【手続補正書】
【提出日】平成21年11月4日(2009.11.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体を認識する物質で表面修飾されたシリカナノ粒子であって、吸光物質又は蛍光物質からなる標識物質を有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍの前記シリカナノ粒子を、合成高分子及び天然高分子で処理することを特徴とするイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記合成高分子がポリエチレングリコールであり、前記天然高分子がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であることを特徴とする請求項１に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記シリカナノ粒子を含有する液中に、前記合成高分子を含有する溶液及び天然高分子を含有する溶液を順次に添加することを特徴とする請求項１又は２に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を含有する液を、ガラスファイバーパッドに粒子重量が単位面積（ｃｍ２）当たり５０μｇ〜２ｍｇとなるように含浸させ、続いて室温で減圧乾燥することを特徴とするイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法で製造されるイムノクロマト法用コンジュゲートパッドと、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化した抗体固定化部を有するメンブレンと、吸収パッドとがこの順に直列連結してなるイムノクロマト法用テストストリップを用い、その前記イムノクロマト法用コンジュゲートパッドに、検体を含有する液体を滴下し、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を前記検体を含有する液体に再分散させると共に、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子と検体の結合反応を生じさせ、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子と検体との複合体及び検体と結合反応を生じなかった前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を毛細管現象でメンブレンを移動させることを特徴とする、前記イムノクロマト法用テストストリップの使用方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】イムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、標識物質を含有したシリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑みて、含有される標識物質を変えることで様々な色相、蛍光波長等を付与することができ、かつ凝集等によっても黒ずんだ色にならないイムノクロマト用標識シリカナノ粒子の製造方法、イムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法、及びそれを用いたイムノクロマト法用テストストリップの使用方法を提供することにある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本発明の上記の課題は下記手段により達成された。
（１）検体を認識する物質で表面修飾されたシリカナノ粒子であって、吸光物質又は蛍光物質からなる標識物質を有してなる平均粒径２０〜６００ｎｍの前記シリカナノ粒子を、合成高分子及び天然高分子で処理することを特徴とするイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
（２）前記合成高分子がポリエチレングリコールであり、前記天然高分子がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であることを特徴とする（１）に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
（３）前記シリカナノ粒子を含有する液中に、前記合成高分子を含有する溶液及び天然高分子を含有する溶液を順次に添加することを特徴とする（１）又は（２）に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子の製造方法。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のイムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を含有する液を、ガラスファイバーパッドに粒子重量が単位面積（ｃｍ２）当たり５０μｇ〜２ｍｇとなるように含浸させ、続いて室温で減圧乾燥することを特徴とするイムノクロマト法用コンジュゲートパッドの製造方法。
（５）（４）に記載の方法で製造されるイムノクロマト法用コンジュゲートパッドと、抗体溶液を塗布、滴下ないしは噴霧後、乾燥して物理吸着により固定化した抗体固定化部を有するメンブレンと、吸収パッドとがこの順に直列連結してなるイムノクロマト法用テストストリップを用い、その前記イムノクロマト法用コンジュゲートパッドに、検体を含有する液体を滴下し、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を前記検体を含有する液体に再分散させると共に、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子と検体の結合反応を生じさせ、前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子と検体との複合体及び検体と結合反応を生じなかった前記イムノクロマト法用標識試薬シリカナノ粒子を毛細管現象でメンブレンを移動させることを特徴とする、前記イムノクロマト法用テストストリップの使用方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の製造方法によれば、様々な吸光特性および蛍光特性を付与することができるので、各種イムノクロマト法に好適に用いられるイムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子及びこれを用いたコンジュゲートパッドを製造することができる。
