(57)【要約】【課題】装置の簡素化及び処理速度の高速化を図ることができる細胞処理装置を提供する。【解決手段】ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置。前記ろ過膜を有するホルダを配置する配置部と、前記配置部に配置された前記ホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、前記配置部に配置された前記ホルダに試薬を分注する第２分注部と、ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備えている。前記第１分注部によって前記ホルダのろ過膜上に細胞懸濁液を分注し、前記第２分注部によって前記ろ過膜上の細胞に試薬を分注し、前記液体供給部によって前記ろ過膜上から試薬処理された細胞が回収されるように液体を供給する。  【選択図】      図１
2008118877.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、
前記ろ過膜を有するホルダを配置する配置部と、
前記配置部に配置された前記ホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、
前記配置部に配置された前記ホルダに試薬を分注する第２分注部と、
ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備え、
前記第１分注部によって前記ホルダのろ過膜上に細胞懸濁液を分注し、前記第２分注部によって前記ろ過膜上の細胞に試薬を分注し、前記液体供給部によって前記ろ過膜上から試薬処理された細胞が回収されるように液体を供給することを特徴とする細胞処理装置。
【請求項２】
前記配置部に配置された前記ホルダに分注された液体をろ過膜を介して吸引する吸引部をさらに備える請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項３】
前記吸引部が、前記ろ過膜上に所定の液体を残存させるように吸引する請求項２に記載の細胞処理装置。
【請求項４】
前記ろ過膜上の液体を検知する液面センサさらに備えている請求項３に記載の細胞処理装置。
【請求項５】
前記液体供給部材が、ろ過膜上の細胞存在領域と対向して配置される対向面、前記対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部、及び前記液体を供給する供給口を備える請求項１に記載の細胞処理装置。
【請求項６】
前記細胞存在領域、対向面及びスペーサー部により形成される流路が、らせん状である請求項５に記載の細胞処理装置。
【請求項７】
前記ろ過膜の細胞存在面の背面側に圧力を付与する空圧源を備える請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項８】
前記空圧源が、前記ろ過膜の細胞存在面の背面側との連通状態を遮断するバルブ手段を備えている請求項７に記載の細胞処理装置。
【請求項９】
前記配置部が、前記ホルダを環状に配置可能であり、且つ、回転移動可能に構成されている請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１０】
前記ろ過膜が、細胞が載置されるメンブレンフィルタと、このメンブレンフィルタを支持するためのメッシュフィルタとの２層構造である請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞処理装置。
【請求項１１】
ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、
前記ろ過膜を有するホルダを複数個配置可能なホルダ配置部と、
このホルダ配置部に配置されたホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、
前記ホルダ配置部に配置されたホルダに試薬を分注する第２分注部と、
前記ホルダに分注された液体をろ過膜を介して吸引し得る吸引部と、
この吸引部の吸引動作を制御する制御部と、
試薬処理されたろ過膜上の細胞を遊離させるための回収液を供給する回収液供給部と
を備えており、ろ過膜上で細胞を処理する過程において、当該ろ過膜上に所定量の液体を残存させるべく前記吸引部による液体の吸引を制御し得るように構成されていることを特徴とする細胞処理装置。
【請求項１２】
ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、
前記ろ過膜を有するホルダを配置する配置部と、
前記配置部に配置された前記ホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、
前記配置部に配置された前記ホルダに試薬を分注する第２分注部と、
ろ過膜に対向して配置される対向面、前記対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部、および前記液体を供給する供給口を有し、ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備えることを特徴とする細胞処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞処理装置に関する。さらに詳しくは、ろ過膜を用いて人体などの細胞に所定の処理を施すための細胞処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸部のスクリーニング法として、通常は細胞診が利用されている。ここで、子宮頸部の細胞診は、子宮頸部表面を綿棒やスクレーパー等の専用の採取器具で擦過し、擦過した細胞を、直ちにスライドグラス上に塗抹して標本を作り、顕微鏡等で観察することにより診断を行っている。あるいは健康診断のように大量の検体を処理する必要がある場合には、擦過により採取した細胞群を、固定液中で保存して検査センターに輸送し、検査センターで、塗抹標本をつくり、それをパパニコロウ染色して、顕微鏡で観察して病変の診断情報を得ることが行われている。  
【０００３】
いずれの場合であっても、個々の検体について塗抹標本を作製し、顕微鏡観察しなければならないため、処理が煩雑で時間を要することや、診断に高度の習熟を要することから、近年細胞診の自動化の試みが検討されている。
