【手続補正書】
【提出日】平成24年2月10日(2012.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
これらの方法を実施するための組成物およびキットも本明細書に記載されている。本発明のこれらの実施形態、他の実施形態、およびその特徴および特性は、下記の説明、図、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
所定の標的に対して親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、該ＳＢＰは第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、該方法は、（ｉ）１またはそれより多くの望ましい性質を有するように選択された該第１のポリペプチド鎖の１またはそれより多くの種類をコードする遺伝物質の集団を含む第１のベクター集団を含む宿主細胞を提供する工程であって、該第１のポリペプチド鎖が該宿主細胞から分泌される工程と、
（ｉｉ）該第２のポリペプチド鎖をコードする遺伝物質の多様な集団を含む第２のベクター集団を、該細胞に感染させる工程であって、該第２のポリペプチド鎖は、該第２のポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための、分泌型ＲＧＤＰの成分と融合している工程と、
（ｉｉｉ）該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を該宿主細胞内で発現させて、該ＲＧＤＰの表面に提示されるＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該第１のポリペプチド鎖と該第２のポリペプチド鎖とが該ＲＧＤＰの表面で結合している工程と、
（ｉｖ）ＳＢＰメンバーを該所定の標的に対する結合について選択する工程と
を含む方法。
（項目２）
前記第１のポリペプチド鎖が抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記第１のポリペプチド鎖が抗体の軽鎖（ＬＣ）またはその抗原結合断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第２のポリペプチド鎖が抗体の重鎖（ＨＣ）またはその抗原結合断片を含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記第１のベクターがプラスミドである、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記第１のベクターがファージベクターである、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第２のベクターがファージベクターである、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第１のベクター集団が１〜１０００種の異なる第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記第２のベクターが、１０５種以上の異なる第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記選択する工程がＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記所定の標的に結合する特異的結合対メンバーを単離する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
工程（ｉｖ）から選択された前記ＲＧＤＰを工程（ｉ）の宿主細胞の新鮮な試料に感染させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１の集団が２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
所定の標的に対して改善された親和性がある特異的結合対（ＳＢＰ）メンバーを作製する方法であって、該ＳＢＰは、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を含み、該方法は、
（ｉ）該ポリペプチド鎖を複製可能な遺伝子提示パッケージ（ＲＧＤＰ）の表面に提示させるための分泌型ＲＧＤＰの成分と融合させた、該所定の標的に対して親和性を有するように選択された該第１のポリペプチド鎖の１またはそれより多くの種類をコードする核酸を含む第１のベクター集団と、
（ｉｉ）該第２のポリペプチド鎖の遺伝的に多様な集団をコードする核酸を含む第２のベクター集団と、
を宿主細胞に導入する工程であって、
該第１のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを該第２のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第１のベクターを宿主細胞に導入するか、または、
該第２のベクターが感染性ＲＧＤＰ内にパッケージングされており、それを該第１のベクターを有する宿主細胞に感染させることにより該第２のベクターを宿主細胞に導入する工程と、
該宿主細胞内で該第１のポリペプチド鎖および該第２のポリペプチド鎖を発現させて、ＲＧＤＰによって提示される該ＳＢＰメンバーのライブラリーを形成する工程であって、該集団の少なくとも１つが、該ＲＧＤＰ成分を用いてパッケージング可能な核酸から発現され、それによって該ＲＧＤＰのそれぞれの遺伝物質が、ＲＧＤＰの表面に提示される該ＳＢＰメンバーのポリペプチド鎖をコードする工程と、
該集団のメンバーを該所定の標的に対する高親和性結合について選択する工程と
を含む方法。
（項目１６）
前記第１の集団が、２つ以上の亜集団に分割され、１つの亜集団から作製されるファージが、他の集団で作製されるファージから選択され別々に増殖される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記第１のベクター集団が１０００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１または１５に記載の方法。
（項目１８）
前記第１のベクター集団が１００種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１または１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のベクター集団が２０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１または１５に記載の方法。
（項目２０）
前記第１のベクター集団が１０種以下の第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１または１５に記載の方法。
（項目２１）
前記第１のベクター集団が１種の第１のポリペプチド鎖をコードする、項目１または１５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
【図１】図１は、実施例１に記載のＲＯＬＩＣ法の実施形態を示す図である。
【図２】図２は、従来のファージ選択スキーム（左側）と例示的なＲＯＬＩＣ  ＬＣ選択スキーム（右側）とを比較して示す図であり、ＲＯＬＩＣの効率および対合率が優れていること、ならびに対合の見込み数を多くするためのライブラリーの必要性が除かれることが例証されている。「Ｈｉｓ６」タグは配列番号３４として開示される。
【図３】図３は、選択／スクリーニングの方法にＲＯＬＩＣを組み込むことで、方法の工程数がどれだけ削減されるかを示す図である。
【図４】図４は、実施例１に記載されている、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦおよび他の細胞系についての細胞株評価の結果を示す図である。
【図５】図５は、ＲＯＬＩＣ法で使用される例示的なＨＣベクターを示す図である。
【図６】図６は、実施例１に記載されている、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣの軽鎖２０種がｐＨＣＳＫ２２内の重鎖２０種と対合してファージ上に機能的Ｆａｂを創出することができるかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１の記載されている、ＤＹ３Ｆ８５ＬＣの軽鎖２０種がｐＨＣＳＫ２２の重鎖２０種と対合してファージ上に機能的Ｆａｂを創出することができるかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図８】図８は、ファージの力価と提示とをＥＬＩＳＡにより比較した結果を示す図である。
【図９】図９は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１１】図１１は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１２】図１２は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１３】図１３は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を示す図である。
【図１４】図１４は、ＲＯＬＩＣ選択が、軽鎖の全多様性および２０種の抗Ｔｉｅ１重鎖（ＬＣ  ４×１０７種×ＨＣ  ２０種）に対して機能するかどうかをＥＬＩＳＡ分析した結果を要約した図である。
【図１５】図１５は、実施例２に記載されている、ＲＯＬＩＣ選択の後にＶＨとＶＬ−ＣＬとを再連結させるための「ジッピング」法の設計概略図である。ＬＣ−ＤＹ３Ｐ８５はＤＹ３Ｆ８５ＬＣと同一である。カセットがｐＭＩＤ２１にクローニングされた場合、提示ファージミドを得る。カセットがｐＭＩＤ２１．０３にクローニングされた場合、ｓＦａｂ発現のためのベクターを得る。
【図１６】図１６は、実施例２に記載されている、「ジッピング」法の成功利用を例証しているＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
【表２−３】
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