(57)【要約】【課題】本発明は、不安障害の発現との関連性が示唆されているDBIにおける多型と不安障害に含まれるアルコール依存症との関連性を明らかにし、不安障害の判定方法を提供することを課題とする。【解決手段】本発明の発明者らは、ジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子の遺伝子多型を解析し、アルコール依存症等の不安障害との関連性を調べた結果、DBI遺伝子における特定の多型対立遺伝子頻度が、不安障害と有意に関連性を有していることを明らかにし、そしてその不安障害と関連している多型対立遺伝子頻度を簡便に判定することができる方法を見いだし、本発明を完成するに至った。具体的には、DBI遺伝子の特定の多型対立遺伝子頻度を検出することからなる、不安障害の判定方法を提供する。本発明においては、また、DBI遺伝子の特定の多型を検出するためのプライマーもまた、提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子のエクソン2の-75 A/Tまたは+147 C/Aの多型対立遺伝子頻度を検出することからなる、不安障害の判定方法。
【請求項２】
不安障害が、アルコール依存症、パニック障害、薬物依存、からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
PCR-CTPP法により、DBI遺伝子のエクソン2における-75 A/T多型を検出する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
DBI遺伝子のエクソン2を増幅するPCRにおいて、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'（SEQ ID NO: 4）、リバースプライマー（DBI-e2CTPR）：5'-caggaaccat caccataccc-3'（SEQ ID NO: 5）、A検出プライマー（DBI-e2A）：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'（SEQ ID NO: 7）およびT検出プライマー（DBI-e2T）：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'（SEQ ID NO: 8）を用いて-75 A/T多型を検出する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
PCR生成物をゲル電気泳動後エチジウムブロマイドで染色することにより検出するか、または増幅が生じた場合にのみ蛍光を発する蛍光色素を結合させたプライマーを使用してリアルタイムPCR法により検出する、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
DBI遺伝子のエクソン2をフォワードプライマー（DBI-e2CTPF）：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'（SEQ ID NO: 4）、リバースプライマー（DBI-e2CTPR）：5'-caggaaccat caccataccc-3'（SEQ ID NO: 5）を用いてPCRにより増幅したのち、C型遺伝子にはないがA型遺伝子には存在するNdeI制限酵素部位を、NdeI制限酵素を用いて切断することにより、+147 C/A多型を検出する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
A検出プライマー（DBI-e2A）：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'（SEQ ID NO: 7）およびT検出プライマー（DBI-e2T）：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'（SEQ ID NO: 8）を有する、DBI遺伝子のエクソン2の-75 A/T多型検出用プライマーセット。
【請求項８】
フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'（SEQ ID NO: 4）、リバースプライマー（DBI-e2CTPR）：5'-caggaaccat caccataccc-3'：SEQ ID NO: 5）、A検出プライマー（DBI-e2A）：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'（SEQ ID NO: 7）およびT検出プライマー（DBI-e2T）：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'（SEQ ID NO: 8）を含む、DBI遺伝子のエクソン2の-75 A/T多型検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール依存症およびパニック障害などの不安障害についての判定方法を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
