(57)【要約】【課題】生着および修復能に優れた生体組織補填材を提供し、そのような生体組織補填材を簡易に製造することができる製造方法を提供する。【解決手段】ゼラチンからなる多孔質担体の表面に、硫酸化ヒアルロン酸からなるコーティングを施した生体組織補填材を提供する。また、ゼラチンからなる多孔質担体に硫酸化ヒアルロン酸溶液を滴下して含浸させるステップＳ３と、硫酸化ヒアルロン酸溶液が含浸された多孔質担体を凍結させるステップＳ４と、凍結した多孔質担体を乾燥させるステップＳ５とを含む生体組織補填材の製造方法を提供する。【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチンからなる多孔質担体の表面に、硫酸化ヒアルロン酸からなるコーティングを施した生体組織補填材。
【請求項２】
前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．６以上である請求項１に記載の生体組織補填材。
【請求項３】
ゼラチンからなる多孔質担体に硫酸化ヒアルロン酸溶液を滴下して含浸させるステップと、
硫酸化ヒアルロン酸溶液が含浸された多孔質担体を凍結させるステップと、
凍結した多孔質担体を乾燥させるステップとを含む生体組織補填材の製造方法。
【請求項４】
硫酸化ヒアルロン酸溶液を含浸させるステップに先立って、
ゼラチンからなる多孔質担体に純水を含浸させるステップと、
多孔質担体に含浸された水分を脱水するステップとを行う請求項３に記載の生体組織補填材の製造方法。
【請求項５】
前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．６以上である請求項３または請求項４に記載の生体組織補填材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生体組織補填材とその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、多孔質ゼラチン等の生体吸収親水性材料と、ポリ乳酸のような生体吸収性高分子材料とを組み合わせた組織再生用基材が知られている（例えば、特許文献１，２参照。）。
【特許文献１】国際公開第９６／１０４２６号のパンフレット
【特許文献２】国際公開第２００３／０１１３５３号のパンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１および特許文献２に開示されている組織再生用基材では、生体適合性や材料の埋植の煩雑さなどから細胞の生着および修復能が必ずしも十分ではなく、軟骨欠損部のような欠損部を十分に修復することができない、あるいは炎症が生ずる等の問題がある。
【０００４】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生着および修復能に優れた生体組織補填材を提供し、またそのような生体組織補填材を簡易に製造することができる製造方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、ゼラチンからなる多孔質担体の表面に、硫酸化ヒアルロン酸からなるコーティングを施した生体組織補填材を提供する。
本発明によれば、ゼラチンからなる多孔質担体の表面にコーティングされた硫酸化ヒアルロン酸の作用により、不安定な各種有用なサイトカイン（例えば、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ等）を吸着して安定化させ、これらのサイトカインの作用を局在する箇所で増強することができる。また、硫酸化ヒアルロン酸は、細胞膜タンパク質Ｎｏｔｃｈを介してＷｎｔ遺伝子群の発現を促進するので、βカテニン経路でカドヘリンやコネキシン等の細胞間接着因子の発現を促進し、特に軟骨への分化を促進することができる。さらに、硫酸化ヒアルロン酸はＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＮＢＰ）の遺伝子発現を向上することができ、軟骨分化が発生する凝集場所を規定し軟骨分化に関与するＩＧＦの分解を抑制し、軟骨分化を促進することができる。これにより、軟骨への細胞の分化や細胞の増殖を促進することができ、特に軟骨等の生体組織の欠損部を早期に修復することができる。
【０００６】
上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．６以上であることが好ましい。
このようにすることで、軟骨細胞の増殖能および分化能を大きく向上することができる。
【０００７】
また、本発明は、ゼラチンからなる多孔質担体に硫酸化ヒアルロン酸溶液を滴下して含浸させるステップと、硫酸化ヒアルロン酸溶液が含浸された多孔質担体を凍結させるステップと、凍結した多孔質担体を乾燥させるステップとを含む生体組織補填材の製造方法を提供する。
本発明によれば、ゼラチンからなる多孔質担体の表面に硫酸化ヒアルロン酸のコーティングが施された生体組織補填材を簡易に製造することができる。
【０００８】
