【手続補正書】
【提出日】平成25年3月12日(2013.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な変異体活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離又は精製された核酸分子であって、該タンパク質のアミノ酸配列が、
(a)残基34、残基82、及び残基156からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(b)残基10における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基156における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(c)残基35における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基145における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(d)残基34における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基160における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(e)残基43における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基120における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(f)少なくとも1つの置換が残基57においてであり、且つ少なくとも1つの置換が残基81又は145においてである、少なくとも2つのアミノ酸置換、
(g)残基156における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基82における少なくとも１つのアミノ酸置換、
(h)残基156における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基34における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(i)残基156における少なくとも1つのアミノ酸置換及び残基157における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(j)残基10、残基82、及び残基156からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(k)残基115における少なくとも1つのアミノ酸置換、及び
(l)残基120における少なくとも1つのアミノ酸置換
の1つ以上によりヒトAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：1又は配列番号：2）とは異なり、該機能的な変異体AIDタンパク質が、細菌パピラ形成アッセイにおいて、ヒトAIDタンパク質と比較して、活性において少なくとも10倍の改善を有する、単離又は精製された核酸分子。
【請求項２】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基34におけるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項３】
残基34におけるアミノ酸置換がK34E又はK34Dである、請求項２に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項４】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基82におけるアミノ酸置換を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項５】
残基82におけるアミノ酸置換がT82I又はT82Lである、請求項４に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項６】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基156におけるアミノ酸置換を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項７】
残基156におけるアミノ酸置換がE156G又はE156Aである、請求項６に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項８】
機能的な変異体活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）タンパク質が、残基157における少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項９】
残基157におけるアミノ酸置換がスレオニン（T）又はリジン（K）である、請求項８に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１０】
機能的な変異体AIDタンパク質が、
(a)残基9、38、及び180からなる群より選択される残基における少なくとも１つのアミノ酸置換、
(b)残基42、115、132、183、及び198からなる群より選択される残基における少なくとも１つのアミノ酸置換、
(c)残基9、96、及び181からなる群より選択される残基における少なくとも１つのアミノ酸置換、及び
(d)残基13、及び197からなる群より選択される残基における少なくとも１つのアミノ酸置換
の1つ以上をさらに含む、請求項８又は９に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１１】
（a）残基9におけるアミノ酸置換がメチオニン（M）又はリジン（K）であり、
（b）残基13におけるアミノ酸置換がフェニルアラニン（F）又はトリプトファン（W）であり、
（c）残基38におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はアラニン（A）であり、
（d）残基42におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はロイシン（L）であり、
（e）残基96におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はアラニン（A）であり、
（f）残基115におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はトリプトファン（W）であり、
（g）残基132におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（h）残基180におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はアラニン（A）であり、
（i）残基181におけるアミノ酸置換がメチオニン（M）又はバリン（V）であり、
（j）残基183におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はプロリン（P）であり、
（k）残基197におけるアミノ酸置換がアルギニン（R）又はリジン（K）であり、且つ
（l）残基198におけるアミノ酸置換がバリン（V）又はロイシン（L）である、
請求項１０に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１２】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基10におけるアミノ酸置換、及び残基156におけるアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１３】
