(57)【要約】【課題】生存動物においてリアルタイムでＰ４５０遺伝子の調節を直接的にモニターする。【解決手段】本発明は、チロクロム発現に関連するマウス遺伝子およびヒト遺伝子（例えば、それぞれ、Ｃｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３Ａ４）由来の転写制御エレメントに関する。単離されたポリヌクレオチド、発現カセット、ベクター、組換え細胞、およびトランスジェニック動物は、本明細書中に記載されるような転写制御エレメントを含み得る。本発明はさらに、このようなレポーター構築物でトランスフェクトされた動物を用いるインビボアッセイに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、概して、分子生物学および医学の分野に関する。特に、本発明は、マウスＣ
ｙｐ３Ａ１１遺伝子およびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のゲノム遺伝子座由来の転写制御エレ
メント、ならびにそれを使用する方法に関する。本発明はさらに、マウスＣｙｐ３Ａ１１
遺伝子およびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の調節領域由来の単離されたポリヌクレオチド、そ
れらの単離されたポリヌクレオチドを含むレポーター構築物、それらのレポーター構築物
で形質転換された細胞、それらのレポーター構築物を含むトランスジェニック動物、なら
びにマウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメントおよびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝
子由来の転写制御エレメントにより媒介される発現を調節する化合物を同定するためのこ
のような細胞およびトランスジェニック動物の使用方法に関する。本発明はさらに、この
ようなレポーター構築物でトランスフェクトされた動物を用いるインビボアッセイに関す
る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
物質の毒物学研究は、伝統的に、単細胞生物（例えば、Ａｍｅｓ試験または米国特許第
４，９９７，７５７号に記載される酵母発癌性アッセイ）または毒性試験およびヒトへの
危険についての予測のためのインビトロ系に依存していた。しかし、このようなデータか
らヒトへの危険を推定することを困難にする多くの要因が存在する。これらの要因として
は、物質の細胞親和性、単一細胞と動物全体との間の取り込みおよび分布の差、物質の代
謝、ならびに物質の効果が細胞プロセスを介して媒介されるカスケード効果が挙げられる
。これらの同一の要因が、動物系における分析物の効果を決定および／または推定するこ
とを試みる場合に、薬学的研究および開発の進行にも影響し得る。
【０００３】
さらに、伝統的な動物ベースの毒物学研究の目的は、代表的に、ＬＤ５０（試験動物の
５０％が死亡する用量）の決定である。死亡した動物は、さらなる研究（例えば、組織病
理学）に供され得るが、そのような分析は、一般的に、労働集約的であり、そして比較的
感度が低い。ＭａｃＧｒｅｇｏｒら（非特許文献１）は、以下を含む慣用的な毒
性試験の分子的目的および方法を概説している：個々の細胞における損傷誘導遺伝子；毒
性の細菌モデル；ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応を用いたストレス
遺伝子発現のスクリーニング；染色体異常の検出のためのハイブリダイゼーションプロー
ブ；単一細胞電気泳動アッセイ；および動物の屠殺およびその後の組織／細胞損傷の研究
を含むインビボ動物研究。
【０００４】
Ｐ４５０酵素は、ステロイドおよびコレステロールの生合成および薬物または生体異物
の代謝に関与することが示されている。Ｐ４５０酵素の誘導は、ステロイドおよびコレス
テロールのレベルにおける変動または薬物もしくは生体異物への反復的な曝露の結果であ
る。Ｐ４５０酵素レベルの変化は、代謝される薬物の血漿および／または組織レベルの変
化を引き起こし、次いで、それらの薬物の安定性、効果、および毒性に影響する。Ｐ４５
０スーパーファミリーの中で、Ｃｙｐ３Ａファミリーは、代表的に、ヒト肝臓ミクロソー
ムに存在する全Ｐ４５０の１４〜３１％および薬物代謝活性の５０〜６０％を占める（非特許文献２）。異なるＣｙｐ３Ａ形態をコードするクローンが、ヒト、ラット、モルモット、およびマウスから単離されている。これらとしては、マウスにおけるＣｙｐ３Ａ１１およびヒトにおけるＣＹＰ３Ａ４が挙げられる。従って、Ｐ４５０酵素の発現、特にＣｙｐ３Ａファミリーの遺伝子の発現は、薬剤の生物利用性および薬物間相互作用の重要な薬理学的パラメータである。
【０００５】
現在、Ｐ４５０遺伝子調節のためのアッセイ（例えば、ノザンブロット、ウェスタンブ
ロット、ＲＴ−ＰＣＲ、またはエキソビボレポーターアッセイ）は、労力を要し、そして
時間がかかる。さらに、細胞系列におけるＰ４５０遺伝子の発現は、困難であることがわ
かっている。従って、生存動物においてリアルタイムでＰ４５０遺伝子の調節を直接的に
モニターする必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２６：１５６−１７３，１９９５
【非特許文献２】Ｔｏｉｄｅら（１９９７）Ａｒｃｈ，Ｂｉｏｃｈｅｍ，ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３３８：４３−４９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
レポーター配列の発現を調節する分析物を同定するための方法であって、そのレポーター配
列の発現は、生存トランスジェニックげっ歯類において、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来の
転写制御エレメントにより媒介され、その方法は、以下：
その分析物を生存トランスジェニックげっ歯類に投与する工程であって、そのトランスジェ
ニックげっ歯類は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含む発現カセット
を含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド１〜１３，０３２に対して
少なくとも９５％以上の同一性を有し、ここで、（ｉ）そのポリヌクレオチドは、目的のコ
ード配列に作動可能に連結されており、（ｉｉ）そのポリヌクレオチドは、少なくとも１つ
の転写制御エレメントを含み、そして（ｉｉｉ）その目的のコード配列の発現は、その生存ト
ランスジェニックげっ歯類の肝臓において、デキサメタゾンまたはリファンピシンにより
誘導される、工程；および
その目的のコード配列の発現をモニタリングする工程、
を包含し、ここで、その目的のコード配列の発現レベルに対する効果は、その分析物が、ヒト
ＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来の転写制御エレメントにより媒介される発現に影響を及ぼすこと
を示す、方法。
（項目２）
（ｉｖ）上記生存トランスジェニックげっ歯類の肝臓領域における上記コード配列の基礎
発現が、その生存トランスジェニックげっ歯類の身体の他の領域におけるそのコード配列の基
礎発現よりも大きいかまたは等しい、項目１に記載の方法。
（項目３）
上記トランスジェニックげっ歯類が、機能的ｈＰＸＰ（ヒトリファンピシンコレセプター
）をコードする配列を含まない、項目１〜２のいずれか１項に記載の方法。
（項目４）
上記目的のコード配列の発現が、上記生存トランスジェニックげっ歯類において、少なく
とも１つの化合物によって誘導され、その化合物は、フェノバルビトール、ニフェジピン、
５−プレグネン−３ｂ−オール−２０−オン−１６ａ−カルボニトリル、およびクロトリ
マゾールからなる群より選択され、ここで、発現の誘導は、その生存トランスジェニックげ
っ歯類の肝臓領域において観察される、項目１〜３のいずれか１項に記載の方法。
（項目５）
上記目的のコード配列の発現が、上記生存トランスジェニックげっ歯類において、５０ｍ
ｇ／ｋｇ体重で投与されたデキサメタゾンによって誘導される、項目１〜４のいずれか
１項に記載の方法。
（項目６）
上記目的のコード配列の発現が、上記生存トランスジェニックげっ歯類において、５０ｍ
ｇ／ｋｇ体重で投与されたリファンピシンによって誘導される、項目１〜４のいずれか
１項に記載の方法。
（項目７）
上記目的のコード配列の発現の誘導が、デキサメタゾンによる基礎レベルの１０倍の誘導
より大きいかまたはそれに等しい、項目５に記載の方法。
（項目８）
上記目的のコード配列の発現の誘導が、リファンピシンによる基礎レベルの２倍の誘導よ
り大きいかまたはそれに等しい、項目６に記載の方法。
（項目９）
上記目的のコード配列の発現が、レポーター配列である、項目１〜８のいずれか１項に
記載の方法。
（項目１０）
上記レポーター配列が、光発生タンパク質をコードする、項目９に記載の方法。
（項目１１）
上記光発生タンパク質が、生物発光タンパク質または蛍光タンパク質である、項目１０
に記載の方法。
（項目１２）
上記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
上記発現カセットが、配列番号１７を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
上記蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク
質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群より選択される、項目
１１に記載の方法。
（項目１５）
上記げっ歯類が、マウスまたはラットである、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方
法。
（項目１６）
トランスジェニックげっ歯類であって、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチド
を含む発現カセットを含み、そのポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド１〜１
３，０３２に対して少なくとも９５％以上の同一性を有し、ここで、（ｉ）そのポリヌクレ
オチドは、目的のコード配列に作動可能に連結されており、（ｉｉ）そのポリヌクレオチド
は、少なくとも１つの転写制御エレメントを含み、そして（ｉｉｉ）その目的のコード配列
の発現は、生存トランスジェニックげっ歯類の肝臓において、デキサメタゾンまたはリフ
ァンピシンにより誘導される、トランスジェニック動物。
（項目１７）
発現カセットであって、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、その
ポリヌクレオチドは、配列番号１２のヌクレオチド１〜１１，００２に対して少なくとも
９５％の同一性を有し、そのポリヌクレオチドは、目的のコード配列に作動可能に連結され
ており、ここで、そのポリヌクレオチドは、少なくとも１つの転写制御エレメントを含む、
発現カセット。
（項目１８）
発現カセットであって、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、その
ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列または配列番号１３の少なくとも約１００個連
続するヌクレオチドのフラグメントに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリヌク
レオチドを含み、そのポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、目的のコード配列に作
動可能に連結されており、ここで、そのポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、少な
くとも１つの転写制御エレメントを含む、発現カセット。
（項目１９）
上記ポリヌクレオチドが、配列番号１３のヌクレオチド５１０４〜６２１８に対して９５
％以上の同一性を有する第１のポリヌクレオチド、および配列番号１３のヌクレオチド６
７９２〜９３３０に対して９５％以上の同一性を有する第２のポリヌクレオチドを含む、
項目１８に記載の発現カセット。
（項目２０）
上記目的のコード配列の発現が、レポーター配列である、項目１８〜１９のいずれか１
項に記載の発現カセット。
（項目２１）
上記レポーター配列が、光発生タンパク質をコードする、項目２０に記載の発現カセッ
ト。
（項目２２）
上記光発生タンパク質が、生物発光タンパク質または蛍光タンパク質である、項目２１
に記載の発現カセット。
（項目２３）
上記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼである、項目２２に記載の発現カセット。
（項目２４）
上記蛍光タンパク質が、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク
質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質からなる群より選択される、項目
２２に記載の発現カセット。
（項目２５）
ベクターであって、
（ａ）項目１８〜２４のいずれかに記載の発現カセット；および
（ｂ）ベクター骨格、
を含む、ベクター。
（項目２６）
上記ベクター骨格がさらに、選択マーカーを含む、項目２５に記載のベクター。
（項目２７）
項目１８〜２４のいずれかに記載の発現カセットを含む、細胞。
（項目２８）
項目２５に記載のベクターを含む、細胞。
（項目２９）
項目１８〜２４のいずれかに記載の発現カセットを含む、トランスジェニックげっ歯類
。
（項目３０）
上記げっ歯類が、マウスまたはラットである、項目２９に記載のトランスジェニックげ
っ歯類。
（項目３１）
項目１８〜２４のいずれかに記載の発現カセットを肝臓に含む、げっ歯類。
（項目３２）
上記げっ歯類が、マウスまたはラットである、項目３１に記載のトランスジェニックげ
っ歯類。
（項目３３）
レポーター配列の発現を調節する分析物を同定するための方法であって、そのレポーター配
列の発現は、生存トランスジェニックげっ歯類において、マウスＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由
来の転写制御エレメントにより媒介され、その方法は、以下：
その分析物を生存トランスジェニックげっ歯類に投与する工程であって、ここで、そのトラ
ンスジェニックげっ歯類は、項目２０〜２４のいずれかに記載の発現カセットを含む、
工程；および
そのレポーター配列の発現をモニタリングする工程、
を包含し、ここで、そのレポーター配列の発現レベルに対する効果は、その分析物が、マウス
ＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメントにより媒介される発現に影響を及ぼすこ
とを示す、方法。
（項目３４）
レポーター配列の発現を調節する分析物を同定するための方法であって、そのレポーター配
列の発現は、生存げっ歯類において、マウスＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメ
ントにより媒介され、その方法は、以下：
項目２０〜２４のいずれかに記載の発現カセットを含むベクター混合物を、生存げっ
歯類に投与する工程；
そのげっ歯類にその分析物を投与する工程；および
そのレポーター配列の発現をモニタリングする工程、
を包含し、ここで、そのレポーター配列の発現レベルに対する効果は、その分析物が、マウス
ＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメントにより媒介される発現に影響を及ぼすこ
とを示す、方法。
（項目３５）
上記げっ歯類への上記ベクター混合物の投与が、そのベクター混合物の静脈内注入を含む、
項目３４に記載の方法。
（項目３６）
細胞中でのレポーター配列の発現をモニタリングするための方法であって、そのレポーター
配列の発現は、マウスＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメントにより媒介され、
その方法は、以下：
細胞中でのレポーター配列の発現をモニタリングする工程であって、その細胞は、項目
２０〜２４のいずれかに記載の発現カセットを含み、ここで、その細胞中でのそのレポーター
配列の発現は、マウスＣＹＰ３Ａ１１遺伝子由来の転写制御エレメントにより媒介される
発現の指標となる、方法。
（発明の要旨）
本発明は、チロクロム発現に関連するマウス遺伝子およびヒト遺伝子（それぞれ、例え
ば、Ｃｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３Ａ４）に由来する転写制御エレメントに関する。本発
明は、本明細書中に記載される転写制御エレメントを含む、単離されたポリヌクレオチド
、発現カセット、ベクター、組換え細胞、肝臓プッシュ（ｌｉｖｅｒ−ｐｕｓｈ）非ヒト
動物およびトランスジェニック非ヒト動物を含む。
【０００７】
１つの局面では、本発明は、チロクロムＰ４５０遺伝子（例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１およ
びＣＹＰ３Ａ４）に由来する転写制御エレメント、これらの制御エレメントを含む発現カ
セット、この発現カセットを含む、ベクター構築物、細胞およびトランスジェニック動物
、ならびにこの発現カセットを含む細胞およびトランスジェニック動物を、例えば、モデ
リング系、スクリーニング系および／または試験系として用いる方法に関する。本発明の
制御エレメント、発現カセット、細胞、およびトランスジェニック動物を用いる方法とし
ては、毒性および薬物代謝に関する研究、ならびに薬物の代謝、安全性および／または可
能な毒性をスクリーニングするための方法が挙げられるがこれらに限定されない。本発明
の実施において有用な例示的な転写制御エレメントとしては、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝
子座に由来する転写制御エレメントおよびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子座に由来する転写制御
エレメントが挙げられる。
【０００８】
特に、本発明は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子およびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のゲノム
遺伝子座に由来する転写制御エレメントに関し、ここで、これらの転写制御エレメントは
、レポーター配列に結合している。特に、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、
および配列番号１５、ならびにそれらのフラグメントを含む組換え核酸分子が記載される
。本発明はさらに、このようなレポーター構築物でトランスフェクトされた動物を用いる
、インビボでのアッセイ方法に関する。
【０００９】
１つの局面では、本発明は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来のポリヌクレオチド（ま
たは代表的には１００を超えて連続したヌクレオチドのそのフラグメント）を含み、この
ポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は、配列番号１２のヌクレオチド１−１１
，００２（またはその対応するフラグメント）に対して少なくとも９５％の同一性を有す
る。ポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は、目的のコード配列に作動可能に連
結され得る。このポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は代表的に、少なくとも
１つの転写制御エレメントを含む。発現カセットは、このポリヌクレオチドおよび目的の
コード配列を含み得る。
【００１０】
別の局面では、本発明は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子に由来するポリヌクレオチド（
または代表的には１００を超えて連続するヌクレオチドそのフラグメント）を含み、この
ポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は、配列番号１３の配列（または配列番号
１３のうちの少なくとも約１００連続したヌクレオチドのそのフラグメント）に対して少
なくとも９５％の同一性を有する。このポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は
、目的のコード配列に作動可能に連結され得る。このポリヌクレオチド（またはそのフラ
グメント）は代表的に、少なくとも１つの転写制御エレメントを含む。発現カセットは、
このポリヌクレオチドおよび目的のコード配列を含み得る。１つの実施形態では、このポ
リヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド５１０４−６２１８に対して９５％以上
の同一性を有する第１ポリヌクレオチドおよび配列番号１３のヌクレオチド６７９２−９
３３０に対して９５％以上の同一性を有する第２ポリヌクレオチドを含む。
【００１１】
１つの局面では、本発明は、配列番号１３の配列（またはそのフラグメント）に対して
少なくとも約９５％の同一性を有し、目的のコード配列に作動可能に連結されたポリヌク
レオチドを含む、単離されたポリヌクレオチドおよび／または発現カセットを含み、ここ
で、このポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、少なくとも１つの転写制御エレメ
ントを含む。
【００１２】
別の局面では、本発明は、配列番号１５の配列（またはそのフラグメント）に対して少
なくとも約９５％の同一性を有し、目的のコード配列に作動可能に連結されたポリヌクレ
オチドを含む、単離されたポリヌクレオチドおよび／または発現カセットを含み、ここで
、このポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、少なくとも１つの転写制御エレメン
トを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、目的のコード配列は、レポーター配列（例えば、光生成タン
パク質）である。このような光生成タンパク質としては、生物発光タンパク質（原核生物
ルシフェラーゼまたは真核生物ルシフェラーゼを含むがこれらに限定されない）および蛍
光タンパク質（青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色
蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質、ならびにその増強改変体および／または不
安定化改変体を含むがこれらに限定されない）が挙げられる。
【００１４】
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび／または発現カセットを含
むベクターを含む。このようなベクターは代表的に、ベクター骨格を含み、そして直鎖状
または環状であり得、１以上の複製起点（例えば、シャトルベクター）を含み、部位特異
的もしくはランダムに組み込まれ、そして１以上の選択マーカーまたはスクリーニング可
能マーカーを含む。
【００１５】
１つの実施形態では、本発明は、本発明の発現カセットおよび／またはベクターを含む
細胞を含む。別の実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、マウス、ラッ
ト、ハムスター、アレチネズミ、およびモルモットを含むがこれらに限定されない齧歯動
物）は、本発明の発現カセットおよび／またはベクターを含み得る。さらなる実施形態で
は、本発明は、本発明の発現カセットおよび／またはベクターを含む細胞のサブセットを
含む非ヒト動物（例えば、肝臓に本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む非
ヒト動物）を含む。このような非ヒト動物は、例えば静脈内注射を介した本発明の発現カ
セットおよび／またはベクターの投与によって作製され得る。
【００１６】
なお別の局面では、本発明は、本発明の発現カセット、ベクター、細胞、および非ヒト
動物を使用する方法を含む。１つの実施形態では、本発明は、トランスジェニック生存非
ヒト動物において、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来転写制御エレメントおよび／または
ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来転写制御エレメントによって媒介される発現（例えば、レポ
ーター配列の発現）を調節する分析物を同定するための方法を含む。このような方法は代
表的に、この動物に分析物（例えば、薬物）を投与することを含む。この動物は、代表的
にレポーター配列を含む、本発明の発現カセットまたはベクターのうちの１以上を含む。
レポーター配列の発現がモニタリングされる。レポーター配列の発現レベルに対する影響
は、この分析物が、この方法において用いられる発現カセットおよび／またはベクターを
構成する転写制御エレメントに対応する遺伝子の発現に影響を与えることを示す。
【００１７】
別の方法は、トランスジェニックの生存非ヒト動物において、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺
伝子由来転写制御エレメントおよび／またはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来転写制御エレメ
ントによって媒介される発現（例えば、レポーター配列の発現）を調節する分析物を同定
する工程を包含する。この方法では、本発明の発現カセットを含むベクター混合物は、分
析物の投与と同時に、投与前に、または投与後に、動物に投与される。このベクター混合
物は、レポーター配列を代表的に含む、１以上の本発明の発現カセットを含む。このレポ
ーター配列の発現がモニタリングされる。このレポーター配列の発現に対する影響は、こ
の分析物が、この方法において用いられた発現カセットおよび／またはベクターを構成す
る転写制御エレメントによって媒介される発現に影響を与えることを示す。１つの実施形
態では、このベクター混合物は、静脈内注射によって投与される。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態では、本発明の転写制御エレメントおよびレポーターを含む
発現カセットを用いて、細胞中でのマウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子またはヒトＣＹＰ３Ａ４
遺伝子の発現がモニタリングされる。この実施形態では、レポーター配列の発現が細胞中
でモニタリングされ、そしてレポーター配列の発現は、この方法において用いられる発現
カセットおよび／またはベクターを構成する転写制御エレメントに対応する遺伝子の発現
に対応する。さらに、分析物は、このような細胞においてスクリーニングされ得、ここで
、このレポーター配列の発現に対する影響は、この分析物が、この方法において用いられ
る発現カセットおよび／またはベクターを構成する転写制御エレメントによって媒介され
る発現に影響を与えることを示す。
【００１９】
別の局面では、本発明は、トランスジェニック非ヒト動物（例えば、齧歯動物）を含む
。トランスジェニック非ヒト動物は代表的に、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレ
オチドを含む発現カセットを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチ
ド１−１３，０３２（またはそのフラグメント）に対して少なくとも９５％以上の同一性
を有し、ここで、（ｉ）このポリヌクレオチド（またはそのフラグメント）は、目的のコ
ード配列に作動可能に連結されている、（ｉｉ）このポリヌクレオチド（またはそのフラ
グメント）は、少なくとも１つの転写制御エレメントを含む、そして（ｉｉｉ）目的のコ
ード配列の発現は、デキサメタゾンまたはリファンピシンによって、生存トランスジェニ
ック非ヒト動物の肝臓において誘導される。
【００２０】
１つの実施形態では、目的のコード配列の発現は、５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたデ
キサメタゾンによって、生存トランスジェニック動物において誘導され、そして／または
目的のコード配列の発現は、５０ｍｇ／ｋｇ体重で投与されたリファンピシンによって、
生存トランスジェニック動物において誘導される。さらに、目的のコード配列の発現の誘
導は、デキサメタゾンによって基底レベルの１０倍の誘導以上であり得、そして／または
目的のコード配列の発現の誘導は、リファンピシンによって基底レベルの２倍以上の誘導
である。
【００２１】
１つの実施形態では、生存トランスジェニック非ヒト動物の肝臓領域におけるコード配
列の基底発現は、この生存トランスジェニック非ヒト動物の身体の他の領域における基底
発現以上である。
【００２２】
別の実施形態では、このトランスジェニック非ヒト動物は、機能的ｈＰＸＲ（ヒトリフ
ァンピシンコレセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ））をコードする配列を有さない。す
なわち、この動物は、機能的ヒトＰＸＲ遺伝子産物を発現しない。
【００２３】
さらなる実施形態では、目的のコード配列の発現は、フェノバルビタール（ｐｈｅｎｏ
ｂａｒｂｉｔｏｌ）、ニフェジピン、５−プレグネン−３ｂ−オール−２０−オン−１６
ａ−カルボニトリルおよびクロトリマゾールからなる群より選択される少なくとも１つの
化合物によって、生存トランスジェニック非ヒト動物において誘導され、ここで、発現の
誘導は、生存トランスジェニック動物の肝臓領域において見られる。
【００２４】
トランスジェニック非ヒト動物では、目的のコード配列は、例えば、レポーター配列で
あり得る。このようなレポーター配列は、例えば、光生成タンパク質（例えば、生物発光
タンパク質または蛍光タンパク質）をコードし得る。１つの例示的な生物発光タンパク質
は、ルシフェラーゼである。本発明の１つの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動
物は、配列番号１７（例示的なＣＹＰ３Ａ４／ｌｕｃ導入遺伝子）を含む発現カセットを
