【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年5月29日(2013.5.29)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】プロスタグランジン／シクロオキシゲナーゼの代謝経路の調節
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロオキシゲナーゼの活性およびプロスタグランジン合成酵素（シンターゼ）の活性に関与する代謝経路ならびにプロスタグランジンの合成を調節することを我々が発見し、結果として、それらのうちの幾つかが、以前の治療体制に対し非常に耐える（難治性である）と証明された種々の疾病および疾患の治療および予防において使用され得る一連の化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロタノイドとも呼ばれるプロスタグランジン（ＰＧｓ）は、生理学的なおよび病理学的な関係の両方において細胞機能を調節する、広く分布する群（グループ）の酸化脂質である。ＰＧｓの生合成は、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）により触媒された反応たる、細胞膜からの、主要な脂肪酸たるアラキドン酸（ＡＡ）の放出を通じ、開始される。放出されたＡＡは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）により不安定な酸化中間体（ＰＧＨ２）に変換される。一旦形成されたら、該ＰＧＨ２中間体は、プロスタグランジン合成酵素（シンターゼ、例えば、ＰＧＥ合成酵素もしくはＰＧＥ−Ｓ、ＰＧＤ合成酵素もしくはＰＧＤ−Ｓ等）と呼ばれる様々の特異的な酵素により、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、プロスタサイクリンＦ２α（ＰＧＦ２α）、もしくはプロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）のような種々のプロスタグランジンへと変換され得る。
【０００３】
ＣＯＸが、３種のアイソフォーム：ＣＯＸ−１、ＣＯＸ−２、および、ＣＯＸ−１のスプライシング変異体たる、ＣＯＸ−３において存在している。ＣＯＸ−１が、大抵の組織において構成的に発現される一方で、ＣＯＸ−２が、炎症誘発性サイトカインおよびストレスに応答して一般的に誘発される。これらの知見は、ＣＯＸ−２がプロスタノイドの有害な炎症誘作用の要因であるとの率直な見方に至った。これゆえ、ＣＯＸ−２の阻害が、炎症性疾患の治療用の薬剤を開発することにおいて主な標的と見なされている。しかしながら、研究者らは、ＣＯＸ−２が、臓器および組織の基底の恒常性において重要な役割をも果たすことを示している。
【０００４】
最近の臨床試験により、ＣＯＸ−２阻害剤を用いた長期の治療が、ＣＯＸ−２誘発ＰＧＩ２の血管保護効果の遮断に属された合併症たる、卒中および心筋梗塞の罹患率を増加させることが明らかになっている。しかしながら、ＣＯＸ酵素の遮断が、ＰＧＤ２の産生をも抑える。末梢組織において、ＰＧＤ２が、血管拡張を促進させ、血小板凝集を阻害する。脳において、最も潤沢なプロスタグランジンであり、最近の研究は、ＰＧＤ２が、海馬神経における神経保護効果を仲介することを示す。ＣＯＸ−２誘発ＰＧＤ２の遮断が、これゆえ、ＣＯＸ−２阻害剤を用いた臨床試験で観察される卒中および心筋梗塞の罹患の増加に寄与し得る。
【０００５】
ＰＧＤ２が、非常に短命であり、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて脱水して、プロスタグランジン１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）を包含する、Ｊ２系列の生物学的に活性なプロスタグランジンを生じる。このプロスタグランジンが、ＰＧＤ２の、天然の化学的に安定な抗炎症誘導体である。１５ｄ−ＰＧＪ２が、抗炎症作用を包含する、広範な細胞機能に関わるリガンド依存核転写因子であるペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する高親和性（アフィニティ）リガンドである。１５ｄ−ＰＧＪ２が、ＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）同様、ＰＰＡＲγ依存機序（メカニズム）を通じ、一酸化窒素合成酵素（シンターゼ）遺伝子、プロスタグランジンＥ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＥＳ）遺伝子、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）遺伝子のような幾つかの炎症遺伝子を抑制する。ラットコンドロサイトにおいて、１５ｄ−ＰＧＪ２は、サイトカインにより刺激されたＰＧＥ２合成およびＰＧＥＳ発現を殆ど完全に減少させており、これは、１５ｄ−ＰＧＪ２が、これらの細胞における炎症誘発性プロスタグランジンたるＰＧＥ２の産生のスウィッチを切る抗炎症メッセンジャーであることを指し示す。該機序（メカニズム）に関わらず、１５ｄ−ＰＧＪ２が、炎症の寛解相（フェーズ）の間、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて存在しており、さらに、炎症応答のフィードバック調節因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）として機能することのあることを示唆している。１５ｄ−ＰＧＪ２の投与が、炎症腸疾病のモデルたる、ラットにおける実験結腸炎の発生を抑えることも示されている。ＰＧＤ２および１５ｄ−ＰＧＪ２に有利にプロスタグランジン産生の状況を変える薬剤および状態が、これゆえ、抗炎症効果を有することが期待されると思われる。
【０００６】
中枢神経系において、１５ｄ−ＰＧＪ２の抗炎症作用が、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症のような神経変性疾患においても、炎症が、脳損傷および細胞死に寄与する、卒中、脊髄傷害、および脳外傷（トラウマ）においても有益たり得る。これらの病状の全てにおいて、脳損傷が、ミクログリアの過剰な活性化と関連する。中枢神経系において、その生来の常在免疫細胞たる、ミクログリアが、炎症過程（プロセス）における主要な役割を果たす。ミクログリアのコントロールされなかった活性化が、炎症サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６）、ＮＯ、ＰＧＥ２、および超酸化物（スーパーオキサイド）のような種々の物質を放出することにより、脳細胞に対し直接、毒性であり得る。幾つかの研究は、１５ｄ−ＰＧＪ２が、活性化されたミクログリア細胞およびアストロサイトによる炎症サイトカインおよびＮＯの産生を抑制し得ることを示し、これらプロスタグランジンが、グリア細胞の過剰な活性化と関連する脳損傷を防ぐことにおいて重要な役割を果たし得ることを示唆している。多発性硬化症に関する動物モデルたる、実験自己免疫脳炎（ＥＡＥ）前、および、この発病時における１５ｄ−ＰＧＪ２の投与が、ＥＡＥの重篤さを有意に抑えたという知見は、更に、１５ｄ−ＰＧＪ２が、炎症神経変性疾病における脳損傷を防ぐことにおいて有効であることを示唆する。
【０００７】
最近の実験研究は、１５ｄ−ＰＧＪ２が、ラットにおける脳内出血後の脳組織炎症および行動機能障害および神経損失を抑え、卒中の実験モデルにおける虚血再灌流傷害から脳を保護することを示す。１５ｄ−ＰＧＪ２の（脳）室内点滴が、ＰＰＡＲγ依存的な様式で、脳梗塞の体積を抑え、脳および神経のアポトーシスを阻害し、ＮＦ−κＢの活性化を抑圧し、強力な内因性抗酸化剤たる、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）を上方修正（アップレギュレーション）させた。虚血性卒中における１５ｄ−ＰＧＪ２の神経保護効果を示唆するこれらの結果は、急性虚血性卒中を有する患者が、通常の被験者よりも高い血漿でのレベル（濃度）の１５ｄ−ＰＧＪ２を有すること、および、血漿１５ｄ−ＰＧＪ２の増加が、より良好な初期および後期の神経学的結論と関連することを示す最近の研究により更に確証される。血漿１５ｄ−ＰＧＪ２の増加も梗塞の体積の抑制と関連するが、この効果が、他の重要な予後変数の効果から独立していた。１５ｄ−ＰＧＪ２に有利なプロスタグランジン産生の平衡（バランス）をずらす（シフトさせる）薬剤および病状が、これゆえ、アルツハイマー氏病（ＡＤ）、パーキンソン氏病（ＰＤ）、および多発性硬化症のような慢性炎症性神経変性疾患、ならびに卒中、脊髄傷害、および外傷（トラウマ）脳傷害のような急性病状の両方における、有益な効果を有することが期待され得る。
【０００８】
ＡＤは、脳における細胞外でのアミロイドβ（Ａβ）斑の付着および細胞内での絡まりの形成により特徴付けられる進行性で致命的な神経変性疾患である。Ａβ斑は、アミロイドβペプチドおよびＡβペプチドから主に構成される。Ａβの蓄積は、ＡＤの病原に寄与すること、および神経の損傷を増加させることが提唱される炎症応答を起こす。可溶性のＡβペプチドの脳でのレベルの増加も、斑が付着するかなり（ｌｏｎｇ）前に、神経機能障害および認知障害を起こすと考えられる。脳におけるＡβペプチドの形成が、これゆえ、ＡＤの病原の主な引き金である。
【０００９】
Ａβの発生は、当該ＡβペプチドのＮ末側において、βアミロイド前駆体蛋白（βＡＰＰ）たる、より大きい前駆体蛋白を開裂させるプロテアーゼにより開始される。βセクレターゼもしくはβ位ＡＰＰ開裂酵素（ＢＡＣＥ１）とも呼ばれる、このプロテアーゼは、膜貫通アスパラギン酸プロテアーゼである。ＢＡＣＥ１蛋白のレベルおよびβセクレターゼの産物（βＣ末断片）が、散発性ＡＤ患者の脳において増加する。ＡＤ脳におけるＡβ産生を抑えることが、これゆえ、主要な治療課題である。
【００１０】
ＢＡＣＥ１のｍＲＮＡでのおよび蛋白でのレベルが、炎症誘発性メディエーターにより増加され、ペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター）γ（ＰＰＡＲγ）へのアゴニストである薬剤により下方制御（ダウンレギュレーション）されることが、報告されている。より最近、ＰＰＡＲγの欠損が、ＢＡＣＥ１遺伝子プロモーター活性を増加することにより、βセクレターゼのｍＲＮＡのレベルを増強させる一方で、ＰＰＡＲγの過剰発現が、ＰＰＡＲγ活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）同様、ＢＡＣＥ１遺伝子プロモーター活性を抑制することにより、ＢＡＣＥ１の転写を特異的に調節することも示されており、ＰＰＡＲγが、ＢＡＣＥ１のレプレッサーたり得ることを示唆している。さらに、ＰＰＡＲγアゴニストを用いた遺伝子導入（トランスジェニック）ｈＡＰＰマウスの治療が、皮質神経におけるＢＡＣＥ１のｍＲＮＡのレベルと、細胞内β−アミロイドのレベルとの両方を抑えた。
【００１１】
ＰＰＡＲγの過剰発現が、ユビキチン化の活性化および前駆体蛋白たるβＡＰＰのプロテオソームにより仲介された劣化を介して培養された細胞におけるＡβ分泌を抑えることも示されており、ＰＰＡＲγの活性化が、培養における細胞に外部付加されたＡβの安定性に直接影響を及ぼすことが報告された。安定性におけるこの減少は、ＰＰＡＲγの活性化が、アミロイドペプチドに関する急速な細胞クリアランスの機序（メカニズム）を誘発させ得ることを示唆する。
【００１２】
要するに、これらのデータが、アミロイド−βの発生の調節におけるＰＰＡＲγに関する主要な役割を裏付け、ＰＰＡＲγの活性化が、脳におけるアミロイド−βペプチドの産生を減少させる保護機序（メカニズム）を示唆する。
【００１３】
ペルオキシソーム増殖因子（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ）活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する高親和性（アフィニティ）リガンドたる、１５ｄ−ＰＧＪ2が、ＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）同様、ＰＰＡＲγ依存機序（メカニズム）を通じ、幾つかの炎症遺伝子を抑制する。１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる状態が、これゆえ、脳炎症過程（プロセス）を抑圧することと、ＡＤ脳におけるアミロイドペプチド形成を抑えることの両方で、期待され得る。それ故に、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる剤および状態が、アルツハイマー病の治療において有益な効果を有することが期待され得る。
【００１４】
Ｊ２系列のプロスタグランジンが、神経成長因子（ＮＧＦ）および脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）の産生の強力な誘発因子（ｉｎｄｕｃｅｒｓ）であり、細胞培養におけるＮＧＦによる神経突起伸長を促進させる。１５ｄ−ＰＧＪ２の神経突起促進能力が、ＰＰＡＲγを通じて起きず、これは、合成ＰＰＡＲγアゴニストおよびアンタゴニストが、１５−デオキシ−ＰＧＪ2の神経突起促進効果を変えなかったからである。動物での研究において、ＮＧＦの脳室内投与が、コリン作動神経を救い、軸索の成長を刺激し、コリン作動機能を向上させることが示されている。同様に、ＮＧＦの脳室内注入が、脳虚血に付されたジャービル（荒れ地ネズミ）の海馬における神経の死を弱めた。ＢＤＮＦが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて発生するニューロンの生存および成長を促進させ、動物モデルにおける運動ニューロンの機能を向上させることが示されている。一過性の前脳虚血に付された動物において、ＢＤＮＦが、虚血神経傷害を弱めた。不運にも、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するこれらの神経栄養の乏しい浸透により、臨床試験では、有意な効果を示さない。しかしながら、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性のレベルを増加させる状態もしくは治療が、これらの成長因子を局所での（ｌｏｃａｌ）産生を容易化させることと、神経の成長を促進させ、このため脊髄におけるおよび脳における神経の修復を容易化させることの両方で、期待され得る。
【００１５】
炎症マーカーのレベルの増加が、虚血血管疾病と関連しており、炎症が、急性冠状動脈症候群（シンドローム）の病原において関与することが次第に考えられる。炎症が、アテローム性動脈硬化症開始および進行に関連する役割を有するが、凝固過程（プロセス）を活性化することによる血栓症の発生における主な役割をも果たし得る。血管炎症を抑える状態および薬剤が、これゆえ、冠状動脈性心臓疾病のような、細胞死もしくは細胞損傷に炎症が寄与する心臓血管疾患において有益たり得る。
【００１６】
プロスタグランジンＤ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＤＳ）ｍＲＮＡが、心臓において発現される。これゆえ、局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）産生されたＰＧＤ２が、筋細胞もしくは周囲の細胞における１５ｄ−ＰＧＪ２を結果与えることがある。ＰＰＡＲγも、心筋細胞において存在しており、機能している。最近の研究は、ＰＧＤ２の天然の代謝産物たる、１５ｄ−ＰＧＪ２が、ＰＰＡＲに依存する様式で、ＩＬ−１β刺激ＣＯＸ−２、ＰＧＥ−Ｓ、およびｉＮＯＳを調節することにより、心筋細胞において、抗炎症効果を発揮することを示した。１５ｄ−ＰＧＪ2は、ＰＧＥ２産生のＩＬ−１β刺激をブロックしたが、ＰＧＩ２のＩＬ−１β刺激もＰＧＦ２αのＩＬ−１β刺激を変更しなかった。これは、ＰＰＡＲγリガンド作用が、ＰＧＥ−Ｓ特異的であることを示す。１５ｄ−ＰＧＪ２によるＩＬ−１β誘発ＰＧＥ−Ｓのブロックが、心臓組織における炎症誘発性プロスタグランジンＰＧＥ２の産生を減少させることが期待され得る。１５ｄ−ＰＧＪ２が、心筋細胞におけるヘメオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）の発現を上方修正（アップレギュレーション）し、局所虚血再灌流誘発心筋梗塞のラットモデルにおける心筋梗塞の大きさを抑えることも示されている。１５ｄ−ＰＧＪ２は、梗塞の大きさにおいて、研究された異なるＰＰＡＲγリガンドの中で最も著しい抑制を生じた。この効果が、ＰＰＡＲγにより仲介される一方で、抗酸化性かつ細胞保護蛋白たるＨＯ−１の発現の増加が、ＰＰＡＲγ非依存的であった。要するに、これらの結果は、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性のレベルを増加させる状態および薬剤が、血管炎症を抑え、これゆえ、心臓血管疾患において有益たり得ることを示唆する。
【００１７】
更なる証拠が、特に肥満存在下、循環炎症因子の主要な源として脂肪組織を同定する。脂肪は、炎症誘発性アジポサイトカインを産生し、これらが、ＴＮＦ−α、レプチン、ＰＡＩ−１、ＩＬ−６、およびアンジオテンシノーゲンを包含する。ＴＮＦ−αが、ＮＦκＢの主要な活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）である。ＴＮＦ−αが、インシュリンシグナルをも阻害し、これにより、インシュリン抵抗性を起こしている。ＰＡＩ−１のレベルが、ＣＡＤおよび糖尿を予測し、これらが、肥満における血栓誘発状態に対する主要な寄与因子（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ）である。ＩＬ−６が、Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）の肝臓での産生を刺激し、肥満患者の血清中の高感受性（ｈｓ）ＣＲＰのレベルの上昇に寄与する。ＨｓＣＲＰが、心筋梗塞、卒中、末梢動脈疾患、および突然死を予測する。アンジオテンシノーゲンが、ＡｎｇＩＩ前駆体であり、血管傷害の多重の機序（メカニズム）を活発化させるとよく知られている。一般的に、これらのアジポカインの全てが、炎症誘発環境を創出する内臓脂肪度の増加を有するインシュリン抵抗性被験者において上昇する。２型糖尿（Ｔ２Ｄ）および肥満が、これゆえ、炎症性状態である。６
【００１８】
脂肪組織が、他の組織に比べ、最高レベルのＰＰＡＲγを発現する。ＰＰＡＲγリガンドが、脂肪細胞分化、および、脂肪組織への遊離脂肪酸の取り込みを促進させる。これらが、ＴＮＦ−α、ＰＡＩ−１、およびＩＬ−６の発現を減少させ、脂肪におけるアジポネクチン発現を増加させることによる炎症促進環境を弱めることに重要な効果をも有する。これゆえ、ＰＰＡＲγの活性化が、血管細胞において直接、脂肪組織における遺伝子発現の制御を通じて間接的に炎症を抑圧する。
【００１９】
Ｔ２Ｄおよび代謝症候群（メタボリックシンドローム）が、骨格筋、肝臓、および脂肪組織を包含する、末梢組織におけるインシュリンの作用に対する抵抗性により特徴付けられる。チアゾリジンジオンのような、特定のこれら合成リガンドによるＰＰＡＲγの活性化が、Ｔ２Ｄの齧歯類モデルにおけるインシュリン分泌を刺激することなく、インシュリン感受性を向上させ、葡萄糖（グルコース）、トリグリセリド、および遊離脂肪酸の循環レベルを低くする。ＰＰＡＲγアゴニストが、ヒトにおける末梢でのインシュリン抵抗性をも軽くさせ、Ｔ２Ｄ患者の治療において有効に使用されている。
【００２０】
１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（レセプター）亜型（サブタイプ）たるＰＰＡＲγに関する推定内因性の、高親和性（アフィニティ）リガンドであるように思われる、天然の化学的に安定な抗炎症プロスタグランジンである。これゆえ、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる薬剤および状態は、血管炎症を抑圧することと、２型糖尿におけるインシュリン感受性を向上させることの両方とも期待され得る。
【００２１】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−アルファのような、炎症誘発性サイトカインが、乾癬およびアトピー皮膚炎において過剰発現される。ＴＮＦ−αが、炎症の開始と持続との両方における重要な役割を果たしており、最近の実験データが、乾癬の実験モデルにおける病巣の進行が、ＴＮＦ−αにより仲介されることを示す。乾癬の病原におけるＴＮＦ−αに関する役割を示唆するこれらの知見は、ＴＮＦ−α（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）もしくは可溶性ＴＮＦ受容体（レセプター）融合蛋白（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の投与が乾癬患者における疾病の改善を与えたことを示す最近の臨床試験の結果により裏付けられている。。
【００２２】
プロスタグランジンＰＧＤ２の化学的に安定な代謝産物たる、１５ｄ−ＰＧＪ2が、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（レセプター）γ（ＰＰＡＲγ）に関する高親和性（アフィニティ）リガンドである。
【００２３】
１５ｄ−ＰＧＪ２が、誘発型ＮＯ合成酵素（シンターゼ、ｉＮＯＳ）の遺伝子および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の遺伝子を包含する、ミクログリア細胞におけるおよびヒトアストロサイトにおける、活性化マクロファージにおける幾つかの炎症誘発性遺伝子を抑制し、この抑制が、ＰＰＡＲγ発現に少なくとも一部依存している。さらに、インシュリン感受性化チアゾリジンジオンのような、合成ＰＰＡＲγリガンドが、ヒト被験者における乾癬を改善させると示されている。要するに、これらの知見が、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性の産生を増加させる薬剤および状態が、乾癬の治療において有効たり得ることを示唆する。
【００２４】
最近の証拠は、特定の合成ＰＰＡＲγアゴニストが、多くの上皮由来ヒト癌細胞株に対し、中程度の抗増殖活性を呈することを指し示す。さらに、最近のデータが、通常の前立腺上皮細胞およびＴリンパ球が、これらのＰＰＡＲγリガンドによるアポトーシスの誘発に対し、より抵抗性であることを指し示す。この癌特異的な効果の観点からと、化学防疫剤としてのＰＰＡＲγアゴニストの有効的な使用が、沢山の注目を受けている。
