(57)【要約】      （修正有）【課題】扁平上皮癌患者、特に子宮頚部扁平上皮癌患者について、不要な治療を受ける患者数を減らし得るような高精度で、かつ特異性の高い癌の予後判定法を提供する。【解決手段】癌組織におけるカルボニルレダクターゼ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）の発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫反応により測定し、得られた発現パターンをｈｅｔｅｒｏ（発現が強い細胞と弱い細胞が混在しているもの）であるか、Ｗ＆Ｈ（正常扁平上皮と比べて汚染強度は弱いが、均一に染色されているもの）であるかを指標として扁平上皮癌の予後を判定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする扁平上皮癌の予後判定方法。
【請求項２】
癌組織において、カルボニルレダクターゼの発現パターンがｈｅｔｅｒｏであるか、Ｗ＆Ｈである場合を、予後不良と判定することを特徴とする請求項１に記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【請求項３】
癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫反応により測定することを特徴とする請求項１または２のいずれかに記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【請求項４】
扁平上皮癌が子宮頚部扁平上皮癌である請求項１〜３のいずれか一項に記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の扁平上皮癌の予後判定のための抗体。
【請求項６】
カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；
のいずれかの抗原性を有するペプチドを用いて、免疫した哺乳動物由来の血清から得られる請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項５または６のいずれかに記載の抗体を作製するための、抗原性を有するペプチドであって、
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；
のいずれかである前記ペプチド。
【請求項８】
請求項５または６のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする扁平上皮癌の予後判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の予後を判定する方法に関し、特に扁平上皮癌組織におけるカルボニルレダクターゼ（Ｃａｒｂｏｎｙｌ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＣＲ）の発現パターンを測定することにより、扁平上皮癌の予後を判定する方法に関する。さらにまた、ＣＲと特異的に結合する抗体、当該抗体を作製するためのペプチド、当該抗体を用いてＣＲを検出するための検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
厚生労働省の年報中の統計データによると、平成１７年の悪性新生物と分類された傷病の総患者数は１４２万人である。同じ統計データから入院患者数をみると１７万であった。さらに癌組織の摘出を行うケースは限られると考えられるが、いずれにしても癌患者の最大の関心事は今後の癌の進行具合である。これまで、癌の予後を判定する方法について、いくつかの報告がある。膀胱癌の予後に関しては、尿中に存在する細胞の中心体複製異常の有無の検出による判定方法が明らかにされており（特許文献１）、メラノーマ又は肺癌の発症や進行については、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ：ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ：活性化白血球接着分子）を血液中から検出し、この検出結果に応じて予後の状況を判定する方法が開示されている（特許文献２）。また、乳癌、肺癌、前立腺癌、または胃癌等の癌から骨転移のリスクが高いと予測する方法として、尿や癌細胞中のγ−ＧＴＰ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ）レベルを測定し、該γ−ＧＴＰレベルが設定値より高い場合に、骨転移のリスクが高いと予測する方法が開示されている（特許文献３）。現在ゲノムプロジェクトにより、多数のヒト遺伝子とその機能が明らかにされているが、それを基に多数の遺伝子の総合的・系統的解析を行うために用いられるＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）を利用して、乳癌の術後予後予測を行う方法として、特定遺伝子グループの発現を前記方法で解析する方法も提供されている（特許文献４）。食道扁平上皮癌に関しては、特定の染色体の特異的な構造変化を検出する方法による予後の診断方法が開示されている（特許文献５）。
【０００３】
