(57)【要約】【課題】本発明は、ＣＲＦ２ファミリーの新規メンバー、それをコードするポリヌクレオチド配列、および、その新規メンバーに結合する抗体、ならびにこれらの誘導体、改変体および変異体を提供することを、課題とする。【解決手段】上記課題は、単離された新規のＣＲＦ２−１２ポリヌクレオチドおよびこのＣＲＦ２−１２ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを提供することによって、解決された。ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体あるいはＣＲＦ２−１２ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体の任意の誘導体（融合誘導体も含む）、改変体、変異体もまた、提供される。本発明はさらに、ＣＲＦ２−１２ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体が、広範囲の病理学的状態の検出および処置において、ならびに他の使用のために利用される、方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸２１〜６６を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分
子、または該核酸分子の相補体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸およびポリペプチドに関し、より詳細には、ＩＩ型サイトカイ
ンレセプターおよび２型サイトカインレセプターの細胞外対応物をコードする核酸および
ポリペプチド、ならびにこのポリペプチドおよびポリヌクレオチドを産生するためのベク
ター、宿主細胞、抗体、および組換え方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
サイトカインは、多くの細胞型の増殖および分化に影響を与える可溶性タンパク質であ
る。これらのレセプターは、１つ以上の内在性膜タンパク質からなり、これらのレセプタ
ーは、このサイトカインに高親和性で結合し、そして特定のレセプターサブユニットの細
胞質部分を介してこの細胞への結合事象を伝達する。サイトカインレセプターは、これら
の細胞外リガンド結合ドメインの類似性に基づきいくつかのクラスに分類されてきた。例
えば、インターフェロン（ＩＦＮ）の結合および／またはその効果の伝達を担うレセプタ
ー鎖は、２型サイトカインレセプターファミリー（ＣＲＦ２）のメンバーであり、これら
は、特徴的な２００〜２５０残基の細胞外ドメインに基づく。インビボで示されたこれら
のインターフェロンの活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト、およびサイ
トカインアンタゴニストの臨床的な潜在能力を示し、そしてそれらを必要とする。
【０００３】
ＣＲＦ２ファミリーのメンバーが、種々のサイトカイン（インターフェロンα、インタ
ーフェロンβ、インターフェロンγ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２２を含む
）のレセプターとして作用することが、報告されている。最近同定されたＣＲＦ２ファミ
リーのメンバーは、ＩＬ−１０様分子であるＩＬ−１９、ＡＫ１５５およびｍｄａ−７に
ついての候補リガンドである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ＣＲＦ２ファミリーの新規メンバーをコードするポリヌクレオチド配列の発
見に一部基づく。
本発明は、以下を提供する：
（項目１）  配列番号２のアミノ酸２１〜６６を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、または該核酸分子の相補体。
（項目２）  前記分子が、配列番号２または配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、項目１に記載の核酸分子。
（項目３）  配列番号２のアミノ酸２１〜６６、または配列番号２のアミノ酸配列に対する１つ以上のアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、あるいは該核酸分子の相補体。
（項目４）  １つ以上の前記アミノ酸置換が、保存的アミノ酸置換である、項目３に記載の核酸分子。
（項目５）  配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
（項目６）  前記核酸が、配列番号１１を含む、項目５に記載の核酸分子。
（項目７）  前記核酸が、配列番号１のヌクレオチド６２〜１９７を含む、項目１に記載の核酸分子。
（項目８）  配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１の、少なくとも９個の連続するヌクレオチドを含む、１００未満のヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド。
（項目９）  項目１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
（項目１０）  項目９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目１１）  項目１に記載の核酸分子および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
（項目１２）配列番号２または配列番号１２のアミノ酸２１−６６を含む、実質的に精製されたポリペプチド。
（項目１３）  前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、または配列番号６のアミノ酸配列を含む、項目１２に記載のポリペプチド。
（項目１４）  非ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに作動可能に連結した、項目１２に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
（項目１５）  前記非−ＣＲＦ２−１２ポリペプチドが、免疫グロブリン分子またはＦＬＡＧエピトープのＦｃ領域、ＨＩＳタグ、およびＭＹＣタグからなる群より選択される少なくとも１つのメンバーを含む、項目１４に記載の融合ポリペプチド。
（項目１６）  項目１２に記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
（項目１７）  項目１２に記載のポリペプチドに選択的に結合する、抗体。
（項目１８）  １つ以上の容器中に、ＣＲＦ２−１２核酸、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドおよびＣＲＦ２−１２ポリペプチドに対する抗体からなる群より選択される化合物を含む、キット。
（項目１９）  ポリペプチドを生成する方法であって、該方法が、項目１に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で、該核酸分子を含む細胞を培養する工程を包含する、方法。
（項目２０）  サンプル中の項目１に記載の核酸分子の存在を検出する方法であって、該方法が、該サンプルを、該核酸分子に選択的に結合する核酸プローブまたはプライマーと接触させる工程、ならびに該核酸プローブまたはプライマーが、該サンプル中に存在する項目１に記載の核酸分子に結合したか否かを決定する工程を包含する、方法。
（項目２１）  サンプル中の項目１２に記載のポリペプチドの存在を検出する方法であって、該方法が、該ポリペプチドと、該ポリペプチドと選択的に結合する化合物との間の複合体の形成を可能にする条件下で、該サンプルを該化合物と接触させる工程、および該複合体を検出する工程、それによって該複合体が存在する場合、該サンプル中の該ポリペプチドを同定する工程を包含する、方法。
（項目２２）  項目１２に記載のポリペプチドの活性を調節する工程であって、該方法が、該ポリペプチドを含む細胞サンプルを、該ポリペプチドに結合する、ポリペプチドの活性を調節するに十分な量の化合物と接触させる工程を包含する、方法。
（項目２３）  生物学的サンプル中でのインターロイキン−２２の活性を調節する方法であって、該方法が、該生物学的サンプルを、該サンプル中のＩＬ−２２の活性を阻害するに十分な量の項目１２に記載のポリペプチドと接触させる工程を包含する、方法。
（項目２４）  前記生物学的サンプルが、インビボで提供される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）  サイトカインが媒介する免疫障害に対する活性または潜伏のモジュレーター、あるいはサイトカインが媒介する免疫障害に対する疾病素質についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
試験化合物を項目１２に記載のポリペプチドと接触させる工程；および
該試験化合物が該ポリペプチドに結合するかどうかを決定する工程、
を包含し、ここで、該試験化合物の該ポリペプチドへの結合は、試験化合物が、サイトカインが媒介する免疫障害に対する活性または潜伏のモジュレーター、あるいはサイトカインが媒介する免疫障害に対する疾病素質であることを示す、方法。
（項目２６）  サイトカインが媒介する免疫障害に対する活性または潜伏のモジュレーター、あるいはサイトカインが媒介する免疫障害に対する疾病素質についてスクリーニングするための方法であって、該方法は、以下：
試験化合物を、該免疫障害に罹患している試験動物または該免疫障害に対する危険性の増加した試験動物に投与する工程であって、ここで該試験動物が、項目１に記載の核酸配列によってコードされるポリペプチドを組換え的に発現する、工程；
該試験動物における該ポリペプチドの活性の発現を測定する工程；
コントロール動物における該ポリペプチドの活性を測定する工程であって、ここで該コントロール動物が、該ポリペプチドを組換え的に発現し、かつ該免疫障害に対する危険性が増加していない、工程；および
該試験動物および該コントロール動物における該ポリペプチドの発現を比較する工程
を包含し、
ここで、該コントロール動物に対する、該試験動物における該ポリペプチドの活性における変化は、該試験化合物が該免疫障害の潜伏のモジュレーターであることを示し、そしてここで、該サイトカインが媒介する免疫障害は、自己免疫障害、Ｔリンパ球関連障害、細胞増殖障害、免疫分化障害、および免疫不全障害からなる群より選択される、
方法。
（項目２７）  項目２６に記載の方法であって、ここで前記試験動物が、組み換え試験動物であり、該試験動物は、試験タンパク質導入遺伝子を発現するか、またはプロモーターの制御下で該導入遺伝子を、野生型試験動物に対して増加したレベルで発現し、ここで、該プロモーターが、該導入遺伝子のネイティブの遺伝子プロモーターではない、方法。
（項目２８）  被験体における、項目１２に記載のポリペプチドの変化したレベルに関連する疾患に対する疾病素質の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該被験体由来のサンプル中の該ポリペプチドの量を定量する工程；および
ｂ）工程（ａ）での該ポリペプチドの量を、コントロールサンプル中に存在する該ポリペプチドの量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプル中の該ポリペプチドのレベルと比較する場合、工程（ａ）での該ポリペプチドのレベルの変化は、該被験体における該疾患に対する該疾病素質の存在を示す、方法。
（項目２９）  前記被験体が、ヒトである、項目２８に記載の方法。
（項目３０）  被験体における、項目１に記載の核酸分子の変化したレベルに関連する疾患に対する疾病素質の存在を決定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）該被験体由来のサンプル中の該核酸の量を定量する工程；および
ｂ）工程（ａ）での該核酸の量を、コントロールサンプル中に存在する該核酸の量と比較する工程、
を包含し、ここで、該コントロールサンプル中の該核酸レベルと比較する場合、工程（ａ）での該核酸のレベルの変化は、該被験体における該疾患に対する該疾病素質の存在を示す、方法。
（項目３１）  前記被験体が、ヒトである、項目３０に記載の方法。
（項目３２）  サイトカインが媒介する障害に関連する病理学的状態を処置または予防するための方法であって、該方法が、項目１２に記載のポリペプチドを、病理学的状態を緩和または予防するために十分な量で、被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３３）  前記被験体が、ヒトである、項目３２に記載の方法。
（項目３４）  免疫障害に関連する病理学的状態を処置または予防するための方法であって、該方法が、項目１に記載の核酸を、病理学的状態を処置または予防するために十分な量で、被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３５）  前記被験体が、ヒトである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）  病理学的状態を処置または予防するための方法であって、該方法が、項目１６に記載の抗体を、病理学的状態を緩和するかまたは予防するために十分な量で、被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３７）  前記被験体が、ヒトである、項目３６に記載の方法。
（項目３８）  被験体において、慢性関節リウマチを処置する方法であって、該方法が、該被検体におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を調節する薬剤を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目３９）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２核酸またはＣＲＦ２−１２ポリペプチドである、項目３８に記載の方法。
（項目４０）  前記被験体が、ヒトである、項目３８に記載の方法。
（項目４１）  前記薬剤が、前記被検体における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を増加させる、項目３８に記載の方法。
（項目４２）  前記薬剤が、前記被検体における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を減少させる、項目３８に記載の方法。
（項目４３）  前記薬剤が、抗ＣＲＦ２−１２抗体である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）  被験体において、多発性硬化症を処置する方法であって、該方法が、該被検体におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を調節する薬剤を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目４５）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２核酸またはＣＲＦ２−１２ポリペプチドである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）  前記被験体が、ヒトである、項目４４に記載の方法。
（項目４７）  前記薬剤が、前記被検体における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を増加させる、項目４４に記載の方法。
（項目４８）  前記薬剤が、前記被検体における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を減少させる、項目４４に記載の方法。
（項目４９）  前記薬剤が、抗ＣＲＦ２−１２抗体である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）  血管平滑筋細胞の増殖を調節する方法であって、該方法が、血管平滑筋細胞を、該細胞におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を調節する薬剤と接触させる工程を包含する、方法。
（項目５１）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２核酸またはＣＲＦ２−１２ポリペプチドである、項目５０に記載の方法。
（項目５２）  前記薬剤が、前記血管平滑筋細胞における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を増加させる、項目５０に記載の方法。
（項目５３）  前記薬剤が、前記血管平滑筋細胞における前記ＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を減少させる、項目５０に記載の方法。
（項目５４）  前記薬剤が、抗ＣＲＦ２−１２抗体である、項目５０に記載の方法。
（項目５５）  前記細胞が、被験体においてインビボで提供される、項目５０に記載の方法。
（項目５６）  前記被験体が、ヒトである、項目５０に記載の方法。
（項目５７）  被験体において、炎症を処置または予防する方法であって、該方法が、該被検体におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を調節する薬剤を、該被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目５８）  前記被験体が、ヒトである、項目５７に記載の方法。
（項目５９）  前記薬剤が、前記被検体におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を増加させる、項目５７に記載の方法。
（項目６０）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドである、項目５９に記載の方法。
（項目６１）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２核酸である、項目５９に記載の方法。
（項目６２）  前記薬剤が、前記被検体におけるＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を減少させる、項目５７に記載の方法。
（項目６３）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２抗体である、項目６２に記載の方法。
（項目６４）  前記薬剤が、ＣＲＦ２−１２アンチセンス核酸である、項目６２に記載の方法。
【０００５】
従って、１つの局面において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、もし
くは配列番号１１の配列、またはそれらのフラグメント、ホモログ、または誘導体を含む
単離された核酸分子を提供する。この核酸としては、例えば、配列番号２、、配列番号４
、配列番号６、または配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと少なくとも７０
％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％以上）同一なポリ
ペプチドをコードする核酸配列を含み得る。核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡフラグメント
、またはｃＤＮＡ分子であり得る。
【０００６】
いくつかの実施形態において、この核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、ま
たは配列番号１１を含む配列の５’側に５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレ
オチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチ
ド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオ
チド、または１５００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、この核酸は、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１を含む配列の３’側に５ヌク
レオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド
、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド
、７５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、または１５００ヌクレオチドを含む。他
の実施形態において、この核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番
号１１を含む配列の５’側および３’側に５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌク
レオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオ
チド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、１０００ヌクレ
オチド、または１５００ヌクレオチドを含む。
【０００７】
配列番号２のアミノ酸配列２１〜６６を含むポリペプチドをコードする核酸（例えば、
配列番号１の核酸６２〜１９７）もまた、本発明の範囲内にある。そのような核酸分子の
例としては、配列番号２、配列番号４、配列番号６のアミノ酸配列を有するポリペプチド
をコードする核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号３、または配列番号５を含む核酸
配列）が挙げられる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＲＦ２−１２核酸は、ポリペプチドをコード
し、この核酸は、以下のポリペプチド配列の１つ以上を含むポリペプチドをコードする：
ＭＭＰＫＨＣＬ／ＦＬＧＬ／ＦＬＩ（配列番号１３）、ＦＱＳＲＮＦＨＮＩＬＨ／ＱＷＱ
Ａ／ＰＧ（配列番号１４）、ＳＩ／ＶＹＦＶＱＹＫＭ／ＩＹＧＱＳ／ＲＱＷ（配列番号１
５）、ＴＰＲＦＴＰＷＷＥＴＫＬ／ＩＤＰＰＶ（配列番号１６）、ＬＶ／ＬＹＲＶＦＴ／
ＩＩＮＮＳＬＥＫＥＱＫＡ／ＶＹＥＧ（配列番号１７）、ＲＡＶＥＩＥＧ／ＡＬＩ／ＴＰ
ＨＳＳＹＣＶＶＡＥＭ／ＩＹＱＰＭ（配列番号１８）、およびＤＲＲＳＰ／ＱＲＳＫ／Ｅ
ＥＲＣＶＱ／ＥＩＰ（配列番号１９）。
【０００９】
いくつかの実施形態において、この核酸は、配列番号２のアミノ酸配列２１〜６６を含
むポリペプチドをコードする配列の５’側に、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５
ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌク
レオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、１０００ヌ
クレオチド、または１５００ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、この核
酸は、配列番号２のアミノ酸２１〜６６をコードする配列の３’側に、５ヌクレオチド、
１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌ
クレオチド、１５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオチド、５００ヌクレオチド、７５０ヌ
クレオチド、１０００ヌクレオチド、または１５００ヌクレオチドを含む。いくつかの実
施形態において、この核酸は、配列番号２のアミノ酸２１〜６６をコードする配列の５’
側および３’側に、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、２５ヌクレ
オチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２５０ヌクレオ
チド、５００ヌクレオチド、７５０ヌクレオチド、１０００ヌクレオチド、または１５０
０ヌクレオチドを含む。
【００１０】
本明細書中に記載される１つ以上の核酸を含むベクター、およびこのベクターまたは本
明細書中に記載される核酸を含む細胞もまた本発明に含まれる。
【００１１】
本発明はまた、任意の上記の核酸分子を含むベクターを用いて形質転換された宿主細胞
に関する。
【００１２】
別の局面において、本発明は、ＣＲＦ２−１２核酸および薬学的に受容可能なキャリア
または希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、実質的に精製されたＣＲＦ２−１２ポリペプチド（
例えば、ＣＲＦ２−１２核酸によってコードされる任意のＣＲＦ２−１２ポリペプチド）
ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体を含む。本発明はま
た、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドならびに薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈剤を含
む薬学的組成物を含む。
【００１４】
なおさらなる局面において、本発明は、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに特異的に結合す
る抗体を提供する。この抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体
、ならびにそれらのフラグメント、ホモログ、アナログ、および誘導体であり得る。本発
明はまた、ＣＲＦ２−１２抗体ならびに薬学的に受容可能なキャリアおよび希釈剤を含む
薬学的組成物を含む。本発明はまた、上記の任意の核酸分子によってコードされるポリペ
プチド上のエピトープに結合する単離された抗体に関する。
【００１５】
本発明はまた、上記の任意の薬学的組成物を備えるキットを含む。
【００１６】
本発明は、ＣＲＦ２−１２核酸（例えば、ＣＲＦ２−１２核酸を含むベクター）を含む
細胞を提供する工程、およびこの核酸によってコードされるＣＲＦ２−１２ポリペプチド
を発現するのに十分な条件下で、この細胞を培養する工程によって、ＣＲＦ２−１２ポリ
ペプチドを産生する方法をさらに提供する。次いで、この発現されたＣＲＦ２−１２ポリ
ペプチドは、この細胞から回収される。好ましくは、この細胞は、内因性ＣＲＦ２−１２
ポリペプチドをほとんど産生しないか、または全く産生しない。この細胞は、例えば、原
核生物細胞または真核生物細胞であり得る。
【００１７】
本発明はまた、サンプルと、このポリペプチドまたは核酸に特異的に結合する化合物と
を接触させる工程、および存在する場合に複合体形成を検出する工程によって、サンプル
中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドまたはＣＲＦ２−１２核酸を同定する方法に関する。
【００１８】
本発明は、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドと化合物とを接触させる工程、およびこのＣＲ
Ｆ２−１２ポリペプチド活性が改変されたか否かを決定する工程によって、ＣＲＦ２−１
２ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法をさらに提供する。
【００１９】
本発明はまた、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドと化合物とを接触させる工程およびこの化
合物がこのＣＲＦ２−１２ポリペプチドの活性を改変するか、このＣＲＦ２−１２ポリペ
プチドに結合するか、またはＣＲＦ２−１２ポリペプチドをコードする核酸分子に結合す
るか否かを決定する工程によって同定される、ＣＲＦ２−１２ポリペプチド活性を調節す
る化合物に関する。
【００２０】
別の局面において、本発明は、被験体中のＣＲＦ２−１２関連障害の存在または素因（
疾病素質）を決定する方法を提供する。この方法は、被験体からサンプルを提供する工程
、および被験体サンプル中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量を測定する工程を包含する
。次いで被験体サンプル中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量は、コントロールサンプル
中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量と比較される。コントロールタンパク質サンプル中
のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの量と比較した被験体タンパク質サンプル中のＣＲＦ２−
１２ポリペプチドの量の変化は、この被験体が組織増殖関連状態を有することを示す。好
ましくは、コントロールサンプルは、マッチする個体であるが（すなわち、年齢、性別、
または他の一般的な条件が類似する）、組織増殖関連状態を有する疑いがない個体から取
り出され得る。あるいは、被験体が組織増殖関連障害に罹患しているという疑いがない時
点で、このコントロールサンプルは、被験体から取り出され得る。いくつかの実施形態に
おいて、このＣＲＦ２−１２は、ＣＲＦ２−１２抗体を用いて検出される。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、被験体のＣＲＦ２−１２関連障害の存在または素因
を決定する方法を提供する。この方法は、被験体から核酸サンプル（例えば、ＲＮＡもし
くはＤＮＡ、またはそれらの両方）を提供する工程、および被験体核酸サンプル中のＣＲ
Ｆ２−１２核酸の量を測定する工程を包含する。次いで、被験体核酸中のＣＲＦ２−１２
核酸サンプルの量は、コントロールサンプル中のＣＲＦ２−１２核酸の量と比較される。
コントロールサンプル中のＣＲＦ２−１２の量と比較した、このサンプル中のＣＲＦ２−
１２核酸の量の変化は、この被験体が、組織増殖関連障害を有することを示す。
【００２２】
なおさらなる局面において、本発明は、ＣＲＦ２−１２関連障害を処置または予防また
は遅延する方法を提供する。この方法は、そのような処置または予防または遅延が所望さ
れる被験体に、被験体の組織増殖関連障害を処置、予防、または遅延するのに十分な量の
ＣＲＦ２−１２核酸、ＣＲＦ２−１２ポリペプチド、またはＣＲＦ２−１２抗体を投与す
る工程を包含する。そのような障害の例としては、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症
が挙げられる。
【００２３】
他に示されない限り、本明細書中に使用される全ての専門用語および科学用語は、本発
明の属する分野における当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書
中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な方法または材料が、本発明の実
施または試験に用いられ得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書
中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献は、本明細書中でそ
の全体が参考として援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに
、材料、方法、および実施例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。
【００２４】
本発明の他の形態および利点は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明
らかである。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＣＲＦ２ポリペプチドとの相同性を示すポリペプチドをコードする新規核酸
配列の発見に、一部基づく。可溶性ＣＲＦ２様ポリペプチドをコードする６９６ヌクレオ
チドの配列（表１；配列番号１を参照のこと）は、本発明に含まれる。そのコードされる
ポリペプチドのアミノ酸配列は、表２（配列番号２）に示される。予想されるオープンリ
ーディングフレームは、２３１アミノ酸長の分泌タンパク質をコードする。
【００２６】
【表１】
2008188023.tif 000002
【００２７】
【表２】
2008188023.tif 000003
【００２８】
可溶性ＣＲＦ２様ポリペプチドをコードする７９２ヌクレオチドの配列（表３；配列番
号３を参照のこと）もまた本発明に含まれる。理論に束縛されることを望まないが、表３
のヌクレオチド配列は、表１のヌクレオチド配列もまたコードするＣＲＦ２−１２遺伝子
から転写されたＲＮＡの選択的スプライシングの結果であると考えられる。表３のヌクレ
オチド配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を表４（配列番号４）に示
す。予想されるオープンリーディングフレームは、２６３アミノ酸長の分泌タンパク質を
コードする。表３のヌクレオチド配列は、表１に示されるヌクレオチド配列と比較して９
６ヌクレオチドの過剰なエキソン（ｅｘｔｒａ  ｅｘｏｎ）を有する。この過剰なエキソ
ンは、表２に示されるポリペプチド配列中に存在しない３２アミノ酸を含むポリペプチド
をコードする。
【００２９】
【表３】
2008188023.tif 000004
【００３０】
【表４】
2008188023.tif 000005
【００３１】
表５に示される核酸もまた、本発明の範囲内にある。理論に束縛されることを望まない
が、表５のヌクレオチド配列は、表１および表３のヌクレオチド配列もまたコードするＣ
ＲＦ２−１２遺伝子から転写されたＲＮＡの選択的スプライシングの結果であると考えら
れる。この開示された核酸は、表６に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドする。１つのエキソンを飛び越し、最後のエキソンにおいて翻訳のフレームを変化する
選択的スプライシングの結果として、表６に示されるアミノ酸配列は、表２のタンパク質
配列より短く、そのカルボキシ末端に独特のアミノ酸を有する。
【００３２】
【表５】
2008188023.tif 000006
【００３３】
【表６】
2008188023.tif 000007
【００３４】
本発明のＣＲＦ２様核酸およびＣＲＦ２様ポリペプチド（表１〜６に示される核酸およ
びポリペプチドを含む）は、「ＣＲＦ２−１２」核酸および「ＣＲＦ２−１２」ポリペプ
チドとして本明細書中で称される。
【００３５】
３つの開示された「ＣＲＦ２−１２」核酸およびコードされるポリペプチドは、ＣＲＦ
２−１２遺伝子中の２つの推定のエキソンに対応する共通の配列を共有する。１つは、配
列番号１のエキソン１〜６１に対応するエキソンを含む。第２のエキソンは、配列番号１
のヌクレオチド６２〜１９７に対応する。これらの配列は、全ての開示されたＣＲＦ２−
１２核酸配列中に存在する。従って、ＣＲＦ２−１２核酸は、これらのエキソンのうちの
１つまたは両方を含み得、そしてＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、これらのエキソンの１
つまたは両方によってコードされるポリペプチド配列を含み得る。例えば、配列番号２の
