(57)【要約】【課題】ＧＡＫ及びＰＰ２Ａ  Ｂ’αの解析結果より得られた知見に基づき、これらに関するシグナル伝達機構を解明する手段、並びに当該手段により明らかにされた作用機能に基づき新たな作用機序を有する医薬及びその開発法などを提供すること。【解決手段】ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンが他のアミノ酸に置換されているか、若しくは欠失しているＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体、又は該置換若しくは欠失部分を含むそのフラグメント；ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系において、上記ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントを共存させることにより脱リン酸化の程度が減少した物質をＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定することを含む、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング方法；被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ５３の転写活性を調節し得る物質のスクリーニング方法など。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンが他のアミノ酸に置換されているか、若しくは欠失しているＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体、又は該置換若しくは欠失部分を含むそのフラグメント。
【請求項２】
ＰＰ２Ａ  Ｂ’αがＰＰ２Ａ  Ｂ’α１である、請求項１記載の変異体又はそのフラグメント。
【請求項３】
ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１がマウス由来であり、且つ該スレオニンが１０４位のスレオニンである、請求項２記載の変異体又はそのフラグメント。
【請求項４】
ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１が配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる、請求項３記載の変異体又はそのフラグメント。
【請求項５】
該他のアミノ酸がアラニンである、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異体又はそのフラグメント。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項９】
ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系において、請求項１〜５のいずれか１項記載のＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントを共存させることにより脱リン酸化の程度が減少した物質をＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定することを含む、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメント、請求項７記載の発現ベクター、あるいは請求項８記載の形質転換体を含む、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング用試薬又はキット。
【請求項１１】
被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ５３の転写活性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の活性を調節し得るか否かの評価が、被験物質が、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αを基質とするＧＡＫのキナーゼ活性又はｐ５３を基質とするＰＰ２Ａ  Ｂ’αのホスファターゼ活性を調節し得るか否かを評価することにより行われる、請求項１１記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
被験物質が、ｐ５３の転写活性を促進し得る物質のスクリーニング方法である、請求項１１又は１２記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
ｐ５３の転写活性を調節し得る物質が細胞増殖異常に起因する疾患を予防又は治療し得る物質である、請求項１１〜１３のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
ｐ５３の転写活性を促進し得る物質が癌に対する医薬である、請求項１３記載のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得る物質を含む、ｐ５３の転写活性の調節剤。
【請求項１７】
ＰＰ２Ａ  Ｂ’αにおいて、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをコードするヌクレオチド部分の変異を検出することを含む、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの変異の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体及びそのフラグメント、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング方法、ｐ５３の転写活性を調節し得る物質のスクリーニング方法、ｐ５３の転写活性の調節剤などに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼ及び引き続くシグナル伝達カスケードによる標的タンパク質のリン酸化は、細胞事象の種々の局面を制御する。一旦標的がリン酸化されると、各種プロテインホスファターゼにより触媒される、脱リン酸化という逆の反応が進行するはずである。プロテインホスファターゼは、それらの同族キナーゼのように、各種の細胞下（subcellular）事象に空間的及び時間的調節の双方を提供すると考えられる。それにもかかわらず、タンパク質リン酸化の分子及び細胞下機構の十分に確立された理解とは対照的に、脱リン酸化の調節機構の詳細は依然として不明である。多くの異なるタイプのホスファターゼの一つであるプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）は、多数のシグナル伝達経路を調節する、多量かつ遍在的に発現している一群のＳｅｒ／Ｔｈｒホスファターゼを示す。このことは、ＰＰ２Ａの多くの可能な標的が真核生物細胞の増殖に重要な役割を果たすことを示唆する（非特許文献１、２）。ＰＰ２Ａは、３つのサブユニット：不変触媒（Ｃ）及び構造（Ａ）サブユニット、並びに可変調節（Ｂ）サブユニットからなる。ＰＰ２Ａ調節サブユニットの３つの無関係なファミリー（Ｂ、Ｂ’及びＢ’’）が同定されている；５つの異なる哺乳動物遺伝子は、Ｂ’サブユニットファミリーのメンバーをコードし、多くのアイソフォームは、これらの遺伝子から生成される。これらの中でも、Ｂ’αサブユニットは、我々が以前に示したように（非特許文献３）、細胞下局在が異なる３つのオルターナティブスプライシング変異体を含む（核：Ｂ’α１及びＢ’α２；細胞質：Ｂ’α３）。
【０００３】
哺乳動物における２つのサイクリンＧパラログの一つであるサイクリンＧ１は、標的タンパク質へのＰＰ２Ａのリクルートの際に主要な役割を果たすことが示されている（非特許文献４、５）。サイクリンＧ１は、そのＣ末端領域で上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）のチロシンリン酸化部位と配列相同性を保有する、サイクリンファミリーの新規メンバーとして最初に同定された（非特許文献６）。サイクリンＧ１は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の標的遺伝子の一つであり（非特許文献７）、ＤＮＡ損傷に応じてｐ５３依存的様式で誘導される。サイクリンＧ１は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の安定化を引き起こすＴ２１６での脱リン酸化を介してＭｄｍ２を活性化する、Ｂ’サブユニットを含む活性ＰＰ２Ａホロ酵素の調節性成分であることが見出されている（非特許文献５）。サイクリンＧ１ヌルマウスは、正常に生まれ、健康に成長する（非特許文献８）が、サイクリンＧ１は、Ｍｄｍ２と直接的に相互作用して、ＤＮＡ損傷後のＡＲＦ／Ｍｄｍ２複合体形成を促進し、ＤＮＡ損傷後のｐ５３の蓄積が、サイクリンＧ１−／−細胞で亢進される（非特許文献９）。これらの知見は、サイクリンＧがｐ５３−Ｍｄｍ２ネットワークの鍵となるレギュレータであることを示唆する（非特許文献１０）。
【０００４】
我々は以前に、Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼドメイン、テンシン（tensin）／オーキシリン（auxilin）様ドメイン、Ｔｙｒリン酸化部位及びロイシンジッパー等のモチーフを保有する、サイクリンＧ１の結合タンパク質、サイクリンＧ会合キナーゼ（ＧＡＫ）を同定した（特許文献１、非特許文献１１）。神経特異的タンパク質であるオーキシリンとのキナーゼドメイン以外の高い相同性により示唆されるように、遍在的なＧＡＫはオーキシリンと同様に、クラスリン被覆小胞（clathrin-coated vesicle）の解体に必須な補因子としてクラスリンが媒介する膜輸送を調節する（非特許文献１２）。低分子ヘアピンＲＮＡによるＧＡＫの発現抑制（ノックダウン）は、ＧＡＫがクラスリンコートピット上でのクラスリン交換を誘導するのみならず、原形質膜及びトランスゴルジネットワークへのクラスリン及びアダプターの結合もまた媒介することを示した（非特許文献１３、１４）。顕微鏡観察により、ＧＡＫが、一過的なダイナミンの移送の後に、クラスリンの作る点状局在場所に一過的に移行するとともに、この移行がＧＡＫに含まれるリン脂質が結合するＰＴＥＮ様領域に依存することが示されてきた（非特許文献１５）。さらにＧＡＫは、クラスリンアダプターＡＰ−１及びＡＰ−２のみならず、ＡＰ２アダプター複合体のｍｕ２サブユニットもリン酸化する。このことは、クラスリン被覆小胞の集合におけるＧＡＫの主要な役割を示唆する（非特許文献１６）。
【０００５】
ＧＡＫが幾つかの保存されたアミノ酸配列を持つことは、他の調節タンパク質との相互作用を介する細胞骨格ネットワークにおいて、膜輸送以外のＧＡＫの未知の役割を示唆する。例えば、低分子ヘアピンＲＮＡによるＧＡＫの発現抑制は、ＥＧＦＲ発現及びそのチロシンキナーゼ活性の劇的な亢進を引き起こし、ＥＧＦＲ信号伝達の下流で起こる様々な現象が有意に変化する（これは受容体輸送における変化に起因し得る）（非特許文献１７）。ヌクレオホスミン（nucleophosmin）未分化リンパ腫キナーゼ（ＮＰＭ−ＡＬＫ）の構成的過剰発現は、未分化大細胞リンパ腫における鍵となる発癌性事象であり、質量分析（ＭＳ／ＭＳ）により、ＮＰＭ−ＡＬＫ相互作用タンパク質の一つとしてＧＡＫが同定された（非特許文献１８）。興味深いことに、ＧＡＫは、リガンド依存性様式においてＡＲ活性を亢進するアンドロゲンレセプター（ＡＲ）相互作用タンパク質として同定され、ＧＡＫ発現は、アンドロゲンの存在とは無関係に前立腺癌の進行に応じて有意に増強した（非特許文献１９）。この報告は、細胞質内のみならず核内でのＧＡＫの役割を示唆する。クラスリン重鎖（ＣＨＣ）がｐ５３に結合し、核内のｐ５３媒介転写に寄与するという最近の知見（非特許文献２０）もまた、核内でのＧＡＫの機能を示唆する。しかしながら、直接的な証拠はこれまでに報告されていない。
【特許文献１】特開平10-286086号公報
【非特許文献１】Janssens V. and Goris, J., Biochem J 353(2001), pp. 417-439.
