(57)【要約】      （修正有）【課題】酸性ホスファターゼの一種を用いて縮合リン酸のリン酸分子をヌクレオシド混合物またはイノシンに付加する製造法において、反応後に残存するオルトリン酸を回収して、再縮合し、再度リン酸付加反応の原料とし、リン酸化収率（核酸収率）及びリン酸使用率を高めるヌクレオチドの製造方法の提供。【解決手段】ヌクレオシドをポリリン酸と酸性フォスファターゼによりリン酸化させヌクレオチドを製造するに際し、（a）ポリリン酸として縮合リン酸塩を用い、リン酸化の反応を一定のｐＨで制御して行うリン酸付加工程、（ｂ）該反応液からリン酸塩を晶析除去する工程、（ｃ）上記（ｂ）で取得したリン酸塩に、オルトリン酸と水酸化ナトリウムを添加し、かつ総リン酸量に対してナトリウム量を1倍モル〜２倍モルに設定し、２００℃〜１２００℃において焼成縮合する工程、（ｄ）上記（ｃ）で得られた縮合リン酸塩を上記（a）の工程にリサイクルする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシドをポリリン酸と酸性フォスファターゼによりリン酸化するに際し、ポリリン酸として縮合リン酸塩を用い、リン酸化の反応を常にｐＨ４．１０〜５．１５の範囲内の一定のｐＨで制御して行うことを特徴とするヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
ヌクレオシドをポリリン酸と酸性フォスファターゼによりリン酸化させヌクレオチドを製造するに際し、
（a）ポリリン酸として縮合リン酸塩を用い、リン酸化の反応を常にｐＨ４．１０〜５．１５の範囲内の一定のｐＨで制御して行うリン酸付加工程、
（ｂ）該反応液からリン酸塩を晶析除去する工程、
（ｃ）上記（ｂ）で取得したリン酸塩に、オルトリン酸と水酸化ナトリウムを添加し、かつ総リン酸量に対してナトリウム量を1倍モル〜２倍モルに設定し、２００℃〜１２００℃において焼成縮合する工程、
（ｄ）上記（ｃ）で得られた縮合リン酸塩を上記（a）の工程にリサイクルすること
からなる、リン酸化収率かつリン酸使用率を向上させること特徴とするヌクレオチドの製造方法。
【請求項３】
ヌクレオシドが、イノシン、グアノシン、又はイノシン及びグアノシンの混合物であることを特徴とする請求項１〜２に記載の方法
【請求項４】
請求項２の上記（ｃ）のナトリウム量を、リン酸に対し１．６０〜１．７５モルとし、かつ温度３００℃〜１２００℃までの間で燃焼する請求項２〜３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグアノシン、イノシンなどのヌクレオシドに酸性ホスファターゼを用いて縮合リン酸塩を作用させ、リン酸を付加してヌクレオチド、例えば５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムや５’−イノシン酸二ナトリウムを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性ホスファターゼ (特開平７−２３１７９３号、特開平９−３７７８５号、特開２００１−２４５６７６号、特開２００１−１３６９８４号)は、縮合リン酸中の１つのリン酸を切り取りヌクレオシドに付加することができる。一方、オルトリン酸は、この様な目的に使われることができない。したがって、酸性ピロリン酸などの縮合度が２の縮合リン酸を使用すると、反応終了後には反応により生じたオルトリン酸が反応終了液に多量に残存してしまい、ヌクレオチドを単離精製した後の廃液中のオルトリン酸が多量となり処理できなく問題がある。
【０００３】
一方、オルトリン酸塩を回収してオルトリン酸および水酸化ナトリウムを所定量添加してナトリウム／リン酸のモル比を調整して燃焼炉またはキルンで燃焼することにより、希望の縮合度の縮合リン酸を得ることは周知の事実である。温度によっては、有機物を完全に燃焼して炭酸ガスとして系外に排出して、縮合リン酸を得る事ができる（特開平１１−６０２２１）。また、回収したリン酸に含有する有機物などを除去する事ができれば、低温で燃焼することにより縮合リン酸を得る事ができる。
