【手続補正書】
【提出日】平成24年3月29日(2012.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化する方法であって、
（１）５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡを含んでいる試料、ならびにＲＮＡポリホスファターゼを準備するステップと；
（２）５’α一リン酸基を除くすべてのリン酸が上記５’ポリリン酸基から除去され、５’一リン酸基を有しているＲＮＡが生成されるための条件において、Ｍｇ２＋カチオンを実質的に欠いている反応混合物において上記試料をＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップを包含している、方法。
【請求項２】
５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡのなかから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ａ）５’三リン酸基を有している上記ＲＮＡが、真核生物の一次ＲＮＡ、原核生物の一次ＲＮＡ；ｎｃＲＮＡ、およびＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応であって、ＲＮＡ増幅反応の一部である場合が挙げられる当該インビトロ転写反応において合成されるＲＮＡのなかから選択されるか；または
（Ｂ）５’二リン酸基を有している上記ＲＮＡが、キャップ形成酵素系のＲＮＡトリホスファターゼを用いた一次ＲＮＡ転写物の消化生成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（３）ＲＮＡリガーゼを用いて、５’一リン酸基を有しているＲＮＡの５’末端に対してＲＮＡアクセプターヌクレオチドをライゲートさせるステップをさらに包含している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つのキャップ形成されていないＲＮＡをも含んでいる試料に存在するキャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製する方法であって、
（１）キャップ形成されているＲＮＡおよび５’ポリリン酸基を有しているキャップ形成されていないＲＮＡを含んでいる試料と；ＲＮＡポリホスファターゼと；５’エキソリボヌクレアーゼとを準備するステップ；
（２）５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが５’一リン酸基を有しているＲＮＡに転化されるための条件において、ステップ（１）から得られた上記試料を上記ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ；ならびに
（３）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化され、キャップ形成されているＲＮＡが消化されないための条件において、ステップ（２）から得られた試料を５’エキソリボヌクレアーゼと接触させることによって、キャップ形成されているＲＮＡを入手するか、単離するか、または精製するステップを包含している、方法。
【請求項６】
上記ＲＮＡポリホスファターゼは、E. coliまたはShigellaのＲＰＰ  Ｉであり、ステップ（１）から得られた上記試料を上記ＲＮＡポリホスファターゼと接触させるステップ（２）は、Ｍｇ２＋カチオンの実質的な非存在下において実施される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
入手されるか、単離されるか、または精製されるキャップ形成されている上記ＲＮＡを用いて真核生物の細胞を形質転換することをさらに包含している、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
上記真核生物の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、上皮細胞および人工の抗原提示細胞のなかから選択される抗原提示細胞（ＡＰＣ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
５’ポリリン酸基を有している上記ＲＮＡが、５’三リン酸基を有しているＲＮＡおよび５’二リン酸基を有しているＲＮＡからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（１）において準備されたキャップ形成されているＲＮＡが、生物学的な試料から入手されるか、またはインビトロキャップ形成反応から入手され、当該インビトロキャップ形成反応が、（ｉ）ＲＮＡポリメラーゼおよびジヌクレオチドキャップ類似物を含んでいる、転写と同時のインビトロキャップ形成反応、ならびに（ｉｉ）ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの酵素活性を有しているキャップ形成酵素系を用いた転写後のインビトロキャップ形成反応のなかから選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
キャップ形成されている上記ＲＮＡは、ＲＮＡグアニルトランスフェラーゼの酵素活性を有しているキャップ形成酵素系を用いてインビトロにおいてキャップ形成されている細菌由来のｍＲＮＡを含んでいる、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（２）の前に、上記試料における総ＲＮＡ量を定量すること；ならびに
（４）ステップ（３）に続いて、以下の：
（ｉ）ステップ（３）において消化されなかったＲＮＡの量を定量して、上記試料におけるキャップ形成されているＲＮＡの量を定量するか；および／または
（ｉｉ）ステップ（３）において消化されたＲＮＡの量を定量することによって上記試料におけるキャップ形成されていないＲＮＡの量を定量するステップをさらに包含している、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（４）は、
上記ＲＮＡに結合しているＲＩＢＯＧＲＥＥＮ  ＤＹＥの蛍光を測定することによってか；または
２．５Ｍの酢酸アンモニウム、０．３Ｍの酢酸ナトリウムもしくは０．３Ｍの酢酸カリウムおよびエタノールもしくはイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、水にペレットを懸濁させ、Ａ260の吸光係数に基づいて分光光度的にＲＮＡを定量することによって、
キャップ形成された上記ＲＮＡを定量することを包含している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（１）において準備された上記試料が、５’一リン酸基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、上記試料における５’一リン酸基を有しているＲＮＡの定量するステップをさらに包含しており、上記ＲＮＡポリホスファターゼと上記試料を接触させるステップ（２）の前に、以下のサブステップ：
上記試料における５’一リン酸基を有している上記ＲＮＡが消化されるが、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよびキャップ形成されているＲＮＡが消化されないための条件において、ステップ（１）において準備された上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに
上記５’エキソリボヌクレアーゼによって消化されたＲＮＡ、または消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップであって、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、５’一リン酸基を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すステップをさらに包含している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（１）において準備された上記試料が、５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡをさらに含んでおり、ステップ（１）においてポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰを準備するステップをさらに包含しており、
（５）５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡがリン酸化されて、５’一リン酸基を有しているＲＮＡになるための、条件においてかつ十分な時間にわたって、ステップ（３）から得られた上記試料を、ポリヌクレオチドキナーゼおよびＡＴＰと接触させるステップ；
（６）５’一リン酸基を有しているＲＮＡが消化されるが、キャップ形成されているＲＮＡ、５’ポリリン酸基を有しているＲＮＡおよび５’ヒドロキシル基を有しているＲＮＡが消化されないための条件において、ステップ（５）から得られた上記試料を、５’エキソリボヌクレアーゼと接触させるステップ；ならびに
（７）ステップ（６）において消化されたＲＮＡまたは消化されなかったＲＮＡの量を定量するステップであって、上記試料における消化されたＲＮＡの量が、５’ヒドロキシル基を有している、上記試料におけるＲＮＡの量を示すステップをさらに包含している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
実質的に精製されているＲＮＡポリホスファターゼ（ＲＰＰ）を含んでいる組成物、および実質的にＭｇ２＋カチオンを実質的に欠いている保存緩衝液もしくは反応緩衝液を備えている、請求項１に記載の方法を実施するための、キット。
【請求項１７】
上記ＲＰＰは、E. coliまたはShigellaのＲＰＰ  Ｉであり、当該ＲＰＰ  Ｉは配列番号１と少なくとも９５％の相同性を示すＤＮＡ配列によってコードされている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
５’エキソリボヌクレアーゼ（ＸＲＮ）をさらに備えいている、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
上記ＲＰＰはE. coliのＲＰＰ  ＩおよびShigellaのＲＰＰ  Ｉから選択されるか、または上記ＸＲＮはSaccharomyces cerevisiaeのＸｒｎ  ＩエキソリボヌクレアーゼおよびＴＥＲＭＩＮＡＴＯＲ（商標）  ５’リン酸依存性のエキソヌクレアーゼから選択される、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
ポリヌクレオチドキナーゼをさらに備えている、請求項１６に記載のキット。