【手続補正書】
【提出日】平成21年8月20日(2009.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケフィア水溶性画分中の、
分子量が６０７．８で、二重結合、水酸基及び芳香族基を有し、
酸性あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定な抗酸化性物質からなることを特徴とするケフィアを用いた抗酸化剤。
【請求項２】
請求項１記載の抗酸化剤を有する糖尿病治療剤。
【請求項３】
請求項１記載の抗酸化剤を有し、ＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤。
【請求項４】
請求項１記載の抗酸化剤を有する健康食品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ケフィアを用いた抗酸化剤、これを用いた糖尿病治療剤、ＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤及び健康食品
【技術分野】
【０００１】
本発明は、健康食品であるケフィアの抗酸化作用及びその効果を利用した糖尿病治療剤、ＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤及び健康食品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ケフィアはグルジア共和国コーカサス地方の人々が愛飲している発酵乳で、ウシやヤギ、ヒツジの乳をヤギの革袋に入れて保存していたものに偶然、乳酸菌、酵母が混入して乳酸及びアルコール発酵して生じたものである。コーカサス型発酵乳ケフィアは独立国家共同体のロシア共和国科学アカデミー微生物中央研究所が長年の歳月をかけ、製造方法を研究して得た安定なケフィア粒を菌種としたものである。消化機能を亢進させ、腎臓病、循環器疾患の治療食として医療機関で用いられている。
ケフィア粒は１〜３ｃｍ前後のスポンジ状の固まりで約２０種類の乳酸菌の他、酵母菌、酢酸菌を有し、日本においては一般にヨーグルトきのこと呼ばれている。ケフィア粒に牛乳を入れ、所定時間常温で密閉することによりケフィア粒混入のケフィア（ケフィアヨーグルトと呼ばれる）が得られ、これをざるで濾してケフィア粒を取り除くことにより簡単にケフィアを得ることができ、健康食品として一般家庭でも愛用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
近年、人間が生命活動を行う上で自らの代謝系から生ずる活性酸素が人間の老化要因として広く注目されている。この活性酸素による酸化ストレスは、不適切な食生活、ストレス、紫外線等によっても生体内において増加し、この活性酸素が老化のみでなく、癌その他の種種の疾病の要因あるいは悪化の要因として問題視され、この活性酸素を減らす事が人間の健康維持のための大きな研究課題となっている。
また、日本においては近年、欧米型の食生活から、インスリン非依存性のＩＩ型糖尿病が増加の一途をたどり、多くの日本人を苦しめている。このＩＩ型糖尿病においては、健康維持の中核の生理作用である細胞のグルコース取り込みが行なえないことで、生態の恒常性維持が行えず、結果として様々な合併症を併発し深刻な症状を呈することが珍しくない。このＩＩ型糖尿病の要因である細胞のグルコース取り込み低下に活性酸素が大きく関与していると考えられ、活性酸素の低減により、細胞のグルコース取り込みが活性化され、ＩＩ型糖尿病治療に役立つと考えられ、さらに活性酸素の低減作用を有する食品及び薬剤の開発が求められている。古くより長寿とされるロシアのコーカサス地方で愛飲され、近年日本でも健康食品として注目されている発酵乳ケフィアにもこの活性酸素の低減作用があるのではないかと推察され、発酵乳ケフィアより、活性酸素低減作用（抗酸化作用）を有する物質を単離・同定して抗酸化作用を有する物質を製造することは、人類の健康維持、かつ糖尿病治療、特にＩＩ型糖尿病治療に多大な貢献となると考えられる。
【０００４】
本発明はこの様な事情に鑑みてなされたもので、発酵乳ケフィアより、活性酸素低減作用（抗酸化作用）を有する物質（抗酸化性物質）を製造することを第１の目的とし、さらにこの抗酸化性物質を主体として使用した糖尿病治療剤、ＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤、及び健康食品を提供することを第２の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の発明に係るケフィアを用いた抗酸化剤は、ケフィア水溶性画分中の、分子量が６０７．８で、二重結合、水酸基及び芳香族基を有し、酸性あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定な抗酸化性物質からなっている。
第２の発明に係る糖尿病治療剤は、第１の発明に係る抗酸化剤を有している。
第３の発明に係るＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤は、第１の発明に係る抗酸化剤を有している。
第４の発明に係る健康食品は、第１の発明に係る抗酸化剤を有している。
【０００６】
ここで、前記抗酸化剤の製造方法は、ケフィアを遠心分離し乳脂肪分を沈澱させ上清を得る第１工程と、該上清を分画分子量１０００の透析膜で透析して分子量１０００以下の外液を得る第２工程と、該外液を濃縮した濃縮液をアルカリで中和して生じた沈澱物を除去して分離液を得る第３工程と、該分離液を分画分子量１００の透析膜で透析し、分子量１００以上の内液を得る第４工程と、該内液よりオンラインＨＰＬＣ法を用いて、抗酸化物質を同定して分取する第５工程とを有している。
