(57)【要約】      （修正有）【課題】ＩκＢＬが関与するＮＦ-κＢ活性化シグナル伝達経路のシグナル伝達機構を解明することにより、当該経路を調節し、当該経路が関与する疾患を予防及び／又は治療する効能を有する薬剤を提供する。【解決手段】ＩκＢＬの安定性を向上させることによりオルタナティブＮＦ-κＢ活性化経路を抑制的に調節しうる薬剤。この薬剤は、ＭＧ１３２等のプロテオソーム阻害剤、あるいはＵＳＰ９Ｘ等の脱ユビキチン化酵素、あるいはＩκＢＬ又はプロテオソーム阻害剤をコードする遺伝子からなるのが好ましい。薬剤は、オルタナティブのＮＦ-κＢ活性化経路におけるＩκＢＬを安定化させ、その抑制的作用を発揮させることにより、当該経路に関連する疾患の予防／治療にも有効である。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩκＢＬの安定性を向上させることによりオルタナティブＮＦ-κＢ活性化経路を抑制的に調節しうる薬剤。
【請求項２】
プロテオソーム阻害剤からなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
プロテオソーム阻害剤がＭＧ１３２又はその機能的類縁体である請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
脱ユビキチン化酵素からなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
脱ユビキチン酵素がＵＳＰ９Ｘ又はその機能的類縁体である請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
ＩκＢＬ又は脱ユビキチン化酵素をコードする遺伝子を含んでなる請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の薬剤からなる関節リウマチの予防又は治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩκＢＬ（遺伝子名：ＮＦＫＢＩＬ１）の安定性を向上させることによりオルタナティブ(alternative)のＮＦ-κＢ活性化シグナル伝達経路を特異的に調節することのできる薬剤に関する。さらに本発明は、当該経路に阻害的に作用するＩκＢＬの活性を維持することにより関節リウマチ等の当該経路が関与する疾患の予防／治療に有効な薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明者等は、ヒトゲノムに所定間隔で配置したマイクロサテライト遺伝多型マーカーを用い、疾患感受性遺伝子をゲノムワイドに特定する研究を行ってきている。例えば、特許文献１では、マイクロサテライトを用いたマッピング方法により数種の新たな関節リウマチ感受性遺伝子を特定した。特許文献１に記載したマッピング方法による解析においても、従来から指摘されているＩκＢＬ遺伝子と関節リウマチとの相関が確認され、当該方法の有効性を裏付けるものであった。
【０００３】
ＩκＢＬ遺伝子は、ヒト第６染色体のＭＨＣクラスＩＩＩ領域のテロメル側に位置することが知られている。Shibata等は、ＩκＢＬに存在する４つのＳＮＰｓの１６通りの可能な組み合わせのうち５つが日本人集団に共通して見出されることを報告し（非特許文献１）、それらをＩκＢＬｐ*０１〜０５と呼称している（図１参照）。
Shibata等（非特許文献１）は、関節リウマチ（ＲＡ）患者（n=120）及び健常者（n=217）について解析し、ＲＡ患者においてＩκＢＬｐ*０１の頻度が増加しているが（73.3%対58.1%；オッズ比1.99）、他の６３Ｔ含有アレルは増加していないことを見出した。このことは、ＲＡに対する感受性が６３Ｔのみではなく、ＩκＢＬプロモーターにある一塩基多型の組み合わせによることを示唆している。
【０００４】
