【誤訳訂正書】
【提出日】平成25年2月18日(2013.2.18)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有する微生物において、当該経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産することを特徴とするピノシルビンを生産する酵母、細菌又は糸状菌である微生物の使用であって、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該記微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産されることを特徴とする微生物の使用。
【請求項２】
前記スチルベンシンターゼが、ラッカセイ属に属する植物、ダイオウ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、或いは、マツ属、トウヒ属、ユリ属、ユーカリノキ属、ツタ属、シッサス属、カロコルタス属、タデ属、グネツム属、パンノキ属、ナンキョクブナ属、ナツメヤシ属、ウシノケグサ属、スゲ属、シュロソウ属、ハカマカズラ属、又はＰｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ属のいずれか１種類に属する植物に由来するリスベラトロールシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．９５）、又は、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｓｔｒｏｂｅｓ、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｔａｅｄａを含むマツ属に属する植物、トウヒ属に属する植物、又はユーカリノキ属のいずれか１種類に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１４６）であることを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項３】
前記ケイヒ酸が、シロイヌナズナ属に属する植物、アブラナ属に属する植物、ミカン属に属する植物、インゲンマメ属に属する植物、マツ属に属する植物、ハコヤナギ属に属する植物、ナス属に属する植物、サクラ属に属する植物、ヴィートス属に属する植物、トウモロコシ属に属する植物、或いは、アガスタケ属、アナナス属、アスパラガス属、ブロムヘディア属、ホウライチク属、フダンソウ属、カバノキ属、キュウリ属、ツバキ属、トウガラシ属、カッシア属、カタランサス属、マメ属、スイカ属、コーヒーノキ属、カボチャ属、ギョウギシバ属、ニンジン属、デンドロビウム属、ナデシコ属、ジギタリス属、ヤマノイモ属、ユーカリ属、ガルス属、イチョウ属、ダイズ属、オオムギ属、ヒマワリ属、サツマイモ属、アキノノゲシ属、リソスペルマム属、ハス属、トマト属、ウマゴヤシ属、リンゴ属、マニホット属、ウマゴヤシ属、メセンブリアンテマム属、タバコ属、オリーブ属、オリザ属、ピスム属、ペルセア属、ペトロセリヌム属、ファレノプシス属、マダケ属、センタイ属、ピケア属、ピルス属、ケルクス属、ラファヌス属、ジオウ属、キイチゴ属、モロコシ属、スフェノスチリス属、ハコベ属、スタイロ属、コムギ属、シャジクソウ属、コムギ属、スノキ属、ササゲ属、又はジニア属のいずれか１種類に属する植物、又は、アスペルギルス属に属する糸状菌に由来するＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＥＣ  ４．３．１．５）によりＬ−フェニルアラニンから形成されることを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項４】
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからケイヒ酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満となるように、前記ＰＡＬが、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項５】
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ（Ｌ−フェニルアラニンからケイヒ酸へ））／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸からクマル酸へ））の比の値は、少なくとも２／１であることを特徴とする請求項４に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項６】
前記微生物が、サッカロミセス属、クリベロミセス属、カンジダ属、ピチア属、デバロミセス属、ハンゼヌラ属、ヤロウイア属、ザイゴサッカロミセス属、又はシゾサッカロミセス属に属する酵母菌であることを特徴とする請求項１に記載のピノシルビン生産微生物の使用。
【請求項７】
ピノシルビンの生産条件下で、酵母、細菌又は糸状菌である微生物を培養する工程を含むピノシルビンを生産する方法であって、
前記微生物が少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有し、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該記微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
前記ＰＡＬが、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満であり、且つ、
前記微生物が、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ酵素（Ｃ４Ｈ）を生産する場合、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ（Ｌ−フェニルアラニンからケイヒ酸へ））／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ（ケイヒ酸からクマル酸へ））の比の値は、少なくとも２／１であることを特徴とするピノシルビンを生産する方法。
