(57)【要約】      （修正有）【課題】褥瘡や糖尿病性下肢潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に苦しむ患者が持つ自然治癒力を正確に把握し、それぞれに適した治療法を選択、組み合わせるための、創傷治癒を予測する方法の提供。【解決手段】特定のペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させることにより、あるいは培養することにより、増殖因子の放出を誘導させ、該増殖因子の放出量を測定する、創傷治癒の予測方法。増殖因子が形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）である創傷治癒の予測方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させることによりあるいは培養することにより、増殖因子の放出を誘導させ、該増殖因子の放出量を測定することを特徴とする、創傷治癒の予測方法。
【化１】
2008118930.tif 000004
【請求項２】
体液が血液または創傷部浸出液であることを特徴とする、請求項１に記載の創傷治癒の予測方法。
【請求項３】
増殖因子が形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）であることを特徴とする、請求項１に記載の創傷治癒の予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷治癒の予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化、食生活などの生活環境の変化等に伴い、褥瘡や糖尿病性下肢潰瘍などの難治性皮膚潰瘍に苦しむ患者数、特に重篤な症例が飛躍的に増加しており、世界的な問題となっている。今後も、さらにこの傾向に拍車がかかるものと予想されている。
これら疾患の治療法としては、長年にわたり強力なものがなかったが、近年、強力な細胞増殖作用を示す塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）や血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）等の生体由来増殖因子が注目され、市販されるようになってきた。また、患者の持つ自然治癒力がより発揮できるための環境を保つことを目的として、さまざまな素材・形態の創傷被覆材も用いられるようになった。
【０００３】
これらの治療法を用いて。有効でかつ安全な最適治療を行うためには、創傷の病態と共に、個々の患者が持つ自然治癒力を正確に把握し、それぞれに適した治療法を選択、組み合わせる必要がある。
最近、難治性皮膚潰瘍の一つである褥瘡において、創傷病態の評価に基づき治療法を選択する指針として、褥瘡局所治療ガイドラインが作成された。
しかしながら、個々の患者が持つ自然治癒力を正確に把握する方法については、現在までに報告例はなく、個々の患者に最適な治療はなされていないのが現状である。
【０００４】
創傷治癒には、さまざまな要因が複雑に関係しているが、その中で最も注目されているのが、生体由来の増殖因子である。これらの増殖因子は、創傷治癒に重要な役割を果たしている種々の細胞、例えば血小板、マクロファージ、線維芽細胞、血管内皮細胞、上皮細胞などから産生、放出されると共に、これら細胞の遊走、活性化、増殖、その他機能の制御などを介して創傷治癒に極めて重要な因子として働いていることが明らかとなっている。
増殖因子の具体例としては、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などが挙げられる。
【０００５】
これらの増殖因子は、血液中や創傷部の浸出液中にも含まれている、そこで、研究的にこれらの測定が行われており、その量によって創傷病態を把握しようとする試みがなされている。しかしながら、上述の通り、個々の患者が持つ自然治癒力を正確に把握する方法については、現在までに報告例はなく、個々の患者に最適な治療はなされていないのが現状である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、創傷治癒を従来よりもより正確に予測できる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１記載の発明は、下記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させることによりあるいは培養することにより増殖因子の放出を誘導させ、該増殖因子の放出量を測定することを特徴とする、創傷治癒の予測方法である。
請求項２記載の発明は、体液が血液または創傷部浸出液であることを特徴とする、請求項１に記載の創傷治癒の予測方法である。
請求項３記載の発明は、増殖因子が形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）であることを特徴とする、請求項１に記載の創傷治癒の予測方法である。
【０００８】
【化１】
2008118930.tif 000002
【０００９】
本発明では、インビトロ系において、上記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させるか、あるいは培養する。この操作により、検体中の細胞から増殖因子が放出される。本発明では、この増殖因子の放出量を測定する。
【００１０】
本発明に用いる体液としては、特に限定されないが、例えば血液、創傷部浸出液等を用いることができる。これら体液の採取方法は特に限定されないが、臨床的に一般的な方法、例えば血液であればヘパリンなどの抗凝固剤を含む採血管を用いた採血などが用いられ、創傷部浸出液であればピペットなどを用いて吸引する方法などが用いられ得る。
