(57)【要約】【課題】フィルターの目詰まりを防止し、迅速かつ高精度に血液製剤中の微生物を精製する方法、微生物検出方法、及び、該方法に供するキットの提供。【解決手段】a）血小板を含む血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、b）微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程a）により生成された凝集塊を除去する工程と、を有することを特徴とする、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の微生物精製方法、さらにｅ）精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法、該精製方法に供するキット、及び、該検出方法に供するキット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
を有することを特徴とする微生物精製方法。
【請求項２】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
を有することを特徴とする微生物精製方法。
【請求項３】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、
（ｃ’）  工程（ｄ）により得られた処理済溶液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
を有することを特徴とする微生物精製方法。
【請求項４】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
（ｄ’）  工程（ｃ）により得られたフィルターを、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、
を有することを特徴とする微生物精製方法。
【請求項５】
前記血液製剤が血小板製剤である、請求項１〜４のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項６】
前記フィブリン凝集阻害剤がキレート剤である、請求項１〜５のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項７】
前記フィブリン凝集阻害剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はクエン酸である、請求項１〜５のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項８】
前記血小板凝集因子がトロンビンである、請求項１〜７のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項９】
前記工程（ａ）中のいずれかの段階において、前記血液製剤の試料を界面活性剤で処理する段階を有する、請求項１〜８のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項１０】
前記界面活性剤が、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びカチオン系界面活性剤からなる群より選ばれる１以上である、請求項３〜９のいずれか記載の微生物精製方法。
【請求項１１】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１２】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１３】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、
（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１４】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
（ｄ’）  工程（ｃ）により得られたフィルターを、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、
（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１５】
血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、
（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、
（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、
（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、
（ｃ’）  工程（ｄ）により得られた処理済溶液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、
（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、
を有することを特徴とする微生物検出方法。
【請求項１６】
前記血液製剤が血小板製剤である、請求項１１〜１５のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項１７】
前記フィブリン凝集阻害剤がキレート剤である、請求項１１〜１６のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項１８】
前記フィブリン凝集阻害剤が、ＥＤＴＡ又はクエン酸である、請求項１１〜１６のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項１９】
前記血小板凝集因子がトロンビンである、請求項１１〜１８のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２０】
前記工程（ａ）中のいずれかの段階において、前記血液製剤の試料を界面活性剤で処理する段階を有する、請求項１１〜１９のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２１】
