(57)【要約】【課題】ＰＭＴＶによる土壌汚染を診断するために、土壌中のＰＭＴＶを効率的に、また高感度に検出する方法を提供する。また、非特異的核酸増幅産物の生じにくいＰＭＴＶ特異的なプライマーを提供する。【解決手段】ジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として土壌中のジャガイモ粉状そうか病菌を選択的に捕捉する。続いて当該植物根部から抽出した核酸を鋳型にして、新たに開発したＰＭＴＶ特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行う。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号２で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号３で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム検出用プローブとしてのポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号３で表される塩基配列の一部を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム検出用プローブとしてのヌクレオチド。
【請求項５】
ジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として供試土壌にて育成する育成工程と、
育成工程後のおとり植物の根部からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程と、
ＲＮＡ抽出工程で得られるＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行う逆転写工程と、
逆転写工程で得られるｃＤＮＡを鋳型として、ジャガイモモップトップウイルスゲノム由来のｃＤＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、
核酸増幅工程で得られる核酸増幅産物からジャガイモモップトップウイルスゲノム固有の核酸増幅産物を検出する検出工程と
からなるジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【請求項６】
前記育成工程は、おとり植物の供試土壌での育成に代えて供試土壌を懸濁して液相中で育成する工程である請求項５に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【請求項７】
前記核酸増幅工程のプライマー対は、請求項１及び２に記載のオリゴヌクレオチドである請求項５又は６に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【請求項８】
前記検出工程は、請求項３に記載のポリヌクレオチド又は請求項４に記載のヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーション法によってジャガイモモップトップウイルスゲノム由来の核酸増幅産物を検出する請求項７に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【請求項９】
前記検出工程のハイブリダイゼーション法がマイクロプレートハイブリダイゼーション法である請求項８に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【請求項１０】
前記おとり植物は、トマトである請求項５から９のいずれか一に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジャガイモモップトップウイルスを土壌中から効率的に、また高感度に検出する方法、ジャガイモモップトップウイルスゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド、並びにジャガイモモップトップウイルスゲノム検出用のポリヌクレオチド及びヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ジャガイモモップトップウイルス（Ｐｏｔａｔｏ  ｍｏｐ−ｔｏｐ  ｖｉｒｕｓ：以下、「ＰＭＴＶ」とする）は、ジャガイモ塊茎褐色輪紋病の病原ウイルスである。当該ウイルスは、１本鎖ＲＮＡ（＋）ウイルスであり、自然界では主としてネコブカビ科に属する土壌伝染病原菌のジャガイモ粉状そうか病菌（Ｓｐｏｎｇｏｓｐｏｒａ  ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）によって伝搬される（非特許文献１、２、３）。その他、低率ながら当該ウイルスを保毒する保毒植物体の接触によっても伝染する。当該ウイルスの宿主範囲は狭く、自然発生植物としてはジャガイモ以外知られていない。
【０００３】
ジャガイモ塊茎褐色輪紋病の病徴は、図１で示すようにジャガイモ塊茎の表面に褐色の輪紋（０１０１）を生じる他、塊茎内部に円弧状の褐変したすじ状病斑（０１０２）を呈する（非特許文献１、２）。ジャガイモ塊茎褐色輪紋病に罹病した塊茎を食用にしても人畜に害はない。しかし、病徴が内部にまで及ぶため、商品としての価値は完全に失われてしまう。それゆえ、ＰＭＴＶの発生はジャガイモ生産現場に甚大な被害を与え得る。また、ＰＭＴＶは、当該ウイルスの媒介菌であるジャガイモ粉状そうか病菌の休眠胞子に保毒されると長期間にわたる土壌伝染が可能となる。したがって、発生地域の特定や未発生地域への拡散阻止などの有効な防除対策を講じなければ、発生地が拡大するという問題がある。
【０００４】
ところが、これまでにＰＭＴＶの防除に関する知見はほとんどなく、当該ウイルスに対する抵抗性品種や有効な薬剤についても知られていない。そのため、現在はジャガイモ粉状そうか病菌の防除を徹底するなどの間接的な発病回避策がとられている（非特許文献１、２）。しかし、ジャガイモ粉状そうか病菌の完全な防除は容易ではなく、また、全てのジャガイモ粉状そうか病菌がＰＭＴＶを保毒しているとは限らない。
【０００５】
ＰＭＴＶ感染防除の最善策はＰＭＴＶを直接的に防除することである。具体的には、ＰＭＴＶ保毒菌若しくはそれを含む土壌、又はＰＭＴＶ罹病植物などの移動を禁止することであるが、そのためにはＰＭＴＶ罹病植物やＰＭＴＶによる土壌汚染を診断する方法が必要不可欠となる。このうち罹病植物体からＰＭＴＶを検出する診断方法については、ＰＭＴＶ特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ法が開発されている（非特許文献１）。一方、ＰＭＴＶによる土壌汚染診断法については、現在のところ有効な方法がない。これは、土壌から回収されるウイルス量ではＥＬＩＳＡ法の検出限界を下回っていること、土壌試料からの核酸抽出が極めて困難なこと、仮に土壌試料からの核酸抽出が可能であったとしても、土壌中に存在するＰＭＴＶは極めて微量であるため複数生物種の核酸が混在する中でのＰＭＴＶの検出は通常の核酸増幅法では困難であること、媒介菌であるジャガイモ粉状そうか病菌が絶対寄生菌で人工培養ができないこと、そして既知のＲＴ−ＰＣＲ用ＰＭＴＶプライマーでは非特異的核酸増幅産物が生じやすく検出感度が低いことなど、多くの解決すべき問題が存在するためである。
【非特許文献１】井本征史、岩本満朗、栃原比呂志、中村啓二、花田薫（１９８６）日植病報  ５２：７５２−７５７
【非特許文献２】北海道病害虫防除所、平成１８年度  病害虫発生予察情報第２号（特殊報第１号）
【非特許文献３】Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＢＤ（１９７４）Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  Ｎｏ．１３８
【非特許文献４】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＥＦ，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＰＭＴＶによる土壌汚染を診断するために、土壌中のＰＭＴＶを効率的に、また高感度に検出することに関する。また、非特異的核酸増幅産物の生じにくいＰＭＴＶ特異的なプライマーを開発することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは、おとり植物とジャガイモ粉状そうか病菌を利用して、土壌中のＰＭＴＶの有無を高感度に検出する方法を開発した。すなわち、当該方法は、まず、ジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として土壌中のジャガイモ粉状そうか病菌を選択的に捕捉する。これによって土壌中に存在し得るＰＭＴＶを効率的に採取すると共に、当該おとり植物細胞内においてＰＭＴＶを増殖させることが可能となる。続いて、当該おとり植物根部から抽出した核酸を鋳型にして、新たに開発したＰＭＴＶ特異的なプライマーを用いて核酸増幅を行うというものである。本願発明は、係る方法に基づくものであり、以下の各発明を提供するものである。
【０００８】
第１の発明は、配列番号１で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの提供である。
【０００９】
第２の発明は、配列番号２で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの提供である。
【００１０】
第３の発明は、配列番号３で表される塩基配列を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム検出用プローブとしてのポリヌクレオチドの提供である。
【００１１】
第４の発明は、配列番号３で表される塩基配列の一部を有するジャガイモモップトップウイルスゲノム検出用プローブとしてのヌクレオチドの提供である。
【００１２】
第５の発明は、ジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として供試土壌にて育成する育成工程と、育成工程後のおとり植物の根部からＲＮＡを抽出するＲＮＡ抽出工程と、ＲＮＡ抽出工程で得られるＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行う逆転写工程と、逆転写工程で得られるｃＤＮＡを鋳型として、ジャガイモモップトップウイルスゲノム由来のｃＤＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う核酸増幅工程と、核酸増幅工程で得られる核酸増幅産物からジャガイモモップトップウイルスゲノム固有の核酸増幅産物を検出する検出工程とからなるジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【００１３】
第６の発明は、前記育成工程が、おとり植物の供試土壌での育成に代えて供試土壌を懸濁して液相中で育成する工程である第５の発明に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【００１４】
第７の発明は、前記核酸増幅工程のプライマー対が、第１の発明又は第２の発明に記載のオリゴヌクレオチドである第５の発明又は第６に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【００１５】
