【手続補正書】
【提出日】平成25年11月1日(2013.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）１つまたは複数の第２の脂質と；
（ｃ）１つまたは複数の核酸と
を備え、固体コアを備える脂質粒子。
【請求項２】
約３０〜約９５モルパーセントのカチオン性脂質を備える、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記第２の脂質が、PEG-脂質、両性イオン性脂質およびステロールからなる群から選択される、請求項１に記載の粒子。
【請求項４】
約１．０〜約１０モルパーセントの第２の脂質を備える請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
直径が約１５〜約３００ｎｍである、請求項１に記載の粒子。
【請求項６】
固体コアが、低温電子顕微鏡で可視化したときに高電子密度コアである、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
固体コアが粒子の全容積の約２５〜約５０パーセントの水性領域を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項８】
固体コアが、同じ粒子サイズの単層のベシクルについて予測されるものの約２０〜約５０％のトラップ容積を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項９】
固体コアが、脂質１マイクロモルあたり約１マイクロリットルから、脂質１マイクロモルあたり約２マイクロリットルのトラップ容積を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項１０】
核酸を細胞に導入するための方法であって、細胞を請求項１に記載の脂質粒子と接触させることを備える方法。
【請求項１１】
請求項１から９のいずれか1項に記載された核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをデバイスに導入することと、
ここで、前記デバイスは、前記デバイスに導入された１つまたは複数の流れをデバイスに流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物をミキサーを用いて混合するための第２の領域とを有する；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを前記デバイスに導入して第１および第２の流れを提供することと、
ここで、前記脂質粒子形成材料はカチオン性脂質を含み、前記第１および第２の溶媒は同一ではない；
（ｃ）前記デバイスの前記第１の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを流し、ここで前記第１の流れと前記第２の流れの容積比が１．０を超え、
（ｄ）前記デバイスの前記第１の領域から前記デバイスの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを層流条件下で流し；
（ｅ）前記デバイスの前記第２の領域において、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを約１００μｓ〜約１０ｍｓの間混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと
を備える方法。
【請求項１２】
１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの流速が、約１ｍＬ／ｍｉｎから約４０ｍＬ／ｍｉｎである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
脂質粒子形成材料の濃度が約１０ｍＭ〜約５０ｍＭである、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子が、約１５〜約３００ｎｍの直径を有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ミキサーがマイクロミキサーである請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
脂質粒子における核酸カプセル封入効率が、約９０〜約１００％である、請求項１１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本発明の方法は、いくつかの点で、その他のマイクロ流体混合法から区別される。特定の既知方法が、同等または実質的に同等の割合の水性および有機溶媒（すなわち１：１）を必要とするが、本発明の方法は、一般に、１：１を越える水性対有機の溶媒比を使用する。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約２：１である。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約３：１である。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約４：１である。特定のその他の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約５：１、約１０：１、約５０：１、約１００：１またはそれ以上である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
表１は、単一のミキサーおよび１０個の個々のミキサーからなるミキサーアレイで形成された粒子サイズ分布を比較する。単一のミキサーを通る総流速は、各交差点で５０：５０の混合比を用いて、４ｍｌ／ｍｉｎであり得る。容積処理量は、１０台のミキサーを並行して作動させることによって１０倍増大でき、その結果、４０ｍｌ／ｍｉｎの総容積流速が得られる。アレイの処理量が、製造規模の合成に適していながら、ＬＮＰ寸法が維持される。
【表１】
2013510096.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
例示的実施形態を示し、記載したが、当然のことではあるが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それに種々の変法を行うことができる。
以下に本願発明の実施態様を記載する。
（１）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）１つまたは複数の第２の脂質と；
（ｃ）１つまたは複数の核酸と
を備え、固体コアを備える脂質粒子。
（２）
前記カチオン性脂質が、アミノ脂質である、（１）に記載の粒子。
（３）
前記カチオン性脂質が、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＲＩＥからなる群から選択される、（１）または（２）に記載の粒子。
（４）
前記カチオン性脂質が、次式を有する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の粒子：
【化３】
2013510096.tif 000002
式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキニルまたは任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アシルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルケニルもしくは任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルキニルであるか、またはＲ3およびＲ4は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；
ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
（５）
前記カチオン性脂質が、ジリノレイルアミノ脂質である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の粒子。
（６）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（１）から（５）のいずれか一項に記載の粒子。
（７）
約３０〜約９５モルパーセントのカチオン性脂質を備える、（１）から（６）のいずれか一項に記載の粒子。
（８）
前記第２の脂質が、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾されたセラミド、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾されたジアルキルグリセロールからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（９）
前記第２の脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡおよびＰＥＧ−ｃ−ＤＭＧからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１０）
前記第２の脂質がＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１１）
前記第２の脂質が中性脂質である、（１）から（１０）のいずれか一項に記載の粒子。
（１２）
前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１３）
前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される中性脂質である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１４）
前記第２の脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１５）
前記第２の脂質がステロールである、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１６）
約１〜約１０モルパーセントの第２の脂質を備える、（１）から（１５）のいずれか一項に記載の粒子。
（１７）
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドである、（１）から（１６）のいずれか一項に記載の粒子。
（１８）
前記核酸が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡである、（１）から（１７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１９）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、（１）から（１７）のいずれか一項に記載の粒子。
（２０）
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１）から（１９）のいずれか一項に記載の粒子。
（２１）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）中性脂質と；
（ｃ）ＰＥＧ−脂質と；
（ｄ）ステロールと；
（ｅ）１つまたは複数の核酸と
を備え、固体コアを備える脂質粒子。
（２２）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２３）
前記ＰＥＧ−脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２４）
前記中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、（２１）に記載の粒子。
（２５）
前記ステロールがコレステロールである、（２１）に記載の粒子。
（２６）
前記核酸がｓｉＲＮＡである、（２１）に記載の粒子。
（２７）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）１つまたは複数の核酸と
からなり、固体コアを備える脂質粒子。
（２８）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２９）
前記核酸がｓｉＲＮＡである、（２１）に記載の粒子。
（３０）
核酸を対象に投与するための方法であって、それを必要とする対象に、（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子を投与することを備える方法。
（３１）
核酸を細胞に導入するための方法であって、細胞を（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子と接触させることを備える方法。
（３２）
標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節するための方法であって、細胞を（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子と接触させることを備え、前記核酸が標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる方法。
（３３）
対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子を投与することを備え、前記核酸がポリペプチドの発現をサイレンシングまたは低減できる方法。
（３４）
核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをマイクロ流体デバイスに導入することと、
ここで、前記デバイスは、前記デバイスに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物をマイクロ流体ミキサーを用いて混合するための第２の領域とを有する；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを前記デバイスに導入して、層流条件下を流れる第１および第２の流れを提供することと、
ここで、前記デバイスは、前記マイクロチャネルに導入される１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有し、前記脂質粒子形成材料はカチオン性脂質を含み、前記第１および第２の溶媒は同一ではない；
（ｃ）前記デバイスの前記第１の領域から前記デバイスの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを流すことと；
（ｄ）前記デバイスの前記第２の領域において層流条件下を流れる、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと
を備える方法。
（３５）
核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをチャネルに導入することと、
ここで、デバイスは、前記チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを導入することと、
ここで、前記チャネルは、前記チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する；
（ｃ）前記チャネルの前記第１の領域から前記チャネルの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを、前記２つの流れの物理的分離を維持しながら流すことと、
ここで、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れは、前記チャネルの前記第２の領域に到達するまで混合しない；
