(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の洗剤用アミラーゼに比べて高度なキレート剤耐性能を有するアルカリ液化型アミラーゼの提供。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなるアルカリ液化型アミラーゼ。１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性が７０％以上である。また、次の酵素学的性質を有する（１）酸化剤耐性能：２％Ｈ2Ｏ2存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後、７０％以上の残存活性を維持する。（２）酵素比活性：pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）での酵素活性値と、タンパク質量より算出した酵素比活性は、３０００Ｕ／mg以上。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列からなるアルカリ液化型アミラーゼ。
【請求項２】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性が７０％以上であるアルカリ液化型アミラーゼ。
【請求項３】
配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、次の酵素学的性質を有するアルカリ液化型アミラーゼ。
１）酸化剤耐性能
２％Ｈ2Ｏ2存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後、７０％以上の残存活性を維持する。
２）酵素比活性
pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）での酵素活性値と、タンパク質量より算出した酵素比活性は、３０００Ｕ／mg以上である。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリ液化型アミラーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のアルカリ液化型アミラーゼを含有する洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度なキレート剤耐性能を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液化型アミラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
α−アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合の適性が知られており、洗浄力増強成分として自動食器洗浄機用洗剤や衣料用洗剤などへも配合が行われている（非特許文献１）。
【０００３】
洗浄剤用として有用なアルカリ側に最適作用を有している液化型α−アミラーゼとしては、本発明者らが以前に見出したバチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３０４８）株由来のものが知られていた（特許文献１）。また、最近、至適pHを８〜８．５付近に有するα−アミラーゼが開示された（特許文献２）が、これはＫＳＭ−１３７８株のアミラーゼとその性質及び構造が酷似しているものであった。
【０００４】
一方、洗剤には、洗浄妨害イオンであるカルシウム等を洗浄液中から除く為にリン酸、クエン酸あるいはゼオライト等のキレート剤が配合されており、液化型α−アミラーゼはＥＤＴＡにより失活することが知られていた〔非特許文献２〕。前述のバチルス エスピー ＫＳＭ−１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ−３０４８）株由来のアルカリ液化型α−アミラーゼに関してもキレート剤による酵素活性の阻害が認められ、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗剤に配合すると必ずしもその効果は十分とはいえなかった。また、最適作用pHは中酸性であるがアルカリ性でも活性を示し、現在、自動食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗剤の配合成分として最もよく用いられているバチルス リケニフォルミス由来の液化型α−アミラーゼ（ターマミル及びデュラミル、いずれもノボ社製）に関しても、そのキレート剤耐性能は十分とはいえなかった。
これまでに知られている液化型アミラーゼのうち、キレート剤に対して影響されないものとしては、パイロコッカス（Pyrococcus）属の株由来の液化型α−アミラーゼ（特許文献３）及び澱粉の液化工程に有効なスルホロブス（Sulfolobus）属の株由来のα−アミラーゼ（特許文献４）が挙げられるが、これら酵素の最適作用pHはそれぞれ、pH４〜６及びpH２．５〜４．５にあり、アルカリ性では作用しないため、洗浄剤の配合成分としては適していなかった。
【特許文献１】国際公開第９４／２６８８１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９５／２６３９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９０／１１３５２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９６／０２６３３号パンフレット
【非特許文献１】Enzymes in Detergency, P203. Marcel Dekker Inc., New York(1995）
【非特許文献２】HANDOBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES, P43. The Amylase Research Society of Japan(1988）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来の洗剤用アミラーゼに比べて高度なキレート剤耐性能を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液化型アミラーゼ、及びこれを配合した洗浄剤組成物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性が７０％以上であるアルカリ液化型アミラーゼを提供するものである。
また、本発明は当該アルカリ液化型アミラーゼをコードするＤＮＡ断片を提供するものである。
