【手続補正書】
【提出日】平成25年7月8日(2013.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸を含む組換え絹糸タンパク質反復ユニット;および
イオン相互作用を介して組換え絹糸タンパク質と複合体を形成する核酸
を含み、該組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞膜不安定化ペプチドまたはRGD残基をさらに含む、生体材料核酸複合体。
【請求項２】
正に荷電したR基を有するアミノ酸がリジンまたはアルギニンである、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項３】
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸がポリリジンである、請求項2記載の生体材料核酸複合体。
【請求項４】
生体材料核酸複合体が球形である、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項５】
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質が少なくとも部分的にβシート構造に自己組織化する、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項６】
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項７】
組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞透過ペプチド(CPP)をさらに含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項８】
細胞膜不安定化ペプチドが1つまたは複数のppTG1配列を含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項９】
組換え絹糸タンパク質が、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の機能ペプチドドメインをさらに含む、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項１０】
核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の生体材料核酸複合体。
【請求項１１】
組換え絹糸タンパク質が絹糸コンセンサス配列の反復ユニットおよびポリ(L-リジン)ドメインである、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項１２】
絹糸コンセンサス配列が、
2012532614.tif 000001
の配列を含有し、ポリ(L-リジン)ドメインが1つまたは複数の15 lysを含有する、請求項11記載の生体材料複合体。
【請求項１３】
組換え絹糸タンパク質と核酸のヌクレオチドのモル比(P/N)が約2.5〜約50である、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項１４】
P/Nが約10〜約25である、請求項13記載の生体材料複合体。
【請求項１５】
組換え絹糸タンパク質が6マーの絹糸コンセンサス残基および30lysのポリ(L-リジン)ドメインである、請求項11記載の生体材料複合体。
【請求項１６】
組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数のRGDドメインをさらに含む、請求項11記載の生体材料複合体。
【請求項１７】
アミンの数と核酸のリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、請求項16記載の生体材料複合体。
【請求項１８】
組換え絹糸タンパク質が6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインである、請求項17記載の生体材料複合体。
【請求項１９】
アミンの数と核酸のリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項２０】
組換え絹糸タンパク質が6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1である、請求項19記載の生体材料複合体。
【請求項２１】
複合体が球形であり、平均サイズが約50nm〜約400nmの直径である、請求項4記載の生体材料複合体。
【請求項２２】
複合体が中性または正に荷電している、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項２３】
複合体が負に荷電している、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項２４】
複合体が、複合体を含有する絹糸フィルムの表面に固定化されている、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項２５】
生体材料核酸複合体が核酸送達システムである、請求項1記載の生体材料複合体。
【請求項２６】
細胞をトランスフェクトする方法であって、細胞と、請求項1〜25のいずれか一項記載の生体材料核酸複合体を含む絹糸ベース核酸送達システムを接触させる工程を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
さらに、絹糸ベース材料の表面に固定された核酸複合体を新たな核酸送達システムとして使用することができる。核酸用または薬物用の、これらの新たな新規のバイオ絹糸タンパク質ベース送達システムの設計および用途に融通がきくことは多くの送達分野において有用である。例えば、絹糸マトリックスは包帯または挿入物として用いられ、組織治癒に有利な増殖因子をコードする核酸を送達することもできる。
[本発明1001]
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸を含む組換え絹糸タンパク質反復ユニット;および
イオン相互作用を介して組換え絹糸タンパク質と複合体を形成する核酸
を含む、生体材料核酸複合体。
[本発明1002]
正に荷電したR基を有するアミノ酸がリジンまたはアルギニンである、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1003]
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸がポリリジンである、本発明1002の生体材料核酸複合体。
[本発明1004]
生体材料核酸複合体が球形である、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1005]
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質が少なくとも部分的にβシート構造に自己組織化する、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1006]
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1007]
組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞結合モチーフをさらに含む、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1008]
細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、本発明1007の生体材料核酸複合体。
[本発明1009]
組換え絹糸タンパク質が1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)をさらに含む、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1010]
CPPが1つまたは複数のppTG1配列を含む、本発明1009の生体材料核酸複合体。
[本発明1011]
組換え絹糸タンパク質が、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の機能ペプチドドメインをさらに含む、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1012]
核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1001の生体材料核酸複合体。
[本発明1013]
