(57)【要約】      （修正有）【課題】光合成に重要な、ルビスコ酵素タンパク質を、試験管内発現系で効果的に発現させる方法の提供。【解決手段】ルビスコ遺伝子を試験管内発現系で発現させてルビスコタンパク質を合成する方法であって、藍藻のＲｂｃＸタンパク質の存在下でルビスコ遺伝子の発現を行わせることを特徴とする方法。好ましくは、ルビスコは、高等植物又は真核藻類のルビスコであり、藍藻のＲｂｃＸタンパク質は、特定のアミノ酸配列又はその均等物からなる。【選択図】図２
2008182983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子を試験管内発現系で発現させてリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質を合成する方法であって、藍藻のＲｂｃＸタンパク質の存在下でリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子の発現を行わせることを特徴とする方法。
【請求項２】
リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼが、高等植物又は真核藻類のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
藍藻のＲｂｃＸタンパク質が、配列番号２によって表わされるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２によって表わされるアミノ酸配列に対して１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列でありかつリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの八量体形成を補助する機能を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子を試験管内発現系で発現させてリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質を合成するためのキットであって、遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬、ｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬、及び藍藻のＲｂｃＸタンパク質を含むことを特徴とするキット。
【請求項５】
リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼが、高等植物又は真核藻類のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼであることを特徴とする請求項４に記載のキット。
【請求項６】
藍藻のＲｂｃＸタンパク質が、配列番号２によって表わされるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２によって表わされるアミノ酸配列に対して１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列でありかつリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼの八量体形成を補助する機能を有するアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４又は５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコとも称される）タンパク質を試験管内発現系で効率的に合成する方法、及びかかる方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ルビスコは、植物や藻類などの光合成を行う生物が有する酵素タンパク質であり、光合成において二酸化炭素を固定する反応を触媒する極めて重要な酵素である。ルビスコの性能は生物種によってかなり異なり、特に植物のルビスコは、二酸化炭素との親和性が低い、反応速度が遅い、副反応として酸素と反応してしまうなどの点でかなり性能が劣る。従って、これらの性能を改善して植物の光合成効率を向上させることが、農作物などの収率の増加の観点から多くの関心を集めている。
【０００３】
酵素タンパク質の性能改善は一般的に、遺伝子工学の手法により酵素タンパク質をコードする遺伝子に対して様々な改変を行い、改変された遺伝子を発現させて酵素タンパク質の様々な変異体を作成し、それらの変異体の性能を活性測定などにより確認して優れた性能を有する変異体を選抜することによって行われる。そして、改変された遺伝子からのタンパク質発現は従来、大腸菌等の細胞の内部に存在する天然のタンパク質発現系を利用する細胞内発現系で実施することが一般的であった。しかし、細胞内発現系では、タンパク質が発現するまで３〜４日かかり、また各サンプルをビーカーなどの大容積の容器で培養する必要がある。さらに、細胞内発現系では、発現したタンパク質は抽出分離処理を行ってから活性測定に供する必要がある。従って、細胞内発現系は様々な変異体タンパク質を効率良く作成するためには必ずしも好適でなかった。これらの欠点を改善した発現系として、遺伝子からのタンパク質発現に必要な試薬を含む反応液中でタンパク質発現を人工的に行わせる試験管内発現系が近年開発されている。試験管内発現系は細胞内発現系と比較して、タンパク質発現に要する時間が短く一日程度しかかからない、必要な容積が小さいのでウェルでの培養で十分であり一度に多数のサンプルを試験できる、発現したタンパク質は抽出分離処理に供さなくてもそのまま活性測定に供することができる等の利点を有しており、様々な変異体タンパク質を効率良く作成するのに適した発現系である。しかしながら、ルビスコ酵素タンパク質の場合、細胞内発現系でのタンパク質発現には成功しているが、試験管内発現系でタンパク質発現を行わせることには今まで成功していない（非特許文献１）。