また、本発明のイムノクロマト法用テストストリップの使用方法によれば以下のすべて又はいずれかの作用効果を奏する。
・様々な吸光特性および蛍光特性を付与することができ、複数種の検体の同時分析に好適である。
・複数種の検体の同時検出、定量又は判定が可能であり、新たなＰＯＣＴの診断手法として好適である。
・蛍光検出による高感度検出ないしは定量が可能である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【図１】図１ａは本発明において好適に用いられるイムノクロマト法用テストストリップの平面図を示し、図１ｂは、ａで示されたイムノクロマト法用テストストリップの平面図の縦断面図を示す図である。
【図２】図２は、実施例で得られた標識物質を含有するシリカナノ粒子のＴＥＭ写真像を示す図である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
まず、本発明の製造方法及びこれにより得られるイムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子について説明する。本発明の製造方法により得られるイムノクロマト法試薬用標識シリカナノ粒子は、標識物質を含有してなるシリカナノ粒子からなる。前記標識シリカナノ粒子の平均粒径は２０〜６００ｎｍであることが好ましく、６０〜３００ｎｍであることがより好ましい。粒径が小さすぎると、検出感度が低下し、粒径が大きすぎると、イムノクロマト法に用いられる多孔質支持体（メンブレン）の目詰まりの原因となる。
本発明において、前記平均粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）等の画像から無作為に選択した５０個のシリカナノ粒子の合計の投影面積からシリカナノ粒子の占有面積を画像処理装置によって求め、この合計の占有面積を、選択したシリカナノ粒子の個数（５０個）で割った値に相当する円の直径の平均値（平均円相当直径）を求めたものである。
粒度分布の変動係数いわゆるＣＶ値は特に制限はないが、１０％以下が好ましく、８％以下がより好ましい。
本明細書及び特許請求の範囲において、単分散とはＣＶ値１５％以下の粒子群をいう。
本発明において、用いるシリカ粒子は特に制限はなく、任意のいかなる調製方法によって得られたシリカ粒子であってもよい。例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １５９，  １５０−１５７（１９９３）に記載のゾル−ゲル法で調製されるシリカ粒子等が挙げられる。
本発明者らは、蛍光色素化合物含有コロイドシリカ粒子の調製方法について特許出願している（例えば、特願２００５−３７６４０１）。その方法に準じて得られた、標識物質を含有するシリカナノ粒子を用いることが特に好ましい。
具体的には、前記標識物質を含有するシリカナノ粒子は、前記標識物質とシラン化合物とを反応させ、共有結合、イオン結合その他の化学的に結合もしくは吸着させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
前記標識物質を含有するシリカナノ粒子の好ましい調製方法の態様としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基、マレイミド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、アルデヒド基、パラニトロフェニル基、ジエトキシメチル基、エポキシ基、シアノ基等の活性基を有する前記標識物質と、それら活性基と対応して反応する置換基（例えば、アミノ基、水酸基、チオール基）を有するシランカップリング剤とを反応させ、共有結合させて得られた生成物に１又は２種以上のシラン化合物を重合させることにより調製することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
次に、本発明において好適に用いられるイムノクロマト法試薬について説明する。このイムノクロマト法試薬は、前記本発明の製造方法により得られる標識シリカナノ粒子からなり、前述のように検体を認識する物質で表面修飾されていることが好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
上記のイムノクロマト法試薬として、前述のように前記標識物質として吸光物質又は蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子からなることが好ましい。
前記吸光物質としては、前記任意の光源による光を吸光する物質であれば特に制限はなく、プレートリーダー等の汎用の検出器（例えば、Ｖｍａｘ（商品名、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）、マイクロプレートリーダーＭＰＲ−Ａ４ｉ（商品名、東ソー社製））による検出およびデータの互換性の観点から、吸光スペクトルにおける吸光最大波長が２００〜８００ｎｍの範囲内にある吸光物質が好ましく、吸光スペクトルにおける吸光最大波長が４００〜７００ｎｍの範囲にある吸光物質がより好ましい。
ここで、「吸光最大波長」とは、吸光スペクトルにおいて、吸収ピークが複数存在する場合において、前記吸収ピークの中で、吸光度が最大であるものの波長をいう。
