(57)【要約】【課題】  複数の外来遺伝子が挿入されても安定な組み換えＨＶＴを得るための外来遺伝子発現用プロモーター及びそれを利用した安定な組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを得る。【解決手段】  ２つの異なる外来遺伝子と、当該２つの外来遺伝子を両方とも支配するように、２つの外来遺伝子の間に配置された、マレック病ウイルス由来の１つのプロモーターとを有する発現遺伝子カセットが、ゲノム中に１つ以上挿入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルス。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる外来遺伝子と、当該２つの外来遺伝子を両方とも支配するように、２つの外来遺伝子の間に配置された、マレック病ウイルス由来の１つのプロモーターとを有する発現遺伝子カセットが、ゲノム中に１つ以上挿入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項２】
プロモーターが配列番号１又は配列番号２に記載された塩基配列からなるものである請求項１記載の組み換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項３】
発現遺伝子カセットの挿入部位が、七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間である請求項１又は２記載の組み換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項４】
挿入される発現遺伝子カセット中の２つの異なる外来遺伝子のうち、少なくとも１つが鳥類感染性の病原体に由来する抗原遺伝子である請求項１から３記載の組み換え七面鳥ヘルペスウイルス。
【請求項５】
請求項４に記載された組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチン
【請求項６】
配列番号１記載の塩基配列からなるプロモーター。
【請求項７】
配列番号２記載の塩基配列からなるプロモーター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、七面鳥ヘルペスウイルス（以下、ＨＶＴということがある）ゲノムに２つ以上の外来遺伝子を組み込んだ組み換えＨＶＴと、外来遺伝子を発現させるために用いるマレック病ウイルス由来のプロモーター、及びそれを利用したワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
米国等の養鶏業においては、既に、ウイルスベクターワクチンである組み換え鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）や組み換え七面鳥ヘルペスウイルスが実用化されている。中でもＨＶＴは家禽での安全性が高く、高マレック病ウイルスワクチンとしても利用されるほど、ワクチン特性も良好であること、鶏へのワクチン接種法の一つである発育鶏卵内にワクチンを接種する卵内接種が可能であることから、鳥類に対するワクチン用のウイルスベクターとしても注目されている。
【０００３】
また、ＨＶＴの感染様式として、感染細胞から他の細胞にウイルスが感染する際、隣り合う細胞へ細胞−細胞間で感染が成立するため、血流中に存在するＨＶＴ特異的抗体の影響を受けにくい。従って、これまでのウイルス生ワクチンの効果を減弱させる大きな要因であった親鳥からの移行抗体の存在下でも十分な効果を発揮するという有利な点もある。
【０００４】
更に、ＨＶＴを含むヘルペスウイルス属は、潜伏感染（ｌａｔｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）や永続感染（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）  の状態で感染動物の体内に永続的に生存し続けることが知られていて、このことも、ＨＶＴのワクチンとしての有効性、つまり、感染期間が長いため長期にわたってワクチン効果を付与できる特徴も有している。従って本発明者らもこの組み換えＨＶＴベクターワクチンの研究を行い、報告してきた（特許第３５８７０６５号、米国特許第７１５３５１１号）。この内、特許第３５８７０６５号では、複数の外来抗原遺伝子（例えばニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＨＮ蛋白質やＦ蛋白質、ガンボロ病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２蛋白質の遺伝子）を挿入した組み換えＨＶＴ（ＨＦ００６、ＨＦ００７）を純化し、これら外来抗原遺伝子の発現やワクチン効果を報告している。
【０００５】
しかしながら、複数の外来遺伝子を発現させるような組み換えＨＶＴは、不安定である場合が多く、更に、純化した組み換えＨＶＴを培養細胞で繰り返し継代するうちに、挿入させた外来遺伝子の一部を喪失したウイルスに変遷してしまうことが度々あった。
【０００６】
【特許文献１】特許第３５８７０６５号（米国特許第６６３２６６４号）公報
【特許文献２】米国特許第７１５３５１１号公報
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ９４／２３０１９号（米国特許第５８７１７４２号）公報
【特許文献４】特開２００４−１１１号（米国特許第６７６４６８４号、米国特許第７１５３５１１号）公報
【特許文献５】国際公開公報ＷＯ２００５／０９３０７０号（欧州公開第１７３１６１２号）公報
【０００７】
