(57)【要約】【課題】ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供する。【解決手段】電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、最表面に分子量２０〜８００の親水性化合物が共有結合により結合している泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、最表面に分子量２０〜８００の親水性化合物が共有結合により結合している泳動路を用いることを特徴とするヘモグロビン類の測定方法。
【請求項２】
親水性化合物がカチオン性基を有することを特徴とする請求項１記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項３】
親水性化合物がシランカップリング剤あることを特徴とする請求項１又は２記載のヘモグロビン類の測定方法。
【請求項４】
アニオン性基を有する水溶性ポリマーを含有する緩衝液を用いることを特徴とする請求項１、２又は３記載のヘモグロビン類の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン（以下、Ｈｂともいう）類、なかでも糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃともいう）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
【０００３】
従来、ＨｂＡ１ｃの測定は、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等により行なわれていた。
このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。
【０００４】
これに対して、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。
【０００５】
これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。
【０００６】
また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー表面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、１０分間程度で測定することができ、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能となる。
【０００７】
しかしながら、このような動的コーティング法は、測定終了後、次検体の測定時に再びコーティングを行う必要がある。そのため、毎測定時に同じコーティング状態とするためには、洗浄操作により一旦コーティング層を剥し、再びコーティング操作をする必要がある。すなわち、連続測定する際には、測定の間に洗浄及びコーティング操作を挿入する必要があり、測定時間の延長を招いていた。また、これらの洗浄及びコーティング操作は、測定誤差発生の要因となりうる。加えて、コーティング用の試薬を測定時に具備する必要があるため、コストの観点からも不利であった。また、連続測定を行わない場合であっても、１０分程度の測定時間はＨＰＬＣ法と比較して非常に長く、臨床検査に適用するには不充分であった。
【０００８】
更に、一般に、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃのなかでも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ、アセチル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。しかしながら、特許文献１及び２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。
【０００９】
このような動的コーティングの問題に対して、キャピラリー表面に各種ポリマー類を固定化コーティングする方法が検討されており、電気浸透流現象や、試料成分の非特異吸着現象を抑制し、分離性能等の性能を向上させる試みが多数なされている。例えば、特許文献３には、イオン性を有するキャピラリー表面に、該表面と逆の荷電を有するポリマーを静電気的に結合させることによって固定化コーティングする方法が開示されている。特許文献４には、キャピラリーの表面に、逆の荷電を有するポリマー同士を交互に繰り返しコーティングする方法が開示されている。
しかしながら、これらのような固定化コーティング法では、コーティング剤であるポリマー類を静電気力等による物理吸着法によりコーティングしたものであるため、結合力が比較的弱く、長期間の使用に耐えることができないという欠点があった。
【００１０】
このような固定化コーティングの欠点を解消する方法として、キャピラリー表面に、コーティング剤であるポリマー類を共有結合によって強固に結合させる技術が開示されている。例えば、特許文献５には、求核反応性官能基を有するシランカップリング剤をキャピラリー表面に共有結合させ、更に、該求核反応性官能基にタンパク質を共有結合させることで、タンパク質類によるコーティングを行なう方法が開示されている。この方法は、古くから知られるシランカップリング反応を用い、シランカップリング剤を仲介して、コーティング剤であるタンパク質類を共有結合によってキャピラリー表面に結合したものである。このように、シランカップリング剤を仲介して、ポリマー類を間接的にキャピラリー表面にコーティングする技術は多数開示されている。
しかしながら、このような方法では、長期間使用した場合に、コーティング剤であるポリマー類自体が変化することによって、得られるエレクトロフェログラムにおける各ピークの移動時間や面積値が変動することがあり、高い測定精度が求められる安定型ＨｂＡ１ｃ等のヘモグロビン類の測定においては、分離性能等の大きな改善は認められなかった。
【００１１】
また、シランカップリング剤を用いた方法としては、シランカップリング剤をキャピラリーとコーティング剤との仲介物として用いる方法の他に、シランカップリング剤が有する官能基をキャピラリー表面に導入する方法も開示されている。例えば、特許文献６には、アルキル基を有するシランカップリング剤をキャピラリー表面に共有結合させることによって、キャピラリー表面にアルキル基を導入する方法が開示されている。
しかしながら、このような方法では、疎水性を有するキャピラリー表面を構成する素材に対して、ヘモグロビン類等のタンパク質類が非特異吸着反応を起してしまい、測定を行なうことができないという問題があった。
