(57)【要約】      （修正有）【課題】高濃度のゲフィチニブに対する耐性を有し、かつ安定したヒト細胞株を樹立すること、またかかる細胞株を用いる、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬の簡便なスクリーニング方法を提供すること、さらには獲得耐性機序の分析に供すること。【解決手段】ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９をゲフィニチブ含有濃度が徐々に高まる培地で繰り返し培養し、ゲフィニチブ耐性株。該耐性株はＥＧＦＲのシグナリングを阻害し、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する細胞株。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９由来であって、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する細胞株。
【請求項２】
前記Ｔ７９０Ｍ変異が１０％以上の割合で導入されている請求項１記載の細胞株。
【請求項３】
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＲＰＣ−９である請求項１記載の細胞株。
【請求項４】
請求項１記載の細胞株を含有する研究試薬。
【請求項５】
ゲフィチニブに対する獲得耐性機序の分析における請求項１記載の細胞株の使用方法。
【請求項６】
ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌のための、請求項１記載の細胞を含有する創薬モデル。
【請求項７】
請求項６記載の創薬モデルを用いる、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９由来であって、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する安定したゲフィチニブ耐性細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年開発された、ＥＧＦＲを選択的に阻害する分子標的薬剤であるゲフィチニブ（ＺＤ１８３９またはイレッサ（登録商標））は、特定のＥＧＦＲ遺伝子変異を有する肺癌に劇的な効果をもたらすが、投与中の獲得耐性が臨床的に問題となっている。
【０００３】
このゲフィチニブの獲得耐性に、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の出現が関与している例がいくつか報告されており、耐性メカニズムのさらなる解析およびその克服が急がれている。
【０００４】
Ｔ７９０Ｍ変異を有する従来のゲフィチニブ耐性細胞株モデルとして、実際に肺癌細胞株をゲフィチニブに持続曝露することで作製されたものは、ゲフィチニブ高感受性株であるＨ３２５５から樹立されたＨ３２５５ＧＲのみである（非特許文献１参照）。
【０００５】
この細胞株Ｈ３２５５ＧＲは、ＥＧＦＲ遺伝子が２０倍以上に増幅された細胞株を親株として使用しており、ＲＴ−ＰＣＲを用いた解析では、Ｔ７９０Ｍを有するＥＧＦＲの占める割合は、３．３％（３／９１）と非常に少ない。このようにＥＧＦＲ遺伝子が高度に増幅された細胞株において、Ｔ７９０Ｍの割合が稀少であると考えられる場合、Ｔ７９０Ｍの存在のみが耐性に関与しているのではない可能性がある。また、クローニング手法を経ていないため、均一な細胞株でない可能性がある。したがって、このような細胞株は、ゲフィチニブに対するＴ７９０Ｍ変異による獲得耐性の機序を解明するための簡便な実験モデルとしては不充分であった。
【０００６】
【非特許文献１】Engelman, J.A., T. Mukohara, et al. (2006). J Clin Invest 116(10): 2695-706.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、このような従来の方法が有していた問題を解決しようとするものであり、高濃度のゲフィチニブに対する耐性を有し、かつ安定したヒト細胞株を樹立すること、またかかる細胞株を用いる、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬の簡便なスクリーニング方法を提供すること、さらには獲得耐性の解除法を検討することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記従来の課題に鑑み、ゲフィチニブ感受性であるヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９を用いることにより、高濃度のゲフィチニブに耐性を示し、かつ、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を高度に有する安定した細胞株を樹立し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＰＣ−９由来であって、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する細胞株に関する。
【００１０】
本発明の細胞株において、Ｔ７９０Ｍ変異が１０％以上の割合で導入されていることが好ましい。
【００１１】
本発明の細胞株は、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＲＰＣ−９であることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、本発明の細胞株を含有する研究試薬に関する。
