(57)【要約】【課題】  ｐＨに依存せず甘味を有する物質を見出すと共に、当該物質を含むことを特徴とする新規な、甘味を有する組成物を提供すること。【解決手段】  ポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失の変異を持たせることにより、ポリペプチドＮＢＳ変異体と組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有する事を特徴とするＮＡＳ変異体；ポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失の変異を持たせることにより、ポリペプチドＮＡＳ変異体と組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有する事を特徴とするＮＢＳ変異体；前記ＮＡＳ変異体及び前記ＮＢＳ変異体の組み合わせからなる二量体；ＮＡＳ変異体、ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を含む組換えベクター；並びに当該ベクターを含有する形質転換体を提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＡＳ変異体。
【請求項２】
置換又は欠失させるアミノ酸が、アスパラギン酸及び／又はヒスチジンであることを特徴とする請求項１に記載のＮＡＳ変異体。
【請求項３】
置換又は欠失させるアミノ酸が、ヒスチジンであることを特徴とする請求項１に記載のＮＡＳ変異体。
【請求項４】
置換がリジン、アルギニン、アラニン、グリシン、及びセリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸への置換であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＡＳ変異体。
【請求項５】
置換がアラニンへの置換であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＡＳ変異体。
【請求項６】
マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミンの比が９／２で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項１〜５に記載のＮＡＳ変異体。
【請求項７】
ポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＢＳ変異体。
【請求項８】
置換又は欠失させるアミノ酸が、アスパラギン酸及び／又はヒスチジンであることを特徴とする請求項７に記載のＮＢＳ変異体。
【請求項９】
置換又は欠失させるアミノ酸が、ヒスチジンであることを特徴とする請求項７に記載のＮＢＳ変異体。
【請求項１０】
置換がリジン、アルギニン、アラニン、グリシン、及びセリンから選ばれるアミノ酸への置換である請求項７〜９のいずれか１項に記載のＮＢＳ変異体。
【請求項１１】
置換がアラニンへの置換である請求項７〜９のいずれか１項に記載のＮＢＳ変異体。
【請求項１２】
請求項１〜６に記載のＮＡＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、の任意の組み合わせからなる二量体タンパク質であり、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする二量体タンパク質。
【請求項１３】
ポリペプチドＮＡＳを構成するヒスチジンの１若しくは数個を欠失若しくはアラニンに置換してなるＮＡＳ変異体と、ポリペプチドＮＢＳを構成するヒスチジンの１若しくは数個を欠失若しくはアラニンに置換してなるＮＢＳ変異体との組み合わせからなる二量体タンパク質であり、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする二量体タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜６に記載のＮＡＳ変異体、請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体、及び請求項１２〜１３に記載の二量体タンパク質からなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有し、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする甘味料組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５に記載のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１７】
請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１９】
請求項１６及び／又は１８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甘味を有するタンパク質及びその用途に関する。更に詳しくは、ｐＨに依存せず甘味を有するＮＡＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ  ａｃｉｄｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）変異体、ＮＢＳ（ｎｅｏｃｕｌｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ）変異体、当該変異体を含有する二量体タンパク質、並びに当該二量体タンパク質を含有する甘味料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
甘味を有するタンパク質は、糖類と比較して低カロリーの甘味料となり得るため、有用とされる。
クルクリゴ・ラチフォリア（Ｃｕｒｃｕｌｉｇｏ ｌａｔｉｆｏｌｉａ）は、西マレーシアやタイ南部などに自生するユリ科に分類される植物であり、該植物に含有されるネオクリンは、飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物に甘味を付与する活性などの味覚改変活性を有するタンパク質として有用であるとされる。
ネオクリンはヘテロ二量体タンパク質であり、ポリペプチドＮＡＳと、ポリペプチドＮＢＳから構成される。
【０００３】
ネオクリンの味覚改変活性については既に報告がなされている（例えば特許文献１参照）。ネオクリンが強い甘味を呈するのは、ネオクリンを口に含んだ後に酸味物質を飲食した場合、すなわち酸性条件下に限定されていた。中性条件下でもネオクリン自体が甘味を有するが、その甘味強度は弱い。そのため、酸味を有する食品に甘味を付与する等の活性を有する味覚改変物質としては優れているが、酸味を有する食品以外にも用途のある甘味料としては不向きであった。
また、ネオクリンの味覚改変活性は口腔内で長時間残存する。この理由からも、食品に甘味料として添加するには不向きであった。
これらのことから、ｐＨに依存せず甘味を有するタンパク質の開発が求められていた。
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上記のようにｐＨに依存せず甘味を有する物質を見出すと共に、当該物質を含む新規な甘味を有する組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題に基づき鋭意検討を重ねた結果、既知のポリペプチドＮＡＳ及びポリペプチドＮＢＳのアミノ酸残基の数ヶ所に変異を導入することにより、既知のネオクリンとは全く異なる性質を有するタンパク質を形成するＮＡＳ変異体と、ＮＢＳ変異体を見出すことに成功した。
さらに、このＮＡＳ変異体とＮＢＳ変異体を含む二量体タンパク質は、ｐＨに依存せず甘味を有することから、既知のネオクリンとは異なり、甘味料として実用性に優れていることを見出した。
これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成するに至ったのである。
【０００７】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、ポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＡＳ変異体である。
請求項２記載の本発明は、置換又は欠失させるアミノ酸が、アスパラギン酸及び／又はヒスチジンであることを特徴とする請求項１に記載のＮＡＳ変異体である。
請求項３記載の本発明は、置換又は欠失させるアミノ酸が、ヒスチジンであることを特徴とする請求項１に記載のＮＡＳ変異体である。
請求項４記載の本発明は、置換がリジン、アルギニン、アラニン、グリシン、及びセリンからなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸への置換であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＡＳ変異体である。
請求項５記載の本発明は、置換がアラニンへの置換であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＡＳ変異体である。
請求項６記載の本発明は、マンノース／Ｎ−アセチルグルコサミンの比が９／２で構成されるＮ結合型糖鎖が付加された請求項１〜５に記載のＮＡＳ変異体である。
請求項７記載の本発明は、ポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＢＳ変異体である。
請求項８記載の本発明は、置換又は欠失させるアミノ酸が、アスパラギン酸及び／又はヒスチジンであることを特徴とする請求項７に記載のＮＢＳ変異体である。
請求項９記載の本発明は、置換又は欠失させるアミノ酸が、ヒスチジンであることを特徴とする請求項７に記載のＮＢＳ変異体である。
請求項１０記載の本発明は、置換がリジン、アルギニン、アラニン、グリシン、及びセリンから選ばれるアミノ酸への置換である請求項７〜９のいずれか１項に記載のＮＢＳ変異体である。
請求項１１記載の本発明は、置換がアラニンへの置換である請求項７〜９のいずれか１項に記載のＮＢＳ変異体である。
請求項１２記載の本発明は、請求項１〜６に記載のＮＡＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、の任意の組み合わせからなる二量体タンパク質であり、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする二量体タンパク質。
である。
請求項１３記載の本発明は、ポリペプチドＮＡＳを構成するヒスチジンの１若しくは数個を欠失若しくはアラニンに置換してなるＮＡＳ変異体と、ポリペプチドＮＢＳを構成するヒスチジンの１若しくは数個を欠失若しくはアラニンに置換してなるＮＢＳ変異体との組み合わせからなる二量体タンパク質であり、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする二量体タンパク質である。
請求項１４記載の本発明は、請求項１〜６に記載のＮＡＳ変異体、請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体、及び請求項１２〜１３に記載の二量体タンパク質からなる群より選ばれる１種又は２種以上を有効成分として含有し、ｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする甘味料組成物である。
請求項１５記載の本発明は、請求項１〜５に記載のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子である。
請求項１６記載の本発明は、請求項１５に記載の遺伝子を含む組換えベクターである。
請求項１７記載の本発明は、請求項７〜１１に記載のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子である。
請求項１８記載の本発明は、請求項１７に記載の遺伝子を含む組換えベクターである。
