【手続補正書】
【提出日】平成25年1月24日(2013.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項２】
前記生物活性が、細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、Ｅ２Ｆ１遺伝子またはＥ２Ｆ２遺伝子の発現の促進活性、および脱メチル化活性からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと試験剤との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドと結合する試験剤を候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項４】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤の存在下で、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドを、脱メチル化される基質と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、該基質のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項５】
前記基質がメチル化ヒストンＨ３である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記メチル化レベルをヒストンＨ３のリシン４で検出する、請求項４記載の方法。
【請求項７】
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるヒストンＨ３のメチル化レベルを検出する段階：および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、ヒストンＨ３のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項８】
前記メチル化レベルをヒストンＨ３のリシン４で検出する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項１０】
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験剤の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
【請求項１１】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
単離された二本鎖分子であって、該分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０に対応する核酸配列を含み、該分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する、分子。
【請求項１３】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３'末端のいずれかまたは両方に、２〜１０ヌクレオチドからなる１つまたは２つの３'オーバーハングを有する、請求項１２記載の二本鎖分子。
【請求項１４】
介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる、請求項１２記載の二本鎖分子。
【請求項１５】
一般式
５'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−３'
を有し、［Ａ］がセンス鎖であり、［Ｂ］が３〜２３ヌクレオチドからなる介在一本鎖核酸配列であり、かつ［Ａ'］が［Ａ］に対する相補的配列を含むアンチセンス鎖である、請求項１４記載の二本鎖分子。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項記載の二本鎖分子をコードする、ベクター。
【請求項１７】
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１または３０のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
【請求項１８】
単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該分子がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約１９〜約２５ヌクレオチド長を有する、組成物。
【請求項１９】
前記二本鎖分子が請求項１２〜１５のいずれか一項記載の二本鎖分子である、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、請求項１８または１９記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
別の態様において、本スクリーニング法は、（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、（ｂ）該レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階、および（ｃ）試験剤または試験化合物の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤または試験化合物を、候補剤または候補化合物として選択する段階を含む。
好ましくは、上記スクリーニング法によって選択された候補剤または候補化合物を、がん細胞と接触させること、および次にがん細胞増殖を阻害する候補剤または候補化合物を選択することにより、さらにスクリーニングする。本発明の１つまたは複数の局面はある目的を達成できるが、一方、１つまたは複数の他の局面は他の目的を達成できることが、当業者には理解されるであろう。各目的は、そのすべての点において、本発明のあらゆる局面に対して等しく適用されるわけではない。このように、前述の目的は、本発明のいずれか１つの局面に関して択一的に捉えることができる。本発明の上記および他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を添付の図面および以下の実施例と併せて読むことにより、より十分に明らかになると考えられる。しかし、前記の本発明の概要および以下の詳細な説明はいずれも好ましい態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。
[本発明1001]
がんを検出または診断するための方法であって、
（ａ）対象由来の生物試料における、ｊｕｍｏｎｊｉ，  ＡＴ  ｒｉｃｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｏｍａｉｎ  1Ｂ（ＪＡＲＩＤ1Ｂ）遺伝子の発現レベルを、
（ｉ）ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出すること；
（ｉｉ）ＪＡＲＩＤ1Ｂタンパク質を検出すること；および
