従ったモノマーであることを特徴とする請求項１または２記載のマイクロキャリア：
【化１】
2012527902.tif 000001
ここで、ＡはＨまたはメチルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ６の直鎖または分岐鎖アルコールまたはエーテルであるか；あるいは
【化２】
2012527902.tif 000002
ここで、ＡはＨまたはメチルであり、Ｂは、Ｃ１−Ｃ６の直鎖または分岐鎖アルコールまたはエーテルである。
【請求項４】
前記ヒドロキシル基を有する非荷電性の親水性不飽和モノマーが、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、アクリル酸２−ヒドロキシエチル、メタクリル酸グリセロール、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸４−ヒドロキシブチル、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、およびＮ−ヒドロキシエチルアクリルアミドからなる群より選択されることを特徴とする請求項１または２記載のマイクロキャリア。
【請求項５】
前記第１の親水性の多官能性不飽和モノマーが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリグリセロールジアクリレート、プロピレングリコールグリセロレートジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、およびグリセリン１，３−ジグリセロレートジアクリレートからなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載のマイクロキャリア。
【請求項６】
前記モノマーの混合物が、多官能性の不飽和（メタ）アクリレートモノマーまたは多官能性の不飽和（メタ）アクリルアミドモノマーから選択される第２の多官能性の不飽和モノマーをさらに含むことを特徴とする請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項７】
前記第２の多官能性の不飽和モノマーが、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートであることを特徴とする請求項６記載のマイクロキャリア。
【請求項８】
前記マイクロキャリアが、マイクロキャリアベース１ミリグラムあたり１００ｎｍｏｌを超える共役ポリペプチドを有することを特徴とする請求項１記載のマイクロキャリア。
【請求項９】
ヒト胚幹細胞を培養する方法であって、
前記細胞を、請求項１〜８いずれか１項記載のマイクロキャリアを有する細胞培養培地と接触させ；
前記細胞を、前記培地中で培養する、
各工程を有してなる方法。
【請求項１０】
前記マイクロキャリアベースが、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、２−カルボキシエチルメタクリレート、および（ｉ）メチレンビスアクリルアミドまたは（ｉｉ）ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミドを含むモノマーの混合物から形成され、
前記モノマーの混合物が、
（ｉ）３０〜７０重量部の前記メタクリル酸２−ヒドロキシエチル；
（ｉｉ）２０〜６０重量部の前記２−カルボキシエチルメタクリレート；および
（ｉｉｉ）１〜１５重量部のメチレンビスアクリルアミドまたはジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド
を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
ここで、Ａは水素またはメチルであり、Ｄは、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換されたＣ１−Ｃ６の直鎖または分岐鎖アルキルである。第７の態様では、親水性のカルボン酸含有不飽和モノマーが、２−カルボキシエチルメタクリレート、アクリル酸２−カルボキシエチル、アクリル酸、メタクリル酸、２−カルボキシエチルアクリルアミド、およびアクリルアミドグリコール酸からなる群より選択される、態様１〜５のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第８の態様では、親水性のカルボン酸含有不飽和モノマーが２−カルボキシエチルメタクリレートである、態様１〜５のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第９の態様では、第１の親水性の多官能性不飽和モノマーが、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−（１，２−ジヒドロキシエチレン）ビスアクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリグリセロールジアクリレート、プロピレングリコールグリセロレートジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレートトリアクリレート、およびグリセリン１，３−ジグリセロレートジアクリレートからなる群より選択される、態様１〜８のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１０の態様では、第１の親水性の多官能性不飽和モノマーが、メチレンビスアクリルアミドおよびジヒドロキシエチレンビスアクリルアミドからなる群より選択される、態様１〜８のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１１の態様では、モノマーの混合物が、多官能性の不飽和（メタ）アクリレートモノマーまたは多官能性の不飽和（メタ）アクリルアミドモノマーからなる群より選択される第２の多官能性の不飽和モノマーをさらに含む、態様１〜１０のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１２の態様では、第２の多官能性の不飽和モノマーが、第１の親水性の多官能性不飽和モノマーよりも親水性に乏しい、態様１１に従ったマイクロキャリアが提供される。