(57)【要約】【課題】植物を用いた、カドミウム等の重金属による土壌汚染の浄化（ファイトリメディエーション）の実用化に寄与するため、植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子を提供すること。【解決手段】下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、植物のカドミウムに対する耐性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子である。（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ（ｃ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ（ｄ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、植物のカドミウムに対する耐性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【請求項２】
植物において、請求項１に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制することを特徴とするカドミウム感受性植物の作出方法。
【請求項３】
塩基の置換、欠失、及び／又は挿入により、請求項１に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制する請求項２に記載のカドミウム感受性植物の作出方法。
【請求項４】
Ｔ−ＤＮＡの挿入により、請求項１に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制する請求項２から３のいずれかに記載のカドミウム感受性植物の作出方法。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載のカドミウム感受性植物の作出方法により得られることを特徴とするカドミウム感受性植物。
【請求項６】
植物がシロイヌナズナである請求項５に記載のカドミウム感受性植物。
【請求項７】
請求項１に記載の遺伝子に、Ｔ−ＤＮＡが挿入されてなることを特徴とする遺伝子。
【請求項８】
配列番号：４で示される塩基配列を含む請求項７に記載の遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子、及び、前記遺伝子を破壊乃至発現抑制することによるカドミウム感受性植物の作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物を用いて、カドミウム、銅、鉛などの重金属による土壌汚染を浄化（ファイトリメディエーション）する方法は、近年盛んに研究されてきている。しかし、単位面積当りや時間当りに植物が重金属を吸収・無害化できる量は少なく、一部の例外を除けば、本格的な実用化には到達していない。そこで、重金属の吸収・蓄積能力を遺伝子組換えによって増強できるならば、従来の方法を補うことが期待できる。そのためには、まず、重金属の吸収・蓄積能力に関与する遺伝子の単離が求められる。現在までに重金属の耐性・蓄積に関与する因子として、ｐｈｙｔｏｃｈｅｒａｔｉｎ、ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ、ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒなどが知られているが、それらの遺伝子を導入した植物では、重金属に対する耐性・蓄積能が増加した場合もあるが、そうでない場合もあり、評価は定まっていない。その理由として、複雑な生理に根ざした重金属の吸収・蓄積の機構は未だ不明な点が多いことや、遺伝子の発現レベル、タンパク質レベルにおける複合的な因子の関与の可能性が挙げられる。このような現状を打破するためには、金属の吸収・蓄積機構の網羅的な解析が有効であると考えられており（非特許文献１参照）、このような研究の進行が望まれているのが現状である。
【０００３】
【非特許文献１】Ｌａｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１：１２１５−１２２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、植物を用いた、カドミウム等の重金属による土壌汚染の浄化（ファイトリメディエーション）の実用化に寄与するため、植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子を提供することを目的とする。更に、本発明は、前記遺伝子を利用して、カドミウム感受性植物を作出する方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、まず、Ｔ−ＤＮＡタギング法（Ｋｏｎｃｚ  Ｃら，（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８６（２１）：８４６７−７１参照）を用いて、アラビドプシス（シロイヌナズナ）の変異体集団を作製し、その中からカドミウム（Ｃｄ）に対して強い感受性を示す変異体を選抜した。次いで、前記変異体において、Ｔ−ＤＮＡによって破壊された遺伝子の塩基配列を解析することにより、植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子を同定し、本発明の完成に至った。
Ｔ−ＤＮＡタギング法は、Ｔ−ＤＮＡを外部からゲノム遺伝子へ挿入し、その遺伝子の発現を抑えることにより、遺伝子の機能を推定する方法である。前記方法は、遺伝子とその機能、即ち表現型との相関が明確であるために、有力な方法であり、ひとたび表現型を発見した場合には、その関連の遺伝子をすぐに同定できる利点がある。
また、アラビドプシス（シロイヌナズナ）のゲノムサイズは非常に小さいため、Ｔ−ＤＮＡタギングによる変異体集団の規模自体を小さくすることができる。そのため、効率よく目的の変異体を選抜することができる点で、有利である。また、アラビドプシスは、既にその全塩基配列が決定されており、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたゲノムのシークエンスを解読することにより、どの遺伝子がＴ−ＤＮＡによって破壊されたかを瞬時に同定することが可能であり、迅速なデータ取得が可能となる点でも有利である。
