(57)【要約】【課題】  糖鎖プライマー伸長法等で得られた糖鎖化合物を経済的かつ工業的に濃縮および／または精製する方法を提供する。【解決手段】  動物細胞を糖鎖プライマー伸長法により所望の糖鎖化合物が細胞培養上清中に得られるような条件下で培養し、得られた培養上清に固体吸着剤を接触させる。ここでの固体吸着剤は、スチレン系合成吸着剤またはメタクリル系合成吸着剤である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物から糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法であって、
該細胞培養物または細胞培養物の上清と固体吸着剤とを接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
さらに、前記細胞培養物または細胞培養物の上清と接触させた固体吸着剤から、糖鎖化合物を溶離させる工程を含む、請求項１記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項３】
前記溶離させる工程が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種の溶離剤を用いて行われる、請求項２記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項４】
前記固体吸着剤がスチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である請求項１から３までのいずれかに記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項５】
前記細胞培養物が、細胞に糖鎖プライマーを加えて培養して得られるものである、請求項１から４までのいずれかに記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項６】
前記細胞が動物細胞である、請求項１から５までのいずれかに記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項７】
さらに酢酸エチルにより糖鎖プライマーを除去する工程を含む、請求項１から６までのいずれかに記載の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法。
【請求項８】
細胞培養物から複数種類の糖鎖化合物を別々に濃縮および／または精製する方法であって、
該細胞培養物または細胞培養物の上清と固体吸着剤とを接触させる工程；および
前記細胞培養物または細胞培養物の上清と接触させた固体吸着剤から、該複数の糖鎖化合物を異なる濃度の溶離剤にてそれぞれ溶離させる工程、を含む方法。
【請求項９】
前記溶離させる工程が、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種の溶離剤を用いて行われ、前記固体吸着剤がスチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖化合物の濃縮および／または精製方法に関し、より詳しくは細胞による糖鎖プライマー伸長法等で得られた糖鎖化合物を細胞培養物または培養培地上清から濃縮および／または精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は構造が複雑であり、同じ生体分子であるDNAやタンパク質よりも産業上の利用の為の開発が遅れている。しかし、近年、糖鎖の研究が急速に進展し、産業上の利用への模索も進められてきている。特に、細胞分化、ガン化、免疫反応等への糖鎖の関わりについて新しい事実が明らかにされつつある。例えば、細胞表層における糖鎖は、タンパク質や脂質と相互作用することによって、生体内における細胞分化、ガン化、免疫反応等の重要なプロセスに関与している。また、糖鎖は、細胞表層における細胞認識、接着、細胞間のシグナル伝達において重要な役割を担っていることも明らかになってきている。
【０００３】
糖鎖の合成方法としては、化学的に合成する方法、分解酵素による方法、糖転移酵素を用いる方法などがあるが、それぞれ、工程が煩雑であったり、収量が低かったり、使用原料が限られるなどの欠点がある。このような中、最近、動物細胞の機能を利用した糖鎖合成技術が注目されている。
【０００４】
動物細胞の機能を利用した糖鎖合成では、糖鎖合成経路の前駆体となる「糖鎖プライマー」を培地中に添加するなどして細胞内に取り込ませると、糖鎖伸長を受けた生成物である糖鎖化合物が細胞外に分泌されるようになる。ここで、糖鎖プライマーとしては、基本的に、オリゴ糖にアルキル鎖が結合された構造の化合物が用いられるが、末端にアジド基などの種々の官能基が付加された構造の化合物を用いることもできる。しかしながら、このような糖鎖プライマーは通常細胞への毒性があることから、添加濃度は制限されなければならず、生成される糖鎖化合物の濃度も必然的に高濃度とはならない。従って得られた糖鎖化合物を利用する際には、培養培地からの分離精製と共に濃縮を行う必要がある。
