【手続補正書】
【提出日】平成21年2月19日(2009.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の柔軟性の鑑別方法であって、皮膚より採取した角層細胞をコンゴレッド色素で染色し、該色素で染色した角層細胞におけるβシート型のケラチンを偏光顕微鏡で観察し、その存在割合が高いほど皮膚柔軟性が低いと判定することを特徴とする鑑別方法。
【請求項２】
染色方法がダイレクトファーストスカーレット染色であることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚の鑑別方法。
【請求項３】
標準的な角層細胞を３７℃、湿度１００％の条件で７２時間保存する処置を施した比較サンプルとの比較において、βシート型ケラチンの存在割合を推定することを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚の鑑別方法。
【請求項４】
次に示す工程に従って行われることを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の皮膚の鑑別方法。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、遠心分離によって得た角層細胞ペレットからパラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。或いは、粘着テープに付いた前記角層細胞を直接パラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。
（工程３）工程２で得られた切片より、切片厚５μｍの角層細胞標本を調製する。
（工程４）前記角層細胞標本をコンゴレッドの染色液中において２０分間放置して染色を行う。
（工程５）染色された角層細胞標本を１００％エタノールで洗浄風乾後、バルサムに封入して偏光顕微鏡下で観察を行い、βシート型ケラチンの存在割合を推定する。
（工程６）βシート型ケラチンの存在量が多いほど、皮膚柔軟性が低いと判定する。
【請求項５】
予め、皮膚より採取した角層細胞を紫外線を光源として顕微鏡下観察し、蛍光の度合いより、１）蛍光強度の強いものと、２）蛍光強度の弱いものの２種に分別し、蛍光強度の強いもののみを対象とすることを特徴とする、請求項１〜４何れか１項に記載の皮膚の鑑別方法。
【請求項６】
化粧料の選択の為であることを特徴とする、請求項１〜５の何れか１項に記載の皮膚の鑑別方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
化粧料を選択する上で、その適用されるべき肌の特性を知ることは非常に重要なことである。これは、肌状態の違いにより、同じ化粧料を使用しても、好ましい効果をもたらすことも存するし、却って好ましからざる効果をもたらすことも存するためである。即ち、肌の手入れにおいて、適切な化粧料を選択することは効果と安全性を確保する上で重要なテーマであると言える。この様な状況を反映して、種々の肌の鑑別法と化粧料の選択法が考案されている。中でも、容易に採取できて、肌状態を適切に反映し、且つ、肌情報を多く有している角層細胞を用いる方法は、近年重点的に研究が重ねられている。かかる角層細胞に関する技術としては、主として、形状、面積、核を有するか否か、どの程度のメラニン顆粒を有するか等、角層細胞の形状或いは病理学的特徴に関するものが主流を占めている。又、形状に加えて比較的マクロな肌の凹凸の状態などを補助因子として加えているものが開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７を参照）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
しかしながら、その一方、角層細胞の形状や病理学的特徴は大差なくとも、肌の状態には大きな差が存するような例も散見されており、角層細胞の形状或いは病理学的特徴以外に、肌の状態に対する因子が存することが推察されている。特に、皮膚の柔軟性などのような皮膚形態を組織学的手段によって、鑑別する手段は存しておらず、専ら弾力などの皮膚の物理学的変形特性による鑑別に依存しているのが現状である。この様な柔軟性などの皮膚形態は、人の外観印象形成に大きな影響を与えるため、柔軟性喪失を適切に鑑別し、予防する手段の開発が望まれていた。かかる皮膚柔軟性低下の予防策としては、例えば、エラスターゼ阻害剤を利用する方法（例えば、特許文献８を参照）、ヒアルロニダーゼ阻害剤を利用する方法（例えば、特許文献９を参照）、アスコルビン酸グルコシドを利用する方法（例えば、特許文献１０を参照）等が開示されており、これらを有効に活用するためには、柔軟性の低下を初期段階に鑑別する手段の開発が必要であると言える。このため、皮膚より採取した角層細胞に紫外線を照射し、その角層細胞の蛍光強度を指標に皮膚を鑑別する方法が開示されている（例えば、特許文献１１、特許文献１２を参照）。この技術により、角層細胞の化学構造を光学的情報から推定し、皮膚の鑑別確度の向上が為されたが、角層細胞において、化学構造的な大きな変化がなくとも、わずかながら蛍光が存することから、かかる蛍光がノイズとなる場合が存し、定量性に課題も存した。かような方法においては、定量性を高め、より低コストで簡便な鑑別方法が望まれていた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
（１）皮膚の柔軟性の鑑別方法であって、皮膚より採取した角層細胞をコンゴレッド色素で染色し、該色素で染色した角層細胞におけるβシート型のケラチンを偏光顕微鏡で観察し、その存在割合が高いほど皮膚柔軟性が低いと判定することを特徴とする鑑別方法。