【０００６】
本発明者らにより同定された植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子は、従来、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）をコードする遺伝子として知られていた遺伝子である。ＴＰＩは、解糖系においてジヒドロキシアセトンリン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸へ異性化する酵素であることが知られているが、カドミウムに対する耐性に関与することは従来知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。また、このＴＰＩ遺伝子の発現を抑制させることにより、カドミウムに対して強い感受性を示す植物が得られることも本発明者らによる新たな知見であり、これらの知見は、ファイトリメディエーション（植物を用いたカドミウム等の重金属による汚染土壌の浄化）の分野における研究開発に非常に有用であると考えられる。
【０００７】
本発明は、本発明者による前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、植物のカドミウムに対する耐性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなることを特徴とする遺伝子である。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
＜２＞  植物において、前記＜１＞に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制することを特徴とするカドミウム感受性植物の作出方法である。
＜３＞  塩基の置換、欠失及び／又は挿入により、前記＜１＞に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制する前記＜２＞に記載のカドミウム感受性植物の作出方法である。
＜４＞  Ｔ−ＤＮＡの挿入により、前記＜１＞に記載の遺伝子を破壊乃至発現抑制する前記＜２＞から＜３＞のいずれかに記載のカドミウム感受性植物の作出方法である。
＜５＞  前記＜２＞から＜４＞のいずれかに記載のカドミウム感受性植物の作出方法により得られることを特徴とするカドミウム感受性植物である。
＜６＞  植物がシロイヌナズナである前記＜５＞に記載のカドミウム感受性植物である。
＜７＞  前記＜１＞に記載の遺伝子に、Ｔ−ＤＮＡが挿入されてなることを特徴とする遺伝子である。
＜８＞  配列番号：４で示される塩基配列を含む前記＜７＞に記載の遺伝子である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、従来における諸問題を解決することができ、植物におけるカドミウム耐性に関与する遺伝子を提供することができ、また、前記遺伝子を利用して、カドミウム感受性植物を作出する方法を提供することができる。本発明は、植物を用いた、カドミウム等の重金属による土壌汚染の浄化（ファイトリメディエーション）の実用化に大きく寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子）
本発明の遺伝子は、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡであり、植物のカドミウムに対する耐性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなることを特徴とする。
（ａ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ
（ｄ）配列番号：２又は配列番号：３で示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ
【００１０】
本発明者らは、植物のカドミウム耐性に関与する新規な遺伝子（以下、本明細書中において、単に「遺伝子」と称することがある）を同定した。なお、本発明者らが同定したアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ：シロイヌナズナ）における前記遺伝子の、タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に、前記タンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号：２（ゲノム配列）及び配列番号：３（ｃＤＮＡ配列）に示す。
前記配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、従来、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）として知られていたタンパク質である。前記ＴＰＩは、解糖系においてジヒドロキシアセトンリン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸へ異性化する機能を有する酵素であることが知られている。
【００１１】
本発明において、前記遺伝子は、それがコードするタンパク質が、植物のカドミウムに対する耐性に関与するものである。ここで、前記「植物のカドミウムに対する耐性に関与する」とは、例えば、前記タンパク質が、植物におけるカドミウムの吸収機構や蓄積機構、カドミウムの無害化機構等に何らかの形で関係をしており、結果として、植物にカドミウムに対する耐性を与えていることをいう。なお、前記植物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、キク科植物、シソ科植物、イネ科植物などが挙げられる。
【００１２】
前記遺伝子がコードするタンパク質が、植物のカドミウムに対する耐性に関与するか否かは、例えば、植物における前記遺伝子を破壊乃至発現抑制し、前記植物のカドミウムに対する感受性が高まったか否かを検討することによって確認することができる。前記遺伝子を破壊乃至発現抑制する方法としては、特に制限はなく、例えば、後述する本発明のカドミウム感受性植物の作出方法の項目に記載した通りである。また、前記植物のカドミウムに対する感受性の確認方法としても、特に制限はなく、例えば、後述する実施例に記載したような、カドミウム感受性試験等を利用して行うことができる。
【００１３】