前記オンラインＨＰＬＣ法はＤＰＰＨ−ＨＰＬＣ法であり、前記第４工程で分取したケフィアの抗酸化物質は、ゲルろ過して精製されている。
【０００７】
前記オンラインＨＰＬＣ法とは、混合物中の抗酸化物質の分離及び同定、活性評価を同時に行うことのできる方法であり、特にＤＰＰＨを用いたオンラインＨＰＬＣ法はＨＰＬＣ分析システムにＤＰＰＨ（ジフェニル１，２−ピクリルヒドラジル）を組み合わせたもので、通常のＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ）分析により混合物中の成分を分離させ、その後、ラインにＤＰＰＨ溶液を混合させ、反応させ、反応物を同時に多数の波長の検出が可能なフォトダイオードアレイ検出器に通し、各成分のスペクトルとＤＰＰＨが抗酸化物質と反応することによる吸光度減少を同時に測定することで抗酸化能を持つピークの同定を行うものである。図１にその構成を示す。図１に示すように、逆相ＨＰＬＣ後の溶離液にメタノールを溶媒としたＤＰＰＨ溶液を供給し、抗酸化物質とＤＰＰＨが反応することによる５１７ｎｍにおける吸光度減少をモニターすることで混合物中の抗酸化活性を有する成分を同定するものであり、低ｐＨの緩衝液（バッファー）でも分析が可能でありＤＰＰＨの吸光度のベースラインはＤＰＰＨの代わりにルミノールを使用したものに比べ安定である。また、抗酸化活性を失わずに抗酸化物質を分離・分取が可能である。ＤＰＰＨはメタノール溶媒中で５１７ｎｍにおいて極大吸収を持ち、目視では紫色として認められる。図２にＤＰＰＨによる抗酸化物質検出の概念図を示すが、図２に示すように、ＤＰＰＨが抗酸化物質から水素を受容する形の反応を起こし還元されると還元型のＤＰＰＨとなり５１７ｎｍにおける極大吸収が著しく減少し、紫色が脱色される。ＨＰＬＣ分析によりこの紫色の脱色のピークを計測することにより、抗酸化物質の検出をする。
【０００８】
【発明の効果】
【０００９】
請求項１記載のケフィアを用いた抗酸化剤は老化のみでなく、癌その他の種種の疾病の要因あるいは悪化の要因として問題視されている生体の活性酸素の低減作用を有するため有用である。
特に請求項１記載のケフィアを用いた抗酸化剤は、酸性あるいは中性で安定で、かつ高圧蒸気滅菌にも安定であるので、利用しやすい。
請求項２記載のケフィアの抗酸化物質を有する糖尿病治療剤は、グルコース取込み増強作用を有しているので、糖尿病特にＩＩ型の抗糖尿病治療剤の開発及び抗糖尿病治療剤への利用が可能となった。
請求項３記載のケフィアの抗酸化物質を有するＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤は、ケフィアの抗酸化物質のＤＮＡ複製のエラー修復作用、ＤＮＡ修復促進作用により、皮膚細胞のＵＶ損傷防止、あるいは皮膚の光老化防止、ＤＮＡの突然変異が原因で生じる癌や遺伝病の予防、治療などへの広範な利用が可能となった。
請求項４記載のケフィアの抗酸化物質を有する健康食品は、生体の活性酸素を低減する機能性食品、又は健康食品の開発が可能となった。
また、以上のケフィアを用いた抗酸化剤はケフィアより、活性酸素低減作用（抗酸化作用）を有する物質を単離して製造しているので、健康食品及びＩＩ型の抗糖尿病機能性食品、ＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤の開発に貢献できる事となった。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステムの構成図である。
【図２】ＤＰＰＨによる抗酸化物質検出の概念図である。
【図３】分子量１０００以下の分画サンプルの調製工程図である。
【図４】アスコルビン酸の抗酸化活性の説明図である。
【図５】ケフィア水溶性画分（分子量１０００以下）の抗酸化物質の探索結果の説明図である。
【図６】ケフィア抗酸化物質の紫外ー可視スペクトル図である。
【図７】ケフィア抗酸化物質及び代表的フラボノイド類の紫外ー可視スペクトル図である。
【図８】活性物質のゲルろ過による精製時の吸光度図である。
【図９】ケフィア抗酸化物質のマススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）の説明図である。
【図１０】ケフィア抗酸化物質の赤外線吸収スペクトル図である。
【図１１】試験管内における抗酸化活性測定の結果の説明図である。
【図１２】ＤＣＦＨ−ＤＡの作用機序の説明図である。
【図１３】ヒト白血病由来細胞株K562を用いた細胞内活性酸素消去試験の工程図である。
【図１４】ＦＣＭ（フローサイトメトリー）による細胞内活性酸素消去活性の測定図である。
【図１５】ケフィア抗酸化物質の脂肪細胞への糖取込促進効果の測定図である。
【図１６】ケフィア抗酸化物質の修復酵素ｈＭＬＨＩ遺伝子発現増強効果の説明図である。
【図１７】ケフィア抗酸化物質の不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）増強効果とその熱安定性の説明図である。
【発明を実施するためのの形態】
【００１１】
以下、本発明に係るケフィアの抗酸化物質の同定方法及び製造方法について具体化した実施の形態及び実施例を挙げて以下に説明する。
【００１２】
（実施例１）
本実施例においてはまずケフィアの水溶性画分を透析膜によっていくつかの分子量範囲に分画し、主要な抗酸化活性を有する分画の同定を行った。さらにその分画中の構成成分を陰イオン交換カラムにより分離し、ＤＰＰＨを用いたオンラインＨＰＬＣ法を採用して抗酸化活性をもつ成分の同定を行った。更にこれを分取し精製を進めた。得られた精製物について高速原子衝撃質量分析法による分子量測定と赤外吸収スペクトルの測定を行った。また精製物の試験管内での抗酸化活性はＤＰＰＨ還元能を指標として測定を行った。
