【手続補正書】
【提出日】平成21年3月24日(2009.3.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（５ａ）
【化１】
2008101015.tif 000001
［式中、Ｌ１は水素原子またはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、スルホネート、トリアルキルすず基、ボロン酸もしくはボロン酸エステルから選ばれる脱離基を、Ａｒ２は、下記置換基群Ａ２から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい、ピリジニル基、ピリミジニル基またはフェニル基を、Ｒ１１は下記置換基群Ａ３から選択される基を意味する］で表される化合物と、下記式（４ａ）
【化２】
2008101015.tif 000002
［式中、Ａｒ１は、下記置換基群Ａ１から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよいイミダゾリル基を意味する］で表される化合物とをカップリング反応に供することを特徴とする、下記式（６ａ）
【化３】
2008101015.tif 000003
［式中、Ａｒ１、ＡＲ２、Ｒ１１は前記の意味を有する］で表される化合物の製造方法。
置換基群Ａ１：（１）水素原子、（２）ハロゲン原子、（３）シアノ基、（４）ニトロ基、（５）Ｃ３−８シクロアルキル基、（６）Ｃ２−６アルケニル基、（７）Ｃ２−６アルキニル基、（８）Ｃ１−６アルコキシ基、（９）Ｃ３−８シクロアルコキシ基、（１０）ホルミル基、（１１）Ｃ１−６アルキルカルボニル基および（１２）Ｃ１−６アルキル基（該Ｃ１−６アルキル基は、ハロゲン原子、水酸基、シアノ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ３−８シクロアルキル基およびＣ１−６アルキルカルボニル基からなる群から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい）。
置換基群Ａ２：（１）水素原子、（２）ハロゲン原子、（３）水酸基、（４）シアノ基、（５）Ｃ１−６アルコキシ基（該Ｃ１−６アルコキシ基は、ハロゲン原子、シアノ基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基およびＣ３−８シクロアルキル基からなる群から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい）、（６）Ｃ３−８シクロアルコキシ基、（７）Ｃ２−６アルケニルオキシ基および（８）Ｃ２−６アルキニルオキシ基。
置換基群Ａ３：（１）水素原子、（２）ハロゲン原子、（３）置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい５ないし１４員芳香族複素環基、（４）Ｃ１−６アルキル基（該Ｃ１−６アルキル基は、ホルミル基、ハロゲン原子、水酸基、保護基を有する水酸基、シアノ基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、Ｃ１−６アルキルスルホニル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、アミノ基（該アミノ基は、１ないし５のハロゲン原子を適宜有するＣ１−６アルキル基で置換されてもよい）、置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい６ないし１４員芳香族炭化水素環基、置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換さ
れてもよい５ないし１４員芳香族複素環基、置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい３ないし１４員非芳香族炭化水素環基、置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい５ないし１４員非芳香族複素環基および−Ｘ−Ａ（ここにおいて、Ｘは、イミノ基、−Ｏ−または−Ｓ−を示し、Ａは、置換基群Ａ４から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい、６ないし１４員芳香族炭化水素環基または５ないし１４員芳香族複素環基を示す）からなる群から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい）および（５）Ｃ１−６アルコキシ基。
置換基群Ａ４：
（１）水素原子、
（２）ハロゲン原子、
（３）水酸基、
（４）シアノ基、
（５）ニトロ基、
（６）Ｃ３−８シクロアルキル基、
（７）Ｃ２−６アルケニル基、
（８）Ｃ２−６アルキニル基、
（９）Ｃ３−８シクロアルコキシ基、
（１０）Ｃ３−８シクロアルキルチオ基、
（１１）ホルミル基、
（１２）Ｃ１−６アルキルカルボニル基、
（１３）Ｃ１−６アルキルチオ基、
（１４）Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、
（１５）Ｃ１−６アルキルスルホニル基、
（１６）ヒドロキシイミノ基、
（１７）Ｃ１−６アルコキシイミノ基、
（１８）Ｃ１−６アルキル基（該Ｃ１−６アルキル基は、下記置換基群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい）
（ａ）ハロゲン原子、
（ｂ）水酸基、
（ｃ）シアノ基、
（ｄ）Ｃ３−８シクロアルキル基、
（ｅ）Ｃ１−６アルキルチオ基、
（ｆ）Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、
（ｇ）Ｃ１−６アルキルスルホニル基、
（ｈ）Ｃ１−６アルキルカルボニル基、
（ｉ）ヒドロキシイミノ基、
（ｊ）Ｃ１−６アルコキシイミノ基、
（ｋ）Ｃ１−６アルコキシ基（該Ｃ１−６アルコキシ基は、水酸基で置換されてもよい。）、
（ｌ）カルバモイル基（該カルバモイル基は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基およびＣ２−６アルキニル基からなる群より選択される１ないし２の置換基で置換されてもよい。）、
（ｍ）６ないし１４員芳香族炭化水素環基（該６ないし１４員芳香族炭化水素環基は下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい）、
（ｎ）３ないし１４員非芳香族炭化水素環基（該３ないし１４員非芳香族炭化水素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される置換基を１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（ｏ）５ないし１４員芳香族複素環基（該５ないし１４員芳香族複素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）
（ｐ）５ないし１４員非芳香族複素環基（該５ないし１４員非芳香族複素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）および
