(57)【要約】【課題】標的細胞内に医薬品が取り込まれるのに必要な時間だけ血中に滞留し、正常細胞に対して副作用を誘発するほど長い時間の血中滞留性を有しない適切な血中滞留性を示し、標的とする細胞への薬剤の輸送効率の高いリポソーム製剤、および当該リポソーム製剤の作製に有用な新規合成リン脂質を提供する。【解決手段】下記一般（１）2008063249.tif 000012（式中、Ｘは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−を示し、Ｒ1はアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｍは１〜１０の整数を示す）で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体またはその塩。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
【化１】
2008063249.tif 000007
（式中、Ｘは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−を示し、Ｒ1はアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｍは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体またはその塩。
【請求項２】
Ｒ2およびＲ3がそれぞれ独立して飽和または不飽和脂肪酸に由来する総炭素数１２〜２２のアシル基である請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｍが、２〜４の整数である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｘが−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ1がアルキル基またはアリール基である請求項１〜３のいずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｘが−Ｏ−であり、Ｒ1がアルキル基である請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物。
【請求項６】
下記一般式（１）
【化２】
2008063249.tif 000008
（式中、Ｘは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−を示し、Ｒ1はアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｍは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体またはその塩および他のリン脂質を含有する脂質組成物。
【請求項７】
Ｒ2およびＲ3がそれぞれ独立して飽和または不飽和脂肪酸に由来する総炭素数１２〜２２のアシル基である請求項６記載の脂質組成物。
【請求項８】
ｍが２〜４の整数である請求項６または７記載の脂質組成物。
【請求項９】
Ｘが−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ1がアルキル基またはアリール基である請求項６〜８のいずれか１項記載の脂質組成物。
【請求項１０】
Ｘが−Ｏ−であり、Ｒ1がアルキル基である請求項６〜９のいずれか１項記載の化合物。
【請求項１１】
他のリン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロールから選ばれるものである請求項６〜１０のいずれか１項記載の脂質組成物。
【請求項１２】
さらに他の中性脂質を含有する請求項６〜１１のいずれか１項記載の脂質組成物。
【請求項１３】
他の中性脂質がコレステロールおよびその誘導体から選ばれるものである請求項１２記載の脂質組成物。
【請求項１４】
さらに下記一般式（２）
【化３】
2008063249.tif 000009
（式中、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体またはその塩を含有する請求項１２または１３に記載の脂質組成物。
【請求項１５】
Ｒ4およびＲ5がそれぞれ独立して飽和または不飽和脂肪酸に由来する総炭素数１２〜２２のアシル基である請求項１４記載の脂質組成物。
【請求項１６】
ｎが２〜４の整数である請求項１４または１５記載の脂質組成物。
【請求項１７】
式（２）のホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体の少なくとも一部に生体内標的因子が結合している請求項１４〜１６のいずれか１項記載の脂質組成物。
【請求項１８】
生体内標的因子がトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、抗体および抗体のフラグメントから選ばれるものである請求項１７記載の脂質組成物。
【請求項１９】
生体内標的因子がトランスフェリンである請求項１８記載の脂質組成物。
【請求項２０】
下記一般式（１）
【化４】
2008063249.tif 000010
（式中、Ｘは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−を示し、Ｒ1はアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｍは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体またはその塩を含有するリポソーム。
【請求項２１】
Ｒ2およびＲ3がそれぞれ独立して飽和または不飽和脂肪酸に由来する総炭素数１２〜２２のアシル基である請求項２０記載のリポソーム。
【請求項２２】
ｍが２〜４の整数である請求項２０または２１記載のリポソーム。
【請求項２３】
Ｘが−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ1がアルキル基またはアリール基である請求項２０〜２２のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項２４】
Ｘが−Ｏ−であり、Ｒ1がアルキル基である請求項２０〜２３のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項２５】
