(57)【要約】【課題】ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）の感染によって起こるネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）の予防用ワクチン並びに該ワクチンを用いたネコ伝染性腹膜炎の予防方法、診断方法及びネコ伝染性腹膜炎感染の検査用試薬を提供する。【解決手段】配列番号３に記載のアミノ酸と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと同一又は実質的に同一の塩基配列のポリヌクレオチドを大腸菌発現用プラスミドに挿入して発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有し、好ましくは無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン液をアジュバントとして含むネコ伝染性腹膜炎用ワクチン、該ワクチンをネコに投与するネコ伝染性腹膜炎の予防方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウイルス用ワクチン。
【請求項２】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列のエピトープ部位を含む蛋白質断片及び／又は該蛋白質断片との融合タンパク質を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウイルス用ワクチン。
【請求項３】
配列番号３に記載のポリヌクレオチドと同一又は実質的に同一のポリヌクレオチドを大腸菌発現用プラスミドに挿入して発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有する請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
大腸菌で発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質がアルギニン処理されたものである請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
更にアジュバントを含む請求項１〜４いずれかに記載のワクチン。
【請求項６】
前記アジュバントがオイルアジュバントである請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記オイルアジュバントの主成分が無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン液である請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチンをネコに投与するネコ伝染性腹膜炎の予防方法。
【請求項９】
前記ワクチンを３０日以内に少なくとも２回ネコに投与する請求項８に記載のネコ伝染性腹膜炎の予防方法。
【請求項１０】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として生体試料中のＦＩＰＶ抗体を検出又は定量するネコ伝染性腹膜炎の診断方法。
【請求項１１】
配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を含む、ネコ伝染性腹膜炎感染の検査用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ；ＦＩＰＶ）の感染によって起こるネコ伝染性腹膜炎（ＦＩＰ）の予防に用いるワクチン及びＦＩＰの予防・診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＦＩＰは、多くのネコ科動物に見られる慢性進行性のウイルス性伝染病であり、発症すると、発熱、食欲不振、不活発、嘔吐、下痢、脱水等の症状を呈し、進行に伴い腹腔、胸腔に浸出液が貯留する滲出型、又は肝臓、腎臓、脾臓等の腹部臓器や眼、中枢神経、肺等の器官への化膿性肉芽腫を形成する非滲出型あるいはそれらの混合型の症状を呈する。一般に滲出型は急性、非滲出型は慢性の経過をたどるが、両型とも発症すれば死に至る。感染経路は、罹患ネコの排泄物に含まれるＦＩＰＶによる経口感染と考えられている。ＦＩＰＶは、コロナウイルス属に属するウイルスで、直径が約１００〜１５０ｎｍ、エンベロープを有し、その内側にらせん状のキャプシド構造を有している。主要な構造蛋白質は、スパイク（Ｓ蛋白質）、メンブラン（Ｍ蛋白質）、ヌクレオキャプシド（Ｎ蛋白質）の３種であり、ウイルスのゲノムは、約２０，０００塩基のプラス鎖の１本鎖ＲＮＡである。
【０００３】
ＦＩＰＶは、培養細胞における増殖の違いからＩ型（増殖が遅い）、ＩＩ型（増殖が速い）に分類されている。Ｉ型のウイルスには遺伝子配列にバリエーションがあるのに対し、ＩＩ型のウイルス間にはそのような報告はない（例えば、非特許文献１を参照。）。また、ＦＩＰＶを含むＩＩ型のネココロナウイルスは、Ｉ型ウイルスとは異なり、Ｓ蛋白質領域の遺伝子配列が組換えによってＩ型では感染できないネコ腎継代細胞（ＣＲＦＫ）で増殖することができる（例えば、非特許文献２を参照。）。さらに、Ｉ型とＩＩ型の間で、Ｍ蛋白質とＮ蛋白質は免疫学的に交差するが、Ｓ蛋白質に交差性は殆どみられない。実際にＦＩＰに感染するネコの７０％はＩ型であり、残りがＩＩ型である（例えば、非特許文献３を参照。）。にも拘わらず、これまでのワクチン開発は、ＩＩ型を用いて行われてきた。その理由は、Ｉ型の組織培養における増殖速度の遅さ、ネコに対する病原性がＩＩ型よりも低いことによる感染実験の組立てにくさ等である。
【０００４】
ＦＩＰＶは、抗体依存性感染増強（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ；ＡＤＥ）を起こすことでコロナウイルスの中でも特徴的である。ＡＤＥとは、本来異物を排除するための生体防御機構である抗体が、逆にウイルスの細胞進入を促進し症状を悪化させることである。ＦＩＰＶに自然感染又はワクチン接種して中和抗体を体内に有するネコは、抗体を有せず、初めて感染したネコよりもはるかに重症で進行の速い症状を示すことが多い（例えば非特許文献１を参照。）。ＦＩＰＶのＳ蛋白質上には、主要な中和エピトープは全て存在するものの、そのうちの多くが感染増強エピトープであることが知られている（例えば非特許文献４〜５を参照。）。一方、Ｎ蛋白質は感染増強エピトープを含まないものの、ウイルス粒子や感染細胞の表面に存在しないため、Ｎ蛋白質のみの免疫では感染を完全に防御することは難しいと考えられる。実際、ＩＩ型ＦＩＰＶのＮ蛋白質をコードする遺伝子を枠にワクシニアウイルスで発現させた組み換え体がワクチンに利用された報告があるが、感染予防効果を裏付けるデータは得られていない（特許文献１を参照。）。
【０００５】
ＦＩＰＶの３つの主要構造蛋白質のうち、中和エピトープと感染増強エピトープを有するＳ蛋白質が、早くからワクチンの抗原に利用されている。Ｖｅｎｎｅｍａらは、ＩＩ型ウイルスの中和に関する抗原決定基をコードする遺伝子（Ｓ蛋白質）をワクシニアウイルスに組み込んだ組換えワクチンを作製したが、感染は防御されず、発症が早まる結果を得た（例えば、非特許文献６を参照。）。Ｉ型Ｓ蛋白質も遺伝子ＲＮＡに対するＤＮＡの全塩基配列が決定され、それにコードされるポリペプチドが大腸菌で発現されている（特許文献２を参照。）。しかしワクチンの効果については報告がない。またネココロナＳ遺伝子の特定のアミノ酸配列を含むペプチド断片又は融合蛋白などが診断及び治療用ワクチンに利用された（特許文献３を参照。）。さらにキメラコロナＳ蛋白質を抗原とするワクチン（特許文献４及び５を参照。）、感染増強効果を引き起こす主要なエピトープを突然変異誘発によって変異させたＳ蛋白質を用いたワクチン（特許文献６を参照。）等がある。
【０００６】
他に、クランドールネコ腎臓細胞系で培養したＦＩＰＶ前駆体を免疫原とした不活化ワクチンがあるが、実用化されていない（特許文献７を参照。）。弱毒化温度感受性株を用いた生ワクチン（特許文献８を参照。）は実用化されているが、そのワクチンの効果及び安全性に関する欧米での評価は、まちまちである。理由は、おそらく高温で増殖できない温度感受性株は体内で増殖できる部位が限定されるためであろう。さらにネコヘルペスウイルスのＯＲＦにＦＩＰＶのヌクレオチドを挿入した生ワクチン（特許文献９を参照。）、改変ポックスウイルス−ＦＩＰＶ組換体を抗原とするもの（特許文献１０を参照。）等もある。
