【手続補正書】
【提出日】平成25年10月1日(2013.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、胚葉前駆細胞の集団を作製する方法:
(a)多能性幹細胞を解離してクラスターまたは単一細胞にする工程;
(b)(a)由来の解離細胞を、重量オスモル濃度260〜340mOsm/kgの培養培地中で培養する工程;および
(c)(b)の細胞を解離し、該細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種し、該培養培地中で少なくとも1日培養して、胚葉前駆細胞を作製する工程。
【請求項２】
前記前駆細胞が、外胚葉性前駆細胞、内胚葉性前駆細胞、および/または中胚葉性前駆細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
(b)が、
(i)(a)由来の解離細胞をマイクロウェル装置内で約24時間培養して、凝集物を形成させる工程、および該マイクロウェル装置内での培養を24時間超にわたり前記培養培地中で続け、次に、該凝集物を遊離させ、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程；
(ii)(a)由来の解離細胞をマイクロウェル装置内で前記培養培地中で約24時間培養して、凝集物を形成させる工程、該凝集物を該マイクロウェル装置から遊離させ、次に該遊離させた凝集物を該培養培地中で少なくとも1日懸濁培養する工程、該凝集物を解離し、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程；または
(iii)(a)由来の解離細胞を該培養培地中で少なくとも1日懸濁培養し、次に該細胞を解離し、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程
を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記凝集物が胚様体を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記胚様体が500〜20,000個の細胞を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
(b)が、(a)由来の解離細胞をコーティングされた培養ディッシュまたはフィーダー上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも3日間培養する工程を含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地がダルベッコ最小必須培地を含み、かつ、ビタミン類、微量元素類、セレン、インシュリン、脂質、β-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、抗生物質、bFGF、B27、N2、またはこれらの混合物をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が哺乳動物多能性幹細胞である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
外胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が260〜280mOsm/kgである、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
外胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が270〜320mOsm/kgである、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、単一の神経前駆細胞を、重量オスモル濃度260〜340mOsm/kgの培養培地中で少なくとも3継代にわたって維持する方法:
(a)請求項11または12記載の方法に従って外胚葉性前駆細胞を作製する工程;
(b)付着培養物から該外胚葉性前駆細胞を解離する工程;
(c)該前駆細胞を播種する工程;および
(d)該前駆細胞を該培養培地中で少なくとも1日培養する工程。
【請求項１４】
前記細胞を、重量オスモル濃度約270mOsm/kgの培養培地中で少なくとも3継代にわたって維持する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
(b)において、Ca2+およびMg2+フリーの緩衝液を含む緩衝溶液を用いて、付着培養物から前記外胚葉性前駆細胞を解離する、請求項13または14記載の方法。
【請求項１６】
Ca2+およびMg2+フリーの緩衝液が、pH7.0〜pH8.0のpH範囲を有する1xPBSまたは1xハンクス緩衝塩類溶液を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
(c)において、前記前駆細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種する、請求項13〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記神経前駆細胞をさらに分化させてニューロン、星状細胞、および/またはオリゴデンドロサイトを形成させる、請求項13〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
内胚葉性前駆細胞および/または中胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が290〜340mOsm/kgである、請求項3〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地の重量オスモル濃度が320〜340mOsm/kgである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
以下の工程を含む、単一の中胚葉性前駆細胞および/または内胚葉性前駆細胞を、重量オスモル濃度320〜340mOsm/kgの培養培地中で少なくとも3継代にわたって維持する方法:
(a)請求項19または20記載の方法に従って中胚葉性前駆細胞および/または内胚葉性前駆細胞を作製する工程;
(b)付着培養物から該中胚葉性前駆細胞および/または該内胚葉性前駆細胞を解離する工程;
(c)該前駆細胞を播種する工程;ならびに
(d)該前駆細胞を培養する工程。
【請求項２２】
(c)において、前記前駆細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記中胚葉性前駆細胞および前記内胚葉性前駆細胞をさらに分化させて間葉系幹細胞、軟骨細胞、心筋細胞、造血幹細胞、骨格筋細胞、膵細胞、または肝細胞を形成させる、請求項21または22記載の方法。
【請求項２４】
以下の工程を含む、胚葉細胞をスクリーニングする方法:
(a)請求項1から12のいずれか一項記載の方法に従って、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性の胚葉細胞の培養物を調製する工程;
(b)該胚葉細胞を1種または複数種の試験剤で処理する工程;および
(c)処理された胚葉細胞を分析に供する工程。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
[本発明1001]
以下の工程を含む、胚葉前駆細胞の集団を作製する方法:
(a)多能性幹細胞を解離してクラスターまたは単一細胞にする工程;
(b)(a)由来の解離細胞を、重量オスモル濃度260〜340mOsm/kgの培養培地中で培養する工程;および
(c)(b)の細胞を解離し、該細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種し、該培養培地中で少なくとも1日培養して、胚葉前駆細胞を作製する工程。
[本発明1002]
(b)が、(a)由来の解離細胞をマイクロウェル装置内で約24時間培養して、凝集物を形成させる工程、および該マイクロウェル装置内での培養を24時間超にわたり前記培養培地中で続け、次に、該凝集物を遊離させ、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記凝集物を最大11日間マイクロウェル中で培養した後に、遊離させ、前記コーティングされた培養ディッシュの上に付着させる、本発明1002の方法。
