【手続補正書】
【提出日】平成25年10月18日(2013.10.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料を、増幅条件下で、
（a）鋳型配列に相補的な3'セグメント；
（b）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含み、かつ少なくとも一つのプライマーの3'セグメントについてのアニーリングを制限する、3'セグメントの5'末端にあるイソ領域；
（c）鋳型配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、イソ領域の5'末端にある5'セグメントであって、少なくとも一つのプライマーが3'セグメントのみを有するプライマーと比較して増加した鋳型配列に対するアニーリング特異性を有する、5'セグメント
を含む少なくとも一つのプライマーと接触させる工程
を含む、増幅反応のアニーリング特異性を増加させるための方法。
【請求項２】
前記少なくとも一つのプライマーが6〜60ヌクレオチド長である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記イソ領域が約1〜約15個の非標準塩基を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
増幅反応が、
PCR；逆転写酵素PCR；リアルタイムPCR；ディファレンシャルディスプレイPCR；PCRに基づくゲノム分析；AP（Arbitrary Primed）-PCR；多重PCR；ロングレンジ（long-range）PCR；直線的（linear）PCR；逆PCR；定量的PCR；タッチダウンPCR；インサイチューPCR；ベクトレット（vectorette）PCR；TAIL（thermal asymmetric interlaced）PCR；MOPAC（mixed oligonucleotide-primed amplification of cDNA）；3'-RACE；5'-RACE、高分解能融解分析、およびプライマー伸長反応
からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記アニーリング工程が、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して、前記少なくとも一つのプライマーのアニーリング特異性を増加させるために十分な温度で実施される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
（a）鋳型配列の変性、少なくとも一つのプライマーのアニーリング、および少なくとも一つのプライマーの伸長を少なくとも2サイクル含む、第一増幅産物を形成させるために第一のアニーリング温度で鋳型配列の第一段階増幅を実施する工程であって、少なくとも一つのプライマーが、
（i）鋳型配列に相補的な3'セグメント；
（ii）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含み、かつ少なくとも一つのプライマーの3'セグメントについてのアニーリングを制限する、3'セグメントの5'末端にあるイソ領域；ならびに
（iii）鋳型配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、イソ領域の5'末端にある5'セグメント
を含む、工程と、
（b）第二のアニーリング温度で、
（i）工程（a）から生成された増幅産物の変性、少なくとも一つのプライマーのアニーリング、および少なくとも一つのプライマーの伸長；または
（ii）工程（a）から生成された増幅産物の変性、ならびに少なくとも一つのプライマーの5'セグメントに対応する配列を含むプライマーのアニーリングおよび伸長
を少なくとも1サイクル含む、第一増幅産物の第二段階増幅を実施する工程と
を含む、二段階反応において標的核酸を増幅するための方法。
【請求項７】
標的核酸が、
（a）オリゴヌクレオチドdTプライマーもしくはアンカード（anchored）オリゴヌクレオチドdTプライマーを標的mRNAのポリAテール領域にハイブリダイズさせるか、または六量体、七量体、および／もしくは八量体のランダムオリゴヌクレオチドを標的mRNAにハイブリダイズさせること；ならびに（b）cDNAを作製するために標的mRNAを逆転写すること
により形成されたcDNAである、請求項6記載の方法。
【請求項８】
二段階増幅手順が、
PCR；多重DNA増幅；差次的に発現された遺伝子の同定；3'-RACE；プライマー伸長反応；5'-RACE；全長cDNAの増幅；5'濃縮（enriched）cDNAの増幅；DNAフィンガープリント；RNAフィンガープリント；多重遺伝子ファミリーにおける保存されたホモロジーセグメントの同定；ヌクレオチド配列変動の同定；プレmiRNA増幅；rRNA増幅；PCR後の高分解能融解分析；および変異誘発
の群を含む方法に適用される、請求項6記載の方法。
【請求項９】
（a）3'セグメントが鋳型配列に相補的である少なくとも一つのプライマーを合成する工程；
（b）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含むイソ領域を、3'セグメントの5'末端に組み入れる工程であって、該イソ領域が、少なくとも一つのプライマーの3'セグメントについてのアニーリングを制限し、それにより、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して、3'セグメントのアニーリング特異性を増加させる、工程；
（c）鋳型配列を含有している鋳型の任意の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む5'セグメントを、イソ領域の5'末端に組み入れる工程であって、それによって少なくとも一つのプライマーが、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して増加した鋳型配列に対するアニーリング特異性を有する、工程
を含む、少なくとも一つのプライマーのアニーリング特異性を増加させるための方法。
【請求項１０】
前記合成する工程が、固相合成；DNA複製；逆転写；制限消化；ランオフ（run-off）転写；PCR；PCRに基づく方法；プライマー伸長反応；およびライゲーションからなる群より選択される方法を含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも一つのプライマー配列が6〜60デオキシリボヌクレオチド長または6〜60リボヌクレオチド長である、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
前記イソ領域が約1〜約15個の非標準塩基を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つのプライマーが増幅反応または二段階増幅反応において使用される、請求項9記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
