【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年1月31日(2013.1.31)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で成長し、前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって、
前記細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし、
前記化学的に定義された培養培地は、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ未定義の動物臓器又は組織抽出物の無い培地であり、
前記未定義の動物臓器又は組織抽出物は、血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である、
培養組織構築物。
【請求項２】
前記線維芽細胞が、新生男児包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来する請求項１に記載の培養組織構築物。
【請求項３】
前記培養細胞が、皮膚の線維芽細胞である請求項１に記載の培養組織構築物。
【請求項４】
前記培養細胞が、毛包の皮膚の乳頭から得られる請求項１に記載の培養組織構築物。
【請求項５】
前記層が、毛包の皮膚の乳頭から得られる培養細胞を有し、該層に配置される請求項１に記載の培養組織構築物。
【請求項６】
前記培養細胞が、ヒト組織から由来し、そして非ヒト成分を含まない培地で培養される請求項１に記載の培養組織構築物。
【請求項７】
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で培養され、前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている培養皮膚の線維芽細胞を包含する培養組織構築物であって、
前記細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン、
（ｉｉｉ）フィブロネクチン
（ｉｖ）テネイシン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、そして該細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし、
前記化学的に定義された培養培地は、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
培養組織構築物。
【請求項８】
（ａ）細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、そして該細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし、
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で培養され、前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている培養線維芽細胞の第一の層；そして 
（ｂ）第一の層に沈着した上皮細胞を含む細胞の第二の層
を包含することを特徴とし、
前記化学的に定義された培養培地は、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
少なくとも２つの層を有する培養組織構築物。
【請求項９】
上皮細胞が、ケラチノサイト、角膜の上皮細胞、口腔粘膜から得られる上皮細胞、食道上皮細胞、および尿道上皮細胞から構成される群から選択される請求項８に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１０】
前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、新生男児包皮、真皮、腱、肺、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来する請求項８に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１１】
前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、皮膚の線維芽細胞である請求項８に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１２】
前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、毛包の皮膚の乳頭から得られる請求項１１に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１３】
前記第一の層が、毛包の皮膚の乳頭から得られる培養細胞を有し、該第一の層に配置される請求項８に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１４】
さらに、上皮細胞の第二の層上に沈着した細胞の第三の層を包含する請求項８に記載の二層培養組織構築物。
【請求項１５】
（ａ）細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示すＩ型およびＩＩＩ型コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン；
（ｉｉｉ）フィブロネクチン、
（ｉｖ）テネイシン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、そして細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で皮膚の線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし、
