(57)【要約】【課題】卵母細胞を凍結させそして解凍するための再生可能な方法および組成物を提供すること。【解決手段】おおよそ動物の体温（特に、ヒトの体温）に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液の使用が、必要に応じて１種または１種よりも多い低温保存溶液（これもまた初期におおよそ体温に維持される）のその後の使用と組み合わされて、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させること、および低温保存を開始することにおける細胞ストレスを最小にするという発見に基づき、新たに収集された成熟した動物の卵母細胞を低温保存するための方法、卵母細胞を低温保存するための安定化溶液、および凍結保護物質を含む卵母細胞の凍結のための凍結保護物質溶液などが本発明によって提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
新たに収集された成熟した哺乳動物の卵母細胞に由来する成熟した収集された哺乳動物の卵母細胞を低温保存するための方法であって、該方法は、
ａ）新たに収集された成熟した卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液中で、該卵母細胞をインビトロ条件に対して安定化するために十分な期間インキュベートする工程であって、ここで、１種よりも多い安定化溶液が使用される場合、各溶液は互いに異なる、工程；
ｂ）凍結保護物質を、該ａ）の工程に由来する該安定化された成熟した卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液と該卵母細胞とを、細胞質内の水の少なくとも一部が凍結保護物質に置き換えられる条件下で接触させることによって、導入する工程；
ｃ）該ｂ）の工程に由来する該卵母細胞を、凍結保護物質と脱水剤とを含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された少なくとも第１の脱水／凍結保護溶液に、さらなる細胞質内の水を除去すると同時にさらなる凍結保護物質を該細胞質に導入するために十分な条件下で、移す工程；
ｄ）該ｃ）の工程の該脱水／凍結保護溶液の温度を、約３分〜１０分間の期間の間に、約２２℃〜約２６℃の温度に低下させる工程；
ｅ）該ｄ）の工程で形成された該脱水／凍結保護溶液中の該卵母細胞を、容器に移す工程であって、該容器は次いで密封される、工程；および
ｆ）該卵母細胞を低温保存する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記卵母細胞がヒトの卵母細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２種の安定化溶液が使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記安定化溶液が、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ならびに必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）からなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記卵母細胞のインビトロ安定化が、第１の安定化溶液中で、約３５℃〜３８℃の温度で、約１時間〜３時間の期間行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記卵母細胞のインビトロ安定化が、ＳＳＳを補充した約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持されたＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ中で、約２時間の期間行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＳＳが約１０体積パーセント存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記卵母細胞が、前記第１の安定化溶液から第２の安定化溶液に移され、該第２の安定化溶液もまた、該卵母細胞への凍結保護物質の導入前に該卵母細胞のさらなる安定化を可能にするために十分な期間、約３３℃〜３８℃の温度に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の安定化溶液が、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ならびに必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記卵母細胞のインビトロ安定化が、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含む第２の安定化溶液中で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の安定化溶液が、ｍＨＴＦと約１０体積パーセント〜３０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３３℃〜３８℃の温度で約１分〜８分間の期間維持される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２の安定化溶液が、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度で約２分〜５分間の期間維持される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
凍結保護物質が、前記安定化された成熟した動物の卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液と該卵母細胞とを接触させることによって導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記凍結保護物質溶液が、凍結保護物質とＳＳＳとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記凍結保護物質がプロピレングリコール（ＰＧ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記凍結保護物質溶液が、プロピレングリコールと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、初期に約３５℃〜３７℃の温度に維持され、ここで、該凍結保護物質溶液中のプロピレングリコールの濃度が１．５Ｍである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記凍結保護物質の導入が、細胞質内の水の排出に付随して凍結保護物質の少なくとも一部を前記卵母細胞の細胞質に導入するために十分な期間維持される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記凍結保護物質の導入が、約１分〜５分間の範囲の期間維持される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
手順ｂ）から回収された前記卵母細胞が、第１の脱水／凍結保護溶液中でインキュベートされ、該第１の脱水／凍結保護溶液が、初期に約３３℃〜３８℃の温度で、該卵母細胞へのさらなる凍結保護物質の導入と組み合わされたさらなる脱水をもたらすために十分な期間維持される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の脱水／凍結保護溶液中での前記卵母細胞のインキュベーションが、約１分〜５分間の期間維持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
インキュベーション後、次いで、前記第１の脱水／凍結保護溶液が、約３分〜１０分間の期間にわたって、約２２℃〜２６℃の温度に冷却される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の脱水／凍結保護溶液が、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．０５Ｍ〜０．１５Ｍのスクロースとを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第２の脱水／凍結保護溶液中での前記卵母細胞のインキュベーションを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２のインキュベーションにおける前記脱水／凍結保護溶液が、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．１５Ｍ〜０．３Ｍのスクロースとを含み、さらに、約２２℃〜２６℃の温度を維持する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の脱水／凍結保護溶液への前記卵母細胞の曝露時間が、約１分〜５分間である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
卵母細胞の低温保存のための安定化溶液であって、
Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）、ならびにＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）から選択される安定化溶液を含み、
ここで、該安定化溶液は約３３℃〜３８℃の温度である、安定化溶液。
【請求項２７】
前記安定化溶液が約３５℃〜３８℃の温度である、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項２８】
前記安定化溶液が約３６．５℃〜３７．５℃の温度である、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項２９】
前記安定化溶液が卵母細胞の凍結のためのものである、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３０】
前記安定化溶液が、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させることにおける細胞ストレスを最小にする、請求項２９に記載の安定化溶液。
【請求項３１】
前記安定化溶液が、卵母細胞の解凍のためのものである、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３２】
前記安定化溶液が、受精前に卵母細胞を安定化する、請求項３１に記載の安定化溶液。
【請求項３３】
前記安定化溶液が、約１０体積パーセントのＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ  ｍｅｄｉａを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３４】
前記安定化溶液が、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含み、約３５℃〜３８℃の温度に維持される、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３５】
前記安定化溶液が、ｍＨＴＦと約１０〜３０体積パーセントのＳＳＳとを含む、請求項３４に記載の安定化溶液。
【請求項３６】
前記安定化溶液が、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３７】
前記安定化溶液が、表１、表２、および表９からなる群より選択される、請求項２６に記載の安定化溶液。
【請求項３８】
凍結保護物質を含む、卵母細胞の凍結のための凍結保護物質溶液であって、該凍結保護物質溶液は、約３３℃〜３８℃の温度に維持され、該凍結保護物質溶液は、低温保存のプロセスの間に卵母細胞の生存を促進する、凍結保護物質溶液。
【請求項３９】
前記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４０】
前記凍結保護物質がプロピレングリコールである、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４１】
前記凍結保護物質がさらにＳＳＳを含む、請求項４０に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４２】
前記凍結保護物質溶液が、プロピレングリコールと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含む、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４３】
前記凍結保護物質が、プロピレングリコールおよび約２０体積パーセントのＳＳＳであり、該プロピレングリコールが１Ｍ〜２Ｍの濃度である、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４４】
前記低温保存の間に前記卵母細胞中の細胞質内の水の脱水を容易にする因子をさらに含む、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４５】
前記因子が、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、およびラフィノースからなる群より選択される、請求項４４に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４６】
前記因子がスクロースである、請求項４５に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４７】
前記凍結保護物質が１．５Ｍのプロピレングリコールであり、前記因子が０．１２Ｍのスクロースである、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４８】
前記凍結保護物質が１．５Ｍのプロピレングリコールであり、前記因子が０．２４Ｍのスクロースである、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４９】
前記凍結保護物質溶液が約３５℃〜３７℃の温度に維持される、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項５０】
前記凍結保護物質溶液が、表３、表４、および表５からなる群より選択される、請求項３８に記載の凍結保護物質溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で米国仮特許出願第６０／８５９，３０５号（２００６年１１月１５日出願）に対して優先権を主張する米国特許出願番号第１１／６９４，８４７号（２００７年３月３０日出願）の一部継続出願である。これらの出願のいずれも、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、卵母細胞（特に、ヒトの卵母細胞のような哺乳動物の卵母細胞）を低温保存するために有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（当該分野の状況）
解凍の際に高い割合の生存能をもたらす容易に再生可能な様式で卵母細胞を低温保存する能力は、いまだ達成されていない。しかし、凍結（ｆｒｅｅｚｅ）した卵母細胞から子孫を首尾よく生み出すことが可能であることが示されている。したがって、これは、卵母細胞を凍結させそして解凍するための再生可能な方法が達成可能であることを示唆する。
【０００４】
数種の卵母細胞凍結技術が示唆されており、各々がそれに特有の一連の利点および不利点を伴う。しかし全体として、これらの方法はかなり非効率的で、予測不可能であり、そして卵母細胞の解凍生存度、卵母細胞の受精、および胚分割に関しては最適以下の割合を生じている。
【０００５】
これらの以前に示唆された技術の典型的なものとしては、卵母細胞を数種の溶液に連続して移動させることによって低温保存するために、最近収集した卵母細胞を調製することが挙げられる。Ｆａｂｂｒｉの特許文献１では、収集した卵母細胞は、合成血清代替物（ＳＳＳ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む洗浄溶液と接触され、その後０．３５ｍＬの１．５Ｍ  プロピレングリコールと６．７９ｍＬ  ＰＢＳ中の０．１５ｍＬ  ＳＳＳとを含む平衡溶液中で例えば１０分間インキュベーションされた後、卵母細胞が凍結保護溶液に導入された。Ｆａｂｂｒｉの洗浄溶液および平衡溶液のいずれも、使用前に約１５分間室温で管理された。
【０００６】
Ｂｏｌｄｔの特許文献２では、ナトリウム欠乏媒体が使用される。
【０００７】
平衡後、凍結保護溶液（例えば、プロピレングリコールまたはＤＭＳＯを含む溶液）が卵母細胞と接触され、その結果、いずれも浸透圧の原理によって、細胞質内の水が除去されるにつれて、凍結保護物質（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）が卵母細胞の細胞質に導入される。代表的に、少なくとも第１の凍結保護溶液の初期温度が、おおよそ室温（例えば、２０℃〜２５℃）に維持される。各々の凍結保護溶液は、凍結保護剤（例えば、１．５Ｍ  プロピレングリコール）を含み、必要に応じて、スクロースのような脱水剤を含む。凍結保護剤は細胞質に導入され、次いで、その細胞は、最終的にそれらが低温保存のために液体窒素に浸漬されるまで、制御された様式で冷却される。
【０００８】
低温保存された卵母細胞の解凍は、代表的に、逆の様式で起こり、その様式において、初期溶液は、凍結保護物質が高濃度に維持され、その後の溶液でその凍結保護物質が連続的に希釈される。凍結プロセスとは異なり、解凍プロセスは、代表的に、３０℃あたりで開始され、その後の溶液は、おおよそ室温に維持される。
【０００９】
文献における成功の記載にもかかわらず、凍結から出生までの全体的な成功率は、許容し得ないほど低い。
【特許文献１】米国特許第７，０１１，９３７号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２５００８８号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、卵母細胞を凍結させそして解凍するための再生可能な方法および組成物を提供することが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、卵母細胞の凍結保護において使用するための方法および組成物に関する。
【００１２】
