(57)【要約】      （修正有）【課題】毛包誘導能を維持するするためのクローナル培養方法、及び該方法により調製された毛乳頭細胞の提供。【解決手段】毛包誘導能を維持する毛乳頭細胞の培養方法であって、生体試料から毛乳頭細胞を１個単離し、フィーダー細胞層上に播種して培養する、毛乳頭のクローナル培養方法。該方法によりクローナル培養された毛乳頭細胞。レシピエント動物に該毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。ヒトに該毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛包誘導能を維持する毛乳頭細胞の培養方法であって、生体試料から毛乳頭細胞を１個単離し、フィーダー細胞層上に播種して培養することを含んでなる、毛乳頭のクローナル培養方法。
【請求項２】
前記クローナル培養した毛乳頭細胞を継代培養することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法によりクローナル培養された毛乳頭細胞。
【請求項４】
レシピエント動物に請求項３に記載の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【請求項５】
ヒトに請求項３に記載の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は毛包誘導能を維持した毛乳頭細胞を培養するためのクローナル培養方法及びそのような方法により調製された毛乳頭細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛包は成熟した生体で自己再生をほぼ一生涯を通じて繰り返す器官である。その自己再生の仕組みを解明することは、組織や細胞移植による脱毛治療、毛包や皮脂腺を含有する自然に近い機能的にも優れた皮膚シートの構築など、ニーズの高い臨床応用に繋がるものと期待される。近年、幹細胞研究への関心の高まりと共に毛包上皮系幹細胞（上皮系細胞）の研究が急速に進展し、また毛包特異的な間葉系細胞たる毛乳頭細胞についてもその性質が少しずつ判ってきた。毛乳頭細胞は毛包の自己再生のために毛包上皮系幹細胞に活性化シグナルを送るいわば司令塔の役割を担い、毛包再構成評価系においては毛包上皮系幹細胞と共に欠くことのできない細胞であることが判っている（Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), pp. 7336-7341；非特許文献１）。
【０００３】
そこで、毛包誘導能をもつ毛乳頭細胞は大量に入手できれば下記のような利点が見出せる。（１）毛包誘導能は毛乳頭細胞の最重要形質なので、毛包誘導能を維持した培養毛乳頭細胞を用いたin vitro実験にこれまで以上に意味が出てくる。（２）植毛等の毛の再生医療を考えた場合、患者自身の毛から採取した毛乳頭細胞を単離・培養し、再び患者自身に戻せるので、拒絶反応もなく、また感染症の危険性もなくなる。しかしながら、毛乳頭細胞はヒトから採取しなければならないため、外科手術や抜き毛などを行なう必要があり、大量に入手するのは困難である。また、これまでの毛乳頭細胞単離方法では、活性毛乳頭細胞を、例えば移植のために十分な量で獲得することが困難であり、毛包再生における活性毛乳頭細胞の役割を完全に解明することができなかった。
【０００４】
細胞の大量入手のためには、それをin vitroで何代にもわたって継代培養できることが一般に望ましいが、毛乳頭細胞の継代培養を行なった場合、増殖性の極端な低下や毛包誘導能の喪失が認められることから、実際には困難であることが知られている（Jahoda CAB et al. (1984) Nature 311 : 560-562）。したがって、毛乳頭細胞の継代培養では、実験や移植に必要とされるのに十分な量の活性毛乳頭細胞を獲得することはできなかった。
【０００５】
よって、毛乳頭細胞に関して、in vitroで長期にわたり増殖性を維持させ、しかも毛包誘導能を維持させながら培養できる培養方法の開発が必要とされる。
【０００６】
【特許文献１】特開平７−２７４９５９号公報
【特許文献２】特開平２００３−７０４６６号公報
【非特許文献１】Kishimoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), vol. 96, pp. 7336-7341
【非特許文献２】Jahoda CAB et al., Nature (1984). vol. 311, pp. 560-562
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、毛包誘導能を維持した毛乳頭細胞の培養方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、驚くべきことに、毛乳頭細胞はその１個を単離してクローナル培養すると、毛包誘導能を維持した状態で培養することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本願は以下の発明を提供する。
