【手続補正書】
【提出日】平成25年4月22日(2013.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
更なる態様において、本発明は、本発明の方法に使用出来るヘモグロビンバリアントに選択的な結合親和性を有する抗体を提供する。幾つかの態様において、本発明は、HbC及び糖化HbCに選択的結合親和性を有するモノクローナル抗体を提供し、当該抗体は、HbC最小エピトープ4TPKEKSAVT12(配列番号１)に、又はアミノ酸配列TX1KE又はLTX1KE(配列番号２)を含むHbC最小エピトープに結合するモノクローナル抗体であり、ここで、X1は、天然に存在する20個のありふれたアミノ酸のいずれか1つである。幾つかの態様において、本発明は、HbS及び糖化HbSに選択的結合親和性を有するモノクローナル抗体を提供し、当該抗体は、HbS最小エピトープ3LTPVEKSAVT12(配列番号３)に、又はアミノ酸配列PVEX2X3A(配列番号４)又はLTPVEX2X3Aを(配列番号５)有するHbS最小エピトープに結合し、ここで、X2及びX3は、独立して、天然に存在する20個のありふれたアミノ酸のいずれか1つから選択される。幾つかの態様において、本発明は、HbE及び糖化HbEに選択的結合親和性を有するモノクローナル抗体を提供し、当該抗体は、HbE最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)、又はアミノ酸配列DEVGGK(配列番号７)又はEVX4X5Kを有するHbE最小エピトープに結合し、ここで、X4及びX5は、独立して、天然に存在する20個のありふれたアミノ酸のいずれか1つから選択される。幾つかの態様において、本発明は、HbE￥D及び糖化HbDに選択的結合親和性を有するモノクローナル抗体を提供し、当該抗体は、HbD最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)に、又はアミノ酸配列GX6QFX7PP(配列番号９)又はQFX7PP(配列番号１０)を有するHbD最小エピトープに結合し、ここで、X6及びX7は、独立して、天然に存在する20個のありふれたアミノ酸のいずれか1つから選択される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
また、本発明は、全ヘモグロビンに選択的に結合する(非ヘモグロビンポリペプチドと比較して)、ポリクローナル又はモノクローナルのいずれかの抗体を採用する場合もある。幾つかの態様において、本発明で使用される全反応性(pan-reactive)ポリクローナル抗体は、アルファグロビン及びベータグロビンの以下の領域に存在する1つ以上のエピトープに結合する。アルファグロビン49SHGSAQVGHGKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDHLHAHKLRRVDPV96(配列番号１１)；ベータグロビン15WGKVNVDEVGGEALG30(配列番号１２)、45FGDLSTP51(配列番号１３)、及び76AHLDNLKGTFAT87(配列番号１４)。幾つかの態様において、全反応性抗体は、エピトープ9SAVTALWGKVNV20(配列番号１５)（ベータグロビン)又は8KSAVTALWGKVNV20(配列番号１６)又は11VTALW15(配列番号１７)に、又は配列ALWG(配列番号１８)又はVTX9LW(配列番号１９)を有するベータグロビン最小エピトープに結合するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり、ここで、X9は、天然に存在する20個のありふれたアミノ酸のいずれか1つである。本発明で使用される抗体は、8KSAVTALWGKVNV20(配列番号１６)、58PKVAHGKKVLGAF71(配列番号２０)、または87TLSELHCDKLHVDPENFR104(配列番号２１)（ベータグロビン)等の、ベータグロビン上のエピトープに結合してもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
一つの側面において、本発明は、HbA1cに結合するモノクローナル抗体並びにヘモグロビンバリアントHbS, HbC, HbE, 及びHbDに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。ヘモグロビンベータ鎖の配列を以下に示す(配列番号２２)：
VHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALGRLLVVYPTQRFFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDNLKGTFATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVAGVANALAHKYH
本明細書中に記載のヘモグロビンベータ鎖中のアミノ酸残基の配置は、他に特段の言及が無い限り、このアミノ酸配列に準拠する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【表１】
2013511717.tif 000001
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
HbSに選択的な本発明の抗HbS抗体は、HbC及びHbA0の親和性よりも少なくとも100倍以上低い（即ち良好な)親和性でHbSと結合するという結合特性を有する。幾つかの態様において、前記抗体は、最小HbSエピトープ5PVEKSAVT12(配列番号４０)と結合する。そのような抗体は、反応性が、６位のバリンがイソロイシンに置換されても同程度の反応性を有し得るが、当該位置がそれ以外のアミノ酸で置換されると、反応性が2倍、又は3倍以上低下する。幾つかの態様において、3LTP5、7E及び10Aも、結合に重要である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
