【手続補正書】
【提出日】平成25年2月25日(2013.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:22からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするか、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかの機能活性変種を含むポリペプチドをコードする核酸であって、
該機能活性変種が、
(i)SEQ ID NO:1〜22のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも60％同一のアミノ酸配列を有する、および/または
(ii)6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、40℃で2〜12時間、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、およびSEQ ID NO:44からなる群より選択される核酸配列、もしくはSEQ ID NO:23〜44の核酸配列のいずれかに相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAによってコードされる、および/または
(iii)VP1、VP2、およびVP3をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)とインフレームにないORFを含み、VP3 ORFの378ヌクレオチドより多いヌクレオチドを含む、パルボウイルスゲノムの一部によってコードされる、
いずれの機能タンパク質も発現することができない、核酸。
【請求項２】
（a）核酸が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを特徴とする；
（b）機能活性変種が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:22のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも65％同一のアミノ酸配列を有する；
（c）機能活性変種が、6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、45℃で、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、およびSEQ ID NO:44の核酸配列のいずれかに相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAよってコードされる；
（d）機能活性変種が、6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、SEQ ID NO:23の核酸配列またはSEQ ID NO:23の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAによってコードされる；
（e）核酸が、VP3 ORFの378ヌクレオチドより多いヌクレオチドを含むことを特徴とする；
（f）核酸が、VP3開始コドン5'側のすぐ上流に位置する、隣接VP2コードヌクレオチドの少なくとも44ヌクレオチドを含むことを特徴とするか、または該核酸の開始コドンが、VP3開始コドンの下流4ヌクレオチドにあるATGであることを特徴とする；
（g）核酸が、VP3のキャプシド集合を促進するタンパク質を発現することができることを特徴とする；
（h）核酸が、AAV2に由来し、かつその翻訳開始コドンが、C2729TG、A2735CG、A2717TT、またはT2720TGであることを特徴とするか、または別のパルボウイルスに由来し、かつその翻訳開始コドンが、AAV2の翻訳開始コドンと相同な部位にあることを特徴とする；
（i）核酸が、オープンリーディングフレームの翻訳の改善を可能にするATG開始コドンを生じさせる変異を含む；
（j）核酸が、核酸のポリペプチドコード配列の後にポリ(A)シグナルが続くことを特徴とする；
（k）核酸が、ポリペプチドコード配列の転写を駆動するプロモーターを含むことを特徴とする；
（l）核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ガチョウパルボウイルス、アヒルパルボウイルス、およびヘビパルボウイルスに由来することを特徴とする；ならびに／または
（m）核酸が、発現カセット、構築物、ベクター、または細胞株の中に含まれる、
請求項1記載の核酸。  
【請求項３】
請求項1または2記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項3記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項５】
請求項3に記載のポリペプチドを調製するための、請求項1または2記載の核酸の使用。
【請求項６】
パルボウイルス粒子を調製するための、請求項1もしくは2記載の核酸または請求項3記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
機能タンパク質VP1、VP2、およびRepのいずれも含まないパルボウイルス粒子を調製するための、請求項6記載の核酸またはポリペプチドの使用。
【請求項８】
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子を産生する方法であって、
（i）rep非依存性プロモーターの制御下にある、パルボウイルスに由来するVP3コード配列(cds)からVP3を発現することができ、かつ請求項1または2記載の核酸によってコードされるタンパク質を発現することができる細胞を提供する工程、ならびに
（ii）VP3および請求項1または2記載の核酸に由来するタンパク質の発現を促す条件で細胞をインキュベートし、それによって、パルボウイルス粒子を産生する工程