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生する条件下で培養され、前記培養線維芽細胞が前記細胞外マトリックスの層内に含まれている培養皮膚の線維芽細胞の第一の層；そして
（ｂ）多層化、層化、分化し、基底層、超基底層、顆粒層および角質層を示す上皮細胞層を形成する、第一の層に沈着されたケラチノサイト細胞の第二の層を包含することを特徴とし、
二層培養皮膚構築物が、第一および第二の層の接合点に存在する基底膜を有し、
前記化学的に定義された培養培地は、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
少なくとも２つの層を有する培養皮膚構築物。
【請求項１６】
培養線維芽細胞を、遺伝的に修飾して、細胞外マトリックス成分を産生する請求項１、７、８又は１５のいずれかに記載の構築物。
【請求項１７】
培養線維芽細胞を、遺伝的に修飾して、成長因子、ホルモン、ペプチド、またはタンパク質を産生する請求項１６に記載の構築物。
【請求項１８】
（ａ）細胞培養培地中の培養容器中の多孔性膜上に、細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞を蒔き、
（ｂ）線維芽細胞を刺激して、培養培地中で細胞外マトリックス成分を合成、分泌、および組織化させ、および
（ｃ）細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、少なくとも厚さ約３０ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、線維芽細胞の培養を継続することを包含し、
細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、そして該細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生されることを特徴とし、
前記培養培地は化学的に定義され、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
培養組織構築物を産生する方法。
【請求項１９】
第一および第二の培養培地が、非ヒト成分を含まない請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ａ）で、線維芽細胞が、約１×１０５細胞／ｃｍ２から約６．６×１０５細胞／ｃｍ２までの間の密度で蒔かれる請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
線維芽細胞が、新生男児包皮、臍帯、真皮、腱、肺、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来する請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）少なくとも８０％コンフルエンスまで、細胞培養培地中の培養容器中の多孔性膜上に、細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞を蒔き、
（ｂ）細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、厚さ約３０から約１１０ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、線維芽細胞の培養を継続し、
（ｃ）段階（ｂ）の合成細胞外マトリックスの頂部表面に上皮細胞を蒔き、そして、
（ｄ）前記線維芽細胞が含まれる細胞外マトリックスおよび上皮細胞の第二の層の二層組織構築物を形成するための培養条件下で、段階（ｃ）の上皮細胞を刺激することを含み、
細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
（ｉｉ）デコリン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、
前記細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生され、
前記細胞培養培地は化学的に定義され、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
二層培養組織構築物を産生する方法。
【請求項２３】
前記細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞が、新生男児包皮、真皮、腱、肺、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記上皮細胞が、ケラチノサイト、角膜の上皮細胞、口腔粘膜から得られる上皮細胞、食道の上皮細胞、および尿道上皮細胞から構成される群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）約８０％から約１００％コンフルエンスまで、細胞培養培地中で培養容器中の多孔性膜上に細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞を蒔き、
（ｂ）細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、少なくとも厚さ約３０ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、線維芽細胞の培養を継続し、細胞外マトリックスが、
（ｉ）４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組織化を示す原線維性コラーゲン；
（ｉｉ）テネイシン；および
（ｉｉｉ）グリコサミノグリカン
を包含し、
