【手続補正書】
【提出日】平成25年3月11日(2013.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応用の反応混合物において、前記反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の前記反応混合物に含めることを含み、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれるが、ただし、前記添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする、反応混合物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの修飾基は、２〜４つの修飾基である、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項３】
前記添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖と、を含む、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項４】
前記修飾基は、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の末端ヌクレオチドに共有結合的に連結される、請求項１〜３のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項５】
前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、請求項２に記載の増幅反応混合物。
【請求項７】
前記混合物は、３本の鎖から成る、請求項６に記載の増幅反応混合物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、天然のヌクレオチドから成る、請求項１〜７のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ＤＮＡである、請求項１〜７のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブではない、請求項１、２および４〜９のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の前記濃度は、１０００ｎＭ以下である、請求項１〜１０のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１２】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の増幅反応混合物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、１〜４つの一本鎖オーバーハングを含む、請求項１に記載の増幅反応混合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、ハイブリッド形成されない時、ステムループ構造を形成する少なくとも１本の鎖を含む、請求項１３に記載の増幅反応混合物。
【請求項１５】
少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するための方法であって、前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を請求項１〜１４のいずれか１項に記載の増幅反応混合物と接触させることと、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度を有するプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に、前記反応混合物を供することと、を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
上述の特定の実施形態は、包括的ではなく、特許請求の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。これらの実施形態の種々の修正は、本明細書に記載される概念から逸脱することなく行うことができる。このような修正は、本特許請求の範囲内に含まれるものとする。

本発明は、以下の態様を含み得る。
［１］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するためのＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長を含む、プライマー依存ＤＮＡ増幅反応用の反応混合物において、前記反応混合物は、少なくとも１つのプライマー対、ＤＮＡポリメラーゼ、およびｄＮＴＰを含み、改善点は、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、その鎖のそれぞれに末端領域を有し、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、１〜４つの修飾基を含み、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分である、少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤を、増幅の開始前の前記反応混合物に含めることを含み、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ミスプライミングの抑制、完全に相補的でない陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、ＡＴ豊富の陥凹３’末端配列を有するハイブリッドに対するポリメラーゼ選択性の増加、反復反応間のばらつきの減少、ポリメラーゼ５’エキソヌクレアーゼ活性の阻害、およびポリメラーゼ活性の阻害の機能のうちの少なくとも１つについて効果的である、前記ＤＮＡポリメラーゼの濃度に対する濃度で含まれるが、ただし、前記添加剤が、任意の標的配列のプライマーまたは検出プローブである場合、少なくとも３つの修飾基を含むものとする、反応混合物。
［２］  前記少なくとも１つの修飾基は、２〜４つの修飾基である、上記［１］に記載の増幅反応混合物。
［３］  前記２〜４つの修飾基は、３つの修飾基である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［４］  前記添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖と、を含む、上記［３］に記載の増幅反応混合物。
［５］  前記２〜４つの修飾基は、４つの修飾基である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［６］  前記修飾基は、前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の末端ヌクレオチドに共有結合的に連結される、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［７］  前記修飾基は、ダブシル（Ｄａｂｃｙｌ）である、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［８］  前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、上記［２］に記載の増幅反応混合物。