更にまた、本発明は当該アルカリ液化型アミラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、今までに知られている洗剤用アミラーゼに比べて、高度なキレート剤耐性能を有する。また最適作用pHは８を超える。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼはアルカリ領域で澱粉を加工する工程など極めて広範囲の産業分野で使用され得る。特に、キレート剤を含有する自動食器洗浄機用洗剤、衣料用洗剤及び漂白剤等に配合することにより有利に使用することができるものであり、工業的に極めて大きな意義を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明において、アルカリα−アミラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものをいう。また、中性とはpH６〜８の範囲をいい、アルカリ性とはそれ以上の範囲をいう。更に、HANDBOOK OF AMYLASES AND RELATED ENZYMES〔Ｐ４０〜４１．The Amylase Research Society of Japan(1988）〕に記載されているように、液化型とは澱粉及び澱粉系多糖類を高ランダムに分解するものをいう。
【０００９】
本発明酵素は１〜１００mMのＥＤＴＡあるいはＥＧＴＡ存在下、pH１０、４５℃、３０分間処理後の残存活性が７０％以上であるアルカリ液化型アミラーゼであり、当該残存活性は、８０％以上が好ましく、９０％以上がより好ましい。
【００１０】
本発明酵素は上記のキレート剤耐性を有すればよいが、更に下記１）及び２）の性質を有するもの、特に１）〜５）の性質を有するものが好ましい。
１）最適作用pH
最適作用pHが８．０を超える（可溶性澱粉を基質、５０℃、１５分間反応）。
２）作用
澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただしプルランには作用しない。
３）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）
４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。
４）作用温度範囲及び最適作用温度
２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜６０℃である。
５）温度安定性
５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中、３０分間処理で、４０℃で８０％以上の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示す。
【００１１】
また本発明酵素の例としては、配列番号１又は２に記載のアミノ酸配列、又はこれらのアミノ酸の１もしくは２以上が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するものが挙げられる。当該置換、欠失又は付加の範囲は、相同性８０％以上が好ましく、９０％以上が特に好ましい。なお、相同性はLipman-Pearson法(Science, 227, 1435(1985))により計算される。
【００１２】
本発明の酵素は、例えばバチルス属に属するその生産菌を培養した後培養物から採取することにより製造される。かかる生産菌としては、例えば下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株が挙げられる。
【００１３】
【表１】
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【００１４】
以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー〔Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology, Williams & Wilkins, United States of America(1986）〕及びジーナス・バチルス〔The Genus Bacillus, Agricultural Research Service, Washington, D. C.(1973)〕を参照し、比較検討した結果、両菌株は有胞子桿菌であるバチルス（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、両菌株は中性領域では生育できず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことから、いわゆる好アルカリ性（Alkaliphilic）微生物に属し、従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。更に、菌学的及び生理学的性質を公知の好アルカリ性バチルスと比較した〔Microbiol., 141, 1745(1995）〕結果、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株は公知の好アルカリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これらを新規菌株と判断して、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株をそれぞれ、第１６８１６号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１６）及び第１６８１７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１６８１７）として通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。
【００１５】
上記の微生物を用いて本発明のアルカリ液化型アミラーゼを得るには、培地に微生物を接種し、常法に従って培養すればよく、好アルカリ性菌である為に、培地のpHがアルカリ性であることが望ましい。斯くして得られた培養物中から目的のアルカリ液化型アミラーゼを採取することができる。この培養上清液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、塩析法、沈殿法、限外濾過法の分離手段により粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化することにより精製酵素として使用することも可能である。
【００１６】
以下、本発明のアルカリ液化型アミラーゼの精製法の一例を挙げる。培養上清液について、（１）硫安沈殿、（２）ＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー社製）カラムクロマトグラフィー、（３）ゲル濾過をすることにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができる。
【００１７】
更に、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、例えば、本発明アルカリ液化型アミラーゼをコードする遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを取得し、次いで該プラスミドを用いて、適当な微生物、好ましくはバチルス属細菌を形質転換し、これを培養することにより得ることもできる。