幾つかの態様において、前記抗体は、最小エピトープ3LTPVEKSAVT12(配列番号３)と結合する。幾つかの態様において、当該抗体は、６位のバリンがイソロイシン又はアラニンで置換されても反応性を有するが、当該位置がそれら以外のアミノ酸で置換された場合、反応性は、2倍、しばしば3倍以上低下する。幾つかの態様において、2HLTPVEK8(配列番号４１)及び10Aも、結合にとって重要である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
幾つかの態様において、5PVEKSAVT12(配列番号４０)等のHbS最小エピトープに結合する抗体は、６位にバリンを有するHbS最小エピトープのバリアントに結合してもよい。そのような最小エピトープの例として、5PVEX2X3A10(配列番号４)が挙げられ、ここで、X2及びX3は、独立して通常の天然に存在するアミノ酸から選択され得て、例えばそれぞれK及びSの保存的置換である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
一つの態様において、本発明のHbS抗体は、免疫原HbS及びH3-KLH : H2N-VHLTPVESAVTALW-C-CONH2(配列番号２６)に対して形成される。他の態様において、当該免疫原は、H3-KLH : H2N-VHLTPVEKSAVTALW-C-CONH2(配列番号２６)及び精製された原型(native)及び/又は変性HbSタンパク質の組合わせ、又は上記免疫原の個々の構成を使用した連続的免疫化である。KLH以外の担体タンパク質を使用することも出来る。例えばアルブミン又はオボアルブミンであり、他の例も当業者にとって明らかである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
当該技術分野で理解され、上記表１で例示されるように、様々な免疫原が、所望の抗体を取得するのに使用され得る。例えば、ペプチド免疫原H3-KLH : H2N-VHLTPVEKSAVTALW-C-CONH2(配列番号２６)、C-末端カルボキサミドではなくC-末端カルボキシレートを有してもよい。幾つかの態様において、システインリンカー部分は、6-アミノヘキサン酸のHx残基をスペーサーとし、又はGly-Glyスペーサー配列等のスペーサーが採用されてもよい。更に、ペプチド配列は様々なものであってもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
抗HbC抗体
ヘモグロビンバリアントHbCは、ヘモグロビンベータ鎖の6位でグルタミン酸と置換されたリシスを有する。本発明に使用される抗HbCモノクローナル抗体は、典型的には、HbS及びHbA0に対する親和性の100倍以上の親和性でHbCと結合する。幾つかの態様において、前記モノクローナル抗体は、最小エピトープ4TPKEKSAVT12(配列番号１)と結合する。幾つかの態様において、前記抗体は、結合に重要な残基が残基3LT4及び6Kであるように、結合親和性を有する。幾つかの態様において、結合に重要な残基は、3LT4及び6KE7であってもよい。また、前記結合特異性は、6位でリシンをアルギニン又はヒスチジンで置換することを許容するが、他のアミノ酸の置換は、反応性を、少なくとも2倍、典型的には3倍以上の損失を引き起こす。他の態様において、HbC抗体の反応性は、6位のリシンがアルギニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン又はグリシンで置換されることを許容するが、他のアミノ酸残基による置換は、反応性の損失を引き起こす。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
幾つかの態様において、4TPKEKSAVT12(配列番号１)等のHbC最小エピトープと結合する抗体は、4TX1KE7又は3LTX1KE7(配列番号２)を有する最小エピトープ等の、6位でKを有するHbC最小エピトープのバリアントと結合する。ここで、X1は、天然に存在する20種類のアミノ酸の1つであり得る。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明の抗体は、免疫原H4-KLH : H2N-VHLTPKESAVTALW-C-CONH2(配列番号２７)に対して生産され得る。他のペプチド免疫原の例は表１に列挙され、KLHの位置に他の通常の担体タンパク質が使用されてもよい。幾つかの態様において、前記免疫化は、前記ペプチド及び精製された原型及び/又は変性HbCタンパク質の組み合わせを使用して実施される。幾つかの態様において、上記免疫原の個々の構成を使用して、連続的な免疫化が実施される。免疫化のプロトコルの一例は、表２に記載される。上記の抗HbS抗体の項で説明したように、当業者は、容易に他の免疫原ペプチドを設計して、所望のHbC結合特異性を有する抗体を取得することが出来る。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
抗HbE抗体
