【手続補正書】
【提出日】平成25年10月29日(2013.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化されている標的の単独個別ユニットを試料中で可視化する方法であって、
ａ）標的の個別ユニットの集団を含む試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の単独標的部位はそれぞれ、前記分別部分集団の個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つが酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、
２ｍＭ未満の量のペルオキシド化合物、
（ａ）の別々の単独標的部位に付随している酵素の第１基質および
前記酵素の第２基質
を含む水溶液（ｉ）中でインキュベートするステップであって、
前記第１基質は、
（３）ペルオキシド化合物の存在下で前記酵素と反応するとラジカルを発生させることができ、
（４）前記酵素およびペルオキシド化合物の両方の存在下で前記第２基質の分子を架橋させて、それによって、前記第２基質の水不溶性ポリマー生成物を生じさせることができる
水溶性の電子リッチな化合物であり、
前記第２基質は、前記酵素の基質および検出可能な標識として働くことができる少なくとも２つの化合物を含むコンジュゲート分子であり、検出可能な標識は、蛍光、発光、放射性もしくは発色物質または特異的結合対のメンバーからなる群から選択され、
それによって、第２基質の別々のデポジットを（ａ）の別々の単独標的部位に形成し、（ａ）の前記単独標的部位を可視化するステップとを含む方法。
【請求項２】
１つまたは複数の結合剤が、特異的結合対のメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵素が、ペルオキシダーゼまたはフェノールオキシダーゼ活性を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第１基質が、式（Ｉ）：
【化１】
2013508691.tif 000001
［式中、
Ｒ１は、アリールまたはビニルであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｈ、Ｎ−（Ｘ）２、Ｏ−（Ｘ）２（ここで、Ｘはアルキル、ビニルまたはアリールまたはＨである）であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同時にＨであることはなく、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素である］
の構造を含む化合物である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
化合物が、３，３’−ジアミノベンジジンまたはその誘導体、またはフェルラ酸またはその誘導体である、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
コンジュゲート分子が、式（ＩＩ）：
【化２】
2013508691.tif 000002
［式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり；
Ｒ２は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２または−ＳＨであり；
Ｒ４は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、−Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ５は、−Ｈ、−Ｏ−Ｘ、Ｎ（Ｘ）２または−Ｓ−Ｘであり、
Ｒ６は、−ＣＯＮ（Ｘ）２またはＣＯ−Ｘであり、
ここで、
Ｈは水素であり；
Ｏは酸素であり、
Ｓは硫黄であり、
Ｎは窒素であり、
Ｘは、Ｈ、アルキルまたはアリールである］
によって定義される、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の基質としての少なくとも１つの化合物を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
少なくとも２つの化合物が、式（ＩＩ）によって定義される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
式（ＩＩ）によって定義される少なくとも２つの化合物が、同一又は異なる化合物である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
化合物が、ケイ皮酸、フェルラ酸、コーヒー酸、アミノケイ皮酸もしくはシナピン酸またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
コンジュゲートが、少なくとも１つのチロシン残基を酵素の基質として含む、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
コンジュゲートにおいて、単独標的部位に付随している酵素の基質として働くことができる少なくとも２つの化合物がいずれも、コンジュゲート分子内において互いに、３０個以下の連続的に接続している原子によって分離されており、検出可能な標識は、前記基質のいずれからも、３０個以上の連続的に接続している原子によって分離されている、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
第２基質が、同一のコンジュゲート分子の集団または異なるコンジュゲート分子の集団によって表され、コンジュゲート分子は、請求項６から１１のいずれかに記載のいずれかと同様である、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
（ｂ）の単独標的部位が検出される、ステップ（ｃ）をさらに含む、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）が、
ｃ'）（ａ）の別々の単独標的部位に第２基質の別々のデポジットを含む（ｂ）の試料を、デポジットされた第２基質の検出可能な標識に特異的に結合することができる結合剤と共にインキュベートし、デポジットされた第２基質の１つまたは複数の分子と、前記結合剤の１つまたは複数の分子とを含む複合体を形成するサブステップと、
（ｃ''）試料（ｃ’）において、第２基質の別々のデポジットに結合している結合剤を検出して、それによって、単独標的部位を検出し、それによって、前記単独標的部位に付随している標的の個別単独ユニットを検出するサブステップとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
結合剤が、酵素を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
結合剤が、発色性、蛍光、発光もしくは放射性物質または特異的結合対のメンバーから選択される検出可能な標識を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
単独標的部位にある第２基質の単独で別々のデポジットが、円形の形状を有し、二次元フィールドにおいて視覚的に別々のドットとして同定される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
標的が、生物学的または化学的標的分子、粒子、分子もしくは細胞複合体、分子もしくは細胞構造、ウイルスもしくは微生物または前記標的分子、粒子、複合体、構造、ウイルスもしくは微生物の断片から選択される、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
標的が、生物学的マーカーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
固定化されていて、試料中で幅広い動的濃度範囲を示している標的の個別単独ユニットを試料中で検出する方法であって、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み；
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
