(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から１種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定する方法であって、
少なくとも第１及び第２の実験パラメータを所定の範囲にわたって変化させることによって複数の異なる実験条件で試料のクロマトグラフィー精製を行うステップ、及び精製中に精製結果を示す出力パラメータをモニタすることによって、各精製をクロマトグラムとして記録するステップと、
グラフィカルユーザインターフェースにおいて、記録されたクロマトグラムの少なくともサブセットをダイアグラム内にクロマトグラムミニチュアとして表示するステップであって、ダイアグラム内のそれぞれの表示されたクロマトグラムミニチュアの位置が、対応する精製の実験パラメータによって決定されることにより、ユーザがダイアグラム内の表示されたクロマトグラムミニチュアの位置に基づいて液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響を視覚的に決定することを可能にする、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
各クロマトグラフィー精製が、アフィニティークロマトグラフィー、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングのうちの１以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
実験パラメータが、溶出液のイオン強度、溶出液のｐＨ、溶出液の流量率、溶出液の種類、カラムの特性、クロマトグラフィー媒体の特性、負荷ｐＨ、負荷伝導率、負荷濃度、負荷質量、負荷ＨＣＰ、負荷添加剤、洗浄体積、洗浄ｐＨ、洗浄伝導率、洗浄添加剤、ステップ溶出レベル、ステップ溶出体積、勾配目標レベル、勾配体積、カットＯＤ、バッファシステム、媒体の種類、床の高さ、流速、滞留時間、塩の種類、溶剤、バッファ添加剤から選択される、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各精製が、精製中に２以上の出力パラメータをモニタすることによって２以上のクロマトグラムとして記録される、請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
出力パラメータは、１以上の波長におけるＵＶ吸光度、導電率、光散乱検出、蛍光発光、質量分析、記録されたｐＨ、記録された圧力のグループから選択される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
クロマトグラフィー精製を行うステップと、記録されたクロマトグラムを表示するステップとを繰り返すステップを含み、第１及び第２の実験パラメータの少なくとも１つは、記録されたクロマトグラムを表示するステップから決定されるため、より狭い範囲にわたって変化する、請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ダイアグラムは、クロマトグラムミニチュアが対応する実験の実験パラメータの相対的な順序に基づいて配置される、マトリックス表現を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ダイアグラム内で実験パラメータのクロマトグラムを予測し、予測されたクロマトグラムミニチュアを、対応する実験によって得られるクロマトグラムミニチュアが利用できないマトリックス位置に表示するステップを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
予測されたクロマトグラムミニチュアは、対応する実験によって得られるクロマトグラムミニチュアから図形的に区別可能である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ダイアグラムは、第１の実験パラメータの値を表す第１の次元を有し、かつ第２の実験パラメータの値を表す第２の次元を有する座標系を含み、クロマトグラムミニチュアは、対応する実験の実験パラメータによって定義された座標に位置付けられる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ダイアグラム内の１以上の実験パラメータ座標を選択することによって、後続のクロマトグラフィー精製実験のための液体クロマトグラフィープロトコルの実験パラメータを定義するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ダイアグラム内のユーザ選択に応じて、ダイアグラム内の実験パラメータ座標に対するクロマトグラムを予測し、予測されたクロマトグラムを表示するステップを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
異なる実験条件が、１以上の追加の実験パラメータを変化させることを含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
追加の実験パラメータの少なくとも１つがオーバーレイダイアグラムとして表示され、パラメータ値はスクロールすることができる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
追加の実験パラメータの１つが第３の次元としてダイアグラム内に表示される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
複数の異なる実験条件は、実験計画モジュールを使用して決定される、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