【０００４】
細胞診の自動化方法としては、例えば、フローサイトメトリが挙げられる。フローサイトメトリは、蛍光標識した任意の抗体で細胞を免疫し、その細胞の懸濁液をフローセルに流してレーザ光を照射し、個々の細胞から発せられる蛍光情報や散乱光情報を測定することによって、短時間に多量の細胞から複数の測定情報を得て、相関解析と統計解析を行う方法である。細胞診においては、癌などの病変に依存する任意のタンパクをマーカーとして選択し、このマーカーに対する蛍光標識特異的抗体で処理した細胞の懸濁液をフローサイトメータで測定することにより、癌細胞の有無を測定することができる。このような細胞の染色工程には、細胞と試薬の反応の工程と、溶液の交換による細胞の洗浄工程とが必要になる。
【０００５】
このような工程を経て、フローサイトメータ用の測定試料を調製する方法としては、細胞と溶液の比重差を利用した遠心分離法が挙げられる。しかしながら、遠心分離法は、細胞処理装置が大型化することや安全性の観点からあまり自動化に適した技術ではない。一方、遠心分離法以外の方法として、細胞の大きさを利用する濾過法が挙げられる。
【０００６】
特許文献１には、弾性変形可能な材料の濾過膜を用い、弾性変形を利用してポア径を変化させて細胞を濾過・回収する技術が記載されている。すなわち、特許文献１の技術では、圧縮状態で小さいポア径を有する濾過膜で細胞を捕捉し、その後非圧縮状態にして該濾過膜のポア径を大きくして、逆方向から供給した液体で捕捉されていた細胞を該濾過膜から離脱させる。
【０００７】
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、濾過膜の延伸・圧縮をするための装置が必要であり、また複数の濾過膜を用いるため、工程が複雑でありコストがかかるという欠点がある。また、細胞を回収するための回収液が多量に必要であり、回収液中の細胞含有率が低くなるため、フローサイトメータ用の測定試料の調製には不適であるという問題もある。
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−１３７５５７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、１つのろ過膜を用いて当該ろ過膜上の細胞に対して処理を行い、当該処理済の細胞を効率よく回収することが可能な細胞処理装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の細胞処理装置は、ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、前記ろ過膜を有するホルダを配置する配置部と、前記配置部に配置された前記ホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、前記配置部に配置された前記ホルダに試薬を分注する第２分注部と、ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備え、前記第１分注部によって前記ホルダのろ過膜上に細胞懸濁液を分注し、前記第２分注部によって前記ろ過膜上の細胞に試薬を分注し、前記液体供給部によってろ過膜上から試薬処理された細胞が回収されるように液体を供給することを特徴としている。
【００１１】
本発明の細胞処理装置は、第１分注部によってホルダのろ過膜上に細胞懸濁液を分注し、第２分注部によってろ過膜上の細胞に試薬を分注し、液体供給部によってろ過膜上から試薬処理された細胞が回収されるように液体を供給するように構成されているので、１つのろ過膜上に分注された細胞に対して試薬処理、回収処理を自動的に行うことができる。
【００１２】
配置部に配置されたホルダに分注された液体をろ過膜を介して吸引する吸引部をさらに備えるのが好ましい。この場合、ろ過膜上に分注された液体を吸引することにより、ろ過膜上における液体の置換を効率的に行うことができる。
【００１３】
吸引部が、ろ過膜上に所定の液体を残存させるように吸引するのが好ましい。この場合、ろ過膜上に所定の液体を残存させるため、細胞がろ過膜に強く固着あるいは付着することがないので、細胞に損傷や変形を与えることがない。
【００１４】
ろ過膜上の液体を検知する液面センサを備えているのが好ましい。この場合、ろ過膜上の液体を吸引部によりろ過膜を介して吸引するに際し、液面センサでろ過膜上の液体を検知し、その信号に基づいて前記吸引部の吸引動作を制御するようにすることができる。これにより、ろ過膜上に所定量の液体を残存させるべく吸引部で液体を吸引することができる。
【００１５】
液体供給部材が、ろ過膜上の細胞存在領域と対向して配置される対向面、対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部、および液体を供給する供給口を備えるのが好ましい。この場合、ろ過膜上の細胞存在領域と対向して配置される対向面と、この対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部という比較的簡素な構成により、細胞をろ過膜から遊離する力を作用させるように液体を供給することが可能となる。
【００１６】
前記細胞存在領域、対向面及びスペーサー部により形成される流路がらせん状であるのが好ましい。流路がらせん状であると、流れの抵抗が小さいので、スムーズに液体をろ過膜の細胞存在領域に供給することができる。
【００１７】
ろ過膜の細胞存在面の背面側に圧力を付与する空圧源を備えているのが好ましい。ろ過膜上の細胞を遊離させるために回収液をろ過膜上に供給すると、ろ過膜上に供給された液体がその供給圧によってろ過膜を透過する漏れ流となることが考えられる。この場合、前記空圧源を設けることで、ろ過膜の細胞存在面の背面側に空気により圧力を付与してろ過膜の変形及び漏れ流を防止することができる。その結果、液体を効率よく一様にろ過膜の細胞存在領域に供給することができ、ろ過膜上の細胞を効率よく回収することができる。
【００１８】
空圧源が、ろ過膜の細胞存在面の背面側との連通状態を遮断するバルブ手段を備えているのが好ましい。所定の圧力をろ過膜の細胞存在面の背面側に付与した後に、バルブ手段により、空圧源とろ過膜の細胞存在面の背面側との連通状態を遮断することで、ろ過膜の背面側の空間を密封された閉空間とすることができ、回収液がろ過膜上に供給されたときのろ過膜の透過流をより小さくすることができる。
