(57)【要約】【課題】一塩基の変異を簡便な操作で迅速且つ高精度で検出する。【解決手段】標的塩基配列を含む核酸４をＬＣＲ反応に供して増幅し、得られたＬＣＲ反応生成物１６を、ＬＡＭＰ反応する。ＬＣＲ反応液６中のＬＣＲプライマーセット１０およびＬＡＭＰ反応液２６中のＬＡＭＰプライマーセット２０は、好ましくは所定の濃度に設定する。ＬＣＲ反応生成物２６をＬＡＭＰ反応に供することで、加熱と冷却とを繰り返すＬＣＲ反応のサイクル数を減らすことができ、また、加熱と冷却が不要なＬＡＭＰ反応でリアルタイム測定によらずに高精度で変異を検出できる。このため、２本鎖ＤＮＡを分析する場合でも、加熱−冷却操作の工数を減らし、リアルタイム測定によらない高精度分析ができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を含む核酸の分析方法であって、
前記核酸を有する試料とＬＣＲ反応用のＬＣＲプライマーセットとを含むＬＣＲ反応液中でＬＣＲ反応を行ってＬＣＲ反応生成物を生成させ、
前記ＬＣＲ反応生成物を、ＬＡＭＰ反応用のＬＡＭＰプライマーセットが含まれたＬＡＭＰ反応液中でＬＡＭＰ反応させる分析方法。
【請求項２】
前記ＬＣＲ反応生成物を熱変性処理することなく前記ＬＡＭＰ反応させる請求項１に記載の核酸の分析方法。
【請求項３】
前記ＬＣＲ反応液中の前記ＬＣＲプライマーセットの濃度、および前記ＬＡＭＰ反応液中の前記ＬＡＭＰプライマーセットの濃度が所定の範囲に調整されている請求項２に記載の核酸の分析方法。
【請求項４】
前記ＬＣＲ反応液中の前記ＬＣＲプライマーセットの濃度は、０．１μＭ以上０．５μＭ以下である請求項３に記載の核酸の分析方法。
【請求項５】
前記ＬＡＭＰプライマーセットは、インナープライマーセットを少なくとも含み、
前記ＬＡＭＰ反応液中の前記インナープライマーセットの濃度は、０．２μＭ以上１．０μＭ以下である請求項３または４に記載の核酸の分析方法。
【請求項６】
前記ＬＡＭＰプライマーセットは、ループプライマーとアウタープライマーとをさらに含み、
前記ＬＡＭＰ反応液中の前記ループプライマーの濃度は、０．１μＭ以上０．５μＭ以下であり、前記アウタープライマーの濃度は、０μＭ以上０．１μＭ以下である請求項５に記載の核酸の分析方法。
【請求項７】
前記ＬＣＲ反応は、９４℃の温度条件で１０秒以上３０秒間以下の熱変性処理を行なった後６５℃以上７０℃以下の温度条件で３０秒間の連結反応を行なう処理を１サイクルとし、該ＬＣＲ反応のサイクル数は３０サイクル以下である請求項１から６のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項８】
前記ＬＡＭＰプライマーセットは、インナープライマーセットと、ループプライマーとを少なくとも含み、
前記ＬＣＲ反応のサイクル数は１０サイクル以上２５サイクル以下である請求項７に記載の核酸の分析方法。
【請求項９】
前記ＬＡＭＰ反応を行なう反応時間は、３０分以下である請求項１から８のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項１０】
前記標的塩基配列は、変異部位を含み、
前記ＬＡＭＰ反応による増幅産物の有無を調べることにより、前記核酸の変異の有無を検出する請求項１から９のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項１１】
前記試料は、２×１０〜２×１０３ヒト・ゲノム／μＬを含む請求項１から１０のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項１２】
前記試料中の核酸は、精製されていない、またはゲノム濃度測定されていない請求項１から１１のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項１３】
前記試料は、純水で希釈した未精製血液である請求項１から１２のいずれかに記載の核酸の分析方法。
【請求項１４】
前記試料は、純水による希釈倍率が１０倍である請求項１３に記載の核酸の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子配列を含む核酸を増幅して塩基配列を分析する核酸の分析方法に関し、特に標的遺伝子配列の塩基配列変異の有無を検出する分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の遺伝子領域における塩基配列の変異は、様々な体質の違いを生じる原因とされる。このため、特に医療分野を中心に、薬剤投与の効果や安全性を高める目的、あるいは特定の疾病にかかりやすいか否かを判断する目的等で、遺伝子領域における塩基配列の変異の有無を検出する分析が行なわれている。
【０００３】
こうした変異の検出方法の一つに、リガーゼ連鎖反応（Ligase  Chain  Reaction：以下、「ＬＣＲ反応」）と呼ばれる反応を利用する方法がある（非特許文献１）。ＬＣＲ反応では、分析に供するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に相補的な塩基配列を有する１対のオリゴヌクレオチド（以下、「オリゴＤＮＡ」）を、僅かな隙間を有する状態で隣接させ、隣り合った一対のオリゴＤＮＡ同士をリガーゼにより連結する。ＬＣＲ反応液は、分析対象とする１本鎖ＤＮＡ（例えば、２本鎖ＤＮＡを分析する場合はセンス鎖またはアンチセンス鎖）に相補結合して互いに隣り合うように設定された２つのオリゴＤＮＡおよび耐熱性リガーゼとを少なくとも含む。
【０００４】
２つのオリゴＤＮＡの一方（以下、「５’側オリゴＤＮＡ」）は、１本鎖ＤＮＡの標的遺伝子の５末端側領域と相補的に結合し、他方（以下、「３’側オリゴＤＮＡ」）は３末端側領域と相補的に結合する。このとき、５’側オリゴＤＮＡと３’側オリゴＤＮＡとは、両者の間にわずかな隙間を挟んで隣り合う状態で鋳型となる１本鎖ＤＮＡと相補的に結合するように設定されている。鋳型ＤＮＡの塩基配列に変異がなければ、５’側オリゴＤＮＡと３’側オリゴＤＮＡの両方が鋳型ＤＮＡと結合して、両者の間がリガーゼにより連結され増幅産物が得られる。変異がない場合、得られた増幅産物を鋳型として上記一連の反応が繰り返されるので、標的塩基配列部分が増幅された増幅産物が指数関数的に増加する。
【０００５】
一方、鋳型ＤＮＡの標的塩基配列に変異があると、５’側オリゴＤＮＡと３’側オリゴＤＮＡの少なくともどちらか一方が鋳型である１本鎖ＤＮＡと完全には結合しない。このため、５’側オリゴＤＮＡと３’側オリゴＤＮＡとは連結されず、増幅反応が繰り返されないため、標的塩基配列に変異があるＤＮＡは増幅されない。
【０００６】
２本鎖ＤＮＡを分析する場合、ＬＣＲ反応液は、一般には、２組４種類のオリゴＤＮＡ（第１の５’側オリゴＤＮＡと第１の３’側オリゴＤＮＡ、および第２の５’側オリゴＤＮＡと第２の３’側オリゴＤＮＡ）を含む。第１の５’側オリゴＤＮＡと第１の３’側オリゴＤＮＡとは、２本鎖ＤＮＡの一方（センス鎖）の標的塩基配列部分に相補的に結合する塩基配列を有するように設定されている。また、第２の５’側オリゴＤＮＡと第２の３’側オリゴＤＮＡは、２本鎖のＤＮＡの他方（アンチセンス鎖）の標的塩基配列部分に相補的な塩基配列を有し、センス鎖、およびアンチセンス鎖について上記反応が生じる。
【０００７】
このようにＬＣＲ法では、標的塩基配列に変異があれば、本来、増幅反応が繰り返されないため変異が検出できる。しかしＬＣＲ法では、オリゴＤＮＡ同士が平滑末端において連結するという、鋳型の存在に依存しない非特異的連結が生じる場合があるため、ＬＣＲ法単独での変異の検出精度は必ずしも高くない。
【０００８】
一方、拡散の標的塩基配列を増幅する方法としてＬＡＭＰ法（Loop-Mediated  Isothermal  Amplification）が知られており（特許文献１、非特許文献２）、ＬＡＭＰ法を利用した変異検出法も提案されている（特許文献２、特許文献３）。ＬＡＭＰ法では、少なくとも２種類のインナープライマー（第１のインナープライマーと第２のインナープライマー）、２種類のアウタープライマー（第１のアウタープライマーと第２のアウタープライマー）、および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。インナープライマーは、該プライマーから伸長した部分の末端に当該プライマーと相補的な配列が含まれるように設計され、インナープライマーを起点として伸張した１本鎖（第１の伸長生成物）はループ構造を形成できる。
【０００９】
