【手続補正書】
【提出日】平成25年1月18日(2013.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内在的に発現する細胞を単離する方法であって、
ａ．細胞の集団を提供する工程；
ｂ．Ｔ１Ｒ２の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入し、および／またはＴ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入する工程；ならびに
ｃ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを発現する細胞を単離する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内在的に発現する細胞を単離する方法であって、
ａ．細胞の集団を提供する工程；
ｂ．Ｔ１Ｒ２の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入し、およびＴ１Ｒ３の発現を検出する分子ビーコンを細胞へと導入する工程；ならびに
ｃ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを発現する細胞を単離する工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
細胞の前記集団がＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３を発現することが公知ではない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記単離された細胞におけるＴ１Ｒ２またはＴ１Ｒ３の任意の発現レベルが、細胞の前記集団の平均細胞におけるよりも少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、２５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５００００倍、または少なくとも１０００００倍高い、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
細胞の前記集団における遺伝的変動が、該単離する工程に先立って増大した、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法に従って作製した単離された細胞。
【請求項７】
甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットを内在的に発現する単離された細胞であって、ここで、前記単離された細胞は、細胞の集団に由来し、かつ前記単離された細胞における甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび／または甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現は、細胞の前記集団の平均細胞におけるよりも少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１０００倍、２５００倍、５０００倍、７５００倍、１００００倍、５００００倍、または１０００００倍高い、前記単離された細胞。
【請求項８】
細胞の前記集団が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、確立されたニューロン細胞株、褐色細胞腫、神経芽腫線維芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）、横紋筋肉腫、後根神経節細胞、ＮＳ０細胞、ＣＶ‐１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ‐１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ‐７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ‐Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ‐Ｃ‐１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）、ＭＲＣ‐５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）、Ｌ細胞、ＨＥＫ‐２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）およびＰＣ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１７２１）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１１２６８）、ＲＢＬ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐１３７８）、ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐２２６６）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ‐３４）、ＳＪ‐ＲＨ３０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ‐２０６１）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ‐８０６５）、ＮＤ７／２３（ＥＣＡＣＣ  ９２０９０９０３）、ＣＨＯ（ＥＣＡＣＣ  ８５０５０３０２）、ベロ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８１）、Ｃａｃｏ‐２（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ  ３７）、Ｋ５６２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４３）、ジャーカット（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ‐１５２）、Ｐｅｒ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、  ライデン、オランダ）、Ｈｕｖｅｃ（ＡＴＣＣヒト初代ＰＣＳ  １００‐０１０、マウスＣＲＬ２５１４、ＣＲＬ２５１５、ＣＲＬ２５１６）、ＨｕＨ‐７Ｄ１２（ＥＣＡＣＣ  ０１０４２７１２）、２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０８５２）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８５）、ＩＭＲ‐９０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １８６）、ＭＣＦ‐７（ＡＴＣ  ＨＴＢ‐２２）、Ｕ‐２  ＯＳ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ‐９６）、Ｔ８４（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２４８）、初代細胞、または不死化細胞の集団である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の細胞の培養物。
【請求項１０】
甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットおよび甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブ不ニットを含む甘味受容体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニットの少なくとも１つの発現は、前記サブユニットをコードする核酸の宿主細胞への導入、あるいは宿主細胞および前記宿主細胞に由来する細胞または細胞株に既に存在するサブユニットをコードする核酸の遺伝子活性化から結果として生じる、前記細胞または細胞株。
【請求項１１】
甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニット、甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニット、およびＧタンパク質を含む、甘味受容体を安定して発現する細胞または細胞株であって、前記サブユニットおよびＧタンパク質のうちの少なくとも１つの発現が、前記サブユニットまたはＧタンパク質をコードする核酸の宿主細胞への導入、あるいは宿主細胞および前記宿主細胞に由来する細胞または細胞株に既に存在する前記サブユニットまたはＧタンパク質をコードする核酸の遺伝子活性化から結果として生じる、前記細胞または細胞株。
【請求項１２】
少なくとも１つの甘味受容体サブユニットが、前記宿主細胞へと導入される該サブユニットをコードする核酸から発現する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１３】
少なくとも１つの甘味受容体サブユニットが、前記宿主細胞に存在する核酸から遺伝子活性化によって発現する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１４】
前記宿主細胞は：
ａ．真核細胞であり；
ｂ．哺乳類細胞であり；
ｃ．甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットもしくはＧタンパク質を内在的に発現せず；または
ｄ．（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の任意の組み合わせ
である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ＨＥＫ‐２９３細胞である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１６】
前記甘味受容体は
ａ．哺乳類であり；
ｂ．ヒトであり；
ｃ．異なる種に由来するサブユニットを含み；
ｄ．キメラである１つ以上のサブユニットを含み；
ｅ．（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１７】
前記甘味受容体が機能的である、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１８】
アッセイにおいて少なくとも０．３のＺ’値を有する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項１９】
アッセイにおいて少なくとも０．７のＺ’値を有する、請求項１７に記載の細胞または細胞株。
【請求項２０】
選択的圧力の不在下で培地において甘味受容体を安定して発現する、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項２１】
前記甘味Ｔ１Ｒ２受容体サブユニットが、下記からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット；
ｂ．配列番号３４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット；
ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３１、または配列番号３４のアミノ酸をコードする核酸とハイブリッド形成する核酸によってコードされるアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット；および
ｄ．配列番号３１と少なくとも８５％同一である核酸、もしくは配列番号３４のアミノ酸をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む、甘味受容体サブユニット。
【請求項２２】
前記甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ２が、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３１を含む核酸：
ｂ．配列番号３４のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；
ｃ．ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸；および
ｄ．配列番号３１と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号３４のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項２３】
前記甘味受容体サブユニットＴ１Ｒ３が、下記からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット；
ｂ．配列番号３５のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット；
ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３２または配列番号３５のアミノ酸配列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット；および
ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一である核酸または配列番号３５のアミノ酸配列もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含む甘味受容体サブユニット。
【請求項２４】
前記甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットが、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３２を含む核酸；
ｂ．配列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸；
ｃ．ストリンジェントな条件下でａ）またはｂ）の核酸とハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸；および
ｄ．配列番号３２と少なくとも８５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号３５のアミノ酸もしくは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項２５】
前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される、請求項１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３６もしくは３７のアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質；
ｂ．配列番号３６もしくは３７と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列または別の種の対応物のアミノ酸配列を含むＧタンパク質；
ｃ．ストリンジェントな条件下で配列番号３３とハイブリッド形成する核酸あるいは配列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質；および
ｄ．配列番号３３と少なくとも８５％同一である核酸配列あるいは配列番号３６もしくは３７のアミノ酸または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むＧタンパク質。
【請求項２６】
前記Ｇタンパク質が、下記からなる群から選択される核酸によってコードされる、請求項１１に記載の細胞または細胞株：
ａ．配列番号３３を含む核酸；
ｂ．配列番号３６もしくは３７のポリペプチドまたは別の種の対応物のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸；
ｃ．ａ）またはｂ）の核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列を含む核酸および；
ｄ．配列番号３３と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列、あるいは配列番号３６もしくは３７のアミノ酸、または別の種の対応物のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項２７】
