【手続補正書】
【提出日】平成25年6月26日(2013.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンテルペノイド系炭化水素を、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
微細藻類微小コロニーを機械的に分散させる工程であって、分散が、細胞を破壊して内部を露出させること（break open）を実質的に伴わない、前記工程；
炭化水素を含有する有機溶媒を含む画分を入手するために、ヘキサン、ヘプタンまたはオクタンからなる群より選択される有機溶媒を用いてテルペノイド系炭化水素を抽出する工程；
有機溶媒画分中に存在するテルペノイド系炭化水素を分光光度的に定量する工程。
【請求項２】
有機溶媒中に存在するテルペノイド系炭化水素を分光光度的に定量する工程が、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いることを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
微細藻類がボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ボツリオコッカス・ブラウニーがボツリオコッカス・ブラウニー変種Showa（Botryococcus braunii, var Showa）である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
有機溶媒がヘプタンである, 前記のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
微細藻類微小コロニーを機械的に分散させる工程およびテルペノイド系炭化水素を抽出する工程が同時並行的に行われ、これらの工程が、有機溶媒中の微細藻類微小コロニーをガラスビーズの存在下でボルテックス処理する工程をさらに含む, 前記の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
微小コロニーを機械的に分断する前に、試料を約100℃に加熱する工程をさらに含む, 前記の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
微小コロニーを機械的に分断する工程が、微小コロニーを低出力で音波処理することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンを、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
炭化水素を含有するヘプタンを含む画分を入手するために、ボツリオコッカス微小コロニーをヘプタン中でガラスビーズの存在下でボルテックス処理する工程；ならびに
有機溶媒中に存在するボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンを、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて分光光度的に定量する工程。
【請求項１０】
ボツリオコッカス属種がボツリオコッカス・ブラウニーである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
細胞外ボツリオキサンチンをボツリオコッカス微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
緑藻微小コロニーを含む試料を提供する工程；
炭化水素を含有するヘプタンを含む画分を入手するために、ヘプタン中で微小コロニーをガラスビーズの存在下でボルテックス処理する工程；
ヘプタン画分中に存在するボツリオキサンチンを、約165±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて450nmで分光光度的に定量する工程。
【請求項１２】
微細藻類がボツリオコッカス・ブラウニーである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
ボツリオコッカス・ブラウニーが、ボツリオコッカスB品種のメンバーである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンテルペノイド系炭化水素を、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから得る方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
破壊されていない細胞および放出されたテルペノイド系炭化水素を含む水性懸濁液を入手するために、ボツリオコッカス微小コロニーを水性媒質中で機械的に分散させる工程；
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程；
テルペノイド系炭化水素をヘプタン、ヘキサンまたはオクタン中に溶解させる工程；および
ボツリオコッセン系炭化水素を、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて分光光度的に定量する工程。
【請求項１５】
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、テルペノイド系炭化水素を水性懸濁液の上部に浮遊させることを含む、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、水性懸濁液の遠心処理を含む、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
細胞外ボツリオキサンチンをボツリオコッカス微小コロニーから得る方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
破壊されていない細胞および放出されたボツリオキサンチンを含む水性懸濁液を入手するために、ボツリオコッカス微小コロニーを水性媒質中で機械的に分散させる工程；
ボツリオキサンチンを培地から分離する工程；および
ボツリオキサンチンを、約165±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて450nmで分光光度的に定量する工程。
【請求項１８】
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、テルペノイド系炭化水素を水性懸濁液の上部に浮遊させることを含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、水性懸濁液の遠心処理を含む、請求項17記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
