(57)【要約】【課題】本発明は、胃癌の判定に有効な胃癌マーカー遺伝子やその発現産物である胃癌マーカーポリペプチド、胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット、胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キット、及び、胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ等を有効成分として含むことを特徴とする胃癌の治療薬剤などを提供することを目的とする。【解決手段】胃非癌組織に比べて胃癌組織において発現が著しく亢進している胃癌マーカー遺伝子や、その発現産物である胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量することにより、胃癌であるかどうかを判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中に存在する、以下の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法。
ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＡＱＰ９遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＢＣＡＴ１遺伝子、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子、ＢＧＮ遺伝子、Ｃ５Ｒ１遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤＨ３遺伝子、ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＩＭＡＧＥ：３０９２４４１４遺伝子、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子、ＣＥＢＰＢ遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＩＡＳ１遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＭＫＯＲ１遺伝子、ＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子、ＣＯＬ５Ａ２遺伝子、ＣＯＬ６Ａ３遺伝子、ＣＯＬ８Ａ１遺伝子、ＣＴＧＦ遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、ＣＸＣＬ１遺伝子、ＣＸＣＬ２遺伝子、ＣＸＣＬ５遺伝子、ＣＸＣＬ６遺伝子、ＣＹＲ６１遺伝子、ＤＡＦ遺伝子、ＥＲＥＧ遺伝子、ＦＡＰ遺伝子、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＦＣＧＲ３Ｂ遺伝子、ＦＮ１遺伝子、ＦＮＤＣ１遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＮＭＢ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＰＲ８４遺伝子、Ｈ１９遺伝子、ＨＯＸＣ６遺伝子、ＩＬ１１遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ２遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ２４遺伝子、ＩＬ６遺伝子、ＩＬ８遺伝子、ＩＭＰ−３遺伝子、ＩＮＨＢＡ遺伝子、ＩＴＧＡ５遺伝子、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子、ＫＬＫ１０遺伝子、ＫＲＴ１７遺伝子、ＫＲＴ２３遺伝子、ＫＲＴ６Ｂ遺伝子、ＭＣＥＭＰ１遺伝子、ＭＭＰ１遺伝子、ＭＭＰ１０遺伝子、ＭＭＰ１２遺伝子、ＭＭＰ３遺伝子、ＭＭＰ７遺伝子、ＭＭＰ９遺伝子、ＭＮＤＡ遺伝子、ＭＲＮＡ； ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２ （ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２) 遺伝子、ＮＣＦ２遺伝子、ＮＩＤ２遺伝子、ＮＮＭＴ遺伝子、ＮＲ４Ａ３遺伝子、ＯＳＭ遺伝子、ＰＢＥＦ１遺伝子、ＰＣＯＬＣＥ遺伝子、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子、ＰＤＰＮ遺伝子、ＰＩ１５遺伝子、ＰＩ３遺伝子、ＰＬＡ２Ｇ７遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、ＰＲＯＫ２遺伝子、ＰＲＲＸ１遺伝子、ＰＴＧＳ２遺伝子、ＲＡＲＲＥＳ１遺伝子、ＲＧＳ１遺伝子、ＲＩＳ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、Ｓ１００Ａ９遺伝子、ＳＥＬＥ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＳＬＣ２Ａ３遺伝子、ＳＮＸ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＳＰＰ１遺伝子、ＳＲＰＸ２遺伝子、ＳＴＣ１遺伝子、ＳＵＬＦ１遺伝子、ＴＦＰＩ２遺伝子、ＴＧＦＢＩ遺伝子、ＴＨＢＳ１遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＴＩＭＰ１遺伝子、ＴＬＲ２遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１遺伝子、ＴＭＥＰＡＩ遺伝子、ＴＮＣ遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＷＩＳＰ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子
【請求項２】
胃癌マーカー遺伝子として、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、ＣＸＣＬ１遺伝子、ＦＡＰ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＮＭＢ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、Ｈ１９遺伝子、ＨＯＸＣ６遺伝子、ＩＮＨＢＡ遺伝子、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子、ＫＬＫ１０遺伝子、ＮＣＦ２遺伝子、ＮＩＤ２遺伝子、ＰＩ３遺伝子、ＳＥＬＥ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＳＰＰ１遺伝子、ＳＲＰＸ２遺伝子、ＳＴＣ１遺伝子、ＴＮＣ遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、及びＷＮＴ５Ａ遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量することを特徴とする請求項１に記載の胃癌の判定方法。
【請求項３】
胃癌マーカー遺伝子として、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子及び／又はＩＮＨＢＡ遺伝子を検出又は定量することを特徴とする請求項１又は２に記載の胃癌の判定方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を用いて胃癌マーカー遺伝子を検出又は定量することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の胃癌の判定方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子として、ヌクレオチド又はタンパク質を用いることを特徴とする請求項４記載の胃癌の判定方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを用いることを特徴とする請求項４又は５記載の胃癌の判定方法。
【請求項７】
ヌクレオチドとして、請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用のヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項５又は６記載の胃癌の判定方法。
【請求項８】
ヌクレオチドとして、請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用の標識化ヌクレオチドを用いることを特徴とする請求項５記載の胃癌の判定方法。
【請求項９】
被検試料中に存在する、以下の胃癌マーカーポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法。
ＡＮＧＰＴ２ポリペプチド、ＡＱＰ９ポリペプチド、ＡＳＰＮポリペプチド、ＢＣＡＴ１ポリペプチド、ＢＣＬ２Ａ１ポリペプチド、ＢＧＮポリペプチド、Ｃ５Ｒ１ポリペプチド、ＣＣＬ３ポリペプチド、ＣＣＬ４ポリペプチド、ＣＤ１４ポリペプチド、ＣＤＨ３ポリペプチド、ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＩＭＡＧＥ：３０９２４４１４ポリペプチド、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６ポリペプチド、ＣＥＢＰＢポリペプチド、ＣＨＩ３Ｌ１ポリペプチド、ＣＩＡＳ１ポリペプチド、ＣＬＤＮ１ポリペプチド、ＣＭＫＯＲ１ポリペプチド、ＣＯＬ１０Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１１Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１２Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１Ａ２ポリペプチド、ＣＯＬ４Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ５Ａ２ポリペプチド、ＣＯＬ６Ａ３ポリペプチド、ＣＯＬ８Ａ１ポリペプチド、ＣＴＧＦポリペプチド、ＣＴＨＲＣ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ２ポリペプチド、ＣＸＣＬ５ポリペプチド、ＣＸＣＬ６ポリペプチド、ＣＹＲ６１ポリペプチド、ＤＡＦポリペプチド、ＥＲＥＧポリペプチド、ＦＡＰポリペプチド、ＦＣＧＲ２Ａポリペプチド、ＦＣＧＲ３Ｂポリペプチド、ＦＮ１ポリペプチド、ＦＮＤＣ１ポリペプチド、ＦＰＲ１ポリペプチド、ＧＰＮＭＢポリペプチド、ＧＰＲ１０９Ｂポリペプチド、ＧＰＲ８４ポリペプチド、Ｈ１９ポリペプチド、ＨＯＸＣ６ポリペプチド、ＩＬ１１ポリペプチド、ＩＬ１３ＲＡ２ポリペプチド、ＩＬ１Ａポリペプチド、ＩＬ１Ｂポリペプチド、ＩＬ２４ポリペプチド、ＩＬ６ポリペプチド、ＩＬ８ポリペプチド、ＩＭＰ−３ポリペプチド、ＩＮＨＢＡポリペプチド、ＩＴＧＡ５ポリペプチド、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、ＫＬＫ１０ポリペプチド、ＫＲＴ１７ポリペプチド、ＫＲＴ２３ポリペプチド、ＫＲＴ６Ｂポリペプチド、ＭＣＥＭＰ１ポリペプチド、ＭＭＰ１ポリペプチド、ＭＭＰ１０ポリペプチド、ＭＭＰ１２ポリペプチド、ＭＭＰ３ポリペプチド、ＭＭＰ７ポリペプチド、ＭＭＰ９ポリペプチド、ＭＮＤＡポリペプチド、ＭＲＮＡ； ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２ （ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２) ポリペプチド、ＮＣＦ２ポリペプチド、ＮＩＤ２ポリペプチド、ＮＮＭＴポリペプチド、ＮＲ４Ａ３ポリペプチド、ＯＳＭポリペプチド、ＰＢＥＦ１ポリペプチド、ＰＣＯＬＣＥポリペプチド、ＰＤＥ４Ｂポリペプチド、ＰＤＰＮポリペプチド、ＰＩ１５ポリペプチド、ＰＩ３ポリペプチド、ＰＬＡ２Ｇ７ポリペプチド、ＰＬＡＵポリペプチド、ＰＲＯＫ２ポリペプチド、ＰＲＲＸ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ２ポリペプチド、ＲＡＲＲＥＳ１ポリペプチド、ＲＧＳ１ポリペプチド、ＲＩＳ１ポリペプチド、Ｓ１００Ａ８ポリペプチド、Ｓ１００Ａ９ポリペプチド、ＳＥＬＥポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＥ１ポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＨ１ポリペプチド、ＳＦＲＰ２ポリペプチド、ＳＬＣ２Ａ３ポリペプチド、ＳＮＸ１０ポリペプチド、ＳＯＣＳ３ポリペプチド、ＳＯＤ２ポリペプチド、ＳＰＡＲＣポリペプチド、ＳＰＰ１ポリペプチド、ＳＲＰＸ２ポリペプチド、ＳＴＣ１ポリペプチド、ＳＵＬＦ１ポリペプチド、ＴＦＰＩ２ポリペプチド、ＴＧＦＢＩポリペプチド、Ｔ��ＢＳ１ポリペプチド、ＴＨＢＳ２ポリペプチド、ＴＩＭＰ１ポリペプチド、ＴＬＲ２ポリペプチド、ＴＭ４ＳＦ１ポリペプチド、ＴＭＥＰＡＩポリペプチド、ＴＮＣポリペプチド、ＴＮＦＡＩＰ６ポリペプチド、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａポリペプチド、ＴＲＥＭ１ポリペプチド、ＷＩＳＰ１ポリペプチド、ＷＮＴ５Ａポリペプチド
