【手続補正書】
【提出日】平成25年6月14日(2013.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、前記宿主細胞が少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドが、
ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
ｅ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なり；及び、
さらに前記宿主細胞が、
（ｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加、
（ｉｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率の増加、
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、組換え宿主細胞。
【請求項２】
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
さらに前記宿主細胞が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；及び、
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも５％のΔ４不飽和化変換効率の増加
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記改良が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときのエイコサペンタエン酸産生宿主細胞における少なくとも１３％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｃ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも１８％のΔ４不飽和化変換効率の増加；
ｄ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるエイコサペンタエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加；
ｅ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも２重量パーセントの増加；及び、
ｆ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のドコサヘキサエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加からなる群から選択される、請求項２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
請求項３に記載の油性微生物組換え宿主細胞から得られたエイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油。
【請求項５】
エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油を作製する方法であって、
ａ）請求項３に記載の油性微生物宿主細胞を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油が産生されるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記微生物油を回収してもよいステップと、
を含む方法。
【請求項６】
長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
【請求項７】
長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のΔ４不飽和化変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６７】
ＬＣ−ＰＵＦＡ生合成の改良（ＬＡ  ％  ＴＦＡの低下、ＥＰＡ  ％  ＴＦＡの増加及びΔ９エロンガーゼ変換効率の増加として計測される）は、複製プラスミド上のヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ８４０６株に形質転換されたときのＳｃＬＰＡＡＴＳ及びＹｌＬＰＡＡＴの双方について同程度であるため、双方のＬＰＬＡＡＴとも宿主染色体に安定的に組み込まれた場合には同様に機能し得ると予想される。従って、ＳｃＬＰＡＡＴＳは、宿主染色体に安定的に組み込まれた場合、実施例４及び５での観察と同様に脂質プロファイルを改良する可能性が高い。
次に、本発明の態様を示す。
１.  少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸の産生を改良するための組換え油性微生物宿主細胞であって、前記宿主細胞が少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを含み、前記ポリペプチドが、
ａ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
ｄ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
ｅ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なり；及び、
さらに前記宿主細胞が、
（ｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加、
（ｉｉ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率の増加、
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、組換え宿主細胞。
２.  前記少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸が、エイコサジエン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、ω−６ドコサペンタエン酸、ω−３ドコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸からなる群から選択される、上記１に記載の組換え宿主細胞。
３.  前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
さらに前記宿主細胞が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；及び、
ｂ）対照宿主細胞と比較したときの少なくとも１つの長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物宿主細胞における少なくとも５％のΔ４不飽和化変換効率の増加
からなる群から選択される少なくとも１つの改良を有する、上記１に記載の組換え宿主細胞。
４.  前記改良が、
ａ）対照宿主細胞と比較したときのエイコサペンタエン酸産生宿主細胞における少なくとも１３％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｂ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも４％のＣ18からＣ20への伸長変換効率の増加；
ｃ）対照宿主細胞と比較したときのドコサヘキサエン酸産生宿主細胞における少なくとも１８％のΔ４不飽和化変換効率の増加；
ｄ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるエイコサペンタエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加；
ｅ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のエイコサペンタエン酸の少なくとも２重量パーセントの増加；及び、
ｆ）対照宿主細胞と比較したときの全脂肪酸の重量パーセントとして計測されるドコサヘキサエン酸産生宿主細胞中のドコサヘキサエン酸の少なくとも９重量パーセントの増加からなる群から選択される、上記３に記載の組換え宿主細胞。
５.  前記微生物が酵母である、上記１〜４のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
６.  前記酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記５に記載の組換え宿主細胞。
７.  上記４に記載の油性微生物組換え宿主細胞から得られたエイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油。
８.  エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油を作製する方法であって、
ａ）上記４に記載の油性微生物宿主細胞を培養するステップであって、エイコサペンタエン酸及び／又はドコサヘキサエン酸を含む油が産生されるステップと、
ｂ）ステップ（ａ）の前記微生物油を回収してもよいステップと、
を含む方法。
９.  ステップ（ｂ）の前記回収される油がさらに処理される、上記８に記載の方法。
１０.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記８に記載の方法。
１１.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１０に記載の方法。
１２.  長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるＣ18からＣ20への伸長変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のＣ18からＣ20への伸長変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
１３.  ａ）少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）前記Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときエイコサペンタエン酸産生宿主細胞において少なくとも１３％である、
上記１２に記載の方法。
１４.  ａ）前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）Ｃ18からＣ20への伸長変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したときドコサヘキサエン酸産生宿主細胞において少なくとも４％である、
上記１２に記載の方法。
１５.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記１２に記載の方法。
１６.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１５に記載の方法。
１７.  長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する油性微生物組換え宿主細胞におけるΔ４不飽和化変換効率を増加させる方法であって、
ａ）前記長鎖多価不飽和脂肪酸を産生する組換え宿主細胞に、少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号９及び配列番号１１からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号２８からなる群から選択される少なくとも１つの膜結合型Ｏ−アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
（ｉｉｉ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号２に示されるとおりのアミノ酸配列と比較したとき少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；
（ｉｖ）Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法に基づき配列番号１５、配列番号１７及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較したとき少なくとも４３．９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド；及び、
（ｖ）配列番号１９及び配列番号２０からなる群から選択される少なくとも１つの１−アシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質ファミリーモチーフを有するポリペプチド；
からなる群から選択され、
前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの単離ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結され、前記調節配列は同じであるか又は異なる、ステップと、
ｂ）前記油性微生物宿主細胞を増殖するステップと、
を含み、前記油性微生物宿主細胞のΔ４不飽和化変換効率が対照宿主細胞と比べて増加する、方法。
１８.  ａ）前記少なくともアシルＣｏＡ：リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが安定的に組み込まれ、及び、
ｂ）前記Δ４不飽和化変換効率の増加が、対照宿主細胞と比較したとき少なくとも１８％である、
上記１７に記載の方法。
１９.  前記宿主細胞が油性酵母である、上記１７に記載の方法。
２０.  前記油性酵母がヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である、上記１９に記載の方法。