【手続補正書】
【提出日】平成25年3月8日(2013.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームに結合して分泌され得るキメラポリペプチドであって、以下のドメイン：
（ｉ）目的のペプチドまたはポリペプチド；
（ｉｉ）膜内標的ドメインであって、前記膜内標的ドメインと細胞膜もしくは小胞膜との間の固定のための、および／または相互作用のための、１もしくは２以上の分子を介して、本発明のキメラポリペプチドが前記細胞膜もしくは小胞膜に固定されることを可能とする、前記膜内標的ドメイン；並びに
（ｉｉｉ）真核細胞において前記キメラポリペプチドを膜小胞、特にエキソソーム形成小胞へ、および／または前記膜小胞の形成に関与する１または２以上の細胞区画へ差し向けることができる膜タンパク質の細胞質ドメイン（ＣＤ）、或いは、前記ＣＤドメインの変異誘導体であって、基準ＣＤドメインの配列の１または２以上の残基の置換、欠失および／または挿入によって規定され、そして前記ＣＤドメインの前記差し向け能力を保存している前記変異誘導体、ここで前記ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、少なくとも１つのモチーフＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＬ、およびモチーフＰｘｘＰを含み、ここでｘは任意の残基を表わし、そしてＹ、Ｌ、Ｄ、およびＰはそれぞれチロシン、ロイシン、アスパラギン酸、およびプロリン残基を表わす；
を含んでなるか、またはこれらから成ることを特徴とし；そして、
前記キメラポリペプチド内に存在するドメイン、特にドメイン（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）は細胞質ドメインまたは核ドメインであり、かつ、前記キメラポリペプチドは小胞体内への取り込まれるためのシグナルペプチドを欠損していると理解される、前記キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記膜内標的ドメインが、表在性膜タンパク質のものであるか、あるいは、前記膜内標的ドメインの変異誘導体であって、基準膜内標的ドメインの配列の中の１もしくは２以上の残基の置換、欠失、および／または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、ポリペプチドのＮ末端部からＣ末端部に向かって、以下の：（ｉｉ）−（ｉ）−（ｉｉｉ）、または（ｉｉ）−（ｉｉｉ）−（ｉ）、または（ｉ）のＮ末端領域−（ｉｉ）もしくは（ｉｉｉ）−（ｉｉｉ）もしくは（ｉｉ）−（ｉ）のＣ末端領域の順で連続して配置されている、請求項１または２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記モチーフＰＸＸＰが、モチーフＰＳＡＰ（配列番号８８）またはＰＴＡＰ（配列番号８９）である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
前記ＣＤドメインが、２つまたは３つのモチーフＹｘｘＬ（ｘは任意の残基を表す）を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＤドメインまたはＣＤドメインの変異誘導体が、以下の：
・ＹＩＮＬ、ＹＳＨＬおよびＤＹＩＮＬから選択されるモチーフＹｘｘＬまたはＤＹｘｘＬの少なくとも１つ；および／または
・ＰＳＡＰまたはＰＴＡＰから選択されるモチーフＰｘｘＰの少なくとも１つ、
を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
前記膜内標的ドメインは、それとの相互作用によって脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、例えば配列ＦＹＶＥ、および／または、脂質、特に脂肪酸、より具体的にはミリスチン酸、パルミチン酸、ゲラニル−ゲラニルまたはファルネシルを介して脂質膜に固定されることを可能にする配列、特にコンセンサス、を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
ミリスチン酸、パルミチン酸、またはゲラニル−ゲラニルが結合すること、特にミリスチン酸が結合することを可能にするコンセンサス配列が、以下の配列：Ｍ−Ｇ−Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｓ／Ｃ（配列中、Ｘ1、Ｘ2、およびＸ3は独立して任意の残基を示し、そしてＭ、ＳおよびＣはそれぞれメチオニン、セリンおよびシステインを示す）を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
配列中：
−Ｘ1がＣ、ＳおよびＬから選択され；および／または
−Ｘ2がＳ、Ｉ、Ｖ、ＭおよびＬから選択され；および／または
−Ｘ3がＫ、Ｑ、Ｈ、Ｆ、ＣおよびＳから選択される、
請求項８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
前記膜内標的ドメインが、複数の塩基性アミノ酸残基、特に残基Ｋ、ＲおよびＨから選択される複数の残基、より好ましくは残基ＫおよびＲから選択され、そしてより一層好ましくは残基Ｋを含んでなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
前記膜内標的ドメインが：
・Ｓｒｃファミリーのタンパク質、特にタンパク質Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｇｒ、ＨｃｋおよびＹｒｋから選択されるタンパク質に由来するか；または
・Ｓｒｃファミリーのタンパク質、特にタンパク質Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｌｙｎ、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｆｇｒ、ＨｃｋおよびＹｒｋから選択されるタンパク質の膜内標的ドメインの変異誘導体であって、前記膜内標的ドメインの配列の中の１もしくは２以上の残基の置換、欠失、および／または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている、前記変異誘導体
