【手続補正書】
【提出日】平成25年1月29日(2013.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞間の相互作用を調べる方法；
ナノリットル未満の容積の液体を保持するために必要な大きさに形成された複数のマイクロウェルを含むスラブを提供する工程であって、該複数のマイクロウェルにおけるマイクロウェルが細胞を含み、平均して、マイクロウェルあたり単一のエフェクター細胞および少なくとも1つの標的細胞を有する、工程；
該スラブを第1の基板と接触させる工程であって、該基板が該基板上に産物に結合する作用物質を含み、ここで、該産物の存在またはレベルがエフェクター細胞と標的細胞の間の相互作用と関連するかまたは該相互作用を示すものであり、且つ該接触工程により、プリントされたアレイが産生される、工程；ならびに
相互作用する細胞を含むマイクロウェルが同定されるように、該プリントされたマイクロアレイ上で作用物質と産物の結合の位置を決定する工程。
【請求項２】
相互作用が溶解であり、エフェクター細胞によって標的細胞を溶解させる条件下で細胞を培養する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
標的細胞を溶解するエフェクター細胞を回収する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記提供工程が、マイクロウェル中にエフェクター細胞の懸濁液を沈着させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
エフェクター細胞と標的細胞が、前記沈着工程の前に互いに組み合わされる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
細胞が蛍光的に検出可能である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
溶解が、Sytox色素で標識することによって、標的細胞の核透過性化における変化をモニターすることによって検出される、請求項2記載の方法。
【請求項８】
溶解が、標的細胞の細胞内カルシウムレベルにおける変化をモニターすることによって検出される、請求項2記載の方法。
【請求項９】
作用物質が、抗体またはその断片である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、HIV gp120に対して特異的である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
作用物質が、抗体、サイトカイン、および溶解の可溶性メディエーターからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
溶解の可溶性メディエーターが、グランザイムB（GzB）またはパーフォリンである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
エフェクター細胞または標的細胞が、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラー（NK）T細胞、γδT細胞、B細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
細胞傷害性T細胞がCD8+細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
NK T細胞が、CD1d+細胞またはVα24+細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
γδT細胞が、Vγ9+細胞またはVδ2+細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
NK細胞がCD16+細胞である、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
エフェクター細胞または標的細胞が、HIVに感染している、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
エフェクター細胞または標的細胞がB細胞であり、プリントされたアレイ中のB細胞により産生された抗体のアイソタイプを決定する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項２０】
HIVと反応性である抗体を発現するB細胞を単離する工程をさらに含む、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
作用物質が、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、およびIFN-γのうちの1つまたは複数を検出する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
エフェクター細胞の細胞傷害性を評価する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
複数のマイクロウェルからエフェクター細胞を回収する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
回収された細胞のクローン増幅を得るため、該回収された細胞を培養する工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
回収された細胞における1つまたは複数の遺伝子の配列または発現を特徴付ける工程をさらに含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
エフェクター細胞または標的細胞が、ヒト対象から得られる、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
ヒト対象が、HIVに感染しているかまたはHIVに感染していると疑われる、請求項26記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
[本発明1001]
以下の工程を含む、対象におけるCD4+HIV感染細胞を溶解することができるCD8+細胞を同定する方法：
マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能（moldable）スラブ上に沈着した、対象由来のエフェクターCD8+細胞および標的細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが、単一のエフェクター細胞を有する工程；
該CD8+細胞によって該標的細胞を溶解させる条件下で、該懸濁液を培養する工程；
該エフェクター細胞による該標的細胞の溶解を検出する工程；ならびに
CD4+HIV感染細胞を溶解することができるCD8+細胞を同定する工程。
[本発明1002]
前記標的細胞を溶解するエフェクター細胞を回収する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記標的細胞を溶解したエフェクター細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記エフェクター細胞および前記標的細胞が、前記マイクロウェル中に細胞を沈着させる前に混合される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記エフェクター細胞および前記標的細胞が、前記マイクロウェル中に細胞を沈着させた後に混合される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
溶解が、標識された細胞の蛍光における変化をモニタリングすることによって検出される、本発明1001の方法。