第８の発明は、前記検出工程が、第３の発明に記載のポリヌクレオチド又は第４の発明に記載のヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーション法によってジャガイモモップトップウイルスゲノム由来の核酸増幅産物を検出する第７の発明に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【００１６】
第９の発明は、前記検出工程のハイブリダイゼーション法がマイクロプレートハイブリダイゼーション法である第８の発明に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【００１７】
第１０の発明は、前記おとり植物が、トマトである第５の発明から第９の発明のいずれか一に記載のジャガイモモップトップウイルス土壌汚染診断法の提供である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドによれば、ＰＭＴＶの核酸増幅用プライマー対として用いることで、複数生物種の核酸存在下においてもＰＭＴＶゲノム由来の核酸を高感度、かつ特異的に増幅できる。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドによれば、目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸を効率的に検出できる。
【００２０】
本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、土壌中のＰＭＴＶをジャガイモ粉状そうか病菌を介しておとり植物に捕捉させることで、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法の開発する上で最大の問題であった土壌からの直接的核酸抽出の困難性と土壌中の酵素阻害物質の混入と土壌中の感染能力を失ったPMTVの混入を解決できる。
【００２１】
本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、ジャガイモ粉状そうか病菌を人工培養できずとも、ジャガイモ粉状そうか病菌をおとり植物に感染させることで、おとり植物細胞内でＰＭＴＶを増殖させることができる。
【００２２】
本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、一回の試験で多検体を処理することが可能なため、ジャガイモの作付け前にＰＭＴＶによる土壌汚染の有無を容易に診断することができる。
【００２３】
本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、以上のような効果からＰＭＴＶによる土壌汚染が事前に明らかになることで、ＰＭＴＶの未汚染地域への拡散防止が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下で前記発明を実施するための最良の形態について説明する。ただし、本願の発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではなく、その作用効果を奏する範囲において種々なる態様で実施し得る。なお、以下の実施形態１は、主に請求項１から４に関する。また、実施形態２は、主に請求項５から１０に関する。
【００２５】
<<実施形態１>>
【００２６】
<実施形態１：概要>
実施形態１はＰＭＴＶゲノム増幅用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド、並びにＰＭＴＶゲノム検出用ポリヌクレオチド及びヌクレオチドに関する。当該オリゴヌクレオチドをＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対として用いることで、複数生物種の核酸存在下にあっても、非特異的核酸増幅産物をほとんど生じさせることなく、目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸を高感度、かつ特異的に増幅できる。
【００２７】
<実施形態１：構成>
【００２８】
１．オリゴヌクレオチドについて
配列番号１で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドは、いずれもＰＭＴＶゲノム増幅用プライマーとして機能するように構成されている。
【００２９】
図２を用いて本実施形態のオリゴヌクレオチドの構成について説明する。この図では、ＰＭＴＶゲノムのＲＮＡ３を示している。図中の白円は５’末端キャップ構造を、三つ葉マークは３’末端ｔＲＮＡ様構造を示す。また、白矩形は、記載のサイズ（Ｋ＝キロダルトン）を有するタンパク質をコードするＯＲＦ（Ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）を示す。ＲＮＡ３において、５１Ｋ、１３Ｋ、２１Ｋの各タンパク質をコードするＯＲＦはトリプルジーンブロック（ＴＧＢ）を構成している。
【００３０】
「配列番号１で表される塩基配列」（以下「Ｓｑ１」とする）は、図２の矢印（０２０１）で示すように、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３のトリプルジーンブロック２１Ｋタンパク質の遺伝子配列の一部からなる。
【００３１】
「配列番号２で表される塩基配列」（以下「Ｓｑ２」とする）は、同じく図２の矢印（０２０２）で示すようにＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３の３’末非翻訳領域に相補的な配列からなる。
【００３２】
本実施形態の「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡ（登録商標；Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）などの擬似ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせなどによって構成されている。当該オリゴヌクレオチドは、合成によって作製すればよい。
【００３３】
「Ｓｑ１を有するオリゴヌクレオチド」とは、塩基配列の全部、又は一部がＳｑ１で構成されるオリゴヌクレオチドをいう。当該オリゴヌクレオチドの塩基数は、２３塩基〜３５塩基の範囲内にあることが好ましい。２３塩基の場合は、Ｓｑ１のみから構成されるオリゴヌクレオチド（以下、便宜的に「ＰＭＴＶ−９Ｐ」とする）に該当する。３６塩基以上が好ましくない理由は、いたずらに合成コストを高くするだけだからである。当該オリゴヌクレオチドがＳｑ１以外の塩基を有する場合、係る塩基は特に限定しない。例えば、制限酵素切断部位やタグ配列であってもよい。ただし、これらの塩基は、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３上でＳｑ１の３’側直下に位置する塩基配列以外は、Ｓｑ１の５’側に付加されなければならない。当該オリゴヌクレオチドはプライマーとして機能しなければならないからである。
【００３４】
「Ｓｑ２を有するオリゴヌクレオチド」とは、全部、又は一部の塩基配列がＳｑ２で構成されるオリゴヌクレオチドをいう。当該オリゴヌクレオチドの塩基数も前記Ｓｑ１を有するオリゴヌクレオチドと同様の理由から、２３塩基〜３５塩基の範囲内にあることが好ましい。２３塩基の場合は、Ｓｑ２のみから構成されるオリゴヌクレオチド（以下、便宜的に「ＰＭＴＶ−９Ｍ」とする）に該当する。当該オリゴヌクレオチドがＳｑ２以外の塩基を有する場合もＳｑ１と同様である。ただし、Ｓｑ２以外の塩基は、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３に相補的な配列上でＳｑ２の３’側直下に位置する塩基配列以外は、Ｓｑ２の５’側に付加されなければならない。
【００３５】
「ＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー」とは、ＰＭＴＶゲノム由来の塩基配列を有する核酸を核酸増幅法によって増幅するためのプライマーをいう。ＰＭＴＶゲノムはＲＮＡで構成されていることから、ＰＭＴＶゲノム増幅用プライマーは、通常、ＰＭＴＶゲノムを鋳型とする逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡに対する増幅用プライマーとして使用される。
【００３６】
ＰＭＴＶゲノム由来の塩基配列を有する核酸を増幅する場合には、前記Ｓｑ１とＳｑ２とをそれぞれ有するオリゴヌクレオチドをＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対として使用することが好ましい。当該プライマー対は、非特異的核酸増幅産物をほとんど生じさせることなく、目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸を高感度、かつ特異的に増幅できるからである。
【００３７】
図３に、様々なＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対を用いてＰＭＴＶゲノム由来の核酸を増幅した際の各プライマー対におけるＰＭＴＶ検出の結果を示す。この図は、アガロースゲル電気泳動の結果である。検出用試料にはジャガイモを用い、基本的な実験方法は後述する実施例１の「Ｂ．全ＲＮＡの抽出」〜「Ｄ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」に準じた。図３のＡはＰＭＴＶ未感染の健康なジャガイモ（男爵薯）、そしてＢはＰＭＴＶに感染したジャガイモ（さやか）である。図中のａ〜ｇは、本発明者らが新たに開発したプライマー対である。これらのプライマー対は、いずれも非特異的核酸増幅産物をほとんど生じさせない点において既知のＰＭＴＶプライマー対よりも優れている。ａ〜ｅは、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ２を認識し増幅するためのプライマー対であり、また、ｆ、ｇは、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３を認識し増幅するためのプライマー対である。このうちｇがＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対に該当する。当該プライマー対は、Ｓｑ１とＳｑ２とをそれぞれ有するオリゴヌクレオチドプライマー対の１形態である。他のプライマー対の詳細については省略する。Ｍは１００塩基ラダーマーカーを示す。いずれのプライマー対を用いた場合もＢにおいてのみ予想されるサイズのＤＮＡ断片（各レーンにおいて０３０１で示すエリアのバンド）が増幅され、新たに開発されたこれらのプライマー対の特異性が高いことが示された。その中でもｇのプライマー対は最も核酸増幅産物量が多く、増幅効率が高いことが示された。
【００３８】
