【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年8月12日(2013.8.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００７】
説明されたワクチン開発アプローチの欠点は、動物の免疫化のためのウイルス抗原のどちらかの抗体のモノクローナル性の選択である。ウイルス標的−タンパク質の種々の変種に特異的な中和抗体のパネルが作製されるような場合であっても、各ｍＡｂは、細菌系における組換モノクローンとして作製される。更に原核生物の組換抗体はそれらの抗原に対する親和性が、動物又はヒトの血清中の未変性のＡｂと比べ、少なくとも１０倍低い。動物において誘発されたポリクローナルＨＩＶ−特異的免疫グロブリンは通常、ヒトなどの種々の生物について免疫毒性である。それらを、診断目的に使用することは可能であるが、アナフィラキシー反応の発生機会の多さは、それらの免疫療法適用に関する当然の制約である。ハイブリドーマｍＡｂ作製技術は、免疫グロブリンにおける生物学的種の差異の問題点を解決しない。ヒト化ｍＡｂ又はキメラｍＡｂの作製技術は、非常に面倒であり、かなり時間がかかりかつ費用もかかる。従ってこの技術により、抗−ＨＩＶ免疫療法のための数十又は数百のｍＡｂ異形を作製することは不可能である。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１２】
しかしこれまで組換ＨＩＶペプチドのカクテルも合成１５〜２０個アミノ酸ペプチドのカクテルも、ウイルス感染及び複製からの防御を提供することができなかった。その主な理由は、どのようにこれらのペプチドが得られたかの原理の分析から明らかにすることができる。組換ペプチド配列は、長いＴａｑ−ポリメラーゼＰＣＲ（通常１０００〜３０００ｂｐ）により増幅されたＨＩＶゲノム断片のステージを含む、患者由来のウイルス材料からのＲＴ−ＰＣＲにより得られた試料の、又はＨＩＶ−特異的プライマーＰＣＲ後の患者のリンパ球由来のＤＮＡの配列の自動ＤＮＡ配列決定の技術、その後の形質転換された大腸菌株コロニーの選択により作製される。現在の技術は、高くないとして平均で多様な変種１０5〜１０6から１配列ケースの頻度での、ランダム様式のＨＩＶ遺伝子型のモノクローナル選択を基礎としており、それから平均感染性ウイルス力価は１％であり、そのためこれは感染活性のあるウイルスの１０3〜１０4コピーである。１個体の患者血液の同じ試料からこの技術で作製された二つの配列の完全なＨＩＶゲノムのデータは、劇的に異なることは、ＨＩＶゲノム配列を作製しそれら自身を分析する研究者には周知である。従ってこれらの組換ペプチド又は３〜４種の組換ペプチドのカクテルによる免疫化は、例え真核生物発現系において適切にグリコシル化された（糖鎖付加された(carbohydrated)）としても、現在対処されるべきウイルス変異株の不活化に特異的な免疫応答の形成を提供することはできない。従って、ＨＩＶワクチン開発アプローチは、これらの標準とは無関係であり、組換ペプチド配列の情報は、他の方法で作成されなければならない。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１３】
合成アミノ酸の小型ＨＩＶペプチド[27]は、矛盾したアプローチにより作製され−ペプチド結合形成の各サイクルに関して、公知のＨＩＶ配列における可能性のあるアミノ酸変種の混合物が添加される場合、数百の変種が自動ペプチドシンセサイザーにおいて混合物として作製されている。ｅｎｖタンパク質の可変領域の多くの変種は、ペプチドシンセサイザーを使用し得ることができる。しかしこれらのペプチドのサイズは、１５〜２０、最大３０個のアミノ酸に限定され、より長いペプチド型は、組換系においてのみ作製が可能である。実際に、小型の合成ペプチド及びそれらのカクテルによる免疫化は、ＨＩＶ免疫反応について十分に高いが、それへの特異性が低いか若しくはないように追加免疫する。個々に、動物（アカゲザル(Rhesus macaques))の合成ＨＩＶペプチド免疫化の試みであっても、標準ＥＬＩＳＰＯＴ法により試験されたそれらの血液中にＨＩＶ特異抗体が存在しないという不満足な結果を引き出す。恐らくＨＡＡＲＴと組合せた治療目的の組成物としての、現存するペプチド−ベースのＨＩＶワクチンは、若干見込みがあるであろう。しかしペプチドワクチン組成物はひとつも、現在まで免疫化後のＨＩＶ感染症−予防作用を示していない。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