【特許文献１】特表平０９−５１０７９２号
【特許文献２】特開平０９−１０５７３９号
【特許文献３】特表平０５−５０３９８９号
【特許文献４】特開平１０−２２１３０５号
【特許文献５】特開平０２−１１２７５６号
【特許文献６】特開昭６３−２１０７６７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討した結果、泳動路の最表面に、所定の低分子量を有する親水性化合物を共有結合によって結合させることによって、高精度なヘモグロビン類の測定を行うことができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
本発明は、電気泳動法を用いてヘモグロビン類を測定する方法であって、最表面に分子量２０〜８００の親水性化合物が共有結合により結合している泳動路を用いるヘモグロビン類の測定方法に関する。
以下に本発明を詳述する。
【００１５】
本発明のヘモグロビン類の測定方法を適用することができる電気泳動装置としては、後述する長さ、幅、形状等を有する泳動路を有するものであれば特に限定されず、キャピラリー電気泳動装置、マイクロチップ電気泳動装置等が挙げられる。
【００１６】
図１に、本発明のヘモグロビン類の測定方法に用いるキャピラリー電気泳動装置の一例を示す。図１に示すように、キャピラリー電気泳動装置１１は、陽極槽１２、陰極槽１３、キャピラリー１４、高圧電源１５、検出器１６、及び、一対の電極１７、１８からなる。キャピラリー１４の両端は陽極槽１２内、及び、陰極槽１３内の緩衝液に浸され、管状のキャピラリー１４の内部は緩衝液で満たされている。また、電極１７及び１８は高圧電源１５と電気的に接続されている。
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、泳動路であるキャピラリー１４の最表面に分子量２０〜８００以下の親水性化合物が共有結合により結合している。
そして、ヘモグロビン類を測定する際には、キャピラリー１４の一方より試料を注入して、高圧電源１５から所定の電圧を印加することにより、キャピラリー１４内を移動する目的成分を検出器１６によって測定する。
【００１７】
本発明のヘモグロビン類の測定方法をマイクロチップ電気泳動装置に適用する場合は、上記キャピラリー電気泳動装置におけるキャピラリー１４、陽極槽１２、陰極槽１３に相当する部位を設けたマイクロチップを用いる。
【００１８】
上記マイクロチップは、従来公知の無機系又は有機系素材からなり、数ｃｍ〜数十ｃｍ角程度の大きさを有する板状の基板をいう。具体的には、例えば、μ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる技術に用いられる従来公知のチップ等が挙げられる。
【００１９】
上記泳動路とは、電気泳動が行われる流路において、測定試料が電気泳動により移動及び／又は分離する部位（測定試料が注入された部位から検出される部位まで）のことをいう。具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリー内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝内の試料が注入された部位から検出器により検出される部位までのことをいう。
上記泳動路の表面とは、具体的には、例えば、キャピラリー電気泳動法の場合は、キャピラリーの泳動路の表面のことをいい、マイクロチップ型電気泳動法の場合は、マイクロチップ型電気泳動装置におけるマイクロチップ溝の泳動路の表面のことをいう。
【００２０】
上記泳動路を構成する素材としては特に限定されず、従来公知の素材を用いることができるが、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英等のガラス系、フューズドシリカ、ポリジメチルシロキサン等のシリカ系、ポリアクリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリ乳酸系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、オレフィン系樹脂等の樹脂系等の素材が好ましい。なかでも、ガラス系、シリカ系、アクリル系樹脂の素材が好ましい。
【００２１】
上記泳動路の長さは、好ましい下限が１０ｍｍ、好ましい上限が５００ｍｍである。１０ｍｍ未満であると、充分に試料が分離されないため、正確な測定をすることができないことがある。５００ｍｍを超えると、測定時間の延長や得られるエレクトロフェログラムにおいてピーク形状の変形が生じることによって、正確な測定をすることができないことがある。
【００２２】
上記泳動路の幅は、好ましい下限が１μｍ、好ましい上限が２００μｍである。１０μｍ未満であると、試料成分を検出するための光路長が小さく、測定精度が低下することがある。２００μｍを越えると、泳動路内部で試料が拡散することによって、得られるエレクトロフェログラムにおいてピークがブロードになり、測定精度が低下することがある。
【００２３】
上記泳動路の形状としては特に限定されず、例えば、直線状、一定の曲率を有する曲線状、渦巻状等が挙げられる。なかでも、直線状であることが好ましい。
上記泳動路の断面の形状としては特に限定されず、例えば、矩形、円形等が挙げられる。
【００２４】
本発明のヘモグロビン類の測定方法では、単数の泳動路が使用されてもよく、複数の泳動路が使用されてもよい。すなわち、キャピラリー電気泳動装置を用いる場合には、キャピラリーとして複数の泳動路を同時に使用するものであってもよく、マイクロチップ電気泳動装置を用いる場合には、１枚のチップ上に複数の泳動路が形成されていてもよい。
【００２５】
上記泳動路の表面は、従来公知の表面改質処理が施されていてもよい。
上記表面改質処理としては特に限定されず、例えば、紫外線照射、プラズマ処理等の光学的処理；各種化学物質による反応・結合等の化学的処理；各種化合物・ポリマー等によるコーティング処理等；従来公知の化学的変性処理及び／又は物理的変性処理等が挙げられる。
【００２６】
上記泳動路の表面は、後述する親水性化合物と、共有結合反応により結合することができる構造（以下、「共有結合性構造」ともいう）を有する。
上記共有結合性構造を有することによって、後述する分子量が２０〜８００の親水性化合物が有する共有結合性構造との間で共有結合を生じ、該分子量が２０〜８００の親水性化合物を上記泳動路の最表面に強固に結合することができる。