【非特許文献１】Ｈａｒｔｍａｎ，Ｆ．Ｃ．ａｎｄ  Ｈａｒｐｅｌ，Ｍ．Ｒ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｏｃｈｅｍ．６３：１９７−２３４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はかかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的はルビスコ酵素タンパク質を試験管内発現系で効率的に発現させることである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らはかかる目的を達成するため、まずルビスコ酵素タンパク質の構造に着目した。ルビスコは、ラージサブユニット（Ｌ）及びスモールサブユニット（Ｓ）の二つのサブユニットからなるＬＳ複合体の八量体（Ｌ８Ｓ８）タンパク質であり、ラージサブユニット遺伝子（ｒｂｃＬ遺伝子）から発現された八つのラージサブユニットとスモールサブユニット遺伝子（ｒｂｃＳ遺伝子）から発現された八つのスモールサブユニットがそれぞれ折りたたまれて会合して一定の立体配置をとることにより初めて酵素活性を有するタンパク質となる。本発明者らは、ルビスコタンパク質を試験管内発現系で適切に発現できないのは、発現された各サブユニットの折りたたみ及び会合が何らかの理由でうまく進行しないためではないかと考え、この進行を補助する因子について鋭意検討した結果、藍藻のＲｂｃＸタンパク質が試験管内発現系でのルビスコの各サブユニットの折りたたみ及び会合を効果的に補助することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
即ち、本発明によれば、リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子を試験管内発現系で発現させてリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質を合成する方法であって、藍藻のＲｂｃＸタンパク質の存在下でリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子の発現を行わせることを特徴とする方法が提供される。
【０００７】
また、本発明によれば、リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ遺伝子を試験管内発現系で発現させてリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質を合成するためのキットであって、遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬、ｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬、及び藍藻のＲｂｃＸタンパク質を含むことを特徴とするキットが提供される。
【０００８】
本発明の方法及びキットの好ましい実施態様によれば、リブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼは、高等植物又は真核藻類のリブロース−１，５ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼであり、藍藻のＲｂｃＸタンパク質は、配列番号２によって表わされるアミノ酸配列からなるか、又は配列番号２によって表わされるアミノ酸配列に対して１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列からなる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、ルビスコタンパク質の各サブユニットの折りたたみ及び会合に必要な補助因子が発現系内に存在するので、発現した各サブユニットは正常に折りたたまれて会合し、Ｌ８Ｓ８の八量体を形成することができ、従って、酵素活性を有する正常な八量体のルビスコタンパク質を試験管内発現系で効果的に発現させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法で発現対象とするルビスコは、その遺伝子が同定されているルビスコであればいかなるものも発現対象とすることができ、例えば光合成効率の向上が強く望まれている農作物を含む高等植物のルビスコや、高等植物のルビスコより二酸化炭素固定能に優れるため高等植物に遺伝子導入することが検討されている紅藻のルビスコを使用することができる。
【００１１】
本発明の方法で使用する試験管内発現系は、無細胞発現系や無細胞タンパク質合成系とも称され、遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬及びｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬を含む反応液中でタンパク質発現を人工的に行わせる系である。遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬は一般的に、ｍＲＮＡの構成成分であるリボヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、各種の転写補助因子、エネルギー源であるＡＴＰ及びＧＴＰなどを含み、ｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬は一般的に、タンパク質の構成成分であるアミノ酸、リボソーム、各種の翻訳補助因子、エネルギー源であるＡＴＰ及びＧＴＰなどを含む。本発明の方法で使用する試験管内発現系は市販のキットであることができ、例えばＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨからＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの商品名で販売されている試験管内発現系キットを使用することができる。
【００１２】