【０００５】
しかし、これまで動物細胞の機能を利用した糖鎖合成において必要となる大量の糖鎖化合物を濃縮および／または分離・精製する方法はなく、主に分析を目的としたC18系固相カートリッジでの濃縮や、ＨＰＬＣまたはＨＰＴＬＣを用いた分離方法が行なわれていた（例えば特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。
【０００６】
【特許文献１】特開２０００−２４７９９２
【非特許文献１】M．C．Z．Kasuyaら、Carbohydrate  Research  329（2000）755−763
【非特許文献２】Johannes Muthing, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 45-64
【非特許文献３】Stephan Ladisch and Ruixiang Li, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 135-145
【非特許文献４】Robert K. Yu and Toshio Ariga, Methods in Enzymology, Vol312, Part B, 115-134
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在糖鎖化合物の濃縮および／または精製に用いられているC18系固相カートリッジあるいはＨＰＬＣやＨＰＴＬＣを用いる方法では、カートリッジあるいは装置の価格が高く、大量の試料の処理には適さない。このように、大量の糖鎖化合物を効率的かつ安価に濃縮および／または精製する方法は未だなく、このような方法の開発が強く望まれている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、細胞による糖鎖プライマー伸長法等で得られた糖鎖化合物を細胞培養物またはその上清から大量にかつ安価に濃縮および／または精製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、以下に示す、細胞により生成された糖鎖化合物の濃縮および／または精製方法により上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１０】
すなわち、本発明は、細胞培養物から糖鎖化合物を濃縮および／または精製する方法であって、このような細胞培養物または細胞培養物の上清と固体吸着剤とを接触させる工程を含む方法を提供する。
【００１１】
上記方法は、さらに、細胞培養物または細胞培養物の上清と接触させた固体吸着剤から、糖鎖化合物を溶離させる工程を含み得る。
【００１２】
上記溶離させる工程は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種の溶離剤を用いて行われる。
【００１３】
上記固体吸着剤は、スチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種であり得る。
【００１４】
上記細胞培養物は、細胞に糖鎖プライマーを加えて培養して得ることができる。
【００１５】
上記細胞は、動物細胞であり得る。
【００１６】
本発明はまた、細胞培養物から複数種類の糖鎖化合物を別々に濃縮および／または精製する方法であって、細胞培養物または細胞培養物の上清と固体吸着剤とを接触させる工程；および細胞培養物または細胞培養物の上清と接触させた固体吸着剤から、複数の糖鎖化合物を異なる濃度の溶離剤にてそれぞれ溶離させる工程、を含む方法を提供する。この方法では、培地由来成分、中性糖鎖化合物、酸性糖鎖化合物を特に好適に分離、精製および／または濃縮できる。
【００１７】
上記溶離させる工程は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種の溶離剤を用いて行われ、上記固体吸着剤がスチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種であり得る。
【発明の効果】
【００１８】
以上のように、本発明を適用することによって、細胞、特に動物細胞を利用して、好ましくは糖鎖プライマーから伸長され生成される糖鎖化合物を、細胞培養物またはその上清から、経済的かつ工業的に容易に濃縮および／または精製することができる。よって、ヒト型糖鎖を始めとする有用な動物細胞由来の糖鎖化合物を安価に大量に調製することが可能になり、糖鎖を利用した製品の開発の迅速な実用化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２０】