「不安障害」は、誰もが感じる程度をはるかに超える不安を持ち、それが原因となって行動や心理的障害をもたらす症状を総称した概念である。このような症状としては、全般性不安障害、社会不安障害、パニック障害、過敏性腸症候群、アルコール依存症、薬物依存症、等があることが知られている。
【０００３】
近年、各種薬物依存動物（アルコール、ニコチン、モルヒネ）において、内因性不安誘発物質として同定されているジアゼパム結合阻害物質（DBI）の有意な増加が報告されており、不安障害の発現とDBIの発現増加との関連性が報告されている。DBIは脳内で、抑制神経伝達物質であるGABAを含有する神経細胞のシナプス小胞体に存在するペプチドで、中枢神経のみならず末梢臓器にも分布している。また、薬理学的、電気生理学的研究により、DBIがベンゾジアゼピン受容体のインバースアゴニストとしての薬理活性を有すること、および内在性不安誘発物質として作用することなどが明らかにされており、多くの中枢性神経疾患で観察される精神症状の発現に関与している可能性が示唆されている。  ラットを用いた研究において、DBIは、分子質量が約10 kDaのペプチドであり、cDNAクローニングにより87個のアミノ酸残基から構成されていることが報告された（非特許文献1：Mocchetti, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 7221-7225）。そしてヒトにおける研究では、DBIは、104個のアミノ酸残基から構成されていることが明らかになり、哺乳動物間においてよく保存され、相同性も高いこと（非特許文献2：Gray, W.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 7547-7551）、そしてDBI遺伝子は2番染色体長腕上（2q12-21）に存在すること（非特許文献3：Debernardi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 85, 6561-6565）、4つのエクソンで構成され、プロセッシングの過程でアミノ酸33〜50番目で構成されているDBI33-50オクタデカンニューロペプチド（octadecaneuropeptide）：ODNが生成されること（非特許文献4：Ferrero, P., et al., Brain Res., 1984, 399, 136-142）、およびアミノ酸17〜50番目で構成されているDBI17-50トリアコンタ-テトラ-ニューロペプチド（triakonta-tetra-neuropeptide）：TTNが生成されること（非特許文献5：Slobodyansky, E., et al., J. Neurochem., 1989, 53, 1276-1284）がそれぞれ報告された。
【０００４】
これまで、DBI遺伝子の変異として、これまでも複数の多型が知られている。しかし、これまでは、それらの多型と疾患との関連性については全く知られておらず、またそれらの多型の検出も、シークエンサーでの配列決定により解析することしか知られていなかった。
【非特許文献１】Mocchetti, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 7221-7225
【非特許文献２】Gray, W.P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 7547-7551
【非特許文献３】Debernardi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 85, 6561-6565
【非特許文献４】Ferrero, P., et al., Brain Res., 1984, 399, 136-142
【非特許文献５】Slobodyansky, E., et al., J. Neurochem., 1989, 53, 1276-1284
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、不安障害の発現との関連性が示唆されているDBIにおける遺伝子多型と不安障害との関連性を明らかにし、不安障害の判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の発明者らは、ジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子の遺伝子多型を解析し、アルコール依存症等の不安障害との関連性を調べた。これまでに、NCBIのGenBankにおいて、ヒトDBIに関するSNP（一塩基多型）が56種類登録されていた。これらのSNPを含め、ヒトDBI遺伝子と不安障害の疾患との関連性を詳細に検討した結果、DBI遺伝子における特定の多型対立遺伝子頻度が、アルコール依存症と有意に関連性を有していることを明らかにし、そしてそのアルコール依存症をはじめとする不安障害と関連している多型対立遺伝子頻度を簡便に判定することができる方法を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明は、一態様において、DBI遺伝子の特定の多型対立遺伝子頻度を検出することからなる、不安障害の判定方法を提供する。