すなわち、図６において符番３５で示す第１の伸長生成物は、一方の末端側にインナープライマーを含んでおり、このインナープライマーから伸長された部分は該プライマーと相補的な配列の末端を有する。そして、アウタープライマーがインナープライマーよりさらに上流に結合し、その伸長生成物が生成される過程で第１の伸長生成物３５が鋳型核酸から剥されて１本鎖にされると、この末端が該プライマー由来の部分と相補結合してループを形成する（図６（ｂ）参照）。一方のインナープライマー（例えば第１のインナープライマーＦＩＰ）を起点として伸長された第１の伸長生成物３５は、他方のインナープライマー（第２のインナープライマーＢＩＰ）を起点とする伸長反応の鋳型となり、第２の伸長生成物３６が得られる（図６（ｃ）参照）。第２の伸長生成物３６の両端にはループが形成され、ループを起点とする更なる伸長反応が生じる（図６（ｄ）参照）。
【００１０】
このように、ＬＡＭＰ法では鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより、２本鎖が剥されながら複数の位置から伸長反応と増幅反応とが同時に進行する。このため、ＬＡＭＰ法では核酸の増幅は超指数関数的に起こり、しかも等温条件下で反応が起こるため、２本鎖ＤＮＡを解離させるために加熱と冷却を繰り返す必要がない。
【００１１】
このようなＬＡＭＰ法を利用した変異検出法では、検出すべき変異部位を含む領域を有するインナープライマーを用いる（特許文献２参照）。分析対象とする核酸に変異がなければ場合、インナープライマーを起点として伸長された伸長生成物には、変異を含む領域と相補的な塩基配列が生成されないので、このような伸長生成物を解離させて１本鎖にしてもループは形成されない。このためＬＡＭＰ反応はそれ以上、進行しない。一方、分析対象とする核酸が変異を含んでいる場合は、インナープライマーを起点として伸長された伸長鎖を１本鎖にするとループが形成され、超指数関数的な増幅が起こる。よって、ＬＡＭＰ反応の結果生じた生成物の量を測定することから、変異の有無を検出できる。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ００／２９０８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０１／３４８３８号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−１５９１００号公報
【非特許文献１】Barany  F.（１９９１）、Genetic  disease  detection  and  DNA  amplification  using  cloned  thermostable  ligase、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.；８８（１）、１８９−１９３
【非特許文献２】Notomi  T.  et  al.（２０００）、Loop-mediated  isothermal  amplification  of  DNA、Nucleic  Acid  Research；２８（１２）、e６３
【非特許文献３】Iwasaki  M.  et  al.（２００３）、Validation  of  the  Loop-Mediated  Isothermal  Amplification Method  for  Single  Nucleotide  Polymorphism  Genotyping  with  Whole  Blood、Genome  Letters  ２（３）、１１９−１２６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＬＡＭＰ法は、本来はプライマーの位置選択に余裕があるため、高特異性での増幅有無の検証が可能であり、所定の時間、ＬＡＭＰ反応を行うことにより得られた最終産物（以下、「ＬＡＭＰ反応生成物」）を測定することで増幅の有無を判定できる。しかし、変異検出用として設計されるインナープライマーは、塩基の一つが野生型用のインナープライマーと異なっている他は野生型用のプライマーとほぼ同じであり、しかも異なる部位は末端塩基に限られるため、非特異的増幅が生じる可能性が高い。このため、変異検出精度を高めるためにはリアルタイム測定が推奨される。
【００１３】
リアルタイム測定は定量性には優れるが、分析に供する試料中に含まれる鋳型となる核酸の量が重要であり、試料中にある程度の量の核酸が含まれていることが必要である上、ダイナミックレンジは低い。
【００１４】
さらに、ＬＡＭＰ反応を行う場合に推奨される条件は、濃度測定を行なった精製ゲノムを使用することが推奨される。これに対し、本発明者が非特許文献３を参考にして未精製血液を試料としてＬＡＭＰ反応を行なったところ、変異の検出が不可能であることが判明した。このため、未精製血液が使用できない場合、臨床現場でＬＡＭＰ反応を利用した分析を行うことは困難となる。
【００１５】
本発明は、上記課題に対し、非特異的増幅を抑制して高精度で塩基変異の有無を検出できる核酸の分析法を提供することを目的とする。特に、ＬＣＲ反応とＬＡＭＰ反応とは互いに干渉しあうおそれがあるのに対し、本発明は、ＬＣＲ法とＬＡＭＰ法とのそれぞれの長所を引き出すことにより、上記課題を解決することを目的とする。また、本発明は、ＬＡＭＰ反応を利用して未精製血液を試料とする変異検出を可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の請求項１に係る発明は、標的塩基配列を含む核酸の分析方法であって、前記核酸を有する試料とＬＣＲ反応用のＬＣＲプライマーセットとを含むＬＣＲ反応液中でＬＣＲ反応を行ってＬＣＲ反応生成物を生成させ、前記ＬＣＲ反応生成物を、ＬＡＭＰ反応用のＬＡＭＰプライマーセットが含まれたＬＡＭＰ反応液中でＬＡＭＰ反応させる分析方法である。
【００１７】
本発明では、ＬＣＲ法により増幅した増幅産物をＬＡＭＰ法の鋳型とする。具体的には、所定の範囲の温度、時間での加熱処理を行った後、所定の範囲の温度とする冷却操作を行い所定範囲の時間、連結反応を行う操作を１サイクルとして、１０〜３０サイクル程度を繰り返すＬＣＲ反応の結果得られた増幅産物を含む液状物（ＬＣＲ反応生成物）をＬＡＭＰ反応に供する。
【００１８】
本発明の請求項２に係る発明は、前記ＬＣＲ反応生成物を熱変性処理することなく前記ＬＡＭＰ反応させる請求項１に記載の核酸の分析方法である。
【００１９】
ＬＡＭＰ法では、従来、２本鎖ＤＮＡを分析対象とし、これを鋳型とする場合は、２本鎖ＤＮＡを１本鎖にしてインナープライマーが結合できるように、２本鎖ＤＮＡを熱変性させる処理が必要である。ここで、ＬＣＲ反応では、ＬＣＲ反応の鋳型とする２本鎖ＤＮＡのそれぞれに対する連結反応は同等ではなく、どちらか一方の１本鎖はもう一方の１本鎖より合成量が多くなる。一方の１本鎖より多く合成され標的遺伝子配列を含む増幅産物は、１本鎖の状態でＬＣＲ反応生成物に含まれる。本発明では、このようなＬＣＲ反応生成物をＬＡＭＰ反応に供するので、１本鎖の状態で存在し標的遺伝子配列を含むＬＣＲ反応の増幅産物をＬＡＭＰ反応の鋳型とできる。よって、ＬＡＭＰ反応工程において熱変性処理を省略でき、操作を簡便かつ迅速にできる。
【００２０】
本発明の請求項３に係る発明は、前記ＬＣＲ反応液中の前記ＬＣＲプライマーセットの濃度、および前記ＬＡＭＰ反応液中の前記ＬＡＭＰプライマーセットの濃度が所定の範囲に調整されている請求項１に記載の核酸の分析方法である。
【００２１】
ＬＣＲ反応生成物には、ＬＣＲ反応の結果得られた増幅産物以外にＬＣＲ反応用のプライマーが含まれる場合がある。ＬＣＲ反応生成物中にＬＣＲ反応用のプライマーが残存する場合、ＬＡＭＰ反応が適正に進行しないおそれがある。これに対し、ＬＣＲ反応を行う際に用いる、複数種類のプライマー（ＬＣＲプライマーセット）の濃度を所定の範囲にするとよい。同様に、ＬＡＭＰ反応を行う際に用いる、複数種類のプライマー（ＬＡＭＰプライマーセット）の濃度も所定の範囲にするとよい。このように、ＬＣＲ反応およびＬＡＭＰ反応に用いるプライマーの濃度を所定の濃度に調整することで、ＬＣＲ反応とＬＡＭＰ反応とが互いに干渉するおそれを回避できる。
【００２２】
本発明の請求項４に係る発明は、前記ＬＣＲ反応液中の前記ＬＣＲプライマーセットの濃度は、０．１μＭ以上０．５μＭ以下である請求項３に記載の核酸の分析方法である。
【００２３】
本発明の請求項５に係る発明は、前記ＬＡＭＰプライマーセットは、インナープライマーセットを少なくとも含み、前記ＬＡＭＰ反応液中の前記インナープライマーセットの濃度は、０．２μＭ以上１．０μＭ以下である請求項３または４に記載の核酸の分析方法である。