扁平上皮癌に関して、その腫瘍マーカーとしてはＳＣＣ抗原（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）がよく知られている（特許文献６）。ＳＣＣ抗原は、扁平上皮癌である肺癌、子宮頸癌、食道癌等の診断や病状管理のために全世界で臨床利用されている組織特異的な腫瘍マーカーである。ＳＣＣ抗原の値を測定することにより、放射線治療や抗癌剤治療効果の有無を判定できると考えられている。しかしながら、ＳＣＣ抗原の発現が、癌特異的ではないケースもあり、判定の精度としては問題がある。
【０００４】
ＳＣＣ抗原の細胞内標的分子として見出されたＣＲは、ＳＣＣ抗原に存在する２種類の遺伝子ＳＣＣＡ１、ＳＣＣＡ２と結合する分子の１つである。遺伝子ＳＣＣＡ１は抗癌剤、ＴＮＦ−α  、ＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞によるアポトーシスを抑制することが知られており（非特許文献１，２）、また、遺伝子ＳＣＣＡ２も放射線、ＴＮＦ−αによるアポトーシスを抑制することが知られている（非特許文献３）。さらに、細胞内の  ＳＣＣＡ２の発現を抑制することによって、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（細胞の形態、極性を維持する機能をもつ細胞間接着分子）の発現が低下し、癌細胞の浸潤能・移動能を増強させることも明らかとなっている（非特許文献４）。このことから、ＣＲも癌関連の機能を有することが推察される。
【０００５】
ＣＲは、ヒトの脳により精製され、分子量が約３０ｋＤａの分子で（非特許文献５）、２７７のアミノ酸からなり（非特許文献６）、その遺伝子は２１番染色体長腕２２．１２に位置し、マウスの遺伝子とは８２％の相同性を持つことが明らかにされている（非特許文献７）。ＣＲは、カルボニル化合物を基質とする細胞質に局在しているＮＡＤＰＨ依存性の酵素である。脳ではプロスタグランジンやステロイドの還元を触媒する作用を有すること、また、肝臓では解毒作用に関与することが知られている。その他、癌関連の機能に関しては、タバコに含まれる癌誘発物質の解毒に作用し、ＣＲの発現が少ない喫煙者では癌発症の誘因となりうるなど腫瘍新生に関与すること、アントラサイクリン系の抗癌剤はＣＲによって還元されるために抗癌作用が低下するなど抗癌剤に対する薬剤耐性にも関与すること、等が知られている。薬剤耐性については、薬剤耐性に関与するＭＲＰ（ｍｕｌｔｉ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞中の量は変化しないが、ＣＲは増加しているという現象があり、薬剤耐性のメカニズムも明確ではない。また最近、ＣＲは癌細胞の転移能を変化させる機能を有することが明らかとなっているが、その作用機序についてもまだ理解されていないのが現状である。
【特許文献１】特開２００６−２７５９８９号公報
【特許文献２】特許第３７７９２９４号公報
【特許文献３】特開２００６−１５３４９９号公報
【特許文献４】特開２００５−２７００９３号公報
【特許文献５】特開２００２−２７２４９７号公報
【特許文献６】特開平６−１００５９９号公報
【非特許文献１】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８２：９８１−９８９，２０００
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：１７７６−１７８０，２００１
【非特許文献３】Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８４：８５１−８５８，２００１
【非特許文献４】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ２９：１２３１−１２３５，２００６
【非特許文献５】Ｂｅｎｄｉｃｈｔ，Ｗ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５６（３）：１２０６−１２１３，１９８１
【非特許文献６】Ｂｅｎｄｉｃｈｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６３（３１）：１６１８５−１６１８８，１９８８
【非特許文献７】Ｆｏｒｒｅｓｔ，ＧＬ．  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１０４８（２−３）：１４９−１５５，１９９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来、扁平上皮癌患者について、不要な治療を受ける患者数を減らし得るような、癌の予後を予測して判定する方法は知られていなかった。本発明は、高精度で、かつ特異性の高い癌の予後判定法を提供することをその主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
扁平上皮癌のマーカーとしてよく知られているＳＣＣ抗原に結合する分子として、本発明者らに見出されたＣＲは、ＳＣＣ抗原と同様に、腫瘍マーカーになることができると予想された。しかしながら、ＣＲの発現パターンは、癌組織において同一ではなく、発現が強い細胞と弱い細胞が存在する。本発明者らは、その点に着眼して、発現パターンと癌の予後の密接な関連を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。
