【手続補正書】
【提出日】平成25年1月17日(2013.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化１９】
2012515534.tif 000001
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化２０】
2012515534.tif 000002
（ここで、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含み、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化２１】
2012515534.tif 000003
を含み、および
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化２２】
2012515534.tif 000004
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
を含み、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merであり、増幅されたＨＣＶ核酸が８０００超の塩基対を有する、方法。
【請求項２】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化２３】
2012515534.tif 000005
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化２４】
2012515534.tif 000006
（ここで、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化２５】
2012515534.tif 000007
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化２６】
2012515534.tif 000008
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５：
【化２７】
2012515534.tif 000009
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６および配列番号１７：
【化２８】
2012515534.tif 000010
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅されたＨＣＶ核酸が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端で配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（ここで、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化３７】
2012515534.tif 000011
のヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１段階のＰＣＲの後に前記第２段階のＰＣＲを行い、それぞれの前記第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、
ａ）温度Ｔ１で時間Ｒ１、および
ｂ）その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクル
でインキュベートし、各タッチダウンサイクルは、
ｉ）温度Ｔ２で時間Ｒ２、
ｉｉ）続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および
ｉｉｉ）続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４
の前記ＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含み、ここで、
Ｔ１およびＴ２が、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、
Ｔ３およびＴ４が、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、
Ｒ１が、１分間と５分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、５秒間と４５秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、５分間と２０分間との間の範囲であり、
Ｖが、０．２℃と０．８℃との間の範囲である、
請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
Ｒ１が、１分間と３分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、１０秒間と２０秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、８分間と１５分間との間の範囲であり、
タッチダウンＰＣＲサイクル数が２０と５０との間の範囲である、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第
２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化３８】
2012515534.tif 000012
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３９】
2012515534.tif 000013
（ここで、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化４０】
2012515534.tif 000014
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化４１】
2012515534.tif 000015
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merであり、増幅されたＨＣＶ核酸が８０００超の塩基対を有する、
方法。
【請求項１８】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５
【化２７】
2012515534.tif 000016
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６
【化２７−１】
2012515534.tif 000017
のヌクレオチド
以外のヌクレオチドである、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチド
が、独立して、配列番号１５
【化２７】
2012515534.tif 000018
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１７
【化２７−２】
2012515534.tif 000019
（ここで、ＲはＡまたはＧである）のヌクレオチド
以外のヌクレオチドである、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
増幅されたＨＣＶ核酸分子が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（ここで、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化４２】
2012515534.tif 000020
のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡテンプレートを増幅する工程が、ｉ）前記第１のＰＣＲによって前記ＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅して第１のアンプリコンを産生する工程、およびｉｉ）前記第２のＰＣＲによって前記第１のアンプリコンの少なくとも一部を増幅して前記増幅されたＨＣＶ核酸を含む第２のアンプリコンを産生する工程、を含む、請求項１または１７に記載の方法。
【請求項２９】
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、ａ）請求項１または１７に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅して増幅されたＨＣＶ核酸を産生する工程、および
ｂ）前記増幅されたＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項３０】
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、ａ）請求項１または１７に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅してアンプリコンを産生する工程、
ｂ）前記アンプリコンをクローニングする工程、および
ｃ）前記クローニングしたアンプリコンの前記ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項３１】
ＨＣＶに感染した患者の耐性プロフィールを提供する方法であって、
ａ）請求項１または１７に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、前記患者から得たＨＣＶ感染サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅する工程、および
ｂ）前記増幅されたＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
【請求項３２】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、該キットは、
ａ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化４３】
2012515534.tif 000021
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化４４】
