(57)【要約】【課題】  本発明は、試料中のヒアルロナンの分子量を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することを目的とする【解決手段】  ヒアルロナンの分子量を測定する方法であって、ヒアルロナンを含む試料を電気泳動法により分離し、転写膜に転写するステップと、転写膜に転写されたヒアルロナンとヒアルロナン結合性タンパク質とを接触させて、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を形成させるステップと、ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している化学発光用酵素、またはヒアルロナン結合性タンパク質に直接的もしくは間接的に結合させた化学発光用酵素と基質とを反応させて、化学発光法により複合体を検出するステップとを含む方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナンの分子量を測定する方法であって、
ヒアルロナンを含む試料を供するステップと、
ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質を供するステップと、
前記試料を電気泳動法により分離し、転写膜に転写するステップと、
前記転写膜に転写されたヒアルロナンと前記ヒアルロナン結合性タンパク質とを接触させて、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を形成させるステップと、
前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している化学発光用酵素、または前記ヒアルロナン結合性タンパク質に直接的もしくは間接的に結合させた化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させて、化学発光法により前記複合体を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記酵素が前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合しておらず、前記検出するステップが、前記複合体に前記酵素を直接的または間接的に結合させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測する方法であって、
請求項１〜３のいずれかに記載の方法を用いて、被験体から得られた試料に含まれるヒアルロナンの分子量を測定するステップと、
測定されたヒアルロナン分子量に基づき、被験体が前記疾患、障害または状態を被っている、または被る可能性を決定するステップと
を含む方法。
【請求項５】
前記疾患、障害または状態が、加齢、リウマチ、関節症、癌、皮膚炎、ＣＰＤ（慢性閉塞性呼吸障害）、肺線維症、肝炎、肝硬変、腎炎、アレルギー性腸炎、および出産時の子宮頸部熟化からなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒアルロナンの分子量を測定するためのキットであって、
ヒアルロナンとの特異的な結合能を有し、化学発光用酵素が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質
を含むキット。
【請求項７】
ヒアルロナンの分子量を測定するためのキットであって、
ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質と、
前記ヒアルロナン結合性タンパク質と直接的または間接的に特異的に結合させることができる化学発光用酵素と
を含むキット。
【請求項８】
前記酵素の基質をさらに含む、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測するための請求項６〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
前記疾患、障害または状態が、加齢、リウマチ、関節症、癌、皮膚炎、ＣＰＤ（慢性閉塞性呼吸障害）、肺線維症、肝炎、肝硬変、腎炎、アレルギー性腸炎、および出産時の子宮頸部熟化からなる群から選ばれる、請求項６〜９のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロナンの分子量を測定する方法、およびヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測する方法、ならびにこれらのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロナンは、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸からなる２糖を単位糖（ユニット）として、これが数多く直線的に繋がった生体直鎖高分子のひとつであり、組織細胞間の細胞外基質の主要な構成成分である。ヒアルロナンは極めて高い保水性を有し、細胞外基質の構成要素としての構造的機能以外に、細胞の親水性環境を保つ機能や、外気にさらされる皮膚でその乾燥を防ぐバリア機能の維持などの機能を持つことが知られている。これらの保水機能はヒアルロナンの分子量に依存していることが知られている（非特許文献１：Lee et al.）。
【０００３】
また、ヒアルロナンは低分子化した場合に多種の生理活性を持つようになることが知られている。例えば、数万ダルトンの中〜低分子量のヒアルロナンは、炎症性核内因子ＮＦ−κＢやサイトカイン類を誘導したり、細胞の遊走能を高めることが知られている（非特許文献２：Noble PW.）。より低分子量であるオリゴ糖のヒアルロナンは、細胞増殖促進や新生血管の誘導の働きがあることが知られている（非特許文献３：Joddar B. et al.）。さらに、後述するように、ヒアルロナンの分子量と、リウマチ、関節症および癌などの疾患との間に相関があることが知られている。このように、ヒアルロナンの生体内での機能には分子量が深く関っており、ヒアルロナンの分子量を測定する技術はこの機能の研究に欠くことのできないものである。
【０００４】