また、前記遺伝子は、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と構造的に類似しているタンパク質であり、植物のカドミウムに対する耐性に関与するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。このような遺伝子としては、例えば、前記タンパク質において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。ここで、前記「複数のアミノ酸」とは、その数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されても、前記タンパク質の植物のカドミウムに対する耐性に関与するという特性が維持される限り、特に制限はないが、通常、１〜１０アミノ酸以内であり、１〜５アミノ酸以内が好ましく、１〜３アミノ酸以内がより好ましい。また、前記タンパク質において、アミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加され得る領域としても、前記特性が維持される限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１４】
また、前記遺伝子の形態としては、特に制限はなく、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等が挙げられ、これらのＤＮＡの調製方法としては、特に制限はなく、例えば、ハイブリダイゼーション技術、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術、逆転写反応（ＲＴ）技術等、当業者に公知の手法を用いて調製することができる。
ゲノムＤＮＡは、例えば、前記遺伝子を有する植物からゲノムＤＮＡを抽出して、ゲノミックライブラリーを作製し、これを展開して、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列を基に調製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、或いはプラークハイブリダイゼーション等を行うことにより調製することができる。また、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列やゲノム上のその近傍の塩基配列に特異的なプライマーを作製し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。
また、ｃＤＮＡは、例えば、前記遺伝子を有する植物から抽出したｍＲＮＡを基に、ｃＤＮＡを合成し、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列を基に作製したプライマーを用いて、ＰＣＲ等を行うことにより調製することができる。また、ｃＤＮＡをλＺＡＰ等のベクターに挿入して、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを展開して、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列を基に作製したプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、或いはプラークハイブリダイゼーション等を行うことにより調製することも可能である。
【００１５】
また、このように調製され得る、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列のコード領域を含むＤＮＡのみならず、前記ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる遺伝子もまた、前記ＤＮＡがコードするタンパク質が植物のカドミウムに対する耐性に関与するという特性を維持する限り、本発明の遺伝子に含まれる。
なお、本発明において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、ナトリウム濃度が、通常、２５〜５００ｍＭであることをいい、２５〜３００ｍＭであることが好ましい。また、温度が、通常、４２〜６８℃であることをいい、４２〜６５℃であることが好ましい。
このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡは、それがコードするタンパク質のアミノ酸配列において、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。ここで、高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも相同性が７０％以上であることをいい、８０％以上が好ましく、９０％以上が更に好ましく、９５％以上が特に好ましい。なお、前記したようなアミノ酸配列又は塩基配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）等、当業者に公知の手段を利用して求めることができる。
【００１６】
（カドミウム感受性植物の作出方法）
本発明のカドミウム感受性植物の作出方法は、植物において、前記本発明の遺伝子（植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子）を破壊乃至発現抑制することを少なくとも含むことを特徴とする。
【００１７】
＜遺伝子の破壊乃至発現抑制＞
前記本発明の遺伝子はカドミウム耐性に関与するタンパク質をコードしているため、植物において前記遺伝子を破壊乃至発現抑制することによれば、前記植物においてカドミウム耐性に関与するタンパク質が産生されず、或いは産生量が減少し、これにより、植物のカドミウムに対する感受性を高めることができる。なお、前記遺伝子の破壊乃至発現抑制を行う対象となる植物の種類としては、特に制限はなく、作出したいカドミウム感受性植物の種類に応じて適宜決定することができる。
前記遺伝子の破壊乃至発現抑制の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、前記遺伝子の構造遺伝子領域、或いは調節遺伝子領域に、塩基の置換、欠失、及び／又は挿入を生じさせることで、前記遺伝子の機能を破壊して発現を抑制させる方法；植物内で、前記遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を発現させることにより、タンパク質への翻訳を抑制する方法；などが挙げられる。
