(57)【要約】【課題】メチル化ＤＮＡ：Ｘの含量の測定方法の提供。【解決手段】Ｘの含量の測定方法で、組合せ工程(i)／(ii)で得られた未消化物Ｃを一本鎖状態に一旦分離し、且つ、生成した一本鎖状態ＤＮＡ：ＣとＢとを結合させてＣを選択し、且つ、選択されたＣを鋳型としＢをプライマー：ＰＲとしてＣを１回伸長させて二本鎖を形成させ、形成した二本鎖：Ｄを一本鎖状態ＤＮＡ（正鎖）：Ｅ及び一本鎖状態ＤＮＡ（負鎖）：Ｆに一旦分離する。生成した一本鎖状態ＤＮＡ（正鎖）：ＥとＢとを結合させてＥを選択し、選択されたＥを鋳型としＢをＰＲとしてＥを１回伸長させて二本鎖を形成させる。生成した一本鎖状態ＤＮＡ（負鎖）：Ｆを鋳型とし特定ＰＲ：ＧをＰＲとしてＦを１回伸長させて二本鎖を形成させる。さらにこれら操作を伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離後、繰返してＸを増幅・定量する等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１及び２）下記のいずれかの組み合わせ工程、並びに、
（ｉ）組み合わせ工程（ｉ）：第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）とを有する第一工程及び第二工程
（ｉｉ）組み合わせ工程（ｉｉ）：第一工程及び第二（Ａ）工程と第二（Ｂ）工程とを有する第二工程
＜組み合わせ工程＞
（ｉ）組み合わせ工程（ｉ）：
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを生成させる第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で保護・生成された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の保護・生成された一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ｂ）工程と
を有する第一工程、及び、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二工程
からなる組み合わせ工程（ｉ）
（ｉｉ）組み合わせ工程（ｉｉ）：
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、及び、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを生成させる第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で保護・生成された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二（Ｂ）工程と
を有する第二工程
からなる組み合わせ工程（ｉｉ）、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドとの両者から一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択し、選択された一本鎖状態であるＤＮＡと前記の一本鎖オリゴヌクレオチドとが結合してなるＤＮＡを結合形成させる工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で結合形成されたＤＮＡを、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する本工程−Ａと、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する
伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする本工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
第一工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの請求項記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかの請求項記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかの請求項記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかの請求項記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法。
（４）請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法の第一工程を行った後、請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程又は組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程を行うことなく、請求項１〜７のいずれかの請求項記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）請求項１〜７のいずれかの請求項記載の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程
【請求項９】
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１０】
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１１】
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１３】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１４】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ担体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
【非特許文献２】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、さらに、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１及び２）下記のいずれかの組み合わせ工程、並びに、
（ｉ）組み合わせ工程（ｉ）：第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）とを有する第一工程及び第二工程
（ｉｉ）組み合わせ工程（ｉｉ）：第一工程及び第二（Ａ）工程と第二（Ｂ）工程とを有する第二工程
＜組み合わせ工程＞
（ｉ）組み合わせ工程（ｉ）：
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを生成させる第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で保護・生成された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の保護・生成された一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ｂ）工程と
を有する第一工程、及び、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二工程
からなる組み合わせ工程（ｉ）
（ｉｉ）組み合わせ工程（ｉｉ）：
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する第一工程、及び、
（２）第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡと、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合することにより、当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを生成させる第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で保護・生成された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する第二（Ｂ）工程と
を有する第二工程
からなる組み合わせ工程（ｉｉ）、
（３）下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドとの両者から一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択し、選択された一本鎖状態であるＤＮＡと前記の一本鎖オリゴヌクレオチドとが結合してなるＤＮＡを結合形成させる工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で結合形成されたＤＮＡを、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する本工程−Ａと、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する
伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする本工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
２．第一工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際に、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを特徴とする前項１記載の方法；
３．二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする前項２記載の方法；
４．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程ーＣ；
５．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ；
６．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ；
７．前項１〜３のいずれかの前項記載の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
請求項１記載の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程−Ｃ；
８．前項１〜７のいずれかの前項記載の方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）。
（４）前項１〜７のいずれかの前項記載の方法の第一工程を行った後、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程又は組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程を行うことなく、前項１〜７のいずれかの前項記載の方法における第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）前項１〜７のいずれかの前項記載の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程；
９．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１０．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１１．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜８のいずれかの前項記載の方法；
