(57)【要約】      （修正有）【課題】培養容器内の細胞を自在に選択、回収できる細胞培養容器、及び細胞培養装置の提供。【解決手段】温度応答性高分子を細胞付着面として、培養容器内の所望の位置を、細胞が付着できる状態の温度と付着できない状態の温度になるよう、温度差を生じさせることで、自在に細胞を選択、回収できる、細胞培養容器。該細胞培養容器を備え、細胞付着面を部位選択的に加熱して、該細胞付着面からの細胞の部位選択的剥離を行うための加熱手段２２と、加熱を制御するための制御手段と、培養液の温度を細胞が剥離する温度まで冷却するための冷却手段とを有する、細胞培養装置。【選択図】図１
2008228585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
温度応答性高分子を有する細胞付着面が設けられた細胞培養容器であって、
前記細胞付着面を部位選択的に加熱して、該細胞付着面からの細胞の部位選択的剥離を行うための加熱手段を有する
ことを特徴とする細胞培養容器。
【請求項２】
温度応答性高分子を有する細胞付着面が設けられた細胞培養容器を備えた細胞培養装置であって、
前記細胞付着面を部位選択的に加熱して、該細胞付着面からの細胞の部位選択的剥離を行うための加熱手段と、
培養液の温度を細胞が剥離する温度まで冷却するための冷却手段と、
前記加熱手段での前記細胞付着面の部位選択的加熱を制御するための制御手段と、
を有する
ことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項３】
前記細胞付着面における加熱部位を選択するための加熱部位選択手段を更に有し、該加熱部位選択手段により選択された部位の加熱を前記制御手段から指令する請求項２に記載の細胞培養装置。
【請求項４】
前記加熱部位手段が、前記細胞付着面での細胞付着状態の画像を取得する画像取得手段を有する請求項３に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を培養するための容器および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞培養基材として、温度応答性高分子を用いたものがある（特許文献１参照）。また温度応答性高分子を用いて、細胞を温度応答性高分子に結合させた後、温度応答性高分子の高次構造を変化させることにより、細胞を前記分離材料より機能を損なうことなく脱離させる方法が開示されている（特許文献２参照）。また、特許文献３には、異なる性質の温度応答性高分子を異なる領域にパターニングして配置することで、異なる種類の細胞を共培養する方法が開示されている。また異なる温度応答性高分子の性質差をうまく利用して、同じ種類の細胞を選択的に回収することが示されている。
【０００３】
上述した各従来技術は、従来の蛋白分解酵素、例えばトリプシンを用いた細胞の剥離方法と比べ、細胞に与えるダメージが少なく、優れた特徴を持っている。
【特許文献１】国際公開第93／03139号パンフレット
【特許文献２】特許第03441530号明細書
【特許文献３】国際公開01/068799号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら一方で、こうした温度応答性高分子を用いて、もっと自在に細胞を選択し、剥離するといった工夫はこれまでの従来技術には見当たらない。例えば、ある幹細胞の培養で、分化の方向性が定まらず、形態またはマーカーによって識別しうる細胞を選択的に除去または回収したいといった課題がある。遺伝子導入した細胞の樹立といった場合にも同様に、導入が成立した細胞を選択的に回収したいといった課題がある。また、単なる継代時においても、過剰なコンフルエント状態に達するのを避けて継代したいときに、細胞数を減らして継代することが必要となる。
【０００５】
