【手続補正書】
【提出日】平成24年11月30日(2012.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、該組成物は、
１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ３．０％以下の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー；
宿主細胞；および
ウイルス培養物を増殖させるための培地、
を含み、
ここでＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。
【請求項２】
エチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーの濃度は、０．００１％〜３．０％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーは、ポロキサマー４０７を含み、前記培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
エンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス増殖に関する１つ以上のパラメータを調節するための方法であって、該方法は、
宿主細胞をエンベロープ型ウイルス培養物に感染させる工程、
前記ウイルスに感染した宿主細胞培養物に、１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーを投与する工程（ここで、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含む）、および
培養物においてエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス増殖の前記１つ以上のパラメータを調節する工程
を含む方法。
【請求項５】
前記組成物を、宿主細胞培養物のエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス感染の前、その間、もしくはその後に、該宿主細胞培養物に投与する工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物を投与することにより、エンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのプラークサイズを、前記組成物を投与しないコントロールエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して増大させる工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物を投与することにより、宿主細胞培養物におけるエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物の遅延時間を、前記組成物を投与しないコントロールエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して減少させる工程を更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルス培養物は、フラビウイルス培養物から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス培養物は、生の、弱毒化ウイルスワクチンを生成するためのウイルス培養物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記遅延時間の減少は、前記組成物なしのエンベロープ型ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス培養物と比較して、遅延時間の１０％以上の減少を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスを培養するためのキットであって、該キットは、
１個以上の容器；および
請求項１に記載の１種以上の組成物
を含む、キット。
【請求項１２】
前記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーであるポロキサマー４０７の濃度は、０．００１％〜３．０％である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記ウイルス培養物は、１種以上のフラビウイルスを含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
フラビウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、
１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ０．００１％〜３．０％の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、
フラビウイルス培養物、
宿主細胞、および
フラビウイルス培養物を増殖させるための培地
を含み、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはフラビウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。
【請求項１５】
ポックスウイルス培養物を増殖させるための組成物であって、
１種以上のエチレンオキシド−プロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーであって、ポロキサマー４０７、ポロキサマー４０３、またはそれらの組合せを含み、かつ０．００１％〜３．０％の濃度のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、
ポックスウイルス培養物、
宿主細胞、および
ポックスウイルス培養物を増殖させるための培地
を含み、ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーはポックスウイルス培養物の増殖を促進する、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ウイルス増殖を誘導するための組成物、方法およびキット
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本明細書で開示される特定の組成物は、コポリマーを単独で、もしくはウイルス増殖を増強し促進するための他の薬剤もしくは化合物と組み合わせて、含み得る。本明細書中の他の実施形態は、生の弱毒化ウイルスの増殖を増強する賦形剤の組み合わせに関する。本明細書中で有用なコポリマーとしては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、プルロニック（登録商標）Ｐ８５（ポロキサマー２３５）、３，０００〜４，０００ ＭＷより大きい他のポリエチレンオキシド−ポリプロピレンオキシド（ＥＯ−ＰＯ）ブロックコポリマーもしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書中の特定の実施形態をさらに示すために含められる。上記実施形態は、これら図面のうちの１つ以上を単独で、もしくは示される特定の実施形態の詳細な説明と合わせて参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、細胞感染後のウイルス増殖、およびウイルス吸着の間の制御因子もしくはコポリマー組成物の導入に対するプルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）の効果を表す。
【図２】図２は、ウイルス吸着および／もしくは増殖の間のコポリマーの存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。
【図３】図３は、ウイルス吸着および増殖の間のコポリマー含有組成物の漸増量の存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。
【図４】図４は、ウイルス吸着の間に添加された特定のコポリマーの存在下もしくは非存在下で、ウイルス培養物の増殖を示す例示的グラフを表す。