２以上のクロマトグラムが同じ実験パラメータに対して記録され、２以上のクロマトグラムが、同じクロマトグラムミニチュアで、又は対応する精製の実験パラメータによって決定される位置の回りにグループ化された個々のクロマトグラムミニチュアとして表示される、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１以上のクロマトグラムを評価して、クロマトグラムに関連する１以上の品質基準を決定するステップであって、品質基準がクロマトグラムミニチュアと組み合わされてダイアグラムに表示される、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１つの品質基準は、１以上の出力パラメータから導出され、クロマトグラムの分解能、効率、選択性、ピーク面積、非対称性、及びピークの広がりのグループから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つの品質基準が、純度、精製時間、収率、生物活性、精製された試料の外部分析からの結果、表示されたパラメータとは異なる出力パラメータ、及び精製コストのグループから選択された精製結果パラメータから導出される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ユーザによって行われたクロマトグラムミニチュアに対するドラッグアンドドロップ操作に続いて、２以上のクロマトグラムがオーバーレイプロットで提示される、請求項１乃至請求項２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１乃至請求項２１のいずれか１項に記載の方法を行うように構成された、液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２３】
請求項２２に記載の液体クロマトグラフィーシステムであって、
試料から１種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定するために、ユーザが液体クロマトグラフィー精製プロトコルの実験シーケンスを定義できるように構成された実験設計モジュールであって、実験シーケンスは、少なくとも第１及び第２の実験パラメータのそれぞれが所定の範囲にわたって変化する、複数の異なる実験条件を含む、実験設計モジュールと、
実験シーケンスに従ってクロマトグラフィーシステムの動作を制御する精製制御モジュールと、
精製の間に出力パラメータをモニタすることによって、各精製の結果をクロマトグラムとして記録する精製記録モジュールと、
記録したクロマトグラムの少なくともサブセットを、ダイアグラム内のクロマトグラムミニチュアとして、ディスプレイに提示するように構成された精製評価モジュールであって、それぞれの表示されたクロマトグラムミニチュアの位置を対応する精製の実験パラメータによって決定することにより、ユーザが、液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響を視覚的に決定することを可能にする、精製評価モジュールと
を含む、液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２４】
プロセッサとディスプレイユニットとを含むコンピュータ上で実行されると、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法を行うように構成されたコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料から1種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの影響を決定するための方法及びシステムに関し、より詳細には、ユーザが液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響をより容易に視覚的に決定することを可能にする、異なる実験パラメータの影響を評価するための簡略化された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的方法は、研究目的のためだけでなく、新規な種類の薬物を調製するために、タンパク質、ペプチド、核酸及び他の生物学的分子及び化合物の生産においてますます使用されている。液体クロマトグラフィーは、その汎用性と化合物に対する感度のため、この文脈においてしばしば好ましい精製方法である。液体クロマトグラフィーという用語は、密接に関連した分離法のファミリーを包含し、これらの分離法はすべて、互いに不混和性の２つの相が接触するという原理に基づいている。より具体的には、標的化合物は、移動（液体）相に導入されて、固定相と接触する。次いで、標的化合物は、移動相によってシステムを通じて搬送される間に、固定相と移動相との間で一連の相互作用を受ける。簡単に述べると、クロマトグラフィーの概念は、移動相及び固定相に関するそれぞれの物理的又は化学的特性の違いに基づいて、試料中の他の分子から標的分子を分離することに関する。一般に使用されるクロマトグラフィー精製技術の例には、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー（ＡＣ）、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲル濾過（ＧＦ）、クロマトフォーカシングなどが含まれる。場合によっては、精製プロトコルは、同じ又は異なる精製技術を用いる２以上の精製ステップを含む。
【０００３】
クロマトグラフィー精製プロトコルの性能は、通常、精製中に１以上の出力パラメータをモニタすることによって「クロマトグラム」として記録される。出力パラメータは、記録することができ、かつ精製の性能を表す、任意のパラメータとすることができる。出力パラメータの例には、限定されるものではないが、１以上の波長におけるＵＶ吸光度、導電率、光散乱検出、蛍光発光、質量分析が含まれる。クロマトグラム１０の模式的な例が図１に示されており、実線２０は、例えば溶出した試料流れのＵＶ吸光度など、記録された出力パラメータを表す。破線３０は、例えばｐＨなどの溶出液パラメータの直線勾配を表し、間隔Ａは、記録される出力パラメータ値のピークによって示されるように、精製された標的物質を含有する溶出液流の分画を表す。
【０００４】
試料から1種以上の標的分子を精製するために新しい液体クロマトグラフィープロトコルを設計する際の１つの課題は、最良の可能なクロマトグラフィープロトコル設定を見出すために、異なる実験パラメータの影響を決定することである。１つの一般的な目標は、十分な純度及び収率の標的分子を低コストかつ可能な限り速く提供するクロマトグラフィープロトコルを見出すことである。このプロセスでは、例えば包括的な薬物開発プロセスなどを迅速化するため、時間が重要な要素である。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＡＫＴＡ  ａｖａｎｔ（商標）及びＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ（商標）などの自動液体クロマトグラフィーシステムを使用した精製の自動化により、異なる実験条件を迅速に試すことが可能となるが、目標達成の進め方を決定するために評価が必要となる多くのデータが生成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８８３８３９７号明細書
