【手続補正書】
【提出日】平成25年1月25日(2013.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物を検出する方法であって、前記方法が、
ｉ）試料を、脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、Ｇタンパク質共役受容体の少なくとも１つのサブユニットが、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含むステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動させるかどうかを決定するステップと
を含み、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成し、かつ、
当該方法は、非生物発光タンパク質をドナー分子として使用し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変動を決定する場合より少なくとも２倍感度がよい、前記方法。
【請求項２】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子のＦｏｒｓｔｅｒ距離が、６．８ｎｍおよび７．６ｎｍの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物発光タンパク質およびアクセプター分子のＦｏｒｓｔｅｒ距離が、７．５ｎｍである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｉ）無細胞組成物が、組換え細胞中でＧタンパク質共役受容体を産生し、細胞の膜を破壊することによって得られた、または
ｉｉ）Ｇタンパク質共役受容体が、リポソームの脂質二重層中に埋め込まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
組換え細胞が酵母細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
マイクロ流体工学を使用して行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
化合物を検出するための精製および／または組換えポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体のサブユニットと、
ｉｉ）生物発光タンパク質およびアクセプター分子と
を含み、細胞中で発現したときにサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ化合物がポリペプチドと結合したときにアクセプター分子に対する生物発光タンパク質の空間的位置および／または双極子配向が変化し、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成し、かつ、
生物発光タンパク質およびアクセプター分子のＦｏｒｓｔｅｒ距離が、６．８ｎｍおよび７．６ｎｍの間である、前記ポリペプチド。
【請求項８】
ｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端および１番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分、第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの１番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、ならびに第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含むか、または
ｉｉ）サブユニットが、第１のＧタンパク質共役受容体サブユニットのＮ末端から５番目の膜貫通ドメインの少なくとも大部分まで、および第２のＧタンパク質共役受容体サブユニットの５番目の非膜貫通ループの少なくとも大部分からＣ末端までを含む、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法または請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
ｉ）生物発光タンパク質が、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼまたはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である、および／または
ｉｉ）基質が、ルシフェリン、セレンテラジン、またはセレンテラジンの誘導体である、および／または
ｉｉｉ）タンパク質であるアクセプター分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはその生物学的に活性な変異体もしくは断片である、
請求項１〜６または８のいずれか１項に記載の方法または請求項７または８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ルシフェラーゼがウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼであり、アクセプター分子がＧＦＰ２であり、かつ基質がセレンテラジン４００ａである、請求項９に記載の方法またはポリペプチド。
【請求項１１】
ｉ）Ｇタンパク質共役受容体が嗅覚受容体である、または
ｉｉ）サブユニットが、２つ以上の異なるＧタンパク質共役受容体サブユニットの部分のキメラである、
請求項１〜６または８〜１０のいずれか１項に記載の方法または請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
嗅覚受容体が、脊索動物受容体、線虫受容体、またはそのいずれか１つの生物学的に活性な変異体もしくは断片である、請求項１１に記載の方法またはポリペプチド。
【請求項１３】
請求項７から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離および／または外因性ポリヌクレオチド。
【請求項１４】
プロモーターと作動可能に連結する、請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドおよび／または請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
酵母細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項７から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１３に記載のポリヌクレオチド、請求項１４に記載のベクター、および／または請求項１５または１６に記載の宿主細胞を含む組成物。
【請求項１８】
脂質二重層中に埋め込まれている、請求項７から１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む無細胞組成物。
【請求項１９】
請求項１８に記載の無細胞組成物を作製する方法であって、前記方法が、請求項１５または１６に記載の細胞を得るステップと、細胞の膜を破壊するステップとを含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項７から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１５または１６に記載の宿主細胞、請求項１７に記載の組成物、および／または請求項１８に記載の無細胞組成物を含むバイオセンサー。
【請求項２１】
Ｇタンパク質共役受容体と結合する化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
ｉ）候補化合物を、脂質二重層中に埋め込まれ、化合物と結合することができる少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体を含む無細胞組成物と接触させるステップであって、
Ｇタンパク質共役受容体が、同じまたは異なる１つまたは複数のサブユニットを含み、Ｇタンパク質共役受容体の少なくとも１つのサブユニットが、生物発光タンパク質およびアクセプター分子を含むステップと、
ｉｉ）ステップｉ）と同時にまたはそれに連続して、生物発光タンパク質の基質を提供し、生物発光タンパク質が基質を修飾することを可能にするステップと、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）が生物発光タンパク質とアクセプター分子の間の生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を変動させるかどうかを決定するステップと
を含み、ＢＲＥＴの変動が、化合物がＧタンパク質共役受容体と結合することを示し、細胞中で発現したときにＧタンパク質共役受容体またはそのサブユニットのＮ末端が細胞の外側にあり、Ｃ末端が細胞の内側にあり、かつ、ＢＲＥＴ比率の変化の幅が試料中の化合物の相対量を示し、かつ
ａ）生物発光タンパク質がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、アクセプター分子がＣ末端の一部を形成し、または
ｂ）アクセプター分子がサブユニットの５番目の非膜貫通ループの一部を形成し、生物発光タンパク質がＣ末端の一部を形成し、かつ、
当該方法は、非生物発光タンパク質をドナー分子として使用し、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の変動を決定する場合より少なくとも２倍感度がよい、前記方法。