【請求項１０】
胃癌マーカーポリペプチドとして、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６ポリペプチド、ＣＬＤＮ１ポリペプチド、ＣＴＨＲＣ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ１ポリペプチド、ＦＡＰポリペプチド、ＦＰＲ１ポリペプチド、ＧＰＮＭＢポリペプチド、ＧＰＲ１０９Ｂポリペプチド、Ｈ１９ポリペプチド、ＨＯＸＣ６ポリペプチド、ＩＮＨＢＡポリペプチド、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、ＫＬＫ１０ポリペプチド、ＮＣＦ２ポリペプチド、ＮＩＤ２ポリペプチド、ＰＩ３ポリペプチド、ＳＥＬＥポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＨ１ポリペプチド、ＳＦＲＰ２ポリペプチド、ＳＰＰ１ポリペプチド、ＳＲＰＸ２ポリペプチド、ＳＴＣ１ポリペプチド、ＴＮＣポリペプチド、ＴＮＦＡＩＰ６ポリペプチド、及びＷＮＴ５Ａポリペプチドから選ばれる１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項９に記載の胃癌の判定方法。
【請求項１１】
胃癌マーカーポリペプチドとして、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、及び／又はＩＮＨＢＡポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項９又は１０に記載の胃癌の判定方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を用いて胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌の判定方法。
【請求項１３】
請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子として、抗体又はアプタマーを用いることを特徴とする請求項１２記載の胃癌の判定方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする請求項１４記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット。
【請求項１６】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを備えたことを特徴とする請求項１４又は１５記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット。
【請求項１７】
ヌクレオチドが、請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用のヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５又は１６記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット。
【請求項１８】
ヌクレオチドが、請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用の標識化ヌクレオチドであることを特徴とする請求項１５記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット。
【請求項１９】
請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キット。
【請求項２０】
請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体及び／又はアプタマーであることを特徴とする請求項１９記載の胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キット。
【請求項２１】
（ａ）請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド、（ｂ）請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ、（ｃ）請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体、又は、（ｄ）請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するリボザイムを有効成分として含むことを特徴とする胃癌の治療薬剤。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡが、請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項２１に記載の胃癌の治療薬剤。
【請求項２３】
ｓｉＲＮＡが、配列番号１６８〜１７１のいずれか記載のＲＮＡと、該ＲＮＡに相補的なＲＮＡとからなるｓｉＲＮＡである請求項２２に記載の胃癌の治療薬剤。
【請求項２４】
ヒト胃癌培養細胞株を被検物質の存在下に培養した後、該ヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する請求項１〜３のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子及び／若しくは請求項９〜１１のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする胃癌治療剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃癌マーカー遺伝子を特定することによる胃癌診断及び創薬への利用に関し、より具体的には、特定の胃癌マーカー遺伝子やその発現産物である胃癌マーカーポリペプチドを用いた胃癌の判定方法、前記胃癌マーカー遺伝子に対するｓｉＲＮＡを含む胃癌治療剤、前記胃癌マーカー遺伝子や胃癌マーカーポリペプチドを利用した胃癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本と東南アジアでは、胃癌は消化管の悪性腫瘍の中で最も多く、また、世界でも、癌死亡率では第２位を占めている。胃癌の予後は、診断技術や治療法の発達により改善しているが、進行胃癌の場合の予後は良いとはいえず、胃漿膜にまで浸潤した胃癌の予後は、５年生存率で３５％と低い。また、進行癌の治癒的切除の後に起こる再発の主原因は腹膜播種である。この腹膜播種再発においてはいまだに有効な治療法がなく、５年生存率は５％以下と報告されている。胃癌細胞の悪性な特性のうち、腹膜への転移は特に複雑な現象であり、多くのステップと多くの遺伝子が関与している。これまでの報告によれば、胃癌の腹膜播種には、接着分子関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子や他の遺伝子が深く関与しているとされており、胃癌の腹膜播種を始めとする胃癌の転移のメカニズム解明には、さらなる研究が必要であるとされている。
【０００３】
胃癌を始めとする癌の検出・診断方法として、血中の腫瘍マーカーを計測する方法が挙げられる。腫瘍マーカーは、腫瘍細胞が産生する物質、又は腫瘍に対する反応により正常細胞が産生する物質であり、これらの物質のうち、血中や尿中で増加する物質を計測することによって、腫瘍の診断を簡便な体外診断により行うことができる。
【０００４】
腫瘍マーカーとしては、乳癌患者の胸部組織と正常人の胸部組織で差異的に発現する遺伝子を使用した悪性腫瘍、特に乳癌を予想、診断、予後判定、予防および処置するための新規な組成物、方法および使用や（例えば、特許文献１参照。）や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎又は肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアＤＮＡの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法（例えば、特許文献２参照。）や、その遺伝子産物がＣＬＬ細胞及び前立腺癌細胞の新生物性又は腫瘍形成性増殖を抑制するｍｉＲ１５及びｍｉＲ１６のコピー数、変異状態又は遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病又は前立腺癌の診断方法（例えば、特許文献３参照。）や、無症候性期又は初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素IIの活性化化合物（腫瘍マーカー）、前記癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法；ならびに該癌の診断方法を行うためのキット（例えば、特許文献４参照。）等が知られている。
【０００５】
また、胃癌に関しては、既知のＩ型コラーゲンのＣ端非３重鎖テロペプチド（ＩＣＴＰ）の発現量の変動をマーカーにすることを特徴とする、進行胃癌、特にスキルス胃癌の適切な診断マーカー（例えば、特許文献５参照。）や、従来のＲＬＧＳ法に比較して少量のＤＮＡサンプルを用い簡便で、迅速、安価に癌患者の予後が良好か否かを診断することのできる技術を確立するものであって、癌部または非癌部組織検体より得られたＤＮＡ繰り返し配列中に存在する脱メチル化ＤＮＡ数を測定し、その割合に基づいて胃癌をはじめ、種々の癌疾患の予後が良好か否かを判断する方法（例えば、特許文献６参照。）や、転移性結腸直腸癌あるいは原発性及び／又は転移性の胃癌又は食道癌をスクリーニング・診断するための試薬、キット及び方法や、その患者を処置するためにインビボでイメージングするための化合物や組成物、その治療や予防のための薬物、遺伝子療法薬およびアンチセンス化合物を運搬するための組成物、ワクチンおよび方法（例えば、特許文献７参照。）や、細胞の生体エネルギー的指数を作成するため、構造タンパク質及びミトコンドリアの呼吸（それぞれ例えば、ｈｓｐ６０やチトクロームオキシダーゼのサブユニットＩおよびＩＶ）に関して、ミトコンドリアの生体エネルギー的機能のタンパク質（Ｈ＋−ＡＴＰ合成酵素のβ−触媒サブユニットなど）の発現についての研究を使用すること、そしてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素及びピルビン酸キナーゼＭなどの細胞の解糖経路のタンパク質の発現に関連する前記ミトコンドリア生体エネルギー指数（β−ＡＴＰａｓｅ／ｈｓｐ６０比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩ比；β−ＡＴＰａｓｅ／ＣＯＸＩＶ比）を使用することからなる、細胞の代謝性マーカーの研究に基づいて、癌の検出、進行の解析、および悪性腫瘍を予後診断するための方法（例えば、特許文献８参照。）等が提案されている。
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−１５９６４０号公報
【特許文献２】特開２００４−１２１０２９号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６４６９号公報
【特許文献４】特表２００１−５２４８１５号公報
【特許文献５】特開２００１−３３４６０号公報
【特許文献６】特開２００２−１１２７９９号公報
【特許文献７】特表２００３−５３２３８９号公報
【特許文献８】特表２００５−５２６９８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、胃癌の判定に有効な胃癌マーカー遺伝子やその発現産物である胃癌マーカーポリペプチド、胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キット、胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キット、及び、胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ等を有効成分として含むことを特徴とする胃癌の治療薬剤などを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、胃癌患者の胃の癌部位（胃癌組織）と非癌部位（胃正常組織）における遺伝子の発現量を網羅的に比較検討し、胃正常組織に比べて胃癌組織において発現が著しく亢進している遺伝子が１２０個存在していることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）被検試料中に存在する、以下の胃癌マーカー遺伝子（以下、「本件胃癌マーカー遺伝子」と総称することがある。）から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法に関する。