本発明の目的は、細胞培養容器内の任意の位置を、細胞が付着できる状態の温度と付着できない状態の温度になるよう、温度差を生じさせることによって、自在に細胞を選択、回収できるようにした細胞培養のための容器及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞培養容器は、温度応答性高分子を有する細胞付着面が設けられた細胞培養容器であって、前記細胞付着面を部位選択的に加熱して、該細胞付着面からの細胞の部位選択的剥離を行うための加熱手段を有することを特徴とする細胞培養容器である。
【０００７】
本発明の細胞培養装置は、温度応答性高分子を有する細胞付着面が設けられた細胞培養容器を備えた細胞培養装置であって、
前記細胞付着面を部位選択的に加熱して、該細胞付着面からの細胞の部位選択的剥離を行うための加熱手段と、
培養液の温度を細胞が剥離する温度まで冷却するための冷却手段と、
前記加熱手段での前記細胞付着面の部位選択的加熱を制御するための制御手段と、
を有する
ことを特徴とする細胞培養装置である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明にかかる細胞培養のための容器および装置は、細胞が付着できる状態の温度と付着できない状態の温度になるよう、温度応答性高分子に温度差を生じさせることによって、自在に細胞を選択、回収できるようにした構造を有する。このため、分化誘導や遺伝子導入を行った、目的とする細胞、細胞集団だけを選択的に回収、培養継続を行うことができる。また無作為、非選択的継代培養であれば、手作業の継代操作を介さず、自動的に継代を続けることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明にかかる細胞培養容器は、培養液や洗浄液などを付与可能な細胞付着面を有する。この細胞付着面は温度応答性高分子を有し、温度によって細胞の付着性が可逆的に変化する機能を有する。更に、この細胞培養容器は、細胞付着面を部位選択的に加熱可能な過熱手段を有している。この加熱手段により、細胞付着面の任意の部位を加熱することが可能となる。
【００１０】
本発明の細胞培養装置は、上記構成の細胞培養容器と、この細胞培養容器の有する加熱手段に部位選択的な加熱を指令する制御手段と、培養液の温度を細胞が剥離する温度まで冷却するための冷却手段と、を有する。この細胞培養装置には、更に、細胞培養容器に設けられた細胞付着面の加熱部位を選択するための加熱部位選択手段を設けても良い。この加熱部位選択手段で選択した部位への加熱を制御手段により指令して加熱手段により行うことができる。加熱部位選択手段は、細胞付着面の画像を取得する手段を有して構成することができる。
【００１１】
以下、図面を参照して本発明を更に説明する。
【００１２】
図１は本発明の培養容器についての説明図である。培養容器には培養液やその他緩衝液を循環させるための入口１と出口２があり、温度応答性高分子を有する細胞付着面としての容器の底３がある。また細胞付着面の任意の位置を加熱できるように、格子状に数多くの加熱手段２２、望ましくは透明な加熱手段が張り巡らされている。なお、容器の上面は開放または半開放されていてもよく、あるいは天井部分で覆われて容器内が密封されていてもよい。
【００１３】
細胞付着面の所望の位置を部位選択的に加熱できるような手段は、次のいずれかを用いることができる。
（１）図２は、３×３格子の発熱抵抗体５を細胞付着面に対応する位置に平面状に配置する場合の例を電気配線図として示した図である。一組の行７と列６の信号線を選択することで、所望の位置の発熱抵抗体５を駆動し、その位置を加熱することができる。発熱抵抗体５は一つ一つ逐次スキャンしても、場合によっては複数の発熱抵抗体５を同時駆動してもよい。図３に実際の構成を示す。図３（ａ）は、高抵抗の発熱抵抗体５を行７と列６に走る信号線で挟み込んでいる。培養容器１１の破線部断面を図３（ｂ）に示す。温度応答性高分子９の上で細胞１０が培養液８中で培養されている。