一つの態様において、イソ領域は約1〜約15個の非標準塩基を含む。一つの態様において、少なくとも一つのプライマーは増幅反応または二段階増幅反応において使用される。
[本発明1001]
核酸試料を、増幅条件下で、
（a）鋳型配列に相補的な3'セグメント；
（b）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含み、かつ少なくとも一つのプライマーのアニーリング位置を3'セグメントに制限する、3'セグメントの5'末端にあるイソ領域；
（c）鋳型配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、イソ領域の5'末端にある5'セグメントであって、少なくとも一つのプライマーが3'セグメントのみを有するプライマーと比較して増加した鋳型配列に対するアニーリング特異性を有する、5'セグメント
を含む少なくとも一つのプライマーと接触させる工程
を含む、増幅反応のアニーリング特異性を増加させるための方法。
[本発明1002]
前記少なくとも一つのプライマーが6〜60ヌクレオチド長である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記イソ領域が約1〜約15個の非標準塩基を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
増幅反応が、
PCR；逆転写酵素PCR；リアルタイムPCR；ディファレンシャルディスプレイPCR；PCRに基づくゲノム分析；AP（Arbitrary Primed）-PCR；多重PCR；ロングレンジ（long-range）PCR；直線的（linear）PCR；逆PCR；定量的PCR；タッチダウンPCR；インサイチューPCR；ベクトレット（vectorette）PCR；TAIL（thermal asymmetric interlaced）PCR；MOPAC（mixed oligonucleotide-primed amplification of cDNA）；3'-RACE；5'-RACE、高分解能融解分析、およびプライマー伸長反応
からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記アニーリング工程が、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して、前記少なくとも一つのプライマーのアニーリング特異性を増加させるために十分な温度で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
（a）鋳型配列の変性、少なくとも一つのプライマーのアニーリング、および少なくとも一つのプライマーの伸長を少なくとも2サイクル含む、第一増幅産物を形成させるために第一のアニーリング温度で鋳型配列の第一段階増幅を実施する工程であって、少なくとも一つのプライマーが、
（i）鋳型配列に相補的な3'セグメント；
（ii）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含み、かつ少なくとも一つのプライマーのアニーリング位置を3'セグメントに制限する、3'セグメントの5'末端にあるイソ領域；ならびに
（iii）鋳型配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、イソ領域の5'末端にある5'セグメント
を含む、工程と、
（b）第二のアニーリング温度で、
（i）工程（a）から生成された増幅産物の変性、少なくとも一つのプライマーのアニーリング、および少なくとも一つのプライマーの伸長；または
（ii）工程（a）から生成された増幅産物の変性、ならびに少なくとも一つのプライマーの5'セグメントに対応する配列を含むプライマーのアニーリングおよび伸長
を少なくとも1サイクル含む、第一増幅産物の第二段階増幅を実施する工程と
を含む、二段階反応において標的核酸を増幅するための方法。
[本発明1007]
標的核酸が、
（a）オリゴヌクレオチドdTプライマーもしくはアンカード（anchored）オリゴヌクレオチドdTプライマーを標的mRNAのポリAテール領域にハイブリダイズさせるか、または六量体、七量体、および／もしくは八量体のランダムオリゴヌクレオチドを標的mRNAにハイブリダイズさせること；ならびに（b）cDNAを作製するために標的mRNAを逆転写すること
により形成されたcDNAである、本発明1006の方法。
[本発明1008]
二段階増幅手順が、
PCR；多重DNA増幅；差次的に発現された遺伝子の同定；3'-RACE；プライマー伸長反応；5'-RACE；全長cDNAの増幅；5'濃縮（enriched）cDNAの増幅；DNAフィンガープリント；RNAフィンガープリント；多重遺伝子ファミリーにおける保存されたホモロジーセグメントの同定；ヌクレオチド配列変動の同定；プレmiRNA増幅；rRNA増幅；PCR後の高分解能融解分析；および変異誘発
の群を含む方法に適用される、本発明1006の方法。
[本発明1009]
（a）3'セグメントが鋳型配列に相補的である少なくとも一つのプライマーを合成する工程；
（b）イソCおよびイソGからなる群より独立に選択される少なくとも2個の連続するかまたは連続しない非標準塩基を含むイソ領域を、3'セグメントの5'末端に組み入れる工程であって、該イソ領域が、少なくとも一つのプライマーのアニーリング位置を3'セグメントに制限し、それにより、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して、3'セグメントのアニーリング特異性を増加させる、工程；
（c）鋳型配列を含有している鋳型の任意の領域に相補的なヌクレオチド配列を含む5'セグメントを、イソ領域の5'末端に組み入れる工程であって、それによって少なくとも一つのプライマーが、3'セグメントのみを有するプライマーと比較して増加した鋳型配列に対するアニーリング特異性を有する、工程
を含む、少なくとも一つのプライマーのアニーリング特異性を増加させるための方法。
[本発明1010]
前記合成する工程が、固相合成；DNA複製；逆転写；制限消化；ランオフ（run-off）転写；PCR；PCRに基づく方法；プライマー伸長反応；およびライゲーションからなる群より選択される方法を含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも一つのプライマー配列が6〜60デオキシリボヌクレオチド長または6〜60リボヌクレオチド長である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記イソ領域が約1〜約15個の非標準塩基を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記少なくとも一つのプライマーが増幅反応または二段階増幅反応において使用される、本発明1009の方法。