【手続補正書】
【提出日】平成24年3月29日(2012.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
パートＣ：円二色性スペクトルデータ
円二色性(ＣＤ)分光分析は、アミロイド原繊維の二次構造コンホメーション破壊に対する試験化合物の効果を決定するために用いられ得る方法である。１つの試験において、本実施例に記載した通り、Ａβ １−４２原繊維のβ−シート・コンホメーションに対する種々の本発明の化合物の効果を決定するために、円二色性分光分析を用いた。この試験のために、Ａβ １−４２(rPeptide Inc., Bogart, GA)を、凍結および凍結乾燥前にｐＨを１０以上に維持しながら、始めに、５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液から凍結乾燥した。次に、ペプチドを２０ｍＭの酢酸緩衝液(pH 4.0)中で濃度１mg/mlで再構成した。ペプチドの最終濃度を０.５mg/mlとし、Ａβ １−４２：試験化合物(wt/wt)の比が１：１および１：０.１となるように、試験化合物またはビークルの希釈および添加を行った。試験化合物を添加しなかった場合、反応混合物に添加されたビークルの量は、試験化合物を送達するために用いられる量と同量であった。化合物またはビークルの存在下で３７℃で５日間インキュベーションした後、ＣＤスペクトルをJasco 810 spectropolarimeter (Easton, MD)で測定した。全てのＣＤスペクトルを０.０５cmまたは０.１cmの石英セル中で測定した。波長トレースを、１９０〜２７０nmで、０.１nm増加で、バンド幅２nmで、スキャン速度５０nm/分で、応答時間１秒で、データピッチ０.１nmでスキャンした。系全体を平衡化し、窒素を継続的に１０ml／分で吹き付けた。ビークルを添加したＡβ １−４２の１０回のスペクトルをインキュベーション前に測定して平均値を求め、インキュベーション時間後の “Ａβ １−４２＋試験化合物”またはビークルの１０回のスペクトルの平均値から引いた。スペクトルの平均値を、その度の楕円率から、式：
[Ψ]＝(Ψｏ／ｄ)×ｃ
(ここで、Ψｏは度における楕円率であり、ｄは光路長(mm)であり、ｃは濃度(mg/ml)である。)を用いて比楕円率に変換した。この方法で、初期溶解時間でのペプチドとインキュベーション後のペプチドの間で起こったペプチドの構造変化を評価し得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
この試験において、３０μｌのα−シヌクレイン(rPeptide)の１mg/ml溶液を３７℃で１４００rpmで４日間撹拌して先に原繊維化させ、続いて３７℃で３日間単独でまたは化合物もしくはＥＤＴＡの存在下でインキュベートした(α−シヌクレイン：試験化合物(重量比)＝１：１、１：０.１、１：０.０１または１：０.００１)。３日間のコ−インキュベーション後、５０μｌの各インキュベーション混合物を、１５０μｌの蒸留水および５０μｌのチオフラビンＴ溶液(すなわち２５０ｍＭのリン酸緩衝液(pH 6.8)中５００ｍＭのチオフラビンＴ)を含む９６ウェル・マイクロタイタープレートに移した。ＥＬＩＳＡプレート蛍光測定器を用いて、４８５nmでの蛍光の放出を測定し(励起波長４４４nm)、緩衝液のみまたは化合物のみをブランクとして引いた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８２】
１つの試験において、本実施例に記載した通り、α−シヌクレインのβ−シート・コンホメーションに対する種々の本発明の化合物の効果を決定するために、円二色性分光分析を用いた。この試験のために、α−シヌクレイン(rPeptide Inc., Bogart, GA)を、９.５ｍＭ  リン酸緩衝液(ＰＢＳ)に溶解して１mg/mlとした。得られたストックを同じ緩衝液で希釈して、ペプチドの最終濃度が０.２５mg/mlとなるように試験化合物またはビークルの何れかを加えて、α−シヌクレイン：化合物の比(wt/wt)を１：１および１：０.１とした。ビークル処置サンプルのＣＤスペクトルを測定した後、全てのサンプルを４日間インキュベーションし、その後、全てのα−シヌクレイン／化合物またはビークル反応液についてスペクトルを得た。