【手続補正書】
【提出日】平成21年5月13日(2009.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2007306872.tif 000001
で表されるプロシアニジンＢ１（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【化２】
2007306872.tif 000002
で表されるプロシアニジンＢ３（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
【請求項２】
前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、請求項１に記載の茶飲料。
【請求項３】
前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、請求項２に記載の茶飲料。
【請求項４】
茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた請求項１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
【請求項５】
血管内皮機能の改善作用を有する、請求項１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
一方、ポリフェノールの摂取量が多いほど、循環器疾患の発症が少ないことが明らかにされており、最近の研究では、ココア、チョコレート、ブドウ、ワインなどの主要なポリフェノールとしてプロアントシアニジンを豊富に含む食品やその素材には、ヒトにおいて血管内皮機能の改善効果が報告されている（非特許文献２〜４参照）。また、このプロシアニジンを含む松樹皮抽出物を含有するカプセル剤の経口投与による血管内皮機能の改善効果も確認されている（非特許文献５，６参照）。
【非特許文献１】Verma S, Anderson TJ, Circulation 2002;105:546-549
【非特許文献２】Stein JH, Circulation 1999;100:1050-5
【非特許文献３】Chou EJ, Am J Cardiol 2001;88:553-5
【非特許文献４】Agewall S, Eur Heart J 2000;21:74-8
【非特許文献５】Shand B, Phytother Res 2003;17:490-4
【非特許文献６】Young JM, Free Radic Res 2006;40:85-94
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明者らは、オリゴメリックプロアントシアニジンの分析方法を確立し、松樹皮抽出物中のプロアントシアニジンの定量的測定を可能にした（特開２００６−３８７６３号）。そして、本分析方法により、熱安定性を有するといわれているプロアントシアニジンが、殺菌処理により一部が分解及び／又は異性化されて低減することが判明した。この知見から、単に松樹皮抽出物を配合しただけでは、臨床上有効な血流改善組成物が得られないとの考えのもと、本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、procyanidin B1（ＰＢ１）及びprocyanidin B3（ＰＢ３）の合計量がプロアントシアニジン含量の指標となることを見出した。そして、このＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料を一日あたり３５０ｍＬずつ１〜１２週間継続摂取することにより血管内皮機能が顕著に改善されることがわかった。また、官能評価から、ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が、３０ｍｇ／Ｌ以下、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ以下であるプロアントシアニジン含有茶飲料が好ましいこと、また、熱水で抽出した松樹皮抽出物がエタノールで抽出した松樹皮抽出物と比べてフェルラ酸等のフェニルプロパノイド及びジヒドロケルセチン等のジヒドロフラボノール含量が少なく、香味面において極めて好ましいことを見出し、本発明を完成するに至った。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に関する。
１．  式（Ｉ）
【化１】
2007306872.tif 000003
で表されるプロシアニジンＢ１（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【化２】
2007306872.tif 000004
で表されるプロシアニジンＢ３（procyanidin B3；ＰＢ３）とを含有し、その合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上であるプロアントシアニジン含有茶飲料。
２．  前記ＰＢ１及びＰＢ３が、松樹皮抽出物中に含有された形で添加されたものである、上記１に記載の茶飲料。
３．  前記松樹皮抽出物が、松樹皮の熱水抽出物である、上記２に記載の茶飲料。
４．  茶の抽出液にプロアントシアニジンを配合して調合液を調製する調合工程、前記調合液を殺菌処理する殺菌工程、殺菌された調合液を容器に充填する充填工程を経て得られる、容器詰めされた上記１〜３のいずれかに記載の茶飲料。