【００２７】
上記共有結合性構造としては、従来公知の化学反応により共有結合を生じることができる構造であれば特に限定されず、例えば、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、アミノ基、エステル基、エーテル基、エポキシ基、ハロゲン基、イミノ基、イミダゾール基、シラノール基、トリアルコキシシリル基等の官能基等を有する構造又は物質類等が挙げられる。
【００２８】
上記泳動路は、上記泳動路を構成する素材自体が上記共有結合性構造を有するものであってもよく、上記表面改質処理を施すことによって、上記泳動路の表面に上記共有結合性構造が付与されてもよい。なかでも、上記泳動路を構成する素材自体が上記共有結合性構造を有することが好ましい。
【００２９】
上記泳動路の最表面には、分子量２０〜８００の親水性化合物（以下、単に親水性化合物ともいう）が共有結合により結合している。上記泳動路内部に満たされる電解質と接する最表面に、上記親水性化合物が共有結合により結合していることによって、測定成分の非特異吸着等を抑制し、高い精度で測定を行うことができる。
【００３０】
上記親水性化合物とは、構造内に親水性官能基を有する化合物を意味する。
上記親水性官能基としては特に限定されず、例えば、水酸基、グリコール基、アミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、リン酸基、スルホン酸基、カルボニル基、アミド基等が挙げられる。
【００３１】
上記親水性化合物は、分子量の下限が２０、上限が８００である。分子量が２０未満であると、親水性化合物による親水性化効果が小さく、非特異吸着の抑制が行なわれ難いことがある。分子量が８００を超えると、泳動路の表面に結合した場合に、ヘモグロビン類の分離性能が不充分となり、測定精度が低下することがあり、特に長期間繰り返し使用した場合には、エレクトロフェログラムが変化し、正確な測定ができなくなることがある。好ましい下限は３０、好ましい上限は５００である。
上記親水性化合物は、分子量が８００以下であれば、２量体、３量体等の繰り返し構造を有するものであってもよい。
【００３２】
上記親水性化合物は、共有結合性構造を有する。
上記共有結合性構造を有することによって、上記泳動路の表面が有する共有結合性構造との間で共有結合を生じ、上記親水性化合物が上記泳動路の表面に強固に結合することができる。
【００３３】
上記共有結合性構造としては特に限定されず、従来公知の化学反応により共有結合を生じることができる構造等が挙げられる。具体的には、上記泳動路の表面が有する共有結合性構造と同様の構造が挙げられる。
【００３４】
上記親水性化合物が有する共有結合性構造と、上記泳動路の表面が有する共有結合性構造との組み合わせとしては、共有結合反応を行なうことができるものであれば特に限定されず、上記親水性化合物が有する共有結合性構造と、上記泳動路の表面が有する共有結合性構造とが同一の構造であってもよく、異なる構造であってもよい。
【００３５】
上記親水性化合物を共有結合によって上記泳動路の表面に結合させる方法としては特に限定されず、上記親水性化合物の種類に応じて、従来公知の反応条件下にて反応させればよい。具体的には、例えば、上記親水性化合物を含有する溶液を泳動路の内部に通液し、該親水性化合物を泳動路の表面に接触させ、適当な反応条件下にて反応させる方法等が挙げられる。
ここで、適宜、官能基の活性化処理を行ってもよく、反応時又は反応後において加熱処理、乾燥処理等を行なってもよい。
【００３６】
上記親水性化合物を含有する溶液を泳動路の内部に通液し、該親水性化合物を泳動路の表面に接触させることによって反応させる場合、該親水性化合物を含有する溶液の濃度は、好ましい下限が０．１重量％、好ましい上限が３０重量％である。０．１％以下であると、濃度が不充分であり、上記親水性化合物を共有結合によって結合することによる効果が現れにくいことがある。３０重量％以上であると、上記親水性化合物の種類によっては取り扱いが困難で、反応生成物が泳動路に詰まること等の不具合を生じることがある。
【００３７】
上記親水性化合物は、上記共有結合性構造の他に、他の機能を有する他の官能基を有してもよい。
上記他の官能基としては特に限定されないが、カチオン性基であることが好ましい。
上記カチオン性基としては特に限定されないが、例えば、１〜３級アミノ基、４級アンモニウム基、イミド基、グアジニノ基、ホスホニウム基等のオニウム基等の従来公知のカチオン性を有する官能基が挙げられる。なかでも、１〜３級のアミノ基であることがより好ましく、１〜２級のアミノ基であることが更に好ましい。
【００３８】
上記他の官能基としては、更に、加水分解反応、還元反応、転移反応等の従来公知の化学反応によって、容易にカチオン性基に変換される構造を有する官能基も挙げられる。具体的には、例えば、アミド基、イミン基、イソシアネート基等の官能基を有する化合物が挙げられる。これらのような官能基を有する化合物を泳動路の表面に結合させた後、加水分解反応等を行うことによって、これらの官能基をアミノ基等のカチオン性基に変換することができる。
【００３９】
上記親水性化合物のうち、好ましい態様の親水性化合物、すなわち、分子量２０〜８００であって、共有結合性構造とカチオン性基とを有する親水性化合物としては特に限定されず、例えば、尿素等の尿素誘導体類、塩類、置換体、重合体等；メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、トリブチルアミン、メチルアミノプロピルアミン、ジメチルアミノプロピルアミン、グリシジルアミノプロピルアミン、ジエタノールアミノプロピルアミン等のアミノアルカン類及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等；エチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、ヒドラジノ基プロパンジアミン等のジアミノアルカン類及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン、ジメチルメタノールアミン、ジエチルエタノールアミン等のアルカノールアミン類及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等；リジン、アルギニン、グルタミン、オルニチン、γ−アミノ酪酸、３−アミノアラニン等のアミノ酸類及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等；グアニジン、アミノグアニジン、ビグアニド、トリメチレンイミン等のイミン・イミド類及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等；３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−（２−アミノエチル）アミノプロピルトリメトキシシシラン、３−（２−アミノエチル）アミノプロピルメチルジメトキシシシラン、アミノシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基含有シランカップリング剤及びその誘導体類、塩類、置換体、重合体等が挙げられる。なかでも、アミノアルカン類、ジアミノアルカン類、シランカップリング剤であることがより好ましい。
