(57)【要約】【課題】  本発明は、高血圧症及び／又はメタボリックシンドロームの新規な治療予防剤を提供するものである。【解決手段】  本発明は、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなるメタボリックシンドロームの予防・治療剤、及び成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなる食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなるメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
【請求項２】
成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬が、グレリンである請求項１に記載のメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
【請求項３】
メタボリックシンドロームが、高血圧、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝からなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を有するものである請求項１又は２に記載のメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
【請求項４】
成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなる食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤。
【請求項５】
食事が、高脂肪食を含有してなる食事である請求項４に記載の高血圧症の治療・予防剤。
【請求項６】
成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬が、グレリンである請求項４又は５に記載の高血圧症の治療・予防剤。
【請求項７】
食事により誘導される高血圧症が、メタボリックシンドロームにおける高血圧症である請求項４〜６のいずれかに記載の高血圧症の治療・予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなるメタボリックシンドロームの予防・治療剤、及び成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなる食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長ホルモン（ＧＨ）の分泌は、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）により促進され、ソマトスタチンにより抑制されるが、それとは異なる成長ホルモンの分泌促進機構が存在することがＧＨＳ（growth hormone secretagogue：成長ホルモン分泌促進因子）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）のクローニングにより明らかにされてきた。しかし、ＧＨＳ−Ｒの内因性リガンドは長い間発見されず、オーファンレセプターとされていたが、１９９９年になって、児島、寒川らによりＧＨＳ−Ｒの生体内リガンドとしてグレリンが、胃から同定された（特許文献１、及び非特許文献１参照）。
ヒト及びラットのグレリンは、次のアミノ酸配列、
ヒト        G S S F L S P E H Q R V Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
ラット      G S S F L S P E H Q K A Q Q R K E S K K P P A K L Q P R
1       5        10         15        20             28
を有する２８個のアミノ酸からなるペプチドで、３位のセリンがオクタン酸でエステル化されているものであり、しかもこのオクタン酸によるエステル化がグレリンの活性発現に必要とされている。ヒトのグレリンにおける、オクタン酸が炭素数１０のデカン酸になっているもの、不飽和結合が入っているデケン酸になっているものや、Ｃ末端のアルギニンが欠けたものなどのマイナー分子もヒトの胃抽出物から見出されてきている。
また、グレリンはヒトやラットだけでなく、両生類、鳥類、魚類などからも発見されてきており、しかも脂肪酸によるエステル化も哺乳類と同じであることから、グレリンは進化の過程においても高度に保存されており、生体にとって必須のペプチドであると考えられている。
【０００３】
グレリンは、胃の内分泌細胞であるＸ/Ａ like cellに多量に存在するが、視床下部の弓状核の神経細胞にも存在し、近年になって本発明者は、膵臓のランゲルハンス島にも存在していることを見出してきた（非特許文献２参照）。
グレリンの分泌は、空腹時に促進され、摂食やグルコース負荷で抑制されるだけでなく、インスリン、ソマトスタチン、コレシストキニンなどのホルモンによっても抑制される。また、血漿中のグレリン濃度は肥満モデル動物やヒトの肥満者において低値で、体格指数（ＢＭＩ）と負の相関を示し、神経性食思不振症やカヘキシアを伴う重症心不全患者では高値を示す。グレリンは胃から分泌され、血中を循環するホルモンとして、強力な成長ホルモン（ＧＨ）分泌促進活性を有しているだけでなく、摂食亢進作用を有している。グレリンのこの摂食亢進作用は、グレリンにより増加した成長ホルモン（ＧＨ）を介したものではなく、神経ペプチドＹ（NPY）産生ニューロンなどの様々な摂食調節ニューロンが介在したグレリン独自の調節機構によるものであるとされている。また、グレリンはレプチンで誘発される摂食低下を抑制することから、グレリンは負のエネルギーバランス時に活性化され、摂食刺激、脂肪蓄積、また成長ホルモン（ＧＨ）による同化作用により生体の恒常性を維持するために必須のものであると考えられている。
さらに、グレリンの循環器系に対する作用としては、グレリンを慢性心不全モデルラットに１日２回、３週間投与を続けると、末梢血管抵抗の低下、心拍出量の増加、左室駆出率の増加、左室リモデリング進展の抑制、非梗塞部の代償性心肥大の促進など心機能の改善が認められたことが報告されている（非特許文献３参照）。これはグレリンによる直接作用と、グレリンにより増加したＧＨ／ＩＧＦ−１を介した作用によるものと考えられている。
