【手続補正書】
【提出日】平成25年5月2日(2013.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体において後嚢混濁を処置または予防するための組成物であって、治療上有効な量のコンブレタスタチンを含む、組成物。
【請求項２】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
全身的に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
非全身的に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記被験体の眼に対して局所投与されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
眼内レンズを挿入するための手術の間に投与されることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
後嚢混濁の処置または予防のための医薬の製造のための、コンブレタスタチンの使用。
【請求項９】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
前記医薬が、全身投与のために適切である、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体の眼に対する局所投与のために適切である、請求項８に記載の使用。
【請求項１３】
後嚢混濁の処置または予防のための組成物であって、コンブレタスタチンを含む、組成物。
【請求項１４】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
全身投与のために適切である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体の眼に対する局所投与のために適切である、請求項１３に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】後嚢混濁を予防するためのコンブレタスタチン
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年７月２日に出願された米国仮特許出願第６１／２２２，８４１号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（Ｉ．背景）
加齢型の白内障は、世界中の失明の５０％を占める（ＷＨＯファクトシートＮ１４３）。白内障手術の最も一般的な合併症は、後嚢混濁（ＰＣＯ）であり、これは、術後の眼の水晶体嚢に残る水晶体上皮細胞の増殖、遊走、および上皮間葉の分化転換から生じる。ＰＣＯは、嚢のしわ、透明度の低下およびさらなる手術の必要性をもたらす。
【０００３】
白内障は極めて蔓延している疾患であり−毎年、イギリスだけで２５０，０００例の新しい症例があり、後嚢混濁（ＰＣＯ）を減少するための眼内レンズの設計は進歩しているが、既存の技術と組み合わせてＰＣＯを予防するための薬理学的解決法が所望される。コンブレタスタチンＡ４−ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）は、微小管の重合を阻害し、本明細書に実証されるとおり、水晶体上皮細胞増殖を阻害する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（ＩＩＩ．発明の要旨）
本発明の一局面は、後嚢混濁（ＰＣＯ）を処置するかおよび／または予防する方法を提供し、この方法は、後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体に対して、治療上有効な量のコンブレタスタチンを投与する工程を包含する。特定の実施では、このコンブレタスタチンは、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである。特定の実施では、このコンブレタスタチンは、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である。このコンブレタスタチンは全身的に、例えば、静脈内に、または非全身的に、例えば、被験体の眼に対して局所的に投与される。特定の実施では、このコンブレタスタチンは、眼内レンズを挿入するため手術の間に投与され、必要に応じてその後、その被験体の眼に対して同じまたは異なる用量の引き続く投与が全身にまたは局所に行われる。
【０００５】
本発明はまた、後嚢混濁の処置または予防のための、医薬の製造のための、コンブレタスタチンの使用を提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体に対して、治療上有効な量のコンブレタスタチンを投与することを包含する、後嚢混濁を処置または予防する方法。
（項目２）
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記コンブレタスタチンが全身的に投与される、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記コンブレタスタチンが非全身的に投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記コンブレタスタチンが前記被験体の眼に対して局所投与される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記コンブレタスタチンが、眼内レンズを挿入するための手術の間に投与される、項目６に記載の方法。
（項目８）
後嚢混濁の処置または予防のための医薬の製造のための、コンブレタスタチンの使用。
（項目９）
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４、またはその誘導体、プロドラッグもしくはアナログである、項目８に記載の使用。
（項目１０）
前記コンブレタスタチンが、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）またはその薬学的に許容され得る塩である、項目８に記載の使用。
（項目１１）
前記医薬が、全身投与のために適切である、項目８に記載の使用。
（項目１２）
前記医薬が後嚢混濁に罹患しているかまたは後嚢混濁を発症するリスクのある被験体の眼に対する局所投与のために適切である、項目８に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、パクリタキセルまたはＣＡ４Ｐに対する曝露後、９６時間の細胞数を４８時間での細胞数に対するパーセンテージとして示す。
【図２】図２は、パクリタキセルまたはＣＡ４Ｐに対する曝露後、４８時間での未処理のコントロールに比較した、処理した嚢についての細胞数のパーセンテージの増大／減少を示す。
【図３】図３は、試験因子に対する曝露後４８時間および９６時間での、未処理であるかまたは１０μＭのＣＡ４Ｐで処理した、ウシ水晶体細胞培養物の写真を示す。
【図４】図４は、１ｍＭのＣＡ４Ｐに対する３０分の曝露後、３０分、２４時間および４８時間での、ＢＩＥ細胞の抗チューブリンのウエスタンブロットを示す。
【図５】図５は、未処理かまたは１ｍＭのＣＡ４Ｐで３０分間処理し、次いで培養培地中で４８時間増殖させた、水晶体嚢上で培養された初代水晶体上皮細胞の写真を示す。
【図６】図６は、１ｍＭのＣＡ４Ｐに対する３０分の曝露後の７２時間にわたる細胞数を示す。
【図７】図７は、１ｍＭのＣＡ４Ｐに対して３０分間曝露した直後のＢＩＥ中のリン酸化Ｅｒｋ１／２のレベルを示す（図７）。ＧＡＰＤＨのレベルが、デンシトメトリーによって定量する場合、正規化のために用いられる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（ＩＶ．詳細な説明）
（Ａ．コンブレタスタチン）
最も一般的には、後嚢混濁を処置、予防または阻害するのに有用な現在公知またはこれから発見される任意のコンブレタスタチンまたはその誘導体を、本明細書に記載される組成物、液体処方物および方法で用いてもよい。
【０００８】
南アフリカの樹木であるＣｏｍｂｒｅｔｕｍ  ｃａｆｆｒｕｍ由来のコンブレタスタチン、例えば、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４）は、最初は、１９８０年代にチューブリン重合の強力なインヒビターとして特定された。ＣＡ４および他のコンブレタスタチン類（例えば、コンブレタスタチンＡ−１（ＣＡ１））は、高い親和性でチューブリン上のコルヒチン結合部位にある部位またはその近位の部位に結合することが示された。インビトロの研究によって、コンブレタスタチン類は、培養中の多様な範囲の腫瘍細胞型に対して強力な細胞傷害性因子であることが明確に示された。ＣＡ４ＰおよびＣＡ１Ｐ（それぞれＣＡ４およびＣＡ１のホスフェートプロドラッグ）が、その後、水不溶性の問題を克服するために開発された（各々が参照によって本明細書に援用される、米国特許第４，９９６，２３７号；同第５，４０９，９５３号；および同第５，５６９，７８６号を参照のこと）。ＣＡ１ＰおよびＣＡ４Ｐはまた、腫瘍組織への血流の迅速かつ急速な遮断を生じることが示されており、それは、腫瘍細胞自体に対するその因子の抗増殖効果とは別であり、かつ異なる。多数の研究によって、コンブレタスタチン類は、腫瘍の微小血管系内の血流の広範囲の遮断を生じ、二次的な腫瘍細胞死を生じることが示された（Ｄａｒｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１８２９−３４，（１９９７）；Ｃｈａｐｌｉｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９：１８９−９６，（１９９９）；Ｈｉｌｌら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２（３）：１４５３−８（２００２）；Ｈｏｌｗｅｌｌら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２（２Ａ）：７０７−１１，（２００２）。正常組織への血流は一般に、腫瘍への血流よりもＣＡ４ＰおよびＣＡ１Ｐによる影響はかなり受けにくい（Ｔｏｚｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：１６２６−３４（１９９９））。
【０００９】
ＣＡ４ＰおよびＣＡ４は、微小管のアセンブリを破壊して、新生の内皮細胞の細胞骨格（成熟内皮細胞の形状は、二次足場タンパク質アクチンによって維持される）の破壊をもたらす。これらの新しく形成されるかまたは異常な内皮細胞は、次に形状を平坦で細長い形状から丸いか球体に変化する。この内皮細胞形状の変化は、未熟および異常な血管では血管の閉塞を生じるが、正常な成熟血管には影響を有さない。選択性は、分化状態と同程度に内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｌｌ）の年齢に依存する。例えば、腫瘍血管系では、成熟内皮細胞は構造的に異常であり、かつアクチン細胞骨格を欠き、それによってＣＡ４Ｐに対して感受性になる。本発明の理論に限定されることなく、未熟上皮細胞に対する選択性によって、ＣＡ４Ｐおよび他のコンブレタスタチン類がＰＣＯを予防するのに特に有効であるようになると考えられる。
【００１０】
特定の実施形態では、コンブレタスタチンは、式Ｉ：
【００１１】
【化１】
2012532113.tif 000001
の化合物であり
ここで、各々のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、他と独立して、水素、Ｃ１〜６アルコキシ、およびハロゲンからなる群より選択され、ここでＲ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも２つは、水素ではなく；
Ｒ４は、Ｒ５、Ｒ６、１つ以上の同じもしくは異なるＲ７もしくはＲ６で置換されるＲ５、１つ以上の同じものもしくはＲ７もしくはＲ６で置換される−ＯＲ７、−Ｂ（ＯＲ７）２、−Ｂ（ＮＲ８Ｒ８）２、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−Ｏ−ＣＨＲ７Ｒ６、−Ｏ−ＣＲ７（Ｒ６）２、−Ｏ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ［（ＣＨ２）ｍＲ６］Ｒ６、−Ｓ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−Ｏ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−Ｓ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−ＮＨ−（ＣＨＲ７）ｍ−Ｒ６、−ＮＨ［（ＣＨ２）ｍＲ６］、−Ｎ［（ＣＨ２）ｍＲ６］２、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨＲ６Ｒ６および−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６からなる群より選択され；
各々のＲ５は独立して、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ４〜１１シクロアルキルアルキル、Ｃ５〜１０アリール、Ｃ６〜１６アリールアルキル、２〜６員のヘテロアルキル、３〜８員のヘテロシクリル、４〜１１員のシクロヘテロアルキルアルキル、５〜１０員のヘテロアリール、６〜１６員のヘテロアリールアルキル、ホスフェート、ホスフェートエステル、ホスホン酸塩、ホスホロジアミデート、ホスホラミデートモノエステル、ホスホラミデートジエステル、環状ホスホラミデート、環状ホスホロジアミデートおよびホスホンアミデートからなる群より選択され
各々のＲ６は、＝Ｏ、−ＯＲ７、Ｃ１〜３ハロアルキルオキシ、−ＯＣＦ３、＝Ｓ、−ＳＲ７、＝ＮＲ７、＝ＮＯＲ７、−ＮＲ８Ｒ８、ハロゲン、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＮＣ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−ＮＯ、−ＮＯ２、＝Ｎ２、−Ｎ３、−Ｓ（Ｏ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２ＯＲ７、−Ｓ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ８、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ８、−ＯＳ（Ｏ）Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２Ｒ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＯＲ７、−ＯＳ（Ｏ）２ＮＲ８Ｒ８、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ８、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ８Ｒ８、−Ｃ（ＮＲ７）ＮＲ８Ｒ８、−Ｃ（ＮＯＨ）Ｒ７、−Ｃ（ＮＯＨ）ＮＲ８Ｒ８、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ７、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ７、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ８Ｒ８、−ＯＣ（ＮＨ）ＮＲ８Ｒ８、−ＯＣ（ＮＲ７）ＮＲ８Ｒ８、−［ＮＨＣ（Ｏ）］ｎＲ７、−［ＮＲ７Ｃ（Ｏ）］ｎＲ７、−［ＮＨＣ（Ｏ）］ｎＯＲ７、−［ＮＲ７Ｃ（Ｏ）］ｎＯＲ７、−［ＮＨＣ（Ｏ）］ｎＮＲ８Ｒ８、−［ＮＲ７Ｃ（Ｏ）］ｎＮＲ８Ｒ８、−［ＮＨＣ（ＮＨ）］ｎＮＲ８Ｒ８および−［ＮＲ７Ｃ（ＮＲ７）］ｎＮＲ８Ｒ８からなる群より独立して選択される適切な基であり；
