(57)【要約】【課題】  柑橘類モノテルペン酵素遺伝子の調製方法及びその調製方法によって得られた柑橘類モノテルペン酵素遺伝子の提供【解決手段】  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−ピロリン酸を基質とする柑橘類におけるモノテルペン合成酵素群において、発現されていない酵素をコードする未知の遺伝子の調製方法であって、公知のモノテルペン合成酵素において保存されている領域の塩基配列の情報に基づきプライマーを設計する工程、上記のプライマーを用いて柑橘類ゲノムＤＮＡ中から未知の遺伝子のＤＮＡを増幅する工程、増幅されたＤＮＡから公知の類似酵素のアミノ酸配列に基づき推定したイントロンをインビトロで除去する工程からなる、調製方法【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−ピロリン酸を基質とする柑橘類におけるモノテルペン合成酵素群において、発現されていない酵素をコードする未知の遺伝子の調製方法であって、下記の工程：
公知のモノテルペン合成酵素において保存されている領域の塩基配列の情報に基づきプライマーを設計する工程、
上記のプライマーを用いて柑橘類ゲノムＤＮＡ中から未知の遺伝子のＤＮＡを増幅する工程、
増幅されたＤＮＡから公知の類似酵素のアミノ酸配列に基づき推定したイントロンをインビトロで除去する工程、
からなる、調製方法。
【請求項２】
下記：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる遺伝子。
【請求項３】
下記：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項２に記載の遺伝子又は請求項３に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項３に記載のタンパク質を用いる、３−カレンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、柑橘類酵素遺伝子調製方法及びその調製方法によって得られた３−カレン合成酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
柑橘類における香気成分は、主としてテルペン（テルペノイド、イソプレノイドともよばれる。）であり、より典型的には、リモネン、γ−テルピネン、α−ピネン、β−ピネン等のイソプレン骨格を有する炭素数が１０個のモノテルペンである。
【０００３】
柑橘類のモノテルペンは、果皮の油胞に局在し、果汁中にも少量が存在する。各モノテルペンの構成比率は、種によって大きく異なり、柑橘類の香気を特徴付けている。たとえば、グレープフルーツでは、リモネンが約９５％であり、γ−テルピネン、α−ピネン及びβ−ピネンは極めて少量である。モノテルペンには、レモン様芳香を持つリモネン（香料、溶剤、ガン予防物質）、α／β−ピネン（香料、溶剤）、メントール（清涼飲料、タバコ香料、局所刺激／麻酔作用）、カンファー（防蛾剤、局所抗痒湿疹剤）等の有用なものが数多く知られている。
【０００４】
モノテルペンは、３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−ピロリン酸（ゲラニルピロリン酸（ＧＰＰ）及びネリルピロリン酸（ＮＰＰ）の異性体がある）を基質として、それぞれのモノテルペンに特異的なモノテルペン合成酵素によって合成される。しかし、現在公知の柑橘由来のモノテルペン合成酵素遺伝子の数は少なく、酵素の構造と生成物特異性との関連については不明な点が多い。
【０００５】
これらの酵素の発現量が少ないことから、植物からこの酵素を単離・精製することは難しい。また、従来の方法は、ｃＤＮＡからモノテルペン合成酵素遺伝子をクローニングするものであったが、翻訳されていない遺伝子についてはｍＲＮＡが作られないことからｃＤＮＡを入手することができないという欠点があった。さらに、モノテルペン合成酵素は立体構造が似ており、類似した反応機構を持つと考えられるが、一つの種類の酵素が何種類かのモノテルペンを一定の比率で合成することから、その反応機構は複雑であり、その詳細は未だ解明されていない。
【０００６】
そこで、これらの酵素をコードする遺伝子の取得が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、柑橘類モノテルペン酵素遺伝子の調製方法及びその調製方法によって得られた柑橘類モノテルペン酵素遺伝子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
