(57)【要約】【課題】活性汚泥中の細菌の種類や生息数を速やかに知ることである。【解決手段】本発明は、基板上に、Nocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、Beggiatoa属糸状性細菌、Thiothrix属糸状性細菌、Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されたＤＮＡチップを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板上に、
Nocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、
Beggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌、
Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、
Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌
のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されてなることを特徴とするＤＮＡチップ。
【請求項２】
基板上に、Sphaerotilus属糸状性細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されている請求項１に記載のＤＮＡチップ。
【請求項３】
基板上に、Desulfococcus属硫黄代謝細菌、Desulfomonas属硫黄代謝細菌、Desulfuromonas属硫黄代謝細菌、Desulfurella属硫黄代謝細菌、Desulfomonile属硫黄代謝細菌、Desulfosarcina属硫黄代謝細菌またはLawsonia属硫黄代謝細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されている請求項１または請求項２に記載のＤＮＡチップ。
【請求項４】
Nitrosolobus属硝化細菌またはNitrobacter属硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されている請求項１〜請求項３のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）チップに関し、詳しくは活性汚泥に含まれる細菌の分析に好適に使用されるＤＮＡチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
活性汚泥を用いて、これに生息している種々の細菌により、排水に含まれる汚染物質、例えば有機態炭素などを生物学的に分解する、いわゆる活性汚泥法は、排水を浄化する排水処理方法は、生物学的に排水を処理する生物学的排水処理方法として広く用いられている〔特許文献１：特開平５−２３７４８８号公報、特許文献２：特開２０００−２７９９８２号公報など〕。
【０００３】
活性汚泥に含まれる細菌は、それぞれ特定の汚染物質を選択的に分解するのが通常である。例えば硫黄代謝細菌は、無機硫黄化合物などを選択的に分解するが、有機態炭素、アンモニア態窒素などは分解しない。しかも、活性汚泥中の細菌は、汚染物質を分解すると、分解量に応じて生息数が増加するが、その一方で、分解すべき汚染物質が無い状態が続くと、次第に死滅して減少する。
【０００４】
また、同一の排水源からの排水に含まれる汚染物質の種類やその濃度は、長期間に亘り概ね一定の範囲内にあるのが通常である。例えば家庭から排出される生活排水は、通常、有機態炭素を主な汚染物質とし、その濃度は概ね一定の範囲内である。
【０００５】
このため、活性汚泥中の細菌の種類やその生息数は、長期間、同じ排水源からの排水を処理し続けることより、その排水の処理に適切なものとなるのが通常である。
【０００６】
しかし、活性汚泥中の細菌が、夏場の高温、突発的な被毒物質の混入、汚染物質の急激な増加など、様々な原因により、全て死滅する場合がある。このような場合に、他の排水源からの排水の処理に使用している活性汚泥を投入し、排水処理を再開することがあるが、このような活性汚泥は、処理すべき排水に含まれる汚染物質に必ずしも適したものではない。このため、汚染物質の分解が効率よく行われず、排水の処理が滞ると言う問題があった。
【０００７】
かかる問題を解決するには、処理すべき排水に対して適切な種類の細菌を適切な生息数で含む活性汚泥を選択して投入し、排水処理を再開すればよい。このため、活性汚泥中の細菌の種類や、その生息数を速やかに、精度よく、知りうる方法が求められている。
【０００８】
活性汚泥中の細菌を分析する方法としては、従来から、顕微鏡により細菌の形状や個数を観察する方法が知られている〔特許文献３：特開平５−１４６７９１号公報〕。
【０００９】
しかし、顕微鏡による従来の分析方法は、細菌を速やかに、精度よく分析しうるものではなかった。
【００１０】
【特許文献１】特開平５−２３７４８８号公報
【特許文献２】特開２０００−２７９９８２号公報
【特許文献３】特開平５−１４６７９１号公報
【非特許文献１】ＳＣＡＳ ＮＥＷＳ ２００５−II〔株式会社住化分析センター(2005年8月22日)発行、第３頁〜第６頁〕
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで本発明者は、活性汚泥中の細菌の種類や生息数を速やかに知るべく鋭意検討した結果、本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
すなわち本発明は、基板上に、
Nocardia属糸状性細菌、Rhodococcus属糸状性細菌、
Beggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌、
Desulfobacter属硫黄代謝細菌、Desulfotomaculum属硫黄代謝細菌、Desulfovibrio属硫黄代謝細菌、Desulfomicrobium属硫黄代謝細菌、Desulforhopalus属硫黄代謝細菌、
Nitrosomonas属硝化細菌、Nitrosospira属硝化細菌およびNitrospira属硝化細菌
のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されてなることを特徴とするＤＮＡチップを提供するものである。
【００１３】
本発明のＤＮＡチップは、基板上に、Sphaerotilus属糸状性細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００１４】
本発明のＤＮＡチップは、基板上に、Desulfococcus属硫黄代謝細菌、Desulfomonas属硫黄代謝細菌、Desulfuromonas属硫黄代謝細菌、Desulfurella属硫黄代謝細菌、Desulfomonile属硫黄代謝細菌、Desulfosarcina属硫黄代謝細菌またはLawsonia属硫黄代謝細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることも好ましい。
【００１５】
本発明のＤＮＡチップは、基板上に、Nitrosolobus属硝化細菌またはNitrobacter属硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることも好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のＤＮＡチップによれば、活性汚泥中の細菌の種類を知り、また、その生息数を見積もる分析を、速やかに、精度よく、行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