１２．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１３．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１２のいずれかの前項記載の方法；
１４．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１３のいずれかの前項記載の方法。
１５．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であることを特徴とする前項１〜１４のいずれかの前項記載の方法；
１６．少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII、又はHhaIであることを特徴とする前項１〜１５のいずれかの前項記載の方法；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡをあげることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料もあげられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
【０００８】
本発明における「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
【０００９】
本発明における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００１０】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列があげられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）があげられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２６】
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明測定方法の第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
【００２７】
本発明（特に、本発明メチル化割合測定方法）における「メチル化割合」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量とメチル化されていないＤＮＡの増幅後の量との合計量を、メチル化されたＤＮＡの増幅後の量で除した数値を意味するものである。
【００２８】
本発明における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性制限酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧ対を含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic  Acid  Research,  9、  2509-2515）。また、一本鎖ＤＮＡ中のメチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素、即ち、メチル化感受性制限酵素の中には一本鎖ＤＮＡを消化するものも存在しており、例えば、HhaI等を挙げることができる。
【００２９】
本発明における「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡの中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての個所でも良い）と相補的に結合することで二本鎖を形成し（即ち、前記箇所を二本鎖状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い。）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、且つ、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとの二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。また、当該マスキング用オリゴヌクレオチドは、後述のリバース用プライマー（正鎖）を伸長プライマーとして、当該マスキング用オリゴヌクレオチド（負鎖）を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。尚、塩基長としては、８〜２００塩基長が望ましい。
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、メチル化している場合には消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）に応じて設計し、これを使用することが特に有用である。
【００３０】
本発明における「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ」とは、前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されていないシトシンである一本鎖ＤＮＡを意味するものである。また「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない伸長形成された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧにおけるシトシンがメチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味するものである。
【００３１】
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ｂ）工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、（マスキング用オリゴヌクレオチドによりメチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる）目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させることにより選択する。
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ｂ）工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第一工程における「一本鎖固定化オリゴヌクレオチド」は、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（以下、本固定化オリゴヌクレオチドと記すこともある。）である。
本固定化オリゴヌクレオチドは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択するために用いられる。本固定化オリゴヌクレオチドは、５〜５０塩基長であることが望ましい。
本固定化オリゴヌクレオチドの５’末端側は、担体と固定化され得るものであり、一方その３’末端側は、後述する第二前工程及び第Ａ２工程により５’末端から３’末端に向かって進行する一回伸長反応が可能なようにフリーな状態であればよい。ここで「担体と固定化され得るもの」とは、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化オリゴヌクレオチドが担体に固定化されていればよく、（１）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合前の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであってもよい。
このような構造を得るには、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、本オリゴヌクレオチドと記すこともある。）の５’末端を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従い、担体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には例えば、本オリゴヌクレオチドの５’末端をビオチン化した後、得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、本オリゴヌクレオチドの５’末端側に、アミノ基、アルデヒド基、チオール基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これを表面がシランカップリング剤等で活性化させたガラス、シリカ若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に、例えば、トリグリセリドを５個直列に連結したもの等のスペーサー、クロスリンカー等を介して共有結合させる方法も挙げられる。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの５’末端側から化学合成させる方法も挙げられる。
【００３２】
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ａ）工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ａ）工程において、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とメチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドとを混合する。
マスキング用オリゴヌクレオチドを混合することにより、前述の通り、一本鎖ＤＮＡの中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての箇所でも良い）を保護する（その部分のみ二本鎖状態にする）ことができ、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い。）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにする。即ち、本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理の前に、マスキング用オリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの目的とするＤＮＡ領域に含まれるメチル化感受性制限酵素の認識部位に結合させて、二本鎖ＤＮＡを基質とするメチル化感受性制限酵素でも、アンメチル状態のＣｐＧを有するメチル化感受性制限酵素の認識配列を消化できるようにする。マスキング用オリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡを一本鎖に分離する前と後とのいずれで混合してもよく、また、組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ａ）工程でマスキング用オリゴヌクレオチドを混合してもよく、更に、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ａ）工程でマスキング用オリゴヌクレオチドを混合してもよい。即ち、メチル化感受性制限酵素で処理する前に、当該メチル化感受性制限酵素が認識しうる塩基配列に結合して二本鎖状態を形成していれば良い。
【００３３】
