【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年1月30日(2013.1.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2009530401.tif 000001
式中：Ｒ１が、ＣＯＯｔＢｕ、ＣＯＯＣＨ２ＰｈもしくはＰｈＯＭｅであり、ここで、ＭｅはＣＨ３であり、Ｐｈはフェニルであり及びＢｕはブチルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ハロゲンもしくは−Ｈである化合物、
式中、Ｒ１がアリールもしくは置換アリールであり、Ｒ２がハロゲンであり、かつＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである式Ｉの化合物、又は
式中、Ｒ１がＰｈ又はＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅであり、且つＲ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５が独立してハロゲンもしくはＨであるが、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちひとつがＨではない式Ｉの化合物。
【請求項２】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の１つだけがＨでない、請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がハロゲンである、請求項１または２の化合物。
【請求項４】
Ｒ２がフルオロ基である、請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｒ１がＰｈＯＭｅであり、Ｒ２がクロロ基であり、且つＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１の化合物。
【請求項６】
Ｒ１がＰｈＯＭｅであり、Ｒ２がブロモ基であり、かつＲ３、Ｒ４及びＲ５がＨである、請求項１の化合物。
【請求項７】
Ｒ１がＣＯＯｔＢｕである、請求項１の化合物。
【請求項８】
Ｒ１がＰｈである、請求項１の化合物。
【請求項９】
Ｒ１がＰｈＯＭｅである、請求項１の化合物。
【請求項１０】
Ｒ２がフルオロ基であり、かつＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項９の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項９の化合物。
【請求項１２】
Ｒ１がＰｈであり、Ｒ２がフルオロ基であり、かつＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１がＣＯＯｔＢｕであり、Ｒ２がＦであり、かつＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１がＣＯＯｔＢｕであり、かつＲ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５がＨである、請求項１の化合物。
【請求項１５】
（ｉ）哺乳類における炎症性疾患を治療し、（ｉｉ）哺乳類におけるセプシス、敗血症または内毒素ショックを治療し、または（ｉｉｉ）哺乳類における自己免疫疾患治療するための薬剤の調製のための化合物の使用であって、該化合物は、式
【化２】
2009530401.tif 000002
式中、Ｒ１が、ＣＯＯｔＢｕ、ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ、ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅもしくはＰｈＯＭｅであり、ここで、ＭｅはＣＨ３であり、Ｐｈはフェニルであり及びＢｕはブチルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ハロゲンもしくはＨである化合物、
式中、Ｒ１がアリールもしくは置換アリールであり、Ｒ２がハロゲンであり、かつＲ３、Ｒ４およびＲ５がＨである式Ｉの化合物、又は
式中、Ｒ１がＰｈであり、かつ（ｉ）Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のうちひとつがＨではないか、（ｉｉ）Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５がＨであるかのいずれか一方である式Ｉの化合物である、使用。
【請求項１６】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の１つだけがＨでない、請求項１５の使用。
【請求項１７】
Ｒ２がハロゲンである、請求項１５または１６の使用。
【請求項１８】
Ｒ２がフルオロ基である、請求項１５の使用。
【請求項１９】
Ｒ１がＰｈＯＭｅである、請求項１５の使用。
【請求項２０】
前記薬剤が、哺乳類におけるセプシス、敗血症もしくは内毒素ショックを治療するためのものである、請求項１５の使用。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】フェノールヒドラゾンマクロファージ遊走阻止因子阻害剤
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
この出願が、２００６年３月２４日出願された米国仮出願第６０／７８５，８３４号の利益を請求する。
【０００２】
（１）本発明分野
本発明が、サイトカイン阻害剤に関する。より具体的には、本発明が、マクロファージ遊走阻止因子の幾つかの阻害剤を同定し、特徴化する。
【背景技術】
【０００３】
（２）関連技術の記述
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、セプシス（ｓｅｐｓｉｓ）の病原および他の炎症疾患に重要な関わりがある強力な原炎症性サイトカインである（ＣａｌａｎｄｒａおよびＲｏｇｅｒ、２００３年；Ｒｉｅｄｅｍａｎｎら、２００３年）。感染に対する致命的な全身性炎症反応であるセプシスが、米国だけで１年当たり２１５，０００人よりも多い人々を死亡させる。現在、その臨床管理に関し、ＦＤＡにより認可される抗炎症治療剤は全くない。ＭＩＦが、全身炎症の重要な遅く作用するメディエーターであると実証されてきており、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける齧歯類における内毒素血症およびセプシスの致命的な結末を弱めるその活性を阻害している（Ｃａｌａｎｄｒａら、２０００年；Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。
【０００４】
ＭＩＦは、ホモトリマーとして存在し（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、１９９５年；Ｓｕｎら、１９９６年；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９６年；Ｔａｙｌｏｒら、１９９９年）、それぞれのインドール誘導体へのＤ−ドーパクロームおよびＬ−ドーパクロームメチルエステルのような非生理学的基質の互変を触媒するための独特な能力を有する（Ｒｏｓｅｎｇｒｅｎら、１９９６年）。この互変活性の生理学的役割が、不確かである一方、Ｄ−およびＬ−ドーパクロームに構造的に似ている化合物が、このＭＩＦの互変化酵素（トートメラーゼ）活性部位に結合し得、これにより、これをブロックし得る（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年；Ｃｉｏｓら、２００２年；ＣｈｅｎｇおよびＡｌ−Ａｂｅｄ、２００６年；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年；Ｓｅｎｔｅｒら、２００２年）。Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ）が、その活性部位でＭＩＦと共有結合複合体を形成し（図１）、ＭＩＦの生物学的逆効果を不可逆的に阻害することができる（Ｓｅｎｔｅｒら、２００２年）。しかしながら、ＮＡＰＱＩの毒性が、ＭＩＦの生存可能な臨床阻害剤としてのその使用を排除する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記に基づいたら、ＭＩＦ活性の非毒性小分子阻害剤の開発が、更なる研究の十分な理由となる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、ＭＩＦ活性を阻害する幾つかの新しい化合物を同定し、特徴化させている。
【０００７】
本発明は、これゆえ、式Ｉ：
【０００８】
【化１】
2009530401.tif 000003
【０００９】
の化合物に関しており、式中：
Ｒ１が、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環基、置換複素環基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ、アミノ、ハロゲン、ホルミル、アシル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、カルバモイル、グアニジノ、ウレイド、アミジノ、メルカプト、スルフィニル、スルホニル、もしくはスルホンアミドであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＲ６、もしくは−Ｈであり、式中、Ｒ６が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
【００１０】
本発明が、医薬として許容可能な担体中、上の化合物のいずれか、もしくは、その医薬として許容可能な塩を含む医薬組成物にも関する。
【００１１】
本発明が、更に、哺乳類におけるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性を阻害する方法に関している。これら方法が、当該哺乳類におけるＭＩＦ活性を阻害するに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１２】
更に、本発明が、哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐ方法に関する。これら方法が、当該哺乳類における当該炎症を治療するかもしくは防ぐのに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１３】
また、本発明が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックを有する哺乳類を治療する方法に関する。当該方法が、当該セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックを治療するのに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１４】
本発明が、更に、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法に関している。これら方法が、当該自己免疫疾患を治療するのに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１５】
加え、本発明が、腫瘍を有する哺乳類を治療する方法に関し、本方法が、当該腫瘍を治療するのに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明が、ＭＩＦ活性を阻害する幾つかの新しい化合物を与える。実施例参照。
【００１７】
本発明が、これゆえ、式Ｉ：
【００１８】
【化２】
2009530401.tif 000004
【００１９】
の化合物に関し、式中：
Ｒ１が、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、複素環基、置換複素環基、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、オキソ、アミノ、ハロゲン、ホルミル、アシル、カルボキシ、カルボキシアルキル、カルボキシアリール、アミド、カルバモイル、グアニジノ、ウレイド、アミジノ、メルカプト、スルフィニル、スルホニル、もしくはスルホンアミドであり；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ハロゲン、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＯＲ６、もしくは−Ｈであり、式中、Ｒ６が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ６アルキルである。