【００１４】
（２）図４は、３×３格子の発熱抵抗体５と、発熱抵抗体５をそれぞれ独立に駆動するためのＴＦＴ１２を持った例である。こうすることで自在に所望の位置を加熱することができる。図５（ａ）に実際の構成を示す。行７と列６の信号線は半導体薄膜１３を挟んで、それぞれゲート電極、ソース電極につながる。ドレイン側では発熱抵抗体５につながれ、絶縁膜１６に設けられたコンタクトホール１４を介してグランド層１５に電流が流れると発熱抵抗体５を加熱できる。図５（ｂ）は破線部断面で、温度応答性高分子９の上で細胞１０が培養液８中で培養されている。
【００１５】
（３）図６は、３×３格子のコンデンサ１７と、発熱抵抗体５をそれぞれ独立に駆動するためのＴＦＴ１２を持った例である。原理的な構成は透過型液晶ディスプレイと同じで、コンデンサ１７は液晶の対向電極１８に接続される。ただしここでコンデンサ１７の中身は液晶ではない。図７（ｂ）に破線部断面を示す。対向電極１８と画素電極１９の間には、温度応答性高分子９の上で細胞１０が培養液８中で培養されている。ここに交流を印加すると、誘電加熱効果によって、この位置を加熱することができる。電圧は概ね１０Ｖ以下で、周波数はＴＦＴの動作範囲内でよい。
【００１６】
上述の、細胞付着面の任意の位置を加熱できるような容器を、本発明の培養装置に使用する場合を図８によって説明する。
【００１７】
培養容器１１内には温度応答性高分子９の層があり、これを細胞付着面として細胞が培養される。培養細胞の観察像は顕微鏡ユニット２１、ＣＣＤカメラ２０を介して、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）に画像を取得できる。顕微鏡ユニットとしては、倒立（光学/蛍光）顕微鏡ユニットが利用できる。取得された画像に基づいて、マウス、キーボードを用いて培養容器内の任意の位置を選択することができる。選択された細胞の位置は、剥離したい細胞（または残して継続培養したい細胞）の位置である。温度応答性高分子は、温度を上げていくと液状からゲル状に相転移が起こる。ゲル状では細胞が付着、液状では細胞が剥離するので、選択位置と非選択位置間に相転移が起こるだけの温度差を生じさせることによって、培養容器内の任意の位置にある細胞を剥離できる。温度差を生じさせるためには、加熱手段２２によって、選択された細胞の位置を温めつつ、温度応答性高分子が液状となる温度以下の培養液、生理食塩水、PBS（リン酸緩衝液）などを循環させることによって達成される。ゲル状態を維持した所では細胞はゲルに付着を続け、培養液の循環によって冷やされたところは剥離し、培養液とともに循環し、所定のボトル等へ回収できる。
【００１８】
また、このような温度差を生じさせるためには、加熱手段２２は、培養容器１１内でなく、外部に設けても本発明の培養装置を構成できる。図９は近赤外（または赤外）の半導体レーザ２３を用いて、集光レンズ２４で集光し、培養面をスキャンする方法を示している。レーザが照射された所は、ゲル状であり、細胞の付着性を保持できる。培養面をスキャンするために、２次元のガルバノミラー２５を用いることができる。レーザON／OFF制御は、培養面の位置に同期して、例えばマウスを使って予め、目的とする細胞の選択された位置情報に基づいて制御される。
【００１９】
各位置に温度差を設けるには、先ほどと同じく、温度応答性高分子が液状となる温度以下の培養液を循環させることによって成される。
【００２０】
尚レーザを用いずにタングステンランプやハロゲンランプと赤外域透過フィルターを組み合わせて赤外線を作り出しても良い。また、光照射などにより部位選択的に加熱を行う場合は、培養容器を光照射可能とする構成とし、更に、光照射により加熱する材料からなる部分を細胞付着面またはそれに対応する位置に設ける。
【００２１】