【非特許文献２】Janssens V et al., Curr Opin Genet Dev. 2005 Feb; 15(1): 34-41.
【非特許文献３】Ito et al., EMBO J. 2000 Feb 15; 19(4): 562-71.
【非特許文献４】Okamoto K et al., Mol Cell Biol. 1996 Nov; 16(11):6593-602.
【非特許文献５】Okamoto K et al., Mol Cell. 2002 Apr; 9(4): 761-71.
【非特許文献６】Tamura et al., Oncogene. 1993 Aug;8(8):2113-8.
【非特許文献７】Okamoto K et al., EMBO J. 1994 Oct 17; 13(20): 4816-22.
【非特許文献８】Kimura SH et al., Oncogene. 2001 May 31; 20(25): 3290-300.
【非特許文献９】Kimura SH et al., Genes Cells. 2002 Aug; 7(8): 869-80.
【非特許文献１０】Chen, Dev Cell. 2002 May;2(5):518-9.
【非特許文献１１】Kanaoka Y et al., FEBS Lett. 1997 Jan 27; 402(1): 73-80.
【非特許文献１２】Greener T et al., J Biol Chem. 2000 Jan 14; 275(2): 1365-70.
【非特許文献１３】Lee DW et al., J Cell Sci. 2005 Sep 15; 118(Pt 18):4311-21.
【非特許文献１４】Zhang CX et al., Traffic. 2005 Dec; 6(12): 1103-13.
【非特許文献１５】Lee DW et al., J Cell Sci. 2006 Sep 1; 119(Pt 17): 3502-12.
【非特許文献１６】Korolchuk and Banting, Traffic. 2002 Jun; 3(6): 428-39.
【非特許文献１７】Zhang L et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul 13; 101(28): 10296-301. Epub 2004
【非特許文献１８】Crockett DK et al., Oncogene. 2004 Apr 8; 23(15): 2617-29.
【非特許文献１９】Ray MR et al., Int J Cancer. 2006 Mar 1; 118(5): 1108-19.
【非特許文献２０】Enari M et al., Genes Dev. 2006 May 1; 20(9): 1087-99.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
遺伝子の機能解析及び／又はシグナル伝達機構の解析は、種々の疾患に対する新たな作用機序を有する医薬の開発などにつながる。本発明は、ＧＡＫ及びＰＰ２Ａ  Ｂ’αの解析結果より得られた知見に基づき、これらに関するシグナル伝達機構を解明する手段、並びに当該手段により明らかにされた作用機能に基づき新たな作用機序を有する医薬及びその開発法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ＧＡＫがＰＰ２Ａ  Ｂ’αと直接的に相互作用し、Ｔｈｒ−１０４を特異的にリン酸化すること、並びに核内でそのホスファターゼ活性を調節することを見出した。本発明者らはまた、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンを他のアミノ酸に置換したＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントを用いたアッセイが、ＰＰ２Ａの新規脱リン酸化標的を見出すために有用であること、並びにこのアッセイによりＰＰ２Ａの新規脱リン酸化標的（例、ｐ５３）を実際に同定することに成功し、本願発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、以下の通りである：
〔１〕ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンが他のアミノ酸に置換されているか、若しくは欠失しているＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体、又は該置換若しくは欠失部分を含むそのフラグメント。
〔２〕ＰＰ２Ａ  Ｂ’αがＰＰ２Ａ  Ｂ’α１である、上記〔１〕の変異体又はそのフラグメント。
〔３〕ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１がマウス由来であり、且つ該スレオニンが１０４位のスレオニンである、上記〔２〕の変異体又はそのフラグメント。
〔４〕ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１が配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列からなる、上記〔３〕の変異体又はそのフラグメント。
〔５〕該他のアミノ酸がアラニンである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの変異体又はそのフラグメント。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかのＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕上記〔６〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔８〕上記〔７〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔９〕ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系において、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかのＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントを共存させることにより脱リン酸化の程度が減少した物質をＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定することを含む、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング方法。
〔１０〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかのＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメント、上記〔７〕の発現ベクター、あるいは上記〔８〕の形質転換体を含む、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング用試薬又はキット。
〔１１〕被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得るか否かを評価することを含む、ｐ５３の転写活性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
〔１２〕被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の活性を調節し得るか否かの評価が、被験物質が、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αを基質とするＧＡＫのキナーゼ活性又はｐ５３を基質とするＰＰ２Ａ  Ｂ’αのホスファターゼ活性を調節し得るか否かを評価することにより行われる、上記〔１１〕のスクリーニング方法。
〔１３〕被験物質が、ｐ５３の転写活性を促進し得る物質のスクリーニング方法である、上記〔１１〕又は〔１２〕のスクリーニング方法。
〔１４〕ｐ５３の転写活性を調節し得る物質が細胞増殖異常に起因する疾患を予防又は治療し得る物質である、上記〔１１〕〜〔１３〕のいずれかのスクリーニング方法。
〔１５〕ｐ５３の転写活性を促進し得る物質が癌に対する医薬である、上記〔１３〕のスクリーニング方法。
〔１６〕ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得る物質を含む、ｐ５３の転写活性の調節剤。
〔１７〕ＰＰ２Ａ  Ｂ’αにおいて、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンのアミノ酸変異、あるいはＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをコードするヌクレオチド部分の変異を測定することを含む、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの変異の検出方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の変異体及びフラグメントは、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの脱リン酸化標的のスクリーニング、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの脱リン酸化標的（例、ｐ５３）の阻害に有用である。
本発明の調節剤及び調節方法は、細胞増殖の亢進を伴う疾患（例、上皮性癌、非上皮性癌、造血組織における癌（例、白血病））等の細胞増殖異常に起因する疾患の予防又は治療に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、細胞増殖異常に起因する疾患に対する医薬などの開発を可能にすることから有用である。本発明のスクリーニング方法はまた、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの脱リン酸化標的の同定、ひいては同定された脱リン酸化標的を利用して、新たな作用機序を有する医薬の開発を可能にすることから有用である。
本発明の検出方法は、本発明の変異体を用いるアッセイにおいて、または多型の検出に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体又はそのフラグメントを提供する。
【００１０】
本発明の変異体は、サイクリンＧ会合キナーゼ（ＧＡＫ）によりリン酸化されるスレオニンが他のアミノ酸に置換されているか、若しくは欠失しているＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体であり得る。ＰＰ２Ａ  Ｂ’α及びＧＡＫは、任意の哺乳動物種に由来するタンパク質であり得る。このような哺乳動物種としては、例えば、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタが挙げられる。また、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αとしては、オルタネイティブスプライシングにより産生されるサブタイプである、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α２、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３が挙げられる。
【００１１】