【００２０】
好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５のうちの１種だけがＨでない。また、好ましくは、Ｒ２が、弗素もしくはＨである。より好ましくは、Ｒ２だけがＨでない。更により好ましくは、Ｒ２がハロゲンであり、そしてＲ３、Ｒ４、およびＲ５が、全てＨである。最も好ましくは、Ｒ２が弗素であり、そしてＲ３、Ｒ４、およびＲ５が、全てＨである。
【００２１】
上の化合物のいずれかに関し、Ｒ１は、好ましくは、ＣＯＯＭｅ、ＣＯＯＥｔ、ＣＯＯｔＢｕ、ＣＯＯＣＨ２Ｐｈ、ＣＯＯＣＨ２ＰｈＯＭｅ、ＣＯＰｈ、ＳＯ２Ｐｈ、Ｍｅ、Ｐｈ、ＰｈＯＭｅ、ＣＯＯｔＢｕ、Ｐｈ、もしくはＰｈＯＭｅであり、式中、ＭｅがＣＨ３であり、Ｐｈがフェニルであり、そしてＢｕがブチルである。より好ましくは、Ｒ１が、ＣＯＯｔＢｕ、Ｐｈ、もしくはＰｈＯＭｅである。更により好ましくは、本化合物が、表１および表２の化合物４〜９および化合物１１〜１９のうちのいずれか１種である。最も好ましくは、本化合物が、表１の化合物５、６、７、８、９、もしくは１９、または、表２の１３、１４、１５、もしくは１８のうちのいずれか１種である。ある態様において、本化合物が、表１の化合物５である。他の態様において、本化合物が、表１の化合物６である。また他の態様において、本化合物が、表１の化合物７である。更なる態様において、本化合物が、表１の化合物８である。更なる態様において、本化合物が、表１の化合物９である。また、本化合物が、表１の化合物１９たり得る。本化合物が、表２の化合物１３でもあり得る。加え、本化合物が、表２の化合物１４たり得る。本化合物が、更に、表２の化合物１５たり得る。本化合物が、更に、表２の化合物１８たり得る。
【００２２】
本発明が、医薬として許容可能な担体中、上の化合物のいずれか、もしくは、その医薬として許容可能な塩を含む医薬組成物にも関する。
【００２３】
「医薬として許容可能な」により、（ｉ）本組成物の他の成分と相溶しており、その意図された目的に本組成物を不適にすることなく、かつ（ｉｉ）本明細書において与えられたとおりの主題を有する使用に適しており、（毒性、過敏、およびアレルギー応答のような）過度の悪影響を及ぼす副作用のない素材が意味されている。副作用が「過度」であるのは、そのリスクが、本組成物により与えられた利益よりも重い場合である。医薬として許容可能な担体の非限定例が、限定なく、燐酸緩衝生理食塩水溶液のような標準医薬担体、水、油／水エマルション、微小（ミクロ）エマルションのようなエマルション等のいずれかを包含する。
【００２４】
上記化合物が、過度の実験なく、特定の応用に適するよう、ヒトを包含する哺乳類に対する投与用に製剤され得る。加え、これら組成物の適正な用量が、過度の実験なく、標準用量−応答プロトコルを使用して求められ得る。
【００２５】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用に設計（デザイン）された組成物が、過度の実験なく、当業界においてよく知られた手段、例えば、不活性稀釈剤を用いてもしくは可食担体を用いて調製され得る。当該組成物が、ゼラチンカプセル中に封じられていてもよく、錠剤（タブレット）に圧縮されていてもよい。経口治療投与目的に関し、本発明の医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれてもよく、タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェーハ、チューイングガム、および同様のものの形態で使用されてもよい。
【００２６】
タブレット、ピル、カプセル、トローチ、および同様のものが、バインダー、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料も含有してよい。バインダーの幾つかの例として、微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンが挙げられる。賦形剤の例として、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤の幾つかの例として、アルギン酸、コーンスターチ、および同様のものが挙げられる。潤滑剤の例として、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムが挙げられる。潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）の例はコロイド状二酸化珪素である。甘味料の幾つかの例として、スクロース、サッカリン、および同様のものが挙げられる。香料の例として、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様のものが挙げられる。これらの種々の組成物を調製することにおいて使用される素材が、医薬として純粋であり、使用される量において非毒性であるべきである。
【００２７】
本化合物は、容易に、例えば、静脈内、筋内、蜘蛛膜下、もしくは皮下注射により非経口投与され得る。非経口投与が、本化合物を溶液もしくは懸濁液（サスペンション）中に取り込むことにより達成され得る。このような溶液もしくは懸濁液が、注射用水、生理食塩水溶液、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤も包含してよい。非経口製剤は、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えば、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート化剤も包含してよい。酢酸塩、クエン酸塩、もしくは燐酸塩のような緩衝剤（バッファー）、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も加えられていてよい。本非経口調製品が、アンプル、使い捨て可能シリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから作られる多数回用量バイアル中に、封じられ得る。
【００２８】
直腸投与が、直腸もしくは大腸中に医薬組成物中の本化合物を投与することを包含する。これが、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬製剤が、容易に、当業界において知られる方法により調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に熱し、本組成物をそのグリセリンに溶かし、その熱せられたグリセリンを混ぜ、その後、精製水が加えられてもよく、そしてその熱い混合物を坐薬型中に注ぐことにより調製され得る。
【００２９】
経皮投与が、皮膚を通る本組成物の経皮吸収を包含する。経皮製剤が、パッチ（よく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ジェル、軟膏、および同様のものを包含する。
【００３０】
これら化合物が、鼻投与用にも調製され得る。本明細書中、使用されたとおり、鼻投与が、その患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に本化合物を投与することを包含する。本化合物の鼻投与用医薬組成物が、例えば、鼻スプレー、点鼻薬、懸濁液、ジェル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として投与されるよく知られた方法により調製された本化合物の治療有効量を包含する。本化合物の投与が、鼻タンポンもしくは鼻スポンジを使用して行われてもよい。
【００３１】
本発明のこれら化合物が、これら自体（原液、ニート）、または医薬として許容可能な塩の形態で投与されてもよい。医薬に使用される場合、当該塩は、薬理学的におよび医薬として両方許容可能であるべきであるが、医薬として許容不可能な塩が、便宜上使用されてよく、遊離の活性化合物もしくはこの医薬として許容可能な塩を調製する。薬理学的におよび医薬として許容可能な塩が、以降の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、琥珀酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されたものを包含するが、これらに限られない。また、医薬として許容可能な塩が、そのカルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類塩として調製され得る。
【００３２】
本発明が、更に、哺乳類におけるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性を阻害する方法に関する。これら方法が、当該哺乳類におけるＭＩＦ活性を阻害するに有効な量で上の医薬組成物のいずれかを当該哺乳類に投与することを含む。
【００３３】
これらの方法は如何なる哺乳類にも使用され得る。好ましくは、本哺乳類が、ヒトである。本哺乳類が、ＭＩＦにより少なくとも一部媒介される炎症サイトカインカスケードを含む病状を有するか、または、これに関するリスクにあることも好ましい。このような病状の非限定例が、増殖脈管疾患、急性呼吸困難症候群、サイトカイン媒介毒性、乾癬、インターロイキン−２毒性、虫垂炎、消化潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍結腸炎、偽膜結腸炎、急性結腸炎、および虚血結腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、炎症腸疾患、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素ショック、悪液質（カケクシア）、超高熱、好酸肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、疣、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄傷害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、バージャー病、１型糖尿、２型糖尿、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。好ましいこのような病状が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックである。
【００３４】
ＭＩＦが、自己免疫疾患における重要な役割を果たすことがと示されている。例えば、Ｃｖｅｔｊｏｖｉｃら、２００５年参照。本方法が、これゆえ、自己免疫疾患の治療において有用であると思われる。これゆえ、これらの方法のある態様において、本哺乳類が自己免疫疾患を有するか、もしくは、これに関するリスクにある。このような自己免疫疾患の非限定例が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リューマチ関節炎、移植片対宿主病、自己免疫性肺炎、自己免疫性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存糖尿病、クローン病、硬皮症、乾癬、シェーグレン症候群、および自己免疫性炎症眼病である。
【００３５】
ＭＩＦも、腫瘍の浸潤および転移を促進させると知られている。例えば、Ｓｕｎら、２００５年参照。本方法が、これゆえ、腫瘍を有する哺乳類の治療に有用であると思われる。
【００３６】
本発明が、哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐ方法にも関する。これら方法が、当該哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐのに有効な量で上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００３７】