本発明のアルカリ液化型アミラーゼをコードする遺伝子の例としては、配列番号３及び４に記載した塩基配列を有するものが挙げられる。
【００１８】
前記の如く本発明のアルカリ液化型アミラーゼはアルカリ側に最適作用pHを有し、かつ高いキレート剤耐性能を有するので、洗浄剤配合用酵素として特に有用である。また、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株由来のアミラーゼは、更に強力な酸化剤耐性も有するので、漂白剤等の酸化剤を配合する洗浄剤にも配合可能である。本発明酵素の洗浄剤への配合量は、０．００１〜５重量％が好ましい。
【００１９】
本発明洗浄剤組成物には、前記アルカリ液化型アミラーゼのほかに、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分としては、ＷＯ９４／２６８８１の第５頁、右上欄、第１４行〜右下欄、第２９行記載のもの、例えば界面活性剤、キレート剤、アルカリ剤及び無機塩、漂白剤、蛍光剤等を使用することができる。
【００２０】
界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物については２０〜５０％配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。二価金属イオン捕捉剤は０．０１〜５０％、好ましくは５〜４０％配合される。アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０％、好ましくは１〜４０％配合される。
再汚染防止剤は０．００１〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。本発明のアミラーゼ以外にプロテアーゼ、セルラーゼ、プロトペクチナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ等を使用することができる。これらの酵素は０．００１〜５％、好ましくは０．１〜３％配合される。漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するとき漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０％配合することができる。蛍光剤はビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染）等が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２％配合するのが好ましい。
【００２１】
上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。また、この洗浄剤組成物は、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。
【実施例】
【００２２】
酵素活性の測定には次の緩衝液を用い、以下の方法に従って行った。
pH４．５〜６．０       酢酸緩衝液
pH６．０〜８．０       リン酸カリウム緩衝液
pH９．０〜１０．５     グリシン水酸化ナトリウム緩衝液
pH１０．０〜１２．０   炭酸緩衝液
pH４．０〜１２．０     ブリットン−ロビンソン緩衝液
【００２３】
〔アミラーゼ活性測定方法〕
１．試薬の調製法
（１％可溶性澱粉水溶液の調製法）
可溶性澱粉（ポテト由来、シグマ社製）５ｇをイオン交換水４００mLに懸濁した後、沸騰水中で攪拌しながら約１０分間加熱溶解し、イオン交換水にて５００mLに定容する。
（２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）の調製法）
グリシン（和光純薬社製特級）９．３８ｇをイオン交換水約３００mLに溶解した後、pHメーターを用い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを１０に調整する。更にイオン交換水にて５００mLに定容する。
（ＤＮＳ試薬の調製法）
水酸化ナトリウム（和光純薬社製特級）８ｇをイオン交換水３００mLに溶解する。これに３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ、和光純薬社製特級）２．５ｇを徐々に添加しながら溶解する。ＤＮＳを完全に溶解させた後、酒石酸ナトリウムカリウム（和光純薬社製特級）を１５０ｇ加える。完全に溶解させた後、イオン交換水にて５００mLに定容する。
（検量線作成用ブドウ糖溶液の調製法）
ブドウ糖標準液（光電用、和光純薬社製）とイオン交換水を用い、０、１、２、３、４、５（μmol／０．１mL）のブドウ糖溶液を調製する。
２．アミラーゼ活性の測定法
（酵素溶液の希釈）
精製酵素を、δ吸光度〔＝（サンプルの吸光度）−（ブランクの吸光度）〕が０．６以下になるように１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で希釈する。
（サンプルの測定）
試験管に１％可溶性澱粉水溶液０．５mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．２mL、イオン交換水０．２mLを加え（以下、基質溶液と略す）、これを５０℃の水浴中で約５分間予熱する。予熱後、適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加え、５０℃で、１５分間反応させる。反応終了後、ＤＮＳ試薬１．０mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を測定する。
（ブランクの測定）
試験管に基質溶液０．９mLを入れ、これにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に酵素溶液０．１mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を測定する。
（検量線の作成）
試験管に基質溶液０．９mLを入れ、これにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に各濃度の検量線作成用ブドウ糖溶液０．１mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を測定する。横軸にブドウ糖溶液の濃度（μmol／０．１mL）、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法により傾きを求め、換算係数（Ｆ）を次式に従って算出する。
換算係数（Ｆ）＝〔１／傾き〕×〔１／１５〕×〔１０００／０．１〕
尚、検量線は活性測定毎に作成するものとする。
（活性の算出）
酵素の力価は、１分間に１μmolのブドウ糖に相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（Ｕ）とし、次式に従って算出する。
アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ）＝〔δ吸光度〕×〔換算係数（Ｆ）〕×〔酵素希釈倍率〕