【００２４】
本発明の請求項６に係る発明は、前記ＬＡＭＰプライマーセットは、ループプライマーとアウタープライマーとをさらに含み、前記ＬＡＭＰ反応液中の前記ループプライマーの濃度は、０．１μＭ以上０．５μＭ以下であり、前記アウタープライマーの濃度は、０μＭ以上０．１μＭ以下である請求項５に記載の核酸の分析方法である。
【００２５】
本発明の請求項７に係る発明は、前記ＬＣＲ反応は、９４℃の温度条件で３０秒間の熱変性処理を行なった後６５℃以上７０℃以下の温度条件で１０秒以上３０秒間以下の連結反応を行なう処理を１サイクルとし、該ＬＣＲ反応のサイクル数は３０サイクル以下である請求項１から６のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
【００２６】
本発明の請求項８に係る発明は、前記ＬＡＭＰプライマーセットは、インナープライマーセットと、ループプライマーとを少なくとも含み、前記ＬＣＲ反応のサイクル数は１０サイクル以上２５サイクル以下である請求項７に記載の核酸の分析方法である。
【００２７】
上述したとおり、従来、ＬＡＭＰ反応を行なうためには２種類のインナープライマーと２種類のアウタープライマーとが必要であった。しかし、本発明者による研究の結果、ＬＣＲ反応生成物を鋳型としてＬＡＭＰ反応を行なう場合は、アウタープライマーが省略可能なことが判明した。よって、本発明によればＬＡＭＰ反応に要するプライマーの種類を減らすことができる。
【００２８】
本発明の請求項９に係る発明は、前記ＬＡＭＰ反応を行なう反応時間は、３０分以下である請求項１から８のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
【００２９】
本発明では、ＬＣＲ反応とＬＡＭＰ反応を組み合わせることにより、ＬＣＲ法単独で変異を検出する場合に必要なサイクル数より少ないサイクル数でＬＣＲ反応を終了できる。よって、分析に要する時間を短縮できる。
【００３０】
本発明の請求項１０に係る発明は、前記標的塩基配列は、変異部位を含み、前記第ＬＡＭＰ反応による増幅産物の有無を調べることにより、前記核酸の変異の有無を検出する請求項１から９のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
【００３１】
従来、ＬＡＭＰ法単独で塩基配列の変異の有無を検出する場合は、高い精度を得るためにはリアルタイム測定が必要であり、蛍光検出法を用いたリアルタイム測定により、ＬＡＭＰ反応による増幅の有無を調べていた。本発明ではＬＣＲ反応生成物を鋳型としてＬＡＭＰ反応を行うため、最終産物を調べることで増幅の有無を判断して変異の有無を検出できる。このため、リアルタイム測定は必要でなく、蛍光検出法以外、例えば電気泳動法等で増幅有無を検出できる。
【００３２】
本発明の請求項１１に係る発明は、前記試料は、２×１０〜２×１０３ヒト・ゲノム／μＬを含む請求項１から１０のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
としたものである。
【００３３】
本発明の請求項１２に係る発明は、前記試料中の核酸は、精製されていない、またはゲノム濃度測定されていない請求項１から１１のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
【００３４】
本発明の請求項１３に係る発明は、前記試料は、純水で希釈した未精製血液である請求項１から１２のいずれかに記載の核酸の分析方法である。
【００３５】
本発明の請求項１４に係る発明は、前記試料は、純水による希釈倍率が１０倍である請求項１３に記載の核酸の分析方法である。
【００３６】
本発明では、リアルタイム測定を行なわずとも高精度でＬＡＭＰ反応を利用した塩基の変異有無を検出できる。このため、精製していない核酸、および濃度を測定していない核酸を試料として分析に供することができ、例えば未精製の血液を純水に希釈するだけで変異の有無を検出できる。
【発明の効果】
【００３７】
本発明によれば、核酸の塩基配列の変異の有無を、高精度で、しかも短時間で分析できる。また本発明によれば、ゲノムの精製や濃度測定を行わずに塩基配列の変異の有無を分析でき、未精製の血液を純水に希釈しただけで分析できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、図面を参照して本発明について詳細に説明する。以下において、同一部材には同一符号を付し、説明を省略または簡略化する。
【００３９】
本発明は、核酸の遺伝子領域の一部を標的塩基配列とし、この標的塩基配列の特定部分の変異の有無を分析するものとする。分析対象とするゲノムは、精製されたゲノムである必要はなく、ゲノムの濃度が測定されている必要もない。このため、例えば、未精製血液を純水に５〜１５倍程度、特に１０倍希釈し、これを試料として本発明に係る分析試料とできる。
【００４０】
分析対象は核酸を含み、ＬＣＲ反応でこの核酸を増幅した後、ＬＣＲ反応により得られた増幅産物を含む反応生成物をＬＡＭＰ反応に供する。そこで、まず、ＬＣＲ反応を行う工程（ＬＣＲ工程）について説明する。
【００４１】
《ＬＣＲ工程》
図１および図２は、本発明の一実施態様に係る分析方法においてＬＣＲ工程を説明する模式図である。まず、図１（ａ）に示すように、符号４で示す分析対象とする２本鎖ＤＮＡを、ＬＣＲプライマーセット１０、および耐熱性リガーゼ２を含むＬＣＲ反応液６に混合する。図１（ｂ）に、２本鎖ＤＮＡ４、およびＬＣＲプライマーセット１０を構成する４種類のオリゴＤＮＡの模式図を示す。本実施態様では、２本鎖ＤＮＡの遺伝子領域のうち、図１（ｂ）においてＸで示す領域の塩基配列を標的塩基配列とし、破線で囲った座位の変異の有無を分析するものとする。
【００４２】
２本鎖ＤＮＡ４は、９４℃〜９９℃程度で１０秒〜１２０秒間、加熱処理することで熱変性させ、図２（ａ）に示すように２本鎖を解離させる。加熱処理時間は２０秒〜４０秒、特に２５秒〜３５秒とすることが好ましい。次いで熱処理したＬＣＲ反応液６を５０℃〜７０℃程度に冷却すると、２本鎖ＤＮＡ４が解離して得られた１本鎖の一方であるセンス鎖４（＋）、および他方であるアンチセンス鎖４（−）に、ＬＣＲプライマーセット１０として添加されたオリゴＤＮＡがハイブリダイズする。冷却による連結反応は、６５℃以上７０℃以下の温度条件で３０秒〜６０秒、特に３０秒間行うとよい。
【００４３】
ＬＣＲプライマーセット１０は、第１のオリゴＤＮＡ対としてセンス鎖４（＋）の標的塩基配列と相補的な配列を有する２つのオリゴＤＮＡ（第１の３’オリゴＤＮＡと第１の５’オリゴＤＮＡ）を含んでいる。ＬＣＲプライマーセットは、第２のオリゴＤＮＡ対として、アンチセンス鎖４（−）の標的塩基配列と相補的な配列を有する１対のオリゴＤＮＡ（第２の３’オリゴＤＮＡと第２の５’オリゴＤＮＡ）をさらに含む。以下、第１のオリゴＤＮＡ対をそれぞれ「３’オリゴＤＮＡ」「５’オリゴＤＮＡ」と記載し、第２のオリゴＤＮＡ対はそれぞれ「３’オリゴＤＮＡｃ」「５’オリゴＤＮＡｃ」と記載する。
【００４４】
これらのオリゴＤＮＡのうち、３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡとは、センス鎖４（＋）の標的塩基配列と相補的な塩基配列を有し、センス鎖４（＋）にハイブリダイズした際、互いにわずかな隙間を有する状態で隣接するように設計されている。一方、３’オリゴＤＮＡｃと５’オリゴＤＮＡｃとは、アンチセンス鎖４（−）の標的塩基配列と相補的で、互いにわずかな隙間を有して隣接した状態で、この１本鎖４（−）にハイブリダイズするように設計されている。
【００４５】
よって、本実施態様では、センス鎖４（＋）の標的塩基配列領域に、３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡがハイブリダイズし、両者は互いにわずかな隙間を有した状態で隣接する。同様に、３’オリゴＤＮＡｃと５’オリゴＤＮＡｃとは、アンチセンス鎖４（−）の標的塩基配列領域にハイブリダイズして、わずかな隙間を挟んで隣接する（図２（ｂ）参照）。
【００４６】
センス鎖４（＋）の標的塩基配列に変異がなければ、３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡとは、センス鎖４（＋）の標的塩基配列にハイブリダイズし、耐熱性リガーゼ２が３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡとの間の隙間を連結し、ＬＣＲ反応による増幅産物である連結産物１５が得られる（図２（ｃ）参照）。
