【手続補正書】
【提出日】平成25年6月21日(2013.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【図１】Ａ．同じ希釈度での複合体の直接測定例を表す（材料と方法を参照）。Ｂ．装置制限のために行うことができない、異なる希釈度での複合体の直接測定例を表す（材料と方法を参照）。Ｃ．異なる希釈度での複合体の直接測定例および装置制限の数学的克服を表す（材料と方法を参照）。
【図２Ａ】図２Ａ−１は、抗原ＬＤＰｅ０５１、ＬＤＰｅ０６４、ＬＤＰｅ０６９、およびＬＤＰｅ０７０に対して抗体のＣＴ１の三つの希釈物をプロットしたグラフを表す。図２Ａ−２は、抗原ＬＤＰｅ０５１、ＬＤＰｅ０６４、ＬＤＰｅ０６９、およびＬＤＰｅ０７０に対して抗体のＣＴ２の三つの希釈物をプロットしたグラフを表す。
【図２Ｂ】ＯＣ（卵巣癌）、ＣＴ（健常対照）およびＢＣ（乳癌）についてのＬＤＰｅ０５１とＬＤＰｅ０６９の計算比率（希釈番号２）を表す。
【図２Ｃ】表７−乳癌５１＿６９についてのＲＯＣ曲線の計算結果（実施例１）を表す。
【図２Ｄ】実施例１において示した結果の乳癌についてのＲＯＣ曲線−抗原ＬＤＰｅ０５１およびＬＤＰｅ０６９を表す。
【図２Ｅ】表８−卵巣癌５１＿６９についてのＲＯＣ曲線の計算結果（実施例１）を表す。
【図２Ｆ】卵巣癌の診断における抗原ＬＤＰｅ０５１およびＬＤＰｅ０６９についてのＲＯＣ曲線を表す。
【図２Ｇ】ＯＣ（卵巣癌）、ＣＴ（健常対照）およびＢＣ（乳癌）についてのＬＤＰｅ０６４とＬＤＰｅ０７０の計算比率（希釈番号２）を表す。
【図２Ｈ】表９−卵巣癌６４＿７０についてのＲＯＣ曲線の計算結果（実施例１）を表す。
【図２Ｉ】卵巣癌の診断における抗原ＬＤＰｅ０６４およびＬＤＰｅ０７０についてのＲＯＣ曲線を表す。
【図２Ｊ】表１０−乳癌６４＿７０についてのＲＯＣ曲線の計算結果（実施例１）を表す。
【図２Ｋ】乳癌の診断における抗原ＬＤＰｅ０６４およびＬＤＰｅ０７０についてのＲＯＣ曲線を表す。
【図３】様々な抗原組に関する結果の解析例（Ａ：配列番号１８および配列番号２０、Ｂ：配列番号１９および配列番号２０、Ｃ：配列番号１および配列番号２、Ｄ：配列番号１および配列番号２０、Ｅ：配列番号２および配列番号５、Ｆ：配列番号４および配列番号１７、Ｇ：配列番号５および配列番号１７、Ｈ：配列番号３および配列番号１７、Ｉ：配列番号５および配列番号１９）を表す。
【図４】図４Ａ−４種の抗原に対して得られた抗原−自己抗体複合体レベル測定値を示している（検査１１３９）。それらの測定値は同一の希釈率系列により得た、図４Ｂ−検査１１３９の４種の抗原に対して得られた平滑化測定値を表し、図４Ｃ−その４種の抗原に対して得られた抗原−自己抗体複合体レベル測定値を表す（検査１１３９）。それらの測定値は各抗原に対して種々の希釈率により得た：Ａｇ１−１：８、Ａｇ２−１：３２、Ａｇ３−１：６４、Ａｇ４−１：５１２、図４Ｄ−検査１１３９に関してＡｇ１〜４に対して得られた平滑化結果を示している。各抗原に対してのサンプルの出発希釈はＡｇ１−１：８、Ａｇ２−１：３２、Ａｇ３−１：６４、Ａｇ４−１：５１２であった。
【図５】図５Ａ−４種の抗原に対して得られた抗原−自己抗体複合体レベル測定値を示している（検査１２００）、それらの測定値は同一の希釈率系列により得た、図５Ｂ−検査１２００の４種の抗原に対して得られた平滑化測定値を表し、図５Ｃ−その４種の抗原に対して得られた抗原−自己抗体複合体レベル測定値を表す（検査１２００）。それらの測定値は各抗原に対して種々の希釈率により得た：Ａｇ１−１：８、Ａｇ２−１：３２、Ａｇ３−１：６４、Ａｇ４−１：５１２、図５Ｄ−検査１２００に関してＡｇ１〜４に対して得られた平滑化結果を示している。各抗原に対してのサンプルの出発希釈はＡｇ１−１：８、Ａｇ２−１：３２、Ａｇ３−１：６４、Ａｇ４−１：５１２であった。
【図６】図６Ａ〜６Ｍ：図６Ａ−罹患／癌対象と健常対照の統計的分離を可能にする１４種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供し、図６Ｂ−１〜６Ｂ−３−表１７、各抗原および各サンプルの第１の希釈率またはポイントについてのｌｎ（ＯＤ）結果を詳述している。横行「０」は健常サンプルを表し、横行「１」は癌サンプルを表す、図６Ｃ−１３種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｄ−１２種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｅ−１１種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｆ−１０種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｇ−９種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｈ−８種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｉ−７種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｊ−６種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｋ−５種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｌ−４種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する、図６Ｍ−３種の抗原を含んでなるサブセットについてのＡＵＣを決定するＲＯＣ解析を提供する。