吸光スペクトルにおける吸光最大波長が２００〜８００ｎｍの範囲内に存在する吸光物質である限り、任意の吸光性色素を用いることができるが、下記式で表されるＤＹＱ−６６０（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ社製）のＮＨＳエステル等が好ましい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
上記のイムノクロマト法試薬において、前記標識物質として蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子であって、検体を認識する物質で表面修飾されたシリカナノ粒子を用いる場合には、前記シリカナノ粒子が発する蛍光を検出することにより高感度検出ないしは定量が可能である。
前記蛍光物質は特に制限はないが、汎用の検出器（例えば、ＡＥ−６９３１ＦＸＣＦ  プリントグラフ（商品名、ＡＴＴＯ社製））による検出およびデータの互換性の観点から、青色蛍光（４４０〜４９０ｎｍ）、黄色蛍光（５４０〜５９０ｎｍ）、オレンジ色蛍光（５９０〜６２０ｎｍ）又は赤色蛍光（６２０〜７４０ｎｍ）である蛍光物質が好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
次に、本発明のイムノクロマト法用テストストリップの使用方法について説明する。
本発明の方法に好適に用いられるイムノクロマト法用テストストリップは、
（１）試料添加用部材（サンプルパッド）と前記標識シリカ粒子を含浸させてなる部材（コンジュゲートパッド）とが、
（２）前記コンジュゲートパッドと抗体固定化部を有するメンブレン（抗体固定化メンブレン）とが、並びに
（３）前記抗体固定化メンブレンと吸収パッドとが
相互に毛細管現象が生じるように直列連結していることがより好ましい。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
図１ａ及びｂを参照して、本発明の方法に用いられるイムノクロマト法用テストストリップの好ましい１つの実施態様について説明する。
図１ａは本発明の方法に好適に用いられるイムノクロマト法用テストストリップの平面図を示し、図１ｂは、ａで示されたイムノクロマト法用テストストリップの平面図の縦断面図を示す図である。このイムノクロマト法用テストストリップ１は、試料添加用部材（サンプルパッド）２、標識シリカナノ粒子含浸部材（コンジュゲートパッド）３、抗体固定化メンブレン４、吸収パッド５からなることが好ましい。上記各構成部材は粘着剤付きバッキングシート６により裏打ちされていることがより好ましい。前記メンブレン４における抗体固定化部としては、検体の有無を判定、すなわち陽性陰性を判定するための捕捉用抗体が固定化されたテストライン４１、および標識シリカ粒子により標識された全ての検体を捕捉する抗体が固定化されたコントロールライン４２を含むことが好ましい。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明の製造方法によれば、イムノクロマト法試薬としての前記標識シリカナノ粒子は、異なる種類の前記標識物質を含有させることにより様々な色相、蛍光波長等を付与することができる。そのようにして得られた２種類以上の標識シリカナノ粒子を用いることによって、例えば、前記テストストリップにおいて、２種類以上の検体を１回の操作で同時に検出、定量、判定又は診断することが可能である。
このとき、前記２種類以上の標識シリカナノ粒子は、それぞれ、異なる検体に対して分子認識する表面修飾物質で修飾されていることが必要である。
具体例としては、Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質を認識するマウス抗Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で表面修飾された赤色色素（例えば、ローダミン）含有シリカナノ粒子と、
Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質を認識するマウス抗Ｂ型インフルエンザウイルス核タンパク質モノクローナル抗体で表面修飾された青色色素（例えば、ＤＹＱ−６６０（商品名、Ｄｙｏｍｉｃｓ社製））含有シリカナノ粒子とからなるイムノクロマト法試薬、及びそれを用いてなるテストストリップ等が挙げられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
次に、イムノクロマト法用蛍光検出システムについて説明する。
イムノクロマト法用蛍光検出システムは、本発明の製造方法により得られる前記標識物質として蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子をイムノクロマト法試薬として用いた場合、具体的には前述のようなテストストリップに用いた場合に使用することができる。
すなわち、本発明の蛍光検出システムは、少なくとも下記（１）及び（２）の構成からなる。
（１）サンプルパッド、蛍光物質を含有してなるシリカナノ粒子を含浸した部材（コンジュゲートパッド）、抗体固定化メンブレン及び吸収パッドからなるテストストリップ、及び
（２）励起光源。
前記テストストリップはバッキングシートにより裏打ちされていることが好ましい。
本発明の蛍光検出システムにおいて、前記シリカナノ粒子の部分が発する蛍光を目視等によって検出する観点から、前記励起光源が、波長２００ｎｍ〜４００ｎｍの励起光を発することが好ましい。前記励起光源としては、水銀ランプ、ハロゲンランプ又はキセノンランプが挙げられる。
また、この蛍光検出システムは、前記励起光源から特定の波長の光のみを透過するためのフィルタを備えていることがより好ましく、さらに、蛍光のみを目視等で検出する観点から、前記励起光を除去し蛍光のみを透過するフィルタを備えていることがさらに好ましい。上記の蛍光検出システムは、前記蛍光を受光する光電子倍増管又はＣＣＤ検出器を備えることが特に好ましく、これにより目視では確認できない強度ないしは波長の蛍光も検出でき、さらにはその蛍光強度を測定できることから検体の定量もでき、高感度検出及び定量が可能となる。