(57)【要約】    【課題】電気泳動分析において、蛍光物質や放射線物質によって試料の標識を行なう必要をなくす。    【解決手段】電気泳動用セル２は互いに平行に配置された複数の電気泳動路２２ａ〜２２ｅを備えている。各電気泳動路２２ａ〜２２ｅは上端が試料注入端となり、上端から離れた位置から下端まで均一な複数の微細流路３３を備えている。電気泳動用セル２の下端は試料受け２４で受けられている。微細流路３３は、この電気泳動用セル２の面に対して垂直な方向に照射された光を回折して回折光を生じる回折格子を構成している。    【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動路上で少なくとも試料注入端から離れた位置に、複数の均一な微細流路からなり、該微細流路が照射光に対して回折を生じる流路幅をもつ回折格子が形成された電気泳動装置を使用し、
試料として標識されていない複数の試料成分を含む混合試料を用意し、
前記電気泳動路に泳動媒体を充填し、電気泳動路の試料注入端に試料を注入した後、電気泳動路の両端間に泳動電圧を印加して前記試料を電気泳動させながら分離させる電気泳動分離工程と、
前記電気泳動路上の試料注入端から離れた位置の前記回折格子に光を照射し、前記回折格子による回折光を測定してその回折光の時間的な変化からその回折格子の位置を電気泳動分離された試料成分が通過したことを検出する検出工程と、
を備えた電気泳動方法。
【請求項２】
前記電気泳動装置として少なくとも４つの電気泳動路をもち、各電気泳動路には試料注入端から等しい距離の位置に前記回折格子が形成されたものを使用し、
試料として１つの核酸の核酸断片試料を末端塩基種別に調製し、標識をしていない４種類の核酸断片試料を用意し、
前記電気泳動分離工程は各核酸断片試料を互いに異なる電気泳動路に注入して行ない、
前記検出工程は各電気泳動路の同じ位置の前記回折格子に光照射をして通過する塩基種の順位を検出することにより前記核酸の塩基配列を決定するものである請求項１に記載の電気泳動方法。
【請求項３】
電気泳動路に泳動媒体が充填され、電気泳動路の試料注入端に試料が注入された後、電気泳動路の両端間に泳動電圧が印加されて前記試料が電気泳動しながら分離される電気泳動部材において、
前記電気泳動路上で少なくとも試料注入端から離れた位置に、複数の均一な微細流路からなり、該微細流路が照射光に対して回折を生じる流路幅をもつ回折格子が形成されていることを特徴とする電気泳動部材。
【請求項４】
電気泳動路が複数個形成されている請求項３に記載の電気泳動部材。
【請求項５】
前記回折格子は光が照射される部分にのみ形成されている請求項３又は４に記載の電気泳動部材。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか一項に記載の電気泳動部材と、
前記電気泳動路上の試料注入端から離れた位置の前記回折格子に光を照射する照射光学系と、
前記照射光学系により光照射された回折格子による回折光を検出する光検出器と、
前記光検出器の検出信号から回折光の時間的な変化を検知し、電気泳動分離された試料成分がその回折格子の位置を通過したことを検出する演算部と、
を備えた電気泳動装置。
【請求項７】
前記電気泳動部材は少なくとも４つの電気泳動路をもち、
前記照射光学系は各電気泳動路の試料注入端から等しい距離の位置の前記回折格子に光照射するものであり、
前記演算部は、試料として１つの核酸の核酸断片試料を末端塩基種別に調製された４種類の核酸断片試料が互いに異なる電気泳動路に注入されて電気泳動されたとき、前記照射光学系により光照射された回折格子を通過する４種類の塩基種の順位を検出することによりその試料核酸の塩基配列を決定するものである請求項６に記載の電気泳動装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの塩基配列決定やタンパク質の分離などに使用される電気泳動方法及び電気泳動用セル並びに電気泳動装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人ゲノムのような長大な塩基配列をもつＤＮＡの塩基配列決定には、高感度で、高速で、かつ大処理能力をもったＤＮＡシークエンサが必要である。その装置として、ゲルを充填した電気泳動路を複数本配列したマルチキャピラリＤＮＡシークエンサがある。
【０００３】
サンガー法によって処理すれば、その末端塩基がＡ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）である４種類のＤＮＡフラグメント試料が生成される。スラブゲルの各レーン又は各電気泳動路には４種類の末端塩基のＤＮＡフラグメントを含んだ試料を注入し、複数のレーン又はカラムで同時に泳動させる。その際、検出時に末端塩基の異なる４種類のＤＮＡフラグメントを識別するために、２種類以上の蛍光物質や放射性物質で標識することが行なわれている（例えば、特許文献１を参照。）。
