【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的抗原に対する１次抗体またはその抗原結合部の親和性成熟方法であって、
ａ）対応する型の１次抗体よりも低下した標的抗原に対する活性を示す関連抗体またはその抗原結合部を特定するステップであって、関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または関連可変軽鎖を含み、
関連抗体またはその抗原結合部の対応する可変重鎖または可変軽鎖の内の１つが、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖に対する少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を示すが、それに対する１００％の配列同一性を示さない抗体であるか；または
関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じおよび／または少なくとも１つの可変軽鎖をコードする核酸分子のＶkおよびＪkもしくは少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkもしくはＶlおよびＪl生殖系列セグメントに同じである抗体であるかのいずれかであるステップ；
ｂ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列を比較するステップ；
ｃ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖内の標的領域を特定するステップであって、標的領域が関連抗体またはその抗原結合部中の同じ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の差異を示すステップ；
ｄ）それぞれ、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がその標的領域内で単一アミノ酸残基の置換により改変され、それによりそれぞれの複数の抗体またはその抗原結合部中の標的領域が、１次抗体またはその抗原結合部に比べてアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含むステップ；
ｅ）複数の改変抗体またはその抗原結合部のそれぞれを標的抗原に対する活性により選別するステップ；ならびに
ｆ）１次抗体またはその抗原結合部に比較して標的抗原に対する活性増加を示す改変抗体またはその抗原結合部を選択するステップ、を含む方法。
【請求項２】
以下の、
ａ）ｄ）において、複数の改変抗体またはその抗原結合部が１次抗体またはその抗原結合部の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、ここで、核酸分子が非改変可変重鎖または可変軽鎖と比較して異なるアミノ酸をコードする標的領域中のアミノ酸をコードする１つのコドン含み、それにより複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により、標的領域中で改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードすること、
ｂ）１次抗体またはその抗原結合部中の標的領域が、関連抗体またはその抗原結合部の対応する領域に比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸差異を示すこと、
ｃ）関連抗体またはその抗原結合部が１、２、３、４、または５関連抗体またはその抗原結合部であること、
ｄ）活性が、
ｉ．結合であって、イムノアッセイ、任意には、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）および電気化学発光測定法からなる群から選択されるイムノアッセイからなる群から選択される方法により評価される任意の結合であって、前記電気化学発光測定法が、任意にメソ・スケール・ディスカバリー（ＭＳＤ）、全細胞パニングおよび表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）である結合、
ｉｉ．シグナル伝達、
ｉｉｉ．分化、
ｉｖ．遺伝子発現の変化、
ｖ．細胞増殖、
ｖｉ．アポトーシス、
ｖｉｉ．走化性、
ｖｉｉｉ．細胞障害性、
ｉｘ．癌細胞浸潤、
ｘ．内皮細胞増殖、ならびに
ｘｉ．管形成
からなる群から選択されること、
ｅ）Ｆａｂ型である場合、１次抗体またはその抗原結合部が、約１０−４Ｍ以下；約１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満の結合親和性で標的抗原に結合すること、
ｆ）関連抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも低い結合親和性を示し、それにより、Ｆａｂ型の関連抗体またはその抗原結合部の結合親和性が、約１０−４Ｍ以下；約１０−４Ｍ〜１０−８Ｍ；または正確にもしくは約１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、またはそれ未満であること、
ｇ）関連抗体またはその抗原結合部が、対応する型の１次抗体またはその抗原結合部より８０％以下の活性；対応する型の１次抗体の約５％〜約８０％の活性；または対応する型の１次抗体の約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または５％未満の活性もしくは前記数値未満の活性を示すこと、