（ｄ）前記マイクロチャネルの前記第２の領域において層流条件下を流れる、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと、
を備える方法。
（３６）
前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合することが、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの濃度または相対混合速度を変更することを備える、（３４）または（３５）に記載の方法。
（３７）
前記第３の流れを水性バッファーで希釈することをさらに備える、（３４）から（３６）のいずれか一項に記載の方法。
（３８）
前記第３の流れを希釈することが、前記第３の流れおよび水性バッファーを第２の混合構造中に流すことを備える、（３７）に記載の方法。
（３９）
カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える前記水性バッファーを透析して、前記第２の溶媒の量を低減することをさらに備える、（３４）から（３８）のいずれか一項に記載の方法。
（４０）
前記第１の溶媒が水性バッファーである、（３４）から（３９）のいずれか一項に記載の方法。
（４１）
前記第２の溶媒が水性アルコールである、（３４）から（４０）のいずれか一項に記載の方法。
（４２）
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドである、（３４）から（４２）のいずれか一項に記載の方法。
（４３）
前記アミノ脂質が、次式を有する、（３４）から（４２）のいずれか一項に記載の方法：
【化４】
2013510096.tif 000003
式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキニルまたは任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アシルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルケニルもしくは任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルキニルであるか、またはＲ3およびＲ4は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；
ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
（４４）
前記第２の流れが、第２の脂質をさらに備える、（３４）から（４３）のいずれか一項に記載の方法。
（４５）
前記第１および第２の流れの内容物を混合することが、カオス的移流を備える、（３４）から（４４）のいずれか一項に記載の方法。
（４６）
前記第１および第２の流れの内容物を混合することが、マイクロミキサーを用いて混合することを備える、（３４）から（４５）のいずれか一項に記載の方法。
（４７）
核酸カプセル封入効率が、約９０〜約１００％である、（３４）から（４６）のいずれか一項に記載の方法。
（４８）
前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの混合が、障壁によって前記第１の領域では防がれる、（３５）に記載の方法。
（４９）
前記障壁が、チャネル壁、シース流体または同心チューブである、（４８）に記載の方法。
（５０）
（３４）から（４９）のいずれか一項に記載の方法によって製造される脂質粒子。
（５１）
核酸をカプセル封入する脂質粒子を製造するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の溶液を受け取るための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の溶媒中に前記核酸を備える第１の流れを提供するための、前記第１の入口と流体連通している第１の入口マイクロチャネルと；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の溶液を受け取るための第２の入口と；
（ｄ）前記第２の溶媒中に前記脂質粒子形成材料を備える第２の流れを提供するための、前記第２の入口と流体連通している第２の入口マイクロチャネルと；
（ｅ）前記第１および第２の流れを受け取るための第３のマイクロチャネルであり、層流条件下で前記マイクロチャネルに導入された前記第１および第２の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供するように適合されている第２の領域とを有する第３のマイクロチャネルと
を備えるデバイス。
（５２）
前記第３の流れを希釈して、カプセル封入された核酸を有する安定化された脂質粒子を備える希釈流を提供するための手段をさらに備える、（５１）に記載のデバイス。
（５３）
前記マイクロチャネルが、約２０〜約３００μｍの流体力学直径を有する、（５１）または（５２）に記載のデバイス。
（５４）
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を備える、（５１）から（５３）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５５）
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、主要な流れ方向および少なくとも１つの溝または突起部が画定されている１つまたは複数の表面を有し、前記溝または突起部が前記主要な方向と角度を形成する配向を有する、（５１）から（５４）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５６）
前記第２の領域がマイクロミキサーを備える、（５１）から（５５）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５７）
前記第１および第２の流れの流速を変更するための手段をさらに備える、（５１）から（５６）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５８）
前記第３の流れを希釈するための手段が、マイクロミキサーを備える、（５２）から（５７）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５９）
前記第１の領域において、前記１つまたは複数の第１の流れを、前記１つまたは複数の第２の流れから物理的に分離するのに有効な障壁をさらに備える、（５２）から（５８）のいずれか一項に記載のデバイス。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０Ａ】
2013510096.tif 000004
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０Ｂ】
2013510096.tif 000005
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ａ】
2013510096.tif 000006
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ｂ】
2013510096.tif 000007
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２２Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２２Ｃ】
2013510096.tif 000008
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５】
2013510096.tif 000009