（ｉｉｉ）ＪＡＲＩＤ1Ｂタンパク質の生物活性を検出すること
からなる群より選択される方法のいずれか1つによって決定する段階；ならびに
（ｂ）該遺伝子の正常対照レベルと比較した、段階（ａ）で測定された発現レベルの増大を、がんの存在と関連付ける段階
を含む、方法。
[本発明1002]
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記対象由来の生物試料が、生検試料、喀痰、血液、胸水または尿を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
（ａ）ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ1Ｂタンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＪＡＲＩＤ1Ｂタンパク質の生物活性を検出するための試薬
からなる群より選択される試薬を含む、がんを診断するためのキット。
[本発明1005]
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、本発明1004のキット。
[本発明1006]
単離された二本鎖分子であって、該分子がＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：21または30に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、分子。
[本発明1007]
センス鎖および／またはアンチセンス鎖の3'末端のいずれかまたは両方に、2〜10ヌクレオチドからなる1つまたは2つの3'オーバーハングを有する、本発明1006の二本鎖分子。
[本発明1008]
介在性の一本鎖核酸配列によって連結されたセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含む単一のポリヌクレオチドからなる、本発明1006の二本鎖分子。
[本発明1009]
一般式
5'−［Ａ］−［Ｂ］−［Ａ'］−3'
を有し、［Ａ］がセンス鎖であり、［Ｂ］が3〜23ヌクレオチドからなる介在一本鎖核酸配列であり、かつ［Ａ'］が［Ａ］に対する相補的配列を含むアンチセンス鎖である、本発明1008の二本鎖分子。
[本発明1010]
本発明1006〜1009のいずれかの二本鎖分子をコードする、ベクター。
[本発明1011]
センス鎖核酸およびアンチセンス鎖核酸を含むポリヌクレオチドの組み合わせのそれぞれを含むベクターであって、該センス鎖核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：21または30のヌクレオチド配列を含み、該アンチセンス鎖核酸が該センス鎖に相補的な配列からなり、該センス鎖および該アンチセンス鎖の転写物が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該ベクターが、ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に細胞増殖を阻害する、ベクター。
[本発明1012]
単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを対象に投与する段階を含む、がんを治療または予防するための方法であって、該分子がＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、方法。
[本発明1013]
前記二本鎖分子が、本発明1006〜1009のいずれかの二本鎖分子である、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌および腎細胞癌からなる群より選択される、本発明1012または1013の方法。
[本発明1015]
単離された二本鎖分子または該二本鎖分子をコードするベクターを含む、がんを治療または予防するための組成物であって、該分子がＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞に導入された場合に該遺伝子の発現を阻害し、該分子がセンス鎖およびそれに相補的なアンチセンス鎖を含み、該鎖が互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、該センス鎖がＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子の核酸配列またはその断片に対応する核酸配列を含み、該分子が約19〜約25ヌクレオチド長を有する、組成物。
[本発明1016]
前記二本鎖分子が本発明1006〜1009のいずれかの二本鎖分子である、本発明1015の組成物。
[本発明1017]
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、本発明1015または1016の組成物。
[本発明1018]
がんを治療もしくは予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ1Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと試験剤との間の結合活性を検出する段階；および
（ｃ）該ポリペプチドと結合する試験剤を候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1019]
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤をＪＡＲＩＤ1Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドの生物活性を検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される生物活性と比較して、該ポリペプチドの生物活性を抑制する該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1020]
前記生物活性が、細胞増殖活性、抗アポトーシス活性、Ｅ2Ｆ1遺伝子またはＥ2Ｆ2遺伝子の発現の促進活性、および脱メチル化活性からなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤の存在下で、ＪＡＲＩＤ1Ｂポリペプチドを、脱メチル化される基質と、該基質の脱メチル化に適した条件下で接触させる段階；
（ｂ）該基質のメチル化レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、該基質のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1022]
前記基質がメチル化ヒストンＨ3である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記メチル化レベルをヒストンＨ3のリシン4で検出する、本発明1021の方法。
[本発明1024]