またShibata等は、ＩκＢＬｐ*０１、ＩκＢＬｐ*０２、ＩκＢＬｐ*０３及びＩκＢＬｐ*０５のホモ接合体から誘導されたＢリンパ芽球様細胞株におけるＩκＢＬの定常状態ｍＲＮＡレベルを測定した（図２)。その結果、１２の異なる細胞株間でGAPDHにより規格化されたＩκＢＬのｍＲＮＡの量は有意に変動したが（one-way ANOVA、F(1,11)=10.82、p=0.0072)、同じジェノタイプを持つ３つの細胞株を含む４つの群各々における変動は有意ではなかったと報告している。即ち、変動の主要な因子の一つはＩκＢＬジェノタイプにおける相違であると考えられる。ジェノタイプ間の比較のpost hoc分析は、ＩκＢＬｐ*０１の発現レベルが他のものに比較して低いという一貫した傾向を示した。これらの結果は、ＩκＢＬｐ*０１に関連するプロモーター活性の低下がＲＡに対する感受性に寄与することを示唆している。
【０００５】
一方、Albertella及びCampbell（非特許文献２）は、ＩκＢＬアミノ酸配列と既知のタンパク質の配列との類似性についてNBRF及びSwissProtデータベースを用いてスクリーニングし、アミノ酸６０と１５１の間のアンキリンリピートとして知られた３３アミノ酸リピートの２つの完全な、そして１つの部分的なコピーの存在を明らかにした（図３）。アンキリンリピートの最大配列同一性は、ＩκＢファミリーのタンパク質、特にｐ１００ＮＦ-κＢ２のものとの間に見られた。ＩκＢＬの第１及び第２の完全アンキリンリピートは、ＩκＢファミリーの第２及び第３のリピートと極めて類似し、ＮＦ-κＢｐ１００におけるこれらのリピートと４４％同一性及び５８％類似性を有している。
【０００６】
ＮＦ-κＢｐ１００はオルタナティブＮＦ-κＢ活性化シグナル伝達経路において重要な役割を果たしていることが知られている。種々の総説（例えば、非特許文献３参照）に記載されているように、ＮＦ-κＢを活性化するシグナル経路としてクラシカル(Classical)経路及びオルタナティブ(alternative)経路とが提唱され、クラシカル経路は、炎症反応、細胞生存、あるいは自然免疫等に関与し、オルタナティブ経路はリンパ器官発生や破骨細胞形成等に関与すると言われている（図４参照）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−２７８４７９号公報
【非特許文献１】Shibata等, Hum. Immunol., Vol.67(4-5), p.363-373, 2006
【非特許文献２】Albertella and Campbell, Hum. Mol. Genet., Vol.3(5), p.793-799 (1994)
【非特許文献３】Beinke and Ley, Biochem.J., 382, 393-409 (2004)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明者等は、ＮＦ-κＢファミリーのｐ１００のアンキリンリピートと高い相同性を持つアンキリンリピートを有するＩκＢＬのＮＦ-κＢ活性化シグナル伝達における役割を詳細に検討することによりシグナル伝達機構を解明し、当該経路を調節して、ひいては当該経路が関与する疾患を予防及び／又は治療する効能を有する薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
かかる課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＩκＢＬはＮＦ-κＢのオルタナティブ経路に関与する転写因子ｐ５２やＲｅｌＢに結合し、その経路の活性化を特異的に阻害することを見出した。さらに、ＩκＢＬはユビキチン化されることが判明し、ユビキチン化されたタンパク質の分解に関与するプロテオソームの阻害剤であるＭＧ１３２の存在下においては、その細胞内安定性が上昇することも明らかになった。また、ＩκＢＬは脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ９Ｘ(Ubiquitin Specific Protease 9X)と結合することも示され、この脱ユビキチン化酵素がＩκＢＬの安定化に関与していることが示唆された。