先に説明されたように、ＤＮＡ−ベースのＨＩＶワクチンの有効性に関する他の主な制限は、ウイルス及び非−ウイルスの遺伝子治療用ベクターのインビボ送達に関する不完全な公知の方法に起因した貧弱な免疫応答である。あらゆる種類の抗−感染症免疫化を提供するＤＮＡ−ベースのワクチン型の見込みが低いことを理解するための科学者の正確な比較は、以下である。任意のタンパク質又は抗原、及び原核生物大腸菌系において作出されたそれらの組換連結されたＩｇＧ軽鎖−重鎖変形に関する仮定のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を想定して欲しい。ここで本発明者らは、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、イムノドットブロット、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡などの、全ての可能な実験室免疫反応アッセイにより、抗原がこれらの２種のｍＡｂ型へ結合するための親和性の比較を行うことを試みる。本発明者らが、これらの型がひとつのアッセイに収められた各状況において認めるものは、以下である−組換ｍＡｂの親和性は、常に天然の動物モノクローナル抗体の親和性よりも少なくとも１０倍低く、更には力価決定時の最小結合活性の差異は、１００〜２００倍に達し得る。ワクチン免疫原性のインビボ評価に関する同じ状況は、研究者が、動物免疫化に使用されるＤＮＡ−ベース組成物及びタンパク質−ベース組成物の活性を分析する場合に、認められる。免疫化された動物の血中の現在の抗原に関するｍＡｂの力価として測定された特異的免疫応答の有効性は、遺伝子ベクターとして送達される抗原の方が、当初のタンパク質−抗原よりも、数倍より低いであろう。ＤＮＡ変種に関する特異的抗原免疫応答の強度は、その「陽性対照」−タンパク質変種よりも常に５〜２０倍より低い。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
未変性のｇｐ１２０ ＨＩＶペプチドは、高い免疫原性を有するが、エピトープ同一性を失っていない組換変種について同レベルを維持するためには、同様のグリコシル化を持つ組換系が必要である。この問題点を解決するためには、細胞培養物、酵母培養物及びリーシュマニア属系を使用することが可能である。真核細胞培養生成は、大腸菌における１０００と比べ平均数１０００万(decades of million)であるような多数の自己細胞タンパク質のために、ごくわずかな量の組換ペプチドをもたらす。酵母培養物は、十分な生産を提供するが、酵母における糖合成(carbohydration)は、先に提唱されたように、真核生物及びＨＩＶと非常に似ている訳ではない。従って本発明者らは、誘導性かつ高い発現で、真核生物に典型的なグリコシル化様式を伴うリーシュマニア属系を選択した。リーシュマニア属において作製されたｇｐ１２０組換変種は、高度かつ１００％のＨＩＶ−特異的免疫応答を提供し、次の段階は、感染症発症の防止のためにこの反応を延長することであった。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
【図１２】図１２：種々の発現系におけるＨＩＶ ｅｎｖペプチド及びそれらの断片の生成： ａ）誘導性発現のｇｐ１２０内部ドメイン、ｇｐ４１エクトドメイン、ＳＤ−ＰＡＧＥ ｂ）永久発現のｇｐ１２０、ｇｐ４１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＥＣＬウェスタンブロット検出
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４２】
【図１３】図１３：他のタンパク質発現系におけるグリコシル化と比較した、リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)細胞（ＬＥＸＳＹ発現システム）におけるタンパク質のＮ−グリコシル化のスキーム。レター(letter)(Jena Bioscience社)において、哺乳類細胞及びリーシュマニア・タレントラエにおいて得られたグリコシル化パターンは、糖鎖末端のＮ−アセチルノイラミン酸の存在のみ異なる；
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５７】
前記組換ポリペプチドは、例えばリーシュマニア誘導型発現系のような真核生物発現系及び真核生物−様グリコシル化を備える酵母などの、任意の好適な発現系において得ることができる。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８３】
２． ＨＩＶ−特異抗体のＳｃＦｖ断片を提示している組換ファージミドライブラリーの濃厚化（バイオパンニング）；
抗体の発現は、抗原に結合することが可能であるポリペプチドを得るのに適した宿主において得ることができ、及びこうして得られたポリペプチドは、異なるドナーから単離された組換ｇｐ１２０−、ｇｐ４１−及び未変性のＨＩＶ−ポリペプチドと共に得られた。これにより、発現されたポリペプチドが宿主の表面上に発現される場合に、これは有利ではあるが、必須ではない。抗体の発現に適した宿主は、ウイルス系、原核細胞及び真核細胞及び／又は細胞培養物を含む。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８４】