である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
前記膜内標的ドメインが：
・以下の配列：Ｍ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｓ／Ｃ−Ｋ−ｘ−ＫおよびＭ−Ｇ−ｘ−ｘ−Ｋ−Ｓ／Ｃ−Ｋ−ｘ−Ｋ−ｘ−ｘ−ｘ−ｘ−Ｒ−Ｒ−Ｒ（配列中、ｘは任意の残基を示す）から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成るか；または
・この配列の変異誘導体であって、この配列の中の１もしくは２以上の残基の置換、欠失、および／または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成るか；または
・以下の配列：Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−ＲまたはＭ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｇを含んでなるか、またはそれらから成るか；または
・前記配列Ｍ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−ＲまたはＭ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｋ−Ｓ−Ｋ−Ｐ−Ｋ−Ｄ−Ｐ−Ｓ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−Ｋ−Ｓ−Ｒ−Ｇ−Ｐ−Ｇ−Ｇの変異誘導体であって、この配列の中の１もしくは２以上の残基の置換、欠失、および／または挿入によって規定され、かつ、小胞膜または細胞膜の脂質二重層に固定されるこのドメインの能力が保存されている前記変異誘導体から成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
２つの連続したドメインを連結する少なくとも１つのリンカーであって、例えば、ペプチドまたはポリペプチドである前記リンカーをさらに含んでなる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＣＤドメインまたはその変異誘導体が、配列ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを欠損しているおよび／または配列ＰＣＰを欠損している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＣＤドメインの前記変異誘導体の配列が、連鎖ＫＣＬＴＳＲＬＬＫＬＬＲＱを欠損している元のＣＤドメインの配列と、少なくとも６０または７０％、特に少なくとも８０％、９０％、９５％の類似性または同一性を有する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＣＤドメインまたはその変異誘導体の配列が、以下の配列：
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘｘＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘＹｘｘｘｘｘｘｘｘＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＹｘnＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰＥｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬ；
ＰｘｘＰｘｘｘｘＰｘｘＰｘｘｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＥｘＹｘｘＬｘＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ；および
ＰｘｘＰｘnＰｘｘＰｘnＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＥＸｎＹｘｘＬｘnＰｘｘＰＤＹｘｘＬｘｘｘｘ、
（配列中、ｘおよびｘnはそれぞれ任意の残基および任意の１または２以上の残基を表わし、そして配列中、モチーフＰｘｘＰのうちの少なくとも１つがモチーフＰＳＡＰまたはＰＴＡＰである）から選択される配列を含んでなるか、またはそれらから成る、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１７】
前記ドメイン（ｉｉｉ）が、レトロウイルス、特にウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の膜貫通型タンパク質（ＴＭ）のＣＤドメイン、またはこのドメインの変異誘導体である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＣＤドメインが、ＢＬＶのＴＭタンパク質のＣＤドメインであって、配列番号６の配列を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項１９】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、以下の：
・細胞質タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、またはこの（これら）ドメインの１もしくは２以上の断片；および／または
・核タンパク質の１もしくは２以上のドメイン、またはこの（これら）ドメインの１もしくは２以上の断片
を含んでなるか、またはこれらから成る、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２０】
前記目的のペプチドまたはポリペプチドが、病原体、病原性物質、抗腫瘍抗原、細胞質抗原、リガンド受容体、特に多数の膜ドメインを有する受容体、例えば、７回膜貫通型ドメインを持つ受容体、サイトカイン受容体またはその断片、毒素または毒素部分、特有の活性を有する化合物、例えば酵素、または例えば核酸に結合するポリペプチドに由来し、前記病原体が、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２１】