しかしながら、従来、生体内におけるヒアルロナン分子量を測定する際、測定に用いることができる試料は、関節液や皮膚など、ヒアルロナンを豊富に含むものに限られていた。その理由は以下の通りである。すなわち、ヒアルロナンはタンパク質や核酸のような特異的な吸収波長や蛍光波長を持たず、また、ヒアルロナンは抗原性が無いため抗体が作れない。このため、ヒアルロナンの分子量測定には、カラムクロマトグラフィーや電気泳動など、タンパク質や核酸の分子量測定に用いられている従来型の測定方法が適用できないからであった。
【０００５】
ヒアルロナンを検出するためには、例えば、カラムクロマトグラフィーでは、分画したフラクションごとに化学的比色定量法を適用することや、ヒアルロナン結合性タンパク質（ＨＡＢＰとも記す）を用いたマルチウエルアッセイシステムを用いることが可能である。あるいは、ヒアルロナンを検出するために、高速液体クロマトグラフィーでは示差屈折計やＵＶ（波長２１０ｎｍ）を利用することが可能である。
【０００６】
しかし、ＨＡＢＰを用いる方法以外はヒアルロナンに対する特異性は無く検出下限も数μｇ／ｍＬ程度である。従って、生体試料からのヒアルロナンを検出するためには、ヒアルロナンを高度に精製しなければならない。また、ＨＡＢＰを用いたマルチウエルアッセイシステムは感度と特異性が高いとはいえ、その前段階でカラムクロマトグラフィーによる処理が必要となる。この際、オープンカラムクロマトグラフィーまたは高速液体カラムクロマトグラフィーのいずれを用いるにしても、使用できるカラムに制限があり、また、生体内に存在するような分子量３００万を超えるような高分子は、現在では分析が困難である。
【０００７】
上述のように、生体各組織臓器におけるヒアルロナンの機能を研究するためには、微量試料中のヒアルロナン分子量を測定することが必要である。その測定に要求されるのは、ヒアルロナンに対し特異的、かつ高感度であることである。Hong Gee LeeとMary K.Cowmanは、ヒアルロナンをアガロースゲルでの電気泳動による分離後に、ポジティブチャージ膜上に転写し、ヒアルロナンとＨＡＢＰとの複合体を形成させ、銀染色法で検出する、ヒアルロナンの分子量測定法を報告した（非特許文献１：Lee et al.）。この方法は、ヒアルロナンに特異性が高く、生体中にあるような高分子量のヒアルロナンも測定可能である。しかしながら、当該文献にも記載の通り、その検出方法は、感度として１サンプルあたり数μｇのヒアルロナンを要し、たいていの生体試料においては微量での測定が可能であると言うことはできなかった。例えば、血液中のヒアルロナン濃度は、数百ｎｇ〜数μｇ／ｍＬであることから、当該文献に記載の方法ではヒアルロナンの分子量を測定することは困難である。
【０００８】
また、Lest et al.は、ヒアルロナンを含むグリコサミノグリカンの分子量を測定する際に、Azure Aを用いる方法を報告している（非特許文献４：Lest et al.）。しかしながら、当該文献においては、各糖を特異的に検出することは意図されておらず、また、他のグリコサミノグリカンと異なりヒアルロナンは、スメアしてしまい分子量が測定できていない。
【０００９】
【非特許文献１】Hong Gee Lee et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1994, 219, pp278-287
【非特許文献２】Noble PW., Matrix Biology, 2002, 21(1), pp25-29
【非特許文献３】Joddar B., Ramamurthi A., Biomaterials, 2006, 27, pp2994-3004
【非特許文献４】Chris H. A. van de Lest et al., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1994, 221, pp356-361
【非特許文献５】Fraser & Laurent "HA turnover and metabolism" The Biology of Hyaluronan, Chiba Foundation Symposium, 1989, 143, pp41-59
【非特許文献６】Jiang D. et al, NATURE MEDHICINE, 2005, vol.11, no.11, pp1173-1179
【非特許文献７】Dahl LB et al, Ann.Rheum.Dis., 1985, 44, pp817-822
【非特許文献８】Wang PM, Lai-Fook SJ., HYALURONAN, Woodhead publishing Limited, 2002, vol 2, pp231-238
【非特許文献９】Yada T et al, HYALURONAN, Woodhead publishing Limited, 2002, vol 2, pp209-216
【非特許文献１０】Holmess MW et al, Biochem J, 1988, 250, pp435-441
【非特許文献１１】Tanimoto K., et al, J Dent Res, 2004, 83(1), pp40-44
【非特許文献１２】Hopwood J, Dorfman A, Pediatr Res, 1978, 12, pp52-56
【非特許文献１３】Allerton SE et al, Cancer Res, 1970, 30, pp679-683
【非特許文献１４】Horai T et al, Cancer, 1981, 48, pp2016-2021
【非特許文献１５】Roboz J et al, Cancer Res, 1985, 45, pp1850-1854
【非特許文献１６】Kawai T et al, Cancer, 1985, 56, pp567-574
【非特許文献１７】Takeuchi J et al, Cancer Res, 1976, 36, pp2133-2139
【非特許文献１８】Takeuchi J et al, Cancer, 1981, 47, pp2030-2035
【非特許文献１９】Kojima J et al, Cancer Res, 1975, 35, pp542-547
【非特許文献２０】Arnold F et al, Int J Clin Exp Microcirc, 1987, 5, pp381-386