【０００７】
Ｎ蛋白質を使用するものでは、Ｎ蛋白質及びＭ蛋白質を発現する組換えアライグマポックスウイルスに関するもの（特許文献１１を参照。）、同じくＮ蛋白質及びＭ蛋白質をコードするヌクレオチド配列に関するもの（特許文献１２を参照。）、Ｎ蛋白質をコードするＤＮＡと生理食塩水からなるワクチン（特許文献１３を参照。）があるものの、安全かつ効果的なワクチンを提供するに至っていない。更に、Ｉ型ＦＩＰＶのＮ蛋白質の遺伝子領域をバキュロウイルスで発現させ、既存のネコ３種混合ワクチンとともに３回免疫して抗Ｎ抗体価の上昇を認めたワクチンがある（特許文献１４を参照。）。これは、ＦＩＰＶのみの成績ではないこと、通常２回免疫が一般的に施行されているにも拘わらず３回免疫していることから、免疫原性が低く、実用性に欠けると思われる。
【０００８】
以上のように、現時点では、ＦＩＰＶ感染の防御効果、安全性及び実用性に関して十分に満足し得るワクチンは開発されていない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許５８１１１０４号公報
【特許文献２】特開平７−３２７６８３号公報
【特許文献３】特開２００３−９３０７８号公報
【特許文献４】特開２００３−１８０３８５号公報
【特許文献５】特開２００４−３１３１９６号公報
【特許文献６】特表１０−５０５２３６号公報
【特許文献７】特表平７−５０４８９７号公報
【特許文献８】特許第２６０８９３５号公報
【特許文献９】特表２０００−５０１９２７号公報
【特許文献１０】特表２０００−５０１９３０号公報
【特許文献１１】特開平７−１８４６６２号公報
【特許文献１２】特許第２９０３１２９号公報
【特許文献１３】特開２０００−３０２６９２号公報
【特許文献１４】特開２００４−３５４９４号公報
【非特許文献１】Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．，４１，８６８，（１９８０）
【非特許文献２】Ｈｅｒｒｅｗｅｇｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２，４５０８，（１９９８）
【非特許文献３】宝達ら，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１１７，８５，（１９９１）
【非特許文献４】Ｃｏｒａｐｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，６６９５，（１９９２）
【非特許文献５】Ｏｌｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，９５６，（１９９２）
【非特許文献６】Ｖｅｎｎｅｍａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４，１４０７（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＦＩＰの感染予防に有用なワクチン並びに該ワクチンを用いたネコ伝染性腹膜炎の予防方法、診断方法及びコ伝染性腹膜炎感染の検査用試薬を提供せんとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明に係るネコ伝染性腹膜炎用ワクチンは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有する。
【００１２】
また、本発明に係るネコ伝染性腹膜炎ウイルス用ワクチンは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列のエピトープ部位を含む蛋白質断片及び／又は該蛋白質断片との融合タンパク質を有効成分として含有する。
【００１３】
更に、本発明に係るネコ伝染性腹膜炎ウイルス用ワクチンは、配列番号３に記載のポリヌクレオチドと同一又は実質的に同一の塩基配列のポリヌクレオチドを大腸菌発現用プラスミドに挿入して発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有する。
【００１４】
上記のような本発明に係るネコ伝染性腹膜炎ウイルス用ワクチンは、アジュバントを含むことが好ましく、前記アジュバントとしてはオイルアジュバントがより好ましく、更に前記オイルアジュバントの主成分が無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン液であることが好ましい。
【００１５】
本発明に係るネコ伝染性腹膜炎の予防方法は、上記のような本発明に係るワクチンをネコに投与するものであり、前記ワクチンを３０日以内に少なくとも２回ネコに投与することが好ましい。
【００１６】
また、本発明に係るネコ伝染性腹膜炎の診断方法は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として生体試料中のＦＩＰＶ抗体を検出又は定量するものである。
【００１７】
更に、本発明に係るネコ伝染性腹膜炎感染の検査用試薬は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質を含む。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス感染の予防のためのワクチン、並びに方法を提供する。本発明のワクチンは、配列番号３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を抗原として利用する。これらの蛋白質の利用によって、幅広い株に対する予防及び／又は治療効果を期待できるワクチンとすることができる。またこれらの蛋白質は感染増強エピトープを含まないため、本発明のワクチンには高い安全性を期待できる。
【００１９】
ネコ伝染性腹膜炎ウイルスは、発症後は致死的な経過を取ることが多い重篤な感染性疾患である。これまでに様々なワクチンが試みられてきたが、その評価は定まっていない。一方本発明のワクチンは、既知のワクチンに比較して予防効果に優れ、かつ安全性も高い。したがって、本発明のワクチンは、ネコ伝染性腹膜炎ウイルスの感染予防に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のワクチンは、配列番号３に記載のアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその断片を有効成分とする。前記アミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列は、ＦＩＰＶのＩ型の株  Ｙａｙｏｉ株に由来する配列番号１に記載のアミノ酸配列および配列番号２に記載の塩基配列を改変したものである。この遺伝子にコードされる蛋白質を利用したＦＩＰの予防法は知られていない。ＦＩＰＶのＩ型とＩＩ型はＳ蛋白質に対する抗血清の違いによって分類されている。両者におけるＳ蛋白質の遺伝子及びアミノ酸配列の相同性は５０％に満たない。一方、ＦＩＰＶのＮ蛋白質は、Ｉ型とＩＩ型とで９０％以上の相同性を示し、Ｉ型及びＩＩ型のＮ蛋白質に対する抗血清は互いに交差性を示す。つまり、Ｉ型の本ウイルスは、Ｉ型のみならずＩＩ型のＦＩＰＶに対しても共通する抗原として使用することができる。さらに配列番号１に記載の蛋白質は、ＦＩＰＶの増殖を抑制する免疫応答を誘導する一方、感染増強エピトープを含まない。したがって、安全性と予防効果に優れたワクチンを提供することができる。さらに、安全性が確認されているアジュバントをワクチン抗原であるＮ蛋白質に配合することにより、免疫効果が一層高まり、更に免疫注射を２回施すことによって致死率の高いＦＩＰＶ感染症からネコを安全に予防することが可能となった。
【００２１】
本発明において、望ましいアミノ酸配列は、配列番号３に対して、通常９３％以上、より望ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。配列番号３に記載のアミノ酸配列に導入しうるアミノ酸残基の変異の数は、通常２６以下、望ましくは７以下である。元の蛋白質の立体構造を保持するために、置換するアミノ酸は、元のアミノ酸に近い化学的性質のアミノ酸であることが望ましい。このような保存的置換の具体例として、例えば、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐの非極性アミノ酸間の相互置換、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎの非荷電性アミノ酸間の置換、酸性アミノ酸であるＡｓｐとＧｌｕとの置換、及び塩基性アミノ酸のＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓによる相互置換を挙げることができる。