ｈ）関連抗体またはその抗原結合部が、陰性対照に比べて、同じまたは類似のレベルの標的抗原に対する活性を示すこと、
ｉ）標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われること、
ｊ）標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われること、
ｋ）標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われ、かつ、別々かつ独立に、標的領域が１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖内で特定され、そこからステップｄ）〜ｆ）が行われること、
ｌ）対応する関連可変重鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部とは異なること、
ｍ）対応する関連可変重鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部が、対応する関連可変軽鎖を含む関連抗体またはその抗原結合部と同じであること、
ｎ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の配列同一性；対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖と約８０％〜約９９％の配列同一性；または対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくともまたは約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示すこと、
ｏ）１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖のアミノ酸配列と少なくとも約９５％配列同一性を示すこと、
ｐ）関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントと同じ抗体である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の１つのＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントと同じ抗体であること、
ｑ）標的抗原が、ポリペプチド、炭水化物、脂質、核酸、および小分子からなる群から選択されること、
ｒ）標的抗原が、ウイルス、細菌、腫瘍または他の細胞の表面上に発現しているものであるか、もしくは組換え型タンパク質またはペプチドであること、
ｓ）標的抗原が、治療介入用の標的であるタンパク質であり、任意に、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３（血管内皮細胞増殖因子受容体１、２、および３）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＩＧＦ−Ｒ１、Ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞増殖因子受容体；ＨＧＦＲとしても知られる）、ＤＬＬ４、ＤＤＲ１（ジスコイジンドメイン受容体）、ＫＩＴ（ｃ−ｋｉｔ受容体）、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４（繊維芽細胞増殖因子受容体１、２、および４）、ＲＯＮ（ｒｅｃｅｐｔｅｕｒ  ｄ’ｏｒｉｇｉｎｅ  ｎａｎｔａｉｓ；マクロファージ刺激１受容体としても知られる）、ＴＥＫ（内皮細胞特異的受容体チロシンキナーゼ）、ＴＩＥ（イムノグロブリンおよび上皮増殖因子相同領域受容体を備えたチロシンキナーゼ）、ＣＳＦ１Ｒ（コロニー刺激因子１受容体）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来増殖因子受容体Ｂ）、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ１（エリトロポイエチン産生肝細胞受容体Ａ１、Ａ２およびＢ１）、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−Ｒ２、ＨＶＥＭ、ＬＴ−βＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＮＯＴＣＨ、Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ、ＥＰＯ−Ｒ、カドヘリン、インテグリン、ＣＤ５２、ＣＤ４４、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＩＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＬＩＧＨＴ、ＢＴＬＡ、リンホトキシン（ＬＴ）、ＩｇＥ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦならびにＥＰＯからなる群から選択されること、
ｔ）標的抗原が、細胞増殖および分化、細胞遊走、アポトーシスまたは血管新生に関与すること、
