【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工３次元肺モデル組織培養物であって、
ａ）多孔質３次元マトリックス、３次元ゲルマトリックスまたは多孔質膜支持体である人工的組織スキャフォールドを含まず、
ｂ）培養細胞から構成され、
ｃ）少なくとも肺上皮細胞及び間質細胞、好ましくは、線維芽細胞を含み、
ｄ）肺上皮細胞が多く存在する表面を有する細胞凝集塊を１以上含み、
ｅ）その上皮細胞が上皮分化マーカーを発現する
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項２】
細胞凝集塊のサイズまたは平均サイズが、少なくとも８０μｍ及び最大でも６００μｍであり、好ましくは、１００〜３００μｍであり、
かつ／または、その細胞の量が、
少なくとも２×１０４細胞、好ましくは、少なくとも４×１０４細胞、
最大でも５×１０５細胞、好ましくは、最大でも２×１０５または最大でも１０５細胞である
請求項１に記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項３】
モデル組織培養物が、人工的組織スキャフォールドを含まず、かつ／または、
モデル組織培養物が、細胞外マトリックスを含み、その細胞外マトリックスタンパク質が、組織培養物に含まれる細胞型のうちの少なくとも１つによって、好ましくは、線維芽細胞によって分泌され、かつ／または、
上皮細胞が、細胞凝集塊の表面の少なくとも一部に肺上皮細胞内層を形成し、好ましくは、肺上皮細胞内層が、少なくとも部分的に、細胞凝集塊の表面を被覆する
請求項１または２に記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項４】
モデル組織培養物が、対象から得られた培養初代細胞を含み、かつ／または、
モデル組織培養物が、培養前に脱分化した細胞及び培養後によって再分化した細胞を含み、かつ／または、
モデル組織培養物が、樹立細胞株の細胞を含む
請求項１ないし３のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項５】
内皮細胞を含む
請求項１ないし４のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項６】
マーカー：ＴＴＦ１、ＡＱＰ３、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＣ、ＫＲＴ７のレベルが、非培養細胞、好ましくは、純化された初代細胞を含む対照と比べて増加していて、
マーカー：ＣＸＣＬ８、ＩＬ１ｂ、Ｓ１００Ａ４のレベルが、非培養細胞を含む対照と比べて減少していて、
マーカー：ＡＱＰ３、ＳＦＴＰＡのレベルが、対照の２次元培養物と比べて増加していて、
マーカー：ＣＸＣＬ８、ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、Ｓ１００Ａ４、Ｎ−カドヘリンのレベルが、対照の２次元培養物と比べて減少している
請求項１ないし５のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項７】
培養細胞、好ましくは、肺上皮細胞及び／または間質細胞が、モデル組織培養物が肺疾患モデル組織培養物となる罹患肺組織の病理学的特徴を有する病的細胞を含み、好ましくは、
その疾患が炎症を伴い、かつ、病的細胞が正常レベルを上回る炎症性サイトカインを発現し、かつ、モデルが炎症モデルであり、
疾患が腫瘍であり、かつ、細胞が、悪性形質転換細胞または不死細胞を含む群から選択される形質転換細胞であり、かつ、モデルが腫瘍モデルであり、
疾患が線維症を伴い、かつ、モデルが線維症モデルであり、
疾患が組織の損傷を伴い、かつ、モデルが再生モデルである
請求項１ないし６のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物。
【請求項８】
人工３次元肺モデル組織培養物の調製方法であって、
少なくとも肺上皮細胞及び間質細胞、好ましくは、線維芽細胞、より好ましくは、初代線維芽細胞の混合懸濁物を調製する工程、
その懸濁物の細胞をペレット化する工程、
細胞をペレット化する工程、
ペレット化した懸濁物を、ＣＯ２の存在下で、細胞が１以上の細胞凝集塊を含む３次元肺モデル組織を形成するのに十分な時間、インキュベートする工程、
必要に応じ、モデル組織を、
ａ）参照培養物と比較したときの発現レベルの増加を、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すとみなし、モデル組織培養物に特徴的な１以上の上皮分化マーカーの発現、ならびに／または、
ｂ）好適な参照培養物と比較したときの発現レベルの減少を、３次元肺モデル組織培養物の形成を示すとみなし、１以上の炎症促進性サイトカインの発現、
ｃ）１以上の凝集塊のサイズ及び形態
についてアッセイする工程、を有する
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織培養物の調製方法。
【請求項９】
細胞凝集塊の平均サイズが、少なくとも、８０μｍ及び最大でも６００μｍであり、好ましくは、１００〜３００μｍであり、かつ／または、
１以上の細胞凝集塊の細胞の量が、
少なくとも２×１０４細胞、好ましくは、少なくとも４×１０４細胞、及び、
最大でも５×１０５細胞、好ましくは、最大でも２×１０５または最大でも１０５細胞である
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ペレット化した懸濁物を、
ＣＯ２の存在下で、
２週間以下の期間、好ましくは、１２、１０、８、７、６または５日以下の期間、及び、
