(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌をスクリーニングおよび／または診断するためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに
１つの脂質、または
（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸
を含む、使用。
【請求項２】
脂質が、アラキドン酸多価不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、およびアラキドン酸飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
代謝産物の組合せが、スフィンゴミエリンおよびグルタコニルカルニチンのうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
代謝産物が、定量的な分析の方法、好ましくは、クロマトグラフィー、分光法および質量分析装置／質量分析に基づいて測定される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
クロマトグラフィーが、ＧＣ、ＣＥ、ＬＣ、ＨＰＬＣおよびＵＨＰＬＣを含み、分光法が、ＵＶ／Ｖｉｓ、ＩＲ、ＮＩＲおよびＮＭＲを含み、質量分析装置／質量分析が、ＥＳＩ、四重極質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析装置、オービトラップ質量分析装置、磁気セクター質量分析装置、静電気セクター質量分析装置、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、ならびにそれらの組合せを含み、例えばシングル四重極（Ｑ）およびトリプル四重極（ＱｑＱ）、ＱｑＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ｑ−オービトラップ、ＡＰＣＩ−ＱｑＱ、ＡＰＣＩ−ＱｑＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＱ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを含む、請求項４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌を評価するための新しいバイオマーカーに関する。特に、本発明は、患者内の乳癌をスクリーニングおよび／または診断する場合、乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答を予測する場合、乳癌の腫瘍活性の生化学的指標を評価する場合、ならびに乳癌腫瘍を、それらの固有のサブタイプに従ってカテゴリーに分けるのに使用するための新しいバイオマーカーを提供する。さらに、本発明は、哺乳動物対象内の乳癌を評価するための方法、および方法を実施するためのキットにも関する。さらに、本発明は、乳癌を評価するための方法であって、哺乳動物対象から生物学的試料、好ましくは、血液を入手するステップと、生物学的試料中の代謝産物の量および／または比を測定するステップとを含む、方法にも関する。本発明に従って、特異的なバイオマーカーおよび方法を利用することによって、乳癌をより適切かつ確実に評価することが可能になる。
【背景技術】
【０００２】
メタボロミクス
メタボロミクスは、主要な代謝産物を体系的に網羅する低分子量化合物の包括的な定量的測定であり、これにより、中間代謝経路の全範囲が示される。代謝産物の大型のアレイを分析することが可能であれば、顕性の生物学的事象の、真性の機能エンドポイントを反映する生化学的情報が抽出され、一方、その他の機能ゲノミクスの技術、例として、トランスクリプトミクスおよびプロテオミクスは、極めて高価であるにもかかわらず、単に表現型の応答の可能性がある原因を示すに過ぎない。したがって、それらは、機能の妥当性確認が追加されない限り、表現型のレベルで、薬物の効果、毒物学的応答および疾患状態を必ずしも予測できるとは限らない。
【０００３】
生物学的流体および組織中の代謝産物の差が種々の表現型の応答への最も密接な関連を提供することから、メタボロミクスは、特にそのような機能情報を描写することによってこの情報のギャップを埋めるものである。いうまでもなく、生化学的表現型のそのような変化は、適切な技術により、こうした情報のコスト効率の高いデータ検索および統合が可能になれば、医薬産業、バイオテクノロジー産業および健康産業が直接的な関心を示す対象である。
【０００４】
一般に、表現型は、遺伝子型により必ずしも予測されるとは限らない。遺伝子型と表現型との間のギャップは、多くの生化学的反応により広げられ、それぞれの反応が個々に、薬物、栄養および環境因子を含めた、種々の影響に依存する。遺伝子から表現型までの生体分子のこの鎖において、代謝産物は、定量化可能な分子であり、表現型への最も密接な関連を示す。多くの表現型および遺伝子型の状態、例として、薬物に対する毒性の応答または疾患の有病率が、生物学的流体および組織内の機能的に適切な代謝産物の濃度の差により予測される。
【０００５】
乳癌
乳癌は、乳房組織、最も一般的には、乳管の内層または乳管に乳汁を供給する小葉に由来する癌のタイプである。全世界で、乳癌は、女性の全ての癌（非メラノーマ性の皮膚癌を除く）の２２．９％を占める。２０１２年に米国では、約２２６，８７０人の女性が乳癌と診断され、これは、新たに診断された女性の癌患者全てのうちの２９％に相当し、２０１１年には米国で、乳癌により、３９，０００超の死亡例が発生し、乳癌は、女性の癌死亡の第２位の原因にランクされている。乳癌については、早期診断により、長期生存率を顕著に増加させることができ、現時点では、マンモグラフィーが、乳癌の検出のための最も許容できる、最も有効なスクリーニング手順であり、Ｕ．Ｓ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ（ＵＳＰＳＴＦ）により、４０歳超の女性に推奨された。しかし、このスクリーンの高い擬陽性率に起因して、２００９年にＵＳＰＳＴＦは、マンモグラム・スクリーニングの頻度を低下させるように勧告を修正した。その他の画像法の技法、例として、超音波検査および磁気共鳴画像法もまた、乳癌のスクリーニングにおいて使用されている。残念なことに、これらの画像法の技法を取り入れても依然として、乳癌患者の約２０％が検出され得ない。
【０００６】
とりわけマンモグラフィー専門のサービスが４０歳超の全ての女性には提供されないような広さの国土を有する発展途上国においては、スクリーニングおよび診断のための新しい方法が非常に有用になると予想される。例えば、ブラジルでは毎年、およそ３０００万人の女性がマンモグラフィー検査を受ける資格を有するが、この検査を実際に受けるのは５０％未満に過ぎない。その結果、毎年、新規の５２，０００症例のうち、６０％超が進行症例に相当し、これらの症例では、手術を可能にするために、過度に大きな腫瘍体積を減少させるための前外科的化学療法が必要となる。
【０００７】
したがって、当技術分野では、容易に実施することができる、すなわち特殊な機器も資源も必要としない新しいスクリーニング手順が緊急に求められている。さらに、乳癌を高い精度で診断するための、より確実かつ有効な方法、ならびに疾患の進行および化学療法への応答を予測するための方法を提供することも緊急に必要である。
【０００８】
乳癌を診断する場合のスクリーニングのための１つの有望なアプローチが、バイオマーカー、例として、血漿（または血清）のバイオマーカー（具体的には、抗原、およびタンパク質のパターン）の使用である。しかし、それらは依然として、臨床で使用するにはほど遠い。いくつかの腫瘍マーカー、例として、ＣＡ１５．３およびＣＡ２７．２９が、スクリーニングのためではなく、治療のモニタリングのために限って推奨されている。
【０００９】
したがって、乳癌のスクリーニングおよび診断のための、新しい、有効なバイオマーカーであって、個々にまたはその他の現存する方法と組み合わせて使用することができるバイオマーカーが緊急に必要である。
【００１０】
最近になって、癌細胞は、好気性の解糖、脂肪酸合成およびグルタミノリシスに依存して増殖することから、癌細胞の代謝特性が正常細胞の代謝特性とは異なることが発見された。脂肪酸合成の増強は、例えば、急速に増殖する腫瘍細胞に、膜の生合成のための脂質を提供して、成長と生存の両方の利点を付与する。同様に、癌細胞は、グルタミン欠乏に対する感受性が極めて高く、培養物中ではグルタミンなしでは増殖できない。「グルタミン依存」の結果、細胞を急速に増殖させるのに必要な副産物、例として、アミノ酸前駆体の生成が増強され、また結果として、細胞代謝の調節不全により、癌療法における薬物抵抗性ももたらされる。実際に、脂肪酸合成を触媒する主要な複合体である脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）が、乳癌におけるタキソール／トラスツズマブ／アドリアマイシン抵抗性および膵臓癌におけるゲムシタビンおよび放射線に対する内因性の抵抗性の獲得をもたらす。ついには、グルタミノリシスが、胃癌において、ラパマイシン複合体１（ｍＴＯＲＣ１）の哺乳類標的のシグナル伝達の活性化を介するシスプラチン抵抗性をもたらす。
【００１１】
乳癌は通常、手術により治療し、それに、化学療法もしくは放射線療法または両方が続く場合がある。ネオアジュバント化学療法は主として、局所進行性乳癌、特に、最初の来診時に手術不能とみなされた局所進行性乳癌を治療するのを支援するために使用されてきた。しかし近年、この療法は、より小さな、手術可能な腫瘍のために使用される場合が増加しており、これは、乳房組織の大きな部分を温存し、維持するためであり、この療法を使用しなければ、最初の手術において、より大きな部分が除去されることになろう。この治療のアプローチの別の特筆に価する点は、採用された化学療法レジメンに応答する腫瘍体積の変化を、臨床的および／または放射線学的な検査により正確に定量化する特有の機会が提供されることである。
【００１２】
さらに、療法のタイプ、薬物および投与レジメンの選択は従来、単に、腫瘍のサイズを決定することによって設定されてきた。しかし、腫瘍のサイズは、腫瘍の生化学的活性も代謝活性も反映せず、したがって同様に、腫瘍が極めて侵襲性である恐れがあるか、または不活性である可能性があるかも反映しない。したがって、当技術分野において従来から使用されてきたツールは、患者の乳癌の治療を適切に定義するには不十分である。
【００１３】
本発明では、乳癌腫瘍のメタボロミック活性に関する貴重な情報を使用して、化学療法に対して、最低限の応答しか観察されないかまたは応答が全く観察されない場合に、代替のレジメンを示すのみならず、また、病理学的完全応答（ｐＣＲ）を達成する患者も同定し、したがって、より好ましい転帰をもたらす。
【００１４】
これまでの当技術分野における主要な取組みは、ｙｐＴ０／ｙｐＮ０としてのｐＣＲに到達する可能性がより高い患者の同定において協働することが可能な予測ツールの開発であった。加えて、疾患の進行の発生もまた、ネオアジュバント化学療法の使用に伴う主要な懸案事項であり、多くの研究者が、ｐＣＲの臨床的および分子的な予測因子を決定することを狙ってきたが、非常にわずかな研究者しか、進行の予測因子について報告していない。
【００１５】
Ｗｅｉ，Ｓ．ら（Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０１２））が、ＮＭＲとＭＳに由来する代謝産物を組み合わせることによる予測モデルを開発し、このモデルにより、腫瘍が化学療法に対して完全応答を示さなかった患者のうちの８０％が正しく同定された。４つの代謝産物の組合せ、すなわち、ＮＭＲにより検出された３つの代謝産物（スレオニン、グルタミンおよびイソロイシン）とＭＳにより検出された１つの代謝産物（リノレン酸）により、患者を、無応答、部分応答または完全応答の群に識別することができた。しかし、正しく同定された患者の数が８０％では、依然として不十分である。
【００１６】
Ｑｉｕ，Ｙ．ら（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ａ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．２０１３）が、３つの代謝産物（リゾＰＣ  ａ  Ｃ１６：０、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：５、およびＰＣ  ａａ  Ｃ３４：２）に基づいて診断の式を開発し、この式により、乳癌患者と健常対照とが、９８．１％の感度および９６．０％の特異度で首尾よく差別化された。しかし、著者らは、化学療法への応答を予測する結果を生み出すことも、乳癌腫瘍を、それらの固有のサブタイプに従ってカテゴリーに分けることを可能にする何らかの結果を生み出すこともできなかった。したがって、依然として、感度および特異度を改善する余地のみならず、また、モデルの適用性を顕著に拡大する余地もある。
【００１７】
したがって、当技術分野では、患者の乳癌の、高い精度および信頼性での同定に、腫瘍のサブタイプおよびその活性の状況の同定に、乳癌の進行、疾患の転帰、および患者の、化学療法への治療応答の予測に適切な新しいスクリーニングおよび診断の技法を開発することが緊急に求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
発明者らは、これらの癌に特異的な代謝変化に基づいて、血液の代謝産物の新しいシグネチャー、すなわち、新しいバイオマーカーを同定することを狙ってきた；こうしたバイオマーカーは、乳癌の集団スクリーニングの際にも、対象内の乳癌を診断するためにも有用であり得るであろう。さらに、疾患の進行を予測したり、患者の、化学療法への治療応答を予測したりするための血液の代謝産物のシグネチャーを同定することも狙ってきた。
【００１９】