（１）毛包誘導能を維持する毛乳頭細胞の培養方法であって、生体試料から毛乳頭細胞を１個単離し、フィーダー細胞層上に播種して培養することを含んでなる、毛乳頭のクローナル培養方法。
（２）前記クローナル培養した毛乳頭細胞を継代培養することをさらに含む、（１）の方法。
（３）（１）又は（２）の方法によりクローナル培養された毛乳頭細胞。
（４）レシピエント動物に（３）の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
（５）ヒトに（３）の毛乳頭細胞を移植し、毛包を再生する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、毛包誘導能を維持した毛乳頭細胞を培養することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
「毛乳頭細胞」とは、間葉系細胞として毛包最底部に位置し、毛包の自己再生のために毛包上皮幹細胞に活性化シグナルを送る、いわば司令塔の役割を担っていると考えられている細胞をいう。
【００１２】
本発明の毛乳頭細胞のクローナル培養の起源となる毛乳頭細胞塊は、生体試料、好ましくは頭皮から、それ自体既知の操作により調製することができる。例えば、上述の Messenger, A. G., Br. J. Dermatol. 110,685-689（1984）に記載の方法に従うことができる。例えば、頭皮などを５ｍｍほどの短冊状に切り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、必要によりタンパク質分解酵素等を用いまたは外科的に処理し、表皮層および真皮層を除き、皮下脂肪層のみにし、次いで毛包を物理的手段、例えばピンセツト等で単離する。毛包から毛球部を切り取り、この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭細胞塊を単離する。
【００１３】
上記毛乳頭細胞塊からの毛乳頭細胞１個の単離方法は特に限定されるものではない。好ましい方法としては、上記毛乳頭細胞塊を、細胞を単一浮遊細胞にするのに適当な酵素溶液、例えばAccumax（Chemicon社）で処理し、次いで、ガラスキャピラリーなどにより、単一の毛乳頭細胞を取り出すことができる。
【００１４】
単離した毛乳頭細胞１個は、フィーダー細胞上に播種して培養することができる。フィーダー細胞の種類は特に制限されないが、好ましくはＷＴ４細胞（培養マウス頬ヒゲ毛乳頭細胞）、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３細胞、ＭＥＦ細胞（マウス胎仔性繊維芽細胞）などが挙げられる。毛乳頭細胞１個に対するフィーダー細胞の量は、１００〜１０，０００個とするのが好ましい。
【００１５】
こうして得られる単離した毛乳頭のクローナル培養は、動物細胞の培養に用いられる市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養することができる。毛乳頭細胞の培養に使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地［Dulbecco′s Modefied Eagle Medium、Gibco ＢＲＬより入手可］、チャン培地(Chang′s medium)［Irvine Scientific より入手可］が挙げられる。培地には、さらに必要に応じて細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとしては、トランスフエリン、インスリン、トリヨードチロニン、グルカゴン、ハイドロコーチゾン、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、セレン等が挙げられる。培養は、好ましくはｂＦＧＦの存在下で行なう。ｂＦＧＦはヒト由来でも、その他の哺乳動物、例えばウシ、マウス、ラット由来であってもよく、組換体であってもよい。培養液に存在させるべきｂＦＧＦの濃度は特に限定されるものではないが、例えば０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ程度とする。
【００１６】
これらの培地での単離毛乳頭細胞の培養は、通常、培養皿を用い、５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃のインキユベーター内に静置して行い、アウトグロースが確認されたら、培地を交換してさらに培養を続けることに(継代培養)より実施する。こうして得られる培養細胞はさらに必要な継代数にわたって、継代培養を行う。継代は乳頭細胞の所望する量が達成されるまで行なうことができ、たとえば10回以上の継代、所望量が多い場合は好ましくは15回以上、さらに好ましくは20回以上まで継代を行なうことができる。
【００１７】