各々のＲ７は独立して、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ４〜１１シクロアルキルアルキル、Ｃ５〜１０アリール、Ｃ６〜１６アリールアルキル、２〜６員のヘテロアルキル、３〜８員のシクロヘテロアルキル、４〜１１員のシクロヘテロアルキルアルキル、５〜１０員のヘテロアリール、６〜１６員のヘテロアリールアルキル、ホスフェート、ホスフェートエステル、ホスホン酸塩、ホスホロジアミデート、ホスホラミデートモノエステル、ホスホラミデートジエステル、環状ホスホラミデート、環状ホスホロジアミデート、およびホスホンアミデートからなる群より選択され；
各々のＲ８は独立して、Ｒ７であるか、あるいは２つのＲ８はこれらが結合している窒素原子と一緒になり、５〜８員のヘテロシクリルまたはヘテロアリールが形成され、これは必要に応じて１つ以上の同じかまたは異なる追加のヘテロ原子を含み、かつこれは必要に応じて、１つ以上の同じもしくは異なるＲ７または適切なＲ６基で置換されてもよく；
各々のｍは独立して１〜３の整数であり；
各々のｎは独立して０〜３の整数であり；
ｐは１〜５の整数であり、かつ
ここで２つの隣接するＲ４基およびそれらの介在する原子は、中央のフェニル基に縮合された５〜８員の環を形成するように結合されてもよい。
【００１２】
特定の実施形態では、コンブレタスタチン誘導体は、コンブレタスタチンのホスフェートプロドラッグである。例示的なホスフェートプロドラッグは、式ＩＩ：
【００１３】
【化２】
2012532113.tif 000002
の化合物であって、ここで
Ｒａは、ＨまたはＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４であり；かつ
ＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４は各々が独立して、ＯＨ、−Ｏ−ＱＨ＋または−Ｏ−Ｍ＋であり、ここでＭ＋は一価または二価の金属陽イオンであり、かつＱは独立して：
ａ）少なくとも２つの窒素原子を含むアミノ酸であって、ここで窒素原子の１つがプロトンと一緒になって、四級アンモニウム陽イオンＱＨ＋を形成するアミノ酸；または
ｂ）少なくとも１つの窒素原子を含む有機アミンであって、プロトンと一緒になって、四級アンモニウム陽イオンＱＨ＋を形成するアミン、である。
【００１４】
式ＩＩの一実施形態では、ＲａはＨであり、ＯＲ１およびＯＲ２の１つがヒドロキシルであり、かつ他は−Ｏ−ＱＨ＋であり、ここでＱはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（「ＴＲＩＳ」または「トロメタミン」）である。
【００１５】
式ＩＩの別の実施形態では、ＲａはＨまたはＯＰ（Ｏ）（ＯＲ３）ＯＲ４であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、脂肪族有機アミン、アルカリ金属、遷移金属、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、ヌクレオシド、ヌクレオチド、アルカロイド、アミノ糖、アミノニトリル、または窒素系抗生物質である。
【００１６】
式ＩＩの別の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、Ｎａ、トロメタミン、ヒスチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエタノールアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、エチレンジアミン、２−（４−イミダゾリル）−エチルアミン、コリンまたはヒドラバミンである。
【００１７】
別の実施形態では、式ＩＩは、式ＩＩＩ：
【００１８】
【化３】
2012532113.tif 000003
の化合物で示され、ここで、
ＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４は各々独立して、ＯＨ、−Ｏ−ＱＨ＋または−Ｏ−Ｍ＋であり、ここでＭ＋は一価または二価の金属陽イオンであり、かつＱは独立して：
ａ）少なくとも２つの窒素原子を含むアミノ酸であって、ここで窒素原子の１つがプロトンと一緒になって、四級アンモニウム陽イオンＱＨ＋を形成するアミノ酸；または
ｂ）少なくとも１つの窒素原子を含む有機アミンであって、プロトンと一緒になって、四級アンモニウム陽イオンＱＨ＋を形成するアミン、
である。
【００１９】
式ＩＩＩの一実施形態では、ＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４のうちの少なくとも１つがヒドロキシルであり、ＯＲ１、ＯＲ２、ＯＲ３およびＯＲ４のうちの少なくとも１つが−Ｏ−ＱＨ＋であり、ここでＱはトロメタミンである。
【００２０】
１つの例示的な実施形態では、コンブレタスタチン誘導体は、ＣＡ４のアミンまたはセリンアミド誘導体、例えば、ＡＶＥ８０３２（Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａ，Ｆｒａｎｃｅ）である。別の例示的な実施形態では、コンブレタスタチン誘導体はＺＤ６１２６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ，ＵＫ）である。
【００２１】
本明細書に記載の方法での使用を意図する例示的なコンブレタスタチン塩は、その全体が参照によって本明細書に援用される、ＷＯ９９／３５１５０；ＷＯ０１／８１３５５；米国特許第６，６７０，３４４号；同第６，５３８，０３８号；同第５，５６９，７８６号；同第５，５６１，１２２号；同第５，４０９，９５３号；同第４，９９６，２３７号に詳細に考察される。
【００２２】
本明細書に開示される方法で用いられ得る、他のコンブレタスタチン誘導体またはコンブレタスタチンのアナログは、Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９８９；Ｃｕｓｈｍａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９１；Ｇｅｔａｈｕｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２；Ａｎｄｒｅｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９３；Ｍａｎｎｉｌａ，ら、Ｌｉｅｂｉｇｓ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９３；Ｓｈｉｒａｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４；Ｍｅｄａｒｄｅら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９５；Ｗｏｏｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５；Ｂｅｄｆｏｒｄら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９６；Ｄｏｒｒら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ，１９９６；Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９６；Ｓｈｉｒａｉら、Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，１９９７；Ａｌｅｋｓａｎｄｒｚａｋ，ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１９９８；Ｃｈｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９８；Ｄｕｃｋｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８；Ｈａｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８；Ｍｅｄａｒｄｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９８；Ｍｅｄｉｎａら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８；Ｏｈｓｕｍｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８；Ｏｈｓｕｍｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９８；Ｐｅｔｔｉｔ，ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９８；Ｓｈｉｒａｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８；Ｂａｎｗｅｌｌら、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９９９；Ｍｅｄａｒｄｅら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９９；Ｓｈａｎら、ＰＮＡＳ，１９９９；Ｃｏｍｂｅａｕら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０００；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０００；Ｐｉｎｎｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０００；Ｆｌｙｎｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００１；Ｇｗａｌｔｎｅｙら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００１；Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００１；Ｎｇｕｙｅｎ−Ｈａｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００１；Ｘｉａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００１；Ｔａｈｉｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１；Ｗｕ−Ｗｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００１；Ｊａｎｉｋら、Ｂｉｏｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００２；Ｋｉｍら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．，２００２；Ｌｉら、Ｂｉｏｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００２；Ｎａｍら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００２；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２；Ｈｓｉｅｈら、Ｂｉｏｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３；Ｈａｄｉｍａｎｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００３；Ｍｕら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００３；Ｎａｍら、Ｃｕｒｒ．Ｍ���ｄ．Ｃｈｅｍ．，２００３；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００３；Ｇａｕｋｒｏｇｅｒら、Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３；Ｂａｉｌｌｙら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００３；Ｓｕｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４；Ｓｕｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００４；Ｌｉｏｕら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；Ｐｅｒｅｚ−Ｍｅｌｅｒｏら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００４；Ｌｉｏｕら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；Ｍａｍａｎｅら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００４；Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；Ｄｕｃｋｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｍａｙａら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｍｅｄａｒｄｅら、Ｊ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００４；Ｓｉｍｏｎｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｖｏｎｇｖａｎｉｃｈら、Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．２００５；Ｔｒｏｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｂｏｒｒｅｌら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｈｓｉｅｈら、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２００５；Ｌａｗｒｅｎｃｅら、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．２００５；Ｈａｄｆｉｅｌｄら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｃｏｇｇｉｏｌｏａら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００５；Ｋａｆｆｙら、Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｍａｔｅｏら、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．２００５；ＬｅＢｌａｎｃら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５；Ｋｏｎｇら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００５；Ｌｉら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００５；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ  Ｎａｔ  Ｐｒｏｄ．２００５；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．２００６；Ｍｏｎｋら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ．２００６；Ｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｏら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｐｅｉｆｅｒら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｋａｆｆｙら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ
Ｃｈｅｍ．２００６；Ｂａｎｗｅｌｌら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｄｕｐｅｙｒｅら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６  Ｓｉｍｏｎｉら、Ｊ
Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｔｒｏｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｒｏｍａｇｎｏｌｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｐａｎｄｉｔら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｎａｋａｍｕｒａら、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ．２００６；Ｐｉｒａｌｉら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｂｅｌｌｉｎａ  ら、Ｂｉｏｏｒｇ
Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００６；Ｈｕら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｃｈａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００６；Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２００６；Ｆｏｒｔｉｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．，２００７；Ｄｕａｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２００７；Ｚｈａｎｇら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００７；Ｗｕら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００７；Ｓｕｎら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．２００７、ＷＯ０７／１４０６６２；ＷＯ０７／０５９１１８；ＷＯ０６／１３８４２７；ＷＯ０６／０３６７４３；ＷＯ０５／００７６３５、ＷＯ０３／０４００７７、ＷＯ０３／０３５００８、ＷＯ０２／５０００７、ＷＯ０２／１４３２９；ＷＯ０１／１２５７９、ＷＯ０１／０９１０３、ＷＯ０１／８１２８８、ＷＯ０１／８４９２９、ＷＯ００／４８５９０、ＷＯ００／７３２６４、ＷＯ００／０６５５６、ＷＯ００／３５８６５、ＷＯ９９／３４７８８、ＷＯ９９／４８４９５、ＷＯ９２／１６４８６、米国特許第７，３１２，２４１号；同第７，２２３，７４７号；同第７，２２０，７８４号；同第７，１３５，５０２号；同第７，１２５，９０６号；同第７，１０５，６９５号；同第７，１０５，５０１号；同第７，０８７，６２７号；同第７，０３０，１２３号；同第７，０７８，５５２号；同第７，０３０，１２３号；同第７，０１８，９８７号；同第６，９９２，１０６号；同第６，９１９，３２４号；同第６，８４６，１９２，６，８５５，７０２号；同第６，８４９，６５６号；同第６，７９４，３８４号；同第６，７８７，６７２号；同第６，７７７，５７８号；同第６，７２３，８５８号；同第６，７２０，３２３号；同第６，４３３，０１２号；同第６，４２３，７５３号；同第６，２０１，００１号；同第６，１５０，４０７号；同第６，１６９，１０４号；同第５，７３１，３５３号；同第５，６７４，９０６号；同第５，４３０，０６２号；同第５，５２５，６３２号；同第４，９９６，２３７号、および同第４，９４０，７２６号（その各々が、その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載される。
【００２３】
この組成物は、追加の活性剤を含むことができる。例示的な活性剤としては、鎮痛剤、麻酔剤または抗炎症剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、液体処方物中で用いられ得る活性剤は、抗炎症剤（例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、フルオシノロン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、フルオロメトロン、ベタメタゾンおよびトリアムシノロン）、ＡＣＥ阻害剤、内因性サイトカイン、基底膜に影響する因子、内皮細胞の増殖に影響する因子、アドレナリン作動薬またはアドレナリン遮断薬、コリン作動薬またはコリン遮断薬、アルドース還元酵素インヒビター、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、バシトラシン、ネオマイシン、ポリミキシン、グラミシジン、セファレキシン、オキシテトラサイクリン、クロラムフェニコール、リファンピシン、シプロフロキサシン、アミノシド類（ａｍｉｎｏｓｉｄｅｓ）、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、キノロン、セフタジジム、バンコマイシン、イミペネム、スルホンアミド類、スルファジアジン、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルフィソキサゾール、ニトロフラゾン、およびプロピオン酸ナトリウム）、抗真菌薬（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ）（例えば、アンホテリシンＢ、フルコナゾール、ケトコナゾールおよびミコナゾール）、抗アレルギー薬（例えば、クロモリンナトリウム、アンタゾリン、メタピリリン、クロルフェニラミン、セチリジン、ピリルアミンおよびプロフェンピリダミン）、降圧剤、昇圧剤、抗原虫薬、抗ウイルス剤、抗真菌剤（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｇｅｎｔ）、抗感染症薬、抗腫瘍剤、代謝拮抗剤および血管新生阻害剤である。
【００２４】
いくつかの実施形態では、追加の活性剤と組み合わせて用いられるコンブレタスタチンは、その追加の活性剤と同時に（すなわち、同時投与）、連続して（すなわち連続投与）、または独立して投与されてもよい。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は、同じ投与経路によって投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は両方とも、医療の専門家への１回の来診の間に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は両方とも、同じ医師への来診の間に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は、医師への２回以上の来診の間に投与される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は、同じ投与経路によって投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤は異なる投与経路によって投与される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンの投与および追加の活性剤の投与の組み合わせは、単独療法として用いる場合の量効果に比較して、一方または両方の薬剤の投与用量（例えば、コンブレタスタチンの投与容積、用量濃度、または量）を低減する。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンおよび追加の活性剤の組み合わせは、投与の間の時間を増大するかもしくは延長するか、および／または一方もしくは両方の剤の投与の頻度を低減する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処方物および薬学的処方物は、ＰＣＯを予防するために用いられる（ここでは限定するものではないがヒト被験体を含む被験体がＰＣＯを発症するリスクが高まっている）。ＰＣＯを発症するリスクが高まっている被験体とは、特定の被験体でＰＣＯが発症する可能性が高いという１つ以上の指標を有する被験体である。いくつかの実施形態では、処方物または薬学的処方物は、ＣＡ４Ｐのようなコンブレタスタチン化合物を含み、かつＰＣＯを処置または予防するために投与される。
【００２８】
本明細書に記載される処方物、液体処方物および方法は被験体におけるＰＣＯを処置、予防または阻害するために用いられ得る。後嚢混濁（ＰＣＯ）とは、後嚢細胞の過形成および遊走によって特徴付けられる障害であって、眼内レンズ（ＩＯＬ）配置のために白内障を除去したとき、後ろに残る水晶体後嚢の肥厚、不透明化および混濁を呈する。これは、視力を損なう場合がある。現在、ＰＣＯの発症を予防する方法も薬物も存在しない。ＰＣＯの現在の標準的な処置は、Ｎｄ−ＹＡＧレーザー（ネオジム−イットリウム−アルミニウム−ガーネット）を使用して、不透明化した水晶体後嚢の中央部分を破断して除去することである。極めて厚い不透明化した水晶体後嚢では、不透明を除去するために手技的な外科的手順が必要である場合がある。
【００２９】
本明細書において用いる場合、コンブレタスタチンの投与によってＰＣＯを「処置する、処理する（ｔｒｅａｔ）」とは、コンブレタスタチンの投与後、ＰＣＯの少なくとも１つの検出可能な身体的特徴または症状の進行が遅くなるか、停止するかまたは逆転されることを意味する。ＰＣＯの例示的な検出可能な身体的な特徴または症状としては限定するものではないが、後嚢細胞の過形成および視力の喪失が挙げられる。
【００３０】
本明細書において用いる場合、コンブレタスタチンの投与によってＰＣＯを「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」とは、コンブレタスタチンの投与後、ＰＣＯの少なくとも１つの検出可能な身体的特徴または症状の進行が遅くなるか、または停止されることを意味する。
【００３１】
本明細書において用いる場合、コンブレタスタチンの投与によってＰＣＯを「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」とは、コンブレタスタチンの投与後、ＰＣＯの検出可能な身体的特徴または症状が発症しないことを意味する。
【００３２】
素因があるかまたは予防の必要な、限定するものではないがヒト被験体を含む被験体は、本明細書の教示を考慮してこの分野の確立された方法および基準によって当業者によって特定され得る。当業者はまた、本明細書の教示を考慮してＰＣＯまたはＰＣＯに対する素因を特定するためのこの分野における確立された基準に基づいて阻害または処置の必要な個体を容易に診断し得る。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「被験体」とは一般には、本明細書に記載されるコンブレタスタチン類の投与から利益を得る場合がある任意の動物である。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチン類は哺乳動物被験体に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチン類は、ヒト被験体に投与される。
【００３４】
（Ｂ．投与）
本明細書に記載される組成物、方法および液体処方物は、限定するものではないがヒト被験体を含む被験体に対して１つ以上のコンブレタスタチン類を送達する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、方法および液体処方物は、ヒト被験体の水性媒体に対して１つ以上のコンブレタスタチン類を送達する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物、方法および液体処方物は、水晶体嚢に対して直接を含めて、被験体の眼に対して１つ以上のコンブレタスタチン類を、ＰＣＯを処置、予防または阻害するために有効な量でかつ期間で送達する。
【００３７】
非限定的な例として、本明細書に記載される組成物、液体処方物および方法は、硝子体、眼房水、強膜、結膜、強膜と結膜との間、網膜脈絡膜組織、黄斑、または被験体の眼の中または近位の他の領域に対して、これらの組織に対する直接投与によってまたは眼の周囲の経路によって、ＰＣＯを処置、予防または阻害するために有効な量でかつ期間にわたって投与され得る。有効な量および期間は、ＰＣＯの各々の処置、予防または阻害について、ならびに送達の各々の異なる部位について異なってもよい。
【００３８】
硝子体内投与は、いくつかの他の種類の眼科手順よりも侵襲的である。有害な影響の潜在的な危険性のせいで、硝子体内投与は、比較的健常な眼の処置には最適ではない場合がある。対照的に、眼の周囲の投与、例えば、結膜下投与は、硝子体内投与よりも侵襲性がかなり低い。コンブレタスタチンが眼の周囲の経路によって送達される場合、硝子体投与を用いて処置できるよりも健康な眼の患者を処置することは可能であろう。いくつかの実施形態では、結膜下注射を用いて眼の疾患または状態の発生を予防または遅延し、ここでは被験体の眼は、２０／４０以上という視力を有する。
【００３９】
「結膜下（ｓｕｂｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖａｌ）」の配置または注射とは本明細書において用いる場合、強膜と結膜との間の配置または注射をいう。結膜下とは時に、本明細書において「ｓｕｂ−ｃｏｎｊ（結膜下）」投与と呼ばれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、眼内レンズの外科的移植の前に、またはそれと同時に、またはその後に投与され得る。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、手術の間に投与される。関連の実施形態では、コンブレタスタチンは、手術の間に局所的に投与され、続いて同じまたは異なる量の１つ以上の引き続く用量が、全身的にまたは眼に局所的に投与される。特定の実施形態では、眼内レンズは、挿入の前にコンブレタスタチンに浸される。コンブレタスタチンは、一回投与されても、または複数回の用量で投与されてもよい。
【００４１】