【００２５】
ＰＰＡＲγに関する天然リガンドたる、１５ｄ−ＰＧＪ２が、抗腫瘍活性を保有するとも示されている。例えば、１５ｄ−ＰＧＪ２が、有意に、細胞成長を阻害し、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、および肝癌細胞を包含する、幾つかの型の癌細胞におけるアポトーシスを誘発させる。機序（メカニズム）の研究が、これらの成長阻害効果が、ＰＰＡＲγ非依存機序（メカニズム）により仲介されていることを示唆する。しかしながら、関与された機序（メカニズム）に関わらず、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性レベルを増加させる薬剤もしくは状態が、腫瘍成長および進行を阻害することが期待され得る。
【００２６】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）のレベルの増加が、種々の悪性疾患において検出されている。幾つかの方面の証拠が、腫瘍におけるＰＧＥ２のレベルの上昇との知見を越え、ＰＧＥ２が癌の発生および進行における役割を果たすことを示唆する。例えば、ＰＧＥ２が、細胞増殖および運動性を刺激し得る一方、アポトーシスおよび免疫監視を阻害する。重要なことに、ＰＧＥ2が、血管内皮成長因子を包含する血管新生促進因子の産生を高めることにより、少なくとも一部、血管新生をも誘発させ得る。これらの知見と一貫し、癌組織標本におけるより高いレベルのＰＧＥ２が、転移性疾病の発病および腫瘍血管新生の増加と有意に相関すると示されている。
【００２７】
実験動物における最近の研究は、ＰＧＥ２が、発癌を促進させ得ることも示唆する。ＰＧＥ２受容体（レセプター）たるＥＰ２の遺伝子の分断が、実験の腫瘍の数およびサイズを減少させることが見いだされたが、他の研究が、抗ＰＧＥ２モノクローナル抗体を用いた処理が、移植可能な腫瘍の成長を阻害したことを示した。この背景（バックグラウンド）を受けて、癌におけるＰＧＥ２の増加した量に至るこれら酵素の経路を阻害する薬剤および状態が、腫瘍成長の進行をも阻害することを期待し得る。
【００２８】
アラキドン酸からのＰＧＥ２の合成が、続けて作用する２酵素、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびプロスタグランジンＥ合成酵素（シンターゼ、ＰＧＥＳ）を必要とする。ＰＧＥＳ発現の増加が、幾つかのヒト悪性腫瘍において検出されており、異常な（ａｂｅｒｒａｎｔ）ＰＧＥＳ発現が、細胞増殖および腫瘍成長に寄与するＰＧＥ２の産生の増加を推進する可能性を惹起させている。１５ｄ−ＰＧＪ２が、サイトカイン誘発ＰＧＥ２合成および膜ＰＧＥ合成酵素（シンターゼ）発現を殆ど完全に阻害すると報告されている。それゆえ、１５ｄ−ＰＧＪ２の内因性レベルを増加させる薬剤および状態が、ＰＧＥ２合成を抑え、このため細胞増殖および腫瘍成長を抑えること、これゆえ、癌の治療において有益な効果を有することが期待される。。
【００２９】
我々が、以前、内因性７−ヒドロキシステロイドたる、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロン（７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ）が、神経保護効果と心臓保護効果との両方を有することを示している（国際公開（ＷＯ）０２／００２２４、国際公開（ＷＯ）０２／００２２５、および国際公開（ＷＯ）０３／０１５７９１）。該ステロイドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて（器官型海馬スライス培養（ＯＴＨＳＣ）およびＰＣ１２細胞）神経細胞死に対し、および、ｉｎ ｖｉｖｏにおける数多くの実験モデルにおける脳損傷に対して保護し、灌流ラット心臓における虚血誘発局所心筋梗塞に対して保護することにおいて有効である。要するに、これらの知見は、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、卒中、脊髄傷害、外傷（トラウマ）脳傷害、およびＡＤのような神経変性病状の予防および治療において、ならびに心筋梗塞（ＭＩ）のような心臓血管病状において、有益な効果を有し得ることを示唆する。
【００３０】
より最近、我々は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤たる、インドメタシンを用いるＰＣ１２細胞のインキュベートが、虚血に対する７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ誘発保護を完全に平坦化させたことを示している。これらの結果は、ＣＯＸ活性が７β−ＯＨ−ＥＰＩＡのこれら神経保護効果に必要とされることを示唆する。
【００３１】
今回、我々は、ナノモル濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いたヒト単球血液細胞（ｈＭＢＣ）のインキュベートが、プロスタグランジン１５−デオキシ−Δ１２，１４−Ｊ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）産生における１０倍に近い増加を起こさせることを示す。この７−ヒドロキシステロイドのこの効果が、１５ｄ−ＰＧＪ２特異的であるように見えるのが、これは、該ステロイドが、これらの細胞におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）産生を有意に代えなかったからである。対照的に、炎症誘発性サイトカインたる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦα）を用いたｈＭＢＣのインキュベートが、およそ３倍、両プロスタグランジンの産生を増加させた。さらに、ＴＮＦ−αと７β−ＯＨ−ＥＰＩＡとを用いた同時インキュベートが、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ単独を用いて観察された増加に似た、１５ｄ−ＰＧＪ２における増加を起こした一方で、ナノモル濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの添加が、ＴＮＦαによるＰＧＥ２におけるこれら増加を完全に消失させた。
【００３２】
１５ｄ−ＰＧＪ２が、ラットコンドロサイトにおけるサイトカイン誘発ＰＧＥ２合成および膜ＰＧＥ合成酵素（シンターゼ、ｍＰＧＥＳ）発現を殆ど完全に阻害すると報告されており、１５ｄ−ＰＧＪ２が、これらの細胞における炎症誘発性プロスタグランジンＰＧＥ２の産生を止める抗炎症メッセンジャーであることを指し示している。我々の知見は、これゆえ、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡによる炎症誘発性プロスタグランジンＰＧＥ２のＴＮＦ−α誘発産生の阻害が、１５ｄ−ＰＧＪ２の放出の増加により仲介されることを指し示し得る。
【００３３】
１５ｄ−ＰＧＪ２が、抗炎症作用、神経保護作用、心臓保護作用、代謝作用、および抗腫瘍作用を包含する、広範な細胞機能に関与するリガンド依存核転写因子たる、ペルオキソーム増殖因子活性化受容体（レセプター、ＰＰＡＲ）亜型（サブタイプ）ＰＰＡＲγに関する、高親和性（アフィニティ）リガンドである。今回、我々は、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡのような薬剤が、１５ｄ−ＰＧＪ２産生を選択的に促進し得、そして、炎症腸疾病および乾癬のような炎症および皮膚疾患、ならびに炎症が機能不全および細胞死に寄与する、卒中、脊髄傷害、外傷（トラウマ）脳傷害、ＡＤ、ＰＤ、冠状動脈性心臓疾病および２型糖尿のような神経学的疾患、心臓血管疾患および代謝疾患、ならびにＰＧＥ２産生の増加が、細胞増殖および腫瘍成長に寄与する種々の型の癌において、有益たり得ることを発見している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これゆえ、一つの態様において、本発明は、高められたレベルのプロスタグランジンＥ２もしくはシクロオキシゲナーゼの他の代謝産物、およびプロスタグランジン合成酵素（シンターゼ）活性により仲介される病状の治療もしくは予防用、または１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２のレベルの抑制もしくはアベイラビリティの抑制により悪化した病状の治療もしくは予防用の医薬品の製造のための、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高める薬剤の使用にある。
【００３５】
更なる態様において、本発明は、高められたレベルのプロスタグランジンＥ２もしくはシクロオキシゲナーゼ−２の他の代謝産物により仲介される病状の治療もしくは予防用、または１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２のレベルの抑制もしくはアベイラビリティの抑制により悪化した病状の治療もしくは予防用医薬品の製造のための、炎症を発生する薬剤の存在下での、１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を促進し、プロスタグランジンＥ２産生を選択的に阻害する薬剤の使用にある。
【００３６】
別のある一態様において、本発明は、神経突起伸長を促進させるための、もしくは末梢ニューロパシーを治療するための医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高める薬剤の使用にある。
【００３７】
末梢ニューロパシーが、シスプラチンのような化学療法剤を用いる治療によるものであり得るか、または糖尿ニューロパシーのような他の原因によるものであり得る。
【００３８】
尚更なる態様において、本発明は、ＰＰＡＲγの活性化を必要とする病状を治療する医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高め、同様にＰＰＡＲγを活性化させる薬剤の使用にある。
【００３９】
また別の一態様において、本発明は、癌の治療もしくは予防用の医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高める化合物の使用を提供する。
【００４０】
尚更に、本発明は、癌細胞増殖を阻害するか、癌細胞におけるアポトーシスを誘発するか、もしくは腫瘍の成長および進行を阻害するための医薬品の製造のための１５−デオキシ−プロスタグランジンＪ２産生を高める化合物の使用を提供する。
【００４１】
本発明の態様が特に有用である癌細胞としては、結腸直腸癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、甲状腺乳頭癌細胞、および食道癌細胞が挙げられる。
【００４２】
加えて、本発明の化合物は：
炎症と関連する疼痛；
重度肢虚血のような末梢動脈疾患（四肢に至る血流を弱め、末梢アテローム性動脈硬化症により起こされる疾患を含む）およびこれらの後遺症；
虚血心疾病（例えば、安定および不安定狭心症）および心筋梗塞（ＭＩ）のような冠状動疾患病並びにこの後遺症；
卒中および一過性虚血発作（ＴＩＡ）のような脳血管疾病およびこの後遺症；
肝臓および腎臓の虚血、例えば、アテローム性硬化性腎臓動脈狭窄；
２型糖尿、および末梢動脈疾患、冠状動脈疾患、腎臓の脈管疾病、および糖尿ニューロパシーのようなその後遺症のような代謝疾病；
肥満、および、２型糖尿、末梢動脈疾患、および冠状動脈疾患のようなその後遺症；
喘息および慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）、例えば、慢性気管支炎のような炎症性気道疾患；
アルツハイマー氏病、パーキンソン氏病、多発性硬化症、および末梢ニューロパシーのような慢性神経変性疾病；
外傷（トラウマ）脳傷害および脊髄傷害のような急性神経学的変性病状；
炎症腸疾病；
リューマチ関節炎、および、一次性および二次性骨関節炎、ならびにこれらの後遺症のような関節軟骨の変性により特徴付けられる炎症性疾病；
創傷治癒；ならびに
化学療法剤により起こされる毒性もしくは末梢ニューロパシー
の治療および予防において使用され得る。
【００４３】
好ましくは、これらの薬剤が、糖尿およびこの後遺症；虚血血管疾病；炎症と関連する疼痛；炎症性皮膚症状；脊髄損傷；末梢ニューロパシー；多発性硬化症；炎症性腸疾病；リューマチ関節炎、代謝症候群（メタボリックシンドローム）Ｘ、肥満、肢端巨大症、および創傷治癒を治療するために使用され得る。
【００４４】
前記薬剤が、例えば、肝臓および腎臓の虚血により起こされるような例えば、肝臓および腎臓などの末梢臓器の炎症性疾患のような病状の治療もしくは予防においても有用であり得る。
【００４５】
これらの薬剤により治療され得る他の炎症性病状としては、喘息、鼻炎、気管支炎、および慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）のような炎症性気道疾病が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
本発明は、添付される図面により例証されており、ここで、そして今後、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンは、本明細書において、以下７β−ＯＨ ＥＰＩＡという。これら図面において：
【図１】実施例１における別々の４実験からの平均百分率（％）細胞死の総合データを示す。
【図２】実施例１において報告された別々の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図３】実施例１において報告された別々の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図４】実施例１において報告された別々の実験における平均百分率（％）細胞死を示す。
【図５】図５（ａ）および図５（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の細胞上清中に検出されるＰＧＤ２レベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させることの効果を示す。
【図６】図６（ａ）および図６（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の細胞上清中に検出されるＰＧＥ２レベルへの、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させることの効果を示す。
【図７】図７（ａ）および図７（ｂ）が、実施例２において報告されたとおり、ＴＮＦ−α存在下および非存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた末梢血単核（球）の細胞上清中に検出される１５ｄ−ＰＧＪ２レベルへの、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させることの効果を示す。
【図８】図８が、実施例４においてより詳しく記載されたとおり、結腸組織における、（Ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに（Ｂ）Ｐｒｏｔ ＣＯと呼ばれる酸化ストレスマーカー、（Ｃ）Ｔｂａｒｓ、および（Ｄ）抗酸化剤マーカーたるＧＳＨへの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療の効果を示す。
【図９】図９が、実施例４における７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療中の種々の期間における、結腸での１５ｄ−ＰＧＪ２レベル（Ａ）、ならびにＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの相対的なｍＲＮＡ発現の定量（Ｂ）を示す。
【図１０】図１０が、実施例４におけるＤＳＳ投与の中の、プロスタグランジンＥ２、Ｄ２、および１５ｄ−ＰＧＪ2の結腸での合成への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果を示す。
【図１１】図１１が、実施例４における結腸炎誘発の中の、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの結腸での発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明において使用され得る化合物が、式（Ｉ）：
【００４８】
【化１】
2010511028.tif 000001
の化合物ならびにこれらの薬学的に許容可能な塩およびエステルを包含し、式中：
この破線の円は、これを含有する環が全部飽和されていてよくまたは１本、２本もしくは３本の炭素−炭素２重結合を有していてもよいことを示し；
この破線は、この結合が炭素−炭素単結合もしくは炭素−炭素２重結合であってよいことを示し；
Ｒ１が、水素原子もしくはメチル基を表し；
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、互いと同一もしくは異なっており、各々が、オキソ基、水酸（ヒドロキシ）基、メルカプト（基）、水素原子、ハロゲン原子、アルコキシ基、アリールオキシ基、もしくはアシル基を表す。
【００４９】
上の式中の数字（３）および数字（７）が、用いられたナンバリング方式を示すためのガイダンスのみのためである。勿論、Ｒ２が、オキソ基を表す場合、この破線の円が、全部飽和された環（該環において２重結合が全くないという意味）または１本もしくは２本の２重結合しか表さなくてよい。
【００５０】
これらの化合物のうち、好ましい化合物が、式（ＩＩ）：
【００５１】
【化２】
2010511028.tif 000002
の化合物（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルを包含する。
【００５２】
これらの化合物の好ましい別の分類（クラス）が、式（ＩＩＩ）：
【００５３】
【化３】
2010511028.tif 000003
の化合物（式中、Ｒ２ａが、オキソ基、水酸（ヒドロキシ）基、メルカプト基、もしくはハロゲン原子を表し；Ｒ１、Ｒ３、およびＲ４が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルである。
【００５４】
これらの化合物の尚更に好ましい分類（クラス）が、式（ＩＶ）：
【００５５】
【化４】
2010511028.tif 000004
の化合物（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、上で定義されたとおりである）およびこれらのエステルである。
【００５６】
これらの化合物の更に好ましい分類（クラス）が、式（Ｖ）：
【００５７】
【化５】
2010511028.tif 000005
の化合物であり、式中、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、上で定義されたとおりである。
【００５８】
式（ＩＩ）の化合物の例が、式（ＩＩａ）：
【００５９】
【化６】
2010511028.tif 000006
を有する、７−ヒドロキシテストステロン、および、このエステルを包含する。この化合物における７−水酸（ヒドロキシ）基が、このαもしくはβの配置にあってよく、または、これら２種の異性体（アイソマー）の混合物が使用されていてよい。
【００６０】
式（ＩＩＩ）の化合物の例が、式（ＩＩＩａ）：
【００６１】
【化７】
2010511028.tif 000007
を有する、７α−ヒドロキシデヒドロＥＰＩアンドロステロン（７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ）およびこのエステル、ならびに、式（ＩＩＩｂ）：
【００６２】
【化８】
2010511028.tif 000008
を有する、７β−類似体およびこのエステル、ならびに、式（ＩＩＩｃ）：
【００６３】
【化９】
2010511028.tif 000009
を有する、７β−ヒドロキシ−プレグネノロンおよびこのエステル、ならびに、７α−ヒドロキシ類似体およびこのエステルを包含する。
【００６４】
式（ＩＶ）の化合物の例が、７−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンを包含し、この７α異性体（アイソマー）もしくはこの７β異性体（アイソマー）およびこれらのエステルの形態にあってよい。７β−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンは、本明細書において、以下７β−ＯＨ ＥＰＩＡと称し、式（ＩＶａ）：
【００６５】
【化１０】
2010511028.tif 000010
を有する、一方７α−ヒドロキシＥＰＩアンドロステロンは、本明細書において、以下７α−ＯＨ ＥＰＩＡと称し、式（ＩＶｂ）：
【００６６】
【化１１】
2010511028.tif 000011
【００６７】
を有する。
【００６８】
式（Ｖ）の化合物の例が、式（Ｖａ）：
【００６９】
【化１２】
2010511028.tif 000012
を有する、７β−ヒドロキシ−１７β−エストラジオールおよびこのエステル、およびその７α−類似体およびこのエステル、ならびに、式（Ｖｂ）：
【００７０】
【化１３】
2010511028.tif 000013
を有する、７β−ヒドロキシ−エストロンおよびこのエステル、およびその複数の７α−類似体およびこのエステルである。
【００７１】
本発明のこれら化合物において、Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ３、もしくはＲ４が、ハロゲン原子を表す場合、これが、弗素原子、塩素原子、臭素原子、もしくは沃素原子であってよく、好ましくは塩素原子である。
【００７２】
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ３、もしくはＲ４が、アルコキシ基を表す場合、これが、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖基もしくは分岐鎖基であってよい。このような基の例としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、２級ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、およびヘキシルオキシ基が挙げられる。
