【手続補正書】
【提出日】平成24年1月20日(2012.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）それぞれが
ｉ）パーキンタンパク質および
ｉｉ）複数の被験物質のうちの１種
を含む複数の被験サンプルを熱不安定化条件に曝露すること；
ｂ）該被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性を、被験物質の非存在下で該熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質を含むコントロールサンプルと比較して決定すること
を含むスクリーニングアッセイであって、
パーキンリガーゼ活性が該コントロールサンプル中の該リガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質は、パーキンソン病の処置のための候補化合物と同定される
アッセイ。
【請求項２】
被験物質の非存在下で前記熱不安定化条件に曝露したパーキンはその当初のＥ３リガーゼ活性の４０〜７０％を保持する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記熱不安定化条件は
（ａ）４５〜６０℃の温度での３０〜１８０分間のインキュベーション；
（ｂ）約５７℃の温度での約９０分間のインキュベーション；または
（ｃ）約６０℃の温度での約１５０分間のインキュベーション
を含む、請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
候補化合物がパーキン安定剤であるかパーキンアゴニストであるかを決定することをさらに含む請求項１に記載のアッセイであって、
該化合物の存在下および非存在下で、減弱していないパーキンタンパク質をインキュベートし、パーキンリガーゼ活性を増大させる化合物はパーキンアゴニストと同定され、パーキンリガーゼ活性を増大させない化合物はパーキン安定剤と同定されること
を含む、アッセイ。
【請求項５】
前記候補化合物をそれに対応する被験サンプルの前記パーキンリガーゼ活性に応じてランク付けすることをさらに含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
パーキン活性の正のモジュレーターの特異性を評価するインビトロアッセイであって、該インビトロアッセイは、
（ａ）請求項１に記載の方法を用いてパーキン活性の正のモジュレーターを同定すること；
（ｂ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を該基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の条件下、該Ｅ３リガーゼタンパク質および該パーキン基質タンパク質をパーキン活性の正のモジュレーターの存在下で一緒にインキュベートすること；
（ｄ）該正のモジュレーターの存在下および非存在下で該Ｅ３リガーゼのリガーゼ活性を比較することを含み、該正のモジュレーターが存在する場合、Ｅ３リガーゼ活性における増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないことを示し、増大がないことは、該正のモジュレーターがパーキンに完全に特異的であることを示す、
インビトロアッセイ。
【請求項７】
前記正のモジュレーターの存在下での基質のユビキチン化の増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないが、該正のモジュレーターは不完全に特異的であることを示し、ここで、不完全に特異的とは、前記非パーキンのＥ３についてのＥＣ１０が１００μＭ以下であり、パーキンについてのＥＣ１０よりも少なくとも４倍大きいことと定義される、請求項６に記載のインビトロアッセイ。
【請求項８】
パーキンリガーゼ活性は（ａ）パーキンタンパク質、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチンおよびパーキン基質タンパク質を適切な緩衝液中で組み合わせること、（ｂ）その組み合わせたものを２０〜３７℃でインキュベートすること、および（ｃ）該パーキン基質タンパク質のユビキチン化の速度または程度を測定することで決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記パーキン基質タンパク質はＳ５ａ、セプチン４またはトロポニン１である、請求項８に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＲＩＮＧ  Ｅ３リガーゼ、Ｍｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰからなる群から選択される、請求項６または７に記載のアッセイ。
【請求項１１】
パーキンソン病の処置のための化合物を選択する方法であって：（ａ）請求項１に記載のアッセイを用いてパーキン活性の正のモジュレーターを同定すること；（ｂ）（ａ）の正のモジュレーターをパーキン安定剤またはパーキンアゴニストと同定すること；（ｃ）パーキン以外のＥ３リガーゼによるパーキン基質のユビキチン化に対する該モジュレーターの作用に基づき、パーキン特異的である正のモジュレーターを選択すること；および（ｄ）パーキンによる複数のパーキン基質のユビキチン化を正に調節する能力に基づき、基質特異的でない正のモジュレーターを選択することを含む、方法。
【請求項１２】
前記複数のパーキン基質はセプチン４を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のパーキン基質はセプチン４と、Ｓ５ａまたはトロポニン１の一方または両方とを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
パーキンリガーゼ活性はドナー発色団がユビキチンに結合し、アクセプター発色団がパーキン基質に結合しているか、またはドナー発色団がパーキン基質に結合し、アクセプター発色団がユビキチンに結合している蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて決定される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記ドナー発色団はユーロピウムクリプレート（ｃｒｙｐｌａｔｅ）であり、前記アクセプター発色団はアロフィコシアニンである、請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
パーキンソン病を処置するための組成物であって、請求項１に記載のアッセイにより同定された候補化合物を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