【００２２】
エピトープを構成するアミノ酸配列を含む蛋白質断片も、本発明のワクチン有効成分として使用できる。蛋白質のエピトープ部位は、公知のいくつかの方法で決定できる。蛋白質断片は、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に同等な活性を有する断片であるかぎり、単一で用いることも、異なるアミノ酸配列からなる複数の断片を組み合わせて用いることもできる。たとえ、単一では免疫学的に同等といえない断片であっても、複数の断片の組み合せることによって免疫学的に同等な活性を示すならば、その断片の組み合せは、本発明に含まれる。また、補助的な成分の組み合せによって免疫学的に同等な活性を達成できる蛋白質断片、例えば、免疫賦活剤の配合によって配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に同等な活性を示す蛋白質断片も本発明に含まれる。更に、他の蛋白質との融合など人工的に合成された蛋白質断片も本発明に用いることができる。
【００２３】
投与された蛋白質に対する宿主の免疫応答は、１）投与された蛋白質に対する抗体価、２）細胞性免疫活性化作用、３）攻撃ウイルスに対する耐過率及び臨床的所見における対照との相違、を指標にして比較できる。
【００２４】
１）抗体価による比較
投与された蛋白質に対する抗体価は、各種のイムノアッセイによって測定することができる。例えば、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を感作したプレートに被検動物の血清試料を加え、更に当該動物のイムノグロブリンに対する標識抗体を反応させることによって、抗体価を測定することができる。
【００２５】
２）細胞性免疫活性化作用による比較
投与された蛋白質による細胞性免疫の活性化作用は、末梢血中のＴ細胞の活性化の程度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定するＣＴＬ  ａｓｓａｙ等によって評価することができる。またサイトカインや細胞障害性に関与する生体分子であるパーフォリンを指標とし、ＥＬＩＳＡ、ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等の手法によりＴ細胞の活性化レベルを測定する方法も利用される。
【００２６】
３）攻撃試験による免疫学的同等性の比較
投与された蛋白質の免疫学的な同等性は、該蛋白質を投与した個体に病原体を接種し、その防御効果によって評価することができる。防御効果は、病原体を接種後の、体温、体重等の臨床所見、あるいは生存率及び生存日数によって比較ができる。
【００２７】
配列番号２に記載のポリヌクレオチドは、Ｉ型ＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株由来であるものの、本発明のワクチンの有効成分として使用されるポリヌクレオチドの由来は、特に制限されない。天然のポリヌクレオチドであっても、人為的に変異が導入されたポリヌクレオチドであっても、人工的に合成した配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。例えば、Ｙａｙｏｉ株から誘導された変異株に由来するポリヌクレオチド、Ｙａｙｏｉ株と相同性の高い塩基配列を有するＦＩＰＶに由来するポリヌクレオチドを用いることもできる。またＹａｙｏｉ株の塩基配列に、人為的な変異を導入したポリヌクレオチドも使用することができる。
【００２８】
配列番号２に記載のポリヌクレオチドの調製及び単離は、公知のハイブリダイゼーション技術及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の技術を利用することで達成できる。ハイブリダイゼーション法に必要なプローブや、ＰＣＲ法に必要なプライマーの塩基配列は、例えば配列番号２に記載されるＮ蛋白質のｃＤＮＡ配列から設計することができる。
【００２９】
本発明のワクチンに有効成分として用いるＮ蛋白質は、公知の方法によって得られる。例えば、配列番号２に記載のポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに挿入し、宿主細胞に導入することにより発現させる。宿主としては、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等が挙げられる。より具体的には、細菌では大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、酵母では分裂酵母Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、さらに哺乳動物細胞ではＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞等である。これらの宿主への形質転換が可能なベクターには、公知のベクターが利用できる。中でも、大腸菌とプラスミドベクターを用いた発現系は、本発明のワクチンの製造に有用である。発現ベクターとしては、大腸菌における複製に必要な複製遺伝子（ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ）に目的遺伝子であるポリヌクレオチドを組み込み、大腸菌においてクローニングする。クローニングした発現ベクターを回収し、コンピテントセルに形質転換することによりＩＰＴＧを添加して、大腸菌内でＮ蛋白質の発現を誘導させることができる。このように発現させて得たＮ蛋白質は、Ｎ蛋白質に対するモノクローナル抗体を使用して特異性を確認後、必要ならば精製する。精製方法はアフィニティクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等の公知の方法を利用する。
【００３０】
本発明では、ワクチンとしての作用効果に優れる観点から、前記大腸菌で発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質がアルギニン処理されたものが好ましい。
【００３１】
本発明では、上記のように大腸菌で発現させたアミノ酸配列を含む蛋白質をアルギニン処理することで、ワクチンの作用効果を顕著に向上できる。ここで、アルギニン処理により上記のようなワクチンの作用効果が向上する理由としては明確ではないが、発現された蛋白質が、ワクチンとして好ましい構造に再形成（リフォールディング）されることが考えられる。また、アルギニンには蛋白質の溶解度を高める効果があり、蛋白質製剤の安定化に寄与することも考えられる。したがって、アルギニン処理により、これらの効果が相乗的に作用して、ワクチンの作用効果が顕著に向上されると考えられる。
【００３２】
アルギニン処理方法としては、アルギニンと前記蛋白質とを接触させる方法であれば特に限定はないが、トリス−アルギニン緩衝液中で前記蛋白質を所定時間、透析する方法が好ましい。トリス−アルギニン緩衝液に用いられるアルギニンとしては、Ｌ−アルギニンが挙げられる。また、緩衝液中のアルギニンおよびトリス（tris(hydroxymethyl)aminomethane）の量としては特に限定はない。
前記緩衝液の媒体は水であるが、他の成分として酸化型グルタチオンなどを配合すると処理効果が向上するという利点がある。
本発明では、前記アルギニン処理されたＮ蛋白質の確認については、例えば、Ｎ蛋白質を含む液の吸光度（３２０ｎｍ）を測定し、処理前と比較して処理後の測定値が高くなっているのを確認することで行うことができる。
【００３３】
本発明のＮ蛋白質は、ＦＩＰＶを感染させた培養細胞から得ることも、化学的に合成して得ることもできる。ＦＩＰＶの培養には、哺乳動物由来の初代細胞あるいは株化細胞が使用される。特にネコに由来する細胞は、ＦＩＰＶの培養に好適であり、具体的にはｆｃｗｆ４細胞やＣＲＦＫ細胞が利用できる。これらの細胞は、細胞バンクから入手することができる。化学的合成としては、アミノ酸を順番に結合して目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドとする合成方法が公知である。合成の難しい長いアミノ酸配列からなる蛋白質も、合成の容易な比較的短いアミノ酸配列からなる蛋白質断片を相互に連結することによって合成することができる。
