(57)【要約】【課題】リガンドが結合していないアポ体のHsp70タンパク質を複雑な操作を経ることなく、かつ安価に精製する方法を提供すること。【解決手段】Hsp70タンパク質を含む溶液を、トリアジン色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することを特徴とする、Hsp70タンパク質の精製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Hsp70タンパク質を含む溶液を、トリアジン色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することを特徴とする、Hsp70タンパク質の精製方法。
【請求項２】
トリアジン色素が、Cibacron Blue F3GAである、請求項１に記載のHsp70タンパク質の精製方法。
【請求項３】
Hsp70タンパク質を含む溶液が、遺伝子工学的手法により得られたHsp70タンパク質を産生する形質転換宿主細胞の培養物である、請求項１に記載のHsp70タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Hsp70タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
熱ストレスタンパク質（HSP）は、熱、活性酸素、重金属などのストレスで誘導される一連のタンパク質群であり、変性タンパク質の除去や修復を促進し、細胞をストレスから防御する。また、HSPは非ストレス下においても発現し、タンパク質の生合成の過程や細胞内輸送に関与し、タンパク質の折りたたみや会合を介助する分子シャペロンとしての機能が解明されつつある。Hsp70タンパク質は、70KDaの分子量をもつ分子シャペロンのひとつであり、真核生物・原核生物に共通に存在し、その構造が非常によく保存されている。Hsp70タンパク質は、タンパク質の発現や安定化、高次構造の形成や輸送、分解などに働くほか、免疫にも関与している。例えば、Hsp70タンパク質は、何らかの原因で崩壊したタンパク質をHsp90やHsp40といった他の分子シャペロンと協同してタンパク質をプロセシングして抗原ペプチドを産生する。この抗原ペプチドはヘルパーT細胞上のMHCクラスI分子に捕捉され、提示された結果、免疫応答が起こる。従って、自己免疫、感染免疫、癌免疫にかかわる抗原ペプチドのプロセシングをHsp70タンパク質によって調節することは、癌、創傷、炎症、自己免疫疾患等の疾患に対する治療薬、診断薬の開発の基盤となりうる。特に、HSP70タンパク質は、腫瘍免疫において重要な役割を持っていることが近年明らかとなり、腫瘍抗原ペプチドと結合し、Hspレセプターを介して抗原提示細胞に提示することから、HSP70-抗原複合体は強い腫瘍ワクチンとしての機能が期待される（非特許文献１）。
【０００３】
Hsp70タンパク質はATP結合タンパクであり、そのATP結合ドメインの結晶構造の立体配座変化がATP結合性に関係するという可能性が示されている（非特許文献２）。Hsp70タンパク質をはじめとするATP結合タンパク質の精製には、従来ATPを修飾したレジンが使用されてきた。しかし、これらのレジンは高価であることや複数種のバッファーを用いた煩雑で時間のかかるレジンの再生操作を必要とすることから、利便性の悪さが指摘されてきた。加えて、このATP修飾レジンによる精製では、目的タンパク質の溶出にATPの使用が必須となるが、ATPを用いた溶出ではATPからADPへの加水分解を伴うことが避けられず、また、アポ体の構造を得ることが困難であった。
【０００４】
【非特許文献１】Chiala Castelli et al, Human Heat Shock Protein 70 Peptide Complexes Specifically Activate Antimelanoma T cells, CANCER RESEARCH 61, 222-227, January, 2001
【非特許文献２】Jerzy Osipiuk et al, Structure of a new crystal form of human Hsp70 ATPase domain, Acta Crystallographica Section D 55, 1105-1107, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明は、リガンドと結合していないアポ体のHsp70タンパク質を複雑な操作を経ることなく、かつ安価に精製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、Hsp70タンパク質の精製を、トリアジン色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーによって行うと、従来のATP修飾レジンによる精製のようにATPによる影響はなく、アポ体の状態でHsp70タンパク質を効率良く高純度に精製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
(1) Hsp70タンパク質を含む溶液を、トリアジン色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することを特徴とする、Hsp70タンパク質の精製方法。
(2) トリアジン色素が、Cibacron Blue F3GAである、(1)に記載のHsp70タンパク質の精製方法。
