【手続補正書】
【提出日】平成25年4月3日(2013.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体であって、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンであり、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体。
【請求項２】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体であって、前記位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、またはヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニンに対応する非ヒトプラスミンの触媒ドメインのリジンまたはアルギニンであるか、または、
（ｉ）位置Ｐの前記少なくとも１つの内部アミノ酸の突然変異が、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置６９８である）のリジンの、自己タンパク質分解により耐性のある、アミノ酸１３７と１３８の間のペプチド結合を与えるアミノ酸への突然変異である場合、前記プラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体またはプラスミン誘導体は、（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）アミノ酸位置５６１および５６２でインタクトな活性化部位を含み、および触媒ドメインの外の（ヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準とした）位置５３６および５４１のアミノ酸が存在する場合は、前記アミノ酸は野生型のシステインであるか、または、
（ｉｉ）位置Ｐの前記少なくとも１つの内部アミノ酸の突然変異が、ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８（これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンを基準としたアミノ酸位置７１９である）のアルギニンの、アラニンまたはグルタミン酸への突然変異である場合、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐ’の、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの少なくとも１つの他の内部アミノ酸が、位置Ｐ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいか、または全く自己タンパク質分解する傾向がないアミノ酸へ突然変異しており、
前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体。
【請求項３】
触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つが、位置Ｐ＋１およびＰ’＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体であって、前記位置Ｐまたは位置ＰおよびＰ’の内部アミノ酸の少なくとも２つは、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；
（ｉｉ）前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１４７のリジン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンもしくはアルギニン；または、
（ｉｉｉ）前記ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１５８のアルギニン、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するアルギニンもしくはリジン；
の２つであり、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸であり、プラスミン変異体の自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であることをさらに特徴とする、単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体。
【請求項４】
ヒト触媒ドメインの位置１３７および／または１５８の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンおよび／またはアルギニンの突然変異をさらに含み、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項１に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項５】
ヒト触媒ドメインの位置１４７の内部アミノ酸、または非ヒトプラスミンの触媒ドメインにおいて対応するリジンまたはアルギニンの突然変異をさらに含み、前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、請求項２に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項６】
触媒定数ｋｃａｔが、野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項７】
自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％であり、触媒定数ｋｃａｔが、野生型プラスミンのｋｃａｔの１０％〜２００％の範囲にあることをさらに特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のプラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項８】
前記プラスミノーゲンまたはプラスミンが、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンまたはＧｌｕ−プラスミン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはＬｙｓ−プラスミン、ミジプラスミノーゲンまたはミジプラスミン、ミニプラスミノーゲンまたはミニプラスミン、マイクロプラスミノーゲンまたはマイクロプラスミン、デルタプラスミノーゲンまたはデルタプラスミンである、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項９】
単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体が、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とし、プラスミン変異体の自己分解定数は、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％である、医薬として使用するための、単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ。
【請求項１０】
医薬として使用するための、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ。
【請求項１１】
単離されたプラスミノーゲン変異体もしくはそれから得られたプラスミン、または単離されたプラスミン変異体、または前記プラスミンのいずれかのタンパク質分解性が活性な、または可逆的に不活性な誘導体は、触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸の少なくとも１つが、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が、自己タンパク質分解しにくいアミノ酸へ突然変異していることを特徴とし、プラスミン変異体の自己分解定数は、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％である、単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、もしくはプラスミン誘導体、またはこれらのいずれかの組合せ、および薬学的に許容される希釈剤、担体または補助剤の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項１３】
抗凝血剤、血栓溶解剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗真菌剤、血管新生阻害剤、抗有糸分裂剤、抗ヒスタミン剤または麻酔剤の少なくとも１つをさらに含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
対象における病的なフィブリン沈着の溶解を誘発する、または促進するための請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１５】
対象における眼における後部硝子体剥離の誘発のための、および／または眼における硝子体の液化の誘発のための、または眼における硝子体切除手術を容易にするための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１６】
対象の損傷した組織の酵素的壊死組織除去のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１７】