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、試料中のヒアルロナンの分子量を簡便かつ高感度に測定する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を微量試料からでも診断または予測できる方法、およびこれらに使用するためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、試料中の微量のヒアルロナンの分子量の測定において、電気泳動法を用い、さらに検出方法として化学発光法を用いることによって、ヒアルロナン分子量を簡便かつ高感度に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、試料中のヒアルロナン分子量を測定することによって、被験体の微量試料からでも、ヒアルロナン分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の一の側面によると、ヒアルロナンの分子量を測定する方法であって、
ヒアルロナンを含む試料を供するステップと、
ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質を供するステップと、
前記試料を電気泳動法により分離し、転写膜に転写するステップと、
前記転写膜に転写されたヒアルロナンと前記ヒアルロナン結合性タンパク質とを接触させて、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を形成させるステップと、
前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している化学発光用酵素、または前記ヒアルロナン結合性タンパク質に直接的もしくは間接的に結合させた化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させて、化学発光法により前記複合体を検出するステップと
を含む方法が提供される。
【００１３】
また、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測する方法であって、
上記方法を用いて、被験体から得られた試料に含まれるヒアルロナンの分子量を測定するステップと、
測定されたヒアルロナン分子量に基づき、被験体が前記疾患、障害または状態を被っている、または被る可能性を決定するステップと
を含む方法が提供される。
【００１４】
さらに、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量を測定するためのキットであって、ヒアルロナンとの特異的な結合能を有し、化学発光用酵素が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質を含むキットが提供される。さらに、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量を測定するためのキットであって、ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質と、前記ヒアルロナン結合性タンパク質と直接的または間接的に特異的に結合させることができる化学発光用酵素とを含むキットが提供される。さらに、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測するための上記キットが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によると、以下に詳細に説明するように、試料中のヒアルロナンの分子量を簡便かつ高感度に測定することが可能となる。また、本発明によると、ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を微量試料からでも診断または予測することが可能となる。また、本発明によると、これらに使用するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態を説明する。もっとも、以下の記載は、本発明を具体的に説明するためのものであって、本発明の技術的範囲を限定することを意図するものではない。
【００１７】
上記したように、本発明の一の側面によると、ヒアルロナンの分子量を測定する方法であって、
ヒアルロナンを含む試料を供するステップと、
ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質を供するステップと、
前記試料を電気泳動法により分離し、転写膜に転写するステップと、
前記転写膜に転写されたヒアルロナンと前記ヒアルロナン結合性タンパク質とを接触させて、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を形成させるステップと、
前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している化学発光用酵素、または前記ヒアルロナン結合性タンパク質に直接的もしくは間接的に結合させた化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させて、化学発光法により前記複合体を検出するステップと
を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明においては、ヒアルロナンを含む試料が測定の対象となる。測定の対象となる試料は、ヒアルロナンを含むものであれば特に限定されない。本発明において、ヒアルロナンとは、交互にグリコシド結合したＤ−グルクロン酸とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンとを含む多糖、もしくはその誘導体、またはその塩である。特に、ヒアルロナンは、Ｄ−グルクロン酸の１位とＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの３位との結合が、β１−３結合であり、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンの１位とＤ−グルクロン酸の４位との結合が、β１−４結合であることが好ましい。
【００１９】
上記誘導体には、構成要素中のＤ−グルクロン酸および／またはＤ−Ｎ−アセチルグルコサミンの少なくとも１つが、これらの不飽和糖であるものが含まれる。特に、上記誘導体には、構成要素中の非還元末端糖が、その不飽和糖であるものが含まれる。特に、上記誘導体には、非還元末端に位置するＤ−グルクロン酸が、その４，５位炭素間が不飽和である不飽和糖であるものが含まれる。また、上記誘導体には、構成要素中の少なくとも１つの水酸基が保護基により保護されているものが含まれる。保護基は、加水分解性であることが好ましく、例えばアシル基（ＲＣＯ−（式中、Ｒは、低級アルキル、好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキルを示す。）であってもよい。