ここで、前記「遺伝子の破壊乃至発現抑制」とは、前記遺伝子のＤＮＡからｍＲＮＡへの転写工程を阻害するものであってもよいし、前記遺伝子のｍＲＮＡからタンパク質への翻訳工程を阻害するものであってもよい。また、その阻害の程度としても、特に制限はなく、結果として、前記遺伝子の破壊乃至発現抑制を受けた植物が、カドミウムに対する感受性を示すようになればよい。
【００１８】
−塩基の置換、欠失、及び／又は挿入による遺伝子の破壊−
−−Ｔ−ＤＮＡの挿入−−
前記遺伝子の構造遺伝子領域、或いは調節遺伝子領域（例えば、プロモーター等）に、塩基の挿入を生じさせる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができ、例えば、Ｔ−ＤＮＡタギング法（Ｋｏｎｃｚ  Ｃら、（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８６（２１）：８４６７−７１参照）等を利用することができる。前記Ｔ−ＤＮＡタギング法は、Ｔ−ＤＮＡを外部からゲノム遺伝子へ挿入し、その遺伝子の発現を抑える方法である。
ここで、前記Ｔ−ＤＮＡは、少なくともその両端に、一定の境界領域（ＲＢ、ＬＢと称される約２５ｂｐからなる同一方向の反復配列）を含んでなるものであればよく、内部の遺伝子は他の遺伝子に置き換えられていてもよい。また、前記Ｔ−ＤＮＡタギング法に用いるベクターは、特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に示すようなｐＧＰＴＶ−ｂａｒ（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｄら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７参照）等を使用することができる。前記ベクターは、当業者に公知の手法により植物細胞内に導入することができ、例えば、前記ベクターをアグロバクテリウムに取り込ませ、それを植物細胞に感染させることにより、植物細胞内に導入することができる。
前記Ｔ−ＤＮＡタギング法により、Ｔ−ＤＮＡを、対象とする植物のゲノムにランダムに挿入し、得られた複数種の変異体の中から、カドミウムに対する感受性を示す変異体を選抜することにより、カドミウム感受性植物を得ることができる。なお、カドミウムに対する感受性を示す変異体を選抜する方法としては、特に制限はなく、例えば、実施例に記載したような、カドミウム感受性試験等を利用して選抜を行うことができる。
【００１９】
−−置換、欠失−−
前記遺伝子の構造遺伝子領域、或いは調節遺伝子領域（例えば、プロモーター等）に、塩基の置換又は欠失を生じさせる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができ、例えば、放射線照射、中性子線照射等の手法を利用することができる。これらの手法により得られた複数種の変異体の中から、カドミウムに対する感受性を示す変異体を選抜することにより、カドミウム感受性植物を得ることができる。
【００２０】
−アンチセンスＲＮＡ鎖による翻訳抑制−
植物内で、前記遺伝子のｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を発現させる方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の手法を適宜利用することができ、例えば、前記遺伝子の少なくとも一部、例えば、配列番号：２又は配列番号：３に示される塩基配列のコード領域の全領域又は一部領域を、プロモーターの下流にアンチセンス方向に連結した発現カセットを構築し、前記発現カセットを植物細胞内に導入する方法などが挙げられる。
前記発現カセットの構築方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、植物内で転写可能なプロモーター配列、前記アンチセンスＲＮＡ鎖をコードするＤＮＡ断片、及び、必要に応じて適宜ターミネーター配列等を連結することにより、構築することができる。
また、前記発現カセットを植物細胞内に導入する方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等、当業者に公知の手法を利用することができる。また、前記発現カセットは、ベクターを介して植物細胞内に導入されてもよい。例えば、適切なベクターに前記発現カセットをクローニングし、前記ベクターをアグロバクテリウムに取り込ませ、それを植物細胞に感染させることにより、前記発現カセットを植物細胞内に導入することができる。
【００２１】
前記のようにして前記遺伝子を破壊乃至発現抑制した植物細胞は、当業者に公知の手法により、植物個体に再生することができる。例えば、カルス状の形質転換細胞をホルモンの種類、濃度を変えた培地へ移して培養し、不定胚を形成させ、完全な植物体を得る方法などが挙げられる。使用する培地としては、例えば、ＬＳ培地、ＭＳ培地などが挙げられる。
一旦、染色体内の前記遺伝子が破壊乃至発現抑制された形質転換植物体（カドミウム感受性植物）が得られれば、前記植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、前記植物体やその子孫、或いはクローンから種子等を得て、それらを基に前記植物体を量産することも可能である。
【００２２】
（カドミウム感受性植物）
本発明のカドミウム感受性植物は、前記本発明のカドミウム感受性植物の作出方法により得られる植物であり、前記本発明の遺伝子（植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子）が破壊乃至発現抑制されてなることを特徴とする。
【００２３】
前記植物の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、キク科植物、シソ科植物、イネ科植物などが挙げられる。
また、前記カドミウム感受性植物としては、前記植物体の全体のみならず、前記植物体の部分又は繁殖材料（例えば、植物器官（例えば、種子、葉、花弁、茎、根等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、植物培養細胞等）が含まれるものとする。
【００２４】