を含み、
細胞1個あたり少なくとも105個のウイルス粒子が形成され、かつ
VP1、VP2、およびRepの機能タンパク質は発現されない、方法。
【請求項９】
（a）細胞1個あたり少なくとも106個のウイルス粒子が形成される；
（b）機能タンパク質VP1、VP2、およびRepのタンパク質発現が細胞において遮断されている；
（c）請求項1または2記載の核酸がVP3 cdsに対してシスで提供される；
（d）請求項1または2記載の核酸がVP3 cdsに対してトランスで提供される；
（e）パルボウイルス粒子が、Rep機能タンパク質のいずれも含有しない；
（f）発現された構造タンパク質の最大で1/50が請求項3記載のポリペプチドである；ならびに／または
（g）粒子の最大で1/100がDNAを含有する、
請求項8記載の方法。
【請求項１０】
VP3 cdsが1つまたは複数の変異を含む、請求項8または9記載の方法。
【請求項１１】
（a）VP3 cdsの変異が、1つまたは複数の欠失、1つまたは複数の挿入、1つまたは複数の置換、およびその組み合わせからなる群より選択される変異である；
（b）VP3 cdsが1つまたは複数のサイレント変異を含む；
（c）VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3 VLPの表面上に位置する1つまたは複数の変異につながる；
（d）VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3のN末端に位置する1つまたは複数の変異につながる；
（e）VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-453、I-459、I-471、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、およびI-716からなる群より選択される1つまたは複数の位置への1つまたは複数の挿入につながる；
（f）VP3が、ウイルスに対して異種の少なくとも1つのエピトープを含む；
（g）VP3が融合タンパク質の中に含まれる；
（h）VP3が、リガンドとの結合に有用な少なくとも1つのタグを含む；ならびに／または
（i）VP3が少なくとも1つのさらなる変異を含む、
請求項10記載の方法。
【請求項１２】
請求項8〜12のいずれか一項記載の方法から入手可能なパルボウイルス粒子。
【請求項１３】
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子であって、
（i）VP3は、任意で1つまたは複数の変異を含み、かつ、
（ii）VP3は、異種核局在化シグナルを含有せず、かつ
（iii）粒子は、Rep機能タンパク質のいずれも含有しない、
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子。
【請求項１４】
キャプシドがVP3のみからなる、および／または
VP3の変異が請求項10または11記載の変異である、
請求項12または13記載のパルボウイルス粒子。
【請求項１５】
医用薬剤として使用するための、請求項12〜14のいずれか一項記載のパルボウイルス粒子。
【請求項１６】
（a）医用薬剤が1種類または複数の種類の賦形剤をさらに含む；
（b）医用薬剤がワクチンである；ならびに／または
（c）自己免疫疾患、感染症、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、代謝病、(慢性)炎症性疾患、神経学的疾患、依存症の予防もしくは治療において使用するための、または眼科学において用いられる、
請求項15記載の使用のためのパルボウイルス粒子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
驚いたことに、かつポリペプチドをコードする機能と合致して、本質的にVP3からなるキャプシドを組み立てるために、配列断片Zをシスまたはトランスで提供することができる。さらに、断片ZおよびVP3は、パルボウイルス科の同じ種または異なる種に由来してもよく、VP3粒子集合に関して互いを相互にトランス相補する。
[本発明1001]
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:22からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするか、またはこれらのアミノ酸配列のいずれかの機能活性変種を含むポリペプチドをコードし、
いずれの機能タンパク質も発現することができず、特に、Rep40、Rep52、Rep68、Rep78、VP1、VP2、およびVP3を発現することができない、核酸であって、
機能活性変種が、
(i)SEQ ID NO:1〜22のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも60％同一のアミノ酸配列を有する、および/または
(ii)6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、40℃で2〜12時間、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、およびSEQ ID NO:44からなる群より選択される核酸配列、もしくはSEQ ID NO:23〜44の核酸配列のいずれかに相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAによってコードされる、および/または
(iii)VP1、VP2、およびVP3をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)とインフレームにないORFを含み、VP3 ORFの378ヌクレオチドより多くを含む、パルボウイルスゲノムの一部によってコードされる、核酸。
[本発明1002]
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードすることを特徴とする、本発明1001の核酸。