図４は、ＰＭＴＶ感染ジャガイモから抽出されたＲＮＡを連続的に希釈したＲＮＡサンプルに対して、ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対を用いて核酸増幅反応を行ったときの結果である。Ａはアガロースゲル電気泳動の結果を、また、Ｂはマイクロプレートハイブリダイゼーション（以下「ＭＰＨ」とする）法による吸光値の結果を示している。ＡのレーンとＢのカラムの対応するサンプルは、Ａ、Ｂ上下で同一の「Ｄ．ＰＣＲ」で得られたＰＣＲ産物を用いている。Ｍはマーカー、Ｐはポジティブコントロールを、星印はＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物が検出できたサンプルを示す。基本的な実験方法については、Ａは図３と同様に後述する実施例１の「Ｂ．全ＲＮＡの抽出」〜「Ｄ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」に準じた。また、Ｂは実施例１の「Ｂ．全ＲＮＡの抽出」〜「Ｄ．ＰＣＲ」及び「Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」に準じた。レーン１は、ＰＭＴＶ罹病ジャガイモ塊茎約２ｍｇから得られた全ＲＮＡを、レーン２以降はレーン１の全ＲＮＡを順次５倍連続希釈（すなわち、５倍、５２倍、５３倍、５４倍、５５倍、５６倍、５７倍、５８倍、５９倍、５１０倍）した全ＲＮＡを、それぞれＲＮＡサンプルとして核酸増幅法に用いたものである。この図で示すように、ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対は、アガロースゲル電気泳動による検出ではＰＭＴＶ罹病ジャガイモから抽出された全ＲＮＡを５４倍しても、検出可能であることが示された（矢印：５０７ｂｐ）。また、ＭＰＨ法であれば、５７倍してもなお検出可能であることが示された。このように、ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対は、ＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対として高感度にＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物を検出できることが示された。
【００３９】
本願ではＳｑ１、又はＳｑ２を有するオリゴヌクレオチドプライマー対の一形態であるＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対による結果を図３、図４で示した。このようにＳｑ１、又はＳｑ２を有するオリゴヌクレオチドプライマー対は、ＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対としてＰＭＴＶゲノム由来の核酸を高感度に、かつ特異的に、さらに高効率で増幅することができる。なお、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３のｃＤＮＡを鋳型に、ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍをプライマー対として遺伝子増幅反応を行った場合、図２、図４で示すように５０７塩基の核酸増幅産物が生じる。
【００４０】
Ｓｑ１、又はＳｑ２を有するオリゴヌクレオチドを構成する一、又は二以上のヌクレオチドは、標識物質で標識されていてもよい。標識物質によって目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸断片の検出が容易になるため便利である。ここでいう「標識物質」とは、例えば、蛍光物質、ＲＩ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などのハプテン、又はビオチンが挙げられる。また「蛍光物質」とは、特定波長の励起光を吸収することで励起状態となり、元の基底状態に戻る際に蛍光を発する性質を有する物質を言う。標識に用いる蛍光物質は、オリゴヌクレオチドに標識可能なものであれば、種類は特に問わない。例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＦＩＴＣが挙げられる。
【００４１】
２．ポリヌクレオチド、又はヌクレオチドについて
配列番号３で表される塩基配列を有するポリヌクレオチド、又はその塩基配列の一部を有するヌクレオチドは、ＰＭＴＶゲノム検出用のプローブとして機能する。
【００４２】
「配列番号３で表される塩基配列」（以下「Ｓｑ３」とする）は、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３に含まれ、前記ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対によって増幅される核酸増幅産物の塩基配列に相当する。したがって、前述のようにＳｑ３は、５０７塩基で構成される。
【００４３】
「Ｓｑ３の一部」とは、Ｓｑ３において任意の連続する１５塩基以上５０６塩基以下の配列が該当する。
【００４４】
「有する」ことから、Ｓｑ３を有するポリヌクレオチド及びＳｑ３の一部を有するヌクレオチドは、いずれも他の塩基を有していてもよい。例えば、Ｓｑ３の全部、又はＳｑ３の一部がベクターなどに挿入されている場合や、制限酵素切断部位やタグ配列が配列末端部に付加されている場合が該当する。
【００４５】
ここでいう「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ＬＮＡ（登録商標；Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）又はＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）などの擬似ヌクレオチド、並びにそれらの組み合わせなどによって構成される。当該ポリヌクレオチド及び当該ヌクレオチドは、合成、核酸増幅反応、クローニング、又はそれらの組み合わせによって作製すればよい。
【００４６】
「ＰＭＴＶゲノム検出用プローブ」とは、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ３若しくはそのｃＤＮＡ、又はＳｑ１とＳｑ２をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドのプライマー対によって増幅される核酸増幅産物を特異的に検出するプローブをいう。後述する実施例１では、当該ポリヌクレオチドをＭＰＨ法のプローブとして用いた例を示している。当該実施例のように、当該ポリヌクレオチド又は当該ヌクレオチドは、前記ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対を用いた核酸増幅反応後にＰＭＴＶゲノム由来の核酸を特異的に検出する上で有用である。
【００４７】
Ｓｑ３を有するポリヌクレオチド又はＳｑ３の一部を有するヌクレオチドを構成する一、又は二以上のヌクレオチドは、蛍光物質、蛍光抑制物質、ＲＩ、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などのハプテン、又はビオチンなどの標識物質で標識されてもよい。目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物を検出するためである。「蛍光物質」に関しては前記オリゴヌクレオチドの項で説明していることから、ここでは省略する。「蛍光抑制物質」とは、いわゆるクエンチャーであって、蛍光物質の励起エネルギーを吸収する物質などをいう。例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３、Ｄａｂｃｙｌ、ＴＡＭＲＡが該当する。標識物質で標識される位置は、使用する標識物質の性質に応じて適宜決定すればよく、特に限定はしない。例えば、５’末端及び／又は３’末端であってもよいし、Ｓｑ３を有するポリヌクレオチド内、又はＳｑ３の一部を有するヌクレオチド内のいずれかのヌクレオチドであってもよい。なお、蛍光抑制物質を使用する場合は通常、蛍光物質と対で標識される。この場合、蛍光物質はオリゴヌクレオチドの５’末端に標識され、蛍光抑制物質は同じオリゴヌクレオチドの３’末端に標識されることが一般的である。また、蛍光抑制物質は、種類によって蛍光の抑制範囲が異なる。したがって、蛍光抑制物質を使用する場合は、ペアとなる前記蛍光物質の発光を抑制できる種類を選択する必要がある。
【００４８】
<実施形態１：効果>
本実施形態の二つのオリゴヌクレオチドによれば、ＰＭＴＶの核酸増幅用プライマー対として用いることで、罹病植物やジャガイモ粉状そうか病菌などの複数生物種の核酸存在下においても非特異的核酸増幅産物をほとんど生じさせることなく、ＰＭＴＶゲノム由来の核酸を高感度、かつ特異的に増幅できる。それゆえ、実施形態２のＰＭＴＶ土壌汚染診断法におけるＰＭＴＶゲノム検出用プライマーとしても有用である。
【００４９】
本実施形態のポリヌクレオチド又はヌクレオチドによれば、本実施形態の二つのオリゴヌクレオチドをプライマー対とする核酸増幅産物を特異的に検出することができる。
【００５０】
<<実施形態２>>
【００５１】
<実施形態２：概要>
実施形態２は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法に関する。図５は実施形態２の概念図である。この図では、本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法のうち、供試土壌を懸濁した液相（Ａ）中でおとり植物（０５０４）を育成（Ｂ）後、当該植物の根部（０５０５）からＲＮＡ（０５０６）を抽出（Ｃ）し、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｄ）を行った後にＭＰＨ法にてＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物（０５０８）を検出（Ｅ）する場合を示している。この図のように、本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法は、トマトなどのジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として、その根にＰＭＴＶを保毒するジャガイモ粉状そうか病菌を感染、増殖させることにより、土壌中からＰＭＴＶを選択的に捕捉する。続いて、おとり植物の根部からＰＭＴＶゲノム断片を核酸増幅法によって増幅し、検出することを基本としている。これによって従来困難であった土壌中に存在するＰＭＴＶの検出が可能となる。
【００５２】
<実施形態２：各工程の流れと構成>
図６に本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法を構成する工程と、その流れを示す。この図で示すように、本実施形態は、育成工程（Ｓ０６０１）、ＲＮＡ抽出工程（Ｓ０６０２）、逆転写工程（Ｓ０６０３）、核酸増幅工程（Ｓ０６０４）、検出工程（Ｓ０６０５）から構成される。以下、各工程の構成について説明をする。
【００５３】
１．育成工程
「育成工程」（Ｓ０６０１）とは、ジャガイモ以外のナス科植物をおとり植物として供試土壌にて育成する工程、若しくは供試土壌での育成に代えて供試土壌を懸濁して液相中で育成する工程である。前述のようにＰＭＴＶはジャガイモ粉状そうか病菌によって媒介される。したがって、ＰＭＴＶを土壌から採取するには、ＰＭＴＶを保毒する媒介菌を土壌中から採取した後、それを培養すればよい。ところが、ジャガイモ粉状そうか病菌は絶対寄生菌であるため人工培養ができない。そこで、当該育成工程は、供試土壌でおとり植物を育成することによって供試土壌中のジャガイモ粉状そうか病菌を当該植物の根部に感染させて、当該おとり植物を利用した土壌中からのジャガイモ粉状そうか病菌の選択的採取と培養を行うことを目的とする。以下、本工程の構成要件について詳細に説明をする。
