【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年9月13日(2013.9.13)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号：１に９５％以上同一であるヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列；または
（ｂ）配列番号：４のポリペプチドおよび配列番号：５のポリペプチドをコードする配列
を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号：１のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号：４のポリペプチドおよび配列番号：５のポリペプチドをコードする配列が、単一のプロモーター領域をさらに含むものである、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号：２のヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項２に記載の核酸分子を含む、プラスミド。
【請求項６】
請求項５に記載のプラスミドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエチオキシ））カルボキシル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸（式Ｉ）：
【化１】
2012523235.tif 000001
（Ｉ）
の生成方法であって、
前記方法が、
（ａ）請求項７に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養して、配列番号：１の核酸分子によってコードされるポリペプチドを発現させ；
（ｂ）前記ポリペプチドを含む酵素濃縮物を部分的に精製し；次いで
（ｃ）培養単離物を、一定量の３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸（式ＩＩ）：
【化２】
2012523235.tif 000002
（ＩＩ）
と、（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸（式ＩＩＩ）：
【化３】
2012523235.tif 000003
（ＩＩＩ）
の生成を可能にする条件下で接触させ；次いで
（ｄ）前記（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸を一定量の二炭酸−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルと、（αＳ）−α−［［（１，１−ジメチルエチオキシ）カルボキシル］−アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸の生成を可能にする条件下で接触させること
を特徴とする方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００３】
本発明は、核酸分子、プラスミド（例えば、二シストロン性プラスミド）、宿主細胞およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）および改変フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨｍｏｄ）の発現に用いられる方法に関する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
酵素であるギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）（例えば、Pichia pastoris（ATCC 20864）に由来する）およびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）（例えば、Thermoactinomyces intermedius（ATCC 33205））の組み換え発現は、３−ヒドロキシ−α−オキソトリシクロ−［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸の（αＳ）−α−アミノ−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸への生体内変換、続いてＤＰＰＩＶ阻害剤であるサクサグリプチンの合成における出発物質である（αＳ）−α−［［（１，１ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］−３−ヒドロキシトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−酢酸への化学的な変換に用いることができる。これまでの試みは、発現を駆動させるための２つの同一のタンデムプロモーター（各酵素に対して１つのプロモーター）を含む単一プラスミドを用いてＦＤＨおよびＰＤＨを発現させるものであり、成功したものは限られていた。特に、これらまでの試みでは、細菌細胞の２種類の異なる集団：１つは、無傷（intact）のプラスミドであり、もう１つはＦＤＨ遺伝子を含むプラスミドの一部が改変されていた（短縮化されていた）可能性があるものを保有する細菌培養物を生じていた可能性がある。このプラスミドの改変は、各細胞世代で増えている可能性が高い。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
１の態様において、本開示は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の部分的に精製された酵素濃縮物を調製する方法であって、前記方法が上記の核酸分子またはプラスミドを含む細胞を含有する発酵ブロスを調製することを特徴とするものである方法に関する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
【図１】二シストロン性ＦＤＨ／ＰＤＨｍｏｄプラスミドの図を示す。
【図２】ＦＤＨ／ＰＤＨｍｏｄ二シストロン性プラスミドの核酸配列（配列番号：２）を示す。ＦＤＨ（配列番号：８）、リボソーム結合部位（配列番号：３）およびＰＤＨｍｏｄ（配列番号：９）をコードする領域は、太字で下線を引いている（配列番号：１）。
【図３】二シストロン性ＦＤＨ／ＰＤＨｍｏｄプラスミドのＥｃｏＲＩ制限酵素消化の結果を示す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２３】
（発明の詳細な説明）
