(57)【要約】【課題】卵母細胞を凍結させそして解凍するための再生可能な方法および組成物を提供すること。【解決手段】室温よりも高いが体温よりも低い温度に維持された１種または１種よりも蘇生溶液の使用が、蘇生される卵母細胞における細胞ストレスを最小にするという発見に関する。別の局面において、本発明はさらに、体温に維持された蘇生安定化溶液中での蘇生される卵母細胞の延長されたインキュベーションが、その卵母細胞の生存能を増強するという発見に基づき、凍結した卵母細胞を蘇生するための方法、凍結保護物質を含む卵母細胞を解凍するための凍結保護物質溶液、および脱水剤を含む卵母細胞を解凍するための脱水溶液などが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温保存された動物の卵母細胞を蘇生するための方法であって、該方法は、
ａ）凍結保護状態から１つまたは１つよりも多い容器を取り出す工程であって、該容器は、凍結保護物質溶液中に凍結された卵母細胞を含む、工程；
ｂ）該回収された容器を、該卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持し、次いで、該卵母細胞を該容器から取り出す工程；
ｃ）該卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、各溶液を約２８℃〜３５℃の温度に維持しながら、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因する該卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程；および
ｄ）該蘇生された卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された蘇生安定化溶液中で、該蘇生された卵母細胞を受精のために安定化するのに十分な期間安定化する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記回収された容器を前記卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持する工程が、
ａ）該容器を周囲大気条件に曝露する工程であって、該周囲大気条件は、例えば、室温に維持された空気環境である、工程；および
ｂ）該容器を温かい水浴に浸漬する工程
を包含する、方法。
【請求項３】
前記容器が、最初に、周囲大気条件に好ましくは５分間未満の期間、より好ましくは１分間未満、さらにより好ましくは約１５秒間曝露される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記容器が、好ましくは約２５℃〜３５℃の温度に維持された温かい水浴に浸漬される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記温かい水浴への浸漬が５分間未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因する該卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程が、約２９℃〜３４℃の温度に維持された溶液中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
より低い勾配の凍結保護物質を含む３種の連続的な溶液が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記３種の連続的な溶液が、
ａ）約０．８Ｍ〜約１．２Ｍのプロピレングリコールを含む第１の溶液；
ｂ）約０．３Ｍ〜約０．７Ｍのプロピレングリコールを含む第２の溶液；および
ｃ）０．３Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、好ましくは０．１Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、さらにより好ましくはプロピレングリコールを含まない第３の溶液、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記溶液の各々が、必要に応じてさらに、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳからなる群より選択される１種または１種よりも多い成分を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記糖がスクロースである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記糖の濃度が、約０．２０Ｍ〜０．３５Ｍである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｍ−ＨＴＦが、約７０体積％〜９０体積％の範囲で使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＳＳＳが、約１０体積％〜３０体積％の濃度で使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記卵母細胞が、前記第１の溶液中に、約３０℃〜３４℃の温度で浸漬される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の溶液中の前記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約１．０Ｍであり、該溶液のｐＨが好ましくは約７．２〜７．３に維持される、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の溶液中の前記卵母細胞の浸漬の後、該卵母細胞が、約３０℃〜３４℃の温度に維持された第２の溶液に移される、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の溶液中の前記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約０．５Ｍであり、該溶液のｐＨが好ましくは約７．２〜７．３に維持される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の溶液中の前記卵母細胞の浸漬の後、該卵母細胞が、約３０℃〜３４℃の温度に維持された第３の溶液に移される、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第３の溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第３の溶液中の前記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第３の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍであり、該第３の溶液のｐＨが約７．２〜７．３である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記連続的な一連の解凍溶液中の浸漬の完了の際、前記卵母細胞が、蘇生安定化溶液に浸漬される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