1つのさらなる局面において、本発明は、細胞外C40カロテノイド系炭化水素、例えばボツリオキサンチン系炭化水素を微細藻類から抽出する方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：緑藻微小コロニーを含む試料を提供する工程；緑藻微小コロニーをヘプタン中でガラスビーズの存在下でボルテックス処理して、炭化水素を含有するヘプタンを含む画分を入手する工程；ヘプタン画分中に存在するボツリオキサンチン系炭化水素を、約165±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて450nmで分光光度的に定量する工程。典型的な態様において、微細藻類はボツリオコッカス・ブラウニーなどのボツリオコッカス属種、例えば、ボツリオコッカスB品種のメンバーである。
[本発明1001]
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンテルペノイド系炭化水素を、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
微細藻類微小コロニーを機械的に分散させる工程であって、分散が、細胞を破壊して内部を露出させること（break open）を実質的に伴わない、前記工程；
ヘキサン、ヘプタンまたはオクタンからなる群より選択される有機溶媒を用いてテルペノイド系炭化水素を抽出して、炭化水素を含有する有機溶媒を含む画分を入手する工程；
有機溶媒画分中に存在するテルペノイド系炭化水素を分光光度的に定量する工程。
[本発明1002]
有機溶媒中に存在するテルペノイド系炭化水素を分光光度的に定量する工程が、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
微細藻類がボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
ボツリオコッカス・ブラウニーがボツリオコッカス・ブラウニー変種Showa（Botryococcus braunii, var Showa）である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
有機溶媒がヘプタンである, 前記のいずれかの方法。
[本発明1006]
微細藻類微小コロニーを機械的に分散させる工程およびテルペノイド系炭化水素を抽出する工程が同時並行的に行われ、これらの工程が、有機溶媒中の微細藻類微小コロニーをガラスビーズの存在下でボルテックス処理する工程をさらに含む, 前記の本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
微小コロニーを機械的に分断する前に、試料を約100℃に加熱する工程をさらに含む, 前記の本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
微小コロニーを機械的に分断する工程が、微小コロニーを低出力で音波処理することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンを、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
ボツリオコッカス微小コロニーをヘプタン中でガラスビーズの存在下でボルテックス処理して、炭化水素を含有するヘプタンを含む画分を入手する工程；ならびに
有機溶媒中に存在するボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンを、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて分光光度的に定量する工程。
[本発明1010]
ボツリオコッカス属種がボツリオコッカス・ブラウニーである、本発明1009の方法。
[本発明1011]
細胞外ボツリオキサンチンをボツリオコッカス微小コロニーから抽出する方法であって、以下の工程を含む方法：
緑藻微小コロニーを含む試料を提供する工程；
ヘプタン中で微小コロニーをガラスビーズの存在下でボルテックス処理して、炭化水素を含有するヘプタンを含む画分を入手する工程；
ヘプタン画分中に存在するボツリオキサンチンを、約165±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて450nmで分光光度的に定量する工程。
[本発明1012]
微細藻類がボツリオコッカス・ブラウニーである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
ボツリオコッカス・ブラウニーが、ボツリオコッカスB品種のメンバーである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
細胞外ボツリオコッセンおよびメチル化スクアレンテルペノイド系炭化水素を、ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーから得る方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
ボツリオコッカス微小コロニーを水性媒質中で機械的に分散させて、破壊されていない細胞および放出されたテルペノイド系炭化水素を含む水性懸濁液を入手する工程；
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程；
テルペノイド系炭化水素をヘプタン、ヘキサンまたはオクタン中に溶解させる工程；および
ボツリオコッセン系炭化水素を、炭化水素の190nmでの吸光度に対して約90±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて定量する工程。
[本発明1015]
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、テルペノイド系炭化水素を水性懸濁液の上部に浮遊させることを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、水性懸濁液の遠心処理を含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
細胞外ボツリオキサンチンをボツリオコッカス微小コロニーから得る方法であって、以下の工程を含む方法：
ボツリオコッカス微細藻類微小コロニーを含む試料を提供する工程；
試料を30分間またはそれ未満にわたって約100℃に加熱する工程；
ボツリオコッカス微小コロニーを水性媒質中で機械的に分散させて、破壊されていない細胞および放出されたボツリオキサンチンを含む水性懸濁液を入手する工程；
ボツリオキサンチンを培地から分離する工程；および
ボツリオキサンチンを、約165±5mM-1cm-1の消衰係数を用いて450nmで分光光度的に定量する工程。
[本発明1018]
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、テルペノイド系炭化水素を水性懸濁液の上部に浮遊させることを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
テルペノイド系炭化水素を培地から分離する工程が、水性懸濁液の遠心処理を含む、本発明1017の方法。