当技術分野に現存する、上記で言及した問題を考慮すると、本発明の基礎をなす目的は、乳癌を評価するための新しいバイオマーカーを提供することであり、これらのマーカーにより、すでに疾患の進行の早期にある乳癌のスクリーニングおよび診断が高い精度および信頼性で可能になる。最適には、マーカーは、生物学的試料、例として、血液中で容易に検出可能であるべきであり、マーカーのレベルは、乳癌の段階に一貫して関連すべきである。さらに、本発明の目的は、迅速、好都合かつハイスループットな実施を可能にする、生物学的試料中で乳癌を評価するための方法を提供することでもある。さらに、新しいバイオマーカーは、乳癌の進行、疾患の転帰、および患者の、化学療法への治療応答を予測するのにも適切であるべきである。
【００２０】
メタボロミクスにより、乳癌の発症の過程で生じる生化学的変化を洞察し、新規のかつより良好である可能性があるいくつかのバイオマーカーを得ることができると予想されることから、発明者らは、本発明の基礎をなす課題を解決するために、メタボロミクスに関する研究に基礎を置いた。当技術分野で実施されているスクリーニングの技法、例として、マンモグラフィーまたはその他の画像法の技法を利用するのではなく、乳癌の進行に伴って変化する代謝産物のパネルを使用する場合に、乳癌に関与する全てのメタボロミクス経路および機構のより包括的な理解が得られることを、発明者らは見出した。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明は、添付した特許請求の範囲において定義するように、乳癌を、特に、疾患の早期において評価するのに適切な、新しいバイオマーカー（すなわち、新しいバイオマーカーのセット）を提供する。さらに、本発明はまた、本明細書に記載するバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットに基づいて、哺乳動物対象内の乳癌を評価するための方法、ならびに方法を実施するように適合させたキットも提供する。
【００２２】
本明細書では、乳癌の進行中における代謝バイオマーカーの増加または減少の本発明に従う例を示す図１〜図１５が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図２Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図３Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図４Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図５Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ２８：１（ＰＣ  ａａ  Ｃ２８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ２８：１（ＰＣ  ａａ  Ｃ２８：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図６Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図７Ａ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図７Ｂ】トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を使用して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図８Ａ】乳癌を対照と比較した、最終的な妥当性確認セットを示すグラフである。
【図８Ｂ】乳癌を対照と比較した、最終的な妥当性確認セットを示すグラフである。
【図９Ａ】トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびドデカンジオイルカルニチン（Ｃ１２−ＤＣ）を使用して、病理学的完全応答を示した患者と３５〜７８％の応答を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図９Ｂ】妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と安定な疾患／進行を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と３５〜７８％の応答を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１０Ｂ】妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と安定な疾患／進行を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１１Ａ】トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と低い応答を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と安定な疾患／進行を示した患者（ＳＤＰＲ）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１２Ａ】トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３２：２、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と８０〜９２％とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３２：２、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者と安定な疾患／進行を示した患者とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果を示すグラフである。
【図１３】乳癌の特異的なサブタイプの、表１１に示す代謝産物を使用する同定を示すグラフである。ルミナル腫瘍Ａ／Ｂを有する患者、ならびに三種陰性およびＨＥＲ２陽性を有する患者の同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果である。
【図１４】乳癌の特異的なサブタイプの、表１２に示す代謝産物を使用する同定を示すグラフである。ＨＥＲ２腫瘍を有する患者（ＬｕｍＢ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２）、ならびに三種陰性およびルミナルＡ／Ｂを有する患者の同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果である。
【図１５】乳癌の特異的なサブタイプの、表１３に示す代謝産物を使用する同定を示すグラフである。三種陰性を有する患者、およびＨＥＲ２陽性／ルミナルＡ／Ｂの同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に従う特異的なバイオマーカー（のセット）および方法を利用することによって、乳癌を、改善された精度および信頼性で評価することが可能になる。
【００２５】
「評価する」は、本発明の意図において、乳癌に罹患する可能性がある対象のスクリーニング、対象の乳癌の診断、ならびに疾患の進行のモニタリング、特に、腫瘍の異なる段階および／または下位分類における疾患の検出およびマーキングを意味する。さらに、「評価する」は、乳癌に罹患している患者が、化学療法、特に、ネオアジュバント化学療法に応答する可能性が高いかどうかを予測することも包含する。さらに、「評価する」は、乳癌の腫瘍活性の生化学的兆候の決定および特徴付けにも関する。さらに、「評価する」は、本発明の意図において、患者の乳癌腫瘍のサブタイプを陽性に同定したり、特定の乳癌腫瘍を、それらの間で固有のサブタイプに従って区別したりすることが可能であることも意味する。
【００２６】
驚くべきことに、本発明において、バイオマーカーまたはバイオマーカーのセットを、対象の試料、例として、血液試料中の特定の代謝産物の量および／または比を測定することによって提供することを達成するに至った。こうしたマーカーにより、乳癌を、改善された様式で、かつ疾患の早期においてスクリーンおよび診断することが可能になり、乳癌に罹患している患者が、化学療法、例として、ネオアジュバント化学療法への応答を示す可能性が高いかどうかをより正確かつ確実に予測することが可能になる。特に、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットにより、患者が、化学療法への病理学的完全応答（ｐＣＲ）に、または安定な疾患および／もしくは進行（ＳＤＰＲ）に到達する可能性が高いかどうかを予測することが可能になる。さらに、驚くべきことに、本発明において、乳癌腫瘍のサブタイプを、それらの特異的な代謝産物プロファイルに基づいて識別することができることも見出すに至った。
【００２７】
本発明の文脈では、病理学的完全応答（ｐＣＲ）を、乳房中にもリンパ節中にも、浸潤性および非侵襲性の残留物がないこと（ｙｐＴＯ  ｙｐＮＯ）と定義し、このことは、化学療法を終了した後に、腫瘍が完全に消失しており、乳房中にもリンパ節中にも癌の残余のシグナルが全く残っていないことを意味する。ｐＣＲは、特に、ルミナルＢ／ＨＥＲ２陰性、ＨＥＲ２陽性または三種陰性の疾患をもつ患者にとっては、適切な代替えエンドポイントである。したがって、本発明により、ｙｐＴＯ  ｙｐＮＯとしてのｐＣＲに到達する可能性がより高い患者を同定することが可能になる。
【００２８】
本発明の文脈では、安定な疾患および／または進行（ＳＤＰＲ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに従って定義する。したがって、用語「安定な疾患」および「進行」は、程度および重症度の点で減少することも増加することもない癌を、悪化するかもしくは体内に広がる癌をそれぞれ意味する。両方の状況が、特に、数ヵ月間の極めて毒性の化学療法レジメンを受けた後では望ましくない；したがって、これらの好ましくない結果を予測するために、両方の可能性を組み合わせて、ただ１つの群（ＳＤＰＲ）にした。
【００２９】
実際に、本発明に従うバイオマーカーは、生物学的試料、特に、血液中で容易に検出可能であり、マーカーのレベルは、乳癌の程度に一貫して関連する。
【００３０】
一般に、バイオマーカーは貴重なツールである。このことは、バイオマーカーが、２つ以上の生物学的状態を相互に識別して、正常な生物学的プロセス、病原性のプロセスのインジケーターとして、または薬学的介入に対する反応として役に立つことが可能であることに起因する。代謝産物は、低分子化合物（＜１ｋＤａ）であり、ほとんどのタンパク質、ＤＮＡおよびその他の巨大分子よりも小さい。タンパク質の活性の小さな変化から、生化学的反応およびそれらの代謝産物（＝代謝バイオマーカー、身体の代謝を示す）の大きな変化が生じ、代謝産物の濃度、流動および輸送機構は、疾患および薬物介入に対して敏感である。このことにより、生理学的および病態生理学的な物質の個々のプロファイルを得ることが可能になり、こうしたプロファイルには、遺伝学も、栄養、身体活動、腸の微生物および投薬のような環境因子も反映される。したがって、代謝バイオマーカーからは、例えば、バイオマーカーではあるが、代謝バイオマーカーではない、タンパク質またはホルモンよりも包括的な情報が得られる。
【００３１】
そうした観点から、用語「代謝バイオマーカー」または短い「バイオマーカー」は、本明細書で使用する場合、哺乳動物体内で代謝プロセスの間に生じる代謝産物または代謝化合物であり、乳癌の存在および状態のインジケーターならびに腫瘍のサブタイプのインジケーターとして適切な化合物であると定義する。用語「バイオマーカー」および「代謝バイオマーカー」は、本発明の文脈では一般に、同義的に使用し、典型的には、代謝産物の量、または２つ以上の代謝産物の比を指す。したがってまた、代謝バイオマーカーまたはバイオマーカーという用語には、２つ以上の代謝産物の間の比も含めることを意図する。
【００３２】
用語「量」は典型的には、試料、例として、血液試料中の代謝産物の濃度を指し、モル／ｌで通常示すが、また、当技術分野で通常使用するその他の単位、例として、ｇ／ｌ、ｍｇ／ｌ等で測定してもよい。用語「合計」は典型的には、それぞれの実施形態で規定する全ての代謝産物の量の合計を意味する。用語「比」は典型的には、それぞれの実施形態で規定する代謝産物の量の比を意味する。
【００３３】
本発明に従って測定する代謝バイオマーカー（のセット）は、アミノ酸および生体アミン；アシルカルニチン；ヘキソース；スフィンゴ脂質；ならびにグリセロリン脂質の代謝産物（すなわち、分析対象）のクラスを含むことができ、これらを、本明細書下記の表１〜表５に列挙する。これらのクラスの定義は、当業者に公知であるが、これらのクラスの好ましいメンバーを、下記の表１〜表５に要約する。さらに、下記の表１の生体アミンは、天然に存在する、生物学的に活性な化合物の群であると理解されており、これらの生体アミンは、天然アミノ酸の酵素的脱カルボキシル化により得られる。生体起源の物質は、生命過程が提供する物質であり、生体アミンは、アミン基を含有する。
【００３４】
好ましくは、本発明に従って測定する代謝バイオマーカー（のセット）は、特許請求の範囲で規定するバイオマーカーの組合せを含む。
【００３５】
驚くべきことに、これらのクラスの代謝産物を含むバイオマーカーのセットを測定する、すなわち、特定の徴候を示す代謝産物の量および／または比を測定すると、乳癌を、改善された様式で、かつ疾患の早期においてスクリーニングおよび／または診断することが可能になり、乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答を予測することが可能になり、乳癌の腫瘍活性の生化学的兆候を評価することが可能になり、乳癌腫瘍の固有のサブタイプの間で下位分類を行うことが可能になることを見出すに至った。
【００３６】