【００２４】
〔キレート剤耐性能試験方法〕
（ＥＤＴＡ溶液の調製）
ＥＤＴＡ（シグマ社製）９．３ｇをイオン交換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを用い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調整する。更にイオン交換水にて１００mLに定容することによって２５０mM ＥＤＴＡ溶液を調製する。次にこれをイオン交換水で希釈して１０〜１００mMのＥＤＴＡを調製する。
ＥＧＴＡ（シグマ社製）９．５ｇをイオン交換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを用い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調整する。更にイオン交換水にて１００mLに定容することによって２５０mM ＥＧＴＡ溶液を調製する。次にこれをイオン交換水で希釈して、１０〜１００mMのＥＧＴＡ溶液を調製する。
（キレート剤耐性能の試験法）
１mM ＥＤＴＡ、４０℃、３０分間処理の場合
試験管に１０mM ＥＤＴＡ溶液０．１mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．２mL、イオン交換水０．１mLを加え、４５℃の水浴中で約５分間予熱する。予熱後、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加え、４５℃で、３０分間保温する。３０分後、予め５０℃の水浴中で予熱した基質溶液０．９mLに処理溶液０．１mLを加え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測定する。
【００２５】
〔酸化剤耐性能試験方法〕
試験管に過酸化水素（３０％ 過酸化水素水、和光純薬社製）０．０６７mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．２mL、イオン交換水０．６３３mLを加え、３０℃の水浴中で約５分間予熱する。予熱後、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加え、３０℃で、６０分間保温する。６０分後、予め氷水中に準備したカタラーゼ（牛肝臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）１μＬ添加試験管に処理溶液０．２mLを加え、過酸化水素を失活させ反応を停止する。その後、予め５０℃の水浴中で予熱した基質溶液０．９mLにこの反応停止処理溶液０．１mLを加え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測定する。
〔タンパク質定量法〕
タンパク質は、バイオラッド社製のプロテインアッセイキットII（カタログ番号５００−０００２）を用い、標準アッセイ法に従って、キットに添付されたウシ血清アルブミンを標準タンパク質として定量した。
【００２６】
実施例１  キレート剤耐性能を有するアルカリ液化型アミラーゼのスクリーニング
土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落の周に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。培養後、遠心分離した上清液について、キレート剤（ＥＤＴＡ）耐性能を測定し、更に最適作用pHを測定して、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ生産菌をスクリーニングした。
【００２７】
上述の方法により、バチルス エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３６株及びバチルス エスピー（Bacillus sp.) ＫＳＭ−Ｋ３８株を取得することができた。
【００２８】
培地Ａ    トリプトン        １．５％
ソイトン          ０．５％
塩化ナトリウム    ０．５％
着色澱粉          ０．５％
寒天              １．５％
Ｎａ2ＣＯ3        ０．５％
（pH  １０）
【００２９】
培地Ｂ    トリプトン        １．５％
ソイトン          ０．５％
塩化ナトリウム    ０．５％
可溶性澱粉        １．０％
Ｎａ2ＣＯ3        ０．５％
（ｐＨ  １０）
【００３０】
実施例２ ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養
実施例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３６株あるいはＫＳＭ−Ｋ３８株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（pH８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ１１７７Ｕ及び５５７Ｕの活性を有していた。
【００３１】
実施例３  本発明のアルカリ液化型アミラーゼの精製
実施例２で得られたバチルス エスピー ＫＳＭ−Ｋ３６株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸アンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、２mM ＣａＣｌ2を含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られた透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いてＯ−１Ｍの食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析することによってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。尚、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。
【００３２】
実施例４  本発明アルカリ液化型アミラーゼのキレート剤耐性能
実施例３でＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清液から得た本発明のアルカリ液化型アミラーゼ精製品（以下、それぞれＫ３６及びＫ３８と略す）を用い、各種キレート剤に対する耐性能を測定した。
【００３３】
１）ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ耐性能終濃度０〜１００mMのＥＤＴＡ（シグマ社製）あるいはＥＧＴＡ（シグマ社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素を添加し、所定の温度（３０℃、４０℃及び４５℃）で３０分間処理を行った後、アミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存酵素活性を測定した。尚、対照として、バチルス リケニフォルミス由来のアミラーゼである、ターマミル及びデュラミル（いずれもノボ社製の造粒物より精製したもの）を使用した。