５．  血管内皮機能の改善作用を有する、上記１〜４のいずれかに記載の茶飲料。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明は、プロシアニジンＢ１（procyanidin B1；ＰＢ１）とプロシアニジンＢ３（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を有効成分の指標とし、前記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量が６．４ｍｇ／Ｌ以上、好ましくは８．１ｍｇ／Ｌ以上含有する茶飲料を提供する。この茶飲料を、一日あたり３５０ｍＬ摂取するだけで、ＮＯの産生増強等により血管内皮機能を改善することができ、動脈硬化等の循環器疾患を予防することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
（プロアントシアニジン）
本発明の茶飲料は、プロアントシアニジン、特に松樹皮由来のプロアントシアニジンを有効成分として含有する。松樹皮由来のプロアントシアニジンは、松樹皮を５０〜１２０℃、好ましくは７０〜１００℃の熱水又は食品の製造に許容される溶媒（エタノール等）あるいはその水溶液で抽出して得ることができる（以下、前者を「水抽出物」、後者のエタノール又はエタノール水溶液による抽出物を「エタノール抽出物」と表記することもある）。松樹皮抽出物の原料となる松樹皮としては、フランス海岸松（Pinus Martima）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダ等の樹皮等が好ましく用いられるが、中でも、フランス海岸松の樹皮が好ましい。ここで、フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
このフランス海岸松の樹皮は、カテキン、プロアントシアニジン及び有機酸等の成分を含有する。抽出溶媒により得られる抽出物の組成は異なり、例えば、松樹皮中に含まれるフェルラ酸等のフェニルプロパノイド（ＰＰ）は、水抽出物ではほとんど含有されないが、エタノール抽出物には約１０％程度含有される。また、ジヒドロケルセチン等のジヒドロフラボノール（ＤＨＦ）も、水抽出物にはほとんど含有されないが、エタノール抽出物には、数％程度含有される。フェルラ酸やジヒドロケルセチンは優れた抗酸化剤として知られ、フェルラ酸については脳血管保護作用（第１４回日本循環薬理学会要旨集プログラムＡ５，２００４）や、血管内皮機能改善作用（特開２００３−２６１４４４号参照）が報告されている。したがって、エタノール抽出物を用いれば、プロアントシアニジンとフェルラ酸及び／又はジヒドロケルセチンとの相加的又は相乗的な血管内皮機能の改善効果が期待されるが、上記ＰＰやＤＨＦは香味面に影響を及ぼすことがあり、特に本発明のような飲料では、香味が持続的摂取のための重要な因子であることから、その影響は無視できない。官能検査において、エタノール抽出物と比較して水抽出物を添加した茶飲料が、良好な風味であると判断されたことから、本発明の茶飲料においては、水抽出物を用いることが好ましい。具体的には、フェルラ酸とジヒドロケルセチンを指標として、その含量の合計が、１０μｇ／ｍｇ以下、好ましくは５μｇ／ｍｇ以下となるような抽出物を用いることが好ましい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明では、松樹皮に抽出溶媒（熱水、エタノール、含水エタノール等）を加えて抽出後、濾過して得られる濾液、又はその精製品を抽出液として用いることもできるし、この抽出液を凍結乾燥等により粉末化したものを用いることもできる。また、松樹皮抽出物として市販されているフラバンジェノール（株式会社東洋新薬）、ピクノジェノール（シーベルヘグナー株式会社）等を用いてもよく、中でも、上記理由から水抽出タイプのフラバンジェノールを好適に用いることができる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
で表されるプロシアニジンＢ１（procyanidin B1；ＰＢ１）と、式（ＩＩ）
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
で表されるプロシアニジンＢ３（procyanidin B3；ＰＢ３）の合計量を指標とすることができる。本発明の血管内皮機能改善作用を有する茶飲料では、上記ＰＢ１及びＰＢ３の合計量を指標に、プロアントシアニジン又はそれを含有する植物抽出物の種類・添加量を選択及び調整するのが好ましい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の茶飲料中のＰＢ１及びＰＢ３含量は、例えば次のようにして測定することができる。まず茶飲料について、カラム等による前処理を行う。カラムとしては、ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０等を例示できる。ＳｈｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０を充填し、水で膨潤したカラム茶飲料を負荷して水で洗浄した後、３５％エタノール及び７０％エタノールで溶出する。７０％エタノール溶出画分を減圧濃縮下で濃縮後、メスフラスコでフィルアップし、各溶出画分をＨＰＬＣに供す。
（ＨＰＬＣ条件）
・カラム：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφ×150mm