(3) Hsp70タンパク質を含む溶液が、Hsp70タンパク質をコードする遺伝子組換え菌の培養物である、(1)に記載のHsp70タンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ATPを使用せずに、Hsp70タンパク質を効率よく精製する方法が提供される。本発明方法は、ATPを修飾したレジンを用いる従来法に比べて、精製時にかかるコストを1/10に抑えることができ、煩雑なレジンの再生操作も省略することができる。また、ATPを使用しないことにより、これまでに報告がなされていないリガンドを含まないアポ体でのHsp70タンパク質の立体構造を決定することが可能となる。また、本発明方法により得られたHsp70タンパク質を利用することで、in vitro実験におけるバックグラウンドが最小限となり、活性測定や相互作用解析のデータの信頼性を高めることができる。さらに、ATPのアナログであるAMP-PNPとの共結晶化による構造決定も行えたことから、この手法で精製されたタンパク質はリガンド認識能を保持しており、これにより発現や可溶化の困難なタンパク質を得る際の添加剤としての使用やタンパク質共結晶体の立体構造の決定への応用も期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のHsp70タンパク質の精製方法は、Hsp70タンパク質を含む溶液を、トリアジン色素をリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することを特徴とする。
【００１０】
Hsp70タンパク質を含む溶液としては、Hsp70タンパク質を含む溶液であれば限定はされないが、特には、Hsp70タンパク質を産生する形質転換宿主細胞の培養物をいう。ここで、「培養物」とは、培養液、培養細胞、培養菌体、培養細胞若しくは培養菌体の破砕物、またはこれらを遠心分離により除去した培養上清のいずれをも意味する。上記破砕物は、菌体又は細胞を超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により破砕することにより得ることができ、遠心分離の前に、界面活性剤処理、リゾチーム処理等を行ってもよい。
【００１１】
前記形質転換宿主細胞は、Hsp70タンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに連結して発現ベクターを構築し、得られた組換えベクターを目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。宿主としては、目的遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、大腸菌（Escherichia coli）等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属に属する細菌；サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母；サル細胞COS-7、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）等の動物細胞；あるいはSf9、Sf21等の昆虫細胞のいずれでもよい。
【００１２】
また、発現タンパク質の精製を容易にするために、上記発現ベクターには、タグを組み込んでおくことが好ましい。タグの例としては、例えば、GSTタグ、Mycタグ、Hisタグ、FLAGタグ、マルトース結合タンパク（MBP）などが挙げられる。
【００１３】
形質転換宿主細胞の培養方法は、その宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。形質転換宿主細胞が大腸菌などの微生物の場合は、培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。さらに、必要に応じて微量金属塩、ビタミン類等を使用してもよい。
【００１４】
培養は通常、嫌気的あるいは微好気的な条件下、振盪培養又は通気攪拌培養で行われ、培養温度としては、20〜40℃が好ましく、30〜40℃がより好ましい。このような条件下で3〜30時間、好ましくは6〜10時間培養することにより、菌体内にHsp70タンパク質が生成、蓄積される。培養期間中、pHは7.0〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００１５】
次に、上記の細胞培養物を結合バッファーに加え、この溶液を、リガンドとしてトリアジン色素を結合させたアフィニティー担体に接触させてHsp70タンパク質を吸着させ、同結合バッファーで洗浄したのち、溶出バッファーにて溶出させる。
【００１６】
上記のリガンドとして用いるトリアジン色素としては、Cibacron Blue F3GA、Cibacron Blue 3GA（チバガイギー社製）、Procion Blue MX-R 、Procion Red HE3B、Reactive Red 120 (RR120)、 Reactive Green 19 (RG19)、Reactive Green 5 (RG5)、Reactive Yellow 86等が挙げられる。
【００１７】
リガンドと結合させる担体としては、特に限定されるものではなく、例えば、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルクロライド、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、架橋ポリアクリルアミド等の不飽和炭素を含む単量体からなる重合体；ポリフェニレンオキシド、ポリメチレンオキシド等のポリエーテル類；ポリアラニン、ポリフェニルアラニン等のポリペプチド類；ナイロン−６、ナイロン−１２、ナイロン−６．６等のポリアミド；テレフタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸等のポリカルボン酸と、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等のポリオールとから誘導されるポリエステル類；グリコール類、乳酸、ヒドロキシピリバリン酸等から誘導されるポリエステル；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン等のシリコンゴム；活性炭、シリカゲル、アルミナ等の無機物の誘導体が挙げられる。
【００１８】
リガンドと担体とを結合させる方法としては、両者を混合するだけでも結合させることができるが、好ましくはリン酸緩衝液中で両者を結合させるとより強固に結合させることができる。
【００１９】