凍結保護物質を含む、卵母細胞を解凍するための凍結保護物質溶液であって、該凍結保護物質溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、該凍結保護物質溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによる該卵母細胞の溶解を阻害する、凍結保護物質溶液。
【請求項２７】
前記凍結保護物質溶液の温度が、約３０℃〜３４℃に維持される、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項２８】
前記凍結保護物質溶液の温度が、約３１℃〜３３℃に維持される、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項２９】
前記凍結保護物質溶液の温度が、３２±０．５℃に維持される、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３０】
前記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３１】
前記凍結保護物質がプロピレングリコールである、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３２】
前記プロピレングリコールの濃度が約０．８Ｍ〜約１．２Ｍである、請求項３１に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３３】
前記プロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍ〜約０．７Ｍである、請求項３１に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３４】
前記プロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍ未満である、請求項３１に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３５】
前記プロピレングリコールの濃度が約０．１Ｍ未満である、請求項３１に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３６】
前記凍結保護物質溶液がさらに、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳからなる群より選択される１種または１種よりも多い成分を含む、請求項３１に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３７】
前記糖が、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、またはラフィノースである、請求項３６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３８】
前記糖がスクロースである、請求項３７に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項３９】
前記糖の濃度が約０．２０Ｍ〜０．３５Ｍである、請求項３６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４０】
前記糖の濃度が約０．２５Ｍである、請求項３９に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４１】
前記ｍ−ＨＴＦの濃度が、約７０体積％〜９０体積％の範囲である、請求項３６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４２】
前記ＳＳＳが、約１０体積％〜３０体積％の濃度である、請求項３６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４３】
前記凍結保護物質溶液が、表６および表７のものである、請求項２６に記載の凍結保護物質溶液。
【請求項４４】
脱水剤を含む、卵母細胞を解凍するための脱水溶液であって、該脱水溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、該脱水溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによる該卵母細胞の溶解を阻害する、脱水溶液。
【請求項４５】
前記脱水溶液が、表８のものである、請求項４４に記載の脱水溶液。
【請求項４６】
前記脱水剤がスクロースである、請求項４４に記載の脱水溶液。
【請求項４７】
前記脱水溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、請求項４４に記載の脱水溶液。
【請求項４８】
前記脱水溶液が、約３２±０．５℃の温度に維持される、請求項４４に記載の脱水溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で米国仮特許出願第６０／８５９，３０５号（２００６年１１月１５日出願）に対して優先権を主張する米国特許出願番号第１１／６９４，８４８号（２００７年３月３０日出願）の一部継続出願である。これらの出願のいずれも、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、概して、低温保存された卵母細胞（特に、ヒトの卵母細胞のような哺乳動物の卵母細胞）を蘇生するために有用な方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（当該分野の状況）
解凍の際に高い割合の生存能をもたらす容易に再生可能な様式で卵母細胞を低温保存し、次いで蘇生する能力は、いまだ達成されていない。しかし、凍結（ｆｒｅｅｚｅ）した卵母細胞から子孫を首尾よく生み出すことが可能であることが示されている。したがって、これは、凍結した卵母細胞を蘇生するための再生可能な方法が達成可能であることを示唆する。
【０００４】
数種の卵母細胞解凍技術が示唆されており、各々がそれに特有の一連の利点および不利点を伴う。しかし全体として、これらの方法はかなり非効率的で、予測不可能であり、そして卵母細胞の解凍生存度、卵母細胞の受精、および胚分割に関しては最適以下の割合を生じている。
【０００５】
これらの以前に示唆された技術の典型的なものとしては、すでに凍結された卵母細胞を数種の溶液に連続して移動させる解凍手順が挙げられる。Ｆａｂｂｒｉの特許文献１では、
凍結した卵母細胞（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｓｔｒａｗ中）は、最初に３０秒間空気で温められ、次いで、アイス（ｉｃｅ）のいかなる痕跡も除去するために３０℃の水浴に４０秒間浸漬された。次いで、卵母細胞は、以下のような一連の４種の溶液中で処理された：
第１の溶液は、１Ｍの１，２−プロパンジオール（ＰＧ）と、０．３Ｍのスクロースと合成血清代替物（ＳＳＳ）とを含み、室温に維持され、そして５分間インキュベートされる；
２番目は、０．５ＭのＰＧと、０．３ＭのスクロースとＳＳＳとを含み、室温に維持され、そして５分間インキュベートされる；
３番目の溶液は、０．３ＭのスクロースとＳＳＳとを含み、室温に維持され、そして５分間インキュベートされる；
さらに４番目は、ＰＢＳ溶液中のＳＳＳを含み、室温に１０分間維持され、その後、その溶液は、３７℃で約１０分間維持される。
