【手続補正書】
【提出日】平成24年12月6日(2012.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１Ａ】図1Aは、実施例に記載の分析方法を用いる、精製前(図1A)のECMS-ニューロテンシン化合物(ECMS-NT)を示すクロマトグラムである。
【図１Ｂ】1Bは、実施例に記載の分析方法を用いる、精製後(図1B)のECMS-ニューロテンシン化合物(ECMS-NT)を示すクロマトグラムである。
【図２】30 mlの30RPC樹脂を充填したカラムを用いるAKTA-エクスプローラー上でのECMS-NTの精製を示すクロマトグラムである。
【図３Ａ】図3Aは、精製前(図3A)のニューロテンシンAngiopep-2-Cysアミドコンジュゲート(NT-AN2Cys-NH2またはNT-An2)を示すクロマトグラムである。このクロマトグラムは実施例に記載の分析方法を用いて得られたものである。
【図３Ｂ】図3Bは、精製後(図3B)のニューロテンシンAngiopep-2-Cysアミドコンジュゲート(NT-AN2Cys-NH2またはNT-An2)を示すクロマトグラムである。このクロマトグラムは実施例に記載の分析方法を用いて得られたものである。
【図４】30 mlの30RPC樹脂を充填したカラムを用いるAKTA-エクスプローラー上でのNT-An2の精製を示すクロマトグラムである。
【図５】NT-An2による低体温誘導を示すグラフである。マウスに、生理食塩水(対照)、NT(1 mg/kg)または2.5 mg/kgもしくは5.0 mg/kg(1および2 mg/kg用量のNTと同等)のNT-An2を投与した。直腸温度を、静脈内注射後、90分間モニターした。
【図６】5、15または20 mg/kgのNT-An2の投与の際のマウスにおける体温の効果を示すグラフである。
【図７】5、10または20 mg/kgの異なる調製物のNT-An2の投与の際のマウスにおける体温の効果を示すグラフである。
【図８】NTおよびNT-An2のin situ脳かん流を示すグラフである。ヨウ素化後、マウスの脳を、指示される時間、Krebsバッファー中の[125I]-NTまたは[125I]-NT-An2誘導体を用いて頸動脈中でかん流した。指示される時間の後、脳をさらに30秒間かん流して、過剰の両化合物を洗浄除去した。脳中の[125I]-NTまたは[125I]-NT-An2誘導体の両方を、βカウンターを用いて定量した。結果を、時間の関数として、脳中の容量の分布(ml/100 g)に関して表した。
【図９】図６について記載されたin situ脳かん流後のNTおよびNT-An2の脳区画化を示すグラフである。脳毛細血管の枯渇を、標準的な手順に従ってデキストランを用いて実施した。脳、毛細血管、および実質組織に存在する[125I]-NTまたは[125I]-NT-An2誘導体の両方を定量し、分布容量(ml/100 g/2分)を報告する。
【図１０】NT-An2の5 mg/kgのボーラス注射を投与した後、1時間後に5 mg/kg/30分(すなわち、10 mg/kg/時)の速度でNT-An2を2.5時間注入したマウスの体温を示すグラフである。
【図１１】20 mg/kgのNT-An2の静脈内ボーラス注射を投与した直後、20 mg/kg/時で3.5時間、NT-An2を注入したラットの体温を示すグラフである。
【図１２】20 mg/kgのNT-An2の静脈内ボーラス注射を投与した直後、20 mg/kg/時でNT-An2を注入し、2.5時間後にこれを40 mg/kg/時に増加させたマウスの体温を示すグラフである。
【図１３】NT-An2の20 mg/kgの静脈内ボーラス注射を投与した直後、20 mg/kg/時でNT-An2を注入したラットの体温を示すグラフである。
【図１４】40 mg/kgのNT-An2を静脈内ボーラス注射を投与した直後、40 mg/kg/時でNT-An2を注入したラットの体温を示すグラフである。これは、実験の12時間について体温の持続的低下をもたらした。
【図１５】化合物の投与の直前および15分後の対照マウス(左)、20 mg/kgのNT-An2を受容するマウス(中央)、および1 mg/kgのブプレノルフィン(右)を受容するマウスにおける足なめ応答のマウスにおけるホットプレート試験における待ち時間を示すグラフである。
【図１６】7.5 mg/kgのNT(8-13)、Ac-Lys-NT(8-13)、Ac-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)、pGlu-NT(8-13)、または対照のボーラス静脈内注射を受容するマウスの体温を示すグラフである。これらの類似体のうち、Ac-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)は体温の最も大きい低下をもたらすことが観察された。
【図１７】対照、NT、NT-An2、NT(8-13)-An2、およびAc-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)-An2のボーラス静脈内注射を受容するマウスの体温を示すグラフである。体温の最も大きい低下は、NT-An2およびAc-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)-An2コンジュゲートについて観察された。
【図１８】Ac-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13) (1 mg/kg)またはAc-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)-An2 (6.25 mg/kg)のボーラス静脈内注射を受容するマウスの体温を示すグラフである。An2コンジュゲート化分子は、コンジュゲート化されていない分子より高い程度まで体温を低下させることが観察された。
