【手続補正書】
【提出日】平成24年2月27日(2012.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで多能性細胞を培養することによって肥満細胞を調製する方法であって、
ａ）造血前駆細胞または巨核球への前記多能性細胞の分化を促進する条件下で前記多能性細胞を培養し、造血前駆体または巨核球を含む第１細胞集団を提供する工程；および
ｂ）肥満細胞への分化を促進する条件下で前記第１細胞集団を培養して、肥満細胞を含む第２細胞集団を提供する工程；
を含み、工程（ａ）の培養工程は、フィーダー層としてマウス胎仔の肝臓由来間質細胞との共培養を使用しない、方法。
【請求項２】
前記第２細胞集団が、トリプターゼ陽性の肥満細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性細胞が、ＭＥＦ上に維持され、そしてヒトｉＰＳ細胞、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、Ｈ１細胞またはｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記多能性細胞が、ＴＰＯを含む培地で培養される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）が、特定条件下で前記多能性細胞を培養する工程を含む、請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記特定条件が以下の逐次工程：
１）少なくとも１つの成長因子を含む第１特定培地で複数の前記多能性細胞を培養または維持する工程；
２）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを本質的に含まない第２特定培地で前記細胞をインキュベートする工程；
３）複数の前記細胞を増殖させる、またはその分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４とＶＥＧＦを含む第３特定培地で前記細胞を培養する工程；および
４）複数の前記細胞を増殖させる、またはその分化を促進するのに十分な量のＩＬ３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む第４特定培地で前記細胞を培養する工程；
を含み、複数の前記多能性細胞が、造血前駆体細胞に分化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ａ）が、
（ｉ）前記多能性細胞を胚様体（ＥＢ）に分化させる工程；
（ｉｉ）ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の少なくとも１つまたは２つを含む第１培地で前記多能性細胞を培養する工程；
（ｉｉｉ）造血細胞への前記多能性細胞の分化に好都合な条件下で細胞を培養する工程であって、得られた該造血細胞が、肥満細胞に分化するのに好都合な条件下で培養される工程；または
（ｉｖ）造血細胞への前記多能性細胞の分化に好都合な条件下で細胞を培養し、その後、巨核球への分化に好都合な条件下で該造血細胞を培養する工程であって、得られた該細胞が、肥満細胞に分化するのに好都合な条件下で培養される工程；
を含む、請求項１、３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（２）の前に、少なくともいくつかの前記細胞が、少なくとも部分的に分離されるか、または実質的に個別化される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、酵素を使用して実質的に個別化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素が、トリプシンまたはＴＲＹＰＬＥである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記個別化の後に、前記細胞をＲＯＣＫ阻害剤とトリプシン阻害剤に接触させる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２、およびＹ−２７６３２からなるリストから選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、約５〜２０％酸素の気圧で前記細胞を培養する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ａ）が、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６を含む培地で前記多能性細胞を培養する工程を含む、請求項１、３、４、５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６が、外因的に添加され、かつ組み換え型である、請求項１、３、４、５〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１培地が、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ−３リガンド、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、および約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含み、これらは外因的に添加され、かつ組み換え型である、請求項１、３、４、５〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ａ）の後、複数の前記多能性細胞が巨核球または肥満細胞のどちらかに分化されて、該肥満細胞はＣＤ１１７とＣＤ４５に対して陽性であるが、ＣＤ３４に対して陰性である、請求項１、３、４、５〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｂ）が、幹細胞因子を含む培地で前記細胞を培養する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記培地が、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む、請求項１または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記培地が、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子と約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む、請求項１、１８または１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ａ）および／または前記工程（ｂ）の少なくとも１つの前記培養工程が、無血清培地を使用して実施される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを使用して、肥満細胞を精製する工程をさらに含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者にとって明らかであるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、実例として挙げられるだけであることを理解されるべきである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
インビトロで多能性細胞を培養することによって肥満細胞を調製する方法であって、
ａ）造血前駆細胞または巨核球への細胞の分化を促進する条件下で多能性細胞を培養し、造血前駆体または巨核球を含む第１細胞集団を提供する工程；および