本発明は、部分的に、低温保存技術の開始後のみならず開始前に、収集した卵母細胞において細胞ストレスを最小にすることが、再生可能な低温保存方法論を提供するために不可欠であるという発見に基づく。具体的に、一局面において、本発明は、おおよそ動物の体温（特に、ヒトの体温）に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液の使用が、必要に応じて１種または１種よりも多い低温保存溶液（これもまた初期におおよそ体温に維持される）のその後の使用と組み合わされて、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させること、および低温保存を開始することにおける細胞ストレスを最小にするという発見に関する。
【００１３】
したがって、本発明の一実施形態において、新たに収集された成熟した動物の卵母細胞を低温保存するための方法が提供され、その方法は、
ａ）新たに収集された成熟した卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液中で、その卵母細胞をインビトロ条件に対して安定化するために十分な期間インキュベートする工程であって、ここで、１種よりも多い安定化溶液が使用される場合、各溶液は互いに異なる、工程；
ｂ）凍結保護物質を、上記ａ）の工程に由来する安定化された成熟した卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液とその卵母細胞とを、細胞質内の水の少なくとも一部が凍結保護物質に置き換えられる条件下で接触させることによって、導入する工程；
ｃ）上記ｂ）の工程に由来する卵母細胞を、凍結保護物質と脱水剤とを含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された少なくとも第１の脱水／凍結保護溶液に、さらなる細胞質内の水を除去すると同時にさらなる凍結保護物質をその細胞質に導入するために十分な条件下で、移す工程；
ｄ）上記ｃ）の工程の脱水／凍結保護溶液の温度を、約３分〜１０分間の期間の間に、約２２℃〜約２６℃の温度に低下させる工程；
ｅ）上記ｄ）の工程で形成された脱水／凍結保護溶液中の卵母細胞を、容器に移す工程であって、その容器は次いで密封される、工程；および
ｆ）その卵母細胞を低温保存する工程
を包含する。
【００１４】
したがって、本発明の一実施形態において、卵母細胞の低温保存のための安定化溶液が提供され、その安定化溶液としては、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）、ならびにＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。安定化溶液は、約３３℃〜３８℃の温度である。
【００１５】
本発明の一実施形態において、凍結保護物質を含む、卵母細胞の凍結のための凍結保護物質溶液が提供され、その凍結保護物質溶液は、約３３℃〜３８℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、低温保存の間に卵母細胞の生存を促進する。
【００１６】
本発明はさらに、以下を提供する。
(項目１）
新たに収集された成熟した哺乳動物の卵母細胞に由来する成熟した収集された哺乳動物の卵母細胞を低温保存するための方法であって、その方法は、
ａ）新たに収集された成熟した卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液中で、その卵母細胞をインビトロ条件に対して安定化するために十分な期間インキュベートする工程であって、ここで、１種よりも多い安定化溶液が使用される場合、各溶液は互いに異なる、工程；
ｂ）凍結保護物質を、そのａ）の工程に由来するその安定化された成熟した卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液とその卵母細胞とを、細胞質内の水の少なくとも一部が凍結保護物質に置き換えられる条件下で接触させることによって、導入する工程；
ｃ）そのｂ）の工程に由来するその卵母細胞を、凍結保護物質と脱水剤とを含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された少なくとも第１の脱水／凍結保護溶液に、さらなる細胞質内の水を除去すると同時にさらなる凍結保護物質をその細胞質に導入するために十分な条件下で、移す工程；
ｄ）そのｃ）の工程のその脱水／凍結保護溶液の温度を、約３分〜１０分間の期間の間に、約２２℃〜約２６℃の温度に低下させる工程；
ｅ）そのｄ）の工程で形成されたその脱水／凍結保護溶液中のその卵母細胞を、容器に移す工程であって、その容器は次いで密封される、工程；および
ｆ）その卵母細胞を低温保存する工程、
を包含する、方法。
(項目２）
上記卵母細胞がヒトの卵母細胞である、項目１に記載の方法。
(項目３）
２種の安定化溶液が使用される、項目２に記載の方法。
(項目４）
上記安定化溶液が、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ならびに必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）からなる群より選択される、項目３に記載の方法。
(項目５）
上記卵母細胞のインビトロ安定化が、第１の安定化溶液中で、約３５℃〜３８℃の温度で、約１時間〜３時間の期間行われる、項目２に記載の方法。
(項目６）
上記卵母細胞のインビトロ安定化が、ＳＳＳを補充した約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持されたＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ中で、約２時間の期間行われる、項目２に記載の方法。
(項目７）
上記ＳＳＳが約１０体積パーセント存在する、項目６に記載の方法。
(項目８）
上記卵母細胞が、上記第１の安定化溶液から第２の安定化溶液に移され、その第２の安定化溶液もまた、その卵母細胞への凍結保護物質の導入前にその卵母細胞のさらなる安定化を可能にするために十分な期間、約３３℃〜３８℃の温度に維持される、項目１に記載の方法。
(項目９）
上記第２の安定化溶液が、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ならびに必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）からなる群より選択される、項目８に記載の方法。
(項目１０）
上記卵母細胞のインビトロ安定化が、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含む第２の安定化溶液中で行われる、項目９に記載の方法。
(項目１１）
上記第２の安定化溶液が、ｍＨＴＦと約１０体積パーセント〜３０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３３℃〜３８℃の温度で約１分〜８分間の期間維持される、項目１０に記載の方法。
(項目１２）
上記第２の安定化溶液が、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度で約２分〜５分間の期間維持される、項目１１に記載の方法。
(項目１３）
凍結保護物質が、上記安定化された成熟した動物の卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液とその卵母細胞とを接触させることによって導入される、項目２に記載の方法。
(項目１４）
上記凍結保護物質溶液が、凍結保護物質とＳＳＳとを含む、項目１３に記載の方法。
(項目１５）
上記凍結保護物質がプロピレングリコール（ＰＧ）である、項目１４に記載の方法。
(項目１６）
上記凍結保護物質溶液が、プロピレングリコールと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、初期に約３５℃〜３７℃の温度に維持され、ここで、その凍結保護物質溶液中のプロピレングリコールの濃度が１．５Ｍである、項目１５に記載の方法。
(項目１７）
上記凍結保護物質の導入が、細胞質内の水の排出に付随して凍結保護物質の少なくとも一部を上記卵母細胞の細胞質に導入するために十分な期間維持される、項目１３に記載の方法。
(項目１８）
上記凍結保護物質の導入が、約１分〜５分間の範囲の期間維持される、項目１７に記載の方法。
(項目１９）
手順ｂ）から回収された上記卵母細胞が、第１の脱水／凍結保護溶液中でインキュベートされ、その第１の脱水／凍結保護溶液が、初期に約３３℃〜３８℃の温度で、その卵母細胞へのさらなる凍結保護物質の導入と組み合わされたさらなる脱水をもたらすために十分な期間維持される、項目２に記載の方法。
(項目２０）
上記第１の脱水／凍結保護溶液中での上記卵母細胞のインキュベーションが、約１分〜５分間の期間維持される、項目１９に記載の方法。
(項目２１）
インキュベーション後、次いで、上記第１の脱水／凍結保護溶液が、約３分〜１０分間の期間にわたって、約２２℃〜２６℃の温度に冷却される、項目１９に記載の方法。
(項目２２）
上記第１の脱水／凍結保護溶液が、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．０５Ｍ〜０．１５Ｍのスクロースとを含む、項目２１に記載の方法。
(項目２３）
