(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の皮膚角層における測定目的のタンパク質の発現量を補正するための方法であって、
被験体から採取した皮膚角層から角層抽出試料を調製する工程、
角層抽出試料中の測定目的のタンパクの発現量を測定する工程、
角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量を測定する工程、及び
前記測定目的のタンパク質の発現量を前記シスタチンＡの発現量を用いて補正する工程、
を含む方法。
【請求項２】
被験体から採取した皮膚角層が、テープストリッピング法により採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
角層抽出試料中の測定目的のタンパクの発現量の測定、及び／又は前記角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量の測定が、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法、イムノクロマト法、無標識免疫センサを用いた定量的免疫アッセイにより行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
皮膚角層中の測定目的のタンパク質の発現に起因する肌状態又は皮膚疾患の評価において用いられる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定目的のタンパク質の発現量をシスタチンＡの発現量で補正することを含む、被験体の皮膚角層における測定目的のタンパク質の発現量を補正するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体因子量の多寡を論ずるには、一定単位あたりでの比較もしくは適切な内部標準での割り付けが必要である。例えば、血液・尿などに含まれる生体因子量は、液量あたりの因子量により表すことできる。臓器などの組織中の生体因子量は、組織重量あたりの因子量により表すことができる。また、抽出工程を経る場合には、抽出された総タンパク量あたりの因子量、又は抽出された内部標準量あたりの因子量により表すことができる。一方で、皮膚角層中の生体因子量測定における補正に関しては、角層重量により補正する場合には、角層採取時にメトラーでの重量測定が必要となるが、角層は微量であるため、測定が極めて困難である。また、角層抽出試料中の総タンパク量で補正する場合には、別途総タンパク質量を測定する必要があり（ＢＣＡ法、ブラッドフォード法、Ｌｏｗｒｙ法など）、測定のための機器（例えば、恒温槽、吸光光度計など）が必要となる。一方、何らかのタンパク質を内部標準として使用して補正する場合には、測定目的因子がタンパク質の場合には、測定目的タンパク質と同じ方法で測定することにより、追加での機器を必要とせずに、補正を行うことが可能である。角層中の因子を内部標準として使用する際の条件として、検出が可能であること（発現量がある程度多いこと）、比較対象内で発現量のばらつきが少ないこと、及び分解などのプロセッシングを受けていないことなどが挙げられる。
【０００３】
生細胞において一般に用いられる内部標準としては、チューブリン、ＧＡＰＤＨ、β−アクチンなどが知られている。これらの因子は、多くの組織において一定量発現しているハウスキーピング因子として知られており、内部標準としてよく使用されている。しかしながら、角層形成過程において、皮膚表皮細胞は分化の過程で核を消失し、タンパク質もまた加水分解などの生体内プロセッシングを受けながら角層へと分化するため、生細胞で内部標準として使用されている因子が角層での内部標準として使用できるとは限らない。実際に、チューブリンやGAPDH、β―アクチンの角層抽出試料中の因子測定における内部標準としての可能性を検討したが、発現量のばらつきや、角層中で分解されている可能性も高いため、角層試料中のタンパク質を定量する場合には、内部標準として活用することはできない。
【０００４】
皮膚角層において発現量が一定であるタンパク質としては、ケラチン２ｅやケラチン３が知られている（特許文献１）。しかしながら、皮膚角層中のケラチン２ｅやケラチン３の発現量と総タンパク質量との相関性は十分とはいえない。また、皮膚角層から抽出したケラチン２ｅやケラチン３は、ウェスタンブロット法などでは検出できないため、検出感度にも課題を有している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１８５８１１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Vasilopoulos Y et al., "Association analysis of the skin barrier gene cystatin A at the PSORS5 locus in psoriatic patients: evidence for interaction between PSORS1 and PSORS5.", European Journal of Human Genetics, 2008;16(8):1002-9
【非特許文献２】Blaydon DC et al., "Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.", The American Journal of Human Genetics, 2011;89(4):564-71
【非特許文献３】Vasilopoulos Y et al., "A nonsynonymous substitution of cystatin A, a cysteine protease inhibitor of house dust mite protease, leads to decreased mRNA stability and shows a significant association with atopic dermatitis.", Allergy. 2007;62(5):514-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、角層抽出試料中のタンパク質量を簡便かつ正確に定量するための新規な方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、鋭意検討した結果、驚くべきことに、角層抽出試料中のシスタチンＡが、皮膚角層において加水分解などのプロセッシングを受けておらず、個人差や肌状態による発現量のばらつきも少なく、また検出感度も高いことから、角層抽出試料中のタンパク質の定量に用いられる内部標準として極めて有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は以下の発明を包含する。