〔基板〕
本発明のＤＮＡチップを構成する基板として通常は、無機ガラス製の板が挙げられる。基板のサイズとしては、取扱いが容易である点で、通常は厚み０．５ｍｍ〜２ｍｍで、短辺が１０ｍｍ〜２０ｍｍ、長辺が５０ｍｍ〜１００ｍｍのものが使用される。このような基板としては、光学顕微鏡観察に広く用いられているスライドグラスが、入手が容易である点で、好ましく用いられ
【００１８】
〔細菌〕
かかる基板の上に固定されるＤＮＡ断片は、上記した糸状性細菌、硫黄代謝細菌および硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むものである。
【００１９】
〔糸状性細菌〕
糸状性細菌は、活性汚泥による汚染物質の分解に対して障害となりうる細菌である。糸状性細菌の中でも、上記したNocardia属、Rhodococcus属のものは、過剰に繁殖すると活性汚泥が浮上する膨化と呼ばれる現象の原因となって活性汚泥による分解に対する障害となり易いものとして、多くの活性汚泥に含まれうるものである。
【００２０】
本発明のＤＮＡチップは、上記した糸状性細菌以外の糸状性細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもSphaerotilus属糸状性細菌は、比較的多くの活性汚泥に含まれうることから、これのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２１】
〔硫黄代謝細菌〕
硫黄代謝細菌は、硫黄または無機硫黄化合物を酸化しうる細菌であり、排水が硫黄または無機硫黄化合物を含む場合に、活性汚泥に多く含まれるものである。硫黄代謝細菌の中でも上記したDesulfobacter属、Desulfotomaculum属、Desulfovibrio属、Desulfomicrobium属およびDesulforhopalus属のものは、活性汚泥により、その量が大きく変化しうるものである。
【００２２】
本発明のＤＮＡチップは、上記した硫黄代謝細菌以外の硫黄代謝細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもDesulfococcus属硫黄代謝細菌、Desulfomonas属硫黄代謝細菌、Desulfuromonas属硫黄代謝細菌、Desulfurella属硫黄代謝細菌、Desulfomonile属硫黄代謝細菌、Desulfosarcina属硫黄代謝細菌、Lawsonia属硫黄代謝細菌は、活性汚泥により、その量が比較的大きく変化しうることから、そのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２３】
〔糸状性細菌硫黄代謝細菌〕
糸状性細菌硫黄代謝細菌は、糸状性細菌の性質と、硫黄代謝細菌の性質を併せ持つ細菌であり、例えばBeggiatoa属糸状性細菌硫黄代謝細菌、Thiothrix属糸状性細菌硫黄代謝細菌などが挙げられる。
【００２４】
〔硝化細菌〕
硝化細菌は、アンモニア態窒素または亜硝酸態窒素を酸化する菌であって、排水がアンモニア態窒素を含む場合に、活性汚泥に多く含まれるものであり、アンモニア態窒素を亜硝酸に酸化するアンモニア酸化細菌、または亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌である。上記したNitrosomonas属硝化細菌（アンモニア酸化細菌）、Nitrosospira属硝化細菌（アンモニア酸化細菌）およびNitrospira属硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）は、活性汚泥により、その量が大きく変化するものである。
【００２５】
本発明のＤＮＡチップは、上記した以外の硝化細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよく、中でもNitrosolobus属硝化細菌（アンモニア酸化細菌）、Nitrobacter属硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）は、活性汚泥により、その量が比較的大きく変化することから、そのＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていることが好ましい。
【００２６】
〔その他の細菌〕
本発明のＤＮＡチップは、上記した糸状性細菌、硫黄代謝細菌、硝化細菌以外の細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片が固定されていてもよい。かかる細菌は、好気性細菌であってもよいし、嫌気性細菌であってもよく、例えばAcinetobacter属ポリリン酸蓄積細菌、Arthrobacter属ポリリン酸蓄積細菌、Microlunatas属ポリリン酸蓄積細菌などが挙げられる。また、上記した以外の糸状性細菌、硫黄代謝細菌、糸状性細菌硫黄代謝細菌、硝化細も挙げられる。
【００２７】
〔ＤＮＡチップの調製〕
本発明のＤＮＡチップは、例えば
(1)上記各細菌のＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ断片を調製するＤＮＡ断片調製工程および
(2)ＤＮＡ断片調製工程で得られたＤＮＡ断片を基板上に固定するＤＮＡ断片固定工程
を経て調製することができる。
【００２８】
〔ＤＮＡ断片調製工程〕
ＤＮＡ断片は、通常の方法、例えば目的とする細菌を溶菌し、ＤＮＡを抽出し、得られたＤＮＡを増幅する方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ反応）により調製することができる。ＤＮＡ断片は両端がＤＮＡプライマーで固定されていてもよい。
【００２９】
〔ＤＮＡ断片固定工程〕
上記ＤＮＡ断片調製工程で得られたＤＮＡ断片は、通常の方法、例えば上記で得られたＤＮＡ断片を溶媒で希釈し、基板上にスポット状に付着させ、次いで乾燥すればよい。
【００３０】
得られたＤＮＡチップは、通常０℃以下、好ましくは−１５℃以下で保存される。
【００３１】
〔細菌の分析〕
本発明のＤＮＡチップは、活性汚泥中の細菌の種類および量を分析することができる。
【００３２】
活性汚泥中の細菌の種類および量は、例えば
(1)活性汚泥から細菌を抽出する細菌抽出工程、
(2)細菌抽出工程で得た細菌を溶菌したのちＤＮＡを抽出する溶菌・ＤＮＡ抽出工程、
(3)溶菌・ＤＮＡ抽出工程で抽出されたＤＮＡを蛍光色素と結合させて標識化する標識化工程、および
(4)標識化工程で標識化したＤＮＡをＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と交雑させる交雑工程
を経て分析される。
【００３３】
〔細菌抽出工程〕
活性汚泥から細菌を抽出するには、例えば活性汚泥を生理食塩水で希釈したのち、遠心分離処理すればよい。遠心分離により、細菌は沈降して沈殿物となるので、遠心処理後の沈殿物として、細菌を得ることができる。
【００３４】
〔溶菌・ＤＮＡ抽出工程〕
