【手続補正書】
【提出日】平成25年7月9日(2013.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性なＡ型ボツリヌス神経毒素複合体を得るための、実質的に動物性成分を含まない（ＡＰＦ）クロマトグラフィープロセスであって、前記プロセスは、以下の連続的なステップ：
（ａ）実質的にＡＰＦである培養培地中でクロストリジウム・ボツリナム菌を培養するステップと、
（ｂ）約２Ｌ〜約７５Ｌの実質的にＡＰＦである発酵培地中で前記培養培地からのクロストリジウム・ボツリナム菌を発酵させるステップであって、前記培養培地および前記発酵培地のうちの少なくとも１つは植物性タンパク質を含む、ステップと、
（ｃ）前記発酵培地に存在する細胞残屑を除去することにより前記発酵培地を採取するステップと、
（ｄ）前記採取済みの発酵培地を濾過により濃縮するステップと、
（ｅ）緩衝液を加えることにより、前記濃縮済みの発酵培地を希釈するステップと、
（ｆ）前記生物学的に活性なボツリヌス神経毒素が陰イオン交換媒体に捕捉されるように、前記希釈した採取済みの発酵培地を前記陰イオン交換媒体と接触させる、第１の接触ステップと、
（ｇ）前記陰イオン交換媒体から前記捕捉されたボツリヌス神経毒素を溶出し、それによって第１の溶離液を得るステップと、
（ｈ）前記第１の溶離液から不純物を除去するために、前記第１の溶離液を陽イオン交換媒体と接触させ、それによって第２の溶離液を得る、第２の接触ステップと、
（ｉ）前記第２の溶離液をダイアフィルトレーションによって処理するステップと、
（ｊ）前記処理した第２の溶離液を濾過し、それによって実質的にＡＰＦであるクロマトグラフィープロセスを使用して生物学的に活性なＡ型ボツリヌス神経毒素複合体を得るステップと、を含み、前記得られたＡ型ボツリヌス神経毒素複合体は、Ａ型ボツリヌス神経毒素複合体の２．０×１０７〜約６．０×１０７単位／ｍｇの効力を有する、プロセス。
【請求項２】
前記発酵培地は、約５％ｗ／ｖ以下の植物由来タンパク質成分、約２％ｗ／ｖ以下の酵母エキス、および約２％ｗ／ｖ以下のグルコースを含み、前記発酵培地のｐＨレベルは、前記発酵ステップの開始時に約ｐＨ６．５〜約ｐＨ８．０である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記培養ステップは、約５４０ｎｍでの前記培養培地の光学密度が約０．８ＡＵ〜約４．５ＡＵになるまで行われる、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記発酵ステップは、約６０〜８０時間、および約８９０ｎｍでの前記発酵培地の光学密度が約０．０５ＡＵ〜約０．７ＡＵに減少するまで行われる、請求項１〜３いずれか一項に記載のプロセス。
【請求項５】
前記培養ステップは、クロストリジウム・ボツリナムのＡＰＦワーキングセルバンクの内容物を前記培養培地に導入することによって開始され、前記ワーキングセルバンクは、前記ワーキングセルバンク１ミリリットル当たり少なくとも約１×１０４〜５×１０７コロニー形成単位のクロストリジウム・ボツリナムを含み、前記ワーキングセルバンク中の前記クロストリジウム・ボツリナム菌は、実質的に均一な形態を有する、請求項１〜４いずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記得られたボツリヌス神経毒素は、前記得られたボツリヌス神経毒素各１ｍｇにつき、１ｎｇまたは１ｎｇ未満の残留核酸を含む、請求項１〜５いずれか一項に記載のプロセス。
【請求項７】
前記プロセスは１週間以内に行われる、請求項１〜６いずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得るための動物性成分を含まない（ＡＰＦ）クロマトグラフィープロセスであって、前記プロセスは以下の連続的なステップ：
（ａ）ＡＰＦワーキングセルバンクからのクロストリジウム・ボツリナム菌をＡＰＦ培養培地に加えるステップと、
（ｂ）前記培養培地中で前記クロストリジウム・ボツリナム菌を培養するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）からの前記クロストリジウム・ボツリナム菌を、クロストリジウム・ボツリナムの細胞溶解が起こるまでＡＰＦ発酵培地中で発酵させるステップと、
（ｄ）前記発酵培養物を採取して、採取済みの発酵培地を提供するステップと、
（ｅ）前記採取済みの発酵培地を濾過による濃縮に供するステップと、
（ｆ）緩衝液の添加により前記濾過済みの発酵培地を希釈して、希釈済みの発酵培地を得るステップと、
（ｇ）前記希釈済みの発酵培地を初期精製クロマトグラフィーと接触させ、前記初期精製クロマトグラフィー媒体は陰イオン交換媒体である、第１の接触ステップと、
（ｈ）前記第１の接触ステップからの溶離液を最終精製クロマトグラフィー媒体と接触させ、前記最終精製クロマトグラフィー媒体は陽イオン交換媒体である、第２の接触ステップと、
（ｉ）第２の接触ステップからの溶離液を濾過し、それによって前記改良されたＡＰＦプロセスにより生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得るステップと、を含み、前記得られたボツリヌス神経毒素は、前記得られたボツリヌス神経毒素各１ｍｇにつき、１ｎｇまたは１ｎｇ未満の残留核酸を含み、前記プロセスは１週間以内に行われる、プロセス。