【請求項８】
シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する有効に機能する代謝経路を有する酵母、細菌又は糸状菌である微生物であって、
前記経路が少なくとも１種類の酵素活性を含み、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該記微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
スチルベンゼンシンターゼが、基質とする４−クマロイル−ＣｏＡとの代謝回転率よりも、基質とするシンナモイル−ＣｏＡとより高い代謝回転率を有することを特徴とする微生物。
【請求項９】
シンナモイル−ＣｏＡを生産し、且つ、そこからピノシルビンを生産する有効に機能する代謝経路を有する酵母、細菌又は糸状菌である微生物であって、
前記経路が少なくとも１種類の酵素活性を含み、
前記経路がケイヒ酸からピノシルビンを生産し、
該微生物における該代謝経路において、
前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から前記微生物に発現したＬ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）によりＬ−フェニルアラニンからケイヒ酸が生産され、
前記微生物中の記遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結している４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする前記遺伝子配列の少なくとも１つのコピーによって、該記微生物に発現した４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）又はシンナモイル−ＣｏＡリガーゼにより触媒される反応で、前記ケイヒ酸からシンナモイル−ＣｏＡが形成され、
前記微生物中において、前記微生物に固有ではない前記酵素をコードする核酸から発現したスチルベンシンターゼによりシンナモイル−ＣｏＡからピノシルビンが生産され、
前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が、基質としてチロシンも受容し、且つ、そこからクマル酸を形成する場合、前記ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１未満となるように、前記Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）が、基質としてフェニルアラニンを受容し、且つ、そこからケイヒ酸を生産することを特徴とする微生物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
植物において、フェニルプロパノイド経路は、リグニン、サリチル酸塩、クマリン、ヒドロキシ、ケイヒアミド、顔料、フラボノイド、及びフィトアレキシンを含む多種多様な第二の代謝化合物の合成に関与する。実際に植物中のスチルベンの形成は、フェニルプロパノイド経路を通じて進行する。アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンは、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）による非酸化脱アミノ反応を経由して、トランス−ケイヒ酸に変換される（図２）。トランス−ケイヒ酸からの経路は、リスベラトロールを形成するルート、或いは、ピノシルビンを形成するルートに分岐させることができる。前者のルートにおいて、トランス−ケイヒ酸は、シンナメート−４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、すなわち、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ酵素によってＮＡＤＰＨ：チトクロームＰ４５０還元酵素（ＣＰＲ）と結合してパラ位で４−ケイヒ酸（４−ヒドロキシケイヒ酸）にヒドロキシル基が導入される。続いて、４−クマル酸は、４−クマレート−ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）の反応によって４−クマロイル−ＣｏＡへ活性化される。リスベラトロールシンターゼ（ＶＳＴ１）は、マロニルＣｏＡをもつ４−クマレート−ＣｏＡのフェニルプロパン単位の凝縮を触媒することができ、リスベラトロールの形成体が得られる。
後者のルートにおいて、トランス−ケイヒ酸は、ピノシルビンシンターゼ（ＰＳＴ）は、続いて、マロニルＣｏＡを有するシンナモイル−ＣｏＡのフェニルプロパン単位の凝縮を触媒する４ＣＬの反応によって、直接的にシンナモイル−ＣｏＡへ活性化させることができる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
スチルベンシンターゼは、さまざまな生理的で、且つ、非生理的な基質を受容することができる特異性の広い酵素である。例えば、さまざまなフェニルプロパノイドＣｏＡ始動エステルの添加によって、生体外で、さまざまな生成物が形成される（Ｉｋｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００４年；Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００１年）。同様に、シンナモイル−ＣｏＡが、クマロイル−ＣｏＡの代わりに基質として使用された場合、ダイオウ（ｒｈｕｂａｒｂ）（Ｒｈｅｕｍ  ｔａｒｔａｒｉｃｕｍ）由来のリスベラトロールシンターゼが、少量のピノシルビンを確かに合成することがわかってきた。（Ｓａｍａｐｐｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３年）。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
