【手続補正書】
【提出日】平成24年12月14日(2012.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
炎症性サイトカインの誘発および樹状細胞（ＤＣ）の成熟は、アジュバントワクチンを投与する間、強い免疫反応を高めることに寄与する。従って、ヒトＤＣにＩＬ−１２ｐ７０を誘発するＣＲＸ５２７とＣＲＸ−５４７の能力を比較する。ＩＬ−１２ｐ７０の誘発はTh1ヘルパーT細胞系列の発達を促し、細胞媒介性免疫応答を促す(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86;Gutcher and Becher 1119-27)。IL-12p70 の発現がＭｙＤ８８およびＴＲＩＦシグナル依存であると示されたので(Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)、ＣＲＸ５４７処理に対するＤＣ応答が消失するか否かが確認される。ＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと比較した場合有意に減少しているが、ＣＲＸ−５４７はヒト単球由来ＤＣからのＩＬ−１２ｐ７０応答を誘発し得る（図３Ａ）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
または、ＤＣにおける炎症性メディエーターであるＩＬ−２３の発現は全面的にＭｙＤ８８依存的である (Re and Strominger 37692-99;Goriely, Neurath, and Goldman 81-86)。樹状細胞のＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７処理によるＩＬ−２３の誘発を比較した場合、ＩＬ−２３発現は事実上ＣＲＸ−５４７処理細胞におけるベースラインまで下がる（図３Ｂ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７により開始したシグナルを比較するために、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７の処理によるNFκBおよびIRF-3の核移行の誘発は、画像ストリーム解析を用いてヒト単球細胞株であるMonoMac6 (MM6) において比較した。図６は、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６細胞のゲーティングストラテジーを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ＣＲＸ−５４７と比べると、ＣＲＸ−５２７はより初期のNFκB 核移行（刺激後、早ければ５分後）を誘発する。ＣＲＸ−５４７活性で誘発されるNFκB 核移行は、ある特定閾値（この場合は５０%前後）以上には決して達しない一方で、ＣＲＸ−５２７による刺激では３０分でほぼ１００％のNFκBが核移行する（図７）。ＡＧＰのいずれも投与量依存的に機能するように見える。ＣＲＸ−５３７であるかＣＲＸ−５４７であるかの刺激に関わらず、高いバックグラウンドレベルのIRF3核移行が存在し、これはＴＲＩＦを介したシグナル伝達を示唆する（データは示さず）。初期のNFκB活性はＭｙＤ８８シグナル伝達パターンを示しているので、このデータはＣＲＸ−５２７はＭｙＤ８８を介して情報伝達するがＣＲＸ−５４７はＭｙＤ８８シグナル伝達の誘発において作用が弱いことを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７での核移行の差異が転写活性化の上昇と言い換えられることを確認するために、ヒトTLR4, MD-2, CD14およびNFкBレポタープラスミドで形質移入したHEK293 細胞内でのＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７誘発NFκB活性化を比較する。核移行アッセイにあるようにＣＲＸ−５２７およびＬＰＳは、ＣＲＸ−５４７と比べて NF-κB プロモータの有意に高い活性化を誘発することが示されている（（図８）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
ＣＲＸ−５２７は、サイトカインおよびケモカインを誘発する転写因子の活性化に導くTLR4/MD2受容体複合体を介して情報伝達する。固定濃度のＣＲＸ−５２７またはＬＰＳを添加する前に、ＣＲＸ−５４７の濃度を高めて一次ヒト付着単球に添加した場合、ＭｙＤ８８依存的サイトカインであるTNFαの誘発は抑制される一方で、ＴＲＩＦ依存的ケモカインであるＭＣＰ−１の誘発は、より高い濃度のＣＲＸ−５４７にて相加的に増大する。TNFα 誘発を抑制するのに必要なＣＲＸ−５４７の濃度はＣＲＸ−５２７およびＬＰＳの固定濃度と同じ範囲にあり、これはＣＲＸ−５４７がＴＬＲ４複合体への結合についてＣＲＸ−５２７およびＬＰＳと競合し得るが、結合時のＴＲＩＦ経路を介したシグナル伝達を主として誘発することを示唆する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
実施例６
ヒトＴＬＲ４の明らかなＴＲＩＦバイアスアゴニズムを持つＣＲＸ−５４７の類似体