好ましくは、毛乳頭細胞はヒト毛乳頭細胞であり、頭皮毛包から採取する。しかしながら、毛乳頭細胞はヒト由来に限定されることはなく、ヒト以外のあらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットの皮膚やひげに由来してもよい。ヒト頭皮は、外科手術の副産物として生じたものを使用することができる。頭皮は、本発明の目的に照らし、成人男性由来のものを使用することが望しいが、それに限定されることはなく、子供由来でも女性由来であってもよい。使用する皮膚は、毛乳頭が正常な生理機能を保持している限り、頭髪に限らず体毛等に属するものを選んでもよい。通常、好ましくは、頭皮のうち、側頭部や後頭部に由来するものがよい。
【００１８】
好ましくは、このようにして調製したクローナル培養毛乳頭細胞をスフェア形成させる（特開平７−２７４９５０号公報）。スフェア形成は、飽和状態になるまで細胞を増殖させ、細胞を剥離した後、培地で懸濁させ、この細胞懸濁物を非接着処理した培養皿中の培地上に捲き、数日放置することにより丸い細胞塊(スフェロイド)の細胞集合体を形成することで行う。好ましくは、スフェア形成はｂＦＧＦの非存在下で行うが、ｂＦＧＦ存在下でも十分にスフェア形成は達成される。なお、スフェア形成を行う時期は特に制限されるものではなく、最後の継代を終えた培養細胞に対し行ってよい。
【００１９】
このようにして調製したスフェア化した毛乳頭細胞は、毛包誘導能を維持しており、したがって、毛包の再構成のメカニズムの解明のために研究のin vitro実験や、毛再生医療などのために利用できる。
【００２０】
本発明に係る方法で調製したクローナル培養毛乳頭細胞をヒトやレシピエント動物に移殖する方法は、それ自体公知の移殖方法によることができる。例えば、Weinberg et al, J. Invest. Dermatol. Vol.100(1993), pp.229-236及びZheng et al. J. Invest. Dermatol. Vol.124(2005), pp.867-876を参照のこと。例えばヌードマウスに移植を行う場合、用意されたクローナル培養毛乳頭細胞と別途調製した上皮系細胞を移植直前〜１時間前に混合し、遠心（9000×ｇ，10 min．）により培養液を取り除き、50〜100μＬ程度の細胞塊にした後、すみやかにヌードマウス背部皮膚に埋め込んだシリコン製のドーム型チャンバー内に流し込む。１週間後にチャンバーを注意深く取りはずし、さらに２週間目以降に移植部位の毛髪形成の有無の肉眼観察を行うことができる。ヒトを含む動物に発毛を目的に移植を行う場合も似たようにして行うことができ、適切な方法は医師や獣医により適宜決定されるであろう。
移植は、例えば直径約１ｃｍの円に対し、毛乳頭細胞が１×106〜108個相当／ｃｍ2、好ましくは1.0〜1.5×107個相当／ｃｍ2の移植量、より好ましくは1.27×107個相当／ｃｍ2の移植量で移植されるように行うのが好ましい。
さらに、より少ない細胞量で移植する方法としては、前述と同様に５×105細胞相当の毛乳頭細胞と別途調製した５×105細胞相当の上皮系細胞を移植間に混合し、レシピエントの背部に注射針でつけた切込み部位に注入移植する方法である。
【００２１】
上記クローナル培養毛乳頭細胞をレシピエント動物に移植する場合、その移植は同種移植、即ち自己移植、同種同系移植もしくは同種異系移植であっても、異種移植であってもよい。レシピエント動物としてはあらゆる哺乳動物、例えばヒト、チンパンジー、その他の霊長類、家畜動物、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、他に実験用動物、例えばラット、マウス、モルモット、より好ましくはヌードマウス、スキッドマウス、ヌードラットが挙げられる。
【００２２】
また、本発明に係る方法により調製されたクローナル培養毛乳頭細胞を適当なレシピエント動物に移植することで、再生毛包を担持するキメラ動物を提供することができる。かかるキメラ動物は、例えば毛包の再生の機構を研究・解明するため、あるいは毛包再生又は発毛もしくは脱毛に有効な薬剤・生薬のスクリーニングを行うための有力な動物モデルを担うことができるであろう。レシピエント動物は、該動物に移植される系に含まれる各細胞の起源に拘わりなく、免疫系が抑制された動物であることが好ましい。また動物種としては、実験動物として使用しうるものであり、本発明の目的に沿うものである限り、いかなる動物であってもよいが、好ましくは、マウス、ラット等を挙げることができる。このような動物のうち、免疫系が抑制されているものとしては、マウスを例にすれば、ヌードマウスのように、胸腺欠損のごとき形質をもつものが挙げられる。なお、本発明の目的を考慮すれば、特に好ましいレシピエント動物としては、市販のヌードマウス（例えば、Ｂａｌｂ−ｃ  ｎｕ／ｎｕ系統）、スキッドマウス（例えば、Ｂａｌｂ／ｃ−ＳＣＩＤ）、ヌードラット（例えば、Ｆ３４４／Ｎ  Ｊｃｌ−ｒｎｕ）を挙げることができる。
