【手続補正書】
【提出日】平成25年6月18日(2013.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）核酸-陰イオン交換複合体を供給する工程；および
（b）陰イオン性化合物を含む溶液を、該核酸-陰イオン交換複合体に添加する工程であって、該陰イオン性化合物が少なくとも2個の陰イオン性基を含む、工程
を含む、陰イオン交換材料から核酸を溶出させる方法であって、
該陰イオン性化合物が該核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させる、方法。
【請求項２】
（a）核酸を含む試料を供給する工程；ならびに
（b）陰イオン交換材料が該核酸と可逆的に複合体化するpH条件および塩条件の下で、該試料を該陰イオン交換材料に添加する工程
を含む方法により、前記核酸-陰イオン交換複合体を供給する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記陰イオン交換材料が、
（a）式R3Nのアミン；
（b）式R2NHのアミン；
（c）式RNH2のアミン；および
（d）式X-(CH2)n-Yのアミン
からなる群より選択される正にイオン化可能な捕獲成分を含み、
式中、
Xが、R2N、RNH、またはNH2であり、
Yが、R2N、RNH、またはNH2であり、
Rが互いに独立して、好ましくはO、N、S、およびPより選択される1個または複数個のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖型、分岐型または環式のアルキル置換基、アルケニル置換基、アルキニル置換基またはアリール置換基であり、かつ
nが、0〜20の範囲の整数である、
請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記陰イオン交換材料が、ポリエチレンイミン（PEI）で修飾された磁性シリカビーズを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの前記陰イオン性化合物が、
（a）カルボン酸、重合可能または縮合可能な酸性モノマーのオリゴマー、有機スルホン酸、有機ホスホン酸、オルガノホスフェート、カーボネート、およびジアセチルアセトンからなる群より選択される、非ポリマー性化合物、ならびに
（b）重合した不飽和カルボン酸；不飽和カルボン酸と少なくとも一つの他のモノマーとのコポリマー；酸性アミノ酸のポリペプチド；酸性アミノ酸と少なくとも一つの他のアミノ酸とのコポリマー；カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフェート、およびカーボネートからなる群より選択される、共有結合したイオン化可能な基を保持しているポリカーボハイドレート；カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフェート、およびカーボネートからなる群より選択される、共有結合したイオン化可能な基を保持しているポリスチレン；第二の核酸；ならびに核酸類似体からなる群より選択される、多価陰イオン性化合物
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記陰イオン性化合物が、少なくとも3個の陰イオン性基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記陰イオン性化合物が、2〜20個の炭素原子を含む非ポリマー性化合物である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン性化合物が、シュウ酸、メリト酸、ピロメリト酸、クエン酸、ポリアクリル酸（PAA）、ポリメタクリル酸（PMA）、ポリグルタミン酸（PGA）、およびデキストラン硫酸（DS）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記溶液が、前記陰イオン性化合物の非存在下では前記核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させないようなpHを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が、前記捕獲成分の正にイオン化可能な基のpKaを超えないpHを有する、請求項3記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液がpH 5〜13の範囲のpHを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液がpH 5〜8.5の範囲のpHを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液がおよそ1Mまたはそれ未満の全塩濃度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液がおよそ0.5Mまたはそれ未満の全塩濃度を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記溶液がpHを有する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記溶液が、ポリメラーゼ活性を有する酵素、および任意でMg2+の供給源をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記溶液が、前記核酸-陰イオン交換複合体が形成されるpH条件および塩条件を超えないpHおよび塩濃度を有する、請求項2記載の方法。
【請求項１８】
（a）核酸-陰イオン交換複合体を供給する工程；
（b）陰イオン性化合物を含む溶液を、該核酸-陰イオン交換複合体に添加する工程であって、該陰イオン性化合物が少なくとも2個の陰イオン性基を含む、工程；ならびに
（c）該陰イオン性化合物および陰イオン交換材料の存在下で核酸を分析する工程
を含む、該陰イオン交換材料の存在下で該核酸を分析する方法。
【請求項１９】