マウスＰＰ２Ａ  Ｂ’αでは、α１、α２、α３のいずれにおいても、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンは、１０４位のスレオニンであり得る。ヒトＰＰ２Ａ  Ｂ’αのサイズはマウスのものよりも少し大きいので、ヒトＰＰ２Ａ  Ｂ’αでは、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンは、１１４位のスレオニンであり得る。参照のため、ヒトＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のヌクレオチド配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）、並びにマウスＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のヌクレオチド配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【００１２】
本発明の変異体において、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンが他のアミノ酸に置換されている場合、他のアミノ酸は、スレオニン以外の天然α−アミノ酸であれば特に限定されず、例えば、中性アミノ酸（例、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、バリン）、酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、ヒスチジン、リジン）が挙げられるが、ドミナントネガティブ活性の観点からは、アラニンが好ましい。また、所定のタンパク質のリン酸化部位のスレオニンをグルタミン酸に変更することで、当該タンパク質の活性が恒常的に活性化されたのと同等な状態になることが周知であるので、本発明においてもまた、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをグルタミン酸に置換することも好ましい。
【００１３】
本発明の変異体において、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンが欠失している場合、本発明の欠失変異体は、スレオニンのみ欠落していてもよいが、スレオニン及びその隣接アミノ酸が１〜数個（例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、最も好ましくは１又は２個）欠落していてもよい。隣接アミノ酸はＮ及び／又はＣ隣接アミノ酸であり得る。
【００１４】
本発明の変異体において、リン酸化されるスレオニン以外のアミノ酸残基は、天然タンパク質と同一（例、配列番号２又は４）であっても、修飾されていてもよい。
【００１５】
例えば、本発明の変異体において、リン酸化されるスレオニン以外にもアミノ酸残基が修飾されている場合、本発明の変異体は、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは約９５％、より好ましくは約９７％、さらにより好ましくは約９８％、最も好ましくは約９９％以上）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなる（アミノ酸配列同一性の計算に際しては、スレオニンの置換又は欠失（隣接アミノ酸も欠失する場合、その欠失も含む）も考慮される）。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。特に断らない場合、アミノ酸配列同一性（％）は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより算出される。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。また、アミノ酸配列同一性（％）は、上記によらずに、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することもできる。別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。アミノ酸配列同一性の算出については、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法を採用してもよい。
【００１６】
また、リン酸化されるスレオニン以外にもアミノ酸残基が修飾されている場合、本発明の変異体は、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基（置換又は欠失されるスレオニン以外のアミノ酸残基）が置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施されたアミノ酸配列からなり得る。修飾されるアミノ酸の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約５０個、好ましくは１〜約４０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個、最も好ましくは１〜約１０個、１〜約５個あるいは１又は２個であり得る。
【００１７】
ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体のフラグメントは、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体の置換若しくは欠失部分を含む、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体の部分ポリペプチドであり得る。フラグメントのサイズは、所定の機能（例、免疫原性又は抗原性、ドミナントネガティブ効果）を発揮し得るサイズである限り特に限定されないが８以上、好ましくは約１２以上、より好ましくは約３０以上、さらにより好ましくは約５０以上、最も好ましくは約１００以上、約２００以上、約３００以上、約４００以上又は約５００以上のアミノ酸残基からなり得る。
【００１８】
本発明の変異体又はフラグメントは、異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合していてもよい。このようなポリペプチドとしては、精製又は可溶化を容易にするポリペプチド、蛍光ポリペプチドが挙げられる。精製又は可溶化を容易にするポリペプチドとしては、例えば、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧタグ、ＩｇＧ分子のＦｃ領域、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグが挙げられる。蛍光ポリペプチドとしては、例えば、ＧＦＰ、DsRed, Kikume Green-Red、Kaede、Keima-Red、Kusabira-Orange、Midoriishi-Cyan、Dronpa-Greenが挙げられる。なお、本発明の変異体又はフラグメントが、上述したように、異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合している場合、融合された異種アミノ酸配列は、上述したアミノ酸配列同一性の計算に際して算入されない。同様に、融合された異種アミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基は、上述したような、１以上のアミノ酸残基の１以上の修飾に含まれないものとする。
【００１９】
本発明の変異体又はそのフラグメントは、自体公知の方法により作製できる。例えば、本発明の変異体又はそのフラグメントは、１）本発明の変異体又はそのフラグメントを発現する後述の形質転換体又はその培養上清から回収してもよく、２）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系により合成してもよく、あるいは３）有機化学的に合成（例、固相合成）してもよい。本発明の変異体又はそのフラグメントは、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。
【００２０】
本発明の変異体及びフラグメントは、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αに比し、ホスファターゼ活性が変化し得る。例えば、本発明の変異体及びフラグメントは、ＧＡＫによりリン酸化されないため、ホスファターゼ活性を有し得ない。従って、本発明の変異体及びフラグメントは、ドミナントネガティブ効果により、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの標的タンパク質の脱リン酸化を減少させ得る。このような標的タンパク質としては、例えば、Ｃｈｋ２、ｐ５３、ＡＴＭ、Ｍｄｍ２が挙げられる。標的タンパク質の脱リン酸化の減少は、標的タンパク質（例、Ｃｈｋ２）の安定化、標的タンパク質（例、ｐ５３）の他のタンパク質（例、ラージＴ抗原）との相互作用の調節などを可能とする。本発明の変異体及びフラグメントはまた、後述するＰＰ２Ａ  Ｂ’αの脱リン酸化標的のスクリーニング、及びｐ５３の転写活性の調節に有用である。
【００２１】
本発明はまた、本発明の変異体又はフラグメントをコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこのような発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。
【００２２】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の変異体又はフラグメントをコードするものである限り特に限定されないが、例えば、配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列のうち、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをコードするヌクレオチド残基が他のアミノ酸をコードするように置換されているか、若しくは欠失しているか、あるいは当該置換若しくは欠失部分を含む、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α変異体遺伝子の部分ポリヌクレオチドであり得る。
【００２３】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。「プロモーターがポリヌクレオチドに機能可能に連結されている」とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を可能とするように、該遺伝子をコードするポリヌクレオチドに結合していることを意味する。
【００２４】
本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、所定の細胞で目的の物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００２５】
宿主細胞として原核生物細胞を用いる場合、原核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。このような発現ベクターは、例えば、プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のＳＮＩポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域、複製起点等のエレメントを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno（SD）配列を含むものである。これらのエレメントについては、自体公知のものを用いることができる。
【００２６】
また、宿主細胞として真核生物細胞を用いる場合、真核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。この場合、使用されるプロモーターは、哺乳動物等の真核生物で機能し得るものであれば特に制限されない。このようなプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。
