【手続補正書】
【提出日】平成25年11月8日(2013.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約４００〜６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、ここで前記培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地。
【請求項２】
塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含む、無血清および異種成分不含の培地であって、ここで前記培地中の前記アスコルビン酸の濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍｌであり、かつここで前記培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地。
【請求項３】
約５０〜２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の濃度範囲でＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む、無血清の培地であって、ここで前記培地は、多能性幹細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、培地。
【請求項４】
約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および血清代替物を含む培地であって、ここで前記培地は、多能性幹細胞を、浮遊培養下、未分化状態で維持する能力を有する、培地。
【請求項５】
塩基性培地、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、および血清代替物からなる培地。
【請求項６】
塩基性培地、約５０μｇ／ｍｌ〜約５００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約２ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲でのｂＦＧＦ、Ｌ−グルタミン、血清代替物および脂質混合物からなる培地。
【請求項７】
多能性幹細胞および請求項２に記載の培地を含む細胞培養物。
【請求項８】
胚性幹細胞系を誘導する方法であって、
（ａ）胎児の着床前期胚盤胞、着床後期胚盤胞および／または生殖器組織に由来する胚性幹細胞を得るステップと、
（ｂ）前記胚性幹細胞を請求項２に記載の培地中で培養するステップと、
を含み、それによって前記胚性幹細胞系を誘導する、方法。
【請求項９】
人工多能性幹細胞系を誘導する方法であって、
（ａ）体細胞を多能性幹細胞に誘導するステップと、
（ｂ）前記多能性幹細胞を請求項２に記載の培地中で培養するステップと、
を含み、それによって前記人工多能性幹細胞系を誘導する、方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法であって、前記多能性幹細胞を請求項２に記載の培地中で培養するステップを含み、それによって前記多能性幹細胞を前記未分化状態で増殖・維持する、方法。
【請求項１１】
多能性幹細胞を未分化状態で増殖・維持する方法であって、前記多能性幹細胞を、無血清、無フィーダー、マトリックス不含およびタンパク質担体不含であり、かつ約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む培地中で培養するステップを含み、ここで前記培地は、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有する、方法。
【請求項１２】
多能性幹細胞を増殖し、かつ前記多能性幹細胞を未分化状態で維持する方法であって、前記多能性幹細胞を、無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養するステップを含み、ここで前記培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β−３（ＴＧＦβ３）およびアスコルビン酸を含み、ここで前記培地中の前記アスコルビン酸の濃度は、少なくとも５０μｇ／ｍｌであり、またここで前記培地は、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有し、それによって前記幹細胞を前記未分化状態で増殖・維持する、方法。
【請求項１３】
多能性幹細胞を増殖し、かつ前記多能性幹細胞を未分化状態で維持する方法であって、前記多能性幹細胞を、無血清および異種成分不含培地中、フィーダー細胞層上で培養するステップを含み、ここで前記培地は、約４００〜６００μｇ／ｍｌの濃度範囲でのアスコルビン酸、約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、異種成分不含血清代替物および脂質混合物を含み、ここで前記培地は、多能性幹細胞を未分化状態で維持する能力を有し、それによって前記幹細胞を前記未分化状態で増殖・維持する、方法。
【請求項１４】
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を増殖し、かつ前記ｉＰＳ細胞を未分化状態で維持する方法であって、前記ｉＰＳ細胞を、基質接着を有せず細胞カプセル化を有しないでかつ前記ｉＰＳ細胞の前記未分化状態での増殖を可能にする培養条件下での浮遊培養下で培養するステップを含み、それによって前記ｉＰＳ細胞を前記未分化状態で増殖・維持する、方法。
【請求項１５】
系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法であって、
（ａ）前記多能性幹細胞を、請求項１０に記載の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化幹細胞を得るステップと、
（ｂ）前記増殖された未分化幹細胞を、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップと、
を含み、それによって前記系統特異的細胞を前記多能性幹細胞から生成する、方法。
【請求項１６】
胚様体を多能性幹細胞から生成する方法であって、
（ａ）前記多能性幹細胞を、請求項１０に記載の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、