本発明の方法は、藍藻のＲｂｃＸタンパク質の存在下でルビスコ遺伝子を試験管内発現系で発現させることを特徴とする。藍藻のＲｂｃＸタンパク質は、藍藻のルビスコオペロン中、ｒｂｃＬ（ルビスコのラージサブユニット）遺伝子とｒｂｃＳ（ルビスコのスモールサブユニット）遺伝子の間のスペーサー領域に存在する遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＲｂｃＸタンパク質を持つ藍藻としては、例えばシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アファニゾメノン（Ａｐｈａｎｉｚｏｍｅｎｏｎ）属、ノストック（Ｎｏｓｔｏｃ）属、ミクロシスティス（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、プランクトスリックス（Ｐｌａｎｋｔｏｔｈｒｉｘ）属、及びチコネマ（Ｔｙｃｈｏｎｅｍａ）属の藍藻がある。好ましくは、本発明の方法で使用するＲｂｃＸタンパク質はシネココッカスｓｐ.ＰＣＣ７００２株のＲｂｃＸタンパク質である。そのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を配列表の配列番号１及び２にそれぞれ示す。配列番号２に示されるアミノ酸配列はＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質配列データバンクに登録されているいかなる他のタンパク質のアミノ酸配列とも有意な類似性を示さない。従って、ＲｂｃＸタンパク質がどのような機能を有するかはアミノ酸配列からは予測不可能であった。本発明者らはＲｂｃＸタンパク質が試験管内発現系でのルビスコのラージサブユニット及びスモールサブユニットの翻訳後折りたたみ及びＬ８Ｓ８会合を補助するシャペロンタンパク質としての機能を有することを初めて見出したものである。
【００１３】
本発明の方法では、配列番号２のアミノ酸配列といわゆる均等の範囲に含まれるタンパク質、つまり配列番号２によって表わされるアミノ酸配列に対して１個〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されているアミノ酸配列でありかつルビスコのＬ８Ｓ８八量体形成を補助する機能を有するアミノ酸配列からなるタンパク質も配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質と同様に好適に使用することができる。
【００１４】
配列番号２のアミノ酸配列といわゆる均等の範囲に含まれるタンパク質は、例えば当業者には周知の部位特異的突然変異法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ６４８７−６５００，１９８２）や、配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列もしくはその一部をプローブとしていわゆるストリンジェントな条件下（例えば６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間）でコロニーもしくはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。得られたタンパク質がルビスコのＬ８Ｓ８八量体形成を補助する機能を有するかどうかは、得られたタンパク質をルビスコ遺伝子の試験管内発現系の反応溶液に添加してルビスコＬ８Ｓ８八量体の形成をウェスタンブロッティング等により測定することにより確認することができる。
【００１５】
本発明の方法で使用する藍藻のＲｂｃＸタンパク質はその遺伝子から市販の発現系キットを使用して容易に合成することができ、次いで常法に従って容易に精製することができる。精製されたＲｂｃＸタンパク質はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液などの適当な緩衝液中に溶解させ、上述の試験管内発現系の反応溶液に添加して反応を行わせればよい。また、精製されたＲｂｃＸタンパク質をすぐに使用しない場合は、適当な緩衝液中に溶解させた状態で−２０℃〜−８０℃程度の温度で冷凍保存することができる。反応溶液へのＲｂｃＸタンパク質の添加濃度は特に限定されないが、ルビスコの十分な量の発現を達成するためには一般的に５μＭ〜５０μＭであることが好ましく、１０μＭ〜４０μＭであることがさらに好ましい。
【００１６】
本発明のキットは、遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬、ｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬、及び藍藻のＲｂｃＸタンパク質を含むキットであり、ルビスコ遺伝子を試験管内発現系で発現させてルビスコタンパク質を合成するためのものである。遺伝子からのｍＲＮＡの試験管内転写に必要な試薬は一般的に、ｍＲＮＡの構成成分であるリボヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、各種の転写補助因子、エネルギー源であるＡＴＰ及びＧＴＰなどを含み、ｍＲＮＡからのタンパク質の試験管内翻訳に必要な試薬は一般的に、タンパク質の構成成分であるアミノ酸、リボソーム、各種の翻訳補助因子、エネルギー源であるＡＴＰ及びＧＴＰなどを含む。これらの試薬及び藍藻のＲｂｃＸタンパク質を長期保存可能な様式でキットに含ませる手法は、当業者には周知であるのでここでは説明を省略する。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
材料及び方法
材料：
制限酵素はタカラバイオ（株）（日本、京都）から購入した。ＤＮＡ配列決定キットはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ）から購入した。ＢＳＡはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉ，ＵＳＡ）から購入した。化学薬品はすべてナカライテスク（株）（日本、京都）から購入した。
【００１９】
ルビスコ発現プラスミドの構築