薬剤として使用される、特に細菌、ウイルス寄生虫の感染、あるいは腫瘍またはその他の病状、例えば、機能的または代謝的な欠陥の予防および／または処置のために薬剤として使用される、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２２】
追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用されることを特徴とし、ここで前記追加のキメラポリペプチドは、適当な真核細胞中で発現されるときに、膜小胞、特にエキソソームと一緒になって分泌され得、かつ、前記追加のキメラポリペプチドが、以下のドメイン：
・目的のペプチドまたはポリペプチド；
・膜貫通型ドメイン；および
・膜タンパク質の細胞質ドメイン（ＣＤ）または前記ＣＤドメインの変異誘導体、ここで前記ＣＤドメインまたはその変異誘導体は、請求項１、４〜６、および１４〜１８のいずれか１項に記載のものである；
を含んでなるか、またはこれらから成り、ここで前記追加のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたは変異誘導体が、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドのＣＤドメインまたはＣＤドメインの変異誘導体と同一であるか、または異なることを特徴とする、請求項２１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２３】
追加のキメラポリペプチドにおいて、以下のドメインが、ポリペプチド内でＮ末端部からＣ末端部に向かって以下の順：目的のペプチドまたはポリペプチド−膜ドメイン−細胞質ドメイン（ＣＤ）または変異誘導体、で連続して配置されている、請求項２１または２２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２４】
免疫付与における使用のための、特にインビボで、宿主、特に哺乳動物のヒト、ヒト以外の哺乳動物または鳥類で、目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、ウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および／または細胞応答を誘発または促進するためのキメラポリペプチドであって、適当であれば、請求項２２または２３に記載された追加のキメラポリペプチドと組み合わせて使用される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドおよび／またはこのポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物、そして適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドおよび／またはこの追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物を含んでなる膜小胞であって、この（これらの）分解産物は、適当であれば、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ型またはII型の分子と結合する、前記膜小胞。
【請求項２６】
エキソソームであることを特徴とする、請求項２５に記載の膜小胞。
【請求項２７】
追加のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの少なくとも１つの断片が、前記膜小胞の外面に、部分的にまたは完全に曝露される、請求項２５または２６に記載の膜小胞。
【請求項２８】
活性成分が、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の１もしくは２以上の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドおよび／またはこの追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物を含んでなる、１もしくは２以上の膜小胞、特に１もしくは２以上のエキソソームを含んでなる、治療用組成物。
【請求項２９】
（例えば、酵素の追加によって）宿主の標的細胞の処理に使用される、および／または宿主（例えば、腫瘍細胞）中の標的細胞を破壊するために使用される、および／または（例えば、本発明のキメラポリペプチドの、目的のペプチドまたはポリペプチドに結合した核酸を検出することによって）宿主の診断を実施するために使用される、および／または、腫瘍に対する、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫感染に対する予防および／または処置のために使用される、特にインビボで、宿主中で、１または２以上の目的のペプチドまたはポリペプチドが由来する腫瘍、またはウイルス、細菌もしくは寄生虫に対する体液性応答および／または細胞性応答を誘発または促進するために使用される、請求項２８に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ならびに適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
以下の：
・請求項３０に記載のポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にＤＮＡ；および
・薬学的に許容され得る支持体、希釈剤またはビヒクル；および
・適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成ることを特徴とする核酸、特にＤＮＡ
を含んでなる、治療用組成物。
【請求項３２】
薬剤としての使用のための、特に細菌、ウイルス、寄生虫の感染、または腫瘍の予防および／または処置に使用される、特にインビボで、宿主、特にヒトまたはヒト以外の哺乳動物、あるいは鳥類で、ドメイン（ｉ）が由来する腫瘍、あるいはウイルス、細菌または寄生虫に対する体液性応答および／または細胞性応答を誘発または促進するために使用され、適当であれば、薬学的に許容され得る支持体、希釈剤もしくはビヒクルおよび請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなるまたはそれから成る核酸、特にＤＮＡを含んでなる免疫原性組成物と組み合わせて使用される、請求項３１に記載の治療用組成物。
