(57)【要約】【課題】プライマー伸長の開始をリアルタイムで蛍光検出する技術などを提供すること。【解決手段】３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１の五炭糖３′位置に結合された消光物質Ｑと、該消光物質Ｑの消光機能が及ぶ射程範囲内に存在するヌクレオチド残基Ｎ２に結合された蛍光物質Ｆと、を備えており、そして、前記３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１の塩基が鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基とされているオリゴヌクレオチドを提供する。加えて、該オリゴヌクレオチドの伸長開始情報を利用するハイブリダイゼーション検出方法などを提供する。【選択図】  図１
2008182920.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３′末端ヌクレオチド残基の五炭糖３′位置に結合された消光物質と、該消光物質の消光機能が及ぶ射程範囲内に存在するヌクレオチド残基に結合された蛍光物質と、を備え、前記３′末端ヌクレオチド残基の塩基が鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基とされているオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして利用する方法であって、
前記ミスマッチ塩基を有する３′末端ヌクレオチド残基をＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって除去した後、該オリゴヌクレオチド（プライマー）の伸長を進行させ、所定波長の励起光の照射によって得られる前記蛍光物質からの蛍光を検出することにより、プライマー伸長の開始の情報を得ることを特徴とするプライマー伸長反応。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドを利用する方法であって、
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを存在させた反応場に前記プライマーを存在させておき、該オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有する核酸鎖とのハイブリダイゼーションを、前記オリゴヌクレオチドを伸長開始に伴って発生する蛍光により検出することを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。
【請求項４】
請求項１記載のオリゴヌクレオチドを利用する方法であって、
プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを存在させた反応場に前記オリゴヌクレオチドを存在させておき、該オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するＰＣＲ増幅産物である核酸鎖とのハイブリダイゼーションを、前記オリゴヌクレオチドの伸長開始に伴って発生する蛍光により検出することで、前記ＰＣＲ増幅産物の検出を行うことを特徴とするＰＣＲ増幅産物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規構造の蛍光標識オリゴヌクレオチドに関する。より詳細には、オリゴヌクレオチドの新規な蛍光標識構造に基づいて、該オリゴヌクレオチドの伸長反応の開始を簡易、かつ、確実に知ることができる技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分野において「プライマー（primer）」は、ＤＮＡの酵素的合成の開始に必要なオリゴヌクレオチドであって、鋳型と塩基対で相補的に結合する短い一本鎖のＤＮＡあるいはＲＮＡを意味する。
【０００３】
ＤＮＡの合成では、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡpolymerase）が該プライマーの３′-ＯＨ基にデオキシリボヌクレオチドを結合することによって、ＤＮＡ鎖の伸長が始まる。また、ＤＮＡの複製の開始においてもプライマーが必須であり、この場合、短いポリ・リボヌクレオチド（ＲＮＡ）鎖がプライマーの役割を果たす。ｍＲＮＡから逆転写酵素でｃＤＮＡを合成する場合もプライマーが必要である。ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲ）でもプライマーが使用され、このプライマーの選択次第で、目的のＤＮＡを正しく効率よく増幅できるか否かが決まる。