【０００６】
文献における成功の記載にもかかわらず、凍結から出生までの全体的な成功率は、許容し得ないほど低いままである。
【特許文献１】米国特許第７，０１１，９３７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、凍結した卵母細胞を蘇生するための再生可能な方法および組成物を提供することが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、部分的に、凍結した卵母細胞の再生において使用するための方法および組成物に関する。
【０００９】
本発明は、部分的に、解凍プロセスの間に卵母細胞における細胞ストレスを最小にすることが、再生可能な蘇生方法論を提供するために不可欠であるという発見に基づく。具体的に、一局面において、本発明は、室温よりも高いが体温よりも低い温度に維持された１種または１種よりも蘇生溶液の使用が、蘇生される卵母細胞における細胞ストレスを最小にするという発見に関する。別の局面において、本発明はさらに、体温に維持された蘇生安定化溶液中での蘇生される卵母細胞の延長されたインキュベーションが、その卵母細胞の生存能を増強するという発見に関する。
【００１０】
したがって、本発明の一実施形態において、凍結した卵母細胞を蘇生するための方法が提供され、その方法は、
ａ）凍結保護状態（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）から１つまたは１つよりも多い容器を取り出す工程であって、その容器は、凍結保護物質溶液中に凍結された卵母細胞を含む、工程；
ｂ）その回収された容器を、その卵母細胞中のいかなる細胞質内アイス（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｉｃｅ）も融解するための条件下で維持し、次いで、その卵母細胞をその容器から取り出す工程；
ｃ）その卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、各溶液を約２８℃〜３５℃の温度に維持しながら、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因するその卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程；および
ｄ）その蘇生された卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された蘇生安定化溶液中で、その蘇生された卵母細胞を受精のために安定化するのに十分な期間安定化する工程、
を包含する。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、凍結保護物質を含む、卵母細胞を解凍するための凍結保護物質溶液に関し、その凍結保護物質溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによる卵母細胞の溶解を阻害する。
【００１２】
本発明はさらに、以下を提供する。
（項目１）
低温保存された動物の卵母細胞を蘇生するための方法であって、その方法は、
ａ）凍結保護状態から１つまたは１つよりも多い容器を取り出す工程であって、その容器は、凍結保護物質溶液中に凍結された卵母細胞を含む、工程；
ｂ）その回収された容器を、その卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持し、次いで、その卵母細胞をその容器から取り出す工程；
ｃ）その卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、各溶液を約２８℃〜３５℃の温度に維持しながら、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因するその卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程；および
ｄ）その蘇生された卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された蘇生安定化溶液中で、その蘇生された卵母細胞を受精のために安定化するのに十分な期間安定化する工程、
を包含する、方法。
（項目２）
項目１に記載の方法であって、上記回収された容器を上記卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持する工程が、
ａ）その容器を周囲大気条件に曝露する工程であって、その周囲大気条件は、例えば、室温に維持された空気環境である、工程；および
ｂ）その容器を温かい水浴に浸漬する工程
を包含する、方法。
（項目３）
上記容器が、最初に、周囲大気条件に好ましくは５分間未満の期間、より好ましくは１分間未満、さらにより好ましくは約１５秒間曝露される、項目２に記載の方法。
（項目４）
上記容器が、好ましくは約２５℃〜３５℃の温度に維持された温かい水浴に浸漬される、項目３に記載の方法。
（項目５）
上記温かい水浴への浸漬が５分間未満である、項目２に記載の方法。
（項目６）
上記卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因するその卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程が、約２９℃〜３４℃の温度に維持された溶液中で行われる、項目１に記載の方法。
（項目７）
より低い勾配の凍結保護物質を含む３種の連続的な溶液が使用される、項目１に記載の方法。
（項目８）
上記３種の連続的な溶液が、
ａ）約０．８Ｍ〜約１．２Ｍのプロピレングリコールを含む第１の溶液；
ｂ）約０．３Ｍ〜約０．７Ｍのプロピレングリコールを含む第２の溶液；および
ｃ）０．３Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、好ましくは０．１Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、さらにより好ましくはプロピレングリコールを含まない第３の溶液、
を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
上記溶液の各々が、必要に応じてさらに、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳからなる群より選択される１種または１種よりも多い成分を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
上記糖がスクロースである、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記糖の濃度が、約０．２０Ｍ〜０．３５Ｍである、項目９に記載の方法。
（項目１２）
上記ｍ−ＨＴＦが、約７０体積％〜９０体積％の範囲で使用される、項目９に記載の方法。
（項目１３）
上記ＳＳＳが、約１０体積％〜３０体積％の濃度で使用される、項目９に記載の方法。
（項目１４）
上記卵母細胞が、上記第１の溶液中に、約３０℃〜３４℃の温度で浸漬される、項目８に記載の方法。
（項目１５）
上記第１の溶液中の上記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、項目８に記載の方法。
（項目１６）