【００４０】
上記泳動路の表面の共有結合性構造と、上記親水性化合物の共有結合性構造とは、直接反応することによって共有結合を形成することが好ましいが、上記親水性化合物の共有結合性構造及び上記泳動路の表面の共有結合性構造と反応することによって共有結合を形成することができる官能基を有する化合物（以下、スペーサともいう）を介して、上記親水性化合物と上記泳動路の表面とを間接的に結合させてもよい。
【００４１】
上記スペーサは、少なくとも上記親水性化合物の共有結合性構造と共有結合反応により結合することができる官能基、及び、上記泳動路の表面の共有結合性構造と共有結合反応により結合することができる官能基を有する。すなわち、上記スペーサとしては、１分子中に２以上の上記共有結合性構造を有する物質であればよい。上記スペーサにおいて、２以上の上記共有結合性構造としては、同種の構造であってもよく、異なる構造であってもよい。
【００４２】
上記スペーサとしては、具体的には、例えば、イミド基を有するカルボジイミド類；アミノ基とカルボキシル基とを有するアミノカルボン酸類；アミノ基を有するアルキルメチレンジアミン類；ハロゲン基を有するエピクロルヒドリン等のエピハロヒドリン類；ジグリシジルエーテル；ジエポキシド等のジエポキシド類等が挙げられる。
【００４３】
本発明のヘモグロビン類の測定方法において、上記スペーサを介して、上記親水性化合物と上記泳動路の表面とを結合させる場合には、上記スペーサの分子量と、上記親水性化合物の分子量とを合計して２０〜８００とする必要がある。
【００４４】
上記親水性化合物は、上記泳動路の最表面に共有結合によって結合されていればよく、上記泳動路の最表面のみに結合されていてもよいし、上記泳動路の最表面と、該泳動路以外の他の流路最表面とに結合されていてもよい。
【００４５】
本発明のヘモグロビン類の測定方法は、上記泳動路の内部に電解質を満たし、上記泳動路の表面に上記親水性化合物を共有結合により結合させたうえで、該泳動路の内部に測定試料を導入して、該泳動路の両端に電圧を負荷することによって行うことができる。
【００４６】
上記電解質としては特に限定されないが、緩衝液が好ましい。
上記緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝能成分を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及び、その塩類；又は、緩衝能を有するこれらの誘導体類等の緩衝能成分を含有する溶液が挙げられる。
これらの緩衝能成分は、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
【００４７】
上記緩衝液は、他に一般に添加される物質、例えば、界面活性剤、カオトロピック化合物、各種ポリマー、親水性の低分子化合物等を適宜添加してもよい。なかでも、添加されるポリマーとしてイオン性ポリマー；特にアニオン性基を有する水溶性ポリマーが添加されることで、性能が向上する場合があることから好ましい。
【００４８】
上記アニオン性基としては特に限定されず、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基等の従来公知のアニオン性を有する官能基である。なかでも、スルホン酸基を有することが好ましい。
上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーは、分子中に、上記アニオン性基を複数有していてもよく、異なる種類の上記アニオン性基を有していてもよい。上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーは、使用時に上記緩衝液に完全に溶解した状態であればよいが、水に対する溶解度の好ましい下限が１ｇ／Ｌである。１ｇ／Ｌ未満であると、アニオン性基を有する水溶性ポリマー低濃度でしか用いることができないため効果が現れにくく、測定精度が不充分となることがある。より好ましい下限が５ｇ／Ｌである。
【００４９】
上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーとしては特に限定されず、具体的には例えば、アニオン性基を有する多糖類、及び、アニオン性基を有する水溶性の有機合成ポリマーが好ましい。
【００５０】
上記アニオン性基を有する多糖類としては特に限定されず、例えば、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヘパラン、フコイダン等のスルホン酸基含有多糖類、及び、その塩類；アルギン酸、ペクチン酸等のカルボキシル基含有多糖類、及び、その塩類；セルロース、デキストラン、アガロース、マンナン、デンプン等の中性多糖類、その誘導体へのアニオン性基導入化物、及び、その塩類等の公知のアニオン性基を有する多糖類等が挙げられる。
【００５１】
上記アニオン性基を有する有機合成ポリマーとしては、例えば、アニオン性の官能基を含有する水溶性の公知の有機合成ポリマーが挙げられるが、特にアクリル系ポリマー；すなわち、アクリル酸又はメタクリル酸及びその誘導体類及びエステル類等を主成分とするポリマー等が好ましい。