ＣＤスペクトルをJasco 810 spectropolarimeter (Easton, MD)で測定した。全てのＣＤスペクトルを０.１０cmの石英セル中で測定した。波長トレースを、１９０〜２７０nmで、０.１nm増加で、バンド幅２nmで、スキャン速度５０nm/分で、応答時間３２秒で、データピッチ０.５nmでスキャンした。系全体を平衡化し、窒素を継続的に１０Ｌ／分で吹き付けた。データを加工するために、ビークルを添加した緩衝液の１０回のスペクトルをインキュベーション前に測定して平均値を求め、インキュベーション時間後の “α−シヌクレイン＋試験化合物”またはビークルの１０回のスペクトルの平均値から引いた。スペクトルの平均値を、その度の楕円率から、式：
[Ψ]＝(Ψｏ／ｄ)×ｃ
(ここで、Ψｏは度における楕円率であり、ｄは光路長(mm)であり、ｃは濃度(mg/ml)である。)を用いて比楕円率に変換した。この方法で、初期溶解時間でのペプチドとインキュベーション後のペプチドの間で起こったペプチドの構造変化を評価し得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
図３Ａは、この試験で得られた幾つかのＣＤスペクトルを示す。０時間でのα−シヌクレインは、ランダムコイルペプチドを示すスペクトルを生じ、１００％阻害のコントロールデータを提供する。インキュベーション後、α−シヌクレインのスペクトルは、β−シート構造を予測させるものであり、より高次の凝集物が形成したことを示しており、０％阻害のコントロールデータを提供するために用いられる。コントロールに用いられるサンプルと試験化合物処置サンプルの間の定量的な関係を確実にするために、コントロールに用いられるサンプルはビークル処置される。これらの２つのスペクトルは、それぞれ１００％原繊維および０％原繊維と仮定されるポジティブコントロールとネガティブコントロールを確立することにより、試験化合物処置サンプルにおける原繊維形成の％阻害の正確な定量を可能とする。これらのコントロールの％が積算値のみであるのにもかかわらず、低限が０〜５％阻害であって、上限が９５〜１００％であるという推測されるのに十分でない不確実性が存在する。同一のα−シヌクレインのストック溶液を用いて、等容積のアリコートに分けて、それに個別の試験化合物またはビークルを加え、定量の正確さを確実とするために平行処理をする各バッチの実行でコントロールが得られる。図３Ａで示したスペクトルは、α−シヌクレイン：化合物の比が１：１(wt/wt)で得られたものである。これらのＣＤスペクトルは、本発明の化合物が、パーキンソン病α−シヌクレイン原繊維または凝集物に特徴的なβ−シート構造の形成を阻害する能力を有することを証明している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
チオフラビンＳは、一般的に、脳組織を含むインサイチュで(Vallet et al., Acta Neuropathol., 83:170-178, 1992)および培養細胞で(Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci., 20:6048-6054, 2000)、アミロイドを含む構造を検出するために用いられ、一方、チオフラビンＴは、しばしば、可溶性アミロイドタンパク質のβ−プリーツシート状構造に富化した原繊維への凝集を分析するためのin vitro試薬として用いられる (LeVine III, Prot. Sci., 2:404-410, 1993)。従って、先に記載された方法を少し修飾して(Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci., 20:6048-6054, 2000)、培養細胞で酸化ストレス誘発剤(この場合はロテノン)に応答して形成されるβ−ひだ状構造を多く含む凝集物を検出するために、チオフラビンＳの組織化学を用いた。簡単に言えば、これらの試験において、細胞をポリ−Ｄ−リジン被覆ガラススライドチャンバー上で、約３×１０４細胞/cm2で増殖させた。