【００５４】
「ナス科植物」とは、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）に属する植物種をいう。ジャガイモ以外では、例えば、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ａｎｎｕｕｍ）、ベンサアミナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）が該当する。また、ナス科植物の各種の品種もここでいうナス科植物に該当する。例えば、トマトの場合であれば、桃太郎、ミニキャロルが該当する。
【００５５】
「おとり植物」とは、土壌中のジャガイモ粉状そうか病菌をその根部に感染させるための植物である。ジャガイモ粉状そうか病菌の主たる宿主植物は、ナス科植物であるので、おとり植物はＰＭＴＶに感染していないジャガイモ以外のナス科植物を用いる。
【００５６】
「ジャガイモ以外のナス科植物」としたのは、ジャガイモがおとり植物として好ましくないからである。つまり、本実施形態で比較的短期の育成期間で得られる根部を用いた場合、ジャガイモは、他のナス科植物と比較してＰＭＴＶの検出が困難であるという理由による。なお、罹病ジャガイモ塊茎からのＰＭＴＶの検出はＥＬＩＳＡ法や、前記実施形態１のプライマー対を用いた核酸増幅法によれば比較的容易である。
【００５７】
おとり植物として好ましいのは、生育が早く、育成が容易なこと、ジャガイモ粉状そうか病菌を根部に捕捉しやすいこと、そして当該根部からＰＭＴＶ由来のゲノムの検出感度が高いことなどの要件を満たす種である。そのような種の使用は、土壌汚染診断結果が短期間で得られ、また、診断精度も高いという理由による。例えば、トマトは前記要件を満たすため、おとり植物として非常に好ましい。
【００５８】
ＰＭＴＶに感染していないおとり植物を得るためには、種子から育成することが好ましい。たとえ当該菌や当該ウイルスに罹病した植物体であっても、それから得られる種子にはＰＭＴＶは存在しないからである。これは、ジャガイモ粉状そうか病菌は宿主植物の根部に局在し、またＰＭＴＶは種子伝染しないことに基づく。なお、おとり植物を供試土壌に移す前に、所定の状態まで通常培土で育成する場合、当該通常培土にジャガイモ粉状そうか病菌若しくはＰＭＴＶが存在しないことを確認しておくことは言うまでもない。
【００５９】
図７に、本実施形態のおとり植物としての適合性に関する結果を示す。この図は、トマトとジャガイモをおとり植物として、ＰＭＴＶの存在する供試土壌を用いて同一条件下で本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法を行ったときのアガロースゲル電気泳動による検出結果である。詳細な方法については、増幅用プライマー対がＳｑ１、又はＳｑ２を有するオリゴヌクレオチドプライマー対ではない以外、実施例１とほぼ同様であるのでここでは説明を省略する。矢印で示す位置のバンド（０７０１）がＰＭＴＶ由来のＤＮＡ増幅断片であり、それ以外のバンドは非特異的増幅によるＤＮＡ増幅断片である。ＰＣはポジティブコントロールを、ＮＣはネガティブコントロールを示す。この図で示すように、当該２種のナス科植物においては、トマトをおとり植物とした場合、ＰＭＴＶは高感度に検出できた。しかし、ジャガイモの場合、ＰＭＴＶ由来のＤＮＡ断片はほとんど検出できなかった。以上の結果から本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法におけるおとり植物としては、トマトが好ましく、ジャガイモは適切でないことが示された。
【００６０】
ところで、前述のように、本工程はおとり植物を供試土壌にて育成する場合と、供試土壌を懸濁して液相中で育成する場合がある。そこで、それぞれの場合について以下で説明をする。
【００６１】
（おとり植物を供試土壌にて育成する場合）
「供試土壌」とは、ＰＭＴＶによる土壌汚染診断に供する土壌である。
【００６２】
「おとり植物を供試土壌にて育成する」とは、土壌汚染診断を行う供試土壌におとり植物を直接植えつけて育成することをいう。野外育成、屋内育成は問わない。土壌汚染診断を行う圃場で直接おとり植物を育成してもよいし、圃場から採取した供試土壌を植木鉢やプランタなどの容器に詰めておとり植物を植え、人工気象器内で育成してもよい。天候に左右されないことや、光量や温度、害虫排除などの管理が可能なこと、診断に要する時間が短期間で済むことなどを考慮すると、屋内育成の方が好ましい。なお、供試土壌を容器に詰めておとり植物を育成する場合、成長促進などの目的でＰＭＴＶを含まない培土や培養液などを当該土壌に混入しても構わない。
【００６３】
なお、本実施形態で「供試土壌にて育成する」とは、おとり植物の育成と共に、その根部に供試土壌中に存在し得るジャガイモ粉状そうか病菌を感染させることを目的とする。したがって、おとり植物は、播種時から供試土壌で育成する必要はない。例えば、所定の状態に成長するまではＰＭＴＶを含まない通常の培土で育成し、その後供試土壌に植え替えても構わない。
【００６４】
供試土壌にて育成する期間は、おとり植物の種類、育成温度、日照時間などに応じて適宜定めればよい。例えば、おとり植物がトマトであって、育成温度が１８℃、かつ１６時間日長下であれば、１〜２週間が適当である。
【００６５】
（おとり植物を供試土壌を懸濁した液相中で育成する場合）
おとり植物を供試土壌を懸濁した液相中で育成する方法は、ジャガイモ粉状そうか病菌が液相を介しておとり植物の根部に捕捉されやすくなる点や、おとり植物の成育に必要な栄養素などを懸濁液中に均一に供給できる点、感染させた根部を傷めることなく比較的容易に回収できる点、また、当該回収により根部への土壌粒子や阻害成分の付着や混入を防ぐことができる点などにおいて前記供試土壌にて育成する方法よりも優れている。
【００６６】
供試土壌を懸濁する液体は、水、若しくは培養液でよい。懸濁に使用する供試土壌の量と液体の容量は、診断状況などに応じて適宜定めればよい。例えば、通常の場合であれば供試土壌の乾燥重量に対して倍容量程度の液体を加えれば足りる。水で懸濁した場合は、当該懸濁液に培養液を添加することが好ましい。おとり植物の育成に必要な養分を供給し、成長促進によって診断期間を短縮するためである。培養液は、水耕培養に使用する通常の培溶液でよい。培養液は、育成途中で必要に応じて追加しても構わない。また、懸濁液中の供試土を構成していた固形物を濾過除去する必要はない。
【００６７】
「液相中で育成する」とは、供試土壌の土に依ることなく、その懸濁液に基づく液相を用いて育成することをいう。具体的には、水耕栽培により育成することである。ただし、当該水耕栽培は、液体のみによる育成に留まらず、供試土壌の懸濁液におとり植物根部の足場となる固形物を加えて育成する固形培地栽培も含む。ここで使用する固形物は、おとり植物の根部の回収が容易なもの、すなわち掘り上げが容易なものであればよい。例えば、砂や礫などの無機質材の他、寒天などの有機質材が挙げられる。
【００６８】
おとり植物を所定の状態まで通常の培土で育成後、当該液相中に移し変えて育成することや、液相中で育成する期間については、前記「おとり植物を供試土壌にて育成する場合」と同様である。
【００６９】
２．ＲＮＡ抽出工程
「ＲＮＡ抽出工程」（Ｓ０６０２）とは、育成工程後のおとり植物の根部からＲＮＡを抽出する工程である。前述のようにＰＭＴＶは、１本鎖ＲＮＡ（＋）ウイルスであり、ＲＮＡをゲノムとする。それゆえ、育成工程後のおとり植物の根部からＰＭＴＶゲノムを検出するためには、ＲＮＡを抽出する必要がある。ここでいう「ＲＮＡ」は、おとり植物の根部から抽出される全ＲＮＡが該当する。通常、当該全ＲＮＡは、その大部分がおとり植物由来のｍＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡなどから構成される。しかし、おとり植物が根部にジャガイモ粉状そうか病菌の感染を受けた場合には、おとり植物由来の全ＲＮＡに加えて、前記当該ジャガイモ粉状そうか病菌由来のｍＲＮＡなどが混在する。さらに、当該ジャガイモ粉状そうか病菌がＰＭＴＶを保毒していた場合には、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡが混在することとなる。
【００７０】
採取するおとり植物の根部は、特に限定はしないが、一部の根のみに偏らないように、なるべく根部全体から採取するようにする。ジャガイモ粉状そうか病菌を捕捉した根を取りこぼすことがないようにするためである。具体例を挙げれば、茎との境界部にあたる根基部より１〜１．５ｃｍの部分を主根、側根を含めて３〜４箇所から採取すればよい。
【００７１】
ＲＮＡ抽出法については、分子生物学において植物細胞からＲＮＡを抽出する公知の方法に準じて行えばよい。例えば、トリゾール法やＡＧＰＣ法などが挙げられる。本願では、ＲＮＡ抽出法の具体例として後述する実施例１Ｂにおいてトリゾール法を用いた場合を示す。
【００７２】
３．逆転写工程
「逆転写工程」（Ｓ０６０３）とは、ＲＮＡ抽出工程で得られるＲＮＡを鋳型として、逆転写反応を行う工程である。本工程は、前記ＲＮＡ抽出工程で得られたＲＮＡから、次の核酸増幅反応において鋳型となるｃＤＮＡを合成することを目的とする。
【００７３】
「逆転写反応」とは、ＲＮＡを鋳型として、逆転写プライマーと逆転写酵素（以下「ＲＴａｓｅ」とする）による酵素反応よってｃＤＮＡを合成する反応である。本工程で用いる逆転写プライマーは、ヘキサマー（ｈｅｘａｍｅｒ）からノナマー（ｎｏｎａｍｅｒ）程度のランダムプライマーを用いればよい。また、検出するＰＭＴＶのゲノムＲＮＡの塩基配列に特異的なプライマーを用いてもよい。ただし、この場合、次の核酸増幅工程で用いる増幅用プライマー対は、当該特異的なプライマーによって逆転写されるｃＤＮＡ領域内の塩基配列を有するように設定する必要がある。反応用酵素は、ＲＴａｓｅであれば特に限定はしない。Ｍ−ＭＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙ−Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）ＲＴａｓｅ、若しくはＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉs  Ｖｉｒｕｓ）ＲＴａｓｅが一般的に利用され、また入手も容易なことから便利である。
【００７４】
本工程の逆転写反応条件は、分子生物学において一般的に知られる逆転写反応条件と同様であり、原則的には公知の条件に準じて行えばよい。本願では、本工程の逆転写反応条件の具体例として後述する実施例１Ｃの条件を示す。
【００７５】
４．核酸増幅工程
「核酸増幅工程」（Ｓ０６０４）とは、逆転写工程で得られるｃＤＮＡを鋳型として、ＰＭＴＶ由来のｃＤＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー対を用いて核酸増幅反応を行う工程である。本工程は、逆転写工程で得られるｃＤＮＡ中にＰＭＴＶゲノムＲＮＡ由来のｃＤＮＡが存在する場合、それを核酸増幅反応によって増幅することを目的とする。
【００７６】