【００２０】
また、本発明においては、ヒアルロナンは塩であってもよい。具体的には、塩は、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリ（ｎ−ブチル）アミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、アミノ酸塩等のアミン塩などが含まれる。
【００２１】
また、本発明において、ヒアルロナンの重量平均分子量は、１万〜６００万であることが好ましく、１万〜４００万であることがさらに好ましい。後述するように、生体に分布するヒアルロナンの分子量の分布がこの範囲であるためである。なお、本明細書において、重量平均分子量は、粘度法による極限粘度からの換算値をいうものとする。
【００２２】
本発明において、測定の対象となる試料は、動物および植物等の生体由来の試料であってもよく、工業的に生産された試料であってもよい。特に、測定の対象となる試料は、動物（好ましくはヒト）由来の試料であることが好ましい。後述するように、本発明にかかるヒアルロナンの分子量測定方法は、診断方法や予測方法に応用できるためである。測定の対象となる試料が動物由来である場合には、関節液や皮膚などのヒアルロナンを豊富に含む生体材料に限られず、ヒアルロナンを含む任意の生体材料を試料として用いることができる。特に、試料は、血清、血管、リンパ液、リンパ管、リンパ節、胸腺、皮膚、軟骨、関節液、滑膜、臍帯、脳脊髄、髄液、尿、腎臓、子宮、肝臓、肺胞、肺胞液、肺サーファクタント、肝臓、眼球強膜および硝子体内液、ならびにこれらの臓器に発生した悪性腫瘍組織および炎症組織から選ばれる少なくとも１に由来することが好ましい。後述するように、従来の技術では測定が困難であった生体材料についても、本発明によると高い感度でヒアルロナンの分子量を測定できる。
【００２３】
生体由来の試料を使用する場合、試料として、電気泳動に適するように前処理されたものを用いることが好ましい。第一に、生体由来の試料を使用する場合には、タンパク質分解酵素を用いた酵素処理によって試料中のタンパク質を分解することが好ましい。タンパク質分解酵素として、プロテナーゼ、アクチナーゼ、コラゲナーゼ等を用いることができる。さらに必要に応じ、試料の前処理として、リパーゼや極性または非極性有機溶媒などによる脱脂処理を行うことが好ましい。極性または非極性有機溶媒として、アセトン、ヘキサン等を用いることができる。酵素処理後は、短時間加熱することが好ましい（例えば１００℃で５分）。不溶物が生じた場合、遠心によりこれを除くことが好ましい。これらの処理後の試料は、例えば、３倍量のエタノール等を加えて遠心し、生じた沈殿を蒸留水等に再溶解し、測定対象試料とすることが好ましい。
【００２４】
本発明においては、ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質が用いられる。本発明において、ヒアルロナン結合性タンパク質は、ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するものであれば特に限定されない。すなわち、本発明においては、ヒアルロナン結合性タンパク質として、ヒアルロナン結合性ドメインを有する任意のタンパク質を用いることができる。具体的には、ヒアルロナン結合性タンパク質として、アグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、ＬＹＶＥ−１、ＣＤ４４、ＴＳＧ−６、ＲＨＡＭＭ、ＧＨＡＰ(Glial hyaluronate binding protein)およびヒアルロネクチン(Hyaluronectin)、VI型コラーゲン、ならびにこれらのヒアルロナン結合性ドメインを有するタンパク質を挙げることができる。
【００２５】
また、ヒアルロナン結合性タンパク質として、化学発光用酵素が予め結合しているヒアルロナン結合性タンパク質（すなわち、化学発光用酵素により標識されたヒアルロナン結合性タンパク質）を用いることができる。後述するように、これにより、ヒアルロナンの特異的な検出をより少ない工程で行うことが可能となる。
【００２６】
化学発光用酵素は、通常の化学発光法に使用可能なものであれば特に限定されない。例えば、化学発光用酵素として、ペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）、アルカリフォスファターゼ等を用いることができる。
【００２７】
なお、ヒアルロナン結合性タンパク質として、化学発光用酵素が予め結合していないヒアルロナン結合性タンパク質を用いる場合、ヒアルロナン結合性タンパク質に化学発光用酵素を特異的に結合させることが必要になる。この場合、ヒアルロナン結合性タンパク質として、標識物質が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質を用い、当該標識物質との特異的な結合能を有する標識物質結合性物質が結合している化学発光用酵素をさらに用いることが好ましい。これにより、化学発光用酵素によるヒアルロナン結合性タンパク質の特異的な認識をより効率よく行うことができる。
【００２８】
上記特異的認識に用いられる標識物質および標識物質結合性物質の組み合わせとして、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジン等）等を用いることができる。特に、これらの組み合わせとして、ビオチンとアビジンを用いることが好ましい。具体的には、標識物質が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質と、標識物質結合性物質が結合している化学発光用酵素との組み合わせとして、ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質およびアビジン化学発光用酵素を用いることが好ましい。
【００２９】