前記植物がカドミウム感受性を示すものであることは、例えば、後述する実施例に示すような、カドミウム感受性試験等を利用して確認することができる。例えば、２５μＭから１００μＭ程度の濃度のカドミウム存在下で、前記植物の種子を生育させ、根の伸長量を野生型と比較する。前記濃度のカドミウム存在下で、前記植物の根の伸長量が、野生型の根の伸長量の例えば２／３程度以下であった場合に、前記植物はカドミウム感受性を示すものであると確認することができる。
なお、前記カドミウム感受性植物のカドミウム感受性の程度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、少なくとも野生型の植物よりも強いカドミウム感受性を示すものであればよい。
【００２５】
（Ｔ−ＤＮＡが挿入された遺伝子）
また、本発明は、前記本発明の遺伝子（植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子）に、Ｔ−ＤＮＡが挿入されてなることを特徴とする遺伝子にも関する。
前記Ｔ−ＤＮＡが挿入された遺伝子は、前記本発明の遺伝子の機能（植物のカドミウム耐性に関与するという機能）が破壊されてなるものである。前記本発明の遺伝子へのＴ−ＤＮＡの挿入方法としては、前記本発明のカドミウム感受性植物の作出方法の項目に記載した通りであり、また、Ｔ−ＤＮＡの挿入部位としても、前記本発明の遺伝子の機能が破壊されるような挿入部位であれば、特に制限はなく、適宜選択することができる。
前記Ｔ−ＤＮＡが挿入された遺伝子としては、具体的には、例えば、配列番号：４に示される塩基配列を含む遺伝子等が挙げられる。前記配列番号：４に示される塩基配列を含む遺伝子は、後述する実施例に示す通り、本発明の遺伝子であるシロイヌナズナＴＰＩ遺伝子の第７イントロンにＴ−ＤＮＡが挿入されてなるものであり、前記本発明の遺伝子の機能（植物のカドミウム耐性に関与するという機能）が破壊されている。
ここで、配列番号：４に示される塩基配列のうち、１〜２３６番目の塩基はシロイヌナズナＴＰＩ遺伝子のゲノム配列の一部（配列番号：２の、１，８７５〜２，１１０番目の塩基に相当）を示し、２３７〜３５２番目の塩基は挿入されたＴ−ＤＮＡ配列の一部を示す。中でも、２６０〜３５２番目の塩基はＴ−ＤＮＡのＬＢ領域を示し、３３１〜３５２番目の塩基はＬＢ３プライマー部位（実施例２参照、後述）を示す。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではなく、本技術分野において行われるこれらに対する通常の改変及び修飾を含むものとする。
【００２７】
（実施例１：カドミウム感受性を示す植物変異体の選抜）
本実施例１では、植物のカドミウム耐性に関与する遺伝子の探索を目的として、Ｔ−ＤＮＡタギング法を用いてアラビドプシス（シロイヌナズナ）の変異体集団を作製し、その中からカドミウム（Ｃｄ）に対する感受性が増した変異体を以下のようにして選抜した。
【００２８】
＜植物の形質転換＞
−Ｔ−ＤＮＡベクター（バイナリーベクター）の構築−
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化したＴ−ＤＮＡベクター（バイナリベクター）ｐＧＰＴＶ−ｂａｒ（Ｂｅｃｋｅｒ  Ｄら，（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０：１１９５−１１９７参照）に、ベクター３５ｓｐ−ｓＧＦＰ−ＰＵＣ１８（静岡県立大学  大学院生活健康科学研究科食品栄養化学専攻（食糧細胞工学研究室）の丹羽康夫博士から分譲を受けたものを使用した）からＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出したｓＧＦＰを含む断片を図１のように組み込んだ。得られた新しいベクターを大腸菌にクローニング後、エレクトロポーレーション装置（Ｂｉｏｒａｄ製）によって、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３１０１）に導入した。エレクトロポーレーションの条件は以下のとおりである。キュベット間隔０．１ｃｍ、電圧１．７ｋｖ、抵抗２００Ω、キャパシタンス２５μＦ。
アグロバクテリウムは、１００ｍｇ／ｌ  カナマイシンと８０ｍｇ／ｌ  リファンピシンを含むＹＥＰ培地で、２８℃、２日間培養した。単一のコロニーを拾い、構築されたベクターの存在をＰＣＲによって確認した後、ＹＥＰ液体培地で培養した。集菌後、ＯＤ６００＝１．５〜２．０になるように懸濁液（５％ショ糖、０．０２５％Ｓｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（ＯＳＩ  ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ，英国））に懸濁した。
【００２９】
−アラビドプシスへの感染−
一方、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌ  ０  ｇｌ−１）を閉鎖系温室（２２℃、１６時間明期）で栽培し、形質転換のための材料とした。アラビドプシスの株から未熟種子及び開いた花を除去し、アグロバクテリウム懸濁液をアラビドプシスの蕾に噴霧した。アグロバクテリウムを感染させた植物を、湿度を保つため２４時間、半密閉容器に入れた。その後、余分な懸濁液やその中に含まれる糖分を除去するために、植物を洗い流した。１回の操作に５〜６株のアラビドプシスを用いた。形質転換した植物は種子が十分に成熟するまで栽培し、その後種子（Ｔ１世代）を収穫した。
【００３０】
＜選抜＞
−除草剤による選抜−
遺伝子組換え操作後に成熟する鞘の中の種子（Ｔ１）には、形質転換されたものとされていないものが混在している。そこで、形質転換された種子のみを選抜する必要がある。形質転換された植物は除草剤（ビアラホス）耐性遺伝子ｂａｒを持つことから、形質転換体の選抜にはビアラホスを含むハービー液剤を用いることにした。しかし、選抜に用いるのに適切な濃度が不明であるため、最初に形質転換個体を選抜するために用いるハービー液剤の最適濃度を決定した。ハービー液剤を種々のビアラホス濃度（０−１，０００ｍｇ／ｌ）に希釈し、発芽後２週間目の野生型及びｂａｒを持つ既知の形質転換アラビドプシスに２日おきに散布した。野生型は３０ｍｇ／ｌの除草剤に対して感受性を示し、散布２週間目には６０ｍｌ／ｌで完全に枯死した。しかし、ｂａｒをもつ形質転換体では２４０ｍｌ／ｌまでは生育阻害は認められず、１，０００ｍｇ／ｌでほとんど枯死した（図２）。これらの結果から、Ｔ１における形質転換体の選抜には１００ｍｇ／ｌ濃度のハービー液剤を用いることにした。