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、液体クロマトグラフィープロトコルにおける少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定するための新規な方法及び液体クロマトグラフィーシステムを提供することであり、この方法及びバイオセンサシステムは、従来技術の１以上の欠点を克服する。これは、独立請求項に定義される方法及びシステムによって達成される。
【０００７】
本発明は、ユーザの意思決定を支援することにより、実験から最終結果までの時間を短縮する。本発明は、実験セットアップからの情報を利用し、それを結果に結び付けることにより、データを自動的にまとめて、異なる実験条件の影響を視覚化することができる。このようにして、傾向を容易に明らかにすることができる。ユーザは、ニーズを満たすためにどの精製プロトコルを使用すべきかをより迅速に決定することができる。
【０００８】
以下の詳細な説明及び図面を参照することによって、本発明並びにそのさらなる特徴及び利点のより完全な理解が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】クロマトグラムの模式的な例である。
【図２】クロマトグラムの分解能を決定する方法の説明図である。
【図３ａ】異なる分解能をもつクロマトグラムの２つの例を示す。
【図３ｂ】異なる分解能をもつクロマトグラムの２つの例を示す。
【図４ａ】異なる選択性をもつクロマトグラムの２つの例を示す。
【図４ｂ】異なる選択性をもつクロマトグラムの２つの例を示す。
【図５】本発明による方法の一実施形態の概略ブロック図を示す。
【図６ａ】本発明の異なる実施形態を示す。
【図６ｂ】本発明の異なる実施形態を示す。
【図７】本発明の異なる実施形態を示す。
【図８】本発明の異なる実施形態を示す。
【図９】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１０】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１１】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１２】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１３】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１４】本発明の異なる実施形態を示す。
【図１５】本発明の一実施形態による液体クロマトグラフィーシステムの概略ブロック図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
上述の通り、本発明は、試料から1種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける、少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定するための方法及び液体クロマトグラフィーシステムに関する。
【００１１】
定義：
本明細書及び特許請求の範囲を通して、以下の用語は以下の非限定的な定義に基づいて使用される。
【００１２】
液体クロマトグラフィー精製／精製：上述の通り、液体クロマトグラフィー精製という用語は、例えば不純物及び／又は他の非標的分子を取り除くことによって、試料から1種以上の標的分子を精製する、現在又は将来のクロマトグラフィーに基づく任意の行為又はプロセスを意味する。液体クロマトグラフィー精製の例には、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、クロマトフォーカシングが含まれる。さらに、明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、「精製」という用語は、「液体クロマトグラフィー精製」の略語として使用され、同じ意味を有することが意図されている。しかしながら、この定義によって、精製されている、精製される、精製された、純粋な、などの関連用語の範囲が決して限定されるものではない。
【００１３】
実験パラメータ：「実験パラメータ」という用語は、改変することができ、かつ液体クロマトグラフィープロトコルの性能に影響を及ぼす可能性のある、任意のパラメータを意味する。実験パラメータは、ｐＨ、イオン強度又は溶出液の流量率など、連続的な範囲にわたって変化し得る可変パラメータであってもよいが、勾配などの変化率であってもよい。さらに、実験パラメータは、クロマトグラフィー媒体の種類、溶出液中の塩の種類などの異なる個別の状態にのみ設定することができる離散型でもよいが、特定の添加剤の有無、すなわちオンオフパラメータであってもよい。さらに、当業者には明らかなように、いくつかの実験パラメータは、例えば第１段階では溶出液中の塩の種類の評価、第２段階では塩の濃度及び／又は勾配特性の評価など、評価の１つの段階では離散型であるが、別の段階では変数であってもよい。実験パラメータの例には、限定されるものではないが、溶出液のイオン強度、溶出液のｐＨ、溶出液の流量率、溶出液の種類、カラムの特性、クロマトグラフィー媒体の特性、負荷ｐＨ、負荷伝導率、負荷濃度、負荷質量、負荷ＨＣＰ、負荷添加剤、洗浄体積、洗浄ｐＨ、洗浄伝導率、洗浄添加剤、ステップ溶出レベル、ステップ溶出体積、勾配目標レベル、勾配体積、カットＯＤ、バッファシステム、媒体の種類、床の高さ、流速、滞留時間、塩の種類、溶剤、バッファ添加剤が含まれる。
【００１４】
液体クロマトグラフィープロトコル：「液体クロマトグラフィープロトコル」という用語は、クロマトグラフィー精製プロセスのための実験パラメータの設定を定義するプロトコルを意味する。液体クロマトグラフィープロトコルは、１以上のクロマトグラフィー精製ステップを含んでいてもよく、濾過などの他のステップとさらに組合せることができる。
【００１５】
標的分子：「標的分子」という用語は、移動相及び固定相に関するそれぞれの物理的又は化学的性質の違いに基づいて、試料中の１以上の他の分子から分離され、精製される分子を意味する。標的分子は、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡなどの生体分子であってもよい。