[本発明1007]
溶解が、前記標的細胞の細胞内カルシウムレベルにおける変化をモニタリングすることにより検出される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記カルシウムが、カルシウム感受性蛍光色素により検出される、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記色素がFura 2AM（Invitrogen）である、本発明1008の方法。
[本発明1010]
以下の工程をさらに含む、本発明1001の方法：
前記マイクロウェルアレイを基板と接触させる工程であって、該基板が、前記エフェクター細胞の産物を特異的に検出することができる少なくとも1種の作用物質で前処理されている工程；および
該作用物質を検出する工程。
[本発明1011]
前記作用物質が、抗体、サイトカイン、または溶解の可溶性メディエーターである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記作用物質がサイトカインである、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記サイトカインがTNF-αまたはIFN-γである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記作用物質が溶解の可溶性メディエーターである、本発明1008の方法。
[本発明1015]
前記溶解の可溶性メディエーターがグランザイムB（GzB）またはパーフォリンである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
CD69によりエフェクター細胞を標識する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
以下の工程を含む、対象における抗体応答を特徴付ける方法：
マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着した、対象由来のB細胞の懸濁液を提供する工程であって、該対象が、HIVに感染しているかまたはHIVに感染していると疑われ、かつ該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが単一の細胞を有する工程；
該マイクロウェルアレイを基板と接触させる工程であって、該基板が少なくとも1種のB細胞検出物質で前処理されている工程；および
該物質を検出し、それによって、該抗体応答を特徴付ける工程。
[本発明1018]
前記B細胞検出物質が、gp120におけるエピトープに特異的な抗体である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記マイクロウェルアレイを、少なくとも1種の第1のB細胞検出物質で前処理されている第2の基板と接触させる工程をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記第1のB細胞検出物質が、HIV gp120に対する抗体である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記抗体が、HIV gp120のC末端に対するものである、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記マイクロウェルアレイ中の前記B細胞により産生された抗体のアイソタイプを判定する工程をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1023]
HIVと反応性である抗体を発現するB細胞を単離する工程をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1024]
前記抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を増幅および単離する工程をさらに含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記B細胞が、該細胞における抗体の産生を刺激した作用物質に曝露される、本発明1017の方法。
[本発明1026]
前記作用物質がCD40Lまたは抗BCR抗体である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記B細胞がCD40Lおよび抗BCR抗体に曝露される、本発明1025の方法。
[本発明1028]
以下の工程を含む、複数のHIV単離物に対するB細胞の交差反応性を特徴付けるための方法：
マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着した、対象由来のB細胞の懸濁液を提供する工程であって、該対象が、HIVに感染しているかまたはHIVに感染していると疑われ、かつ該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが、単一の細胞を有する工程；
該マイクロウェルアレイを第1の基板と接触させる工程であって、該基板が、該少なくとも1個のマイクロウェル中の該B細胞により産生された抗体で前処理されている工程；
該基板を第1の標識されたHIVビリオンおよび第2の標識されたHIVビリオンと接触させる工程；ならびに
該第1の標識されたビリオンおよび該第2の標識されたビリオンが該マイクロウェル中の同一細胞により産生された抗体に結合するかどうかを判定する工程。
[本発明1029]
前記第1の標識されたビリオンおよび前記第2の標識されたビリオンに特異的に結合する抗体を産生するB細胞を回収する工程をさらに含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
回収された前記B細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記ビリオンの少なくとも一方が標識される、本発明1017の方法。
[本発明1032]
前記第1のビリオンおよび前記第2のビリオンが別個に標識される、本発明1021の方法。
[本発明1033]
以下の工程を含む、対象におけるHIV感染に応答性であるエフェクター細胞についての機能プロファイルを作製する方法：
CTL（CD8+）、NK細胞（CD16+）、NK T細胞（CD1d+、Vα24+）、またはγδT細胞（Vγ9+、Vδ2+）からなる群より選択されるエフェクター細胞の集団を提供する工程であって、マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着した該エフェクター細胞が、対象から得られ、該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが単一のエフェクター細胞を有し、エフェクター細胞の該集団が同族の標的細胞集団と同時にロード（co-load）される工程；
該エフェクター細胞を可視化する工程；
該エフェクター細胞の細胞傷害性を査定する工程；
該マイクロウェルアレイを第1の基板と接触させる工程であって、該基板が、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、およびIFN-γのうちの1種または複数種を特異的に検出する作用物質で前処理されている工程；ならびに
該マイクロウェル中の該エフェクター細胞が1種または複数種の該作用物質に結合するかどうかを判定する工程。
[本発明1034]
細胞傷害性が、カルセインAMの放出を検出することにより査定される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記細胞を1種または複数種の特異的表面マーカータンパク質について標識する工程をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1036]