２４時間後、示された通りに、５００ｎＭ、１μＭまたは５μＭのロテノン(Sigma)またはビークル(０.０５％  ＤＭＳＯ)で細胞を処置した。ロテノン(またばビークル)を添加した直後に、ロテノン存在下で、化合物を示した濃度で加えるか、または細胞培養培地のみ(化合物なし)を加えた。同じ処置を４８時間後に繰り返した。さらに４８時間後、３％  パラホルムアルデヒドで細胞を２５分間固定化した。ＰＢＳ洗浄後、細胞を、５０％  エタノール中０.０１５％  チオフラビンＳと共に２５分間インキュベートし、５０％  エタノール中で４分間２回、脱イオン水で５分間２回洗浄し、次いで光退色から保護することを意図された水をベースとするマウント剤(mountant)を用いてマウントした。チオフラビンＳに結合する凝集物を、特記しない限りHigh Q FITC フィルターセット(４８０〜５３５nmのバンド幅)および２０×対物レンズを用いて、蛍光顕微鏡写真で検出した。条件毎に８および１６個の間の代表的な像を、処置条件について知らされていない実験者によって、選択し、画像化し、処理させた。チオフラビンＳに陽性な凝集物の量を評価するために、チオフラビンＳに陽性な封入体によって覆われた領域当たりの総面積を決定した。この目的のために、プリセットサイズまたはピクセル強度閾値変数を超えないバックグラウンド蛍光を、Q-capture ソフトウェアを用いて除いた。見かけの、非細胞関連蛍光を手動で除いた。特記しない限り、データは、グループの平均値±ＳＥＭを表す。統計学的分析をGraphPad Prism (GraphPad Inc)で行った。平均値(２つのサンプル)の間の相違は、スチューデントｔ検定によって評価した。多くの平均値間の相違は、一元配置ＡＮＯＶＡ、次いでテューキーの多重比較検定によって評価した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
実施例９：本発明の化合物がロテノン誘発細胞毒性から保護する
ＸＴＴ細胞毒性アッセイ(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)は、Ａ５３Ｔ α−シヌクレインが酸化ストレス依存性メカニズムを介して、ＢＥ−Ｍ１７細胞における細胞死を増加させることを証明するために、先に用いられたものである(Ostrerova-Golts et al., J. Neurosci., 20:6048-6054, 2000)。研究により、α−シヌクレインのレヴィー小体への蓄積は、パーキンソン病および関連の障害における神経変性に機構的に寄与することが示された (Polymeropoulos et al., Science 276:2045-2047, 1997; Kruger et al., Nature Genet. 18:106 108, 1998)。ここで、ロテノン誘発細胞毒性から保護する試験化合物の能力(神経保護能力)を測定するために、ＸＴＴ細胞毒性アッセイ(以後ＸＴＴアッセイと称する)を用いた。このアッセイは、代謝活性な生存細胞のみで、黄色のテトラゾリウム塩ＸＴＴの橙色ホルマザン色素(４９０nm付近で光を吸収する)への変換が起こるという原理に基づいている。従って、４９０nmでの吸光度は、細胞生存率に比例する。このアッセイにおいて、細胞をウェル当たり１０４細胞で９６ウェル組織培養皿に播いた。２４時間後、示された通りに、細胞を５００ｎＭまたは２μＭのロテノンまたはビークル(０.０５％  ＤＭＳＯ)で処置した。ロテノン添加直後に、化合物を示された濃度で加えた。コントロールとして、化合物をロテノンなしで加え(ビークルのみ, ０.０５％  ＤＭＳＯ)、試験された投与量で毒性なしという結果を得た。非処置細胞には、細胞培養培地のみを与えた(化合物なし、ロテノン有りまたは無し)。処置の４０〜４４時間後、馴化培地を除去し、製造者の推奨に従って、１００μｌの新しい培地および５０μｌのＸＴＴ標識反応混合物と置き換えた。５〜６時間後、４９０nmの吸光度を測定し、７００nmの参照波長の吸光度で補正した。５００ｎＭおよび２μＭのロテノンでの処置により、ロテノンなしの非処置細胞と比べて、通常、３５〜４５％まで生存率が減少した(図２０)。試験化合物処置によって除かれたロテノン誘発吸光度(生存率)減少の割合として、細胞死の％阻害を計算した。