図６Ｎ：７名の卵巣癌患者および１７名の健常対象で、ＬＤＰｅ００２およびＬＤＰｅ０９２について第１の最小希釈度（１：８）で得られた結果の二次元グラフを表す。図６Ｏ：７名の卵巣癌患者および１７名の健常対象で、ＬＤＰｅ００２およびＬＤＰｅ０９２について第１の最小希釈度（１：８）で図６Ｎにおいて得られ示した結果のＡＵＣ曲線を表す。図６Ｐ：１４名の卵巣癌患者および１４名の健常対象で、ＬＤＰｅ００１およびＬＤＰｅ０９２について第１の最小希釈度（１：８）で得られた結果の二次元グラフをを表す。図６Ｑ：１４名の卵巣癌患者および１４名の健常対象で、ＬＤＰｅ００１およびＬＤＰｅ０９２について第１の最小希釈度（１：８）で図６Ｐにおいて得られ示した結果のＡＵＣ曲線を表す。
【図７】癌の存在について評価中の診断対象への診断の割り当てに用いる、コンピュータにより実行される診断方法のフローチャートを表す。
【図８】癌の診断法のために作動する診断モニタリングシステムの概略ブロック図を表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本研究の目的では、限定されるわけではないが、本発明者らは、表１１、表３８に明記する複数の抗原（ペプチドを含む）を選択し、血漿サンプル中の対応する抗体の同定／検出にそれらを使用した。本明細書において、抗原という用語は、体内に導入されると免疫応答を促進しその免疫応答によって抗体生産をもたらすことができる任意の物質を意味すると解釈すべきである。ある特定の実施形態では、それらの抗原は、少なくとも２個以上のアミノ酸からなる腫瘍関連ペプチド、このような腫瘍関連ペプチドを含んでなるペプチドおよびタンパク質ならびにそれらの誘導体である。しかし、上記のように、抗原は必ずしも、ＴＡＡとして古典的に知られているものである必要はない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
本願では、配列番号１〜２６によって定義される特異的抗原（ＴＡＡ）を利用する（表３８で示されるとおりである）。本質的に、ＴＡＡおよびＴＡＡ認識抗体は、癌の診断のための重要なツールとして本明細書に記載する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
よって、本発明の抗原は、対象から得られた血漿サンプルにおける抗体の検出のために、それ自体をまたは診断用組成物中に含められた活性剤として使用した。特異的抗原が認識する抗体の検出は、そのサンプルを少なくとも２種の特異的抗原と（すなわち、本発明の抗原、例えば、配列番号１〜２６によって示される、表１、表５、表１１、および表３８に詳述する抗原と）接触させることによって達成される。好ましくは、それらの抗原は、約２．５〜２５０μｇ／ｍｌの濃度で使用される（ＥＬＩＳＡに基づく抗体検出アッセイの場合）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
腫瘍指標となる自己抗体の検出に必要な抗原は、その抗原として働くことができる、（腫瘍の）全細胞を含む、いくつかの形であり得る、細胞膜（その産物を抗原として使用することができる）、単離されたもしくは組換えにより生産された（それらのタンパク質は、通常、細胞、細菌、酵母、ファージを形質転換するためにベクターに挿入された構築物から作製される）、または合成的に生産された腫瘍関連タンパク質（またはそれらのフラグメント）。好適な腫瘍抗原の具体的な例は、本明細書において表１、表５、表１１、および表３８に詳述する抗原である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
ここで、本発明の実施形態に従う、コンピュータにより実行される診断方法１００を示す図７を参照する。この方法は、該診断対象の生体サンプルを所定の抗原セットと接触させて該サンプルの自己抗体と複合体を形成することによって得られる抗原−抗体複合体レベルを含んでなる測定データを受信することを含み、ここで、該抗原は各々、癌の存在に対する該所定の相対的寄与因子によって特徴付けられる。その生体サンプルは、血漿サンプルまたは血清サンプルであってもよい。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