これらの方法に関し、本哺乳類が、好ましくはヒトである。本哺乳類が、炎症、例えば、増殖脈管疾患、急性呼吸困難症候群、サイトカイン媒介毒性、乾癬、インターロイキン−２毒性、虫垂炎、消化潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍結腸炎、偽膜結腸炎、急性結腸炎、および虚血結腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、炎症腸疾患、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素ショック、悪液質（カケクシア）、超高熱、好酸性肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳ感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄傷害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、バージャー病、１型糖尿、２型糖尿、バージャー病、ルティエ症候群、もしくはホジキン病に関する病を有し得るか、もしくは、これらの病に関するリスクにあり得る。好ましくは、本哺乳類が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックを有するか、あるいは、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックに関するリスクにある。
【００３８】
これらの方法が、本哺乳類に対する第２の抗炎症剤の投与を包含し得る。このような第２の抗炎症剤の例が、ＮＳＡＩＤｓ、サリチラート、ＣＯＸ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、およびステロイドである。好ましくは、本哺乳類が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを有するか、または、これらに関するリスクにあり、第２の治療が、ムスカリンアゴニスト、アドレノメデュリン、アドレノメデュリン結合蛋白、乳脂球状表皮成長因子ＶＩＩＩ、活性化蛋白Ｃ、もしくはα２Ａ−アドレナリン作動アンタゴニストの投与である。
【００３９】
本発明が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックを有する哺乳類を治療する方法にも関する。これら方法が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックを治療するのに有効な量において当該哺乳類に上の医薬組成物を投与することを含む。
【００４０】
本発明が、更に、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法に関する。当該方法が、当該自己免疫疾患を治療するのに有効な量で当該哺乳類に上の医薬組成物を投与することを含む。このような自己免疫疾患の例が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リューマチ関節炎、移植対宿主疾患、自己免疫性肺炎、自己免疫性脳脊髄炎、ギラン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存糖尿病、クローン病、硬皮症、乾癬、シェーグレン症候群、および自己免疫性炎症眼病を包含する。
【００４１】
加え、本発明が、腫瘍を有する哺乳類を治療する方法に関し、本方法が、当該腫瘍を治療するのに有効な量で当該哺乳類に上の医薬組成物を投与することを含む。
【００４２】
下の実施例２において樹立されたとおり、これらの化合物が、有効に経口投与され得る。これゆえ、上の方法のいずれにおいても本医薬組成物が経口投与され得る。あるいは、本医薬組成物が非経口投与され得る。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例において記載される。本明細書中の請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書の考慮、もしくは、本明細書中に開示された発明の実際から当業者に対して明らかとなる。本発明の範囲および意図が、これら請求項により指し示されており、これら実施例と一緒に本発明は、単なる例示とみなされることが意図され、これら実施例に伴う。
【実施例】
【００４４】
実施例１．フェノールヒドラゾンが、マクロファージ遊走阻止因子原炎症活性の有効な阻害剤であり、セプシスにおける生存率向上剤である
実施例の要約
一連のフェノールヒドラゾンが合成され、これらのＭＩＦ活性阻害に関し評価された。化合物７が、１３０ｎＭのＩＣ５０を有する有効なＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）阻害剤として浮上した。化合物７が、用量依存的に、リポ多糖（リポポリサッカライド、ＬＰＳ）刺激マクロファージからのＴＮＦα分泌を抑えた。該化合物の投与が、臨床的に意義のある期間中に開始された場合、化合物７によるＭＩＦ阻害の治療の重要さは、セプシスの致死性からの有意な保護により実証される。
【００４５】
はじめに
合理的な設計（デザイン）のアプローチが使用され、より有効なＭＩＦ小分子阻害剤を産生する。ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）触媒のインドール中間体が、それ自体、有効なＭＩＦ阻害剤の開発に適するテンプレートとして提示した。そのフェニルイミン骨格の周りでデザインされた化合物が、有効なＭＩＦアンタゴニストとして作用し得ると思われることが、理由付けられた。実際、この合理的なデザインから、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）阻害剤としてのアミノ酸シッフ塩基（シッフベース）およびイソキサゾリン化合物が開発された（Ｄｉｏｓら、２００２年；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年）。ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害できる能力に関しテストされたアミノ酸シッフベースの中で、化合物１が最も有効であったことが見出された（図１、表１）。最近、ＭＩＦイソキサゾリン阻害剤「ＩＳＯ−１」（化合物２、図１）が報告され、これはトートメラーゼ部位をブロックし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗炎症糖質（グルコ）コルチコイド活性を克服できるＭＩＦの能力を阻害し、実験セプシス動物モデルにおける生存率を向上させる（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年）。
【００４６】
より有効なＭＩＦ阻害剤を見出すに当たり、該フェニルイミン骨格が再考され、窒素を加えることにより修飾され、ヒドラゾン型（タイプ）化合物を得た（図１）。アミノ酸シッフベースおよび化合物２での以前の研究が、パラ（ｐ−）ヒドロキシル基はフェノール部分で例示されたとおり、重要な構造的特徴であり、活性に必要とされることを解き明かした。フェニル−もしくはハロゲン（ハライド）−置換フェニル基またはｐ−メトキシフェニル基を用いて１および２のフェノール部分を置換すると、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害できるそれらの能力の低下もしくは完全な損失が生じた（Ｄｉｏｓら、２００２年；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年）。この結果に従って、新しいファーマコフォアの化学構造が、フェノール環を含有しなければならない（図１）。この重要な構造的特徴ならびにＭＩＦと複合体化された１および２の観察を利用して、フェノールヒドラゾン３〜１９（表１および表２）が、有効なＭＩＦ阻害剤として合成された。
【００４７】
表１．フェノールヒドラゾン、および、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性阻害に関するＩＣ５０値。
【００４８】
【表１】
2009530401.tif 000005
ａ化合物が、１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲ、およびＭＳにより特徴付けられた。ｂＬ−ドーパクロームメチルエステル（実験の部参照）に関するＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性の分光解析。ｃ６〜９の合成の一般的手順に関する実験の部参照。
【００４９】
表２．フェノールヒドラゾンカルバメート、および、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性阻害に関するＩＣ５０値。
【００５０】
【表２】
2009530401.tif 000006
ａ化合物が、１Ｈ、１３Ｃ  ＮＭＲ、およびＭＳにより特徴付けられた（補足情報参照）。ｂＬ−ドーパクロームメチルエステルに関するＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性の分光解析。
【００５１】
この研究において調製されたヒドラゾンの全ての化合物３〜１９が、全て４−ヒドロキシフェニルの形での「フェノール頭部」を保有するという点において、１つの共通の重要な構造的特徴を有する。このフェノール環が、ＭＩＦ活性部位内で、その疎水性表面のアミノ酸残基アスパラギン−９７Ｃとの間の重要な水素結合相互作用を形成することが示されている（Ｄｉｏｓら、２００２年；Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年；Ｏｒｉｔａら、２００１年）。この重要な水素結合相互作用に加え、疎水性相互作用があり、これはフェノールの芳香環と、この疎水性ポケットのアミノ酸残基たる、Ｐｒｏ−１、Ｍｅｔ−２、Ｉｌｅ−６４、Ｔｙｒ−９５、Ｖａｌ−１０６、およびＰｈｅ−１１３の側鎖との間に存在し、更に、本阻害剤の結合に寄与する（Ｏｒｉｔａら、２００１年）。このヒドロキシル官能基と、このアミノ酸残基アスパラギン−９７Ｃとの間の重要な相互作用に関する裏付けの証拠が、１）この位置を修飾し、２）他の官能基を用いてこのヒドロキシル基を置換することにより得られた。パラ（ｐ−、ＩＣ50２．５μＭ）からメタ（ｍ−、ＩＣ50１５０μＭ）にこの位置を変更すると、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害できるその能力の劇的な消失が生じたという点において、このヒドロキシル基の位置は、これらヒドラゾンの決定的な特徴である。さらに、水素、フルオロ、アミノ、メトキシ、およびニトロ官能基を用いてこのヒドロキシル基を置換すると不活性なヒドラゾンを得た（データは示さなかった）。これらフェノールヒドラゾンと、ＭＩＦとの間の構造−活性相関を展開すると、ヒドラゾン３〜６が、その（対応する）簡単なヒドラジンたる、メチルヒドラジン、フェニルヒドラジン、およびｐ−メトキシフェニルヒドラジンから合成された。我々のフェノールヒドラゾンの活性に対する１種の更なる前提が、これらが、疎水性尾部を必要とすることである。これが、化合物３から明らかである（ＩＣ５０＝＞５００μＭ）。この化合物におけるヒドラゾンの水素置換が、如何なる疎水性相互作用をも提供せず、結果として、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性の非常に乏しい阻害剤である（表１）。メチル基を用いてこの水素を置換すると、ＭＩＦ互変化（トートメラーゼ）活性を阻害できるメチルヒドラゾン４の能力における明らかな向上（ＩＣ５０＝４３μＭ）が、観察された。これが、このメチル基と、ＭＩＦ表面との間の疎水性相互作用があることを示唆する。このより疎水性のフェニル環を用いて４のメチル基を置換し、１６倍有効であるヒドラゾン５を得た（ＩＣ５０＝２．６μＭ）。５の芳香環上でのパラ（ｐ−）メトキシ基の導入により、その親化合物よりも阻害剤として５倍有効なヒドラゾン６を得た。このｐ−メトキシフェニルヒドラゾンのこの増加した結合が、そのエーテル酸素と、既知のアミノ酸残基との間の水素結合相互作用、ならびに、このｐ−メトキシフェニル環と、ＭＩＦ活性部位の第２の疎水性領域との間のπ−πスタッキング（電子雲の重なり）および／またはファンデルワールス（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａａｌｓ）相互作用の可能性により、説明され得る。アミノ酸、Ｐｒｏ−３３、Ｔｙｒ−３６、Ｐｈｅ−４９、Ｔｒｐ−１０８、およびＰｈ��−１１３が、ＭＩＦ活性部位の縁での第２の疎水性表面を作り上げることが、報告されている（Ｄｉｏｓら、２００２年；Ｏｒｉｔａら、２００１年）。これらの残基が、このファーマコフォアと、ＭＩＦ活性部位との間の疎水性相互作用および水素結合相互作用に更に寄与する（Ｏｒｉｔａら、２００１年）。これらの相互作用の更なる裏付けにおいて、その（対応する）Ｌ−アミノ酸シッフ塩基（ベース）の阻害効果が、それぞれ、Ｌ−フェニルアラニン（ＩＣ５０＝５０μＭ）からＬ−チロシン（ＩＣ５０＝１０μＭ）に当該アミノ酸残基を変更すると、５倍向上したことが、以前示された。これは、この増加した有効性がＭＩＦの縁での残基内の水素結合相互作用に起因されたことを示唆する（Ｄｉｏｓら、２００２年）。ヒドラゾン６が、Ｌ−トリプトファンシッフ塩基（ベース）１よりも１２倍有効な阻害剤であり、文献において記載された最も有効なＭＩＦ阻害剤を遙かに凌ぐ（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年；Ｄｉｏｓら、２００２年；ＣｈｅｎｇおよびＡｌ−Ａｂｅｄ、２００６年；Ｏｒｉｔａら、２００１年；Ｏｒｉｔａら、２００２年）。最近、２のモノ弗素化が、ＭＩＦ活性阻害を向上させたことが発見された（ＣｈｅｎｇおよびＡｌ−Ａｂｅｄ、２００６年）。帰結として、我々は、このより有効なヒドラゾン、つまり、ｐ−メトキシフェニルヒドラゾン（６）の、３−フルオロ、３−クロロ、および３−ブロモ−４−ヒドロキシフェニル誘導体を合成した。これらモノハロゲン化ヒドラゾン誘導体合成が、塩酸４−メトキシフェニルヒドラジンおよび３−ハロゲン化−４−ヒドロキシベンズアルデヒドの水酸化ナトリウム水＋メタノール懸濁の処理に関与した（表１）。ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性阻害における一般的な増加が、これら３−ハロゲン化−４−ヒドロキシフェニルヒドラゾン誘導体７〜９に関して観察された（表１）。これらのヒドラゾンの間で、化合物７が、１３０ｎＭのＩＣ５０値を有する最も有効な阻害を示した一方、８および９が、それぞれ、２２０ｎＭおよび３３０ｎＭの値を与えた。これらのハロゲン化ヒドラゾン７〜９の阻害効果における有意な向上が、ヒドロキシル部分の分極における変化をもたらし得、その結果、これをより強い水素結合供与体（ドナー）／受容体（アクセプター）にする（σ結合を伝う）誘導効果により、説明され得る。
