【手続補正書】
【提出日】平成24年3月2日(2012.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、本明細書において互いに置き換え得るように用いられ、それらの用語には、ペプチド結合によって結合した２つ又はそれより多くのアミノ酸を含む任意の組成物が含まれる。ポリペプチドには、２０種の天然に存在するアミノ酸と一般に呼ばれる２０種のアミノ酸以外のアミノ酸が含まれ得ることが理解され得る。また、ポリペプチドには、末端アミノ酸を含む１つまたはそれより多くのアミノ酸が含まれ得、これらは、当該技術分野において公知の方法によって（自然に、あるいは人工的に）修飾される。ポリペプチド修飾の例として、例えばグリコシル化による修飾、または他の翻訳後修飾が挙げられる。本発明のポリペプチドにおいて存在してよい修飾には以下のものが含まれるがこれらに限定されない。アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、糖化、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ素（またはヨード）化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化等のタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介付加およびユビキチン化。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
現在のところ、同調調節または非調和（ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ）調節が臨床的に興味深い１００種類を超えるサイトカイン／ケモカインが存在する。特定の疾患過程をサイトカインのレベルにおける変化と関連付けるために、理想的なアプローチは、試料を、所定の１つのサイトカインまたは複数のサイトカインに関して高い感度で分析することを必要とする。現在マーカーパネルにおいて使用されており、かつ本発明の方法および組成物において使用してよい例示的サイトカインには以下のものが含まれるが、これらに限定されない。ＢＤＮＦ、ＣＲＥＢ  ｐＳ１３３、ＣＲＥＢ  Ｔｏｔａｌ、ＤＲ−５、ＥＧＦ、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、脂肪酸結合タンパク質、塩基性ＦＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＧＣＰ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長関連癌遺伝子−ケラチノサイト（ＧＲＯ−ＫＣ）、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、インターロイキンＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１２  ｐ４０／ｐ７０、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ／ＩＬ−１Ｆ３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、インターフェロン誘導タンパク質（１０  ＩＰ−１０）、ＪＥ／ＭＣＰ−１、ケラチノサイト（ＫＣ）、ＫＣ／ＧＲＯａ、ＬＩＦ、リンホタクチン、Ｍ−ＣＳＦ、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＧ、炎症性マクロファージ（ＭＩＰ−１α）、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−１γ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３β、ＯＳＭ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ（ＲＡＮＴＥＳ）、Ｒｂ（ｐＴ８２１）、Ｒｂ（ｔｏｔａｌ）、Ｒｂ  ｐＳｐＴ２４９／２５２、Ｔａｕ（ｐＳ２１４）、Ｔａｕ（ｐＳ３９６）、Ｔａｕ（ｔｏｔａｌ）、組織因子、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＶＣＡＭ−１ならびにＶＥＧＦ。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１０、ＩＬ−１α、ＩＬ−３、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１８、ＩＬ−１０、ＩＬ−５、エオタキシン、ＩＬ−１６、ＭＩＧ、ＩＬ−８、ＩＬ−１７、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１３、ＩＬ−２Ｒ（可溶性）、ＩＬ−２、ＬＩＦ／ＨＩＬＤＡ、ＩＬ−１β、Ｆａｓ／ＣＤ９５／Ａｐｏ−１またはＭＣＰ−１である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
［５．生物学的状態のマーカー］
マーカーは、件の特定の表現型の状態の存在を示し得る。表現型の状態の例として以下のものが挙げられる。環境の変化、薬物治療、遺伝子操作もしくは遺伝子変異、傷害、食物の変化、加齢、または１つの生物もしくは生物の網もしくは亜網の他の何らかの（１つまたは複数の）特性に起因する表現型。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９２】
「蛍光部分」は、本明細書においてその用語を用いる場合、１つ又はそれより多くの蛍光成分であって、その全蛍光は、本明細書に記載の単一分子検出器において蛍光部分を検出し得るようなものである、蛍光成分を含む。従って、蛍光部分は、単一の成分（例えば量子ドットまたは蛍光分子）または複数の成分（例えば複数の蛍光分子）を含んでよい。「（蛍光）部分」が、本明細書においてその用語を用いる際に蛍光成分の群、例えば複数の蛍光色素分子を意味する場合、検出されるべき十分な蛍光を、それらの成分が１つの群として提供する限りにおいて、各個別の成分は別々に結合パートナーと結合してよく、または成分は一緒に結合してよいことが、理解されるであろう。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