まず、本実施例において使用する材料、及び装置について概略説明する。
（１）材料
出発材料であるケフィアは日本ケフィア株式会社から提供されたケフィア発酵液（乳固形分１７％、内乳脂肪分２％、乳酸５０％溶液、ペクチン０．６％、ｐＨ調整３．９０）を冷蔵保存（４℃）したものを用いる。
（２）透析膜と浸透圧測定
活性成分の分子量を検討するために、スペクトラム（SPECTRUM）社の透析膜で分画分子量２,000（Spectra/Por  Membrane  MWCO:2,000）、分画分子量1,000（Spectra/Por  Membrane  MWCO:1,000）、分画分子量500（Spectra/Por  Membrane  MWCO:500）、分画分子量100（Spectra/Por  Membrane  MWCO:100）のものを用いた。また各分子量範囲の水溶性画分の浸透圧測定にはヴォーゲル（VOGEL）社の浸透圧測定器OM802-Dを用いた。
（３）ＤＰＰＨを用いた試験管内抗酸化能試験
ＤＰＰＨは和光純薬工業株式会社より入手した。ＤＰＰＨは８０％メタノールを溶媒とし、必ず実験当日に調製を行い遮光して冷蔵保存した。また抗酸化能試験においては、多サンプルの吸光度を同一条件で測定するためにテカン（TECAN）社のスペクトラリーダーを用い、９６穴のウェルプレート（孔あきプレート）上で４９２ｎｍにおける吸光度でＤＰＰＨの吸光度減少を同時測定した。
【００１３】
（４）オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム
図１に示すように、オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０は、システムコントローラ１２（Waters  600E  System  Controller）、オートサンプラー１３（Waters  717  plus  Autosampler）、フォトダイオードアレイ検出器１４（Waters  996  Photodiode  Array  Detector）を用いてウォーターズ（Waters）社のクロマトグラフィマネージャー１８（Chromatography  Manager  MILLENIUM32）によりシステムのコントロール及びデータ解析を行った。またＤＰＰＨ溶液供給用ポンプとしてＤＰＰＨポンプ１５（Waters  501  HPLC  pump）を用いた。分離用カラムとして東ソー（TOSOH）社のTSKgel  DEAE-5PW（φ７.５ｍｍ×７５ｍｍ）を陰イオン交換カラム１６として使用した。また目的物質分取の自動化に際しアドバンテック（ADVANTEC）社のフラクションコレクター１７（SF-2120  SUPER  FRACTION  COLLECTOR）を用いた。
【００１４】
（５）ゲルろ過
ゲルろ過精製のためにバイオラッド（BIO-RAD）社のバイオゲル／BIO-Gel  P-2樹脂（分離分子量範囲１００−１８００）を用いたカラムを作製した（φ１０ｍｍ×４５０ｍｍ）。カラムはFPLC-HPLC変換アダプターによりオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステムへと接続して使用した。
さらにゲルろ過溶出パターンによる精製物の分子量推測を行った。標準品としてはビタミンＢ12（M.W.1355.4）、ブロモフェノールブルー（M.W.669.97）、フェノールレッド（M.W.354.38）を和光純薬工業株式会社より入手し実験に用いた。
【００１５】
（６）逆相ＨＰＬＣ分析
ゲルろ過後精製物の分析のため分割管（Waters  2695  Separation  Module）をウォーターズ社のクロマトグラフィマネージャー１８によりコントロールしてデータ解析を行った。分離用カラムとして東ソー社の逆相系カラムであるTSKgel  ODS-80Ts（φ４.６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いた。
【００１６】
（７）高速原子衝撃質量分析法（FAB-MS）による分子量測定
九州大学大学院薬学研究院創薬科学部門薬用資源制御学講座にゲルろ過後精製物１ｍｇを供し、高速原子衝撃質量分析法（Fast  Atom  Bombarment  Mass  Spectrometry,  FAB-MS）による分子量測定を依頼した。
（８）赤外線吸収スペクトル測定
（株）島津総合分析センターに赤外線吸収スペクトル測定を依頼した。ゲルろ過後精製物０．５ｍｇを供し、島津フーリエ変換赤外分光光度計FTIR-8200PC、赤外顕微鏡AIM-8000による顕微赤外線吸収スペクトル測定を行った。
【００１７】
実験方法と結果
（１）ケフィア水溶性画分の調整と分子量分画
分子量１０００以下のケフィア水溶性画分サンプル調製時における、各段階でのサンプル重量、体積及び浸透圧を図３に示す。
図３に示すように、ケフィア発酵液２７５ｇ（乳固形分１７％、内乳脂肪分２％、乳酸５０％溶液、ペクチン０．６％、ｐＨ調整３．９０）を遠心分離（１１０００ｇ、３０ｍｉｎ）し、乳脂肪分を沈澱させケフィア上清（ケフィア水溶性画分サンプルＡ）１１５ｇを得た（第１工程）。
得られた上清を分画分子量１０００の透析膜に移し、１０００ｍｌの超純水で２４時間の透析を行い分子量１０００以下の外液を得た（第２工程）。得られた外液をエバポレーターによって濃縮した。濃縮液は４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて中和し、生じた主として蛋白質の沈澱物を遠心分離（５５０ｇ、２０ｍｉｎ）する事で除いた（第３工程）。ここで得られた上清（分離液）は脱塩の目的で分画分子量１００の透析膜に移し、１０００ｍｌの超純水で２４時間の透析を行い分子量１００以上の内液を得た（第４工程）。得られた内液をエバポレーターによって濃縮し、浸透圧を０.３００ｏｓｍｏｌ／ｋｇに調整したものを分子量１０００以下のサンプル（Ｂ）とした。
