【手続補正書】
【提出日】平成25年6月7日(2013.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一酸化炭素又は水素由来の還元当量を生成し、それにより還元的TCA回路を介してCO2を固定するのに十分な量で発現する酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、非天然微生物であって、該酵素が、一酸化炭素脱水素酵素、ヒドロゲナーゼ、及びNAD（P）H：フェレドキシン酸化還元酵素から選択され、かつ該微生物が2-ブタノール経路をさらに含む、前記非天然微生物。
【請求項２】
前記微生物が、スクシニル-CoAトランスフェラーゼをさらに含む、請求項１記載の非天然微生物。
【請求項３】
前記微生物が、フェレドキシンをさらに含む、請求項１記載の非天然微生物。
【請求項４】
MEKを産生するのに十分な量で発現するMEK経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、MEK経路を有する非天然微生物であって、該MEK経路は、アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、3-オキソブタノールデヒドラターゼ、MEK酸化還元酵素、3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKPアミノトランスフェラーゼ、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、AKPデアミナーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、AKPデカルボキシラーゼ、グルタマート脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、及びAKP酸化還元酵素（アミノ化）からなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項５】
MEKを産生する条件下、かつそれに十分な時間、MEKを産生するのに十分な量で発現するMEK経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、MEK経路を有する非天然微生物を培養することを含む、MEKの産生方法であって、該MEK経路が、アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、3-オキソブタノールデヒドラターゼ、MEK酸化還元酵素、3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKPアミノトランスフェラーゼ、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、AKPデアミナーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、AKPデカルボキシラーゼ、グルタマート脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、及びAKP酸化還元酵素（アミノ化）からなる群から選択される酵素を含む、前記方法。
【請求項６】
前記MEK経路が、下記からなる群から選択される1セットのMEK経路酵素を含む、請求項４記載の非天然微生物、又は、請求項５記載の方法：
（a）（1）アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、（2）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、並びに（3）MEK酸化還元酵素；
（b）（1）アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、（3）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、並びに（4）MEK酸化還元酵素；
（c）（1）アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、（2）3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ及び／又は3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、（3）4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、並びに（4）MEK酸化還元酵素；
（d）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPアミノトランスフェラーゼ及び／又はAKP酸化還元酵素（アミノ化）、（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、（5）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、（6）MEK酸化還元酵素、並びに（7）グルタマート脱水素酵素；
（e）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPデアミナーゼ、（3）アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、（4）MEK酸化還元酵素、並びに（5）グルタマート脱水素酵素；及び
（f）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPデカルボキシラーゼ、（3）4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、（4）MEK酸化還元酵素、並びに（5）グルタマート脱水素酵素。
【請求項７】
前記微生物が、MEK経路酵素を各々コードする2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、又は7つの外来性核酸を含む、請求項４又は６のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項５又は６のいずれか1項記載の方法。
【請求項８】
（a）前記アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（b）前記アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（c）前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（d）前記3-オキソブタノールデヒドラターゼが、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、aroD、aroQ、及びmhpDからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（e）前記MEK酸化還元酵素が、NtRed1、YML131W、AtDBR1、P2、PulR、PtPPDBR、ALH1、enr、fadH、clcE、tfdFII、及びmacAからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（f）前記3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼが、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta‐1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（g）前記4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（h）前記2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼが、ortA、ortB、Amet_2368、Amet_2369、Teth512_1478、Teth514_1479、TTE1235、及びthrCからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（i）前記AKPアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、Got2、avtA、serC、及びdatからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（j）前記2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、及びkdcAからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（k）前記AKPデアミナーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（l）前記アセチルアクリラートデカルボキシラーゼが、CAD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、pad1、pdc、pofK、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（m）前記AKPデカルボキシラーゼが、lysA、Odc1、及びpanDからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（n）前記グルタマート脱水素酵素が、GDH2、rocG、gdh1、gdh2、及びGDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（o）前記3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、ldh、nadX、及びlysDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；又は
（p）前記AKP酸化還元酵素（アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、ldh、nadX、及びlysDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、
請求項４又は６のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項５又は６のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
