【手続補正書】
【提出日】平成25年11月5日(2013.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1以上の試料中のHPVを塩基配列決定、検出または分類する方法であって、以下のステップ：
１）各試料について、1つのインデックスプライマー群により試料中のDNAを増幅するステップ
［ここで、
前記インデックスプライマー群は11のインデックスプライマーを含み、前記インデックスプライマーの配列は、インデックス配列およびPCRプライマー配列を含み、インデックス配列はPCRプライマー配列の5'末端に、任意にリンカー配列を介して連結しており、
ここで、
i）前記インデックス配列は、配列番号：1〜95からなる群より選択され、前記の11の各インデックスプラマーは、同一のインデックス配列を有し、および
ii）前記の11のインデックスプライマーのPCRプライマー配列は、それぞれ配列番号：96〜106に記載され、
ここで、異なる試料に使用されるインデックスプライマー群は、同一であっても異なっていてもよく、異なるインデックスプライマー群は異なるインデックス配列を使用する］と；
２）ステップ１）で異なるインデックスプライマー群により増幅を行って得られた増幅産物を混合することにより、1以上のPCR産物ライブラリを得るステップと；
３）ステップ２）で得られた1以上のPCR産物ライブラリに、DNAリガーゼアッセイなどの非PCR法によってアダプターを付加することにより、1以上の塩基配列決定ライブラリを構築するステップ［ここで、異なる塩基配列決定ライブラリで使用されるアダプターは、同一であっても異なっていてもよく、異なるアダプターは同一の塩基配列決定配列を共有するが、しかし異なる特徴的配列を有する］と；
４）任意に、ステップ３）で得られた異なるアダプターを有する塩基配列決定ライブラリを混合することにより、1以上のライブラリ混合物を得るステップと；
５）第二世代塩基配列決定法、好ましくはペアエンド法（Solexa、Illumina Hiseq 2000など）を用いて、ステップ３）で得られた1以上の塩基配列決定ライブラリまたはステップ４）で得られた1以上のライブラリ混合物に対して、塩基配列決定を実施するステップと；
６）インデックスプライマー群のインデックスプライマー配列に基づいて、またはインデックスプライマー群のインデックスプライマー配列およびアダプターの特徴的配列に基づいて、塩基配列決定結果を１つずつ試料と対応させるステップ
［ここで前記試料は、好ましくは剥離細胞であり、好ましくはヒトなどの動物由来である］
とを含む方法。
【請求項２】
少なくとも10、好ましくは少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または95のインデックスプライマー群をステップ１）で使用し、好ましくは、使用されるインデックス配列は、少なくとも配列番号：1〜10、もしくは配列番号：11〜20、もしくは配列番号：21〜30、もしくは配列番号：31〜40、もしくは配列番号：41〜50、もしくは配列番号：51〜60、もしくは配列番号：61〜70、もしくは配列番号：71〜80、もしくは配列番号：81〜90、もしくは配列番号：91〜95に記載のインデックス配列またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1、好ましくは少なくとも2、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、または少なくとも200のアダプターをステップ３）で使用し、例えば、前記アダプターが配列番号121〜132からなる群より選択される配列を有し得る、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料の塩基配列決定結果をHPVデータベース内の配列と並べることにより、試料中のHPVを正確に分類するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の試料中の高処理能なHPVの塩基配列決定、検出または分類をするための方法であって、以下のステップ：
１）分析する試料をm個の群に分割するステップ［ここでmは1以上の整数である］と；
２）各群の試料に以下のステップ：
２a）分析する試料からDNAを抽出するステップ；
２b）HPV DNAを増幅するためのプライマー群内のすべてのプライマー配列に基づいて、インデックスのセットを設計するステップ［ここで、インデックスの数、つまりnは群内の試料の数と等しい］；
２c）ステップ２b）で設計された各インデックスを、すべての順方向プライマーもしくは逆方向プライマーまたはすべてのプライマー配列の5'末端にそれぞれ付加することにより、n個のインデックスプライマー群を用意するステップ；
２d）ステップ２a）で得られたDNA試料に対して、ステップ２c）で用意したインデックスプライマー群を用いてPCR増幅を実施することにより、PCR産物を用意するステップ［ここで、異なるインデックスプライマー群が各DNA試料に対して使用される］；および
２e）ステップ２d）のすべてのPCR産物を混合することにより、PCR産物ライブラリを得るステップ；