［１］  被験体の皮膚角層における測定目的のタンパク質の発現量を補正するための方法であって、
被験体から採取した皮膚角層から角層抽出試料を調製する工程、
角層抽出試料中の測定目的のタンパクの発現量を測定する工程、
角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量を測定する工程、及び
前記測定目的のタンパク質の発現量を前記シスタチンＡの発現量を用いて補正する工程、
を含む方法。
［２］  被験体から採取した皮膚角層が、テープストリッピングにより採取されたものである、［１］に記載の方法。
［３］  角層抽出試料中の測定目的のタンパクの発現量の測定、及び／又は前記角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量の測定が、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法を含む）、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法、イムノクロマト法、無標識免疫センサ（表面プラズモン共鳴、弾性表面波、水晶振動子マイクロバランスなどに基づいたバイオセンサー）を用いた定量的免疫アッセイなどにより行われる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］皮膚角層中の測定目的のタンパク質の発現に起因する肌状態又は皮膚疾患の評価において用いられる、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、皮膚角層中の測定目的のタンパク質量を簡便かつ正確に補正することが可能となる。これにより、採取された角層量や抽出効率のばらつきにかかわらず、皮膚角層中の測定目的のタンパク質に起因する肌状態を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】角層抽出試料のウェスタンブロット分析結果を示す写真である。
【図２】角層抽出試料中の全タンパク質量とシスタチンＡの発現量との相関性（Ｎ＝３４）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、測定目的のタンパク質の発現量をシスタチンＡの発現量で補正することを含む、被験体の皮膚角層における測定目的のタンパク質を定量するための方法を供する。
本発明の方法において内部標準として用いられるシスタチンＡは、表皮細胞、消化管粘膜上皮、白血球に存在するシステインプロテアーゼインヒビターであり、表皮ではコーニファイドエンベロープを形成することが知られている。シスタチンＡは、乾癬、剥離性魚鱗癬、アトピー性皮膚炎と関連性があることや（非特許文献１−３）シスタチンＡの不存在下では、培養したケラチノサイトの物理刺激に対する細胞間接着不全が確認されることが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、皮膚角層中のシスタチンＡの発現量とタンパク質の発現量との間に相関性を有することについてはこれまでに知られていない。
【００１３】
皮膚角層の採取方法は特に限定されるものではないが、簡便であり、非侵襲的であることを鑑みると、テープストリッピング法が好ましい。テープストリッピングとは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、剥がし、皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層試料を採取する方法である。テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールや水などで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば、約２×約６ｃｍ）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばＳｃｏｔｃｈ Ｓｕｐｅｒｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍａｉｌｉｎｇ Ｔａｐｅ（３Ｍ社製）、セロファンテープ（セロテープ（登録商標）；ニチバン株式会社）等が使用できる。繰り返しは２回、３回、４回、５回又はそれ以上であってよいが、採取した皮膚角層が顆粒層にまで至っていないことが好ましい。
【００１４】
採取した皮膚角層からの角層抽出試料の調製には、非イオン性の界面活性剤を含む、中性〜弱アルカリ性のバッファー、例えば、以下の抽出バッファー［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０］を用いることができるが、これに限定されるものではない。皮膚角層が付着したテープをはさみ等で細切し遠心チューブなどの容器に移し、少量の上記バッファーに浸漬し、転倒攪拌や超音波処理を行うことにより、効率よく可溶性成分を抽出できる。調製された角層抽出試料中の測定目的のタンパクの発現量及びシスタチンＡの発現量が測定される。このような測定は、特に制限されることなく、当業界において慣習的な方法によって行うことができるが、典型的には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法を含む）、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法、ウェスタンブロット法、イムノクロマト法、無標識免疫センサ（表面プラズモン共鳴、弾性表面波、水晶振動子マイクロバランスなどに基づいたバイオセンサー）を用いた定量的免疫アッセイを利用することができる。
【００１５】