第１３の態様では、第２の多官能性の不飽和モノマーがテトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートである、態様１１または請求項１２に従ったマイクロキャリアが提供される。第１４の態様では、第１の親水性の多官能性不飽和モノマーと第２の多官能性の不飽和モノマーを合わせて、モノマーの混合物の１５重量部を超えない、態様１１〜１３のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１５の態様では、ポリペプチドがＲＧＤ含有ポリペプチドである、態様１〜１４のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１６の態様では、ポリペプチドが、ＢＳＰポリペプチド、ビトロネクチンポリペプチド、フィブロネクチンポリペプチド、およびコラーゲンポリペプチドからなる群より選択される、態様１〜１４のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１７の態様では、マイクロキャリアがマイクロキャリアベース１ミリグラムあたり１００ｎｍｏｌを超える共役ポリペプチドを有する、態様１〜１６のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１８の態様では、マイクロキャリアベースがモノリス型である、態様１〜１７のいずれかに従ったマイクロキャリアが提供される。第１９の態様では、ヒト胚幹細胞を培養する方法であって、前記細胞を、請求項１〜１８のいずれかに従ったマイクロキャリアを有する細胞培養培地と接触させ；前記細胞を前記培地中で培養する、各工程を有してなる方法が提供される。第２０の態様では、マイクロキャリアベースが、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、２−カルボキシエチルメタクリレート、および（ｉ）メチレンビスアクリルアミドまたは（ｉｉ）ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミドを含むモノマーの混合物から形成され、前記モノマーの混合物が、（ｉ）３０〜７０重量部のメタクリル酸２−ヒドロキシエチル；（ｉｉ）２０〜６０重量部の２−カルボキシエチルメタクリレート；および（ｉｉｉ）１〜１５重量部のメチレンビスアクリルアミドまたはジヒドロキシエチレンビスアクリルアミドを含み、前記ポリペプチドがＲＧＤ含有ポリペプチドである、態様１９に従った方法が提供される。第２１の態様では、前記ポリペプチドがビトロネクチンポリペプチドである、態様２０に従った方法が提供される。第２２の態様では、前記モノマーの混合物が、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートをさらに含み、前記テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートと前記メチレンビスアクリルアミドの組合せまたは前記テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレートと前記ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミドとの組合せがモノマーの混合物の１５重量部を超えない、態様２０または２１に従った方法が提供される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
実施例１４：マイクロキャリアの調製（μＨＧ１４）
２００ｇの乾燥トルエンおよび１５ｇのＳＰＡＮ８５乳化剤を、温度の自動調節器つきの覆いおよび下部ドレイン、滴下漏斗、アンカースターラーおよび不活性ガスのバブリングチューブを備えた５００ミリリットルの反応器に入れた。反応器の温度を４０℃に設定し、混合物を、アルゴンバブリング下、少なくとも１５分間、３３０ｒｐｍで攪拌した。次に、１０ミリリットルの脱イオン水、３．１ｇのメタクリル酸２−ヒドロキシエチル、５．０ｇのアクリル酸２−カルボキシエチル、０．８ｇのグリセリン１，３−ジグリセロレートジアクリレートを含む均質な混合物を調製した。ｐＨを、約４.４６ｇの１０Ｍ 水酸化ナトリウムを滴下して加えることによって、ｐＨ８〜９に調整した。次に、０．６３ｇの過硫酸アンモニウムを、透明かつ均質な溶液が得られるまで、この水溶液に溶解した。次いで、この溶液を乾燥アルゴンで１分間バブリングし、４０℃で、滴下漏斗を用いて、攪拌したトルエン／ＳＰＡＮ８５混合物にて気化して加えた。１５分間の混合後、１５０マイクロリットルのテトラメチルエチレンジアミンを攪拌エマルションに素早く加えた。３時間の反応後、温度を２０℃まで冷却し、マイクロキャリアを、反応器の下部ドレインを使用して反応器から回収した。界面活性剤および未反応の材料を除去するために、得られたマイクロキャリアをアセトンで十分に洗浄した。ビーズを水中で２時間膨潤させ、１００、２００および４００μｍのナイロンメッシュの篩を用いて湿式篩にかけた。風乾後、２００〜４００μｍの大きさを有する、篩にかけたマイクロキャリアを、実施例１３から得たプロトコルに従ったペプチド共役に用いた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
表１に提示される数字は、ｇ単位で用いられるモノマーの量を表している；ＨＥＭＡ＝２−メタクリル酸２−ヒドロキシエチル；ＣＥＡ＝アクリル酸２−カルボキシエチル；ＭＢＡ＝メチレンビスアクリルアミド；ＴＥＧＤＭＡ＝テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート；ＧＤＧＤＡ＝グリセリン１，３−ジグリセロレートジアクリレート。