【手続補正書】
【提出日】平成25年1月22日(2013.1.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、ＴｏｌＢ、ＣｕｐＣ２、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）、メチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）、及びＢｃｅ分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列を含む、単離核酸分子であって、前記核酸分子が、
ａ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、１９、２１、２３又は７のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２０、２２、２４又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、核酸分子。
【請求項２】
ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、ＴｏｌＢ、ＣｕｐＣ２、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）、メチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）、及びＢｃｅ分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列であって、その分泌シグナルコード配列が、
ａ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、１９、２１、２３又は７のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２０、２２、２４又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、分泌シグナルコード配列を含む、ベクター。
【請求項３】
ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、ＴｏｌＢ、ＣｕｐＣ２、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）、メチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）、及びＢｃｅ分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列であって、その分泌シグナルコード配列が、
ａ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、１９、２１、２３又は７のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２０、２２、２４又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、分泌シグナルコード配列を含む、組換え細胞。
【請求項４】
ａ）宿主細胞；及び
ｂ）ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、ＴｏｌＢ、ＣｕｐＣ２、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）、メチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）、及びＢｃｅ分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列であって、その分泌シグナルコード配列が、
ａ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、１９、２１、２３又は７のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２０、２２、２４又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、分泌シグナルコード配列に作動可能に連結された対象タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター
を含む、対象タンパク質又はポリペプチドの発現のための発現系。
【請求項５】
ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、ＴｏｌＢ、ＣｕｐＣ２、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）、メチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）、及びＢｃｅ分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列であって、その分泌シグナルコード配列が、
ａ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、１９、２１、２３又は７のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２０、２２、２４又は８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：１５、１７、３、５、９、１１、１、４９、１３、２１、２３又は７のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：１６、１８、４、６、１０、１２、２、５０、１４、２２、２４又は８から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、分泌シグナルコード配列に作動可能に連結された対象タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを含有する宿主細胞を提供することを含む、宿主細胞における組換えタンパク質の発現のための方法。
【請求項６】
前記核酸分子が、その核酸分子を発現するために選択された宿主生物のコドン選択を反映するように調整されている、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、ベクター、細胞、発現系又は方法。