【００４７】
ＬＣＲ工程は、２本鎖を解離させる加熱操作と、加熱処理後の反応液を冷却してハイブリダイズおよび連結反応を行なわせる操作とを１つのサイクルとし、このサイクルを１０〜６０サイクル、好ましくは２０〜３０サイクル、特に好ましくは２３サイクル繰り返す。連結産物は、次のサイクルにおける鋳型となるため、上記反応を繰り返すことで、標的塩基配列をコピーしたＬＣ連結産物１５が指数関数的に増幅され（図３（ａ）参照）、連結産物１５を含むＬＣＲ反応生成物１６が得られる（図３（ｂ）参照）。ＬＣＲ工程は、全体で（すなわち２３サイクル行う場合は第１サイクル開始から第２３サイクル終了まで）３０分以内でよい。
【００４８】
なお、ＬＣＲプライマーセット１０は、２本鎖ＤＮＡ４の少なくともどちらか一方の１本鎖上の標的塩基配列とハイブリダイズするように設計された１対２種類のオリゴＤＮＡを含んでいればよい。すなわち、本実施態様における第１のオリゴＤＮＡ対（３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡ）または第２のオリゴＤＮＡ対（３’オリゴＤＮＡｃと５’オリゴＤＮＡｃ）のどちらか一方を含んでいればよい。
【００４９】
ＬＣＲプライマーセット１０の各オリゴＤＮＡは、０．１μＭ以上０．５μＭ以下の濃度でＬＣＲ反応液６に含有させることが好ましく、０．２μＭ程度の濃度とすることがさらに好ましく、特に０．２５μＭを最適濃度とする。
【００５０】
ＬＣＲ反応では、ＤＮＡ４の標的塩基配列に変異があると、ＬＣＲプライマーセット１０として添加されたオリゴＤＮＡは標的塩基配列領域にハイブリダイズしない（図３（ｃ）参照）。このため、標的塩基配列上で隣り合う３’オリゴＤＮＡと５’オリゴＤＮＡ（または３’オリゴＤＮＡｃと５’オリゴＤＮＡｃ）とは、本来、連結されず、連結産物が得られない。このため、変異があればＬＣＲ反応を行っても本来は標的塩基配列が増幅されない。
【００５１】
しかし、オリゴＤＮＡの平滑末端において非特異的連結が生じて増幅が生じることがあるため、ＬＣＲ法単独で変異を検出する場合の精度は必ずしも高くない。そこで、本発明では、ＬＣＲ反応により得られた連結産物をＬＡＭＰ法の鋳型として用いることで一塩基変異の検出精度を向上させる。以下、ＬＡＭＰ反応を行う工程（ＬＡＭＰ工程）について説明する。
【００５２】
《ＬＡＭＰ工程》
ＬＡＭＰ工程ではＬＡＭＰ反応に用いるプライマーとして、少なくとも２種類のインナープライマーを含むＬＡＭＰプライマーセット２０を用いる。具体的には、ＬＡＭＰプライマーセット２０は、一対のインナープライマーＦＩＰおよびＢＩＰを少なくとも含む。ＬＡＭＰプライマーセット２０はさらに、少なくとも一つのループプライマー（ループプライマーＦＬＰまたはＢＬＰ）を含むことが好ましい。またＬＡＭＰプライマーセット２０は、少なくとも一つのアウタープライマー（アウタープライマーＦＯＰまたはＢＯＰ）をさらに含んでもよい。ＬＡＭＰプライマーセット２０は、ＬＡＭＰ反応液２６中で、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ１２の存在下、ＬＣＲ反応生成物１６と混合する（図４参照）。
【００５３】
第１のインナープライマーＦＩＰおよび第２のインナープライマーＢＩＰは、５’側がループ構造を形成するように構成されている。これら一対のインナープライマーＦＩＰ、ＢＩＰのどちらか一方、または両方が標的塩基配列における変異の有無をチェックするチェックプライマーとして機能するように設計されている。チェックプライマーは、標的塩基配列の変異が存在しうる特定の領域の塩基配列と予測される塩基配列を含むように設計され、変異があればループ構造を形成しないことによって変異の有無をチェックする。
【００５４】
図５および図６を用いてＬＡＭＰ反応の概要を説明する。図５（ａ）は、前記ＬＣＲ反応により得られた連結産物１５を模式的に示している。本発明では、図４に示すように連結産物１５を含むＬＣＲ反応生成物１６をＬＡＭＰ反応に供する。ＬＣＲ反応生成物１６は、変異が存在しうる座位を含む領域を標的塩基配列として増幅された連結産物１５を含み、連結産物１５は変異が存在しうる特定の領域（変異領域）を含む。連結産物１５の標的塩基配列を含む領域の３’側にある一部の領域を、標的塩基配列の３’側を規定する領域（第１規定領域）Ｆ２とする。また、標的塩基配列を含む領域の５’側にある一部の領域を、標的塩基配列の５’側を規定する領域（第２規定領域）Ｂ２とする。変異が存在しうる領域は、第１規定領域Ｆ２と第２規定領域Ｂ２との間に位置し、以下、この領域を変異領域と称する。
【００５５】
なお、ＬＣＲ工程では２本鎖ＤＮＡが合成されており、２本鎖ＤＮＡの一方の鎖（センス鎖）上の第１規定領域Ｆ２に対し、他方の鎖（アンチセンス鎖）上にあって第１規定領域Ｆ２の塩基配列と予測される配列と相補的な塩基配列を有する領域をアンチ第１規定領域Ｆ２ｃと記載する。以下、同様とし、センス鎖上の第２規定領域Ｂ２の塩基配列と予想される配列と相補的な塩基配列を有する領域をアンチ第２規定領域Ｂ２ｃと記載する。図面では、センス鎖に符号１５（＋）を、アンチセンス鎖に符号１５（−）を付すが、文中では表記を簡潔にするためこれらについては符番の記載を省略する。
【００５６】
第１のインナープライマーＦＩＰをチェックプライマーとする場合、センス鎖における第１規定領域Ｆ２は、変異領域Ｆ１の５’側の隣にある領域とし、第１のインナープライマーＦＩＰがセンス鎖の第１規定領域Ｆ２にハイブリダイズするように設定する。具体的には、第１のインナープライマーＦＩＰは、３’側に第１規定領域Ｆ２の塩基配列と予測される塩基配列と相補的な塩基配列で構成されたアンチ第１規定領域Ｆ２ｃを有する。また、第１のインナープライマーＦＩＰは、５’側に変異領域Ｆ１の塩基配列と予測される塩基配列で構成された変異領域Ｆ１を有するように設計されている。
【００５７】
よって、ＬＣＲ反応生成物１５と前記第１のインナープライマーＦＩＰとを混合して６５℃付近の温度条件下でインキュベートすると、２本鎖ＤＮＡが動的平衡状態となることにより、第１のインナープライマーＦＩＰのアンチ第１規定領域Ｆ２ｃ部分が、センス鎖の第１規定領域Ｆ２にハイブリダイズする（図５（ｂ）参照）。ＬＡＭＰ工程では、反応液中に鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼ１２が含まれており、センス鎖にハイブリダイズした第１のインナープライマーＦＩＰの３’を起点としてセンス鎖と相補的なＤＮＡ鎖（第１の伸長生成物）３５が合成される（図５（ｃ）参照）。
【００５８】
本実施態様では、ＬＡＭＰプライマーセット２０は、一対のアウタープライマーＦＯＰ、ＢＯＰであるアウタープライマーセットを含んでいる。アウタープライマーＦＯＰ、ＢＯＰはそれぞれ、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、各インナープライマーＦＩＰ、ＢＩＰにより合成された伸長生成物３５を鋳型ＤＮＡから剥しながら伸長反応を行うように設計されている。具体的には、第１のアウタープライマーＦＯＰは、センス鎖の第１規定領域Ｆ２の５’側にある剥離用の領域Ｆ３の塩基配列と相補的な塩基配列を３’側に有するように構成されている。このため、第１のアウタープライマーＦＯＰは、図５（ｄ）に示すようにセンス鎖の第１規定領域Ｆ２より５’側にある領域Ｆ３にハイブリダイズする。
【００５９】
このように、アウタープライマーＦＯＰが、第１のインナープライマーＦＩＰによる伸長生成物３５とこれの鋳型となったセンス鎖との間に挟まるようにハイブリダイズしてアウタープライマーＦＯＰを起点とするＤＮＡ合成により、センス鎖を複製した相補鎖１５（−）´が合成される（図６（ａ）参照）。一方、アウタープライマーＦＯＰを起点とするＤＮＡ合成により複製された相補鎖１５（−）´が合成されることにより１本鎖とされた第１の伸長生成物３５は、５’側にループ構造を形成する。
【００６０】
ここで、第１の伸長生成物３５は、５’側に第１のインナープライマーＦＩＰ由来の部分（Ｆ１とＦ２ｃ）を含み、その３’側は、第１のインナープライマーＦＩＰを起点として伸長された領域（伸長領域）である。伸長領域の５’側は、センス鎖の第１規定領域Ｆ２の５’側に隣接する変異領域Ｆ１がコピーされている。よって、第１伸長生成物３５は図６（ｂ）に示すように５’側にあるＦ１とＦ１ｃとが相補的に結合してループを形成する。
【００６１】
