【手続補正書】
【提出日】平成25年4月26日(2013.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプロパノール経路を有する非天然微生物であって、イソプロパノールを産生するのに十分な量で発現するイソプロパノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該イソプロパノール経路がアセトアセタートデカルボキシラーゼ(1G)、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトナーゼ(1B)、3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素(1C)、アセトアセチル-CoAシンテターゼ(1D)、アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ(1E)、アセトアセチル-CoAヒドロラーゼ(1F)、及びアセトン還元酵素(1H)からなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項２】
請求項１に記載の非天然微生物であって、
(i)  前記少なくとも1つの外来性核酸が、異種性核酸である；
(ii)  前記微生物が、実質的に嫌気性の培地中にある；又は
(iii)  前記微生物が、細菌、酵母、真菌の種である、前記非天然微生物。
【請求項３】
1セットのイソブタノール経路酵素を含み、該イソブタノール経路酵素のセットが下記からなる群から選択される、請求項1又は２に記載の非天然微生物：
(a)  (i)アセトアセタートデカルボキシラーゼ(1G)、及び(ii)アセトン還元酵素(1H)；
(b)  (i)アセトアセタートデカルボキシラーゼ(1G)、(ii)アセトン還元酵素(1H)、及び(iii)アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ(1E)、アセトアセチル-CoAシンテターゼ(1D)、又はアセトアセチル-CoAヒドロラーゼ(1F)；並びに
(c)  (i)アセトアセタートデカルボキシラーゼ(1G)、(ii)アセトン還元酵素(1H)、(iii) アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼ(1E)、アセトアセチル-CoAシンテターゼ(1D)、又はアセトアセチル-CoAヒドロラーゼ(1F)；及び(iv) 4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトナーゼ(1B)、又は3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素(1C)。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
A)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
B)  前記クロトナーゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
C)  前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbdl、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
D)  前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、AF1211、scs、及びPAE3250からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
E)  前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、cat1、cat2、cat3、gctA、gctB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
F)  前記アセトアセチル-CoAヒドロラーゼが、acot12、hibch、BC_2292、tesB、acot8、tesA、ybgC、paaI、及びybdBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
G)  前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、pdc、pdc1、mdlC、dpgB、ilvB-1、kgd、kdcA、lysA、panD、dmpH、dmpE、xylII、xylIII、Reut_B5691、Reut_B5692、CAD、pad1、pofK、（pad）、padC、及びpadからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
H)  前記アセトアセタートデカルボキシラーゼが、Adc、cbei_3835、CLL_A2135、RBAM_030030からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は、
I)  前記アセトン還元酵素が、thrA、akthr2、hom6、hom1、hom2、fadB、fadJ、Hbd2、Hbd1、hbd、HSD17B10、phbB、phaB、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、adh、adhA、adh-A、mdh、ldhA、ldh、及びbdhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
AA)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、
BB)  前記クロトナーゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
CC)  前記3-ヒドロキシブチリル-CoA脱水素酵素が、hbd、Hbd2、Hbdl、Msed_1423、Msed_0399、Msed_0389、Msed_1993、fadB、及びfadJからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
DD)  前記アセトアセチル-CoAシンテターゼが、sucC、sucD、AACS、及びAF1211からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
EE)  前記アセチル-CoA：アセトアセタート-CoAトランスフェラーゼが、atoA、atoD、actA、cgO592、ctfA、ctfB、HPAGl_0676、HPAGl_0677、ScoA、及びScoBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
FF)  前記アセトアセチル-CoAヒドロラーゼが、acotl2、hibch及びtesAからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は
GG)  前記アセトン還元酵素が、adh、adhA、及びadh-Aからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項６】
イソプロパノールを産生する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物を、イソプロパノールを産生する条件下で十分な時間培養することを含む、前記方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物により産生されるイソプロパノールを含む培地。
【請求項８】
請求項６に記載の方法により任意に産生される、生合成されたイソプロパノール。
【請求項９】
請求項８に記載の生合成されたイソプロパノールを含む、組成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の生合成されたイソプロパノールを含む、または該イソプロパノールから製造された、化学化合物、ポリマー又はその他の製品。
【請求項１１】
化学化合物、ポリマー又はその他の製品製造における請求項８に記載の生合成された1,3-BDOの使用であって、該製造が任意に該イソプロパノールの化学的転換を含む、前記使用。
【請求項１２】