前記界面活性剤が、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びカチオン系界面活性剤からなる群より選ばれる１以上である、請求項１１〜２０のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２２】
前記工程（ｅ）の検出方法が、蛍光染色試薬を用いて検出するものである、請求項１１〜２１のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２３】
前記工程（ｅ）の検出方法が、核酸染色及び／又は生きている微生物が有する活性の測定によるものである、請求項１１〜２２のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２４】
前記生きている微生物が有する活性が、エステラーゼ活性又は呼吸活性である、請求項２３記載の微生物検出方法。
【請求項２５】
前記生きている微生物が有する活性を、蛍光染色試薬を用いて測定するものである、請求項２３又は２４記載の微生物検出方法。
【請求項２６】
前記核酸染色を、蛍光染色試薬を用いて行うものである、請求項２３〜２５のいずれか記載の微生物検出方法。
【請求項２７】
血小板を含む血液製剤中の微生物を精製するためのキットであって、フィブリン凝集阻害剤と、血小板凝集因子と、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤と、を有することを特徴とする微生物精製キット。
【請求項２８】
前記フィブリン凝集阻害剤がＥＤＴＡであり、前記血小板凝集因子がトロンビンである、請求項２７記載の微生物精製キット。
【請求項２９】
血小板を含む血液製剤中の微生物を検出するためのキットであって、フィブリン凝集阻害剤と、血小板凝集因子と、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤と、微生物を検出するための蛍光染色試薬と、を有することを特徴とする微生物検出キット。
【請求項３０】
前記フィブリン凝集阻害剤がＥＤＴＡであり、前記血小板凝集因子がトロンビンである、請求項２９記載の微生物検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法、該方法を用いた微生物の検出方法、該微生物精製方法に用いるキット、及び、該微生物検出方法に用いるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
輸血は、医療現場では必要不可欠な行為であるが、ウィルスや細菌に汚染された血液製剤の使用により、感染症に罹ることがある。特に血小板製剤は、他の製剤とは異なり、冷凍・冷蔵保存ができないため、採血時に混入した細菌が保存中に増殖し、その製剤を投与された患者に重篤な感染症を引き起こす危険性が最も高い。このため、血液製剤に含まれる細菌等の微生物を速やかに検出することにより、血液製剤の安全性を高めることが強く望まれている。
【０００３】
血液製剤中に存在する病原性微生物の精製・検出については、種々の方法が開示されている。例えば、ａ）血液製剤の試料に血液細胞の凝集処理を受けさせる、ｂ）汚染菌を通すが、細胞の凝集体を通さない第１フィルターに、処理した試料を通過させることによってステップ（ａ）で形成した凝集体を除去する、ｃ）ステップ（ｂ）で得た濾液の残留細胞を選択的に溶解させる、ｄ）細胞片を通す第２フィルターに、ステップ（ｃ）の溶解物を通過させることによって汚染菌を回収する、及びｅ）場合により精製された汚染菌を検出するために第２フィルターを分析する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特表２００５−５０３８０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の方法では、第1フィルターと第２フィルターの双方が目詰まりを起こしやすいため、操作に時間がかかり、かつ再現性に乏しい。また、細胞溶解処理としてＳＤＳ、ツイーン、トリトン等の洗剤を添加すると、試料溶液の濾過性が若干向上されるが、血液製剤中に場合により存在する微生物の細胞膜も破壊されるという問題がある。
【０００５】
洗剤により微生物の細胞膜が破壊されると、核酸染色の染色性は向上するものの、生きている微生物のみを検出することはできないという問題がある。一方、生きている微生物の検出方法としてエステラーゼ活性測定があるが、細胞膜破壊により、エステラーゼ活性の低下や、分解されたエステラーゼ基質の細胞外への流出等により、染色性が低下するという問題がある。このため、上記の方法では、生きている微生物検出の信頼性は低い。
【０００６】
本発明は、フィルターの目詰まりを防止し、迅速かつ高精度に血液製剤中の微生物を精製する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、フィルターの目詰まりを防止し、高精度かつ高感度に血液製剤中の微生物を検出する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、該微生物を精製する方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