【００７３】
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ３、もしくはＲ４が、アリールオキシ基を表す場合、これが、好ましくはフェノキシ基もしくはナフチルオキシ基である。
【００７４】
Ｒ２、Ｒ２ａ、Ｒ３、もしくはＲ４が、アシル基を表す場合、これが、例えば、脂肪族アシル基もしくは芳香族アシル基であってよい。脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、およびヘキサノイル基のような、１〜６個の炭素原子を有する基が挙げられる。芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、ナフトイル基、およびトルオイル基が挙げられる。
【００７５】
該化合物が、式−ＯＲ基を含有し、式中、Ｒが、Ｒ２などに関して上記で定義された基および原子のいずれかである場合、該活性種が、遊離水酸（ヒドロキシ）基を含有する化合物であることが多いことが認められる。従って、水酸（ヒドロキシ）基にｉｎ ｖｉｖｏにおいて変換され得る如何なる基も該水酸（ヒドロキシ）基の代わりに使用されてよい。
【００７６】
これらの化合物が、親ステロイドから出発して、これら自体においてよく知られる種々の過程（プロセス）により調製されてよい。例えば、これらが、欧州特許（ＥＰ）１２９４３８２号において記述された方法により調製されてよい。
【００７７】
式（Ｉ）のこれら化合物が、慢性神経変性疾病もしくは病状および急性神経変性疾病もしくは病状の治療もしくは予防における使用に関して、欧州特許（ＥＰ）１２９４３８２号、国際公開（ＷＯ）２００２／０００２２４号、および国際公開（ＷＯ）２００２／０００２２５号において、並びに、慢性心臓変性疾病もしくは病状および急性心臓変性疾病もしくは病状の治療もしくは予防における使用に関して、国際公開（ＷＯ）２００２／０１５７９１号において開示されており、勿論、このような治療もしくは予防が、式（Ｉ）の化合物に関してのみ、本請求項から除外されている。
【００７８】
本発明において使用されてよい化合物の別の分類（クラス）が、式（ＶＩ）：
【００７９】
【化１４】
2010511028.tif 000014
式中：
Ｘが、式＞ＣＲ５Ｒ６基を表し、または、Ｒ１０が水素原子を表さない場合、式＞ＳＯ２基を表し；
Ｙが、式＞ＮＨもしくは式＞ＣＲ５Ｒ６基を表し；
Ｚが、式＞Ｃ＝Ｏ基、式＞ＣＨ２基、もしくは直接の結合を表し；
Ｒ５が、水素原子を表し、Ｒ６が、水素原子、カルボキシ基、もしくはヒドロキシ基を表し；または
Ｒ５およびＲ６が、オキソ基、メチレンジオキシ基、もしくはヒドロキシイミノ基を共に表し； 
Ｒ７が、水素原子もしくは低級アルキル基を表し；
Ｒ８が、２つの水素原子またはオキソ基もしくはヒドロキシイミノ基を表し；
Ｒ９が、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表し；
Ｒ１０が、水素原子、低級アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ１１およびＲ１２は、互いに同一もしくは異なっており、各々、水素原子、低級アルキル基、もしくはハロゲン原子を表す、
の化合物ならびに塩およびエステルを含む。
【００８０】
式（ＶＩ）のこれら化合物において、Ｚが、直接の結合であってよく、このケースにおいて窒素含有複素環状５員環に融合された５員環の一部を形成し、または、式＞ＣＨ２もしくは式＞Ｃ＝Ｏ基であってよく、このケースにおいて６員環の一部を形成する。
【００８１】
Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１１、もしくはＲ１２が、低級アルキル基を表す場合、これが、１〜１０、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖アルキル基であってよい。このような基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、２級ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、２−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、４−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、２−メチルペンチル基、１−メチルペンチル基、３，３−ジメチルブチル基、２，２−ジメチルブチル基、１，１−ジメチルブチル基、１，２−ジメチルブチル基、１，３−ジメチルブチル基、２，３−ジメチルブチル基、２−エチルブチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、およびデシル基が挙げられ、これらのうち、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、およびヘキシル基が、好ましく、メチル基およびエチル基が、より好ましく、メチル基が、最も好ましい。
【００８２】
Ｒ９、Ｒ１１、もしくはＲ１２が、ハロゲン原子を表す場合、これが、弗素、塩素、臭素、もしくは沃素原子であってよく、これらのうち、弗素原子および塩素原子が、好ましい。
【００８３】
Ｒ１０が、低級アルコキシ基を表す場合、これが、１〜１０、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐鎖アルコキシ基であってよい。このような基の例としは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、２級ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、２−メチルブトキシ基、１−エチルプロポキシ基、４−メチルペンチルオキシ基、３−メチルペンチルオキシ基、２−メチルペンチルオキシ基、１−メチルペンチルオキシ基、３，３−ジメチルブトキシ基、２，２−ジメチルブトキシ基、１，１−ジメチルブトキシ基、１，２−ジメチルブトキシ基、１，３−ジメチルブトキシ基、２，３−ジメチルブトキシ基、２−エチルブトキシ基、ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基、オクチルオキシ基、ノニルオキシ基、およびデシルオキシ基が挙げられ、これらのうち、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、およびヘキシルオキシ基が、好ましく、メトキシ基およびエトキシ基が、より好ましく、メトキシ基が、最も好ましい。
【００８４】
本発明のこれら化合物のうち：
Ｘが、式＞ＣＲ５Ｒ６基を表し、式中、Ｒ５がハロゲン原子を表し、Ｒ６が水素原子、ヒドロキシ基、もしくはカルボキシ基を表し、またはＲ５およびＲ６が、オキソ基もしくはメチレンジオキシ基を共に表し；
Ｙが、式＞ＣＲ５Ｒ６基を表し、式中、Ｒ５が水素原子を表し、Ｒ６が水素原子もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ７が、水素原子を表し；
Ｒ８が、２つの水素原子もしくはオキソ基を表し；
Ｒ９が、水素原子を表し；
Ｒ１０が、水素原子、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ基、もしくはカルボキシ基を表し；
Ｒ１１およびＲ１２が、互いに同一もしくは異なっており、各々、水素原子もしくはＣ1〜Ｃ4アルキル基を表す
ものならびにこれらの塩およびこれらのエステルが特に好ましい。
【００８５】
本発明の化合物の特定の例が、以降の表１において与えられている：
【００８６】
【表１−１】
2010511028.tif 000015
【００８７】
【表１−２】
2010511028.tif 000016
【００８８】
【表１−３】
2010511028.tif 000017
【００８９】
【表１−４】
2010511028.tif 000018
【００９０】
式（ＶＩ）の最も好ましい化合物が、上の表において、４、６、７、８、１０、１４、１５、１６、１７、２０、２１、２２、および２３と付番された化合物である。
【００９１】
本発明の化合物が、カルボキシ基を含有する場合、例えば、Ｒ５もしくはＲ１０が、カルボキシ基を表す場合、本発明の化合物が、エステルを形成し得、従来のエステル化手法により調製されてよい。該エステルの性質への特定の拘束は全くないが、但し、この得られる化合物が、医療に使用される場合、該化合物が、薬学的に許容可能であり、すなわち、親化合物以上に活性があるか、許容可能な活性である、もしくはより毒性がないか、より許容不可能な毒性でないものである。しかしながら、該化合物が、例えば、他の化合物の調製における中間体として、非医療使用のために使用される場合、この拘束さえ当てはまらず、この時、形成されてよいこれらエステルの性質への拘束は全くない。
【００９２】
エステル基の例としては：Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１１、もしくはＲ１２、および、ドデシル基、トリデシル基、ペンタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、およびイコシル基のような、当業界においてよく知られるような高級アルキル基に対する関係において例示されたもののような、１〜２０個の炭素原子、より好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基；
【００９３】
３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、およびシクロヘプチル基；
【００９４】
アリールアルキル（アラルキル）基、ここで、このアルキル部が、１〜３個の炭素原子有し、このアリール部が、６〜１４個の炭素原子を有する炭素乾式芳香族基であり、置換でも非置換でもよく；このようなアラルキル基のとしては、ベンジル基、フェネチル基、１−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、２−（１−ナフチル）エチル基、２−（２−ナフチル）エチル基、ベンズヒドリル（つまり、ジフェニルメチル）基、トリフェニルメチル基、ビス（ｏ−ニトロフェニル）メチル基、９−アントリルメチル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、４−ブロモベンジル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、３−ニトロベンジル基、４−メトキシベンジル基、およびピペロニル基が挙げられ；
【００９５】
ビニル基、アリル基、２−メチルアリル基、１−プロペニル基、およびイソプロペニル基のような、２〜６個の炭素原子を有するアルケニル基；
【００９６】
２，２，２−トリクロロエチル基、２−ハロエチル基（例えば、２−クロロエチル、２−フルオロエチル、２−ブロモエチル、もしくは２−ヨードエチル）、２，２−ジブロモエチル基、および２，２，２−トリブロモエチル基のような、１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を有するハロゲン化アルキル基；
【００９７】
置換シリルアルキル基、例えば、２−トリ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルシリルエチル基、特に、２−トリメチルシリルエチル基；
【００９８】
置換フェニル基および非置換フェニル基、例えば、フェニル基、トリル基、およびベンズアミドフェニル基；
【００９９】
置換フェナシル基および非置換フェナシル基、例えば、フェナシル基自体もしくはｐ−ブロモフェナシル基；
【０１００】
環状テルペニル基および非環状テルペニル基、例えば、ゲラニル基、ネリル基、リナリル基、フィチル基、メンチル基（特に、ｍ−およびｐ−メンチル）、ツジル基、カリル基、ピナニル基、ボルニル基、ノルカリル基、ノルピナニル基、ノルボルニル基、メンテニル基、カンフェニル基、およびノルボルネニル基；
【０１０１】
メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、およびメトキシエトキシメチル基のようなアルコキシメチル基、ここで、このアルコキシ部が、１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を有し、これ自体が、非置換単一アルコキシ基により置換されてよい；
【０１０２】
アセトキシメチル基、プロピオニルオキシメチル基、ブチリルオキシメチル基、イソブチリルオキシメチル基、ピバロイルオキシメチル基、１−ピバロイルオキシエチル基、１−アセトキシエチル基、１−イソブチリルオキシエチル基、１−ピバロイルオキシプロピル基、２−メチル−１−ピバロイルオキシプロピル基、２−ピバロイルオキシプロピル基、１−イソブチリルオキシエチル基、１−イソブチリルオキシプロピル基、１−アセトキシプロピル基、１−アセトキシ−２−メチルプロピル基、１−プロピオニルオキシエチル基、１−プロピオニルオキシプロピル基、２−アセトキシプロピル基、および１−ブチリルオキシエチル基のような、脂肪族アシルオキシアルキル基、ここで、このアシル基が、好ましくはアルカノイル基であり、より好ましくは２〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基であり、このアルキル部が、１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する；
【０１０３】
シクロヘキシルアセトキシメチル基、１−（シクロヘキシルアセトキシ）エチル基、１−（シクロヘキシルアセトキシ）プロピル基、２−メチル−１−（シクロヘキシルアセトキシ）プロピル基、シクロペンチルアセトキシメチル基、１−（シクロペンチルアセトキシ）エチル基、１−（シクロペンチルアセトキシ）プロピル基、および２−メチル−１−（シクロペンチルアセトキシ）プロピル基のようなシクロアルキル置換脂肪族アシルオキシアルキル基、ここで、このアシル基が、好ましくはアルカノイル基であり、より好ましくは２〜６個の炭素原子を有するアルカノイル基であり、このシクロアルキル置換基が、３〜７個の炭素原子を有し、このアルキル部が、１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する；
【０１０４】
アルコキシカルボニルオキシアルキル基、特に、１−メトキシカルボニルオキシエチル基、１−エトキシカルボニルオキシエチル基、１−プロポキシカルボニルオキシエチル基、１−イソプロポキシカルボニルオキシエチル基、１−ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−イソブトキシカルボニルオキシエチル基、１−２級（ｓ−）ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−ｔ−ブトキシカルボニルオキシエチル基、１−（１−エチルプロポキシカルボニルオキシ）エチル基、および１−（１，１−ジプロピルブトキシカルボニルオキシ）エチル基のような１−（アルコキシカルボニルオキシ）エチル基、および、２−メチル−１−（イソプロポキシカルボニルオキシ）プロピル基、２−（イソプロポキシカルボニルオキシ）プロピル基、イソプロポキシカルボニルオキシメチル基、ｔ−ブトキシカルボニルオキシメチル基、メトキシカルボニルオキシメチル基、およびエトキシカルボニルオキシメチル基のような他のアルコキシカルボニルアルキル基、ここで、該アルコキシ基および該アルキル基の両方が、１〜６、好ましくは１〜４個の炭素原子を有する；
【０１０５】
シクロアルキルカルボニルオキシアルキル基およびシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシメチル基、１−メチルシクロヘキシルオキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルカルボニルオキシメチル基、１−（シクロヘキシルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘプチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロヘプチルカルボニルオキシ）エチル基、１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシメチル基、１−メチルシクロペンチルオキシカルボニルオキシメチル基、２−メチル−１−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（１−メチルシクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（シクロヘキシルカルボニルオキシ）プロピル基、２−メチル−１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、２−（シクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）エチル基、１−（１−メチルシクロペンチルカルボニルオキシ）プロピル基、アダマンチルオキシカルボニルオキシメチル基、アダマンチルカルボニルオキシメチル基、１−アダマンチルオキシカルボニルオキシエチル基、および１−アダマンチルカルボニルオキシエチル基；
【０１０６】
シクロアルキルアルコキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、シクロプロピルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロブチルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロペンチルメトキシカルボニルオキシメチル基、シクロヘキシルメトキシカルボニルオキシメチル基、１−（シクロプロピルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロブチルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（シクロペンチルメトキシカルボニルオキシ）エチル基、および１−（シクロヘキシルメトキシカルボニルオキシ）エチル基；
【０１０７】
テルペニルカルボニルオキシアルキル基およびテルペニルオキシカルボニルオキシアルキル基、例えば、１−（メンチルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（メンチルカルボニルオキシ）エチル基、メンチルオキシカルボニルオキシメチル基、メンチルカルボニルオキシメチル基、１−（３−ピナニルオキシカルボニルオキシ）エチル基、１−（３−ピナニルカルボニルオキシ）エチル基、３−ピナニルオキシカルボニルオキシメチル基、および３−ピナニルカルボニルオキシメチル基；
【０１０８】
５−アルキル−もしくは５−フェニル−（２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル基、例えば、（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−イソプロピル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基、および１−（５−メチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）エチル基；ならびに、他の基、特に、フタリジル基、インダニル基、および２−オキソ−４，５，６，７−テトラヒドロ−１，３−ベンゾジオキソレン−４−イル基のようなｉｎ ｖｉｖｏにおいて容易に除かれる基が挙げられる。
【０１０９】
また、もし、本発明の化合物がカルボキシ基を含有すれば、これらは従来の方法により、塩基との塩へと変換され得る。このような塩の性質への特定の制限は全くなく、但し、これら化合物が医療的に使用される場合、該化合物は薬学的に許容可能である。しかしながら、本化合物が、例えば、他の化合物の調製における中間体として、非医療使用に使用される場合、この制限さえ適用されず、この時、形成されてよい塩の性質への制限は全くない。これらのような塩の例としては：ナトリウム、カリウム、もしくはリチウムのようなアルカリ金属との塩；バリウムもしくはカルシウムのようなアルカリ土類金属との塩；マグネシウムもしくはアルミニウムのような別の金属との塩；アンモニウム塩；メチルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、シクロヘキシルアミン、もしくはジシクロヘキシルアミンとの塩のような有機塩基塩；ならびに、リジンもしくはアルギニンのような塩基性アミノ酸との塩が挙げられる。薬学的に許容可能な塩が好ましい。
【０１１０】
本発明の化合物が、従来の方法により、酸との塩にも変換され得る。このような塩の性質への特定の制限は全くなく、但し、該化合物が医療的に使用される場合、該化合物は薬学的に許容可能である。しかしながら、本化合物が、例えば、他の化合物の調製における中間体として、非医療使用に使用される場合、この制限さえ適用されず、この時、形成されてよい塩の性質への制限は全くない。このような塩の例としては：鉱酸、特にハロゲン化水素酸（弗化水素酸、臭化水素酸、沃化水素酸、もしくは塩化水素酸のような）、硝酸、過塩素酸、炭酸、硫酸、もしくは燐酸との塩；メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、もしくはエタンスルホン酸のような低級アルキルスルホン酸との塩；ベンゼンスルホン酸もしくはパラ（ｐ−）トルエンスルホン酸のようなアリールスルホン酸との塩；酢酸、フマル酸、酒石酸、蓚酸、マレイン酸、林檎酸、琥珀酸、安息香酸、マンデル酸、アスコルビン酸、乳酸、グルコン酸、もしくは枸櫞酸のような有機カルボン酸との塩；ならびに、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のようなアミノ酸との塩が挙げられる。これらの薬学的に許容可能な塩が好ましい。
【０１１１】
式（ＶＩ）の化合物は、慢性および急性の神経変性疾病もしくは病状の治療もしくは予防における使用に関し、国際公開（ＷＯ）２００６／０８２４０９号に開示されており、勿論、このような治療もしくは予防が、式（ＶＩ）の化合物に関してのみ、本願請求項から除外される。
【０１１２】