【００５２】
活性が、窒素上での二置換により影響を受けるかどうか求めるに当たり、化合物１０が、合成された（図２）。沃化メチルおよびナトリウムアミドを用いたフェニルヒドラジン（５）のメチル化が、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルヒドラジンを与えた。典型的な条件下でのヒドラゾン形成が、８６％収率において１０を与えた。化合物１０が、ＭＩＦ活性の非常に弱い阻害剤であり、３００μＭのＩＣ５０値を表示している。この観察は、増加した立体障害により、または、二置換ヒドラゾン誘導体１０とＭＩＦ活性部位との間の減少した数の水素結合相互作用により説明されうる。
【００５３】
これらヒドラゾンと、ＭＩＦとの間の構造−活性相関を更に調べるに当たり、もう１種別のある分類（クラス）の化合物たる、フェノールヒドラゾンカルバメートが評価された。これらフェノールヒドラゾンカルバメート１１〜１５および１８が選ばれたのは、これらが、アミノ酸シッフ塩基（ベース）１および２のものに似た重要な官能基を表示したからである（表２）。これらの官能基は、ヒドロキシル基、フェニル環、およびカルボン酸部分である。２次的な水素結合相互作用は、２のカルボン酸部分と、ＭＩＦ活性部位のリジン−３２Ａとの間に存在することが報告されている（Ｄｉｏｓら、２００２年）。およそ１０倍のＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性の阻害における向上が、より親脂性のｔ−ブチル部分１３（ＩＣ５０＝５．５μＭ）に１１（ＩＣ５０＝５５μＭ）のメチル基を変更すると、観察された。フェニル環がＭＩＦ活性阻害を向上させるかどうか求めるに当たり、そのｔ−ブチルカルバメートが、ベンジルカルバメート１４およびｐ−メトキシベンジルカルバメート１５を用いて置換された。嵩高いアルキル１３から芳香族基１４〜１５（ＩＣ５０＝１０．８μＭ）に至るこの変更が、結果、阻害効果における僅かな減少を与えた。
【００５４】
生物活性。
細胞内ＭＩＦが、リポ多糖（リポポリサッカライド、ＬＰＳ）内毒素により活性化された経路に対する細胞応答を媒介することにおける決定的な役割を占め（Ｒｏｇｅｒら、２００１年）、ＭＩＦ不全細胞が、内毒素に対し、低応答である（Ｂｏｚｚａら、１９９９年）。ＭＩＦなしマクロファージが、野生型に比べたら、５０〜６０％少ないＴＮＦを産生し得る（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、２００２年）。加え、抗ＭＩＦ抗体（１０μｇ／ｍＬ）が、ＬＰＳ処理マクロファージからのＴＮＦ放出の５０％を阻害する（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。化合物２（ＩＳＯ−１）が、野生型からのＬＰＳ誘導ＴＮＦ放出を用量依存的に阻害するが、ＭＩＦなしマクロファージからのは、そうでなく、ＭＩＦ化学阻害剤が、特異的であることを示唆している。従って、ＭＩＦに結合する化合物７が、マクロファージにおけるＬＰＳ応答を抑圧すると思われることが理由付けられた。化合物７が、ＬＰＳ誘導ＴＮＦ放出を用量依存的に正に阻害した（表３）。これゆえ、化合物７が、ＭＩＦ不全マクロファージの表現型を反復させ、ＬＰＳに対する応答におけるＴＮＦ産生の減少と関連している。
【００５５】
セプシスにおける分子治療標的としてのＭＩＦの重要性は、抗ＭＩＦ抗体もしくは化合物２を用いた処理がセプシスマウスにおける生存率を有意に向上させるとの最近の観察により、確認されている（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。更に、血清ＭＩＦレベルが、ＣＬＰ２４時間後内で、最大レベルの７０％にまで増加したが、３６時間においてピークを打った（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。これが、セプシスにおける後発メディエーターとしてＭＩＦを同定したが、臨床的に意義のある期間においてＭＩＦを阻害する治療有効性を指し示した。これゆえ、化合物７を用いた遅延治療が、ＭＩＦ放出の速度論と整合して、上手く応用され得、セプシスにおける生存率を向上させることが理由付けられた。セプシスの広く使用された前臨床モデルたる盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）誘導腹腔炎における生存率を向上させられる化合物７の能力がテストされた。７（４ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内治療が、ＣＬＰ外科手術２４時間後に開始され、３日間継続されて、コントロール（ビヒクル処理）群における２８％に比べ、６５％の生存率（ｐ＜０．０１）をもたらした（図４）。これゆえ、化合物７を用いた治療が、セプシス致死率に対する有意な保護を与え、これは抗ＭＩＦ抗体および化合物２の効果に比肩する（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。顕著に、２よりも１０倍少ない化合物７の用量で、同様の保護を達成した。この知見が、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性部位を阻害することにおける化合物７の有効性と、実験セプシスにおける生存率を向上させるその有益な効果との間の関係を指し示す。
【００５６】
要約すると、フェノールヒドラゾンが、非毒性有効ＭＩＦアンタゴニストとして設計（デザイン）され、合成された。その構造−活性相関研究が、これらヒドラゾンの官能基化における小変更（マイナーチェンジ）が、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性部位に対するこれらの化合物の結合に影響を及ぼすことを示唆する。特記すべきは、化合物７が、テストされた全化合物の最大活性を呈し、文献において記載されたＭＩＦの最も有効な阻害剤を遙かに凌いでいる（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年；Ｄｉｏｓら、２００２年；ＣｈｅｎｇおよびＡｌ−Ａｂｅｄ、２００６年；Ｏｒｉｔａら、２００１年；Ｏｒｉｔａら、２００２年）。
【００５７】
化合物７が、ＬＰＳ誘導マクロファージ活性化の抑圧により実証されたとおりの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける有効な抗炎症活性を呈した。更に、治療がこの疾患の発症２４時間後に開始された場合、相対的に低濃度のこの小分子ＭＩＦ阻害剤は、セプシスおける生存率を向上させたである。
【００５８】
セプシスは、複雑な炎症疾患であり、この臨床管理（マネージメント）が、チャレンジングな健康問題である。これゆえ、化合物７が、この疾患の発症２４時間後に有効であるとの知見が、考慮され得る臨床での関心たり得ると思われる。加え、齧歯類セプシスモデルにおける効率を示す抗サイトカイン剤が、リューマチ関節炎およびクローン病のような、種々のヒト炎症疾患および自己免疫疾患用の価値ある治療剤であるとされている。
【００５９】
実験の部
一般的な実験。
全ての化学物質を商業供給元から得て、更なる精製なく使用した。２５４ｎｍ蛍光指示薬を有するアルミニウム焼成シリカゲル６０ＴＬＣ板（プレート）が使用された。展開されたＴＬＣ板（プレート）が、短波長ＵＶ灯（ランプ）下、視覚化され、Ｉ２−ＳｉＯ２混合物を用いて染色された。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ）が、フラッシュ用シリカゲル（３２〜６３μｍ）を使用して実施され、通常通り、ＴＬＣ移動度と相関した段階的（ステップワイズ）溶媒極性勾配を用いた。融点（Ｍ．ｐ．）が、開口毛管（キャピラリー）中、Ｇａｌｌｅｎｋａｍｐ融点装置で求められたが、較正されていない。ＩＲスペクトルが、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｉｃｏｌｅｔ  ＩＲ  １００  ＦＴ−ＩＲ分光器で得られた。全ての１Ｈスペクトルが、２７０ＭＨｚもしくは３００ＭＨｚでのＪｅｏｌ分光器もしくはＧＥ  ＱＥ  ３００分光器で記録された。１３Ｃスペクトルが、７５ＭＨｚでのＧＥ  ＱＥ  ３００分光器で記録された。化学シフト（ケミカルシフト）が、重水素化溶媒のピークに相対しており、ｐｐｍ単位である。カップリング定数（Ｊ）が、ヘルツ（Ｈｚ）単位で測定される。１Ｈシグナルが、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、カルテット（ｑ）、マルチプレット（ｍ）、およびブロードシングレット（ｂｒ ｓ）として記載される。低および高分解能質量スペクトルが、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校の質量スペクトル施設において完遂された。
【００６０】
化合物３〜５および化合物１０〜１９に関する一般的な実験。
４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１２２ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）もしくは３−フルオロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１４０ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）と、ヒドラジド（２ミリモル）とが、エタノール（１０ミリリットル（ｍＬ））に溶解された。これに酢酸（１ミリモル）が加えられ、この反応が室温において終夜攪拌された。真空中でのこのエタノールの除去が、油性残渣を与えた。この残渣が、酢酸エチルに溶解されて水洗された。この有機層が分離され、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を用いて乾燥された。真空中での濃縮が残渣を与え、引き続き、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１）を使用してＦＣＣにより精製され、化合物３〜５および化合物１０〜１５を得た。
【００６１】
化合物６〜９に関する一般的な手順。