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程、において、組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ｂ）工程、又は、組み合わせ工程（ｉｉ）の第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡを少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）を除去する。
【００３４】
当該メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
因みに、組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ｂ）工程、又は、組み合わせ工程（ｉｉ）の第一工程で選択された一本鎖ＤＮＡにおいては、マスキング用オリゴヌクレオチドが添加されているので、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと結合している部分と、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した目的とするＤＮＡ領域は、二本鎖状態になっている。負鎖としての本固定化オリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域とは結合しないが、メチル化感受性制限酵素の認識部位はマスキング用オリゴヌクレオチドが結合して二本鎖状態である。負鎖としてのマスキング用オリゴヌクレオチドに含まれるシトシンはメチル化されていない状態であり、正鎖側の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡに含まれるシトシンは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡに含まれるシトシンがメチル化されていたか、それともメチル化されていなかったかにより、ゲノムＤＮＡ由来の一本鎖ＤＮＡの状態がアンメチル状態であるか否かが決まる。即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態（アンメチル状態ではない状態。負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されている状態）であり、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていなければ、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態（負鎖：メチル化されていない状態、正鎖：メチル化されていない状態）である。従って、前記のメチル化感受性制限酵素がヘミメチル状態である二本鎖ＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はアンメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、マスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分はヘミメチル状態であり、当該メチル化感受性制限酵素により切断されない。
従って、目的とするＤＮＡ領域に含まれるメチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列とマスキング用オリゴヌクレオチドとを結合させてから消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施することにより、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおけるマスキング用オリゴヌクレオチドが結合した二本鎖ＤＮＡ部分の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
具体的には例えば、メチル化感受性制限酵素としてHpaII又はHhaIを使用し、且つ、マスキング用オリゴヌクレオチドを使用することにより、一本鎖ＤＮＡのメチル化有無を判別することができる。即ち、上記の操作で得られた一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが結合した一本鎖ＤＮＡのHpaII又はHhaIの認識部位に含まれるＣｐＧのシトシンがメチル化されていたならば、HpaII又はHhaIは当該ＤＮＡを消化することができない。一方、メチル化されていなければ、HpaII又はHhaIは当該ＤＮＡを消化することができる。従って、上記反応を実施した後、目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施すると、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡがアンメチル化状態であれば増幅産物は得られず、一方、当該ＤＮＡがメチル化状態であれば増幅産物が得られることになる。
【００３５】
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程までは、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施する。
（ａ）まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー及びメチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドを混合する。
（ｂ）次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱する。その後、当該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを形成させるために（マスキング用オリゴヌクレオチドとの一部二本鎖を形成させるために）、例えば、マスキング用オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
（ｃ）上記で得られた試料に、ビオチン化オリゴヌクレオチド（当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの）を添加することにより、混合物を得る。
（ｄ）次いで、得られた混合物を、９５℃で数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させるために、例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
（ｅ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ｄ）で得られた混合物を添加し、さらに、これを３７℃で数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｅ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。
また、上述の（ａ）を実施後（ｂ）を実施せずに（ｃ）以降の操作を実施してもよいし、さらに、上述の（ｃ）までの操作を実施後（ｄ）を実施せず（ｅ）の操作を実施してもよい。
（ｆ）ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、その後当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、その後当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
当該操作は、固定化されていないＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているＤＮＡが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中ＤＮＡとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するＤＮＡ（例えば、ヒトの生物由来検体の場合は、ラットＤＮＡ等）を大量に生物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。
（ｇ）上記（ｆ）で得られた試料に、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素を添加し、３７℃で１時間〜１晩インキュベーションすることにより消化処理を行う。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。上記（ｅ）で得られた試料に、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜1晩インキュベーションすればよい。これにより、目的とするＤＮＡ領域に含まれるマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。
（ｈ）このように１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
【００３６】
また、本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉｉ）の第二工程までは、具体的には例えば、本固定化オリゴヌクレオチドがビオチン化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施する。
（ａ）まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー及びビオチン化オリゴヌクレオチド（当該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本固定化オリゴヌクレオチドと担体との結合により固定化されるものであるために、現段階では遊離状態にあるもの）を添加することにより、混合物を得る。
（ｂ）次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に存在する目的とするＤＮＡ領域を含む二本鎖ＤＮＡを一本鎖にするために、９５℃で数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とビオチン化オリゴヌクレオチドとを結合させるために、例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
（ｃ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ｄ）で得られた混合物を添加し、さらに、これを３７℃で数分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、ビオチン化オリゴヌクレオチドとの結合を、ビオチン化オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体との固定よりも前段階で実施しているが、この順番は、どちらが先でも構わない。
（ｄ）ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した後、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、その後当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、その後当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
当該操作は、固定化されていないＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ、を反応溶液から取り除くため、重要である。これら操作が不十分であれば、反応溶液中に浮遊しているＤＮＡが鋳型となり、増幅反応で予期せぬ増幅産物が得られることとなる。支持体と生物由来検体中ＤＮＡとの非特異的結合を避けるためには、目的領域とはまったく異なる塩基配列を有するＤＮＡ（例えば、ヒトの生物由来検体の場合は、ラットＤＮＡ等）を大量に生物由来検体に添加し、上記の操作を実施すればよい。