ＡＮＧＰＴ２遺伝子、ＡＱＰ９遺伝子、ＡＳＰＮ遺伝子、ＢＣＡＴ１遺伝子、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子、ＢＧＮ遺伝子、Ｃ５Ｒ１遺伝子、ＣＣＬ３遺伝子、ＣＣＬ４遺伝子、ＣＤ１４遺伝子、ＣＤＨ３遺伝子、ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＩＭＡＧＥ：３０９２４４１４遺伝子、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子、ＣＥＢＰＢ遺伝子、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子、ＣＩＡＳ１遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＭＫＯＲ１遺伝子、ＣＯＬ１０Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１２Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子、ＣＯＬ５Ａ２遺伝子、ＣＯＬ６Ａ３遺伝子、ＣＯＬ８Ａ１遺伝子、ＣＴＧＦ遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、ＣＸＣＬ１遺伝子、ＣＸＣＬ２遺伝子、ＣＸＣＬ５遺伝子、ＣＸＣＬ６遺伝子、ＣＹＲ６１遺伝子、ＤＡＦ遺伝子、ＥＲＥＧ遺伝子、ＦＡＰ遺伝子、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子、ＦＣＧＲ３Ｂ遺伝子、ＦＮ１遺伝子、ＦＮＤＣ１遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＮＭＢ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、ＧＰＲ８４遺伝子、Ｈ１９遺伝子、ＨＯＸＣ６遺伝子、ＩＬ１１遺伝子、ＩＬ１３ＲＡ２遺伝子、ＩＬ１Ａ遺伝子、ＩＬ１Ｂ遺伝子、ＩＬ２４遺伝子、ＩＬ６遺伝子、ＩＬ８遺伝子、ＩＭＰ−３遺伝子、ＩＮＨＢＡ遺伝子、ＩＴＧＡ５遺伝子、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子、ＫＬＫ１０遺伝子、ＫＲＴ１７遺伝子、ＫＲＴ２３遺伝子、ＫＲＴ６Ｂ遺伝子、ＭＣＥＭＰ１遺伝子、ＭＭＰ１遺伝子、ＭＭＰ１０遺伝子、ＭＭＰ１２遺伝子、ＭＭＰ３遺伝子、ＭＭＰ７遺伝子、ＭＭＰ９遺伝子、ＭＮＤＡ遺伝子、ＭＲＮＡ； ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２ （ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２) 遺伝子、ＮＣＦ２遺伝子、ＮＩＤ２遺伝子、ＮＮＭＴ遺伝子、ＮＲ４Ａ３遺伝子、ＯＳＭ遺伝子、ＰＢＥＦ１遺伝子、ＰＣＯＬＣＥ遺伝子、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子、ＰＤＰＮ遺伝子、ＰＩ１５遺伝子、ＰＩ３遺伝子、ＰＬＡ２Ｇ７遺伝子、ＰＬＡＵ遺伝子、ＰＲＯＫ２遺伝子、ＰＲＲＸ１遺伝子、ＰＴＧＳ２遺伝子、ＲＡＲＲＥＳ１遺伝子、ＲＧＳ１遺伝子、ＲＩＳ１遺伝子、Ｓ１００Ａ８遺伝子、Ｓ１００Ａ９遺伝子、ＳＥＬＥ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＳＬＣ２Ａ３遺伝子、ＳＮＸ１０遺伝子、ＳＯＣＳ３遺伝子、ＳＯＤ２遺伝子、ＳＰＡＲＣ遺伝子、ＳＰＰ１遺伝子、ＳＲＰＸ２遺伝子、ＳＴＣ１遺伝子、ＳＵＬＦ１遺伝子、ＴＦＰＩ２遺伝子、ＴＧＦＢＩ遺伝子、ＴＨＢＳ１遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＴＩＭＰ１遺伝子、ＴＬＲ２遺伝子、ＴＭ４ＳＦ１遺伝子、ＴＭＥＰＡＩ遺伝子、ＴＮＣ遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＷＩＳＰ１遺伝子、ＷＮＴ５Ａ遺伝子
【００１０】
また本発明は、（２）胃癌マーカー遺伝子として、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、ＣＸＣＬ１遺伝子、ＦＡＰ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＮＭＢ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、Ｈ１９遺伝子、ＨＯＸＣ６遺伝子、ＩＮＨＢＡ遺伝子、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子、ＫＬＫ１０遺伝子、ＮＣＦ２遺伝子、ＮＩＤ２遺伝子、ＰＩ３遺伝子、ＳＥＬＥ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＳＰＰ１遺伝子、ＳＲＰＸ２遺伝子、ＳＴＣ１遺伝子、ＴＮＣ遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、及びＷＮＴ５Ａ遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量することを特徴とする上記（１）記載の胃癌の判定方法や、（３）胃癌マーカー遺伝子として、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子及び／又はＩＮＨＢＡ遺伝子を検出又は定量することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の胃癌の判定方法に関する。
【００１１】
また本発明は、（４）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を用いて胃癌マーカー遺伝子を検出又は定量することを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌の判定方法や、（５）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子として、ヌクレオチド又はタンパク質を用いることを特徴とする上記（４）記載の胃癌の判定方法や、（６）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを用いることを特徴とする上記（４）又は（５）記載の胃癌の判定方法や、（７）ヌクレオチドとして、上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用のヌクレオチドを用いることを特徴とする上記（５）又は（６）記載の胃癌の判定方法や、（８）ヌクレオチドとして、上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用の標識化ヌクレオチドを用いることを特徴とする上記（５）記載の胃癌の判定方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、（９）被検試料中に存在する、以下の胃癌マーカーポリペプチド（以下、「本件胃癌マーカーポリペプチド」と総称することがある。）から選択される１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする胃癌の判定方法に関する。
ＡＮＧＰＴ２ポリペプチド、ＡＱＰ９ポリペプチド、ＡＳＰＮポリペプチド、ＢＣＡＴ１ポリペプチド、ＢＣＬ２Ａ１ポリペプチド、ＢＧＮポリペプチド、Ｃ５Ｒ１ポリペプチド、ＣＣＬ３ポリペプチド、ＣＣＬ４ポリペプチド、ＣＤ１４ポリペプチド、ＣＤＨ３ポリペプチド、ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＩＭＡＧＥ：３０９２４４１４ポリペプチド、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６ポリペプチド、ＣＥＢＰＢポリペプチド、ＣＨＩ３Ｌ１ポリペプチド、ＣＩＡＳ１ポリペプチド、ＣＬＤＮ１ポリペプチド、ＣＭＫＯＲ１ポリペプチド、ＣＯＬ１０Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１１Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１２Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ１Ａ２ポリペプチド、ＣＯＬ４Ａ１ポリペプチド、ＣＯＬ５Ａ２ポリペプチド、ＣＯＬ６Ａ３ポリペプチド、ＣＯＬ８Ａ１ポリペプチド、ＣＴＧＦポリペプチド、ＣＴＨＲＣ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ２ポリペプチド、ＣＸＣＬ５ポリペプチド、ＣＸＣＬ６ポリペプチド、ＣＹＲ６１ポリペプチド、ＤＡＦポリペプチド、ＥＲＥＧポリペプチド、ＦＡＰポリペプチド、ＦＣＧＲ２Ａポリペプチド、ＦＣＧＲ３Ｂポリペプチド、ＦＮ１ポリペプチド、ＦＮＤＣ１ポリペプチド、ＦＰＲ１ポリペプチド、ＧＰＮＭＢポリペプチド、ＧＰＲ１０９Ｂポリペプチド、ＧＰＲ８４ポリペプチド、Ｈ１９ポリペプチド、ＨＯＸＣ６ポリペプチド、ＩＬ１１ポリペプチド、ＩＬ１３ＲＡ２ポリペプチド、ＩＬ１Ａポリペプチド、ＩＬ１Ｂポリペプチド、ＩＬ２４ポリペプチド、ＩＬ６ポリペプチド、ＩＬ８ポリペプチド、ＩＭＰ−３ポリペプチド、ＩＮＨＢＡポリペプチド、ＩＴＧＡ５ポリペプチド、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、ＫＬＫ１０ポリペプチド、ＫＲＴ１７ポリペプチド、ＫＲＴ２３ポリペプチド、ＫＲＴ６Ｂポリペプチド、ＭＣＥＭＰ１ポリペプチド、ＭＭＰ１ポリペプチド、ＭＭＰ１０ポリペプチド、ＭＭＰ１２ポリペプチド、ＭＭＰ３ポリペプチド、ＭＭＰ７ポリペプチド、ＭＭＰ９ポリペプチド、ＭＮＤＡポリペプチド、ＭＲＮＡ； ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２ （ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２) ポリペプチド、ＮＣＦ２ポリペプチド、ＮＩＤ２ポリペプチド、ＮＮＭＴポリペプチド、ＮＲ４Ａ３ポリペプチド、ＯＳＭポリペプチド、ＰＢＥＦ１ポリペプチド、ＰＣＯＬＣＥポリペプチド、ＰＤＥ４Ｂポリペプチド、ＰＤＰＮポリペプチド、ＰＩ１５ポリペプチド、ＰＩ３ポリペプチド、ＰＬＡ２Ｇ７ポリペプチド、ＰＬＡＵポリペプチド、ＰＲＯＫ２ポリペプチド、ＰＲＲＸ１ポリペプチド、ＰＴＧＳ２ポリペプチド、ＲＡＲＲＥＳ１ポリペプチド、ＲＧＳ１ポリペプチド、ＲＩＳ１ポリペプチド、Ｓ１００Ａ８ポリペプチド、Ｓ１００Ａ９ポリペプチド、ＳＥＬＥポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＥ１ポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＨ１ポリペプチド、ＳＦＲＰ２ポリペプチド、ＳＬＣ２Ａ３ポリペプチド、ＳＮＸ１０ポリペプチド、ＳＯＣＳ３ポリペプチド、ＳＯＤ２ポリペプチド、ＳＰＡＲＣポリペプチド、ＳＰＰ１ポリペプチド、ＳＲＰＸ２ポリペプチド、ＳＴＣ１ポリペプチド、ＳＵＬＦ１ポリペプチド、ＴＦＰＩ２ポリペプチド、ＴＧＦＢＩポリペプチド、Ｔ��ＢＳ１ポリペプチド、ＴＨＢＳ２ポリペプチド、ＴＩＭＰ１ポリペプチド、ＴＬＲ２ポリペプチド、ＴＭ４ＳＦ１ポリペプチド、ＴＭＥＰＡＩポリペプチド、ＴＮＣポリペプチド、ＴＮＦＡＩＰ６ポリペプチド、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａポリペプチド、ＴＲＥＭ１ポリペプチド、ＷＩＳＰ１ポリペプチド、ＷＮＴ５Ａポリペプチド
【００１３】
また本発明は、（１０）胃癌マーカーポリペプチドとして、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６ポリペプチド、ＣＬＤＮ１ポリペプチド、ＣＴＨＲＣ１ポリペプチド、ＣＸＣＬ１ポリペプチド、ＦＡＰポリペプチド、ＦＰＲ１ポリペプチド、ＧＰＮＭＢポリペプチド、ＧＰＲ１０９Ｂポリペプチド、Ｈ１９ポリペプチド、ＨＯＸＣ６ポリペプチド、ＩＮＨＢＡポリペプチド、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、ＫＬＫ１０ポリペプチド、ＮＣＦ２ポリペプチド、ＮＩＤ２ポリペプチド、ＰＩ３ポリペプチド、ＳＥＬＥポリペプチド、ＳＥＲＰＩＮＨ１ポリペプチド、ＳＦＲＰ２ポリペプチド、ＳＰＰ１ポリペプチド、ＳＲＰＸ２ポリペプチド、ＳＴＣ１ポリペプチド、ＴＮＣポリペプチド、ＴＮＦＡＩＰ６ポリペプチド、及びＷＮＴ５Ａポリペプチドから選ばれる１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（９）に記載の胃癌の判定方法や、（１１）胃癌マーカーポリペプチドとして、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド、及び／又はＩＮＨＢＡポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（９）又は（１０）に記載の胃癌の判定方法に関する。