第２の脱水／凍結保護溶液中での上記卵母細胞のインキュベーションを含む、項目２に記載の方法。
(項目２４）
上記第２のインキュベーションにおける上記脱水／凍結保護溶液が、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．１５Ｍ〜０．３Ｍのスクロースとを含み、さらに、約２２℃〜２６℃の温度を維持する、項目２３に記載の方法。
(項目２５）
上記第２の脱水／凍結保護溶液への上記卵母細胞の曝露時間が、約１分〜５分間である、項目２３に記載の方法。
(項目２６）
卵母細胞の低温保存のための安定化溶液であって、
Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）、ならびにＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）から選択される安定化溶液を含み、
ここで、その安定化溶液は約３３℃〜３８℃の温度である、安定化溶液。
(項目２７）
上記安定化溶液が約３５℃〜３８℃の温度である、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目２８）
上記安定化溶液が約３６．５℃〜３７．５℃の温度である、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目２９）
上記安定化溶液が卵母細胞の凍結のためのものである、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３０）
上記安定化溶液が、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させることにおける細胞ストレスを最小にする、項目２９に記載の安定化溶液。
(項目３１）
上記安定化溶液が、卵母細胞の解凍のためのものである、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３２）
上記安定化溶液が、受精前に卵母細胞を安定化する、項目３１に記載の安定化溶液。
(項目３３）
上記安定化溶液が、約１０体積パーセントのＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ  ｍｅｄｉａを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３４）
上記安定化溶液が、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含み、約３５℃〜３８℃の温度に維持される、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３５）
上記安定化溶液が、ｍＨＴＦと約１０〜３０体積パーセントのＳＳＳとを含む、項目３４に記載の安定化溶液。
(項目３６）
上記安定化溶液が、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３７）
上記安定化溶液が、表１、表２、および表９からなる群より選択される、項目２６に記載の安定化溶液。
(項目３８）
凍結保護物質を含む、卵母細胞の凍結のための凍結保護物質溶液であって、その凍結保護物質溶液は、約３３℃〜３８℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、低温保存のプロセスの間に卵母細胞の生存を促進する、凍結保護物質溶液。
(項目３９）
上記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４０）
上記凍結保護物質がプロピレングリコールである、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４１）
上記凍結保護物質がさらにＳＳＳを含む、項目４０に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４２）
上記凍結保護物質溶液が、プロピレングリコールと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含む、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４３）
上記凍結保護物質が、プロピレングリコールおよび約２０体積パーセントのＳＳＳであり、そのプロピレングリコールが１Ｍ〜２Ｍの濃度である、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４４）
上記低温保存の間に上記卵母細胞中の細胞質内の水の脱水を容易にする因子をさらに含む、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４５）
上記因子が、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、およびラフィノースからなる群より選択される、項目４４に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４６）
上記因子がスクロースである、項目４５に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４７）
上記凍結保護物質が１．５Ｍのプロピレングリコールであり、上記因子が０．１２Ｍのスクロースである、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４８）
上記凍結保護物質が１．５Ｍのプロピレングリコールであり、上記因子が０．２４Ｍのスクロースである、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目４９）
上記凍結保護物質溶液が約３５℃〜３７℃の温度に維持される、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
(項目５０）
上記凍結保護物質溶液が、表３、表４、および表５からなる群より選択される、項目３８に記載の凍結保護物質溶液。
【００１７】
添付の図面は、従来の凍結保護によって誘発される細胞ストレスのほんの一因を示す。細胞ストレスおよび潜在的な細胞溶解をもたらす他の要因としては、細胞からの水の急速な流出を生じる浸透ストレス（これは、細胞内小器官を損傷し得、そして／または細胞膜破裂を生じ得る）；温度の突然の変化に起因する熱ストレス；卵母細胞が凍結保護物質に曝露される時間の長さに起因する毒性が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、他に示されない限り、以下の定義を適用するものとする。
【００１９】
「成熟した動物の卵母細胞」とは、成熟の尺度で「成熟期−−ＭＩＩ」と格付けされる収集された卵母細胞を指す。この尺度はさらに、収集された卵母細胞を「中期−−（ＭＩ）」または「未成熟期−−（ＧＶ）」と同定する。
【００２０】
用語「卵」は、本明細書中で使用される場合、用語「卵母細胞」と同義であるように意味される。
【００２１】
「新たに収集された」とは、卵母細胞が、安定化／低温保存プロセスの開始の８時間以内に、好ましくは安定化／低温保存プロセスの開始の４時間以内に、より好ましくは安定化／低温保存プロセスの開始の１時間以内に、そしてさらにより好ましくは安定化／低温保存プロセスの開始の０．１時間以内に、動物ドナーから収集されたことを意味する。
【００２２】
「安定化溶液」とは、新たに収集された成熟した卵母細胞がインビボ抽出後にインキュベートされ、その卵母細胞を低温保存プロセスの開始前にそのインビトロ環境で平衡化することを可能にする溶液を指す。安定化溶液は、インビトロでの卵母細胞のさらなる成熟を可能にすることが意図される。具体的に、安定化溶液は、卵が取り出された小胞内の環境を模倣するように設計される。小胞は、インビボで卵母細胞の成熟の継続中のプロセスを支持し、そのプロセスは、好ましくは、卵母細胞が小胞から取り出され、安定化溶液に入れられるときに再現される。安定化溶液はまた、さらなる減数分裂の進行のための養分を提供し、そして卵母細胞内で継続する代謝プロセスを支持し、さらに細胞膜を支持する。安定化溶液のさらなる機能は、卵母細胞内の代謝から生じる生物学的廃棄物を除去すること、および卵母細胞内のｐＨを安定化することである。安定化溶液は、いかなる凍結保護物質も、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もプロピレングリコールも含まない。本発明で有用な安定化溶液としては、例示の目的で、Ｇｌｏｂａｌ（登録商標）媒体（Ｌｉｆｅ  Ｇｌｏｂａｌ，ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅから入手可能）、ＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ（登録商標）媒体（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ−Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）（必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）が補充される）、ならびに改変ＨＴＦ（ＨＥＰＥＳを含むＨＴＦ（ｍＨＴＦ）−Ｌｉｆｅ  Ｇｌｏｂａｌ，ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅから入手可能）（必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ナトリウム欠乏ＰＢＳ（例えば、リン酸水素ナトリウム（Ｈ２ＮａＰＯ４））が補充される）などが挙げられる。