ａ．甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットをコードする核酸を含む第一のベクター、甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットをコードする核酸を含む第二のベクター、および任意に、Ｇタンパク質をコードする核酸を含む第三のベクターを宿主細胞へと導入する工程；
ｂ．前記甘味受容体Ｔ１Ｒ２サブユニットの発現を検出する第一の分子ビーコン、前記甘味受容体Ｔ１Ｒ３サブユニットの発現を検出する第二の分子ビーコン、および任意に、前記Ｇタンパク質の発現を検出する第三の分子ビーコンを、工程ａ）において作製される宿主細胞へと導入する工程；ならびに
ｃ．前記Ｔ１Ｒ２サブユニット、前記Ｔ１Ｒ３サブユニット、および任意に前記Ｇタンパク質を発現する細胞を単離する工程
を含む、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法。
【請求項２８】
工程ｃ）において単離された細胞から細胞株を作製する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記宿主細胞が：
ａ．真核細胞であり；
ｂ．哺乳類細胞であり；
ｃ．甘味受容体の少なくとも１つのサブユニットもしくはＧタンパク質を内在的に発現せず；または
ｄ．ａ）、ｂ）およびｃ）の任意の組み合わせ
である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ａ．細胞を１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間培養する工程；
ｂ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現を該時間にわたって周期的にアッセイし、前記発現がＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；および
ｃ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの実質的に安定した発現を特徴とする細胞または細胞株を、１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間にわたって選択する工程
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
ａ．細胞を１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間培養する工程；
ｂ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現レベルを該時間にわたって測定し、前記発現がＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでアッセイされる工程；および
ｃ．前記甘味受容体またはそのサブユニットの発現の実質的に同じレベルを特徴とする細胞または細胞株を、１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間にわたって選択する工程
をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記甘味受容体のタンパク質発現レベルの測定が、機能的アッセイを用いて実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記Ｔ１Ｒ２サブユニットが、請求項１２のａ）〜ｄ）のサブユニットからなる群から選択され、前記Ｔ１Ｒ３サブユニットが、請求項１４のａ）〜ｄ）のサブユニットからなる群から選択され、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１６のａ）〜ｄ）のタンパク質からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔ１Ｒ２サブユニットが、請求項１３のａ）〜ｄ）に記載の核酸によってコードされるサブユニットからなる群から選択される核酸によってコードされ、前記Ｔ１Ｒ３サブユニットが、請求項１５のａ）〜ｄ）に記載の核酸によってコードされるサブユニットからなる群から選択され、かつ前記Ｇタンパク質が、請求項１７のａ）〜ｄ）に記載の核酸によってコードされるタンパク質からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記単離する工程が、蛍光励起セルソーターを利用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
請求項６、１０、または１１に記載の少なくとも１つの細胞または細胞株を、少なくとも１つの試験化合物に曝露し、かつ甘味受容体機能における変化を検出する工程を含む、甘味受容体機能の修飾因子を同定するための方法。
【請求項３７】
前記修飾因子が、甘味受容体阻害薬、甘味受容体アンタゴニスト、甘味受容体遮断薬、甘味受容体活性化因子、甘味受容体アゴニスト、または甘味受容体増強薬からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記甘味受容体がヒト甘味受容体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記試験化合物が、小分子、化学部分、ポリペプチド、または抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記試験化合物が、化合物のライブラリである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記ライブラリが、低分子ライブラリ、組み合わせライブラリ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）、ペプチドライブラリ、または抗体ライブラリである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記修飾因子が、甘味受容体の酵素的に修飾された形態に対して選択的である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
請求項３６に記載の方法によって同定される修飾因子。
【請求項４４】
前記細胞または細胞株が、１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間にわたる、甘味受容体の実質的に安定した発現を特徴とする、請求項６、１０、または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項４５】
前記細胞または細胞株が、１〜４週間、１〜９ヶ月間、またはその間の任意の時間の群から選択される期間にわたる前記甘味受容体の発現の実質的に同じレベルを特徴とする、請求項６、１０、または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項４６】
前記発現レベルが、機能的アッセイを用いて測定される、請求項４５に記載の細胞または細胞株。
【請求項４７】
請求項２７〜３５のいずれか一項記載の方法によって作製される、請求項６、１０、または１１に記載の細胞または細胞株。
【請求項４８】
前記細胞が、経時的に一貫して少なくとも１つの望ましい特性を有し、下記を含む、請求項１０または１１に記載の細胞または細胞株を作製するための方法：
ａ．前記甘味受容体のサブユニットまたは任意にＧタンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する複数の細胞を提供する工程；
ｂ．細胞を個々の培養容器に分散させ、それにより複数の個別の細胞培養物を提供する工程；
ｃ．１セットの所望の培養条件が、前記個別の細胞培養物の各々と実質的に同一であることを特徴とする自動細胞培養方法を用いて前記条件下で細胞を培養し、該培養の間、各個別の細胞培養物におけるウェルあたりの細胞数が標準化され、かつ前記個別の培養物が、同じスケジュールで継代される工程；
ｄ．前記個別の細胞培養物を前記甘味受容体のまたは該受容体を産生する細胞の少なくとも１つの所望の特徴について少なくとも２回アッセイする工程；および
ｅ．前記所望の特徴を有する個別の細胞培養物を両アッセイにおいて同定する工程。
【請求項４９】
甘味受容体を産生し、かつ経時的に一貫した少なくとも１つの所望の特性を有し、請求項４８に記載の方法によって作製される細胞または細胞株。