【手続補正書】
【提出日】平成24年12月17日(2012.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）第１のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；
（ｂ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結された複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｃ）該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および
（ｄ）該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記工程（ｄ）において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細胞から得る工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、ＰＣＲによって得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＣＲは、単一細胞ＰＣＲである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イムノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞ベースのアッセイが、ＣＥＬＩＳＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞複合体が、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間に形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノバインダーは抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｄａｂおよびナノボディーからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、ｓｃＦｖである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記内在性膜タンパク質は、ＧＰＣＲまたはイオンチャネルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記内在性膜タンパク質は、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）およびＮＭＤＡチャネルからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のソート可能な標識もしくは前記第２のソート可能な標識は、蛍光標識である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記イムノバインダー発現細胞は、Ｂ細胞である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｂ細胞は、免疫化した動物から単離された、請求項２６または２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記動物は、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３２】
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、請求項３１に記載の核酸分子を、該コードされたイムノバインダーが生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
【請求項３４】
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）非ヒト動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程、
（ｂ）Ｂ細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
（ｃ）該Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；
（ｄ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｅ）該抗原発現細胞と、該Ｂ細胞とを接触させる工程；および
（ｆ）複数の該Ｂ細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程、
を包含する、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
別の局面において、本発明はまた、目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法を提供し、上記方法は、動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程；上記免疫化した動物からＢ細胞を単離する工程；上記Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで上記目的の抗原は、上記抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；上記抗原発現細胞と、上記Ｂ細胞とを接触させる工程；および上記複数のＢ細胞から、上記抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における上記第１のおよび第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程を包含する。
本発明の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するイムノバインダーを同定するための方法であって、該方法は、
（ａ）第１のソート可能な標識に作動可能に連結された複数のイムノバインダー発現細胞を提供する工程；
（ｂ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｃ）該抗原発現細胞と、該イムノバインダー発現細胞とを接触させる工程；および
（ｄ）該複数のイムノバインダー発現細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のイムノバインダー発現細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのイムノバインダー発現細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するイムノバインダーを同定する、工程、
を包含する、方法。
（項目２）
前記工程（ｄ）において得られたイムノバインダー発現細胞をクローン的に単離し、必要に応じて、続いて、該クローン的に単離された細胞のクローン性増殖を行う工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列を、前記単離されたイムノバインダー発現細胞から得る工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記イムノバインダーをコードする核酸配列は、ＰＣＲによって得られる、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記ＰＣＲは、単一細胞ＰＣＲである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記単離されたイムノバインダー発現細胞を、細胞ベースのアッセイに供して、前記イムノバインダーを機能的に特徴付ける工程をさらに包含する、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記細胞ベースのアッセイが、ＣＥＬＩＳＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
細胞複合体が、抗原と、Ｂ細胞レセプターとの間に形成される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記イムノバインダーは抗体である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記抗体は、マウス抗体、ウサギ抗体、ニワトリ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記抗体は、全長免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｄａｂおよびナノボディーからなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記抗体は、ｓｃＦｖである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記目的の抗原は、外因性遺伝子から発現される、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記目的の抗原は、遺伝的に操作された抗原である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記目的の抗原は、内在性膜タンパク質である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記内在性膜タンパク質は、ＧＰＣＲである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記ＧＰＣＲは、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ−１、ＣＩＣ−２、ＣＩＣ−４、ＣＩＣ−５、ＣＩＣ−７、ＣＩＣ−Ｋａ、ＣＩＣ−Ｋｂ、Ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎｓ、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡレセプター、グリシンレセプター、ＡＢＣ輸送体、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン−１−ホスフェートレセプター（Ｓ１Ｐ１Ｒ）およびＮＭＤＡチャネルからなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記内在性膜タンパク質は、イオンチャネルである、項目１５に記載の方法。
（項目１９）
前記第１のソート可能な標識もしくは前記第２のソート可能な標識は、蛍光標識である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
前記蛍光標識は、蛍光タンパク質、抗体／蛍光体結合体および蛍光性細胞標識からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記セルソーターは、蛍光細胞分析分離装置である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記抗原発現細胞は、酵母細胞、酵母スフェロプラストもしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記抗原発現細胞は、ヒト細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抗原発現細胞は、外因性抗原を発現する、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記抗原発現細胞は、発現ベクターでトランスフェクトされる、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記イムノバインダー発現細胞は、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記イムノバインダー発現細胞は、Ｂ細胞である、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｂ細胞は、ウサギＢ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記Ｂ細胞は、免疫化した動物から単離される、項目２７または２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記動物は、ＤＮＡワクチン接種によって免疫化される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記イムノバインダー発現細胞は、発現ベクターから発現されるイムノバインダーを含む、上記項目のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
項目１〜３１のいずれか１項に記載の方法によって選択されるイムノバインダーをコードする、単離された核酸分子。
（項目３３）
目的の抗原に結合し得るイムノバインダーを生成する方法であって、該方法は、項目３２に記載のイムノバインダーをコードする核酸配列を、該コードされたイムノバインダーが生成されるように、発現環境に導入する工程を包含する、方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法によって生成される、イムノバインダー。
（項目３５）
目的の細胞表面抗原に特異的に結合するＢ細胞クローンを同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）動物を、細胞表面抗原をコードするＤＮＡで免疫化する工程、
（ｂ）Ｂ細胞を、免疫化した該動物から単離する工程、
（ｃ）該Ｂ細胞を、第１のソート可能な標識で標識する工程；
（ｄ）第２のソート可能な標識に作動可能に連結した複数の抗原発現細胞を提供する工程であって、ここで該目的の抗原は、該抗原発現細胞の表面にディスプレイされる、工程；
（ｅ）該抗原発現細胞と、該Ｂ細胞とを接触させる工程；および
（ｆ）複数の該Ｂ細胞から、該抗原発現細胞に特異的に結合し得る１個以上のＢ細胞を、セルソーターを使用して分離する工程であって、ここで単一の細胞複合体における該第１のソート可能な標識および該第２のソート可能な標識の存在は、抗原発現細胞へのＢ細胞の結合を示し、それによって、目的の抗原に結合するＢ細胞クローンを同定する、工程、
を包含する、方法。