(57)【要約】【課題】カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われているが、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルスが存在することが報告された。カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ウイルス安全性保証を高めるために、カイコマキュラ様ウイルスを不活化する方法を提供する。  【解決手段】マキュラ様ウイルスが感染したカイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、カイコマキュラ様ウイルスを不活化するために、製造工程で中間製品を４級アンモニウム塩溶液中で処理を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マキュラ様ウイルスが感染したカイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、製造工程中間製品を４級アンモニウム塩溶液中で処理することを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項２】
４級アンモニウム塩が塩化ベンザルコニウムであることを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項３】
有用タンパク質の製造が、有用タンパク質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞に接種することを特徴とする請求項１または２記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項４】
有用タンパク質の製造が、有用タンパク質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ虫体に接種することを特徴とする請求項１または２記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項５】
カイコ虫体がカイコ幼虫またはカイコ蛹であることを特徴とする請求項４記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、カイコ由来細胞に存在しているカイコマキュラ様ウイルスを不活化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ由来細胞を用いて遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製し、その遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞やカイコ虫体に接種して、有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われている（特許文献１）。しかしながら、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルス（以下ＢｍＭＬＶと略称する）が存在することが報告された（非特許文献１）。そのため、有用タンパク質の製造工程にカイコ由来細胞を使用する際には、ＢｍＭＬＶに関する安全性保証のために、ＢｍＭＬＶを不活化または／かつ除去することが必要となる。
【特許文献１】特許第２６２１６５６号明細書
【非特許文献１】Ｋａｔｓｕｍａら著、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９巻、５５７７−５５８４ページ（２００５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、カイコマキュラ様ウイルスの不活化が可能となれば、カイコ由来細胞を利用した有用タンパク質の生産法のウイルス安全性保証のレベルは向上し、カイコ由来細胞を利用した生産法による有用タンパク質の量産の道は更に広がると期待される。本発明の目的は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ＢｍＭＬＶを不活化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、カイコマキュラ様ウイルスを４級アンモニウム塩溶液処理で不活化することに成功し、カイコ由来細胞を用いて有用タンパク質を生産する方法を確立し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ＢｍＭＬＶが感染したカイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、製造工程中間製品を４級アンモニウム塩溶液中で処理することを特徴とするＢｍＭＬＶの不活化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、以下に説明するとおり、カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に効率よくＢｍＭＬＶを不活化することができ、生産された有用タンパク質のウイルス安全性保証レベルを高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の最良の実施形態の例を説明する。
【０００７】
本発明の有用タンパク質としては特に限定されないが、塩化ベンザルコニウムなどの４級アンモニウム塩に対して安定なタンパク質が好ましい。そのようなタンパク質としては種々報告され、今後も多くのものが報告されるであろうが、それらへの応用が可能である。例えば、イヌインターフェロン−γ、ヒトインターフェロン−β、ネコインターフェロン−ω、マウスインターフェロン−βなどのインターフェロン類が挙げられる。
【０００８】
本発明は、製造のいずれかの工程でカイコ由来細胞を使用する有用タンパク質の製造方法であれば適用できる。例えるならば、有用タンパク質をコードする遺伝子を単離し、それを市販の核多角体病ウイルスのゲノム中に挿入し、ＢＭ−Ｎ細胞などのカイコ培養細胞に感染させることで、遺伝子組換えウイルスを作製し、それをＢＭ−Ｎ細胞、カイコ幼虫やカイコ蛹などのカイコ虫体に接種して有用タンパク質を製造する方法に適用できる。核多病体病ウイルスは昆虫に感染し、多角体と呼ばれる構造体を昆虫細胞内に蓄積させるウイルスであり、そのタンパク質合成能力の高さから、遺伝子組み換えタンパク質の製造に用いられている。またその他の例として、遺伝子組換えカイコ細胞、遺伝子組換えカイコ虫体を用いた有用タンパク質の製造法にも適用できる。
【０００９】