[本発明1003]
機能活性変種が、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:22のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも99％、および特に100％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1001または1002の核酸。
[本発明1004]
機能活性変種が、6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、45℃、より好ましくは50℃、より好ましくは55℃、より好ましくは60℃、特に65℃、および有利には68℃で、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、およびSEQ ID NO:44の核酸配列のいずれかに相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAよってコードされる、本発明1001〜1003のいずれかの核酸。
[本発明1005]
機能活性変種が、6xSSC、5xデンハルト液、0.5％SDSの中で、SEQ ID NO:23の核酸配列またはSEQ ID NO:23の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズするcDNAによってコードされる、本発明1001〜1004のいずれかの核酸。
[本発明1006]
VP3 ORFの378より多いヌクレオチド、好ましくは少なくとも400ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも425、および特に少なくとも445ヌクレオチドを含むことを特徴とする、本発明1001〜1005のいずれかの核酸。
[本発明1007]
VP3開始コドン5'側のすぐ上流に位置する、隣接VP2コードヌクレオチドの少なくとも44ヌクレオチド、好ましくは少なくとも20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも5ヌクレオチドを含むことを特徴とするか、またはその開始コドンが、VP3開始コドンの下流4ヌクレオチドにある、好ましくは24ヌクレオチドにある、およびより好ましくは44ヌクレオチドにあるATGであることを特徴とする、本発明1001〜1006のいずれかの核酸。
[本発明1008]
VP3のキャプシド集合を促進するタンパク質を発現することができることを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかの核酸。
[本発明1009]
AAV2に由来し、かつその翻訳開始コドンが、C2729TG、A2735CG、A2717TT、またはT2720TGであることを特徴とするか、または別のパルボウイルスに由来し、かつその翻訳開始コドンが、AAV2の翻訳開始コドンと相同な部位にあることを特徴とする、本発明1001〜1008のいずれかの核酸。
[本発明1010]
オープンリーディングフレームの翻訳の改善を可能にするATG開始コドンを生じさせる変異を含む、好ましくは、AAV2の翻訳開始コドンの1つまたは他のパルボウイルスの相同な部位がATG開始コドンに変異している、本発明1001〜1009のいずれかの核酸。
[本発明1011]
核酸のポリペプチドコード配列の後にポリ(A)シグナルが続くことを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの核酸。
[本発明1012]
ポリペプチドコード配列の転写を駆動するプロモーター、好ましくは、異種プロモーター、特に、誘導性異種プロモーターを含むことを特徴とする、本発明1001〜1011のいずれかの核酸。
[本発明1013]
アデノ随伴ウイルス(AAV)、ガチョウパルボウイルス、アヒルパルボウイルス、およびヘビパルボウイルスに由来することを特徴とする、本発明1001〜1012のいずれかの核酸。
[本発明1014]
AAVが、ウシAAV(b-AAV)、イヌAAV(CAAV)、マウスAAV1、ヤギAAV、ラットAAV、トリAAV(AAAV)、AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびAAV13、特に、AAV2からなる群より選択されることを特徴とする、本発明1013の核酸。
[本発明1015]
発現カセット、構築物、ベクター、または細胞株の中に含まれる、本発明1001〜1014のいずれかの核酸。
[本発明1016]
本発明1001〜1014のいずれかの核酸によってコードされるポリペプチド。
[本発明1017]
集合活性化タンパク質(AAP)である、本発明1016のポリペプチド。
[本発明1018]
宿主細胞において、本発明1001〜1014のいずれかの核酸を発現させる工程を含む、本発明1016または1017のポリペプチドを産生する方法。
[本発明1019]
宿主細胞が、哺乳動物細胞株、特に、ヒト細胞株、バキュロウイルス感染に用いられる細胞株、細菌株、および酵母株からなるリストより選択されることを特徴とする、本発明1018の方法。
[本発明1020]
本発明1017のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
[本発明1021]
AAV2のAAP(SEQ ID NO.1)に特異的に結合することを特徴とする、本発明1020の抗体。
[本発明1022]
本発明1016または1017のポリペプチドを調製するための、本発明1001〜1014のいずれかの核酸の使用。
[本発明1023]
パルボウイルス粒子を調製するための、本発明1001〜1014のいずれかの核酸または本発明1016または1017のポリペプチドの使用。
[本発明1024]