【特許文献１】特開平１０−２０６３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、末端塩基がＡ，Ｇ，Ｃ及びＴのいずれであるかを識別するための蛍光物質や放射線物質による標識は標識化のための化学処理工程を設ける必要があり、コストもかかる。
そこで本発明は、電気泳動分析において、蛍光物質や放射線物質によって試料の標識を行なう必要をなくすことを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の電気泳動方法は、電気泳動路上で少なくとも試料注入端から離れた位置に、複数の均一な微細流路からなり、該微細流路が照射光に対して回折を生じる流路幅をもつ回折格子が形成された電気泳動装置を使用し、試料として標識されていない複数の試料成分を含む混合試料を用意し、電気泳動路に泳動媒体を充填し、電気泳動路の試料注入端に試料を注入した後、電気泳動路の両端間に泳動電圧を印加して試料を電気泳動させながら分離させる電気泳動分離工程と、電気泳動路上の試料注入端から離れた位置の回折格子に光を照射し、回折格子による回折光を測定してその回折光の時間的な変化からその回折格子の位置を電気泳動分離された試料成分が通過したことを検出する検出工程と、を備えたものである。
【０００６】
本発明の電気泳動方法の好適な適用例は、電気泳動装置として少なくとも４つの電気泳動路をもち、各電気泳動路には試料注入端から等しい距離の位置に回折格子が形成されたものを使用し、試料として１つの核酸の核酸断片試料を末端塩基種別に調製し、標識をしていない４種類の核酸断片試料を用意し、電気泳動分離工程は各核酸断片試料を互いに異なる電気泳動路に注入して行ない、検出工程は各電気泳動路の同じ位置の回折格子に光照射をして通過する塩基種の順位を検出することにより核酸の塩基配列を決定することである。
【０００７】
本発明の電気泳動部材は、本発明の電気泳動方法において用いるものであり、電気泳動路に泳動媒体が充填され、電気泳動路の試料注入端に試料が注入された後、電気泳動路の両端間に泳動電圧が印加されて試料が電気泳動しながら分離される電気泳動部材であって、電気泳動路上で少なくとも試料注入端から離れた位置に、複数の均一な微細流路からなり、該微細流路が照射光に対して回折を生じる流路幅をもつ回折格子が形成されていることを特徴とする。
【０００８】
本発明の電気泳動部材においては、電気泳動路が複数個形成されていることが好ましい。そうすれば、複数種類の試料を同時に電気泳動分析することができる。
【０００９】
回折格子は光が照射される部分にのみ形成されていてもよい。その場合には、回折格子を構成している微細流路部分が短くてすむため、目詰まりが発生しにくくなる。
【００１０】
本発明の電気泳動装置は、本発明の電気泳動部材と、電気泳動路上の試料注入端から離れた位置の回折格子に光を照射する照射光学系と、照射光学系により光照射された回折格子による回折光を検出する光検出器と、光検出器の検出信号から回折光の時間的な変化を検知し、電気泳動分離された試料成分がその回折格子の位置を通過したことを検出する演算部と、を備えている。
【００１１】
本発明の電気泳動装置の好ましい適用例はＤＮＡなどの核酸の塩基配列決定装置である。その場合、電気泳動部材は少なくとも４つの電気泳動路をもち、照射光学系は各電気泳動路の試料注入端から等しい距離の位置の回折格子に光照射するものであり、演算部は、試料として１つの核酸の核酸断片試料を末端塩基種別に調製された４種類の核酸断片試料が互いに異なる電気泳動路に注入されて電気泳動されたとき、照射光学系により光照射された回折格子を通過する４種類の塩基種の順位を検出することによりその試料核酸の塩基配列を決定するようになっている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の電気泳動方法及び電気泳動装置においては、電気泳動路上で少なくとも試料注入端から離れた位置に複数の均一な微細流路からなり、該微細流路が照射光に対して回折を生じる流路幅をもっている回折格子が形成された電気泳動部材を使用し、電気泳動路上の試料注入端から離れた位置の回折格子に光を照射し、回折格子による回折光を測定してその回折光の時間的な変化からその回折格子の位置を電気泳動分離された試料成分が通過したことを検出するようにしたので、試料を蛍光物質などで標識する必要がなく、試料を標識する工程を省略してコストの低減を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、本発明の電気泳動装置を用いた電気泳動方法及びそれに用いる電気泳動用セルの好適な実施形態を説明する。図１は電気泳動装置の一実施例を示す概略構成図である。また、図２は電気泳動部材である電気泳動用セルの一実施例を示す図であり、（Ａ）はその平面図、（Ｂ）は（Ａ）の破線円２８で囲まれた部分の拡大図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ位置の断面図、（Ｄ）は（Ａ）のＹ−Ｙ位置の断面図である。
