(57)【要約】      （修正有）【課題】液−液拡散法を用いて微量のサンプルでタンパク質等を結晶化することができ、容易に結晶を取り出してタンパク質溶液や沈殿剤の充填を行うことが可能な結晶作製器具を提供する。【解決手段】結晶作製器具は，ＰＤＭＳ製の流路プレート１０と，ポリエチレンテレフタレート製の第１カバーシート１２及び第２カバーシート１４を備えている。流路プレート１０は細長い流路２０ｃを備えていて，この流路２０ｃは，その長手方向に延びるひとつの面が流路プレート１０の底面４０に露出している。流路２０ｃの両端にはタンパク質溶液導入口２４と沈殿剤導入口２２が連通している。流路２０ｃの途中にはゲル導入口２６と空気抜き穴２８が連通している。流路２０ｃから結晶４８を取り出すには，第２カバーシート１４をカッターナイフで切り取って，流路２０ｃを露出させる。【選択図】図７
2008024527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において，次の（ア）乃至（ウ）を備える結晶作製器具。
（ア）次の（ａ）乃至（ｆ）を備える流路プレート。
（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。
（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって，その流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出している流路。
（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第１端部に連通している物質溶液導入口。
（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。
（ｅ）前記本体に形成された空気抜き穴であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記第２端部の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。
（ｆ）前記本体に形成されたゲル導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第２端部と前記空気抜き穴の間の地点において前記流路に連通しているゲル導入口。
（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって，少なくとも前記物質溶液導入口の開口，前記結晶生成溶液導入口の開口，前記空気抜き穴の開口及び前記ゲル導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。
（ウ）前記第２面を覆う透明で柔軟な第２カバーシートであって，少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【請求項２】
結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において，次の（ア）乃至（ウ）を備える結晶作製器具。
（ア）次の（ａ）乃至（ｅ）を備える流路プレート。
（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。
（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって，その流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出している流路。
（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第１端部に連通している物質溶液導入口。
（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。
（ｅ）前記本体に形成された空気抜き穴であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記第２端部の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。
（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって，少なくとも前記物質溶液導入口の開口，前記結晶生成溶液導入口の開口及び前記空気抜き穴の開口を気密に覆う第１カバーシート。
（ウ）前記第２面を覆う透明で柔軟な第２カバーシートであって，少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【請求項３】
結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において，次の（ア）乃至（ウ）を備える結晶作製器具。
（ア）次の（ａ）乃至（ｄ）を備える流路プレート。