【００１３】
本発明は、さらに、ゲフィチニブに対する獲得耐性機序の分析における前記細胞株の使用方法に関する。
【００１４】
本発明は、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌のための前記細胞を含有する創薬モデルに関する。
【００１５】
本発明はまた、前記創薬モデルを用いる、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明により樹立された細胞株は、高濃度のゲフィチニブに対する耐性を有し、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異の割合も高く、かつ安定した増殖を示すことができる。また、親株の特徴が十分解明されており、さらにクローニング手法を経ているため、均一な細胞集団と考えられ、ＥＧＦＲ遺伝子におけるＴ７９０Ｍ変異に起因するゲフィチニブに対する獲得耐性の機序を研究するための非常に優れた研究材料となり得る。ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する治療薬のスクリーニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のゲフィチニブ耐性細胞は、ゲフィチニブ感受性であるヒト非小細胞肺癌細胞ＰＣ−９をゲフィチニブの存在下で培養することにより得ることができる。
【００１８】
具体的には、たとえば、ＰＣ−９細胞を、段階的にゲフィチニブの濃度を上げて、１０％  ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ2存在下で通常の培養方法にしたがって培養することにより得ることができ、さらにクローニングすることにより、ゲフィチニブに優れた耐性を示す細胞株を選別することができる。
【００１９】
ゲフィチニブの濃度は、たとえば、好ましくは０．０１μＭから開始し、最終的には、好ましくは０．４μＭまで段階的に上昇させる。各上昇幅は特に限定されるものではないが、１．５倍〜２倍の範囲で上昇させ、各濃度で一定期間、好ましくは５日〜１９日間培養する。
【００２０】
細胞の培養は、好ましくは１〜２×１０5細胞個／ｍｌの濃度で開始し、おおよそ３、４日毎に、好ましくは８〜９×１０5細胞個／ｍｌで継代することが好ましい。培養温度は、約３７℃が好ましい。使用可能な基本培地としては、ＲＰＭＩ  １６４０が好ましいが、一般的に細胞培養に使用可能な培地であれば特に限定されるものではない。培地には、血清を添加する必要があり、ＦＢＳなどを使用することができる。その他、培地には、通常の細胞培養において使用される成長因子などを添加することができる。
【００２１】
本発明に使用するヒト非小細胞肺癌細胞ＰＣ−９は種々の機関から入手可能であり、たとえばＩＢＬ（株式会社免疫生物研究所）から製品番号３７０１２として市販されている。このＰＣ−９細胞は、細胞の性質、特にゲチフィニブに対する感受性や、ＥＧＦＲ遺伝子の配列などに影響を与えない限り、マイコプラズマなどの細菌またはウイルスなどに感染していても特に問題はない。
【００２２】
クローニングは、限界希釈法、カップ法、軟寒天法などいずれかの方法を用いて行うことができる。
【００２３】
本発明の耐性株は、クローニング後、ゲフィチニブを含まない培地に交換し、１年以上継代培養しても、獲得耐性は喪失されず安定な耐性を有するものである。
【００２４】
得られた細胞株のゲフィチニブ耐性は、ゲフィチニブによる細胞増殖阻害試験を行うことにより確認することができる。細胞生存率から増殖曲線を求め、細胞株における５０％細胞増殖抑制濃度（ＩＣ50）を決定し、これにより各細胞におけるゲフィチニブ耐性の程度を比較することができる。
【００２５】
本発明のゲフィチニブ耐性細胞は、ＩＣ50が８μＭ以上であることが好ましい。
【００２６】
本発明のゲフィチニブ耐性細胞株は、ＥＧＦＲにＴ７９０Ｍ変異を高率に有するものである。ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異の導入割合は、１０％以上が好ましく、３０％以上が最も好ましい。導入割合が１０％より低いとＴ７９０Ｍの存在のみが耐性に関与しているのではない可能性がある。
【００２７】
本発明のゲフィチニブ耐性細胞の最も好ましい態様は、ＲＰＣ−９細胞である。ＲＰＣ−９細胞株は、実施例において詳しく説明するが、ＰＣ−９細胞を、基本培地として１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ−４５０４、シグマ製、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて、１×１０5〜２×１０5細胞／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ2で培養し、基本培地にゲフィチニブ（イレッサ、ＺＤ１８３９、アストラゼネカ製）を段階的に添加しながら（０．０１μＭ（５日間）、０．０２μＭ（９日間）、０．０４μＭ（１９日間）、０．０７μＭ（９日間）、０．２μＭ（５日間）および０．４μＭ（８日間））培養し、限界希釈法にてクローニングすることにより樹立したものである。得られたＲＰＣ−９細胞株は、２００７年３月７日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託当局であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に国際寄託中であり、正式に寄託されるまでは、本発明者らが分譲を保証するものである。