（ｑ）−Ｘ−Ａ（ここにおいて、Ｘは、イミノ基、−Ｏ−または−Ｓ−を示し、Ａは、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい、６ないし１４員芳香族炭化水素環基または５ないし１４員芳香族複素環基を示す。）、
（１９）Ｃ１−６アルコキシ基、
（２０）アミノ基（該アミノ基は、６ないし１４員芳香族炭化水素環基で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基およびＣ２−６アルキニル基からなる群より選択される１ないし２の置換基で置換されてもよい。）
（２１）カルバモイル基（該カルバモイル基は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基およびＣ２−６アルキニル基からなる群より選択される１ないし２の置換基で置換されてもよい。）、
（２２）６ないし１４員芳香族炭化水素環基（該６ないし１４員芳香族炭化水素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（２３）５ないし１４員芳香族複素環基（該５ないし１４員芳香族複素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（２４）３ないし１４員非芳香族炭化水素環基（該３ないし１４員非芳香族炭化水素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（２５）５ないし１４員非芳香族複素環基（該５ないし１４員非芳香族複素環基は、下記置換基群Ａ４−１より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（２６）Ｃ２−６アルケニルオキシ基、
（２７）Ｃ２−６アルキニルオキシ基、
（２８）Ｃ３−８シクロアルキルスルフィニル基、
（２９）Ｃ３−８シクロアルキルスルホニル基、
（３０）−Ｘ−Ａ（ここにおいて、Ｘは、イミノ基、−Ｏ−または−Ｓ−を示し、Ａは、下記置換基群Ａ４−１から選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい、６ないし１４員芳香族炭化水素環基または５ないし１４員芳香族複素環基を示す）、
（３１）−ＣＯ−Ａ（ここにおいて、Ａは、前記の意味を有する）および
（３２）＝ＣＨ―Ａ（ここにおいて、Ａは、前記の意味を有する）。
置換基群Ａ４−１：
（１）ハロゲン原子、
（２）水酸基、
（３）シアノ基、
（４）ニトロ基、
（５）Ｃ１−６アルキルカルボニル基、
（６）Ｃ１−６アルキルチオ基、
（７）Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、
（８）Ｃ１−６アルキルスルホニル基、
（９）Ｃ１−６アルコキシ基（該Ｃ１−６アルコキシ基は、水酸基およびハロゲン原子からなる群より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（１０）Ｃ２−６アルケニルオキシ基、
（１１）Ｃ２−６アルキニルオキシ基、
（１２）Ｃ１−６アルキル基（該Ｃ１−６アルキル基は、下記置換基群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい。）
（ｉ）ハロゲン原子、
（ｉｉ）水酸基、
（ｉｉｉ）Ｃ１−６アルコキシ基（該Ｃ１−６アルコキシ基は、Ｃ３−８シクロアルキル基で置換されてもよい。）、
（ｉｖ）Ｃ２−６アルケニルオキシ基、
（ｖ）Ｃ２−６アルキニルオキシ基、
（ｖｉ）Ｃ１−６アルキルチオ基、
（ｖｉｉ）Ｃ１−６アルキルスルフィニル基、
（ｖｉｉｉ）Ｃ１−６アルキルスルホニル基、
（ｉｘ）６ないし１４員芳香族炭化水素環基（該６ないし１４員芳香族炭化水素環基は、ハロゲン原子、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい。）、
（ｘ）３ないし１４員非芳香族炭化水素環基(該３ないし１４員非芳香族炭化水素環基は、ハロゲン原子、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい。)、
（ｘｉ）５ないし１４員芳香族複素環基（該５ないし１４員芳香族複素環基は、ハロゲン原子、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい。）および
（ｘｉｉ）５ないし１４員非芳香族複素環基（該５ないし１４員非芳香族複素環基は、ハロゲン原子、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基を有していてもよい。）、
（１３）アミノ基（該アミノ基は、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基およびＣ２−６アルキニル基からなる群より選択される１ないし２の置換基で置換されてもよい。
）、
（１４）６ないし１４員芳香族炭化水素環基（該６ないし１４員芳香族炭化水素環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（１５）３ないし１４員非芳香族炭化水素環基（該３ないし１４員非芳香族炭化水素環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（１６）５ないし１４員芳香族複素環基（該５ないし１４員芳香族複素環基は、ハロゲン原子、水酸基、１ないし３の水酸基で置換されてもよいＣ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよいＣ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（１７）５ないし１４員非芳香族複素環基（該５ないし１４員非芳香族複素環基は、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ２−６アルケニル基、Ｃ２−６アルキニル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ２−６アルケニルオキシ基、Ｃ２−６アルキニルオキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基、Ｃ１−６アルキルスルフィニル基およびＣ１−６アルキルスルホニル基からなる群より選択される１ないし３の置換基で置換されてもよい。）、
（１８）−Ｘ−Ａ（ここにおいて、Ｘは、イミノ基、−Ｏ−または−Ｓ−を示し、Ａは、１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよい、６ないし１４員芳香族炭化水素環基または５ないし１４員芳香族複素環基を示す。）および
（１９）−ＣＯ−Ａ（ここにおいて、Ａは１ないし３のハロゲン原子で置換されてもよい、６ないし１４員芳香族炭化水素環基または５ないし１４員芳香族複素環基を示す。
【請求項２】
下記式（ＩＩ）
【化４】
2008101015.tif 000004
［式中、Ｌ１は前記の意味を有する］で表される化合物と下記式（ＩＩＩ）