上記第１の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約１．０Ｍであり、その溶液のｐＨが好ましくは約７．２〜７．３に維持される、項目８に記載の方法。
（項目１７）
上記第１の溶液中の上記卵母細胞の浸漬の後、その卵母細胞が、約３０℃〜３４℃の温度に維持された第２の溶液に移される、項目８に記載の方法。
（項目１８）
上記第２の溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
上記第２の溶液中の上記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
上記第２の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約０．５Ｍであり、その溶液のｐＨが好ましくは約７．２〜７．３に維持される、項目１７に記載の方法。
（項目２１）
上記第２の溶液中の上記卵母細胞の浸漬の後、その卵母細胞が、約３０℃〜３４℃の温度に維持された第３の溶液に移される、項目８に記載の方法。
（項目２２）
上記第３の溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
上記第３の溶液中の上記卵母細胞の浸漬時間が、約３分〜７分間である、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
上記第３の溶液中のプロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍであり、その第３の溶液のｐＨが約７．２〜７．３である、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
上記連続的な一連の解凍溶液中の浸漬の完了の際、上記卵母細胞が、蘇生安定化溶液に浸漬される、項目１に記載の方法。
（項目２６）
凍結保護物質を含む、卵母細胞を解凍するための凍結保護物質溶液であって、その凍結保護物質溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによるその卵母細胞の溶解を阻害する、凍結保護物質溶液。
（項目２７）
上記凍結保護物質溶液の温度が、約３０℃〜３４℃に維持される、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目２８）
上記凍結保護物質溶液の温度が、約３１℃〜３３℃に維持される、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目２９）
上記凍結保護物質溶液の温度が、３２±０．５℃に維持される、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３０）
上記凍結保護物質が、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３１）
上記凍結保護物質がプロピレングリコールである、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３２）
上記プロピレングリコールの濃度が約０．８Ｍ〜約１．２Ｍである、項目３１に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３３）
上記プロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍ〜約０．７Ｍである、項目３１に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３４）
上記プロピレングリコールの濃度が約０．３Ｍ未満である、項目３１に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３５）
上記プロピレングリコールの濃度が約０．１Ｍ未満である、項目３１に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３６）
上記凍結保護物質溶液がさらに、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳからなる群より選択される１種または１種よりも多い成分を含む、項目３１に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３７）
上記糖が、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、またはラフィノースである、項目３６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３８）
上記糖がスクロースである、項目３７に記載の凍結保護物質溶液。
（項目３９）
上記糖の濃度が約０．２０Ｍ〜０．３５Ｍである、項目３６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目４０）
上記糖の濃度が約０．２５Ｍである、項目３９に記載の凍結保護物質溶液。
（項目４１）
上記ｍ−ＨＴＦの濃度が、約７０体積％〜９０体積％の範囲である、項目３６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目４２）
上記ＳＳＳが、約１０体積％〜３０体積％の濃度である、項目３６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目４３）
上記凍結保護物質溶液が、表６および表７のものである、項目２６に記載の凍結保護物質溶液。
（項目４４）
脱水剤を含む、卵母細胞を解凍するための脱水溶液であって、その脱水溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、その脱水溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによるその卵母細胞の溶解を阻害する、脱水溶液。
（項目４５）
上記脱水溶液が、表８のものである、項目４４に記載の脱水溶液。
（項目４６）
上記脱水剤がスクロースである、項目４４に記載の脱水溶液。
（項目４７）
上記脱水溶液が、約３１℃〜３３℃の温度に維持される、項目４４に記載の脱水溶液。
（項目４８）
上記脱水溶液が、約３２±０．５℃の温度に維持される、項目４４に記載の脱水溶液。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本明細書中で使用される場合、他に示されない限り、以下の定義を適用するものとする。
【００１４】
「成熟した動物の卵母細胞」とは、成熟の尺度で「成熟期−−ＭＩＩ」と格付けされる収集された卵母細胞を指す。この尺度はさらに、収集された卵母細胞を「中期−−（ＭＩ）」または「未成熟期−−（ＧＶ）」と同定する。
【００１５】
「蘇生された卵母細胞」とは、受精および胚の発達が可能な解凍された卵母細胞を指す。
【００１６】
用語「卵」は、本明細書中で使用される場合、用語「卵母細胞」と同義であるように意味される。
【００１７】