【００１９】
ホルダ配置部が、前記ホルダを環状に配置可能であり、且つ、回転移動可能に構成されているのが好ましい。ホルダを環状に配置したホルダ配置部を回転移動可能にすることで、ホルダ配置部を回転させて複数の被処理物を自動的に処理する構成を容易に実現することができる。
【００２０】
ろ過膜を、細胞が載置されるメンブレンフィルタと、このメンブレンフィルタを支持するためのメッシュフィルタとの２層構造とすることができる。このような２層構造とすることで、ろ過膜上の細胞の処理又は回収工程におけるろ過膜の破損を防止するとともに、変形を小さくすることができる。これにより、ろ過膜の機能を充分に発揮させることができる。
【００２１】
本発明の細胞処理装置は、ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、
前記ろ過膜を有するホルダを複数個配置可能なホルダ配置部と、
このホルダ配置部に配置されたホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、
前記ホルダ配置部に配置されたホルダに試薬を分注する第２分注部と、
前記ホルダに分注された液体をろ過膜を介して吸引し得る吸引部と、
この吸引部の吸引動作を制御する制御部と、
試薬処理されたろ過膜上の細胞を遊離させるための回収液を供給する回収液供給部と
を備えており、ろ過膜上で細胞を処理する過程において、当該ろ過膜上に所定量の液体を残存させるべく前記吸引部による液体の吸引を制御し得るように構成されていることを特徴としている。
【００２２】
本発明の細胞処理装置は、ホルダに分注された液体をろ過膜を介して吸引し得る吸引部と、この吸引部の吸引動作を制御する制御部とを備えており、ろ過膜上で細胞を処理する過程において、当該ろ過膜上に所定量の液体を残存させるべく前記吸引部による液体の吸引を制御し得るように構成されている。したがって、処理過程において、液体分の欠如により細胞がろ過膜に強く固着あるいは付着することがないので、細胞に損傷や変形を与えることなく１つのフィルタ上で試薬処理や洗浄処理などの処理を行うことができる。その結果、従来技術のように試薬の交換率を確保するために大量の試薬を必要とすることがなることから、装置の簡素化及び処理速度の高速化を図ることができる。
【００２３】
ろ過膜上で細胞を処理する細胞処理装置であって、前記ろ過膜を有するホルダを配置する配置部と、前記配置部に配置された前記ホルダに細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部と、前記配置部に配置された前記ホルダに試薬を分注する第２分注部と、ろ過膜に対向して配置される対向面、前記対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部、および前記液体を供給する供給口を有し、ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備えることを特徴とする。
【００２４】
本発明の細胞処理装置は、ろ過膜に対向して配置される対向面、前記対向面に設けられ、ろ過膜と対向面との間隔を規定するスペーサー部、および前記液体を供給する供給口を有し、ろ過膜上の細胞を遊離させるための液体を供給する液体供給部とを備えることによって、細胞を効率的にろ過膜上から遊離させることができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の細胞処理装置によれば、１つのろ過膜を用いてろ過膜上の細胞に対して連続的に試薬の交換処理を行い、処理済の細胞を回収することにより、装置の簡素化及び処理速度の高速化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、添付図面を参照しつつ、本発明の細胞処理装置の実施の形態を詳細に説明する。
図１は本発明の一実施の形態に係る細胞処理装置の平面説明図である。この細胞処理装置１は、細胞懸濁液中の細胞をろ過膜でろ過し、ろ過膜上の細胞に対して染色などの試薬処理と洗浄液での洗浄処理を施した後、ろ過膜上の細胞を回収液中に回収する装置である。
【００２７】
細胞処理装置１は、図１及び図１０に示すように、フィルタ（ろ過膜）を有するホルダ２が複数個配置されるホルダ配置部１０、前記ホルダ２に細胞を含む細胞懸濁液を分注する第１分注部である検体分注ユニット２０、前記ホルダ２に試薬を分注する第２分注部である試薬分注ユニット３０、試薬処理されたろ過膜上の細胞を遊離させるための回収液を供給する回収液供給部である回収液供給ユニット４０、回収液中の検体を回収する検体回収ユニット５０、使用済みのホルダ２をホルダ配置部１０から取り外すホルダ脱着ユニット６０、回収液供給ユニット４０を洗浄するための洗浄スピッツ８０、細胞懸濁液を収容するバイアルを移送するためのバイアル移送部７１、回収ユニット４０により回収液中から回収された検体を収容するチューブを移送するためのチューブ移送部１３０、ホルダ配置部を回転させる回転駆動部１１０、ホルダ２のフィルタ上の液体を吸引するための吸引ユニット１２０及び制御部１０１により主に構成されている。また、制御部１０１は、検体分注ユニット２０、試薬分注ユニット、回収液供給ユニット４０、検体回収ユニット５０、回転駆動部１１０、吸引ユニット１２０、ホルダ脱着ユニット６０、洗浄スピッツ８０、チューブ移送部１３０およびバイアル移送部７１に電気的に接続されている。
【００２８】
ホルダ配置部１０は、リング形状を呈しており、周方向に沿って所定間隔で複数の凹所１１（図３〜４参照）が形成されている。そして、各凹所１１内にフィルタを有するホルダ２が着脱自在に配設される。これにより、ホルダ２は所定の間隔で環状に配置される。ホルダ配置部１０は、図示しない駆動手段（回転駆動部１１０）により所定のピッチで回転可能であり、これにより各ホルダ２を検体分注位置、試薬分注位置など必要な処理が施される位置に移動させることができる。ホルダ２を環状に配置したホルダ配置部１０を回転移動可能にすることで、当該ホルダ配置部１０を回転させて複数の被処理物を自動的に処理する構成を容易に実現することができる。