・移動相：A-0.05%TFA/H2O、B-90%CH3CN/0.05%TFA/H2O、1ml/min
・グラジエントプログラム：9%Bアイソクラティク（15min）9%B→100% B（1min）100%Bアイソクラティク（10min）100%B→9%B（1min）で10min平衡化後、次の分析を開始
・検出：Ａ２２５ｎｍ
・インジェクション：１０μＬ
（茶飲料の製造方法）
本発明の茶飲料は、茶の抽出液にＰＢ１及びＰＢ３を含有するプロアントシアニジン、好ましくはプロアントシアニジンを含有する植物抽出物を添加して調製する。茶の抽出液は、原料茶葉を加温水にて抽出し、その茶抽出液から抽出残渣を取り除くことにより得られる。本発明でも用いる原料茶葉としては、煎茶、玉露、てん茶などの緑茶類、総称してウーロン茶と呼ばれる鉄観音、色種、黄金桂等の半発酵茶、紅茶と呼ばれるダージリン、アッサム、スリランカなどの発酵茶の他、包種茶、松葉茶、麦茶、その他ブレンド茶など特に限定されないが、中でも、緑茶類や包種茶が風味的な好ましさから好適に用いられる。また、茶葉の品種、産地、摘採時期、摘採方法、栽培方法などは何ら限定されず、どのような茶葉も対象とすることができ、例えば生茶葉等（葉や茎を含む）を原料茶葉とすることも可能である。抽出は、ニーダー等の抽出装置を用いた公知の方法で行うことができ、具体的には、原料茶葉に対して２０〜１００倍量、７０〜１００℃（好ましくは、７０〜９０℃）の抽出水で約１分〜２０分間、必要に応じて１回〜数回攪拌して、常圧又は加圧下で抽出を行えばよい。ここで、抽出に用いる抽出水は、純水（硬水、軟水、イオン交換水を含む）のほか、アスコルビン酸含有水溶液及びｐＨ調製水等を例示することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
２．血管機能評価（動物試験）
Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）雄性ラットを日本チャールスリバー社より購入し、一定期間馴化させた後、２０〜２１週齢で実験に供した。動物は、空調設備のある飼育室（ＳＰＦ、温度；２３．５±１．０℃、湿度；５５±１０％、換気回数；１２−１５回／時間、照明；７：００−１９：００／日）で飼育した。馴化期間中は、市販飼料（ＣＥ−２，日本クレア株式会社）、及び水道水を自由摂取させた。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
以上より、松樹皮抽出物の血管内皮機能改善作用の関与物質が、プロアントシアニジンであることが示唆された。
３．松樹皮抽出物の組成分析
動物試験で用いた松樹皮抽出物及びプロシアニジン高含有画分について、その組成分析を行った。具体的には、カテキン及びエピカテキン含量（Ｃ＋ＥＣ）、プロアントシアニジン含量（Ｐｒ）、フェニルプロパノイド含量（ＰＰ）、ジヒドロフラボノール含量（ＤＨＦ）及びその他の成分（ｏｔｈｅｒｓ）について測定した。それぞれの分析方法は以下のとおり。
１．Ｃ＋ＥＣ
松樹皮抽出物２ｍｇを１０ｍＬの１０％エタノールに溶解し、０．４５μｍのフィルターで濾過の後、下記条件のＨＰＬＣ（島津製作所 LC-10Aシステム／SPD-10Avp検出器）に供した。ＨＰＬＣ測定結果から、サンプル中のカテキン類を(+)-catechin及び(-)-epicatechinの５０μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬの１０％エタノール溶液で作成した検量線を用いて定量した。定量にはＡ２２５ｎｍの面積値を用いた。本条件で(+)-catechinおよび(-)-epicatechinの溶出時間は８．１ｍｉｎおよび９．５ｍｉｎであった。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
血管内皮機能は、被験者の反応充血時動脈血流量と安静時基礎血流量をプレティスモグラフィー（Plethysmograph EC6、Primetech Co.）を用いて測定した。安静時基礎血流量は、被験者が３０分間仰臥位となり安静となった後、利き腕と対側の腕にカフ３つとストレインゲージを巻いた１５分後からの前腕動脈血流量を測定した。測定は７回以上行い、その測定結果から５回のトリム平均を算出した。反応充血時動脈血流量は、安静時基礎血流量測定後に、上腕に巻いたカフに収縮期血圧より５０ｍｍＨｇ以上高い圧をかけて、５分間駆血した後に解放した際の解放後の前腕動脈血流量を０秒後より１５秒間隔で測定した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【表９】
2007306872.tif 000005
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
血管内皮機能は、実施例１と同様に、プレティスモグラフィー（Plethysmograph EC6、Primetech Co.）を用いて行った。ただし、血管内皮機能の測定は、摂取４週間前（前観察）、摂取直前（０週間）、摂取４，８，１２週間後及び摂取終了４週後（後観察）の計６回実施した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2007306872.tif 000006
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2007306872.tif 000007