DBI遺伝子のエクソン2における遺伝子多型は、-75 A/T、+147 C/A、等の多型が存在する。アルコール依存症患者および不安障害患者におけるこれらの遺伝子多型の対立遺伝子頻度を検討したところ、-75 A/Tおよび+147 C/Aの2つの遺伝子多型が、アルコール依存症および不安障害と有意に相関していることが明らかになった。アルコール依存症患者では、変異型である-75 T型と+147 A型の組合せが多数を占めることがわかり、一方不安障害患者では、野生型である-75 A型と+147 C型が多数を占めることが分かった。
【０００８】
したがって、本発明においては、上記の知見に基づいて、DBI遺伝子のエクソン2の-75 A/Tまたは+147 C/Aの多型対立遺伝子頻度を検出することにより、アルコール依存症および不安障害を判定することができる。すなわち、-75 A/Tおよび+147 C/Aの2つの遺伝子多型（これらの多型は連鎖している）を調べて、変異型アリルである-75 T型と+147 A型である場合にはアルコール依存症の傾向があると判断することができる。
【０００９】
本発明において、不安障害という場合、全般性不安障害、社会不安障害、パニック障害、過敏性腸症候群、アルコール依存症、薬物依存症、等が含まれる。これらは、いずれも、DBI遺伝子の作用機序から判断して、DBI遺伝子が何らかの作用を有していることが示唆されている疾患である。
【００１０】
DBI遺伝子のエクソン2の多型対立遺伝子頻度を検出するための方法としては、当該技術分野において遺伝子型を定性的に調べることができる手段であればどのようなものであっても使用することができ、例えば、リアルタイムPCR法、PCR-RFLP法（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism；PCR-制限酵素断片長多型）、PCR-CTPP法（polymerase chain reaction with confronting two-pair primers；PCR-2対プライマー）等を使用することができる。
【００１１】
リアルタイムPCR法を用いて遺伝子型を決定する場合、多型部位を含む領域を増幅することができるようにフォワードプライマーおよびリバースプライマー、およびTaqMan（登録商標）プローブなどのクエンチャーとリポーターを含むプローブを使用して、当該技術分野において一般的に使用されているリアルタイムPCR装置（ABI、BioRad、Cepheid、TaKaRa等から入手可能）を使用して、リアルタイムに多型の遺伝子型を決定することができる。この際、クエンチャーとリポーターを含むプローブは、多型部位がプローブのほぼ中央部分になるように設計する。例えば、本発明において開示したDBI遺伝子エクソン2に関する-75 A/T多型を例にとれば、A型遺伝子を検出するためのプローブのヌクレオチド配列とT型遺伝子を検出するためのプローブのヌクレオチド配列は、プローブのほぼ中央部に位置する多型部位のA/T以外については全く同一の配列であり、リポーターは、単一のPCR反応混合物中で同時に検出する場合には、別個の波長の励起・放射波長を有するリポーターを使用することができる。このようなプローブを使用することにより、A型遺伝子が鋳型となってPCR反応が進行する場合には、A型検出用のプローブのみが鋳型配列にアニーリングし、それに応じたリポーターによる蛍光を発し、一方、T型遺伝子が鋳型となってPCR反応が進行する場合には、T型検出用のプローブのみが鋳型配列にアニーリングし、それに応じたリポーターによる蛍光を発することとなる。これらのリポーターをリアルタイムに検出することにより、遺伝子型を定性的に決定できる。
【００１２】
PCR-RFLP法を用いて遺伝子型を決定する場合、多型により制限酵素部位が新たに出現することまたは多型により既存の制限酵素部位が消失することにより制限酵素切断パターンが変化することを利用して、PCRを行った後に、制限酵素処理を行い、その制限酵素切断パターンを調べることにより、遺伝子型を定量的に決定できる。例えば、本発明において開示したDBI遺伝子エクソン2に関する+147 C/A多型を例にとれば、野生型のC型遺伝子ではNdeI制限酵素部位が存在しないものの、CからAへの変異が生じてA型遺伝子となると、NdeI制限酵素部位が出現することから、フォワードプライマー（例えば、DBI-e2CTPF）とリバースプライマー（例えば、DBI-e2CTPR）との間でPCR反応により目的とする553 bpの長さのDNA領域を増幅し、次いで、NdeI制限酵素処理した後、電気泳動を行い、PCR生成物の制限酵素切断パターンを確認することにより、遺伝子型を定量的に決定できる。この処理により、C型遺伝子を持つ場合には、553 bpの断片のみが形成され、一方A型遺伝子を持つ場合には、NdeIによる切断の結果、445 bpと108 bpの2本の断片が生成される。したがって、PCR生成物について所定の制限酵素処理を行った後、直ちに電気泳動を行い、得られた断片のバンド位置を確認することにより、遺伝子型決定できる。