「蘇生安定化溶液」とは、蘇生後に、蘇生された卵母細胞がインキュベートされる溶液を指す。本発明で有用な安定化溶液としては、例示の目的で、Ｇｌｏｂａｌ（登録商標）媒体（Ｌｉｆｅ  Ｇｌｏｂａｌ，ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅから入手可能）、ＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ（登録商標）媒体（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）、ヒト卵管溶液（ＨＴＦ−Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）（必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）が補充される）、ならびに改変ＨＴＦ（ＨＥＰＥＳを含むＨＴＦ（ｍＨＴＦ）−Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）（必要に応じてＳＳＳおよび／または抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ナトリウム欠乏ＰＢＳ（例えば、リン酸水素ナトリウム（Ｈ２ＮａＰＯ４））が補充される）などが挙げられる。
【００１８】
上記解凍された卵母細胞は、受精に必要な減数分裂紡錘体の形成に関連するプロセスを回復するために、さらにミトコンドリアエネルギー生産を増強し、そしてｍＲＮＡプロセスおよびタンパク質活性を回復するために、蘇生安定化溶液に浸漬される。
【００１９】
用語「凍結保護物質」とは、代表的に浸透圧性の方法によって動物の卵母細胞の細胞壁を越えて浸透し、低温保存された状態のみならず低温保存のプロセスの間も卵母細胞の生存および生存能の保持を促進する液体を指す。適切な凍結保護物質は当該分野で周知であり、例示のみの目的で、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール、プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）、グリセロール、およびそのような凍結保護物質のうちの２種以上の混合物などが挙げられる。
【００２０】
用語「糖」とは、１〜８個の糖単位、好ましくは２〜３個の糖単位を有する単糖類および多糖類を指す。適切な糖としては、例示の目的で、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノースなどが挙げられる。
【００２１】
用語「Ｇｌｏｂａｌ（登録商標）媒体」、「ＳＳＳを補充したＧｌｏｂａｌ（登録商標）媒体」「ヒト卵管溶液」または「改変ヒト卵管溶液」とは、市販の溶液（本明細書に記載されるとおり）、あるいは表１〜表２および／または表９の溶液組成を指す。
【００２２】
（１．方法論）
本発明の方法は、低温保存された動物の卵母細胞を効率的に蘇生するための多段階プロセスに関する。具体的に、低温保存された動物の卵母細胞を蘇生するための方法が提供され、その方法は、
ａ）凍結保護状態から１つまたは１つよりも多い容器を取り出す工程であって、その容器は、凍結保護物質溶液中に凍結された卵母細胞を含む、工程；
ｂ）その回収された容器を、その卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持し、次いで、その卵母細胞をその容器から取り出す工程；
ｃ）その卵母細胞を、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液中に、各溶液を約２８℃〜３５℃の温度に維持しながら、卵母細胞が蘇生されかつ浸透圧ショックに起因するその卵母細胞の溶解が阻害される条件下で浸漬することによって、蘇生する工程；および
ｄ）その蘇生された卵母細胞を、約３３℃〜約３８℃の温度に維持された蘇生安定化溶液中で、その蘇生された卵母細胞を受精のために安定化するのに十分な期間安定化する工程、
を包含する。
【００２３】
以下の議論において、用語「卵母細胞」とは、この用語が「１つ」、「ある」、「その」、「上記」などのような語を用いるかどうかにかかわらず、単数および複数の両方を指す。
【００２４】
一実施形態において、低温保存状態からの容器の取り出しから、蘇生された卵母細胞を蘇生安定化溶液中に入れるまでの全体の時間は、約１時間に過ぎず、好ましくは約３０分間に過ぎず、さらにより好ましくは約１５分〜２０分間である。
【００２５】
一実施形態において、上記回収された容器を上記卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するための条件下で維持する工程は、
ａ）その容器を周囲大気条件（例えば、室温に維持された空気環境）に曝露する工程；および
ｂ）その容器を温かい水浴に浸漬する工程
によって達成される。
【００２６】
この実施形態の一局面において、上記容器は、最初に、周囲大気条件に好ましくは５分間未満の期間、より好ましくは１分間未満、さらにより好ましくは約１５秒間曝露される。
【００２７】
この実施形態の別の局面において、上記容器は、好ましくは約２５℃〜３５℃の温度に維持された温かい水浴に浸漬される。この実施形態のより好ましい局面において、上記温かい水浴は、約３０℃〜３４℃の温度に、さらにより好ましくは、約３２±０．５℃に維持される。この温かい水浴中の浸漬は、好ましくは５分間未満であり、さらに好ましくは１分間未満であり、さらにより好ましくは約１５秒間である。
【００２８】
当業者に明らかなように、空気曝露および水浸漬についての合計の時間は、卵母細胞中のいかなる細胞質内アイスも融解するように選択される。したがって、細胞質内アイスが融解されるという条件で、２つの工程のうちの一方についての期間は短縮され得、他方は延長され得る。
【００２９】
一実施形態において、次いで、上記卵母細胞は、容器から取り出され、各々が前の溶液よりも低い勾配の凍結保護物質を含む連続的な温かい水溶液に、卵母細胞を蘇生しかつ浸透圧ショックに起因するその卵母細胞の溶解を阻害する条件下で浸漬されることによって、蘇生される。好ましくは、これらの溶液の各々は、約２９℃〜３４℃の温度に、より好ましくは約３２±０．５℃に維持される。
【００３０】
この実施形態の一局面において、より低い勾配の凍結保護物質を含む３種の連続的な溶液が使用される。特に好ましい経路において、これらの複数の溶液は、以下を含む一例において、使用される：
ａ）約０．８Ｍ〜約１．２Ｍのプロピレングリコールを含む第１の溶液；
ｂ）約０．３Ｍ〜約０．７Ｍのプロピレングリコールを含む第２の溶液；および
ｃ）０．３Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、好ましくは０．１Ｍ未満のプロピレングリコールを含む、さらにより好ましくはプロピレングリコールを含まない第３の溶液。
【００３１】
これらの溶液の各々はさらに、必要に応じて、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳのような成分を含む。好ましくは、これらの溶液は、スクロースと、ｍ−ＨＴＦとＳＳＳとを含む。特に好ましい実施形態において、単独で使用されるか組み合わせて使用されるかどうかにかかわらず、上記糖の濃度は、好ましくは約０．２０Ｍ〜０．３０Ｍ、より好ましくは約０．２５Ｍであり；上記ｍ−ＨＴＦは、好ましくは約７０体積パーセント〜９０体積パーセントの範囲で使用され、そして上記ＳＳＳは、好ましくは約１０体積パーセント〜３０体積パーセントの濃度で使用される。
【００３２】