【００１０】
オルタナティブ経路に関与するタンパク質であるｐ１００は、破骨細胞分化に深く関与するreceptor activator of ＮＦ-κＢ（ＲＡＮＫ）受容体の下流に位置し、細胞がＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）によって刺激されたとき、ユビキチン化依存的にｐ５２にプロセッシングされることが知られている（図１５参照）。また、RAW264.7マウスmonocyte/macrophage細胞は、ＲＡＮＫＬによる刺激を受けると破骨細胞に分化することも知られている。従って、この細胞をＲＡＮＫＬで処理すると、ＲＡＮＫＬの濃度依存的に、破骨細胞マーカータンパク質であるtartrate-resistant acid phosphatase（ＴＲＡＰ）の細胞内活性が上昇した（実施例６参照）。しかし、ＩκＢＬを一過性に過剰発現している細胞を用いると、その活性の上昇が阻害された（実施例６参照）。逆に、ＲＮＡｉを用いて内在性のＩκＢＬの発現を抑制した場合、ＲＡＮＫＬ処理後の細胞内ＴＲＡＰ活性は、コントロール(scramble RNAi)に比べて上昇した（実施例６参照）。これらの結果は、ＩκＢＬが破骨細胞分化に対し、阻害的に働く因子であることを示唆している。ＩκＢＬは、オルタナティブ経路を不活性化し、破骨細胞分化を阻害することによって、必要以上に骨破壊が起こることを防止し、関節リウマチに対して抑制的に作用するものと考えられる。このことは、実際にＩκＢＬ遺伝子に感受性アリルを持ち、その発現量が低下している人において関節リウマチが高頻度で発症しているという事実と一致する。
【００１１】
ＩκＢＬが、実際に破骨細胞分化阻害因子であるならば、このタンパク質が破骨細胞前駆細胞であるmacrophage中に存在することは意味をなさない。そこで、ＲＡＮＫＬにより刺激を受けたRAW264.7細胞中でのＩκＢＬタンパク質量を、ウエスタン法を用いて解析した。その結果、ＲＡＮＫＬ処理開始後約２４時間頃に、一時的にＩκＢＬのタンパク量が減少することがわかった（実施例７参照）。これに対し、良く知られているように、ＲＡＮＫＬはｐ１００の発現を誘導した（実施例７参照）。また、ＲＡＮＫＬはｐ１００のプロセッシングをも誘導し、ｐ５２の細胞内タンパク量を上昇させることも知られている（例えば、Novack等, J. Exp. Med., 198, 771-781 (2003)参照）。従って、ＲＡＮＫＬは転写因子ｐ５２の細胞内量を上昇させると同時に、その阻害因子であるＩκＢＬの量を減少させ、破骨細胞分化に必要な遺伝子の発現を誘導すると考えられる。
【００１２】
よって、ＩκＢＬの活性あるいは安定性を向上させてＮＦ-κＢ活性化シグナル伝達のオルタナティブ経路を不活性化することにより、関節リウマチの発症や進行を抑制することが可能であると考えられる。本発明は、シグナル伝達に直接関与するＩκＢＬのみならず、特にＩκＢＬの安定性に関与することが見出されたプロテオソーム阻害剤や、ＩκＢＬと相互作用する脱ユビキチン化酵素であるＵＳＰ９Ｘが、関節リウマチ等のＮＦ-κＢのオルタナティブ経路が関与する疾患治療に対する新たな創薬ターゲットになりうることを初めて見出したものである。
【００１３】
即ち本発明は、ＩκＢＬの安定性を向上させることによりオルタナティブＮＦ-κＢ活性化経路を抑制的に調節しうる薬剤を提供するものであり、当該薬剤は、ＭＧ１３２等のプロテオソーム阻害剤やＵＳＰ９Ｘ等の脱ユビキチン化酵素であり得る。
本発明に係る薬剤は、オルタナティブＮＦ-κＢ活性化経路に阻害的に作用するＩκＢＬを安定化させ、その抑制的作用を発揮させることにより、当該経路が関与する種々の疾患、例えば関節リウマチの予防又は治療薬としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