【００１４】
まず、電気泳動用セル２について説明する。
図２に示されているように、電気泳動用セル２は互いに平行に配置された複数の電気泳動路２２ａ〜２２ｅを備えている。各電気泳動路２２ａ〜２２ｅは上端が試料注入端となり、上端から離れた位置から下端まで均一な複数の微細流路３３を備えている。電気泳動用セル２の下端は試料受け２４で受けられている。
電気泳動路２２ａ〜２２ｅには上端を僅かに残して下端まで電気泳動媒体であるゲルが充填されており、電気泳動路２２ａ〜２２ｅの上端のゲル上と下端の試料受け２４内には電気泳動時の電極との接触のためのバッファ液が入れられている。
【００１５】
電気泳動用セル２は、例えば石英などの透明な板部材により構成された２枚の透明基板２ａ，２ｂが張り合わされて構成されている。透明基板２ｂは平板状の部材である。透明基板２ａの透明基板２ｂに対向する面に５本の電気泳動路２２ａ〜２２ｅと、各電気泳動路２２ａ〜２２ｅ内の規則的な凹凸形状３０，３２からなる複数の微細流路３３がＭＥＭＳ技術によって形成されている。なお、この構成は一例であり、透明基板２ａと２ｂは上下が逆になっていてもよい。
【００１６】
微細流路３３は、この電気泳動用セル２の面に対して垂直な方向（図２（Ａ）では紙面に対して垂直方向）に照射された光を回折して回折光を生じる回折格子を構成している。微細流路３３は例えば１０μｍ〜１００μｍのピッチで形成されている。破線領域２６は光源１０及びレンズ１２からなる照射側光学系からの光束が照射される光照射位置である。光照射位置２６への光照射は帯状に収束された光束による連続照射又はビーム状に収束された光束を走査する方式により行なわれる。
【００１７】
上述の電気泳動用セル２を用いた電気泳動装置について図１を参照して説明する。
電気泳動用セル２の電気泳動路２２ａ〜２２ｅの試料注入端から試料を注入するための液輸送・回収部４及び電気泳動路２２ａ〜２２ｅの両端に電圧を印加するための電源６が設けられている。液輸送・回収部４と電源６の動作は制御部８によって制御されている。
電気泳動用セル２の光照射位置２６に泳動方向に対して垂直な方向から光を照射する照射光学系としての光源１０とレンズ１２が設けられている。光源１０及びレンズ１２とは電気泳動用セル２を挟んで反対側に、電気泳動用セル２の各電気泳動路２２ａ〜２２ｅに形成されている微細流路３３によって生じた回折光の強度分布をそれぞれ測定するための受光光学系１４が設けられている。受光光学系１４は、例えばＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサやフォトダイオードアレイなどのイメージセンサで構成されている。受光光学系１４はアンプ（増幅回路）１６を介して演算処理部１８に接続されている。また、表示部２０が設けられており、演算処理部１８の演算結果等が表示部に表示されるようになっている。
なお、図１は電気泳動用セル２を上からみた状態で示しており、照射光学系は照射光を帯状に収束させて電気泳動用セル２の光照射位置２６を照射することを示している。
【００１８】
演算処理部１８は受光光学系１４から回折光の強度分布情報を読み取り、回折光の強度分布の変化を検知するようになっている。回折光の強度分布は電気泳動路の光照射位置２６に試料が到達してその部分のゲルの屈折率が変化したときに変化するため、回折光の強度分布を監視してその変化を検知することにより、どの電気泳動路において光照射位置に試料成分が到達したかを検出することができる。演算処理部１８は受光光学系１４を介して回折光の強度分布を監視し、その変化に基づいて試料成分が光照射位置２６に到達した電気泳動路を検出するようになっている。
なお、演算処理部１８は回折光の強度分布が変化した電気泳動路の順番を記憶する記憶回路を備えていてもよい。その効果については以下の電気泳動方法の説明において述べる。
【００１９】
この電気泳動装置を用いた電気泳動方法の一例を説明する。