「核酸増幅反応」とは、目的とする核酸の特定領域をＤＮＡポリメラーゼなど酵素反応よって増幅する反応である。当該反応に基づく増幅方法としては、増幅用プライマーを用いて増幅する核酸増幅法や大腸菌などの生物を用いたクローニング法が挙げられる。本実施形態においては、迅速性、簡易性の点から核酸増幅法が望ましい。核酸増幅法は、逆転写工程で得られるｃＤＮＡを鋳型として、ＰＭＴＶ由来のｃＤＮＡを増幅可能な方法であれば、特に限定はしない。例えば、ＰＣＲ法、ＩＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法、又はＮＡＳＢＡ法が挙げられる。このうちＰＣＲ法は特に好ましい。なぜなら、ＰＣＲ法は、医学、分子生物学の分野において現在世界中で最も広く浸透している方法であり、リアルタイムＰＣＲ法などの様々な応用技術も知られているからである。本工程でＰＣＲ法を用いた場合、前記逆転写工程から当該核酸増幅工程までの一連の方法は、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ法となる。
【００７７】
「ＰＭＴＶ由来の」とは、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡに基づいて逆転写された、の意味である。
【００７８】
「ＰＭＴＶ由来のｃＤＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー対」とは、ＰＭＴＶゲノム由来のｃＤＮＡ塩基配列のセンス鎖、アンチセンス鎖にそれぞれ相補的な塩基配列を有し、核酸増幅反応によって当該ｃＤＮＡ断片の特定領域を増幅し得るＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対をいう。当該相補的な塩基配列は、ＰＭＴＶゲノムＲＮＡ上に存在するＰＭＴＶ特異的な塩基配列を選択することが好ましい。核酸増幅反応における非特異的な核酸増幅を回避するためである。ＰＭＴＶ特異的な塩基配列は、例えば、前記実施形態１で述べたＳｑ１やＳｑ２が該当する。前述のように本実施形態のプライマー対としては、Ｓｑ１、Ｓｑ２をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドのプライマー対が特に好ましい。
【００７９】
核酸増幅反応については、使用する核酸増幅法に応じて適宜定める。例えば、ＰＣＲ法であれば、通常、鋳型の熱変性反応、プライマーなどのアニーリング反応、プライマーの伸長反応の３反応を１サイクルとして、当該サイクルを繰り返す方法を基本とする。また、アニーリング反応と伸長反応を同一条件で同時に行う２反応１サイクルとしてもよい。効率的に核酸増幅を行うには、使用するプライマーの塩基配列や塩基数、予想される核酸増幅産物の塩基数に応じて前記各反応における温度と時間を適宜定めることが望ましい。一般的には、熱変性反応が８８℃〜９８℃で３０秒間〜１分間、アニーリング反応が５２℃〜６０℃で３０秒間〜１分間、そして伸長反応が７０℃〜７５℃で３０秒間〜３分間で行われる。一方、ＩＣＡＮ法やＬＡＭＰ法を使用する場合は、５０℃から６５℃の一定温度で増幅が可能である。これらの核酸増幅法は、サーマルサイクラーなどの温度制御機器を要しないため便利である。また、サイクル数は、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類や所望する核酸の増幅量によって異なるが、通常、２５サイクルから４５サイクル程度で足りる。好ましくは３０サイクルから４０サイクルである。核酸増幅反応の詳細な反応条件や方法については、公知の技術に準ずればよい。本願では、具体例として実施例１にＰＣＲ法を用いた際の核酸増幅反応条件と方法を示す。
５．検出工程
「検出工程」（Ｓ０６０５）とは、核酸増幅工程で得られる核酸増幅産物からＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出する工程である。
【００８０】
「核酸増幅工程で得られる核酸増幅産物」とは、前記核酸増幅工程で使用したＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対によって増幅される核酸増幅産物をいう。すなわち、当該核酸増幅産物は目的とする核酸増幅産物の他、非特異的に増幅された核酸増幅産物も含む。
【００８１】
「ＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物」とは、前記核酸増幅工程で使用したＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対によって増幅されるべき、目的とするＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物、の意味である。当該ＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物は、通常、ＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対の決定によって一意に定まる。例えば、ＰＭＴＶ−９ＰとＰＭＴＶ−９Ｍのプライマー対を用いた場合であれば、図２で示した５０７塩基からなる核酸増幅産物が、当該ＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物に該当する。
【００８２】
核酸増幅産物からＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出する方法としては、（１）核酸増幅産物の塩基長に基づいて検出する方法、（２）核酸増幅産物に所定の処理をして検出する方法、（３）核酸増幅産物の増幅に伴う現象を利用して検出する方法、（４）ハイブリダイゼーション法により検出する方法などが挙げられる。以下、それぞれの方法について具体例を挙げて説明する。
【００８３】
（１）核酸増幅産物の塩基長に基づいて検出する方法
この方法は、核酸増幅反応を行った際に、そのＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対により生じる事が予想される塩基長に基づいてＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出する方法である。増幅断片の塩基長を視認する方法は、アガロースゲル電気泳動法やポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いればよい。これらのゲル電気泳動法は分子生物学の分野で頻用される確立した技術であり、公知の技術に準ずればよい。本願では具体例として実施例１でアガロースゲル電気泳動法を用いた核酸増幅産物を検出する方法を示した。
【００８４】
（２）核酸増幅産物に所定の処理をして検出する方法
この方法は、核酸増幅産物を所定の制限酵素で切断した際に、それぞれの塩基配列中に存在する制限酵素部位の相違によって生じる切断パターンからＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出する方法である。異なる核酸増幅産物間で核酸増幅産物の塩基長が近似する場合であっても、目的のＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出できる点で便利である。ただし、核酸増幅産物中に制限酵素部位が存在する必要がある。切断パターンの検出は、核酸増幅産物に対して通常の制限酵素切断処理を行った後、前記ゲル電気泳動法によって検出すればよい。
【００８５】
（３）核酸増幅産物の増幅に伴う現象を利用して検出する方法
この方法は、例えば、ＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物の増加に伴う蛍光強度の増加を測定するなど、核酸増幅産物の増加を経時的に検出する方法である。当該方法の具体例としては、リアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲ法には、５’ヌクレアーゼ法（ＴａｑＭａｎプローブ法）、サイクリングプローブ法、又はＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎなどの核酸染色剤を核酸増幅の反応液中に加え、核酸増幅反応とともに染色することによって核酸増幅産物の増加を当該核酸染色剤から発せられる蛍光の強度により検出する方法などが知られるが、核酸増幅産物の増加を反映する蛍光強度の増加を経時的に検出できれば、いずれの方法であっても構わない。リアルタイムＰＣＲ法は、現在頻用される公知の技術であり、各社から試薬や機器が市販されている他、プロトコールも頒布されているのでそれらに準じて行えばよい。
【００８６】
（４）ハイブリダイゼーション法により検出する方法
この方法は、ＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物の塩基配列を識別できるオリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドをプローブとして、ハイブリダイゼーションによってＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を検出する方法である。例えば、（４−１）ゲル・ブロッティング法や、（４−２）核酸を直接フィルターや基板に固定したものを用いる方法が挙げられる。以下、それぞれの方法について説明する。
【００８７】
（４−１）ゲル・ブロッティング法
ゲル・ブロッティング法の具体例としては、サザンブロット・ハイブリダイゼーション法、又はそれらを原理とするブロッティング法などが挙げられる。サザンブロット・ハイブリダイゼーション法は、電気泳動後のゲル中で分画された核酸増幅産物であるＤＮＡをメンブレンに転写した後、標識されたプローブを当該メンブレン上の目的の塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズさせて検出することを基本とするものである。ゲル・ブロッティング法は分子生物学分野で確立した極めて一般的な技術であり、非特許文献４などのプロトコールに準じて行えばよいことから詳細な説明については省略する。
【００８８】
（４−２）核酸を直接フィルターや基板に固定したものを用いる方法
核酸が固定されたフィルターや基板を用いる方法の具体例としては、ドットブロットハイブリダイゼーション法、ＭＰＨ法などの解析法などが該当する。
【００８９】
ドットブロットハイブリダイゼーション法には、マクロアレイ、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた検出方法が含まれる。これらの方法は、複数の検体を同時検出可能な上、高感度に検出が可能なことから便利である。ドットブロットハイブリダイゼーション法は、公知の技術であり、市販のプロトコールなどに準じて行えばよいことからここでは詳細な説明を省略する。なお、マイクロアレイ、又はＤＮＡチップを用いた方法は基板など作製のための技術、労力、コストを考慮すると受託解析サービスを行っている専門業者を利用する方が便利である。
【００９０】