本発明のこれら化合物が、これゆえ、種々の慢性および急性の疾病もしくは病状の治療もしくは予防において使用されてよく、これらの目的に向け、当業界においてよく知られているような、従来の医薬調製品として製剤されてよい。これゆえ、該化合物が、例えば、錠剤（タブレット）、カプセル、顆粒、粉末、シロップ、スプレーの形態において、もしくは他にこのようなよく知られた形態において、経口投与されてよく、または、例えば、注射、スプレー、点眼、接着軟膏、もしくは坐薬等により、非経口投与されてよい。
【０１１３】
これらの医薬調製品が、従来手段により調製され得、この分野においてよく使用される型の既知のアジュヴァントを含有してよく、例えば、ビヒクル、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、安定剤、矯正薬等であり、該調製品の意図された使用および形態に依存する。その用量が、その患者の病状、年齢、および体重に並びに治療されるべき疾患の性質および重篤さに依存するが、ヒト成人患者に対する経口投与のケースにおいて、通常、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重（より好ましくは０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重）の１日の全用量が示唆され、例えば、１日当たり１〜３回、単回用量においてもしくは分けられた用量において投与されてよい。
【０１１４】
一般的に、本発明の化合物が、種々の炎症性症状、もしくは、炎症をもたらす代謝経路から生じている種々の病状の治療用にもしくは予防用に使用されてよい。これらの化合物が使用され得るものの例として：神経突起伸長の促進；糖尿（特に２型糖尿）およびこの後遺症の治療もしくは予防；虚血血管疾病の治療および予防；炎症と関連する疼痛の治療；乾癬および創傷治癒を包含する炎症性皮膚症状の治療および予防が挙げられる。治療又は予防され得る、またはその作用が本発明の化合物の使用により和らげられ得る他の炎症性症状としては、脊髄損傷、末梢ニューロパシー、多発性硬化症、炎症性腸疾病、リューマチ炎；およびシスプラチンのような化学療法剤によりもしくは糖尿ニューロパシーのような他の原因により起こされた末梢ニューロパシーもしくは毒性が挙げられる。最後に、治療又は予防され得るまたはその効果が、本発明のこれら化合物の使用により、和らげられて得る病状としては、種々の型の癌を挙げられる。
【０１１５】
本発明が、以降の非限定実施例により更に例証される。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
ＰＣ−１２細胞における虚血に対する７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンの保護効果：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤たるインドメタシンによる阻害
この実施例の目的が、プロスタグランジン合成のインドメタシンにより弱められる場合の低酸素のモデルにおけるその神経保護効率を７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、保持するかどうか調べることにあった。使用される主な実験系が、ＰＣ１２細胞における虚血誘発細胞毒性であった。実験の測定された終点が、細胞死であった。
【０１１７】
虚血誘発ＰＣ−１２細胞死が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにより一貫して抑えられた。インドメタシン（１０μＭ）（これは、プロスタグランジン合成をブロックする。）が虚血により誘発された細胞死への直接の効果が全くなかったが、１μＭおよび１０μＭの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に全部拮抗した。プロスタグランジン合成が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの神経保護効果に必要とされているという仮説を裏付ける。
【０１１８】
方法論
ＰＣ−１２細胞培養
ＰＣ−１２細胞が、以降の組成：２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、最終濃度４．５ｇ／Ｌを与える追加のグルコース（ＲＰＭＩは通常２ｇ／Ｌを有する）、１０％熱不活化馬血清、５％牛胎児血清、および５０単位のペニシリン／ストレプトマイシンを有する、Ｌ−グルタミン無しのＲＰＭＩ  １６４０を有するＰＣ−１２培地において１型コラーゲンを用いてコーティングされたフラスコ上に、維持された。培地が、２日毎に交換された。
【０１１９】
ＰＣ−１２細胞アッセイ
ＰＣ−１２細胞のコンフルエントな培養物は、無血清だが５０ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦを有するＰＣ−１２培地（ＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地）において７日間、培養することにより分化された。これら細胞が採取され、洗浄され、計数され、１×１０５ＰＣ−１２細胞／穴（ウェル）を、グルコースのないＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地においてミクロタイタープレートに終夜で培養された。該培地が、次いで、テストされるべき化合物を含有する、グルコースのないＰＣ−１２  ＮＧＦ  培地に変更され、これら皿（プレート）が、３０分間、通常酸素条件下、放置された。
【０１２０】
この段階（ステージ）の間、この無酸素曝露用の培地およびテスト物質が、チャンバーに入れられ、９５％Ｎ２／５％ＣＯ２を用いて脱酸素化された。シールされて終夜（１８時間）３７℃においてインキュベートされる前、プレートにおける培地が、脱酸素化培地に取り替えられ、プレートが、次いで、１０分間、９５％Ｎ２ ５％ＣＯ２を用いて気体（ガス）を供給した嫌気チャンバーに入れられた。通常酸素のコントロールに関し、全てのインキュベートが、５％ＣＯ２／９５％空気（エア）中であったことを除き、これら細胞が、虚血治療に同じく処理された。
【０１２１】
生存度が、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ）色素排除試験を使用して、求められた。
【０１２２】
結果
ＰＣ−１２細胞が、低酸素に対し、相対的に抵抗性であった。このせいで、我々が、毒性を開始させるのにより重篤な酸素−グルコースの組み合わせの欠乏（虚血）プロトコールを使用した（図１）。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、１μＭ（細胞死における２６％の減少）および１０μＭ（細胞死における５３％の減少）において観察される有意な神経保護と共にこのアッセイにおいて用量依存的に細胞保護的であった。図１が、この効果を示す４実験からの総合データを提示する。図１が、別々の４実験からの総合データの平均百分率（％）細胞死を示す。このデータが、平均±ｓｅｍとして表現される。７６％±２．２％の細胞死が、虚血単独で観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における２６％の減少、ｐ＜０．００１）、１０μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５３％の減少、ｐ＜０．００１）で観察された。＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２３】
ＮＭＤＡ受容体（レセプター）拮抗薬（アンタゴニスト）たるＭＫ−８０１が、ＰＣ−１２細胞の虚血により誘発された毒性をも抑えた（図２）。シクロオキシゲナーゼ阻害剤たるインドメタシンが、１００μＭにおいて中程度の保護効果（細胞死における２９％の抑制）を有したが、より低い濃度では有さなかった（図２）。図２が、平均百分率（％）細胞死を示す。このデータが、平均±ｓｅｍとして表現される。７９％±５．３％の細胞死が、虚血単独で観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１００μＭ インドメタシン（ＩＭ、細胞死における２９％の減少、ｐ＜０．０５）、１０μＭ ＭＫ８０１（細胞死における６２％の減少、ｐ＜０．００１）で観察された。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２４】
７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果が、虚血単独に曝された培養物と区別不可能であるこれらの培養物における毒性と共に１０〜１００μＭのインドメタシン（ＩＭ、図３）により全部拮抗された。図３は平均百分率（％）細胞死を示す。このデータが、平均±ｓｅｍとして表現される。７６％±４．２％の細胞死が虚血単独で観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１０μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５０％の減少、ｐ＜０．００１）、１０μＭ  ＭＫ８０１（細胞死における４２％の減少、ｐ＜０．００１）で観察された。＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２５】
図４において見られるとおり、１０μＭ  インドメタシンが、１μＭおよび１０μＭ両方の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に全部拮抗した。図４が、平均百分率（％）細胞死を示す。このデータが、平均±ｓｅｍとして表現される。７６％±４．８％の細胞死が、虚血単独で観察された。細胞死における統計的に有意な減少が、１μＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における２５％の減少、ｐ＜０．０５）、１０μＭ ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（細胞死における５０％の減少、ｐ＜０．００１）で観察された。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．００１対（ｖｓ）虚血単独。
【０１２６】
結論
虚血により誘発されたＰＣ−１２細胞死が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにより一貫して抑えられた。インドメタシンが、プロスタグランジン合成をブロックするが、１０μＭまでの濃度ではＰＣ−１２細胞死に直接影響しなかった。しかしながら、該濃度が、更に１００μＭに増加された場合、中程度の神経保護効果が、観察された。
【０１２７】
インドメタシン（１０μＭ）が、虚血により誘発された細胞死への直接の効果を全く有さなかった、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果を有意に弱めた。プロスタグランジン合成が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの神経保護効果に必要とされているという仮説を裏付ける。
【０１２８】
実施例２
ヒト単核細胞による、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、およびプロスタグランジン１５−デオキシ−Δ１２，１４−Ｊ２の産生への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩアンドロステロンの効果
この実施例の目的は、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ヒト単球細胞におけるアラキドン酸特異的代謝産物、すなわち、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、および１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）の生合成を誘発し得たかどうか確かめることにあった。
【０１２９】
単球血液細胞が、炎症促進性刺激たる、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αの非存在下もしくは存在下で、様々な濃度の７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに曝され、産生されたＰＧＤ２、ＰＧＥ２、および１５ｄ−ＰＧＪ２の量が、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）により測定された。
【０１３０】
７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、通常のヒト末梢血単核細胞からのＰＧＤ２産生における濃度依存的増加を誘発させた。ＴＮＦ−αが、コントロールに比べて、ＰＧＤ２産生を増加させ、これが、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度において高められた。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、通常のヒト末梢血単核細胞におけるＰＧＥ２生合成への有意な効果を全く有していないように見えたが、ＰＧＥ２産生におけるＴＮＦ−αにより誘発された増加を完全に抑圧した。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）が、それらのそれぞれのコントロールに比べて、ＴＮＦ−α非存在下でおよそ９〜１２倍、およびＴＮＦ−α存在下で２〜２．５倍、通常のヒト末梢血単核細胞における１５ｄ−ＰＧＪ２産生を増加させることが見いだされた。
【０１３１】
方法論
末梢血単核細胞
単核細胞（単球およびリンパ球）が、フィコール／ハイパーク密度遠心法にヒト全血４８ｍｌを付することにより調製された。血液を、該フィコール（密度＝１．０７７ｇ／ｍｌ）の頂（トップ）上で層状にし、１時間、４００ｇにおいて遠心分離し（２２℃）、この後、相間における細胞が、ピペットにより除かれ、未使用のチューブに移された。チューブに、徹底的に混合されながら、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地（２体積）で満たされ、次いで、５分間、４００ｇにおいて遠心分離された（２２℃）。上清が捨てられ、細胞ペレットが、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地に再懸濁され、体積が、下の結果の部（セクション）において指し示されたとおりの、インキュベート１回当たりの適切な数の細胞を与えるように調整された。細胞が、３７℃、空気中５％ＣＯ２、および１００％湿度において１８時間、最終体積１ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培地において１．５ｍｌの無菌プラスチックチューブ中でインキュベートされた。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、次いで加えられ、細胞が３７℃において更に１時間インキュベートされた後、組み換えヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が加えられ、インキュベートが、更に３時間継続された。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製され、全ての残りの剤が、ＲＰＭＩ １６４０培地中で調製された。必要なコントロールが、培地か、常に０．１％（体積／体積、ｖ／ｖ）未満であった同一濃度のＤＭＳＯのどちらかを含有した。インキュベートが、２２℃において３０秒間、１１，０００ｇにおいてチューブを遠心分離し、１．５ｍｌの未使用のチューブに上清を移すことにより終結された。サンプルが、次いで、下記されたとおりＰＧＤ２の評価用に直ちに加工されたか、または、ＰＧＥ２もしくは１５ｄ−ＰＧＪ２の測定の前に−２０℃において保管されたかのどちらかであった。
【０１３２】
プロスタグランジン酵素免疫アッセイ（ＥＩＡｓ）
ＴＮＦ−αを用いた刺激非存在下もしくは存在下、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに対する応答におけるヒト単球細胞によるプロスタグランジン産生が、商品として入手可能なＥＩＡキットを使用して、エイコサノイド細胞外レベルを測定することにより求められた。
【０１３３】
ＰＧＤ２ＥＩＡ
ＰＧＤ２を細胞上清から直接アッセイされ得ないのは、これが、化学的に不安定であり、ＰＧＪ２、Δ１２−ＰＧＪ２、および１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２を包含する数多くのＪ系列のプロスタグランジンに急速に分解するからである。この問題を回避するために、不安定なＰＧＤ２が、化学的に処理されて安定な誘導体を与え、このケースにおいてはプロスタグランジンＤ２−メトキサミン（ＰＧＤ２−ＭＯＸ）であり、引き続いての分析用に保管された。インキュベートの終結後直ちに、サンプル上清１００μｌが、１０：９０（体積／体積、ｖ／ｖ）エタノール／水溶液に溶解されたメチルオキシム化試薬（Ｍｅｔｈｙｌ Ｏｘｉｍａｔｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ、塩酸メトキシルアミン（ＭＯＸ−ＨＣｌ））および酢酸ナトリウム１００μｌを含有する１．５ｍｌのチューブに加えられた。チューブが、次いで、水浴に入れられ、６０℃において３０分間、反応が進むようにした。この間の最後にサンプルが、−８０℃において保管された。ＰＧＤ２のレベルが、引き続き、Ｃａｙｍａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌのプロスタグランジンＤ２−ＭＯＸ ＥＩＡキット（カタログ番号５１２０１１）を使用して評価された。
【０１３４】
ＰＧＥ２ＥＩＡ
ＰＧＥ２の細胞外レベルが、その高感受性プロトコール用の製造元の説明書に従って、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＰａｒａｍｅｔｅｒ  ＰＧＥ２ＥＩＡ  Ｋｉｔを使用して評価された。
【０１３５】
１５ｄ−ＰＧ２ＥＩＡ
１５ｄ−ＰＧＪ２の細胞外レベルが、その製造元の説明書に従って、Ａｓｓａｙ  ＤｅｓｉｇｎｓのＣｏｒｒｅｌａｔｅ−ＥＩＡ プロスタグランジン１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２ＥＩＡキット（カタログ番号９００−０２３）を使用して評価された。
【０１３６】
統計解析
結果が、ｎ＝３のインキュベートに関し、その平均±ｓ．ｄ．として表現される。Ｕｎ−ｐａｒｉｅｄ（対応のない）Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  ｔ−検定（ｔ−Ｔｅｓｔ）は、２組（セット）のデータが、互いに異なっていたという確率（Ｐ）を求めるのに使用された。この違いが、Ｐ＜０．０５の場合、有意であると見なされた。統計計算が、Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ Ｉｎｃ．からの、ソフトウェアパッケージたるＳｔａｔｖｉｅｗを使用して、アップル マッキントッシュ（Ａｐｐｌｅ Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）のコンピューターで実行された。
【０１３７】
結果
ヒト単核細胞によるＰＧＤ２産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図５（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて、４時間インキュベートされた１×１０７末梢血単核細胞／ｍｌの細胞上清中に検出されるＰＧＤ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、コントロールよりも有意に大きかった（４０±１３ｐｇ／ｍｌ  ＰＧＤ２； Ｐ＝０．０１）１００ｎＭ  ７β−ＯＨ−ＥＰＩＡにおける極大（１０２±２４ｐｇ／ｍｌ  ＰＧＤ２）に達するＰＧＤ２産生における濃度依存性増加を誘発させるように見えた。
【０１３８】
図５（ｂ）が、ＴＮＦ−α（０．５μｇ／ｍｌ）存在下、インキュベートされた単核細胞の細胞上清中に検出されるＰＧＤ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。ＴＮＦ−αが、ＤＭＳＯビヒクルコントロールに比べて、ＰＧＤ２における２．３倍の増加を刺激した（Ｐ＜０．０５）。０．１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度において７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α誘発ＰＧＤ２生合成への効果を全く有していないように見えた。この実験において使用された７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度（１０００ｎＭ）におけるＰＧＤ２のレベルが、１６４±３１ｐｇ／ｍｌにまで増加した（ＴＮＦ−α単独に比べて、Ｐ＝０．０３）。
【０１３９】
ヒト単核細胞によるＰＧＥ２産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図６（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて、４時間インキュベートされた６×１０５末梢血単核細胞／ｍｌの細胞上清中に検出されるＰＧＥ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＤＭＳＯコントロールに比べて、ＰＧＥ２のレベルを増加させるように見えたが、しかしながら、これらの増加が、統計的に有意な差ではなかった。
【０１４０】
図６（ｂ）が、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、インキュベートされた単核細胞の細胞上清中に検出されたＰＧＥ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。ＴＮＦ−αが、ＤＭＳＯコントロールに比べて、ＰＧＥ２における有意な１．９７倍の増加を刺激した（Ｐ＝０．００１）。１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度において、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α単独に対する応答における１６７±６ｐｇ／ｍｌから、それぞれ１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに関して、７５±２５ｐｇ／ｍｌ、８２±２３ｐｇ／ｍｌ、および７４±１２ｐｇ／ｍｌまでＴＮＦ−α誘発ＰＧＥ２生合成を有意に抑圧した（ＴＮＦ−αのみと比べて、全てＰ＜０．０２）。この実験において使用された７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの最高濃度（１０００ｎＭ）におけるＴＮＦ−α誘発ＰＧＥ２産生への効果が、全く観察されなかった。
