【手続補正書】
【提出日】平成25年7月8日(2013.7.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞産生宿主における抗体の進化及び発現の方法であって、前記方法は、
ａ．鋳型抗体を選択する工程と、
ｂ．変異抗体の真核細胞表層ディスプレイを用いて前記宿主において１セットの変異抗体の生成を可能にするために前記鋳型抗体を進化させる工程と、
ｃ．少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記変異抗体をスクリーニングする工程と、
ｄ．前記鋳型抗体の同一の性質、特徴或いは活性と比較した場合の、前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性の最適化に基づいて前記１セットの変異抗体からアップ突然変異抗体を選択する工程と、
ｅ．工程ｂにおける同一の宿主において前記アップ突然変異抗体を発現させる工程と
を有する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、工程ａに先行して、
ａ１．前記変異抗体の細胞表層ディスプレイを用いて前記真核細胞産生宿主において抗−抗原抗体ライブラリを作成する工程と、
ａ２．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して前記ライブラリをスクリーニングする工程と
を有する工程が存在し、
前記鋳型抗体は前記ライブラリから選択されるものである、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記真核細胞産生宿主は哺乳類細胞産生宿主である、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記真核細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；ＰＥＲ  Ｃ．６ヒト胚細胞；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞；及びピキア酵母細胞から選択されるものである、方法。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、前記スクリーニングする工程は、蛍光標示式細胞分取器を有するものである、方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記進化させる工程は、ｍ個の相補性決定領域を持つ前記鋳型抗体から形成された１セットの変異抗体の生成を可能にする工程であって、ここにおいて、ｍは１〜６の整数であり、各々の前記相補性決定領域はｎ個のアミノ酸残基を有するものである、前記可能にする工程を有するものであって、前記方法は、
ａ．ｍｘｎの別々のセットの抗体を産生する工程であって、各セットは相補性決定領域の単一の既定の位置にＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバー抗体を有するものであり、ここにおいて各セットの抗体は、単一の既定の位置が異なり；産生された異なるメンバー抗体の数はｍｘｎｘＸに等しいものである、前記抗体を産生する工程を有するものである、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、ｍは６である、方法。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記抗体は、重鎖、軽鎖、可変ドメイン、定常ドメイン、超可変領域、相補性決定領域１、相補性決定領域２及び相補性決定領域３から選択される抗体断片である、方法。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、
前記進化させる工程ｂは、
ｈ．前記鋳型抗体からｎ−１の別々のセットの変異ポリペプチドを産生する工程であって、各セットは前記ポリペプチドの単一の既定の位置でＸ個の異なる既定のアミノ酸残基を持つメンバーポリペプチドを有するものであり；ここにおいて各セットのポリペプチドは前記単一の既定の位置が異なるものであり；産生された前記異なるメンバーポリペプチドの数は、［ｎ−１］ｘＸと等しいものである；前記産生する工程を有するものであり、
前記スクリーニングする工程ｃは、
ｉ．前記少なくとも１つの既定の性質、特徴或いは活性に対して各メンバーポリペプチドをアッセイする工程と、
ｊ．前記鋳型ポリペプチドと比較して前記メンバーポリペプチドの性質、特徴或いは活性におけるあらゆる変化を同定する工程と、
ｋ．機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作る工程とを有する、前記スクリーニングする工程を有するものである、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、Ｘは１９の天然由来のアミノ酸残基を示すものであり、前記鋳型ポリペプチドの所定の位置を表したものではない、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記産生する工程は、
ｉ．変異誘発された各コドンに対する６４重縮重オリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ−ベース複製へ、前記鋳型ポリペプチドをコード化しているコドン−含有ポリヌクレオチドを暴露する工程であって、ここにおいて、１セットの子孫ポリヌクレオチドを産生するために、前記各６４重縮重オリゴヌクレオチドは、第一の相同配列及び変性Ｎ，Ｎ，Ｎトリプレット配列を有するものである、前記暴露する工程と、
ｉｉ．前記子孫ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドを発現させるように、クローン複製へ前記１セットの子孫ポリヌクレオチドを暴露する工程とを有するものである、方法。
【請求項１２】
