【手続補正書】
【提出日】平成25年2月5日(2013.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2012517801.tif 000001
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸおよびＡ１は各々独立して任意であり、そして
Ｘは任意の化学残基、特にＨまたはアシル残基、特にＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＣＯまたは（ＣＨ３）２ＣＨＣＯであり；
Ａ１はアスパラギン酸以外の標準アミノ酸、特にグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンまたはセリン、特にスレオニンであり；
Ａ３は非塩基性標準アミノ酸またはその非塩基性誘導体、特にロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたはそれらの誘導体、特にＡｈｐまたはその誘導体、特にＡｈｐ誘導体３−アミノ−２ピペリドンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンまたはその誘導体、特にチロシンであり；
Ａ７はロイシン、イソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
で示される化合物または式（Ｉ’）
【化２】
2012517801.tif 000002
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸはＣＨ３ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＯ、ＣＨ３Ｓ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯまたはＣ６Ｈ５ＣＯであり；
Ａ１はグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンであり；
Ａ３はロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたは５−ヒドロキシ−プロリンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンであり；
Ａ７はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
で示される化合物の生産に関与する非リボソームペプチドシンターゼであるＮＲＰＳ２またはＮＲＰＳ１をコードする生合成遺伝子クラスターの１個以上の機能的フラグメントを含む単離されたポリヌクレオチドであって、以下のものを含むポリヌクレオチド：
(i) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号４６、４８、５０、５２、１、３、５、７、９、１１、１３、５４、５６、５８および６０からなる群から選択される配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ii) ＮＲＰＳ２ドメインをコードする配列番号４６、４８、５０、５２、１、３、５、７、９、１１、１３、５４、５６、５８または６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iii) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号４７、４９、５１、５３、２、４、６、８、１０、１２、１４、５５、５７、５９または６１からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(iv) ＮＲＰＳ２ドメインを示す配列番号４７、４９、５１、５３、２、４、６、８、１０、１２、１４、５５、５７、５９または６１からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(v) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vi) 配列番号１５、配列番号２８からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(vii) ＮＲＰＳドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択される配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(viii) ＮＲＰＳドメインをコードする配列番号３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２および４４からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(ix) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択される配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(x) ＮＲＰＳ１ドメインを示す配列番号３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５からなる群から選択されるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
(xi) 配列番号２６からなる群から選択される配列と、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列および／またはその相補体；または
(xii)配列番号２６からなる群から選択されるヌクレオチド配列の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列および／またはその相補体；
ここで、前記(i) 〜 (xii)のヌクレオチド配列は、配列番号４７、４９、５１、５３、２、４、６、８、１０、１２、１４、５５、５７、５９、６１、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３および／または４５の参照配列によって示される対応ＮＲＰＳドメインの活性を保持する発現産物をコードする。
【請求項２】
(a)以下の１個以上のＮＲＰＳ２ドメイン：
(i)配列番号４７のチオレーションドメイン；
(ii)配列番号４９のコンデンセーションドメイン；
(iii)配列番号５１のプロリンのアデニレーションドメイン；
(iv)配列番号５３のチオレーションドメイン；
(v)配列番号２のコンデンセーションドメイン；
(vi)配列番号４のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(vii)配列番号６のチオレーションドメイン；
(viii)配列番号８のコンデンセーションドメイン；
(ix)配列番号１０のチロシンのアデニレーションドメイン；
(x)配列番号１２のＮ−メチレーションドメイン；
(xi)配列番号１４のチオレーションドメイン；
(xii)配列番号５５のコンデンセーションドメイン；
(xiii)配列番号５７のイソロイシンのアデニレーションドメイン；
(xiv)配列番号５９のチオレーションドメイン；および
(xv)配列番号６１のチオエステラーゼドメイン、または
(b)以下の１個以上のＮＲＰＳ１ドメイン
(xvi)配列番号３１のローディングドメイン；
(xvii)配列番号３３のグルタミンのアデニレーションドメイン；
(xviii)配列番号３５のチオレーションドメイン；
(xix)配列番号３７のコンデンセーションドメイン；
(xx)配列番号３９のスレオニンのアデニレーションドメイン；
(xxi)配列番号４１のチオレーションドメイン；
(xxii)配列番号４３のコンデンセーションドメイン；および
(xxiii)配列番号４５のロイシンのアデニレーションドメイン
の活性を保持する発現産物をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２９に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２７に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の１個以上のポリヌクレオチドによってコードされる単離されたポリペプチド。
【請求項６】
式（Ｉ）または（Ｉ’）で示される化合物の生産において含まれる単離されたポリペプチドであって、以下のものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド：