【００１６】
試料：「試料」という用語は、分離されて精製される標的分子を少なくとも含む初期液体試料を意味する。試料は、例えば細胞培養物、生体、体液などに由来する、生物由来の試料液のような標的分子を含む任意の液体であってもよい。
【００１７】
クロマトグラム：「クロマトグラム」という用語は、クロマトグラフィー精製の少なくとも一部の間に記録された１以上の出力パラメータのグラフ表現を意味する。クロマトグラムは、時間、蓄積量、又はクロマトグラフィー精製に関連する任意の他のパラメータの関数として、出力パラメータを提示することができる。
【００１８】
出力パラメータ：「出力パラメータ」という用語は、クロマトグラフィー精製の結果を示す記録可能なパラメータを意味する。出力パラメータは、例えば、クロマトグラフィー精製からの出力流における１以上の特性の測定値であり、出力パラメータは、限定されるものではないが、１以上の波長におけるＵＶ吸光度、伝導率、光散乱検出、蛍光放出、質量分析、記録された流れ、記録されたｐＨ、記録された圧力から選択され得る。
【００１９】
品質基準：「品質基準」という用語は、クロマトグラフィー精製の品質を表す任意の基準を意味する。品質基準は、クロマトグラフィー精製中に記録された１以上のクロマトグラムから決定される基準であってもよく、純度、精製時間などの精製結果パラメータから導出される基準であってもよいし、いくつかのパラメータの組合せから算出される複合的な基準であってもよい。
【００２０】
クロマトグラフィー精製プロトコルの作成：
上述の通り、効率的かつ経済的な方法で十分な純度及び量を有する標的分子を得る必要性は、生化学的特徴付けのための濃縮タンパク質抽出物の調製から、治療的組換えタンパク質の大規模生産まで、本質的にあらゆるクロマトグラフィー精製プロトコルに適用される。
【００２１】
上述の通り、クロマトグラフィー精製プロトコルは、１以上の精製ステップを含んでいてもよく、一例では、プロトコルは一般に捕捉、中間精製、及び最終精製（polishing）と呼ばれる３つの精製ステップを含む。表１は、異なるクロマトグラフィー精製技術の選択に対応する特徴、及び３ステップのプロトコルの異なる精製ステップにおける対応する使用を示す。クロマトグラフィー精製プロトコルを設計する場合、各精製工程を計画する際には、分解能、容量、速度、及び回収率という４つの重要な考慮すべき性能パラメータがある。これらの４つのパラメータのうちいずれか１つの最適化は他を犠牲にしてのみ達成することができ、各精製ステップは妥協となる。各パラメータの重要性は、例えば、精製ステップが捕捉のために使用されるのか、中間精製のために使用されるのか、又は最終精製のために使用されるのかなど、各精製ステップの目的に応じて変化する。精製方法は、各精製ステップの目的に合わせて選択し、最適化すべきである。回収率は最適化の重要なパラメータではないかもしれないが、それでも、特に高価値製品の生産のための準備状況においては懸念されることがあり、捕捉ステップの最適化の間に回収率をアッセイすることが重要である。
【００２２】
【表１】
0006656710.tif 000002
容量と分解能の最適なバランスは、ケースごとに定義する必要がある。捕捉段階では、標的分子の高い結合能力を達成することだけではなく、選択性が重要である。しかしながら、ほとんどの捕捉ステップとは対照的に、溶出中の選択性は重要であり、通常、連続勾配又は多段階溶出手順を適用することによって達成される。
【００２３】
種々の精製方法を通して利用可能な異なる選択性に加えて、精製効率は、各方法について利用可能な異なるクロマトグラフィー媒体の選択に強く依存する。効率、流れ抵抗、選択性、及び容量は、媒体によって異なる。媒体の粒子サイズは、効率及び流れ抵抗に強く影響する。
【００２４】
大きなビーズを含む媒体ではカラム効率が低く（ピークが広い）、背圧が低くなるが、小さなビーズでは効率が高く、背圧が高くなる。精製プロセスの初期（例えば捕捉ステージ）では、試料体積が大きく、試料を迅速に安定させる必要があるため、高速度がしばしば必要とされる。解像度にはあまり重点が置かれない。高い流量率で低い背圧を与える大きな粒子を有するクロマトグラフィー媒体を選択すべきである。最終精製段階では、高純度に重点が置かれ、高純度は、高効率すなわち小さなビーズを含むクロマトグラフィー媒体で得られる。これらの媒体は、より低い流量率を必要とする可能性のあるより高い背圧、及び高圧に耐えるカラムをもたらす。この段階での試料の体積及び量はより少ないため、これらの制限は許容可能である。
【００２５】
プロトコルの作成
例えば生物医薬品のためのクロマトグラフィー精製プロトコルの作成には、研究のため、及び発見段階及び作成段階の全体にわたって材料を得るため、実験室規模の精製が必要である。最初の精製プロトコルを作成する際、効率的にスケールアップできない方法の使用を避けることによって、将来のプロセス作成を考慮する必要がある。探究的発見環境のための精製プロセスから高度に規制された生産環境のための精製プロセスに移行する際に、規制要件も変化する。
【００２６】
プロセス作成には、クロマトグラフィー法を選択して最適化し、基本的な性能に関してだけでなく、堅牢性、簡易性、コスト、容量などに関しても最適化する方法に留意することが含まれる。同様に、化学的及び物理的安定性、機能性、再現性などの観点から、適切なクロマトグラフィー媒体の選択を行うべきである。堅牢なプロセスを確保するためには、精製パラメータ空間に関する十分な知識が必要である。したがって、プロセスの理解度を高め、堅牢な精製プロセスを作成する可能性を高めるために、広範囲のクロマトグラフィー条件を早期に探究する必要がある。
【００２７】
カラムクロマトグラフィー精製では、標的分子を固定相（クロマトグラフィー媒体）に結合させ、続いて選択的に溶出させるか、或いは不純物を結合させることにより標的分子を夾雑物から分離し、標的タンパク質を保持せずに通過させることを可能にする。或いは、（結合することなく）試料成分を遅延させる条件下で精製を行うことにより、異なる溶出位置を与えることができる。ＧＦはこの後者の方法の一例である。
【００２８】
標的分子の結合は、溶出ステップ中の分画を可能にする。溶出は、例えば、塩濃度を増加させること、ｐＨを変更すること、又はクロマトグラフィー媒体上のリガンドの標的タンパク質と競合する物質を添加することによって、溶出液中の条件を変化させることによって達成される。