機能タンパク質VP1、VP2、およびRep、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78をいずれも含まないパルボウイルス粒子を調製するための、本発明1023の核酸またはポリペプチドの使用。
[本発明1025]
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子を産生する方法であって、
i.rep非依存性プロモーターの制御下にある、パルボウイルスに由来するVP3コード配列(cds)からVP3を発現することができ、かつ本発明1001〜1014のいずれかの核酸によってコードされるタンパク質を発現することができる細胞を提供する工程、
ii.VP3および本発明1001〜1014のいずれかの核酸に由来するタンパク質の発現を促す条件で細胞をインキュベートし、それによって、パルボウイルス粒子を産生する工程、ならびに
iii. 任意で、細胞からパルボウイルス粒子を精製する工程
を含み、
細胞1個あたり少なくとも105個のウイルス粒子が形成され、かつ
VP1、VP2、およびRep、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78の機能タンパク質は発現されない、方法。
[本発明1026]
細胞1個あたり少なくとも106個、および好ましくは少なくとも107個のウイルス粒子が形成される、本発明1025の方法。
[本発明1027]
機能タンパク質VP1、VP2、およびRep、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78のタンパク質発現が細胞において遮断されている、本発明1025または1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
本発明1001〜1014のいずれかの核酸がVP3 cdsに対してシスで提供される、本発明1025〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
本発明1001〜1014のいずれかの核酸がVP3 cdsに対してトランスで提供される、本発明1025〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
パルボウイルス粒子が、Rep機能タンパク質、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78をいずれも含有しない、本発明1025〜1029のいずれかの方法。
[本発明1031]
発現された構造タンパク質の最大で1/50、好ましくは最大で1/100、より好ましくは最大で1/250、最も好ましくは最大で1/500が本発明1016のポリペプチドであり、特に、どの構造タンパク質も本発明1016のポリペプチドでない、本発明1025〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
粒子の最大で1/100、好ましくは粒子の最大で1/1,000、より好ましくは粒子の最大で1/10,000がDNAを含有し、特に、どの粒子もDNAを含有しない、本発明1025〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
VP3 cdsが1つまたは複数の変異を含む、本発明1025〜1032のいずれかの方法。
[本発明1034]
VP3 cdsの変異が、1つまたは複数の欠失、1つまたは複数の挿入、1つまたは複数の置換、およびその組み合わせからなる群より選択される変異である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
VP3 cdsが1つまたは複数のサイレント変異を含む、本発明1033または1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3 VLPの表面上に位置する1つまたは複数の変異につながる、本発明1033〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3のN末端に位置する1つまたは複数の変異につながる、本発明1033〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-453、I-459、I-471、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、およびI-716、好ましくはI-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587、特に、I-587からなる群より選択される1つまたは複数の位置への1つまたは複数の挿入につながる、本発明1033〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
I-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587からなる群より選択される2つの位置に、好ましくはI-261とI-587との組み合わせ、I-261とI-453との組み合わせ、またはI-453とI-587との組み合わせに、2つの挿入がなされる、本発明1038の方法。
[本発明1040]
VP3の3つの位置で変異される、好ましくは、位置453における挿入と位置587における挿入との組み合わせおよびさらなる変異と組み合わせされる、本発明1038の方法。
[本発明1041]
VP3が、ウイルスに対して異種の少なくとも1つのエピトープを含む、本発明1033〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
VP3タンパク質のエピトープがB細胞エピトープである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
B細胞エピトープが、I-453および/またはI-587、特に、AAV1、AAV2、またはAAV4のI-453および/またはI-587に挿入される、本発明1041または1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
