【手続補正書】
【提出日】平成25年5月7日(2013.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵段階を使用して製造される２−ケトカルボン酸またはその塩であって、該２−ケトカルボン酸が、２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸、２−ケト−３−メチルペンタン酸の群から選択され、且つ、２−ケトカルボン酸またはその塩の純度が、６０質量％またはそれより高い、２−ケトカルボン酸またはその塩。
【請求項２】
２−ケトカルボン酸またはその塩の純度が、８０質量％またはそれより高い、請求項１に記載の２−ケトカルボン酸またはその塩。
【請求項３】
２−ケトカルボン酸またはその塩の純度が、９０質量％またはそれより高い、請求項１に記載の２−ケトカルボン酸またはその塩。
【請求項４】
一般式（Ｉ）  Ｒ1−ＣＯ−ＣＯＯＨ  ［式中、Ｒ1は３〜７つの炭素原子を有する分枝アルキル基である］を有する２−ケトカルボン酸またはそれらの塩の製造方法であって、以下の段階
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換、抽出工程、蒸留工程からなる群から選択される１つまたはそれより多くの段階に供する段階、
ｃ）  段階ｂ）において得られた生成物を、さらなる濃縮、沈殿または結晶化、またはそれらの組み合わせに供し、且つ、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を得る段階
を含み、且つ、２−ケトカルボン酸またはその塩の純度が、６０質量％またはそれより高い、前記製造方法。
【請求項５】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、該発酵ブロスのｐＨシフトを伴う蒸留工程に供する段階
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換に供する段階
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
段階ｂ）において得られた溶出液を、イオン交換、抽出または蒸留の群から選択される１つまたはそれより多くのさらなる精製段階に供する、請求項４または６に記載の方法。
【請求項８】
以下の段階：
ａ）  微生物を培地中で成長させて、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する培養ブロスを準備する、発酵段階、
ｂ）  段階ａ）において得られた発酵ブロスを、イオン交換に供する段階、および
ｃ）  段階ｂ）において得られた溶出液を、イオン交換、抽出または蒸留の群から選択される１つまたはそれより多くのさらなる精製段階に供する段階、および
ｄ）  段階ｃ）において得られた生成物を、さらなる濃縮、沈殿または結晶化段階またはそれらの組み合わせに供して、且つ２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を得る段階
を含む、請求項４、６または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ1が３、４または５つの炭素原子を有する分枝アルキル基である、請求項４から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
２−ケトカルボン酸が、２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸、２−ケト−３−メチルペンタン酸、またはそれらの塩である、請求項４から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
段階ａ）において得られた培養ブロスが、少なくとも１０ｇ／ｌの２−ケトカルボン酸またはそれらの塩を含有する、請求項４から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
発酵段階のために使用される微生物が、式（Ｉ）の化合物を生成するための改善された能力を有している、請求項４から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
発酵段階のために使用される微生物が、コリネバクテリウムである、請求項４から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
コリネバクテリウム菌株が、以下：
トランスアミナーゼＢ  （Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２、ｉｌｖＥ−遺伝子により符号化）、バリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ  ＡｖｔＡ  （Ｅ．Ｃ．２．６．１．６６、ａｖｔＡ−遺伝子により符号化）、アラニントランスアミナーゼ  ＡｌａＴ  （Ｅ．Ｃ．２．６．１．２、ａｌａＴ−遺伝子により符号化）、
ピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（Ｅ．Ｃ．１．２．４．１、ａｃｅＥ遺伝子により符号化）、ピルビン酸キノンオキシドレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．２．２、ｐｑｏ遺伝子により符号化）およびホスホグルコイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．１．９、ｐｇｉ遺伝子により符号化）
を含む群から選択される任意の１つまたはそれより多く、または全てのタンパク質において、欠失または減少されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
コリネバクテリウム菌株において、以下：
ｉｌｖＢＮ（アセトヒドロキシ酸シンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．１．３．１８）、ｉｌｖＣ（アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．１．１．１．８６）およびｉｌｖＤ（ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．１．９）
の群から選択される１つまたはそれより多くの遺伝子が過剰発現し、且つ、２−ケトイソ吉草酸が生成される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
コリネバクテリウム菌株において、以下：
ｉｌｖＡ（トレオニンデヒドラターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．１．１６）、ｈｏｍ（ホモセリンデヒドロゲナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．１．１．１．３）、ｔｈｒＢ（ホモセリンキナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．２．７．１．３９）、ｔｈｒＣ（スレオニンシンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．４．２．３．１）、ｌｙｓＣ（アスパルトキナーゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．２．７．２．４）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ａａｔ、Ｅ．Ｃ．２．６．１．１）、アスパルテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１１）、およびピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ、Ｅ．Ｃ．６．４．１．１）