HbEは、ヘモグロビンベータ鎖の26位でグルタミン酸がリシンに置換されている。本発明の抗HbEモノクローナル抗体は、HbEに対して、HbAと比較して、典型的には4倍又は5倍以上、しばしば10倍以上の反応性で結合する。幾つかの態様において、前記モノクローナル抗体は、最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)に結合する。幾つかの態様において、そのような抗HbE抗体は、22EVGGK26(配列番号６)に対する結合特異性を有し、22Eに依存し、21D、23V及び26Kは結合に重要である。幾つかの態様において、前記抗体は、26位のKのS, T、A, R, Q又はGへの置換が結合活性を少なくとも50％、典型的には70％又はそれ以上保持するように、結合特異性を有する。幾つかの態様において、26位のKのS, T、A, R, 又はVへの置換が結合活性を少なくとも50％、典型的には70％又はそれ以上保持するように、結合特異性を有する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
幾つかの態様において、22EVGGK26(配列番号６)等のHbE最小エピトープに結合する抗体は、21DEVGGK26又は22EVX4X5K26(配列番号７)を有する最小エピトープ等の、26位にKを有するHbE最小エピトープのバリアントと結合し得る。ここでX4及びX5は、Gの保存的置換等の、天然に存在する20種類のアミノ酸から独立して選択され得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
本発明の抗HbE抗体は、例えば免疫原H5bis-KLH : H2N-CYG-VTALWGKVNVDEVGGK-CONH2(配列番号２９)を使用して取得できる。幾つかの態様において、前記抗体は、免疫原H5bis-KLH : H2N-CYG-VTALWGKVNVDEVGGK-CONH2(配列番号２９)と、ペプチド、原型HbE抗原及びHbE変性抗原との混合物、又は連続注射により作成される。ペプチド免疫原の例は、表1に提供される。ペプチド免疫原は、他の変性又は原型HbEを用いて、又は用いずに使用できる。免疫化プロトコルの一例は、表2に提供される。抗HbS抗体に関する上記項で説明したように、当業者は、他の免疫原ペプチドを設計して、容易に所望のHbE結合特異性を有する抗体を取得することが出来る。読者は、他のペプチド抗原の例として、表１を再び参照できる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
抗HbD抗体
HbDは、ヘモグロビンベータ鎖の121位のグルタミン酸がグルタミンで置換されたものである。本発明の抗HbDモノクローナル抗体のHbDへの反応性は、HbAへの反応性と比較して、典型的には少なくとも3倍又はそれ以上である。幾つかの態様において、前記抗体は、最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)と結合する。幾つかの態様において、前記抗体の結合特異性において、119G,  121QF122, 及び124pp125が重要である。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
幾つかの態様において、121QFTPP125(配列番号８)等のHbD最小エピトープに結合する抗体は、119GX6QFX7PP125(配列番号９)又は121QFX7PP125(配列番号１０)を有する最小エピトープ等、121位にQを有するHbE最小エピトープのバリアントに結合し得る。ここで、X6及びX7は、それぞれK及びTの保存的置換等の、天然に存在する20種類のアミノ酸から独立して選択され得る。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
本発明の抗HbD抗体は、例えば免疫H6-KLH : H2N-CYGVLAHHFGKQFTPPVQAA-CONH2(配列番号３２)を使用して、又は原型及び/又は変性HbD及びH6-KLH : H2N-CYGVLAHHFGKQFTPPVQAA-CONH2(配列番号３２)を使用して、又は様々な免疫原の組み合わせ又は連続注射により取得できる。所望のHbD結合特異性を有する抗体の取得に利用できる他の免疫原ペプチドは、当業者にとって容易に明らかになり得る。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
全反応性(Pan-reactive)抗体
本発明は、本発明において使用される全反応性抗体をも提供する。そのような抗体は、様々なフォームのヘモグロビンと結合し得る。全反応性抗体は、H5bis-KLH : H2N- CYGVTALWGKVNVDEVGGK-CONH2(配列番号２９)又は H1-KLH : H2N-VHLTPEEKSAVTALW-C-CONH2(配列番号２３)を含む、多数の異なる免疫原を使用して生産できる。そのようなペプチド免疫原は、原型又は変性HbA0と混合して、又は原型及び/又は変性HbA0と連続して注射され得る。当該技術分野で理解されるように、Hbバリアントに加えてHbA0に選択的に結合するHb抗体を取得するために、任意の数のHb抗原が使用され得る。全反応性抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体であってもよい。全反応性抗体は、ペプチド免疫原を使用せずに、原型又は変性ヘモグロビンを用いた免疫化により取得することも出来る。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
幾つかの態様において、本発明において使用される全反応性ポリクローナル抗体は、以下のアルファグロビン及びベータグロビンの領域：アルファグロビン49SHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDHLHAHKLRRVDPV96(配列番号１１)、ベータグロビン15  WGKV VDE VGGEALG29(配列番号１２)、 45FGDLSTP51(配列番号１３)及び76AHLDNLKGTFAT87(配列番号１４)中に存在する一つ以上のエピトープに結合する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