VP3が融合タンパク質の中に含まれる、本発明1025〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
VP3が、リガンドとの結合に有用な少なくとも1つのタグを含む、本発明1025〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
VP3が少なくとも1つのさらなる変異を含む、本発明1033〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
本発明1025〜1046の方法から入手可能なパルボウイルス粒子。
[本発明1048]
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子であって、
i.VP3は、任意で1つまたは複数の変異を含み、かつ、
ii.VP3は、異種核局在化シグナルを含有せず、かつ
iii.粒子は、Rep機能タンパク質、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78をいずれも含有しない、
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子。
[本発明1049]
キャプシドがVP3のみからなる、本発明1047または1048のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1050]
VP3の変異が本発明1033〜1046のいずれかの変異である、本発明1047〜1049のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1051]
異種プロモーターおよび本発明1025〜1046のいずれかのVP3 cdsを含む、VP3発現カセットAであって、VP3の転写は異種プロモーターによって駆動され、かつ該発現カセットは本質的にVP3のみを発現することができる、VP3発現カセットA。
[本発明1052]
異種プロモーター、本発明1025〜1046のいずれかのVP3 cds、ならびに本発明1001〜1014のいずれかの核酸を含む、組み合わせ発現カセットであって、VP3および本発明1016〜1017のいずれかのポリペプチドの発現は、この1つの異種プロモーターによって駆動される、組み合わせ発現カセット。
[本発明1053]
本発明1051の少なくとも1つのVP3発現カセット、および本発明1015の発現カセットに含まれる少なくとも1つの核酸を含む、キット。
[本発明1054]
本発明1052の少なくとも1つの組み合わせ発現カセットおよびマニュアルを含む、キット。
[本発明1055]
医用薬剤として使用するための、本発明1047〜1050のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1056]
医用薬剤が1種類または複数の種類の賦形剤をさらに含む、本発明1055のパルボウイルス粒子。
[本発明1057]
医用薬剤がワクチンである、本発明1055または1056のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1058]
ワクチンが1種類または複数のアジュバントをさらに含む、本発明1057のパルボウイルス粒子。
[本発明1059]
自己免疫疾患、感染症、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、代謝病、(慢性)炎症性疾患、神経学的疾患、依存症の予防もしくは治療において使用するための、または眼科学において用いられる、本発明1055〜1058のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1060]
自己免疫疾患および/または慢性炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、乾癬、およびクローン病からなる群より選択される、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1061]
腫瘍疾患が、モノクローナル抗体を用いた治療に適している、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1062]
アレルギー性疾患が、喘息、アレルギー、およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1063]
神経学的疾患がアルツハイマー病である、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1064]
代謝病がアテローム性動脈硬化症である、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1065]
眼科学的疾患が加齢黄斑変性である、本発明1059のパルボウイルス粒子。
[本発明1066]
B細胞寛容を破壊する方法において使用するための、本発明1055〜1065のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1067]
パルボウイルス変異構造タンパク質が遺伝子療法におけるベクターとして用いられない、本発明1055〜1066のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1068]
遺伝子療法のための、本発明1055〜1056および1059〜1066のいずれかのパルボウイルス粒子の使用。
[本発明1069]
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子を産生する方法であって、
i.細胞において、rep非依存性プロモーターの制御下にある、パルボウイルスに由来するVP3コード配列(cds)からVP3を発現させる工程、
