(57)【要約】【課題】  手入れが簡単で、長期間測定することができるうえ、細胞表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることができる酵素固定化SPMを有する表面成分同定センサを提供する。【解決手段】  SPM探針を被検査体物質表面に接近もしくは接触させて原子レベルの精度で走査し、前記被検査体物質表面と前記探針との間で生じる物理量を検出する走査型プローブ顕微鏡に用いるSPM探針あって、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブのSPM探針の先端部分に、リンカー分子を介して、耐熱性酵素が取り付けられた酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサ。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
SPM探針を被検査体物質表面に接近もしくは接触させて原子レベルの精度で走査し、前記被検査体物質表面と前記探針との間で生じる物理量を検出する走査型プローブ顕微鏡に用いるSPM探針であって、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブのSPM探針の先端部分に、リンカー分子を介して、耐熱性酵素が取り付けられた酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサ。
【請求項２】
被検査体物質が、キチン質を含有するポリマーであり、耐熱性酵素がThermococcus
kodakaraensis KOD1由来キチン分解酵素である請求項1に記載した酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサ。
【請求項３】
SPM探針の先端部分表面が金又はシリコンであり、一方の末端がチオール又はシランであり、他方の末端がカルボキシル基であり、分子中央部は炭素数３〜２０のアルキル、デキストラン若しくはポリエチレングリコールであるリンカー分子を用いる請求項１に記載した酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサ。
【請求項４】
リンカー分子の他方の末端カルボキシルとしてニトリロ三酢酸を有するリンカー分子を用い、ヒスチジンタグがある酵素を用いる請求項３に記載した酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検査体物質表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることができる酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、SPM（走査型プローブ顕微鏡の略称）の先端に酵素などのセンサを取り付けた装置は既に知られている（特許文献１参照）。
また、試料と相互作用する探針を有するプローブ、該プローブの製造方法、該プローブを用いた分子間の相互作用の測定方法及び測定装置も知られている（特許文献２）。ここでは、有機分子の取り付けやDNAを固定している。また、分子間相互作用を力の大小で評価しているにすぎない。
さらに、上述のような測定装置の探針作製方法の詳細についても知られている（特許文献３）。ここでも化学反応のことが記されているが、酵素あるいは変異酵素について言及されていない。
【０００３】
またさらに、液晶と配向膜の間に働く3次元的な力を検出し、液晶セル組み前に液晶の廃港状態を予想してより効率的な工業プロセスを実現することができるSPM探針及びその製造方法も知られている（特許文献４）。
探針へDNAを取り付け、遺伝子地図を解析する手法についても知られている（特許文献５）。
物質表面の構造を、分子レベルや原子集団のレベルで直接調べたり、加工するSPMおよびそれによる分子加工法についても知られているが、この方法では、酵素あるいは変異酵素の固定化について言及されていない（特許文献６参照）。
【０００４】
従来技術においては、酵素の探針への固定化密度、酵素活性、基質特異性によって分析領域をナノメートルスケールで制御しながら、細胞表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることは行われていなかった。
【特許文献１】特開2003-14607号公報
【特許文献２】特開2005-283433号公報
【特許文献３】特許第3543967号明細書
【特許文献４】特開2003-222583号公報
【特許文献５】特開2001-165840号公報
【特許文献６】特開平5-93623  号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、手入れが簡単で、長期間測定することができるうえ、酵素の探針への固定化密度、酵素活性、基質特異性によって分析領域をナノメートルスケールで制御しながら、細胞表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることができる酵素固定化SPMを有する表面成分同定センサを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために本発明は、SPM探針に工夫をし、リンカー分子を介して、耐熱性酵素が取り付けることにより、手入れが簡単で、長期間測定することができる表面成分同定センサを開発することができた。
