(57)【要約】【課題】良性腫瘍が悪性転化することを予知できる指標（発癌予知マーカー）を提供することを課題とする。また、発癌予知マーカーの用途を提供することを課題とする。【解決手段】エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカーが提供される。被験者より採取された検体中における発癌予知マーカーの発現量を指標とすることによって発癌の予知が可能となる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカー。
【請求項２】
被験者より採取された検体中における、請求項１に記載の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いることを特徴とする、発癌を予知する方法。
【請求項３】
以下のステップ（１）〜（３）を含む、請求項２に記載の方法、
（１）被験者より採取された検体を用意するステップ、
（２）前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
（３）発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。
【請求項４】
前記ステップ（３）において、ステップ（２）で得られた発現量と、対照検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（３）において、ステップ（２）で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記発現量がエンドセリン受容体Bタンパク質発現量、エンドセリン-1タンパク質発現量、エンドセリン受容体B mRNA発現量、及びエンドセリン-1 mRNA発現量からなる群より選択される一以上の発現量である、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記検体が腫瘍組織の一部である、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記検体が血漿又は血清である、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記癌が悪性黒色腫、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽腫、耳下腺癌、多発性内分泌腺種症2A型、多発性内分泌腺種症2B型、又は家族性甲状腺髄様癌である、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が悪性黒色腫である、請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に検出する核酸プローブ、又はエンドセリン-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする発癌予知用試薬。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発癌予知用試薬を含む、発癌予知用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は発癌予知マーカー及びその用途に関する。本発明の発癌予知マーカーは、癌の発症を事前に把握するために利用される。
【背景技術】
【０００２】
悪性黒色腫（メラノーマ）は高い転移能を持ち、非常に予後不良な癌の1つである（非特許文献１、２、３）。世界統計において、皮膚悪性黒色腫の増加率は、全ての癌腫の中で第1位となっている（非特許文献４）。実際、米国においては毎年20,000〜40,000症例の表皮内黒色腫（in situ melanoma）及び45,000症例を超える浸潤性皮膚悪性黒色腫（invasive cutaneous malignant melanoma）の報告がある（非特許文献４）。しかしながら、悪性黒色腫の進展メカニズムは十分に明らかにされていない。黒色腫の悪性転化を予知するために臨床利用可能なバイオマーカーの報告はなく、悪性黒色腫の予防に有効な治療法も確立されていない。このため黒色腫は全世界的に公衆衛生への大きな脅威となっている。
c-RETプロト癌遺伝子は受容体型チロシンキナーゼ（receptor-tyrosine kinase）をコードする（非特許文献５）。最近、GDNF、neurturin、artemin及びpersephon等のグリア細胞由来栄養因子（GDNF）リガンドがRETのリガンドであることが報告された（非特許文献６）。RFP-RET遺伝子はc-RET遺伝子とRFP遺伝子が組み換えをおこしてできたハイブリッド癌遺伝子であり、NIH3T3のトランスフェクション・アッセイによって単離された（非特許文献７、８）。以前に我々は、304/B6系統のマウスを用いてmetallothionein I/RFP-RET-トランスジェニックマウス（RET-マウス）の作製に成功したことを報告した（非特許文献１０）。
エンドセリン受容体B（Ednrb）はGタンパク質共役受容体ファミリーに属する分子であり、エンドセリンの多面的な作用を媒介する（非特許文献１７〜１９）。エンドセリン-1、2及び3（ET-1、ET-2及びET-3）は同等の親和性を有する、Ednrbのリガンドである（非特許文献２０、２１）。最近、黒色腫ではEdnrbの発現が亢進していることが報告された（非特許文献２２、２３）。また、Ednrb、ET-1及びET-3が黒色腫の進展に関与することが報告された（非特許文献１９、２４、２５）。一方、近年、黒色腫細胞株では１７株中１６株においてメラニン細胞及び母斑細胞よりもEdnrbの発現が減少していることが報告された（非特許文献２６）。さらに、原発性のブドウ膜悪性黒色腫においてもEdnrbの発現レベルの減少が報告されている（非特許文献２７）。また、最近、Ednrbの機能が低下した患者では、黒色腫のリスクが有意に増加することが示された（非特許文献２８）。以上のような相矛盾する数々の報告は、黒色腫発症における、Ednrb及びそのリガンドの役割が依然として不明であることを示している。
【非特許文献１】Chen, Y.T., Dubrow, R., Holford, T.R., Zheng, T., Barnhill, R.L., Fine, J., and Berwick, M. 1996. Malignant melanoma risk factors by anatomic site: a case-control study and polychotomous logistic regression analysis. Int J Cancer. 67:636-43.
【非特許文献２】Kato, M., Liu, W., Yi, H., Asai, N., Hayakawa, A., Kozaki, K., Takahashi, M., and Nakashima, I. 1998. The herbal medicine Sho-saiko-to inhibits growth and metastasis of malignant melanoma primarily developed in ret-transgenic mice. J Invest Dermatol. 111:640-4.
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【非特許文献４】Greenlee, R.T., Murray, T., Bolden, S., and Wingo, P.A. Cancer statistics, 2000. CA Cancer J Clin. 50:7-33.
【非特許文献５】Kato, M., Takeda, K., Kawamoto, Y., Iwashita, T., Akhand, A.A., Senga, T., Yamamoto, M., Sobue, G., Hamaguchi, M., and Takahashi M., et al. 2002. Repair by Src kinase of function-impaired RET with multiple endocrine neoplasia type 2A mutation with substitutions of tyrosines in the COOH-terminal kinase domain for phenylalanine. Cancer Res. 62:2414-2
【非特許文献６】Takahashi, M. 2001. The GDNF/RET signaling pathway and human diseases. Cytokine Growth Factor Rev. 12:361-73.
【非特許文献７】Takahashi, M., Ritz, J., and Cooper, G.M. 1985. Activation of a novel human transforming gene, ret, by DNA rearrangement. Cell. 42:581-8.
【非特許文献８】Kato, M., Iwashita, T., Akhand, A.A., Liu. W., Takeda, K., Takeuchi, K., Yoshihara, M., Hossain, K., Wu, J., Du, J., et al. 2000. Molecular mechanism of activation and superactivation of Ret tyrosine kinases by ultraviolet light irradiation. Antioxid Redox Signal. 2:841-9.
【非特許文献９】Iwamoto, T., Takahashi, M., Ito, M., Hamatani, K., Ohbayashi, M., Wajjwalku, W., Isobe, K., and Nakashima, I. 1991. Aberrant melanogenesis and melanocytic tumour development in transgenic mice that carry a metallothionein/ret fusion gene. EMBO J. 10:3167-75.
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【非特許文献１１】Kato, M., Takeda, K., Kawamoto, Y., Tsuzuki, T., Hossain, K., Tamakoshi, A., Kunisada, T., Kambayashi, Y., Ogino, K., and Suzuki, H., et al. 2004. c-Kit-targeting immunotherapy for hereditary melanoma in a mouse model. Cancer Res. 64:801-6.
【非特許文献１２】Kato, M., Liu, W., Akhand, A.A., Dai, Y., Ohbayashi, M., Tuzuki, T., Suzuki, H., Isobe, K., Takahashi, M., and Nakashima, I. 1999. Linkage between melanocytic tumor development and early burst of Ret protein expression for tolerance induction in metallothionein-I/ret transgenic mouse lines. Oncogene. 18:837-42.
【非特許文献１３】Kato, M., Ohgami, N., Kawamoto, Y., Tsuzuki, T., Hossain, K., Yanagishita, T., Ohshima, Y., Tsuboi, H., Yamanoshita, O., and Matsumoto, Y. et al. 2006. Protective Effect of Hyperpigmented Skin on UV-Mediated Cutaneous Cancer Development. J Invest Dermatol. in press.