【００１３】
PCR-CTPP法を用いて遺伝子型を決定する場合、2種類のフォワードプライマー（F1およびF2）、および2種類のリバースプライマー（R1およびR2）の4本のプライマーを使用して、アレルに特異的な長さを持つDNAを同時に合成するPCR法である。例えば、本発明において開示したDBI遺伝子エクソン2に関する-75 A/T多型を例にとれば、A型遺伝子を持つ場合には、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）とリバースプライマー（DBI-e2CTPR）との間でPCR反応が進行して553 bpの長さのDNAが合成されると同時に、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）とA検出プライマー（DBI-e2A）との間でPCR反応が進行して347 bpの長さのDNAが合成される。一方、T型遺伝子を持つ場合には、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）とリバースプライマー（DBI-e2CTPR）との間でPCR反応が進行して553 bpの長さのDNAが合成されると同時に、T検出プライマー（DBI-e2T）とリバースプライマー（DBI-e2CTPR）との間でPCR反応が進行して249 bpの長さのDNAが合成される。したがって、PCR後に、直ちに電気泳動を行い、増幅されたバンドのヌクレオチド数を確認することにより、遺伝子型決定できる。この方法は、PCRを行うために4本のプライマーを必要とするが、その他の点については通常のPCRと全く同じである。
【００１４】
本発明においては、また、上述したようなDBI遺伝子の特定の多型を検出するためのPCR-CTPP法またはリアルタイムPCR法において使用することができるプライマーまたはプローブもまた、提供する。このようなプライマーまたはプローブは、配列解析の結果に基づいて、プライマーまたはプローブ設計ソフトウェアを使用して、容易に設計することができる。例えば、本発明において開示した-75 A/T多型をPCR-CTPP法により検出するためのプライマーとして、A検出プライマー（DBI-e2A）：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'（SEQ ID NO: 7）およびT検出プライマー（DBI-e2T）：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'（SEQ ID NO: 8）を使用することができる。また、本発明において開示した-75 A/T多型をリアルタイムPCR法により検出するためのプライマーとして、使用することができる。
【００１５】
本発明においては、リアルタイムPCR法またはPCR-CTPP法などのPCRに基づくアッセイにおいて、DBI遺伝子エクソン2についての不安障害に関連する多型を検出するための、上述したようなプライマーおよび／またはプローブを含有するキットもまた提供する。このようなキットには、必要最小限のプライマーおよび／またはプローブのみを含有していても、さらにPCRを行うために必要な酵素や試薬などを含有していてもよい。
【００１６】
本発明においてはまた、PCR-RFLP法によるアッセイにおいてDBI遺伝子エクソン2についての不安障害に関連する多型を検出するための、PCR用のプライマーおよび所望の制限酵素を含有するキットもまた提供する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明において、DBI遺伝子エクソン2の-75A/Tおよび+147C/Aの多型対立遺伝子頻度と、アルコール依存症に代表される不安障害とが、有意な関連性を有していることが明らかになったことから、DBI遺伝子エクソン2の-75A/Tおよび+147C/Aの多型対立遺伝子頻度を調べることにより、不安障害を判定することが可能となった。
【発明の実施の形態】
【００１８】
ジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子エクソン2およびその周辺領域の配列解析
健常者および不安障害の患者から末梢血を採取し、それぞれの末梢血からフェノール・クロロホルム法に基づいてDNAを抽出・精製して、これをPCR法の鋳型として使用した。この鋳型DNAを利用して、ヒトDBI遺伝子のイントロン1bおよびエクソン2における領域のヌクレオチド配列を一般的なPCRのプロトコルにしたがって増幅し、このPCR法により増幅された遺伝子領域のヌクレオチド配列を、配列決定した。この配列決定により検出された配列を、公知の野生型DBI遺伝子配列と比較した。
【００１９】
その結果、DBI遺伝子のイントロン1bおよびエクソン2領域における塩基配列のうち、エクソン2の開始ヌクレオチドから-75番目においてAからTへの変異多型、147番目においてCからAへの変異多型、が検出された。健常者とアルコール依存症患者において、これらの変異多型それぞれについての分布を調べたところ、-75番目においてAからTへの変異多型、147番目においてCからAへの変異多型が、不安障害との有意な関連性があることが示された。