そして細胞外マトリックスは、培養条件の間、外因性マトリックス成分または合成構成員の不在下、化学的に定義された培養培地存在下で線維芽細胞を培養することによって産生され、
前記細胞培養培地は化学的に定義され、（Ｉ）基礎栄養培地、（ＩＩ）インスリン、（ＩＩＩ）Ｌ−グルタミン又はＬ−グルタミン誘導体、および（ＩＶ）アスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体を含み、且つ血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、胚抽出物、並びにフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子の無い培地である、
培養組織構築物を産生する方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１７】
本発明の１つの好ましい具体例は、少なくとも１つの型の細胞外マトリックス産生細胞、および、さらに簡単には、マトリックスが、細胞を培養することによって、完全に細胞で合成され、そして組立てられる「マトリックス」と称される、内因的に産生される細胞外マトリックス成分の構造的層を包含する。この層は、ここで、細胞が、それらのマトリックス内およびそれらを通して、それら自身を分泌し、含有するので、「細胞−マトリックス構築物」または「細胞−マトリックス層」と称される。培養組織構築物は、外因性マトリックス成分を必要とせず、したがって、含まない、すなわち、マトリックス成分は、培養細胞によって産生されずに、他の手段によって導入される。いっそう好ましい具体例では、ヒト皮膚の線維芽細胞によって産生される細胞−マトリックス構築物は、元来の皮膚に類似するコラーゲンの優勢な濃度を示すことが示される。電子顕微鏡によって立証されるとおり、マトリックスは、生来のコラーゲンに類似する原線維および原線維束の組織を包装することと同様に、４分の１差の６７ｎｍ結合パターンを示すコラーゲンを含む自然界で多孔性である。遅延還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、生来のヒト皮膚に見られる優勢なコラーゲン型であるこれらの構築物中のＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの両方の存在を検出した。標準免疫組織化学（ＩＨＣ）技術を用いて、皮膚の細胞−マトリックス構築物は、コラーゲン原線維に結合されることが知られ、そして生体内で原線維の直径を調節すると思われているデルマタン硫酸プロテオグリカンである、デコリンに対して陽性に染色する。デコリンは、ＴＥＭを用いて構築物中で可視化もされうる。産生した組織は、例えば、修復中の間葉または組織で見られる細胞外マトリックス糖タンパク質であるテネイシンに対して陽性に染色もする。生体内で修復中の組織とより同様に、培養基中で産生された組織は、マトリックスが形成されるときにＩ型対ＩＩＩ型コラーゲンのそれの比を増大することが示された。理論により結合されることを望まない一方で、細胞は、それらの間の開放空間に、主にＩＩＩ型コラーゲンおよびフィブロネクチンから構成される顆粒組織に類似のゆるいマトリックスで、すばやく充填し、そしてその後、このゆるいマトリックスを、主にＩ型コラーゲンから構成される周密マトリックスで再生すると思われる。産生された細胞−マトリックスは、ヒアルロン酸（ＨＡ）のようなグリコサアミノグリカン（ＧＡＧ）；フィブロネクチン；ビグリカンおよびベルシカンのようなデコリンに加えてプロテオグリカン；およびジヒアルロン酸；ジコンドロイチン−Ｏ−硫酸；ジコンドロイチン−４−硫酸；ジコンドロイチン−６−硫酸；ジコンドロイチン−４，６−硫酸；ジコンドロイチン−４−硫酸−ＵＡ−２Ｓ；およびジコンドロイチン−６−硫酸−ＵＡ−２Ｓのような硫酸グリコサアミノグリカンのプロファイルを含むことが示された。これらの構造的および生化学的特性は、構築物が培養基中で発生するとき、それら自身を示し、そして構築物がその最終形態に近づくときに明らかに明白である。十分に形成された培養皮膚の細胞−マトリックス構築物でのこれらの成分の存在は、その構築物が、正常な真皮のものに近づく構造的および生化学的特性を示すことを示す。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
線維芽細胞により産生される優勢な主要な細胞外マトリックス成分は、原線維コラーゲン、特にコラーゲンＩ型である。原線維コラーゲンは、細胞−マトリックス構造での主要な成分である；しかし、本発明は、このタンパク質またはタンパク質型のみから構成されるマトリックスに限定されない。例えば、他のコラーゲンは、コラーゲン型ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸのようなコラーゲンファミリーから得られる原線維性および非原線維性コラーゲンの両方は、適切な細胞型の使用によって産生されうる。同様に、最近の方法を用いて産生および沈着されうる他のマトリックスタンパク質としては、それに限定されないが、エラスチン；デコリンまたはビグリカンのようなプロテオグリカン；またはテネイシンのような糖タンパク質；ビトロネクチン；フィブロネクチン；ラミニン、スロボスポリンＩ、およびヒアルロン酸（ＨＡ）のようなグリコサアミノグリカン（ＧＡＧ）が挙げられる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