【非特許文献１４】Kato, M., Takeda, K., Kawamoto, Y., Tsuzuki, T., Kato, Y., Ohno, T. Hossain, K., Iftakhar-E-Khuda, I., Ohgami, N., and Isobe, K. et al. 2006. Novel Hairless RET-Transgenic Mouse Line with Melanocytic Nevi and Anagen Hair Follicles. J Invest Dermatol. 126:2547-50.
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【非特許文献１９】Bagnato, A., Spinella, F., and Rosano, L. 2005. Emerging role of the endothelin axis in ovarian tumor progression. Endocr Relat Cancer. 12:761-72.
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【非特許文献２９】Iwamoto T, Takahashi M, Ito M, Hamaguchi M, Isobe K, Misawa N, Asai J, Yoshida T, Nakashima I. Oncogenicity of the ret transforming gene in MMTV/ret transgenic mice.Oncogene. 1990;5(4):535-42.
【非特許文献３０】Iwamoto T, Pu M, Ito M, Takahashi M, Isobe K, Nagase F, Kawashima K, Ichihara M, Nakashima I. Preferential development of pre-B lymphomas with drastically down-regulated N-myc in the E mu-ret transgenic mice. Eur J Immunol. 1991 Aug;21(8):1809-14.
【非特許文献３１】Iwamoto T, Taniguchi M, Wajjwalku W, Nakashima I, Takahashi M. Neuroblastoma in a transgenic mouse carrying a metallothionein/ret fusion gene. Br J Cancer. 1993 Mar;67(3):504-7.
【非特許文献３２】Kawai K, Iwashita T, Murakami H, Hiraiwa N, Yoshiki A, Kusakabe M, Ono K, Iida K, Nakayama A, Takahashi M. Tissue-specific carcinogenesis in transgenic mice expressing the RET proto-oncogene with a multiple endocrine neoplasia type 2A mutation. Cancer Res. 2000 Sep 15;60(18):5254-60.
【非特許文献３３】Asai N, Jijiwa M, Enomoto A, Kawai K, Maeda K, Ichiahara M, Murakumo Y, Takahashi M. RET receptor signaling: dysfunction in thyroid cancer and Hirschsprung's disease. Pathol Int. 2006 Apr;56(4):164-72.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
病理組織診断は最終診断である。例えば指先の腫瘍が悪性黒色腫（メラノーマ）と診断されれば、臨床的に切断等の濃厚治療に進むことになる。しかし、実際には良性と悪性の境界の腫瘍がしばしば存在し、病理診断に苦慮する場合は少なくない。良性か悪性かを診断しづらい病理組織像を持つ腫瘍について、近い将来における悪性転化を予知できれば、より適切に最終病理診断をくだし、最善の臨床治療に結びつけることができる。
実際に、現在迄に様々な腫瘍マーカーが見出され、そのいくつかは臨床応用されている。しかしながら、従来の腫瘍マーカーは既に発症した癌の検知を可能にするものであり、これから発症する癌の予知には利用できない。
そこで本発明は、良性腫瘍が悪性転化することを予知できる指標、即ち発癌予知マーカーを提供することを課題とする。また、発癌予知マーカーの用途を提供することも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
RET-マウスは全身性の皮膚黒色症（腫瘍は発生しない）、良性メラノサイト系腫瘍、及び遠隔転移を伴う悪性黒色腫を段階的に自然発症する（非特許文献２、９、１０）。このように皮膚黒色腫を多発するという特徴の動物モデルは非常に希である（非特許文献１０、１１）。RET-マウスにおける黒色腫の進展プロセスに関する肉眼的所見は、生下時より巨大なメラノサイト系母斑を生じ、高率でこの母斑より悪性黒色腫が発症することで知られるヒト先天性巨大母斑症（獣皮様母斑）の所見に類似する（非特許文献１２〜１４）。ヒトの黒色腫は比較的高い割合（6〜14%）で遺伝性である（非特許文献１５、１６）ことから、RET-マウスはまた遺伝性黒色腫のモデルとしても有用である。さらに重要なことには、RET-マウスは、「良性腫瘍が発症するまで」及び「良性腫瘍の悪性転化」に関与又は影響する遺伝子、薬剤、環境ストレスなどの選別・解析に利用可能である。黒色腫を移植した従来の動物モデルではこのような解析は不可能である。
本発明者らは、黒色腫の発症、進展などを解析する上でRET-マウスが有用であると考え、RET-マウスを用いた種々の検討を行った。まず、RET-マウスにおいて、病理組織学的に良性腫瘍期と悪性腫瘍期の中間にある前癌期（移行期）を定義した。次に、エンドセリン受容体Bに注目して実験を進めた結果、RET-マウスでは、前癌期の腫瘍中のエンドセリン受容体B（Ednrb）及びエンドセリン１（ET-1）の発現レベルが良性腫瘍期の20〜50倍、悪性腫瘍期の2〜5倍であった。また、前癌期のときに血漿ET-1レベルの著明な上昇を認めた。悪性腫瘍期のRET-マウスにおいて、肺転移だけでも65％（13/20）という極めて高い比率で認められたのに対して、前癌期のRET-マウスでは、基本的に転移は認められなかった。これらの結果は、黒色腫の発症（悪性転化）を予知するためのバイオマーカーとしてEdnrb及びET-1が有用であることを示唆する。
以上の結果を得た後、RET-マウスをEdnrbノックアウトマウスと交配することによって部分的にEdnrbを発現するRET-マウス（Ednrb(+/-)RET-マウス）とほとんどEdnrbを発現しないRET-マウス（Ednrb(-/-)RET-マウス）を作出した。これらEdnrb発現調節RET-マウスを用い、黒色腫発症におけるEdnrb及びそのリガンドの生物学的意義を検討することにした。その結果、Ednrb(-/-）RET-マウスでは、良性腫瘍を含め、腫瘍の発症は全く認められなかった。一方、Ednrb(+/-）RET-マウスでは良性腫瘍から悪性腫瘍への移行が認められなかった。興味深いことにEdnrb(+/-）RET-マウスでは、RET-マウスと異なり、Ednrb発現レベルの著明な上昇は観察されなかった。これらの結果は、Ednrb/ET-1シグナルが良性腫瘍の形成及び悪性腫瘍への転化に必須であることを示すとともに、悪性黒色腫の予知マーカーとしてEdnrb及びET-1が有用であることを裏付ける。
ここで、RET-癌遺伝子の導入によって甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽細胞腫、耳下腺癌などの様々な癌が誘導される事実（非特許文献２９〜３２）、及び、RET癌遺伝子がヒトの多発性内分泌腺種症2A型(MEN2A: 甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、副甲状腺機能亢進症)、多発性内分泌腺種症2B型(MEN2B: 甲状腺髄様癌、褐色細胞腫、神経節細胞腫、Marfan様体型)、家族性甲状腺髄様癌(FMTC)も誘導する事実（非特許文献５、６、８、１１及び３３）を考慮すれば、以上の各実験結果は、Ednrb及びET-1が発癌予知マーカーとして広範な種類の癌に適用可能であることを示唆する。