【０１４１】
ヒト単核細胞による１５ｄ−ＰＧＪ２産生への７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
図７（ａ）が、７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて４時間、インキュベートされた単核細胞の細胞上清中で検出される１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、使用された全ての濃度において、およそ９〜１２倍１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルを有意に増加させた。レベルが、ＤＭＳＯコントロールに関して、５１±６ｐｇ／ｍｌから、それぞれ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡに関して、５０６±１０１ｐｇ／ｍｌ、５３９±５１ｐｇ／ｍｌ、５２０±４５ｐｇ／ｍｌ、４５０±１３３ｐｇ／ｍｌ、および５９０±８４ｐｇ／ｍｌまで増加された（ＤＭＳＯコントロールと比べて、全てＰ＜０．０５）。
【０１４２】
図７（ｂ）が、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いてインキュベートされた単核細胞の細胞上清中で検出される１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの濃度を増加させる（０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ）ことの効果を示す。この実験において使用されたサイトカインの濃度において、ＴＮＦ−αが、１５ｄ−ＰＧＪ２における小さな増加を刺激するように見えたが、しかしながら、これが、ＤＭＳＯコントロールから、有意な差ではなかった。使用された全ての濃度において７β−ＯＨ−ＥＰＩＡが、ＴＮＦ−α存在下、１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルを増加させた。１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルが、ＴＮＦ−α単独存在下での１５７±３９ｐｇ／ｍｌから、それぞれ、ＴＮＦ−α＋０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１０００ｎＭの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡ存在下で、３４８±４８ｐｇ／ｍｌ、３３４±２４ｐｇ／ｍｌ、３５６±８５ｐｇ／ｍｌ、４０６±３０ｐｇ／ｍｌ、および３１８±１００ｐｇ／ｍｌまで増加された（ＴＮＦ−αのみと比べて、全てＰ＜０．０５）。
【０１４３】
実施例３
７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡは、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびエピアンドロステロン（ＥＰＩＡ）の自然代謝産物である。数多くのステロイドが、炎症過程（プロセス）および免疫過程（プロセス）に干渉すると報告されているので、我々の課題が、ＰＧ産生および関連酵素遺伝子発現へのこれらのヒドロキシステロイドの効果をテストすることであった。ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）が、炎症誘発性サイトカインたるＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）の添加もしくは非添加で、これらステロイドの各々（１〜１００ｎＭ）の存在下、４時間および２４時間、培養された。ＰＧＥ２のレベル、ＰＧＤ２のレベル、および１５−デオキシ−Δ１２，１４−ＰＧＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）のレベルが、そのインキュベート培地において測定され、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ−２）およびＰＧＥ合成酵素（シンターゼ、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡの細胞含量が、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより査定された。ＴＮＦ−αの添加が、結果的に、ＰＧ産生の上昇ならびにＣＯＸ−２ｍＲＮＡレベルおよびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルの増加を与えた。テストされた３種のステロイドの間で、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡしか、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１の発現を減少させなかった一方、顕著に、ＰＧＥ２の産生を減少させ、１５ｄ−ＰＧＪ２の産生を増加させた。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、抗炎症効果を有することを指し示す。
【０１４４】
１．１．ヒトＰＢＭＣ調製および培養
全血が、Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｕ  Ｓａｎｇ（ブレスト、フランス）におけるＥＤＴＡ補完パウチ中のドナーから収集された。次いで、該ＰＢＭＣが、収集後３６時間以内、無菌条件下で全血から単離された。密度勾配遠心分離が、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｅｕｒｏｂｉｏ）で実行された。ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｅｕｒｏｂｉｏ）中での洗浄後、細胞が、１０％熱不活化牛胎児血清（Ｅｕｒｏｂｉｏ）、２ｍＭ  グルタミン（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、１００Ｕのペニシリン／ｍｌ（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）、および１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌ（Ｄ．Ｄｕｔｓｃｈｅｒ）を用いて補完されたＲＰＭＩ  １６４０培地に懸濁された。単球が、１時間、プラスチックに対する接着により選ばれ、およそ１０7の細胞が、６穴（ウェル）組織培養プレート（１ウェル当たり、３ｍＬの培地）に培養された。全てのインキュベートが、３７℃および５％ＣＯ２における加湿したインキュベータ内で、実施された。細胞が回収され、０．０１μｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α（シグマ−アルドリッチ）存在下もしくは非存在下、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ、７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ、もしくは７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡ（エタノール２０μＬ中）のいずれかを用いて補完された未使用インキュベート培地２ｍｌ中に分散された。コントロールのインキュベートが、エタノール２０μｌを含有したが、全くステロイドを含有しなかった。上清が、４時間後、収集され、これらのＰＧ含量および細胞の測定用の２４時間インキュベートが、引き続いてのＲＮＡの単離用に使用された。Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジ−ポントワーズ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））を使用する単一工程（ステップ）抽出法が全ＲＮＡを規定した。
【０１４５】
１．２．リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ
ｃＤＮＡが、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ 第１ストランド合成システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ  Ｉ処理ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、ＵＫ）から、合成された。ＲＴ−ＰＣＲ増幅混合物（５０μＬ）が、２，５ｘＲｅａｌＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／２０ｘ  ＳＹＢＲ溶液（１１，２５μＬ、エッペンドルフ、ル  ペック、フランス）ならびに２００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含有した。反応が、ＲｅａｌＰｌｅｘ  ｅｐ  勾配  Ｓ  マスターサイクル機（エッペンドルフ）で行われた。サイクル条件が、９５℃で１０分、かつ９５℃、５５℃、および６８℃で、それぞれ、１５秒間、３０秒間、および３０秒間４５サイクルを行った。。各アッセイが、コントロールのｃＤＮＡの４点の連続の稀釈点（ポイント）の標準曲線を包含した。ＨＰＲＴ１ハウスキーピング遺伝子が、定量化用に使用された。全てのオリゴヌクレオチドプライマー（表２）が、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ／Ｄｉｓｔｒｉｂｉｏ（エヴリ、フランス）により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物の融解曲線の検査によりモニターされ、アガロースゲル電気泳動での分析により確かめられた。
【０１４６】
１．３．ＰＧ測定
商品として入手可能なＥＩＡキットが、培養培地におけるＰＧＥ２レベル（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ）および１５ｄ−ＰＧＪ２レベル（Ａｓｓａｙ ｄｅｓｉｎｇｎｓ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）の決定用に使用された。ＰＧＤ２レベルの測定が、プロスタグランジンＤ２−ＭＯＸ  ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を使用して得られた。このケースにおいて、および、アッセイの前に、新しいサンプルがＭＯＸ−ＨＣｌ試薬（これが、ＰＧＤ２−ＭＯＸへとＰＧＤ２を変換した）と直ちに処理されることで、如何なる更なる化学的劣化をも防ぐ。
【０１４７】
１．４．データの統計解析
全てのアッセイが、３回ずつで実行され、結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされた。一元配置分散分析が、群の間での違いを比べるために、ダンカンの多重範囲テスト（Ｄａｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔｓ）に従って実施された。違いが、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意と見なされた。
【０１４８】
２．１．７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで培養された。ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルが、その培養培地において測定され、関連する遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が、その細胞において測定された。得られたデータが、表２において示される。ＴＮＦ−αの非存在および３種の異なる濃度の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いた補完が、４時間培養における、ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。１５ｄ−ＰＧＪ２しか、２４時間の培養後に中程度の増加を示さなかった。７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、２４時間後、培養においてｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルを有意に増加させた。
【０１４９】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間後、全てのＰＧのレベルにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、テストされたいずれの濃度においてもＰＧのレベルを変化させなかった。対照的に、ＴＮＦ−α単独と比べた場合、２４時間の７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡおよびＴＮＦ−αを用いた同時インキュベート後、ＰＧＥ２のレベルおよびＰＧＤ２−１５ｄ−ＰＧＪ２のカップリングのレベルが、それぞれ、有意に増加され、および、減少された。さらに、ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における顕著な増加に至った。７α−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、ＴＮＦ−α単独と比べた場合、ｍＲＮＡレベルにおける一貫した変化を起こさなかった。
【０１５０】
２．２．７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡの効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで、培養された。ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルが、培養培地において測定され、関連する遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が細胞において測定された。得られたデータが、表３において示される。ＴＮＦ−α非存在下での４時間の３種の濃度の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡを用いたインキュベートが、その培養培地における、ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、ＰＧＤ２レベルおよび１５ｄ−ＰＧＪ２レベル、並びにｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルが、培養における７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとのインキュベート２４時間後、増加された。
【０１５１】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間に全てのＰＧにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、テストされた濃度のいずれにおいてもＰＧのレベルを更に変化させなかった。対照的に、ＴＮＦ−α単独と比べた場合、２４時間の７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡおよびＴＮＦ−αを用いた同時インキュベート後、ＰＧＤ２レベルおよび１５ｄ−ＰＧＪ２レベル両方が、有意に減少された。さらに、ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における顕著な増加に至った。７β−ヒドロキシ−ＤＨＥＡとの同時インキュベートが、ＴＮＦ−α単独と比べた場合、複数のｍＲＮＡレベルにおける一貫した変化を全く起こさなかった。
【０１５２】
２．３．７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果
ヒトＰＢＭＣが、４時間かもしくは２４時間かどちらか、ＴＮＦ−αの添加有りもしくは無しで、培養された。ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ２レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルが培養培地において測定され、関連する遺伝子（ＣＯＸ−２、ｍ−ＰＧＥＳ１）のｍＲＮＡ産生が細胞において測定された。得られたデータが、表４において示される。ＴＮＦ−α非存在下での４時間の３種の濃度の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、その培養培地における、ＰＧＥ２レベル、ＰＧＤ2レベル、および１５ｄ−ＰＧＪ２レベルにおける有意な変化を全く起こさなかった。しかしながら、細胞培養物が、２４時間、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた場合、ＰＧＤ２および１５ｄ−ＰＧＪ２両方が、顕著に増加された。ＣＯＸ−２発現が、４時間かもしくは２４時間かどちらかに前記ステロイドにより目立った（ｎｏｔｉｃｅａｂｌｙ）変化はかったが、ｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡレベルが、それぞれ、４時間および２４時間に有意な減少および増加を示した。
【０１５３】
ＴＮＦ−αの存在が、２４時間に全てのＰＧにおいて期待された増加を起こさせた。４時間の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡとの同時インキュベートが、テストされた濃度のいずれにおいてもＰＧのレベルを更に変化させなかった。対照的に、２４時間に、ＴＮＦ−α単独と比べた場合、これら２種のより低い方の用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、ＰＧＤ２レベルを減少させ、１５ｄ−ＰＧＪ２レベルを増加させた。ＴＮＦ−αとのインキュベート（つまり、炎症活性化）が、ＣＯＸ−２およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡにおける顕著な増加にも至った。細胞培養が、２４時間、１０および１００ｎＭ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡと共にインキュベートされた場合、ＴＮＦ−αによるＣＯＸ−２における増加およびｍ−ＰＧＥＳ１ｍＲＮＡ産生における増加が鈍化された。
【０１５４】
要するに、これらの結果は、明らかに、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、驚くべきことに、有意な抗炎症効果を有することを指し示す。
【０１５５】
【表２】
2010511028.tif 000019
【０１５６】
【表３】
2010511028.tif 000020
【０１５７】
【表４】
2010511028.tif 000021
【０１５８】
実施例４
結腸炎の実験モデルへの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
連続６日間の飲料水中のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）のラットに対する投与が、結腸の長さの減少、ＭＰＯ活性の増加、杯細胞における粘液の枯渇、ならびに、ＣＯＸ−２およびｍＰＧＥＳ−１合成酵素（シンターゼ）の発現の増加、および、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の産生の増加により特徴付けられる結腸の炎症（結腸炎）を起こさせる。ＤＳＳの投与が、腸における蛋白のカルボニル（Ｐｒｏｔ ＣＯ）およびＴバーのような酸化ストレスマーカーをも増加させる。今回、我々は、ＤＳＳ投与前、７日間、１日１回、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた治療が、ＤＳＳ誘発結腸炎の発生を防ぎ得るとの証拠を与える。０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、結腸炎による損傷および組織の炎症を完全に防ぎ、この７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果が、酸化ストレスマーカーおよびＰＧＥ２産生における顕著な抑制と関連し、これは、ＣＯＸ−２発現における早いが一過性の増加および抗炎症プロスタグランジン１５ｄ−ＰＧＪ２産生における持続された増加と関連する。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、炎症腸疾病（ＩＢＤ）のこの許容された実験モデルにおける非常に低い用量レベルにおいて顕著な抗炎症効果を有することを示す。
【０１５９】
実験手順
動物
全ての実験プロトコールおよび手順が、実験動物の使用に関する、ヨーロッパ共同体（ＥＣ）の方針８６／６０９／ＣＥＥに従った。雄ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラット（１８０〜２００ｇ）が、チャールズリヴァー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、ラルブレスル（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ）から購入され、齧歯類の実験室での食事を用いて給餌され、自由に水を与えた。
【０１６０】
薬剤治療および結腸炎誘発
