(57)【要約】【課題】  簡便かつ安価な方法でトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍のモデル動物を作製する方法を提供すること。【解決手段】  トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すゼブラフィッシュの製造方法であって、受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵をＱＴ延長薬の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にＱＴ延長薬の非存在下で飼育することを特徴とする方法が開示される。また、試験物質がトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を誘発する可能性を評価する方法も開示される。本発明のトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を呈するゼブラフィッシュは、不整脈の病態の研究、ならびに不整脈の治療薬および予防薬の研究開発のためのモデル動物として有用である。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すゼブラフィッシュの製造方法であって、受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵をＱＴ延長薬の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にＱＴ延長薬の非存在下で飼育することを特徴とする方法。
【請求項２】
試験物質がヒトにおいてトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を誘発する可能性を評価する方法であって，受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵を試験物質の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にその試験物質の非存在下で飼育し、次に心室の拍動が回復した後にゼブラフィッシュの心電図を測定して、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すか否かを判定することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を呈するモデル動物として有用なゼブラフィッシュに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品による副作用で最も問題となっているものの１つとして、薬物誘発性不整脈（ＱＴ延長症候群、ＡＶブロックなど）がある。例えば、1998年に市場から撤退した抗ヒスタミン剤テルフェナジンでは、服用した患者において高率に薬物誘発性QT延長症候群が発症し、その一部がトルサード・ド・ポアンツ（Torsades de Pointes）へと発展し、突然死に至る。この副作用により医薬品市場から撤退した薬剤には、テルフェナジンの他に、抗ヒスタミン剤アステミゾール、消化管運動促進剤シサプリドなどが存在する。また、他のいくつかの向精神薬や抗生物質でも同様の副作用が報告されている。
【０００３】
ＱＴ延長症候群とは、心電図上でＱＴ間隔（心室の脱分極から再分極までに要する時間）が長くなる病態であり、心拍数補正した修正ＱＴ時間（ＱＴｃ＝ＱＴ／（ＲＲ）1/2，ＲＲはＲＲ間隔である）が男性で４４０ｍｓｅｃ、女性で４６０ｍｓｅｃ以上であることを特徴とする。ＱＴ延長を示す不整脈のうち、特にトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍（以下、トルサード・ド・ポアンツとも称する）が突然死の危険性が高いことが知られている。トルサード・ド・ポアンツとは、ＱＴ延長を伴う多型性心室頻拍であり、ＱＲＳ波の振幅が基線のまわりをねじれるように変動する心電図波形を示すことを特徴とする。
【０００４】
薬物誘発性ＱＴ延長症候群、特にトルサード・ド・ポアンツは致死的副作用であり、薬物療法における影響は甚大である。ＱＴ延長症候群の症状を呈するモデル動物としては、サル、イヌ、ラット、マウスなどが用いられているが、哺乳動物のモデル動物は高価であり、広い実験施設を必要とするという欠点がある。近年、より安価で大量の処理に適したモデル動物として、ゼブラフィッシュが注目されつつある。ゼブラフィッシュは個体発生が早く、大規模なドラッグスクリーニングに利用できる脊椎動物という点が最大の利点である。したがって、ＱＴ延長症候群の症状を呈するゼブラフィッシュのモデル動物を開発することができれば、不整脈の病態や薬剤の副作用を研究する系として非常に有用であると考えられる。
【０００５】
Langheinrichらは、ゼブラフィッシュ初期胚を種々のＱＴ延長薬に曝露すると、ゼブラフィッシュの心臓でＡＶブロック型の徐脈性不整脈が生ずることを見いだし、この事象に関与する遺伝子Herg（Zerg）を同定したことを報告している（Langheinrich, et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2003 Dec 15;193(3):370-82.）。この論文では、ゼブラフィッシュ胚をＱＴ延長薬に曝露しても、頻脈性不整脈やトルサード・ド・ポアンツ型不整脈は引き起こされず、これは胚と成体とでは生理学やチャネルの構造が異なるためであるか、あるいは種の違いによるものであろうと考察している。