なお、ヒアルロナン結合性タンパク質として、化学発光用酵素および標識物質のいずれも結合していないものも用いることができる。この場合、ＨＡＢＰとの特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質が結合している化学発光用酵素を用いることが好ましい。例えば、このような化学発光用酵素として、抗ＨＡＢＰ抗体が結合している化学発光用酵素を用いることができる。あるいは、ＨＡＢＰとの特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質を用い、ＨＡＢＰ結合性物質との特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質結合性物質が結合している化学発光用酵素をさらに用いることができる。例えば、このようなＨＡＢＰ結合性物質およびＨＡＢＰ結合性物質結合性物質が結合している化学発光用酵素として、抗ＨＡＢＰ抗体（一次抗体）および当該一次抗体を特異的に認識する抗体（二次抗体）が結合している化学発光用酵素を用いることができる。
【００３０】
本発明においては、化学発光用基質がさらに用いられる。化学発光用基質として、化学発光用酵素に応じて一般に市販されている種々の基質を用いることができる。例えば、ペルオキシダーゼに対してＴＭＢ(3,3'5,5'-tetramethylbenzidine)や、アルカリフォスファターゼに対してＢＣＩＰ／ＮＢＴ(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium)を用いることができる。
【００３１】
本発明にかかる分子量測定方法は、前記試料を電気泳動法により分離し、転写膜に転写するステップを含む。
【００３２】
ヒアルロナンを含む測定対象試料に、約同体積のグリセリン水溶液（例えば４０容量％）を添加し電気泳動用試料とすることができる。本発明によると、１レーンあたり０．５ｎｇのヒアルロナンを検出することができる。このため、さらに作業性等を考慮すると、電気泳動用ゲルにアプライする試料中のヒアルロナンの量は、１〜５０ｎｇ／レーンであることが好ましく、１〜２０ｎｇ／レーンであることがさらに好ましい。一般的な大きさの電気泳動用ゲルを用いる場合、１レーンあたりにアプライする試料の量は１〜５０μＬであることが好ましい。このため、本発明によると、測定対象試料に含まれるヒアルロナンの量は、２０ｎｇ／ｍＬ〜５０μｇ／ｍＬであることが好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。なお、測定対象試料に、グリセリン水溶液を添加する前に、必要に応じて試料を減圧濃縮することも可能である。
【００３３】
非特許文献１（Lee et al.）においては、ヒアルロナンの検出下限の推奨値は４μｇとされており、非特許文献４（Lest et al.）においては、ヒアルロナンの分子量は測定できていない。一方で、驚くべきことに、本願発明によると、従来の約１０００倍の感度である数ｎｇのヒアルロナンを測定することができた。これにより、例えば血液等のヒアルロナンの含有量が比較的少ない検体に対しても、ヒアルロナンの分子量を測定することが可能となる。
【００３４】
例えば、頻繁に実験動物として用いられるラットの各組織中のヒアルロナン含量は次のようなものである。脳：74μg/g，肺：34μg/g，腎臓：30μg/g，腸管：44μg/g，肝臓：4μg/g，リンパ液：1〜47μg/g，血漿：0.02-0.03μg/g（非特許文献５：Fraser & Laurent）。このヒアルロナン含量では、従来の測定方法によりヒアルロナン分子量を測定するためには、何頭分かの組織をまとめる必要があり、ヒアルロナン分子量の個体差を調べることは困難であった。しかしながら、本発明によると、一個体からの組織片で十分に測定できる。また、体液を用いる場合、従来の方法では動物を屠殺して採取しなければ十分な量のヒアルロナンが得られなかった。しかしながら、本発明によると、一個体を生かしたまま継続的に採取できる量でヒアルロナン分子量の測定が可能となる。さらに、これを人に応用すれば、バイオプシなどで得られる程度の組織片でヒアルロナン分子量の測定が可能になる。
【００３５】
なお、ヒアルロナンの濃度は、任意の方法で測定することができるが、ヒアルロナンに特異性が高く、感度に優れた方法で測定することが好ましい。ヒアルロナン濃度の測定方法として、例えばヒアルロナンを固定化したマルチウエルプレートへのヒアルロナン結合性タンパク質（HABP）の結合を阻害することで試料中のヒアルロナン含量を測定する方法（HA/HABP結合拮抗阻害法）を挙げることができる。
【００３６】
また、測定対象試料に含まれるヒアルロナンの分子量を決定するために、予め分子量の分かっているヒアルロナン標品溶液を標準試料として用いることが好ましい。標準試料は測定対象試料と同様に調製することができる。標準試料のアプライ量は、１レーンあたりヒアルロナン量として１ｎｇ程度でよい。もし、測定対象試料中のヒアルロナンの濃度の定量も行いたい場合には、標準試料のアプライ量を数段階用意することも可能である。
【００３７】
電気泳動用ゲルは、例えば、アガロースゲル、またはポリアクリルアミドゲルを用いることができるが、電気泳動ができるものであればこれらに限定されない。特に、電気泳動用ゲルがアガロースゲルであることが好ましい。これらのゲルは一般的な方法により調製することができる。例えば、電気泳動用ゲルとしてアガロースゲルを用いる場合、第一に、電気泳動用アガロースを、泳動用緩衝液（例えば、40mM Tris，5mM 酢酸ナトリウム，0.9mM EDTA，pH 8.0、ＴＡＥとも記す）に加熱溶解させる。この際、アガロースの濃度は０．５重量％〜０．７５重量％が好ましい。但し、アガロースの濃度は、予想されるヒアルロナン分子量に応じて調整することができる。さらに、加熱溶解させたアガロース溶液を、組み立てたゲル板に流し込み、サンプルコウムを差し込んで冷蔵庫などで冷やし固める。ゲルのサイズは任意であるが、例えば、縦横１０ｃｍｘ１０ｃｍ、厚さ２ｍｍとすることができる。また、キャピラリー電気泳動とすることもできる。
【００３８】
電気泳動法による分離は、例えば以下の手順および条件で行うことができる。すなわち、調製したゲルからサンプルコウムを抜き取り、泳動槽にセットしてＴＡＥ等の泳動用緩衝液を注入する。さらに、電気泳動用サンプルおよび分子量標準試料を、ウエルに注入する。例えば、泳動は定電圧で泳動ゲルの泳動方向の長さ１ｃｍあたり２．５Ｖ程度で行うことができる。この電圧の場合、泳動時間は、長さ１０ｃｍのサイズ、ゲル濃度０．７５重量％で５時間程度、ゲル濃度０．５重量％で３．５時間程度が好ましい。
【００３９】