１．  ３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−ピロリン酸を基質とする柑橘類におけるモノテルペン合成酵素群において、発現されていない酵素をコードする未知の遺伝子の調製方法であって、下記の工程：
公知のモノテルペン合成酵素において保存されている領域の塩基配列の情報に基づきプライマーを設計する工程、
上記のプライマーを用いて柑橘類ゲノムＤＮＡ中から未知の遺伝子のＤＮＡを増幅する工程、
増幅されたＤＮＡから公知の類似酵素のアミノ酸配列に基づき推定したイントロンをインビトロで除去する工程、
からなる、調製方法、
２．  下記：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる遺伝子、
３．  下記：
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質、
４．  上記２に記載の遺伝子又は上記３に記載のタンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター、
５．  上記４に記載の組換えベクターを含む宿主細胞、
６．  上記３に記載のタンパク質を用いる、３−カレンの製造方法
である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明で、３，７−ジメチルオクタ−２，６−ジエン−１−ピロリン酸を基質とする柑橘類におけるモノテルペン合成酵素とは、柑橘類に由来する酵素であり、ＧＰＰ又はＮＰＰを基質として、少なくとも１つのモノテルペンを合成することができる酵素をいう。
【００１０】
本発明において、「発現されていない」とは、通常の方法では、ＲＴ−ＰＣＲ等の通常のＲＮＡ検出手段を用いてはｍＲＮＡを検出することができない程度の極めて発現レベルが低いか又は全く発現されていないことをいう。
【００１１】
本発明で「酵素をコードする未知の遺伝子」とは、適切な発現系よって発現させることができる酵素のアミノ酸配列のみをコードする遺伝子であって、未だその塩基配列が知られていないものをいう。
【００１２】
公知のモノテルペン合成酵素において保存されている領域の塩基配列の情報に基づきプライマーを設計する工程
本発明の公知のモノテルペン合成酵素において保存されている領域は、下記の方法を用いて特定することができる。
生成物が異なる少なくとも３種類のカンキツモノテルペン合成酵素遺伝子の配列を用い、従来公知の配列解析ソフトウエア、例えばCLUSTALWを利用することでアラインメントし、これらの配列を相互に比較する。その結果、連続する２０塩基中で、相互に一致する塩基が１６塩基、好ましくは１７塩基、より好ましくは１８塩基、さらにより好ましくは１９塩基以上の領域を保存領域とすることができる。
選択された保存領域の中から適宜プライマーを設計することができる。プライマーの設計は、特に制限されず、従来公知のプライマー設計用ソフトウエア、例えば、Primer3を利用することができる。
【００１３】
本発明のプローブ用ポリヌクレオチドの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造することができる。
【００１４】
本発明のＤＮＡの増幅は、従来公知の方法であれば任意の方法を用いることができる。たとえば、ＰＣＲ、ＬＡＭＰやＩＣＡＮ法を挙げることができる。
【００１５】
イントロンは得られたゲノムＤＮＡを従来公知の塩基配列解析ソフトウエア、例えばｔＢＬＡＳＴｘを利用することでアミノ酸に翻訳後、公知のモノテルペン合成酵素遺伝子のアミノ酸配列と比較すること、およびイントロンの５’末端がＧＴそして３’末端がＡＧであることによって推定することができる。イントロンと予想された領域のインビトロでの除去方法は、例えばHorton RM, Hunt HD, Ho SN, et al.（Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. GENE 77 (1): 61-68 1989）記載の方法により可能である。
【００１６】
本発明の別な態様は、下記：
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
からなる遺伝子である。
【００１７】
本発明で「ストリンジェントな条件」とは、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００mg／mLニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。
【００１８】