ＭＰＨ法は、ＥＬＩＳＡ法などで使用されるポリスチレン製をはじめとするマイクロプレートに核酸を固定化し、ＤＩＧなどの標識プローブを用いたハイブリダイゼーションによって目的の核酸を検出する方法である。固相の洗浄が容易で、プレハイブリダイゼーションが不要であり、非放射性標識プローブを使用できるなどの利点がある。また、高額な専用解析装置を必要とするマイクロアレイやＤＮＡチップと異なり、ＥＬＩＳＡ法で使用するマイクロプレートリーダーで解析可能であるため、一般の研究室でも簡便に解析できる点で優れている。ＭＰＨ法は、ＰＣＲなどの核酸増幅法と組み合わせることによって、高感度かつ特異的な検出が可能となる。例えば、前記図４で示したように、連続希釈ＲＮＡサンプルを用いて、核酸増幅産物の塩基長に基づいたアガロースゲル電気泳動法によるＰＭＴＶ核酸増幅産物の検出と、ＭＰＨ法によるＰＭＴＶ核酸増幅産物の検出とでは、アガロースゲル電気泳動による検出は５４倍希釈が検出限界であったが、ＭＰＨ法は５７倍希釈まで検出可能であった。このように、ＭＰＨ法は、解析が簡便でありながら、検出感度が非常に高いことから、本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法における検出方法としても好ましい。本願では、ＭＰＨ法の具体例として、実施例１ＦでＭＰＨ法を利用したＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物の検出例を示した。
【００９１】
Ｓｐ１及びＳｑ２を有する二つのオリゴヌクレオチドをＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対とするＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物をハイブリダイゼーション法により検出する場合、その検出に使用するプローブは、前記実施形態１で述べたＳｑ３を有するポリヌクレオチド、又はＳｑ３の一部を有するヌクレオチドであることが望ましい。目的のＰＭＴＶ固有の核酸増幅産物を効率的に検出できるからである。
【００９２】
以上の工程を経ることで、土壌中のＰＭＴＶを効率的、かつ高感度に検出することができる。
【００９３】
<実施形態２：効果>
本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、土壌中のＰＭＴＶをジャガイモ粉状そうか病菌を介しておとり植物に捕捉させることで、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法の開発する上で最大の問題であった土壌からの直接的核酸抽出の困難性と土壌中の酵素阻害物質の混入を解決できる。それによって、土壌中のＰＭＴＶを効率的、かつ高感度に検出することができる。
【００９４】
本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、人工培養のできないジャガイモ粉状そうか病菌をおとり植物細胞内にて増殖させることができる。さらに、当該ウイルスが土壌中に僅かにしか存在しない場合であっても、おとり植物へ寄生させることでＰＭＴＶも検出が可能な量まで増殖させることができる。
【００９５】
本実施形態のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によれば、一回の試験で多検体を処理することが可能なため、ジャガイモの作付け前にＰＭＴＶによる土壌汚染の有無を容易に診断することができる。当該方法でＰＭＴＶによる土壌汚染が事前に明らかになることで、ＰＭＴＶの未汚染地域への拡散防止が可能となる。
【実施例１】
【００９６】
以下の実施例をもって本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法を具体的に説明する。本実施例では、実際に各地の圃場から供試土壌を採取し、当該供試土壌を懸濁した液相中でおとり植物としてのトマトを育成後、配列番号１、及び２のオリゴヌクレオチドをプライマー対、および配列番号３のポリヌクレオチドをプローブの鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲ−ＭＰＨ法によってＰＭＴＶゲノムを検出する例を示している。なお、本発明はこの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００９７】
Ａ．おとり植物を用いた土壌中の粉状そうか病菌の選択的捕捉
【００９８】
本操作はＰＭＴＶ土壌汚染診断法における育成工程に相当する。
【００９９】
<材料・試薬など>
（ａ）おとり植物：トマト種子（品種：桃太郎）約１００粒
（ｂ）水耕培養液 
・Ｍｅｒｚの水耕培養液（保存用）：  ３．５４ｇ  Ｃａ（ＮＯ３）２・４H２O／２．５３ｇ  ＫＮＯ３／１．３６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４／２．４７ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ／０．１０ｇ  Ｆｅ−ＥＤＴＡ／５ｍｌ  Ｈｏａｇｌａｎｄ用微量栄養素液／１０００ｍｌ  蒸留水；  これらの試薬などを調製後、１２１℃、１５分でオートクレーブ滅菌を行う。冷蔵庫（４℃）に保存し、使用時には本溶液を十分撹拌した後、蒸留水で１０倍希釈する。
・Ｈｏａｇｌａｎｄ用微量栄養素液：  １００ｍｇ  Ａｌ２（ＳＯ４）３／５０ｍｇ  ＫＩ／５０ｍｇ  ＫＢｒ／１００ｍｇ  ＴｉＯ２／５０ｍｇ  ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ／５０ｍｇ  ＬｉＣｌ／７００ｍｇ  ＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ／１００ｍｇ  ＺｎＳＯ４／１１００ｍｇ  Ｈ３ＢＯ３／１００ｍｇ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ／１００ｍｇ  ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ／１００ｍｇ  Ｃｏ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ／１８０ｍｌ  蒸留水；  これらの試薬などを調製後、使用前には十分に撹拌する。
（ｃ）培土：粒状園芸培土
（ｄ）供試土壌：診断を行う土壌を１００ｇほど
【０１００】
<方法>
【０１０１】
１．おとり植物（トマト苗）の準備
（１）トマト播種（０日）：4号素焼鉢に培土を詰め、５０粒のトマト種子を鉢あたり均等に、２鉢播種した。播種後、ガラス温室で育成し、管理した。
（２）トマト苗掘り上げ（播種後２１日）：本葉２枚程度となった頃を目安に、播種したトマトを掘り上げた。根がらみを解き、流水中で根に付着した培土を丁寧に取り除いた。
（３）ミニトマトパック移植とコンディショニング（播種後２１日）：フタ側に予め直径約１８mmの穴を４点開けたミニトマトパック（縦１２５ｍｍ×横１２９ｍｍ×高さ６０ｍｍ（フタの高さ２０ｍｍを含む））に、１０倍希釈した水耕培養液を約２００ml入れた。サイズがほぼ均等な４株のトマト苗を１株ずつポリエチレンプラグに挟み、ミニトマトパックの各穴に挿入して固定した。トマト苗を移植したミニトマトパックは１８℃、１６時間日長の人工気象器内でコンディショニングを行った。
【０１０２】
２．土壌試料準備（調査ポイント：２４箇所）
（１）土塊破砕と風乾（０日）：供試土壌８０〜１００ｇを各箇所から採取し、フルーツケースなどの容器に広げ、土塊を破砕した後、室温（２５℃〜３０℃）で風乾した。
（２）土壌撹拌（風乾開始後４日）：土壌の乾燥度合いに応じてスパチュラなどで撹拌した。
（３）土壌懸濁液調製（風乾開始後７日）：前記２．２）で準備した土壌を３００ｍｌの三角フラスコに５０ｇ量りとり、１０倍の希釈水耕培養液を約１００ｍｌ加えた。フラスコの口をパラフィルムでシールした後、振とう器にセットして、室温、１４０ｒｐｍ程度で２０分間振とうした。土壌を十分分散させて、土壌懸濁液を調製した。
【０１０３】
３．トマトへの接種と粉状そうか病菌の捕捉
（１）接種（播種後２８日）：前記１．で準備したミニトマトパックの水耕培養液を廃棄し、２．３）で調製した土壌懸濁液を十分に撹拌してミニトマトパックに注ぎ込んだ。その後、当該三角フラスコに１００ｍｌ程度の１０倍の希釈水耕培養液を加え、残留した土壌を再懸濁して当該ミニトマトパックに移した。ミニトマトパックのフタをして根部を土壌懸濁液中に浸漬させ、接種を行った。土壌懸濁液中の粉状そうか病菌を捕捉するために、１８℃、１６時間日長の人工気象器内で９日間培養した。
（２）水耕培養液補充（播種後約３２日、捕捉開始後約4日目）：水耕培養液の減少度合いに応じて水耕培養液を補充した。
【０１０４】
４．サンプリング（播種後約３７日、捕捉開始後約９日目）
（１）根洗い：ミニトマトパックのトマト地上部を切除した。根部に付着した土壌をビーカーなどに入れた水で大まかに除いた後、流水で十分に洗浄した。洗浄後の根部はサンプル名を記したペーパータオル上に並べて、余分の水分を除去した。なお、洗浄水は回収して滅菌後に廃棄した。
（２）根採取：根基部の「くびれ」部分下１〜１．５ｃｍの部分から根を採取した。一部の根に偏らないように全体から少しずつ（３、４カ所から数本摘んで切り取る）、約５０ｍｇ程度採取した。
（３）保存：採取した根部サンプルは２ｍｌスクリューキャップ付サンプルチューブに入れ、キャップをしてディープフリーザで保存した。採取した残りの根部は株ごとにチャックつきポリ袋に入れて、再試験に備えて同様にディープフリーザで保存した。
【０１０５】
Ｂ．全ＲＮＡ抽出
本操作は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法におけるＲＮＡ抽出工程に相当する。核酸汚染を防ぐため、以下、本実施例で使用する器具、容器、試薬などは、原則として核酸フリー、ＲＮＡａｓｅフリーであることを前提とする。
【０１０６】
<材料・試薬など>
・トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）：  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社  １５５９６−０２６
【０１０７】
<方法>
（１）前記「おとり植物を用いた土壌中の粉状そうか病菌の選択的捕捉４（２）」で採取した根部約５０ｍｇを乳鉢に入れ、トリゾール１ｍｌを加えた。乳棒を用いて、サンプルをホモジェナイズした。
（２）十分に摩砕したサンプルを１．５ｍｌチューブに移し、室温で５分間インキュベートした。
（３）２００μｌのクロロホルムを加え、ボルテックスした。
（４）再び室温で３分間インキュベートした後、４℃にて１５０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。
（５）上清５００〜６００μｌを新しい１．５ｍｌチューブに移した。
（６）５００μｌのイソプロパノールを加え、ボルテックスした。
（７）室温で１０分間インキュベートした。
（８）４℃にて１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心を行った。
（９）上清を除き、洗浄のため５００μｌ程度の７５％エタノールを静かに加えた。
（１０）４℃にて１５０００ｒｐｍ、５分間遠心を行った。
（１１）７５％エタノールを除き、沈殿物（全ＲＮＡ）を１０分間風乾した。
（１２）５０μｌの滅菌水を加え、沈殿物を溶解した。
【０１０８】
Ｃ．逆転写反応
本操作は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法における逆転写工程に相当する。
【０１０９】
<材料・試薬など>
（ａ）５×ＲＴａｓｅ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）  ２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．３）／３７５ｍＭ  ＫＣｌ／１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