得られた細菌を溶菌するには、例えば細菌を溶媒中、粉砕媒体と共に震盪すればよい。粉砕媒体としては。例えばガラスビーズなどが用いられる。震盪することにより、細菌が粉砕媒体に衝突するなどして破壊され、細菌中のＤＮＡが溶媒中に分散する。その後、粉砕媒体を分離し、遠心分離により固形分を除去し、塩化ナトリウムおよびエタノールを加えてＤＮＡを沈降させ、遠心分離により沈降物としてＤＮＡを得ることができる。
【００３５】
〔標識化工程〕
抽出されたＤＮＡを標識化するには、例えばインドカルボシアニン（Ｃｙ）色素などの蛍光色素で標識したプライマーをＰＣＲ法により結合させればよい。
【００３６】
〔交雑工程〕
標識化した後のＤＮＡを、ＤＮＡチップ上のＤＮＡ断片と交雑させるには、このＤＮＡをＤＮＡチップ上に塗布すればよい。塗布は、例えばＤＮＡを溶媒中に分散させ、滴下したのち、乾燥することにより行われる。塗布により、ＤＮＡは、これに対応するＤＮＡ断片と結合する。
【００３７】
交雑工程の後、水洗するなどして、結合しなかった余分のＤＮＡを除去し、紫外線照射下に蛍光を観察することにより、細菌を分析することができ、蛍光の有無から、活性汚泥に含まれる細菌の有無を分析することができ、蛍光強度から、その細菌の量を分析することができる。
【００３８】
本発明のＤＮＡチップによれば、活性汚泥に含まれる細菌の種類、量を速やかに、精度よく、分析することができるので、例えば活性汚泥中の細菌が死滅した場合に、他の活性汚泥を用いて排水処理を再開するにあたり、最適な活性汚泥を速やかに選択することができる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例によって本発明をより詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例により限定されるものではない。
【００４０】
〔ＤＮＡチップの調製〕
以下の糸状性細菌、糸状性細菌硫黄代謝細菌、硫黄代謝細菌、硝化細菌を用いてＤＮＡチップを調製した。
【００４１】
なお、用いた細菌の中には属が明らかであるが、種が明らかでないものがあるので、このような細菌には、それぞれ（＊）を付した。また、２種類と記載している細菌は、異なる種であることが判明している２種類の細菌のＤＮＡをそれぞれ用いたことを示す。
【００４２】
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糸状性細菌
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Nocardia属      ：Nocardia 1(*)、Nocardia 2(*)、Nocardia 3(*)、Nocardia 4(*)
Rhodococcus属   ：Rhodococcus 1(*)、Rhodococcus 2(*)
Thiothrix属     ：eikelbloomii 1、eikelbloomii 2、fructosivorans、
Thiothrix sp.1,EJ1M-B(*)、unzii、Eikelbloom Type 1701
Sphaerotilus属    ：Sphaerotilus(*)
上記以外の属    ：Microthrix、Haliscomenobacter、Nostocoida 1、
Nostocoida 2(*)、Nostocoida 3(*)、Achromatium 1(*)、
Achromatium 2(*)
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【００４３】
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糸状性細菌硫黄代謝細菌
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Beggiatoa属     ：Beggiatoa1、Beggiatoa2、Beggiatoa3、Beggiatoa4、Beggiatoa5、
Beggiatoa6
Thiothrix属     ：Thiothrix1、Thiothrix2、Thiothrix3、Thiothrix4、Thiothrix5、
Thiothrix6
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【００４４】
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硫黄代謝細菌
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Desulfobacter属   ：Desulfobacter1(*)、Desulfobacter2(*)、Desulfobacter3(*)、
Desulfobacter4(*)
Desulfotomaculum属：D. acetoxidance、D. aeronauticum、D. alkaliphilum、
D. auripigmentum、D. guttoideum、D. halophilum、
D. kuznetsovii、D. nigrificans 1、D. nigrificans 2、
D. reducens、D. ruminis、D. thermobenzoicum
Desulfovibrio属   ：Desulfovibrio 1（２種類）(*)、Desulfovibrio 2（２種類）(*)                      、Desulfovibrio 3（２種類）(*)、Desulfovibrio 4(*)、
Desulfovibrio 5(*)、Desulfovibrio 6(*)、Desulfovibrio 7(*)
Desulfomicrobium属：Desulfomicrobium、D. apsheronum、D. norvegicum
Desulforhopalus属 ：Desulforhopalus 1(*)、Desulforhopalus 2(*)、
Desulforhopalus 3(*)
Desulfococcus属   ：Desulfococcus 1（biacutus）(*)、Desulforhopalus 2(*)
Desulfomonas属    ：Desulfomonas
Desulfuromonas属  ：Desulfuromonas acetoxidance、D. chloroethanica、
Desulfuromonas 1(*)、Desulfuromonas 2(*)、
Desulfuromonas 3(*)、Desulfuromonas 4(*)、
Desulfuromonas 5(*)、Desulfuromonas 6(*)
Desulfurella属    ：Desulfurella
Desulfomonile属   ：Desulfomonile limimaris、Desulfomonile sp.(*)、
Desulfomonile sp.1(*)、Desulfomonile sp.2(*)、
Desulfomonile sp.3(*)
Desulfosarcina属  ：Desulfosarcina
Lawsonia属        ：Lawsonia intracellularis
上記以外の属      ：Bilophila wadsworthia、Desulfobotulus、
Desulfobulbus 1(*)、Desulfobulbus 2(*)、
Desulfobulbus 3(*)、Desulfobulbus 4(*)、
Desulfocapsa 1(*)、Desulfocapsa 2(*)、Desulfocapsa 3(*)、