液体処方物を投与するために用いられ得る投与経路としては、限定するものではないが、被験体における水性媒体への、例えば注射による、液体処方物の配置が挙げられ、これには限定するものではないが、ヒト被験体を含む被験体の眼への、限定するものではないが注射によるものを含む配置が挙げられるがこれらに限定されない。液体処方物は、全身的に投与されてもよく、これには限定するものではないが、以下の送達経路が挙げられる：直腸、膣、注入、筋肉内、腹腔内、動脈内、くも膜下、気管支内、槽内、皮膚、皮下、皮内、経皮、静脈内、頚内、腹内、頭蓋内、眼内、肺内、胸腔内、気管内、鼻腔内、口腔内（ｂｕｃｃａｌ）、舌下、経口、非経口または噴霧もしくはエアロゾル化（エアロゾル噴射剤を用いる）。
【００４２】
コンブレタスタチンを含む組成物および液体処方物は、種々の手順を用いて眼に直接投与され得、この種々の手順としては、限定するものではないが、（１）注射器および皮下注射針を用いた注射によってコンブレタスタチンが投与される手順、（２）コンブレタスタチンを注射するために特別に設計されたデバイスを用いる手順、（３）コンブレタスタチンを注射する前に、コンブレタスタチンまたはコンブレタスタチン組成物の貯蔵容器としての機能を果たすポケットを強膜内に外科的に形成する手順、が挙げられる。例えば、ある投与手順においては、外科医が眼の強膜内にポケットを形成し、続いてこのポケット内に、コンブレタスタチンを含む溶液または液体処方物を注射する。
【００４３】
他の投与手順としては、限定するものではないが、（１）コンブレタスタチンが眼の一部に直接配置されるように特別に設計された湾曲したカニューレを通じて、コンブレタスタチンの処方物が注射される手順、（２）コンブレタスタチンの圧縮型が眼の一部に直接配置される手順、（３）特別に設計された注射器または挿入器によってコンブレタスタチンを強膜内に挿入する手順、（４）コンブレタスタチンを含む液体処方物がポリマー内に組み込まれる手順、（５）外科医が小さな結膜切開を作成して、これを通じて縫合糸および任意のコンブレタスタチン送達構造物が通過し、強膜に隣接して構造物を固定する手順、（６）眼の硝子体内、あるいは記載されている任意の他の部位内に直接注射するために注射針が用いられる手順、が挙げられる。
【００４４】
本明細書に記載されている液体処方物は、例えば、エリキシル剤として、注射によって、直接用いられてもよく、局所的投与のために、限定するものではないが、点眼液を介して投与されてもよく、またはミニタブレット（ｍｉｎｉｔａｂｌｅｔ）中で投与されてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている液体処方物は、局所的投与によって投与されてもよい。いくつかの実施形態では、局所的投与は、眼の局所的投与である。いくつかの実施形態では、眼の局所的投与としては、限定するものではないが、点眼液、コンタクト（ｃｏｎｔａｃｔ）、涙点プラグ（ｐｕｎｃｔｕａｌ  ｐｌｕｇ）、または他の眼科用デバイスを介した投与が挙げられる。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所的に適用され、例としては、一日におよそ１、２、３、４または５回のいずれかで、眼に局所的に用いられる。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所的に、例としては眼に局所的に、およそ１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１または２８日ごとにおよそ１回以下適用される。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所的に、例としては眼に対して局所的に、ほぼ１日に１回以下適用される。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所的に、例としては眼に対して局所的に、およそ５日ごとに１回以下適用される。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所的に、例としては眼に対して局所的に、およそ１０日ごとに１回以下適用される。
【００４６】
特定の実施では、コンブレタスタチンは好ましくは、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内、静脈内、皮下または腹腔内に投与される。キャリアまたは賦形剤または賦形剤の混合物は、例えば、種々の極性もしくは非極性の溶媒、その適切な混合物、または油を含む溶媒または分散性媒体であってもよい。本明細書において用いる場合、「キャリア」または「賦形剤」とは、薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤を意味し、これには、任意のかつ全ての溶媒、分散剤または媒体、コーティング（単数または複数）、抗菌剤、等張性／低張性／高張性剤、吸収変性（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質のためのこのような物質および剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または剤が、活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物における使用が意図される。さらに、他のまたは補助的な活性成分をまた、最終の組成物中に組み込んでもよい。
【００４７】
コンブレタスタチンの溶液は、適切な希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、液体ポリエチレングリコール（類）、種々の油類、および／またはそれらの混合物、ならびに当業者に公知のその他のものの中で調製され得る。
【００４８】
注射用途に適切な薬学的形態としては、滅菌溶液、分散物、エマルジョンおよび無菌粉末が挙げられる。最終の形態は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならない。さらに、最終の薬学的形態は、混入を防御されなければならず、従って細菌または真菌のような微生物の増殖を阻害できなければならない。単独の静脈内または腹腔内用量が投与されてもよい。あるいは、緩徐な長期注入または多数回の短期の毎日の注入が利用されてもよく、これは代表的には１〜８日続く。隔日または数日間ごとに１回の投薬を利用してもよい。
【００４９】
無菌の注射可能な溶液は、１つ以上の適切な溶媒中に必要な量で化合物を組み込むことによって調製され、ここに当業者に公知である他の成分が必要に応じて追加されてもよい。無菌の注射用溶液は、必要に応じて種々の他の成分とともに、適切な溶媒中に必要な量でコンブレタスタチンを組み込むことによって調製される。滅菌手順、例えば、濾過を続いて行う。代表的には、分散物は、化合物を無菌のビヒクル（これはまた、分散媒体および上に示すような必要な他の成分も含む）中に組み込むことによって作製される。無菌粉末の場合、好ましい方法としては、任意の必要な成分が添加される真空乾燥または凍結乾燥が挙げられる。
【００５０】
注記するように、全ての場合、最終形態は、無菌でなければならず、かつ中空針のような注射デバイスを容易に通過可能でなければならない。適切な粘度は、溶媒または賦形剤の適切な選択によって達成されかつ維持され得る。さらに、分子または粒子状コーティング、例えば、レシチンの使用、分散物中の粒子サイズの適切な選択、またはサーファクタントの特性を有する材料の使用も利用され得る。
【００５１】
微生物の増殖の予防または阻害は、１つ以上の抗菌剤、例えば、クロロブタノール、アスコルビン酸、パラベン、チメロサールなどの添加を通じて達成され得る。糖または塩などの張度を変更する剤を含むことも好適である場合がある。
【００５２】
ヒトを含む哺乳動物では、有効量は、標準的な方法によって決定されて、体表面積に基づいて投与され得る。投薬量の相互関係は、動物の種々の大きさおよび種によって変化し、ヒトについては（体表面積のｍｇ／ｍ２に基づく）、Ｅ．Ｊ．Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，５０（４）：２１９（１９６６）に記載される。体表面積は、個体の身長および体重から近似的に決定され得る（例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｓｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．ｐｐ．５３７−５３８（１９７０）を参照のこと）。適切な用量の範囲は、体表面積１ｍ２あたり１〜１０００ｍｇ当量のコンブレタスタチン、例えば、５０〜５００ｍｇ／ｍ２である。
【００５３】
（Ｃ．組成物および処方物）
本明細書に記載される処方物は、コンブレタスタチンを含み、かつ一般には、任意の液体または半液体の処方物であってもよく、これには限定するものではないが、溶液、懸濁液、エマルジョンおよびゲルが挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積は、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約１０００μｌ未満、約９００μｌ未満、約８００μｌ未満、約７００μｌ未満、約６００μｌ未満、約５００μｌ未満、約４００μｌ未満、約３００μｌ未満、約２００μｌ未満、約１５０μｌ未満、約１００μｌ未満、約９０μｌ未満、約８０μｌ未満、約７０μｌ未満、約６０μｌ未満、約５０μｌ未満、約４０μｌ未満、約３０μｌ未満、約２０μｌ未満、約１０μｌ未満、約５μｌ未満、約３μｌ未満、または約１μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約２００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約１００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約２００μｌ〜約３００μｌ、約３００μｌ〜約４００μｌ、約４００μｌ〜約５００μｌ、約６００μｌ〜約７００μｌ、約７００μｌ〜約８００μｌ、約８００μｌ〜約９００μｌ、約９００μｌ〜約１０００μｌ、約５０μｌ〜約１５０μｌ、約０．１μｌ〜約１００μｌ、約０．１μｌ〜約５０μｌ、約１μｌ〜約４０μｌ、約１μｌ〜約３０μｌ、約１μｌ〜約２０μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、または約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約１０μｌ〜約２００μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約４０μｌ〜約１６０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約４０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して局所的に投与され、これは、約８０μｌである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、約５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約５．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約４．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約４．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約３．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約３．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約２．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約２ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約１．２ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約１．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約０．８ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約０．６ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、約０．４ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量が局所的に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるある量のコンブレタスタチンを含む処方物のある容積が投与される。いくつかの実施形態では、局所的に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約２０μｇ〜約４０００μｇ、約１０μｇ〜約２０００μｇ、約１０μｇ〜１７５０μｇ、約１５００μｇ〜１０００μｇ、または約１０μｇ〜１０００μｇのいずれかである。いくつかの実施形態では、局所的に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約１６６０μｇである。いくつかの実施形態では、局所的に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約８８０μｇである。いくつかの実施形態では、局所的に投与されるコンブレタスタチンの総量は、４０μｇである。いくつかの実施形態では、局所的に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約２８μｇである。
【００５６】
特定の容積の液体処方物が投与される場合、液体処方物を投与するために用いられ得る種々のデバイスの精度にはある程度の不正確性が存在することが理解される。特定の容積を記述する場合、これが標的の容積であることが理解される。しかし、特定のデバイス、例えば、インスリン注射器は、１０％超まで不正確であり、時には、２０％超まで不正確である。ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ＨＰＬＣ型のシリンジは一般に、１０％内まで正確であると思われ、１０μｌ未満の容積を注射するのに推奨される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の容積は、被験体の眼、例としては限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約５００μｌ未満、約４００μｌ未満、約３００μｌ未満、約２００μｌ未満、約１００μｌ未満、約９０μｌ未満、約８０μｌ未満、約７０μｌ未満、約６０μｌ未満、約５０μｌ未満、約４０μｌ未満、約３０μｌ未満、約２０μｌ未満、約１０μｌ未満、約５μｌ未満、約３μｌ未満、または約１μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、ウサギまたは被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは約２０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が硝子体に対して投与され、これは約１０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約１５０μｌ、約０．１μｌ〜約１００μｌ、約０．１μｌ〜約５０μｌ、約１μｌ〜約４０μｌ、約１μｌ〜約３０μｌ、約１μｌ〜約２０μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、または約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約１μｌ〜約１０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼の硝子体、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約２μｌ、約４μｌ、約５μｌ、約６μｌ、約８μｌ、約１０μｌ、約１２μｌ、約１４μｌ、約１６μｌ、約１８μｌ、または約２０μｌのいずれかである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼の硝子体、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約２μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼の硝子体、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは、約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼の硝子体に対して投与され、これは約８μｌである。