一般的に、本開示は、核酸分子、プラスミド、ベクター、宿主細胞、および所望の化合物（例えば、ＤＰＰＩＶ阻害剤であるサクサグリプチンのような薬物）の生成時において化学分子の有用な合成前駆体分子および／または中間体への生体内変換を提供する方法に関する。核酸分子は、発現ベクターまたはプラスミドなどのベクターに組み込むことができ、宿主細胞（例えば、細菌細胞）内で遺伝学的に安定な組み換え構築物を提供する。前記細胞およびプラスミドは、ギ酸デヒドロゲナーゼおよびフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ活性を含む方法での用途が見出された。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
用語「ギ酸デヒドロゲナーゼ」または「ＦＤＨ」は、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質、ならびにその酵素学的に活性なフラグメントおよび変異体を意味する。ＦＤＨの非限定的な例には、ギ酸デヒドロゲナーゼ活性を有する配列番号：４、ならびに配列番号：４の酵素学的に活性なフラグメントおよび変異体が含まれる。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
１の態様において、本開示は、配列番号：１、または機能的なギ酸デヒドロゲナーゼおよび機能的なフェニルアラニンデヒドロゲナーゼをコードする配列を含む単離された核酸分子を提供する。具体例において、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）には、特定の種に由来するＦＤＨ配列またはその機能的なフラグメントが含まれうる。具体例において、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）は、特定の種に由来するＰＤＨ配列またはその機能的なフラグメントであり得る。１の具体例において、ＦＤＨ配列には、配列番号：４、またはその機能的なフラグメントもしくは変異体が含まれる。１の具体例において、ＰＤＨ配列には、配列番号：５、またはその機能的なフラグメントもしくは変異体が含まれる。１の具体例において、核酸分子には、配列番号：１のヌクレオチド配列が含まれる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５６】
１の態様において、本開示は、二シストロン性プラスミドを含む単離された宿主細胞であって、前記プラスミドがＦＤＨおよびＰＤＨｍｏｄをコードするものである細胞を提供する。宿主細胞は、適当な宿主細胞であり得、所望される適用（例えば、増幅および／またはポリペプチド発現のため）に基づいて当業者によって選択することができる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
１の具体例において、本開示は、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）およびギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）の部分的に精製した酵素濃縮物を調製する方法であって、前記方法が、本明細書に記載される核酸分子またはプラスミドを含有する細胞を含む発酵ブロスを調製し；前記発酵ブロスを、約４℃から３０℃の間で前記発酵ブロスの温度を維持しながらマイクロ流体化して、ＰＤＨおよびＦＤＨを含有するマイクロ流体化したブロスを形成させ；このマイクロ流体化させたブロスを、凝集剤で処理して、細胞残屑を凝固させ、ＤＮＡおよび不要なタンパク質を取り除くことによって浄化し、これにより浄化されたブロスを形成させ；浄化されたブロスをろ過してろ液を得て；次いで、場合により、前記ろ液を濃縮して、前記部分的に精製された酵素濃縮物を得て、前記濃縮物が、約４００ＩＵ／ｍｌから約１０００ＩＵ／ｍｌのＰＤＨ活性および約２０ＩＵ／ｍｌから約２００ＩＵ／ｍｌのＦＤＨ活性を含むものであることを特徴とする方法を提供する。具体例において、酵素濃縮物は、ケト含有化合物をキラルアミン含有化合物に還元的にアミノ化することができ、前記キラルアミン含有化合物は、酵素濃縮物から単離することなく、ＢＯＣ保護することができる。具体例において、浄化は、場合により、前記マイクロ流体化されたブロスを珪藻土と接触させることを含むことができ、前記ろ過は、珪藻土をフィルタープレスでろ過することを含む。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１０６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１０６】
１の態様において、本開示は、サクサグリプチン前駆体を生成する方法であって、本明細書に記載される核酸分子および／またはプラスミド（例えば、二シストロン性プラスミド）を含む宿主細胞を適当な条件下で培養して、ＦＤＨおよびＰＤＨｍｏｄを発現させ；前記ポリペプチドを前記培養物から単離し；次いで、単離されたポリペプチドを還元アミノ化反応に用いることを特徴とする方法に関する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１４】
プラスミドＤＮＡはダイデオキシターミネーター化学（ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（登録商標））を用いて配列決定した。プライマーは、全ての挿入ＰＣＲフラグメント（ＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩフラグメント）および消化したベクター配列との接合部を配列決定するように設計した。ＦＤＨ遺伝子の終結部分とＰＤＨｍｏｄ配列の開始部分の間の遺伝子間配列は、予想どおりであった。二シストロン性ＦＤＨ／ＰＤＨｍｏｄプラスミドを大腸菌発現宿主ＪＭ１１０に形質転換させた。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１５】
実施例２：二シストロン性ＦＤＨ／ＰＤＨｍｏｄプラスミドの安定性の確認
二シストロン性プラスミドで形質転換した大腸菌宿主ＪＭ１１０の凍結バイアルの１つを、氷上で融解し、１００μＬを３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地２０ｍＬに接種し、２５０ｒｐｍで３０℃にて終夜インキュベートした。培養液を新たな２０ｍＬ体積のＬＢ＋３０μｇ／ｍＬのカナマイシンにさらに９回移し、２５０ｒｐｍで３０℃にて８〜２０時間インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ｍｉｄｉプラスミドキットを用いて、最終２０ｍＬの培養液から単離した。前記プラスミドをＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、アガロースゲルで解析した（図３）。６と７ｋｂ分子量マーカーの間で単一バンドが観察され、無傷（intact）の直線化されたプラスミドの期待されたサイズであった。ゲル上に他のバンドが見られなかったことから、プラスミドが遺伝学的に安定であることが示された。