アミノ酸２１〜６６と相同な配列を含むポリペプチドをコードするＣＲＦ２−１２核酸（
例えば、配列番号１のヌクレオチド６２〜１９７を含む核酸）は、本発明中に含まれる。
配列番号２のアミノ酸２１〜６６と相同な配列を含むポリペプチドもまた、本発明の範囲
内である。配列番号２のアミノ酸１〜６１と相同な配列を含むポリペプチドをコードする
ＣＲＦ２−１２核酸（例えば、配列番号１のヌクレオチド１〜６１を含む核酸）もまた、
本発明に含まれ得る。配列番号２のアミノ酸１〜６１と相同な配列を含むポリペプチドも
また、本発明の範囲内にある。
【００３６】
表１および表２に開示される配列は、ＩＩ型サイトカインレセプターファミリータンパ
ク質のために構築されたＨｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖモデル（ＨＭＭ）を用いて同定され
た。次いで、このＨＭＭモデルは、タンパク質データベースおよび核酸データベースを検
索するために用いられた。表１に示される核酸は、編集された配列に基づきアセンブルさ
れた。
【００３７】
表１に示される核酸配列に対応するｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を用いて同定された。用い
たＰＣＲプライマーは、５’ＣＴＴＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣ
（配列番号５）またはＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＧ（配列番
号６）および３’（ＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣ）（
配列番号７）を含んだ。
【００３８】
このプライマーを使用して、ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡ種を増幅した。ライブ
ラリーを調製するために使用されたＲＮＡを、ＰＨＡおよびＰＭＡで活性化された混合リ
ンパ球培養物から単離した。約７００〜７５０ｂｐの大部分の種を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲキットを使用して、５つの別々のＰＣＲ反応より４０サイク
ル後に獲得した。これらの５つのフラグメントを、Ｓｉｇｍａ  ＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍｉ
ｎｕｓ  ＥｔＢｒ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓを使用して、分離用アガロースゲルから精
製した。引き続き、これらフラグメントをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＡクローニングキッ
トを使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐＣＲ２．１にライゲーションした。Ｘ
−ｇａｌスクリーニングと組み合わされたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ  １０  Ｏｎ
ｅ  Ｓｈｏｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎを使用して、白色の形
質転換体を獲得した。３０個の白色コロニーを採取して（元の「ＰＣＲ反応」に対応する
各々の形質転換から６個のコロニー）、アンピシリンを補充したＬＢ中で一晩培養した。
４．５ｍｌの細胞培養物についてＱｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｍｉｎｉｐｒ
ｅｐｓを行い、そして引き続いてそのＤＮＡを、ＥｃｏＲ１制限酵素およびアガロースゲ
ル電気泳動の評価を使用して、挿入物について分析した。２３個のクローンを挿入物の配
列の存在について評価した。３つのクローンは、表１に示されるヌクレオチド配列を有す
る挿入物を含んだ。
【００３９】
表２に示されるポリペプチドは、膜貫通ドメインを含まないＣＲＦ２ファミリーの第１
のメンバーである。従って、このポリペプチドは、細胞から分泌される可能性がある。コ
ードされるＯＲＦは、ＺｃｙｔｏＲ７、ＺｃｙｔｏＲ１１および組織因子と最も高い相同
性を有する。表２で示されるポリペプチドもまた、先に記載したクラスＩＩサイトカイン
レセプターと高い類似性を示す。先に記載したサイトカインレセプター因子との関連性を
、以下に示す。
【００４０】
【表７】
2008188023.tif 000008
2008188023.tif 000009
2008188023.tif 000010
表２に示されるポリペプチドと、先に記載した２型サイトカインレセプターポリペプチ
ドとの間の関連性の程度は、２１％〜３４％の同一性の範囲である。４０〜４７％のアミ
ノ酸が、ポジティブなアミノ酸として関連する。
【００４１】
Ｑ９ＹＧＣ８  ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）インターロイキン−１０レセ
プター２（５／１９９９）と、表２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸３０位〜２２７位
との間のアラインメントを以下に提供する。示されるアラインメントについては、長さ＝
３４１、スコア＝７３．４、ビット（１７７．０）、期待値＝１ｅ−１２、同一性＝５６
／２００（２８％）、およびポジティブ＝９２／２００（４６％）である。
【００４２】
【表８】
2008188023.tif 000011
【００４３】
プライマーＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＧ（配列番号９）お
よびプライマーＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣ（配列番
号１０）を使用するＰＣＲ増幅アッセイにおいて、さらなるＣＲＦ２−１３のコード配列
を同定した。種々のヒト組織由来のプールされたｃＤＮＡにおいて、表３に提供される配
列を含むｃＤＮＡを同定した。表５に示される配列を含むｃＤＮＡを、胃組織由来のｃＤ
ＮＡライブラリーにおいて同定した。表１に示されるＤＮＡのクローニングについて使用
された、同様のライゲーション方法、形質転換方法、スクリーニング方法および配列決定
方法を使用して、表３および表５に示される配列を含むｃＤＮＡを作製した。
【００４４】
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドをコードするマウスヌクレオチド配列を、表７に
示す。
【００４５】
【表９】
2008188023.tif 000012
【００４６】
表７に示されるヌクレオチド配列は、表８に示されるアミノ酸配列を有する２３０アミ
ノ酸のポリペプチドをコードする。
【００４７】
【表１０】
2008188023.tif 000013
【００４８】
ヒトＣＲＦ２−１３配列に基づくプローブを使用して、マウスの配列を同定した。マウ
スＣＲＦ２−１３配列の単離および性質決定を、以下の実施例において詳細に開示する。
【００４９】
ＣＲＦ２−１２核酸およびコードされるペプチドは、本発明に従い、種々の適用および
状況において有用である。例えば、配列比較は、開示のＣＲＦ２−１２核酸（表１、表３
、表５および表７）がＣＲＦ２−１２ファミリーのレセプターの分泌されるメンバーをコ
ードすることを明らかにする。１つ以上の分泌されるレセプターの鎖は、ＣＲＦ２の別の
膜結合性メンバーまたは別のファミリーの膜結合性レセプターと会合し得、および／また
はそれらの活性を調節し得る。あるいは、またはさらに、本明細書中で開示されるレセプ
ター鎖は、単特で作用し得るか、または別の可溶性レセプターと組み合わせて作用し得る
。その効果において、そのレセプターはリガンドでもあり得る。
【００５０】
表２、表４および表６に示されるポリペプチド配列に基づいたポリペプチドの代替形態
が、異なる組織および／または異なる条件において発現され得、そしてそれによって組織
特異的な影響を実行し得る。
【００５１】
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドはさらに、可溶性のレセプターアンタゴニストと
して使用され得る。特定のサイトカイン（例えば、ＴＮＦ）の活性をブロックする可溶性
レセプターアンタゴニストは、当該分野で公知である。本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプ
チドは、同様に、ＣＲＦ２メンバーを介して作用するサイトカインの活性をブロックし得
る。このようなポリペプチドの例としては、ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ
−２２、ＡＫ１５５、ｍｄａ−７またはインターフェロン（例えば、インターフェロンα
、インターフェロンβまたはインターフェロンγ）が挙げられる。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドを使用して、ＩＬ−２
２の機能を拮抗する。ＩＬ−２２はＩＬ−１０と配列において遠い関係にあり、そして活
性化されたＴ細胞によって産生される。ＩＬ−２２の細胞内へのシグナル伝達は、そのレ
セプター鎖ＩＬ−２２ＲおよびＣＲＦ２−４（両者ともＣＲＦ２ファミリーのメンバー）
によって媒介される。このＣＲＦ２−４レセプターは、元々、ＩＬ−１０シグナル伝達に
おける第２成分として役立つことが報告された。ＩＬ−２２は、ヒトＴｈ２  Ｔ細胞から
のＩＬ−４産生を阻害すること、およびマウスの肝臓において急性期タンパク質を誘導す
ることが報告された。
【００５３】
本発明に従い、ＣＲＦ２−１２核酸およびＣＲＦ２−１２ポリペプチドをさらに使用し
て、細胞集団において、本発明を作製する細胞型または本発明と結合する細胞型を同定し
得る。このＣＲＦ２−１２核酸およびＣＲＦ２−１２ポリペプチドはまた、単独でかまた
は別のレセプターと併用して、この可溶性レセプターと会合するリガンド、ならびにこの
リガンドが上記の作用機構および／または病因に対して有する影響に基づいて、免疫調節
、炎症、免疫抑制、アレルギー、喘息、自己免疫疾患（慢性関節リウマチおよび多発性硬
化症を含む）、血管の損傷または疾患の後の血管平滑筋細胞の修復、移植、および癌のた
めに使用され得る。
【００５４】
例えば、本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、以下の活性のうちの１つ以上を示し
得る：（１）調節（例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−１０またはＩＬ−２２）により
媒介されるシグナル伝達経路を拮抗し得る）；（２）サイトカインの産生および／または
分泌の調節（例えば、炎症誘発性サイトカインの産生および／または分泌）；（３）リン
ホカインの産生および／または分泌の調節；（４）核内転写因子の発現または活性の調節
；（５）サイトカインリガンドのサイトカインレセプターとの競合；（６）細胞の増殖、
成長または分化（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−２２）に刺激
される産生、成長および分化）の調節；（７）細胞免疫応答の調節；サイトカイン媒介性
の炎症誘導作用の調節；ならびに／または免疫反応の促進および／もしくは潜在力。
【００５５】
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、膜結合レセプターと会合して直接的にか、ま
たは可溶性リガンドとのそれの会合により間接的に、以下の細胞型の１つ以上に影響し得
るか、またはそれら細胞型に効力をもたらし得る：循環する細胞または組織と会合した細
胞：Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、ニュ
ートロフィル、肥満細胞、好塩基球、好酸球、ならびに気道、膵臓、腎臓、肝臓、小腸お
よび大腸における細胞。本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、さらに、ホルモン性免
疫応答および細胞媒介性免疫反応の上方制御を調節し得；炎症誘導性のサイトカインおよ
びケモカインの合成を調節し得；そして、創傷、敗血症、胃腸疾患および心血管疾患、ま
たは外科手術後の炎症に関連した炎症応答を、調節し得る。
【００５６】
タンパク質の効果的な産生のために、ＣＲＦ２−１２配列を、所望される宿主における
発現が最適化された発現制御配列の制御下に置くことが好ましい。例えば、その配列は、
最適化された転写制御配列および／または翻訳制御配列（例えば変更されたＫｏｚａｋ配
列）を含み得る。さらに、ＣＲＦ２−１２タンパク質の成熟アミノ末端は、タンパク質の
成熟アミノ末端の予測的決定または経験的決定に基づいて、ＣＲＦ２−１２のものでない
シグナル配列と、作動可能に連結され得る。
【００５７】
ＣＲＦ２−１２融合タンパク質を使用して、当該分野で公知のアッセイを使用して、結
合パートナーを同定および決定し得る。これらのアッセイとしては、例えば、組織学的免
疫化学的ＢＩＡＣＯＲＥまたは細胞生物学ベースのアッセイが挙げられる。
【００５８】
アッセイはまた、本発明のＣＲＦ２−１２タンパク質が、ＣＲＦ２ファミリーの他のメ
ンバーをすでに発現する細胞型と結合するか否かを決定するために、実施され得る。本発
明のＣＲＦ２−１２はまた、公知のサイトカインまたは新規のサイトカインの活性を（例
えば、サイトカインの機能を阻害することにより、またはさもなければ、この機能を拮抗
することにより）調節するその能力について、試験され得る。
【００５９】
例えば、いくつかの新規のＩＬ−１０様分子がクローニングされた。ＩＬ−２２はこれ
らの分子うちの１つである。この分子がＴｈ２細胞（ヒト）によるＩＬ−４の産生をブロ
ックして、そして急性期応答（マウス）を開始することが報告された。ＣＲＦ２−１２が
ＩＬ−２２（またはＩＬ−１０様の分子）と結合してそしてＩＬ−２２を阻害するという
知見は、本発明のＣＲＦ２−１２を使用して高レベルのＩＬ−２２ポリペプチドと関連し
た疾患の処置し得るかまたは予防し得ることを、示す。
【００６０】
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドが、他のレセプターおよび／またはＣＲＦ２ファ
ミリー内の関連サイトカインと結合することもまた予測される。例えば、本発明のＣＲＦ
２−１２は、ＩＬ−２２Ｒのいずれかの鎖と会合し得、そしてそのレセプターまたはＩＬ
−２２リガンドの機能に影響し得る。
【００６１】
（ＣＲＦ２−１核酸）
本発明の核酸は、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドまたはＣＲＦ２−１２タンパク質をコー
ドする核酸を含む。本明細書中で使用される場合、用語ポリペプチドおよびタンパク質は
、相互交換可能である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＣＲＦ２−１２核酸は、成熟のＣＲＦ２−１２ポリペプ
チドをコードする。本明細書中で使用される場合、明細書中で記載される「成熟の」形態
のポリペプチドまたはタンパク質は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態また
はプロタンパク質の産物に関する。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタン
パク質としては、非限定的な例として、対応する遺伝子によりコードされる、全長の遺伝
子産物が挙げられる。あるいは、本明細書中に記載されるオープンリーディングフレーム
によりコードされる、ポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として規定され得る。
産物の「成熟の」形態は、再び非限定的な例として、その遺伝子産物が生じる細胞内で起
こり得る、１つ以上の天然に存在するプロセシング工程の結果として生じる。ポリペプチ
ドまたはタンパク質の「成熟の」形態を導くこのようなプロセシング工程の例としては、
オープンリーディングフレームの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の
切断、またはシグナルペプチド配列もしくはリーダー配列のタンパク質分解性の切断が、
挙げられる。従って、残基１〜Ｎを有する、前駆体のポリペプチドまたはタンパク質から
生じる成熟の形態（ここで、残基１はＮ末端のメチオニンである）は、Ｎ末端メチオニン
の除去後、残存する残基２〜Ｎを有する。あるいは、残基１〜Ｎを有する、前駆体のポリ
ペプチドまたはタンパク質から生じる成熟の形態は、残基１〜残基ＭのＮ末端シグナルペ
プチドが切断される場合、残存する残基Ｍ＋１〜残基Ｎを有する。さらに本明細書中で使
用される場合、ポリペプチドまたはタンパク質の「成熟の」形態は、タンパク質分解性の
切断現象以外の翻訳後修飾の工程から生じ得る。このような追加の過程としては、非限定
的な例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化が挙げられる。一般的に、
成熟のポリペプチドまたはタンパク質は、これらの過程のうちのただ１つの操作から生じ
得るか、またはこれらの過程の任意の組み合わせから生じ得る。
【００６３】
配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１において提供される核酸
またはそれらのフラグメントは、ＣＲＦ２−１２核酸の中のうちである。さらに、本発明
は、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号１１の変異体核酸もしくは改
変体核酸、またはそれらのフラグメントを含み、これらのうちの任意の塩基は対応する塩
基から変更され得るが、そのＣＲＦ２−１２様活性および生理学的機能（例えば、サイト
カインに結合すること）のうちの少なくとも１つを維持するタンパク質を依然としてコー
ドする。本発明はさらに、開示されたＣＲＦ２−１２核酸の核酸配列（そのフラグメント
、誘導体、アナログおよびホモログを含む）の相補体を含む。本発明はさらに、核酸もし
くは核酸フラグメント、またはその相補体を含み、それらの構造体は化学修飾を含む。
【００６４】
本発明はまた、ポリペプチド配列ＭＭＰＫＨＣＬ／ＦＬＧＬ／ＦＬＩ（配列番号１３）
、ＦＱＳＲＮＦＨＮＩＬＨ／ＱＷＱ  Ａ／ＰＧ（配列番号１４）、ＳＩ／ＶＹＦＶＱＹＫ
Ｍ／ＩＹＧＱＳ／ＲＱＷ（配列番号１５）、ＴＰＲＦＴＰＷＷＥＴＫＬ／ＩＤＰＰＶ（配
列番号１６）、ＬＶ／ＬＹＲＶＦＴ／ＩＩＮＮＳＬＥＫＥＱＫＡ／ＶＹＥＧ（配列番号１
７）、ＲＡＶＥＩＥＧ／ＡＬＩ／ＴＰＨＳＳＹＣＶＶＡＥＭ／ＩＹＱＰＭ（配列番号１８
）およびＤＲＲＳＰ／ＱＲＳＫ／ＥＥＲＣＶＱ／ＥＩＰ（配列番号１９）のうちの１つ以
上を有する、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００６５】
本発明の１つの局面は、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部
分をコードする単離された核酸分子に関する。また、ＣＲＦ２−１２をコードする核酸（
例えば、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡ）を同定するためのハイブリダイゼーションプローブ
としての用途にとって十分なフラグメント、およびＣＲＦ２−１２核酸分子の増幅または
変異のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーとしての用途のためのフラグメ
ントも包含される。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例
えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド
アナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログ、ならびにそれらの誘導体
、フラグメント、およびホモログを含むことが企図される。核酸分子は、１本鎖または２
本鎖であり得るが、好ましくは、２本鎖ＤＮＡである。
【００６６】
「プローブ」は、可変長の核酸配列であって、その長さは、好ましくは、その用途に依
存して、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）、約１００ｎｔ、または約６０００ｎｔもの大きさ
であり得る。プローブは、同一、類似、または相補的な核酸配列の検出において使用され
る。より長いプローブが、通常、天然の供給源または組換え供給源から得られ、非常に特
異的であり、かつオリゴマーよりも遅くハイブリダイズする。プローブは、１本鎖または
２本鎖であり得、そして、ＰＣＲ技術、メンブレン（膜）依存型ハイブリダイゼーション
技術、またはＥＬＩＳＡに類似の技術において特異性を有するように設計され得る。
【００６７】
「単離（単離された）」核酸分子は、この核酸の天然供給源において存在する他の核酸
分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子の例としては、ベクターに含ま
れる組換えＤＮＡ分子、異種宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分子、部分的また
は実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡ分子または合成ＲＮＡ分子が挙げられ
るが、これらに限定されない。好ましくは、「単離」核酸は、この核酸が由来する生物の
ゲノムＤＮＡ中で、この核酸に天然において隣接する配列（すなわち、この核酸の５’末
端および３’末端に位置する配列）を有さない。例えば、種々の実施形態において、この
単離ＣＲＦ２−１２核酸分子は、この核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に
天然で隣接するヌクレオチド配列の、５０ｋｂ、２５ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２
ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含み得る。さらに、「単離」核酸分
子（例えば、ｃＤＮＡ分子）は、組換え技術によって作製された場合に他の細胞性物質ま
たは培養培地を実質的に含み得ず、また化学合成された場合には、化学的前駆体または他
の化学物質を実質的に含み得ない。
【００６８】
本発明の核酸分子（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号５、配列
番号１１のヌクレオチド配列、またはそれらの相補体を有する核酸分子）は、標準的な分
子生物学的技術および本明細書中において提供された配列情報を使用して単離され得る。
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１の核酸配列の全てまたは一部
をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ＣＲＦ２−１２核酸配列は、標準的
なハイブリダイゼーション技術および標準的なクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら編、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵ
ＡＬ  第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌら
編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ
、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９３に記載されるよ
うなそれらの技術）を使用して、単離され得る。
【００６９】
本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ、また、あるいは、ゲノムＤＮＡを、標準的
なＰＣＲ増幅技術に従ったテンプレートおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーとし
て使用して、増幅され得る。そのように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニン
グされ、そして、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられ得る。さらに、ＣＲＦ２−１２ヌ
クレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術（例えば、自動ＤＮ
Ａ合成機の使用）によって、調製され得る。
【００７０】
本明細書中において使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、一連の連結され
たヌクレオチド残基をいい、このオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ反応において使用される
のに十分な数のヌクレオチド塩基を有している。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノム
配列またはｃＤＮＡ配列に基づき得るか、またはそれらにから設計され得、そして、この
短いオリゴヌクレオチドは、特定の細胞または組織中の同一、類似、または相補的なＤＮ
ＡまたはＲＮＡを、増幅し、それらの存在を確認し、またはそれらの存在を明らかにする
ために使用される。オリゴヌクレオチドは、約１０ｎｔ長、約５０ｎｔ長、または約１０
０ｎｔ長、好ましくは、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ長を有する核酸配列の部分を含む。１つ
の実施形態において、１００ｎｔ長未満の核酸分子を含むオリゴヌクレオチドはさらに、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１あるいはそれらの相補体の少
なくとも６連続したヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、化学合成され得、そし
てプローブとして使用され得る。
【００７１】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配
列番号５、または配列番号１１あるいはそのヌクレオチド配列の部分に示されたヌクレオ
チド配列の相補体である核酸分子を含み得る。配列番号１、配列番号３、配列番号５、ま
たは配列番号１１あるいはそのヌクレオチド配列の部分に示されたヌクレオチド配列の相
補体である核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１に示
されたヌクレオチド配列とミスマッチをほとんど有することなく、またはミスマッチを有
さないで水素結合し得、それによって、安定な二重鎖を形成し得る、配列番号１、配列番
号３、配列番号５、または配列番号１１に示されたヌクレオチド配列に十分に相補的な核
酸分子である。
【００７２】
本明細書中において使用される場合、用語「相補的（相補的である）」とは、核酸分子
のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ
塩基対形成をいい、そして、用語「結合（結合する）」とは、２つのポリペプチドもしく
は化合物または会合したポリペプチドもしくは化合物あるいはそれらの組み合わせの間の
物理学的相互作用また化学的相互作用を意味する。結合としては、イオン相互作用、非イ
オン相互作用、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用などが挙げられる。物理学
的相互作用は、直接的または間接的のいずれかであり得る。間接的相互作用は、別のポリ
ペプチドまたは化合物の効果を介し得るか、またはそれらに起因し得る。直接結合とは、
別のポリペプチドまたは化合物の効果を介して、または、それらに起因して生じず、その
代わり、他の実質的な化学中間体を有さない相互作用をいう。
【００７３】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号１１ま
たは配列番号１１の核酸配列の一部分（例えば、プローブまたはプライマーとして使用さ
れ得るフラグメント、あるいはＣＲＦ２−１２の生物学的に活性な部分をコードするフラ
グメント）のみを含み得る。本明細書中で提供されるフラグメントは、少なくとも６の（
連続した）核酸または少なくとも４の（連続した）アミノ酸の配列、つまり、核酸の場合
においては、特定のハイブリダイゼーション、または、アミノ酸の場合においては、エピ
トープの特定の認識を可能にするのに十分な長さとして、それぞれ定義され、フラグメン
トは、高々、全長配列未満のいくつかの部分である。フラグメントは、選択された核酸配
列またはアミノ酸配列の任意の連続した部分に由来し得る。誘導体は、直接的に、あるい
は改変または部分的置換のいずれかによって、天然化合物から形成され得る、核酸配列ま
たはアミノ酸配列である。アナログは、天然の化合物に類似の構造をしているが、それに
対して同一ではなく、特定の構成性分または側鎖に関して異なっている核酸配列またはア
ミノ酸配列である。アナログは、合成性であり得るか、または、異なる進化的な起源に由
来し、かつ、野生型と比較して類似または反対の代謝活性を有し得る。
【００７４】
誘導体およびアナログは、上述のように、これらの誘導体またはアナログが修飾された
核酸またはアミノ酸を含む場合、全長であり得るか、または全長ではない。本発明の核酸
またはタンパク質の誘導体またはアナログとしては、種々の実施形態において、同一サイ
ズの核酸またはアミノ酸のとき、または、アライメントされた配列（ここで、このアライ
メントは、当該分野で公知の相同性プログラムによって行われる）と比較したときに、少
なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％もの同一性
（結果として、好ましくは８０〜９９％である）によって、本発明の核酸またはタンパク
質に実質的に相同な領域を含む分子、またはそれをコードする核酸が、ストリンジェント
な条件、中程度にストリンジェントな条件、または低度にストリンジェントな条件下で、
上述のタンパク質をコードする配列にハイブリダイズし得る分子が挙げられるが、これら
に限定されない。Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯ
ＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
、ＮＹ  １９９３および以下を参照のこと。例示的なプログラムは、Ｇｐａプログラム（
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、ＵＮＩＸ
（登録商標）版バージョンン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）であり、こ
れは、Ｓｉｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いるデフォルトの設定を使用す
る（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、１９８１，２：４８２−４８９（これらは全体が参
考として援用される））。
【００７５】
「相同（相同性）核酸配列」または「相同（相同性）アミノ酸配列」あるいはその改変
体は、上で議論したヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルでの相同性によって特徴付
けられる配列をいう。相同性ヌクレオチド配列は。ＣＲＦ２−１２ポリペプチドのアイソ
フォームをコードするこれらの配列をコードする。アイソフォームは、例えば、ＲＮＡの
選択的スプライシングの結果として、同じ生物種の異なる組織において発現され得る。あ
るいは、アイソフォームは、異なる遺伝子によってコードされ得る。本発明において、相
同なヌクレオチド配列は、ヒト以外の種のＣＲＦ２−１２ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を含み、この種としては、哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されず、
従って、このアイソフォームは、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマおよ
び他の生物体を含み得る。相同なヌクレオチド配列としては、本明細書中に示されるヌク
レオチド配列の、天然に存在する対立遺伝子のバリエーションおよび変異体を含み得るが
、これららに限定されない。しかし、相同性ヌクレオチド配列は、ヒトＣＲＦ２−１２タ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含まない。相同な核酸配列は、配列番号２、配
列番号４、配列番号６または配列番号１２ならびにＣＲＦ２−１２活性を有するポリペプ
チドにおける保存的アミノ酸置換体（以下を参照のこと）をコードする核酸配列を含む。
例えば、本発明のＣＲＦ２−１２ヌクレオチドは、配列番号２の２１〜６２のアミノ酸と
比較して、そのアミノ酸配列において、１以上、例えば、２、３、５、１０、１５、２０
、または２５あるいはそれ以上の置換を有するポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００７６】
ＣＲＦ２−１２タンパク質の生物学的活性は、以下に記載される。相同性はアミノ酸配
列は、ヒトＣＲＦ２−１２ポリペプチドのアミノ酸配列をコードしない。
【００７７】
ヒトＣＲＦ２−１２遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の細
胞型（例えば、他の組織由来の細胞型）ならびに他の哺乳動物由来のＣＲＦ２−１２ホモ
ログを同定および／またはクローニングにおける用途にために設計されたプローブおよび
プライマーの作製を可能にする。これらのプローブ／プライマーは、代表的には、実質的
に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチドは、代表的には、配列
番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１の、少なくとも約１２、２５、５
０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、または４００あるいはそれ以上
の保存的なセンス鎖ヌクレオチド配列；あるいはこれらの配列の一方のアンチセンス鎖ヌ
クレオチド配列；あるいはこれらのうちの一方の天然に存在する変異体にストリンジェン
ト条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。
【００７８】
ヒトＣＲＦ２−１２ヌクレオチド配列に基づくプローブは、同一または相同なタンパク
質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用され得る。種々の実施形態
において、このプローブは、さらに結合した標識基、をさらに含み、例えば、この標識基
は、放射性同位体、蛍光発光性化合物、酵素、酵素補因子であり得る。このようなプロー
ブは、被験体由来の細胞のサンプル中のＣＲＦ２−１２コード核酸のレベルを測定するこ
とによって（例えば、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡを検出することによって、またはゲノム
ＣＲＦ２−１２遺伝子が変異または欠失されたか否かを決定することによって）、ＣＲＦ