さらに他のリン脂質を含有する請求項２０〜２４のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項２６】
他のリン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロールから選ばれるものである請求項２５記載のリポソーム。
【請求項２７】
さらに他の中性脂質を含有する請求項２５または２６に記載のリポソーム。
【請求項２８】
他の中性脂質がコレステロールおよびその誘導体から選ばれるものである請求項２７記載のリポソーム。
【請求項２９】
さらに下記一般式（２）
【化５】
2008063249.tif 000011
（式中、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｎは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体を含有する請求項２７または２８に記載のリポソーム。
【請求項３０】
Ｒ4およびＲ5がそれぞれ独立して飽和または不飽和脂肪酸に由来する総炭素数１２〜２２のアシル基である請求項２９記載のリポソーム。
【請求項３１】
ｎが２〜４の整数である請求項２９または３０記載のリポソーム。
【請求項３２】
式（２）のホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体の少なくとも一部に生体内標的因子が結合している請求項２９〜３１のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項３３】
生体内標的因子がトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、抗体および抗体のフラグメントから選ばれるものである請求項３２記載のリポソーム。
【請求項３４】
生体内標的因子がトランスフェリンである請求項３３記載のリポソーム。
【請求項３５】
薬剤、核酸または不活性ガスを内封してなる請求項２０〜３４のいずれか１項記載のリポソーム。
【請求項３６】
薬剤が医療用薬剤または診断用薬剤である請求項３５記載のリポソーム。
【請求項３７】
医療用薬剤が抗腫瘍性物質である請求項３６記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なホスファチジルエタノールアミン誘導体およびこれを含有するリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品が正常細胞に及ぼす副作用を軽減させるため、また不安定な医薬品を標的とする細胞へ輸送し、到達するまでの工程を保護するために、医薬品をリポソーム中に封入して投与する試みが広く検討されている。
【０００３】
しかしながら、初期のリポソームは、卵黄リン脂質および大豆リン脂質等の天然に存在する細胞膜のリン脂質が用いられ、静脈内投与では肝臓、脾臓などの細網内皮系に取り込まれやすく、血中滞留性が低いという問題があった。
その後、この問題を解決する手段として、リポソーム膜構成成分として脂質部分が飽和結合のみである合成リン脂質等が用いられ、さらにリポソーム表面をポリエチレングリコールで修飾したリポソーム（ＰＥＧリポソーム）が開発され、細網内皮系回避可能な血中滞留性の高い画期的なリポソームとして脚光を浴びるようになった。しかしながら、血中滞留性を高くすることにのみ注力するあまり、それによる副作用（例えば、ドキシル（ドキソルビシンのリポソーム製剤）における末梢系の副作用であるハンド・フット・シンドローム等）（ドキシル添付文書）が問題視されている。
【０００４】
リポソームは、リポソーム中への医薬品の取り込み、このようなリポソーム製剤自体の安定性、適切な血中滞留性および標的細胞への効率的な輸送の点で、更なる改良が求められているのが現状である。
【０００５】
また、医薬品の送達に有用な、ホスファチジルエタノールアミンにジカルボン酸が結合した合成ホスホリピッド化合物が報告されているが（特許文献１）、同公報に記載の化合物は実質的にポリアルキレングリコール部分を有するものであり、上記した副作用の問題が懸念される。
【特許文献１】特開昭５９−２０４１９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、標的細胞内に医薬品が取り込まれるのに必要な時間だけ血中に滞留し、正常細胞に対して副作用を誘発するほど長い時間の血中滞留性を有しない適切な血中滞留性を示し、標的とする細胞への薬剤の輸送効率の高いリポソーム製剤、および当該リポソーム製剤の作製に有用な新規合成リン脂質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討を重ねた結果、後記一般式（１）で表される特定のホスファチジルエタノールアミン誘導体が、リポソーム表面電荷の偏りを緩和し得ることから、前記リポソーム製剤用合成リン脂質として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、下記一般式（１）
【０００９】
【化１】
2008063249.tif 000002
【００１０】
（式中、Ｘは−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−を示し、Ｒ1はアルキル基、シクロアルキル基またはアリール基を示し、Ｒ2およびＲ3はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｍは１〜１０の整数を示す）
で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体またはその塩、およびこれを含有するリポソームを提供するものである。
また本発明は、上記ホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）および他のリン脂質を含有する脂質組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明にかかる新規なリン脂質を用いたリポソームは、抗癌剤等の医薬品を含有し、保存安定性が高く、投与された場合に標的とする腫瘍細胞への薬剤の輸送効率が高く、かつ標的細胞に医薬品が取り込まれるのに必要なだけ血中に滞留し、正常細胞に対し副作用を誘発するほど長く血中に滞留性しない、適切な血中滞留性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