また、本発明においては、体液をそのまま用いてもよいし、含まれる細胞成分を分離した後に使用してもよい。細胞分離の方法は特に限定されず、例えば遠心分離による方法、比重による分離法、細胞分離膜による方法などが適宜用いられ得る。
【００１１】
本発明において、上記ペプチドと体液あるいは体液に含まれる細胞とを接触させあるいは培養する際の検体量は、後に増殖因子を測定するのに十分な量であれば特に限定されない。また、その際の上記ペプチドの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとなるように調製する。
【００１２】
本発明において、上記ペプチドと体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させあるいは培養する際の容器等は特に限定されないが、個々の検体を生体に近い状態で反応させ、より正確な創傷治癒の予測を可能とするため、エンドトキシンなどの汚染や混入などがないものを用い、クリーン環境で操作することが好ましい。
また、上記の接触或いは培養は、通常はプレートや試験管等の容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが好ましい。
【００１３】
接触或いは培養の際の温度は、好ましくは１５〜４２℃であり、通常は３７℃付近の温度条件下で行われる。
また、培養の際の接触時間は、特に限定されない。
【００１４】
本発明において、放出された増殖因子を測定する方法は、特に限定されないが、例えば各種の酵素免疫測定法、酵素測定法、比色定量法、化学発光法等で行うことができる。
また、本発明で測定される増殖因子は、特に限定されないが、ＴＧＦ−βが好ましい。
【００１５】
次に本発明の一実施様態として、内部を減圧にすることが可能である測定容器に、上記式（Ｉ）で示されるペプチド及び血液抗凝固剤を収納して製造した測定容器を用いて、免疫機能を測定する方法を述べる。
まず、血管または採血容器と上記測定容器とを、例えばマルチプル注射針（両端が搾針でき、かつ連通されている採血針）を用いて連通させ、上記測定容器中に創傷患者の血液を吸入させる。これにより、血液細胞が上記式（Ｉ）で示されるペプチドと接触し、増殖因子が放出される。この増殖因子の量を上記の方法により測定することによって、創傷治癒を予測することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明では、上記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させあるいは培養することにより増殖因子の放出を誘導させ、該増殖因子の放出量を測定することにより、創傷治癒の予測を正確に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１８】
（実施例１〜２）
（ペプチドの調製）
理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を、酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）添加澱粉・アンモニウム培地５０ｍＬを含む５００ｍＬ容坂口スラスコ５本で、２６℃、１５０ｒｐｍ、１２０時間振盪培養（前々培養）した。続いて同培地１２Ｌを含む２０Ｌ容ジャーファメンターに前々培養菌液２４０ｍＬを接種し、２６℃、４１０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／分で２４時間培養（前培養）した。更に、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍＬ中に可溶性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０５ｇ、塩化アンモニウムを０．０５ｇ含む）１４０Ｌを含む２００Ｌ容ジャーファメンターに、前培養菌液１２Ｌを接種し、２６℃、２４時間種培養した。
【００１９】
次いで、澱粉・アンモニウム培地１４００Ｌを含む２０００Ｌ容タンクに、種培養菌液１４０Ｌを接種し、２６℃、１４０ｒｐｍ、通気量７００Ｌ／分、ｐＨ７．５で７日間培養した。
【００２０】
培養終了後、濾過により菌体を濾別した。このようにして得られた菌体６．３４ｋｇ（湿重量）のうち、菌体１ｋｇ（湿重量）にジクロロメタン３Ｌを加え、室温で１５時間攪拌後、菌体を濾別し、菌体抽出液を得た。菌体については、同操作を３回繰り返した。得られた菌体抽出液を濃縮後、シリカゲル担体１２０ｇに吸着させた。本吸着シリカゲル担体をシリカゲルカラムにより精製した。
【００２１】
シリカゲル担体８００ｇを充填した径８．０ｃｍのカラムに上記抽出物吸着担体約１２０ｇをチャージし、シリカゲルカラムを作成した。このシリカゲルカラムを下記の条件を用いて精製を行った。溶出溶剤として、ａ）ヘキサン：酢酸エチル＝４：６を４Ｌ、ｂ）酢酸エチルを３．５Ｌ、ｃ）メタノール２Ｌを、この順に流速５００ｍＬ／時間で流した。分画は、溶剤組成を変更する毎に行い、特に酢酸エチルの溶出画分は５００ｍＬずつ分画した（従って、酢酸エチルについては、溶出画分数は合計７画分となる）。
【００２２】
上記の各溶出画分について、それぞれ、ＯＤＳ−８０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×長さ２５．０ｃｍのカラム（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６０００、Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオーブン６５５Ａ−５２）によって、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で、溶離液として水：アセトニトリル＝３：７を用いて、純度を確認した。
