(57)【要約】【課題】有機塩素化合物分解微生物を検出する方法であって、検出の信頼性が向上可能な検出方法の提供【解決手段】被検試料から有機塩素化合物分解酵素遺伝子を保持する微生物を検出する方法であって、前記遺伝子に特異的なプローブのスポットが配置されたマイクロアレイを準備する工程と、標識化合物で標識されたターゲットを前記被検試料中の核酸を用いて前記遺伝子領域を増幅可能なＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により調製する工程と、前記ターゲットを前記マイクロアレイにハイブリダイズして前記標識のシグナルを測定する工程とを含み、前記プローブが、前記ターゲットの３’末端側の領域の配列に相補的な配列のプローブを含む。【選択図】図１
2008228681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料から有機塩素化合物分解酵素遺伝子を保持する微生物を検出する方法であって、
前記遺伝子に特異的なプローブのスポットが配置されたマイクロアレイを準備する工程と、標識化合物で標識されたターゲットを前記被検試料中の核酸を用いて前記遺伝子領域を増幅可能なＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により調製する工程と、前記ターゲットを前記マイクロアレイにハイブリダイズして前記標識のシグナルを測定する工程とを含み、
前記プローブが、前記ターゲットの３’末端側の領域の配列に相補的な配列のプローブを含むことを特徴とする検出方法。
【請求項２】
前記有機塩素化合物分解酵素遺伝子が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１のｐｃｅＣ遺伝子、又は、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＴＣＥ−１のｐｃｅＡ遺伝子である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記ｐｃｅＣ遺伝子のプローブが、下記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチドであり、前記ｐｃｅＡ遺伝子に対するプローブが、下記（５）〜（８）のいずれかのポリヌクレオチドである請求項２記載の検出方法。
（１）配列表の配列番号１〜８の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１〜８の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１〜８の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列表の配列番号１〜８の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号９〜１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（７）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（８）前記（５）から（７）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機塩素化合物分解微生物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）やトリクロロエチレン（ＴＣＥ）をはじめ各種の有機塩素化合物による地下水や土壌の汚染は世界共通の深刻な問題であり、しばしば、新聞紙上等のマスコミでも詳細に取り上げられている。これらの物質による環境汚染を修復する生物的方法（バイオレメディエーション）の技術開発が社会的に強く要求されている。バイオレメディエーションの方法の１つに、汚染された土壌や地下水に元来生息する微生物に、例えば、各種栄養物質等を供給し、微生物の持つ環境汚染物質の分解除去能力を増強させる方式（バイオスティミュレーション）がある。
【０００３】
バイオスティミュレーションを行うためには、まず、汚染環境中に有用な遺伝子を持つ有機塩素化合物分解微生物の存在を確認する必要がある。前記有機塩素化合物分解微生物を検出・同定する方法としては、例えば、マイクロアレイを用いる方法が提案されている（例えば、特許文献１及び２）。これらの方法は、微生物に特異的な配列をプローブに使用し、既知の微生物を検出・同定する方法である。
【特許文献１】特開２００５‐２３７２５０号公報
【特許文献２】特開２００６‐３２５５２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、既知の微生物種のみを検出するのでは、例えば、有用な有機塩素化合物分解遺伝子が水平伝播して新たなに前記遺伝子を保持するようになった微生物を見落とす可能性がある。
【０００５】
また、ＤＮＡマイクロアレイを用いる従来の方法では、ターゲットに対するプローブの相対的な位置によって検出感度が異なることがある。すなわち、検出ターゲットの３’末端側の領域の配列に相当するプローブの検出感度が著しく低下する問題がある。
【０００６】