一方、第１の伸長生成物３５の３’側には、センス鎖の第２規定領域Ｂ２がコピーされたアンチ第２規定領域Ｂ２ｃが含まれる。ここで第２のインナープライマーＢＩＰは、３’側に第２規定領域Ｂ２の塩基配列と予測される塩基配列と相補的な塩基配列で構成されたアンチ第２規定領域Ｂ２ｃを有し、５’側には、第２規定領域Ｂ２ｃの５’側にある領域Ｂ１の塩基配列と予測される塩基配列で構成された領域Ｂ１を有する。よって、第２のインナープライマーＢＩＰは、アンチセンス鎖とハイブリダイズできるのみならず、図６（ｂ）に示すように第１の伸長生成物３５とハイブリダイズできる。
【００６２】
第１の伸長生成物３５に第２のインナープライマーＢＩＰがハイブリダイズすることにより、第１の伸長生成物３５を鋳型として第２の伸長生成物３６が合成される。そして、第１の伸長生成物３５に第２のアウタープライマーＢＯＰがハイブリダイズすることにより、第２の伸長生成物３６は第１の伸長生成物３５から剥離され１本鎖となる。このとき、第２の伸長生成物３６は両端にループを形成し（図６（ｄ）参照）、３’側のループを起点とする合成反応が始まる。
【００６３】
このように、変異領域Ｆ１に変異がなければ、ＬＡＭＰ反応による伸長生成物からも標的塩基配列が合成される。一方、変異領域Ｆ１に変異があれば、本来であればアンチ変異領域Ｆ１ｃが形成される領域の塩基配列は、変異領域Ｆ１と相補的な塩基配列とならない。このため、変異があれば、ループ構造が形成されず、第２の伸長生成物３６が合成された時点でＬＡＭＰ反応が止まる。
【００６４】
よって、ＬＡＭＰ工程における最終産物の量を後述するように電気泳動法等で測定することで変異の有無を検出できる。このように、本発明によればリアルタイム測定を行う必要がないため、分析に供するゲノムを精製し、また濃度測定する必要はなく、未精製血液を純水で希釈した試料を測定できる。また、ＬＡＭＰ工程では鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼを用いることから温度条件を６０℃〜６５℃付近にした状態で増幅反応が進行するため、ＬＣＲ反応のように加熱と冷却を繰り返す必要がない。さらに、１本鎖の状態で存在するＬＣＲ反応による増幅産物を含むＬＣＲ反応生成物がＬＡＭＰ反応に供されるため、ＬＣＲ反応生成物は熱変性させることなくＬＡＭＰ反応を行なうことができる。
【００６５】
なお、本実施態様では、ＬＡＭＰプライマーセット２０は、一対のループプライマーＦＬＰ、ＢＬＰを含むループプライマーセットをさらに含んでいる。ループプライマーＦＬＰ、ＢＬＰはそれぞれ、各インナープライマーＦＩＰ、ＢＩＰにより合成された伸長生成物３５、３６の別々の末端に形成されるループにハイブリダイズするように設計されている。具体的には、第１のループプライマーＦＬＰは、第１規定領域Ｆ２に相補的な配列Ｆ２ｃを有し、第２のループプライマーＢＬＰは、第２規定領域Ｂ２に相補的な配列Ｂ２ｃを有する。第１のインナープライマーＦＩＰにより合成された伸長生成物の３’側において、アンチ第１規定領域Ｆ２ｃは、変異領域Ｆ１とこれに相補的な配列を有するアンチ変異領域Ｆ１ｃに挟まれる。伸長生成物が１本鎖とされると、変異領域Ｆ１とアンチ変異領域Ｆ１ｃとがハイブリダイズしてループが形成される。第１のループプライマーＦＬＰは、ループの環状部分となるアンチ第１規定領域Ｆ２ｃにハイブリダイズする（図６（ｄ）参照）。
【００６６】
そして、第１のループプライマーＦＬＰが起点となり、合成反応が進行する。このように、ＬＡＭＰプライマーセット２０にループプライマーＦＬＰ、ＢＬＰを含ませることで、ＤＮＡ合成の起点を増やすことができる。このため、ＬＡＭＰ反応に要する時間を短くできる。また、本発明においては、後述するようにＬＣＲ反応のサイクル数を少なくできる。
【００６７】
本実施態様では、一対のアウタープライマーＦＩＰ、ＢＩＰを用いているが、アウタープライマーＦＩＰ、ＢＩＰどちらか一方でもよい。同様に、ループプライマーも一対としているが、ループプライマーＦＬＰ、ＢＬＰのどちらか一方でよい。なお、本発明では、ループプライマーのみならずアウタープライマーをも省略可能であり、インナープライマーのみでＬＡＭＰ反応を行なうこともできる。
【００６８】
本発明においては、ＬＣＲ反応による反応生成物を鋳型としてＬＡＭＰ反応を行うため、それぞれの反応に用いる反応液中のプライマーの濃度を所定の範囲に設定するとよい。具体的には、ＬＣＲ反応については上述したとおりであり、ＬＡＭＰ反応についてはインナープライマーの濃度を０．２μＭ以上１．０μＭ以下、特に０．４μＭとするとよい。アウタープライマーについては省略することも可能であることから、その濃度は０μＭ以上０．１μＭ以下とし、特に０．０５μＭとするとよい。さらに、ＬＡＭＰプライマーセットにループプライマーを含ませる場合、ループプライマーの濃度は０．１μＭ以上０．５μＭ以下、特に０．２μＭとするとよい。
【００６９】
ＬＡＭＰ工程は、３０分以内とすることが好ましく、特に１５分〜２０分程度とするとよい。ＬＡＭＰ工程終了後、ＬＡＭＰ工程から得られた反応済液に含まれる最終産物を測定して、標的塩基配列が増幅されているか否かを分析すれば変異の有無を検出できる。標的塩基配列が増幅されていれば、ＬＡＭＰ工程から得られた反応済液には増幅産物が多く含まれるため、蛍光検出法によらずに増幅の有無が分析できるため、反応済み液は蛍光検出法以外、例えば電気泳動法、拡散電気化学法、拡散分光高度測定、または濁度測定等で分析できる。
【００７０】
［参考例１］
参考例１では、精製したゲノム由来のＤＮＡを分析に供する試料とした。精製ゲノムとしては、市販されている精製ヒトゲノム（Roche社製、Human  Genomic  DNA、Cat.  No.11-691-001）を使用した。精製ゲノム由来のＤＮＡの濃度は０．５ｎｇ／μＬとした。以下では、試料とするＤＮＡの塩基配列のうちヒトＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を標的遺伝子配列とし、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のＧ６３６Ａ１塩基多型を標的変異として変異の有無を検出することを想定した。ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の野生型の塩基配列を配列番号１に示す。１塩基変異型は、配列番号１の５６番目（以下に示す配列の下線を付した座位）がＧではなくＡとなる。
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子；配列番号１
Ttct  taacttgatg  gaaaaattga  atgaaaacat  caggattgta  agcaccccct  ggatccaggt  aaggccaagt  tttttgcttc  ctgagaaacc  acttacagtc  tttttttctg  gg
【００７１】
まず、ＬＣＲ反応に要する時間を検討することとし、第１の３’側オリゴＤＮＡ、第２の３’側オリゴＤＮＡ、第１の５’側オリゴＤＮＡ、および第２の５’側オリゴＤＮＡからなるＬＣＲプライマーセットを用意した。第１の３’側オリゴＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、第２の３’側オリゴＤＮＡの塩基配列を配列番号３に、第１の５’側オリゴＤＮＡの塩基配列を配列番号４に、第２の５’側オリゴＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。
第１の３’側オリゴＤＮＡ（WT−sp−FIP）；配列番号２
tct  taacttgatg  gaaaaattga  atgaaaacat  caggattgta  agcaccccct  gG
第２の３’側オリゴＤＮＡ（WT−sp−rFIP）；配列番号３
Ccagggggtgcttacaatcctgatgttttcattcaatttttccatcaagttaaga
第１の５’側オリゴＤＮＡ（sp-BIP）；配列番号４
atccaggt  aaggccaagt  tttttgcttc  ctgagaaacc  acttacagtc  tttttttctg  gg
第２の５’側オリゴＤＮＡ（sp-rBIP）；配列番号５
cccagaaaaaaagactgtaagtggtttctcaggaagcaaaaaacttggccttacctggat
【００７２】
第１の３’側オリゴＤＮＡと第１の５’側オリゴＤＮＡ（以下、「第１のオリゴＤＮＡ対」）はセンス鎖に相補的塩基配列を有し、第２の３’側オリゴＤＮＡと第２の５’側オリゴＤＮＡ（以下、「第２のオリゴＤＮＡ対」はアンチセンス鎖に相補的な塩基配列を有する。