ＡＧＰファミリーの中の類似体を評価するために、類似パターンのサイトカイン/ケモカイン誘発について、化合物を試験する。エステル連結二次アシル鎖を持つ、セリルＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７のＬとＤの異性体対を、エーテル連結二次アシル鎖、化合物１ａおよび１ｂ（図１に示す化合物）、リード候補ＡＧＰの潜在的安定性強化修飾を持つセリル類縁体と比較した。興味深いことに、１ｂにおいて、分子を修飾してエステル結合二次アシル鎖ではなくエーテル結合二次アシル鎖を有することにより、ＭｙＤ８８依存的シグナル伝達の誘発についてＬ異性体に比べてＤ異性体において実質的な有効性を回復する（図１３）。エーテル結合Ｄ異性体によるＭｙＤ８８有効性救済の機序的な根拠は不明である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
実施例７
ＣＲＸ−５２７またはＣＲＸ−５４７で、またはＣＲＸ−５２７もしくはＣＲＸ−５４７で刺激されたＭＭ６で刺激された一次ヒト単球のリン酸―ウェスタンブロット解析
セリン/トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫ−１の分解はＭｙＤ８８依存的ＴＬＲ４シグナル伝達の下流で起こる一方で、ＴＲＩＦ依存的ＴＬＲ４シグナル伝達はＩＲＦ−３活性化を起こす(Yamamoto et al. 6668-72;Yamamoto et al. 640-43)。一次ヒト単球は示された時間、ＣＲＸ−５４７かＣＲＸ−５２７のいずれかで刺激され、細胞分解溶解物をＭｙＤ８８経路―活性化キナーゼ、ＩＲＡＫ−１およびＴＲＩＦ経路―活性化転写因子ＩＲＦ−３（リン酸―ＩＲＦ−３および総ＩＲＦ−３）のレベルについて、ウェスタンブロットにて解析する。β−アクチンの値はローディング対照として使用される。ＣＲＸ−５２７で刺激した単球はＩＲＡＫ−１が急激に減少する一方で、ＣＲＸ−５４７で刺激した細胞ではこのタンパク質の分解の遅れ、減少が示された（図４）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
実施例８
マウスにおけるＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ依存的シグナル伝達の評価
一次ヒト細胞の結果とは対照的に ＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈投与した後ＣＲＸ−５４７はマウス血清中に同様のレベルのＭｙＤ８８依存的サイトカインを誘発する。この反応がＢＡＬＢ／ｃマウスに特異的でないことを確認するために、Ｃ５７／ＢＬ／６マウスにおいて血清サイトカイン誘発の同様の試験を実施する。ＢＡＬＢ／ｃマウスに認められる場合と比べて、選択したサイトカインについてＣＲＸ−５４７による相対的な誘発は僅かに小さいが（示していない）、動態（投与後２時間または６時間で誘発）およびサイトカイン誘発の強度はＭｙＤ８８依存的 (TNFα, IL-10) およびＴＲＩＦ依存的(RANTES, IP-10, MIG) サイトカイン/ケモカインについてはＣＲＸ−５２７およびＣＲＸ−５４７と類似している。さらに、関心がもたれているものは、試験されたＭｙＤ８８依存的サイトカインの誘発が投与後６時間よりも２時間において常に高い値である一方で、ＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発は各アゴニストの６時間で高く、これは二つの経路を介したサイトカインの誘発の異なる動態を示唆する。この現象は、多くのＴＲＩＦ依存的サイトカインの誘発について従来から認められている初期のIFNβ誘発およびオートクリン／パラクリン活性の必要性(Perry et al. 407-22)、または、エンドサイトーシスの必要性によるＴＲＩＦ依存的シグナルの遅れ(Kagan et al. 361-68)で説明できる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
huTLR4、huMD-2、およびhuCD14で形質移入された、ならびにＣＲＸ−５４７で刺激されているHEK293細胞はＣＲＸ−５２７とＬＰＳと比べてNFκBリポータ活性を少なく誘発する一方で、muTLR4-、muMD-2-、およびmuCD14-形質移入HEK293細胞におけるＣＲＸ−５４７により誘発される活性レベルはＣＲＸ−５２７およびＬＰＳに類似している。ＣＲＸ−５４７によるシグナルの誘発について、この解析はマウスＴＬＲ４受容体複合体を好むことを示す。この種特異性の理由がＴＬＲ４自身なのか別の補助受容体成分なのかをはっきりするために、解析にはヒトおよびマウスＴＬＲ４受容体成分の組み合せを発現するＨＥＫ２９３細胞を含める。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
図８に示すように、ヒトＨＥＫ２９３細胞がＴＬＲ４およびマウスＭＤ−２の組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の間にプロモータ活性の誘導についての大きな相対差が残ることは、この相違がヒトＴＬＲ４でのＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７の相互作用における相違からくることを示唆する。ＨＥＫ２９３細胞がマウスＴＬＲ４とヒトＭＤ−２との組み合せで形質移入された場合、ＣＲＸ−５２７とＣＲＸ−５４７が類似のレベルのプロモータ活性を誘発していることは、活性の差がＡＧＰ/ＴＬＲ４接触面での相互作用の相違からきていることを示唆する。これらの結果は、アシル鎖の長さおよびＭｕｒｏｉらが認めた分子のＭＤ−２との相互作用の差を発生させた組成物における修飾の影響とは異なる(Muroi, M and Tanamoto, K. (2006). J. Biol. Chem. 281. p5484-5491)。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