一般式（１）中、Ｒ1で示されるアルキル基としては、炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられ、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
シクロアルキル基としては、炭素数３〜１０のシクロアルキル基が挙げられ、具体的にはシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等が挙げられる。
アリール基としては、炭素数６〜１５のアリール基が挙げられ、具体的にはフェニル基、トリル基、キシリル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基等が挙げられる。
【００１３】
これらの置換基の中で、Ｒ1として好ましいのはアルキル基またはアリール基であり、特に好ましいのはアルキル基である。
【００１４】
また、Ｘとして好ましいのは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、特に好ましいのは−Ｏ−である。
【００１５】
Ｒ2およびＲ3で示されるアシル基としては、飽和または不飽和の脂肪酸由来のアシル基が好ましく、そのうち総炭素数１２〜２２の脂肪酸由来のアシル基がより好ましく、総炭素数１４〜２０の脂肪酸由来のアシル基が特に好ましい。これらのアシル基としての由来となる脂肪酸の具体例としては、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸、ヘンエイコサン酸、ベヘン酸等の直鎖飽和カルボン酸；２−ラウロレイン酸、リンデル酸、トウハク酸、５−ラウロレイン酸、１１−ラウロレイン酸、ツズ酸、５−ミリストレイン酸、ミリストレイン酸、２−パルミトレイン酸、７−パルミトレイン酸、ｃｉｃ−９−パルミトレイン酸、ｔｒａｎｓ−９−パルミトレイン酸、ペトロセリン酸、ペトロセリジン酸、オレイン酸、エライジン酸、アスクレビン酸、バクセン酸、ゴンドイン酸、ｔｒａｎｓ−ゴンドイン酸、エルシン酸、リノール酸、リノエライジン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、リノレン酸、リノレンエライジン酸、α−パリナリン酸、β−パリナリン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ガドレイン酸、イワシ酸、ステアリドン酸、プニカ酸、リシノール酸、リシネライジン酸等の直鎖不飽和カルボン酸が挙げられる。Ｒ2およびＲ3としては、とりわけ好ましいのはオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸に由来するアシル基である。
【００１６】
ｍは１〜１０の任意の整数を示すが、好ましくは２〜４である。
【００１７】
ホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アミン塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１８】
本発明のホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）は、例えば下記（ａ）〜（ｃ）に示すような方法にて製造することができる。
【００１９】
【化２】
2008063249.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｙは水素原子または金属原子を示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘおよびｍは前記と同じ。）
【００２１】
すなわち、一般式（３）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体と求核種（４）とを反応させることにより、本発明化合物（１）が得られる。
【００２２】
ホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体（３）は、ＵＳＰ４，５３４，８９９号に記載の方法又はこれに準じた方法により製造できる。
【００２３】
求核種（４）におけるＹとしては、水素原子、グリニヤール試薬を構成する金属（ＭｇＢｒ等）、ギルマン試薬を構成する金属（ＣｕＬｉ等）等が挙げられる。また、Ｒ1ＸＨで表される化合物としては、メタノール、エタノール等の飽和脂肪族炭化水素系アルコール；シクロヘキサノール等の飽和脂環式炭化水素系アルコール；フェノール等の芳香族炭化水素系アルコール；メチルアミン、エチルアミン等の飽和脂肪族炭化水素系アミン；シクロヘキシルアミン等の飽和脂環式炭化水素系アミン；アニリン等の芳香族炭化水素系アミン；メチルメルカプタン等の飽和脂肪族炭化水素系チオール；シクロヘキシルメルカプタン等の飽和脂環式炭化水素系チオール；チオフェノール等の芳香族炭化水素系チオール等が挙げられる。
【００２４】
本発明のホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）は、式（３）のカルボン酸化合物に対し求核種（４）を５０〜５０，０００当量、好ましくは１，０００〜５，０００当量、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶媒およびトリエチルアミン、炭酸カリウム、硫酸等の触媒の存在下、上記求核種（４）の沸点以下の温度で反応させることにより得ることができる。有機溶媒の使用量は、上記求核種（４）の半分量（体積比）程度であることが好ましく、また触媒の添加量はカルボン酸化合物（３）に対し１〜１０当量であることが好ましい。
また用いる求核種（４）によっては、まず式（３）のカルボン酸化合物を塩化チオニル、塩化ホスホリル等のハロゲン化剤を用いてハロゲン化物とし、次いでこれと求核種（４）とを反応させることにより製造することもできる。具体的には、式（３）のカルボン酸化合物に対しハロゲン化剤を２〜５当量、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶媒の存在下反応させることにより、まずカルボン酸化合物のハロゲン化物を得る。有機溶媒の使用量は、式（３）のカルボン酸化合物の１，０００〜５，０００当量が好ましい。続いてこのハロゲン化物に、求核種（４）を反応させる。具体的には、ハロゲン化物に対し求核種（４）を１〜５当量、好ましくは１．５〜２当量、クロロホルム、塩化メチレン等の有機溶媒およびトリエチルアミン、炭酸カリウム等の触媒の存在下、０℃〜室温で反応させることにより、本発明のホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）を得ることができる。有機溶媒の使用量は、式（３）のカルボン酸化合物の１，０００〜５，０００当量が好ましく、また触媒の添加量は求核種（４）に対し１〜５当量であることが好ましい。