変異ＤＮＡは、例えば、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により調製することができる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。
【００１９】
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることもでき、例えば、配列番号１に示される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを好適に例示することができる。
【００２０】
本発明で「３−カレン合成酵素」とは、ＮＰＰを基質として３−カレン、リモネン及びα−テルピネオールを合成する酵素をいう。ＮＰＰを基質として少なくとも３−カレンを合成することができる限り、３−カレン合成酵素活性を有するという。得られたそのタンパク質が、３−カレン合成酵素活性を有するかどうかは、例えば後述の実施例に記載したように、そのタンパク質とＮＰＰを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、３−カレンの生成を調べることで容易に確認することができる。
【００２１】
本発明の別の態様は、（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、又は（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−カレン合成酵素活性を有するタンパク質である。
【００２２】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜１２０個、好ましくは１〜６０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。
【００２３】
遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００２４】
本発明のさらに別な態様は、上記遺伝子、又は上記タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターである。
【００２５】
本発明の組換えベクターとしては、本件遺伝子ＤＮＡが組み込まれた組換えベクターであれば特に制限されることなく用いることができる。本発明の組換えベクターは、本件遺伝子ＤＮＡを発現ベクターに適切に組換えることにより構築することができる。例えば、本件遺伝子ＤＮＡを適当なプロモーターの下流につないだ構成を好適に例示することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子の発現に関与するプロモーター、ターミネーター等の制御配列及び転写制御因子の遺伝子を含有しているものを好適に使用することができる。
【００２６】
また、本発明は、上記組換えベクターを含む宿主細胞にも関する。
本発明の宿主細胞は、従来公知の任意の細胞を用いることができ、好適には、微生物、植物又は動物細胞である。微生物としては、上記本発明の組換えベクターを導入することができる微生物であれば特に制限されず、例えばエシェリヒア属細菌、シュードノカルディア属細菌、ストレプトミセス属細菌、バチルス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、スタフィロコッカス属細菌等を挙げることができる。上記組換えベクターを宿主微生物に導入する方法としては、モレキュラークローニング第２版など多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション、形質導入、形質転換等により行うことができる。また、本発明の形質転換微生物を培養することによって、本件タンパク質を培養物中に生成蓄積させ、さらに、該培養物から該タンパク質を採取することにより、本件タンパク質を大量に製造することができる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、本発明のタンパク質を用いる、３−カレンの製造方法である。本発明のタンパク質とＮＰＰを適当なバッファー又は塩溶液中で接触させ、３−カレン、リモネン及びα−テルピネオールを製造することができる。
【実施例】
【００２８】
材料として、独特の爽やかな香りが評価され、調味料や香水に利用されているユズ（Citrus junos）を用いた。静岡県立大学の圃場に生育するユズの葉を採取し、液体窒素で凍結後、乳鉢および乳棒を用い破砕し、Isoplant II（日本ジーン）を用い添付のプロトコールにしたがってゲノムＤＮＡを抽出した。
【００２９】
特異的プライマーを用いたユズゲノムＤＮＡの増幅とクローニング