加熱手段が抵抗発熱体、誘電加熱効果によるもの、レーザ照射であっても、温度差を生じさせる手段は、熱伝導方程式を使って同じ説明ができる。
【００２２】
ここでＴは温度、ｔは時間、λは蓄熱体の熱伝導率、Ｃvは蓄熱体の熱容量、Qは熱源のとき、熱伝導方程式は
【００２３】
【数１】
2008228585.tif 000003
【００２４】
となる。熱源から熱が供給されない、すなわち加熱OFFの位置では、
Q＝０
である。よって、
【００２５】
【数２】
2008228585.tif 000004
【００２６】
となる。培養液が十分に循環し、定常状態に達すれば、
【００２７】
【数３】
2008228585.tif 000005
【００２８】
となる。したがってOFFの位置では温度の勾配をもたず、細胞を剥離することができる。
【００２９】
一方、加熱状態ONの位置では定常状態のとき、
【００３０】
【数４】
2008228585.tif 000006
【００３１】
となって、供給する熱量が、ＯＮの位置ではある温度勾配をもってつり合う。したがってＯＮのある位置では熱を供給することで、ゲル状態を維持することができる。
【００３２】
図８に示す例では、顕微鏡ユニット２１、ＣＣＤカメラ２０、ＰＣにおける細胞付着面の画像の表示と、加熱位置の特定を行う画像処理部とを有して加熱部位選択手段が構成されている。また、ＰＣには、画面上で特定された部位に対応する培養容器の細胞付着面での位置に対する加熱を加熱手段２２に指令する制御手段の機能が組み込まれている。
【実施例】
【００３３】
（実施例１）
本発明の培養容器の実施例を以下に示す。
図１０に示す、アクリル板に予め型形成した部材４の裏面の所定領域に、スパッタ装置でＩＴＯを約３００ｎｍ製膜する。ＡＺ１５００（AZ エレクトロニックマテリアルズ（株）の商品名）レジストを塗布し、露光、現像する。次に、ＩＴＯエッチング液（関東化学（株）製）によって信号線、列６のパターニングを行い、アセトン洗浄によってレジストを除去する。レジストＺＰＮ１０００（東京材料（株）の商品名）を塗布、露光、現像する。酸化物微粒子を分散させた透明導電膜塗料、ＥＣＨ−１１１（コルコート（株）の商品名）をスピンコートし、紫外線を照射して表面に高抵抗の膜を作製する。アセトン、超音波洗浄によってリフトオフによってレジストを除去し、各格子点にタイル状の抵抗体パターンを形成する（図３（ａ）参照）。次に行７の信号線パターンを形成する。レジストＺＰＮ１０００（東京材料（株）の商品名）を塗布、露光現像する。その上にスパッタ装置でＩＴＯを約３００ｎｍ製膜、アセトン、超音波洗浄によってリフトオフ、レジストを除去する。以上によって酸化物微粒子を分散させた高抵抗発熱体を挟んだ格子状の電極ができる。
【００３４】
同様に蓋２５となるアクリル板に、スパッタ装置でＩＴＯを約２０ｎｍ製膜する。蓋２５に製膜したＩＴＯは、容器が液体で満たされてない場合、結露防止ヒータとして用いることができる。格子状に並んだ各行７、列６の信号線に電流を流せるよう接続するには、100μｍピッチの異方性導電ゴム（富士高分子工業（株））を用いて、蓋２５と部材４および異方性導電ゴムを重ね、ホルダーで密着、固定する。
【００３５】
（実施例２）
本発明の培養装置の実施例を以下に示す。
【００３６】
図１１に示すように、制御手段及び加熱位置選択手段を構成するＰＣを設け、ＰＣに内蔵のアナログＩ／Ｏ、デジタルＩ／Ｏを介して必要な全てのデバイスに信号が送られる。一方で、倒立（光学/蛍光）顕微鏡ユニット２１、ＣＣＤカメラ２０から、培養容器１１内の培養画像を取り込むことができる。実施例１で作製した培養容器１１の細胞付着面積は、４００ｍｍ2であり、温度応答性ゲルPoly(N-isopropylacrylamide) (Mn=20000-25000、Aldrich社)を２０μｌ分注する。底面全体に行き渡らせ、約30分間、室温で静置させる。余剰な液体は吸引除去する。次に１×１０5／ｍｌ程度に調整した細胞を８０μｌ播く。