前記核酸を分析する工程が該核酸を増幅することを含む、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸を増幅することが、PCR、逆転写酵素（「RT」）反応、RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、定量的リアルタイムRT-PCR、多重分析、融解曲線分析、高分解能融解曲線分析、tHDA、RT-tHDA、定量的リアルタイムtHDA、および定量的リアルタイムRT-tHDAからなる群より選択される手法を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
（a）少なくとも2個の陰イオン性基を含み；かつ
（b）核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させるのに十分な濃度で存在する
陰イオン性化合物を含み、かつ
該陰イオン性化合物の非存在下では該核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させないようなpHを有する、
溶出組成物。
【請求項２２】
溶出緩衝液が、核酸増幅反応を実施するのに適しているpHおよび塩濃度を有する、請求項21記載の溶出組成物。
【請求項２３】
ポリメラーゼ活性を有する酵素をさらに含み、かつ任意でMg2+またはその供給源を含む、請求項21記載の溶出組成物。
【請求項２４】
（a）核酸；
（b）陰イオン交換材料；
（c）ポリメラーゼ活性を有する酵素；
（d）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含み、かつ
（e）任意でMg2+またはその供給源を含む、
増幅組成物。
【請求項２５】
前記核酸のさらなる精製の必要なしに酵素反応において直接使用可能である、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法に従って生成された溶出液。
【請求項２６】
前記酵素反応が、PCR、逆転写酵素（「RT」）反応、RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、定量的リアルタイムRT-PCR、多重分析、融解曲線分析、高分解能融解曲線分析、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（「tHDA」）、RT-tHDA、定量的リアルタイムtHDA、および定量的リアルタイムRT-tHDAからなる群より選択される核酸増幅である、請求項25記載の溶出液。
【請求項２７】
前記核酸がRNAである、請求項25記載の溶出液。
【請求項２８】
（a）陰イオン交換材料；および
（b）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含む、生物学的試料から核酸を単離するためのキット。
【請求項２９】
前記陰イオン性化合物が溶出組成物中に含まれる、請求項28記載のキット。
【請求項３０】
（a）陰イオン交換材料；
（b）ポリメラーゼ活性を有する酵素；
（c）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含み、かつ
（d）任意でMg2+またはその供給源をさらに含む、
核酸を分析するためのキット。
【請求項３１】
陰イオン性基を少なくとも2個含む陰イオン性化合物により引き起こされるPCR阻害を逆転させるためのMg2+の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
さらなる局面において、陰イオン交換材料に可逆的に結合した核酸を、該陰イオン交換材料から置換するための、少なくとも2個の陰イオン性基を含む陰イオン性化合物の使用が提供される。一つの態様において、少なくとも2個の陰イオン性基を含む、化合物は、多価陰イオン性化合物である。別の態様において、少なくとも2個の陰イオン性基を含む、化合物は、非ポリマー性化合物である。
[本発明1001]
（a）核酸-陰イオン交換複合体を供給する工程；および
（b）陰イオン性化合物を含む溶液を、該核酸-陰イオン交換複合体に添加する工程であって、該陰イオン性化合物が少なくとも2個の陰イオン性基を含む工程
を含む、陰イオン交換材料から核酸を溶出させる方法であって、
該陰イオン性化合物が該核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させる、方法。
[本発明1002]
（a）核酸を含む試料を供給する工程；ならびに
（b）陰イオン交換材料が該核酸と可逆的に複合体化するpH条件および塩条件の下で、該試料を該陰イオン交換材料に添加する工程
を含む方法により、前記核酸-陰イオン交換複合体を供給する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記陰イオン交換材料が、
（a）式R3Nのアミン；
（b）式R2NHのアミン；
（c）式RNH2のアミン；および
（d）式X-(CH2)n-Yのアミン
からなる群より選択される正にイオン化可能な捕獲成分を含み、
式中、
Xが、R2N、RNH、またはNH2であり、
Yが、R2N、RNH、またはNH2であり、
Rが互いに独立して、好ましくはO、N、S、およびPより選択される1個または複数個のヘテロ原子を含んでもよい、直鎖型、分岐型または環式のアルキル置換基、アルケニル置換基、アルキニル置換基またはアリール置換基であり、かつ
nが、0〜20の範囲の整数である、
本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記陰イオン交換材料が、ポリエチレンイミン（PEI）で修飾された磁性シリカビーズを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
少なくとも一つの前記陰イオン性化合物が、
（a）カルボン酸、重合可能または縮合可能な酸性モノマーのオリゴマー、有機スルホン酸、有機ホスホン酸、オルガノホスフェート、カーボネート、およびジアセチルアセトンからなる群より選択される、非ポリマー性化合物、ならびに
（b）重合した不飽和カルボン酸；不飽和カルボン酸と少なくとも一つの他のモノマーとのコポリマー；酸性アミノ酸のポリペプチド；酸性アミノ酸と少なくとも一つの他のアミノ酸とのコポリマー；カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフェート、およびカーボネートからなる群より選択される、共有結合したイオン化可能な基を保持しているポリカーボハイドレート；カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、ホスフェート、およびカーボネートからなる群より選択される、共有結合したイオン化可能な基を保持しているポリスチレン；第二の核酸；ならびに核酸類似体からなる群より選択される、多価陰イオン性化合物
からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記陰イオン性化合物が、少なくとも3個の陰イオン性基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記陰イオン性化合物が、2〜20個の炭素原子を含む非ポリマー性化合物である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記陰イオン性化合物が、シュウ酸、メリト酸、ピロメリト酸、クエン酸、ポリアクリル酸（PAA）、ポリメタクリル酸（PMA）、ポリグルタミン酸（PGA）、およびデキストラン硫酸（DS）からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記溶液が、前記陰イオン性化合物の非存在下では前記核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させないようなpHを有する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記溶液が、前記捕獲成分の正にイオン化可能な基のpKaを超えないpHを有する、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記溶液がpH 5〜13の範囲のpHを有する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記溶液がpH 5〜8.5の範囲のpHを有する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記溶液がおよそ1Mまたはそれ未満の全塩濃度を有する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記溶液がおよそ0.5Mまたはそれ未満の全塩濃度を有する、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記溶液がpHを有する、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記溶液が、ポリメラーゼ活性を有する酵素、および任意でMg2+の供給源をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記溶液が、前記核酸-陰イオン交換複合体が形成されるpH条件および塩条件を超えないpHおよび塩濃度を有する、本発明1002の方法。
[本発明1018]
（a）核酸-陰イオン交換複合体を供給する工程；
（b）陰イオン性化合物を含む溶液を、該核酸-陰イオン交換複合体に添加する工程であって、該陰イオン性化合物が少なくとも2個の陰イオン性基を含む工程；ならびに
（c）該陰イオン性化合物および陰イオン交換材料の存在下で核酸を分析する工程
を含む、該陰イオン交換材料の存在下で該核酸を分析する方法。
[本発明1019]
前記核酸を分析する工程が該核酸を増幅することを含む、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記核酸を増幅することが、PCR、逆転写酵素（「RT」）反応、RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、定量的リアルタイムRT-PCR、多重分析、融解曲線分析、高分解能融解曲線分析、tHDA、RT-tHDA、定量的リアルタイムtHDA、および定量的リアルタイムRT-tHDAからなる群より選択される手法を含む、本発明1018の方法。
[本発明1021]
（a）少なくとも2個の陰イオン性基を含み；かつ
（b）核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させるのに十分な濃度で存在する
陰イオン性化合物を含み、かつ
該陰イオン性化合物の非存在下では該核酸-陰イオン交換複合体を崩壊させないようなpHを有する、
溶出組成物。
[本発明1022]
溶出緩衝液が、核酸増幅反応を実施するのに適しているpHおよび塩濃度を有する、本発明1021の溶出組成物。
[本発明1023]
ポリメラーゼ活性を有する酵素をさらに含み、かつ任意でMg2+またはその供給源を含む、本発明1021の溶出組成物。
[本発明1024]
（a）核酸；
（b）陰イオン交換材料；
（c）ポリメラーゼ活性を有する酵素；
（d）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含み、かつ
（e）任意でMg2+またはその供給源を含む、
増幅組成物。
[本発明1025]
前記核酸のさらなる精製の必要なしに酵素反応において直接使用可能である、本発明1001〜1017のいずれかの方法に従って生成された溶出液。
[本発明1026]
前記酵素反応が、PCR、逆転写酵素（「RT」）反応、RT-PCR、定量的リアルタイムPCR、定量的リアルタイムRT-PCR、多重分析、融解曲線分析、高分解能融解曲線分析、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅（「tHDA」）、RT-tHDA、定量的リアルタイムtHDA、および定量的リアルタイムRT-tHDAからなる群より選択される核酸増幅である、本発明1025の溶出液。
[本発明1027]
前記核酸がRNAである、本発明1025の溶出液。
[本発明1028]
（a）陰イオン交換材料；および
（b）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含む、生物学的試料から核酸を単離するためのキット。
[本発明1029]
前記陰イオン性化合物が溶出組成物中に含まれる、本発明1028のキット。
[本発明1030]
（a）陰イオン交換材料；
（b）ポリメラーゼ活性を有する酵素；
（c）少なくとも2個の陰イオン性基を含む、陰イオン性化合物
を含み、かつ
（d）任意でMg2+またはその供給源をさらに含む、
核酸を分析するためのキット。
[本発明1031]
陰イオン性基を少なくとも2個含む陰イオン性化合物により引き起こされるPCR阻害を逆転させるためのMg2+の使用。