（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。
（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって，その流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出している流路。
（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第１端部に連通している物質溶液導入口。
（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。
（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって，少なくとも前記物質溶液導入口の開口及び前記結晶生成溶液導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。
（ウ）前記第２面を覆う透明で柔軟な第２カバーシートであって，少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において，前記本体の材質はポリジメチルシロキサンであることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項に記載の結晶作製器具において，前記第２カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート，ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする結晶作製器具。
【請求項６】
請求項５に記載の結晶作製器具において，前記第１カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート，ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンであることを特徴とする結晶作製器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液−液拡散法で結晶を作製するときに使う結晶作製器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を結晶化する手法のひとつとして，液−液拡散法が知られている。この液−液拡散法は，タンパク質溶液と沈殿剤とを接触させて，その自由界面で両者を拡散させて，タンパク質を部分的に過飽和状態にさせ，これによって，タンパク質を結晶化させるものである。この液−液拡散法を用いてタンパク質を結晶化させるときの条件をスクリーニングするためには，多数の条件について，同時に，微量のサンプルで結晶化の実験をできるようにすることが好ましい。そのような実験を可能にする器具として，特許文献１に開示されたような結晶化プレートが知られている。本発明はこの種の結晶化プレートに関連がある。
【特許文献１】米国特許公開２００５／０２０１９０１
【０００３】
この特許文献１に開示されている結晶化プレートは，微量のサンプルで多数の結晶化条件についてスクリーニングが可能であり，プレート中に多数の細長い溝を形成して，その溝の内部でタンパク質溶液と沈殿剤を接触させるようにしている。この結晶化プレートは，タンパク質溶液の通路と沈殿剤の通路との間を開閉する開閉弁と，タンパク質溶液の供給口付近に配置したタンパク質溶液供給弁と，沈殿剤の供給口付近に配置した沈殿剤供給弁とを備えていて，これらの弁の開閉を制御することで，タンパク質溶液及び沈殿剤の供給作業を実施するとともに，タンパク質溶液と沈殿剤両者の間の相互拡散の開始を制御している。弁の開閉は，気体の圧力を利用しているため，加圧するための専用装置が必要である。拡散を開始した後は，一定期間後に開閉弁を閉じて，溶液からの水分の蒸発による濃度変化を利用して，結晶を析出させている。
【０００４】
また，液−液拡散法の一種として，ゲル・カウンタ・ディフュージョン法が知られている（非特許文献１及び特許文献２）。このゲル・カウンタ・ディフュージョン法は，ゲルを挟んでタンパク質溶液と沈殿剤を配置するもので，これによって，タンパク質溶液と沈殿剤がゲルを通して混じり合って，タンパク質が結晶化するものである。本発明は，このゲル・カウンタ・ディフュージョン法にも関連がある。
【非特許文献１】J. Synchrotron Rad. (2004) 11, 45-48 "A simplified counter diffusion method combined with a 1-D simulation program for optimizing crystallization conditions"
【特許文献２】特開平６−３２１７００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