【００１８】
またここで分画分子量１０００の透析膜内に残された内液の液量を適正に保ちながら透析を２回繰り返して分子量１０００以下の物質を除いた。次にこうして調製した分子量およそ１０００以上の物質を含む内液を分画分子量２０００の透析膜に移し、１０００ｍｌの超純水で２４時間の透析を行った。得られた外液をエバポレーターによって濃縮し、浸透圧を０.３００ｏｓｍｏｌ／ｋｇに調整したものを分子量１０００から２０００のサンプル（Ｃ）とした。
また得られた内液をエバポレーターによって濃縮し、浸透圧を０.３００ｏｓｍｏｌ／ｋｇに調整したものを分子量２０００以上のサンプル（Ｄ）とした。
【００１９】
（２）分子量分画サンプルの定性的抗酸化能試験
ＤＰＰＨは実験当日に８０％メタノール溶媒に溶解させ、０.１ｍＭの濃度でストックした。
調製したケフィア水溶性画分サンプル（Ａ）と、分子量１０００以下のサンプル（Ｂ）、１０００〜２０００のサンプル（Ｃ）、２０００以上のサンプル（Ｄ）の３つに分子量分画したケフィア水溶性画分サンプル（Ｂ、Ｃ、Ｄ）との４サンプルについてＤＰＰＨを用いた定性的抗酸化能試験を行った。まずポジティブコントロールとして用いた０.１ｍＭアスコルビン酸水溶液を含む全てのサンプルを５０ｍｌずつ１.５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに分注した。そこに１００％メタノールを５０ｍｌずつ分注し混合させ、タンパク成分を沈澱させた。これは、ケフィア水溶性画分中の残余のたんぱく質をメタノールにより析出させるためである。
全量１００ｍｌとなったエッペンドルフチューブを遠心分離器にかけてタンパク成分を完全に沈澱させた（４５００ｇ，１０ｍｉｎ）。次に全てのサンプルから上清を５０μｌずつとり、新しいエッペンドルフチューブに分注した。またネガティブコントロールとして５０％メタノールを５０μｌ分注したサンプルを作製した。こうして準備した計６個のサンプル全てに前述の０.１ｍＭＤＰＰＨ溶液１００μｌを素早く分注し、遮光して３７℃で放置した。３０分放置後、各サンプルを９６穴ウェルプレートに５０μｌずつ分注し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表１に示す。ここで分子量１０００以下のサンプルにおいて最も強い吸光度の減少が見られ、最も強い抗酸化能が確認された。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
（３）オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステムによる抗酸化物質の同定
オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０の溶離液１１としては０.１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。図１に示すように、単一組成の溶離液１１を流速０.７ｍｌ／ｍｉｎでオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０に供給した。
ＤＰＰＨは実験当日に８０％メタノール溶媒に溶解させ、０.１ｍＭの濃度でストックした。これを８０％メタノール溶媒で１０倍希釈し０.０１ｍＭとしたＤＰＰＨ溶液１９をＤＰＰＨポンプ１５により流速０.７ｍｌ／ｍｉｎで陰イオン交換カラム１６より分離後のオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０のラインに混合させた。
実験前日からオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０の陰イオン交換カラム１６は流速０.７ｍｌ／ｍｉｎで平衡化させた。そして実験当日にＤＰＰＨ溶液１９を調製し、ＤＰＰＨポンプ１５を作動させた。ポンプ作動と同時に８０％メタノール溶媒２００ｍｌを注入し、５１７ｎｍにおけるＤＰＰＨの吸光度のベースラインが安定するまでシステムを作動させた。ベースラインの安定を確認後、このシステムが水溶性の抗酸化物質の検出が可能であることを確認するために当日調製した０.１ｍＭのアスコルビン酸水溶液２００ｍｌをオートサンプラー１３より注入した。結果を図４に示す。２８０ｎｍの波長でアスコルビン酸をモニターしたところ１０分付近からピークが検出され、ピークに対応する形でＤＰＰＨの５１７ｎｍにおける吸光度減少が確認された。
そこで分子量１０００以下のケフィア水溶性画分サンプル２００ｍｌを注入して抗酸化物質の探索を行った。結果を図５に示す。２８０ｎｍの波長で成分をモニターしたところ複数のピークが認められた。その中でも３８分付近から確認されるピーク（Ｑ）のみが対応するＤＰＰＨの吸光度減少を示し、抗酸化活性を有することが判明した。また同時に多種の波長での吸光度を検出できる装置であるフォトダイオードアレイ検出器１４によってピーク（Ｑ）時における目的物質の紫外−可視スペクトルを取得した結果を図６に示す。目的の物質は２３６.０ｎｍ及び２９１.４ｎｍ（λmax）に極大吸収を持つ物質であることが判明した。また図７に示すように天然抗酸化物質中ではフラボノイド類において類似するスペクトルパターンを有する化合物が見いだされた。
本実施例ではオンラインＨＰＬＣ法としてオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステムを使用したオンラインＨＰＬＣ法を採用したが、ＤＰＰＨの代わりにルミノールを使用する場合も本発明方法に含まれる。
【００２２】