【００２９】
可能な溶出方法は３つある。
・勾配溶出：クロマトグラフィー媒体からのターゲット分子の解離に好都合な条件に向けて溶出液組成を連続的に変更する。溶出位置は、例えばそれらの親和性に依存して、物質間で異なる。
・段階溶出：溶出液の組成を段階的に１回又は数回変更する。各段階でいくつかの物質が溶出することがある。
・アイソクラティック溶出：溶出液の組成は、試料成分とクロマトグラフィー媒体との間に弱い相互作用を生じるか、又は相互作用を生じないように選択され、条件は精製（結合及び溶出）全体にわたって変更しない。標的タンパク質は、不純物よりも遅く又は速くカラムを通過する。
【００３０】
勾配溶出は、アイソクラティック溶出と比較してより広い範囲の性質を有する成分の分離を可能にし、ピークテーリングが低減される。勾配が急になればなるほど、標的分子はより近く溶出される。勾配はほとんどの場合線形だが、場合によっては勾配の特定の部分内で解像能を最適化するために、凸状、凹状、又はカスタムプログラムされた形状になり得る。段階溶出は、勾配溶出に代わるより速い方法であり、連続勾配の代わりに離散ステップを使用する。バッファの消費量はより少なく、より簡易な装置、例えば手動フォーマットを使用することができる。したがって、定常及び大規模精製では、段階溶出がしばしば好まれる。満足のいく結果を得るには、最適化が必要な場合がある。しばしば、勾配溶出によって溶出条件の最適化行い、適切な条件を選択した後、段階溶出に使用する。
【００３１】
クロマトグラフィー精製の分解能は、カラムから溶出するピーク間の距離（選択性）と、狭く対称のピークをもたらすカラムの能力（効率）との組合せである。これらの因子は、マトリックスの性質、結合及び溶出条件、カラム充填率、流量率及びシステムピークの広がりなどの実際的な因子によって影響される。分解能（Ｒs）は、２つのピークの平均基底幅（Ｗｂ）と比較したピーク最大値間の距離として定義される。図２に示すように、クロマトグラムからＲｓを求めることができる。
【００３２】
【数１】
0006656710.tif 000003
溶出量とピーク幅は同じ単位で測定され、無次元の分解能値が得られる。Ｒsは、２つのピーク間の相対的分離の尺度を与え、クロマトグラフィー手順のさらなる最適化が必要かどうかを決定するために使用することができる。Ｒs＝１．０の場合、ピークが対称でほぼ同じ大きさであれば、ピーク回収率９８％で９８％の純度が達成されている。ベースラインの分解能には、Ｒs＞１．５が必要である。この値では、図３ａ及び図３ｂに示すように、ピーク純度はほぼ１００％である。
【００３３】
１つのよく分解されたピークは必ずしも純粋な物質ではなく、選択した溶出条件で分離できないいくつかの成分を表している可能性がある。別のクロマトグラフィー法を用いてさらなる精製が必要となり得る。
【００３４】
カラム効率は、充填床から狭く対称のピークを溶出する能力として特徴付けられ、カラム上で起こるピークの広がりに関連し、理論段数で言及されることが多い。効率の重要な要素は、ビーズサイズ、カラムの寸法、カラムの充填、及び流量率である。高効率はまた、カラム及びクロマトグラフィーシステムにおいて、小さなピークの広がりを必要とする。下記のピークの広がりに関するセクションを参照されたい。良好なカラム充填は高効率をもたらす。これは特にＧＦカラムの場合に当てはまる。不均一な充填、堅過ぎ又は緩過ぎる充填床、又は気泡を含む床は、カラムを通過する試料（及びバッファ）の不均一性、ピークの広がりにつながり、したがって解像能の低下を招く。
【００３５】
粒子サイズは効率の重要な要素である。最も小さい粒子は最も効率的な物質移動をもたらし、適切な溶出条件下及び十分に充填されたカラムにおいて最も狭いピークをもたらす。マトリックスの粒子サイズを小さくすることによって効率を改善することができるが、粒子を小さくすると背圧が高くなり、流量率を減らしてランニング時間を長くする必要がある。したがって、クロマトグラフィー媒体を精製のための要件（速度、分解能、純度など）と一致させることが好ましい。
【００３６】
選択性は、ピーク間の分離の程度として特徴付けられ、図４ａ及び図４ｂに示すように、解像度に大きな影響を与え、解像度を決定する際に高効率よりも重要な要素である。
【００３７】
選択性は、いくつかの因子、すなわちリガンドの性質（ＡＣ、ＩＥＸ、ＨＩＣなど）、マトリックス上の置換及び分布の程度（ＩＥＸ、ＨＩＣ）、及びマトリックス、特に細孔構造の特性（ＧＦ）に依存する。選択性は、明らかに、標的分子、不純物、及び溶出の様式を含む精製に使用される条件にも依存する。これらの性質間のバランスを確立することにより、良好に分離され、高度に選択的な分離が達成される。
【００３８】
分解能は、クロマトグラフィー媒体の選択性及び効率に大きく依存する。これに加えて、カラムハードウェア及びクロマトグラフィーシステムは、溶出するピークの幅を広げる。ピークの広がりの主な原因の１つは、試料の長手方向の拡散（カラム方向への拡散）である。例えば、十分な選択性を得ながら、カラムをできるだけ短く保つなど、縦方向の拡散に利用できる距離を最小限に抑えられれば、ピークの広がりを最小限にすることができる。クロマトグラフィー媒体とカラムハードウェアの組合せは、注意深く選択する必要がある。
【００３９】
クロマトグラフィーシステムの設計と、カラム及びシステムの適切な組合せとが広範なピークの広がりを避けるために重要である。例えば管／毛細管、インライン検出用の細胞、バルブなど、クロマトグラフィーシステムの流路内のすべての構成要素が、異なる程度でピークの広がりの一因となる。管の長さはできるだけ短くするべきである。管の直径もピークの広がりに大きく影響する。したがって、高分解能クロマトグラフィーのためのクロマトグラフィーシステムは、短くて狭い管を有するべきである。最高の分解能を得るには、流路を最適化し、例えば、カラムバルブ、及びｐＨ測定又は導電率測定用のインラインセルなど、必要な構成要素のみを接続する必要がある。
【００４０】
したがって、最適化された液体クロマトグラフィープロトコルを提供するために確立する必要のある、多くの実験パラメータがあると結論付けることができる。そして、試料から1種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの影響を決定するプロセスを容易にする必要がある。本発明は、改良された、又はさらに最適化されたクロマトグラフィープロトコルを達成するために、決定プロセスにおいてツールの使用者を支援する視覚化ツールに関する。
