【手続補正書】
【提出日】平成25年5月10日(2013.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＥＲ２活性を調節する化合物に対する細胞の感受性を決定する方法であって：
（ａ）前記細胞から生成された細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）で決定されたＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを、化合物感受性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の第１参照活性化レベル及び化合物耐性細胞中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の第２参照活性化レベルと比較する工程；を含み、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の前記第１参照活性化レベルと比較して同様の又はより低い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であることを示し、
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の前記第２参照活性化レベルと比較して同様の又はより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して耐性であることを示す、前記方法。
【請求項２】
前記化合物がＨＥＲ２活性を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物がモノクローナル抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体がトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））、ペルツズマブ（２Ｃ４）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記チロシンキナーゼ阻害剤がゲフィチニブ、エルロチニブ、ピリチニブ、カネルチニブ、ラパチニブ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物感受性細胞がＢＴ−４７４細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ２活性化のレベルが前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ２活性化のレベルより少なくとも２〜３倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物耐性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２活性化レベルが前記化合物感受性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２活性化のレベルより少なくとも５倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及びｐ９５ＨＥＲ２両方の活性化レベルを決定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルがＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞抽出物中の追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上の活性化レベルを決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記追加のシグナル伝達分子１種又は２種以上がＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＭＥＫ、ＰＴＥＮ、ＳＧＫ３、４Ｅ−ＢＰ１、ＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１）、ＥＲＫ１（ＭＡＰＫ３）、ＰＤＫ１、Ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＧＳＫ−３β、Ｓｈｃ、ＩＧＦ−１Ｒ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＫＩＴ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、受容体二量体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ３の第２参照活性化レベルと比較して同様の又はより高い前記細胞抽出物中のＨＥＲ３活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して耐性であることを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物耐性細胞中のＨＥＲ３活性化のレベルが前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ３活性化のレベルより少なくとも２〜３倍高い、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物耐性細胞中のＰＩ３Ｋの第２参照活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のＰＩ３Ｋ活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でないことを示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記受容体二量体がｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ２ホモ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３へテロ二量体、ＨＥＲ１／ＨＥＲ２ヘテロ二量体、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物耐性細胞中のｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体の第２参照活性化レベルと比較してより高い前記細胞抽出物中のｐ９５ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体活性化レベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性でないことを示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞が循環腫瘍細胞、又は腫瘍から得られた微細針吸引液（ＦＮＡ）細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が乳癌を有する被験者から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が全血、血清、血漿、又は腫瘍組織試料である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）で得られた比較の結果を読み取り可能なフォーマットでユーザーに提供する工程（ｃ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルを決定する工程がリン酸化ＨＥＲ２又はリン酸化ｐ９５ＨＥＲ２に特異的な抗体を用いて前記細胞抽出物中のＨＥＲ２又はｐ９５ＨＥＲ２のリン酸化レベルを検出する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）のＨＥＲ２の活性化レベルの決定が、以下の段階：
（ｉ）細胞抽出物をＨＥＲ２に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体上に拘束されている段階；
（ｉｉ）前記複数の捕捉された受容体をＨＥＲ２に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして複数の検出可能な捕捉された受容体を形成する段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記複数の検出可能な捕捉された受容体を前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｉｖ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ａ）のｐ９５ＨＥＲ２の活性化レベルの決定が、以下の段階：
（ｉ）前記細胞抽出物を、全長ＨＥＲ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）結合領域に特異的な複数のビーズとインキュベートする段階；
（ｉｉ）前記細胞抽出物から前記複数のビーズを除去し、それによって全長ＨＥＲ２を除去して、全長ＨＥＲ２を含まない細胞抽出物を形成する段階；
（ｉｉｉ）前記全長ＨＥＲ２を含まない細胞抽出物を全長ＨＥＲ２の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）結合領域に特異的な捕捉抗体の希釈系列とインキュベートして複数の捕捉された受容体を形成する段階であって、前記捕捉抗体が固体支持体に拘束されている段階；
（ｉｖ）前記複数の捕捉された受容体を、全長ＨＥＲ２のＩＣＤ結合領域に特異的な活性化状態非依存性抗体及び活性化状態依存性抗体を含む検出抗体とインキュベートして、複数の検出可能な捕捉された受容体を形成する段階であって、
前記活性化状態非依存性抗体が促進成分を用いて標識化されており、前記活性化状態依存性抗体がシグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されており、そして前記促進成分が前記シグナル増幅対の第１のメンバーへチャネリングして該メンバーと反応する酸化剤を生成する段階；
（ｖ）前記複数の検出可能な捕捉された受容体を、前記シグナル増幅対の第２のメンバーとインキュベートして、増幅シグナルを生成する段階；及び
（ｖｉ）前記シグナル増幅対の第１及び第２のメンバーから生成された前記増幅シグナルを検出する段階；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ＥＣＤ結合領域に特異的な複数のビーズがストレプトアビジン−ビオチン対を含んでおり、ストレプトアビジンがビーズに結合しており、ビオチンが抗体に結合している、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が全長ＨＥＲ２のＥＣＤ結合領域に特異的である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記支持体がガラス、プラスチック、チップ、ピン、フィルター、ビーズ、紙、膜、繊維束、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記捕捉抗体がアドレス可能なアレイにおける固体支持体上に拘束されている、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性化状態非依存性抗体が前記促進成分を用いて直接的に標識化されている、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記活性化状態依存性抗体が前記シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて直接的に標識化されている、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性化状態依存性抗体が、該活性化状態依存性抗体にコンジュゲートされた結合対の第１のメンバーと前記シグナル増幅対の第１のメンバーにコンジュゲートされた結合対の第２のメンバーとの間の結合を介して、前記シグナル増幅対の第１のメンバーを用いて標識化されている、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記結合対の第１のメンバーがビオチンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合対の第２のメンバーがストレプトアビジンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記促進成分がグルコースオキシダーゼである、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記グルコースオキシダーゼ及び前記活性化状態非依存性抗体がスルフヒドリル活性化デキストラン分子にコンジュゲートされている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記スルフヒドリル活性化デキストラン分子が分子量約５００ｋＤａを有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記酸化剤が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記シグナル増幅対の第１のメンバーがペルオキシダーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シグナル増幅対の第２のメンバーがチラミド試薬である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記チラミド試薬がビオチン−チラミドである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記増幅シグナルが、活性化チラミドを生成する、前記ビオチン−チラミドのペルオキシダーゼ酸化によって生成される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記活性化チラミドが直接的に検出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記活性化チラミドがシグナル検出性試薬の添加により検出される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記シグナル検出性試薬がストレプトアビジン標識化フルオロフォアである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記シグナル検出性試薬がストレプトアビジン標識化ペルオキシダーゼと発色試薬との組み合わせである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記発色試薬が３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記化合物耐性細胞がＢＴ／Ｒ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞抽出物中のＨＥＲ２及び／又はｐ９５ＨＥＲ２の発現レベルを決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記化合物感受性細胞中のＨＥＲ３の第１参照活性化レベルと比較して同様の又はより低い前記細胞抽出物中のＨＥＲ３活性化のレベルの存在が、前記細胞が前記化合物に対して感受性であることを示す、請求項１２に記載の方法。