【０００９】
（１）癌の予後を判定する方法であって、癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを指標とする扁平上皮癌の予後判定方法。
【００１０】
（２）癌組織において、カルボニルレダクターゼの発現パターンがｈｅｔｅｒｏであるか、Ｗ＆Ｈである場合を、予後不良と判定することを特徴とする上記（１）に記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【００１１】
（３）癌組織におけるカルボニルレダクターゼの発現パターンを、カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体を用いた免疫反応により測定することを特徴とする上記（１）または（２）のいずれかに記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【００１２】
（４）扁平上皮癌が子宮頚部扁平上皮癌である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の扁平上皮癌の予後判定方法。
【００１３】
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の扁平上皮癌の予後判定のための抗体。
【００１４】
（６）カルボニルレダクターゼと特異的に結合する抗体であって、
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；
のいずれかの抗原性を有するペプチドを用いて、免疫した哺乳動物由来の血清から得られる上記（５）に記載の抗体。
【００１５】
（７）上記（５）または（６）のいずれかに記載の抗体を作製するための、抗原性を有するペプチドであって、
（ａ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列からなるペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号２または配列番号３に示すアミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド；
のいずれかである前記ペプチド。
【００１６】
（８）上記（５）または（６）のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする扁平上皮癌の予後判定用キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、癌の予後判定法、特に子宮頚部扁平上皮癌の高精度かつ高特異度の予後判定法を提供することができ、さらに、簡便に判定するための測定用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の扁平上皮癌の予後判定方法においては、配列表の配列番号２または配列番号３に示すペプチド、あるいは同様な抗原性を有する類似ペプチドを作製し、該ペプチドを動物に感作し、常法により分離・精製して抗体を作製し、該抗体を用いて癌組織内のＣＲの発現パターンを測定する。そして、癌組織内のＣＲの発現パターンを解析することにより、癌の予後を判定することができる。
【００１９】
癌組織中に存在するＣＲは、ヒトの組織だけでなく、他の哺乳動物や非哺乳動物種の組織にも広く存在するたんぱく質で、多種類のカルボニル化合物のＮＡＤＰＨ依存性還元反応を触媒する酸化還元酵素である。
【００２０】
ＣＲの遺伝子に関する情報は、ヒトＣＲとして公知であり、ＮＣＢＩの遺伝子データベースにおいて、アクセッションナンバーＪ０４０５６として登録されている。それによると、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであることがわかる。
【００２１】
ヒトＣＲは、公知の方法により調整することができる。Ｗｅｒｍｕｔｈらが明らかにしているように、ヒト胎盤から得られたｃＤＮＡのライブラリーからクローンを用いて生産する方法（上記非特許文献２）がある。あるいは、ＧＳＴ（グルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ）蛋白質との融合として、大腸菌等の宿主細胞内で発現させ、グルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することもできる。
【００２２】
ＣＲの発現パターンの測定は、本発明のペプチドを用い、当該ペプチドに特異的に結合する抗体を作製し、当該抗体と癌細胞中のＣＲの結合体を、免疫学的測定法を利用して行うことができる。免疫源とする本発明のペプチドは、少なくとも８アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。
【００２３】