バイオマーカーのそれぞれの組合せについて規定する１つの代謝産物もしくは代謝産物の１つのクラスを除いたり、または代謝産物もしくは代謝産物のクラスの数を減少させたりすると、乳癌の評価の感受性および信頼性が低下する。このことは、特に、疾患の早期に当てはまり、たとえ既知の方法に従って、既知のバイオマーカーを使用したとしても、乳癌を確実には検出し得ない。実際に、バイオマーカーのそれぞれのセット中に含有される代謝産物を同時に測定することにより、より正確かつより確実な乳癌の評価が、典型的には、好ましくは、８０％超、より好ましくは、９０％超、さらにより好ましくは、９８％超、最も好ましくは、１００％の感度で可能になる。そのような事実は、記載されたこともなく、先行技術から明らかにされたこともない。
【００３７】
さらに、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットにより、より確実かつ正確な乳癌の評価が、８０％超、より好ましくは、８５％超、さらにより好ましくは、９０％超、最も好ましくは、１００％の特異度で可能になる。
【００３８】
さらに、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、４０％超、より好ましくは、５０％超、さらにより好ましくは、６０％超、最も好ましくは、８０％超の陽性予測値（ＰＰＶ）で可能になる。
【００３９】
さらに、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、８０％超、より好ましくは、９０％超、さらにより好ましくは、９８％超、最も好ましくは、１００％の陰性予測値（ＮＰＶ）で可能になる。
【００４０】
好ましい実施形態では、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、１００％の感度および１００％のＮＰＶで可能になる。
【００４１】
用語「感度」、「特異度」、「陽性予測値」および「陰性予測値」の意味は典型的には、当技術分野で公知であり、本発明の文脈では、米国のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａにより確立された「Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ  Ｔｈｅｏｒｙ」に従って定義する。
【００４２】
この理論では、手順の診断値が、その感度、特異度、予測値および効率により定義される。下記に、式を要約する。
【００４３】
テストの感度は、疾患を提示している全ての患者のうちの、テストで陽性を示す患者のパーセントである。ＴＰ＝テストで陽性を示す；ＦＮ＝擬陰性
【００４４】
（ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ））×１００＝感度（％）
【００４５】
テストの特異度は、疾患を有さない全ての患者のうちの、テストで陰性を示す患者のパーセントである。ＴＮ＝テストで陰性を示す；ＦＰ＝擬陽性
【００４６】
（ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ））×１００＝特異度（％）
【００４７】
テストの予測値は、（陽性または陰性の）値が真値である測定結果（％）であり、すなわち、全ての陽性のテスト結果のうちの、真陽性であるパーセントが、陽性予測値である。
【００４８】
（ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ））×１００＝陽性の結果の予測値（％）
【００４９】
（ＴＮ／（ＦＮ＋ＴＮ））×１００＝陰性の結果の予測値（％）
【００５０】
さらに、統計学的な一変量解析において、本明細書で使用する陽性および陰性の尤度比（ＬＲ）を決定することによって、バイオマーカーの性能を評価することもできる。
【００５１】
【表１】
0006656233.tif 000002
【００５２】
より好ましい実施形態では、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、１００％の感度、８５％以上の特異度、および１００％のＮＰＶで可能になる。
【００５３】
より好ましい実施形態では、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、１００％の感度、９０％以上の特異度、８０％以上のＰＰＶ、および１００％のＮＰＶで可能になる。
【００５４】
最も好ましい実施形態では、本明細書に記載する本発明のバイオマーカーのセットにより、より確実な乳癌の評価が、１００％の感度、１００％の特異度、１００％のＰＰＶ、および１００％のＮＰＶで可能になる。
【００５５】
上記で言及したように、評価しようとする疾患は、乳癌である。好ましくは、乳癌は、ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの乳癌、より好ましくは、ステージＩＩＩ、例として、ステージＩＩＩａ、ｂまたはｃの乳癌である。乳癌の医学的なステージの定義は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）より定義される（Ｂｒｅａｓｔ、Ｅｄｇｅ  ＳＢ、Ｂｙｒｄ  ＤＲ、Ｃｏｍｐｔｏｎ  ＣＣら編：ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ．第７版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、２０１０、３４７〜７６ページを参照されたい）。段階付けシステムにより、患者を、予後に関してグループ分けするための戦略が提供される。治療の決定は、ある程度は、段階付けのカテゴリーに従って下されるが、主として、腫瘍のサイズ、リンパ節の状況、腫瘍組織中のエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のレベル、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の状況、閉経期の状況、ならびに患者の全身健康状態に従って下される。
【００５６】
生物学的試料を、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ミニブタまたはヒト、最も好ましくは、ヒト、さらに好ましくは、女性から入手する。生物学的試料は、好ましくは、血液である；しかしまた、本発明に従う測定を可能にする、当業者に公知である任意のその他の生物学的試料も適切である。血液試料は典型的には、完全な血液、血清または血漿であり、血漿が好ましい。また、紙フィルター中に収集された乾燥試料も受容される。したがって、本発明に従う方法は典型的には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法である。
【００５７】
生物学的試料中の代謝産物の濃度の測定のためには、定量的な分析の方法、例として、クロマトグラフィー、分光法および質量分析を利用するが、質量分析が特に好ましい。クロマトグラフィーは、ＧＣ、ＬＣ、ＨＰＬＣおよびＵＨＰＬＣを含むことができ；分光法は、ＵＶ／Ｖｉｓ、ＩＲおよびＮＭＲを含むことができ；質量分析装置／質量分析は、ＥＳＩ−ＱｑＱ、ＥＳＩ−ＱｑＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＱ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ、およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを含むことができる。より好ましくは、質量分析装置／質量分析は、四重極質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析装置、オービトラップ質量分析装置、磁気セクター（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｅｃｔｏｒ）質量分析装置、静電気セクター（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｓｅｃｔｏｒ）質量分析装置、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、ならびに質量分析装置の組合せを含み、例えばシングル四重極（Ｑ）およびトリプル四重極（ＱｑＱ）、ＱｑＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ｑ−オービトラップを含む。ＦＩＡおよびＨＰＬＣとのタンデム型質量分析の使用が好ましい。
【００５８】
略語を、以下に示す：ＧＣ＝ガスクロマトグラフィー、ＣＥ＝キャピラリー電気泳動、ＬＣ＝液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ＝高圧液体クロマトグラフィー、ＵＨＰＬＣ＝超高圧液体クロマトグラフィー、ＵＶ−Ｖｉｓ＝紫外−可視、ＩＲ＝赤外、ＮＩＲ＝近赤外、ＮＭＲ＝核磁気共鳴、ＥＳＩ＝エレクトロスプレーイオン化、ＭＡＬＤＩ＝マトリックス支援レーザー脱離／イオン化、ＴＯＦ＝飛行時間、ＡＰＣＩ＝大気圧化学イオン化、ＱｑＱ＝トリプル四重極の構成であり、これはまた、Ｑ１ｑ２Ｑ３としても公知である（Ｑ１四重極およびＱ３四重極は、質量フィルターであり、ｑ２は、非質量分離四重極である）。
【００５９】
代謝産物の量を測定するために、標的メタボロミクスを使用して、生物学的試料中の代謝産物を定量化し、これらの代謝産物には、アミノ酸、生体アミン、アシルカルニチン、ヘキソース、スフィンゴ脂質およびグリセロリン脂質の分析対象のクラスが含まれる。定量化は、同位体で標識した内部標準の存在下で行い、上記の記載に従う方法により決定する。代謝産物として、本発明に従って測定するのが適切な分析対象のリストを、それらの略語（ＢＣコード）を含めて、以下の表に示す。
【００６０】
【表２】
0006656233.tif 000003
【００６１】
【表３Ａ】
0006656233.tif 000004
【表３Ｂ】
0006656233.tif 000005
【００６２】
【表４】
0006656233.tif 000006
【００６３】
【表５】
0006656233.tif 000007
【００６４】
【表６Ａ】
0006656233.tif 000008
【表６Ｂ】
0006656233.tif 000009
【００６５】
以下に、本発明のさらに好ましい実施形態を記載する。しかし、上記に詳しく記載した特徴を有するそれらの組合せを排除する意図はない。
【００６６】
乳癌のスクリーニングおよび／または診断
最初の実施形態では、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットを使用して、乳癌に罹患する可能性がある対象、例として、ヒト患者のスクリーニング、およびこれらの対象内の乳癌の診断を行う。驚くべきことに、本発明において、本明細書に記載するバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットが、多数の対象、例として、ヒト患者の迅速、容易かつハイスループットなスクリーニングを行い、乳癌を、これらの対象の血液試料から診断するのに特に有用であり、結果の精度が改善されることを見出すに至った。したがって、この実施形態では、評価することが、哺乳動物対象、好ましくは、ヒト内の乳癌をスクリーニングおよび／または診断することを含む。
【００６７】
したがって、本発明は、代謝産物の組合せの使用であって、代謝産物の組合せが、乳癌をスクリーニングおよび／または診断するためのバイオマーカーのセットとして、少なくとも、
（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに
１つの脂質、または
（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸
を含む、使用を対象とする。
【００６８】
さらに、本発明はまた、哺乳動物対象または哺乳動物対象の集団における乳癌のスクリーニングおよび／または診断のための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに
１つの脂質、または
（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸
の量を測定するステップを含む、方法も対象とする。
【００６９】
スクリーニングおよび／または診断の精度および信頼性が、上記で規定したバイオマーカーの組合せを使用することによって、特異度、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶのうちの１つまたは複数のパラメータにより決定される場合、先行技術の技法、例として、マンモグラフィーと比較してすでに大きく改善されているが、精度および信頼性を、１つまたは複数、好ましくは、２つ以上、さらに好ましくは、３つ以上の追加の代謝産物を使用することによってさらに改善することができる。
【００７０】
したがって、好ましい実施形態では、バイオマーカーのセットは、１つまたは複数の追加のアミノ酸、例として、表１に含まれるものをさらに含む。追加のアミノ酸は、好ましくは、グルコース生成／ケトン体生成アミノ酸、例として、グリシン、システイン、アラニン、アルギニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、最も好ましくは、アスパラギンおよびアスパラギン酸から選択される。
【００７１】
さらに、脂質は、好ましくは、スフィンゴ脂質およびグリセロ脂質、例として、グリセロリン脂質、例えば、表４および表５に含まれる脂質のうちの１つまたは複数から選択される。さらに好ましくは、脂質は、アラキドン酸、好ましくは、３８個以上の炭素原子を含有する脂質に由来するアラキドン酸に由来し、最も好ましくは、アラキドン酸多価不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル；アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル；およびアラキドン酸飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルから選択される。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、代謝産物の組合せは、スフィンゴミエリンおよびグルタコニルカルニチンのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００７３】