Desulfokalobium、Desulfonatronum、
Desulfonosporus thiosulfogenes、Desulfotalea 1(*)、
Desulfotalea 2(*)、Desulfuromusa 1(*)、
Desulfuromusa 2(*)、Desulfuromusa 3(*)、
Thermosulfovibrio、Thermoterrabacterium ferrireducens
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【００４５】
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硝化細菌（アンモニア酸化細菌）
────────────────────────────────────────
Nitrosomonas属    ：Nitrosomonas、Nitrosomonas sp.（２種類）(*)、
N. aestuarii、N. communis、N. cryotolerans、N. europaea、
N. halophila、N. nitrosa、N. oligotropha、N. ureae
Nitrosospira属    ：Nitrosospira、N. briensis、N. multiformis
Nitorosolobus属   ：Nitrosolobus
上記以外の属      ：Nitrosococcus、Nitrosococcus 1(*)、Nitrosococcus 2(*)、
Nitrosococcus 3(*)、Anammoxoglobus 1(*)、
Anammoxoglobus 2(*)、Brocadia、Kuenenia、Scalindua 1(*)、
Scalindua 2(*)、Scalindua 3(*)
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【００４６】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）
────────────────────────────────────────
Nitrospira属      ：Nitrospira、N. marina、N. moscoviensis
Nitrobacter属     ：Nitrobacter、Nitrobacter 1(*)、Nitrobacter 2(*)、
Nitrobacter 3(*)、Nitrobacter 4(*)
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【００４７】
〔ＤＮＡ断片の調製〕
各細菌はのＤＮＡ断片は、各種の遺伝子データベースに掲載されている１６ＳｒＲＮＡ（リボゾームＲＮＡ）塩基配列情報から固有の遺伝子領域を選出し、そのクローンを合成することにより得た。
【００４８】
〔ＤＮＡ断片の固定〕
上記で得たＤＮＡ断片をそれぞれスライドガラス上の所定位置にスポット状に付着させ、乾燥することにより、固定してＤＮＡチップを得た。得られたＤＮＡチップは、以下の交雑に使用するまで−２０℃で保管した。
【００４９】
〔細菌の分析〕
上記で得たＤＮＡチップを用いて、以下の活性汚泥(Ａ)、活性汚泥(B1)、活性汚泥(B2)、活性汚泥(Ｃ)、活性汚泥(Ｄ)および活性汚泥(Ｅ)に含まれる細菌の種類および量を以下の手順で分析した。
【００５０】
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活性汚泥(Ａ)：化学工場の総合排水を処理する生物学的排水処理施設から採取した活性汚              泥                                                      （８検体）
活性汚泥(B1)：活性汚泥(Ａ)とは異なる化学工場の総合排水を処理する生物学的排水処理              施設から採取した活性汚泥                              （１２検体）
活性汚泥(B2)：活性汚泥(B1)を採取したと同じ化学工場の排水処理施設から、活性汚泥(              Ｂ１)の採取してから６月後に採取した活性汚泥             （４検体）
活性汚泥(Ｃ)：都市下水の公共下水処理場から採取した活性汚泥            （１検体）
活性汚泥(Ｄ)：活性汚泥(Ａ)、活性汚泥(B1)および活性汚泥(B2)を採取したとは異なる化              学工場から排出され、有機化学物質を多く含む排水を処理する生物学的排              水処理施設から採取した活性汚泥                          （１検体）
活性汚泥(Ｅ)：活性汚泥(Ａ)、活性汚泥(B1)、活性汚泥(B2)および活性汚泥(Ｄ)とは異な              る化学工場から排出され、無機物を多く含む排水を処理する生物学的排水              処理施設から採取した活性汚泥                            （１検体）
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【００５１】
〔細菌の抽出〕
活性汚泥４ｍＬに生理食塩水〔大塚製薬社製〕３６ｍＬを加えたのち震盪した。その後、２ｍＬを分取し、１５０００回転／分の遠心分離を行ったのち、上澄み液を分離して沈降物を得、緩衝水溶液〔エーエムアール社（岐阜市）製「ライシス・バッファー」〕１５０μＬを加えて希釈した。なお、使用した器具は全て滅菌処理したものである。
【００５２】
〔溶菌およびＤＮＡの抽出〕
上記で希釈した後の沈降物に、ガラスビーズを加え、９０℃で１０分間保持した後、ガラスビーズ細胞破砕機〔安井機器社製「Multibeads Shocker」〕により２５００ｒｐｍで６０秒間振盪した。その後、ガラスビーズを除去し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液〔濃度０．２質量％〕２００μＬを加え、１分間、ボルテックス撹拌を行い、１５０００回転／分で５分間、遠心分離した後、上澄み液を分取し、この上澄み液に対して０．０５容量倍の塩化ナトリウム水溶液〔５モル／Ｌ〕および２容量倍のエタノール〔１００％〕を加え、３０秒間、ボルテックス撹拌を行った。その後、１５０００回転／分で５分間、遠心分離して沈殿物を分取し、５５℃で５分間保持することにより乾燥して、ＤＮＡを含む沈降物を得た。
【００５３】
〔標識化〕
上記で得た沈降物に、１６ＳｒＲＮＡ８ＵＡ−５１９Ｂプライマー１００μＬを用いてＰＣＲ法により、ＤＮＡの増幅を行った。
【００５４】
その後、Ｃｙ Ｄｙｅ ８ＵＡ−５１９Ｂプライマー（蛍光色素）１００μＬを用いたＰＣＲ法により、ＤＮＡを蛍光色素と結合させて標識化した。
【００５５】
その後、ＤＮＡを蛍光色素と結合させた後の混合物に対して０．０５容量倍の塩化ナトリウム水溶液〔５モル／Ｌ〕および２容量倍のエタノール〔１００％〕を加え、３０秒間、ボルテックス撹拌を行った。その後、１５０００回転／分で５分間、遠心分離して沈殿物を分取し、ＰＣＲグレードの純水２０μＬに懸濁させて懸濁液としたのち、−２０℃で保管した。
【００５６】
〔交雑〕
先に調製したＤＮＡチップを、塩化ナトリウム（０．１５モル／Ｌ）−クエン酸ナトリウム（０．０１５モル／Ｌ）混合水溶液〔以下、ＳＳＣ水溶液とする。〕２容量部およびＳＤＳ水溶液（濃度０．２質量％）１容量部の混合液を用いて室温で１５分間洗浄し、さらに９５℃で５分間洗浄したのち、超純水により３回洗浄した。その後、８００回転／分にて遠心乾燥したのち、ＤＮＡ断片上にカバーガラスを被せた。
