【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
個々のコロニーのパッチを、まず３ｍｌのＳＥＧ（２％グルコース、０．１％ＥｔＯＨ）培地に播種し、１５０ｒｐｍの回転ドラム中、３０℃で１晩（２０時間）増殖させた。２０ｍｌのＳＥＧ培地が入っている１２５ｍｌのフラスコに、１晩培養物をＯＤ６００  約０．３になるまで播種し、しっかりと蓋を閉めた。１５０ｒｐｍで振盪しながら、培養物を３０℃で増殖させた。一般方法であるＨＰＬＣによる分析用に、様々な時点でサンプリングを行った。
図４および５に示す結果から、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）由来のＩｌｖＣコード領域を含む酵母株は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のｉｌｖＣおよび出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＩＬＶ５を含む酵母株より、速く増殖し、多くのイソブタノールを生成したことがわかる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞であって、該リペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記酵母細胞。
２．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１に記載の酵母細胞。
３．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記１に記載の酵母細胞。
４．細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属の酵母のメンバーである、上記１に記載の酵母細胞。
５．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であって、該ポリペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記微生物細胞。
６．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記５に記載の微生物細胞。
７．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性をコードするポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記５に記載の微生物細胞。
８．細胞が細菌細胞または酵母細胞である、上記５に記載の宿主微生物細胞。
９．宿主細胞が、エシェリキア、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、エンテロコッカス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、ザイモモナス、サルモネラ、ペディオコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される属の細菌細胞である、上記８に記載の宿主微生物細胞。
１０．宿主細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキアからなる群から選択される属の酵母細胞である、上記８に記載の宿主微生物細胞。
１１．アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）（ａ）の酵母細胞とアセト乳酸を接触させるステップであって、ここで２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸が生産される、該ステップと；を含む、上記方法。
１２．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１１に記載の方法。
１３．イソブタノールを生産する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を含む微生物細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドは、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと；
を含む、上記方法。
１４．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１３に記載の方法。
１５．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２
、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記１３に記載の方法。
１６．酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも約８０％同一性を有するコード領域を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
１７．酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも約８０％の同一性を有するキメラ遺伝子を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
１８．配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１の配列を有するプラスミド。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞であって、該リペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記酵母細胞。
【請求項２】
ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であって、該ポリペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記微生物細胞。
【請求項３】
アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）（ａ）の酵母細胞とアセト乳酸を接触させるステップであって、ここで２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸が生産される、該ステップと；を含む、上記方法。
【請求項４】
イソブタノールを生産する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を含む微生物細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドは、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと；
を含む、上記方法。
【請求項５】
酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも約８０％同一性を有するコード領域を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
【請求項６】
酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１
つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも約８０％の同一性を有するキメラ遺伝子を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
【請求項７】
配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１の配列を有するプラスミド。