後述する実施例においても示唆されるように、ＩκＢＬはユビキチン化されることによりプロテオソームによって分解されると解される。本発明の薬剤は、当該一連の分解反応を阻害することによって細胞内におけるＩκＢＬの安定性を向上させ、その活性を維持する機能を有する物質である。
【００１５】
従って、本発明の第一の態様は、プロテオソーム阻害剤からなる薬剤である。プロテオソームの作用を阻害することにより、ＩκＢＬがユビキチン化されてもプロテオソームによる分解が抑制され、その結果ＩκＢＬが安定化され得る。
本発明で使用しうるプロテオソーム阻害剤としては、特に限られるものではないが、例えば、下記式で表されるＭＧ１３２：
【化１】
2008127322.tif 000003
又はその機能的類縁体が挙げられる。ここで、機能的類縁体とは、上記ＭＧ１３２と化学構造は相違するが同等の機能を有する化合物を意味し、例えば、プロテオソーム阻害剤として既知の化合物、あるいは同等の機能を有する類似構造の化合物を包含する。例えば、下記式で表されるBertezomib(PS341)：
【化２】
2008127322.tif 000004
等を挙げることができる。
【００１６】
次に、本発明の第二の態様は、脱ユビキチン化酵素からなる薬剤である。脱ユビキチン化酵素によってＩκＢＬが脱ユビキチン化されることにより、プロテオソームによる分解作用を受けず、その結果ＩκＢＬが安定化され得ると考えられる。
本発明で使用しうる脱ユビキチン化酵素としては、特に限られるものではないが、例えば、ＵＳＰ９Ｘ等を挙げることができる。
【００１７】
本発明における薬剤は、上記のプロテオソーム阻害剤あるいは脱ユビキチン化酵素そのものからなるものでもよいが、それらの機能的類縁体（脱ユビキチン化酵素とアミノ酸配列は相違するが同等の機能を有する物質）であってもよい。
また、本発明の薬剤は、ＩκＢＬ又は脱ユビキチン化酵素あるいはそれらの機能的類縁体をコードする遺伝子であってもよく、当該遺伝子は、ベクターに組み込まれた形態であって、細胞内でＩκＢＬ又はＵＳＰ９Ｘ等の脱ユビキチン化酵素を発現できるものでもよい。
【００１８】
本発明の薬剤は、プロテオソームの機能を阻害することにより、あるいはＩκＢＬを脱ユビキチン化することによってプロテオソームによる分解を受け難くすることにより、ＩκＢＬの安定性を向上させ、オルタナティブのＮＦ-κＢ活性化経路に対する阻害的作用を発揮させることができる。従って、オルタナティブのＮＦ-κＢ活性化によって発症又は進行する各種疾患の症状を防止又は抑制することが可能である。そのような症状としては骨破壊などが挙げられ、この症状を特徴とする関節リウマチの予防／治療薬としての効能を有するものと考えられる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例に則して本発明を詳細に説明する。
（実施例１）
ＮＦ-κＢ結合部位をＴＡＴＡボックスの上流に持つプロモーターをルシフェラーゼ遺伝子の上流にクローンしたレポーターコンストラクトを、ヒトＨＥＫ２９３細胞に一過性に導入した。その細胞を、ＩκＢＬ過剰発現の有無において、ＴＮＦα、ＩＬ１β又はＮＩＫで活性化したときのルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図６に示す。
【００２０】
ＩκＢＬの過剰発現の有無は、ヒトＩκＢＬをＣＭＶプロモーターの制御下に発現するプラスミドを同時に導入する（ＩκＢＬ有り）又はＩκＢＬ発現用のベクターのみを導入する（ＩκＢＬ無し）ことにより制御した。図中、各活性化物質（ＴＮＦα等）についての棒グラフのうち左側がＩκＢＬ無し、右側がＩκＢＬ有りの結果を示す。
【００２１】