【００５７】
一方、上記〔標識化〕で得た懸濁液に純水を加えてＤＮＡ濃度が１００ｎｇ／μＬとなるように希釈し、２８μＬを分取し、ＳＳＣ水溶液１０μＬおよびＳＤＳ水溶液（濃度０．２質量％）２μＬを加えた後、ＤＮＡチップ上に被せたカバーガラスの端に滴下して、カバーガラスとＤＮＡチップとの間の隙間に浸透させた。５０℃〜６５℃で１２時間〜１６時間保持した。その後、ＤＮＡチップを３７℃にて、塩化ナトリウム（０．３モル／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（０．０３モル／Ｌ）およびＳＤＳ（濃度０．２質量％）の水溶液に１分間浸漬してカバーガラスを脱落させ、次いで、塩化ナトリウム（０．３モル／Ｌ）、クエン酸ナトリウム（０．０３モル／Ｌ）およびＳＤＳ（濃度０．２質量％）の水溶液中で５分間振盪し、ＳＳＣ水溶液にて洗浄後、８００回転／分にて遠心乾燥した。
【００５８】
〔蛍光強度の測定〕
上記で乾燥したのちのＤＮＡチップに、レーザースキャナー〔ＧＳＩ ＬＵＭＯＮＩＣＳ社製、「Ｓｃａｎ Ａｒｒａｙ ４０００」にて紫外線を照射し、蛍光シグナルの強度を測定し、相対強度を求めた。
【００５９】
蛍光強度の測定には、画像解析ソフト〔日立ソフト社製「ＤＮＡＳＹＳ ＡＲＲＡＹ」〕を用いた。蛍光強度は、検出された全ての蛍光シグナルの合計強度を１００％とし、０．１％未満の蛍光強度は、非検出とした。
【００６０】
活性汚泥(Ａ)、活性汚泥(B1)、活性汚泥(B2)については、各細菌について、測定した検体の中で、その細菌が検出された検体の割合を検出率として求めた。
【００６１】
活性汚泥(Ｃ)、活性汚泥(Ｄ)および活性汚泥(Ｅ)については、これら３つの活性汚泥の中で、その細菌が検出された活性汚泥の割合を検出率として求めた。
【００６２】
結果を以下に示す。なお、ＮＡは測定を行わなかったことを示す。
【００６３】
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糸状性細菌                                              検出率（％）          
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
Nocardia属
Nocardia 1                          １００    １００      ５０    １００  
Nocardia 2                            １３    １００      ２５      ３３  
Nocardia 3                            １３    １００      ２５      ３３  
Nocardia 4                              ０    １００      ５０        ０  
Rhodococcus属
Rhodococcus 1                           ０    １００      ２５    １００  
Rhodococcus 2                       １００        ０      ２５        ０  
Thiothrix属    
eikelbloomii 1                        ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
eikelbloomii 2                        ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
fructosivorans                        ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Thiothrix sp.1，EJ1M-B                ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
unzii                                 ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Eikelbloom Type 1701                  ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Sphaerotilus属
Sphaerotilus                        １００    １００      ５０      ３３  
上記以外の属
Microthrix                            ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Haliscomenobacter                     ＮＡ      ＮＡ      ５０      ＮＡ  
Nostocoida 1                          ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nostocoida 2                          ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nostocoida 3                          ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Achromatium 1                         ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Achromatium 2                         ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
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【００６４】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
糸状性細菌硫黄代謝細菌                                検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
Beggiatoa属
Beggiatoa 1                         １００    １００      ２５    １００  
Beggiatoa 2                           ７５        ０        ０        ０  
Beggiatoa 3                             ０        ８      ２５      ３３  
Beggiatoa 4                             ０        ０    １００      ６７  
Beggiatoa 5                             ０        ０        ０        ０  