【００３４】
得られたＮ蛋白質は、そのままワクチンとして使用した場合、抗体の産生や感染防御効果はあまり期待できない。そのため、例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化することによって、Ｎ蛋白質に対する抗体の産生や、感染防御効果の増強が必要になる。各種免疫賦活剤の添加も有効である。
【００３５】
ワクチンに配合されるアジュバントには、例えばアルミニウム塩などの無機物質、微生物もしくは微生物由来物質（ＢＣＧ、ムラミルジペプチド、百日せき菌、百日せきトキシン、コレラトキシンなど）、界面活性作用物質（サポニン、デオキシコール酸など）、油性物質（鉱油、植物油、動物油）のエマルジョン等があり、これらは、単独で使用するか、複数を組み合わせて使用することができる。本発明のワクチンに配合するアジュバントとしては、特にオイルアジュバントが好ましい。さらに好ましくはスクワランを主成分とするオイルアジュバントであり、具体的に例をあげれば、無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン液が安全性の上からも好ましい。このアジュバントの効果は予想以上に著しく、本発明のワクチンは、このアジュバントの配合によって、ＦＩＰに対する優れた防御効果と高い安全性を獲得することができる。
無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン液とは、無水マンニトールオレイン酸エステルおよびスクワランからなる溶液をいう。
【００３６】
本発明のワクチンの動物への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、動物の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。一般にネコのワクチンは、生後８週以降に２〜３週間隔で２回接種される。本発明のワクチンにおいても、生後８週以降に少なくとも１回、より好ましくは２〜３週間隔で２回接種することにより、ネコ科動物のＦＩＰの予防を達成できる。
【００３７】
本発明のワクチンは、ネコにおけるＦＩＰＶの予防に有用である。本発明において、ＦＩＰＶの予防とは、ＦＩＰＶの感染経験の無い動物、あるいは感染の後の発症前の状態に有る動物への予防的な投与によって、発症を阻害する作用を言う。発症の阻害とは、１）発症そのものを防ぐ作用、２）発症を遅らせる作用、３）発症後の症状を軽減する作用、４）発症後の治癒を早める作用、５）発症後の延命率を向上させる作用、６）発症した個体から他の個体への感染力を阻害する作用、が含まれるが、これらの作用のうちでも、本発明のワクチンは、特に発症そのものを防ぐ効果が高い。
【００３８】
また、本発明は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を抗原として、ネコ血清中の抗体を検出及び／又は定量するネコ伝染性腹膜炎ウイルス感染の検査方法に関する。実施例に示したように、Ｙａｙｏｉ株に由来するＮ蛋白質は、ＦＩＰＶの幅広い株の抗血清と強く反応する。このことは、Ｙａｙｏｉ株のＮ蛋白質が、ＦＩＰＶのワクチンとしての有用性が高いことを示すと同時に、特にＦＩＰＶのスクリーニング用抗原としても有用であることを示している。
【００３９】
抗体の検出及び／又は定量を行う方法は、公知の技術が利用できる。例えば、固相上に抗原を固定し、この抗原に結合する抗体を、抗体を認識する抗体（第２抗体）によって検出することができる。あるいは、試料中に含まれる抗体を固相上に捕捉し、この抗体に抗原を反応させることによって、抗原特異的な抗体の存在を検出することができる。いずれの方法においても、抗体や抗原は、検出を容易にするために標識しておくことができる。抗原や抗体の標識には、酵素、蛍光物質、発光物質、着色粒子、あるいは放射性同位元素などが用いられる。また、抗原を感作したラテックスや金コロイド等の粒子担体の、抗体による凝集を指標として抗体を検出する方法も利用できる。単なる粒子凝集のみならず、抗原と結合した該粒子を毛管流で移動させ、第２抗体を固定した検出域でトラップするイムノクロマトグラフィも利用可能である。
【００４０】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質に結合する抗体が検出された個体は、ＦＩＰＶの感染経験を有すると診断される。あるいは、抗体価の変化を追跡することで、症状の程度を診断することもできる。例えば、抗体価の上昇は、ウイルスの増殖に引き続いて起こる。したがって、抗体価が上昇しつつある個体は、ウイルスの増殖を伴っている可能性が高い。症状が軽快した後に抗体価が低下すれば、その個体は回復している可能性が高いと診断される。
【００４１】
本発明はまた、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス感染の検査用試薬に関する。本発明の試薬における配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質は、上記の各種のイムノアッセイフォーマットに応じて、固相や粒子に固定することができる。また、上記の各種のイムノアッセイフォーマットに応じて、標識抗体、標識を検出するために必要な付加的な試薬、陽性対照、あるいは陰性対照等と組み合せて診断用キットとすることができる。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明する。
【００４３】
ウイルス蛋白質の精製
ＦＩＰＶ  ＩＩ型  ７９−１１４６株はＡＴＣＣより購入し、ネコ腎臓由来株化細胞（ＣＲＦＫ）で培養した。培養液としてＥａｇｌｅｓ  ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｅ−ＭＥＭ）に牛胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）１０％加えたものを使用した。
【００４４】
ウイルスの精製
１００  ＴＣＩＤ50のウイルスをＣＲＦＫ細胞に接種し、３７℃で１時間吸着後、培養液を加え培養した。ＣＰＥが認められた２〜３日目に培養上清を回収した。回収した上清を濃縮し、これを２０％から６０％ショ糖密度勾配に重層して２７，０００ｒｐｍ ２時間遠心しウイルス粒子のバンドを回収した。回収したウイルス液をＮＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.４）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解した後、１００,０００ｇ １時間遠心して、その沈澱をＮＴＥ緩衝液に溶解してウイルス溶液とし、ウェスタンブロットに使用した。
【００４５】
蛋白分画：
精製ウイルスにサンプル緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ６．８），  ４％  ＳＤＳ，  ２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ，  ０．１％  ＢＰＢ）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をおこなった。泳動後のゲルを取り出し、マーカー蛋白質の位置からＮ蛋白質の分子量に相当する位置を判断して、Ｎ蛋白質が含まれる位置のゲルを切り出した。ゲルに含まれる蛋白質を回収して精製Ｎ蛋白質とし、得られた精製Ｎ蛋白質をＥＬＩＳＡ抗原として使用した。
【００４６】
ＦＩＰＶ  Ｉ型  Ｙａｙｏｉ株の塩基配列
ＦＩＰＶ  Ｉ型  Ｙａｙｏｉ株は、乳のみマウス脳で１５回継代されたウイルス（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，  Ｙａｎａｉ，Ｔ．，  Ｔｓｕｒｕｄｏｍｅ，Ｍ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，Ｈ．，  Ｗａｔａｂｅ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．，：１９８２：  Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｖｅｔ  Ｓｃｉ．；４３：６６９−６７６．）を東京大学農学部家畜微生物研究室より分与され、ネコ胎児由来株化細胞  ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｔｕｓ  ｗｈｏｌｅ  ｆｅｔｕｓ  （ｆｃｗｆ−４）  で培養した。培養液として、Ｅ−ＭＥＭ  とＬ−１５  ｍｅｄｉｕｍを等量混合した培養液にＦＣＳ１０％加えたものを使用した。
