【手続補正書】
【提出日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
紫外線は、多量に暴露すると皮膚に炎症を惹起したり、水泡を生じたりするなど、皮膚に対して様々な悪影響を与えることはよく知られている。また、累積的な暴露でも、メラニン生成の亢進を通して、シミ、ソバカスなどの原因ともなり美容的にも問題となっている。シミ、ソバカスや日焼け後の皮膚色素沈着は、皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）の活性化によりメラニン生成が著しく亢進したものであり、中高年齢層の肌の悩みの一つになっている。これら皮膚色素トラブルを防止、改善する目的でアスコルビン酸類、過酸化水素水、グルタチオン、コロイド硫黄、ハイドロキノン、カテコール等の美白剤を配合した皮膚外用剤が知られている。しかしながら、アスコルビン酸類は、含水化粧料のような水分を多く含む系においては酸化され易く不安定であり、変色の原因となる。また、過酸化水素水は、保存上の安定性ならびに安全性上の問題があり、グルタチオンやコロイド硫黄は、著しい異臭を放つため製品に使用することは制約されている。更には、ハイドロキノン、カテコール等は、皮膚刺激、アレルギー性等の安全性に問題があり、いまだ充分に満足できる美白剤が得られていないのが現状である。又、皮膚色素沈着現象に関しても種々の作用機序があることが明らかになってきており、それぞれに作用する化合物が有ることも明らかになりつつある。そういう意味に於いても、新規なメラニン生成を抑制する化合物を開発することが望まれていた。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
レスペデザフラバノンＨを、レスペデザフラバノンＨを含有する植物体から抽出して得る場合には、通常の抽出方法により抽出し、さらに疎水性樹脂カラムやシリカゲルカラムを用いて精製することができる。例えば、レスペデザフラバノンＨを植物体から極性溶媒などを用いて抽出し、抽出物を更に水に対して非混和性の有機溶媒と水により液液抽出し、水に対して非混和性の有機溶媒層を必要に応じて濃縮し、疎水性樹脂カラムやシリカゲ
ルカラムを用いた精製などを行うことにより、得ることが可能である。より具体的には、例えば、マメ科ハギ属キハギの地上部を細かく細断したもの１質量部に、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；酢酸エチル、酢酸メチル等のエステル類；クロロホルム、ジクロロメタン等のハロゲン化炭化水素類等の極性溶媒１〜２０質量部を加え、室温なら数日間〜１週間沸点付近なら数時間浸漬し、濾過などにより不溶物を除去した後、減圧濃縮等により溶媒を留去し、これをジエチルエーテルや酢酸エチル等の水と混和しない有機溶媒（水に対して非混和性の有機溶媒）と水とで液液抽出を行い、水に対して非混和性の有機溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；クロロホルム／メタノール＝１００／０→９８／２）等で分画し、更にＯＤＳカラム等の逆相カラムクロマトグラフィー（溶出溶媒；７５％アセトニトリル）などで分画し、溶媒を留去することにより、レスペデザフラバノンＨを得ることができ、このようにして精製したレスペデザフラバノンＨを、メラニン生成抑制用の有効成分として使用することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
また、マメ科ハギ属キハギ等の植物体の極性溶媒による抽出物を、レスペデザフラバノンＨ含有抽出液として、そのまま本発明の皮膚外用剤に使用することも可能であり、さらに必要により濃縮して、レスペデザフラバノンＨを含有する植物体の抽出物として本発明の皮膚外用剤に使用することも可能である。マメ科ハギ属キハギの植物体中におけるレスペデザフラバノンＨの含有量は、本発明者らの検討によれば、植物体１ｋｇ中に３００ｍｇ〜５００ｍｇである。したがって、エタノール、含水エタノール、１，３−ブタンジオール、含水１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール、含水プロピレングリコール、グリセリン、含水グリセリンなどの、そのまま皮膚外用剤に添加して使用することが可能な極性溶媒を使用して抽出した場合には、そのままレスペデザフラバノンＨ含有抽出液として使用することができる。例えば、１ｋｇのキハギの植物体を１Ｌの極性溶媒で抽出した場合、抽出液中のレスペデザフラバノンＨの含有量は、０．０３〜０．０５ｗｔ／ｖ％、１ｋｇのキハギの植物体を１０Ｌの極性溶媒で抽出した場合、抽出液中のレスペデザフラバノンＨの含有量は、０．００３〜０．００５ｗｔ／ｖ％となる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
マメ科ハギ属キハギの木幹部１ｋｇを粉砕して、チップとし、これを１０Ｌのメタノール中に浸漬し、３時間加熱還流した後、チップを除くことにより、メタノール抽出液を得た。このメタノール抽出液を濃縮し、ジエチルエーテル、水を加え液液抽出を行なった後、ジエチルエーテル層を取り、これを濃縮し、粗精製物を得た（５．８３ｇ）。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２で溶出）にて分画した。濃縮後、逆相カラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ；７５％アセトニトリルにて溶出）にて、分画して、レスペデザフラバノンＨを４１４ｍｇ得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
レスペデザフラバノンＨの1Ｈ−ＮＭＲ（in  Acetone-d6）
1.59(3H,s),1.61(3H,s),1.64(3H,s),1.76(3H,s),1.69(3H,s),1.72(3H,s),2.80(1H,dd),3.10(1H,dd),3.26-3.36(6H,m),5.16-5.21(2H,m),5.30-5.35(1H,m),5.67(1H,dd),6.49(1H,s),7.20(1H,s)