本発明は主として以上の成果・知見に基づくものであり、以下の癌予知マーカー及びその用途を提供する。
［１］エンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる発癌予知マーカー。
［２］被験者より採取された検体中における、［１］に記載の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いることを特徴とする、発癌を予知する方法。
［３］以下のステップ（１）〜（３）を含む、［２］に記載の方法、
（１）被験者より採取された検体を用意するステップ、
（２）前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
（３）発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。
［４］前記ステップ（３）において、ステップ（２）で得られた発現量と、対照検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、［３］に記載の方法。
［５］前記ステップ（３）において、ステップ（２）で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性を評価する、［３］に記載の方法。
［６］前記発現量がエンドセリン受容体Bタンパク質発現量、エンドセリン-1タンパク質発現量、エンドセリン受容体B mRNA発現量、及びエンドセリン-1 mRNA発現量からなる群より選択される一以上の発現量である、［２］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記検体が腫瘍組織の一部である、［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記検体が血漿又は血清である、［２］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［９］前記癌が悪性黒色腫、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽腫、耳下腺癌、多発性内分泌腺種症2A型、多発性内分泌腺種症2B型、又は家族性甲状腺髄様癌である、［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］前記癌が悪性黒色腫である、［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１１］抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン-1 mRNAを特異的に増幅する核酸プライマー、エンドセリン受容体B mRNAを特異的に検出する核酸プローブ、又はエンドセリン-1 mRNAを特異的に検出する核酸プローブからなることを特徴とする発癌予知用試薬。
［１２］［１１］に記載の発癌予知用試薬を含む、発癌予知用キット。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（用語）
用語「発癌予知マーカー」とは、癌の発症、即ち腫瘍の悪性転化を事前に知るための指標となる分子のことをいい、癌（又は腫瘍）の発症の指標とされる癌マーカー（又は腫瘍マーカー）とは異なる。発癌の可能性を把握・評価することに「発癌予知マーカー」は使用される。尚、特に言及しない限り、本明細書では癌と悪性腫瘍は同義なものとして扱う。
発癌予知マーカーのmRNA発現量及びタンパク質発現量を包括的に表す表現として用語「発癌予知マーカーの発現量」を使用する。
「発癌を予知する」とは、癌の発症の可能性ないし確率を事前に評価することをいう。評価結果は定性的なものでも定量的なものでもよい。
【０００６】
（本発明の第１の局面）
本発明の第１の局面は発癌予知マーカーに関する。本発明の発癌予知マーカーはエンドセリン受容体B又はエンドセリン-1からなる。ここで、エンドセリン受容体B（GeneID: 1910, Entrez Gene, NCBI）とは、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーに属する分子である。エンドセリン受容体Bとして公共のデータベースに登録されているアミノ酸配列を添付の配列表に配列番号１（DEFINITION: endothelin receptor type B [Homo sapiens]. ACCESSION: AAP32295, Entrez Protein, NCBI）及び配列番号３（DEFINITION: endothelin receptor type B. ACCESSION: AAA52342, Entrez Protein, NCBI）で示す。また、配列番号１のアミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号２（DEFINITION: Homo sapiens endothelin receptor type B (EDNRB) mRNA, complete cds. ACCESSION: AY275463, Entrez Nucleotide, NCBI）で、配列番号３のアミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号４（DEFINITION: Homo sapiens endothelin receptor type B (EDNRB) mRNA, complete cds. ACCESSION: L06623, Entrez Nucleotide, NCBI）でそれぞれ示す。
一方、エンドセリン-1（GeneID: 1906, Entrez Gene, NCBI）とは、エンドセリン受容体Bのリガンドの一つである。添付の配列表において、エンドセリン-1のアミノ酸配列を配列番号５（DEFINITION: endothelin 1 [Homo sapiens]. ACCESSION: NP_001946, Entrez Protein, NCBI）で示し、当該アミノ酸配列に対応するmRNAの配列を配列番号６（DEFINITION: Homo sapiens endothelin 1 (EDN1), mRNA. ACCESSION: NM_001955, Entrez Nucleotide, NCBI）で示す。
【０００７】
後述の通り、疾患モデルマウスを用いた実験において、良性腫瘍期と悪性腫瘍期の中間である前癌期（移行期）にエンドセリン受容体Bの発現量とエンドセリン-1の発現量の急激な亢進が認められた。この事実より、エンドセリン受容体Bの発現量及びエンドセリン-1の発現量を調べれば、良性腫瘍期から悪性腫瘍期への移行（即ち発癌）を事前に把握することが可能といえる。このようにエンドセリン受容体B及びエンドセリン-1は、発癌を予知するための指標として有用である。
【０００８】
本発明の発癌予知マーカーによって発癌の可能性（リスク）が評価され得る癌の種類は特に限定されない。ここでの癌として、悪性黒色腫(メラノーマ)、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、食道癌、口腔癌、上顎癌、喉頭癌、咽頭癌、胃癌、十二指腸癌、大腸癌、肝細胞癌、胆管細胞癌、肺癌、前立腺癌、腎癌、膀胱乳頭癌、前立腺癌、尿道扁平上皮癌、骨肉腫、軟骨肉腫、滑液膜肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、多発性骨髄腫、扁平上皮癌、神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、乳房肉腫、子宮上皮内癌、子宮頸部扁平上皮癌、子宮腺癌、子宮肉腫、卵巣癌、甲状乳頭腺癌、甲状腺濾胞癌、急性骨髄性白血病、急性前髄性白血病、急性骨髄性単球白血病、急性単球性白血病、急性リンパ性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、及び成人型Ｔ細胞白血病を例示することができる。本発明の発癌予知マーカーは、好ましくは悪性黒色腫、甲状腺癌、乳癌、悪性リンパ腫、神経芽腫、耳下腺癌、多発性内分泌腺種症2A型、多発性内分泌腺種症2B型、又は家族性甲状腺髄様癌の発症の可能性評価に利用され、更に好ましくは悪性黒色腫の発症の可能性評価に利用される。