７日の適応期間後、動物が、コントロールの２群（擬似（ｓｈａｍ）コントロールおよび７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療コントロール群）ならびに結腸炎の２群（結腸炎および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療結腸炎）へと分けられた。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ（ＤＭＳＯに溶解された、０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇ体重）あるいはＤＭＳＯ単独（ビヒクル）が、０日目〜７日目、７日間、１日１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与された。結腸炎が、飲料水に対するＤＳＳ（分子量３６〜５０ｋＤａ； ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、フランス）の添加により、７〜１４日目に誘発された。これらコントロールの２群が、水道水しか受けなかった。
【０１６１】
結腸の損傷の巨視的査定
９、１１、１３、１４日目に、体重、結腸長さ、軟便度が、記録され、新しい直腸出血が、肉眼での検査により評価された。結腸の損傷の重篤さが、Ｍａｂｌｅｙら、２００１、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．； ５０： ５６１−５６９ により記述されたとおり盲検的にスコア化された（０： よく形成されたペレットおよび全く結腸の損傷なし； １：糞便と混合して存在する少量の血液を有する結腸； ２：糞便と共に存在する大量の血液を有する結腸； ３： 血液で満たされた結腸および全く糞便なし）。
【０１６２】
組織学的検査
近位結腸の部分（１ｃｍ）が、４％ホルムアルデヒド（Ｌａｂｏｎｏｒｄ、Ｔｅｍｐｌｅｍａｒｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中で固定され、パラフィン中に埋められた。組織切片（５μｍ）が調製され、この後、きれいにされ、水和され、それぞれ、結腸の損傷および粘液杯細胞の含量の組織学的評価用の標準プロトコールに従って、ヘマトキシリン／エオシンを用いるかアルシアンブルーを用いるかどちらかで染色された。
【０１６３】
組織ホモジェネートの調製
結腸が、腸間膜の縁に沿って開けられ、その上皮細胞が、ガラススライドの平滑な端を用いてスクラップされて離され、次いで、荷重され、洗浄され、そして遠心分離された。そのペレットが、９倍体積のＴＫＥ緩衝液（バッファー、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１５０ｍＭ  ＫＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．４）中で均一化され、次いで、更なる使用までずっと、−８０℃において凍結された。ホモジェネートの蛋白含量が、Ｌｏｗｒｙら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９５１； １９３： ２６５−７４）に従って、測定された。
【０１６４】
ＭＰＯ活性
ＭＰＯ活性が、Ｐｅｌｉｓｓｉｅｒらの変法（Ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ２００６；７１（３）：２４０−８）と共にＫｒａｗｉｓｚらのオルト（ｏ−）ジアニシジン法（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９８４；８７（６）：１３４４−５０）を加えてホモジェネートにおいて査定された。ＭＰＯ活性が、酸化オルト（ｏ−）ジアニシジンに関する消光係数（１．１３×１０４モル−１ｃｍ−１）を使用して４６０ｎｍでの吸光度における１分当たりの変化を生成させるのに必要な酵素の量として表現した。
【０１６５】
酸化ストレスの生化学的決定
脂質過酸化（Ｔｂａｒｓ）が、Ｏｈｋａｗａらにより記述された方法（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９７９； ９５： ３１５−５８）の、Ａｌｂｒｅｃｈｔらによる変法（１９９２、Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ； ６３： ９１−９６）により測定された。赤い（red）１：２付加物たるマロンジアルデヒド−チオバルビツール酸（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、サンカンタン−ファラヴィエ（Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ−Ｆａｌｌａｖｉｅｒ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））の吸光度が、５３２ｎｍにおいて測定された（使用された消光係数：０．１５６μモル−１ｃｍ−１）。酸化された蛋白におけるカルボニル含量（Ｐｒｏｔ  ＣＯ）が、Ｌｅｖｉｎｅらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９９０；１８６：４６４−７８）により査定された。その非蛋白スルフヒドリル基含量（主にＧＳＨ）が、ホモジェネート中の抗酸化剤防御マーカーとして採用され、ＳｅｄｌａｋおよびＬｉｎｄｓａｙの方法（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ １９６８；２５（１）：１９２−２０５）により求められた。
【０１６６】
プロスタグランジン免疫アッセイ
商品として入手可能なＥＩＡキットが、新しい（fresh）ホモジェネートから得られた結腸の上清中、ＰＧＥ２のレベル（オックスフォード バイオメディカル リサーチ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、英国（ＵＫ））および１５ｄ−ＰＧＪ２のレベル（Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）の決定のために使用された。ＰＧＤ2のレベルの測定が、プロスタグランジンＤ２−ＭＯＸ ＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｅｕｒｏｍｅｄｅｘ）を使用して得られた。このケースにおいて、および、アッセイの前に、新しいサンプルが、ＰＧＤ２−ＭＯＸへとＰＧＤ２を変換したＭＯＸ−ＨＣｌ試薬を用いて直ちに処理され、こうして如何なる更なる化学的劣化をも防ぐ。
【０１６７】
リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ
新しい結腸サンプル（３００ｍｇ）からの全ＲＮＡが、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、セルジ−ポントワーズ（Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）、フランス（Ｆｒａｎｃｅ））を使用して抽出された。ポリ（Ａ）ＲＮＡが、ＭｉｃｒｏＰｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｕｎｔｉｎｇｄｏｎ、英国（ＵＫ））を用い、全ＲＮＡから精製された。ｃＤＮＡが、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ 第１ストランド合成システムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成された。リアルタイムＰＣＲが、２．５ｘＲｅａｌＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ／２０ｘ  ＳＹＢＲ溶液（１１．２５μＬ、エッペンドルフ、ル ペック、フランス）および３００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含有する混合物（２５μＬ）を使用して実施された。反応が、ＲｅａｌＰｌｅｘ ｅｐ  勾配  Ｓ  マスターサイクル機（エッペンドルフ）で行われた。これらサイクルの条件が、１０分間、９５℃、かつ９５℃、５５℃、および６８℃をそれぞれ、１５秒間、３０秒間、および３０秒間４０サイクルであった。各アッセイが、コントロールのｃＤＮＡの４点の連続稀釈点（ポイント）の標準曲線を包含した。オリゴヌクレオチドプライマーが、Ｇｅｎｅｃｕｓｔ／Ｄｉｓｔｒｉｂｉｏ（エヴリ、フランス）により合成された。増幅された生成物の特異性が、その生成物融解曲線の検査によりモニターされ、アガロースゲル電気泳動上での分析により確かめられた。ｍＲＮＡのこれらレベルが、ＨＰＲＴ１に対する規格化後、ＤＭＳＯコントロールのものに相対し、表現された。
【０１６８】
統計解析
全てのアッセイが、各動物に関し、３回ずつ実行され、結果が、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．としてプロットされる。一元配置分散分析が、群の間での違いを比べるためにダンカンの多重範囲テスト（Ｄａｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｔｅｓｔｓ）に従って実施された。違いが、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意と見なされた。
【０１６９】
結果
結腸炎誘発の時間経過（タイムコース）研究
７日間（７日目〜１４日目、Ｄ７〜Ｄ１４）、飲料水中、５％のＤＳＳを用いたラットの治療が、死亡率を伴わず、結腸炎の臨床兆候および組織学的兆候を結果的に与えた。典型的に、全てのこれらラットが、結腸炎誘発（１２日目）後の５日、重篤な下痢を呈し、次の日、直腸での出血が生じた。体重、副睾丸の脂肪組織の質量、および肝臓重量における減少が、擬似コントロールと比べた場合、全てのＤＳＳ治療ラットにおいて１１日目に記録された（それぞれ、−５％、−１７％、−８％；ｐ＜０．０５）。これらの減少が、１４日目にも観察された（表５）。脾臓重量における変化は全く観察されなかった。該擬似コントロール群と比べた場合、ＤＳＳ治療ラットが、結腸の肥厚した組織および大便の損失（ロス）と関連する、１１日目（−１４％、ｐ＜０．０５）〜１４日目（−２６％；ｐ＜０．０５）、結腸の有意な短縮も実証した。表５参照。結腸粘膜におけるＭＰＯ活性が、好中球浸潤の指標（インデックス）として測定された。１３および１４日目に、粘膜のＭＰＯ活性の９倍および７倍の増加が、擬似コントロールと比べた場合、該結腸炎群において観察された（ｐ＜０．０５、Ａ）。ＭＰＯ活性の修飾が、１３日目の前に全く観察されなかった。これらの結果が、組織学的分析と一致している。本当に、結腸の炎症の主要なホールマーク、すなわち、陰窩（ｃｒｙｐｔｉｃ）のねじれ、粘膜組織中への好中球の浸潤、および、より少ないムチンを含有した杯細胞の損失（ロス）が、１３日目に該結腸炎群において明らかとなり、擬似コントロール群と比べた場合、１４日目により明らかになった（データは示されなかった）。
【０１７０】
図８において示されたとおり、酸化ストレスに関するこれら２種のマーカー、すなわち、Ｐｒｏｔ  ＣＯ、Ｔｂａｒ、および、抗酸化剤防御パラメーターＧＳＨのレベルが、結腸炎を有する動物の結腸の粘膜において１３および１４日目にコントロールのレベルを上回って有意に増加された。
【０１７１】
結腸炎への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの保護効果
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡのこれら２種の低い用量（０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）が、１４日目に下痢の抑圧および直腸での出血により示されたようなＤＳＳ誘発結腸損傷を防いだ。ＤＳＳ投与前、７日間、１日に１回、０．０１ｍｇ／ｋｇ ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの腹腔内注射が、副睾丸の重量を変化することなく、コントロールのレベルに体重を回復させた（表５）。９日目〜１４日目、結腸の長さの減少が、結腸炎群よりも、ステロイドの２種の低い方の用量（０．０１、０．１ｍｇ／ｋｇ）により治療された群で少なく見受けられた（ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ）（９日目に関してデータは示さず。表５）。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、１４日目に杯細胞における粘液の枯渇、および、クリプト（ｃｒｙｐｔｓ）および好中球の浸潤の異常のような組織学的変化を防ぎ（データは示さず）、全ての用量のレベル、０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇにおいてＭＰＯ活性を有意に減少させた（Ａ）。これら酸化ストレスパラメーター（Ｐｒｏｔ  ＣＯ、Ｔｂａｒ）およびＧＳＨのレベルが、全ての群、すなわち、擬似コントロール、結腸炎、および７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療（０．０１、０．１、および１ｍｇ／ｋｇ）結腸炎群において９日目（示されなかった）および１１日目に似ていた（Ｂ、Ｃ、およびＤ）。酸化ストレスの全てのマーカーおよび抗酸化剤防御マーカーが、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いて治療された動物において変化しないままであった一方（Ｄ０〜７日目）、これらのパラメーターが、該結腸炎群において有意に増加された（ｐ＜０．０５）。これらの結果が、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、炎症腸疾病（ＩＢＤ）のこの実験モデルにおいて非常に低い用量レベルにおいて顕著な抗炎症効果を有することを示す。
【０１７２】
【表５】
2010511028.tif 000022
【０１７３】
結腸組織におけるプロスタグランジン（ＰＧ）産生：β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療が、結腸炎のないコントロールのラットにおけるＰＧＥ２結腸組織レベルおよびＰＧＤ２結腸組織レベルを変化させなかった（データは示されなかった）。対照的に、０日目〜７日目、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、２日目〜１４日目、１５ｄ−ＰＧＪ２レベルの基底レベルを上回る有意な増加に至った。０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、２日目に５１倍の増加を結果的に与えたが、４日目〜１４日目、漸進的に減少した（４４倍〜５倍の範囲である増加分。図１０）。
【０１７４】
７日目〜１４日目、炎症剤ＤＳＳの投与が、１４日目に炎症誘発性プロスタグランジンＰＧＥ２産生における顕著な増加を生じさせた一方で、抗炎症プロスタグランジン１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルが、強く抑えられた（図９Ａおよび１０Ｃ）。
【０１７５】
０日目（Ｄ０）〜７日目（Ｄ７）、０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた治療が、日において結腸ＰＧＥ２のＤＳＳ誘発産生を完全に防いだ一方、１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルを劇的に増加させる（図１０）。
【０１７６】
擬似群および結腸炎群におけるＣＯＸ−２およびＰＧ合成酵素（シンターゼ）発現：７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ前処理効果
のプロスタグランジンレベルにおける有意な修飾が、ＤＳＳ投与および７つのβ−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療と共に観察され、我々が、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの発現が、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる特異的ｍＲＮＡの定量によるステロイド前処理により変化したかどうかテストした。これらの遺伝子の転写が、検査され、ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１のものに関連した。結腸炎のないコントロールのラットにおいて、０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの投与が、１５時間にＣＯＸ−２ｍＲＮＡレベルにおける有意な１．５倍の増加を誘発させたが、次いで、２日目および４日目に有意な減少、この後、基底値に戻った（Ｂ）。ｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡ発現が、６時間〜１５時間の間、一過性に増加したが、２日目に基底レベルに向って戻った。Ｈ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの合成が、本実験のコースの間中、変わらなかった。
【０１７７】
ＤＳＳによる結腸炎誘発後、ＣＯＸ−２ｍＲＮＡ発現における２．５倍の増加が、１３および１４日目に観察された一方（Ａ）、ｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡが、１３日目にしか有意に増強されなかった（Ｂ）。Ｈ−ＰＧＤＳが、ＤＳＳ投与により変化しなかった。
【０１７８】
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた前処理（０日目〜７日目）が、ＤＳＳによるＣＯＸ−２およびｍＰＧＥＳ−１ｍＲＮＡ合成両方におけるこれらの増加を抑圧した（図１１）。
【０１７９】
要するに、これらの知見は、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡのこれら抗炎症効果が、ＰＧＥ２における同時減少および１５ｄ−ＰＧＪ２産生における増加を通じ媒介されることを指し示す。この研究において見られた１５ｄ−ＰＧＪ２産生への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの長続きする効果は、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが炎症およびこの寛解において関与する遺伝子の発現における変化の持続を起こすことを示唆する。
【０１８０】
図面において、図８が、（Ａ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、および酸化ストレスマーカー、すなわち、（Ｂ）Ｐｒｏｔ  ＣＯ、（Ｃ）Ｔｂａｒ、および（Ｄ）結腸組織における抗酸化剤マーカーたるＧＳＨへの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療効果を示す。生体マーカーレベルが、ＤＳＳ治療ラットが、１３および１４日目にコントロールから有意に（ｐ＜０．０５）異なったことを示す。７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、結腸炎群に比べ、有意に（ｐ＜０．０５）１３および１４日目にＭＰＯ活性を抑え、全ての用量レベルにおいて１３および１４日目に、コントロールレベルに酸化ストレスパラメーター（Ｂ、Ｃ、およびＤ）を回復させた。値が、１群当たり、３〜２３匹のラットを用い、平均±ＳＥＭであり（Ａ）、また、擬似群に対する百分率（％）である（Ｂ、Ｃ、およびＤ）。Ａ〜Ｄにおいて、黒いバー＝擬似コントロール；白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；中くらいの灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８１】
ＤＳＳ結腸炎対（ｖ）擬似コントロール群（ｐ＜０．０５）；§７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療群対（ｖ）ＤＳＳ結腸炎群（ｐ＜０．０５）。
【０１８２】
図９が、結腸での１５ｄ−ＰＧＪ２のレベル（Ａ）、および、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ治療の中の、種々の期間での、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳの相対的なｍＲＮＡ発現の定量化（Ｂ）を示す。値が、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３〜１５）であり（Ａ）、ｍＲＮＡが、ＨＰＲＴ１に対する規格化後、擬似コントロールのものに相対し、表現される。Ａにおいて、黒いバー＝擬似コントロール群；暗い灰色のバー＝０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；中くらいの灰色のバー＝０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、明るい灰色のバー＝１．０ｍｇ／ｋｇ ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。Ｂにおいて、白いドットを有する暗い灰色のバー＝ＣＯＸ−２；黒いドットを有する明るい灰色のバー＝ｍＰＧＥＳ−１；そして、黒いドットを有する白いバー＝Ｈ−ＰＧＤＳ。
【０１８３】
図１０が、ＤＳＳ投与中の、プロスタグランジンＥ２、Ｄ２、および１５ｄ−ＰＧＪ２の結腸での合成への７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの効果を示す。ＤＳＳ投与が、１３（ｐ＜０．０５）および１４（ｐ＜０．０５）日目に有意に、ＰＧＥ２（Ａ）、Ｄ２（Ｂ）、および１５ｄ−ＰＧＪ２の合成を増加させた。ＤＳＳ投与前、７日間、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた治療が、１３および１４日目にＰＧＥ２の合成を抑えた一方（Ａ）、全ての用量のレベルにおいて有意に、１５ｄ−ＰＧＪ２の産生を増加させる（Ｃ）。データが、ｎ＝３〜２３を用いた平均±ＳＥＭとして表現される。Ａ〜Ｃにおいて、黒いバー＝擬似コントロール；白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；白いドットを有する暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；黒いドットを有する明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、黒いドットを有する白いバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ  ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８４】