さらに、乳癌のスクリーニングおよび／または診断のための方法は、好ましくは、以下：
−  アラキドン酸多価不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計、
−  アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計、
−  アラキドン酸飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計、
−  アラキドン酸多価不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計／アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計の比、
−  アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計／アラキドン酸飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルの合計の比、
−  ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１、
−  ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ２８：１、
−  スフィンゴミエリン  Ｃ２４：１および／またはスフィンゴミエリン  Ｃ１８：０、ならびに
−  グルタコニルカルニチン
のうちの１つまたは複数、好ましくは、２つ以上、さらに好ましくは、３つ以上の量、または量の比を測定するステップをさらに含む。
【００７４】
任意選択により、この方法はさらに、測定した代謝産物の量および代謝産物の比に基づいて、乳癌に罹患している対象を同定するステップを含み、さらに好ましくは、これらの対象内の乳癌を、例えば、化学療法により治療するステップも含む。
【００７５】
この実施形態の方法は、血液試料から実施することができることから、この方法により、対象のコンプライアンスが、先行技術のスクリーニングの技法、例として、マンモグラフィーと比較して大きく増加する。特に、この方法により、スクリーニングの結果の信頼性および感度が大きく増加し、特に、擬陽性および擬陰性の結果の数が低下し、時間のかかる程度が低下し、したがって、多数の患者に対してこの方法を実施することができる。
【００７６】
さらに、この方法により、対象のコンプライアンスが、先行技術のスクリーニングの技法、例として、マンモグラフィーと比較して大きく増加する。特に、この方法により、スクリーニングの結果の信頼性および感度が大きく増加し、特に、擬陽性および擬陰性の結果の数が低下し、時間のかかる程度が低下する。
【００７７】
ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測
別の実施形態では、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットを使用して、乳癌に罹患している患者が、ネオアジュバント化学療法に応答する可能性が高いかどうかを予測する。ネオアジュバント療法は、通常は手術である、主要な治療の前に、腫瘍を縮小させるための最初のステップとして行われる治療のモダリティである。ネオアジュバント療法の例として、化学療法（例として、シクロホスファミド、タキソール、ドキソルビシン）、放射線療法、およびホルモン療法（タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤）が挙げられる。
【００７８】
したがってさらに、本発明は、乳癌に罹患している哺乳動物対象が、ネオアジュバント化学療法に応答する可能性が高いかどうかを予測するための、以下に記載するバイオマーカーのセットを含む代謝産物の組合せの使用も対象とする。
【００７９】
特に、本発明は、哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測のためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
−  セリンおよびグルタミンから選択される１つのアミノ酸、
−  メチル化アルギニン、
−  １つのアシルカルニチン、ならびに
−  １つの脂質
を含む、使用を対象とする。
【００８０】
さらに、本発明は、哺乳動物対象における乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測のための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  セリンおよびグルタミンから選択される１つのアミノ酸、
−  メチル化アルギニン、
−  １つのアシルカルニチン、ならびに
−  １つの脂質
の量を測定するステップを含む、方法も対象とする。
【００８１】
予測の精度および信頼性が、上記で規定したバイオマーカーの組合せを使用することによって、特異度、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶのうちの１つまたは複数のパラメータにより決定される場合、先行技術の技法と比較してすでに大きく改善されているが、精度および信頼性を、１つまたは複数、好ましくは、２つ以上、さらに好ましくは、３つ以上の追加の代謝産物を使用することによってさらに改善することができる。
【００８２】
好ましくは、メチル化アルギニンは、ジメチル化アルギニン（ＤＭＡ）である。
【００８３】
好ましい実施形態では、バイオマーカーのセットは、１つまたは複数の追加のアミノ酸、例として、表１に含まれるものをさらに含む。追加のアミノ酸は、好ましくは、グルコース生成／ケトン体生成アミノ酸、例として、グリシン、システイン、アラニン、アルギニン、プロリン、アスパラギン酸、アスパラギン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、リジン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、最も好ましくは、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸およびグリシンから選択される。
【００８４】
好ましい実施形態では、アシルカルニチンは、表２に含まれるものから選択され、さらに好ましくは、グルタリルカルニチン（Ｃ５−ＤＣ）およびメチルグルタリルカルニチン（Ｃ５−Ｍ−ＤＣ）およびドデカンジオイルカルニチン（Ｃ１２−ＤＣ）のうちの１つまたは複数から選択される。さらに好ましくは、代謝産物の組合せは、１つまたは複数の追加のアシルカルニチン、例として、表２に含まれる、脂肪酸のベータおよびオメガ酸化の計算を可能にするものをさらに含む。
【００８５】
さらに、脂質は、好ましくは、スフィンゴ脂質およびグリセロ脂質、例として、グリセロリン脂質、例えば、表４および表５に含まれる脂質のうちの１つまたは複数から選択される。さらに好ましくは、アラキドン酸脂質（分子中に３８個以上の炭素原子を含有する脂肪酸）が、４、５および６つの不飽和を含有する多価不飽和脂質、一不飽和脂質ならびに飽和脂質から選択される。
【００８６】
さらに好ましくは、脂質は、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：６；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：５；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：４；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３２：２；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ１７：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２６：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ３０：０；およびリゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２４：０から選択される。
【００８７】
さらに好ましくは、代謝産物の組合せは、プトレシン、スペルミンおよびジメチル化アルギニンのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００８８】
乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測のための方法は、好ましくは、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：６；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：５；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：４；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３２：２；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ１７：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２６：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ３０：０；リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２４：０；プトレシン；スペルミン；総ジメチル化アルギニンのうちの１つまたは複数、好ましくは、２つ以上、さらに好ましくは、３つ以上の量、または量の比を測定するステップをさらに含む。
【００８９】
特に好ましい実施形態では、上記に記載したバイオマーカーの組合せを、乳癌に罹患している対象の化学療法への治療完全応答（ｐＣＲについての高い予測値）を予測するためのバイオマーカーのセットとして使用することができる。したがって、代替の実施形態では、本発明は、乳癌に罹患している対象の化学療法への治療完全応答（ｐＣＲについての高い予測値）を予測するためのバイオマーカーのセットとしての、上記に記載した代謝産物の組合せの使用を対象とする。
【００９０】
乳癌の腫瘍活性の生化学的指標の評価
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの使用であって、代謝産物の組合せが、乳癌の腫瘍活性の生化学的指標を評価するためのバイオマーカーのセットとして、少なくとも、
−  グルタミン酸、グルタミン、アラニン、グリシン、セリンおよびアスパラギン酸から選択される１つのアミノ酸、ならびに
−  １つの脂質
を含む、使用を対象とする。
【００９１】
さらに、本発明は、哺乳動物対象内の乳癌の腫瘍活性の生化学的指標を評価するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  グルタミン酸、グルタミン、アラニン、グリシン、セリンおよびアスパラギン酸から選択される１つのアミノ酸、ならびに
−  １つの脂質
の量を測定するステップを含む、方法も対象とする。
【００９２】
驚くべきことに、本発明において、乳癌の腫瘍活性を、特定の代謝バイオマーカーの測定により特徴付けることができることを発見するに至り、これらのバイオマーカーは、腫瘍の代謝の酵素活性を反映する。したがって、本発明の文脈では、乳癌の活性の生化学的兆候（指標またはミラー）を、前駆体：生成した代謝産物の比の測定値と定義し、これらの測定値は、発癌に関連する重要な代謝反応の酵素活性、例として、グルタミノリシス、解糖、グルタミナーゼ活性およびアルキルグリセロンリン酸シンターゼ活性（ＡＧＰＳ）を反映する。
【００９３】
特に、驚くべきことに、代謝バイオマーカーを利用する腫瘍活性の特徴付けが、好都合であり、当技術分野で実施されている腫瘍の特徴付け、例として、腫瘍のサイズまたは体積を測定することによる特徴付けと比較して優れていることを発見するに至った。特に、代謝活性は、一般に、腫瘍のサイズに依存せず、したがって、乳癌の活性を決定するのにより適切なパラメータを提供することを見出すに至った。例えば、療法のタイプ、および薬物の投与量、例えば、化学療法の間の投与量はしばしば、当技術分野では単に、腫瘍のサイズを測定することによって決定されている。しかし、腫瘍のサイズは、腫瘍のメタボロミック活性を反映せず、同じサイズの腫瘍が、極めて侵襲性である場合があり、または不活性である場合もある。したがって、患者には、療法および治療を、腫瘍の実際の代謝活性に基づいて調整する必要がある。したがって、当技術分野で適用される療法はしばしば、患者の乳癌を有効に治療するのに十分でなかったり、適切でなかったりした。したがって、乳癌の腫瘍活性の生化学的なまたは代謝の指標を評価することによって、患者の療法を適応させ、調整するのに適切なツールが得られ、それにより、患者のコンプライアンスおよび生活の質が大きく向上する。
【００９４】
脂質は、好ましくは、スフィンゴ脂質およびグリセロ脂質、例として、グリセロリン脂質、例えば、表４および表５に含まれる脂質のうちの１つまたは複数から選択される。さらに好ましくは、アラキドン酸脂質（３８個以上の炭素を含有する脂肪酸）が、４、５および６つの不飽和を含有する多価不飽和脂質、一不飽和脂質ならびに飽和脂質から選択される。
【００９５】
より好ましくは、脂質は、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、およびホスファチジルコリン  アシル−アシルから選択される。
【００９６】
さらに好ましくは、代謝産物の組合せは、ロイシンおよびオルニチンのうちの１つまたは複数をさらに含む。
【００９７】