【００７３】
４種類のオリゴＤＮＡは、いずれも終濃度２μＭとなるようにＬＣＲ反応液中に混合した。耐熱性リガーゼとしてはAmpligase（商品名、５Ｕ／μＭ、Epicentre社製）用い、この酵素に付属しているバッファーを推奨濃度で使用した。ＬＣＲ反応液の組成を以下に記載する。
【００７４】
〈ＬＣＲ反応液〉
精製ゲノム（１０ｎｇ／μＬ）      ：１μＬ
蒸留水                              ：１２μＬ
Ampligase付属バッファー（１０倍希釈）：２μＬ
耐熱性リガーゼ（５Ｕ／μＬ）        ：１μＬ
各プライマー（それぞれ４０μＭ）    ：１μＬ
【００７５】
Ampligaseを用いてＬＣＲ反応を行う場合の推奨温度反応は９４℃１２０秒での反応させた後、６８℃６０秒で反応させるというものであったが、参考例１では、ＬＣＲ反応の条件を変化させた１０パターンの試験および温度サイクルなしの１パターン、合計１１パターンの試験を行なった。各パターンの実験条件を表１に示す。
【００７６】
【表１】
2008228589.tif 000003
【００７７】
結果を図７に示す。図７では、各レーンを丸付き括弧で示している。９４℃で保持する時間および６８℃で保持する時間をどちらも３０秒に短縮した場合（図７の第９レーンおよび第１０レーン）でも、増幅産物量は減少するものの、酵素活性に著しい影響は起きないことが判明した。
【００７８】
［参考例２］
【００７９】
参考例２では、ＬＣＲ反応による増幅産物をＬＡＭＰ反応の鋳型とする際に必要となるＬＣＲ反応の長さ（サイクル数）を検討した。
【００８０】
参考例２では、参考例１で用いた精製ＤＮＡを、それぞれ１００ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、１ｎｇ／μＬ、または０．１ｎｇ／μＬの濃度としてＬＣＲ反応に供した。ＬＣＲ反応の反応液は、鋳型とする精製ゲノムの濃度が異なる以外は参考例１と同様とした。また、ＬＣＲ反応に用いたＬＣＲプライマーセットも参考例１と同じとした。
【００８１】
参考例２では、ＬＣＲ反応の１サイクルは、９４℃３０秒での熱変性処理後、６８℃３０秒で反応させるものとし、反応サイクル数を１０サイクル、３０サイクル、または５０サイクルとした。また、参考例２においてコントロールとして、９４℃６０秒で反応させた後、６８℃１２０秒で反応させる増幅反応を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返すことにより増幅産物を含むＬＣＲ反応生成物を得た。
【００８２】
得られたＬＣＲ反応生成物を混合したＬＡＭＰ反応液を調整し、ＬＡＭＰ反応を行った。ＬＡＭＰ反応液の組成を以下に記載する。なお、各実験区についてＬＡＭＰ反応液にループプライマーセットを加えた場合と加えない場合とを設定した。
【００８３】
ＬＡＭＰプライマーセットを構成する一対のインナープライマーの一方（第１のインナープライマーＦＩＰ）の塩基配列を配列番号６、他方(第２のインナープライマーＢＩＰ)の塩基配列を配列番号７に示す。
第１のインナープライマーＦＩＰ；配列番６
TCCAGGGGTCTTAACTTGATGGAAAAAT
第２のインナープライマーＢＩＰ；配列番号７
GGATCCAGGCCCAGAAAAAAAGACTGT
【００８４】
ＬＡＭＰプライマーセットに含まれる一対のループプライマーの一方（第１のループプライマーＦＬＰ）の塩基配列を配列番号８、他方(第２のループプライマーＢＬＰ)の塩基配列を配列番号９に示す。
第１のループプライマーＦＬＰ；配列番８
GCTTACAATCCTGATGTT
第２のループプライマーＢＬＰ；配列番号９
GTAAGGCCAAGTTTTTTG
【００８５】
ＬＡＭＰプライマーセットに含まれる一対のアウタープライマーの一方（第１のアウタープライマーＦＯＰ）の塩基配列を配列番号１０、他方(第２のアウタープライマーＢＯＰ)の塩基配列を配列番号９に示す。
第１のアウタープライマーＦＯＰ；配列番１０
TCCAGAAACGTTTCG
第２のアウタープライマーＢＯＰ；配列番号１１
AGGGCTTGGTCAATAT
【００８６】
〈ＬＡＭＰ反応液〉
ＬＣＲ反応生成物                      ：１．０μＬ
蒸留水                                ：０．４５μＬ
付属バッファー（１０倍希釈）          ：０．８μＬ
２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ                  ：１．０μＬ
ベタイン（５Ｍ）                      ：１．０μＬ
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）：０．２５μＬ
プライマーミックス                    ：０．５μＬ
【００８７】
なお、プライマーとしては、栄研化学株式会社製Loopamp（登録商標）  P450タイピング試薬キットに付属のプライマーミックスを用いた。プライマーミックスの組成は以下の通りである。
〈プライマーミックス〉
インナープライマー（１６ｐｍｏｌ／μＬ）  
アウタープライマー（２ｐｍｏｌ／μＬ）    
ループプライマー（８ｐｍｏｌ／μＬ）      
【００８８】
ＬＡＭＰ反応は、６０℃で３０分間を行い、ＬＡＭＰ反応終了後の反応済み液を電気泳動法による分析に供して増幅の有無を調べた。結果は図８に示すとおりである。
【００８９】
参考例２より、ＬＣＲ反応のサイクル数を３０サイクル以上とすれば、ＬＣＲ反応で得られたＬＣＲ反応生成物を鋳型とするＬＡＭＰ反応による増幅が起きることが判明した。また、ＬＡＭＰ反応を行う際に、反応液にループプライマーを含ませればＬＣＲ反応のサイクル数を３０サイクル以下にでき、１０サイクル以上でよいことが判明した。
【００９０】
［参考例３］
参考例３では、ＬＣＲ反応の際に用いるプライマー（ＬＣＲプライマー）が、ＬＣＲ反応生成物に残留して含まれることによってＬＡＭＰ反応の増幅率および変異識別能に及ぼす影響を調べた。参考例３では、特異性の判断を的確に行なえるかどうかを見当するため、参考例１および２で用いた精製ゲノムに代えてＧホモであるＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムを用いた。ＧアレルとＡアレルとはそれぞれ別の孤立した反応で行い、Ｇアレル検出用のＬＣＲ反応で用いるプライマーセットは、参考例１で用いたＬＣＲプライマーセット（以下、「ＬＣＲプライマーセット（Ｇ）」）を用いた。
【００９１】
一方、Ａアレル検出用のＬＣＲ反応で用いるＬＣＲプライマーセット（ＬＣＲプライマーセット（Ａ））としては、ＬＣＲプライマーセット（Ｇ）の第１の３’側オリゴＤＮＡに代えて配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴＤＮＡ（以下、「第１の３’側オリゴＤＮＡ（Ａ）」）を用いた。また、ＬＣＲプライマーセット（Ｇ）第２の３’側オリゴＤＮＡに代えて配列表１３に示す塩基配列を有するオリゴＤＮＡ（以下、「第２の３’オリゴＤＮＡ（Ａ）」）を用いた。
Ａアレル検出用の第１の３’側オリゴＤＮＡ（MT−sp−FIP）；配列番号１２
tct  taacttgatg  gaaaaattga  atgaaaacat  caggattgta  agcaccccct  gＡ
Ａアレル検出用第２の３’側オリゴＤＮＡ（MT−sp−rFIP）；配列番号１３
Ｔcagggggtgcttacaatcctgatgttttcattcaatttttccatcaagttaaga
【００９２】
これらＬＣＲプライマーセット（Ｇ）または（Ａ）を、それぞれのオリゴＤＮＡの終濃度が２．０μＭ、１．５μＭ、１．０μＭ、０．５μＭ、または０．２μＭとなるようにＬＣＲ反応液を調製した。また、鋳型とする精製ゲノム由来のＤＮＡの濃度は、１０ｎｇ／μＬの濃度とし、添加量は１μＬとした。ＬＣＲ反応液に含まれるその他の成分の濃度および添加量は参考例１と同じとした。
【００９３】
参考例３でも参考例２と同じくＬＣＲ反応は、９４℃３０秒で反応させた後６８℃３０秒で反応させる反応を１サイクルとして、これを１０、２３、３７、または５０サイクル繰り返した。参考例３ではネガティブコントロールとして、ＤＮＡの代わりに栄研化学社製Loopamp（登録商標）  P450タイピング試薬キットの付属品である蒸留水を用いた。
【００９４】