【図５】図５は、種々の濃度のコポリマーの存在下もしくは非存在下で、例示的ウイルス培養物のプラークサイズ（ｐｌａｇｕｅ ｓｉｚｅ）の変化を示す例示的表を表す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ＥＯ−ＰＯブロックコポリマー」とは、ポリ（エチレンオキシド）およびポリ（プロピレン）オキシドのブロックからなるコポリマーを意味し得る。さらに、本明細書で使用される場合、「プルロニック（登録商標）」とは、ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘのＥＯ−ＰＯブロックコポリマーを意味し得る。ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーのこの構成はまた、「ポロキサマー」もしくは「シンペロニック」といわれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本明細書中の実施形態は、培養におけるウイルス増殖の増殖速度を増強するか、もしくはその遅延時間を減少させるたえに、種々の組成物を使用することに関する。これら実施形態によれば、組成物は、コポリマー因子を含み得る。本願の実施形態は、一般に、ウイルス増殖を誘導し、促進するための方法、組成物および使用に関する。特定の実施形態において、本願は、一般に、ウイルス増殖を促進し、そして／またはウイルスプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用に関する。他の実施形態において、フラビウイルス増殖を促進し、増殖における遅延を減少させ、そして／またはプラークサイズを増大させるためのコポリマー組成物の方法、組成物および使用に関する。本明細書中で企図された特定のコポリマー組成物としては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８）、プルロニック（登録商標）Ｐ８５（ポロキサマー２３５）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、３，０００〜４，０００ ＭＷより大きい他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマー、もしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
（コポリマー）
特定の実施形態において、組成物は、コポリマー（例えば、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７））を含み得る。プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７、本明細書中ではＦ１２７ともいわれる）は、非イオン性ポリエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーである。プルロニック（登録商標）ブロックコポリマーは、ポロキサマーとしてそれらの非商標名の下で公知である。それらは、界面活性剤として使用するために最初は開発された。これら化合物は、親水性エチレンオキシド（ＥＯ）および疎水性プロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックからなる。上記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド（ＥＯと称される−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）およびポリプロピレンオキシド（ＰＯと称される−ＣＨ２ＣＨＣＨ３Ｏ−）のブロックを含み得る。上記ＰＯブロックは、ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘ配置において２つのＥＯブロックが隣接し得る。上記ＰＯ成分は、親水性であり、上記ＥＯ成分は、疎水性であるので、全体的な親水性、分子量および界面活性剤特性は、上記ＥＯｘ−ＰＯｙ−ＥＯｘブロック構造におけるｘおよびｙを変化させることによって、調節され得る。製造業者（例えば、ＢＡＳＦ，Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ１２７、ポロキサマー４０７）に依れば、Ｆ１２７は、クリームおよび液体エマルジョンにおいて、濃化剤および共乳化剤（ｃｏ−ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒ）として使用され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
これらプルロニック（登録商標）ブロックコポリマーの活性化の機構は、現在未知である。しかし、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）は、キトサンと組み合わせて、ワクチン送達系の徐放性成分として研究されてきた。Ｆ１２７を含む破傷風トキソイドによるマウスのワクチン接種は、鼻内に送達した破傷風抗原および全身に送達した破傷風抗原において抗体応答を増大させた。特定の方法において、プルロニック（登録商標）は、細胞膜の微小粘性、およびその融通性に寄与し得る流動性の変化を誘導することが示された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）は、種々のヒト薬学的適用（歯科医薬、口腔医薬および緩下医薬が挙げられる）において使用されてきた。ワクチン処方物はまた、材料損失を防ぐために、安定化剤として界面活性剤を使用してきた。特定の濃度のＦ１２７（０．０１％ ｗ／ｖ）を用いたＤＮＡワクチン送達の研究は、おそらく、成熟樹状細胞の細胞取り込みおよび漸増を強化することによって、増大した薬物送達を示した。体温でのゲル処方物は、上記ＥＯ−ＰＯブロックコポリマーゲルの使用が、ワクチンおよび薬物送達適用において薬物デポーとして作用することを可能にする。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本明細書で開示される特定の組成物は、コポリマーを、単独で、もしくは他の薬剤もしくは化合物と合わせて含み得る。さらに、本明細書で開示される組成物は、１種以上のコポリマー因子が、他の培地補充物に加えて上記培地に添加された培地組成物を含み得る。本明細書で開示される組成物において有用な培地は、本明細書で企図されるウイルス生物を増殖させることが公知の、当該分野で公知の任意の培地、または特定のウイルス生物に対して特異的な培地を含み得る。本明細書中の他の実施形態は、生のウイルス（例えば、弱毒化ウイルス）の増殖を大いに増強する賦形剤の組み合わせに関する。本明細書中のなお他の組成物および方法は、ウイルス生物の増殖に関する遅延時間を減少することに関する。いくつかの実施形態は、ウイルス生物のプラークサイズ（ｐｌａｇｕｅ ｓｉｚｅ）を調節することに関する。本明細書中で有用なコポリマーとしては、プルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）、プルロニック（登録商標）Ｆ６８（ポロキサマー１８８）、プルロニック（登録商標）Ｐ８５（ポロキサマー２３５）、プルロニック（登録商標）Ｐ１２３（ポロキサマー４０３）、３，０００〜４，０００ ＭＷより大きい他のＥＯ−ＰＯブロックコポリマーもしくはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（実施例）
（実施例１）
図１に表される１つの例示的方法において、フラビウイルス増殖に対するプルロニック（登録商標）Ｐ１２３またはＦ１２７（それぞれ、ポロキサマー４０３または４０７）の効果を、１つの例示的細胞株であるＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルＶｅｒｏ細胞）で試験した。Ｖｅｒｏ細胞を、例えば、Ｔ−７５ｃｍ２フラスコ中で、ＭＯＩ ０．００１でフラビウイルスに（示されるように）感染させる前に２日間、コンフルエントになるまで増殖させた。１８０分間のウイルス吸着を、プルロニック（登録商標）（Ｐ１２３もしくはＦ１２７（それぞれ、ポロキサマー４０３または４０７））の存在下もしくは非存在下で、２ｍＬ ＰＢＳ中で評価した。コントロールサンプルは、コポリマーなしのＰＢＳ中でウイルス吸着を含んでいた。増殖培地（１８ｍＬ 無血清ＤＭＥＭ）を、吸着後に添加した。アリコートを、毎日採取し、Ｖｅｒｏ細胞単層に対して力価測定した。ウイルス力価を、図１中に図示されるように、測定した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
（実施例３）
別の例示的方法で、例示的コポリマーＦ１２７の存在下でプラークサイズが増大するか否かを分析した。図５は、例示的な表（表１）を表す。この実験は、フラビウイルスのプラークサイズが、増殖の間にプルロニック（登録商標）Ｆ１２７（ポロキサマー４０７）の漸増濃度の存在下で増大することを実証した。ここで、Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層を、Ｆ１２７の存在下もしくは非存在下で、２０ｍＬ ＤＭＥＭ２％ ＦＢＳ培地中、Ｔ７５ｃｍ２フラスコで増殖させ、ここで上記Ｖｅｒｏ細胞を、ＭＯＩ＝０．００１でＤＥＮ２／４に感染させた。吸着は、Ｆ１２７の存在下（０．１％もしくは１．０％）もしくは非存在下で１ｍＬ ＤＭＥＭ中、１．５時間であった。プラーク（例えば、８）を、ライトボックスで可視化し、それらの直径を測定した。表１は、Ｆ１２７の非存在下、もしくはＦ１２７の漸増濃度の存在下で、ＤＥＮＶａｘ ２／４増殖のプラークサイズ（ｍｍ）差の一元配置ＡＮＯＶＡの結果を表す。