電気泳動法により分離されたヒアルロナンの転写膜への転写は、例えば以下の手順および条件で行うことができる。すなわち、転写膜をＴＡＥ等の泳動用緩衝液に浸し、電気泳動後のゲルを載せる。さらにゲルの大きさに切った濾紙（Whatman 3MMなど）を３枚ないし４枚重ねてＴＡＥ等の泳動用緩衝液に浸したもので、ゲルと転写膜の上下を挟む。これを例えばセミドライ式のブロッターにセットする。転写は、例えばゲル１００ｃｍ2あたり１００ｍＡで、２時間で行うことができる。ヒアルロナンは陰イオン性多糖であることから、転写膜として、ポジティブチャージ膜（Amersham Bioscience社、Hybond N+など）、セルロース膜等、ポジティブイオンを持つ任意の膜を用いることができる。
【００４０】
なお、転写の前処理として、ヒアルロナンを部分低分子化する目的で、電気泳動後のゲルを鉄イオン処理することが好ましい。これにより、転写膜への転写をより効率的に行うことができる。鉄イオン処理は、例えば以下の手順および条件で行うことができる。すなわち、鉄イオン液中に泳動後のゲルを浸し、３０分間震盪する。その後、鉄イオン液を捨て、新たに泳動用緩衝液中で１５分ずつ２回震盪し、洗浄する。鉄イオン液として、ＴＡＥ等の泳動用緩衝液に、１２．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸と２５０ｍＭの硫酸第一鉄をさらに添加したものを用いることができる。
【００４１】
また、転写の後処理として、ヒアルロナン結合性タンパク質による処理の前に、転写膜をブロッキング処理することが好ましい。これにより、ヒアルロナン結合性タンパク質が転写膜に非特異的に吸着するのを防ぐことができる。ブロッキング処理は、例えば以下の手順および条件で行うことができる。すなわち、スキムミルク等のブロッキング剤を例えば50mM Tris-HCl、0.1M NaCl、pH7.5（ＴＢＳとも記す）に溶解し、必要に応じて使用直前に１００℃で５分間程度加熱したサケＤＮＡ等のブロッキング剤をさらに添加して得られたブロッキング液に、転写後の転写膜を接触させ室温で一晩震盪する。ブロッキング後の膜は、ヒアルロナン結合性タンパク質による処理の前に、例えば、ＴＢＳにより１０分ずつ２回洗浄することが好ましい。
【００４２】
本発明にかかる分子量測定方法は、前記転写膜に転写されたヒアルロナンと前記ヒアルロナン結合性タンパク質とを接触させて、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体を形成させるステップを含む。上記したように、ヒアルロナン結合性タンパク質として、化学発光用酵素により標識されたヒアルロナン結合性タンパク質、ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質、または化学発光用酵素および標識物質が結合していないヒアルロナン結合性タンパク質を用いることができる。
【００４３】
具体的には、例えば、ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質（ｂ−ＨＡＢＰとも記す）を、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳとも記す）または１／１０に希釈したブロックエースR（大日本住友製薬）に溶かし、０．１μｇ／ｍＬとする。膜を一枚あたり１０ｍＬのｂ−ＨＡＢＰ溶液に浸し、室温で１時間震盪する。
【００４４】
一の態様では、本発明にかかる分子量測定方法は、前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させて、化学発光法により前記複合体を検出するステップを含む。すなわち、前記酵素が前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合している場合、転写膜のヒアルロナン結合性タンパク質による処理により、化学発光用酵素とヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体が形成される。これにより、化学発光法によりヒアルロナンを検出することができる。
【００４５】
他の態様では、本発明にかかる分子量測定方法は、前記ヒアルロナン結合性タンパク質に直接的もしくは間接的に結合させた化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させて、化学発光法により前記複合体を検出するステップを含む。すなわち、前記酵素が前記ヒアルロナン結合性タンパク質に予め結合していない場合、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体に、前記酵素を直接的または間接的に結合させるステップが必要となる。
【００４６】
この場合、例えば、ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質およびアビジン化学発光用酵素のように、標識物質が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質と、標識物質結合性物質が結合している化学発光用酵素との組み合わせを用いることで、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体に前記酵素を直接的に結合させることができる。また、例えば、抗ＨＡＢＰ抗体（一次抗体）および当該一次抗体を特異的に認識する抗体（二次抗体）が結合している化学発光用酵素のように、ＨＡＢＰ結合性物質と、ＨＡＢＰ結合性物質結合性物質との組み合わせを用いることで、ヒアルロナン結合性タンパク質とヒアルロナンとの複合体に前記酵素を間接的に結合させることができる。
【００４７】
これは、転写膜を、特異的に結合する物質を含む溶液に順次接触させることで行うことができる。具体的には、例えば以下の手順および条件により、ヒアルロナン結合性タンパク質に化学発光用酵素を直接的に結合させることができる。すなわち、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０またはこれと相当の界面活性剤を加えたＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎとも記す）等でｂ−ＨＡＢＰで処理をした転写膜を１５分ずつ３回洗浄する。アビジン結合ホースラディッシュパーオキシダーゼ（Ａｖｉ−ＨＲＰとも記す）をｂ−ＨＡＢＰと同じ溶媒（ＰＢＳまたは１／１０ブロックエースR等）に溶かして０．０５μｇ／ｍＬとし、この中に膜を浸して室温で１時間震盪する。
