【手続補正書】
【提出日】平成25年2月7日(2013.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子座を分析する方法であって、該方法は：
複数の標的核酸の各々をプローブセットと接触させる工程であって、
ここで、各プローブセットは、複数の異なるプローブを含み、各プローブは、該標的核酸の複数の部分領域のうちの１つの同じ鎖に隣接する核酸と相補的である、５’領域および３’領域に隣接する中央領域を有し、ここで、該標的核酸の部分領域は、異なるものであり、各部分領域は、少なくとも１つの他の部分領域と重複している、工程、
複数の核酸を単離する工程であって、該複数の核酸の各々は、該複数の標的核酸の各々に関して異なる部分領域の核酸配列を有する、工程、ならびに
該単離された核酸を分析する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
各プローブの前記５’領域および前記３’領域の配列が、それぞれ、他の各プローブの５’領域および３’領域の配列と重複していないか、または
各プローブの前記５’領域および前記３’領域の配列が、それぞれ、他の各プローブの５’領域および３’領域の配列と異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体の遺伝子型を検出する方法であって、該方法は：
分子反転プローブによる捕捉産物を得る工程であって、各捕捉産物は、分子反転プローブおよび標的核酸を含み、ここで、該分子反転プローブの配列は、識別タグ配列および必要に応じてプライマー配列を含み、ここで、該標的核酸は、該被験体の捕捉されるゲノム遺伝子座である、工程、
該分子反転プローブによる捕捉産物を増幅する工程を包含し、
ここで、各標的核酸について、分子反転プローブによる捕捉産物の標的核酸配列と識別タグ配列との少なくとも閾値数の独特の組み合わせの配列が決定され、そして
必要に応じて、標的核酸配列と識別タグ配列との独特の組み合わせの数に基づいて、遺伝子型に対する統計学的信頼度を決定することによって該被験体の遺伝子型が検出される、方法。
【請求項４】
前記得る工程は、分子反転プローブを用いて前記被験体のゲノムサンプルから標的核酸を捕捉する工程を包含し、該分子反転プローブの各々は、独特の識別タグ配列を含み、そして前記捕捉工程が、標的と識別タグ配列との同一の組み合わせを用いて２つ以上の分子反転プローブによる捕捉産物を得る尤度が所定の値と等しいかまたはそれ未満である条件下で行われ、必要に応じてここで、該所定の値が約０．０５である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
特定の標的核酸配列に対する前記閾値数が、遺伝子型に対する所望の統計学的信頼度に基づいて選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
標的核酸が異常な長さを有するか否かを決定するための方法であって、該方法は、被験体由来の生物学的サンプル中の標的核酸の捕捉効率を評価する工程を包含し、ここで、基準となる捕捉効率と異なる捕捉効率は、該生物学的サンプル中の異常な長さを有する標的核酸の存在を示す、方法。
【請求項７】
前記基準となる捕捉効率よりも低い捕捉効率または前記基準となる捕捉効率よりも高い捕捉効率は、前記被験体が、前記標的領域に挿入を有すること、または前記被験体が、前記標的領域に欠失を有すること、および場合によっては、前記被験体が、前記挿入についてヘテロ接合であること、または前記被験体が、前記欠失についてヘテロ接合であることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サブターゲット核酸が、分子反転プローブを用いて前記標的核酸から捕捉され、ここで必要に応じて、前記分子反転プローブが、その５’末端に第１の標的化アームを含み、その３’末端に第２の標的化アームを含み、ここで、該第１の標的化アームは、前記サブターゲット核酸の一方の末端に隣接する第１の領域と特異的にハイブリダイズすることができ、そしてここで該第２の標的化アームは、該標的核酸の同じ鎖における該サブターゲット核酸の他方の末端に隣接する第２の領域と特異的にハイブリダイズすることができ、そして必要に応じて、前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、約１０から約１００ヌクレオチド長であり、そしてここで必要に応じて、前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、同じ長さを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームのハイブリダイゼーションＴｍが、同一である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記サブターゲット核酸が、核酸リピートを含み、ここで必要に応じて、前記核酸リピートが、ジヌクレオチドリピートまたはトリヌクレオチドリピートであり、ここで必要に応じて、前記サブターゲット核酸が、核酸リピートを含む脆弱Ｘ遺伝子座の領域である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
一方または両方の標的化アームが、核酸リピートの領域のすぐ隣である、前記標的核酸における領域とハイブリダイズするか、または