そこで、本発明は、有用な有機塩素化合物分解酵素遺伝子を検出することによりバイオスティミュレーションに役立つ有機塩素化合物分解微生物を検出する方法であって、検出の信頼性が向上可能な検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明は、被検試料から有機塩素化合物分解酵素遺伝子を保持する微生物を検出する方法であって、前記遺伝子に特異的なプローブのスポットが配置されたマイクロアレイを準備する工程と、標識化合物で標識されたターゲットを前記被検試料中の核酸を用いて前記遺伝子領域を増幅可能なＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により調製する工程と、前記ターゲットを前記マイクロアレイにハイブリダイズして前記標識のシグナルを測定する工程とを含み、前記プローブが、前記ターゲットの３’末端側の領域の配列に相補的な配列のプローブを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、微生物種ではなく有機塩素化合物分解酵素遺伝子を検出することで、例えば、バイオスティミュレーションに有用な既知の微生物に加え、例えば、水平伝播等により該遺伝子を有することとなった未知の有用な微生物をも検出できる。
【０００９】
また、本発明によれば、マイクロアレイのターゲット配列に対するプローブの相対的な位置効果を抑制できるから、例えば、より信頼性が向上した検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の検出方法において、前記有機塩素化合物分解酵素遺伝子としては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１のｐｃｅＣ遺伝子、又は、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＴＣＥ−１のｐｃｅＡ遺伝子があげられる。
【００１１】
本発明の検出方法において、前記ｐｃｅＣ遺伝子のプローブは、下記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチドであってもよく、前記ｐｃｅＡ遺伝子に対するプローブは、下記（５）〜（８）のいずれかのポリヌクレオチドであってもよい。
（１）配列表の配列番号１〜８の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（２）配列表の配列番号１〜８の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号１〜８の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（３）配列表の配列番号１〜８の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（１）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（４）前記（１）から（３）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（５）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（６）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、配列表の配列番号９〜１３の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（７）配列表の配列番号９〜１３の塩基配列の１個から数個の塩基が、欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、前記（５）のポリヌクレオチドとの相同性が９０％以上であるポリヌクレオチド。
（８）前記（５）から（７）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１２】
本発明において、「有機塩素化合物分解酵素」とは、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）及びこれらの脱ハロゲン化物（例えば、ジクロロレチレン、塩化ビニル）のいずれかを分解できる酵素をいう。前記分解としては、例えば、脱塩素があげられる。前記有機塩素化合物分解酵素としては、ＰＣＥをシスジクロロエチレンに分解するデハロゲナーゼがあげられる。前記デハロゲナーゼとしては、嫌気性バクテリアＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１のｐｃｅＣ遺伝子の遺伝子産物、又は、嫌気性バクテリアＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＴＣＥ−１のｐｃｅＡ遺伝子の遺伝子産物があげられる。