ｕ）標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが、アミノ酸置換により改変されること、
ｖ）標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で異なるアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変されること、
ｗ）標的領域内の１次抗体と関連抗体の間で同じアミノ酸残基のみが、アミノ酸置換により改変されること、
ｘ）標的領域中の全てのアミノ酸残基がアミノ酸置換により改変されること、
ｙ）標的領域中で改変される各アミノ酸残基が、全１９の他のアミノ酸残基、または制限されたそのサブセットに改変されること、
ｚ）アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、改変抗体で変えられたアミノ酸改変を決定するステップをさらに含むこと、
ａａ）前記方法が反復繰り返され、その後の親和性成熟のために、前記改変抗体またはその抗原結合部が、前記１次抗体またはその抗原結合部としてステップａ）で選択されかつ使用されること、
ｂｂ）選択した改変抗体またはその抗原結合部の１つ以上の可変重鎖または１つ以上の可変軽鎖の標的領域中の１つ以上のアミノ酸置換が、さらなる改変抗体またはその抗原結合部を産生するために組み合わせられ、それにより、前記さらなる改変抗体、またはその抗原結合部が、さらなる改変抗体またはその抗原結合部を特定するために、標的抗原に対する活性により選別され、これは１次抗体またはその抗原結合部ならびに選択された改変抗体またはその抗原結合部に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示すこと、ならびに、
ｃｃ）可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む抗体その抗原結合部が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、Ｆｄ、Ｆｄ’、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｄ’断片、ｓｃＦｖ断片、ならびにｓｃＦａｂ断片からなる群から選択されること、
の内の少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
関連抗体またはその抗原結合部が、関連可変重鎖または可変軽鎖を含み、１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変重鎖をコードする核酸分子のＶＨ、ＤＨおよびＪＨ生殖系列セグメントの１つと同じ遺伝子ファミリー由来である；および／または少なくとも１つのＶkおよびＪkまたは１次抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子の少なくとも１つのＶlおよびＪl生殖系列セグメントが、関連抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖をコードする核酸分子のＶkおよびＪkまたはＶlおよびＪl生殖系列セグメントの１つと同じ遺伝子ファミリー由来である、請求項１に記載の方法。 
【請求項４】
前記１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖が、対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖と少なくとも６０％以上の配列同一性；または対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖と６０％から９９％の配列同一性；または対応する関連抗体またはその抗原結合部の関連可変重鎖または可変軽鎖と約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ａ）前記１次抗体またはその抗原結合部が、コンビナトリアル抗体ライブラリーまたはコンビナトリアル抗原結合抗体フラグメントライブラリーの選別により特定され、
ｂ）前記コンビナトリアルライブラリーが、
ｉ）インフレームでのＶＨ、ＤＨおよびＪＨヒト生殖系列セグメントまたはその一部を組み合わせてＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｉ）インフレームのＶkおよびＪkヒト生殖系列セグメントもしくはその一部、またはＶlおよびＪl生殖系列セグメントもしくはその一部を組み合わせて、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子の配列を生成し、
ステップｉ）およびｉｉ）で、ＶＨ、ＤＨ、ＪＨ、Ｖk、Ｊk、ＶlまたはＪlの各部分が、抗原結合部位を形成するのに充分なＶＨまたはＶＬもしくはその一部を含む抗体またはその抗原結合部を産生するのに充分であるステップ、
ｉｉｉ）ステップｉ）およびｉｉ）を複数回繰り返して、複数の異なる核酸分子の配列を生成するステップ、
ｉｖ）核酸分子を合成して２つのライブラリーを作製し、
第１のライブラリーが、ＶＨ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含み；および
第２のライブラリーが、ＶＬ鎖またはその一部をコードする核酸分子を含むステップ、
