【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を２つ以上の区分に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
ｇ．前記区分の前記数に基づいて前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の区分に分割しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅過程中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記決定する工程（ｆ）中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２のライゲーションプローブをそれぞれ前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合させるようにデザインする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記分割する工程（ｄ）が前記標的ポリヌクレオチド分子を分割する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記２つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合させるようにデザインする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記区分が少なくとも２つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
連続油相が前記水滴を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第１の領域に結合させるようにデザインし、前記第２のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第２の領域に結合させるようにデザインし、前記第１および第２の領域が同一の配列を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試験染色体が２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体、Ｘ染色体、およびＹ染色体からなる群から選択される染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第２のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合させるようにデザインする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合させるようにデザインする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記隣接配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ライゲーション反応が、前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域と前記３’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
酵素によって切断可能な前記部位が１つ以上のウラシルを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１のシグナル伝達因子が第１の色調の蛍光マーカーであり、前記第２のシグナル伝達因子が第２の色調の蛍光マーカーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記決定する工程（ｆ）が、前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第１の染色体の異なる領域に向けられ、前記第２のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第２の染色体の異なる領域に向けられる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１および第２のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、請求項１３に記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の２つ以上の水滴に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む２つ以上の水滴の数を決定する工程、および
ｇ．前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の水滴に分割しない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記増幅する工程（ｅ）中または前記決定する工程（ｆ）中に、前記２つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ｄ）の前記２つ以上の水滴が４，０００滴超を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記４，０００滴超を１００，０００水滴／ｍｌ超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記液滴は単分散液滴である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記方法は、１，０００コピー未満の前記第１の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第１の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記２つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、５０ｎｍと３００μｍとの間である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションする、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記２つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５５】
前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス（商標）である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記クライトックスが、クライトックスＡＳ、クライトックスＦＳＨ、およびクライトックスＦＳＨのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記油相がフッ素化油を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記２つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物中の標的ポリヌクレオチドの相対レベルを、胎児の遺伝子状態の指標とする方法であって、
ａ．標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと合わせる工程、
ｂ．前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも１つが前記標的ポリヌクレオチドおよび前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
ｃ．前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
ｄ．前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
ｅ．前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定する工程
を含む、方法。
【請求項６０】
前記反応体積が連続油相内の水滴である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記反応体積が、平均して、１コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記反応体積が、平均して、１コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
前記標的ポリヌクレオチドは、１８、１３、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程（ｅ）中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下：
ａ．複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
ｂ．少なくとも１つの前記結合したライゲーションプローブの５’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの３’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも１つのライゲーション産物を得る工程、
ｃ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
ｄ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
ｅ．前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。
【請求項７６】
前記変換が５０℃超での加熱を含む、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項７７】
前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項７８】
