【手続補正書】
【提出日】平成25年2月13日(2013.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３４＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で多能性幹細胞を培養する工程；および
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３４＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞は胚性幹細胞または誘導胚性幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記低酸素雰囲気は約０．５％酸素ガスから約５．５％酸素ガスを含み、好ましくは前記低酸素雰囲気は約１．５％酸素ガスから約５．３％酸素ガスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ３４＋前駆細胞またはその子孫を培養から８日から１２日で収集する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養培地はＢＭＰ−４を約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地はＶＥＧＦを約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記培養培地はｂＦＧＦを約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養培地は血清またはフィーダー細胞を含まないか、あるいは血清またはフィーダー細胞を本質的に含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法の少なくとも一部を自動化するためロボットを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
複数の前記多能性幹細胞はバイオリアクターを使用して培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ３１からなる群の１つまたは複数の発現に基づき前記ＣＤ３４＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）多能性幹細胞コロニーまたはクローン細胞群を分散させ、分散した本質的に個別の細胞を形成する工程、および
ｂ）前記分散させた細胞を培養面１平方センチメートル当たり約１０，０００幹細胞から培養面１平方センチメートル当たり約７０，０００幹細胞の密度で培養培地に播種する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は生存因子を含む培養培地に分散される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分散された細胞は培養面１平方センチメートル当たり約１０，０００幹細胞から培養面１平方センチメートル当たり約５０，０００幹細胞の密度で播種される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記多能性幹細胞は有効量の１種または複数種の酵素による処理により分散される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素の少なくとも１種はトリプシンまたはｔｒｙｐＬＥである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化培地は規定された分化培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３１＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
【請求項１９】
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）マトリックス成分；および
ｂ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む分化培地
を含む培地で多能性幹細胞を増殖させる工程を含み、
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まないか、または非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを本質的に含まない、
方法。
【請求項２０】
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記培地は非ヒト動物のタンパク質を含まないか、または非ヒト動物のタンパク質を本質的に含まない、請求項１９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明により明らかになる。しかし、詳細な説明および個々の例については、本発明の具体的な実施形態を示すものではあるが、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内で様々な変更および修正が当業者には明らかになるため、例示のみを目的としたものであることを理解すべきである。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３４＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で多能性幹細胞を培養する工程；および
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３４＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
（項目２）
前記多能性幹細胞は胚性幹細胞または誘導胚性幹細胞である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記低酸素雰囲気は約０．５％酸素ガスから約５．５％酸素ガスを含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記低酸素雰囲気は約１．５％酸素ガスから約５．３％酸素ガスを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記マトリックス成分はフィブロネクチン、コラーゲンまたはＲＧＤペプチドを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＣＤ３４＋前駆細胞またはその子孫を培養から８日から１２日で収集する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＣＤ３４＋前駆細胞またはその子孫を培養から６日から９日で収集する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記培養培地はＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記培養培地はＢＭＰ−４を約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記培養培地はＶＥＧＦを約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記培養培地はｂＦＧＦを約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量で含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記培養培地は生存因子をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記生存因子はＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）のインヒビターまたはミオシンＩＩのインヒビターである、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記培養培地は血清またはフィーダー細胞を含まないか、あるいは血清またはフィーダー細胞を本質的に含まない、項目１に記載の方法。
（項目１５）
分化の前にＴｅＳＲを含む第１の培地で前記多能性幹細胞を培養または維持する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の培地はＴｅＳＲ培地および生存因子を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記生存因子はＲｈｏ関連キナーゼ（ＲＯＣＫ）のインヒビターまたはミオシンＩＩのインヒビターである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記ＣＤ３４＋前駆細胞を赤血球、マクロファージ、顆粒球、巨核球、樹状細胞、マスト細胞または内皮細胞からなる群の１つまたは複数に分化させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記さらなる分化はＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびヘパリンからなる群の１つまたは複数を含む培養培地で起こる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記さらなる分化はＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）およびヘパリンを含む培養培地で起こる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記培養培地は１種または複数種のアミノ酸、抗生物質、ビタミン、塩、ミネラルまたは脂質を含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記培養培地はＢＩＴ９５００、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、モノチオグリセロール、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記培養培地はＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される２種以上の組換え型増殖因子を含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
少なくとも一部を自動化するためロボットを使用することを含む、項目１に記載の方法。
（項目２５）
複数の前記多能性幹細胞はバイオリアクターを使用して培養される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用して前記ＣＤ３４＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２７）