その他にも、Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓのｐｃｅＡ遺伝子、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｃｅ  Ｙ５１のｐｃｅＡ遺伝子、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＴＣＥ１のｐｃｅＡ遺伝子、Ｄｅｈａｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｕｓ  ＰＥＲ−Ｋ２３のｐｃｅＡ遺伝子、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ  １９５のｔｃｅＡ遺伝子、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ ｓｐ．  ＶＳのｖｃｒＡ遺伝子、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．のｐｒｄＡ遺伝子、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓのｃｐｒＡ遺伝子の遺伝子産物等があげられる。
【００１３】
本発明において、「プローブ」とは、前記有機塩素化合物分解酵素をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドを含むプローブである。本発明の検出方法において、プローブは、前記遺伝子のターゲット増幅領域内であればどの位置であっても設定することができる。前記プローブの長さとしては、特に制限されないが、例えば、２０〜１００ヌクレオチドであって、好ましくは４０〜８０ヌクレオチドである。プローブのポリヌクレオチドとしては、特に限定されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は、従来公知のこれらの誘導体や類縁体等を使用できる。プローブの製造方法としては、特に制限されず、例えば、従来公知の方法により化学合成により製造してもよく、酵素的にインビボ又はインビトロで製造してもよい。本発明では、前記プローブをＤＮＡマイクロアレイとして利用するから、前記プローブには、マイクロアレイの基板に固定するための修飾がされていてもよい。前記修飾は、使用するマイクロアレイ基板の種類に応じて従来公知のものを選択できるが、例えば、プローブのポリヌクレオチドの５’又は３’側のＣ（３〜７）アミノ化等が挙げられる。
【００１４】
前記ｐｃｅＣ遺伝子に対するプローブとしては、前記（１）〜（４）のいずれかのポリヌクレオチドが好ましく、前記ｐｃｅＡ遺伝子に対するプローブとしては、上記（５）〜（８）のいずれかのポリヌクレオチドが好ましい。
【００１５】
本発明において、「ターゲット」とは、被検試料中の核酸と前記有機塩素化合物分解酵素遺伝子又はその一部の領域を増幅可能なプライマーとを用いてＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により増幅して調製されたポリヌクレオチドをいう。前記ＬＡＴＥ−ＰＣＲにおいて、過剰プライマーが、標識化合物により標識化されていることが好ましい。前記ｐｃｅＣ遺伝子に対する検出用ＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーとしては、配列表の配列番号１４及び１５のポリヌクレオチド対があげられる。前記ｐｃｅＡ遺伝子に対する検出用ＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーとしては、配列表の配列番号１６及び１７のポリヌクレオチド対があげられる。
【００１６】
上述したとおり、本発明の検出方法であれば、プローブは、ターゲットとの相対的な位置効果の考慮することなく設定できる。すなわち、前記ターゲットの領域内であれば、前記ターゲットの３’末端側に位置するプローブも好ましく使用できる。前記３’末端側とは、例えば、前記ターゲットの領域の中央から３’末端にかけての領域であって、好ましくは、前記ターゲットの３’末端側の３分の１の領域である。
【００１７】
本発明において、「プローブのスポットが配置されたマイクロアレイ」とは、基材と、前記基材の表面上に規則的に配置された前記プローブのスポットとを含むマイクロアレイをいう。前記プローブの種類は、１又は１以上であることが好ましい。前記マイクロアレイの製造方法は、特に制限されず、例えば、プローブ溶解液を基材に微小滴下するインクジェット法や、半導体製造技術で用いられるフォトリソグラフィー法を応用した方法等の従来公知の方法を利用して製造できる。前記基材としては、特に制限されず、例えば、ガラス、金属、プラスチック等が挙げられる。
【００１８】
本発明において、「ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法」とは、アシンメトリックＰＣＲ法を改良した方法をいう（Ｌｉｎｅａｒ−Ａｆｔｅｒ−Ｔｈｅ−Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ−ＰＣＲ；  Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＰＮＡＳ，  １０１（７）；  １９３３−１９３８）。アシンメトリックＰＣＲ法とは、１組のプライマーのモル比を、例えば、１００：１のように不均等にして、主に単一鎖ＤＮＡ産物を生成することを目的としたＰＣＲ法である。ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法のポイントは、プライマー設計であって、少ない方のプライマーのＴｍ値を、過剰な方のプライマーのＴｍ値以上とすることである。前記Ｔｍ値の計算は、例えば、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）により行うことが好ましく、例えば、前記ＰＲＩＭＲＯＳＥ等のソフトウェアにより計算できる。