また、グレリンの血圧降下作用については、グレリンの健常者への単回静脈内投与（１０μｇ／ｋｇ）は、成長ホルモン（ＧＨ）の濃度の上昇と共に比較的長時間持続する約１０ｍｍＨｇ程度の血圧（平均動脈圧）低下作用が示されたこと（非特許文献４参照）、心不全患者への静脈内投与(一過性投与)により、心拍数を変化させることなく平均血圧を低下させ心収縮能を改善すること（非特許文献５参照）、無麻酔正常ウサギに対するグレリンの側脳室内投与により、平均血圧、心拍数の低下と共に腎交感神経活性の抑制が認められたこと（非特許文献６参照）などが報告されている。しかし、一方では、健常人へのグレリンの皮下投与（１０μｇ／ｋｇ）により，濃度依存性に左室収縮能の増加が認められたが、心拍数，平均血圧に関しては有意な変化を認めなかったこと（非特許文献７参照）、心不全患者へのグレリンの静脈内投与（２μｇ／ｋｇ，３週間，ＢＩＤ）により、左室収縮能の改善、ＬＶ  ｍａｓｓの増加が認められたが、心拍数、平均血圧には有意な変化は認められなかったこと（非特許文献８参照）が報告されており、グレリンに血圧降下作用が有るか否かということは確定されてはいない。
【０００４】
また、成長ホルモン分泌促進因子受容体（ＧＨＳ−Ｒ）アンタゴニスト、又は抗体などのグレリン中和試薬を用いて、肥満症などにおけるグレリン作用を選択的に阻害する方法も報告されている（特許文献２参照）。
グレリンは３位のセリンがオクタン酸などの脂肪酸でエステル化されたものが活性を有するとされているが、非アシル化グレリンが、高齢者の成長ホルモン（ＧＨ）欠損症、糖尿病、及び肥満症患者の血糖調節剤として有用であることも報告されている（特許文献３参照）。
また、グレリンの活性部位からの類推により、グレリン類似物質をグレリンと同様なＧＨＳ−Ｒのリガンドとして開発することも試みられてきている（特許文献４及び５参照）。
【０００５】
一方、メタボリックシンドロームは、代謝症候群、シンドロームＸ(Reaven, 1988)、死の四重奏(Kaplan, 1989)、インスリン抵抗性症候群(De Fronzo, 1991)、内臓脂肪症候群とも呼ばれる複合生活習慣病であり、動脈硬化の危険因子である「肥満」、「高血圧」、「高血糖」、及び／又は「高脂血症」を重複して発症していることが多いこともメタボリックシンドロームの特徴とされている。このような複合型リスク症候群を「メタボリックシンドローム」という概念のもとに統一しようとする世界的な流れの中で、日本内科学会などが日本におけるメタボリックシンドロームの診断基準を２００５年４月に公表した。この診断基準では、必須項目となる内臓脂肪蓄積（内臓脂肪面積１００ｃｍ２以上）のマーカーとして、ウエスト周囲径が男性で８５ｃｍ、女性で９０ｃｍ以上を「要注意」とし、その中で  （１）血清脂質異常（トリグリセリド値１５０ｍｇ／ｄＬ以上、ＨＤＬコレステロール値４０ｍｇ／ｄＬ未満のいずれか、又は両方）、（２）血圧高値（最高血圧１３０ｍｍＨｇ以上、最低血圧８５ｍｍＨｇ以上のいずれか、又は両方）、（３）高血糖（空腹時血糖値１１０ｍｇ／ｄＬ）の（１）〜（３）の３項目のうち２つ以上を有する場合をメタボリックシンドロームと診断する、と規定している。「肥満」、「高血圧」、「高血糖」、「高脂血症」、又は「高コレステロール血症」の危険因子を２つ持つ人は全く持たない人に比べ、心臓病の発症リスクが１０倍近く高く、３〜４つ併せ持つ人では３１倍も高いとされており、メタボリックシンドロームは現代人における脅威の生活習慣病とされてきている。このように、たとえ異常の程度は軽くても複数の危険因子が重複しているケースでは、動脈硬化が起きやすく、早期の治療や予防が重要視されてきている。
メタボリックシンドロームの治療予防剤としては、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Peroxisome Proliferator-activated receptor:ＰＰＡＲ）γリガンド剤を有効成分とするもの（特許文献６参照）、ＰＰＡＲα／γを活性化を有効成分とするもの（特許文献７参照）などが報告されてきているが、さらなる治療予防剤の開発が望まれている。
なお、グレリンの血管内皮機能の改善について、メタボリックシンドローム患者を対象にした例により、グレリンは血管内皮機能をＮＯ依存性に改善したことが報告されている（非特許文献９参照）が、これはメタボリックシンドロームを治療予防しようというものではない。
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ  ０１／０７４７５号公報
【特許文献２】ＷＯ ０１／８７３３５号公報
【特許文献３】特表２００５−５１１７７１号公報
【特許文献４】特表２００５−５３５７０７号公報
【特許文献５】特表２００５−５１５２７１号公報
【特許文献６】特開２００５−９７２１６号公報
【特許文献７】特開２００６−１８２６６８号公報
【非特許文献１】Kojima M., Kangawa K., et al., Nature, 402, 656-660 (1999)
【非特許文献２】Dezaki K., Yada T., et al., Diabetes, 53, 3142-3151 (2004)
【非特許文献３】Nagaya N.,Kangawa K., et al., Circulation, 104, 1430-1435 (2001)
【非特許文献４】Nagaya N., Kangawa K., et al., Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 280, R1483-1487 (2001)
【非特許文献５】Nagaya, et al., J Clin Endocrinol Metab., 86, 5854-5859 (2001)
【非特許文献６】Matsumura, et al., Hypertension, 40, 694-699 (2002)
【非特許文献７】Enomoto, et al., Clin Science, 105, 431-435 (2003)
【非特許文献８】Nagaya, et al., Circulation, 110, 3674-3679 (2004)