表面マーカータンパク質が、CD62L、CXCR3、CCR4、またはCCR7である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
1個または複数個のマイクロウェルからエフェクター細胞を回収する工程をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1038]
回収された細胞のクローン増幅を得るため、該回収された細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記回収された細胞における1種または複数種の遺伝子の発現を特徴付ける工程をさらに含む、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記細胞が、CD8+細胞傷害性T細胞（CTL）、ナチュラルキラー（NK）細胞、NK T細胞、またはγδT細胞である、本発明1033の方法。
[本発明1041]
前記対象が、感染の急性期にあるか、高活性抗レトロウイルス剤療法（highly active antiretroviral therapy）（HAART）対象であるか、またはエリートコントローラー（elite controller）である、本発明1033の方法。
[本発明1042]
以下の工程を含む、HIV感染を有する対象における自然免疫応答を査定する方法：
マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着した、対象由来のNK細胞の懸濁液を提供する工程であって、該対象が、HIVに感染しているかまたはHIVに感染していると疑われ、かつ該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが、沈着した単一の細胞を有する工程；および
該マイクロウェルアレイを基板と接触させる工程であって、該基板が少なくとも1種のNK細胞検出物質で前処理されている工程；および
該物質を検出し、それによって、該自然免疫応答を査定する工程。
[本発明1043]
前記NK細胞が、NKp46-Cy3、CD107a-Alexa647、および／またはCD69-Alexa488を用いて検出される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記細胞が、前記成形可能スラブ上に沈着させる前に同時培養される、本発明1032の方法。
[本発明1045]
前記細胞がIL-12およびIL-18と同時培養される、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記NK細胞検出物質がNK細胞を検出する、本発明1045の方法。
[本発明1047]
以下の工程を含む、NK細胞の集団におけるクローン多様性を査定する方法：
マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着した、対象由来のNK細胞および標的細胞の懸濁液を提供する工程であって、該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが単一のエフェクター細胞を有する工程；
該NK細胞によって該標的細胞を溶解させる条件下で、該懸濁液を培養する工程；
該エフェクター細胞による該標的細胞の溶解を検出する工程；および
該エフェクター細胞を同定し、それによって、NK細胞の該集団におけるクローン多様性を査定する工程。
[本発明1048]
前記標的細胞を溶解するエフェクター細胞を回収する工程をさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
回収された前記細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記標的細胞を溶解したNK細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1051]
前記NK細胞および前記標的細胞が、前記マイクロウェル中に細胞を沈着させる前に混合される、本発明1047の方法。
[本発明1052]
前記NK細胞および前記標的細胞が、前記マイクロウェル中に細胞を沈着させた後に混合される、本発明1047の方法。
[本発明1053]
標的細胞の溶解が、標識された細胞の蛍光における変化をモニタリングすることにより判定される、本発明1047の方法。
[本発明1054]
以下の工程をさらに含む、本発明1047の方法：
前記マイクロウェルアレイを基板と接触させる工程であって、該基板が、前記NK細胞の産物を特異的に検出することができる少なくとも1種の作用物質で前処理されている工程；および
該作用物質を検出する工程。
[本発明1055]
前記作用物質が、抗体、サイトカイン、または溶解の可溶性メディエーターである、本発明1055の方法。
[本発明1056]
前記サイトカインが、TNF-αまたはIFN-γである、本発明1055の方法。
[本発明1057]
以下の工程を提供する、NK細胞およびB細胞の集団における多様性を査定する方法：
拡大されたHIV感染CD4+T細胞、活性化されたNK細胞、およびB細胞、ならびに標的細胞を含む細胞の懸濁液を提供する工程であって、該懸濁液が、マイクロウェルアレイ中に少なくとも1個のマイクロウェルを備える成形可能スラブ上に沈着し、該マイクロウェルアレイ中の少なくとも1個のマイクロウェルが単一のT細胞を有する工程；
B細胞により産生された抗体をT細胞の表面に結合させる条件下で、細胞を培養する工程；
B細胞、NK細胞、および溶解されたT細胞を含有しているウェルを同定する工程；ならびに
B細胞またはNK細胞を同定する工程。
[本発明1058]
前記NK細胞がIL-2により活性化される、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記B細胞がCD40Lまたは抗BCRにより活性化される、本発明1057の方法。
[本発明1060]
B細胞がCD40Lおよび抗BCR抗体により活性化される、本発明1057の方法。
[本発明1061]
前記NK細胞がIL-2により活性化される、本発明1057の方法。
[本発明1062]
前記B細胞がCD40Lまたは抗BCR抗体により活性化される、本発明1057の方法。
[本発明1063]
以下の工程をさらに含む、本発明1057の方法：
前記ウェルからB細胞またはNK細胞を回収する工程；および
該B細胞の一つまたは複数の特性を特徴付ける工程。
[本発明1064]
前記B細胞における抗体遺伝子を特徴付ける工程を含む、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記B細胞における抗体をコードする遺伝子のVDJ領域を分析する工程を含む、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記B細胞により産生された抗体を基板に付着させる条件下で、前記マイクロウェルアレイを該基板と接触させる工程を含む、本発明1057の方法。
[本発明1067]
以下の工程を含む、本発明1057の方法：
前記基板をHIV感染細胞由来の溶解物と接触させる工程、および
該HIV溶解物または抗IgG3抗体に結合する抗体を産生するB細胞を有するウェルを同定する工程。
[本発明1068]
前記HIV溶解物または前記抗IgG3抗体に結合する抗体を産生するB細胞を有するウェルを同定する工程を含む、本発明1067の方法。
本発明のその他の特色および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白になるであろう。