具体的には例えば、（メタ）アクリル酸、２−（メタ）アクリロイロキシエチルコハク酸等のカルボキシル基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、（（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（２−（メタ）アクリロイルオキシエチル）アシッドホスフェート、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル）アシッドホスフェート等のリン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー、２−（メタ）アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、（メタ）アクリルアミドプロパンスルホン酸、スルホプロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシナフタレンスルホン酸等のスルホン酸基を有するモノマーを重合して得られるアクリル系ポリマー等が挙げられる。
【００５２】
上記アクリル系ポリマーは、アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと、アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとの共重合体であってもよい。
上記アニオン性基を有しない（メタ）アクリルモノマーとしては、上記アニオン性基を有する（メタ）アクリルモノマーと共重合が可能な（メタ）アクリルモノマーであれば特に限定されないが、例えば、非イオン性の親水性である（メタ）アクリル酸エステル類であることが好ましい。具体的には、例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート；グリシジル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００５３】
上記緩衝液の上記アニオン性基を有する水溶性ポリマーの含有量の好ましい下限は０．０１重量％、好ましい上限は１０重量％である。０．０１重量％未満であると、水溶性ポリマーを添加することによる効果が発現しにくく、ヘモグロビン類の測定において、分離等が不充分となることがある。１０重量％を超えると、測定時間の延長や分離不良を引き起こすことがある。
【発明の効果】
【００５４】
本発明方法によれば、測定成分の非特異吸着等が抑制されることによって、糖尿病診断の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃの測定を１試料当たり数分という短時間に、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度の高精度で測定することができる。また、繰り返し測定しても、測定精度の安定性が損なわれることがないため、低コストで高精度の測定をすることができる。更に、より簡便な測定原理である電気泳動法によって糖尿病患者の安定型ＨｂＡ１ｃ値の管理を好適に行うことができるため、マイクロチップ電気泳動装置のような、安価・小型の測定システムを構築することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１）
（１）泳動路の作製
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製、内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）をキャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。０．２ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、１．０重量％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（親水性化合物、分子量２２１、信越シリコーン社製）を含有する水溶液を６０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入して、上述の水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させることによって、最表面に親水性化合物が共有結合したキャピラリーを得た。
【００５７】
（２）測定試料の調製
測定試料として、健常人よりＥＤＴＡ採血して得られた健常人全血７０μＬに、０．０１重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬社製）を含有するクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）２００μＬを添加して溶血希釈したものを健常人血試料として用いた。
また、同一の健常人よりＥＤＴＡ採血して得られた健常人全血７０μＬに、グルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加し、３７℃で３時間加温して得られた、修飾Ｈｂの一種である不安定型ＨｂＡ１ｃを多量に含有する測定試料を人為的に調製し、修飾Ｈｂ含有試料として用いた。
【００５８】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に親水性化合物が共有結合したキャピラリーを用いて、上述の健常人試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、２．０重量％のコンドロイチン硫酸（アニオン性ポリマー、和光純薬社製）を含有する２４０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、キャピラリーの一方より上述の健常人試料又は修飾Ｈｂ含有試料を注入して、２０ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
【００５９】
図２は、実施例１において、健常人血試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図２中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０を示す。図２に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃのピークは良好に分離された。
図３は、実施例１において、修飾Ｈｂ含有試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図３中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。図３に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂである不安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離された。
