【手続補正書】
【提出日】平成25年9月20日(2013.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ糖におけるマンノース−６−リン酸残基をキャップ除去するための方法であって、
ａ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノース結合を有する該オリゴ糖を提供するステップと、
ｂ）該オリゴ糖を、該マンノース−１−ホスホ−６−マンノース残基をホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼと接触させるステップと、
を含み、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー９２のメンバーである、方法。
【請求項２】
以下に列挙する特徴のうちの１つ以上を有する、請求項１に記載の方法：
（Ｉ）前記マンノシダーゼが、以下の特徴のうちの１つ以上を有する：
ａ）該マンノシダーゼが、配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｂ）該マンノシダーゼが、配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｃ）該マンノシダーゼが、配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
ｄ）該アミノ酸配列が、配列番号５０の残基１〜７７４または配列番号５０を含み、必要に応じてここで、該アミノ酸配列が、配列番号５０の残基１〜７７４のＮ末端または配列番号５０のＮ末端に、配列番号１５の残基１〜１５をさらに含む；
ｅ）該マンノシダーゼは、図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標を有する；
ｆ）該マンノシダーゼが、（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）または（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む；
ｇ）該マンノシダーゼが、ターゲティング配列を含む；
（ＩＩ）前記接触させるステップが、精製されたマンノシダーゼ、組換えマンノシダーゼ、該組換えマンノシダーゼを含有する細胞溶解産物または該組換えマンノシダーゼを含有する真菌細胞を用いて行われる；
（ＩＩＩ）前記オリゴ糖がタンパク質に連結している；
（ＩＶ）（ＩＩＩ）の前記タンパク質が、真菌生物において発現されるヒトタンパク質である；
（Ｖ）（ＩＶ）の該真菌生物が、
ａ）Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ；
ｂ）メチロトローフ酵母（例えば、ここで、該メチロトローフ酵母が、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａまたはＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａである）；および
ｃ）糸状菌（例えば、該糸状菌が
【数９】
2013505735.tif 000001
である）
から選択される；
（ＶＩ）（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の該タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である；
（ＶＩＩ）（ＶＩ）の該リソソームタンパク質がリソソーム酵素である；
（ＶＩＩＩ）（ＶＩＩ）の該リソソーム酵素がリソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）に関連する；
（ＩＸ）（ＶＩＩＩ）の該リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）が、ファブリ病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス１型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である；
（Ｘ）（ＶＩＩＩ）の該リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）がポンペ病またはファブリ病である。
【請求項３】
キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
マンノース−１−ホスホ−６−マンノース残基をホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含みそして発現するように遺伝的に操作されている真菌細胞を提供するステップと、
該細胞に、標的タンパク質をコードする核酸を導入するステップと、
を含み、該細胞が、該細胞において発現された該発現されたマンノシダーゼによって該標的上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース残基がホスホ−６−マンノース残基に変換された該標的タンパク質を生産する、方法。
【請求項４】
以下に列挙した特徴のうちの１つ以上を有する、請求項３に記載の方法：
（Ｉ）前記マンノシダーゼが、ａ）配列番号５０のアミノ酸１〜７７４に対して、もしくは配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはｂ）（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）もしくは（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）（Ｉ）の該マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる；
（ＩＩＩ）前記真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む；
（ＩＶ）該真菌細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝的に操作されている；