前記化学化合物、ポリマー又はその他の製品が溶媒、消毒用アルコール、塗料、ラッカー、薄め液、インク、接着剤、汎用洗剤、消毒薬、化粧品、洗面用品、除氷液、及び医薬品、モーターオイル、イソプロピルアミン、イソプロピルエーテル、又はイソプロピルエステルである、請求項１０に記載の化学化合物、ポリマー又はその他の製品、又は請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
n-ブタノール経路を有する非天然微生物であって、n-ブタノールを産生するのに十分な量で発現するn-ブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該n-ブタノール経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1J)、ブチルアルデヒド還元酵素(1K)、及びブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1L)からなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の非天然微生物であって、
(i)  前記少なくとも1つの外来性核酸が、異種性核酸である；
(ii)  前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある；又は
(iii)     前記微生物が、細菌、酵母、真菌の種である；前記非天然微生物。
【請求項１５】
1セットのn-ブタノール経路酵素を含み、該セットのn-ブタノール経路酵素が、下記からなる群から選択される、請求項１３〜１４のいずれか一項に記載の非天然微生物：
(a)  (i)クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、(ii)ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1J)及び(iii) ブチルアルデヒド還元酵素(1K)；
(b)  (i)クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、(ii)ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1J)、(iii)ブチルアルデヒド還元酵素(1K)及び(iv)4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)；
(c)  (i)クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、(ii)ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1L)、及び(iii)ブチルアルデヒド還元酵素(1K)；並びに
(d)  (i)クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、(ii)ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1L)、(iii)ブチルアルデヒド還元酵素(1K)、及び(iv)4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
A)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fuml、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
B)  前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
C)  前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acrl、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd-2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
D)  前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は
E)  前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、adhE2、mcr、Rcas_2929、NAPl_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
AA)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、
BB)  前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
CC)  前記ブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr、及びAldからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
DD)  前記ブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は
EE)  前記ブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項１８】
n-ブタノールを産生する方法であって、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の非天然微生物を、n-ブタノールを産生する条件下で十分な時間培養することを含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の非天然微生物により産生されるn-ブタノールを含む培地。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法により任意に産生される、生合成されたn-ブタノール。
【請求項２１】
請求項２０に記載の生合成されたn-ブタノールを含む、組成物。
【請求項２２】
請求項２０に記載の生合成されたn-ブタノールを含む、または該n-ブタノールから製造された、化学化合物、ポリマー又はその他の製品。
【請求項２３】
化学化合物、ポリマー又はその他の製品製造における請求項２０に記載の生合成されたn-ブタノールの使用であって、該製造が任意に該n-ブタノールの化学的転換を含む、前記使用。
【請求項２４】
前記化学化合物、ポリマー又はその他の製品がブチルアクリラート、ブチルメタクリラート、乳化されたポリマー、溶液のポリマー、ラテックスコーティング、エナメル、ラッカー、酢酸ブチル、グリコールブチルエーテル、溶媒又はバイオ燃料である、請求項２２に記載の化学化合物、ポリマー又はその他の製品、又は請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
イソブタノール経路を有する非天然微生物であって、イソブタノールを産生するのに十分な量で発現するイソブタノール経路酵素をコードする少なくとも1つの外来性核酸を含み、該イソブタノール経路が、4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、イソブチリル-CoAムターゼ(1M)、4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ(1Q)、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ(1R)、メタクリリル-CoA-還元酵素(1S)、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1N)、イソブチルアルデヒド還元酵素(1O)、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1P)からなる群から選択される酵素を含む、前記非天然微生物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の非天然微生物であって、
(i)  前記少なくとも1つの外来性核酸が異種性核酸である；
(ii)  前記非天然微生物が、実質的に嫌気性培地中にある；又は
(iii)  前記非天然微生物が、細菌、酵母、真菌の種である；前記非天然微生物。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の非天然微生物であって、1セットのイソブタノール経路酵素を含み、該セットのイソブタノール経路酵素が、下記からなる群から選択される：