【００２０】
DBI遺伝子多型-75 A/TのPCR-CTPP法による検出
ヒトDBI遺伝子のヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号NT_005112）に基づいて、イントロン1bおよびエクソン2における領域を増幅するためのプライマー対（フォワードプライマーDBI-e2CTPF：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'：SEQ ID NO: 4およびリバースプライマーDBI-e2CTPR：5'-caggaaccat caccataccc-3'：SEQ ID NO: 5）を作製し、さらに-75 A/T多型を検出するためのA対立遺伝子検出用プライマー（DBI-e2A：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'：SEQ ID NO: 7）およびT対立遺伝子検出用プライマー（DBI-e2T：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'：SEQ ID NO: 8）を作製した。
【００２１】
これらのプライマーを単一のPCR反応混合物中で使用して、当該技術分野において公知のPCR法を行った。このPCR反応により、サンプルがA型遺伝子を持つ場合には、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）とリバースプライマー（DBI-e2CTPR）との間でおよびA検出プライマー（DBI-e2A）とリバースプライマーDBI-e2CTPRとの間で、それぞれPCR反応が進行して553 bpおよび347 bpの長さのDNAが合成され、一方、T型遺伝子を持つ場合には、フォワードプライマー（DBI-e2CTPF）とリバースプライマー（DBI-e2CTPR）との間でおよびフォワードプライマー（DBI-e2CTPF）T検出プライマー（DBI-e2T）との間で、それぞれPCR反応が進行して、553 bpおよび249 bpの長さのDNAが合成される。
【００２２】
したがって、鋳型DNAがA/A型の個体に由来するものである場合、553 bpおよび347 bpの断片が検出され、A/Tヘテロ型の個体に由来するものである場合、553 bp、347 bp、および249 bpの断片が検出され、そしてT/T型の個体に由来するものである場合、553 bpおよび249 bpの断片が検出される。このPCR生成物を定量することにより、母集団におけるDBI遺伝子エクソン2に関する-75 A/T多型に関して、A/A型、A/T型、そしてT/T型を容易に峻別することができると同時に、それぞれの遺伝子型頻度を明らかにすることができる。
【００２３】
DBI遺伝子多型+147 C/AのPCR-RFLP法による検出
ヒトDBI遺伝子のヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号NT_005112）のイントロン1bおよびエクソン2における領域を増幅するためのプライマー対（フォワードプライマーDBI-e2CTPF：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'：SEQ ID NO: 4およびリバースプライマーDBI-e2CTPR：5'-caggaaccat caccataccc-3'：SEQ ID NO: 5）を使用して、DBI遺伝子のイントロン1bおよびエクソン2における領域を増幅する。
【００２４】
DBIエクソン2の+147 C/A多型部位においては、野生型のC型遺伝子ではNdeI制限酵素部位が存在しないものの、CからAへの変異が生じると、CA↓TATG（下線を付したアデニンが+147 C/A多型部位に対応する）のNdeI制限酵素部位が出現する。したがって、上述したPCR生成物をNdeI制限酵素により処理することにより、野生型C型遺伝子は切断されず553 bpの断片のままであるが、A型遺伝子は切断されて445 bpの断片と108 bpの断片とに切断される。
【００２５】
そのため、鋳型DNAがC/C型である場合、553 bpの断片が検出され、C/Aヘテロ型である場合、553 bp、445 bp、および108 bpの断片が検出され、そしてA/A型である場合、445 bpおよび108 bpの断片が検出される。この制限酵素処理したPCR生成物を定量することにより、母集団におけるDBI遺伝子エクソン2に関する+147 C/A多型に関して、C/C型、C/A型、そしてA/A型を容易に峻別することができると同時に、それぞれの遺伝子型頻度を明らかにすることができる。
【実施例】
【００２６】
実施例1：ジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子エクソン2およびその周辺領域の配列解析
本実施例は、DBI遺伝子のエクソン2およびその周辺領域における多型の存在を詳細に検討することを目的として行った。
