【手続補正書】
【提出日】平成25年10月10日(2013.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
a）少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性膜活性ポリアミンであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合をそれぞれ介して該両親媒性膜活性ポリアミンに、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有する複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、両親媒性膜活性ポリアミン；そして、
ここで前記オリゴヌクレオチドは該両親媒性膜活性ポリアミンに結合していない。
【請求項２】
下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
a）ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーに共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性膜活性ポリアミンであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合をそれぞれ介して該両親媒性膜活性ポリアミンに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、両親媒性膜活性ポリアミン；そして、
ここで前記オリゴヌクレオチドは該両親媒性膜活性ポリアミンに結合していない。
【請求項３】
下記を含む、インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物：
2013520460.tif 000001
式中、
Pは両親媒性膜活性ポリアミンであり、
L2はpHに不安定なマレアマート連結であり、
M1は、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトース誘導体を含む電荷中性マスキング剤であり、
M2はポリエチレングリコールを含む電荷中性マスキング剤であり、
yおよびzは、ゼロよりも大きいかまたは等しい整数であり、ここでyおよびzを合わせた値はPのアミンの50％よりも大きく、
Nはオリゴヌクレオチドであり、
Aは、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
M1およびM2のマレアマート連結L2を通じての結合による、両親媒性膜活性ポリアミンPの一級アミンの数の50％よりも多くの修飾により、Pの正電荷は中和され、かつPの膜活性は可逆的に阻害され；かつ
pHの低下に反応してのL2の切断が、Pのアミンおよび膜活性を復旧する。
【請求項４】
下記の段階を含む、オリゴヌクレオチド送達組成物の製造法：
a）両親媒性膜活性ポリアミンを形成する段階；
b）ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトース誘導体を含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第一のマスキング剤を形成する段階；
c）ポリエチレングリコールを含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第二のマスキング剤を形成する段階；
d）両親媒性膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する段階であって、ここで阻害は、両親媒性膜活性ポリアミンを第一および第二のマスキング剤と反応させ、それにより、生理的にpHに不安定な二置換マレアマート連結を介して複数のガラクトース誘導体および複数のポリエチレングリコールを両親媒性膜活性ポリアミンに連結させることにより、両親媒性膜活性ポリアミン上のアミンの数の50％以上を修飾することからなる、段階；および
e）オリゴヌクレオチドを、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有するガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に連結する段階；
f）インビボでの投与に適した溶液中にオリゴヌクレオチドおよび可逆的に阻害された両親媒性膜活性ポリアミンを提供する段階。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項６】
肝細胞が肝実質細胞からなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
両親媒性膜活性ポリアミンが一級アミン含有モノマーおよび疎水性基含有モノマーを含む、請求項3記載の組成物。
【請求項８】
両親媒性膜活性ポリアミンが、一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから構成される、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
可逆的にマスクした両親媒性膜活性ポリアミンが水溶性である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
両親媒性膜活性ポリアミンがランダムコポリマーである、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
ランダムコポリマーが、ポリ(ビニルエーテル)およびポリ(アクリラート)からなる群より選択される、請求項10記載の組成物。
【請求項１２】
一級アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーが、4〜8一級アミン含有モノマー：3〜5低級疎水性基含有モノマー：1高級疎水性基含有モノマーの比で存在する、請求項1、2、または8のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１３】
低級疎水性基がブチル基からなり、かつ高級疎水性基がオクタデシルまたはドデシル基からなる、請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
マスキング剤が、両親媒性膜活性ポリアミン上の一級アミンの数の少なくとも70％に可逆的に連結している、請求項3記載の組成物。
【請求項１５】
マスキング剤が、両親媒性膜活性ポリアミン上の一級アミンの数の少なくとも80％に可逆的に連結している、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+30から-30mVのゼータ電位を有する、請求項1〜3および5〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+20から-20mVのゼータ電位を有する、請求項16記載の組成物。