2-ブタノールを産生するのに十分な量で発現する2-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む、2-ブタノール経路を有する非天然微生物であって、該2-ブタノール経路が、アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、3-オキソブタノールデヒドラターゼ、MEK酸化還元酵素、MEK還元酵素、3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKPアミノトランスフェラーゼ、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、AKPデアミナーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、AKPデカルボキシラーゼ、グルタマート脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、及びAKP酸化還元酵素（アミノ化）からなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項１０】
2-ブタノールを産生する条件下、かつそれに十分な時間、2-ブタノールを産生するのに十分な量で発現する2-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含む2-ブタノール経路を有する非天然微生物を培養することを含む、2-ブタノールの産生方法であって、該2-ブタノール経路が、アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、3-オキソブタノールデヒドラターゼ、MEK酸化還元酵素、MEK還元酵素、3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼ、4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼ、AKPアミノトランスフェラーゼ、2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、AKPデアミナーゼ、アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、AKPデカルボキシラーゼ、グルタマート脱水素酵素、3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、及びAKP酸化還元酵素（アミノ化）からなる群から選択される酵素を含む、前記方法。
【請求項１１】
前記2-ブタノール経路が、下記からなる群から選択される1セットの2-ブタノール経路酵素を含む、請求項９記載の非天然微生物、又は、請求項１０記載の方法：
（a）（1）アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）、（2）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、（3）MEK酸化還元酵素、並びに（4）MEK還元酵素；
（b）（1）アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、（2）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、（3）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、（4）MEK酸化還元酵素、並びに（5）MEK還元酵素；
（c）（1）アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素、（2）3-オキソブチルアルデヒドトランスアミナーゼ及び／又は3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）、（3）4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、（4）MEK酸化還元酵素、並びに（5）MEK還元酵素；
（d）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPアミノトランスフェラーゼ及び／又はAKP酸化還元酵素（アミノ化）、（3）2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼ、（4）3-オキソブチルアルデヒド還元酵素、（5）3-オキソブタノールデヒドラターゼ、（6）MEK酸化還元酵素、（7）MEK還元酵素、並びに（8）グルタマート脱水素酵素；
（e）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPデアミナーゼ、（3）アセチルアクリラートデカルボキシラーゼ、（4）MEK酸化還元酵素、（5）MEK還元酵素、並びに（6）グルタマート脱水素酵素；及び
（f）（1）AKPチオラーゼ、（2）AKPデカルボキシラーゼ、（3）4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼ、（4）MEK酸化還元酵素、（5）MEK還元酵素、並びに（6）グルタマート脱水素酵素。
【請求項１２】
前記微生物が、2-ブタノール経路酵素を各々コードする2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、又は８つの外来性核酸を含む、請求項９又は１１のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項１０又は１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
（a）前記アセトアセチル-CoA脱水素酵素（二機能性）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（b）前記アセトアセチル-CoAアルデヒド脱水素酵素が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_709、mcr、asd‐2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（c）前記3-オキソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（d）前記3-オキソブタノールデヒドラターゼが、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、aroD、aroQ、及びmhpDからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（e）前記MEK酸化還元酵素が、NtRed1、YML131W、AtDBR1、P2、PulR、PtPPDBR、ALH1、enr、fadH、clcE、tfdFII、及びmacAからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（f）前記MEK還元酵素が、sadh、adhA、及びAdhからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（g）前記3-オキソブチルアルデヒドアミノトランスフェラーゼが、SkyPYD4、SkUGA1、UGA1、Abat、Gta‐1、gabT、及びpuuEからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（h）前記4-アミノブタン-2-オンデアミナーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（i）前記2-アミノ-4-ケトペンタノアート（AKP）チオラーゼが、ortA、ortB、Amet_2368、Amet_2369、Teth512_1478、Teth514_1479、TTE1235、及びthrCからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（j）前記AKPアミノトランスフェラーゼが、aspC、AAT2、ASP5、Got2、avtA、serC、及びdatからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（k）前記2,4-ジオキソペンタノアートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB‐1、kgd、及びkdcAからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（l）前記AKPデアミナーゼが、aspA及びansBからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（m）前記アセチルアクリラートデカルボキシラーゼが、CAD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、pad1、pdc、pofK、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされるか；
（n）前記AKPデカルボキシラーゼが、lysA、Odc1、及びpanDからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（o）前記グルタマート脱水素酵素が、GDH2、rocG、gdh1、gdh2、及びGDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；
（p）前記3-オキソブチルアルデヒド酸化還元酵素（アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、ldh、nadX、及びlysDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされるか；又は
（q）前記AKP酸化還元酵素（アミノ化）が、gdhA、gdh、gdhA1、ldh、nadX、及びlysDHからなる群から選択される遺伝子によってコードされる、
請求項９又は１１のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項１０又は１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である、請求項３、６、９、又は１１のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項５、６、１０、又は１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記非天然微生物が実質的に嫌気性培地中にある、請求項３、６、９、又は１１のいずれか1項記載の非天然微生物、又は、請求項５、６、１０、又は１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
2-ブタノールを産生する条件下、かつそれに十分な時間、請求項１〜３のいずれか1項記載の微生物を培養することを含む、2-ブタノールの産生方法。
【請求項１７】
前記MEK又は2-ブタノールを、前記培養物中の他の成分から分離する工程をさらに含む、請求項１０〜１６のいずれか1項記載の方法。
【請求項１８】
前記分離工程が、抽出、連続液体‐液体抽出、浸透気化法、膜濾過、膜分離、逆浸透、電気透析、蒸留、結晶化、遠心分離、抽出濾過、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、又は限外濾過を含む、請求項１７記載の方法。