【手続補正書】
【提出日】平成25年10月11日(2013.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
4-ヒドロキシブタナールを生成するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシブタナール経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む4-ヒドロキシブタナール経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、該4-ヒドロキシブタナール経路が：
スクシニル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)；4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；及び、4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ； 
アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；及び、4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ；
コハク酸レダクターゼ；4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；及び、4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ；
アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ、又はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ若しくはグルタミン酸トランスアミナーゼ及びグルタミン酸デカルボキシラーゼ及び4-アミノ酪酸デヒドロゲナーゼ又は4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ；4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；及び、4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ；又は、
アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ；及び、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ；
を含む、前記非天然微生物体。
【請求項２】
前記微生物体が、4-ヒドロキシブタナールを生成するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシブタナール経路酵素をコードしている外因性核酸を含み、該4-ヒドロキシブタナール経路が：
4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ；スクシニル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成)；及び、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；又は、
4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ；アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；及び、4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ；
を含む、請求項1記載の非天然微生物体。
【請求項３】
前記少なくとも1つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項1又は2記載の非天然微生物体。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項記載の非天然微生物体を、4-ヒドロキシブタナールを生成するための条件下且つ十分な時間にわたり培養することを含む、4-ヒドロキシブタナールの生成方法。
【請求項５】
前記非天然微生物体が、実質的に嫌気性培養培地内にある、請求項4記載の方法。
【請求項６】
プトレシンを生成するのに十分な量で発現されるプトレシン経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含むプトレシン経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、該プトレシン経路が：
コハク酸レダクターゼ；4-アミノ酪酸デヒドロゲナーゼ又は4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼ；
アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；4-アミノ酪酸デヒドロゲナーゼ又は4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼ；
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸トランスアミナーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼ；
アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ又は5-アミノ-2-オキソペンタン酸トランスアミナーゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼ；又は、
アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ又は5-アミノ-2-オキソペンタン酸トランスアミナーゼ；オルニチンデヒドロゲナーゼ又はオルニチントランスアミナーゼ；及び、オルニチンデカルボキシラーゼ；
を含む、前記非天然微生物体。
【請求項７】
前記微生物体が：
コハク酸レダクターゼ；4-アミノ酪酸デヒドロゲナーゼ又は4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼをコードしている4つの外因性核酸；
アルファ-ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；4-アミノ酪酸デヒドロゲナーゼ又は4-アミノ酪酸トランスアミナーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼをコードしている4つの外因性核酸；
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ又はグルタミン酸トランスアミナーゼ；グルタミン酸デカルボキシラーゼ；4-アミノ酪酸レダクターゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼをコードしている4つの外因性核酸；
アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ又は5-アミノ-2-オキソペンタン酸トランスアミナーゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デカルボキシラーゼ；及び、プトレシンデヒドロゲナーゼ又はプトレシントランスアミナーゼをコードしている4つの外因性核酸；又は、
アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-アミノ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ又は5-アミノ-2-オキソペンタン酸トランスアミナーゼ；オルニチンデヒドロゲナーゼ又はオルニチントランスアミナーゼ；及び、オルニチンデカルボキシラーゼをコードしている4つの外因性核酸；