【００２８】
本発明はまた、本発明の細胞株を含有する研究試薬に関する。
【００２９】
本発明のゲフィチニブ耐性株は、ゲフィチニブに対する獲得耐性機序の分析において有用なものである。
【００３０】
本発明のゲフィチニブ耐性株はまた、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌のための創薬モデルとして使用することができ、ＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬のスクリーニング方法に用いるといった用途が考えられる。
【００３１】
本発明のＥＧＦＲ遺伝子にＴ７９０Ｍ変異を有する肺癌の治療薬のスクリーニング方法は、本発明のゲフィチニブ耐性株を候補化合物に曝露し、該候補化合物が本発明のゲフィチニブ耐性株の増殖を阻害するか否かを評価することにより行うことができる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物は、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異を有するゲフィチニブ耐性肺癌細胞の増殖を阻害するものであるため、ＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異を有するゲフィチニブ耐性肺癌治療薬として有用である。もちろん、この化合物をＥＧＦＲのＴ７９０Ｍ変異を有するゲフィチニブ耐性肺癌治療薬として用いる場合には、一般に薬学的に許容される賦形剤と混合することによって、医薬組成物を製造することができる。そのような賦形剤としては、特に限定されるものではなく、たとえば、水、乳糖、ブドウ糖、デンプン、結晶セルロース、ゼラチンなどがあげられ、剤形に応じて、本発明の方法によって同定された化合物と混合して使用される。
【００３２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
ゲフィチニブ耐性株の樹立およびクローニング
非小細胞肺癌細胞ＰＣ−９（ＩＢＬ（株式会社免疫生物研究所）、製品番号３７０１２）を、基本培地として１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｒ−４５０４、シグマ製、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて、１×１０5〜２×１０5細胞／ｍｌで、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。基本培地にゲフィチニブ（イレッサ、ＺＤ１８３９、アストラゼネカ製）を段階的に添加しながら培養した（０．０１μＭ（５日間）、０．０２μＭ（９日間）、０．０４μＭ（１９日間）、０．０７μＭ（９日間）、０．２μＭ（５日間）および０．４μＭ（８日間））。継代は、８×１０5〜９×１０5細胞／ｍｌで平均３、４日毎に継代した。
【００３４】
クローニングは、９６ウェルプレートを用い、０．３細胞／ウェル以下の濃度で細胞を播き、単一コロニーを採取し、継代し、細胞株ＲＰＣ−９を得た。
【００３５】
得られたＲＰＣ−９細胞株は、２００７年３月７日付けでブタペスト条約に基づく国際寄託当局であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に国際寄託中であり、正式に寄託されるまでは、本発明者らが分譲を保証するものである。
【実施例２】
【００３６】
ゲフィチニブによる細胞増殖阻害試験
実施例１で樹立されたＲＰＣ−９細胞およびＰＣ−９細胞を、９６ウェルプレートに３０００細胞個／ウェルずつ播種し、種々の濃度のゲフィチニブに９６時間曝露した。
【００３７】
生細胞の測定は、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８（同仁化学研究所、東京）を用いて行った。
【００３８】
ゲフィチニブを添加していない各細胞の増殖率を１００％対照として各細胞の増殖率を決定した。
【００３９】
結果を図１に示す。ゲフィチニブに対するＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞のＩＣ50は、それぞれ０．００２μＭおよび８．８４μＭであった。
【００４０】
この結果から、ＲＰＣ−９細胞は、ＰＣ−９細胞の約４０００倍もの耐性を獲得したことが示された。
【実施例３】
【００４１】
ＲＰＣ−９のゲフィチニブ耐性の安定性
実施例１で樹立されたＲＰＣ−９を、ゲフィチニブ不含培地で１年間継代培養し、ゲフィチニブ耐性の安定性を確認した。継代培養は、実施例１と同様に１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ2で、３、４日毎に継代した。得られた細胞株について、実施例２と同様にしてゲフィチニブによる細胞増殖阻害試験を行った。
【００４２】
結果を図１に示す。ゲフィチニブ不含培地で１年間継代培養したＲＰＣ−９Ｒは、実施例１で樹立されたＲＰＣ−９と同様の結果が得られ、ゲフィチニブに対する感受性の回復はみられなかった。
【００４３】
したがって、本発明のＲＰＣ−９株は、ゲフィチニブを添加せず継代してもゲフィチニブに対する耐性は変化することなく安定である。
【実施例４】
【００４４】
増殖試験