【００４７】
ウイルスＲＮＡの調製：
ＦＩＰＶ  Ｉ型  Ｙａｙｏｉ株を接種したｆｃｗｆ−４細胞を３７℃で１時間吸着後、培養液を加えＣＯ2インキュベーターで培養した。ＣＰＥを呈した細胞をセルスクレイパーで剥離し回収した。感染細胞はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、最終的にエタノール沈澱して乾燥したペレットをＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅの水に溶解してＲＮＡ溶液とした。ＲＮＡ溶液はＯｌｉｇｏ−ｄＴカラムを用いたｍＲＮＡ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）でｍＲＮＡを抽出した。
【００４８】
ＲＴ−ＰＣＲ：
Ｐ１（センス側）５'−ＣＴＧＡＣＡＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＣＡＴＧ−３'（配列番号：４）
Ｐ２（アンチセンス側）５'−ＡＣＡＧＣＡＴＧＴＡＧＧＡＡＡＡＣＧＡＧＣ−３'（配列番号：５）
ＲＴ−ＰＣＲは、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＮＡ−ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ社）を用いた。逆転写酵素反応用緩衝液に５ｍＭ ＭｇＣｌ2，１ｍＭｄＮＴＰ，  ０．４μＭセンスおよびアンチセンスプライマー、０．１Ｕ／μＬ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，０．１Ｕ／μＬ逆転写酵素およびｍＲＮＡを加えて５０℃で３０分間逆転写反応をさせて、９４℃で２分間ＲＴａｓｅの不活化の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分間を３０サイクルのＰＣＲ反応によって遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物の特異性は１％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００４９】
クローニング：
ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、滅菌蒸留水で溶解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ用緩衝液に精製したＰＣＲ産物とプラスミドベクターｐＴ７ＢｌｕｅＶｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを加えて１６℃で１時間ライゲーション反応をおこなった。環状化したＤＮＡを大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株のコンピテントセルにトランスフォームし、カルベニシリン加寒天平板培地にプレーティングして３７℃で一晩培養した。培地上にできたコロニーを釣菌してカルベニシリン加Ｌ−Ｂｒｏｔｈで１晩培養後、プラスミドを抽出して制限酵素で切断し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片の大きさを確認して、クローニングの成否を確認した。クローニングされていることを確認した大腸菌を、カルベニシリン加Ｌ−Ｂｒｏｔｈで一晩培養し、組換えプラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００５０】
塩基配列：
精製した組換えプラスミドＤＮＡから、Ｎ蛋白質遺伝子領域を含むＤＮＡの上流と下流でベクターの塩基配列をプライマーとし、ジデオキシ法に基ずいたＮ蛋白質遺伝子の塩基配列を決定した。ＦＩＰＶの遺伝子ＲＮＡの全長約２０ｋｂのうち、Ｙａｙｏｉ株のＮ蛋白質のｃＤＮＡの塩基配列および推定されるアミノ酸配列を解析し、配列番号1及び２に示した。Ｎ蛋白質遺伝子は開始コドンＡＴＧから終始コドンＴＡＡまで１，１３４塩基のＯＲＦからなり、３７８アミノ酸をコードしており、計算上４３．４７ｋＤａの初期蛋白質を発現すると推定された。
【００５１】
ホモロジー：
表１に、ＦＩＰＶ  Ｉ型に属するＹａｙｏｉ株、ＫＵ−２株、Ｂｌａｃｋ株、ＵＣＤ１株、ＦＩＰＶ  ＩＩ型に属する７９−１１４６株、ネコ腸コロナウイルス  ＩＩ型（ＦＥＣＶ）  ７９−１６８３株のＮ遺伝子のアミノ酸配列のホモロジーを示した。このアミノ酸配列の比較により、Ｙａｙｏｉ株の遺伝子は、他の５株と９０％以上の高いホモロジーを示した。表中のホモロジーは、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸのマキシマムマッチングを用いて算出し、ウイルス名は、それぞれ、表１の欄外に記載したウイルスを示す。また表の数値は、対角線上に記載した１００％の右上が塩基配列の、そして左下がアミノ酸配列の相同性を示す。
【００５２】
【表１】
2008127283.tif 000002
【００５３】
組換えＮ蛋白質の発現
ＰＣＲ：
得られた遺伝子配列を基に、Ｎ蛋白質遺伝子のＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）が発現できるように、制限酵素認識配列（Ｎｄｅ  Ｉ，Ｘｈｏ  Ｉ）を付加したプライマーを作成し、以下に示した。アンチセンスプライマーは翻訳後のコドンがメチオニンになることを避けるため、下線部の塩基をシトシンからグアニンに替えた。
Ｐ３（センス側）５'−ＴＴＧＣＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＣＧＣＧＴＣ−３'（配列番号：６）
Ｐ４（アンチセンス側）５'−ＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＴＣＧＴＡＡＣＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＴＣＴＣ−３'（配列番号：７）
ＰＣＲ反応用緩衝液に、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭ  ｄＮＴＰ，０．４μＭセンスおよびアンチセンスプライマー、０．１Ｕ／μＬ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，およびＮ蛋白質遺伝子を挿入してクローニングした組換え精製プラスミドＤＮＡを加えて、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で２分間を３０サイクル、そして７２℃で５分間のＰＣＲ反応によって遺伝子を増幅した。ＰＣＲ産物の特異性は１％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００５４】
クローニング：
クローニングにはプラスミドベクターｐＴ７ＢｌｕｅＶｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用した。ＰＣＲ産物をエタノール沈殿後、滅菌蒸留水で溶解し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ用緩衝液に精製したＰＣＲ産物とベクターのＤＮＡ断片を混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを加えて１６℃で１時間ライゲーション反応をおこなった。環状化したＤＮＡを大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ株のコンピテントセルにトランスフォームし、カルベニシリン加寒天平板培地にプレーティングして３７℃で一晩培養した。培地上にできたコロニーを釣菌してカルベニシリン加Ｌ−Ｂｒｏｔｈで１晩培養後、プラスミドを抽出して塩基配列及びアミノ酸配列を再確認した(配列番号３)。また、制限酵素で切断し、１％アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片の大きさを確認して、クローニングの成否を確認した。クローニングされていることを確認した大腸菌を、カルベニシリン加Ｌ−Ｂｒｏｔｈで一晩培養し、組換えプラスミドＤＮＡを抽出・精製した。