【００５９】
いくつかの実施形態では、硝子体内に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約２０μｇ〜約７５０μｇ、約２０μｇ〜約５００μｇ、または約３０μｇ〜約２００μｇのいずれかである。いくつかの実施形態では、硝子体内に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約４４μｇ、約１１０μｇ、約１３２μｇ、約１３３．５μｇ、約１７６μｇ、約２６４μｇ、約３５２μｇ、約４４０μｇまたは約９７６μｇのいずれかである。いくつかの実施形態では、硝子体内に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約４４μｇである。いくつかの実施形態では、硝子体内に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約１１０μｇである。いくつかの実施形態では、硝子体内に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約９６７μｇである。いくつかの実施形態では、４４μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約２μｌを投与することによってヒト被験体に対して硝子体内に投与される。いくつかの実施形態では、１１０μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約５μｌを投与することによってヒト被験体に対して硝子体内に投与される。いくつかの実施形態では、１７６μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約８μｌを投与することによってヒト被験体に対して硝子体内に投与される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１０００μｌ未満、約９００μｌ未満、約８００μｌ未満、約７００μｌ未満、約６００μｌ未満、約５００μｌ未満、約４００μｌ未満、約３００μｌ未満、約２００μｌ未満、約１００μｌ未満、約９０μｌ未満、約８０μｌ未満、約７０μｌ未満、約６０μｌ未満、約５０μｌ未満、約４０μｌ未満、約３０μｌ未満、約２０μｌ未満、約１０μｌ未満、約５μｌ未満、約３μｌ未満、または約１μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約２０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約０．１１〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約２００μｌ〜約３００μｌ、約３００μｌ〜約４００μｌ、約４００μｌ〜約５００μｌ、約６００μｌ〜約７００μｌ、約７００μｌ〜約８００μｌ、約８００μｌ〜約９００μｌ、約９００μｌ〜約１０００μｌ、約５０μｌ〜約１５０μｌ、約０．１μｌ〜約１００μｌ、約０．１μｌ〜約５０μｌ、約１μｌ〜約４０μｌ、約１μｌ〜約３０μｌ、約１μｌ〜約２０μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、または約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１μｌ〜約１０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１５０μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１０μｌ、約２０μｌ、約３０μｌ、約４０μｌ、約５０μｌ、約６０μｌ、約７０μｌ、約８０μｌ、約９０μｌ、または約１００μｌのいずれかである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約２０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約３０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、４０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対して結膜下に投与され、これは、約１０μｌ〜約５０μｌ、約１５μｌ〜約４５μｌ、約２０μｌ〜約４０μｌ、または約２５μｌ〜約３５μｌのいずれかである。
【００６２】
いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約５０μｇ〜約３ｍｇ、約１５０μｇ〜約７５０μｇ、約３００μｇ〜約１０００μｇ、約３００μｇ〜約９５０μｇ、約４００μｇ〜約９００μｇ、約４５０μｇ〜約８５０μｇ、約５００μｇ〜約８００μｇ、約５５０μｇ〜約７５０μｇ、または約６００μｇ〜約７００μｇのいずれかである。いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約２２０μｇ、約４４０μｇ、約５８７μｇ、約６３０μｇ、約６６０μｇ、約８８０μｇ、約１３２０μｇ、約１７６０μｇ、または約２２００μｇのいずれかである。いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約２２０μｇである。いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約４４０μｇである。いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約６６０μｇである。いくつかの実施形態では、結膜下に投与されるコンブレタスタチンの総量は、約８８０μｇである。いくつかの実施形態では、２２０μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約１０μｌを投与することによってヒト被験体に対して結膜下に投与される。いくつかの実施形態では、４４０μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約２０μｌを投与することによってヒト被験体に対して結膜下に投与される。いくつかの実施形態では、６６０μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約３０μｌを投与することによってヒト被験体に対して結膜下に投与される。いくつかの実施形態では、８８０μｇの量のコンブレタスタチンを含む液体処方物が、本明細書に記載される液体処方物の約４０μｌを投与することによってヒト被験体に対して結膜下に投与される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物の総容積が被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約１０００μｌ未満、約９００μｌ未満、約８００μｌ未満、約７００μｌ未満、約６００μｌ未満、約５００μｌ未満、約４００μｌ未満、約３００μｌ未満、約２００μｌ未満、約１５０μｌ未満、約１００μｌ未満、約９０μｌ未満、約８０μｌ未満、約７０μｌ未満、約６０μｌ未満、約５０μｌ未満、約４０μｌ未満、約３０μｌ未満、約２０μｌ未満、約１０μｌ未満、約５μｌ未満、約３μｌ未満、または約１μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約２００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約１００μｌ未満である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌ、約５０μｌ〜約２００μｌ、約２００μｌ〜約３００μｌ、約３００μｌ〜約４００μｌ、約４００μｌ〜約５００μｌ、約６００μｌ〜約７００μｌ、約７００μｌ〜約８００μｌ、約８００μｌ〜約９００μｌ、約９００μｌ〜約１０００μｌ、約５０μｌ〜約１５０μｌ、約０．１μｌ〜約１００μｌ、約０．１μｌ〜約５０μｌ、約１μｌ〜約４０μｌ、約１μｌ〜約３０μｌ、約１μｌ〜約２０μｌ、約１μｌ〜約１０μｌ、または約１μｌ〜約５μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約１０μｌ〜約２００μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約０．１μｌ〜約２００μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約５０μｌ〜約１５０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約３０μｌである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物のある容積が、被験体の眼、例としては、限定するものではないが、ヒト被験体の眼に対してテノン嚢下に投与され、これは、約１２０μｌである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、約５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約５．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約４．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約４．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約３．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約３．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約２．５ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約２ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約１．２ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約１．０ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約０．８ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約０．６ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、約０．４ｍｇ未満というコンブレタスタチンの総量がテノン嚢下に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される量のコンブレタスタチンを含む処方物の容積がテノン嚢下に投与される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンとは、コンブレタスタチンＡ−４またはそのアナログ、プロドラッグもしくは誘導体である。いくつかの実施では、コンブレタスタチンとは、コンブレタスタチンＡ−４ホスフェートである。
【００６６】
「コンブレタスタチンの総量」とは本明細書において用いる場合、患者および／または医師および／または他の医療専門家によって単回投与セッション（ｓｅｓｓｉｏｎ）の間に投与されるコンブレタスタチンの総量を指す。いくつかの実施形態では、単回投与セッションは、コンブレタスタチンの単回投与を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、コンブレタスタチンの２回以上の投与を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、単一の投与経路を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、複数の投与経路を包含する。従って、いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンの総量のうちの一部は、単回の投与セッションの間に別々に投与される。このような実施形態では、別々に投与される総量のうちの一部は、同じおよび／または異なる投与経路によって投与されてもよい。さらにいくつかの実施形態では、別々に投与される総量のうちの一部は、同じおよび／または異なる処方物で投与されてもよい。
【００６７】
「液体処方物の総容積」とは、本明細書において用いる場合、患者および／または医師および／または他の医療専門家によって、単回投与セッションの間に投与される液体処方物の総容積を指す。いくつかの実施形態では、単回投与セッションは、液体処方物の単回の投与を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、液体処方物の２回以上の投与を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、単一の投与経路を包含する。いくつかの実施形態では、１回の投与セッションは、複数の異なる投与経路を包含する。従って、いくつかの実施形態では、総容積の一部が単回投与セッションの間に別々に投与される。このような実施形態では、別々に投与される総容積のうちの一部は、同じおよび／または異なる投与経路で投与されてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは複数の眼の位置に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは硝子体内におよび結膜下に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは最初に、硝子体内に投与され、そして少なくとも１回の引き続く投与が結膜下に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、最初に結膜下に投与され、そして少なくとも１回の引き続く投与が、硝子体内に投与される。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは最初に、硝子体内に、結膜下に、またはテノン嚢下に投与され、そして少なくとも１回の（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎ）引き続く投与は局所的である。いくつかの実施形態では、同じ（すなわち、同一の）コンブレタスタチンの液体処方物が最初およびその後の投与のために用いられる。いくつかの実施形態では、異なる液体処方物が、最初およびその後の投与のために用いられる。いくつかの実施形態では、複数の眼の位置に対する投与が医師への１回の来診の間に行われる。いくつかの実施形態では、複数の眼の位置に対する投与が医師への別々の来診の間に行われる。