その結果、図１及び２に示したように、Ｋ３６及びＫ３８とも高濃度のＥＤＴＡ及びＥＧＴＡによっても全く影響を受けず、ターマミル及びデュラミルと比べて、高度な耐性能を有することが明らかになった。
【００３４】
２）クエン酸及びゼオライト耐性能
終濃度０〜０．５％のクエン酸三ナトリウム二水和物（和光純薬社製特級）あるいは合成ゼオライトＡ−３（和光純薬社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素を添加し、所定の温度（４０℃及び４５℃）で３０分間処理を行った後、アミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存酵素活性を測定した。
【００３５】
その結果、Ｋ３６及びＫ３８ともクエン酸及びゼオライトにより全く影響を受けないことが示された（図３〜６）。
【００３６】
実施例５  本発明アルカリ液化型アミラーゼの作用pH及び最適作用pH
終濃度５０mMの各種緩衝液〔酢酸緩衝液（pH４．５〜６．０）、リン酸カリウム緩衝液（pH６．０〜８．０）、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１０．５）及び炭酸緩衝液（pH１０．０〜１２．０）〕を用い、アミラーゼ活性測定法に準じてＫ３６及びＫ３８を測定し、それぞれ最大の活性を１００％として、相対活性で示した。
この結果（図７及び８）、いずれも、pH６．０〜１０．０の範囲で作用し、最適作用pHは８．０〜９．０であることが明らかになった。尚、pHは反応液の実測値を測定して示した。
【００３７】
実施例６  本発明アルカリ液化型アミラーゼの酸化剤耐性能及び酵素比活性
終濃度２％（５８０mM）のＨ2Ｏ2を含む５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した酵素（Ｋ３６、Ｋ３８、ターマミル及びデュラミル）を添加し、３０℃で６０分間処理を行い、経時的にアミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存活性を測定した。酸化剤耐性能はそれぞれ、未処理での活性を１００％として、残存活性で示した。
【００３８】
その結果（図９）、Ｋ３６及びＫ３８はいずれも、２％Ｈ2Ｏ2存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後でも７０％以上、特に９４％以上の残存活性を維持しており、充分な酸化剤耐性能を有することが認められた。
また、pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）での酵素活性値と、プロテインアッセイキット（バイオラド社製）により測定したタンパク質量より算出したＫ３６及びＫ３８の酵素比活性は、それぞれ、４３００Ｕ／mg及び３６００Ｕ／mgとなり（表２）、両酵素はいずれも３０００Ｕ／mg以上の比活性を有しており、タンパク工学によって構築された酸化剤耐性酵素（ＬＡＭＹ・Ｍ２０２Ｔ（ＷＯ９８／４４１２６）及びデュラミル）と比較して、極めて高い酵素比活性を有することが明らかになった。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、洗剤への配合量などの面や工業的発酵生産の面に於いて優位である。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
実施例７  本発明アルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３８）のその他の酵素学的性質
両精製酵素の解析を行った結果、以下の特性が明らかになった。
【００４１】
（１）作用
いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただしプルランには作用しない。
（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）
いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。
（３）作用温度範囲及び最適作用温度
いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜６０℃である。
（４）温度安定性
５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中にて温度を変化させ、各温度で３０分間処理することにより失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以上の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示した。
（５）分子量
いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±５，０００である。
（６）等電点
いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は４．２付近である。
（７）界面活性剤の影響
直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及びソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、pH１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活性阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。
（８）金属塩の影響
各種金属塩と共存させて、pH１０、３０℃で３０分間処理してその影響を調べた。Ｋ３６は、１mMのＭｎ2+により阻害され（阻害率約９５％）、１mMのＨｇ2+、Ｂｅ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率３０〜４０％）。Ｋ３８は、１mMのＭｎ2+により阻害され（阻害率約７５％）、１mMのＳｒ2+及びＣｄ2+により若干阻害される（阻害率約３０％）。
（９）Ｎ末端アミノ酸配列
両アミラーゼのＮ末端アミノ酸配列をエンドマン分解法〔Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 283,(1948）〕によりプロテイン−ケンサー（ＡＢＩ社製）４７７Ａを用いて測定した結果、いずれも、Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Thr-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu の配列を有することが判った。
【００４２】
実施例８  本発明アルカリ液化型アミラーゼの自動食器洗浄機用洗剤洗浄力評価