前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項７９】
前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８０】
前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８１】
前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８２】
前記マイクロカプセルが７０℃超の温度で実質的にインタクトなままである、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８３】
前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８４】
前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８５】
前記遺伝子標的が、２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８６】
１つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８７】
１つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８８】
１つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項７５に記載のマイクロカプセル。
【請求項８９】
２つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第１の標的ポリヌクレオチドに向けられる第１のライゲーションプローブを含み、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第２の標的ポリヌクレオチドに向けられる第２のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
【請求項９０】
前記第１の標的ポリヌクレオチドおよび前記第２の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９１】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９２】
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９３】
前記第１の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第１の領域を含み、前記第２の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第２の領域を含み、前記第１の領域が前記第２の領域と同一の配列を有さない、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９４】
前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９５】
前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも０．０１％の濃度で存在する、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９６】
前記油中水混合物が前記第１の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９７】
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９８】
前記第１のライゲーションプローブが環状プローブである、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項９９】
前記第１のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、請求項８９に記載の油中水混合物。
【請求項１００】
前記酵素切断がウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、請求項９９に記載の油中水混合物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
本発明は、母体および胎児の遺伝子材料の混合物中の標的配列の差分検出（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）方法であって、ａ）母体および胎児の遺伝子材料の両方を含む母体組織を得る工程；ｂ）遺伝子材料を個別のサンプルに分配する工程であって、各サンプルが、平均して、サンプルあたり約１つ以下の標的配列を含み、個別のサンプルが既知の標的配列に対するプライマー組および／または既知の基準配列に対する基準プライマー組を含む、分配する工程、ｃ）増幅反応を行う工程、ｄ）個別のサンプル中の標的配列または基準配列の存在を検出する工程、およびｅ）検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して、差分量の標的配列を決定する工程を含む、方法を含む。前記方法は、さらに、検出された標的配列の検出された基準配列に対する比を比較して差分量の標的配列を決定する工程であって、検出された標的配列の検出された基準配列に対する相違が胎児の遺伝子異常を示す、決定する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、本方法は胎児異数性の検出方法である。いくつかの場合では、標的配列は異数性のマーカーであり、基準配列は母体および胎児の遺伝子材料中の二倍体である。母体組織は、母体の末梢血、血漿、もしくは血清、または本明細書中に記載の他の組織であり得る。いくつかの実施形態では、反応サンプルは、乳濁液中の水相中に存在する。いくつかの場合では、標的配列または基準配列の存在の検出は、さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕでの蛍光標識を有する核酸とのハイブリッド形成を含む。いくつかの場合では、反応サンプル数は少なくとも約１０，０００である。いくつかの場合では、工程ｂ）〜ｅ）を、異なる標的配列に対するプライマー組を使用して繰り返す。いくつかの場合では、反応体積は、特定の標的配列に対する各プライマー組を有する１つを超えるプライマー組を含む。いくつかの場合では、反応体積は、特定の基準配列に対する各プライマー組を有する１つを超える基準プライマー組を含む。使用することができるプライマー組の例には、ヒト２１番染色体、ヒト１８番染色体、ヒト１３番染色体、またはヒトＸ染色体に特異的なプライマー組が含まれる。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が１を超える場合に検出される。いくつかの場合では、異数性は、検出された標的配列の基準配列に対する比が１未満の場合に検出される。いくつかの場合では、標的配列は、ＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子（Ｆ８遺伝子）、βグロビン、血色素症、Ｇ６ＰＤ、神経線維腫症、ＧＡＰＤＨ、βアミロイド、またはピルビン酸キナーゼ遺伝子の少なくとも一部である。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を２つ以上の区分に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の領域を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む前記区分の数を決定する工程、および
ｇ．前記区分の前記数に基づいて前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
（項目２）
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の区分に分割しない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記増幅過程中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記決定工程（ｆ）中に前記２つ以上の区分が実質的にインタクトなままである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２のライゲーションプローブをそれぞれ前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合させるようにデザインする、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記分割工程（ｄ）が前記標的ポリヌクレオチド分子の分割を含まない、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記２つ以上の区分が前記ライゲーションした産物から開始される増幅反応を含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記第１のライゲーションプローブを種内の個体間で保存されているポリヌクレオチド配列に結合させるようにデザインする、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記区分が少なくとも２つの不混和性流体の混合物内に存在する水滴である、項目１に記載の方法。
（項目１１）