【非特許文献１】Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３６：８５８−８７０（１９９２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：７９８０−７９８８（２０００）
【非特許文献３】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１９９７−２００１（１９９８）
【非特許文献４】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０：２４１７−２４２２（１９９９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者は、上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、プロモーターとして、双方向の転写活性を有するものを採用し、このプロモーターを挟むように２つの外来遺伝子を連結させて、１つのプロモーターによって２つの外来遺伝子を支配する発現遺伝子カセットを組み込んだ組み換え七面鳥ヘルペスウイルスが、挿入した遺伝子の脱落を起こさない極めて安定な組み換えウイルスであり、これがワクチンとして使用できることを見出し、本発明を完成したものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かくして本発明によれば、２つの異なる外来遺伝子と、当該２つの外来遺伝子を両方とも支配するように、２つの外来遺伝子の間に配置された、マレック病ウイルス由来の１つのプロモーターとを有する発現遺伝子カセットが、ゲノム中に１つ以上挿入された組み換え七面鳥ヘルペスウイルスが提供される。
前記プロモーターとしては、プロモーターが配列番号１又は配列番号２が好ましい。これら二つのプロモーターは、いずれも新規なプロモーターである。
また、前記発現遺伝子カセットの挿入部位は、七面鳥ヘルペスウイルスのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間であるのが好ましい。
挿入される発現遺伝子カセット中の２つの異なる外来遺伝子のうち、少なくとも１つが鳥類感染性の病原体に由来する抗原遺伝子であるものは、家禽用ワクチンとして用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳述する。
（１）七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）
本発明の組み換え七面鳥ヘルペスウイルスの親株として使用する七面鳥ヘルペスウイルスは、天然に得られるものの他、細胞・微生物・遺伝子バンクであるＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから有償または無償で入手できるものなどであればよく、特に限定されるものではない。
ＨＶＴの好ましい例としては、ガンマヘルペスウイルス亜科に属し、生来非病原性であり、かつ非腫瘍性のウイルスで家禽用のワクチンとして用いられているものが挙げられる。具体的には、ＦＣ１２６（ＡＴＣＣＶＲ−５８４Ｂ）、ＰＢ−ＴＨＶ１、Ｈ−２、ＹＴ−７、ＷＴＨＶ−１、ＨＰＲＳ−２６などの株が挙げられ、例えば、ＦＣ１２６株を好適に使用することができる。
【００１１】
（２）マレック病ウイルス（ＭＤＶ）
本発明において、二つの外来遺伝子を発現させるプロモーターの由来となるマレック病ウイルスもまた、天然に得られるものの他、ＡＴＣＣなどから有償または無償で入手できるものなどであればよく、特に限定されるものではない。好ましい例としては、家禽用ワクチンとして用いられているものが挙げられ、具体的には、ＣＶＩ９８８株やＳＢ１株などを挙げることができる。
【００１２】
（３）プロモーター
本発明の組み換えＨＶＴにおいて、２つの異なる外来遺伝子を発現させるために、その間に置かれるＭＤＶ由来プロモーターは、マレック病ウイルスゲノムから得られたプロモーターであって、双方向の転写活性を有するものである。マレック病ウイルスゲノムから得られたプロモーターを、プロモーターとしての活性が維持できる範囲で、一部を切り縮めるなどの改変をしてもよい。
双方向の転写活性を有するプロモーターは、マレック病ウイルスゲノムの中から、読み枠が反対方向を向いている、二つのオープン・リーディング・フレームを探し、その間に位置するプロモーター領域をプロモーター候補として絞り込み、後述する実施例中の、プロモーターのクローニング方法に従ってクローニングすることにより得られる。
また、本発明に用いるプロモーターは、組み換え体の安定性の観点から、遺伝子長が１ｋｂｐより短いのが好ましく、８００ｂｐより短いのが更に好ましい。
このようなプロモーターの具体例として、ＭＤＶのゲノム配列（ジーンバンクのアクセッション番号：ＡＦ２４３４３８）の９１８２７番目から９２１９６番目までの塩基領域（配列番号１）や、同じく９８７５７番目から９９４１２番目までの塩基領域（配列番号２）が挙げられる。
【００１３】
更に、ゲノムから得られたプロモーターの両末端に異なる制限酵素認識サイトを導入すると、このプロモーターの前後に異なる外来遺伝子を容易に配置できるようになり実用性が向上するので、極めて好ましい。そのように改変されたプロモーターの具体例としては、配列番号19の60番目から482番目までの配列、又は配列番号22の60番目から768番目までの配列が挙げられる。
【００１４】
（４）発現遺伝子カセット
本発明の組み換えＨＶＴに挿入される遺伝子は、異なる２つの外来遺伝子とその間にＭＤＶ由来の１つのプロモーターからなる発現遺伝子カセットとして挿入されたものである。挿入されるカセットの数に格別な制限はないが、組み換えウイルスの安定性の観点から、挿入するカセットの全長（複数個ある時は、その合計の長さ）が１０Ｋｂｐを超えないことが好ましい。
【００１５】