ｖ）第１のライブラリー由来および第２のライブラリー由来の核酸分子を細胞中に導入し、これを複数回繰り返して細胞のライブラリーを作成するステップであって、各細胞が細胞ライブラリー中の少なくともいくつかの細胞間で異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬをコードする核酸分子を含むステップ、および
ｖｉ）細胞を増殖して各細胞中で抗体またはその抗原結合部を発現させ、それにより複数の抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、ライブラリー中の各異なる抗体またはその抗原結合部が、異なる組み合わせのＶＨおよびＶＬ鎖または抗原結合部位を形成するのに充分なその部分を含むステップ、を含む方法により作成され、かつ、
ｃ）ライブラリーの選別を、
ｉ）ライブラリー中の抗体またはその抗原結合部を標的タンパク質と接触させ、
ｉｉ）抗体またはその抗原結合部の標的タンパク質に対する結合および／または抗体またはその抗原結合部が標的タンパク質の機能活性を調節するかどうかを評価し、かつ、
ｉｉｉ）標的タンパク質に対し活性を示す抗体またはその抗原結合部を特定する（特定された抗体またはその抗原結合部が１次抗体である）ことにより実行する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下の、
ａ）関連抗体もまた、コンビナトリアル抗体ライブラリーをステップａ）〜ｃ）に従い選別することにより特定され、それにより、関連抗体が、１次抗体に比べて、標的抗原に対する活性の減少を示すこと、
ｂ）ライブラリーがアドレス指定できるライブラリーであり、それにより：
ステップｉｖ）で、合成核酸配列が個別にアドレス指定され、それにより、第１のアドレス指定される核酸ライブラリーおよび第２のアドレス指定される核酸ライブラリーを生成し；
ステップｖ）で、細胞がアドレス指定され、各座位が、アドレス指定される細胞ライブラリー中の全ての他の細胞からのＶＨおよびＶＬの異なる組み合わせをコードする核酸分子を含む細胞を含み；かつ、
ステップｖｉ）で、複数の抗体またはその一部がアドレス指定され、
ここで、ライブラリー中の各座位の抗体またはその一部が、同じ抗体であり、また、各および全ての他の座位のものと異なり；かつ、
抗体またはその一部の同一性をそのアドレスにより知ることができ、
ここで、任意にアドレス指定できるライブラリー中の抗体が空間アレイ、任意にはマルチウェルプレート中に配置され、任意にアレイの各個別座位が異なる抗体メンバーに対応すること、
ｃ）抗体が、アドレス指定できるライブラリー中にあり、ここで任意にアドレス指定できるライブラリー中の抗体が、空間アレイ中に、任意にはマルチウェルプレート中に配置され、ここで任意にアレイの各個別座位が異なる抗体メンバーに対応し、かつ前記抗体が、フィルター、チップ、スライド、ビーズおよびセルロースからなる群から選択される固体支持体に結合し、異なる抗体メンバーが、その表面に固定されること、
ｄ）複数の核酸分子が、ＰＣＲ変異誘発、カセット変異導入、部位特異的変異誘発、ランダム点変異誘発、ウラシル含有テンプレートを使った変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップ二重鎖ＤＮＡを使った変異誘発、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使った変異誘発、制限選択および制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、および二重鎖切断修復からなる群から選択される方法により生成されること、ならびに、
ｅ）複数の核酸分子が、ＮＮＫ、ＮＮＳ、ＮＮＮ、ＮＮＹまたはＮＮＲ変異誘発からなる群から選択される方法により生成されること、
のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップｄ）の前に、
ｇ）１次抗体またはその抗原結合部の系統的変異導入を行うステップで、可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数の改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖またはその一部が、標的領域の単一アミノ酸残基のスキャンアミノ酸残基による置換により改変され、それにより、複数の抗体またはその抗原結合部がそれぞれ、１次抗体またはその抗原結合部と比べて標的領域中にアミノ酸置換を含み、ここでスキャンアミノ酸は、アラニン、トレオニン、プロリン、グリシン、および非天然のアミノ酸からなる群から任意に選択される、ステップ、
ｈ）標的抗原に対する活性により複数の改変抗体またはその抗原結合部のそれぞれを選別するステップ、および、
ｉ）アミノ酸置換不含の１次抗体またはその抗原結合部に比較して、標的抗原に対する活性の保持または増加を示す改変抗体またはその抗原結合部の中から２次抗体またはその抗原結合部を選択し、それにより、ステップｂ）で１次抗体またはその抗原結合部の代わりに２次抗体またはその抗原結合部が使用されるステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項９】
以下の、
