【手続補正書】
【提出日】平成25年7月3日(2013.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【図１Ａ−１】例示的な一本鎖延長ダイサー基質の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。図１Ａにおいて、パネルＡは、一本鎖延長部を有さないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＣは、一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴ（「不連続相補体」；図示すように不連続３’パッセンジャー相補体）を有する、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＤは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＥは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。白色＝ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド）。図１Ｂは、例示的な一本鎖延長ダイサー基質のヌクレオチド修飾及び修飾のパターンを示す。パネルＡは、一本鎖延長部を有さないＤｓｉＲＮＡを示す。パネルＢは、ガイド鎖の５’オーバーハング１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）を有する「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＣは、一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴ（「不連続相補体」；図示すように不連続３’パッセンジャー相補体）を有する、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。パネルＤは、パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤を示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小矢印＝ダイサー切断部位；大矢印＝不連続性。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１Ｂ位）。Ｃ＝一本鎖延長領域に対して相補的な短いオリゴの５’末端ヌクレオチドから開始する位置（１Ｃ位）；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１Ｄ位）；Ｅ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１Ｅ位）；Ｆ＝第一の鎖の５’の一本鎖オーバーハングと連続した５’末端ヌクレオチドから開始する位置（１Ｆ位）。小矢印は、予想されるダイサー切断部位を示し；大矢印は、不連続性を示す。
【図１Ａ−２】同上。
【図１Ｂ】同上。
【図２】ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０〜１５ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置（１Ｂ位）。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。
【図３】パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０〜１５ヌクレオチド）の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１Ａ位）；Ｄ＝パッセンジャー鎖の３’末端ヌクレオチド残基から開始する位置。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。
【図４】ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ１３３８Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。加えて、ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ；ＤＰ１３３９Ｇ；ＤＰ１３７１Ｇ；及びＤＰ１３３８Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖と、ＤＰ１３７２Ｐ及びＤＰ１３７３Ｐにより示される修飾パターンを有する「不連続３’パッセンジャー相補体」鎖とを有する一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３７０Ｇにより示される修飾を有するガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。
【図５】パッセンジャー鎖の１〜３０ヌクレオチド長の３’オーバーハングを有する例示的な「パッセンジャー鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の構造及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１ＸＸＸＧにより示される修飾パターンを有するガイド鎖と、ＤＰ１ＹＹＸＰ；ＤＰ１ＹｘｘＰ；及びＤＰ１ＹｘｘＰにより示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖とを有する一本鎖パッセンジャー延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３０１Ｐにより示される修飾を有するパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。青色＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；灰色＝デオキシリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；緑色＝ホスホロチオエート２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；桃色＝ホスホロチオエートリボヌクレオチド；薄黄色＝メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。
【図６】ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＫＲＡＳ−２４９Ｍを標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）；ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１６）；ＤＰ１３４０Ｇ（配列番号：１７）；ＤＰ１３４１Ｇ（配列番号：１８）；及びＤＰ１３４２Ｇ（配列番号：１８）により示されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。ＤＰ１３０１Ｐにより示されるパッセンジャー（passender）とＤＰ１３３６Ｇにより示されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示した。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ１３３６Ｇは、配列番号：１４である。
【図７】図５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＫＲＡＳ−２４９Ｍの発現量（fold expression）を示す柱状グラフ。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。