【００１９】
本発明において、「標識化合物」とは、特に制限されず、例えば、発光標識や放射性標識の化合物が挙げられる。前記発光標識としては、例えば、蛍光標識、生体発光標識、化学発光標識及び比色定量標識等が挙げられ、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等の蛍光標識化合物が好ましい。市販の蛍光標識化合物としては、例えば、フルオレプライム（ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ、アマシャムファルマシア社製）、フルオレダイト（Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３及びＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）等の蛍光ホスホルアミダイト類が挙げられる。
【００２０】
本発明において、「被検試料」は、特に制限されず、例えば、土壌、地下水、池、海水等の環境から採取された試料の他、食物や生体から採取される試料であってもよい。また、後述するように、被検試料は、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、トリクロロエチレン（ＴＣＥ）及びこれらの脱ハロゲン化物からなる群から選択される有機塩素化合物で汚染された環境から採取された試料であってもよい。
【００２１】
次に、本発明の検出方法について説明する。
【００２２】
（マイクロアレイ準備工程）
まず、マイクロアレイを準備する工程において、前記有機塩素化合物分解酵素遺伝子に対する前記プローブが基板上に配置されたマイクロアレイを準備する。前記プローブは、１種類又は複数種類の前記遺伝子に対するものが配置されていてもよい。また、前記プローブは、１種類の前記遺伝子に対して複数種類のプローブが配置されることが好ましい。上述したとおり、前記ターゲットの３’末端側に位置するプローブも好ましく使用できる。
【００２３】
（ターゲット準備工程）
つぎに、ターゲットを準備する工程において、前記遺伝子領域を増幅可能なＬＡＴＥ−ＰＣＲ法により標識化合物で標識されたターゲットを前記被検試料から抽出した核酸を用いて調製する。また、必要に応じて、競合ハイブリダイゼーションのため、前記遺伝子の標準試料を用いて、前記標識化合物と異なる標識化合物で標識されたリファレンスを調製してもよい。リファレンスの調製方法は、ターゲットの調製方法と同様であることが好ましい。前記ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法の条件は、当業者であれば適宜設定可能である。
【００２４】
（ハイブリダイゼーション工程）
つぎに、前記ターゲットを、必要に応じて前記リファレンスを混合し、前記マイクロアレイにハイブリダイズして各スポットについて標識シグナルを測定する。ハイブリダイゼーションの方法及び条件は、特に制限されず、従来公知の方法で行うことができ、当業者であれば、プローブ、ターゲット、ポリヌクレオチドの種類等によって、適宜調節できる。また、標識シグナルを検出し測定する方法は、特に制限されず、標識の種類に応じて、従来公知の方法又は装置により測定できる。
【００２５】
前記ターゲットの標識シグナル強度、又は、標識シグナルのターゲット／リファレンス比等から、前記被検試料における前記有機塩素化合物分解酵素遺伝子の有無を判定でき、その結果、前記遺伝子を保持する微生物の有無が判定できる。
【００２６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００２７】
＜ｐｃｅＣ遺伝子検出用マイクロアレイの作製＞
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１のｐｃｅＣ遺伝子のプローブを、前記遺伝子配列全体にプローブが位置するように８種類設計してＤＮＡマイクロアレイを作製した。８種類のプローブの位置を図１に示し、その配列を下記表１に示す。同図に示すとおり、プローブは、ｐｃｅＣ遺伝子のコード鎖（センス鎖）配列を使用し、ターゲットの標識化は、非コード鎖（アンチセンス鎖）配列を使用した。
【００２８】
【表１】
2008228681.tif 000003
【００２９】
＜ＬＡＴＥ−ＰＣＲとＰＣＲとの比較＞
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ用のフォワードプライマーとして配列表の配列番号１４の塩基配列からなるＤＮＡを作製し、リバースプライマーとして配列表の配列番号１５の塩基配列からなるＣｙ３標識ＤＮＡを作製した（下記表２及び図１参照）。
【００３０】
【表２】
2008228681.tif 000004
【００３１】