【請求項１８】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で+10から-10mVのゼータ電位を有する、請求項17記載の組成物。
【請求項１９】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-30mVのゼータ電位を有する、請求項1〜3および5〜15のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２０】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-20mVのゼータ電位を有する、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
可逆的に修飾された両親媒性膜活性ポリアミンがpH8で0から-10mVのゼータ電位を有する、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容される担体または希釈剤中で提供される、請求項1〜3および5〜21のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２３】
マレアマート連結が二置換マレアマート連結である、請求項3記載の組成物。
【請求項２４】
NがAに生理的に不安定な連結L1を介して連結されている、請求項3記載の組成物。
【請求項２５】
L1が、マレアマートに直交する生理的に不安定な共有結合である、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
Aが、20個またはそれ以上の炭素原子を有する前記疎水性基を含む、請求項3記載の組成物。
【請求項２７】
Aが、ガラクトースと等しいかまたはそれよりも大きなアシアロ糖タンパク質受容体への親和性を有する前記ガラクトーストリマーを含む、請求項3記載の組成物。
【請求項２８】
両親媒性膜活性ポリアミンに連結されているガラクトース誘導体のPEGに対する比が1対0.5〜2である、請求項1〜3のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２９】
ガラクトース誘導体がN-アセチルガラクトサミンからなる、請求項1〜3および5〜28のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３０】
ガラクトーストリマーがN-アセチルガラクトサミントリマーからなる、請求項2〜3、5〜25または27〜29のいずれか一項記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
[本発明1001]
インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、下記を含む組成物：
a）少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性ポリマーであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合を介して該ポリマーに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、ポリマー。
[本発明1002]
インビボでオリゴヌクレオチドを肝細胞に送達するための組成物であって、下記を含む組成物：
a）ガラクトーストリマーに共有結合されているオリゴヌクレオチド；および
b）アミン含有モノマー、低級疎水性基含有モノマー、および高級疎水性基含有モノマーから合成されたターポリマーを含む、可逆的にマスクした標的化両親媒性ポリマーであって、pHに不安定な二置換マレアミド結合を介して該ポリマーに複数のガラクトース誘導体およびPEG基が個別に連結され、該pHに不安定な二置換マレアミド結合の切断がアミン基を生じ、それにより膜活性ポリアミンを生じる、ポリマー。
[本発明1003]
インビボでRNA干渉ポリヌクレオチドを肝細胞に送達するための結合体送達システムであって、下記を含む送達システム：
2013520460.tif 000002
式中、
Pは膜活性ポリアミンであり、
L2はpHに不安定な連結であり、
M1はガラクトース誘導体を含む電荷中性マスキング剤であり、
M2はポリエチレングリコールを含む電荷中性マスキング剤であり、
yおよびzは1よりも大きい整数であり、ここでyおよびzを合わせた値はPのアミンの50％よりも大きく、
NはRNA干渉ポリヌクレオチドであり、
Aはガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基であり、
M1およびM2の生理的にpHに不安定な連結L2を通じての結合による、Pアミンの50％よりも多くの修飾により、Pの正電荷は中和され、かつPの膜活性は可逆的に阻害され；かつ
pHの低下に反応してのL2の切断が、Pのアミンおよび膜活性を復旧する。
[本発明1004]
下記の段階を含む、RNAオリゴヌクレオチド送達組成物の製造法：
a）膜活性ポリアミンを形成する段階；
b）ガラクトース誘導体を含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第一のマスキング剤を形成する段階；
c）ポリエチレングリコールを含む電荷中性二置換無水マレイン酸を含む第二のマスキング剤を形成する段階；
d）膜活性ポリアミンの膜活性を可逆的に阻害する段階であって、ここで阻害は、ポリアミンを第一および第二のマスキング剤と反応させ、それにより、生理的にpHに不安定な二置換マレアマート連結を介して複数のガラクトース誘導体および複数のポリエチレングリコールを膜活性ポリマーに連結させることにより、ポリアミン上のアミンの50％以上を修飾することからなる、段階；および
e）RNA干渉ポリヌクレオチドをガラクトーストリマーまたは少なくとも20個の炭素原子を有する疎水性基に連結する段階；
f）インビボでの投与に適した溶液中にRNA干渉ポリヌクレオチドおよび可逆的に阻害された膜活性ポリアミンを提供する段階。
[本発明1005]
RNA干渉ポリヌクレオチドが、DNA、RNA、dsRNA、RNA干渉ポリヌクレオチド、siRNA、およびmiRNAからなる群より選択される、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1006]
肝細胞が肝実質細胞からなる、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1007]