一方または両方の標的化アームが、任意の核酸リピートを含まない領域によって核酸リピートの領域から分離された前記標的核酸における領域とハイブリダイズする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記分子反転プローブが、捕捉された前記サブターゲット核酸ならびに必要に応じて前記第１の標的化アームおよび／または前記第２の標的化アームを配列決定するために使用され得るプライマー結合領域をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的サンプル中の複数の異なる標的核酸が分析され、そして前記複数の標的核酸が、複数の異なる分子反転プローブを用いて分析され、ここで必要に応じて、異なる分子反転プローブの各々が、３’末端および５’末端の各々に第１の標的化アームと第２の標的化アームとの異なる対を含み、そしてここで必要に応じて、異なる分子反転プローブの各々が、同じプライマー結合配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
前記捕捉効率が、捕捉された標的核酸の量を測定することによって評価され、必要に応じて、ここで、評価することが、
（ａ）独立して捕捉された標的核酸分子の数を測定すること、または
（ｂ）捕捉された標的核酸の前記量を、捕捉された核酸の基準となる量と比較すること、
を包含し、ここで必要に応じて、前記基準となる量が、独立して捕捉された基準となる核酸の分子の数を測定することによって測定され、ここで必要に応じて、前記基準となる核酸が、欠失もしくは挿入を含むとは疑われない生物学的サンプル中の異なる遺伝子座の核酸であるか、または前記基準となる核酸が、捕捉反応に加えられる、既知サイズおよび既知量の核酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉効率が、前記基準となる捕捉効率と統計学的に有意に異なる場合、前記被験体は、前記遺伝子座の１つ以上の対立遺伝子に挿入または欠失を有する、請求項６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
しかしながら、本発明の局面は、目的の遺伝子座における１つ以上の対立遺伝子の存在が医学的判断（例えば、疾患のリスクまたは検出、疾患の予後、治療の選択、治療のモニタリングなど）と関連がある任意の医学的評価に関連して使用され得ることが認識されるだろう。本発明のさらなる局面は、腫瘍組織もしくは循環腫瘍細胞における、癌を引き起こす細胞経路内もしくは処置レジメンの有効性を予測する細胞経路内の変異の検出、または環境内もしくは被験体、例えば、ヒト被験体から得られたサンプル中の病原生物の検出および同定に関連して使用され得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
複数の遺伝子座を分析する方法であって、該方法は：
複数の標的核酸の各々をプローブセットと接触させる工程であって、
ここで、各プローブセットは、複数の異なるプローブを含み、各プローブは、該標的核酸の複数の部分領域のうちの１つの同じ鎖に隣接する核酸と相補的である、５’領域および３’領域に隣接する中央領域を有し、ここで、該標的核酸の部分領域は、異なるものであり、各部分領域は、少なくとも１つの他の部分領域と重複している、工程、
複数の核酸を単離する工程であって、該複数の核酸の各々は、該複数の標的核酸の各々に関して異なる部分領域の核酸配列を有する、工程、ならびに
該単離された核酸を分析する工程
を包含する、方法。
（項目２）
少なくとも１つの部分領域が、少なくとも１つの他の部分領域と完全に重複する、項目１に記載の方法。
（項目３）
各プローブの前記５’領域および前記３’領域の配列が、それぞれ、他の各プローブの５’領域および３’領域の配列と重複していない、項目１に記載の方法。
（項目４）
各プローブの前記５’領域および前記３’領域の配列が、それぞれ、他の各プローブの５’領域および３’領域の配列と異なる、項目１に記載の方法。
（項目５）
複数の遺伝子座を分析する方法であって、該方法は：
複数の標的核酸の各々をプローブセットと接触させる工程であって、
ここで、各プローブセットは、複数の異なるプローブを含み、各プローブは、該標的核酸の複数の部分領域のうちの１つの同じ鎖に隣接する核酸と相補的である、５’領域および３’領域に隣接する中央領域を有し、ここで、該標的核酸の部分領域は、異なるものであり、プローブの該５’領域の一部および該３’領域の一部は、それぞれ、異なるプローブの５’領域および３’領域の配列を有する、工程、
複数の核酸を単離する工程であって、該複数の核酸の各々は、該複数の標的核酸の各々に関して異なる部分領域の核酸配列を有する、工程、ならびに
該単離された核酸を分析する工程
を包含する、方法。
（項目６）
前記標的核酸が、表１から選択される、項目１または５に記載の方法。
（項目７）
前記分析工程が、前記標的核酸の多型の遺伝子タイピングを行う工程を包含する、項目１または５に記載の方法。
（項目８）
前記多型が、表２から選択される、項目７に記載の方法。
（項目９）
被験体の遺伝子タイピングを行う方法であって、該方法は：
独立して単離された少なくとも閾値数の核酸の配列を決定する工程を包含し、ここで、単離された核酸の各々の配列は、標的核酸配列および識別タグ配列を含み、