含み得る。例示的な蛍光タンパク質としては、青色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク
質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質が挙げられる
がこれらに限定されない。
【００２５】
トランスジェニック非ヒト動物は、齧歯動物であり得、齧歯動物としては、マウス、ラ
ット、ハムスター、アレチネズミ、またはモルモットが挙げられるがこれらに限定されな
い。
【００２６】
本発明はまた、レポーター配列の発現を調節する分析物を同定するための方法を包含し
、ここで、このレポーター配列の発現は、トランスジェニック生存齧歯動物において、例
えば、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に由来する転写制御エレメントによって媒介される。この
方法では、分析物は、上記のトランスジェニック生存非ヒトトランスジェニック動物へと
投与される。レポーター配列の発現がモニタリングされる。レポーター配列の発現レベル
に対する影響は、この分析物が、転写制御エレメント（例えば、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子
に由来する転写制御エレメント）によって媒介されるものに影響を与えることを示す。
【００２７】
本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書中の開示を考慮すれば、当業者に容易
に思いつく。
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示さない限り、分子生物学、微生物学、細胞生物学、トランスジ
ェニック動物操作、および組換えＤＮＡの従来技術を用い、これらの従来技術は、当該分
野の技術範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，およびＭａｎｉａ
ｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡ
Ｌ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬ
ＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，１９８７）；シリーズＭＥＴＨ
ＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐ
ＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，
Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編，１９９５）；ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬ
Ｌ  ＣＵＬＴＵＲＥ  （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８７）；「Ｔｒａｎｓｇｅｎ
ｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏ
ｏｋ」，Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ（編）第１版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；
ＩＳＢＮ：０１２５５７１６５８；および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕ
ｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，Ｂｒｉｇｉｄ  Ｈｏ
ｇａｎら，ＩＳＢＮ：０８７９６９３８４３，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉ
ｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，出版日：１９９９年９月，第
２版を参照のこと。
【００２９】
（１．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語を用い、そして以下に示されるとおりに定義される
べきことが意図される。他に示さない限り、本明細書中で用いられる全ての用語は、本発
明の分野の当業者に対して有するのと同じ意味を有する。
【００３０】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドもしくは
リボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログの、任意の長さのポリマー形態の
ヌクレオチドを言及するために交換可能に用いられ、そしてこれらの任意の長さのポリマ
ー形態のヌクレオチドを言及する。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、そ
して既知または未知の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例として
は、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリ
ヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離された
ＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。
【００３１】
ポリヌクレオチドは代表的に、４つのヌクレオチド塩基の特定の配列から構成される：
アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオ
チドがＲＮＡである場合、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））。従って、用語ポリ
ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子のアルファベットによる表示である。このア
ルファベットによる表示は、中央処理装置を有するコンピュータ中のデータベースに入力
され得、そしてバイオインフォーマティクスでの適用（例えば、機能的ジェノミクスおよ
び相同性検索）に用いられ得る。
【００３２】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な調節配
列（または「制御エレメント」）の制御下に置かれた場合、例えば、インビボで、（ＤＮ
Ａの場合）転写され、そしてポリペプチドへと（ｍＲＮＡの場合）翻訳される核酸分子で
ある。コード配列の境界は代表的に、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’（カ
ルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列としては、ウイルス
、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡ
由来のゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るがこれらに限定
されない。転写終結配列は、コード配列に対して３’側に配置され得る。他の「制御エレ
メント」もまた、コード配列に結合し得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所
望のポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーを表す、選択された細胞によって好まれるコ
ドンを用いることによって、選択された細胞における発現のために最適化され得る。「コ
ードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列であって、ここで、このポリ
ペプチド配列またはその一部分が、その核酸配列によってコードされるポリペプチド由来
の少なくとも３〜５アミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、そしてさら
により好ましくは少なくとも１５〜２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む核酸配列をいう。
この配列によってコードされるポリペプチドを用いて免疫学的に同定可能であるポリペプ
チド配列もまた包含される。
【００３３】
「転写因子」とは代表的に、特定の遺伝子の転写、従って特定の遺伝子の発現に影響を
与えるタンパク質（またはポリペプチド）をいう。転写因子とは、単一のポリペプチド転
写因子、順次もしくは協調して作用する１以上のポリペプチド、またはポリペプチド複合
体を言及し得る。
【００３４】
代表的「制御エレメント」としては、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント
、シス作用性転写調節エレメント（転写調節因子、例えば、遺伝子の転写に影響を与える
シス作用性エレメント、例えば、転写因子が相互作用して遺伝子の発現を誘導または抑制
するプロモーター領域）、転写開始シグナル（例えば、ＴＡＴＡボックス）、基本的プロ
モーター、転写終結シグナル、ならびにポリアデニル化配列（翻訳停止コドンに対して３
’側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列に対して５’側に位置す
る）、翻訳増強配列、および翻訳終結配列が挙げられるがこれらに限定されない。転写プ
ロモーターとしては、例えば、誘導性プロモーター（ここで、このプロモーターに作動可
能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などに
よって誘導される）、抑制性プロモーター（ここで、このプロモーターに作動可能に連結
されたポリヌクレオチド配列の発現は、分析物、補因子、調節タンパク質などによって誘
導される）、および構成性プロモーターが挙げられ得る。
【００３５】
「発現増強配列」はまた、「エンハンサー配列」または「エンハンサー」とも呼ばれ、
代表的には、このような制御エレメント（例えば、プロモーター、プロモーターエンハン
サー、エンハンサーエレメント、および翻訳エンハンサー（例えば、シャイン−ダルガー
ノ配列））の非存在下での発現レベルと比較して、ポリヌクレオチドの転写または翻訳を
改善する制御エレメントをいう。
【００３６】
用語「調節」とは、部分的阻害を含め、阻害、ならびに刺激の両方をいう。従って、例
えば、レポーター配列の発現を調節する化合物は、部分的もしくは完全にのいずれかでそ
の発現を阻害してもよく、またはその配列の発現を刺激してもよい。
【００３７】
「精製されたポリヌクレオチド」とは、そのポリヌクレオチドが天然で会合しているタ
ンパク質を本質的に含まない、例えば、そのタンパク質のうちの約５０％未満、好ましく
は約７０％未満、そしてより好ましくは約９０％未満を含む、目的のポリヌクレオチドま
たはそのフラグメントをいう。目的のポリヌクレオチドを精製するための技術は、当該分
野で周知であり、そして例えば、カオロピック剤を用いたこのポリヌクレオチドを含む細
胞の破壊、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
および密度による沈降によるポリヌクレオチドとタンパク質との分離を包含する。
【００３８】
「異種配列」とは代表的に、（ｉ）目的の細胞にも生物にも通常見出されない核酸配列
、または（ｉｉ）ゲノム部位に導入された核酸配列であって、ここで、この核酸配列は、
天然ではその部位に通常生じない、核酸配列のいずれかをいう。例えば、ポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列は、酵母から入手され得、そして細菌細胞へと導入され得る。この
場合、酵母ＤＮＡ配列は、細菌細胞のネイティブＤＮＡに対して「異種」である。あるい
は、Ｔｉｅ２遺伝子由来のプロモーター配列は、ｆｏｓＢ遺伝子のゲノム位置へと導入さ
れ得る。この場合、Ｔｉｅ２プロモーター配列は、ネイティブｆｏｓＢゲノム配列に対し
て「異種」である。
【００３９】
「ポリペプチド」は、その最も広範な意味で使用されて、２以上のサブユニットアミノ
酸、アミノ酸アナログ、または他のペプチド模倣物の化合物をいう。このサブユニットは
、ペプチド結合によって連結されてもよく、または他の（例えば、エステル、エーテルな
どの）結合によって連結されてもよい。用語「アミノ酸」は代表的に、天然および／また
は非天然もしくは合成のいずれかのアミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異
性体、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む）をいう。３以上のアミノ
酸のペプチドは、そのペプチド鎖が短い場合、通常、オリゴペプチドと呼ばれる。そのペ
プチドが長い場合、そのペプチドは代表的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる
。
【００４０】
「作動可能に連結される」とは、このように記載された構成要素が、それらの通常の機
能を果たすように配置される、エレメントの配置をいう。従って、コード配列（例えば、
レポーター発現カセット）に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が
存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。このプロモーターまたは他の制御エレ
メントは、それらが機能してその発現を指向する限り、コード配列と連続する必要はない
。例えば、介在する翻訳されないが転写される配列は、プロモーター配列とコード配列と
の間に存在し得、そしてこのプロモーター配列はなおも、コード配列に「作動可能に連結
されている」とみなされ得る。
【００４１】
核酸分子を記載する、「組換え体」とは、その起源または操作によって、以下であるゲ
ノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成の起源のポリヌクレオチドを意味する：（１）天然
で会合しているポリヌクレオチドの全てとも一部分とも会合していない；および／または
（２）天然で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結している。用
語「組換え」とは、タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、組換えポリ
ヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、
「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および例えば、原核生物微生物ま
たは単細胞実体として培養された真核生物細胞株を示す他のこのような用語は、交換可能
に用いられ、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡについてのレシピエントとして用いら
れ得るかまたは用いられている細胞を言及し、そしてトランスフェクトされた元の細胞の
子孫を包含する。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的変異に起因して、形態また
は元の親に相補的なゲノムＤＮＡもしくは総ＤＮＡが必ずしも完全に同一でないかもしれ
ないことが理解される。適切な特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド
配列の存在）によって特徴付けられる、親細胞と充分に類似した親細胞の子孫は、この定
義によって意図される子孫に含まれ、そして上記の用語によって包含される。
【００４２】
「単離されたポリヌクレオチド」分子は、その分子が天然で見出される生物全体から分
離されて不連続の核酸分子；または天然で通常会合している配列を全体的もしくは部分的
に含まない核酸分子；または天然に存在するような、しかしそれに会合した異種配列（以
下に規定のとおり）を有する配列である。
【００４３】
核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術もまた、当該分野で公知で
ある。代表的に、このような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決
定する工程および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定する工程、なら
びにこれらの配列を第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対して比較する工程を
包含する。一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つ
のポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミ
ノ酸の一致をいう。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「パ
ーセント同一性」を決定することによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性
は、核酸配列またはアミノ酸配列によらず、より短い配列の長さによって除算し、そして
１００を掛けた、２つの整列した配列の間での正確な一致の数である。核酸配列について
のおよその整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐ
ｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所相同性ア
ルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏ
ｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａ
ｙｈｏｆｆ編，５補遺３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  
Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡに
よって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７
４５−６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリング行列を用いることによっ
てアミノ酸配列に適用され得る。配列のパーセント同一性を決定するこのアルゴリズムの
例示的実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される
。この方法のためのデフォルトパラメーターは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ
８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ
，ＷＩから入手可能）において記載される。本発明の状況においてパーセント同一性を確
立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があ
り、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発
され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ
，ＣＡ）によって配布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。
この一式のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが用いられ得、
ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリング表に関して用いられる（例えば、１２
のギャップオープンペナルティー（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、１のギャップ
伸長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、および６のギャッ
プ（ｇａｐ））。作成したデータから、「一致（Ｍａｔｃｈ）」の値は、「配列同一性（
ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を反映する。配列間のパーセント同一性または
パーセント類似性を算出するための他の適切なプログラムは一般に、当該分野で公知であ
り、例えば、別の整列プログラムは、ＢＬＡＳＴであり、デフォルトパラメーターととも
に用いられる。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメー
ターを用いて使用され得る：遺伝暗号（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ）＝標準；フィルター
（ｆｉｌｔｅｒ）＝なし；鎖（ｓｔｒａｎｄ）＝両方；カットオフ（ｃｕｔｏｆｆ）＝６
０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）＝１０；行列（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（
Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート（ｓｏｒｔ  ｂｙ）＝ハイスコア（ＨＩ
ＧＨ  ＳＣＯＲＥ）；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅｓ）＝非重複のＧｅｎＢａｎｋ＋
ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓ
ｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、
以下のインターネットアドレスに見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌ
ｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４４】
当業者は、上記のプログラムにおいて所定の配列について使用するに適切な検索パラメ
ーターを容易に決定し得る。例えば、検索パラメーターは、問題の配列のサイズに基づい
て変動し得る。従って、例えば、本発明の代表的実施形態は、Ｘ個連続したヌクレオチド
を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、（ｉ）Ｘ個連続したヌクレオチドは
、本明細書中に記載される配列のうちのいずれかに由来するＹ個連続したヌクレオチドに
対して少なくとも約５０％の同一性を有する、（ｉｉ）Ｘは、Ｙに等しい、そして（ｉｉ
ｉ）Ｘは、６から、本明細書中に記載されるとおりの選択された全長配列中に存在するヌ
クレオチドの数（上記の範囲内に入る全ての整数の値を含む）までに等しい（例えば、実
施例、図面、配列表および特許請求の範囲を参照のこと）。ポリヌクレオチドの「フラグ
メント」とは、本明細書中に記載される、より長いポリヌクレオチドに由来する、任意の
長さのポリヌクレオチド分子（すなわち、Ｙ個連続したヌクレオチド、ここで、ちょうど
記載したとおり、Ｘ＝Ｙ）をいう。例示的なフラグメント長としては、少なくとも約６個
連続したヌクレオチド、少なくとも約５０個連続したヌクレオチド、約１００個連続した
ヌクレオチド、約２００個連続したヌクレオチド、約２５０個連続したヌクレオチド、約
５００個連続したヌクレオチド、または少なくとも約１０００個以上連続したヌクレオチ
ドが挙げられるがこれらに限定されず、ここで、このような連続したヌクレオチドは、連
続したヌクレオチドのより長い配列に由来する。
【００４５】
精製されたポリヌクレオチドおよび本発明の発現カセットの構築において用いられるポ
リヌクレオチドとしては、本明細書中に開示される配列、ならびに約８０％〜１００％お
よびこれらの間の整数の値の配列同一性を有する関連のポリヌクレオチド配列が挙げられ
る。代表的に、本明細書中に開示される配列および本願配列の間のパーセント同一性は、
少なくとも約８０〜８５％、好ましくは少なくとも約９０〜９２％、より好ましくは少な
くとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８％（これらの記載された範囲内
に入る全ての整数値を含む）の配列同一性である。これらのパーセント同一性は、例えば
、本発明の配列が問合せ配列として使用される場合、本願配列、または本発明の他の配列
に対するものである。
【００４６】
あるいは、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の程度は、相同領域の間で安定な二重鎖
を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて、一本鎖特異
的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され
得る。２つのＤＮＡ配列または２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、上記の方法
を用いて決定した場合、これらの分子の規定の長さにわたって、参照配列に対して少なく
とも約８０〜８５％、好ましくは８５〜９０％、より好ましくは９０〜９５％、そして最
も好ましくは９８〜１００％の配列同一性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。
実質的に相同とはまた、指定されたＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同
一性を示す配列をいう。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定のシステムについて
規定したとおりの、例えば、ストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーショ
ン実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当
該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと
。
【００４７】
２つの核酸フラグメントは、本明細書中に記載されたとおり、「選択的にハイブリダイ
ズする」とみなされる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、このような分子の間
のハイブリダイゼーション事象の効率および強度に影響を与える。部分的に同一の核酸配
列は、完全に同一な配列が、標的分子に対してハイブリダイズすることを少なくとも部分
的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野で周知で
あるハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価され得る（例えば、サザンブロット、
ノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１
９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。このよう
なアッセイは、種々の程度の選択性を用いて、例えば、低いストリンジェンシーから高い
ストリンジェンシーまで変化する条件を用いて実施され得る。低いストリンジェンシーの
条件が用いられる場合、非特異的結合が存在しないことは、一部という程度にすら配列同
一性を欠く二次プローブを用いて評価され得（例えば、標的分子との約３０％未満の配列
同一性を有するプローブ）、その結果、非特異的結合事象の非存在下で、二次プローブは
、標的にハイブリダイズしない。
【００４８】
ハイブリダイゼーションベースの検出系を利用する場合、標的核酸配列に対して相補的
である核酸プローブが選択され、次いで、適切な条件の選択によって、プローブと標的配
列とが、「選択的にハイブリダイズ」するか、または互いに結合して、ハイブリッド分子
を形成する。「中程度にストリンジェントな」下で標的配列に選択的にハイブリダイズし
得る核酸分子は代表的に、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同
一性を有する、少なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にす
る条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は代表
的に、選択された核酸プローブの配列と約９０〜９５％より高い配列同一性を有する、少
なくとも約１０〜１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブおよ
び標的が特定の程度の配列同一性を有する、プローブ／標的ハイブリダイゼーションに有
用なハイブリダイゼーション条件は、当該分野で公知のように決定され得る（例えば、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）Ｏｘｆ
ｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００４９】
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、多数の同等の条
件を用いて、例えば、以下の要因を変化させることによって、特定のストリンジェンシー
が達成され得ることが当該分野で周知である：プローブおよび標的配列の長さおよび性質
、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブ
リダイゼーション溶液中でのブロッキング剤の存在または非存在（例えば、ホルムアミド
、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温
度および時間のパラメーター、ならびに種々の洗浄条件。特定のセットのハイブリダイゼ
ーション条件の選択は、当該分野における標準的方法に従って選択される（例えば、Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍ
ａｎｕａｌ，第２版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参
照のこと）。
【００５０】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞へと移入し得る。代表的に、「ベクター構築物