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
マメ科ハギ属キハギの木幹部６００ｇを粉砕して、チップとし、これを３Ｌのメタノール中に浸漬し、３時間加熱還流した後、チップを除くことにより、メタノール抽出液を得た。このメタノール抽出液を濃縮し、ジエチルエーテル、水を加え液液抽出を行なった後、ジエチルエーテル層を取り、これを濃縮し、粗精製物を得た（３．５ｇ）。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２で溶出）にて分画した。濃縮後、逆相カラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ；７５％アセトニトリルにて溶出）にて、分画して、アモリリンを６７ｍｇ得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
マメ科ハギ属キハギの木幹部８５ｇを粉砕して、チップとし、これを１Ｌのメタノール中に浸漬し、３時間加熱還流した後、チップを除くことにより、メタノール抽出液を得た。このメタノール抽出液を濃縮し、ジエチルエーテル、水を加え液液抽出を行なった後、ジエチルエーテル層を取り、これを濃縮し、粗精製物を得た（５４１ｍｇ）。これをシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝９８／２で溶出）にて分画した。濃縮後、逆相カラムクロマトグラフィー（ＯＤＳ；７５％アセトニトリルにて溶出）にて、分画して、アモリシンを５．３ｍｇ得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
マメ科ハギ属キハギの木幹部１kｇを粉砕して、チップとし、これを１，３−ブタンジオールの５０％水溶液１０Ｌ中に１週間浸漬した後、チップを除き、５０％  １，３−ブタンジオール水抽出液を得た。実施例１で精製した化合物を標品として、この抽出液をＨＰＬＣにて、分析（ＯＤＳカラム；ＵＶ２８０ｎｍ、７５％アセトニトリル溶出）したところ、０．００４％のレスペデザフラバノンＨを含有していた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
＜試験例２＞
試験例１と同様のメラニン生成抑制試験を、実施例４で得られた抽出液を用いて行った。具体的には、メラノサイトのプレ培養後の培地交換に於いて、実施例４で作製した抽出液を０．５ｗｔ／ｖ％、１ｗｔ／ｖ、２ｗｔ／ｖ％含有する培地に交換して培養した。その結果を表２に示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である乳液を作製した。即ち、（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分を８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に（Ｂ）の混合物を加えて撹拌して乳化させ、更に（Ｃ）を加えて中和し、その後３５℃にまで撹拌、冷却し、実施例５の乳液を得た。尚、実施例５の処方において、レスペデザフラバノンＨを水に置換したものを作製し、比較例１の乳液とした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
（Ａ）
ベヘニルアルコール                                          ０．５  質量％
イソオクタン酸セチル                                        ２．０  質量％
スクワラン                                                  ８．０  質量％
ジメチコン                                                  ２．０  質量％
セスキステアリン酸ソルビタン                                １．５  質量％
ＰＯＥ（４５）ステアリン酸                                  １．０  質量％
ステアリン酸セチル                                          ０．５  質量％
ベヘン酸                                                    ０．５  質量％
（Ｂ）
１，３−ブタンジオール                                      ５．０  質量％
グリセリン                                                  ５．０  質量％
１，２−オクタンジオール                                    １．０  質量％
純水                                                      ５０．０  質量％
実施例４の抽出物                                            ５．０  質量％
（レスペデザフラバノンＨとして、乳液中に０．０００２質量％含有）
グリチルリチン酸ジカリウム                                  ０．１  質量％
（Ｃ）
純水                                                      １９．３  質量％
水酸化カリウム                                              ０．６  質量％
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
【表３】
2007186439.tif 000001