（Ｖ）該マンノシダーゼが、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのマンノシダーゼである。
【請求項５】
真菌生物においてキャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を有する標的タンパク質を生産する方法であって、
ａ）マンノース−１−ホスホ−６−マンノースをホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含みそして発現するように遺伝的に操作されており、標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む真菌細胞を提供し、ここで、該細胞において発現された該発現されたマンノシダーゼによって該標的上のマンノース−１−ホスホ−６−マンノース残基がホスホ−６−マンノース残基に変換されているステップと、
ｂ）該キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を有する該標的タンパク質を単離するステップと、
を含む、方法。
【請求項６】
以下に列挙した特徴のうちの１つ以上を有する、請求項５に記載の方法：
（Ｉ）前記マンノシダーゼが、（ａ）配列番号５０のアミノ酸１〜７７４に対して、もしくは配列番号５０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）もしくは（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）（Ｉ）の該マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる；
（ＩＩＩ）前記標的タンパク質および該マンノシダーゼが前記細胞により分泌される。
【請求項７】
キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されている単離された真菌細胞であって、マンノシダーゼをコードする核酸を含み、該真菌細胞における前記マンノシダーゼの発現が、該キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を含む糖タンパク質の生産をもたらし、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー９２のメンバーである、真菌細胞。
【請求項８】
以下に列挙した特徴のうちの１つ以上を有する、請求項７に記載の真菌細胞：
（Ｉ）前記マンノシダーゼが、ａ）配列番号５０のアミノ酸１〜７７４に対して、もしくは配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはｂ）（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）もしくは（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）（Ｉ）の該マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる；
（ＩＩＩ）該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む；
（ＩＶ）該真菌細胞が、ＯＣＨ１（外鎖伸長）活性を欠損するように遺伝的に操作されている；
（Ｖ）該真菌細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸を含み、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝的に操作されている；
（ＶＩ）該真菌細胞が、糖タンパク質である標的タンパク質をコードする核酸をさらに含む；
（ＶＩＩ）（ＶＩ）の該標的タンパク質がヒトタンパク質である；
（ＶＩＩＩ）（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の該標的タンパク質が、病原体タンパク質、リソソームタンパク質、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、抗体もしくはその抗原結合性断片または融合タンパク質である；
（ＩＸ）該リソソームタンパク質がリソソーム酵素である；
（Ｘ）（ＩＸ）の該リソソーム酵素が酸性アルファグルコシダーゼまたはアルファガラクトシダーゼである；
（ＸＩ）（ＶＩ）から（Ｘ）の該標的タンパク質が、ＬＳＤに関連するタンパク質である；
（ＸＩＩ）（ＸＩ）の該ＬＳＤが、ファブリ病、ムコ多糖症Ｉ型、ファーバー病、ゴーシェ病、ＧＭ１ガングリオシドーシス、テイ・サックス病、サンドホフ病、ＧＭ２活性化因子疾患、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病、モルキオ病、マロトー・ラミー病、ヒアルロニダーゼ欠損症、アスパルチルグルコサミン尿症、フコシドーシス、マンノシドーシス、シンドラー病、シアリドーシス１型、ポンペ病、濃化異骨症、セロイドリポフスチン沈着症、コレステロールエステル貯蔵病、ウォルマン病、多種スルファターゼ欠損症、ガラクトシアリドーシス、ムコリピドーシス、シスチン症、シアル酸貯蔵病、マリネスコ・シェーグレン症候群を伴うカイロミクロン停滞病、ヘルマンスキー・プドラック症候群、チェディアック・東症候群、ダノン病または幸福顔貌骨異形成症である；
（ＸＩＩＩ）該真菌細胞が、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａまたはＡｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ細胞である；
（ＸＩＶ）マンノシルリン酸化を促進することのできる（ＩＩＩ）の該ポリペプチドが、ＭＮＮ４ポリペプチドである；
（ＸＶ）（ＸＩＶ）の該ＭＮＮ４ポリペプチドが、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＣ．ａｌｂｉｃａｎｓのポリペプチドである；