本発明の細胞培養物は、好ましくは動物細胞を糖鎖化合物が得られるような条件下にて培養することで得られる。動物細胞は特に限定されず、所望の糖鎖化合物の種類に応じて様々な動物細胞が用いられ得る。動物細胞の例としては、ヒト由来、マウス由来、サル由来、ラット由来などの哺乳動物細胞が挙げられ、特にＢ１６マウスメラノーマ細胞、ラットＰＣ１２細胞、マウスＮｅｕｒｏ２ａ細胞、ラットＲＢＬ−２Ｈ３細胞、ヒトＭＯＬＴ−４細胞、ヒトＨＬ−６０細胞、サル腎臓由来ベロ細胞などが好適に用いられ得る。培養は、通常の動物細胞の培養条件に従って行う。
【００２１】
糖鎖化合物が得られるような条件とは、例えば、上記の動物細胞を、室温から４５℃までの温度の間で１時間から７０時間までの間の時間でＤＭＥＭ／Ｆ１２などの培養培地で前培養した後、糖鎖プライマーを添加した培地に置換してさらに培養を行い、糖鎖伸長反応を行うことなどである。
【００２２】
ここで、糖鎖プライマーは、用いられる細胞種、所望の糖鎖構造により任意に選択することができる。限定はされないが、好ましい糖鎖プライマーの例としては、式（Ｉ）：（Ｇ1)x（Ｇ2)y（Ｇ3)z−Ｌ−Ｘで表される化合物が挙げられる。ここで、式中、Ｇ1、Ｇ2及びＧ3は、それぞれ独立して環状構造の単糖残基又はその誘導体であり、Ｌは、−Ｏ−（ＣＨ2)n−、−Ｓ−（ＣＨ2)n−、及び−ＮＨ−（ＣＨ2)n−から選択される連結基であり、Ｘは、−Ｎ3、−ＮＨ2、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、及び−Ｃ1-Ｃ4アルキルから選択される基であり；ｘ、ｙ、及びｚは、それぞれ独立して０〜１０の整数であり、好ましくは０〜５、さらに好ましくは０から３であり、ｘ、ｙ及びｚの全てが同時に０であることはない。また、ｎは、８〜２０の整数であり、好ましくは８〜１６、特に好ましくは１２である。単糖としては、限定はされないが、ペントース及びヘキソースを使用するのが好ましい。またアルドース、ケトースのいずれも使用することができる。
【００２３】
このような糖鎖プライマーを各種細胞の培地に添加して細胞を培養すると、細胞は、プライマーを取り込み、その糖鎖部分に更に糖を付加してグリコシル化し、その糖付加生成物を細胞内には蓄積せずに細胞外に分泌する。付加される糖は、細胞により異なる。
【００２４】
得られる細胞培養物または細胞培養物から細胞を除いた上清は、糖鎖プライマーから伸長して得られた生成物である糖鎖化合物を含有する。この細胞培養物または細胞培養物の上清に、固体吸着剤を接触させることにより、糖鎖化合物を濃縮および／または精製することができる。
【００２５】
接触は、例えば、細胞培養物または細胞培養物の上清に直接固体吸着剤を加え、３０分以上の時間で振盪するなどして行う。あるいは、カラムなどに予め固体吸着剤を充填しておき、充填したカラムに細胞培養物または細胞培養物の上清を流すことによって行う。
【００２６】
本発明においては、さらに、接触工程終了後の固体吸着剤に適度な濃度の溶離剤を接触させて、固体吸着剤から糖鎖化合物を脱着させるとともに、脱着させた糖鎖化合物を溶離剤中に溶離させる溶離工程を行い得る。溶離剤は、限定はされないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ブタノール、アセトン、およびアセトニトリルからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。この工程は、糖鎖化合物と吸着体が疎水性相互作用によって吸着していたものに、有機溶媒などの溶離剤を接触させることで、吸着剤から糖鎖化合物を脱着させて、さらにこの糖鎖化合物を有機溶媒中に溶離させる工程である。
【００２７】
ここで、固体吸着剤は、スチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体からなる群より選択される少なくとも1種であり得る。その他、フェノール系合成吸着体も用いることができる。培養物中または培養上清中の糖鎖化合物を吸着させるスチレン系合成吸着剤としては、例えばスチレン−ジビニルベンゼン共重合体を樹脂母体とするものが挙げられる。スチレン系合成吸着体として、具体的には、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ２０、ＨＰ２１、セパビーズ（登録商標、以下同じ）ＳＰ２０７、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０、ＳＰ８７５、ロームアンドハース社製アンバーライト（登録商標、以下同じ）ＸＡＤ４、ＸＡＤ１６、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００、Ｂａｙｅｒ社製ＶＰＯＣ１０６２、ＶＰＯＣ１０６４等が挙げられる。また、メタクリル系合成吸着体として、三菱化学社製ダイヤイオン（登録商標、以下同じ）ＨＰ１ＭＧ、ＨＰ２ＭＧ等を用いることができる。本発明者の検討によって、スチレン系及びメタクリル系合成吸着体は特に糖鎖化合物を良好に吸着させることが判った。
【００２８】