一態様では、本発明は、パーキンソン病を処置する方法であって、そうした処置を必要とする患者に、本発明の方法により同定された候補化合物を投与するか、またはそうした候補化合物の誘導体を投与することを含む方法を提供する。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）それぞれが
ｉ）パーキンタンパク質および
ｉｉ）複数の被験物質のうちの１種
を含む複数の被験サンプルを熱不安定化条件に曝露すること；
ｂ）該被験サンプル中のパーキンリガーゼ活性を、被験物質の非存在下で熱不安定化条件に曝露したパーキンタンパク質を含むコントロールサンプルと比較して決定すること
を含むスクリーニングアッセイであって、
パーキンリガーゼ活性が該コントロールサンプル中の該リガーゼ活性を上回る被験サンプル中に含まれる被験物質は、パーキンソン病の処置のための候補化合物と同定される
アッセイ。
（項目２）
被験物質の非存在下で前記熱不安定化条件に曝露したパーキンはその当初のＥ３リガーゼ活性の４０〜７０％を保持する、項目１に記載のアッセイ。
（項目３）
前記熱不安定化条件は４５〜６０℃の温度での３０〜１８０分間のインキュベーションを含む、項目２に記載のアッセイ。
（項目４）
前記熱不安定化条件は約５７℃の温度での約９０分間のインキュベーションを含む、項目２に記載のアッセイ。
（項目５）
前記熱不安定化条件は約６０℃の温度での約１５０分間のインキュベーションを含む、項目２に記載のアッセイ。
（項目６）
パーキンリガーゼ活性はパーキンタンパク質、ユビキチン活性化酵素Ｅ１、ユビキチン結合酵素Ｅ２、ＡＴＰ、ユビキチンおよびパーキン基質を適切な緩衝液中で組み合わせ、その組み合わせたものを２０〜３７℃でインキュベートし、該パーキン基質のユビキチン化の速度または程度を測定することで決定される、項目１に記載のアッセイ。
（項目７）
前記パーキン基質はＳ５ａ、セプチン４またはトロポニン１である、項目６に記載のアッセイ。
（項目８）
前記パーキン基質はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現されるＳ５ａである、項目７に記載のアッセイ。
（項目９）
パーキンリガーゼ活性はドナー発色団がユビキチンに結合し、アクセプター発色団がパーキン基質に結合しているか、またはドナー発色団がパーキン基質に結合し、アクセプター発色団がユビキチンに結合している蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイを用いて決定される、項目１に記載のアッセイ。
（項目１０）
前記ドナー発色団はユーロピウムクリプレート（ｃｒｙｐｌａｔｅ）であり、前記アクセプター発色団はアロフィコシアニンである、項目９に記載のアッセイ。
（項目１１）
前記パーキン基質はＳ５ａである、項目９に記載のアッセイ。
（項目１２）
１５３６ウェルプレートで行われる、項目９に記載のアッセイ。
（項目１３）
パーキン安定剤であるパーキン活性の正のモジュレーターをパーキンアゴニストである候補化合物と識別することをさらに含む項目１に記載のアッセイであって、
該化合物の存在下および非存在下で、減弱していないパーキンタンパク質をインキュベートし、パーキンリガーゼ活性を増大させる化合物はパーキンアゴニストと同定され、パーキンリガーゼ活性を増大させない化合物はパーキン安定剤と同定されること
を含む、アッセイ。
（項目１４）
前記候補化合物をそれに対応する被験サンプルの前記パーキンリガーゼ活性に応じてランク付けすることをさらに含む、項目１に記載のアッセイ。
（項目１５）
パーキン活性の正のモジュレーターの特異性を評価するインビトロ法であって、該インビトロ法は、
（ａ）項目１に記載の方法を用いてパーキンの正のモジュレーターを同定すること
（ｂ）パーキン以外のＥ３リガーゼタンパク質およびパーキン基質タンパク質を該基質がユビキチン化される条件下で一緒にインキュベートすること；
（ｃ）（ｂ）の条件下、該Ｅ３リガーゼタンパク質および該パーキン基質タンパク質をパーキン活性の正のモジュレーターの存在下で一緒にインキュベートすること；
（ｄ）該正のモジュレーターの存在下および非存在下で該Ｅ３リガーゼのリガーゼ活性を比較することを含み、該正のモジュレーターが存在する場合、Ｅ３リガーゼ活性における増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないことを示し、増大がないことは、正のモジュレーターがパーキンに完全に特異的であることを示す、
インビトロ法。
（項目１６）
前記正のモジュレーターの存在下での基質のユビキチン化の増大は、該正のモジュレーターがパーキンに完全には特異的でないが、正のモジュレーターは不完全に特異的であることを示し、ここで、不完全に特異的とは、前記非パーキンのＥ３についてのＥＣ１０が１００μＭ以下であり、パーキンについてのＥＣ１０よりも少なくとも４倍大きいことと定義される、項目１５に記載のインビトロアッセイ。
（項目１７）
前記パーキン基質はＳ５ａである、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記パーキン基質はトロポニン１である、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＲＩＮＧ  Ｅ３リガーゼである、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＭｄｍ２、Ｎｅｄｄ４、Ｍｕｒｆ１およびＥ６ＡＰからなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｅ３リガーゼタンパク質はＭｕｒｆ１である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
パーキンソン病の処置のための化合物を選択する方法であって：（ａ）パーキン活性の正のモジュレーターを同定すること；（ｂ）（ａ）の正のモジュレーターをパーキン安定剤またはパーキンアゴニストと同定すること；（ｃ）パーキン以外のＥ３リガーゼによるパーキン基質のユビキチン化に対する該モジュレーターの作用に基づき、パーキン特異的である正のモジュレーターを選択すること（ｄ）パーキンによる複数のパーキン基質のユビキチン化を正に調節する能力に基づき、基質特異的でない正のモジュレーターを選択することを含む、方法。
（項目２３）
前記複数のパーキン基質はセプチン４を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記複数のパーキン基質はセプチン４と、Ｓ５ａまたはトロポニン１の一方または両方とを含む、項目２２に記載の方法。
（項目２５）
パーキンソン病を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に項目１に記載の方法により同定された候補化合物を投与すること、またはそのような候補化合物の誘導体を投与することを含む、方法。