【０００４】
具体的なリン酸の縮合再生の公知方法としては、Ｕｌｌｍａｎ‘ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,  ｖｏｌ．Ａ１９,  ４８７−４９２（１９９１年）に記されているように、縮合再生温度とＭ／Ｐ（Ｍはアルカリ金属元素のモル量、Ｐはリン酸元素のモル量を表す。）をコントロールすることにより、様々な縮合度の縮合リン酸を作り出すことができる。たとえば、Ｍ／Ｐモル比１．０の２００〜２５０℃で酸性ピロリン酸、Ｍ／Ｐモル比１．０の３００℃〜５００℃でヘキサメタリン酸、Ｍ／Ｐモル比１．７の３００〜５５０℃でトリポリリン酸が生成する。
【０００５】
テトラポリリン酸については、たとえばドイツ特許第７６２９０３号（１９５０年１０月５日発行）にあるように、３００℃を超えるが、リン酸混合物の融点よりは低い温度で加熱することによって取得できることが知られている。
【０００６】
更に、このようにして縮合した縮合リン酸塩はアルカリ金属を含むため、アルカリ性を示す。したがって、酸性フォスファターゼの至適条件である酸性ｐHで反応を行うために、酸を添加してｐＨを調整する必要がある。この際に反応前にｐHを調整するだけであると、ｐHがアルカリ側にシフトしてしまい、高リン酸化収率を得ることが困難になるという問題がある。
【特許文献１】特開平７−２３１７９３号公報
【特許文献２】特開平９−３７７８５号公報
【特許文献３】特開２００１−２４５６７６号公報
【特許文献４】特開２００１−１３６９８４号公報
【特許文献５】ドイツ特許第７６２９０３号
【非特許文献１】Ullman’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol.A19,487-492(1991)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、ヌクレオシドと縮合リン酸塩を酸性フォスファターゼを用いてリン酸化する際に、副生するオルトリン酸やピロリン酸を回収し、該リン酸を焼成縮合してアルカリ性ポリリン酸とし、該アルカリ性ポリリン酸を再びヌクレオシドのリン酸化に用いて、高リン酸化収率及び高リン酸使用率を達成することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を達成するため、種々検討の結果、焼成縮合して得られたアルカリ性の縮合リン酸塩を使用するに際し、酵素反応ｐHを常に一定に保つことにより上記課題が解決できることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明の第１は、ヌクレオシドをポリリン酸と酸性フォスファターゼによりリン酸化するに際し、ポリリン酸として縮合リン酸塩を用い、リン酸化の反応を常にｐＨ４．１０〜５．１５の範囲内の一定のｐＨで制御して行うことを特徴とするヌクレオチドの製造方法である。第２の発明は、ヌクレオシドをポリリン酸と酸性フォスファターゼによりリン酸化させヌクレオチドを製造するに際し、（a）ポリリン酸として縮合リン酸塩を用い、リン酸化の反応を常にｐＨ４．１０〜５．１５の範囲内の一定のｐＨで制御して行うリン酸付加工程、（ｂ）該反応液からリン酸塩を晶析除去する工程、（ｃ）上記（ｂ）で取得したリン酸塩に、オルトリン酸と水酸化ナトリウムを添加し、かつ総リン酸量に対してナトリウム量を1倍モル〜２倍モルに設定し、２００℃〜１２００℃において焼成縮合する工程、（ｄ）上記（ｃ）で得られた縮合リン酸塩を上記（a）の工程にリサイクルすることからなる、リン酸化収率かつリン酸使用率を向上させること特徴とするヌクレオチドの製造方法である。第３の発明は、第１〜２の発明において、ヌクレオシドが、イノシン、グアノシン、又はイノシン及びグアノシンの混合物である。第４の発明は、第２の発明において、（ｃ）のナトリウム量を、リン酸に対し１．６０〜１．７５モルとし、かつ温度３００℃〜１２００℃までの間で燃焼することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【０００９】