ＱＤは、広い励起特性および狭い放射特性を有し、ＱＤは、カラーフィルタリングと共に用いられる場合、唯一つの電磁波源が、１つの試料における多数のターゲットの多重分析の間に、個々の信号を解像することを必要とする。従って、いくつかの態様において、分析器システムは、１つの連続波レーザー、および各々が１つのＱＤでラベリングされた粒子を含む。コロイド状に調製されたＱＤは浮遊しており、金属配位官能基を介して種々の分子に結合し得る。これらの群には、チオール、アミン、ニトリル、ホスフィン、ホスフィンオキシド、ホスホン酸、カルボン酸または他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。適切な分子を表面に結合させることによって、量子ドットはほとんど全ての溶媒中に分散もしくは溶解し得、または様々な無機および有機フィルムの中に組み込まれ得る。量子ドット（ＱＤ）は、マレイミドエステルカップリング反応によってストレプトアビジンと直接カップリングし得、またはマレイミド−チオールカップリング反応によって抗体とカップリングし得る。これにより、表面に共有結合した生体分子を有する材料がもたらされ、比活性度の高い共役を形成する。いくつかの態様において、単一分子分析器で検出されるタンパク質は、１つの量子ドットでラベリングされる。いくつかの態様において、量子ドットは直径が１０〜２０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が２〜１０ｎｍである。他の態様において、量子ドットは直径が約２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍまたは２０ｎｍである。有用な量子ドットには、ＱＤ６０５、ＱＤ６１０、ＱＤ６５５およびＱＤ７０５が含まれる。好ましい量子ドットはＱＤ６０５である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明は、生物学的試料中のタンパク質の単一分子の有無を決定する方法を提供し、その方法は、前記分子をラベルでラベリングすること、および単一分子検出器において前記ラベルの有無を検出することを含み、ラベルは、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出し得る蛍光部分を含み、レーザーは、当該部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、単一分子検出器は、１つ以下のインタロゲーション・スペースを含んでよい。試料中の単一分子の検出限界は、約１０、１、０．１、０．０１または０．００１フェムトモル濃度より小さくてよい。いくつかの態様において、検出限界は約１フェムトモル濃度より小さい。検出は、前記蛍光部分によって放射される電磁放射線の検出を含んでよい。本方法は、電磁放射線、例えばレーザー（約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍＷの出力を有するレーザー等）によって与えられる電磁放射線に、前記蛍光部分を曝すことを更に含む。いくつかの態様において、レーザーによる刺激は、約１０〜１０００マイクロ秒、または約１０００、２５０、１００、５０、２５または１０マイクロ秒の間、インタロゲーション・スペースに光を供給する。いくつかの態様において、ラベルは、前記分子を結合するのに特異的な結合パートナー、抗体等を更に含む。いくつかの態様において、蛍光部分は蛍光色素分子（少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する色素分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む色素分子等）を有する。いくつかの態様において、色素分子は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択されるＡｌｅｘＦｌｕｏｒ分子である。いくつかの態様において、色素分子はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素分子である。いくつかの態様において、蛍光部分は複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含む。いくつかの態様において、複数のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子は約２〜４のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子、または約３〜６のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７分子を含む。いくつかの態様において、蛍光部分は量子ドットである。本方法は、試料中の前記タンパク質の濃度測定を更に含んでよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
いくつかの態様において、前記ラベルの有無の検出は以下の工程を含む：（ｉ）インタロゲーション・スペースを通して前記試料の一部を移動させる工程；（ｉｉ）前記インタロゲーション・スペースを電磁放射線に曝露させる工程であって、前記ラベルが存在する場合、前記電磁放射線は、前記蛍光部分を刺激して光子を放出させるのに十分である工程；および（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の前記曝露の間に放出される光子を検出する工程。本方法は、前記インタロゲーション・スペースにおけるバックグラウンド光子レベルを決定する工程を更に含んでよく、前記バックグラウンドレベルは、インタロゲーション・スペースが工程（ｉｉ）と同じ方法で電磁放射線に付されるがインタロゲーション・スペースにラベルが存在しない場合の、インタロゲーション・スペースの平均光子放出を表している。本発明は、工程（ｉｉｉ）において検出される光子の量を閾値光子レベルと比較する工程を更に含んでよく、前記閾値光子レベルは、前記バックグラウンド光子レベルの関数であり、工程（ｉｉｉ）において検出される、閾値レベルの光子量より多い光子量は、前記ラベルの存在を意味し、工程（ｉｉｉ）において検出される、閾値レベルに等しい又はそれより少ない光子の量は、前記ラベルが存在しないことを意味する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