（ｂ）前記増殖された未分化多能性幹細胞を、前記幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップと、
を含み、それによって前記胚様体を前記多能性幹細胞から生成する、方法。
【請求項１７】
系統特異的細胞を多能性幹細胞から生成する方法であって、
（ａ）前記多能性幹細胞を、請求項１０に記載の方法に従って培養し、それによって増殖された未分化多能性幹細胞を得るステップと、
（ｂ）前記増殖された未分化多能性幹細胞を、前記増殖された未分化幹細胞の胚様体への分化に適した培養条件下に置くステップと、
（ｃ）前記胚様体の細胞を、系統特異的細胞の分化および／または増殖に適した培養条件下に置くステップと、
を含み、それによって前記系統特異的細胞を前記多能性幹細胞から生成する、方法。
【請求項１８】
前記幹細胞は、胚性幹細胞である、請求項７に記載の細胞培養物。
【請求項１９】
前記幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項７に記載の細胞培養物。
【請求項２０】
前記胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞である、請求項１８に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
前記人工多能性幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞である、請求項１９に記載の細胞培養物。
【請求項２２】
前記培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む、請求項３に記載の培地。
【請求項２３】
前記培地は、血清代替物をさらに含む、請求項２に記載の培地。
【請求項２４】
前記培地中の前記ＴＧＦβ３の濃度は、少なくとも約０．５ｎｇ／ｍｌである、請求項２に記載の培地。
【請求項２５】
前記培地中の前記ＴＧＦβ３の濃度は、約２ｎｇ／ｍｌである、請求項２４に記載の培地。
【請求項２６】
前記培地中の前記ｂＦＧＦの濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌである、請求項２に記載の培地。
【請求項２７】
前記培地中の前記ｂＦＧＦの濃度は、約５ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌの範囲内である、請求項２に記載の培地。
【請求項２８】
前記培地中の前記アスコルビン酸の濃度は、約４００マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）〜約６００μｇ／ｍｌの範囲内である、請求項２に記載の培地。
【請求項２９】
前記培地中の前記アスコルビン酸の濃度は、約５００μｇ／ｍｌ（マイクログラム／ミリリットル）である、請求項２に記載の培地。
【請求項３０】
前記ｂＦＧＦは、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、前記ＴＧＦβ３は、約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、前記アスコルビン酸は、約５０μｇ／ｍｌ〜約５０００μｇ／ｍｌの濃度範囲である、請求項２に記載の培地。
【請求項３１】
前記ｂＦＧＦは、約５ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、前記ＴＧＦβ３は、約０．５ｎｇ／ｍｌ〜約５ｎｇ／ｍｌの濃度範囲であり、前記アスコルビン酸は、約４００μｇ／ｍｌ〜約６００μｇ／ｍｌの濃度範囲である、請求項２に記載の培地。
【請求項３２】
前記培地は、血清代替物をさらに含む、請求項２に記載の培地。
【請求項３３】
前記血清代替物は、異種成分を含まない、請求項３２に記載の培地。
【請求項３４】
前記培地は、脂質混合物をさらに含む、請求項２に記載の培地。
【請求項３５】
前記培地は、約５％〜約１０％の濃度での重炭酸ナトリウムをさらに含む、請求項２に記載の培地。
【請求項３６】
前記脂質混合物は、約１％の濃度である、請求項３４に記載の培地。
【請求項３７】
前記ＩＬ６ＲＩＬ６キメラの前記濃度は、約１００ｐｇ／ｍｌである、請求項３に記載の培地。
【請求項３８】
前記培養するステップは、浮遊培養下で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項３９】
前記培地は、ＴＧＦβ３を含まない、請求項１に記載の培地。
【請求項４０】
前記培地は、０．１ｎｇ／ｍｌ以下のＴＧＦβ３を含む、請求項１に記載の培地。
【請求項４１】
前記ｂＦＧＦの前記濃度は、約１００ｎｇ／ｍｌである、請求項４に記載の培地。
【請求項４２】
前記浮遊培養の培地は、無血清および無フィーダー細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項４３】
前記培地は、約５０〜２００ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含み、ここで前記培地は、前記ｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記培地は、少なくとも２０００単位／ｍｌの濃度での白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含み、ここで前記培地は、前記ｉＰＳ細胞を、フィーダー細胞支持の不在下、未分化状態で維持する能力を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記培地は、約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度範囲での塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記培地は、約５０〜２００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）の濃度範囲でのＩＬ６ＲＩＬ６キメラを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記培地は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記培地は、タンパク質担体を含まない、請求項１４に記載の方法。