上述の通り、（ａ）〜（ｄ）工程を図１のように組み合わせることで、リン酸付加工程で生じた反応後の残存リン酸（オルトリン酸およびピロリン酸の混合物）を高収率でリサイクルして縮合リン酸塩中のリン酸使用率を高めることができる。さらに、アルカリ性の縮合リン酸塩を使用することによるリン酸化収率の低下を、ｐH調整方法を改良することにより、向上させることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明におけるリン酸化収率とは、ヌクレオシドがリン酸化するモル比率すなわちヌクレオチドへの変換収率であり、リン酸使用率とは、ヌクレオチド生産に用いられた原料縮合リン酸類のうちのヌクレオチド化に使用されたリン酸のモル比率を指す。
【００１１】
本発明で利用するヌクレオシドとしては、グアノシン、イノシン及びこれらの2種の混合物を指す。ヌクレオシドは市販品あるいは、公知の発酵法を用いて製造することができ、例えばグアノシンは特公昭５７−１４１６０号公報、イノシンは特公昭５７−２２５５８号公報、特公昭６２−３７９５９号公報記載の方法を採用できる。。
【００１２】
反応に用いるヌクレオシド懸濁液中のヌクレオシドの濃度は、１〜２０ｗｔ％であることが好ましい。ヌクレオシドの中でも、グアノシンについては反応性を向上させるために、比表面積０．４ｍ２／ｇ以上であることが好ましい。さらに、この懸濁液に対して、酸性ピロリン酸、トリポリリン酸ナトリウム、それ以上の縮合度の縮合リン酸塩との混合物が使用できる。これらの縮合リン酸を、ヌクレオシドのモル量に対して、２．０〜４．０倍モルのリン酸エステル結合量を含むように添加する。酸性ピロリン酸の場合は懸濁液の状態でｐＨが４．１０以下になるため、酸性ホスファターゼの至適条件であるｐＨ４．１０〜５．１５のうちの一定のｐＨになるようにアルカリ（水酸化ナトリウムなど）を加え、その他の縮合リン酸塩については、ｐＨ５．１５以上のアルカリ性を示すため、酸を適量加える。この場合の酸は、塩酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸など種々の酸が使用できる。
【００１３】
本発明で使用される酵素は、酸性フォスファターゼであれば特に制限は無いが、ヌクレオチダーゼ活性が低下したもの、ヌクレオシドに対する親和性が向上したものが好ましい。このため、微生物を起源とする野生型酸性フォスファターゼを、変異処理又は遺伝子工学的手法により得られる変異型酸性フォスファターゼが特に好ましい。例えば、特開２００２−２８９に記載されている参考例１に示されているプラスミドｐＥＰＩ３７０を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９/ｐＥＰＩ３７０をＬ培地５０ｍｌに摂種し、３７℃で１６時間培養後、培養液を酵素液として使用することができる。該菌株は、プラスミドｐＥＰＩ３０５をエシェリヒア・コリＪＭ１０９株に保持させたＦＥＲＭ  ＢＰ−５４２３株から、上述の特開２００２−２８９号公報の参考例１に記載の方法で構築できる。
【００１４】
この酵素液を１〜２００ｍｌ／Ｋｇ（反応前スラリー）となるように、反応原料スラリーに添加して、反応を開始する。反応温度は通常、２０〜６０℃の間、好ましくは３０〜４０℃の間で一定に制御する。反応時間は、基質量、酵素活性等により一定ではないが、通常、３〜５０時間である。反応中は、反応ｐＨを反応開始時の値に維持するため、酸性ピロリン酸を使用した場合はアルカリを、その他の縮合リン酸を使用した場合は酸を添加してｐＨを一定に制御する。ｐＨ制御は、指定したｐＨ±０．０５の範囲内で行われることが望ましい。本ｐＨ一定制御法により、ポリリン酸ナトリウムを使用した場合の、原料ヌクレオシドから５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムへのモル収率は、後述の実施例１中の図２に示したように２〜８％向上する。