【００２７】
サンプルは、健常者140人およびアルコール依存症患者43人から、それぞれインフォームド・コンセントに基づいて同意を得た後、末梢血からフェノール・クロロホルム法に基づいてDNAを抽出・精製して20 ng/μlとし、これを鋳型として使用した。
【００２８】
ヒトDBI遺伝子のヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号NT_005112）に基づいて、イントロン1bおよびエクソン2における領域を増幅するためのプライマー対（DBIexon2FN：5'-atctttctag ctgccgttgg-3'：SEQ ID NO: 1およびDBIexon2R：5'-tagagagtag ctgctggtga-3'：SEQ ID NO: 2）を作製した。PCR法における反応混合物中には、5ユニットのAmpli Taq DNAポリメラーゼを0.1μl、10×PCRバッファを2.5μl、10 mM dNTP混合物2μl、各10μMのDBIexon2FNプライマーおよびDBIexon2Rプライマーをそれぞれ1.0μl、20 ng/μlの鋳型DNAが含まれ、これに1.0μlの滅菌水を添加して、全量25.0μlとした。
【００２９】
PCR反応は、GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）を使用して、94℃にて5分間の初期変性の後、94℃にて1分の変性工程、67℃にて1分のアニーリング工程、そして72℃にて1分の伸長工程を1サイクルとして35サイクル繰り返し、その後最終伸長反応として72℃にて10分間インキュベートした。このPCR反応の結果、目的領域を含む543 bpのPCR生成物（SEQ ID NO: 3）を得た。
【００３０】
この遺伝子領域のヌクレオチド配列を、ABI（登録商標）PRISM 3100 Genetic AnalyzerおよびABI（登録商標）PRISM 310 Genetic Analyzer（ともにApplied Biosystems）を利用してジデオキシ法により配列決定した。この配列決定により検出された配列は、BioEditソフトウェアを用いて、GenBankアクセッション番号NT_00512上におけるDBI遺伝子配列との比較を行った。
【００３１】
イントロン1およびエクソン2領域における塩基配列決定の結果、エクソン2の開始ヌクレオチドから-75番目においてAからTへの変異、147番目においてCからAへの変異、が検出された。また、これらの変異は連鎖しており、同一DNA上においては、-75番目ヌクレオチドがAである場合には+147番目ヌクレオチドはCであり、-75番目ヌクレオチドが変異型のTである場合には+147番目ヌクレオチドも変異型のAであることがわかった。
【００３２】
実施例2：不安障害と関連するDBI遺伝子多型-75 A/Tの検出
本実施例は、実施例1において明らかになった不安障害と関連するDBI遺伝子多型を、PCR-CTPP法を用いて迅速・簡便に検出することができる方法を開発することを目的として行った。
【００３３】
サンプルは、アルコール依存症患者43名、気分障害（感情障害）患者71名（躁うつ病30名、うつ病41名）、統合失調症患者100名、そして比較対照として健常者416名（平均年齢29.6±11.79）から、それぞれインフォームド・コンセントに基づいて同意を得た後、末梢血からフェノール・クロロホルム法に基づいてDNAを抽出・精製して20 ng/μlとし、これを鋳型として使用した。
【００３４】
ヒトDBI遺伝子のヌクレオチド配列（GenBankアクセッション番号NT_005112）に基づいて、イントロン1bおよびエクソン2における領域を増幅するためのプライマー対（フォワードプライマーDBI-e2CTPF：5'-ctgccctctt cactgctgta-3'：SEQ ID NO: 4およびリバースプライマーDBI-e2CTPR：5'-caggaaccat caccataccc-3'：SEQ ID NO: 5）を作製し、さらに-75 A/T多型を検出するためのA対立遺伝子検出用プライマー（DBI-e2A：5'-tccccgtaac tgggctgcca-3'：SEQ ID NO: 7）およびT対立遺伝子検出用プライマー（DBI-e2T：5'-gtaagaatcc tactgtggcc ttaa-3'：SEQ ID NO: 8）を作製した。
【００３５】
PCR法における反応混合物中には、5ユニットのAmpli Taq DNAポリメラーゼを0.1μl、10×PCRバッファを2.5μl、10 mM dNTP混合物を2.0μl、各10μMのDBI-e2CTPFプライマー、DBI-e2CTPRプライマー、DBI-e2AプライマーおよびDBI-e2Tプライマーをそれぞれ0.5μl、20 ng/μlの鋳型DNAが含まれ、これに1.0μlの滅菌水を添加して、全量25.0μlとした。
【００３６】