発現遺伝子カセット中の外来遺伝子は、本来、ＨＶＴ由来でない遺伝子であり、発現調節遺伝子以外の遺伝子であれば特に限定されないが、家禽用ワクチンを得る場合、鳥類の感染症の病原体に由来する抗原遺伝子が好ましい。鳥類の感染症を引き起こす病原体としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫などを挙げることができる。
【００１６】
このような病原体としては、具体的には、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、ガンボロ病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、マイコプラズマ（ＭＧ）、およびコクシジウムなどを挙げることができる。
【００１７】
特に、中和抗原遺伝子または感染防御抗原の遺伝子を挿入した組み換えＨＶＴはワクチンとして使用することが可能になるので最適である。
具体的な例を挙げれば、ＮＤＶでは、ＨＮ蛋白質、Ｆ蛋白質、ＮＰ蛋白質が、また、ＩＢＶでは、Ｎ蛋白質、Ｓ蛋白質が挙げられる。ＩＢＤＶでは、ＶＰ２タンパク質、ＩＬＴＶではｇＢ蛋白質、マイコプラズマでは４０Ｋ蛋白質、６６Ｋ蛋白質、６７Ｋ蛋白質など（国際公開公報ＷＯ９４／２３０１９号に配列が記載）などが挙げられる。
【００１８】
抗原遺伝子以外に好適に用いられる外来遺伝子としては、組み換えＨＶＴであることの指標となるようなマーカー蛋白質の遺伝子も好適である。マーカー蛋白質の具体例としては、緑色蛍光を発するオワンクラゲ由来のＧＦＰ蛋白質や、βーガラクトシダーゼなどの酵素が挙げられる。
【００１９】
本発明の発現遺伝子カセットは、前述したとおり、異なる２つの外来遺伝子とその間にＭＤＶ由来の１つのプロモーターから構成されるが、それ以外にカセットの両末端にポリＡシグナルと制限酵素サイトからなる短い端末配列（組み換え体の安定性の観点から、通常１００ｂｐ以下、好ましくは５〜５０ｂｐ）を有することが、より望ましい（図１）。その端末配列の一例は配列番号３と配列番号４である。
【００２０】
（５）組み換えＨＶＴの作製法
組み換えＨＶＴの作製法に格別な制限はなく、その具体例としては、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３６：８５８−８７０（１９９２）や特許第３５８７０６５号公報に記載された、親ウイルスゲノムの非必須領域の一部の中に、目的の抗原遺伝子等が挿入されたプラスミドを構築し、ウイルスに相同組み換えによって、抗原遺伝子を挿入する一般的な組み換えウイルスの作製方法が挙げられる。
【００２１】
組み換えＨＶＴを作製するためのプラスミド（本発明では、ホモロジーベクター又はカセット含有プラスミドと呼ぶことがある）は、挿入部位を含むＨＶＴゲノムＤＮＡの一部をクローニングしたプラスミドの挿入部位に、発現遺伝子カセットを１つ以上組み込んだプラスミドである。ここで用いられるプラスミドは、特に限定されるものではなく、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、およびｐＵＣ９などのプラスミド、ｐＨＣ７９などのコスミド等を例示することができる。
【００２２】
発現遺伝子カセットを挿入するＨＶＴゲノム中の挿入部位としては、特許第３５８７０６５号公報に記載された挿入部位が好適であり、特に、発現遺伝子カセットの脱落が極めて起こりにくい、安定した組み換え体が得られる観点から、ＨＶＴのＵＬ４５とＵＬ４６のオープン・リーディング・フレームの間がより好ましい。
【００２３】
カセット含有プラスミドを用いて組み換えＨＶＴを作製及び純化する方法は、前述の通り、Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓ．３６：８５８−８７０（１９９２）や特許第３５８７０６５号公報に記載されている。
【００２４】
（６）組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチン
本発明の組み換え七面鳥ヘルペスウイルスを有効成分とする家禽用ワクチンの調製方法は、特に限定されないが、例えば次の方法によって調製することができる。
【００２５】
本発明の組み換えＨＶＴの感染細胞を当該ウイルスが生育できる細胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、増殖させた後、細胞をスクレーパーまたはトリプシンではがし、遠心分離によって感染細胞と上清とに分離する。
【００２６】
宿主細胞としては、トリ由来の細胞が好ましく、ＣＥＦ（鶏胚繊維芽細胞）、鶏腎細胞などを好適に使用することができる。使用する培地は、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ、ライボビッツＬ−１５／マッコイ５Ａ（１：１混合）培地（以下ＬＭ培地という場合がある）などが好適である。得られた感染細胞は、１０％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地に、懸濁し、液体窒素存在下で凍結保存する。ワクチンとして使用するときは１００倍量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にこの凍結保存品を溶かして使用する。液体窒素下で上記感染細胞を保存するための安定剤やその他の成分は、ウイルス感染細胞が安定的に生存でき、かつ接種を受ける家禽にとって薬理学的に問題のない成分であれば特に限定されない。
【００２７】
本発明のワクチンの家禽への投与方法もまた特に限定されないが、皮下に注射により接種する方法や、発育鶏卵に接種する方法が一般的に用いられており、マレック病に対するワクチンとして用いられている従来ワクチンと同じである。接種量も従来ワクチンと同様でよい。即ち、１０〜１０５ｐ．ｆ．ｕ．／ｄｏｓｅ、好ましくは１０２〜１０４ｐ．ｆ．ｕ．／ｄｏｓｅになるように適量のリン酸緩衝液などに溶かして、初日齢の鶏の頸部皮下に、あるいは孵化前の卵に注射や接種用機器を使って投与する。