４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１２２ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）もしくは３−フルオロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１４０ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）もしくは３−クロロ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１５６ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）もしくは３−ブロモ−４−ヒドロキシベンズアルデヒド（２０１ミリグラム（ｍｇ）、１ミリモル）と、塩酸４−メトキシフェニルヒドラジン（３５０ミリグラム（ｍｇ）、２ミリモル）とが、メタノール（１０ミリリットル（ｍＬ））に懸濁された。この懸濁液に水酸化ナトリウム（６０ミリグラム（ｍｇ）、１．５ミリモル）の２Ｍ水溶液が加えられ、この反応が室温において終夜、攪拌された。次いで、この反応の完結の際、この溶液が、１Ｍの塩酸（ＨＣｌ）の添加によりｐＨ４にまで酸性化された。真空中でのこのメタノールの除去が、油性残渣を与えた。この残渣が、酢酸エチルで溶解され水洗された。この有機層が分離され、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）を用いて乾燥された。真空中での濃縮が、残渣を与え、引き続き、溶出液としてヘキサンおよび酢酸エチル（４：１）を使用してＦＣＣにより精製され、化合物６〜９を得た。
【００６２】
酵素活性を求める分光アッセイ。
Ｌ−ドーパクロームメチルエステルの保管未使用の溶液（２．４ｎＭ）が、過沃素酸ナトリウムを用いたＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルの酸化により生成され、橙（オレンジ）色溶液を産生した。活性が、ｐＨ６、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（バッファー）中、ＭＩＦ溶液（８５０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍＬ））１μＬを含有するセルにドーパクロームメチルエステル（０．３ミリリットル（ｍＬ））を加えることにより、室温において求められ、分光器で４７５ナノメートル（ｎｍ）での２〜２０秒の吸光における減少を測定した。阻害剤３〜１５が、種々の濃度（０．１〜１００μＭ）においてＤＭＳＯに溶解され、１マイクロリットル（μＬ）が、ドーパクロームの添加前にＭＩＦを有するセルに加えられた。
【００６３】
細胞アッセイ。
化合物７が、ＬＰＳ処理マクロファージからのＴＮＦ分泌を阻害する。ＲＡＷ２６７．４マクロファージ（１０５個）が、ＬＰＳ添加３０分前に種々の濃度のヒドラゾン７（０．０１〜１００μＭ）を用いて処理された。インキュベート１６時間後、細胞培養上澄み（上清）が、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ濃度決定用に回収された。データーが、平均±Ｓ．Ｄ．として提示される（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０１）。
【００６４】
動物研究。
全ての動物実験が、ノースショア・ロングアイランド・ジューイッシュ・ヘルスシステム研究所内使用委員会により認められた。８週齢の雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスが、盲腸結紮および穿刺（ＣＬＰ）に付された。ＣＬＰ手順の詳細が、以降のとおり完遂されている：麻酔された（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン８ｍｇ／ｋｇが、筋内投与された）雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて盲腸が結紮され、単回穿刺を与えられた。腹部アクセスが、中線切開経由で得られた。盲腸が単離され、回盲弁の下、６−０絹（シルク）結紮糸を用いて結紮され、盲腸が２２Ｇ針を用いて一旦穿刺され、糞（およそ１ｍｍ）がこの穴から押し出され、盲腸が腹の空洞中に戻して入れられた。腹が、２層の６−０Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合糸を用いて閉じられた。抗生物質（プレマキシン０．５ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｋｇ）、皮下、合計量０．５ミリリットル（ｍｌ）／マウスで）がＣＬＰ直後投与され、単回用量の蘇生液（通常の食塩水、２０ミリリットル（ｍｌ）／キログラム（ｋｇ）体重）が、ＣＬＰ外科手術直後皮下投与された（Ｗａｎｇら、１９９９年）。マウス（ｎ＝１３、＊＊Ｐ＜０．０１）が、ＣＬＰ２４時間後４ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｋｇ）もしくはビヒクルを用いて腹腔内注射された。更なる２回の注射が、２日目および３日目に与えられた。ビヒクル（２０％ＤＭＳＯ水）処理もしくは化合物７（４ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｋｇ）；腹腔内）治療が、セプシス誘導２４時間後に始められ、２日目および３日目に、日に２回繰り返された。動物生存率が、１４日間モニターされた。
【００６５】
ＮＭＲデータ
化合物３：黄色固体（９０％）。融点２４８〜２５０℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３２２０、３３１５、１６５０、１６０３、１５６８、１５０６。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ６．９９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．９４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．８７（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）δ１１７．９（Ｃ３、Ｃ５）、１２１．７（Ｃ１）、１３４．７（Ｃ４、Ｃ６）、１６３．２（Ｃ７）、１６６．１（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）１３７．１（Ｍ＋１、２５）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ７Ｈ９Ｎ２Ｏに関し、計算値１３７．０７１５、実測値１３７．０７１９。
化合物４：赤色固体（８５％）。融点５８〜６０℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３６１、１６７１、１６０４、１５１３。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ２．８１（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、Ｍｅ）、６．８７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．４２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、７．９５（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．３５（ｂｒ ｓ、２Ｈ、ＯＨ、ＮＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３６．１（Ｍｅ）、１１６．５（Ｃ３、Ｃ５）、１２７．９（Ｃ１）、１２９．６（Ｃ２、Ｃ６）、１５１．２（Ｃ７）、１５７．８（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）１５１．１（Ｍ＋１、１００）、１５２．１（Ｍ＋２、８）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ８Ｈ１１Ｎ２Ｏに関し、計算値１５１．０８７１、実測値１５１．０８７４。
化合物５：褐色固体（８８％）。融点１５４〜１５６℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３４０６、３２９１、１５９９、１５０８。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ６．７０（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、１．２Ｈｚ、Ｈ４’）、６．８２（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．０７（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．５、１．２Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．１６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、７．５０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、７．７７（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．５０（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．１５（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ１１３．１（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１６．４（Ｃ３、Ｃ５）、１１９．５（Ｃ４’）、１２８．２（Ｃ３’、Ｃ５’）、１２８．８（Ｃ１）、１２９．８（Ｃ２、Ｃ６）、１３８．２（Ｃ７）、１４６．９（Ｃ１’）、１５８．６（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）２１３．１（Ｍ＋１、８５）、２１４．１（Ｍ＋２、１０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１３Ｈ１３Ｎ２Ｏに関し、計算値２１３．１０２８、実測値２１３．１０３０。
化合物６：褐色残渣（８４％）。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３４１９、１６８１、１６７０、１６５０、１６３５、１６０３、１５０７。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．６５（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、６．７８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、６．８０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．０１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．４７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、７．７２（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．４０（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、８．９１（ｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５５．９（ＯＭｅ）、１１４．７（Ｃ３’、Ｃ５’）、１１５．４（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１６．６（Ｃ３、Ｃ５）、１２８．４（Ｃ１）、１３０．２（Ｃ２、Ｃ６）、１３７．２（Ｃ７）、１４１．２（Ｃ１’）、１５１．２（Ｃ４’）、１６３．９（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）２４１．１（Ｍ−１、６５）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１４Ｈ１３Ｎ２Ｏ２に関し、計算値２４１．０９７７、実測値２４１．０９８１。
