【手続補正書】
【提出日】平成25年8月9日(2013.8.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＤＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＤＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のＢＲＡＦ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項２】
サンプル中のＢＲＡＦ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＲＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＲＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；及び（ｃ）前記増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここでＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出は、前記サンプル中のＢＲＡＦ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項３】
前記ＢＲＡＦ変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＡＦ変異の存在が、前記サンプル中の転移性メラノーマの陽性指標である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＲＡＦ変異が、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｄ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｍ、及びＢＲＡＦ  Ｖ６００Ａ変異から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルが、血液、組織、又は細胞から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記の組織サンプルが、ホルマリン固定されたパラフィン包理組織である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
ＢＲＡＦ核酸配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる前記の第二のプライマーが、配列番号１０である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
患者において、腫瘍を治療するための化学療法計画を決定するための方法であって、以下：（ａ）固定された腫瘍サンプルを得るために、腫瘍の組織サンプルを得て、サンプルを固定すること；（ｂ）固定された腫瘍サンプルからｍＲＮＡを単離すること；（ｃ）ＢＲＡＦ増幅産物を得るために、ＢＲＡＦ遺伝子の領域を増幅することができる一対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｍＲＮＡを増幅に供すること；（ｄ）増幅されたサンプル中のＢＲＡＦｍＲＮＡの量を測定すること；（ｅ）ステップ（ｄ）からのＢＲＡＦｍＲＮＡの量を、内部対照遺伝子のｍＲＮＡの量と比較すること；及び（ｅ）増幅されたサンプル中のＢＲＡＦｍＲＮＡの量、及びＢＲＡＦ遺伝子発現についての閾値に基づいて化学療法計画を決定すること、を含む方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、オリゴヌクレオチドプライマー対：配列番号１及び配列番号１０、又は配列番号２及び配列番号１０、配列番号３及び配列番号１０、配列番号４及び配列番号１０、配列番号５及び配列番号１０、配列番号６及び配列番号１０、配列番号７及び配列番号１０、配列番号８及び配列番号１０、配列番号９及び配列番号１０、又は少なくともそれと８０％同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対から成る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプライマー対：配列番号１及び配列番号１０、又は配列番号２及び配列番号１０、配列番号３及び配列番号１０、配列番号４及び配列番号１０、配列番号５及び配列番号１０、配列番号６及び配列番号１０、配列番号７及び配列番号１０、配列番号８及び配列番号１０、配列番号９及び配列番号１０、又は少なくともそれと８０％同一であるオリゴヌクレオチドプライマーの対を含む、ＢＲＡＦ遺伝子の発現を検出するためのキット。
【請求項１２】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号１１を含むプローブ。
【請求項１３】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｋ、Ｖ６００Ｍ、及びＶ６００Ａ変異に特異的な核酸プローブであって、配列番号１２を含むプローブ。
【請求項１４】
プローブを添加することを含む、変異体ＢＲＡＦ核酸配列の存在を検出する方法であって、前記プローブが配列番号１１又は配列番号１２のオリゴヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１５】
サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＤＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで、増幅反応は、サンプルのＤＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；（ｃ）前記サンプルの前記ＤＮＡ配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号２である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＤＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができない；及び（ｄ）前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の陽性指標である、を含む方法。
【請求項１６】
サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の存在を検出するための方法であって、以下：（ａ）前記サンプルから核酸を単離すること、ここでサンプルはＲＮＡ配列を含む；（ｂ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の第一の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第一の位置でＢＲＡＦ変異体配列と特異的にアニーリングすることができる配列番号１である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで前記第一及び第二のプライマーは、二本鎖ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の異なる鎖にアニールし、ここで増幅反応は、サンプルのＲＮＡ配列が前記ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列の前記第一の位置で変異体配列を含むＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列を含む場合、ＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができる；（ｃ）前記サンプルの前記ＲＮＡ配列の第二の増幅反応を行うこと、ここで前記増幅反応は、配列番号２である第一のプライマーと、ＢＲＡＦ  ＲＮＡ配列中の第二の位置で特異的にアニーリングすることができる第二のプライマーとを含み、ここで第一のプライマーの厳密性のために、増幅反応はＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物を生成することができない；及び（ｄ）前記第一の増幅反応により生成された増幅産物を視覚化すること、ここで一つのサンプル中のＢＲＡＦ変異体特異的増幅産物の検出、及び第二の反応からの増幅産物の不在は、前記サンプル中のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｋ変異の陽性指標である、を含む方法。