図５が、結腸炎誘発中の、ＣＯＸ−２、ｍＰＧＥＳ−１、およびＨ−ＰＧＤＳのｍＲＮＡの結腸での発現を示す。結腸炎が、１３および１４日目にＣＯＸ−２のｍＲＮＡの合成の有意な増加に至った一方（Ａ）、ｍＰＧＥＳ−１が、１３日目にしか増強されなかった（Ｂ）。遺伝子発現の基底レベルに向かう回帰、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの全ての用量を用いて観察された。Ａ〜Ｃにおいて、白いバー＝ＤＳＳ結腸炎群；暗い灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．０１ｍｇ／ｋｇ ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；中くらいの灰色のバー＝ＤＳＳ＋０．１ｍｇ／ｋｇ ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ；そして、明るい灰色のバー＝ＤＳＳ＋１．０ｍｇ／ｋｇ ７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ。
【０１８５】
実施例５
１．コラーゲン誘発関節炎における７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの効果
この研究は、コラーゲン誘発関節炎のモデルと関連する炎症変化および病理変化をコントロールすることに狙いを定めた７β−ＯＨ−ＥＰＩＡの有効性をテストした。そのネズミモデルが、ヒト関節炎の臨床での疾病のレミニッセントを実証する。
【０１８６】
雄のＤＢＡ／１匹のマウス（１０〜１２週齢）が、尾の付け根での注射により０日目、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ＣＩＩ／ＣＦＡ）中に乳化された１００μｇの鶏ＩＩ型コラーゲンを与えられた。治療が、下記の通り、皮下注射により２０日目〜５０日目（群２、３、および４）、皮下注射により０日目〜３０日目（群５）に毎日与えられた：
実験群（ｎ＝１０／群）
群１： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、無治療−偽治療、２０日目〜５０日目
群２： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、治療７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ １μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群３： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、治療７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ １０μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群４： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、治療７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ １００μｇ／ｋｇ、２０日目〜５０日目
群５： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、治療７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡ １０μｇ／ｋｇ、 ０日目〜３０日目
群６： ０日目、ＣＩＩ／ＣＦＡ、無治療−偽治療、 ０日目〜３０日目。
【０１８７】
終了時に、（２本の）後ろ脚が除かれ、膝ホモジェネートが、プロスタグランジン測定用に集められ（群１および群４だけ）、（２本の）足が、標準方法による病理検査用に固定された。各足が、縦に半側切断され、切開され、切断できるように脱灰された。脱灰されたサンプルが、通常に加工され、切断され、染色された区画が、検査用に調製された。これが、各見本の両半分を包含した。各足が、標準スコア化システムに従って、スコア化された。サンプルが、実験プロトコールの知識も群の同定もなしに、盲検的にスコア化された。
【０１８８】
臨床での関節腫張が、２１日目〜５０日目、週に２回、スコア化された。各機会に、四肢の各々が、以降のスコア化システム（臨床での疾病スコアの組み合わせ）に従ってスコアを与えられた：
０ 通常
１ 関節全部の僅かな腫張または個々の指での炎症
２ 赤味を帯びた関節全体の中間的な腫張および／または２つ以上の指における炎症
３ 重篤な関節炎症および多くの指にまで広がっている赤味
４ 重篤な関節炎症および多くの指にまで広がっている赤味、骨の再モデル化の顕わな兆候（サイン）。
【０１８９】
結果が、表６に示される。７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて治療すると、コントロール群（これら偽コントロール群１および６が、組み合わされている）と比べた場合、上記の臨床疾病のスコア化方法により測定されたとおり、関節の腫張の顕著な抑制に至ったことが判る。この知見は、両足における腫張の抑制の病理学的証拠により確かめられた（表７）。表７から、７β−ヒドロキシＥＰＩＡ治療が、関節炎を誘発させるためにコラーゲンが与えられて、３０日目まで治療を続ける時と同じ時期に開始されると、１０匹の動物のうちの９匹が両足関節における組織病理学的変化を完全にクリアするという最小病理学的スコアが判る。これゆえ、リューマチ関節炎のような疾病の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡを用いた早い治療が、有益な効果を有し得る。
【０１９０】
２．これら膝ホモジェネート中のプロスタグランジンの測定
上記で調製されたとおりの膝ホモジェネート中の１５ｄ−ＰＧＪ２レベルおよびＰＧＥ２レベルが、標準アッセイ手法を使用して測定された。表８から、ＰＧＥ２のこれらレベルが、無治療コントロール群と比べた場合、０．１ｍｇ／ｋｇの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて治療された群においてより低かったことがわかる。０．１ｍｇ／ｋｇの７β−ＯＨ−ＥＰＩＡを用いて治療された群が、無治療のコントロールと比べた場合、より高いレベルの１５ｄ−ＰＧＪ２を有した。
【０１９１】
結論：
７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの明らかな抗炎症効果があった。誘発時での治療が、最大効果を有するように見えた。これが、このモデルにおいてステロイドを包含する他のテスト化合物と調和を保ち、既存の変化を改善することとは対照的に、関節の損傷を予防することの相対的容易性を反映する。こう言ってきているが、より高い方の用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡで治療される動物における疾病のレベルは、治療が２０日目まで延ばされた場合と類似していた。疾病からのこの保護レベルが、治療体制用に良好である。最低用量の７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、疾病のレベルへより少ない効果を有するように見えたが、統計解析は、これが明らかな用量効果であったかどうか調べるのに必要とされると思われる。
【０１９２】
プロスタグランジンＥ２レベルおよび１５ｄ−Ｊ２レベルの解析が、治療の明らかな効果を示した。ＰＧＥ２のレベルが、未治療のコントロールに比べたよりも治療されたマウスにおいて低かった。対照的に、１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルが、治療に追随して増加された。
【０１９３】
臨床での疾病の観察およびその組織病理をまとめると、関節炎のこのモデルにおける７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡの抗炎症効果に関する強力な証拠が与えられる。疾病発症前の治療は、このモデルのケースにおいても例外がないように、最も有効であった。しかしながら、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、発症時前後に与えられた場合、疾病の発生を抑圧し得るという知見が、多くの競合からこの化合物を際立たせ、大いに助長する。
【０１９４】
【表６】
2010511028.tif 000023
【０１９５】
これらの結果から、１．０μｇ／ｋｇと同じぐらい低い用量での７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、関節の損傷を抑えるのに可能であると、結論されてよい。
【０１９６】
【表７】
2010511028.tif 000024
【０１９７】
これらの結果から、１０．０μｇ／ｋｇでの７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、殆ど完全に疾病、つまり、関節の損傷の進行を防ぐと結論されてよい。
【０１９８】
【表８】
2010511028.tif 000025
【０１９９】
これらの結果から、７β−ヒドロキシ−ＥＰＩＡが、コラーゲン誘発関節炎のこれら臨床症状の重篤さを抑え、炎症の解消、細胞の保護、および組織の修復に有利に組織プラスタグランジン産生を変えることが、結論され得る。
【０２００】
実施例６
シスプラチン誘発末梢ニューロパシーモデルについての７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの効果
シスプラチンが、癌の治療に使用された抗有糸分裂化合物である。しかしながら、この使用が幾つかの副作用により制限され、これらの間でもこれら末梢ニューロパシーが特に窮迫している。シスプラチン誘発ニューロパシーが、優先して敏感なニューロパシーである。患者が、感覚失調により伴われた遠位の四肢における感覚の損失を患う。組織学研究が、軸索の変性を示した。細胞培養物において、シスプラチンによる感覚ニューロンの治療が、細胞体の変性により伴われた神経突起ネットワーク密度の減少を誘発させた。感覚ニューロンに特異的な成長因子たる、神経成長因子（ＮＧＦ）が、この中毒に対する神経への保護効果を有する。培養物におけるシスプラチンによる感覚ニューロンの中毒が、これゆえ、末梢ニューロパシーにおける化合物の神経保護効果の研究用のふさわしいモデルである。
【０２０１】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの神経保護効果が、末梢ニューロパシーのモデルにおけるラット感覚ニューロンについて評価された。
【０２０２】
解離された背根神経節感覚ニューロンの１次培養が、４８時間および７２時間、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ有りおよび無しで、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いてインキュベートされ、以降のパラメーターが評価された：
−抗ＭＡＰ  ２（微小管関連蛋白２）抗体を用いて染色された神経細胞体
−抗β−チューブリン抗体を用いて染色された神経突起ネットワークの密度
【０２０３】
神経の培養
ラット感覚ニューロンが、Ｈａｌｌら、１９９７年［Ｈａｌｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年４月１５日；１７（８）；２７７５〜８４］により記述された方法に従って調製された。端的に、雌ラット（妊娠１５日）が、頸脱臼により屠殺され（Ｒａｔｓ  Ｗｉｓｔａｒ；Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）、その胎児が、その子宮から除かれた。背根神経節（ＤＲＧ）を有するそれらの脊髄が除かれ、ペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ＰＳ、１％）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ１％、Ｓｉｇｍａ Ａ６００３）を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ１５、Ｆｉｓｈｅｒ  １１４１５−０４９）の氷冷培地に入れられた。ＤＲＧが回収され、カルシウムおよびマグネシウムなしにＰＢＳ中で稀釈された（Ｆｉｓｈｅｒ  ２００７−０３）トリプシンＥＤＴＡ１０Ｘ、１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １５４０００５４、３７℃において２０分間、トリプシン処理により解離された。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ診断薬１０４１５９）および牛胎児血清（ＦＢＳ１０％、Ｆｉｓｈｅｒ１０２７０−０９８）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｈｅｒ２１９６９−０３５）の添加により、止められた。この細胞懸濁液が、１０ｍｌのピペットを用いて摩砕され(triturated)、室温において１０分間、３５０×ｇにおいて遠心分離された。解離された細胞のペレットが、次いで、決められた培養培地において再懸濁された。
【０２０４】
生存可能な細胞が、前記トリパンブルー色素排除テスト（Ｓｉｇｍａ）を使用してノイバウワー（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計算器において計数され、９６穴（ウェル）プレート（Ｎｕｎｃ）において密度３０，０００細胞／ウェルに播種された。ウェルが、超純粋無菌水（Ｍｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ  ６０７５９．０１）中、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ２６３６）を用いて予めコーティングされた。
【０２０５】
細胞が、２時間、接着するようにされ、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中、３７℃において加湿したインキュベーター中で維持された。
【０２０６】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いた神経培養のインキュベート
培養５日後、その培養培地が、下記：
・ビヒクル（ＤＭＳＯ ０．１％）
・ビヒクル（ＤＭＳＯ ０．１％）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ参照番号：ｐ４３９４）
・テスト化合物７β−ＯＨ ＥＰＩＡ（１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ）
・対照化合物ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋シスプラチン（３μｇ／ｍｌ）
の異なる条件に従って決められた培養培地へと変更された。
【０２０７】
１つの条件当たり６ウェルが、神経の生存率を査定するように実行された。インキュベート４８時間および７２時間後、これら神経細胞が、−２０℃でのエタノール／酢酸溶液（９５％／５％）中に５分間固定され、ＰＢＳで３回濯がれた。
【０２０８】
化合物の神経栄養効果のコントロールに関し、ＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）および７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ（１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭ）が、４８時間および７２時間インキュベートされた。このインキュベートの終わりにおいて、これら細胞が、−２０℃でのエタノール／酢酸溶液（９５％／５％）で５分間固定され、ＰＢＳで３回濯がれた。
【０２０９】
１フィールド当たりの細胞体数および神経突起ネットワークの解析
感覚ニューロンの細胞体が、モノクローナル抗ＭＡＰ−２抗体（Ｓｉｇｍａ Ｍ４４０３）により標識され（ラベルされ）、感覚ニューロンの神経突起が、モノクローナルβ−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ Ｔ８６６０）により標識された（ラベルされた）。これらの抗体が、インキュベート溶液（ＦＣＳ５％およびサポニン０．１％を有するＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ｓ−７９００）中、１：４００において稀釈された。これらの抗体が、それぞれ、神経細胞体および神経突起を特異的に標識する（ラベルする）。
【０２１０】
インキュベート２時間後、これら細胞が、ＰＢＳで洗浄され、そのＭＡＰ−２抗体およびそのβ−チューブリン抗体を明かすようにインキュベート溶液中で１：３００において稀釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ１１００１）を用いてインキュベートされた。細胞核が、蛍光マーカーを用いて染色された（Ｈｏｅｃｈｓｔ染色溶液、ＳＩＧＭＡ  Ｈ６０２４、１時間中、インキュベート溶液中１μｇ／ｍｌ）。
【０２１１】
各条件に関し、１ウェル当たり２枚の写真（１条件当たり１２枚の写真）が、コンピューターソフトウェアＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．によりコントロールされたＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用て撮られた。そのＭＡＰ−２標識化に関し、その拡大率が、×１０であり、そのβ−チューブリン標識化に関し、その拡大率が、×２０であった。各標識化に関し、全ての画像（イメージ）が同一条件において撮られた。
【０２１２】
抗ＭＡＰ−２抗体を用いて標識された（ラベルされた）細胞体の数、および、抗β−チューブリン抗体を用いて標識された（ラベルされた）神経突起の全長の解析が、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して完遂された。これら結果が、前記ビヒクルに比べた百分率（％）において表現された。各群（各グループ）の比較が、対応のないＴ検定を使用して完遂された。
【０２１３】
結果
神経突起密度のシスプラチン誘発損失に対しての７β−ＯＨ  ＥＰＩＡによる保護
３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いた４８時間のインキュベート
神経突起密度が、培地（ビヒクル）を用いた感覚ニューロンのインキュベート後、つまり、４８時間、シスプラチンなしで、１フィールド当たり平均５４５９μｍの全神経突起長を表した。シスプラチンを用いた４８時間のインキュベートが、およそ４５８５μｍにまで、１フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べた場合、統計的に有意であった（−１６％、ｐ＜０．００１）。
【０２１４】
１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた４８時間のインキュベートが、培地だけを用いてインキュベートされた培養と比べた場合、神経突起のシスプラチン誘発損失を防ぎ、神経突起長における有意な増加を起こさせた。
【０２１５】
１ｎＭおよび１０ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、４８時間でのシスプラチン誘発神経突起損失に対して感覚ニューロンを保護した。この効果が、統計的に有意であった。全神経突起長が、それぞれ、１ｎＭおよび１０ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート４８時間後、５３７８μｍおよび５５４９μｍであったが、それぞれ、９０．７％および１０１％のシスプラチン誘発毒性の抑制を表す。
【０２１６】
３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いた７２時間のインキュベート
シスプラチンなしの「ビヒクル」培地における感覚ニューロンが、１フィールド当たり平均５３２０μｍの全神経突起長を発現させた。シスプラチンを用いた７２時間のインキュベートが、およそ４０４６μｍにまで、１フィールド当たりの該全神経突起長を抑えた。シスプラチンによる神経突起ネットワーク密度におけるこの抑制が、ビヒクルに比べた場合、統計的に有意であった（−２４％、ｐ＜０．００１）。
【０２１７】
１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた７２時間のインキュベートが、培地だけを用いてインキュベートされた培養と比べられた場合、複数の神経突起のシスプラチン誘発損失を防ぎ、神経突起長における有意な増加を起こさせた。
【０２１８】
１ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、７２時間でのシスプラチン誘発神経突起損失に対して感覚ニューロンを保護した。その効果が、統計的に有意であった。全神経突起長が、１ｎＭの７β−ＯＨ ＥＰＩＡを用いたインキュベート７２時間後、４９４８μｍであったが、７０．８％のシスプラチン誘発毒性の抑制を表す。
【０２１９】
【表９】
2010511028.tif 000026
【０２２０】
【表１０】
2010511028.tif 000027
【０２２１】
シスプラチン誘発神経細胞死（神経細胞体の損失）に対する７β−ＯＨ  ＥＰＩＡによる保護
４８時間、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベート
フィールド当たり平均６１本の感覚ニューロンが、４８時間においてシスプラチンなく、「ビヒクル」と一緒の培地中でのインキュベート後に観察された。３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たり平均４１本の感覚ニューロンにまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる神経細胞体の損失（ロス）が、シスプラチンなし、つまり、ビヒクルだけを含有する培地が、４８時間後、査定された細胞体の数と比べた場合、統計的に有意であった（−３３％、ｐ＜０．００１）。
【０２２２】
４８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、細胞体のシスプラチン誘発損失（ロス）を殆ど完全に防いだ。
【０２２３】
１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、４８時間でのシスプラチン誘発細胞死に対し、感覚ニューロンを保護した。この効果は統計的に有意であった。フィールド当たりの感覚ニューロン全数が、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート４８時間後、５１、４５、および５０であったが、それぞれ、５３，１％、１８，７％、および４３，８％のシスプラチン誘発細胞死の抑制を表す。
【０２２４】
７２時間、３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベート
フィールド当たり平均５４本の感覚ニューロンが、７２時間においてシスプラチンなしに、「ビヒクル」と一緒の培地中でのインキュベート後に観察された。３μｇ／ｍｌのシスプラチンを用いたインキュベートが、フィールド当たり平均３３本の感覚ニューロンにまで、神経数を抑えた。シスプラチンによる神経細胞体の損失（ロス）が、シスプラチンなく、つまり、ビヒクルだけを含有する培地が、７２時間後、査定された細胞体の数に比べられた場合、統計的に有意であった（−３９％、ｐ＜０．００１）。
【０２２５】
４８時間、１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、細胞体のシスプラチン誘発損失（ロス）を完全に防いだ。
【０２２６】
１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、７２時間でのシスプラチン誘発細胞死に対し、感覚ニューロンを殆ど完全に保護した。この効果は統計的に有意であった。フィールド当たりの感覚ニューロン全数が、それぞれ、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート７２時間後、５２、５５、および５２であったが、それぞれ、９３％、１０４％、および９３％のシスプラチン誘発細胞死の抑制を表す。
【０２２７】
【表１１】
2010511028.tif 000028
【０２２８】
【表１２】
2010511028.tif 000029
【０２２９】
実施例７
本研究は、１次培養における解離脊髄の運動ニューロンおよび感覚ニューロンへの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡの神経突起成長促進効果を評価する。神経が、抗β−チューブリン抗体を用いて染色され、全神経長の解析が、「Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ」を使用して実行された。神経細胞培養が、１０−９Ｍ〜１０−４Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いてインキュベートされ、その神経ネットワークの密度が、インキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後に査定された。運動ニューロンに特異的な成長因子たる、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、および、感覚ニューロンに特異的な成長因子たる、神経成長因子（ＮＧＦ）が、対照化合物として使用された。我々のデータは、７β−ＯＨ  ＥＰＩＡが、運動ニューロンおよび感覚ニューロン両方への、顕著な神経栄養効果を有することを示す。、ＢＤＮＦの効果およびＮＧＦの効果に匹敵しうるこれらの効果が、このヒドロキシステロイドのナノモル濃度において特に見受けられた。要するに、我々の知見が、神経突起伸長を促進させるためのおよび末梢ニューロパシーを治療するに至る７−ヒドロキシステロイドの使用を裏付ける。
【０２３０】
１．材料および方法
１．１．ラット脊髄運動神経細胞培養物の調製
ラット脊椎運動ニューロンが、Ｍａｒｔｉｎｏｕら、１９９２年（Ｍａｒｔｉｎｏｕ  ＪＣ、Ｍａｒｔｉｎｏｕ  Ｉ、Ｋａｔｏ  ＡＣ、コリン作動分化因子（ＣＤＦ／ＬＩＦ）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける単離ラット胚運動ニューロンの延命を促進させる。Ｎｅｕｒｏｎ．１９９２年４月；８（４）：７３７〜４４）により記述された方法に従って調製された。端的に、妊娠１５日の妊娠雌ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットが、頸脱臼により屠殺され、その胎児が、子宮から除かれた。それらの脊髄が除かれ、牛血清アルブミン（脂肪酸なしＢＳＡ、Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、フランス、ＧＸＸＢＳＡ０１−６５）１％を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ（Ｌ１５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１４１５−０４９）氷冷培地に入れられた。髄膜が、注意して除かれた。
【０２３１】
これら脊椎運動ニューロンが、３７℃での２０分間のトリプシン処理により解離され（トリプシンＥＤＴＡ  １０Ｘ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５４０００５４）、カルシウムおよびマグネシウムなしに、ＰＢＳ中で稀釈された（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２００７−０３）。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ  診断薬  １０４１５９）および１０％子牛胎児血清（ＦＣＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０２７００９８）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２１９６９−０３５）の添加により止められた。この懸濁液が、次いで、１０ｍｌのピペットを３回通して機械的に解離された。細胞が、次いで、室温において１０分間、５８０ｇにおいて遠心分離された。解離された細胞のペレットが、Ｌ１５培地中に再懸濁され、得られた懸濁液が、Ｌ１５培地中の層のＢＳＡ溶液（３．５％）上、室温において１０分間、１８０×ｇでの遠心分離により、運動ニューロンにおいて、濃縮された。その上清を捨て、該ペレットが、ＤＮａｓｅ  Ｉ（１％）で補完されたＬ１５培地中で再懸濁された。次いで、該懸濁液が、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（ｄ：１．０６ｇ／ｍｌ；Ａｂｃｙｓ、パリ、フランス；１０３００６１）のクッションの上に層となり、室温において１５分間、３３５×ｇにおいて遠心分離された。上の方の相が、精製された運動ニューロンを含有しており、これが回収され、Ｌ１５培地を用いて再懸濁され、室温において１０分間、８００×ｇにおいて遠心分離された。該細胞ペレットが、２％のＢ２７、２ｍＭのＬ−グルタミン、およびペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌを用いて補われた神経基礎培地からなる定められた培養培地中で最後に再懸濁された。生存可能な細胞が、トリパンブルー色素排除テスト（Ｓｉｇｍａ Ｔ８１５４）を使用して、ノイバウワー血球計算器において計数（カウント）され、次いで、９６穴プレート（ポリ−ｌ−リジンを用いて予めコーティングされた；Ｎｕｎｃｌｏｎ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ５８９９）において３０，０００細胞／穴に入れられ、加湿した空気（９５％）ＣＯ2（５％）雰囲気中、３７℃において培養された。
【０２３２】
１．２．ラット感覚ニューロン細胞培養の調製
ラット感覚ニューロンが、Ｈａｌｌら、１９９７年（Ｈａｌｌ  ＡＫ、Ａｉ  Ｘ、Ｈｉｃｋｍａｎ  ＧＥ、ＭａｃＰｈｅｄｒａｎ  ＳＥ、Ｎｄｕａｇｕｂａ  ＣＯ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  ＣＰ。ラット感覚神経節（ガングリオン）における神経の不均一さの発生。Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７年４月１５日；１７（８）：２７７５〜８４）により記述された方法に従って調製された。端的に、雌ラット（妊娠１５日）が、頸脱臼により屠殺され（Ｒａｔｓ Ｗｉｓｔａｒ；Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）、それらの胎児が、子宮から除かれた。その背根神経節（ＤＲＧ）と共にそれらの脊髄が除かれ、ペニシリン５０ＵＩ／ｍｌ−ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（ＰＳ、１％）および牛血清アルブミン（ＢＳＡ１％、Ｓｉｇｍａ  Ａ６００３）を含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚ氷冷培地（Ｌ１５、Ｆｉｓｈｅｒ  １１４１５−０４９）に入れられた。これらＤＲＧが回収され、３７℃での２０分間のトリプシン処理により解離され（トリプシンＥＤＴＡ  １０Ｘ、１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １５４０００５４）、カルシウムおよびマグネシウムなしのＰＢＳ中で稀釈された（Ｆｉｓｈｅｒ  ２００７−０３）。この反応が、ＤＮａｓｅ  Ｉ  グレード  ＩＩ（ＩＩ等級、０．１ｍｇ／ｍｌ  Ｒｏｃｈｅ  診断薬 １０４１５９）および牛胎児血清（ＦＢＳ１０％、Ｆｉｓｈｅｒ  １０２７０−０９８）を含有しているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｈｅｒ  ２１９６９−０３５）の添加により止められた。この細胞懸濁液が、１０ｍｌのピペットで摩砕（tritutated）され、室温で１０分間、３５０×ｇにおいて遠心分離された。解離された細胞のペレットが、次いで、定められた培養培地中で再懸濁された。
【０２３３】
生存可能な細胞が、トリパンブルー色素排除テスト（Ｓｉｇｍａ）を使用してノイバウワー血球計算器において計数（カウント）され、９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）で密度２５，０００細胞／穴に播種された。穴が、超純粋無菌水（Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ  ６０７５９．０１）中、ポリ−Ｌ−リジン（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ｐ２６３６）を用いて予めコーティングされた。
【０２３４】
細胞が、２時間、接着するようにされ、５％ＣＯ２／９５％空気の雰囲気中、３７℃での加湿したインキュベーター中で維持された。
【０２３５】
１．３．活性化合物を用いた脊髄運動神経細胞培養のインキュベート
本培養培地が、下記：
コントロール（ビヒクル、０．１％ＤＭＳＯ）
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ−１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、および１０−９Ｍ（０．１％ＤＭＳＯ中）
ＢＤＮＦ  ５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＤＭＳＯ中）
の条件を伴って、１２時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
【０２３６】
インキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後、細胞が、−２０℃においてエタノール／酢酸の溶液（９５％／５％）中に５分間固定され、ＰＢＳで３回濯がれた。
【０２３７】
１．４．活性化合物を用いた感覚神経細胞培養のインキュベート
本培養培地が、下記：
コントロール（ビヒクル、０．１％ＤＭＳＯ）
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡ−１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、および１０−９Ｍ（０．１％ＤＭＳＯ中）
ＮＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌ（０．１％ＤＭＳＯ中）
の条件を伴ってながら、１２時間のインキュベート期間後、定められた培養培地へと変更された。
【０２３８】
７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート６時間後、１２時間後、および２４時間後、細胞が、−２０℃においてエタノール／酢酸の溶液（９５％／５％）中に５分間固定され、ＰＢＳで３回濯がれた。
【０２３９】
１．５．神経突起成長解析
運動ニューロンおよび感覚ニューロンが、インキュベート溶液（ＦＣＳ５％およびサポニン０．１％を有するＰＢＳ、Ｓｉｇｍａ  Ｓ−７９００）中、１：４００において稀釈されたモノクローナル抗β−チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｔ８６６０）により標識された（ラベルされた）。この抗体が、神経細胞体および神経突起を特異的に標識する（ラベルする）。
【０２４０】
インキュベート２時間後、細胞がＰＢＳで洗浄され、β−チューブリンＩＩＩ抗体を明らかにするために、インキュベート溶液中、１：３００で稀釈されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ Ａ１１００１）を用いてインキュベートされた。
【０２４１】
抗β−チューブリン抗体を用いて標識された（ラベルされた）ニューロンの全長の解析が、Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００  ３．２．Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ソフトウェアを使用して実行された。
【０２４２】
これら結果が、前記ビヒクルに比べられた、百分率（パーセンテージ、％）で表現された。群の比較が、Ｕｎｐａｉｒｅｄ（対応のない）Ｔ検定を使用して実行された。
【０２４３】
２−結果
２．１．運動ニューロンの神経突起長への薬剤治療の効果
細胞伸長の全長の解析が、テスト化合物の神経栄養特性を示唆する。
【０２４４】
ａ）インキュベート６時間後
これら結果が、表１３中に示される。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌでのＢＤＮＦを用いた治療が、それぞれ、１８０％および１９３％、前記ビヒクルに比べて、運動ニューロンにより形成された神経突起ネットワークの密度を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。
【０２４５】
６時間、１０−８Ｍおよび１０−９Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、前記ビヒクルに比べた場合、１５０％および１８８％、運動ニューロンの神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。  
【０２４６】
ｂ）インキュベート１２時間後
これら結果が、表１４中に示される。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いた治療が、それぞれ、１５２％および１７３％、前記ビヒクルに比べた場合、運動ニューロンにより形成された神経突起ネットワークの密度を有意に増加させた（ｐ＜０．００１）。
【０２４７】
１２時間、１０−４Ｍ〜１０−９Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、前記ビヒクルと比べた場合、２２６％〜１３７％、神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた。
【０２４８】
ｃ）インキュベート２４時間後
結果が、表１５中に示される。１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いた２４時間のインキュベートが、ビヒクルと比べた場合、神経突起ネットワーク密度を有意に増加させた（１７０％、ｐ＜０．０１）。しかしながら、５０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを用いたインキュベートが、神経突起ネットワーク密度を有意に修飾しなかった。
【０２４９】
２４時間、１０−８Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、ビヒクルと比べた場合、１７４％、神経突起ネットワーク密度を増加させた（ｐ＜０．００５）。
【０２５０】
２．２．感覚ニューロンの神経突起長への薬剤治療の効果
ａ）インキュベート６時間後
結果が、表１６中に示される。６時間、５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いた治療が、それぞれ、２７３％（ｐ＜０．００１）および１９１％（ｐ＜０．０１）、前記ビヒクルに比べて、感覚ニューロンにより形成された神経突起ネットワークの密度を有意に増加させた。
【０２５１】
６時間、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、および１０−９Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、１７１％（ｐ＜０．００１）、１７６％（ｐ＜０．００５）、および１４９％（ｐ＜０．０５）、コントロールと比べた場合、感覚ニューロンの神経突起ネットワーク密度が増加した。
【０２５２】
ｂ）インキュベート１２時間後
結果が、表１７中に示される。５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたインキュベートが、それぞれ、２１６％（ｐ＜０．００１）および１２８％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルに比べて、感覚ニューロン神経により形成された神経突起ネットワークの密度を有意に増加させた。
【０２５３】
１０−９Ｍおよび１０−７Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベートが、それぞれ、１４５％（ｐ＜０．００１）および１３４％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルと比べた場合、本神経突起ネットワーク密度が有意に増加した。
【０２５４】
ｃ）インキュベート２４時間後
結果が、表１８中に示される。インキュベート２４時間後、５０ｎｇ／ｍｌおよび１０ｎｇ／ｍｌのＮＧＦを用いたら、前記ビヒクルと比べた場合、それぞれ、３０９％および３７１％、感覚神経により形成された神経突起ネットワークの密度が有意に増加した（ｐ＜０．００１）。
【０２５５】
２４時間、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、および１０−９Ｍの７β−ＯＨ  ＥＰＩＡを用いたインキュベート２４時間後、それぞれ、１７３％（ｐ＜０．００５）、１７４％（ｐ＜０．０１）、および１４７％（ｐ＜０．０５）、前記ビヒクルと比べた場合、神経突起ネットワーク密度が増加した。
【０２５６】
【表１３】
2010511028.tif 000030
【０２５７】
【表１４】
2010511028.tif 000031
【０２５８】
【表１５】
2010511028.tif 000032
【０２５９】
【表１６】
2010511028.tif 000033
【０２６０】
【表１７】
2010511028.tif 000034
【０２６１】
【表１８】
2010511028.tif 000035
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓又は腎臓から選択される末梢臓器の炎症性疾患、炎症性気道疾患、炎症に関連する疼痛、炎症性皮膚症状、多発性硬化症、リューマチ関節炎、肢端巨大症、創傷治癒、末梢動脈疾患およびこれの後遺症、冠状動脈疾患及びこれの後遺症、関節軟骨の変性並びにアテローム硬化性腎臓動脈狭窄からなる群から選択される炎症性症状の治療又は予防のための医薬品の製造のための７α−ヒドロキシエピアンドロステロン、７β−ヒドロキシエピアンドロステロン又はこれらの薬学的に許容可能な塩もしくはエステルの使用。
【請求項２】
前記炎症性気道疾患が、喘息、鼻炎、気管支炎、もしくは慢性閉塞性肺疾患から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
請求項１または２に記載の７α−ヒドロキシエピアンドロステロンもしくは７β−ヒドロキシエピアンドロステロン又はこれらの薬学的に許容可能なエステルの使用。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図８】
2010511028.tif 000036
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図９】
2010511028.tif 000037
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１０】
2010511028.tif 000038
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】図１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【図１１】
2010511028.tif 000039