細胞をクラシカル経路又はオルタナティブ経路を活性化する各物質（図４、５参照）で処理した後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定した。具体的な活性化処理としては、ＴＮＦα及びＩＬ１βについては当該物質を培地に加えることにより、ＮＩＫについてはＮＩＫ発現プラスミドをレポーターコンストラクトと同時に細胞に一過性に導入することにより実施した。図中の「Ｎｏ］は活性化処理を行っていない細胞の結果を示す。
【００２２】
ＴＮＦα、ＩＬ１β及びＮＩＫは全てＮＦ-κＢ結合部位を持つプロモーターを活性化した（Ｎｏとの比較）。しかしながら、クラシカル経路を活性化することが知られているＴＮＦα及びＩＬ１βで処理した場合には、ＩκＢＬ過剰発現の有無によって活性化の程度に大きな変化は見られなかったが、クラシカル経路に加えオルタナティブ経路を活性化するＮＩＫで処理した場合には、ＩκＢＬの過剰発現によってプロモーター活性が顕著に減少した。
以上の結果から、ＩκＢＬがＮＦ-κＢのオルタナティブ経路に対して特異的に作用する阻害剤となりうることが示唆された。
【００２３】
（実施例２）
精製用の２種類のタグ（S-tag及びFLAG-tag)を付したヒトＩκＢＬを安定的に過剰発現するＨｅＬａ細胞を構築した。その細胞中よりＩκＢＬをタンデムアフィニティ精製(tandem affinity purification)法を用いてマイルドな条件下で精製し、ＩκＢＬとともに精製されてくるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。結果を図７に示す。図中「＋」のレーンは上述のＩκＢＬ過剰発現細胞を用いた結果であり、「−」のレーンはＩκＢＬ発現用のベクターのみを用いて構築した細胞株からの結果である。ゲルから抽出したタンパク質の同定には質量分析装置を用いた。
【００２４】
図７に示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＩκＢＬとともに精製されてくる数種のタンパク質が存在することが明らかになった。図７に矢印で示したタンパク質を質量分析装置を用いて解析したところ、基質特異的な脱ユビキチン化酵素（ＵＳＰ９Ｘ）であることが判明した。
【００２５】
次いで、ヒトＵＳＰ９Ｘのマウスオーソロガス遺伝子であるFat facet in mouse（ＦＡＭ）のｃＤＮＡを入手し、ヒトＨＥＫ２９３細胞中でヒトＩκＢＬと共発現させたところ、それら２つのタンパク質は免疫沈降（ＩＰ）で共沈することが示された。結果を図８に示す。この結果は、ＩκＢＬがＵＳＰ９Ｘに結合することを示唆し、タンデムアフィニティ精製法で得られた結果を支持するものである。
【００２６】
（実施例３）
ＮＩＫ過剰発現によって刺激されたとき、ＵＳＰ９Ｘはｐ１００と相互作用することが知られている(Bouwmeester等, Nature Cell Biology, 6, 97-105 (2002))。そこで、ＵＳＰ９Ｘに結合するＩκＢＬもクラシカル又はオルタナティブのＮＦ-κＢ経路に属するタンパク質と相互作用するか否かを検討した。
【００２７】
ＦＬＡＧタグを付したヒトＩκＢＬをヒトＨＥＫ２９３細胞中で一過性に発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＩκＢＬを免疫沈降（ＩＰ）させた後、ＮＦ-κＢシグナル伝達（クラシカル及びオルタナティブ経路）に関与するとされている各種タンパク質に対する抗体を用い、それらのタンパク質がＩκＢＬと共沈するか否かをウエスタンブロットにより解析した。また、各タンパク質が細胞抽出液(Extract)中に存在するか否かもウエスタンブロットにより確認した。結果を図９に示す。
【００２８】