2012515534.tif 000022
（ここで、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、アウターＰＣＲプライマー対と、
ｂ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化４７】
2012515534.tif 000023
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化４８】
2012515534.tif 000024
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
を含む、インナーＰＣＲプライマー対と
を含み、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merであり、８０００超の塩基対を有するＨＣＶ核酸が、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーによって増幅される、キット。
【請求項３３】
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化４５】
2012515534.tif 000025
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化４６】
2012515534.tif 000026
（ここで、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化４９】
2012515534.tif 000027
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５０】
2012515534.tif 000028
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５：
【化５１】
2012515534.tif 000029
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７：
【化５２】
2012515534.tif 000030
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化５３】
2012515534.tif 000031
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化５４】
2012515534.tif 000032
（ここで、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｂ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化５５】
2012515534.tif 000033
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５６】
2012515534.tif 000034
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
インナーＰＣＲプライマー対
を含み、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merであり、８０００超の塩基対を有するＨＣＶ核酸が、前記インナープライマーおよび前記アウタープライマーによって増幅される、キット。
【請求項３７】
請求項３６に記載のキットであって、
ＲＴプライマーをさらに含み、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（ここで、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、キット。
【請求項３８】
請求項３７に記載のキットであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化６７】
2012515534.tif 000035
を含む、キット。
【請求項３９】
請求項３８に記載のキットであって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化７３】
2012515534.tif 000036
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化７４】
2012515534.tif 000037
（ここで、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含み、そしてここで、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５：
【化７５】
2012515534.tif 000038
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番号１７：
【化７６】
2012515534.tif 000039
（ここで、ＲはＡまたはＧである）
を含む、キット。
【請求項４０】
前記増幅されたＨＣＶ核酸が、８０％より高い再現性で産生される、請求項１または２７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明を、例えば、臨床分離株（ＨＣＶに感染した患者の組織由来の臨床分離株など）由来のＨＣＶ核酸の増幅のために使用することができる。本発明のＰＣＲ法を使用して、例えば、８，０００塩基対超のＨＣＶゲノム配列を、１０３〜１０４ＩＵ／ｍｌのＨＣＶサンプルを使用した場合でさえ比較的高い再現性で（例えば、成功率８０％超、８５％超、または９０％超）増幅および配列決定することができる。本発明のＰＣＲ法を、１０３ＩＵ／ｍｌ未満のＨＣＶサンプル中のＨＣＶゲノムの増幅および配列決定のために使用することもできる。ＨＣＶゲノムの配列情報を、患者におけるＨＣＶ感染の診断および／または処置の開発のために使用することができ、他の種々の実験目的（例えば、ＨＣＶゲノムまたはそのフラグメントを含むベクターの生成）のために使用することもできる。例えば、本発明を、ＨＣＶ患者の耐性プロフィールまたは特定の療法に対する応答（例えば、特定の多形性の表示）のモニタリングまたは追跡およびそのための診断キットのために使用することができる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化１９】
2012515534.tif 000040
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化２０】
2012515534.tif 000041
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含み、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化２１】
2012515534.tif 000042
を含み、および
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化２２】
2012515534.tif 000043
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、方法。
（項目２）
前記インナープライマーおよびアウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merで
ある、項目１に記載の方法。
（項目３）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化２３】
2012515534.tif 000044
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化２４】
2012515534.tif 000045
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１または２に記載の方法。
（項目４）
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化２５】
2012515534.tif 000046
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化２６】
2012515534.tif 000047
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１から３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
ａ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５：
【化２７】
2012515534.tif 000048
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６および配列番号１７：
【化２８】
2012515534.tif 000049
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目４に記載の方法。
（項目６）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化２９】
2012515534.tif 000050
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３０】
2012515534.tif 000051
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化３１】
2012515534.tif 000052
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３および配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化３２】
2012515534.tif 000053