【０００９】
（本発明の第２の局面）
本発明の第２の局面は、発癌を予知する方法（以下、「発癌予知法」ともいう）に関する。本発明の発癌予知法では、被験者より採取された検体中における発癌予知マーカーの発現量が評価の指標として用いられる。このように、被験者由来の検体中の発癌予知マーカーの発現量を指標として用いる点が本発明の発癌予知法の最大の特徴である。
【００１０】
本発明の発癌予知法では以下のステップを実施する。
（１）被験者より採取された検体を用意するステップ、
（２）前記検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べるステップ、及び
（３）発癌予知マーカーの発現量に基づき発癌の可能性を評価するステップ。
【００１１】
ステップ（１）では、被験者より採取された検体を用意する。検体としては、被験者の腫瘍組織を構成する細胞、血液、血漿、血清、尿、汗、唾液等が用いられる。好ましくは腫瘍組織を構成する細胞（即ち、腫瘍組織の一部）又は血漿若しくは血清を検体とする。腫瘍組織を構成する細胞は、生検組織診（バイオプシー）又は細胞診を行う際の要領で採取すればよい。腫瘍組織を構成する細胞は、通常、生体で存在していた状態、即ち周囲の各種の細胞や間質結合組織と結合した状態（即ち組織片として）で採取された後、本発明の発癌予知法に供される。血漿又は血清についても、常法で調製した後、本発明の発癌予知法に供すればよい。血漿及び血清は調製が容易であり、調製に伴う被験者への負担も小さいという利点を有する。現在、血漿又は血清は様々な検査法の検体として利用されている。従って、他の検査法と同時に本発明の発癌予知法が実施されることを想定した場合、血漿又は血清を検体とすれば本発明の実施のために改めて検体を調製しなくてもよくなる。このように血漿又は血清を検体とすれば被験者及び検査に携わる者の負担が軽減し、同時に検査時間の短縮化も図られる。
【００１２】
被験者は特に限定されない。即ち、発癌の可能性があるか否か（又は可能性がどの程度か）の判定が必要な者に対して広く本発明を適用することができる。健康診断の一項目として本発明を実施することにしてもよい。
悪性転化前の腫瘍が認められた患者に対して本発明の発癌予知法を適用すれば、発癌の徴候を事前に把握でき、適切な治療法の選択及びそれに伴う患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）向上が可能となる。一方、癌治療後の患者に対して本発明を適用すれば、癌の再発や転移の兆候を事前に把握することが可能である。このように、癌治療後の再発を防ぐ目的に本発明を利用することもできる。
【００１３】
ステップ（２）では、検体中の発癌予知マーカーの発現量を調べる。本明細書では、発癌予知マーカーの発現の有無を調べることも含む包括的な表現として「発癌予知マーカーの発現量を調べる」を使用する。尚、発癌予知マーカーとして、エンドセリン受容体Bとエンドセリン-1の両者を併用してもよい。
発癌予知マーカーの発現量を厳密に定量することは必須でない。即ち、後続のステップ（３）において発癌の予知が評価可能となる程度に発癌予知マーカーの発現量を測定できればよい。
【００１４】
発現量としてタンパク質発現量を調べる場合、これに限定されるものではないが、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法及び免疫組織化学（免疫染色）等の免疫学的手法を利用するとよい。免疫組織化学によれば、細胞の形態や分布状態なども調べることができ、付加的な情報が同時に得られる。免疫組織化学は例えばABC（Avidin-Biotin Complex）法、PAP（Peroxydase-anti-Peroxydase Complex）法、LAB（Linked Avidin-Biotin）法、LSAB(Linked Streptavidin-Biotin)法等で行うことができる。これらの各方法についての標準的なプロコールは周知である（例えば、「酵素抗体法、改訂第３版」、渡辺慶一、中根一穂編集、学際企画を参照）。
免疫学的手法では発癌予知マーカーを特異的に認識する抗体（抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン１−抗体）が使用され、当該抗体の結合性（結合量）を指標として発癌予知マーカーの発現量が調べられる。尚、文献「Lahav R, Suva ML, Rimoldi D, Patterson PH, Stamenkovic I. Endothelin receptor B inhibition triggers apoptosis and enhances angiogenesis in melanomas. Cancer Res. 2004;64(24):8945-53.」には抗エンドセリン受容体B抗体を使用したウエスタンブロット法の記述があり参考となる。同様に、文献「Abdel-Naser MB, El-Khateeb EA, Sallam TH, Habib MA. Endothelin-1 is significantly elevated in plasma of patients with vitiligo treated with psoralen plus ultraviolet A. Clin Exp Dermatol. 2006;31(4):571-5.」には抗エンドセリン-1抗体を使用したELISA法の記述があり参考となる。
【００１５】
免疫学的手法に使用する抗体の種類や由来などは特に限定されない。好ましくはモノクローナル抗体を使用するが、十分な特異性で発癌予知マーカーを検出可能である限り、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）又はポリクローナル抗体を使用することもできる。Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片を使用することにしてもよい。
市販の抗体を使用しても或いは免疫学的手法、ファージディスプレイ法、リボソームディスプレイ法などを利用して新たに調製したものを使用することにしてもよい。尚、抗エンドセリン受容体B抗体としてGSNSSLMRFRTAEVC（配列番号１５）をエピトープとした抗体（AbCam Limited社）、C末端をエピトープとした抗体（American Research Products社）等が市販されており、抗エンドセリン-1抗体としてa.a.8-16をエピトープとした抗体（AbCam Limited社）やBiogenesis社の抗体等が市販されている。
【００１６】
発現量としてmRNA発現量を調べることにしてもよく、この場合のmRNAの検出／測定にはRT-PCR（Molecular Cloning, Third Edition,8.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ノザンブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.42,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、ドットブロット法（Molecular Cloning, Third Edition,7.46,Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）、DNAチップ（DNAアレイ）を用いた方法、in situハイブリダイゼーションなどを利用できる。
当業者であれば、エンドセリン受容体BのmRNAの配列（配列番号２、配列番号４）、エンドセリン-1のmRNAの配列（配列番号６）を基に各方法に適した核酸プライマー又は核酸プローブを常法で設計することができる。以下、エンドセリン受容体BのmRNAをRT-PCRで検出する際に使用可能なプライマーの例を示す。尚、文献「S. Yokoyama et al., FEBS Journal 273(2006)1805-1820及びM. Tsutsumi et al., Gene 228(1999)43-49」には、エンドセリン受容体BのmRNAをRT-PCRで検出する際に使用したプライマーが記載されており参考になる。
（エンドセリン受容体B）
フォワードプライマー：aga gga ctg gcc att tg（配列番号７）
リバースプライマー：act cca aga agc aac agc（配列番号８）
（エンドセリン-1）
