【手続補正書】
【提出日】平成24年11月21日(2012.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子を含み、前記外来遺伝子がプロモーターに動作可能に連結している、油産生微生物の細胞。
【請求項２】
前記外来遺伝子が、ショ糖インベルターゼ、脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡ／アルデヒド還元酵素、脂肪酸アシル−ＣｏＡ還元酵素、脂肪族アルデヒド還元酵素、脂肪族アルデヒド脱炭酸酵素、アシルキャリアータンパク質、抗生物質への耐性を付与するタンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記外来遺伝子が、鎖長がＣ８、Ｃ１０、Ｃ１２又はＣ１４の１つ以上の酸アシル−ＡＣＰ基質に対して加水分解活性を有する脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記脂肪酸アシル−ＡＣＰチオエステラーゼが、配列番号５９、６１、６３、１３８〜１４０からなる群から選択される１つ以上の配列に対するアミノ酸同一性が少なくとも５０％である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記細胞の脂質プロフィールが、Ｃ８が少なくとも０．３％、Ｃ１０が少なくとも２％、Ｃ１２が少なくとも２％、Ｃ１４が少なくとも４％、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも３０％からなる群から選択される、請求項３に記載の細胞。
【請求項６】
前記細胞の脂質プロフィールが、Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％である、請求項１、２、３又は４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、ショ糖インベルターゼをコードする外来遺伝子をさらに含む、請求項２に記載の細胞。
【請求項８】
前記外来遺伝子が、脂肪酸デサチュラーゼをコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記脂肪酸デサチュラーゼが、ω−６脂肪酸デサチュラーゼ、ω−３脂肪酸デサチュラーゼ、ω−６−オレイン酸デサチュラーゼ、およびステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
ノックアウトまたは下方調節された外来デサチュラーゼ遺伝子をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
油産生微生物が、微細藻類である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記微細藻類は、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の微細藻類である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記外来遺伝子が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内での発現のためにコドンが最適化されたコード配列を含み、前記コード配列は、前記コドンが最適化された配列が、前記外来遺伝子をコードする天然の配列よりもＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でより効率的に翻訳されるように、前記コード配列のコドンの少なくとも６０％に対し、表１の最も好ましいコドンまたは２番目に好ましいコドンを含む、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ内での発現のためにコドンが最適化された第２のコード配列を含む、第２の外来遺伝子をさらに含み、前記第２のコード配列は、前記コドンが最適化された配列が、前記第２の外来遺伝子をコードする天然の配列よりもＰｒｏｔｏｔｈｅｃａ内でより効率的に翻訳されるように、前記第２のコード配列のコドンの少なくとも６０％に対し、表１の最も好ましいコドンまたは２番目に好ましいコドンを含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
各コード配列が、各コード配列のコドンの少なくとも８０％に対し、表１の最も好ましいコドンを含む、請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記プロモーターのヌクレオチド配列が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種に内在する、請求項１に記載の細胞。
【請求項１７】
前記プロモーターのヌクレオチド配列が、配列番号９１〜１０２のヌクレオチドの５０ヌクレオチド以上のセグメントを含む、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
細胞外の環境が、少なくとも５ｍＭの窒素を含む状態から、０ｍＭの窒素を含む状態に変わると、前記プロモーターが、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の細胞において、少なくとも３倍上方調節される、請求項１、１６、又は１７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記外来遺伝子が、プラスチド標的配列をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記プラスチド標的配列のヌクレオチド配列が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ属の種に内在する、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
前記プラスチド標的配列が、配列番号１２７〜１３３のアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも２５％である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞は、２３Ｓ  ｒＲＮＡを有しており、この２３Ｓ  ｒＲＮＡが、配列番号１１〜１９のヌクレオチド配列に対するヌクレオチド同一性が少なくとも７５％の配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｍｏｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｋｒｕｇａｎｉ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｓｔａｇｎｏｒａ、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ  ｚｏｐｆｉｉからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２４】
ａ．Ｃ８〜Ｃ１４が少なくとも４％、および
ｂ．以下の１つ以上の属性：
ｉ．総カロチノイドが約０．４マイクログラム／ｍｌ未満；
ｉｉ．リコピンが約０．００１マイクログラム／ｍｌ未満；
ｉｉｉ．βカロチンが約０．０２マイクログラム／ｍｌ未満；
ｉｖ．油脂１ｋｇあたり、クロロフィルが約０．０２ミリグラム未満；
ｖ．油脂１００ｇあたり、γ−トコフェロールが約０．４０〜０．６０ミリグラム；
ｖｉ．油脂１００ｇあたり、カンペステロールが約３〜９ｍｇ；
ｖｉｉ．油脂１ｇあたり、総トコトリエノール量が約０．５ミリグラム未満
の脂質プロフィールを有する、トリグリセリド油脂組成物。
【請求項２５】
請求項２４の油を、大豆油、菜種油、キャノーラ油、パーム油、パーム核油、ココナツ油、トウモロコシ油、野菜くず油、ナンキンハゼ油、オリーブ油、ヒマワリ油、綿実油、鶏脂、牛脂、豚脂、微細藻類油、大型藻類油、クフェア油、亜麻油、ピーナッツ油、上質のホワイトグリース、ラード、カメリナ・サティバ油、カラシの種子油、カシューナッツ油、オーツ麦油、ハウチワマメ油、ケナフ油、キンセンカ油、麻油、コーヒー油、亜麻仁（亜麻）油、ヘーゼルナッツ油、ユーホルビア油、カボチャの種油、コリアンダー油、ツバキ油、ゴマ油、ベニバナ油、イネ油、アブラギリ油、ココア油、コプラ油、ケシ油、トウゴマの実油、ピーカン油、ホホバ油、ジャトロファ油、マカダミア油、ブラジルナッツ油、アボカド油、石油、または上述のいずれかの油の留分からなる群から選択される油とブレンドする、ブレンドした油。
【請求項２６】
トランスエステル化、水素化、ハイドロクラッキング、脱酸素、異性化、インターエステル化、ヒドロキシル化、加水分解、、熱水処理、エポキシ化、アミノ化、オゾン分解、インターエステル化、方向性を持ったインターエステル化、および鹸化からなる群から選択される１つ以上の化学反応を行う工程を含む、請求項２４又は請求項２５に記載の油を処理することによって、燃料を製造する方法。
【請求項２７】
再生可能なディーゼル又はバイオディーゼルである、請求項２６に記載の方法で作られる燃料。
【請求項２８】
前記燃料は、ＡＳＴＭ  Ｄ８６  Ｔ１０−Ｔ９０の蒸留範囲が少なくとも２５℃であり、ＡＳＴＭ  Ｄ６７５１  Ａ１の冷状態浸漬時間が１２０秒未満である、請求項２７に記載の燃料。