を実施するステップと；
３）ステップ２）で得られたPCR産物ライブラリにアダプターを付加するステップ［ここで、各PCR産物ライブラリは異なるアダプターを使用してm個の塩基配列決定ライブラリを構築し、ここで、各アダプターは同じ塩基配列決定配列を共有し、異なる特徴的配列を有する］と；
４）m個の塩基配列決定ライブラリを混合し、SolexaまたはIllumina Hiseq 2000塩基配列決定法を用いて塩基配列決定を実施することにより、すべての試料の塩基配列決定結果を得るステップと；
５）塩基配列決定結果中のアダプターの特徴的配列、インデックス配列、およびプライマー配列に基づいて、配列結果を１つずつ試料と対応させ、任意に、各試料の塩基配列決定結果をHPVデータベースと並べることにより、HPVの塩基配列決定、検出または分類をするステップ
［ここで前記試料は、好ましくは剥離細胞であり、および好ましくはヒトなどの動物由来である］
とを含む方法。
【請求項６】
ステップ２b）のプライマー群が11のプライマーを含み、その配列は配列番号：96〜106にそれぞれ記載される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ２b）で設計されたインデックスは、配列番号1〜95からなる群より選択される配列を有してもよく、および好ましくは少なくとも配列番号：1〜10、もしくは配列番号：11〜20、もしくは配列番号：21〜30、もしくは配列番号：31〜40、もしくは配列番号：41〜50、もしくは配列番号：51〜60、もしくは配列番号：61〜70、もしくは配列番号：71〜80、もしくは配列番号：81〜90、もしくは配列番号：91〜95に記載のインデックスまたはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも2、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100または少なくとも200のアダプターをステップ３）で使用し、および例えば、前記アダプターが配列番号：121〜132からなる群より選択される配列を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも10、好ましくは少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または95のインデックスを含むインデックス群であって、前記インデックスは、配列番号：1〜95からなる群より選択される配列を有し、
好ましくは、前記インデックス群は、少なくとも配列番号：1〜10、もしくは配列番号：11〜20、もしくは配列番号：21〜30、もしくは配列番号：31〜40、もしくは配列番号：41〜50、もしくは配列番号：51〜60、もしくは配列番号：61〜70、もしくは配列番号：71〜80、もしくは配列番号：81〜90、もしくは配列番号：91〜95に記載のインデックス、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば配列番号1〜95のインデックスを含む、
インデックス群。
【請求項１０】
11のインデックスプライマーを含むインデックスプライマー群であって、前記インデックスプライマーの配列はインデックス配列およびPCRプライマー配列を含み、インデックス配列はPCRプライマー配列の5'末端に、任意にリンカー配列を介して連結しており、
ここで、
i）前記インデックス配列は、配列番号：1〜95からなる群より選択され、インデックスプライマー群のうちの前記の11の各インデックスプラマーは、同一のインデックス配列を有し、および
ii）前記の11のインデックスプライマーのPCRプライマー配列は、それぞれ配列番号：96〜106に記載される配列である、
インデックスプライマー群。
【請求項１１】
請求項１０に記載の、少なくとも10、好ましくは少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90または95のインデックスプライマー群を含むインデックスプライマーセットであって、異なるインデックスプライマー群で使用されるインデックス配列は異なっており、
好ましくは、前記インデックスプライマーセットで使用されるインデックス配列は、少なくとも配列番号：1〜10、もしくは配列番号：11〜20、もしくは配列番号：21〜30、もしくは配列番号：31〜40、もしくは配列番号：41〜50、もしくは配列番号：51〜60、もしくは配列番号：61〜70、もしくは配列番号：71〜80、もしくは配列番号：81〜90、もしくは配列番号：91〜95に記載のインデックス配列、またはこれらの任意の組み合わせ、例えば配列番号1〜95のインデックス配列を含む、
インデックスプライマーセット。
【請求項１２】
請求項１０に記載のインデックスプライマー群または請求項１１に記載のインデックスプライマーセットを含むキットであって、
キットは、少なくとも1、好ましくは少なくとも2、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも100、または少なくとも200のアダプター、例えば配列番号121〜132に記載されたアダプターをさらに含む、
キット。