【００２５】
【化３】
2008063249.tif 000004
【００２６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘおよびｍは前記と同じ）
【００２７】
すなわち、ホスファチジルエタノールアミン（５）にカルボン酸化合物（６）またはその無水物を反応させることにより本発明化合物（１）が得られる。
【００２８】
カルボン酸化合物（６）がカルボン酸無水物である場合は、例えばホスファチジルエタノールアミンおよびカルボン酸化合物（６）の無水物を、有機溶媒中、アルカリ触媒の存在下に反応させる。有機溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒；ヘキサン、ヘプタン等の炭化水素系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒；ジメチルエーテル、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等のエステル系溶媒等が挙げられる。係る有機溶媒は、十分に脱水する等して、活性水素を有さないか低減させたものを用いるのがより好ましい。またアルカリ触媒としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の金属水酸化物；ピリジン系化合物、ピロリジン系化合物、ピペリジン系化合物、モルホリン系化合物、アルキルアミン系化合物、ジアルキルアミン系化合物、トリアルキルアミン系化合物、アルコールアミン系化合物、ジアルコールアミン系化合物、トリアルコールアミン系化合物、Ｎ−アルキルアルコールアミン系化合物、Ｎ，Ｎ’−ジアルキルアルコールアミン系化合物、シクロアルキルアミン系化合物、ベンジルアミン系化合物、アニリン系化合物等が挙げられる。
【００２９】
例えば、ホスファチジルエタノールアミン（５）を係る有機溶媒に、約１〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは約５〜１５％ｗ／ｖの濃度となるように溶解する。次いでアルカリ触媒を、ホスファチジルエタノールアミンに対して０．１〜１０当量、好ましくは０．５〜５当量となるように加える。そしてカルボン酸化合物（６）の無水物を、ホスファチジルエタノールアミンに対して１〜１０当量、好ましくは１〜５当量となるように加える。反応温度は０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、０．５〜５時間、好ましくは１〜３時間、窒素ガス等の不活性ガスの存在下で反応させる。
【００３０】
カルボン酸化合物（６）がフリーのカルボン酸の場合は、例えばホスファチジルエタノールアミンとフリーのカルボン酸化合物（６）とを、有機溶媒の存在下、縮合剤と反応させる。有機溶媒としては、上記で説明したものと同様のものが用いられ、また縮合剤としてはＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等のカルボジイミドが使用できる。
【００３１】
具体的には、ホスファチジルエタノールアミン（５）を係る有機溶媒に、約１〜２０％ｗ／ｖ、好ましくは約５〜１５％ｗ／ｖの濃度となるように溶解する。次いで縮合剤を、ホスファチジルエタノールアミンに対して０．１〜１０当量、好ましくは０．５〜５当量となるように加える。そしてフリーのカルボン酸化合物（６）を、ホスファチジルエタノールアミンに対して１〜１０当量、好ましくは１〜５当量となるように加える。反応温度は０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃で、０．５〜５時間、好ましくは１〜３時間、窒素ガス等の不活性ガスの存在下で反応させる。なお係る反応においては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール等の縮合助剤を加えることにより、副反応を抑制することができるので好ましい。係る縮合助剤は、上記縮合剤とともに加えることができ、その添加量はホスファチジルエタノールアミンに対して０．１〜１０当量、より好ましくは０．５〜５当量である。
【００３２】
【化４】
2008063249.tif 000005
【００３３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｙおよびｍは前記と同じ）
【００３４】
すなわち、ホスファチジルエタノールアミン（５）と、ジカルボン酸誘導体（７）またはその無水物と、求核種（４）とを反応させることにより本発明化合物（１）が得られる。
【００３５】
式（７）の化合物がカルボン酸無水物の場合、ホスファチジルエタノールアミンおよび式（７）で表されるカルボン酸の無水物を、有機溶媒の存在下、アルカリ触媒と反応させる。次いでこれに求核種（４）を反応させ、目的とする化合物（１）を得ることができる。求核種（４）、有機溶媒およびアルカリ触媒は、上記反応（ａ）および反応（ｂ）にて説明したものと同様のものが挙げられ、上記反応（ａ）および反応（ｂ）にて説明した条件と同様にして反応を行うことができる。
【００３６】
式（６）の化合物がフリーのカルボン酸である場合も同様で、ホスファチジルエタノールアミンおよび式（６）で表されるフリーのカルボン酸とを、有機溶媒中、縮合剤の存在下に反応させる。次いでこれに求核種（４）を反応させ、目的とする化合物（１）を得ることができる。求核種（４）、有機溶媒および縮合剤は、上記反応（ａ）および反応（ｂ）にて説明したものと同様のものが挙げられ、上記反応（ａ）および反応（ｂ）にて説明した条件と同様にして反応を行うことができる。
【００３７】
かくして得られる式（１）で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体は、常法、例えばろ過、抽出、洗浄、乾燥、濃縮、再結晶、各種クロマトグラフィー等の手段を用いて単離、精製することができる。