【００２３】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２４】
「毛乳頭細胞の単離とクローナル培養」
４周齢のGFPトランスジェニックマウス [Okabe et al, FEBS Lett 407, 313, 1997]の頬ヒゲ毛包から、顕微鏡下でヒゲ毛乳頭を注意深く単離した。ＧＦＰトランスジェニックマウスとは、全ての細胞においてＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスであり、毛乳頭細胞とフィーダー細胞を区別することを可能にする。単離したヒゲ毛乳頭を酵素処理(Accumax、Chemicon社)によって細胞を一つずつに解離させた後に、１２穴のマルチウェル培養プレートのフィーダー細胞上に、ガラスキャピラリーを用いて細胞を一つずつ播種した。このとき、マウス胎仔性繊維芽細胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）、マウス３Ｔ３、あるいは培養マウスヒゲ毛乳頭細胞を、マイトマイシンＣで処理し、5000〜10000 cells/cm2の密度で播種して、フィーダー細胞とした。１０％血清を含むDulbecco’s modified essential medium （以下１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ）で３７℃、５％  ＣＯ2条件下で１０〜１４日間培養した。培養に際し、必要に応じて塩基性繊維芽細胞増殖因子(別名ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ、ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２、以下ｂＦＧＦ）を１０ ng/ml添加した。培養期間中、増殖した毛乳頭細胞は０．２５％trypsin-ＥＤＴＡ処理を行い、細胞を回収した後、２×１０5 cells/１００mm培養皿の条件で継代し更に培養を継続した。培地交換は４日に１回行い、ｂＦＧＦ添加は培地交換・継代の時に行った。培養皿に細胞がコンフルエント状態になる前に細胞を回収して、培養皿あたりの総細胞数を計測した。最終的に培養後回収した細胞を１×１０5個/ml濃度に分散し、スフェア形成のために本細胞分散液０．１mlを低細胞接着性の丸底９６穴プレート(Nunc社)に播種・静置培養した。なお、スフェア形成の培養はｂＦＧＦを含まない１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで３７℃、５％  ＣＯ2で行い、培養後、２〜４日後にスフェアを回収し、ヌードマウスへの移植実験に用いた。
【００２５】
表１に毛乳頭細胞のクローナル培養の結果を示す。ＷＴ４細胞、３Ｔ３細胞、ＭＥＦ細胞をそれぞれフィーダー細胞として用いた場合において、増殖の認められたクローンの数はそれぞれ２０％、１２．８％、４３．６％となった。よって、クローナル培養の効率の観点では、フィーダー細胞としてＭＥＦを使用すると良好な結果が得られた。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
「移植細胞の調製とヌードマウスへの移植実験」
上記方法で調製したクローナル増殖させた毛乳頭細胞の毛包誘導能を比較するため、これら毛乳頭細胞とマウス足裏皮膚組織を用いたヌードマウスへの移植毛包誘導実験を行った。クローナル増殖させた毛乳頭細胞のスフェアは前述の方法で調製した。足裏の皮膚組織を６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス皮膚から採取し、1000U/mlディスパーゼで室温にて１０分間処理した。次に、酵素処理終了後に一旦上皮を剥がしてから、作製したスフェア１個あるいは３個を真皮の上に静置した。剥がした上皮を再び真皮の上から被せ、10％ＦＢＳ−ＤＭＥＭで37℃、５％  ＣＯ2条件下で一晩培養した。
【００２８】
ヌードマウスをペントバルビタールナトリウムで麻酔後、解剖ハサミで皮膚の一部を約１ｃｍ幅で切開し、前述の方法で調製したスフェアの挟み込まれた足裏皮膚を、角層を筋層に向けた状態で移植した。移植２〜３週間後に、移植部位での毛包誘導を組織学的に観察した。その結果、本発明に係る方法でクローナル培養した毛乳頭細胞を移植した場合、顕著な毛包の形成、即ち毛包の誘導が認められた（図１）。また、以下にフィーダー細胞毎での毛包誘導能の結果を示す。
【００２９】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明に係る毛乳頭細胞培養方法は毛包を再生するための毛包移植や、毛包再構成についての研究・開発、さらには脱毛症の治療に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】毛乳頭細胞の移植による毛包誘導を示す。
【図１】
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