【００２８】
本発明のワクチンは、親ウイルスであるＨＶＴによるマレック病に対するワクチン効果だけでなく、挿入された発現遺伝子カセット中の抗原遺伝子が発現することによって、それらの遺伝子の由来病原体による疾病に対するワクチン効果も発現するため、多価ワクチンとして使用することができる。
【実施例】
【００２９】
以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
本発明のプラスミド構築は特に記載がない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ．Ｎ．Ｙ．１９８９）記載の標準的な分子生物学手法を用いて行った。尚、制限酵素断片はアガロースゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製、カタログ番号＃２８７０４）を使って精製した。
七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、アメリカ農務省Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ．Ｗｉｔｔｅｒが分離した七面鳥ヘルペスウイルスＦＣ１２６株を使用した（Ｗｉｔｔｅｒ  Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．１９７０．３１．５２５−５３８）。
【００３０】
１．ＭＤＶ由来プロモーターのクローニング
マレック病ウイルスのゲノム構造は、Ｔｕｌｍａｎらによって報告されている（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：７９８０−７９８８（２０００））が、ＭＤＶのゲノム上にあるプロモーターの明確な位置や活性についてはあまり解析がなされていない。数少ない例として、ＩｚｕｍｉｙａらによるＵＬ４１からＵＬ５１遺伝子間のｍＲＮＡ解析論文（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７９：１９９７−２００１（１９９８））や、ＵＬ３０からＵＬ４０遺伝子間のｍＲＮＡ解析論文（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０：２４１７−２４２２（１９９９））が報告されている程度である。上記３つの論文から、ＭＤＶ由来プロモーターとして、ＭＤＶのゲノム配列（ジーンバンクのアクセッション番号：ＡＦ２４３４３８）の９１８２７番目から９２１９６番目までの塩基領域、及び９８７５７番目から９９４１２番目までの塩基配列領域が候補として挙げられた。
【００３１】
マレック病ワクチンとして市販されているマレック病ウイルスＣＶＩ９８８株を直径１５ｃｍの培養皿のＣＥＦ細胞に感染させウイルスを増やした後、ＰＢＳで洗浄後、リシスバッファー（０．５％ＳＤＳ１０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、２００μｇ／ｍｌプロテナーゼ）を４ｍｌ加えて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃）で４時間インキュベートし、細胞溶解物を５０ｍｌファルコンチューブに移し、等量のフェノール（ＴＥ飽和）を加え、１５分間ゆっくり回転し、混合した。次に、１５００×Ｇで５分間遠心後、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移した。クロロフォルム：イソアミルアルコール＝２４：１を等量加え、１５分間ゆっくり混合した。その後、１５００×Ｇで５分間遠心し、水層をピペットでゆっくり吸い取り、新しいチューブに移し、１００％エタノールを水層の倍量加え、良く混ぜてから１５００×Ｇで５分間遠心した。その沈殿を７０％エタノールでリンスした後、軽く風乾してＭＤＶのゲノムＤＮＡを含む核酸画分を調製した。
【００３２】
上記で調製したＭＤＶのゲノムＤＮＡ画分をテンプレートにして、ＭＤ５０Ｆ（配列番号５）とＭＤ５１Ｒ（配列番号６）のプライマーセットでＰＣＲを行い、ＭＤＶのゲノム配列の９１７０９番目から９２２６１番目までのＤＮＡ領域を増幅させ、それをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐベクター（ストラタジーン社製）にライゲーションし、ＪＭ１０９を形質転換した。そうして、得られた形質転換株３株からプラスミドを調製して、挿入ＤＮＡの塩基配列分析を行った。３株のうち、２株の挿入ＤＮＡの塩基配列が完全に一致した（配列番号７）。それらのプラスミドをｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０と命名した。
【００３３】
同様にして、ＭＤ５４Ｆ（配列番号８）とＭＤ５５Ｒ（配列番号９）のプライマーセットでＰＣＲを行い、ＭＤＶのゲノム配列の９８７１５番目から９９４６４番目までのＤＮＡ領域を増幅させ、それをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐベクターにクローニングした。挿入されたＤＮＡ配列は、ジーンバンクのＡＦ２４３４３８の配列とは１塩基異なるが、３クローン間で完全に一致した。その配列を配列番号１０に示す。こうして得られたプラスミドをｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５４と命名した。
【００３４】
２．ＭＤＶ由来プロモーターの改変