一つの態様において、全反応性抗体は、ベータグロビンエピトープ9SAVTALWGKVNV20(配列番号１５)に結合する。幾つかの態様において、前記抗体は、ベータグロビンエピトープ11VTALW15(配列番号１７)に結合する。幾つかの態様において、11VT12及び14LW15は、結合にとって重要である。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
幾つかの態様において、全反応性抗体は、以下の配列：ベータグロビン最小エピトープ8KSAVTALWGKVNV20(配列番号１６)、ベータグロビン最小エピトープ58PK VK AHGKK VLG AF71(配列番号２０)、及びベータグロビン87TLSELHCDKLH VDPENFR  104(配列番号２１)最少エピトープを有するベータ及びアルファグロビンエピトープに結合する。幾つかの態様において、残基13ALWG16(配列番号１８)は、結合に重要である。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本発明の幾つかの態様において、様々なフォームのヘモグロビンに結合する全反応性抗体は、全ての解析物に結合する標識された結合メンバーとして使用されることにより、結合された解析物を標識する。故に、例えば、エピトープ：アルファグロビン49SHGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDDMPNALSALSDHLHAHKLRRVDPV96(配列番号１１)、ベータグロビン16GKV VDEVGGEALG29(配列番号４２)、46GDLSTP51 (配列番号４３)及び78LDNLKGTFAT87(配列番号４４)に結合する標識された全反応性ポリクローナル抗体が、アッセイされる解析物(ヘモグロビンの様々なフォーム)の全てに結合する抗体を検出するユニバーサル検出抗体として使用されることにより、結合された解析物を標識する。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
抗HbA1c抗体
本発明は、追加で、糖化ヘモグロビンに結合特異性を有する抗HbA1c抗体を提供する。そのような抗体は、GP3-KLH : 1-デオキシフルクトピラノシル-HN-VHLTPEE-Hx-C-CONH2(配列番号３８)等の免疫原を使用して生産され得る。前記抗体はIgGであり、たとえば、当該抗体は、IgG1、IgG2、又はIgG3アイソタイプを有し得る。いくつかの態様において、軽鎖定常領域はカッパー鎖である。他の態様において、軽鎖定常領域は、ラムダ鎖であってもよい。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
A1cモノクローナル抗体は、糖化ペプチドGP3(1 -デオキシフルクトピラノシル-HN-VHLTPEE-Hx-C-CONH2(配列番号３８))が原型Hb A1cと結合を競合するが、非糖化ペプチド、例えばRW1a( VHLTPEE-CONH2(配列番号４５))とは競合しないように、競合的結合実験における結合特異性を有する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
19E10-E7は、ベータグロビン最小エピトープ5PVEKSAVT12(配列番号４０)に結合する。5PVE7及びA10は、結合に重要である。L3及びT4も、結合活性に貢献する。追加のエピトープマッピング実験は、V6が、結合活性の損失無く、Iに置換され得ることを示した。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
12C8-A11は、ベータグロビン最小エピトープ4TPKEKSAVT12(配列番号１)に結合する。T4及びK6は、結合に重要である。L3も、結合に貢献する。追加のエピトープマッピング実験は、K6が、結合活性の損失無く、Rに置換され得ることを示した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
4A10-2D6-2G8は、ベータグロビン最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)に結合する。22EV23及びK26は、結合に重要である。D21も、結合に貢献する。追加のエピトープマッピング実験は、K26が、結合活性の損失無く、S又はTに置換され得ることを示した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
7B3-2C3-1G10は、ベータグロビン最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)に結合する。G119も、結合に貢献する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の血液細胞溶解物の試料中の、HbA1c、及び多数のヘモグロビンバリアントを含む多数のヘモグロビン含有解析物を個別に検出する方法であり、当該方法が：
(a)前記試料をビーズの集団とインキュベーションし、当該集団が均一な混合物(common mixture)中の多数のサブ集団からなり、当該集団の各ビーズに、前記解析物と同数の多数の分類染料(classifier dye)の一つが結合しており、そして当該分類染料は、当該分類染料、ひいては前記サブ集団が、当該分類染料が励起されることで放射される蛍光放射により互いに区別されるように選択され、当該各サブ集団が、更に、前記解析物の1つに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーを結合させていることにより、各解析物を、前記サブ集団に結合させられた前記免疫学的結合メンバーを介して、個々のビーズサブ集団と結合させること；