請求項１９記載の本発明は、請求項１６及び／又は１８に記載の組換えベクターを含む形質転換体である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、既知のポリペプチドＮＡＳ、ＮＢＳとは異なる新規のアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドＮＡＳ変異体、ＮＢＳ変異体が提供され、当該ポリペプチドを用いてｐＨに依存せず甘味を有する新規な二量体タンパク質を提供することが可能となった。
また、当該二量体タンパク質を用いて、食品等に実用可能であり、かつｐＨに依存せず甘味を有する新規な甘味料組成物を提供することが可能となった。
【０００９】
本発明により提供される二量体タンパク質は、「ｐＨに依存せず甘味を有する。」という、既知のネオクリンとは全く異なる特徴を有する。
一般的に、タンパク質はその立体構造と機能が深く関わっている。タンパク質においては、アミノ酸配列、すなわち一次構造における変異が、タンパク質の劇的な立体構造変化の要因となる場合があり、その結果、タンパク質は全く性質の異なるものになる可能性がある。
【００１０】
それゆえ、本発明において提供されるＮＡＳ変異体、ＮＢＳ変異体及びそれらからなる二量体タンパク質と、既知のポリペプチドＮＡＳ、ＮＢＳやネオクリンとは、一次構造における配列においては１若しくは数ヶ所の違いを有するのみであるが、立体構造においては全く異なるものであると推測される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（１）本発明のＮＡＳ変異体
本発明のＮＡＳ変異体とは、既知のポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＡＳ変異体の事である。
【００１２】
本発明においてポリペプチドＮＡＳとは、ネオクリンを構成する２つのサブユニットのうちの１つであって、下記の（Ａ）又は（Ｂ）に示すものである。
（Ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｂ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体タンパク質であるネオクリンを形成しうるポリペプチド
ここで、味覚改変活性とは、酸味、苦味又はえぐ味を顕著に低減すると共に、飲食物の嗜好性を高めるような活性を言う。すなわち、苦味を有する飲食物の苦味を抑える活性、えぐ味を有する飲食物のえぐ味を抑える活性、飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物に甘味を付与する活性、酸味を呈する飲食物の酸味を抑える活性を意味する。
【００１３】
また、本発明においてポリペプチドＮＢＳとは、ネオクリンを構成する２つのサブユニットのうちの１つであって、下記の（Ｃ）又は（Ｄ）に示すものである。
（Ｃ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（Ｄ）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ポリペプチドＮＡＳと共に味覚改変活性を有する二量体タンパク質であるネオクリンを形成しうるポリペプチド
【００１４】
なお、上記ポリペプチドＮＡＳ、ＮＢＳについては、国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報に詳述されており、それに記載された方法によりこれらポリペプチドやその遺伝子を容易に取得することができる。
【００１５】
本発明のＮＡＳ変異体は、上記した既知のポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドである。つまり、本発明のＮＡＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＡＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を導入してなるポリペプチドである。
【００１６】
本発明者らは、ネオクリンのＸ線結晶構造解析と分子動力学シミュレーションを行い、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー (Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ) ２００６年３５９巻１４８−１５８頁において報告している。この報告によると、図１に示すように、ネオクリンは中性条件下では二量体タンパク質の２つのサブユニットが近接した状態にあり、酸性条件下では２つのサブユニットが互いに反発した状態に構造変化すると推測された。すなわち、ネオクリンは２つのサブユニットが互いに反発した状態で強い甘味を有すると考えられた。また、構造変化には、中性から酸性領域において荷電を変化させる側鎖を有するアミノ酸の関与が示唆された。
【００１７】
上記の知見より、本発明において置換又は欠失の変異を導入するポリペプチドＮＡＳ中のアミノ酸の種類としては、中性域においても、二量体タンパク質を構成する２つのサブユニットが反発した状態に構造変化させるものならば制限は無い。しかし、特に中性から酸性域において荷電を変化させる側鎖を有するアミノ酸、すなわちアスパラギン酸、ヒスチジンが望ましく、中でもヒスチジンが好ましい。
本発明のＮＡＳ変異体において、ポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち変異を有するアミノ酸の数は１若しくは数個であり、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは２個である。
【００１８】
上記の変異が置換である場合、ポリペプチドＮＡＳを構成するアスパラギン酸、ヒスチジン等のアミノ酸と置換して新たに含ませるアミノ酸の種類は、上述の構造変化を起こすものならば制限は無いが、特に中性条件下でも陽電荷を持つリジン、アルギニンや、分子量が小さく側鎖も小さいために立体障害を生じ難いアラニン、グリシン、セリンなどが好ましい。
置換するアミノ酸と、新たに含ませるアミノ酸との組み合わせについても制限はないが、例えばＮＡＳポリペプチド鎖の１４位のヒスチジンのアラニンへの置換、及び３６位のヒスチジンのアラニンへの置換が挙げられる。この結果得られるＮＡＳ変異体のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２８に示す。
【００１９】
本発明のＮＡＳ変異体は、安定性の高い二量体タンパク質を形成することができる点で、糖鎖が付加されてなることが好ましく、特に、Ｎ結合型糖鎖が付加されてなることが好ましい。ここでＮ結合型糖鎖とは、タンパク質の一次構造に存するアスパラギン残基に結合したＮ−アセチルグルコサミン（Ｎ-ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）を基点として伸長する糖鎖構造の総称を意味する。
Ｎ結合型糖鎖の中でも、特に、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）／Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ-ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）の比が９／２で構成されるＮ結合型糖鎖であることが好ましい。具体的には、図２に示す構造からなる糖鎖配列を挙げることができる。尚、図２に示す構造の一部に付加、欠如、置換、又は修飾があってもよい。
尚、ＮＡＳ変異体におけるＮ結合型糖鎖の結合部位は、Ｎ結合型糖鎖の結合特性を考慮すると、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列中８１位のアスパラギンであるものと推測される。
【００２０】
本発明のＮＡＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＡＳに上記のような変異を導入してなるポリペプチドであり、公知の遺伝子組み替え技術、突然変異体の選抜技術、タンパク質の発現技術などを組み合わせて取得することができる。
例えば、実施例１に記載するように公知のＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いて、配列表の配列番号１に記載のＮＡＳ遺伝子のＤＮＡ配列に変異を導入することで、目的のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を取得できる。さらに、このＤＮＡ配列を公知の適当なタンパク質発現系に供することで、本発明のＮＡＳ変異体を取得することが出来る。
【００２１】
本発明のＮＡＳ変異体は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするものである。配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、後述する本発明のＮＢＳ変異体の１つである。そして、本発明のＮＡＳ変異体と配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを組み合わせることにより、後述する本発明の二量体タンパク質が形成される。
【００２２】
本発明において「ｐＨに依存せず甘味を有する」とは、酸性域だけではなく、中性域、塩基性域においても強い甘味強度を有するという意味である。つまり、例えば既知のネオクリンのように、酸性域に比べて中性域において甘味強度が著しく低下するようなものとは異なる。
具体的には、本発明における「ｐＨに依存せず甘味を有する」に該当する甘味強度としては、酸性域、中性域、塩基性域のいずれにおいても１２.５より大きいことが必要であり、好ましくは２５以上、さらには５０以上有することが好ましい。
なお、甘味強度は、アスパルテームの甘味の強度を１として相対値で示したものであり、ここでは官能評価によるモル濃度あたりの甘味の強度を比較している。
【００２３】
なお、本発明のＮＡＳ変異体は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド以外のＮＢＳ変異体とも二量体タンパク質を形成し、当該二量体タンパク質としてもｐＨに依存せず甘味を発揮するものであって良い。
また、本発明のＮＡＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＢＳ又はポリペプチドＮＡＳとのヘテロダイマーとして、或いはＮＡＳ変異体同士のホモダイマーとしても、ｐＨに依存せず甘味を有する二量体タンパク質を形成する可能性を排除されない。
さらに、本発明のＮＡＳ変異体は、単量体としてｐＨに依存せず甘味を発揮するものであっても良い。
【００２４】
（２）本発明のＮＢＳ変異体
本発明のＮＢＳ変異体とは、既知のポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＢＳ変異体の事である。
また、ここでいうポリペプチドＮＢＳについては、上記（１）で説明した通りである。
【００２５】
本発明のＮＢＳ変異体は、上記した既知のポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドである。つまり、本発明のＮＢＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＢＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を導入してなるポリペプチドである。
【００２６】
本発明のＮＡＳ変異体と同様に、本発明において置換又は欠失の変異を導入するポリペプチドＮＢＳ中のアミノ酸の種類としては、中性域においても、二量体タンパク質を構成する２つのサブユニットが反発した状態に構造変化させるものなら制限は無い。しかし、特に中性から酸性域において荷電を変化させる側鎖を有するアミノ酸、すなわちアスパラギン酸、ヒスチジンが望ましく、中でもヒスチジンが好ましい。
本発明のＮＢＳ変異体において、ポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち変異を有するアミノ酸の数は１若しくは数個であり、好ましくは１〜１１個、更に好ましくは３個である。