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０ＦとｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５４Ｆをそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩで切断後、更にＳａｌＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＵ（配列番号１１）と、Ａｄ＿Ｋｐ−Ｂｇ−ＳａＬ（配列番号１２）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをそれぞれｐＰｍｄ５０Ｍ１、ｐＰｍｄ５４Ｍ１と命名した。
【００３５】
ｐＰｍｄ５０Ｍ１とｐＰｍｄ５４Ｍ１をそれぞれ制限酵素ＳａｃＩで切断後、更にＮｏｔＩで切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＵ（配列番号１３）と、Ａｄ＿Ｎｏ−Ｓｆ−ＳａＬ（配列番号１４）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをそれぞれｐＰｍｄ５０Ｍ２、ｐＰｍｄ５４Ｍ２と命名した。
【００３６】
次いで、ｐＰｍｄ５０Ｍ２とｐＰｍｄ５４Ｍ２をそれぞれ制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで二重切断して回収したプラスミドに、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＵ（配列番号１５）と、Ａｄ＿Ｎｃ−Ｂｇ−Ｘｈ−ＮｏＬ（配列番号１６）の２つの合成ヌクレオチドをアニールさせた合成ＤＮＡアダプターを挿入した。このようにして得られたプラスミドをそれぞれｐＰｍｄ５０Ｍ３、ｐＰｍｄ５４Ｍ３と命名した
【００３７】
ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５０をテンプレートにして、Ｐｍｄ５０Ｆ（配列番号１７）とＰｍｄ５１Ｒ（配列番号１８）のＰＣＲプライマーでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断して得られた約３８０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０Ｍ３とライゲーションして、ｐＰｍｄ５０Ｆを構築した。このｐＰｍｄ５０ＦのＫｐｎＩサイトからＳａｃＩサイトまでの塩基配列が、配列番号１９である。
【００３８】
同様に、ｐＰＣＲ−Ｐｍｄ５４をテンプレートにして、Ｐｍｄ５４Ｆ（配列番号２０）とＰｍｄ５５Ｒ（配列番号２１）のＰＣＲプライマーでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断してうられた約６７０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩとＮｃｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５４Ｍ３とライゲーションして、ｐＰｍｄ５４Ｆを構築した。このｐＰｍｄ５４ＦのＫｐｎＩサイトからＳａｃＩサイトまでの塩基配列が、配列番号２２である。
【００３９】
３．２つの外来遺伝子を発現する発現遺伝子カセットプラスミドの構築
オワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質ＧＦＰ遺伝子を持った市販プラスミドベクターｐＧＦＰ（クロンテック社製、カタログ番号：６０９７−１）をテンプレートにして、ＧＦＰＢｓｐＦ（配列番号２３）とＧＦＰＳａｌＲ（配列番号２４）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩとＳａｌＩで二重切断し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５０ＦとライゲーションしてｐＰｍｄ５１ＧＦＰを作製した。
【００４０】
特許第３５８７０６５号の実施例７に記載されているｐＲＳＶ−Ｆのプラスミドに含まれているニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）のＦ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断してアガロースゲルから回収し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断したｐＰｍｄ５１ＧＦＰとライゲーションして、ｐＰｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ（図２）を作製した。
このプラスミドｐＰｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰは、オワンクラゲ由来のＧＦＰ遺伝子とＮＤＶ由来のＦ遺伝子という２つの外来遺伝子とその間にＭＤＶ由来の１つのプロモーター（ＢＤＰ１：配列番号１）から構成される発現遺伝子カセットを有するプラスミドである。
【００４１】
特開２００４−１１１号公報記載のプラスミドｐ４５／４６ｂａｃＶＰ２−Ｅをテンプレートにして、ＢｓｐＶＰ２−Ｆ（配列番号２５）とＶＰ２Ｘｈｏ−Ｒ（配列番号２６）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。増幅されたＰＣＲ産物（伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２蛋白質遺伝子；約１．４ｋｂｐ）を制限酵素ＢｓｐＨＩとＸｈｏＩで二重切断し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＰｍｄ５４ＦとライゲーションしてｐＰｍｄ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２を作製した。
