(57)【要約】【課題】  有効にリン酸化ＭＢＰを増加させることのできる物質を見出し、これを利用するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤を提供すること。【解決手段】  ヘスペリジンおよび／またはナリルチンを有効成分として含有するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘスペリジンおよび／またはナリルチンを有効成分として含有するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項２】
エクソン２を有するリン酸化ＭＢＰの産生を促進するものである請求項１記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項３】
エクソン２を有するリン酸化ＭＢＰが、２１．５ｋＤまたは１７.０ｋＤのものである請求項第２項記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項４】
ヘスペリジンおよび／またはナリルチンが陳皮より得たものである請求項第１項ないし第３項の何れかの項記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項５】
ミエリン形成改善効果を有する請求項第１項ないし第４項の何れかの項記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項６】
脱髄疾患の予防および／または治療効果を有する請求項第１項ないし第４項の何れかの項記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【請求項７】
脱髄疾患が、多発性硬化症、認知症、統合性失調症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症および急性若しくは亜急性壊死性出血性脳脊髄炎から選ばれるものである請求項６記載のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリン酸化ＭＢＰ産生促進剤に関し、更に詳細には、ミエリン形成改善効果や、脱髄疾患の予防および／または治療効果を有するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系に存在するミエリンは、オリゴデンドロサイトの細胞膜が延長され、渦状に巻かれたものである。しかし、実際は、ミエリンを構成する細胞膜の細胞質側同士がミエリン・ベーシック・プロテイン（ＭＢＰ）によって強固に接着される特殊機構によってミエリンは厚密化されている。この厚密化機構によりミエリンの水分含有量は極めて低くなり、神経細胞の軸索を絶縁することが可能となる。このようにミエリンの主機構の絶縁と関係することから、ＭＢＰの重要性が理解しうるが、さらにＭＢＰはミエリン形成開始のシグナルとして働いているともいわれている。すなわち、ＭＢＰ遺伝子は、７つのエクソンを持ち、選択的スプライシングによって主に４種類のアイソフォームが産生されるが、特にエクソン２を含む２種類のＭＢＰアイソフォームは核内に移行してミエリン形成を制御しているとされている。
【０００３】
ところで、上記ＭＢＰには、いくつかの修飾体があり、そのうちリン酸化ＭＢＰは脱随疾患では低下することが知られている。本発明者らは、先に、ＭＢＰのリン酸化について研究を行い、リン酸化ＭＢＰが脱随防止や、再ミエリン化と深く関係していることを知った。
【０００４】
このように、リン酸化ＭＢＰの増加は、脱随防止や、再ミエリン化を通じて神経細胞の老化を防止することが期待されるが、有効かつ十分にリン酸化ＭＢＰを増加させることのできる薬剤が知られていないのが実情であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って本発明は、有効にリン酸化ＭＢＰを増加させることのできる物質を見出し、これを利用するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、特に生薬成分に注目してそれらの薬理効果を検討していたところ、生薬である陳皮に多く含まれるヘスペリジンやナリルチンは優れたリン酸化ＭＢＰ産生促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、ヘスペリジンおよび／またはナリルチンを有効成分として含有するリン酸化ＭＢＰ産生促進剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤は、老化等により減少するリン酸化ＭＢＰの量を増加させることができるものであり、脱随防止や、神経細胞の再ミエリン化に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において有効成分として使用されるヘスペリジンやナリルチンは、何れもフラバン配糖体であり、下記式で示されるものである。
【００１０】
【化１】
2008127325.tif 000002
【００１１】
【化２】
2008127325.tif 000003
