(57)【要約】【課題】  オートフォーカス動作を容易にして、画像を確実に取得することのできるウェルプレート、生物顕微鏡及び生物観察装置を提供する【解決手段】  容器内部に載置された試料が底面６２を介して生物顕微鏡により観察される生物観察容器６０において、前記底面６２の表面６３に反射防止膜６５が形成されたことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内の試料が底面を介して観察される生物観察容器において、
前記底面の表面に反射防止膜が形成された
ことを特徴とする生物観察容器。
【請求項２】
焦点誤差信号に基づいて請求項３記載の生物観察容器底面の裏面を基準とする合焦位置に対物レンズの焦点位置を調節する
ことを特徴とする生物顕微鏡。
【請求項３】
前記生物観察容器内の前記試料から出る蛍光像を、請求項２記載の生物顕微鏡を介してカメラで撮像した画像に基づいて画像処理を行う
ことを特徴とする生物観察装置。
【請求項４】
ウェルプレートを生物観察容器とすることを特徴とする請求項１記載の生物観察容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウェルプレート等の生物観察容器並びに生物観察容器内の試料からの蛍光信号に基づいて観察を行う生物顕微鏡及び生物観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
図３は創薬装置等で用いられる従来のウェルプレートを示す、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は一部切欠き断面側面図である。ウェルプレート６はそれぞれに試料（観測対象）が注入される複数のウェル６１及び、光学ガラスからなる底面６２から構成される。
【０００３】
創薬のハイコンテンツ・スクリーニング（ＨＣＳ）装置では、予め培養した細胞を培養液と共にウェルプレート６にあるウェル６１に適切な数で分注し、ウェル６１毎に異なる濃度、量又は種類の試薬を滴下して、テスト試料を用意しておく。次に、これらの試料に光を照射して励起し、励起された試料から出る蛍光像を、顕微鏡システムを介してカメラで取り込む。その際、全てのウェル６１から蛍光画像を取得するため、ＸＹステージでウェルプレートを移動する。カメラで取得した画像に対して画像処理を行い、その結果に基づいて薬の候補になる試料を見出す。画像の画質を高めるため、顕微鏡とカメラの間に共焦点スキャナが設置される。
【０００４】
顕微鏡の対物レンズは、試料のカバーガラスの厚さ０．１７ｍｍを考慮して、収差をなくすように設計しているため、高画質の画像を得るには、ウェルプレート６の底面にｔ０．１７ｍｍのガラスを使用したものが最もよい。
【０００５】
一般的に、ウェルプレート６の底面６２は完全な平面ではなく、歪みを持つ。また、底面６２の材料（ガラス）の厚さにもばらつきが存在する。このような底面厚の不均一さによって、個々のウェル６１にある試料と顕微鏡の対物レンズとの距離が同じでなくなり、ウェルによっては画像を取得できないものがでてくる。画像を確実に取得するため、創薬装置では、顕微鏡の対物レンズにオートフォーカス機能を持たせ、ウェルプレート底面の歪みに合わせて対物レンズの焦点位置を調整する。
【０００６】
図４は上記のような創薬スクリーニング装置において使用される生物顕微鏡の従来例を示すブロック図である。図４に示すように、本実施形態の生物顕微鏡は、観察光学系１０および焦点誤差検出光学系２０を含んで構成される光学系１と、対物レンズ１１の位置を制御するための制御回路３と、観察光学系の焦点位置を調整する焦点調整手段としての焦点調整部４と、を備える。
【０００７】
光学系１は、試料５の近傍に配置される対物レンズ１１と、試料５側からの光を観察光および焦点誤差検出光に分離する分離手段としてのダイクロイックミラー１２と、ダイクロイックミラー１２を透過した観察光を受け付ける観察部１３と、観察部１３への焦点誤差検出光の入射を防止するためのフィルタ１４と、焦点誤差検出用光源としてのレーザダイオード２１と、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光を試料５に向けて通過させるレンズ群２２と、焦点誤差検出光の一部を折り曲げるハーフミラー２３と、試料５で反射されハーフミラー２３で折り曲げられた焦点誤差検出光を反射させるミラー２４と、焦点誤差検出光を受光する焦点誤差信号生成手段としての４分割フォトダイオード２５と、４分割フォトダイオード２５に入射する焦点誤差検出光のビーム形状を所定形状に成形するコリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７と、ダイクロイックミラー１２で折り曲げられた観察光を遮断するためのフィルタ２８と、を備える。
【０００８】
図４に示すように、対物レンズ１１は、アクチュエータ１６によりＺ方向(光軸方向)に移動可能とされている。アクチュエータ１６は制御回路３により制御される。
【０００９】