【００４２】
国際公開ＷＯ２００５／０９３０７０号公報記載のホモロジーベクターｐ４５／４６ＰｅｃＩＬｇＢｄｅｌｌａｃ＋ＳＴＰから制限酵素ＢａｍＨＩとＳａｌＩで伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）のｇＢ遺伝子（約１．９ｋｂｐ）を切り出してアガロースゲルから回収し、ＢａｍＨＩとＳａｌＩで二重切断したｐＰｍｄ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２とライゲーションして、ｐＰｍｄ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２（図３）を作製した。
このプラスミドｐＰｍｄ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２は、ＩＬＴＶ由来のｇＢ遺伝子とＩＢＤＶ由来のＶＰ２遺伝子という２つの外来遺伝子とその間にＭＤＶ由来の１つのプロモーター（ＢＤＰ２：配列番号２）から構成される発現遺伝子カセットを有するプラスミドである。
【００４３】
４．組み換えＨＶＴを作製するためのホモロジーベクター（カセット含有プラスミド）の構築
特許第３５８７０６５号公報の実施例１の記載に従って、ＨＶＴ−ＤＮＡを調整し、それをテンプレートにして、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２７）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号２８）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。増幅したＰＣＲ産物（約１．０Ｋｂｐ）をＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断して、同じくＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断したｐＮＺ４５／４６ＢａｃｐＡ（特開２００４−１１１の実施例３．２）とライゲーションしてプラスミドｐ４６を得た。これをテンプレートにして、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２７）と４５ＳｆｉＲ（配列番号２９）のプライマーセットでＰＣＲを実施した。同様にして、４６ＳｆｉＦ（配列番号３０）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号２８）のプライマーセットで、ＰＣＲを実施した。それぞれ０．４ｋｂｐと０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅したので、更にその２断片をテンプレートにして、ＨＶＴ４５Ｓｐｈ（配列番号２７）とＨＶＴ４６Ｘｈｏ（配列番号２８）のプライマーセットで乗り換えＰＣＲを実施してＳｆｉＩサイトを導入した。その結果生じた１．０ｋｂｐのＰＣＲ産物を制限酵素ＳｐｈＩとＸｈｏＩで二重切断して、ｐ４６のＳｐｈＩとＸｈｏＩの間のＤＮＡと置き換えたプラスミドｐ４６Ｓｆｉ（図４）を作製した。
【００４４】
プラスミドｐＰｍｄ５０ＮＤＶ＿Ｆ５１ＧＦＰを制限酵素ＢｇｌＩで切断して、約３．１ｋｂｐの発現カセットをアガロースゲルから回収した。そのカセットを制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６Ｓｆｉにライゲーションしてｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰを作製した。
【００４５】
次にプラスミドｐＰｍｄ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２を制限酵素ＢｇｌＩで切断して、約４．０ｋｂｐの発現カセットをアガロースゲルから回収し、制限酵素ＳｆｉＩで切断したｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰにライゲーションしてｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２を作製した。このプラスミドｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２（図５）は、２つの発現遺伝子カセットを含有する組み換えＨＶＴを作製するためのホモロジーベクターである。
【００４６】
５．組み換えＨＶＴ（ＦＷ１０１）の作製・純化
トリプシンで剥がした単層のＣＥＦ細胞を、ＳａｌｉｎｅＧ（０．１４Ｍ塩化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化カリウム、１．１ｍＭリン酸一水素二ナトリウム、１５ｍＭリン酸二水素一ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム・６水和物、０．０１１％グルコース）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液（２×１０７個）に、実施例４で作製したカセット含有プラスミドｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２を２５μｇと、特許第３５８７０６５号公報の実施例１記載の方法で調製したＨＶＴのＤＮＡ１５μｇを混合して、ジーンパルサー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、０．５ｋＶｃｍ−１、０．５ｍｓｅｃの条件下でエレクトロポレーションした。
【００４７】