対象において、循環フィブリノーゲンを減少させるための、またはα２−抗プラスミンレベルを減少させるための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１８】
病的なフィブリン沈着のリスクを減少させるための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離されたプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項１９】
安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
（ｉ）野生型プラスミンの触媒ドメインにおいて、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解する傾向にある位置Ｐの内部アミノ酸を少なくとも１つを同定すること、
（ｉｉ）（ｉ）において同定された位置Ｐの前記アミノ酸を、位置Ｐ＋１の内部アミノ酸とのペプチド結合が自己タンパク質分解しにくいアミノ酸に突然変異させること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定すること、および
（ｉｖ）自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％である突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有する変異体として（ｉｉｉ）から選択すること、
を含む方法。
【請求項２０】
安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体をスクリーニングするための方法であって、前記方法が、
（ｉ）ヒトプラスミンの触媒ドメインの位置１３７、１４７および１５８のアルギニンまたはリジンアミノ酸、または非ヒトプラスミンにおいて対応するアルギニンまたはリジンの、１つ又は複数を、天然のアミノ酸とは異なるアミノ酸へ突然変異させること、
（ｉｉ）（ｉ）で得られた突然変異体の自己タンパク質分解安定性を測定すること、および
（ｉｉｉ）自己分解定数が、野生型プラスミンの自己分解定数の最大で９５％である突然変異体を、安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体として、（ｉｉ）から選択することを含み、
前記ヒトプラスミンの触媒ドメインは位置１のアミノ酸バリンで始まり、これはヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンの位置５６２で生じているのと同じバリンアミノ酸である、方法。
【請求項２１】
前記安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体のタンパク質分解活性を測定するステップをさらに含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質分解活性を有意に損なわず長期にわたり貯蔵できる安定した自己タンパク質分解性を有するプラスミン変異体を同定し、同定されたプラスミンを組成物に含有させるステップを含む、プラスミン含有組成物の長期貯蔵安定性を強化するための方法。
【請求項２３】
請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体をインビトロで産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた宿主細胞で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて前記宿主細胞を生育させるステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと；
を含む方法。
【請求項２４】
（ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを精製するステップ（ｉｖ）をさらに含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミン変異体をインビトロで産生するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミノーゲンをコードする核酸を、前記プラスミノーゲンを発現できる適切な宿主細胞に導入するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）で得られた前記宿主細胞を、前記宿主細胞内で前記プラスミノーゲンが発現するのに十分な条件下、十分な時間をかけて生育させるステップと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）で発現した前記プラスミノーゲンを回収するステップと；
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の前記プラスミノーゲンをプラスミンへ活性化させるステップと；
を含む方法。
【請求項２６】
（ｉｉｉ）において回収された前記プラスミノーゲンを（ｉｖ）における活性化に先立って精製する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉｖ）において得られた前記活性プラスミンを精製する、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記活性プラスミンが誘導体化される、および／または可逆的に不活化される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体またはプラスミン変異体をコードする単離された核酸配列。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項３１】
請求項２９に記載の核酸、または請求項３０に記載のベクターで形質転換されたエキソビボ宿主細胞。
【請求項３２】
位置１３７のリジンが、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、リジン以外の親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異されている、請求項２から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３３】
位置１３７のリジンが、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇから選ばれたアミノ酸に突然変異されている、請求項２から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３４】
位置１４７のリジンが、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、リジン以外の親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異されている、請求項１および３から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３５】
位置１４７のリジンが、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＰｈｅから選ばれたアミノ酸に突然変異されている、請求項１および３から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３６】
位置１５８のアルギニンが、疎水性脂肪族アミノ酸、疎水性芳香族アミノ酸、親水性の酸性アミノ酸、親水性の塩基性アミノ酸、中程度に疎水性の芳香族アミノ酸、および中程度に疎水性の脂肪族アミノ酸の群内のアミノ酸に突然変異されている、請求項２から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３７】
位置１５８のアルギニンが、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＨｉｓから選ばれたアミノ酸に突然変異されている、請求項２から５のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体、プラスミン変異体、またはプラスミン誘導体。
【請求項３８】
プラスミノーゲンがヒトプラスミノーゲンである、請求項１から５、８から１０、１４から１８および３２から３７のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体。
【請求項３９】
プラスミノーゲンが配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンである、請求項１から５、８から１０、１４から１８および３２から３７のいずれか一項に記載のプラスミノーゲン変異体。
【請求項４０】
プラスミノーゲンがヒトプラスミノーゲンである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
プラスミノーゲンが配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンである、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
プラスミノーゲンがヒトプラスミノーゲンである、請求項１９から２１および２３から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
プラスミノーゲンが配列番号１により定義されるヒトプラスミノーゲンである、請求項１９から２１および２３から３１のいずれか一項に記載の方法。