次に、本実施形態の生物顕微鏡の動作について説明する。
【００１０】
試料５からの観察光は、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４を介して観察部１３に入射し、観察部１３において試料５の観察像が得られる。これら、対物レンズ１１、ダイクロイックミラー１２、フィルタ１４および観察部１３は、観察光学系１０を構成する。
【００１１】
一方、レーザダイオード２１から照射された焦点誤差検出光は、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８を通ってダイクロイックミラー１２により折り曲げられ、対物レンズ１１を介して試料５に照射される。試料５で反射された焦点誤差検出光は、対物レンズ１１を介してダイクロイックミラー１２に戻り、ここで折り曲げられてフィルタ２８に入射する。フィルタ２８を通過した焦点誤差検出光は、ハーフミラー２３、ミラー２４で折り返され、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過する。コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７を通過した焦点誤差検出光は、４分割フォトダイオード２５で受光される。
【００１２】
これら、レンズ群２２、ハーフミラー２３、フィルタ２８、ダイクロイックミラー１２、対物レンズ１１、ミラー２４、４分割フォトダイオード２５、コリメータレンズ２６およびシリンドリカルレンズ２７は、焦点誤差検出光学系２０を構成する。
【００１３】
焦点誤差検出光学系２０に設けられたフィルタ２８は、ダイクロイックミラー１２により除去されきれなかった試料５の側からの観察光を遮断する。本実施形態では、フィルタ２８において観察光を遮断し、フィルタ２８を経由した焦点誤差検出光のみが４分割フォトダイオード２５に入射する。このため、４分割フォトダイオード２５において、観察光の影響を受けない正確な焦点誤差検出信号を生成することができる。また、観察光の影響を排除することで、焦点誤差検出の感度を向上させることができるので、試料５に照射する焦点誤差検出光の光量を低下させることができ、試料５が生細胞である場合などに、試料５への悪影響を防止できる。
【００１４】
コリメータレンズ２６及びシリンドリカルレンズ２７は、光軸（ｚ軸）と直交し、かつ互いに直交する２方向（ｘ方向、ｙ方向）について焦点距離を異ならせ、４分割フォトダイオード２５の受光量に基づく、非点収差法を用いた焦点誤差検出が可能となる。後述のように、焦点誤差検出光学系２０および制御回路３等は合焦手段として機能する。
【００１５】
図５は、４分割フォトダイオード２５に照射される焦点誤差検出光の投影形状を示しており、図５（Ａ）は合焦時の形状、図５（Ｂ）は焦点が遠い場合の形状、図５（Ｃ）は焦点が近い場合の形状を、それぞれ示している。フォトダイオード２５の領域２５ａの出力レベルを「Ａ」、領域２５ｂの出力レベルを「Ｂ」、領域２５ｃの出力レベルを「Ｃ」、領域２５ｄの出力レベルを「Ｄ」とすると、「（Ａ＋Ｃ）−（Ｂ＋Ｄ）」を演算することで、焦点誤差（フォーカスエラー）検出信号を得ることができる。いわゆる焦点誤差検出信号のＳ字カーブにおいて、信号強度が「０」の点で合焦状態が得られる。４分割フォトダイオード２５から出力された焦点誤差検出信号は、焦点調整部４を介して制御回路３に与えられる。なお、非点収差法による焦点誤差検出は周知の技術であるため、詳細説明は省略する。
【００１６】
顕微鏡のオートフォーカス技術に関連する先行技術文献としては次のようなものがある。
【００１７】
【特許文献１】特開平５−８８０７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
図６に示すように、上記の装置では、ウェル６１の底面ガラス６２の裏面６４と培養液５１（ほぼ水である）との境界面での屈折率の差による光の反射を利用して、ウェルの底（裏面６４）を検出し、これを基準として対物レンズ１１の焦点位置を一定に制御する。
【００１９】
しかしながら、従来のウェルプレート６では、ウェル６１の底面ガラス６２の表面６３からも、オートフォーカス用の焦点誤差検出光１０１が反射され（表面反射光１０２）、しかもその強度が裏面の反射光１０３より１０倍強い。このため、図７の焦点誤差検出信号チャートに示すように、表面反射信号２０１により、必要な信号である裏面反射信号２０２のＳＮ比が悪くなり、結果としてオートフォーカス動作が困難になるという問題がある。
【００２０】
これは、光は屈折率の差によって反射の度合いが異なり、ガラスと空気の境界では入射光に対して約４％、ガラスと水の境界では約０．４％の反射が発生し、図７のオートフォーカス動作では、後者である０．４％の反射光を検出してウェルの底、即ちガラスの裏面を検出することになるためである。
【００２１】
本発明はこのような課題を解決しようとするもので、顕微鏡によるオートフォーカス動作を容易にして、画像を確実に取得することのできるウェルプレート、生物顕微鏡及び生物観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