【００２７】
上記の変異が置換である場合、ポリペプチドＮＢＳを構成するアスパラギン、ヒスチジン等のアミノ酸と置換して新たに含ませるアミノ酸の種類は、上述の構造変化を起こすものならば制限は無いが、特に中性条件下でも陽電荷を持つリジン、アルギニンや、分子量が小さく側鎖も小さいために立体障害を生じ難いアラニン、グリシン、セリンなどが好ましい。
置換するアミノ酸と、新たに含ませるアミノ酸との組み合わせについても制限はないが、例えばＮＢＳポリペプチド鎖の１１位のヒスチジンのアラニンへの置換、１４位のヒスチジンのアラニンへの置換、及び６７位のヒスチジンのアラニンへの置換が挙げられる。この結果得られるＮＢＳ変異体のアミノ酸配列を、配列表の配列番号２９に示す。
【００２８】
本発明のＮＢＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＢＳに上記のような変異を導入してなるポリペプチドであり、公知の遺伝子組み替え技術、突然変異体の選抜技術、タンパク質の発現技術などを組み合わせて取得することができる。
例えば、実施例２に記載するように公知のＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いて、配列表の配列番号２に記載のＮＢＳ遺伝子のＤＮＡ配列に変異を導入することで、目的のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子のＤＮＡ配列を取得できる。さらに、このＤＮＡ配列を公知の異種タンパク質発現法に供することで、本発明のＮＢＳ変異体を取得することが出来る。
【００２９】
本発明のＮＢＳ変異体は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするものである。配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとは、前述した本発明のＮＡＳ変異体の１つである。そして、本発明のＮＢＳ変異体と配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを組み合わせることにより、後述する本発明の二量体タンパク質が形成される。
ここで、「ｐＨに依存せず甘味を有する」とは、上記（１）で説明した通りの意味である。
【００３０】
なお、本発明のＮＢＳ変異体は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド以外のＮＡＳ変異体とも二量体タンパク質を形成し、当該二量体タンパク質としてもｐＨに依存せず甘味を発揮するものであって良い。
また、本発明のＮＢＳ変異体は、既知のポリペプチドＮＡＳ又はポリペプチドＮＢＳとのヘテロダイマーとして、或いはＮＢＳ変異体同士のホモダイマーとしても、ｐＨに依存せず甘味を有する二量体タンパク質を形成する可能性を排除されない。
さらに、本発明のＮＢＳ変異体は、単量体としてｐＨに依存せず甘味を発揮するものであっても良い。
【００３１】
（３）本発明の二量体タンパク質
本発明の二量体タンパク質は、（１）に記載のＮＡＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、（２）に記載のＮＢＳ変異体のうちいずれか１種のポリペプチドと、の任意の組み合わせからなる二量体タンパク質であり、且つｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とする二量体タンパク質である。
ここで、「ｐＨに依存せず甘味を有する」とは、上記（１）で説明した通りの意味である。
【００３２】
本発明の二量体タンパク質は、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子、及び／またはＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を用いて、公知の適当なタンパク質発現系に供することで取得することができる。例えば、下記の（６）で説明する方法により、以前に出願人らによって出願された国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１で報告されたアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）を用いるタンパク質発現系に供することで取得することができる。
【００３３】
（４）本発明の甘味料組成物
本発明の甘味料組成物は、有効成分として、（１）に記載のＮＡＳ変異体、（２）に記載のＮＢＳ変異体、及び（３）に記載の二量体タンパク質からなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有し、且つｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするものである。
【００３４】
上記（１）のＮＡＳ変異体及び上記（２）のＮＢＳ変異体は、ヘテロダイマーを形成することにより、上述の如くｐＨに依存せず甘味を有する本発明の二量体タンパク質となる。また、ＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体が、そのホモダイマー或いは単量体として、ｐＨに依存せず甘味を発揮するものである場合は、本発明の甘味料組成物には、ＮＡＳ変異体のみ或いはＮＢＳ変異体のみを含むものも含まれる。
【００３５】
本発明の甘味料組成物は、そのまま摂取してもよいが、野菜ジュース、グレープフルーツ等の果汁、すしネタ等各種料理用調味液をはじめとする飲食物又は薬剤等に適当量を配合して使用してもよい。この場合のネオクリン変異体の配合量は、当該組成物が高度に精製されたネオクリン変異体粉末を飲料に添加する場合を例に取ると、５〜５，０００μｇ／ｍｌ、特に５０〜５００μｇ／ｍｌが好ましい。
【００３６】
また、本発明の甘味料組成物は、配合対象である飲食物又は薬剤等の性状に応じて、粉末状、溶液状、シート状、スプレー状、顆粒状、又は乳化物状等に加工して使用することができる。
【００３７】
（５）本発明の遺伝子
本発明の遺伝子は、（１）に記載のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子、及び、（２）に記載のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子である。
【００３８】
すなわち、第一に、本発明のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子は、ポリペプチドＮＡＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２９に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＡＳ変異体をコードする遺伝子である。
つまり、既知のポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子において、１若しくは数個のアミノ酸残基に置換若しくは欠失の変異を生じさせるような変異を導入することによって、本発明のＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を得ることができる。
なお、ポリペプチドＮＡＳのアミノ酸配列に導入する変異については、上記（１）で説明した通りである。
【００３９】
このポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子は、具体的には、（ａ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列を含むＤＮＡとして得ることができるが、これと実質的に同一の塩基配列、すなわち、（ｂ）配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ポリペプチドＮＢＳと共に味覚改変活性を有する二量体タンパク質であるネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡとして得ることもできる。
【００４０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のハイブリダイゼーションの洗浄条件、例えば０．１×ＳＳＣで０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度にて６５℃で洗浄が行われる条件などが挙げられる。
【００４１】
このような、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子は、以下のような方法により取得可能である。
例えば、受粉から数週間後のクルクリゴ・ラチフォリアの果実から、ｍＲＮＡを抽出し、逆転写ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）によってｃＤＮＡを合成し、ファージベクターにパッケージングする。これをファージに感染させｃＤＮＡライブラリーを得る。続いて、ポリペプチドＮＡＳのアミノ酸配列（例えば、配列表の配列番号１参照）に基づいて作製したプローブをプラークハイブリダイゼーションさせて、目的とするＤＮＡを特定し、回収して取得することができる。
一方、配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲによって得ることもできるほか、市販されている種々のＤＮＡ合成装置によっても、上記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡを合成することができる。
【００４２】
また、（ｂ）に示すＤＮＡは、例えば配列表の配列番号５に記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜置換、欠失、挿入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突然変異処理によっても取得することが可能である。
なお、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子において、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を生じさせるような変異を導入する方法についても、上記で説明した通りである。
【００４３】
また、第二に、本発明のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子は、ポリペプチドＮＢＳを構成するアミノ酸残基のうち、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を有するポリペプチドであり、配列番号２８に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと組み合わせた場合にｐＨに依存せず甘味を有することを特徴とするＮＢＳ変異体をコードする遺伝子である。
つまり、既知のポリペプチドＮＢＳをコードする遺伝子において、１若しくは数個のアミノ酸残基に置換若しくは欠失の変異を生じさせるような変異を導入することによって、本発明のＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を得ることができる。
なお、ポリペプチドＮＢＳのアミノ酸配列に導入する変異については、上記（１）で説明した通りである。
【００４４】
このようなポリペプチドＮＢＳをコードする遺伝子は、具体的には、（ｃ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７７〜４２１からなる塩基配列を含むＤＮＡとして得ることができるが、これと実質的に同一の塩基配列、すなわち、（ｄ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７７〜４２１からなる塩基配列又は当該塩基配列の少なくとも一部から作成したプローブとなりうる塩基配列のＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ポリペプチドＮＡＳと共に味覚改変活性を有する二量体タンパク質であるネオクリンを形成しうるポリペプチドをコードするＤＮＡとして得ることもできる。