【非特許文献１】Langheinrich, et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2003 Dec 15;193(3):370-82.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、簡便かつ安価な方法でトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍のモデル動物を作製する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、ヒトにおいて催不整脈作用が報告されている医薬品92種類をゼブラフィッシュに投与し、心機能や心電図に与える影響を解析したところ、ヒトにおける心電図異常と非常に類似した波形異常がゼブラフィッシュにおいても認められることを見いだした。具体的には、ゼブラフィッシュの受精卵をＱＴ延長薬に暴露すると心停止が生じ、その後にＱＴ延長薬を洗い流すと心拍が回復すること、さらにこの回復の際にトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍に特徴的な心電図波形を示すことを見いだした。
【０００８】
本発明は、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すゼブラフィッシュの製造方法であって、受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵をＱＴ延長薬の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にＱＴ延長薬の非存在下で飼育することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
本発明はまた、試験物質がヒトにおいてトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を誘発する可能性を評価する方法であって，受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵を試験物質の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にその試験物質の非存在下で飼育し、次に心室の拍動が回復した後にゼブラフィッシュの心電図を測定して、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すか否かを判定することを特徴とする方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ゼブラフィッシュ（属名Danio、例えばDanio rerio）とはインド原産の体長 5 cm ほどの小型の熱帯魚であり、コイ目 コイ科 ダニオ亜科（ラスボラ亜科、ハエジャコ亜科とも）に属し、オイカワ、コイや金魚などに近い。成体の体表に紺色の横じまをもつことから、シマウマにみたててこの名がある。飼育、繁殖が容易な魚で、流通価格も安く、観賞魚としてよく飼われている。いくつかの近交系が国際的に認められているが、本発明で用いる種としては横じまの少ないゴールデン系統などが望ましい。ゼブラフィッシュは魚類であるが、主要臓器・組織の発生・構造などはヒトと良く似ており、各パーツ（臓器など）が受精卵から分化して形成されていく過程が透明な体を通して観察できる。受精後48時間で主要臓器・組織の基本構造が出来上がっても体長は２ミリ以下であって96ウエルプレートなどの小スペースで取り扱うことができる。したがって、モデル動物全体への影響を指標とした新薬候補化合物スクリーニングへの適用が可能であり、既に、ゼブラフィッシュを用いる新薬候補化合物のスクリーニングが商業的に実施されている。また、ゼブラフィッシュの全ゲノムも解読されており（Sanger Institute）、遺伝子発現プロファイルの分析も可能である。
【００１１】
ゼブラフィッシュの受精卵を飼育する水としては、一般に熱帯魚を飼育するのに適した飼育水のいずれを用いてもよく、例えば、以下の組成を有する飼育溶液（塩化カルシウム0.1g、塩化ナトリウム3.5g、塩化カリウム0.05g、炭酸水素ナトリウム0.2g／1L）やInstant Ocean （最終濃度60 μg/ml）などを用いることができる。飼育温度としては、一般に２６℃〜３０℃、好ましくは約２８℃を用いる。容器としては、例えば、９６ウェルマイクロプレートから100mLビーカーまで、幅広い実験用容器を用いることができる。また１匹あたりの水量は受精卵の状態で最低１００μl程度は必要である。
【００１２】
このようにして受精卵を飼育すると、通常は、受精直後から約４８〜７２時間で孵化し、発生過程がほぼ終了する。このときの体長は約３ｍｍである。さらに同様の条件で飼育を続けると、約５日で骨以外のほとんどの臓器の形成が完了し、約６日で骨を含むすべての臓器形成が完了する。約７日で体長が約５ｍｍとなり、このとき心臓の大きさは約０．３ｍｍである。ゼブラフィッシュは受精後約１ヶ月まで身体が透明であるため、心臓・血管をはじめとして、各種臓器の形態は肉眼で観察することができる。
【００１３】