ユズゲノムＤＮＡを鋳型にして、柑橘類のモノテルペン合成酵素遺伝子で保存されている領域の中から、モノテルペン合成酵素の活性部位であるＤＤｘｘＤアミノ酸配列モチーフを挟む２カ所について下記のプライマーを設計した。
Cmt  5 fd 5'-TTRGAGGCAAGGTGGTTCAT-3'（配列番号３）
Cmt 12 rv 5'-TCCGATGAWGTTCCCAAATC-3'、R=A+G、W=A+T（配列番号４）
これら２つのプライマーを用い、ユズゲノムを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られたＰＣＲ産物をTA cloning kit（プロメガ）を用いてライゲーションした後、大腸菌を形質転換した。
【００３０】
制限酵素処理による増幅配列の分類
得られた増幅断片を制限酵素XbaI、EcoRI、HaeIIIにより処理し、得られたフラグメントの数及び長さのパターンによってそれらを分類した。同じグループに分類されたクローン及び増幅断片長が６５０bp以下のものを除き塩基配列を決定した。
【００３１】
公知配列との比較
得られたクローンの塩基配列を、下記の公知の柑橘類モノテルペン酵素遺伝子の塩基配列と比較し、相同性を調べた。
レモン（Citrus limon）
リモネン合成酵素遺伝子(AF514287、AF514289)、
γ-テルピネン合成酵素遺伝子(AF514286)、
β-ピネン合成酵素遺伝子(AF514288)
温州ミカン（Citrus unshiu）
リモネン合成酵素遺伝子(AB110636、AB110637)
γ-テルピネン合成酵素遺伝子(AB110639、AB110640)
β-ピネン合成酵素遺伝子(AB110641)
(E)-β-オシメン合成酵素遺伝子(AB110642)
1,8 シネロール合成酵素遺伝子(AB110638)
相同性は、配列解析ソフトウエアCLUSTALWを利用して算出した。
【００３２】
公知のモノテルペン合成酵素遺伝子と相同性が８５％以上のクローンは、すでに単離されている遺伝子と同種であるとみなし、相同性が８５％未満のクローンが新規遺伝子である可能性が高いと判断した。得られた９つのクローンの中から、ｙｕｚｕ１６と名付けたクローンの配列は、温州みかん由来のｄ−リモネン合成酵素遺伝子との相同性が最も高くて７４％であったため新規遺伝子とみなす判断基準に合致し、さらにCLUSTALWを利用した系統樹解析の結果、公知のいずれのモノテルペン合成酵素遺伝子とも異なる場所に位置した。これらの結果から、ｙｕｚｕ１６が新規の遺伝子に由来すると判断し、その全長配列の取得を目指した。
【００３３】
全長配列の取得
ｙｕｚｕ１６のみに特異的な下記の配列のプライマーを作製した。
y16sp2 rv 5'-GTAATAAGCCTAGCCACTGATG-3'（配列番号５）
y16sp3 fd 5'-CTTTCTGCCACAGATCCAATCG-3'（配列番号６）
y16sp3 rv 5'-GAGCAACTTACCAGGAAGAACTC-3'（配列番号７）
【００３４】
また、柑橘類のモノテルペン合成酵素遺伝子で保存されている領域をカバーした特異的プライマーも作製した
CMRR fd 5'-AGGCGATCAGCMRAYTAC-3'（配列番号８）
CM1  fd 5'-GAARAGCTGARGGRAVAAGT-3'（配列番号９）
CM3  rv 5'-CACCRTGHCCATCTCCA-3'（配列番号１０）
(R=A+G, M=A+C, Y=C+T, V=A+C+G, H=A+C+T）。
【００３５】
上記のプライマーのうち、CMRR fdとy16sp3 rv、CM1 fdとy16sp2 rv、y16sp3 fdとCM3 rvをそれぞれ用いてＰＣＲを行った。得られた３種類の増幅断片をサブクローニングし、塩基配列を決定した。
【００３６】
イントロンは、得られたゲノムＤＮＡ配列を従来公知の塩基配列解析ソフトウエア、例えばｔＢＬＡＳＴｘを利用することでアミノ酸に翻訳後、公知のモノテルペン合成酵素のアミノ酸と比較すること、およびイントロンの５’末端がＧＴそして３’末端がＡＧであることによって推定した。CMRR fdからCM3  rvの領域（配列番号１１）における６つのイントロンを配列番号１１のアノテーションとして示した。
【００３７】
イントロンと予想された領域を除去し、インビトロでエクソン同士を連結するために、Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al.（Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes - gene-splicing by overlap extension. GENE 77 (1): 61-68 1989）記載の方法を用いた。