【００２３】
「安定化された卵母細胞」とは、依然として卵丘塊（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｍａｓｓ）（顆粒膜細胞）を保持する成熟した卵母細胞を指し、その卵丘塊は、その卵丘塊中のギャップジャンクションを通して養分を取り込むことによって卵母細胞の成熟を可能にする。成熟した卵母細胞は、第１極体の放出に関連する減数分裂紡錘体を形成すること、さらに細胞内タンパク質の完全性／活性を維持することによって特徴付けられる。
【００２４】
この点について、多くのポリペプチドホルモンが卵母細胞の様々な区画で見出されている。例えば、細胞質内タンパク質（例えば、６−ＧＤＰ；グルコースリン酸イソメラーゼ（ＧＰＩ）；クレアチンキナーゼおよびＬＤＨ）は、特異的に細胞質においてそれらの効果を発揮する。他のタンパク質は、卵母細胞の細胞膜に関連し、受動的にまたは活性なエンドサイトーシスによってインポートされる。透明帯として、ポリペプチドの異なる群が、精子の侵入を容易にするためのレセプター特異性において役割を果たし得る。さらに、別のファミリーのタンパク質は、卵内で休眠状態（ｄｏｒｍａｎｔ）を維持し、その後の胚成長の間にのみ活性化もしくは再活性化された状態になり得る。
【００２５】
いずれにしろ、凍結そしてその後の解凍後にこれらのタンパク質／ポリペプチドがそれらの意図される使用のために卵母細胞内で利用され得るように、これらのタンパク質／ポリペプチドの完全性／活性を維持することは、安定化溶液の本質的な特徴である。
【００２６】
用語「凍結保護物質」とは、代表的に浸透圧性の方法によって動物の卵母細胞の細胞壁を越えて浸透し、低温保存された状態のみならず低温保存のプロセスの間も卵母細胞の生存および生存能の保持を促進する液体を指す。適切な凍結保護物質は当該分野で周知であり、例示のみの目的で、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）、グリセロール、およびそのような凍結保護物質のうちの２種以上の混合物などが挙げられる。
【００２７】
用語「脱水／凍結保護溶液」とは、低温保存の間に卵母細胞中の細胞質内の水の脱水を容易にするための因子をさらに含む、上記のような凍結保護溶液を指す。好ましくは、そのような因子は、卵母細胞の細胞壁を浸透圧では越えない。脱水剤としては、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノースなどが挙げられる。
【００２８】
用語「Ｇｌｏｂａｌ（登録商標）媒体」、「ＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ（登録商標）媒体」「ヒト卵管溶液」または「改変ヒト卵管溶液」とは、市販の溶液（本明細書に記載されるとおり）、あるいは表１〜表２および／または表９の溶液組成を指す。
【００２９】
（１．方法論）
本発明の方法は、新たに収集した動物の卵母細胞の低温保存を効率的に行うための多段階プロセスに関する。具体的に、新たに収集された成熟した収集された動物の卵母細胞を低温保存するための方法が提供され、その方法は、
ａ）新たに収集された成熟した卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された１種または１種よりも多い安定化溶液中で、その卵母細胞をインビトロ条件に対して安定化するために十分な期間インキュベートする工程であって、ここで、１種よりも多い安定化溶液が使用される場合、各溶液は互いに異なる、工程；
ｂ）凍結保護物質を、上記ａ）の工程に由来する安定化された成熟した卵母細胞に、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液とその卵母細胞とを、細胞質内の水の少なくとも一部が凍結保護物質に置き換えられる条件下で接触させることによって、導入する工程；
ｃ）上記ｂ）の工程に由来する卵母細胞を、凍結保護物質と脱水剤とを含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された少なくとも第１の脱水／凍結保護溶液に、さらなる細胞質内の水を除去すると同時にさらなる凍結保護物質をその細胞質に導入するために十分な条件下で、移す工程；
ｄ）上記ｃ）の工程の脱水／凍結保護溶液の温度を、約３分〜１０分間の期間の間に、約２２℃〜約２６℃の温度に低下させる工程；
ｅ）上記ｄ）の工程で形成された脱水／凍結保護溶液中の卵母細胞を、容器に移す工程であって、その容器は次いで密封される、工程；および
ｆ）その卵母細胞を低温保存する工程
を包含する。
【００３０】
以下の議論において、用語「卵母細胞」とは、この用語が「１つ」、「ある」、「その」、「上記」などのような語を用いるかどうかにかかわらず、単数および複数の両方を指す。
【００３１】
上記の手順ａ）に関して、低温保存の開始前の新たに収集した成熟した卵母細胞のインビトロ安定化は、好ましくは、その卵母細胞をインビトロで、１種または１種よりも多い安定化溶液中で、約３３℃〜３８℃の温度で、その卵母細胞がそのインビトロ環境中で安定化されることを可能にするために十分な期間インキュベートすることを含む。この実施形態の１つの好ましい局面において、上記安定化溶液は、Ｇｌｏｂａｌ  ＭｅｄｉａまたはＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａから選択される。
【００３２】
好ましくは、卵母細胞のインビトロ安定化は、第１の安定化溶液中で、約３５℃〜３８℃の温度で、約０．４時間〜約４時間、より好ましくは約１時間〜３時間の期間行われる。さらにより好ましくは、卵母細胞のインビトロ安定化は、ＳＳＳ（好ましくは約１０体積パーセント）を補充した約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持されたＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ中で、約２時間の期間行われる。
【００３３】
必要に応じて、卵母細胞のさらなるインビトロ安定化が、卵母細胞を第１の安定化溶液から第２の安定化溶液に移すことによって行われ、その第２の安定化溶液は、約３３℃〜３８℃の温度で、卵母細胞への凍結保護物質の導入の前に卵母細胞のさらなる安定化を可能にするために十分な期間維持され、その第２の安定化溶液は、第１の安定化溶液と異なる。上記第２の安定化溶液は、好ましくは、ｍＨＴＦとＳＳＳ（より好ましくは、約１０体積パーセント〜３０体積パーセントのＳＳＳ）とを含み、ここで、その溶液は、約３３℃〜３８℃の温度で、約１分〜８分間の期間維持される。最も好ましくは、この溶液は、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度で、約２分〜５分間の期間、特に、約３分間維持される。
【００３４】
安定化された卵母細胞の低温保存は、凍結保護物質をその卵母細胞の細胞質に、代表的に浸透圧の原理によって導入することによって開始される。これは、好ましくは、卵母細胞を、凍結保護物質を含む約３３℃〜約３８℃の温度に維持された水溶液と接触させる工程を包含する方法によって達成される。好ましい実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、凍結保護物質とＳＳＳとを含む。さらにより好ましくは、この溶液は、プロピレングリコール（ＰＧ）と約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、初期に約３５℃〜３７℃の温度に維持される。ＰＧは、好ましくは、水溶液中で１Ｍ〜２Ｍの濃度に、より好ましくは、水溶液中で約１．５Ｍの濃度に維持される。代表的に、この導入段階は、上記のとおりこの溶液の温度を維持しながら、細胞質内の水の排出に付随して凍結保護物質の少なくとも一部を卵母細胞の細胞質に導入するために十分な期間継続される。好ましくは、この導入段階は、約１分〜５分間、より好ましくは約１．５分〜３分間、そしてさらにより好ましくは約２分間に及ぶ。
【００３５】
その後、その細胞質の少なくとも一部に凍結保護物質を含む卵母細胞は、１種または１種よりも多い脱水／凍結保護溶液に移され、ここで、凍結前に、再び浸透圧の原理によって、さらなる細胞質の水が除去される。この実施形態において、卵母細胞からの細胞質の水の除去と同時にその細胞質にさらなる凍結保護物質を導入することは、好ましくは、その卵母細胞を少なくとも第１の脱水／凍結保護溶液中でインキュベートする工程を包含する方法によって行われ、その脱水／凍結保護溶液は、初期に約３３℃〜３８℃の温度で、卵母細胞へのさらなる凍結保護物質の導入と組み合わされたさらなる脱水をもたらすために十分な期間維持される。好ましくは、この第１の脱水／凍結保護溶液に対する卵母細胞の曝露は、約１分〜５分間、より好ましくは、約３分間に及ぶ。次いで、この溶液は、約３分〜１０分間の期間にわたって、好ましくは約５分間で、約２２℃〜２６℃の温度に冷却される。上記第１の脱水／凍結保護溶液は、好ましくは、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．０５Ｍ〜０．１５Ｍのスクロースとを含み；より好ましくは、約１．５Ｍのプロピレングリコールと約０．１２Ｍのスクロースとを含む。
