【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
実施例８に記載されているのと同じ培地、増殖条件、および試料調製を使用して、株ＤＷＳ２３０７のイソブタノール生成を試験した。株ＤＷＳ２２７９（実施例８）を対照として増殖させた。濾過された上澄液を、ＳＨＯＤＥＸ  Ｓｕｇａｒカラムを備えたＨＰＬＣ（１２００  Ｓｅｒｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ
Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を用いて、ＵＶ２１０および屈折率で検出し、移動相１０ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で分析した。表６の結果は、ＤＷＳ２２７９と比較した、ＤＷＳ２３０７についてのイソブタノール、ギ酸、アセトイン、およびエタノールの生成を示すものである。ΔｐｆｌＢ２Ａ２−突然変異を含むＤＷＳ２３０７によって生成されたイソブタノールの量は１９．１ｍＭであった。これは、野生型ｐｆｌＢ２Ａ２＋を含むＤＷＳ２２７９によって生成されたイソブタノールレベル（８ｍＭ）より約２．４倍高い。遺伝子ｐｆｌＢ２およびｐｆｌＡ２について欠失しており、したがってギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性を含んでいないＤＷＳ２３０７では、ギ酸の生成が見られなかった。
【表６】
2013505739.tif 000001
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．組換え乳酸菌細胞であって、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を低減するかまたは排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変、を含む上記組換え乳酸菌細胞。
２．内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変、および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変を含む、上記１に記載の菌細胞。
３．遺伝子工学による改変がそれぞれ、アセト乳酸デカルボキシラーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の少なくとも一部分の欠失である、上記１に記載の菌細胞。
４．前記アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、ａｌｄＢ、ａｌｄＣ、およびａｌｄからなる群から選択される、上記３に記載の菌細胞。
５．アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が、配列番号：２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、および３８からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、上記４に記載の菌細胞。
６．前記遺伝子が、乳酸デヒドロゲナーゼをコードし、ｌｄｈＬ、ｌｄｈＤ、ｌｄｈＬ１、およびｌｄｈＬ２からなる群から選択される、上記３に記載の菌細胞。
７．乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子が、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２からなる群から選択される配列と少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、上記６に記載の菌細胞。
８．細胞が、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、およびストレプトコッカスからなる群から選択される属のメンバーである、上記１に記載の菌細胞。
９．ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含む、上記１に記載の菌細胞。
１０．遺伝子改変が、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素をコードする遺伝子、または両遺伝子に存在する、上記９に記載の菌細胞。
１１．ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする前記遺伝子が、ｐｆｌ、ｐｆｌＢ１およびｐｆｌＢ２からなる群から選択され、ギ酸Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ活性化酵素をコードする遺伝子が、ｐｆｌＡ、ｐｆｌＡ１およびｐｆｌＡ２からなる群から選択される、上記１０に記載の菌細胞。
１２．細胞がイソブタノールを生産する、上記１、２、または８のいずれかに記載の菌細胞。
１３．イソブタノール生合成経路を含む、上記１２に記載の菌細胞。
１４．イソブタノール生合成経路が、
ａ）ピルビン酸からアセト乳酸へと、
ｂ）アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸へと、
ｃ）２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸へと、
ｄ）α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへと、
ｅ）イソブチルアルデヒドからイソブタノールへと
からなる変換を生産するための基質を含む、上記１３に記載の菌細胞。
１５．組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
ｂ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現させて、非染色体で発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼを有する細胞を作出するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
１６．組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
ｂ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現させて、非染色体で発現された乳酸デヒドロゲナーゼを有する細胞を作出するステップと、
（ｄ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
１７．ステップ（ｂ）が、（ｃ）の前に、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする第１の遺伝子への改変を含み、次いでステップ（ｃ）の後に、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする第２の遺伝子が遺伝子工学によって改変される、上記１５に記載の方法。
１８．ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減するように、少なくとも１つの内在性遺伝子を改変するステップをさらに含む、上記１５〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．イソブタノールを生産する方法であって：
（ａ）ｉ）内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変、および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変；および