すなわち、本発明は、SPM探針を被検査体物質表面に接近もしくは接触させて原子レベルの精度で走査し、前記被検査体物質表面と前記探針との間で生じる物理量を検出する走査型プローブ顕微鏡に用いるSPM探針であって、位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブのSPM探針の先端部分に、リンカー分子を介して、耐熱性酵素が取り付けられた酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサである。
また、本発明は、被検査体物質が、キチン質を含有するポリマーであり、耐熱性酵素がThermococcus kodakaraensis KOD1由来キチン分解酵素とすることができる。
さらに本発明は、SPM探針の先端部分表面が金又はシリコンであり、一方の末端がチオール又はシランであり、他方の末端がカルボキシル基であり、分子中央部は炭素数３〜２０のアルキル、デキストラン若しくはポリエチレングリコールであるリンカー分子を用いることができる。
また、本発明は、リンカー分子の他方の末端カルボキシルとしてニトリロ三酢酸を有するリンカー分子を用い、ヒスチジンタグがある酵素を用いることができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の表面成分同定センサは、SPM探針の手入れが簡単で、長期間測定することができるうえ、被検査体物質の表面を走査することにより、被検査体物質同定を含めた表面のマッピングが可能となり、コンビナトリアルな手法によって得られる特異的認識ペプチドなどを利用すれば、生体分子に限らず無機物の同定でさえも可能となる。
また、本発明の表面成分同定センサは、細胞表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることが可能となり、疾病の原因解明や状態を見極めることなど医療分野、生化学的研究などにおいても多大な貢献をすると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の表面成分同定センサに用いるSPM探針の作製方法についてより具体的に述べる。
（１）SPM探針へのリンカー分子の設置
本発明で用いるSPM探針の先端部分表面を金又はシリコンとし、一方の末端がチオール又はシランであり、他方の末端がカルボキシルであり、分子中央部は炭素数３〜２０のアルキル、デキストラン若しくはポリエチレングリコールであるリンカー分子を用いることにより、金−チオール反応、若しくはシランカップリング反応によってリンカー分子をSPM探針に設置する。アルキル基の部分は、ポリエチレングリコール、デキストランなど、チオール、シラン、又は酵素に不活性な分子であればどのようなものでも良い。
固定化対象の酵素にヒスチジンタグがある場合には、金属イオンとの錯形成に基づき、酵素を固定化するため、例えば、ニトリロ三酢酸等の分子を先端部に保有する分子を上述の方法でSPM探針に固定化することができる。
【０００９】
（２）酵素の選択
本発明で用いる酵素は、特異的な基質認識能を有する。これらの酵素を（１）のリンカー分子に設置する。
例えば、キチナーゼ、アミラーゼ、セルラーゼなどの基質吸着部位や全長酵素、加水分解の触媒活性部位のアミノ酸残基に変異を導入した変異酵素、若しくは、変異でない酵素、抗体、低分子ペプチドなどを挙げることができる。一般的な酵素タンパク質は安定性が低いため、ここでは90℃以上の高温でも生育可能な超好熱菌由来の耐熱性酵素を利用することができる。コンビナトリアルな手法によって得られる特異的認識ペプチドなどを利用すれば、生体分子に限らず無機物の同定でさえも可能となる。更に、変異酵素を用いることで、基質特異性を改変することもできる。
【００１０】
（３）分析精度の向上
リンカー分子の設置に際して、酵素の探針への固定化密度を調整するために、リンカー分子の設置に際して、アルカンチオール炭素数２−３０などの酵素固定化に参加することができない分子（例えば、末端がメチル基）であるスペーサ分子とリンカー分子を混合して下地のスペーサー領域を作製したり、あるいは、酵素の固定化を阻害するような嵩高い分子をリンカー分子と混合しておくことにより、酵素の探針への固定化密度を調整することができる。
（４）観察対象
本件発明は、特に、生きた細胞の膜タンパク質など、生体関連物質および一般的な低分子化合物から高分子化合物などが被検査体物質として挙げられる。
とくにキチンを混入したポリマー組成物の表面において、キチンの分布を検出し、リアルタイムで同定・マッピングすることができる。
酵素の基質特異性は、遺伝子組み換えまたは酵素、抗体、低分子ペプチドの種類によって改変できるため、本手法は、あらゆる物質表面の解析に用いることができる。