【００１５】
図２にあるように、ｐH制御無しの場合は、反応前に図中の括弧で示めされたｐHに調整され、反応終了後には、図の横軸に表示した値となる。例えば、反応開始時にｐH４．２０程度であったものが、ｐH４．４７にまで変化する。単純にｐH変化だけの問題であったとすると、ｐH制御ありの場合の、ｐH４．２からｐH４．４７まで変化する際の、リン酸化収率の平均値が制御無しのケースと一致するはずであるが、実際には、このｐH領域では、ｐH制御無しの方が予想よりはるかに低いリン酸化収率の結果を示している。現段階でこの差異を説明できるメカニズムは、知られておらず、この差を理論的に説明することができない。
【００１６】
リン酸付加反応終了後の液には、未反応の縮合リン酸、反応に伴って分解したオルトリン酸およびピロリン酸、反応原料であるヌクレオシド、反応生成物であるヌクレオチド、５‘−リボヌクレオチド二ナトリウム（本発明では、５’−グアニルサン二ナトリウムと５‘−イノシン酸二ナトリウムの混合化合物を指す）が含まれる。このうち、オルトリン酸およびピロリン酸をナトリウム塩として晶析除去する。反応終了後の液を、温度４５〜６５℃に維持して、水酸化ナトリウムでｐＨ９．５〜１２．４に調整する。これを温度４〜１０℃にまで、冷却して晶析を行う。本晶析により８０％以上のオルトリン酸が晶析され、析出した結晶は、ろ過分離により回収して縮合再生に使用する。
【００１７】
ろ液には、生成物である５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムが含まれており、晶析や濃縮乾固など適当な方法によって、５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムを固体として取り出すことができる。
【００１８】
先に述べた冷却晶析によって得られたオルトリン酸塩およびピロリン酸塩の混合物は、新たに供給するオルトリン酸と水酸化ナトリウムを用いて、リン酸に対して、ナトリウム量を１倍モルから２倍モルまで変化させて、２００℃から１２００℃において焼成縮合する。新たに加えるオルトリン酸の量は、回収したオルトリン酸塩（リン酸水素二ナトリウム・１２水塩）のナトリウム量と加える水酸化ナトリウムの量を基準に、Ｍ／Ｐで適宣決めることができる。Ｍ／Ｐを１．６〜１．７５、好ましくは１．６６に調整して温度３００〜６００℃で電気炉または再生炉またはキルンを用いて１〜１２時間加熱することにより平均重合度が約３〜４のポリリン酸ナトリウムに縮合再生する。
【００１９】
焼成による縮合反応では、単一の縮合物ができるわけではなく、種々の縮合リン酸が生成するが、本発明では主として生成する生成物で表している。生成するその他の縮合リン酸塩も、本反応の基質となりえるので、特に分離、精製等の必要は無い。
【００２０】
これら再生した縮合リン酸を用いて、再度先に述べたリン酸化反応を行うことで、リン酸を無駄にすることなく、有効に製品化することができる。本製造プロセスに添加するリン酸原料（縮合原料もしくはオルトリン酸）リサイクルシステムにより、リン酸使用率は縮合再生する前は、２９〜４４％であったものが、縮合再生して使用した場合には５６〜８５％にまで飛躍的に向上する。これらの数値は、再生した縮合リン酸塩の縮合度とヌクレオシドの組み合わせによる幅である。以下、実施例でさらに説明する。
【実施例１】
【００２１】
平均重合度が約３〜４のアルカリ性縮合リン酸ナトリウムを使用してヌクレオシドにリン酸付加する場合のリン酸化収率向上
【００２２】