【０００４】
「プライマー伸長方法（primer extension technique）」は、一般には、ＲＮＡの転写開始部位や発現量を調べる方法のことを指す。例えば、ＲＮＡの転写開始部位を調べる場合、鋳型となるＲＮＡの一部塩基領域と相補的なプライマーＤＮＡを合成し、このプライマーＤＮＡを放射性同位元素などで標識し、その後、前記ＲＮＡとハイブリダイズさせ、逆転写酵素でプライマーＤＮＡをＲＮＡの５′末端まで伸長させる。この伸長したＤＮＡを電気泳動にかけてその長さを調べればＲＮＡの転写開始部位を知ることができる。このプライマー伸長反応の基本的な原理については、上記ＰＣＲによる核酸鎖増幅の他、ジデオキシ法による塩基配列決定法、ランダムプライマー法によるプローブ作製などに共通して用いられている。このように、プライマーあるいはプライマー伸長反応を利用する技術は多い。
【０００５】
プライマーの伸長の際に、該プライマーの伸長反応を検出する技術もある。例えば、蛍光成分を有するデオキシリボヌクレオチドを取り込ませ、該蛍光成分の蛍光シグナルを検出することで該プライマーの伸長反応を検出する技術が提案されている（特許文献１、特許文献２）。
【特許文献１】特開２００５−０００１７４号公報。
【特許文献２】特開２００３−０８８３６７号公報。
【０００６】
次に、ＤＮＡポリメラーゼに話しを移す。ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型の核酸鎖に従ってＤＮＡを合成する酵素の総称であり、伸長する鎖の末端の３′-ＯＨ基へ鋳型ＤＮＡの塩基配列と相補的なデオキシリボヌクレオチドを、ヌクレオチドをリン酸ジエステル結合により次々と付加し、５′→３′方向へ合成する（５′→３′ＤＮＡポリメラーゼ活性）。したがって、ＤＮＡポリメラーゼ反応の開始には、上記したように、３′-ＯＨ基を有するプライマーが必要である。
【０００７】
このＤＮＡポリメラーゼは、上記した「５′→３′ＤＮＡポリメラーゼ活性」以外に、二つの活性を持っている。その一つは、「二本鎖特異的５′→３′エキソヌクレアーゼ活性」であり、これは、損傷を受けたヌクレオチドを除去したり、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分化したりする。残りの一つは、「プルーフリーディング（proof reading）活性」であり、これは、ＤＮＡ複製中に誤って取り込まれた塩基を除去する。
【０００８】
ＤＮＡポリメラーゼは、構造的にPolＩ型とα型に分類できる。PolＩ型酵素は、ＤＮＡ鎖伸長活性が強くＰＣＲに適しているが、プルーフリーディング活性を持たないものが多いためＤＮＡ合成の忠実性には難がある。一方、α型酵素は、プルーフリーディング活性が強く忠実性が高いが、伸長活性が弱い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明では、ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の開始を、該プライマー自体の構造を予め工夫しておくことによって検出する技術、より詳しくは、ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性を利用してプライマー伸長の開始を蛍光検出できるように工夫したプライマーの新規構造、並びに、該新規プライマーを利用したプライマー伸長技術やハイブリダイゼーション検出技術などを提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、まず、オリゴヌクレオチド断片の新規構造に関するものである。本発明に係るオリゴヌクレオチドは、３′末端ヌクレオチド残基の３′位置に結合された消光物質と、該消光物質の消光作用の射程範囲内に存在するヌクレオチド残基に結合された蛍光物質と、を備えており、前記３′末端ヌクレオチド残基の塩基が鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基とされていることが特徴である。
