【手続補正書】
【提出日】平成25年6月6日(2013.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明のさらなる応用および態様は、本開示を読むことによって当業者には明らかになるであろう。
[本発明1001]
(a) マウスRAG遺伝子ノックアウト；
(b) マウスIl2rg遺伝子ノックアウト；
(c) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換；および
(d) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含む、遺伝子改変されたマウス。
[本発明1002]
ヒトトロンボポエチン遺伝子がマウストロンボポエチン遺伝子座に存在する、マウストロンボポエチン遺伝子の該ヒトトロンボポエチン遺伝子との置換
をさらに含む、本発明1001のマウス。
[本発明1003]
前記RAG遺伝子ノックアウトが、RAG1遺伝子ノックアウト、RAG2遺伝子ノックアウト、およびこれらの組合せから選択される、本発明1001のマウス。
[本発明1004]
ヒト造血細胞の移植をさらに含む、本発明1001のマウス。
[本発明1005]
前記ヒト造血細胞が、臍帯血細胞および胎児肝細胞からなる群より選択される、本発明1004のマウス。
[本発明1006]
前記ヒト造血細胞が、CD34+細胞であるヒト臍帯血細胞である、本発明1005のマウス。
[本発明1007]
CD34陽性細胞、造血幹細胞、造血細胞、骨髄前駆細胞、骨髄細胞、樹状細胞、単球、顆粒球、好中球、肥満細胞、またはこれらの組合せであるヒト細胞を含む、本発明1003のマウス。
[本発明1008]
ヒト造血幹細胞前駆細胞（hematopoietic stem and progenitor cell）、ヒト骨髄前駆細胞、ヒト骨髄細胞、ヒト樹状細胞、ヒト単球、ヒト顆粒球、ヒト好中球、ヒト肥満細胞、ヒト胸腺細胞、ヒトT細胞、ヒトB細胞、ヒト血小板を含む、本発明1003のマウス。
[本発明1009]
チフス菌(Salmonella typhi)感染を含む、本発明1004のマウス。
[本発明1010]
前記チフス菌感染が、全身的なチフス菌感染である、本発明1009のマウス。
[本発明1011]
結核菌(Mycobacterium tuberculosis)感染を含む、本発明1004のマウス。
[本発明1012]
ヒト免疫細胞を含む肺肉芽腫を含む、本発明1011のマウス。
[本発明1013]
(a) 遺伝子改変され、移植され、かつヒト病原体に感染したマウスに剤を投与する段階であって、
該マウスが、
(i) RAG1遺伝子ノックアウトもしくはRAG2遺伝子ノックアウト、またはこれらの組合せ、
(ii) Il2rg遺伝子ノックアウト、
(iii) ヒトIL-3遺伝子がマウスIL-3遺伝子座に存在する、マウスIL-3遺伝子の該ヒトIL-3遺伝子との置換、および
(iv) ヒトGM-CSF遺伝子がマウスGM-CSF遺伝子座に存在する、マウスGM-CSF遺伝子の該ヒトGM-CSF遺伝子との置換
を含み、
該マウスが、CD34陽性ヒト臍帯血細胞またはCD34陽性ヒト胎児肝細胞を用いて移植される、段階；ならびに
(b) 該剤がヒト病原体に感染した該マウスにおいて該ヒト病原体の量を低減するかどうかを判定する段階
を含む、ヒト病原体感染を抑制する剤を同定するための方法。
[本発明1014]
前記マウスが、マウストロンボポエチン遺伝子のヒトトロンボポエチン遺伝子との置換をさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記ヒト病原体がチフス菌である、本発明1013の方法。
[本発明1016]
前記ヒト病原体がマイコバクテリアであり、かつ該マイコバクテリアが、ヒト免疫細胞を含む肉芽腫を前記マウスにおいて引き起こす、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記マイコバクテリアが結核菌である、本発明1016の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
実施例3
hIL-3/GM-CSFを移植されたマウス：感染
チフス菌ISP2825 (Galan J.E.およびCurtiss, R. (1991) Distribution of the invA, -B, -C, and -D genes of S. thyphimurium among other S. serovars: invA mutants of S. typhi are deficient for entry into mammalian cells, Infect. Immun. 59(9):2901-2908；参照により本明細書に組み入れる)は、腸チフス患者からの臨床分離株であるが、このチフス菌をLBブロスで一晩増殖させた。翌日、40μLの細菌細胞培養物を、0.3M NaClを含む新鮮なLBブロス2mLに移し、かつその培養物が約0.9のOD600に達するまで37℃で約3時間増殖させた。その細菌培養物をスピンダウンし、緩衝生理食塩水に再懸濁させて、感染のために使用した。9〜12週齢のヒト化マウスと対照マウスに1×103または1×104または1×105個のチフス菌を0日目に腹腔内接種した。感染したマウスを念入りに監視し、かつ感染後4週で屠殺した。脾臓、肝臓および胆のうを無菌的に摘出し、0.05％デオキシコール酸ナトリウムを含む無菌PBS 3〜5mL中で機械的にホモジナイズした。組織ホモジネートを連続希釈し、LB寒天プレートにまき、コロニー数の計測のために37℃で一晩インキュベートした。コロニー数を計測し、かつ回収された全コロニー形成単位の数を算出した。マウスのデータは図1〜4に提供される。図1において、「対照」マウスは、移植されていない遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO/hIL-3, hGM-CSF)である。図2〜4において、「対照」マウスは移植されていないRAG KO/Il2rg KOマウスである(すなわち、それらはIL-3とGM-CSFのヒト化を欠くが、代わりに内在性マウスIL-3と内在性マウスGM-CSFをもつ)。「対照」マウスには、ヒトCD34+細胞の代わりにPBSを注射した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
図1に示す通り、脾臓におけるチフス菌感染は感染後10日で2匹の遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO/hIL-3, hGM-CSF)に検出される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
図2に示す通り、1×103個のチフス菌の感染後1週で、3.8および3％の生着率を有する遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO)は、対照マウスより約1000倍高い、脾臓での感染を示した(p＜0.01)。対照マウスとヒト化マウス間の差のp値はp＜0.01であった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
図3に示す通り、胎児肝由来のCD34陽性細胞を用いて移植され、かつ1×104個のチフス菌を感染させた、遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO)は、感染後4週で、脾臓(平均して約1,000〜約10,000倍)と肝臓(平均して約1,000倍)の両方にチフス菌感染を示した。脾臓のチフス菌について試験したコホート中の各マウスは、(図3の左パネルの「ヒト化」コホートにおいて上から下に)23.5、40.1、16.5、50、26、および51.7のヒト細胞の生着率を有していた。肝臓のチフス菌について試験したコホート中の各マウスは、(図3の右パネルの「ヒト化」コホートにおいて上から下に)16.5、40.1、23.5、26、50、および51.7のヒト細胞の生着率を有していた。脾臓では対照マウスとヒト化マウス間の差のp値はp＜0.01であった；肝臓ではp＜0.03。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
図4に示す通り、胎児肝由来のCD34陽性細胞を用いて移植され、かつ1×104個のチフス菌を感染させた、遺伝子改変されたマウス(RAG KO, Il2rg KO)は、感染後4週で、胆のうにおけるチフス菌感染を示し、チフス菌cfuは平均して対照マウスより100万倍高かった。胆のうのチフス菌について試験したコホート中の各マウスは、(図3の「ヒト化」コホートにおいて上から下に)23.5、16.5、40.1、50、26、および51.7のヒト細胞の生着率を有していた。対照マウスとヒト化マウス間の差のp値はp＜0.03であった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８Ｅ】
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