【請求項７】
前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記対象タンパク質又はポリペプチドが発現される宿主生物に対してネイティブである、請求項４又は５に記載の発現系又は方法。
【請求項８】
前記対象タンパク質又はポリペプチドがシュードモナスの種に対してネイティブである、請求項４又は５に記載の発現系又は方法。
【請求項９】
前記対象タンパク質又はポリペプチドがシュードモナスフルオレッセンスに対してネイティブである、請求項４又は５に記載の発現系又は方法。
【請求項１０】
前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記対象タンパク質又はポリペプチドが発現される宿主生物に対してネイティブではないタンパク質又はポリペプチドから得られる、請求項４又は５に記載の発現系又は方法。
【請求項１１】
プロモーターをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、ベクター、細胞、発現系又は方法。
【請求項１２】
前記分泌シグナルコード配列が発現ベクター内にある、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、ベクター、細胞、発現系又は方法。
【請求項１３】
前記分泌シグナルコード配列が、対象タンパク質又はポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、ベクター、細胞、発現系又は方法。
【請求項１４】
前記細胞が、前記分泌シグナルポリペプチドに作動可能に連結された前記対象タンパク質又はポリペプチドを発現する、請求項４、５又は１３に記載の細胞、発現系又は方法。
【請求項１５】
前記タンパク質又はポリペプチドが前記細胞のペリプラズム画分において発現される、請求項４、５又は１３に記載の細胞、発現系又は方法。
【請求項１６】
前記細胞内の酵素が、前記対象タンパク質又はポリペプチドから前記分泌シグナルポリペプチドを切断する、請求項４、５又は１３に記載の細胞、発現系又は方法。
【請求項１７】
前記対象タンパク質又はポリペプチドが前記細胞のペリプラズム画分において発現される、請求項４、５又は１３に記載の細胞、発現系又は方法。
【請求項１８】
前記細胞を高細胞密度で増殖させる、請求項３、４又は５に記載の細胞、発現系又は方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
前記発明を、理解の明瞭さのために説明及び例としてある程度詳細に記述したが、ある
種の変更及び修正が付属の特許請求の範囲内で実施され得ることは明白である。
上記の説明により、例えば本願発明として以下の発明が提供される。
［１］  タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）及びメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列を含む、単離核酸分子。
［２］  前記核酸分子が、
ａ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、［１］に記載の核酸分子。
［３］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６０℃〜約７０℃の温度を含む、［２］に記載の核酸分子。
［４］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６８℃の温度を含む、［２］又は［３］に記載の核酸分子。
［５］  前記核酸分子が、核酸分子を発現するために選択された宿主生物のコドン選択を反映するように調整されている、［１］に記載の核酸分子。
［６］  タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）又はメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列を含む、ベクター。
［７］  前記核酸分子が、
ａ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、［６］に記載のベクター。
［８］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６０℃〜約７０℃の温度を含む、［７］に記載のベクター。
［９］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６８℃の温度を含む、［７］又は［８］に記載のベクター。
［１０］  前記核酸分子が、核酸分子を発現するために選択された宿主生物のコドン選択を反映するように調整されている、［６］に記載のベクター。
［１１］  前記分泌シグナルコード配列が、対象タンパク質又はポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている、［６］に記載のベクター。
［１２］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記対象タンパク質又はポリペプチドが発現される宿主生物に対してネイティブである、［１１］に記載のベクター。
［１３］  前記対象タンパク質又はポリペプチドがＰ．フルオレッセンスに対してネイティブである、［６］に記載のベクター。
［１４］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記対象タンパク質又はポリペプチドが発現される宿主生物に対してネイティブではないタンパク質又はポリペプチドに由来する、［１１］に記載のベクター。
［１５］  前記対象タンパク質又はポリペプチドがシュードモナスではない生物に由来する、［１１］に記載のベクター。
［１６］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが真核生物に由来する、［６］に記載のベクター。
［１７］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが哺乳類生物に由来する、［１６］に記載のベクター。
［１８］  シグナルポリペプチド配列と前記対象タンパク質又はポリペプチド配列との間に連結配列をさらに含む、［６］に記載のベクター。
［１９］  前記連結配列がシグナルペプチダーゼによって切断可能である、［１９］に記載のベクター。