【００４８】
化学発光法による検出は、化学発光用酵素と、前記酵素の基質とを反応させることで行うことができる。化学発光法による検出は、例えば以下の手順および条件で行うことができる。すなわち、膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等で１５分ずつ３回洗浄する。Ｘ線フィルム用のカセットに透明ラップをしき、その上に膜を載せる。市販の化学発光反応基質溶液（PIERCE社Supersignalなど）を用いて化学発光処理を行い、Ｘ線フィルム（富士フイルム社、RX-Uなど）を用いて写真撮影を行う。
【００４９】
本発明にかかる分子量測定方法によると、生体由来の試料中のヒアルロナンの分子量を高感度に測定することができる。すなわち、本発明によると、従来は、測定が困難であった微量のヒアルロナンしか含まない検体に対してもヒアルロナンの分子量を測定することが可能であり、このため本発明は、ヒアルロナン分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測する方法に応用することが可能である。すなわち、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測する方法であって、
上記方法を用いて、被験体から得られた試料に含まれるヒアルロナンの分子量を測定するステップと、
測定されたヒアルロナン分子量に基づき、被験体が前記疾患、障害または状態を被っている、または被る可能性を決定するステップと
を含む方法が提供される。
【００５０】
ヒアルロナンの分子量は、特定の疾患、障害または状態を被ると変化することから、本発明にかかる測定方法を用いて、生体由来の試料中におけるヒアルロナン分子量の増減を測定し、当該測定値を指標として、疾患、障害または状態を診断または予測することが可能である。
【００５１】
診断または予測の対象とする被験体は、特定の疾患、障害または状態とヒアルロナンの分子量の変化との関連が認められる動物であれば、特に限定されないが、特にヒトであることが好ましい。また、被験体から得られた試料は、特定の疾患、障害または状態において、ヒアルロナンの分子量の変化が認められる生体材料であれば、特に限定されない。得られた試料に対して、上記した分子量測定方法により、当該試料に含まれるヒアルロナンの分子量を測定することができる。
【００５２】
診断または予測することのできる疾患、障害または状態は、ヒアルロナン分子量の変化と関連する疾患、障害または状態であれば特に限定されない。具体的には、診断または予測することのできる疾患、障害または状態として、加齢、リウマチ、関節症、癌、皮膚炎、ＣＰＤ（慢性閉塞性呼吸障害）、肺線維症、肝炎、肝硬変、腎炎、アレルギー性腸炎、および出産時の子宮頸部熟化が挙げられる（非特許文献６：Jiang D. et al，非特許文献７：Dahl LB et al，非特許文献８：Wang PM et al，非特許文献９：Yada T et al）
【００５３】
例えば、リウマチを罹患することにより、患部関節内ヒアルロナンの分子量は低下し、症状の回復に従って正常な分子量に復帰していくことが知られている（非特許文献１０：Holmess MW et al）。分子量低下の程度には個人差があり、これが症状の程度の個人差を反映していると思われるので、分子量を測定することで個人に適合した治療を選ぶことが出来る。関節液は健常人ではほとんど採取できず、健常人の関節液に含まれるヒアルロナンの分子量は求めることが困難である。しかし、本発明によると、ごく少量の関節液からでもヒアルロナンの分子量を求めることができ、また、バイオプシで採取した滑膜や軟骨に含まれるヒアルロナンの分子量も測定が可能である。
【００５４】
また、関節症を罹患することにより、リウマチ同様にヒアルロナンの分子量は低下することが知られている（非特許文献１１：Tanimoto K. et al）。これは患部の炎症部位での活性酸素の働きによるところが大きく、したがって症状の程度を反映していると考えられている。分子量を測定することは、リウマチ同様、患者個人の症状の度合いを知る手だてとなる。
【００５５】
さらに、癌を罹患すると、癌組織の内外でヒアルロン酸の生産量が増大する。高分子量のヒアルロナンは、癌細胞の周辺組織への浸潤を促進することが知られており、また低分子量のヒアルロン酸は血管の新生を促し、癌組織の栄養補給に貢献すると考えられている（非特許文献１２：Hopwood J et al，非特許文献１３：Allerton SE et al，非特許文献１４：Horai T et al，非特許文献１５：Roboz J et al，非特許文献１６：Kawai T et al，非特許文献１７：Takeuchi J et al，非特許文献１８：Takeuchi J et al，非特許文献１９：Kojima J et al，非特許文献２０：Arnold F et al）。したがって癌組織内外の局所的なヒアルロナンの分子量を測定することで、その癌組織の悪性度をモニターすることができる。例えば癌の周辺領域と癌組織とでヒアルロナンの分子量を比較し、周辺部でヒアルロナンの低分子化が進んでいればヒアルロニダーゼ活性の増加が窺われ、生じる低分子ヒアルロナンによる血管新生促進を予測することができる。また、周辺部でも高分子量のヒアルロナンが多く見られるようならば、その癌細胞は周辺組織への浸潤の活性が高いことを窺うことが出来る。
【００５６】
さらに、本発明の他の側面によると、ヒアルロナンの分子量を測定するためのキット、およびヒアルロナンの分子量の変化と関連する疾患、障害または状態を診断または予測するためのキットが提供される。本発明にかかるキットは、上記ヒアルロナンの分子量測定方法または診断、予測方法に特に適した試薬を含むものである。当該キットにより、試料中のヒアルロナン分子量を簡便かつ高感度に測定することができ、被験体からのより少量の試料により診断または予測が可能となる。
【００５７】
一の態様では、本発明にかかるキットは、ヒアルロナンとの特異的な結合能を有し、化学発光用酵素が結合しているヒアルロナン結合性タンパク質（例えば、化学発光用酵素により標識されたヒアルロナン結合性タンパク質）を含む。
【００５８】
他の態様では、本発明にかかるキットは、（１）ヒアルロナンとの特異的な結合能を有するヒアルロナン結合性タンパク質と、（２）前記ヒアルロナン結合性タンパク質と直接的または間接的に特異的に結合させることができる化学発光用酵素とを含む。