【００６０】
（実施例２）
（１）泳動路の作製
ＰＶＡコーティングキャピラリー（アジレント社製、内径７５μｍ×全長３０ｃｍ）をキャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。イオン交換水及び０．１ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、１．０重量％のエピクロルヒドリン（スペーサ、分子量９３、和光純薬社製）水溶液を５分間通液し、この水溶液を満たしたままキャピラリーの両端に密栓をした後、５０℃の恒温槽内に５時間静置した。その後、２．０重量％のジエタノールアミン（親水性化合物、分子量１０５、和光純薬社製）水溶液を５分間通液し、この水溶液を満たしたままキャピラリーの両端に密栓をした後、６０℃で１２時間静置し、最表面に親水性化合物が共有結合したキャピラリーを得た。
【００６１】
（２）測定試料の調製
実施例１と同様の方法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００６２】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に親水性化合物が共有結合したキャピラリーを用いて、上述の健常人試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、２．０重量％のデキストラン硫酸（和光純薬社製）を含有する２００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、キャピラリーの一方より上述の健常人試料又は修飾Ｈｂ含有試料を注入して、２２ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
健常人血試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００６３】
（実施例３）
（１）泳動路の作製
ポリジメチルシロキサン製のマイクロチップ（７ｃｍ×５ｃｍ）に、幅１００μｍのダブルＴ型の電気泳動用流路を形成した。形成した流路に０．１ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．２ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液して流路内を洗浄した後、１．０重量％の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（親水性化合物、分子量１７９、信越シリコーン社製）を含有する水溶液を３０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入して、上述の水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させることによって、最表面に親水性化合物が共有結合した流路を得た。
【００６４】
（２）測定試料
実施例１と同様の方法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００６５】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に親水性化合物が共有結合した流路を用いて、上述の健常人試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、２．０重量％のコンドロイチン硫酸（アニオン性ポリマー、和光純薬社製）を含有する２５０ｍＭコハク酸緩衝液（ｐＨ５．２）を用い、流路の一方より上述の健常人試料又は修飾Ｈｂ含有試料を注入して、０．８ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
健常人血試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００６６】
（実施例４）
（１）泳動路の作製
メチルメタクリレート及びグリシジルメタクリレートの共重合体製のマイクロチップ（７ｃｍ×５ｃｍ）に、幅８０μｍのダブルＴ型の電気泳動用流路を形成した。形成した流路に０．０１ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．０１ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液して流路内を洗浄した後、２０重量％のエチレンジアミン（親水性化合物、分子量６０、和光純薬社製）水溶液を５分間通液し、この水溶液を満たしたまま流路の両端に密栓をした後、５０℃の恒温槽内に３時間静置した。その後、上述の流路内をイオン交換水で洗浄した後、該流路内に０．０５Ｎの硫酸を３分間通液して、この水溶液を満たしたままキャピラリーの両端に密栓をした後、５０℃で５時間恒温槽内に静置した。その後、上述の流路内をイオン交換水で洗浄して、最表面に親水性化合物が共有結合した流路を得た。
【００６７】
（２）測定試料の調製
実施例１と同様の方法により、健常人血試料及び修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００６８】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に親水性化合物が共有結合した流路を用いて、上述の健常人試料及び修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、１．７重量％の２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亞合成化学社製）共重合体を含有する３００ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．２）を用い、流路の一方より上述の健常人試料又は修飾Ｈｂ含有試料を注入して、１．０ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
健常人血試料の測定では、図２と同様のエレクトロフェログラムが得られた。修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００６９】
（比較例１）
（１）泳動路の作製