また、本発明は、該微生物を検出する方法に用いるためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、血小板凝集処理を行う工程で、血液製剤中のフィブリノーゲンがフィブリンに変化し、これが不溶性のフィブリンポリマーを形成して第1フィルターを目詰まりさせること、第1フィルターを通過した濾液中の残留細胞の選択的溶解処理の操作中にもフィブリンポリマーの形成反応は進行しているため、第1フィルターを通過した濾液中で生成したフィブリンポリマーによって第２フィルターも目詰まりを起こしてしまうことを見出した。そして、さらに検討した結果、血小板の凝集反応には影響を与えずに、不溶性フィブリンポリマー生成を抑制して、血小板凝集塊を分離することにより、フィルターの目詰まりを防止し得ることを見出した。さらに、微生物と同時に第２フィルター上に捕集される、第１フィルターで捉えられなかった血小板、すなわち、凝集不活性な血小板や血小板凝集塊より剥離した血小板を、微生物検出前に選択的に分解することにより、検出の際のバックグラウンドを抑えて微生物を精度良く検出する方法を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、を有することを特徴とする微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、を有することを特徴とする微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、（ｃ’）  工程（ｄ）により得られた処理済溶液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、を有することを特徴とする微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の精製方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、（ｄ’）  工程（ｃ）により得られたフィルターを、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、を有することを特徴とする微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記血液製剤が血小板製剤である、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤がキレート剤である、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）又はクエン酸である、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記血小板凝集因子がトロンビンである、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ａ）中のいずれかの段階において、前記血液製剤の試料を界面活性剤で処理する段階を有する、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、前記界面活性剤が、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びカチオン系界面活性剤からなる群より選ばれる１以上である、微生物精製方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｃ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、（ｄ’）  工程（ｃ）により得られたフィルターを、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中に場合により存在する微生物の検出方法であって、（ａ）  前記血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる工程と、（ｂ）  微生物は通すが、凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する工程と、（ｄ）  工程（ｂ）により得られた濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程と、（ｃ’）  工程（ｄ）により得られた処理済溶液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過することにより、微生物を捕集する工程と、（ｅ）  精製された微生物を検出する工程と、を有することを特徴とする微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記血液製剤が血小板製剤である、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤がキレート剤である、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤が、ＥＤＴＡ又はクエン酸である、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記血小板凝集因子がトロンビンである、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（a）中のいずれかの段階において、前記血液製剤の試料を界面活性剤で処理する段階を有する、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記界面活性剤が、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤及びカチオン系界面活性剤からなる群より選ばれる１以上である、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ）の検出方法が、蛍光染色試薬を用いて検出するものである、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記工程（ｅ）の検出方法が、核酸染色及び／又は生きている微生物が有する活性の測定によるものである、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記生きている微生物が有する活性が、エステラーゼ活性又は呼吸活性である、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記生きている微生物が有する活性を、蛍光染色試薬を用いて測定するものである、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、前記核酸染色を、蛍光染色試薬を用いて行うものである、微生物検出方法を提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中の微生物を精製するためのキットであって、フィブリン凝集阻害剤と、血小板凝集因子と、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤と、を有することを特徴とする微生物精製キットを提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤がＥＤＴＡであり、前記血小板凝集因子がトロンビンである、微生物精製キットを提供するものである。
