【手続補正書】
【提出日】平成25年2月22日(2013.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、
ａ）胎児核酸および母体核酸を含む、妊婦に由来する核酸を、複数の遺伝子座において該母体核酸を特異的に消化するメチル化感受性制限酵素と接触させ、それによって該胎児核酸を富化する工程であって、ここで該複数の遺伝子座が、
ｉ）胎児核酸において高メチル化されている遺伝子座；および
ｉｉ）配列番号９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および２６１の遺伝子座から選択される１以上の遺伝子座
を含む、工程と；
ｂ）標的染色体についての胎児核酸の量を決定する工程と；
ｃ）該標的染色体についての胎児核酸の量に従って胎児の異数性の存在または非存在を決定する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９、および２６１の遺伝子座から選択される１以上の遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１９３、２００、２０８、２０９、２１１、２１３、２１４、２３１、２３２、２３５、および２４１の遺伝子座から選択される１以上の遺伝子座を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の遺伝子座が、配列番号２０９の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の遺伝子座が、配列番号２１１の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の遺伝子座が、配列番号２１３の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の遺伝子座が、配列番号２１４の遺伝子座を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
参照染色体由来の胎児核酸の量を決定する工程を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記標的染色体についての胎児核酸の量を、前記参照染色体についての胎児核酸の量に対して比較し、それにより、該標的染色体についての胎児核酸の量と該参照染色体についての胎児核酸の量との間の統計的有意差が、胎児の異数性の存在を決定する工程を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的染色体および前記参照染色体のそれぞれの３〜１５個の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的染色体および前記参照染色体のそれぞれの約１６個以上の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）で消化されなかった前記遺伝子座またはその部分を増幅反応で増幅し、それにより増幅産物を生成する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的染色体および前記参照染色体についての胎児核酸の量を決定する工程が、競合剤ベースの増幅方法の使用を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）全核酸の量を決定する工程と；
ｉｉ）前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する工程と；
ｉｉｉ）前記核酸におけるＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程と
をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸中に存在するＹ染色体核酸の量が、男の胎児について決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
胎児核酸の量が、Ｙ染色体核酸の量に対して比較される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
２以上のアッセイを用いて核酸の総量を決定し、１以上のアッセイを用いて男の胎児のＹ染色体核酸の量を決定し、そして１以上のアッセイを用いて前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
（ｂ）における胎児核酸の量を決定する工程が、質量分析法の使用を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（ｂ）における胎児核酸の量を決定する工程が、配列決定方法の使用を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記配列決定方法が、合成による配列決定を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
試料における胎児核酸の量を決定するための方法であって、
ａ）胎児核酸および母体核酸を含む、妊婦由来の核酸を、複数の遺伝子座において該母体核酸を特異的に消化するメチル化感受性制限酵素と接触させ、それによって該胎児核酸を富化する工程であって、該胎児核酸と該母体核酸との組み合わせが、該試料中の総核酸を構成し、ここで該複数の遺伝子座が、
ｉ）胎児核酸において高メチル化されている遺伝子座；および
ｉｉ）配列番号９０〜１６３、１７６、１７９、１８０、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９５、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２２１、２２３、２２５、２２６、２３１、２３２、２３３、２３５、２３９、２４１、２５７、２５８、２５９および２６１の遺伝子座から選択される１以上の遺伝子座
を含む、工程と；
ｂ）該試料中の胎児核酸の量を決定する工程と；
を含む、方法。
【請求項２２】
前記試料中に存在する全核酸の量を決定する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料中の胎児核酸の量を決定する工程が、（ｂ）における胎児核酸の量を、核酸の総量に対して比較する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
胎児核酸の量を決定する工程が、増幅反応において１つ以上の競合剤を既知濃度で導入する工程を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料中の胎児核酸の絶対量を決定する工程を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１５４の遺伝子座を含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１５８の遺伝子座を含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１６３の遺伝子座を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の遺伝子座が、配列番号１〜５９の遺伝子座から選択される遺伝子座をさらに含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の遺伝子座が、配列番号４２および配列番号５２の遺伝子座から選択される遺伝子座をさらに含む、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
３以上の遺伝子座における胎児核酸の量が決定される、請求項２１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
１０以上の遺伝子座における胎児核酸の量が決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｉ）前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する工程と；
ｉｉ）前記核酸におけるＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程と
をさらに含む、請求項２１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸中に存在するＹ染色体核酸の量が男の胎児について決定される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
胎児核酸の量が、Ｙ染色体核酸の量に対して決定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