フォワードプライマー：tac ttc tgc cac ctg gac（配列番号９）
リバースプライマー：tga gtt ctt ttc ctg ctt g（配列番号１０）
【００１７】
ステップ（３）では、ステップ（２）の結果（発癌予知マーカーの発現量）に基づいて発癌の可能性（リスク）を評価する。例えば、ステップ（２）で得られた発現量を対照検体（コントロール）中に認められた発現量と比較し、その結果より発癌の可能性を評価する。
【００１８】
腫瘍を構成する細胞を検体とする場合の陰性対照検体（ネガティブコントロール）には正常細胞や良性腫瘍期の細胞を用いることができる。また、陽性対照検体（ポジティブコントロール）には前癌期の腫瘍細胞を好適に用いることができる。尚、これら対照の細胞は被験者自身由来であっても、他の者由来であってもよい。
血漿又は血清を検体とする場合の陰性対照検体には、癌を罹患していない者の血漿又は血清が好適に用いられる。ここでの「癌を罹患していない者」は典型的には健常者であるが、良性腫瘍を保有する患者もこれに該当する。癌を発症していない状態にある被験者自身から調製した血漿又は血清を陰性対照検体として用いてもよい。この場合、ステップ（２）で得られた発現量と、癌を発症していない状態のときに同一の被験者より採取された検体中に認められた発癌予知マーカーの発現量とを比較し、その結果より発癌の可能性が評価されることになる。ここでの「癌を発症していない状態」には、腫瘍を全く発症していない状態と良性腫瘍を発症している状態が含まれる。また、「腫瘍を全く発症していないとき」には、治療（典型的には腫瘍組織の切除）によって腫瘍の存在が認められなくなった状態が含まれる。一方、陽性対照検体には前癌期の腫瘍を保有する患者の血漿又は血清を用いることができる。尚、血漿又は血清以外の体液を検体とする場合の陰性対照検体及び陽性対照検体については、血漿又は血清を検体とする場合と同様である。
【００１９】
以下、ステップ（３）における評価の手順の一例を示す。まず、発癌予知マーカーの発現量と、発癌の可能性の程度が関連付けられた複数の評価区分を設定しておく。そして、ステップ（２）で得られた発癌予知マーカーの発現量に基づき、検体が該当する評価区分を決定する。評価区分の設定に関する具体例として、発癌予知マーカーとしてエンドセリン受容体Bタンパク質を用い、検体として腫瘍組織の一部を用いた例（例１）、発癌予知マーカーとしてエンドセリン-1 mRNAを用い、検体として腫瘍組織の一部を用いた例（例２）、発癌予知マーカーとしてエンドセリン-1タンパク質を用い、検体として血漿を用いた例（例３）を以下に示す。尚、区分名：当該区分に関連付けられる発癌予知マーカーの発現量：当該区分に関連付けられる評価結果の順で記載する。
＜例１＞
区分１：検体（腫瘍組織）にエンドセリン受容体Bタンパク質の弱い発現を認める：将来の発癌の可能性は低い
区分２：検体（腫瘍組織）にエンドセリン受容体Bタンパク質の中程度の発現を認める：将来の発癌の可能性がある
区分３：検体（腫瘍組織）にエンドセリン受容体Bタンパク質の強い発現を認める：将来の発癌の可能性が高い
【００２０】
＜例２＞
区分１：検体（腫瘍組織）中のエンドセリン-1の転写レベルが、陰性対照検体中のエンドセリン-1の転写レベルの３倍未満：将来の発癌の可能性が低い
区分２：検体（腫瘍組織）中のエンドセリン-1の転写レベルが、陰性対照検体中のエンドセリン-1の転写レベルの３倍以上：将来の発癌の可能性が高い
【００２１】
＜例３＞
区分１：検体（血漿）中のエンドセリン-1タンパク質量が、陰性対照検体中のエンドセリン-1タンパク質量の１．５倍未満：将来の発癌の可能性が低い
区分２：検体（血漿）中のエンドセリン-1タンパク質量が、陰性対照検体中のエンドセリン-1タンパク質量の１．５倍以上：将来の発癌の可能性が高い
【００２２】
評価区分の数、及び各評価区分に関連付けられる発癌予知マーカーの発現量及び評価結果はいずれも上記の例に何らとらわれることなく、予備実験等を通して任意に設定することができる。
【００２３】
本発明の一態様では、ある時点で測定された発癌予知マーカーの発現量と、以前に同一の被験者より採取された検体中の発癌予知マーカーの発現量とを比較し、発現量の増減の有無及び／又は増減の程度を調べる。その結果得られたデータ（発癌予知マーカーの発現量の変化に関するデータ）は腫瘍の進展をモニターするために有用な情報となる。即ち、発現量の増加が認められたという結果に基づいて、例えば、前回の検査から今回の検査までの間に腫瘍が進展したとの判定、又は前回の検査から今回の検査までの間に発癌の可能性（リスク）が高まったとの判定、を行うことができる。他方、発現量の減少が認められたという結果に基づいて、例えば、前回の検査から今回の検査までの間に腫瘍の改善が認められるとの判定、又は前回の検査から今回の検査までの間に発癌の可能性（リスク）が低下したとの判定、を行うことができる。また、発現量の変化が認められなかったという結果に基づいて、例えば、前回の検査から今回の検査までの間に腫瘍の進展は認められないとの判定、又は前回の検査から今回の検査までの間に発癌の可能性（リスク）の変化はないとの判定、を行うことができる。
上記のごとき評価を癌治療と並行して行えば、治療効果の確認が行えることはもとより、癌の再発の兆候を事前に把握することができる。これによって、より適切な治療方針の決定が可能となる。このように本発明は、治療効果の最大化及び患者のＱＯＬ（生活の質）向上に多大な貢献をする。
【００２４】
（本発明の第３の局面）
本発明の第３の局面は、本発明の発癌予知法に用いられる試薬（発癌予知用試薬）及びキット（発癌予知用キット）に関する。本発明の試薬の一態様は、免疫学的手法で発癌予知法を実施する際に使用される試薬であり、発癌予知マーカーに特異的結合性を示す物質からなる。当該試薬の好適な例は抗発癌予知マーカー抗体（抗エンドセリン受容体B抗体、抗エンドセリン-1抗体）であるが、これに限られるものではない。抗発癌予知マーカー抗体の調製法ないし入手法については、上記の免疫学的手法についての説明の欄に記載した通りである。尚、ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体（数種〜数十種の抗体の混合物）、及びモノクローナル抗体のいずれでもよく、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。標識化などの修飾が施されている抗体であってもよい。
【００２５】
本発明の試薬の他の態様は、発癌予知マーカーのmRNA発現量の検出／測定を伴う発癌予知法を実施する際に使用される核酸プライマー又は核酸プローブである。核酸プライマー及び核酸プローブは、採用する検出法／測定法に適合するよう、発癌予知マーカーのmRNAの配列に基づき設計すればよい（上記のmRNAの検出法／測定法についての説明の欄を参照）。尚、核酸プライマー及び核酸プローブは増幅対象又は検出対象に特異的である限りその具体的な配列は特に限定されない。標識化などの修飾が施されていても良い。
【００２６】
本発明のキット（発癌予知用キット）は上記試薬（発癌予知用試薬）を含む。本発明のキットを用いることによって、本発明の発癌予知法をより簡便に且つより短時間で実施することが可能となる。
免疫学的手法で発癌予知法を実施するために使用されるキットには、例えば、標識化抗発癌予知マーカー抗体が含まれることになる。当該キットによれば抗発癌予知マーカー抗体の結合量を直接検出することができる。一方、未標識の抗発癌予知マーカー抗体と二次抗体（標識二次抗体）を組み合わせれば、間接的検出によって結果を得るキットが構築される。本発明のキットに発癌予知マーカータンパク質（抗原）を更に含めることにしてもよい。発癌予知マーカータンパク質は検量線の作成や、キットを使用して得られた染色性が抗発癌予知マーカー抗体と発癌予知マーカータンパク質との特異的結合に基づくものであることを確認するために使用される。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫学的操作を実施する上で必要な一以上の試薬（例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など）や器具などを更に含めてもよい。
【００２７】
一方、発癌予知マーカーのmRNA発現量の検出／測定を伴う発癌予知法を実施する際に使用されるキットの場合、発癌予知マーカーのmRNA特異的な核酸プライマー及び／又は核酸プローブが含まれることになる。この場合においても、各反応の実施に必要な一以上の試薬（逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、dNTP、各種バッファー等）や器具等をキットに含めることができる。