（１）酸性フォスファターゼを含む菌体の調製
特開２００２−２８９号公報に記載されている参考例１に示されているプラスミドｐＥＰＩ３７０を保持するエシェリヒア・コリＪＭ１０９/ｐＥＰＩ３７０をL培地５０ｍｌに摂種し、３７℃で１６時間培養後、培養液を酵素液として使用した。該酵素液は、酸性フォスファターゼを含む菌体を含むものである。以下の実施例での酵素液は、全てこの方法により調製されたものを使用した。
【００２３】
（２）リン酸付加反応原料スラリーの調製
特開２００２−２８９号公報に開示されている方法を用いた。すなわち、グアノシン結晶を水中で２７．１ｗｔ％スラリーとし、粉砕機（スイスＷＡＢ社製ＤＹＮＯ-ＭＩＬＬ）により結晶の粉砕処理を行って、比表面積０．８ｍ２／ｇの粉砕スラリーを取得した。この粉砕スラリー５７．７ｇにイノシン結晶を１８．４ｇ混合し、さらに１１１．９ｇの水を加えてリン酸付加反応原料スラリーとした。
【００２４】
（３）５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムの生産
次に、タイ国ＴＰＣ社製トリポリリン酸ナトリウム４５．６ｇを反応原料スラリーに加えたのち、若干の３５％塩酸でｐＨを図２中に示す所定の値に調整した。この反応原料スラリーに酵素液を４５．６ｍｌ添加して反応開始した。反応は３５℃でおこない、ヌクレオシドに対するリン酸化収率が最大の時点（3〜５０時間）で反応を停止した。なお、本実施例の場合は、３５％塩酸を反応中に追加添加してｐＨを一定に制御するようにおこなった。対照として、反応中に３５％塩酸を添加しない反応中のｐＨ制御無しの実験も行った。
【００２５】
結果を図２に示した。図２中ｐH制御をしない場合のリン酸化収率は、対照として用意した実験であり、ｐH制御無しと記してある。本実施例では、ｐH制御ありの実験をｐH制御有りとして記してある。結果からわかるように、反応中にｐHを一定に制御した場合は、対照実験よりも収率を高くすることができる。以上より、反応中に変化するｐHを酸添加により一定に維持することができれば、アルカリ性を示すトリポリリン酸塩を用いたとしても、高リン酸化収率を実現できることがわかった。
【実施例２】
【００２６】
５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムの製造工程からオルトリン酸塩およびピロリン酸塩の混合物を回収し、回収したリン酸塩を平均重合度が約３〜４の縮合リン酸ナトリウムに縮合再生して、再度５‘−リボヌクレオチド二ナトリウムの生産に使用した場合
【００２７】
（１）ヌクレオシドへのリン酸付加反応
実施例１と同様粉砕処理にかけた後のグアノシンスラリーを用いて、イノシン９２ｇ、グアノシン７９ｇおよびトリポリリン酸ナトリウム２２８ｇを水７６０ｇに懸濁させ、さらに３５％塩酸９５ｇを添加して、ｐHを４．５に調製して３５±０．５℃において、酵素液２２８ｍｌを添加して反応を開始した。反応中は、３５％塩酸３０ｇを間欠的に添加して、ｐＨ４．５を維持できるようにした。反応開始約１９時間後に、５‘−リボヌクレオチド２８９ｇを含む酵素反応液を得た。
【００２８】
（２）リン酸塩晶析除去工程
上記反応液を３４％水酸化ナトリウム水溶液によって、ｐH９．７に調整して５０℃から８℃までの冷却晶析を行い、分離後リン酸水素2ナトリウム・１２水塩と、ピロリン酸ナトリウム塩を含む混合物４２６ｇを得た。
【００２９】
（３）リン酸焼成縮合工程
得られたリン酸水素2ナトリウム・１２水塩とピロリン酸ナトリウム塩の混合物４００ｇに、３４％水酸化ナトリウム６４ｇおよび９７％オルトリン酸５５ｇ（Ｍ／Ｐ＝１．６６）を加えて、５００℃、５時間電気炉で加熱することで９６ｗｔ％の平均重合度が約３〜４のポリリン酸ナトリウム塩が２００ｇ得られた。なお、このポリリン酸塩の分析を行うと、オルトリン酸約１０％、ピロリン酸約３０％、トリポリリン酸約３０％、テトラポリリン酸約１０％、その他は、それ以上の高重合リン酸であった。
