【手続補正書】
【提出日】平成25年4月18日(2013.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
P-ループに天然に存在しているか、またはP-ループに導入されているアミノ酸で
標識されたキナーゼであって、前記の標識化は、前記のアミノ酸の遊離チオール
またはアミノ基で行われ、かつ、前記の標識が、
(a)その環境における極性変化に感受性のある、チオールまたはアミノ反応性フ
ルオロフォアであるか；または
(b)チオール反応性スピン標識、同位体または濃縮同位体チオールまたはアミノ
反応性標識であり、
前記のフルオロフォア、スピン標識、同位体または濃縮同位体標識は、触媒活性
を阻害せず、キナーゼの安定性を妨げず、標識されているアミノ酸が、システイ
ン、リシン、アルギニンまたはヒスチジンである前記キナーゼ。
【請求項２】
MEKキナーゼ、CSK、オーロラキナーゼ、GSK-3β、cSrc、EGFR、Abl、DDR1、AKT、LCK、CDK、p38αまたは別のMAPKである請求項１に記載のキナーゼ。
【請求項３】
P-ループの外側に存在する、溶媒にさらされているシステインの1つ以上が欠失しているか置換されている請求項１または２に記載のキナーゼ。
【請求項４】
p38αであり、かつ、標識されるシステインは配列番号1の35位に導入され、好ましくは配列番号1の119位および162位のシステインが、別のアミノ酸で置換されている請求項２または３のいずれかに記載のキナーゼ。
【請求項５】
チオールまたはアミノ反応性フルオロフォアが、二置換ナフタレン化合物、クマリン系化合物、ベンゾキサジアゾール系化合物、ダポキシル系化合物、ビオシチン系化合物、フルオレスセイン、スルホン化ローダミン系化合物、アット(Atto)フルオロフォア、もしくはルシファー・イエロー(Lucifer Yellow)、または環境変化に対する感受性を示す上記いずれかの誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載のキナーゼ。
【請求項６】
チオール反応性スピン標識がニトロキシドラジカルである請求項１〜４のいずれかに記載のキナーゼ。
【請求項７】
キナーゼ阻害剤のスクリーニング方法であって、
(a)請求項１〜６のいずれかに記載のキナーゼを供給すること；
(b)前記の、蛍光的またはスピン標識またはアイソトープ標識したキナーゼを
候補阻害剤と接触させること；
(c)工程(a)および工程(b)の蛍光標識したキナーゼの、励起の際の、1以上の
波長での蛍光発光シグナルまたはスペクトルを記録すること；または
(c)'工程(a)および工程(b)のスピン標識またはアイソトープ標識したキナー
ゼの電子常磁性共鳴（EPR）または核磁気共鳴（NMR）スペクトルを記録するこ
と；および
(d)工程(c)で記録される1以上の波長での蛍光発光シグナルまたはスペクトル
、または工程(c)'で記録されるEPRまたはNMRスペクトルを比較することを含み
；
ここで、前記の工程(c)で得られる前記の蛍光標識したキナーゼの、1以上の波
長、好ましくは発光極大での蛍光強度の差、および／または、スペクトルにお
ける蛍光発光波長のシフト、または、前記の工程(c)'で得られるスピン標識ま
たはアイソトープ標識したキナーゼの、EPRまたはNMRスペクトルにおける変化
は、候補阻害剤がキナーゼ阻害剤であることを示すスクリーニング方法。
【請求項８】
キナーゼ阻害剤のリガンドの結合および／もしくは会合または解離のキネティ
クスを決定する方法であって、
(a)請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光標識キナーゼを種々の濃度の阻害剤と
接触させること、または、
(a)'阻害剤に結合した請求項１〜６のいずれかに記載の蛍光標識キナーゼを、
種々の濃度の非標識キナーゼと接触させること；
(b)前記の蛍光標識したキナーゼの、励起の際の、1以上の波長での蛍光発光シ
グナルまたはスペクトルを、各濃度について記録すること；
(c)工程(b)で記録された1以上の波長での蛍光発光シグナルまたはスペクトルか
ら、各濃度の速度定数を決定すること、または