Beggiatoa 6（1）                        ０      ７５        ０        ０  
Beggiatoa 6（2）                        ０        ０        ０        ０  
Thiothrix属
Thiothrix 1                         １００    １００      ７５      ６７  
Thiothrix 2                             ０        ０      ５０      ６７  
Thiothrix 3                           ７５    １００      ５０    １００  
Thiothrix 4                           ６３      ８３      ５０        ０  
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００６５】
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硫黄代謝細菌                                          検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
Desulfobacter属
Desulfobacter 1                     １００    １００        ０    １００  
Desulfobacter 2                         ０        ０        ０        ０  
Desulfobacter 3                         ０        ０        ０        ０  
Desulfobacter 4                         ０      １７        ０        ０  
Desulfotomaculum属
D. acetoxidance                     １００    １００        ０      ６７  
D. aeronauticum                         ０        ８        ０        ０  
D. alkaliphilum                         ０        ０        ０        ０  
D. auripigmentum                        ０        ０        ０        ０  
D. guttoideum                           ０        ０        ０        ０  
D. halophilum                           ０      ２５        ０        ０  
D. kuznetsovii                          ０        ８        ０        ０  
D. nigrificans 1                        ０        ０        ０        ０  
D. nigrificans 2                        ０        ０        ０        ０  
D. reducens                             ０      ２５      ２５        ０  
D. ruminis                              ０        ０        ０        ０  
D. thermobenzoicum                      ０        ０      ２５        ０  
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【００６６】
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硫黄代謝細菌（続き）                                  検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
Desulfovibrio属
Desulfovibrio 1                     １００    １００      ５０    １００  
Desulfovibrio 2                       ２５      ３３        ０      ６７  
Desulfovibrio 3 (1)                     ０        ０        ０        ０  
Desulfovibrio 3 (2)                     ０        ０        ０        ０  
Desulfovibrio 4                       ５０    １００        ０      ６７  
Desulfovibrio 5                         ０      １７        ０      ３３  
Desulfovibrio 6                       ５０      ６７        ０      ６７  
Desulfovibrio 7                         ０        ０        ０        ０  
Desulfomicrobium属
Desulfomicrobium                      ６３        ０      ２５        ０  
D. apsheronum                       １００    １００        ０    １００  
D. norvegicum                         １３        ０        ０        ０  
Desulforhopalus属
Desulforhopalus 1                   １００    １００      ５０    １００  
Desulforhopalus 2                       ０        ０        ０        ０  
Desulforhopalus 3                       ０        ０      ２５        ０  
Desulfococcus属
Desulfococcus 1 (biacutus)              ０        ０        ０        ０  
Desulforhopalus 2                   １００    １００        ０    １００  
Desulfomonas属
Desulfomonas                        １００    １００    １００    １００  
Desulfuromonas属
Desulfuromonas acetoxidance             ０        ０        ０        ０  