【００３８】
本発明のホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）は新規な化合物であり、リン脂質の特性を生かして各種医薬品またはその原材料に適用することができる。具体的には、リポソーム等の微小粒子を構成する成分として用いることができる。以下に、具体例を挙げて説明する。
【００３９】
前記ホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）は、他のリン脂質とともに、脂質組成物を形成することができる。他のリン脂質としては特に制限はされないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはホスファチジルグリセロールであるのが好ましい。より好ましくは、ホスファチジルコリンである。ホスファチジルコリンは、天然物由来のもの、合成されたもののいずれでもよい。ホスファチジルコリンの中でも、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリンがとりわけ好ましい。
【００４０】
係る脂質組成物におけるホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）および他のリン脂質との組成比は、好ましくは１〜２０：８０〜９９（モル比）、より好ましくは２〜１０：９０〜９８（モル比）である。
【００４１】
さらに前記脂質組成物は、他の中性脂質を含むものであるのが好ましい。係る中性脂質としては、コレステロールまたはその誘導体（コレステロールプルラン、ＤＣ−コレステロール等）が挙げられ、より好ましくはコレステロールである。他の中性脂質を含む場合の脂質組成物は、ホスファチジルエタノールアミン誘導体（１）：他のリン脂質：他の中性脂質が１〜２０：３０〜７０：１０〜７０（モル比）であることが好ましく、より好ましくは２〜１０：５０〜７０：２０〜５０（モル比）である。
【００４２】
さらに前記脂質組成物は、前記式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体を含むことができる。
【００４３】
【化５】
2008063249.tif 000006
【００４４】
（式中、Ｒ4およびＲ5はそれぞれ独立してアシル基を示し、ｎは１〜１０の整数を示す）
【００４５】
Ｒ4およびＲ5で示されるアシル基としては、前記Ｒ2およびＲ3で定義したものと同様の飽和または不飽和脂肪酸に由来するアシル基が挙げられ、好ましくは総炭素数１２〜２２のアシル基である。より好ましくは、総炭素数１４〜２０のアシル基であり、とりわけ好ましいのはオレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸に由来するアシル基である。
ｎは１〜１０の任意の整数を表すが、好ましくは２〜４である。
【００４６】
なお式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体は、ＵＳＰ４，５３４，８９９号に記載の方法あるいは同方法に準じて合成することができる。
【００４７】
式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体を含む場合の脂質組成物は、式（１）の誘導体：式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体：他のリン脂質：他の中性脂質が０．８〜１６：０．２〜４：３０〜７０：１０〜７０（モル比）であることが好ましく、より好ましくは１．６〜８：０．４〜２：５０〜７０：２０〜５０（モル比）である。
【００４８】
かかる式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体は、その一部に生体内標的因子を結合させることにより、分子標的機能を付与することができる。
【００４９】
生体内標的因子は、生体内の細胞に対して指向性を有するもので、標的とする細胞表面上に存在するレセプターまたは表面抗原と結合することができる物質であれば特に制限はされないが、具体的にはトランスフェリン、葉酸、ヒアルロン酸、糖鎖、抗体（好ましくは、モノクローナル抗体）、抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ等）が挙げられ、好ましくはトランスフェリン、特に好ましくは鉄と結合しているホロ型のトランスフェリンである。なおトランスフェリンを用いる場合、トランスフェリンは精製された蛋白質として市販されているものを用いても、遺伝子組換えにより製造されたもののいずれを使用しても良い。
【００５０】
前記式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体に生体内標的因子を結合させる手段としては、好ましくは式（２）で表される誘導体の末端カルボキシル基を利用する。具体的には、式（２）で表される誘導体にＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド等のカルボジイミドを反応させ、これを介してＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）等のスクシンイミドを結合させる。次に、これを生体内標的因子と反応させると、末端カルボキシル基に生体内標的因子が結合した当該脂質誘導体を得ることができる。
【００５１】
式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体に生体内標的因子が結合したリン脂質を含む場合の脂質組成物は、式（１）の誘導体：式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体：式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体に生体内標的因子が結合したリン脂質：他のリン脂質：他の中性脂質が０．８〜１６：０．１９９８〜３．９６：０．００２〜０．０４：３０〜７０：１０〜７０（モル比）であることが好ましく、より好ましくは１．６〜８：０．３９〜１．９８：５０〜７０：２０〜５０（モル比）である。
【００５２】
本発明の他の態様においては、前記式（１）で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体を脂質成分とするリポソームを提供する。