【００３１】
Ｔ１種子、５，０００〜７，５００粒を細粒砂と混合し、イネ用の育苗トレー（３００×６００×３０ｍｍ）に播種した。潅水してラップで包み、４℃、７日間催芽処理を行って閉鎖系温室で栽培した。なお、栽培にはバーミュキュライト、パーライト、プランター培土、ピートモスを１：１：１：３の割合で混合した土壌を用いた。除草剤（ビアラホス）耐性遺伝子ｂａｒを持つ形質転換個体を選抜するために、発芽後２週間目の幼植物にハービー液剤（サンケイ化学；有効成分として１８％ビアラホスを含有する）をビアラホス濃度が５０ｍｇ／ｌになるように調整して、１トレーあたり２００ｍｌ散布した。以後、４日おきに１００ｍｇ／ｌのビアラホス濃度のハービー液剤を、非形質転換植物が完全に枯死するまで散布した。生き残った個体、５株ずつを集めて、新しいトレーに移植した。登熟後、Ｔ２世代種子を採取した。
【００３２】
実際に形質転換を行って得られた種子（Ｔ１）をトレーに播種し、形質転換体の選抜を行った様子を図３に示す。除草剤散布後１週間で、形質転換体と思われる植物（Ｔ１）と野生型と思われる植物の成長に差が現れ始めた。２週間目になるとその差がはっきりと現れ、野生型では成長がほぼ止まり、葉が黄色〜褐色になった。生き残った個体は葉が旺盛に茂り成育の遅れは認められなかった。このような方法で、最終的に約１３，０００系統の形質転換体を得ることができた。なお、形質転換実験のロット間に形質転換効率の違い（０．３−０．８％）が見られたが、平均の形質転換効率は０．５１％であった（表１）。形質転換体は５株を１まとめにして種子（Ｔ２）を採取した。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
−Ｃｄによる１次選抜−
Ｃｄ感受性変異体を得るための方法として、形質転換体の芽生えを、Ｃｄを含有する培地に置き、根の伸長量が抑制されている個体を変異体として選抜するのが有効と考えられる。しかし、培地に入れるのに最適なＣｄ濃度は不明である。そこで、最初に感受性個体の選抜に最適なＣｄ濃度を求めるために、後述する実施例３で示したようなＣｄ感受性試験を、野生型を用いて行った。その結果、Ｃｄ濃度の増加によって、根の伸長量は徐々に減少すると共に、側根の発生が増加した。特に７５μＭ以上の場合の根の伸長抑制は大きくなった（図４）。本実験は５回繰り返したが、いずれも同様な結果となった。
これらのことから、Ｃｄによって根の伸長量が抑えられ、実験後の生存も可能であり、更に、野生型と変異体との根の伸長量の差が大きくなると予想される濃度として５０μＭが妥当であると考えられた。
【００３５】
以上の結果を元に、Ｔ２種子を５０μＭ  Ｃｄを含む培地に播種して、Ｃｄ感受性変異体を以下のようにして選抜した。
Ｔ２世代種子は、５系統の種子が混合されて採種されているので、その取り扱い単位をサブプールとした。更に５サブプールを１スーパープールとした。つまり、１スーパープールには２５系統の種子があることとなる。１スーパープールあたり約５００粒を１．５ｍｌチューブに入れ、水を加えた後４℃、４日間の催芽処理をおこなった。種子を有効濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液に１５分浸漬することによって滅菌を行った。滅菌した種子を蒸留水で数回洗浄して、５０μＭ  ＣｄＣｌ２を含む１／２濃度のＭＳ培地５枚（直径９０ｍｍ）に播種した。２４℃、１６時間照明下で７日間培養した後、シャーレを観察し、根の伸長が野生型の根と比較しておよそ２／３以下に抑制されている個体や、葉色が薄くなった個体を目視により選抜し、ＣｄＣｌ２を含まない１／２濃度のＭＳ培地に継代した。２〜３週間後、鉢上げを行い、Ｔ３世代種子を採取した。
【００３６】
前記１次選抜によりＣｄ感受性変異体を選抜した結果、４，９８５個体を得ることができた。これらを鉢上げして次世代（Ｔ３）種子を得たが、生育不良等で栽培途中に枯死したものや、不稔などで実際に採種できたのは２，８５１個体分であった。この中で同系統由来で重複している種子を除くと、１次選抜の結果、独立して得られた系統数はおよそ１，６００系統と推定された。
【００３７】
−Ｃｄによる２次選抜−
１次選抜によって得られた系統の中には、Ｃｄ感受性変異体のほかに、発芽不良のため結果的に根の伸長が少ない個体も相当数含まれると考えられることから、選抜を確かなものとするために２次選抜を以下のようにして行った。
まず、１次選抜によって得られたＴ３世代種子と非形質転換種子をそれぞれ約２０粒ずつ１．５ｍｌチューブに入れ、１次選抜と同様な方法で催芽処理及び滅菌処理を行った。種子は、ＣｄＣｌ２を含まない１／２濃度のＭＳ培地（スクロース３％、アガー１．２％含む）に播種された。
４日間の培養後、生育が良好で根の長さが同程度の個体を選び、５０μＭ  ＣｄＣｌ２を含む１／２濃度のＭＳ培地（スクロース３％、アガー１．２％含む）に１系統につき５個体ずつ置いた。そして、根端にシャーレの裏面から、マーカーで印をつけた。６日後に伸長した根端にマーカーで印をつけた。変異体と野生型の根の伸長を目視にて比較し、その結果、根の伸長が野生型の根と比較しておよそ２／３以下に抑制されている変異体を選抜した。
【００３８】
２次選抜の様子を図５に示す。１次選抜で得られた系統のうち７４０系統に対して２次選抜を行い、３０系統の変異体を得ることができた。これらのうち、特にカドミウムに対して強い感受性を示す系統（４１−３系統；図６）を選択し、以下の実施例２において遺伝子の同定を行った。
【００３９】
（実施例２：カドミウム耐性に関与する遺伝子の同定）
実施例２では、実施例１の２次選抜によって得られた変異体の中から、特にカドミウムに対して強い感受性を示す系統（４１−３系統；図６）を選択し、Ｔ−ＤＮＡ挿入により破壊された（発現が抑制された）遺伝子の同定を行った。カドミウムに対して強い感受性を示す変異体において、Ｔ−ＤＮＡ挿入により破壊されている（発現が抑制されている）遺伝子が、植物においてカドミウム耐性に関与する遺伝子であることが推定できる。
【００４０】
＜ＴＡＩＬ−ＰＣＲによる増幅と塩基配列の決定＞
２次選抜によって得られた変異体の中で特にカドミウムに対して強い感受性を示す４１−３系統（図６）からＤＮＡを抽出し、Ｔ−ＤＮＡタギングによって破壊された遺伝子を検出するために、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ）を行った。ＴＡＩＬ−ＰＣＲは、Ｔ−ＤＮＡのボーダー配列に特異的なプライマーと非特異的なプライマーとを組み合わせ、ゲノムへ組み込まれたＴ−ＤＮＡとゲノムの境界領域をＰＣＲによって増幅させる方法である（Ｌｉｕら，（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ８：４５７−４６３参照）。