(i)ＮＲＰＳ１を示す請求項４に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、ＮＲＰＳ２を示す請求項３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列、チトクロムＰ４５０を示す配列番号６３；および
(ii)(i)に列挙したアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の配列同一性を有し、実質的に同じ触媒機能を保持する、(i)に列挙したアミノ酸配列の機能的変異体。
【請求項７】
請求項６に記載の１個以上のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
(i)配列番号２７またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列；および
(ii)配列番号２９またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
さらに配列番号６３またはその機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
受託番号ＤＳＭ  １９３２９を有するコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）株ＮＰＨ−ＭＢ１８０から単離された、請求項７〜９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
オープンリーディングフレームが転写および翻訳配列と作動可能に連結している、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜４および７〜１０のいずれか１項に記載の組換えポリヌクレオチドの１個以上または請求項１１または１２に記載の発現ベクターで遺伝子操作されている宿主細胞。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドがゲノムに組み込まれている、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２および配列番号２４からなる群から選択される式（Ｉ）または（Ｉ’）の化合物の生産に必要な１個以上のオープンリーディングフレームまたはそれらの機能的変異体をさらに含む、請求項１３または１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
図１Ａおよび図１Ｂに記載されている式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）ならびに（ＸＶＩＩ）および（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物を生産するための、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
組換えポリヌクレオチドが遺伝子発現に最適化するために修飾されている、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドのコドン出現頻度が宿主細胞の豊富なタンパク質のコドン出現頻度に調節されている、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
宿主細胞が大腸菌（E. coli）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・グリセオフスカス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトマイセス・アムボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）、ソランギウム・セルロサム（Sorangium cellulosum）、コンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）、シュードモナス属、ストレプトマイセス属、バシラス属およびスタフィロコッカス属、酵母、Drosophila S2、Spodoptera Sf9、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫、およびアデノウイルスから選択される、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
宿主細胞がミキソコッカス目（Myxococcales）またはシュードモナス属（Pseudomonas）もしくはストレプトマイセス属（Streptomyces）から選択される、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
宿主細胞がコンドロマイセス・クロカツス（Chondromyces crocatus）である、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
図１Ａおよび図１Ｂに記載されている式（Ｉ）もしくは（Ｉ’）または式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）、（ＸＩ）〜（ＸＩＶ）もしくは（ＸＶＩＩ）〜（ＸＶＩＩＩ）で示される化合物を製造する方法であって、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞を、当該化合物が生産される条件下で培養することを含む、製造方法。
【請求項２３】
当該化合物を回収する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
宿主細胞を、イソ酪酸を含む成長培地で培養する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
実質的に前記請求項に定義されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、または請求項１１または１２に記載の発現ベクター、または請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の宿主細胞、または請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明は、式Ｉ
【化１】
2012517801.tif 000003
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸおよびＡ１は各々独立して任意であり、そして
Ｘは任意の化学残基、特にＨまたはアシル残基、特にＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２ＣＯまたは（ＣＨ３）２ＣＨＣＯであり；
Ａ１はアスパラギン酸以外の標準アミノ酸、特にグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンまたはセリン、特にスレオニンであり；
Ａ３は非塩基性標準アミノ酸またはその非塩基性誘導体、特にロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたはそれらの誘導体、特にＡｈｐまたはその誘導体、特にＡｈｐ誘導体３−アミノ−２ピペリドンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンまたはその誘導体、特にチロシンであり；
Ａ７はロイシン、イソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
のデプシペプチドの生合成に関与する生合成クラスターの同定、並びに式Ｉの非リボソームペプチドまたはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体を生産するための異種発現系の開発に関する。特に、式（Ｉ’）
【化２】
2012517801.tif 000004
［式中、Ａ７のカルボキシ基とＡ２のヒドロキシ基の間にエステル結合があり、所望により、Ａ５とＡ６の間のアミド結合の窒素原子がメチルで置換されていてもよく、
ＸはＣＨ３ＣＯ、（ＣＨ３）２ＣＨＣＯ、ＣＨ３Ｓ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯまたはＣ６Ｈ５ＣＯであり；
Ａ１はグルタミンであり；
Ａ２はスレオニンであり；
Ａ３はロイシンであり；
Ａ４はＡｈｐ、デヒドロ−ＡＨＰ、プロリンまたは５−ヒドロキシ−プロリンであり；
Ａ５はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンであり；
Ａ６はチロシンであり；
Ａ７はイソロイシンまたはバリン、特にイソロイシンである。］
のデプシペプチドの生合成における生合成遺伝子クラスターの使用を見出す。