本発明の方法においては、まず受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵をＱＴ延長薬の存在下で飼育する。受精後６日を越えると、ＱＴ延長薬の作用を受けない個体が生じ、試験結果にばらつきがでるようになる。好ましくは受精後４８〜７２時間の受精卵を用いる。特に好ましくは、受精後７２時間でＱＴ延長薬に曝露する。受精直後あるいは受精後２４時間からＱＴ延長薬に曝露することも可能である。受精卵をＱＴ延長薬の存在下で飼育すると、６時間から２４時間後に拍動に異常が認められ、ＡＶブロックが生じていることが観察される。さらにＱＴ延長薬の存在下で飼育を継続すると、２４時間から４８時間後に心室停止に至る。次に、心室停止から２４時間以内に飼育水を交換して、ＱＴ延長薬の非存在下で飼育を継続すると、６時間から２４時間以内に心拍が回復する。この回復の際にトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍に特徴的な心電図波形を示す個体が見られる。
【００１４】
ＱＴ延長薬としては、ＱＴ延長症候群の原因となることが知られている薬剤であればいずれのものを用いてもよいが、例えば、テルフェナジン、アステミゾール、シサプリド、キニジン、プロカインアミド、ジソピラミド、シベンゾリン、プロパフェノン、アミオダロン、ソタロール、ペプリジル、アミトリプチリン、イミプラミン、ノルトリプチリン、マプロチリン、クロルプロマジン、ハロペリドール、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ドキソルビシンなどが挙げられる。現在、米国市場に出ている医薬品のうちQT延長作用のあるものは以下のＵＲＬに記載されており、これらも本発明においてＱＴ延長薬として使用することができる：http://www.arizonacert.org/medical-pros/drug-lists/drug-lists.htm#）。
【００１５】
好ましくは、ＱＴ延長薬としてアステミゾールを用いる。アステミゾール（astemizole）とは、商品名ヒスマナール、構造式1-[(4-フルオロフェニル)メチル]-N-[1-[2-(4-メトキシフェニル)エチル]-4-ピペリジル]-ベンゾイミダゾール-2-アミン、C28H31FN4O、分子量458.571の化合物である。アステミゾールは鎮静作用のない長時間作用型ヒスタミン（Ｈ１）受容体拮抗薬であるが、不整脈の原因となるなどの副作用のため、現在は医薬品としては使用されていない。
【００１６】
飼育水中のアステミゾールの好ましい濃度は１００ｎＭ〜１０μＭ、より好ましくは３００ｎＭ〜１μＭである。濃度が低すぎると不整脈の出現頻度が低くなり、濃度が高すぎると非特異的な変化や死亡の頻度が高くなり、いずれの場合もモデル動物の調製には不適切である。
【００１７】
また、アステミゾールは、受精卵へのマイクロインジェクション、稚魚への注射による各組織へのマイクロインジェクション、稚魚への経口投与（受精後４日目以降）、親魚への投与（経口あるいは溶解、各組織への注射）などにより、ゼブラフィッシュまたはその受精卵に投与してもよい。
【００１８】
本発明の方法により得られるトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍のモデル動物は、不整脈の病態や薬剤の副作用を研究する系として有用である。ゼブラフィッシュは透明であるため、ゼブラフィッシュの心臓の形態は、肉眼または実体顕微鏡で容易に観察することができる。心房および心室の心拍数を測定するためには、１５秒間で、心房と心室のそれぞれにおける収縮から弛緩のプロセスが何回起こるかを、カウンターを用いて、顕微鏡下にて測定する。また、心電図を測定するためには、測定部において導電性のある溶液の中に基準となる電極を設置し、生体に接触する電極との電気的な差を記録することにより、生体から放出されるシグナルを捉えることができる。さらに、不整脈の病態や生理学的・生化学的な知見を得るために、心臓や心臓周囲のサイズの測定、心拍出量の算出、血管造影法による心血管系の循環状態の確認、組織学的検討、遺伝子発現解析、タンパク質発現解析などを併せて行ってもよい。
【００１９】
本発明の別の態様においては、試験物質がヒトにおいてトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を誘発する可能性を評価する方法が提供される。この方法では、受精後６日以内のゼブラフィッシュ受精卵を試験物質の存在下で飼育し、心室停止が生じた後にその試験物質の非存在下で飼育し、次に心室の拍動が回復した後にゼブラフィッシュの心電図を測定して、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すか否かを判定する。本発明の方法にしたがえば、薬剤が不整脈の副作用を誘発するリスクを簡便かつ容易に試験することができる。
【００２０】