（ｅ）上記（ｄ）で得られた試料に、マスキング用オリゴヌクレオチドと少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素を添加し、３７℃で１時間〜１晩インキュベーションすることにより消化処理を行う。本操作では、第二（Ａ）工程と第二（Ｂ）工程を同時に実施することができる。具体的には例えば、以下のように実施すればよい。上記（ｄ）で得られた試料に、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを夫々約10pmol加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜1晩インキュベーションすればよい。これにより、目的とするＤＮＡ領域に含まれるマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。
（ｆ）このように１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理した後、生成した遊離の消化物（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、消化物（前記制限酵素の認識部位に少なくとも１つ以上のアンメチル状態のＣｐＧを含む一本鎖ＤＮＡ）の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）する。
【００３７】
本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）及び（ｉｉ）の第二工程までの目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、当該一本鎖ＤＮＡの３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有する一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させる際、及び、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）とマスキング用オリゴヌクレオチドとを結合させる際における好ましい態様としては、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ２、ＭｇＣｌ２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭの濃度で含まれることがよい。
【００３８】
尚、本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。
従って、本発明測定方法の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程、及び、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程において複数のメチル化感受性制限酵素による処理を実施する場合には、具体的には例えば、以下のように行えばよい。組み合わせ工程（ｉ）の第一（Ｂ）工程、又は、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ａ）工程において選択された一本鎖ＤＮＡに、最適な緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素HpaII及び/又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜1晩インキュベーションする。目的とするＤＮＡ領域に含まれるマスキング用オリゴヌクレオチドで保護された当該メチル化感受性制限酵素の認識部位（箇所）がメチル化されていなかった場合、当該箇所は消化されることになる。その後、前記と同様な操作に準じて、ピペッティング又はデカンテーションにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。より具体的には例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブを使用する場合には、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。またストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズを使用する場合には、磁石によりビーズを固定した後、まず溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加した後、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。
【００３９】
尚、本発明測定方法又は後述のメチル化割合測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を本固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
また、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には、前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムＤＮＡは二本鎖ＤＮＡとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HhaI）だけでなく、二本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等等）を用いることができる。
【００４０】
本発明測定方法の第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドとの両者から一旦分離する工程（第一前工程）と、
生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖オリゴヌクレオチドとを結合させることにより、前記の生成した一本鎖状態であるＤＮＡを選択し、選択された一本鎖状態であるＤＮＡと前記の一本鎖オリゴヌクレオチドとが結合してなるＤＮＡを結合形成させる工程（第二（Ａ）前工程）と、
当該工程（第二（Ａ）前工程）で結合形成されたＤＮＡを、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の選択された一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする工程（第二（Ｂ）前工程）と
を有する工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ａ１工程と、第Ａ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ２工程とを有する本工程−Ａと、
（ｂ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする本工程−Ｂとを有し、
さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４１】
本発明測定方法の第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第一前工程として、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）を前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと前記のマスキング用オリゴヌクレオチドから一旦分離して一本鎖状態ＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で得られた未消化物である一本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧを含まない一本鎖ＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱する。その後、第二（Ａ）前工程では、具体的に例えば、組み合わせ工程（ｉｉ）の第一工程に準じて実施すれば良く、メチル化状態の一本鎖ＤＮＡと一本鎖オリゴヌクレオチドが結合してなるＤＮＡを結合形成させる。第二（Ｂ）工程は、具体的には例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化オリゴヌクレオチドの場合には、以下のように実施する。
結合形成されたＤＮＡに、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM  dNTPを3μL、5N  ベタインを6μL加え、次いで当該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとし、37℃で2時間インキュベーションする。その後、インキュベーションされた溶液をピペッティング又はデカンテーションにより取り除いた後、これに生物由来検体の容量と略等量の洗浄バッファーを添加し、当該洗浄バッファーをピペッティング又はデカンテーションにより取り除けばよい。次いで、このような操作を数回実施することにより、残溶液の除去及び洗浄（ＤＮＡ精製）を行う。
第二前工程において得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する。具体的には例えば、第二前工程において得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡ（前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位にアンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ）に、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱する。
その後、本工程として、
(ａ)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）にアニーリングさせるために、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチド（負鎖）のＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ｂ)その後、室温に戻す。（本工程ーＡにおける第Ａ１工程）
(ｃ)上記(ａ)で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドをプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、本工程ーＡにおける第Ａ２工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(ｄ)生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３'末端よりさらに３'末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、当該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする（即ち、本工程ーＢ）。具体的には例えば、上記(ｃ)と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第二（Ｂ）前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(ｅ)さらにかかる各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第Ａ工程及び第Ｂ工程）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。具体的には例えば、上記と同様に、後述の説明や前述の本発明測定方法の第三工程における第二（Ｂ）前工程、本工程ーＡ及び本工程＝Ｂでの操作方法等に準じて実施すればよい。