核酸と複合体を形成する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、該コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニットおよびポリ(L-リジン)ドメインを含む、絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1014]
核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1015]
絹糸コンセンサス配列が、
2012532614.tif 000002
の配列を含有し、ポリ(L-リジン)ドメインが1つまたは複数の15 lysを含有し、核酸がDNAである、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1016]
組換え絹糸タンパク質とDNAのヌクレオチドとモル比(P/N)が約2.5〜約50である、本発明1015の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1017]
P/Nが約10〜約25である、本発明1016の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1018]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基および30lysのポリ(L-リジン)ドメインであり、P/Nが10である、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1019]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のRGDドメインをさらに含む、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1020]
アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、本発明1019の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1021]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインであり、N/Pが2である、本発明1020の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1022]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のppTG1ドメインをさらに含む、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1023]
アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、本発明1022の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1024]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1であり、N/Pが2である、本発明1023の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1025]
複合体が球形であり、平均サイズが約50nm〜約400nmの直径である、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1026]
組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有する、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1027]
組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1028]
複合体が中性または正に荷電している、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1029]
複合体が負に荷電している、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1030]
複合体が、複合体を含有する絹糸フィルムの表面に固定化されている、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1031]
核酸が、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはルシフェラーゼをコードする核酸を含む、本発明1013の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1032]
細胞をトランスフェクトする方法であって、細胞と、核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む絹糸ベース核酸送達システムを接触させる工程を含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニットおよびポリ(L-リジン)ドメインを含む、前記方法。
[本発明1033]
絹糸ベース核酸送達システムが、P/N 10でDNAと複合体を形成した、
2012532614.tif 000003
の配列を有する6マーの絹糸コンセンサス配列および30lysのポリ(L-リジン)ドメインを含有する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数の細胞結合モチーフをさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1035]
細胞トランスフェクションが細胞結合モチーフの1つによって標的化される、本発明1034の方法。
[本発明1036]
細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、本発明1034の方法。
[本発明1037]
絹糸ベース核酸送達システムが、N/P 2でDNAと複合体を形成した、
2012532614.tif 000004
の配列を有する6マーの絹糸コンセンサス配列、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインを含有する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが1つまたは複数のCPPをさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1039]
CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
絹糸ベース核酸送達システムが、N/P 2でDNAと複合体を形成した、
2012532614.tif 000005
の配列を有する6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1を含有する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、細胞透過ペプチド、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される機能ペプチドドメインをさらに含む、本発明1032の方法。
[本発明1042]
接触させる工程の前に、組換え絹糸生体高分子の二次構造を移行させる工程をさらに含み、複合体からの核酸の放出によって特徴付けられるトランスフェクション挙動が組換え絹糸コポリマーの二次構造によって制御される、本発明1032の方法。
[本発明1043]
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸を含む組換え絹糸タンパク質反復ユニットおよび1つまたは複数の機能ペプチドドメイン;ならびに
イオン相互作用を介して組換え絹糸タンパク質と複合体を形成する核酸
を含む、生体材料核酸複合体。
[本発明1044]
機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞結合モチーフを含む、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1045]
細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、本発明1044の生体材料核酸複合体。
[本発明1046]