藍藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ７００２のリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ルビスコ）のｒｂｃプロモータ部、ラージサブユニット（ｒｂｃＬ）、スモールサブユニット（ｒｂｃＳ）およびｒｂｃＸ遺伝子からなるオペロン（ＤＤＢＪ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｄ１３９７１）をＰＣＲで増幅し、シアノバクテリア用シャトルベクターｐＡＱＪ４に導入してｐＲｂｃＬＸＳを作製した。このｐＲｂｃＬＸＳのｒｂｃＸ遺伝子にあるＳａｃＩ  ｓｉｔｅを切断し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理することによりｒｂｃＸ遺伝子のフレームシフトによる不活性化を行ったｐＲｂｃＬＳを作製した（Ｏｎｉｚｕｋａ  Ｔ，Ｅｎｄｏ  Ｓ，Ａｋｉｙａｍａ  Ｈ，Ｋａｎａｉ  Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｍ，Ｙｏｋｏｔａ  Ａ，Ｔａｎａｋａ  Ｓ，Ｍｉｙａｓａｋａ  Ｈ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００４  Ｏｃｔ；４５（１０）：１３９０−５）。このｐＲｂｃＬＳを鋳型としてｒｂｃプロモータ部を除くルビスコオペロン（２．３ｋｂ）をＰＣＲにて増幅し、Ｔ７プロモータを持つベクターｐＩＶＥＸ２．４ｂ−Ｎｄｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｄｅＩ，ＸｈｏＩサイトに導入して図１に示すような発現プラスミドｐＴ７ＬＳを作製した。
【００２０】
ＲｂｃＸタンパク質の調製
藍藻Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＰＣＣ７００２のｒｂｃＸ遺伝子をＰＣＲ増幅し、ベクターｐＩＶＥＸ２．３（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ）に導入して発現プラスミドを構築した。この発現プラスミドを鋳型ＤＮＡとし、反応装置ＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒおよび試薬ＲＴＳ  ９０００  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ）を用いて試験管内発現系でのＲｂｃＸタンパク質の発現を行わせた。具体的にはキットに含まれるＲｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ，Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｙｓａｔｅ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｍｉｘ及びＭｅｔｈｉｏｎｉｎ溶液を混合して調製した反応溶液に上述の発現プラスミド１５０μｇを加えて全量を１０．９ｍＬとし、そのうちの１０ｍＬを反応装置ＲＴＳ  ＰｒｏｔｅｏＭａｓｔｅｒの反応槽に加えた。また、キットに含まれるＦｅｅｄｉｎｇ  Ｍｉｘ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｍｉｘ及びＭｅｔｈｉｏｎｉｎ溶液を混合して調製した供給溶液１０９ｍＬのうち１００ｍＬを同装置の供給槽に加え、攪拌速度９００ｒｐｍ、３０℃で２４時間反応させた。反応後、反応溶液に硫酸アンモニウムを最終濃度２０重量％となるように加え、１５０００ｇ，４℃で１０分間遠心処理して沈殿を除去した。上清にさらに硫酸アンモニウムを最終濃度３０重量％となるように加え、同様の遠心操作にてＲｂｃＸタンパク質を含む沈殿を回収した。沈殿は２０重量％硫酸アンモニウムに再溶解してろ過後、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，１．０Ｍ  硫酸アンモニウム）で平衡化したＲＥＳＯＵＲＣＥ  ＰＨＥ  ６ｍｌ  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）に添加した。緩衝液Ａで洗浄した後、１．０−０Ｍの硫酸アンモニウム溶液で溶出した。ＲｂｃＸタンパク質を含む画分について透析処理（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５）を行い、緩衝液Ｂ（２５ｍＭ  ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ６．０）で平衡化したＭｏｎｏＱ  １０／１０  ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍａｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）に添加した。緩衝液Ｂで洗浄後、０−０．５Ｍの塩化ナトリウム溶液で溶出した。ＲｂｃＸタンパク質を含む画分を集め、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５溶液中に濃縮し、使用するまで−２０℃あるいは−８０℃にて保存した。
【００２１】
ルビスコタンパク質の試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）発現：
ルビスコタンパク質の試験管内発現はＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）１００  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＹ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＧｍｂＨ）を用いて行った。キット付属のマニュアルに従い、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｙｓａｔｅ，ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，及びＭｅｔｈｉｏｎｉｎｅを混合して調製した反応溶液に鋳型ＤＮＡとして上述の発現プラスミドｐＴ７ＬＳ  ２５０ｎｇを加え、さらに実験条件によりＲｂｃＸタンパク質又はＢＳＡタンパク質を加えて全量を２５μＬとした。タンパク合成反応条件は３０℃、６時間であった。
【００２２】
ルビスコタンパク質のウェスタンブロッティング：