【００２９】
ホルダ２は、図３〜４に示されるように、略短円筒形状を呈しており、ポリプロピレンなどの合成樹脂で作製されている。なお、補強のために前記合成樹脂中に１０重量％程度のグラスファイバーを混入させるようにしてもよい。ホルダ２の一方の端面２ａ（凹所１１内に挿入される側の端面）付近には、細胞懸濁液中の細胞が載置されるフィルタ３が張設されている。ホルダ２の他方の端面付近の外周面には、断面略Ｌ字形のリング状係止部４が形成されている。この係止部４は、ホルダ２の外周面から径方向外方に突設されたつば部４ａと、このつば部４ａの先端から軸方向に沿って前記一方の端面側に延設された垂下部４ｂとからなっている。そして、この垂下部４ｂの先端には、径方向内方に突出する第１爪部４ｃが形成されている。この第１爪部４ｃは、前記ホルダ配置部１０の凹所１１の開口周縁に立設されたリング状の固定部５の外周面に形成された、径方向外方に突出する第２爪部５ｂと係合し、ホルダ２をホルダ配置部１０に着脱可能に固定する役割を果たしている。
【００３０】
前記フィルタ３は、図５に示されるように、細胞が載置されるメンブレンフィルタ３ａと、このメンブレンフィルタ３ａを支持するためのメッシュフィルタ３ｂとの２層構造を有している。メンブレンフィルタ３ａは、直接細胞や試薬と接する反応の場であることから、適切な耐薬性を有しかつ細胞が付着しにくい材料で作製するのが好ましく、例えば、親水性のポリテトラフルオロエチレン、親水性ナイロン、親水性ポリビニリデンフロライド、親水性ポリカーボネイト、親水性ポリプロピレン、親水性ポリスルフォン及び親水性ポリエーテルスルホンなどで作製することができる。また、ポア径は、処理する細胞の大きさに応じて選定すればよく、本発明において特に限定されるものではないが、通常、１〜５μｍが目安である。一方、メッシュフィルタ３ｂは、液体分注時などにおける前記メンブレンフィルタ３ａの変形を抑制するために設けられており、当該メンブレンフィルタ３ａよりも弾性が小さく、強度の大きい材料、例えば、ナイロンなどの合成樹脂でメッシュ状に作製されている。メッシュサイズは、特に限定されるものではないが、例えば２０〜５００μｍとすることができる。フィルタ３を２層構造とすることで、当該フィルタ３上の細胞の処理又は回収工程におけるフィルタ３の破損を防止するとともに、変形を小さくすることができる。これにより、フィルタ３の機能を充分に発揮させることができる。
【００３１】
かかるフィルタ３は、金型にメンブレンフィルタ３ａ及びメッシュフィルタ３ｂを重ねたものを配置し、ついでホルダ２を構成する合成樹脂を用いてアウトサート成型することで当該ホルダ２と一体化させることができる。これにより、少ない工程でフィルタ３付きのホルダ２を作製することができる。なお、ホルダ２とフィルタ３を別々に作製し、フィルタ３を接着剤などによりホルダ２に固着することもできる。
【００３２】
検体分注ユニット２０は、Ｚ軸（鉛直軸）廻りに回動可能であるとともに当該Ｚ軸に沿って上下動可能なアーム２１と、この回動アーム２１の先端部（回動軸と反対側の端部）に取り付けられた検体分注用ピペットとを備えている。アーム２１はステッピングモータ２０ａにより上下動、回動可能に構成されている。さらに、検体分注ユニット２０は、検体分注用ピペットにより検体を吸引および分注するための図示しないポンプ手段を備えている。ベルトコンベアからなるバイアル移送部７１により移送されるバイアル７２内に収容されている、細胞を含む細胞懸濁液を前記検体分注用ピペットにより吸引して、ホルダ２のフィルタ３上に分注する。なお、バイアル移送部７１は、ベルトコンベアを移送させるための駆動モータ７１ａを備えている。
【００３３】
試薬分注ユニット３０は、図６に示されるように、細胞処理装置１が配置されるベースプレート３１上に立設された支柱３２と、この支柱３２の上端から水平方向に突設されたアーム３３と、このアーム３３により垂直状態に保持された試薬分注ピペット３４とで主に構成されている。試薬分注ピペット３４の根元側端部には、試薬注入チューブ７３が接続されており、この試薬注入チューブ７３の他端側は、図示しないポンプ手段を経由して試薬収容部７４（図１参照）に配設された試薬ボトル７５に接続されている。
【００３４】
試薬分注ユニット３０は、ホルダ配置部１０に配置された複数のホルダに試薬の分注を行うためにホルダ配置部１０の外周に沿って配設されている。ホルダ２が試薬分注位置に回転移動させられると、ポンプ手段が駆動されて、試薬分注ピペット３４先端よりホルダ２のフィルタ３上に所定量の試薬が分注される。
【００３５】
また、前記アーム３３には、フィルタ３上の液体を検出する液面センサ７６が取り付けられており、この液面センサ７６により、フィルタ３上の液体の液面を検出する、換言すれば、液面までの距離を検出するように構成されている。そして、この液面センサ７６からの信号に従って、後述するように、前記ホルダ２のフィルタ３の背面側（細胞懸濁液や試薬が分注される側と反対側）を負圧にする吸引手段の駆動を停止させるようにしている。
【００３６】
回収液供給ユニット４０は、前記検体分注ユニット２０と同様に、Ｚ軸廻りに回動可能であるとともに当該Ｚ軸に沿って上下動可能なアーム４１を備えている。アーム４１はステッピングモータ４０ａにより上下動、回動可能に構成されている。このアーム４１の先端付近には、試薬処理されたフィルタ３上の細胞を回収するための筒体４１（図７〜８参照）が接続されている。この筒体４１の根元側には、回収液供給チューブ（図示せず）が接続されており、容器に収容されている回収液が、図示しないポンプ手段により当該回収液供給チューブ及び筒体４１を経由してフィルタ３に供給されるようになっている。
【００３７】
前記筒体４１の先端には、図７〜８に示されるように、フィルタ３の表面に一定の流れの回収液を供給する回収液供給部材４２が設けられている。この回収液供給部材４２は、前記フィルタ３上の細胞存在領域と対向して配置される対向面４３と、この対向面４３に設けられ、フィルタ３と対向面４３との間隔を規定するスペーサー部４４と、前記回収液を供給する供給口４５とを備えている。
【００３８】