」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を指向し
得、かつ遺伝子配列を標的細胞へと移入し得る、任意の核酸構築物を意味する。従って、
この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびに組込みベクターを含む
。
【００５１】
「核酸発現ベクター」または「発現カセット」とは、目的の配列または遺伝子の発現を
指向し得るアセンブリをいう。核酸発現ベクターは、目的の配列または遺伝子に作動可能
に連結されたプロモーターを含む。他の制御エレメントもまた存在し得る。本明細書中に
記載される発現カセットは、プラスミド構築物中に含まれ得る。発現カセットの成分に加
えて、このプラスミド構築物はまた、細菌の複製起点、１以上の選択マーカー、プラスミ
ド構築物が一本鎖ＤＮＡとして存在するのを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３の複製
起点）、マルチプルクローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４
０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００５２】
「発現カセット」は、目的の遺伝子／コード配列の発現を指向し得る任意の核酸構築物
を含む。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞中に移入するために、「ベクタ
ー」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」または「遺伝子移入ベクター」中に構築さ
れ得る。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイ
ルスベクターを含む。
【００５３】
種々の「レポーター遺伝子」はまた、「レポーター配列」および「マーカー配列」とも
呼ばれ、すなわち、その発現は、レポーター遺伝子または配列が作動可能に連結されてい
る目的のポリヌクレオチド配列の発現を示す遺伝子または配列である。好ましいのは、（
好ましくは慣用アッセイにおいて）容易に測定されるタンパク質産物を産生するレポータ
ー配列である。適切なレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ（ＣＡＴ）、光生成タンパク質（例えば、ｌｕｃにコードされる蛍光タンパ
ク質、ｌｕｘにコードされる蛍光タンパク質）、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられ
るがこれらに限定されない。便利なアッセイとしては、熱量アッセイ、蛍光測定アッセイ
および酵素アッセイが挙げられるがこれらに限定されない。１つの局面では、細胞内で発
現され、かつその細胞外産物が、細胞内媒体または培養細胞株の細胞内媒体の抽出物にお
いて直接的に測定される、レポーター遺伝子が用いられ得る。これは、その産物が分泌さ
れるレポーター遺伝子を用いることを超える利点を提供する。なぜなら、分泌の速度およ
び効率は、アッセイの解釈を複雑にし得るさらなる変数を導入するからである。好ましい
実施形態では、レポーター遺伝子は、光生成タンパク質である。本明細書中に記載される
光生成レポータータンパク質を用いる場合、発現は、上記のように、正確かつ非侵襲的に
評価され得る（例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．
４：２４５−７；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔ
ｏｂｉｏｌ．６６：５２３−３１；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３を参照のこと）。
【００５４】
「光生成タンパク質」または「発光タンパク質」は、代表的には２００ｎｍ〜１１００
ｎｍ、好ましくは可視スペクトル（すなわち、約３５０ｎｍと８００ｎｍとの間）の範囲
の光を生成し得る、生物発光タンパク質または蛍光タンパク質である。生物発光タンパク
質は、化学反応（代表的には、基質、エネルギー源および酸素を必要とする）をとおして
光を生成する。蛍光タンパク質は、（例えば、緑色蛍光タンパク質を用いて）放射線の吸
収および再発光をとおして光を生成する。生物発光タンパク質の例としては、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：「ルシフェラーゼ」は、他に述べない限り、原核生物（
例えば、細菌のｌｕｘにコードされる）ルシフェラーゼおよび真核生物（例えば、蛍のｌ
ｕｃにコードされる）ルシフェラーゼ、ならびに変動もしくは変化した光学的特性を保有
する改変体（例えば、異なる色の光を生成するルシフェラーゼ（例えば、Ｋａｊｉｙａｍ
ａ，Ｎ．，およびＮａｋａｎｏ，Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４（
６）：６９１−６９３（１９９１））；ならびに「光タンパク質」（例えば、カルシウム
活性化光タンパク質（例えば、Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．Ｃ．ら，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｊ．Ａｎ
ａｌ．Ｃｈｅｍ．３６６（６−７）：７６０−７６８（２０００））を包含する。蛍光タ
ンパク質の例としては、緑色、黄色、シアン、青色、および赤色の蛍光タンパク質（例え
ば、Ｈａｄｊａｎｔｏｎａｋｉｓ，Ａ．Ｋ．ら，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ
ｌ．１１５（１）：４９−５８（２００１））が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
「生物発光タンパク質基質」は、代表的には、エネルギー源（例えば、ＡＴＰまたはＦ
ＭＮＨ２）および酸素の添加によって、エネルギー崩壊基質（例えば、ルシフェリン）お
よび光の光子を生成する光生成タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ酵素）の基質を記載
する。このような基質の例としては、細菌ｌｕｘ系におけるデカナール、蛍ルシフェラー
ゼ（ｌｕｃ）系における４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリ
ル）−４−チアゾールカルボン酸（または単にルシフェリンと呼ばれる）、生物発光性真
菌Ｐａｎｅｌｌｕｓ  ｓｔｉｐｔｉｃｕｓ系における「パナール（ｐａｎａｌ）」（Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４４：１５９７−１６０２，１９８８）およびミミズＤｉｐｌｏｃ
ａｒｄｉａ  ｌｏｎｇａ系におけるＮ−イソ−バレリル−３−アミノプロパノール（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１５：１００１−１００４，１９７６）が挙げられるがこれらに限定されな
い。いくつかの系では、本明細書中に記載のとおり、アルデヒドを、光生成タンパク質に
ついての基質として用い得る。
【００５６】
「光」は、他に述べない限り、約２００ｎｍ（例えば、ＵＶ−Ｃについて）と約１１０
０ｎｍ（例えば、赤外）との間の波長を有する電磁放射と本明細書中で定義される。可視
光の波長は、約３５０ｎｍ〜約８００ｎｍ（すなわち、約３，５００Åと約８，０００Å
との間）の範囲にわたる。
【００５７】
「動物」とは代表的に、非ヒト動物（家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギお
よびウマ）；家庭用哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（クロアシイタチ、
ノウサギおよびウサギ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ
およびモルモット）を含む）を含むがこれらに限定されない）；非ヒト霊長類（チンパン
ジーを含む）をいう。用語「動物」はまた、以下を包含し得るがこれらに限定されない；
鳥類（家庭用鳥類、野生の鳥類および狩猟用鳥類を含む（例えば、ニワトリ、シチメンチ
ョウおよび他のキジ類の鳥類、アヒル、ガチョウなど））、ならびに両生類、魚類、昆虫
、爬虫類など。この用語は、特定の齢を示さない。従って、成体、胚、胎仔、および新生
仔の個体は、包含されることが意図される。
【００５８】
「トランスジェニック動物」とは、遺伝子操作された動物または遺伝子操作された動物
の子孫をいう。トランスジェニック動物は通常、少なくとも１つの無関係の生物（例えば
、ウイルス、微生物、植物または他の動物）由来の物質を含む。用語「キメラ動物」は、
異種遺伝子が見出されるか、または異種遺伝子がその動物のいくつかの細胞で発現される
が全ての細胞では発現されない動物を言及するために用いられる。
【００５９】
「分析物」とは、その効果（例えば、特異的プロモーターの誘導または抑制）が、本発
明の試験動物および方法を用いて評価され得る任意の化合物または物質をいう。このよう
な分析物としては、化合物、薬学的化合物、ポリペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド
、およびポリヌクレオチドアナログが挙げられるがこれらに限定されない。多くの組織（
例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，薬品会社およ
び化学会社）が、天然プロセスもしくは合成プロセス、または発酵ブロスもしくは発酵抽
出物由来の化合物または生物学的化合物の大きなライブラリーを有する。このような化合
物／分析物は、本発明の実施において用いられ得る。
【００６０】
用語「ポジティブ選択マーカー」とは、遺伝子を保有する細胞のみが、特定の条件下で
生存および／または増殖するのを可能にする産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導
入したネオマイシン耐性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する、植物細胞および動物細胞は、化
合物Ｇ４１８に対して耐性である。Ｎｅｏｒ遺伝子マーカーを保有しない細胞は、Ｇ４１
８によって殺傷される。他のポジティブ選択マーカーは、当業者に公知である。代表的に
、ポジティブ選択マーカーは、容易にアッセイされ得る産物をコードする。従って、ポジ
ティブ選択マーカーを用いて、特定のＤＮＡ構築物が細胞、器官または組織に導入された
か否かを決定し得る。
【００６１】
「ネガティブ選択マーカー」とは、細胞を特定の条件下で選択的に殺傷するため、およ
び／または細胞の増殖を選択的に阻害するために用いられ得る産物をコードする遺伝子を
いう。ネガティブ選択挿入物の非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子が挙げられる。活性なＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含む細胞は
、ガンシクロビルまたは類似の薬剤の存在下で増殖することができない。従って、基質に
依存して、いくつかの遺伝子産物は、ポジティブ選択マーカーまたはネガティブ選択マー
カーとして作用し得る。
【００６２】
用語「相同組換え」とは、２つのＤＮＡ分子または染色分体の間での、本質的に同一の
ヌクレオチド配列の部位でのＤＮＡフラグメントの交換をいう。実質的に相同な配列は、
ヌクレオチド配列中に挿入、欠失および置換を含み得ることが理解される。従って、ヌク
レオチドの直鎖状配列は、ヌクレオチド残基のうちのいくつかが正確には対応せず、整列
もしない場合でさえ、本質的に同一であり得る（上記を参照のこと）。
【００６３】
「ノックアウト」変異とは、標的遺伝子の少なくとも一部の発現の部分的または完全な
喪失をいう。ノックアウト変異の例としては、異種配列による遺伝子置換、異種配列によ
る遺伝子破壊、およびその遺伝子の必須エレメント（例えば、プロモーター領域、コード
配列の一部）の欠失が挙げられるがこれらに限定されない。「ノックアウト」変異は代表
的に、変異によって作製される表現型によって同定される。
【００６４】
「遺伝子」は、本発明の状況において用いられる場合、遺伝的機能が関連する、遺伝的
核酸（染色体、プラスミドなど）におけるヌクレオチドの配列である。遺伝子は、生物の
ゲノム内の特定の物理的位置（「座」「遺伝子座」または「遺伝的位置」）を占める、ポ
リヌクレオチド配列（例えば、哺乳動物についてはＤＮＡ配列）を含む（例えば、生物の
）遺伝単位である。遺伝子は、発現産物（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
（例えば、ｔＲＮＡ））をコードし得る。あるいは、遺伝子は、特定の事象／機能（例え
ば、タンパク質および／または核酸の結合）についてのゲノム位置（例えば、ファージ結
合部位）を規定し得、ここで、この遺伝子は、発現産物をコードしない。代表的に、遺伝
子は、コード配列（例えば、ポリペプチドコード配列）および非コード配列（例えば、転
写制御エレメント（例えば、プロモーター配列）、ポリアデニル化配列、転写制御配列（
例えば、エンハンサー配列））を含む。多くの真核生物遺伝子は、「イントロン」（非コ
ード配列）によって中断された「エキソン」（コード配列）を含む。特定の場合には、遺
伝子は、別の遺伝子（例えば、重複遺伝子）と配列を共有し得る。
【００６５】
遺伝子の「ネイティブな配列」または「野生型配列」は、その遺伝子に対応する遺伝子
座を構成するポリヌクレオチド配列（例えば、生物の野生型ゲノムにおいて存在するよう
な、完全に機能的な遺伝子産物の発現に必要な全ての調節配列およびオープンリーディン
グフレームコード配列）である。遺伝子のネイティブな配列は、例えば、転写プロモータ
ー配列、翻訳増強配列、イントロン、エキソン、およびポリ−Ａプロセシングシグナル部
位を含み得る。一般的集団では、野生型遺伝子は、互いに対して配列の変化を含み、なお
も認識し得る病理学的影響を引き起こさない、複数の優勢なバージョンを含み得ることが
留意される。これらのバリエーションは、「多型」または「対立遺伝子バリエーション」
と称される。
【００６６】
「置換配列」によって、遺伝子のネイティブまたは野生型の配列の少なくとも一部の代
わりとなるポリヌクレオチド配列が意味される。
【００６７】
「直鎖状ベクター」または「直鎖化ベクター」は、２つの末端を有するベクターである
。例えば、環状ベクター（例えば、プラスミド）は、プラスミド中の１部位で切断する制
限エンドヌクレアーゼでの消化によって直鎖化され得る。好ましくは、本明細書中に記載
される発現ベクターは、目的の配列内に末端が存在しないように直鎖化される。
【００６８】
本発明を詳細に記載する前に、本発明が、特定の処方も方法のパラメーターももちろん
変動し得るので、特定の処方にも方法のパラメーターにも限定されないことが理解される
べきである。本明細書中で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を記載する目的の
ためのみであって、限定することを意図しないこともまた理解されるべきである。
【００６９】
本明細書中に記載された方法および材料と類似かまたは等価の多数の方法および材料が
本発明の実施において用いられ得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載さ
れる。
【００７０】
（２．発明を実施する形態）
本願をとおして、種々の刊行物、特許および公開特許出願が、同定する引用によって言
及される。本願において援用されるこれらの刊行物、特許、および公開特許明細書の開示
は、本発明が属する分野の技術水準を記載するのを助ける。
【００７１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ
」および「ｔｈｅ」は、内容がそうでないと明らかに示さない限り、複数の言及を含む。
従って、例えば、「発現構築物」についての言及は、２以上のこのような因子の混合物を
包含する。
【００７２】
（２．１．０  一般的概観）
１つの局面では、本発明は、チロクロムＰ４５０遺伝子（例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１およ
びＣＹＰ３Ａ４）に由来する転写制御エレメント、これらの制御エレメントを含む発現カ
セット、この発現カセットを含むベクター構築物、細胞およびトランスジェニック動物、
ならびにこの発現カセットを含む細胞およびトランスジェニック動物を例えば、モデリン
グ系、スクリーニング系および／または試験系として使用する方法に関する。本発明の制
御エレメント、発現カセット、細胞、およびトランスジェニック動物を用いる方法として
は、毒性および薬物代謝に関する研究、ならびに薬物の代謝、安全性および／または可能
な毒性についてスクリーニングする方法が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の
実施において有用な例示的な転写制御エレメントとしては、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子
座に由来する転写制御エレメントおよびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子座に由来する転写制御エ
レメントが挙げられる。本発明を支持して実施される実験は、Ｃｙｐ３Ａ１１転写制御エ
レメントまたはＣＹＰ３Ａ４転写制御エレメントによって媒介される発現の調節に対する
化合物の影響が、生存動物において直接的にモニタリングされて、その化合物の影響（例
えば、毒性）についての情報を提供し得ることを実証する。
【００７３】
１つの実施形態では、本発明は、以下に関する：（１）マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子の
遺伝子座またはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の遺伝子座に由来する転写制御エレメント（例え
ば、プロモーター）；（２）遺伝子産物（例えば、レポーター、タンパク質、ポリペプチ
ド、ホルモン、リボザイム、またはアンチセンスＲＮＡ）をコードする遺伝子に作動可能
に連結された、このような転写制御エレメントを含む発現カセット、（３）このような発
現カセットを含む組換え細胞、（４）このような細胞を用いた安全性および／または可能
な毒性についてのスクリーニングの方法（例えば、本発明の転写制御エレメントによって
媒介される発現を調節した化合物の毒性または安全性についてのスクリーニング）、（５
）上記の転写制御エレメント、発現カセット、および／またはベクター構築物を含む動物
（例えば、トランスジェニックまたは「肝臓プッシュ」）、（６）このような動物を用い
て安全性および／または毒性をモニタリングする方法、ならびに（７）このような動物を
用いて化合物の安全性および／または毒性についてスクリーニングする方法。
【００７４】
種々の転写制御エレメントは、本発明の実施（例えば、薬物代謝に関連した遺伝子また
は遺伝子座由来の転写制御エレメント）において有用である。規定のポリヌクレオチド配
列内の選択された転写制御エレメントの特定の位置は、本明細書の教示を考慮して、当業
者に公知の方法（例えば、配列比較、欠失分析、および／またはリンカー−挿入変異誘発
）によって同定され得る。例示的な転写制御エレメントは、薬物の酸化的代謝に関連した
転写制御エレメント（例えば、広範な種々の内因性物質および生体異物を代謝する、Ｐ４
５０スーパーファミリーの血液タンパク質）であり得る。このような転写制御エレメント
の特定の実施形態としては、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子に関連する転写制御エレメント
およびヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子に関連する転写制御エレメントが挙げられる。このように
して、レポーター配列の発現は、例えば、候補薬物の投与後の場合、本発明のトランスジ
ェニック動物において誘導され、そしてその薬物の安全性および／または毒性が、動物全
体を用いた非侵襲的画像化方法によって評価され得る。本明細書中に記載される本発明の
異なる実施形態の種々の形態は、組み合わされ得る。
【００７５】
哺乳動物被験体における発光結合体の非侵襲的画像化および／または検出は、Ｃｏｎｔ
ａｇらによる米国特許第５，６５０，１３５号および同第６，２１７，８４７号（それぞ
れ、１９９７年７月２２日発行および２００１年４月１７日発行）に記載された。この画
像化技術は、本明細書の教示を考慮して、本発明の実施において用いられ得る。この画像
化方法では、この結合体は、生体適合性実体および光生成部分を含む。生体適合性実体と
しては、低分子（例えば、環状有機分子）；高分子（例えば、タンパク質）；微生物（例
えば、ウイルス、細菌、酵母および真菌）；真核生物細胞；全ての型の病原体および病原
性物質；ならびに粒子（例えば、ビーズおよびリポソーム）が挙げられるがこれらに限定
されない。別の局面では、生体適合性実体は、画像化される哺乳動物被験体を構成する細
胞の全てまたはいくつか（例えば、レポーター配列を発現する、本発明の発現カセットを
保有する細胞）であり得る。
【００７６】
発光能力は、光生成部分の結合体化によって、生物適合性実体に付与される。このよう
な部分としては、蛍光分子、蛍光タンパク質、光子を放出する酵素反応物、および発光物
質（例えば、生物発光タンパク質）が挙げられる。本発明の状況では、発光能力は代表的
に、少なくとも１コピーの光生成タンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）の存在を有する
ことによって、標的細胞に付与される。好ましい実施形態では、ルシフェラーゼは、ルシ
フェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を促進し得る適切な制御エレメントに作動可
能に連結される。ルシフェラーゼの基質は、細胞に対して内因性であっても細胞もしくは
系に対して付与されてもよい（例えば、ルシフェラーゼ構築物を保有する細胞を有するト
ランスジェニックマウスへの、適切なルシフェラーゼ基質（例えば、ルシフェリン）の注
射）。結合体化は、化学的カップリング工程、融合タンパク質の遺伝子操作工程、または
光生成タンパク質を発現させるための、細胞、微生物もしくは動物の形質転換を含み得る
。
【００７７】
従って、１つの局面では、本発明は、目的の分析物の毒物学研究のための動物試験系お
よび方法に関する。本発明の実施において、２以上のストレス誘導遺伝子の制御エレメン
ト（例えば、プロモーターまたは転写調節配列）が、レポーター遺伝子コード配列（例え
ば、ルシフェラーゼ）に作動可能に連結されているトランスジェニック哺乳動物または生
存プッシュ動物が構築される。レポーター遺伝子産物についての適切な基質は、目的の分
析物に加えて、この動物に投与される。これらの２つの物質の投与の順序は、各目的の分
析物について経験的に決定され得る。次いで、制御エレメントのいずれかによって媒介さ
れる発現の誘導は、動物全体を用いた非侵襲的画像化方法によって評価される。
【００７８】
従って、本発明の１つの局面では、本明細書中に記載の動物は、例えば、毒性関連遺伝
子（例えば、Ｐ４５０）の発現に対する高生産量（ＨＰＶ）物の影響を調べることによっ
て、ＨＰＶの化学物質のインビボでの効果を評価するために用いられ得る。今日までに、
非ポリマー化学物質のセット内に約３，０００のＨＰＶ化学物質が存在する（ポリマー化
学物質は、生物によってほとんど吸収されない傾向があり、従って一般に低い毒性を有す
る）。本発明の前には、これらの化学物質のインビボでの毒性を評価する慣用的な有効な
方法は存在せず、これは、化学物質自体の毒性だけではなく、その代謝産物（例えば、分
解産物）の毒性をも考慮する。
【００７９】
化学物質の製造業者および輸入業者は、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎ
ｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）によって、それらの高生
産量（ＨＰＶ）の化学物質についての基本的毒性情報を提供するように促されている。Ｈ
ＰＶ化学物質は、１年あたり１００万ポンドを超える量で合衆国において産生されるかま
たは合衆国へと輸入される化学物質である。自主計画に参加する各化学物質の会社は、そ
の会社が試験に適合する化学物質を同定すると確約する。ＥＰＡによって確立されたガイ
ドラインに従って、参加する会社は、以下の作業を行う：既存のデータの妥当性の評価；
試験計画の設計および提出；作成された試験結果を提供する；そして各化学物質を特徴付
けするデータのまとめを準備する。現在、自主計画は、スクリーニング情報データセット
（Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｅｔ：ＳＩＤＳ）プログ
ラムによって用いられる、同じ試験、試験プロトコル、および基本情報のまとめの様式を
使用する。ＳＩＤＳは、世界中のＨＰＶ化学物質についての基本的毒性情報を補償する、
協調的国際的努力である。従って、米国の国内計画のために準備された情報は、国際的努
力において受け入れられ得る。
【００８０】
米国が輸入また生産する約３，０００個の化学物質は、１００万Ｉｂｓ．／ｙｒ．より
も多く、近年のＥＰＡ分析は、４３％のこれらの高い生産量の化学物質は、基本的な毒性
に基づく試験データを有さず、そして７％のみしか完全なセットの基本的な試験データを
有さないことを見出す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｐｐｔｉｎｔｒ／ｃ
ｈｅｍｔｒｋ）。この試験データの欠除は、環境、家、仕事場、および製品中に見出され
る化学物質について知る公衆の権利を損なう。
【００８１】
毒性についての高い産生量（ＨＰＶ）化学物質をスクリーニングするための国際的に承
諾されている６つの基本的な試験がある。Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｅｃｏｎ
ｏｍｉｃ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ’ｓ  Ｓｃｒｅｅ
ｎｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｅｔ（ＯＥＣＤ／ＳＩＤＳ）プログラ
ムの下で承諾された試験としては、以下が挙げられる：急性毒性；慢性毒性；発生／生殖
毒性；変異原性；生態毒性および環境破壊。これらの試験のいくつかは、動物モデルに依
存し、ここで動物モデルは、毒性データを入手するために屠殺されなければならない。本
明細書中に記載されるトランスジェニック動物は、毒性試験について有用であり、そして
モデルの「最終点での死（ｄｅａｔｈ  ａｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）」の必要性
を避けるために有用である。従って、毒性を評価するための本発明のトランスジェニック
動物の使用は、毒性試験のより人道的な手段を提供する。さらに、本発明のレポーター発
現カセットを保有するトランスジェニック動物を使用すると、「最終点での死」は必ずし
も必要でないので、生きた動物における毒性試験に関するコストが削減され得るようであ
る。
【００８２】
ＥＰＡ’ｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｈａｚａｒｄ  Ｄａｔａ  Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ
Ｓｔｕｄｙは、公的に容易に利用可能である基本的情報における大きなギャップを見出
した。大半の消費者は、基本的な毒性試験は、有効であり、そして今日販売されている全
ての化学物質は安全であると想定している。近年のＥＰＡ研究は、これは賢明な想定では
ないことを見出している。ＥＰＡは、公的に利用可能なデータを審査し、そしてこれらの
大半は、これらがヒトまたは環境に対してどの程度毒性であるかを決定する試験を全くな
されていないことを突き止めた。ＥＰＡは、基本的な情報なしでＨＰＶ消費者化学物質の
危険（ｈａｚａｒｄ）および危険性（ｒｉｓｋ）の判断を始め得ず、実は、実際により詳
細かつ徹底的な試験が、これらの高度に曝露された化学物質を評価するために必要とされ
る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｐｐｔｉｎｔｒ／ｃｈｅｍｔｒｋ）。企
業が、この問題により本気で取り組むことが必要であることは、明らかである。
【００８３】
ＳＩＤＳ試験は、化学物質の毒性を完全には測定しない。この試験は、化学物質の関連
する危険性を決定するため、およびさらなる試験が必要な否かを決定するために使用され
得る最小限のセットの情報のみを提供する。しかし、本発明のトランスジェニック動物は
、これらの化学物質およびその代謝物の危険性について利用可能な情報を多いに展開し得
るインビボ毒性試験についてのモデルを提供する。
【００８４】
ＯＳＨＡは、仕事場における危険な化学物質についての可能な曝露制限（Ｐｅｒｍｉｓ
ｓｉｂｌｅ  Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  Ｌｉｍｉｔｓ）（ＰＥＬ）を設定する。ＰＥＬを伴なう
化学物質は、ヒト健康効果について少なくとも換算に試験されることが当然期待される。
しかし、ＰＥＬを伴なう高容量の化学物質でさえも、基本的なスクリーニング試験設定の
ヒト健康部分と有意なデータギャップを有する。ＰＥＬを伴なうこれらの高容量の化学物
質の５３％のみが、４つ全てのヒト健康指標についての基本的なスクリーニング試験を有
する。対照的に、５％の非ＰＥＬ  ＨＰＶ化学物質の５％のみが、４つ全ての健康効果試
験を有し、そして４９％は、利用可能な健康試験データを有さない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｅｐａ．ｇｏｖ／ｏｐｐｔｉｎｔｒ／ｃｈｅｍｒｔｋ）。従って、最小限データのＰ
ＥＬ欠損も有さないＨＰＶ化学物質のかさは、労働者を保護するＰＥＬ値の開発を支持す
るために必要とされる。本発明のトランスジェニック動物は、化学物質それ自体のみだけ
でなくこれらの化学物質の代謝産物の毒性も考慮するインビボデータを特異的に提供する
毒性を試験するための手段を提供する。
【００８５】