２−１２タンパク質を誤って発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓ）する細胞または組織を同定す
るための診断試験キットの一部として使用され得る。
【００７９】
「ＣＲＦ２−１２の生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、用量依存的であ
っても、用量依存的でなくとも、特定の生物学的アッセイにおいて、測定されるように、
本発明のポリペプチドの活性に類似の活性であって、それに必ずしも同一ではない活性を
提示する（成熟形態を含む）ポリペプチドをいう。「ＣＲＦ２−１２の生物学的に活性な
部分」をコードする核酸フラグメントは、ＣＲＦ２−１２生物学的活性（ＣＲＦ２−１２
タンパク質の生物学的活性は、以下に記載される）を有するポリペプチドをコードする、
配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１の一部分を単離し、ＣＲＦ２
−１２タンパク質のうちのコードされた部分を（例えば、インビトロでの組換え発現によ
って）発現し、そして、ＣＲＦ２−１２のコード部分の活性を評価することによって、調
製され得る。例えば、ＣＲＦ２−１２の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメ
ントは、必要に応じてＡＴＰ結合ドメインを含み得る。別の実施形態において、ＣＲＦ２
−１２の生物学的に活性な部分をコードする核酸フラグメントは、１以上の領域を含む。
【００８０】
（ＣＲＦ２−１２改変体）
本発明は、遺伝コードの縮重に起因して、配列番号１、配列番号３、配列番号５、また
は配列番号１１に示されるヌクレオチド配列と異なる核酸分子をさらに含む。従って、こ
れらの核酸は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１に示されてい
るヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質（例えば、それぞれ、配列番号２、
配列番号４、配列番号６、または配列番号１２のポリペプチド）と同じＣＲＦ２−１２タ
ンパク質をコードする。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、それぞ
れ。配列番号２、配列番号４、配列番号６、または配列番号１２に示されるアミノ酸配列
を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００８１】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７または配列番号１１に示されるヒト
ＣＲＦ２−１２ヌクレオチド配列に加えて、ＣＲＦ２−１２のアミノ酸配列における変化
を生じるＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）において存在し得る。ＣＲＦ２−
１２遺伝子におけるこのような遺伝的多型は、天然の対立遺伝子のバリエーションに起因
して、集団内の個体中に存在し得る。本明細書中で使用される場合、「遺伝子」および「
組換え遺伝子」は、ＣＲＦ２−１２タンパク質、好ましくは、哺乳動物ＣＲＦ２−１２タ
ンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子をいう。このような
天然の対立遺伝子バリエーションは、代表的には、ＣＲＦ２−１２遺伝子のヌクレオチド
配列において１〜５％の分散を生じ得る。任意および全てのこのようなヌクレオチドバリ
エーション、および天然対立遺伝子バリエーションの結果であり、かつＣＲＦ２−１２の
機能活性を変更しない、ＣＲＦ２−１２における得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲
に包含されることが企図される。
【００８２】
さらに、他の種由来のＣＲＦ２−１２タンパク質をコードしており、かつ配列番号１、
配列番号３もしくは配列番号５のヒトの配列、または配列番号１１のマウス配列とは異な
るヌクレオチド配列を有する、核酸分子は、本発明の範囲に包含されることが企図される
。本発明のＣＲＦ２−１２  ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子改変体およびホモログに対応す
る核酸分子は、ストリンジェントな条件下でヒトｃＤＮＡまたはその一部分を標準ハイブ
リダイゼーション技術に従うハイブリダイゼーションプローブとして使用し、本明細書中
において開示されるヒトＣＲＦ２−１２核酸に対するそれらの相同性に基づいて単離され
得る。例えば、可溶性型のヒトまたはマウスＣＲＦ２−１２  ｃＤＮＡは、ヒト膜結合型
ＣＲＦ２−１２にたいする相同性に基づいて単離され得る。同様にして、膜結合型のヒト
またはマウスのＣＲＦ２−１２  ｃＤＮＡは、可溶型ヒトＣＲＦ２−１２に対する相同性
に基づいて、単離され得る。
【００８３】
従って、別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも６ヌクレ
オチド長であり、かつ、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１のヌク
レオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。別の実
施形態において、この核酸は、少なくとも、１０、２５、５０、１００、２５０、５００
、または７５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、本発明の単離された核酸
分子は、そのコード領域にハイブリダイズする。本明細書中で使用される場合、用語「ス
トリンジェント条件下でのハイブリダイズ（ストリンジェント条件下でハイブリダイズす
る）」は、互いに対して少なくとも６０％相同性であるヌクレオチド配列が、代表的には
、互いにハイブリダイズすることが保持される、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のた
めの条件を記述することを企図される。
【００８４】
ホモログ（すなわち、ヒト以外の種由来であるＣＲＦ２−１２タンパク質をコードする
核酸）または他の関連配列（例えば、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよび
クローニングのための当該分野で周知の方法を使用する、プローブとして全部または一部
分の特定ヒト配列との低度、中程度、または高度にストリンジェントなハイブリダイゼー
ションによって、取得され得る。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
」は、プローブ、プライマー、またはオリゴヌクレオチドが、それらの標的配列にハイブ
リダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェント条件
は、配列依存的であり、異なる環境においてストリンジェント条件は異なる。より長い配
列は、より高温において、短い配列よりも特異的にハイブリダイズする。一般的に、スト
リンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨで特定の配列についての熱融解温
度（Ｔｍ）よりもおおよそ５℃低いように選択される。このＴｍは、標的配列に対して相
補的なプローブの５０％が、平衡状態での標的配列に対してハイブリダイズする（規定さ
れたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度のもとでの）温度である。標的配列は、一般に過
剰に存在するので、Ｔｍにおいて、このプローブの５０％は、平衡状態で占められている
。代表的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオンで
あり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン（また
は他の塩）であり、かつこの温度は、短い（例えば、１０〜５０ｎｔの）プローブ、プラ
イマー、またはオリゴヌクレオチドについて少なくとも約３０℃であり、そしてより長い
プローブ、プライマー、およびオリゴヌクレオチドについては少なくとも６０℃である。
ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成
される。
【００８６】
ストリンジェントな条件は、当業者にとって公知であり、そしてＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲ
ＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６において見出される。好まし
くは、この条件は、互いに対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、
９５％、９８％または９９％相同性であるヌクレオチド配列が、代表的には、互いにハイ
ブリダイズすることが保持される条件である条件である。ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件の非限定的な例は、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７
．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２
％  ＢＳＡ、および５００ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを６５℃で含む高塩緩衝液で
のハイブリダイゼーションである。このハイブリダイゼーションの後に、５０℃で、０．
２×ＳＳＣ、０．０１％  ＢＳＡで１回以上の洗浄する。配列番号１、配列番号３、配列
番号５、または配列番号１１の配列に対してストリンジェント条件でハイブリダイズする
本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。本明細書中で使用
される場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然において存在する（例えば、天然の
タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子をい
う。
【００８７】
第２の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１
、あるいはそれらのフラグメント、アナログ、または誘導体のヌクレオチド配列を含む核
酸分子にハイブリダイズ可能な、核酸配列は、中程度のストリンジェンシーの条件下で、
提供される。中程度のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は
、５５℃での、６×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍ
ｌ変性サケ精子ＤＮＡ中のハイブリダイゼーション、その後の、３７℃での、１×ＳＳＣ
、０．１％ＳＤＳでの１回以上の洗浄である。使用され得る中程度のストリンジェントの
他の条件は、当該分野で周知である。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵ
ＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈ
ｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡ
ＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ
、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。
【００８８】
第３の実施形態において、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１
のヌクレオチド配列を含む核酸分子、あるいはそれらのフラグメント、アナログ、または
誘導体は、低度のストリンジェントな条件で、提供される。低度のストリンジェントなハ
イブリダイゼーションの非限定的例は、４０℃での、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０２％  ＰＶＰ、
０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％
（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、その後の、５０℃における、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％ＳＤＳ中での１
回以上の洗浄である。使用され得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該分野で周知
である（例えば、交差種ハイブリダイゼーションについて使用される）。例えば、Ａｕｓ
ｕｂｅｌら（編）、１９９３、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵ
ＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹおよびＫｒｉｅｇｌｅ
ｒ、１９９０、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ、Ａ  ＬＡ
ＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｓｈｉｌｏお
よびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７
８」６７８９−６７９２を参照のこと。
【００８９】
（保存的変異）
集団中に存在し得るＣＲＦ−１２配列の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当
業者は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１のヌクレオチド配列に
、変化が変異によって導入され得、これによって、ＣＲＦ２−１２タンパク質の機能的能
力を変化することなしにコード化ＣＲＦ−１２タンパク質のアミノ酸配列に変化を導入し
得るということをさらに理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を
導入するヌクレオチド置換は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１
の配列中でなされ得る。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を変化させることなく
、ＣＲＦ２−１２の野生型配列から変化され得る残基である一方、「必須」アミノ酸残基
は、生物学的活性に必要とされる。例えば、本発明のＣＲＦ２−１２タンパク質間で保存
されるアミノ酸残基は、特に改変の影響を受けにくいと予想される。
【００９０】
本発明の別の局面は、活性に必須でないアミノ酸残基における変化を含むＣＲＦ２−１
２タンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなＣＲＦ２−１２タンパク質は、
配列番号２、配列番号４、または配列番号１２のアミノ酸配列とは異なり、なお生物学的
活性を維持する。１つの実施形態において、単離された核酸分子は、タンパク質をコード
するヌクレオチド配列を含む一方、タンパク質は、これらのアミノ酸配列の１つに対して
少なくとも約７５％の相同性のアミノ酸配列を含む。好ましくは、核酸によってコードさ
れるタンパク質は、これらのアミノ酸配列の１つに対して少なくとも約８０％相同性であ
って、より好ましくは、これらのアミノ酸配列の１つに対して少なくとも約９０％、約９
５％、約９８％、そして最も好ましくは少なくとも約９９％相同性である。
【００９１】
配列番号２、配列番号４、配列番６または配列番号１２のタンパク質に対して相同なＣ
ＲＦ２−１２タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１つ以上のヌクレオチドの
置換、付加、または欠失を、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１の
ヌクレオチド配列に導入することによって作製され得、その結果、１つ以上のアミノ酸の
置換、付加、または欠失が、コード化タンパク質に導入される。
【００９２】
変異は、標準的技術（例えば、部位特異的変異、およびＰＣＲ媒介変異）によってＣＲ
Ｆ２−１２ヌクレチド配列（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番
号１１）に導入され得る。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の推定非必須ア
ミノ酸残基で作製され得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有
するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリ
ーは当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リ
ジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）
非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、
チロシン、システイン），非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイ
シン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分子側鎖（例
えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フ
ェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。従って
、ＣＲＦ２−１２中の推定非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーから別のアミノ
酸残基に置換される。あるいは、別の実施形態において、変異は、ＣＲＦ２−１２コード
配列の全部または一部の間で無作為に導入され得（例えば、飽和変異誘発によって）、そ
して、生じた変異体は、活性を維持する変異体を同定するためにＣＲＦ２−１２生物学的
活性についてスクリーニングされ得る。配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列
番号１１の変異誘発に続いて、コード化タンパク質は、当該分野で公知の任意の組換え技
術によって発現され得、そして、このタンパク質の活性が決定され得る。
【００９３】
１つの実施形態において、変異体ＣＲＦ２−１２タンパク質は、以下についてアッセイ
され得る：（１）他のＣＲＦ２−１２タンパク質、他の細胞表面タンパク質、またはその
生物学的活性部分とのタンパク質：タンパク質相互作用を形成する能力；（２）変異体Ｃ
ＲＦ２−１２タンパク質とＣＲＦ２−１２レセプターとの間の複合体形成；（３）変異体
ＣＲＦ２−１２タンパク質の細胞内標的タンパク質またはその生物学的活性部分（例えば
、アビジンタンパク質）への結合能力；（４）ＣＲＦ２−１２タンパク質に結合する能力
；（５）抗ＣＲＦ２−１２タンパク質抗体を特異的に結合する能力、または（６）ＩＬ−
２２のようなサイトカインポリペプチドに結合する能力。
【００９４】
（アンチセンスＣＲＦ２−１２核酸）
本発明の別の局面は、配列番号１、配列番号３、配列番号５もしくは配列番号１１のヌ
クレオチド配列、またはそれらのフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸分子
に対してハイブリダイズ可能かまたは相補的である、単離されたアンチセンス核酸分子に
関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に対して相補
的である（例えば、２本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的であるか、またはｍＲ
ＮＡ配列に対して相補的である）ヌクレオチド配列を含む。特定の局面において、少なく
とも約１０、２５、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドまたは全ＣＲＦ２
−１２コード鎖に対してか、あるいはその一部のみに対して相補的な配列を含む、アンチ
センス核酸分子が提供される。配列番号２、配列番号４または配列番号６のＣＲＦ２−１
２タンパク質のフラグメント、ホモログ、誘導体およびアナログをコードする核酸分子、
あるいは配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１のＣＲＦ２−１２核酸
配列に相補的なアンチセンス核酸がさらに提供される。
【００９５】
１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ２−１２をコードするヌク
レオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領
域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域（例えば、配列
番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１２に対応するヒトＣＲＦ２−１２のタ
ンパク質コード領域）をいう。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ
２−１２をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセ
ンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５
’配列および３’配列をいう（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域をまたい
う）。
【００９６】
本明細書中に開示されるＣＲＦ２−１２をコードするコード鎖配列（例えば、配列番号
１、配列番号３、配列番号５または配列番号１１）を考えると、本発明のアンチセンス核
酸は、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対の規定に従って設
計され得る。アンチセンス核酸分子は、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡのコード領域全体に対
して相補的であり得るが、より好ましくは、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡのコード領域また
は非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例え
ば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺
の領域に対して相補的であり得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレチドは、約５、１
０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。
本発明のアンチセンス核酸は、化学合成を使用するか、または当該分野で公知の手順を使
用する酵素的リガンド反応を使用して構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば
、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生
物学的安定性を増大するようにか、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成
された２本鎖の物理学的安定性を増大させるように設計された種々に改変されたヌクレオ
チドを使用して（例えば、ホスホロチオネート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド
が使用され得る）化学的に合成され得る。
【００９７】
アンチセンス核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては、以下
が挙げられる：５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−
ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アシルシトシン、５−（カルボキシ
ヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン
、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシ
ルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−
メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン
、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５
−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ
−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウ
ラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（
ｖ）、ワイブトキソジン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、キューオシ
ン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウ
ラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５
−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−
カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリン。あるい
は、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている（すな
わち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方
向を有し、以下の小節にさらに記載される）発現ベクターを使用して生物学的に生成され
得る。
【００９８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的に、被検体に投与されるか、またはインサイ
チュで生成され、その結果、それらは、ＣＲＦ２−１２タンパク質をコードする細胞ｍＲ
ＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたは結合し、それによって、
タンパク質の発現を阻害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって
）。ハイブリダイゼーションは、安定な２本鎖を形成するような従来のヌクレオチド相補
鎖によるものであり得るか、または例えば、ダブルヘリックスの主要な溝の特異的相互作
用を介して、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合においてあり得る。本
発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例として、組織部位での直接注射が挙げられる
。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的化するために改変され得、
次いで、全身的に投与され得る。例えば、全身投与について、アンチセンス分子は改変さ
れ得、その結果、それらは選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗体に特
異的に結合する（例えば、アンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結
合するペプチドまたは抗体に連結することによって）。このアンチセンス核酸分子はまた
、本明細書中で記載されるベクターを使用して細胞へ送達され得る。アンチセンス分子の
十分な細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩまたはｐ
ｏｌＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
【００９９】
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子
である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡとの特異的２本鎖ハイブリッドを形成し
、通常のβユニットとは反対に、鎖は互いに平行である（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７
）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６６２５〜６６４１）。アンチセンス核
酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １５：６１３１〜６１４８）、またはキメラＲＮＡ−ＤＮ
Ａアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２１５：３２７〜３３０）
を含み得る。
【０１００】
このような改変としては、非制限例として、改変された塩基および糖リン酸骨格が改変
されるかまたは誘導体化される核酸が挙げられる。これらの改変は、改変された核酸の化
学的安定性を増大するように、少なくとも一部分において実行され得、その結果、これら
は、例えば、被験体中の治療的用途におけるアンチセンス結合核酸として使用され得る。
【０１０１】
（ＣＲＦ２−１２リボザイムおよびＰＮＡ部分）
なお別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザ
イムは、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を切断し得、相補的領域を有するリボヌクレアーゼ
活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば、（Ｈａｓｅｌｈｏｆ
ｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１中に記載さ
れる）ハンマーヘッドリボザイム）は、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断
するために使用され得、それによってＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡの転写を阻害する。ＣＲ
Ｆ２−１２コード核酸に特異性を有するリボザイムは、本明細書中に開示されるＣＲＦ２
−１２  ＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、配列番号３、配列番号５ま
たは配列番号１１）に基づいて設計され得る。例えば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１
９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、活性部位の核酸配列が構築され得、ここでＣＲＦ２−１
２コードｍＲＮＡ中の切断されるべき核酸配列と相補的である。例えば、Ｃｅｃｈら、米
国特許第４，９８７，０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５，１１６，７４２号を
参照のこと。あるいは、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子のプールから、特異的
なリボヌクレアーゼ活性を有する、触媒ＲＮＡを選択するために使用され得る。例えば、
Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと
。
【０１０２】
あるいは、ＣＲＦ２−１２遺伝子発現は、標的細胞中のＣＲＦ２−１２遺伝子の転写を
予防する三重らせん構造を形成するようなＣＲＦ２−１２の調節領域（例えば、ＣＲＦ２
−１２プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的な標的ヌクレオチド配列によ
って阻害され得る。一般的にＨｅｌｅｎｅ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕ
ｇ  Ｄｅｓ．６：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅら（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １
４：８０７−１５を参照のこと。
【０１０３】
多様な実施形態において、ＣＲＦ２−１２の核酸は、改善するように塩基性部分、糖部
分またはリン酸骨格を改変し得る（例えば、分子の、安定性、ハイブリダイゼーションま
たは可溶性）。例えば、核酸のデオキシリボースリン酸骨格は、ペプチド核酸を生成する
ように改変され得る（Ｈｙｒｕｐら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：
５−２３を参照のこと）。本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド核酸」または
「ＰＮＡ」は、核酸擬態（例えば、ＤＮＡ擬態）をいい、これはデオキシリボースリン酸
骨格が、シュードペプチド骨格によって置きかえられ、そして４つの天然の核酸塩基のみ
が残る。ＰＮＡの天然骨格は、低いイオン強度の条件下でＤＮＡおよびＲＮＡを特異的に
ハイブリダイゼーション可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈ
ｙｒｕｐら（１９９６）上記；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）ＰＮＡＳ  ９
３：１４６７０−６７５に記載されるような標準固相ペプチド合成プロトコルを使用して
実行され得る。
【０１０４】
ＣＲＦ２−１２のＰＮＡは、治療用途および診断用途において使用され得る。例えば、
ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳停止を誘導するかまたは複製を阻害することによって
、遺伝子発現の配列特異的改変のためのアンチセンス薬剤または抗原薬剤として使用され
得る。ＣＲＦ２−１２のＰＮＡはまた、例えば、ＰＣＲクランピングを方向付けるＰＮＡ
；他の酵素と組み合わせて用いる場合、人工的な制限酵素（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（
Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）上記））；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーショ
ンのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐら（１９９６），上記；Ｐｅｒｒｙ−