このＬＡＴＥ−ＰＣＲ用プライマーとｐｃｅＣ標準試料（プラスミド抽出液）とを用いて、下記条件でＬＡＴＥ−ＰＣＲ法、及び、ＰＣＲ法を行ってターゲットを調製した。
・ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法
ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法は、１ｎｇ／μｌ  ｐｃｅＣプラスミド抽出液を１．５μｌ、０．１μＭ  フォワードプライマーを０．９μｌ、１０μＭ  Ｃｙ３標識リバースプライマーを０．９μｌ、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰを１．５μｌ、１０×ＰＣＲバッファーを１．５μｌ、Ｔａｑポリメラーゼを０．０７５μｌ、水を８．６２５μｌを用いた合計１５μｌの反応溶液で行った。
・ＰＣＲ法
ＰＣＲ法は、フォワードプライマーの濃度を１０μＭとした以外は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法と同様の反応溶液で行った。
・温度サイクル条件
反応の温度サイクルは両者ともに、９４℃で１０分後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を５５サイクル行った。
【００３２】
１０μｌのＬＡＴＥ−ＰＣＲ産物及びＰＣＲ産物を、商品名：ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて精製した後に完全に乾燥させた。このように調製したターゲットをハイブリダイゼーションバッファーに溶解後、ＤＮＡマイクロアレイへのハイブリダイゼーション（６５℃、４時間）を行った。ハイブリダイゼーション後、Ｗａｓｈ１（１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）溶液で２回洗浄し、Ｗａｓｈ１溶液に浸けた状態で５分間静置した。次にＷａｓｈ２（１×ＳＳＣ）溶液で２回洗浄し、Ｗａｓｈ２溶液に浸けた状態で５分間静置した。最後にＷａｓｈ３（０．００２５×ＳＳＣ）溶液で洗浄し、２０００ｒｐｍで２分間遠心分離して乾燥させた。その後、スキャナー（商品名：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５６５ＢＡ、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いてシグナルを検出した。
【００３３】
ＰＣＲ法でターゲットの結果の一例を図２に示し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法の結果の一例を図３に示す。図２に示すとおり、ＰＣＲ法で調製したターゲットでは、プローブ５、６、７で非常に弱いシグナルとなった。これらのプローブは、図１に示すとおり、ターゲット配列の３’末端側、すなわち、ＬＡＴＥ−標識プライマーの伸長開始点から遠い位置に設計されたプローブである。これに対し、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法の場合、図３に示すとおり、ＰＣＲ法で生じたプローブの位置効果は解消されていた。
【実施例２】
【００３４】
＜競合ハイブリダイゼーション＞
ｐｃｅＣ遺伝子検出用ＤＮＡマイクロアレイの精度と特異性を確認するため、ｐｃｅＣ遺伝子同士の競合ハイブリダイゼーション、及び、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ  ＴＣＥ−１のｐｃｅＡ遺伝子との競合ハイブリダイゼーションを試みた。
【００３５】
ターゲットは、１ｎｇ／μｌ  ｐｃｅＣプラスミド抽出液をテンプレートとして用い、ＬＡＴＥ−Ｆプライマー（配列番号１４）及びＣｙ３標識ＬＡＴＥ−Ｒプライマー（配列番号１５）を用いて上記と同様にＬＡＴＥ−ＰＣＲ法を行って調製した。ｐｃｅＣ遺伝子のリファレンスは、１ｎｇ／μｌ  ｐｃｅＣプラスミド抽出液をテンプレートとして用い、ＬＡＴＥ−Ｆプライマー（配列番号１４）及びＣｙ５標識ＬＡＴＥ−Ｒプライマー（配列番号１５）を用いてＬＡＴＥ−ＰＣＲ法を行って調製した。一方、ｐｃｅＡ遺伝子のリファレンスは、１ｎｇ／μｌ  ｐｃｅＡプラスミド抽出液をテンプレートとしてＬＡＴＥ−Ｆプライマー（配列番号１６）及びＣｙ５標識ＬＡＴＥ−Ｒプライマー（配列番号１７）を用いてＬＡＴＥ−ＰＣＲ法を行って調製した。それぞれのＬＡＴＥ−ＰＣＲ産物はＡｕｔｏ  Ｓｅｑ  Ｇ５０カラムで精製した。精製したターゲットとリファレンスのＬＡＴＥ−ＰＣＲ産物を１：１で混合し、真空乾燥機で完全に乾燥させた。そして１６．５μｌのハイブリダイゼーションバッファーに溶かした後、９４℃で３分間インキュベートしてから氷上で２分静置させ、前記ＤＮＡマイクロアレイにアプライして競合ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、洗浄してからスキャンした。得られたシグナルからソフトウェア（商品名：Ａｒｒａｙ  Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社製）を用いてシグナル強度を数値化してグラフを作成した。得られたシグナルからＣｙ５をｘ軸、Ｃｙ３をｙ軸にとってｓｃａｔｔｅｒ  ｐｌｏｔを作成した。