ルビスコの試験管内タンパク質合成を行った反応溶液について遠心操作（１４０００ｒｐｍ，３０分，４℃）を行った。次に、実施例１及び２については、上清画分のサンプルを４−１２％グラディエントゲルを用いたＮａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥに供した。また、実施例３については、上清５μＬに５０μＬの冷アセトンを加え、沈殿を２０μＬのＳＤＳ用サンプル緩衝液に再溶解し、不溶画分をそのまま２５μＬのＳＤＳ用サンプル緩衝液に溶解して４−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。電気泳動の後、タンパク質をゲルからＰＶＤＦメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に１００Ｖで１時間トランスファーした。１次抗体には抗ＰＣＣ７００２  ｒｂｃＬ抗体あるいは抗ＰＣＣ７００２  ｒｂｃＳ抗体を用いた。２次抗体は抗ウサギＩｇＧ抗体（ＩｇＧ−ＨＲＰ）を用いた。反応時間は各１時間であった。検出には化学発光法を用いた。
【００２３】
実施例１
藍藻のＲｂｃＸタンパク質がルビスコタンパク質の試験管内発現に与える影響を調べるため、７．３μＭのＲｂｃＸタンパク質を反応溶液に添加してルビスコタンパク質の試験管内発現を行わせた。また、コントロールとして、ＲｂｃＸタンパク質を添加しない条件及びＲｂｃＸタンパク質の代わりにＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）タンパク質７．３μＭを反応溶液に添加した条件でルビスコタンパク質の試験管内発現を行わせた。ルビスコタンパク質の試験管内発現の有無はウェスタンブロッティングにより確認した。その結果を図２に示す。
【００２４】
図２中、Ａは１次抗体として抗ＰＣＣ７００２  ｒｂｃＬ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果であり、Ｂは１次抗体として抗ＰＣＣ７００２  ｒｂｃＳ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果である。図２Ａ及びＢにおいて、左端のレーンはＲｂｃＸタンパク質を反応溶液に添加しない場合であり、中央のレーンはＲｂｃＸタンパク質（７．３μＭ）を反応溶液に添加した場合であり、右端のレーンはＢＳＡ（７．３μＭ）を反応溶液に添加した場合である。図２Ａ及びＢから、ＲｂｃＸタンパク質を反応溶液に添加した場合にのみ、ルビスコのＬ８Ｓ８八量体の分子量に相当する位置に濃いバンドが検出されることが明らかである。従って、ルビスコの試験管内発現系での発現にはＲｂｃＸタンパク質が発現系に存在することが必要であることが理解される。
【００２５】
実施例２
藍藻のＲｂｃＸタンパク質がルビスコタンパク質の試験管内発現に与える影響が濃度依存的であるかどうかを調べるため、０μＭ、１μＭ、５μＭ又は１０μＭの濃度のＲｂｃＸタンパク質を反応溶液に添加してルビスコタンパク質の試験管内発現を行わせた。ルビスコタンパク質の試験管内発現の有無及びその量はウェスタンブロッティングにより確認した。その結果を図３に示す。
【００２６】
図３において、各レーンは左から順に０μＭ、１μＭ、５μＭ又は１０μＭの濃度のＲｂｃＸタンパク質を反応溶液に添加した場合を示す。図３から、ＲｂｃＸタンパク質がルビスコタンパク質の試験管内発現に与える影響は濃度依存的であり、ＲｂｃＸタンパク質の量が多いほど形成されるルビスコＬ８Ｓ８八量体の量も多くなることが明らかである。
【００２７】
実施例３
ＲｂｃＸタンパク質の存在下で発現されたルビスコＬ８Ｓ８八量体が、正常に折りたたまれた機能的なラージサブユニット及びスモールサブユニットからそれぞれ構成されているかどうかを調べるため、発現されたルビスコタンパク質をアセトン処理してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、可溶化された（つまり、正常に折りたたまれた機能的な）ラージサブユニット及びスモールサブユニット、並びに不溶性の（つまり正常に折りたたまれておらずルビスコとしての機能を奏することができない）ラージサブユニット及びスモールサブユニットに分離してそれぞれウェスタンブロッティングを行った。なお、発現系の反応溶液へのＲｂｃＸタンパク質の添加量は０μＭ、１μＭ、５μＭ又は１０μＭの四段階とした。結果を図４に示す。
【００２８】
図４において、Ａはルビスコのラージサブユニット（ＲｂｃＬ）の有無及びその量を示し、Ｂはルビスコのスモールサブユニット（ＲｂｃＳ）の有無及びその量を示す。図４中、記号Ｓを付されたレーンは可溶化物のレーンであり、記号Ｐを付されたレーンは不溶性物のレーンである。図４から、不溶性のルビスコラージサブユニット及びスモールサブユニットの量は発現系の反応溶液に添加したＲｂｃＸタンパク質の濃度にかかわらずほぼ一定であるが、可溶化されたルビスコラージサブユニット及びスモールサブユニットの量はＲｂｃＸタンパク質の濃度に依存しており、ＲｂｃＸタンパク質の量が多いほど可溶化されたルビスコラージサブユニット及びスモールサブユニットの量も多くなることが明らかである。従って、本発明によればＲｂｃＸタンパク質の存在下でルビスコの試験管内発現を行わせることにより、酵素活性を有する正常なＬ８Ｓ８八量体のルビスコタンパク質を発現させることができることが理解できる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、細胞内発現系と比べて所要時間が短い、必要な容積が小さい、発現したタンパク質の抽出分離処理が不要であるなどの様々な利点を有する試験管内発現系で、正常な酵素活性を有するルビスコタンパク質を効果的に発現させることができる。従って、本発明は遺伝子工学の手法によるルビスコタンパク質の性能改善などの多数のルビスコタンパク質サンプルを迅速に処理することが要求される分野で極めて有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】実施例で構築したルビスコ発現プラスミドの構造を示す。
【図２】実施例１のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図３】実施例２のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図４】実施例３のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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