連続油相が前記水滴を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチドに結合し、少なくとも４つのライゲーションプローブを前記第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記第１のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第１の領域に結合させるようにデザインし、前記第２のライゲーションプローブを前記第１の標的ポリヌクレオチド内の第２の領域に結合させるようにデザインし、前記第１および第２の領域が同一の配列を有さない、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一ではない、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記試験染色体が２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２番染色体、Ｘ、およびＹ染色体からなる群から選択される染色体である、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが染色体のセグメントである、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記染色体のセグメントが胎児異数性に関連する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして環状のライゲーションした産物を得る、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第２のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションして前記第１および第２のライゲーションプローブの少なくとも一部を含む線状のライゲーションした産物を得る、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の近接配列に結合させるようにデザインする、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域および前記３’領域を、それぞれ、前記第１の標的ポリヌクレオチド内の隣接配列に結合させるようにデザインする、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記隣接配列が少なくとも１つのヌクレオチドによって分離される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記ライゲーション反応が、前記第１のライゲーションプローブの前記５’領域と前記３’領域との間の領域中にヌクレオチドを組み込むためのテンプレート駆動ギャップ充填反応をさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１のライゲーションプローブが酵素によって切断可能な部位を含む、項目１に記載の方法。
（項目２８）
酵素によって切断可能な前記部位が１つ以上のウラシルを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
酵素によって切断可能な前記部位が制限部位を含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目１に記載の方法。
（項目３１）
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目１に記載の方法。
（項目３２）
酵素反応を行って線状ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３３）
酵素反応を行って一本鎖ポリヌクレオチドを除去する工程をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３４）
前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子にコンジュゲートし、前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子にコンジュゲートする、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記第１のシグナル伝達因子が第１の色調の蛍光マーカーであり、前記第２のシグナル伝達因子が第２の色調の蛍光マーカーである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記決定工程（ｆ）が、前記第１のライゲーションプローブを第１のシグナル伝達因子で検出する工程および前記第２のライゲーションプローブを第２のシグナル伝達因子で検出する工程を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第１のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第１の染色体の異なる領域に向けられ、前記第２のライゲーションプローブが複数のライゲーションプローブを含み、各プローブが第２の染色体の異なる領域に向けられる、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが試験染色体であり、前記第２の標的ポリヌクレオチドが基準染色体である、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記第１および第２のライゲーションプローブを同一のシグナル伝達色を有するシグナル伝達因子とコンジュゲートする、項目１４に記載の方法。
（項目４０）
遺伝子材料集団内の標的ポリヌクレオチドのコピー数を検出する方法であって、
ａ．第１のライゲーションプローブを第１の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｂ．第２のライゲーションプローブを第２の標的ポリヌクレオチドに結合させる工程、
ｃ．前記第１および第２のライゲーションプローブをライゲーション反応に供して１つ以上のライゲーションした産物を得る工程、
ｄ．前記１つ以上のライゲーションした産物を連続油相内の２つ以上の水滴に分割する工程、
ｅ．前記１つ以上のライゲーションした産物内の配列を増幅して増幅された産物を得る工程、
ｆ．前記増幅された産物を含む２つ以上の水滴の数を決定する工程、および
ｇ．前記第１の標的ポリヌクレオチドのコピー数を計算する工程
を含む、方法。
（項目４１）
前記標的ポリヌクレオチドを前記２つ以上の水滴に分割しない、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記増幅工程（ｅ）中または前記決定工程（ｆ）中に、前記２つ以上の水滴が実質的にインタクトなままである、項目４０に記載の方法。
（項目４３）
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４４）
工程（ｄ）の前記２つ以上の水滴が４，０００滴超を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４５）
前記４，０００滴超を１００，０００水滴／ｍｌ超の密度で単一のチャンバー内で互いに合わせる、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記液滴は単分散液滴である、項目４０に記載の方法。
（項目４７）
前記方法は、１，０００コピー未満の前記第１の標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子材料集団内の前記第１の標的ポリヌクレオチドを検出することができる、項目４０に記載の方法。
（項目４８）
前記２つ以上の水滴が平均して１つを超えるライゲーションしたプローブを含み、前記方法が、アルゴリズムを使用して水滴あたりの標的にライゲーションしたプローブの平均数を計算する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
（項目４９）
前記２つ以上の水滴の直径は、それぞれ、平均して、５０ｎｍと３００μｍとの間である、項目４０に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが遺伝子障害に関連する染色体セグメントである、項目４０に記載の方法。
（項目５１）
前記ライゲーション反応によって前記第１のライゲーションプローブの５’領域を前記第１のライゲーションプローブの３’領域にライゲーションする、項目４０に記載の方法。
（項目５２）
前記第１のライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目４０に記載の方法。
（項目５３）
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目４０に記載の方法。
（項目５４）
前記２つ以上の水滴が相当数のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたビーズを含まない、項目４０に記載の方法。
（項目５５）
前記連続油相が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目４０に記載の方法。
（項目５６）
前記陰イオン性フルオロ界面活性剤が陰イオン性フルオロ界面活性剤のアンモニウム塩であるクライトックス（商標）である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記クライトックスが、クライトックスＡＳ、クライトックスＦＳＨ、およびクライトックスＦＳＨのモルホリノ誘導体からなる群から選択される、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
前記油相がフッ素化油を含む、項目４０に記載の方法。
（項目５９）
前記２つ以上の水滴がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたマイクロビーズを含まない、項目４０に記載の方法。
（項目６０）
胎児の遺伝子状態を検出する方法であって、
ａ．標的ポリヌクレオチドを含む母体および胎児の遺伝子材料の混合物を得る工程、
ｂ．前記混合物を前記標的ポリヌクレオチドに結合するターゲティングオリゴヌクレオチドと合わせる工程、
ｃ．前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを反応体積に細分割する工程であって、前記反応体積の少なくとも１つが前記標的ポリヌクレオチドや前記ターゲティングオリゴヌクレオチドを含まない、細分割する工程、