リジェネレートプライマーＤＥＧ１及び特異的プライマーＬＢ１〜ＬＢ３は表２のように設計した。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は図７に示す条件で行った。反応液量は２０μｌとし、終濃度をそれぞれｄＮＴＰ０．２ｍＭ、リジェネレートプライマー１μＭ、特異的プライマー０．２μＭ、ポリメラーゼ（Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラ））０．０５ｕｎｉｔ／μｌとした。２回目、３回目の反応におけるテンプレートは１回目、２回目の反応液を５０倍希釈したものを１μｌ用いた。増幅されたＤＮＡはアガロースゲル電気泳動により確認した。結果を図８に示す。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
次いで、ＴＡＩＬ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動後、ゲルから切り出し、ダイレクトシークエンスを行った。蛍光試薬はＢｉｇｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、メーカーのプロトコールに従いＤＮＡのラベルをした。シーケンサーはＡＢＩ社製を用いた。なお、シークエンスの結果が不良な場合は、ＤＮＡをゲルから切り出した後、ＴＡクローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を行い、シークエンスした。シークエンスの結果を配列番号：４に示す。得られた塩基配列情報はＤＮＡ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ  ｏｆ  ＪａｐａｎのＢＬＡＳＴで検索を行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）。更に、塩基配列情報を元にＴ−ＤＮＡの挿入部位を決定した。
その結果、ＴＡＩＬ−ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの塩基配列（配列番号：４）は、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子のゲノム配列の一部（配列番号：２の１，８７５〜２，１１０番目の塩基に対応）と、Ｔ−ＤＮＡ配列の一部（ＬＢ３プライマー部位まで）からなるものであった（図９Ａ参照）。即ち、図９Ｂに示すように、第３染色体に座上しているＴＰＩ遺伝子の第７イントロンに、Ｔ−ＤＮＡが挿入されていることが推定された。なお、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）は、従来、解糖系においてジヒドロキシアセトンリン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸へ異性化する酵素であることが知られており、そのアミノ酸配列は配列番号：１に、ＤＮＡ配列は配列番号：２（ゲノム配列）及び配列番号：３（ｃＤＮＡ配列）に示す通りである。
【００４３】
＜Ｔ−ＤＮＡ挿入部位の確認＞
次に、前記で決定したＴ−ＤＮＡ挿入部位が正しいかどうかを調べるために、４１−３系統のゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行った。用いたプライマー（４１−３Ｆ／Ｒ／ＬＢ）を表３に記す。また、用いたプライマーがゲノムＤＮＡにアニールする部位の模式図を図１０Ａに示す。なお、ＰＣＲ条件は以下のとおりである。９４℃／５分の後、９４℃／３０秒、５６℃／１分、７２℃／１分を２５回繰り返した。更に７２℃／５分の後、４℃に保った。
ＰＣＲの結果を図１０Ｂに示す。実験を行った全ての個体で、Ｆ及びＬＢのプライマーの組み合わせを用いた場合にバンドが得られ、変異体型を示したことから、この挿入部位が正しいことが分かるとともに、この挿入部位がホモであることが強く示唆された。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
＜ＴＰＩ遺伝子の発現抑制の確認＞
次に、Ｔ−ＤＮＡの挿入によってＴＰＩ遺伝子の発現が抑制されているかどうかを確かめる目的で、４１−３系統において半定量ＰＣＲを行った。用いたプライマー（ＡＣＴ  Ｆ／Ｒ、ＴＰＩ  Ｆ／Ｒ）を表３に記す。野生型及び変異体（４１−３系統）からトリゾルを用いてＲＮＡを抽出し、それを鋳型として逆転写反応を行った。更に反応後、得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
その結果、野生型ではＴＰＩ遺伝子の発現が認められたが、４１−３系統では全く見られなかった（図１１）。これは、Ｔ−ＤＮＡの導入によってＴＰＩ遺伝子の転写が行われなくなっているか、又は、転写産物が速やかに分解されていることを示している。いずれにしても、４１−３系統のＴＰＩ遺伝子の転写産物は蓄積していないことから、ＴＰＩは作られていないことが強く示唆された。
【００４６】
（実施例３：選抜された植物変異体のカドミウム感受性）
実施例３では、実施例１で選抜された植物変異体（４１−３系統）のカドミウム(Ｃｄ)に対する感受性を確認した。
【００４７】
＜Ｃｄ感受性試験＞
４１−３系統の特性を把握するために、Ｃｄ存在下における根の伸長試験を行った。４１−３系統の種子に対して、１次選抜と同様に催芽処理及び滅菌処理を行い、１／２濃度のＭＳ培地に播種した。４日後、０〜１５０μＭの各濃度のＣｄＣｌ２を含むＭＳ培地に発芽した幼植物を継代した。そして、２次選抜の場合と同様にマーカーで根端に印をつけ、６日後、スキャナーで画像を取り込み、解析ソフトＳｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｏｎｃｏｒｐ．ｃｏｍ／）で根の伸長量を測定した。
【００４８】
その結果、Ｃｄが０μＭの場合は変異体と野生型の根の伸長に差は認められなかったが、特に２５μＭから１００μＭのＣｄ濃度において、変異体の根の伸長は野生型に比べて抑制された（図１２）。また、１２５μＭ以上の場合、両者ともほとんど根の伸長が止まっていた。