【図１９】Ac-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)-An2コンジュゲートの6.25 mg/kgのボーラス静脈内注射、次いで60分後に6.25 mg/kg/時の該コンジュゲートの注入を受容するマウスの体温を示すグラフである。
【図２０】4℃または37℃で40 nMのNTの存在下または非存在下でNTSR1を発現するHT29細胞への放射標識されたNT([3H]-NT)の結合を示すグラフである。
【図２１】0.4 nM〜40 nMの濃度のNTの存在下でのHT29への[3H]-NTの結合を示すグラフである。
【図２２】NTまたはAc-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)の存在下でのHT29細胞への[3H]-NTの結合を示すグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
さらなるポリペプチドを、本明細書に記載のアッセイまたは方法の1つを用いることにより同定することができる。例えば、候補ポリペプチドを、従来のペプチド合成により製造し、パクリタキセルとコンジュゲートさせ、実験動物に投与することができる。生物学的に活性なポリペプチドコンジュゲートを、例えば、腫瘍細胞を注入され、コンジュゲートで治療されなかった(例えば、コンジュゲート化されていない薬剤で治療された)対照と比較してコンジュゲートで治療された動物の生存率を増加させる能力に基づいて同定することができる。例えば、生物学的に活性なポリペプチドを、in situ脳かん流アッセイにおいて、実質組織中のその位置に基づいて同定することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
NT-An2コンジュゲートがBBBを通過することを確認するために、NTとコンジュゲートの両方を標準的な手順を用いてヨード化し、当業界で標準的な方法を用いてin situ脳かん流を実施した。初期の輸送を時間の関数として測定した(図8)。結果は、NT-An2コンジュゲートの初期の脳による取込みは、コンジュゲート化されていないNTよりも高いことを明確に示唆している。さらに、in situかん流の2分後、毛細血管枯渇を行って、脳の実質組織に認められるNT-An2の量を定量した(図9)。NTと比較した場合、脳の実質組織においてより高いレベルのNT-An2が認められた。さらに、これらの結果は、NT-An2が脳の毛細血管中に捕捉されないことを示唆している。全体として、本発明者らの結果は、新規NT-An2誘導体が、体温の制御に関与するその受容体を活性化するのに必要とされる十分な濃度でBBBを通過することを証明している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：A-X-B
(式中、
Aは配列番号114、1〜105および107〜113、またはその断片からなる群より選択される配列と少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むペプチドベクターであり；
Xはリンカーであり；ならびに
Bはニューロテンシン、ニューロテンシンアナログまたはニューロテンシン受容体アゴニストからなる群より選択されるペプチド治療剤である)
を有する化合物。
【請求項２】
前記化合物が以下の構造、
【化１】
2012510796.tif 000001
（式中、pELYENKPRRPYIL配列のリシンに結合された該-(CH2)4NH-部分が当該リシンの側鎖を表し、AN2Cys配列のC末端システインに結合された-CH2S-部分がそのシステインの側鎖を表し、さらにpELYENKPRRPYIL配列およびAN2CysのC末端OHおよびNH2基がそれぞれ、該pELYENKPRRPYIL配列がC末端ヒドロキシル基を有し、該AN2CysがC末端アミン基を有し、pEがL-ピログルタミン酸を示す）
である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Aが、Angiopep-1(配列番号67)、Angiopep-2(配列番号97)、cys-Angiopep-2(配列番号113)、およびAngiopep-2-cys(配列番号114)からなる群より選択される配列と少なくとも70％、好ましくは少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、ここでAはAngiopep-1、Angiopep-2、cys-Angiopep-2、またはAngiopep-2-cysを含むあるいはAngiopep-1、Angiopep-2、cys-Angiopep-2、またはAngiopep-2-cysからなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Bがヒトニューロテンシン、ヒトニューロテンシン(8-13)、Ac-Lys-[D-Tyr11]NT(8-13)、Ac-Lys-NT(8-13)、pE-Lys-NT(8-13)、またはpELYENKPRRPYIL-OHを含み、ここでpEはL-ピログルタミン酸を表す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
(a) Xが式
【化２】
2012510796.tif 000002