【００４１】
図５に概略を示す一実施形態では、試料から1種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定する方法９０が提供され、
少なくとも第１及び第２の実験パラメータのそれぞれが所定の範囲にわたって変化する、複数の異なる実験条件で試料のクロマトグラフィー精製を行うステップ１００、及び精製中に精製結果を示す出力パラメータをモニタすることによって、各精製をクロマトグラムとして記録するステップ１１０と、
記録したクロマトグラムの少なくともサブセットをダイアグラム１３０内にクロマトグラムミニチュア１４０として表示するステップ１２０であって、表示された各クロマトグラムミニチュア１４０の位置が対応する精製の実験パラメータによって決定されることにより、ユーザが液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響を視覚的に決定することを可能にする、ステップ１２０と
を含む。
【００４２】
上述の通り、少なくとも第１及び第２の実験パラメータは、改変することができ、かつ液体クロマトグラフィープロトコルの性能に影響を及ぼす可能性がある、任意のパラメータを意味する。異なる実験パラメータは、クロマトグラフィー精製結果における同一又は類似の性質に影響を及ぼす可能性があるため、方法は、
少なくとも第１及び第２の実験パラメータのそれぞれが所定の範囲にわたって変化する、複数の異なる実験条件で、試料のクロマトグラフィー精製を行うステップを含む。
【００４３】
２つの異なる実験パラメータのそれぞれが変化する異なる実験条件で複数の精製を行うことによって、記録された性質の実験パラメータ間の影響及び相互作用を調査することが可能である。異なる実験条件で行われるクロマトグラフィー精製の数は、１対の実験パラメータに対して「相互作用面」を提供するように選択されるべきである。一例では、４つの異なる実験条件があり、第１及び第２の実験パラメータは、以下の条件で第１及び第２の状態間でそれぞれ変化する。
【００４４】
【表２】
0006656710.tif 000004
他の例では、１以上の実験パラメータを１以上の中間状態に設定して、追加の実験条件を提供することができる。さらに、いくつかの実験パラメータは制御が困難な場合があるため、同じ状態（例えば高）は必ずしも同じパラメータ値を意味するのではなく、むしろ相対的な設定を意味する。中間パラメータ状態を含む一例では、以下の条件が探究される。
【００４５】
【表３】
0006656710.tif 000005
この例では、５つの異なる実験条件で精製が行われるが、中‐中精製からの結果を比較することによって信頼性の尺度を提供するために、他の条件の間で中‐中条件を繰り返す。他の例では、実験パラメータの性質に応じて、任意の中間の数を含めて７、８、９、１０、１５、２０，２５又はそれ以上など、６以上の異なる実験条件で精製を行ってもよい。一実施形態では、複数の異なる実験条件は、統計的実験計画法（ＤｏＥ）モジュールを使用して決定される。
【００４６】
本方法では、精製中に出力パラメータをモニタすることによって、各精製をクロマトグラムとして記録する。「出力パラメータ」という用語は、クロマトグラフィー精製の結果を示す記録可能なパラメータを意味する。出力パラメータの例には、限定されるものではないが、１以上の波長におけるＵＶ吸光度、導電率、光散乱検出、蛍光発光、質量分析、記録された流れ、記録されたｐＨ、記録された圧力が含まれる。出力パラメータは、クロマトグラフィー精製の下流の流路においてライン内で適切に測定される。
【００４７】
一実施形態では、各クロマトグラフィー精製は、上記でより詳細に開示したように、アフィニティークロマトグラフィー、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、フロースルークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、擬似移動床クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過、クロマトフォーカシングのうちの１以上を含んでいてもよい。関与するクロマトグラフィー精製の種類並びに所望の調査結果に応じて、変化する実験パラメータは、限定されるものではないが、
・溶出液のイオン強度、溶出液のｐＨ、溶出液の流量率、溶出液の種類、ステップ溶出レベル、ステップ溶出体積、勾配目標レベル、勾配体積などの溶出液パラメータ、
・カラムの特性、クロマトグラフィー媒体の特性、媒体の種類、床の高さなどのハードウェア及び媒体パラメータ、
・負荷ｐＨ、負荷導電率、負荷濃度、負荷質量、負荷ＨＣＰ、負荷添加剤などの試料負荷パラメータ、
・洗浄体積、洗浄ｐＨ、洗浄伝導率、洗浄添加剤などの洗浄ステップパラメータ、
・カットＯＤ、バッファシステム、塩の種類、溶剤、バッファ添加剤などのバッファパラメータ、
・流速、滞留時間などのプロセス設定
を含む広範なパラメータから選択することができる。
【００４８】
一実施形態では、記録されたクロマトグラムの少なくともサブセットをダイアグラム１３０のクロマトグラムミニチュア１４０として表示するステップ１２０は、対応する実験の実験パラメータの相対的な順序に基づいて、クロマトグラムミニチュアを表示するステップを含む。図６ａ及び図６ｂは、実験パラメータが表２及び表３に従って変化し、各クロマトグラムミニチュア１４０がダイアグラム１３０の対応する相対位置に配置されている、２つの実施例の概略図１３０を示す。図６ａ及び図６ｂにおいて、ダイアグラム１３０は、離散型並びに連続型の両方の実験パラメータとともに使用され得る、複数の異なる実験条件の「マトリックス表現」を提供する。実験パラメータの少なくとも１つが連続パラメータである一実施形態では、クロマトグラムミニチュア１４０は、相対位置に対応するマトリックス位置、例えば高、中、又は低それぞれに示されているが、パラメータの値は、同じ相対位置に対して同一でなくてもよい。
【００４９】
複数の異なる実験条件に対応する相対位置におけるクロマトグラムミニチュア１４０として、得られたクロマトグラムのダイアグラム１３０の視覚的な表現を提供することによって、ユーザは、それぞれのクロマトグラムミニチュア１４０の結果的な外観の解釈に直接基づいて、液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響を視覚的に決定することができる。各クロマトグラムが独立して又はオーバーレイモードで観察されるか、又は結果のパラメータ値がクロマトグラムから抽出され、ダイアグラム内でデータ値として提示される、実験パラメータの影響を評価する従来の方法と比較して、本方法は、ユーザが直感的にアクセスできる追加情報を豊富に提供する。