【００５３】
リポソームは、水性の内部を有する球形の脂質二重層である。リポソームを形成する時に水性溶液中に存在する分子は、水性の内部に取り込まれる。リポソームの内容物は、外部微小環境から保護され、かつ、リポソームが細胞膜と融合するため細胞質内に効率的に輸送される。
【００５４】
かかるリポソームは、前記式（１）で表されるホスファチジルエタノールアミン誘導体を脂質成分とする限りにおいて特に制限はされないが、好ましくは他のリン脂質を含有する。かかる他のリン脂質、およびリポソーム中における組成比については、前述の脂質組成物の通りである。
さらに本発明にかかるリポソームは、他のリン脂質に加えて、他の中性脂質を含有するものがより好ましい。かかる他の中性脂質、およびリポソーム中における組成比については、前述の脂質組成物の通りである。
さらに本発明にかかるリポソームは、他のリン脂質、他の中性脂質に加えて、前記式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体を含有することができる。かかるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体、およびリポソーム中における組成比については、前述の脂質組成物の通りである。なおかかるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体は、少なくともその一部に生体内標的因子を結合させることができる。かかる生体内標的因子、およびリポソーム中における各組成比については、前述の脂質組成物の通りである。
【００５５】
本発明のリポソームは、薬剤、核酸または不活性ガスを内封し、医療用、診断用の製剤とすることができる。
薬剤としては、医療用薬剤または診断用薬剤が挙げられる。医療用薬剤としては哺乳動物の、好ましくはヒトの各種疾患に対する治療用および／または予防用として用いられるものであれば、特に制限はされないが、より好ましいのは抗腫瘍性物質、すなわち抗がん剤である。かかる抗がん剤としては、具体的にはアルキル化剤（chlorambucil、cyclophosphamide、estramustine、ifosfamide、mechlorethamine、melphalan等のナイトロジェンマスタード類；triethylenethiophosphoramide等のエチレンイミン誘導体；busulfan等のアルキススルフォネート類；carmustine、lomustine、semustine、streptozotocin等のニトロソウレア類；dacarbazine等のトリアジン類；carboplatin、cicplatin、oxaliplatin等の金属塩）、代謝拮抗剤（methotrexate、raltitrexed、trimetrexate等の葉酸類似体；azacitidine、capecitabine、cytarabine、floxuridine、fluorouracil、gemcitabine等のピリミジン類似体；mercaptopurine、thioguanine、pentostatin、cladribine、fludarabine等のプリン類似体）、天然物由来の抗がん剤（vinblastine、vincristine、vindesine、vinorelbine等の細胞分裂阻害剤；docetaxel、paclitaxel等の微小管ポリマー安定剤；irinotecan、topotecan等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；etoposide、teniposide等のトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；bleomycin、dactinomycin、daunorubicin、doxorubicin、epirubicin、idarubicin、plicamycin、mitomycin、mitoxantrone等の抗生物質；asparaginase等の酵素製剤）、ホルモンおよびホルモン拮抗剤（fluoxymesterone等のアンドロゲン類；dexamethasone、prednisone等のコルチコステロイド類；diethylstilbestrol等のエストロゲン類；megestrol acetate、medroxyprogesterone acetate等のプロゲスティン類；raloxifene、tamoxifen、toremifene等のエストロゲン拮抗剤；aminoglutethimide、anastrozole、letrozole等のアロマターゼ阻害剤；bicalutamide、flutamide、nilutamide等のアンドロゲン拮抗剤；leuprolide、goserelin等の視床下部ホルモン類似物質；levothyroxine、liothyronine等の甲状腺ホルモン類）、生物学的製剤（trastuzumab、rituximab等のモノクローナル抗体；interferon−α2a、interferon−α2b等のインターフェロン類；aldesleukin、oprelvekin等のインターロイキン類；erythropoietin、filgrastim、sargramostim等のミエロイドおよびエリスロイド刺激因子類）、hydroxyurea等の尿素誘導体、procarbazine等のメチルヒドラジン誘導体、mitotane等のアドレノコルチカル抑制剤、altretamine等のメラミン置換体、amsacrine等のアクリジン色素、pamidronate等のビスホスフォネート類、porfimer等の光増感剤、amifostine等のサイトプロテクター、anagrelide等の血小板減少剤、octreotide等のソマトスタチン類似体等が挙げられる。
【００５６】