トリアジン色素を上記担体に結合させたアフィニティークロマトグラフィー用カラムの例としては、HiTrap Blue HP Columns（GEヘルスケア バイオサイエンス社製）、ブルーセルロファイン（生化学工業社製）、ブルーセファロース（ファルマシア社製）、ブルートヨパール（東ソー社製）、アフィゲルブルー（バイオラド社製）等の市販品が挙げられ、これらを利用することができる。
【００２０】
Hsp70タンパク質のカラムへの結合と溶出のための具体的な操作や試薬は、基本的には上記のHiTrap Blue HP Columns添付の指示書に従えばよい。
【００２１】
結合バッファーとしては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が用いられる。結合バッファーのpHは4〜12の範囲が好ましく、特に好ましくはpH7〜9である。また、カラムは、結合バッファーと同じバッファーで予め平衡化しておくことが好ましい。結合バッファーの量としては、担体のタンパク質結合容量に応じて適宜調整すればよく、例えば、担体1mlあたり20mg程度のタンパク質が結合させるような量が好ましい。また、Hsp70タンパク質を含む溶液のカラムへの通液速度としては、0.5〜1ml／分が好ましい。
【００２２】
担体からHsp70タンパク質を溶出する際の溶出液としては、塩化ナトリウム溶液、塩化カリウム溶液等の塩溶液、リン酸、イミダゾール、酢酸、クエン酸、トリス、グッド等の緩衝液及びこれらの混合溶液等を用いればよく、溶出は塩濃度グラジエントまたはpHグラジエント（段階的な増加）によって行う。溶出液の量としては、担体の体積の15〜20倍量が好ましい。
【００２３】
上記のような操作を経て精製されたHsp70は、ゲル濾過クロマトグラフィーで分画分析すると、分子量70kDaに相当する位置に単一のピークとして現れることによって確認できる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（実施例１）
大腸菌を用いたタンパク質発現のため、TEVプロテアーゼによるタグ切断サイトを組み込んだpET32（Novagen社製）のベクターにHsp70 ATPaseドメイン（配列番号２）をコードする塩基配列(配列番号１）を組み込み、Rosetta DE3（Novagen社製）の菌株に導入した。OD600が0.6に達するまで37℃で培養し、0.3mMのIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside）を添加して20℃で一晩培養を続けた。
【００２６】
遠心分離により回収した菌体はpH8.0のバッファー（20 mMリン酸緩衝液、5 mMイミダゾール、500 mM NaCl、5 mMメルカプトエタノール）に溶解し、超音波破砕と遠心操作により上清を回収した。このサンプルをHisタグのアフィニティー精製用カラムであるHis Trapカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製、column volume:5 ml, Max.back pressure :0.5 MPa)に添加し、イミダゾールのグラジエントにより溶出を行い、目的タンパク質を含む画分を回収した。Hisタグを切断し、さらにNaClとイミダゾールの濃度を下げるため、回収してきた目的タンパク質を含む画分とTEVプロテアーゼを透析膜中に入れ、pH8.0のバッファー（20 mMリン酸緩衝液、30mMイミダゾール、50mM NaCl、5 mMメルカプトエタノール）中で透析を行った。そして、この透析膜中の溶液を再度His Trapカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製、column volume:5 ml, Max.back pressure :0.5 MPa)に添加し、非吸着画分から目的タンパク質を含む画分を回収した。続いて、サンプル中のNaClとイミダゾールの濃度を0 mMとするため、pH8.0のバッファー（20 mMリン酸緩衝液、5 mMメルカプトエタノール）中で透析を行った後、HiTrapTM Blueカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製、column volume:1 ml, Max.back pressure :0.3 MPa)を使用してNaClのグラジエントによる溶出で目的タンパク質を分離した。上記バッファーを20 mM Tris-HCl pH8.0、25 mM NaCl、5 mMメルカプトエタノールのバッファーに置換したのち、目的タンパク質をMonoQカラム（GEヘルスケアバイオサイエンス製）に結合させ、NaClのグラジエントにより溶出を行った。最後にSuperdex200(GEヘルスケアバイオサイエンス製）のカラム（流速：0.5ml/min、１フラクション0.5mlずつ採取）を用いて単一の分子量の画分を回収し（図１）、結晶化のために濃縮を行った。
【００２７】
この手法により得られた目的タンパク質を約8 mg/mlの濃度で0.1 M HEPES pH7.0、25% PEG 3350の条件により結晶化し、PF BL-5A（大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構）のビームラインにおいてデータセットの取得を行った。結果を下記表１に示す。さらに、上記の結晶化条件に5 mM MgCl2、5 mM AMP-PNPを加えて再度結晶化を行うことにより複合体を結晶化し、SPring-8 BL26B2(財団法人高輝度光科学研究センター)においてデータセットを取得した。いずれのデータセットも分子置換法により構造決定を行うことができた。
【００２８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】精製Hsp70タンパク質のSuperdex200カラムによる溶出パターンを示す。
【図１】
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【配列表】
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