次にＤＰＰＨ供給系をシステムから分離して活性を維持した状態の抗酸化物質の分取を行った（第５工程）。
分子量１０００以下のケフィア水溶性画分サンプル（Ｂ）の注入量を１０００ｍｌへと増加させ、１サイクル６０分のプログラムを用い、目的ピークの大量分取を行った。大量分取に際してはフラクションコレクター１７を用い３５分から５０分までの範囲を３分ずつ５本のフラクションに分けて自動分取させた。１回につき２０時間連続運転させたのち、８０％メタノール溶媒２００ｍｌ、０.２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２００ｍｌの順で注入して陰イオン交換カラム１６の洗浄を行った。さらに１Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用い陰イオン交換カラムの洗浄を行った。
最終のサンプル注入における溶出パターンから、目的物質の含まれるフラクションのみを選択してエバポーレーターにより濃縮した。またここでエバポレーターによる濃縮と超純水を再び加えることによる再濃縮操作を繰り返し、揮発性を有する酢酸アンモニウム塩を可能な限り除いた。最終的にサンプル（Ｂ）を５ｍｌ程度まで濃縮して凍結保存し、凍結乾燥を行った。
【００２３】
（４）ゲルろ過による精製と分子量推定
自作したゲルろ過カラムはオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム１０に接続し、実験前日より１０％酢酸水溶液を流速０.５ｍｌ／ｍｉｎで供給することにより平衡化させた。
凍結乾燥したサンプル（Ｂ）を可能な限り少量の１０％酢酸水溶液に溶解させオートサンプラーにより１００ｍｌを注入した。図６の紫外−可視スペクトルの結果から、ゲルろ過では２９０ｎｍにおいて目的物質の溶出をモニターした。ゲルろ過による精製・脱塩の結果を図８に示す。
図８に示すように、１１０分付近から溶出する目的ピークを分取し、エバポレーターによる濃縮と超純水を再び加えることによる再濃縮を繰り返して揮発性の酸である酢酸を完全に除いた。最終的にサンプルを５ｍｌ程度まで濃縮して凍結保存し、凍結乾燥を行った。
同時に分子量既知の各種物質を同条件においてゲルろ過し、それらの溶出時間から目的物質の分子構造上のサイズを推測した。まずゲルろ過後の精製物を１ｍｇ／ｍｌに調製し５０ｍｌを供給したところ１２１.３分をピークとして溶出した。また同様の濃度と供給量でビタミンＢ12（M.W.1355.4）、ブロモフェノールブルー（M.W.669.97）、フェノールレッド（M.W.354.38）について試験したところビタミンＢ12が３２.２分、フェノールレッドが１５７.９分をピークとして溶出した。またブロモフェノールブルーはこの条件では検出できなかった。結果を表２に示す。一方、ビタミンＢ12とフェノールレッドのデータから推定したケフィア抗酸化物質の分子量は６５０であった。ここでの結果と分画分子量５００の透析膜を用いて得られる外液に目的物質が濃縮可能であることから、目的物質の分子量はおよそ５００以下の範囲にあると推測された。しかし、この透析膜による濃縮は物質の形状や電荷によって変化しうるので、この５００以下という数値は正確なものではない。同様に、ゲルろ過による分子量推定も分子の形によって変化するので分子量の位置標識として分子量マーカーを使って作成した検量線によっても正確な分子量の推定は困難である。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
（５）逆相ＨＰＬＣ分析
ゲルろ過後の精製のため一般的な逆相ＨＰＬＣの溶出条件である０.０５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）水／メタノール系で流速１.０ｍｌ／ｍｉｎにおいて溶出を試みた。
ゲルろ過後のサンプル（Ｂ）を逆相ＨＰＬＣに注入後、溶離液の組成が水１００％の段階で３つのピークが確認された。またメタノール８０％まで濃度勾配をかけても他のピークは認められなかった。２.４分付近に２３０ｎｍの紫外線吸収でモニターされたピークは陰イオン交換カラムでの大量分取に用いた溶離液中の酢酸アンモニウム塩であることが確認された。また３.８分付近のピークはフォトダイオードアレイ検出器１４から得られた紫外−可視スペクトルのパターンから、陰イオン交換カラム溶出時における目的ピークの前ピークの混入物であることが判明した。さらに目的物質は５分付近から検出され、非常に極性の高い物質であることがわかった。
ゲルろ過後のサンプルの回収量が非常に少ないため、逆相ＨＰＬＣによる精製・分取を現段階では断念し、このゲルろ過後のサンプルを用いて各種機器分析を行った。
【００２６】
（６）高速原子衝撃質量分析法（FAB-MS／マススペクトル）による分子量測定
九州大学大学院薬学研究院創薬科学部門薬用資源制御学講座に高速原子衝撃質量分析法（FAB-MS）に依頼した分子量測定の結果を図９に示す。結果最大で分子量６０７.８ｍ／ｚのピークが検出された。また、３４１.４ｍ／ｚに強いピークが認められた。このことから、この物質の分子量は６０７.８であり、準安定な分解産物の分子量が３４１.４であろうと推定された。
【００２７】
（７）赤外線吸収スペクトル測定
（株）島津総合分析センターに依頼したケフィア中抗酸化物質の赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル（顕微ＩＲ）の結果を図１０に示す。報告書を要約すると、赤外線（ＩＲ）吸収スペクトル（顕微ＩＲ）分析値を保存するサドラー社のライブラリー中には依頼したケフィア抗酸化物質と類似したスペクトルはなく、最も構造の近い物質としてエチレン様の二次結合を有する化合物である可能性がある。そして部分構造解析からはオルト位に置換基を持つベンゼン環が存在するということが報告された。また１１２５、１０２９、９９１、７８３、７４４ｃｍ-1における吸収は隣接三置換基を有するベンゼン環の面外変角振動を示し、３３００〜２８００ｃｍ-1における吸収は水酸基の存在を示唆している。