【００５０】
図６ａ及び図６ｂでは、クロマトグラムミニチュア１４０が概略的なクロマトグラムとして示されているが、クロマトグラムミニチュア１４０は、モニタされた出力パラメータのクロマトグラムを表すべきであることを理解されたい。いくつかの場合において、一連のクロマトグラフィー精製は、例えば表３で上記に示すように、同じ実験条件で実施される２以上の精製を含み、その場合対応するクロマトグラムミニチュア１４０は、例えば図６ｂに示すように、ダイアグラム内の同じ相対位置にマルチクロマトグラムミニチュア１５０として表示することができ、クロマトグラムミニチュアは、中‐中位置に並べて示されるか、或いは実験パラメータ位置の周りにグループ化される。このようなマルチクロマトグラムミニチュア１５０は、オーバーレイクロマトグラムミニチュアとしてさらに表示されてもよく、異なるクロマトグラムは、異なる色、線の種類などで３Ｄ表現などとして示されてもよい。また或いは、同じ実験条件で記録されたクロマトグラムを、異なるクロマトグラム間の変化を示すように適合された差プロット技術を用いて表示してもよい。
【００５１】
一実施形態では、クロマトグラムミニチュアは、正規化されたスケールを用いて表示され、これにより、ユーザは、収率の差などを容易に決定することができる。
【００５２】
一実施形態では、各精製は、精製中に２以上の出力パラメータをモニタすることによって、２以上のクロマトグラムとして記録される。２以上の記録されたクロマトグラムは、上記のマルチクロマトグラムミニチュアと同様に表示されてもよいし、グラフィカルユーザインターフェースにおいてユーザによって選択され得る、別個のダイアグラムとして表示されてもよい。一実施形態では、２以上の出力パラメータ曲線を同じクロマトグラムミニチュアで表示することができるため、２以上の出力パラメータ間の相関を見ることができる。またさらに、クロマトグラムミニチュアは、溶出液勾配などの実験パラメータを表す曲線を有していてもよい。
【００５３】
図７に概略を示す一実施形態では、ダイアグラム１３０は、第１の実験パラメータの値を表す第１の次元を有し、かつ第２の実験パラメータの値を表す第２の次元を有する座標系を含み、クロマトグラムミニチュア１４０は、対応する実験の実験パラメータによって定義された座標に位置付けられる。図７において、中−中位置に記録されたクロマトグラムは、３Ｄマルチクロマトグラムミニチュア１５０として概略的に開示されている。図７に示すような座標系にクロマトグラムミニチュア１４０を表示することにより、異なる精製のための実験パラメータの変化が直観的に直接表示される。さらに、自由に選択可能な実験条件での追加の精製を表示することができる。
【００５４】
多くの場合、少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定する方法は、クロマトグラフィー精製を行うステップと、記録されたクロマトグラムを表示するステップとを繰り返すことを含み、第１及び第２の実験パラメータの少なくとも１つは、記録されたクロマトグラムを表示するステップから決定されるため、より狭い範囲にわたって変化する。実験パラメータのより狭い範囲の選択は、図に提示された結果に基づいてユーザによって行われる。図８及び図９に概略を示す一実施形態では、後続のクロマトグラフィー精製実験のためのクロマトグラフィープロトコルパラメータを定義するステップは、ダイアグラム内の１以上の実験パラメータ座標を選択することによって行われる。この選択は、例えば、グラフィカルユーザインターフェース内のポインタ１７０などを用いてダイアグラム１３０内の所望のパラメータ領域１６０をマーキングすることによって行われてもよい。図８では、選択されたパラメータ領域１６０は矩形選択として示されているが、代替の実施形態では選択は任意の形状であってもよい。図９において、ダイアグラム１３０はマトリックス型ダイアグラムであり、クロマトグラムミニチュアは、実験パラメータ座標ではなく、対応する実験用の実験パラメータの相対的な順序に基づいて配置されるが、実験パラメータのより狭い範囲の直観的な選択を可能にするため、オーバーレイ座標系で選択を行うことにより、選択を後続の実験のための実パラメータ範囲に変換する。
【００５５】
一実施形態では、図１０及び図１１に概略的に開示されているように、本方法は、実験クロマトグラムが記録されていないダイアグラムにおいて実験パラメータのクロマトグラムを予測し、予測されたクロマトグラムミニチュア１８０をダイアグラム１３０の対応する位置に表示するステップを含む。クロマトグラムのミニチュアの予測は、実験パラメータなどに記録されたクロマトグラムを使用する補間アルゴリズムに基づいてもよい。図１０は、例えば高−中及び中−高など特定のパラメータの組合せに対して実験クロマトグラムミニチュアが利用できない場合の相対的マトリックスタイプのダイアグラム１３０を示しており、その位置には予測されたクロマトグラムミニチュア１８０が表示されている。図１０に示されているように、予測されたクロマトグラムミニチュア１８０は、例えば色、線種などによって、実験クロマトグラムミニチュア１４０と図形的に区別可能であることが好ましい。図１１に概略的に開示された一実施形態では、クロマトグラムを予測するステップがダイアグラム内のユーザの選択に応じて行われることにより、クロマトグラムは、ダイアグラム内の選択された実験パラメータ座標について予測され、予測されたクロマトグラムミニチュア１８０は対応する位置に表示される。実験パラメータの選択は、例えば、ダイアグラム座標系のポインタ装置を用いて行うことができる。一実施形態では、予測されたクロマトグラムミニチュア１８０は、ポインタが実験パラメータ座標に関して移動した場合に更新される。予測されたクロマトグラムミニチュア１８０のパラメータ選択は、追加の精製実験を行うための入力パラメータとしてさらに使用されてもよい。このような場合、後続の実験精製クロマトグラムを分析し、例えば機械学習によって、クロマトグラム予測アルゴリズムを更新するために使用することができる。
【００５６】