前記回収液供給部材４２においては、前記フィルタ３上の細胞存在領域、対向面４３及びスペーサー部４４により形成されるらせん状の流路４６に前記供給口４５から回収液が供給される。この場合に、前記回収液供給部材４２は、細胞を遊離させるための回収液を供給する工程において、フィルタ３上の細胞存在領域にスペーサー部４４を接した状態で配設される。フィルタ３上の細胞存在領域にスペーサー部４４を接した状態で回収液供給部材４２を配設することで、フィルタ３上の細胞に対し当該フィルタ３に対して平行な流路に回収液を供給することで、フィルタ３面に対して平行な回収液の流れを作る。このことにより、フィルタ面の細胞存在領域に一様で強力な剪断力を作用させるように回収液を供給することが可能となり、細胞を損傷させることなくきれいな形で当該細胞をろ過膜から遊離させて回収液中に分散した状態で効率よく回収液中に回収することができる。さらに、流路がらせん状であるので、円形のフィルタ面の細胞存在領域に一様で強力な流れの回収液をフィルタ３の細胞存在領域に供給することができる。なお、細胞をフィルタ３から遊離させる剪断力は、供給される回収液の単位時間当たりの流量、スペーサー部４４の高さ、及びスペーサー部４４により形成される流路の幅によって調整することができ、処理する細胞の状態や量に応じて適宜設定することができる。
【００３９】
前記流路に供給された回収液は、らせん状に細胞存在領域を流れた後に、当該らせん状の流路の終端付近に設けられた、フィルタ３から遊離した細胞を含む回収液を排出する排出口４７より、回収液を貯留する貯留部４８に排出される。この貯留部４８は、凹所からなっており、前記回収液供給部材４２における、対向面４３と反対側の面に形成されている。
【００４０】
検体回収ユニット５０は、前記検体分注ユニット２０と同様に、Ｚ軸廻りに回動可能であるとともに当該Ｚ軸に沿って上下動可能なアーム５１と、この回動アーム５１の先端部（回動軸と反対側の端部）に取り付けられた検体回収用ピペット（図示せず）を備えている。アーム５１はステッピングモータ５０ａにより上下動、回動可能に構成されている。さらに、検体回収ユニット５０は、検体回収用ピペットにより検体を吸引および分注するための図示しないポンプ手段を備えている。検体回収ユニット５０は、前記回収液供給部材４２の貯留部４８内の回収液（フィルタ３から遊離した細胞を含んでいる）を回収する。前記検体回収用ピペットの吸い口は、当該検体回収用ピペットの軸心より３〜２０度程度オフセットするように配置されており、前記アーム５１を上下動及び回動させることで、前記吸い口を貯留部４８内の回収液中に配置し、ついで図示しないポンプ手段を駆動させて回収液の吸引を行う。
【００４１】
回収液を吸引した後、アーム５１は所定角度回動し、ついで、前記検体回収用ピペットは、ベルトコンベアからなるチューブ移送部１３０により移送されるチューブ４９内に回収液を排出する。なお、チューブ移送部１３０は、ベルトコンベアを移送させるための駆動モータ１３０ａを備えている。
【００４２】
貯留部４８内の回収液が吸引された回収液供給部材４２は、洗浄スピッツ８０により洗浄される。この洗浄スピッツ８０は、図９に示されるように、上部が開放された有底円筒体８１からなっており、有底円筒体８１の側壁８２には、洗浄液の入口ポート８３及び出口ポート８４が形成されている。前記入口ポート８３及び出口ポート８４には、洗浄液を供給するためのチューブ８５及び排出するためのチューブ８６がそれぞれ接続されている。入り口ポート８３と出口ポート８４は図示しないポンプ手段に接続されている。なお、洗浄液は、ポンプ手段により洗浄液ボトル７６から入口ポート８３を介して、洗浄スピッツ８０内部に供給される。洗浄スピッツ８０内部に供給された洗浄液は、ポンプ手段により出口ポート８４を介して吸引され、排出される。また、有底円筒体８１の底部８７には、排液口８８が形成されており、図示しない吸引手段により有底円筒体８１内の洗浄液が吸引されるように構成されている。有底円筒体８１内において、回収液供給部材４２は複数回上下動され、その間に入口ポート８３から供給される洗浄液によって回収液供給部材４２が洗浄される。
【００４３】
ホルダ脱着ユニット６０は、先端に開閉可能な把持部６１を備えたアーム６２を有しており、このアーム６２は、上下動及び進退可能に構成されている。後退位置にあるアーム６２を前進させ、ついで前記把持部６１を閉じて、ホルダ２の口部を把持し、この状態でアーム６２を上昇させて、当該ホルダ２を凹所１１内から取り出す。そして、アーム６２を前進させて、把持部６１を開くことで、把持していたホルダ２をホルダ廃棄部６３に落とす。このホルダ廃棄部６３に溜まった使用済みのホルダ２は、ユーザにより適宜回収され、廃棄される。
【００４４】
図１において、９０は遮光カバーであり、細胞を染色するのに用いた蛍光染料が光により退色し、フローサイトメータで用いる励起用のレーザ光を当てたときに光らなくなるのを防止するために設けられている。
【００４５】
つぎに、図２を参照しつつ、吸引ユニット１２０の構成とフィルタ３上の液体を吸引する機構及び当該フィルタ３の背面側に圧力を付与する機構について説明をする。
吸引ユニット１２０は、ホルダ配置部１０と、第１バルブ１４と、第２バルブ１５と、第３バルブ１９と、陰圧源１６と、陽圧源１７とから構成されている。そして、ホルダ２の裏面側に形成された第１ポート１２には、配管１３の一端が接続されており、この配管１３の他端側は、第１バルブ１４及び第２バルブ１５を経由して吸引部である陰圧源１６と、空圧源である陽圧源１７とに接続されている。また、ホルダ配置部１０の側面に形成された第２ポート１８には大気開放管８の一端が接続されており、この大気開放管８の他端は第３バルブ１９を経由して大気に開放されている。前記第１バルブ１４及び第３バルブ１９は、開閉機能を有する開閉バルブであり、一方、前記第２バルブ１５は、流路の切換を行う切換バルブである。
【００４６】
まず、フィルタ３上に分注した液体を、その一部をフィルタ３上に残存させつつ残りを当該フィルタ３を介して吸引する場合、第１バルブ１４を開にし、第３バルブ１９を閉にする。ついで、第２バルブ１５を陰圧源１６側に切り替えた後に当該陰圧源１６を駆動させて、前記フィルタ３の背面側を負圧にする。これにより、フィルタ３上の液体を当該フィルタ３を介して吸引することができる。その際、前記液面センサ７６により、フィルタ３上の液体の液面までの距離が検出され、この液面センサ７６からの信号に従って、第１バルブ１４を閉にし、第３バルブ１９を開にして、フィルタ３の背面側を大気圧に開放する。これにより、フィルタ３上に確実に所定量の液体を残存させつつ不要な液体を吸引することができる。