もう１つの態様において、固相結合分析は、競合的結合分析であり得る。そのような方法の１つは以下の通りである。第１に、結合表面において固定化された捕捉抗体が、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）検出可能なラベルを含む分子（検出試薬）のラベリングされた類似物によって競合的に結合される。第２に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。もう１つのそのような方法は以下の通りである。第１に、検出可能なラベルを有する抗体（検出試薬）を、ｉ）試料中の件の分子、例えば生物学的状態のマーカー、およびｉｉ）結合表面に固定化された分子（捕捉試薬）の類似物と、競合的に結合させる。第２に、単一分子分析器を用いてラベルの量を測定する。本明細書において、「分子の類似物」は、捕捉抗体に結合させるための分子と競合する種を意味する。競合免疫測定の例は、Ｄｅｕｔｓｃｈらの米国特許第４，２３５，６０１号、Ｌｉｏｔｔａの米国特許第４，４４２，２０４号およびＢｕｅｃｈｌｅｒらの米国特許第５，２０８，５３５号に開示されており、それらの全ては引用することによって本明細書に組み込まれる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
本発明の分析器キットの一の態様を図１５に表す。キットは、タンパク質分子に対する結合パートナーと蛍光部分とを有する、タンパク質分子に対するラベルを含む。キットは、単一タンパク質分子を検出するための分析器システム（３００）を更に含み、その分析器システムは、蛍光部分を刺激するための電磁放射線源３０１、ラベルを通過させるためのキャピラリーフローセル３１３；キャピラリーフローセルにおいてラベルを移動させるための駆動力源（図示せず）；電磁波源から放射される電磁放射線を受け取るための、キャピラリーフローセル内に規定されたインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）；および刺激された蛍光部分の電磁気学的特性を測定するための、インタロゲーション・スペースに操作可能に接続された電磁放射線検出器３０９を有し、蛍光部分は、当該部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出することができ、レーザーは、当該部分を含む直径が約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、電磁放射線源３０１からのビーム３１１は、顕微鏡対物レンズ３１５によって焦点が合わせられて、キャピラリーフローセル３１３内に１つのインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）を形成する。いくつかの態様において、顕微鏡対物レンズは０．７、０．８、０．９または１．０に等しい又はそれより大きい開口数を有してよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
単一粒子分析器システム３００において、各粒子が電磁放射線源のビーム３１１を通過すると、粒子は励起状態になる。粒子がその励起状態から緩和すると、検出可能な光のバーストが放射される。粒子がビームを通過するのにかかる長さの時間、各粒子によって励起−放射サイクルが何度も繰り返され、分析器システム３００が、粒子がインタロゲーション・スペース３１４を通過する際に各粒子に対して数十〜数千個の光子を検出することができる。蛍光粒子によって放出される光子を、検出器３０９（図１Ａ）によって、粒子−ラベル複合体がインタロゲーション・スペースを通過する時間を示す時間遅延と共に記録する。光子強度を検出器３０９によって記録し、サンプリング時間をビンに分割し、ビンは、均一で任意の、自由に選択可能な時間チャンネル幅を有する時間セグメントである。各ビンに含まれる信号の数を評価する。粒子が存在する場合を決定するためにいくつかの統計的分析方法の１つまたは組み合わせを採用する。そのような方法には、分析器システムのベースラインノイズを決定すること、および検出器からの偽陽性信号を排除するために、ベースラインノイズより大きい統計的レベルにおいて蛍光ラベルの信号強度を設定することが含まれる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
電磁放射線源３０１は、分析器システム３００のキャピラリーフローセル３１３に焦点が合わせられ、キャピラリーフローセル３１３は、試料システムに流体接続される。インタロゲーション・スペース３１４を図２Ａに示す。図１Ａの連続波電磁放射線源３０１からのビーム３１１は、キャピラリーフローセル３１３の内部の特定の深さ（または深度）に光学的に焦点が合わせられる。ビーム３１１は、試料を満たしたキャピラリーフローセル３１３に、キャピラリーフローセル３１３に垂直な角度で向けられる。ビーム３１１は、件の粒子をラベリングするのに用いられる特定の蛍光ラベルを励起させるように選択された所定の波長で操作される。インタロゲーション・スペース３１４の寸法または体積は、ビーム３１１の直径、およびビーム３１１の焦点が合わせられる深度（または深さ）によって規定される。別法として、インタロゲーション・スペースは、既知の濃度の較正試料を分析器システムの中に流すことによって規定され得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８６】
いくつかの態様において、電磁放射線源の光学的構成および検出器の光学的構成を、共焦点光学配置で配置する。そのような配置において、電磁放射線源３０１および検出器３０９は、同一の焦点面に配列する。共焦点配置は、分析器システムを移動させる場合に電磁放射線源３０１および検出器光学３０９を再調整する必要がないので、分析器のロバスト性をより高める。この配置は、分析器システムの要素を再調整する必要がないので、分析器の使用をより簡単にする。分析器３００（図１Ａ）および分析器３５５（図１Ｂ）に対する共焦点配置を各々、図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａは、電磁放射線源３０１からのビーム３１１が顕微鏡対物レンズ３１５によって焦点を合わせられて、キャピラリーフローセル３１３の中に１つのインタロゲーション・スペース３１４（図２Ａ）を形成することを示す。ダイクロイックミラー（または二色鏡）３１６は、レーザー光を反射するが蛍光を透過し、レーザー光から蛍光を分離するのに用いられる。検出器の正面に配置されるフィルター３１７は、検出器における非蛍光を排除する。いくつかの態様において、共焦点配置で構成される分析器システムは、２つ又はそれより多くのインタロゲーション・スペースを有し得る。そのような方法は既に開示されており、先の米国特許出願第１１／０４８，６６０号から引用することによって組み込まれる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