ここで、該閾値数は、標的核酸配列と識別タグ配列との独特の組み合わせの数であり、ここで、該単離された核酸は、標的核酸配列と識別タグ配列との独特の組み合わせを含む場合、独立して単離されたと同定され、ここで、該標的核酸配列は、被験体のゲノム遺伝子座の配列である、方法。
（項目１０）
前記単離された核酸が、分子反転プローブによる捕捉産物である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
被験体の遺伝子タイピングを行う方法であって、該方法は：
分子反転プローブによる捕捉産物の配列を決定する工程であって、該分子反転プローブによる捕捉産物の各々は、分子反転プローブおよび標的核酸を含み、該分子反転プローブの配列は、識別タグ配列および必要に応じてプライマー配列を含み、該標的核酸は、被験体の捕捉されたゲノム遺伝子座である、工程、ならびに
分子反転プローブによる捕捉産物の標的核酸配列と識別タグ配列との少なくとも閾値数の独特の組み合わせの配列に基づいて、該捕捉されたゲノム遺伝子座について該被験体の遺伝子タイピングを行う工程
を包含する、方法。
（項目１２）
被験体の遺伝子タイピングを行う方法であって、該方法は：
分子反転プローブによる捕捉産物を得る工程であって、各捕捉産物は、分子反転プローブおよび標的核酸を含み、ここで、該分子反転プローブの配列は、識別タグ配列および必要に応じてプライマー配列を含み、ここで、該標的核酸は、該被験体の捕捉されるゲノム遺伝子座である、工程、
該分子反転プローブによる捕捉産物を増幅する工程、ならびに
各標的核酸について、分子反転プローブによる捕捉産物の標的核酸配列と識別タグ配列との少なくとも閾値数の独特の組み合わせの配列を決定することによって該被験体の遺伝子タイピングを行う工程を包含する、方法。
（項目１３）
前記得る工程は、分子反転プローブを用いて前記被験体のゲノムサンプルから標的核酸を捕捉する工程を包含し、該分子反転プローブの各々は、独特の識別タグ配列を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記捕捉工程が、標的と識別タグ配列との同一の組み合わせを用いて２つ以上の分子反転プローブによる捕捉産物を得る尤度が所定の値と等しいかまたはそれ未満である条件下で行われ、必要に応じて該所定の値が約０．０５である、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
特定の標的核酸配列に対する前記閾値数が、遺伝子型に対する所望の統計学的信頼度に基づいて選択される、項目１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
標的核酸配列と識別タグ配列との独特の組み合わせの数に基づいて、遺伝子型に対する統計学的信頼度を決定する工程をさらに包含する、項目１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
複数の遺伝子座を分析する方法であって、該方法は：
分子反転プローブによる複数の捕捉産物を得る工程であって、該複数の捕捉産物の各々は、分子反転プローブおよび標的核酸を含み、ここで、該分子反転プローブの配列は、識別タグ配列および必要に応じてプライマー配列を含む、工程、
該分子反転プローブによる複数の捕捉産物を増幅する工程、
増幅された複数のものにおける、分子反転プローブによる捕捉産物の標的核酸配列と識別タグ配列との組み合わせの出現数を測定する工程、ならびに
標的核酸配列と識別タグ配列との特定の組み合わせの出現数が、所定の値を超える場合、該特定の組み合わせを含む該分子反転プローブの増幅におけるバイアスを検出する工程
を包含する、方法。
（項目１８）
前記複数のものにおける標的配列の遺伝子タイピングを行う工程をさらに包含し、ここで、該遺伝子タイピング工程は、バイアスが検出された場合に該バイアスを補正する工程を包含する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記標的核酸配列が、表１から選択される遺伝子の配列である、項目９〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
標的核酸が異常な長さを有するか否かを決定するための方法であって、該方法は、被験体由来の生物学的サンプル中の標的核酸の捕捉効率を評価する工程を包含し、ここで、基準となる捕捉効率と異なる捕捉効率は、該生物学的サンプル中の異常な長さを有する標的核酸の存在を示す、方法。
（項目２１）
欠失または挿入を有すると疑われる標的領域の捕捉効率を測定する工程、ならびに該捕捉効率を、正常な捕捉効率を示す参照と比較する工程を包含する、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記捕捉効率が、前記基準となる捕捉効率よりも低い、項目２０〜２１に記載の方法。
（項目２３）
前記被験体が、前記標的領域に挿入を有すると同定される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記捕捉効率が、前記基準となる捕捉効率よりも高い、項目２０〜２１に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体が、前記標的領域に欠失を有すると同定される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記被験体が、前記挿入についてヘテロ接合であると同定される、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記被験体が、前記欠失についてヘテロ接合であると同定される、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