【図８】ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＨＰＲＴ１を標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ＤＰ１００１Ｐ（配列番号：１９）により示されるパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３５０Ｇ（配列番号：２１）；ＤＰ１３５１Ｇ（配列番号：２２）；ＤＰ１３５２Ｇ（配列番号：２２）；ＤＰ１３５３Ｇ（配列番号：２３）；ＤＰ１３５４Ｇ（配列番号：２４）；及びＤＰ１３５５Ｇ（配列番号：２４）により示されるガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。ＤＰ１００１Ｐにより示されるパッセンジャー（passender）と、ＤＰ１００２Ｇにより示されるガイド鎖とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を、参照として使用した。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示した。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。ＤＰ１００２Ｇは、配列番号：２０である。
【図９】図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＨＰＲＴ１の発現量を示す柱状グラフ。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。
【図１０】ＫＲＡＳ−２４９Ｍ又はＨＰＲＴ１を標的とする一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤（パッセンジャー＋ガイド鎖）上のダイサー活性を示すゲルの画像。処理：２ｈ＠３７Ｃ  Ｔｕｒｂｏダイサー（１Ｕ／反応物）。ゲル：１８％Ｔｒｉｓ９０’＠１０Ｗ。負荷：（１μｌ  ５０μＭ＋５０μｌ緩衝液及び負荷１０μｌ）又は（５μｌ反応物＋２０μｌ緩衝液及び負荷１０μｌ）。
【図１１】１〜１６ヌクレオチド長であり、５’ガイド鎖延長部と塩基対をなす、ガイド鎖延長部（「不連続相補体」）を相補する例示的な短いオリゴの配列及び構造。ＤＰ１３６５Ｐ（配列番号：２５）；ＤＰ１３６６Ｐ（配列番号：２５）；ＤＰ１３６７Ｐ（配列番号：２６）；ＤＰ１３６８Ｐ（配列番号：２５）；及びＤＰ１３６９Ｐ（配列番号：２５）により示される不連続相補体を有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成され、試験された。不連続相補体の修飾パターンの記載を、右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す。それぞれのヌクレオチド対における下部の鎖は、配列番号：２７である。
【図１２】図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖と、図１０に示した不連続相補体とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＫＲＡＳ−２４９Ｍの発現量を示す柱状グラフ。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖延長部（ｌ．−ｒ．ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅ  ＲＮＡ）を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤に対応する３つの棒グラフの各セットの上方に表示する。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。
【図１３】図７に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖と、図１０に示した不連続相補体とを有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を使用した、正規化されたＨＰＲＴ１の発現量を示す柱状グラフ。使用した不連続相補体を、５’ガイド一本鎖延長部（ｌ．−ｒ．ＤＮＡ、ＲＮＡ、２’ＯＭｅ  ＲＮＡ）を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤に対応する３つの棒グラフの各セットの上方に表示する。Ｈｅｌａ細胞を０．１ｎＭのＤｓｉＲＮＡ薬剤を用いてＲＮＡｉＭＡＸ中で２４時間処理した。
【図１４】インビボでの実験における例示的な一本鎖延長ダイサー基質の構造及び予想されるダイサー−仲介加工（実験条件：処理：１０ｍｇ／ｋｇ  １回の注入；標的：ＫＲＡＳ；トランスフェクション：インビボフェクタミン；組織：肝臓）。パネルＡは、一本鎖延長部を有さない負対照に使用される修飾パターンを示す。パネルＢは、一本鎖延長部を有さない正対照ＤｓｉＲＮＡに使用される修飾パターンを示す。パネルＣは、一本鎖延長部を有さない試験ＤｓｉＲＮＡに使用される修飾パターンを示す。パネルＤは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する、試験「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤に使用される修飾パターンを示す。パネルＥは、ガイド鎖の１〜３０ヌクレオチド長（図示すように１０ヌクレオチド）の５’オーバーハングを有する、試験「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤に使用される修飾パターンを示す。ＤｓｉＲＮＡを形成するオリゴヌクレオチド鎖の各対において、上部鎖はパッセンジャー鎖であり、下部鎖はガイド鎖である。青色＝リボヌクレオチド又は修飾リボヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド）；灰色＝デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド；白色＝リボヌクレオチド；暗黄色＝デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド（例えば２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド；メチルホスホネートデオキシリボヌクレオチド）。小矢印＝ダイサー切断部位；大矢印＝不連続性。Ａ＝パッセンジャー鎖の５’末端ヌクレオチド残基に対して相補的な前記第二の鎖のヌクレオチド残基から開始する位置（１Ａ位）；Ｂ＝ガイド鎖の５’末端ヌクレオチド残基から開始する位置。小矢印は、予想されるダイサー切断部位を示し；大矢印は、不連続性を示す。
【図１５】ガイド鎖の１〜１５ヌクレオチド長の５’オーバーハングを有する、ＫＲＡＳ−２４９Ｍ及びＨＰＲＴ１を標的とする例示的な「ガイド鎖延長」ＤｓｉＲＮＡ薬剤の配列、構造、及び予想されるダイサー−仲介加工。ガイド鎖延長部（「不連続相補体」）を相補する例示的な短いオリゴの配列及び構造は、５’ガイド鎖延長部配列と塩基対をなすよう示される。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）、ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３７１Ｇ（配列番号：１６）、及びＤＰ１３５２Ｇにより示される修飾パターンを有するガイド鎖とを有する一本鎖ガイド延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。加えて、ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾パターンを有するパッセンジャー鎖と、ＤＰ１３３７Ｇ（配列番号：１５）、ＤＰ１３３８Ｇ（配列番号：１３）、ＤＰ１３３９Ｇ（配列番号：１６）、ＤＰ１３７１Ｇ（配列番号：１６）、及びＤＰ１３５２Ｇ（配列番号：２２）により示される修飾パターンを有するガイド鎖と；ＤＰ１３７２Ｐ（配列番号：２８）及びＤＰ１３７３Ｐ（配列番号：２８）により示される修飾パターンを有する「不連続相補体」鎖とを有する一本鎖延長ＤｓｉＲＮＡ薬剤が生成された。ＤＰ１３０１Ｐ（配列番号：１３）により示される修飾を有するパッセンジャー鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤を参照として使用し、ＤＰ１３７０Ｇ（配列番号：１３）により示される修飾を有するガイド鎖を参照として使用した。パッセンジャー鎖、ガイド鎖、及び不連続相補体の用量を右側に表示する。不連続相補体の修飾パターンの記載も、右側に表示する。ＲＮＡ＝リボヌクレオチド；ＰＳ＝ホスホロチオエート；ＤＮＡ＝デオキシリボヌクレオチド；２’ＯＭｅ＝２’−Ｏ−メチル；下線＝２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；太字＝ガイド鎖の５’オーバーハング；下部＝デオキシリボヌクレオチド；上部＝リボヌクレオチド。矢印は、予想されるダイサー切断部位を示す配列番号：２８は、配列番号：２９と対形成する。ＤＰ１３７０Ｇは、配列番号：１４である。。