【００３６】
必要に応じて、卵母細胞からの細胞質の水のさらなる除去と同時にその細胞質になおさらなる凍結保護物質を導入することが、第２の脱水／凍結保護溶液の使用によって達成され得る。この第２の脱水／凍結保護溶液は、好ましくは、約１Ｍ〜２Ｍのプロピレングリコールと約０．１５Ｍ〜０．３Ｍのスクロースとを含み；より好ましくは、約１．５Ｍのプロピレングリコールと約０．２４Ｍのスクロースとを含む。この第２の溶液に対する卵母細胞の曝露時間は比較的短く、代表的に、約１分〜５分間であるが、好ましくは、１分〜３分間、さらにより好ましくは、約２分間であり、さらに、その溶液は、約２２℃〜２６℃の温度に維持される。
【００３７】
次いで、このように処理された卵母細胞は、密封された容器に移され、低温保存される。調製された卵母細胞の低温保存は、従来の技術によって進行し、その技術としては、Ｆａｂｂｒｉらの米国特許第７，０１１，９３７号（この特許は、その全体が参考として援用される）によって記載されたものと類似の様式での卵母細胞の遅延型凍結（ｓｌｏｗ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）が挙げられる。一実施形態において、そのように処理された卵母細胞は、適切な容器（例えば、０．２５ｍＬのプラスチックストロー）に充填される。それらのストローは、両端で密封され、Ｋｒｙｏ  １０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩＩ（Ｐｌａｎｅｒ  １０／１．７  ＧＢ）のような自動化生物学的直立型フリーザー中に置かれる。
【００３８】
上記ストローは、制御された冷却速度で約−７℃にチルドされ、その際に、水分子が結晶化するように誘発するために「シーディング」が行われる。好ましい実施形態において、上記ストローは、１分間あたり約−０．５℃〜約−４℃の速度で冷却され；より好ましくは、ストローは、１分間あたり約−１℃〜約−３℃の速度で冷却され；さらにより好ましくは、ストローは、１分間あたり約−２℃の速度で冷却される。−７℃での保持期間の後、冷却は、ストローが約−３３℃に達するまで制御された速度で再開され、卵母細胞への凍結保護物質の拡散を可能にする。好ましい実施形態において、上記ストローは、１分間あたり−０．１℃〜約−１℃の速度で冷却され；より好ましくは、ストローは、１分間あたり−０．２℃〜約−０．５℃の速度で冷却され；さらに好ましくは、ストローは、１分間あたり−０．３℃の速度で冷却される。次いで、ストローは、保管のために液体窒素中に入れられる。
【００３９】
本発明の方法において、細胞内の細胞質小器官および減数分裂紡錘体は、氷晶形成のせん断力から生じる損傷、および他の凍結プロトコルに関連する室温への曝露を容認される。
【００４０】
さらに、プロピレングリコール凍結保護物質に対する卵母細胞の曝露時間および曝露温度を制限することによって、本発明は、卵母細胞への毒性を最小にする。図１〜図３は、本発明の局面を示し、特に、細胞内の水が卵の外へ流れる速度、および凍結保護物質が卵の中に流れる速度が、飽和レベルに達するにつれて変化することを示す。具体的に、図１では、凍結溶液（凍結保護物質）によって囲まれた卵が示されている。流体交換は、細胞質の水が卵の外に流れ、凍結保護物質が卵の中に流れるにつれて、卵の膜を越えて起こる。
【００４１】
図２は、Ｆａｂｂｒｉら（前出）によって記載されるように、細胞質の水の除去が凍結保護物質の置き換えよりも速いことを示す。従来の手順の下で、細胞の外への細胞質の水のこの不均衡な流れは、卵母細胞の球形の性質の喪失、およびその表面上の起伏の存在を生じる。
【００４２】
図３は、卵がその最終的な収縮した状態に達するにつれてその卵が縮小することをさらに示す。凍結保護物質は、卵の内側の液体の大部分を置き換えており、凍結の準備をする。この時点で、卵は、凍結溶液と平衡である。凍結保護物質溶液中での卵の継続的なインキュベーションは、その卵形の形状への漸進的な戻りとあいまって卵の容積の増加を生じる。
【００４３】
（２．組成物）
本発明は、部分的に、おおよそ動物の体温（特に、ヒトの体温）に維持された卵母細胞の凍結のための１種または１種よりも多い安定化溶液の使用が、必要に応じて１種または１種よりも多い低温保存溶液（これもまた初期におおよそ体温に維持される）のその後の使用と組み合わされて、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させること、および低温保存を開始することにおける細胞ストレスを最小にするという発見に関する。本発明はさらに、部分的に、室温よりも高くかつ体温よりも低い温度に維持された卵母細胞の解凍のための１種または１種よりも多い安定化溶液の使用が、蘇生された卵母細胞における細胞ストレスを最小にし、受精前に卵母細胞を安定化するという発見に関する。
【００４４】
一局面において、本発明は、卵母細胞の低温保存のための安定化溶液に関し、その安定化溶液としては、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、合成血清代替物（ＳＳＳ）を補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、ＳＳＳおよび／または抗生物質で置き換えられたヒト卵管溶液（ＨＴＦ）、改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）、ならびにＳＳＳおよび／または抗生物質を含む改変ＨＴＦ（ｍＨＴＦ）挙げられるが、これらに限定されない。その安定化溶液は、約３３℃〜３８℃の温度である。
【００４５】
一実施形態において、上記安定化溶液は、約３５℃〜３８℃の温度である。
【００４６】
一実施形態において、上記安定化溶液は、約３６．５℃〜３７．５℃の温度である。
【００４７】
一実施形態において、上記安定化溶液は、卵母細胞の凍結のためのものである。１つの好ましい実施形態において、上記安定化溶液は、インビボからインビトロへ卵母細胞の環境を変化させることにおける細胞ストレスを最小にする。
【００４８】
一実施形態において、上記安定化溶液は、卵母細胞の解凍のためのものである。１つの好ましい実施形態において、上記安定化溶液は、受精の前に卵母細胞を安定化する。
【００４９】
一実施形態において、上記安定化溶液は、ＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される。１つの好ましい実施形態において、上記ＳＳＳは、約１０体積パーセント存在する。
【００５０】
一実施形態において、上記安定化溶液は、卵母細胞への凍結保護物質の導入前または導入後に、その卵母細胞を安定化する。
【００５１】
一実施形態において、上記安定化溶液は、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含む。１つの好ましい実施形態において、上記安定化溶液は、ｍＨＴＦとＳＳＳとを含み、３５℃〜３８℃の温度に維持される。
【００５２】
一実施形態において、上記安定化溶液は、ｍＨＴＦと約１０体積パーセント〜３０体積パーセントのＳＳＳとを含む。
【００５３】
１つの好ましい実施形態において、上記安定化溶液は、ｍＨＴＦと約２０体積パーセントのＳＳＳとを含み、約３６．５℃〜３７．５℃の温度に維持される。
【００５４】
１つの好ましい実施形態において、上記安定化溶液は、表１、表２、および表９からなる群より選択される。
【００５５】
一実施形態において、本発明は、凍結保護物質を含む卵母細胞の凍結のための凍結保護物質溶液に関し、その凍結保護物質溶液は、約３３℃〜３８℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、低温保存のプロセスの間に卵母細胞の生存を促進する。
【００５６】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、約３５℃〜３７℃の温度に維持される。
【００５７】
一実施形態において、上記凍結保護物質としては、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５８】
１つの好ましい実施形態において、上記凍結保護物質はプロピレングリコールである。
【００５９】
一実施形態において、上記凍結保護物質はさらにＳＳＳを含む。
【００６０】
一実施形態において、上記凍結保護物質は、プロピレングリコールおよび約２０体積パーセントのＳＳＳである。
【００６１】
一実施形態において、上記凍結保護物質は、プロピレングリコールおよび約２０体積パーセントのＳＳＳであり、そのプロピレングリコールは、１Ｍ〜２Ｍの濃度である。
【００６２】
別の実施形態において、上記凍結保護物質は、プロピレングリコールおよび約２０体積パーセントのＳＳＳであり、そのプロピレングリコールは、１．５Ｍの濃度である。
【００６３】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液はさらに、低温保存の間に卵母細胞中の細胞質内の水の脱水を容易にする因子を含む。
【００６４】
一実施形態において、上記因子としては、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、およびラフィノースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