本発明はさらに、図８に示すように、癌の診断法のために作動する診断モニタリングシステム２００を提供する。癌は、乳癌または卵巣癌のいずれかであってよい。他の実施形態では、癌は、結腸癌、肺癌、または前立腺癌である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
プレートを０．１％ＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗ヒトＩｇ  ＨＲＰコンジュゲート（ブロッキングバッファーで１：５０００希釈したもの）を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。
プレートを０．０５％ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢＥを各ウェルに加えた。
３０分後０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて発色を止め、４５０ｎｍでＯＤを測定した。
二つの健常対照（ＣＴ１、ＣＴ２）について得られた結果のサンプルを表２および図２Ａ−１および図２Ａ−２に示している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
完全配列を表１１に示す。
健常個体（「真陰性」）と、例えば、生検により、乳癌であると明確に診断された個体（「真陽性」）由来の血液サンプルを採取し、血漿を得た。統計的評価に十分な数の陽性サンプルおよび陰性サンプルを集めた。各血漿サンプルについて、表５に列挙した抗原各々を用いて９つの異なるＥＬＩＳＡ試験を（実施例１に記載のとおり）行った。ＥＬＩＳＡの結果から、それらのサンプル各々における９種の抗原各々に対する自己抗体の実際のレベルを決定した。各個体についての総ての考えられる組合せの自己抗体レベル、２種の複合体間の比率を計算し、各抗原組に対する各個体の比率を収集し、それらの結果を、（実施例１の場合のように）公知の統計的方法によってＡＵＣについて解析した。総ての考えられる組合せを、計算したＡＵＣによりソートした。抗原組が高いＡＵＣ値を示すほど診断上の関連性が高くなるが、ＡＵＣ値が５０％に近い抗原組はそれほど重要ではない。表６から分かるように、（ＡＵＣによって）「良好な」組合せと、「不良の」組合せとが存在する。「良好な」対（陽性被験者と陰性被験者を所定の範囲で区別することができる比率、例えば、少なくとも８０％ＡＵＣ、をその間に有するような組）の選択には非常に多くの試験が必要となる場合がある。そのような試験は、本明細書において詳細に記載する方法に従う（例えば、上の実施例１を参照）が、日常的に行われている。最良の対を、指標となる／診断用抗原組として使用することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
第１の様式に戻り、図４Ａは、生体サンプルを総ての抗原に対して１：８で始める単一希釈率で希釈した場合の、検査１１３９についてＡｇ１〜Ａｇ４に対して得られた結果を示すグラフである。図４Ｂは、検査１１３９に関してＡｇ１〜Ａｇ４に対して得られた平滑化結果を示している。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
図５Ａは、生体サンプルを総ての抗原に対して１：８で始める単一希釈率で希釈した場合の、検査１２００についてＡｇ１〜Ａｇ４に対して得られた結果を示すグラフである。図５Ｂは、検査１２００についてＡｇ１〜Ａｇ４に対して得られた平滑化結果を示している。Ａｇ２、Ａｇ３およびＡｇ４は、十分なデータポイントがなかったため除いた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
図４Ｂでは、十分なデータポイントがなかったためＡｇ２およびＡｇ４を除いた。特に、抗原Ａｇ２およびＡｇ４では、ＯＤ＜２．５の測定ポイントが三つ以下存在するが、それでは高い確実性で線形回帰を得るのに十分ではない。表１４は、検査１１３９および検査１２００のＡｇ１〜Ａｇ４についての平滑化結果を示している。検査１１３９に関し、抗原Ａｇ２およびＡｇ４についての不十分なデータポイントは明らかである。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
検査１２００に関して、表１４は、Ａｇ２、Ａｇ３、およびＡｇ４に関しての不十分なデータポイントを示している。検査１２００について、未加工データを、表１２ならびに図５Ａおよび図５Ｂに記載している。Ａｇ２、Ａｇ３、およびＡｇ４では、（外れ値の排除後）ＯＤ＜２．５の測定値が三つ以下存在するが、それでは高い確実性で線形回帰を得るには不十分であった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
総ての抗原に対して同一の希釈率を使用する上での欠点を克服するために、生体サンプルを４つの異なる出発希釈に希釈した。Ａｇ１に対する出発希釈は１：８、Ａｇ２では１：３２、Ａｇ３では１：６４、Ａｇ４では１：５１２であった。未加工データは、表１３に要約し、検査１１３９については図４Ｃに、検査１２００については図５Ｃに要約する。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