［９］  前記混合物は、３本の鎖から成る、上記［８］に記載の増幅反応混合物。
［１０］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、天然のヌクレオチドから成る、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１１］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤は、ＤＮＡである、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１２］  前記少なくとも１つの添加剤は、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブではない、上記［１］〜［３］および［５］〜［１１］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１３］  前記少なくとも１つの二本鎖オリゴヌクレオチド添加剤の前記濃度は、１０００ｎＭ以下である、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１４］  逆転写酵素をさらに含む、上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の増幅反応混合物。
［１５］  前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、１〜４つの一本鎖オーバーハングを含む、上記［１］に記載の増幅反応混合物。
［１６］  前記少なくとも１つの二本鎖添加剤は、ハイブリッド形成されない時、ステムループ構造を形成する少なくとも１本の鎖を含む、上記［１５］に記載の増幅反応混合物。
［１７］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅するための方法であって、前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を上記［１］に記載の増幅反応混合物と接触させることと、プライマーアニーリング温度およびプライマー伸長温度を有するプライマー依存ＤＮＡ増幅反応に、前記反応混合物を供することと、を含む、方法。
［１８］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物と接触させることは、一本鎖形態の前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を前記反応混合物に添加することから成る、上記［１７］に記載の方法。
［１９］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を得るために、逆転写ＲＮＡを含む、上記［１７］に記載の方法。
［２０］  前記少なくとも１つの修飾因子は、２〜４つの修飾因子である、上記［１７］に記載の方法。
［２１］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にある融解温度（Ｔｍ）を有する、上記［２０］に記載の方法。
［２２］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、前記アニーリング温度より高い融解温度（Ｔｍ）を有する、上記［２０］に記載の方法。
［２３］  前記添加剤は、３つの修飾基を有し、前記少なくとも１つの標的配列のためのプライマーまたはプローブである第１の鎖と、前記第１の鎖に部分的に相補的である逆相補体鎖とを含む、上記［１７］に記載の方法。
［２４］  前記少なくとも１つの添加剤は、２つの添加剤の混合物である、上記［２０］に記載の方法。
［２５］  前記混合物は、前記プライマーアニーリング温度から、前記プライマーアニーリング温度より多くても５℃低い温度までの範囲にあるＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第１の添加剤と、前記プライマーアニーリング温度より高いＴｍを有する、二本鎖オリゴヌクレオチドを有する第２の添加剤と、を含む、上記［２２］に記載の方法。
［２６］  各添加剤は、３〜４つの修飾基を含む、上記［２５］に記載の方法。
［２７］  前記プライマー依存増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅反応である、上記［１７］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２８］  前記プライマー依存増幅は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ増幅反応である、上記［１７］〜［２６］のいずれかに記載の方法。
［２９］  前記少なくとも１つのＤＮＡ標的配列は、ＲＮＡ標的配列から逆転写される、上記［１７］〜［２８］のいずれかに記載の方法。
［３０］  上記［１７］〜［２９］のいずれかに記載の増幅と、増幅中にリアルタイムで、もしくは増幅後のエンドポイントのいずれかでの、前記反応の一本鎖産物、前記反応の二本鎖産物、または両方の蛍光検出とを含む増幅アッセイであって、前記反応の二本鎖産物は、蛍光ＤＮＡ色素によって検出されるか、前記反応の一本鎖産物は、少なくとも１つの蛍光的に標識されたハイブリッド形成プローブによって検出されるか、または両方である、増幅アッセイ。
［３１］  少なくとも１つのＤＮＡ標的配列を増幅する試薬のキットであって、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の反応混合物のための前記試薬を含む、キット。
［３２］  逆転写酵素をさらに含む、上記［３１］に記載のキット。
［３３］  ＤＮＡ色素をさらに含む、上記［３１］または上記［３２］に記載のキット。
［３４］  前記少なくとも１つの標的配列のための蛍光的に標識された検出プローブをさらに含む、上記［３１］〜［３３］のいずれかに記載のキット。
［３５］  鎖のそれぞれに末端領域を有し、６〜５０のヌクレオチド長の長さのハイブリッドを有し、３２℃で少なくとも５０％が二本鎖であり、かつそれぞれ異なる末端領域に共有結合的に結合される、２〜４つの修飾基を含む、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドであって、前記修飾基は、非平面の巨大部分を有さない多環式部分であり、前記修飾されたオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼドメインを阻害することができる、修飾された二本鎖オリゴヌクレオチド。
［３６］  前記二本鎖オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡである、上記［３５］に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
［３７］  前記修飾基は、末端ヌクレオチドに結合される、上記［３５］または上記［３６］に記載の修飾されたオリゴヌクレオチド。
［３８］  上記［３５］〜［３７］のいずれかに記載の２つの修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドの混合物。
［３９］  前記２つの二本鎖オリゴヌクレオチドは、３本の鎖を含む、上記［３８］に記載の混合物。
［４０］  前記ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性である、上記［１］に記載の増幅反応混合物。