このような課題を達成するために、本発明のうち請求項１記載の発明は、
容器内の試料が底面を介して観察される生物観察容器において、
前記底面の表面に反射防止膜が形成されたことを特徴とする。
【００２３】
請求項２記載の発明に係る生物顕微鏡は、
焦点誤差信号に基づいて請求項１記載の生物観察容器底面の裏面を基準とする合焦位置に対物レンズの焦点位置を調節することを特徴とする。
【００２４】
請求項３記載の発明に係る生物観察装置は、
前記生物観察容器内の前記試料から出る蛍光像を、請求項２記載の生物顕微鏡を介してカメラで撮像した画像に基づいて画像処理を行うことを特徴とする。
【００２５】
請求項４記載の発明は、
請求項１記載の生物観察容器において、
ウェルプレートを生物観察容器とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２６】
以上説明したことから明らかなように、本発明によれば、容器内の試料が底面を介して観察される生物観察容器において、前記底面の表面に反射防止膜が形成されたことにより、オートフォーカス動作を容易にして、画像を確実に取得することのできる生物観察容器、生物顕微鏡及び生物観察装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下本発明について図面を用いて詳細に説明する。
図１は本発明に係るウェルプレートの第１の実施例を示す（Ａ）は平面図、（Ｂ）は一部切欠き断面側面図である。図３と同一の箇所は同じ記号を付して重複した説明は省略する。ウェルプレート６０は容器内の試料が底面を介して観察される生物観察容器を構成する。図１のウェルプレート６０が図３と異なるのは、反射防止膜６５を、ウェルプレート６０の底面６２を構成する光学ガラスの表面６３にコーティングした点である。
【００２８】
図１のウェルプレートの作用を以下に示す。図１において、底面ガラス６２の表面６３に反射防止膜６５をコーディングすることによって、表面６３の反射率は、従来の４％に対し１％以下に抑えられる。その結果、図２の焦点誤差検出信号チャートに示すように、表面６３の反射（信号２０３）が裏面６４の反射（信号２０４）に影響を与えないようにすることができる。
【００２９】
上記のような構成のウェルプレートによれば、ウェルプレートの底面ガラスの表面に反射防止膜をコーティングすることにより、オートフォーカス用の焦点誤差検出光の表面反射を抑えるので、ウェルの底（底面ガラスの裏面）を精度よく検出することができ、試料の画像を確実に取得することができる。
【００３０】
なお、反射防止膜の形成は、塗布、蒸着、吹きつけその他任意の方法を用いることができる。
【００３１】
また、反射防止膜を形成する対象はウェルプレートに限られず、カバーガラスやガラスボトムディッシュなど、生物顕微鏡により底面を介して観察が行われる生物観察用容器のすべてに適用することができる。
【００３２】
また、図４に例示したような生物顕微鏡のウェルプレート６の代わりに図１のウェルプレート６０を用いることにより、オートフォーカス動作が容易で、試料の画像を確実に取得することができる生物顕微鏡を提供することができる。
【００３３】
さらに、そのような生物顕微鏡によって得られた蛍光像を共焦点スキャナによってＳＮ比の高い画質の画像に高め、これをカメラで撮像した後、画像処理装置で画像処理を行うことにより、オートフォーカス動作が容易で、画像を確実に取得することができる生物観察装置を提供することができる。画像処理の結果に基づいて薬の候補になる試料を見出すこと（創薬スクリーニングという）により同様の長所を持つ創薬スクリーニング装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明に係るウェルプレートの第１の実施例を示す（Ａ）は平面図、（Ｂ）は一部切欠き断面側面図である。
【図２】図１のウェルプレートの焦点誤差検出信号を示すチャートである。
【図３】従来のウェルプレートを示す、（Ａ）は平面図、（Ｂ）は一部切欠き断面側面図である。
【図４】従来の生物顕微鏡の例を示すブロック図である。
【図５】従来装置における焦点誤差検出光の投影形状を示す図である。
【図６】従来装置におけるウェルプレート底面ガラス６２の反射光を示す説明図である。
【図７】従来装置における焦点誤差検出信号を示すチャートである。
【符号の説明】
【００３５】
６０  生物観察容器
６５  反射防止膜
６２  底面
６３  表面
６４  裏面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008267842.tif 000007
【図６】
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【図７】
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