（式中、nは2〜15の整数、特に３、６または１１であり、YがA上のチオールでありかつZがB上の１級アミンであるか、あるいは、YがB上のチオールでありかつZがA上の１級アミンであり、より具体的にはAがcys-AngioPep-2 (配列番号113)またはAngioPep-2-cys-NH2 (配列番号114)であり、かつ、BがヒトニューロテンシンまたはpELYENKPRRPYIL-OHであり、ここでpEはL-ピログルタミン酸を表し、YはAのシステイン上のチオール基であり、ZはBのLys6のε-アミンである）、または
(b) 前記化合物が次の構造
【化３】
2012510796.tif 000003
である、請求項１、３または４に記載の化合物。
【請求項６】
Xがペプチド結合である、または
Xが少なくとも１つのアミノ酸であり、かつAおよびBがそれぞれペプチド結合によりXと共有結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項６に記載の化合物をコードする核酸分子、または前記核酸を含むベクター、ここで前記核酸はプロモーターに機能的に連結されている。
【請求項８】
細胞中で請求項７に記載のベクターによりコードされるポリペプチドを発現させ、該ポリペプチドを精製することを含む、請求項６に記載の化合物の製造方法、または固相支持体上で前記化合物を合成することを含む、前記方法。
【請求項９】
被験体の体温を低下させる方法であって、体温を低下させるのに十分な量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記被験体が、卒中、心発作、脳虚血、心虚血、もしくは神経損傷を罹患しているかまたは罹患したことがあり、または神経保護を必要としている、より具体的には
前記神経損傷が脳または脊髄損傷である、より具体的には
前記脳損傷が外傷性の頭部または脳の損傷である、より具体的には
前記被験体が手術を施されているまたは手術を施されるところである、より具体的には
前記手術が、心臓手術であるかまたは心臓切開手術である、前記化合物。
【請求項１０】
被験体における疼痛を処置する方法、予防的に疼痛を処置する方法、または疼痛感受性を低減させる方法であって、前記疼痛を処置するまたは疼痛感受性を低減させるのに十分な量で請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記疼痛が、機械的な疼痛、熱い疼痛、冷たい疼痛、虚血性疼痛および化学的に誘導された疼痛からなる群より選択される急性疼痛である、または
前記疼痛が、末梢または中枢神経病性疼痛、炎症性疼痛、偏頭痛関連疼痛、頭痛関連疼痛、過敏性腸症候群関連疼痛、線維筋痛関連疼痛、関節痛、骨格痛、結合部（関節）痛、胃腸疼痛、筋肉痛、咽頭痛、顔面痛、骨盤痛、跛行、術後疼痛、外傷後疼痛、緊張性頭痛、産科学的疼痛、婦人科医学的疼痛、または化学療法誘導疼痛である、前記化合物。
【請求項１１】
精神障害を有する被験体の治療方法であって、前記障害を治療するのに十分な量で請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を前記被験体に投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記精神障害が統合失調症である、前記化合物。
【請求項１２】
被験体における薬物依存または薬物乱用を治療する方法であって、前記依存症または乱用を処置するのに十分な量の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を前記被験体に投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記薬物が精神刺激薬またはアルコールである、より具体的には
前記神経刺激薬が、アンフェタミン、メタンフェタミン、3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン、ニコチン、コカイン、メチルフェニデート、およびアレコリンからなる群より選択される、前記化合物。
【請求項１３】
代謝障害を有する被験体の治療方法であって、前記障害を治療するのに十分な量で請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を前記被験体に投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記十分な量が、該ペプチドベクターにコンジュゲートされていないときのニューロテンシンアゴニストの相当する用量として必要とされる量の50%未満、より具体的には15%未満である、あるいは
前記代謝障害が、糖尿病、肥満、肥満の結果としての糖尿病、高血糖症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、X症候群、インスリン耐性、耐糖能異常(IGT)、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、心血管疾患、または高血圧である、前記化合物。
【請求項１４】
被験体における神経学的障害を治療または予防的に処置する方法であって、前記障害を治療または予防するのに十分な量で請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を前記被験体に投与することを含む前記方法に用いるための請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物、具体的には
前記神経学的障害が統合失調症、強迫神経症またはトゥレット症候群である、前記化合物。