プラスミド及びＨＶＴのＤＮＡを導入した細胞を、１０７個のＣＥＦ細胞と混合して、培養用９６ウェル平底マルチプレート（ファルコン社製）５枚にまいて３７℃にてＨＶＴ特有のプラークが形成されるまで約４日〜５日間培養した。
【００４８】
倒立型落射蛍光観察装置（オリンパス社製「ＩＸ−ＦＬＡ」）付の倒立顕微鏡（オリンパス社製「ＩＸ７０」）を使って、出現したＨＶＴのプラークを観察し、蛍光蛋白を発現しているプラークを選択した。選択したプラークの入っているウェルに１％トリプシンを加えて組み換えＨＶＴ感染細胞を含むＣＥＦ細胞をそれぞれ回収し、２×１０６個の細胞と混合し、それぞれのプラークごとに、１枚の培養用９６ウェル平底マルチプレートにまいて、３７℃にて約３日〜５日間培養した。
【００４９】
再び出現したＨＶＴのプラークを蛍光顕微鏡にて、各プラークが蛍光蛋白を発現しているか否かを観察した。各ウェルに存在するＨＶＴプラークが全て蛍光蛋白を発現するプラークとなっていなければ、蛍光蛋白を発現するプラークの割合が最も多いウェルを選択して、再び、１％トリプシンを加えて組み換えＨＶＴ感染細胞を含むＣＥＦ細胞をそれぞれ回収し、２×１０６個の細胞と混合し、それぞれのプラークごとに、１枚の培養用９６ウェル平底マルチプレートにまいて、３７℃にて約３日〜５日間培養した。
【００５０】
このようにして、各ウェルに存在するＨＶＴプラークが全て蛍光蛋白を発現するプラークとなるまで、スクリーニング操作を繰り返した。
【００５１】
ウェル中の全ＨＶＴプラークが蛍光蛋白を発現するようになったら、そのウェルのＣＥＦ細胞をトリプシンで回収し、培養用６ウェルプレート（ファルコン社製）の１ウェルを使って感染細胞を増殖させた後、ＳＰＧＡ−ＳＢＴバッファー（１００ｍｌ当たり、７．４６ｇシュークロース、５．２ｍｇ  ＫＨ２ＰＯ４、１２５．４ｍｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、９１．７ｍｇ  Ｌ−グルタミン・Ｎａ、１ｇ  ＢＳＡ、１０ｇソルビトール）２ｍｌに回収し、１ｍｌをエッペンドルフチューブに移した。
【００５２】
そのチューブを超音波破砕器（三光純薬社製「ＢＩＯＳＯＮＩＣ」）にセットし、最大出力で３分間超音波破砕した。その後、５０００ｒｐｍ５分間遠心分離し、上清を回収した。これにより、セルフリーウイルスが回収された。回収した上清をＳＰＧＡ−ＳＢＴバッファーで段階希釈して、別途用意したＣＥＦ細胞を単層培養した９６ウェル平底マルチプレートに各ウェルあたり４０μｌずつ重層して、２時間インキュベーターで感染させた。液をすて、ＬＭ培地を２００μｌずつ加えてプラークが出現するまで培養した。
【００５３】
出現したＨＶＴのプラークを蛍光顕微鏡にて観察し、全ウェル中に１つのプラークで、且つ、そのプラークが蛍光蛋白を発現しているウェルを選択した。これで、このウェル中のＨＶＴは１００％純度になったと判断され、このようにして純化した組み換えＨＶＴをＦＷ１０１と命名した。
【００５４】
６．組み換えＨＶＴのゲノム構造の確認とその安定性試験
６．１  サザンハイブリダイゼーション
実施例５で純化が終了したＦＷ１０１をＣＥＦ細胞とともに２枚の１５０ｍｍ径培養皿で全面にプラークが出現するまで培養し、その感染細胞をスクレーパーで培養皿から剥がして遠心分離（５００×Ｇ、５分）して感染細胞を集め、ＰＢＳで洗浄後、１．２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、溶解バッファー（１．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭ  ＥＤＴＡがＰＢＳに入ったもの）０．８ｍｌを加えて攪拌して細胞を可溶化した。３０００ｒｐｍ、５分間で細胞残さを除去し、上澄をエッペンドルフチューブに移して１５０００ｒｐｍ、２０分間、２２℃で遠心してウイルスを落とした。１２．５ｍＭ  トリス（ｐＨ７．５）を１ｍｌ加えて、ヌクレアーゼ液（０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）を４μｌ加えて３７℃、３０分間静置した。その後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを２５μｌ、１０％ＳＤＳを１２５μｌ、水８７μｌ、１０ｍｇ／ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼＫを１２．５μｌ、２−メルカプトエタノール０．５μｌ加えて、５５℃、３０分間静置した。その液をフェノール：クロロホルム（＝１：１混合）で２回抽出した。
【００５５】
その水層に５Ｍ塩化ナトリウム１６μｌを加え、水層の２．５倍量の（−２０℃で冷やした）１００％エタノールを加えて沈殿させ、遠心分離で沈殿させた沈殿物（ＤＮＡ）を７０％エタノールで洗浄後、再度遠心分離して沈殿させた後乾燥させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）５０μｌに溶かした。
こうして回収されたウイルスＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ／ＳｔｕＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動を行い、制限酵素で切断されたＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにブロットし、サザンハイブリダイゼーションを行った。プローブは“ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ”（ＲＯＣＨＥ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣＳ社製、カタログ番号＃１６３６０９０）の試薬を用いて２種類のＤＩＧ標識されたＤＮＡプローブを調製した。そのＤＮＡプローブは、ＶＰ２  ｃＤＮＡ領域内のプローブ（以下ＶＰ２プローブ）と外来遺伝子の挿入部位のＨＶＴゲノム領域（以下４５／４６プローブ）である。前者のプローブはＶＰ２−Ｆ（配列番号３１）とＶＰ２−Ｒ（配列番号３２）の２本のプライマー及びプラスミドｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２をテンプレートとして、後者は、４５／４６−Ｆ（配列番号３３）と４５／４６−Ｒ（配列番号３４）の２本のプライマー及びプラスミドｐ４６ＳｆｉをテンプレートとしてＰＣＲ反応によって調製した。