最終的に、消費者の製品に含まれる化学物質は、子供および他の感受性の集団（例えば
、妊婦および健康を損なった個体）へのその曝露の傾向に起因する主な観点である。化学
産業が、他のＨＰＶ化学物質よりもこれらの化学物質についてより多く基本的試験を行っ
てているが、本発明のトランスジェニック動物を用いるインビボ毒性のより完全な評価が
、所望される。消費者の製品の大きな曝露ポテンシャルを与えるために、有意により多い
量の試験が、このような化学物質の危険性を評価するために必要とされる。本明細書中に
記載されるトランスジェニック動物は、この必要性への対処を助ける。
【００８６】
本発明の関連する局面において、本明細書中に記載されるトランスジェニック動物は、
内分泌撹乱物質（ＥＤ）のインビボでの効果を評価するために使用され得る。ＥＤは、内
分泌系の正常な機能に緩衝する代表的な化学物質である（例えば、農薬および肥料が挙げ
られる）。公的な目的の観点およびＵ．Ｓ．Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔから
の試験についての命令の両方においての、ＨＰＶおよび潜在的な内分泌撹乱物質の評価に
ついての必要性の増大は、トランスジェニック動物によって対応され、そして本発明の化
合物スクリーニング方法を伴なうようである。
【００８７】
いくつかのストレス関連遺伝子、およびそのプロモーター／コントロールエレメントは
、以下により詳細に記載される。
【００８８】
（２．２．０  プロモーター）
本明細書中に記載される発現カセット、ベクター、細胞およびトランスジェニック動物
は、検出可能な遺伝子産物をコードする遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子）を含み
、転写制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。コノプロモー
ターは、トランスジェニック動物と同じ種（例えば、トランスジェニックマウスを作製す
るための構築において使用されるマウスプロモーター）または異なる種（例えば、トラン
スジェニックマウスを作製するための構築において使用されるヒトプロモーター）に由来
し得る。このプロモーターは、目的の任意の遺伝子に由来し得る。本発明の１つの実施形
態において、このプロモーターは、その発現が、酸化的代謝（例えば、肝臓を介した薬物
のクリアランス）の間に誘導される遺伝子に由来する。従って、薬物が、本発明のベクタ
ー構築物を保有するトランスジェニック動物に投与される場合、プロモータは誘導され、
そして動物は、ルシフェラーゼを発現し、これは、インビボでモニターされ得る。
【００８９】
本発明の使用についての例示的な転写制御エレメント（例えば、プロモーター）として
は、Ｐ４５０−関連遺伝子および遺伝子ファミリー由来のプロモーターが挙げられるがこ
れらに制限されない。ヒトにおいて、４０個の異なるＰ４５０遺伝子（「ＣＹＰ」遺伝子
と称される）および１３個の偽遺伝子が、現在知られている。これらの遺伝子は、アミノ
酸配列類似性に基づいて１６のファミリーに分類される。ファミリー１、２および３は、
薬物代謝に関連し、そしてヒトにおける９０％を超える薬物酸化は、６つのＣＹＰ遺伝子
（１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１および３Ａ４）のみに寄与する。１Ａ２、
２Ｃ９、２Ｄ６および３Ａ４が最も寄与し、ＣＹＰ３Ａ４は活性の５０〜６０％と見積も
られる。マウスＣｙｐ３Ａ１１は、例えば、Ｙａｎａｇｉｍｏｔｏ  Ｔら（１９９７）Ａ
ｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３
４０（２）：２１５〜８およびＴｏｉｄｅ  Ｋら、（１９９７）Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３３８（１）：４３〜４
９に記載される。ヒトＣＹＰ３Ａ４は、例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｈ．ら（１９９３
）に記載される。Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８（２）：５８５〜９５；Ｇｏｏｄ
ｗｉｎ  Ｂ．ら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５６（６）：１３２９〜３９
；およびＢｅｒｔｉｌｓｓｏｎ  Ｇ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓ
ｃｉ  ＵＳＡ．９５（２１）：１２２０８〜１３に記載される。本明細書中で、マウスＣ
ｙｐ３Ａ１１由来の転写制御エレメントおよびヒトＣＹＰ３Ａ４由来の転写エレメントが
例示される。
【００９０】
当業者が、本明細書の技術の観点を理解する場合、転写制御エレメント配列は、本明細
書中の技術の観点において当該分野において公知の方法を用いて、例えば、ゲノム配列に
由来して、単離され得る。例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１の転写制御エレメント配列を、以下の
実施例１に記載されるように単離し、そして配列決定した。
【００９１】
同様に、肝臓特異的発現を与える配列を、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子から得た。ＨＩＦ４、Ｃ
ＯＵＰ−ＴＦ／ＨＩＦ４、ＧＲＥ、リファンピシン、Ｄｅｘ応答エレメントが、ＣＹＰ３
Ａ４の１０．５ｋｂプロモーター領域に位置することが示唆されている（Ｇｏｏｄｗｉｎ
ら、前出）。しかし、本出願以前に、この遺伝子座の遠位の２．５Ｋｂ領域の調節エレメ
ントは記載されていない。本明細書中に記載されるように、１０．５Ｋｂおよび１３Ｋｂ
のプロモーターの活性を、肝臓プッシュ（ｌｉｖｅｒ−ｐｕｓｈ）実験およびトランスジ
ェニック動物において比較した場合、１３Ｋｂのプロモーターは、１０．５Ｋｂプロモー
ターよりも肝臓においてはるかに高い発現を媒介することを見出した。実際、肝臓押出し
実験は、１３Ｋｂプロモーター活性は、１０．５Ｋｂプロモーターを用いて観察された活
性よりも２５倍高いことを示した。さらに、１３Ｋｂプロモーターを含有するトランスジ
ェニックマウスにおけるルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼレポータが肝臓において
最高であることを示した一方で、１０．４Ｋｂトランスジェニック動物におけるルシフェ
ラーゼ発現は、腸において高い。従って、肝臓押出し実験およびトランスジェニック動物
から得られたデータは、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターの約２．５Ｋｂ端のフラグメントが、
肝臓特異的遺伝子発現を劇的に増強することを実証する。この２．５Ｋｂにおける潜在的
な転写因子結合部位としては：４つの潜在的なＨＮＦ−３ｂ部位（逆方向）および２つの
ＨＮＦ−３ｂ部位（順方向）が挙げられる。
【００９２】
プロモーター配列単離の別の例示的な方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ
，ＣＡ）から市販されているＧｅｎｏｍｅ  Ｗａｌｋｅｒ（登録商標）キットを用い、そ
してこのキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈのカタログ（１９９７〜１９９８）の２７ページに
記載される。
【００９３】
（２．２．１  マウスＣｙｐ３Ａ１１およびヒトＣＹＰ３Ａ４転写制御エレメント配列
）
本発明の対象の核酸（例えば、実施例１に記載される）は、広範な種々の適用を見出し
、この適用としては、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、ＰＣＲプライマー
、化合物スクリーニングに有用な発現カセット、Ｃｙｐ３Ａ１１もしくはＣＹＰ３Ａ４遺
伝子またはその改変体の存在の検出、遺伝子転写物の存在の検出、さらなるＣｙｐ３Ａ１
１もしくはＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列またはそのホモログ（および構造的アナログ）
をコードする核酸の検出または増幅、ならびに種々のスクリーニングアッセイが挙げられ
る。
【００９４】
本発明は、毒性または薬剤を検出するための有効な方法を提供し、この薬剤は、Ｃｙｐ
３Ａ１１もしくはＣＹＰ３Ａ４遺伝子転写のレベルで活性である。転写発現のための広範
な種々のアッセイが、本発明の教示に基づいて使用され得、これらとしては、細胞ベース
の転写アッセイ、トランスジェニック動物におけるインビボでのスクリーニング、および
プロモータータンパク質結合アッセイが挙げられる。例えば、開示されたルシフェラーゼ
レポーター構築物は、細胞ベースの転写アッセイのために細胞をトランスフェクトするた
めに使用される。例えば、初代の内皮細胞は、マイクロタイタープレート上に蒔かれ、そ
してルシフェラーゼ発現によってモニターされるように、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３
Ａ４遺伝子プロモーターの転写調節を調節する化合物についての候補因子のライブラリー
をスクリーニングするために使用される（以下の実施例を参照のこと）。
【００９５】
上記のように、本発明は、組換え核酸分子に関連し、この核酸分子は、マウスＣｙｐ３
Ａ１１遺伝子遺伝子座またはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子座に由来する転写制御エレメントを
含む。特に、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５を含む組換
え核酸分子、ならびにそのフラグメントが記載される。このフラグメントは、開示される
配列に対して約８０％〜１００％、およびその間の整数値、ならびに参照の配列（すなわ
ち、本発明の配列）に対して少なくとも８０〜８５％、好ましくは８５〜９０％、より好
ましくは９０〜９５％、そして最も好ましくは９８〜１００％の配列同一性を有する。本
発明としてはまた、上記のポリヌクレオチド配列に実質的に相補的な核酸配列、またはそ
のフラグメント、および上記のポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントに特異的
にハイブリダイズする核酸配列が挙げられ得る。
【００９６】
本発明は、本明細書の技術（配列情報および単離方法（例えば、実施例１）が挙げられ
るがこれらに限定されない）に基づいて同定された転写制御エレメント配列（例えば、プ
ロモーター配列）をさらに含む。
【００９７】
本発明の核酸分子は、トランスフェクト細胞、肝臓押出し動物およびそれ自体が種々の
適用において有用であるトランスジェニック動物の生成、ならびにＰ４５０−媒介代謝を
調節する化合物の安全性および／または可能な毒性のスクリーニングについて有用である
（実施例２〜４を参照のこと）。
【００９８】
当業者は、単離についての分子の標準的な手順、およびＣｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３
Ａ４転写制御エレメントの特徴、その宿主細胞へのトランスフェクション、および上記の
Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４プロモーターに作動可能に連結した異種ＤＮＡの発現
を補充した明細書の支持に従って、本発明を実施し得る。例えば、ＤＮＡは、リン酸カル
シウム媒介遺伝子転移、エレクトロポレーション、リポフェクション、ウイルス感染など
によってレシピエントの哺乳動物細胞中に一般に移されるか、または導入される。遺伝子
転移および発現のための一般的な方法およびベクターは、例えば、Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒ
，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に見出され得る。イン
ビボでの細胞への直接的な遺伝子転移は、例えば、改変されたウイルスベクター（レトロ
ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルス、リポソーム、
および特定の細胞型へのＤＮＡの直接注入が挙げられるが、これらに限定されない）によ
って達成され得る。この様式において、所望の異種遺伝子に作動可能に連結された本発明
のＣｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３Ａ４転写制御エレメントを含む組換え発現ベクターおよ
び組換え細胞は、インビボで特定の標的細胞に送達され得る。例えば、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３６５：６９１〜６９２（１９９３）；Ｐｌａｕｔｚら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ
Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７１６：１４４〜１５３（１９９４）；Ｆａｒｈｏｏｄら、Ａ
ｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７１６：２３〜３４（１９９４）およびＨｙｄｅ
ら  Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５０〜２５５（１９９３）を参照のこと。さらに、細胞は
、エキソビボで形質転換され得、そして注射（例えば、関節内、皮内、筋内など）によっ
て局在的部位に直接導入され得る。さらに、組換え発現ベクターは、例えば、静脈内注射
による動物への肝臓押出しを介して送達され得る（以下の実験材料および方法を参照のこ
と）。
【００９９】
Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントおよびＣＹＰ３Ａ４遺伝子座由来の
転写制御エレメントのクローニングおよび特徴づけは、以下の実施例１に記載される。Ｃ
ＹＰ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのクローニングおよび特徴づけについても
また、以下の実施例に記載される。マウスＣｔｐ３Ａ１１遺伝子座およびヒトＣＹＰ３Ａ
４遺伝子座の５’非コード領域のいくつかの領域の特徴は、実施例５に表される（図１８
および１９もまた参照のこと）。
【０１００】
本発明は、作動可能に連結した異種遺伝子配列の転写を独身するのに有効なポリヌクレ
オチドを含み、このポリヌクレオチドは、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子の５’非コード領
域に由来する。本発明の１つの局面は、約１３ｋｂの配列（配列番号１２）およびそのフ
ラグメントを含み、特に、転写プロモーターおよび／または転写制御配列として機能し得
るフラグメントを含む。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明の転写制御エレメントとしては、配列番号１２のヌク
レオチド１〜１１，００２に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むマ
ウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来のポリヌクレオチドを含む。本発明の１つの局面は、約９
．３ｋｂの配列（配列番号１３）およびそのフラグメントを含み、特に、転写プロモータ
ー
および／または転写制御配列として機能し得るフラグメントを含む。１つの実施形態にお
いて、本発明の転写制御エレメントとしては、配列番号１３に９０％以上の同一性を有す
るポリヌクレオチド配列を含むマウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子由来のポリヌクレオチドが挙
げられる。別の実施形態において、本発明の転写制御エレメントとしては、マウスＣｙｐ
３Ａ１１由来のポリヌクレオチドが挙げられ、このポリヌクレオチドは、配列番号１３の
ヌクレオチド５１０４〜６２１８に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む
。別の実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子
由来のポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド
６７９２〜９３３０に９０％以上同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態
において、本発明の転写制御エレメントは、マウスＣｙｐ３Ａ１１由来のポリヌクレオチ
ドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１３のヌクレオチド５１０４〜６２１８に
９０％以上の同一性を有する第１のポリヌクレオチド、および配列番号１３のヌクレオチ
ド６７９２〜９３３０に９０％以上の同一性を有する第２のポリヌクレオチドを含む。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、９．３ｋｂの配列（配列番号１３）を含むポリヌ
クレオチド、またはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド）はまた、基底プロモータ
ー（例えば、基底プロモーターは、転写を促進するために必要な最小単位を含み得る（例
えば、ＴＡＴＡボックス））上の特定の調節特徴を与えるために、基底プロモーターと関
連し得る。
【０１０３】
本発明は、単離されたポリヌクレオチド（例えば、記載されるようなポリヌクレトチド
）、このようなポリヌクレオチドの使用方法、このようなポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、このようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、このようなポリヌクレオチドを含
むベクター、このようなポリヌクレオチドを含む組み換え細胞、このようなポリヌクレオ
チドを含む肝臓押し出し非ヒト動物、およびこのようなポリヌクレオチドを含むトランス
ジェニック非ヒト動物が挙げられるが、これらに限定されない。１つの実施形態において
、本発明は、レポーター遺伝子（例えば、光生成タンパク質）に作動可能に連結した３Ａ
１１由来のポリヌクレオチドを含む、トランヅジェニック非ヒト動物（例えば、ラットま
たはマウス）を含む。
【０１０４】
本発明は、作動可能に連結した異種遺伝子配列の転写を促進するために有効なポリヌク
レオチドを含み、このポリヌクレオチドは、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の５’非コード領域
に由来する。本発明の１つの局面は、約１３ｋｂの配列（配列番号１４）およびそのフラ
グメントを含み、特に、転写プロモーターおよび／または転写調節配列として機能し得る
フラグメントを含む。１つのこのような例示的なフラグメントは、配列番号１５によって
同定される。１つの実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、配列番号１４の
ヌクレオチド１〜１３，０３２に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含むヒ
トＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含む。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、配列番号１４に９０％以上
の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含むヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレ
オチドを含む。別の実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、ヒトＣＹＰ３Ａ
４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌク
レオチド１２９０〜２４４６に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別
の実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポ
リヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド２７５８
〜４１１１に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態におい
て、本発明の転写制御エレメントは、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを
含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド４４２４〜６０１０に９０
％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本発明の転写
制御エレメントは、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、このポリヌ
クレオチドは、配列番号１４のヌクレオチド６３１７〜９０９９に９０％以上の同一性を
有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、本発明の転写制御エレメントは
、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配
列番号１４のヌクレオチド９４０１〜１２９９８に９０％以上の同一性を有するポリヌク
レオチドを含む。なお別の実施形態において、本発明の転写制御エレメントは、ヒトＣＹ
Ｐ３Ａ４遺伝子由来のポリヌクレオチドを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１４
のヌクレオチド１２９０〜２４４６に９０％以上の同一性を有する第１のポリヌクレオチ
ド、配列番号１４のヌクレオチド２７５８〜４１１１に９０％以上の同一性を有する第２
のポリヌクレオチド、配列番号１４のヌクレオチド４４２４〜６０１０に９０％以上の同
一性を有する第３のポリヌクレオチド、配列番号１４のヌクレオチド６３１７〜９０９９
に９０％以上の同一性を有する第４のポリヌクレオチド、および配列番号１４のヌクレオ
チド９４０１〜１２９９８に９０％以上の同一性を有する第５のポリヌクレオチドを含む
。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、約１３ｋｂの配列（配列番号１４）を含むポリヌ
クレオチドまたはそのフラグメントを含むポリヌクレオチド）はまた、基底プロモーター
（例えば、基底プロモーターは、転写を促進するために必要な最小限の単位（例えば、Ｔ
ＡＴＡボックス）を含む）上に特定の調節特徴を与えるために基底プロモーターと結合し
得る。
【０１０７】
本発明は、単離されたポリヌクレオチド（例えば、記載されるようなポリヌクレオチド
）、このようなポリヌクレオチドの使用方法、このようなポリヌクレオチドを含むベクタ
ー、このようなポリヌクレオチドを含む発現カセット、このようなポリヌクレオチドを含
むベクター、このようなポリヌクレオチドを含む組み換え細胞、このようなポリヌクレオ
チドを含む肝臓押し出し非ヒト動物、およびこのようなポリヌクレオチドを含むトランス
ジェニック非ヒト動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明の１つの局面の好ましい実施形態は、トランスジェニック非ヒト動物を含み、こ
れは、（例えば、ルシフェラーゼのような光生成タンパク質をコードする）異種遺伝子配
列に作動可能に連結したヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子由来の転写制御エレメント（例えば、配列
番号１４のヌクレオチド１〜１３，０３２に９０％以上の同一性を有するポリヌクレオチ
ド配列）を含む。１つの実施形態において、トランスジェニック非ヒト動物は、ｈＰＸＲ
（ヒトリファンピシンコレセプター）をコードするポリヌクレオチドを含まず、すなわち
、トランスジェニック非ヒト動物は、機能的ヒトＰＸＲタンパク質を発現しない。例えば
、トランスジェニックげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺
伝子由来の転写制御エレメントを含むように生成されているが、この動物は、ヒトリファ
ンピシンコレセプターを発現しない（実施例６を参照のこと）。
【０１０９】
（２．３．０  発現カセットおよびベクター）
本明細書中に記載される発現カセットは、代表的に以下の成分を含む：（１）レポータ
ー遺伝子をコードするポリヌクレオチド（例えば、光生成タンパク質をコードする配列）
、（２）レポーター遺伝子配列に作動可能に連結した転写制御エレメント、ここで、この
制御エレメントは、光生成タンパク質のコード配列（例えば、本発明のＣｙｐ３Ａ１１配
列およびＣＹＰ３Ａ４配列）に異種である。本明細書中で提供された配列に由来する転写
制御エレメントは、例えば、基底転写プロモーター上のこのような制御エレメントによっ
て提供される調節を与えるための基底転写プロモーターと結合され得る。例示的な発現構
築物は、実施例１に記載される。
【０１１０】
本発明はまた、ベクター中の発現カセットを提供する工程を包含し、このベクターは、
例えば、適切なベクター骨格および骨格マーカー（例えば、ポジティブもしくはネガティ
ブな選択マーカー）をコードする必要に応じた配列）を含む。適切なベクター骨格として
は、一般に、Ｆ１複製起点；ｃｏｌＥ１プラスミド由来の複製起点；ポリアデニル化配列
；抗生物質耐性（例えば、アンピシリン耐性）および他の調節もしくは制御エレメントを
コードする配列が挙げられる。適切な骨格の非制限的な例としては、以下が挙げられる：
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）；ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および他の
市販のベクター。
【０１１１】
種々のレポーター遺伝子が、本発明の実施において使用され得る。慣用的なアッセイで
容易に測定されるタンパク質産物を生成するものが好ましい。適切なレポーター遺伝子と
しては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、光生成タンパク
質（例えば、ルシフェラーゼ）、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに
限定されない。都合のよいアッセイとしては、熱量アッセイ、蛍光アッセイ、および酵素
アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。１つの局面において、レポーター遺伝
子が使用され、これは、細胞内で発現され、そしてその細胞外産物は、細胞内媒体、また
は培養された細胞株の細胞内媒体の抽出物で直接測定される。これは、その産物が分泌さ
れるレポーター遺伝子の使用に渡って利点を提供する。なぜならば、この分泌の速度およ
び効率は、アッセイの解釈を完全にし得るさらなる可能性を誘導するからである。好まし
い実施形態において、レポーター遺伝子は、光生成タンパク質である。本明細書中に記載
される光生成レポータータンパク質を用いる場合、発現は、上記のように迅速かつ非侵襲
的に評価され得る（例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．，ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍ
ｅｄ．４：２４５〜７；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．，ら（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  
Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６６：５２３〜３１；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．，ら（１９９５）Ｍ
ｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３〜６０３を参照のこと）。
【０１１２】
本発明の１つの局面において、光生成体は、ルシフェラーゼである。本発明の実施にお
いて有用なルシフェラーゼコード配列としては、ｌｕｘ遺伝子から得られた配列（ルシフ
ェラーゼ活性をコードする原核生物遺伝子）、およびｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼ活性
をコードする真核生物遺伝子）が挙げられる。同定されている種々のルシフェラーゼコー
ド遺伝子としては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：Ｂ．Ａ．Ｓｈｅｒｆお
よびＫ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５，６７０，３５６号（１９９７年９月２３日発行）
；Ｋａｚａｍｉ，Ｊら、米国特許第５，６０４，１２３号（１９９７年２月１８日発行）
；Ｓ．Ｚｅｎｎｏら、米国特許第５，６１８，７２２号；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第
５，６５０，２８９号（１９９７年７月２２日発行）；Ｋ．Ｖ．Ｗｏｏｄ，米国特許第５
，６４１，６４１号（１９９７年６月２４日発行）；Ｎ．ＫａｊｉｙａｍａおよびＥ．Ｎ
ａｋａｎｏ、米国特許第５，２２９，２８５号（１９９３年７月２０日発行）；Ｍ．Ｊ．
ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ，米国特許第５，２９２，６５８号（１９９
４年３月８日発行）；Ｍ．Ｊ．ＣｏｒｍｉｅｒおよびＷ．Ｗ．Ｌｏｒｅｎｚ，米国特許第
５，４１８，１５５号（１９９５年３月２３日発行）；ｄｅ  Ｗｅｔ，Ｊ．Ｒ．，ら、Ｍ
ｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：７２５〜７３７，１９８７；Ｔａｔｓｕｍｉ，Ｈ．
Ｎ．，ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１３１：１６１〜１６５，１