【非特許文献９】Tesauro, et al., Circulation, 112, 2986-2992 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、高血圧症及び／又はメタボリックシンドロームの新規な治療予防剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、グレリンが、膵臓のランゲルハンス島にも存在していることを見出してきた（非特許文献２参照）。そして、グレリンがインスリンの分泌を抑制する作用を有し、グレリンによるインスリン分泌抑制機能の低下が高インスリン血症の成因のひとつになっていることを見出してきた。このグレリンによる作用を調節することにより、糖尿病、特にII型糖尿病の治療・予防薬として有用であることを示してきた。
本発明者らは、グレリンの高インスリン血症に対する作用に加えて、生活習慣病としての高血圧症のモデルである食事（フルクトース）誘導の高血圧症について検討することにより、グレリンが生活習慣病としての高血圧症を抑制することができれば、グレリンの降圧作用とインスリン分泌抑制作用を用いることにより、高インスリン血症を伴う高血圧症の治療・予防に有効となり、加えて中性脂肪を伴う高血圧症の抑制にも有効となることから、グレリンがメタボリックシンドロームに対する有効な治療・予防剤となると考えた。そこで、本発明者らは、食事（フルクトース）誘導の高血圧症についてグレリンの長期間投与による作用効果を検討したところ、グレリンが長期間にわたって食事（フルクトース）誘導の高血圧症に対して降圧作用を有していることを見出した。
【０００９】
本発明は、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬、好ましくはグレリンを含有してなるメタボリックシンドロームの予防・治療剤に関する。
また、本発明は、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬、好ましくはグレリンを含有してなる食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤に関する。
【００１０】
より詳細には、本発明は、以下の（１）〜（７）に関する。
（１）成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなるメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
（２）成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬が、グレリンである前記（１）に記載のメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
（３）メタボリックシンドロームが、高血圧、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝からなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を有するものである前記（１）又は（２）に記載のメタボリックシンドロームの予防・治療剤。
（４）成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなる、食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤。
（５）食事が、高脂肪食を含有してなる食事である前記（４）に記載の高血圧症の治療・予防剤。
（６）成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬が、グレリンである前記（４）又は（５）に記載の高血圧症の治療・予防剤。
（７）食事により誘導される高血圧症が、メタボリックシンドロームにおける高血圧症である前記（４）〜（６）のいずれかに記載の高血圧症の治療・予防剤。
【００１１】
本発明者らは、メタボリックシンドロームに至る原因のひとつとされている高脂肪食などの食事により誘導される高血圧症に対するグレリンの機能を検討するために、フルクトースを高含量で含有する食餌によりラットに高血圧症を誘発させて実験を行った。フルクトースは、肝臓で脂肪酸合成を促進させ、血中の中性脂肪（ＴＧ）を増加させ、脂肪組織や筋肉組織への脂肪の蓄積を促進させる。また、フルクトースは、骨格筋内への中性脂肪の蓄積によりインスリンの細胞内のシグナル伝達を阻害しインスリン抵抗性をもたらす。このために高含量のフルクトースを含有する食事により誘導される高血圧は、生活習慣病としての高血圧症のモデルとしてだけでなく、メタボリックシンドロームのモデルとすることもできる。フルクトースによる高血圧症の機構の詳細については、必ずしも明らかにされていないが、高含量のフルクトースの摂取によりインスリン抵抗性に対する代償性高インスリン血症が生じ、腎臓でのＮａの再吸収が亢進し、交感神経系の賦活化、ＲＡＡ系の刺激作用により血圧の上昇が生じるのではないかと考えられている。
【００１２】
実験用のラットとしては、ＳＤラットより系統分離された５週齢のダールラット（Dahl-S rat）を用いた。このラットは、８％の高食塩負荷により３〜４週後に２００ｍｍＨｇを超える高血圧を発症し、８週以内に心不全により１００％死亡するものである。この実験における食餌中の食塩濃度は０．３％として、高食塩負荷による高血圧症の発症を示さない範囲に設定した。
５週齢のダールラット１６匹を、３週間飼育して慣らした後、８匹づつの２群に分け、１群をコントロール食群とし、他の１群を高フルクトース食群とし、１２週間、それぞれの食餌で飼育した。高フルクトース食群は、フルクトースを６０％含有する食餌を与え、コントロール食群は６０％のフルクトースを６０％のコーンスターチとした食餌を与えた。次いで、コントロール食群と高フルクトース食群のそれぞれを、４匹づつの２群、合計４群に分け、コントロール食群と高フルクトース食群のそれぞれについてグレリン投与群とコントロール群とした。グレリン投与群には、グレリン１０ｎｍｏｌ／ｋｇを１日２回、３週間、腹腔内投与した。コントロール群にはビヒクルのみを同様に投与した。これらの４群をＡ群〜Ｄ群とした。
Ａ群  ：  高フルクトース食を１２週間、グレリン投与を３週間。
Ｂ群  ：  高フルクトース食を１２週間、ビヒクルのみを投与を３週間。