従って、いくつかの態様において、本発明の分析器システムは、分析後に試料を回収するための試料回収システムを更に提供する。これらの態様において、システムは、試料を分析器の中へと抜き出し、分析し、その後、例えば同じ経路によって、試料ホルダー、例えば試験管に戻すメカニズムおよび方法を含む。試料が破壊されないので、また、試料がバルブまたは他の管ののいずれにも入らないので、試料は汚染されないままである。更に、試料経路における全ての材料が高度に不活性である（例えばＰＥＥＫ、溶融石英またはサファイア）ので、試料経路からの汚染がほとんど存在しない。ステッピングモーターで制御されたポンプ（特に分析ポンプ）を使用することにより、引き上げられる体積および外に押し返される体積の正確な制御が可能となる。これにより、洗浄緩衝液による僅かな希釈がたとえあったとしても、試料の完全な又はほとんど完全な回収が可能となる。従って、いくつかの態様において、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％より多くの試料が分析の後に回収される。いくつかの態様において、回収された試料は希釈されない。いくつかの態様において、回収された試料は約１．５倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍、１．１倍、１．０５倍、１．０１倍、１．００５倍または１．００１倍より小さい倍率で希釈される。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
いくつかの態様において、本発明は、例えばマーカーの単一分子に結合したラベルを検出することによって、マーカーの単一分子を検出し、それによって生物学的試料のマーカー濃度を測定し、それによって、第１集団から得られる生物学的試料中のマーカーに関する濃度範囲を設定することにより、生物学的状態に関するマーカーを確立する方法を提供する。いくつかの態様において、マーカーは、ポリペプチドまたは小分子である。試料は本明細書に記載のいずれのもの（例えば血液、血漿、血清または尿）であってもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
マーカーの単一分子の検出は、蛍光部分の励起波長で光を放射するレーザーによって刺激すると、少なくとも約２００個の光子を放出し得る蛍光部分を含むラベルでマーカーをラベリングすることを含んでよく、レーザーは、当該部分を含む直径約５ミクロン以上のスポットに焦点が合わせられ、レーザーによってスポットに向けられる全エネルギーは、約３マイクロジュール以下である。いくつかの態様において、蛍光部分は、少なくとも１つの置換インドリウム環系を有する分子であって、インドリウム環の３位の炭素における置換基が化学反応性基または共役物質を含む分子を有する。いくつかの態様において、蛍光部分は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００からなる群から選択される色素を含んでよい。いくつかの態様において、蛍光部分はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７を含む。いくつかの態様において、ラベルはマーカーに対する結合パートナー、例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体等の、前記マーカーに対して特異的な抗体を更に含む。種々のマーカーに対する結合パートナーは本明細書に記載される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５８】
癌の検出およびモニタリングはしばしば、腫瘍の成長の粗い測定（腫瘍自体の可視化等）の使用に依存し、その測定は不正確であり、または、例えば現在の方法による実際の臨床状況において検出可能になる前に、高いレベルに達してしまう。検出の時点において、腫瘍はしばしばかなりの大きさに成長し、転移の前に介入が行われる可能性は低い。例えば、Ｘ線による肺癌の検出は、腫瘍の直径が１ｃｍより大きいことを必要とし、ＣＴスキャンによる検出は、腫瘍の直径が２〜３ｍｍより大きいことを必要とする。別法として、腫瘍成長のバイオマーカーを使用してよいが、バイオマーカーが現在の臨床技術で利用可能なレベルで検出可能である時点までに、腫瘍は再びかなり発達していることが多い。更に、医療介入（例えば、１つの腫瘍もしくは複数の腫瘍を縮小もしくは除去するための外科手術、化学療法、または放射線療法）の後に、残存疾患が、更なる介入が成功しない可能性の高い時点に進行するまでに、癌の再発が存在するか否かを決定するのに十分な感度で腫瘍マーカーを測定することは不可能であることが多い。本発明の分析器、システムおよび方法を用いると、例えば転移可能性が低いので介入が成功する可能性の高い時点における、腫瘍成長の発現および腫瘍成長の再発の両方を検出することが可能である。今までは示されていないレベルで検出可能である癌のためのマーカーには、本明細書に記載のマーカーが含まれる。診断マーカーへと再目的化し得るマーカーを検出するための分析の例として、本明細書に記載されているように、ＴＧＦβ、Ａｋｔ１、ＦａｓリガンドおよびＩＬ−６が挙げられる。
［Ｂ．例示的マーカー］
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７７】
本発明は、健康で正常な人の被験体からの血漿中のＩＬ−１α濃度を、従来は達成不可能であったレベルの確度および精度で定量するのに十分な高感度のＩＬ−１α分析を提供する。実施例２３を参照のこと。それは、健康な状態と疾患状態との間のＩＬ−１α濃度の区別を可能にし、有効な前臨床および臨床研究設計を可能にする。ＩＬ−１α分析により、薬物の有効性または疾患の進行に関する識見を提供し得る非常に低いレベルにおける定量と、小さい濃度変化の間の区別とが可能になることによって、ＩＬ−１αの有用性が増大する。ＩＬ−１α分析は、幅広いダイナミックレンジにおけるヒト血漿中のＩＬ−１αの正確な定量を可能にする。種々の態様において、分析は、研究者が：（１）ＩＬ−１を介した炎症性反応を妨げるように設計された治療法（キネレット等）の有効性および投与量を測定すること；（２）ＡＭＧ１０８の臨床試験のように、ＩＬ−１α濃度を治療上のエンドポイントとして使用し得る場合に、よりロバスト性の高い臨床および前臨床研究を設計すること；ならびに／または（３）患者が健康な状態から病気の状態に移行する際に、患者におけるＩＬ−１αレベルの変化の様子を理解することを可能にする。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８０】