液−液拡散法の結晶化プレート，及び，ゲル・カウンタ・ディフュージョン法を実施するための結晶化装置は，結晶を取り出すことが必ずしも容易ではないという問題がある。また，従来の結晶化プレートは，タンパク質溶液と沈殿剤に圧力をかけて充填するため，専用の加圧装置が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は，液−液拡散法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて，かつ，結晶を取り出すことが容易な結晶作製器具を提供することにある。本発明の別の目的は，液−液拡散法を用いて微量のサンプルで結晶化を実施できて，かつ，流路内部の空気を逃がすことで充填を容易にした結晶作製器具を提供することにある。
【０００７】
本発明の結晶作製器具は，結晶化すべき物質を含む物質溶液から前記物質の結晶を作製するための結晶作製器具において，次の（ア）乃至（ウ）を備えている。（ア）次の（ａ）乃至（ｅ）を備える流路プレート。（ａ）第１面と第２面を備える平板状の本体。（ｂ）前記本体に形成された細長い流路であって，その流路の長手方向に延びるひとつの面が前記第２面に露出している流路。（ｃ）前記本体に形成された物質溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第１端部に連通している物質溶液導入口。（ｄ）前記本体に形成された結晶生成溶液導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の第２端部に連通している結晶生成溶液導入口。（ｅ）前記本体に形成された空気抜き穴であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記第２端部の間の地点において前記流路に連通している空気抜き穴。（ｆ）前記本体に形成されたゲル導入口であって，一端が前記第１面に開口していて他端が前記流路の前記第１端部と前記空気抜き穴の間の地点において前記流路に連通しているゲル導入口。（イ）前記第１面を覆う第１カバーシートであって，少なくとも前記物質溶液導入口の開口，前記結晶生成溶液導入口の開口，前記空気抜き穴の開口及び前記ゲル導入口の開口を気密に覆う第１カバーシート。（ウ）前記第２面を覆う透明で柔軟な第２カバーシートであって，少なくとも前記流路の長手方向に延びる開口を気密に覆う第２カバーシート。
【０００８】
本発明の結晶作製器具は，上述のゲル導入口を省略したものであってもよい。また，本発明の結晶作製器具は，上述のゲル導入口と空気抜き穴の両方を省略したものであってもよい。
【０００９】
流路プレートの本体の材質はポリジメチルシロキサンであることが好ましい。また，第２カバーシートの材質はポリエチレンテレフタレート，ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンであることが好ましい。その場合に，第１カバーシートの材質も同様の材質とすることができる。
【００１０】
本発明の結晶作製器具は，液−液拡散法を用いて微量のサンプルで特にタンパク質を結晶化させるのに最適であるが，液−液拡散法を用いてその他の物質を結晶化させることに用いることもできる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば，液−液拡散法を用いて微量のサンプルで結晶を作製する場合に，結晶を取り出すことが容易になる。また，空気抜き穴を設けると，物質溶液や結晶生成溶液，さらにはゲルを導入する際に，流路内部の空気が容易に抜けるので，圧力をかけなくても物質溶液と結晶生成溶液を充填することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下，図面を参照して本発明の実施例を詳しく説明する。図１は本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。この結晶作製器具は，液−液拡散法を用いて物質溶液（結晶化すべき物質を含む溶液）から結晶を作製するための器具である。以下の説明では，タンパク質結晶を作製することを例にして説明する。この結晶作製器具は，流路プレート１０，第１カバーシート１２，第２カバーシート１４，ケース１６及びケース蓋１８からなる。この結晶作製器具の使用方法を簡単に説明すると，流路プレート１０の底面（第２面）に第２カバーシート１４を貼り付けてから，物質溶液としてのタンパク質溶液と，結晶生成溶液としての沈殿剤と，ゲルを，タンパク質溶液導入口と沈殿剤導入口とゲル導入口を介して，流路プレート１０の流路内に充填する。それから，流路プレート１０の上面に第１カバーシート１２を貼り付ける。このように二つのカバーシート１２，１４で挟まれた状態の流路プレート１０を，ケース１６の内部に配置して，上からケース蓋１８を被せる。この状態で所定時間が経過すると，流路プレート１０の流路内でタンパク質の結晶が成長する。
【００１３】