Ｏ’Ｋｅｅｆｅ（１９９６），上記）による、例えば、遺伝子中の単一塩基対の変異の分
析において使用され得る。
【０１０５】
別の実施形態において、ＣＲＦ２−１２のＰＮＡは、例えば、それらの安定性または細
胞内への取り込みを増強するために、ＰＮＡに対して親油性基または他のヘルパー基を結
合することによって、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成によって、あるいはリポソームまたは
当業者に公知の薬物送達の他の技術を使用によって改変され得る。例えば、ＰＮＡおよび
ＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得るＣＲＦ２−１２のＰＮＡ−ＤＮＡキメラが、生成さ
れ得る。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡポ
リメラーゼがＤＮＡ部分と相互作用するのを可能にする一方で、ＰＮＡ部分は高い結合親
和性および特異性を提供するのを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキン
グ、核酸塩基の間での多数の結合および配向の期間において選択される適切な長さのリン
カーを用いて、結合され得る（Ｈｙｒｕｐ（１９９６）上記）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの
合成は、上記のＨｙｒｕｐ（１９９６）およびＦｉｎｎら（１９９６）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉ
ｄｓ  Ｒｅｓ  ２４：３３５７−６３中に記載されるように実行され得る。例えば、ＤＮ
Ａ鎖は、標準ホスホルアミダイトカップリング化学物質を用いて固体支持体上で合成され
得、そして改変されたヌクレオシドアナログ（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）
アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端
との間に使用され得る（Ｍａｇら（１９８９）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １７：５９
７３−８８）。ＰＮＡモノマーは、次いで５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメ
ントを用いてキメラ分子を生産するために、段階的な様式でカップリングされる（Ｆｉｎ
ｎら（１９９６）上記）。あるいは、キメラ分子は、５’ＤＮＡセグメントおよび３’Ｐ
ＮＡセグメントを用いて合成され得る。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇ  
Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  ５：１１１９−１１１２４を参照のこと。
【０１０６】
他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、以下のような他の付加基を含み得る：
ペプチド（例えば、インビボでの標的化宿主レセプターに対する）、または細胞膜を通過
する輸送を促進する試薬（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、
１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開
番号Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号Ｗ
０８９／１０１３４を参照のこと）。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼー
ション標的化切断試薬（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６
：９５８−９７６を参照のこと）または挿入試薬（例えば、Ｚｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒ
ｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて改変され得る。この目的のため
に、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション標的
化架橋剤、輸送試薬、ハイブリダイゼーション標的化切断試薬など）に結合体化され得る
。
【０１０７】
（ＣＲＦ２−１２ポリペプチド）
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、配列が配列番号２、配列番号４、配列番号６
または配列番号１２に提供されるＣＲＦ２−１２様タンパク質を含む。ＣＲＦ２−１２核
酸によってコードされるＣＲＦ２−１２ポリペプチドもまた本発明は、本明細書中に開示
した。例えば、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、変異体タンパク質または改変体タンパク
質を含み、そのＣＲＦ２−１２様活性および生物学的機能を維持するタンパク質をなおコ
ードするが、これらの残基のいずれかがこれらのポリペプチド配列中に示される対応する
残基から変化され得るが、そのＣＲＦ２−１２様活性および生理学的機能、またはそれら
の機能的フラグメントを維持するタンパク質をさらにコードする。ある実施形態において
、２０％以上の残基が、変異体タンパク質または改変体タンパク質中でそのように変化さ
れ得る。ある実施形態において、本発明に従うＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、成熟ポリ
ペプチドである。
【０１０８】
一般的に、ＣＲＦ２−１２機能を保持するＣＲＦ２−１２様改変体は、配列中の特定の
位置の残基が他のアミノ酸によって置換されている任意の改変体を含み、そしてさらなる
残基または親タンパク質の２つの残基の間の残基を挿入する可能性、ならびに親配列から
１つ以上の残基を欠損する可能性をさらに含む。任意のアミノ酸置換、挿入または欠損は
、本発明によって含まれる。順境において、置換は、上記のような保持的置換である。
【０１０９】
本発明の１つの局面は、単離されたＣＲＦ２−１２タンパク質およびその生物学的に活
性な部分、またはそれらの誘導体、フラグメント、アナログまたはホモログに関する。抗
−ＣＲＦ２−１２抗体を産生するために免疫原として使用するための適切なポリペプチド
フラグメントもまた提供される。１つの実施形態において、ネイティブなＣＲＣ２−１２
タンパク質は、標準タンパク質精製技術を用いて、適切な精製スキームによって細胞供給
源または組織供給源から単離され得る。別の実施形態において、ＣＲＦ２−１２タンパク
質は、組換えＤＮＡ技術によって生産される。組換え発現の代替として、ＣＲＦ２−１２
タンパク質またはＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を用いて化学的
に合成され得る。
【０１１０】
「単離された」タンパク質または「精製された」タンパク質あるいはそれらの生物学的
に活性な部分は、ＣＲＦ２−１２タンパク質から誘導体化される細胞供給源または組織供
給源由来の細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まず、あるいは化学的に合成
された場合、化学的前駆体または他の化学物質から実質的に含まない。用語「細胞材料を
実質的に含まない」とは、タンパク質が単離されたまたは組換え生産された細胞の細胞成
分から分離されるＣＲＦ２−１２タンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、
用語「細胞材料を実質的に含まない」とは、約３０％（乾燥重量で）未満の非ＣＲＦ２−
１２タンパク質（「混入タンパク質」としてまた本明細書中で言われる）、より好ましく
は約２０％の非ＣＲＦ２−１２タンパク質、なおより好ましくは約１０％未満の非ＣＲＦ
２−１２タンパク質、そして最も好ましくは約５％未満の非ＣＲＦ２−１２タンパク質を
有するＣＲＦ２−１２タンパク質の調製を含む。ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生
物学的に活性な部分が、組換え生産される場合、好ましくはまた、培養培地を実質的に含
まない、すなわち、培養培地は、約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、そして最
も好ましくは約５％未満のタンパク質調製物の容積を表す。
【０１１１】
用語「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」とは、タンパク質がタン
パク質の合成に関する化学的前駆体または他の化学物質から分離されるＣＲＦ２−１２タ
ンパク質の調製物を含む。１つの実施形態において、用語「化学的前駆体または他の化学
物質を実質的に含まない」は、約３０％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体もしくは非Ｃ
ＲＦ２−１２化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学的前駆体もしくは非ＣＲＦ２
−１２化学物質、なおより好ましくは約１０％未満の化学的前駆体もしくは非ＣＲＦ２−
１２化学物質、そして最も好ましくは約５％未満の化学的前駆体もしくは非ＣＲＦ２−１
２タンパク質化学物質を有するＣＲＦ２−１２タンパク質の調製物を含む。
【０１１２】
ＣＲＦ２−１２タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２−１２タンパク質のア
ミノ酸配列に十分に相同であるかまたはこれに由来するアミノ酸配列（例えば、全長ＣＲ
Ｆ２−１２タンパク質よりも少ないアミノ酸配列を含む、配列番号２、配列番号４、配列
番号６または配列番号１２に示されるアミノ酸配列）を含むペプチドを含み、そしてＣＲ
Ｆ２−１２タンパク質の少なくとも１つの活性（例えば、ＩＬ−１０またはＩＬ−２２の
ようなサイトカインへの結合）を示す。代表的には、生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２
−１２タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ＣＲ
Ｆ２−１２タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００以
上のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。
【０１１３】
本発明のＣＲＦ２−１２タンパク質の生物学的に活性な部分は、ＣＲＦ２−１２タンパ
ク質間で保存された、少なくとも１つの上記で同定されたドメインを含み得る。さらに、
このタンパク質の他の領域が欠失した他の生物学的に活性な部分は、組換え技術を使用し
て調製され得、そしてネイティブのＣＲＦ２−１２タンパク質の１以上の機能的活性につ
いて評価され得る。
【０１１４】
１つの実施形態において、ＣＲＦ２−１２タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配
列番号６または配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、
ＣＲＦ２−１２タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１２
に実質的に相同であり、そして配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１２
のタンパク質の機能的活性を保持するが、なお、以下に詳細に記載するような天然の対立
遺伝子バリエーションまたは変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。従って、別の
実施形態において、ＣＲＦ２−１２タンパク質は、配列番号２、配列番号４、配列番号６
または配列番号１２のアミノ酸配列に少なくとも約４５％相同なアミノ酸配列を含み、そ
して配列番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１２のＣＲＦ２−１２タンパク
質の機能的活性を保持するタンパク質である。
【０１１５】
本発明のＣＲＦ２−１２ポリペプチドはまた、配列番号２のアミノ酸２１〜６２と比較
して、そのアミノ酸配列中に１以上（例えば、２、３、５、１０、１５、２０または２５
以上）の置換を有するポリペプチドを含む。
【０１１６】
（２つ以上の配列間の相同性を決定する）
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性％を決定するために、これらの配列を、
最適な比較目的のために整列させる（例えば、これらの配列間の最適なアラインメントの
ために、比較されている配列のいずれかに、ギャップが導入され得る）。対応するアミノ
酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドが、次いで比較され
る。第一の配列中の位置が、第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌク
レオチドで占められる場合、この分子は、その位置で相同である（すなわち、本明細書中
で使用される場合、アミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性
」と等価である）。
【０１１７】
核酸配列の相同性は、２つの配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当
該分野で公知のコンピュータプログラム（例えば、ＧＣＧプログラムパッケージにおいて
提供されるＧＡＰソフトウェア）を使用して決定され得る。ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷ
ｕｎｓｃｈ  １９７０  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３−４５３を参照のこと。以
下の核酸配列比較のための設定（ＧＡＰ生成ぺナルティー５．０およびＧＡＰ伸長ペナル
ティー０．３）を用いて、ＧＣＧ  ＧＡＰソフトウェアを使用して、上記で言及されるア
ナログ核酸配列のコード領域は、配列番号１、配列番号３、配列番号５または配列番号１
１に示されるＤＮＡ配列のＣＤＳ（コード）部分と、好ましくは、少なくとも７０％、７
５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性の程度を示す。
【０１１８】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が、比較
される特定の領域にわたって、残基毎を基礎として同一である程度をいう。用語「配列同
一性の割合」は、比較される領域にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、同一
な核酸塩基（例えば、核酸の場合、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が両方の配列において
存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得て、比較される領域中の全位置数（
すなわち、ウインドウサイズ）によって一致した位置の数を除算し、そして結果に１００
を乗じて配列同一性の割合を得ることによって計算される。用語「実質的に同一」は、本
明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、このポリヌクレオチド
は、比較される領域にわたって参照配列と比較した場合、少なくとも８０％の配列同一性
、好ましくは少なくとも８５％の同一性、そしてしばしば９０〜９５％の配列同一性、よ
り通常は少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。用語「ポジティブ残基の割
合」は、比較される領域にわたって２つの最適に整列された配列を比較し、上記のように
、同一および保存的アミノ酸置換が両方の配列において存在する位置の数を決定して、一
致した位置の数を得て、比較される領域中の全位置数（すなわち、ウインドウサイズ）に
よって一致した位置の数を除算し、そして結果に１００を乗じてポジティブ残基の割合を
得ることによって計算される。
【０１１９】
（キメラタンパク質および融合タンパク質）
本発明はまた、ＣＲＦ２−１２のキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。
本明細書中で使用される場合、ＣＲＦ２−１２の「キメラタンパク質」または「融合タン
パク質」は、非ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに作動可能に連結したＣＲＦ２−１２ポリペ
プチドを含む。「ＣＲＦ２−１２ポリペプチド」は、ＣＲＦ２−１２に対応するアミノ酸
配列を有するポリペプチドをいうが、「非ＣＲＦ２−１２ポリペプチド」は、ＣＲＦ２−
１２タンパク質に実質的に相同でないタンパク質（例えば、ＣＲＦ２−１２タンパク質と
は異なるタンパク質および同じかまたは異なる生物由来のタンパク質）に対応するアミノ
酸配列を有する。ＣＲＦ２−１２融合タンパク質において、ＣＲＦ２−１２ポリペプチド
は、ＣＲＦ２−１２タンパク質の全てまたは一部に対応し得る。１つの実施形態において
、ＣＲＦ２−１２融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１２タンパク質の少なくとも１つの生物
学的に活性な部分を有する。別の実施形態において、ＣＲＦ２−１２融合タンパク質は、
ＣＲＦ２−１２タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を有する。融合タン
パク質において、用語「作動可能に連結される」は、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドおよび
非ＣＲＦ２−１２ポリペプチドが、互いにインフレームで融合していることを示すように
意図される。非ＣＲＦ２−１２ポリペプチドは、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドのＮ末端ま
たはＣ末端に融合され得る。
【０１２０】
例えば、１つの実施形態において、ＣＲＦ２−１２融合タンパク質は、第二のタンパク
質（すなわち、非ＣＲＦ２−１２タンパク質）の細胞外ドメインまたは第二のタンパク質
（すなわち、非ＣＲＦ２−１２タンパク質）の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインのい
ずれかに作動可能に連結されたＣＲＦ２−１２を含む。このような融合タンパク質は、Ｃ
ＲＦ２−１２の活性を調節する化合物についてのスクリーニングアッセイにおいてさらに
使用され得る（このようなアッセイは、以下に詳細に記載される）。
【０１２１】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、ＣＲＦ２−１２配列がＧＳＴ（すなわ
ち、グルタチオンＳトランスフェラーゼ）配列のＣ末端に融合している、ＧＳＴ−ＣＲＦ
２−１２融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＣＲＦ２−１２の
精製を容易にし得る。
【０１２２】
別の実施形態において、この融合タンパク質は、１以上のドメインを含むＣＲＦ２−１
２配列が、免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバー由来の配列に融合している、
ＣＲＦ２−１２−免疫グロブリン融合タンパク質である。
【０１２３】
本発明のＣＲＦ２−１２融合タンパク質（例えば、ＣＲＦ２−１２−免疫グロブリン融
合タンパク質）は、薬学的組成物中に組み込まれ、そして被験体に投与されて、細胞表面
レセプターとそのリガンドとの間の相互作用を阻害または増大し得る。これは、以下のい
ずれかによって生じる：１）このレセプターについて利用可能なリガンドに結合し、そし
て除去する（バイオアベイラビリティーに影響を与えるリガンドの、Ｆｃ媒介性の除去）
；２）リガンドに結合し、そしてこのリガンドが細胞レセプターに結合する能力をブロッ
クする（拮抗または中和）；３）別のＣＲＦメンバーと結合し、それによって下流のシグ
ナル伝達カスケードを調節（例えば、阻害）する；４）リガンドまたは別のＣＲＦのいず
れかと結合し、リガンドの活性を促進する。これら全ての機構によって、ＣＲＦ２−１２
タンパク質を使用して、ＣＲＦ２レセプターとその同族リガンドとの間の相互作用（例え
ば、ＩＬ−１０とＩＬ−１０レセプターとの間の相互作用、およびＩＬ−２２とＩＬ−２
２レセプターとの間の相互作用）を調節し得る。
【０１２４】
ＣＲＦ２−１２リガンド／ＣＲＦ２−１２相互作用の阻害は、サイトカインおよびケモ
カインカスケード機構の変更による、増殖障害および分化障害（例えば、癌、細胞生存の
調節（例えば、促進または阻害））ならびに免疫調節障害、自己免疫、移植および炎症の
両方の処置のために、治療的に使用され得る。さらに、本発明のＣＲＦ２−１２−免疫グ
ロブリン融合タンパク質を、免疫原として使用して、被験体における抗ＣＲＦ２−１２抗
体を生成し得、ＣＲＦ２−１２リガンドを精製し得、そしてスクリーニングアッセイにお
いて、ＣＲＦ２−１２とＣＲＦ２−１２リガンドとの相互作用を阻害する分子を同定し得
る。
【０１２５】
本発明のＣＲＦ２−１２のキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的な組換え
ＤＮＡ技術によって生成され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ
フラグメントは、従来技術に従って、インフレームで一緒に連結される（例えば、ライゲ
ーションのための平滑末端またはスタッガー末端、適切な末端を提供するための制限酵素
消化、適切な場合の粘着末端の埋め込み（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、所望でない連結を回
避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的連結を使用する）。別の実施形
態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来技術によって合成され得る。
あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅が、引き続いてアニーリングおよび再増幅さ
れてキメラ遺伝子配列を生成し得る、２つの連続遺伝子フラグメント間の相補的な突出部
を生じるアンカープライマーを使用して、実行され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編
）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、
Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照のこと）。さらに、すでに融合部分
（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をコードしている多数の発現ベクターが市販されている
。ＣＲＦ２−１２をコードする核酸は、このような発現ベクター中にクローニングされ得
、その結果、この融合部分は、ＣＲＦ２−１２タンパク質とインフレームで連結される。
【０１２６】
（ポリペプチドライブラリー）
さらに、ＣＲＦ２−１２タンパク質コード配列のフラグメントのライブラリーは、ＣＲ
Ｆ２−１２タンパク質改変体のスクリーニングおよび引き続く選択のために、ＣＲＦ２−
１２フラグメントの多様化した集団を生成するために使用され得る。１つの実施形態にお
いて、コード配列フラグメントのライブラリーは、１分子当たり約１回だけのニックが生
じる条件下でヌクレアーゼを用いてＣＲＦ２−１２コード配列のフラグメントの二本鎖Ｐ
ＣＲフラグメントを処理し、この二本鎖ＤＮＡを変性させ、このＤＮＡを再生させて異な
るニックの入った産物由来のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、
Ｓ１ヌクレアーゼ処理によって、再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、そして得
られたフラグメントのライブラリーを発現ベクター中に連結させることによって、作製さ
れ得る。この方法によって、ＣＲＦ２−１２タンパク質のＮ末端および種々の大きさの内
部フラグメントをコードする発現ライブラリーが誘導され得る。
【０１２７】
点変異または短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をス
クリーニングするため、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライ
ブラリーをスクリーニングするための、いくつかの技術が、当該分野で公知である。この
ような技術は、ＣＲＦ２−１２タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって作製され
る遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングのために適合性である。大きい遺伝子ライ
ブラリーをスクリーニングするための、高スループットの分析を受け入れる、最も広く使
用される技術は、代表的に、複製可能な発現ベクター中に遺伝子ライブラリーをクローニ
ングする工程、得られたベクターのライブラリーを用いて適切な細胞を形質転換する工程
、および所望の活性が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易
にする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させる工程を包含する。ライブラリー中
の機能的変異体の頻度を増強する新技術である、再帰集合変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ
ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）は、ＣＲＦ２−１２改変体を
同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用され得る（Ａｒｋｉｎおよび
Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら
（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：３２７−３３１）。
【０１２８】
（ＣＲＦ２−１２抗体）
ＣＲＦ２−１２タンパク質またはＣＲＦ２−１２タンパク質のフラグメントに対する抗
体もまた、本発明に含まれる。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、免疫グロ
ブリン（Ｉｇ）分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原
に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子をいう。このような抗体と
しては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ポリクローナル、モノクローナル
、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ
発現ライブラリー。一般に、ヒトから得られる抗体分子は、分子中に存在する重鎖の特徴
によって互いに異なるクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＤのいずれか
に関する。特定のクラスは、同様にサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など）を有
する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。抗体に対する本明細
書の言及は、ヒト抗体種の全てのこのようなクラス、サブクラスおよび型に対する言及を
含む。
【０１２９】
本発明の単離されたＣＲＦ２−１２関連タンパク質は、抗原またはその一部もしくはフ
ラグメントとして働くように意図され得、そしてさらに、ポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体の調製のための標準的な技術を使用して、抗原に免疫特異的に結合する抗
体を作製するために、免疫原として使用され得る。全長タンパク質が使用され得るか、あ
るいは本発明は、免疫原としての使用のための、抗原の抗原性ペプチドフラグメントを提
供する。抗原性ペプチドフラグメントは、全長タンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列
番号２、配列番号４、配列番号６または配列番号１２に示されるアミノ酸配列）の少なく
とも６アミノ酸残基を含み、そしてそれらのエピトープを包含し、その結果、このペプチ
ドに対して惹起された抗体は、全長タンパク質もしくはエピトープを含む任意のフラグメ
ントと特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、この抗原性ペプチドは、少なくとも１
０アミノ酸残基または少なくとも１５アミノ酸残基または少なくとも２０アミノ酸残基ま
たは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。この抗原性エピトープに包含される好ましいエ
ピトープは、その表面上に位置するタンパク質の領域であり、一般にこれらは、親水性領
域である。
【０１３０】
本発明の特定の実施形態において、抗原性ペプチドに含まれる少なくとも１つのエピト
ープは、そのタンパク質の表面上に位置するＣＲＦ２−１２関連タンパク質の領域（例え
ば、親水性領域）である。ヒトＣＲＦ２−１２関連タンパク質配列の疎水性分析は、ＣＲ
Ｆ２−１２関連タンパク質のどの領域が特に親水性であるか、従って、抗体産生を標的化
するために有用な表面残基をコードする可能性があるかを示す。抗体産生を標的化するた
めの手段として、親水性および疎水性の領域を示すハイドロパシープロットが、当該分野
で周知の方法（例えば、フーリエ変換を用いるかまたは用いない、Ｋｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉ
ｔｔｌｅまたはＨｏｐｐ  Ｗｏｏｄｓの方法を含む）のいずれかによって作製され得る。
例えば、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ  １９８２、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１４２（その各々が、本明細書中でその全体が参
考として援用される）を参照のこと。抗原性タンパク質またはその誘導体、フラグメント
、アナログもしくはホモログ内の１以上のドメインに特異的な抗体もまた、本明細書中に
提供される。
【０１３１】
本発明のタンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオ
ルソログ（ｏｒｔｈｌｏｇ）は、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の
作製において、免疫原として使用され得る。
【０１３２】
当該分野で公知の種々の手順は、本発明のタンパク質またはその誘導体、フラグメント
、アナログ、ホモログもしくはオルソログに対するポリクローナル抗体またはモノクロー
ナル抗体の産生のために使用され得る（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ  ＥおよびＬａｎｅ  Ｄ、１９８８、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。こ
れらの抗体のいくつかを、以下に考察する。
【０１３３】
（ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、
マウスまたは他の哺乳動物）が、ネイティブなタンパク質、その合成改変体または上記の
誘導体を用いる１回以上の注射によって、免疫され得る。適切な免疫原性調製物は、例え
ば、天然に存在する免疫原性タンパク質、免疫原性タンパク質を示す化学合成ポリペプチ
ド、または組み換え的に発現される免疫原性タンパク質を含み得る。さらに、このタンパ
ク質は、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが知られている第二のタンパク
質に結合体化され得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、以下が挙げられる
が、これらに限定されない：キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ
サイログロブリンおよびダイズトリプシンインヒビター。この調製物は、アジュバントを
さらに含み得る。免疫学的応答を増大させるために使用される種々のアジュバントとして
は、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロイント（完全または不完全）、鉱
物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、界面活性剤（例えば、リゾレシチン、プルロニ
ックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、ジニトロフェノールなど）
、ヒトにおいて使用可能なアジュバント（例えば、カルメット−ゲラン杆菌（Ｂａｃｉｌ
ｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）および挫瘡菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ  ｐａｒｖｕｍ））または同様の免疫刺激剤。使用され得るアジュバントのさらなる例
としては、ＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルＬｉｐｉｄ  Ａ、合成トレハロ
ースジコリノミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。
【０１３４】
この免疫原性タンパク質に対するポリクローナル抗体分子は、哺乳動物（例えば、血液
）から単離され得、そして周知技術（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを使用す
るアフィニティークロマトグラフィー（これは、免疫血清のＩｇＧ画分を主に提供する）
）によってさらに精製され得る。続いて、またはあるいは、免疫グロブリン探索の標的で
ある特定の抗原またはそのエピトープは、免疫アフィニティークロマトグラフィーによっ
て免疫特異的抗体を精製するために、カラム上に固定化され得る。免疫グロブリンの精製
は、例えば、Ｄ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｓｔ，Ｉｎｃ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  ＰＡにより刊行、第１４巻、第８号
（２０００年４月７日）、２５〜２８頁）によって考察される。
【０１３５】
（モノクローナル抗体）
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノク
ローナル抗体組成物」は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる抗
体分子の１つの分子種のみを含む、抗体分子の集団をいう。特に、モノクローナル抗体の
相補性決定領域（ＣＤＲ）は、集団の全ての分子において同一である。従って、ＭＡｂは
、抗原結合部位に対する特有の結合親和性によって特徴づけられる抗原の特定のエピトー
プと免疫反応し得る抗原結合部位を含む。
【０１３６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔ
ｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載される方法）を用いて調製さ
れ得る。ハイブリドーマ方法において、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物
は、免疫化剤を用いて代表的に免疫化されて、その免疫化剤に特異的に結合する抗体を生
成するか、または生成し得るリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、インビボで免
疫化され得る。
【０１３７】
免疫化剤としては、代表的に、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タン
パク質が挙げられる。一般に、ヒト起源の細胞が所望される場合、末梢血リンパ球が使用
され、または非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合、脾臓細胞もしくはリンパ節細胞が
使用される。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を
用いて不死化細胞株に融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９〜１０３）。不死化細
胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞（特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄
腫細胞）である。通常、ラットまたはマウスの骨髄腫細胞株が、用いられる。ハイブリド
ーマ細胞は、好ましくは、融合していない不死化細胞の増殖および生存を阻害する１つ以
上の物質を含む適切な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチ
ングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損する
場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的にヒポキサンチン、アミノプテリン、
およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖
を妨げる。
【０１３８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による抗体の安定
な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性の細胞株である。よ
り好ましい不死化細胞株は、マウス骨髄腫株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇ
ｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａから入手可能である
。ヒト骨髄種細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫（ｈｅｔｅｒｏｍｙｅｌｏｍａ）細
胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生成について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ
．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌ
ｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
，（１９８７）ｐｐ．５１〜６３）。
【０１３９】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対するモノクローナル抗
体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成され
るモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降または、インビトロ結合アッセイ（例え
ば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ））
によって決定される。このような技術およびアッセイは、当該分野において公知である。
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によっ
て決定され得る。好ましくは、標的抗原に対して高い程度の特異性および高い結合親和性
を有する抗体が、単離される。
【０１４０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが、限界希釈手順によってサブク
ローン化され得、そして標準的な方法によって増殖され得る。この目的のための適切な培
養培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培
地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳
動物における腹水のようにインビボで増殖され得る。
【０１４１】
サブクローン化によって分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製
手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）によって培養培地ま
たは腹水液から単離または精製され得る。
【０１４２】
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５
６７号に記載される方法）によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコード
するＤＮＡは、従来の手順（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に
特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を用いて容易に単
離され、そして配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの
好ましい供給源として作用する。一旦単離されると、ＤＮＡは、組み換え宿主細胞におけ
るモノクローナル抗体の合成を得るために、発現ベクター中に配置され得、次いでこれは
宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、また
はトランスフェクトしなければ免疫グロブリンタンパク質を生成しない骨髄腫細胞）中に
トランスフェクトされる。このＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖定常ドメインおよびヒト
軽鎖定常ドメインについてのコード配列を、相同なマウス配列の代わりに置換することに
よって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８、
８１２〜１３（１９９４））または非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列
の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって、改変され
得る。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換
され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得キメ
ラ二価抗体を作製し得る。
【０１４３】
（ヒト化抗体）
本発明のタンパク質抗原に対する抗体は、さらにヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る
。これらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を発生させる
ことなくヒトに投与するのに適切である。抗体のヒト化形態は、主にヒト免疫グロブリン
の配列から構成され、そして非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含む、キメラ免
疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化は、げっ歯類
のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応するヒト抗体の配列と置換することによって、Ｗｉｎ
ｔｅｒおよびその同僚の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２〜５２５（
１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３〜３２７（１９８８
）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）
）に従って実行され得る（米国特許第５，２２５，５３９号もまた参照のこと）。いくつ
かの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖ骨格残基は、対応する非ヒト残基によって置
換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲもしくは骨格配列
でも見出されない残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、実質的に全体の少なくとも１
つ、そして代表的には２つの可変ドメインを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣ
ＤＲ配列は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ配列に対応し、そして全てまたは実質的に全
ての骨格領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の骨格領域である。ヒト化抗体は
また、好ましくは免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンの
免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ））少なくとも一部のを含む（Ｊｏｎｅｓら、１９８６；
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ
．Ｂｉｏｌ．，２：５９３〜５９６（１９９２））。
【０１４４】
（ヒト抗体）
完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全体の配列が本質的にヒト遺
伝子から生じる、抗体分子に関する。このような抗体は、本明細書中で「ヒト抗体」また
は「完全ヒト抗体」といわれる。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトＢ細
胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：
７２）およびヒトモノクローナル抗体を生成するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら
、１９８５  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  Ｔ
ＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７〜９６を参照のこと）によ
って調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そし
てヒトハイブリドーマを用いることによってか（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ  Ｎａ
ｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０：２０２６〜２０３０）またはインビトロでエプ
スタインバーウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、１
９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥ
ＲＡＰＹ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７〜９６を参照のこと）生成さ
れ得る。
【０１４５】
さらに、ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリーを含む、さらなる技術を
用いて生成され得る（ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８
１（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、トランスジェ
ニック動物（例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が、部分的または完全に不活性化され
たマウス）中に導入することによって作製され得る。チャレンジの際に、ヒト抗体生成が
観察され、これは遺伝子再配列、アセンブリ、および抗体レパートリーを含む全ての点で
ヒトにおいて見出されるものに密接に類似する。このアプローチは、例えば、米国特許第
５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５
，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号；およびＭ
ａｒｋｓら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９〜７８３（１９９２））；Ｌ
ｏｎｂｅｒｇら（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６〜８５９（１９９４））；Ｍｏｒｒｉｓ
ｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２〜１３（１９９４））；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら（Ｎａ
ｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５〜５１（１９９６））；Ｎｅｕｂ
ｅｒｇｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６））
；ならびにＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１３  ６５〜９３（１９９５））に記載される。
【０１４６】
ヒト抗体は、抗原によるチャレンジに応答した動物の内因性抗体よりもむしろ完全なヒ
ト抗体を生成するように改変されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて、さらに生成
され得る（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／０２６０２を参照のこと）。非ヒト宿主において重
鎖免疫グロブリンおよび軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子は、不適格であり
、そしてヒト重鎖免疫グロブリンおよびヒト軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝
子座が、宿主のゲノム中に挿入される。例えば、ヒト遺伝子は、必須のヒトＤＮＡセグメ
ントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。次いで、全ての所望の改変を提供する
動物が、トランスジェニック動物の交雑によって子孫として得られ、この中間トランスジ
ェニック動物は、改変の補体を完全には含まない。このような非ヒト動物の好ましい実施
形態は、マウスであり、そしてＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／３３７３５およびＷＯ９６／３
４０９６に開示されるようにＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭといわれる。この動物は、完全なヒ
ト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を生成する。この抗体は、目的の免疫原で免疫化され
た後、動物から直接得られ得るか（例えば、ポリクローナル抗体の調製として）、あるい
は動物由来の不死化Ｂ細胞（例えば、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ）か
ら直接得られ得る。さらに、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子は
、抗体を直接得るために回収され、そして発現され得るか、または抗体のアナログ（例え
ば、単鎖Ｆｖ分子）を得るためにさらに改変され得る。
【０１４７】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠損した非ヒト宿主（マウスとして例示される）を
生成する方法の例は、米国特許第５，９３９，５９８号に開示される。これは、遺伝子座
の再配列および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を妨げるために
、胚幹細胞における少なくとも１つの内因性重鎖遺伝子座由来のＪセグメント遺伝子を欠
失することを含む方法によって得られ得、この欠失は、選択マーカーコードする遺伝子を
含む標的化ベクターによってもたらされ；そしてその体細胞および生殖細胞が選択マーカ
ーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスが、その肺幹細胞から生成される
。
【０１４８】
目的の抗体（例えば、ヒト抗体）を生成する方法は、米国特許第５，９１６，７７１号
に開示される。これは、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、培養
物中の一方の哺乳動物宿主細胞中に導入する工程、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を
含む発現ベクターを、別の哺乳動物宿主細胞中に導入する工程、およびこれら２つの細胞
を融合してハイブリッド細胞を形成する工程を含む。このハイブリッド細胞は、重鎖およ
び軽鎖を含む抗体を発現する。
【０１４９】
この手順のさらなる改善において、免疫原上の臨床的に関連するをエピトープを同定す
る方法、および高い親和性で関連のエピトープに免疫特異的に結合する抗体を選択する相
関的な方法が、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／５３０４９に開示される。
【０１５０】
（Ｆａｂフラグメントおよび単鎖抗体）
本発明に従って、本発明の抗原タンパク質に特異的な単鎖抗体の生成のための技術が、
適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、タン
パク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログについて所望の特異
性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ有効な同定を可能にする、Ｆａ
ｂ発現ライブラリーの構築のための方法が、適用され得る（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８
９  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと）。タンパク質抗原に対
するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野で公知の技術によって生成され
得、この抗体フラグメントとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ｉ）
抗体分子のペプシン消化によって生成されるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（
ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるＦａｂフ
ラグメント；（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いて抗体分子を処理することによって
生成されるＦａｂフラグメント、ならびに（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０１５１】
（二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））
二重特異性抗体は、モノクローナル抗体であり、好ましくは、少なくとも２つの異なる
抗原に対して結合特異性を有するヒト抗体またはヒト化抗体である。本場合において、結
合特異性の１つは、本発明の抗原性タンパク質に関する。２番目の結合標的は、任意の他
の抗原であり、そして有利には、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプタ
ーサブユニットである。
【０１５２】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において公知である。伝統的に、二重特異
性抗体の組み換え生成は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、ここ
で、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，Ｎａ
ｔｕｒｅ，３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の無
作為な分別に起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗
体分子の可能性のある混合物を生成し、ここでこれらの１つのみが、正確な二重特異的構
造を有する。正確な分子の精製は、通常アフィニティーグロマトグラフィー工程によって
達成される。類似の手順が、１９９３年５月１３日に公開されたＷＯ９３／０８８２９、
およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５〜３６５９
に開示される。
【０１５３】
所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリ
ン定常ドメイン配列に融合され得る。この融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣ
Ｈ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖定常ドメインと共になされる。少
なくとも１つの融合物に存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ
１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ、および所
望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクター中に挿入され
、そして適切な宿主生物中で同時発現される。二重特異性抗体を生成するためのさらなる
詳細について、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
，１２１：２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１５４】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対間の界面は
、組み換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーのパーセンテージを最大化するため
に操作され得る。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含
む。この方法において、第１の抗体分子の界面に由来する１つ以上の小さいアミノ酸側鎖
は、より大きい側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きな側
鎖に対する同一または類似のサイズ鎖の代償の「空洞」は、大きいアミノ酸側鎖と小さい
アミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）とを置換することによって第２の抗
体分子の界面に生成される。これは、他の所望でない最終産物（例えば、ホモダイマー）
を超えらヘテロダイマーの収率を増加する機構を提供する。
【０１５５】
二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメントとして調製され得る（例えば、Ｆ
（ａｂ’）２二重特異性抗体）。抗体フラグメントからの二重特異性抗体を生成するため
の技術は、文献中に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製
され得る。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタク
トな抗体が、タンパク質分解的に切断されてＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順
を記載する。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還
元されて、近隣のジチオールを安定化し、そして分子内ジスルフィド形成を妨げる。次い
で、生成されたＦａｂ’フラグメントが、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転
換される。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つが、メルカプトエチルアミンで還元す
ることによってＦａｂ’−チオールに再転換され、そして当モル量の他のＦａｂ’−ＴＮ
Ｂ誘導体と混合されて、二重特異性抗体を形成する。この生成された二重特異性抗体は、
酵素の選択的固定化のための因子として使用され得る。
【０１５６】
さらに、Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され得、そして化学的に
カップリングして二重特異性抗体を形成し得る。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ
’）２分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから別々に分泌
され、そしてインビトロで指向される化学カップリングに供され、二重特異性抗体を形成
した。従って、この形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する
細胞および正常なヒトＴ細胞に結合し得、そしてヒト胸部腫瘍標的に対するヒト細胞傷害
性リンパ球の溶解活性を誘発し得る。
【０１５７】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種
々の技術がまた、記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用い
て生成されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７
〜１５５３（１９９２）。Ｆｏｓタンパク質およびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッ
パーペプチドは、遺伝子融合によって異なる２つの抗体のＦａｂ’部分に連結された。こ
の抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されて、モノマーを形成し、次いで再度酸化さ
れて抗体ヘテロダイマーを形成した。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のために
利用され得る。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９０：６４４４〜６４４８（１９９３）によって記載される「ジアボディー（ｄｉａｂ
ｏｄｙ）」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構を提供して
いる。このフラグメントは、短すぎて同じ鎖の２つのドメインの間で対形成が不可能な、
リンカーによって軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含
む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメインおよびＶＬドメインを、別のフラグメン
トの相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対形成させ、これによって２つの抗原結合部位を形
成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーの使用による二重特異性抗体フラグメントを作製す
るための別のストラテジーがまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１５２：５３６８（１９９４）を参照のこと。
【０１５８】
２つよりも多い結合価を有する抗体が、企図される。例えば、三重特異的抗体が調製さ
れる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１５９】
例示的な二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに結合し得、それらのエピトープ
のうちの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。あるいは、免疫グロブ
リン分子の抗抗原性アームは、特定の抗原を発現する細胞に、細胞防御機構を合わせるた
めに、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）、ＩｇＧ
に対するＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ
（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））のような白血球上の誘因（ｔｒｉｇｇ
ｅｒｉｎｇ）分子と結合するアームと、組合せられ得る。二重特異性抗体をまた使用して
、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を方向付けし得る。これらの抗体は、抗原
結合アームと、細胞傷害性薬剤または放射性核種キレート剤（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、Ｄ
ＰＴＡ、ＤＯＴＡまたはＴＥＴＡ）に結合するアームを有する。目的の別の二重特異性抗
体は、本明細書中で記載されるタンパク質抗原に結合し、そしてさらに、組織因子（ＴＦ
）に結合する。
【０１６０】
（ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は、共有結合され
た２つの抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を所望しない細胞
に標的化すること（米国特許第４，６７６，９８０号）、そして、ＨＩＶ感染の処置（Ｗ
Ｏ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）が提唱されてい
る。抗体が合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用し
てインビトロで調製され得ることが、企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交
換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この
目的に適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチル
イミデート、ならびに例えば米国特許第４，６７６，９８０号中で開示された試薬が挙げ
られる。
【０１６１】
（エフェクター機能操作）
エフェクター機能に関して、本発明の抗体を、例えば癌の処置における抗体の有効性を
増大するために改変することが所望され得る。例えば、システイン残基が、Ｆｃ領域に導
入され得、これによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。こ
のように生成されたホモダイマー抗体は、改良された内部移行能力および／または増大さ
れた補体媒介細胞死滅、ならびに抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａ
ｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１〜１１９５（１９９２）およびＳｈｏ
ｐｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：２９１８〜２９２２（１９９２）を参照のこと
。増大した腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ、５３：２５６０〜２５６５（１９９３）中に記載のようなヘテロ二官能
性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、二重のＦｃ領域を有する抗体が操作され得
、これによって、増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ
ら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、３：２１９〜２３０（１９８９
）を参照のこと。
【０１６２】
（免疫結合体）
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素
的活性毒素、またはそのフラグメント）、または放射性同位体（すなわち放射性結合体）
のような細胞傷害性薬剤に結合体化された抗体を含む、免疫結合体に関する。
【０１６３】
このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は、上記されている。使用され
得る酵素的活性毒素およびそのフラグメントとしては、以下が挙げられる：ジフテリアＡ
鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、αサルシ
ン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏ
ｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、
ニガウリインヒビター、カルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、ｓａｐ
ａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、
マイトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉ
ｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）お
よびトリコセセネス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）。種々の放射性核種が、放射性結合
体化抗体の生成に利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９
０Ｙおよび１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１６４】
抗体と細胞障害性薬剤との結合体は、以下のような種々の二官能性タンパク質カップリ
ング剤を使用して作製され得る：Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール
）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオレン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘
導体誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えばジスクシ
ンイミジルスブレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化
合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム
誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソ
シアネート（例えば、トルエン（ｔｏｌｙｅｎｅ）２，６−ジイソシアネート）、および
ビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン。例え
ば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：１０９８（１９８
７）中に記載のように調製され得る。Ｃ１４標識化１−イソチオシアネートベンジル−３
−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレ
オチドの結合体化のための例示的なキレート剤である。ＷＯ  ９４／１１０２６を参照の
こと。
【０１６５】
別の実施形態において、抗体−レセプター結合体が患者に投与され、続いて除去剤を使
用して循環から非結合結合体が除去され、次いで、細胞障害性薬剤と結合体化されている
「リガンド」（アビジン）が投与されるような腫瘍予備標的化において利用するために、
抗体は、「レセプター」（例えばストレプトアビジン）に結合体化され得る。
【０１６６】
（ＣＲＦ２−１２組換え発現ベクターおよび宿主細胞）
本発明の別の局面は、ＣＲＦ２−１２タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、
アナログ、もしくはホモログをコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクター
に関する。本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」は、連結されている別の核酸を
輸送し得る核酸分子をいう。ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さ
らなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二本鎖ＤＮＡループをいう。ベクターの別の
型はウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントがそのウイルスゲノム
に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およ
びエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらのベクターが導入される宿主細胞中で自律複
製し得る。他のベクター（非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞へ導入する際に
、宿主細胞のゲノムへ組み込まれ、これによって、宿主ゲノムとともに複製される。さら
に、特定のベクターは、これらのベクターが作動的に連結された遺伝子の発現を指向し得
る。このようなベクターは、本明細書中で「発現ベクター」といわれる。一般に、組換え
ＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細
書中において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが、最も一般的に使用
されるベクターの形態であるので、互換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、
ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連
ウイルス）のような他の形態の発現ベクター含むことが意図され、これらは、同等の機能
を果たす。
【０１６７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適切な形態で、本発明
の核酸を含み、これは、この組換え発現ベクターが、発現のために使用される宿主細胞に
基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味し、この調節配列は、発現され
る核酸配列に作動可能に連結される。組換え発現ベクターにおいて、「作動可能に連結さ
れた」は、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系における、ま
たは、ベクターが宿主細胞に導入される場合は宿主細胞における）そのヌクレオチド配列
の発現を可能にする様式において、調節配列に連結されることを意味することが意図され
る。
【０１６８】
用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例
えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例え
ば、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴ
ＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａ
ｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）中に記載される。調節配列としては、多くの
宿主細胞型においてヌクレオチド配列の構成的な発現を指向する調節配列、および特定の
宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指向する調節配列（例えば、組織特異的
調節配列）が挙げられる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望
されるタンパク質の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが、当業者によって理
解される。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入し、これによって本明細書中に記載す
るような核酸によってコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質または融
合ペプチドを含む）（例えば、ＣＲＦ２−１２タンパク質、ＣＲＦ２−１２タンパク質の
変異形態、融合タンパク質など）を生成し得る。
【０１６９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核生物細胞または真核生物細胞におけるＣＲＦ２−
１２タンパク質の発現のために設計され得る。例えば、ＣＲＦ−２−１２タンパク質は、
細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス
発現ベクターを使用して）、酵母細胞または哺乳動物細胞中で発現され得る。適切な宿主
細胞はさらに、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ
Ｙ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅ
ｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）中で考察される。あるいは、組換
え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用し
て、インビトロで転写され得、そして翻訳され得る。
【０１７０】
原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれか
の発現を指向する、構成型プロモーターまたは誘導型プロモーターを含むベクターを用い
て、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて最もよく実施される。融合ベクターは、
多くのアミノ酸を、そのベクター中にコードされているタンパク質に（通常は、組み換え
タンパク質のアミノ末端に）付加する。このような融合ベクターは、代表的には以下の３
つの目的を果たす：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増大すること；（ｉｉ）組換えタン
パク質の可溶性を増大すること；および（ｉｉｉ）アフィニティー精製におけるリガンド
として作用することで、組換えタンパク質の精製に役立つこと。融合発現ベクターにおい
て、しばしば、タンパク質切断部位が、融合部分と組換えタンパク質との接合部に誘導さ
れ、融合部分からの組換えタンパク質の分離、続く融合タンパク質の精製が可能となる。
このような酵素およびそれらの同族認識配列としては、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエ
ンテロキナーゼが挙げられる。代表的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８８．Ｇ
ｅｎｅ  ６７：３１〜４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂ
ｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａ
ｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらは、それぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質と
融合させる。
【０１７１】
適切な誘導型非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ
ら、（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅ
ｒら、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ
ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ
，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０〜８９）が挙げられる。
【０１７２】
Ｅ．ｃｏｌｉ中での組換えタンパク質発現を最大にするための１つのストラテジーは、
組換えタンパク質をタンパク質分解性切断する能力に障害がある宿主細菌で、このタンパ
ク質を発現することである。例えば、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩ
ＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １８５，
Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）１１９
〜１２８を参照のこと。別のストラテジーは、各アミノ酸についての個々のコドンがＥ．
ｃｏｌｉで優先的に利用されるコドンとなるように、発現ベクターに挿入される核酸の核
酸配列を変化させることである（例えば、Ｗａｄａら、１９９２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８を参照のこと）。本発明の核酸配列のこのような改
変は、標準的ＤＮＡ合成技術によって実施され得る。
【０１７３】
別の実施形態において、ＣＲＦ２−１２発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵
母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅ中で発現するためのベクターの例と
しては、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら、１９８７、ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９〜
２３４）、ｐＭＦａ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、１９８２、Ｃｅｌｌ  
３０：９３３〜９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら、１９８７、Ｇｅｎｅ  ５４
：１１３〜１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓ
ａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）およびｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，
Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。
【０１７４】
あるいは、ＣＲＦ２−１２は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、昆虫細胞中
で発現され得る。培養された昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利
用可能なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、１９８３
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６〜２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕ
ｃｋｌｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、１９８９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１〜３９）
が挙げられる。
【０１７５】
なお別の実施形態において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳
動物細胞中で発現される。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ、
１９８７．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら、１
９８７．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７〜１９５）が挙げられる。哺乳動物中で使用される場
合、発現ベクターの制御機能は、しばしば、ウイルスの調節エレメントによって提供され
る。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメ
ガロウイルス、およびサルウイルス４０由来である。原核生物細胞および真核生物細胞の
両方に適切な他の発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ
：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒ
ｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の
第１６章および第１７章を参照のこと。
【０１７６】
別の実施形態において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的
に核酸の発現を指向し得る（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現す
る）。組織特異的調節エレメントは、当該分野で公知である。適切な組織特異的プロモー
ターの非限定的な例としては、以下が挙げられる：アルブミンプロモーター（肝臓特異的
；Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７７）、リンパ系
特異的プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ、１９９８、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．４３：２３５〜２７５）（特に、Ｔ細胞レセプターの特定のプロモーター（Ｗｉｎｏ
ｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９、ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９〜７３３）および
免疫グロブリンの特定のプロモーター（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３、Ｃｅｌｌ  ３３：
７２９〜７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８３、Ｃｅｌｌ  ３３：７
４１〜７４８））、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモー
ター；ＢｙｒｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３〜５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら、
１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２〜９１６）および乳腺特異的プロモーター（
例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州出願公開番号２
６４，１６６）。発生により調節されるプロモーター（例えば、マウスｈｏｘプロモータ
ー（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４〜３７
９）およびαフェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ、１
９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７〜５４６））もまた、含まれる。
【０１７７】
本発明はさらに、アンチセンス方向で発現ベクターにクローニングされた本発明のＤＮ
Ａ分子を含む、組換え発現ベクターを提供する。すなわち、そのＤＮＡ分子は、ＣＲＦ２
−１２  ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の（そのＤＮＡ分子の転写によ
る）発現を可能とする様式において、調節配列に作動的に連結される。アンチセンス方向
にクローニングされた核酸に作動的に連結される調節配列（これは、種々の細胞型におい
て、アンチセンスＲＮＡ分子の連続的発現を指向し、例えば、ウイルスプロモーターおよ
び／もしくはエンハンサーである）が選択され得るか、または、アンチセンスＲＮＡの構
成的発現か、組織特異的発現もしくは細胞型特異的な発現を指向する調節配列が、選択さ
れ得る。アンチセンス発現ベクターは、高効率の調節領域の制御下でアンチセンス核酸が
生成される、組換えプラスミド、ファージミド、または弱毒ウイルスの形態であり得、こ
れらの活性は、このベクターが導入される細胞型によって決定され得る。アンチセンス遺
伝子を使用する遺伝子発現の調節の考察について、例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、「Ａ
ｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎ
ｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１７８】
本発明の別の局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入される宿主細胞に関する。用
語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書中で互換可能に使用される。この
ような用語は、特定の対象の細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫
もまたいうことが理解される。特定の改変が、変異かまたは環境の影響のいずれかに起因
して、後世代で生じ得るので、このような子孫は、実際は、親細胞とは同一ではないかも
しれないが、本明細書中で使用するような用語の範囲内に、なお含まれる。
【０１７９】
宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。例えば、ＣＲＦ２−
１２タンパク質は、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞、酵母細胞、または哺
乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＣＯ
Ｓ細胞）で発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１８０】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術またはトランスフェクション技術を介して、原
核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。本明細書中で使用する場合、用語「形質
転換」および「トランスフェクション」は、異種核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入
するための、当該分野で認知された種々の技術をいうことが意図され、これらとしては、
リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランス
フェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。宿主細胞
を形質転換するかまたはトランスフェクトするのに適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（
ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ．第２
版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒ
ｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９），および他の実験説明書中に見出され得る。
【０１８１】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、使用される発現ベクターおよび
トランスフェクション技術に依存して、細胞のほんの一部分のみが、異種ＤＮＡをそれら
のゲノムに組込み得るということは、公知である。これらの組込み体を同定し、そして選
択するために、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、一般に、
目的の遺伝子とともに宿主細胞に導入される。種々の選択マーカーとしては、薬剤耐性（
例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサート）を与える選択マーカーが
挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、ＣＲＦ２−１２をコードする核酸と同一
のベクター上で、宿主細胞に導入され得るか、または、別のベクター上で導入され得る。
導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択によって同定され得る
（例えば、選択マーカー遺伝子を取りこんだ細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）。
【０１８２】
本発明の宿主細胞（例えば、培養中の原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞）を使
用して、ＣＲＦ２−１２タンパク質を生成（すなわち発現）し得る。従って、本発明はさ
らに、本発明の宿主細胞を使用して、ＣＲＦ２−１２タンパク質を生成する方法を提供す
る。１つの実施形態において、この方法は、適切な培地中で、本発明の宿主細胞（これに
、ＣＲＦ２−１２タンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入される）を、ＣＲＦ
２−１２タンパク質が生成されるように培養する工程を包含する。別の実施形態において
、この方法はさらに、培地または宿主細胞からＣＲＦ２−１２タンパク質を単離する工程
を包含する。
【０１８３】
（トランスジェニックＣＲＦ２−１２動物）
本発明の宿主細胞はまた、非ヒトトランスジェニック動物を作製するために使用され得
る。例えば、１つの実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＲＦ２−１２タンパク質
コード配列が導入された受精した卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、このような
宿主細胞は、外因性ＣＲＦ２−１２配列がそれらのゲノムに導入された非ヒトトランスジ
ェニック動物または内因性ＣＲＦ２−１２配列が変更された相同組換え動物を作製するた
めに使用され得る。このような動物は、ＣＲＦ２−１２タンパク質の機能および／または
活性を研究するため、ならびにＣＲＦ２−１２タンパク質活性のモジュレーターを同定お
よび／または評価するために有用である。本明細書中で使用される場合、「トランスジェ
ニック動物」とは、その動物の１つ以上の細胞が導入遺伝子を含有する、非ヒト動物、好
ましくは、哺乳動物、より好ましくは、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である
。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ
、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生す
る細胞のゲノム中に組込まれ、そして成熟動物のゲノム中に残存する、外因性ＤＮＡであ
り、それによってトランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織においてコード
された遺伝子の発現を指向する。本明細書中で使用される場合、「相同組換え動物」とは
、内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子が、その動物の発生の前に、内因性遺伝子と動物の細胞（
例えば、動物の胚性細胞）中に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって
変更された、非ヒト動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、マウスである。
【０１８４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＲＦ２−１２コード核酸を、受精した卵母細胞
のオスの前核中に導入することによって（例えば、微量注入、レトロウイルス感染によっ
て）作製され得、そしてこの卵母細胞を、偽妊娠のメスの養育動物中で発生させることを
可能にする。配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１を含む配列は、
非ヒト動物のゲノム中に導入遺伝子として導入され得る。あるいは、ヒトＣＲＦ２−１２
遺伝子の非ヒト相同体（例えば、マウスＣＲＦ２−１２遺伝子）は、ヒトＣＲＦ２−１２
ｃＤＮＡ（上にさらに記載される）に対するハイブリダイゼーションに基づいて単離さ
れ得、そして導入遺伝子として使用され得る。イントロン配列およびポリアデニル化シグ
ナルはまた、導入遺伝子に含有されて、導入遺伝子の発現効率を増加させ得る。組織特異
的調節性配列は、特定の細胞に対してＣＲＦ２−１２タンパク質の発現を指向するように
、ＣＲＦ２−１２導入遺伝子に作動可能に連結され得る。胚操作および微量注入を介した
、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作製するための方法は、当該分野
において慣用的になってきており、そして例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；同
第４，８７０，００９号；および同第４，８７３，１９１号；ならびにＨｏｇａｎ、１９
８６．ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＮＧ  ＴＨＥ  ＭＯＵＳＥ  ＥＭＢＲＹＯ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐ
ｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．中に記載される。同様な方法は、他のトランスジェニック動物の
作製について使用され得る。トランスジェニック創始（ｆｏｕｎｄｅｒ）動物は、その動
物の組織もしくは細胞におけるゲノムにおけるＣＲＦ２−１２導入遺伝子の存在および／
またはＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡの発現に基づいて同定され得る。次いで、トランスジェ
ニック創始動物は、導入遺伝子を保有するさらなる動物を育種するために使用され得る。
さらに、導入遺伝子がコードするＣＲＦ２−１２タンパク質を保有するトランスジェニッ
ク動物は、さらに、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物に育種され得
る。
【０１８５】
相同組換え動物を作製するために、ベクターが調製され、このベクターは、欠失、付加
または置換が導入されたＣＲＦ２−１２遺伝子の少なくとも一部分を含有し、それによっ
て、ＣＲＦ２−１２遺伝子を変更（例えば、機能的に破壊）する。このＣＲＦ２−１２遺
伝子は、ヒト遺伝子（例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１
１のＤＮＡ）であり得るが、より好ましくは、ヒトＣＲＦ２−１２遺伝子の非ヒト相同体
である。例えば、配列番号１、配列番号３、配列番号５、または配列番号１１のヒトＣＲ
Ｆ２−１２遺伝子のマウス相同体は、マウスゲノムにおいて内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子
を変更するために適切な相同組換えベクターを構築するために使用され得る。１つの実施
形態において、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子が、機能的
に破壊（すなわち、もはや機能性タンパク質をコードしない；「ノックアウト」ベクター
としても言及される）されるように設計される。
【０１８６】
あるいは、ベクターは、相同組換えの際に、内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子が、機能性タ
ンパク質をなおコードするが、変異されるかまたはそうでなければ変更されるように設計
され得る（例えば、上流の調節領域が、変更されて、それによって内因性ＣＲＦ２−１２
タンパク質の発現を変更し得る）。相同組換えベクターにおいて、ＣＲＦ２−１２遺伝子
の変更された部分は、ＣＲＦ２−１２遺伝子のさらなる核酸によって、その５’末端およ
び３’末端に隣接されて、ベクターによって保有される外因性ＣＲＦ２−１２遺伝子と、
胚性幹細胞における内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子との間で、相同組換えを生じさせ得る。
このさらに隣接するＣＲＦ２−１２核酸は、内因性遺伝子と首尾良く相同組換えするため
に十分な長さの核酸である。典型的に、数千キロベースの隣接ＤＮＡ（５’末端および３
’末端の両方）が、ベクター中に含まれる。相同組換えベクターの詳細については、例え
ば、Ｔｈｏｍａｓら、１９８７．Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと。次いで、このベ
クターは、胚性幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、そ
して導入されたＣＲＦ２−１２遺伝子が内因性ＣＲＦ２−１２遺伝子と相同的に組換えら
れた細胞が、選択される。例えば、Ｌｉら、１９９２．Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照の
こと。
【０１８７】
次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス）の胚盤胞中に注入されて、凝集キ
メラを形成する。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９８７．ＴＥＲＡＴＯＣＡＲＣＩＮＯＭＡ
Ｓ  ＡＮＤ  ＥＭＢＲＹＯＮＩＣ  ＳＴＥＭ  ＣＥＬＬＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  Ａ
ＰＰＲＯＡＣＨ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１１３〜１５２頁を参
照のこと。次いで、キメラ胚は、適切な偽妊娠のメスの養育動物中に移植され得、そして
出産間近までもたらされる。それらの生殖細胞において相同的に組換えられたＤＮＡを保
有する子孫は、動物の全ての細胞が、導入遺伝子の生殖系列伝達によって相同的に組換え
られたＤＮＡを含む動物を育種するために使用され得る。相同組換えベクターおよび相同
組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ、１９９１．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．２：８２３〜８２９；ＰＣＴ国際出願番号：ＷＯ９０／１１３５４；Ｗ
Ｏ９１／０１１４０；ＷＯ９２／０９６８；およびＷＯ９３／０４１６９にさらに記載さ
れる。
【０１８８】
別の実施形態において、導入遺伝子の制御された発現を可能にする選択された系を含む