尚、本発明のキットには通常、使用説明書が添付される。
【実施例】
【００２８】
１．材料と方法
（１）マウス
以前の報告（参考文献２、９、１０）の通り、基本的にはC57BL/6の遺伝的背景をもつmetallothionein-I/RFP-RETトランスジェニックマウス（304/B6系統、RET-マウス）は段階的に皮膚黒色症、良性メラノサイト系腫瘍、及び悪性黒色腫を発症する。一方、Hosodaらはエンドセリン受容体B（Ednrb）欠損マウスを作製した（参考文献１８）。また、Ednrbホモ欠損型マウスでは、ヒトドーパミンβヒドロキシダーゼ（DβH）プロモーターによって誘導されたEdnrbの遺伝子導入によってHirschsprung病の発症が抑制されることが示されている（参考文献２９）。本研究ではまず、Ednrbヘテロ欠損型マウス（Ednrb(+/-)-マウス）とEdnrbホモ欠損型マウス（Ednrb(-/-)-マウス）を用意した（いずれのマウスも原則としてC57BL/6の遺伝的背景をもつ）。次にEdnrb(+/-)-マウスとEdnrb(-/-)-マウスをそれぞれRET-マウスと交配し、部分的にEdnrbを発現するRET-マウス（Ednrb(+/-)RET-マウス）とほとんどEdnrbを発現しないRET-マウス（Ednrb(-/-)RET-マウス）を新たに作出した。実験に使用したマウスは毎日観察することにした。中部大学の動物実験委員会（受理番号18001）及び組換えDNA実験安全委員会（受理番号06-01）の承認の下、本研究は行われた。
【００２９】
（２）リアルタイムPCR
High Pure RNA Isolation Kit（ロッシュ・ダイアグノスティクス）を用いて凍結腫瘍試料及び凍結皮膚試料より全RNAを調製した。操作方法は添付のプロトコールに従った。SupercriptTMIII reverse transcriptase（インビトロジェン。RT enzyme mix、RT reaction mixを含む）を用いて全RNAを逆転写し、cDNAを得た。操作方法は添付のプロトコール通りとした。
SupercriptTMIII（インビトロジェン）Platinum SYBR Green PCR master mixを用い、ABI Prism7700 sequence detection system（パーキン・エルマー）内でリアルタイム定量RT-PCRを行った（参考文献３０）。定量RT-PCR（リアルタイムPCR）で測定した、RFP-RET、Ednrb及びET-1の各転写産物の発現レベルは、β-アクチンの発現レベルをコントロールとして調整した。以下、使用したプライマーを示す。
(a)Ednrb用プライマー（マウスEdnrbとヒトEdnrbに共通する）
フォワードプライマー（増幅産物130bp）：aga gga ctg gcc att tg（配列番号７）
リバースプライマー（増幅産物130bp）：act cca aga agc aac agc（配列番号８）
(b)ET-1用プライマー（マウスEdnrbとヒトEdnrbに共通する）
フォワードプライマー（増幅産物196bp）：tac ttc tgc cac ctg gac（配列番号９）
リバースプライマー（増幅産物196bp）：tga gtt ctt ttc ctg ctt g（配列番号１０）
(c)ET-3用プライマー
フォワードプライマー（増幅産物217bp）：tct act att gcc acc tgg a（配列番号１１）
リバースプライマー（増幅産物217bp）：gtg aca tct ctg gtg cg（配列番号１２）
(d)RFP-RET用プライマー
フォワードプライマー（増幅産物139bp）：tga cgg aga gtc taa agc ag（配列番号１３）
リバースプライマー（増幅産物139bp）：gct tta atc ccc cgg ggc（配列番号１４）
【００３０】
（３）ウエスタンブロット
以前に報告した方法（参考文献１１）に従い免疫ブロットを行った。ライセート（細胞溶解物）をSDS-ポリアクリルアミドゲル（10%）電気泳動（SDS-PAGE）に供し、泳動終了後、PDVF（polyvinylidene difluoride）膜に転写した。一次抗体及び二次抗体との反応の後、ウエスタンブロット用化学ルミネセンス試薬で反応性を調べた。抗RET抗体はIBL（藤岡市、日本）より、抗Ednrb抗体はCalbiochem（Darmstadt、ドイツ）よりそれぞれ購入した。
【００３１】
（４）試料の採取、及び血漿ET-1レベルの評価
EDTAを使用して血液サンプルを採取した後、プロテアーゼ阻害剤のアプロチニンを添加した（0.6 TIU/ml）。その後、直ちに氷上に移し、1,600 g、15分、4℃の条件下で遠心処理した。上清（血漿）を採取した後、液体窒素で速やかに凍結し、-80℃で保存した。血漿の採取から一月以内に、競合酵素免疫アッセイキット（Phoenix Pharmaceuticals）を用い、添付のプロトコールに従い、血漿ET-1濃度を測定した。全ての試料及びコントロールについて２回の測定を実施し、平均値を算出した。
【００３２】
（５）統計解析
RET-マウスの各腫瘍期の腫瘍における、核／細胞質（N/C）比率（図１Ｈ）の差、核のサイズ（図１Ｉ）の差、及び分裂期の細胞数（図１Ｊ）の差をKruskal-Wallisテストで統計解析した。各種マウスの皮膚Ednrb発現レベルの統計解析もKruskal-Wallisテストで行った（図４Ａ）。RET-マウスとEdnrb(+/-）RET-マウスの前癌期の腫瘍における、RFP-RET発現レベル（図５Ｂ）の差、Ednrb発現レベル（図５Ｄ）の差、ET-1発現レベル（図５Ｆ）の差をMann-Whitney Uテストで統計解析した。RET-マウス、Ednrb(+/-）RET-マウス及びEdnrb(-/-）RET-マウスにおける腫瘍サイズの差を月毎にMann-Whitney Uテストで統計解析した。RET-マウス、Ednrb(+/-）RET-マウス及びEdnrb(-/-）RET-マウスにおける生後18ヶ月以内の良性腫瘍、前癌期の腫瘍、悪性腫瘍の発症数の差をχ2テストで統計解析した（図４Ｄ）。
【００３３】
２．結果
（１）RET-マウスの黒色腫形成過程における各ステージの定義（病理学的所見に基づく）
最近、ヒトの様々な癌について、良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な組織病理学的特徴を示す腫瘍が報告されている（参考文献３１〜３６）。良性メラノサイト系腫瘍と悪性黒色腫の特徴に関するこれまでの報告（参考文献１０、１１、１３、１４）を精査し、RET-マウスにおける、良性メラノサイト系腫瘍と悪性黒色腫の中間的な特徴を有する前癌腫瘍を以下の通り定義した。
RET-マウスの良性腫瘍期の腫瘍（腫瘍サイズ：＜1,500mm3）は、肉眼的所見でヒト良性メラノサイト系腫瘍に類似し（図１Ａ、Ｂ）、組織病理学的所見によれば正常な円形の核を有する円形の細胞から構成されており、転移能を有しない（図１Ｅ）。潰瘍及び痂皮を有する悪性腫瘍期の腫瘍（腫瘍サイズ：＞8,000mm3）の肉眼的所見を図１Ａ及びＤに示す。組織病理学的所見では、悪性腫瘍期の腫瘍は異型細胞から構成されており、核の大きさは様々である（図１Ｇ）。この腫瘍では細胞分裂が盛んであり、異型分裂も観察される（図１Ｇ）。これらの特徴は、既報（参考文献２、１０）のヒト悪性黒色腫の特徴に類似する。前癌期の腫瘍（腫瘍サイズ：1,500mm3〜8,000mm3）は良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な肉眼的所見を示す（図１Ａ、Ｃ、Ｆ）。前癌期の腫瘍では表面に潰瘍や痂皮は認めない。このことは腫瘍の増殖速度が潰瘍形成に至る程は速くないことを示唆する。組織病理学的所見では、前癌期の腫瘍は正常な円形の核を有する円形の細胞と、核の大きさに変化を認める異型細胞から構成される（図１Ｆ）。更なる組織病理学的検討の結果、前癌期の腫瘍では細胞核−細胞質（N/C）比率（図１Ｈ）及び細胞核の大きさ（図１Ｉ）が統計的に良性腫瘍と悪性腫瘍の中間的な値を示すことが明らかとなった。前癌期の腫瘍においても分裂期の細胞はいくつか観察されるものの、異型分裂は認められなかった（図１Ｊ）。良性腫瘍期の腫瘍（n=30）及び前癌期の腫瘍（n=18）のいずれにおいても基本的に転移は認められない。一方、悪性腫瘍期の腫瘍（n=20）では肺への転移（65%）が認められた。