【００４７】
また、試薬処理、洗浄などの所定の処理が施された細胞を、回収液を供給して当該回収液中に回収する場合、第３バルブ１９を開、第１バルブを開、第２バルブを陰圧側に切り替え、ホルダ配置部１０及びチューブ移送部１３内部の液を排出して空気で置換した後、第３バルブ１９を閉にし、次に第２バルブ１５を陽圧源１７側に切り替えた後に当該陽圧源１７を駆動させて、前記フィルタ３の背面側を陽圧にする。フィルタ３上の細胞を遊離させるために回収液をフィルタ３上に供給すると、当該回収液によってフィルタ３上に供給された回収液がその供給圧によってフィルタ３を透過する漏れ流となることにより、効果的にフィルタ面に平行な流れを生むことが出来ない。またフィルタ３が下方に突出するように撓み、これにより、回収液の流れに乱れが生じて細胞を効率よく回収することができないことが考えられる。しかしながら、フィルタ３の背面側を空気により陽圧にすることで当該フィルタ３の変形及び前記漏れ流を防止することができる。その結果、回収液を効率よくスムーズにフィルタ３の細胞存在領域に供給することができ、当該フィルタ３上の細胞を効率よく回収することができる。
【００４８】
なお、フィルタ３の背面側を所定の陽圧にした後に、前記第１バルブ１４を閉にするのが好ましい。所定の圧力をフィルタ３の細胞存在面の背面側に付与した後に、前記陽圧源１７とフィルタ３の背面側との連通状態を遮断することで、前記フィルタ３の背面側の空間を密封された閉空間とすることができ、回収液がフィルタ３上に供給されたときの当該フィルタ３の変形をより小さくすることができる。
【００４９】
前記所定の圧力（陽圧）は、フィルタ３上に供給される回収液の液圧以上であり、かつフィルタ３がエアを通さないように当該フィルタ３のバブルポイント以下に設定するのが好ましい。このような状態でフィルタ３上に回収液が供給されると、フィルタ３の変形及び漏れ流が防止され効率よく回収液の流れを形成することができる。
【００５０】
次に、図１０に示された回転駆動部１１０について説明する。回転駆動部１１０は、ホルダ設置部１０を所定のピッチで回転させる回転駆動源（図示せず）を備えている。そして、ホルダ設置部１０は、制御部１０１から回転駆動部１１０に供給された駆動パルス信号のパルス数に応じた分だけ回転し、停止する。
【００５１】
なお、制御部１０１は、供給した駆動パルス信号のパルス数をカウントすることにより、ホルダ設置部１０の原点位置からのホルダ設置部１０の回転移動量を決定し、ホルダ設置部１０の回転移動を制御することが可能である。また、制御部１０１は、ホルダ設置部１０を３分間に１ピッチ、左回りに回転移動するように回転駆動部１１０を制御している。
【００５２】
制御部１０１は、図１１に示すように、ＣＰＵ１０１ａとＲＯＭ１０１ｂと、ＲＡＭ１０１ｃと、通信インターフェース１０１ｄとから主として構成されている。
ＣＰＵ１０１ａは、ＲＯＭ１０１ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１０１ｃに読み出されたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＲＯＭ１０１ｂは、ＣＰＵ１０１ａに実行させるためのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータ等を記憶している。ＲＡＭ１０１ｃは、ＲＯＭ１０１ｂに記憶しているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１０１ａの作業領域として利用される。
【００５３】
通信インターフェース１０１ｄは、検体分注ユニット２０、試薬分注ユニット３０、回収液供給ユニット４０、検体回収ユニット、回転駆動部１１０、吸引ユニット１２０、ホルダ脱着ユニット６０、洗浄スピッツ８０、チューブ移送部１３０及びバイアル移送部７１の各部を駆動するためのＣＰＵ５０１ａからの指令を送信するための機能を有する。
【００５４】
つぎに、本実施の形態に係る細胞処理装置を用いた細胞処理の方法の一例について説明をする。この方法において、細胞懸濁液中の細胞は、例えば、患者から採取された細胞であり、その細胞を検査することにより診断を支援する情報を得るためのものである。例えば、子宮頸癌の診断には、子宮頸部由来細胞を溶媒に懸濁した細胞懸濁液が用いられる。
【００５５】
図１に示すように、ホルダ設置部１０は、ホルダ２を５１個設置でき、回転駆動部１１０により３分間に１ピッチ、左回りに回転移動し、各所定位置において各処理が行われる。つまり、５１の所定位置において、各処理が行われる。各所定位置に対応して、１Ｐ〜５１Ｐの位置番号が付与されている。以下、図１２〜１６、図１７に示すフローチャートをもちいて、位置番号に対応して、ホルダ設置部１０に設置されたホルダ２における処理工程について説明する。なお、制御部１０１による回転駆動部１１０の制御については、ホルダ設置部１０を３分間に１ピッチ、左回りに回転移動させるだけなので、その説明については省略する。
【００５６】
＜位置番号１Ｐ〜１２Ｐ＞
まず、ユーザがホルダ設置部１０の１Ｐ〜１２Ｐにホルダ２を設置する。
【００５７】
＜位置番号１３Ｐ＞
次に、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、希釈／洗浄液を１３Ｐのホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ１）。ついで、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ２）。
ここで、ステップＳ２における吸引処理を図１７に示すフローチャートをもちいて、具体的に説明する。制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、フィルタ３の背面側から弱陰圧をかけてフィルタ３上の液体の吸引を開始する（ステップＳ１０１）。液面センサ７６にてフィルタ３上の液面を検知し、所定の液面レベルにあるか否かを判断する（ステップＳ１０２）。所定の液面レベルにない場合、所定の液面レベルになるまで、ステップＳ１０２の処理を繰り返す。所定の液面レベルにある場合には、制御部１０１は、第１バルブ１４を閉にし、第３バルブ１９を開にして、フィルタ３の背面側を大気圧に開放、その直後に閉にすることにより、陰圧による吸引を停止する（ステップ１０３）。このように、フィルタ３上の液面を検知することにより、フィルタ３が常に液体で濡れた状態になるようにしている。