(b)前記サブ集団のビーズに結合した前記解析物を、全ての前記解析物と結合する標識された結合メンバーとインキュベーションすることにより、当該解析物に標識を結合させること；及び
(c)そのように標識された前記結合した解析物について、蛍光放射によりサブ集団の標識を区別しながら、前記結合した解析物に結合した標識を検出することにより、当該解析物を個別に検出すること；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記多数のヘモグロビン含有解析物が、全ヘモグロビン、HbA1c、及び前記多数のヘモグロビンバリアントからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記HbA1cに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記多数のヘモグロビンバリアントが、HbS, HbC, HbE, 又はHbDの1つ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘモグロビンバリアントHbS, HbC, HbE, 又はHbDに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーが、当該バリアント及び糖化バリアントに選択的に結合するモノクローナル抗体である、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記バリアントがHbCであり、HbC及び糖化HbCに選択的親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbC最小エピトープ4TPKEKSAVT12(配列番号１)に結合するモノクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記バリアントがHbSであり、HbS及び糖化HbSに選択的親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbS最小エピトープ3LTPVEKSAVT12(配列番号３)に結合するモノクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記バリアントがHbEであり、HbE及び糖化HbEに選択的親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbE最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)又は21DEVGGK26(配列番号７)に結合するモノクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
前記バリアントがHbDであり、HbD及び糖化HbDに選択的親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbD最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)又は119GKQFTPP125(配列番号４６)に結合するモノクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
前記多数のビーズサブ集団が、全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含まず、そして前記方法が、更に、非免疫アッセイ手段により全ヘモグロビンを判定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記多数のビーズサブ集団が、全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含み、全ヘモグロビンに対する選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体が、ベータグロビン鎖最小エピトープ9SAVTALWGKVV20(配列番号１５)、8KSAVTALWGVV20(配列番号１６)、又は11VTALW15(配列番号１７)に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記多数のビーズサブ集団が、全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含み、全ヘモグロビンに選択的結合親和性を有する前記免疫学的結合メンバーがポリクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記血液細胞溶解物が変性血液細胞ライゼートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が糖尿病患者から採取されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
血液細胞溶解物の試料中の、全ヘモグロビンに対するHbA1cの比率を決定する方法であり、当該比率は、HbA1cの測定に干渉するヘモグロビンバリアントが当該溶解物中に存在する可能性を考慮して調整され、当該方法が：
(a)前記試料をビーズの集団とインキュベーションし、当該集団が均一な混合物中の多数のサブ集団からなり、当該集団の各ビーズに、多数の分類染料の一つが結合しており、そして当該分類染料は、当該分類染料、ひいては前記サブ集団が、当該分類染料が励起されることで放射される蛍光放射により互いに区別が可能なように選択され、当該各サブ集団が、更に、HbA1c及びヘモグロビンバリアントを含む多数の解析物の1つに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーを結合させていることにより、各解析物を、当該免疫学的結合メンバーを介して、個々のビーズサブ集団と結合させること；