【００６９】
本明細書に記載される液体処方物のいくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、液体媒体中のＣＡ４Ｐの溶液または懸濁液である。本明細書に記載される液体処方物は、可溶化剤成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、可溶化剤成分とは、サーファクタントである。溶媒であってもよい成分と可溶化剤との間にはある程度の重複があり、従って、同じ成分はいくつかの系では、溶媒または可溶化剤のいずれかとして用いられ得ることに注意のこと。コンブレタスタチンおよび溶媒または可溶化剤またはサーファクタントのいずれかとみなされ得る成分を含む液体処方物は、溶媒の役割を果たす場合、溶媒とみなされ；その成分が溶媒の役割を果たしていない場合、その成分は、可溶化剤またはサーファクタントとみなされてもよい。
【００７０】
一般には、任意の可溶化剤または可溶化剤の組み合わせは、本明細書に記載される液体処方物中で用いられ得る。いくつかの実施形態では、可溶化剤はサーファクタントまたはサーファクタントの組み合わせである。多くのサーファクタントが可能である。種々の種類のサーファクタントの組み合わせを含む、サーファクタントの組み合わせもまた用いられてもよい。例えば、非イオン性、陰イオン性（すなわち、石鹸、スルホン酸塩）、陽イオン性（すなわち、ＣＴＡＢ）、両性イオン性、ポリマーまたは両性であるサーファクタントを用いてもよい。
【００７１】
用いられ得るサーファクタントは、目的のコンブレタスタチンと推定の溶媒および推定のサーファクタントとを混合すること、ならびに媒体に対する曝露後の処方物の特徴を観察することによって決定され得る。サーファクタントの例としては限定するものではないが、脂肪酸のエステルもしくはアミドもしくはエーテルのアナログ、またはそれらの親水性誘導体；モノエステルもしくはジエステル、またはそれらの親水性誘導体；あるいはそれらの混合物；モノグリセリドもしくはジグリセリド、またはそれらの親水性誘導体；あるいはそれらの混合物；富化されたモノ−もしくは／およびジグリセリドを有する混合物、またはそれらの親水性誘導体；親水性部分で部分的に誘導体化されたサーファクタント；モノエステルもしくはジエステルもしくは他のアルコールの複数−エステル、ポリオール、糖類もしくはオリゴ糖類もしくは多糖類、オキシアルキレンオリゴマーもしくはポリマーもしくはブロックコポリマー、またはそれらの親水性誘導体、あるいはそれらのアミドアナログ；アミン、ポリアミン、ポリイミン、アミノアルコール、アミノ糖、ヒドロキシアルキルアミン、ヒドロキシポリイミン、ペプチド、ポリペプチドの脂肪酸誘導体、またはそれらのエーテルアナログが挙げられる。
【００７２】
液体処方物は必要に応じてさらに、安定化剤、賦形剤、ゲル化剤、アジュバント、抗酸化剤、および／または本明細書に記載されるような他の成分を含んでもよい。
【００７３】
いくつかの実施形態では、液体処方物中のコンブレタスタチン以外の全ての成分は室温で液体である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、液体処方物は、放出改変剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。いくつかの実施形態では、この放出改変剤は、フィルム形成ポリマー成分である。このフィルム形成ポリマー成分は、１つ以上のフィルム形成ポリマーを含んでもよい。任意のフィルム形成ポリマーを賦形剤成分中で用いてもよい。いくつかの実施形態では、フィルム形成ポリマー成分は、水不溶性のフィルム形成ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、放出改変剤成分は、アクリル系ポリマー、例としては、限定するものではないが、ポリメタクリレート、例としては、限定するものではないが、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  ＲＬを含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、液体処方物中のコンブレタスタチンは、組成物の総重量のうち約０．０１〜約３０％；約０．０５〜約１５％；約０．１〜約１０％；約１〜約５％；または約５〜約１５％；約８〜約１０％；約０．０１〜約１％；約０．０５〜約５％；約０．１〜約０．２％；約０．２〜約０．３％；約０．３〜約０．４％；約０．４〜約０．５％；約０．５〜約０．６％；約０．６〜約０．７％；約０．７〜約１％；約１〜約５％；約５〜約１０％；約１５〜約３０％、約２０〜約３０％；または約２５〜約３０％を構成する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、液体処方物中のコンブレタスタチンは、組成物の総重量の約０．００１〜約１．００％を構成する。いくつかの実施形態では、液体処方物中のコンブレタスタチンは、組成物の総重量のうち約０．０７％、約０．０８％、０．０９％、０．１７％、１．３８％、１．４７％、２％、４％、４．８４％、または５％のいずれかを構成する。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、コンブレタスタチンの化合物であってもよい。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンは、ＣＡ４またはそのアナログ、プロドラッグもしくは誘導体であってもよい。いくつかの実施形態では、コンブレタスタチンはＣＡ４Ｐである。
【００７７】
液体処方物の溶媒成分は、例えば、組成物の総重量の、例えば、約０．０１〜約９９．９％；約０．１〜約９９％；約２５〜約５５％；約３０〜約５０％；または約３５〜約４５％；約０．１〜約１０％；約１０〜約２０％；約２０〜約３０％；約３０〜約４０％；約４０〜約４５％；約４０〜約４５％；約４５〜約５０％；約５０〜約６０％；約５０〜約７０％；約７０〜約８０％；約８０〜約９０％；または約９０〜約１００％を構成してもよい。
【００７８】
液体処方物の可溶化剤成分は、例えば、組成物の総重量の約０．０１〜約３０％；約０．１〜約２０％；約２．５〜約１５％；約１０〜約１５％；または約５〜約１０％；約８〜約１２％；約１０〜約２０％；約２０〜約３０％を構成してもよい。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、４０％〜１２０％センチポイズの粘度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、６０％〜８０％センチポイズの粘度を有する。
【００８０】
本明細書に記載される液体処方物は、粘度改変剤（ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）とともに投与されてもよいし、またはさらに粘度改変剤を含んでもよい。用いられ得る１つの例示的な粘度改変剤は、ヒアルロン酸である。ヒアルロン酸はグリコサミノグリカンである。これは、グルクロン酸およびグルコサミンの反復配列からなる。ヒアルロン酸は、身体の多くの組織および臓器に存在し、このような組織および臓器の粘性およびコンシステンシーに寄与する。ヒアルロン酸は、眼の硝子体を含めて、眼に存在し、コラーゲンとともにその粘性に寄与する。本明細書に記載される液体処方物はさらに、ヒアルロン酸を含んでもよいし、またはヒアルロン酸とともに投与されてもよい。粘度改変剤の他の非限定的な例としては、ポリアルキレンオキシド類、グリセロール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、キトサン、デキストラン、硫酸デキストランおよびコラーゲンが挙げられる。これらの粘度改変剤は、化学的に修飾されてもよい。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、コンブレタスタチンおよび溶媒成分を含む。この溶媒成分は、単一の溶媒または溶媒の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、溶媒は、グリセリン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールホルマール、エトキシジグリコール、トリエチレングリコールジメチルエーテル、トリアセチン、ジアセチン、コーン油、クエン酸アセチルトリエチル（ＡＴＣ）、乳酸エチル、ポリグリコール化カプリルグリセリド、γブチロラクトン、ジメチルイソソルビド、ベンジルアルコール、エタノール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール（ＰＧ）、種々の分子量のポリエチレングリコール、例としては限定するものではないが、ＰＥＧ３００およびＰＥＧ４００またはそれらの１つ以上の組み合わせである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、溶媒は、ポリエトキシ化ヒマシ油（（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（ＰＥＧ  ３５ヒマシ油））、カプリル酸のモノグリセリド類および／またはジグリセリド類（例えば、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ（Ｃ８））、アルキルアリールポリエーテルアルコールの非イオン性ポリマー（例えば、チロキサポール（エトキシ化ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノールホルムアルデヒドポリマー））、プロピレングリコール／エタノールキャリア中の５０％ホスファチジルコリン（例えば、Ｐｈｏｓａｌ（登録商標）５０ＰＧ）、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、エタノール、またはそれらの１つ以上の混合物である。いくつかのバリエーションでは、溶媒は少なくとも２つの溶媒の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの溶媒は、第一の溶媒、例えば、ポリエトキシ化ヒマシ油（（例えば、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（ＰＥＧ  ３５ヒマシ油））、プロピレングリコールモノラウレート、プロピレングリコールジカプリレート／ジカプレート、マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、またはアルキルアリールポリエーテルアルコールの非イオン性ポリマー（例えば、チロキサポール（エトキシ化ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェノールホルムアルデヒドポリマー））、および第二の溶媒、例えば、カプリル酸のモノグリセリド類および／またはジグリセリド類（例えば、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ（Ｃ８））を含んでいる。いくつかの実施形態では、この溶媒はさらに、エタノールを含んでもよい。いくつかの実施形態では、この溶媒はさらに水を含んでもよい。いくつかの実施形態では、液体処方物は局所に投与される。いくつかの実施形態では、液体処方物は、点眼液として投与される。いくつかの実施形態では、液体処方物は、ＰＣＯを処置または予防するために用いられる。
【００８３】
この溶媒成分は、例えば、組成物の総重量の約０．０１〜約９９．９％；約０．１〜約９９％；約２５〜約５５％；約３０〜約５０％；または約３５〜約４５％；約０．１〜約１０％；約１０〜約２０％；約２０〜約３０％；約３０〜約４０％；約４０〜約４５％；約４０〜約４５％；約４５〜約５０％；約５０〜約６０％；約５０〜約７０％；約７０〜約８０％；約８０〜約９０％；または約９０〜約１００％の水を含んでもよい。いくつかの実施形態では、水は、液体処方物の約１５〜約３０％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は、液体処方物の約８０〜約９０％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は少なくとも１５％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は液体処方物の少なくとも２０％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は、液体処方物の少なくとも２５％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は液体処方物の少なくとも約５％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は液体処方物の約１６％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は約２２％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は液体処方物の約２８％（ｗ／ｗ）を構成する。いくつかの実施形態では、水は液体処方物の約８３％（ｗ／ｗ）を構成する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、懸濁液であり、かつコンブレタスタチンおよび希釈剤成分を含む。いくつかの実施形態では、この希釈剤成分は、溶媒または可溶化剤として本明細書に列挙される１つ以上の成分を含む、ここでこの得られた混合物は懸濁液である。いくつかの実施形態では、液体処方物は部分的に溶液であり、かつ部分的に懸濁液である。
【００８５】
本明細書に記載される組成物および処方物は、ＰＣＯを処置、予防または阻害するために有効な量のコンブレタスタチン類を送達するために用いられてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物および処方物は、１つ以上の血管破壊剤（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および／または追加の活性剤を長期間にわたって送達する。
【００８６】
「有効量」とは、本明細書に記載されるような投与のためのコンブレタスタチンの「治療上有効な量」とも本明細書で呼ばれ、これは限定するものではないがヒト被験体を含む被験体に投与された場合、所望の治療効果をもたらすコンブレタスタチンの量である。種々の治療効果を達成するには、異なる有効量のコンブレタスタチンを要する場合がある。例えば、疾患または状態を予防するために用いられるコンブレタスタチンの治療上有効な量は、その疾患または状態を処置または阻害するために用いられる治療上有効な量とは異なる場合がある。さらに、治療上有効な量は、取り組まれている疾患または状態において熟知されたものに対して周知であるとおり、被験体の年齢、体重および他の健康状態に依存し得る。さらに治療上有効な量は、投与経路に依存し得る。従って、治療上有効な量は、コンブレタスタチンが投与されるあらゆる被験体において同じでなくてもよい。