乳癌の腫瘍活性の生化学的兆候を評価するための方法は、好ましくは、ロイシン；オルニチン；総ホスファチジルコリン  アシル−アルキル／総ホスファチジルコリン（アシル−アルキル、およびアシル−アシル）の比のうち、１つまたは複数、好ましくは、２つ以上、より好ましくは、３つ以上の量、または量の比を測定するステップをさらに含む。
【００９８】
乳癌腫瘍の下位分類
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内の乳癌腫瘍の下位分類のための、本明細書に記載するバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットの使用を対象とする。
【００９９】
乳癌の分類および下位分類は典型的には、細胞受容体の状態に基づいて実施する。乳癌細胞は、多くの異なるタイプの受容体を有する場合または有さない場合があり、提示する分類における３つの最も重要な受容体が、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびＨＥＲ２である。細胞は、これらの受容体を有する場合または有さない場合に、ＥＲ陽性（ＥＲ＋）、ＥＲ陰性（ＥＲ−）、ＰＲ陽性（ＰＲ＋）、ＰＲ陰性（ＰＲ−）、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）およびＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）と呼ばれている。細胞が、これらの受容体をいずれも有さない場合には、基底様または三種陰性と呼ばれている。
【０１００】
驚くべきことに、本発明において、血液の代謝産物のシグネチャーが、腫瘍のサブタイプに特異的であることを見出すに至った。したがって、本明細書に記載するバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットは、血液試料中の乳癌腫瘍の下位分類に特に有用である。さらに、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットを用いると、血液の代謝産物の特異的な特徴に基づいて、癌に固有のサブタイプを、低い応答性の腫瘍および高い応答性の腫瘍に細分することも可能になる。
【０１０１】
特に、本発明は、
ａ）ＨＥＲ２陰性であるが、ＥＲ陽性および／またはＰＲ陽性であるルミナルＡ型／ルミナルＢ型の腫瘍（ルミナルＡおよびＢ、ＥＲ＋／ＰＲ＋、ＥＲ＋／ＰＲ−、ＥＲ−／ＰＲ＋）
ｂ）ＥＲ陽性および／またはＰＲ陽性であるが、またＨＥＲ２陽性でもある、ルミナルＢ−ＨＥＲ２陽性の型の腫瘍（ルミナルＢ  ＨＥＲ２＋）
ｃ）ＥＲ陰性およびＰＲ陰性であるが、ＨＥＲ２陽性である、ＨＥＲ２陽性型の腫瘍
ｄ）三種陰性型の腫瘍（ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）
の腫瘍のサブタイプの間での区別に適切なツールを提供する。
【０１０２】
したがって、本発明を用いると、上記で言及した、血液中の乳癌腫瘍のタイプを陽性に同定すること、およびそれらの間で区別することが可能になる。
【０１０３】
したがってさらに、本発明は、哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの使用であって、代謝産物の組合せが、乳癌腫瘍の固有のサブタイプの間での下位分類のためのバイオマーカーのセットとして、少なくとも、
−  分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する１つのアシルカルニチン、および
−  分子中に最多で３つの不飽和を含有する１つの脂質
を含む、使用も対象とする。
【０１０４】
用語「不飽和」は、脂質分子中に含有される炭素間の二重結合の数を意味する。
【０１０５】
本発明は、哺乳動物対象の乳癌腫瘍の固有のサブタイプの間で下位分類を行うための方法をさらに提供し、この方法は、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する１つのアシルカルニチン、および
−  分子中に最多で３つの不飽和を含有する１つの脂質
の量を測定するステップを含む。
【０１０６】
さらなる任意選択による代謝産物が、メチオニンスルホキシド；リジン；ヒスチジン；リゾＰＣ  ａ  Ｃ２４：０；リゾＰＣ  ａ  Ｃ２０：３；シトルリン；およびアルギニンのうちの１つまたは複数から選択される。
【０１０７】
アシルカルニチンは、好ましくは、分子中に１０個超の炭素原子、好ましくは、１２個超、さらに好ましくは、１３個超の炭素原子を含有する、表２に含まれるものから選択され、さらに好ましくは、グルタリルカルニチン（Ｃ５−ＤＣ）およびメチルグルタリルカルニチン（Ｃ５−Ｍ−ＤＣ）およびドデカンジオイルカルニチン（Ｃ１２−ＤＣ）のうちの１つまたは複数から選択される。
【０１０８】
脂質は、好ましくは、スフィンゴ脂質およびグリセロ脂質、例として、グリセロリン脂質、例えば、表４および表５に含まれる脂質のうちの１つまたは複数から選択される。脂質は、さらに好ましくは、アラキドン酸、最も好ましくは、分子中に３８個以上の炭素原子を有する脂質に由来する。
【０１０９】
より好ましくは、脂質は、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、およびホスファチジルコリン  アシル−アシルから選択され、最も好ましくは、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：３；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３６：０；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ４２：０；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：０；ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１；ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：２；およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４０：１から選択される。
【０１１０】
さらに好ましい実施形態では、代謝産物の組合せは、１つまたは複数のアミノ酸、好ましくは、表１に含まれるものから選択される、１つまたは複数のアミノ酸、最も好ましくは、アルギニン、メチオニン、ブテニルカルニチン、キヌレニンおよびトリプトファンのうちの１つまたは複数から選択されるアミノ酸をさらに含む。
【０１１１】
さらに、高い応答性の腫瘍と低い応答性の腫瘍とを比較すると、腫瘍の同じサブタイプ内では、腫瘍のサブタイプの存在が、血液の代謝産物の特定のシグネチャーと顕著に関連があることも示されている。
【０１１２】
特に、驚くべきことに、本発明において、乳癌腫瘍を、この腫瘍に特異的であるバイオマーカーに基づいて、特定のタイプの間で区別することが可能であることを見出すに至った。したがって、この好ましい実施形態では、評価することは、哺乳動物対象、好ましくは、ヒト内の乳癌腫瘍の下位分類を含む。
【０１１３】
特に好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内のルミナルＡ様の腫瘍を同定するための方法であり、この方法は、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；最多で３つの不飽和を含有する１つの、ＰＣ  ａａ；および少なくとも１つのアミノ酸の量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１４】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内のルミナルＢ様、ＨＥＲ２陰性の腫瘍を同定するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；最多で３つの不飽和を含有する少なくとも１つの、ＰＣ  ａａ；少なくとも１つの、ＰＣ  ａｅ；少なくとも１つのアミノ酸；および少なくとも１つの、リゾＰＣ  ａの量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１５】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内のルミナルＢ様、ＨＥＲ２陽性の腫瘍を同定するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；少なくとも１つの、ＰＣ  ａａ；最多で３つの不飽和を含有する少なくとも１つの、ＰＣ  ａｅ；および少なくとも１つのアミノ酸の量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内のＥＲ２陽性の腫瘍を同定するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；最多で３つの不飽和を含有する少なくとも１つの、ＰＣ  ａａ；少なくとも１つのアミノ酸；および少なくとも１つの、リゾＰＣ  ａの量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内の三種陰性の腫瘍を同定するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；最多で３つの不飽和を含有する少なくとも１つの、ＰＣ  ａａ；少なくとも１つのアミノ酸；および少なくとも１つの、リゾＰＣ  ａの量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物対象内のＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍（ＨＥＲ２陽性、およびルミナルＢ、ＨＥＲ２陽性）を同定するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン；少なくとも１つの、ＰＣ  ａｅ；および少なくとも１つの、ＰＣ  ａａの量を測定するステップを含む、方法を対象とする。
【０１１９】
腫瘍の特定のサブタイプが、化学療法へのそれらの応答に関して相互に異なり、例えば、高い応答と低い応答との間で差別化を行うことができることから、この好ましい実施形態に従う本発明の方法により、患者が、化学療法、例として、ネオアジュバント化学療法に応答を示す可能性が高いかどうかを、療法を行う前にでさえ予測することが可能になる。したがって、乳癌の療法を、患者の腫瘍のタイプに基づいて個別化することができる。結果として、化学療法の成功を、大幅に高めることができる。
【０１２０】
キット
さらにまた、本発明は、上記の記載に従う方法を実施するように適合させたキットであって、１つまたは複数のウエル、および少なくとも１つの内部標準を含浸させた１つまたは複数の挿入体を含有するデバイスを含む、キットも対象とする。そのようなデバイスが、ＷＯ２００７／００３３４４およびＷＯ２００７／００３３４３に詳細に記載されており、これらの両方の出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
以下の実施例により、本発明をさらに説明し、明らかにするが、いかなる場合であっても本発明の範囲を制限する意図はない。
【実施例】
【０１２２】
一般的な情報：
患者および方法
総数６４例の、治療を以前に受けたことがない、ステージＩＩＩ乳癌の女性の血漿試料、および平行して３セットの対照を含めた。９３例の健常女性と共に第１のセットを、発見フェーズの間に使用した。第２のセットを、独立の妥当性確認セットとして分析し、このセットは、乳癌女性から得られた３０例の血漿試料、および２４例の対照を有した。最後に、第３のセットは、結果の特異度を調べるために、６１６例のボランティアと共に使用し、これらのボランティアは、５２４例の健常な参加者、加えて、９２例（結腸癌から得られた５５例およびＨＩＶ患者から得られた３７例）の試料であった。
【０１２３】
腫瘍の最初の寸法（３．５ｃｍ〜１４ｃｍ）は、７．０９ｃｍの平均を有し、手術前に、臨床的および放射線学的な測定値を使用して計算した。最終的な腫瘍体積は、専任の病理学者が手術の生成物上で直接評定し、ｐＣＲを、乳房中にもリンパ節中にも侵襲性の残留物および非侵襲性残留物の組織病理学的証拠が全くないこと（ｙｐＴ０／ｙｐＮ０）と定義した。次いで、乳房中で少なくとも９０％の応答を示し、腋窩中に残余の腫瘍を有さない患者を、「高応答者」（Ｈｒｅｓｐ）と名付け、「低応答者」（Ｌｒｅｓｐ）と名付けた残りの患者と比較した。ｐＣＲと関連がある代謝産物を同定するために、第１に含めた２９例の患者を使用して、トレーニングの間に予測マーカーの発見を行い、次の３０例を、独立の妥当性確認セットとして利用した。
【０１２４】
安定な疾患／進行（ＳＤＰＲ）と結び付く代謝産物を同定するために、３０％の最大の臨床的応答を示す全ての患者を含め、これらには、１２例の安定な疾患および７例の進行が含まれた。トレーニングセットを、代謝の予測マーカーの発見の間に、第１の、２１例の入院患者を使用して組み立て、残りの３８例の患者は、独立の妥当性確認セットとして利用することができた。
【０１２５】
予測モデルが、高いおよび低い応答率とだけでなく、代わりに、腫瘍の応答の異なる程度とも相関するかどうかテストするために、結果の妥当性を、特異的な代謝産物を、腫瘍の応答の進行の程度（０％、３０％、３０〜７５％、７５〜９０％、９０〜９９％および１００％）、またはＳＤＰＲ（０〜３０％）、Ｌｒｅｓｐ（３０〜９０％）、Ｈｒｅｓｐ（＞９０％）、ｐＣＲ（１００％）に従って分析することによって確認した。平行して、同定した代謝産物の腫瘍形成性についての追加の確認を支援することも試み、したがってまた、それらの代謝産物を、最初の腫瘍体積が４ｃｍの腫瘍のサイズを有する群から開始して、１２ｃｍまでの段階的進行においてもテストした。
【０１２６】