（ＸＶＩ）マンノシルリン酸化を促進することのできる（ＩＩＩ）の該ポリペプチドが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＰＮＯ１ポリペプチドである；
（ＸＶＩＩ）該マンノシダーゼが、Ｃ．ｃｅｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓのマンノシダーゼである；
（ＸＶＩＩＩ）該マンノシダーゼが分泌シグナルを含む；
（ＸＩＸ）該マンノシダーゼが、該マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む；
（ＸＸ）該マンノシダーゼが、分泌シグナルおよび該マンノシダーゼを細胞内区画にターゲッティングするためのターゲティングシグナルを含む；
（ＸＸＩ）該真菌細胞が、単離された形態にある。
【請求項９】
Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｏｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの細胞を含む実質的に純粋な培養物であって、該細胞は、キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を含む糖タンパク質を生産するように遺伝的に操作されており、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースをホスホ−６−マンノースに加水分解することのできるマンノシダーゼをコードする核酸を含み、ここで、該マンノシダーゼが、グリコシルヒドロラーゼファミリー９２のメンバーである、培養物。
【請求項１０】
以下に列挙した特徴のうちの１つ以上を有する、請求項９に記載の培養物：
（Ｉ）前記マンノシダーゼが、ａ）配列番号５０のアミノ酸１〜７７４に対して、もしくは配列番号５０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはｂ）（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）もしくは（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む；
（ＩＩ）該マンノシダーゼに関して、最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる；
（ＩＩＩ）該細胞が、マンノシルリン酸化を促進することのできるポリペプチドをコードする核酸をさらに含む；
（ＩＶ）該細胞が、ＯＣＨ１活性を欠損するように遺伝的に操作されている。
【請求項１１】
請求項１〜６のうちいずれか一項に記載の方法によって生産された、キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を含む糖タンパク質（例えば、ここで、該糖タンパク質は、単離された形態にある）。
【請求項１２】
糖タンパク質を含む組成物であって、該糖タンパク質におけるＮ−グリカンの少なくとも４７％（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％または少なくとも９０％）が、キャップ除去されたホスホ−６−マンノース残基を有する、組成物。
【請求項１３】
配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、マンノース−１−ホスホ−６−マンノースをホスホ−６−マンノースに加水分解することができ；例えば、ここで、該ポリペプチドは、以下の特徴のうちの１つ以上を有する、ポリペプチド：
（Ｉ）該アミノ酸配列が、配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９５％の同一性を有する；
（ＩＩ）該アミノ酸配列が、配列番号５０の残基１〜７７４に対して、または配列番号５０に対して少なくとも９８％の同一性を有する；
（ＩＩＩ）該アミノ酸配列が、配列番号５０の残基１〜７７４または配列番号５０を含む；
（ＩＶ）（ＩＩＩ）の該配列は、配列番号５０の残基１〜７７４のＮ末端または配列番号５０のＮ末端に、配列番号１５の残基１〜１５をさらに含む；
（Ｖ）該ポリペプチドの最小触媒中心に位置するアミノ酸側鎖中の原子の三次元タンパク質座標が図３３における等価原子の座標の１．５Å偏差内に収まる；
（ＶＩ）該ポリペプチドが、（ｉ）ＧＶＧＸＸＧＸＧＧモチーフ（式中、ＸはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＣｙｓである）、（ｉｉ）ＶＲＸＥモチーフ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）、（ｉｉｉ）Ｘ１ＹＱＧＸ２モチーフ（式中、Ｘ１はＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＭｅｔであり、Ｘ２はＴｈｒ、ＳｅｒまたはＡｓｎである）または（ｉｖ）ＧＤＸＧＮ（式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり得る）を有するアミノ酸配列を含む。
【請求項１４】
核酸であって、
（ａ）請求項１３に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；または
（ｂ）該ヌクレオチド配列の相補体
を含む、核酸；例えば、ここで：
（Ｉ）該ヌクレオチド配列が、配列番号５０の残基１〜７７４または配列番号５０をコードする；または
（ＩＩ）該ヌクレオチド配列が、配列番号１４のヌクレオチド４６〜２３２２または配列番号１４のヌクレオチド４６〜４９９５を含み；該配列は必要に応じて、配列番号１４のヌクレオチド４６〜２３２２の５’または配列番号１４のヌクレオチド４６〜４９９５の５’に、配列番号１４のヌクレオチド１〜４５をさらに含む。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む発現ベクター；または該発現ベクターを含む宿主細胞；またはポリペプチドを作製する方法であって、該宿主細胞を培養するステップと、該培養物から該ポリペプチドを単離するステップとを含む、方法。