このようにして測定された角層抽出試料中の測定目的のタンパク質の発現量を角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量を用いて補正することにより、皮膚角層における特定のタンパク質量を容易かつ正確に測定することが可能となる。このような補正は、典型的には、角層抽出試料中の測定目的のタンパク質の発現量を角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量で除することにより行われる。あるいは、角層抽出試料中の総タンパク質量と角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量を測定して、これらの測定量の相関関数を予め作製しておき、当該相関関数を用いることにより、角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量から角層抽出試料中の総タンパク質量を算出することができる。したがって、角層抽出試料中の測定目的のタンパク質の発現量を算出した角層抽出試料中の総タンパク質量で除することにより、角層抽出試料中の総タンパク質量あたりの相対量として角層抽出試料中の測定目的のタンパク質の発現量を補正することもできる。
【００１６】
本願明細書でいう「測定目的のタンパク質」とは、皮膚角層に存在する定量すべきタンパク質であって、典型的には、肌状態や皮膚疾患に関与し得るタンパク質を意味する。このようなタンパク質としては、例えば、ＳＣＣＡ１やブレオマイシンハイドロラーゼ、カスパーゼ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１ＲＡなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の方法により、被験者の個人差や肌状態にかかわらず、皮膚角層中の測定目的のタンパク質量を簡便かつ正確に補正することが可能となる。したがって、本発明の方法は、皮膚角層中の測定目的のタンパク質の発現に起因する肌状態又は皮膚疾患の評価において用いることができる。
【００１８】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
（１）角層抽出試料の調製
テープストリッピング法により、被験者の前腕部から皮膚角層を採取した。具体的には、適当なサイズ（約２×約６ｃｍ）に切ったセロファンテープ（ニチバン株式会社）片を被験者の前腕部の皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付けた後、均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることにより、セロファンテープに皮膚角層を付着させた。
その後、皮膚角層が付着したセロファンテープを裁断し、抽出バッファー［０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０, １ｍｌ］に浸漬させ、超音波処理（３０秒×４）を行い、角層抽出試料を作製した。当該角層抽出試料を下記のウェスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ分析及び総タンパク量測定に供した。
【００２０】
（２）ウェスタンブロット分析
抗β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社）、抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社）、抗β−マイクログロブリン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社）、抗シスタチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｊａｐａｎ社）、抗チューブリン抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗ＨＰＲＴ抗体（Ａｂｃａｍ社）、抗ケラチン２ｅ抗体（Ｐｒｏｇｅｎ社）、抗リボソームタンパク抗体（ａｖｉｖａ社）を用いて、ウェスタンブロット分析を行った。具体的には、上記で得られた角層抽出試料（ｎ＝１１）をＳＤＳ電気泳動後、ｉＢｌｏｔ Ｄｒｙ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてメンブレンに転写し、この転写されたメンブレンを洗浄・ブロッキングを行った後、各種抗体と４℃で一晩反応させた。さらに洗浄により抗体を除去したのち、ＨＲＰ結合二次抗体を反応させた。洗浄後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）により発光させた各タンパクバンドをＸ線フィルムに焼付け、バンドの有無により、上記抗体に対応する候補因子を検出した。
その結果、シスタチンＡ及びＧＡＰＤＨ以外の候補因子のシグナルは検出できなかった。シグナルが検出されたタンパク質のうち、ＧＡＰＤＨについては、約３７ｋＤａの単一のバンドが確認できたが、発現量が一定でないことから、内部標準としては活用できないことが判明した（データは示していない）。一方、シスタチンＡについては、全ての試料において、約１１ｋＤａの分子量の単一のバンドが見られ、発現量のバラつきが少ないため、内部標準として有用であることが確認された（図１）。各候補因子についての結果を以下の表に示す。
【表１】
0006656946.tif 000002
【００２１】
（３）ＥＬＩＳＡ分析
Ｈｕｍａｎ Ｃｙｓｔａｔｉｎ−Ａ（ＣＳＴＡ／ＳＴＦ１／ＳＴＦＡ）ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｃｕｓａｂｉｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて、推奨プロトコールに従い、上記で得られた角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量を測定した。
【００２２】
（４）総タンパク量測定
ＲＣ ＤＣ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、推奨プロトコールに従い、上記で得られた角層抽出試料中の総タンパク量を測定した。
【００２３】
（５）シスタチンＡの発現量と総タンパク量との相関性
上記で得られた角層抽出試料（Ｎ＝３４）中の総タンパク量（ｙ：ｍｇ／ｍｌ）とシスタチンＡ（ｘ：ｎｇ／ｍｌ）の発現量から、以下の式：
ｙ＝０．００２ｘ＋０．００２１２
で表される相関関数を得た（図２）。
角層抽出試料中のシスタチンＡの発現量と総タンパク量との相関係数は０．９１７８（Ｒ2＝０．８４２５）であった。したがって、皮膚角層中のシスタチンＡの発現量はタンパク質量と極めて高い相関性を有することが確認された。
【図１】
0006656946.tif 000003
【図２】
0006656946.tif 000004