「ストリンジェントな条件」については、ポリペプチドＮＡＳをコードする遺伝子の場合と同様である。
【００４５】
このような、ポリペプチドＮＢＳをコードする遺伝子は、例えば、受粉から数週間後のクルクリゴ・ラチフォリアの果実から、ポリペプチドＮＡＳの場合と同様にして取得することができる。また、該配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７７〜４２１に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いたＰＣＲや、市販されている種々のＤＮＡ合成装置によっても、上記（ｃ）又は（ｄ）に示すＤＮＡを合成することができる。
また、（ｄ）に示すＤＮＡは、例えば配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、塩基番号７７〜４２１からなる塩基配列に、部位特異的変異導入法等を用いて、適宜置換、欠失、挿入、又は付加変異を導入することで得ることができる。また、既知の突然変異処理によっても取得することが可能である。
なお、ポリペプチドＮＢＳをコードする遺伝子において、１若しくは数個のアミノ酸に置換若しくは欠失の変異を生じさせるような変異を導入する方法についても、上記で説明した通りである。
【００４６】
なお、本発明の２つの遺伝子が、塩基配列の調整要素及び当該遺伝子の構造部分を含んでも良いことは、言うまでもない。
【００４７】
（６）本発明の組換えベクター及び形質転換体
本発明においては、ＮＡＳ変異体及びＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を高効率に発現させ、本発明の二量体タンパク質の工業生産を可能とするための宿主−ベクター系として、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を含む組換えベクター、及びＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を含む組換えベクターを提供する。更に、本発明は、上記２種の組換えベクターのうちいずれか１種、又はこれら２種を組み合わせて含む形質転換体をも提供する。
【００４８】
上記２種の組換えベクターを共に含む形質転換体を培養することにより、本発明の二量体タンパク質を製造することができる。また、ＮＡＳ変異体遺伝子を導入した組換えベクターを含む形質転換体を培養して得られたＮＡＳ変異体、及びＮＢＳ変異体遺伝子を導入した組換えベクターを含む形質転換体を培養して得られたＮＢＳ変異体を結合させることによって、本発明の二量体タンパク質を製造することもできる。
【００４９】
本発明の組換えベクターは、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子或いはＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーター機能を含む発現調節機能を備えている必要がある。
【００５０】
また、本発明の組換えベクターは、該ベクターに導入したＮＡＳ変異体遺伝子やＮＢＳ変異体遺伝子が宿主菌体内において発現して生産されるＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体を、宿主菌体外に分泌生産させるための機能を備えていることが望ましい。具体的には、例えば、ＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体をコードする遺伝子のほかに、宿主が分泌するタンパク質、例えば、麹菌（アスペルギルス・オリゼなど）を宿主とした場合、麹菌由来の分泌タンパク質α−アミラーゼをコードする遺伝子を適当なベクターに組み込み、ＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体とα−アミラーゼとの融合タンパク質として発現させることにより、宿主菌の菌体外に分泌生産させることができる。尚、α−アミラーゼの代わりに、グルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）を用いることもできる。
【００５１】
さらに、上述のように融合タンパク質として発現させる場合、本発明の組換えベクターは、融合タンパク質をＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体単独のタンパク質にするためのプロセシング機能も備えているのが望ましい。具体的には、例えば、麹菌のゴルジ体に存在するＫＥＸ２様プロテアーゼが認識するアミノ酸配列（Ｌｙｓ−Ａｒｇ，Ｌｙｓ−Ｌｙｓ，Ａｒｇ−Ｌｙｓ，Ａｒｇ−Ａｒｇ）をコードする塩基配列を利用して、該塩基配列をα−アミラーゼ遺伝子とＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体遺伝子との間に組み込んでこれを発現させ、後でＫＥＸ２様プロテアーゼを作用させることにより、形質転換体が産生した融合タンパク質からα−アミラーゼを単離し、ＮＡＳ変異体やＮＢＳ変異体の二量体タンパク質を得ることができる。
【００５２】
更に、上記のようにしてＫＥＸ２様プロテアーゼにより切断する場合には、ＫＥＸ２の認識配列付近の立体構造によって不正確になされることがあること、及び、本発明の二量体タンパク質はヘテロ２量体を形成し、切断部位付近の立体構造が複雑であると予想されることから、切断効率と切断の正確性の改良を行うことが好ましい。例えば、ＮＡＳ変異体及びＮＢＳ変異体のＮ末端のアスパラギン酸の直前にグリシン、アラニン、セリンなどのように分子量が小さく、側鎖も小さいために立体障害を生じ難いアミノ酸を３残基程度挿入することができる。
【００５３】
このような一連の操作は、ベクター構築キット（Multisite Gateway Three-Fragment Vector Construction Kit；Invitrogen社製）を利用することにより、より簡便に行うことができる。すなわち、該キットを利用して、（１）５’エントリークローンの作製、（２）目的遺伝子エントリークローンの作製、（３）３’エントリークローンの作製、（４）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による組換えベクターの作製、の順でコンストラクションを行って、所望の組換えベクターを得ることができる。一方、常法に基づき、必要な遺伝子断片を切り出し、ベクター上の適切なサイトに導入することによっても、組換えベクターを作製することが可能である。
【００５４】
本発明の組換えベクターの具体例としては、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を導入した組換えベクターとしてｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪ、ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を導入した組換えベクターとしてｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａなどを挙げることができる（実施例３参照）。
【００５５】
次に、本発明の形質転換体について説明する。本発明の形質転換体は、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子及び／又はＮＢＳ変異体をコードする遺伝子が適当な宿主に組み込まれてなるものである。つまり、本発明の形質転換体は、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を含む組換えベクター及び／又はＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を含む組換えベクターを含むものである。
【００５６】
本発明の組換えベクターの宿主としては、真核生物が望ましい。大腸菌等の原核生物を宿主とした場合は、菌体内にタンパク質がインクルージョンボディとして生産されるために、これを甘味を発揮できる正しいヘテロダイマーとするために、該インクルージョンボディを構成するＮＡＳ変異体及びＮＢＳ変異体を、塩化グアニジン等の溶解剤などを用いて一旦溶解した後、再構築（再構成）過程を経る必要があることから、好ましくない。これに対して、麹菌などの真核生物を宿主とすると、溶解剤などの試薬を用いる必要がない上に、再構築などの余分な過程を必要とせずに、ｐＨに依存せず甘味を有する二量体タンパク質として分泌生産させることが可能である。
【００５７】
本発明の組換えベクターを導入するための宿主としては、真核生物の中でも糸状菌が好ましく、その中でさらに好ましいのは麹菌である。また、麹菌の具体的なものとしては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）が挙げられ、さらにその代表的なものとしてアスペルギルス・オリゼＮＳ−ｔＡｐＥ株が挙げられる。
【００５８】
このような形質転換体の例として、本発明者らは、アスペルギルス・オリゼＮＳ−ｔＡｐＥ株に、ＮＡＳ変異体遺伝子を含む組換えベクター及びＮＢＳ変異体遺伝子を含む組換えベクターを導入して、アスペルギルス・オリゼＮＳｔＡｐＥ−ＮＣＬＨＡ株を得た。このアスペルギルス・オリゼＮＳｔＡｐＥ−ＮＣＬＨＡ株は、日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０７９９として寄託されている。
【００５９】
上記形質転換体を培養することによって、ｐＨに依存せず甘味を有する二量体タンパク質である本発明の二量体タンパク質を製造することができる。
形質転換体の培養は、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子とＮＢＳ変異体をコードする遺伝子の発現割合が特定比率となるような条件で行うことが望ましい。発現量がどちらか一方に偏りがあると、ホモダイマーが形成されてＮＡＳ変異体とＮＢＳ変異体からなるヘテロダイマーの生産割合が低くなり、本発明の二量体タンパク質の生産効率が低下する。
本発明においては、形質転換操作に用いるＮＡＳ変異体をコードする遺伝子とＮＢＳ変異体をコードする遺伝子の割合を１：５の比率とした際に得られた形質転換体の中から、高い確率で高発現株を選抜できた。尚、高い生産効率を達成するためには、ｐＨ８．０前後の培地条件で培養を行うことが好ましい。
このようにして、本発明の二量体タンパク質が効率的に生産可能である。
【００６０】
また、上述のように、ＮＡＳ変異体又はＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換体を別途培養し、ＮＡＳ変異体又はＮＢＳ変異体をそれぞれ生産させた後、得られた両サブユニットを結合させ、本発明の二量体タンパク質を得ることもできる。このとき、形質転換体の作出方法や培養方法は上記と同様とすることができる。
【実施例】
【００６１】
次に、実施例を示して本発明を実施するための最良の形態について詳細に記載するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６２】
実施例１
ＮＡＳポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミド（以下ｐＮＡＳと称する。）を作製した。次にＩｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いて変異を導入しＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミド（以下ｐＮＡＳＨ１４ＡＨ３６Ａと称する。）を得た。遺伝子への変異は、ポリペプチド鎖の１４位のヒスチジンのアラニンへの置換、及び３６位のヒスチジンのアラニンへの置換が起こるように導入された。
【００６３】