【００２７】
本発明の発現ベクターはさらに、転写開始及び転写終結のための部位、及び転写領域において翻訳に必要とされ得るリボソーム結合部位、複製起点ならびに選択マーカー遺伝子などを含み得る。選択マーカー遺伝子としては、宿主として特定の細胞又は細菌を用いた場合に、形質転換体を選別できるものである限り特に限定されないが、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン等の抗生物質に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００２８】
本発明の形質転換体は、本発明の発現ベクターが導入された細胞であり得る。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、目的のポリペプチドを発現し得るものであれば特に限定されず、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞株などが挙げられる。詳細には、このような宿主細胞としては、例えば、大腸菌、バチルス属菌（例、枯草菌）、放線菌等の原核生物細胞、ならびに酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞（例、上述の哺乳動物に由来する細胞）等の真核生物細胞が挙げられる。本発明の形質転換体は、自体公知の方法により作製できる（例、Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989）参照)。
【００２９】
形質転換体の培養は、自体公知の方法により液体培地等の栄養培地中で行われ得る。培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが挙げられ、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類などを添加してもよい。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明の変異体又はそのフラグメントが大量に生産されるように適宜選択される。培養温度は、例えば３０〜３７℃である。
【００３０】
本発明はまた、本発明の変異体又はフラグメントに特異的なアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、並びにこれらの発現ベクターを提供する。このようなアンチセンス核酸及びＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明の変異体又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドにおける、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンの置換又は欠失部位をコードするヌクレオチド配列を含み、それにより本発明の変異体又はフラグメントの活性を特異的に阻害し得る。このような抗体は、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンの置換又は欠失部位を特異的に認識することにより本発明の変異体又はそのフラグメントに特異的に結合／阻害する。これらの物質は、例えば、後述するようなＰＰ２Ａ  Ｂ’αの脱リン酸化標的のスクリーニング方法におけるコントロールとして有用であり得る。
【００３１】
本発明はまた、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニング方法は、ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系において、本発明の変異体又はそのフラグメントを共存させることにより脱リン酸化の程度が減少した物質をＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定することを含み得る。
【００３２】
ＰＰ２Ａは、３つのサブユニット（Ａ、Ｂ、Ｃ）からなる、セリン／トレオニン脱リン酸化酵素である。このうちＡサブユニットは触媒活性を、Ｃサブユニットは足場機能を、Ｂサブユニットは調節機能をもつ。Ｂサブユニットには３つの亜型（Ｂ、Ｂ’、Ｂ’’）が異なる遺伝子によりコードされており、それぞれが多数の可変スプライシングによって多彩なアミノ酸を持つＢサブユニットを産生している。ＣサブユニットとＡサブユニットは共通に働き、多種類存在するＢサブユニットが入れ替わる事によりＰＰ２Ａの細胞内局在や基質特異性が決定される。サイクリンＧはＢ’サブユニットに特異的に結合し、ＰＰ２Ａを標的まで正確に運んでゆく働きをすると考えられる。海産二枚貝に蓄積する有毒成分のオカダ酸によって脱リン酸化酵素活性が特異的に阻害される。本発明で用いられるホスファターゼ反応系は、このようなＰＰ２Ａの３つのサブユニットを構成因子として含む。
【００３３】
ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系は、細胞系又は再構成系（非細胞系）であり得る。リン酸化物質は、ＰＰ２Ａにより脱リン酸化される可能性があるリン酸化物質である限り特に限定されず、例えば、リン酸化タンパク質が挙げられる。なお、本スクリーニング方法で用いられるリン酸化物質は、自体公知の有機合成法又はキナーゼ反応により調製してもよく、あるいは細胞又は組織から抽出してもよい。ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系は、ＰＰ２Ａによるホスファターゼ反応に必要な補因子をさらに含み得る。このような補因子としては、ＧＡＫ、サイクリンＧが挙げられる。ＰＰ２Ａによるホスファターゼ反応は、自体公知の方法により行うことができる（例、Okamoto et al., Mol. Cell, 2002 Apr; 9(4) 761-71）。また、ＰＰ２Ａによるホスファターゼ反応は、ＩＭＡＰテクノロジーを用いたＰＰ２Ａアッセイキット（モレキュラーデバイス社製）等の市販のキットを利用することにより簡便に行うことができる。
【００３４】
例えば、ホスファターゼ反応系が細胞系である場合、ＰＰ２Ａ発現細胞（例、初代培養細胞、細胞株）、あるいはＰＰ２Ａの全て又は一部の構成因子（例、Ｂ’α）の発現ベクターが導入された形質転換体（宿主細胞は前述と同様であり得る）を用いて本発明のスクリーニング方法が行われ得る。ＰＰ２Ａの発現細胞、及び形質転換体の作製に使用される宿主細胞は、種々のリン酸化タンパク質等を細胞内に含むことから、ＰＰ２Ａの発現細胞あるいはＰＰ２Ａの全て又は一部の構成因子の発現ベクターが導入された形質転換体は、ＰＰ２Ａ及びリン酸化物質を含むホスファターゼ反応系として利用できる。本発明の変異体又はそのフラグメントのこのような細胞系への共存は、例えば、ＰＰ２Ａ発現細胞あるいはＰＰ２Ａの全て又は一部の構成因子の発現ベクターが導入された形質転換体に対する本発明の発現ベクターの導入により達成できる。本発明の発現ベクターが導入されていない細胞系に比し、本発明の発現ベクターが導入された細胞系で脱リン酸化の程度が減少した物質が、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定され得る。脱リン酸化の程度が減少した物質の検出は、リン酸化アミノ酸（例、ホスホスレオニン、ホスホセリン、ホスホチロシン）又は非リン酸化アミノ酸（例、スレオニン、セリン、チロシン）に特異的な抗体、リン酸化又は非リン酸化タンパク質に対する特異的な抗体の使用により、放射活性（例、３２Ｐ）又は蛍光強度等のホスファターゼ活性指標の測定により、あるいは質量分析により行われ得る。例えば、質量分析が用いられる場合、本発明の変異体又はそのフラグメントの共存下で、１以上のリン酸基に相当する分子量が減少した一連のピークを同定することにより、用いた細胞内に含まれる一連の標的が網羅的に同定され得る。
【００３５】
また、ホスファターゼ反応系が再構成系である場合、本発明の変異体又はフラグメントを含まない再構成系に比し、本発明の変異体又はフラグメントを含む再構成系で脱リン酸化の程度が減少した物質が、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的として同定され得る。脱リン酸化の程度が減少した物質の検出は、上述と同様の方法により行われ得る。
【００３６】
本発明はまた、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的のスクリーニング用試薬又はキットを提供する。本発明の試薬又はキットは、本発明の変異体又はそのフラグメント、本発明の発現ベクター、あるいは本発明の形質転換体を含み得る。本発明の試薬又はキットはまた、リン酸化アミノ酸（例、ホスホスレオニン、ホスホセリン、ホスホチロシン）又は非リン酸化アミノ酸（例、スレオニン、セリン、チロシン）に特異的な抗体、リン酸化又は非リン酸化タンパク質に対する特異的な抗体などの、リン酸化の程度を測定可能な手段を含んでいてもよい。本発明の試薬又はキットはまた、本発明の変異体又はフラグメントに特異的なアンチセンス核酸、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、並びにこれらの発現ベクターを含んでいてもよい。
【００３７】
本発明は、ｐ５３の転写活性の調節剤を提供する。本発明の剤は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得る物質を含み得る。ＰＰ２Ａの構成因子としては上述したものが挙げられる。
【００３８】
一実施形態では、本発明の剤は、ｐ５３の転写活性の抑制剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を促進し得る物質を含み得る。
【００３９】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現とは、ＰＰ２Ａの構成因子をコードする遺伝子から翻訳産物（即ち、タンパク質）が産生され且つ機能的な状態でその作用部位に局在することをいう。従って、ＰＰ２Ａの構成因子の発現を促進する物質は、ＰＰ２Ａの構成因子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。なお、本明細書中で使用される場合、ＰＰ２Ａの構成因子の発現の促進としては、ＰＰ２Ａの構成因子（タンパク質）自体の補充をも含むものとする。
【００４０】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を促進する物質としては、例えば、ＰＰ２Ａの構成因子及びその発現ベクターが挙げられる。ＰＰ２Ａの構成因子は、天然タンパク質又は組換えタンパク質であり得る。ＰＰ２Ａの構成因子は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’変異体について上述したような、自体公知の方法により調製できる。
【００４１】
別の実施形態では、本発明の剤は、ｐ５３の転写活性の促進剤であり得る。この場合、本発明の剤は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を抑制し得る物質を含み得る。ＰＰ２Ａの構成因子の発現を抑制する物質は、ＰＰ２Ａの構成因子の転写、転写後調節、翻訳、翻訳後修飾、局在化およびタンパク質フォールディング等の、いかなる段階で作用するものであってもよい。