【００４２】
第三工程は、具体的には、第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第一前工程から第三前工程まで、各々、独立した反応としてを実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
【００４３】
上述の通り、メチル化感受性制限酵素による消化処理の後（第二工程終了後）に目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法（第三工程を一度に実施する方法）としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして本固定化オリゴヌクレオチドを用いることができるので、もう一方のプライマーのみ添加してＰＣＲを行うことにより、増幅産物が得られ、その増幅産物も固定化されることとなる。この際、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明測定方法の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq  Gold  (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液をあげることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間さらに72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件があげられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、固定化された蛍光標識体の量を測定することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した当該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。当該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
【００４４】
さらに、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列のビオチン化オリゴヌクレオチドを片側のプライマー、又は、一本鎖固定化オリゴヌクレオチドより、３’端側に新しいビオチン化オリゴヌクレオチドを設計しそれを片側のプライマーとし、その相補側プライマーを用いて、目的領域を増幅することもできる。この場合、得られた増幅産物は、ストレプトアビジンで被覆した支持体があれば固定化されるので、例えば、ストレプトアビジンコートＰＣＲチューブでＰＣＲを実施した場合には、チューブ内に固定されるため、上記の通り、標識されたプライマーを用いれば、増幅産物の検出が容易である。また、先の一本鎖固定化オリゴヌクレオチドが共有結合等による固定化の場合であれば、ＰＣＲで得られた増幅産物を含む溶液をストレプトアビジン被覆支持体が存在する容器に移し、増幅産物を固定化することが可能である。検出については、上述の通り実施すればよい。目的領域を増幅する相補側のプライマーは、メチル化感受性制限酵素の認識部位を１つ以上有する目的領域を増幅でき、かつ、その認識部位を含まないプライマーでなければいけない。この理由は、以下の通りである。選択及び１回伸長反応で得られた二本鎖ＤＮＡの本固定化オリゴヌクレオチド側のＤＮＡ鎖（新生鎖）の一番３’端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位のみがメチル化されていない場合には、その部分だけがメチル化感受性制限酵素で消化されることになる。消化後、前述のように洗浄操作を行っても、新生鎖で言う３’端の一部だけを失った二本鎖ＤＮＡが固定化されたままの状態で存在する。相補側のプライマーが、この一番３’端側のメチル化感受性制限酵素の認識部位を含んでいた場合には、当該プライマーの３’端側の数塩基が、新生鎖の３’端の数塩基とアニーリングし、その結果、目的領域がＰＣＲにより増幅する可能性があるからである。
【００４５】
本発明は、本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階又は後操作段階、あるいは第三工程の第三前工程の前操作段階又は後操作段階において、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有するような変法を含む。
即ち、
【００４６】
（変法１）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の、第二前工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程ーＣ
【００４７】
（変法２）
本発明測定方法の第三工程の第一前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の、第二前工程と各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法（以下、本発明メチル化割合測定方法と記すこともある。）
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程ーＣ
【００４８】
（変法３）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の前操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程ーＣ
【００４９】
（変法４）
本発明測定方法の第三工程の第三前工程の後操作段階において、
前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を反応系内に添加する工程（追加前工程）を追加的に有し、且つ、
本発明測定方法の第三工程の各本工程として、下記の１つの工程をさらに追加的に有することを特徴とする方法。
（ｃ）（ｉ）生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）と、上記の追加前工程で反応系内に添加された一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）とを結合させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを選択する第Ｃ１工程と、
（ｉｉ）第Ｃ１工程で選択された一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記の一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）をプライマーとして、当該プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする第Ｃ２工程と
を有する本工程ーＣ
【００５０】
当該変法では、外部から「前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）の３'末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列を有し且つ遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）」を反応系内に添加すること等により、第三工程における前述の目的とするＤＮＡ領域の増幅効率を容易に向上させることが可能となる。尚、追加前工程で反応系内に添加される一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）は、一本鎖ＤＮＡの３’末端の一部（但し、前記の目的とするＤＮＡ領域を含まない。）に対して相補性である塩基配列であって、５’末端が、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じである塩基配列を有する遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドであれば、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列であっても、又は、短い塩基配列であっても、或いは、長い配列であってもよい。但し、前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドよりも長い配列の場合には、前記リバース用プライマー（正鎖）を伸長プライマーとし、当該一本鎖オリゴヌクレオチド（負鎖）を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できない遊離状態である一本鎖オリゴヌクレオチドであることが重要である。
【００５１】
目的領域を増幅する際に、片側のプライマーとして本固定化オリゴヌクレオチドを用いて、もう一方のプライマーのみ添加してＰＣＲを行う例を前記したが、目的産物の検出のために他の方法（例えば、ＰＣＲで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法）を実施するのであれば、上記の如く、目的領域を増幅する際に、本固定化オリゴヌクレオチドを一方（片側）のプライマーとして使用せず、一対のプライマーを添加してＰＣＲを実施してもよい。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の量を求める。
【００５２】
本発明測定方法の第三工程は繰り返し工程を有するが、例えば、第Ａ１工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味することになる。
また、第Ｂ工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（負鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味する。但し、第三工程がさらに追加的にＣ工程を有する場合には、第１回目の第三工程の操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味し、一方、第２回目以降の第三工程の繰り返し操作において「生成した『固定の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」と「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」との両者を意味することになる。
【００５３】
また、第三工程の各本工程で得られた「伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」とは、第Ａ工程の場合には、第１回目の第三工程の操作において「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」を意味し、一方、第２回目以降の第三工程の繰り返し操作において「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含まない伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」と「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位に、アンメチル状態のＣｐＧ対を含む伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」との両者を意味することになる。第Ｂ工程の場合には、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「前記のマスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素の認識部位では全てがアンメチル状態のＣｐＧ対である伸長形成された二本鎖ＤＮＡ」を意味することになる。