即ち、本オリゴヌクレオチドは、通常、３′末端ヌクレオチド残基に位置する消光物質（クエンチャーとも称される。）が、蛍光物質の蛍光を抑制している。しかし、該オリゴヌクレオチドの伸長（プライマー伸長）が起こるときには、ＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって、鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基を持つ３′末端ヌクレオチド残基が除去され、該３′末端ヌクレオチド残基に結合している消光物質も本オリゴヌクレオチドから除去される。これにより、本オリゴヌクレオチドに結合している蛍光物質は消光物質の消光作用が及ぶ射程範囲外となるので、所定の励起光の照射によって蛍光を発生し得る状態となる。このような反応機構に基づいて、蛍光検出を行うと、本発明に係るオリゴヌクレオチドの伸長反応が開始したか否かを知ることができる。
次に、本発明は、上記オリゴヌクレオチドを利用する代表的な三つの方法を提供する。
第一には、鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基を持つ３′末端ヌクレオチド残基をＤＮＡポリメラーゼのプルーフリーディング活性によって除去した後、該オリゴヌクレオチド（プライマー）の伸長を進行させるように工夫したプライマー伸長反応を提供する。このプライマー伸長反応は、上記した反応機構により、プライマーの伸長反応が開始したか否かをリアルタイムで知ることができることが特徴である。
第二には、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを存在させた反応場に上記オリゴヌクレオチドを存在させておき、該オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有する核酸鎖とのハイブリダイゼーションを、前記オリゴヌクレオチドの伸長開始に伴って発生する蛍光により検出することを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法を提供する。この方法において本オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション検出用のプローブとして機能する。
第三に、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを存在させた反応場に上記オリゴヌクレオチドを存在させておき、該オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するＰＣＲ増幅産物である核酸鎖とのハイブリダイゼーションを、前記オリゴヌクレオチドの伸長開始に伴って発生する蛍光により検出することで、前記ＰＣＲ増幅産物の検出を行うことを特徴とするＰＣＲ増幅産物の検出方法を提供する。
この方法によれば、ＰＣＲ法による増幅産物の検出、同増幅産物種の定量解析などを行うことができる。例えば、ＲＴ-ＰＣＲ（reverse-transcribed-PCR）からの増幅産物であるｃＤＮＡ（発現したｍＲＮＡの逆転写産物）の定量、即ち、遺伝子発現解析を行うことができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る新規オリゴヌクレオチドによれば、プライマーとして機能するオリゴヌクレオチドの伸長の開始を蛍光検出によってリアルタイムで知ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
まず、本発明に係るオリゴヌクレオチドの基本構造とその基本的な機能について、図１、図２を参照しながら簡潔に説明する。
【００１３】
まず、図１において、正円で示されているそれぞれの物質は、ヌクレオチドを表しており、全体としてオリゴヌクレオチドを示している。なお、オリゴヌクレオチドは、一般に数塩基〜数十塩基程度のヌクレオチド分子からなる核酸鎖を指すが、その分子数の概念については、本発明の目的に照らし妥当な範囲に解釈されるべきであり、狭く解釈されない。
【００１４】
そして、オリゴヌクレオチドＸは、３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１の五炭糖３′位置に結合された消光物質Ｑと、該消光物質Ｑの消光作用が及ぶ射程範囲内に存在するヌクレオチド残基Ｎ２に結合された蛍光物質Ｆと、を備えている。さらに、前記３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１の塩基が、図１では示さない鋳型ＤＮＡに対してミスマッチ塩基とされている。
【００１５】