【００１２】
これらは、何れもミカン等の柑橘類の果皮に多く含まれており、生薬である陳皮の主要薬効成分である。
【００１３】
本発明において使用されるヘスペリジンおよびナリルチンは、ミカンの果皮あるいは陳皮から抽出等適当な分離精製手段で得たものを利用しても良いし、また、これら化合物の市販品を使用しても良い。更に、これらが混合して含まれている陳皮を利用しても良い。
【００１４】
本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤は、上記したヘスペリジンおよび／またはナリルチンを有効成分とし、他の医薬用担体と適宜混合し、これを経口剤あるいは非経口剤として製剤化することにより製造することができる。
【００１５】
経口剤としては、粉剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、液剤等とすることができ、これに応じた医薬用担体、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等を利用することができる。また、経口剤の調製にあたっては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することができる。
【００１６】
また、非経口剤も常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を用いることができる。更に、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定剤を加えてもよい。
【００１７】
更に、この非経口剤は安定性の点から、バイアル等に充填後冷凍し、通常の凍結乾燥技術により水分を除去し、使用直前に凍結乾燥物から液剤を再調製することもできる。更にまた、必要に応じて適宜、等張化剤、安定剤、防腐剤、無痛化剤等を加えてもよい。その他の非経口剤としては、外用液剤、軟膏等の塗布剤、直腸内投与のための坐剤等が挙げられ、これらは何れも常法に従って製造される。
【００１８】
本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤において、有効成分であるヘスペリジンおよび／またはナリルチンの配合量は、対象疾患、疾患程度、患者年齢等によっても相違するが、例えば、ヘスペリジンまたはナリルチンのみを有効成分とする経口製剤の場合は、大人一人当たり一日量として、０.１ないし１０００ｍｇ程度であり、１ないし１００ｍｇとすることが好ましい。更に、ヘスペリジンとナリルチンの双方を有効成分とする経口製剤の場合は、前記投与量を参考にして決めればよい。
【００１９】
なお、既に漢方薬として公知の人参養栄湯には、上記のヘスペリジンおよびナリルチンが高い濃度で含まれているので、ヘスペリジンおよび／またはナリルチンに代え、これを本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤の有効成分として使用することもできる。
【００２０】
以上のようにして得られる本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤は、リン酸化ＭＢＰ量の減少に起因する疾患、例えば、多発性硬化症、認知症、統合性失調症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症、急性若しくは亜急性壊死性出血性脳脊髄炎脱髄疾患等の疾患の予防、治療に有効である。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００２２】
実  施  例  １
インビトロ（in vitro）のオリゴデンドロサイト前駆細胞培養系での
リン酸化ＭＢＰの変化：
【００２３】
（１）オリゴデンドロサイト前駆細胞の調製
胎生１７日マウスの大脳を０.３％  ディスパーゼ（Dispase）ＩＩ、０.０５％  ＤＮａｓｅ溶液（いずれもダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で希釈）で酵素的に分散し、得られた分散細胞をＤＭＥＭで洗った後、ポアーサイズ７０μｍのナイロンメッシュに通した。１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭに懸濁した後、ポリ−Ｌ−リシンコートした培養皿（１.３ｘ１０７ｃｅｌｌ／直径１０ｃｍディッシュ）上に播種し、５％炭酸ガスインキュベーター中で５日間培養した。
【００２４】
その後、細胞を０.２％  トリプシン／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で剥離し、４℃、１０００回転で１０分間遠心し、上清を捨て去った後、無血清培地（ＤＭＥＭにグルコース（５.６ｍｇ／ｍｌ），カナマイシン（６０ｍｇ／ｍｌ），インスリン（５μｇ／ｍｌ），トランスフェリン（０.５μｇ／ｍｌ），ＢＳＡ（１００μｇ／ｍｌ），プロゲステロン（０.０６ｎｇ／ｍｌ），プトレスシン（putrescine）（１６μｇ／ｍｌ），亜セレン酸ナトリウム（４０ｎｇ／ｍｌ），チロキシン（Ｔ４）（４０ｎｇ／ｍｌ），トリヨードチロニン（Ｔ３）（３０ｎｇ／ｍｌ）を添加したもの）に、５ｘ１０６ｃｅｌｌ／直径１０ｃｍデッシュになるよう懸濁し、播種し培養した。