診断用薬剤としては哺乳動物の、好ましくはヒトの各種疾患に対する診断用として用いられるものであれば、特に制限はされない。具体的には、Ｘ線造影剤（iopromide、iomeprol、iopamidol、ioversol、iohexol、ioxilan等の非イオン性モノマー型；iotrolan、iodixanol等の非イオン性ダイマー型；meglumine sodium amidotrizoate、sodium iotalamate、meglumine iotalamate等のイオン性モノマー型；ioxaglic acid、iotroxate meglumine等のイオン性ダイマー型；iodized oil等の油性剤；barium sulfate等の経口剤）、ＭＲＩ造影剤（gadodiamide hydrate、gadoteridol、meglumine gadoterate、meglumine gadopentate等の陽性造影剤；ferric ammonium citrate、ferucarbotran、ferumoxides等の陰性造影剤）、magnetite等の磁性ナノ微粒子、18F-fluorodeoxyglucose等のPET用体内診断用放射性医薬品等が挙げられる。これらの薬剤は、リポソームを構成する総脂質量当たり、３〜４００μｇ／ｍｇ（総脂質量）程度内封される。
【００５７】
核酸としては、ヌクレオシドまたはヌクレオチドがエステル結合で連なった生体高分子が挙げられ、具体的にはｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等が挙げられる。これらの核酸は、リポソームを構成する総脂質量当たり、１〜４００μｇ／ｍｇ（総脂質量）程度内封される。
【００５８】
不活性ガスとしては、例えば超音波造影剤に分野で知られているもの、具体的にはパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロブタン、パーフルオロペンタン等のパーフルオロカーボンガス；硫化ヘキサフルオライドガス；パーフルオロエーテルガス；窒素ガス；ヘリウム、アルゴン、ネオン等の希ガス等が挙げられる。
【００５９】
なお上記した薬剤または核酸は、必要に応じてトレハロース、マルトース、ショ糖、ラクトース、マンニトール、グリセロールおよびデキストロース等の糖溶液に溶解して用いることができる。かかる糖溶液の濃度は、１０重量％以下程度が好ましい。
【００６０】
本発明のリポソームは、リン脂質を適切な有機溶媒中に溶解し、これを水性溶液中に分散させて超音波処理または逆相蒸発法を行うことにより製造することができる。薬剤または核酸を含有させる場合は、リン脂質を適切な有機溶媒中に溶解し、これを薬剤または核酸を含有する水性溶液中に分散させて超音波処理または逆相蒸発法を行う。リポソームの調製には、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）（米国特許４，２３５，８７１号）のほか、単純水和法やエタノール注入法等の一般的なリポソーム作成法を用いることもできる。次に、形成されたリポソームをサイズ分画して、均一な平均粒子径を有するリポソームを調製することができる。また必要に応じてリポソーム液を濃縮してもよく、その際には限外ろ過法、超遠心分離法等が利用できる。
【００６１】
リポソームの外表面には、前述の生体内標的因子を結合させることができる。例えばかかる生体内標的因子としてトランスフェリン等のタンパク性因子を用いる場合、前記式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体の末端カルボキシル基を利用するのが好ましい。すなわちこれに、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド等のカルボジイミドを反応させ、これを介してＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓ−ＮＨＳ）等のスクシンイミドを結合させる。次に、このリンカーを付加したリポソームをトランスフェリン等のタンパク性因子と反応させると、リポソームの外表面にタンパク性因子が結合した生体内標的因子結合リポソームを得ることができる。
【００６２】
なお、式（２）で表されるホスファチジルエタノールアミンのジカルボン酸誘導体の末端カルボキシル基に、同様の方法を用いてＳ−ＮＨＳを予め結合させておき、これをリン脂質として他のリン脂質等と用いてリポソーム化した後、生体内標的因子をこれに結合させることもできる。
【００６３】
リポソーム内に不活性ガスを封入する場合は、例えば予め上記リポソームを調製しておき、これを一定の空隙を有する密封容器に入れる。当該空隙部に前述したガスを充填し、超音波処理、具体的には２０〜５０ｋＨｚの超音波を１〜５分間照射することにより、リポソーム内部の水溶液と不活性ガスとが置換し、ガス封入リポソームを容易にかつ安定して調製することができる。
【００６４】
かくして得られる薬剤を内封する本発明のリポソームは、薬学的に許容される担体とともに、製剤化して用いることができる。かかるリポソーム製剤は、好ましくは腫瘍を治療するための医薬組成物として用いられる。対象となる腫瘍は特に制限はされないが、具体的には白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫等の非固形腫瘍；また胆管、骨、膀胱、脳／ＣＮＳ、乳房、結直腸、子宮内膜、胃、頭頸部、肝臓、肺、神経細胞、食道、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓、皮膚、精巣、甲状腺、子宮、膣等の癌に代表される固形腫瘍が挙げられる。
薬学的に許容される担体としては、滅菌水、緩衝液および食塩水を用いることができる。製剤には、さらに、種々の塩類、糖類、蛋白質、澱粉、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコール等を含んでいてもよい。かかるリポソーム製剤は、ボーラス注射または連続注入により非経口的に投与することができる。投与量は、投与経路、症状の重篤度、患者の年齢および状態、副作用の程度等により様々でありうるが、通常は１０〜１００ｍｇ／ｍ2／日の範囲である。
【００６５】
診断用薬剤または不活性ガスを内封した場合のリポソームは、Ｘ線画像診断用、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）用、超音波画像診断用、核医学画像診断用として、薬学的に許容される担体とともに診断用組成物として用いることができる。薬学的に許容される担体としては、上記したものと同様のものが用いられる。かかる診断用組成物は、ボーラス注射または連続注入により非経口的に投与することができる。投与量は、投与経路、症状の重篤度、患者の年齢および状態、副作用の程度等により様々でありうるが、通常は１０〜１００ｍｇ／ｍ2／日の範囲である。
【００６６】