【００５５】
組み換えプラスミドＤＮＡの構築
精製したプラスミドＤＮＡは、プライマー上に配置したＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉサイトで制限酵素を用いて消化した。また、発現用プラスミドベクターは、ｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を使用し、同じくＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ制限酵素で消化した。両者を１％アガロースゲルで電気泳動後、ＤＮＡを含むゲルを切り出してＤＮＡを抽出、精製した。精製した両断片にＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを加えて１６℃で１時間ライゲーション反応をおこない、環状のプラスミドを形成させ、コンピテントセルにトランスフォームしてクローニングした。
【００５６】
組み換え蛋白質の発現
精製したｃＤＮＡは、更に大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォームしてクロラムフェニコールとカルベニシリン加寒天平板培地にプレーティングして３７℃で一晩培養した。上記抗生物質耐性コロニーを釣菌し、カルベニシリン加Ｌ−Ｂｒｏｔｈ  ４０ｍＬを３７℃３時間培養後０．１ｍＭ  ＩＰＴＧでヒスチジンが付加された融合Ｎ蛋白質の発現を誘導した。誘導後３時間後に、増殖した大腸菌を集菌し、超音波処理および０．５％トライトンＸ−１００を用いて可溶化した後、１００，０００ｇ  １時間の超遠心した上清を採取した。この可溶性分画からニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ニッケルレジンに結合した融合Ｎ蛋白をイミダゾールで溶出して精製した。溶出された精製蛋白は５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２００ｍＭ ＮａＣｌで透析して実験に用いた。
【００５７】
また、別な精製方法として以下の方法でも精製することが可能である。ｐＥＴ１６ｂにＦＩＰＶのＮ蛋白遺伝子をＮｄｅ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉサイトへ挿入し、ＢＬ２１（ＤＥ３）でＨｉｓｔ−Ｔａｇを含む融合Ｎ蛋白質を発現させた。大腸菌は超音波処理後、高圧ホモジナイザーを用いて粉砕し、７０００ｒｐｍ、４０分間遠心した上清を５０％飽和硫安で塩析した。塩析したペレットに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、８Ｍ 尿素、２．５％グリセリン３５０ｍＬで可溶化し、５，１，０．２２フィルターで濾過した後、同緩衝液で１Ｌとし、イオン交換クロマトグラフィー精製した。イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換体であるＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦを用いて実施した。平衡化溶液は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、８Ｍ  尿素、２．５％グリセリンを使用し、溶出は平衡化緩衝液に１Ｍ  ＮａＣｌを加える塩濃度勾配によって実施した(図５)。Ｎ蛋白溶出分画はＰＢＳ（−）で４℃一晩透析したサンプルと以下の緩衝液と手順で透析したサンプルの２種類を作成した。基本緩衝液 （５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ）＋４Ｍ尿素で４℃一晩。次に基本緩衝液＋２Ｍ尿素＋３７５μＭ  ＧＳＳＧ（Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）＋４００ｍＭ  Ｌ−アルギニンで４℃４時間。最後に基本緩衝液で４℃一晩透析（以下、トリス−アルギニン透析という。）した。
【００５８】
特異性の確認
ウェスタンブロット：
作製した抗原にサンプル緩衝液を加えて１００℃で５分間加熱処理した後、１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開した。ゲルを取り出し、転写装置を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。転写膜は５％スキムミルクで浸漬しブロッキングした。
１次血清としてＦＩＰＶ（７９−１１４６株）感染猫血清（II型抗血清）及びＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株の精製ウイルスをウサギに免疫した抗血清（I型抗血清）を使用した。転写膜を３７℃で１時間反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
２次血清としてＰＯＤ標識ヤギ抗ネコＩｇＧまたはＰＯＤ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧを使用した。標識抗体を加えた血清希釈液に浸漬して３７℃で１時間反応させた後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。転写膜を基質液（０．０２％  ＤＡＢ，０．００６％  Ｈ2Ｏ2，０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））に５〜２０分程度浸漬して発色させた後、蒸留水で洗浄し反応を停止させた。
【００５９】
発現Ｎ蛋白質の精製と検出
ウェスタンブロットの結果から、配列番号３のアミノ酸配列を有する組換えＮ蛋白質はニッケルカラムアフィニティークロマトグラフィーにおいて５０ｍＭイミダゾールでは溶出されず、５００ｍＭイミダゾールで溶出することができた。
ＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株のＮ蛋白質は計算上約４３ｋＤａの分子量を示すが、ベクター上の融合蛋白質を加えて約４８．４ｋＤａの融合蛋白質として発現される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのＣＢＢ染色や抗ＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株ウサギ血清またはＦＩＰＶ（７９−１１４６株）感染猫血清を用いた免疫ブロット像から、推定された４８．４ｋＤａのバンドが検出された。さらに、ＦＩＰＶのＩ型及びＩＩ型の両抗血清に反応したことから、発現蛋白質がＮ蛋白質であることが確認された（図２,３,４）。一方、イオン交換体で精製し、溶出した分画ピーク１とピーク２をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットで解析した結果、感染猫血清を用いた免疫ブロット像からイオン交換体クロマトグラフィーで精製した溶出分画ピーク１が計算上４８．５ｋＤａの分子量として検出されたことから、ピーク１の溶出分画にＦＩＰＶのＮ蛋白質が高濃度に含有されていることが確認された（図５，６）。
【００６０】
アジュバントの検討
アジュバントとして、日本国内で市販されているネコ４種混合不活化ワクチン［京都微研フィライン−４や京都微研フィライン−７（商品名、株式会社微生物化学研究所）］に含まれるＯ／Ｗ（水中油）型のオイルアジュバントである無水マンニトールオレイン酸エステル（ＡＭＯＥ）加スクワラン液（無水マンニトールオレイン酸エステル６ｖｏｌ％、粧原基スクワラン４０ｖｏｌ％）、同じくＯ／Ｗ型のオイルアジュバントであるＩＳＡ−２５（Ｓｅｐｉｃ社）、水酸化アルミニウムゲル（Ｒｅｈｅｉｓ社）を用いて、発現Ｎ蛋白質に対するＥＬＩＳＡ抗体価を比較し、最適なアジュバントを選択した。３〜３．５ヶ月齢のコロナウイルス抗体陰性のＳＰＦネコを１群３頭用いて、１頭当たり０．１ｍｇになるようにＮ蛋白質抗原と各アジュバントを混合し、１ｍＬを１用量とした。３週間隔で２回、猫の頸部皮下に免疫し、採血した血清について抗Ｎ−ＥＬＩＳＡ抗体価を測定した。
その結果、水酸化アルミニウムゲルは、２回免疫では抗体の上昇が認められなかった。また、ＡＭＯＥ加スクワランは、ＩＳＡ−２５より高い抗体価を示した。したがって、以後の感染防御試験では、ＡＭＯＥ加スクワラン液をアジュバントとして使用した（図７，８，９）。
【００６１】
ワクチンの作製
抗原の調製：