【００２８】
（８）試験管内における精製物の抗酸化活性測定
精製したケフィア抗酸化物質と水溶性抗酸化物質であるアスコルビン酸との比活性を検討した。ＤＰＰＨは実験当日に８０％メタノール溶媒に溶解させ、０.５ｍＭの濃度で調製した。アスコルビン酸水溶液は実験当日に１０ｍＭの濃度で調製した。
まず１０ｍＭのアスコルビン酸水溶液を希釈して０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、６００、８００、１０００μＭのサンプルを調製した。また１ｍｇ／ｍｌのケフィア抗酸化物質を希釈して０、０.２、０.４、０.６、０.８、１.０ｍｇ／ｍｌのサンプルを調製した。次に全てのサンプルを５０ｍｌずつ１.５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに分注した。そこに１００％メタノールを５０μｌずつ分注し混合させた。全量１００μｌとなった全てのサンプルに０.５ｍMＤＰＰＨ溶液１００μｌを素早く分注し、遮光して３７℃で３０分間放置した。各サンプルを９６穴ウェルプレートに５０ｍｌずつ３点分注し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。結果を表３、表４、図１１に示す。
【００２９】
【表３】
2009102397.tif 000003
【００３０】
【表４】
2009102397.tif 000004
【００３１】
表３、表４、図１１に示すように、アスコルビン酸の５０％ＤＰＰＨ還元濃度は３００μＭであり、ケフィア抗酸化物質では０.４ｍｇ／ｍｌであった。ケフィアの分子量を６０８と仮定すると、０.４ｍｇ／ｍｌは６６０μＭに相当し、ケフィア抗酸化物質は５０％ＤＰＰＨ還元を指標とした重量濃度でアスコルビン酸の２分の１程度の抗酸化活性を有することがわかった。
【００３２】
（９）考察
発酵乳ケフィアの抗酸化作用について活性物質を水溶性画分から探索したところ主に分子量１０００以下の範囲に存在することがわかった。確認のため分子量１０００、２０００の範囲のサンプルについてもオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨ法を用いて活性成分を探索したところ新たな成分は見いだせなかった。また、先に分別した分子量１００以下についても抗酸化作用について同様の検索を行ったが抗酸化作用を有する新たな成分は見いだせなかった。オンラインＨＰＬＣ法のＤＰＰＨ−ＨＰＬＣ法により活性の確認された活性物質は陰イオン交換カラムで分離可能であることから負に帯電していると言える。また逆相ＨＰＬＣでの分析結果からこのケフィア抗酸化物質は非常に親水性の高い（極性の高い）物質であることが強く示唆された。さらに精製における出発材料である分子量１０００以下に分画したケフィア水溶性サンプルを高圧蒸気滅菌処理してもこの活性は維持されることから、熱安定な物質であると考えられる。
また、上記実施例におけるオンライン−ＤＰＰＨ供給系をシステムから分離して活性を維持した状態の抗酸化物質の分取を行うことにより、ケフィアの抗酸化物質の製造が可能となった。さらにゲルろ過等の方法により、より精製した抗酸化物質が製造できることとなった。
本実施例ではオンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨ法後の抗酸性物質の精製をゲルろ過で行ったが、他の精製方法を用いる場合も本発明方法に含まれる。
【００３３】
次にケフィア抗酸化物質の分子的特徴を知るためにまず分子量の検討を行った。実験初期における分子量分画サンプルやゲルろ過による実験結果から分子量は５００以下であると推測された。しかしこの５００以下という数値は正確なものではなくゲルろ過による分子量推定も分子の形によって変化するのでは正確な分子量の推定は困難である。次にゲルろ過精製したケフィア抗酸化物質について高速原子衝撃質量分析法（マススペクトル）による分子量測定を依頼したところ、最大で分子量６０７.８を示すピークが検出された。このマススペクトルによる分子量推定が最も正確な分子量推定であると考えられ、この物質の分子量は６０７.８であり、準安定な分解産物の分子量が３４１.４であろうと推定された。
さらにこのケフィア抗酸化物質の構造的特徴を知るために赤外線吸収スペクトルの測定を依頼した。結果サドラー社のライブラリー中には依頼したケフィア抗酸化物質と類似したスペクトルは存在せず、新規性を有する化合物である可能性が高い。スペクトルに対応する帰属から、分子骨格としては複数の置換基を有するベンゼン環とエチレン様二重結合の存在が示唆された。また天然抗酸化物質に特徴的である水酸基の存在も示唆された。この結果はおもに水酸基からの水素受容によってＤＰＰＨが還元されるという事実とも一致している。
従って、現段階では、ケフィア水溶性画分に含まれる抗酸化性物質は分子量１００〜７００、水酸基、及び芳香族基を有し、酸性、中性に安定でかつ高温蒸気滅菌にも安定な物質であるといえる。
【００３４】
（実施例２）
（１０）動物培養細胞におけるケフィア抗酸化物質の生理活性
一般に試験管内で抗酸化活性を示す化合物であっても、実際に細胞内で適当な作用量で抗酸化活性を有するとは限らない。そこで、次に本発明方法の前記実施例により製造された、即ちケフィア水溶性画分より精製した分子量１００〜７００ｍ／ｚで水溶性のケフィア抗酸化物質が、実際に細胞内で適正な作用量で抗酸化活性を有するかどうかを動物培養細胞における生理活性を調べることにより、以下に検討した。