D. chloroethanica                       ０        ０        ０        ０  
Desulfuromonas 1                    １００    １００        ０    １００  
Desulfuromonas 2                        ０        ０        ０        ０  
Desulfuromonas 3                        ０        ０        ０        ０  
Desulfuromonas 4                        ０        ０        ０      ３３  
Desulfuromonas 5                        ０        ０        ０        ０  
Desulfuromonas 6                        ０        ０      ５０        ０  
Desulfurella属
Desulfurella                          ７５    １００      ２５      ６７  
Desulfomonile属
Desulfomonile limimaris                 ０        ０        ０        ０  
Desulfomonile sp.                       ０        ０    １００        ０  
Desulfomonile sp.1                    ８８      ９２      ２５      ３３  
Desulfomonile sp.2                      ０        ０        ０        ０  
Desulfomonile sp.3                      ０        ０        ０        ０  
Desulfosarcina属
Desulfosarcina                        １３      ９２      ５０        ０  
Lawsonia属
Lawsonia intracellularis            １００    １００        ０    １００  
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００６７】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
硫黄代謝細菌（続き）                                  検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
上記以外の属
Bilophila wadsworthia                 １３      １７        ０        ０  
Desulfobotulus                          ０        ０        ０        ０  
Desulfobulbus 1                         ０        ０      ２５        ０  
Desulfobulbus 2                         ０        ０        ０        ０  
Desulfobulbus 3                         ０        ０        ０        ０  
Desulfobulbus 4                         ０        ０        ０        ０  
Desulfocapsa 1                          ０        ０        ０        ０  
Desulfocapsa 2                          ０        ０        ０        ０  
Desulfocapsa 3                          ０        ０        ０        ０  
Desulfohalobium                       ３８        ０        ０        ０  
Desulfonatronum                         ０        ０        ０      ３３  
Desulfonosporus thiosulfogenes          ０        ０        ０        ０  
Desulfotalea 1                          ０        ０        ０        ０  
Desulfotalea 2                          ０        ０        ０        ０  
Desulfuromusa 1                         ０        ０        ０        ０  
Desulfuromusa 2                         ０        ０        ０        ０  
Desulfuromusa 3                         ０        ０        ０        ０  
Thermodesulfovibrio                 １００    １００    １００      ６７  
Thermoterrabacterium ferrireducens  １００    １００        ０    １００  
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
【００６８】
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
硝化細菌（アンモニア酸化細菌）                        検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
───────────────────────────────────────
Nitrosomonas属
Nitrosomonas                        １００    １００      ７５      ６７  
Nitrosomonas sp. (1)                １００      ９２    １００      ６７  
Nitrosomonas sp. (2)                １００    １００        ０      ６７  
N. aestuarii                        １００    １００    １００    １００  
N. communis                           ２５      ９２      ２５        ０  
N. cryotolerans                       ５０      ８３      ２５      ３３  