を含む、請求項6記載の非天然微生物体。
【請求項８】
前記少なくとも1つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項6記載の非天然微生物体。
【請求項９】
請求項6〜8のいずれか1項記載の非天然微生物体を、プトレシンを生成するための条件下且つ十分な時間にわたり培養することを含む、プトレシンの生成方法。
【請求項１０】
前記非天然微生物体が、実質的に嫌気性培養培地内にある、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
4-ヒドロキシブチリル-CoA(4-HBCoA)を生成するのに十分な量で発現される4-ヒドロキシブチリル-CoA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む4-ヒドロキシブチリル-CoA経路を有する微生物体を含む非天然微生物体であって、該4-ヒドロキシブチリル-CoA経路が、アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ；及び、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱炭酸)を含む、前記非天然微生物体。
【請求項１２】
前記微生物体が、アルファ-ケトグルタル酸レダクターゼ；5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ；及び、5-ヒドロキシ-2-オキソペンタン酸デヒドロゲナーゼ(脱炭酸)をコードしている3つの外因性核酸を含む、請求項11記載の非天然微生物体。
【請求項１３】
前記少なくとも1つの外因性核酸が、異種核酸である、請求項11記載の非天然微生物体。
【請求項１４】
請求項11〜13のいずれか1項記載の非天然微生物体を、4-ヒドロキシブチリル-CoAを生成するための条件下且つ十分な時間にわたり培養することを含む、4-ヒドロキシブチリル-CoAの生成方法。
【請求項１５】
前記非天然微生物体が、実質的に嫌気性培養培地内にある、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
以下からなる群から選択される、非天然微生物体：
(A)   CO、CO2又はH2をアセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路を有する微生物体であって、該酵素が、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びフマル酸レダクターゼからなる群から選択され、
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ及び4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼから選択される少なくとも5つの酵素を含む1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、前記微生物体；
(B)   一酸化炭素デヒドロゲナーゼ又はヒドロゲナーゼ活性、及び、CO、CO2又はH2をアセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路を有する微生物体であって、該酵素が、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択され、
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼを含む1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、前記微生物体；
(C)   CO、CO2又はH2をアセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路を有する微生物体であって、該酵素が、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びフマル酸レダクターゼからなる群から選択され、
該微生物体が、4-ヒドロキシ酪酸経路をさらに含み、かつ
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼから選択される5つの酵素を含む、前記微生物体；
(D)  一酸化炭素デヒドロゲナーゼ又はヒドロゲナーゼ活性、及び、CO、CO2又はH2をアセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路を有する微生物体であって、該酵素が、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼからなる群から選択され、
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む4-ヒドロキシ酪酸経路をさらに含む、前記微生物体；
(E)  一酸化炭素又は水素から還元当量を生成し、これにより還元的TCA回路を介してCO2を固定するのに十分な量で発現される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む微生物体であって、該少なくとも1つの外因性核酸が、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びフェレドキシンから選択され、
該微生物体が、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ又はスクシニル-CoAシンテターゼ;スクシニル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;コハク酸レダクターゼ;スクシニル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ;4-ヒドロキシブチリル-ホスフェートレダクターゼ;及び4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)から選択される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、前記微生物体；
(F)  一酸化炭素又は水素から還元当量を生成して、これにより還元的TCA回路を介してCO2を固定するのに十分な量で発現される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む微生物体であって、該少なくとも1つの外因性核酸が、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、及びNAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択され、
該微生物体が、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ又はスクシニル-CoAシンテターゼ;スクシニル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);4-ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;コハク酸レダクターゼ;スクシニル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ  4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼ;4-ヒドロキシブチリル-ホスフェートレダクターゼ;及び4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成)から選択される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、前記微生物体；