ケース１６の平面形状は矩形であり，その材質は透明な硬質プラスチック（例えばポリスチレン）である。ケース蓋１８も，平面形状は同様に矩形であり，ケース１６と同じ材質でできている。
【００１４】
流路プレート１０は，平板状の本体に，タンパク質溶液，沈殿剤及びゲルのための流路や，タンパク質溶液，沈殿剤及びゲルのための導入口，さらには，空気抜き穴などを形成したものである。流路プレート１０の本体の平面形状は９０ｍｍ×６０ｍｍの矩形であり，その厚さは２〜３ｍｍ程度である。流路プレート１０の本体の材質はポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane，略称はＰＤＭＳ）である。このＰＤＭＳは無色透明なシリコーンゴムである。
【００１５】
第１カバーシート１２と第２カバーシート１４の平面形状は，流路プレート１０と同じ大きさの矩形であり，材質はポリエチレンテレフタレートである。これらのカバーシートは，厚さが０．１〜０．１５ｍｍの，透明で柔軟なシートである。
【００１６】
流路プレート１０と二つのカバーシート１２，１４とケース１６とケース蓋１８は，すべて，可視光に対して透明であり，これにより，流路プレート１０の内部の状況を外部から観察できるようになっている。
【００１７】
図２は流路プレート１０の上面（第１面）を示した平面図である。破線で示したものは，流路プレート１０の底面（第２面）側に露出するように形成された８本の流路２０ａ〜２０ｈである。以下，８本の流路を特に区別しないで説明するときは，これらの流路を符号２０で代表する。流路２０の一端（第１端部）にはタンパク質溶液導入口２４が連通しており，流路２０の他端（第２端部）には沈殿剤導入口２２が連通している。タンパク質溶液導入口２４と沈殿剤導入口２２は流路プレート１０の上面に開口している。この開口部分から，タンパク質溶液と沈殿剤を導入できる。
【００１８】
流路プレート１０には８本の流路２０ａ〜２０ｈが形成されている。これらの流路２０ａ〜２０ｈは，いずれも，上述のように，第１端部にタンパク質溶液導入口２４が連通しており，第２端部に沈殿剤導入口２２が連通している。８本の流路の特徴を説明する。第１の流路２０ａと第２の流路２０ｂは，タンパク質溶液導入口２４と沈殿剤導入口２２の間には何も他の導入口等が連通していない。第１の流路２０ａと第２の流路２０ｂの違いは流路の長さにあり，第１の流路２０ａの長さ（タンパク質溶液導入口２４の中心から沈殿剤導入口２２の中心までの距離）は５０ｍｍであり，第２の流路２０ｂの長さは７０ｍｍである。第３の流路２０ｃと第４の流路２０ｄは，流路の途中にゲル導入口２６と空気抜き穴２８が形成されている。第３の流路２０ｃと第４の流路２０ｄの違いは空気抜き穴２８の位置にあり，第３の流路２０ｃよりも，第４の流路２０ｄの方が，空気抜き穴２８の位置がゲル導入口２６に近い。第５の流路２０ｅと第６の流路２０ｆは，流路の途中に空気抜き穴２８だけが形成されている。第５の流路２０ｅと第６の流路２０ｆの違いは空気抜き穴２８の位置にあり，第５の流路２０ｅよりも，第６の流路２０ｆの方が，空気抜き穴２８の位置が沈殿剤導入口２２に近い。第７の流路２０ｇは第５の流路２０ｅに似ているが，その違いについては後述する。第８の流路２０ｈは，流路の途中が二つに分岐していて，分かれた先が二つのタンパク質溶液導入口２４に連通している。
【００１９】
タンパク質溶液導入口２４の直径は２ｍｍであり，沈殿剤導入口２２の直径は６ｍｍであり，ゲル導入口２６の直径は２ｍｍであり，空気抜き穴２８の直径は０．５ｍｍである。
【００２０】
図２に示す流路プレート１０は，流路幅が異なる４種類のものを作製した。すなわち，流路幅が２００μｍ，１００μｍ，５０μｍ，２０μｍの４種類である。流路深さは流路幅と同じである。各流路プレートにおいて，上述の８本の流路は，基本的には，互いに同一の流路幅になっている。
【００２１】
以下，流路幅が２００μｍの流路プレートを例にして，８本の流路の形状及び寸法を詳しく説明する。まず，第１の流路２０ａと第２の流路２０ｂは，流路幅が２００μｍで，流路深さが２００μｍである。
【００２２】
次に，第３の流路２０ｃを説明する。図４（Ａ）は第３の流路２０ｃを流路プレートの底面側から見た平面図であり，図４（Ｂ）は第３の流路２０ｃを幅方向の中央で切断した切断端面図である。流路２０ｃの両端にはタンパク質溶液導入口２４と沈殿剤導入口２２が連通している。流路２０ｃの途中にはゲル導入口２６と空気抜き穴２８が連通している。空気抜き穴２８はゲル導入口２６とタンパク質溶液導入口２４の間に位置している。この第３の流路２０ｃはゲル・カウンタ・ディフュージョン法でタンパク質を結晶化するための流路である。図４（Ｂ）に示すように，タンパク質溶液導入口２４，沈殿剤導入口２２，ゲル導入口２６及び空気抜き穴２８は，それらの一端（上端）が流路プレートの上面３８（第１面）に開口している。それらの導入口２２，２４，２６及び空気抜き穴２８の他端（下端）は，流路２０ｃに連通している。そして，流路２０ｃの長手方向に延びるひとつの面（底面側の面）が流路プレートの底面４０（第２面）に開口している。