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製、内径２５μｍ×全長３０ｃｍ）をキャピラリー電気泳動装置にセットし、０．２ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ溶液の順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、０．５重量％の牛血清アルブミン（分子量約６７，０００、和光純薬社製）を含有する２４０ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ４．７）を０．５分間通液し、表面に牛血清アルブミンが動的コーティングされたキャピラリーを得た。
【００７０】
（２）測定試料
実施例１と同様の方法により、修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００７１】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に牛血清アルブミンが動的コーティングされたキャピラリーを用いて、上述の修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製）を含有する３５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用い、キャピラリーの一方より上述の修飾Ｈｂ含有試料を注入して、８．５ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
図４は、比較例１において、修飾Ｈｂ含有試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。図４中、ピーク１は安定型ＨｂＡ１ｃ、ピーク２はＨｂＡ０、ピーク３は修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）を示す。
図４において、安定型ＨｂＡ１ｃと修飾Ｈｂとは充分に分離されなかった。
【００７２】
（比較例２）
（１）泳動路の作製
フューズドシリカ製キャピラリー（ＧＬサイエンス社製、内径７５μｍ×全長５０ｃｍ）をキャピラリー電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社製、ＰＡＣ／Ｅ  ＭＤＱ）にセットした。０．２ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．５ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液してキャピラリー内を洗浄した後、５．０重量％のポリブレン（分子量５，０００〜１０，０００、ナカライテスク社製）水溶液を２０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入して上述のポリブレン水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。その後、再び上述のポリブレン水溶液の注入、空気の注入及び乾燥を５回繰り返し、表面にポリブレンが固定化コーティングされたキャピラリーを得た。
【００７３】
（２）測定試料の調製
実施例１と同様の方法により、修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００７４】
（３）電気泳動による測定
上述の表面にポリブレンが固定化コーティングされたキャピラリーを用いて、上述の修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、０．２重量％のデキストラン硫酸（和光純薬社製）を含有する３５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．７）を用い、キャピラリーの一方より上述の修飾Ｈｂ含有試料を注入して、１８ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００７５】
（比較例３）
（１）泳動路の作製
ポリジメチルシロキサン製のマイクロチップ（７ｃｍ×５ｃｍ）に、幅１００μｍのダブルＴ型の電気泳動用流路を形成した。形成した流路に０．１ＮのＮａＯＨ溶液、イオン交換水、０．２ＮのＨＣｌ溶液をこの順で通液して流路内を洗浄した後、１．０重量％の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（信越シリコーン社製）を含有する水溶液を３０分間通液した。その後、空気をキャピラリー内に注入して水溶液を追い出した後、４０℃の乾燥機内で１２時間乾燥させた。
次いで、上述の流路内に５．０重量％のグルタルアルデヒドを含有するリン酸緩衝液を６０分間通液した後、更に、１００ｍＭのリン酸緩衝液を６０分間通液して洗浄した。更に、上述の流路内に０．２ｍＭ牛血清アルブミン（分子量６７，０００、和光純薬社製）を含有する１００ｍＭリン酸緩衝液を５分間通液した後、４℃にて１２０分間静置することによって、表面に牛血清アルブミンがコーティングされた流路を得た。
【００７６】
（２）測定試料の調製
実施例１と同様の方法により、修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００７７】
（３）電気泳動による測定
上述の表面に牛血清アルブミンがコーティングされた流路を用いて、上述の修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。電気泳動用緩衝液として、０．２重量％のコンドロイチン硫酸（和光純薬社製）を含有する２００ｍＭリンゴ酸緩衝液（ｐＨ５．０）を用い、流路の一方より上述の修飾Ｈｂ含有試料を注入して、０．９ｋＶの電圧により電気泳動を行い、４１５ｎｍにおける吸光度測定を行なった。
修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
【００７８】
（比較例４）
（１）泳動路の作製
親水性化合物として０．１重量％のポリリジン（分子量１，０００〜４，０００、和光純薬社製）を用いたこと以外は、実施例４と同様の方法により、最表面に親水性化合物が共有結合した流路を得た。
【００７９】
（２）測定試料の調製
実施例１と同様の方法により、修飾Ｈｂ含有試料を調製した。
【００８０】
（３）電気泳動による測定
得られた流路を用いたこと以外は、実施例４と同様の方法により、修飾Ｈｂ含有試料の測定を行なった。
修飾Ｈｂ含有試料の測定では、図３と同様のエレクトロフェログラムが得られた。得られたエレクトロフェログラムでは、いずれのピークも良好に分離されていた。
【００８１】
（評価）
（１）修飾Ｈｂ類の分離性能確認