がんを治療または予防するためまたはがん細胞増殖を阻害するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）該細胞におけるヒストンＨ3のメチル化レベルを検出する段階：および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出されるメチル化レベルと比較して、ヒストンＨ3のメチル化レベルを増大させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1025]
前記メチル化レベルをヒストンＨ3のリシン4で検出する、本発明1024の方法。
[本発明1026]
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子を発現している細胞と接触させる段階；
（ｂ）ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子の発現レベルを検出する段階；および
（ｃ）試験剤の非存在下で検出される発現レベルと比較して、ＪＡＲＩＤ1Ｂ遺伝子の発現レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1027]
がんを治療または予防するための候補剤をスクリーニングする方法であって、
（ａ）試験剤を、ＪＡＲＩＤ1Ｂの転写調節領域および該転写調節領域の制御下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターが導入された細胞と接触させる段階、
（ｂ）該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階；ならびに
（ｃ）試験剤の非存在下における発現レベルまたは活性レベルと比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性レベルを低下させる該試験剤を、候補剤として選択する段階
を含む、方法。
[本発明1028]
前記がんが、急性骨髄性白血病、膀胱癌、乳癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌または腎細胞癌からなる群より選択される、本発明1018〜1027のいずれかの方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
【図１Ａ−Ｃ】図１は、英国人および日本人の患者の膀胱癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。Ａは、正常膀胱組織および臨床病期別に分類した膀胱癌組織における、定量的リアルタイムＰＣＲを用いて測定したＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現レベルの散布図を示す。Ｂは、英国人症例での正常膀胱組織および腫瘍膀胱組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現を表す。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを定量的リアルタイムＰＣＲによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。相対的ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現によって正規化した値を示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｃは、日本人患者における膀胱の正常組織と腫瘍組織との間の発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。
【図１Ｄ−Ｅ】Ｄは、日本人患者における正常膀胱組織と腫瘍膀胱組織の間でのＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の比較を表す。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｅは、膀胱組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの免疫組織化学染色を表す。ＩｇＧの非特異的結合からまたは二次抗体からの偽陽性応答の可能性を除くために、非免疫マウスＩｇＧを一次抗体の代わりに用いた。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０および×４００。
【図２】図２は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現に関する標準的な免疫組織化学法によって染色した、さまざまな背景の膀胱腫瘍の組織マイクロアレイ画像を表す。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×１００、×２００、および×４００。
【図３Ａ−Ｂ】図３は、肺癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。Ａは、正常肺組織と非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）組織の間での発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。Ｂは、正常肺組織と小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）組織の間での発現比を表す。各試料のシグナル強度はｃＤＮＡマイクロアレイによって分析されたものであり、発現比は腫瘍組織におけるシグナル強度を正常組織のそれによって除算したものである（１が正常）。
【図３Ｃ−Ｄ】Ｃは、正常肺組織と腫瘍肺組織の間でのＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の比較を表す。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図によって示す（中央の５０％を四角で囲む）。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。Ｄは、肺組織におけるマウスモノクローナル抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体を用いた免疫組織化学染色像を表す。ＩｇＧの非特異的結合からまたは二次抗体からの偽陽性応答の可能性を確認するために、非免疫マウスＩｇＧを一次抗体の代わりに用いた。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０、および×４００。
【図４】図４は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現について標準的な免疫組織化学法によって染色したさまざまな背景を持つ肺腫瘍の組織マイクロアレイ画像を表す。各切片に関する臨床情報を組織像の上方に示す。対比染色はヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×１００、×２００、および×４００。