【００１４】
また本発明は、（１２）上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を用いて胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量することを特徴とする上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌の判定方法や、（１３）上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子として、抗体又はアプタマーを用いることを特徴とする上記（１２）記載の胃癌の判定方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（１４）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、（１５）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が、ヌクレオチド又はタンパク質であることを特徴とする上記（１４）記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、（１６）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを備えたことを特徴とする上記（１４）又は（１５）記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、（１７）ヌクレオチドが、上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用のヌクレオチドであることを特徴とする上記（１５）又は（１６）記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、（１８）ヌクレオチドが、上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒのプローブ用の標識化ヌクレオチドであることを特徴とする上記（１５）記載の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、（１９）上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたことを特徴とする胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キットや、（２０）上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子が、抗体及び／又はアプタマーであることを特徴とする上記（１９）記載の胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キットに関する。
【００１６】
また本発明は、（２１）（ａ）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド、（ｂ）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ、（ｃ）上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体、又は、（ｄ）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するリボザイムを有効成分として含むことを特徴とする胃癌の治療薬剤や、（２２）上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡが、上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するｓｉＲＮＡであることを特徴とする上記（２１）に記載の胃癌の治療薬剤や、（２３）ｓｉＲＮＡが、配列番号１６８〜１７１のいずれか記載のＲＮＡと、該ＲＮＡに相補的なＲＮＡとからなるｓｉＲＮＡである上記（２２）に記載の胃癌の治療薬剤に関する。
【００１７】
さらに本発明は、（２４）ヒト胃癌培養細胞株を被検物質の存在下に培養した後、該ヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する上記（１）〜（３）のいずれか記載の胃癌マーカー遺伝子及び／若しくは上記（９）〜（１１）のいずれか記載の胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価することを特徴とする胃癌治療剤のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
生体試料中における本件胃癌マーカー遺伝子や本件胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量すること等により、生体試料の採取源が胃癌患者であるかどうか、又は生体試料が胃癌組織であるかどうかを非常に簡便に判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の胃癌の判定方法としては、被検試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量する方法や、本件胃癌マーカーポリペプチドから選択される１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量する方法であれば特に制限されないが、上記本件胃癌マーカー遺伝子や本件胃癌マーカーポリペプチドとしては、胃癌患者や胃癌組織に特異的に発現し、他の癌患者や癌組織には発現しないものが好ましい。また、上記被検試料としては、胃癌組織、胃正常組織等の組織のほか、血清、血漿等の血液サンプル、リンパ液、尿、唾液等を例示することができるが、中でも血清、血漿等の血液サンプルを好適に例示することができる。なお、本明細書中においては、「癌」と「腫瘍」は同じ意味に用いられる。
【００２０】
本件胃癌マーカー遺伝子の配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、以下の表１に記載されたアクセッションナンバーによりアプローチすることができる。
【００２１】
【表１】
2008118915.tif 000002
2008118915.tif 000003
2008118915.tif 000004
2008118915.tif 000005
【００２２】
また、本件胃癌マーカー遺伝子は、以下の配列表の配列番号によって示される塩基配列によっても特定することができる。
ＡＮＧＰＴ２遺伝子（配列番号１）、ＡＱＰ９遺伝子（配列番号２）、ＡＳＰＮ遺伝子（配列番号３）、ＢＣＡＴ１遺伝子（配列番号４）、ＢＣＬ２Ａ１遺伝子（配列番号５）、ＢＧＮ遺伝子（配列番号６）、Ｃ５Ｒ１遺伝子（配列番号７）、ＣＣＬ３遺伝子（配列番号８）、ＣＣＬ４遺伝子（配列番号９）、ＣＤ１４遺伝子（配列番号１０）、ＣＤＨ３遺伝子（配列番号１１）、ＣＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ＩＭＡＧＥ：３０９２４４１４遺伝子（配列番号１２）、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子（配列番号１３）、ＣＥＢＰＢ遺伝子（配列番号１４）、ＣＨＩ３Ｌ１遺伝子（配列番号１５）、ＣＩＡＳ１遺伝子（配列番号１６）、ＣＬＤＮ１遺伝子（配列番号１７）、ＣＭＫＯＲ１遺伝子（配列番号１８）、ＣＯＬ１０Ａ１遺伝子（配列番号１９）、ＣＯＬ１１Ａ１遺伝子（配列番号２０）、ＣＯＬ１２Ａ１遺伝子（配列番号２１）、ＣＯＬ１Ａ１遺伝子（配列番号２２）、ＣＯＬ１Ａ２遺伝子（配列番号２３）、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子（配列番号２４）、ＣＯＬ５Ａ２遺伝子（配列番号２５）、ＣＯＬ６Ａ３遺伝子（配列番号２６）、ＣＯＬ８Ａ１遺伝子（配列番号２７）、ＣＴＧＦ遺伝子（配列番号２８）、ＣＴＨＲＣ１遺伝子（配列番号２９）、ＣＸＣＬ１遺伝子（配列番号３０）、ＣＸＣＬ２遺伝子（配列番号３１）、ＣＸＣＬ５遺伝子（配列番号３２）、ＣＸＣＬ６遺伝子（配列番号３３）、ＣＹＲ６１遺伝子（配列番号３４）、ＤＡＦ遺伝子（配列番号３５）、ＥＲＥＧ遺伝子（配列番号３６）、ＦＡＰ遺伝子（配列番号３７）、ＦＣＧＲ２Ａ遺伝子（配列番号３８）、ＦＣＧＲ３Ｂ遺伝子（配列番号３９）、ＦＮ１遺伝子（配列番号４０）、ＦＮＤＣ１遺伝子（配列番号４１）、ＦＰＲ１遺伝子（配列番号４２）、ＧＰＮＭＢ遺伝子（配列番号４３）、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子（配列番号４４）、ＧＰＲ８４遺伝子（配列番号４５）、Ｈ１９遺伝子（配列番号４６）、ＨＯＸＣ６遺伝子（配列番号４７）、ＩＬ１１遺伝子（配列番号４８）、ＩＬ１３ＲＡ２遺伝子（配列番号４９）、ＩＬ１Ａ遺伝子（配列番号５０）、ＩＬ１Ｂ遺伝子（配列番号５１）、ＩＬ２４遺伝子（配列番号５２）、ＩＬ６遺伝子（配列番号５３）、ＩＬ８遺伝子（配列番号５４）、ＩＭＰ−３遺伝子（配列番号５５）、ＩＮＨＢＡ遺伝子（配列番号５６）、ＩＴＧＡ５遺伝子（配列番号５７）、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子（配列番号５８）、ＫＬＫ１０遺伝子（配列番号５９）、ＫＲＴ１７遺伝子（配列番号６０）、ＫＲＴ２３遺伝子（配列番号６１）、ＫＲＴ６Ｂ遺伝子（配列番号６２）、ＭＣＥＭＰ１遺伝子（配列番号６３）、ＭＭＰ１遺伝子（配列番号６４）、ＭＭＰ１０遺伝子（配列番号６５）、ＭＭＰ１２遺伝子（配列番号６６）、ＭＭＰ３遺伝子（配列番号６７）、ＭＭＰ７遺伝子（配列番号６８）、ＭＭＰ９遺伝子（配列番号６９）、ＭＮＤＡ遺伝子（配列番号７０）、ＭＲＮＡ； ｃＤＮＡ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２ （ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅ ＤＫＦＺｐ６６７Ａ１８２) 遺伝子（配列番号７１）、ＮＣＦ２遺伝子（配列番号７２）、ＮＩＤ２遺伝子（配列番号７３）、ＮＮＭＴ遺伝子（配列番号７４）、ＮＲ４Ａ３遺伝子（配列番号７５）、ＯＳＭ遺伝子（配列番号７６）、ＰＢＥＦ��遺伝子（配列番号７７）、ＰＣＯＬＣＥ遺伝子（配列番号７８）、ＰＤＥ４Ｂ遺伝子（配列番号７９）、ＰＤＰＮ遺伝子（配列番号８０）、ＰＩ１５遺伝子（配列番号８１）、ＰＩ３遺伝子（配列番号８２）、ＰＬＡ２Ｇ７遺伝子（配列番号８３）、ＰＬＡＵ遺伝子（配列番号８４）、ＰＲＯＫ２遺伝子（配列番号８５）、ＰＲＲＸ１遺伝子（配列番号８６）、ＰＴＧＳ２遺伝子（配列番号８７）、ＲＡＲＲＥＳ１遺伝子（配列番号８８）、ＲＧＳ１遺伝子（配列番号８９）、ＲＩＳ１遺伝子（配列番号９０）、Ｓ１００Ａ８遺伝子（配列番号９１）、Ｓ１００Ａ９遺伝子（配列番号９２）、ＳＥＬＥ遺伝子（配列番号９３）、ＳＥＲＰＩＮＥ１遺伝子（配列番号９４）、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子（配列番号９５）、ＳＦＲＰ２遺伝子（配列番号９６）、ＳＬＣ２Ａ３遺伝子（配列番号９７）、ＳＮＸ１０遺伝子（配列番号９８）、ＳＯＣＳ３遺伝子（配列番号９９）、ＳＯＤ２遺伝子（配列番号１００）、ＳＰＡＲＣ遺伝子（配列番号１０１）、ＳＰＰ１遺伝子（配列番号１０２）、ＳＲＰＸ２遺伝子（配列番号１０３）、ＳＴＣ１遺伝子（配列番号１０４）、ＳＵＬＦ１遺伝子（配列番号１０５）、ＴＦＰＩ２遺伝子（配列番号１０６）、ＴＧＦＢＩ遺伝子（配列番号１０７）、ＴＨＢＳ１遺伝子（配列番号１０８）、ＴＨＢＳ２遺伝子（配列番号１０９）、ＴＩＭＰ１遺伝子（配列番号１１０）、ＴＬＲ２遺伝子（配列番号１１１）、ＴＭ４ＳＦ１遺伝子（配列番号１１２）、ＴＭＥＰＡＩ遺伝子（配列番号１１３）、ＴＮＣ遺伝子（配列番号１１４）、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子（配列番号１１５）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子（配列番号１１６）、ＴＲＥＭ１遺伝子（配列番号１１７）、ＷＩＳＰ１遺伝子（配列番号１１８）、ＷＮＴ５Ａ遺伝子（配列番号１１９）
【００２３】