ｂ）肥満細胞への分化を促進する条件下で前記第１細胞集団を培養して、肥満細胞を含む第２細胞集団を提供する工程；
を含み、工程（ａ）の培養工程は、フィーダー層としてマウス胎仔の肝臓由来間質細胞との共培養を使用しない、方法。
（項目２）
前記第２細胞集団が、トリプターゼ陽性の肥満細胞を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記多能性細胞が、ヒトｉＰＳ細胞またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記多能性細胞が、Ｈ１細胞またはｉＰＳ細胞である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記多能性細胞が、ＭＥＦ上に維持される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記多能性細胞が、ＴＰＯを含む培地で培養される、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記多能性細胞が、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞またはＯＰ９細胞上でさらに培養される、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記工程（ａ）が、特定条件下で前記多能性細胞を培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記工程（ａ）が以下の逐次工程：
１）少なくとも１つの成長因子を含む第１特定培地で複数の前記多能性細胞を培養または維持する工程；
２）ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ＩＬ３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを本質的に含まない第２特定培地で前記細胞をインキュベートする工程；
３）複数の前記細胞を増殖させる、またはその分化を促進するのに十分な量のＢＭＰ４とＶＥＧＦを含む第３特定培地で前記細胞を培養する工程；および
４）複数の前記細胞を増殖させる、またはその分化を促進するのに十分な量のＩＬ３、Ｆｌｔ３リガンド、およびＧＭＣＳＦを含む第４特定培地で前記細胞を培養する工程；
を含み、複数の前記多能性細胞が、造血前駆体細胞に分化される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
工程（２）の前に、少なくともいくつかの前記細胞が、少なくとも部分的に分離されるか、または実質的に個別化される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記細胞が、酵素を使用して実質的に個別化される、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記酵素が、トリプシンまたはＴＲＹＰＬＥである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記個別化の後に、前記細胞をＲＯＣＫ阻害剤とトリプシン阻害剤に接触させる、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、ＨＡ−１００、Ｈ−１１５２、およびＹ−２７６３２からなるリストから選択される、項目９に記載の方法。
（項目１５）
前記方法が、約５〜２０％酸素の気圧で前記細胞を培養する工程を含む、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記工程（ａ）が、前記多能性細胞を胚様体（ＥＢ）に分化させる工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記工程（ａ）が、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の少なくとも１つを含む第１培地で前記多能性細胞を培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記第１培地が、幹細胞因子を含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記工程（ａ）が、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のうちの少なくとも２つを含む第１培地で前記多能性細胞を培養する工程を含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記工程（ａ）が、ＦＬＴ−３リガンド、幹細胞因子、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６を含む培地で前記多能性細胞を培養する工程を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ＦＬ３、幹細胞因子、ＴＰＯ、ＩＬ−３、およびＩＬ−６が、外因的に添加されて、組み換え型である、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記第１培地が、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＦＬ３、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、および約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含み、これらは外因的に添加されて、組み換え型である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記工程（ａ）の後、複数の前記多能性細胞が巨核球または肥満細胞のどちらかに分化されて、該肥満細胞はＣＤ１１７とＣＤ４５に対して陽性であるが、ＣＤ３４に対して陰性である、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記工程（ｂ）が、幹細胞因子を含む培地で前記細胞を培養する工程を含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
前記培地が、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記培地が、約１０〜１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子と約１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記工程（ａ）および／または前記工程（ｂ）の少なくとも１つの前記培養工程が、無血清培地を使用して実施される、項目１に記載の方法。
（項目２８）
前記方法が、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳを使用して、肥満細胞を精製する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記工程（ａ）が、造血細胞への前記多能性細胞の分化に好都合な条件下で細胞を培養する工程を含み、得られた該造血細胞が、肥満細胞に分化するのに好都合な条件下で培養される、項目１に記載の方法。
（項目３０）
前記工程（ａ）が、造血細胞への前記多能性細胞の分化に好都合な条件下で細胞を培養し、その後、巨核球への分化に好都合な条件下で該造血細胞を培養する工程を含み、得られた該細胞が、肥満細胞に分化するのに好都合な条件下で培養される、項目１に記載の方法。