本発明は、薬物の有効性または疾患の進行に関する識見を提供し得る非常に低いレベルにおける定量、および小さい濃度変化の間の区別を可能にすることによって、ＩＬ−１βの有用性を増大させるＩＬ−１β分析を提供する。実施例２４を参照のこと。ＩＬ−１β分析は、健康で正常な人間の被験体からの血漿中のＩＬ−１β濃度を、以前は達成不可能であったレベルの確度および精度で定量するのに十分な高感度である。ＩＬ−１β分析は、幅広いダイナミックレンジでのヒト血漿中のＩＬ−１βの正確な定量を可能にする。種々の態様において、この分析は、研究者が：（１）ＩＬ−１を介した炎症性反応を妨げるように設計された治療法（キネレット等）の有効性および投与量を測定すること、；（２）ＡＭＧ１０８の臨床試験のように、ＩＬ−１β濃度を治療上のエンドポイントとして使用し得る場合に、よりロバスト性の高い臨床試験および前臨床試験を設計すること；ならびに（３）患者が健康状態から疾病状態に移行する際に、患者におけるＩＬ−１βレベルの変化の様子を理解することを可能にするだろう。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
ＩＬ−６関連疾患は、敗血症、末梢動脈疾患および慢性閉塞性肺疾患を含むがこれらに限定されない。インターロイキン−６を介した炎症は、アテローム硬化性血管疾患ならびに骨粗鬆症および２型糖尿病を含む年齢関連疾患に対する共通の原因要素および治療対象でもある。更に、ＩＬ−６は、敗血性ショック等の更なる疾患を診断するために、他のサイトカイン、例えばＴＮＦαと組み合わせて測定可能である。ＩＬ−６は、抗炎症および急性相反応の抑制をもたらすであろう薬物ターゲットとしての治療可能性を有する。異質な病原体に対する宿主反応に関して、ＩＬ−６は、マウスにおいて、バクテリア、肺炎連鎖球菌に対する抵抗を必要とすることが示された。ＩＬ−６の阻害物質（エストロゲンを含む）が、閉経後骨粗鬆症を治療するのに用いられる。ＩＬ−６はハイブリドーマ成長に不可欠であり、ｂｒｉｃｌｏｎｅ等の多数の追加（または補助）クローニング媒体において発見されるので、癌に対する治療可能性も存在する。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
ロイコトリエン経路の活性化は尿中ＬＴＥ４レベルの増加を伴い、喘息の急性悪化は尿中ＬＴＥ４レベルが増加してその後、消散の間にかなり減少することを伴う。悪化および追跡期間の間、気流制限の程度は尿中ＬＴＥ４レベルと相関し、従って、ロイコトリエン経路が急性喘息の間に活性化されることを示す。更に、ＬＴＣ４またはＬＴＥ４の気管支収縮用量の吸入は、用量依存的な方法で尿中ＬＴＥ４の排出を変化させ、従って、喘息患者の肺におけるスルフィドペプチドロイコトリエン合成のマーカーとして尿中ＬＴＥ４を使用し得ることを示す。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
いくつかの態様において、本発明は、正常レベルのＶＥＧＦを定量する方法、および早期段階の癌／腫瘍の存在を示す、異常に増加したＶＥＧＦレベルを同定する方法を提供する。ヒトにおけるＶＥＧＦの通常の健常レベルは５０ｐｇ／ｍｌより小さく、癌の被験体においてはかなり増加する（＞１００ｐｇ／ｍｌ、しばしば２００〜５００ｐｇ／ｍｌ）。他の態様において、本明細書に記載の方法は、他の癌（前立腺およびリンパ腫等）の存在を示すのに使用可能である。本発明の方法は、増加したＶＥＧＦレベルを有するであろう血管新生中の固形（または充実性）腫瘍の存在を示すのに使用可能である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
本発明は、標準的な試料体積である１００μｌより小さい、非常に小さい試料体積におけるＶＥＧＦを測定する方法を提供する。本発明の方法は、分析の感度によって可能となり、他の方法と比較して、より多数の試料が小さい体積にて定量可能な結果を提供することが可能となる。一の態様において、本発明の方法は、１０μｌより少ない又はそれに等しいヒトまたはマウス血漿試料中のＶＥＧＦを測定する。もう１つの態様において、本発明の方法は、１０μｌより少ない又はそれに等しいヒトまたはマウス血漿試料からの組織溶解物中のＶＥＧＦを測定する。これらの方法は、ヒト乳癌組織生検からの溶解物において、およびいくつかのマウス株からの組織溶解物において検査された。もう１つの態様において、本発明の方法は、健康な個体および病気の個体における組織生検から調製された溶解物中のＶＥＧＦを測定する。通常の１ｍｍの針生検、および１０μｌより小さい又はそれに等しい得られる溶解物体積に基づいて、この方法は、針生検からのＶＥＧＦの定量を可能にする。小体積の試料サイズは本発明の他のマーカーによっても提供される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３８】
いくつかの態様において、第２マーカーは、ｐｒｏＢＮＰ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ｃＴｎＩ、ＶＥＧＦ、インスリン、ＧＬＰ−１、ＴＲＥＭ１、ロイコトリエンＥ４、Ａｋｔ１、Ａβ−４０、Ａβ−４２またはＦａｓリガンドを含むバイオマーカーである。いくつかの態様において、第２マーカーはサイトカインである。ここで開示するように、現在のところ、その同調調節または非調和調節が臨床的に注目されている１００を越えるサイトカイン／ケモカインが存在し、そのいずれも、本発明の方法を用いて検出可能である。いくつかの態様において、サイトカインはＧ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１α、ＩＬ−１０、ＩＬ−２２、ＩＬ−８、ＩＬ−５、ＩＬ−２１、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−１５、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１β、ＭＣＰ、ＩＬ−３２またはＲＡＮＴＥＳである。いくつかの態様において、サイトカインはＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−７、ＩＬ−１αまたはＩＬ−１βである。他の態様において、第２マーカーは多量のタンパク質である。そのような態様において、第２マーカーはアポリポタンパク質、虚血修飾アルブミン（ＩＭＡ）、フィブロネクチン、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ｐｒｏＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを含む）またはミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）であり得る。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４８】
一の態様において、本発明の装置によって検出されるマーカー、例えばｃＴｎＩまたはＶＥＧＦのレベルの増加、および遺伝子マーカーの存在は、生物学的状態、例えば疾患を意味する。例えば、被験体における状態は、第１マーカーおよび病態と相関関係にあるＳＮＰのレベルの増加によって検出してよい。例えば、被験体における状態は、第１マーカー、および病態と相関することがわかっているＤＮＡメチル化パターンのレベルの増加によって検出してよい。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