尚、第三工程がさらに追加的に本工程ーＣを有する場合にも同様である。
【００５４】
また、第三工程がさらに追加的に本工程ーＣを有する場合において、第Ｃ１工程における「生成した一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」とは、第１回目の第三工程の操作及び第２回目以降の第三工程の繰り返し操作の両操作において「生成した『遊離の』一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）」を意味することになる。
【００５５】
また本発明は、本発明測定方法の工程として、下記の２つの工程をさらに追加的に有することを特徴とするメチル化割合の測定方法（即ち、本発明メチル化割合測定方法）を含む。
（４）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第一工程を行った後、本発明測定方法（前記の変法を含む）の組み合わせ工程（ｉ）の第二工程、又は、組み合わせ工程（ｉｉ）の第二（Ｂ）工程を行うことなく、本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程を行うことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域のＤＮＡ（メチル化されたＤＮＡ及びメチルされていないＤＮＡの総量）を検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第四工程、及び、
（５）本発明測定方法（前記の変法を含む）の第三工程により定量されたＤＮＡの量と、第四工程により定量されたＤＮＡの量とを比較することにより得られる差異に基づき前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの割合を算出する第五工程
【００５６】
当該メチル化割合測定方法は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が低く且つ疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいてメチル化割合が高いＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
【００５７】
このような本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定、メチル化割合の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が担体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
実施例１
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、及び、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを合成して、夫々につき０．００１ｐｍｏｌ/１０μＬ  ＴＥバッファー溶液を調製した。
【００６０】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド＞  
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                （配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                （配列番号１８）
【００６１】
また、配列番号１９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢｉｏ−ＧＰＲ７−２１７６Ｒを合成し、０．１μＭ ＴＥバッファー溶液を調製した。
【００６２】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Bio-GPR7-2176R：5'- GCACGACGAGTGTGACGATC -3'  （配列番号１９）
【００６３】
得られたメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドの夫々の溶液各１０μＬに、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを１μＬ、アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）２μＬを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。次いで得られた混合物を、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻した（メチル化オリゴヌクレオチド及びアンメチル化オリゴヌクレオチドにつき、各々３本作製）。
【００６４】
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加し、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００６５】
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の３種の処理を施した。
【００６６】
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００６７】
Ｂ群（ＨｐａＩＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００６８】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００６９】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5'- GCCACCCGGCGCGA -3'             （配列番号２０）
【００７０】
各々の反応液を３７℃で１６時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加し、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００７１】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ２及びＰＲ２）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチル化シトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００７２】
＜プライマー＞
PF2：5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'          （配列番号２１）
PR2：5'-GCACGACGAGTGTGACGATC-3'          （配列番号２２）
【００７３】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                  （配列番号２３）
【００７４】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを３μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を３μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μLを０．１５μLと、５Ｎベタイン水溶液を６μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を３０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【００７５】
その結果を図１に示した。Ａ処理群（無処理群）の場合とＢ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）（Ｍ）と、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ（Ｕ）ともに、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩによる消化処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）（Ｍ）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ（Ｕ）では、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００７６】
以上より、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加しメチル化感受性制限酵素を用いることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
【００７７】
実施例２
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、及び、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを合成して、夫々につき０．００１ｐｍｏｌ/１０μＬ  ラット血清溶液を調製した。
【００７８】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチド＞  
Nはメチル化シトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                （配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                （配列番号１８）
【００７９】
また、配列番号１９で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢｉｏ−ＧＰＲ７−２１７６Ｒを合成し、０．１μM ＴＥバッファー溶液を調製した。
【００８０】
＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Bio-GPR7-2176R：5'- GCACGACGAGTGTGACGATC -3'  （配列番号１９）
【００８１】
得られたメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドの夫々の溶液各１０μＬに、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを１μＬ、アニーリングバッファー（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）２μＬを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。次いで得られた混合物を、９５℃で５分間加熱した。その後、ビオチン化オリゴヌクレオチドとメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させるために、５０℃まで速やかに冷却し、その温度で５分間保温した。次いで、これを３７℃で５分間保温した後、室温に戻した。（メチル化オリゴヌクレオチド及びアンメチル化オリゴヌクレオチドにつき、各々３本作製）。