(c1)各濃度の阻害剤について、工程(b)で記録された1以上の波長での蛍光発光
シグナルまたはスペクトルから、Kdを決定すること、または
(c2)各濃度の非標識キナーゼについて、工程(b)で記録された1以上の波長での
蛍光発光シグナルまたはスペクトルから、Kaを決定すること；
(d)工程(b)で得られた種々の濃度の阻害剤についてのシグナルまたはスペクト
ルから工程(c)で決定した速度定数より、直接、konを決定すること、および／ま
たは、koffを外挿すること、または
(d)'工程(b)で得られた種々の濃度の非標識キナーゼについてのシグナルまた
はスペクトルから工程(c)で決定した速度定数より、直接、koffを決定すること
、および／または、konを外挿すること；および
(e)任意に、工程(d)または(d)'で得られたkonおよびkoffから、Kdおよび／または
Kaを計算することを含む方法。
【請求項９】
キナーゼ阻害剤の解離または会合を決定する方法であって、
(a)請求項１〜６のいずれかに記載のスピン標識またはアイソトープ標識したキ
ナーゼを、種々の濃度の阻害剤と接触させること、または
(a)'阻害剤に結合した請求項１〜６のいずれかに記載のスピン標識またはアイ
ソトープ標識したキナーゼを、種々の濃度の非標識キナーゼと接触させること
；
(b)前記のスピン標識またはアイソトープ標識したキナーゼのEPRまたはNMRスペ
クトルを、各濃度の阻害剤および／または非標識キナーゼについて記録するこ
と；および
(c)種々の濃度の阻害剤について、工程(b)で記録されたEPRまたはNMRスペクト
ルからKdを決定すること；または
(c)'種々の濃度の非標識キナーゼについて、工程(b)で記録されたEPRまたはN
MRスペクトルからKaを決定することを含む方法。
【請求項１０】
キナーゼ阻害剤のスクリーニングに好適な突然変異キナーゼの産生方法であっ
て、
(a)関心のあるキナーゼにおいて存在する場合、P-ループの外部に遊離チオール
またはアミノ基を有する、溶媒にさらされているアミノ酸、および／または、
P-ループ内部の好適でない位置に遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ
酸を、遊離チオールまたはアミノ基を有しないアミノ酸で置換すること；
(b)P-ループ内に遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ酸が存在しない場
合、前記の関心のあるキナーゼのP-ループにおけるアミノ酸を突然変異して、
遊離チオールまたはアミノ基を有するアミノ酸とすること；
(c)関心のあるキナーゼを、その環境における極性変化に感受性のあるチオール
-またはアミノ-反応性フルオロフォア、チオール反応性スピン標識、アイソト
ープまたは濃縮アイソトープチオール-またはアミノ-反応性標識で標識するこ
とであって、前記のフルオロフォア、スピン標識、アイソトープまたは高アイ
ソトープ標識は、キナーゼの触媒活性を阻害せず、および／または、キナーゼ
の安定性を妨げない；
(d)工程(c)で得られたキナーゼを、前記のキナーゼの知られている阻害剤と接
触させること；および
(e)工程(c)および(d)の前記の蛍光標識キナーゼの、励起の際の、1以上の波長
での蛍光発光シグナルまたはスペクトルを記録すること、または
(e)'工程(c)および(d)の前記のスピン標識キナーゼのEPRまたはNMRスペクトル
を記録すること；および
(f)工程(e)で記録された蛍光発光スペクトル、または、工程(e)'で記録された
EPRまたはNMRスペクトルを比較することを含み、
工程(e)で得られる、少なくとも1つの波長、好ましくは発光極大での蛍光強度
の差、および／または、前記の蛍光標識キナーゼのスペクトルにおける蛍光発
光波長のシフト、または、工程(e)'で得られる前記のスピン標識またはアイソ
トープ標識キナーゼのEPRまたはNMRスペクトルの変化から、該キナーゼがキナ
ーゼ阻害剤のスクリーニングに好適であることが示される方法。
【請求項１１】
キナーゼ阻害剤がキナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合する請求項７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に、部分的または完全に結合するキナーゼ阻害剤の特定方法であって、