【００５６】
この２種類のプローブを使ったサザンハイブリダイゼーションの結果、ＶＰ２プローブでは２．０ｋｂｐのバンドがハイブリダイズし、４５／４６プローブでは０．６ｋｂと１．７ｋｂの２本のバンドがハイブリダイズした。この結果は、どちらのプローブも予期した通りのバンドであったので、組み換えＨＶＴは設計どおり正しい組み換え体であることが確認された。
【００５７】
６．２  ゲノム安定性試験
組み換えＨＶＴをＣＥＦ細胞で２０代継代した組み換えウイルスについても前記６．１と同様にサザンブロッティングを実施し、２０代継代後の組み換えウイルスも正しい遺伝子構造を持っていることが確認された。一方、特許第３５８７０６５号公報記載の組み換えＨＶＴのＨＦ００４〜ＨＦ００７の組み換え体について、同様に２０代継代したところ、これら全ての組み換えＨＶＴのゲノム構造は、継代前の組み換えＨＶＴの構造と異なっていた。これらの組み換えＨＶＴについては、継代途中に遡って安定性を調べたところ、ＨＦ００４とＨＦ００５は１０代、ＨＦ００６とＨＦ００７については、５代継代した時点で、継代前の構造と異なっており、不安定であることがわかった。従って、２０代継代してもゲノム構造が変化しないＦＷ１０１は極めて安定な組み換えＨＶＴであることがわかった。
【００５８】
７．組み換えＨＶＴの蛋白発現確認
７．１  ＦＩＴＣ標識抗体を使った蛍光検出法
特許第３５８７０６５号公報の実施例１６に記載した方法に従って、組み換えウイルスＦＷ１０１が外来抗原遺伝子であるＮＤＶのＦ蛋白質、ＩＢＤＶのＶＰ２蛋白質を発現していることを確認した。
【００５９】
７．２  ウエスタンブロット法
９ｃｍ径ディッシュに新鮮な１０７個のＣＥＦ細胞と１×１０５ｐ．ｆ．ｕ．のＦＷ１０１をまき、約７２時間後に、感染細胞をスクレーパーにて回収した。遠心分離（２０００ｒｐｍで５分）で感染細胞を回収し、１０ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、再び遠心分離で細胞を集めた。その細胞ペレットに２×サンプルバッファー（０．１１２Ｍトリス−アセテート（ｐＨ７）、２％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、５％シュークロース、０．００５％ブロモフェノールブルー  ）を０．１ｍｌ添加し、１００℃で５分煮沸した。
【００６０】
煮沸したサンプル５μｌを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにアプライした。電気泳動終了後、ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア）にエレクトロブロッティングし、ブロットしたＰＶＤＦメンブレンをＩＢＤＶのＶＰ２に対するモノクローナル抗体Ｒ−６３（ハイブリドーマはＡＴＣＣから入手、ＡＴＣＣ：ＨＢ−９４９０）を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、約４０ｋＤａの大きさの蛋白質が検出された。この大きさは、文献で知られているＩＢＤＶのＶＰ２の大きさであり、ＦＷ１０１は期待通り目的とする大きさのＶＰ２が発現していた。
【００６１】
また、ＧＦＰ蛋白に対する市販モノクローナル抗体ＪＬ−８（クロンテック社製）を使って同じくブロットしたＰＶＤＦメンブレンと反応させたところ、約２６ｋＤａの大きさの蛋白質が検出された。この大きさはＧＦＰ蛋白の分子量と一致し、ＦＷ１０１が期待通りの大きさのＧＦＰ蛋白質も発現していることを確認した。
【００６２】
８．ＦＷ１０１のワクチン効果動物試験
ＦＷ１０１を鶏に免疫してワクチン効果を調べた。３０００ｐ．ｆ．ｕ．／ｄｏｓｅのＦＷ１０１（対照は親株ＨＶＴ）をＳＰＦ鶏の発育鶏卵（日生研）の孵化後の鶏の背部皮下に接種した。接種後、１週間隔で採血をし、その血中の抗体価を市販ＥＬＩＳＡキット（ゲン・コーポレーション社製、ＩＢＤエリーザキット）で測定した。そのデータ（Ｓ／Ｐ  ｖａｌｕｅ）を表１に示す。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
表１に示したように、挿入した抗原遺伝子の蛋白質に対する抗体が上昇し、ワクチン活性が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、発現遺伝子カセットの概念図である。
【図２】図２は、発現遺伝子カセットプラスミドｐＰｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰの模式図。
【図３】図３は、発現遺伝子カセットプラスミドｐＰｍｄ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２の模式図である。
【図４】図４は、挿入部位を含むＨＶＴ−ＤＮＡ含有プラスミドｐ４６Ｓｆｉの模式図である。
【図５】図５は、ＦＷ１０１作製用ホモロジーベクター  ｐ４６ｍｄ５０ＮＤ＿Ｆ５１ＧＦＰ５４ＩＬ＿ｇＢ５５ＩＢＤ＿ＶＰ２の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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