図３（Ａ）に示されているように、例えばサンガー法で作成されたＤＮＡフラグメントを各電気泳動路２２ａ〜２２ｅの試料注入端から注入する。この実施例では、電気泳動路２２ａの試料注入端に末端塩基がＡ（アデニン）のＤＮＡフラグメントを注入し、電気泳動路２２ｂの試料注入端に末端塩基がＧ（グアニン）のＤＮＡフラグメントを注入し、電気泳動路２２ｃの試料注入端に末端塩基がＴ（チミン）のＤＮＡフラグメントを注入し、電気泳動路２２ｄの試料注入端に末端塩基がＣ（シトシン）のＤＮＡフラグメントを注入し、電気泳動路２２ｅの試料注入端に塩基数既知のＤＮＡフラグメントをマーカーとして注入する。各電気泳動路２２ａ〜２２ｅに注入するＤＮＡフラグメントは、蛍光物質や放射性物質によって標識化されていない。
【００２０】
電気泳動用セル２の上端と下端に入れられたバッファ液中に電源６に電気的に接続された電極を挿入して各電気泳動路２２ａ〜２２ｅの両端に所定の電圧を印加する。試料注入端に注入された試料は、図３（Ｂ）に示されているように、その分子量によって成分ごとに分離しながら電気泳動路２２ａ〜２２ｅのゲル中を試料受け２４に向かって泳動する。各電気泳動路２２ａ〜２２ｄを泳動する試料は、その塩基数の少ないＤＮＡフラグメントほど泳動速度が速く、塩基数の少ないＤＮＡフラグメントから順に光照射位置２６を通過する。
【００２１】
ＤＮＡフラグメントが光照射位置２６に到達すると、光照射位置２６のゲルの屈折率が変化するため、受光光学系１４で検出される回折光の強度分布が例えば図４に示されているように変化する。図４は回折光の強度分布の変化の一例を示す図であり、（Ａ）は試料成分が光照射位置２６を通過していないときの回折光強度分布を示すグラフ、（Ｂ）は試料成分が光照射位置２６を通過しているときの回折光強度分布を示すグラフである。その回折光の強度分布の変化を読み取ることにより試料成分が光照射位置を通過したことを検出する。図１に示す電気泳動装置としては、演算処理部１８が回折光強度の変化を読み取り、どの電気泳動路を泳動しているＤＮＡフラグメントが光照射位置２６に到達したのかを検出する。
【００２２】
電気泳動路２２ａ〜２２ｅにおいて同時に電気泳動を開始すると、分子量の小さい、すなわち塩基数の少ない順番でＤＮＡフラグメントが光照射位置２６を通過するため、電気泳動路からの回折光の強度分布が変化する順番を測定することによって測定対象となっているＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
演算処理部１８に記憶回路を備えさせ、電気泳動時に回折光の強度分布が変化した電気泳動路の順番をその記憶回路に記憶させるようにすれば、ＤＮＡの塩基配列を自動的に決定することが可能な塩基配列決定装置とすることができる。
【００２３】
ところで、上記実施例では、複数の均一な微細流路３３が電気泳動路２２ａ〜２２ｅの試料注入端から少し離れた位置から下端にかけて形成されているが、本発明はこれに限定されるものではなく、図５に示されるように、光照射位置２６にのみ回折格子３３ａが設けられていてもよい。そうすれば、微細流路３３の長さが短くなるので、微細流路３３において試料の目詰まりが起こりにくくなる。
また、図２（Ａ）において、微細流路３３に代えてキャピラリーを並列に配置してもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】電気泳動装置の一実施例を示す概略構成図である。
【図２】電気泳動用セルを詳細に説明するための図であり、（Ａ）はその平面図、（Ｂ）は破線円部分の拡大図、（Ｃ）は（Ｂ）のＸ−Ｘ位置における断面図、（Ｄ）は（Ａ）のＹ−Ｙ位置における断面図である。
【図３】同実施例の電気泳動装置を用いた電気泳動方法の一実施例を説明するための図であり、（Ａ）は電気泳動用セルの平面図、（Ｂ）は電気泳動時の試料の流れを示す電気泳動用セルの平面図である。
【図４】回折光の光強度分布の一例を示すグラフであり、（Ａ）は光照射位置に試料が到達していないときの回折光強度分布、（Ｂ）は光照射位置に試料が到達したときの回折光強度分布である。
【図５】電気泳動用セルの他の実施例を示す平面図である。
【符号の説明】
【００２５】
２    電気泳動用セル
２ａ  下側透明基板
２ｂ  上側透明基板
４    液輸送・回収部
６    電源
８    制御部
１０  光源
１２  レンズ
１４  受光光学系
１６  アンプ
１８  演算処理部
２０  表示部
２２ａ〜２２ｅ  電気泳動路
２４  試料受け
２６  光照射位置
３３  微細流路
３４  試料成分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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