表１５では、検査１１３９および検査１２００についての、抗原Ａｇ１、Ａｇ２、Ａｇ３およびＡｇ４に対する、異なる第１の希釈Ａｇ１−１：８、Ａｇ２−１：３２、Ａｇ３−１：６４、Ａｇ４−１：５１２での平滑化結果を示している。検査１１３９および検査１２００について、平滑化結果をそれぞれ図４Ｄおよび図５Ｄに説明する。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０２】
図４Ｄおよび図５Ｄから分かるように、第２の様式で行った検査では、完全な平滑化を行い、各抗原−抗体複合体について測定装置の線形範囲内にあるＯＤ読み取り値を得た。よって、これらの結果は、診断アルゴリズムおよび適用にさらに組み込むことができる。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
表１７（図６Ｂ１−６Ｂ３）では、各抗原および各サンプルの第１の希釈率についてのｌｎ（ＯＤ）結果を詳述している。列ｎｔｙｐｅの「０」は健常サンプルを表し、列ｎｔｙｐｅの「１」は癌サンプルを表している。上記のように、上の抗原組合せのロジスティック回帰を行い、図６Ａに示すように、ＲＯＣ解析により上のサンプルセットのＡＵＣを決定した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
特に、１３種の抗原を含んでなるサブセットの利用の結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９０９１であり（表１８、図６Ｃ）、１２種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．８７９４であり（表１９、図６Ｄ）、１１種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．８５７６であり（表２０、図６Ｅ）、１０種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９５４５であり（表２１、図６Ｆ）、９種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９５４５であり（表２２、図６Ｇ）、８種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９５４５であり（表２３、図６Ｈ）、７種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９５７７であり（表２４、図６Ｉ）、６種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．９０５３であり（表２５、図６Ｊ）、５種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．８８９２であり（表２６、図６Ｋ）、４種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．８９８９であり（表２７、図６Ｌ）、３種の抗原を含んでなるサブセットの結果、ＲＯＣ曲線下面積は０．８７９２であった（表２８、図６Ｍ）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
表２９では、各抗原に対する血漿サンプルの第１の希釈率をさらに示す。ｌｎ（ＯＤ）を計算し、各抗原に対する第１の希釈ＯＤを用いた。表３０では、各抗原および各サンプルの第１の希釈率についてのｌｎ（ＯＤ）結果を詳述している。ｎｔｙｐｅの「０」は健常サンプルを表し、ｎｔｙｐｅの「１」は患者サンプルを表している。計７名の患者と１７名の健常者を検査した。
上記のように、上の抗原組合せＬＤＰｅ００２（配列番号９）およびＬＤＰｅ０９２（配列番号１６）のロジスティック回帰を行い、図６Ｎに示すように、ＲＯＣ解析により上のサンプルセットのＡＵＣを決定した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５４】
図６Ｎは、７名の患者および１７名の健常対象で、ＬＤＰｅ００２およびＬＤＰｅ０９２について第１の最小希釈度で得られた結果を示しており、図６Ｏは、上のデータについてのＡＵＣ計算値を９０％として示している。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５５】
同一の手順を用いて、罹患／癌対象と健常対照の統計的分離を可能にするとしてさらなる抗原サブセットが確認された。
上記のように、上の抗原組合せＬＤＰｅ００１（配列番号８）およびＬＤＰｅ０９２（配列番号１６）のロジスティック回帰を行い、図６Ｐに示すように、ＲＯＣ解析により上のサンプルセットのＡＵＣを決定した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
図６Ｐは、１４名の患者および１４名の健常対象でＬＤＰｅ００１およびＬＤＰｅ０９２について第１の／最小希釈度で得られた結果を示す。