【請求項９】
生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得るためにクロマトグラフィーを利用する、実質的に動物性成分を含まない（ＡＰＦ）プロセスであって、前記プロセスは、以下のステップ：（ａ）実質的にＡＰＦである発酵培地を提供するステップと、（ｂ）前記発酵培地中でクロストリジウム・ボツリナム菌を発酵させるステップと、（ｃ）前記発酵培地を陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と接触させ、その後、前記陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からの溶離液を陽イオン交換クロマトグラフィーと接触させることによって、前記発酵培地から前記生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を回収するステップと、を含み、それによって、前記実質的にＡＰＦであるクロマトグラフィープロセスから前記生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得る、プロセス。
【請求項１０】
前記得られたボツリヌス神経毒素は、前記得られたボツリヌス神経毒素の１００万分の１未満の残留核酸を含む、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記プロセスは１週間以内に行われる、請求項９または１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
請求項９〜１１いずれか一項に記載のプロセスにより得た、生物学的に活性なボツリヌス神経毒素。
【請求項１３】
生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得るための、実質的に動物性成分を含まない（ＡＰＦ）クロマトグラフィーシステムであって、前記システムは、
クロストリジウム・ボツリナム菌を嫌気的に培養するための第１の装置であって、約２００ｍＬ〜約１Ｌの実質的にＡＰＦである培養培地を含有することが可能な第１の装置と、
前記第１の装置において培養されたクロストリジウム・ボツリナム菌の嫌気的発酵のための第２の装置であって、約２Ｌ〜約７５Ｌの実質的にＡＰＦである発酵培地を含有することが可能であり、酸化還元プローブ、ｐＨプローブ、および濁度プローブからなる群から選択される少なくとも１つの使い捨てプローブを含む、第２の装置と、
前記発酵培地を採取するための第３の装置と、
前記採取済みの発酵培地を濃縮し、濾過済みの発酵培地を希釈するための、第４の装置と、
前記採取済みの発酵培地から得られたボツリヌス神経毒素の第１の精製を行うための第５の装置であって、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体を備え、それによって第１の精製ボツリヌス神経毒素を得る、第５の装置と、
前記ボツリヌス神経毒素の第２の精製を行うための第６の装置であって、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体を備え、それによって第２の精製ボツリヌス神経毒素を得る、第６の装置と、
ボツリヌス神経毒素の第３の精製を行うための第７の装置であって、疎水性相互作用媒体を備え、それによって第３の精製ボツリヌス神経毒素を得る、第７の装置と、
前記第３の精製ボツリヌス神経毒素を濾過するための第８の装置であって、濾過膜を備えている該第８の装置とを備え、前記得られたボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス神経毒素の約２．０×１０７〜約６．０×１０７単位／ｍｇの効力を有し、前記得られたボツリヌス神経毒素は、前記得られたボツリヌス神経毒素各１ｍｇにつき、約１ｎｇまたは約１ｎｇ未満の残留核酸を含み、前記プロセスは１週間以内に行われる、システム。
【請求項１４】
第１の装置を含むことが可能な嫌気性チャンバを含む、モジュール式雰囲気制御型システムをさらに備えるシステムであって、前記嫌気性チャンバは、前記嫌気性チャンバ内に統合型高性能微粒子エアフィルタを有する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得るための、実質的に動物性成分を含まない（ＡＰＦ）クロマトグラフィーシステムであって、前記システムは、
（ａ）実質的にＡＰＦである発酵培地と、
（ｂ）前記発酵培地中で発酵させるためのクロストリジウム・ボツリナム菌と、
（ｃ）前記発酵培地から生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を回収するための、陰イオン交換クロマトグラフィー媒体と、
（ｄ）前記陰イオン交換クロマトグラフィー媒体からの溶離液から、さらに生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を回収するための、陽イオン交換クロマトグラフィー媒体と、を備え、それによって、実質的にＡＰＦであるクロマトグラフィープロセスから生物学的に活性なボツリヌス神経毒素を得る、システム。