本発明のペプチドは、ＣＲと同様の免疫原性を有するものであり、その作製法としてはいくつかの方法があげられる。例えば、ＣＲの遺伝子情報を基にマーカー遺伝子又はその部分遺伝子を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体又は培養上清から精製することにより得る方法、ＣＲのアミノ酸配列情報を基にオリゴペプチドを化学的に合成する方法があげられる。あるいはＣＲの蛋白質を適切な蛋白切断酵素を用いて切断して得ることもできる。
【００２４】
本発明のペプチドは、所望の免疫原性を有する限り、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が修飾されていてもよく、配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有することが望ましい。配列番号２のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位を抗原決定部位とみなし、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧのアミノ酸配列を有する。
【００２５】
さらに、配列番号３のペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の第９９番目のアスパラギン（Ａｓｐ）酸から第１１３番目のスレオニン（Ｔｈｒ）までのアミノ酸配列部位が、別のもう１つの抗原決定部位とみなし、Ｃ末端側のスレオニンの後にシステインを付加して、化学的に合成されたものであり、ＤＰＴＰＦＨＩＱＡＥＶＴＭＫＴＣのアミノ酸配列を有する。
【００２６】
また、本発明のペプチドは、配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドであってもよい。このような変異体は、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２７】
本発明の抗体は、上記ペプチドを認識する抗体であり、癌組織内のＣＲと特異的に結合し、ＣＲの発現パターンを測定することができる抗体である。
【００２８】
本発明の抗体は、公知の方法を用いて作製することができる。かかる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体のいずれであってもよい。また、ＣＲを認識する特性を失わない限り、低分子化抗体や、修飾された抗体などの抗体フラグメントであってもよい。
【００２９】
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原性を有する配列表の配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、あるいは、配列表の配列番号２または配列番号３に記載のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加されたペプチドを、必要に応じて適当なアジュバントを用いて、ウサギ、ラット、マウス、サル、ヒツジなどの哺乳動物の皮下あるいは腹腔内に投与して感作し、感作した動物から血液を採取し、この血液から公知の方法により血清を分離して得られる。ポリクローナル抗体としては、分離した血清をそのまま使用することができるが、さらに、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動）や、ＣＮＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（アマシャム社製）を使用するＡｆｆｉｎｉｔｙ法で精製して使用することもできる。
【００３０】
本発明の抗体を用いたＣＲの発現パターンの測定は、公知の蛋白質の測定方法に従って行うことができる。例えば、ウェスタンブロッティング法、ドットブロット法や、免疫沈降法、酵素免疫測定法  （ＥＩＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、蛍光抗体法（ＦＩＡ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、免疫細胞染色等の免疫学的測定法が挙げられる。
【００３１】
上記測定法においては、ＣＲと特異的に結合する抗体を検出可能な物質で標識する。標識としては、放射性同位体や例えばビオチン、アビジン等のアフィニティー標識、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素標識、例えばＦＩＴＣ、ローダミン等蛍光標識、ＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｉｍｉ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）による化学発光標識等があげられる。そのような標識は組み合わせても良く、標識を行う方法は、すでによく知られている方法で行う。
【００３２】
免疫学的測定法の例としては、競合アッセイ法やサンドイッチ法があげられる。当該サンドイッチ法のＥＬＩＳＡ法では、結合した酵素標識抗体に、酵素基質となる物質を加えて発色あるいは発光させ、その後に反応停止液を加え、発色あるいは発光の強さやパターンを測定する。試料中の抗原濃度に比例した強さやパターンが得られるため、対照物質との比較に基づいて試料中の抗原の発現状況を把握することができる。