PCR反応は、GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）を使用して、94℃にて10分間の初期変性の後、94℃にて1分の変性工程、62℃にて1分のアニーリング工程、そして72℃にて1分の伸長工程を1サイクルとして7サイクル繰り返し、その後94℃にて1分の変性工程、58℃にて1分のアニーリング工程、そして72℃にて1分の伸長工程を1サイクルとして33サイクル繰り返し、さらに最終伸長反応として72℃にて7分間インキュベートした。この結果、フォワードプライマーDBI-e2CTPFとリバースプライマーDBI-e2CTPRによる553 bpの目的領域（SEQ ID NO: 6）の他、鋳型DNAが-75 A型遺伝子の場合にはA対立遺伝子検出用プライマーDBI-e2A（SEQ ID NO: 7）とリバースプライマーDBI-e2CTPRによる347 bpの領域（SEQ ID NO: 6の226〜553 bpに相当）を、鋳型DNAが-75 T型遺伝子の場合にはフォワードプライマーDBI-e2CTPFとT対立遺伝子検出用プライマーDBI-e2T（SEQ ID NO: 8）による249 bpの領域（SEQ ID NO: 6の1〜249 bpに相当）を、それぞれ増幅した。
【００３７】
増幅されたPCR生成物を、2％アガロースゲル電気泳動により電気泳動し、遺伝子型の判定を行った。電気泳動像を図1に示す。
鋳型DNAがA/A型である場合、553 bpおよび347 bpの断片が検出され（図1レーン1）、A/Tヘテロ型である場合、553 bp、347 bp、および249 bpの断片が検出され（図1レーン2）、そしてT/T型である場合、553 bpおよび249 bpの断片が検出された（図1レーン3）。
【００３８】
また、健常者416人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、A/A型が228人（54.9％）、A/T型が159人（38.1％）、そしてT/T型が29人（7.0％）であった。そして対立遺伝子頻度については、A型遺伝子が74.0％、T型遺伝子が26.0％であった。一方、アルコール依存症患者43人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、A/A型が16人（37.2％）、A/T型が21人（48/.8％）、そしてT/T型が6人（14％）であった。そして対立遺伝子頻度については、A型遺伝子が61.6％、T型遺伝子が38.3％であった。また、うつ病患者４１人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、A/A型が21人（51.2％）、A/T型が18人（43.9％）、そしてA/T型が2人（4.9％）であった。そして対立遺伝子頻度については、A型遺伝子が73.2％、T型遺伝子が26.8％であり、そして統合失調症患者100人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、A/A型が51人（51.0％）、A/T型が41人（41.0％）、そしてT/T型が8人（8.0％）であった。そして対立遺伝子頻度については、A型遺伝子が71.5％、T型遺伝子が28.5％であった。
【００３９】
これらの結果から、DBI-e2AプライマーおよびDBI-e2TプライマーをPCR反応混合物中に添加することにより、DBI遺伝子エクソン2に関して-75 A/T多型の対立遺伝子頻度を簡便に調べることができ、その結果、-75 A/T多型においてアルコール依存症に関連しているT/T型を容易に検出することができることが明らかになった。
【００４０】
実施例3：不安障害と関連するDBI遺伝子多型+147 C/Aの検出
本実施例は、実施例1において明らかになった不安障害と関連するDBI遺伝子多型を、PCR-RFLP法を用いて迅速・簡便に検出することができる方法を開発することを目的として行った。
【００４１】
サンプルは、実施例2と同様に調製した。
PCR法における反応混合物中には、5ユニットのAmpli Taq DNAポリメラーゼを0.1μl、10×PCRバッファを2.5μl、2.5 mM dNTP混合物を2.0μl、各10μMのDBI-e2CTPFプライマー（SEQ ID NO: 4）およびDBI-e2CTPRプライマー（SEQ ID NO: 5）をそれぞれ0.5μl、20 ng/μlの鋳型DNAが含まれ、これに1.0μlの滅菌水を添加して、全量25.0μlとした。
【００４２】
PCR反応は、GeneAmp PCRシステム9700（Applied Biosystems）を使用して、94℃にて10分間の初期変性の後、94℃にて1分の変性工程、62℃にて1分のアニーリング工程、そして72℃にて1分の伸長工程を1サイクルとして5サイクル繰り返し、その後95℃にて1分の変性工程、58℃にて1分のアニーリング工程、そして72℃にて1分の伸長工程を1サイクルとして30サイクル繰り返し、さらに最終伸長反応として72℃にて7分間インキュベートして、目的領域である553 bpのPCR生成物を増幅した。
【００４３】