膜活性ポリマーが2つまたはそれ以上の異なるモノマーを含む、本発明1003または1004のいずれかの組成物。
[本発明1008]
膜活性ポリマーが、アミン含有モノマー、低級疎水性基モノマー、および高級疎水性基モノマーから構成される、本発明1007の組成物。
[本発明1009]
可逆的にマスクした膜活性ポリアミンが水溶性である、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1010]
膜活性ポリアミンがランダムコポリマーである、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1011]
ランダムコポリマーが、ポリ(ビニルエーテル)およびポリ(アクリラート)からなる群より選択される、本発明1010の組成物。
[本発明1012]
アミン含有モノマー、低級アルキルモノマー、および高級アルキルモノマーが、4〜8アミン含有モノマー：3〜5低級疎水性基モノマー：1高級疎水性基モノマーの比で存在する、本発明1001、1002、または1008のいずれかの組成物。
[本発明1013]
低級疎水性基がブチル基からなり、かつ高級疎水性基がオクタデシルまたはドデシル基からなる、本発明1012の組成物。
[本発明1014]
マスキング剤がポリアミン上のアミンの少なくとも70％に可逆的に連結している、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1015]
マスキング剤がポリアミン上のアミンの少なくとも80％に可逆的に連結している、本発明1014の組成物。
[本発明1016]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+30から-30mVのゼータ電位を有する、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1017]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+20から-20mVのゼータ電位を有する、本発明1016の組成物。
[本発明1018]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で+10から-10mVのゼータ電位を有する、本発明1017の組成物。
[本発明1019]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-30mVのゼータ電位を有する、本発明1001〜1015のいずれかの組成物。
[本発明1020]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-20mVのゼータ電位を有する、本発明1019の組成物。
[本発明1021]
可逆的に修飾されたポリマーがpH8で0から-10mVのゼータ電位を有する、本発明1020の組成物。
[本発明1022]
薬学的に許容される担体または希釈剤中で提供される、本発明1001〜1021のいずれかの組成物。
[本発明1023]
L2がマレアマート連結である、本発明1003の組成物。
[本発明1024]
L2が二置換マレアマート連結である、本発明1023の組成物。
[本発明1025]
NがAに生理的に不安定な連結L1を介して連結されている、本発明1003の組成物。
[本発明1026]
L1が、L2に直交する生理的に不安定な共有結合である、本発明1025の組成物。
[本発明1027]
Aが20個またはそれ以上の炭素原子を有する疎水性基を含む、本発明1003の組成物。
[本発明1028]
Aがガラクトーストリマーを含む、本発明1003の組成物。
[本発明1029]
ポリマーに連結されているガラクトース誘導体のPEGに対する比が1対05.〜2である、本発明1001〜1004のいずれかの組成物。
[本発明1030]
ガラクトース誘導体がN-アセチルガラクトサミンからなる、本発明1001〜1029のいずれかの組成物。
[本発明1031]
ガラクトーストリマーがN-アセチルガラクトサミントリマーからなる、本発明1002〜1030のいずれかの組成物。
本発明のさらなる目的、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に読めば、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
E.  リポソーム溶解
10mgの卵ホスファチジルコリンを、100mMカルボキシフルオレセイン（CF）および10mM HEPES、pH7.5を含む緩衝液1mLで水和した。次いで、リポソームを孔径100nmのポリカーボネートフィルター（Nucleopore, Pleasanton, CA）を通して押し出した。捕捉されていないCFを、Sepharose 4B-200を用い、pH8の10mM HEPESおよび0.1mol/L NaClで溶出するサイズ排除クロマトグラフィにより除去した。一定量200μLのCFロードリポソームを等張緩衝液1.8mLに加えた。小胞懸濁液に0.25μgのポリマーを加えた30分後、蛍光（λex＝488、λem＝540）を測定した。各実験終了時に、1％Triton X-100溶液40μlを加えて小胞を破壊し、最大溶解を判定した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
E.  GalNAcクラスターベンジルエステル
2013520460.tif 000003
上で調製した(2-{2-[2-((2R,3R,4R,5R,6R)-4,5-ジアセトキシ-6-アセトキシメチル-3-アセチルアミノ-テトラヒドロ-ピラン-2-イルオキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-酢酸（2.820g、5.246mmol）および(S)-6-アミノ-2-((S)-2,6-ジアミノ-ヘキサノイルアミノ)-ヘキサン酸ベンジルエステル塩酸塩（調製は下記参照、0.829g、1.749mmol）をCH2Cl2 32mLおよびDMF 3.2mLの混合物に溶解し、ヒューニッヒ塩基（2.096ml、12.25mmol）、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾール（0.714g、5.248mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.006g、5.248mmol）で逐次処理し、周囲温度で終夜撹拌した。すべての揮発性物質を減圧中で除去し、粗製反応混合物を調製用HPLC（38回、Gemini、5μ、C18）で精製し、凍結乾燥後に1.650gの表題生成物を白色粉末で得た。MS (ISP): 1945.8 [M+Na]+。NMR (600 MHz、DMSO)。