請求項９記載の方法において、前記機能マップは、（ａ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、前記変異ポリペプチドの活性に影響を与えない位置及び変異；（ｂ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、完全に変異可能な部位；及び（ｃ）前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異を生じる位置及び変異、の１若しくはそれ以上を同定するために使用されるものである、方法。
【請求項１３】
請求項１記載の方法において、前記既定の性質、特徴或いは活性は、タンパク質−タンパク質凝集の軽減、タンパク質安定性の増強、タンパク質可溶性の増加、グリコシル化部位の導入、共役部位の導入、免疫原性の軽減、タンパク質発現の増強、抗原親和性における増加、抗原親和性の減少、結合親和性における変化、免疫原性における変化、および特異性の増強から選択されるものである、方法。
【請求項１４】
請求項３記載の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、３Ｔ３マウス線維芽細胞；ＢＨＫ２１シリアンハムスター線維芽細胞；ＭＤＣＫイヌ上皮細胞；Ｈｅｌａヒト上皮細胞；ＰｔＫ１ラットカンガルー上皮細胞；ＳＰ２／０マウス形質細胞；及びＮＳ０マウス形質細胞；ＨＥＫ２９３ヒト胚性腎細胞；ＣＯＳサル腎細胞；ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｓチャイニーズハムスター卵巣細胞；Ｒ１マウス胚細胞；Ｅ１４．１マウス胚細胞；Ｈ１ヒト胚細胞；Ｈ９ヒト胚細胞；及びＰＥＲ  Ｃ．６ヒト胚細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶおよびＮＳＯ宿主細胞株から選択されるものである、方法。
【請求項１５】
請求項４および１４のいずれか記載の方法において、前記哺乳類細胞産生宿主は、ＣＨＯ−ＳおよびＨＥＫ２９３から選択されるものである、方法。
【請求項１６】
請求項２記載の方法において、工程ａに先行して、抗原を選択する工程を有する工程が存在するものである、方法。
【請求項１７】
請求項２記載の方法において、前記抗−抗原抗体ライブラリは、ヒト化抗−抗原抗体ライブラリである、方法。
【請求項１８】
請求項１記載の方法において、前記スクリーニングする工程は、機能マップを作成する工程であって、ここにおいて前記機能マップは、前記鋳型ポリペプチドと比較して、アップ突然変異及び／若しくはサイレント変異を生じる、前記変異ポリペプチドにおける位置及び変異を同定するために使用されるものである、前記機能マップを作成する工程を有するものである、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
多くの抗体は、細菌における細菌ファージディスプレイシステムを用いて開発されている一方、完全長抗体の発現は、第一に哺乳類細胞において実行されている。この類似性の欠如によって、発現に対するクローンの進化或いは選択が不可能となっている。付加的な障壁としては、今までの技術で多数の変異体をスクリーニングしなくてはいけないという従来の必要条件が含まれ、高度な哺乳類発現システムは、多数の変異体のクローニングではなく発現のために最適化されていた。抗体／タンパク質選択、進化及び哺乳類発現システムを統合することは、以前は設計されていなかった。最適化された哺乳類宿主細胞の内部における抗体／タンパク質の非確率的な進化と組み合わせて、多数の変異体を扱うための哺乳類細胞における表層ディスプレイを使用することは、成功の可能性を増加し、製造工程において望まれている哺乳類細胞において十分に高いレベルで発現するであろう最適化された抗体／タンパク質の産生の工程を大いに早めるものである。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献１】  米国特許出願公開第２００３／０２１９７５２号明細書
【特許文献２】  米国特許出願公開第２００６／０１１５８５０号明細書
【特許文献３】  米国特許出願公開第２００７／０１２８２０３号明細書
【特許文献４】  国際公開第０２／０９２７８０号
【特許文献５】  国際公開第２００５／００３３４５号
【特許文献６】  国際公開第０３／０２３０３２号
【非特許文献】
【非特許文献１】  Ｃｈｅｎ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．"Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，"Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．；  ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ  １２７７−１２８６，２００８  Ｄｅｃ  ２２．
【非特許文献２】  Ｒａｊｐａｌ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．"Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，"Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．；ｖｏｌ．１０２，ｐａｇｅｓ  ８４６６−８４７１．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊｕｎ  ６．
【非特許文献３】  Ｉｂａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．"Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｉｘ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，"Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９４，ｐａｇｅｓ  ３５−４６，１９９７  Ｊｕｌ  １８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】