なお、以降の吸引処理は、ステップＳ２と同様であるため、その説明は省略する。
【００５８】
＜位置番号１４Ｐ＞
次に、制御部１０１は、子宮頸部擦過検体から調整された細胞懸濁液（径が３〜２００μｍ程度の細胞を１ｍＬの固定液中に約１×１０５個含有）が収容されたバイアル７２をバイアル移送部７１により吸引位置まで移送し（ステップＳ３）、移送されたバイアル７２から細胞懸濁液を検体分注アーム２０の検体分注用ピペットにより吸引し、ホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ４）。フィルタ３は、固液分離膜としての親水性ＰＴＦＥ平膜フィルタ（ポア径０．４〜５μｍ）を６０μｍ程度の網状シート上に積層した２層構造のものを用いた。
【００５９】
＜位置番号１５Ｐ〜１６Ｐ＞
次に、１５Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ５）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ６）。
次に、１６Ｐにおいて、制御部１０１は、同様な処理を行う（ステップＳ７，８）。
【００６０】
＜位置番号１７Ｐ＞
次に、１７Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ９）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ１０）。さらに、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ１１）。
【００６１】
＜位置番号１８Ｐ＞
次に、１８Ｐにおいて、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から賦活化剤を分注する（ステップＳ１２）。
【００６２】
＜位置番号１９Ｐ〜２０Ｐ＞
次に、１９Ｐ〜２０Ｐにおいて、制御部１０１は処理を行わない（細胞と賦活化剤とを反応させるための時間が設けられる）。
【００６３】
＜位置番号２１Ｐ〜２２Ｐ＞
次に、２１Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ１３）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ１４）。
次に、２２Ｐにおいて、制御部１０１は、同様な処理を行う（ステップＳ１５，１６）。
【００６４】
＜位置番号２３Ｐ＞
次に、２３Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ１７）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ１８）。さらに、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ１９）。
【００６５】
＜位置番号２４Ｐ＞
次に、２４Ｐにおいて、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から賦活化反応停止剤を分注する（ステップＳ２０）。
【００６６】
＜位置番号２５Ｐ〜２８Ｐ＞
次に、２５Ｐ〜２８Ｐにおいて、制御部１０１は処理を行わない（賦活化剤と賦活化反応停止剤とを反応させるための時間が設けられる）。
【００６７】
＜位置番号２９Ｐ＞
次に、２９Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ２１）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ２２）。さらに、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ２３）。
【００６８】
＜位置番号３０Ｐ＞
次に、３０Ｐにおいて、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５からブロッキング剤をフィルタ３上に分注する（ステップＳ２４）。
【００６９】
＜位置番号３１Ｐ〜３４Ｐ＞
次に、２５Ｐ〜２８Ｐにおいて、制御部１０１は処理を行わない（細胞とブロッキング剤とを反応させるための時間が設けられる）。
【００７０】
＜位置番号３５Ｐ＞
次に、３５Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ２５）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から抗体をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ２６）。
【００７１】
＜位置番号３６Ｐ〜３９Ｐ＞
次に、３６Ｐ〜３９Ｐにおいて、制御部１０１は処理を行わない（細胞と抗体とを反応させるための時間が設けられる）。
【００７２】
＜位置番号４０Ｐ〜４１Ｐ＞
次に、４０Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ２７）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ２８）。
次に、４１Ｐにおいて、制御部１０１は、同様な処理を行う（ステップＳ２９，３０）。
【００７３】
＜位置番号４２Ｐ＞
次に、４２Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ３１）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ３２）。さらに、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ３３）。
【００７４】
＜位置番号４３Ｐ＞
次に、４３Ｐにおいて、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から染色液を分注する（ステップＳ３４）。
【００７５】
＜位置番号４４Ｐ〜４５Ｐ＞