［２０］  前記対象タンパク質又はポリペプチド配列が２番目のシグナル配列に作動可能に連結されている、［６］に記載のベクター。
［２１］  前記２番目のシグナル配列が、外膜分泌シグナルを標的する配列を含む、［２０］に記載のベクター。
［２２］  前記ベクターがプロモーターをさらに含む、［６］に記載のベクター。
［２３］  前記プロモーターが細菌宿主細胞に対してネイティブである、［２２］に記載のベクター。
［２４］  前記プロモーターが細菌宿主細胞に対してネイティブではない、［２２］に記載のベクター。
［２５］  前記プロモーターが大腸菌に対してネイティブである、［２３］に記載のベクター。
［２６］  前記プロモーターが誘導的プロモーターである、［２２］に記載のベクター。
［２７］  前記プロモーターがｌａｃプロモーター又はｌａｃプロモーターの誘導体である、［２２］に記載のベクター。
［２８］  タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）及びメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドについての分泌シグナルコード配列を含む、組換え細胞。
［２９］  前記コード配列が、
ａ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される、［２８］に記載の組換え細胞。
［３０］  分泌シグナルコード配列が発現ベクター内にある、［２８］に記載の細胞。
［３１］  前記分泌シグナルコード配列が、対象タンパク質又はポリペプチドをコードする配列に作動可能に連結されている、［２８］に記載の細胞。
［３２］  細胞が、分泌シグナルポリペプチドに作動可能に連結された前記対象タンパク質又はポリペプチドを発現する、［３１］に記載の細胞。
［３３］  前記タンパク質又はポリペプチドが細胞のペリプラズム画分（periplasmic compartment）において発現される、［３２に記載の細胞。
［３４］  前記細胞内の酵素が、前記対象タンパク質又はポリペプチドから前記分泌シグナルポリペプチドを切断する、［３２］に記載の細胞。
［３５］  前記細胞が細菌宿主に由来する、［２８］に記載の細胞。
［３６］  前記宿主がシュードモナスである、［３５］に記載の細胞。
［３７］  前記宿主がＰ・フルオレッセンスである、［３６］に記載の細胞。
［３８］  前記宿主が大腸菌である、［３５］に記載の細胞。
［３９］  タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）及びメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌ポリペプチドを含む、単離ポリペプチド。
［４０］  前記ポリペプチドが、
ａ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
ｃ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、分泌シグナルポリペプチドであるポリペプチド；
ｄ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、分泌シグナルポリペプチドであるポリペプチド；
ｅ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドであって、分泌シグナルポリペプチドであるポリペプチド；及び
ｅ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド
から成る群より選択される、［３９］に記載の単離ポリペプチド。
［４１］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６０℃〜約７０℃の温度を含む、［４０］に記載の核酸分子。
［４２］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６８℃の温度を含む、［３９］に記載の核酸分子。
［４３］  前記分泌シグナルポリペプチドが対象タンパク質又はポリペプチドに作動可能に連結されている、［３９］に記載のポリペプチド。
［４４］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが、Ｐ．フルオレッセンス生物ではない生物に由来する、［４３］に記載のポリペプチド。
［４５］  ａ）宿主細胞；及び
ｂ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）及びメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌シグナルポリペプチドに作動可能に連結された対象タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター
を含む、対象タンパク質又はポリペプチドの発現のための発現系。
［４６］  前記分泌シグナルポリペプチドが、
ａ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される核酸分子によってコードされる、［４５］に記載の発現系。
［４７］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６０℃〜約７０℃の温度を含む、［４６］に記載の発現系。
［４８］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６８℃の温度を含む、［４６］に記載の発現系。
［４９］  前記宿主細胞が、前記分泌シグナルポリペプチドに作動可能に連結された前記対象タンパク質又はポリペプチドを発現する、［４５］に記載の発現系。
［５０］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが細胞のペリプラズム画分において発現される、［４９］に記載の発現系。
［５１］  前記細胞内の酵素が、前記対象タンパク質又はポリペプチドから前記シグナルポリペプチドを切断する、［４９］に記載の発現系。
［５２］  前記細胞が細菌宿主に由来する、［４５］に記載の発現系。
［５３］  前記宿主がシュードモナスである、［４５］に記載の発現系。
［５４］  前記宿主がＰ・フルオレッセンスである、［５３］に記載の発現系。
［５５］  前記宿主が大腸菌である、［５２］に記載の発現系。
［５６］  発酵培地をさらに含む、［４５］に記載の発現系。