以上のように、RET-マウスでは、未腫瘍期、良性腫瘍期、前癌期及び悪性腫瘍期からなる、黒色腫形成の全過程を解析することが可能である（図１Ａ）。黒色腫を移植した動物モデルを利用した解析方法や、ヒトでの母斑と黒色腫の比較研究によっては、このような解析は不可能である。
【００３４】
（２）RET-マウスの前癌期の腫瘍におけるRFP-RET発現レベル及びEdnrb発現レベルの亢進
次に、悪性黒色腫の進展に対する癌遺伝子RET（RFP-RET）及びEdnrbの影響を調べた。その結果、前癌期の腫瘍ではRFP-RETの転写レベル（図２Ａ）及びタンパク質発現レベル（図２Ｂ）は良性腫瘍期よりも３〜１０倍上昇していた。一方、悪性腫瘍期の初期では良性腫瘍期よりも２〜５倍の上昇を認めた（図２Ａ、Ｂ）。悪性腫瘍期の後期にはこれら両レベルの低下を認めた（図２Ａ、Ｂ）。
興味深いことに、前癌期の腫瘍におけるEdnrb転写産物の発現レベルは良性腫瘍期の腫瘍に比較して２０〜５０倍高く、悪性腫瘍期の初期の腫瘍と比較しても２〜５倍高い（図２Ｃ）。しかしながら、悪性腫瘍期の後期の腫瘍におけるEdnrbの転写レベルは良性腫瘍期の腫瘍のそれよりも低い。この転写レベルのダイナミクス（変化）は、Ednrbタンパク質の発現レベル解析によって検証された（図２Ｄ）。これらの結果は、RET-マウスにおいて、RFP-RET及びEdnrbの発現レベルの上昇が前癌期から悪性腫瘍期への移行に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００３５】
（３）RET-マウスの前癌期におけるET-1発現レベルの亢進
次に、悪性黒色腫の進展に対するEdnrbリガンドの影響を調べた。良性腫瘍と比較して、前癌期の腫瘍ではET-1の転写レベルが20〜50倍であった。また、悪性腫瘍期の初期においても良性腫瘍期に比較して３〜１０倍の転写レベルの上昇を認めた（図３Ａ）。一方、RET-マウスでは腫瘍形成の全過程を通してET-3の転写産物の発現は認められなかった（データ示さず）。Ednrbの転写レベルの上昇を示したこと（図２Ｃ、Ｄ）と合わせて考えると、Ednrb/ET-3シグナルではなくEdnrb/ET-1シグナルが、前癌期から悪性腫瘍期への移行に重要な役割を果たしていることが示唆される。
続いて、前癌期の腫瘍におけるET-1の転写レベルの上昇が血漿中のET-1タンパク質発現レベルに反映されるか否かを検討した。図３Ｂに示す通り、前癌期の血漿ET-1レベルは、良性腫瘍期と比較して有意な上昇を示した。良性腫瘍の存在の如何に拘わらず、コントロールマウス（C57BL/6）とRET-マウスとの間で血漿ET-1レベルに実質的な差異はなかった（データ示さず）。悪性腫瘍期の血漿ET-1レベルは、良性腫瘍期に比較すれば高いものの、前癌期よりも低い。腫瘍形成の全過程を通して血漿ET-1タンパク質レベルの変化は腫瘍内のET-1転写レベルの変化に呼応しており（図３Ａ）、腫瘍においてET-1の産生が亢進した結果として血漿ET-1レベルが上昇したと考えられる。以上の結果は、ELISAで測定可能な血漿ET-1レベルに基づいて、近い将来起きるであろう悪性黒色腫への転化を予知できる可能性を示す。
【００３６】
（４）癌遺伝子RETが関与する良性腫瘍の形成及び悪性転化に必須な分子としてのEdnrb
黒色腫の形成過程におけるEdnrbの役割を更に検討するため、Ednrbの発現を部分的に欠失させたRET-マウス（Ednrb(+/-）RET-マウス)と、完全に欠失させたRET-マウス（Ednrb(-/-）RET-マウス)を作出した。Ednrb(+/-）マウス及びEdnrb(+/-）RET-マウスでは、皮膚でのEdnrb発現レベルがRET-マウスの約半分であった（図４Ａ）。一方、Ednrb(-/-）マウス及びEdnrb(-/-）RET-マウスでは、Ednrbの発現はほとんど認められなかった（図４Ａ）。この結果は、Ednrb(-/-）マウス及びEdnrb(-/-）RET-マウスの皮膚の病態へのDβH/Ednrb導入遺伝子の関与は、過去の報告（参考文献２９）通り、限定的であることを示唆する。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは良性腫瘍すら形成されなかったことから（図４Ｃ、Ｄ）、黒色腫の形成過程における腫瘍の発生（開始）においてEdnrbの発現が必須であると示唆された。一方、Ednrb(+/-)RET-マウスの2/3では良性腫瘍すら形成されなかった（図４Ｄ）。また、Ednrb(+/-)RET-マウスにおいては腫瘍の進展も顕著に抑制された（図４Ｂ）。更に重要なのは、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、良性腫瘍期又は前癌期を認めたものの、悪性黒色腫が形成されなかったことである。
前癌期から悪性腫瘍期への移行に関してさらに解析を進めるため、RFP-RET、ET-1及びEdnrbの発現レベルをRET-マウスとEdnrb(+/-）RET-マウスの間で比較することにした。Ednrb(+/-）RET-マウスの前癌期腫瘍でのRFP-RET発現レベルはRET-マウスに比較して高かった（図５Ａ、Ｂ）。一方、両群の間にET-1発現レベルの差はなかった（図５Ｅ、Ｆ）。興味深いことに、Ednrb(+/-）RET-マウスの前癌期腫瘍では、RET-マウスの前癌期腫瘍に比べ、Ednrb発現レベルの有意な抑制が認められた（図５Ｃ、Ｄ）。これらの結果は、Ednrbの発現が高度に亢進することが、良性腫瘍期から悪性腫瘍期への移行に重要であることを示す。
【００３７】
３．考察
本研究では、まず、RET-マウスでの黒色腫形成過程における前癌期のメラノサイト系腫瘍を定義した。次に、RET-マウスの前癌期では、腫瘍内及び血漿中のEdnrb/ET-1発現レベルが劇的に上昇することを示した。最後に、新たに作出したEdnrb抑制RET-マウスを用いて、Ednrbが良性腫瘍の形成及び悪性腫瘍への転化に必須であることを示した。
様々な癌モデルマウスにおいて前癌状態が認められている（参考文献３７〜４０）。本研究では、肉眼的観察（図１Ａ〜Ｄ）及び病理組織学的所見（図１Ｅ〜Ｊ）に基づき、RET-マウスの前癌期の腫瘍を定義した。ヒトでは、色素細胞性メラノサイト系母斑（dysplastic melanocytic nevi）は、母斑細胞と黒色腫の中間的な病理組織学的特徴を持つので黒色腫の前癌期と考えられている（参考文献３５、４１〜４３）。従って、RET-マウスにおいても良性メラノサイト系腫瘍（図１Ａ、Ｂ、Ｅ）が前癌期（図１Ａ、Ｃ、Ｆ）を経て黒色腫（図１Ａ、Ｄ、Ｇ）へ転化することは妥当といえよう。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは、Ednrbの発現はほとんど検出されず（図４Ａ）、良性腫瘍すら形成されない（図４Ｃ、Ｄ）。RET-マウスでは、前癌期及び悪性腫瘍期の腫瘍に比較して、良性腫瘍期の腫瘍におけるEdnrb発現レベルは遙かに低い（図２Ｃ、Ｄ）。これらの結果より、Ednrbの低レベルでの発現上昇が良性腫瘍形成の開始に必要と思われる。また、悪性腫瘍期の初期では依然としてEdnrbの発現レベルは高い（図２Ｃ、Ｄ）。しかしながら、悪性腫瘍期の後期にはEdnrbの発現レベルが低下する（図２Ｃ、Ｄ）。ステージ依存的なこのような発現レベルの変化のために、過去の研究（参考文献２２、２３、２６、２７）においてEdnrbの発現レベルに差が観察された可能性がある。一方、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、皮膚でのEdnrb発現レベルがRET-マウスの約半分であり（図４Ａ）、前癌期から悪性腫瘍期への移行は認められなかった（図４Ｄ）。RET-マウスでは、前癌期の腫瘍におけるEdnrb及びET-1の発現レベルは良性腫瘍期又は悪性腫瘍期の腫瘍に比較して格段に高い（図２Ｃ、Ｄ及び図３Ａ）。また、Ednrb(+/-)RET-マウスでは、RET-マウスの前癌期に観察されたようなEdnrbの発現レベルの顕著な上昇は観察されなかった（図５Ｃ、Ｄ）。これらの結果より、RET-マウスにおいて、良性腫瘍の形成開始には比較的低いレベルのEdnrbの発現が必要であり、一方で悪性腫瘍への転化には比較的高いレベルのEdnrbの発現が要求されるといえる。