化合物７：褐色固体（８９％）。融点１２０〜１２１℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３１９、３３０２、１６１９、１５１４。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．６９（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、６．８０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、６．９５（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ５）、７．０４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．２１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ６）、７．４２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．６、１．８Ｈｚ、Ｈ２）、７．７０（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．７８（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．１１（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５６．０（ＯＭｅ）、１１３．３（ＪＣＣＦ＝１９．５Ｈｚ、Ｃ２）、１１４．３（Ｃ３’、Ｃ５’）、１１５．５（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１８．７（Ｃ５）、１２３．４（Ｃ６）、１３０．２（ＪＣＣＣＦ＝４．９Ｈｚ、Ｃ１）、１３５．９（Ｃ７）、１４０．７（Ｃ１’）、１４５．６（ＪＣＣＦ＝１３．７Ｈｚ、Ｃ４）、１５２．６（ＪＣＦ＝２３９．２Ｈｚ、Ｃ３）、１５４．４（Ｃ４’）。ＭＳ（ＥＳＩ）２６１．１（Ｍ＋１、３０）、２６２．１（Ｍ＋２、６）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１４Ｈ１４Ｎ２Ｏ２Ｆに関し、計算値２６１．１０３９、実測値２６１．１０４８。
化合物８：褐色固体（８９％）。融点１０８〜１１０℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：１６０１、１５５７、１５０１。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．６９（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、６．８０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、７．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．１３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ５）、７．３２（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．６、１．８Ｈｚ、Ｈ６）、７．５４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ２）、７．６７（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．８０（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．１２（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５５．９（ＯＭｅ）、１１４．３（Ｃ３’、Ｃ５’）、１１５．５（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１７．８（Ｃ５）、１２１．６（Ｃ３）、１２６．４（Ｃ６）、１２７．６（Ｃ２）、１３０．６（Ｃ１）、１３５．５（Ｃ７）、１４０．６（Ｃ１’）、１５３．５（Ｃ４）、１５４．４（Ｃ４’）。ＭＳ（ＥＳＩ）２７７．１（ＭＣｌ３５＋１、６０）、２７９．１（ＭＣｌ３７＋１、２５）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１４Ｈ１３Ｎ２Ｏ２Ｃｌに関し、計算２７７．０７４４、実測２７７．０７３９。
化合物９：褐色固体（９０％）。融点１３５〜１３７℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３４５３、３３０５、１５９７。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．６９（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、６．８０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、６．９７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ５）、７．０３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．４５（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．２、２．２Ｈｚ、Ｈ６）、７．６９（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、７．７８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１．８Ｈｚ、Ｈ２）、８．８５（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．１５（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５５．９（ＯＭｅ）、１１０．８（Ｃ３）、１１４．２（Ｃ３’、Ｃ５’）、１１５．５（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１７．４（Ｃ５）、１２７．１（Ｃ６）、１３０．８（Ｃ２）、１３１．０（Ｃ１）、１３５．３（Ｃ７）、１４０．６（Ｃ１’）、１５４．４（Ｃ４’）、１５４．５（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）３２１．０（ＭＢｒ７９＋１、１００）、３２３．０（ＭＢｒ８１＋１、８０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１４Ｈ１３Ｎ２Ｏ２Ｂｒに関し、計算値３２１．０２３９、実測値３２１．０２４０。
化合物１０：白色固体（８６％）。融点９３〜９５℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３００、１６００、１５０６。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．３８（ｓ、３Ｈ、Ｍｅ）、６．８１（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ４’）、６．８３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．２４（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ３’、Ｈ５’）、７．３７（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．１、１．１Ｈｚ、Ｈ２’、Ｈ６’）、７．５７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、７．６０（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．４３（ｓ、１Ｈ、ＯＨ、Ｄ２Ｏ交換可能）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３３．１（Ｍｅ）、１１５．５（Ｃ２’、Ｃ６’）、１１６．３（Ｃ３、Ｃ５）、１２０．５（Ｃ４’）、１２８．３（Ｃ３’、Ｃ５’）、１２９．６（Ｃ２、Ｃ６）、１２９．８（Ｃ１）、１３３．５（Ｃ７）、１４９．２（Ｃ１’）、１５８．３（Ｃ４）。ＭＳ（ＥＳＩ）２２７．１（Ｍ＋１、１００）、２２８．１（Ｍ＋２、２０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１４Ｈ１５Ｎ２Ｏに関し、計算値２２７．１１８４、実測値２２７．１１７４。
化合物１１：白色固体（９０％）。融点１６５〜１６７℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３２５３、１６５１、１６３５、１６０６、１５５６、１５１４。1Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．７８（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、６．９３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．６０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．０８（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．７８（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．８５（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５２．４（ＯＭｅ）、１１６．４（Ｃ３、Ｃ５）、１２７．４（Ｃ１）、１２９．３（Ｃ２、Ｃ６）、１４４．９（Ｃ７）、１５４．９（Ｃ４）、１５９．８（Ｃ＝Ｏ）。ＭＳ（ＥＳＩ）１９５．１（Ｍ＋１、１００）、１９６．１（Ｍ＋２、１０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ９Ｈ１１Ｎ２Ｏ３に関し、計算値１９５．０７７０、実測値１９５．０７７６。
化合物１２：白色固体（８９％）。融点１８９〜１９０℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３３８、３２０２、１６７８、１６０７、１５８１、１５５８、１５１３。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ１．２１（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ３）、４．１３（ｑ、２Ｈ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、ＯＣＨ２ＣＨ３）、６．８４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．５０（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．７３（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．７４（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ１５．１（ＯＣＨ２ＣＨ３）、６１．５（ＯＣＨ２ＣＨ３）、１１６．４（Ｃ３、Ｃ５）、１２７．５（Ｃ１）、１２９．３（Ｃ２、Ｃ６）、１４４．８（Ｃ７）、１５４．４（Ｃ４）、１５９．８（Ｃ＝Ｏ）。ＭＳ（ＥＳＩ）２０９．１（Ｍ＋１、１００）、２１０．１（Ｍ＋２、１０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１０Ｈ１３Ｎ２Ｏ３に関し、計算値２０９．０９２６、実測値２０９．０９３２。
化合物１３：白色固体（８９％）。融点１５５〜１５６℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３４６、３２４３、１６６０、１６０８、１５７８、１５３４、１５１０。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ１．４８（ｓ、９Ｈ、Ｃ（ＣＨ３）３）、６．８７（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．５３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．０１（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．６９（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．５８（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。13Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ２８．７（Ｃ（ＣＨ３）３）、８０．２（Ｃ（ＣＨ３）３）、１１６．４（Ｃ３、Ｃ５）、１２７．７（Ｃ１）、１２９．２（Ｃ２、Ｃ６）、１４４．２（Ｃ７）、１５３．４（Ｃ４）、１５９．６（Ｃ＝Ｏ）。ＭＳ（ＥＳＩ）２３７．１（Ｍ＋１、３０）、２３８．１（Ｍ＋２、５）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１２Ｈ１７Ｎ２Ｏ３に関し、計算値２３７．１２３９、実測値２３７．１２４９。