残基10のアミノ酸がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）で置換されており、且つ、残基156のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されている、請求項１２に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１４】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基13、34、82、95、115、120、134及び145からなる群より選択される残基における少なくとも1つの更なるアミノ酸置換を含む、請求項１２又は１３に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１５】
（a）残基13におけるアミノ酸置換がフェニルアラニン（F）又はトリプトファン（W）であり、
（b）残基34におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（c）残基82におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はロイシン（L）であり、
（d）残基95におけるアミノ酸置換がセリン（S）又はロイシン（L）であり、
（e）残基115におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はトリプトファン（W）であり、
（f）残基120におけるアミノ酸置換がアルギニン（R）又はアスパラギン（N）であり、且つ
（g）残基145におけるアミノ酸置換がロイシン（L）又はイソロイシン（I）である、
請求項１４に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１６】
機能的な変異体AIDタンパク質が、
(a)残基35におけるアミノ酸置換及び残基145におけるアミノ酸置換、
(b)残基34におけるアミノ酸置換及び残基160におけるアミノ酸置換、
(c)残基43におけるアミノ酸置換及び残基120におけるアミノ酸置換、
(d)1つの置換が残基57においてであり、且つ1つの置換が残基81又は145においてである、少なくとも2つのアミノ酸置換、
(e)残基156におけるアミノ酸置換及び残基82におけるアミノ酸置換、
(f)残基156におけるアミノ酸置換及び残基34におけるアミノ酸置換、及び
(g)残基156におけるアミノ酸置換及び残基157におけるアミノ酸置換
の1つ以上を更に含む、請求項１に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１７】
(a)残基35のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基145のアミノ酸がロイシン（L）又はイソロイシン（I）で置換されている、
(b)残基34のアミノ酸がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）で置換されており、且つ残基160のアミノ酸がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）で置換されている、
(c)残基43のアミノ酸がプロリン（P）で置換されており、且つ残基120のアミノ酸がアルギニン（R）で置換されている、
(d)残基156のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基82のアミノ酸がロイシン（L）又はイソロイシン（I）で置換されている、
(e)残基156のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基34のアミノ酸がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）で置換されている、及び
(f)残基156のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基157のアミノ酸がリジン（K）又はアスパラギン（N）で置換されている、
請求項１６に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１８】
少なくとも2つのアミノ酸置換が残基57及び145においてである、請求項１６に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項１９】
残基57のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基145のアミノ酸がロイシン（L）又はイソロイシン（I）で置換されている、請求項１８に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２０】
少なくとも2つのアミノ酸置換が残基57及び81においてである、請求項１６に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２１】
残基57のアミノ酸がグリシン（G）又はアラニン（A）で置換されており、且つ残基81のアミノ酸がチロシン（Y）又はトリプトファン（W）で置換されている、請求項２０に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２２】
機能的な変異体AIDタンパク質が、残基10、82、及び156からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２３】
機能的な変異体AIDタンパク質が、
(a)残基9、36、44、88、93、及び142からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(b)残基66、104、及び160からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(c)残基15、115、及び185からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(d)残基9、30、34、100、及び184からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(e)残基34、35、59、120、及び157からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(f)残基9、74、77、118、157、及び188からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、
(g)残基53、及び145からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換、及び
(h)残基18、93、100、160、及び192からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換
の1つ以上をさらに含む、請求項２２に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２４】
（a）残基9におけるアミノ酸置換がセリン（S）、メチオニン（M）、又はトリプトファン（W）であり、
（b）残基10におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（c）残基15におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はロイシン（L）であり、
（d）残基18におけるアミノ酸置換がアラニン（A）又はロイシン（L）であり、
（e）残基30におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はセリン（S）であり、
（f）残基34におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（g）残基35におけるアミノ酸置換がセリン（S）又はリジン（K）であり、
（h）残基36におけるアミノ酸置換がシステイン（C）であり、
（i）残基44におけるアミノ酸置換がアルギニン（R）又はリジン（K）であり、
（j）残基53におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はグルタミン（Q）であり、
（k）残基59におけるアミノ酸置換がメチオニン（M）又はアラニン（A）であり、
（l）残基66におけるアミノ酸置換がスレオニン（T）又はアラニン（A）であり、