上記発明においては、硫酸化ヒアルロン酸溶液を含浸させるステップに先立って、ゼラチンからなる多孔質担体に純水を含浸させるステップと、多孔質担体に含浸された水分を脱水するステップとを行うこととしてもよい。
このようにすることで、硫酸化ヒアルロン酸溶液をゼラチンからなる多孔質担体の奥部まで浸透させることが可能となり、多孔質担体の奥部に配される気孔内面にまで硫酸化ヒアルロン酸がコーティングされた生体組織補填材を製造することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度が０．６以上であることが好ましい。
このようにすることで、軟骨細胞の増殖能および分化能を大きく向上させることが可能な生体組織補填材を製造することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る生体組織補填材によれば、生着および修復能に優れ、欠損部を早期に修復することができるという効果を奏する。また、本実施形態に係る生体組織補填材の製造方法によれば、生着および修復能に優れ、欠損部を早期に修復可能な生体組織補填材を簡易に製造することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の一実施形態に係る生体組織補填材とその製造方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る生体組織補填材は、ゼラチンからなる多孔質担体の表面に硫酸化ヒアルロン酸のコーティングを施すことにより構成されている。硫酸化ヒアルロン酸としては、その硫酸化度が０．６以上のものが使用されている。
【００１２】
次に、本発明の一実施形態に係る生体組織補填材の製造方法について説明する。
本実施形態に係る生体組織補填材を製造するに先立って、使用する道具に対して乾熱滅菌またはオートクレーブによる滅菌を施しておく。
【００１３】
特に、ゼラチンからなるスポンジ状の多孔質担体は、完全な滅菌状態にしておく。多孔質担体は、ゼラチンを水に溶解し、泡立てた後にそのまま凍結乾燥させることにより調製できる。多孔質担体の気孔径は、５０〜５００μｍであり、気孔率は９０％程度である。
また、硫酸化ヒアルロン酸溶液は、硫酸化度０．６の硫酸化ヒアルロン酸を２５０μｇ／ｍＬの濃度で純水に溶解させ、フィルタ滅菌しておく。
【００１４】
本実施形態に係る生体組織補填材の製造方法は、まず、上記のようにして調製されたゼラチンからなる多孔質担体にフィルタ滅菌された純水を含浸させ、水和させておく（水和ステップＳ１）。次いで、オートクレーブ滅菌した後に乾燥させた濾紙の上に水和させられた多孔質担体を載せ、水分を濾紙に吸収させることにより脱水する（脱水ステップＳ２）。
【００１５】
多孔質担体から十分に水分が脱水された後に、滅菌されたディッシュ内に滅菌された４フッ化エチレン樹脂シートを載せ、その上に脱水された多孔質担体を載せる。そして、多孔質担体に対し、上記により製造しておいた硫酸化度０．６の硫酸化ヒアルロン酸溶液をゆっくり滴下し、全体に行き渡らせる（含浸ステップＳ３）。
【００１６】
その後、ディッシュに蓋をして滅菌パックに封入し、−８０℃のフリーザに滅菌パックごとディッシュを入れ、十分な時間をかけて凍結させる（凍結ステップＳ４）。そして、凍結された後には、フリーザから素早く出して多孔質担体が溶解する前に凍結乾燥機に入れて減圧することにより乾燥する（乾燥ステップＳ５）。
これにより、本実施形態に係る生体組織補填材が製造される。
【００１７】
このようにして構成された本実施形態に係る生体組織補填材によれば、ゼラチンからなる多孔質担体の表面にコーティングされた硫酸化ヒアルロン酸の作用により、不安定な各種有用なサイトカイン（例えば、ｂＦＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ等）が吸着されて安定化させられ、これらのサイトカインの作用を局在する箇所で増強することができる。
また、硫酸化ヒアルロン酸は、細胞膜タンパク質Ｎｏｔｃｈを介してＷｎｔ遺伝子群の発現を促進するので、βカテニン経路でカドヘリンやコネキシン等の細胞間接着因子の発現を促進し、特に軟骨への分化を促進することができる。
【００１８】
さらに、硫酸化ヒアルロン酸はＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＮＢＰ）の遺伝子発現を向上することができ、軟骨分化が発生する凝集場所を規定し軟骨分化に関与するＩＧＦの分解を抑制し、軟骨分化を促進することができる。これにより、軟骨への細胞の分化や細胞の増殖を促進することができ、特に軟骨等の生体組織の欠損部を早期に修復することができる。
【００１９】
ここで、硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度および供給量を変化させたときの軟骨細胞の増殖能および軟骨への分化能の変化について、図２〜図４を参照して説明する。
図２〜図４は、硫酸化ヒアルロン酸の硫酸化度をそれぞれ０．４，０．６，１．０としたときのグラフであり、（ａ）細胞の増殖能、（ｂ）軟骨への分化能をそれぞれ示している。図中、ｃｏｎｔｒｏｌは、硫酸化ヒアルロン酸を添加しない場合、１０μｇ、５０μｇ、１００μｇは、それぞれ硫酸化ヒアルロン酸をその量だけ加えた場合のｃｏｎｔｒｏｌに対する比率である。