（ｂ）０．１Ｍ  ＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）
（ｃ）２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社）
（ｄ）１２．５μＭ  Ｒａｎｄｏｍ  ｎｏｎａｍｅｒ  （ＴａＫａＲａ社）
（ｅ）Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社、２００Ｕ／μｌ）
【０１１０】
<方法>
ここでは、次の「Ｄ．ＰＣＲ」と共にＴｗｏ  Ｓｔｅｐ−ｔｗｏ  ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（ＲＴ：  １０μｌ反応系、ＰＣＲ：２５μｌ反応系）を行った。
【０１１１】
１．ＲＴプレミックスの作製
・５×ＲＴａｓｅ緩衝液            ２μｌ
・０．１Ｍ  ＤＴＴ                １μｌ
・滅菌水                ２．５μｌ
・２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰｓ            ２μｌ
・１２．５μＭ  Ｒａｎｄｏｍ  ｎｏｎａｍｅｒ    １μｌ
・Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴａｓｅ            ０．５μｌ
以上の試薬（１件体分）を検体数よりもやや多めにチューブ内で混合し、ＲＴプレミックスを作製した。
【０１１２】
２．ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブ又は９６穴プレートに前記ＲＴプレミックスを９μｌずつ分注し、前記「Ｂ．全ＲＮＡ抽出」で得られたＲＮＡ試料を１μｌづつ加えた。
【０１１３】
３．前記サンプルをサーマルサイクラー（ＰＥ９７００：ＡＢＩ社）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で３０分間処理して逆転写反応を行った。
【０１１４】
４．９９℃で５分間熱変性処理した後、１０℃で保持した。これによって得られた逆転写産物を次のＰＣＲに用いた。
【０１１５】
Ｄ．ＰＣＲ
本操作は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法における核酸増幅工程に相当する。
【０１１６】
<材料・試薬など>
（ａ）１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液（ＴａＫａＲａ社）
（ｂ）２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社）
（ｃ）１０μＭ  センス鎖プライマー（ここではＰＭＴＶ−９Ｐ）
（ｄ）１０μＭ  アンチセンス鎖プライマー（ここではＰＭＴＶ−９Ｍ）
（ｅ）５Ｕ／μｌＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）
【０１１７】
<方法>
【０１１８】
１．ＰＣＲプレミックスの作製
・１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液            ２．５μｌ
・２．５  ｍＭ  ｄＮＴＰs            ２μｌ
・１０μＭ  センス鎖プライマー        ０．５μｌ
・１０μＭ  アンチセンス鎖プライマー        ０．５μｌ
・Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ        ０．１２５μｌ
・滅菌水                    １８．３７５μｌ
以上の試薬（１検体分）を検体数よりもやや多めにチューブ内で混合し、ＰＣＲプレミックスを作製した。
【０１１９】
２．ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブ、又は９６穴プレートに前記ＰＣＲプレミックスを２４μｌずつ分注し、前記「Ｃ．逆転写反応」で得られたＲＴ産物を１μｌづつ加えた。
【０１２０】
３．前記サンプルをサーマルサイクラー（ＰＥ９７００：ＡＢＩ社）を用いて、９４℃で４分３０秒プレヒートした後、変性アニーリング伸長反応（変性：９４℃  ３０秒間→アニーリング：５５℃  １分間→伸長  ７２℃  １分間）を３５サイクル行った。
【０１２１】
４．変性アニーリング伸長反応後、サンプルを７２℃で４分間処理し、１０℃で保持した。これによって得られたＰＣＲ産物を次の「Ｅ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶ断片の検出」、若しくは「Ｆ．ＭＰＨ法を用いたＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」に用いた。
【０１２２】
Ｅ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出
本操作は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法における検出工程に相当する。なお、本実施例では、本操作と次の「Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」とを併用したが、ＰＭＴＶの高感度な検出結果を求める場合には、次の「Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」のみでもよい。
【０１２３】
<材料・試薬など>
（ａ）２％アガロースゲル：２％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液；  混合後、電子レンジで加熱融解し、電気泳動用ゲル作製トレイに流し込み、冷却固化させる。
（ｂ）１０×ＴＢＥ緩衝液：  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ  １０８ｇ／ホウ酸  ５５ｇ／ＥＤＴＡ・２Ｎａ−２Ｈ２Ｏ  ３．７ｇ；  混合後、滅菌水で１Ｌにフィルアップした。使用時は滅菌水で１０倍希釈した１×ＴＢＥを用いた。
【０１２４】
<方法>
【０１２５】
１．前記アガロースゲルを泳動槽に設置し、泳動バッファー（１×ＴＢＥ）を注いだ。当該アガロースゲルの１ウェル内に前記「Ｄ．ＰＣＲ」で得られた各ＰＣＲ産物を５μｌアプライした。泳動サンプルとともに別のウェルにサイズラダーマーカー（１００ｂｐＤＮＡＬａｄｄｅｒ：ＮＥＢ社）を２μｌアプライした。続いて、一定電圧で電気泳動した。
【０１２６】
２．前記電気泳動後、アガロースゲルをエチジウムブロミドを含む溶液に浸漬させ、緩やかに振動しながらゲル中の核酸を染色した。最後に染色したゲルに紫外線ランプを照射し核酸増幅産物のバンドのパターンを記録した。
【０１２７】
Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出
本操作は、ＰＭＴＶ土壌汚染診断法における検出工程に相当する。
【０１２８】
<材料・試薬など>
【０１２９】
（（プローブ用））
（ａ）１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液（ＴａＫａＲａ社）
（ｂ）２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ＴａＫａＲａ社）
（ｃ）ｄＮＴＰs  （1ｍＭ  ｄＧＴＰ、1ｍＭ  ｄＡＴＰ、1ｍＭ  ｄＣＴＰ、０．６５  ｍＭ  ｄＴＴＰ）
（ｄ）１ｍＭ  ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ社）
（ｅ）１０μＭ  センス鎖プライマー（ここではＰＭＴＶ−９Ｐ）
（ｆ）１０μＭ  アンチセンス鎖プライマー（ここではＰＭＴＶ−９Ｍ）
（ｇ）Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社）：１．２５Ｕ／μｌに希釈
（ｈ）２０ｎｇ／μｌ  Ｓｑ３を有するプラスミドクローン
【０１３０】
（（ＭＰＨ用））
・ＤＮＡ固定化液：１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）
・５× ＳＳＣ：０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
【０１３１】
（（洗浄用））
・ＰＢＳ−T：  １３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２HPO４・１２Ｈ２Ｏ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２PO４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０；  混合後、オートクレーブして使用。
【０１３２】
（（ハイブリダイゼーション用））
・ハイブリダイゼーション液：  ５×ＳＳＣ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）、５０％  ホルムアミド（Ｍｅｒｃｋ社）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１００μｇ／ml  酵母ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈ社）；  混合後、１００℃で５分加熱変性し、急冷させたものを使用。ＤＩＧ標識プローブは本工程で作成したＤＩＧ標識プローブを１０００倍程度に希釈して用いた。
【０１３３】
（（抗原抗体反応用））
・７５０Ｕ／ｍｌ  アルカリフォスファターゼ（ＡＰ）標識抗ＤＩＧポリクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ社）
【０１３４】
（（発色反応用））
・１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム溶液：ＨＣｌでｐＨ９．８に調整した１０％ジエタノールアミン緩衝液に溶解したもの。使用直前に調製。
【０１３５】
<方法>
【０１３６】
（（プローブの作製））
【０１３７】
１．プレミックスの作製
５０μｌ反応系で行った。
【０１３８】
（ＤＩＧ標識用プレミックス）
・１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液                ５μｌ
・ｄＮＴＰs                        ５μｌ
・１ｍＭ  ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰ            １．７５μｌ
・１０μＭ  センス鎖プライマー            ５μｌ
・１０μＭ  アンチセンス鎖プライマー            ５μｌ
・１．２５Ｕ／μｌ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ    １μｌ
・滅菌水                        ２６．２５μｌ
【０１３９】
（未標識用プレミックス：標識確認用ネガティブコントロール）
・１０×Ｅｘ  Ｔａｑ緩衝液                ５μｌ
・２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                ４μｌ