【００３３】
本発明の抗体を用いたＣＲの発現解析は、ヒト組織染色用キットを用いることもできる。免疫組織化学染色用キットのヒストファイン（ニチレイ社製）を使用する場合は、ＣＲと結合した抗体に、ビオチン標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として結合させ、そこへ酵素試薬であるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジンを結合させる。次いで、ＤＡＢ（３，３−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）によりペルオキシターゼを染色することにより、癌組織中のＣＲの発現状態を観察することができる。
【００３４】
癌患者の組織を用いて、癌の予後を判定する場合は、インフォームド・コンセントが得られた患者の癌組織に由来する試料に、本発明の抗体組成物を接触させてＣＲの免疫複合体を形成させ、当該免疫結合体の測定により予後を判定することができる。評価法は、例えばＳｈｉｏｚａｋｉらの方法（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １３９：１７−２３，１９９１）  に準じて行うことができる。つまり、癌組織におけるＣＲの発現パターンを３つのパターン（Ａ）ｓｔｒｏｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎ（正常扁平上皮と同等の染色強度で、均一に染色されているもの）、（Ｂ）ｗｅａｋ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ（Ｗ＆Ｈ：正常扁平上皮と比べて染色強度は弱いが、均一に染色されているもの）、（Ｃ）ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ（ｈｅｔｅｒｏ：発現が強い細胞と弱い細胞が混在しているもの）に分け、各々のパターンについて、（１）ＣＲの発現態度とリンパ節転移、（２）ＣＲの発現態度と無進行生存（ＰＦＳ：ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ、治療開始日から組織学的に再発が確認されるまでの期間）、（３）ＣＲの発現態度と全生存（ＯＳ：ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ、治療開始日から死亡までの期間）の３段階評価を行う方法である。
【００３５】
本発明のＣＲの測定のための試薬を予め組み合わせてキット化することもできる。該キットには、抗体のほか、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物等を含めることもできる。
【００３６】
以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。
【実施例１】
【００３７】
＜ヒト正常細胞中のＣＲの確認＞
ヒトケラチノサイト（ヒト表皮細胞、ＮＣＥ１６：ヒューマンサイエンス振興財団より購入）を用いて、正常細胞中のＣＲの存在を確認した。まず、ＳＣＣ抗原の組み換え蛋白質としてＧＳＴ融合蛋白（以下、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ１、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ２とする）を大腸菌で誘導・合成した。この大腸菌を超音波破砕機で処理した破砕菌液を、ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｂｅａｄｓ（アマシャム・ファルマシア社製）と混合し、反応・結合させた。次いで、ヒトケラチノサイト１Ｘ１０７個の細胞破砕物と上記で得られたｂｅａｄｓを混合し反応させた。反応終了後、ｂｅａｄｓ  を十分に洗浄し、このｂｅａｄｓ  にＳＤＳ−ＰＡＧＥ  サンプルバッファーを添加し、１００度で５分間インキュベート後、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ１、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ２およびコントロールであるＧＳＴと結合する物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図１）。肉眼的に異なるバンドを切り出し、これを質量分析器（島津製作所）によるｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｉｎｔｉｎｇによりこの結果、ＳＣＣＡ１およびＳＣＣＡ２と結合する分子の１つとしてＣＲを確認し、ヒトケラチノサイトにＣＲが存在することが明らかとなった。
【実施例２】
【００３８】
＜ペプチドの合成＞
配列番号１に示すＣＲのアミノ酸配列の情報を解析し、ＣＲの抗原決定部位を検索した。その結果、配列番号１のアミノ酸配列の第１８４番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第１９５番目のグリシン（Ｇｌｙ）までのアミノ酸配列部位が優れた抗原決定部位と分かった。そこで、ＣＲの抗体を作成するために、Ｎ末端側のヒスチジンの前にシステインを付加した合成ペプチドＣＨＱＫＥＧＷＰＳＳＡＹＧ（配列表の配列番号２）を作製した。