ＣＤ３４、ＣＤ４３およびＣＤ３１からなる群の１つまたは複数の発現に基づき前記ＣＤ３４＋前駆細胞を分取する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
ａ）多能性幹細胞コロニーまたはクローン細胞群を分散させ、分散した本質的に個別の細胞を形成する工程、および
ｂ）前記分散させた細胞を培養面１平方センチメートル当たり約１０，０００幹細胞から培養面１平方センチメートル当たり約７０，０００幹細胞の密度で培養培地に播種する工程
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞は生存因子を含む培養培地に分散される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記分散された細胞は培養面に１平方センチメートル当たり約１０，０００幹細胞から培養面に１平方センチメートル当たり約５０，０００幹細胞の密度で播種される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記多能性幹細胞は有効量の１種または複数種の酵素による処理により分散される、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記酵素の少なくとも１種はトリプシンまたはｔｒｙｐＬＥである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記分化培地は規定された分化培地である、項目１に記載の方法。
（項目３４）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ４３＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ４３＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
（項目３５）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）多能性幹細胞を、フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まず、マトリックス成分、ならびにＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む培養培地で培養する工程；および
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３１＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程
を含む、方法。
（項目３６）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）マトリックス成分；および
ｂ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む分化培地
を含む培地で多能性幹細胞を増殖させる工程を含み、
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まないか、または非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを本質的に含まない、
方法。
（項目３７）
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まない、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記培地は非ヒト動物のタンパク質を含まないか、または非ヒト動物のタンパク質を本質的に含まない、項目３６に記載の方法。
（項目３９）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３４＋前駆細胞に分化させる方法であって：
ａ）マトリックス成分；および
ｂ）ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子を含む分化培地
を含む培地で多能性幹細胞を増殖させる工程を含み、
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まないか、または非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを本質的に含まない、
方法。
（項目４０）
前記培地は非ヒト動物血清、フィーダー細胞およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まない、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記培地は非ヒト動物のタンパク質を含まないか、または非ヒト動物のタンパク質を本質的に含まない、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３１＋前駆細胞に分化させる方法であって、多能性幹細胞を規定された分化培地で培養する工程を含む、方法。
（項目４３）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ３４＋前駆細胞に分化させる方法であって、多能性幹細胞を規定された分化培地で培養する工程を含む、方法。
（項目４４）
ヒト多能性幹細胞をＣＤ４３＋前駆細胞に分化させる方法であって、多能性幹細胞を規定された分化培地で培養する工程を含む、方法。
（項目４５）
ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびマトリックス成分を含む分化培養培地であって、前記培地はフィーダー細胞、血清およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まないか、またはフィーダー細胞、血清およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを本質的に含まない、分化培養培地。
（項目４６）
さらに非ヒト動物増殖因子を含まないか、または非ヒト動物増殖因子を本質的に含まない、項目４５に記載の分化培地。
（項目４７）
さらに非ヒト動物のタンパク質を含まないか、または非ヒト動物のタンパク質を本質的に含まない、項目４５に記載の分化培地。
（項目４８）
フィーダー細胞、血清およびＭａｔｒｉｇｅｌＴＭを含まない、項目４５に記載の分化培地。
（項目４９）
前記マトリックス成分はフィブロネクチン、コラーゲンまたはＲＧＤペプチドを含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５０）
約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量のＢＭＰ−４を含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５１）
約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量のＶＥＧＦを含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５２）
約５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの量のｂＦＧＦを含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５３）
ＢＩＴ９５００、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、モノチオグリセロール、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５４）
１種または複数種のアミノ酸、抗生物質、ビタミン、塩、ミネラルまたは脂質をさらに含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５５）
多能性幹細胞、前駆細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、ＣＤ４３＋前駆細胞およびＣＤ３１＋前駆細胞からなる群より選択される１種または複数種の細胞をさらに含む、項目４５に記載の分化培地。
（項目５６）
規定された培地である、項目４５に記載の分化培地。
（項目５７）
１つまたは複数の密封バイアルに項目４５に記載の分化培養培地を含む、キット。
（項目５８）
細胞をさらに含む、項目５７に記載のキット。
（項目５９）
前記細胞は多能性細胞、前駆細胞、ＣＤ３４＋前駆細胞、ＣＤ４３＋前駆細胞またはＣＤ３１＋前駆細胞である、項目５７に記載のキット。
（項目６０）
多能性細胞のＣＤ３４＋前駆細胞への分化を促進する能力について候補物質をスクリーニングする方法であって：
ａ）フィーダー細胞を含まないか、またはフィーダー細胞を本質的に含まない培養培地であって、マトリックス成分と、ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦからなる群より選択される少なくとも１種の組換え型増殖因子と、候補物質とを含む、培地で多能性幹細胞を培養する工程；
ｂ）前記細胞を５．５％未満酸素の低酸素雰囲気下で前記ＣＤ３４＋前駆細胞を得るための期間分化させる工程；および
ｃ）ＣＤ３４＋前駆細胞への分化について前記多能性細胞を評価する工程
を含む、方法。
（項目６１）
評価する工程は前記候補物質の存在下での前記多能性幹細胞の分化と、前記候補物質を使用しない同様の細胞培地での前記多能性幹細胞の分化とを比較する工程を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記候補物質は小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗体フラグメントまたは核酸である、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記分化培地はＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−３、ＩＬ−６およびヘパリンからなる群の１つまたは複数をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６４）
ＣＤ３４＋前駆細胞を含むクローン細胞集団であって、前記細胞の少なくとも５％はＣＤ３４＋またはＣＤ４３＋前駆細胞であり、前記細胞集団は血清およびフィーダー細胞を含まないか、または血清およびフィーダー細胞を本質的に含まない規定された培地中に存在する、クローン細胞集団。
（項目６５）
約１０６〜約１０１５個のＣＤ３４＋またはＣＤ４３＋前駆細胞を含む、項目６４に記載の細胞集団。
（項目６６）
ＣＤ３１＋前駆細胞を含むクローン細胞集団であって、前記細胞の少なくとも２０％はＣＤ３１＋またはＣＤ３４＋前駆細胞であり、前記細胞集団は血清およびフィーダー細胞を含まないか、または血清およびフィーダー細胞を本質的に含まない規定された培地中に存在する、クローン細胞集団。
（項目６７）
約１０６〜約１０１５個のＣＤ３１＋またはＣＤ３４＋前駆細胞を含む、項目６６に記載の細胞集団。