N. europaea                           ５０      ６７    １００      ３３  
N. halophila                          ２５    １００      ７５      ３３  
N. nitrosa                              ０      ３３    １００        ０  
N. oligotropha                          ０      ５８      ２５      ３３  
N. ureae                                ０      ６７    １００      ３３  
Nitrosospira属
Nitrosospira                        １００      ９２    １００      ６７  
N. briensis                             ０        ０        ０        ０  
N. multiformis                          ０      ２５        ０      ３３  
Nitrosolobus属
Nitrosolobus                        １００    １００    １００    １００  
上記以外の属
Nitrosococcus                           ０      １７        ０        ０  
Nitrosococcus 1                       ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nitrosococcus 2                       ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nitrosococcus 3                       ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Anammoxoglobus 1                      ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Anammoxoglobus 2                      ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Brocadia                              ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Kuenenia                              ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Scalindua 1                           ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Scalindua 2                           ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Scalindua 3                           ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
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【００６９】
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硝化細菌（亜硝酸酸化細菌）                            検出率（％）            
Ａ        B1        B2    Ｃ，Ｄ，Ｅ
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Nitrospira属
Nitrospira                            ５０      ８３      ５０      ６７  
N. marina                             ７５    １００      ５０    １００  
N. moscoviensis                       ８８    １００      ７５    １００  
Nitrobacter属
Nitrobacter                         １００    １００    １００    １００  
Nitrobacter 1                         ＮＡ      ＮＡ      ７５      ＮＡ  
Nitrobacter 2                         ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nitrobacter 3                         ＮＡ      ＮＡ        ０      ＮＡ  
Nitrobacter 4                         ＮＡ      ＮＡ      ５０      ＮＡ  
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【００７０】
活性汚泥(Ａ)は、糸状性細菌のうちThiothriz属細菌、Beggiatoa属細菌およびSphaerotilus属細菌の検出率が高いことから、活性汚泥(Ａ)では、これらの糸状細菌が優先種である。
【００７１】
活性汚泥(B1)は、糸状細菌のうちNocardia属細菌の検出率が高いことから、この糸状性細菌が活性汚泥(B1)では優先種である。
【００７２】
これに対して活性汚泥(B2)では糸状性細菌の検出率が低くなっていることから、活性汚泥(B1)を採取してから活性汚泥(B2)を採取するまでの６月間に、これを採取した生物学的排水処理施設における活性汚泥に含まれる細菌の種類、生息数が変化したことを示す。
【００７３】
また、活性汚泥(B2)は、Desulfobacter属をはじめとする硫黄代謝細菌の検出率が活性汚泥(B1)、活性汚泥(A)と比較して少ないことから、硫黄や無機硫黄化合物の分解能力が他の排水処理施設と比較して低くなっていることが予想され、例えば排水中の硫黄などの濃度が急激に増加すると、流入した硫黄などを分解できなくなることが予想される。また、このように硫黄などの流入量が急増した場合には、例えば活性汚泥(Ａ)などのように、硫黄代謝細菌の検出率が比較的高い活性汚泥を投入することにより、硫黄などの分解を促進することも可能である。
【００７４】
本発明のＤＮＡチップに固定した糸状性細菌のうち、Nocardia 1、Beggiatoa 1、Desulfovibrio 1、Desulfomonas、Nitrosomonas aestuarii、NitrosolobusおよびNitrobacterは、上記の活性汚泥の全てで比較的高い検出率を示すことから、これらの細菌は、活性汚泥中に広く一般に生息しているものと考えられる。