９９２；ならびにＷｏｏｄ，Ｋ．Ｖ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７００〜７０２，
１９８９。生体発光タンパク質の別の群としては、エクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）ファ
ミリーの光生成タンパク質が挙げられる（Ｐｒａｓｈｅｒ，Ｄ．Ｃ．，ら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．２６：１３２６〜１３３２（１９８７））。ルシフェラーゼおよびエクオリン様分子
は、エネルギー源（例えば、ＡＴＰ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈなど）、および基質（例えば、ルシ
フェリンまたはコエレントリジンおよび酸素）を必要とする。
【０１１３】
野生型ホタルルシフェラーゼは、典型的には約５５０ｎｍで発光極大を有する。異なる
発光極大を持つ多くの改変体もまた、研究されている。例えば、Ｋａｊｉｙａｍａおよび
Ｎａｋａｎｏ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．４（６）：６９１−６９３，１９９１；米国特
許第５，３３０，９０６号、１９９４年７月１９日発行）は、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃ
ｉａｔａルシフェラーゼコード配列に対する単一のアミノ酸変化によって作製される５つ
の改変体ホタルルシフェラーゼを教示する。これらの改変体は、５５８ｎｍ、５９５ｎｍ
、６０７ｎｍ、６０９ｎｍおよび６１２ｎｍの発光ピークを有する。約５４０ｎｍの発光
ピークを有する黄緑色ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから、
ｐＧＬ３の商品名で市販されている。約６１０ｎｍの発光ピークを持つ赤色ルシフェラー
ゼは、例えば、Ｃｏｎｔａｇら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：２４５−２４７および
Ｋａｊｉｙａｍａら（１９９１）Ｐｏｒｔ．Ｅｎｇ．４：６９１−６９３に記載されてい
る。Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ由来のルシフェラーゼのコード配列もまた、記載
されている（ｍＲＮＡ、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＹ０１５９８８、タンパク質登録番号
ＡＡＧ５４０９４）。
【０１１４】
本発明の別の局面において、光生成タンパク質は、蛍光タンパク質（例えば、青色蛍光
タンパク質、青緑色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および
赤色蛍光タンパク質）である。
【０１１５】
いくつかの光生成タンパク質コード配列が市販されており、このコード配列としては以
下が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃ
Ａ）は、ルシフェラーゼおよび種々の蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質、青緑色蛍光
タンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質を含
む）についてのコード配列を提供する。増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）改変体は、
哺乳動物系においてよく発現され、そして野生型ＧＦＰよりもより明るい蛍光を示す傾向
がある。増強蛍光タンパク質としては、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、増強青緑
色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）が挙げられる。さ
らに、Ｃｌｏｎｔｅｃｈは、迅速な代謝速度を特徴とする、不安定化増強蛍光タンパク質
（ｄＥＦＰ）改変体を提供する。ｄＥＦＰ改変体のより短い半減期は、その改変体を、反
応速度論的研究に有用であり、かつ定量的レポーターとして有用なものにする。ＤｓＲｅ
ｄコード配列は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｏｎｔｅｃｈ．ｃｏｍ
／ｔｅｃｈｉｎｆｏ／ｖｅｃｔｏｒｓ／ｖｅｃｔｏｒｓＤ／ｔｅｘｔ／ｐＤｓＲｅｄ．ｔ
ｘｔ）から入手可能である。ＤｓＲｅｄは、発現研究において有用な赤色蛍光タンパク質
である。さらに、Ｆｒａｄｋｏｖ，Ａ．Ｆ．，らは、Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ  ｃｏｒａｌ由
来の新規の蛍光タンパク質および特有の塩赤外の蛍光を呈するその変異体を記載する（Ｆ
ＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９（３），１２７−１３０（２０００））（ｍＲＮＡ配列、ＧＥ
ＮＢＡＮＫ登録番号ＡＦ２７２７１１、タンパク質配列、ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＧ
１６２２４）。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もまた、ホタルルシフェラーゼ
についてのコード配列を提供する（例えば、ｐＧＬ３ベクターに含まれるような）。さら
に、多くの蛍光タンパク質についてのコード配列は、ＧＥＮＢＡＮＫから入手可能である
（例えば、登録番号ＡＹ０１５９９５、ＡＦ３２２２２１、ＡＦ０８０４３１、ＡＦ２９
２５６０、ＡＦ２９２５５９、ＡＦ２９２５５８、ＡＦ２９２５５７、ＡＦ１３９６４５
、Ｕ４７２９８、Ｕ４７２９７、ＡＹ０１５９８８、ＡＹ０１５９９４、およびＡＦ２９
２５５６）。
【０１１６】
改変されたｌｕｘコード配列がまた、例えば、ＷＯ０１／１８１９５（２００１年３月
１５日公開、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に記載されている。さらに、例
えば、細胞中の発現を評価する場合に、さらなる光生成系が使用され得る。このような系
としては、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられるが、これに限定さ
れない。
【０１１７】
陽性選択マーカーとしては、容易にアッセイされ得る生成物である任意の遺伝子が挙げ
られる。その例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＨＰＲＴ遺伝子
（Ｌｉｔｔｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １４５：７０９−７１０（１９
６４））、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子、
またはアデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、前出）、チミジンキナーゼ遺伝子（すなわち「ＴＫ」）および特に単純ヘルペス
ウイルスのＴＫ遺伝子（Ｇｉｐｈａｒｔ−Ｇａｓｓｌｅｒ，Ｍ．ら、Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ
．２１４：２２３−２３２（１９８９））、ｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．
ら，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎａ
ｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２（１９８８））、またはアミノ酸もしくはヌクレオシ
ドアナログ、または抗生物質などに対する耐性を付与する他の遺伝子（例えば、ジヒドロ
フォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）酵素、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アスパ
ラギンシンテターゼ（ＡＳ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、もしくは
ＣＡＤ酵素（カルバミルリン酸シンセターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼ、
およびジヒドロオロターゼ）のような酵素をコードする遺伝子配列）。ポジティブ選択マ
ーカーの適切な基質の添加は、ポジティブ選択マーカーの産物が発現されるか否かを決定
するために使用され得、例えば、ポジティブ選択マーカーｎｐｔＩＩを発現しない細胞は
、基質Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に曝された場合にが殺傷される。
【０１１８】
このベクターは、典型的には目的のポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のＣｙｐ３
Ａ１１配列およびＣＹＰ３Ａ４配列）を挿入するための挿入部位を備える。これらの挿入
部位は、好ましくは、陽性選択マーカー、ルシフェラーゼおよびプロモーターをコードす
る配列のいずれかの側における、２つの部位、１つの部位に存在するような部位に含まれ
る。挿入部位は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位であり、そして例えば、独特
の制限部位を示し得る。このように、このベクターは、適切な酵素消化され得、そして目
的の配列でベクター中に連結され得る。
【０１１９】
必要に応じて、このベクター構築物は、ネガティブ選択マーカーをコードするポリヌク
レオチドを含み得る。適切なネガティブ選択マーカーとしては、ＨＳＶ−ｔｋ（例えば、
Ｍａｊｚｏｕｂら（１９９６）ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：９０４−９０７お
よび米国特許第５，４６４，７６４号）、およびジフテリア毒素、テタナス毒素、コレラ
毒素および百日咳毒素を含む種々の毒素をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限
定されない。さらなるネガティブな選択マーカー遺伝子は、６−チオグアニン中でのネガ
ティブ選択のためのヒポキサンチン−グアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｈ
ＰＲＴ）遺伝子である。
【０１２０】
本発明の実施に使用するための例示的なプロモーターは、上に記載される。
【０１２１】
（ベクター構築物）：本明細書中に記載されるベクターは、本明細書中の教示を考える
と、分子生物学の分野で公知の方法論（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓ
を参照のこと）を使用して構築され得る。上記のように、発現カセットを含むベクター構
築物は、所望の成分を適切なベクター骨格に挿入することによって構築される。そのベク
ター骨格は、例えば、（１）光生成タンパク質（例えば、目的の転写制御エレメントに作
動可能に連結されたルシフェラーゼ遺伝子）のようなレポーター遺伝子をコードするポリ
ヌクレオチド；（２）ポジティブ選択マーカーをコードする配列；および必要に応じて（
３）ネガティブ選択マーカーをコードする配列がある。さらに、このベクター構築物は、
目的のさらなる配列が、ポジティブ選択マーカーをコードする配列およびルシフェラーゼ
コード配列に隣接するように容易に挿入され得るような挿入部位を含む。
【０１２２】
ポリヌクレオチド、適切な制御配列（例えば、プロモーター）を得る好ましい方法は、
ＰＣＲである。ＰＣＲについての一般的な手段は、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら，ＰＣＲ：Ａ
ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９１））に教示されるとおりである。各適
用反応についてのＰＣＲ条件は、経験的に決定され得る。パラメータの数は、反応の成功
に影響する。これらのパラメータとしては、アニーリングの温度および時間、伸長時間、
Ｍｇ２＋濃度およびＡＴＰ濃度、ｐＨ、ならびにプライマー、テンプレートおよびデオキ
シリボヌクレオチドの相対濃度がある。例示的なプライマーは、以下の実施例に記載され
る。増幅後、得られたフラグメントは、アガロースゲル電気泳動、続く臭化エチジウム染
色での可視化および紫外線照射によって検出され得る。
【０１２３】
１つの実施形態において、ＰＣＲは、ゲノムライブラリ由来のフラグメントを増幅する
ために使用され得る。多くのゲノムライブラリは、市販されている。あるいは、ライブラ
リは、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。好ましくは、ＤＮＡが由来す
る生物は、識別可能な疾患も表現型効果（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）も有さ
ない。この単離されたＤＮＡは、任意の細胞供給源または体液（例えば、ＥＳ細胞、肝臓
、腎臓、血球、頬細胞、腟頸管細胞（ｃｅｒｖｉｏｖａｇｉｎａｌ  ｃｅｌｌ）、尿由来
の上皮細胞、胎児細胞、または生検、尿、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）によって得られた組
織中に存在する任意の細胞および感染部位または炎症部位で浸出する組織）から得られ得
る。ＤＮＡは、細胞溶解およびＤＮＡ精製の公知の方法を使用して細胞または体液から抽
出される。次いで、この精製されたＤＮＡを、適切な発現系（例えば、λファージ）に導
入する。ポリヌクレオチド（例えば、短く、ランダムなヌクレオチド配列）を得るための
別の方法は、例えば、酵素消化によるものである。
【０１２４】
ポリヌクレオチドは、当該分野で公知の方法を使用してベクター骨格に挿入される。例
えば、挿入ＤＮＡおよびベクターＤＮＡが、適切な条件下で、互いに対合し得かつリガー
ゼで連結され得る各分子上で、相補的末端または平滑末端を作製するための制限酵素と接
触され得る。あるいは、合成核酸リンカーは、ポリヌクレオチドの末端に連結され、ベク
ターＤＮＡ中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る他の手段が公知であり、そ
して本明細書中の教示を考慮して使用され得る。
【０１２５】
このベクター骨格は、シャトルベクターを提供するために、１種より多い選択された生
物中で機能する成分（例えば、細菌の複製起点および真核生物プロモーター）を含み得る
。あるいは、このベクター骨格は、組み込みベクター（すなわち、標的ゲノムへのランダ
ムな、または部位特異的な組み込みのために使用されるベクター）を構成し得る。
【０１２６】
最終的な構築物は、（例えば、ＥＳ細胞への導入のため、または肝臓プッシュアッセイ
（ｌｉｖｅｒ−ｐｕｓｈ  ａｓｓａｙ）のために）すぐに使用され得るか、または使用さ
れるまで（例えば、−２０℃で）凍結保存される。いくつかの実施形態において、この構
築物は、例えば、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、使用の前に直線化
される。
【０１２７】
（２．４．０  レバープッシュ動物）
本発明の発現カセットは、本明細書中に記載される方法を実施するために動物中に（ゲ
ノム外で）導入され得る。高レベルでの外来性遺伝子発現は、裸のプラスミドＤＮＡの直
接的な中ｓｙを介して筋肉および肝臓中で得られている。さらに、高レベルの発現はまた
、肝臓または筋肉に供給する血管中に裸のプラスミドＤＮＡを直接的に、血管内に投与す
ることで達成され得る。Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−
１４６８；Ｂｕｄｋｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：５９３−５９８；Ｂｕ
ｄｋｅｒら（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：２７２−２７６；Ｚｈａｎｇら（１９
９７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８：１７６３−１７７２を参照のこと。最近、
Ｚｈａｎｇら（１９９９）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：１７３５−１７３７
によって、高レベルの外来性遺伝子の発現が、裸のプラスミドＤＮＡの尾静脈注射後の肝
細胞中で見られることが報告された。
【０１２８】
従って、好ましい実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、静脈内
（例えば、マウスの尾静脈中）に肝細胞中の発現を達成するのに十分な量、用量および期
間で注射される。このような量および容量の決定は、当業者の範囲内である。例えば、Ｄ
ＮＡ注射の容量は、好ましくは、比較的大きく、例えば、約１〜１０ｍＬの間、より好ま
しくは、約１〜５ｍＬの間、なおより好ましくは約１〜３ｍＬの間、および最も好ましく
は約２．５ｍＬである。このＤＮＡは、水溶液、またはリンガー溶液のような任意の薬学
的に受容可能なビヒクルで投与され得る。他の受容可能なビヒクルは、当業者に公知であ
り、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（前出）に記載される。ＤＮＡの量が同様に決定
され得、その量は、好ましくは約５〜１０００μｇの間、より好ましくは、約１０〜５０
０μｇの間、そしてなおより好ましくは、１０〜３００μｇの間である。さらに、この注
入は、比較的迅速であることが好ましく、例えば、２分間未満にわたって全容量が注入さ
れ、より好ましくは１分間未満にわたってそしてなおより好ましくは３０秒間未満にわた
って全体量が注入される。
【０１２９】
（２．５．０  トランスジェニック動物）
本発明の発現カセットは、本発明の方法を実施する目的のためのトランスジェニック動
物を作製するために、動物のゲノムに導入され得る。本発明の好ましい実施形態において
、トランスジェニック動物は、トランスジェニックげっ歯類（例えば、マウス、ラット、
またはモルモット）である。光生成タンパク質がレポーターとして使用される場合、画像
化が、典型的にはインタクトな生存非ヒトトランスジェニック動物（例えば、生存トラン
スジェニックげっ歯類（例えば、マウスまたはラット））を使用して実施される。種々の
形質転換技術が当該分野において周知である。これらの方法には以下が含まれる。
【０１３０】
（ｉ）核への直接微量注射：発現カセットは、機械的に組換えＤＮＡを移入するために
、マイクロピペットを使用して動物の細胞核に直接的に微量注射され得る。この方法は、
核以外の細胞区画にＤＮＡを曝さない点、および高頻度で安定な組換え体を生じる点に利
点を有する。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０）を
参照のこと。
【０１３１】
例えば、本発明の発現カセットは、雄性前核膜の形成後にできる限り早く、および雌性
前核接合体によるその処理の前に、接合体の初期雄性前核中に微量注射され得る。従って
、この方法に従う微量注射は、雄性前核および雌性前核が十分に分離され、そしてその両
方が細胞膜の近くに配置されるときに、行なわれるべきである。例えば、Ｗａｇｎｅｒら
に対する米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年１０月１０日発行）；およびＲｉ
ｃｈａ，Ｊ．，（２００１）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍ
ｉｃｅ，」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｃｈ  ２００１  
ｖｏｌ．１７：２６１−８を参照のこと。
【０１３２】
（ｉｉ）ＥＳ細胞トランスフェクション：本発明の発現カセットを含むＤＮＡはまた、
胚性幹（ＥＳ）細胞に導入され得る。標的ベクターとの相同組換えを受けるＥＳ細胞クロ
ーンが同定され、次いでＥＳ細胞−マウスキメラが作成される。ホモ接合性動物は、ヘミ
接合性キメラ動物の交配によって作製される。手順は、例えば、Ｋｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｈ．
およびＳｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．，（１９９２）「Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  
ａｎｉｍａｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：７０５−３０に記載される。
【０１３３】
（ｉｉｉ）エレクトロポレーション：本発明の発現カセットを含むＤＮＡはまた、エレ
クトロポレーションによって動物細胞に導入され得る。この技術において、動物細胞は、
発現カセットを含むＤＮＡの存在下でエレクトロポレーションされる。高い場の強度の電
気インパルスは、生体膜を可逆的に透過させて、ＤＮＡの取りこみを可能にする。エレク
トロポレーションの間に作製される孔は、ＤＮＡのような高分子の取りこみを可能にする
。手順は、例えば、Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７１６１−７１６５（１９８４）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｃｈ
．１６に記載される。
【０１３４】
（ｉｖ）リン酸カルシウム沈殿：この発現カセットはまた、例えば、リン酸カルシウム
を使用して直接取りこむ他の方法によって細胞中に移入され得る。例えば、Ｇｒａｈａｍ
，Ｆ．，およびＡ．Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７（
１９７３）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ，ｃｈ．１６を参照のこと。
【０１３５】
（ｖ）リポソーム：人工膜小胞（リポソーム）内へのＤＮＡのカプセル化、それに続く
リポソームと標的細胞膜との融合はまた、動物細胞内へのＤＮＡの導入のために使用され
得る。Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．およびＳ．Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，ＢｉｏＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓ，６：６８２（１９８８）を参照のこと。
【０１３６】
（ｖｉ）ウイルスキャプシド：ウイルスおよび空のウイルスキャプシドもまた、動物細
胞へのＤＮＡの取りこみおよびＤＮＡの移入のために使用され得る。例えば、ＤＮＡは、
空のポリオーマウイルスキャプシド中に取り込まれ得、次いで、ポリオーマ感受性細胞に
送達され得る。例えば、Ｓｌｉｌａｔｙ，Ｓ．およびＨ．Ａｐｏｓｈｉａｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ  ２２０：７２５（１９８３）を参照のこと。
【０１３７】
（ｖｉｉ）ポリブレンまたはＤＥＡＥ−デキストランを使用するトランスフェクション
：これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｃｈ．１６に記載される。
【０１３８】
（ｖｉｉｉ）プロトプラスト融合：プロトプラスト融合は、典型的には、多数の目的の
プラスミドを保有する細菌プロトプラストと培養された動物細胞との融合（通常ポリエチ
レングリコールで処理することで媒介される）を含む。Ｒａｓｓｏｕｌｚａｄｅｇａｎ，
Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，２９５：２５７（１９８２）。
【０１３９】
（ｉｘ）弾道貫入（Ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）：核酸セグメント
の導入の別の方法は、小ビーズまたは小粒子のマトリクス内かまたは表面上へのいずれか
の，核酸を有する小粒子による高粘度の弾道貫入である（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，
３２７，７０−７３，１９８７）。
【０１４０】
選択された動物細胞にＤＮＡを導入するために使用され得る任意の技術が使用され得る
（例えば、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，Ｃａｒｌ  Ａ．Ｐｉｎｋｅｒｔ（編者），第１版
，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０１２５５７１６５８；「Ｍａｎｉｐｕｌ
ａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕ
ａｌ，」Ｂｒｉｇｉｄ  Ｈｏｇａｎら，ＩＳＢＮ：０８７９６９３８４３，出版社：Ｃｏ
ｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９年９
月発行、第２版）。エレクトロポレーションは、容易さの利点があり、そして広範に適用
可能であることが見出されているが、かなりの割合の標的化された細胞が、エレクトロポ
レーションの間に殺傷され得る。従って、敏感な細胞または少数でのみ得られ得る細胞に
ついて、核への直接的な微量注射が好ましくあり得る。また、高頻度でのＤＮＡ取りこみ
が特に重要である場合、（上記のような）選択マーカーを使用しない形質転換のような、
核への直接微量注射が、有利な方法である。なぜなら、典型的には、標的化された細胞の
５〜２５％が、微量注射されたＤＮＡを安定に取り込むからである。レトロウイルスベク
ターもまた非常に効率的であるが、いくつかの場合において、このレトロウイルスベクタ
ーは、Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．，およびＡ．Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．９：１６２１−１６２７（１９８９）に記載されるような他の欠点に曝される。エ
レクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿またはリポソーム融合のような、より低効
率の技術が使用される場合、発現カセット中に選択マーカーを有することが好ましく、そ
の結果、上で議論されたような安定な形質転換体が容易に選択され得る。
【０１４１】
いくつかの場合において、異種ＤＮＡの導入は、それ自体が選択可能な表現型を生じ、
この場合において、標的化された細胞は、相同な組換えについて直接的にスクリーニング
され得る。例えば、遺伝子ｈａｒｔの破壊は、６−チオグアニンに対する耐性を生じる。
しかし、多くの場合において、形質転換は、このような容易に選択可能な表現型を生じず
、そしてリン酸カルシウム沈殿のような低効率の形質転換技術が使用される場合、発現カ
セット中に選択マーカーを含むことが好ましく、その結果、ゲノム中の発現カセットの安
定な組み込みは、選択可能な表現型を導く。例えば、導入されたＤＮＡが、ｎｅｏ遺伝子
を含む場合、取りこみについての選択は、Ｇ４１８上で増殖され得る細胞を選択すること
によって達成され得る。
【０１４２】
上記のように調製されるトランスジェニック動物は、本発明の方法を実施するために有
用である。目的のプロモーターの、レポーター配列への作動可能な連結は、当業者が広範
な種々の生物学的プロセス（プロモーターが由来する遺伝子の発現を含む）をモニターす
ることを可能にする。本発明の発現カセットを含む本発明のトランスジェニック動物は、
インビボで生じるプロセスの観察、およびこのプロセスが起こるメカニズムの解明のため
の手段を当業者に提供する。
【０１４３】
レポーター配列として光生成タンパク質を使用する発現カセットを保有するトランスジ
ェニック動物に関して、非侵襲性の動物全体の画像化を使用するルシフェラーゼレポータ
ー発現カセットの発現のモニタリングが記載されている（Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．ら，米国特
許第５，６５０，１３５号および同第６，２１７，８４７号、それぞれ１９９７年７月２
２日、２００１年４月１７日の発行，；Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ  ４（２）：２４５−２４７，１９９８；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．，ら，ＯＳＡ  Ｔ
ＯＰＳ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ａ
ｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ３：２２０−２２４，１９９６；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ
．ら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６６（４）
：５２３−５３１，１９９７；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８（４）：５９３−６０３，１９９５）。このような画像化は、
典型的には、少なくとも１つの光検出デバイス要素（例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）カ
メラ）を使用する。
【０１４４】
従って、１つの例示的な実施形態において、ルシフェラーゼコードレポーター配列に作
動可能に連結される、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４由来の制御エレメントを含む発
現カセットを保有するトランスジェニックマウスは、Ｃｙｐ３Ａ１１媒介性薬物代謝また
はＣＹＰ３Ａ４媒介性薬物代謝をモニターするために使用され得る。本発明の発現カセッ
トを含む本発明のトランスジェニック動物はまた、このような毒性および代謝プロセスを
調節し、それによって安全性、毒性の可能性および薬学的用途について化合物を同定しそ
して特徴付け得る、分析物をスクリーニングするための手段を提供する。
【０１４５】