さらに、本発明の方法により得られるトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍のモデル動物は、不整脈治療薬の候補物質を同定するために用いることができる。この方法では、試験物質を本発明の方法により製造されたトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を呈するゼブラフィッシュと接触させて，試験物質がゼブラフィッシュの不整脈の症状を変化させるか否かを測定する。試験物質は、水溶性である場合には飼育水中に溶解すればよく、水不溶性である場合には適当な界面活性剤との複合体またはエマルジョンの形で飼育水中に懸濁すればよい。あるいは、ゼブラフィッシュの餌に混ぜて経口投与してもよく、注射などにより非経口投与してもよい。試験物質は、ゼブラフィッシュをＱＴ延長薬に曝露する前に予め投与してもよく、ＱＴ延長薬に曝露する際に同時に投与してもよく、あるいは、心室停止後、ＱＴ延長薬の不在下でゼブラフィッシュを飼育する際に投与してもよい。試験物質を投与した場合と投与しない場合について、心房と心室の心拍数や心電図を測定して比較することにより、不整脈の症状を軽減・緩和させる試験物質を不整脈治療薬の候補物質として同定することができる。
【００２１】
本発明にしたがえば、簡便な方法によりトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍モデル動物を得ることができる。また、試験物質がトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を引き起こす可能性について簡便な方法により試験することができる。
【００２２】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
実施例１．アステミゾール投与による心室停止および回復
ゼブラフィッシュ（Tuebingen）の成魚飼育方法はTHE ZEBRAFISH BOOK（by Monte Westerfield, Institute of Neuroscience, University of Oregon）にしたがった（URL: http://www.shigen.nig.ac.jp:6070/zf＿info/zfbook/zfbk.html）。試験の前日に、オスとメスを１匹ずつ水槽に入れ暗室に置き、早朝照明をつけることにより産卵を促進し、受精卵を回収した。受精卵１５０個を３群（洗浄群、非洗浄群、対照群）に分け、受精直後から３日まで、飼育水（塩化カルシウム0.1g、塩化ナトリウム3.5g、塩化カリウム0.05g、炭酸水素ナトリウム0.2g／1L）中で飼育した。密度は卵１個あたりの水量が0.25mLを下回らないようにして、２８℃の恒温漕で、毎日飼育水を交換して飼育した。受精卵は受精後２〜３日目で孵化した。第３日に飼育水にアステミゾール（最終濃度０．５μＭまたは１μＭ）を加え、飼育を継続した。対照群（control）はアステミゾールを含まない飼育水で飼育した。第４日（4dpf）に心房（Atrium）と心室（Ventricle）の心拍数を各15秒間測定した。測定後、非洗浄群（ATZ）は同じ濃度のアステミゾールを含む飼育水で、洗浄群（ATZ wash(+)）はアステミゾールを含まない飼育水で、それぞれさらに飼育を継続した。第５日（5dpf）に再び心拍数を測定した。
【００２４】
その結果、アステミゾールの存在下で飼育した稚魚は第４日に心房、心室とも拍動が低下していたが、心室の拍動の低下が大きく、ＡＶブロックが生じていることがわかった（図１）。また、第４日からアステミゾールの非存在下で飼育すると、心室の拍動が回復することがわかった。一方、アステミゾールの存在下で飼育を継続した非洗浄群では、心室の拍動は停止したままであった。
【００２５】
実施例２．アステミゾール投与によるトルサード・ド・ポアンツモデル作成
実施例１と同様にして受精卵１００個を２群（試験群および対照群）に分けて飼育した。受精後第５日に稚魚をシャーレに移し、アステミゾール（最終濃度１μＭ）を含む飼育水で2日間飼育した。溶媒はEgg Waterを用いた。薬物投与後2日（受精後第７日）に心室の拍動が停止し、心臓の膨潤が観察された。次に、アステミゾールを含まない飼育水に交換し、さらに2日間飼育すると、心室の拍動が回復した。この時点で心電図を測定したところ、多くの個体でQT間の延長が認められた。またある個体では、トルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍に典型的な波形である、QT間の延長およびQRS波形が変化する多形性心室頻拍が計測された（図２：（Ａ）対照群、（Ｂ）投与群）。すなわち、本発明にしたがってアステミゾールの存在下でゼブラフィッシュの受精卵を飼育することにより、ＱＴ延長やトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を示すモデル動物を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明のトルサード・ド・ポアンツ型心室頻拍を呈するゼブラフィッシュは、不整脈の病態の研究、ならびに不整脈の治療薬および予防薬の研究開発のためのモデル動物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、アステミゾールの存在下で１日間、その後アステミゾールの非存在下で１日間飼育したゼブラフィッシュの心房および心室の心拍数を示す。
【図２】図２は、アステミゾールの存在下で２日間、その後アステミゾールの非存在下で２日間飼育したゼブラフィッシュの心電図を示す。
【図１】
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【図２】
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