【００４２】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現を抑制する物質としては、例えば、ＰＰ２Ａの構成因子に対する、アンチセンス核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ヌクレオチド、あるいはそれらのキメラ分子）、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（細胞内に導入されることによりＲＮＡｉ効果を誘導し得るポリヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ：例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。発現ベクターは、上述と同様のものを使用できる。
【００４３】
ＰＰ２Ａの構成因子の活性を抑制する物質としては、例えば、ＰＰ２Ａの構成因子に対する抗体、ドミナントネガティブ変異体（例、本発明のＰＰ２Ａ  Ｂ’変異体又はそのフラグメント）又はそれらの発現ベクター、あるいは低分子化合物が挙げられる。
【００４４】
ＰＰ２Ａの構成因子の活性を抑制する物質はまた、ＧＡＫに対する、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体（例、キナーゼデッド変異体）、抗体、アプタマー、並びにこれらをコードする核酸を含む発現ベクターが挙げられる。
【００４５】
本発明の剤は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節する物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、あるいは散剤、顆粒剤等である。
【００４７】
非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００４８】
本発明の剤の投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式（例、経口、非経口）、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１ｍｇ〜約５．０ｇである。本発明の剤は、上述した本発明の医薬と同様に用いられ得る。
【００４９】
本発明の剤は、例えば、医薬として有用である。本発明の剤が医薬として使用される場合、例えば、細胞増殖異常に起因する疾患の予防又は治療に用いられ得る。ｐ５３の転写活性の調節により予防又は治療され得る、細胞増殖異常に起因する疾患としては、細胞増殖の亢進を伴う疾患（例、上皮性癌、非上皮性癌、造血組織における癌（例、白血病））が挙げられる。
【００５０】
本発明はまた、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節する物質を用いた、ｐ５３の転写活性の調節方法を提供する。本発明の調節方法は、インビボ又はインビトロで行われ得る。インビトロで行われる場合、例えば、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節する物質でｐ５３の発現細胞を処理することにより、ｐ５３の転写活性が調節され得る。ｐ５３の転写活性の調節は、ｐ５３の転写活性の指標（例、ｐ５３の標的遺伝子の発現）により確認できる。
【００５１】
本発明は、ｐ５３の転写活性を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得るか否かを評価することを含み得る。
【００５２】
スクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる化合物であってもよく、例えば、核酸（例、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）、糖質（例、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖）、脂質（例、飽和又は不飽和の直鎖、分岐鎖及び／又は環を含む脂肪酸）、アミノ酸、タンパク質（例、オリゴペプチド、ポリペプチド）、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリ、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリ、あるいは天然成分（例、微生物、動植物、海洋生物等由来の成分）が挙げられる。
【００５３】
本発明のスクリーニング方法は、被験物質がＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性を調節し得るか否かを評価可能である限り、如何なる形態でも行われ得る。例えば、本発明のスクリーニング方法では、細胞又は再構成系を用いて、ＰＰ２Ａの構成因子の発現又は活性が評価され得る。なお、本発明のスクリーニング方法で細胞が用いられる場合、細胞は、上述の哺乳動物由来の細胞であり得る。
【００５４】
より詳細には、細胞を用いてＰＰ２Ａの構成因子の発現を評価するスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物質をＰＰ２Ａの構成因子の発現を解析可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＰＰ２Ａの構成因子の発現量を測定する工程；
（ｃ）該発現量を、被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＰ２Ａの構成因子の発現量と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、ＰＰ２Ａの構成因子の発現量を調節する被験物質を選択する工程。
【００５５】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現を解析可能な細胞とは、ＰＰ２Ａの構成因子の産物（例、転写産物、翻訳産物）の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。ＰＰ２Ａの構成因子の産物の発現レベルを直接的に評価可能な細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現細胞であり得、一方、ＰＰ２Ａの構成因子の産物の発現レベルを間接的に評価可能な細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞であり得る。ＰＰ２Ａの構成因子の発現を解析可能な細胞は、上述した動物由来細胞であり得る。
【００５６】
ＰＰ２Ａの構成因子の発現細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子を潜在的に発現するものである限り特に限定されない。かかる細胞は、当業者であれば容易に同定でき、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、市販の細胞株、セルバンクより入手可能な細胞株などを使用できる。
【００５７】
ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞である。ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域、レポーター遺伝子は、発現ベクター中に挿入され得る。ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域は、ＰＰ２Ａの構成因子の発現を制御し得る領域である限り特に限定されないが、例えば、ＰＰ２Ａの構成因子の転写開始点から上流約２ｋｂｐまでの領域、あるいは該領域の塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、且つＰＰ２Ａの構成因子の転写を制御する能力を有する領域などが挙げられる。レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質又は検出可能な物質を生成する酵素をコードする遺伝子であればよく、例えばＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子、ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）遺伝子、ＣＡＴ（クロラムフェニコルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子等が挙げられる。
【００５８】
ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節領域、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子が導入される細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子の転写調節活性を評価できる限り、即ち、該レポーター遺伝子の発現量が定量的に解析可能である限り特に限定されない。しかしながら、ＰＰ２Ａの構成因子に対する生理的な転写調節因子を発現し、ＰＰ２Ａの構成因子の発現調節の評価により適切であると考えられることから、該導入される細胞としては、ＰＰ２Ａの構成因子の発現細胞が好ましい。
【００５９】
被験物質とＰＰ２Ａの構成因子の発現を解析可能な細胞とが接触される培地は、用いられる細胞の種類などに応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地などである。培養条件もまた、用いられる細胞の種類などに応じて適宜決定されるが、例えば、培地のｐＨは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。
【００６０】
また、ＰＰ２Ａの構成因子の活性を解析可能な細胞を用いてＰＰ２Ａの構成因子の活性を評価するスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｄ）を含み得る：
（ａ）被験物質をＰＰ２Ａの構成因子の活性を解析可能な細胞に接触させる工程；
（ｂ）被験物質を接触させた細胞におけるＰＰ２Ａの構成因子の活性を測定する工程；
（ｃ）該活性を、被験物質を接触させない対照細胞におけるＰＰ２Ａの構成因子の活性と比較する工程；
（ｄ）上記（ｃ）の比較結果に基づいて、ＰＰ２Ａの構成因子の活性を調節する被験物質を選択する工程。
【００６１】
ＰＰ２Ａの構成因子の活性を解析可能な細胞とは、ＰＰ２Ａの構成因子の活性（例、ホスファターゼ活性）を直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。このような細胞は、ＰＰ２Ａ及びその基質タンパク質（例、Ｃｈｋ２、ｐ５３）、ＧＡＫ等のタンパク質を発現する細胞であり得る。例えば、このような細胞は、ＰＰ２Ａの構成因子（例、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α）及びその基質タンパク質、並びにＧＡＫ等のタンパク質から選ばれる１以上のタンパク質の発現ベクターで形質転換された細胞であり得る。なお、ＰＰ２Ａの構成因子の活性を直接的に評価可能な細胞は、ＰＰ２Ａ及びその基質タンパク質の発現細胞であり得、一方、ＰＰ２Ａの構成因子の活性を間接的に評価可能な細胞は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α及びＧＡＫの発現細胞であり得る。なぜなら、被験物質が、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αを基質とするＧＡＫのキナーゼ活性を調節し得るか否かを評価することにより、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの活性、ひいてはＰＰ２Ａの活性を間接的に調節し得る物質のスクリーニングが可能だからである。
【００６２】
さらに、再構成系において、ＰＰ２Ａの構成因子の活性を評価するスクリーニング方法は、例えば、下記の工程（ａ）〜（ｃ）を含み得る：
（ａ）被験物質の存在下で、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性又はＧＡＫのキナーゼ活性を測定する工程；