[本発明1004]
(b)が、(a)由来の解離細胞を前記マイクロウェル装置内で前記培養培地中で約24時間培養して、凝集物を形成させる工程、該凝集物を該マイクロウェル装置から遊離させ、次に該遊離させた凝集物を該培養培地中で少なくとも1日懸濁培養する工程、該凝集物を解離し、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記凝集物が胚様体を含む、本発明1002〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
前記胚様体が500〜20,000個の細胞を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
(b)が、(a)由来の解離細胞を該培養培地中で少なくとも1日懸濁培養し、次に該細胞を解離し、コーティングされた培養ディッシュの上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも1日培養する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
(b)が、(a)由来の解離細胞をコーティングされた培養ディッシュまたはフィーダー上に付着させ、かつ該培養培地中で少なくとも3日間培養する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記培養培地がダルベッコ最小必須培地を含み、かつ、ビタミン類、微量元素類、セレン、インシュリン、脂質、β-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、抗生物質、bFGF、B27、N2、またはこれらの混合物をさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記多能性幹細胞が哺乳動物多能性幹細胞である、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞または胚性幹細胞である、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記胚葉が、外胚葉性、内胚葉性、および/または中胚葉性である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
外胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が260〜280mOsm/kgである、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1015]
外胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が270〜320mOsm/kgである、本発明1008の方法。
[本発明1016]
以下の工程を含む、単一の神経前駆細胞を、重量オスモル濃度260〜340mOsm/kgの培養培地中で維持する方法:
本発明1014または1015の方法に従って外胚葉性前駆細胞を作製する工程;
付着培養物から該外胚葉性前駆細胞を解離する工程;
該前駆細胞を該培養培地中に播種して少なくとも1日培養する工程。
[本発明1017]
前記重量オスモル濃度が約270mOsm/kgである、本発明1016の方法。
[本発明1018]
Ca2+およびMg2+フリーの緩衝液を含む緩衝溶液を用いて、前記細胞を解離する、本発明1016または1017の方法。
[本発明1019]
Ca2+およびMg2+フリーの緩衝液が、pH7.0〜pH8.0のpH範囲を有する1xPBSまたは1xハンクス緩衝塩類溶液を含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記前駆細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種する、本発明1016〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記細胞を、少なくとも3継代にわたって培養状態で増殖させかつ維持する、本発明1016〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上で増殖させかつ維持する、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記神経前駆細胞をさらに分化させてニューロン、星状細胞、および/またはオリゴデンドロサイトを形成させる、本発明1016〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
内胚葉性前駆細胞および/または中胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が290〜340mOsm/kgである、本発明1002〜1007のいずれかの方法。
[本発明1025]
内胚葉性前駆細胞および/または中胚葉性前駆細胞を誘導する場合の前記培養培地の重量オスモル濃度が320〜340mOsm/kgである、本発明1008の方法。
[本発明1026]
以下の工程を含む、単一の中胚葉性前駆細胞および/または内胚葉性前駆細胞を、重量オスモル濃度320〜340mOsm/kgの培養培地中で維持する方法:
本発明1024または1025の方法に従って中胚葉性前駆細胞および/または内胚葉性前駆細胞を作製する工程;
付着培養物から該中胚葉性前駆細胞および/または該内胚葉性前駆細胞を解離する工程;ならびに
該前駆細胞を播種および培養する工程。
[本発明1027]
前記前駆細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上に播種する、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記細胞を、少なくとも3継代にわたって培養状態で増殖させかつ維持する、本発明1026または1027の方法。
[本発明1029]
前記細胞を、コーティングされた培養ディッシュの上で増殖させかつ維持する、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記中胚葉性前駆細胞および前記内胚葉性前駆細胞をさらに分化させて間葉系幹細胞、軟骨細胞、心筋細胞、造血幹細胞、骨格筋細胞、膵細胞、または肝細胞を形成させる、本発明1026〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
以下の工程を含む、胚葉細胞をスクリーニングする方法:
(a)本発明1001から1013のいずれかの方法に従って、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性の胚葉細胞の培養物を調製する工程;
(b)該胚葉細胞を1種または複数種の試験剤で処理する工程;および
(c)処理された胚葉細胞を分析に供する工程。
[本発明1032]
以下の工程を含む、神経前駆細胞をスクリーニングする方法:
(a)本発明1016〜1022のいずれかの方法に従って、神経前駆細胞の培養物を調製する工程;
(b)神経前駆細胞を1種または複数種の試験剤で処理する工程;および
(c)処理された神経前駆細胞を分析に供する工程。
[本発明1033]
多能性幹細胞から作製された凝集物またはクラスターから外胚葉性胚葉前駆細胞を誘導するのに使用するための、260〜280mOsm/kgの重量オスモル濃度を含む培養培地。
[本発明1034]
付着培養物から外胚葉性胚葉前駆細胞を誘導するのに使用するための、270〜320mOsm/kgの重量オスモル濃度を含む培養培地。
[本発明1035]
凝集物または胚様体から中胚葉性胚葉前駆細胞および/または内胚葉性胚葉前駆細胞を誘導するのに使用するための、320mOsm/kg超の重量オスモル濃度を含む培養培地。
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の実施例は本開示の好ましい態様を示しているが、この詳細な説明から本開示の精神および範囲の中で様々な変更および修正が当業者に明らかになるので、例示にすぎないことが理解されるはずである。