化学的に定義された培養培地の使用が好ましく、すなわち、未定義の動物臓器のない培地または、組織抽出物例えば、血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、胎盤抽出物、または胚抽出物、およびフィーダー細胞によって分泌されるタンパク質および因子である。最も好ましい具体例では、培地は、未定義の成分および非ヒト起源から由来する定義された生物学的成分を含まない。未定義の成分の添加は、好ましくないが、それらは、組織構築物を首尾よく作製するために、培養基中で任意の点で開示方法によって使用されうる。本発明は、非ヒト動物源から由来する化学的に定義した成分を用いてスクリーニングしたヒト細胞を利用することを行うときに、結果物である組織構築物は、定義されたヒト組織構築物である。合成官能当量を添加して、最も好ましい作製方法に使用するために化学的に定義された定義の全範囲内の化学的に定義された培地を補足しうる。一般に、細胞培養の当業者は、適切な自然のヒト、ヒト組換え体、または過度の調査または実験なしに、本発明の培養培地を補足する一般に公知の動物成分に対する合成等価物を決定できる。診療所でこのような構築物を使用する上での利点は、偶発的動物または交雑種ウイルス混入および感染の関係が減少されることである。試験のシナリオで、化学的に定義された構築物の利点は、試験されるときに、未定義の成分の存在により、混乱されるべき結果の機会がないことである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
細胞産生細胞がコンフルエントであり、そして培養培地に、マトリックス合成、分泌、または組織化で支援する成分を補足する場合、細胞は、それらの細胞によって合成された細胞およびマトリックスから構成される組織構築物を形成するのを刺激するようである。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
いったん十分な細胞数が得られたら、細胞を回収し、適切な培養表面に蒔き、そして適切な成長条件下で培養して、細胞のコンフルエントシートを形成する。好ましい具体例では、細胞を、孔を通して、そして上に直接培養物の下から培地を接触させるために隠されている多孔性膜に蒔く。好ましくは、細胞を、基本または育成培地のいずれかに懸濁させ、そして細胞培養表面に、約１×１０５細胞／ｃｍ２から約６．６×１０５細胞／ｃｍ２までの間、さらに好ましくは約３×１０５細胞／ｃｍ２から約６．６×１０５細胞／ｃｍ２までの間、そして最も好ましくは約６．６×１０５細胞／ｃｍ２（表面の平方センチメートル当たりの細胞）の密度で蒔く。培養物を、育成培地で培養して、培養物を樹立し、そしてそれらが、培地を、細胞外マトリックスの合成および分泌を上昇調節するために、マトリックス産生培地に交換することによって、化学的に誘導される時に、約８０％から１００％コンフルエンスまで培養する。選択的方法では、細胞を、産生培地に直接蒔いて、基本培地から産生培地に交換する必要性を排除するが、しかし、それは、高い種付け密度を必要とする方法である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
培養の間じゅう、線維芽細胞は、分泌されたマトリックス分子を組織化して、三次元組織様構造を形成するが、形成する細胞−マトリックス構築物に、培養基質からそれ自身を接触および剥ぎ取りさせる明らかな収縮力を示さない。培地交換は、新たなマトリックス産生培地で２から３日毎に行われ、やがて、分泌マトリックスは、厚みおよび組織化において増大する。細胞−マトリックス構築物を作製するのに必要な時間は、当初の播種濃度の能力、細胞型、セルラインの年齢、およびマトリックスを合成および分泌するセルラインの能力に依存する。十分に形成された場合、本発明の構築物は、細胞によって産生および組織化される線維性マトリックスにより塊状厚みを示す；それらは、細胞が、互いにゆるく粘着性でありうる場合、通常にコンフルエントであったり、または過度にコンフルエントな細胞培養であったりしない。線維性品質は、それらが、医療設定での日常の取扱いで亀裂またはクラッキングのような物理的損傷に抵抗するので、通常の培養と違って、構築物に粘着性組織様特性を付与する。培養皮膚構築物の作製で、細胞は、細胞培養表面上でそれら自身の周囲に、膜の表面を越えて、好ましくは少なくとも厚み約３０ミクロンまたはそれ以上、さらに好ましくは厚み約６０から約１２０ミクロンの間の組織化マトリックスを形成する；しかし、厚みは、１２０ミクロンの過剰で得られ、そしてこのような厚み増大が必要とされる試験または医療用途に使用するのに適している。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
分化表皮層を形成する方法で、二次培養ケラチノサイトを、細胞保存液から取り、そしてそれらの細胞数を拡大する。必要数の細胞が得られるときに、それらは、培養基質から放出され、懸濁され、計数され、希釈され、そしてその後、細胞−マトリックス構築物の頂部表面に、約４．５×１０３細胞／ｃｍ２から約５．０×１０５細胞／ｃｍ２までの間、さらに好ましくは約１．０×１０４細胞／ｃｍ２から約１．０×１０５細胞／ｃｍ２までの間、そして最も好ましくは約４．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で、蒔かれる。その後、構築物を、約６０から約９０分の間、３７±１℃で、１０％ＣＯ２でインキュベートして、ケラチノサイトを付着させる。インキュベーション後、構築物を、表皮化生培地で浸水させる。培養物での十分な長さの時間の後、ケラチノサイト増殖し、そして拡大して、細胞−マトリックス構築物を越えてコンフルエント単層を形成する。いったんコンフルエントとなったら、細胞培地処方を、分化培地に交換して、細胞分化を誘導する。多層上皮が形成されたときに、その後、角質化培地を使用し、そして培養物に空気−液体干渉にかける。ケラチノサイトの分化および角質化について、細胞を、乾燥または低湿度空気−液体干渉に曝す。乾燥または低湿度干渉は、皮膚の低湿度レベルを複写する試みとして特徴づけうる。やがて、ケラチノサイトは、これらの条件に曝された場合に、生来の皮膚で見られるほとんどまたは全ての角質および他の特徴を表す。