化合物１４：白色固体（９０％）。融点１５９〜１６０℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３３９７、１６６８、１６０６、１５５６、１５０６。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５．１６（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２）、６．８４（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、７．２６〜７．３５（ｍ、３Ｈ、ＡｒＣＨ）、７．３６（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、ＡｒＣＨ）、７．５１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．７１（ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）、９．９１（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ６７．１（ＯＣＨ２Ａｒ）、１１６．４（Ｃ３、Ｃ５）、１２７．４（Ｃ１）、１２８．８（ＣＨ）、１２９．２（Ｃ２、Ｃ６）、１２９．３（ＣＨ）、１３７．９（ＣＣＨ）、１４５．２（Ｃ７）、１５４．３（Ｃ４）、１５９．８（Ｃ＝Ｏ）。ＭＳ（ＥＳＩ）２７１．１（Ｍ＋１、１００）、２７２．１（Ｍ＋２、１０）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１５Ｈ１５Ｎ２Ｏ３に関し、計算値２７１．１０８３、実測値２７１．１０８９。
化合物１５：白色固体（８９％）。融点１４７〜１４８℃。ＩＲ（ヌジョールムル）νｃｍ−１：３４１２、３２７０、１６８３、１６０２、１５４３、１５１４。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．７６（ｓ、３Ｈ、ＯＭｅ）、５．０８（ｓ、２Ｈ、ＯＣＨ２）、６．８３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、Ｈ３、Ｈ５）、６．８９（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、ＣＨＣＯＭｅ）、７．３３（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、ＣＨＣＣＯＭｅ）、７．５１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、Ｈ２、Ｈ６）、８．００（ｓ、１Ｈ、Ｈ７）、８．７０（ｓ、１Ｈ、Ｄ2Ｏ交換可能）、９．８２（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｄ２Ｏ交換可能）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ５５．６（ＯＭｅ）、６６．９（ＯＣＨ２）、１１４．６（Ｃ３、Ｃ５）、１１６．４（ＣＣＯＭｅ）、１２７．４（Ｃ１）、１２９．３（Ｃ２、Ｃ６）、１２９．８（ＣＣＣＣＯＭｅ）、１３０．７（ＣＣＣＯＭｅ）、１４５．０（Ｃ７）、１５４．３（Ｃ４）、１５９．８（Ｃ＝Ｏ）、１６０．６（ＣＯＭｅ）。ＭＳ（ＥＳＩ）３０１．１（Ｍ＋１、２５）、３０２．１（Ｍ＋２、５）。ＥＳＩＨＲＭＳ ｍ／ｚ Ｃ１６Ｈ１７Ｎ２Ｏ４に関し、計算値３０１．１１８８、実測値３０１．１２００。
化合物１６：白色固体（８６％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ３．７６（ｓ、３Ｈ）、５．０８（ｓ、２Ｈ）、６．８２（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、６．８７（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．３１（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、２Ｈ）、７．４９（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、２Ｈ）、７．９９（ｓ、１Ｈ）、８．７０（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２９９．５（Ｍ−Ｈ）。
化合物１７：白色固体（８７％）。１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ６．８９（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、７．５４（ｍ、５Ｈ）、７．９４（ｄ、Ｊ＝７．９Ｈｚ、２Ｈ）、８．４０（ｓ、１Ｈ）、８．８５（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２３９．３（Ｍ−Ｈ）。
化合物１８：白色固体（８９％）。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ１．４４（ｓ、９Ｈ）、６．９８（ｄｄ、Ｊ＝２．５、８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．２７（ｄ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｄｄ、Ｊ＝２．２、１２．１Ｈｚ、１Ｈ）、７．９７（ｓ、１Ｈ）、８．９８（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２５３．３（Ｍ−Ｈ）。
化合物１９：褐色固体（８７％）。１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＣＯ）δ６．７７（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、１Ｈ）、７．０１（ｔ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．１２〜７．２９（ｍ、４Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝１．７、１０．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．７７（ｓ、１Ｈ）。ＭＳ ｍ／ｚ ２２９．７（Ｍ−Ｈ）。
【００６６】
酵素活性を求める分光アッセイ。
Ｌ−ドーパクロームメチルエステルの保管未使用の溶液（２．４ｎＭ）が、過沃素酸ナトリウムを用いたＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルの酸化により生成され、橙（オレンジ）色溶液を産生した。活性が、ｐＨ６、５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（バッファー）中、ＭＩＦ溶液（８５０ナノグラム（ｎｇ）／ミリリットル（ｍＬ））１μＬを含有するセルにドーパクロームメチルエステル（０．３ミリリットル（ｍＬ））を加えることにより、室温において求められ、分光器で、４７５ナノメートル（ｎｍ）での２〜２０秒の吸光における減少を測定した。阻害剤３〜１５が、種々の濃度（０．１〜１００ｍＭ）においてＤＭＳＯに溶解され、１マイクロリットル（μＬ）が、ドーパクロームの添加前にＭＩＦを有するセルに加えられた。
【００６７】
動物研究。
化合物７は、治療がＣＬＰモデル（図４）において２４時間後に開始された場合でさえ、保護的である。マウスが、ＣＬＰ２４時間後、３．５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１３、＊＊Ｐ＜０．０１）もしくはビヒクルを用いて腹腔内注射された（ｎ＝１３）。２回の更なる注射が、２日目および３日目に与えられた。ＣＬＰの手順の詳細が、以降のとおり、完遂される：麻酔された（ケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン８ｍｇ／ｋｇが、筋内投与された）雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて盲腸が、結紮され、単回穿刺を与えられた。腹部アクセスが、中線切開経由で得られた。盲腸が単離され、回盲弁の下、６−０絹（シルク）結紮糸を用いて結紮され、盲腸が２２Ｇ針を用いて一旦穿刺され、糞（およそ１ｍ）がこの穴から押し出され、盲腸が腹の空洞中に戻して入れられた。腹が、２層の６−０Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合糸を用いて閉じられた。抗生物質（プレマキシン０．５ミリグラム（ｍｇ）／キログラム（ｋｇ）、皮下、合計量０．５ミリリットル（ｍｌ）／マウスで）が、ＣＬＰ直後に投与され、単回用量の蘇生液（通常の食塩水、２０ミリリットル（ｍｌ）／キログラム（ｋｇ）体重）が、ＣＬＰ外科手術直後に皮下投与された（Ｗａｎｇら、１９９９年）。
【００６８】
実施例２．急性炎症に対する応答における白血球の動員への化合物７の効果。
空気嚢は、スイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ）雄マウス（２５〜３０ｇ）において標準手順（Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｍａｌｌｏら、２００２年）に従い、０日目（６ｍＬ）および３日目（３ｍＬ）に無菌空気（エア）を皮下注射することにより調製された。６日目、動物が、指し示されたとおり、腹腔内（ｉ．ｐ．）もしくは強制飼養（経口）のビヒクル（３５０μＬ２０％ＤＭＳＯ）もしくは化合物７（７ｍｇ／ｋｇ）を用いて治療された。１５分後、これら動物が、該空気嚢の空洞中に１ｍＬＰＢＳ中１％カラゲナンを注射することにより刺激された。カラゲナン注射５時間後、これら動物が、屠られ、これらパウチがＰＢＳ洗浄され、滲出物が回収され、そして浸潤細胞合計数が定量された。プロットが、ビヒクル単独（ｖｅｈ．）を用いて見られたものに対して正常化された細胞数を示す。
【００６９】
結果を図５に示した。化合物７を用いた腹腔内（ｉ．ｐ．）治療および経口治療の両方が、空気嚢の空洞中へのカラゲナン処理により引き起こされた炎症に対する応答における白血球の動員における有意な低減を示した。
【００７０】
もう１種別の実験中、空気嚢が、上のとおり調製された。６日目、動物が、屠られ、細胞を回収する前に、指し示された時刻においてビヒクル（３５０μＬ２０％ＤＭＳＯ）もしくは化合物７（７ｍｇ／ｋｇ、栄養）を用いて治療された。全ての場合（ケース）中、１％カラゲナンが、屠る５時間前に空気嚢の空洞中に注入された。
【００７１】
結果を図６に示した。プロットは、ビヒクル単独（ｖｅｈ．）を用いて見られたものに対して正常化された細胞数を示す。マウスが、定量用空気嚢細胞を回収する５．２５時間および７時間前に（しかし９時間前でない）、化合物７を用いて経口治療された場合、白血球の動員において有意な低減が観察された。これは、経口投与を用いると、化合物７が７〜９時間の明らかな生物学的半減寿命を有することを指し示す。
【００７２】
実施例３．化合物７が、致命的な内毒素血症からマウスを保護する。
内毒素血症が、ＬＰＳ（１６ｍｇ／ｋｇ、最大、もしくは、１９ｍｇ／ｋｇ、最小）注射により、Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて誘導された。マウスが、ＬＰＳ点滴２時間前、および、ＬＰＳ点滴２４時間後、ビヒクル（３５０μＬ２０％ＤＭＳＯ）もしくは化合物７（７ｍｇ／ｋｇ）を用いて腹腔内（ｉ．ｐ．）治療された。これらマウスの生存率が、モニターされた。
【００７３】
結果を図７に示した。化合物７が、さもなければ致命的なＬＰＳ被曝からのこれらマウスに対する保護を与えた。
【００７４】
参照文献
Al-Abed, Y.; Dabideen, D.; Aljabari, B.; Valster, A.; Messmer, D. et al. ISO-I binding to the tautomerase active site of MIF inhibits its pro-inflammatory activity and increases survival in severse sepsis. J. Biol Chem. 2005, 280, 36541-35644.