ｄ．前記反応体積内で増幅反応を行う工程、
ｅ．前記反応体積内の前記標的ポリヌクレオチドまたは前記ターゲティングオリゴヌクレオチドの存在を検出する工程、および
ｆ．前記混合物中の前記標的ポリヌクレオチドの相対レベルを決定して、胎児の遺伝子状態を検出する工程
を含む、方法。
（項目６１）
前記反応体積が連続油相内の水滴である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがプライマー対を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３）
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが分子反転プローブを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６５）
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがパッドロックプローブを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６６）
前記反応体積が、平均して、１コピーを超えるターゲティングオリゴヌクレオチドを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６７）
前記反応体積が、平均して、１コピーを超える標的ポリヌクレオチドを含む、項目６０に記載の方法。
（項目６８）
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するプライマーをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６９）
前記反応体積が基準ポリヌクレオチドに対するライゲーションプローブをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目７０）
前記ライゲーションプローブを前記反応体積内で増幅する、項目６３に記載の方法。
（項目７１）
前記遺伝子材料が胎児の遺伝子材料を選択的に予め富化させた細胞サンプルに由来しない、項目６０に記載の方法。
（項目７２）
前記標的ポリヌクレオチドは、１８、１３、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目６０に記載の方法。
（項目７３）
前記反応体積が油相内の水滴であり、前記ターゲティングオリゴヌクレオチドがライゲーションプローブであり、工程（ｆ）中の前記決定が前記ライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数を基準ポリヌクレオチドに向けられるライゲーションプローブの増幅された産物を含む液滴の数と比較することを含む、項目６０に記載の方法。
（項目７４）
前記基準ポリヌクレオチドが、胎児の遺伝子異常に関連しない染色体領域である、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記ターゲティングオリゴヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドへのハイブリッド形成後のライゲーションの際に環状になるライゲーションプローブである、項目６０に記載の方法。
（項目７６）
ライゲーションしたプローブを含むマイクロカプセルであって、前記マイクロカプセルが、以下：
ａ．複数のライゲーションプローブを遺伝子サンプル内の標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させる工程、
ｂ．少なくとも１つの前記結合したライゲーションプローブの５’末端を同一または異なる結合したライゲーションプローブの３’末端にライゲーションし、それにより、少なくとも１つのライゲーション産物を得る工程、
ｃ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水溶液を液滴生成デバイスに導入する工程、
ｄ．前記少なくとも１つのライゲーション産物を含む水滴を産生するためのデバイスを使用する工程であって、前記水滴が不混和性流体内に存在する、工程、および
ｅ．前記液滴を固相外面を含むマイクロカプセルに変換する工程
によって得られる、マイクロカプセル。
（項目７７）
前記変換が５０℃超での加熱を含む、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目７８）
前記不混和性流体がフッ素化界面活性剤を含む、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目７９）
前記不混和性流体がフッ化炭素油を含む、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８０）
前記不混和性流体が陰イオン性フルオロ界面活性剤を含む、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８１）
前記不混和性流体がアンモニウムクライトックスを含む、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８２）
前記マイクロカプセルが、オリゴヌクレオチドに結合したビーズを含まない、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８３）
前記マイクロカプセルが７０℃超の温度で実質的にインタクトなままである、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８４）
前記ライゲーションプローブが、遺伝子障害に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８５）
前記ライゲーションプローブが、胎児異数性に関連する標的ポリヌクレオチドに選択的に結合させることができる、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８６）
前記遺伝子標的が、２１番染色体、１３番染色体、１８番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される染色体内に存在する、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８７）
１つ以上の前記ライゲーションプローブがパッドロックプローブである、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８８）
１つ以上の前記ライゲーション産物が環状化プローブである、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目８９）
１つ以上の前記ライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目７６に記載のマイクロカプセル。
（項目９０）
２つ以上の水滴を含む油中水混合物であって、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第１の標的ポリヌクレオチドに向けられる第１のライゲーションプローブを含み、前記２つ以上の水滴のうちの少なくとも１つが第２の標的ポリヌクレオチドに向けられる第２のライゲーションプローブを含む、油中水混合物。
（項目９１）
前記第１の標的ポリヌクレオチドおよび前記第２の標的ポリヌクレオチドが同一の分子である、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９２）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドの配列と異なる配列を有する、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９３）
前記第１の標的ポリヌクレオチドが前記第２の標的ポリヌクレオチドと同一の配列を有する、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９４）
前記第１の標的ポリヌクレオチドがゲノムセグメント内に第１の領域を含み、前記第２の標的ポリヌクレオチドが前記ゲノムセグメント内に第２の領域を含み、前記第１の領域が前記第２の領域と同一の配列を有さない、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９５）
前記油中水混合物がアンモニウムクライトックス界面活性剤をさらに含む、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９６）
前記アンモニウムクライトックス界面活性剤が前記混合物の油相中に少なくとも０．０１％の濃度で存在する、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９７）
前記油中水混合物が前記第１の標的ヌクレオチドの増幅された産物を含まない、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９８）
前記第１のライゲーションプローブが分子反転プローブである、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目９９）
前記第１のライゲーションプローブが環状プローブである、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目１００）
前記第１のライゲーションプローブが、酵素切断に供した環状化プローブの線状化産物である、項目９０に記載の油中水混合物。
（項目１０１）
前記酵素切断がウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたは制限酵素によって触媒される、項目１００に記載の油中水混合物。
参照による引用
本明細書中で言及された全ての刊行物および特許出願は、その全体および各刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参考として援用されることが示されるのと同一の範囲に参考として援用される。