分析物を投与する方法としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：注射（皮
下、表皮、皮内）、粘膜内（鼻、直腸および膣など）、腹腔内、静脈内、経口または筋肉
内。他の投与様式としては、経口投与および肺投与、坐薬、および経皮適用が挙げられる
。投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。例えば
、目的の分析物は、用量／応答曲線を決定するために、ある濃度の範囲で投与され得る。
この分析物は、一連の試験動物または単一の試験動物に対して投与され得る（ただし、分
析物に対する応答は、トランスジェニック動物から証明され得る）。
【０１４６】
従って、１つの例示的な実施形態において、ルシフェラーゼコードレポーター配列に作
動可能に連結されるＣｙｐ３Ａ１１プロモーターまたはＣＹＰ３Ａ４プロモーターを含む
発現カセットを有するトランスジェニックマウスは、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４
の発現に対する候補化合物の影響をモニターするために使用され得る。これらの実験の結
果は、本発明のトランスジェニックマウスが、効果的な薬学的因子であり得る化合物をス
クリーニングするために使用され得る。
【０１４７】
ＣＹＰ３Ａ４導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の作製および表現型特徴付けは
、実施例６に記載される（図２２も参照のこと）。実施例６に記載される特徴付けの方法
はまた、Ｃｙｐ３Ａ１１導入遺伝子を含むトランスジェニック動物の特徴付けに対しても
適用され得る。
【０１４８】
例えば、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするた
めのモデルにおいて有用なトランスジェニック動物（例えば、げっ歯類）を選択する基準
は、一般に以下のとおりである：
基準１。ｄｅｘまたはｒｉｆでの処置に応答するレポーター遺伝子発現（例えば、肝臓
領域からの光の出力によって測定されるルシフェラーゼ遺伝子発現）の増加。デキサメタ
ゾン（例えば、体重１ｋｇあたり５０ｍｇで投与される）による肝臓における高度の誘導
（好ましくは、基底レベルを超える１０倍よりも大きいか１０倍に等しい誘導）および／
またはリファンピシン（例えば、体重１ｋｇあたり５０ｍｇで投与される）による肝臓に
おける誘導（好ましくは、基底レベルを超える２倍よりも大きいか２倍に等しい誘導）。
【０１４９】
基準２。動物全体の他の身体領域に対して、肝臓領域におけるより大きい誘導。
【０１５０】
基準３。肝臓領域中に見られる基底発現は、動物身体の他の領域における基底発現より
も大きいかまたはそれに等しい。基底発現および誘導された発現の両方で、肝臓における
発現に対して、より低レベルの腸管での発現が好ましい。
【０１５１】
基準４（必要に応じて適用され得る）。レポーター遺伝子発現（例えば、レポーターと
してのルシフェラーゼ）および以下：フェノバルビトール（Ｐｈｅｎｏｂ）、ニフェジピ
ン（Ｎｉｆ）、５−プログネン−３ｂ−ＯＬ−２０−ＯＮＥ−１６ａ−カルボニトリル（
ＰＣＮ）、およびクロトリマゾール（Ｃｌｏｔｒｉｍ）の群から選択される化合物のうち
の少なくとも１つでの処理に対して応答した、肝臓領域からの光の出力によって測定され
る発現における増加。さらに、プレグネノロン（Ｐｒｅｇ）が使用され得る。
【０１５２】
ｈＰＸＲは、細胞培養物中でのＣＹＰ３Ａ４誘導を媒介する生体異物レセプターである
ことが報告されている。上記の７種の化合物は、細胞培養物中のｈＰＸＲを種々の程度ま
で活性化することが示されている（Ｘｉｅ  Ｗら、２０００；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０
００  Ｄｅｃ  １；１４（２３）：３０１４−２３；Ｇｏｏｄｗｉｎら、１９９９；Ｍｏ
ｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  Ｄｅｃ；５６（６）：１３２９−３９）。Ｒｉｆ、
Ｃｌｏｔｒｉｍ、ＮｉｆおよびＰｈｅｎｏｂは、ＣＹＰ３Ａ４発現の比較的良い誘導物質
であったが、Ｄｅｘ、ＰＣＮおよびＰｒｅｇは、弱い誘導物質であったようである。しか
し、ヒト肝細胞の研究は、Ｄｅｘが良いＣＹＰ３Ａ４誘導物質であることを示唆した（Ｌ
ｅｄｉｒａｃら、２０００；Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．２０００  Ｄｅｃ；
２８（１２）：１３９１−３）。本明細書中に示される結果は、Ｃｌｏｔｒｉｍ、Ｄｅｘ
、ＰＣＮおよびＮｉｆが、他の３種の化合物よりも良好に導入遺伝子ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕ
ｃを誘導したことを示す。しかし、Ｐｒｅｇを除く全ての薬物は、種々の程度まで導入遺
伝子を誘導し、これらのデータは、この動物モデルがＣＹＰ３Ａ４誘導物質をスクリーニ
ングするために有用であることを支持する。
【０１５３】
本発明支持して実施された実験は、機能的ｈＰＸＲ遺伝子産物の存在が、トランスジェ
ニックの非ヒト動物における、またはレバープッシュ実験におけるＣＹＰ３Ａ４（または
Ｃｙｐ３Ａ１１）導入遺伝子レポーターの使用のために重要ではないことを示す（例えば
、実施例２および６を参照のこと）。
【０１５４】
チトクロムＰ４５０  ＣＹＰ３Ａ４は、肝臓中で発現される酵素をコードする重要なヒ
ト遺伝子である。このＣＹＰ３Ａ４遺伝子産物は、多くの外因性化学物質（生体異物）（
治療剤およびステロイドホルモンのような内因性物質を含むが、これらに限定されない）
の代謝に対して極めて重要であると考えられている。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の発現レベルに
おける変化は、薬物の排泄に劇的に影響を与え得、そしてそれ自体薬物の有効性に大きな
影響を与える。
【０１５５】
（２．６．０  プロモーター活性のモニタリング）
本発明の発現カセットおよびベクターを含む転写制御エレメント配列の活性は、プロモ
ーターに作動可能に連結されたレポーター配列によってコードされるタンパク質産物を検
出および／または定量化することによってモニターされ得る。プロモーター活性をモニタ
ーするのに使用される特定の方法は、使用されるレポーター配列に依存し、そしてこの方
法としては、例えば、酵素アッセイ法、および光生成タンパク質をコードするレポーター
配列の場合には、インビトロまたはインビボでの画像化が挙げられ得る。
【０１５６】
例えば、本発明の発現カセットを保有するレバープッシュまたはトランスジェニック動
物におけるプロモーター活性は、インビボでの生体発光画像化（Ｃｏｎｔａｇら（例えば
、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．ら，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：２４５−７；Ｃ
ｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら，（１９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６６
：５２３−３１；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら，（１９９５）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．１８：５９３−６０３を参照のこと）を参照のこと）を使用してモニターされ得る。
【０１５７】
次いで、プロモーター活性をモニターすることにより、このプロモーターが関連する生
物学的プロセスをモニターし得る。これは、それらプロセスをプロモーターレベルで調節
する分析物をスクリーニングする方法において、さらに使用され得る（以下の節の考察を
参照のこと）。
【０１５８】
従って、本発明の１つの局面において、肝臓プッシュ（ｌｉｖｅｒ  ｐｕｓｈ）、また
は上記の配列のようなＰ４５０関連遺伝子座由来のプロモーター配列を含有する発現カセ
ットを保有するトランスジェニック動物を使用して、薬物代謝および存在し得る毒性をモ
ニターし得る。
【０１５９】
Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４の発現に対する薬物の効果は、Ｃｙｐ３Ａ１１プロ
モーターまたはＣＹＰ３Ａ４プロモーターの肝臓プッシュまたはトランスジェニック動物
のインビボ画像化による、本発明のこの局面のなお別の実施形態である。肝臓プッシュ実
験の結果は、本発明の発現構築物を保有する動物を使用して、薬物代謝のプロセスの間の
、Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター媒介性遺伝子発現またはＣＹＰ３Ａ４プロモーター媒介性
遺伝子発現に対する影響によって、薬物の存在し得る毒性および代謝を調査し得ることを
、実証する。
【０１６０】
（２．７．０  分析物のスクリーニング）
上記に考察された、プロモーター活性をモニターする方法は、種々の生物学的プロセス
を調節する分析物（例えば、候補薬物）をスクリーニングする目的のために使用され得、
その分析物の毒性効果および代謝効果は、プロモーターレベルでの発現を決定することに
よって評価され得る。スクリーニングを、一過性トランスフェクトされた細胞または安定
トランスフェクトされた細胞を使用するインビトロアッセイによって、達成し得、そして
また、上記で考察された本発明の肝臓プッシュおよび／またはトランスジェニック動物を
、単独でか、またはこれらの動物中に導入されている他の野生型もしくは形質転換した、
細胞もしくは組織と組み合わせるかのいずれかで使用して、スクリーニングを行い得る。
プロモーター活性に対する種々の候補化合物の効果を測定するために使用される、特定の
アッセイ方法は、使用される細胞または動物によって保有される発現カセット中に存在す
る特定のレポーター配列によって、決定される。上記で論じられるように、肝臓プッシュ
、または光生成タンパク質をコードするレポーター配列を使用する構築物を保有するトラ
ンスジェニック動物におけるプロモーター活性は、エキソビボアッセイ方法によってか、
または以前に参照されたインビボ画像化技術によって（例えば、生物発光タンパク質レポ
ーターまたは蛍光タンパク質レポーターを使用する）、測定され得る。
【０１６１】
従って、本発明の１つの局面は、毒性（Ｐ４５０プロモーター活性の誘導を介する）に
ついてのスクリーニングにおける使用のため、または、必然的に転写に先行するシグナル
伝達経路に影響することによるか、またはＰ４５０遺伝子の転写に直接影響することによ
るかのいずれかで、Ｐ４５０（例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１、ＣＹＰ３Ａ４など）プロモータ
ー活性の発現を調節する、薬理学的に活性な因子（または化合物）についてのスクリーニ
ングにおける使用のための、発現カセットおよび発現ベクターの使用である。
【０１６２】
スクリーニングの目的のために、適切な宿主細胞（好ましくは、Ｃｙｐ３Ａ１１のプロ
モーター媒介性発現をモニターするための肝臓細胞）を、本発明のＰ４５０（例えば、Ｃ
ｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４のいずれか）遺伝子プロモーターと作動可能に連結され
たレポーター遺伝子を含有する発現ベクターで、形質転換する。次に形質転換された細胞
を、種々の試験物質に曝して、次いでそのレポーター遺伝子の発現について分析する。こ
れらの細胞によって提示される発現を、試験物質に曝されていない細胞からの発現と比較
し得る。Ｐ４５０プロモーターのプロモーター活性を調節する化合物は、結果としてコン
トロールに対して、調節されたレポーター遺伝子の発現を生じる。以下の実施例を参照の
こと。
【０１６３】
従って、本発明の１つの局面は、Ｐ４５０（例えば、Ｃｙｐ３Ａ）遺伝子座由来の転写
制御エレメント（例えば、プロモーター）によって媒介される、遺伝子発現レベルを調節
（すなわち、刺激または阻害）する試験化合物についてスクリーニングすることである。
スクリーニングは、例えば、以下によって達成され得る：（ｉ）本明細書中に開示される
Ｐ４５０プロモーターがレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）と作動可能に連結
されている宿主細胞を、試験化合物を含む試験培地と、レポーター遺伝子発現を可能とす
る条件下で接触させる工程；（ｉｉ）試験培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定
する工程；（ｉｉｉ）この宿主細胞を、試験化合物を含まないが、それ以外は（ｉ）の試
験培地と本質的に同一であるコントロール培地と、（ｉ）で使用される条件と本質的に同
じ条件下で接触させる工程；（ｉｖ）コントロール培地の存在下でレポーター遺伝子の発
現を測定する工程；および（ｖ）（ｉｉ）と（ｉｖ）との間の発現の差異を、試験化合物
がプロモーターの活性に影響する能力と、関連付ける工程。
【０１６４】
あるいは、形質転換した細胞を、転写誘導因子（例えば、ＩＬ−１もしくはＴＮＦ−α
、フォルスコリン、ジブチリル−ｃＡＭＰ、またはホルボール型の腫瘍促進剤（例えば、
ＰＭＡ）））を用いて誘導し得る。転写活性を、既知の活性の薬理学的因子（例えば、標
準化合物）または推定の毒性の薬理学的因子（例えば、試験化合物）の存在下または非存
在下で測定する。試験化合物の存在下でのレポーター遺伝子発現レベルの変化を、標準化
合物によってもたらされる変化と比較する。この方法において、試験化合物がＰ４５０（
例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４）転写に影響する能力、ならびに試験化合物
および標準化合物の相対的な毒性を決定し得る。
【０１６５】
従ってさらなる局面では、本発明は、以下によって、試験化合物がＣｙｐ３Ａ１１また
はＣＹＰ３Ａ４の転写を調節する能力を測定する方法を提供する：（ｉ）本明細書中に開
示されるＣｙｐ３Ａ１１プロモーターまたはＣＹＰ３Ａ４プロモーターが、レポーター遺
伝子に作動可能に連結されている宿主細胞を、レポーター遺伝子の発現を可能とする条件
下で、プロモーター活性の誘導因子と、接触させる工程；（ｉｉ）試験化合物の非存在下
でレポーター遺伝子の発現を測定する工程；（ｉｉｉ）この宿主細胞を誘導因子と接触さ
せる工程の、前、同時または後のいずれかに、宿主細胞を試験化合物に曝す工程；（ｉｖ
）試験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定する工程；および（ｉｖ）（ｉｉ
）と（ｉｖ）との間の発現差異を、Ｃｙｐ３Ａ１１媒介性またはＣＹＰ３Ａ４媒介性の転
写を調節する試験化合物の能力と関係付ける工程。
【０１６６】
異なる誘導因子は異なるシグナル伝達様式に影響することが公知であるので、特定のシ
グナル伝達経路に影響する化合物を、より高い特異性で同定することが可能である。さら
に、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４は、薬物代謝のプロセスにおいて上方制御される
ことが示されている。従って、このようなアッセイは、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ
４に対する化合物の影響によって、化合物の毒性を同定する手段を提供する。
【０１６７】
本発明はまた、Ｐ４５０（例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４）遺伝子発現に
関する、他の生理学的プロセスおよび病理学的プロセスを研究するためのモデルとして有
用な、トランスジェニック動物を提供する。
【０１６８】
本明細書中に記載される、本発明の異なる実施形態の種々の形態が、組み合わされ得る
。
【０１６９】
（実験）
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。これら例は、単なる例示
の目的ために提供され、そして本発明の範囲をいかようにも限定するようには意図される
ものではない。
【０１７０】
（材料および方法）
他に示されない場合、本明細書中に記載される実験は、標準的な方法を使用して実施さ
れた。
【０１７１】
（Ａ．ＰＣＲ増幅）
ＰＣＲ増幅については、反応混合物は、５μｌの１０×反応緩衝液（ＭｇＣｌ２を含ま
ない）；４μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．４μｌの２５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物；０．
５μｌの１０ｐモル／μｌの順方向プライマー；０．５μｌの１０ｐモル／μｌの逆方向
プライマー；１μｌ（０．２μｇ）のＤＮＡ（ＢＡＣまたはゲノム）；３８．３５μｌの
Ｈ２Ｏ；および０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）を含んだ。ＰＣＲを以下：９４℃で３分；９４℃で３０秒、５７℃で３０秒および７
２℃で１分３０秒を３０サイクル；７２℃で７分のように実施し；そして４℃で保存した
。
【０１７２】
（Ｂ．サザンブロッティング）
（ｉ）マウス１２９／ＳｖＪゲノムＤＮＡ  ＢＡＣ（細菌人工染色体）ライブラリー（
Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＰＣＲスクリー
ニングするために、プライマーを設計し、そして使用して、Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター
配列を単離した。
【０１７３】
５０ｋｂ〜２４０ｋｂの間に及ぶサイズを有する、平均で１２０ｋｂの含有インサート
を含むライブラリーを、スクリーニングした。Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター領域を含む巨
大なゲノムＤＮＡフラグメントを獲得した。同様にして、同様なサイズにされたヒトライ
ブラリーをスクリーニングすることによって、ＣＹＰ３Ａ４プロモーターを含む巨大なＤ
ＮＡフラグメントを獲得した。
【０１７４】
Ｃｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３Ａ４のＢＡＣ  ＤＮＡを、ＣｓＣｌ超遠心分離によって
単離し、そして種々の制限酵素で２時間消化した。消化されたＤＮＡフラグメントを、１
％アガロースゲルで分離した。このゲルを２５０ｍＭ  ＨＣＬ中で１０分間、脱プリン化
して、次いで０．５Ｍ  ＮａＯＨを含む２０×ＳＳＣ中で２０分間２回変性した。次いで
、ＤＮＡを、バキュームブロッティング装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ
，ＣＡ）を使用して、２０×ＳＳＣを用いて１〜２時間、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋メンブレン
（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）上にトランスファーした。トランス
ファーの後、ＵＶ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌ
ａ，ＣＡ）を使用して、製造業者の指図書に従いこのメンブレンを架橋し、そして５×Ｓ
ＳＣでリンスした。次いで、このメンブレンを、プレハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、６０℃で１〜６時間プレハイブ
リダイゼーションした。
【０１７５】
プローブを、ＰＣＲフラグメントまたは単離したＤＮＡを標識することによって調製し
た。例えば、（例えば、実施例１に記載されるように）ＰＣＲによって増幅した１．６ｋ
ｂのプロモーターフラグメントを、Ｇｅｎｅ  Ｉｍａｇｅ  Ｒａｎｄｏｍ−Ｐｒｉｍｅ  
Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐ
ｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して、製造業者の指図書に従って、標識した。変性し
たプローブを、プレハイブリダイゼーション溶液に添加して、そしてメンブレンを６０℃
で一晩ハイブリダイゼーションした。
【０１７６】
ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを、予め加温した１×ＳＳＣ、０．１％  Ｓ
ＤＳを用いて、各々６０℃で２０分間、２回洗浄した。続いて、このメンブレンを、予め
加温した０．５×ＳＳＣを用いて、各々６０℃で２０分間、２回洗浄した。このメンブレ
ンをブロッキング溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、
室温で１時間、ブロッキングし、アルカリホスファターゼと結合体化した抗体と共に、１
時間インキュベートした。３回洗浄した後、基質ＣＤＰ−Ｓｔａｒを５分間添加した。こ
のメンブレンを、基質１分と３時間との間、Ｘ線フィルムに露光した。
【０１７７】
（ｉｉ）ヒトゲノムＤＮＡ  ＢＡＣ（細菌人工染色体）ライブラリー（Ｇｅｎｏｍｅ  
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＰＣＲスクリーニングするため
に、プライマーを設計して、そして使用して、ＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列を単離した
。このライブラリーは、５０ｋｂ〜２４０ｋｂの間の範囲のサイズを有する、平均で１２
０ｋｂのインサートを含有した。ＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域を含有する巨大なゲノム
ＤＮＡフラグメントを獲得した。ＰＣＲフラグメントプローブおよび単離されたＤＮＡプ
ローブがＣＹＰ３Ａ４配列特異的であることを除いて、本質的に上記のように、サザンブ
ロット分析を実施した。
【０１７８】
（Ｃ．インビボ発現アッセイ：肝臓プッシュプロトコル）
Ｃｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４の調節配列によって媒介されるインビボ遺伝子発現
を、「肝臓プッシュ」アッセイによってアッセイした。
【０１７９】
肝臓プッシュ実験のために投与されるプラスミドを、Ｌｉｕ  Ｆ．ら（１９９９）Ｈｕ
ｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：１７３５−１７３７の方法に従って、静脈内
投与した。例えば、所望のＣｙｐ３Ａ１１またはＣＹＰ３Ａ４のプロモーター構築物を含
有する、２．２ｍｌのＰＢＳ溶液を、８秒未満の間にわたって、尾部静脈内に注射した。
【０１８０】
Ｃｙｐ３Ａ１１およびＣＹＰ３Ａ４について、コレセプターがリファンピシンによる誘
導に必要であると、以前に考えられた。従って、ｈＰＸＲ（ヒトリファンピシンコレセプ
ター）を発現するプラスミドを、必要に応じて、Ｃｙｐ３Ａ１１−ｌｕｃ構築物またはＣ
ＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ構築物と一緒に同時投与した。ＰＸＲ発現プラスミドは、Ｇｌａｘｏ
−ＷｅｌｌｃｏｍｅのＤｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ｋｌｉｅｗｅｒから入手した。
【０１８１】
（Ｄ．トランスジェニック動物の調製）
以下に記載されるトランスジェニック動物を、１細胞期の胚へのマイクロインジェクシ
ョンを使用して調製した（例えば、Ｗａｇｎｅｒらに対する米国特許第４，８７３，１９
１（１９８９年１０月１０日発行）；Ｒｉｃｈａ，Ｊ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：２６１−８を参照のこと）。この胚を、擬似受胎
のメスに移植し、そして子孫の選別（ｓｃｒｅｅｎｅｒ）を、プライマーｌｕｃＦ１（Ｇ
ＣＣＡＴＴＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＧ；配列番号１１）およびプライマーｌ
ｕｃＲ４（ＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＡＣＡＴＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＴＴＴＡＣＴＴＧＣ；配
列番号１６）を使用するＰＣＲによって行った。動物の画像化を、以下のように行った。
【０１８２】
（Ｅ．インビボ画像化）
インビボ画像化を、５０ｍｍ  ｆ  １．２  Ｎｉｋｋｏｒレンズ（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐ
ａｎ）を装着した増感ＣＣＤカメラ（ＩＣＣＤ；モデルＣ２４００−３２，Ｈａｍａｍａ
ｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）およびイメージ処理装置（Ａｒｇｕｓ  ２０，Ｈａｍａｍａｔｓｕ
）、または、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して制御される、統合画像化システ
ム（ＩＶＩＳＴＭ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ．）として利用可能な、５０ｍｍ  ｆ  ０．９５  Ｎａｖ
ｉｔａｒレンズ（Ｂｕｈｌ  Ｏｐｔｉｃａｌ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を取り付け
た低温冷却カメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）のいず
れかを使用して、
以前に記載されるように実施した（Ｃｏｎｔａｇら、（例えば、Ｃｏｎｔａｇ，Ｐ．Ｒ．
ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：２４５−７；Ｃｏｎｔａｇ，Ｃ．Ｈ．ら（１
９９７）Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．６６：５２３−３１；Ｃｏｎｔａｇ
，Ｃ．Ｈ．ら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８：５９３−６０３；Ｚｈａ
ｎｇら（２００１）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．２００１年１０月；１０（５）：４
２３−３４を参照のこと））。
【０１８３】
基質ルシフェリンを、画像化の約５分前に、体重１ｋｇ当り１５０ｍｇ（３０ｍｇ／ｍ
ｌのルシフェリンストック）の用量で、腹腔内腔に注入した。マウスをネンブタール（体
重１ｋｇ当り２５〜５０ｍｇ）を用いるか、またはイソフルラン／酸素の混合を有するガ
スチャンバー中に置いてそしてイソフルランの配管を動物の鼻に配置するかのいずれかで
麻酔して、そして麻酔状態で画像化ステージ上に置いた。マウスを、通常は腹側より１分
間画像化した。肝臓領域に渡る相対的な光子放出を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（登録商標
）ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）を使用して定量化した。
【０１８４】
これらの画像化方法を使用して、試験の被験体において事象を経時的に追跡し得る。例
えば、ある化合物を被験体（光生成レポーターを含有する）に投与し得、そして化合物投
与後の被験体からの光子放出を測定し得る。このような測定を、選択された時間間隔で繰
り返し得、このことは通常は、被験体におけるレポーター発現レベルに対する化合物の効
果を一定時間に渡り追跡するのに、有効である。
【０１８５】
（Ｆ．ウエスタンブロット分析）
最終的な画像化の後、動物を屠殺し、そしてその肝臓を摘出し、そして直ちに液体窒素
で凍結した。次いで、Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ，ＰＡ）を使用して、各々の動物由来の肝臓組織を、４倍量のＰＢＳ緩衝液
中に別々にホモジナイズした。各々のホモジネートのタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒ
ｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ
）を、製造業者の推奨に従い使用して測定した。組織ホモジネート中のタンパク質を、Ｌ
ａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．（１９７０）の方法に従い、変性１０％ポリアクリルアミドゲル
でサイズによって分離し、次いで、ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ，Ｅｍｅｒｙｖｉ
ｌｌｅ，ＣＡ）にトランスファーした。
【０１８６】
Ｃｙｐ３Ａ１１タンパク質を、１次ヤギ抗ラットＣｙｐ３Ａ２抗体（ＧｅｎＴｅｓｔ，
Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，０１８０１）を使用して検出した。２次抗体は、抗ヤギＩｇＧペル
オキシダーゼ結合体化抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）であった。
【実施例】
【０１８７】
（実施例１）
（ベクター構築）
（Ａ．マウスＣｙｐ３Ａ１１）
Ｃｙｐ３Ａ１１発現構築物および他の発現構築物を、以下に記載されるように構築した
。
【０１８８】
ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓ：  図５は、ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓと称する構
築物の模式図を示す。簡潔に述べると、この構築物は以下のように作製した。Ｃｙｐ３Ａ
１１プロモーターの１．６ｋｂのフラグメント（−１．６ｋｂから＋６５ｂｐに及ぶ）を
、Ｃｙｐ３Ａ１１ＴｏｐＥｃｏＲＩ．プライマー（ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＡＴ
ＧＡＧＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧ、配列番号１）およびＣｙｐ３Ａ１１ＢｏｔＸｈｏ
Ｉ．プライマー（ＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣ
ＴＧ、配列番号２）を使用して、マウスゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。（また、Ｔｏ
ｉｄｅら（１９９７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３３
８：４３−４９を参照のこと）。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化して、そして１．６ｋｂの
Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーターフラグメントをこのベクター中にライゲーションした。
【０１８９】
ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍ：  この構築物は、マウスＣｙｐ３Ａ１１プロモーター
の６ｋｂのフラグメントを含み、そして以下のように構築した。Ｃｙｐ３Ａ１１Ｆ１．プ
ライマー（ＧＧＴＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＡＴＧＣＡＴＡＣ、配列番号３）、お
よびＣｙｐ３Ａ１１Ｒ２．プライマー（ＣＡＧＡＴＡＧＧＡＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＣＡＧ
ＡＧＧ、配列番号４）と称するプライマーを使用して、マウスゲノムＤＮＡのＢＡＣクロ
ーンをスクリーニングした（また、上記の材料と方法を参照のこと）。１つのポジティブ
なＢＡＣクローンを選択し、そして１．６ｋｂのプロモーターフラグメントをプローブと
して使用して、上記のように、制限消化およびサザンブロッティングによって分析した。
【０１９０】
選択されたＢＡＣクローンのこれらのサザンブロットを基に、ＢＡＣクローンのＰｓｔ
Ｉフラグメントを単離し、配列決定用ベクターにサブクローニングし、そして配列決定し
た。続いて、このＰｓｔＩサブクローンをＳｍａＩ／ＰｓｔＩで消化し、そして得られた
５．９ｋｂのＸｍａＩ／ＰｓｔＩフラグメントを単離した。ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１
ＳをＸｍａＩ／ＰｓｔＩで消化し、そしてこのバックボーン（３’ＰｓｔＩ部位〜Ｘｈｏ
Ｉ部位に及ぶ下流のプロモーター領域を含む）を単離した。この５．９ｋｂのＸｍａＩ／
ＰｓｔＩフラグメントを、ＸｍａＩ／ＰｓｔＩ消化したｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓバ
ックボーン中にクローニングした。従って、ライゲーション後、得られたｐＢＳＳＫ−Ｃ
ｙｐ３Ａ１１Ｍ（図６）は、５．９ｋｂのＳｍａＩ／Ｐｓｔ  ＢＡＣフラグメントと、さ
らにｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓの３’ＰｓｔＩ部位〜ＸｈｏＩ部位に及ぶ下流のプロ
モーター配列を含んだ。
【０１９１】
ｐＧＬ３−Ｉ−Ｂａｓｉｃ：  ２０８塩基対のイントロンフラグメントを、Ｉｎｔｒｏ
ｎ  Ｔｏｐ  ＢｇｌＩＩ．プライマー（ＴＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡ
ＣＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧ、配列番号５）およびＩｎｔｒｏｎ  Ｂｏｔ  ＨｉｎｄＩＩＩ
．プライマー（ＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＧ、配列番号６
）を使用して、ｐＣＡＴ−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から増
幅した。約５４０ｎｍの放出ピークを有するイエロー−グリーンルシフェラーゼは、ｐＧ
Ｌ３という名称でＰｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩよりプラスミドベクターにおい
て市販され、そしてこのプラスミドをＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次い
で、このＰＣＲイントロンフラグメントを、ＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ切断したｐＧＬ
３ベクター中にライゲーションした。得られたベクターを、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｂａｓｉｃと
名付けて、図７に示す。
【０１９２】
ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓ：  １．６ｋｂのＣｙｐ３Ａ１１Ｓプロモーターを、
Ｃｙｐ３Ａ１１ＴｏｐＫｐｎＩ．プライマー（ＧＴＴＧＧＴＡＣＣＣＡＧＣＴＡＡＴＧＡ
ＧＧＧＣＡＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧ、配列番号７）およびＣｙｐ３Ａ１１ＢｏｔＨｉｎｄＩ
ＩＩ．プライマー（ＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＧＴＴＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡ
ＣＴＧ、配列番号８）を使用して、Ｃｙｐ３Ａ１１−ＢＡＣクローンから増幅した。この
ＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＧＬ３−Ｉ−Ｂａｓｉ
ｃベクター中にクローニングした。得られた構築物ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｓを、
図２に示す。
【０１９３】
ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍ：  ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１ＭをＸｍａＩおよび
ＸｈｏＩで消化し、そして得られた６ｋｂのフラグメントを、ＸｍａＩおよびＸｈｏＩで
予め消化しておいたｐＧＬ３−Ｉ−Ｂａｓｉｃ中にライゲーションした。得られた構築物
を、図３に示す。
【０１９４】
ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｌ：  上記のように、１．６ｋｂのプロモーターフラグ
メントをプローブとして使用して、選択されたＢＡＣクローンについて、サザンブロッテ
ィングを実行した。ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍを作製するために使用した６ｋｂのＰ
ｓｔＩフラグメントに加えて、１０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントも同定した。この１０ｋ
ｂのＫｐｎＩフラグメントをサブクローニングし、配列決定し、そして配列から制限部位
を同定した。この１０ｋｂのフラグメントが５．９  ｐＢＳＳＫ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍのフ
ラグメントと重なり、そしてまたさらなる上流の配列を含むことを決定した。重なり部分
は、ＮｈｅＩ部位を含んだ（図６）。ｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｍおよび１０ｋｂのＫｐｎ
Ｉサブクローンの両方をＮｈｅＩおよびＫｐｎＩで消化した。この結果、ベクターのバッ
クボーン中にＮｈｅＩからＸｈｏＩに及ぶプロモーターの上流領域を含む、ｐＧＬ３−Ｉ
−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍバックボーンを生じた。１０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントのＮｈｅＩ
／ＫｐｎＩフラグメントを、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｍバックボーン中にライゲー
ションした後に、得られたｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１Ｌは、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３
Ａ１１Ｍの内部ＮｈｅＩ部位から隣のＸｈｏＩ部位まで及ぶさらなる下流配列を含む、約
９ｋｂのプロモーター配列を含んだ。得られた構築物を図４に示す。
【０１９５】
ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１ＸＬ：  ６ＫｂのＰｓｔＩサブクローンおよび１０Ｋｂ
のＫｐｎＩサブクローンに加えて、１１ＫｂのＸｍａＩフラグメントをまた、３Ａ１１Ｂ
ＡＣクローンからサブクローニングした。配列データは、この１１ＫｂのＸｍａＩフラグ
メントが１０ＫｂのＫｐｎＩフラグメントと重なることを示した。２．１ＫｂのＫｐｎＩ
フラグメントを、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１ＬのＫｐｎＩ部位中の１１Ｋｂのサブク
ローンからクローニングした。２．１ＫｂのＫｐｎＩフラグメントの向きを、ＤＮＡ配列
決定によって確認した。１１ＫｂのＣｙｐ３Ａ１１プロモーター領域を含む、得られた新
規構築物を、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃｙｐ３Ａ１１ＸＬと称した。
【０１９６】
本発明の支持に実施された実験は、Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子座のタンパク質コード領域上
流に由来する、約９，３３０塩基対（図１Ｂ；配列番号１３）の配列を提供した。転写制
御エレメントを含むプロモーター領域の配列を、図１Ａ（配列番号１２）に提示する。こ
の図は、開始ＡＴＧコドンを含むゲノム配列を含む。表１は、Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子座の
タンパク質コード領域上流に由来の配列を示し、これは上記の構築物を構成する。表１の
開始位置および終結位置を、図１Ａに提示される配列に関連して示す。
【０１９７】
（表１）
【０１９８】
【表１】
2008188024.tif 000002
（Ｂ．ヒトＣＹＰ３Ａ４）
ＣＹＰ３Ａ４発現構築物および他の発現構築物を、以下に記載するように構築した。
【０１９９】
ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ：  １３ＫｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーターを、ヒト
ＢＡＣクローン（プライマー３Ａ４Ｔｏｐ（ＧＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣ
ＡＣＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＴＧ、配列番号９）および３Ａ４Ｂｏｔプライマー（ＡＴＣ
ＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣ、配列番号１０）
を使用して、Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．によりスクリーニングされた）
から構築した。Ｇｏｏｄｗｉｎら、（ＷＯ  ９９６１６２２  Ａ１、１９９９年１２月２
日に公開された）は、１３ｋｂのプロモーター配列のうちの約６ｋｂ〜約５．４ｋｂの由
来の、６３２ｂｐのＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列を公開した。およそ−１３Ｋｂ〜−１
０．５Ｋｂ（ＫｐｎＩ部位〜ＢａｍＨＩ部位）に対応する領域についての上流の（５’）
ＤＮＡ配列を、取得した。肝細胞核内因子３ｂ（ＨＮＦ−３ｂ）の推定結合部位を、この
領域中に同定した。得られた構築物を、図９に示す。
【０２００】
ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｍ：  １０．５ｋｂのプロモーター領域を含む、ｐＧＬ３
−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ由来の１２．５ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＢＳＳＫ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中にクローニングした。得られたプラス
ミドを、ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｍと称した。得られた構築物を図８に示す。
【０２０１】
図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子座のタンパク質コード領域上流
に由来する、約１３ｋｂの配列を提示する。この図は、開始ＡＴＧコドンを含むゲノム配
列を含む。マウス肝臓において肝臓特異的な基本的発現に影響する転写制御エレメント（
本明細書中で同定された）を含むプロモーター領域の２．５ｋｂのフラグメントを、図１
７Ｂ（配列番号１５）に提示する。
【０２０２】
表２は、ＣＹＰ３Ａ４遺伝子座のタンパク質コード領域上流の配列を示し、これは上記
の構築物を構成する。表２の開始位置および終結位置を、図１７Ａに提示される配列に関
連して示す。
【０２０３】
（表２）
【０２０４】
【表２】
2008188024.tif 000003
（実施例２）
（肝臓プッシュ（ｌｉｖｅｒ  ｐｕｓｈ）アッセイ）
肝臓プッシュアッセイを、上記に記載されるように実施した。
【０２０５】
（Ａ．マウスＣｙｐ３Ａ１１構築物）
簡単には、実施例１Ａに記載される発現構築物を、マウスに静脈内注射し、上記のよう
に２週間後に画像化した（前処置群）。各発現構築物について、その後、３匹のマウスを
、１００μｌのＤＭＳＯで処置し（溶媒コントロール）；３匹のマウスを、０．１ｍｇ／
ｇのデキサメタゾン（１００μｌ）で処置し；そして、３匹のマウスを、０．１ｍｇ／ｇ
のリファンピシン（１００μｌ）で処置した。デキサメタゾンおよびリファンピシンは、
Ｃｙｐ３Ａ１１を誘導することが以前に示された（Ｙａｎａｇｉｍｏｔｏら、（１９９７
）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３４０（２）：２１５−８）。さらに、
マウスを、同じ用量で、単一用量のＤＭＳＯ、リファンピシン（Ｒｉｆ）およびデキサメ
タゾン（Ｄｅｘ）で処置した。次いで、薬物投与後、マウスを、種々の時点で画像化した
。
【０２０６】
図１０に示されるように、５μｇのＣｙｐ３Ａ１１Ｍおよび０μｇのｈＰＸＲを用いた
肝臓プッシュに供された画像化マウスは、デキサメタゾン投与の約４８時間後、ルシフェ
ラーゼ活性のほぼ５倍の誘導が見られた。ＤＭＳＯ処置マウスは、ほとんど誘導を示さな
いかまたは全く示さないのに対して、リファンピシン処置マウスは、薬物処置の約４８〜
９６時間後に、ルシフェラーゼのいくらかの誘導を示した。
【０２０７】
図１２に示されるように、５μｇのＣｙｐ３Ａ１１Ｌおよび１μｇのｈＰＸＲを用いた
肝臓プッシュに供された画像化マウスは、リファンピシン投与の約６時間後、ルシフェラ
ーゼ活性のほぼ８倍の誘導が見られた。ＤＭＳＯ処置マウスは、ほとんど誘導を示さない
かまたは全く示さないのに対して、デキサメタゾン処置マウスは、薬物処置の約２４〜４
８時間後に、ルシフェラーゼの約４倍の誘導を示した。
【０２０８】
従って、Ｃｙｐ３Ａ１１転写コントロール要素によって媒介される発現の調整は、生育
動物において、直接モニタリングされ、化合物の毒性に対する情報を提供し得る。
【０２０９】
（Ｂ．ｈＰＸＲの滴定）
リファンピシンの取り込みには、リファンピシンコレセプター（例えば、ｈＰＸＲ）の
同時投与を必要とすると、以前は考えられた。特に、ｈＰＸＲは、薬物（デキサメタゾン
およびリファンピシン）によって、ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４発現の誘導を媒介す
ることが示された。Ｐａｓｃｕｓｓｉ  ＪＭら、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０００
Ａｕｇ）５８（２）：３６１−７２を参照のこと。
【０２１０】
この概念を試験するために、本発明者らは、実施例１に記載されるように、変動量のｈ
ＰＸＲおよびｃｙｐ発現構築物を用いて、肝臓プッシュ実験を実施した。図１１、１３お
よび１６に示されるように、ＰＸＲは、ＣＹＰ３Ａ４ＬまたはＣｙｐ３Ａ１１Ｍによって
媒介される、リファンピシンの取り込みまたはルシフェラーゼ活性の誘導には必要ではな
い。実際に、特定の場合において、ルシフェラーゼ発現の誘導は、より高い用量のＰＸＲ
が使用された場合に、実際に減少した。
【０２１１】
従って、リファンピシンコレセプターの投与は、リファンピシンの取り込みには必要で
はない。
【０２１２】
（Ｃ．ヒトＣＹＰ３Ａ４構築物）
簡単には、実施例１Ｂに記載される発現構築物を、マウスに静脈内注射し、上記のよう
に２週間後に画像化した（前処置群）。各発現構築物について、２．２ｍｌ体積のプラス
ミド混合物（ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４ＭまたはｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ）を、
２２ｇのＦＶＢ雌性マウスに、８秒未満の期間にわたって、静脈注射した。画像化のため
に、基質ルシフェリンを、１５０ｍｇ／体重ｋｇ（１５ｍｇ／ｍｌルシフェリンストック
）の用量で、腹膜腔へと注射した。次いで、マウスを、ガスチャンバー中でイソフルラン
／酸素で麻酔した。ルシフェリン注射の５分後、鼻に挿管して、イソフルランで麻酔され
たマウスを、画像化ステージに配置し、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳイメージングシステム
を使用して１分間、腹側から画像化した。肝臓領域全体の相対的光子放出を、Ｌｉｖｉｎ
ｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して定量した。
【０２１３】
図１４に示されるように、５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌおよび０μｇのｈＰ
ＸＲを用いた肝臓プッシュに供されたマウスは、Ｒｉｆ投与の約６時間後、ルシフェラー
ゼ活性の約１５倍の誘導を示した；デキサメタソン処理の６時間後の、約１３倍の誘導を
示し、そしてＤＭＳＯ投与後いつでも、ほとんど誘導しなかったかまったく誘導を示さな
かった。図１５に示されるように（データは、第１の投与の１２日後の第２の投薬につい
て示され、マウスを、第２の用量で処置し、画像化した）、５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹ
Ｐ３Ａ４Ｌおよび１μｇのｈＰＸＲを用いた肝臓プッシュに供されたマウスは、Ｒｉｆ投
与の約１２時間後に約４０倍のルシフェラーゼ活性の誘導を示し；デキサメタゾン処置の
約１２時間後に約６０倍の誘導を示し、そしてＤＭＳＯの投与後いつでもほとんど誘導し
なかったかまたは全く誘導を示さなかった。
【０２１４】
さらに、１３Ｋｂプロモーター（ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ）は、１０．５Ｋｂプ
ロモーター（ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｍ）より、約２５倍肝臓中でさらにより高い発
現を媒介した。
【０２１５】
（実施例３）
（ＣＹＰ３Ａ１１／ＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列を介するハイスループット毒性スク
リーニング）
化合物を、これらの能力をモニタリングすることによって安全性および／または可能な
毒性についてスクリーニングし、トランスフェクトされた細胞における、Ｃｙｐ３Ａ１１
プロモーター媒介性生物発光またはＣＹＰ３Ａ４プロモーター媒介性生物発光を媒介し得
る。宿主細胞（例えば、肝細胞）を、例えば、Ｃｙｐ３Ａ１１−ＬｕｃまたはＣＹＰ３Ａ
４−Ｌｕｃを含有するリポフェクタミン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使
用して、トランスフェクトし、９６ウェルプレートにプレートし、化合物ライブラリーの
ハイスループットスクリーニングに使用した。トランスフェクションを、製造業者の指示
書または標準プロトコールに従って実施した。トランスフェクション後、細胞を、選択さ
れた化合物で約３６時間処置し、続いてこの細胞を、受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）
で溶解し、そしてＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙシス
テム（Ｐｒｏｍｅｇａ）でルシフェラーゼ活性についてアッセイする。
【０２１６】
（実施例４）
（Ｃｙｐ３Ａ１１媒介性代謝またはＣＹＰ３Ａ４媒介性代謝のインビボモニタリング）
（Ａ．マウスＣｙｐ３Ａ１１）
Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター−ＬｕｃＹＧ−発現カセットを保有するトランスジェニッ
クマウスを、トランスジェニックマウスを作製するための公知の方法を用いて得る（上記
考察を参照のこと）。これらの動物（「親（ｆｏｕｎｄｅｒ）」）を、非トランスジェニ
ックマウスと交配させ、同産児（「Ｆ１動物」）を産出した。
【０２１７】
この親からのＦ１動物を、上記に記載される方法に従って１〜６週齢まで画像化した。
観測されたシグナル強度を、定量化した。
【０２１８】
これらの実験は、本発明の発現カセットおよびトランスジェニック動物を、インビボで
のＣｙｐ３Ａ１１プロモーター媒介性の生物発光をモニターするために使用し得ることを
示す。
【０２１９】
（Ｂ．ヒトＣＹＰ３Ａ４）
トランスジェニックマウスを、ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｍ−ｌｕｃ構築物またはｐ
ＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ構築物を使用して作製した。ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｍ
について、プラスミドを、ＢａｍＨＩで消化し、１０．５ＫｂのＣＹＰ３Ａ４プロモータ
ー、キメラのイントロン、および発光飛翔昆虫ルシフェラーゼｃＤＮＡを含む１２．５ｋ
ｂのフラグメントを、電気溶出によってアガロースゲルから精製した。ｐＧＬ３−Ｉ−Ｃ
ＹＰ３Ａ４Ｌについて、プラスミドを、ＰｖｕＩで消化し、１３ＫｂのＣＹＰ３Ａ４プロ
モーター、キメラのイントロン、および発光飛翔昆虫ルシフェラーゼｃＤＮＡを含む１５
ｋｂを、電気溶出によってアガロースゲルから精製した。
【０２２０】
次いで、精製されたフラグメントを、単細胞段階のＦＶＢ胚へと各々マイクロインジェ
クションした。次いで、この胚を、偽妊娠マウスへと移植した。親を、ＰＣＲおよび画像
化によってスクリーニングし、得られたトランスジェニック動物を、上記に記載される方
法に従って、１〜６週齢まで画像化した。観測されたシグナル強度を、定量化した。ルシ
フェラーゼレベルは、ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４Ｌ動物の肝臓およびｐＧＬ３−Ｉ−Ｃ
ＹＰ３Ａ４Ｍ動物の腸管において最大であった。
【０２２１】
（実施例５）
（反復配列およびプロモーター領域の同定）
（Ａ．Ｃｙｐ３Ａ１１におけるプロモーター領域）
図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御因子のヌク
レオチド配列を含む。この図において、この配列は、全部で１２，２７５ヌクレオチドを
示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３位〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴ
Ａボックスは、１０，８８４位〜１０，８８７位に位置し、主要な転写開始部位は、１０
，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂ領域は、図１Ａのヌク
レオチド位１〜９，３３０であり、約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂに単独で示される（配列
番号１３）。本発明はまた、配列番号１２のヌクレオチド１〜１１，００２のポリヌクレ
オチドを含む転写制御因子配列を包含する。
【０２２２】
マウスＣｙｐ３Ａ１１プロモーター由来の約９．３ｋｂ配列を、ＧｅｎＢａｎｋのＢＬ
ＡＳＴ検索において使用した。１つの検索において、マウスＬ１要素（反復配列のＬＩＮ
Ｅファミリー）（Ｌｏｃｕｓ  ＭＵＳＬ１Ｍ９）に対する一致が同定された。マウスゲノ
ムにおいて、３つの公知のＬ１要素のファミリーが存在する（Ｍｅａｒｓ，Ｍ．Ｌ．およ
びＨｕｔｃｈｉｓｏｎ，Ｃ．Ａ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２００１年１月；５２（１）
：５１−６２）。Ｌ１要素は、マウスにおいてレトロトランスポゾンサブファミリーと関
連すると考えられる（例えば、Ｇｏｏｄｉｅｒ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２
００１年１０月；１１（１０）：１６７７−８５）。この配列と３Ａ１１配列との整列は
、約９１％の同一性を有する領域を同定した（図１８を参照）。
【０２２３】
さらに、約９．３ｋｂの３Ａ１１配列を、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒプログラム（ｈｔ
ｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／Ｒ
ｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ）を使用して分析した。このプログラムは、公知の反復配列（例
えば、ＬＩＮＥＳエレメント、ＳＩＮＥＳエレメント、およびＬＴＲエレメント）に高い
相同性を有する領域を同定し得る。Ｌ１エレメントに高い相同性（９１％）を有する３つ
の領域（約１〜６２３、２５０３〜５１０３、および６１２９〜６７９１）を、同定した
（図１８）。別の領域（約６２３〜２５０３）が、マウスＭａＬＲ反復ファミリーに高度
に相同性であることを示した（図１８）。このＭａＬＲ反復ファミリーはまた、哺乳動物
レトロトランスポゾン様スーパーファミリーと関連すると考えられる（Ｋｅｌｌｙ，Ｒ．
Ｇ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９４年１２月；２４（３）：５０９−１５）。
【０２２４】
約９．３ｋｂの３Ａ１１配列における２つの一次非反復領域を同定した（約５１０４〜
６２１８および６７９２〜９３３０）。
【０２２５】
（Ｂ．ＣＹＰ３Ａ４におけるプロモーター領域）
図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御配列のヌクレ
オチド配列を包含する。この図において、この配列は、全部で１３，０３５ヌクレオチド
を示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴ
Ａボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要な転写開始部位は、１２，
９３０位のＡで開始する。ＣＹＰ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂ領域は、本明細書中に記載
される発現に有用であり、図１７Ａのヌクレオチド位１〜２，４６１であり、約２．５ｋ
ｂ配列は、図１７Ｂに単独で示される（配列番号１５）。
【０２２６】
上記に記載される配列に対する類似する分析を、約１３ｋｂのＣＹＰ３Ａ４プロモータ
ー領域で実施した。この分析の結果の概要を、図１９に示す。２つの異なる種類の反復配
列を同定した：Ｌ１要素およびＡｌｕ反復。
【０２２７】
約１３ｋｂのＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域における５つの一次非反復領域を同定した
（約１２９０〜２４４６、２７５８〜４１１１、４４２４〜６０１０、６３１７〜９０９
９、および９４０１〜１２９９８）。
【０２２８】
（実施例６）
（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ  ＦｖＢトランスジェニックマウス株の産生）
（Ａ．プラスミド構築物）
ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃレポーターを、本質的には、実施例１Ｂに記載されるように、簡
単には以下のように設計した。ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域を包含するＢＡＣクロ
ーンを、ＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域のヌクレオチド−１１０５から−１０８０に対応
するプライマー（５’−ＧＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡ
ＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号９））およびＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域のヌクレオチ
ド＋４０から６９に対応するプライマー（５’−ＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＧＣ
ＴＣＴＧＴＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣ−３’（配列番号１０））を使用して、ＰＣＲによ
ってスクリーニングした。これらプライマーをまた、ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＣＹＰ３