クルクリゴ・ラチフォリアの果実より、ｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡライブラリーを作製した。そしてＮＡＳ遺伝子断片をプローブとしてスクリーニングを行いＮＡＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンを取得した。取得したｃＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号５に示す通りであった。詳細な手法については国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例６に開示されている。
【００６４】
次に、該ｃＤＮＡクローンのうち、成熟ＮＡＳポリペプチドをコードする遺伝子領域（配列表の配列番号５記載の塩基配列のうち、塩基番号７０〜４０８からなる部分）を鋳型とし、配列表の配列番号６に示す塩基配列からなるプライマ−１（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’）と、配列表の配列番号７に示す塩基配列からなるプライマ−２（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣ−３’）とを使用したＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ−）に導入しＮＡＳ遺伝子クローン（ｐＮＡＳ）を得た。
【００６５】
さらに、ｐＮＡＳ上のＮＡＳポリペプチドの１４位のヒスチジンをコードするＤＮＡ配列を、アラニンをコードする配列に置換した。具体的には配列表の配列番号８に示すプライマー３（５’−ｇｇｃＧＣＣＧＧＣＡＴＡＣＡＧＡＧＴＴＴＧＣＣ−３’、但し、小文字は変異を挿入した部分を示す。）と、隣接する領域に逆向きにアニールするように設計された配列表の配列番号９に示すプライマー４（５’−ＴＣＣＣＴＣＡＣＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＴＡＴＡ−３’）を用いてｐＮＡＳを鋳型にしたＰＣＲを行った。この時、用いたプライマーは予めＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化を行った。ＰＣＲの反応組成液と反応条件は以下の通り。
【００６６】
反応組成液（２０μｌ当たり）
５×ｉＰｒｏｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４  μｌ
１０  ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．６  μｌ
リン酸化したプライマー３（１０  ｐｍｏｌ／μｌ）１  μｌ
リン酸化したプライマー４（１０  ｐｍｏｌ／μｌ）  １  μｌ
ｐＮＡＳ（１  ｎｇ／μｌ）  １  μｌ
ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＢｉｏＲａｄ社）  ０．２  μｌ
Ｈ２Ｏ  １１．２  μｌ
【００６７】
ＰＣＲ条件
９８℃  ３０秒間×１サイクル
（９８℃  ３０秒間、  ５５℃  ３０秒間、  ７２℃  ５５秒間）×３０サイクル
７２℃  １０分間×１サイクル
その後、４℃に冷却
【００６８】
得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、ライゲーション反応によりセルフライゲーションを行い変異導入された遺伝子を含むベクターを得た。これを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
【００６９】
得られたプラスミドに対し同様の操作を繰り返し、ＮＡＳポリペプチドの３６位のヒスチジンをコードするＤＮＡ配列を、アラニンをコードする配列に置換した。この際、配列表の配列番号１０に示すプライマー５（５’−ｇｇｃＣＴＧＧＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧ−３’、但し、小文字は変異を挿入した部分を示す。）と、隣接する領域に逆向きにアニールするように設計された配列表の配列番号１１に示すプライマー６（５’−ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＡ−３’）を用いた。このようにしてＮＡＳ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＡＳＨ１４ＡＨ３６Ａ）を得た。
【００７０】
実施例２
ＮＢＳをコードする遺伝子を含むプラスミド（以下ｐＮＢＳと称する。）を作製した。次に、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法を用いて変異を導入し、ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミド（以下ｐＮＢＳＨ１１ＡＨ１４ＡＨ６７Ａと称する。）を得た。遺伝子への変異は、ポリペプチド鎖の１１位のヒスチジンのアラニンへの置換、１４位のヒスチジンのアラニンへの置換及び６７位のヒスチジンのアラニンへの置換が起こるように導入された。
【００７１】
クルクリゴ・ラチフォリアの果実より、ｍＲＮＡを抽出しｃＤＮＡライブラリーを作製した。そしてＮＢＳ遺伝子断片をプローブとしてスクリーニングを行いＮＢＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンを取得した。取得したｃＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番号１２に示すとおりであった。詳細な手法については特開平６−１８９７７１号公報の実施例１〜１１において開示されている。
【００７２】
次に、該ｃＤＮＡクローンのうち、成熟ＮＢＳをコードする遺伝子の領域（配列表の配列番号１２記載の塩基配列のうち、塩基番号７７〜４２１からなる部分）を鋳型とし、配列表の配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマ−７（５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’）と、配列表の配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマ−８（５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＧＣＧ−３’）とを使用したＰＣＲを行った。得られたＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＳＫ−）に導入し、ＮＢＳ遺伝子クローン（ｐＮＢＳ）を得た。
【００７３】
さらに、ｐＮＢＳ上のＮＢＳポリペプチドの１１位のヒスチジンをコードするＤＮＡ配列を、アラニンをコードする配列に置き換えた。具体的には配列表の配列番号１５に示すプライマー９（５’−ｇｇｃＣＡＧＡＧＴＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＡＧＣ−３’、但し、小文字は変異を挿入した部分を示す。）と、隣接する領域に逆向きにアニールするように設計された配列表の配列番号１６に示すプライマー１０（５’−ＧＣＣＧＡＣＣＡＣＴＣＴＣＴＣＣＡＧ−３’）を用いてｐＮＡＳを鋳型にしたＰＣＲを行った。この時、プライマーは予めＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化を行った。反応組成液と反応条件は以下の通り。
【００７４】
反応組成液（２０μｌ当たり）
５×ｉＰｒｏｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４  μｌ
１０  ｍＭ  ｄＮＴＰ  １．６  μｌ
リン酸化したプライマー９（１０  ｐｍｏｌ／μｌ）１  μｌ
リン酸化したプライマー１０（１０  ｐｍｏｌ／μｌ）  １  μｌ
ｐＮＢＳ（１  ｎｇ／μｌ）  １  μｌ
ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＢｉｏＲａｄ社）  ０．２  μｌ
Ｈ２Ｏ  １１．２  μｌ
【００７５】
ＰＣＲ条件
９８℃  ３０秒間×１サイクル
（９８℃  ３０秒間、  ５５℃  ３０秒間、  ７２℃  ５５秒間）×３０サイクル
７２℃  １０分間×１サイクル
その後、４℃に冷却
【００７６】
得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、ライゲーション反応によりセルフライゲーションを行い変異導入された遺伝子を含むベクターを得た。これを大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
【００７７】
得られたプラスミドに対し同様の操作を繰り返し、ＮＢＳポリペプチドの１４位と６７位のヒスチジンをコードするＤＮＡ配列を、それぞれアラニンをコードする配列に置き換えた。この際、１４位における置換には、配列表の配列番号１７に示すプライマー１１（５’−ｇｇｃＧＴＣＧＧＣＡｇｃＣＡＧＡＧＴＴＴＧＣＣ−３’、但し、小文字は変異を挿入した部分を示す。）と、隣接する領域に逆向きにアニールするように設計された配列表の配列番号１８に示すプライマー１２（５’−ＴＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＣＣ−３’）を用い、６７位における置換には、配列表の配列番号１９に示すプライマー１３（５’−ｇｇｃＧＴＣＧＴＡＧＡＴＡＡＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＧ−３’、但し、小文字は変異を挿入した部分を示す。）と、隣接する領域に逆向きにアニールするように設計された配列表の配列番号２０に示すプライマー１４（５’−ＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＧ−３’）を用いた。
このようにして、ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミド（ｐＮＢＳＨ１１ＡＨ１４ＡＨ６７Ａ）を得た。
【００７８】
実施例３
ＮＡＳ変異体の発現ベクター（以下、ｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪと称する。）及びＮＢＳ変異体の発現ベクター（以下、ｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａと称する。）を構築し、アスペルギルス・オリゼを用いたタンパク質発現系を用いて本発明の二量体タンパク質を得た。このタンパク質発現系は、宿主のα−アミラーゼをキャリアタンパク質とする事で目的のタンパク質の分泌量を増加するように設計されたものである。また、キャリアタンパク質を切り離す目的で、ＫＥＸ２プロテアーゼ切断配列（リジン−アルギニン）がα−アミラーゼと目的タンパク質の連結部に挿入され、更に切断効率を上昇させるためにＮＡＳ変異体、及びＮＢＳ変異体のＮ末端のアスパラギン酸の直前に３残基のグリシンが挿入されるように設計されている。詳細は以前に出願人らによって出願された国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１において開示されている。但し、発現ベクターに挿入した遺伝子はＮＡＳ変異体遺伝子、及びＮＢＳ変異体遺伝子である。
【００７９】
また、宿主はアスペルギルス・オリゼＮＳ−ｔＡｐＥ株（ｎｉａＤ−、ｓＣ−、ｔｐｐＡ−、ｐｅｐＥ−）を用いた。この菌株は、国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１において用いられているＮＳ４株の二種類のプロテアーゼ遺伝子であるｔｐｐＡ及びｐｅｐＥ遺伝子を破壊した菌株である。プロテアーゼ遺伝子の破壊によりタンパク質発現量が増加するとされている。この菌株は、東京大学大学院  農学生命科学研究科  応用生命工学専攻  微生物学研究室より分与を受けた。この菌株について詳細は生物工学会誌２００６年、８４巻、３５１頁、及び第５８回日本生物工学会大会講演要旨集、１３１頁、１Ｈ１１−４「麹菌のプロテアーゼ遺伝子２重破壊株によるキモシンの生産」において示されている。