クラシカル経路については、ＴＮＦ-αを添加することにより活性化し、オルタナティブ経路はＮＩＫを過剰発現させることにより活性化した。図９に示すように、クラシカル経路に関与することが知られているｐ５０及びｐ６５は刺激物質であるＴＮＦ-αの有無にかかわらず全細胞抽出液中に存在している。また、ＴＮＦ-αを細胞培養液中に添加した際に、クラシカル経路が活性化された状態にあることは、リン酸化されたｐ６５（Ｐ-ｐ６５）が検出されることから明らかである。しかしながら、これらタンパク質はクラシカル経路活性化の有無にかかわらずＩκＢＬと共沈しなかった。一方、オルタナティブ経路に関与するタンパク質であるｐ１００及びＲｅｌＢは刺激物質ＮＩＫの有無によらず全細胞抽出液中に存在するが、これらタンパク質はＮＩＫによってオルタナティブ経路が活性化されたときにのみＩκＢＬと相互作用した。また、ＮＩＫによる刺激によりｐ１００がプロセスされｐ５２が全細胞抽出液中に検出されるが、このタンパク質もＩκＢＬと共沈した。
これらの結果から、実施例２においても示されたように、ＩκＢＬがＮＦ-κＢのオルタナティブ経路に関与するタンパク質であることが更に裏付けられた。
【００２９】
（実施例４）
ＦＬＡＧタグを付したヒトＩκＢＬと、ＨＡタグを付したユビキチンとを、ヒトＨＥＫ２９３細胞中で一過性に発現させ、抗ＦＬＡＧ抗体を用いて免疫沈降させた後、抗ＨＡ抗体を用いてＩκＢＬのユビキチン化をウエスタンブロットにより解析した（図１０参照）。
さらに、ＦＬＡＧタグを付したヒトＩκＢＬを一過性に発現しているＨＥＫ２９３細胞を、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２で様々な時間処理した後、細胞中のＩκＢＬタンパク量を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した（図１１右側）。コントロールとしてはＭＧ１３２を溶解するために用いたＤＭＳＯのみで処理したものを用いた(図１１左側）。ローディングコントロール(Loading control)としてはアクチンを用いた（図１１の下側）。
【００３０】
図１０及び１１から、ＨＥＫ２９３細胞中でectopicallyに発現させたＩκＢＬはユビキチン化されており、プロテオソーム活性が阻害されたときに、その細胞内量が増加したことがわかる。即ち、ＩκＢＬの安定性が少なくとも一部はプロテオソームによる分解によって調節されていることが示唆された。上述の実施例で示されたように、ＩκＢＬは脱ユビキチン化酵素ＵＰＳ９Ｘと結合する。その結果ＩκＢＬは脱ユビキチン化され、それによりプロテオソームによる分解を免れて安定化している可能性がある。
【００３１】
（実施例５）
実施例１と同様のリポーターアッセイを使用してＲＮＡ干渉実験を行った。ＲＮＡ干渉には、プラスミドベクターよりsmall hairpin RNA（ｓｈＲＮＡ）を発現させることにより実施し、オルタナティブ経路はＮＩＫの過剰発現により活性化した。また、コントロールにはscrambled ｓｈRNA配列を用いた。結果を図１２に示す。
【００３２】
図１２に示されるように、ＮＩＫの過剰発現がない場合にはルシフェラーゼ活性は観察されず、ＮＩＫにより活性化された場合には、ＲＮＡ干渉によりＩκＢＬ又はＵＳＰ９Ｘの発現が抑制されると、ルシフェラーゼ活性がコントロールに比較して格段に向上した。
即ち、内在性(endogeneous)のＩκＢＬ及びＵＳＰ９ＸがＮＩＫによって活性化されるＮＦ-κＢ経路を阻害的に調節していることが確認された。本実施例の結果は、上述の実施例１の結果とも合致するものである。
【００３３】
（実施例６）
マウスmonocyte/macrophage細胞株RAW264.7を、図１３の横軸に示した濃度のＲＡＮＫＬで処理した。その結果、ＲＡＮＫＬの濃度依存的に、破骨細胞マーカータンパク質であるtartrate-resistant acid phosphatase (ＴＲＡＰ) の細胞内活性が上昇した（図１３の左側パネル、各濃度の左側の棒グラフ）。しかし、ＩκＢＬを一過性に過剰発現している細胞を用いると、その活性の上昇が阻害された（図１３の左側パネル、各濃度の右側の棒グラフ）。逆に、ＲＮＡｉを用い内在性のＩκＢＬの発現を抑制した場合、ＲＡＮＫＬ処理後の細胞内ＴＲＡＰ活性は、コントロール（scramble RNAi）に比べて上昇した。