本件胃癌マーカー遺伝子の中でも、検出・定量感度等の観点から、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６遺伝子、ＣＬＤＮ１遺伝子、ＣＴＨＲＣ１遺伝子、ＣＸＣＬ１遺伝子、ＦＡＰ遺伝子、ＦＰＲ１遺伝子、ＧＰＮＭＢ遺伝子、ＧＰＲ１０９Ｂ遺伝子、Ｈ１９遺伝子、ＨＯＸＣ６遺伝子、ＩＮＨＢＡ遺伝子、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子、ＫＬＫ１０遺伝子、ＮＣＦ２遺伝子、ＮＩＤ２遺伝子、ＰＩ３遺伝子、ＳＥＬＥ遺伝子、ＳＥＲＰＩＮＨ１遺伝子、ＳＦＲＰ２遺伝子、ＳＰＰ１遺伝子、ＳＲＰＸ２遺伝子、ＳＴＣ１遺伝子、ＴＮＣ遺伝子、ＴＮＦＡＩＰ６遺伝子、及びＷＮＴ５Ａ遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量することが好ましく、中でも、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子及び／又はＩＮＨＢＡ遺伝子を検出又は定量することがより好ましい。
【００２４】
本明細書中における、「胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子を検出又は定量する」とは、該遺伝子を検出又は定量する限り特に制限されず、例えば、該遺伝子ＤＮＡを直接検出又は定量してもよいし、該遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡを検出又は定量してもよい。これらの検出又は定量には、胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を用いることが好ましい。胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子としては、特に制限されないが、胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合するヌクレオチドや、抗体等のタンパク質などを例示することができる。胃癌マーカー遺伝子を検出又は定量するより具体的な方法としては、胃癌マーカー遺伝子ＤＮＡやｃＤＮＡの場合、胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合するプローブ用の標識化ヌクレオチドを用いたサザンブロット法を、ｍＲＮＡの場合、該プローブを用いたノーザンブロット法等を用いることができ、これらのヌクレオチドの検出又は定量に、特にｃＤＮＡの検出又は定量に、マイクロアレイやマイクロチップを用いる方法を適用することができる。サザンブロット法やノーザンブロット法に用いるプローブ用の標識化ヌクレオチドとしては、本件胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖（すなわち、配列番号１〜１１９のいずれかで表されるヌクレオチド配列又はその相補配列）と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１５〜３０−ｍｅｒの塩基長を有するヌクレオチドを標識化した標識化ヌクレオチドを例示することができる。マイクロアレイやマイクロチップとしては、本件胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを例示することができ、該分子としてはヌクレオチドやタンパク質などを好ましく例示することができ、該ヌクレオチドとしては、本件胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１５〜３０−ｍｅｒの塩基長を有するヌクレオチドからなるプローブ用のヌクレオチドをより好ましく例示することができる。
【００２５】
本明細書において「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチド同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いポリヌクレオチド同士がハイブリダイズしない条件、あるいは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるヌクレオチドをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、例えばモレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載の方法で行うことができる。
【００２６】
上記プローブの標識化に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素、スピン試薬などを挙げることができる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕、〔３２Ｐ〕、〔３３Ｐ〕、〔３５Ｓ〕、〔５９Ｆｅ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などを用いることができ、蛍光物質としては、例えば、シアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどを用いることができ、発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを用いることができる。
【００２７】
上記本発明における標識化プローブを用いて、本件胃癌マーカー遺伝子の有無を検出したり、発現量を測定することにより、胃癌の判定を行うことができる。また、被検試料中の本件胃癌マーカー遺伝子ＤＮＡ等の量が少ない場合には、ＤＮＡやＲＮＡをＰＣＲ法や、ＬＡＭＰ法等により増幅することができる。また、ＰＣＲ法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、コンペティティブＰＣＲ法を挙げることができる。ＰＣＲに用いるプライマーとして具体的には、表１に記載されたプローブセットナンバーのプローブ（Affymetrix社製）を好ましく例示することができる。また、本件胃癌マーカー遺伝子の配列情報に基づいてプライマーの配列を適宜設計し、適当なオリゴヌクレオチド合成装置を用いて作製することもできる。
【００２８】
上記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、細胞内のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：MolecularProbes社製）ＧｒｅｅｎＩや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Applied Biosystems社製）プローブ等があげられる。リアルタイムＰＣＲ法は、白血球中から単離したＲＮＡ等の微量のＲＮＡであっても簡便にｍＲＮＡを検出又は定量することができるので特に好ましく挙げられる。
【００２９】
また、定量的ＰＣＲとして知られている上記コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡとＤＮＡコンペティターとを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
【００３０】
前記のように、胃癌マーカー遺伝子等の検出や定量には、マイクロアレイやマイクロチップを用いる方法を適用することができる。通常、マイクロアレイやマイクロチップは、プローブが支持体上の定められた領域に固定されているアレイ又はチップであり、アレイ又はチップの支持体としては、ハイブリダイゼーションに使用可能なものであればよく、例えばガラス、シリコン、プラスチックなどの基板や、ニトロセルロース膜、ナイロン膜等を好適に用いることができる。マイクロアレイやマイクロチップの製造方法は特に制限されず、例えば、以下に示す文献に記載されたような当業者に公知の任意の方法で製造することが出来る。
ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル、林崎良英 監修（羊土社）；DNA Microarrays -A Practical Approach-, Edited by Mark Schene, Oxford University Press 1999；Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H, Brown EL. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays；Nat Biotechnol. 1996 Dec;14(13):1675-80；Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, Lockhart DJ. Genome-wide expression monitoring in Saccharomyces cerevisiae；Nat Biotechnol. 1997 Dec;15(13):1359-67.
【００３１】
マイクロアレイやマイクロチップに用いるプローブは、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよいが、プローブの安定性に優れていることからＤＮＡプローブであることが好ましい。マイクロアレイやマイクロチップを用いることにより、被検試料中や対照試料中に存在する本件胃癌マーカー遺伝子を非常に簡便に検出又は定量することができる。本発明におけるマイクロアレイやマイクロチップの使用方法については特に制限されず、通常の方法で使用することができる。例えば、生体試料（被検試料や対照試料）からｍＲＮＡを調製し、該ｍＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行う際に、適切な標識を付したプライマーや標識ヌクレオチドを使用することにより、標識されたｃＤＮＡを得ることができる。この標識化ｃＤＮＡとマイクロアレイやマイクロチップ表面上に固定された本発明におけるプローブとの間でハイブリダイゼーションを行わせ、被検試料とのハイブリダイゼーション及び対照試料とのハイブリダイゼーションのそれぞれ結果を比較し、本件胃癌マーカー遺伝子の有無を検出したり、発現量を測定することにより、胃癌の判定を行うことができる。ハイブリダイゼーションは公知の方法で実施すればよく、その条件は使用するマイクロアレイ（マイクロチップ）や標識ｃＤＮＡに適したものを適宜選択すればよい。例えば、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）、第２版、第９．５２−９．５５頁（１９８９）に記載を参考にしてハイブリダイゼーション条件を選択することができる。
【００３２】
上記標識化ｃＤＮＡの作製に用いられる標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質、発光団を有する物質等の物質を用いることができる。例えば、蛍光物質としては、Ｃｙ２、ＦｌｕｏｒＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン等が挙げられる。また、標識化ｃＤＮＡに代えて、標識化ｍＲＮＡや、ｃＤＮＡより転写あるいは増幅された標識化核酸を用いることもできる。標識核酸の検出法は、用いられる標識物質の種類により、適宜選択すればよく、前記Ｃｙ３及びＣｙ５を標識物質として用いる場合、Ｃｙ３は５３２ｎｍ、Ｃｙ５は６３５ｎｍの波長でスキャンすることにより検出又は定量することができる。標識物質からのシグナルの強度を検出又は定量することによって、被検試料中や対照試料中に存在する本件胃癌マーカー遺伝子の発現を検出又は定量することができる。
【００３３】
被検試料と対照試料との遺伝子発現の差を測定する方法として、比較的発現変動の少ない標準的な遺伝子を用いて両者のｍＲＮＡ量を補正することが好ましい。例えば、２種類の蛍光を用いてマイクロアレイ（マイクロチップ）上で競合ハイブリダイゼーションを行なう場合には、２種の蛍光物質間の強度差を補正することにより、より正確なデータを得ることができる。このような補正の目的に使用される核酸としては、非癌部位の試料由来の核酸；ハウスキーピング遺伝子〔例えば、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤ）遺伝子、シクロフィリン遺伝子、β−アクチン遺伝子、α−チューブリン遺伝子、ホスフォリパーゼＡ２遺伝子等〕に対応する核酸等が挙げられ、また、非特異的なハイブリダイゼーションでないことを確認するための陰性対照としては、試料とまったく関連のない核酸、例えばプラスミドｐＵＣ１８等を挙げることができる。
【００３４】