標的の個別単独ユニットの第１分別部分集団を備えた１つまたは複数の別々の第１標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、前記第１分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つはオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、（ａ）の第１標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１の単独標的部位に付随している残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが前記標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、標的の個別単独ユニットの第２の分別部分集団で１つまたは複数の別々の第２の標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、前記第２分別部分集団の個別単独ユニットのうちの個別単独ユニット１つと、そのうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の前記試料を、第２単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第１集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、標的の第２集団の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）およびステップ（ｄ）の結合剤が、同じ又は異なる結合剤である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１集団の第２基質の分子および第２集団の第２基質の分子が、異なるコンジュゲート分子である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
試料中に存在する少なくとも２種の異なる固定化標的の個別単独ユニットを可視化および検出する方法であって、
ａ）試料を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つがオキシドレダクターゼ活性を有する酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第１標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第１標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第１標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第１単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第１標的部位はそれぞれ、第１標的の個別単独ユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｂ）（ａ）の試料を、第１単独標的部位に付随している酵素の第１基質、前記酵素の第２基質の分子の第１集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ａ）の第１単独標的部位に形成するステップと；
ｃ）（ｂ）の試料を、（ａ）の第１単独結合部位に付随している酵素の残りの活性をクエンチするのに十分な量の過酸化水素溶液と共にインキュベートするステップと；
ｄ）試料（ｃ）を、
（１）結合剤のうちの少なくとも１つが酵素を含み、
（２）結合剤のうちの少なくとも１つが第２標的の個別単独ユニットに直接結合することができる、
第２標的に結合することができる１つまたは複数の結合剤と共にインキュベートし、
それによって、第２標的の個別単独ユニットを備えた１つまたは複数の別々の第２単独標的部位を形成するステップであって、単独の別々の第２標的部位はそれぞれ、第２標的の個別のユニット１つと、結合剤のうちの少なくとも１つは酵素を含む１つまたは複数の結合剤との複合体を含むステップと；
ｅ）（ｄ）の試料を、第２単独結合部位に付随している第１基質、オキシドレダクターゼ活性を有する酵素の第２基質の分子の第２集団および請求項１のステップ（ｂ）によるペルオキシド化合物と共にインキュベートして、それによって、第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、（ｄ）の第２標的部位に形成するステップと；
ｆ）試料において、第１標的部位にある第１集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第１の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第１標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップと；
ｇ）試料において、第２標的部位にある第２集団の第２基質の分子の別々のデポジットを、第２の視覚的に識別可能なドットとして検出し、それによって、第２標的の１つまたは複数の個別単独ユニットを検出するステップとを含む方法。
【請求項２４】
少なくとも２種の標的が、異なる生物学的分子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
第１集団の第２基質分子および第２集団の第２基質が、異なる第２基質分子である、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
第２基質分子が、請求項６から１１のいずれかに記載の化合物から選択され、第１基質分子が、請求項４又は５に記載の化合物から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２７】
試料が、組織学的試料である、請求項１から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
定義されたステップのいずれかの前または後に、１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１から２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
ステップのうちの少なくとも１つが自動化されているか、または少なくとも１つの自動化ステップをさらに含む、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
固定化標的を試料中で定量的評価する方法であって、
ａ）請求項１から２９のいずれかに記載の方法によって、試料を処理するステップと；
ｂ）試料中の視覚的に識別可能なドットを定量するステップと；
ｃ）試料中の標的の量を評価するステップとを含む方法。
【請求項３１】
識別可能なドットを手動または自動で定量する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
標的の量を、参照マーカー、試料体積または試料面積当たりの標的の量として相対的に評価する、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
患者において疾患を診断する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から３２のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
【請求項３４】
患者における治療処置の効力を推定する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から３２のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
【請求項３５】
患者において疾患が発生する危険性または疾患からの回復の見込みもしくは失敗を予測する方法であって、患者から得られた生体試料を、請求項１から３２のいずれかに記載の方法に従って処理するステップを含む方法。
【請求項３６】
請求項１から３２のいずれかに記載の方法に従って、標的の単独ユニットを検出するステップを含むアッセイ。