最後に、血液の代謝産物により、乳癌の個々のサブタイプの観点から、化学療法への応答を予測することができるかどうかを評定するために、患者を、第１に、Ｍｉｎｃｋｗｉｔｚら（２０１２年）に従って、癌に固有のそれらのサブタイプに分け、第２に、腫瘍の応答率に従って、高い応答性の腫瘍（Ｈｒｅｓｐ、７５％超）および低い応答性の腫瘍（Ｌｒｅｓｐ、７５％未満）に分けた。
【０１２７】
代謝産物の測定
１．非標的化ショットガン探索的ＭＳ／ＭＳ分析を、Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ、ＳＰ、ブラジルに所在するＡＢ−Ｓｃｉｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの独立業務によって実施した。１００スペクトル／秒の獲得スキャン速度および約２ｐｐｍの安定な質量精度を有するＡＢ−Ｓｃｉｅｘ  ５６００トリプルＴＯＦ質量分析計にカップリングさせたＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＬＣシステム上に、血漿試料を注入した。フローインジェクション分析（ＦＩＡ）を、５．０ｍＭのギ酸アンモニウムを有するメタノール／水（９０／１０）を用いる均一濃度の溶出を使用して実施した。流速および注入体積はそれぞれ、０．０２５ｍＬ／分および５０μＬであった。イオン供給源およびデクラスタリング電位（５０Ｖおよび−４０Ｖ）の最適化は実施しなかった。以下のイオン化のパラメータを適用した：ＣＵＲ＝２０ｐｓｉ、ＧＳ１＝２０ｐｓｉ、ＧＳ２＝１５ｐｓｉ、Ｔｅｍｐ＝２５０ｏＣ、ＩＳ＝５０００Ｖ（−４０００Ｖ）。０．２５秒の蓄積時間で１００〜１２００ｍ／ｚの範囲に及ぶＭＳスキャン、および０．０３秒の蓄積時間で１００〜１２００ｍ／ｚの範囲に及ぶプロダクトイオンのスキャンが、調査および従属するスキャンのそれぞれの間に採用したパラメータであった。
【０１２８】
２．標的化（ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）定量的メタボロミクス／リピドミクスのプロファイリングを、Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ、Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ、オーストリアおよびＱｕｅｓｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｓａｎ  Ｊｕａｎ  Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、ＣＡ、米国で、２つの独立した、個別支払い方式を利用して３４例の乳癌女性から得られた血漿試料および６１６例の対照を有する独立の妥当性確認セットにおいて、定量的メタボロミクスのプラットフォームを使用して実施した。標的化（ＥＳＩ）ＭＳ／ＭＳの定量的な技法は、ＵＳ２００７／０００４０４４に詳細に記載されている。手短に述べると、標的化プロファイリングスキームを使用して、既知の低分子代謝産物について、多重反応モニタリング、ニュートラルロスおよびプリカーサーイオンのスキャンを使用して定量的にスクリーンする。生物学的試料の代謝産物の定量化を、適切な内部標準を参照することにより達成し、この方法は、２１ＣＦＲ（米国連邦規則集）第１１章に適合することが証明されており、このことは、所与の誤差範囲内の再現性が裏付けられていることを意味する。分析した代謝産物の濃度は全て、μＭで報告された。
【０１２９】
代謝産物のパネル
全部で１８３個の異なる代謝産物を検出するに至り、それらは、４０個のアシルカルニチン類、１９個のタンパク新生アミノ酸類、オルニチンおよびシトルリン、１９個の生体アミン類、ヘキソース類の合計、７６個のホスファチジルコリン類、１４個のｌｙｓｏ−ホスファチジルコリン類、ならびに１５個のスフィンゴミエリン類である。
【０１３０】
グリセロリン脂質を、グリセロール部分中のエステル（ａ）結合およびエーテル（ｅ）結合の存在に関してさらに差別化し、２つの文字（ａａ＝ジアシル、ａｅ＝アシル−アルキル、ｅｅ＝ジアルキル）は、２つのグリセロールの位置が脂肪酸残基に結合していることを表し、一方、単一の文字（ａ＝アシルまたはｅ＝アルキル）は、単一の脂肪酸残基の存在を示す。
【０１３１】
脂質の側鎖の組成を、Ｃｘ：ｙと略し、式中、ｘは、側鎖中の炭素の数を意味し、ｙは、二重結合の数を意味する。例えば、「ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１」は、２つの脂肪酸側鎖中に３８個の炭素を有し、それらのうちの１つ中に単一の二重結合を有するプラズマローゲン／プラスミノーゲンホスファチジルコリンを表す。
【０１３２】
データ解析
ロジスティック回帰解析により、マーカーを発見するため、および応答と関連がある可能性がある臨床変数があればそれを同定するために、トレーニング症例を使用した。代謝産物の濃度の定量化および品質管理の評価を、ＭｅｔＩＤＱ（登録商標）ソフトウエアパッケージ（Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ、Ｉｎｎｓｂｒｕｃｋ、オーストリア）を用いて実施した。内部標準は、代謝産物の濃度の計算のための参照として働く。次いで、ｘｌｓファイルをエクスポートし、このファイルは、試料名、代謝産物名、および血漿中のμｍｏｌ／Ｌの単位で示す代謝産物の濃度を含有した。
【０１３３】
次いで、データを、ウェブベースの解析パイプラインＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔ  ２．０（ｗｗｗ．ｍｅｔａｂｏａｎａｌｙｓｔ．ｃａ）にアップロードし、ＭｅｔａｂｏＡｎａｌｙｓｔの正規化プロトコール（Ｘｉａら、２０１２年）を使用して正規化して、一変量解析および多変量解析、高い次元のフィーチャの選択、クラスター化および教師あり分類、機能エンリッチメント、ならびに代謝経路解析を行った。
【０１３４】
また、データをｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｃｃｅｔ．ｃａ／ＲＯＣＣＥＴ／で利用可能なＲＯＣＣＥＴ（ＲＯＣ  Ｃｕｒｖｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  ＆  Ｔｅｓｔｅｒ）にインポートし、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、部分最小二乗−判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）およびランダムフォレストにより入手する、一変量および多変量受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線の生成も行った。
【０１３５】
モンテカルロクロスバリデーション（ＭＣＣＶ）により、均衡のとれたサブサンプリングを使用して、曲線を生成し、この場合、試料の３分の２（２／３）を、フィーチャの重要性を評定するために使用した。次いで、有意なフィーチャを使用して、分類モデルを構築し、これらのモデルの妥当性を、除外されていた、試料の１／３上で確認した。同じ手順を、複数回反復して、各モデルの性能および信頼区間を計算した。
【０１３６】
用語の定義：
（１）上方制御および下方制御：上方制御は、代謝産物の濃度の増加、例えば、この生化学的反応が生じる、例えば、酵素活性の変化に起因する速度の増加を意味する。下方制御は、その反対である。
【０１３７】
（２）ｔ検定：ｔ検定は、統計学的な仮説検定であり、使用されているその１つが、ＭａｒｋｅｒＶｉｅｗソフトウエア中に組み入れているものであり、表中の全ての変数に適用され、各群についての平均が有意に異なるかどうかを、標準偏差および試料の数を考慮して決定し、例えば、２つの異なる群の平均（means、average）の間に実際に差があるかどうかを見出す。
【０１３８】
（３）ｐ値：ｐ値は、帰無仮説（変化または効果がないという仮説）が本当であると仮定して、実際に観察された結果と少なくとも同じ程度の最も高い結果を得る確率である。ｐ値は常に正の値であり、値が小さいほど、変化が発生する確率はより低い。０．０５以下のｐ値は、帰無仮説を、５％のレベルで拒絶し、５％のレベルとは、変化が偶発的に発生する機会がわずか５％に過ぎないことを意味する。これは、我々の表で設定したレベルである。
【０１３９】
（４）対数倍の変化：対数倍の変化を、各条件における平均対数変換濃度間の差と定義する。これは、１つの群に属する値が、別の群と比較して、どれだけより高いまたはより低いかを記載する方法である。例えば、０．３の対数倍の変化は、対照（より健康な群）と比較して、ｅｘｐ（０．３）＝１．３４倍の変化の増加に「相当する」。さらに、−０．３の対数倍の変化は、対照と比較して、ｅｘｐ（−０．３）＝０．７４＝（１／１．３４）倍の変化の増加に、または疾患と比較して、１．３４倍の変化の減少に「相当する」。
【０１４０】
結果：
１．乳癌のスクリーニングおよび／または診断
一変量および多変量探索的ＲＯＣ解析
最初に、主成分解析（ＰＣＡ）およびＲＯＣ曲線解析を、発見（３０例の患者および９３例の対照）について、さらに、妥当性確認セット１（３４例の患者および２４例の対照）ならびに妥当性確認セット２（３４例の患者および６１６例の対照）について実施するに至った；これらから、スクリーニングおよび診断の卓越した信頼性が明らかになり、このことを、以下の表６に示す。
【０１４１】
【表７】
0006656233.tif 000010
【０１４２】
最初に含めた６４例の女性から得られたＰＣＡおよびＰＬＳ−ＤＡ解析を、６１６例の対照と比較した。両方のセットにおいて、検出能力の高い、血液の代謝産物が癌患者間に、対照と比較して存在すること（２０００回の並べ替え検定の後に、ｐ＝０．０２４５）により、ＰＣＡの解析結果が確認された。並べ替え検定の統計操作により、２０００回の並べ替えの後に、５ｅ−０４未満のｐ値が示されている（８Ａ）。この結果により、ＰＬＳ−ＤＡの解析結果が極めて有意であることが確認されている（８Ｂ）。
【０１４３】
一変量または多変量解析のために使用し、同定した代謝産物のシグネチャーを、表１および表２に、併せて、ｔ検定および相関関係研究も記載し、全ての代謝産物について、ｐ値および偽発見率（ＦＤＲ）が極めて有意であることを示す（表７および８）。
【０１４４】
【表８】
0006656233.tif 000011
【０１４５】
【表９】
0006656233.tif 000012
【０１４６】
スクリーニングの目的で、トレーニングセット、および結果の性能を評価するための妥当性確認セットにおいて得られた多変量ＲＯＣ曲線による評定を、表６に示す。同定した代謝産物は、癌患者と対照とを、感度＝１００％、特異度＝９８．３１％、陽性予測値（ＰＰＶ）＝７９．０９％、および陰性予測値（ＮＰＶ）＝１００％で正確に隔離する。
【０１４７】
重要なことに、並べ替えを１０００回行った後でも、シグネチャーは、極めて有意な状態を維持し、ＲＯＣ曲線の解析結果を確認した。
【０１４８】
相関関係解析からは、以下の表９に示すように、臨床的および病理学的な変数に関して腫瘍の応答率の間で有意な結果はいずれも示されなかった。
【０１４９】
【表１０】
0006656233.tif 000013
【０１５０】
さらに、トレーニングセットにおいて得られたＲＯＣ曲線の解析結果から、少なくとも、（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに１つの脂質、または（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸を含む、癌患者と対照とを正確に隔離するための代謝産物の最小のセットも明らかになった。ＲＯＣ曲線の解析から得られた結果を、図１〜図７に示す。
【０１５１】
図１Ａ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られた、ＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−９．３９７、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝１（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝８．００１９Ｅ−２２、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５２】
図１Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−９．３９７、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝０．９７４（０．９３５〜１）、陽性の尤度比＝３８．５、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝１．２６３２Ｅ−５８、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５３】
図２Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−６．６４５、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝０．９８４４（０．９５３〜１）、陽性の尤度比＝６４．０、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝９．９６３６Ｅ−３１、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５４】
図２Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−６．６４５、感度＝０．９８４４（０．９５３〜１）、特異度＝０．９４８１（０．８９６〜０．９６７）、陽性の尤度比＝１８．９５、陰性の尤度比＝０．０１６４８、Ｔ検定＝３．６３４７Ｅ−４２、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５５】