本オリゴヌクレオチドＸは、後述するプライマー伸長反応が始まらない段階では、消光物質Ｑの影響によって蛍光物質Ｆの蛍光発生は抑制されている（図１の（Ａ）参照）。一方、本オリゴヌクレオチドＸは、鋳型ＤＮＡ（図示せす。）に相補結合した状態において、ＤＮＡポリメラーゼＥのプルーフリーディング活性が働くと、３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１が除去される。
【００１６】
この結果、３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１に結合されている消光物質Ｑも除去されるため、蛍光物質Ｆには消光物質Ｑの消光作用が及ばなくなる。この状態で、所定波長の励起光Ｐが照射されると、蛍光物質Ｆから蛍光が発せられる（図１の（Ｂ）参照）。したがって、この蛍光の検出によって、３′末端ヌクレオチド残基Ｎ１の除去が起きたことを知ることができる。
【００１７】
図２は、本発明に係るオリゴヌクレオチドＸのプライマーとして機能する一実施形態例を示す図である。この図２には、３０ｍｅｒのオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）であるプライマー（フォワードプライマー、配列番号１）が例示されている。なお、リバースプライマーを配列番号２に示す。
【００１８】
このフォワードプライマー（図１のオリゴヌクレオチドＸに対応）は、３′末端ヌクレオチド残基の近傍に位置するヌクレオチド残基に蛍光物質の一例である６-ＦＡＭが結合されている。また、３′末端ヌクレオチド残基（この場合、塩基はチミン：Ｔ）の五炭糖３′位置に消光物質の一例であるＢＨＱ（Black Hole Quencher）が結合されている（図２の（Ａ）参照）。具体的には、２５番目チミン残基に６-ＦＡＭ、３０番目のチミン残基にＢＨＱが結合している。
【００１９】
したがって、このプライマーでは、蛍光物質（６-ＦＡＭ）は消光物質（ＢＨＱ）によって消光されており、かつ、３′末端ヌクレオチド残基（この場合、塩基はチミン：Ｔ）の五炭糖３′位置には、水酸基（−ＯＨ基）が存在していないため、この状態では、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成（即ち、プライマー伸長）は起こらない。
【００２０】
しかし、本プライマーでは、３′末端ヌクレオチド残基の塩基が鋳型ＤＮＡに対して相補的なアデニンではなく、ミスマッチ塩基（Ｔ）となるように工夫されている（図２の（Ｂ）参照）。このため、プルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼを本プライマーと同反応場に存在させておくと、前記活性によってミスマッチ塩基を有する３′末端ヌクレオチド残基を除去する反応が起き、この反応によって、新たな３′末端ヌクレオチド残基の五炭糖３′位置には、水酸基（−ＯＨ基）が形成される（図２の（Ｃ）参照）。
【００２１】
このとき、３′末端ヌクレオチド残基とともに消光物質が除去されることになるので、蛍光物質（６−ＦＡＭ）は励起光によって蛍光を発し得る状態に変化する。この蛍光を検出すると、以下のＤＮＡ合成（プライマー伸長）が開始されることを知ることができる。
【００２２】
ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの末端ヌクレオチド残基の五炭糖３′位置の水酸基（-ＯＨ基）へ鋳型ＤＮＡの塩基配列と相補的なデオキシリボヌクレオチドをリン酸ジエステル結合によって次々と付加し、これにより５′→３′方向へＤＮＡ合成が進む（５′→３′ＤＮＡポリメラーゼ活性）。即ち、プライマーの伸長反応が起こる（図２の（Ｄ）参照）。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
本実施例１は、上記したオリゴヌクレオチドの機能を検証するとともに、該オリゴヌクレオチドをプローブとして用いて、ＰＣＲ増幅産物を蛍光検出できた例に関する。
【００２４】
まず、ＰＣＲ反応に用いるプライマーペアーの片方には修飾のない通常のオリゴＤＮＡを用い、他方には図２に例示したような蛍光標識されたオリゴＤＮＡを用いた。本ＰＣＲ反応における酵素は、iProof High-Fidelity DNA polymerase(BioRad社)を用いた。また、ＰＣＲ反応によって増幅する鋳型ＤＮＡ（template DNA）には全長のβ-actin遺伝子を用いた。
【００２５】