本発明はまた、細胞培養物から複数種類の糖鎖化合物を別々に濃縮および／または精製する方法であって、細胞培養物または細胞培養物の上清と固体吸着剤とを接触させる工程；および細胞培養物または細胞培養物の上清と接触させた固体吸着剤から、複数の糖鎖化合物を異なる濃度の溶離剤にてそれぞれ溶離させる工程、を含む方法を提供するが、この方法では、培地由来成分、中性糖鎖化合物、酸性糖鎖化合物を特に好適に分離、精製および／または濃縮することができる。
【００２９】
すなわち、合成吸着体の吸着力の違いにより、糖鎖化合物を分離・精製することができる。例えば、疎水性相互作用の大きいものは、極性の高い酸性の糖鎖化合物も効率よく吸着できる反面、極性の低い中性の糖鎖化合物は溶出しにくい。一方、疎水性相互作用の小さいものは、極性の高い酸性の糖鎖化合物は極性の高い溶媒で容易に溶出される半面、極性の低い中性の糖鎖化合物も溶出しやすい。以上のような、合成吸着体の吸着力を利用すれば、糖鎖化合物を分離・精製することができる。
【００３０】
例えば、吸着剤としてダイヤイオンHP２０を用いて糖鎖化合物を吸着させた場合、５０％の濃度のメタノールにより培地由来成分を溶離させることができ、７０％の濃度のメタノールにより、ＧＭ３等の酸性糖鎖化合物を溶出することができ、１００％の濃度のメタノールにより、中性の糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドや、Ｇｂ３やＧｂ４等の中性糖鎖化合物を溶出できる。
【００３１】
すなわち、極性の異なる２種以上の溶離液を用い、これら溶離液を極性の高い順に合成吸着剤に接触させることができる。このように溶離液を極性の高いものから低いものに段階的に接触させることにより、高極性化合物から順に溶出でき、糖鎖化合物の極性に応じて分離することが可能である。
【００３２】
更に、疎水性相互作用か強く吸着力の高いダイヤイオンＳＰ２０７を吸着剤として用いた場合、中性の糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドは１００％の濃度のメタノールを用いても完全に溶出することが困難であるくらい吸着力が強いため、糖鎖プライマーなどの中性糖鎖の除去に使用できる。
【００３３】
また、中性である糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドは、培地上清に同量の酢酸エチルを添加し振盪することにより、酢酸エチル層に抽出できることにより除くことも可能である。よって、培地上清を吸着剤に接触させる前に、酢酸エチルによる抽出により中性である糖鎖プライマーである１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを除いておくと、吸着工程及び、溶離工程における負荷を軽減することが可能である。
【００３４】
糖鎖プライマーは、ラクトースやN-アセチルグルコサミンなどをドデシル基と結合することで作成し利用できる。更に、アジド基などの官能基をアグリコン部分に導入しておけば、後の操作でその部分と別の化合物とを共有結合などで結合して固定化することが可能である。
【００３５】
以下に、本発明の糖鎖化合物の精製方法および濃縮方法の具体例を実施例の態様で示すが、本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３６】
まず、触媒としてルイス酸であるboron trifluoride etherate (BF3・OEt2)とアジド基を導入したアルコールを用いてグリコシル化を行った後、脱アセチル化反応を行うことにより、糖鎖プライマー：１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを得た（Murozuka, Y., Kasuya, M. C., Kobayashi, M., Watanabe, Y., Sato, T. and Hatanaka, K. 2005, Chemistry and Biodiversity, 2, 1063,  Kasuya, M. C., Wang, L., Lee, Y. C., Mitsuki, M., Nakajima, N., Sato, T., Hatanaka, K., Yamagata, S. and Yamagata, T. 2000, Carbohydr. Res., 329, 755.）
【００３７】
１００ｍｍのディッシュに、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマB１６細胞及びサルの腎臓由来であるベロ細胞をそれぞれ７ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（インビトロジェン）に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。
【００３８】
