【手続補正書】
【提出日】平成25年9月5日(2013.9.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団を作製するための方法であって、該方法は、
外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含むリプログラミング培地において体細胞およびその子孫細胞を培養し、それによってｉＰＳ細胞の集団を作製するステップ
を含み、
該体細胞は、１つ以上のリプログラミング因子を発現する染色体外遺伝エレメントを含む、方法。
【請求項２】
前記リプログラミング培地は、フィーダー細胞を本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リプログラミング培地は、マトリックス構成成分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記体細胞は、ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記染色体外遺伝エレメントは、ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記染色体外遺伝エレメントは、ＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記染色体外遺伝エレメントは、エピソームベクターとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記エピソームベクターは、細菌エレメントを本質的に含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記エピソームベクターは、リプログラミング因子の発現のための複製開始点および１つ以上の発現カセットを含み、該発現カセットの１つ以上は、染色体外鋳型を複製するために複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そして／または前記体細胞は、そのようなトランス作用因子を発現する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記複製開始点は、リンパ向性ヘルペスウイルスの複製開始点であり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰに対応する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複製開始点は、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の複製開始点である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランス作用性因子は、ＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記リプログラミング因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログ、およびＳＶ４０ＬＴから成る群から選択される１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記リプログラミング因子は、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リプログラミング因子は、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は、少なくとも５日間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の少なくとも約１日間〜５日間を含む期間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の約１日間〜１５日間を含む期間、前記リプログラミング培地において培養される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない増殖培地を有する増殖条件において前記ｉＰＳ細胞を培養するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖培地は、既知組成培地である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｉＰＳ細胞を選択するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｉＰＳ細胞は、１つ以上の胚細胞の特質に基づいて選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＯＣＫ阻害剤は、ＨＡ−１００である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記リプログラミング培地は、外部添加の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記リプログラミング培地は、既知組成培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記既知組成培地は、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、またはＮ２Ｂ２７培地である請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＦＧＦを有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記リプログラミング培地は、外部添加のＴＧＦβを本質的に含まない、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団ならびに外部添加のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、および形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤を含む培地を含む組成物。
【請求項３５】
前記培地は、既知組成培地である、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
マトリックス構成成分をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３９】
前記培地は、外部添加のＨＡ−１００をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項４０】
前記培地は、外部添加のＦＧＦをさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値が、デバイス、値を決定するために利用される方法についての誤差の固有の差異または研究対象の間で存在する差異を含むことを示すために使用される。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ｉＰＳ細胞の集団を作製するための方法であって、
ａ）１つ以上のリプログラミング因子を発現する染色体外遺伝エレメントを含む体細胞を得るステップと、
ｂ）外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を含むリプログラミング条件において該体細胞およびその子孫細胞を培養し、それによってｉＰＳ細胞の集団を作製するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記リプログラミング条件は、フィーダー細胞を本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記リプログラミング条件は、マトリックス構成成分を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、項目３に記載の組成物。
（項目５）
前記体細胞は、ヒト細胞である、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記体細胞は、線維芽細胞、ケラチノサイト、造血細胞、間葉細胞、脂肪細胞、内皮細胞、神経細胞、筋細胞、乳房細胞、肝細胞、腎細胞、皮膚細胞、消化管細胞、卵丘細胞、腺細胞、または膵島細胞である、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記染色体外遺伝エレメントは、ＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記染色体外遺伝エレメントは、ＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記染色体外遺伝エレメントは、エピソームベクターとしてさらに定義される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記エピソームベクターは、細菌エレメントを本質的に含まない、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記エピソームベクターは、リプログラミング因子の発現のための複製開始点および１つ以上の発現カセットを含み、該発現カセットの１つ以上は、染色体外鋳型を複製するために複製開始点に結合するトランス作用因子をコードするヌクレオチド配列をさらに含み、そして／または前記体細胞は、そのようなトランス作用因子を発現する、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記複製開始点は、リンパ向性ヘルペスウイルスの複製開始点であり、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のｏｒｉＰに対応する、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記複製開始点は、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、またはマレック病ウイルス（ＭＤＶ）の複製開始点である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記トランス作用性因子は、ＥＢＶ核抗原１（ＥＢＮＡ−１）である、項目１１に記載の方法。
（項目１５）
前記リプログラミング因子は、Ｓｏｘ、Ｏｃｔ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログ、およびＳＶ４０ＬＴから成る群から選択される１つ以上を含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記リプログラミング因子は、形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体またはホモログを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記リプログラミング因子は、ＬＭＹＣ（ＮＭ＿００１０３３０８１）、Ｎ末端の４１アミノ酸が欠失したＭＹＣ（ｄＮ２ＭＹＣ）、またはアミノ酸１３６に変異を有するＭＹＣ（Ｗ１３６Ｅ）を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記細胞は、少なくとも５日間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の少なくとも約１日間〜５日間を含む期間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞は、前記体細胞への前記染色体外遺伝エレメントの導入後の約１日間〜１５日間を含む期間、前記リプログラミング条件において培養される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
外部添加のＧＳＫ−３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＴＧＦ−β受容体阻害剤を本質的に含まない増殖培地を有する増殖条件において前記ｉＰＳ細胞を培養するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記増殖培地は、既知組成培地である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記増殖培地は、ＴｅＳＲ培地またはｍＴｅＳＲ培地である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記ｉＰＳ細胞を選択するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記ｉＰＳ細胞は、１つ以上の胚細胞の特質に基づいて選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
リプログラミング培地は、外部添加のＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤またはミオシンＩＩ阻害剤をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記ＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤は、ＨＡ−１００である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記リプログラミング培地は、外部添加の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記リプログラミング培地は、既知組成培地である、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記既知組成培地は、ＴｅＳＲ培地、ヒト胚細胞培養培地、またはＮ２Ｂ２７培地である項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＦＧＦを有する、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記リプログラミング培地は、外部添加のＴＧＦβを本質的に含まない、項目３０記載の方法。
（項目３４）
外因性の遺伝エレメントを本質的に含まない人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の集団ならびに外部添加のグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、および形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤を含む培地を含む組成物。
（項目３５）
前記培地は、既知組成培地である、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
マトリックス構成成分をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３７）
前記マトリックス構成成分は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む、項目３６に記載の組成物。
（項目３８）
前記培地は、外部添加のＬＩＦをさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３９）
前記培地は、外部添加のＨＡ−１００をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目４０）
前記培地は、外部添加のＦＧＦをさらに含む、項目３４に記載の組成物。