１０μｌの受動的阻害溶液および１０μｌの標準物質または試料を、各ウェルに加えた。標準物質は４回測定した。プレートをＡｘｙｓｅａｌ封止フィルムで封止し、３０００ＲＰＭで１分間遠心分離し、２５℃で２時間振動させながら培養した。プレートを５回洗浄し、ペーパータオルの上で反転させた状態で、ローターが３０００ＲＰＭに達するまで遠心分離した。１ｎＭの検出抗体の実施希釈液を調製し、２０μｌの検出抗体を各ウェルに加えた。プレートを封止して遠心分離し、アッセイを、２５℃で１時間振動させながら培養した。３０μｌの溶出緩衝液をウェル毎に加え、プレートを封止し、アッセイを２５℃で１／２時間培養した。プレートは、分析前に４℃にて最大で４８時間保存し、または試料は直ちに分析した。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８４】
アリコートを、ポンプで分析器の中に送った。唯１つの蛍光ラベルの放射が、レーザー励起後の規定されたスペースにおいて検出されるように、インタロゲーション体積を設定することによって、個別にラベリングされた抗体をキャピラリーフローの間に測定した。デジタルイベントを表す各信号によって、この構成は極めて高い分析感度を可能にする。全蛍光信号は、個々のデジタルイベントの合計として決定される。カウントされた各分子は、数百〜数千のＤＭＣイベント／試料を含む陽性データ点である。本発明のｃＴｎＩ分析の検出限界は、「平均＋３ＳＤ」法によって決定した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０４】
ＳＭＤ：アリコートをポンプで分析器の中に送る。レーザー励起によって唯１つの蛍光分子の放射が規定されたスペースにおいて検出されるように、インタロゲーション体積を設定することによって、個別にラベリングされた抗体をキャピラリーフローの間に測定する。各信号がデジタルイベントを表すことにより、この構成は極めて高い分析感度を可能にする。全蛍光信号は、個々のデジタルイベントの合計として決定される。カウントされた各分子は、数百〜数千のＤＭＣイベント／試料を含む陽性データ点である。本発明のｃＴｎＩ分析の検出限界を「平均＋３ＳＤ」法によって決定する。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１１】
更に、本発明の方法および組成物は、患者から採取した最初の試料に関する結果からわかるように、心筋トロポニンレベルに基づくより一層早期の診断および介入の可能性を可能にする。１００〜３５０ｎｇ／ｍｌの市販の分析の初期ｃＴｎＩ値を有した３つの場合において、本発明の分析方法によって、全てがｃＴｎＩに対して陽性であった（即ち７ｐｇ／ｍｌを超えるｃＴｎＩ）。１００ｐｇ／ｍｌより小さい市販の分析の初期ｃＴｎＩ値を有した１２の場合において、本発明の分析によって、５つの分析が心血管系イベントに対して陽性であると決定された（即ち７ｐｇ／ｍｌを超えるｃＴｎＩ）。本発明の分析の期待される用途は、緊急治療室に入る際の試料を検査した場合に現在の市販の分析より５３％多いＡＭＩ事例を検出しただろう。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４２２】
材料：
（提供された試薬）
捕捉抗体：Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に、２．５マイクログラム／ｍｌで被覆された８４１６６０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（３８４ウェルプレート）
分析緩衝液
再懸濁緩衝液
希釈緩衝液
標準希釈剤
Ａｋｔ  １標準物質
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７でラベリングされた（２〜４のｆｌｕｏｒ／ＩｇＧ）、Ａｋｔ１に対する検出抗体試薬、ＡＦ１７７５（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）
（必要とされる他の試薬）
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００洗浄緩衝液（１０ｍＭボレート、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ８．３）
溶出緩衝液（０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００１％ＢＳＡを含有する４Ｍ尿素）
「７」に設定されたマイクロプレート振盪機
マイクロプレート洗浄器
プレート遠心分離器
Ａｘｙｓｅａｌ封止フィルム、Ａｘｙｇｅｎ製品３２１−３１−０５１
Ｎｕｎｃ穿孔可能封止テープ、Ｎｕｎｃ製品２３５３０６
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３６】
［実施例８  Ｆａｓリガンドの検出］
［血清中の低レベルのＦａｓリガンドを定量するためのサンドウィッチ免疫測定］
高濃度標準物質を緩衝タンパク質溶液中で希釈することによって、検量線を作成した。１０マイクロリットル（μｌ）の分析緩衝液および１０μｌの試料または標準物質を、Ｆａｓリガンドに対して特異的な抗体で被覆した３８４−ウェルプレートの各ウェルに加え、２時間培養した。プレートを洗浄し、Ｆａｓリガンドに特異的な、ラベリングされた検出抗体２０μｌを各ウェルに加えた。１時間培養した後、プレートを洗浄して、結合していない検出抗体を除去した。結合された検出抗体を溶出し、ＺｅｐｔＸ（商標）装置において測定した。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７４】
異なる細胞株の細胞溶解物、および培地におけるｈＶＥＧＦレベルの決定：
２種類の異なるヒト細胞株を培養して採取した。より低濃度のＳＤＳが用いられること、および試料が煮沸されないことを除いて、ＮＣＩ  ＳＯＰ＃３４０５０６に従って細胞を溶解させた。用いられる細胞株は、ヒト細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１胸腺癌およびＨＴ−２９結腸腺癌であった。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４７８】