DBIエクソン2の+147 C/A多型部位においては、野生型のC型遺伝子ではNdeI制限酵素部位が存在しないものの、CからAへの変異が生じると、CA↓TATGのNdeI制限酵素部位が出現する。このことに基づいて、PCR生成物をNdeI制限酵素で処理することにより、C型遺伝子は切断されず553 bpの断片であるが、A型遺伝子は切断されて445 bpの断片と108 bpの断片とに切断される。この予想に基づいて、遺伝子型決定を行った。
【００４４】
NdeIによる制限酵素処理は、上述したPCR生成物8.0μl、NdeI（New England BioLabs）を0.2μl、10×NEバッファー4（500 mM酢酸カリウム、200 mMトリスアセテート、100 mM MgCl2、10 mMジチオスレイトール（DTT）、pH 7.9）1.5μl、および100×BSAを0.1μlの混合物に対して、滅菌水を添加して、全量15.0μlとした。この混合物を37℃にて一晩インキュベートし、制限酵素処理を行った後、1.5％アガロースゲル電気泳動により電気泳動し、遺伝子型の判定を行った。電気泳動像を図2に示す。
【００４５】
上記に予想されたとおり、鋳型DNAがC/C型である場合、553 bpの断片が検出され（図2レーン1）、C/Aヘテロ型である場合、553 bp、445 bp、および108 bpの断片が検出され（図2レーン2）、そしてA/A型である場合、445 bpおよび108 bpの断片が検出された（図2レーン3）。
【００４６】
また、健常者416人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、C/C型が228人（54.9％）、C/A型が159人（38.1％）、そしてA/A型が29人（7.0％）であった。そして対立遺伝子頻度については、C型遺伝子頻度が74.0％、A型遺伝子頻度が26.0％であった。一方、アルコール依存症患者43人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、C/C型が16人（37.2％）、C/A型が21人（48.8％）、そしてA/A型が6人（14.4％）であった。そして対立遺伝子頻度については、C型遺伝子が61.6％、A型遺伝子が38.3％であった。また、うつ病患者41人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、C/C型が21人（51.2％）、C/A型が18人（43.9％）、そしてA/A型が2人（4.9％）であった。そして対立遺伝子頻度については、C型遺伝子が73.2％、A型遺伝子が26.8％であり、そして統合失調症患者100人における各遺伝子型の出現頻度を調べると、C/C型が51人（51.0％）、C/A型が41人41.0％）、そしてA/A型が8人（8.0％）であった。そして対立遺伝子頻度については、C型遺伝子が71.5％、A型遺伝子が28.5％であった。
【００４７】
これらの結果から、+147 C/A多型は、-75 A/T多型と分布が完全に一致しておりこれら二つのヌクレオチドは連鎖している。このことから、NdeI制限酵素を利用したPCR-RFLP法を用いても+147 C/A多型の対立遺伝子頻度を簡便に調べることができ、その結果、+147 A/T多型において不安障害に関連しているA/A型を容易に検出することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明において、精神活性物質に関連する内在性不安誘発物質のジアゼパム結合阻害物質（DBI）遺伝子エクソン2の-75A/Tおよび+147C/Aの多型対立遺伝子頻度と、アルコール依存症に代表される不安障害とが、有意な関連性を有していることが明らかになったことから、DBI遺伝子エクソン2の-75A/Tおよび+147C/Aの多型対立遺伝子頻度を調べることにより、不安障害を判定することが可能となった。
【００４９】
また、DBIの簡便な遺伝子型決定方法（−75A/Tおよび＋147C/A）を開発したことから、この方法を使って、アルコール依存症や不安発作（パニック障害や社会性不安障害）の発病機序（不安などの誘引）解明の一助となり、それらの治療薬開発の一助になる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図1は、DBI遺伝子エクソン2の-75 A/T多型の検出を示す電気泳動像であり、レーン1は鋳型DNAがA/A型である場合の553 bpおよび347 bpの断片を示し、レーン2は鋳型DNAがA/Tヘテロ型である場合の553 bp、347 bp、および249 bpの断片を示し、そしてレーン3は鋳型DNAがT/T型である場合の553 bpおよび249 bpの断片を示す。
【図２】図2は、DBI遺伝子エクソン2の+147 C/A多型の検出を示す電気泳動像であり、レーン1は鋳型DNAがC/C型である場合の553 bpの断片を示し、レーン2は鋳型DNAがC/Aヘテロ型である場合の553 bp、445 bp、および108 bpの断片を示し、そしてレーン3は鋳型DNAがA/A型である場合の445 bpおよび108 bpの断片を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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