実施例１〜４及び比較例１〜４の測定条件について、健常人血試料と、該健常人血を元に調製した修飾Ｈｂ含有試料、すなわち実施例１と同様の方法により健常人血にグルコースを２５００ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られた不安定型ＨｂＡ１ｃ含有試料と、更に他の修飾Ｈｂ含有試料、すなわち該健常人血にアセトアルデヒドを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたアセチル化Ｈｂ含有試料、シアン酸ナトリウムを５０ｍｇ／ｄＬとなるように添加して得られたカルバミル化Ｈｂ含有試料を調製し、各試料における安定型ＨｂＡ１ｃ値を求めた。
なお、各試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値は、全ヘモグロビンピークの面積に対する安定型ＨｂＡ１ｃピークの面積の比率（％）を求めることにより算出した。
得られた各修飾Ｈｂ含有試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値から、得られた健常人血試料の安定型ＨｂＡ１ｃ値を差し引いた値（ΔＨｂＡ１ｃ値）を求めた。
結果を表１に示した。
【００８２】
【表１】
2008267819.tif 000002
【００８３】
実施例１〜４の測定条件においては、修飾Ｈｂ含有試料と修飾Ｈｂを含有しない健常人血試料との安定型ＨｂＡ１ｃの測定値の差はほとんどなく、測定値差は０．２％以下であり、修飾Ｈｂ類の存在下においても、安定型ＨｂＡ１ｃが正確に測定できることがわかった。
一方、比較例１の測定条件では、修飾Ｈｂ類と安定型ＨｂＡ１ｃの分離が不充分なため、安定型ＨｂＡ１ｃ値が大きく変動し、正確な測定ができないことがわかった。比較例２〜４の測定条件では、比較例１よりは修飾Ｈｂ類と安定型ＨｂＡ１ｃとが良好に分離されたが、実施例１〜４に比較すると測定値の変動がみられる試料があった。
【００８４】
（２）同時再現性試験
実施例１〜４及び比較例１〜４の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を１０回連続して測定し、得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値を算出した。
また、比較例１では、１回の測定が終了した時点で、０．２ＮのＮａＯＨ溶液を０．３分間通液し、緩衝液を１．８分間通液して流路内を洗浄した後、再びコーティング剤として０．５重量％の牛血清アルブミンを含有するリンゴ酸緩衝液を０．５分間通液して、流路表面に動的コーティングを施した後、次測定試料を注入し、測定を繰り返し行うことによって同時再現性試験を行った。
結果を表２に示した。
【００８５】
（３）耐久性試験
実施例１〜４及び比較例１〜４の測定条件を用いて、同一の健常人血試料を１００回連続して測定して得られた安定型ＨｂＡ１ｃ値の最大値と最小値との差（Ｒ値）を算出した。結果を表２に示した。
【００８６】
【表２】
2008267819.tif 000003
【００８７】
表２に示すように、実施例１〜４では、同時再現性試験において、バラツキ度合いを示すＣＶ値が１％前後であり良好な結果であった。また、耐久性試験における連続１００試料測定時のバラツキ幅についても、０．２％程度と非常に小さく、大量検体の連続測定においても精度良く安定型ＨｂＡ１ｃを測定できることがわかった。
一方、比較例１については、同時再現性試験におけるＣＶ値が約５％と大きく、また耐久性試験におけるバラツキ幅も１％程度であり、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理する上で全く不充分な値となっていた。また、比較例２〜４については、修飾Ｈｂの一部について分離は可能であったが、繰り返し測定を行うことによって徐々に測定値が変化し、最終的に大きなＣＶ値及びバラツキ幅を示したことから、安定した測定をすることができないことがわかった。
【００８８】
以上のように、実施例１〜４では、安定型ＨｂＡ１ｃを短時間で高精度に分離でき、繰り返し測定した場合においても安定した性能を示した。実施例１〜４の評価結果が示す数値は、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理するために充分に使用することができるレベルであった。
一方、比較例１では、分離性能が不充分なため精度よく測定することができなかった。また、比較例２及び３では、修飾Ｈｂの一部は分離できるものの、繰り返し測定した場合には性能の劣化が激しく、安定した測定ができなかった。更に、比較例４に示すように、所定の分子量範囲を逸脱した親水性化合物が結合した泳動路を用いた場合においても、繰り返し測定時の性能が悪かった。比較例１〜４の評価結果が示す数値は、糖尿病患者のＨｂＡ１ｃ値を管理するためには適用できないレベルであった。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明によれば、ヘモグロビン類、特に糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃの測定を、短時間で高精度に行うことが可能なヘモグロビン類の測定方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】キャピラリー電気泳動装置の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１〜４において、健常人血の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図３】実施例１〜４、比較例２〜４において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【図４】比較例１において、修飾Ｈｂを含む試料の測定によって得られたエレクトロフェログラムである。
【符号の説明】
【００９１】
１１  キャピラリー電気泳動装置
１２  陽極槽
１３  陰極槽
１４  キャピラリー
１５  高圧電源
１６  検出器
１７  電極
１８  電極
１  安定型ＨｂＡ１ｃのピーク
２  ＨｂＡ０のピーク
３  修飾Ｈｂ（不安定型ＨｂＡ１ｃ）のピーク
【図１】
2008267819.tif 000004
【図２】
2008267819.tif 000005
【図３】
2008267819.tif 000006
【図４】
2008267819.tif 000007