２以上のアッセイを用いて核酸の総量が決定され、１以上のアッセイを用いて男の胎児についてのＹ染色体核酸の量が決定され、そして１以上のアッセイを用いて前記メチル化感受性制限酵素の消化効率が決定される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
（ｂ）における胎児核酸の量を決定する工程が、質量分析法の使用を含む、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ｂ）における胎児核酸の量を決定する工程が、配列決定方法の使用を含む、請求項２１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記配列決定方法が、合成による配列決定を含む、請求項３８に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
一部の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。キットの構成成分の１つは、メチル化感受性結合剤である。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
胎児核酸を調製するための方法であって、
ａ）妊婦に由来する試料を提供する工程と；
ｂ）該妊婦の該試料に由来する胎児核酸を母体核酸から、該胎児核酸と該母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって分離する工程であって、該胎児核酸が、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む工程と；
ｃ）パート（ｂ）において分離された胎児核酸を鋳型として利用するプロセスによって胎児核酸を含む核酸を調製する工程と
を含む方法。
（項目２）
メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目１に記載の方法。
（項目３）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤がメチル−ＣｐＧ結合性タンパク質（ＭＢＤ）またはその断片である、項目２に記載の方法。
（項目４）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された胎児核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目５）
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された母体核酸に結合する、項目２に記載の方法。
（項目６）
メチル化されていないヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目２に記載の方法。
（項目７）
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目１に記載の方法。
（項目８）
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用剤が、メチル化感受性制限酵素である、項目７に記載の方法。
（項目９）
２種以上のメチル化感受性制限酵素を同じ反応において使用する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
工程ｃ）の前記プロセスが増幅反応である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
工程ｃ）の前記プロセスが、胎児核酸の絶対量を決定するための方法である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の３つ以上を調製する、項目１に記載の方法。
（項目１３）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の絶対量を決定するための方法であって、
ａ）１種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって、配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を
使用して、工程ａ）からの胎児核酸の絶対量を決定する工程と
を含む方法。
（項目１４）
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の濃度を決定するための方法であって、
ａ）該母体試料中に存在する核酸の総量を決定する工程と；
ｂ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｃ）配列番号９０〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、工程ｂ）からの胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ａ）からの核酸の総量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量と比較し、それによって該母体試料中の胎児核酸の濃度を決定する工程と
を含む方法。
（項目１６）
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料に由来する胎児核酸を使用して胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、
ａ）メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と；
ｂ）配列番号１６４〜２６１のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、標的染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｃ）配列番号９０〜１６３のポリヌクレオチド配列の１つ以上に由来する１つ以上のＣｐＧ部位を含む、参照染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と；
ｄ）工程ｂ）からの胎児核酸の量を、工程ｃ）からの胎児核酸の量に対して比較する工程であって、標的胎児核酸の量と参照胎児核酸の量との間の統計的有意差により、胎児の異数性の存在が示される工程と
を含む方法。
（項目１８）
前記標的染色体および参照染色体のそれぞれの３〜１５個の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記定量化を実施するための、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない方法が、胎児核酸の量を決定するための競合剤ベースの方法を使用する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２１）
母体試料中に存在するＹ染色体核酸の存在または非存在を決定する工程をさらに含む、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２２）
男の胎児について、母体試料中に存在するＹ染色体核酸の量を決定する、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
胎児核酸の量を、Ｙ染色体核酸の量と比較する、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、または５０個超の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目１３または１５に記載の方法。
（項目２５）
母体試料中に存在する核酸の総量を決定する、項目１３または１７に記載の方法。
（項目２６）
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量とを決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２７）
核酸の総量と、男の胎児についてＹ染色体核酸の量と、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率とを全て決定する、項目１３、１５または１７に記載の方法。
（項目２８）
核酸の総量を決定するために２種以上のアッセイを使用し、男の胎児についてＹ染色体核酸の量を決定するために１種以上のアッセイを使用し、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定するために１種以上のアッセイを使用する、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
３つ以上の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
消化された母体核酸の平均長よりも大きなアンプリコンを生成する増幅反応によって前記胎児核酸の量を決定し、それによって該胎児核酸をさらに富化する、項目１３、１５または１７に記載の方法。