これらの結果は、ＩκＢＬが破骨細胞分化に対し、阻害的に働く因子であることを示唆している。
【００３４】
（実施例７）
ＲＡＮＫＬにより刺激されたRAW264.7細胞中でのＩκＢＬタンパク量を、ウエスタン法を用いて解析した。結果を図１４に示す。図１４に見られるように、ＲＡＮＫＬ処理開始後約２４時間頃に、一時的にＩκＢＬのタンパク量が減少することが判った。一方、従来から知られているように、ＲＡＮＫＬがｐ１００の発現を誘導することも確認された。また、データは示さないが、ＲＡＮＫＡＬがｐ１００のプロセッシングをも誘導し、ｐ５２の細胞内タンパク量を上昇させることも知られている。
従って、ＲＡＮＫＬは転写因子ｐ５２の細胞内量を上昇させると同時に、その阻害因子であるＩκＢＬの量を減少させ、破骨細胞分化に必要な遺伝子の発現を誘導すると考えられる。
【００３５】
以上の結果に基き、ＩκＢＬはリウマチ発症に関して次の様な関与をしているのではないかと推察される。
ＲＡＮＫＬ刺激を受けていない破骨細胞前駆細胞においては、オルタナティブ経路は活性化されておらず、ＲｅｌＢ等も細胞質中に存在し、破骨細胞分化に必要な遺伝子は誘導されていない。しかし、何らかの理由でｐ５２／ＲｅｌＢ complexが形成され核内に移行すると、必要でない時や場所において破骨細胞分化を起こす遺伝子群が誘導される恐れがある。ＩκＢＬには核移行シグナルが存在し、主に核内に局在することが知られているが、破骨細胞前駆細胞の核内に存在するＩκＢＬは、この不必要な遺伝子発現を阻害し、破骨細胞分化が過剰に起る事を妨げていると推測している。
リウマチ患者においては、ＩκＢＬのプロモーター領域において、ＩκＢＬ*０１と呼ばれるハプロタイプが多くみられる。また、そのハプロタイプを持つＩκＢＬプロモーターは、他のハプロタイプを持つプロモーターに比べ、転写開始能が減少している。上記の我々のモデルはこの結果と一致し、ある特定のハプロタイプを持つ人においてはＩκＢＬの発現量が低いため、破骨細胞分化の抑制がタイトに行われず、必要以上に骨破壊が起るため、リウマチになりやすい、あるいはリウマチの症状が悪化するのではないかと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ヒトＩκＢＬに存在するＳＮＰｓの組み合わせ及びその発現頻度を示す図である。
【図２】ＩκＢＬｐ*０１〜０３及び０５のｍＲＮＡの発現を示すグラフである。
【図３】ＩκＢファミリー及びＩκＢＬに存在するアンキリンリピートを比較する図である。
【図４】ＮＦ-κＢ活性化の２つの経路及びその関連機能を示す概略図である。
【図５】ＮＦ-κＢ活性化の２つの経路を簡潔に表した図である。
【図６】実施例１におけるＩκＢＬの特異的抑制作用を示すグラフである。
【図７】実施例２におけるＩκＢＬと結合するタンパク質を示す図である。
【図８】実施例２におけるＩκＢＬとＦＡＭとの結合性を示す図である。
【図９】実施例３におけるＩκＢＬとＮＦ-κＢ活性化経路に属するタンパク質との相互作用を解析した結果を示す図である。
【図１０】実施例４におけるＩκＢＬのユビキチン化を解析した結果を示す図である。
【図１１】実施例４におけるプロテオソームによるユビキチン化ＩκＢＬの分解を解析した結果を示す図である。
【図１２】実施例５におけるＲＮＡ干渉実験の結果を示す図である。
【図１３】実施例６におけるＲＡＮＫＬの刺激によるＴＲＡＰ活性を示すグラフである。
【図１４】実施例７におけるＲＡＮＫＬによるＩκＢＬ及びｐ１００のタンパク量変化を示す図である。
【図１５】ＮＦ-κＢ活性化と破骨細胞分化及び骨破壊との関係を示す模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月25日(2007.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008127322000001.app