また、本発明は、血小板を含む血液製剤中の微生物を検出するためのキットであって、フィブリン凝集阻害剤と、血小板凝集因子と、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤と、微生物を検出するための蛍光染色試薬と、を有することを特徴とする微生物検出キットを提供するものである。
また、本発明は、前記フィブリン凝集阻害剤がＥＤＴＡであり、前記血小板凝集因子がトロンビンである、微生物検出キットを提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、フィルターの目詰まりが防止され、迅速に血液製剤中に場合により存在する微生物が精製できる。従来フィブリンポリマーによって凝集塊に絡めとられていた可能性のある微生物も精製されるため、より精度の高い微生物の精製が可能となる。細胞溶解処理は含まれないため、生きている微生物に対する影響も小さい。このような効果を有する本発明の精製方法を用いた微生物の検出方法により、微生物を高精度かつ高感度に検出することができる。
したがって、血液センター等における微生物検出費用の削減、安全な血液製剤の供給の効率化が期待できる。
また、本発明に係る微生物精製キットにより、簡便に微生物を精製できる。
また、本発明に係る微生物検出キットにより、簡便に微生物を検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において用いられる血液製剤とは、血液及び血液から作り出される医療用製剤を意味する。したがって、血液製剤には、全血製剤、赤血球製剤、血小板製剤等が含まれる。このうち、血小板製剤が好ましい。
【００１１】
本発明において用いられる血小板凝集因子は、血小板凝集を引き起こす物質であれば、特に限定されるものではない。例えば、トロンビン、コラーゲン、トロンボキサンチン、ＰＡＦ（血小板活性化因子）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、フォン・ヴィレブラント因子、セロトニン等である。
【００１２】
好ましくはトロンビン、コラーゲン、トロンボキサンチンである。血小板凝集作用が強いためである。より好ましくはトロンビンである。汎用されており、使用が簡便であるためである。
【００１３】
本発明において用いられるフィブリン凝集阻害剤は、フィブリン凝集、すなわち、不溶性のフィブリンポリマー形成を阻害し、かつ、同時に用いられる血小板凝集因子による血小板凝集を阻害しないものであれば、特に限定されるものではない。例えば、キレート剤、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ配列で開始する短ペプチド又はペプチド誘導体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, ｐ3085〜3089（1978年）を参照）、プラスミン等である。
【００１４】
好ましくはキレート剤、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ配列で開始する短ペプチド又はペプチド誘導体である。より好ましくはキレート剤である。Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ配列で開始する短ペプチド又はペプチド誘導体は、直接フィブリノーゲンに結合することによりフィブリンポリマー形成を阻害するため、血小板凝集過程に対する影響が小さい。キレート剤は、フィブリンが重合する時に必要なカルシウムイオンを捕捉することによりフィブリンポリマー形成を阻害するため、阻害効果が最も高い。
【００１５】
キレート剤は、カルシウムイオンを捕捉する効果を有する物質であれば、特に限定されるものではない。例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、クエン酸等である。好ましくはＥＤＴＡ、クエン酸である。血液製剤中の他の成分に対する影響が低いためである。より好ましくはＥＤＴＡである。血小板凝集が促進されるためである。
【００１６】
Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ配列で開始する短ペプチド又はペプチド誘導体は、フィブリノーゲンに結合するものであれば、特に限定されるものではない。好ましくはＧｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-Ｓａｒ（アルギニルサルコシン）であり、より好ましくはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−ＮＨ2である。フィブリノーゲンへの結合性が強いためである。
【００１７】
本発明において用いられる微生物は通すが凝集塊は通さないフィルターの孔径は、５μｍ〜５０μｍが好ましい。より好ましくは５μｍ〜２０μｍである。
【００１８】
本発明において用いられる微生物を通さないフィルターの孔径は、０．1μｍ〜５μｍが好ましい。より好ましくは０．1μｍ〜１μｍである。かかるフィルターとしては、例えば、ポリカーボネート、ポリエステルを基材としたフィルターであり、特開２００６−１２９７２２で開示されている、厚さが１０μｍ〜５００μｍのポリマー層と、前記ポリマー層上に厚さが０．1ｎｍ〜１μｍの金属層とを有する微生物検出用メンブランフィルターがより好ましい。捕集した微生物を検出する際に、様々な波長の蛍光色素の組合せにおいて蛍光バックグラウンドを低く抑えることができ、また、操作性に優れているためである。