ＰＣ−９および実施例１で得られたＲＰＣ−９を２４ウェルプレートに播種し、（６×１０4細胞／ｍｌ）、基本培地に種々の濃度のゲフィチニブを添加し（０、０．０２、０．２および２μＭ）、３７℃、５％ＣＯ2で培養した。２４時間毎にトリパンブルー染色を行い、血球計算板により細胞数をカウントした。
【００４５】
結果を図２に示す。ＰＣ−９ではゲフィチニブ濃度が０．２および２μＭの場合、細胞数の増殖は観察されず増殖が阻害されたが、ＲＰＣ−９では、いずれのゲフィチニブ濃度においてもゲフィチニブを添加していない場合とほぼ同様の増殖を示した。
【００４６】
また、ゲフィチニブを添加しない条件下では、ＲＰＣ−９はＰＣ−９よりやや速い増殖を示すことが確認された。
【実施例５】
【００４７】
形態変化の確認
ＰＣ−９細胞と実施例１で樹立したＲＰＣ−９細胞とに１μＭのゲフィチニブを添加し７２時間培養後の細胞を顕微鏡で観察・確認した。
【００４８】
結果を図３に示す。図３の（ａ）および（ｃ）は、それぞれＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞にゲフィチニブを添加しなかった対照を示し、（ｂ）および（ｄ）は、それぞれＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞に１μＭのゲフィチニブを添加して７２時間培養したあとの各細胞の顕微鏡写真である。（ｂ）では、細胞が縮小して丸くなり、大部分の細胞は死んで培養皿から剥がれているが、（ｄ）では（ｃ）とほとんど変わらなかった。
【００４９】
この結果から、ＲＰＣ−９はゲフィチニブ添加による形態学的変化がほとんど見られないことが示された。
【実施例６】
【００５０】
ＥＧＦＲのシグナリング阻害確認
実施例１で得られたゲフィチニブ耐性株のＲＰＣ−９細胞およびＰＣ−９細胞を、種々の濃度のゲフィチニブ（０、０．００２、０．０２、０．２および２μＭ）を添加した基本培地で６時間培養した。各細胞を溶解バッファー（ＲＩＰＡ：１％トリトンＸ−１００、０．１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１０ｍＭ  β−グリセロリン酸塩、１０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4、プロテアーゼ阻害剤）中で溶解後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、細胞内の各タンパク質、ＥＧＦＲ、リン酸化ＥＧＦＲ（Ｐ−ＥＧＦＲ）、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ（Ｐ−Ａｋｔ）、ＭＡＰＫおよびリン酸化ＭＡＰＫ（Ｐ−ＭＡＰＫ）を測定した。一次抗体には、ｐＹ１０６８（ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ）、ｐＴ２０２／ｐＹ２０４（ＭＡＲＫ、ｐＭＡＲＫ）、ｐＳｅｒ４７３（Ａｋｔ、ｐＡｋｔ）（すべてセル・シグナリング・テクノロジー（Cell Signaling Technology）製、ベバリー、マサチューセッツ州、米国）を使用し、二次抗体にはホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇ（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス（GE Healthcare Biosciences）製、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）を用いた。
【００５１】
結果を図４に示す。ＰＣ−９細胞では、ゲフィチニブの濃度が増加するにつれてタンパク質のリン酸化レベルが低下したが、ＲＰＣ−９細胞では、ほぼ不変であった。
【００５２】
この結果から、ＰＣ−９細胞においては、ゲフィチニブによりＥＧＦＲシグナル経路のリン酸化が抑制されにくくなっていることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ゲフィチニブによる細胞増殖阻害効果を示すグラフである。
【図２】ＰＣ−９細胞（ａ）およびＲＰＣ−９細胞（ｂ）の増殖曲線を示すグラフである。
【図３】ゲフィチニブによる細胞の形態への影響を示す写真である。（ａ）および（ｃ）は、それぞれゲフィチニブを添加していない培地で培養したＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞の顕微鏡写真であり、（ｂ）および（ｄ）は、それぞれ１μＭのゲフィチニブを含む培地で７２時間培養したＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞の顕微鏡写真である。
【図４】ＰＣ−９細胞およびＲＰＣ−９細胞における各タンパク質、ＥＧＦＲ、リン酸化ＥＧＦＲ（Ｐ−ＥＧＦＲ）、Ａｋｔ、リン酸化Ａｋｔ（Ｐ−Ａｋｔ）、ＭＥＲＫおよびリン酸化ＭＥＲＫ（Ｐ−ＭＥＲＫ）の発現量を示すウエスタンブロッディングの結果を示す。
【図５】ＰＣ−９細胞（ａ）およびＲＰＣ−９細胞（ｂ）の塩基配列を示している。（ｂ）では、ＥＧＦＲの２３６９番目の塩基がＣからＴに変化しており、これは、ＥＧＦＲの７９０番目のアミノ酸のＴからＭへの変化に対応する。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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