【手続補正書】
【提出日】平成21年4月10日(2009.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
mRNAの測定方法であって、
(a) プライマーを用いてのCK19 mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を２種類のプローブを用いて検出する、
ことを含んで成り；
前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり、
ここで、前記プライマーの少なくとも１つの配列がその３’においてCK19偽遺伝子に対して少なくとも１個のミスマッチを含み、そして前記プライマーのいずれな１つがCK19偽遺伝子に対して少なくとも２個のミスマッチを含み、
そして前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3’−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
であり、
前記プローブの１つがドナーによりラベルされとおり、そして前記プローブの他方がアクセプターによりラベルされている、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ドナーが、FITC（fluorescein isothiocyanate）であり、そして前記アクセプターが、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１プローブがその3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブがその5'−末端でアクセプターによりラベルされる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
CK19 mRNA及びCK20 mRNAの同時測定方法であって、
(a) CK19 mRNAのための１組のプライマー及びCK20 mRNAのための１組のプライマーを用いて前記mRNAの一部分を増幅し、そして
(b) 形成された増幅物を、CK19 mRNAのための１組のプローブ及びCK20 mRNAのための１組のプローブを用いて検出する、
ことを含んでなり；
前記CK19 mRNAのための１組のプライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
であり、
ここで、前記プライマーの少なくとも１つの配列がその３’においてCK19偽遺伝子に対して少なくとも１個のミスマッチを含み、そして前記プライマーのいずれな１つがCK19偽遺伝子に対して少なくとも２個のミスマッチを含み、
前記CK19 mRNAのためのプローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で、且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流に隣接するCK19遺伝子のエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
であり；前記CK20 mRNAのためのプライマーが、
−CK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プライマー、及び
−前記第３プライマーの下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プライマー、
であり；そしてCK20 mRNAのためのプローブが、
−前記第３プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第４プライマーが結合する領域の上流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プローブ、及び
−前記第４プライマーが結合する領域の上流で且つ前記第３プローブが結合する領域の下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プローブ、
であり；ここで、
前記CK19 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、そして前記CK20 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、ここでCK19ドナー/アクセプター対が前記CK20ドナー/アクセプター対とは異なる、
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記第１プローブ及び第３プローブがそれらの3'−末端でドナーによりラベルされ、そして前記第２プローブ及び第４プローブがそれらの5'−末端でアクセプターによりラベルされる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナーが、FITCであり、そして前記アクセプターが、ローダミン色素及びシアニン色素から成る群から選択される、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記CK19 mRNA及びCK20 mRNAの一部分の増幅及び前記形成される増幅物の検出が、同じ反応容器内で行われる、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
CK19 mRNAの検出のために有用な組成物であって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5'−末端に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プローブ、
を含んで成り、
ここで、前記プライマーの少なくとも１つの配列がその３’においてCK19偽遺伝子に対して少なくとも１個のミスマッチを含み、前記プライマーのいずれな１つがCK19偽遺伝子に対して少なくとも２個のミスマッチを含み、そして前記プローブの１つがドナーによりラベルされとおり、そして前記プローブの他方がアクセプターによりラベルされている、
ことを特徴とする組成物。
【請求項９】
CK19 mRNAの増幅及び検出のためのキットであって、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１組のプライマー、
ここで、前記プライマーの少なくとも１つの配列がその３’においてCK19偽遺伝子に対して少なくとも１個のミスマッチを含み、そして前記プライマーのいずれな１つがCK19偽遺伝子に対して少なくとも２個のミスマッチを含む；
並びに
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する１組のプローブ、
前記プローブの１つがドナーによりラベルされとおり、そして前記プローブの他方がアクセプターによりラベルされている；
を少なくとも含んで成るキット。
【請求項１０】
CK19 mRNA及びCK20 mRNAを同時に増幅し、そして個別に検出するためのキットであって、２対のプライマー及び２対のプローブを少なくとも含んで成り、前記CK19 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、前記CK20 mRNAの検出のためのプローブがドナー及びアクセプターによりラベルされ、ここでCK19ドナー/アクセプター対が前記CK20ドナー/アクセプター対とは異なり、
CK19 mRNAの増幅のための前記プライマーが、
−CK19遺伝子の第１のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第１プライマー、及び
−前記第１のエキソンの下流に位置するCK19遺伝子の第２のエキソン上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第２プライマー、
を有する１組のプライマーであり、
ここで、前記プライマーの少なくとも１つの配列がその３’においてCK19偽遺伝子に対して少なくとも１個のミスマッチを含み、そして前記プライマーのいずれな１つがCK19偽遺伝子に対して少なくとも２個のミスマッチを含み;そして
検出のための前記プローブが、
−前記第１プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子のエキソンの3'−末端に位置する領域にハイブリダイズする第１プローブ、及び
−前記第１プローブが結合する領域の下流で且つ前記第２プライマーが結合する領域の上流のCK19遺伝子の隣接するエキソンの5’−末端に位置する領域にハイブリダイズする第２プローブ、
を有する、ことを特徴とするキット。
【請求項１１】
CK20のためのプライマーが、
−CK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プライマー、及び
−前記第３プライマーの下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プライマー、
であり；そして
CK20 mRNAのためのプローブが、
−前記第３プライマーが結合する領域の下流で且つ前記第４プライマーが結合する領域の上流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第３プローブ、及び
−前記第４プライマーが結合する領域の上流で且つ前記第３プローブが結合する領域の下流のCK20遺伝子上に位置する領域へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有する第４プローブ、
である、請求項10に記載のキット。
【請求項１２】
前記プライマー対が混合物に含まれ、又は前記プローブ対が混合物に含まれ、又は前記プライマー対及び前記プローブ対が混合物に含まれる、請求項９〜11のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
さらに緩衝液を含む、請求項９〜12のいずれか１項に記載のキット。