試料は、本発明の分析およびＲ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡ分析の両方において２回測定した。溶解物は、最初は１：８に希釈し、その後（３）連続１：２希釈を行った。媒体をそのまま分析し、また、１：４、１：１６および１：６４に希釈して分析した。各試料を２回ずつ検査した。２つの分析からの値の比較を図２４に示す。両方の分析が、細胞抽出物および使用済み媒体におけるＶＥＧＦを検出した。分析結果は、細胞株の各々に対して同様の範囲にあり、図２４Ａ〜Ｃに示される。図の間でわかるように、４Ｔ１乳腺細胞株は、最も低いレベルを有した；Ｂ１６黒色腫試料は、４Ｔ１の約４倍のレベルを有し、ＣＴ２６結腸試料は、Ｂ１６の約２倍の高さのレベルであった。２つの分析間で一貫した差異が存在した。本発明の分析は、細胞溶解物においてより多くのＶＥＧＦを検出し、使用済み媒体においてより少ないＶＥＧＦを検出した。更に、放出されたＶＥＧＦに対する細胞内ＶＥＧＦの割合は、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ分析に関しては一貫して約５：１であったが、ＥＬＩＳＡ分析結果に関しては、細胞外のＶＥＧＦに対する細胞内のＶＥＧＦの割合がかなり変化した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４８２】
ヒトＶＥＧＦのアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性：
試料の調製：
ヒト血漿試料に対する検量線および値のアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）再現性を試験するために、３日間にわたって異なる人により試料当たり３回の反復試験と共に独立して７回分析を行った。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９２】
［実施例１５  異種移植片マウスにおけるＶＥＧＦ］
マウス乳癌異種移植片からの試料は、ワシントン大学のＤｒ．Ｍａｔｔｈｅｗ  Ｅｌｌｉｓの研究室から入手した。血漿および乳癌組織は、５つの異なる異種移植片株から得た。対照として、ＳＣＩＤマウスからの血漿およびマウス胸部組織を使用した。全ての試料を、マウスＶＥＧＦおよびヒトＶＥＧＦの存在に関して試験した。マウスＶＥＧＦは、正常なマウス血漿において８６〜１０９ｐｇ／ｍｌの範囲であった。３つの異種移植片マウスは、正常なものの２倍の大きさのＶＥＧＦレベルを有し、他の２つの異種移植片試料は、現在の正常範囲の下方におけるＶＥＧＦレベルを有する（８０〜８６ｐｇ／ｍｌ）。データを表２２に示す。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０２】
（試薬調製）
１．使用前に全ての試薬を室温に温める。
２．１Ｘ洗浄緩衝液を（１０Ｘ洗浄緩衝液から）以下のように調製する：
ａ．１０Ｘ洗浄緩衝液の２５ｍＬ瓶を２５０ｍＬ容器に注ぎ入れる。
ｂ．２２５ｍＬの脱イオン水を加える。
ｃ．ゆっくりと反転させることによって十分に混合する。
３．使用する直前に、回転器を用いて３０分間バイアルを反転させることによってＭＰを再懸濁させ、それによって、バイアルにおいてＭＰが確実に均等に分布するのを助ける。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１３】
（ヒトＶＥＧＦクイック分析ガイド）
１．  全ての試薬、検量線および試料を指示通りに準備する。
２．  ９６−ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに１００μｌの捕捉試薬を加え、次いで１００μｌの標準物質／試料を加える。
３．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
４．  カバーを取り除き、プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを２分間安定させ／寄せ集め、上澄みを取り除く。
５．  プレートを磁石上に置いた状態で、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。２分間待ち、緩衝液を取り除く。
６．  磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。１００ｘｇでパルス（ｐｕｌｓｅ）遠心分離する。
７．  覆いをし、室温で１時間培養する／振動させる。
８．  プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを寄せ集めるために２分間待つ。上澄みを除去する。
９．  磁石の近くでＭＰを磁気的に寄せ集めながら、２５０μｌの洗浄緩衝液を３回加えて除去する。各サイクルの間に、緩衝液を吸引する前に２分間待つ。
１０．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させて、ＭＰを再懸濁させる。全内容物を新しい９６−ウェルプレートに移す。
１１．プレートを磁石の上に設置し、２分間待つ。上澄みを除去する。
１２．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させる。
１３．工程１１および１２を各々繰り返す。
１４．磁石から取り外し、各ウェルに２０μｌの溶出緩衝液を加える。１００ｘｇでパルス遠心分離する。
１５．覆いをし、室温で３０分間培養する／振動させる。
１６．フィルタープレートを３８４−ウェルプレート（分析プレート）の上に設置する。
１７．９６−ウェルプレートの内容物を、３８４−ウェルフィルタープレート／分析プレートの組み合わせに移す。
１８．フィルタープレートの組み合わせを覆い、１分間８５０ｘｇで遠心分離する。
１９．上部のフィルタープレートを取り外して廃棄する。３８４−ウェルプレートを穴開け可能なプレートシールカバーで覆う。
２０．プレートをＥｒｅｎｎａシステムに取り付ける。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１８】
（提供された試薬）
【表３１】
2011513753.tif 000001
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５２５】
（試薬調製）
使用前に全ての試薬を室温に温める。１Ｘ洗浄緩衝液を（１０Ｘ洗浄緩衝液から）下記のように調製する：１０Ｘ洗浄緩衝液の２５ｍＬ瓶を２５０ｍＬ容器に注ぎ入れる；２２５ｍＬの脱イオン水を加える；ゆっくりと反転させることによって十分に混合する。使用前に、回転器を用いて３０分間バイアルを反転させることによってＭＰを再懸濁させ、それによって、バイアルにおいてＭＰを確実に均等に分布させる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３３】