好ましい実施態様において、該抗体の断片は、ファージディスプレイライブラリーを作製するバクテリオファージＭ１３において発現され、これはファージディスプレイ技術の使用のために異なるファージにより各々提示される非常に多数の異なる構築体の展示を可能にする。このファージディスプレイアプローチは、免疫グロブリン遺伝子のクローニング並びに機能性抗体の発現及び検出のための強力なツールである。抗体の可変性の重鎖及び軽鎖断片を、モノクローナル抗体選択の段階を伴わずに、ＨＩＶ−特異抗体のプール又はライブラリーとしてファージ表面上に展示された融合タンパク質として、得ることができる。このアプローチは、任意の抗原に対する抗体を迅速に見つけ、かつ必要な場合には、他の発現系におけるグリコシル化を伴う及び／又は伴わずに、それらの可溶型変種を作製することを可能にする。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１７】
７． 主要ＨＩＶ ｅｎｖペプチドのクローニング及びリーシュマニア・タレントラエにおけるワクチン開発のための組換ペプチドの作製；
ＨＩＶ生活環は、ヒト、サル又は齧歯類において生じ、かつそのタンパク質のグリコシル化は、哺乳類代謝に近い。真核生物発現系は、酵母システム、糸状菌を含むが、昆虫、哺乳類及び／又は植物からの細胞培養物も含む。ｇｐ１２０及びｇｐ４１は両方とも、それらの外部ドメインにおいて高度にグリコシル化される。発現された断片又はタンパク質のグリコシル化が望ましい場合、発現は、真核生物系、例えば酵母、哺乳類細胞培養物、リーシュマニア細胞培養物、バキュロウイルス発現培養物において実行されなければならない。ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター細胞）又はＣｏｓ−７（アフリカミドリザル腎上皮細胞）などの哺乳類細胞における発現は可能であるが、哺乳類細胞は細胞代謝における数百万のタンパク質を有するので、その組換物の発現はかなり低く、かつ作製された組換体は、クロマトグラフィーによる単離が難しい。結果的に本発明者らは、リーシュマニア・タレントラエをｅｎｖペプチド産生系として選択した。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２１】
ワクチン開発のための組換タンパク質製造に関する発現系の選択に関して、いくつかの特徴が重要である。それらの発現は：ｉ）誘導性；ii）同様にグリコシル化されるか又は継代される哺乳類翻訳後修飾でなければならない。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２２】
ｉ）誘導性発現は、組換ペプチドの妥当な量及び濃度を達成するために必要である。誘導性系において図１２に示されたように、組換タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡゲル電気泳動の走査により可視化できる（図１２ａ）。細胞が非誘導性発現ベクターによりトランスフェクションされる場合、通常これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいては明白ではないので、これはウェスタンブロットにより検出されなければならない（図１２ｂ）。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１２３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１２３】
ii）ワクチン接種ために作製された組換ペプチドのグリコシル化は、可能な限りウイルス宿主−真核生物リンパ球細胞に関する天然の典型にマッチしなければならない。数百万のそれら自身のタンパク質の中で真核細胞培養物において組換タンパク質の十分な産生を得ることは、困難でありかつ経費がかかる。そのため、酵母株、昆虫細胞又は真核細胞の寄生系において、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（ｇｐ１２０、ｇｐ４１及び全ｇｐ１６０）の生成を試行することが可能である。本発明者らの考えた選択肢は、トリパノソーマ原虫宿主のリーシュマニア・タレントラエであり、これは容易な操作で真核生物タンパク質の発現／フォールディング／修飾型を組合せ、かつ哺乳類に対し病原性でもない。この発現系の主な利点は、標的タンパク質の哺乳類型の翻訳後修飾、例えばグリコシル化、リン酸化又はプレニル化などである（図１３）。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症を予防するＨＩＶ−ワクチンを製造する方法であって、