Ｃ群  ：  コントロール食を１２週間、グレリン投与を３週間。
Ｄ群  ：  コントロール食を１２週間、ビヒクルのみを投与を３週間。
これらの投与が終了した後も、コントロール食、高フルクトース食の投与を続け、体重、収縮期血圧(Tail cuff法)、随時血糖値の計測を継続した。
【００１３】
このときの収縮期血圧(Tail cuff法)の結果を図１に示す。図１の縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図１の黒四角印（■）で黒太線はＡ群を、黒菱形印（◆）はＢ群の結果を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。各印の縦線はそれぞれの標準偏差を示す。
この結果、高フルクトース食群（黒四角印（■）及び黒菱形印（◆））では、約３０日頃から、フルクトースの負荷による収縮期血圧の上昇が認められるようになった。一方、コントロール食群（黒三角印（▲）及びバツ印（×））では、試験期間を通して血圧の変動はほとんど無く、グレリン投与群（Ｃ群）と非投与群（Ｄ群）との血圧の相違もほとんど観察されなかった。
グレリン投与群（Ａ群（■））では、飼育開始１０６日目からのグレリンの投与によりコントロール食群（黒三角印（▲）及びバツ印（×））と同程度までに血圧が降下し、非投与群（Ｂ群）と有意に相違した。即ち、グレリンはフルクトースによる血圧上昇を完全に抑制することがわかった。さらに、グレリンの投与期間が終了した後（１２７日目以降）においても、グレリンによる降圧効果はグレリン投与中止後約１００日間部分的に持続した。
【００１４】
試験期間中の、体重、及び随時血糖値の計測結果を、それぞれ図２及び図３に示す。図２の縦軸は体重（ｇ）を示し、図３の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示し、図２及び図３の横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図２及び図３の黒四角印（■）はＡ群の結果を、黒菱形印（◆）はＢ群を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。
この結果、フルクトースの負荷によって体重と随時血糖値に有意な変化は認められなかった。また、グレリンの投与によって体重に有意な変化は認められなかった。
【００１５】
この試験の結果、ダールラットに高フルクトース食を負荷することにより、肥満及び糖尿病を伴わない血圧の上昇を認めた。これは、高フルクトース食の負荷により、ヒトでの高脂肪食を含有する食事により誘導されると同様の高血圧症を発症させることができることが示されたことになる。このようなフルクトースの負荷により誘導された高血圧に対してグレリン投与（３週間）を行ったところ、コントロール食群の正常血圧レベルまでの完全な降圧効果が認められた。しかも、グレリン投与（３週間）終了後、降圧効果は部分的に約１００日間持続した。一方、グレリンの投与はコントロール群の正常血圧には影響しなかったし、体重、及び血糖値にも影響を与えなかった。
この試験結果におけるフルクトースによる昇圧、グレリンによる降圧作用の機序は現在のところ必ずしも明確ではないが、グレリンの作用機序としてＴＧレベルの低下、インスリン抵抗性／高インスリン血症の改善が関与している可能性が考えられる。
【００１６】
グレリンによる、高フルクトース食により誘導される高血圧症における降圧作用、及びグレリン投与終了後における引き続く降圧作用という驚くべき作用効果が見出されたが、この結果をさらに確認するために同様な実験を再度繰り返した（第２クール）。その収縮期血圧(Tail cuff法)の結果を図４に示す。図４の縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図４の黒四角印（■）はＡ群の結果を、黒菱形印（◆）はＢ群を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。各印の縦線はそれぞれの標準偏差を示す。
この結果からも明らかなように、フルクトースの負荷による昇圧、グレリンの投与による降圧、グレリン投与中止後の部分的な高血圧の抑制について第１クールと同様の結果が再現され、我々の実験が確かなものであることが確認された。
【００１７】
グレリンの作用機序としてＴＧレベルの低下が考えられたので、第２クールの実験においてグレリン投与期間中における血中トリグセリド（ＴＧ）の濃度を測定した。
結果を図５に示す。図５の縦軸はＴＧ値（ｍｇ／ｄｌ）を示し、横軸は、左側からＤ群（細かい右下がり斜線）、Ｂ群（荒いドット）、Ｃ群（太い右下がり斜線）、及びＡ群（両斜線）をそれぞれ示す。
この結果、本発明者らの予想のとおり、血中ＴＧ濃度はフルクトース負荷群で上昇傾向が認められたが（Ａ群及びＢ群）、グレリン投与により、フルクトース群、コントロール群ともに低下傾向が認められた（Ａ群及びＣ群）。
即ち、グレリンが血中トリグセリド（ＴＧ）の低下作用を有していることが確認された。
次に、グレリンによる血中グルコース濃度の変化、及び血中インスリンの濃度の変化を試験した。ｄｄＹマウスにグレリン１ｎモル／ｋｇ又は１０ｎモル／ｋｇをそれぞれ投与し、同時に1g/kgのグルコースを投与し、投与後の血中グルコース濃度及び血中インスリン濃度を測定した。結果を図６Ａ（血中グルコース濃度）、及び図６Ｂ（血中インスリン濃度）に示す。図６Ａの縦軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図６Ｂの縦軸は血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図６Ａ及びＢにおける白丸印（○）はコントロールの場合を示し、黒丸印（●）はグレリンを１ｎモル／ｋｇ投与した場合を示し、黒三角印（▲）はグレリンを１０ｎモル／ｋｇ投与した場合を示す。図６Ａ及びＢ中の＊印はＰ＜０．０５で有意差が有ったことを示し、＊＊印はＰ＜０．０１で有意差が有ったことを示す。この結果、投与後、３０分、６０分後ではグルコース濃度は有意に高くなり、また、５分、１０分後のインスリン濃度は有意に低くなった。糖負荷をかけた場合においても、グレリンの投与によりインスリン分泌応答が抑制されていることがわかる。
【００１８】