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１から５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化３３】
2012515534.tif 000054
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０および配列番号１１の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３４】
2012515534.tif 000055
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１５の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５：
【化３５】
2012515534.tif 000056
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１６および配列番号１７の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６および配列番号１７：
【化３６】
2012515534.tif 000057
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１から５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、項目１から７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、項目８に記載の方法。
（項目１０）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目９に記載の方法。
（項目１１）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１０の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１３の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、項目８に記載の方法。
（項目１３）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオ
チドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１２に記載の方法。
（項目１４）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号９の５’末端から１〜１４位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に５’末端から１〜１２位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１２の５’末端から１〜１６位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的に配列番号１４の５’末端から１〜１３位の１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記増幅ＨＣＶ核酸が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、項目１から１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端で配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、項目１から１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記ＲＴプライマーのｎが１０〜２０の整数である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化３７】
2012515534.tif 000058
のヌクレオチド配列を含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程が、前記増幅工程の前に、ポリ−Ａ  ＲＮＡおよび細菌ｔＲＮＡからなる群より選択されるキャリアＲＮＡを使用して前記ＨＣＶ感染サンプルから前記ＨＣＶ  ＲＮＡを単離する工程を含む、項目１６から１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１段階のＰＣＲの後に前記第２段階のＰＣＲを行い、それぞれの前記第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、
ａ）温度Ｔ１で時間Ｒ１、および
ｂ）その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクル
でインキュベートし、各タッチダウンサイクルは、
ｉ）温度Ｔ２で時間Ｒ２、
ｉｉ）続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および
ｉｉｉ）続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４
の前記ＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含み、ここで、
Ｔ１およびＴ２が、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、
Ｔ３およびＴ４が、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、
Ｒ１が、１分間と５分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、５秒間と４５秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、５分間と２０分間との間の範囲であり、
Ｖが、０．２℃と０．８℃との間の範囲である、
項目１から１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
Ｒ１が、１分間と３分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、１０秒間と２０秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、８分間と１５分間との間の範囲であり、
タッチダウンＰＣＲサイクル数が２０と５０との間の範囲である、
項目２０に記載の方法。
（項目２２）
Ｔ１が９４℃であり、Ｔ２が９４℃であり、Ｔ２が６８℃であり、Ｔ３が６８℃であり、Ｖが０．５℃であり、タッチダウンＰＣＲサイクル数が３０である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１段階および第２段階のＰＣＲの各ＰＣＲ反応混合物が、独立して、Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、１：１と３：１との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ比で含む、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記第１段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２単位と３単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と１．５単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記第２段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２．５単位と３．５単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と２単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記第１および第２のＰＣＲ段階のそれぞれのＰＣＲ反応混合物が、独立して、０．７５Ｍと２Ｍとの間の量のベタインを含む、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸を増幅する方法であって、前記方法は、２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅する工程を含み、第１段階のＰＣＲは第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを使用し、第
２段階のＰＣＲは第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを使用し、ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化３８】
2012515534.tif 000059
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化３９】
2012515534.tif 000060
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化４０】
2012515534.tif 000061
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｖ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化４１】
2012515534.tif 000062
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
方法。
（項目２８）
前記インナープライマーおよびアウタープライマーがそれぞれ独立して１５〜５０merで
ある、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａまたは１ｂである、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ａである、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが
、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１６のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記ＨＣＶ核酸が遺伝子型１ｂである、項目２９に記載の方法。
（項目３４）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１４のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ａ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｂ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１１のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｃ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチド
が、独立して、配列番号１５のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｄ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１７に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１７のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目３３に記載の方法。
（項目３６）
前記増幅ＨＣＶ核酸分子が、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂタンパク質をコードする遺伝子を含む、項目２７から３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
ＲＴプライマーを使用した逆転写（ＲＴ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的な前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程であって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、工程をさらに含む、項目２７から３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記ＲＴプライマーのｎが１０〜２０の整数である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記ＲＴプライマーが、その３’末端に、配列番号８：
【化４２】
2012515534.tif 000063
のヌクレオチド配列を含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記ＤＮＡテンプレートを形成する工程が、前記増幅工程の前に、ポリ−Ａ  ＲＮＡおよび細菌ｔＲＮＡからなる群より選択されるキャリアＲＮＡを使用して前記ＨＣＶ感染サンプルから前記ＨＣＶ  ＲＮＡを単離する工程を含む、項目３７から３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記ＨＣＶ  ＲＮＡを、前記ＲＴプライマーを使用して、前記ＨＣＶゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）でプライムする、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記第１のインナープライマーおよびアウタープライマーは、独立して、前記ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）でプライムし、前記第２のインナープライマーおよびアウタープライマーは、独立して、前記ＨＣＶゲノムのＮＳ５Ｂ領域でプライムする、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記第１段階のＰＣＲの後に前記第２段階のＰＣＲを行い、それぞれの前記第１段階および第２段階のＰＣＲ中に、各ＰＣＲ反応混合物を、独立して、
ａ）温度Ｔ１で時間Ｒ１、および
ｂ）その後の複数のタッチダウンＰＣＲサイクル
でインキュベートし、各タッチダウンサイクルは、
ｉ）温度Ｔ２で時間Ｒ２、
ｉｉ）続いてサイクルｍ回について温度［Ｔ３−（Ｖ℃×ｍ）］で時間Ｒ３、および
ｉｉｉ）続いて温度Ｔ４で時間Ｒ４
の前記ＰＣＲ反応混合物のインキュベーションを含み、ここで、
Ｔ１およびＴ２が、独立して、９０℃と１００℃との間の範囲であり、
Ｔ３およびＴ４が、独立して、６５℃と７０℃との間の範囲であり、
Ｒ１が、１分間と５分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、５秒間と４５秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１０秒間と４０秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、５分間と２０分間との間の範囲であり、
Ｖが０．２℃と０．８℃との間の範囲である、
項目２７から４２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
Ｒ１が、１分間と３分間との間の範囲であり、
Ｒ２が、１０秒間と２０秒間との間の範囲であり、
Ｒ３が、１５秒間と２５秒間との間の範囲であり、
Ｒ４が、８分間と１５分間との間の範囲であり、
タッチダウンＰＣＲサイクル数が２０と５０との間の範囲である、
項目４３に記載の方法。
（項目４５）
Ｔ１が９４℃であり、Ｔ２が９４℃であり、Ｔ２が６８℃であり、Ｔ３が６８℃であり、Ｖが０．５℃であり、タッチダウンＰＣＲサイクル数が３０である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記第１段階および第２段階のＰＣＲの各ＰＣＲ反応混合物が、独立して、Ｋｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを、１：１と３：１との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ：Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ比で含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記第１段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２単位と３単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と１．５単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第２段階のＰＣＲのＰＣＲ反応混合物が、２．５単位と３．５単位との間のＫｌｅｎｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび１単位と２単位との間のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記第１および第２のＰＣＲ段階のそれぞれのＰＣＲ反応混合物が、独立して、０．７５Ｍと２Ｍとの間の量のベタインを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記ＤＮＡテンプレート増幅工程が、ｉ）前記第１のＰＣＲによって前記ＤＮＡテンプレートのセグメントを増幅して第１のアンプリコンを産生する工程、およびｉｉ）前記第２のＰＣＲによって前記第１のアンプリコンの少なくとも一部を増幅して前記増幅ＨＣＶ核酸を含む第２のアンプリコンを産生する工程、を含む、項目１から４９のいずれか１項に記載の方法。
（項目５１）
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、ａ）項目１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅して増幅ＨＣＶ核酸を産生する工程、および
ｂ）前記増幅ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
（項目５２）
ＨＣＶ感染サンプル中のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイする方法であって、ａ）項目１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅してアンプリコンを産生する工程、
ｂ）前記アンプリコンをクローニングする工程、および
ｃ）前記クローニングしたアンプリコンの前記ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
（項目５３）
ＨＣＶに感染した患者の耐性プロフィールをモニタリングする方法であって、
ａ）前記患者からＨＣＶ感染サンプルを得る工程、
ｂ）項目１から５０のいずれか１項に記載の２段階ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記サンプル由来のＨＣＶ  ＲＮＡのゲノムに相補的なＤＮＡテンプレートを増幅する工程、および
ｃ）前記増幅ＨＣＶ核酸を配列決定する工程、
を含む、方法。
（項目５４）
第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対を含む、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号２：
【化４３】
2012515534.tif 000064
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号３または配列番号４：
【化４４】
2012515534.tif 000065