【００２３】
上記のＨＰＬＣによる純度確認において、リテンションタイムが１２〜１５分で溶出されるピーク面積が、全溶出ピーク面積の８０％以上を占めることが確認されたシリカゲルカラム溶出画分を合わせ、同一画分とした。本画分を濃縮乾固後、メタノール−ジクロロメタン系を用いて繰り返し再結晶を行い、柱状結晶３．５ｇを得た。
【００２４】
この物質の構造は、種々の機器分析データよりＷＯ９６／１２７３２号公報に記載された物質と同一であり、上記式（１）で表されるペプチドであることがわかった。
得られたペプチドの機器分析データを以下に示す。
【００２５】
１．ＭＳ
・ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝９１３．６（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ）＋、９３１．６（Ｍ＋Ｈ）＋、９５３．６（Ｍ＋Ｎａ）＋
・ＨＲＦＡＢ−ＭＳ
Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ＝９１３．５０７９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ２Ｏ）＋、ｍ／ｚ＝９１３、９５３、９３１（９１３がメイン，９３１は非常に小さい）
Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ：Ｃ４５Ｈ６９Ｎ８Ｏ１２
ｍ／ｚ＝９１３．５０５３
【００２６】
２．ＩＲ
ＩＲ：３，４００ｃｍ−１：−ＯＨ，−ＮＨ
２，９００ｃｍ−１：アルキル基
１，７５０ｃｍ−１：−Ｃ（＝Ｏ），−Ｏ−
１，６５０ｃｍ−１：−Ｃ（＝Ｏ），−ＮＨ−
【００２７】
３．アミノ酸分析
加水分解物としてＤ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−Ｎ−メチル−フェニルアラニンが認められた。
【００２８】
（増殖因子の放出、測定）
Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（８週齢、雌性、日本クレア社）から、ヘパリン採血した。
この血液を、エンドトキシンフリー（抽出液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未満）のポリエチレンテレフタレート製採血管（内容量５ｍＬ、１２．６φ×７５ｍｍ、積水化学社製）に０．５ｍＬ添加し、さらに上記ペプチドのメタノール溶液（５μｇ／ｍＬ）を１０μＬ（上記ペプチドとして５０ｎｇ、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）添加した。次いで、管径に合うブチルゴム製の栓体で開口部を密栓した。
これを、３７℃で３時間インキュベートし、反応終了後、４℃、１６００Ｇで１０分間遠心分離して、上清を採取した。ここで得られた上清を検体として、ＴＧＦ−β１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を用いてＴＧＦ−β１量の測定を行った（Ａ）。
また、上記ペプチドのメタノール溶液のかわりに、上記ペプチドを含まないメタノールを使用した以外は、同様の操作を行った場合のＴＧＦ−β１量を測定した（Ｂ）。
上記により得られたＴＧＦ−β１測定値の差（Ａ−Ｂ）をＴＧＦ−β１放出量として算出した（実施例１）。
また、ｄｂ／ｄｂ系遺伝的糖尿病マウス（８週齢、日本クレア社）を用いて上記と同様の操作を行い、ＴＧＦ−β１放出量を算出した（実施例２）。
本試験は、それぞれ５匹のマウスを用いて行い、ＴＧＦ−β１放出量の平均値を求めた。
結果を表１に示した。
【００２９】
（マウス皮膚欠損モデルにおける治癒日数の評価）
Ｃ５７ＢＬ／６系マウス（８週齢、雌性、日本クレア社）及びｄｂ／ｄｂ系遺伝的糖尿病マウス（８週齢、日本クレア社）の背部を毛刈りし、背部正中線を中心に肩甲骨にまたがる直径１６ｍｍの欠損部（創面積２ｃｍ２）を、眼科用ハサミを用いて作成した後に、創面をポリウレタンドレッシング材（「バイオクルーシブ」、ジョンソンアンドジョンソン社）で覆った。なお、週３回の割合でポリウレタンフィルム材を交換し、創面を生理食塩水で洗浄した。本試験は、それぞれ５匹のマウスを用いて行い、創が完全に閉じて治癒するのに要した平均日数を求めた。
結果を表１に示した。
【００３０】
【表１】
2008118930.tif 000003
【００３１】
表１から明らかなように、正常マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系マウス）では極めて短時間で創傷の治癒がなされたが、遺伝的糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ系マウス）では創傷の治癒が有意に遅延した。
このとき、それぞれのマウスの血液から上記ペプチドにより放出されたＴＧＦ−β１量を比較すると、遺伝的糖尿病マウスで有意に低下していた。
以上から明らかなように、本発明による増殖因子放出量を測定することにより、創傷治癒を予測することができる。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
従来から、創傷治癒を予測することは非常に困難であったところ、本発明の方法を用いることにより、従来よりもより正確に創傷治癒を予測することが可能となり、結果として個々の患者に最適な治療を行うことができるようになる。即ち、本発明の方法は、疾病の治療等に極めて有用に用いられ得るものである。