【００１９】
本発明に係る微生物精製法では、まず工程（ａ）として、血液製剤の試料にフィブリン凝集阻害剤を添加した後に、血小板凝集因子を添加することにより血小板を凝集させる。
フィブリン凝集阻害剤よりも先に血小板凝集因子を添加すると、もともと血小板製剤に含まれるフィブリノーゲンや、凝集作用により血小板から放出されたフィブリノーゲンがフィブリンへ変化し、不溶性のフィブリンポリマーが形成されてしまう。その後にフィブリン凝集阻害剤を添加しても、既に生成されたフィブリンポリマーは除去できないため、血小板凝集因子よりもフィブリン凝集阻害剤を先に添加する必要がある。
例えば、フィブリンポリマー形成は、フィブリノーゲンが第ＸIII因子により活性化されてフィブリンへと変化することにより形成されるが、この第ＸIII因子の活性化はカルシウムイオンが担っている。血液製剤の試料中に先にキレート剤を添加することにより、カルシウムイオンのマスキングが行われる。この結果、その後血小板凝集因子を添加しても、フィブリンポリマーの形成は阻害される。
【００２０】
フィブリン凝集阻害剤は、各フィブリン凝集阻害剤に応じた適切な濃度を添加する。例えば、ＥＤＴＡは最終濃度が０．５％（重量／体積）〜５％（重量／体積）になるように添加することが好ましく、１％（重量／体積）〜３％（重量／体積）がより好ましい。クエン酸は最終濃度が１％（重量／体積）〜２０％（重量／体積）になるように添加することが好ましく、２％（重量／体積）〜１０％（重量／体積）がより好ましい。また、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ配列で開始する短ペプチド又はペプチド誘導体は、最終濃度が０．1ｍＭ以上になるように添加することが好ましく、１０ｍＭ以上がより好ましい。但し、いずれのフィブリン凝集阻害剤を使用する場合であっても、本発明に係る方法において、フィブリン凝集を阻害し、かつ、血小板凝集を阻害しない濃度であれば、特に限定されるものではない。
【００２１】
血液製剤の試料に添加する血小板凝集因子は、各血小板凝集因子に応じた適切な濃度を添加する。例えば、トロンビンは最終濃度が０．５Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌになるように添加することが好ましく、１Ｕ／ｍｌ〜４Ｕ／ｍｌがより好ましい。但し、いずれの血小板凝集因子を使用する場合であっても、本発明に係る方法において血小板を凝集させる濃度であれば、特に限定されるものではない。
【００２２】
血液製剤の試料に添加するフィブリン凝集阻害剤と血小板凝集因子は、共に中性の緩衝液を用いて調製したものを使用することが好ましい。ｐＨ７．０〜ｐＨ７．８が好ましく、ｐＨ７．４〜ｐＨ７．６がより好ましい。血小板凝集反応を阻害しないためである。
【００２３】
血小板凝集因子添加後に震盪することにより、血小板を凝集させる。震盪時間は特に限定されないが、好ましくは５分〜３０分であり、より好ましくは５分〜２０分である。震盪温度は室温〜３７℃が好ましい。
【００２４】
血小板を凝集させた後、工程（ｂ）として、微生物は通すが凝集塊は通さないフィルターを用いて濾過することにより、工程（ａ）により生成された凝集塊を除去する。
【００２５】
さらに、工程（ｃ）として、工程（ｂ）により得られた濾液を、微生物を通さないフィルターを用いて濾過し、微生物を捕集することにより、微生物を濃縮して精製することができる。
【００２６】
前記工程（b）により得られた凝集塊を除去した濾液を、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程を含んでもよい。該処理により、凝集塊に含まれなかった、若しくは、凝集塊から剥離した、微生物以外の物質のうち、蛋白質は分解され、脂肪球はミセル化される。この結果、より精製度が高くなり、微生物検出の際のバックグラウンドが軽減される。
該蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する工程は、前記工程（ｃ）の前に行ってもよく、後に行ってもよい。前記工程（ｃ）における濾過性がさらに向上することから、前記工程（ｃ）の前に行うほうが好ましい。
【００２７】
具体的には、工程（ｄ）として、工程（ｂ）により得られた濾液を蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する場合には、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤を、工程（ｂ）により得られた濾液に添加し、インキュベートすることにより行う。また、工程（ｄ’） として、工程（ｃ）により得られたフィルターを蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理する場合には、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で該フィルターを洗浄することにより行う。
蛋白質分解酵素と界面活性剤の両方で処理する場合には、いずれを先に添加しても良いし、同時に添加しても良い。界面活性剤により蛋白質分解酵素反応が抑制されるおそれがある場合には、先に蛋白質分解酵素処理をした後に界面活性剤を添加する方が好ましい。
【００２８】
前記工程（a）中のいずれかの段階において、前記血液製剤の試料を界面活性剤で処理してもよい。なお、前記血液製剤の試料への界面活性剤処理は、フィブリン凝集阻害剤添加前にしてもよく、フィブリン凝集阻害剤添加後にしてもよい。さらに、血小板凝集因子添加後にしてもよい。工程（b）における濾過工程の際に、大きな脂肪球に付着する等により、微生物が凝集塊とともにフィルター上に残留してしまうことがあるが、該処理により、微生物は効率よくフィルターを通過できるようになる。
【００２９】
本発明において用いられる蛋白質分解酵素は、本発明に係る方法において微生物に影響を与えない物質であれば、特に限定されるものではない。例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、プロテイナーゼＫ等である。好ましくはトリプシンである。室温かつ中性付近において、十分な活性があるためである。