図６Ｑは、上のデータについてのＡＵＣ計算値を８５％として示す。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
この特定の相対的寄与因子と判別関数の使用の結果、表３７に示すように、乳房外科医による臨床的要求に厳密に従う、中感度（４４％）および高特異性（９１％）であった。
表１１
2012531581.tif 000001
表１１の続き
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表１１の続き
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表１１の続き
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表１１の続き
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表１１の続き
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表１１の続き
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表１１の続き
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表３８
2012531581.tif 000009
表３８の続き
2012531581.tif 000010
表３８の続き
2012531581.tif 000011
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2012531581000001.app
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2012531581.tif 000012
【図１Ｂ】
2012531581.tif 000013
【図１Ｃ】
2012531581.tif 000014
【図２Ａ−１】
2012531581.tif 000015
【図２Ａ−２】
2012531581.tif 000016
【図２Ｂ】
2012531581.tif 000017
【図２Ｃ】
2012531581.tif 000018
【図２Ｄ】
2012531581.tif 000019
【図２Ｅ】
2012531581.tif 000020
【図２Ｆ】
2012531581.tif 000021
【図２Ｇ】
2012531581.tif 000022
【図２Ｈ】
2012531581.tif 000023
【図２Ｉ】
2012531581.tif 000024
【図２Ｊ】
2012531581.tif 000025
【図２Ｋ】
2012531581.tif 000026
【図３Ａ】
2012531581.tif 000027
【図３Ｂ】
2012531581.tif 000028
【図３Ｃ】
2012531581.tif 000029
【図３Ｄ】
2012531581.tif 000030
【図３Ｅ】
2012531581.tif 000031
【図３Ｆ】
2012531581.tif 000032
【図３Ｇ】
2012531581.tif 000033
【図３Ｈ】
2012531581.tif 000034
【図３Ｉ】
2012531581.tif 000035
【図４Ａ】
2012531581.tif 000036
【図４Ｂ】
2012531581.tif 000037
【図４Ｃ】
2012531581.tif 000038
【図４Ｄ】
2012531581.tif 000039
【図５Ａ】
2012531581.tif 000040
【図５Ｂ】
2012531581.tif 000041
【図５Ｃ】
2012531581.tif 000042
【図５Ｄ】
2012531581.tif 000043
【図６Ａ】
2012531581.tif 000044
【図６Ｂ−１】
2012531581.tif 000045
【図６Ｂ−２】
2012531581.tif 000046
【図６Ｂ−３】
2012531581.tif 000047
【図６Ｃ】
2012531581.tif 000048
【図６Ｄ】
2012531581.tif 000049
【図６Ｅ】
2012531581.tif 000050
【図６Ｆ】
2012531581.tif 000051
【図６Ｇ】
2012531581.tif 000052
【図６Ｈ】
2012531581.tif 000053
【図６Ｉ】
2012531581.tif 000054
【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図７】
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【図８】
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