【００２０】
ゼラチンからなる多孔質担体としては、直径約１２ｍｍ、厚さ約３ｍｍ、気孔径約５０〜５００μｍ、気孔率約９０％のものを使用した。このような多孔質担体に軟骨細胞を播種して３０分間静置した。
【００２１】
その結果、これらの図２〜図４によれば、硫酸化度０．６以上の場合には、硫酸化ヒアルロン酸が５０μｇ以上において軟骨細胞の増殖能および軟骨への分化能が大きく増加していることがわかった。また、硫酸化度１．０の場合には、硫酸化ヒアルロン酸の量にかかわらず、軟骨細胞の増殖能および軟骨への分化能が大きく増加していることがわかった。
【００２２】
なお、本実施形態においては、多孔質担体に硫酸化ヒアルロン酸溶液を含浸させた後、凍結乾燥することにより多孔質担体の表面に硫酸化ヒアルロン酸をコーティングすることとしたが、これに代えて、バインダを用いてコーティングしてもよい。
バインダとしては、例えば、アルコキシシリル基やイソシアネート基、もしくは４−メタクリロイロキシエチルトリメリト酸無水物(4-methacryloyloxyethyl
trimellite anhydride)を挙げることができる。
【００２３】
次に、硫酸化ヒアルロン酸によるコーティングのない多孔質担体からなる生体組織補填材を軟骨欠損部に補填する場合の実施例について説明する。
ミニブタに直径１２ｍｍ厚さ３ｍｍの軟骨欠損部を作成し、同じサイズの多孔質担体を作成した。多孔質担体は、ゼラチンを水に溶解し、泡立てた後にそのまま凍結乾燥させることで調製した。多孔質担体の気孔径は５０〜５００μｍ、気孔率は約９０％である。
【００２４】
細胞懸濁液は、ミニブタの骨髄液２０ｍＬを１３日間培養し、シャーレに接着した骨髄由来細胞を採取し、５×１０６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
上記多孔質担体に一旦培地を含浸させて脱水した後、その体積の１／３容量の細胞懸濁液を播種し、３７℃で静置した。静置時間は１５分で播種効率８０％以上を達成した。
【００２５】
細胞播種した多孔質担体を軟骨欠損部に移植した。多孔質担体は柔軟性があり、かつ、細胞懸濁液を吸収することにより膨潤しているので、軟骨欠損部に隙間無く嵌め込むことができ、一旦嵌め込まれると抜けなくなる。これにより、縫合糸による固定を実施することなく軟骨欠損部に埋植状態に維持した。
【００２６】
移植から６ヶ月後の移植部の肉眼的所見によれば、図５に示されるように、埋植部分の表面は比較的スムーズであり、光沢も周囲正常軟骨部分と遜色なかった。図５によれば、（ｂ）の細胞なしでは、埋植部分に組織がシュリンクしていて滑らかではないが、（ａ）の細胞有りでは、埋植部分に多少の凹凸はあるものの細胞なしに比べて組織が滑らかであった。
【００２７】
また、組織学的所見（トルイジンブルーおよびサフラニン染色）によれば、図６に示されるように、トルイジンブルーおよびサフラニンＯ染色陽性部分が大半を占めていた。軟骨組織が染色される図６によれば、（ｂ）の細胞なしでは組織がきちんと形成されていないが、（ａ）の細胞有りでは層状の組織がきちんと形成されているのがわかる。
【００２８】
これらの所見により、軟骨欠損部に埋植された多孔質担体に軟骨の形成が確認され、欠損部の修復が行われていることが確認された。
なお、多孔質担体のサイズとしては、軟骨欠損部と同じサイズに限られるものではなく、軟骨欠損部より若干大きいサイズを採用してもよい。
【００２９】
以上の通り、軟骨細胞を含有したゼラチンは軟骨修復に有効であることが示された。また、先に示したとおり、このゼラチンに硫酸化ヒアルロン酸をコートすれば、硫酸化ヒアルロン酸と軟骨細胞との相乗効果、さらにはサイトカインとの相乗効果により、軟骨修復にきわめて有用な生体組織補填体を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織補填材の製造方法を示すフローチャートである。
【図２】本実施形態に係る生体組織補填材に硫酸化度０．４の硫酸化ヒアルロン酸を用いた場合の硫酸化ヒアルロン酸の量に対する（ａ）軟骨細胞の増殖能、（ｂ）軟骨への分化能の関係を示すグラフである。
【図３】本実施形態に係る生体組織補填材に硫酸化度０．６の硫酸化ヒアルロン酸を用いた場合の図２と同様のグラフである。
【図４】本実施形態に係る生体組織補填材に硫酸化度１．０の硫酸化ヒアルロン酸を用いた場合の図２と同様のグラフである。
【図５】移植部の肉眼的所見を示す（ａ）細胞有りの場合、（ｂ）細胞なしの場合の写真である。
【図６】トルイジンブルーおよびサフラニン染色による組織学的所見を示す（ａ）細胞有りの場合、（ｂ）細胞なしの場合の軟骨組織の断層写真である。
【符号の説明】
【００３１】
Ｓ１  水和ステップ
Ｓ２  脱水ステップ
Ｓ３  含浸ステップ
Ｓ４  凍結ステップ
Ｓ５  乾燥ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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