【００８２】
次に、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブに、上記のようにして、前調製された混合物を添加し、さらに、これを３７℃で５分間保温することにより、ビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体に固定した。
次いで、前記のＰＣＲチューブから溶液を除去した後、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加し、当該洗浄バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００８３】
このようにして選択され得られた一本鎖ＤＮＡについて、以下の３種の処理を施した。
【００８４】
Ａ群（無処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００８５】
Ｂ群（ＨｐａＩＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００８６】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩによる消化処理群）：上記で調製された一本鎖ＤＮＡに、ＨｐａＩＩを１５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を３μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を３μＬと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとした。
【００８７】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5'- GCCACCCGGCGCGA -3'             （配列番号２０）
【００８８】
各々の反応液を３７℃で１６時間インキュベーション（消化処理）した後、上清を取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO・7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加し、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。
【００８９】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ２及びＰＲ２）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチル化シトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００９０】
＜プライマー＞
PF2：5'-GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3'            （配列番号２１）
PR2：5'-GCACGACGAGTGTGACGATC-3'            （配列番号２２）
【００９１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5'- GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3'                  （配列番号２３）
【００９２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを３μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を３μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μLを０．１５μLと、５Ｎベタイン水溶液を６μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を３０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった。
【００９３】
その結果を図２に示した。Ａ処理群（無処理群）の場合とＢ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）（Ｍ）と、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ（Ｕ）ともに、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩによる消化処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）（Ｍ）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ（Ｕ）では、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００９４】
以上より、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料としての血清溶液を用いても、前記の実施例１と同様に、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、且つ、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加しメチル化感受性制限酵素を用いることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
【００９５】
実施例３
ＡＴＣＣより購入された哺乳動物由来の乳癌細胞株ＭＣＦ−７(ATCC NO.HTB-22)を、ＡＴＣＣのカタログに記載された当該細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養することにより、約１×１０７個の細胞を得た。得られた細胞に、ＳＥＤＴＡバッファー［10mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA pH 8.0、100mM NaCl］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、proteinase K（Sigma）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％(w/v)になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［1M Tris-HCl、pH 8.0 にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）に溶解し、これに４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下のプライマー及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられる配列番号２４で示される塩基配列（Genbank Accession No.M80343等に示されるLINE1配列の塩基番号257〜352に相当する領域）を含むＤＮＡフラグメント（ＤＮＡフラグメントＸ１、配列番号２５で示される塩基配列を有する。Genbank Accession No.M80343等に示されるＬＩＮＥ１配列の塩基番号8〜480に相当する領域）を増幅した。
【００９６】
PF1：5'-GAGCCAAGATGGCCGAATAGG-3'（配列番号２６）
PR1：5'-CTGCTTTGTTTACCTAAGCAAGC-3'（配列番号２７）
【００９７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを２ｎｇと、１００ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列番号２６及び配列番号２７で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各０．１２５μｌと、each ２ｍＭ  ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ  ５Ｕ／μｌを０．１２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６３℃にて６０秒間さらに７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＸ１を精製した。
得られたＤＮＡフラグメントＸ１の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（NEB社）により処理し、５−ＣＧ−３’全てをメチル化したＤＮＡフラグメント（以下、ＤＮＡフラグメントＹ１と記す）を得た。これについても、先と同様に、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、目的のＤＮＡフラグメント（473bp）を切り出し、QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社）により、ＤＮＡフラグメントＹ１を精製した。
ＤＮＡフラグメントＸ１及びＤＮＡフラグメントＹ１を用いて、以下のメチル化フラグメントと非メチル化フラグメントとの混合物を調製した。
【００９８】
【表１】
2008182985.tif 000002
【００９９】
I〜Ｖ各々のＤＮＡフラグメントを用いて、以下の４種の溶液を調製した。
【０１００】
Ａ群（無処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
【０１０１】
Ｂ群（HpaII処理群）:ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩを０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
【０１０２】
Ｃ群（HhaI処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｈａＩを０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
【０１０３】
Ｄ群（HpaII及びHhaI処理群）：ＤＮＡフラグメント約２５ｎｇに、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩをそれぞれ０．５Ｕと、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩに最適な１０×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を２μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬとを加えて、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした。
【０１０４】
各々の反応液を３７℃で２時間インキュベーションした後、これに滅菌超純水を加えて１００倍希釈した。
各希釈溶液５μＬ（DNAフラグメント62.5pg相当量）を鋳型とし、配列番号１７で示される塩基配列からなる領域のＤＮＡ量を求めるために、下記のプライマーＰＦ２及びＰＲ２並びに５’末端がレポーター蛍光色素であるＦＡＭ（６−カルボキシ−フルオレッセイン）及び３’末端がクエンチャー蛍光色素であるＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で標識されたプローブＴ１を用いたリアルタイムＰＣＲを行った。