次に、本件胃癌マーカーポリペプチドは、上記本件胃癌マーカー遺伝子の発現産物であり、本件胃癌マーカーポリペプチドのアミノ酸配列の配列情報は、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、前記表１に示されたそれぞれのアクセッションナンバーによりアプローチすることもできる。これら本件胃癌マーカーポリペプチドの中でも、検出感度等の観点から、ＣＤＮＡ ＦＬＪ１０１９６ ｆｉｓ， ｃｌｏｎｅ ＨＥＭＢＡ１００４７７６ポリペプチド、ＣＬＤＮ１ポリペプチド（配列番号１４４）、ＣＴＨＲＣ１ポリペプチド（配列番号１４５）、ＣＸＣＬ１ポリペプチド（配列番号１４６）、ＦＡＰポリペプチド（配列番号１４７）、ＦＰＲ１ポリペプチド（配列番号１４８）、ＧＰＮＭＢポリペプチド（配列番号１４９）、ＧＰＲ１０９Ｂポリペプチド（配列番号１５０）、Ｈ１９ポリペプチド（配列番号１５１）、ＨＯＸＣ６ポリペプチド（配列番号１５２）、ＩＮＨＢＡポリペプチド（配列番号１５３）、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド（配列番号１５４）、ＫＬＫ１０ポリペプチド（配列番号１５５）、ＮＣＦ２ポリペプチド（配列番号１５６）、ＮＩＤ２ポリペプチド（配列番号１５７）、ＰＩ３ポリペプチド（配列番号１５８）、ＳＥＬＥポリペプチド（配列番号１５９）、ＳＥＲＰＩＮＨ１ポリペプチド（配列番号１６０）、ＳＦＲＰ２ポリペプチド（配列番号１６１）、ＳＰＰ１ポリペプチド（配列番号１６２）、ＳＲＰＸ２ポリペプチド（配列番号１６３）、ＳＴＣ１ポリペプチド（配列番号１６４）、ＴＮＣポリペプチド（配列番号１６５）、ＴＮＦＡＩＰ６ポリペプチド（配列番号１６６）、及びＷＮＴ５Ａポリペプチド（配列番号１６７）から選ばれる１種又は２種以上のポリペプチドを検出又は定量することが好ましく、ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチド及び／又はＩＮＨＢＡポリペプチドを検出又は定量することがより好ましい。なお、本件胃癌マーカーポリペプチドは、一般的に細胞に局在するか又は細胞から分泌されるものが好ましく、細胞から分泌されるものがより好ましく、血液中に分泌されるものがさらに好ましい。
【００３５】
本件胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量する方法としては、所定のポリペプチドを検出又は定量できる方法であれば特に制限されず、例えば、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を用いる方法を好ましく例示することができる。胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子としては、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体やアプタマー等を好ましく例示することができ、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、２つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができ、また、これら抗体のＦａｂ断片やＦ（ａｂ’）２断片等も使用しうるが、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、本件胃癌マーカーポリペプチド又はその断片を抗原として用いて作製することができる。アプタマーとは、タンパク質、アミノ酸、抗生物質等の各種分子に特異的に結合する核酸分子である。本件発明におけるアプタマーは、本件胃癌マーカーポリペプチドのいずれかに特異的に結合する。
【００３６】
前述の本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、被検試料中に存在する本件胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量する場合、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法等の公知の免疫学的測定法を用いることができる。抗体は、適当な標識剤により標識されていてもよい。標識剤としては特に制限されず、標識化ヌクレオチドを作製する際に用いる標識剤と同様の標識剤を用いることができる。また、被検試料中、特に好ましくは血清、血漿等の血液サンプルに存在する本件胃癌マーカーポリペプチドを免疫学的手法で検出又は定量することにより、簡便に胃癌かどうか判定することができる。
【００３７】
本発明の胃癌の判定方法においては、被検試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子を検出又は定量する工程や、本件胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量する工程の後に、検出又は定量結果を評価する工程を含んでいてもよい。検出又は定量結果の評価は、正常人の生体試料又は胃癌患者の非癌組織（胃正常組織）における検出又は定量結果を基準として行うことができる。例えば、ある生体試料（被検試料）について、該被検試料の採取源が胃癌患者であるかどうか、又は該被検試料が胃癌組織であるかを判定する場合、正常人から採取した生体試料であって、該被検試料と同種の生体試料、又は、被検試料の採取源から採取した生体試料であって、該被検試料と同様の部位の、癌組織でない生体試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子や本件胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量結果を基準として行う。
【００３８】
より具体的には、（ｉ）被検試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子の発現量が、正常対照試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子の発現量（基準量）よりも有意に高い場合や、（ii）被検試料中に存在する、本件胃癌マーカーポリペプチドの量が、正常対照試料中に存在する、本件胃癌マーカーポリペプチドの量（基準量）よりも有意に高い場合や、（iii）正常対照試料中には本件胃癌マーカー遺伝子が検出されなかったのに対し、被検試料中には本件胃癌マーカー遺伝子が検出された場合や、（iv）正常対照試料中には本件胃癌マーカーポリペプチドが検出されなかったのに対し、被検試料中には本件胃癌マーカーポリペプチドが検出された場合は、被検試料の採取源が胃癌患者であることや被検試料が胃癌組織であると評価する。上記（ｉ）〜（iv）の中でも、胃癌であるかどうかを最も簡便に判定できることから、（iv）である場合が特に好ましい。
【００３９】
上記判定に際して「有意に高い」とは、被検試料中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子の発現量（又は本件胃癌マーカーポリペプチドの発現量）が、正常対照試料中に存在する、本発明における遺伝子の発現量（又は本件胃癌マーカーポリペプチド）の発現量よりも高く、かつ、例えば５連（ｎ＝５）で発現量の測定を行った結果についてＰａｉｒｅｄ  Ｔ−ｔｅｓｔを行った場合に、ｐ＜０．０５、より好ましくはｐ＜０．００５、さらに好ましくはｐ＜０．０００５、さらにより好ましくはｐ＜０．００００５となることを意味する。また、被検試料における発現量が基準量よりも有意に高い場合の別の指標としてより具体的には、被検試料における発現量が、基準量に対して５倍以上、好ましくは６倍以上、より好ましくは７倍以上、さらに好ましくは８倍以上、さらにより好ましくは９倍以上、よりさらに好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１１倍以上、より好ましくは１２倍以上である場合を挙げることができる。
【００４０】
判定に際して、有意に高いかどうかを確認する具体的な方法として以下の方法を好ましく挙げることができる。
１）被検試料として胃癌組織を用い、対照試料として胃正常組織を用い、両試料から常法にしたがってトータルＲＮＡを抽出する。該トータルＲＮＡ（各サンプルにつき２μｇ）と、Affymetrix社製の全遺伝子型マイクロアレイ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  Ａｒｒａｙ）と、同社製のプローブとを用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Affymetrix社）に準じてマイクロアレイ解析を行う。マイクロアレイ解析により得られた全遺伝子の発現値を、ＢＲＢ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、中央値による正規化を行う。被検試料における発現量が基準量に対して何倍であるかを算出する場合は、正規化により得られた発現量の数値を用いる。また、Ｐａｉｒｅｄ  Ｔ−ｔｅｓｔにおけるｐ値については、正規化により得られた発現量の数値を用いて、同一患者における胃癌組織検体と胃正常組織検体に対して、Ｐａｉｒｅｄ  Ｔ−ｔｅｓｔを行うことにより算出する。
【００４１】
なお、基準量は、被検試料における発現量を測定する度に毎回測定する必要はなく、例えば、様々な種の生体試料についてあらかじめ基準量を測定しておき、生体試料の種類ごとに検量線を作成しておけば、被検試料と同種の生体試料の基準量をすぐに検索して用いることができる。
【００４２】
本発明の胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットとしては、本件胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子を備えたキットであれば特に制限されず、本件胃癌マーカー遺伝子に特異的に結合する分子が、少なくとも１つ以上固定化されているマイクロアレイ又はマイクロチップを備えたキット等を例示することができ、このキットを用いることにより、胃癌の判定を行うことができる。上記分子としては、特に制限されないが、ヌクレオチドや、抗体等のタンパク質などを例示することができ、該ヌクレオチドとしては、本件胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖（すなわち、配列番号１〜１１９のいずれかで表されるヌクレオチド配列又はその相補配列）と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１５〜３０−ｍｅｒの塩基長を有するヌクレオチドを標識化したプローブ用の標識化ヌクレオチドや、本件胃癌マーカー遺伝子のセンス鎖又はアンチセンス鎖と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜１００−ｍｅｒ、好ましくは１０〜５０−ｍｅｒ、より好ましくは１５〜３０−ｍｅｒの塩基長を有するプローブ用のヌクレオチドを好ましく例示することができる。また、本発明の胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キットとしては、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子を備えたキットであれば制限されず、このキットを用いることにより、胃癌の判定を行うことができる。胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する分子としては、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体やアプタマー等を好ましく例示することができる。また、上記胃癌マーカー遺伝子の検出又は定量用キットや、胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量用キットには、ハイブリダイズ試薬、洗浄剤等他の試薬を含んでいてもよい。なお、上記プローブ、マイクロアレイやマイクロチップ、抗体の作製方法は前述のとおりである。
【００４３】