（ｂ）該活性を、被験物質の不在下で、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性又はＧＡＫのキナーゼ活性と比較する工程；
（ｃ）上記（ｂ）の比較結果に基づいて、ＰＰ２Ａのホスファターゼ活性又はＧＡＫのキナーゼ活性を調節する被験物質を選択する工程。
【００６３】
ホスファターゼ活性の測定は、上述したように、自体公知の方法により行うことができる。また、キナーゼ活性の測定は、自体公知のインビトロキナーゼアッセイにより行うことができる（例、Yabuta, N. et al., Genes Cells, 8(5), 413-421, 2003参照）。なお、上記アッセイでは、キナーゼ活性の測定の際、必要な補因子（例、３２Ｐで標識されていてもよいＡＴＰ、塩化マグネシウム）等が適宜補充される。
【００６４】
本発明はまた、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αの変異の測定方法を提供する。本発明の検出方法は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αにおいて、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをコードするヌクレオチド部分の変異を検出することを含み得る。ＰＰ２Ａ  Ｂ’αにおける、ＧＡＫによりリン酸化されるスレオニンをコードするヌクレオチド部分の変異の検出は、自体公知の方法により行うことができる。例えば、このような方法としては、ＤＮＡシーケンシング、並びにプライマー及び核酸プローブを利用する方法が挙げられる。ＰＰ２Ａ  Ｂ’αは、本発明の形質転換体由来のもの、あるいはヒト等の哺乳動物由来のサンプルに含まれるものであり得る。本発明の検出方法は、本発明の変異体を用いるアッセイにおける当該変異体の検出に有用であり得る。本発明の検出方法はまた、本発明の変異体に該当するような多型が天然に存在する場合、そのような多型の検出を可能にし、例えば、ＰＰ２Ａに関連する疾患（例、細胞増殖異常に関連する疾患）の発症リスクの評価を可能とするため、有用である。
【００６５】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００６６】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００６７】
材料および方法
細胞培養
ヒト細胞をAmerican Type Culture Collectionから購入した。ＨＥＦは、M.Yutsudo博士からの供与物である。ＨｅＬａ細胞は、Japanese Cancer Research Resources Bank（ＪＣＲＢ）から提供された。細胞を、５％仔ウシ血清（Hyclone Laboratory, UT）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で５％ＣＯ２において３５℃で維持した。
【００６８】
抗体調製
抗ＧＡＫモノクローナル抗体を、標準的な方法に従って、ラットＧＳＴ−ＧＡＫ融合タンパク質を用いてマウスを免疫することにより作製した。ＧＳＴを認識するモノクローナル抗体は、スクリーニング手法の間に除いた。ラットＧＡＫ又はヒトサイクリンＧ１に対するポリクローナル抗体を、ラットＧＳＴ−ＧＡＫ又はヒトＧＳＴ−サイクリンＧ１を用いてニュージーランド白ウサギを免疫した後、標準的な方法によって惹起した。ＧＳＴ部分を認識する抗体は、ＧＳＴ結合樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより除去した。Ｂ’α１−α３サブタイプを区別しない抗ＰＰ２Ａ  Ｂ’αポリクローナル抗体を、既報（Ito et al., 20000）のように作製した。他の抗体は、以下の会社から購入した；Ｍｙｃ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｏｄａｌｅ，ＮＹ）、アクチン及びＧＦＰ（ＭＢＬ，Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）、ｐ５３（ＤＯ−１）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｔｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ｐ５３Ｐ−Ｓ９、ｐ５３Ｐ−Ｓ１５、ｐ５３Ｐ−Ｓ２０、ｐ５３Ｐ−Ｓ４６、ｐ５３Ｐ−Ｓ３９２、Ｃｈｋ２Ｐ−Ｔ６８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＣＨＣ、ｐ２１（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ｃｈｋ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＧＡＰＤＨ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＭＡ）、ＳＶ４０  Ｔ抗原（Ａｂ−１）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）並びにＡＴＭ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。
【００６９】
蛍光免疫染色
細胞（同調化又は対数期中）を、培養皿（直径６ｃｍ）中に浸したカバースリップ上で培養した。それらを、ＰＢＳ中の３．７％ホルムアミド、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０により連続して１０分間２０℃で固定した。培地の除去後、カバースリップ上の細胞を、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ）を補充したＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）により室温で３回（それぞれ２ｍｌで５分間）リンスした。顕微鏡用のカバースリップを持ち上げ、関連抗体を含む、パラフィルム上にスポットされた１００μｌのＴＢＳＴに対して細胞側を下にして層状にした。室温での１時間のインキュベーション後、カバースリップを培養皿において細胞側を上にして上記のようにＴＢＳＴ／ＢＳＡによりリンスした。ＦＩＴＣ−又はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−架橋抗ウサギＩｇ（ロバ由来；Ａｍｅｒｓｈａｍ）又はＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ架橋抗マウスＩｇ（ヒツジ由来；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を第２プローブとして用いて免疫染色を可視化した。これらの第２抗体をカバースリップに付着した細胞と共に１時間インキュベートし、上記のように３回リンスした。写真を撮影し、画像を、倒立レーザー走査顕微鏡顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ４１０又はＬＳＭ５１０）により記録した。
【００７０】
細胞の照射及びトランスフェクション
細胞を、Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  ４０  Ｅｘａｃｔｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｒｒａｄｉａｔｏｒ（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  Ｃａｎａｄａ）において１３７Ｃｓ線源を１．１４２Ｇｙ／分の速度で用いて１０Ｇｙ線量のγ照射に供した。ＵＶ照射を、培養培地を有する細胞及びプレートカバーを取り除いた細胞に対して、０．２２Ｊ／ｍ２／ｓの速度でgerminal lampを用いた照射によって行った。
【００７１】
免疫沈降及びウエスタンブロット解析
免疫沈降を、本質的に既報（Kanaoka et al., 1997）に記載されるように行った。簡潔には、細胞を回収し、プロテアーゼインヒビター（２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌのロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、５０μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ）を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）中で溶解した。１０，０００×ｇで５分間の遠心分離により抽出液を清澄化した後、上清のアリコートを、プロテインＡ−セファロースのみの使用によって免疫沈降させた。引き続き、清澄化した溶解液を、関連抗体を用いて免疫沈降させた。次いで、等量の新鮮又は免疫沈降した細胞抽出液を、プロテインＡ−セファロースに吸収させ、ペレットにし、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した。ウエスタンブロッティングについては、ゲル上で分解させた総細胞タンパク質及び免疫沈降物を、ニトロセルロースフィルターに転写し、関連抗体でプローブした。免疫反応性タンパク質バンドを、ＲｅｎａｉｓｓｅｎｓｅＴＭ化学発光試薬（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を用いて可視化した。
【００７２】
ＧＦＰ融合構築物の調製
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）融合ベクターのインフレーム接合（in-frame junction）を作製するため、合成リンカーを、ＡｓｃＩ−ＮｏｔＩ部位を介して、ｃＤＮＡ挿入物をインフレームに融合させるように設計したｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）中に挿入した。インフレームＡｓｃＩ−ＮｏｔＩ部位を保有するヒトＧＡＫのｃＤＮＡ挿入物を得るために、開始コドン（＋ＡｓｃＩ部位）及び終始コドン（＋ＮｏｔＩ部位）周囲のオリゴヌクレオチドのセットを合成し、関連ｃＤＮＡを基質とするＰＣＲについてのプライマーとして用いた。各遺伝子の同一性は、独立した４つのクローンのＤＮＡシーケンシングにより確認し、ミスマッチＤＮＡ配列を含まないプラスミドＤＮＡを選択し、ＡｓｃＩ及びＮｏｔＩで切断し、生成したｃＤＮＡ挿入物をＧＦＰベクター中に組み込んだ。同様の戦略を他のプラスミド構築物を作製するために適用した。ＧＦＰ−ＧＡＫプラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってＴｒａｎｓＩＴＴＭポリアミントランスフェクション試薬（Ｐａｎ  Ｖｅｒａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いてＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトし、発現したＧＦＰ融合タンパク質を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点光顕微鏡を用いて可視化した。
【００７３】
プルダウンアッセイ
ＧＳＴ−ＰＰ２Ａタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させ、グルタチオンセファロース４Ｂ上で精製した。ＧＬＡＧ−ＧＡＫを、ＴＮＴ発現系を用いることにより発現させ、溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で溶解し、これをＧＳＴ−ＰＰ２Ａタンパク質とグルタチオンセファロース４Ｂ上で混合し、徹底的な洗浄後にウエスタンブロット解析を行った。ＴＮＴ溶解液中に発現したＦＬＡＧ−ＧＡＫをポジティブコントロールとして使用し、ＧＳＴ単独をネガティブコントロールとして供した。