【化５】
2008101015.tif 000005
で表される化合物とをカップリング反応に供することを特徴とする、下記式（Ｉ）
【化６】
2008101015.tif 000006
で表される３−メトキシ−４−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒドを製造する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｌ１がフッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子である、請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
Ｌ１がフッ素原子である請求項２記載の製造方法。
【請求項５】
下記式（Ｉ）
【化７】
2008101015.tif 000007
で表される３−メトキシ−４−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−１−イル）ベンズアルデヒド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
試験例１  ［ラット胎仔脳由来神経細胞培養におけるＡβペプチド定量］
（１）
ラット初代神経細胞培養
胎生１８日齢のＷｉｓｔａｒ系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ，Ｙｏｋｏｈａｍａ，Ｊａｐａｎ）より大脳皮質を単離し培養に供した。具体的には、エーテル麻酔下、妊娠ラットより無菌的に胎仔を摘出した。胎仔より脳を摘出し、氷冷Ｌ−１５  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃１１４１５−０６４，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡあるいはＳＩＧＭＡ  Ｌ１５１８など）に浸した。その摘出脳から、実体顕微鏡下で大脳皮質を採取した。採取した大脳皮質断片を、０．２５％  ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃１５０５０−０６５，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）および０．０１％  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｄ５０２５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有した酵素溶液中、３７℃下３０分間の酵素処理することにより、細胞を分散させた。この際、酵素反応は非働化済みウマ血清を加えることで停止させた。この酵素処理溶液を１５００ｒｐｍにて５分間遠心分離し、上清を除いた。得られた細胞塊に培地を５〜１０ｍｌ加えた。培地にはＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃２１１０３−０４９，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）に、２％  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃１７５０４−０４４，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）と２５μＭ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ、ＷＡＫＯ  Ｃａｔ  ＃１３９−０６８６１、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）と０．５ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃２５０３０−０８１，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）およびＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ−Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．Ｃａｔ  ＃１５２４０−０６２，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）を添加したもの（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／２−ＭＥ）を用いた。但し、アッセイの際は、２−ＭＥのみを添加しない培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７）を用いた。培地が加えられた細胞塊を、緩やかなピペッティング操作により細胞を再分散させた。この細胞分散液を、４０μｍナイロンメッシュ（セルストレーナー、Ｃａｔ  ＃．３５−２３４０、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ、ＵＳＡ）でろ過し、細胞塊を除くことにより、神経細胞懸濁液を得た。この神経細胞懸濁液を培地にて希釈し、予めｐｏｌｙ−ＬあるいはＤ−ｌｙｓｉｎｅにてコーティングされた９６  ｗｅｌｌ  ポリスチレン製培養器（Ｆａｌｃｏｎ  Ｃａｔ  ＃．３５−３０７５，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡを以下の方法でｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコートを施したもの、あるいはＢＩＯＣＯＡＴＴＭ  ｃｅｌｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｒｅ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、Ｃａｔ  ＃．３５−６４６１、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）に初期細胞密度が５  ｘ  １０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように１００μｌ／ｗｅｌｌにて播種した。Ｐ��ｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅコーティングは以下のように行った。０．１５Ｍ  Ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５）を用いて１００μｇ／ｍｌのｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ  Ｐ２６３６，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）溶液を無菌的に調製した。その溶液を１００μｇ／ｗｅｌｌにて９６ｗｅｌｌポリスチレン製培養器に添加し、室温１時間以上、あるいは４℃一晩以上、インキュベートした。その後、コーティングした９６ｗｅｌｌポリスチレン製培養器は、滅菌水を用いて４回以上洗浄した後、乾燥させるか、あるいは無菌ＰＢＳあるいは培地などを用いてすすいだ後に、細胞播種に用いた。播種した細胞は、５％  ＣＯ２−９５％  ａｉｒ下、３７℃インキュベーター中にて一日培養した後、培地全量を新鮮なＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／２―ＭＥ培地と交換し、引き続き３日間培養した。