【００１１】
本発明で用いる酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサは、あらゆる物質表面のマッピングが可能であり、材料表面の微細構造をナノメートルスケールで同定分析することが可能となる。
酵素を固定化したSPM探針を作製し、材料表面を走査することにより、異性体でも厳密に区別できる。
【実施例１】
【００１２】
本発明について図１を用いてさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜1.耐熱性キチン結合タンパク質の調製＞
＜1-1.超好熱始原菌KOD1株由来のキチン結合タンパク質遺伝子のクローニング＞
＜1-1-1.KOD1株の染色体DNAの調製＞
鹿児島県子宝島にて単離された超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1 株（以下、「KOD1株」という。KOD1株は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターに寄託されており、その受託番号は、JCM 12380である。）を85℃にて培養後、菌体を回収した。得られた菌体から常法に従い、KOD1株の染色体ＤＮＡを調製した。
＜1-1-2.キチン結合ドメイン遺伝子の増幅＞
KOD1株のキチナーゼ遺伝子(Tanaka, T.ら、Applied and Environmental  Microbiology, 65, 5338−5344 (1999))のうち、キチン結合ドメイン1(ChBD1)とキチン結合ドメイン2(ChBD2)に対応する部分のDNAをそれぞれPCR法で増幅した。
キチン結合ドメイン1(ChBD1)及びキチン結合ドメイン2(ChBD2)ではプライマーとして次のものを用いた。
【表１】
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表１に示すように、ChBD1ではプライマーにBDU-2とBDR-1、 ChBD2ではプライマーに、BDU-3とBDR-2を使用した。
PCR法においては、上記で調製した染色体DNA（500ng）、各プライマー10pmol及びKOD-DNAポリメラーゼ（TOYOBO社製）を含む５０μｌの反応液中で、まず98℃で60秒、55℃で30秒および74℃で60秒反応させたのち、98℃で15秒、55℃で2秒および74℃で30秒のサイクルを25回繰り返し、反応させた。
＜1-1-3.キチン結合ドメイン発現ベクターの構築＞
PCR法により得られたChBD1遺伝子およびChBD2遺伝子の増幅産物をアガロースゲル電気泳動し、目的の分子量の断片が得られたことを確認した。その後、ChBD1遺伝子はNdeI及びBglIIで、ChBD2遺伝子はNdeI及びBamHIで制限酵素処理し、次いでアガロースゲル電気泳動を行い、目的の遺伝子断片部位を回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社製)にて精製した。
同様にNdeI及びBamHIで制限酵素処理したプラスミドベクター pET15bもアガロースゲル電気泳動及びWizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社製)にて精製し、ChBD1遺伝子断片とChBD2遺伝子断片をそれぞれLigation kit ver.2(Takara社製)を用いてライゲーションした。ライゲーション反応溶液を、大腸菌コンピテントセルJM109を宿主として塩化カルシウム法にて形質転換を行った。形質転換後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１２時間培養した。得られた形質転換体についてコロニーPCRを行い、プラスミドにChBD1遺伝子とChBD2遺伝子が挿入されているクローンを選抜した。得られた発現ベクターはそれぞれ、pET-ChBD1またはpET-ChBD2と名付けた。
得られたベクターによって生産されるタンパク質は、N末端側にpETベクターに由来するヒスチジンタグが付加される。
【００１３】
＜1-2.耐熱性キチン結合タンパク質の調製＞
＜1-2-1.組換えタンパク質の大腸菌における発現＞
上記で得られた発現ベクターpET-ChBD1またはpET-ChBD2を用いて、大腸菌コンピテントセルBL21-CodonPlus(DE3)-RILを塩化カルシウム法にて形質転換を行った。形質転換後、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地に植菌し、３７℃で１２時間培養した。得られた形質転換体をアンピシリン含有ＬＢ液体培地にて３７℃，１２時間の条件で前培養を行った後、この培養液をアンピシリン含有ＬＢ液体培地に１%植菌し、OD660が約0.3〜0.6になるまで３７℃で培養した。イソプロピル-β-Ｄ-チオガラクトピラノシドを終濃度０．１ｍＭで添加し、さらに3.5時間培養を続けた。
＜1-2-2.組換えタンパク質の精製＞