一実施形態では、異なる実験条件は、第３又はそれ以上の実験パラメータの影響を決定するために、１以上の追加の実験パラメータが変化することを含む。このような１以上の追加の実験パラメータは、オーバーレイダイアグラムとして表示されてもよく、パラメータ値は、例えばポインタ装置などを用いてスクロールすることができる。一実施形態では、すべてのクロマトグラムミニチュア１４０を含む全体のダイアグラム１３０を同時にスクロールすることができるが、代わりに、ダイアグラム内の特定の実験条件での１以上の追加実験パラメータの影響に焦点を当てるために、各クロマトグラムミニチュア１４０を個別にスクロールしてもよい。さらに、１以上の追加の実験パラメータのうちの１つを、クロマトグラムミニチュア１４０（表示されていない）ごとに第３の次元で表示することができる。
【００５７】
一実施形態では、本方法は、クロマトグラムに関連する１以上の品質基準を決定するステップを含み、品質基準は、クロマトグラムミニチュアと組合せてダイアグラムに表示される。一実施形態では、１以上の品質基準は、１以上の出力パラメータから導出され、記録されたクロマトグラムの分解能、効率、選択性、ピーク面積、非対称性及びピークの広がりのグループから選択される。一実施形態では、１以上の品質基準は、純度、精製時間、収率、精製された試料の外部分析からの結果、表示されたパラメータとは異なる出力パラメータ、及び精製コストのグループから選択された、精製結果パラメータから導出される。図１２は、品質基準がクロマトグラムミニチュアと組合せてダイアグラムにどのように表示され得るかのいくつかの模式的な例を示す。上２つのクロマトグラムミニチュア１９０では、品質基準は、それぞれのクロマトグラムミニチュア１９０に関連してパラメータ値Ｑ１、Ｑ２…として提供され、下２つのクロマトグラムミニチュア２００では、品質基準は、品質パラメータの値を示す棒グラフとして提供されている。図１３では、品質基準は、ダイアグラム内の「ヒートマップ」として概略的に提供され、実験パラメータの全スパンにわたる品質基準に対する実験パラメータの影響を示している。
【００５８】
本方法は、クロマトグラムを互いに比較する様々な方法をさらに備え、実験パラメータの影響の決定を容易にする。図１４は、模式的な一例を示し、ユーザによって行われたクロマトグラムミニチュアに対するドラッグアンドドロップ操作に続く、２つのクロマトグラムがオーバーレイプロットで提示されている。この機能によって、ユーザは、ポインタ装置などを用いて、クロマトグラムミニチュア２１０の１つをドラッグし、別のクロマトグラムミニチュア２２０上にドロップすることができ、グラフィカルユーザインターフェースは、ドロップ操作に応じて、拡大されたオーバーレイプロット２３０を表示するように構成される。本発明の方法を実装するグラフィカルユーザインターフェースは、評価プロセスを容易にするために、クロマトグラムミニチュアと相互作用する一連の類似の方法を含んでいてもよい。
【００５９】
一実施形態では、上記の方法ステップを行うように構成された、液体クロマトグラフィーシステム３００が提供される。このような液体クロマトグラフィーシステム３００は、
液体クロマトグラフィー精製に関連して流体操作を行う自動流体モジュール３１０と、
試料から1種以上の標的分子を精製するための液体クロマトグラフィープロトコルにおける少なくとも第１及び第２の実験パラメータの影響を決定するために、ユーザが液体クロマトグラフィー精製プロトコルの実験シーケンスを定義できるように構成された実験設計モジュール３３０であって、実験シーケンスは、少なくとも第１及び第２の実験パラメータのそれぞれが所定の範囲にわたって変化する、複数の異なる実験条件を含む、実験設計モジュール３３０と、
実験シーケンスに従ってクロマトグラフィーシステムの動作を制御する精製制御モジュール３４０と、
精製の間に出力パラメータをモニタすることによって、各精製の結果をクロマトグラムとして記録する精製記録モジュール３５０と、
記録されたクロマトグラムの少なくともサブセットを、ダイアグラム内のクロマトグラムミニチュアとして、ディスプレイ３７０に提示するように構成された精製評価モジュール３６０であって、それぞれの表示されたクロマトグラムミニチュアの位置を、対応する精製の実験パラメータによって決定することにより、ユーザが、液体クロマトグラフィープロトコルにおける実験パラメータの傾向及び影響を視覚的に決定することを可能にする、精製評価モジュール３６０と
を含んでいてもよい。
【００６０】
またさらに、プロセッサ及びディスプレイユニットを備えるコンピュータ上で実行される場合、上記の方法ステップによる方法を行うように構成されたコンピュータプログラムが提供される。
【符号の説明】
【００６１】
１０  クロマトグラム
２０  実線
３０  破線
９０  方法
１００  精製を行うステップ
１１０  記録するステップ
１２０  表示するステップ
１３０  ダイアグラム
１４０  クロマトグラムミニチュア
１５０  マルチクロマトグラムミニチュア
１６０  パラメータ領域
１７０  ポインタ
１８０  予測されたクロマトグラムミニチュア
１９０  クロマトグラムミニチュア
２００  クロマトグラムミニチュア
２１０  クロマトグラムミニチュア
２２０  クロマトグラムミニチュア
２３０  オーバーレイプロット
３００  液体クロマトグラフィーシステム
３１０  自動流体モジュール
３３０  実験設計モジュール
３４０  精製制御モジュール
３５０  精製記録モジュール
３６０  精製評価モジュール
３７０  ディスプレイ
【図１】
0006656710.tif 000006
【図２】
0006656710.tif 000007
【図３ａ】
0006656710.tif 000008
【図３ｂ】
0006656710.tif 000009
【図４ａ】
0006656710.tif 000010
【図４ｂ】
0006656710.tif 000011
【図５】
0006656710.tif 000012
【図６ａ】
0006656710.tif 000013
【図６ｂ】
0006656710.tif 000014
【図７】
0006656710.tif 000015
【図８】
0006656710.tif 000016
【図９】
0006656710.tif 000017
【図１０】
0006656710.tif 000018
【図１１】
0006656710.tif 000019
【図１２】
0006656710.tif 000020
【図１３】
0006656710.tif 000021
【図１４】
0006656710.tif 000022
【図１５】
0006656710.tif 000023