化合物添加
培養４日目に薬物添加を以下の通りに行った。培地全量を抜き取り、２−ＭＥを含まない、２％  Ｂ−２７を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７）を１８０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。試験化合物のジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯと略す）溶液をＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７にて最終濃度の１０倍になるように希釈した。この希釈液を２０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、よく混和した。最終ＤＭＳＯ濃度は１％以下とした。また対照群にはＤＭＳＯのみを添加した。
サンプリング
化合物添加後３日間培養し、培地全量を回収した。得られた培地は、ＥＬＩＳＡサンプルとした。Ａβｘ−４２測定には希釈せずに、各ＥＬＩＳＡに供した。
細胞生存の評価
細胞生存は以下の方法でＭＴＴアッセイにより評価した。培地回収後のｗｅｌｌに温めた培地を１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、さらにＤ−ＰＢＳ（−）（ＤＵＬＢＥＣＣＯ’Ｓ  ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ  ＢＵＦＦＥＲＥＤ  ＳＡＬＩＮＥ、ＳＩＧＭＡ  Ｄ８５３７、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、ＵＳＡ）に溶解した８ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ  Ｍ２１２８，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、ＵＳＡ）溶液を８μｌ／ｗｅｌｌにて添加した。この９６ｗｅｌｌポリスチレン製培養器を、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下、３７℃インキュベーター中にて２０分間インキュベートした。そこへＭＴＴ溶解バッファーを１００μｌ／ｗｅｌｌ加え、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下、３７℃インキュベーター中にてＭＴＴフォルマザン結晶をよく溶解させた後、各Ｗｅｌｌの５５０ｎｍの吸光度を測定した。ＭＴＴ溶解バッファーは以下の通りに調製した。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＷＡＫＯ  ０４５−０２９１６、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）と蒸留水を２５０ｍＬずつ混合した溶液に、１００ｇ  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）、ＷＡＫＯ  １９１−０７１４５、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を溶解した。さらに、この溶液に濃塩酸および酢酸を各３５０μｌ添加することにより、溶液の最終ｐＨを４．７程度にした。
測定の際、細胞を播種しないｗｅｌｌに培地とＭＴＴ溶液のみを加えたものをバックグラウンド（ｂｋｇ）として設定した。各測定値は、以下の数式に従い、ｂｋｇを差し引き、対照群（薬物処理しなかった群、ＣＴＲＬ）に対する比率（％  ｏｆ  ＣＴＲＬ）を算出し、細胞生存活性を比較・評価した。
％  ｏｆ  ＣＴＲＬ＝（Ａ５５０＿ｓａｍｐｌｅ−Ａ５５０＿ｂｋｇ）／（Ａ５５０＿ＣＴＲＬ−ｂｋｇ）ｘ  １００
（Ａ５５０＿ｓａｍｐｌｅ：  サンプルｗｅｌｌの５５０ｎｍ吸光度、Ａ５５０＿ｂｋｇ：  バックグラウンドｗｅｌｌの５５０ｎｍ吸光度、Ａ５５０＿ＣＴＲＬ：対照群ｗｅｌｌの５５０  ｎｍ吸光度）
Ａβ  ＥＬＩＳＡ
Ａβ  ＥＬＩＳＡは、免疫生物研究所（ＩＢＬ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）のＨｕｍａｎ  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ（１−４２）Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃１７７１１または＃２７７１１）を用いた。方法はメーカー推奨のプロトコール（添付文書に記載の方法）にて行った。但しＡβ検量線は、ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １−４２，ｒａｔ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ．＃１７１５９６［Ａβ４２］）を用いて作製した。結果は、対照群の培地中Ａβ濃度に対する百分率（％  ｏｆ  ＣＴＲＬ）にて表１に示した。
（２）その結果、本発明化合物は、Ａβ４２産生低下作用が確認された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８５３】
【化２６８】
2008101015.tif 000008
１−（３，５−ジフルオロフェニル）エチルアミンの合成
実施例９３８と同様の方法により、３，５−ジフルオロアセトフェノン（６１１ｍｇ）から表題化合物を含む粗精製物（純度８３ｗｔ％、７３８ｍｇ）を得た。表題化合物の物性値は以下の通りである。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４８（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，３Ｈ），４．１９（ｑ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），６．７２（ｔｔ，Ｊ＝８．４，２．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９０（ｄｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２．４Ｈｚ，２Ｈ）．
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０７６】
【表２８−９】
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