図３Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝６．２３１、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝１．９２０４Ｅ−１３、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）
【０１５６】
図３Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ３８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝５．５７５、感度＝０．９２１９（０．８５１〜０．９６９）、特異度＝０．９３（０．８８５〜０．９８）、陽性の尤度比＝１３．１７、陰性の尤度比＝０．０８４０１、Ｔ検定＝１．６９５１Ｅ−４３、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５７】
図４Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝７．４６８、感度＝０．９６５５（０．９１４〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０３４４８、Ｔ検定＝３．７０７７Ｅ−１０、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５８】
図４Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、セリン（Ｓｅｒ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝７．１６２、感度＝０．８９０６（０．８１２〜０．９６９）特異度＝０．９８（０．９５〜１）、陽性の尤度比＝４４．５３、陰性の尤度比＝０．１１１６、Ｔ検定＝１．６９５１Ｅ−４３、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１５９】
図５Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ２８：１（ＰＣ  ａａ  Ｃ２８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）と対照（ｎ＝１１）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−６．１１９、感度＝０．９４８３（０．８８８〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０５１７２、Ｔ検定＝４．１９７２Ｅ−２０、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６０】
図５Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ２８：１（ＰＣ  ａａ  Ｃ２８：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−６．３３５、感度＝０．９２１９（０．８５９〜０．９７７）、特異度＝０．８３（０．７５〜０．９）、陽性の尤度比＝５．４２３、陰性の尤度比＝０．０９４１３、Ｔ検定＝２．１６５７Ｅ−２６、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６１】
図６Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。感度＝１００％、特異度＝１００％、陽性予測値＝１００％、陰性予測値＝１００％、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６２】
図６Ｂ：妥当性確認セットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：１（ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：１）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。感度＝１００％、特異度＝９９％、陽性予測値＝９８．４６％、陰性予測値＝１００％、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６３】
図７Ａ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝１１）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１．１０１、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝１．１（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝９．９０５８Ｅ−１７、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６４】
図７Ｂ：トレーニングセットにおいて、２つの代謝産物、すなわち、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）を使用して、乳癌（ｎ＝６４）を対照（ｎ＝７７）と比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１．１０１、感度＝０．９２１９（０．８５１〜０．９６９）、特異度＝０．９３（０．８６〜０．９７）、陽性の尤度比＝１３．１７、陰性の尤度比＝０．０８４０１、Ｔ検定＝４．６２６８Ｅ−４０、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１６５】
上記のデータから認めることができるように、本発明により、既知の方法と比較して改善された精度および信頼性で、乳癌患者についてスクリーニングすること、およびそれらの患者を診断することが可能になる。特に、以下の比較（表１０）から、このことを示すことができる。
【０１６６】
【表１１】
0006656233.tif 000014
【０１６７】
２．化学療法への高い応答（Ｈｒｅｓｐ）または低い応答（ＳＤＰＲ）の予測：
全部で１０例の患者（トレーニングセットにおける６例および妥当性確認セットにおける４例）が、少なくとも９０％の応答を達成した；それらの患者のうちの７例が、ｙｐＴ０／ｙｐＮ０と定義した病理学的完全応答（ｐＣＲ）に到達した。ｐＣＲおよびＳＤＰＲの総パーセントがそれぞれ、患者の１１．８％（７／５９）および３２％（１９／５９）において観察された。
【０１６８】
トレーニングセットにおいて得られたＲＯＣ曲線の解析結果から、少なくとも、セリンおよびグルタミンから選択される１つのアミノ酸、メチル化アルギニン、１つのアシルカルニチン、ならびに１つの脂質を含む、化学療法への応答を正確に予測するための代謝産物の最小のセットが明らかになった。ＲＯＣ曲線の解析から得られた結果を、図９〜図１２に示す。
【０１６９】
図９Ａ：トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびドデカンジオイルカルニチン（Ｃ１２−ＤＣ）を使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と３５〜７８％の応答を示した患者（ｎ＝２１）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１１．５６、感度＝１．０（１〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０、Ｔ検定＝８．５５３Ｅ−６、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１７０】
図９Ｂ：妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と安定な疾患／進行を示した患者（ＳＤＰＲ、ｎ＝２２）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１１．５６、感度＝０．９０９１（０．７７３〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．０９０９１、Ｔ検定＝２．５３８１Ｅ−４、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１７１】
図１０Ａ：トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と３５〜７８％の応答を示した患者（ｎ＝２１）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１０．１２、感度＝０．７１４３（０．５７１〜０．９０５）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．２８５７、Ｔ検定＝８．５５３Ｅ−６、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１７２】
図１０Ｂ：妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３０：０、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と安定な疾患／進行を示した患者（ＳＤＰＲ、ｎ＝２２）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−１０．１２、感度＝０．７７３（０．５９１〜０．９５５）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．２２７３、Ｔ検定＝４．８１２５Ｅ−４、ｐ値：＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１７３】
図１１Ａ：トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と低い応答を示した患者（ｎ＝５２）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝８．４１６、感度＝０．４９０２（０．３４２〜０．６３８）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．５０９８、Ｔ検定＝０．０１８９０５、ｐ値：＜０．００１（１００回の並べ替え）
【０１７４】
図１１Ｂ：妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ４２：０、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と安定な疾患／進行を示した患者（ＳＤＰＲ）（ｎ＝２２）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝−８．４１２、感度＝０．８７５（０．６２５〜１）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．１２５、Ｔ検定＝０．０１３８１３、ｐ値＜０．００１（１００回の並べ替え）。
【０１７５】
図１２Ａ：トレーニングセットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３２：２、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と８０〜９２％の応答を示した患者（ｎ＝８）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝１１．３８、感度＝０．６２５（０．３７５〜０．８７５）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．３７５、Ｔ検定＝０．０１７７６５、ｐ値：＜０．００１（１００回の並べ替え）。
【０１７６】
図１２Ｂ：妥当性確認セットにおいて、総ＤＭＡ、ＰＣ  ａｅ  Ｃ３２：２、セリン（Ｓｅｒ）、およびＣ１２−ＤＣを使用して、病理学的完全応答を示した患者（ｐＣＲ、ｎ＝７）と安定な疾患／進行を示した患者（ＳＤＰＲ）（ｎ＝２２）とを比較して得られたＲＯＣ曲線の解析結果。カットオフ＝１１．３７、感度＝０．５９０９（０．４７９〜０．７９７）、特異度＝１．０（１〜１）、陽性の尤度比＝無限大、陰性の尤度比＝０．４０９１、Ｔ検定＝０．０２６９６１、ｐ値：＜０．００１（１００回の並べ替え）。
【０１７７】
上記のデータは、上記で規定したバイオマーカーの組合せを使用することによる、特異度、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶのパラメータにより決定した場合の、卓越した、予測の精度および信頼性を示している。
【０１７８】
３．乳癌の固有のサブタイプに従う代謝産物
トレーニングセットにおいて得られたＲＯＣ曲線の解析結果から、分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する少なくとも１つのアシルカルニチン、および分子中に最多で３つの不飽和を含有する少なくとも１つの脂質を含む、乳癌のサブタイプの下位分類のための代謝産物の最小のセットが明らかになった。ＲＯＣ曲線の解析から得られた結果を、図１３〜図１５に示す。
【０１７９】
図１３：乳癌の特異的なサブタイプの、表１１に示す代謝産物を使用する同定。ルミナル腫瘍Ａ／Ｂを有する患者（ｎ＝３０）、ならびに三種陰性およびＨＥＲ２陽性を有する患者（その他の腫瘍；ｎ＝２９）の同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果。ＡＵＣ＝０．８２１（９５％ＣＩ：０．６８６〜０．９４５）、感度＝８１．０８％、特異度＝８２．８６％、陽性予測値：８３．３３％、陰性予測値：８０．５６％、ｐ値＝０．００８（１０００回の並べ替え）。
【０１８０】
【表１２】
0006656233.tif 000015
【０１８１】