次に、４４Ｐ〜４５Ｐにおいて、制御部１０１は処理を行わない（抗体と染色とを反応させるための時間が設けられる）。
【００７６】
＜位置番号４６Ｐ〜４８Ｐ＞
次に、４６Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ３５）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ３６）。
次に、４７Ｐ〜４８Ｐにおいて、制御部１０１は、同様な処理を行う（ステップＳ３７〜４０）。
【００７７】
＜位置番号４９Ｐ＞
次に、４９Ｐにおいて、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ４１）。そして、制御部１０１は、試薬分注ユニット３０を制御することにより、試薬ボトル７５から希釈／洗浄液をホルダ２のフィルタ３上に分注する（ステップＳ４２）。さらに、制御部１０１は、吸引ユニット１２０を制御することにより、吸引処理を行う（ステップＳ４１）。
次に第３バルブを開、第１バルブを開にしてホルダ配置部１０及びチューブ移送部１３内部の液を排出して空気で置換した後、第３バルブ１９を閉、第一バルブ１４を開にしフィルタ３の背面側に当該フィルタ３のバブルポイント以下であり、かつ回収液供給時にフィルタ３上に供給される回収液の液圧以上となるような陽圧を印加した後、第１バルブ１４を閉にしてフィルタ３の背面側を閉塞させる（ステップＳ４４）。
【００７８】
＜位置番号５０Ｐ＞
次に、５０Ｐにおいて、制御部１０１は、チューブ移送部１３０を制御することにより、チューブ４９を回収位置に移動させる（ステップＳ４５）。
回収液供給ユニット４０のアーム４１を回動及び下降させて、図７〜８に示される回収液供給部材４２のスペーサー部４４をフィルタ３上の細胞存在領域に接した状態で配設する（ステップＳ４６）。つぎに、フィルタ３上の細胞存在領域、対向面４３及びスペーサー部４４により形成されるらせん状の流路４６に、回収液供給部材４２の中心部に位置する供給口４５から回収液を供給する（ステップ４７）。これにより、フィルタ３面に平行で一様な流れが形成され、この流れによりフィルタ３上の細胞が遊離され回収液中に回収される。その際、回収液供給部材４２を上下に数回往復させることで、フィルタ３に強固に付着した細胞の遊離や細胞同士の分散を促進しても良い。
次に、制御部１０１は、前記回収液供給部材４２の貯留部４８に収容された、フィルタ３から遊離された細胞を含む回収液を、検体回収ユニット５０を制御することにより、チューブ４９内に回収し、封入する（ステップＳ４８）。また、制御部１０１は、回収液供給ユニット４０および洗浄スピッツ８０を制御することにより、回収液供給部材４２を洗浄液で洗浄する（ステップＳ４９）。このチューブ４９をフローサイトメータの所定位置にセットすることで、検体の測定及び分析を行うことができる。
【００７９】
＜位置番号５１Ｐ＞
次に、制御部１０１は、ホルダ脱着ユニット６０を制御することにより、ホルダ設置部１０の設置されたホルダ２を取り外し、ホルダ廃棄部６３へ廃棄する（ステップ５０）。
【００８０】
前記実施の形態において、ユーザがホルダ設置部１０にホルダ２を設置するようにしたが、ホルダ２をホルダ設置部１０に自動的に供給する供給部をも設けても良い。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の細胞処理装置の一実施の形態の平面説明図である。
【図２】図１に示される細胞処理装置におけるホルダ配置部の空気回路図である。
【図３】フィルタを有するホルダとホルダ配置部の断面説明図である。
【図４】ホルダが装着されたホルダ配置部の断面説明図である。
【図５】ホルダの端部付近の断面説明図である。
【図６】試薬分注ユニット及びホルダ配置部の断面説明図である。
【図７】回収液供給ユニットにおける回収液供給部材を下方から見た説明図である。
【図８】回収液供給ユニットにおける回収液供給部材を上方から見た説明図である。
【図９】洗浄スピッツの断面説明図である。
【図１０】細胞処理装置を構成するユニットの説明図である。
【図１１】細胞処理装置を制御する制御部の説明図である。
【図１２】本発明の細胞処理装置を用いた細胞処理の例を示すフローチャートである。
【図１３】本発明の細胞処理装置を用いた細胞処理の例を示すフローチャートである。
【図１４】本発明の細胞処理装置を用いた細胞処理の例を示すフローチャートである。
【図１５】本発明の細胞処理装置を用いた細胞処理の例を示すフローチャートである。
【図１６】本発明の細胞処理装置を用いた細胞処理の例を示すフローチャートである。
【図１７】本発明における吸引処理のフローチャートである。
【符号の説明】
【００８２】
１        細胞処理装置
２        ホルダ
３        フィルタ
４        係止部
５        固定部
１０        ホルダ配置部
１１        凹所
１２        第１ポート
１３        配管
１４        第１バルブ
１５        第２バルブ
１６        陰圧源
１７        陽圧源
１８        第２ポート
１９        第３バルブ
２０        検体分注ユニット
２１        アーム
３０        試薬分注ユニット
３２        支柱
３３        アーム
４０        回収液供給ユニット
４２        回収液供給部材
４３        対向面
４４        スペーサー部
４５        供給口
４６        流路
４７        排出口
４８        貯留部
５０        検体回収ユニット
６０        ホルダ脱着ユニット
７１        バイアル移送部
７２        バイアル
７３        試薬注入チューブ
７４        試薬収容部
７５        試薬ボトル
７６        液面センサ
８０        洗浄スピッツ
９０        遮光カバー
【図１】
2008118877.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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