【図１６】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。
【図１７】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。
【図１８】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の肝臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、肝臓サンプルを分析した。
【図１９】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。
【図２０】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。
【図２１】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の脾臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、脾臓サンプルを分析した。
【図２２】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した個々の動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した。
【図２３】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示す柱状グラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した。
【図２４】図１４及び／又は１５に示したパッセンジャー鎖及びガイド鎖を有するＤｓｉＲＮＡ薬剤で処理した動物の腎臓内の、ｍＫＲＡＳの正規化された発現量を示すグラフ。動物を１０ｍｇ／ｋｇのインビボフェクタミン中のＤｓｉＲＮＡ薬剤を注射して処置し、腎臓サンプルを分析した
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
インビトロにおける、ＲＮＡ分離及び解析
細胞を２ｍＬのＰＢＳで一度洗浄し、総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出して、３０μＬの最終容積において溶出した。１μｇの総ＲＮＡを、製造業者の説明書に従って、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びランダムなヘキサマーを用いて逆転写させた。得られたｃＤＮＡの１／３０（０．６６μＬ）を、３．３３μＬのＨ２Ｏ  及び１μＬのヒト遺伝子ＨＰＲＴ−１（受け入れ番号ＮＭ＿０００１９４）及びＳＦＲＳ９（受け入れ番号ＮＭ＿００３７６９）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブを含む３μＭの混合物と共に、５μＬのｉＱ（商標）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した：
Ｈｕ  ＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５１７  ＧＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＴＣＡＧ（配列番号：１）
Ｈｕ  ＨＰＲＴリバースプライマーＲ５９１  ＧＧＣＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＧＴＧＧＧ（配列番号：２）
Ｈｕ  ＨＰＲＴプローブ  Ｐ５５４Ｃｙ５−ＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＴＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴ−ＩＢＦＱ（配列番号：３）
Ｈｕ  ＳＦＲＳ９フォワードプライマーＦ５６９  ＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＡＧＴ（配列番号：４）
Ｈｕ  ＳＦＲＳ９リバースプライマーＲ７１２  ＣＴＧＧＴＧＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＡ（配列番号：５）
Ｈｕ  ＳＦＲＳ９プローブ  Ｐ６４４  ＨＥＸ−ＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣＣＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣＴＧＧＡ−ＩＢＦＱ（配列番号：６）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
インビトロにおける第一の鎖ｃＣＮＡ合成
製造業者の説明書にし従ってたがって、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）及びオリゴｄＴを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡの１／４０（０．６６μＬ）を、３．３３μＬのＨ２Ｏ及び１μＬのマウス遺伝子ＨＰＲＴ−１（受け入れ番号ＮＭ＿０１３５５６）及びＫＲＡＳ（受け入れ番号ＮＭ＿０２１２８４）遺伝子に特異的な２セットのプライマー及びプローブを含む３μＭの混合物と共に、５μμＬのＩＱ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｐｏｗｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）と混合した：
Ｍｍ  ＨＰＲＴフォワードプライマーＦ５７６  ＣＡＡＡＣＴＴＴＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴ  （配列番号：７）
Ｍｍ  ＨＰＲＴリバースプライマーＲ６６４  ＣＡＡＣＡＡＡＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＴＡＴＣ（配列番号：８）
Ｍｍ  ＨＰＲＴプローブＰ６１６  Ｃｙ５−ＴＧＧＴＴＡＡＧＧＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＧＧＴＧ−ＩＢＦＱ（配列番号：９）
Ｍｍ  ＫＲＡＳフォワードプライマーＦ２７５  ＣＴＴＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧＴＡＣＧＡＣＣ（配列番号：１０）
Ｍｍ  ＫＲＡＳリバースプライマーＲ３９０  ＣＡＣＴＧＴＡＣＴＣＣＴＣＴＴＧＡＣＣＴ（配列番号：１１）
Ｍｍ  ＫＲＡＳプローブＰ２９７  ＦＡＭ−ＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＴ−ＩＢＦＱ（配列番号：１２）