培養終了後、菌体を遠心分離により回収し、50 mM Tris-HCl (pH7.5)を添加して懸濁した後、超音波処理により細胞を破砕した。これを再度遠心分離することにより可溶性タンパク質が含まれる画分を回収した。
次に前記可溶性画分について、80℃で20分間の熱処理を行い、遠心分離により沈澱を除き、熱に安定なタンパク質を含む可溶性画分を得た。この可溶性画分にChBD1では飽和濃度が40％になるように、ChBD2では飽和濃度が60％になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、遠心分離を行うことにより目的タンパク質を沈殿として回収した。この沈殿に適当量の緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH7.5)）を添加し、再可溶化した後、ニッケルキレートカラムクロマトグラフィーを用いてさらに精製を行った。50 mM Tris-HCl (pH7.5)で平衡化したHisTrapカラム（GEヘルスケア社製）を用い、ChBD1、または、ChBD2を含む試料を該カラムに付与し、前記カラムを洗浄用緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaCl）で洗浄後、溶出用緩衝液（50 mM Tris-HCl (pH7.5), 300 mM NaCl, 500 mM imidazole）で目的タンパク質を溶出させた。
脱塩カラムHiTrap Desalting（GEヘルスケア社製）を50 mM Tris-HCl (pH7.5), 25 mM NaCl緩衝液で平衡化し、該カラムにChBD1もしくはChBD2を含む試料を付与し該緩衝液で脱塩した。最終的に得られたタンパク質試料を精製タンパク質とした。精製サンプルのSDS-PAGE後の写真を図３に示す。
【００１４】
＜2.キチン結合タンパク質のキチン結合能の確認＞
キチン結合能の確認実験で用いるChBD1とChBD2は、80℃、20分の熱処理後の熱安定画分を60％硫酸アンモニウムで濃縮した粗精製サンプルを使用した。結合実験に用いるコロイダルキチンは特開平11-313688に示されている方法で調製した。粗精製のChBD1もしくはChBD2の溶液20μlを、10μlの１％コロイダルキチンと混合し、そして4℃で25時間インキュベートした。次いで、反応液を遠心分離し、上清、およびコロイダルキチンを含む沈澱を得、沈澱については沈澱を50 mM Tris-HCl (pH7.5)で1回洗浄し、そしてこれらをSDS-PAGEに供した。結果を図３及び図４に示す。図４において、レーン1および4はコロイダルキチン無添加の試料を、レーン2および5はコロイダルキチン添加後の上清を、そしてレーン3および6はコロイダルキチン添加後の沈澱を示し、レーン1〜3はChBD1についての結果を、そしてレーン4〜6はChBD2についての結果を示す。ChBD1では結合量が少ないが、ChBD1とChBD2の両方に結合能があることが確認できた。
【００１５】
（Thermococcus kodakaraensis KOD1由来キチン分解酵素によるキチン質の表面成分同定センサ）
SPM探針の先端部分表面を金とし、一方の末端がチオールであり、他方の末端がカルボキシルであり、分子中央部は炭素数６程度のアルキルであるリンカー分子（3,3’-dithiobis[N-(5-amino-5-carboxypentyl)propionamide-N’,N’-diacetic acid]）と、上記の方法により得られた耐熱性酵素のキチン結合ドメイン1(ChBD1)とキチン結合ドメイン2(ChBD2)をそれぞれ用いて、酵素固定化SPM探針を作成した。
位置決め手段により位置決め可能に設けられる表面走査用プローブ先端を所定の形状に添ってSPM探針を移動させ、リアルタイムでポリ乳酸被膜表面のキチンの分布マップを作成することができる。
図１中、酵素は六角形の標的分子を特異的な相互作用を持つため、酵素固定化SPMで走査することにより、丸のポリ乳酸分子と区別することができる。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明の表面成分同定センサは、細胞表面に存在する膜タンパク質などを、生きたまま、直接(非標識で)、リアルタイムで同定・マッピングすることが可能となり、疾病の原因解明や状態を見極めることなど医療分野、生化学的研究などにおいても多大な貢献をすると考えられ、産業上の利用可能性は高い。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】酵素の基質特異性を利用した表面成分同定センサの概念図
【図２】キチンの分子構造
【図３】大腸菌で発現され、精製されたタンパク質の電気泳動写真
【図４】ChBD1とChBD2のキチン結合能を示す電気泳動写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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