［５７］  前記発酵培地が化学誘導物質を含む、［５６］に記載の発現系。
［５８］  タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＣ（ｄｓｂＣ）、突然変異型リン酸結合タンパク質（ｐｂｐ＊）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ（ｄｓｂＡ）、Ｂｃｅ、ＣｕｐＡ２、ＣｕｐＢ２、ＣｕｐＣ２、ＮｉｋＡ、ＦｌｇＩ、テトラトリコペプチドリピートファミリータンパク質（ＯＲＦ５５５０）、トルエン耐性タンパク質（Ｔｔｇ２Ｃ）及びメチル基受容走化性タンパク質（ＯＲＦ８１２４）分泌ポリペプチドから成る群より選択される分泌シグナルポリペプチドに作動可能に連結された対象タンパク質又はポリペプチドをコードするベクターを含有する宿主細胞を提供することを含む、宿主細胞における組換えタンパク質の発現のための方法。
［５９］  前記分泌シグナルポリペプチドが、
ａ）配列番号：５、１、３、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１又は２３のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７、２１又は２３のヌクレオチド配列に少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が分泌ポリペプチドをコードする、核酸分子；
ｃ）配列番号：６、２、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のアミノ酸配列を含むポリポリペプチドをコードする核酸分子；
ｄ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８、２２又は２４のアミノ酸配列に少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｅ）配列番号：２０のアミノ酸配列に少なくとも９６％のアミノ酸配列同一性を有するポリポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記ポリポリペプチドが分泌ポリペプチドである、核酸分子；
ｆ）配列番号：５、３、７、９、１１、１３、１５、１７又は２１のヌクレオチド配列の実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
ｇ）配列番号：６、４、８、１０、１２、１４、１６、１８及び２２から成る群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、実質的に全長にわたってストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
から成る群より選択される核酸分子によってコードされる、［５８］に記載の方法。
［６０］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６０℃〜約７０℃の温度を含む、［５９］に記載の発現系。
［６１］  前記ハイブリダイゼーション条件が約６８℃の温度を含む、［５９］に記載の発現系。
［６２］  前記細胞を無機塩培地で増殖させる、［５８］に記載の方法。
［６３］  前記細胞を高細胞密度で増殖させる、［５８］に記載の方法。
［６４］  前記細胞を少なくとも２０ｇ／Ｌの細胞密度で増殖させる、［６３］に記載の方法。
［６５］  前記組換えタンパク質を精製することをさらに含む、［５８］に記載の方法。
［６６］  前記組換えタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製する、［６５］に記載の方法。
［６７］  前記対象タンパク質又はポリペプチドと前記分泌シグナルポリペプチドの作動可能な連結が、前記宿主細胞に対してネイティブな酵素によって切断され得る、［５８］に記載の方法。
［６８］  前記分泌シグナルポリペプチドが発現の間に前記対象タンパク質又はポリペプチドから切断される、［６７］に記載の方法。
［６９］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記宿主細胞が由来する生物に対してネイティブである、［５８］に記載の方法。
［７０］  前記対象タンパク質又はポリペプチドがＰ．フルオレッセンス生物に対してネイティブである、［５８］に記載の方法。
［７１］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが、前記宿主細胞が由来する生物に対してネイティブではない、［５８］に記載の方法。
［７２］  前記対象タンパク質又はポリペプチドがシュードモナスではない生物に由来する、［５８］に記載の方法。
［７３］  前記対象タンパク質又はポリペプチドが真核生物に由来する、［５８］に記載の方法。
［７４］  前記組換えタンパク質が、少なくとも２個のシステイン残基を有する配列を含む、［５８に記載の方法。
［７５］
少なくとも１つのジスルフィド結合が、前記細胞における前記組換えタンパク質内で形成される、［５８］に記載の方法。
［７６］  前記シグナルポリペプチド配列と前記対象タンパク質又はポリペプチドの配列との間に連結配列をさらに含む、［５８］に記載の方法。
［７７］  前記対象タンパク質又はポリペプチドの少なくとも５０％がネイティブアミノ末端を含む、［６９］に記載の方法。
［７８］  前記対象タンパク質又はポリペプチドの少なくとも８０％がネイティブアミノ末端を含む、［７７］に記載の方法。
［７９］  前記対象タンパク質又はポリペプチドの少なくとも９０％がネイティブアミノ末端を含む、［７８］に記載の方法。
［８０］  前記組換えタンパク質の少なくとも５０％が活性である、［５８］に記載の方法。
［８１］  前記組換えタンパク質の少なくとも８０％が活性である、［８０］に記載の方法。
［８２］  前記組換えタンパク質の少なくとも５０％がペリプラズム画分において発現される、［５８］に記載の方法。
［８３］  前記組換えタンパク質の少なくとも７５％がペリプラズム画分において発現される、［８２］に記載の方法。
［８４］  前記組換えタンパク質の少なくとも９０％がペリプラズム画分において発現される、［８３］に記載の方法。
［８５］  前記宿主細胞がシュードモナス細胞である、［５８］に記載の方法。
［８６］  前記細胞がＰ．フルオレッセンス細胞である、［８５］に記載の方法。
［８７］  前記細胞が大腸菌細胞である、［５８］に記載の方法。