また核酸を内封する場合のリポソームも同様に、薬学的に許容される担体とともに組成物として用いることができる。薬学的に許容される担体としては、上記したものと同様のものが用いられる。かかる組成物は、ボーラス注射または連続注入により非経口的に投与することができる。投与量は様々でありうるが、通常は１０〜１００ｍｇ／ｍ2／日の範囲である。
【実施例】
【００６７】
以下に実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限
定するものではない。
【００６８】
実施例１
Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンのメチルエステルの合成
３００ｍＬナス型フラスコに、Ｎ−グルタリル−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（日本油脂（株）製）２．５ｇおよび攪拌子を入れ、これにクロロホルム、メタノールをそれぞれ７５ｍＬずつ加えた。１Ｎ硫酸を１５ｍＬ加えた後、６０℃で２４時間加熱還流させながらエステル化反応を行った。ＴＬＣ（展開層としてクロロホルム：メタノール：蒸留水＝７０：３０：２を使用）にて反応の終了を確認した後、フラスコを室温に戻し、攪拌子を取り出して約１００ｍＬになるまでロータリー・エバポレーター（ＥＹＥＬＡ製，Ｎ−１０００Ｖ）で濃縮した。
【００６９】
これを２００ｍＬ分液ロートに移し、蒸留水７０ｍＬおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬを加えて振とうし、下層のみを３００ｍＬナス型フラスコに取り出した。ロートの残液（上層）にクロロホルムおよびメタノールをそれぞれ２５ｍＬずつ加え、蒸留水７０ｍＬおよび飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３０ｍＬを加えて振とうし、同様に下層のみを３００ｍＬナス型フラスコに取り出した。この操作を３回繰返し、ＴＬＣ（展開層としてクロロホルム：メタノール：蒸留水＝７０：３０：２を使用）にて水層に目的とするエステル化合物が存在しないことを確認し、抽出した有機層のｐＨを測定し（ｐＨは約３）、ロータリー・エバポレーター（ＥＹＥＬＡ製，Ｎ−１０００Ｖ）で濃縮乾燥した。
【００７０】
直径３ｃｍ、高さ３０ｃｍのオープンカラムに、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ製，Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０Ｆ254，層の厚さ：０．２ｍｍ）をクロロホルムを用いながら高さ１５ｃｍまで充填した。濃縮乾燥させた化合物に３〜５ｍＬのクロロホルムを加えて溶解させ、これをシリカゲル・カラムに供した。１００ｍＬのクロロホルムを通液し、これを１つのフラクションとして採取した後、クロロホルム：メタノール＝１０：１の展開溶媒を通液し、５００ｍＬ分のフラクション（２０ｍＬずつ）に採取して、ＴＬＣ（展開層としてクロロホルム：メタノール：蒸留水＝７０：３０：２を使用）にてスポットを確認した。３００ｍＬ目のフラクションから目的とするエステル化合物が確認されたので、採取および濃縮を繰り返した。
【００７１】
クロロホルム：メタノール＝５：１の展開溶媒を通液し、１０００ｍＬ分のフラクション（２０ｍＬずつ）に採取して、ＴＬＣ（展開層としてクロロホルム：メタノール：蒸留水＝７０：３０：２を使用）にてスポットを確認した。
【００７２】
採取、濃縮したサンプルをクロロホルムに溶解させた後、予め重量を量ったナス型フラスコに移して、ロータリー・エバポレーター（ＥＹＥＬＡ製，Ｎ−１０００Ｖ）で濃縮した。これを終夜真空乾燥させ、２５０ｍｇの目的とするエステル化合物を得た。
重クロロホルム溶液にて 1Ｈ−ＮＭＲを測定した結果を、図１に示す。
【００７３】
実施例２
リポソーム製剤の製造例
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ：日本油脂（株）製）９１ｍｇ、コレステロール（Ｓｏｌｖｅｙ製）２５ｍｇおよび上記実施例１で合成したエステル化合物９ｍｇ（以上、モル比で６２：３３：５）を、１３．５ｍＬの容量の褐色バイアルに入れた。これにエタノール５００μＬを加えて６０℃で１５分間攪拌した後、３００ｍＭ  炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．９）を４．５ｍＬ加え、同様に６０℃で１５分間攪拌した。
【００７４】
エクストルーダー（ＮＬＩ製，Ｔ−００２）に、１００ｎｍメンブレンフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ製，Ｔｒａｃｋ−Ｅｔｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を３枚重ねでセットし、これを用いて上記混合物を６０℃でサイジングした。サイジングしたリポソーム溶液を、１４５ｍＭの塩化ナトリウム溶液で限外ろ過（１０倍量洗浄、５０ｍＬ）した後、７ｍＬまで濃縮した。
【００７５】
濃縮物をＰＢＳ（２５ｍＭ  リン酸緩衝液および１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）に溶解し、ＱＥＬＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ製，ｎａｎｏ−ＺＳ）で粒子径分布を測定したところ、平均粒子径は１１９ｎｍであった（ＰＤＩ  ０．０５３，Ｚ−ａｖｅ−４６．８）。
【００７６】
これに２２０ｍＭのメトトレキセート溶液（Ｈｅｕｍａｎｎ  ＰＣＳ製。ＮａＯＨおよびＨＣｌを用いて溶解させ、ｐＨ６．９に調製したもの）３ｍＬを加え、６０℃で２日間攪拌した。１４５ｍＭの塩化ナトリウム溶液で限外ろ過（１０倍量洗浄、１００ｍＬ）し、メトトレキセートを内封するリポソーム製剤を得た。
【００７７】
高速液体クロマトグラフィーを用いて、ＤＳＰＣ（検出器（ＵＶ）：（株）日立製作所製，Ｌ−２４００／Ｌ−２４２０）およびメトトレキセート（検出器（ＰＡＤ／ＤＡＤ）：（株）日立製作所製，Ｌ−２４５０）を定量したところ、１６μｇ−メトトレキセート／１ｍｇ−ＤＳＰＣであった。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】実施例１で得られたリン脂質の 1Ｈ−ＮＭＲチャートを示す。
【図１】
2008063249.tif 000013