４級アンモニウム塩処理を行う工程は、製造工程中のどの段階でも可能である。細胞培養で有用タンパク質の製造する場合であれば、培養終了後の培養液でも、精製工程の中間工程製品でも４級アンモニウム塩処理することが可能であるし、また、カイコ虫体で有用タンパク質を製造する場合であれば、カイコ殻の抽出液でも、精製工程の中間工程製品でも４級アンモニウム塩処理することが可能である。カイコ虫体として幼虫を用いる場合はカイコ体液を４級アンモニウム塩処理することが好ましい。カイコ体液を４級アンモニウム塩処理するには、カイコ体液に４級アンモニウム塩を加える方法、４級アンモニウム塩溶液中に体液を受ける方法、もしくは開腹カイコをそのまま４級アンモニウム塩溶液中に入れて攪拌する方法が可能である。これらの４級アンモニウム塩処理の操作は氷水浴中で行うのが好ましいが、限定されない。また４級アンモニウム塩は、それが可溶であれば、どのような溶媒に溶解して調製することも可能であるが、好的には水溶液が用いられる。
【００１０】
４級アンモニウム塩の例としては、塩化ベンザルコニウムが好ましいが、それ以外にも塩化ベンゼトニウムなどの４級アンモニウム塩の溶液を用いることができる。
【００１１】
処理する塩化ベンザルコニウムの濃度としては０．１％以上が好ましい。上限は特に規定されず、目的の有用タンパク質が安定である範囲で使用できる。
【００１２】
塩化ベンザルコニウム処理の時間も、有用タンパク質の失活がなくＢｍＭＬＶが不活化される範囲なら限定されないが、好ましい時間は３〜４０時間、特に６〜２４時間にするのが好ましい。
【実施例】
【００１３】
実施例１
（１）ＢｍＭＬＶ液の調製
ＢｍＭＬＶは、ＢｍＭＬＶに慢性感染したＢＭ−Ｎ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８９１０）から調製した。１０％牛血清アルブミンを含むＴＣ−１００培地で培養したＢｍＮ細胞３Ｘ１０９個を遠心分離で集め、３０ｍＬの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、冷蔵下で超音波処理することによって細胞を破砕した。この細胞破砕液を１００ｋＤａで限外濾過して１００ｋＤａ以上の分子量を有する画分５ｍＬを回収した。この回収液をＢｍＭＬＶ液とした。ＢｍＭＬＶ液１００μＬからＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン）によってＲＮＡを調製し、２．４μｇのＲＮＡを回収した。次に、ＢｍＭＬＶの塩基配列のうちＢｍＭＬＶのコートタンパク質をコードする領域を配列番号１および配列番号２のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、ＣＵＧＡ  ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）ニッポン・ジーン）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写によってＲＮＡを合成した。得られたＲＮＡはモル換算すると６３ｐｍｏｌであった。このＲＮＡとＢｍＭＬＶ液をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III ワンステップ  ＲＴ−ＰＣＲ  システム  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（インビトロジェン）によってＲＴ−ＰＣＲを行った。図１に示したように、両者の楔印をつけた検体の比較により半定量したところ、ＢｍＭＬＶ液にはゲノム換算で約３０ａｍｏｌ／μＬのＢｍＭＬＶが存在した。
【００１４】
（２）ＢｍＭＬＶの検出法
活性を有するＢｍＭＬＶの検定系として、ＢｍＭＬＶを昆虫由来Ｓｆ−９細胞に感染させる方法の利用が可能か試験した。（１）で調製したＢｍＭＬＶ液１Ｘ１０−７〜２０μＬを１２穴培養プレートで培養した１Ｘ１０５個のＳｆ−９細胞に添加し、１時間２６℃で保温後、新鮮な１０％牛血清アルブミンを含むＴＣ−１００培地で細胞を洗浄し、同培地を添加して２６℃で５日間培養した。培養プレートのそれぞれの穴を、ＰＢＳで１回洗浄後、各細胞サンプルからＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン）によってＲＮＡを抽出し、３０μＬの水でＲＮＡを回収した。このＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III ワンステップ  ＲＴ−ＰＣＲ  システム  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（インビトロジェン）によって配列番号１および配列番号２のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。図２の楔印に示したように、１Ｘ１０−４μＬのＢｍＭＬＶ液を添加した検体までＢｍＭＬＶは検出され、Ｓｆ−９細胞を用いて活性を有するＢｍＭＬＶを高感度に検出することができた。
【００１５】
（３）塩化ベンザルコニウム処理によるＢｍＭＬＶの不活化
（１）で調製したＢｍＭＬＶ液１００μＬに、処理濃度の２倍濃度の塩化ベンザルコニウム水溶液１００μＬを加え、室温で６時間放置した。本ＢｍＭＬＶの処理液を、Ｓｆ−９細胞培養用の培地で１００倍に希釈した後、（２）の方法により、Ｓｆ−９細胞へ添加し５日間培養後にＳｆ−９細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。またコントロールとして生細胞に普遍的に発現しているβアクチン遺伝子を同様の方法で、配列番号３および配列番号４のプライマーを用いて測定した。その結果、図３の楔印で示した比較のとおり、０．１％以上の塩化ベンザルコニウムで処理したＢｍＭＬＶを添加し、培養したＳｆ−９細胞からはＢｍＭＬＶの核酸は検出されなかった。すなわちＢｍＭＬＶは０．１％以上の塩化ベンザルコニウム処理することによって不活化されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明は、遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いた有用タンパク質の製造に限らず、形質転換カイコ細胞や形質転換カイコを用いた有用タンパク質の製造に応用することができるが、その応用範囲が、これらに限られるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は実施例１においてBmMLV液中に存在するBmMLVをゲノム換算で半定量した電気泳動の結果である。
【図２】図２は実施例２においてBmMLVをSf-9細胞に添加後培養し、Sf-9細胞からBmMLVの検出することによって、活性のあるBmMLVを検出する検出系を構築した電気泳動の結果である。
【図３】図３は実施例３において塩化ベンザルコニウム処理することによってBmMLVが不活化されることを確認した電気泳動の結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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