（a）請求項８の方法に従って、阻害剤をスクリーニングすること、および
（b）工程(a)で特定された阻害剤の速度定数を決定することを含み、
工程(b)で決定された＜0.140秒-1の結合速度は、特定されたキナーゼ阻害剤が、キナーゼのATP結合部位に隣接するアロステリック部位に部分的または完全に結合することを示す方法。
【請求項１３】
キナーゼが、P-ループに天然に存在しているかまたは導入されているシステインで標識されている、請求項１〜６のいずれかに記載のキナーゼまたは請求項７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記のキナーゼの阻害剤として特定された化合物の薬理学的特性を最適化することをさらに含む請求項７または１０〜１３のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、キナーゼのP-ループに天然に存在しているか、または導入されて
いるアミノ酸を標識したキナーゼに関し、ここで、前記の標識は、前記のアミ
ノ酸の遊離チオールまたはアミノ基で行われ、かつ、前記の標識は、(a)その環
境における極性変化に感受性のある、チオールまたはアミノ反応性フルオロフ
ォアであるか；または(b)チオール反応性スピン標識、同位体または濃縮同位体
チオールまたはアミノ反応性標識であって、前記のフルオロフォア、スピン標
識、同位体または濃縮同位体標識は、触媒活性を阻害せず、キナーゼの安定性
を妨げない。さらに、本発明は、キナーゼ阻害剤のスクリーニング方法、キナ
ーゼ阻害剤のリガンドの結合および／または解離のキネティクスの決定方法、
および本発明の標識キナーゼを用いるキナーゼ阻害剤のスクリーニングに好適
な変異キナーゼの製造方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
従って、本発明は、キナーゼのP-ループに天然に存在しているか、または導
入されているアミノ酸で標識されたキナーゼに関し、ここで、前記の標識化は
、前記のアミノ酸の遊離チオールまたはアミノ基で行われ、かつ、前記の標識
は、(a)その環境における極性変化に感受性のある、チオールまたはアミノ反応
性フルオロフォアであるか；または(b)チオール反応性スピン標識、同位体また
は濃縮同位体チオールまたはアミノ反応性標識であって、前記のフルオロフォ
ア、スピン標識、同位体または濃縮同位体標識は、触媒活性を阻害せず、キナ
ーゼの安定性を妨げない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の修飾キナーゼは、P-ループ中に天然に存在しているか、または導入
されているアミノ酸で標識されている。好適なアミノ酸、即ち、遊離チオール
またはアミノ基を有するアミノ酸がP-ループ中に存在しない場合、前記のアミ
ノ酸は、当業界でよく知られた技術により導入され得、即ち、前記のアミノ酸
を添加するか、存在するアミノ酸を置換することにより挿入され得る。あらゆ
る場合において、アミノ酸が標識試薬との反応により標識される場合、アミノ
酸をP-ループ中に導入した後にのみ標識することを、誤解を避けるために理解
すべきである。上記の技術は、部位特異的変異誘発、並びに他の組み換え、合
成または半合成技術を含む。非標準的アミノ酸をキナーゼ中に導入する場合に
は、前記のアミノ酸を含有するアミノ酸ストレッチを化学的に合成した後、組
み換え的または合成的に製造したものでもよいキナーゼの残りの部分に結合さ
せてもよい。或いは、その後の標識化で所望の位置に特殊な非標準アミノ酸を
組み込むために発現および設計されたキナーゼは、改変した遺伝子コードを適
用することにより、組み換え技術で製造してもよい（例えば、リウ(Liu)および
シュルツ(Schltz)、2010年参照）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
本発明のキナーゼまたは方法の別の好ましい態様において、キナーゼは、P-
ループ中に天然に存在するか、または導入されているシステインで標識される
。