ii.細胞において、rep非依存性プロモーターの制御下にあるDNA配列断片(断片Z)を発現させる工程であって、断片Zは、
(1)VP3開始コドン上流にある少なくとも44ヌクレオチド、ならびに
(2)
a)パルボウイルス、または
b)AAV2に由来する断片Zのヌクレオチド配列と少なくとも60％、好ましくは80％、より好ましくは90％、特に99％、および有利には100％同一のヌクレオチド配列(図2)、または
c)4xSSC、0.1％SDSにおいて65℃で、AAV2の断片Z DNA分子の相補鎖にハイブリダイズする核酸配列、または
d)トランス相補アッセイにおいて使用して、VP3 VLPの集合を引き起こすことができる核酸配列
に由来する、開始コドンから開始して、VP3 cdsの242ヌクレオチドより多く
を含む、工程、
iii.VP3発現に適した条件で細胞をインキュベートする工程、ならびに
iv.細胞からパルボウイルス粒子を精製する工程
を含み、
細胞1個あたり約105個、好ましくは約106個、およびより好ましくは約107個のウイルス粒子が形成され、かつ
VP1、VP2、およびRep、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78タンパク質は本質的に発現されない、方法。
[本発明1070]
断片Zの配列がVP3 cdsと重複しないことから、VP3のみからなるパルボウイルス粒子が得られる、本発明1069の方法。
[本発明1071]
VP1、VP2、およびRep、特に、Rep40、Rep52、Rep68、およびRep78のタンパク質発現が遮断されている、本発明1069または1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
断片ZのDNA配列の後にポリ(A)シグナルが続く、本発明1069〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
断片Zが、VP3開始コドンの上流にある少なくとも44ヌクレオチド、好ましくは113ヌクレオチド、およびより好ましくは198ヌクレオチドを含む、本発明1069〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
断片Zが、開始コドンから開始して、VP3 cdsの242ヌクレオチドより多く、好ましくは約275ヌクレオチドより多く、約300ヌクレオチドより多く、約325ヌクレオチドより多く、約350ヌクレオチドより多く、約375ヌクレオチドより多く、約400ヌクレオチドより多く、約425ヌクレオチドより多く、および最も好ましくは約445ヌクレオチドより多くを含む、本発明1069〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
断片Zが少なくとも1つの変異を含む、本発明1069〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
断片Zの変異が、タンパク質翻訳のための少なくとも1つの停止コドンを含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
断片ZがVP3 cdsに対してシスで提供される、本発明1069〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
断片ZがVP3 cdsに対してトランスで提供される、本発明1069〜1077のいずれかの方法。
[本発明1079]
パルボウイルス粒子がRepタンパク質を含有しない、本発明1069〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
発現された構造タンパク質の1/50のみ、好ましくは構造タンパク質の1/100、より好ましくは構造タンパク質の1/250、最も好ましくは構造タンパク質の1/500がVP3のN末端伸長バージョンであり、および特には、いずれの構造タンパク質もVP3のN末端伸長バージョンでない、本発明1069〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
粒子の1/100のみ、好ましくは粒子の1/1000、より好ましくは粒子の1/10000のみがウイルスDNAを含有し、および特には、いずれの粒子も全くウイルスDNAを含有しない、本発明1069〜1080のいずれかの方法。
[本発明1082]
パルボウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ウシAAV(b-AAV)、イヌAAV(CAAV)、およびトリAAV(AAAV)からなる群より選択される、本発明1069〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
AAVが、AAV-1、AAV-2、AAV-3b、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、およびAAV-12、特に、AAV-2からなる群より選択される、本発明1082の方法。
[本発明1084]
VP3 cdsが1つまたは複数の変異をさらに含む、本発明1069〜1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
VP3 cdsの変異が、1つまたは複数の欠失、1つまたは複数の挿入、1つまたは複数の置換、およびこれらの変異の組み合わせからなる群より選択される変異である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
VP3 cdsが1つまたは複数のサイレント変異を含む、本発明1084または1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3 VLPの表面上に位置する1つまたは複数の変異につながる、本発明1084〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、VP3のN末端に位置する1つまたは複数の変異につながる、本発明1084〜1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