次にラットの膵臓のランゲルハンス島を用いてグレリンによる、膵臓のランゲルハンス島からのインスリン分泌を検討した。グルコース８．３ｍモル／Ｌの存在下でグレリンを１０−１２モル、１０−１０モル、１０−８モルをそれぞれ投与した。
結果を図７に示す。図７の縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／島細胞／時間）を示し、横軸は、左側から、グルコース２．８ｍモル／Ｌ存在下（２．８Ｇ）におけるグレリン無しの場合、グルコース８．３ｍモル／Ｌの存在下（８．３Ｇ）におけるグレリン無しの場合（コントロール）、グレリンを１０−１２モル投与した場合（Ｌｏｇ−１２）、グレリンを１０−１０モル投与した場合（Ｌｏｇ−１０）、グレリンを１０−８モル投与した場合（Ｌｏｇ−８）、をそれぞれ示す。試験回数は１０回（ｎ＝１０）で、図７中の＊印はＰ＜０．０５で有意差があることを示す。この結果、グレリンのランゲルハンス島への投与により、グルコース誘発によるランゲルハンス島からのインスリンの分泌を有意に低下させることがわかる。
【００１９】
さらに、ラットの膵臓のランゲルハンス島を用いて、免疫蛍光染色法によりランゲルハンス島におけるインスリン及びグレリンの存在を観察した。結果を図８にカラー写真で示す。図８の上段（図８Ａ）は、左側から、インスリン（緑色）、グレリン（赤色）、両者を重ね合わせたものをそれぞれ示す。図８の下段（図８Ｂ）は、左側から、グルカゴン（緑色）、グレリン（赤色）、両者を重ね合わせたものをそれぞれ示す。重ね合わせた写真で黄色になっている部分は、両者が共存していることを示す。この結果、グレリンは、膵臓のランゲルハンス島に局在していることがわかった。
次に、ラットの膵臓のランゲルハンス島を用いて、グルコース５．６ｍモル／Ｌで誘発されるインスリンの分泌に対する、［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ（１μモル／Ｌ）、ＳＰＡ（［Ｄ−Ａｒｇ１，Ｄ−Ｐｈｅ５，Ｄ−Ｔｒｐ７，９，Ｌｅｕ１１］−サブスタンスＰ（ＧＨＳ−Ｒ拮抗薬））（１μモル／Ｌ）、及び抗グレリン血清（０．１％）の作用を試験した。通常の血清（０．１％）を比較のために用いた。トルブタミド（Ｔｏｌｂ）（３００μＭ）を陽性コントロールとして用いた。結果を、図９に示す。図９の縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／島細胞／時間）を示し、横軸は左側から、コントロール、［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ（１μモル／Ｌ）、ＳＰＡ（１μモル／Ｌ）、通常の血清（０．１％）、抗グレリン血清（０．１％）、陽性コントロールのトルブタミド（Ｔｏｌｂ）（インスリン分泌促進薬）（３００μＭ）をそれぞれ示す。試験回数は１０回（ｎ＝１０）で、平均値±標準偏差で示している。図９中の＊印は、Ｐ＜０．０５でコントロールに対して、又は通常の血清の場合に対して有意差があったことを示す。
この結果、グレリンの中和抗体、ＧＨＳ−Ｒ拮抗薬が存在した場合には、膵臓のランゲルハンス島からのインスリンの分泌が増加されることがわかった。
【００２０】
これらの結果によれば、グルコースにより誘発されるインスリンの分泌は、膵臓のランゲルハンス島に内在するグレリンにより抑制され、これは外来性のグレリンの投与によっても抑制され、そして、グレリンの中和抗体の存在によりグレリンの作用が非活性化されるために、インスリンの分泌が促進されることがわかった。
これらの関係を図１０により模式的に示す。図１０は膵臓のランゲルハンス島（膵島）におけるインスリンの分泌とグレリンの作用を模式的に示したものである。
【００２１】
これらの試験結果は、グレリンが血圧降下作用を有していること、特に高フルクトース食を含有する食事により誘発される高血圧に対して有意な血圧降下作用を有していることがわかった（図１及び図４参照）。また、また、グレリンは血中トリグリセリド（ＴＧ）を低下させる作用を有していること、特に高フルクトース食を含有する食事により誘発される血中トリグリセリド（ＴＧ）の増加に対する血中トリグリセリド（ＴＧ）の低下作用を有していることがわかった（図５参照）。さらに、グレリンは、グルコースにより誘発されるインスリンの分泌を抑制する作用を有していることがわかった。
これらの作用は、いずれもメタボリックシンドロームに対して有効な作用であり、かつこれらの作用を同時に有していることはメタボリックシンドロームに対して総合的な予防及び／又は治療ができることを示している。メタボリックシンドローム、特に高脂肪食により誘発されるメタボリックシンドロームは、高血圧、高脂血症、及び糖尿病などを伴う複合的な病態であり、これらにより動脈硬化（心筋梗塞、脳卒中など）、腎障害、癌などの重篤な疾患に対する危険因子となるものであり、早期の治療や予防処置が求められているものである。従来はこれらの高血圧、高脂血症、及び糖尿病などに対して個別的に対処されていたが、本明細書において明らかにされてきたようにグレリンは、高血圧、高脂血症、及び糖尿病などのいずれの病態に対しても有効性を有するものであり、メタボリックシンドロームに対する総合的な予防剤及び／又は治療剤として極めて優れたものである。
【００２２】
以上の例では、グレリンを例として挙げて説明してきたが、グレリンは成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬としてよく知られたものであり、以上の試験の結果はグレリンの成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬としての作用に起因するものと考えられることから、本発明における有効成分としては、グレリンだけでなく成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）に対する活性を有する成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬が挙げられる。当該成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬としの代表的なものとしては、グレリンが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、グレリンとしては、アミノ酸２８個からなり、３位のセリンがオクタン酸によりアシル化されたものだけでなく、グレリンとしての活性を有するものであれば、アミノ酸が１個、２個、３個、４個、又は５個程度欠失したものでもよく、アミノ酸が１個、２個、３個、４個、又は５個程度付加されたものであってもよい。また、グレリンの２８個のアミノ酸にうちの、１個、２個、３個、４個、又は５個程度が他のアミノ酸に置換されたものであってもよい。さらに、これらの欠失、付加、置換がくみあわされたものであってもよい。セリンにおけるアシル基もオクタン酸によるものに限定されるものでなく、グレリンの活性を有する限りにおいて、他のカルボン酸やスホン酸などでアシル化されたものであってもよい。また、グレリンの活性を有する限りにおいて、アシル化されていないものであってもよい。