(b)前記サブ集団のビーズに結合した前記解析物を、全ての前記解析物と結合する標識された結合メンバーとインキュベーションすることにより、当該解析物に標識を結合させること；
(c)そのように標識された前記結合した解析物について、蛍光放射によりサブ集団の標識を区別しながら、前記結合した解析物に結合した標識を検出することにより、前記試料中の当該解析物の濃度を個別に検出すること；及び
(d)前記濃度から全ヘモグロビンに対するHbA1cの比率を決定し、当該比率が、検出されたヘモグロビンバリアント濃度とHbA1cの濃度との間の予め決められた関係に実験的に由来する調整係数により、当該ヘモグロビンバリアントの濃度で調整されること；
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記多数の解析物が、更に、全ヘモグロビンを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記多数のビーズサブ集団が全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含まず、更に前記方法が、非免疫アッセイ手法により全ヘモグロビンを決定することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記HbA1cに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記多数のビーズサブ集団が全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含み、前記全ヘモグロビンに対して選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記モノクローナル抗体が、ベータグロビン最小エピトープ9SAVTALWGKVV20(配列番号１５)、8KSAVTALWGKVNV20(配列番号１６)、又は11VTALW15(配列番号１７)に結合する、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記多数のビーズサブ集団が全ヘモグロビンに結合するサブ集団を含み、前記全ヘモグロビンに対して選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーがポリクローナル抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記血液細胞溶解物が変性血液細胞溶解物である、請求項16に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘモグロビンバリアントが、HbC, HbS, HbD, 及びHbEから成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘモグロビンバリアントHbC, HbS, HbD, 又はHbEに選択的に結合する免疫学的結合メンバーが、当該ヘモグロビンバリアント及び糖化バリアントに結合するモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘモグロビンバリアントがHbCであり、HbCに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbC最小エピトープ4TPKESAVT12(配列番号１)に結合するモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘモグロビンバリアントがHbSであり、当該バリアントに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbS最小エピトープ3LTPVESAVT12(配列番号３)に結合するモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘモグロビンバリアントがHbEであり、当該バリアントに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbE最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)又は21DEVGGK26(配列番号７)に結合するモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヘモグロビンバリアントがHbDであり、当該バリアントに選択的結合親和性を有する免疫学的結合メンバーが、HbD最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)又は119GKQFTPP125(配列番号４６)に結合するモノクローナル抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が糖尿病患者から採取されたものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
血液細胞溶解物の試料中の、全ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンバリアントの比率を決定する方法であり、当該方法が：
(a)前記試料をビーズの集団とインキュベーションし、当該集団が均一な混合物中の多数のサブ集団からなり、当該集団の各ビーズに、多数の分類染料の一つが結合しており、そして当該分類染料は、当該分類染料、ひいては前記サブ集団が、当該分類染料が励起されることで放射される蛍光放射により互いに区別が可能なように選択され、当該各サブ集団が、更に：
第一の免疫学的結合メンバーとして、前記糖化ヘモグロビンバリアント及びHbA1cの両方からなる第一の解析物に選択的結合親和性を有するもの、及び