図１４：乳癌の特異的なサブタイプの、表１２に示す代謝産物を使用する同定。ＨＥＲ２腫瘍を有する患者（ＬｕｍＢ−ＨＥＲ２＋ＨＥＲ２）（ｎ＝１９）、ならびに三種陰性およびルミナルＡ／Ｂを有する患者（その他の腫瘍；ｎ＝４０）の同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果。ＡＵＣ＝０．８０３（９５％ＣＩ：０．６３９〜０．９２６）、感度＝８６．３６％、特異度＝７６．９２％、陽性予測値＝６１．２９％、陰性予測値＝９３．０２％、ｐ値＝０．００２（１０００回の並べ替え）。
【０１８２】
【表１３】
0006656233.tif 000016
【０１８３】
図１５：乳癌の特異的なサブタイプの、表１３に示す代謝産物を使用する同定。三種陰性を有する患者（ｎ＝１０）、およびＨＥＲ２陽性／ルミナルＡ／Ｂ（その他の腫瘍；ｎ＝４９）の同定を示すＲＯＣ曲線の解析結果。ＡＵＣ＝０．８７５（９５％ＣＩ：０．７６２〜０．９８）、感度＝８３．３３％、特異度＝８５．９６％、陽性予測値＝５５．５６％、陰性予測値＝９６．０８％、ｐ値＜０．００１（１０００回の並べ替え）。
【０１８４】
【表１４】
0006656233.tif 000017
【０１８５】
上記のデータから、特異度、感度、ＰＰＶおよびＮＰＶのパラメータにより決定する場合には、乳癌腫瘍を、この腫瘍に特異的であるバイオマーカーに基づいて、特定のタイプの間で、高い精度および信頼性で区別することが可能であることが示されている。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明により、改善された様式で、乳癌に罹患する可能性がある対象、特に、ヒト患者をスクリーンすること、および対象内の乳癌を診断することが可能になり、それにより、より正確、確実かつ有効なスクリーニングおよび診断の手順が提供される。
【０１８７】
さらに、本発明により、乳癌に罹患している患者が、化学療法、例としてネオアジュバント化学療法への応答を示す可能性が高いかどうかを、疾患の早期によりよく予測することが可能になる。実際に、本発明に従うバイオマーカーは、血液中で容易に検出可能であり、それらのレベルは、乳癌の段階に一貫して関連する。したがって、本発明の方法は、短い期間にハイスループットで容易に実施することができ、したがって、患者のコンプライアンスの改善を可能にする。
【０１８８】
加えて、本発明のバイオマーカーおよびバイオマーカーのセットを用いると、腫瘍のサブタイプを区別することも可能になり、したがって、腫瘍のサブタイプに基づく個別の治療が可能になり、それによりさらに、患者のコンプライアンスが増加し、療法の成功が高まる。
【０１８９】
さらに、本発明により、代謝バイオマーカーを利用して、腫瘍活性を決定することも可能になり、このことは、好都合であり、当技術分野で実施されている腫瘍の特徴付けと比較して優れている。乳癌の腫瘍活性の生化学的兆候を評価することによって、患者の療法を適応させ、調整するのに適切なツールが提供され、それにより、患者のコンプライアンスおよび生活の質が大きく向上する。
【０１９０】
それらに基づいて、キットを調製することが可能であり、こうしたキットは、乳癌をスクリーニングおよび診断すること、患者の腫瘍を分類し、その生化学的活性を決定すること、疾患の進行および患者の、ネオアジュバント化学療法への治療応答をモニタリングすることに役立つのに適切である。
【０１９１】
実施形態：
したがって、本発明は、以下の好ましい実施形態に関する。
【０１９２】
１．哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌をスクリーニングおよび／または診断するためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに
１つの脂質、または
（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸
を含む、使用。
【０１９３】
２．脂質が、アラキドン酸多価不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、アラキドン酸一不飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、およびアラキドン酸飽和ホスファチジルコリン  アシル−アルキルから選択される、実施形態１に記載の使用。
【０１９４】
３．代謝産物の組合せが、スフィンゴミエリンおよびグルタコニルカルニチンのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態１または２に記載の使用。
【０１９５】
４．哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測のためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
−  セリンおよびグルタミンから選択される１つのアミノ酸、
−  メチル化アルギニン、
−  １つのアシルカルニチン、ならびに
−  １つの脂質
を含む、使用。
【０１９６】
５．アシルカルニチンが、グルタリルカルニチンおよびメチルグルタリルカルニチンのうちの１つまたは複数から選択される、実施形態４に記載の使用。
【０１９７】
６．脂質が、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：６、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４４：５、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：４、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３２：２、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３０：０、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４２：０、リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ１７：０、リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２６：０、リゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ３０：０、およびリゾホスファチジルコリン  ａ  Ｃ２４：０から選択される、実施形態４または５に記載の使用。
【０１９８】
７．代謝産物の組合せが、プトレシン、スペルミンおよびジメチル化アルギニンのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態４から６のいずれか１つに記載の使用。
【０１９９】
８．哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌の腫瘍活性の生化学的指標を評価するためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
−  グルタミン酸、グルタミン、アラニン、グリシン、セリンおよびアスパラギン酸から選択される１つのアミノ酸、ならびに
−  １つの脂質
を含む、使用。
【０２００】
９．脂質が、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル、およびホスファチジルコリン  アシル−アシルから選択される、実施形態８に記載の使用。
【０２０１】
１０．代謝産物の組合せが、ロイシンおよびオルニチンのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態８または９に記載の使用。
【０２０２】
１１．哺乳動物対象の血液試料中に含有される代謝産物の組合せの、乳癌腫瘍のサブタイプの下位分類のためのバイオマーカーのセットとしての使用であって、代謝産物の組合せが、少なくとも、
−  分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する１つのアシルカルニチン、および
−  分子中に最多で３つの不飽和を含有する１つの脂質
を含む、使用。
【０２０３】
１２．脂質が、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：３、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３６：０、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ４２：０、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：０、ホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ３８：１、ホスファチジルコリン  アシル−アシル  Ｃ３８：２、およびホスファチジルコリン  アシル−アルキル  Ｃ４０：１から選択される、実施形態１１に記載の使用。
【０２０４】
１３．代謝産物の組合せが、メチオニンスルホキシド、リジン、ヒスチジン、リゾＰＣ  ａ  Ｃ２４：０、リゾＰＣ  ａ  Ｃ２０：３、シトルリン、およびアルギニンのうちの１つまたは複数をさらに含む、実施形態１１または１２に記載の使用。
【０２０５】
１４．哺乳動物対象内の乳癌をスクリーニングおよび／または診断するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
（ａ）グルタミン、グルタミン酸およびセリンから選択される１つのアミノ酸、ならびに
１つの脂質、または
（ｂ）グルタミンおよびグルタミン酸
の量を測定するステップを含む方法。
【０２０６】
１５．哺乳動物対象における乳癌ネオアジュバント化学療法への治療応答の予測のための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  セリンおよびグルタミンから選択される１つのアミノ酸、
−  メチル化アルギニン、
−  １つのアシルカルニチン、ならびに
−  １つの脂質
の量を測定するステップを含む方法。
【０２０７】
１６．哺乳動物対象内の乳癌の腫瘍活性の生化学的指標を評価するための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  グルタミン酸、グルタミン、アラニン、グリシン、セリンおよびアスパラギン酸から選択される１つのアミノ酸、ならびに
−  １つの脂質
の量を測定するステップを含む方法。
【０２０８】
１７．哺乳動物対象内の乳癌腫瘍のサブタイプの下位分類のための方法であって、対象から入手した血液試料中で、少なくとも、
−  分子中に少なくとも１０個の炭素原子を含有する１つのアシルカルニチン、および
−  分子中に最多で３つの不飽和を含有する１つの脂質
の量を測定するステップを含む方法。
【０２０９】
１８．測定が、定量的な分析の方法、好ましくは、クロマトグラフィー、分光法および質量分析装置／質量分析に基づく、１４から１７の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
１９．クロマトグラフィーが、ＧＣ、ＣＥ、ＬＣ、ＨＰＬＣおよびＵＨＰＬＣを含み、分光法が、ＵＶ／Ｖｉｓ、ＩＲ、ＮＩＲおよびＮＭＲを含み、質量分析装置／質量分析が、ＥＳＩ、四重極質量分析装置、イオントラップ質量分析装置、ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析装置、オービトラップ質量分析装置、磁気セクター質量分析装置、静電気セクター質量分析装置、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、ならびにそれらの組合せを含み、例えばシングル四重極（Ｑ）およびトリプル四重極（ＱｑＱ）、ＱｑＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ｑ−オービトラップ、ＡＰＣＩ−ＱｑＱ、ＡＰＣＩ−ＱｑＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＱ、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦを含む、実施形態１８に記載の方法。
【図１Ａ】
0006656233.tif 000018
【図１Ｂ】
0006656233.tif 000019
【図２Ａ】
0006656233.tif 000020
【図２Ｂ】
0006656233.tif 000021
【図３Ａ】
0006656233.tif 000022
【図３Ｂ】
0006656233.tif 000023
【図４Ａ】
0006656233.tif 000024
【図４Ｂ】
0006656233.tif 000025
【図５Ａ】
0006656233.tif 000026
【図５Ｂ】
0006656233.tif 000027
【図６Ａ】
0006656233.tif 000028
【図６Ｂ】
0006656233.tif 000029
【図７Ａ】
0006656233.tif 000030
【図７Ｂ】
0006656233.tif 000031
【図８Ａ】
0006656233.tif 000032
【図８Ｂ】
0006656233.tif 000033
【図９Ａ】
0006656233.tif 000034
【図９Ｂ】
0006656233.tif 000035
【図１０Ａ】
0006656233.tif 000036
【図１０Ｂ】
0006656233.tif 000037
【図１１Ａ】
0006656233.tif 000038
【図１１Ｂ】
0006656233.tif 000039
【図１２Ａ】
0006656233.tif 000040
【図１２Ｂ】
0006656233.tif 000041
【図１３】
0006656233.tif 000042
【図１４】
0006656233.tif 000043
【図１５】
0006656233.tif 000044