【００３６】
その結果を図４及び図５に示す。図４に示すとおり、ｐｃｅＣ遺伝子をリファレンスに使用して競合ハイブリダイゼーションを行った場合、結合した両者のシグナルは黄色を呈し（図４Ａ）、また、スキャタープロットからｙ＝０．８７ｘ、Ｒ2＝０．９６の直線が得られた（図４Ｂ）。したがって、ターゲットＤＮＡがリファレンスＤＮＡと競合してハイブリダイズしていると考えられる。一方、ｐｃｅＡ遺伝子をリファレンスに使用して競合ハイブリダイゼーションを行った場合、結合した両者のシグナルは赤色を呈し（図５Ａ）、また、スキャタープロットからｙ＝０．０３ｘ、Ｒ2＝０．１８の直線が得られた（図５Ｂ）。したがって、ｐｃｅＡリファレンスがハイブリダイズしていないのは明らかである。
【実施例３】
【００３７】
＜土壌からのｐｃｅＣ遺伝子の検出＞
土壌１０ｇに５日間純粋培養したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１を１０ｍｌ添加し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上清を除去して土壌試料を作製した。コントロールとして、土壌１０ｇに水を１０ｍｌ添加したものを用いて、同様の操作で行った。ゲノムＤＮＡの抽出には、商品名：ＵｌｔｒａＣｌｅａｎ  Ｍｅｇａ  Ｐｒｅｐ  Ｓｏｉｌ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（ＭＯ  ＢＩＯ社製）を用いた。回収した核酸（ゲノムＤＮＡ）を使用して、実施例２と同様にｐｃｅＣ遺伝子をリファレンスとして競合ハイブリダイゼーションを行った。
【００３８】
その結果を図６及び図７に示す。図６に示すとおり、前記微生物を添加した土壌試料の場合、結合した両者のシグナルは黄色を呈し（図６Ａ）、また、スキャタープロットからｙ＝０．９６でＲ2＝０．９９の直線が得られた（図６Ｂ）。したがって、土壌に添加したＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｍｅｎｔａｎｓ  ＤＰＨ−１が保持するｐｃｅＣ遺伝子が検出できた。一方、水を添加した土壌試料の場合、結合した両者のシグナルは赤色を呈し（図７Ａ）、土壌に水のみを添加したコントロール試料ではｐｃｅＣ遺伝子は検出されなかった。これらの結果から、本発明の検出方法により、ｐｃｅＣ遺伝子を特異的に検出することができたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上説明したとおり、本発明は、例えば、環境浄化の分野、バイオレメディエーションの分野、バイオスティミュレーションの分野等で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ｐｃｅＣ遺伝子の検出用プライマーの設定位置及びターゲットのＬＡＴＥ−ＰＣＲプライマーの設定位置を示す模式図である。
【図２】図２は、ＰＣＲ法で作製したターゲットを用いたハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及び蛍光強度グラフ（Ｂ）の一例を示す。
【図３】図３は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法で作製したターゲットを用いたハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及び蛍光強度グラフ（Ｂ）の一例を示す。
【図４】図４は、ｐｃｅＣをリファレンスに使用した競合ハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及びスキャタープロット（Ｂ）の一例を示す。
【図５】図５は、ｐｃｅＡをリファレンスに使用した競合ハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及びスキャタープロット（Ｂ）の一例を示す。
【図６】図６は、ｐｃｅＣをリファレンスに使用した競合ハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及びスキャタープロット（Ｂ）のその他の例を示す。
【図７】図７は、ｐｃｅＣをリファレンスに使用した競合ハイブリダイゼーションの蛍光観察写真（Ａ）及びスキャタープロット（Ｂ）のさらにその他の例を示す。
【図８】図８は、ＰＣＥの分解経路を説明する図である。
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
配列番号１〜８：ｐｃｅＣ遺伝子プローブ１〜８
配列番号９〜１３：ｐｃｅＡ遺伝子プローブ
配列番号１４：ｐｃｅＣ遺伝子ＬＡＴＥ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１５：ｐｃｅＣ遺伝子ＬＡＴＥ−ＰＣＲ用リバースプライマー
配列番号１６：ｐｃｅＡ遺伝子ＬＡＴＥ−ＰＣＲ用フォワードプライマー
配列番号１７：ｐｃｅＡ遺伝子ＬＡＴＥ−ＰＣＲ用リバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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