【００３０】
本発明において用いられる界面活性剤は、本発明に係る方法において微生物に影響を与えないものであれば、特に限定されるものではない。例えば、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン系界面活性剤である。好ましくはノニオン系界面活性剤であり、より好ましくはＰＬＥ（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、ＯＤＥ（オレイン酸エタノールアミド）である。
【００３１】
蛋白質分解酵素処理は、各蛋白質分解酵素に応じた適切な濃度、ｐＨ及び温度でインキュベートすることにより行う。例えば、トリプシンは最終濃度が０．１Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌになるように添加することが好ましく、０．５Ｕ／ｍｌ〜２Ｕ／ｍｌがより好ましい。インキュベート温度は室温〜３７℃が好ましく、３７℃がより好ましい。インキュベート時間は特に限定されないが、好ましくは５分〜９０分である。
【００３２】
界面活性剤処理は、各界面活性剤に応じた適切な濃度を濾液に添加する。例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテルは最終濃度が０．１％（重量／体積）〜４％（重量／体積）になるように添加することが好ましい。インキュベート温度は特に限定されないが、室温以下である方が好ましい。微生物に対する影響が抑えられるためである。インキュベート時間も特に限定されないが、好ましくは０．５分〜９０分である。
【００３３】
本発明に係る微生物精製方法を用いて、血小板を含む血液製剤中に存在する微生物を高精度かつ高感度に検出することができる。該微生物を検出する方法は、特に限定されるものではない。例えば、核酸染色や、生きている微生物が有する活性の測定、抗体による免疫染色がある。生きている微生物を精度よく検出することができるため、生きている微生物が有する活性の測定が好ましい。このような活性には、例えば、エステラーゼ活性や呼吸活性がある。
【００３４】
また、いずれの検出方法を用いて検出する場合でも、蛍光染色試薬を用いて検出する方法が好ましい。検出感度が高いためである。本発明において用いられる蛍光染色試薬は、蛍光物質のみならず、無蛍光物質であって、微生物が有する酵素や微生物の行う種々の生命活動による化学反応の結果、蛍光物質となる物質も含まれる。
【００３５】
核酸染色に用いる蛍光染色試薬には、ヘキスト33342やＤＡＰＩ （4',6 -diamidino -2  -phenylindole）等がある。エステラーゼ活性測定に用いる蛍光染色試薬には、ＣＦＤＡ(carboxy fluorescein diacetate)やカルセインＡＭエステル等がある。呼吸活性測定に用いる蛍光染色試薬には、ＣＴＣ（5 -Cyano -2,3 -ditolyl -2H -tetrazolium chloride）等がある。
【００３６】
核酸染色では血小板は染色されないが、死んだ微生物も生きている微生物と同様に染色される。一方、エステラーゼ活性測定では、死んだ微生物は検出されないが、血小板もエステラーゼ活性を持つ上に、サイズ／形状等が微生物とほぼ同等であるため、凝集されなかった血小板と微生物との識別が困難である。このため、生きている微生物の検出には、核酸染色とエステラーゼ活性測定を併用することが好ましい。
【００３７】
例えば、ＤＡＰＩ染色とＣＦＤＡを基質としたエステラーゼ活性測定を併用することができる。
まず、ＤＡＰＩをフィルター上に捕集された微生物に取り込ませ、核酸を染色する。ＤＡＰＩにより、微生物は染色されるが、血小板は染色されない。次に、ＣＦＤＡを微生物に取り込ませ、微生物内のエステラーゼ活性によりＣＦＤＡが分解され、蛍光を発する。微生物だけではなく血小板もこの蛍光を発する。
その後、青色励起光を照射してフィルター全面をスキャンしながら、緑色の蛍光を発する微生物様の形状の蛍光点を探索する。続いて、探索した微生物様の蛍光点にＵＶ励起光を照射し、核酸染色性を確認する。ここで、陽性判定であれば微生物であり、陰性判定であれば血小板である。なお、青色励起光とＵＶ励起光の照射順序は逆にしても検出可能である。
【００３８】
ただし、本発明に係る微生物精製方法を用いると、精製される微生物にはほぼ全ての血小板が効率よく除去されているため、エステラーゼ活性測定のみでも生きている微生物を高精度に検出することが可能となる。
【００３９】
検出装置は、蛍光顕微鏡等の様々な装置を用いることができるが、異なる波長の蛍光染色像を簡便に得ることができるため、ＷＯ２００３／００８６３４で開示された検出方法を採用したマイクロファインダーが、より好ましい。
【００４０】
また、本発明に係る微生物精製キットにより、血小板を含む血液製剤の試料に、キットのフィブリン凝集阻害剤、血小板凝集因子、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤を、順次添加するだけで、簡便に微生物を精製することが可能となる。
【００４１】
同様に、本発明に係る微生物検出キットにより、血小板を含む血液製剤の試料に、キットのフィブリン凝集阻害剤、血小板凝集因子、蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤、蛍光染色試薬を、順次添加するだけで、簡便に微生物を検出することが可能となる。
【００４２】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４３】
血小板製剤３．５ｍｌと１０％（重量／体積）ＰＬＥリン酸緩衝液（pＨ７．６）２ｍｌを５０ｍｌ容の遠沈管にとり、試料溶液とした。該試料溶液に、１８．６％（重量／体積）ＥＤＴＡリン酸緩衝液（pＨ７．６）１ｍｌを添加し、良く攪拌した。次に、５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Sigma社製  T8885-10VL）リン酸緩衝溶液（pＨ７．６）５ｍｌを添加し、５分間震盪して血小板を凝集させた後、孔径１０μｍのフィルターを用いて濾過した。