精製した発現Ｎ蛋白質（配列番号３のアミノ酸からなるＮ蛋白質）は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ社）により抗原の吸光度（波長５６２ｎｍ）を分光光度計で測定し、ＢＳＡの検量線から抗原の蛋白量を算出し、０．５ｍＬ当たり０．１ｍｇになるように調整した。
【００６２】
アジュバント：
前記検討結果から、アジュバントとしてＡＭＯＥ加スクワランを抗原０．５ｍＬに対して０．５ｍＬ混合し、良く混和してワクチンとした。対照としてＰＢＳ０．５ｍＬにアジュバント０．５ｍＬを混合して使用した。以上のワクチン１ｍＬを１用量とした。
【００６３】
免疫試験（１）
動物：
実験動物には、３〜３．５ヶ月齢のコロナウイルス抗体陰性のＳＰＦネコを用いた。１頭当たり１００μｇに調整したＮ蛋白質ワクチンの免疫群に４頭（猫Ｎｏ．１，２，３，４）を使用し、対照群には２頭（猫Ｎｏ．５，６）を使用した（表２）。
【００６４】
【表２】
2008127283.tif 000003
【００６５】
ワクチン接種：
ワクチン１用量を、３週間隔で２回、頸部皮下に接種した（図１）。各免疫の直前に採血をして、その血清の抗体価を測定した。
【００６６】
攻撃方法：
免疫試験のネコに対し、２回目の免疫後２週目に攻撃試験を実施した（図１）。攻撃用ウイルスとして、ＦＩＰＶのＩＩ型である７９−１１４６株を使用し、その１０3.0ＴＣＩＤ50（１ｍＬ）を経口接種した（表２）。臨床症状は、ウイルス接種日から実験終了まで毎日観察した。体温、体重は、１〜３日毎に測定した。直腸及び口腔拭い液（スワブ）を適時採取してウイルス分離後に使用した。また、抗体測定用に適時採血した。
【００６７】
体温の推移：
免疫猫４頭及び対照猫２頭は、３週間隔で２回の免疫によって発熱を示すことはなかった。対照猫２頭は、攻撃後２日目と３日目に、免疫猫（Ｎｏ．４）は、同じく３日目に４０℃を超える一過性の発熱を示した。対照猫２頭は、攻撃後１３日目と１５日目から死亡するまでの約１０日間、持続性の発熱を示した。発熱した免疫猫Ｎｏ．４は、一過性の発熱後、２回４０℃を超える発熱を示した。その他の免疫猫は、３８℃〜３９℃前後の平熱を維持した（図１０）。
【００６８】
体重の推移：
免疫期間中（初回免疫後５週間）、いずれの猫も順調に体重の増加を示した。対照猫Ｎｏ．５は、初回攻撃後３日目から、また対照猫Ｎｏ．６は、初回攻撃後２日目から体重が減少し、その後、一時的に体重の回復が認められたが、攻撃後１７日目以降から死亡するまで体重の減少が示された。免疫猫Ｎｏ，４も、攻撃後３日目から体重の低下が認められたが、その後、体重の増減を繰り返した後、２９日目から下降して死亡した。その他の免疫猫は、攻撃後も順調に体重の増加を示した（図１１）。
【００６９】
血球数：
白血球数は、攻撃後２週目に、対照猫Ｎｏ．５とＮｏ６で、約５０×１０2／μＬまで顕著に低下して死亡した。その他の免疫猫では、極端な増加または減少は認められなかった（図１０）。赤血球数においては、攻撃後、対照猫では約５００×１０4／μＬまで極端に低下して死亡した。また、死亡した免疫猫Ｎｏ．４も同じレベルまで低下した。その他の免疫猫では極端な増加または減少は認められなかった。ヘマトクリット値もほぼ赤血球数と同じように推移した（図１２，１３，１４）。
【００７０】
ウイルスの検出：
攻撃後に採取した直腸スワブを１０倍階段希釈し、ＣＲＦＫ細胞に接種して３７℃で１週間ＣＰＥ（細胞変性効果）を指標にして観察した。また、直腸スワブからＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲでウイルス遺伝子を検出することにより、生体内におけるウイルスの増殖を確認した。攻撃後の直腸スワブからのウイルス分離では、いずれの猫からもＣＲＦＫ細胞に感染するウイルスは認められなかった。また、ＲＴ−ＰＣＲ法によるウイルス検出では、Ｎｏ．１．２，６で３日目に、Ｎｏ．２，３，４で１４日目に、Ｎｏ．２で４９日目に検出された。直腸におけるウイルスの存在と本疾病の発病との関連性は導きだせなかった（表３）。しかし、口腔スワブでは、対照猫Ｎｏ．５が攻撃後３日目に、また、同じく対照猫Ｎｏ．６が３日目と７日目に、ＲＴ−ＰＣＲ法によってＦＩＰＶが検出された。一方、免疫猫は、ウイルス分離及びＲＴ−ＰＣＲ法のいずれでもウイルスは検出されなかった（表４）。
【００７１】
【表３】
2008127283.tif 000004
【００７２】
【表４】
2008127283.tif 000005
【００７３】
中和抗体価の測定：
９６  ｗｅｌｌプレートで４倍階段希釈したネコ血清０．０２５ｍＬと２００  ＴＣＩＤ50に調整したウイルス液を等量混合し、３７℃で１時間反応させた。これにＣＲＦＫ細胞を１×１０6／ｗｅｌｌ加え１週間培養した。ＣＰＥ（細胞変性効果）を完全に抑制したネコ血清の最高希釈倍数の逆数を中和抗体価とした。
Ｎ蛋白質免疫猫１頭（Ｎｏ．４）及び対照猫２頭（Ｎｏ．５，６）は、攻撃後２週目から中和抗体が検出され、その他の免疫猫は０週〜１２週目まで、いずれも４倍未満であった。免疫猫は初期感染防御によって攻撃ウイルスの侵入を防いだ結果、中和抗体が産生されず、ＡＤＥが起こらなかった。しかし、ウイルス侵入を許容した個体では中和抗体が産生され、ＡＤＥによってウイルス量が増加していることが推察された（表５）。
【００７４】
【表５】
2008127283.tif 000006
【００７５】
ＥＬＩＳＡによる抗Ｎ抗体価の測定：
ウイルス感染細胞培養上清から抽出したＮ蛋白質を抗原として、固相化用緩衝液で希釈してＥＬＩＳＡプレートに分注し、４℃で一晩固相化した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０加ＰＢＳ（−）で洗浄後、０．３％牛血清アルブミン及び５％サッカロース加ＰＢＳ（−）を使って３７℃３０分間静置してブロッキングした。洗浄後、１次血清として採血したネコの血清を希釈液で１００倍に希釈して３７℃１時間反応させた。洗浄後、希釈したＰＯＤ標識ヤギ抗ネコＩｇＧ抗体を３７℃１時間反応させた。洗浄後、基質液を加え常温で３０分発色させ、反応停止液を加えて４９２及び６３０ｎｍで吸光度を測定した。
３週間隔２回の免疫後２週目から免疫猫Ｎｏ．１，２，４では、抗Ｎ−ＥＬＩＳＡ抗体価の上昇が確認された。これに対して、対照猫Ｎｏ．５及び６では抗Ｎ抗体の上昇は認められず、免疫猫Ｎｏ．３は対照猫に比べれば、わずかではあるが抗体応答が認められた。免疫猫Ｎｏ．４は攻撃後２週目から高い抗体価の上昇を示し、その後死亡する４週間高い抗体価を維持した。対照猫Ｎｏ．５及び６では攻撃後３週目から死亡する１から２週間、抗体価の上昇が認められた。免疫猫Ｎｏ．１及び２はウイルスの攻撃に対して抗体価の変化はなく、一定の抗体レベルを維持した。一方、抗体レベルの低かった免疫猫Ｎｏ．３は攻撃後３週目から徐々に抗体価の上昇を示した。攻撃後の極端な抗Ｎ抗体の上昇は、初期感染防御できなかった猫が攻撃株に対する中和抗体が産生され、これによって最終的に攻撃株に対する抗体依存性促進作用（ＡＤＥ）が起こり、腹・胸水の病状をともなって死亡することになる。しかし、免疫猫Ｎｏ．１、２、３は、ウイルスの初期感染を防御したことによって中和抗体が産生されず、ＡＤＥを免れたことが推察された（図１５）。
【００７６】
生存率：
対照猫Ｎｏ．６は攻撃後２６日目に、Ｎｏ．５は２９日目に死亡し、対照猫の致死率は１００％を示した。両猫は剖検によって腹水の貯留が確認された。一方、Ｎ蛋白質免疫猫のうち、Ｎｏ．４は攻撃後４８日目に腹水貯留をともなって死亡したが、対照猫よりも長く生存した。このことは、初期感染においてウイルスに対する抵抗力が対照猫に比べて強かったことを意味し、ＡＤＥによって死亡することにはなるが、中和抗体保有猫がＡＤＥによって早死にするのではなく、ワクチンによる延命効果が示されたものである。１回目の攻撃で生存した免疫猫は、初回攻撃後約２ヶ月間生存し、従ってＮ蛋白質免疫猫の生存率は７５％（４頭中３頭）を示した（図１６）。
一方、イオン交換体で精製したＮ蛋白質をＰＢＳ透析及びトリス−アルギニン透析した各サンプルを１００μｇ／ｍＬになるようにＡＭＯＥ加スクワランオイルアジュバントと混合して３週間隔２回免疫後２週目にＦＩＰＶのＩＩ型である７９−１１４６株を使用し、その１０3.0ＴＣＩＤ50（１ｍＬ）を経口感染させた感染防御試験の結果、未接種対照群は全頭腹水または胸水の貯留を示して死亡し、ＰＢＳ透析では５頭中３頭が腹水または胸水の貯留を示して死亡したが、トリス−アルギニン透析では５頭中４頭が生存した。（図１７）。この結果から、大腸菌発現させたＮ蛋白質が尿素によって可溶化されてその立体構造が失われたが、ＰＢＳ透析よりもトリス−アルギニン透析によって天然型もしくは類似する立体的な構造を再構成させ、免疫機能を誘導したものと思われる。