【００８０】
以下に発現ベクターの作製について示した。
ベクター構築キット（Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ Ｇａｔｅｗａｙ Ｔｈｒｅｅ‐Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して発現ベクター（ｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪ及びｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａ）を作製した。
このキットを用いた方法は、（１）５’エントリークローンの作製、（２）目的遺伝子エントリークローンの作製、（３）３’エントリークローンの作製、（４）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による発現ベクターの作製、の順でコンストラクションを行うものである。
【００８１】
具体的には、以下に示すような手順及び条件にて実施した。
（１）５’エントリークローンの作製
ａｍｙＢプロモーター及びそのＯＲＦの配列を含む５’エントリークローン（以下ｐｇ５’ＰＦａと称する。）を作製した。詳細は国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１において開示されている。
【００８２】
（２）目的遺伝子エントリークローンの作製
目的遺伝子のうち、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子のエントリークローン（以下、ｐＥ３ＧＮａＨＡ１と称する）は、以下のようにして作製した。すなわち、ｐＮＡＳＨ１４ＡＨ３６Ａを鋳型とし、Ｎ末端の前にＫＥＸ２切断配列及び３残基のグリシンを付加して設計された配列表の配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマー１５（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣ−３’、但し下線はａｔｔＢサイト配列を示す）と、Ｃ末端の後に終止コドンを含む塩基配列を付加して設計された配列表の配列番号２２に示す塩基配列からなるプライマー１６（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣ−３’、但し、下線はａｔｔＢサイト配列を示す）とを使用したＰＣＲを行った。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子のエントリークローンｐＥ３ＧＮａＨＡ１を得た。その後、ｐＥ３ＧＮａＨＡ１を大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
【００８３】
ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子のエントリークローン（以下、ｐＥ３ＧｂＨＡ１と称する）についても、基本的には上記ＮＡＳ変異体をコードする遺伝子の場合と同様に行った。すなわち、ｐＮＢＳＨ１１ＡＨ１４ＡＨ６７Ａを鋳型とし、Ｎ末端の前にＫＥＸ２切断配列及び３残基のグリシンを付加して設計された配列表の配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマー１７（５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＴＡＡＡＣＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＡＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＣＧ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列）と、Ｃ末端の後に終止コドンが入る配列を付加して設計された配列表の配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマー１８（５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＡＴＣＣＡＣＣＡＴＴＡＡＣＡＣＧＧＣＧ−３’、但し下線はａｔｔＢプライマー配列）とを使用したＰＣＲを行った。
ＰＣＲによって得られた増幅断片を、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入し、ＮＢＳ変異体をコードする遺伝子のエントリークローンｐＥ３ＧＮｂＨＡ１を得た。その後、ｐＥ３ＧＮｂＨＡ１を大腸菌ＤＨ５α株に導入し、得られたコロニーを増殖させた後、プラスミドを抽出した。
【００８４】
（３）３’エントリークローンの作製
ＡｍｙＢターミネーターと、アスペルギルス  ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のＡＴＰスルフリラーゼ（ｓＣ）遺伝子と、を含む３’エントリークローン（以下ｐｇ３’ｓＣＪと称する。）及び、ＡｍｙＢターミネーターのみを含む３’エントリークローン（以下ｐｇ３’Ｔａと称する。）を作製した。詳細は国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１において開示されている。
【００８５】
（４）３種類のエントリークローンとデスティネーション・ベクターとの組換え反応による発現ベクターの作製
上述の（１）で得られたｐｇ５’ＰＦａと、（２）で得られたｐＥ３ＧＮａＨＡ１と、（３）で得られたｐｇ３’ｓＣＪの３種類のエントリークローンを、デスティネーション・ベクターｐＤＥＳＴ  Ｒ４−Ｒ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、ａｔｔＬサイトとａｔｔＲサイトの組換え反応を行い、目的のＮＡＳ変異体発現ベクター（ｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪ）を得た。このようなｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪの作製過程及び構造の概略を、図３に示した。
【００８６】
また、（１）で得られたｐｇ５’ＰＦａと、（２）で得られたｐＥ３ＧＮｂＨＡ１と、（３）で得られたｐｇ３’Ｔａの３種類のエントリークローンを、デスティネーション・ベクターｐＤＥＳＴ  Ｒ４−Ｒ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し、ＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加え、ａｔｔＬサイトとａｔｔＲサイトの組換え反応を行い、目的のＮＢＳ変異体発現ベクター（ｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａ）を得た。このようなｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａの作製過程及び構造の概略を、図４に示した。
なお、上記の手法の詳細は国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１において開示されている。
【００８７】
（５）形質転換体の作製と高生産株の選抜
形質転換は、プントらの方法（「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．）」、２１６巻、ｐ．４４７−４５７、１９９２年）の方法を改変して、以下のようにして行った。
【００８８】
（ａ）プロトプラストの調製
ＰＤプレート（１リッターの水に対して３９ｇのポテトデキストロース（ニッスイ社製）を溶解しオートクレーブした後、滅菌済みプレートに分注）に、アスペルギルス・オリゼＮＳ−ｔＡｐＥ株（ｎｉａＤ−、ｓＣ−、ｔｐｐＡ−、ｐｅｐＥ−）を滅菌した竹串で塗布し、７日間３０℃でインキュベーションして分生子を生育させた。
これを１００ｍｌのＤＰＹ液体培地（２％Ｄｅｘｔｒｉｎ、１％Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．５％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ５．５）に竹串で掻き入れ、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養した後、滅菌したミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）で菌体を回収し、滅菌水で洗浄した。
１０ｍｌのＳｏｌ−１（１％Ｙａｔａｌａｓｅ（宝酒造社製）、０．６Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭ  Ｍａｌｅａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ５．５）を入れたＬ字管に菌体を移し、３０℃で３時間やさしく振とうし、プロトプラスト化した。
【００８９】
（ｂ）発現ベクターの導入
得られたプロトプラストをミラクロスに通して菌体残渣を除去し、等量のＳｏｌ−２（１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加え、２０００ｒｐｍ、４℃、ｂｒｅａｋ  ｏｆｆで遠心した。
沈殿をＳｏｌ−２で２回洗浄後、２００μｌのＳｏｌ−２に、１×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌになるように懸濁した。
ｐｇＦａ３ＧＮａＨＡ１ＳＪを２μｇ、ｐｇＦａ３ＧＮｂＨＡ１Ｔａを１０μｇずつ加え、３０分間氷上でインキュベートした。２５０μｌ、２５０μｌ、８５０μｌと段階的にＳｏｌ−３（６０％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）を加えてやさしく混合し、２０分間室温で放置した。５〜１０ｍｌのＳｏｌ−２を加えて遠心後、沈殿を５００μｌのＳｏｌ−２に懸濁した。
懸濁液を、予め分注し保温しておいた５ｍｌのＴｏｐ  Ａｇａｒ（１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ入り）に加え、下層培地（ＭＳプレート；１．２Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、０．２％ＮＨ４Ｃｌ、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％Ａｇａｒ、ｐＨ５．５）に流し込んだ。
その後、パラフィルムを巻いて空気穴を開け、３０℃で３〜５日間インキュベートした。得られたコロニーをＭプレート（０．２％ＮＨ４Ｃｌ、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＫＣｌ、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＫＨ２ＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００２％ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２％ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％Ａｇａｒ、ｐＨ５．５）に３回植え継いで形質を安定させた。１プレートにつき３０株の形質転換体が得られた。
【００９０】
（ｃ）ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）による小スケールでの異種タンパク質生産と培養液の回収
得られた形質転換体のうち１２株を前記Ｍプレートに塗布し、３０℃で２〜４日間インキュベートした。オートクレーブで滅菌した竹串で分生子を掻き取り、２０ｍｌのＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）（（ａ）に記載のＤＰＹ液体培地（ｐＨ５．５）の試薬の組成のうち、０．５％ＫＨ２ＰＯ４を０．５％Ｋ２ＨＰＯ４に替え、１Ｍ  ＮａＯＨ溶液でｐＨを８．０に調整）を入れた１００ｍｌフラスコにおいて３０℃、２００ｒｐｍで３日間振とう培養した。培養液から菌体をミラクロスで分離し、回収した。
