【手続補正書】
【提出日】平成25年5月24日(2013.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち１種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって対立遺伝子特異的に増幅する方法であって、
（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドを、前記標的配列にハイブリダイズさせるステップ、ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドは、その３’側部分及び５’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち１種の変異配列のみと相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有し、前記選択的ヌクレオチドは、３’末端の内側に配置されており、前記第２のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基は、アデノシンの６位のアミノ基、グアノシンの２位のアミノ基又はシチジンの４位のアミノ基である、
（ｂ）核酸ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの伸長に適した、前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチドの、前記標的配列のうち少なくとも１種の変異配列へのハイブリダイゼーションのための条件を整えるステップ、ここで、前記ポリメラーゼは、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的な前記変異配列にハイブリダイズするときには、前記第２のオリゴヌクレオチドを選択的に伸長させる能力を有するが、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的でない前記変異配列にハイブリダイズするときには、その能力が実質的に低下する、並びに
（ｃ）一連のハイブリダイゼーション及び伸長ステップを複数回繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｂ）における前記核酸ポリメラーゼが、前記選択的ヌクレオチドが前記標的配列と塩基対を形成するときにのみ、前記第２のオリゴヌクレオチドを伸長させることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択的ヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドの３’末端付近の１〜５個のヌクレオチドに位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）におけるプライマー伸長産物を検出するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸ポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ，Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼ，ΔＺ０５  ＤＮＡポリメラーゼ及びΔＺ０５−Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸ポリメラーゼが３’−５’ヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸ポリメラーゼが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ及びサーモトガ・マリティマ（Thermatoga Maritima）からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）における前記変異配列が、ヒトＢＲＡＦ，ＥＧＦＲ，ＰＩＫ３ＣＡ又はＫＲＡＳ遺伝子のＶ６００Ｅ変異配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のオリゴヌクレオチドが配列番号１１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列番号２，３，４，５，７，８，９，１０及び１７からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち１種の変異配列を検出する方法であって、
（ａ）第１及び第２のオリゴヌクレオチドを、前記標的配列にハイブリダイズさせるステップ、ここで、前記第１のオリゴヌクレオチドは、前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドは、その３’側部分及び５’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち１種の変異配列のみと相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有し、前記選択的ヌクレオチドは、３’末端の内側に配置されており、前記第２のオリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基は、アデノシンの６位のアミノ基、グアノシンの２位のアミノ基又はシチジンの４位のアミノ基である、
（ｂ）核酸ポリメラーゼによる前記オリゴヌクレオチドの伸長に適した、前記第１及び前記第２のオリゴヌクレオチドの、前記標的配列のうち少なくとも１種の変異配列へのハイブリダイゼーションのための条件を整えるステップ、ここで、前記ポリメラーゼは、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的な前記変異配列にハイブリダイズするときには、前記第２のオリゴヌクレオチドを選択的に伸長させる能力を有するが、前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列のうち、前記選択的ヌクレオチドと相補的でない前記変異配列にハイブリダイズするときには、その能力が実質的に低下する、
（ｃ）一連のハイブリダイゼーション及び伸長ステップを複数回繰り返すステップ、並びに
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドの伸長産物を検出するステップ、ここで、前記伸長は、前記第２のオリゴヌクレオチドが有する選択的ヌクレオチドと相補的な標的配列の変異配列の存在を表す、
を含む方法。
【請求項１２】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち１種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって対立遺伝子特異的に増幅するためのキットであって、
（ａ）前記標的配列と少なくとも部分的に相補的な第１のオリゴヌクレオチド、
（ｂ）その３’側部分及び５’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち１種の変異配列のみと相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記選択的ヌクレオチドが、３’末端の内側に配置されており、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基がアデノシンの６位のアミノ基、グアノシンの２位のアミノ基又はシチジンの４位のアミノ基である第２のオリゴヌクレオチド、並びに
（ｃ）核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、前記核酸ポリメラーゼによる核酸伸長に適した緩衝液、及び対立遺伝子特異的増幅を実施するための説明書
を含むキット。
【請求項１３】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち１種の変異配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による対立遺伝子特異的増幅を実施するためのオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）その３’側部分及び５’側部分が前記標的配列の一部分と少なくとも部分的に相補的な配列、
（ｂ）前記標的配列のうち１種の変異配列のみと相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドであって、３’末端の内側に配置された選択的ヌクレオチド、ここで、前記オリゴヌクレオチドは、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有するヌクレオチドの構造は、下記群：
【化１】
2013513360.tif 000001
［式中、Ｓは糖残基を表し、Ｒは修飾基を表す。］
から選択され、前記修飾ヌクレオチドは、３’末端に対して５位、４位、３位、２位又は１位に存在する、
を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
環外アミノ基が共有結合的に修飾された前記塩基が、下記式：
【化２】
2013513360.tif 000002
［式中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、非置換又は置換アリール及びフェノキシからなる群より選択される。］
の修飾基を含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
環外アミノ基が共有結合的に修飾された前記塩基が、Ｎ6−ベンジル−アデニン，Ｎ6−パラ−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジルアデニン，Ｎ2−アルキル−グアニン及びＮ4−ベンジル−シトシンからなる群より選択される、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号２，３，４，５，７，８，９，１０及び１７からなる群より選択された配列を有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
数種の変異配列の形態で存在する標的配列のうち１種の変異配列をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって対立遺伝子特異的に増幅するための反応混合物であって、
（ａ）前記標的配列と少なくとも部分的に相補的な第１のオリゴヌクレオチド、及び
（ｂ）その３’側部分及び５’側部分が前記標的配列と少なくとも部分的に相補的であり、前記標的配列のうち１種の変異配列のみと相補的な少なくとも１個の選択的ヌクレオチドを有する第２のオリゴヌクレオチドであって、前記選択的ヌクレオチドが、３’末端の内側に配置されており、環外アミノ基が共有結合的に修飾された塩基を有する少なくとも１個のヌクレオチドを含み、前記環外アミノ基がアデノシンの６位のアミノ基、グアノシンの２位のアミノ基又はシチジンの４位のアミノ基である第２のオリゴヌクレオチド、並びに
（ｃ）核酸ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、及び前記核酸ポリメラーゼによる核酸伸長に適した緩衝液
を含む反応混合物。