（２）染色方法がダイレクトファーストスカーレット染色であることを特徴とする、（１）に記載の皮膚の鑑別方法。
（３）標準的な角層細胞を３７℃、湿度１００％の条件で７２時間保存する処置を施した比較サンプルとの比較において、βシート型ケラチンの存在割合を推定することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の皮膚の鑑別方法。
（４）次に示す工程に従って行われることを特徴とする、（１）〜（３）の何れかに記載の皮膚の鑑別方法。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、遠心分離によって得た角層細胞ペレットからパラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。或いは、粘着テープに付いた前記角層細胞を直接パラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。
（工程３）工程２で得られた切片より、切片厚５μｍの角層細胞標本を調製する。
（工程４）前記角層細胞標本をコンゴレッドの染色液中において２０分間放置して染色を行う。
（工程５）染色された角層細胞標本を１００％エタノールで洗浄風乾後、バルサムに封入して偏光顕微鏡下で観察を行い、βシート型ケラチンの存在割合を推定する。
（工程６）βシート型ケラチンの存在量が多いほど、皮膚柔軟性が低いと判定する。
（５）予め、皮膚より採取した角層細胞を紫外線を光源として顕微鏡下観察し、蛍光の度合いより、１）蛍光強度の強いものと、２）蛍光強度の弱いものの２種に分別し、蛍光強度の強いもののみを対象とすることを特徴とする、（１）〜（４）何れかに記載の皮膚の鑑別方法。
（６）化粧料の選択の為であることを特徴とする、（１）〜（５）何れかに記載の皮膚の鑑別方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
前記皮膚角層細胞の採取、処理及び皮膚の鑑別の工程は、以下のように行うことが好ましい。
（工程１）粘着テープを用いて、皮膚より角層細胞を採取する。
（工程２）前記粘着テープの粘着剤は有機溶剤により軟化・溶解させ、遠心分離によって得た角層細胞ペレットからパラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。或いは、粘着テープに付いた前記角層細胞を直接パラフィン薄切片又は凍結切片を作成する。
（工程３）工程２で得られた切片より、切片厚１〜１０μｍ、好ましくは５μｍの角層細胞標本を調製する。
（工程４）前記角層細胞標本をコンゴレッド（ダイレクトファーストスカーレット）の染色液中において１０〜６０分、好ましくは２０分間放置して染色を行う。
（工程５）染色された角層細胞標本を９０〜１００％の、好ましくは１００％のエタノールで洗浄風乾後、バルサムに封入して偏光顕微鏡下で観察を行い、βシート型ケラチンの存在割合を推定する。
（工程６）βシート型ケラチンの存在量が多いほど、皮膚柔軟性が低いと判定する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
前記コンゴレッド色素（染料）による染色において、βシート型のタンパク質（例えば
、ケラチン、アミロイド）の染色に有効な成分はダイレクトファーストスカーレット（Direct Fast Scarlet）であり、コンゴレッド色素より抽出精製され試薬として市販されているものを用いて染色することが好ましい。ダイレクトファーストスカーレット染色液は、定法によって作成し用いることができる。例えば、染色液として、蒸留水１００〜３０ｍｌ、好ましくは５０ｍｌを４０〜６０℃、好ましくは５０℃に加温し、ダイレクトファーストスカーレット０．１〜１ｇ、好ましくは０．５ｇ及び塩化ナトリウム２〜１０ｇ、好ましくは５ｇを溶解し、この液２０〜６０ｍｌ、好ましくは４０ｍｌに純アルコール１〜３０ｍｌ、好ましくは１０ｍｌを混合して調製することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
前記βシートとは、タンパク質の構造の一つである。タンパク質の鎖は−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−という構造が繰り返され、このＨ（水素）とＯ（酸素）は水素結合で引き合い、タンパク質の構造を決める大きな要因である。例えば、あるアミノ酸のＯとその３つ先のＨが順番に水素結合し、タンパク質の鎖が螺旋型を描いたものはαへリックスと呼ばれる。又、アミノ酸の鎖が一直線に長く伸びた形で、何本か水素結合で引き合って束になり平面的に並んだものはβシートと呼ばれる。このようにタンパク質は、一定の形に折り畳まれることによって立体構造を為し、柔軟性や流動性を保持しつつその機能を発揮する。かかる特性は、物理学的な特性にとどまることなく、見た目、個人の自覚的認識の柔らかさにも及んでいることを本発明者らは見出している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