１０時間以上の期間、好ましくは、１２または１４時間以上の期間、インキュベートする
請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
混合懸濁物を調製する際に、１種類以上の細胞を、１８時間以内に、好ましくは、１２時間以内に、より好ましくは、４時間以内に、特に好ましくは、１時間以内にまたは同時に容器に添加し、特に好ましくは、使用される各種類の細胞をその期間内に添加する
請求項８ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
容器が組織培養用の処理を行なっていないＶ底の容器であり、かつ／または、
ペレット化を２００〜６００ｇで１〜２０分間、好ましくは、２〜１０分間行ない、かつ／または、
細胞を、以下の細胞特徴：細胞の細胞状態、例えば、細胞相、細胞生存性、アポトーシスもしくは瀕死状態；細胞型；細胞位置；悪性形質転換；炎症のうちの１つまたは複数について知らせるのに好適な生体適合性色素で染色する
請求項８ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、対象から得られた培養初代細胞を含み、かつ／または、
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、培養前に脱分化した細胞を含み、かつ、細胞が培養によって再分化し、かつ／または、
少なくとも肺上皮細胞及び肺間質細胞の混合懸濁物が、樹立細胞株の細胞を含む
請求項８ないし１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
培養細胞、好ましくは、肺上皮細胞及び／または間質細胞が、モデル組織培養物が肺疾患モデル組織培養物となる罹患肺組織の病理学的特徴を有する病的細胞を含む
請求項８ないし１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
肺組織に対する薬物の効果についてスクリーニングする方法であって、
請求項１ないし７のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物を準備する工程、
モデル組織培養物の少なくとも試験サンプル及び参照サンプルを採取する工程、
試験サンプルを薬物と接触させる一方で、試験サンプル及び参照サンプルを同じ条件下に維持する工程、
参照サンプルと比較して試験サンプルの何らかの変化または変更を検出し、試験サンプルの何らかの変化または変更が検出された場合、薬物の効果を示すものと評価する工程、を有する
ことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１６】
モデル組織培養物が健康肺組織のモデルであり、かつ、薬物の有害効果を試験し、試験サンプルの細胞を害する変化または変更を、薬物の毒性効果または有害効果と評価する
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
モデル組織培養物が、病理学的特徴を有する病的細胞を含む肺疾患モデル組織培養物であり、かつ、薬物の有益な効果が試験され、
疾患の程度を得るために、病理学的特徴を測定または評価するアッセイをモデル組織培養物について準備し、
健康肺組織の参照サンプル（健康参照サンプル）及び／または罹患肺組織の参照サンプル（罹患参照サンプル）を準備し、
それを薬物と接触させる前及び接触させた後に、病理学的特徴を健康参照サンプル及び／または罹患参照サンプルならびに少なくとも１つの試験サンプルにおいて測定または評価し、
試験サンプルにおける疾患の程度を、健康参照サンプルにおける疾患の程度へと変化させる及び／または罹患参照サンプルにおける疾患の程度から変化させる、試験サンプルにおける何らかの変化または変更を、薬物の有益な効果と評価する
請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１ないし７のいずれかに記載の人工３次元肺モデル組織培養物の各サンプルが、プレートの別々の容器中に入れられている少なくとも２つの容器と、
モデル組織培養物の細胞を培養するための適切な培地と、
多数並んだ容器を有する試験プレートとを備える
ことを特徴とする人工３次元肺モデル組織キット。
【請求項１９】
プレートが９６ウェルプレートであるか、
プレートがＶ底プレートであるか、
容器中の培養物サンプルが、
少なくとも１０３、好ましくは、少なくとも１０４、より好ましくは、少なくとも２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４細胞、及び、
最大でも１０７、好ましくは、最大でも１０６、より好ましくは、最大でも５×１０５、４×１０５、３×１０５、２×１０５までの細胞、または最大でも１０５、の量の細胞を含むか、
容器が個別にまたは１つにまとめて密封されていて、かつ、肺組織培養に好適なＣＯ２が豊富な環境または雰囲気を含むか、
ＣＯ２が豊富な環境または雰囲気が、
少なくとも２％、３％、４％のＣＯ２環境、最大でも１０％、９％、８％または７％のＣＯ２環境、特に好ましくは、約５％のＣＯ２を含むか、
のいずれかの特徴を１つまたは複数を有する
請求項１８に記載の人工３次元肺モデル組織キット。
【請求項２０】
毒性試験、候補化合物の探索を含む群から選択される肺組織に対する化合物の効果についての並行スクリーニング、
モデル組織培養物が初代患者肺細胞から得られるという条件での、化合物のその治療能力についての患者特異的な試験、
肺組織における細胞相互作用の研究、
肺疾患を含む群から選択される疾患の期間中における遺伝子変化の研究、
のいずれかのための、請求項１ないし６のいずれかに記載の３次元肺モデル組織培養物の使用。