適切な反応条件の下でＰＣＲ反応を行う過程で、ＰＣＲサイクル毎に溶液からの蛍光シグナルを計測し、Ｘ軸にはサイクル数、Ｙ軸には蛍光シグナル強度（相対値）をプロットした（図３の左グラフ参照）。
【００２６】
その結果、鋳型ＤＮＡを加えないネガティブコントロールサンプルでは、１から３５サイクルを通じて緩やかな蛍光シグナルの上昇が観察されたのに対して（図３のtemplate（-）グラフ参照）、鋳型ＤＮＡを加えたサンプルでは１８サイクルから３５サイクルにかけて、急激なシグナルの増強が観察された（図３のtemplate（＋）グラフ参照）。これに対して、酵素を加えないネガティブコントロールサンプルでは、全サイクルにわたってシグナルの増強は観察されなかった（図３のno enzymeグラフ参照）。なお、本実験では、ＰＣＲのフォワードプライマーは配列番号１のオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーは配列番号２のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００２７】
また、上記観察に用いたＰＣＲ溶液から一部を分取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＰＣＲ産物を解析した（図４の図面代用写真参照）。電気泳動後のゲルは蛍光スキャナーにて観察することで、上記の実験結果との相関を考察した。
【００２８】
酵素を加えないネガティブコントロールサンプルでは、一本のバンドが観察された（図４中の１を参照）。これは、蛍光標識されたオリゴＤＮＡのバックグラウンドシグナルと考えられ、図３中のno enzymeグラフの蛍光シグナルに相当すると考えられる。
【００２９】
鋳型ＤＮＡ（template DNA）を加えないネガティブコントロールサンプルでは、符号１のバンドに加えてさらに低分子のバンドが観察された（図４の符号２参照）。これは酵素の非特異的なエキソヌクレアーゼ活性により、蛍光プローブの消光物質が付加されたヌクレオチド残基が除去され、蛍光を発するようになったオリゴＤＮＡであると考えられる。このオリゴＤＮＡが生じることによって増加する蛍光シグナルは、図３のtemplate（-）グラフに相当すると考えられる。
【００３０】
また、鋳型ＤＮＡ（template DNA）を加えたサンプルでは、プライマーと鋳型ＤＮＡ配列から予想される鎖長のＤＮＡに相当するバンドが観察された（図４の符号３のバンド参照）。このバンドに相当するＤＮＡから生じる蛍光シグナルが、図３のtemplate（＋）グラフに相当すると考えられる。
【００３１】
これらの観察結果から、酵素による非特異的なシグナル増加はあるものの、ＰＣＲ反応によって生じる産物を、蛍光標識されたオリゴＤＮＡによって検出することが可能であることが明らかとなった。
【００３２】
（実施例２）
本実施例２は、本発明に係るオリゴヌクレオチド（プライマー）を定量リアルタイムＰＣＲ解析に用いた例に関する。本実験では、フォワードプライマーに配列番号３のオリゴヌクレオチドを使用し、リバースプライマーとして配列番号４のオリゴヌクレオチドを用いた。
【００３３】
鋳型（template）として反応チューブに加えるβ-actin遺伝子を１×１０２コピーから１×１０７コピーまで１０倍毎に量をふって、ＰＣＲサイクルの進行に伴う蛍光シグナル強度の変化をそれぞれ観察した。その結果を図５に示す。
【００３４】
また、適当なシグナル強度を閾値と設定し、各サンプルのシグナル強度が閾値に達するＰＣＲサイクル数を、あらかじめ加えた鋳型（template）の量のlog値に対してプロットしたグラフを作成した。そのグラフを図６に示す。
【００３５】
その結果、あらかじめ加えた鋳型（template）の量と閾値に達するＰＣＲサイクル数の間には極めて強い直線的相関(相関係数0.996)が得られた（図６参照）。この結果は、この蛍光標識されたオリゴＤＮＡによって、既存の手法による定量リアルタイムＰＣＲ解析と少なくとも同等の定量性を有する解析が可能であることを示している。
【００３６】
（実施例３）
本実施例３は、図１に示すような基本構造を備える、蛍光標識オリゴＤＮＡ（蛍光プローブ）を基板に固定し、ＰＣＲ増幅産物の検出を行った応用例に関する。
【００３７】
表面に活性エステル基が生じるように表面処理を施すなどした基板やビーズなどに、５′末端にアミノ基を導入するなどした蛍光標識オリゴＤＮＡを固定することができる。あるいは、アビジンで表面処理された基板やビーズなどに対して５′末端がビオチンでラベルされた蛍光標識オリゴＤＮＡを、アビジン−ビオチン結合により固定することもできる。