最近、我々はRET-マウスの黒色腫に対する予防療法として、漢方薬及び分子標的免疫療法を組み合わせることを提案した（参考文献２、１１、４４〜４７）。これまでの検討ではRET-マウスの黒色腫を予防するためには、c-Kit分子標的療法が最も効果的であった（参考文献１１）。それでも、c-Kitの機能欠損を伴うRET-マウスの約15%に良性腫瘍、同5%に悪性黒色腫が形成された（参考文献１１）。本研究によって、Ednrbの発現レベルが極めて低いRET-マウス（Ednrb(-/-)RET-マウス）では良性腫瘍さえ全く形成されないことが明らかとなった（図４Ｃ、Ｄ）。これらの結果より、RET-マウスにおける悪性黒色腫の発症を予防するための標的分子としてEdnrbは、c-Kitよりもさらに効果的であるといえる。
Ednrb(-/-)RET-マウスでは良性腫瘍さえ全く形成されなかった理由として、このマウスにおいて、Ednrbが関与するメラニン細胞の増殖及び遊走（参考文献１８、４８）が大幅に阻害された可能性が考えられる。しかしながら、Ednrbが関与するメラニン細胞の増殖及び遊走は基本的に阻害されていないEdnrbが部分的に欠損したRET-マウス（Ednrb(+/-)RET-マウス）においてもなおメラノサイト系腫瘍の発症及び進展は明らかに抑制された（図４Ｂ、Ｄ）。これらの結果は、Ednrbは単にメラニン細胞の増殖及び遊走の修飾のみではなく、メラノサイト系腫瘍の発症機構そのものに深く関わっている可能性を示している。Ednrb(+/-)RET-マウスでは前癌期から悪性期への形質転換が抑制された。その一方で、Ednrb(+/-)RET-マウスの前癌期の腫瘍では、RET-マウスの前癌期の腫瘍よりもRFP-RET癌遺伝子の発現レベルが高かった（図４Ｂ，Ｄ、図５Ａ，Ｂ）。これらの結果は、Ednrbが介在するシグナル伝達経路が、RET依存的悪性黒色腫の発症・進展に関わるシグナル経路の下流に位置することを示唆する。今後、RETとEdnrb/ET-1のクロストークの分子的機序に関し、更なる検討が必要であろう。
図３Ｂに示すように、前癌期のRET-マウスにおいて血漿ET-1レベルの上昇を認めた。様々な種類の癌が既に発症した患者において、血漿／血清ET-1レベルが上昇することが報告されている（参考文献４９〜５２）。また、肺癌患者又は結腸直腸癌患者の血漿／血清ET-1レベルが、癌を発症した患者の予後を知るための診断マーカーとして有用であるとの提案がなされた（参考文献４９、５１、５２）。しかし、本研究では、これ迄の報告とは異なり、癌発症後ではなく癌の発症前の段階で悪性転化を予知するための指標として血漿ET-1レベルの上昇が有用であるとの知見が得られた（図３Ｂ）。Ednrb/ET-1発現レベルの変化に関する実験結果（図２Ｃ，Ｄ、図３Ａ）を合わせて考えれば、前癌期の腫瘍におけるEdnrb/ET-1の発現レベルの上昇は、病理学者にとって悪性黒色腫の発症を予知するための有益な情報（バイオマーカー）になるであろう。血漿中又は腫瘍内のET-1レベルをバイオマーカーとして前癌期の患者を選抜すれば、多くの患者の癌の発症を予知し、適切な治療を早期に行うことができ、もって発癌を未然に防止できるであろう。
以上をまとめると、本研究によって、悪性黒色腫の進展過程へのEdnrb/ET-1の関与が示された。また、黒色腫の発症を前癌期に予知するためのバイオマーカーとしてEdnrb/ET-1が有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の発癌予知マーカーは発癌の可能性（リスク）を事前に把握することを可能にする。従って、癌の発症を未然に防ぐ手段としてその利用価値は高い。
癌治療において解決すべき大きな問題の一つは、如何にして再発を防ぐかである。様々な治療法の確立によって癌治療の奏功率は向上したものの、治療後数年を経て突然癌を再発し、死亡する例が後を絶たない。癌治療後の再発や転移の兆候を把握するために本発明の発癌予知マーカーを利用することも大いに期待される。
【００３９】
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【００４０】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】RET-トランスジェニックマウス（304/B6系統）における腫瘍進展のダイナミクス。Ａ：腫瘍サイズの経時的変化（代表例）。未腫瘍期（白抜き）、良性腫瘍期（薄灰色）、前癌期（濃灰色）、悪性腫瘍期（黒）。Ｂ−Ｄ：腫瘍の肉眼的所見。良性腫瘍期（Ｂ）、前癌期（Ｃ）、悪性腫瘍期（Ｄ）。白抜きの矢印は腫瘍の位置を示す。黒の矢印は悪性黒色腫の表面に形成された潰瘍の位置を示す。Ｅ−Ｇ：腫瘍の顕微鏡像。良性腫瘍期（Ｅ）、前癌期（Ｆ）、悪性腫瘍期（Ｇ）。スケールバーは50μM。H，Ｉ：核・細胞質比率（Ｎ／Ｃ比率；平均値±標準偏差）（Ｈ）と核サイズ（平均値±標準偏差）（Ｉ）。ステージ毎、異なる5つの腫瘍から計500細胞を選択し評価に用いた。良性腫瘍期（薄灰色）、前癌期（濃灰色）、悪性腫瘍期（黒）。Ｊ：各ステージ（前癌期：濃灰色、悪性腫瘍期：黒）の細胞分裂活性（平均値±標準偏差）。悪性の指標となる、病理組織学的にみて異型の分裂が認められる細胞の数を斜線で示した（参考文献３６）。視野（倍率400倍）あたりの分裂期の細胞数が示される。ステージ毎、異なる6つの腫瘍から計60視野を無作為に選択し評価に用いた。*及び†は、良性腫瘍期の腫瘍（コントロール）に比較して有意差（*：p<0.0001、†：p<0.01）があることを示す。
【図２】RET-マウスの腫瘍における癌遺伝子RET（RFP-RET）及びEdnrbの発現レベルのダイナミクス。RET-マウスの良性腫瘍期、前癌期、及び悪性腫瘍期の各腫瘍内におけるRFP-RET（Ａ，Ｂ）、Ednrb（Ｃ，Ｄ）及びβ-アクチン（Ｂ，Ｄ）の転写産物（Ａ，Ｃ）及びタンパク質（Ｂ，Ｄ）の発現レベルをリアルタイムPCR又はウエスタンブロットで測定した。薄灰色のバーは良性腫瘍期、濃灰色のバーは前癌期、黒色のバーは悪性腫瘍期をそれぞれ示す。４回の独立した実験から抽出した代表的な結果を示した。
【図３】RET-マウスのET-1発現レベルのダイナミクス。Ａ：RET-マウスの良性腫瘍期、前癌期、及び悪性腫瘍期の各腫瘍内におけるET-1転写産物の発現レベルをリアルタイムPCRで測定した。Ｂ：RET-マウスの良性腫瘍期、前癌期、及び悪性腫瘍期の血漿ET-1レベルをELISAで測定し、２検体の平均濃度を示した。３回の独立した実験から抽出した代表的な結果を示した。
【図４】Ednrbを介した腫瘍の進展阻害。Ａ：野生型C57BL/6マウス（WT）、RET-マウス（RET）、Ednrbノックアウトマウス（ヘテロ欠損型マウス）（E(+/-)）、Ednrb(+/-)RET-マウス（E(+/-)RET）、Ednrbノックアウトマウス（ホモ欠損型マウス）（E(-/-)）、及びEdnrb(-/-)RET-マウス（E(-/-)RET）を用いて、皮膚でのEdnrb転写レベルをリアルタイムPCRで測定した。Ｂ，Ｃ：RET-マウス（RET、■、n=40）、Ednrb(+/-)RET-マウス（E(+/-)RET、▲、n=38）及びEdnrb(-/-)RET-マウス（E(-/-)RET、●、n=32）の腫瘍サイズ（平均値±標準誤差）のダイナミクス。Ｄ：RET-マウス（RET、n=40）、Ednrb(+/-）RET-マウス（E(+/-)RET、n=38）及びEdnrb(-/-）RET-マウス（E(-/-)RET、n=32）における生後18ヶ月以内の良性腫瘍、前癌期腫瘍、悪性腫瘍の発症数。白のバーは未腫瘍期の割合、薄灰色のバーは良性腫瘍期の割合、濃灰色のバーは前癌腫瘍期の割合、黒のバーは悪性腫瘍期の割合をそれぞれ示す。*及び†は、RET-マウス（コントロール）に比較して有意差（*：p<0.0001、†：p<0.01）があることを示す。
【図５】RET-マウス及びEdnrb(+/-)RET-マウスの腫瘍におけるRFP-RET、Ednrb及びET-1の転写レベルの比較。RET-マウス及びEdnrb(+/-)RET-マウスの腫瘍におけるRFP-RET（Ａ，Ｂ）、Ednrb（Ｃ，Ｄ）及びET-1（Ｅ，Ｆ）の転写レベルを良性腫瘍期（Ａ，Ｃ，Ｅ）及び前癌期（Ｂ，Ｄ，Ｆ；平均値±標準誤差）についてリアルタイムPCRで測定した。*は、RET-マウス（コントロール）に比較して有意差（p<0.05）があることを示す。三回の独立した実験から抽出した代表的な結果を示した。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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