【００２３】
本発明におけるメタボリックシンドロームとは、日本内科学会などが日本におけるメタボリックシンドロームの診断基準に基づくものが挙げられるがこれに限定されるものではなく、米国基準やＷＨＯによる基準などのいずれに基づくものであってもよい。本発明のメタボリックシンドロームの予防・治療剤は、メタボリックシンドロームによる高血圧、高脂血症、及び／又は糖尿病などに至る病態を総合的に正常化させることができるものであり、高齢化社会における成人病に対する極めて有効な予防及び／又は治療（予防・治療）剤として、特に高齢者の生活の質の向上に有用なものとなる。また、本発明におけるメタボリックシンドロームの予防・治療剤は、メタボリックシンドローム、例えば、内臓肥満に起因する、高血圧、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂血症、内臓脂肪型肥満、及び脂肪肝からなる群から選ばれる少なくとも１つの症状を呈するメタボリックシンドロームの予防剤及び／又は治療剤である。
また、本発明は、前記してきた成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬を含有してなる、食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤を提供するものである。グレリンの血圧低下作用については、健常者の血圧（平均動脈圧）低下作用を示すこと（非特許文献４参照）、心不全患者の平均血圧を低下させること（非特許文献５参照）、無麻酔正常ウサギに対するグレリンの側脳室内投与により、平均血圧の低下が示されたこと（非特許文献６参照）などが報告されている。
しかしながら、食事、特に高フルクトース、高脂肪食を含有する食事により誘発される高血圧症の予防・治療に有効であることは、本発明が初めて明らかにするものである。このような高血圧症は、すでに報告されている健常人や心不全患者における高血圧症とは異なるものであり、また、側脳室内投与するものではなく、新規な薬理作用に基づくものである。さらに、本発明の高血圧症の治療・予防剤は、単回投与ではなく、数日又は数週間にわたる連続投与が好ましいものである。
これらの点から、本発明の食事により誘導される高血圧症の治療・予防剤は新規な用途であるだけなく、食事、特に高脂肪食を含有する食事により誘発される高血圧症に対する極めて有効な治療・予防剤として、予想外に顕著な効果を有するものである。
【００２４】
本発明のメタボリックシンドロームの予防・治療剤、及び食事、特に高脂肪食を含有する食事により誘発される高血圧症の予防・治療剤としての有効成分となる成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬、好ましくはグレリンの有効投与量は、患者、患者の状態、症状などにより適宜変更されるが、通常は０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が挙げられ、これを１日１〜数回に分けて投与することができる。本発明のこれらの予防・治療剤の投与方法としては、特に限定されるものではない。投与方法としては静脈投与が好ましいが、これに限定されるものでは無く、直腸投与、経鼻投与などの経粘膜投与することもできる。また、本発明の予防・治療剤は、前記した投与形態に応じて、公知の各種の方法により製剤化することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、高血圧、高脂血症、及び糖尿病などに至るメタボリックシンドローム、特に高脂肪食を含有する食事により誘発されるメタボリックシンドロームに対する新規な予防・治療剤を提供するものであり、本発明の有効成分となる、成長ホルモン分泌促進因子（ＧＨＳ）レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）作動薬、好ましくはグレリンは、高血圧、高脂血症、及び糖尿病などの各種の病態に対して総合的な優れた活性を示すものであり、メタボリックシンドロームに対する総合的な有効性を有する予防・治療剤としてだけでなく、高齢化社会における成人病に対する極めて有効な予防及び／又は治療（予防・治療）剤として、特に高齢者の生活の質の向上に有用なものとなる。
また、本発明は、食事、特に高脂肪食を含有する食事により誘発される高血圧症の新規な予防・治療剤を提供するものであり、食事の豊富化や、相対的な高脂肪食を含有する食事による高血圧症に対する有効な予防及び／又は治療（予防・治療）剤として、特に高齢者の生活の質の向上に有用なものとなる。さらに、本発明の予防・治療剤による降圧効果は、投与中止後も長期間に亘って降圧効果が持続することから、若年者への短期間の介入により高血圧発症を遅延させる効果が期待できる。
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
フルクトースの負荷によるラットの血圧降下試験
ＳＤラット系統から分離された、８％高食塩負荷により３−４週後に２００ｍｍＨｇを超える高血圧を発症し、８週以内に心不全により１００％死亡する５週齢のダールラット１６匹を、３週間飼育して慣らした後、８匹づつの２群に分け、１群をコントロール食群とし、他の１群を高フルクトース食群とし、１２週間、それぞれの下記の食餌で飼育した。
コントロール食        高フルクトース食    
魚粉                              １０．０％            １０．０％
脱脂大豆                            ７．５％              ７．５％