一実施形態において、容器から第１の溶液に移された卵母細胞は、第１の溶液に、約３０℃〜３４℃の温度で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは３２±０．５℃で浸漬される。浸漬時間は、好ましくは約３分〜７分間、好ましくは約５分間続く。好ましくは、第１の溶液中のプロピレングリコールの濃度は約１．０Ｍであり、この溶液のｐＨは、好ましくは約７．２〜７．３に維持される。
【００３３】
この実施形態のさらなる局面において、卵母細胞は、この第１の溶液から上に記載される第２の溶液に移される。好ましい実施形態において、そのように移された卵母細胞は、第２の溶液に、約３０℃〜３４℃の温度で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは３２±０．５℃で浸漬される。浸漬時間は、好ましくは約３分〜７分間、好ましくは約５分間続く。好ましくは、第２の溶液中のプロピレングリコールの濃度は約０．５Ｍであり、この溶液のｐＨは、好ましくは約７．２〜７．３に維持される。
【００３４】
この実施形態のさらなる局面において、卵母細胞は、この第２の溶液から上に記載される第３の溶液に移される。好ましい実施形態において、そのように移された卵母細胞は、第３の溶液に、約３０℃〜３４℃の温度で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは３２±０．５℃で浸漬される。浸漬時間は、好ましくは約３分〜７分間、好ましくは約５分間続く。好ましくは、第３の溶液中のプロピレングリコールの濃度は、約０．３Ｍ未満、より好ましくは０．１Ｍ未満であり、さらにより好ましくは、この第３の溶液中にプロピレングリコールは存在しない。この第３の溶液のｐＨは、好ましくは約７．２〜７．３に維持される。一実施形態において、第３の溶液は、プロピレングリコールを全く含まないが、脱水剤（例えば、スクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、ラフィノースなど）を含む。脱水剤は、卵母細胞中の細胞質内の水の脱水を容易にする。好ましくは、そのような因子は、卵母細胞の細胞壁を浸透圧で越えない。
【００３５】
この連続的な一連の解凍溶液中の浸漬の完了の際に、卵母細胞は、受精の前に解凍安定化溶液に入れられる。この溶液は、生理学的温度に対して卵母細胞を安定化すると同時に、養分に富む環境を提供する。好ましい実施形態において、卵母細胞は、この溶液中に、安定化されるまで維持される。好ましい実施形態において、安定化は、約２時間以内に起こる。この時点で、卵母細胞は受精の準備ができている。
【００３６】
（２．組成物）
一局面において、本発明は、凍結保護物質を含む、卵母細胞を解凍するための凍結保護物質溶液に関し、その凍結保護物質溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、その凍結保護物質溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによるその卵母細胞の溶解を阻害する。
【００３７】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、約３０℃〜３４℃の温度に維持される。一実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、約３１℃〜３３℃の温度に維持される。１つの好ましい実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、３２±０．５℃の温度に維持される。
【００３８】
一実施形態において、上記凍結保護物質としては、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
１つの好ましい実施形態において、上記凍結保護物質はプロピレングリコールである。一実施形態において、上記プロピレングリコールの濃度は、約０．８Ｍ〜約１．２Ｍである。一実施形態において、上記プロピレングリコールの濃度は、約０．３Ｍ〜約０．７Ｍである。一実施形態において、上記プロピレングリコールの濃度は、約０．３Ｍ未満である。一実施形態において、上記プロピレングリコールの濃度は、約０．１Ｍ未満である。
【００４０】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液はさらに、１種または１種よりも多い成分を含み、その成分としては、例えば、糖、ｍ−ＨＴＦおよびＳＳＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
一実施形態において、上記糖はスクロース、デキストロース、トレハロース、ラクトース、またはラフィノースである。１つの好ましい実施形態において、上記糖はスクロースである。一実施形態において、上記糖の濃度は、約０．２０Ｍ〜０．３５Ｍである。一実施形態において、上記糖の濃度は、約０．２５Ｍである。
【００４２】
一実施形態において、上記ｍ−ＨＴＦは、約７０体積％〜約９０体積％の範囲で使用される。
【００４３】
一実施形態において、上記ＳＳＳは、約１０体積％〜３０体積％の濃度で使用される。
【００４４】
一実施形態において、上記凍結保護物質溶液は、表６または表７のものである。
【００４５】
一実施形態において、本発明は、脱水剤を含む、卵母細胞を解凍するための脱水溶液を提供し、その脱水溶液は、約２９℃〜３４℃の温度に維持され、その脱水溶液は、卵母細胞を蘇生し、かつ浸透圧ショックによるその卵母細胞の溶解を阻害する。
【００４６】
一実施形態において、上記脱水溶液は、表８のものである。
【００４７】
一実施形態において、上記脱水溶液中の上記脱水剤はスクロースである。
【００４８】
一実施形態において、上記脱水溶液は、約３１℃〜３３℃の温度に維持される。
【００４９】
一実施形態において、上記脱水溶液は、約３２±０．５℃の温度に維持される。
【００５０】
以下の実施例は、本発明の特定の局面を例示するため、および本発明を実施することにおいて当業者を支援するために提供される。これらの実施例は、決して本発明の範囲を制限すると考えられるべきではない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例および本願の全体を通じて、以下の組成物が記載され、これらの組成物は以下に記載されるように市販されている。
【００５２】
Ｇｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ、ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅ、ｐ／ｎ  ＬＧＧＧ
合成血清代替物（ＳＳＳ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ  ９９１９３
改変ヒト卵管流体（ｍＨＴＦ）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｐ／ｎ  ９０１２６
プロピレングリコール、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｐ／ｎ  ２４１２２９  
スクロース、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ｐ／ｎ  Ｓ１８８８。
【００５３】