【００２５】
（２）イムノブロット解析
上記（１）で調製したオリゴデンドロサイト前駆細胞にＰＢＳで希釈したヘスペリジンとナリルチンの１：１の混合物を１μｇ／ｍＬとなるように添加し、７２時間培養を行った。細胞を溶解し、抗ＭＢＰ抗体で免疫沈降を行った後、イムノブロット（Immuno Blot）解析を行った。
【００２６】
具体的には、タンパクを含む溶液を、１５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後にトランスファーした。３％スキムミルクで１時間ブロッキング後、抗リン酸化ＭＢＰ抗体を１次抗体として室温で２時間インキュベートした。
【００２７】
ＰＶＤＦ膜を洗浄後、アルカリフォスファターゼラベルしたマウスあるいはウサギＩｇＧを２次抗体として室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（Nitro Blue Tetrazolium（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）溶液を基質として発色させ、バンドをデンシトメーターによって定量した。この結果を表１に示す。なお、コントロールとしては、ＰＢＳを使用した。
【００２８】
【表１】
2008127325.tif 000004
【００２９】
実  施  例  ２
老齢モデルでのリン酸化ＭＢＰの変化
（１）マウスの飼育および薬剤投与
１群３匹から６匹の種々の月齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを、東京都老人総合研究所実験動物施設にてＳＰＦ飼育した。各飼育マウス群のうち、２９ヶ月齢のマウスのみ更に２群に分け、一方の群のみに１％の濃度で、飲水に混ぜた人参養栄湯を２ヶ月間投与した。
【００３０】
（２）ミエリン画分の調製
各群のマウスを屠殺後、大脳０.２ｇを量り取り、これを２０倍量の０.３２Ｍショ糖溶液中で、テフロンホモジナイザーを用いてホモジナイズをした。その後、これを０.８５Ｍショ糖溶液に重層し、２５,０００回転で、３０分間遠心した。
【００３１】
２層のショ糖溶液中の中間層に存在する粗ミエリン層を採取し、テフロンホモジナイザーを用いてホモジナイズすることによって水に懸濁後、２５,０００回転で、１５分間遠心後上清を廃棄し、同様の操作を繰り返して洗浄した。さらに得られたミエリンの沈殿を０.３２Ｍショ糖溶液中で懸濁した後、０.８５Ｍショ糖溶液上に重層して遠心し、中間層の部分を精製したミエリン画分とした。
【００３２】
（３）イムノブロット解析
タンパクを含む溶液を、１５％  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動後にトランスファーした。３％スキムミルクで１時間ブロッキング後、抗ＭＢＰ抗体、抗リン酸化ＭＢＰ抗体、あるいは抗アクチン抗体を１次抗体として室温で２時間インキュベートした。
【００３３】
ＰＶＤＦ膜を洗浄後、アルカリフォスファターゼラベルしたマウスあるいはウサギＩｇＧを２次抗体として室温で２時間インキュベートし、洗浄した後、ニトロ・ブルー・テトラゾリウム（Nitro Blue Tetrazolium（ＮＢＴ）／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）溶液を基質として発色させ、バンドをデンシトメーターによって定量した。ＭＢＰの定量値をアクチンの定量値によって除し、電気泳動したタンパク量の補正を行った。リン酸化ＭＢＰについての結果を表２に、総ＭＢＰについての結果を表３にそれぞれ示す。
【００３４】
【表２】
2008127325.tif 000005
【００３５】
【表３】
2008127325.tif 000006
【００３６】
各アイソフォームの総ＭＢＰは有意に減少しなかったが、リン酸化ＭＢＰ（21.5kD）は劇的に減少した。さらに２ヶ月の人参養栄湯投与を行った３１ヶ月齢の老齢マウスのリン酸化ＭＢＰ（21.5kD）量は１２ヶ月齢の成齢マウスと同程度に回復した。
【００３７】
製  剤  例  １
錠  剤：
以下の処方、製法により錠剤を製造した。
【００３８】
［処  方］
（１）デキストリン                              ５４ｇ
（２）結晶セルロース                            ３２ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム        ６ｇ
（４）ポリエチレングリコール６０００              ６ｇ
（５）ヘスペリジン                                ２ｇ
計                                    １００ｇ
【００３９】
［製  法］
上記の処方に従って（１）〜（５）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して一錠１００ｍｇの錠剤を得た。この錠剤一錠には、ヘスペリジン