の群から選択される１つまたはそれより多くの遺伝子が過剰発現し、且つ、ケトメチルバレレートが生成される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
コリネバクテリウム菌株において、以下：
ｌｅｕＡ（２−イソプロピルマレートシンターゼを符号化している遺伝子、Ｅ．Ｃ．２．３．３．１３）、ｌｅｕＢ（３−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ、Ｅ．Ｃ．１．１．１．８５）、およびｌｅｕＣＤ（３−イソプロピルマレートデヒドラターゼ、Ｅ．Ｃ．４．２．１．３３）
を含む群から選択される１つまたはそれより多くの遺伝子が過剰発現し、且つ、ケトイソカプロレートが生成される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１８】
培養ブロスをイオン交換段階（ｂ）に適用する前に、細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去する追加的な段階を行う、請求項４、または６から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞および／または細胞破片を培養ブロスから除去した後、且つ、段階ｂ）の前に、イオン交換樹脂または炭を使用することによって予備精製を行う、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階ｂ）において、カチオン樹脂を使用することによってイオン交換を行う、請求項４または６から１９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
段階ｃ）において、イオン交換のためにアニオン樹脂を使用する、請求項４または６から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｃ）の蒸留が、蒸気蒸留である、請求項４または６から２０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
蒸留を、１０〜１００℃の温度で行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
蒸留を、１０〜１００ｍｂａｒの圧力で行う、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
沈殿および結晶化段階である段階ｄ）において、２−ケトカルボン酸が、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｎａ+、Ｋ+からなる群から選択されるものとの塩として、またはアミノ酸を伴う塩として得られる、請求項４または８から２３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項４から２５までのいずれか１項に記載の方法によって得られる、２−ケトカルボン酸またはそれらの塩。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
好ましくは、発酵段階のために使用される微生物は、２−ケトイソ吉草酸、２−ケト−４−メチルペンタン酸および／または２−ケト−３−メチルペンタン酸を生成する能力が向上したコリネバクテリウム、特に好ましくはコリネバクテリウムグルタミクムである。１つまたはそれより多くのタンパク質、例えばトランスアミナーゼＢ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．４２、ｉｌｖＥ−遺伝子により符号化）、バリン−ピルビン酸トランスアミナーゼＡｖｔＡ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．６６、ａｖｔＡ−遺伝子により符号化）、またはアラニントランスアミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．２、ａｌａＴ−遺伝子により符号化）において減少または欠失しているコリネバクテリウム菌株を使用することが特に有用である。さらに、１つまたはそれより多くのタンパク質、例えばピルビン酸デヒドロゲナーゼのＥ１サブユニット（Ｅ．Ｃ．１．２．４．１、ａｃｅＥ遺伝子により符号化）、ピルビン酸キノンオキシドレダクターゼ（Ｅ．Ｃ．１．２．２．２、ｐｑｏ遺伝子により符号化）、ホスホグルコイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．３．１．９、ｐｇｉ遺伝子により符号化）において減少または欠失しているコリネバクテリウム菌株の使用が有用である。良好な収率を達成するために、コリネバクテリウム菌株は、上述の遺伝子産物のいくつか、全て、または組み合わせにおいて、減少または欠失している。ａｃｅＥの遺伝子産物は、ピルベートのアセチルＣｏＡへの反応を触媒する。ｉｌｖＥの遺伝子産物は、２−ケトイソ吉草酸のアミノ酸バリンへのアミノ交換を触媒する（それは１モルのグルタメートを、アミノ交換反応によってアルファ−ケトグルタラートに変換する）。ａｖｔＡの遺伝子産物は、２−ケトイソ吉草酸のアミノ酸バリンへのアミノ交換を触媒する（それは１モルのアラニンを、アミノ交換反応によってピルベートに変換する）。ａｌａＴ遺伝子の遺伝子産物は、ピルベートのアラニンへの反応を触媒する。ｐｑｏの遺伝子産物は、ピルベートのアセテートへの反応を触媒する。ｐｇｉの遺伝子産物は、グルコース−６−ホスフェートからフルクトース−６−ホスフェートへの反応を触媒する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
表１：  実施例１によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表２】
2012528577.tif 000001
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
湿ったケークを真空下、４０〜４５℃の温度で、一定の質量に到達するまで乾燥させ、引き続き、２−ケトイソバレレートのＣａ2+塩として分析した。ＨＰＬＣによる分析は、前記２−ケトイソバレレート塩の純度が８５質量％より高いことを示した（表２参照）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
表２：  実施例２によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表３】
2012528577.tif 000002
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
湿ったケークを真空下、４０〜４５℃の温度で、一定の質量（５．１ｋｇ）に到達するまで乾燥し、引き続き、２−ケトイソバレレートのＣａ2+塩として分析した。ＨＰＬＣによる分析は、前記２−ケトイソバレレート塩の純度が９９質量％より高いことを示した（表３参照）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
表３：  この実施例によって得られた２−ケトイソバレレートの純度
【表４】
2012528577.tif 000003