本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３８）の自動食器洗浄機用洗剤での洗浄評価を下記条件で行った。別に対照として本発明酵素を含有しない洗剤を用いた。
１）汚染皿の調製
沸騰水道水で煮沸した後、水道水を加えて溶液状にしたオートミール（クエーカー社製）１mLを磁性皿に塗布し、室温で約３時間乾燥させた後、使用直前まで５℃（半密閉状態）にて保存した。１回の洗浄には３枚供した。
２）洗浄条件
・使用機種；松下電器（株）製全自動食器洗い機ＮＰ−８１０
・洗浄温度；水温から約５５℃まで徐々に昇温する。
・洗浄用水；水道水
・洗浄剤濃度；０．２重量％
・洗浄時間；洗浄約２０分→すすぎ約２０分（標準コース）
・洗浄時の循環水量；３．５Ｌ
３）洗剤組成（％は重量％を示す）
プルロニックＬ−６１ ２．２％、炭酸ナトリウム２４．７％、炭酸水素ナトリウム２４．７％、過炭酸ナトリウム１０．０％、１号珪酸ナトリウム１２．０％及びクエン酸３ナトリウム２０．０％、ポリプロピレングリコール３０００２．２％、シリコーンＫＳＴ−０４（東芝シリコーン社製）０．２％、ソカランＣＰ−４５（ＢＡＳＦ社製）４．０％。
４）添加酵素量
緩衝液としてグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）を用い、上述のアミラーゼ活性測定法により実施例３で得られた精製酵素の活性値を測定し、洗浄当たり１５０Ｕ添加した。
５）洗浄力評価方法
洗浄後の皿にヨウ素溶液を塗布し、ヨウ素−澱粉反応による色を目視で判定した。
【００４３】
その結果、本発明酵素含有洗剤を用いた場合汚れを完全に除去でき、本発明酵素を含有しない場合と比べ極めて優れた洗浄性能を有していた。
【００４４】
実施例９
SaitoとMiuraの方法〔Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1961）〕によって抽出したＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、既知のバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼに於いて保存性が高いMet-Gln-Tyr-Phe-Glu-Trp配列、及びTrp-Phe-Lys-Pro-Leu-Tyr配列を基にしてデザインした２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、常法に従ってＰＣＲを行った結果、いずれの場合も約１．０ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られた。両ＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、次いで、両断片の上流側、下流側のＤＮＡ断片を逆ＰＣＲ法〔T. Trigliaら, Nucleic Acids Res., 16, 81(1988)〕及びＰＣＲインビトロクローニングキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて取得し、その塩基配列の解析を行った。この結果、両株ともに約１．７ｋｂの遺伝子領域中に配列番号１及び２に示した５０１アミノ酸残基をコードする唯一のオープン リーディング フレーム（Open reading frame, ORF)が見出され、アミノ末端領域の配列（アミノ酸番号Asp1〜Leu15)が、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養液から精製されたアミラーゼＫ３６及びＫ３８のアミノ末端配列（１５アミノ酸残基）と完全に一致することが明らかになった。決定されたＫ３６及びＫ３８アミラーゼ遺伝子は、それぞれ、配列番号３及び４に示した塩基配列を有していた。
【００４５】
実施例１０
両株の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ法によって、開始コドンの０．７ｋｂ上流から終始コドンの０．１ｋｂ下流までの１．７ｋｂのＤＮＡ断片を増幅し、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社製）を用いて、枯草菌ＩＳＷ１２１４株に導入した。得られた組換え体枯草菌株は、いずれも液体培養に於いて培養液中にアミラーゼを生産した。実施例３に示した方法によって培養上清からアミラーゼを精製し、その特性を解析したところ、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培養液から精製されたアミラーゼの特性と良く一致し、いずれも作用至適pHはpH８〜９に認められ、pH１０に於いて約４０００Ｕ／mgの比活性を有し、更に、キレート剤及び酸化剤に対して高い耐性を有していることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＤＴＡ処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図２】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＧＴＡ処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図３】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のゼオライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図４】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のクエン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図５】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のゼオライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図６】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のクエン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。
【図７】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６の反応pHと相対活性との関係を示す図面である。
【図８】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８の反応pHと相対活性との関係を示す図面である。
【図９】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＨ2Ｏ2処理時間と残存活性との関係を示す図面である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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