【図５】図５は、日本人群のＡＭＬ、子宮頸癌、ＣＭＬ、乳癌および腎細胞癌におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の上昇を表す。ＪＡＲＩＤ１Ｂの発現レベルを正常組織と腫瘍組織の間で比較した。各試料のシグナル強度をｃＤＮＡマイクロアレイによって分析し、結果を箱ひげ図（中央の５０％を四角で囲む）によって示す。統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定を用いた。
【図６】図６は、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次にアフィジコリン除去から４時間後および１２時間後に抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ５９４）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ４８８）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）を用いて免疫細胞化学染色した、ＳＢＣ５細胞を表す。挿入図は、アフィジコリン処理から４時間後（上）および１２時間後（下）における細胞周期停止の同期的解除を実証するＦＡＣＳ分析を示す。
【図７Ａ−Ｅ】図７は、膀胱癌細胞および肺癌細胞の増殖におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの関与を表す。Ａは、１２種の膀胱癌細胞株、４種の非小細胞肺癌細胞株および１種の小細胞肺癌細胞株におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の発現パターンを表す。Ｂは、ＳＷ７８０細胞およびＡ５４９細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）によるＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子の内在性発現の抑制を示す、定量的リアルタイムＰＣＲを表す。ＥＧＦＰを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＰ）を対照として用いた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｃは、膀胱癌細胞株（ＲＴ４、ＳＷ７８０およびＵＭＵＣ３）および肺癌細胞株（ＬＣ３１９、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＡＩおよびＳＢＣ５）の生存率に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。細胞生存率は３回調べた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤ。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｄは、対照ｓｉＲＮＡまたはＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）による処理から７２時間後にＦＡＣＳによって分析した、ＳＢＣ５細胞のＤＮＡ含量を表す。Ｅは、細胞周期の状態毎に細胞を分類した、ＤにおけるＦＡＣＳの結果の数値解析を表す。サブＧ１期のがん細胞の割合は、対照ｓｉＲＮＡで処理したがん細胞と比較して、ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１による処理後の方が有意に高い。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【図７Ｆ−Ｇ】Ｆは、ＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞における２種類の異なるＪＡＲＩＤ１Ｂ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１および＃２）による内在性ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現の抑制を示す、定量的リアルタイムＰＣＲの結果を表す。ｓｉＥＧＦＰおよびｓｉＮＣを対照として用いた。ｍＲＮＡ発現レベルはＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現によって正規化されたものであり、値はｓｉＥＧＦＰに対して相対的である（ｓｉＥＧＦＰ＝１）。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｇは、膀胱癌細胞株（ＳＷ７８０およびＲＴ４）および肺癌細胞株（Ａ５４９、ＬＣ３１９およびＳＢＣ５）の生存率に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ  ｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。相対的細胞数は、ｓｉＥＧＦＰで処理した細胞に対して正規化した値を示す。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。
【図８】図８は、ＪＡＲＩＤ１Ｂ発現をノックダウンした後のＳＷ７８０およびＡ５４９のｍＲＮＡ発現プロファイルの、二次元の教師なし階層型クラスター分析を表す。差次的に発現している遺伝子をこの分析のために選択した。赤色はアップレギュレートされた遺伝子を示す（左の１列）；緑色はダウンレギュレートされた遺伝子を示す（右の２列）。
【図９】図９は、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２がＪＡＲＩＤ１Ｂの下流遺伝子であることの確認を表す。ＡおよびＢは、ＳＷ７８０細胞、Ａ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞におけるＥ２Ｆ１（Ａ）およびＥ２Ｆ２（Ｂ）の発現レベルを表しており、これらはＪＡＲＩＤ１Ｂを標的とするｓｉＲＮＡ（ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１）またはＥＧＦＰ（対照）による処理後に定量的リアルタイムＰＣＲによって分析された。相対的ｍＲＮＡ発現は任意値であるが、各細胞群についての発現をＧＡＰＤＨおよびＳＤＨの発現に対して正規化した。統計分析は３回の独立した実験に基づいて行った。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｃは、リアルタイムＰＣＲによって測定したＥ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現を表しており、非腫瘍性膀胱組織と比較して、膀胱腫瘍組織において有意にアップレギュレートされ、腫瘍組織におけるＪＡＲＩＤ１Ｂ発現に相関していた。１３種のがん組織および正常組織をそれぞれ分析し、統計分析にはマン・ホイットニーのＵ検定およびスピアマンの順位相関係数を用いた。