【００８７】
ＰＣＯを処置、予防または阻害するためのコンブレタスタチンの有効量はまた、ＰＣＯまたはその症状を処置、予防または阻害するために有効な量のコンブレタスタチンとしても本明細書に言及される。
【００８８】
コンブレタスタチンのレベルがＰＣＯを処置、予防または阻害するために「治療上有効な量」であるか否かを決定するために、処方物はＰＣＯの動物モデルに投与されてもよく、この効果が観察され得る。さらに、用量設定の（ｄｏｓｅ  ｒａｎｇｉｎｇ）ヒト臨床治験を行って、コンブレタスタチンの治療上有効な量を決定してもよい。
【００８９】
一般には、コンブレタスタチンは、必要な送達期間にわたって被験体に対してまたは被験体の眼に対してコンブレタスタチンの治療上有効な量を送達し得る、任意の組成物または処方物中に処方され得る。組成物としては液体処方物が挙げられる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の処方物は、１つ以上の単位剤形（ｕｎｉｔ
ｄｏｓｅ  ｆｏｒｍ）で提供され、ここでこの単位剤形は、これが投与される疾患または状態を処置または予防するために有効である量の本明細書に記載される液体処方物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される処方物は、１つ以上の単位剤形で提供され、ここでこの単位剤形は、ＰＣＯを処置または予防するために有効である量の本明細書に記載の液体コンブレタスタチン処方物を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、この単位剤形は、投与される濃度で調製される。いくつかの実施形態では、この単位剤形は、被験体に対する投与の前に希釈される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、被験体に対する投与の前に水性媒体中に希釈される。いくつかの実施形態では、この水性媒体は、等張性媒体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される液体処方物は、被験体に対する投与の前に非水性媒体中に希釈される。
【００９２】
さらなる局面では、本明細書に記載されるような１つ以上の単位剤形を含むキットが本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、このキットは、１つ以上の疾患または状態を処置する使用のための１つ以上の包装および説明書を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、処方物または薬学的処方物と物理的接触をしていない希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、１つ以上の密閉容器中に、本明細書に記載の任意の１つ以上の単位剤形を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、任意の１つ以上の無菌単位剤形を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、この単位剤形は、限定するものではないが、無菌の密閉容器などの容器中にある。いくつかの実施形態では、この容器は、バイアル、アンプルまたは低容積のアプリケーター、例としては限定するものではないが注射器である。いくつかの実施形態では、低容積のアプリケーターは、ＰＣＯの処置のために、限定するものではないがＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチンを事前に充填される。本明細書に記載されるのは、限定するものではないがＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチンを含む処方物を事前に充填されたプレフィルド（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）低容積アプリケーターである。いくつかの実施形態では、低容積アプリケーターは、限定するものではないがＣＡ４Ｐなどのコンブレタスタチンを含む溶液を事前に充填され、かつ必要に応じてさらに、１つ以上の追加の成分（限定するものではないが、溶媒、サーファクタントおよび／または安定化剤を含む）を含む。
【００９４】
１つ以上の容器を含むキットが本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の低容積アプリケーターを含み、これは、限定するものではないがＣＡ４Ｐを含む処方物などの、コンブレタスタチンを含む本明細書に記載される処方物を事前に充填され、かつ必要に応じてさらに、１つ以上の追加の成分を含む。いくつかの実施形態では、このキットは、１つ以上の容器を含み、この容器としては、限定するものではないが、プレフィルド低容積アプリケーター（その使用のための説明書を備える）が挙げられる。さらなるバリエーションでは、キットは、ＣＡ４Ｐを事前に充填された１つ以上の低容積アプリケーター（ＰＣＯを処置するのにおけるその使用のための説明書を備える）を備える。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される容器は、二次的な包装中にある。
【実施例】
【００９５】
（Ｖ．実施例）
コンブレタスタチン−Ａ−４−ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）は、腫瘍内の血管系を破壊することが示された微小管重合化のインヒビターである（Ｑｕａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２２：１７３０−１７３７（２００８））。本発明者らは、白内障手術の共通の合併症である後嚢混濁（ＰＣＯ）の間、水晶体上皮細胞の上皮間葉移行（ＥＭＴ）の強力なインヒビターとして、ＣＡ４Ｐを試験した。抗チューブリン免疫蛍光およびイムノブロッティングによって示されるとおり、１μＭのＣＡ４Ｐに対する３０分の曝露は、インビトロで培養された固定されたウシ水晶体上皮細胞、およびその天然の基底膜、水晶体嚢上でインビトロで増殖された初代ウシ水晶体上皮細胞の両方において、微小管の網目状構造を効果的に脱重合するのに十分であった。この効果は、ＣＡ４Ｐ曝露後最大４８時間まで持続した。水晶体上皮細胞の増殖もまた、Ｋｉ６７免疫蛍光、ＭＴＴ−ベース細胞生存度アッセイ、およびフローサイトメトリーによる細胞周期分析で評価した場合、影響を受けていた。ＥＭＴの特徴、すなわち、細胞の極性および遊走挙動の喪失もまた、水晶体嚢で増殖した初代ウシ水晶体上皮細胞で調べたところ、ＣＡ４Ｐ曝露によって減少されていたが、細胞の多層化は影響されなかったようであった。これらの結果によって、既に十分特徴付けられた化合物での潜在的な新規な治療適用が特定され、ここでは１回の３０分曝露の後最大２日間有意な効果が達成された。
【００９６】
実施例１
（Ａ．実施例１：ＣＡ４Ｐは、水晶体上皮細胞増殖を阻害する）
初代ウシ水晶体上皮細胞を、生存因子は水晶体嚢から放出させて、無血清条件で培養した。パクリタキセルまたはコンブレタスタチンＡ−４ホスフェートをこの培養物に対して、１０ｎＭ、１００ｎＭまたは１０μＭという最終濃度まで添加した。細胞数は、各々の（水晶体）嚢について、試験因子の添加後４８時間および９６時間で測定した。１処理あたり２つの（水晶体）嚢をとって、細胞数は、４８時間の値のパーセンテージとして表した後に平均した。これによって、パーセンテージとして正規化された、４８時間の期間内（すなわち、４８時間〜９６時間）の細胞数の増大／減少が示される。ＣＡ４Ｐのコントロールと１０μＭとの間の独立Ｔ検定のＰ値は０．０００２である。コンブレタスタチンＡ−４ホスフェートは、９６時間の曝露にわたって細胞数の減少を誘導するのにパクリタキセルよりも効果的である（図１および図２）。
【００９７】
光学顕微鏡によれば、コントロールの培養物において、水晶体細胞がアクチンｓｍ／デスミン陽性細胞へ分化転換して（水晶体）嚢からの遊走を開始したとき、ＣＡ４Ｐは、細胞の形態に劇的な効果を有し、水晶体上皮の玉石状の特徴を保持している。写真は、ＦｕｊｉＦｉｎｅｐｉｘによる、水晶体嚢上の生きた初代ウシ細胞から撮った（図３）。未処理のコントロールは、上皮細胞シートおよび線維芽細胞様の細胞塊の混合物を示すが、処理したサンプル（ＣＡ４Ｐ  １０μＭ）は、レンズ上皮の典型的な玉石状外観を有する上皮シートしか示さない。
【００９８】
実施例２
（Ｂ．実施例２：ＣＡ４Ｐに対する一過性の曝露）
（１．培養細胞中でのチューブリン重合体の喪失）
ＢＭＩ−不死化ウシ水晶体上皮（ＢＩＥ）細胞（プラスチック上）、および初代ウシ水晶体上皮細胞（そのもともとのインビボの基底膜上）（眼の水晶体嚢）を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）−補充培地（３７℃）中で培養した後に１μＭのＣＡ４Ｐに対して３０分曝露して、その後にそれらの細胞を１０％のＦＣＳ補充培地に戻した。比較的短時間の曝露を選択して、白内障手術の期間に近似した。曝露後のある範囲の時点で、細胞を細胞生存度アッセイ（ＭＴＴベースのアッセイ、ＰＲＯＭＥＧＡ，ＵＫ）、イムノブロッティングまたは免疫蛍光に供した。
【００９９】
ＢＭＩ−不死化ウシ水晶体上皮細胞（ＢＩＥ細胞株，イギリス、ダラム大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｒｈａｍ）のＲｏｙ  Ｑｕｉｎｌａｎ研究室で作製）を、３７℃、５％ＣＯ２で、１０ｃｍの直径のペトリ皿中で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充した組織培養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）中で増殖させた。コンフルエンスに近くなった場合、それらを、１０％ＦＣＳ補充培地中で希釈した１μＭのコンブレタスタチンＡ４−ホスフェート（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ，ＵＫ）に３０分間曝露し、その後、細胞を１０％のＦＣＳ補充培地に戻した。ＣＡ４Ｐ曝露の終了直後、細胞を抽出して、Ｌｉｅｕｖｉｎら、１９９４（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２４（６）：９８５−９９６）に記載されるように、ダイマー／ポリマーのチューブリンの割合を評価した。要するに、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、次いで事前に３０℃に温めておいた５００μＬの溶解緩衝液（８０ｍＭのＰｉｐｅｓ−ＫＯＨ  ｐＨ６．８、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１０％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ））中で３分間抽出した。細胞溶解物を、細胞をかきとることなくペトリ皿の端部に収集させて、５００μＬの２×サンプル緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２ｍＭのＥＤＴＡ、２％のＳＤＳ、４０％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ））に添加し、その後に３分間煮沸した。この最初の抽出物は、ダイマーのチューブリン画分を含む。ペトリ皿中に保持されている細胞は、１０ｍＬの溶解緩衝液中で１回３０分間洗浄し、その後それらを５００μＬの１％ＳＤＳ中で３分間抽出した。次いで、細胞をかきとって、この第二の溶解物を５００μＬの２×サンプル緩衝液に添加し、続いて注射器に通し（ｓｙｒｉｎｇｉｎｇ）（２５Ｇのニードル、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｌａｎｃｅ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、３分間煮沸した。この第二の抽出物は、ポリマーチューブリン画分を含む。この手順をＣＡ４Ｐ曝露の終わった後、２４時間で繰り返した。全ての抽出物は、−２０℃で使用まで保持した。
【０１００】
ダイマー／ポリマーのチューブリンの割合を、ウエスタンブロットによって評価した。１５μＬの抽出物を１２％のアクリルアミド変性ゲルの１レーンあたりにロードして、これを２００Ｖで４０分間泳動し、続いて、ニトロセルロース膜上に０．８ｍＡ／ｃｍ２で２時間ブロットして、Ｔｗｅｅｎ−Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＴＢＳ：０．２％  Ｔｗｅｅｎ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中のミルク（α−チューブリン）またはウシ血清アルブミン（ＧＡＰＤＨ）のいずれかで室温で１時間ブロッキングした。ＴＴＢＳ中での単回の５分の洗浄後、次に膜を、ＴＴＢＳ中の一次抗体（α−チューブリン：マウスモノクローナル、１／１０００、イギリス、ダラム大学のＫａｒａｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕ博士から贈呈；ＧＡＰＤＨ：マウスモノクローナル、１／１０００、ａｂ９４８４（ＡＢＣＡＭ，ＵＫ））に対して一晩４℃で曝した。翌朝、膜をＴＴＢＳ中で３回１０分洗浄し、次いで、二次抗体（ポリクローナルヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合体化、１／１０００，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に対して、３７℃で１時間曝した。さらにＴＴＢＳ中で３回１０分の洗浄後、膜を化学発光（緩衝液１（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．０２％Ｈ２Ｏ２）および緩衝液２（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．４４％クマリン酸、１％ルミノール）の２０ｍｌの１：１混合物）によって暗所で５分間、発色させ、その後シグナルをＦｕｊｉＦｉｌｍ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｄａｒｋ
Ｂｏｘ  ＩＩで検出し、ＩＲ−ＬＡＳ−１０００  Ｐｒｏ  Ｖ３．１２ソフトウェアを介して分析した。１μＭのＣＡ４Ｐでの単回の３０分の処理によって、ＣＡ４Ｐ曝露の開始後３０分（すなわち、曝露終了の直後）およびＣＡ４Ｐ曝露の終了後最大２４時間の両方で、重合されたチューブリンの喪失が生じる（図４）。
【０１０１】
（２．初代ウシ水晶体上皮細胞中の微小管の喪失）