皮膚角層細胞であるケラチンがβシート型で存するかの確認は、例えば、標準的な角層細胞を３５〜４０℃、好ましくは３７℃、湿度９０〜１００％、好ましくは１００％の条件で４８〜９６時間、好ましくは７２時間保存する処置、又は、オートクレーブ１１０〜１３０℃、好ましくは１２１℃で、１０〜３０分、好ましくは２０分間処置を施した後、市販の蛍光顕微鏡システム（例えば、オリンパス社製）を用いて蛍光強度を測定することによって為される。則ち、かような湿熱処置によってαヘリックスからβシートへのケラチンの構造転移が促進され、βシート型ケラチンの増加に伴って角層細胞の蛍光強度が顕著に増加する所以である（図１参照）。また、この湿熱処置後、コンゴレッド染色した角層細胞を偏光顕微鏡で観察することによって、βシート型構造を示す偏光の増加を検出できる（図２参照）。蛍光を用いた方法では、角層細胞の表層（コーニファイドエンベロープ）と角層細胞の内部（ケラチン）の両方からの積算された蛍光を観察しているのに対し、本発明の偏光は角層細胞の断面を観察しており、角層細胞内部であるβシート型ケラチンを直接観察できる点において格段に定量性が優れている。また、かような湿熱処置の程度や種々の蛍光強度の基準となるサンプルを予め設定しておき、それらと偏光の程度との関係を利用することで、後述するようなβシート型ケラチンの存在割合を推定することも本発明の範囲に属するものである。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
前記βシート型のケラチンの存在割合を推定するには、偏光顕微鏡による角層細胞の偏光の強弱判定を肉眼にて３〜５段階で定量化を行う（図３参照）。前述した湿熱処置の程度や種々の偏光強度の基準となるサンプルを予め設定しておき、かような偏光の強弱を示す角層細胞の基準図（図３参照）との相関関係を利用することで、βシート型ケラチンの存在割合を推定することができる。則ち、角層細胞における偏光の強弱より、角層細胞を構成するケラチンにおいて、βシートのものが多いか、αヘリックスのものが多いかを推定することができる訳である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
前記皮膚柔軟性とは、皮膚の柔らかさ又は硬くない程度を示す。かかる程度は、物理学的変形可能性によって表現される、「物理学的な柔らかさ」にとどまらず、「見た目の柔らかさ」或いは「自覚としての柔らかさ」をも包含する言葉である。前記見た目の柔らかさは、物理学的特性によってのみ表されるものではないため、その指標が存しないのが現状である。従来の物理学的変形を指標とする、皮膚柔軟性の計測機器としては、ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ ＳＥＭ５７５（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社製）、ビーナストロン（株式会社アクシム社製）等が例示できる。ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ ＳＥＭ５７５では皮膚を吸引し、吸引力に対する皮膚の伸びを指標として皮膚柔軟性を計測できる。また、ビーナストロンでは触覚センサーを皮膚に押し込み、皮膚の周波数変化量を指標として皮膚柔軟性を計測できる。これらの計測機器を用いて、個人差、加齢変化、部位差、及び全身性強皮症の皮膚硬化度等に関する皮膚柔軟性の報告がなされている。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
角層細胞における、βシート型構造と偏光との関係を確認するために、粘着テープを使用してテープストリップによって、３１名の女性被験者（２０〜４９才）の頬部より角層細胞を各々２回分採取し、粘着テープの粘着剤を溶解させ、遠心分離によって得た角層細胞ペレットからパラフィン薄切片を作成し、角層細胞標本を調製した。角層細胞標本の一方に対して３７℃、湿度１００％の条件で７２時間の湿熱処置を施した後、オリンパス社製の蛍光顕微鏡システム（カメラＤＰ−５０、顕微鏡ＢＸ−６０、メタルハライド光源）を用いて暗室にて角層細胞の蛍光を観察した。さらに、コンゴレッド染色液中において２０分間放置して染色を行い、１００％エタノールで洗浄風乾後、バルサムに封入してオリンパス社製のシステム偏光顕微鏡（ＢＸ５１−Ｐ）で観察を行った。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
２３才の女性の頬部角層細胞について、図１に湿熱処置の前（左図）及び後（右図）の蛍光画像を、図２に、湿熱処置の前（左図）及び後（右図）の偏光画像を示す。これらの結果のように、湿熱処置によって明らかに蛍光及び偏光の増加が認められた。このような変化は今回のすべての被験者の角層細胞において認められ、αヘリックスからβシートへ
のケラチンの構造転移が促進され、βシート型構造を示す蛍光及び偏光によるものと推察される。かように、コンゴレッド色素によって染色された角層細胞は、偏光顕微鏡によってβシート型ケラチンについて鑑別できることが分かる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の皮膚の鑑別法及び角層細胞への紫外線照射による蛍光強度を指標とした皮膚の鑑別方法（特許文献１２を参照）を用い、４２名の女性被験者（２０〜５５才）の肌の特性（柔軟性）を調べて化粧料の選択を行った。即ち、右頬部角層細胞の偏光の強弱の程度を示す図３の基準に従って、パネラーを柔軟性が少ない群（Ａ１群）、柔軟性がやや少ない群（Ａ２群）、柔軟性が充分に存する群（Ａ３群）の３群に分類し、次に、左頬部角層細胞の蛍光強度に従って、同様に柔軟性が少ない群（Ｂ１群）、柔軟性がやや少ない群（Ｂ２群）、柔軟性が充分に存する群（Ｂ３群）の３群に、４２名を再分類を行った。Ａ１及びＢ１群には、処方１に示す柔軟性の喪失抑制作用及び柔軟性回復作用に優れる化粧水を、Ａ２及びＢ２群には処方２に示す、柔軟性喪失抑制作用を有する化粧水を、Ａ３及びＢ３群には通常の保湿化粧水を渡し、今まで使用していた化粧水に代えて、左右半顔の別々にて、４週間連日使用してもらった。使用終了後に、アンケートを実施し、普段使用している化粧水と、試験に使用した化粧水とではどちらの方が肌を柔軟にしたかを回答してもらった。結果を表２に示す。