実施例１３ マウスRAW264.7細胞のウェスタンブロット解析
RAW264.7細胞でのＴＲＩＦ対ＭｙＤ８８における主要なタンパク質シグナル伝達分子のリン酸化（活性化）状態を測るために、細胞は予備活性化（10 -7M PMAを用いて）し10ng/mlのＡＧＰで刺激した。細胞分解溶解物は、０、１５ｍ、３０ｍ、４５ｍ、６０ｍ、１２０ｍ、２４０ｍで調製した。ＭＭ６細胞の結果と同様に、ＣＲＸ−５４７と比べてIκBα の分解がＣＲＸ−５２７での刺激の後は早く進んだ(図17)。驚くべきことに、ＣＲＸ−５４７の刺激はより高いIκBαリン酸化とＩＲＦ３リン酸化をもたらす。これらの細胞の増加した反応性は単球細胞の成熟状態を向上させると知られるＰＭＡでの予備活性化によると思われ、ＣＲＸ−５４７はリン酸―IκBαおよびリン酸―IRF3の発現を誘発する。ＩＲＦ３はＴＲＩＦ媒介性シグナル伝達を経て誘発される。また、総ＩＲＦ３タンパク質の量はＣＲＸ−５４７で処理された細胞においてより高い。（注記：実験回数は一回であり、負荷コントロール(βactin)は不均一な負荷の可能性を示唆する。）
実施例１４ ＲＮＡ干渉解析
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＴＬＲ２，ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８のＴＬＲシグナル伝達経路に含まれる特異的遺伝子の発現を破壊するのに利用される。RAW264.7 siRNA細胞株は市販されているプラスミド (Invivogen)を使って調製される。このプラスミドはZeocin選択マーカー、ＧＦＰをコードする配列およびノックダウン用のshRNAをコードする配列を含む。細胞が一度効率的に形質移入すると、安定した細胞株が抗生物質選択を経て生じる。培養物の精度は、培養系内のＧＦＰ+細胞で決定される。また、無関係なプラスミドも対照として安定的に細胞を形質移入するのに使われる。図３０は、同系のsiRNAの安定的な形質移入体においてのＭｙＤ８８とＴＲＩＦのノックダウンを示す。図３０Ａは、サイトカイン−再生実験の前にＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージが３つのすべての細胞株において９６％以上であることを示す。図３０Ｂは、ＬＰＳでの刺激が無関係の対照と比べてタンパク質のレベルが低下しているのでＭｙＤ８８とＴＲＩＦについて首尾よくノックダウンした証拠を示す。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＸ５４７含まないリピッドＡ模倣物組成物をヒトに投与した場合に誘発されるＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルと比べて、ＭｙＤ８８依存的サイトカインのレベルを減少させるための医薬組成物であって、該医薬組成物がＣＲＸ５４７を含むリピッドＡ模倣物組成物を含む、上記医薬組成物。
【請求項２】
ＣＲＸ５４７をリピッドＡアジュバント組成物へ組み込むことを含む、より低いレベルのIL-12p70およびIL-23の誘発が可能なヒトリピッドＡ模倣物アジュバント組成物を製造する方法。
【請求項３】
ＭｙＤ８８依存的サイトカインの減少が、ＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ模倣物組成物により誘発されるNF-κB活性のレベルおよびＩＲＦ−３レベルと比較した場合に、有意に低いレベルのNF-κB活性、および同等か、またはより高いレベルのＩＲＦ３をヒト系において誘発することを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
リピッドＡ模倣物組成物がさらに、第一のリピッドＡ模倣物および第二合成リピッドＡ模倣物を含み、該第二合成リピッドＡ模倣物がＣＲＸ５４７である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬組成物であって、第一のリピッドＡ模倣物がアミノアルキルグルコサミニド４‐リン酸（ＡＧＰ）であり、かつ該医薬組成物がさらにＣＲＸ５４７を含まないリピッドＡ組成物により誘発されるIL-12p70およびIL-23のレベルと比べてより低いレベルのIL-12p70およびIL-23をヒト細胞に誘発する、上記医薬組成物。
【請求項６】
リピッドＡ模倣物アジュバント組成物の治療係数を向上させる方法であって、該リピッドＡ模倣物アジュバント組成物がＣＲＸ５４７ではない第一のリピッドＡ模倣物を含み、該方法が該アジュバント組成物にＣＲＸ５４７を組み入れるステップを含む、上記方法。
【請求項７】
ＣＲＸ５４７を組み入れるステップがアジュバント組成物における第一のリピッドＡ模倣物の全てまたは一部をＣＲＸ５４７と置換することを含む、請求項６に記載の方法。