ＬＡＭＰ反応は非特許文献２に基づいて行い、Ｇアレル検出用のプライマーセット（ＬＡＭＰプライマーセット（Ｇ））として参考例２で用いたＬＡＭＰプライマーを用いた。
【００９５】
Ａアレル検出用のプライマーセット（ＬＡＭＰプライマーセット（Ａ））としては、ＬＡＭＰプライマーセット（Ｇ）の第１のインナープライマーＦＩＰに代えて、配列番号１４に示す塩基配列を有するＡアレル用第１のインナープライマーＭＴ−ＦＩＰを用いた。また、ＬＡＭＰプライマーセット（Ａ）では、ＬＡＭＰプライマーセット（Ｇ）の第２のインナープライマーＢＩＰに代えて、配列番号１５に示す塩基配列を有するＡアレル用第２のインナープライマーＭＴ−ＢＩＰを用いた。
Ａアレル検出用の第１のインナープライマー（ＭＴ−ＦＩＰ）；配列番号１４
TTCAGGGGTCTTAACTTGATGGAAAAAT
Ａアレル検出用の第２のインナープライマー（ＭＴ−ＢＩＰ）；配列番号１５
GAATCCAGGCCCAGAAAAAAAGACTGT
【００９６】
ＬＡＭＰ反応の反応液には、一対２種類のインナープライマーをそれぞれ１．６μＭの濃度で、一対２種類のループプライマーをそれぞれ０．８μＭの濃度で、一対２種類のアウタープライマーをそれぞれ０．２μＭ（いずれも終濃度）で含有させた。ＬＡＭＰ反応は、反応時間を２０分で行った。結果を図９に示す。図９において、レーン名は、アリール・タイプ（ＧかＡ)とＬＣＲ反応に使用した添加プライマー濃度示す。また、Ｄ０１およびＤ０２は、ネガティブコントロールとして、精製ゲノム由来のＤＮＡに代えて蒸留水を使用した場合のレーンを示す。
【００９７】
図９に示すようＬＣＲ工程での反応を１０サイクルとした場合は、ＬＣＲ反応で増幅は起こったものの特異性がなく、サイクル数を１０以上、特に２３とすると特異性が得られた。また、ＬＣＲプライマーの濃度が特異性に影響を与えていることが判明した。
【００９８】
［参考例４］
参考例４では、ＬＣＲ反応による増幅産物を鋳型としてＬＡＭＰ反応を行う場合おけるＬＡＭＰプライマー濃度について検討した。具体的には、参考例３において、ＬＡＭＰプライマーの濃度を、２倍、４倍、または８倍に希釈した。参考例４では、ＬＡＭＰプライマー濃度以外は参考例３と同様とし、ＬＣＲ反応は１０サイクル、または２３サイクルとした。参考例４においてＬＡＭＰ反応により得られたＬＡＭＰ増幅産物を電気泳動法による分析に供したところ、図１０に示す結果が得られ、ＬＡＭＰプライマー濃度を参考例３の４倍希釈とすることがよいことが判明した。
【００９９】
[参考例５]
さらに、参考例３で用いた精製ゲノム由来のＤＮＡの濃度を、１００ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、または１ｎｇ／μＬ濃度とし、ＬＣＲ反応を行なった後、ＬＡＭＰ反応させた。ＬＣＲ反応液は、ＬＣＲプライマー濃度が２０ｐｍｏｌ／μＬ、１５ｐｍｏｌ／μＬ、１０ｐｍｏｌ／μＬ、５ｐｍｏｌ／μＬ、または２ｐｍｏｌ／μＬとなるようにし、それ以外は参考例１と同様とした。ＬＣＲ反応は、９４℃３０秒での反応後、６８℃３０秒で反応させる操作を１サイクルとしてサイクル数は２３サイクルとした。
【０１００】
ＬＡＭＰ反応は、プライマーミックスの濃度を、２倍、または４倍希釈とした以外は上記参考例２で使用したＬＡＭＰ反応液と同じＬＡＭＰ反応液を使用し、６０℃で２０分間の反応を行なった。結果を図１１に示す。
【０１０１】
図１１に示すように、鋳型とする精製ゲノムＤＮＡの濃度範囲での違いは認められず、ＬＣＲプライマーの濃度と、ＬＡＭＰプライマーの濃度とを調整することで、非特異的増幅を制御できる可能性が高くなることが示された。また、ＬＡＭＰプライマーを２倍希釈した場合、４倍希釈した場合とも、特異性は得られたものの特異性が高い範囲が異なった。そして、ＬＡＭＰプライマーの濃度が低いほどＬＣＲプライマーが高濃度であっても特異的増幅が得られること、およびＬＣＲプライマーの濃度が低くなりすぎると多少の非特異的増幅が見られることが判明した。
【０１０２】
［参考例６］
参考例６として、参考例３におけるＬＡＭＰ反応時間を１０分、１５分、１７分とした。参考例５では、ＬＡＭＰ反応の時間以外は参考例３と同様とした。参考例６においてＬＡＭＰ反応により得られたＬＡＭＰ増幅産物を電気泳動法による分析に供したところ、ＬＡＭＰ反応時間を１７分とすればよいことが判明した。
【０１０３】
［参考例７］
参考例７では、参考例３で用いた精製ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／Ｌ、または１ｎｇ／Ｌに希釈して試料とした。参考例７では、ＬＣＲ反応液のＬＣＲプライマー濃度は、濃度５μＭのものを、全反応液量２０μＬに対して添加量１μＬで添加し、終濃度０．２５μＭとした。ＬＣＲ工程のその他の条件は、参考例３と同様にした。また、ＬＡＭＰ反応は、各ＬＡＭＰプライマーの終濃度が、インナープライマーについて０．４μＭ、アウタープライマーについて０．０５μＭ、ループプライマーについて０．２μＭとなるように添加し、それ以外の条件は参考例３と同様にし、ＬＡＭＰ反応の時間は１７分とした。
【０１０４】
さらに、参考例７ではコントロールとして、ＬＣＲ反応を行うことなく上記３段階希釈した精製ゲノムをＬＡＭＰ反応に供した。コントロールについては、ＬＡＭＰ栄研化学株式会社製Loopamp（登録商標）  P450タイピング試薬キットを用い、インナープライマー、アウタープライマー、およびループプライマーは、いずれもキット付属品を希釈することなくそのまま用い、ＬＡＭＰ反応の時間３５分として３段階希釈した試料をＬＡＭＰ反応に供した。
【０１０５】
結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＬＣＲ反応生成物をＬＡＭＰ反応の鋳型とする場合、ＬＣＲ反応なしでＬＡＭＰ反応を単独で行う場合に比べて、ダイナミックレンジを１桁以上多くできることが示された。
【０１０６】
[参考例８]
参考例８として、ＬＡＭＰプライマーセットにアウタープライマーＦＯＰ、ＢＯＰを含めない場合と含めた場合とを比較する実験を行った。参考例８では、ＬＣＲ反応は参考例１に記載した組成のＬＣＲ反応液を用い、９４℃３０秒での反応後、６８℃３０秒での反応を行なう操作を１サイクルとし、サイクル数は２３サイクルとした。なお、ＬＣＲ反応液としては、ＬＣＲプライマー濃度が５ｐｍｏｌ／μＬのものと２ｐｍｏｌ／μＬのものとの２種類を用いた。
【０１０７】
ＬＡＭＰ反応は、プライマーミックスとして以下の組成のものを使用した以外は上記参考例２で使用したＬＡＭＰ反応液を用い、６０℃１５分間の反応を行なった。
〈プライマーミックス〉
インナープライマー（８ｐｍｏｌ／μＬ）  
ループプライマー（４ｐｍｏｌ／μＬ）    
アウタープライマー（１．６ｐｍｏｌ／μＬ）
【０１０８】
結果を図１３に示す。図１３に示すように、アウタープライマーを用いる場合と比べ、アウタープライマーを用いない場合は、反応効率はやや低下するが、検出精度には大きな影響を及ぼさないことが明らかとなった。
【０１０９】
［実施例１］
実施例１として、参考例３で用いたＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムＤＮＡ（Ｇアレルホモ）を１０ｎｇ／μＬの濃度とした試料を用いて、参考例１で示した組成のＬＣＲ反応液でＬＣＲ反応を行った。ＬＣＲ反応の１サイクルは、９４℃３０秒での加熱処理後、６８℃３０秒で反応させるものとし、反応サイクル数は２３サイクルとした。
【０１１０】
次に、得られたＬＣＲ反応生成物を、ＬＡＭＰ反応に供した。ＬＡＭＰ反応液の組成は以下に示す通りであり、ＬＡＭＰプライマーセットとしては、Ｇアレル検出用、Ａアレル検出用共に参考例３で用いたプライマーセットと同じプライマーを用いた。
【０１１１】
〈ＬＡＭＰ反応液〉
ＬＣＲ反応生成物                      ：１．２５μＬ
蒸留水                                ：５．２５μＬ
キット付属ＲＭバッファー              ：５．０μＬ
鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ）：０．５μＬ
【０１１２】
ＬＡＭＰプライマーとしては、参考例２で用いたプライマーミックスを用い、添加量を０．５μＬとして、インナープライマーの終濃度０．４μＭ、アウタープライマーの終濃度０．０５μＭ、ループプライマーの終濃度０．２μＭとした。
【０１１３】
実施例１では、ポジティブコントロールとしてＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムＤＮＡ（Ｇアレルホモ）に代えて、へテロの精製ゲノム由来のＤＮＡを用いた実験も行った。さらに、ネガティブコントロールとして精製ゲノム由来のＤＮＡに代えて純水を用いた実験も行った。
【０１１４】
［比較例１］
比較例として、実施例１でＬＣＲ反応に供した精製ゲノムをそのまま、ＬＡＭＰ法に供した。すなわち、比較例１ではＬＡＭＰ法を単独で行った。比較例１では、ＬＡＭＰ反応を開始する前に、栄研化学株式会社製Loopamp（登録商標）  P450タイピング試薬キットの取扱説明書に記載されていたとおり、精製ゲノムを９５℃で５分間、熱変性処理させた後、５分間、氷上冷却を行なった。なお、実施例１ではＬＣＲ反応生成物はこのような熱変性および冷却処理することなく、ＬＡＭＰ反応に供している。
【０１１５】
［実施例１および比較例１の結果］
実施例１と比較例１の実験を２０回、繰り返すことにより、ＬＡＭＰ反応単独と本発明とを比較し、繰り返し検証により反応の安定性を検証した。実験結果の一例を図１４に示す。図１４において、ＰＣはポジティブコントロール（ＧとＡが陽性）、ＬＳはヘテロ（Ｇ陽性、Ａ陰性）、ＤＤＷはネガティブコンコトール（ＧとＡがともに陰性）を示す。
【０１１６】
実施例１および比較例１では、ポジティブコントロールについて、Ｇアレル検出用のプライマーセット、Ａアレル検出用プライマーセットどちらを用いた場合でも特異的増幅が起これば、正しい結果が得られたことになる。一方、ＧアレルホモのＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムＤＮＡを用いた場合については、Ｇアレル検出用のプライマーセットを用いた場合しか特異的増幅が起こらなければ、実験結果が正しかったことになる。さらに、ネガティブコントロールについては、どちらのプライマーを用いても特異的増殖が起こらなければ実験結果は正しいことになる。
【０１１７】
実施例１ではポジティブコントロール、ネガティブコントロール、およびＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムＤＮＡについて、実験結果が正しくなかったのは、３回であった。比較例１では、図１４に示すようにＬＳＩ７４Ｔ培養細胞由来の精製ゲノムＤＮＡで、Ｇアレル検出用プライマーを用いた場合でも増幅が起こらないというように、約６回に１回の頻度で増幅が生じないか、増幅しても非特異的増幅であり誤判定を誘導することが明らかとなった。
【０１１８】
［実施例２］
実施例２として、精製ゲノムＤＮＡに代えて未精製血液を純水で１０倍希釈した試料を用いた実験を行った。実施例２では、添加物なしで−８０℃の条件下、３ヶ月間保存した血液、添加物なしで保存していない血液、ＥＤＴＡを添加して４℃で３ヶ月保存した血液、の３種類から試料を調製した。実施例２では、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のＧ６３６Ａ変異の有無を検出することとした。
【０１１９】
実施例２では、試料を純水で希釈した未精製血液とした以外は、実施例１と同様の条件で実験を行ったところ、図１５に示す結果が得られ、全ての試料について特異的な増幅が得られた。
【０１２０】
以下に、未精製血液を試料として用いる場合において、本発明で推奨される核酸の分析方法を記載するが、本発明はこれに限定されない。
【０１２１】
〈試料〉
純水製造装置（Millipore社製、商品名Milli-Q  GPAII）で調製した純水で血液を１０倍希釈する。
【０１２２】
〈ＬＣＲ反応液〉
未精製血液（１０倍希釈）    ：１μＬ
純水                        ：５．５μＬ
耐熱性リガーゼ（Epicentre社製、５Ｕ／μＬ）：０．５μＬ
各プライマー（それぞれ５μＭ）：０．５μＬ
【０１２３】
〈ＬＣＲ反応〉
９４℃３０秒間の熱処理の後、６８℃３０秒間で反応させる操作を１サイクルとし、２３サイクルでＬＣＲ反応を終了してＬＣＲ反応生成物を得る。
【０１２４】
〈ＬＡＭＰ反応液〉
ＬＣＲ反応生成物                ：１．２５μＬ
純水                            ：５．２５μＬ
バッファー（４倍希釈）          ：５μＬ
ＬＡＭＰプライマーセット        ：０．５μＬ
鎖型ＤＮＡポリメラーゼ（８Ｕ／μＬ）：０．５μＬ
【０１２５】
ＬＡＭＰ反応液中のバッファー、ＬＡＭＰプライマーセットおよび鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼとしては、栄研化学株式会社製のLoopamp  P450タイピング試薬キット、RNA増幅試薬キット、DNA増幅試薬キット等に付属の試薬を用いればよい。ただし、試薬はこれらに限定されず、例えば非特許文献３に従ったＬＡＭＰ反応液を調整してもよい。ただし、非特許文献３の組成のＬＡＭＰ反応液とする場合は、ＬＡＭＰプライマーの濃度は４分の１とする。ＬＡＭＰ反応は、６０℃で１７分行えばよい。
【０１２６】
表２にEpicentre社製Ampligase（商品名）を用いた場合に推奨されるＬＣＲ法、栄研化学株式会社製Loopamp  P450タイピング試薬キットを用いた場合に推奨されるＬＡＭＰ法、および本発明について、それぞれの特徴を記載する。なお、表２において「急冷」とは、２本鎖ＤＮＡを熱変性させた後、ＤＮＡが元の２本鎖に戻ることを防止するために４℃以下に急冷する操作を意味する。かかる操作を「急冷」とするには、ＬＣＲ反応で加熱処理後に連結反応を行なわせるために冷却する操作と区別するためである。
【０１２７】
【表２】
2008228589.tif 000004
【０１２８】
表２に示すように、本発明によれば、簡便な操作で迅速に塩基配列の変異が検出でき、ダイナミックレンジもＬＡＭＰ法に比べて広い。また、ＬＣＲ反応とＬＡＭＰ反応を組み合わせて２種類の化学反応で変異の有無を検出するため、表２に示すように操作を簡便化しながら実施例１および実施例２に示すように変異検出精度を高くできる。さらに、未精製血液を試料とできるため、本発明は臨床での分析に適しており、本発明方法による分析機器には冷却機構を省略することもできる。
【産業上の利用可能性】
【０１２９】
本発明は、遺伝子の塩基配列変異の検出に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の一実施態様におけるＬＣＲ工程を示す模式図。
【図２】本発明の一実施態様におけるＬＣＲ工程を示す模式図。
【図３】本発明の一実施態様におけるＬＣＲ工程を示す模式図。
【図４】本発明の一実施態様におけるＬＡＭＰ工程を示す模式図。
【図５】本発明の一実施態様におけるＬＡＭＰ工程を示す模式図。
【図６】本発明の一実施態様におけるＬＣＲ工程を示す模式図。
【図７】参考例１の結果を示す電気泳動写真の図。
【図８】参考例２の結果を示す電気泳動写真の図。
【図９】参考例３の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１０】参考例４の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１１】参考例５の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１２】参考例７の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１３】参考例８の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１４】実施例１および比較例１の結果を示す電気泳動写真の図。
【図１５】実施例２の結果を示す電気泳動写真の図。
【符号の説明】
【０１３１】
２        ：耐熱性リガーゼ
４        ：ＤＮＡ（核酸）
６        ：ＬＣＲ反応液
１０      ：ＬＣＲプライマーセット
１２      ：鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ
１６      ：ＬＣＲ反応生成物
２０      ：ＬＡＭＰプライマーセット
２６      ：ＬＡＭＰ反応液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2008228589.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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