（マウスＶＥＧＦクイック分析ガイド）
１．  全ての試薬、検量線および試料を指示通りに準備する。
２．  ９６−ウェルポリプロピレンプレートの各ウェルに５０μｌの捕捉試薬を加え、次いで１０μｌの標準物質／試料を加える。
３．  最大１００ｘｇでプレートをパルス回転させて、試料が確実にＭＰ溶液中に存在するようにする。
４．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
５．  カバーを取り除き、プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを２分間安定させ／寄せ集め、上澄みを取り除く。
６．  プレートを磁石上に置いた状態で、２５０μｌの洗浄緩衝液を加える。２分間待ち、緩衝液を取り除く。
７．  磁石から取り外し、２０μｌのＶＥＧＦ検出試薬を各ウェルに加える。１０００ＲＰＭでパルス遠心分離する。
８．  覆いをし、室温で２時間培養する／振動させる。
９．  プレートを磁石の上に設置し、ＭＰを寄せ集めるために２分間待つ。上澄みを除去する。
１０．磁石の近くでＭＰを磁気的に寄せ集めながら、２５０μｌの洗浄緩衝液を３回加えて除去する。各サイクルの間に、緩衝液を吸引する前に２分間待つ。
１１．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させて、ＭＰを再懸濁させる。全内容物を新しい９６−ウェルプレートに移す。
１２．プレートを磁石の上に設置し、２分間待つ。上澄みを除去する。
１３．磁石から取り外し、２５０μｌの洗浄緩衝液を加え、１０秒間プレートを振動させる。
１４．工程１１、１２および１３を各々繰り返す。
１５．磁石から取り外し、各ウェルに２０μｌの溶出緩衝液を加える。１００ｘｇでパルス遠心分離する。
１６．覆いをし、室温で３０分間培養する／振動させる。
１７．フィルタープレートを３８４−ウェルプレート（分析プレート）の上に設置する。
１８．９６−ウェルプレートの内容物を、３８４−ウェルフィルタープレート／分析プレートの組み合わせに移す。
１９．フィルタープレートの組み合わせを覆い、１分間８５０ｘｇで遠心分離する。
２０．上部のフィルタープレートを取り外して廃棄する。３８４−ウェルプレートを穴開け可能なプレートシールカバーで覆う。
２１．プレートをＥｒｅｎｎａシステムに取り付ける。
この分析は、様々な種類の血漿および細胞溶解物を検査するのに用いてよい。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５３６】
［実施例１８  ＶＥＧＦの高感度検出］
血漿中の異なる濃度のＶＥＧＦに関するシステムの感度を表３１に示す。データを図２５Ａにおいて図示する。
【手続補正４１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４１】
［実施例１９  ＶＥＧＦに関する予測値に対する測定値］
図２６は、ＶＥＧＦに関して予測値に対する測定値を３つの異なる分析形式で示す。異なる固相免疫測定形式を用いた３つのヒトＶＥＧＦ分析に対する標準的な検量線（または較正曲線）を、連続的に希釈した較正試料の共通の組において作成した。ｈＶＥＧＦ  ＭＰをベースとする分析は、固相捕捉形式としての検出抗体、および蛍光ラベリングされた検出抗体で被覆された常磁性微粒子を使用する。ｈＶＥＧＦプレートをベースとする分析は、３８４−ウェルプレートを使用し、ウェルは、固相捕捉形式としての検出抗体、および蛍光ラベリングされた検出抗体で被覆した。ｈＶＥＧＦ  ＨＲＰ−ＥＬＩＳＡ分析は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的に利用可能なＥＬＩＳＡ分析（ＬｏＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ）であり、これは、９６−ウェル固相捕捉フォーマットからなり、酵素的に共役した検出抗体を使用する。
【手続補正４２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４２】
［実施例２０  血漿および細胞溶解物の小体積試料中のＶＥＧＦの検出］
健康な患者および乳癌患者からの１０μｌの試料において検出されたヒトＶＥＧＦのレベルを比較した。標準的なＥＬＩＳＡ形式（ＬＯＤ＝３１．２ｐｇ／ｍｌ）に対する、本発明の方法を用いた検出限界（ＬＯＤ）（Ｅｒｒｅｎａ；ＬＯＤ＝３．５ｐｇ／ｍｌ）を示す。ヒト血漿（図２７Ａ）および組織（図２７Ｂ）試料を、Ｅｒｅｎｎａ  ｈＶＥＧＦ−Ａ免疫測定で試験した。（図２７Ａ）ｈＶＥＧＦ−Ａの血中濃度を、健康な血液ドナー（ｎ＝２４）および乳癌の被験体（ｎ＝１５）からの血漿試料において測定した。血漿ＶＥＧＦレベルのメジアンおよび４分位範囲を計算し、健康な供血者と乳癌の被験体との間で比較した。（図２７Ｂ）乳癌の被験体（ｎ＝１０）からの適合された悪性組織生検標本と非悪性（または良性）組織生検標本との、メジアンおよび４分位範囲の比較。組織試料を、手術後に正常または悪性のいずれかとして指定し、結果を、試料当たりの全タンパク質１ｍｇ当たりのＶＥＧＦタンパク質（ｐｇ）で示す。標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いた定量は、健康な試料の質の悪い定量を示したが、本発明による血漿試料の定量には、健康な被験体および癌の被験体から試験された全ての試料が含まれた。標準的なＥＬＩＳＡ分析を用いた定量は、健康な試料の質の悪い定量を示すが、血漿における場合と同様に、本発明による組織試料の定量には健康な被験体および癌の被験体から試験された全ての試料が含まれる。
【手続補正４３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５４３】
［実施例２１  組み合わされたアナログおよびデジタルＶＥＧＦ測定］
図２８は、本発明に関する読み出し方法の相関を示す。ｈＶＥＧＦ被分析物に対して検量線を作成し、Ｅｒｅｎｎａシステムを用いて測定した。３つの異なる読み出し方法の各々に対して結果を示す：（ａ）全光子（ＴＰ）、これは標準的なＥＬＩＳＡプレート・リーダー技術に類似している；（ｂ）検出されたイベント（ＤＥ）、これはインタロゲーション・ゾーンを通過する単一分子を別々のイベントとしてカウントする；ならびに（ｃ）全光子および検出されたイベントを組み合わせる処理アルゴリズムの使用。（図２８Ａ）および（図２８Ｂ）傾きによって除された２標準偏差の平均を用いた各方法（ＤＥおよびＴＰ）の結果を用いて、ＬｏＤを計算した。図２８Ａおよび図２８Ｂにおけるデータを、４つのパラメータの曲線を用いて分析した。線形回帰を用いて図２８Ｃにおけるデータを分析し、得られた方程式および相関統計を示す。