以下の実施例において、すべてのパーセントは、他に指定されない限り体積パーセントである。同様に、すべての温度は、他に記載されない限り、摂氏温度で報告される。
【００５４】
実施例において、以下の略語は、以下の意味を有する：
【００５５】
【化１】
2008118997.tif 000002
（実施例１）
卵母細胞の凍結
以下の実施例１では、以下の溶液が示される。これらの溶液を以下のとおりに調製した：
第１の安定化溶液。  卵母細胞の凍結のための第１の安定化溶液を、約１０体積％のＳＳＳを含むＧｌｏｂａｌ  Ｍｅｄｉａ（ＩＶＦ  Ｏｎｌｉｎｅ）を用いることによって調製した。
【００５６】
第２の安定化溶液。  第２の凍結溶液を調製し、これは、約８０体積％のｍＨＴＦを含み、ＳＳＳが補充されている。この溶液は、使用する前に４℃で保管されるべきである。
【００５７】
凍結保護物質溶液。  凍結保護物質溶液を、ｍＨＴＦ中の約１．５Ｍ  プロピレングリコールから調製し、ＳＳＳ（８０：２０）を補充し、そして好ましくは、ｐＨ７．２〜７．３で維持する。
【００５８】
脱水／凍結保護物質（Ｄ／Ｃ）溶液１。  Ｄ／Ｃ溶液１は、スクロース中に懸濁された約１．５Ｍのプロピレングリコールから構成され、さらに８０：２０のｍＨＴＦ／ＳＳＳを含む。好ましくは、そのスクロース濃度は、０．０５Ｍ〜０．１５Ｍであり、０．１２Ｍの濃度が好ましい。好ましくは、この溶液は、７．２〜７．３のｐＨで維持される。
【００５９】
脱水／凍結保護物質（Ｄ／Ｃ）溶液２。  Ｄ／Ｃ溶液２は、スクロース中に懸濁された約１．５Ｍのプロピレングリコールから構成され、さらに８０：２０のｍＨＴＦ／ＳＳＳを含む。好ましくは、そのスクロースは、０．２０Ｍ〜０．３０Ｍであり、０．２４Ｍの濃度が好ましい。好ましくは、この溶液は、７．２〜７．３のｐＨで維持される。
【００６０】
（溶液の浸透圧）
プロピレングリコール（不凍剤）は、溶液の凍結点が代表的な溶質よりも実質的に低下されるように、その溶液の浸透圧について人工的に高い数字をもたらす。以下の表は、使用される成分の各々についての好ましい浸透圧を提供し、これは従来の方法を用いて溶液を改変することによって達成され得る。
【００６１】
【化２】
2008118997.tif 000003
浸透圧データは、上記安定化溶液が卵母細胞に、より高い浸透圧を有する凍結保護物質溶液に浸漬する前に低度〜中程度の浸透圧の溶液中で安定化する機会を提供することを示す。さらに、先行技術と比較してこれらの溶液で使用されるより高い温度は、さらなる安定性を提供する。上記の各々は、記載される浸漬時間と組み合わされて、卵母細胞の減数分裂紡錘体を安定化するために使用され、この卵母細胞の減数分裂紡錘体を安定化することは、解凍後の受精のために卵母細胞の生存能を維持するために重要である。
【００６２】
凍結保護物質溶液中と脱水／凍結保護溶液中との間の浸透圧の差が、紡錘体に損傷を与えることなく浸透圧性交換を推進するために十分に大きいことが特に重要である。その浸透圧の差が低すぎる場合、浸透に対する推進力が減少され、より長い曝露時間をもたらし、紡錘体に損傷を与え得る。一方、浸透圧の差が高すぎる場合、細胞膜の溶解が生じ得る。
【００６３】
各溶液についての浸透圧および浸漬時間は、凍結保護物質による細胞質の水の急速な交換を容易にするために凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護溶液の十分に高い浸透圧が必要とされる様式で、組み合わされる。具体的に、これらの溶液に対して延長された卵母細胞の曝露は、毒性の増加および不可逆的な紡錘体損傷の増加を生じる。したがって、好ましい実施形態において、凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護物質溶液について上に提供される浸漬時間は、これらの溶液の浸透圧に関連し、卵母細胞の生存能を最大にするように選択される。
【００６４】
好ましい実施形態において、凍結保護物質溶液および脱水／凍結保護溶液の浸透圧は、好ましくは、約１０００〜３０００、より好ましくは、約１２００〜２５００の範囲である。特に好ましい実施形態において、上記溶液の浸透圧は、使用される一連の溶液の各々について上向きの勾配（ｕｐｗａｒｄ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）である。上の表は、好ましい浸透圧範囲を提供する。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態においてヒトの卵母細胞は、当業者に公知の超音波誘導技術によって得られる。
【００６６】
収集された中期ＩＩ（ＭＩＩ）卵母細胞を試験し、球形で半透明であり第１極体を放出しているものを、第１の安定化溶液を含むディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）に置く。そのディッシュを、８９％〜９０％  Ｎ２；５％〜６％  ＣＯ２および５％  Ｏ２の大気を備えるトリガス（ｔｒｉ−ｇａｓ）インキュベーターに、３３℃〜３８℃、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で、約２時間入れる。好ましい実施形態において、ＣＯ２の割合は、約７．２〜７．３の溶液のｐＨが提供されるように調整される。いかなる理論に制限されることなく、安定化溶液のｐＨが卵母細胞の生存能を維持することにおいて重要であり、そしてそのｐＨの注意深い制御が溶液中のＣＯ２の量を調整することによって達成される（ここで、そのｐＨは卵母細胞の細胞内ｐＨに対応して制御される）と考えられる。好ましくは、ここで卵丘塊を卵母細胞から除去する。
【００６７】
次に、その卵母細胞を第２の安定化溶液に移し、６分〜７分間まで、好ましくは２分〜５分間の範囲、より好ましくは約３分間、ディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）中で、３３℃〜３８℃で、好ましくは３６．５℃〜３７．５℃で培養する。
【００６８】
次いで、凍結保護溶液への卵母細胞の移動のために調製を行い、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に含め、約３５℃〜３７℃で、１分〜５分間の間、好ましくは１．５分〜３分間の範囲、より好ましくは約２分間保持する。
【００６９】
次に、その卵母細胞をＤ／Ｃ溶液１に移し、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に含め、３５℃〜３７℃で、約３分間保持する。次いで、この溶液の温度を、１℃／分〜３℃／分、好ましくは２±０．５℃／分の速度で、２２℃〜２６℃、好ましくは約２４℃の温度に、最大８分間で、好ましくは約５分間で徐々に低下させる。
【００７０】
工程ｅ）が完了した後、次いで、その卵母細胞を、Ｄ／Ｃ溶液２に移し、その溶液をディッシュ（例えば、Ｎｕｎｃ  ４ウェルディッシュ）内に、２４℃で約１分〜５分間、好ましくは１．５分〜３分間、最適には約２分間含め、一方で同時に、卵母細胞を０．２５ｍｌプラスチックストロー（ＩＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）から入手可能）に充填する。そのストローを両端で密封し、Ｋｒｙｏ  １０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩＩ（Ｐｌａｎｅｒ  １０／１．７  ＧＢ）のような自動化生物学的直立型フリーザー中に置く。
