【手続補正書】
【提出日】平成25年4月26日(2013.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1,3-ブタンジオール（1,3-BDO）経路を有する非天然微生物であって、1,3-BDOを産生するのに十分な量で発現する1,3-BDO経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該1,3-BDO経路が 3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKP脱水素酵素、2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼ、2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアート酸化還元酵素（脱アミノ化）、2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼ、3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素、AKPアミノトランスフェラーゼ、AKP酸化還元酵素（脱アミノ化）、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）、4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素、AKPデカルボキシラーゼ、4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オン酸化還元酵素（脱アミノ化）、4-アミノブタン-2-オンアンモニアリアーゼ、ブテノンヒドラターゼ、AKPアンモニア-リアーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）、アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）、アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）、3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ、及びクロトナーゼからなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の非天然微生物であって、
(a)  前記3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、bld、adhE、Msed_0709、mcr、asd-2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(b)  前記AKPチオラーゼが、ortA（α）、ortB（β）、Amet_2368（α）、Amet_2369（β）、Teth514_1478（α）、Teth514_1479（β）、TTE1235（α）、及びthrC（β）からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(c)  前記AKP脱水素酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(d)  前記2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT-II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGAl、UGAl、Abat、Gta-1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(e)  前記2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアート酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhAl、rocG、gdhl、gdh2、GDH、GDH2、ldh、及びnadXからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(f)  前記2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdcl、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、padl、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(g)  前記3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdh I、bdh II、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(h)  前記AKPアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT-II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta-1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(i)  前記AKP酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、rocG、gdh1、gdh2、GDH、GDH2、ldh、及びnadXからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(j)  前記2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(k)  前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(l)  前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）が、alrA、ADH2、yqhD、bdh I、bdh II、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(m)  前記4-ヒドロキシ,2-ブタノン還元酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される１つ以上の遺伝子によってコードされる、
(n)  前記AKPデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(o)  前記4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、got2、avtA、lysN、AadAT-II、dat、lat、ygjG、spuC、SkyPYD4、SkUGAl、UGAl、Abat、Gta-1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(p)  前記4-アミノブタン-2-オン酸化還元酵素（脱アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhAl、rocG、gdh1、gdh2、GDH、GDH2、ldh、nadX、kdd、及びlysDHからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(q)  前記4-アミノブタン-2-オンアンモニア-リアーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(r)  前記ブテノンヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crtl、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(s)  前記AKPアンモニア-リアーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(t)  前記アセチルアクリラートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、cadA、ldc、ldcC、AF323910.1：1…1299、odc1、VV2_1235、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK（pad）、padC、pad、adc、cbei_3835、CLL_A2135、及びRBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(u)  前記アセトアセチルCoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、bld、adhE、Msed_0709、mcr、asd-2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(v)  前記アセトアセチルCoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAPl_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(w)  前記アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(x)  前記3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
(y)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、Msed_1220、fadA、fadB、fadI、fadJ、及びfadRからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は、
(z)  前記クロトナーゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、ech paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、Msed_1220、fadA、fadB、fadI、fadJ、及びfadRからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項３】
1,3-BDO経路酵素を各々コードする2つ、3つ、4つ又は5つの外来性核酸を含む、請求項１又は２に記載の非天然微生物。
【請求項４】
前記1,3-BDO経路が、1セットの1,3-BDO経路酵素を含み、該セットの1,3-BDO経路酵素が、下記からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然微生物：
（a）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）；（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（b）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKP脱水素酵素；（3）2-アミノ-4-ヒドロキシペンタノアートアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）2-オキソ-4-ヒドロキシペンタノアートデカルボキシラーゼ；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（c）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（d）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（e）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（5）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（f）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアミノトランスフェラーゼ又は酸化還元酵素（脱アミノ化）；（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（g）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPデカルボキシラーゼ；（3）4-アミノブタン-2-オンアンモニア-リアーゼ；（4）ブタノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；並びに
（h）（1）AKPチオラーゼ；（2）AKPアンモニア-リアーゼ；（3）アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ；（4）ブタノンヒドラターゼ；及び（5）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（i）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（ケトン還元）；及び（3）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素；
（j）（1）アセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルコール形成）及び（2）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（k）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（CoA依存性、アルデヒド形成）；（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素（アルデヒド還元）；及び（3）4-ヒドロキシ-2-ブタノン還元酵素；
（l）（1）アセトアセチル-CoA還元酵素（ケトン還元）及び（2）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；
（m）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；及び（3）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）；並びに
（n）（1）4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ；（2）クロトナーゼ；（3）3-ヒドロキシブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）；及び（4）3-ヒドロキシブチルアルデヒド還元酵素。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然微生物であって：
(a)  前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある；
(b)  前記少なくとも1つの外来性核酸が、異種性核酸である；又は
(c)  前記微生物が、細菌、酵母、真菌の種である、前記非天然微生物。
【請求項６】
1,3-BDOを産生する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物を1,3-ブタンジオールを産生する条件下で十分な時間培養することを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物により産生される1,3-BDOを含む培地。
【請求項８】
請求項６に記載の前記方法により任意に産生される、生合成された1,3-ブタンジオール。
【請求項９】
請求項８に記載の生合成された1,3-ブタンジオールを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の生合成された1,3-ブタンジオールを含む、または該1,3-ブタンジオールから製造された、化学化合物、ポリマー又はその他の製品。
【請求項１１】
化学化合物、ポリマー又はその他の製品の製造における請求項８に記載の生合成された1,3-ブタンジオールの使用であって、該製造が任意に該1,3-ブタンジオールの化学的転換を含む、前記使用。
【請求項１２】
前記化学化合物、ポリマー又はその他の製品が1,3-ブタンジエン、ゴム、タイヤ、ラテックス又は樹脂である、請求項１０に記載の化学化合物、ポリマー又はその他の製品、又は請求項１１に記載の使用。