弊社ビタミン／ミネラル混合          １．０％              １．０％
フルクトース−                      −−−              ６０．０％
コーンスターチ                    ６０．０％              −−−
大豆油                              １．０％              １．０％
グルテンミール                    ２０．０％            ２０．０％
炭酸カルシウム                      ０．５％              ０．５％
ＮａＣｌ                            ０．３％              ０．３％      
両者の栄養成分含量
蛋白質            ２３％
脂質                ２％
炭水化物          ６３％
総カロリー      ３５９ｋｃａｌ／１００ｇ
高フルクトース食群は、フルクトースを６０％含有する食餌を与え、コントロール食群は６０％のフルクトースを６０％のコーンスターチとした食餌を与えた。次いで、コントロール食群と高フルクトース食群のそれぞれを、４匹づつの２群、合計４群に分け、コントロール食群と高フルクトース食群のそれぞれについてグレリン投与群とコントロール群とした。グレリン投与群には、グレリン１０ｎｍｏｌ／ｋｇを１日２回、３週間、腹腔内投与した。コントロール群にはビヒクルのみを同様に投与した。これらの４群をＡ群〜Ｄ群とした。
Ａ群  ：  高フルクトース食を１２週間、グレリン投与を３週間。
Ｂ群  ：  高フルクトース食を１２週間、ビヒクルのみを投与を３週間。
Ｃ群  ：  コントロール食を１２週間、グレリン投与を３週間。
Ｄ群  ：  コントロール食を１２週間、ビヒクルのみを投与を３週間。
これらの投与が終了した後も、コントロール食、高フルクトース食の投与を続け、体重、収縮期血圧(Tail cuff法)、随時血糖値の計測を継続した。
尾静脈より採取した血液をグルコカードダイアメーター（アークレイ(株)）により測定した。採血時は午後に行い、絶食とせず随時血糖を測定した。また、室町機械（株）の「BP MONITOR FOR MICE & RATS MK-2000」を用いてテイルカッフ（Tail cuff）法により収縮期血圧を測定した。測定は午後に行い、無麻酔、室温で測定した。
結果を図１（収縮期血圧）、図２（体重）、及び図３（随時血糖値）に示す。
また、同じ方法により第２クールの実験を行った結果を図４に示す。
【実施例２】
【００２８】
フルクトースの負荷によるラットの血中ＴＧの測定
実施例１に記載した第２クールの実験において、グレリン又はビヒクルの投与期間終了後、一晩絶食させた後、尾静脈より採血を行い血中ＴＧを測定した。測定キットは和光純薬工業(株)の「トリグリセライド E-テスト（GPO・DAOS法）」を用いた。
結果を図５に示す。
【実施例３】
【００２９】
グレリンの投与による、マウス糖負荷試験におけるインスリン分泌応答の抑制
第１群のマウスには１ｇ／ｋｇのグルコースのみを腹腔内に投与し、第２群のマウスには１ｇ／ｋｇのグルコース及び１ｎｍｏｌ／ｋｇのグレリンを腹腔内に投与し、第３群のマウスには１ｇ／ｋｇのグルコース及び１０ｎｍｏｌ／ｋｇのグレリンを投与した。コレラのマウスを一晩絶食させた後、尾静脈より採血を行いグルコース濃度及びインスリン濃度をそれぞれ測定した。インスリン濃度の測定は、ＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業(株)）を用い、グルコース濃度はグルコカードＤＩＡメーター（GlucoCard DIA meter (Arkray)）を用いた。
結果を図６に示す。
【実施例４】
【００３０】
グレリンの投与によるラット膵島のグルコース誘発インスリン分泌の抑制
８−１２週齢のウィスターラットから膵臓のランゲルハンス島（膵島）をコラゲナーゼ消化法により分離した。分離した膵島を集め、１２−１５の膵島を２．８ｍｍｏｌ又は８．３ｍｍｏｌのグルコースの存在下で、ＨＫＲＢ中で１時間３７℃でインキュベートした。
８．３ｍｍｏｌのグルコースの存在下での試験においては、グレリンが１０−１２モル、１０−１０モル、又は１０−８モル存在させた群で、同様にインキュベートした。
それぞれの群におけるインスリン濃度をＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業(株)）を用いて測定した。
結果を図７に示す。
【実施例５】
【００３１】
ラット膵島における内因性グレリンの局在
ラットの膵臓を４％パラホルムアルデヒドで固定化した。各セッションを、マウス抗グルカゴンモノクローナル抗体、又はマウス抗インスリンモノクローナル抗体の１：１０００希釈液の存在下で、それぞれ一晩インキュベートした。次いで、各サンプルをアレキサフルアー４８８（Alexa Fluor 488）で標識化されたヤギ抗ＩｇＧ抗体（Molecular Probes）でインキュベートした。これをラットのアシル化グレリン（＃４０５）に対するウサギ抗血清の１：５０００希釈液の存在下で４℃で一晩インキュベートした。結合した抗体を、アレキサフルアー５６８（Alexa Fluor 568）で標識化されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Molecular Probes）を用いて検出した。グレリン、インスリン、及びグルカゴンのそれぞれの免疫蛍光を、マルチフォトンレーザースキャニング顕微鏡（FluoView FV300-TP, Olympus）で観察して、写真を撮った。
結果を図８にカラー写真で示す。
【実施例６】
【００３２】
内因性グレリンの、受容体アンタゴニスト、中和抗体による阻害
８−１２週齢のウィスターラットから膵臓のランゲルハンス島（膵島）をコラゲナーゼ消化法により分離した。分離した膵島を集め、１２−１５の膵島を５．６ｍｍｏｌのグルコースの存在下で、図９に示される、［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ（１μモル／Ｌ）、ＳＰＡ（１μモル／Ｌ）、通常の血清（０．１％）、抗グレリン血清（０．１％）、又は陽性コントロールのトルブタミド（Ｔｏｌｂ）（インスリン分泌促進薬）（３００μＭ）のそれぞれの試薬の存在下、又は非存在下（コントロール）で、ＨＫＲＢ中で１時間３７℃でインキュベートした。それぞれの群におけるインスリン濃度をＥＬＩＳＡキット（和光純薬工業(株)）を用いて測定した。