ｉｉ）イソブタノール生合成経路；
を含む乳酸菌細胞を備えるステップ：および
（ｂ）（ａ）の細胞を、イソブタノールが生産される条件下で培養するステップ：
を含む、上記方法。
２０．（ａ）の乳酸菌細胞が、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を低減する少なくとも１つの遺伝子改変をさらに含む、上記１９に記載の方法。
２１．乳酸菌用組込み型ベクターであって：
ａ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
ｂ）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
ｃ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
ｄ）大腸菌細胞の複製開始点と；
ｅ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
を含み、Ｔｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素が、ｂ）のＤＮＡセグメントの乳酸菌細胞ゲノムへのランダムな組込みに向ける組込み型ベクター。
２２．ＤＮＡセグメントを乳酸菌細胞ゲノムにランダムに組み込む方法であって：
ａ）ｉ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
ｉｉ）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
ｉｉｉ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
ｉｖ）大腸菌細胞の複製開始点と；
ｖ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
を含むベクターを備えるステップ：
ｂ）組込み用ＤＮＡセグメントをステップａ（ｉｉ）の構成要素間に配置し、組込み構築物を作出するステップ：
ｃ）組込み構築物を乳酸菌細胞に形質転換し、それによって形質転換細胞が生産されるステップ：
ｄ）ステップａ（ｉｉ）の選択マーカーを使用して、ステップ（ｃ）の形質転換細胞を許容条件で増殖させ、選択して、選択された形質転換体を生産するステップと：
ｅ）ステップ（ｄ）の選択された形質転換体を非許容条件で増殖させるステップと：
を含み、ここでベクターが乳酸菌細胞から除去され、組込み用ＤＮＡセグメントが、乳酸菌細胞のゲノムにランダムに組み込まれる、上記方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え乳酸菌細胞であって、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を低減するかまたは排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子工学による改変、を含む上記組換え乳酸菌細胞。
【請求項２】
組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
ｂ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現させて、非染色体で発現されたアセト乳酸デカルボキシラーゼを有する細胞を作出するステップと、
（ｄ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞由来のアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
【請求項３】
組換え乳酸菌細胞を生産する方法であって、
ａ）乳酸菌細胞を備えるステップと、
ｂ）（ｃ）の細胞においてアセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする内在性遺伝子を、内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
ｃ）（ｂ）の細胞においてプラスミド由来の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現させて、非染色体で発現された乳酸デヒドロゲナーゼを有する細胞を作出するステップと、
（ｄ）（ａ）の細胞において乳酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの内在性遺伝子を、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除するように遺伝子工学により改変するステップと、
（ｅ）（ｄ）の細胞に由来する乳酸デヒドロゲナーゼ活性を発現するプラスミドを除去するステップと
を含み、それによって、内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼおよびアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性がない組換え乳酸菌細胞が生産される、上記方法。
【請求項４】
イソブタノールを生産する方法であって：
（ａ）ｉ）内因的に発現されるアセト乳酸デカルボキシラーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変、および内因的に発現される乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を排除する少なくとも１つの遺伝子改変；および
ii）イソブタノール生合成経路；
を含む乳酸菌細胞を備えるステップ：および
（ｂ）（ａ）の細胞を、イソブタノールが生産される条件下で培養するステップ：
を含む、上記方法。
【請求項５】
乳酸菌用組込み型ベクターであって：
ａ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
ｂ）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
ｃ）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
ｄ）大腸菌細胞の複製開始点と；
ｅ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
を含み、Ｔｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素が、ｂ）のＤＮＡセグメントの乳酸菌細胞ゲノムへのランダムな組込みに向ける組込み型ベクター。
【請求項６】
ＤＮＡセグメントを乳酸菌細胞ゲノムにランダムに組み込む方法であって：
ａ）ｉ）乳酸菌細胞において活性であるプロモーターに機能的に結合されているＴｎ−５トランスポザーゼコード領域と；
ii）大腸菌および乳酸菌細胞において活性な選択マーカーならびに組込みの標的とされるＤＮＡセグメントの境界を定めるＴｎ５ＩＥおよびＴＮ５ＯＥ構成要素と；
iii）乳酸菌細胞において活性な第２の選択マーカーと；
iv）大腸菌細胞の複製開始点と；
ｖ）条件付きで活性である、乳酸菌細胞の複製開始点と；
を含むベクターを備えるステップ：
ｂ）組込み用ＤＮＡセグメントをステップａ（ii）の構成要素間に配置し、組込み構築物を作出するステップ：
ｃ）組込み構築物を乳酸菌細胞に形質転換し、それによって形質転換細胞が生産されるステップ：
ｄ）ステップａ（ii）の選択マーカーを使用して、ステップ（ｃ）の形質転換細胞を許容条件で増殖させ、選択して、選択された形質転換体を生産するステップと：
ｅ）ステップ（ｄ）の選択された形質転換体を非許容条件で増殖させるステップと：
を含み、ここでベクターが乳酸菌細胞から除去され、組込み用ＤＮＡセグメントが、乳酸菌細胞のゲノムにランダムに組み込まれる、上記方法。