【手続補正書】
【提出日】平成25年6月21日(2013.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の遺伝物質を修飾する方法であって、
（ａ）標的ＤＮＡ配列を含有する細胞を提供するステップと、
（ｂ）転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼをコードするベクターを前記細胞へ導入するステップであって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡを切断することができるＦｏｋＩドメイン、および
（ｉｉ）組み合わせて標的ＤＮＡ配列中の特定のヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン
を含むものであり、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、前記細胞またはその子孫中の前記特定のヌクレオチド配列内にあるまたはそれに隣接する前記標的ＤＮＡ配列を切断するように、ＴＡＬエフェクター−ＤＮＡ修飾酵素を前記細胞へ導入する、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列と前記核酸との間で相同組換えが起こるように、前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む核酸を、前記細胞に提供するステップをさらに含む、方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が植物細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、
前記導入ステップが、前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしているベクターを用いて細胞を形質移入することを含む、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列内の特定のヌクレオチド配列と結合する前記ＴＡＬエフェクタードメインが、１５個以上のＴＡＬエフェクター反復配列を含む、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定する反復可変性二残基（ＲＶＤ）を含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＲＶＤが、
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および、
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法であって、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＲＶＤが、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊［ただし＊はＲＶＤの第２位置中のギャップを表す］、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項９】
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を作製する方法であって、当該方法は、
（ａ）細胞のゲノム中の第１のユニークなヌクレオチド配列を同定するステップと、
（ｂ）（ｉ）組み合わせて前記第１のユニークなヌクレオチド配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列、および（ｉｉ）第１のヌクレオチド配列内においてまたはそれに隣接する部位において二本鎖切断を生じるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインを含む、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を合成するステップであって、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っており、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および、
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含むステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼが、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの１つまたは複数を含む、方法。
【請求項１１】
請求項９または１０に記載の方法であって、
前記第１のヌクレオチド配列が以下の基準：
ｉ）最小で１５個の塩基の長さであり、５’から３’に配向されており、Ｔが５’末端の部位の直前にあること、
ｉｉ）第１（５’）位置にＴを有さない、または、第２位置にＡを有さないこと、
ｉｉｉ）最終（３’）位置がＴで終わり、最後から２番目の位置にＧを有さないこと、ならびに
ｉｖ）０〜６３％のＡ、１１〜６３％のＣ、０〜２５％のＧ、および２〜４２％のＴの塩基組成を有すること
のうちの少なくとも１つを満たす、方法。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、
前記細胞のゲノム中の第２のヌクレオチド配列を同定するステップをさらに含み、
前記第１および第２のヌクレオチド配列が、１５〜１８ｂｐで分離されている、方法。
【請求項１３】
前記エンドヌクレアーゼが、前記第１および第２のヌクレオチド配列の間に二本鎖切断を生じる、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡに特異的なＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインとを含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体であって、
前記ＤＮＡ結合ドメインが複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が前記標的ＤＮＡ中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み、
それぞれのＴＡＬエフェクター反復配列が、前記標的ＤＮＡ中の１つの塩基対の認識を司っている、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体であって、
ここで、当該単量体は、他の単量体と共に、スペーサーを有する二連認識部位にわたる二量体として機能し、ＦｏｋＩが二量体化してスペーサー内の前記標的ＤＮＡにおけるニ本鎖切断を生じることを可能とする、
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体。
【請求項１６】
請求項１４に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体であって、
ここで、前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
Ｇを認識するためのＮＮ、
Ａを認識するためのＮＳ、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＩＧ、
Ｇを認識するためのＮＫ、
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、および、
Ｇを認識するためのＮＡ、
のうちの１つまたは複数を含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体。
【請求項１７】
請求項１４に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体が、以下のＲＶＤ：
Ｃを認識するためのＨＡ、
Ｃを認識するためのＮＤ、
Ｃを認識するためのＨＩ、
Ｇを認識するためのＨＮ、
Ｇを認識するためのＮＡ、
ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、
Ｔを認識するためのＹＧ、および
Ｇを認識するためのＮＫ、
のうちの１つまたは複数、ならびに
Ｃを認識するためのＨＤ、
Ｔを認識するためのＮＧ、
Ａを認識するためのＮＩ、
ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、
ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ、
ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、
Ｔを認識するためのＨＧ、
Ｔを認識するためのＨ＊、および
Ｔを認識するためのＩＧ
のうちの少なくとも１つまたは複数を含む、ＴＡＬＥＮ。
【請求項１８】
請求項１４に記載のＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体であって、
前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列が、配列番号３３〜配列番号５５、配列番号７２、および配列番号７３から選択される配列に対し、少なくとも９５％の同一性を有する、
ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ単量体。。
【請求項１９】
動物を作製する方法であって、
ｉ）遺伝子修飾を導入することが所望される標的ＤＮＡ配列を含む真核細胞を提供するステップと、ここで、前記細胞は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインおよび標的ＤＮＡ配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を含み、
ｉｉ）前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内で二本鎖切断を生じるステップと、
ｉｉｉ）前記二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡの少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記細胞内に導入するステップであって、
前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間に相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
前記相同組換えが起こった細胞またはその子孫から動物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項２１】
植物を作製する方法であって、
ｉ）事前に選択された遺伝子修飾の導入が所望される標的ＤＮＡ配列を含む植物細胞を提供するステップと、ここで、前記細胞は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインおよび標的ＤＮＡ配列と結合するＴＡＬエフェクタードメインを含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を含み、
ｉｉ）前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼを用いて、前記標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断を生じるステップと、
ｉｉｉ）前記二本鎖切断が起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記標的ＤＮＡ配列の少なくとも一部分に相同的な配列を含む外因性核酸を、前記植物細胞内に導入するステップであって、前記導入するステップが、前記外因性核酸と前記細胞またはその子孫中の前記標的ＤＮＡ配列との間で相同組換えが起こることを可能にする条件下で行われる、ステップと、
前記相同組換えが起こった細胞またはその子孫から植物を作製するステップと
をさらに含む、方法。
【請求項２３】
細胞における標的化遺伝子組換えの方法であって、
ｉ）選択されたＤＮＡ標的配列を標的としたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸を前記細胞内に導入するステップと、
ｉｉ）前記細胞内での前記ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼの発現を誘導するステップと、
ｉｉｉ）前記選択されたＤＮＡ標的配列が突然変異を示している細胞を同定するステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記突然変異が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入の両方からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞内にドナーＤＮＡを導入するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が昆虫細胞、植物細胞、魚細胞、または哺乳動物細胞である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）二本鎖ＤＮＡを切断することができるＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメイン、および、（ｉｉ）組み合わせて、選択された標的ＤＮＡ配列と結合する複数のＴＡＬエフェクター反復配列を含むＴＡＬエフェクタードメイン、を含むＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼをコードしている核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセット。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現カセットを含む宿主細胞。