ここでは蛍光色素ＤＣＦＨ−ＤＡ（2,7-dichlorofluorescein  diacetate）を用いた細胞内酸化状態の測定を行った。
【００３５】
図１２はＤＣＦＨ−ＤＡの作用機序の説明図、図１３はヒト白血病由来細胞株K562を用いた細胞内活性酸素消去試験の工程図である。
図１２に示すように、膜透過性プローブであるＤＣＦＨ−ＤＡは細胞外から細胞内へと移行し、細胞質中のエステラーゼにより加水分解を受けＤＣＦＨとなる。このＤＣＦＨは膜透過性を失うために細胞内にとどまり、そこで過酸化水素などの細胞内活性酸素種と反応し、酸化されることによってＤＣＦとなる。このＤＣＦは蛍光を発する（λex=502nm、λem=526nm）ため、ＤＣＦＨ−ＤＡを投与した細胞のＤＣＦ蛍光強度を測定することにより細胞内の酸化状態を測定することができる。
接着細胞の場合では細胞を接着させたままでＤＣＦＨ−ＤＡを処理し、共焦点レーザー顕微鏡によりＤＣＦ蛍光強度を測定するが、この際の観察位置の決定や実験結果の数値化が困難である。そこで本研究では非接着性細胞であるヒト白血病由来細胞株K562を用いＦＣＭ（蛍光染料で染色した細胞にレーザー光を照射し、細胞の大きさ、ＤＮＡ含量や膜抗原の発現量の分布を測定する方法）で蛍光強度の分布を分析することで細胞内酸化状態の測定を行った。
【００３６】
（１１）実験材料
細胞培養
RPMI１６４０培地（基本栄養培地）は日水製薬株式会社より入手した。
図１３に示すように、１０％の牛胎児血清（FBS）を含むRPMI１６４０培地でヒト白血病由来細胞K562を９０ｍｍディッシュで培養し、飽和密度になる毎に細胞数を１０分の１に希釈し継代を行った。
試薬
蛍光色素ＤＣＦＨ−ＤＡ  ハンクス液は日水製薬株式会社より入手した。
【００３７】
（１２）使用機器（ＦＣＭ）
ＤＣＦ蛍光強度はベックマン・コールター（BECKMAN  COULTER  ）社のEPICS  XL/XL-MLL  SystemII（別名ＦＡＣＳ）を用いて測定を行った。
（１３）結果及び考察
ＦＣＭ（フローサイトメトリー）によるＤＣＦ蛍光強度解析
図１３にヒト白血病由来細胞株K562を用いた細胞内活性酸素消去試験の手順を示す。
図１３に示すように、ヒト白血病由来細胞K562を１０％の牛胎児血清（FBS）を含むRPMI１６４０培地で培養し、飽和になる毎に細胞数を１０分の１に希釈し継代を行った。細胞数が１×１０6個になったものを試験管にとり、５μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ蛍光色素で７分間処理したものに、本発明方法の前記実施例により製造された分子量１００〜７００で水溶性のケフィア抗酸化物質を添加して１０分間処理した。ケフィア抗酸化物質処理をしないものをコントロールとした。１０分間経過後、コントロール及びケフィア抗酸化物質処理したヒト白血病由来細胞株K562についてＦＣＭによる蛍光検出を行った。
その結果を図１４に示す。図１４から分かるように、細胞の蛍光強度はケフィア抗酸化物質処理により、コントロールに比較して左に移動した。これは細胞当たりの蛍光強度が全体的に低下したことを示しており、ケフィア抗酸化物質により細胞内の過酸化水素が消去されたことが推測された。
コントロールの蛍光強度を１００％とした場合、１及び１０μｇ／ｍｌの濃度で５０〜６０％の細胞内活性酸素が消去されたことから、ケフィア抗酸化物質は強い細胞内活性酸素消去能をもつと言える。
本結果より、酸化ストレスは動物細胞に様々な機能低下を生じさせ、多くの疾病の原因となっていることから、ケフィア抗酸化物質が様々な疾病の予防及び治療に効果をもつことが期待された。
【００３８】
（実施例３）
（１４）ケフィア由来抗酸化物質の脂肪細胞への糖取込促進活性
上記オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨ法により精製したケフィア抗酸化物質が脂肪細胞に対して糖取込を促進するかどうかを検定し、糖取込み不全に起因するいわれる糖尿病特にＩＩ型糖尿病に対する効果及びを確認するために以下に実験した。
【００３９】
（実験例）
３Ｔ３／Ｌ１前駆脂肪細胞は、１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地で培養し、半飽和に達した後、０.５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（isobutyl  metylxanthine）、０.２５μＭデキサメサゾン（dexamethasone）、及び１０μｇ／ｍｌインスリンを添加し７２時間培養し、１０μｇ／ｍｌインスリンのみを含む培地で４８時間培養した後１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭのみの培地に戻すことにより分化誘導を行った。分化処理終了後７２時間通常培地にて培養し分化した細胞をグルコース取り込み検定に使用した。
分化した細胞をケフィア由来抗酸化物質を含む培地で４時間培養し、２０分間インスリン刺激を行った後、３００μlのグルコース無しのＨＢＳ溶液で２回リンスし、１ｗｅｌｌあたり５００μlの１μCi／ｍｌ  2-Deoxy-D-[１-3H]glucose含有ＨＢＳを加え、１０分間処理を行った。１０分後この放射性溶液を吸引除去し、３００μlの氷冷０.９％ＮａＣｌ溶液で素早く３回リンスした。５００μlの０.５Ｎカセイソーダを加え、細胞を溶解した後、１００μlの２N酢酸で中和した。各サンプル５００μlずつを２ｍｌのエッペンにとり８００μlのアクアゾル液体シンチレーションカクテル（放射線測定用蛍光色素含有液）を加え、液体シンチレーションカウンター（放射線量測定装置）により測定を行った。測定は１サンプルにつき５分間行った。
【００４０】
結果
図１５はＦＣＭによる細胞内活性酸素消去活性の測定図である。