Ｄは、Ｅ２Ｆの転写活性に対するＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子発現のｓｉＲＮＡノックダウンの影響を表す。このアッセイにはＣｉｇｎａｌ（商標）Ｅ２Ｆ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いた。３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示した。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を用いて算出した。Ｅは、ＪＡＲＩＤ１Ｂ、Ｅ２Ｆ１およびＥ２Ｆ２の発現をタンパク質レベルで表す。ｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃１またはｓｉＪＡＲＩＤ１Ｂ＃２による処理後のＡ５４９細胞およびＳＢＣ５細胞由来の溶解物を、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体、Ｅ２Ｆ１抗体、Ｅ２Ｆ２抗体およびアクチン抗体を用いてイムノブロットした。アクチンは内部対照として利用した。
【図１０】図１０は、ＪＡＲＩＤ１Ｂのタンパク質発現に関する標準的な免疫組織化学法によって染色した正常な心臓、腎臓および肝臓の画像を表す。対照染色は、二次抗体からの偽陽性応答の可能性を除くために一次抗体を用いずに行い、対比染色は、ヘマトキシリンおよびエオジンによって行った。元の倍率は×４０および×４００である。
【図１１】図１１は、Ａ５４９細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞内局在を表す。これらの細胞を、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次に、アフィジコリン除去から０、４、８、１２および２４時間後に抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ４８８［緑色］）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ５９４［赤色］）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；青色）を用いて免疫細胞化学的に染色した。挿入図は、細胞周期停止の同期的解除を実証するＦＡＣＳ分析を示しており、矢印はＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞質局在を示す。Ａ５４９細胞を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で２０分間固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）を室温で２分間用いて透過性にした。引き続いて、該細胞を、３％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（−）を用いて室温で１時間覆って非特異的ハイブリダイゼーションを遮断し、その後、希釈比１：１００で希釈したマウス抗ＪＡＲＩＤ１Ｂ抗体（１Ｇ１０、Ａｂｎｏｖａ）とともにインキュベーションした。ＰＢＳ（−）で洗浄した後に、細胞を、１：１０００希釈したＡｌｅｘａ５９４結合抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）によって染色した。核を、４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ）で対比染色した。蛍光画像をＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で得た。
【図１２】図１２は、ＳＢＣ５細胞におけるＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞内局在を表す。ＳＢＣ５細胞を、７．５μｇ／ｍｌのアフィジコリンを用いた２４時間の処理による細胞周期停止に供し、次に、アフィジコリン除去から０、４、８、１２および２４時間後に、抗ＪＡＲＩＤ１Ｂモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ４８８［緑色］）、ファロイジン（Ｆ−アクチン、Ａｌｅｘａ５９４［赤色］）および４'，６'−ジアミジン−２'−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ；青色）を用いて免疫細胞化学的に染色した。挿入図は、細胞周期停止の同期的解除を実証しているＦＡＣＳ分析を示しており、矢印はＪＡＲＩＤ１Ｂの細胞質局在を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
本発明のキットはさらに、陽性対照試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂ標準試料を含んでもよい。本発明の陽性対照試料は、急性骨髄性白血病、膀胱癌、慢性骨髄性白血病、子宮頸癌、肺癌および腎細胞癌に由来する細胞などのＪＡＲＩＤ１Ｂ陽性試料を採取した後、それらのＪＡＲＩＤ１Ｂレベルを分析することによって、調製され得る。あるいは、精製されたＪＡＲＩＤ１Ｂタンパク質またはＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子を細胞にトランスフェクトして、陽性試料またはＪＡＲＩＤ１Ｂの標準物質を形成させてもよい。
別の態様において、本発明のキットはさらに陰性対照試料を含んでもよい。本発明の陰性対照試料は、非がん性細胞などの、ＪＡＲＩＤ１Ｂを発現しない細胞または組織である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
より具体的には、本方法は、
（ａ）試験剤または試験化合物を、ＪＡＲＩＤ１Ｂ遺伝子に由来するＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドと接触させる段階；
（ｂ）該ポリペプチドと該試験剤または試験化合物との間の結合レベルを検出する段階；
（ｃ）（ｂ）の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の非存在下で検出した結合レベルと比較する段階；および
（ｄ）（ｃ）の結合レベルを、該試験剤または試験化合物の治療効果と関連付ける段階
を含む。
本発明において、治療効果は、ＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドの結合レベルと相関し得る。例えば、試験剤または試験化合物がＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合する場合には、該試験剤または試験化合物を、治療効果を有する候補剤または候補化合物として同定または選択することができる。代替的に、試験剤または試験化合物がＪＡＲＩＤ１Ｂポリペプチドに結合しない場合には、該試験剤または試験化合物を、有意な治療効果を有さない剤または化合物として同定することができる。