第二の免疫学的結合メンバーとして、前記ヘモグロビンバリアント及び前記糖化ヘモグロビンバリアントの両方からなる第二の分析物に選択的結合親和性を有するもの
を含む多数の免疫学的結合メンバーの1つを有することにより、当該第一及び第二の解析物を、当該第一及び第二の各免疫学的結合メンバーと結合させること；
(b)結合した前記第一及び第二解析物を、全ての前記解析物と結合する標識された結合メンバーとインキュベーションすることにより、当該解析物に標識を結合させること；
(c)そのように標識された前記結合した解析物について、蛍光放射によりサブ集団の標識を区別しながら、前記標識を検出することにより、前記試料中の当該第一及び第二の解析物の濃度を個別に検出すること；及び
(d)全ヘモグロビンの濃度を決定し、そして前記濃度から全ヘモグロビンに対する前記第一の解析物の比率を決定し、当該比率が、検出されたヘモグロビンバリアント濃度と全ヘモグロビン濃度との間の予め決められた関係に実験的に由来する調整係数により、全ヘモグロビンに対する当該第二の解析物の濃度で調整されることにより、全ヘモグロビンに対する糖化ヘモグロビンバリアントの比率を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記多数の免疫学的結合メンバーが、更に全ヘモグロビンに選択的親和性を有する第三の免疫学的結合メンバーを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記全ヘモグロビンに選択的結合親和性を有する第三の免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記モノクローナル抗体が、ベータグロビン最小エピトープに結合し、当該モノクローナル抗体が、ベータグロビン最小エピトープ9SAVTALWGKVNV20(配列番号１５)、8KSAVTALWGKVNV20(配列番号１６)、又は11VTALW  15(配列番号１７)に結合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記全ヘモグロビンに選択的親和性を有する第三の免疫学的結合メンバーがポリクローナル抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記多数の免疫学的結合メンバーが、全ヘモグロビンに対する選択的親和性を有する免疫学的結合メンバーを含まず、前記工程(d)における全ヘモグロビンの濃度が、非免疫アッセイ手段により決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一の解析物に選択的結合親和性を有する第一の免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記第二の解析物に選択的結合親和性を有する第二の免疫学的結合メンバーがモノクローナル抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記第二の解析物が、HbC, HbS, HbD, 及びHbEからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記第二の解析物がHbCであり、前記第二の免疫学的結合メンバーが、HbC最小エピトープ4TPKEKSAVT12に結合するモノクローナル抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記前記第二の解析物がHbSであり、前記第二の免疫学的結合メンバーが、HbS最小エピトープ3LTPVEKSAVT12(配列番号３)に結合するモノクローナル抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記前記第二の解析物がHbEであり、前記第二の免疫学的結合メンバーが、HbE最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)又は21DEVGGK26(配列番号７)に結合するモノクローナル抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記前記第二の解析物がHbDであり、前記第二の免疫学的結合メンバーが、HbD最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)又は119GKQFTPP125(配列番号４６)に結合するモノクローナル抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が糖尿病患者から採取されたものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
HbC最小エピトープ4TPEKSAVT12(配列番号１)に結合する、ヘモグロビンバリアントHbC及び糖化HbCに選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項４６】
HbS最小エピトープ3LTPVEKSAVT12(配列番号３)に結合する、ヘモグロビンバリアントHbS及び糖化HbSに選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項４７】
HbE最小エピトープ22EVGGK26(配列番号６)又は21DEVGGK26(配列番号７)に結合する、ヘモグロビンバリアントHbE及び糖化HbEに選択的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項４８】
HbD最小エピトープ121QFTPP125(配列番号８)又は119GKQFTPP125(配列番号４６)に結合する、ヘモグロビンバリアントHbD及び糖化HbDに選択的に結合するモノクローナル抗体。