Ａ４の１．２ｋｂプロモーター領域を増幅した。ＰＣＲ生成物を、ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩを用いて消化し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  Ｋｉｔ（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ，ＣＡ）を使用してアガロースゲルから精製した。１．２ｋｂプロモーター領域を改変
された発光飛翔昆虫のルシフェラーゼｃＤＮＡ配列を含有するｐＧＬ３−基本型ベクター
（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングした。次いで、ｐＣＡＴ−
３−基本型ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）由来のキメラのイントロ
ンを包含する２３３ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ＣＹＰ３Ａ４プロモーター領
域とルシフェラーゼ遺伝子との間に挿入した。ＢＡＣクローンからサブクローニングされ
た１．８８ｋｂのＫｐｎＩ／ＢｇｌＩＩフラグメント、９５０ｂｐのＢｇｌＩＩフラグメ
ント、および１０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを、続いて前の構築物へと挿入した。最終
構築物ｐＧＬ３−Ｉ−ＣＹＰ３Ａ４は、１３ｋｂのヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター領域、
２３３ｂｐのキメラのイントロン、および改変された発光飛翔昆虫のルシフェラーゼｃＤ
ＮＡを包含する。この構築物の全ての連結部を、ＤＮＡ配列決定法によって確認した（Ｓ
ｔａｎｆｏｒｄ  ＰＡＮ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，ＣＡ）。ＣＹＰ３Ａ４
−ｌｕｃ導入遺伝子の全配列を、図１７Ｃに示す（配列番号１７）。
【０２２９】
（Ｂ．ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃトランスジェニック（Ｔｇ）マウス）
トランスジェニック株を、ＦＶＢドナー胚を使用して、マイクロインジェクション法に
よって作製した（例えば、Ｗａｇｎｅｒらの米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９
年１０月１０日に公開された）；およびＲｉｃｈａ，Ｊ．，（２００１）「Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ  ２００１年３月第１７巻：２６１−８を参照のこと）。
【０２３０】
（Ｃ．Ｔｇマウスのスクリーニング）
１８匹の親マウスを、ＬｕｃＦ１プライマーおよびＬｕｃＲ４プライマー、またはＬｕ
ｃ３プライマー（５’−ＧＡＡＡＴＧＴＣＣＧＴＴＣＧＧＴＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣ−３’
（配列番号１８））およびＬｕｃ４プライマー（５’−ＣＣＡＡＡＡＣＣＧＴＧＡＴＧＧ
ＡＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡ−３’（配列番号１９））を使用して、ＰＣＲによってスクリ
ーニングした。これら同一のプライマーを、Ｔｇの子孫をスクリーニングするためにもま
た使用した。
【０２３１】
（（ｉ）ＰＣＲスクリーニング）
図２０は、ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ  Ｔｇマウスの例示的なＰＣＲスクリーニングの結果
を示す。この図において以下のとおりである：レーン１、ＤＮＡラダー；レーン２、ネガ
ティブ同産児；レーン３、ポジティブ同産仔。この結果は、ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ  Ｔｇ
マウスの同定を示す。
【０２３２】
（（ｉｉ）サザンハイブリダイゼーション分析）
全ルシフェラーゼｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を包含するｐＧＬ３−基本
型由来の１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩフラグメントを、サザンハイブリダイゼ
ーションのためのプローブとして使用した。１０μｇの異型接合ゲノムＤＮＡを、Ｂａｍ
ＨＩで消化し、１７ｐｇのｐＧＬ３−基本型を、ポジティブコントロールとして供した（
図２１）。導入遺伝子の期待される大きさは、１２ｋｂであった。例示的なハイブリダイ
ゼーション分析の結果を、図２１に示す。この図において以下のとおりである：図２１に
は、サザンハイブリダイゼーションによるＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）
の例示的なスクリーニングの結果を示す。この図において以下のとおりである：レーン１
、１０μｇのＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ  ＴｇゲノムＤＮＡ；レーン２、１７ｐｇのｐＧＬ３
−基本型ポジティブコントロール。これらの結果は、トランスジェニックマウスにおける
導入遺伝子の存在を示す。
【０２３３】
（Ｄ．選択基準に適用された表現型データ）
動物株を評価するための一般的な方法は、以下のとおりである。Ｔｇ親を、野生型Ｆｖ
Ｂマウスと交配して、Ｆ１マウスを作製した。雌性トランスジェニック親を、野生型Ｆｖ
Ｂオスと交配し、雄性トランスジェニック親を、数匹の野生型ＦｖＢメスと交配した。
【０２３４】
３０ｍｇ／ｍｌのルシフェリンストック溶液を、滅菌ＰＢＳ中に調製した。ルシフェリ
ンを、Ｂｉｏｓｙｎｔｈ  ＡＧ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからＤ−ルシフェリンカリウム
塩（カタログ番号ＸＲ−１００１、ロット番号１４０２１／２）として購入した。
【０２３５】
デキサメタゾン（カタログ番号；Ｄ１７５６）、リファンピシン（カタログ番号；Ｒ３
５０１）、プレグネノロン（カタログ番号；Ｐ９１２９）、クロトリマゾール（カタログ
番号；Ｃ６０１９）、ニフェジピン（カタログ番号；Ｎ７６３４）、５−プレグネン−３
ｂ−ＯＬ−２０−ＯＮＥ−１６ａ−カルボニトリル（カタログ番号；Ｐ０５３４）、およ
びフェノバルビタール（カタログ番号；Ｐ３７６１）を全て、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕ
ｉｓ，ＭＯ）から購入した。フェノバルビタールを、ＰＢＳ緩衝液中に調製し、その他を
、ＤＭＳＯ中に調製した。
【０２３６】
薬物およびルシフェリンの投与経路は、ＩＰであった。ルシフェリン基質および薬物の
試薬投与用量は、以下のとおりであった。ルシフェリンの用量（１５０ｍｇ／ｋｇの３０
ｍｇ／ｍｌのルシフェリンストック）を、ＩＶＩＳＴＭ（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ，Ａｌａｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）システム中で画像化する前に５分
間、ＩＰ投与した。化学物質の用量はいかのとおりであった：フェノバルビタールを除く
全ての薬物を、ＤＭＳＯ中に調製し、５０ｍｇ／ｋｇ（フェノバルビタールを１００ｍｇ
／ＫｇでＰＢＳ中に調製した）の用量でＩＰ注射した。ＤＭＳＯを、ビヒクルコントロー
ルとして調製した。処置の持続時間は、代表的には２〜３日間であった。
【０２３７】
ルシフェリンの投与後に、動物を、気体麻酔法（イソフルラン）を使用して麻酔し、画
像化のためにＩＶＩＳＴＭボックス（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｌａ
ｍｅｄａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に配置した。全ての動物を、化学物質の投与前および
後に、画像化し、オスおよびメスそれぞれについて、１０秒間または１分間、高分解能（
ビンニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）２）で画像化した。
【０２３８】
代表的なＣＹＰ３Ａ４誘導体（デキサメタゾン（５０ｍｇ／体重ｋｇ）およびリファン
ピシン（５０ｍｇ／体重ｋｇ））によるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃの誘導を、動物において評
価した。各親からのＦ１マウス（すなわち、導入遺伝子の存在に対してＰＣＲポジティブ
なマウス）を、ＤＭＳＯ、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、またはリファンピシン（Ｒｉｆ）
のＴ＝０（処置前）ならびにＴ＝３時間後およびＴ＝６時間後に画像化した。これを、１
８のうち９の親株由来の３匹のマウス（両方の性を含む）の群で実施した。Ｄｅｘ処置お
よびＲｉｆ処置から得られた一次スクリーニングの結果を、以下に記載する。
【０２３９】
（ａ）７５株、１９５株、２３０株、および２４０株は、肝臓の基礎発現よりも、より
高い腸管基礎発現を有する、腸管領域中での誘導を示した。
【０２４０】
（ｂ）２２５株は、肝臓および腸管において、ＤｅｘおよびＲｉｆによる誘導を示した
が、肝臓の基礎発現よりも、より高い腸管基礎発現を有した。
【０２４１】
（ｃ）２３３株は、ＤｅｘおよびＲｉｆによって、小腸における強い誘導および肝臓に
おける僅かな誘導を示した。この株は、高い腸管基礎発現を有した。
【０２４２】
（ｄ）株２２１は、いずれの薬物によっても誘導を示さず、非常に低いレベルの基礎発
現を有した。
【０２４３】
（ｅ）株８２および株２０８は、他の領域においてよりも肝臓において、Ｄｅｘおよび
Ｒｉｆによるより強い誘導を示し、肝臓における基礎発現は、小腸における基礎発現より
も、より高く；オスは、メスよりも強く応答した。
【０２４４】
このデータを、本明細書において前に記載された選択基準に対して評価した；（ｉ）肝
臓における遺伝子発現の誘導−２２５株、２３３株、８２株および２０８株は、この基準
を満たした；（ｉｉ）他の領域（例えば、腸管）においてよりも肝臓領域においてのより
高い誘導−８２株および２０８株は、この基準を満たした；および（ｉｉｉ）体の他の部
分における基本的な発現よりもより高いまたはそれに等しい、肝臓における基礎発現−８
２株および２０８株は、この基準を満たした。
【０２４５】
上記基準を満たすマウスを、代表的には、以下の分析のために選択した。８２株および
２０８株は、肝臓においてＤｅｘおよびＲｉｆによる強い誘導を示し、雄性肝臓領域にお
いてより高い基本ルシフェラーゼレベルを有したので、これら株を、二次スクリーニング
に選択した。
【０２４６】
（二次スクリーニング）
８２株および２０８株は、基準の第１のセットを満たし、特に、導入遺伝子（ＣＹＰ３
Ａ４−ｌｕｃ）発現を、ＤｅｘおよびＲｉｆによって、肝臓領域に誘導し、そして動物に
おける導入遺伝子発現は、少なくともオスにおいて、より高い肝臓基礎発現を示した。こ
れらの２つの株は、一次スクリーニングにおいてほぼ同一に見えた。株８２は、さらに、
ＣＹＰ３Ａ４発現を誘導すると考えられている７つの化合物を使用して特徴付けられた。
この化合物としては、プレグネノロン（Ｐｒｅｇ）、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂ
）、リファンピシン（Ｒｉｆ）、ニフェジピン（Ｎｉｆ）、５−プレグネン−３ｂ−ＯＬ
−２０−ＯＮＥ−１６ａ−カルボニトリル（ＰＣＮ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）および
クロトリマゾール（Ｃｌｏｔｒｉｍ）が挙げられる。発現を、両方の性について評価した
。例示的な結果を、以下に示される図２２、パネルＡ〜Ｄに示される。株８２は、肝臓内
で、ほとんどのＣＹＰ３Ａ４誘導物質に応答し、この細胞株を、最終株として選択し、Ｆ
ＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）と命名した。
【０２４７】
ＴｇマウスにおけるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ導入遺伝子の誘導の例示的な分析の結果は、
図２２、パネルＡ〜Ｄに示される。この図において、マウスを、ＤＭＳＯ、プレグネノロ
ン（Ｐｒｅｇ）、フェノバルビタール（Ｐｈｅｎｏｂ）、リファンピシン（Ｒｉｆ）、ニ
フェジピン（Ｎｉｆ）、５−プレグネン−３ｂ−ＯＬ−２０−ＯＮＥ−１６ａ−カルボニ
トリル（ＰＣＮ）、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）およびクロトリマゾール（Ｃｌｏｔｒｉｍ
）の投与Ｔ＝０（処置前）およびＴ＝６時間後、画像化した。ＮＴは、非処置コントロー
ルである。各画像化セッションの前に、マウスを、１５０ｍｇ／ｋｇルシフェリンでｉ．
ｐ．注射した。パネルＡは、９匹のオスマウスについての例示的な誘導データを示し、各
マウスは、パネルＣの下の説明文に示される化合物で処置した。パネルＣは、９匹の雌性
マウスについての例示的な誘導データを示し、各マウスは、パネルＣの下の説明文に示さ
れる化合物で処置した。パネルＢは、類似する誘導実験を示す棒グラフを示し、ここでこ
の結果は、３匹の雌性マウスの群に適用された場合の各処置に対する結果（パネルＤの下
に示される）を示す。各マウスに対する測定を、上記に記載されるように実施した。付随
するエラーバーを示す。パネルＤは、類似する誘導実験を示す棒グラフを示し、ここでこ
の結果は、３匹の雌性マウスの群に適用された場合の各処置に対する結果（パネルＤの下
に示される）を示す。各マウスに対する測定を、上記に記載されるように実施した。付随
するエラーバーを示す。
【０２４８】
この分析の結果は、上記の基準に概略されるように、所望の表現型を有するＣＹＰ３Ａ
４−ｌｕｃ  Ｔｇマウスが、本明細書中に教示される方法によって同定され得る。
【０２４９】
当業者に明らかなように、上記実施形態の種々の改変およびバリエーションを、本発明
の精神および範囲を逸脱することなくなし得る。これらの改変およびバリエーションは、
本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２５０】
【図１−１】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−２】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−３】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−４】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−５】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−６】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−７】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−８】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−９】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１０】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１１】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１２】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１３】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１４】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１５】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１６】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１７】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１８】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−１９】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−２０】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図１−２１】図１Ａ（配列番号１２）は、マウスＣｙｐ３Ａ１１遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１２，２７５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１１，００３〜１１，００５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１０，８８４〜１０，８８７位に位置し、主要転写開始部位は、１０，９１４位のＣで開始する。Ｃｙｐ３Ａ１１遺伝子の約９．３ｋｂの領域は、図１Ａのヌクレオチド１〜９，３３０位由来であり、そして約９．３ｋｂ配列は、図１Ｂ（配列番号１３）に単独で示される。
【図２】図２は、１．６ｋｂ  Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター配列を含むｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｓベクター構築物の概略図である。
【図３】図３は、６．０ｋｂ  Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター配列を含むｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｍベクター構築物の概略図である。
【図４】図４は、９．０ｋｂ  Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター配列を含むｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｌベクター構築物の概略図である。
【図５】図５は、１．６ｋｂ  Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター配列を含むｐＢＳＳＫ−３Ａ１１Ｓベクター構築物の概略図である。
【図６】図６は、６ｋｂ  Ｃｙｐ３Ａ１１プロモーター配列を含むｐＢＳＳＫ−３Ａ１１Ｍベクター構築物の概略図である。
【図７】図７は、ｐＧＬ３−Ｉ−Ｂａｓｉｃベクター構築物の概略図である。
【図８】図８は、１０ｋｂ  ＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列を含むｐＧＬ−Ｉ−３Ａ４Ｍベクター構築物の概略図である。
【図９】図９は、１３ｋｂ  ＣＹＰ３Ａ４プロモーター配列を含むｐＧＬ−Ｉ−３Ａ４Ｌベクター構築物の概略図である。
【図１０】図１０は、肝臓プッシュ（ｌｉｖｅｒ  ｐｕｓｈ）実験の結果を示す。５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｍ構築物および０μｇのｈＰＸＲプラスミドを用いて、ＦＶＢマウスを肝臓プッシュさせた。
【図１１】図１１パネルＡ〜Ｄは、５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｍと同時投与されるｈＰＸＲプラスミドの量を最適化するために実施した、ｈＰＸＲ力価測定実験の結果を示す。パネルＡ、０μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｍ−ｌｕｃ、パネルＢ、１μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｍ−ｌｕｃ、パネルＣ、２μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｍ−ｌｕｃ、パネルＤ、５μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｍ−ｌｕｃ。
【図１２】図１２は、肝臓プッシュ実験の結果を示す。５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｌ構築物および１μｇのｈＰＸＲプラスミドを用いて、ＦＶＢマウスを肝臓プッシュさせた。
【図１３】図１３パネルＡ〜Ｄは、５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ１１Ｌと同時投与されるｈＰＸＲプラスミドの量を最適化するために実施した、ｈＰＸＲ力価測定実験の結果を示す。パネルＡ、０μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｌ−ｌｕｃ、パネルＢ、１μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｌ−ｌｕｃ、パネルＣ、２μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｌ−ｌｕｃ、パネルＤ、５μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ１１Ｌ−ｌｕｃ。
【図１４】図１４は、肝臓プッシュ実験の結果を示す。５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ４Ｌ構築物および０μｇのｈＰＸＲプラスミドを用いて、ＦＶＢマウスを肝臓プッシュさせた。
【図１５】図１５は、肝臓プッシュ実験の結果を示す。５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ４Ｌ構築物および１μｇのｈＰＸＲプラスミドを用いて、ＦＶＢマウスを肝臓プッシュさせた。
【図１６】図１６パネルＡ〜Ｄは、５μｇのｐＧＬ３−Ｉ−３Ａ４Ｌと同時投与されるｈＰＸＲプラスミドの量を最適化するために実施した、ｈＰＸＲ力価測定実験の結果を示す。パネルＡ、０μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ４Ｌ−ｌｕｃ、パネルＢ、１μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ４Ｌ−ｌｕｃ、パネルＣ、２μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ４Ｌ−ｌｕｃ、パネルＤ、５μｇ  ｈＰＸＲ＋５μｇ  ３Ａ４Ｌ−ｌｕｃ。
【図１７−１】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−２】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−３】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−４】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−５】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−６】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−７】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−８】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−９】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１０】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１１】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１２】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１３】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１４】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１５】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１６】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１７】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１８】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−１９】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−２０】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−２１】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１７−２２】図１７Ａ（配列番号１４）は、ヒトＣｙｐ３Ａ４遺伝子座由来の転写制御エレメントのヌクレオチド配列を含む。この図において、配列は、合計１３，０３５ヌクレオチドを示し、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は、１３，０３３〜１３，０３５位に位置し、ＴＡＴＡボックスは、１２，９０１〜１２，９０４位に位置し、主要転写開始部位は、１２，９３０位のＡで開始する。Ｃｙｐ３Ａ４遺伝子の約２．５ｋｂの領域は、本明細書中に記載されるように発現を促進するのに有用であり、図１７Ａのヌクレオチド１〜２，４６１位由来であり、そして約２．５ｋｂ配列は、図１７Ｂ（配列番号１５）に単独で示される。図１７Ｃ（配列番号１７）は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）マウスを作製するために使用されるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃのトランスジーンの配列全体を示す。
【図１８】図１８は、マウスゲノムにおいてＣｙｐ３Ａ１１コード配列の５’側に位置する約９．３ｋｂプロモーター領域配列の概略図を示す。図は、２つの公知のファミリー由来の反復エレメントのおよその位置を示す。
【図１９】図１９は、ヒトゲノムにおいてＣｙｐ３Ａ１１コード配列の５’側に位置する約１３ｋｂプロモーター領域配列の概略図を示す。図は、２つの公知のファミリー由来の反復エレメントのおよその位置を示す。
【図２０】図２０は、ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ  ＴｇマウスのＰＣＲスクリーニングの代表的な結果を示す。
【図２１】図２１は、ＦＶＢ／Ｎ−ＴｇＮ（ＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃ）についての代表的なサザンハイブリダイゼーション分析を示す。
【図２２】図２２パネルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、Ｔｇ  ＦｖＢマウスの＃８２系統におけるＣＹＰ３Ａ４−ｌｕｃの発現に対する生体異物の効果の代表的な結果を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図１−１８】
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【図１−１９】
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【図１−２０】
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【図１−２１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１７−６】
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【図１７−７】
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【図１７−８】
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【図１７−９】
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【図１７−１０】
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【図１７−１１】
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【図１７−１２】
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【図１７−１３】
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【図１７−１４】
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【図１７−１５】
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【図１７−１６】
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【図１７−１７】
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【図１７−１８】
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【図１７−１９】
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【図１７−２０】
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【図１７−２１】
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【図１７−２２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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