Bozza, M.; Satoskar, A. R.; Lin, G.; Lu, B.; Humbles, A. A. et al. Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis. J. Exp. Med. 1999, 189, 341-346.
Calandra, T.; Echtenacher, B.; Roy, D. L.; Pugin, J.; Metz, C. N.; Hultner, L.; Heumann, D.; Mannel, D.; Bucala, R.; Glauser, M. P. Protection from septic shock by neutralization of macrophage migration inhibitory factor. Nat. Med. 2000, 6, 164-170.
Calandra, T.; Roger, T. Macrophage migration inhibitory factor: a regulator of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 2003, 3, 791-800.
Cvetkovic, L; Al-Abed, Y. et al. Critical role of macrophage migration inhibitory factor activity in experimental autoimmune diabetes. Endocrinol. 2005, 146, 2942-2951.
Cheng, K. F.; Al-Abed, Y. Critical modifications of the ISO-I scaffold improve its potent inhibition of macrophage migration inhibitory factor (MIF) tautomerase activity. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 3376-9.
Dios, A.; Mitchell, R. A.; Aljabari, B.; Lubetsky, J.; O'Connor, K. A.; Liao, H.; Senter, P. D.; Manogue, K. R.; Lolis, E.; Metz, C; Bucala, R.; Callaway, D. J. E.; Al-Abed, Y. Inhibition of MIF bioactivity by rational design of pharmacological inhibitors of MIF tautomerase activity. J. Med Chem. 2002, 45, 2410-2416.
Garcia-Ramallo E.; Marques, T. et al. Resident cell chemokine expression serves as the major mechanism for leukocyte recruitment during local inflammation. J. Immunol. 2002, 169, 6467-6473.
Lubetsky, J. B.; Dios, A.; Han, J.; Aljabari, B.; Ruzsicska, B.; Mitchell, R.; Lolis, E.; Al-Abed, Y. The tautomerase active site of macrophage migration inhibitory factor is a potential target for discovery of novel anti-inflammatory agents. J. Biol. Chem. 2002, 277, 24976-24982.
Mitchell, R. A.; Liao, H.; Chesney, J.; Fingerle-Rowson, G.; Baugh, J. et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) sustains macrophage pro-inflammatory function by inhibiting p53: regulatory role in the innate immune response. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 345-350.
Orita, M.; Yamamoto, S.; Katayama, N.; Aoki, M.; Takayama, K.; Yamagiwa, Y.; Seki, N.; Suzuki, H.; Kurihara, H.; Sakashita, H.; Takeuchi, M.; Fujita, S.; Yamada, T.; Tanaka, A. Coumarin and chromen-4-one analogues as tautomerase inhibitors of macrophage migration inhibitory factor: Discovery and X-ray crystallography. J. Med. Chem. 2001, 44, 540-547.
Orita, M.; Yamamoto, S.; Katayama, N.; Fujita, S. Macrophage migration inhibitory factor and the discovery of tautomerase inhibitors. Curr. Pharm. Des. 2002, 8, 1297-1317.
Riedemann, N. C.; Guo, R. F.; Ward, P.A. Novel strategies for the treatment of sepsis. Nat. Med. 2003, 9, 517-524.
Roger, T.; David, J.; Glauser, M. P.; Calandra, T. MIF regulates innate immune responses through modulation of Toll-like receptor 4. Nature 2001, 414, 920-924.
Rosengren, E.; Bucala, R.; Aman, P.; Jacobsson, L.; Odh, G. et al. The immuno-regulatory mediator macrophage migration inhibitory factor (MIF) catalyzes a tautomerization reaction. Mol. Med. 1996, 2, 143-149.
Senter, P. D.; Al-Abed, Y.; Metz, C. N.; Benigni, F.; Mitchell, R. A. et al. Inhibition of macrophage migration inhibitory factor (MIF) tautomerase and biological activities by acetaminophen metabolites. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 144-149.
Sugimoto, H.; Suzuki, M.; Nakagawa, A.; Tanaka, I.; Fujinaga, M. et al. Crystallization of rat liver macrophage migration inhibitory factor for MAD analysis. J. Struct. Biol. 1995, 115, 331-334.
Sun, B.; Nishihira, J. et al. Macrophage migration inhibitory factor promotes tumor invasion and metastasis via the Rho-dependent pathway. Clin. Cancer Res. 2005, 11, 1050-1058.
Sun, H. W.; Bernhagen, J.; Bucala, R.; Lolis, E. Crystal structure at 2.6-A resolution of human macrophage migration inhibitory factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, 5191-5196.
Suzuki, M.; Sugimoto, H.; Nakagawa, A.; Tanaka, I.; Nishihira, J. et al. Crystal structure of the macrophage migration inhibitory factor from rat liver. Nat. Struct. Biol. 1996, 3, 259-266.
Taylor, A. B.; Johnson, W. H., Jr.; Czerwinski, R. M.; Li, H. S.; Hackert, M. L. et al. Crystal structure of macrophage migration inhibitory factor complexed with (E)-2-fluoro-p-hydroxycinnamate at 1.8 A resolution: implications for enzymatic catalysis and inhibition. Biochemistry 1999, 38, 7444-7452.
Wang, H.; Bloom, O.; Zhang, M.; Vishnubhakat, J. M.; Ombrellino, M. et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science 1999, 285, 248-251.
【００７５】
上の観点中、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が達成されたことが分かる。
【００７６】
本発明範囲から逸脱することなく、上の方法および組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され且つ添付図面において示された全事項が、例示として、限定的な意味ではなく解釈されるべきであると意図される
【００７７】
この明細書において引用された全参照が、本明細書により援用される。本明細書におけるこれら参照の議論が、単にその著者らによりなされた主張を要約すると意図されており、如何なる参照も先行技術を構成することは全く認められていない。出願人は、これら引用の正確さおよび適切さに挑むに当たっての権利を保留する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】ＭＩＦ阻害剤の合理的設計（デザイン）に関するスキームを示すダイヤグラムである。
【図２】二置換ヒドラゾンたる化合物１０に関する化学式である。
【図３】化合物７が、ＬＰＳ処理マクロファージからのＴＮＦ分泌を阻害することを示す実験結果のグラフである。ＲＡＷ２６７．４マクロファージ（１０５個）が、ＬＰＳ、もしくは、抗ＭＩＦ（ＸＩＶ．１５．５；α−ＭＩＦ）マウスモノクローナル抗体１０μｇ／ｍＬ添加３０分前に種々の濃度の化合物７（０．０１〜１００μＭ）を用いて処置された。１６時間のインキュベート後、細胞培養上清が、ＥＬＩＳＡによるＴＮＦα濃度の決定用に回収された。データが、平均±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３、＊、ｐ＜０．０１）として表示されている。
【図４】ヒドラゾン化合物７が、ＣＬＰモデルにおける２４時間の遅い治療後、保護的であることを示す実験結果のグラフである。マウスが、ＣＬＰ２４時間後、化合物７（「ヒドラゾン」）（４ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝１３、ｐ＜０．０１）もしくはビヒクルと共に腹腔内注射された（ｎ＝１３）。単回注射が、２０％ＤＭＳＯ：８０％生理食塩水溶液２００μＬ中、化合物７（１００μｇ、４ｍｇ／ｋｇに等価）から構成された。化合物７の更なる投与（日に２回）が、２日目および３日目に与えられた。
【図５】化合物７が、経口もしくは腹腔内（Ｉ．Ｐ．）投与され、急性炎症の樹立されたモデルにおける白血球の動員を阻害することを示している実験結果のグラフである。ビヒクル単独に相対し、＊ｐ＜０．０５（ｎ＝５）；＊＊ｐ＜０．００６（ｎ＝２０）。
【図６】化合物７が、カラゲナンと共に挑まれた空気（エア）パウチモデルにおける白血球の浸潤の阻害により査定されたとおり、７〜９時間の明らかな生物学的半減期を有することを示す実験結果のグラフである。ビヒクル単独に相対し、＊＊ｐ＜０．００６（ｎ＝２０）。
【図７】化合物７が、内毒素血症動物モデルにおける保護剤であることを示す実験結果のグラフである。