【実施例３】
【００３９】
＜ＣＲの抗体作製＞
実施例２で作成した合成ペプチドを、フロイントアジュバントを用いてエマルジョンを作製し、当該エマルジョンをウサギの皮下に注射して免疫した。免疫は、第１回目に０．１５ｍｇの合成ペプチドを投与し、２週間後に０．３ｍｇ、その後は２週間おきに計４回の投与を行った。採血は、合成ペプチドを投与する前、合成ペプチドを３回投与した１週間後、さらに４回目を投与した１週間後に各１ｃｃずつ、計３回の試験採血を行った。各試験採血におけるＣＲの抗体価はＥＬＩＳＡ法で測定した。最終免疫終了の１週間後に、免疫したウサギから全血を最終採血した。最終採血分はＣＮＢｒ−ａｃｖｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（アマシャム・ファルマシア社製）によるａｆｆｉｎｉｔｙ精製を実施し、ＣＲのポリクローナル抗体を得た。
【実施例４】
【００４０】
＜ＣＲとポリクローナル抗体との反応＞
実施例３で得られたポリクローナル抗体は、ウエスタンブロット法によりＣＲとの反応性を確認した。さらに、ＣＲの存在が確認されたヒトケラチノサイト、および６種類の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞を用いて、ＣＲの発現を確認した。この結果、当該ポリクローナル抗体の優れた反応性を証明した。
【００４１】
１．ＣＲと作製したポリクローナル抗体との反応性の検出
ＣＲと作製したポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロットで確認した。下記（１）〜（４）の手順で処置したものを、（５）のウエスタンブロットにより解析した。
【００４２】
（１）実施例１の手順に従って、ＧＳＴ、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ１およびその変異体、ＧＳＴ−ＳＣＣＡ２およびその変異体とケラチノサイト細胞破砕液を混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜（ＡＴＴＯ社）に蛋白質を転写する。（２）一次抗体反応として、５％スキムミルクー０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）液で８μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗ＣＲポリクローナル抗体と４℃で一晩反応させる。（３）ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間４回洗浄後、５％スキムミルクー０．１％ＴＢＳ−Ｔ液で４０００倍に希釈した二次抗体であるＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：西洋ワサビ過酸化酵素）標識ブタ抗ウサギ免疫グロブリン（ＤＡＫＯ社）と室温で６０分間反応させる。（４）ＰＶＤＦ膜は０．１％ＴＢＳ−Ｔ液で１５分ずつ４回洗浄する。（５）ＥＣＬ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャム・ファルマシア社）  を使用し、ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（アマシャム・ファルマシア社）に感光させて解析した。その結果、図２に示すように、ＣＲが存在する１のケラチノサイト細胞破砕液や、ＳＣＣ抗原と結合したCRが存在する３〜６では、抗体との結合体のバンドが見られ、ＣＲが存在しない２のＧＳＴ＋ケラチノサイト細胞破砕液では、バンドが見られないことから、実施例３で作製した抗体はＣＲとの反応性が優れていることが証明された。
【００４３】
２．培養細胞におけるＣＲの発現検出
さらに、ヒトケラチノサイト、および以下の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞  ＢＯＫＵ、ＭＥ−１８０、ＳＫＧＩ、ＳＫＧ  ＩＩ（以上ヒューマンサイエンス振興財団より購入）、ＳｉＨａ（東北大学加齢医学研究所より購入）、ＳＫＧ  ＩＩＩａ（慶応大学医学部産科婦人科  野澤  志朗博士より供与）におけるＣＲの発現を解析した。方法は上記に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットにより解析した。結果は、図３に示すように、いずれの培養細胞でもＣＲの発現を認めるが、ケラチノサイトと比較し６種類の子宮頸部扁平上皮癌培養細胞での発現は低く、ＣＲの測定を行うための対照としては、ケラチノサイトが優れていることが分かった。
【実施例５】
【００４４】
＜正常扁平上皮組織中のＣＲの検出＞