前培養後、終濃度５０μＭになるように１２‐アジドドデシル‐βラクトシド及び１％のＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面を1.5mlのＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。
【００３９】
得られた培地上清を用い、本発明における濃縮および精製を行った。まず、酢酸エチル抽出処理を行った後、スチレン系合成吸着剤としてダイヤイオンＨＰ２０、溶離剤としては、５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノール、１００％濃度のメタノールを順に用いた。
【００４０】
具体的には、以下のようにして糖鎖化合物の濃縮・精製を行った。
（１）培地上清（7ml）+洗浄液の量（1.5ml）に対して同量（8.5ml）の酢酸エチルによる抽出による糖鎖プライマー除去操作を２回行った。
（２）酢酸エチルによる糖鎖プライマー除去を行った液を、容量５ｍｌのスチレン系合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ２０）を充填したカラムに通液した（吸着剤接触工程）。
（３）通液終了後、４カラム容量の水でスチレン系合成吸着剤を洗浄した。次いで、溶離剤として、５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノール、１００％濃度のメタノールを順に２０ｍｌずつ通液した（溶離工程）。
【００４１】
各々の溶離剤を、減圧濃縮、乾燥を行い、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を図１に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。
【００４２】
図１（A）の中央よりやや下側にあるバンドは、Ｂ１６細胞を用いて生成された糖化合物である酸性糖由来のバンドである。上側のバンドは、糖鎖プライマー由来のバンドである。図１（A）から明らかなように、７０％メタノールおよび１００％メタノールのいずれの溶離剤を用いた場合でも、スチレン系合成吸着体による酸性糖の濃縮および／または精製が、従来のＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて同じ条件で溶出を行った場合と同等もしくはそれ以上にできることが証明された。図１（Ｂ）の中央あたりのバンドは、ベロ細胞を用いて生成された糖化合物である中性糖由来のバンドである。図１（Ｂ）から明らかなように、１００％メタノールの溶離剤を用いた場合には、スチレン系合成吸着体による中性糖の濃縮および／または精製が、従来のＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた場合で同じ条件で溶出を行った場合と同等もしくはそれ以上にできることが証明された。
【実施例２】
【００４３】
１５０枚の１００ｍｍのディッシュに各々、細胞数２×１０６ｃｅｌｌｓのマウスメラノーマB１６細胞を７ｍｌの１０％  ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁して播き、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間、前培養を行った。前培養後、終濃度５０μＭになるように１２‐アジドドデシル‐βラクトシド及び１％のＩＴＳＸ（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に置換し、更に、ＣＯ２インキュベターの中で３７℃にて４８時間培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収し、更にディッシュ表面をＰＢＳで洗浄することにより、培地上清全量を回収した。
【００４４】
得られた培地上清を用い、本発明における濃縮・精製を行った。この場合、まず、５０ｇのスチレン系合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ２０を培地上清に加え、１６時間振盪し、糖鎖化合物を吸着剤に吸着させた（吸着剤接触工程）。
次に、１００ｍｌの水で５回洗浄した後、５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノール、１００％濃度のメタノールを順に１００ｍｌで４回ずつ通液した。
【００４５】
５０％濃度のメタノール、７０％濃度のメタノールによる溶出液については、ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、容量５０ｍｌのスチレン系合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ２０）を充填したカラムで、吸着剤へ再吸着を行い、適量の４０〜５０％メタノールを通液した後、２００ｍｌの７０％濃度のメタノールで目的糖鎖化合物であるＧＭ３型糖鎖化合物を溶出した。