(G)  還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路（ここで、該少なくとも1つの外因性核酸は、ATP-クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、及びアルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。）；及び
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びフェレドキシンから選択される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸；
を有する微生物体であって、
該酵素が、該還元的TCA経路を介して、1)CO、2)CO2及びH2、3)CO及びCO2、4)CO及びH2を含む合成ガス、又は5)CO、CO2、及びH2を含む合成ガスから、炭素を固定するのに十分な量で発現され、
該微生物体が、1,4-ブタンジオール経路をさらに含み、かつ
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;4-ヒドロキシ酪酸キナーゼ及び4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼから選択される少なくとも5つの酵素を含む、前記微生物体；
(H)  1)CO、2)CO2及びH2、3)CO及びCO2、4)CO及びH2を含む合成ガス、及び5)CO、CO2、及びH2を含む合成ガスを、アセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路（ここで、該少なくとも1つの外因性核酸は、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼから選択される。）；及び
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ及びNAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される還元当量生成酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元当量生成経路；
を有する微生物体であって、
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルコール形成);4-ヒドロキシブチリル-CoAレダクターゼ(アルデヒド形成);1,4-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸レダクターゼを含む1,4-ブタンジオール経路を含む1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、前記微生物体；
(I)  還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路（ここで、該少なくとも1つの外因性核酸は、ATP-クエン酸リアーゼ、クエン酸リアーゼ、フマル酸レダクターゼ、及びアルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される。）；及び
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、NAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、及びフェレドキシンから選択される酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸；
を有する微生物体であって、
該酵素が、該還元的TCA経路を介して、1)CO、2)CO2及びH2、3)CO及びCO2、4)CO及びH2を含む合成ガス、又は5)CO、CO2、及びH2を含む合成ガスから炭素を固定するのに十分な量で発現され、
該微生物体が、4-ヒドロキシ酪酸経路をさらに含み、かつ
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼから選択される5つの酵素を含む、前記微生物体；及び
(J)  1)CO、2)CO2及びH2、3)CO及びCO2、4)CO及びH2を含む合成ガス、及び5)CO、CO2、及びH2を含む合成ガスを、アセチル-CoAに変換するのに十分な量で発現される還元的TCA経路酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元的TCA経路（ここで、該少なくとも1つの外因性核酸は、ATPクエン酸-リアーゼ、クエン酸リアーゼ、アコニターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アルファ-ケトグルタル酸:フェレドキシンオキシドレダクターゼ、スクシニル-CoAシンテターゼ、スクシニル-CoAトランスフェラーゼ、フマル酸レダクターゼ、フマラーゼ及びリンゴ酸デヒドロゲナーゼから選択される。）；及び
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ及びNAD(P)H:フェレドキシンオキシドレダクターゼから選択される還元当量生成酵素をコードしている少なくとも1つの外因性核酸を含む還元当量生成経路；
を有する微生物体であって、
該微生物体が、3-ヒドロキシブチリル-CoAデヒドロゲナーゼ;4-ヒドロキシブチリル-CoAトランスフェラーゼ、4-ヒドロキシブチリル-CoAヒドロラーゼ又は4-ヒドロキシブチリル-CoAシンテターゼ;ホスホトランス-4-ヒドロキシブチリラーゼ;及び4-ヒドロキシ酪酸キナーゼを含む4-ヒドロキシ酪酸経路をさらに含む、前記微生物体。
【請求項１７】
前記微生物体が、1,4-ブタンジオール経路をさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項記載の非天然微生物体。
【請求項１８】
請求項16又は17記載の非天然微生物体を、1,4-ブタンジオール又は4-ヒドロキシ酪酸を生成するための条件下且つ十分な時間にわたり培養することを含む、1,4-ブタンジオール又は4-ヒドロキシ酪酸の生成方法。
【請求項１９】
生合成された4-ヒドロキシブタナール、プトレシン、4-ヒドロキシブチリル-CoA又は1,4-ブタンジオール、及び、請求項1〜3、6〜8、11〜13、16又は17のいずれか1項記載の非天然微生物体又はその細胞溶解物若しくは培養上清を含む、組成物。
【請求項２０】
培地をさらに含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
請求項1〜3、6〜8、11〜13、16又は17のいずれか1項記載の微生物体によって生成される、生合成された4-ヒドロキシブタナール、4-ヒドロキシブチリル-CoA、1,4-ブタンジオール又はプトレシンを、化学的に又は酵素的に、ポリマーに変換することを含む、ポリマーの製造方法。
【請求項２２】
請求項1〜3、6〜8、11〜13、16又は17のいずれか1項記載の微生物体によって生成される、生合成的に生成された4-ヒドロキシブタナール、プトレシン、4-ヒドロキシブチリル-CoA又は1,4-ブタンジオール。
【請求項２３】
請求項1〜3、6〜8、11〜13、16又は17のいずれか1項記載の微生物体によって生成される、生合成的に生成された4-ヒドロキシブタナール、プトレシン、4-ヒドロキシブチリル-CoA又は1,4-ブタンジオールを含む、又はそれを変換することによって得られる、ポリマー。