【００３８】
このように固定された蛍光標識オリゴＤＮＡ（図１再参照）によって特定のＰＣＲ増幅産物を検出することが可能である。具体的には、図７に示した例のように、蛍光標識オリゴＤＮＡを固定した基板をＰＣＲ反応液中に浸しておいて、液中では通常のＰＣＲ反応を進行させる。
【００３９】
この時、基板に固定する蛍光標識オリゴＤＮＡには、ＰＣＲ反応によって増幅産生される産物に含まれる塩基配列のものを使用することで、溶液中で生じるＰＣＲ産物の一部が基板に固定されている蛍光標識オリゴＤＮＡとハイブリダイゼーションし、それに引き続いてプライマー伸長反応が起こる（図７参照）。
【００４０】
よって、このＰＣＲ増幅産物の生成は、蛍光標識オリゴＤＮＡのシグナル増加として検出できる。このことを実証するために、実際にある遺伝子をＰＣＲ反応によって増幅して、増幅される遺伝子の一部を、基板に固定した蛍光標識オリゴＤＮＡによって検出する実験を行った。
【００４１】
時計遺伝子のひとつであるヒトBmal1遺伝子のほぼ全長を含むＤＮＡを鋳型に、このBmal1遺伝子の一部の配列を増幅するためのプライマーセット、その他必要な基質や緩衝液によって構成されるＰＣＲ溶液を調製し、ＰＣＲ酵素としてiProof High-Fidelity DNA polymeraseを加えたものと、加えないものをそれぞれ２００μＬ容量のＰＣＲチューブ二本に分注した。
【００４２】
それぞれのＰＣＲチューブには、増幅されるBmal1遺伝子断片の内部の配列で設計された蛍光プローブ（図中Positive Probeと表記、配列番号５）、あるいはBmal1遺伝子断片には含まれない配列で設計された蛍光プローブ（図中Negative Probeと表記、配列番号６）を固定した基板を入れ、ＰＣＲ溶液にて浸した状態でＰＣＲ反応を行った（図８の概念図参照）。
【００４３】
なお、配列番号５の蛍光プローブの４番目チミン残基には蛍光物質ＦＩＴＣ、３′末端のチミン残基にＢＨＱ-1が結合されており、配列番号６の蛍光プローブの５番目チミン残基には蛍光物質ＦＩＴＣ、３′末端のチミン残基にＢＨＱ-1が結合され、さらに、５′末端には計６個の炭素鎖を介してアミノ基を導入した。
【００４４】
ＰＣＲ反応後、蛍光プローブからの蛍光シグナルを観察するために、基板をＰＣＲチューブから取り出して洗浄し、乾燥させた後に蛍光スキャナーにて基板表面の蛍光プローブが固定された部分からの蛍光シグナルを測定した（図８の概念図参照）。
【００４５】
その結果、酵素を加えた反応液と加えない反応液を比較した場合、Negative Probeのシグナル増加に比べ、Positive Probeのシグナル増加が大きかった(図９参照)。図９では同様の実験を３回行い、その平均値と標準偏差を示した。この結果は、Bmal1遺伝子配列の一部がＰＣＲ反応によって増幅され、そのＰＣＲ増幅産物によって基板に固定された蛍光プローブの蛍光シグナルが増加し、さらにそのシグナル増加がＰＣＲ増幅産物に特異的であることを示している。
【００４６】
（実施例４）
本実施例４は、複数遺伝子の同時定量解析に関する。
【００４７】
上記実施例をさらに発展させれば、基板に固定された蛍光プローブ（図１参照）によって複数遺伝子の同時定量解析が可能である。つまり、細胞や組織などに由来する全ＲＮＡ、あるいはｃＤＮＡを出発材料として、定量したい複数種類の遺伝子断片を増幅することのできるプライマーを設計する。
【００４８】
ＲＮＡを出発材料とした場合は、逆転写反応に続いて、複数種のＰＣＲ増幅産物を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲを行う(図１０の概念図参照)。この時、マルチプレックスＰＣＲの各産物の増幅効率をそろえるために、各プライマーに共通配列を付加し、後にその配列を認識するユニバーサルプライマーにてマルチプレックスＰＣＲを行うなどしてもよい。
【００４９】
一方基板には、マルチプレックスＰＣＲ増幅産物を検出できる配列にて設計された蛍光プローブ（図１の構造）をアレイ状に配し、これをＰＣＲ溶液にて満たした状態で反応を行う。この時、光を透過する素材で作られた蓋、あるいは基板を使用することで、反応中に随時外部から蛍光プローブの蛍光シグナルを検出することが可能である。
【００５０】