図１５に示すように、ケフィア抗酸化物質は０.１μｇ／ｍｌ濃度で約２.０倍、１０μｇ／ｍｌで約２.５倍の促進効果が認められ、濃度依存的に糖取込を促進することが明らかとなった。これらの結果から、このケフィア由来の抗酸化物質を主体とする添加した新たな抗糖尿病治療剤、機能性食品の開発が可能であると期待された。
また、ケフィア抗酸化剤を用いた健康食品は、美味しくするため、栄養価を上げる、更なる効果を期待するために更に他の栄養素、物質を加える事も可能である。
【００４１】
次にケフィアの抗酸化物質についてのＤＮＡ修復作用を有する組織修復剤としての作用についても検索した。
（実施例４）
ミスマッチ修復酵素ｈＭＬＨ１の遺伝子発現に及ぼす効果
ミスマッチ修復遺伝子は、ＤＮＡ複製の際に生じるエラーを修復することでゲノムの安定を保ち、エラー塩基の蓄積を抑制することで発癌を抑制している。さらに、ミスマッチ修復遺伝子が正常に機能していない固体は、除去修復機能にも機能不全が観察されることから、ミスマッチ修復遺伝子は除去修復機構とも関わりがあると考えられている。ただ、その詳細は明らかとなっていない。ＨＰＬＣ−ＤＰＰＨ法によりケフィア抗酸化物質を高度に精製できたので、この物質のミスマッチ修復遺伝子ｈＭＬＨ１の遺伝子発現増強効果を調べた。また、１００℃で１０分間加熱することによる熱安定性も調べた。
【００４２】
方法
抗酸化物質をＨＭＶ−１細胞（メラトーマ細胞／皮膚のモデル細胞)に添加して１５時間培養し、ミスマッチ修復遺伝子ｈＭＬＨ１の発現をＲＴ−ＰＣＲ法（細胞からメッセンジャーＲＮＡを抽出し、逆転写酵素により相補正ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、ついで特定の遺伝子のｃＤＮＡ部分配列断片（プライマー）を用いて特定のｃＤＮＡを増幅することにより、遺伝子の発現の程度を調べる方法）を用いて解析した。
結果及び考察
結果を図１６に示した。数値データは下記のとおりである。
コントロール                            １．０
ケフィア抗酸化物質（０．４μｇ／ｍｌ）  １．２６
ケフィア抗酸化物質（１μｇ／ｍｌ）      １．３３
【００４３】
精製したケフィア抗酸化物質を添加した細胞は、ミスマッチ修復遺伝子ｈＭＬＨ１の発現が増加することが明らかとなった。このことから、ミスマッチ修復遺伝子ｈＭＬＨ１の遺伝子発現がレドックス制御（酸化ストレスによって遺伝子発現が制御される生体反応）を受けていることが推測された。ビタミンＣの約１／３の抗酸化性を有するこのケフィア抗酸化物質を添加することで、ＤＮＡ複製のエラーを修復する新たな抗癌剤の開発が可能になった。
【００４４】
（実施例５）
次にケフィア抗酸化物質及び加熱処理ケフィア抗酸化物質が不定期ＤＮＡ合成に及ぼす促進効果について調べた。
目的
ＤＮＡが損傷を受けた際に、ＤＮＡ複製とは無関係のＤＮＡ修復のためのＤＮＡ合成が行われる。これを不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）と呼ぶ。不定期ＤＮＡ合成が促進されると、細胞のＤＮＡ修復活性が促進されたと推測できる。
紫外線（ＵＶＡ）を照射すると、ＤＮＡの塩基が損傷を受け、損傷塩基は塩基除去修復機構によって修復される。
方法
９６穴プレートにまいたＨＭＶ−１細胞に、ＵＶＡを３４００Ｊ／ｍ2照射した後にケフィア抗酸化物質を0.4μｇ／ｍｌの濃度で添加して１時間培養した。不定期ＤＮＡ合成（ＵＤＳ）は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取り込みによって測定した。細胞分裂により生じるＤＮＡ複製を最小にするため、細胞分裂を引き起こす細胞周期を停止させる作用を有する５０ｍＭヒドロキシルウレア（Ｗａｋｏ）で処理し、細胞周期を停止させた。
結果
図１７に示したように、ケフィア抗酸化物質を添加した細胞では、ＵＤＳが明らかに増大した。また、１００℃、１０分間加熱しても、ケフィア抗酸化物質のＵＤＳ促進効果は低下しなかったため、このケフィア抗酸化物質は熱安定性であると考えられた。
考察
上記の結果から、ケフィア抗酸化物質によって細胞のミスマッチ修復機構等が賦活化されてＤＮＡ修復が促進されたと考えられた。ここで、用いたケフィア抗酸化物質はＨＰＬＣ精製において、溶媒を変化させても単一のピークを示したことから、高度に精製されたものと推定された。この物質が熱安定性であることは機能性食品への応用の面でも有利であると考えられる。
また、これらの結果から、細胞のＤＮＡ修復活性を促進し、ＤＮＡ修復作用を有する新たな組織修復剤及び機能性食品の開発が可能となった。ケフィア抗酸化物質は皮膚細胞のＵＶ損傷防止方法、あるいは皮膚の光老化防止方法の開発及び、ＤＮＡの突然変異が原因で生じるガンや遺伝病の予防、治療などへ広範に利用できることとなった。
【００４５】
以上、本発明を実施例により説明したが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
上記実施例では、ケフィアは日本ケフィア株式会社供与のケフィア（ケフィア発酵液）を使用したが、日本で製造、販売されたケフィア菌を使用したケフィアでも、ロシア以外のその他国由来のものでも、あるいはケフィア粒を求めて自分で培養したものを使用しても良い。
また、上記実施例で使用した装置及び薬剤はこれに限定するものでなく、結果に影響を与えない限り変更可能である。
【符号の説明】
【００４６】
１０：オンラインＨＰＬＣ−ＤＰＰＨシステム、１１：溶離液、１２：システムコントローラ、１３：オートサンプラー、１４：フォトダイオードアレイ検出器、１５：ＤＰＰＨポンプ、１６：陰イオン交換カラム、１７：フラクションコレクター、１８：クロマトグラフィマネージャー、１９：ＤＰＰＨ溶液