本発明における胃癌の治療薬剤は、（ａ）本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスヌクレオチド、（ｂ）本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡ、（ｃ）本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体、又は、（ｄ）本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するリボザイムを有効成分として含むことを特徴とする。上記（ａ）のアンチセンスヌクレオチドや（ｂ）のアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡとからなる２本鎖ＲＮＡや（ｄ）本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するリボザイムは、例えばそれをヒト細胞に投与した場合に、それを投与しなかった場合に比べて、ヒト細胞内における本件胃癌マーカー遺伝子の発現を抑制することができる限り特に制限されない。上記（ｂ）の２本鎖ＲＮＡとしては、本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子に対するｓｉＲＮＡを好ましく例示することができる。本発明のｓｉＲＮＡは、本件胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡの標的となる特定配列（以下、「特定配列」ともいう）に相同なセンス鎖ＲＮＡと、該センス鎖ＲＮＡと相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡである。上記の本件胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡの標的となる特定配列の長さとしては、１９〜２１ｂｐの塩基長であることが好ましく、かかる特定配列としては、本件胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡに特異的な配列であることが好ましい。本発明におけるｓｉＲＮＡとして具体的には、配列番号１６８〜１７１のいずれか記載のＲＮＡと、該ＲＮＡに相補的なＲＮＡとからなるｓｉＲＮＡを好ましく例示することができる。
【００４４】
かかるｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、本件胃癌マーカー遺伝子の配列情報に基づいて設計することができる。ｓｉＲＮＡの設計の指針については既に多数の文献や成書において公表されており、これらの指針にしたがって本件胃癌マーカー遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡを設計することができる。例えば、ｓｉＲＮＡの作製は、合成による作製方法及び遺伝子組換え技術を用いる作製方法等、公知の作製方法を適宜用いることができる。
【００４５】
上記合成による作製方法としては、配列情報に基づき、常法により二本鎖ＲＮＡを合成する方法を例示することができる。すなわち、２本鎖のオリゴリボヌクレオチドであるｓｉＲＮＡを合成するには、先ずセンス鎖オリゴリボヌクレオチド及びアンチセンス鎖オリゴリボヌクレオチドをそれぞれ合成することができる。一般的に、保護基のついた４種類のリボヌクレオチドを用い、合成機を使用した有機合成で合成することができる。ＲＮＡは、４種類のヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）がホスホジエステル結合によって連なったポリマー分子で、合成はアミダイドに、バックボーンを形成する糖の２’末端に２’−ビス（アセトキシエトキシ）−メチルエーテル（２’−ＡＣＥ）保護基をつけ、１塩基ずつリン酸結合（カップリング）させることができる。生成された一本鎖ＲＮＡは、１００ｍＭＴＥＭＥＤ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ３．８）バッファーで、６０℃、３０分反応させることにより脱保護を行い、ＨＰＬＣを用いて品質チェックを行うことができる。高い純度のＲＮＡを必要とする場合は、さらに変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ゲルからＲＮＡを精製したり、ＨＰＬＣで精製を行うことができる。次に両鎖をアニーリングさせることができる。濃度約５０μＭ（５０ｐｍｏｌ／μＬ）の両鎖の水溶液を調製し、各々の水溶液と５ｘアニーリング用緩衝液（５００ｍＭ酢酸カリウム，１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ ７．４，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム）を混合した溶液を９０℃で１分間加熱し、その後、３７℃６０分間保温することができる。このことにより、センスオリゴヌクレオチドとアンチセンスオリゴヌクレオチドは互いにアニーリングし２本鎖のｓｉＲＮＡを得ることができる。
【００４６】
また、上記遺伝子組換え技術を用いる作製方法としては、センス鎖ＤＮＡやアンチセンス鎖ＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを構築し、該ベクターを宿主細胞に導入後、転写により生成されたセンス鎖ＲＮＡやアンチセンス鎖ＲＮＡをそれぞれ取得することによって作製する方法を例示することもできるが、本発明における特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットを構築し、該二本鎖ＲＮＡ発現カセットを発現ベクターのプロモーターの下流に連結し、インビボでの発現・構築により所望の二本鎖ＲＮＡを作製する方法を好適に例示することができる。
【００４７】
ｓｉＲＮＡは、リポフェクション法等により直接細胞内に導入することができる。通常陰電荷を有するホスファチジルセリン（ＰＳ）からなるリポソームを用いることができるが、より安定したリポソームを形成する陽イオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ、商品名：トランスフェクタム、リポフェクトアミン）を用いることもできる。これら陽イオン脂質と陰電荷をもつｓｉＲＮＡとの複合体を形成させると、正に荷電しているリポソームが、負に荷電している細胞の表面に吸着し、細胞膜と融合することでｓｉＲＮＡを細胞内に導入することができる。実際の治療にあたっては患部またはその周辺組織にｓｉＲＮＡとリポソームの複合体を直接注入することができる。
【００４８】
また、本件胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、ｓｉＲＮＡを直接細胞内に導入した場合より、ｓｉＲＮＡが細胞内に存在できる期間が長くなり、遺伝子発現抑制の効率が高くなるという利点を有する。かかる本件胃癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡを標的にしたｓｉＲＮＡ発現ベクターは、上記特定配列のセンス鎖ＤＮＡ−リンカー−アンチセンス鎖ＤＮＡからなる二本鎖ＲＮＡ発現カセットをプロモーターの下流に挿入することにより作製することができる。また、ｓｉＲＮＡ発現用のベクターは市販品を含め公知のものを用いることができるが、哺乳動物に導入する場合にはウイルスベクターであることが好ましい。ウイルスベクターとしては、例えば、マウス白血病レトロウイルスベクター（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １５８， １−２３， １９９２）や、アデノ随伴ウイルスベクター（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５８， ９７−１２９，１９９２）や、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５２， ４３１−４３４， １９９１）や、リポソーム等を具体的に挙げることができるが、ＨＩＶレンチウイルスベクターは、非分裂細胞にも効率よく長期発現が可能であるという特徴を有する点で好ましい。また、これら発現系は、発現を起こさせるだけでなく、発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。これらの発現ベクターへの二本鎖ＲＮＡ発現カセットの導入は常法によって行うことができ、例えばこれら発現ベクター中の適当なプロモーターの下流に二本鎖ＲＮＡ発現カセットを挿入することによりｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築することができる。
【００４９】
前述の本発明における胃癌の治療薬剤の有効成分の１つである、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合する抗体としては、本件胃癌マーカーポリペプチドに特異的に結合することによって、胃癌の治療薬剤としての効果を発揮するものであれば特に制限はされない。また、前述の本発明における胃癌の治療薬剤の有効成分の１つである、本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断する活性を有するリボザイムとしては、本件胃癌マーカー遺伝子から選ばれる１種又は２種以上の遺伝子のｍＲＮＡを切断することによって、胃癌の治療薬剤としての効果を発揮するものであれば特に制限はされない。
【００５０】
本発明の胃癌の治療薬剤は、胃癌の治療薬剤、胃癌の増殖抑制剤、又は胃癌の予防薬剤として用いることができ、好ましくは胃癌の治療薬剤又は胃癌の増殖抑制剤として用いることができる。本明細書中において、胃癌の治療薬剤とは、胃癌の増殖を抑制する活性や胃癌を縮小する活性を有する薬剤をいい、また、胃癌の予防薬剤とは、胃癌の発生を予防する活性を有する薬剤をいう。
【００５１】
本発明の胃癌の治療薬剤を哺乳動物の生体、組織、細胞等に投与又は導入するに際しては、この分野で通常用いられる薬学的に許容される担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分とともに用いることができる。該薬学的に許容される担体とともに用いる薬学的組成物は、その投与形態、例えば経口（口腔内又は舌下を含む）投与、或いは非経口投与（注射剤等）等に合わせて、薬学の分野ではそれ自体周知の製剤形態で製剤化することができる。具体的な製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、坐薬、軟膏剤、注射剤などをあげることができる。製剤の担体として具体的には、たとえば結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪ならびに油、ガム、ポリアルキレングリコールとなどをあげることができる。本発明の胃癌の治療薬剤は製剤中に０．００１〜１００％含ませることができる。
【００５２】
本発明の胃癌の抑制剤及び／又は治療剤のスクリーニング方法としては、ヒト胃癌培養細胞株を被検物質の存在下に培養した後、該ヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する本件胃癌マーカー遺伝子及び／若しくは本件胃癌マーカーポリペプチドを検出又は定量し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、本件胃癌マーカー遺伝子や本件胃癌マーカーポリペプチドの検出又は定量方法として、上述の本発明の胃癌の判定方法と同様の方法を用いることができる。また、ヒト胃癌培養細胞株としては、特に制限されないが、例えば、ＯＣＵＭ、Ｏｋａｊｉｍａ、ＫＡＴＯ、５８Ａｓ１、４４Ａｓ３、ＭＫＮ、ＭＫＮ１、ＭＫＮ７、ＭＫＮ２８、ＭＫＮ７４等を好ましく挙げることができる。
【００５３】
上記比較・評価に際して、（ａ）被検物質の存在下に培養したヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する、本件胃癌マーカー遺伝子の発現量が、被検物質の非存在下における場合と比較して減少している場合や、（ｂ）被検物質の存在下に培養したヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する、本件胃癌マーカーポリペプチドの量が、被検物質の非存在下における場合と比較して減少している場合や、（ｃ）被検物質の存在下に培養したヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中には本件胃癌マーカー遺伝子が検出されなかったのに対し、被検物質の非存在下ではその本件胃癌マーカー遺伝子が検出された場合や、（ｄ）被検物質の存在下に培養したヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中には本件胃癌マーカーポリペプチドが検出されなかったのに対し、被検物質の非存在下ではその本件胃癌マーカーポリペプチドが検出された場合は、当該被検物質は胃癌の治療、増殖抑制、転移抑制に有効な胃癌の抑制剤や治療剤である可能性が大きいと判断することとなる。
【００５４】
上記（ａ）や（ｂ）の場合における減少の程度は、用いる被検物質の濃度や、定量の対象が本件胃癌マーカー遺伝子なのか本件胃癌マーカーポリペプチドなのかや、培養時間等によっても異なるため一概に言うことはできないが、例えば、被検物質の存在下に培養したヒト胃癌培養細胞株の細胞溶解物中に存在する本件胃癌マーカー遺伝子の発現量及び／又は本件胃癌マーカーポリペプチドが、被検物質の非存在下における場合の０．８倍以下であることが好ましく、０．６倍以下であることがより好ましく、０．４倍以下であることがさらに好ましい。
【００５５】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
１．胃癌高発現遺伝子の決定
（１）検体の調製