【００９１】
（ｄ）生産株の選抜とウェスタンブロッティング解析
回収した培養液を、還元下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）に供した後、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に転写し、ウェスタンブロッティング解析を行った。
転写終了後の膜を、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに浸し、６０分間室温でゆるやかに振とうさせた。２．５ｍｌの５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに、０．５μｌの抗ネオクリン抗体を１次抗体として加え、これを膜と共にプラスチックバッグに入れて室温で６０分間放置した。ＴＢＳＴで膜を１０分間ずつ３回洗浄したのち、５％スキムミルクを含むＴＢＳＴに２．５μｌのアルカリフォスファターゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を２次抗体として加え、これを膜と共にプラスチックバッグに入れて室温で６０分間放置した。ＴＢＳＴで膜を１０分間ずつ３回洗浄したのち、１０ｍｌの反応液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１Ｍ  ＮａＣｌ）に、基質として６６μｌのＮＢＴと３３μｌのＢＣＩＰを加えたものの中に膜を移し、遮光条件で数分間反応させて発色させた。その結果から、本発明の二量体タンパク質を高発現する菌株を選択し、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＮＳｔＡｐＥ−ＮＣＬＨＡ株と命名した。この菌株は、日本国茨城県つくば市中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０７９９として寄託されている。
【００９２】
（６）大量培養
（ａ）分生子の回収
アスペルギルス・オリゼＮＳｔＡｐＥ−ＮＣＬＨＡ株の分生子を、ＰＤプレートに竹串で塗りつけ、３０℃で３〜７日間インキュベートした。分生子が成長したプレートに１０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を注ぎ滅菌スポイト（Sarstedt社製）で分生子を掻き取った。
これを１５ｍｌファルコンに回収し、１分間激しく攪拌したのち、滅菌したミラクロスで菌体残渣を取り除いた。４℃で４０００ｒｐｍ、５分間遠心した後、上清を捨て、１０ｍｌの０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を加え攪拌した。同じ操作をもう１度繰り返した後、４℃で４０００ｒｐｍ、５分間遠心し、上清を捨て、沈殿を１ｍｌの滅菌水に溶解した。回収液のうち数μｌを水で１０倍程度に希釈し、トーマ血球計算盤を用いて分生子の数を計測した。
【００９３】
（ｂ）ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）での大量振とう培養
ＤＰＹ液体培地（ｐＨ８．０）を１２０ｍｌずつ、５００ｍｌフラスコに加えたものを５つ用意した。それぞれに分生子を１×１０７ｃｅｌｌ／ｌとなるように加え、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振とう培養した。培養液から菌体をミラクロスで分離し、約４００ｍｌを回収した。
【００９４】
（７）精製
（ａ）硫安分画
上記（６）の大量培養で回収した培地に、飽和硫安濃度が６０％になるように硫安を加えたのち、３０分間インキュベートした。１００００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心し、沈殿を回収した。
【００９５】
（ｂ）フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製
硫安分画して得られた沈殿をＢｕｆｆｅｒＡ（３Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０）に溶解したのち、ＢｕｆｆｅｒＡに対して１晩透析した。回収後、溶液を０．４５μｍフィルターでろ過したものをサンプルとした。
カラムはＨＩＣ  ＰＨ−８１４（２０×１５０ｍｍ）（Ｓｈｏｄｅｘ社製）を用い、０〜２０分まではＢｕｆｆｅｒＡ、２０〜９０分の間はＢｕｆｆｅｒＡに対してＢｕｆｆｅｒＢ（２０ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０）を、０から１００％のグラジェント、さらに、９０〜１１０分まではＢｕｆｆｅｒＢを移動相として、流速３．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で、フェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる分画（検出；２８０ｎｍ）を行った。その結果を図５に示す。図５中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は２８０ｎｍの吸収を示す。溶出時間６０分付近（図５の矢印で示す領域）の画分を回収した。得られた画分の一部を電気泳動した後、ウェスタンブロッティング解析して目的のタンパク質の溶出を確認した。さらにこの画分の精製を進めた。
【００９６】
（ｃ）ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる精製
上述のフェニル疎水カラムクロマトグラフィーによる精製で得られた画分を水に対して透析後、凍結乾燥したのち、少量の水に溶解したものをサンプルとした。
カラムはＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷ（７．５×３００ｍｍ）（ＴＯＳＯＨ社製）を用い、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ−Ｎａ、ｐＨ５．０を移動相として、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎの条件で、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる分画（検出；２８０ｎｍ）を行った。その結果を図６に示す。図６中、横軸は溶出時間を示し、縦軸は２８０ｎｍの吸収を示す。溶出時間１６分付近（図６の矢印で示す領域）の画分を回収した。得られた画分の一部を電気泳動した後、ウェスタンブロッティング解析して目的のタンパク質の溶出を確認した。この画分を水に対して透析後、凍結乾燥をした。これで精製を完了した。
【００９７】
（８）糖鎖修飾の解析
変異体の糖鎖修飾について、以下の手順に従い解析した。すなわち、上記（７）において精製した二量体タンパク質を試料として、ＡＢＥＥ糖組成分析キットプラスＳ（ホーネンコーポレーション社製）を用いて、糖鎖の糖組成を分析した。また、精製した二量体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＮＡＳ変異体の分子量を推定した。
【００９８】
具体的には、精製した二量体タンパク質を試料として、糖鎖を還元糖に変換した。引き続き、酸加水分解により、糖タンパク質の糖鎖中に含まれるグリコシド結合を全て切断し、単糖に遊離した。生じた単糖は標識化をした後、ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０ＴｓＱＡカラム（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×７．５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣで分離し、３０５ｎｍの吸収で検出し、分析した。
【００９９】
分析の結果、ＮＡＳ変異体に付加された糖鎖の糖組成は、マンノースおよびＮ−アセチルグルコサミンが９:２の割合であった。また、ガラクトースが微量検出された。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＮＡＳ変異体の分子量はおよそ１４ｋＤａであった。ＮＡＳ変異体のアミノ酸配列から計算した推定分子量は１２２５３であるので、ＮＡＳ変異体には２ｋＤａ程度の糖鎖が付加していることが予想された。
以上より、ＮＡＳ変異体には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の糸状菌に典型的な高マンノース型のＮ結合型糖鎖が主に付加していると推定された。推定された糖鎖の例を図２に示した。
【０１００】
実施例４
官能評価を行い、異なるｐＨにおける本発明の二量体タンパク質の甘味強度を評価した。なお、本発明の二量体タンパク質としては、実施例３で精製したものを用いた。また、対照のネオクリンとしては、ネオクリン高生産株であるアスペルギルス・オリゼＮＳ−ＮＡＢ２株により生産されたネオクリンを精製したものを用いた。この株、生産方法、精製方法については、国際公開ＷＯ  ２００５／０７３３７２号公報の実施例１１に詳述されている方法を用いた。
評価は、甘味強度に応じて１〜７点の点数（ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｓｃｏｒｅ）をつけて行った。ここでいう「ｓｗｅｅｔｎｅｓｓ  ｓｃｏｒｅ」とは、甘味強度をアスパルテームの甘味強度と比較してスコア化したものである。各得点は、以下の通り各濃度のアスパルテームの甘味強度と対応する。
【０１０１】
７点：  ＞２．０  ｍＭ
６点：  ２．０  ｍＭ
５点：  ０．５−２．０  ｍＭ
４点：  ０．５  ｍＭ
３点：  ０．１−０．５  ｍＭ
２点：  ０．１  ｍＭ
１点：  ＜０．１  ｍＭ
すなわち、４点はモル濃度比でアスパルテームの１２.５倍の甘味強度を、６点は５０倍の甘味強度を、７点は５０倍より大きい甘味強度を、それぞれ示すことを意味する。
【０１０２】
官能評価は４名のパネラーで行った。官能試験前３０分間は食事を控えた。まず、０．１、０．５、２．０ｍＭのアスパルテーム溶液を３００μｌずつ味わい、各溶液の甘味強度を確認した。次に、本発明の二量体タンパク質またはネオクリンを、４０μＭ（１．０ｍｇ／ｍｌ）の濃度でｐＨの異なる３種類の溶液（１００ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、水（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ  酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０））に溶解した。これを１００μｌ舌の先に乗せ、３０秒間なじませた後、その甘味を評価した。
【０１０３】
結果を図７に示す。この際、ネオクリンは、ｐＨ４．０において２．０ｍＭ  アスパルテーム溶液相当の甘味を示した。また、ｐＨ７．０や８．０においては甘味強度が低下し、０．５ｍＭ  アスパルテーム溶液相当の甘味を示した。一方、本発明の二量体タンパク質は、ｐＨに関わらず、２．０ｍＭ  アスパルテーム溶液以上の強い甘味を示した。以上の結果より、本発明の二量体タンパク質は、ｐＨに依存せず甘味を有するタンパク質であることが確認された。
【０１０４】
実施例５
上述の官能評価において本発明の二量体タンパク質またはネオクリンを味わった後、続いて、ｐＨの異なる３００μｌの１００ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０，４．５，５．０，５．５，６．０）を順に味わい、酸により誘導される甘味の強度、すなわち味覚改変活性を評価した。
各ｐＨの酢酸ナトリウム溶液を味わったときの甘味強度を、実施例４と同様に評価した。ネオクリンによる結果を図８に、本発明の二量体タンパク質による結果を図９に、それぞれ示す。なお、図中、横軸のラベルは酢酸ナトリウム溶液のｐＨを示し、３つの棒グラフのｐＨは、実施例４においてタンパク質を溶解させた溶液のｐＨを示す。