本発明は、ケイヒ酸からピノシルビンを生産する少なくとも１種類の酵素活性を含む有効に機能する代謝経路を有する微生物を提供する。好ましい微生物において、前記経路は、ケイヒ酸を生産し、そこからピノシルビンを生産する。特に、本発明は、ピノシルビンを生産する際のそのような微生物の使用を提供するものである。そのような微生物は自然に存在してよく、縮重ＰＣＲ（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ、及びｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｓｅａｒｃｈｅｓ等の適切なスクリーニング手順により単離してもよく、さらに好ましくは遺伝子組み換えされている。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
スチルベンシンターゼは、基質とする４−クマロイル−ＣｏＡとの代謝回転率よりも、基質とするシンナモイル−ＣｏＡとより高い代謝回転率を有するものであってもよく、例えば、少なくとも１．５のファクター、又は少なくとも２のファクターを有するものであってもよい。さらに、好ましい実施態様として、前記スチルベンシンターゼは、ピノシルビンシンターゼであって、好適には、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ユーカリノキ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）又はマクルラ属（Ｍａｃｌｕｒａ）の木の種属等に由来する。特に、スチルベンシンターゼは、Ｐ．ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐ．ｓｔｒｏｂｅｓ、Ｐ．ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａ、Ｐ．ｔａｅｄａを含むマツ属（Ｐｉｎｕｓ）に属する植物、トウヒ属（Ｐｉｃｅａ）に属する植物、又はユーカリノキ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）のいずれか１種類に属する植物に由来するピノシルビンシンターゼ（ＥＣ  ２．３．１．１４６）であってもよい。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
上述したように、ピノシルビンの生産について我々は、基質の特異性の広いＰＡＬによるチロシン由来のクマル酸の生成か、Ｃ４Ｈ酵素によるケイヒ酸の変換によるチロシン由来のクマル酸の生成よりはむしろ、ＰＡＬ酵素によるケイヒ酸の生成、及びピノシルビンへの変換を要求するので、本発明で利用する微生物は、好ましくは基質としてチロシン（クマル酸を生成する）以上にフェニルアラニン（ケイヒ酸を生成する）に有利に働くＰＡＬを有する。好ましくは、ＰＡＬに対するＫｍ（フェニルアラニン）／Ｋｍ（チロシン）の比の値は、１／１よりも少なく、好ましくは１／５よりも少なく、例えば１／１０よりも少ない。通常、Ｋｍは、生成形成物の最大速度の半分を生産する基質（フェニルアラニン、又はチロシン）のモル濃度である。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
Ｃ４Ｈの存在は、ピノシルビンの生産に役立たないが、クマル酸を経てリスベラトロールの形成に関してピノシルビンの生産から離れてケイヒ酸の転換が過度でなければＣ４Ｈは禁止されるものではない。それゆえ、好ましくはＣ４Ｈ生産が、非存在であるか、或いは、Ｋｃａｔ（ＰＡＬ）／Ｋｃａｔ（Ｃ４Ｈ）は、２よりも大きく、好ましくは４よりも大きくなるようにするかどちらかである。従来通り、それぞれのケースで、ＫｃａｔはＶｍａｘ／［酵素］である。ここで、［酵素］は、関連のある酵素の濃度である。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４４】
任意に、４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４５】
任意に、スチルベンゼンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
任意に、ピノシルビンシンターゼをコードする遺伝子配列の少なくとも１つのコピーが、天然かどうかにかかわらず、該生物において該遺伝子配列に天然では関連しない発現シグナルに有効に機能可能に連結される。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
ある態様において、本発明は、第１酵素により触媒され、かつその反応工程がアンモニアを作る反応により第１代謝産物が第２代謝産物に変換され、ＡＴＰ及びＣｏＡが基質であり、ＡＤＰが生成物である第２酵素により触媒される反応で該第２代謝産物が第３代謝物に変換され、内在性マロニル−ＣｏＡが基質である第３酵素により触媒される反応で第３代謝産物が第４代謝産物に変換される有効に機能する代謝経路を有するさまざまに記述された代謝改変微生物を提供する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４８】
上記微生物として、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結された４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたリスベラトロールシンターゼになるであろうスチルベンシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物が挙げられる。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
また、上述した微生物としては、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたチロシンアンモニアリアーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結された４−クマレートＣｏＡリガーゼ、又はシンナメート−ＣｏＡリガーゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有し、発現シグナルに有効に機能可能に連結されたピノシルビンシンターゼをコードする異種ＤＮＡ配列の１つ以上のコピーを含有する微生物も挙げられる。