【手続補正書】
【提出日】平成25年2月8日(2013.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、（ｂ）イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド及び／または１以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする核酸及び（ｄ）１以上の１、３−プロパンジオール及び/またはグリセロール経路ポリペプチド、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチド、又は１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸、を含む組換え宿主細胞であって、当該細胞は、酸素移動速度（ＯＴＲ）が酸素取り込み速度（ＯＵＲ）よりも低い酸素制限培養条件下で、イソプレンと、エタノール、１、３−プロパンジオール、及び水素からなる群から選ばれる副生成物を同時に生成するものである、細胞。
【請求項２】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結されている、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項２記載の細胞。
【請求項４】
前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ）由来のものである、請求項３記載の細胞。
【請求項５】
ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含む、請求項４記載の細胞。
【請求項６】
前記副生成物が１，３−プロパンジオールである、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
前記（ｄ）の核酸は、１以上の１，３−プロパンジオール経路及び/またはグリセロール経路ポリペプチドをコードする、請求項６記載の細胞。
【請求項８】
１，３−プロパンジオール、及び/又はグリセロール経路ポリペプチドが、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である、請求項７記載の細胞。
【請求項９】
前記副生成物がエタノールである、請求項１記載の細胞。
【請求項１０】
前記（ｄ）の核酸は１以上のエタノール発酵に関与するポリペプチドをコードするものである、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
前記エタノール発酵に関与するポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）ポリペプチド、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）ポリペプチド、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）ポリペプチドである、請求項１０記載の細胞。
【請求項１２】
前記副生成物が水素である、請求項１記載の細胞。
【請求項１３】
前記（ｄ）の核酸が１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドをコードするものである、請求項１２記載の細胞。
【請求項１４】
前記ヒドロゲナーゼポリペプチドが、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである、請求項１３記載の細胞。
【請求項１５】
イソプレンと副生成物を同時に生成する方法であって、
（１）  酸素移動速度（ＯＴＲ）が酸素取り込み速度（ＯＵＲ）よりも低い酸素制限培養条件下、イソプレンと、エタノール、１，３−プロパンジオール、および水素からなる群から選択される副生成物とを同時に生成することができる組換え宿主細胞を培養すること、ここで、前記細胞は、（ａ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸、（ｂ）イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする核酸、（ｃ）１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド及び／または１以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする核酸及び（ｄ）１，３−プロパンジオール及び又はグリセロール経路ポリペプチド、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチド、又は１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする核酸、を含むものであり、
（２）イソプレンと前記副生成物を同時に生成すること、を含む方法。
【請求項１６】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸がプロモーターに機能的に連結されている、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記イソプレンシンターゼポリペプチドが植物イソプレンシンターゼポリペプチドである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記植物イソプレンシンターゼポリペプチドが、ウラジロハコヤナギ由来のものである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、またはＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記副生成物が１，３−プロパンジオールである、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記（ｄ）の核酸が１以上の１，３−プロパンジオール及び/又はグリセロール経路ポリペプチドをコードするものである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
１，３−プロパンジオール及び/又はグリセロール経路ポリペプチドが、ジヒドロキシアセトンリン酸レダクターゼ（ＤＡＲ１）、グリセロール−リン酸ホスファターゼ（ＧＰＰ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ１（ｄｈａＢ１）、グリセロールデヒドラターゼＢ２（ｄｈａＢ２）、グリセロールデヒドラターゼＢ３（ｄｈａＢ３）、ｄｈａＸ、ｏｒｆＸ、ｏｒｆＹ、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、またはジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記副生成物がエタノールである、請求項１５記載の方法。
【請求項２４】
前記（ｄ）の核酸が、エタノール発酵に関与する１以上のポリペプチドをコードするものである請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記エタノール発酵に関与するポリペプチドが、アルコールデヒドロゲナーゼＢ（ａｄｈＢ）ポリペプチド、アルコールデヒドロゲナーゼＥ（ａｄｈＥ）ポリペプチド、またはピルビン酸デカルボキシラーゼ（ｐｄｃ）ポリペプチドである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記副生成物が水素である、請求項１５記載の方法。
【請求項２７】
前記（ｄ）の核酸が１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドをコードするものである、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒドロゲナーゼポリペプチドが、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチド、または酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸をさらに含む、請求項１の細胞。
【請求項３０】
ＤＸＰ経路ポリペプチドとＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１の細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、デオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸をさらに含む請求項１５の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、ＤＸＰ経路ポリペプチドとＭＶＡ経路ポリペプチドを含む請求項１５の方法。
【請求項３３】
（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド（ｉｖ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｖ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）または；（ｖｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）から選択される１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１の細胞。
【請求項３４】
前記細胞が（ｉ）アセトアセチル−補酵素Ａシンターゼ（チオラーゼ）ポリペプチド；（ｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａシンターゼポリペプチド；および（ｉｉｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼポリペプチド（ｉｖ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；または（ｖ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；または（ｖｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）から選択される１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドを含む、請求項１５の方法。
【請求項３５】
０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有する、請求項１の細胞。
【請求項３６】
前記細胞が０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有する、請求項１５の方法。
【請求項３７】
４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間から２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項１の細胞。
【請求項３８】
前記細胞が４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間から２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項１５の方法。
【請求項３９】
大腸菌細胞である、請求項１の細胞。
【請求項４０】
前記細胞が大腸菌細胞である、請求項１５の方法。
【請求項４１】
（ｉ）０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有するか、又は（ｉｉ）４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間から２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項３９の細胞。
【請求項４２】
前記細胞が（ｉ）０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、０．１ｍｇ／Ｌ液体培地／時間を上回る１，３−プロパンジオールの平均容積生産性を有するか、又は（ｉｉ）４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間から２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間から２００ｍｍｏｌ／Ｌ液体培地／時間の速度で１，３−プロパンジオールを産出する、請求項４０の方法。