【００７７】
再感染防御試験
攻撃方法：
初回ウイルス攻撃に対してＦＩＰＶの感染及び症状を示さなかった免疫猫３頭（Ｎｏ．１、２、３）に対して初回攻撃９週後に再攻撃を行った。攻撃方法は、初回と同様に７９−１１４６株を用いて、その１０3.0ＴＣＩＤ50（１ｍＬ）を経口接種し、８週間観察した（図１）。
【００７８】
体温の推移：
Ｎｏ．２は、再攻撃後４日目から４０℃を超える一過性の発熱を示した後、再攻撃後３７日目から再び４０℃前後の発熱が試験終了日まで続いた。Ｎｏ．１及び３は、３８．５℃前後の平熱を８週間維持し、感染の兆候を示さなかった（図８）。
【００７９】
体重の増加：
Ｎｏ．１及び３は、再攻撃から８週間、体重の増減が認められず、成猫の体重を維持した。Ｎｏ．２は、再攻撃後２８日目以降から徐々に体重の低下が認められた（図９）。
【００８０】
血球数：
白血球数は、Ｎｏ．３において、再攻撃後、徐々に増加したが、正常範囲内であった。その他の猫も正常値を維持した（図１２）。赤血球についても、いずれの猫も正常範囲内に推移しているが、Ｎｏ．２において、再攻撃後、徐々に減少傾向を示した（図１３）。ヘマトクリット値は、Ｎｏ．２において、他の猫に比べて、再攻撃後、低下傾向を示した（図１４）。
【００８１】
ウイルスの検出：
再感染後０、３、７、１０、１４、２８、４２日目の糞便及び口腔スワブから、ＣＲＦＫ細胞を用いたウイルス分離及びＲＴ−ＰＣＲ法による検出においてウイルスを検出することはできなかった。再感染によるウイルス増殖が初回攻撃に比べて抑制されていることが示された（表３，４）。
【００８２】
中和抗体価：
免疫猫Ｎｏ．２においては、再攻撃後２週目から中和抗体の上昇が示され、６週後には６５，５３６倍の高い抗体価を示した。これに対して、免疫猫Ｎｏ．１及び３は、再攻撃に対して中和抗体の上昇が認められず、ウイルスの再攻撃に対して感染防御したことが示された（表６）。
【００８３】
【表６】
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【００８４】
ＥＬＩＳＡによる抗Ｎ抗体価の測定：
中和抗体価が陰性であった免疫猫Ｎｏ．１及び３は、再攻撃に際して、それまで維持していた抗Ｎ抗体の１．０前後のＯ．Ｄ．値を、試験を終了した２２週目まで同レベルの抗Ｎ抗体を保有し続けた。これに対して、中和抗体を保持した免疫猫Ｎｏ．２は、再攻撃前のＯ．Ｄ．値１．７から再攻撃後の２週目には３．５以上の値を示した。再攻撃したウイルスがＡＤＥによって増加したことが推察されたが、試験終了日までの８週間生存した（図１５）。
【００８５】
剖検所見と生存率：
試験終了後、Ｎｏ．２を剖検した結果、多量の腹水が貯留しており、試験終了日以降に死亡していたかもしれないが、初回攻撃における対照猫が攻撃後４週以内に死亡したのに対して、８週以上生存していたことは、本ワクチンの免疫効果により、再攻撃に対しても延命効果を示したことになる。また、他の免疫猫Ｎｏ．１及び３を剖検した結果、腹水や胸水の貯留はなく、主要臓器における結節等、本疾病を示す病的変化は認められなかった。従って、再攻撃における生存率は１００％であった（図１６）。
【００８６】
実用性：
通常、動物用ワクチンは、ワクチン未接種の動物に対してはブースター効果を期待し、２回もしくはそれ以上のワクチン接種によってその防御効果を最大限に発揮させる。本ワクチンでは、２回の免疫によって抗Ｎ蛋白抗体の産生が認められ、さらに、致死率１００％の２回のウイルス攻撃に対して、免疫猫２頭はＡＤＥを誘導する中和抗体を産生せず、本疾病の感染防御を達成した。また、その他の免疫猫２頭は中和抗体の産生にもかかわらず、延命効果を示した。これは、アジュバントによる免疫増強により、主として細胞性免疫が強化されたものと思われ、これまでのＦＩＰウイルスに対するワクチンと比較して有意性を示すものである。一方、アフィニティークロマトグラフィー精製よりも実用的な製造方法として、尿素存在下でのイオン交換体によって精製されたＮ蛋白質をトリス−アルギニン透析する方法の優位性が感染防御試験によって確認された。アルギニンの蛋白再形成への効果によるものであり、感染防御試験において未接種対照群の生存率が０％に対してトリス−アルギニン透析処理した精製ＦＩＰＶを接種した群の生存率は８０％を示した（図１７）。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】感染防御試験の設定と日程。
【図２】発現Ｎ蛋白質のアフィニティークロマトグラフィー精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像（ＣＢＢ染色）。  レーン１：精製前。  レーン２：ニッケルレジン未吸着液。  レーン３、４、５、６：５０ｍＭイミダゾール溶出液。  レーン７〜１２：５００ｍＭイミダゾール溶出液。
【図３】発現Ｎ蛋白質のアフィニティークロマトグラフィー精製のウエスタンブロッティング像（ＦＩＰＶ７９−１１４６株感染猫血清とＰＯＤ標識ヤギ抗猫ＩｇＧ抗体を用いて検出）。  レーン１：精製前。  レーン２：ニッケルレジン未吸着液。  レーン３、４、５、６：５０ｍＭイミダゾール溶出液。  レーン７〜１２：５００ｍＭイミダゾール溶出液。
【図４】発現N蛋白質のアフィニティークロマトグラフィー精製のウエスタンブロッティング像（ＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株精製ウイルス免疫ウサギ血清とＰＯＤ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出）。  レーン１：精製前。  レーン２：ニッケルレジン未吸着液。  レーン３、４、５、６：５０ｍＭイミダゾール溶出液。  レーン７〜１２：５００ｍＭイミダゾール溶出液。
【図５】発現Ｎ蛋白質のイオン交換クロマトグラフィー精製１Ｍ  ＮａＣｌ濃度勾配及び吸光度２８０ｎｍにおける溶出ピーク
【図６】イオン交換クロマトグラフィーで精製した発現蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＣＢＢ染色）(左)及びウェスタンブロッティング像（ＦＩＰＶ  Ｙａｙｏｉ株精製ウイルス免疫ウサギ血清とＰＯＤ標識ヤギＩｇＧ抗体を用いて検出）(右)  レーン１：精製前  レーン２：ピーク１  レーン３：ピーク２
【図７】発現Ｎ蛋白質と水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ2Ｏ3）を免疫した猫の抗Ｎ−ＥＬＩＳＡ抗体価。
【図８】発現Ｎ蛋白質とＩＳＡ−２５アジュバントを免疫した猫の抗Ｎ−ＥＬＩＳＡ抗体価。
【図９】発現Ｎ蛋白質と無水マンニトールオレイン酸エステル加スクワラン（ＡＭＯＥ−Ｓ）免疫した猫の抗Ｎ−ＥＬＩＳＡ抗体価。
【図１０】試験期間中の猫の体温の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１１】試験期間中の猫の体重の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１２】試験期間中の猫の白血球数の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１３】試験期間中の猫の赤血球数の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１４】試験期間中の猫のヘマトクリット値の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１５】試験期間中の抗Ｎ蛋白質抗体価の推移。  猫Ｎｏ．１，２，３，４は発現Ｎ蛋白質免疫猫。  Ｎｏ．５，６は対照猫。  黒矢印はワクチン接種。白矢印は攻撃ウイルス接種。
【図１６】攻撃試験後の生存率（１）。白矢印は攻撃ウイルス接種。    アフィニティークロマトグラフィー精製Ｎ蛋白免疫猫及び対照猫の攻撃試験生存率
【図１７】攻撃試験後の生存率（２）。白矢印は攻撃ウイルス接種。    イオン交換クロマトグラフィー精製Ｎ蛋白免疫猫及び対照猫の攻撃試験生存率
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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