ａ）ステップｇ）で複数の改変抗体またはその抗原結合部が、標的領域を含む改変型の１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生することにより産生され、核酸分子が、スキャンアミノ酸をコードしない非改変可変重鎖または可変軽鎖の対応するコドンに比べて、標的領域中のスキャンアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより各複数の核酸分子が、標的領域内の単一アミノ酸残基の同じスキャンアミノ酸残基による置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードすること、
ｂ）対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも７５％以上の活性；対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも７５％〜２００％；または、対応する型の１次抗体またはその抗原結合部の少なくとも、もしくは約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、２００％またはそれ以上の活性を示す２次抗体またはその抗原結合部が選択されること、
ｃ）ステップｉ）の後に、２次抗体またはその抗原結合部中で、アミノ酸置換不含１次抗体に比べて、中性アミノ酸を含むように改変されたアミノ酸残基位置を決定すること、
ｄ）標的領域中のアミノ酸残基のサブセットが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変されること、
ｅ）標的領域内の１次抗体またはその抗原結合部と関連抗体またはその抗原結合部の間で異なるアミノ酸残基のみが、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変されること、
ｆ）標的領域内の全てのアミノ酸が、スキャンアミノ酸へのアミノ酸置換により改変されること、
ｇ）選択された改変抗体またはその抗原結合部が、１次抗体またはその抗原結合部に比べ、約２倍、５倍、１０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、１００００倍またはそれを超えて改善された標的抗原に対する活性を示すこと、ならびに、
ｈ）改変抗体またはその抗原結合部が１次抗体またはその抗原結合部の結合親和性よりも大きく、また、約１ｘ１０−９Ｍ以下；１ｘ１０−９Ｍ〜１ｘ１０−１１Ｍ；または正確に、もしくは約１ｘ１０−９Ｍ、２ｘ１０−９Ｍ、３ｘ１０−９Ｍ、４ｘ１０−９Ｍ、５ｘ１０−９Ｍ、６ｘ１０−９Ｍ、７ｘ１０−９Ｍ、８ｘ１０−９Ｍ、９ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、２ｘ１０−１０Ｍ、３ｘ１０−１０Ｍ、４ｘ１０−１０Ｍ、５ｘ１０−１０Ｍ、６ｘ１０−１０Ｍ、７ｘ１０−１０Ｍ、８ｘ１０−１０Ｍ、９ｘ１０−１０Ｍもしくはそれ未満の結合親和性を示すこと、
の中の少なくとも１つをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１次抗体またはその抗原結合部の可変重鎖にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む１次改変抗体またはその抗原結合部を選択し；
１次抗体の可変軽鎖に、独立かつ別々にステップａ）〜ｆ）を実行し、それぞれ標的領域にアミノ酸置換を含む２次改変抗体またはその抗原結合部を選択し；
１次改変抗体またはその抗原結合部の可変重鎖を２次改変抗体またはその抗原結合部の可変軽鎖と結合して、それぞれ可変重鎖および可変軽鎖の標的領域内のアミノ酸置換を含む複数の異なる３次改変抗体またはその抗原結合部を生成し；かつ、
標的抗原に対する結合により複数の３次改変抗体またはその抗原結合部をそれぞれ選別し；かつ、
１次および２次改変抗体に比較して、標的抗原に対する活性の増加を示す３次改変抗体またはその抗原結合部を選択することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｆ）で１次改変抗体またはその抗原結合部を選択後：
ｊ）さらなる変異誘発のために、１次改変抗体またはその抗原結合部の可変重鎖または可変軽鎖内の別の異なる領域を選択するステップであって、任意に前記さらなる異なる領域が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４からなる群から選択されるステップ；
ｋ）１次改変抗体またはその抗原結合部の改変型の可変重鎖または可変軽鎖をコードする複数の核酸分子を産生するステップであって、核酸分子が、選択領域中に、１次改変可変重鎖または可変軽鎖とは異なるアミノ酸をコードする１つのコドンを含み、それにより、複数の各核酸分子が単一アミノ酸残基の置換により改変される可変重鎖または可変軽鎖をコードするステップ；
ｌ）それぞれ可変重鎖および可変軽鎖、またはその一部を含む複数のさらなる改変抗体またはその抗原結合部を産生するステップであって、少なくとも１つの可変重鎖または可変軽鎖がステップｋ）で産生されたものであり、それにより、それぞれ複数の抗体またはその抗原結合部の選択領域が、１次改変抗体またはその抗原結合部に比べて、アミノ酸の異なるアミノ酸への置換を含むステップ；
ｍ）標的抗原に対する結合により、それぞれ複数のさらなる改変抗体またはその抗原結合部を選別するステップ；および
ｎ）１次改変抗体またはその抗原結合部に比べて、標的抗原に対する活性の増加を示すさらなる改変抗体またはその抗原結合部を選択するステップ、
をさらに含む請求項１に記載の方法。