実施例３で作製した抗体を用いて、培養細胞であるヒトケラチノサイトと患者の同意を得て採取した子宮頸部正常扁平上皮組織におけるＣＲの発現を免疫染色により確認した。実験法は、精製したポリクローナル抗体と、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キット（ニチレイ社）を用いて、プロトコールに従い、免疫組織染色を（１）〜（８）の手順に従って実施した。（１）ホルマリン固定パラフィン包埋組織を５μｍ厚に切り出し、キシレンに３回浸した後、１００％エタノールに浸して、脱パラフィン操作を行う。（２）０．３％過酸化水素入りメタノールに組織切片を５０分浸し、内因性ペルオキシダーゼを失活させる。（３）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、作製した抗ＣＲ抗体の非特異的吸着を防ぐため、ヒストファインＳＡＢ−ＰＯ（Ｒ）キットに付属する１０％ヤギ正常血清を用いて室温で１０分間ブロッキングを行う。（４）一次抗体反応として、１％ウシアルブミン含有ＰＢＳで２μｇ／ｍｌの濃度に調整した抗ＣＲポリクローナル抗体と４℃で一晩反応させる。（５）組織切片をＰＢＳで３回洗浄後、キットに含まれる二次抗体ビオチン標識ヤギ抗ラビットＩｇＧ抗体と室温で１０分間反応させる。（６）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し、キットに含まれるペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加する。室温で５分間反応させる。（７）終了後、組織切片をＰＢＳで３回洗浄し０．０２％  ＤＡＢ液（３０ｍｇ  ＤＡＢを、１３０ｍｌ  ０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒと、２０ｍｌ  ０．０５ＭＴｒｉｓｍａ  ｂａｓｅに溶解する。）に１分間浸す。終了後、５分間流水で洗浄する。（８）へマトキシリン染色し、流水で１０分間洗浄し、封入する。
【００４５】
以上の結果より、ＣＲは細胞質に局在（図４）しており、正常扁平上皮の全層で強く発現していることが明らかとなった（図５）。
【実施例６】
【００４６】
＜扁平上皮癌組織中のＣＲの検出＞
組織の採取および検討に対し、インフォームド・コンセントが得られた手術前未治療で予後の追跡が可能である子宮頸部扁平上皮癌患者の組織中のＣＲを検出した。癌患者例数およびその病態レベルを表１に示した。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
原発巣におけるＣＲの発現態度について、Ｓｈｉｏｚａｋｉらの方法（Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９１；１３９：１７−２３）に準じて、３パターンに分類し評価した。免疫組織学的染色によるＣＲの発現状況を図６、図７、図８に示した。解析した結果を表２に示した。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
その結果、ＨｅｔｅｒｏとＷ＆Ｈでは、リンパ節転移と強い関連性を認め、無進行生存の短縮が認められ、さらに、全生存の短縮も認められた。これにより、子宮頸部扁平上皮癌原発巣におけるＣＲの発現減弱を示したＨｅｔｅｒｏとＷ＆Ｈの症例では、リンパ節転移や再発・死亡に至るなど、明らかに予後不良であった。以上の結果より、ＣＲは子宮頸癌の予後を判定し、治療の個別化を検討する上で新たな指標となりうることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の、癌組織中のＣＲの発現パターンを指標とする扁平上皮癌の予後判定方法は、細胞の状況を肉眼的に行うため、精度のよい判定が可能になり、癌患者に対し将来の生活態度に関する重要な情報を与えることができる。また、臨床治験における新薬の評価についても、ＣＲの発現パターンを指標にして行うことが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ケラチノサイト中で、ＣＲの存在を確認した結果を示す図である。
【図２】ＣＲと、作製したポリクローナル抗体の反応性をウエスタンブロットで確認した結果を示す図である。
【図３】ケラチノサイト、および６種類の子宮頚部扁平上皮癌の培養細胞でのＣＲの発現検出結果を示す図である。
【図４】正常扁平上皮細胞の細胞質に局在するＣＲの検出結果を示す図である。
【図５】正常扁平上皮細胞の全層で強く発現するＣＲの検出結果を示す図である。
【図６】免疫組織学的染色によるＣＲの発現状況で、Ｓｔｒｏｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎの検出結果を示す図である。
【図７】免疫組織学的染色によるＣＲの発現状況で、Ｗｅａｋ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ（Ｗ＆Ｈ）の検出結果を示す図である。
【図８】免疫組織学的染色によるＣＲの発現状況で、Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ  ｐａｔｔｅｒｎ（Ｈｅｔｅｒｏ）の検出結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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