１つの好ましい実施形態において、上記因子はスクロースである。
【００６６】
一実施形態において、上記因子は、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍのスクロースである。別の実施形態において、上記因子は、０．１５Ｍ〜０．３Ｍのスクロースである。
【００６７】
一実施形態において、上記凍結保護物質は上記凍結保護物質溶液中で１．５Ｍのプロピレングリコールであり、上記因子は上記凍結保護物質溶液中で０．１２Ｍのスクロースである。別の実施形態において、上記凍結保護物質は１．５Ｍのプロピレングリコールであり、上記因子は０．２４Ｍのスクロースである。
【００６８】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、表３、表４、および表５からなる群より選択される。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の特定の局面を例示するため、および本発明を実施することにおいて当業者を支援するために提供される。これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限すると考えられるべきではない。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例および本願の全体を通じて、以下の組成物が記載され、これらの組成物は以下に記載されるように市販されている。
【００７１】
Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅ、ｐ／ｎ  ＬＧＧＧ
合成血清代替物（ＳＳＳ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ  ９９１９３
改変ヒト卵管流体（ｍＨＴＦ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ  ９０１２６
プロピレングリコール、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｐ／ｎ  ２４１２２９  
スクロース、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｐ／ｎ  Ｓ１８８８。
【００７２】
以下の実施例において、すべてのパーセントは、他に指定されない限り体積パーセントである。同様に、すべての温度は、他に記載されない限り、摂氏温度で報告される。
【００７３】
実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する：
【００７４】
【化１】
2008118998.tif 000002
（実施例１）
卵母細胞の凍結
以下の実施例１では、以下の溶液が示される。これらの溶液を以下のとおりに調製した：
第１の安定化溶液。  卵母細胞の凍結のための第１の安定化溶液を、約１０体積％のＳＳＳを含むＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅ）を用いることによって調製した。
【００７５】
第２の安定化溶液。  第２の凍結溶液を調製し、これは、約８０体積％のｍＨＴＦを含み、ＳＳＳが補充されている。この溶液は、使用する前に４℃で保管されるべきである。
【００７６】
凍結保護物質溶液。  凍結保護物質溶液を、ｍＨＴＦ中の約１．５Ｍ  プロピレングリコールから調製し、ＳＳＳ（８０：２０）を補充し、そして好ましくは、ｐＨ７．２〜７．３で維持する。
【００７７】
脱水／凍結保護物質（Ｄ／Ｃ）溶液１。  Ｄ／Ｃ溶液１は、スクロース中に懸濁された約１．５Ｍのプロピレングリコールから構成され、さらに８０：２０のｍＴＨＦ／ＳＳＳを含む。好ましくは、そのスクロース濃度は、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍであり、０．１２Ｍの濃度が好ましい。好ましくは、この溶液は、７．２〜７．３のｐＨで維持される。
【００７８】
脱水／凍結保護物質（Ｄ／Ｃ）溶液２。  Ｄ／Ｃ溶液２は、スクロース中に懸濁された約１．５Ｍのプロピレングリコールから構成され、さらに８０：２０のｍＴＨＦ／ＳＳＳを含む。好ましくは、そのスクロースは、０．２０Ｍ〜０．３０Ｍであり、０．２４Ｍの濃度が好ましい。好ましくは、この溶液は、７．２〜７．３のｐＨで維持される。
【００７９】
（溶液の浸透圧）
プロピレングリコール（不凍剤）は、溶液の凍結点が代表的な溶質よりも実質的に低下されるように、その溶液の浸透圧について人工的に高い数字をもたらす。以下の表は、使用される成分の各々についての好ましい浸透圧を提供し、これは従来の方法を用いて溶液を改変することによって達成され得る。
【００８０】
【化２】
2008118998.tif 000003
浸透圧データは、上記安定化溶液が卵母細胞に、より高い浸透圧を有する凍結保護物質溶液に浸漬する前に低度〜中程度の浸透圧の溶液中で安定化する機会を提供することを示す。さらに、先行技術と比較してこれらの溶液で使用されるより高い温度は、さらなる安定性を提供する。上記の各々は、記載される浸漬時間と組み合わされて、卵母細胞の減数分裂紡錘体を安定化するために使用され、この卵母細胞の減数分裂紡錘体を安定化することは、解凍後の受精のために卵母細胞の生存能を維持するために重要である。
【００８１】
凍結保護物質溶液中と脱水／凍結保護溶液中との間の浸透圧の差が、紡錘体に損傷を与えることなく浸透圧性交換を推進するために十分に大きいことが特に重要である。その浸透圧の差が低すぎる場合、浸透に対する推進力が減少され、より長い曝露時間をもたらし、紡錘体に損傷を与え得る。一方、浸透圧の差が高すぎる場合、細胞膜の溶解が生じ得る。
【００８２】
各溶液についての浸透圧および浸漬時間は、凍結保護物質による細胞質の水の迅速な交換を容易にするために凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護溶液の十分に高い浸透圧が必要とされる様式で、組み合わされる。具体的に、これらの溶液に対する延長された卵母細胞の曝露は、毒性の増加および不可逆的な紡錘体損傷の増加を生じる。したがって、好ましい実施形態において、凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護物質溶液について上に提供される浸漬時間は、これらの溶液の浸透圧に関連し、卵母細胞の生存能を最大にするように選択される。
【００８３】
好ましい実施形態において、凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護溶液の浸透圧は、好ましくは、約１０００〜３０００、より好ましくは、約１２００〜２５００の範囲である。特に好ましい実施形態において、上記溶液の浸透圧は、使用される一連の溶液の各々について上向きの勾配（ｕｐｗａｒｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）である。上の表は、好ましい浸透圧範囲を提供する。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態においてヒトの卵母細胞は、当業者に公知の超音波誘導技術によって得られる。
【００８５】
収集された中期ＩＩ（ＭＩＩ）卵母細胞を試験し、球形で半透明であり第１極体を放出しているものを、第１の安定化溶液を含むディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）に置く。そのディッシュを、８９％〜９０％  Ｎ２；５％〜６％  ＣＯ２および５％  Ｏ２の大気を備えるトリガス（ｔｒｉ−ｇａｓ）インキュベーターに、３３℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、約２時間入れる。好ましい実施形態において、ＣＯ２の割合は、約７．２〜７．３の溶液のｐＨが提供されるように調整される。いかなる理論に制限されることなく、安定化溶液のｐＨが卵母細胞の生存能を維持することにおいて重要であり、そしてそのｐＨの注意深い制御が溶液中のＣＯ２の量を調整することによって達成される（ここで、そのｐＨは卵母細胞の細胞内ｐＨに対応して制御される）と考えられる。好ましくは、ここで卵丘塊を卵母細胞から除去する。
【００８６】
次に、その卵母細胞を第２の安定化溶液に移し、６分〜７分間まで、好ましくは２分〜５分間の範囲、より好ましくは約３分間、ディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）中で、３３℃〜３８℃で、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で培養する。
【００８７】
次いで、凍結保護溶液への卵母細胞の移動のために調製を行い、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に含め、約３５℃〜３７℃で、１分〜５分間の間、好ましくは１．５分〜３分間の範囲、より好ましくは約２分間保持する。
【００８８】
次に、その卵母細胞をＤ／Ｃ溶液１に移し、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に含め、３５℃〜３７℃で、約３分間保持する。次いで、この溶液の温度を、１℃／分〜３℃／分、好ましくは２±０．５℃／分の速度で、２２℃〜２６℃、好ましくは約２４℃の温度に、最大８分間で、好ましくは約５分間で徐々に低下させる。