その結果、ネオクリンではｐＨの低下に依存して甘味が増強したのに対して（図８）、本発明の二量体タンパク質では、いずれの溶液を味わった後にもネオクリンのような味覚改変活性は確認されなかった（図９）。以上より、本発明の二量体タンパク質は、ネオクリンに見られるような、口腔内で長時間残存する味覚改変活性は有しておらず、甘味料として優れていることが示された。
【０１０５】
実施例６
ヒト甘味レセプターであるｈＴ１Ｒ２‐ｈＴ１Ｒ３、およびキメラＧαタンパク質を培養細胞ＨＥＫ２９３Ｔにおいて共発現してシグナリング系を構築した。その培養細胞を用いて、カルシウムイメージング法によって本発明の二量体タンパク質の活性を評価した。
すなわち、評価するサンプルを味溶液として調製し、味溶液でシグナリング系を構築した培養細胞を刺激した。その際の応答細胞を、細胞内カルシウム濃度をモニターすることで検出して、応答強度を評価した。この評価系を用いる事で、評価サンプルの甘味強度のデータを客観的に得る事ができる。詳細を以下に記載する。
また、この評価系は本発明者らによって開発され、２００７年度日本農芸化学会大会で発表された。
【０１０６】
配列表の配列番号２５に記載のｈＴ１Ｒ２のｃＤＮＡおよび配列表の配列番号２６に記載のｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡをｐＥＡＫ１０ベクター（Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）に導入したプラスミドを、Ｄｒ．  Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｚｕｋｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｏｆ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）とＤｒ．  Ｎｉｃｈｏｌａｓ  Ｊ．  Ｐ．  Ｒｙｂａ（ＮＩＤＣＤ）に分与していただいた。
【０１０７】
配列表の配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるキメラＧαタンパク質であるＧ１５Ｇｉ３（様々なＧタンパク質共役型受容体と作用するＧ１５のＣ末端５残基をＧｉ３のものと置換したもので、甘味レセプターと効率よく作用することが知られている）をコードする遺伝子をＰＣＲ法にて作製し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した。
すなわち、ｒａｔ  Ｇ１５遺伝子配列（アクセッションＮｏ．：ＡＢ０１５３０８）の全長を含むプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号３０に示すプライマー１９（５’−ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴ−３’）と配列表の配列番号３１に示すプライマー２０（５’−ＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＴＴＣＧＴＣＣＡＧＧＴＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡ−３’）とを用いて、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメーラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社）でＰＣＲ増幅した。
プライマー１９は、４個のアデニン塩基−ＡｓｃＩ切断サイト−Ｋｏｚａｋ配列−ｒａｔ  Ｇ１５遺伝子配列の５’末端１８塩基という構造を持つフォワードプライマーである。プライマー２０は、４個のアデニン塩基−ＮｏｔＩ切断サイト−終止コドン−アミノ酸部分配列をＥＣＧＬＹに換える１５塩基−ｒａｔ  Ｇ１５遺伝子配列の２０塩基という構造を持つリバースプライマーである。
ＰＣＲ産物をＡｓｃＩ−ＮｏｔＩで処理して切り出したものを、ｐＥＡＫ１０ベクターをＡｓｃＩ−ＮｏｔＩで切断したものに導入して、Ｇ１５Ｇｉ３遺伝子を作製した。尚、このキメラＧαタンパク質は、米国科学アカデミー紀要  ９９巻、４６９２−４６９６頁、２００２年において公表されている。
【０１０８】
味溶液は、ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ），１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ，５ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，ａｎｄ  １．２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．２）に味物質、クエン酸およびＮａＯＨを添加し、細胞に投与後の最終ｐＨが４．７−８．０になるように調製した。味物質としては、実施例３で精製した本発明の二量体タンパク質（５．０μＭ）、対照実験の目的でネオクリン（２０．０μＭ）又は相対強度を求める目的でアスパルテーム（１０ｍＭ）を選択した。
なお、以下に記すが、味溶液で細胞を刺激する際には、予め測定系の容器内に入っている溶液により味物質の濃度が１．５倍に希釈される。
【０１０９】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１００ｍｍ  ｄｉｓｈ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件でＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ社）に１０％ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ（ＪＲＨ社）および０．０５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加した培地中で培養した。コンフルエントになる前に２日おきに継代した。
【０１１０】
トランスフェクションを行う場合、その前日に、細胞を直径３５ｍｍのｄｉｓｈに、翌日８０−９０％コンフルエントになるよう播種した。ｈＴ１Ｒ２のｃＤＮＡを含むベクター、ｈＴ１Ｒ３のｃＤＮＡを含むベクター、キメラＧαタンパク質をコードする遺伝子を含むベクター、およびトランスフェクション効率のマーカーｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１  （タカラバイオ社）を、ＤＮＡ導入比率が重量比（４：４：１：０．２）、導入量４．６−５．５  μｇとなるようにして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。トランスフェクション効率は、ＤｓＲｅｄ２の蛍光から見積もって、およそ６０−８０％程度であった。
【０１１１】
細胞は、トランスフェクション６時間後に培地を交換し、５０％に継代した。これを、トランスフェクション２４時間後にトリプシンではがし、黒い側面の９６ウェルｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ社）に１０６細胞を播種した。トランスフェクション４８時間後に培地を回収し、上記ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒに２．５μＭのカルシウムイオン指示薬  Ｆｕｒａ２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を溶解したものを１００μｌロードし、３７℃で３０分間静置した。次に、上記ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒでウェルをリンス後、ウェル中の溶液が５０μｌとなるようにして、２０分間室温で静置した。その後、ピペットを用いて１００μｌの上記で作製した味溶液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒに味物質を溶解したもの）を添加し、細胞を刺激した。
【０１１２】
細胞内カルシウム濃度の変化は、２つの励起波長３４０ｎｍ，３８０ｎｍによって生じる蛍光強度の比率（Ｆ３４０／Ｆ３８０）を、吸収波長５１０ｎｍを測定することで算出した。測定にはコンピュータ制御のｆｉｌｔｅｒ  ｃｈａｎｇｅｒ（Ｌａｍｂｄａ  １０−２；Ｓｕｔｔｅｒ社）、ＭｉｃｒｏＭａｘ  ｃｏｏｌｅｄ  ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）、およびｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＩＸ１０；Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を使用した。
なお、測定結果の画像は刺激投与後９０秒に渡って記録した。また、酸刺激による細胞の非特異的な応答を防ぐため、測定は室温静置後６０分以内に行った。
【０１１３】
測定結果を図１０、１１に示す。図中、横軸は味溶液のｐＨを示す。縦軸の「relative response（相対応答強度）」とは、濃い濃度（６．７ｍＭ）のアスパルテーム溶液に対する応答細胞の数で、味刺激に対する応答細胞の数を標準化することで算出した値である。なお、「応答細胞」とは、味刺激後３０−９０秒の間で、Ｆ３４０／Ｆ３８０  ｒａｔｉｏの増加が０．１５より大きいものを定義した。味物質を含まない溶液で刺激した細胞はほとんど応答しなかった。
【０１１４】
その結果、本発明の二量体タンパク質に対する細胞の応答は、酸性域、中性域、塩基性域の全てにおいて弱まる事は無かった（図１０）。一方、対照実験として行ったネオクリンに対する細胞応答は、ｐＨ６以上の中性域、塩基性域において弱まった。例えば、中性域であるｐＨ７付近では応答は約半分になり、塩基性域であるｐＨ８付近では応答は約１０分の１に弱まった（図１１）。これらのことから、本発明の二量体タンパク質は、ネオクリンとは異なり、ｐＨに依存せず甘味を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明により、既知のＮＡＳ、ＮＢＳポリペプチドとは異なり、新規のアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドＮＡＳ変異体、ＮＢＳ変異体が提供され、当該ポリペプチドを用いて、ｐＨに依存せず、それ自体が甘味を有する新規な二量体タンパク質を提供することが可能となった。
また、当該二量体タンパク質を用いて、食品等に実用可能であり、かつ新規な、ｐＨに依存せず甘味を有する組成物を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】推測されたネオクリンの構造変化を示した図である。
【図２】ＮＡＳ変異体に付加された糖鎖の推定糖鎖構造を示した図である。
【図３】ＮＡＳ変異体発現ベクターの作製法の概略を示した図である。
【図４】ＮＢＳ変異体発現ベクターの作製法の概略を示した図である。
【図５】本発明の二量体タンパク質をフェニル疎水カラムクロマトグラフィーにより精製した際の溶出パターンを示した図である。
【図６】本発明の二量体タンパク質をゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより精製した際の溶出パターンを示した図である。
【図７】甘味強度の官能評価結果を示すグラフである。
【図８】ネオクリンの残存する味覚改変活性評価結果を示すグラフである。
【図９】本発明の二量体タンパク質の残存する味覚改変活性評価結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の二量体タンパク質の細胞応答による甘味強度評価結果を示すグラフである。
【図１１】ネオクリンの細胞応答による甘味強度評価結果を示すグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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