サブターゲット核酸が、分子反転プローブを用いて前記標的核酸から捕捉される、前述のいずれかの項目に記載の方法。
（項目２９）
前記分子反転プローブが、その５’末端に第１の標的化アームを含み、その３’末端に第２の標的化アームを含み、ここで、該第１の標的化アームは、前記サブターゲット核酸の一方の末端に隣接する第１の領域と特異的にハイブリダイズすることができ、該第２の標的化アームは、該標的核酸の同じ鎖における該サブターゲット核酸の他方の末端に隣接する第２の領域と特異的にハイブリダイズすることができる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、約１０から約１００ヌクレオチド長である、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、約１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０または４０〜５０ヌクレオチド長である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、約２０ヌクレオチド長である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームが、同じ長さを有する、項目２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームのハイブリダイゼーションＴｍが、同様のものである、項目２９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームのハイブリダイゼーションＴｍが、互いの２〜５℃以内である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第１の標的化アームおよび前記第２の標的化アームのハイブリダイゼーションＴｍが、同一である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記サブターゲット核酸が、核酸リピートを含む、項目２８〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記核酸リピートが、ジヌクレオチドリピートまたはトリヌクレオチドリピートである、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記サブターゲット核酸が、核酸リピートの異常な増加または減少の非存在下において、１０〜１００コピーの前記核酸リピートを含む、項目３７に記載の方法。
（項目４０）
前記サブターゲット核酸が、核酸リピートを含む脆弱Ｘ遺伝子座の領域である、項目３７に記載の方法。
（項目４１）
一方または両方の標的化アームが、核酸リピートの領域のすぐ隣である、前記標的核酸における領域とハイブリダイズする、項目２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
一方または両方の標的化アームが、任意の核酸リピートを含まない領域によって核酸リピートの領域から分離された前記標的核酸における領域とハイブリダイズする、項目２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記分子反転プローブが、捕捉された前記サブターゲット核酸ならびに必要に応じて前記第１の標的化アームおよび／または前記第２の標的化アームを配列決定するために使用され得るプライマー結合領域をさらに含む、項目２９〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目４４）
生物学的サンプル中の複数の異なる標的核酸が分析される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
（項目４５）
前記複数の標的核酸が、複数の異なる分子反転プローブを用いて分析される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
異なる分子反転プローブの各々が、３’および５’末端の各々に第１の標的化アームと第２の標的化アームとの異なる対を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
異なる分子反転プローブの各々が、同じプライマー結合配列を含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記生物学的サンプルが、血液サンプルである、前述のいずれかの項目に記載の方法。
（項目４９）
前記生物学的サンプルが、組織サンプルである、前述のいずれかの項目に記載の方法。
（項目５０）
前記捕捉効率が、捕捉された標的核酸の量を測定することによって評価される、前述のいずれかの項目に記載の方法。
（項目５１）
捕捉された標的核酸の前記量が、独立して捕捉された標的核酸分子の数を測定することによって測定される、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