【請求項３３】
組換え型のエキソソーム産生細胞、特に免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にＴおよびＢリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞であって：
・前記細胞が、請求項３０に記載の１もしくは２以上のポリヌクレオチド、および適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドをコードする１もしくは２以上のポリヌクレオチドと再結合されることを特徴とするか；あるいは
・前記細胞が、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の膜小胞、ならびに適当であれば、請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチドおよび／またはこの追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物を含んでなる１もしくは２以上の膜小胞、特に１もしくは２以上のエキソソームを吸収することを特徴とする、前記細胞。
【請求項３４】
前記目的のペプチドもしくはポリペプチド、または前記ペプチドもしくはポリペプチドの断片、あるいは請求項２２または２３に記載の追加のキメラポリペプチド、および／またはこの追加のキメラポリペプチドの１もしくは２以上の分解産物と相互作用することができる特定のパートナーのインビトロでの検出のための、請求項２７に記載の１もしくは２以上の膜小胞の使用。
【請求項３５】
目的のペプチドまたはポリペプチドおよび／またはこの目的のペプチドまたはポリペプチドの分解産物を含んでなる、膜小胞、特にエキソソームのインビトロでの産生方法であって、適当であれば、この分解産物は主要組織適合遺伝子複合体の分子に結合され、以下のステップ：
ａ）請求項３０に記載の１もしくは２以上のポリヌクレオチドであって、前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドを、エキソソーム産生細胞、特に２９３Ｔ細胞、または免疫系の細胞、より具体的にはマスト細胞、リンパ球、特にＴおよびＢリンパ球、ならびに樹状細胞、特にランゲルハンス細胞から選択される免疫系の細胞へ導入し、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドを含んでなるポリペプチドおよび／またはこのポリペプチドの分解産物を含んでなる、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の１もしくは２以上の膜小胞とエキソソーム産生細胞とを接触させ；
ｂ）前記エキソソーム産生細胞を培養し；
ｃ）前記エキソソーム産生細胞によって産生される膜小胞、特にエキソソームを回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項３６】
ステップａ）とｂ）の間に中間ステップをさらに含んでなり、この間にエキソソームの分泌を誘発および／または増加するために、あるいは特定の細胞タンパク質、例えば、タンパク質ＩＣＡＭに関してエキソソーム組成物で特異性を誘発するために、細胞が選択および／または刺激されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
膜小胞、特にエキソソームの表面で発現される目的の１もしくは２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするポリクローナル血清を調製するための方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の膜小胞、請求項２８、２９または３１のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３０に記載のポリヌクレオチドを、アジュバントと結合させてまたは結合させずに、ヒト以外の動物へ、適当であれば繰り返し投与し；そして
ｂ）１または２以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができる、形成された抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項３８】
膜小胞、特にエキソソーム内またはその表面に発現される１もしくは２以上の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を調製するための方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の膜小胞、請求項２８、２９または３１のいずれか１項に記載の組成物、あるいは請求項３０に記載のポリヌクレオチドを、適当であればアジュバントと組み合わせて投与された、および適当であれば繰り返し投与がなされた、（ヒトまたはヒト以外の）宿主、例えばＢａｌｂ／ｃマウスから得られる脾臓細胞を、ミエローマ細胞と融合し；
ｂ）抗体の産生が可能な条件下でハイブリドーマを培養および選択し；
ｃ）１または２以上の目的の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを対象とするモノクローナル抗体を回収すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項３９】
目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と相互作用する分子をスクリーニングするためのインビトロでの方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項２７に記載の膜小胞を、前記目的のペプチドまたはポリペプチドと相互作用することができる１もしくは２以上の分子と接触させ；
ｂ）前記目的のペプチドまたはポリペプチド、あるいは前記目的のペプチドまたはポリペプチドの断片と、前記１または２以上の分子との間の任意の相互作用を検出すること
を含んでなる、前記方法。