蓋２５をして、固定する。ＣＯ2発生ボトル２９では、５％重曹水をスターラーで攪拌しつつ周囲を約４0℃に加温する。発生したＣＯ2ガスはポンプ２８によって培養液供給ボトル３０に送り込まれ、培養液をバブリングする。培養液供給ボトル３０には予め培養液を入れておく。培養液はポンプ付き方向切換バルブ２６によって吸い上げられ、培養中の培養容器１１に絶えず新鮮な培養液を供給できる。培養液が劣化していない間は、ペルチェコントローラ付きポンプ２７で温度を３７℃に保った培養液を、ポンプ付き方向切換バルブ２６、培養容器１１を経由して絶えず循環させることができる。培養中はＣＣＤカメラ２０でタイムラップス撮影をする事ができる。細胞を選択して剥離したいときには、ペルチェコントローラ付きポンプ２７で循環させる培養液を２０℃まで下げ、付着状態を維持したい細胞の付着部位を選択的に加熱し、培養液の温度低下によって剥離した細胞は廃液回収ボトル３１に不要な細胞を回収する。もしくは培養容器１１に回収して、別の培養を行う。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本件は細胞培養において、細胞の遺伝子改変や改質、幹細胞に関わる分化、脱分化、未分化、細胞の樹立、株化、不死化といった必須の技術要素に関連して発生する細胞の分離抽出を必要とする場合に利用できる。また閉鎖されたままの容器内で連続培養が可能となるので、自動化が容易で、医薬品等、クリーンな環境を要求される培養に利用できる。また温度応答性高分子を液状で、細胞の付着を防ぎながら培養すると、細胞を思い通りに整列させることができる。こうしたことは同種または異種の細胞間に働く相互作用の解析、さらに細胞を制御する方法として、利用価値が生まれると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明の培養容器についての説明図を表す。
【図２】本発明の培養容器の加熱手段が発熱抵抗体である例を表す。
【図３】図２の（ａ）平面図、（ｂ）断面図を表す。
【図４】本発明の培養容器で、独立にＴＦＴを持った例を表す。
【図５】図４の（ａ）平面図、（ｂ）断面図を表す。
【図６】本発明の培養容器で、誘電加熱効果による例を表す。
【図７】図６の（ａ）平面図、（ｂ）断面図を表す。
【図８】本発明の培養装置の例を表す。
【図９】本発明の培養装置の例を表す。
【図１０】本発明の培養容器を表す。
【図１１】本発明の培養装置の全体図を表す。
【符号の説明】
【００３９】
１  入口
２  出口
３  容器の底
４  部材
５  発熱抵抗体
６  列（信号線）
７  行（信号線）
８  培養液
９  温度応答性高分子
１０  細胞
１１  培養容器
１２  ＴＦＴ
１３  半導体薄膜
１４  コンタクトホール
１５  グランド層
１６  絶縁膜
１７  コンデンサ
１８  対向電極
１９  画素電極
２０  ＣＣＤカメラ
２１  倒立（光学／蛍光）顕微鏡ユニット
２２  加熱手段
２３  半導体レーザ
２４  集光レンズ
２５  蓋
２６  ポンプ付き方向切換バルブ
２７  ペルチェコントローラ付きポンプ
２８  ポンプ
２９  ＣＯ２発生ボトル
３０  培養液供給ボトル
３１  廃液回収ボトル
【図１】
2008228585.tif 000007
【図２】
2008228585.tif 000008
【図３】
2008228585.tif 000009
【図４】
2008228585.tif 000010
【図５】
2008228585.tif 000011
【図６】
2008228585.tif 000012
【図７】
2008228585.tif 000013
【図８】
2008228585.tif 000014
【図９】
2008228585.tif 000015
【図１０】
2008228585.tif 000016
【図１１】
2008228585.tif 000017