【００７４】
実施例１：ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１は、核内でＧＡＫと優先的に会合する
ＧＡＫは、インビボにおいてＢ’α１と会合する（データ示さず）ので、次いで、我々は、Ｂ’αサブユニットのどのサブタイプがＧＡＫと優先的に会合するか検討した。この目的のため、我々は、Ｎ末端でＭｙｃタグ化したＢ’α１、Ｂ’α２又はＢ’α３を発現できるプラスミドをＦＬＡＧタグ化ＧＡＫと共に用いて、２９３Ｔ細胞を形質転換した。なお、本実験及び以下の実験では、ＧＡＫはラット（キナーゼ活性を測定した場合）又はヒト（キナーゼ活性の測定以外の場合）由来のものを、ＰＰ２Ａ  Ｂ’αはマウス由来のものを用いた。次いで、我々は、細胞抽出液を回収し、抗Ｍｙｃ抗体により免疫沈降し、抗ＦＬＡＧ抗体によりプローブされたウエスタンブロット解析を行った。我々は、ＧＡＫがＢ’α１と最も強力に会合し、次いでＢ’α２と弱く会合し、そしてＢ’α３と非常に僅かに会合することを見出した（図１Ａ）。逆免疫沈降／ウエスタンブロット解析により、Ｂ’α２及びＢ’α３に比し、Ｂ’α１とＧＡＫの最も優先的な会合が確認された（図１Ｂ）。
次いで、我々は、免疫染色によりＰＰ２Ａ  Ｂ’αとのＧＡＫとの細胞下共局在を調べ、そして細胞質シグナルが僅かな混合（merge）シグナルを示すものの、約２５％のシグナルが核内に共局在することを見出した（図２Ｃ）。Ｂ’α３ではなくＢ’α１及びＢ’α２が核内に局在でき、また、ＧＡＫはＢ’α２よりもＢ’α１とより優先的に会合することから、この結果は、核内でＧＡＫと機能するのはＢ’α１であることを示す。
次いで、我々は、ＧＡＫのどの部分がＢ’α１と会合するか決定した。この目的のため、我々は、ＧＡＫを３つの部分に分け、同様の免疫沈降／ウエスタン解析を行い、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１がキナーゼ及び非キナーゼドメインの双方でＧＡＫと会合することを見出した（図１Ｃ）。ＧＡＫフラグメントのＰＰ２Ａ  Ｂ’α１との会合を、図２Ａの右パネルに要約する。
【００７５】
実施例２：ＧＡＫは、ＰＰ２ＡをＴｈｙ１０４でリン酸化する
次いで、我々は、ＧＡＫのこれらの会合パートナー（例、ｐ５３、ＣＨＣ又はＰＰ２Ａ  Ｂ’α）のいずれがＧＡＫによりリン酸化されるかを調べた。我々は、Ｂ’αのみがＧＡＫのリン酸化標的となることを見出した（図３Ａ）。リン酸化部位を正確に決定するために、我々は、Ｂ’α  ｃＤＮＡを４つのフラグメントに分け、Ｅ．ｃｏｌｉ中でフラグメント化Ｂ’αタンパク質を発現させ、基質として使用されるべきアフィニティー精製ＧＳＴ融合タンパク質を得た（図３Ｂ）。我々は、フラグメントα１−１のみが、ポジティブコントロールである全長Ｂ’α３（図３Ｃ、右パネル、レーン８）と同様の強いバンド（図３Ｃ、右パネル、レーン２）を示すことを見出した。このことは、α１−１フラグメントに単一のリン酸化部位が存在することを示す。この領域に含まれるセリン及びスレオニン残基のうち、我々は、ＧＡＫ標的として４つの候補を選択した（図３Ｄ、上パネルで太字として示す）。なぜなら、それらは、インビトロでＧＡＫにより直接的にリン酸化されると我々が最近決定したＧＡＫ標的残基との保存配列を保有するからである（我々の未公開の結果）。実際、我々は、示されるセリン又はスレオニンがアラニンと一つずつ置換された変異タンパク質をＥ．ｃｏｌｉ中で発現できる４種のプラスミド構築物を調製し（図３Ｄ、下パネルで１−、２−、３−又は４−変異として示す）、これらのタンパク質をアフィニティー精製し、アフィニティー精製ＧＳＴ−ＧＡＫを用いてインビトロキナーゼアッセイにそれらを供したところ、我々は、１つの構築物（α１−１−４変異）のみが３２Ｐ取り込みの非存在を示すことを見出した（図３Ｅ）。このことは、スレオニン１０４（Ｔ１０４）がＧＡＫの真のリン酸化標的であることを示す。我々は、ＷＴタンパク質とは対照的にＧＳＴ−ＧＡＫの存在下でさえもリン酸化されないα１−Ｔ１０４Ａ又はα３−Ｔ１０４Ａ変異タンパク質の調製によってこのことを確認した（図３Ｆ）。
このリン酸化の生理学的重要性についての洞察を得るため、我々は、ホスホＴ１０４Ｂ’αに対するウサギポリクローナル抗体を調製した。アフィニティー精製抗体は、ホスホＴ１０４Ｂ’αを認識した（図３Ｇ）。この抗体の質を確認するため、我々は、α１−１−３変異又はα１−１−４変異タンパク質を用いてＧＡＫの存在下又は非存在下のいずれかでインビトロキナーゼアッセイを行った。実際、我々は、α１−１−３変異タンパク質のみが、ＧＡＫが反応混合液中に存在した場合のみに、３２Ｐを取り込むことを確認できた（図３Ｈ）。この結果は、この抗体がホスホＴｈｙ１０４Ｂ’αを認識したことを示す。
【００７６】
実施例３：ＧＡＫは、インビボにおいてＴ１０４のリン酸化によりＰＰ２Ａ  Ｂ’のホスファターゼ活性を亢進する
次いで、我々は、Ｔ１０４がアラニンに置換されたＦＬＡＧタグ化ＰＰ２Ａ変異体（Ｆ−Ｔ１０４Ａ）及びＧＡＫのＭｙｃタグ化キナーゼデッド変異体（Ｍ−ｋｄ）のトランスフェクションにより、Ｔ１０４でのＰＰ２Ａ  Ｂ’のリン酸化が、インビボにおいて任意の生物学的効果を引き起こすかどうかを調べた。コントロールとして、ベクター（Ｍ−Ｖ）、ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、及びＭ−ｋｄのみを別々に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。先ず、我々は、Ｃｈｋ２の量（そのリン酸化チロシン６８がＰＰ２Ａの脱リン酸化標的であり、Ｃｈｋ２分解を引き起こす）（Dozier C et al., Biol Cell. 2004, 96(7): 509-17）を調べた。実際、我々は、外来的に発現したＭ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａを有する細胞抽出液がＣｈｋ２タンパク質量の増加を示すことを見出した（図４Ａ）。このことは、Ｃｈｋ２が、外来的に発現したＰＰ２Ａ変異体（Ｆ−Ｔ１０４Ａ）のドミナントネガティブ効果による脱リン酸化の減少に起因して安定化されることを示唆する。関連抗ホスホ抗体により明らかにされたような、リン酸化型のＣｈｋ２−Ｔ６８の顕著な増加は、本解釈を強く支持する（図３Ａ中の矢頭）。Ｆ−Ｔ１０４Ａのみの過剰発現は、このような効果を示さなかった（データ示さず）。これはおそらく、内因性ＧＡＫが内因性ＰＰ２Ａを活性化するからである；ＧＡＫ（Ｍ−ｋｄ）のキナーゼデッド変異体の共発現がこの効果の観察に必要であった。
上記の結果は、このシンプルなＴ１０４Ａアッセイが、ＰＰ２Ａの新規脱リン酸化標的を見出すために有用であることを示唆する。実際、我々がｐ５３の市販抗ホスホ抗体を試験した場合、我々は、Ｓ１５及びＳ２０がＰＰ２Ａの脱リン酸化標的の候補であり、その増強がｐ５３タンパク質自体の量の増加よりも顕著であったことを見出した。一方、Ｓ９、Ｓ４６及びＳ３９２のバンド強度は、顕著に変化しなかった。このことは、それらが標的ではないことを示唆する。興味深いことに、ＣＨＣもまた、安定化されているようである；この場合、Ｍ−ｋｄのみの過剰発現が、ＣＨＣの安定性を既に増強していた。ＧＡＫがＣＨＣを直接的にリン酸化しなかったこと（図３Ａ）を考慮すると、この結果は、ＰＰ２Ａによる脱リン酸化ではなく、ｍｕ２等のＧＡＫ標的のリン酸化（Korolchuk and Banting, Traffic. 2002 Jun; 3(6): 428-39）がこの現象の説明に重要であるかもしれないことを示唆する。
【００７７】
実施例４：ＰＰ２Ａ  Ｂ’αは、ＳＶ４０ラージＴ抗原へのｐ５３の会合において役割を果たす
２９３Ｔ細胞のｐ５３は、ＳＶ４０によりコードされる主要初期遺伝子産物であるラージＴ抗原（ＬＴａｇ）の直接的な会合により、ｐ５３のＤＮＡ結合ドメインで不活化されることが知られている（Lilysstrom et al., Genes Dev. 2006 Sep 1; 20(17): 2373-82）。我々は、ｐ５３とＬＴａｇとの間の会合が影響されるかもしれないと推測した。なぜなら、ｐ５３のＳ１５及びＳ２０の脱リン酸化は、Ｍ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａの異所共発現により妨げられるようだからである（図４Ｂ）。従って、我々は、Ｍ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａの異所発現が、２９３Ｔ細胞のγ線照射により誘導されるＤＮＡ損傷の間、ｐ５３の安定性を変更するかどうかを調べた。予期されたように、Ｍ−Ｖ、Ｍ−Ｋ及びＭ−ｋｄの異所共発現は、ｐ５３の量において如何なる変化も引き起こさなかった（図５Ａ）。しかしながら、我々は、ｐ５３の安定化を見出した；ｐ５３の量は、照射の３〜１２時間後にサンプル中で増加し、次いで、照射の２０時間後に初期の量に戻った（図５Ａ、下パネル）。この結果は、ｐ５３とＬＴａｇとの間の相互作用がＭ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａの発現により影響されたことを示唆する。
実際、我々が抗ｐ５３抗体により細胞抽出液を免疫沈降させ、ウエスタンブロットを抗ＬＴａｇ抗体によりプローブした場合、我々は、それらの会合がＭ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａの共発現により消失したことを見出した（図５Ｂ）。この結果は、ＰＰ２Ａによるｐ５３の脱リン酸化（おそらくＳ１５又はＳ２０上）が、図５Ｃに模式的に要約されるように、ｐ５３とＰＰ２Ａとの間の会合に重要であり得ることを示唆する。注意すべきことに、Ｍ−ｋｄのみの発現はそれらの会合をある程度低減させていた；このことは、ｐ５３とＬＴａｇとの間の相互作用にも影響するＧＡＫの未知リン酸化標的が存在することを示唆する。
【００７８】
実施例５：Ｔ１０４Ａの過剰発現はｐ５３を活性化する
最近の報告は、ＣＨＣがｐ５３に結合し、ｐ５３媒介転写を調節することを示唆する（Enari M et al., Genes Dev. 2006 May 1; 20(9): 1087-99）。ＧＡＫがこの調節に関与するかどうかを調べるため、我々は、２９３Ｔ細胞においてＲＴ−ＰＣＲを用いてＴ１０４Ａアッセイを行い、ｐ２１及びＰｕｍａ等のｐ５３標的遺伝子の転写を解析した。図６Ａに示されるように、我々は、ｐ２１及びＰｕｍａのｍＲＮＡレベルがＭ−ｋｄ及びＦ−Ｔ１０４Ａの異所発現により増強したことを見出した；この結果は、転写因子としてのｐ５３の機能が活性化されることを示す。この結果は、ｐ５３活性化を生じ得るｐ５３／ＬＴａｇ相互作用の消失と一致していた（図６Ｂ）。この結果は、ＧＡＫのキナーゼ活性がｐ２１転写の調節に関与することを示唆する。
【００７９】
以上を要約すれば、本発明者らにより以下が示された。
１．ＧＡＫはＰＰ２Ａと会合する（図１）
２．ＧＡＫは核タンパク質（サイクリンＧ１、ｐ５３、ＣＨＣ及びＰＰ２Ａ  Ｂ’）と会合する（図２）。
３．ＧＡＫは、ＰＰ２Ａ  Ｂ’をスレオニン１０４（Ｔ１０４）でリン酸化する（図３）。
４．ＰＰ２Ａ  Ｂ’のＴ１０４変異型の異所発現は、ｐ５３経路中の因子のリン酸化に影響する（図４）。
５．ＰＰ２Ａ  Ｂ’のＴ１０４Ａ変異型の２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションは、ｐ５３媒介転写の再活性化を生じる、ｐ５３のＳＶ４０ラージＴ抗原からの解離につながる（図５）。