【００４４】
上記濾液に、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．６）５ｍｌを加えてよく攪拌した後、２５Ｕ／ｍｌのトリプシン（Difco Laboratories社製  Trypsin Bacto）Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝溶液（１０ｍＭ、ｐH７．６）０．５ｍｌを添加し、３７℃で１５分間インキュベートを行った。その後、孔径０．４μｍのフィルターを用いて濾過し、フィルター上の残留物を超純水で洗浄した。
【実施例２】
【００４５】
血小板製剤３．５ｍｌを５０ｍｌ容の遠沈管にとり、試料溶液とした。該試料溶液に、７．２％（重量／体積）クエン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）８．５ｍｌを添加し、良く攪拌した。次に、５Ｕ／ｍｌのトロンビン（Sigma社製  T8885-10VL）リン酸緩衝溶液（pＨ７．６）５ｍｌを添加し、５分間震盪して血小板を凝集させた後、孔径１０μｍのフィルターを用いて濾過した。
【００４６】
上記濾液に、１０％（重量／体積）ＯＤＥリン酸緩衝液（pＨ７．６）１０ｍｌと３Ｕ／ｍｌのアルカラーゼ（Calbiochem Novabiochem Novagen社製）リン酸緩衝溶液（ｐH７．６）５ｍｌを添加し、３７℃で６０分間インキュベートを行った。その後、孔径０．４μｍのフィルターを用いて濾過し、フィルター上の残留物を超純水で洗浄した。
【００４７】
（比較例１）
１８．６％ＥＤＴＡリン酸緩衝液（pＨ７．６）１ｍｌの代わりに１０％（重量／体積）ＰＬＥリン酸緩衝液（pＨ７．６）１ｍｌを添加した以外は、実施例１と同様にして残留物を得た。
【００４８】
図１は、フィブリンポリマー生成阻害因子存在下と非存在下における、血小板製剤の血小板凝集因子添加により生成された凝集塊をそれぞれ示したものである。フィブリンポリマー生成阻害因子がないと、広範囲にフィブリンポリマーが形成されていることがわかる。
【００４９】
図２〜図８は、実施例１及び２と比較例１における、各工程で得られた溶液の粒度分布図である。横軸は溶液中に含まれる粒子の直径、縦軸は検出強度であり、図２は処理前の血小板製剤の試料溶液の粒度分布図である。
【００５０】
図３、４及び５は、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液の粒度分布図であり、図３は比較例１、図４は実施例１、図５は実施例２のものである。図３には図２と同様に大きな粒子が多く存在しているが、図４及び５では大きな粒子が明らかに減少し、図２では検出できなかった小さい粒子の全体に占める割合が増えていることがわかる。これは、比較例１では、血小板凝集塊濾過後も、フィブリンポリマー形成が進行しているのに対し、実施例１及び２ではフィブリンポリマーが形成されていないためと考えられる。
【００５１】
図６、７及び８は、トリプシン又はアルカラーゼ処理後の溶液の粒度分布図であり、図６は比較例１、図７は実施例１、図８は実施例２のものである。図７のみ縦軸が容積になっているのは、他の溶液と比較して非常に濃度が薄いため、検出感度を上げたためである。図７及び８ではシングルピークであり、小さい粒子径のみが存在しているのに対し、図６では図２及び３と同様、大きな粒子が多く存在していることがわかる。これは、大きな粒子が不溶性のフィブリンポリマーによる凝集塊であるため、蛋白質分解酵素では分解できず、そのまま残留しているためと考えられる。
【００５２】
実施例１及び２と比較例１の結果から、本発明のようにフィブリンポリマー生成阻害因子を添加した場合には、添加しなかった場合に比して、凝集塊濾過後の濾液に大きな粒子が顕著に減少しており、フィルターの目詰まりが解消されることが明らかである。蛋白質分解酵素及び／又は界面活性剤で処理をすることにより、ほぼ完全に大きな粒子がなくなり、さらにフィルターの濾過性は向上する。したがって、微生物を通さない孔径の小さいフィルター上の残留物から、微生物以外の不要物の大部分が効率よく除去される結果、微生物検出時のバックグラウンドが下がり、検出精度及び感度が高くなる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明に係る微生物の検出方法は、血液製剤の病原性検査の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】フィブリンポリマー生成阻害因子存在下と非存在下における、血小板製剤の血小板凝集因子添加により生成された凝集塊を示す。
【図２】血小板凝集因子添加前の血小板製剤の試料溶液の粒度分布図を示す。
【図３】フィブリンポリマー生成阻害因子非存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液の粒度分布図を示す。
【図４】ＥＤＴＡ存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液の粒度分布図を示す。
【図５】クエン酸存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液の粒度分布図を示す。
【図６】フィブリンポリマー生成阻害因子非存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液を、トリプシン処理した溶液の粒度分布図を示す。
【図７】ＥＤＴＡ存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液を、トリプシン処理した溶液の粒度分布図を示す。
【図８】クエン酸存在下における、トロンビン処理後孔径１０μｍのフィルターに濾過して血小板凝集塊を除いた濾液を、アルカラーゼ処理した溶液の粒度分布図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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