ウシの眼を、Ｃｏａｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｍｅａｔ  Ｇｒｏｕｐ（Ｆｅｌｌｉｎｇ，ＵＫ）から、処分の日に入手して、下に記載されるように無菌組織培養フードのもとで水晶体を眼から解体した。７０％エタノール中にたっぷり浸した後、角膜−結膜境界に対して平行かつ後方のシングルカットを介して、メジャー・サージカル・ブレード（ｍａｊｏｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｌａｄｅ）（Ｓｗａｎｎ−Ｍｏｒｔｏｎ，ＵＫ）を用いて眼を切り開いた。次いで、眼を反転させて、硝子体を除去した。水晶体を毛様体繊維から解放し、直ちに１２ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，ＵＫ）のＳＹＬＧＡＲＤ−カバー（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ウェル中に前面に置いた。水晶体嚢の後側を、細い外科用メスでＹ形に切り、得られたフラップを巻き上げてＳＹＬＧＡＲＤ上にピン固定した。繊維塊を、水晶体嚢前方に穏やかに巻き取ることによって取り除いて、これによって水晶体嚢前方上に付着した初代水晶体上皮細胞層のほとんどを残した。次いで、この初代水晶体上皮細胞層をそのもとの水晶体嚢上で３７℃、５％ＣＯ２で、０％のＦＣＳ補充組織培養中で培養した。
【０１０２】
切開直後、初代水晶体上皮細胞を、０％ＦＣＳ培地中で希釈した１μＭのＣＡ４Ｐに対して３０分間曝露し、その後それらを０％ＦＣＳ補充培地に戻した。ＣＡ４Ｐ曝露の直後、およびＣＡ４Ｐ曝露の終わりの４８時間後、初代水晶体上皮細胞層中の重合したチューブリンの存在を免疫蛍光によって検討した。
【０１０３】
水晶体嚢上の細胞を、ＰＢＳ中で３回リンスし、続いてメタノールおよびアセトンの１：１混合物中で単回２０分間固定し、ＰＢＳ／０．２ｇ／Ｌ  ＢＳＡ／０．２ｇ／Ｌ  Ｎａ  Ａｚｉｄｅ中で３回リンスし、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中で希釈した１０％のヤギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）中で単回２０分のブロッキング工程を行った。次いでこの細胞を一次抗体（α−チューブリン：マウスモノクローナル、１／１００、イギリス、ダラム大学のＫａｒａｋｅｓｉｓｏｇｌｏｕ博士から贈呈）に対して室温で１時間曝露し、その後、それらをＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中で３回リンスして、二次抗体（ヤギ抗−マウス  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ−結合体化、１／１００；ＤＡＰＩ，１／１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ））に対して暗所で室温で１時間曝した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中の３回の最後のリンス後、細胞層およびそれらの水晶体嚢を、顕微鏡のスライド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にプレートして、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡およびその関連のソフトウェアを用いて検査した。
【０１０４】
１μＭのＣＡ４Ｐを用いた単回３０分の処理によって、ＣＡ４Ｐ曝露の開始後３０分（すなわち、曝露終了の直後）およびＣＡ４Ｐ曝露の終了後最大４８時間までの両方で、重合されたチューブリンの喪失が生じる（図５）。さらに、無血清状態で水晶嚢上で４８時間増殖した初代ウシ水晶体上皮細胞は、創傷の端部から離れていく。創傷を付けた直後１ｍＭのＣＡ４Ｐに対する３０分の曝露によって、細胞は創傷の端部から離れないように防がれるが、細胞の多層化は妨げない（データ示さず）。
【０１０５】
３．細胞生存度
ＢＭＩ−不死化ウシ水晶体上皮細胞（ＢＩＥ細胞株，イギリス、ダラム大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｒｈａｍ）のロイ・クインラン研究室（Ｒｏｙ  Ｑｕｉｎｌａｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で作製）を、１２ウェルの組織培養プレート上で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）補充組織培養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）中に播種して、３７℃、５％ＣＯ２で一晩保持した。翌朝、それらを、１０％ＦＣＳ補充培地中で希釈した１μＭのＣＡ４Ｐに対して３０分間曝露し、その後、細胞を１０％のＦＣＳ補充培地に戻した。生きている細胞数を、直ちに、ならびに曝露の終了後、２４時間、４８時間および７２時間で、ＭＴＴベースの比色アッセイ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９５Ｒ  Ａｑｕｅｏｕｓ非放射性細胞増殖アッセイ，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＫ）を用い、製造業者の指示に従ってアッセイした。要するに、もとの細胞培養培地を全てのウェルから廃棄して、５００μＬの新鮮培地と交換し、ここに１００μＬのキット試薬を添加した。次いでこのウェルを暗所で３７℃、５％ＣＯ２に２時間３０分間戻し、その後、２００μＬを各々のウェルから９６ウェルプレート中に移して、これを４９２ｎｍの吸光度でＡｎｔｈｏｓ  Ｌｕｃｙ  Ｉ（Ａｎｔｈｏｓ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で読み取った。吸光度の値は、水晶体上皮細胞に特異的な標準曲線（イギリス、ダラム大学、ロイ・クインラン研究室（Ｒｏｙ  Ｑｕｉｎｌａｎ’ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫ）で決定）を用いて細胞数に変換し、得られた生きた細胞数を標準偏差つきで平均した。種々の時点でコントロールと処理細胞との間で得られた値の有意な相違を、独立、両側ｔ検定を用いて評価した。図は、３つの独立した繰り返しの照合した結果を示す。
【０１０６】
１μＭのＣＡ４Ｐによる単回３０分間の処理によって、ＣＡ４Ｐ処理後７２時間にわたるＢＩＥ細胞の数の一貫した減少が生じる（図６）。
【０１０７】
（４．細胞増殖）
ＢＭＩ−不死化ウシ水晶体上皮細胞（ＢＩＥ細胞株，イギリス、ダラム大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｒｈａｍ）のロイ・クインラン研究室（Ｒｏｙ  Ｑｕｉｎｌａｎ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で作製）を、１３ｍｍの丸いカバースリップ上で、６ウェル組織培養プレート中で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）補充組織培養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）中に播種して、３７℃、５％ＣＯ２で一晩保持した。翌朝、それらを、１０％ＦＣＳ補充培地中で希釈した１μＭのＣＡ４Ｐに対して３０分間曝露し、その後、細胞を１０％のＦＣＳ補充培地に戻した。４８時間後、Ｋｉ６７陽性細胞の存在率を、免疫蛍光によって評価した。
【０１０８】
カバースリップ上のＢＩＥ細胞を、ＰＢＳ中で３回リンスし、続いて、メタノールおよびアセトンの１：１混合物中で単回２０分間固定し、ＰＢＳ／０．２ｇ／Ｌ  ＢＳＡ／０．２ｇ／Ｌ  Ｎａ  Ａｚｉｄｅ中で３回リンスし、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中で希釈した１０％のヤギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）中で単回２０分のブロッキング工程を行った。次いでこの細胞を一次抗体（Ｋｉ−６７：マウスモノクローナル、１／１００、ＭＩＢ−１（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に対して室温で１時間曝露し、その後、それらをＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中で３回リンスして、二次抗体（ヤギ抗−マウス  ＩｇＧ  ＦＩＴＣ−結合体化、１／１００；ＤＡＰＩ，１／１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ））に対して暗所で室温で１時間曝した。ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＡｚｉｄｅ中の３回の最後のリンス後、細胞を、顕微鏡のスライド（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）にプレートして、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ共焦点顕微鏡およびその関連のソフトウェアを用いて検査した。Ｋｉ−６７陽性細胞を、各々３回の独立した反復について２つのカバースリップについて、１つのカバースリップあたり全部で２００〜５００個の細胞をカウントし、カウントされた細胞総数（ＤＡＰＩ染色によって決定した場合）のうちのＫｉ−６７陽性細胞の平均割合として表した。コントロール細胞と処理細胞との間の有意な相違をχ２−検定によって評価した。
【０１０９】
Ｋｉ６７（細胞増殖を伴う）陽性細胞の割合は、曝露後４８時間で決定した場合、コントロール細胞および処理細胞の両方で同様であった（表１）が、核形態の変化および多核性細胞が曝露の３０時間後に検出された（データ示さず）。この異常な核形態は、有糸分裂の間の細胞質分離の欠陥を連想させる。とりわけ、４８時間までは、細胞の喪失は広範であって、核形態の異常を呈する細胞は観察されず、これによって、それらの「異常な」細胞は、ＣＡ４Ｐ曝露の３０時間〜４８時間後に失われることが示唆される。
【０１１０】
【表１】
2012532113.tif 000004
（５．Ｅｒｋ１／２リン酸化）
ウシの眼を、Ｃｏａｓｔ  ａｎｄ  Ｃｏｕｎｔｙ  Ｍｅａｔ  Ｇｒｏｕｐ（Ｆｅｌｌｉｎｇ，ＵＫ）から、処分の日に入手して、下に記載されるように無菌組織培養フードのもとで水晶体を眼から解体した。７０％エタノール中にたっぷり浸した後、角膜−結膜境界に対して平行かつ後方のシングルカットを介して、メジャー・サージカル・ブレード（ｍａｊｏｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｂｌａｄｅ）（Ｓｗａｎｎ−Ｍｏｒｔｏｎ，ＵＫ）を用いて眼を切り開いた。次いで、眼を反転させて、硝子体を除去した。水晶体を毛様体繊維から解放し、直ちに１２ウェル組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，ＵＫ）のＳＹＬＧＡＲＤ−カバー（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ウェル中に前面に置いた。水晶体嚢の後側を、細い外科用メスでＹ形に切り、得られたフラップを巻き上げてＳＹＬＧＡＲＤ上にピン固定した。繊維塊を、水晶体嚢前方に穏やかに巻き取ることによって取り除いて、これによって水晶体嚢前方上に付着した初代水晶体上皮細胞層のほとんどを残した。次いで、この初代水晶体上皮細胞層をそのもとの水晶体嚢上で３７℃、５％ＣＯ２で、０％のＦＣＳ補充組織培養中で培養した。
【０１１１】
切開直後、初代水晶体上皮細胞を、０％ＦＣＳ培地中で希釈した１μＭのＣＡ４Ｐに対して３０分間曝露し、その後それらを０％ＦＣＳ補充培地に戻した。ＣＡ４Ｐ曝露の直後、およびＣＡ４Ｐ曝露の終わりの１時間後、初代水晶体上皮細胞層中のＥＲＫ１／２（ｐ４２およびｐ４４）のリン酸化状態をイムノブロッティングによって検討した。要するに、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄し、次いで、３分間、１ウェルあたり１５０μＬの２×サンプル緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２％のＳＤＳ、４０％グリセロール（ｖｏｌ／ｖｏｌ））中で抽出し、その後注射し、３分間煮沸した。全ての抽出物を使用まで−２０℃で保持した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）による抽出物の総タンパク質定量後、２０μｇの抽出物を１２％のアクリルアミド変性ゲルの１レーンあたりにロードして、これを２００Ｖで４０分間泳動し、続いて、ニトロセルロース膜上に０．８ｍＡ／ｃｍ２で２時間ブロットして、ミルク（Ｅｒｋ１／２）またはＢＳＡ（ＧＡＰＤＨ）のいずれかが含有されるＴＴＢＳ（０．２％Ｔｗｅｅｎ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ７．４）中で室温で１時間ブロッキングした。ＴＴＢＳ中での単回の５分の洗浄後、次に膜を、ＴＴＢＳ中に含有される一次抗体（リン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒ）−Ｅｒｋ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）：ウサギモノクローナル、１／１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＵＫ）；ＧＡＰＤＨ：マウスモノクローナル、１／１０００、ａｂ９４８４（ＡＢＣＡＭ，ＵＫ））に対して一晩４℃で曝した。翌朝、膜をＴＴＢＳ中で３回１０分洗浄し、次いで、ＴＴＢＳ中に含まれる二次抗体（ポリクローナルヤギ抗マウスＨＲＰ−結合体化、１／１０００；ポリクローナルブタ抗ウサギＨＲＰ結合体化（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ））に対して、４℃で一晩曝露した。さらにＴＴＢＳ中で３回１０分の洗浄後、膜を化学発光（緩衝液１（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．０２％Ｈ２Ｏ２）および緩衝液２（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ  ｐＨ８．５、０．４４％クマリン酸、１％ルミノール）の２０ｍｌの１：１混合物）によって暗所で５分間、発色させ、その後シグナルをＦｕｊｉＦｉｌｍ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ
Ｄａｒｋ  Ｂｏｘ  ＩＩで検出し、ＩＲ−ＬＡＳ−１０００  Ｐｒｏ  Ｖ３．１２ソフトウェアを介して分析した。Ｅｒｋ１／２のリン酸化レベルは、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅ  Ｖ４．２３ソフトウェアおよびＧＡＰＤＨレベルに対する正規化を用いて濃度測定によって定量した。
【０１１２】
ホスホ（ｐｈｏｓｐｈｏ）−Ｅｒｋ１／２レベルは、コントロール細胞および処理細胞の両方においてＣＡ４Ｐ曝露の終了後直ちに上昇され、そしてコントロール細胞および処理細胞の両方においてＣＡ４Ｐ曝露の終了１時間後に低下された（図７）。これによって、一時的なＥｒｋリン酸化が切開／手術後正常な過程として生じ、この状況ではＣＡ４Ｐによって影響されないことが示唆される。この実験をＢＩＥ細胞（ＣＡ４Ｐ曝露の前の切開に関連する任意の潜在的なストレスを経験しない）で繰り返した。この場合、ホスホ−Ｅｒｋレベルは、ＣＡ４Ｐ曝露の終わりの直後にはＣＡ４Ｐ処理で上昇されたが、ＣＡ４Ｐ曝露の終わりの１時間後にはコントロールのレベルに戻った。従って、初代細胞では、切開に起因する一般的なストレス応答は、Ｅｒｋリン酸化に対するＣＡ４Ｐの影響をマスクするということが仮定され得る。リン酸化されたｐ３８およびＪＮＫのレベルは、ＣＡ４Ｐ処理によって影響されなかった（データ示さず）。