【００３８】
最初に、７つ存在するエクソンについて、以下に示す各エクソンに対応するfdおよびrvプライマーの組み合わせで各エクソンをＰＣＲにて増幅した。
【００３９】
エクソンの増幅および結合のためのプライマー
Y16exon1Nde fd 5'-ATACATATGAGGCGATCAGCAAATTACCAACCTTCAATTTGGGACCATG-3'
（配列番号１２）
Y16exon1 rv  5'-TTTGTAACTTTCGCCCGTAAAGTTGCAACTAAATGAGTGCAGAAAGTCATGGTCCC-3'
（配列番号１３）
Y16exon2 fd  5'-AGTTGCAACTTTACGGGCGAAAGTTACAAAAAACAAGC -3' （配列番号１４）
Y16exon2 rv  5'-AGCTACTAAAAACCTCTTGAGATACATTATAACCATG -3（配列番号１５）
Y16exon3 fd  5'-ATAATGTATCTCAAGAGGTTTTTAGTAGCTTTAGAGAC -3' （配列番号１６）
Y16exon3 rv  5'-TGTCTTTCCACCACCCTGAAATGTCTTTGAGTTCTT -3' （配列番号１７）
Y16exon4 fd  5'-CAAAGACATTTCAGGGTGGTGGAAAGACAAAGGTC-3' （配列番号１８）
Y16exon4 rv  5'-AAATTGATGTCCCACCTCTCCACAGCATTAGTGAAC -3' （配列番号１９）
Y16exon5 fd  5'-TAATGCTGTGGAGAGGTGGGACATCAATTTTGCTATA-3' （配列番号２０）
Y16exon5 rv  5'-TAATAAGCCTAGCCATGAATTTTTAATTCTGAGAAGCT -3' （配列番号２１）
Y16exon6 fd  5'-AGAATTAAAAATTCATGGCTAGGCTTATTACAAGCC-3' （配列番号２２）
Y16exon6 rv  5'-CCTCTGTATCTCATCCGATGAAGTTCCCAAATCATC -3' （配列番号２３）
Y16exon7 fd  5'-TTGGGAACTTCATCGGATGAGATACAGAGGGGGG-3' （配列番号２４）
Y16exon7 rv  5'-AGATTCAATATGAATTCATTTGTGA-3' （配列番号２５）
【００４０】
さらに未クローニングのC末端側の約１５０bpと予想される領域に相当する部分は、公知の配列中で最も相同性が高いリモネン合成酵素遺伝子の配列を参考に、ユズゲノムからLSstop fdとLSstopBam rvプライマーを用いＰＣＲにて増幅した。
LSstop fd     5'-ATTCATATTGAATCTTGTGAGAATGTCCCATTTTATG-3' （配列番号２６）
LSstopBam rv  5'-TTAGGATCCATCATCAGCCTTTGGTGCCA-3' （配列番号２７）
なお、Y16exon1Nde fdおよびLSstopBam rv以外のプライマーには、隣のエクソンと連結するために必要な、隣のエクソンに対応する配列が含まれる。
【００４１】
次ぎに、得られた８つのＤＮＡ断片について、エクソン１と２の増幅断片および最末端に位置する２つのプライマーY16exon1Nde fdとY16exon2 rvを用いたＰＣＲ反応によってエクソン１と２を結合し、同様に、エクソン３と４の増幅断片およびプライマーY16exon3 fdとY16exon4 rv、エクソン５と６の増幅断片およびプライマーY16exon5 fdとY16exon6 rv、エクソン７とＣ末端部分の増幅断片およびプライマーY16exon7 fdとLSstopBam rvのそれぞれの組み合わせでエクソン３と４、５と６、７とＣ末端部分を各々連結した合計４つのＤＮＡ断片を得た。
【００４２】
同様にしてエクソン１+２と３+４の増幅断片およびプライマーY16exon1Nde fdとY16exon4 rv、エクソン５+６と７+Ｃ末端部との増幅断片およびプライマーY16exon5 fdとLSstopBam rvを用いたＰＣＲ反応によってエクソン１+２と３+４、エクソン５+６と７+Ｃ末端部とを結合した２つのＤＮＡ断片を、そして最後にエクソン１+２+３+４と５+６+７+Ｃ末端部の増幅断片およびプライマーY16exon1Nde fdとLSstopBam rvを用いたＰＣＲ反応によって全長がつながったＤＮＡ断片を作成した。得られた全長ＤＮＡ断片を制限酵素のＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断後、発現ベクターのpET-15b（Novagen）のＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトに導入した。