（m）残基74におけるアミノ酸置換がヒスチジン（H）又はリジン（K）であり、
（n）残基77におけるアミノ酸置換がセリン（S）又はリジン（K）であり、
（o）残基82におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はロイシン（L）であり、
（p）残基88におけるアミノ酸置換がセリン（S）又はスレオニン（T）であり、
（q）残基93におけるアミノ酸置換がロイシン（L）、アルギニン（R）、又はリジン（K）であり、
（r）残基100におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）、トリプトファン（W）、又はフェニルアラニン（F）であり、
（s）残基104におけるアミノ酸置換がイソロイシン（I）又はアラニン（A）であり、
（t）残基115におけるアミノ酸置換がチロシン（Y）又はロイシン（L）であり、
（u）残基118におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はバリン（V）であり、
（v）残基120におけるアミノ酸置換がアルギニン（R）又はロイシン（L）であり、
（w）残基142におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（x）残基145におけるアミノ酸置換がロイシン（L）又はチロシン（Y）であり、
（y）残基156におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はアラニン（A）であり、
（z）残基157におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はリジン（K）であり、
（aa）残基160におけるアミノ酸置換がグルタミン酸（E）又はアスパラギン酸（D）であり、
（bb）残基184におけるアミノ酸置換がアスパラギン（N）又はグルタミン（Q）であり、
（cc）残基185におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はアスパラギン酸（D）であり、
（dd）残基188におけるアミノ酸置換がグリシン（G）又はグルタミン酸（E）であり、且つ
（ee）残基192におけるアミノ酸置換がスレオニン（T）又はセリン（S）である、
請求項２２又は２３に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２５】
機能的な変異体AIDタンパク質が、
(a)残基115におけるアミノ酸置換、及び
(b)残基120におけるアミノ酸置換
の1つ以上を含む、請求項１に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２６】
残基115のアミノ酸が、チロシン（Y）、トリプトファン（W）、又はロイシン（L）で置換されている、請求項２５に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２７】
残基120のアミノ酸が、アルギニン（R）、アスパラギン（N）、又はロイシン（L）で置換されている、請求項２５又は２６に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２８】
機能的な変異体AIDタンパク質が、C末端切断、融合タンパク質、又は残基181において若しくはその遠位にストップコドンを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項２９】
機能的な変異体AIDタンパク質が、M6K、N7K、R8Q、R9K、K10Q、K10L、Q14H、Q14N、R25H、A39P、F42C、Y48H、N52S、N52A、N52M、D67A、G100A、G100W、E118D、V135A、A138G、Y145F、H156R、R171H、S173T、Q175K、R158K、R194K、T195I、L198A、L198F、118の後にKの挿入、及びD119Eからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項３０】
単離又は精製された核酸の配列が、体細胞超変異（SHM）モチーフの数を低減するために最適化されたコドンを有する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の単離又は精製された核酸分子。
【請求項３１】
機能的な変異体活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離又は精製された核酸分子であって、該タンパク質のアミノ酸配列が、残基34、残基82、及び残基156からなる群より選択される残基における少なくとも1つのアミノ酸置換により、(a)イヌAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：3）、(b)マウスAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：4）、(c)ラットAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：5）、(d)ウシAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：6）、又は(e)ニワトリAIDタンパク質のアミノ酸配列（配列番号：7）とは異なり、該機能的な変異体AIDタンパク質が、細菌パピラ形成アッセイにおいて、ヒトAIDタンパク質と比較して、活性において少なくとも10倍の改善を有する、単離又は精製された核酸分子。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子又は請求項３２に記載のベクターを含む、単離された真核細胞又は原核細胞。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、トランスジェニック動物。
【請求項３５】
動物が、マウス、ウサギ、ラクダ、ヤギ、及びラットからなる群より選択される、請求項３４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
所望の性質を有する遺伝子産物の調製方法であって、該方法は、該遺伝子産物をコードする核酸を細胞集団中で発現することを含み、該細胞集団は、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされる機能的な変異体活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）タンパク質を発現し、又は発現するように誘導されることができ、該機能的なAID変異体タンパク質の発現は、該遺伝子産物をコードする核酸内に変異を引き起こす、方法。
【請求項３７】
該所望の性質を有する遺伝子産物をコードする変異された核酸配列を発現する該集団内の細胞を選択する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞がB細胞又はB細胞由来のものである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
細胞が、SHMモチーフの数を増加させるためにSHMについて最適化されているコドンを有する少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
所望の表現系を有するように生物を変異させる方法であって、該生物において請求項１〜３１のいずれか１項に記載の核酸分子によりコードされる機能的な変異体活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）タンパク質を発現するか、又はその発現を誘導することを含み、該機能的な変異体AIDタンパク質の発現は、該生物の染色体DNA内で変異を引き起こす、方法。
【請求項４２】
該所望の表現系を示す該生物中の細胞を選択する工程をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
生物が、SHMモチーフの数を増加させるためにSHMについて最適化されているコドンを有する少なくとも1つの核酸配列を含む、請求項４１又は４２に記載の方法。