（ｉ）ＨＩＶ−１特異的ＳｃＦｖ抗体の断片を含むヒト組換ＩｇＧファージミドライブラリーを作製し；
（ii）上記（ｉ）で作製されたファージミドライブラリー中のＨＩＶ−１特異的ＳｃＦｖ抗体断片を、未変性又は組換ＨＩＶ−１ペプチドでのパンニングにより濃縮し；
（iii）ＨＩＶ−１ペプチドを含むＨＩＶ−１材料を増幅し；
（iv）上記（ii）で濃縮されたＨＩＶ−１ファージミドライブラリーを支持体に結合させて用い、上記（iii）で増幅されたＨＩＶ−１材料からリバースパンニングによりＨＩＶ−１ペプチドを収集し；
（ｖ）上記（iv）で収集されたＨＩＶ−１ペプチドを、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）法により同定及び特徴決定し；
（vi）上記（ｖ）の同定及び特徴決定の結果に基づき、真核生物のグリコシル化に適した宿主からなる発現系で、グリコシル化組換ＨＩＶ−１ ｅｎｖペプチドを発現させ；
（vii）上記（vi）で得られたグリコシル化組換ＨＩＶ−１ ｅｎｖペプチドを精製し；
（viii）上記（vii）で得られたグリコシル化組換ＨＩＶ−１ ｅｎｖペプチドを用いてＨＩＶワクチン組成物を調製することを含んでなる方法。
【請求項２】
前記発現系が、リーシュマニア・タレントラエ（Leishmania tarentolae）細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＨＩＶ−１材料が得られる個体が、同一又は異なるＨＩＶ亜型に感染されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＨＩＶ−１材料が得られる個体が、抗レトロウイルス療法ナイーブ患者又は抗レトロウイルス療法が施された患者である、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ファージミドライブラリーが：
ａ）ＨＩＶに感染した多数の個体から得られたＢ−リンパ球において発現された免疫グロブリンの、各々、軽鎖及び重鎖の可変領域をコードする核酸由来のＤＮＡ−断片を調製する工程；
ｂ）免疫グロブリン軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ−断片を連結し、免疫グロブリンの、各々、軽鎖及び重鎖の可変領域を含むポリペプチドの発現を可能にし、多数の異なる特異性を作製する工程；
ｃ）ファージミドベクター内の連結された断片をクローニングし、かつバクテリオファージの表面上での発現のために細菌株を形質転換する工程
により調製される、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）におけるＤＮＡ断片の調製が、抗レトロウイルス療法により治療された及び／又はされないＨＩＶ−１亜型Ａ及びＢ感染患者のＢ−リンパ球から得られたＲＮＡ−プールからのｃＤＮＡの調製、並びに軽鎖及び重鎖の可変領域の増幅を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅が、下記の配列を有するプライマーのうち何れか２種以上の組み合わせにより実行される、請求項６に記載の方法。
【表１】
2010540674.tif 000001
【表２】
2010540674.tif 000002
【表３】
2010540674.tif 000003
【表４】
2010540674.tif 000004
【表５】
2010540674.tif 000005
【表６】
2010540674.tif 000006
【表７】
2010540674.tif 000007
【請求項８】
工程（ii）で濃縮されるＨＩＶ−１特異的ＳｃＦｖ抗体断片が、ＨＡＡＲＴ−又は任意の他の抗レトロウイルス療法を経験した患者において実行された抵抗性ＨＩＶ変異株に対し特異性がある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ii）が、異なるドナーから単離された組換ｇｐ１２０−、ｇｐ４１−及び未変性のＨＩＶ−ポリペプチドに対してＨＩＶ−特異抗体を結合するパンニング手法により、ＨＩＶ−１特異的ＳｃＦｖ抗体断片を含む組換ＩｇＧファージミドライブラリーを濃縮することを更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（viii）が、任意の免疫原性刺激因子、アジュバント又は担体の添加又は複合により、ＨＩＶワクチン組成物を調製することを含む、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）を、アジュバント又は担体として使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により取得し得るＨＩＶワクチン。
【請求項１３】
ＨＩＶ感染症及びＡＩＤＳ疾患の罹患及び発症に対し、未感染の個体を免疫化するための、請求項１２に記載のＨＩＶワクチン。