(a)  4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、イソブチリル-CoAムターゼ(1M)、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1N)、及びイソブチルアルデヒド還元酵素(1O)；
(b)   4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼ(1A)、クロトノイル-CoA還元酵素(1I)、イソブチリル-CoAムターゼ(1M)、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1P)；
(c)   4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ(1Q)、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ(1R)、メタクリリル-CoA還元酵素(1S)、イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）(1N)、及びイソブチルアルデヒド還元酵素(1O)；並びに
(d)   4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼ(1Q)、3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼ(1R)、メタクリリル-CoA-還元酵素(1S)、及びイソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）(1P)、前記非天然微生物。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
A)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_l220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
B)  前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
C)  前記イソブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
D)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icm、icmB、icmA、Mpe_B0538、Mpe_B0541、scpA、mutA、mutB、mcmA、mcmB、sbm、SARI_04585、YfreA_01000861、argK、PPA0597、及びmeaBからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
E)  前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、fumA、fumB、fumC、fumH、fum1、MmcB、MmcC、hmd、BACCAP_02294、ANACOL_02527、NtherDRAFT_2368、dmdA、dmdB、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF、paaG、abfD、及びMsed_1220からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
F)  前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter、TDE0597、IBD、RPA3448、FadH、及びenrからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
G)  前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、acr1、sucD、bphG、adhE、Msed_0709、mcr、asd-2、Saci_2370、Ald、及びeutEからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
H)  前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、adhA、4hbd、adhI、P84067、mmsb、dhat、及び3hidhからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は
I)  前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE、ahdE2、mcr、Rcas_2929、NAP1_02720、MGP2080_00535、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項２９】
請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の非天然微生物であって、
AA)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドラターゼが、abfDによってコードされる、
BB)  前記クロトノイル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
CC)  前記イソブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
DD)  前記4-ヒドロキシブチリル-CoAムターゼが、icmB、icmA、Mpe_B0538及びMpe_B0541からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
EE)  前記3-ヒドロキシイソブチリル-CoAデヒドラターゼが、crt、crt1、paaA、paaB、phaA、phaB、maoC、paaF及びpaaGからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
FF)  前記メタクリリル-CoA還元酵素が、bcd、etfA、etfB、Ter及びTDE0597からなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
GG)  前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルデヒド形成）が、sucD、bphG、Msed_0709、mcr及びAldから選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、
HH)  前記イソブチルアルデヒド還元酵素が、alrA、ADH2、yqhD、bdhI、bdhII、4hbd、adhI、P84067及びmmsbからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、又は
II)  前記イソブチリル-CoA還元酵素（アルコール形成）が、adhE2、mcr、及びFARからなる群から選択される1つ以上の遺伝子によってコードされる、前記非天然微生物。
【請求項３０】
イソブタノールを産生する方法であって、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の非天然微生物を、イソブタノールを産生する条件下で十分な時間培養することを含む、前記方法。
【請求項３１】
請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の非天然微生物により産生されるイソブタノールを含む培地。
【請求項３２】
請求項３０に記載の方法により任意に産生される、生合成されたイソブタノール。
【請求項３３】
請求項３２に記載の生合成されたイソブタノールを含む、組成物。
【請求項３４】
請求項３２に記載の生合成されたイソブタノールを含む、または該イソブタノールから製造された、化学化合物、ポリマー又はその他の製品。
【請求項３５】
化学化合物、ポリマー又はその他の製品製造における請求項３２に記載の生合成されたイソブタノールの使用であって、該製造が任意に該イソブタノールの化学的転換を含む、前記使用。
【請求項３６】
前記化学化合物、ポリマー又はその他の製品がバイオ燃料、酢酸イソブチル、溶媒、ラッカー、コーティング、調味料、イソブチルエステル、プラスチック、ゴム、塗料、ワニス除去剤、又はインクである、請求項３４に記載の化学化合物、ポリマー又はその他の製品、又は請求項３５に記載の使用。