【００３０】
（４）再縮合リン酸塩を使用したヌクレオシドへのリン酸付加反応
イノシン４６ｇ、グアノシン４０ｇおよび上記再縮合によって得られた平均重合度が約３〜４のポリリン酸ナトリウム１１４ｇを水３８０ｇに懸濁させ、さらに３５％塩酸  ４８ｇを添加して、ｐHを４．５に調製して３５±０．５℃において、酵素液１１４ｍｌを添加して反応を開始した。反応中は、３５％塩酸６５ｇを間欠的に添加して、ｐＨ４．５を維持できるようにした。反応開始約１９時間後に、５‘−リボヌクレオチド２４４ｇを含む酵素反応液を得た。（１）の工程でのリン酸使用率が２９％であったものが、（１）〜（４）の工程を経ることによりリン酸使用率は７１％に向上した。なお、これにより（１）の工程のリン酸化収率は、低下しなかった。
【実施例３】
【００３１】
５‘−イノシン酸二ナトリウムの製造工程からオルトリン酸塩およびピロリン酸塩の混合物を回収し、回収したリン酸塩を平均重合度が約３〜４の縮合リン酸ナトリウムに縮合再生して、再度５‘−イノシン酸二ナトリウムの生産に使用した場合
【００３２】
（１）ヌクレオシドへのリン酸付加反応
イノシン５５ｇおよびトリポリリン酸ナトリウム５４ｇを水９７ｇに懸濁させ、さらに３５％塩酸  １５ｇを添加して、ｐHを４．５に調製して３５±０．５℃において、酵素液５０ｍｌを添加して反応を開始した。反応中は、３５％塩酸１２ｇを間欠的に添加して、ｐＨ４．５を維持できるようにした。反応開始約２６時間後に、５‘−イノシン酸二ナトリウム１０１ｇを含む酵素反応液を得た。
【００３３】
（２）リン酸塩晶析除去工程
上記反応液を３４％水酸化ナトリウム水溶液によって、ｐH９．７に調整して５０℃から８℃までの冷却晶析を行い、分離後、リン酸水素2ナトリウム・１２水塩とピロリン酸ナトリウム塩の混合物８４ｇを得た。
【００３４】
（３）リン酸焼成縮合工程
得られたリン酸水素2ナトリウム・１２水塩とピロリン酸ナトリウム塩の混合物８０ｇに、３４％水酸化ナトリウム１３ｇおよび９７％オルトリン酸１１ｇを加えて、５００℃、５時間電気炉で加熱することで９６ｗｔ％の平均重合度が約３から４のポリリン酸ナトリウムが４０ｇ得られた。なお、このポリリン酸塩の分析を行うと、オルトリン酸約１０％、ピロリン酸約３０％、トリポリリン酸約３０％、テトラポリリン酸約１０％、その他は、それ以上の高重合リン酸であった。
【００３５】
（４）再縮合リン酸塩を使用したヌクレオシドへのリン酸付加反応
イノシン２８ｇおよび再縮合したトリポリリン酸ナトリウム２７ｇを水４９ｇに懸濁させ、さらに３５％塩酸  ８ｇを添加して、ｐHを４．５に調製して３５±０．５℃において、酵素液２５ｍｌを添加して反応を開始した。反応中は、３５％塩酸６ｇを間欠的に添加して、ｐＨ４．５を維持できるようにした。反応開始約２６時間後に、５‘−イノシン酸二ナトリウム５０ｇを含む酵素反応液を得た。（１）の工程でのリン酸使用率が４３％であったものが、（１）〜（４）の工程を経ることによりリン酸使用率は８５％に向上した。なお、これにより（１）の工程のリン酸化収率は、低下しなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
図１のように、（ａ）〜（ｄ）工程を組み合わせることで、酸性フォスファターゼによるヌクレオシドへのリン酸付加工程で生じた反応後の残存リン酸を、縮合リン酸塩としてリサイクルし、リン酸の使用率を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】全工程概略図
【図２】リン酸付加反応における各反応終了時ｐHでの５‘−リボヌクレオチド二ナトリウム収率
【図１】
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【図２】
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