（式中、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、キット。
（項目５５）
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号９：
【化４５】
2012515534.tif 000066
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化４６】
2012515534.tif 000067
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目５４に記載のキット。
（項目５６）
第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対を含む、ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイす
るためのキットであって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号５：
【化４７】
2012515534.tif 000068
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号６または配列番号７：
【化４８】
2012515534.tif 000069
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、キット。
（項目５７）
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１２：
【化４９】
2012515534.tif 000070
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列がその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドが、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５０】
2012515534.tif 000071
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
項目５６に記載のキット。
（項目５８）
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１５：
【化５１】
2012515534.tif 000072
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列が配列番号１６または配列番号１７：
【化５２】
2012515534.tif 000073
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
項目５７に記載のキット。
（項目５９）
ＲＴプライマーをさらに含み、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、項目５４から５８のいずれか１項に記載のキット。
（項目６０）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化５３】
2012515534.tif 000074
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化５４】
2012515534.tif 000075
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｂ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化５５】
2012515534.tif 000076
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化５６】
2012515534.tif 000077
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
インナーＰＣＲプライマー対
を含む、キット。
（項目６１）
ＲＴプライマーをさらに含み、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、項目６０に記載のキット。
（項目６２）
前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列が配列番号８：
【化５７】
2012515534.tif 000078
を含む、項目６１に記載のキット。
（項目６３）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化５８】
2012515534.tif 000079
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化５９】
2012515534.tif 000080
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化６０】
2012515534.tif 000081
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５：
【化６１】
2012515534.tif 000082
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番
号１７：
【化６２】
2012515534.tif 000083
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
（項目６４）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に配列番号１：
５’−（Ａ）ｎ−ＡＡＡＡ−３’（配列番号１）
（式中、ｎは１〜２６の整数である）
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号９：
【化６３】
2012515534.tif 000084
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１０または配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１０および配列番号１１：
【化６４】
2012515534.tif 000085
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１２に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１２：
【化６５】
2012515534.tif 000086
のヌクレオチド以外のヌクレオチドであり、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列はその３’末端に、配列番号１３または配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含み、任意選択的にその１、２、または３個のヌクレオチドは、独立して、配列番号１３および配列番号１４：
【化６６】
2012515534.tif 000087
（式中、ＲはＡまたはＧである）
のヌクレオチド以外のヌクレオチドである、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
（項目６５）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化６７】
2012515534.tif 000088
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化６８】
2012515534.tif 000089
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化６９】
2012515534.tif 000090
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１２：
【化７０】
2012515534.tif 000091
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１３または配列番号１４：
【化７１】
2012515534.tif 000092
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。
（項目６６）
ＨＣＶ感染サンプル由来のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）核酸をアッセイするためのキットであって、
ａ）ＲＴプライマーであって、前記ＲＴプライマーのヌクレオチド配列は配列番号８：
【化７２】
2012515534.tif 000093
を含む、ＲＴプライマー、
ｂ）第１のアウタープライマーおよび第２のアウタープライマーを含むアウターＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号９：
【化７３】
2012515534.tif 000094
を含み、
ｉｉ）前記第２のアウタープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１０または配列番号１１：
【化７４】
2012515534.tif 000095
（式中、ＹはＣ、Ｔ、またはＵであり、ＶはＡ、Ｃ、またはＧである）
を含む、
アウターＰＣＲプライマー対、および
ｃ）第１のインナープライマーおよび第２のインナープライマーを含むインナーＰＣＲプライマー対であって、
ｉ）前記第１のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１５：
【化７５】
2012515534.tif 000096
を含み、
ｉｉ）前記第２のインナープライマーのヌクレオチド配列は配列番号１６または配列番号１７：
【化７６】
2012515534.tif 000097
（式中、ＲはＡまたはＧである）
を含む、
インナーＰＣＲプライマー対、
を含む、キット。