VP3 cdsの1つまたは複数の変異が、I-261、I-266、I-381、I-447、I-448、I-453、I-459、I-471、I-534、I-570、I-573、I-584、I-587、I-588、I-591、I-657、I-664、I-713、およびI-716、好ましくは、I-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587、特に、I-587からなる群より選択される1つまたは複数の位置への1つまたは複数の挿入につながる、本発明1084〜1088のいずれかの方法。
[本発明1090]
I-261、I-453、I-534、I-570、I-573、およびI-587からなる群より選択される2つの位置に、好ましくは、I-261とI-587との組み合わせ、I-261とI-453との組み合わせ、またはI-453とI-587との組み合わせに、2つの挿入がなされる、本発明1089の方法。
[本発明1091]
VP3が、ウイルスに対して異種の少なくとも1つのエピトープを含む、本発明1084〜1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
VP3タンパク質のエピトープがB細胞エピトープである、本発明1091の方法。
[本発明1093]
B細胞エピトープが、I-453および/またはI-587、特に、AAV-1、AAV-2、またはAAV-4のI-453および/またはI-587に挿入される、本発明1091または1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
VP3が第2のタンパク質またはペプチドと融合している、本発明1085〜1093のいずれかの方法。
[本発明1095]
VP3が、リガンドとの結合に有用な少なくとも1つのタグを含む、本発明1085〜1094のいずれかの方法。
[本発明1096]
VP3が少なくとも1つのさらなる変異を含む、本発明1085〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
本発明1069〜1096の方法から入手可能なパルボウイルス粒子。
[本発明1098]
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子であって、
i.VP3は、1つまたは複数の変異を含み、かつ
ii.VP3は、異種核局在化シグナル(NLS)を含有せず、かつ
iii.粒子は、Repタンパク質を含有しない、
VP3から本質的になるパルボウイルス粒子。
[本発明1099]
キャプシドがVP3のみからなる、本発明1097または1098のパルボウイルス粒子。
[本発明1100]
VP3の変異が、本発明1085〜1096のいずれかの変異である、本発明1097〜1099のいずれかのパルボウイルス粒子。
[本発明1101]
異種プロモーターならびに本発明1069および1084〜1096のいずれかのVP3 cdsを含む、発現カセットAであって、VP3の転写は異種プロモーターによって駆動され、かつ該発現カセットは本質的にVP3のみを発現し、特に好ましくはVP3しか発現しない、発現カセットA。
[本発明1102]
異種プロモーターならびに本発明1069および1073〜1076のいずれかの断片Zを含む、発現カセットBであって、断片Zの転写は異種プロモーターによって駆動される、発現カセットB。
[本発明1103]
異種プロモーター、本発明1069および1084〜1096のいずれかのVP3 cds、ならびに本発明1069および1073〜1076のいずれかの断片Zを含む、発現カセットCであって、VP3および断片Zの発現は、この1つの異種プロモーターによって駆動される、発現カセットC。
[本発明1104]
本発明1101の少なくとも1つの発現カセットAおよび本発明1102の少なくとも1つの発現カセットBを含む、キット。
[本発明1105]
本発明1103の少なくとも1つの発現カセットCを含む、キット。
[本発明1106]
本発明1097〜1100のいずれかのパルボウイルス粒子を含む、医用薬剤。
[本発明1107]
1種類または複数の種類の賦形剤をさらに含む、本発明1106の医用薬剤。
[本発明1108]
ワクチンである、本発明1106または1107のいずれかの医用薬剤。
[本発明1109]
1種類または複数の種類のアジュバントをさらに含む、本発明1108のワクチン。
[本発明1110]
自己免疫疾患、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、代謝病、炎症性疾患、神経学的疾患の予防もしくは治療のための、または眼科学において用いられる、本発明1106〜1109のいずれかの医用薬剤。
[本発明1111]
免疫寛容を破壊するための、本発明1106〜1110のいずれかの医用薬剤。
[本発明1112]
疾患が感染症でない、本発明1106〜1111のいずれかの医用薬剤。
[本発明1113]
パルボウイルス変異構造タンパク質が遺伝子療法におけるベクターとして用いられない、本発明1106〜1112のいずれかの医用薬剤。
[本発明1114]
好ましくは、自己免疫疾患および/もしくは慢性炎症性疾患、好ましくは、慢性関節リウマチおよび/もしくはクローン病、腫瘍疾患、アレルギー性疾患、喘息、アルツハイマー病、アテローム性動脈硬化症、代謝病、炎症性疾患、神経学的疾患を予防もしくは治療するための、または眼科学において用いられる、ワクチンを製造するための、パルボウイルスにとって異種の少なくとも1つのB細胞エピトープを含む本発明1097〜1100のいずれかのパルボウイルス粒子の使用であって、特に、医用薬剤が本発明1106〜1113のいずれか一項に記載されている通りである、使用。