機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)を含む、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1047]
CPPが1つまたは複数のppTG1配列を含む、本発明1046の生体材料核酸複合体。
[本発明1048]
機能ペプチドドメインが、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1049]
正に荷電したR基を有するアミノ酸がリジンまたはアルギニンである、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1050]
正に荷電したR基を有する複数のアミノ酸がポリリジンである、本発明1043の生体材料核酸複合体
[本発明1051]
生体材料核酸複合体が球形である、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1052]
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質が少なくとも部分的にβシート構造に自己組織化する、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1053]
生体材料核酸複合体の組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、本発明1043の生体材料核酸複合体。
[本発明1054]
核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1043〜1053のいずれかの生体材料核酸複合体。
[本発明1055]
核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、および1つまたは複数の細胞結合ドメインを含む、絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1056]
細胞結合モチーフが1つまたは複数のRGD残基を含む、本発明1055の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1057]
核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含み、コポリマーが絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、ならびに1つまたは複数の細胞透過ペプチドおよび/または細胞膜不安定化ペプチド(CPP)を含む、絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1058]
CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、本発明1057の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1059]
核酸が、DNA、cDNA、DNAベクターまたはDNAプラスミド、RNAベクターまたはRNAプラスミド、dsRNA、siRNA、shRNA、saRNA、mRNA、miRNA、プレmiRNA、リボザイム、アンチセンスRNA、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1055〜1058のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1060]
絹糸コンセンサス配列が
2012532614.tif 000006
の配列を含有し、ポリ(L-リジン)ドメインが1つまたは複数の15lysを含有し、核酸がDNAである、本発明1055〜1058のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1061]
アミンの数とDNAのリン酸の数の比(N/P)が約2〜約10である、本発明1060の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1062]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインであり、N/Pが2である、本発明1060の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1063]
組換え絹糸ベースブロックコポリマーが、6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1であり、N/Pが2である、本発明1060の絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1064]
組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有する、本発明1055〜1063のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1065]
組換え絹糸タンパク質がβシート構造を含有しない、本発明1055〜1063のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1066]
複合体が球形であり、平均サイズが約50nm〜約400nmの直径である、本発明1055〜1065のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1067]
複合体が中性または正に荷電している、本発明1055〜1066のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1068]
複合体が負に荷電している、本発明1055〜1066のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1069]
複合体が、複合体を含有する絹糸フィルムの表面に固定化されている、本発明1055〜1068のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1070]
核酸が、緑色蛍光タンパク質(GFP)またはルシフェラーゼをコードする核酸を含む、本発明1055〜1069のいずれかの絹糸ベース核酸送達システム。
[本発明1071]
細胞をトランスフェクトする方法であって、細胞と、核酸と複合体を形成した組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む絹糸ベース核酸送達システムを接触させる工程を含み、コポリマーが、絹糸コンセンサス配列の反復ユニット、ポリ(L-リジン)ドメイン、および1つまたは複数の機能ペプチドドメインを含む、前記方法。
[本発明1072]
機能ペプチドドメインが1つまたは複数の細胞結合モチーフを含み、細胞トランスフェクションが細胞結合モチーフの1つによって標的化される、本発明1071の方法。
[本発明1073]
細胞結合モチーフがRGD残基を含む、本発明1072の方法。
[本発明1074]
絹糸ベース核酸送達システムが、N/P 2でDNAと複合体を形成した、配列
2012532614.tif 000007
を有する6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および11RGDのRGDドメインを含有する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む、本発明1073の方法。
[本発明1075]
機能ペプチドドメインが1つまたは複数のCPPを含む、本発明1071の方法。
[本発明1076]
CPPが1つまたは複数のppTG1残基を含む、本発明1075の方法。
[本発明1077]
N/P 2でDNAと複合体を形成した、
2012532614.tif 000008
の配列を有する6マーの絹糸コンセンサス残基、30lysのポリ(L-リジン)ドメイン、および二量体ppTG1を含有する組換え絹糸ベースブロックコポリマーを含む、本発明1076の方法。
[本発明1078]
機能ペプチドドメインが、細胞透過ペプチド、ウイルスのシグナルペプチド、腫瘍ホーミングペプチド、金属結合ドメイン、細胞標的化ペプチド、薬物結合ペプチド、細胞活性を変える機能ドメイン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、本発明1071の方法。
[本発明1079]
接触させる工程の前に、組換え絹糸生体高分子の二次構造を移行させる工程をさらに含み、複合体からの核酸の放出によって特徴付けられるトランスフェクション挙動が組換え絹糸コポリマーの二次構造によって制御される、本発明1071〜1078のいずれかの方法。