【００４３】
酵素の発現と精製
発現株ＢＬ２１ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（Novagen）をｙｕｚｕ１６遺伝子の入った発現ベクターで形質転換し、得られた形質転換体をＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）＋Ｃｍ（３０μｇ／ｍｌ）液体培地１００ｍｌに０．５Mソルビトールと２．５mM ベタインを添加した後に植菌し、３７℃，２００rpmでＯＤ ０．６になるまで振とう培養した。その後、０．５mM ＩＰＴＧを加え、２０℃，１００ rpmにて一晩振とう培養した。
【００４４】
培養した菌を、４℃，４０００rpm，３０minで遠心し集菌した。菌体１gに対して、１０mlのSonication buffer(２５mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ pH ７．５，１００mM ＮａＣｌ）を加え、マイクロチップを装備したＳＯＮＩＦＩＥＲ  ２５０を用い、Ｄｕｔｙ  ３０％、Ｏｕｔｐｕｔ  ３、３０minの条件で超音波破砕した。得られた破砕液を１１，０００rpm，４℃，３０minで遠心した後、上清を０．４５μmのフィルター(AVANTEC DISMIC 25 cs)に通し、粗酵素液とした。
【００４５】
Ｎｉ2+を吸着させたHi TrapTM Cheleting SepharoseTMHPアフィニティーカラム(GE Healthcae Bio-Science)を、平衡buffer（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH７．４）、０．５M ＮａＣｌ）で平衡化した後、粗酵素液を添加してタンパク質を吸着させ、Wash buffer（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、０．５M ＮａＣｌ、５０mMイミダゾール）で洗浄後、Elution buffer（２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、０．５M ＮａＣｌ、５００mMイミダゾール）で目的のタンパク質を溶出した。得られたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果、期待される約６０ｋDaにバンドが認められた。
【００４６】
酵素活性の測定
精製した酵素を用い、０．１１mMＧＰＰあるいはＮＰＰを基質として含む、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．２）、１０mMＭｇＣｌ２、２mMＤＴＴ、１０％グリセロール反応溶液１００μlとして調製後、内部標準として上層に０．０５mMのカンファー５０μlを加え密封し、３０℃，６時間反応させた。反応後、３０秒間のボルテックス処理を行い、５，５００rpm，４℃，１０minで遠心した。遠心後、上層４０μlを測定用のビンに移し、以下の条件でＧＣ−ＭＳ分析した。
【００４７】
カラム：ＨＰ−５ＭＳ  ３０cm×０．２５mm（Agilent Technologies）、オーブン：６０℃、Front inlet：２５０℃、Ａｕｘ：２５０℃、昇温プログラム：６０℃で２min保持、６０℃〜１２０℃＝５℃/minで昇温、１２０℃〜２００℃＝２０℃/minで昇温。
【００４８】
ＧＰＰを基質として用いた場合には、反応生成物が検出できなかった（図１）。一方、ＮＰＰを基質とした場合には３つのピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ）が得られた（図２）。それらをライブラリ検索した結果、３−カレン（ピークＡ）、リモネン（ピークＢ）、α−テルピネオール（ピークＣ）と一致することが明らかになった。
【００４９】
本発明の遺伝子調製方法は、種々の生理活性を有するモノテルペンの合成に有用である遺伝子を提供することができる。また、本発明の酵素を用いて合成される３−カレンは、鎮咳作用やアセチルコリンエステラーゼ阻害作用を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ＧＰＰを基質として用いた場合の反応生成物である。
【図２】図２は、ＮＰＰを基質として用いた場合の反応生成物である。
【図１】
2008182950.tif 000002
【図２】
2008182950.tif 000003
【配列表】
2008182950000001.app