【００８９】
工程ｅ）が完了した後、次いで、その卵母細胞を、Ｄ／Ｃ溶液２に移し、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に、２４℃で約１分〜５分間、好ましくは１．５分〜３分間、最適には約２分間含め、一方で同時に、卵母細胞を０．２５ｍｌプラスチックストロー（ＩＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）から入手可能）に充填する。そのストローを両端で密封し、Ｋｒｙｏ  １０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩＩ（Ｐｌａｎｅｒ  １０／１．７  ＧＢ）のような自動化生物学的直立型フリーザー中に置く。
【００９０】
そのストローを２℃／分〜３℃／分の冷却速度で−７℃にチルドする。この温度にて、鉗子でストローの外側に触れることによって「シーディング」を行う。これを液体窒素中で冷却して、水分子が結晶化するように誘発した。そのストローを−７℃で１０分間保持し、その後、０．３℃／分の速度で−３３℃まで冷却を再開して、卵母細胞への凍結保護物質の拡散を可能にする。次いで、保管のためにそのストローを液体窒素に入れる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、細胞内の細胞質小器官および減数分裂紡錘体は、氷晶形成のせん断力から生じる損傷、および他の凍結プロトコルに関連する室温への曝露を容認される。
【００９２】
さらに、プロピレングリコール凍結保護物質に対する卵母細胞の曝露時間および曝露温度を制限することによって、本発明は、卵母細胞への毒性を最小にする。
【００９３】
（実施例２）
卵母細胞を解凍するための方法
ヒトの卵母細胞の凍結の逆転は、卵母細胞の受精が計画されたときに行われる。深い凍結保管からの卵の蘇生は、解凍プロセスが過剰にゆっくりと行われた場合に生じ得る再結晶化を最小にする方法で、凍結段階を効率的かつ迅速に逆転することを必要とする。
【００９４】
好ましい実施形態において、蘇生または解凍段階は、容器（ストロー）を液体窒素容器から取り出す工程を包含する。そのストローを、室温で１５秒間保持し、次いで、水浴に約３１℃で１５秒間沈める。
【００９５】
その後の工程において、卵母細胞の解凍を、凍結保護物質を細胞質から素早く除去すると同時に卵母細胞への浸透圧ショックを回避するための条件下で行う。これらの工程の目的は、プロピレングリコール凍結保護物質の濃度を操作することによって、高度に濃縮された細胞内の凍結保護物質を卵質の外にスムーズかつ効率的に拡散させることである。卵母細胞を、以下の３種の連続的なリンスに供する：
解凍溶液Ａ：ｍ−ＨＴＦ中の約１．０Ｍのプロピレングリコールとスクロース、およびＳＳＳ。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３５Ｍ  スクロース、好ましくは約０．２９Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
解凍溶液Ｂ：ｍ−ＨＴＦ中の約０．５Ｍのプロピレングリコールとスクロース、およびＳＳＳ。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３５Ｍ  スクロース、好ましくは約０．２９Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
解凍溶液Ｃ：ｍ−ＨＴＦ中のスクロース、およびＳＳＳ（プロピレングリコールはゼロ）。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３０Ｍ、好ましくは約０．２５Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
【００９６】
上記の工程が完了した後、卵母細胞はインキュベートの準備ができている。３７℃の温度で、その卵母細胞を解凍安定化溶液（これは、第１の安定化溶液について実施例１に記載されるとおりである）中で、２時間、８９％〜９０％  Ｎ２；５％〜６％  ＣＯ２および５％  Ｏ２（使用されるＣＯ２の量は７．２〜７．３のｐＨを提供するように選択される）を備えるトリガスインキュベーターを用いてインキュベートする。このようにして、卵母細胞を生きている状態に戻す。
【００９７】
卵母細胞の受精：
卵母細胞の授精が計画される場合、従来の細胞質内精子注入技術（ＩＣＳＩ）が使用される。なぜなら、透明帯が凍結プロセスの副産物として固くなっているからである。この重要な工程の認識が欠如すると非常に低い受精率となり、他のプロトコルに伴う不本意な結果の原因となる。
【００９８】
したがって、新鮮なヒトの卵母細胞の凍結または解凍のための本発明の改良された実施形態において、優れた生存率、改良された受精率および胚分割率が達成され得る。
【００９９】
以下の表は、報告された文献と比べた全体的な成功の比較を提供する。
【０１００】
【化３】
2008118998.tif 000004
上のデータは、本発明の凍結方法が解凍方法と組み合わせた場合に、妊娠の高い成功率をもたらすことを示す。
【０１０１】
（実施例３）
溶液
以下の表は、本発明において卵母細胞の凍結または解凍ために使用され得る種々の溶液組成を示す。これらの溶液組成は、本発明で使用される商業的供給源から入手される溶液を置き換え得る。以下の表１〜表９におけるすべての量は、最適な結果を与えるために絶対値で提供される。各構成メンバーが、溶液中で、±２５％、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±３％、またはさらにより好ましくは±１％の範囲であることが理解される。当業者は、本明細書で規定される目的のために、その溶液の必要浸透圧を調整し得る。
【０１０２】
以下の表１は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【０１０３】
【表１−１】
2008118998.tif 000005
【０１０４】
【表１−２】
2008118998.tif 000006
以下の表２は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【０１０５】
【表２】
2008118998.tif 000007
以下の表３は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【０１０６】
【表３】
2008118998.tif 000008
以下の表４は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【０１０７】
【表４】
2008118998.tif 000009
以下の表５は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【０１０８】
【表５】
2008118998.tif 000010
以下の表６は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【０１０９】
【表６】
2008118998.tif 000011
以下の表７は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【０１１０】
【表７】
2008118998.tif 000012
以下の表８は、１リットルの基礎溶液のための脱水溶液の組成を示す。
【０１１１】
【表８】
2008118998.tif 000013
以下の表９は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【０１１２】
【表９−１】
2008118998.tif 000014
【０１１３】
【表９−２】
2008118998.tif 000015
本発明が図面に示されるように特定の実施例または好ましい実施形態に関してこれまで記載されてきたことが理解される。種々の追加、削除、変更および改変が、本発明の意図される精神および範囲から逸脱することなく上記の実施形態および実施例に対してなされ得る。
【０１１４】
（開示の要約）
卵母細胞（特に、ヒトの卵母細胞のような哺乳動物の卵母細胞）を低温保存するために有用な本発明および組成物が開示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、凍結保護溶液中の卵母細胞を示す。卵母細胞の細胞質への凍結保護物質の流入、および細胞質内の水の流出が、浸透圧によって制御される。
【図２】図２は、凍結保護物質の流入に対して不均衡な細胞質内の水の流出が、卵母細胞の収縮を生じること、および使用されるストレス条件に起因して卵母細胞の卵形の性質が多くの起伏に取って替わり、それによって卵母細胞が不安定化になることを示す。
【図３】図３は、卵母細胞の細胞質への凍結保護物質の流入に対して継続的に不均衡な細胞質内の水の流出が、卵母細胞のもともとの卵形の形状からのなおさらなる起伏およびゆがみを生じ、これが卵母細胞をさらに不安定化することをさらに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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