【００４９】
以上、実施例１〜３より、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子が、植物におけるカドミウムに対する耐性に関与する遺伝子であることが示唆された。ＴＰＩは、解糖系においてジヒドロキシアセトンリン酸からグリセルアルデヒド３−リン酸へ異性化する酵素であることが知られているが、カドミウムに対する耐性に関与することは従来知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。また、このＴＰＩ遺伝子の発現を抑制させることにより、カドミウムに対して強い感受性を示す植物が得られることも本発明者らによる新たな知見であり、これらの知見は、例えばファイトリメディエーション（植物を用いたカドミウム等の重金属による汚染土壌の浄化）の分野における研究開発に、非常に有用であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明において同定されたカドミウムに対する耐性に関与する遺伝子、及び前記遺伝子を利用したカドミウム感受性植物の作出方法は、例えば、ファイトリメディエーション（植物を用いたカドミウム等の重金属による汚染土壌の浄化）の分野における研究開発に、好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、実施例１で構築したＴ−ＤＮＡベクター（バイナリーベクター）の模式図である。ｐＧＰＴＶ−ｂａｒ−ＧＵＳからＧＵＳを切り出し、そこにｓＧＦＰを導入した。Ｎｏｓ３’：Ｎｏｓターミネーター、ＣａＭＶ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ＬＢ：レフトボーダー、ＲＢ：ライトボーダー。
【図２】図２は、実施例１において形質転換個体を選抜するために用いるビアラホス含有除草剤（ハービー液剤）の最適濃度を決定するために、ビアラホスの濃度の違いによる組換え体の生育の違いを調べた結果を示す図である。野生型とｂａｒ遺伝子を持つ組換え体の種子を土壌に播種し、ビアラホス（０−１，０００ｍｇ／ｌ）を２日おきに散布した。
【図３】図３は、実施例１における形質転換により得られた種子（Ｔ１）の選抜の様子を示す図である。発芽後、２週目の個体を５０ｍｇ／ｌビアラホス含有除草剤で選抜し、以後１００ｍｇ／ｌビアラホス含有除草剤で選抜した。トレーは縦３０ｃｍ、横６０ｃｍ、高さ３ｃｍのものを使用し、１トレーに対し２００ｍｌの除草剤を２日おきに散布し、２週間かけて選抜を行った。矢印で記した個体は形質転換体。
【図４】図４は、実施例１において感受性個体の選抜に最適なカドミウム（Ｃｄ）濃度を求めるために、Ｃｄ感受性試験を野生型を用いて行った結果を示す図である。野生型の種子を１／２ＭＳ培地に播種し、３日後にＣｄＣｌ２を含む１／２ＭＳ培地にて６日間暴露した。ｎ＝１５、縦線は標準偏差を示す。
【図５】図５は、実施例１におけるカドミニウム（Ｃｄ）による形質転換体の２次選抜の様子を示す図である。５０μＭ  Ｃｄを含む培地に発芽後４日目の実生を置き、６日後に撮影した。右上の丸は野生型、左上、中央、及び中央下の丸は感受性を示した変異体。
【図６】図６は、実施例１で選抜されたカドミウム感受性変異体（４１−３系統）の、カドミニウム（Ｃｄ）による根の伸長阻害を示す図である。０μＭと５０μＭ  Ｃｄで６日間暴露したときの野生型と４１−３系統の根の伸長具合を比較した。
【図７】図７は、実施例２で行ったＴＡＩＬ−ＰＣＲのＰＣＲ条件を示す図である。
【図８】図８は、実施例２で行ったＴＡＩＬ−ＰＣＲの結果を示す電気泳動像である。１：分子量マーカー（１００ｂｐ  ｌａｄｄｅｒ）、２：１回目のＴＡＩＬ  ＰＣＲ産物、３：２回目のＴＡＩＬ  ＰＣＲ産物、４：３回目のＴＡＩＬ  ＰＣＲ産物（５０倍に希釈した２回目の反応物を鋳型とした）、５：３回目のＴＡＩＬ  ＰＣＲ産物（５００倍に希釈した２回目の反応物を鋳型とした）。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例２で行ったＴＡＩＬ−ＰＣＲによる増幅部位を示す図である。３回目の増幅産物（ＬＢ３プライマーを用いて増幅を行った産物）についてシークエンスを行った（配列番号：４）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例２で決定したカドミウム感受性変異体（４１−３系統）におけるＴ−ＤＮＡの挿入部位を示す図である。Ｔ−ＤＮＡはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）遺伝子の第７イントロンに挿入されていた。直線とボックスは、それぞれイントロンとエクソンを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実施例２においてＴ−ＤＮＡ挿入部位の確認のため行ったＰＣＲで、用いたプライマーがアニールする部位の模式図である。４１−３系統のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＬＢ、Ｆ、Ｒはプライマーを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実施例２においてＴ−ＤＮＡ挿入部位の確認のため行ったＰＣＲの結果を示す電気泳動像である。１：Ｆ、Ｒのプライマーの組み合わせ、２：Ｆ、ＬＢのプライマーの組み合わせ。
【図１１】図１１は、実施例２において、Ｔ−ＤＮＡの挿入によりＴＰＩ遺伝子の発現が抑制されているかどうかを確認する目的で、４１−３系統において半定量ＰＣＲを行った結果を示す電気泳動像である。温室で栽培した植物からＲＮＡを抽出し、ＴＰＩ遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した。ＷＴ：野生型、４１−３：４１−３系統（カドミウム感受性変異体）。
【図１２】図１２は、実施例３において、実施例１で選抜された植物変異体（４１−３系統）のカドミウム（Ｃｄ）に対する感受性を確認した結果を示す図である。４１−３系統（●）及び野生型（■）の実生を０〜１５０μＭ  Ｃｄを含有する培地に置床し、６日目に根の伸長量を測定した。ｎ＝１５、縦線は標準誤差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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