トランスジェニック非ヒト動物が、作製され得る。このような系の１つの例は、バクテリ
オファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビ
ナーゼ系の詳細については、例えば、Ｌａｋｓｏら、１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２〜６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の
別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ
系である。Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、１９９１．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１〜１３５
５を参照のこと。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系が、導入遺伝子の発現を制御するた
めに使用される場合、Ｃｒｅリコンビナーゼおよび選択されたタンパク質の両方をコード
する導入遺伝子を保有する動物が、要求される。このような動物は、「二重（ｄｏｕｂｌ
ｅ）」トランスジェニック動物の構築（例えば、２匹のトランスジェニック動物（一方は
、選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を保有し、そして他方は、リコンビナー
ゼをコードする導入遺伝子を保有する）を交配することによって）を介して提供され得る
。
【０１８９】
本明細書中に記載される非ヒトトランスジェニック動物のクローンはまた、Ｗｉｌｍｕ
ｔら、１９９７．Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０〜８１３に記載される方法に従って作製
され得る。簡潔には、トランスジェニック動物由来の細胞（例えば、体細胞）は、単離さ
れ得、そして増殖サイクルを抜け出て、Ｇ０期に入るように誘導され得る。次いで、静止
細胞は、例えば、電気的パルスの使用を通じて、静止細胞が単離される同一種の動物に由
来する除核した卵母細胞に融合され得る。次いで、再構築された卵母細胞は、これが、桑
実胚または未分化胚芽細胞まで発育するように培養され、次いで偽妊娠のメスの養育動物
に移される。このメスの養育動物から生まれた子孫は、細胞（例えば、体細胞）が単離さ
れた動物のクローンである。
【０１９０】
（薬学的組成物）
本発明のＣＲＦ２−１２核酸分子、ＣＲＦ２−１２タンパク質、および抗ＣＲＦ２−１
２抗体（本明細書中において「活性化合物」としても言及される）、ならびにそれらの誘
導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与のために適切な薬学的組成物中に
組込まれ得る。このような組成物は、典型的に、核酸分子、タンパク質、または抗体およ
び薬学的に受容可能なキャリアを含有する。本明細書中において使用される場合、「薬学
的に受容可能なキャリア」は、薬学的な投与と適合する、任意の溶媒および全ての溶媒、
分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むこ
とを企図される。適切なキャリアは、当該分野における標準的な参照テキスト、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（これは、本明細書
中にに参考として援用される）の最新版において記載される。このようなキャリアまたは
希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）溶液、デキ
ストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない
。リポソームおよび非水性ビヒクル（例えば、不揮発性油）もまた、使用され得る。薬学
的に活性な物質に関するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知であ
る。任意の慣用的な媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である範囲以外は、この組成
物におけるそれらの使用が、企図される。補助的に活性な化合物もまた、この組成物中に
組込まれ得る。
【０１９１】
本明細書中に開示される抗体はまた、免疫リポソーム（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｏｓｏｍｅ
）として処方され得る。抗体を含有するリポソームは、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；な
らびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号において記載さ
れる、当該分野において公知の方法によって調製される。増強された循環時間を有するリ
ポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号中に開示される。
【０１９２】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導
体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相エ
バポレーション法によって生成され得る。リポソームは、規定された孔径のフィルターを
通じて押し出されて、所望される直径を有するリポソームを生成する。本発明の抗体のＦ
ａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６〜
２８８（１９８２）に記載されるように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに結
合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ））は
、必要に応じて、リポソーム中に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  
Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１９３】
本発明の薬学的組成物は、その企図される投与経路と適合性であるように処方される。
投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内、皮内、皮下）、経口投与（例えば
、吸入）、経皮投与（すなわち、局所）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非
経口、皮内、または皮下の適用について使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含
有し得る：滅菌した希釈剤（例えば、注入のための水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポ
リエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒）；抗菌
剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（アスコルビン酸ま
たは亜硫酸水素ナトリウム）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ））；緩衝液（アセテート、シトレートまたはホスフェート）、および張度の調整のた
めの薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、酸または塩基（例
えば、塩酸または水酸化ナトリウム）で調整され得る。非経口的調製物は、ガラスまたは
プラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアル中に封入され得
る。
【０１９４】
注射可能な使用について適切な薬学的組成物としては、滅菌した水溶液（ここで、水溶
性）または分散物（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）、および滅菌した注射可能な溶液または分散
物の即座（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）の調製のための滅菌した散剤が挙げられる。
静脈内投与について、適切なキャリアとしては、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈ
ｏｒｅ  ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．）またはリン酸緩衝化生
理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。全ての場合において、組成物は、滅菌でなければなら
ず、そして容易な注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度まで流
動性であるべきである。この組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなけらばならず
、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならな
い。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピ
レングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合
物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例
えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合における要求される粒子サイズの維持に
よって、そして界面活性剤活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の阻止は、
種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アス
コルビン酸、チメロサールなど）によって達成され得る。多くの場合において、等張剤
（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトー
ル（ｍａｎｉｔｏｌ）、ソルビトール、塩化ナトリウム））を組成物中に含有することが
好ましい。注射可能組成物の延長された吸収は、その組成物中に、吸収を遅延する薬剤（
例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を含有させることによってもた
らされ得る。
【０１９５】
滅菌した注射可能溶液は、上に列挙した成分の１つ以上の組合わせとともに適切な溶媒
中に必要とされる量の活性化合物（例えば、ＣＲＦ２−１２タンパク質または抗ＣＲＦ２
−１２抗体）を組込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌によって調製され得る。一般的に
は、分散物は、基本的分散媒体および上に列挙された成分からの必要とされる他の成分を
含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組込むことによって調製される。滅菌注射可能溶
液の調製のための滅菌散剤の場合において、調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり
、これらは、活性成分に加えて、既に滅菌濾過したその溶液由来の任意のさらなる所望さ
れる成分の散剤を生成する。
【０１９６】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含有する。これらは、ゼ
ラチンカプセル剤中に入れられるか、または錠剤へと圧縮され得る。経口治療投与の目的
のために、活性化合物は、賦形剤とともに組込まれ、そして錠剤、トローチ剤、またはカ
プセル剤の形態で使用され得る。経口組成物はまた、うがい薬としての使用のために流動
性キャリアを用いて使用され得る。ここで、流動性キャリア中の化合物は、経口的に適用
され、音を立てられ、そして喀出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性の結合剤
および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含有され得る。錠剤、丸剤、カ
プセル剤、トローチ剤などは、任意の以下の成分、または同様な性質の化合物を含み得る
：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、またはゼラチン）；賦形剤
（例えば、デンプンまたはラクトース）、崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅ
ｌ、またはコーンスターチ）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅ
ｒｏｔｅ）；滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（
蔗糖またはサッカリン）；または香味剤（ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレ
ンジ香味剤）。
【０１９７】
吸入による投与について、化合物は、適切な噴霧剤（例えば、二酸化炭素のような気体
）を含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器からエアロゾルスプ
レーの形態で送達される。
【０１９８】
全身性投与はまた、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）手段または経皮手段によって
であり得る。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるべき障壁に対して適切な浸
透剤が、処方物において使用される。このような浸透剤は、一般的に、当該分野において
公知であり、そして例えば、経粘膜投与に対して、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジ
ン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用を通じて達成され得る。経皮
投与について、活性化合物は、一般的に当該分野において公知である、軟膏剤（ｏｉｎｔ
ｍｅｎｔ）、軟膏剤（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【０１９９】
化合物はまた、直腸送達のための、坐剤（例えば、カカオ脂および他のグリセリドのよ
うな慣用的な坐剤基剤とともに）または貯留浣腸の形態で調製され得る。
【０２００】
１つの実施形態において、活性化合物は、身体からの急速な排泄に対して化合物を保護
するキャリア（例えば、移植物およびマイクロカプセル化送達系を含む制御された放出処
方物）とともに調製される。生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、酢酸エチレンビニ
ル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポ
リ乳酸）が、使用され得る。このような処方物の調製のための方法は、当業者に明らかで
ある。この物質はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソームの懸濁液（ウイ
ルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞に標的化されるリポソームを含む）
はまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許
第４，５２２，８１１号に記載されるような当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０２０１】
投与の容易さおよび投薬の均一性についての投薬単位形態において、経口組成物または
非経口組成物を処方することは、特に有利である。本明細書中において使用される投薬単
位形態は、処置されるべき被験体に対する単位投薬量として適切な物理的に別個の単位を
いい；各単位は、所定の量に計算された活性化合物を含み、必要とされる薬学的キャリア
と共同して所望の治療効果を生じる。本発明の投薬単位形態に関する仕様は、活性化合物
の独特な特性および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の処置に対してこのよ
うな活性化合物を配合する当該分野における固有な制限によって影響され、そしてそれら
に依存する。
【０２０２】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用
され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（例えば、米国特許第
５，３２８，４７０号を参照のこと）によってか、または定位注入（例えば、Ｃｈｅｎら
、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４〜３０５
７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物
は、受容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクル
が包理される徐放マトリクスを包含し得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組
換え細胞からインタクトで産生される場合（例えば、レトロウイルスベクター）、この薬
学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１つ以上の細胞を含み得る。
【０２０３】
本発明のタンパク質および本明細書中で開示されるスクリーニングアッセイによって同
定される他の分子を特異的に結合する抗体は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置の
ために投与され得る。そのような組成物の調製に関する原理および考察、ならびに成分の
選択における手引きは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ
Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第１９編（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎ
ｎａｒｏら、編）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：１９９５；Ｄｒｕ
ｇ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ：Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｐｏｓｓｉｂ
ｉｌｉｔｉｅｓ，Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，Ａｎｄ  Ｔｒｅｎｄｓ，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐａ．，１９９４；およ
びＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（Ａｄｖａｎ
ｃｅｓ  Ｉｎ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第４巻），１９９１，Ｍ．Ｄ
ｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供される。抗原性タンパク質が細胞内にあり、そして
抗体全体がインヒビターとして使用される場合、抗体を内部移行することが好ましい。し
かし、リポソームはまた、抗体または抗体フラグメントを細胞に送達するために使用され
得る。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結
合する最小の阻害フラグメントが、好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、
標的タンパク質配列を結合する能力を保持するペプチド分子が、設計され得る。このよう
なペプチドは、化学的に合成され得、そして／または組換えＤＮＡ技術によって産生され
得る。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３を参照のこと。本明細書中の処方物はまた、処置され
る特定の指標について必要な１つより多くの活性化合物を含み得、好ましくは、互いに悪
影響を与えない相補的活性を有する化合物を含み得る。あるいは、またはさらに、この組
成物は、その機能を増強する薬剤（例えば、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法剤
、または増殖阻害剤）を含み得る。このような分子は、意図される目的のために有効であ
る量で組み合わせて適切に存在する。活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術
または界面重合化によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシ
メチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メタクリル酸メチル
）マイクロカプセル）、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロ
スフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）またはマクロエマル
ジョン中に内包され得る。
【０２０４】
インビボ投与のために使用される処方物は、滅菌されていなければならない。この処方
物は、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。
【０２０５】
徐放性調製物が、調製され得る。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固
体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは、成形された物品（
例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリクスの例として
は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート
）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９
号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー、非分解性エチレ
ン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  
ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注
入可能なミクロスフェア）、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられ
る。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００
日を超えて分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは、より短い期間タンパク質を
放出する。
【０２０６】
薬学的組成物は、投与に関する使用説明書と一緒に、容器、パッケージ、またはディス
ペンサー中に含まれ得る。
【０２０７】
（スクリーニングおよび検出の方法）
本発明の単離された核酸分子は、（例えば、遺伝子治療適用における宿主細胞での組換
え発現ベクターを介して）ＣＲＦ２−１２タンパク質を発現し、（例えば、生物学的サン
プル中の）ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２遺伝子における遺伝的損傷を
検出し、そして、以下にさらに記載されるように、ＣＲＦ２−１２活性を調節するために
使用され得る。さらに、ＣＲＦ２−１２タンパク質は、ＣＲＦ２−１２タンパク質活性ま
たは発現を調節する薬物または化合物をスクリーニングするため、およびＣＲＦ２−１２
タンパク質の不十分もしくは過剰な産生、またはＣＲＦ２−１２野生型タンパク質と比べ
て、減少した活性もしくは異常な活性を有するＣＲＦ２−１２タンパク質形態の産生によ
って特徴付けられる障害を処置するために使用され得る。さらに、本発明の抗ＣＲＦ２−
１２抗体は、ＣＲＦ２−１２タンパク質を検出および単離し、そして、ＣＲＦ２−１２活
性を調節するために使用され得る。例えば、ＣＲＦ２−１２活性としては、Ｔ細胞または
ＮＫ細胞の増殖および分化、抗体産生、ならびに腫瘍増殖が挙げられる。
【０２０８】
本発明はさらに、本明細書中に記載されるスクリーニングアッセイによって同定される
新規の薬剤、および上記されるような処置に対するその薬剤の使用に関する。
【０２０９】
（スクリーニングアッセイ）
本発明は、ＣＲＦ２−１２タンパク質に結合するか、または、例えば、ＣＲＦ２−１２
タンパク質発現もしくはＣＲＦ２−１２タンパク質活性に対して、刺激効果もしくは阻害
効果を有するモジュレーター、すなわち、候補化合物もしくは試験化合物または薬剤（例
えば、ペプチド、ペプチド模倣物、低分子または他の薬物）を同定するための方法（本明
細書中では、「スクリーニングアッセイ」ともいわれる）を提供する。本発明はまた、本
明細書中に記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される化合物を含む。
【０２１０】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＲＦ２−１２タンパク質もしくはＣＲＦ２−１
２ポリペプチドの膜結合形態またはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはその
活性を調節する、候補化合物または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提
供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー
法（生物学的ライブラリー；空間的に位置づけ可能な平行固相ライブラリーまたは液相ラ
イブラリー；デコンボリューションを要求する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物
」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブ
ラリー法が挙げられる）における任意の多数のアプローチを使用して得られ得る。生物学
的ライブラリーアプローチは、ペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプロ
ーチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは低分子の化合物ライブラリーに適用可能
である。例えば、Ｌａｍ、１９９７．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  
１２：１４５を参照のこと。
【０２１１】
本明細書に使用される場合、「低分子」は、約５ｋＤ未満の分子量、そして最も好まし
くは約４ｋＤ未満の分子量を有する組成物をいうことが意味される。低分子は、例えば、
核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭化水素、脂質または他の有機分子も
しくは無機分子であり得る。化学的混合物および／または生物学的混合物（例えば、真菌
抽出物、細菌抽出物、または藻類抽出物）のライブラリーは、当該分野で公知であり、本
発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングされ得る。
【０２１２】
分子ライブラリーの合成に関する方法の例は、技術分野で見出され得、例えば、ＤｅＷ
ｉｔｔら、１９９３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９
０９；Ｅｒｂら、１９９４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１
：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６
７８；Ｃｈｏら、１９９３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１
９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌ
ｌら、１９９４．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；お
よびＧａｌｌｏｐら、１９９４．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に見出される。
【０２１３】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９９２．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ，１９９１．Ｎａ
ｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ，１９９３．Ｎａｔｕｒｅ  ３
６４：５５５−５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞
子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９
９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）、
もしくはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９
：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６
；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
７：６３７８−６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ，１９９１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３
０１−３１０；Ｌａｄｎｅｒ、米国特許第５，２２３，４０９号）に示され得る。
【０２１４】
１つの実施形態において、アッセイは、細胞ベースのアッセイであり、ここで細胞表面
上にＣＲＦ２−１２タンパク質の膜結合形態またはその生物学的に活性な部分を発現する
細胞が、試験化合物と接触させられ、試験化合物のＣＲＦ２−１２タンパク質に結合する
能力が、決定される。細胞は、例えば、哺乳動物起源または酵母細胞であり得る。試験化
合物のＣＲＦ２−１２タンパク質の結合する能力を決定することは、例えば、試験化合物
のＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生物学的に活性な部分への結合が、複合体中の標
識された化合物を検出することによって決定され得るように、試験化合物を放射性同位体
または酵素標識とカップリングすることによって達成され得る。例えば、試験化合物は、
直接的かまたは間接的かのいずれかで１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで標識され
得、放射性同位体は、放射線放出の直接計数によって、またはシンチレーション計数によ
って検出される。あるいは、試験化合物は、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで、酵素的に標識され得、酵素的標識を、適
切な基質から生成物への変換を決定することによって検出する。１つの実施形態において
、このアッセイは、細胞表面にＣＲＦ２−１２タンパク質の膜結合形態またはその生物学
的に活性な部分を発現する細胞をＣＲＦ２−１２を結合する公知の化合物と接触させて、
アッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、および
ＣＲＦ２−１２タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程を包含し、こ
こで、ＣＲＦ２−１２タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、公
知の化合物と比べて、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生物学的に活性な部分に優先
的に結合する、試験化合物の能力を決定する工程を含む。
【０２１５】
別の実施形態において、アッセイは、細胞表面上にＣＲＦ２−１２タンパク質の膜結合
形態またはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を、試験化合物とを接触させる工程
、およびＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生物学的に活性な部分の活性を調節（例え
ば、刺激または阻害）する、試験化合物の能力を決定する工程を包含する細胞ベースのア
ッセイである。ＣＲＦ２−１２またはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化
合物の能力を決定することは、例えば、ＣＲＦ２−１２標的分子に結合するかまたはそれ
と相互作用するＣＲＦ２−１２タンパク質の能力を決定することによって達成され得る。
本明細書中で使用される場合、「標的分子」は、ＣＲＦ２−１２タンパク質が天然で結合
または相互作用する分子であり、例えば、ＣＲＦ２−１２相互作用タンパク質を発現する
細胞の表面上の分子、第２の細胞の表面上の分子、細胞外環境中での分子、細胞膜の内表
面と結合する分子または細胞質分子である。ＣＲＦ２−１２標的分子は、非ＣＲＦ２−１
２分子、または本発明のＣＲＦ２−１２タンパク質もしくはポリペプチドであり得る。１
つの実施形態において、ＣＲＦ２−１２標的分子は、細胞膜を通りかつ細胞内へ入る細胞
外シグナル（例えば、化合物の、膜結合型ＣＲＦ２−１２分子への結合によって発生され
たシグナル）の伝達を容易にするシグナル伝達経路の１成分である。この標的は、例えば
、触媒活性を有する第２の細胞内タンパク質、または下流シグナル伝達分子のＣＲＦ２−
１２との結合を容易にするタンパク質であり得る。
【０２１６】
ＣＲＦ２−１２標的分子に結合するかまたはそれと相互作用するＣＲＦ２−１２タンパ
ク質の能力を決定することは、直接の結合の決定について、上記の方法の１つによって達
成され得る。１つの実施形態において、ＣＲＦ２−１２標的分子に結合するまたはそれと
相互作用するＣＲＦ２−１２タンパク質の能力を決定することは、標的分子の活性を決定
することによって達成され得る。例えば、標的分子の活性は、標的の細胞内セカンドメッ
センジャー（すなわち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を
検出する工程、適切な基質に対する標的の触媒／酵素活性を決定する工程、レポーター遺
伝子（検出可能なマーカー（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする核酸に作動可能に結