２ｍｇが含有されており、成人１日１〜６錠を数回にわけて服用する。
【００４０】
製  剤  例  ２
顆  粒  剤：
以下の処方、製法により顆粒剤を製造した。
【００４１】
［処  方］
（１）デキストリン                              ９０ｇ
（２）ポリエチレングリコール６０００          ２．５ｇ
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム        ６ｇ
（４）軽質無水ケイ酸                          ０．５ｇ
（５）チンピエキス末                              １ｇ
計                                    １００ｇ
【００４２】
［製  法］
上記の処方に従って（１）〜（５）を均一に混合し、圧縮成型機にて圧縮成型後、破砕機により粉砕し、篩別して顆粒剤を得た。この顆粒剤１ｇには、チンピエキス末が１０ｍｇ含有されており、成人１日２００〜１０００ｍｇを数回にわけて服用する。
【００４３】
製  剤  例  ３
カ  プ  セ  ル  剤：
以下の処方、製法によりカプセル剤を製造した。
【００４４】
［処  方］
（１）無水結晶マルトース                        ９８ｇ
（２）軽質無水ケイ酸                              １ｇ
（３）ナリルチン                                  １ｇ
計                                    １００ｇ
【００４５】
［製  法］
上記の処方に従って（１）〜（３）を均一に混合し、２００ｍｇを２号カプセルに充填した。このカプセル剤１カプセルには、ナリルチンが２ｍｇ含有されており、成人１日１〜６カプセルを数回にわけて服用する。
【００４６】
製  剤  例  ４
注  射  剤：
以下の処方、製法により注射剤を製造した。
【００４７】
［処  方］
（１）注射用蒸留水                          ９０．４ｇ
（２）大豆油                                      ５ｇ
（３）大豆リン脂質                            ２．５ｇ
（４）グリセリン                                  ２ｇ
（５）ナリルチン                              ０．１ｇ
全  量                                １００ｇ
【００４８】
［製  法］
上記の処方に従って（５）を（２）および（３）に溶解し、これに（１）と（４）の溶液を加えて乳化し、注射剤を得た。
【００４９】
製  剤  例  ５
錠  剤：
以下の処方、製法により錠剤を製造した。
【００５０】
［処  方］
（１）カルボキシメチルセルロース                ２１ｇ
（２）炭酸水素ナトリウム                        １０ｇ
（３）ステアリン酸マグネシウム                    １ｇ
（４）軽質無水ケイ酸                              １ｇ
（５）人参養栄湯エキス粉末                      ６７ｇ
計                                    １００ｇ
【００５１】
［製  法］
上記の処方に従って（１）〜（５）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して一錠１００ｍｇの錠剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤の有効成分であるヘスペリジンおよび／またはナリルチンは、老化等により減少するリン酸化ＭＢＰの量を増加させることができるものである。
【００５３】
従って本発明のリン酸化ＭＢＰ産生促進剤は、老化等によるリン酸化ＭＢＰの減少に起因する疾患、例えば、多発性硬化症、認知症、統合性失調症、急性散在性脳脊髄炎、炎症性広汎性硬化症、急性若しくは亜急性壊死性出血性脳脊髄炎脱髄疾患等の疾患の予防、治療に有効なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例１において、インビトロ（in vitro）でのリン酸化ＭＢＰ(２１．５ｋＤ)の発現量を示す図である。
【図２】実施例２において、老齢ラットにおけるリン酸化ＭＢＰと総ＭＢＰの測定結果を示す図である。                                                                                                                              以    上
【図１】
2008127325.tif 000007
【図２】
2008127325.tif 000008