捕捉された標的核酸の前記量が、捕捉された核酸の基準となる量と比較される、項目５０〜５１に記載の方法。
（項目５３）
前記基準となる量が、独立して捕捉された基準となる核酸の分子の数を測定することによって測定される、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記基準となる核酸が、欠失または挿入を含むとは疑われない生物学的サンプル中の異なる遺伝子座の核酸である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記基準となる核酸が、捕捉反応に加えられる、既知サイズおよび既知量の核酸である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記捕捉効率が、前記基準となる捕捉効率と統計学的に有意に異なる場合、被験体は、前記遺伝子座の１つ以上の対立遺伝子に挿入または欠失を有すると同定される、前述のいずれかの項目に記載の方法。
（項目５７）
標的核酸の長さを推定するための方法であって、該方法は：
（ｉ）該標的核酸に対する検出プローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で複数の該検出プローブと該標的核酸を接触させる工程であって、
ここで、各検出プローブは、該標的核酸の第１の領域にハイブリダイズする第１のアームおよび該標的核酸の第２の領域にハイブリダイズする第２のアームを含むポリヌクレオチドであり、
ここで、該第１の領域および該第２の領域は、該標的核酸の共通の鎖に存在し、
ここで、該第１の領域の５’末端と該第２の領域の３’末端との間のヌクレオチド配列は、サブターゲット核酸のヌクレオチド配列である、工程；ならびに
（ｉｉ）複数の該検出プローブとハイブリダイズした複数のサブターゲット核酸を捕捉する工程；ならびに
（ｉｉｉ）該複数のサブターゲット核酸におけるあるサブターゲット核酸の出現頻度を測定する工程であって、ここで、該複数のサブターゲット核酸における該サブターゲット核酸の出現頻度は、該サブターゲット核酸の長さを示す、工程
を包含する、方法。
（項目５８）
核酸検出アッセイの感度を高める方法であって、該方法は：
生物学的サンプルに対して第１の調製方法を用いて標的核酸の第１の調製物を得る工程、該生物学的サンプルに対して第２の調製方法を用いて標的核酸の第２の調製物を得る工程、
第１の核酸調製物と第２の核酸調製物との両方において得られた配列をアッセイする工程、
第１の核酸調製物と第２の核酸調製物との両方からの配列情報を用いることにより、該生物学的サンプル中の該標的核酸の遺伝子型を決定する工程
を包含し、ここで、該第１の調製方法および該第２の調製方法は、異なる体系的な配列バイアスを有する、方法。
（項目５９）
前記第１の核酸調製物および前記第２の核酸調製物が、配列アッセイを行う前に混合される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
別個の配列アッセイが、前記第１の核酸調製物および前記第２の核酸調製物において行われ、両方のアッセイからの配列情報が、組み合わされることにより、前記生物学的サンプル中の前記標的核酸の遺伝子型が決定される、項目５８に記載の方法。
（項目６１）
前記第１の調製方法が、ＰＣＲベース、ハイブリダイゼーションベースまたは環状プローブベースの調製方法である、項目５８に記載の方法。
（項目６２）
前記第２の調製方法は、ＰＣＲベース、ハイブリダイゼーションベースまたは環状プローブベースの調製方法であるが、但し、該第２の調製方法は、前記第１の方法と異なる、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
生物学的サンプル中の核酸を代表する核酸調製物を得る方法であって、該方法は、
生物学的サンプルに対して第１の調製方法を用いて第１の標的核酸調製物を得る工程、
該生物学的サンプルに対して第２の調製方法を用いて第２の核酸調製物を得る工程、ならびに
該第１の核酸調製物および該第２の核酸調製物を混合することにより、該生物学的サンプル中の核酸を代表する混合された調製物を得る工程
を包含する、方法。
（項目６４）
第１の調製方法および第２の調製方法と異なる第３の調製方法を用いて第３の核酸調製を行う工程をさらに包含し、ここで、該第１の調製方法、該第２の調製方法および該第３の調製方法のすべてが、異なる体系的な配列バイアスを有する、項目１または６に記載の方法。
（項目６５）
前記異なる調製方法が、前記生物学的サンプル中の複数の異なる遺伝子座に対して用いられることにより、多重核酸分析の感度が高められる、前述の項目のいずれかの項目に記載の方法。
（項目６６）
生物学的サンプル中の核酸の遺伝子タイピングを行う方法であって、該方法は：
生物学的サンプルに対してある調製方法を用いて核酸調製物を得る工程、
該核酸調製物の標的核酸をシークエンシングする工程、ならびに
該生物学的サンプルに対して分子反転プローブによる捕捉反応を行う工程であって、ここで、該生物学的サンプル中の該標的核酸の分子反転プローブによる捕捉は、該標的核酸における多型の存在を示す、工程、
該シークエンシングおよび該捕捉反応の結果に基づいて該標的核酸を遺伝子タイピングする工程
を包含する、方法。
（項目６７）
前記標的核酸が、表１から選択される遺伝子の配列を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。