合されたＣＲＦ２−１２応答性調節要素を含む）の誘導を決定する工程、または細胞応答
（例えば、細胞生存、細胞分化、または細胞増殖）を決定する工程によって決定され得る
。
【０２１７】
さらに別の実施形態において、本発明のアッセイは、ＣＲＦ２−１２タンパク質または
その生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、およびＣＲＦ２−１２タンパ
ク質またはその生物学的に活性な部分に結合する試験化合物の能力を決定する工程を包含
する、無細胞アッセイである。試験化合物のＣＲＦ２−１２タンパク質への結合は、上記
されるように直接的または間接的のいずれかで決定され得る。１つのそのような実施形態
において、このアッセイは、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生物学的に活性な部分
をＣＲＦ２−１２を結合する公知の化合物と接触させて、アッセイ混合物を形成する工程
、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、およびＣＲＦ２−１２タンパク質と相
互作用する試験化合物の能力を決定する工程を含み、ここで、ＣＲＦ２−１２タンパク質
と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は、公知の化合物と比べて、ＣＲＦ２−
１２またはその生物学的に活性な部分に優先的に結合する、試験化合物の能力を決定する
工程を含む。
【０２１８】
なお別の実施形態において、アッセイは、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその生物学
的に活性な部分を試験化合物と接触させる工程、およびＣＲＦ２−１２タンパク質または
その生物学的に活性な部分の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する、試験化合物の
能力を決定する工程を包含する、無細胞アッセイである。ＣＲＦ２−１２の活性を調節す
る試験化合物の能力を決定する工程は、例えば、直接結合を決定するための上記の方法の
１つによって、ＣＲＦ２−１２標的分子に結合するＣＲＦ２−１２タンパク質の能力を決
定する工程によって達成され得る。代替的な実施形態において、ＣＲＦ２−１２タンパク
質の活性を調節する試験化合物の能力を決定することは、ＣＲＦ２−１２標的分子をさら
に調節するＣＲＦ２−１２タンパク質の能力を決定する工程によって達成され得る。例え
ば、適切な基質に対する標的分子の触媒／酵素活性は、上記のように決定され得る。
【０２１９】
さらに別の実施形態において、無細胞アッセイは、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはそ
の生物学的に活性な部分をＣＲＦ２−１２タンパク質を結合する公知の化合物と接触させ
て、アッセイ混合物を形成する工程、アッセイ混合物を試験化合物と接触させる工程、お
よびＣＲＦ２−１２タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程を包含し
、ここで、ＣＲＦ２−１２タンパク質と相互作用する試験化合物の能力を決定する工程は
、ＣＲＦ２−１２標的分子に優先的に結合するかまたはその活性を調節するＣＲＦ２−１
２タンパク質の能力を決定する工程を含む。
【０２２０】
本発明の無細胞アッセイは、ＣＲＦ２−１２タンパク質の可溶性形態または膜結合形態
の両方の使用に扱いやすい。ＣＲＦ２−１２タンパク質の膜結合形態を含む無細胞アッセ
イの場合、ＣＲＦ２−１２タンパク質の膜結合形態が溶液中に保持されるように可溶化剤
を使用することが望ましくあり得る。このような可溶化剤の例としては、ｎ−オクチルグ
ルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０
０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポ
リ（エチレングリコールエーテル）ｎ、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニ
オ−１−プロパンスルホナート、３−（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａ
ｍｍｉｎｉｏｌ）−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、または３−（３−コラミ
ドプロピル）ジメチルアンモニオ（ａｍｍｉｎｉｏｌ）−２−ヒドロキシ−１−プロパン
スルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）のような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２２１】
本発明の上記アッセイ方法の１つより多い実施形態において、タンパク質の１つまたは
両方の非複合体形態からの、複合体形態の分離を容易にし、そしてアッセイの自動化を提
供するために、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその標的分子のいずれかを固定すること
が望ましくあり得る。試験化合物のＣＲＦ２−１２タンパク質への結合、または候補化合
物の存在下および非存在下での、ＣＲＦ２−１２タンパク質の標的分子との相互作用は、
反応物を含むのに適する任意の容器中で達成され得る。そのような容器の例としては、マ
イクロタイタープレート、試験管、および微小遠心管が挙げられる。１つの実施形態にお
いて、１つまたは両方のタンパク質がマトリクスに結合することを可能にするドメインを
付加する融合タンパク質が、提供され得る。例えば、ＧＳＴ−ＣＲＦ２−１２融合タンパ
ク質またはＧＳＴ−標的融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍ
ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化マイクロ
タイタープレート上に吸着され得、次いで、その融合タンパク質を、試験化合物と、また
は試験化合物および吸着していない標的タンパク質もしくはＣＲＦ２−１２タンパク質の
いずれかと併せ、そしてその混合物を、複合体形成を導く条件（例えば、塩およびｐＨに
関して生理学的な条件）下でインキュベートする。インキュベーションに続いて、全ての
非結合成分を除去するために、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄し、
ビーズの場合、マトリクスを固定化し、複合体を、例えば、上記のように、直接的または
間接的のいずれかで決定する。あるいは、この複合体をマトリクスから解離し得、そして
、ＣＲＦ２−１２タンパク質の結合レベルまたは活性レベルを、標準的な技術を使用して
決定する。
【０２２２】
マトリクス上にタンパク質を固定するための他の技術はまた、本発明のスクリーニング
アッセイにおいて使用され得る。例えば、ＣＲＦ２−１２タンパク質またはその標的分子
のいずれかは、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合体化を利用して固定化され得る
。ビオチン化されたＣＲＦ２−１２タンパク質または標的分子は、当該分野において周知
の技術（例えば、ビオチン化キット，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，Ｉｌｌ）を使用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から
調製され得、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ）のウェル中に固定化される。あるいは、ＣＲＦ２−１２タンパク質または標的分子
と反応性の抗体は、その標的分子に対するＣＲＦ２−１２タンパク質の結合を干渉しない
が、プレートのウェルに誘導体化され得、そして非結合標的またはＣＲＦ２−１２タンパ
ク質は、抗体の結合体化によって、ウェルに捕捉され得る。そのような複合体を検出する
方法は、ＧＳＴ固定化複合体についての上記方法に加えて、ＣＲＦ２−１２タンパク質ま
たは標的分子と反応性の抗体を使用する複合体の免疫検出、およびＣＲＦ２−１２タンパ
ク質または標的分子に結合する酵素活性の検出を頼りにする、酵素結合アッセイを含む。
【０２２３】
別の実施形態において、ＣＲＦ２−１２タンパク質発現の調節因子は、細胞を候補化合
物と接触し、そして細胞内のＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質
の発現を決定する方法において同定される。候補化合物の存在下でのＣＲＦ２−１２  ｍ
ＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の発現レベルは、候補化合物の非存在下でのＣＲ
Ｆ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の発現レベルに匹敵する。次いで
、この比較に基づいて、候補化合物を、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２
タンパク質発現の調節因子として同定し得る。例えば、候補化合物の存在下で、その非存
在下よりも、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の発現が多い（
すなわち、統計学的に、有意に高い）場合、この候補化合物は、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮ
ＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の発現の刺激因子として同定される。あるいは、候補
化合物の存在下で、その非存在下よりも、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１
２タンパク質の発現が少ない（統計学的に、有意に低い）場合、この候補化合物は、ＣＲ
Ｆ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の発現のインヒビターとして同定
される。この細胞中での、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の
発現のレベルは、ＣＲＦ２−１２  ｍＲＮＡまたはＣＲＦ２−１２タンパク質の検出につ
いて本明細書中に記載される方法によって、決定され得る。
【０２２４】
本発明のさらに別の局面において、ＣＲＦ２−１２タンパク質は、ツーハイブリッドア
ッセイまたはスリーハイブリッドアッセイ（例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；
Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３．Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら、１９９
３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら、１９
９３．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９
９３．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０
３００号を参照のこと）において、「ベイトタンパク質」として使用され得、ＣＲＦ２−
１２に結合するかまたはＣＲＦ２−１２と相互作用する他のタンパク質（「ＣＲＦ２−１
２結合タンパク質」または「ＣＲＦ２−１２−ｂｐ」）を同定し、そしてＣＲＦ２−１２
活性を調節する。そのようなＣＲＦ２−１２結合タンパク質はまた、例えば、ＣＲＦ２−
１２経路の上流要素または下流要素として、ＣＲＦ２−１２タンパク質によるシグナルの
伝播に関与する可能性がある。
【０２２５】
ツーハイブリッド系は、大部分の転写因子のモジュールの性質に基づき、これは分離可
能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインからなる。簡潔に記すと、このアッセイは
２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物において、ＣＲＦ２−１２をコード
する遺伝子は、既知の転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードす
る遺伝子と融合される。他方の構築物において、未同定のタンパク質（「捕食（ｐｒｅｙ
）」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列（ＤＮＡ配列のライブラリに由来する
）は、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合される。この「えさ（
ｂａｉｔ）」タンパク質およびこの「捕食」タンパク質がインビボで相互作用してＣＲＦ
２−１２依存的な複合体を形成し得る場合、転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび活性化
ドメインがきわめて接近させられる。この接近は、転写因子に応答性の転写調節部位に作
動可能に連結された、レポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写を可能とする。レポ
ーター遺伝子の発現を検出し得、そして機能性の転写因子を包含する細胞コロニーを単離
してそして使用して、ＣＲＦ２−１２と相互作用するタンパク質をコードするクローン化
された遺伝子を取得し得る。
【０２２６】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイにより同定された新規薬剤、および本
明細書中に記載されるような処置に対するその使用に関する。
【０２２７】
本発明はさらに、以下の非限定的な実施例において例示される。
【実施例】
【０２２８】
（実施例１：マウスＣＲＦ２−１２配列の単離）
マウスゲノムＤＮＡデータベースおよびＥＳＴ  ＤＮＡデータベースをスクリーニング
して、そしてｈＣＲＦ２−１２とのホモロジーを含む特定のクローンを同定した。このホ
モロジーに基づいて、アミノ末端およびカルボキシ末端のＣＲＦ−２−１２配列をコード
する配列を含むマウスの配列を明らかにした。ＯＲＦ−ｍｓ１５−６（ＧＧＡＡＣＴＣＴ
ＧＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣ）（配列番号１３）およびプライマーｍｓ５３
−５（ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＧＡの逆向き相補体）（
配列番号１４）の５’末端および３’末端に対応するプライマーをそれぞれ、合成してそ
してＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。これらのＰＣＲ反応からのＤＮＡ生
成物を、ＴＡクローニングによりｐＣＲＩＩ  ＴＯＰＯベクター中にクローニングして、
そしてそれらプラスミドを配列決定した。このＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、それ
ぞれ表７および表８に示す。
【０２２９】
（実施例２：ヒトのＣＲＦ２−１２ポリペプチド配列とマウスのＣＲＦ２−１２ポリペ
プチド配列との間のホモロジー領域の同定）
ヒトＣＲＦ２−１２ポリペプチドおよびマウスＣＲＦ２−１２ポリペプチドのアミノ酸
配列を比較した。このアラインメントを以下に提供する。Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１０９１５−１９，１９９２において
記載されるように、アラインメントを調整した。示されるアラインメントについて、ギャ
ップ重さ＝８、平均マッチ＝２．９１２、長さ重さ＝２、平均ミスマッチ＝−２．００３
、質＝８２９、長さ＝１１０１、割合＝３．５８９、ギャップ＝１である。その２つのタ
ンパク質が、６９．５６５％類似であり、そして６６．９５７％同一であることを見出し
た。
【０２３０】
【化１】
2008188023.tif 000014
【０２３１】
アラインメントは、２つのタンパク質が６９．５６５％類似であり、そして６６．９５
７％同一であることを明かにする。完全な同一性、またはほぼ完全な同一性を、２つのポ
リペプチドのいくつかの領域について決定する（例えば、アミノ酸ＭＭＰＫＨＣＬ／ＦＬ
ＧＬ／ＦＬＩ（配列番号１３）、アミノ酸ＦＱＳＲＮＦＨＮＩＬＨ／ＱＷＱＡ／ＰＧ（配
列番号１４）、アミノ酸ＳＩ／ＶＹＦＶＱＹＫＭ／ＩＹＧＱＳ／ＲＱＷ（配列番号１５）
、アミノ酸ＴＰＲＦＴＰＷＷＥＴＫＬ／ＩＤＰＰＶ（配列番号１６）、アミノ酸ＬＶ／Ｌ
ＹＲＶＦＴ／ＩＩＮＮＳＬＥＫＥＱＫＡ／ＶＹＥＧ（配列番号１７）、アミノ酸ＲＡＶＥ
ＩＥＧ／ＡＬＩ／ＴＰＨＳＳＹＣＶＶＡＥＭ／ＩＹＱＰＭ（配列番号１８）およびアミノ
酸ＤＲＲＳＰ／ＱＲＳＫ／ＥＥＲＣＶＱ／ＥＩＰ（配列番号１９）を含むポリペプチド領
域にわたる）。
【０２３２】
（実施例３：ＣＲＦ２−１２ＲＮＡ配列の組織発現パターン）
第１鎖ｃＤＮＡ配列のパネルを含むＯｒｉｇｅｎｅキットを使用して、ＣＲＦ２−１２
配列の発現を試験した。ｈＣＲＦ２−１２配列に特異的なプライマーを使用して、ＣＲＦ
２−１２配列の存在について、種々の組織由来のＲＮＡを調査した。相対的発現レベルを
、「＋」または「−」スコア付けシステムを使用して割り当て、「−」は、ＲＮＡ配列が
全く検出されないことを示し、そして「＋＋＋＋」は、高発現を示す。より低度の相対的
レベルのＣＲＦ２−１２  ＲＮＡ配列に、「＋」、「＋＋」または「＋＋＋」の可能性あ
るスコアを割り当てた。
【０２３３】
高レベル（＋＋＋＋）のＣＲＦ２−１２転写物を、胎盤および皮膚の組織において検出
した。低〜中レベルのＣＲＦ２−１２転写物を、結腸（＋）、前立腺（＋）、小腸（＋＋
）および脾臓（＋＋）において検出した。無し〜低レベルのＣＲＦ２−１２転写物を、脳
、腎臓、肝臓、筋肉、胃、精巣、甲状腺、副腎、膵臓、卵巣、子宮、末梢血リンパ球（Ｐ
ＢＬ）、骨髄、胎児の脳および胎児の肝臓（全て（−））；ならびに心臓または唾液の組
織（共に（＋／−））において、検出した。
【０２３４】
これらの結果は、ＣＲＦ２−１２核酸および／またはＣＲＦ２−１２タンパク質を認識
するプローブが、ＣＲＦ２−１２配列が高度に発現される組織（例えば、胎盤および皮膚
の組織）を検出することに有用であることを示す。このようなプローブをまた使用して、
結腸、前立腺、小腸および脾臓の組織を検出し得る。ＣＲＦ２−１２核酸および／または
ＣＲＦ２−１２ポリペプチドを認識するプローブとのハイブリダイゼーションが存在しな
いことをまた使用して、ＣＲＦ２−１２が発現されない組織（例えば、胃、精巣、甲状腺
、副腎、膵臓、卵巣、子宮、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、骨髄、胎児の脳および胎児の肝
臓の組織）の同定を確認し得る。
【０２３５】
（実施例４．ＣＲＦ２−１２核酸配列を含むベクターの構築）
ＴＯＰＯベクターより、ＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素フラグメントとして、マウ
スＣＲＦ２−１２（ｍＣＲＦ２−１１２）ｃＤＮＡを単離した。このフラグメントをＨｉ
ｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩ消化したアデノウイルスベクターＡｄｏｒｅ１−２へとサブク
ローニングした。この構築物を、ｃＤＮＡ挿入物の限定消化分析および配列決定すること
により、確認した。このベクターにおいて、ｍＣＲＦ２−１２はサイトメガロウイルス（
ＣＭＶ）前初期プロモーターおよびエンハンサーの制御の下にある。
【０２３６】
この構築物を使用して、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
ａｒｙｌａｎｄ）における相同組み換えにより、複製不能で、Ｅ１／Ｅ３の除去された、
組換え５型（ｄｌ３２７）アデノウイルスを構築する。
【０２３７】
（実施例５：ＣＲＦ２−１２ポリペプチド配列を含む融合タンパク質の構築）
変異を有するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインと融合された、全てのｍＣＲＦ２−１２
ＯＲＦに対応する融合遺伝子から、ＣＲＦ２−１２ポリペプチド配列を含む融合タンパ
ク質を構築した。プライマーを設計してそして使用して、平滑末端ＰＣＲポリメラーゼを
使用してＴＯＰＯベクターからｍＣＲＦ２−１２をＰＣＲ反応において増幅する。
【０２３８】
変異を有するマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃドメインと融合された、全てのｍＣＲＦ２−１２
ＯＲＦに対応する融合遺伝子を、ＰＣＲが平滑末端ＰＣＲポリメラーゼを使用してＴＯ
ＰＯベクターからｍＣＲＦ２−１２を増幅するプライマーを使用して構築する。５’プラ
イマー（ＶＬ３３４：ＧＡＡＴＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＴＡＡＧＣＡＴＴ
ＧＣＣＴＴＣ（配列番号３１）は、ｍＣＲＦ２−１２配列の上流のＳａｌＩ部位およびＫ
ｏｚａｋリーダー配列を含む。３’プライマーは、ＶＬ３３５：ＴＧＧＡＡＴＣＴＧＣＡ
ＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＣ（配列番号３２）である。ＰＣＲ産物を、ＳａｌＩを用いて切断
して、そしてＳａｌＩおよび平滑ＦｓｐＩ切断したＧａｔｅｗａｙエントリーベクターｐ
Ｇ３５２（これは、ＰＣＲ増幅されたｍＣＲＦ２−１２を、インフレームで、変異を有す
るＩｇＧ２ａ遺伝子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の配列と融合した）とラ
イゲーションした。生じた形質転換は、ｍＣＲＦ２−１２のｍＩｇＧ２ａヒンジ−ＣＨ２
−ＣＨ３とのインフレームでの融合を含むプラスミドである。次いで、この融合エントリ
ーベクターを使用して、挿入物をレトロウイルスのＧａｔｅｗａｙ宛先（ｄｅｓｔｉｎａ
ｔｉｏｎ）ベクターｐＧ３４３中にシャトルさせた。ｍＣＲＦ−１２−ＦｃＧ２ａｍ融合
遺伝子をコードするレトロウイルスを作製して、そして増幅する細胞株を作製する。
【０２３９】
生じた構築物は、ｍＣＲＦ２−１２のｍＩｇＧ２ａヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３とのインフ
レームでの融合を含むプラスミドである。次いで、この融合エントリーベクターを使用し
て、挿入物をレトロウイルスのＧａｔｅｗａｙ宛先ベクターｐＧ３４３中にシャトルする
。ｍＣＲＦ−１２−ＦｃＧ２ａｍ融合遺伝子をコードするレトロウイルスを作製して、そ
して増幅する細胞株を構築する。このウイルスを使用して、疾患の動物モデルにおいて使
用される細胞、およびこれらの細胞の養子性の（ａｄｏｐｔｉｖｅ）移入を受け入れる細
胞に輸送する。
【０２４０】
（実施例６．ＣＲＦ２−１２核酸配列プローブを使用した、胎盤組織の検出）
胎盤組織を含むことが疑われる生物学的サンプルを用意して、そしてＲＮＡを回収する
。そのＲＮＡを、ＣＲＦ２−１２  ＲＮＡサンプルを特異的に検出するプローブと接触さ
せる。ＣＲＦ２−１２  ＲＮＡの存在は、そのサンプルが胎盤組織を含むことを示す。
【０２４１】
（実施例７．ＣＲＦ２−１２核酸配列プローブを使用した、皮膚組織の検出）
皮膚組織を含むことが疑われる生物学的サンプルを用意して、そしてＲＮＡを回収する
。そのＲＮＡを、ＣＲＦ２−１２  ＲＮＡサンプルを特異的に検出するプローブと接触さ
せる。サンプル中のＣＲＦ２−１２  ＲＮＡの存在は、そのサンプルが皮膚組織を含むこ
とを示す。
【０２４２】
（実施例８．ＣＲＦ２−１２ポリペプチドを特異的に検出するプローブを使用した、胎
盤組織の検出）
胎盤組織を含むことが疑われる生物学的サンプルを用意して、そしてタンパク質を回収
する。そのタンパク質を、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに特異的に結合する抗体プローブ
と接触させる。サンプル中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの存在は、そのサンプルが胎盤
組織を含むことを示す。
【０２４３】
（実施例９．ＣＲＦ２−１２ポリペプチドを特異的に検出するプローブを使用した、皮
膚組織の検出）
皮膚組織を含むことが疑われる生物学的サンプルを用意して、そしてタンパク質を回収
する。そのタンパク質を、ＣＲＦ２−１２ポリペプチドに特異的に結合する抗体プローブ
と接触させる。サンプル中のＣＲＦ２−１２ポリペプチドの存在は、そのサンプルが皮膚
組織を含むことを示す。
【０２４４】
（実施例１０．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２０に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における２３位のグルタミンは、配列番号２０において対応する位置でアスパ
ラギンに置き換えられる。
【０２４５】
【化２】
2008188023.tif 000015
【０２４６】
（実施例１１．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２１に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における２６位のヒスチジンは、配列番号２１において対応する位置でアルギ
ニンに置き換えられる。
【０２４７】
【化３】
2008188023.tif 000016
【０２４８】
（実施例１２．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２２に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における２７位のグルタミン酸は、配列番号２２において対応する位置でアス
パラギン酸に置き換えられる。
【０２４９】
【化４】
2008188023.tif 000017
【０２５０】
（実施例１３．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２３に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における２９位のロイシンは、配列番号２３において対応する位置でバリンに
置き換えられる。
【０２５１】
【化５】
2008188023.tif 000018
【０２５２】
（実施例１４．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２４に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における３０位のリジンは、配列番号２４において対応する位置でヒスチジン
に置き換えられる。
【０２５３】
【化６】
2008188023.tif 000019
【０２５４】
（実施例１５．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２５に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における３３位のアルギニンは、配列番号２５において対応する位置でリジン
に置き換えられる。
【０２５５】
【化７】
2008188023.tif 000020
【０２５６】
（実施例１６．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２６に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における４０位のアスパラギンは、配列番号２６において対応する位置でグル
タミンに置き換えられる。
【０２５７】
【化８】
2008188023.tif 000021
【０２５８】
（実施例１７．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２７に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における４５位のロイシンは、配列番号２７において対応する位置でバリンに
置き換えられる。
【０２５９】
【化９】
2008188023.tif 000022
【０２６０】
（実施例１８．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２８に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における５２位のアラニンは、配列番号２８において対応する位置でロイシン
に置き換えられる。
【０２６１】
【化１０】
2008188023.tif 000023
【０２６２】
（実施例１９．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号２９に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における５３位のロイシンは、配列番号２９において対応する位置でアラニン
に置き換えられる。
【０２６３】
【化１１】
2008188023.tif 000024
【０２６４】
（実施例２０．開示のＣＲＦ２−１２ポリペプチドアミノ酸配列（配列番号２）の配列
改変体）
配列番号２のアミノ酸配列から１つのアミノ酸配列で異なるポリペプチド配列を、配列
番号３０に示す。改変のアミノ酸配列は、太字で示される。配列番号２に示されるポリペ
プチド配列における５９位のバリンは、配列番号３０において対応する位置でイソロイシ
ンに置き換えられる。
【０２６５】
【化１２】
2008188023.tif 000025
【０２６６】
（他の実施形態）
本発明は、本発明の詳細な記載と連結して記載されたが、前述の記載は本発明を例示し
、そしてその範囲を限定しないことを意図するものであり、本発明は添付の特許請求の範
囲の範囲により規定される。他の局面、利点および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲
内にある。
【配列表】
2008188023000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月16日(2008.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
表１に示される核酸配列に対応するｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を用いて同定された。用いたＰＣＲプライマーは、５’ＣＴＴＧＣＡＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号３６）またはＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＧ（配列番号３７）および３’（ＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣ）（配列番号７）を含んだ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
Ｑ９ＹＧＣ８  ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）インターロイキン−１０レセプター２（５／１９９９）（配列番号８）と、表２に示されるアミノ酸配列（配列番号３３）のアミノ酸３０位〜２２７位との間のアラインメントを以下に提供する。示されるアラインメントについては、長さ＝３４１、スコア＝７３．４、ビット（１７７．０）、期待値＝１ｅ−１２、同一性＝５６／２００（２８％）、およびポジティブ＝９２／２００（４６％）である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
プライマーＡＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＡＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＴＡＧＧ（配列番号９）およびプライマーＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号１０）を使用するＰＣＲ増幅アッセイにおいて、さらなるＣＲＦ２−１２のコード配列を
同定した。種々のヒト組織由来のプールされたｃＤＮＡにおいて、表３に提供される配列を含むｃＤＮＡを同定した。表５に示される配列を含むｃＤＮＡを、胃組織由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定した。表１に示されるＤＮＡのクローニングについて使用された、同様のライゲーション方法、形質転換方法、スクリーニング方法および配列決定方法を使用して、表３および表５に示される配列を含むｃＤＮＡを作製した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
ヒトＣＲＦ２−１２配列に基づくプローブを使用して、マウスの配列を同定した。マウスＣＲＦ２−１２配列の単離および性質決定を、以下の実施例において詳細に開示する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２８】
（実施例１：マウスＣＲＦ２−１２配列の単離）
マウスゲノムＤＮＡデータベースおよびＥＳＴ  ＤＮＡデータベースをスクリーニングして、そしてｈＣＲＦ２−１２とのホモロジーを含む特定のクローンを同定した。このホモロジーに基づいて、アミノ末端およびカルボキシ末端のＣＲＦ−２−１２配列をコードする配列を含むマウスの配列を明らかにした。ＯＲＦ−ｍｓ１５−６（ＧＧＡＡＣＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＧＡＣＡＡＧＣＡＣＡＣ）（配列番号３８）およびプライマーｍｓ５３−５（ＣＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＴＧＴＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＧＡの逆向き相補体）（配列番号３９）の５’末端および３’末端に対応するプライマーをそれぞれ、合成してそしてＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用した。これらのＰＣＲ反応からのＤＮＡ生成物を、ＴＡクローニングによりｐＣＲＩＩ  ＴＯＰＯベクター中にクローニングして、そしてそれらプラスミドを配列決定した。このＤＮＡ配列およびタンパク質配列を、それぞれ表７および表８に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
（実施例２：ヒトのＣＲＦ２−１２ポリペプチド配列とマウスのＣＲＦ２−１２ポリペプチド配列との間のホモロジー領域の同定）
ヒトＣＲＦ２−１２（配列番号３４）ポリペプチドおよびマウスＣＲＦ２−１２（配列番号３５）ポリペプチドのアミノ酸配列を比較した。このアラインメントを以下に提供する。Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８９：１０９１５−１９，１９９２において記載されるように、アラインメントを調製した。示されるアラインメントについて、ギャップ重さ＝８、平均マッチ＝２．９１２、長さ重さ＝２、平均ミスマッチ＝−２．００３、質＝８２９、長さ＝１１０１、割合＝３．５８９、ギャップ＝１である。その２つのタンパク質が、６９．５６５％類似であり、そして６６．９５７％同一であることを見出した。