【００４６】
一方、１００％濃度のメタノールによる溶出液については、ロータリーエバポレーターで濃縮後、乾燥した。この乾燥物に対し、３ｍｌのＤＭＳＯを加えて溶解した後、１００ｍｌの水を加えた後、容量５０ｍｌのスチレン系合成吸着剤（セパビーズＳＰ２０７）を充填したカラムで、吸着剤へ再吸着を行い、２００ｍｌの水で洗浄した後、２００ｍｌの７０％濃度のメタノールで目的糖鎖化合物であるＧＭ３型糖鎖化合物を溶出した。
【００４７】
各々の目的糖鎖化合物であるＧＭ３の溶出液を、減圧濃縮、乾燥を行い、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を図２に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。全溶出液を減圧濃縮及び、乾燥させた後、１８．５ｍｇの白色粉末としてＧＭ３型糖鎖化合物が得られた。
【実施例３】
【００４８】
様々な種類のスチレン系合成吸着体およびメタクリル系合成吸着体の糖鎖化合物を濃縮および／または精製する能力を検討する為に、以下の実験も行った。
【００４９】
BALL-1細胞を実施例１または２と同様にして前培養後、１２‐アジドドデシル‐βラクトシドを添加した培地に置換し、更に、培養し、糖鎖伸長反応を行った。糖鎖伸長反応後、培地を回収した。
【００５０】
得られた培地（同じものを４つ）を用い、本発明における濃縮および精製を行った。まず、洗浄した各種吸着剤（スチレン系HP２０、ＳＰ８５０、ＳＰ２０７、メタクリル系ＨＰ２ＭＧ）をそれぞれ５ｍｌずつ充填したカラムに通液した。続いて、１０ｍｌの水で洗浄した後、溶離剤として、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％濃度のメタノールを用いて溶出を行った。
【００５１】
各々の溶離剤を、減圧濃縮、乾燥を行い、ＨＰＴＬＣにより分析した結果を図３に示す。展開溶媒としては、クロロホルム／メタノール／０．２５％ＫＣｌ水溶液（５：４：１）を用い、レゾルシノールにより発色を行った。
【００５２】
図３（A）から（Ｅ）までのすべてにおいて、中央よりやや下側にあるバンドは、ＢALL-1細胞を用いて生成された糖化合物である酸性糖由来のバンドである。上側のバンドは、糖鎖プライマー由来のバンドである。この図から明らかなように、用いる吸着体の種類により濃度は異なるが、メタノールを溶離剤とした場合に、スチレン系合成吸着体でもメタクリル系合成吸着体でも、酸性糖の濃縮および／または精製が、従来のＳｅｐ−ＰａｋＣ−１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた場合で同じ条件で溶出を行った場合と同等もしくはそれ以上にできることが証明された。（Sは分画前のサンプルを指す）
【００５３】
（比較例１）
実施例１と同様の方法にて得られたＢＡＬＬ−１細胞培養物１０mlをDEAE−Sephadex  A−２５（酢酸型）を２０ｍｌ充填したカラム（内径1.5cm、長さ15cm）に流した。次に、５カラム容量のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（５：１０：１）を流し、次に５カラム容量のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／１Ｍ酢酸ナトリウム（５：１０：１）で溶出し、各画分をＳｅｐ−Ｐａｋにより脱塩してＨＰＴＬＣ分析に供した。この結果を図４に示す。図４から明らかなように、DEAEで非吸着画分と吸着分画とを分ける前には得られた糖鎖化合物のバンドは、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘで低回収率でしか回収することができなかった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｂ１６細胞とベロ細胞により生成された糖鎖化合物をＨＰ２０により濃縮・分離したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図２】Ｂ１６細胞により生成された糖鎖化合物をＨＰ２０により精製したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図３】ＢＡＬＬ−１細胞により生成された糖鎖化合物を各種合成吸着剤により精製したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図４】ＢＡＬＬ−１細胞により生成された糖鎖化合物をイオン交換樹脂により精製したものをＨＰＴＬＣにより分析した結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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