【００７１】
そのストローを２℃／分〜３℃／分の冷却速度で−７℃にチルドする。この温度にて、鉗子でストローの外側に触れることによって「シーディング」を行う。これを液体窒素中で冷却して、水分子が結晶化するように誘発した。そのストローを−７℃で１０分間保持し、その後、０．３℃／分の速度で−３３℃まで冷却を再開して、卵母細胞への凍結保護物質の拡散を可能にする。次いで、保管のためにそのストローを液体窒素に入れる。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態において、細胞内の細胞質小器官および減数分裂紡錘体は、氷晶形成のせん断力から生じる損傷、および他の凍結プロトコルに関連する室温への曝露を容認される。
【００７３】
さらに、プロピレングリコール凍結保護物質に対する卵母細胞の曝露時間および曝露温度を制限することによって、本発明は、卵母細胞への毒性を最小にする。
【００７４】
（実施例２）
卵母細胞を解凍するための方法
ヒトの卵母細胞の凍結の逆転は、卵母細胞の受精が計画されたときに行われる。深い凍結保管からの卵の蘇生は、解凍プロセスが過剰にゆっくりと行われた場合に生じ得る再結晶化を最小にする方法で、凍結段階を効率的かつ迅速に逆転することを必要とする。
【００７５】
好ましい実施形態において、蘇生または解凍段階は、容器（ストロー）を液体窒素容器から取り出す工程を包含する。そのストローを、室温で１５秒間保持し、次いで、水浴に約３１℃で１５秒間沈める。
【００７６】
その後の工程において、卵母細胞の解凍を、凍結保護物質を細胞質から素早く除去すると同時に卵母細胞への浸透圧ショックを回避するための条件下で行う。これらの工程の目的は、プロピレングリコール凍結保護物質の濃度を操作することによって、高度に濃縮された細胞内の凍結保護物質を卵質の外にスムーズにかつ効率的に拡散させることである。卵母細胞を、以下の３種の連続的なリンスに供する：
解凍溶液Ａ：ｍ−ＨＴＦ中の約１．０Ｍのプロピレングリコールとスクロース、およびＳＳＳ。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３５Ｍ  スクロース、好ましくは約０．２９Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
解凍溶液Ｂ：ｍ−ＨＴＦ中の約０．５Ｍのプロピレングリコールとスクロース、およびＳＳＳ。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３５Ｍ  スクロース、好ましくは約０．２９Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
解凍溶液Ｃ：ｍ−ＨＴＦ中のスクロース、およびＳＳＳ（プロピレングリコールはゼロ）。スクロース濃度は、０．２０Ｍ〜０．３０Ｍ、好ましくは約０．２５Ｍである。この溶液を、３０℃〜３４℃で、好ましくは３１℃〜３３℃で、より好ましくは、３２±０．５℃で、４分〜７分間、好ましくは約５分間使用する。
【００７７】
上記の工程が完了した後、卵母細胞はインキュベートの準備ができている。３７℃の温度で、その卵母細胞を解凍安定化溶液（これは、第１の安定化溶液について実施例１に記載されるとおりである）中で、２時間、８９％〜９０％  Ｎ２；５％〜６％  ＣＯ２および５％  Ｏ２（使用されるＣＯ２の量は７．２〜７．３のｐＨを提供するように選択される）を備えるトリガスインキュベーターを用いてインキュベートする。このようにして、卵母細胞を生きている状態に戻す。
【００７８】
卵母細胞の受精：
卵母細胞の授精が計画される場合、従来の細胞質内精子注入技術（ＩＣＳＩ）が使用される。なぜなら、透明帯が凍結プロセスの副産物として固くなっているからである。この重要な工程の認識が欠如すると非常に低い受精率となり、他のプロトコルに伴う不本意な結果の原因となる。
【００７９】
したがって、新鮮なヒトの卵母細胞の凍結または解凍のための本発明の改良された実施形態において、優れた生存率、改良された受精率および胚分割率が達成され得る。
【００８０】
以下の表は、報告された文献と比べた全体的な成功の比較を提供する。
【００８１】
【化３】
2008118997.tif 000004
上のデータは、本発明の凍結方法が解凍方法と組み合わせた場合に、妊娠の高い成功率をもたらすことを示す。
【００８２】
（実施例３）
溶液
以下の表は、本発明において卵母細胞の凍結または解凍ために使用され得る種々の溶液組成を示す。これらの溶液組成は、本発明で使用される商業的供給源から入手される溶液を置き換え得る。以下の表１〜表９におけるすべての量は、最適な結果を与えるために絶対値で提供される。各構成メンバーが、溶液中で、±２５％、±１０％、好ましくは±５％、より好ましくは±３％、またはさらにより好ましくは±１％の範囲であることが理解される。当業者は、本明細書で規定される目的のために、その溶液の必要浸透圧を調整し得る。
【００８３】
以下の表１は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【００８４】
【表１−１】
2008118997.tif 000005
【００８５】
【表１−２】
2008118997.tif 000006
以下の表２は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【００８６】
【表２】
2008118997.tif 000007
以下の表３は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【００８７】
【表３】
2008118997.tif 000008
以下の表４は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【００８８】
【表４】
2008118997.tif 000009
以下の表５は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【００８９】
【表５】
2008118997.tif 000010
以下の表６は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【００９０】
【表６】
2008118997.tif 000011
以下の表７は、１リットルの基礎溶液のための凍結保護物質溶液の組成を示す。
【００９１】
【表７】
2008118997.tif 000012
以下の表８は、１リットルの基礎溶液のための脱水溶液の組成を示す。
【００９２】
【表８】
2008118997.tif 000013
以下の表９は、１リットルの基礎溶液のための安定化溶液の組成を示す。
【００９３】
【表９−１】
2008118997.tif 000014
【００９４】
【表９−２】
2008118997.tif 000015
本発明が図面に示されるように特定の実施例または好ましい実施形態に関してこれまで記載されてきたことが理解される。種々の追加、削除、変更および改変が、本発明の意図される精神および範囲から逸脱することなく上記の実施形態および実施例に対してなされ得る。
【００９５】
（開示の要約）
低温保存された卵母細胞（特に、ヒトの卵母細胞のような哺乳動物の卵母細胞）を解凍するために有用な本発明および組成物が開示される。