結果を図９に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明は、高血圧、高脂血症、及び糖尿病などに至るメタボリックシンドローム、特に高脂肪食を含有する食事により誘発されるメタボリックシンドロームに対する新規な予防・治療剤、及び食事、特に高脂肪食を含有する食事により誘発される高血圧症の新規な予防・治療剤を提供するものであり、製薬産業などにおける産業上の利用可能性を有するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、グレリン投与による、高脂肪食のモデルである高フルクトース食負荷における収縮期血圧(Tail cuff法)の結果を示すグラフである。図１の縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図１の黒四角印（■）で黒太線はＡ群を、黒菱形印（◆）はＢ群の結果を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。各印の縦線はそれぞれの標準偏差を示す。
【図２】図２は、グレリン投与による、高脂肪食負荷における試験期間中の、体重の計測結果を示すグラフである。図２の縦軸は体重（ｇ）を示し、図２の横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図２及び図３の黒四角印（■）はＡ群の結果を、黒菱形印（◆）はＢ群を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。
【図３】図３は、グレリン投与による、高脂肪食負荷における試験期間中の、血糖値の計測結果を示すグラフである。図３の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示し、図３の横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図２及び図３の黒四角印（■）はＡ群の結果を、黒菱形印（◆）はＢ群を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。
【図４】図４は、図１に示した結果をさらに確認するために同様な実験を再度繰り返した（第２クール）収縮期血圧(Tail cuff法)の結果を示すグラフである。図４の縦軸は収縮期血圧（ｍｍＨｇ）を示し、横軸は飼育を開始した時からの日数を示す。図４の黒四角印（■）はＡ群の結果を、黒菱形印（◆）はＢ群を、黒三角印（▲）はＣ群を、バツ印（×）はＤ群を、それぞれ示す。各印の縦線はそれぞれの標準偏差を示す。
【図５】図５は、グレリン投与期間中における血中トリグセリド（ＴＧ）の濃度を測定した結果を示すグラフである。図５の縦軸はＴＧ値（ｍｇ／ｄｌ）を示し、横軸は、左側からＤ群（細かい右下がり斜線）、Ｂ群（荒いドット）、Ｃ群（太い右下がり斜線）、及びＡ群（両斜線）をそれぞれ示す。
【図６】図６は、グルコース負荷試験（1g/kg)におけるグレリン投与による血中グルコース濃度の変化、及び血中インスリンの濃度の変化を試験した結果を示すグラフである。図６Ａは血中グルコース濃度の結果を示し、図６Ｂは血中インスリン濃度の結果を示す。図６Ａの縦軸は血中グルコース濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図６Ｂの縦軸は血中インスリン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示し、横軸は時間（分）を示す。図６Ａ及びＢにおける白丸印（○）はコントロールの場合を示し、黒丸印（●）はグレリンを１ｎモル／ｋｇ投与した場合を示し、黒三角印（▲）はグレリンを１０ｎモル／ｋｇ投与した場合を示す。図６Ａ及びＢ中の＊印はＰ＜０．０５で有意差が有ったことを示し、＊＊印はＰ＜０．０１で有意差が有ったことを示す。
【図７】図７は、グルコース８．３ｍモル／Ｌの存在下で膵臓のランゲルハンス島からのインスリン分泌を検討した結果を示すグラフである。図７の縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／膵島／時間）を示し、横軸は、左側から、グルコース２．８ｍモル／Ｌ存在下（２．８Ｇ）におけるグレリン無しの場合、グルコース８．３ｍモル／Ｌの存在下（８．３Ｇ）におけるグレリン無しの場合（コントロール）、グレリンを１０−１２モル投与した場合（Ｌｏｇ−１２）、グレリンを１０−１０モル投与した場合（Ｌｏｇ−１０）、グレリンを１０−８モル投与した場合（Ｌｏｇ−８）、をそれぞれ示す。試験回数は１０回（ｎ＝１０）で、図７中の＊印はＰ＜０．０５で有意差があることを示す。
【図８】図８は、ラットの膵臓のランゲルハンス島を用いて、免疫蛍光染色法によりランゲルハンス島におけるインスリン及びグレリンの存在を観察した結果を示す、カラー写真である。図８の上段（図８Ａ）は、左側から、インスリン（緑色）、グレリン（赤色）、両者を重ね合わせたものをそれぞれ示す。図８の下段（図８Ｂ）は、左側から、グルカゴン（緑色）、グレリン（赤色）、両者を重ね合わせたものをそれぞれ示す。
【図９】図９は、膵臓のランゲルハンス島におけるグルコース５．６ｍモル／Ｌで誘発されるインスリンの分泌に対する作用を試験した結果を示すグラフである。図９の縦軸はインスリン分泌量（ｎｇ／膵島／時間）を示し、横軸は左側から、コントロール、［Ｄ−Ｌｙｓ３］−ＧＨＲＰ（１μモル／Ｌ）、ＳＰＡ（１μモル／Ｌ）、通常の血清（０．１％）、抗グレリン血清（０．１％）、陽性コントロールのトルブタミド（Ｔｏｌｂ）（３００μＭ）をそれぞれ示す。試験回数は１０回（ｎ＝１０）で、平均値±標準誤差で示している。図９中の＊印は、Ｐ＜０．０５でコントロールに対して、又は通常の血清の場合に対して有意差があったことを示す。
【図１０】図１０は、膵臓のランゲルハンス島（膵島）におけるインスリンの分泌とグレリンの作用を模式的に示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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