【０１０５】
＜プライマー＞
ＰＦ２(フォワード側)： 5'-CACCTGGAAAATCGGGTCACT-3'（配列番号２８）
ＰＲ２（リバース側）： 5'-CGAGCCAGGTGTGGGATATA-3'（配列番号２９）
【０１０６】
＜プローブ＞
Ｔ１：5'-CGAATATTGCGCTTTTCAGACCGGCTT-3'（配列番号３０）
【０１０７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡフラグメント６２．５ｐｇと、３ｐｍｏｌ／μｌに調製した配列番号２８及び配列番号２９で示される塩基配列からなるプライマーの溶液２種を各２．５μｌと、２．５ｐｍｏｌ／μＬに調製した配列番号３０で示される塩基配列からなるプローブを２．５μＬと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×ＰＣＲ緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μｌを０．１２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。リアルタイムPCRは、Gene Amp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いて実施した。配列番号１７で示される塩基配列のうち塩基番号1〜94で示される塩基配列からなる領域（ＤＮＡ）を増幅するために、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて１５秒間、６０℃にて６０秒間を１サイクルとしてリアルタイムPCRを行った。当該リアルタイムPCRの結果により、当該領域のＤＮＡ量を定量した。各生物由来検体について３回試験を実施した。
その結果を図３〜図７に示した。Ａ群での当該領域のＤＮＡ量を１として、他の群での当該領域のＤＮＡ量を示した。図３（「Ｉ」）は、メチル化割合０％のフラグメント混合物であるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０」、図４（「ＩＩ」）は、メチル化割合１０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．１」、図５（「ＩＩＩ」）は、メチル化割合２５％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．２５」、図６（「ＩＶ」）は、メチル化割合５０％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「０．５」、図７（「Ｖ」）は、メチル化割合１００％のフラグメントであるため、Ｂ群、Ｃ群及びＤ群での理論値は「１」を示すことになる。実験の結果、図３〜図７に示す通り、Ｄ群で、この理論値に最も近い値が得られており、２種類以上のメチル化感受性制限酵素での消化処理が好ましいことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルに、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」又は「Ｃ（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋HpaII処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ａ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ｂ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ｃ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ａ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ｂ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ｃ」処理が施されたサンプルでの結果を示している。
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルに、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」又は「Ｃ（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋HpaII処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。  図中の一番左のレーンから、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ａ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ｂ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-M(7)（Ｍ）の「Ｃ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ａ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ｂ」処理が施されたサンプル、HpaIIの認識配列がメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドGPR7-2079-2176/98mer-UM（Ｕ）の「Ｃ」処理が施されたサンプルでの結果を示している。
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプル「（Ｉ）」に、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」、「Ｃ（HhaI処理）」又は「Ｄ（HpaII及びHhaIの同時処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２４で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにて測定した結果を示した図である。  図中の縦軸は、「Ａ」処理が施されたサンプルでのＤＮＡの量を１とした場合の相対値を示している（３回の平均値±標準偏差）。また、理論値とは、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群で予想される計算値（メチル化割合）を示している。
【図４】図４は、実施例３において、調製されたサンプル「（ＩＩ）」に、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」、「Ｃ（HhaI処理）」又は「Ｄ（HpaII及びHhaIの同時処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２４で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにて測定した結果を示した図である。  図中の縦軸は、「Ａ」処理が施されたサンプルでのＤＮＡの量を１とした場合の相対値を示している（３回の平均値±標準偏差）。また、理論値とは、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群で予想される計算値（メチル化割合）を示している。
【図５】図５は、実施例３において、調製されたサンプル「（ＩＩＩ）」に、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」、「Ｃ（HhaI処理）」又は「Ｄ（HpaII及びHhaIの同時処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２４で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにて測定した結果を示した図である。  図中の縦軸は、「Ａ」処理が施されたサンプルでのＤＮＡの量を１とした場合の相対値を示している（３回の平均値±標準偏差）。また、理論値とは、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群で予想される計算値（メチル化割合）を示している。
【図６】図６は、実施例３において、調製されたサンプル「（ＩＶ）」に、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」、「Ｃ（HhaI処理）」又は「Ｄ（HpaII及びHhaIの同時処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２４で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにて測定した結果を示した図である。  図中の縦軸は、「Ａ」処理が施されたサンプルでのＤＮＡの量を１とした場合の相対値を示している（３回の平均値±標準偏差）。また、理論値とは、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群で予想される計算値（メチル化割合）を示している。
【図７】図７は、実施例３において、調製されたサンプル「（Ｖ）」に、「Ａ（無処理）」、「Ｂ（HpaII処理）」、「Ｃ（HhaI処理）」又は「Ｄ（HpaII及びHhaIの同時処理）」のいずれかの処理を施し、配列番号２４で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡの量をリアルタイムＰＣＲにて測定した結果を示した図である。  図中の縦軸は、「Ａ」処理が施されたサンプルでのＤＮＡの量を１とした場合の相対値を示している（３回の平均値±標準偏差）。また、理論値とは、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群で予想される計算値（メチル化割合）を示している。
【０１１０】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１９
支持体への固定化のために設計されたビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号２１
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、メチル化シトシンもCで表す）からなる設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号２６
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
リアルタイムPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
リアルタイムPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３０
リアルタイムPCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプローブ
【図１】
2008182985.tif 000003
【図２】
2008182985.tif 000004
【図３】
2008182985.tif 000005
【図４】
2008182985.tif 000006
【図５】
2008182985.tif 000007
【図６】
2008182985.tif 000008
【図７】
2008182985.tif 000009
【配列表】
2008182985000001.app