６．ｐ５３標的遺伝子の転写は、ＰＰ２Ａ  Ｂ’のＴ１０４Ａ変異型の異所発現により誘導される（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】ＧＡＫが、２９３Ｔ細胞において、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α２よりも、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１及びＰＰ２Ａ  Ｂ’α３、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫ、ＦＬＡＧタグ化ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１及びＦＬＡＧタグ化ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３と優先的に共免疫沈降することを示す図である。抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いる免疫沈降（ＩＰ）をウエスタンブロット解析に供した。略語の使用は以下の通りである。３ＦＬＡＧ−ＧＡＫ（Ｆ−Ｋ）、６Ｍｙｃ−ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、６Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１（Ｍ−α１）、６Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’２（Ｍ−α２）、６Ｍｙｃ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３（Ｍ−α３）、３ＦＬＡＧ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１（Ｆ−α１）、３ＦＬＡＧ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α２（Ｆ−α２）及び３ＦＬＡＧ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３（Ｆ−α３）。ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１−１、ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１−２、ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１−３、ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１−４、ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α２−４及びＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３−４。
【図１Ｂ】ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１及びＰＰ２Ａ  Ｂ’α３が、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α２よりもＧＡＫと優先的に共免疫沈降することを示す図である。ＦＬＡＧタグ化ＧＡＫ及びＭｙｃタグ化ＰＰ２Ａ  Ｂ’各アイソフォームを２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ウエスタンブロッティングのために、抗Ｍｙｃ抗体及び抗ＦＬＡＧ抗体を用いる免疫沈降。
【図１Ｃ】ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１が、ＧＡＫのキナーゼ及び非キナーゼドメインの双方とインビボで会合することを示す図である。ＦＬＡＧタグ化ＧＡＫ及びＭｙｃタグ化ＰＰ２Ａ  Ｂ’α３を２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。抗Ｍｙｃ抗体を用いる免疫沈降を、抗Ｍｙｃ又は抗ＦＬＡＧ抗体によりプローブしたウエスタンブロット解析に供した。
【図２Ａ】フラグメント化ＧＡＫの模式図（左パネル）及びＰＰ２Ａ  Ｂ’とのそれらの会合の概略（右パネル）を示す図である。−は会合しないことを意味し、＋／−は弱い会合を意味し、＋は会合を意味する。
【図２Ｂ】ＰＰ２Ａ  Ｂ’のサブタイプの模式図（左パネル）及びＧＡＫとのそれらの会合の概略（右パネル）を示す図である。２つ又は３つの＋は、より強い会合を示す。
【図２Ｃ】抗ＧＡＫ（９−１３）及び抗ＰＰ２Ａ  Ｂ’抗体によるＴＩＧ１細胞の免疫染色（左の３つのパネル）を示す図である。標準偏差を有する棒グラフ（ｎ＝１０）は、混合（merged）画像における黄色シグナルの百分率を示す（最も右のパネル）。
【図３Ａ】ＧＡＫは、ＧＳＴ−ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１をリン酸化するが、ＣＨＣ（ＧＳＴ−ＣＨＣ１〜ＧＳＴ−ＣＨＣ５）、ＧＳＴ−ｐ５３  Ｎ末端及びＧＳＴ−ｐ５３  Ｃ末端をリン酸化しないことを示す図である。ＣＨＣ１〜ＣＨＣ５フラグメント、ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１、ｐ５３  Ｎ末端及びｐ５３  Ｃ末端フラグメントを、キナーゼアッセイについての基質として用いた。アフィニティー精製したＴＩＧＡ１（Yabuta N, et al., Nucleic Acids Res. 2006; 34(17): 4878-92）をネガティブコントロールとして用いた。
【図３Ｂ】本研究で用いたＰＰ２Ａフラグメントの模式図である。ＧＳＴ−α１−１（１−１２１ａ．ａ．）、ＧＳＴ−α１−２（１２２−２１０ａ．ａ．）、ＧＳＴ−α１−３（２１１−２７９ａ．ａ．）、ＧＳＴ−α１−４（２８０−５１５ａ．ａ．）、ＧＳＴ−α２−４（２８０−４７６ａ．ａ．）及びＧＳＴ−α３−４（２８０−４４３ａ．ａ．）。
【図３Ｃ】ＧＡＫがＰＰ２Ａ  Ｂ’α１−１フラグメントをリン酸化することを示す図である。ＧＳＴ融合α１−１、ＧＳＴ融合α１−２、ＧＳＴ融合α１−３、ＧＳＴ融合α１−４、ＧＳＴ融合α２−４、ＧＳＴ融合α３−４及びＧＳＴ融合α３を、本アッセイにおける基質として用いた。ＧＳＴ−ＮＰＭを、ネガティブコントロールとして用いた。
【図３Ｄ】本研究で用いたＰＰ２Ａ  Ｂ’α１変異フラグメントの模式図である。α１−１フラグメントには、１１個のセリン／スレオニンが存在する。４種のフラグメントを作製した（セリン又はスレオニンをアラニンに置換した）；ＧＳＴ−α１−１  ４−変異体、ＧＳＴ−α１−１  ３−変異体、ＧＳＴ−α１−１  ２−変異体、ＧＳＴ−α１−１  １−変異体。図３Ｄ中の５つのアミノ酸配列（配列番号５〜９）。
【図３Ｅ】ＧＡＫがインビトロにおいてＰＰ２Ａ  Ｂ’のＴ１０４をリン酸化することを示す図である。図３Ｄで示した残基のアラニン変異を保有するＧＳＴ融合Ｂ’α１−１フラグメントを、キナーゼアッセイにおいて、野生型α１−１フラグメント及びインタクトな野生型Ｂ’α３タンパク質と共に基質として用いた。α１−１−４フラグメントのみリン酸化されなかった。
【図３Ｆ】ＧＡＫがインビトロにおいてＰＰ２Ａ  Ｂ’のＴ１０４をリン酸化することを示す図である。ＧＳＴ融合インタクトＰＰ２Ａ  Ｂ’α１及びＢ’α３（各々Ｔ１０４Ａ変異を伴うか、又は伴わない）を、キナーゼアッセイの基質として用いた。Ｂ’α１及びＢ’α３をそれぞれ矢印又は矢頭で示す。
【図３Ｇ】抗ホスホＴ１０４抗体がＰＰ２Ａ  Ｂ’のホスホＴ１０４ペプチドを認識することを示す図である。ドットブロット解析を、ホスホペプチド及び非ホスホペプチドを用いて行った。免疫前の血清及び抗ホスホＴ１０４抗体を本解析に用いた。
【図３Ｈ】ＧＡＫがＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のＴ１０４をリン酸化することを示す図である。ＧＳＴ−α１−１  ４−変異体及びＧＳＴ−α１−１  ３−変異体を本アッセイにおける基質として用いた。抗ホスホＴ１０４抗体及び抗ＧＳＴ抗体をウエスタンブロッティングに用いた。
【図４Ａ】Ｃｈｋ２及びホスホＴ６８についてのウエスタンブロットを示す図である。Ｃｈｋ２は、ＰＰ２Ａの脱リン酸化標的タンパク質であることが知られている。９Ｍｙｃベクター（Ｍ−Ｖ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫキナーゼデッド（Ｍ−Ｋｄ）又はＭ−ｋｄ＋ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のＦＬＡＧタグ化Ｔ１０４Ａ変異体（Ｍ−ｋｄ＋Ｆ−Ｔ１０４Ａ）を、２９３Ｔ細胞中に別々にトランスフェクトした。全細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した（図４Ｂでも同様）。
【図４Ｂ】クラスリン重鎖（ＣＨＣ）、ｐ５３、ｐ２１、ｐ５３ホスホ−Ｓｅｒ９、ｐ５３ホスホ−Ｓｅｒ１５、ｐ５３ホスホ−Ｓｅｒ２０及びｐ５３ホスホ−Ｓｅｒ３９２についてのウエスタンブロット解析を示す図である。アステリスクは非特異的バンドを示す。
【図５Ａ】抗ｐ５３抗体の免疫沈降物に対する抗Ｔ抗原又は抗ｐ５３抗体によるウエスタンブロット解析を示す図である。免疫前の血清（ＩｇＧ）についての免疫沈降物もまた、コントロールとして解析した。ＴＥ（総抽出液）もまた、コントロールとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。９Ｍｙｃベクター（Ｍ−Ｖ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫキナーゼデッド（Ｍ−Ｋｄ）又はＭ−ｋｄ＋ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のＦＬＡＧタグ化Ｔ１０４Ａ変異体（Ｍ−ｋｄ＋Ｆ−Ｔ１０４Ａ）を、２９３Ｔ細胞中に別々にトランスフェクトした。アステリスクは非特異的バンドを示す。
【図５Ｂ】１０グレイ（Ｇｙ）のγ線により照射された２９３Ｔ細胞におけるｐ５３についてのウエスタンブロット解析を示す図である。細胞に照射し、各時点（３、６、１２及び２０時間）後に溶解した。Ｍｙｃタグ化ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫキナーゼデッド（Ｍ−ｋｄ）及びＦＬＡＧタグ化ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１Ｔ１０４Ａ変異体を２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。全細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【図５Ｃ】Ｔ１０４Ａ発現がｐ５３のＳＶ４０ラージＴ抗原からの解離を誘導する様式を説明する模式図である。
【図６Ａ】ｐ２１及びＰＵＭＡ遺伝子についてのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。９Ｍｙｃベクター（Ｍ−Ｖ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫ（Ｍ−Ｋ）、Ｍｙｃタグ化ＧＡＫキナーゼデッド（Ｍ−Ｋｄ）又はＭ−ｋｄ＋ＰＰ２Ａ  Ｂ’α１のＦＬＡＧタグ化Ｔ１０４Ａ変異体（Ｍ−ｋｄ＋Ｆ−Ｔ１０４Ａ）を、２９３Ｔ細胞中に別々にトランスフェクトした。２９３Ｔ細胞から抽出した総ＲＮＡを、ｐ２１及びＰＵＭＡ  ｃＤＮＡについての適切なプライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲに供した。アステリスクは、非特異的バンドを示す。
【図６Ｂ】本研究の作用仮説を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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