原発性の切除不能胃癌、又は転移性の切除不能胃癌に対し５−ＦＵ（ＴＳ−１，メソトレキセート／５−ＦＵを含む）若しくはシスプラチン・イリノテカン併用療法が行われた患者で、かつ、文書でインフォームド・コンセントの得られた患者３０例を検体の採取源とした。これらの患者３０例のそれぞれについて、胃癌組織と胃正常組織（癌組織ではない胃の組織）を内視鏡を用いて採取し、計６０個の検体を得た。検体は連結可能匿名化を行った後、−８０度で保存した。
【００５７】
（２）全遺伝子に関するマイクロアレイ解析
上記１．（１）の６０検体からトータルＲＮＡの抽出を行った。各検体から得られたトータルＲＮＡを試料とし、市販のマイクロアレイを用いて、前述の各検体のトータルＲＮＡ試料中の全遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。マイクロアレイ解析は、Affymetrix社製の全遺伝子型マイクロアレイ（GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Array）と、同社製のプローブと、トータルＲＮＡ（各検体につき２μｇ）とを用い、Expression Analysis Technical Manual（Affymetrix社）に準じて行った。
得られた全遺伝子の発現値を、ＢＲＢ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、中央値による正規化を行い、次いで、同一患者における胃癌組織検体と胃正常組織検体に対して、Ｐａｉｒｅｄ  Ｔ−ｔｅｓｔを行った。得られた結果を検討し、胃癌組織検体における発現量が胃正常組織検体における発現量に対して５倍以上であり、かつ胃癌組織検体における発現量が胃正常組織検体における発現量に対して有意差（ｐ＜０．００００５）を示した遺伝子を、全遺伝子の中から１１９種類同定した。前述の表１に、同定した１１９種類の遺伝子名、用いたプローブセット名、遺伝子のアクセッション番号等を示す。なお、表１のａｖ−ｃａ、ａｖ−ｎｏｎ、ｓｄ−ｃａ、ｓｄ−ｎｏｎの数値はそれぞれ、得られた測定値をｌｏｇ２変換した後の数値を用いている。
これらの１２０種類の遺伝子のうち、胃癌マーカー遺伝子として特に優れていると考えられる２５種類の遺伝子を表２示す。これら２５種類の遺伝子について、上記と同様の方法によりマイクロアレイを行い、ｍＲＮＡの発現量を調べた。その結果を図１に示す。この結果から、同定された２５種類の遺伝子の発現量は胃癌組織で胃正常組織に対して有意に増加していることが確認された。
【００５８】
【表２】
2008118915.tif 000006
【００５９】
２．ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に関するＰＣＲ解析
上記の２５種類の遺伝子（表２）のうちの１種であるＫＩＡＡ１１９９遺伝子のｍＲＮＡの発現は、Affymetrix社製のプローブセット２１２９４２＿ｓ＿ａｔ（配列番号１２０−１３０）を用いたマイクロアレイ解析により同定されたが、その再現性を検討するために、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子について、上記１．の胃癌患者３０症例のうち最初の１０症例の臨床検体を用いたＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲは、２種類のプライマー（配列番号１３１：Ｕｐｐｅｒ: ＡＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＴＡ， 配列番号１３２：Ｌｏｗｅｒ: ＴＡＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＡＴＧ）を用い、９５℃３分、（９５℃４５秒、５７℃４５秒、７２℃６０秒）×３７サイクル、７２℃５分という条件で行った。ＰＣＲ産物の電気泳動結果を図２（左）に示す。ＫＩＡＡ１１９９遺伝子のＰＣＲ産物を、胃癌組織検体（Ｔ）と胃正常組織検体（Ｎ）で比較したところ、解析した１０症例のうち、７例で胃癌組織検体（Ｔ）の方にのみＫＩＡＡ１１９９遺伝子のＰＣＲ産物が確認された。このことから、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子の発現は胃癌特異的であることが示唆された。
【００６０】
３．ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた発現抑制試験
ＫＩＡＡ１１９９遺伝子の発現を抑制することによる影響を調べるために、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いて以下のような試験を行った。
まず、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡをデザインした。その配列を配列番号１６８〜１７１に示す。また、ネガティブコントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡ（配列番号１７２〜１７５）と、スクランブルｓｉＲＮＡ（配列番号１７６，１７７）の合計３種類のｓｉＲＮＡを用いた。
ＫＩＡＡ１１９９遺伝子のｍＲＮＡ発現抑制による細胞増殖への影響を調べるために、前述の合計５種類のｓｉＲＮＡを用いて以下のＭＴＴアッセイを行った。
９６ウェルのマイクロカルチャープレートに１ｗｅｌｌ当たり１８０μｌのヒト胃癌細胞（ＫＡＴＯIII細胞）の懸濁液を加えて、３７℃で一日間前培養を行った。トランスフェクト試薬に、最終濃度５０ｎＭとなるように前述の５種類のｓｉＲＮＡを加えて、トランスフェクト溶液を５種類作製した。これらの前培養したヒト胃癌細胞（ＫＡＴＯIII細胞）それぞれ１７５μｌに、トランスフェクト溶液を２５μｌずつ加えて、３７℃で７２時間本培養した。本培養後の細胞数をＴｈｉａｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ （ＭＴＴ）試薬を用いて処理した後、ＯＤ値として検出した。その結果を図２（右）に示す。図２（右）から分かるように、胃癌細胞株においてＫＩＡＡ１１９９遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制すると、著明な細胞増殖抑制効果を示した。このことから、ＫＩＡＡ１１９９は、胃癌の治療標的分子としても有望であることが確認された。
【００６１】
４．ＩＮＨＢＡ遺伝子に関するＲＴ−ＰＣＲ解析
上記の２５種類の遺伝子（表２）のうちの１種であるＩＮＨＢＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現は、Affymetrix社製のプローブセット２２７１４０＿ｓ＿ａｔ（配列番号１３３−１４３）を用いたマイクロアレイ解析により同定されたが、その再現性を検討するために、ＩＮＨＢＡ遺伝子について、上記２．で用いた胃癌患者１０症例の臨床検体を用いたｒｅａｌ ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。また、コントロールとして、ＩＮＨＢＡ遺伝子の近縁遺伝子であるＩＮＨＡ遺伝子及びＩＮＨＢＢ遺伝子についても同様にｍＲＮＡの発現量を測定した。その結果を図３（左）に示す。図３の結果から分かるように、ＩＮＨＢＡ遺伝子については全症例の胃癌組織において発現の亢進が観察され、図１に示すマイクロアレイ解析の結果の再現性が確認された。一方、ＩＮＨＢＡ遺伝子の近縁遺伝子であるＩＮＨＡ遺伝子及びＩＮＨＢＢ遺伝子については、胃癌組織における発現の亢進が見られなかった。
【００６２】
５．アクチビンＡタンパクの発現解析
ＩＮＨＢＡ遺伝子の遺伝子産物は生体内では二量体を形成しアクチビンＡタンパクとなることが知られている。そこで、ＩＮＨＢＡ遺伝子のタンパクレベルでの発現を調べるために、１０種類の公知のヒト胃癌細胞（ＯＣＵＭ細胞、Ｏｋａｊｉｍａ細胞、ＫＡＴＯ細胞、５８Ａｓ１細胞、４４Ａｓ３細胞、ＭＫＮ１細胞、ＭＫＮ７細胞、ＭＫＮ細胞、ＭＫＮ２８細胞、ＭＫＮ７４細胞）のアクチビンＡタンパクの発現量を、Human Activin A  Duoset(R＆D  SYSTEMS社製)の抗体を利用したＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図３（右）に示す。図３の結果から、胃癌細胞株において蛋白レベルでアクチビンＡが高発現していることが確認された。この結果は、アクチビンＡが胃癌の腫瘍マーカーである可能性を示唆している。
【００６３】
６．ＫＩＡＡ１１９９ポリペプチドに結合する抗体の作製
ＫＩＡＡポリペプチドを示す配列番号１５４に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２０２〜２２０のアミノ酸配列のＮ末端にシステインを付加したアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１７８）、アミノ酸番号６１２〜６２７のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１７９）、及びアミノ酸番号１１５９〜１１７６のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１８０）の計３つのペプチドを合成した。これらのペプチドに対するポリクローナル抗体の作製を株式会社 免疫生物研究所に依頼したところ、各々のペプチドを免疫した３羽のウサギから抗血清が得られた。抗血清を段階的に希釈した希釈液と、各々のペプチドを固定したプレートとを用いてアッセイを行ったところ、抗血清中の抗体と各々のペプチドとの反応が確認された。なお、抗血清中の抗体と各々のペプチドとの反応は、抗血清を２０４８００倍に水で希釈した希釈液を用いた場合にも確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】胃癌マーカー遺伝子として特に優れていると考えられる２５種類の遺伝子の発現量をマイクロアレイで測定した結果を示す図である。表２で示した２５種類の遺伝子のマイクロアレイでの発現値を正規化した後、胃癌部（胃癌組織）と胃非癌部（胃正常組織）に分けて算出した平均値とＳＤ値をグラフに示した。なお、マイクロアレイでの発現値はｌｏｇ２変換して用いた。
【図２】左図：胃癌部（胃癌組織：Ｔ）と胃非癌部（胃正常組織：Ｎ）における、ＫＩＡＡ１１９９遺伝子の発現をＰＣＲで確認した結果を示す図である。右図：ｓｉＲＮＡを用いて胃癌細胞におけるＫＩＡＡ１１９９遺伝子の発現を抑制することによる、該胃癌細胞の増殖への影響を示す図である。ＫＩＡＡ１１９９に対する２種類のｓｉＲＮＡをヒト胃癌細胞にトランスフェクトし、その細胞の増殖能をＭＴＴアッセイにて測定した（黒カラム）。また、ネガティブコントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対する２種類のｓｉＲＮＡと、スクランブルｓｉＲＮＡの合計３種類のｓｉＲＮＡをそれぞれトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖能についても、ＭＴＴアッセイにて測定した（白カラム）。グラフの数値は、スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率を１００％としたときの増殖率（％）を示している。右図のグラフのバーは左からそれぞれ、・スクランブルｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率・ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ＃１をトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率・ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ＃２をトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率・ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に対するｓｉＲＮＡ＃１をトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率・ＫＩＡＡ１１９９遺伝子に対するｓｉＲＮＡ＃２をトランスフェクトしたヒト胃癌細胞の増殖率を示している。
【図３】左図：胃癌臨床検体におけるＩＮＨＢＡの発現をｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法に解析した結果を示す図である。Ｎ：胃非癌部（胃正常組織）；  Ｔ：胃癌部（胃癌組織）右図：胃癌細胞株におけるアクチビンＡタンパクの発現量を示す図である。
【図１】
2008118915.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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