【００５９】
このような態様においては、化学発光用酵素が、ヒアルロナン結合性タンパク質との特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質が結合していることが好ましい。例えば、当該キットは、（１）ヒアルロナン結合性タンパク質と、（２）抗ＨＡＢＰ抗体が結合している化学発光用酵素とを含むことが好ましい。
【００６０】
あるいは、このような態様においては、前記ヒアルロナン結合性タンパク質が標識物質に結合しており、前記化学発光用酵素が前記標識物質との特異的な結合能を有する標識物質結合性物質に結合していることが好ましい。例えば、当該キットは、（１）ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質と、（２）アビジン化化学発光用酵素とを含むことが好ましい。
【００６１】
あるいは、この態様においては、当該キットが、ヒアルロナン結合性タンパク質との特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質をさらに含み、前記化学発光用酵素が、ＨＡＢＰ結合性物質との特異的な結合能を有するＨＡＢＰ結合性物質結合性物質が結合していることが好ましい。例えば、当該キットは、（１）ヒアルロナン結合性タンパク質と、（２）抗ＨＡＢＰ抗体（一次抗体）と、（３）当該一次抗体を特異的に認識する抗体（二次抗体）が結合している化学発光用酵素とを含むことが好ましい。
【００６２】
これらのキットにおけるヒアルロナン結合性タンパク質、標識物質、標識物質結合性物質、化学発光用酵素等については、上述した本発明にかかる分子量測定方法と同様に選択することができる。
【００６３】
本発明にかかるキットは、前記酵素の基質をさらに含むことが好ましい。また、本発明にかかるキットは、測定において通常必要とされる緩衝液、分子量標準試料等を必要に応じ本発明の所望の効果を損なわない限りにおいて、その構成要素とすることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの記載によって限定されるものではない。
【００６５】
［１．サンプルの調製］
生体試料として、マウス頸部リンパ節断片を用いた。生体試料に対して、タンパク質分解酵素（プロナーゼ）による酵素処理を行った。さらに、アセトンなどによる脱脂処理を行った。酵素処理後１００℃で５分間加熱し、不溶物を遠心により除いた。
【００６６】
［２．ヒアルロナン濃度の測定］
得られた酵素処理液に３倍量のエタノールを加えて遠心し、沈殿を蒸留水に再溶解し、測定対象試料とした。この溶液に含まれるヒアルロナン濃度は１．４〜９．８μｇ／ｍＬであった。
【００６７】
［３．電気泳動用サンプルの調製］
得られたヒアルロナン濃度に基づき、０．５から３．７μＬの酵素処理液（ヒアルロナン約５ｎｇ相当）に同体積の４０％グリセリンを加え、電気泳動用試料とした。
【００６８】
［４．電気泳動用ゲルの調製］
電気泳動用アガロースを適量取り、ＴＡＥ中で加熱溶解した。アガロース濃度は、０．５％とした。アガロース溶液を組み立てたゲル板に流し込み、サンプルコウムを差し込んで冷蔵庫などで冷やし固めた。ゲルのサイズは、縦横１０ｃｍｘ１０ｃｍで、厚さ２ｍｍとした。
【００６９】
［５．電気泳動］
得られたゲルのサンプルコウムを抜き取り、泳動槽にセットしてＴＡＥを注入した。調製した電気泳動用試料および分子量標準試料をウエルに注入した。泳動は定電圧で、泳動ゲルの泳動方向の長さ１ｃｍあたり２．５Ｖとした。泳動時間は、３．５時間とした。
【００７０】
［６．鉄イオン処理］
１２．５ｍＭのＬ−アスコルビン酸と２５０ｍＭの硫酸第一鉄を含むＴＡＥ中に泳動後のゲルを浸し、３０分間震盪した。その後、鉄イオン液を捨て、新たにＴＡＥ中で１５分ずつ２回震盪し、洗浄した。
【００７１】
［７．ポジティブチャージ膜への転写］
ポジティブチャージ膜（Amersham Bioscience社 Hybond N+）をＴＡＥに浸し、その上に鉄イオン処理後のゲルを載せた。さらにゲルの大きさに切った濾紙（Whatman 3MM）を３枚ないし４枚重ねてＴＡＥに浸したものでゲルと膜の上下を挟んだ。これをセミドライ式のブロッターにセットした。転写は、ゲル１００ｃｍ2あたり１００ｍＡで２時間行った。
【００７２】
［８．ブロッキング］
スキムミルクをＴＢＳに溶かして１０％とし、さらに使用直前に１００℃で５分間加熱したサケＤＮＡを０．２ｍｇ／ｍＬになるよう加え、転写後の膜をこれに浸した。室温で一晩震盪した。
【００７３】
［９．ＨＡＢＰ処理］
ブロッキング後の膜をＴＢＳで１０分ずつ２回洗浄した。ビオチン化ヒアルロナン結合性タンパク質（生化学工業）を、ＰＢＳに溶かし、０．１μｇ／ｍＬとした。膜を一枚あたり１０ｍＬのビオチン化ＨＡＢＰ溶液に浸し、室温で１時間震盪した。
【００７４】
［１０．アビジン−ＨＲＰ処理］
０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳで膜を１５分ずつ３回洗浄した。アビジン結合ホースラディッシュパーオキシダーゼ（インビトロジェン）をＰＢＳに溶かして０．０５μｇ／ｍＬとし、この中に膜を浸して室温で１時間震盪した。
【００７５】
［１１．化学発光処理］
膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１５分ずつ３回洗浄する。Ｘ線フィルム用のカセットに透明ラップをしき、その上に膜を載せた。市販の化学発光反応基質溶液（PIERCE社SuperSignal）を用いて化学発光処理を行い、Ｘ線フィルム（富士フイルム社、RX-U）を用いて写真撮影を行った。
【００７６】
［結果］
図１に、本発明にかかる分子量測定方法により、マウス頸部リンパ節に含まれるヒアルロナンの分子量を測定した結果を示す。図１に示すように、ヒアルロナン約５ｎｇを含む試料から、５匹のマウスからとられた頸部リンパ節のヒアルロナン分子量が約８０万であることを測定できた。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明にかかる分子量測定方法により、マウス頸部リンパ節に含まれるヒアルロナンの分子量を測定した結果を示す。
【図１】
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