よって、ＰＣＲの各サイクルで蛍光プローブからのシグナルを検出することで、ＰＣＲ増幅産物の増加をリアルタイムでモニターすることが可能である。通常の定量リアルタイムＰＣＲ解析と同様に、シグナルが検出閾値に達するまでのサイクル数を調べることで、サンプル中に含まれていた解析対象遺伝子の相対量(基準となる遺伝子の何倍に相当するか)を決定することができる。
【００５１】
また、相対定量の基準となる遺伝子に存在量が既知のものを設定することで、解析対象遺伝子の絶対量を知ることもできる。また、SMART PCR法(Clontech社)など、発現しているすべての遺伝子由来のｃＤＮＡを増幅する手法を取り入れることで、原理的にはすべての遺伝子の網羅的な定量解析も可能である。
【００５２】
（実施例５）
本実施例５は、ＳＮＰ（一塩基多型）などのジェノタイプの決定を迅速に行う技術の応用例に関する。
【００５３】
具体的には、図１の構造を有する蛍光プローブの３′末端のミスマッチ塩基を、調べたいＳＮＰの各アレルと相補的な塩基をあてがうように設計したものを基板に固定しておき、ＳＮＰを含むゲノム領域を任意のＰＣＲプライマーにて増幅した産物の検出に用いる。
【００５４】
増幅されたゲノム断片のＳＮＰが、基板に固定された蛍光プローブの３′末端に相補的なアレルであった場合には蛍光シグナルは増加せず、反対に他のアレルであった場合にはシグナルが増加する。この検出では、複数のＳＮＡＰについて同時に行うことで、微量のゲノムサンプルから複数のＳＮＰアレルのタイピングができる。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、例えば、ＰＣＲ伸長反応技術、ハイブリダイゼーション検出技術（ＤＮＡチップ技術を含む）、ＰＣＲ増幅産物の検出や定量に関する技術、遺伝子発現解析技術（ＳＮＰ解析技術を含む）などに利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明に係るオリゴヌクレオチドＸの基本構造とその基本的な機能を説明するための図である。
【図２】本発明に係るオリゴヌクレオチドＸの一実施形態例を示す図である。
【図３】実施例１に関し、ＰＣＲ反応におけるＰＣＲサイクル毎に溶液からの蛍光シグナルを計測し、Ｘ軸にはサイクル数、Ｙ軸には蛍光シグナル強度（相対値）をプロットした図（グラフ）である。
【図４】実施例１に関し、ＰＣＲ溶液から一部を分取し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にてＰＣＲ産物を解析した図（図面代用写真参照）である。
【図５】実施例２に関し、鋳型（template）として反応チューブに加えるβ-actin遺伝子を１×１０２コピーから１×１０７コピーまで１０倍毎に量をふって、ＰＣＲサイクルの進行に伴う蛍光シグナル強度の変化をそれぞれ観察した結果を示す図（グラフ）である。
【図６】実施例２に関し、適当なシグナル強度を閾値と設定し、各サンプルのシグナル強度が閾値に達するＰＣＲサイクル数を、あらかじめ加えた鋳型（template）の量のlog値に対してプロットしたグラフである。
【図７】実施例３に関し、蛍光標識オリゴＤＮＡを固定した基板をＰＣＲ反応液中に浸しておいてＰＣＲ反応を進行させる概念を示す図である。
【図８】実施例３に関するＰＣＲ反応系の概念を示す模式図である。
【図９】実施例３に関し、酵素を加えた反応液と加えない反応液を比較した場合で、Negative Probeのシグナル増加に比べ、Positive Probeのシグナル増加が大きかったことを示す図(グラフ)である。
【図１０】実施例４に関するマルチプレックスＰＣＲの概念を示す模式図である。
【符号の説明】
【００５７】
Ｅ  酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）
Ｆ  蛍光物質
Ｘ  本発明特有の蛍光標識構造を備えるプライマー（オリゴヌクレオチド）
Ｎ１  ３′末端ヌクレオチド残基
Ｑ  消光物質
【図１】
2008182920.tif 000003
【図２】
2008182920.tif 000004
【図３】
2008182920.tif 000005
【図４】
2008182920.tif 000006
【図５】
2008182920.tif 000007
【図６】
2008182920.tif 000008
【図７】
2008182920.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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