・１０μＭ  センス鎖プライマー            １μｌ
・１０μＭ  アンチセンス鎖プライマー            １μｌ
・１．２５Ｕ／μｌ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ    １μｌ
・滅菌水                        ３７μｌ
以上の試薬（各１検体分）を検体数よりもやや多めにチューブ内で混合し、プレミックスを作製した。
【０１４０】
２．ＰＣＲ用０．２ｍｌチューブに前記プレミックスをそれぞれ１検体分ずつ分注し、鋳型となる２０ｎｇ／μｌ  Ｓｑ３を有するプラスミドクローンを１μｌずつ加えた。
【０１４１】
３．前記サンプルをそれぞれサーマルサイクラー（ＰＥ９７００：ＡＢＩ社）を用いて、９４℃で４分３０秒プレヒートした後、変性アニーリング伸長反応（変性：９４℃  ３０秒間→アニーリング：５５℃  １分間→伸長  ７２℃  １分間）を３０サイクル行った。
【０１４２】
４．変性アニーリング伸長反応後、サンプルを７２℃で４分間処理し、１０℃で保持した。
【０１４３】
５．ＤＩＧ標識の確認
【０１４４】
ＤＩＧ−１１−ｄＵＴＰがＰＣＲ産物に取り込まれると、未標識ＰＣＲ産物に比べて移動度が遅くなる。そこで、ＤＩＧ標識ＰＣＲ産物を未標識ＰＣＲ産物とともに、それぞれ２．５μｌずつ２％アガロースゲルで電気泳動して両者の移動度を比較した。アガロースゲル電気泳動については、前記「Ｅ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」の方法に準じた。ＤＩＧ標識されていることが確認された後、当該ＤＩＧ標識ＰＣＲ産物をＤＩＧプローブとしてＭＰＨに用いた。
【０１４５】
（（ＭＰＨ））
【０１４６】
１．核酸増幅産物のプレート固定化
（１）「Ｄ．ＰＣＲ」で得られたＰＣＲ産物を９９℃で５分間加熱変性した。
（２）アイスウォーターバス中に移して急冷後、そのまま５分間保持した。
（３）予めＤＮＡ固定化液を１００μｌ入れたマイクロプレート（Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭ  ｐｌａｔｅＩＩ、Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｃａｔ  Ｎｏ．４４２４０４）のウェルに（２）のＰＣＲ産物を２μｌ入れた。
（４）プレートをエアーインキュベーター内にて３７℃で２時間静置した。
（５）プレートを逆さにしてウェル内の溶液を勢い良く捨てた。
【０１４７】
２．洗浄
（１）ＰＢＳ−Ｔを１ウェルあたりに２００〜３００μｌ入れた。
（２）プレートを3 分室温にて静置した。
（３）プレートを逆さにしてウェル内のＰＢＳ−Ｔを勢い良く捨てた。
（４）プレートを逆さにしたままペーパータオル上で数回たたいて、ウェル内のＰＢＳ−Ｔを完全に切った。
（５）上記操作を３〜４回繰り返した。
【０１４８】
３．ハイブリダイゼーション
（１）ハイブリダイゼーション液を１ウェルあたりに１００μｌ入れた。なお、プレハイブリダイゼーションは不要である。
（２）プレートをエアーインキュベーター内にて４２℃で１２時間以上静置した。
（３）プレートを逆さにしてウェル内の溶液を勢い良く捨てた。
（４）前記「２．洗浄」と同様の方法にて洗浄を行った。
【０１４９】
４．抗原抗体反応
（１）ＡＰ標識抗ＤＩＧポリクローナル抗体をＰＢＳ−Ｔで５０００倍希釈したものを１ウェルあたりに１００μｌ加えた。なお、ブロッキングをする必要はない。
（２）プレートをエアーインキュベーター内にて３７℃で１時間静置した。
（３）プレートを逆さにしてウェル内の溶液を勢い良く捨てた。
（４）前記「２．洗浄」と同様の方法にて洗浄を行った。
【０１５０】
５．発色反応
（１）１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸２ナトリウム溶液を１ウェルあたりに１００μｌ加えた。
（２）室温（３０℃以下）にて静置して、基質の加水分解を行った。これによりニトロフェノールが生成する。
（３）マイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯ−ＭＸ１：ＡＢＩ社）で波長４０５nmの吸光値を測定した。
【０１５１】
Ｇ．結果
【０１５２】
（（アガロースゲル電気泳動とＭＰＨ法よるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出））
図８Ａに前記「Ｅ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」を、また図８Ｂに前記「Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」の結果を示す。Ａ、Ｂ共に１〜２４の各レーンは、それぞれ異なる採取地の供試土壌サンプルを示す。ＡのレーンとＢのカラムの対応するサンプルは、Ａ、Ｂ上下で同一の「Ｄ．ＰＣＲ」で得られたＰＣＲ産物を用いている。また、Ｍはマーカー、Ｐはポジティブコントロール、Ｎはネガティブコントロールを示す。図８Ａで矢印の位置に見られるバンドが、ＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物である。つまり、この位置にバンドが出た供試土壌サンプルには、ＰＭＴＶが存在することを意味している。
【０１５３】
図８Ａ、Ｂで示すように、従来技術では困難であった土壌中のＰＭＴＶを実施形態２のＰＭＴＶ土壌汚染診断法によって検出できることが示された。本実施例では、図８Ａのアガロース電気泳動のみであっても、ＰＭＴＶが存在するほとんどの供試土壌サンプルを検出できた。ここで、星印を付した供試土壌サンプルは、アガロース電気泳動による検出では、図８Ａで示すように、予想される位置に僅かにバンドが見られる程度であった。しかし、ＭＰＨ法による検出結果では、図８Ｂで示すように、これらの星印を付した供試土壌サンプルが、ＰＭＴＶを含むことが明瞭に示された。このように、ＭＰＨ法を用いることで検出感度は、さらに向上する。また、アガロース電気泳動でバンドが検出できなかった白丸を付した供試土壌サンプルは、ＭＰＨ法でもＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物は検出できず、ＰＭＴＶに汚染されていないことが再確認された。実際の診断においては、まずアガロースゲル電気泳動による検出を行い、ネガティブであったサンプルについてＭＰＨ法により再確認するなど両検出方法を併用した診断を行うと、診断精度が向上するため便利である。
【実施例２】
【０１５４】
以下の実施例をもって、本発明のＰＭＴＶ土壌汚染診断法においてＭＰＨ法を用いたＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出感度について具体的に説明する。
【０１５５】
本実施例では、ＰＭＴＶによる汚染が明らかな単一圃場の土壌を採取し、前記実施例１と同様のＰＭＴＶ土壌汚染診断法を５回反復して行った。ＰＭＴＶ土壌汚染診断法に用いた試薬、方法は、原則、前記実施例１と同様であることからここではその説明を省略する。なお、本実施例では、前記実施例１のＣ．逆転写反応」において鋳型として使用するＲＮＡ試料を１μｌ、２μｌ、４μｌと３段階に分けて行い、以降、それぞれのサンプルについて検出を行った。検出は、前記実施例１の「Ｅ．アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」と「Ｆ．ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出」の両方を行った。
【０１５６】
図９Ａにアガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出を、また図９ＢにＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出の結果を示す。ＡのレーンとＢのカラムの対応するサンプルは、Ａ、Ｂ上下で同一のＰＣＲ産物を用いている。また、Ｍは１００塩基ラダーマーカー、Ｐはポジティブコントロール、ＮＣはネガティブコントロールを示す。図９Ａで矢印の位置に見られるバンドが、ＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物である。
【０１５７】
図９Ａより、アガロースゲル電気泳動による検出では、ＰＭＴＶの存在が明らかな同一圃場の土壌であるにもかかわらず、反復の回によってはＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物が検出されない場合があった（１回目〜３回目）。これは、採取した回の土壌中に存在するＰＭＴＶ量やおとり植物の生育状態に起因するものと思われる。一方、図９Ｂより、ＭＰＨ法による検出では、吸光値に差はあるものの、全ての回の土壌からＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物が検出できた。このように、ＭＰＨ法は検出感度が極めて高いことから、ＰＭＴＶの診断精度が高く、本発明の検出方法に有用な方法であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
０５０１：ジャガイモ粉状そうか病菌
０５０２：ＰＭＴＶを保毒したジャガイモ粉状そうか病菌
０５０３：供試土壌懸濁液
０５０４：おとり植物
０５０５：おとり植物根部
０５０６：ＲＮＡ
０５０７：核酸増幅産物
０５０８：核酸増幅産物
０５０９：標識プローブ
０５１０：ＤＩＧ
０５１１：ＡＰ標識抗ＤＩＧ抗体
０５１２：基質
０５１３：ＡＰによる基質分解生成物
【図１】ジャガイモ塊茎褐色輪紋病の病徴を説明する図
【図２】実施形態１のオリゴヌクレオチドの構成を説明する図
【図３】複数のＰＭＴＶゲノム増幅用プライマー対を用いてＰＭＴＶゲノム由来の核酸を増幅した際の各プライマー対におけるＰＭＴＶ検出のアガロースゲル電気泳動結果
【図４】ＰＭＴＶ感染ジャガイモ由来のＲＮＡを連続的に希釈したＲＮＡサンプルに対して、ＰＭＴＶ−９Ｐ／ＰＭＴＶ−９Ｍプライマー対を用いて核酸増幅反応を行ったときのアガロースゲル電気泳動結果
【図５】実施形態２の概念図
【図６】実施形態２のＰＭＴＶ土壌汚染診断法を構成する工程と、その流れを説明する図
【図７】おとり植物としての適合性を検証したアガロースゲル電気泳動結果
【図８】実施形態２のＰＭＴＶ土壌汚染診断法の実施例（Ａ）アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出結果（Ｂ）ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出結果
【図９】実施形態２のＭＰＨ法を用いたＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出感度（Ａ）アガロースゲル電気泳動によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出結果（Ｂ）ＭＰＨ法によるＰＭＴＶゲノム由来の核酸増幅産物の検出結果
【図１】
2008118895.tif 000003
【図２】
2008118895.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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