【００２３】
第３の流路２０ｃは，その流路プレートの標準の流路幅となっている通路（以下，広い通路という）と，それよりも幅が狭い通路とから構成されている。なお，幅が広い，または，幅が狭い，という表現は相対的なものである。沈殿剤導入口２２の側から述べると，第１の狭い通路３０，第１の広い通路３２，第２の狭い通路３４，及び，第２の広い通路３６が，順番につながっている。第１の広い通路３２の長手方向の中央部にゲル導入口２６が連通しており，第２の狭い通路３４の長手方向の中央部に空気抜き穴２８が連通している。狭い通路３０，３４は，タンパク質溶液が通路内を進むときのスピードを抑制するために設けているが，狭い通路を無くして，すべて同一幅の通路とすることもできる。
【００２４】
図６（Ａ）は図４（Ａ）の６Ａ−６Ａ線断面図であり，第１の広い通路３２の断面形状を示している。第１の広い通路３２の深さは２００μｍであり，幅も２００μｍ（この流路プレートの標準の流路幅）である。この図では，通路３２のひとつの面（下側の面）が流路プレートの底面（第２面）４０に開口していることがよく分かる。図６（Ｂ）は図４（Ａ）の６Ｂ−６Ｂ線断面図であり，第１の狭い通路３０の断面形状を示している。第１の狭い通路３０の深さは２００μｍであり，幅は５０μｍである。狭い通路と広い通路は，深さが同じで，幅だけが異なっている。図４（Ａ）に戻って，第２の広い通路３６の断面形状は第１の広い通路３２と同じであり，第２の狭い通路３４の断面形状は第１の狭い通路３０と同じである。
【００２５】
図４（Ａ）において，タンパク質溶液導入口２４の中心から沈殿剤導入口２２の中心までの距離Ｌ１は７０ｍｍである。第１の狭い通路３０の距離Ｌ２は２ｍｍであり，第１の広い通路３２の距離Ｌ３は１０ｍｍであり，第２の狭い通路３４の距離Ｌ４は３ｍｍである。したがって，第２の広い通路３６の距離は５１ｍｍであり，他の通路３０，３２，３４と比較して長くなっている。第２の広い通路３６の途中は省略して図示している。
【００２６】
図３は第３の流路２０ｃの一部の斜視図であり，流路の幅方向の中央で切断した状態を示している。沈殿剤導入口２２の側から順に，第１の狭い通路３０，第１の広い通路３２，第２の狭い通路３４，及び，第２の広い通路３６が順番につながっている。そして，第１の広い通路３２の長手方向の中央部にゲル導入口２６が連通しており，第２の狭い通路３４の長手方向の中央部に空気抜き穴２８が連通している。
【００２７】
次に，図２に戻って，第４の流路２０ｄを説明する。この第４の流路２０ｄは第３の流路２０ｃとほぼ同じである。第３の流路２０ｃと違うところは，第３の流路２０ｃと比較して，空気抜き穴２８の位置がゲル導入口２６に近づいていることである。
【００２８】
次に，第５の流路２０ｅを説明する。図５（Ａ）は第５の流路２０ｅを流路プレートの底面側から見た平面図であり，図５（Ｂ）は第５の流路２０ｅを幅方向の中央で切断した切断端面図である。流路２０ｅの両端にはタンパク質溶液導入口２４と沈殿剤導入口２２が連通していて，流路２０ｅの途中には空気抜き穴２８が連通している。ゲル導入口が存在しないこと以外は，第３の流路２０ｃと同じである。この流路２０ｅはゲルを利用しない液−液拡散法でタンパク質を結晶化するための流路である。広い通路の幅は２００μｍで，狭い通路の幅は５０μｍである。
【００２９】
図２に戻って，第６の流路２０ｆは，第５の流路２０ｅとほぼ同じであるが，第５の流路２０ｅと比較して，空気抜き穴２８の位置が沈殿剤導入口２２に近づいている。
【００３０】
第７の流路２０ｇは，流路の幅が２００μｍで，深さが２００μｍである。第５の流路２０ｅと類似しているが，第５の流路２０ｅと異なっているところは，空気抜き穴２８の付近でも流路が狭くなっていないことである。
【００３１】
第８の流路２０ｈは，流路の幅が２００μｍで，深さが２００μｍであり，流路の途中が二つに分岐している。
【００３２】
以上の説明は，標準の流路幅が２００μｍの流路プレートの例であるが，流路幅が１００μｍ，５０μｍ，２０μｍの流路プレートの場合は，上述の２００μｍを，それぞれ，１００μｍ，５０μｍ，２０μｍに置き換えればよい。ただし，標準の流路幅よりも狭い通路については（第３の流路２０ｃ〜第６の流路２０ｆに存在する），次のようにしている。標準の流路幅が１００μｍの流路プレートの場合は，狭い通路の幅は５０μｍである。標準の流路幅が５０μｍの流路プレートの場合は，狭い通路の幅は２０μｍである。標準の流路幅が２０μｍの流路プレートの場合は，狭い通路の幅は１０μｍである。
【００３３】
流路プレートに細長い流路を形成するには，フォトレジストを用いたリソグラフィー技術を用いることができる。
【００３４】
図７は結晶作製器具の使用方法を説明する切断端面図である。図２に示す８種類の流路のうち，第３の流路２０ｃを用いて，ゲル・カウンタ・ディフュージョン法でタンパク質を結晶化する例である。まず，図７（Ａ）に示すように，流路プレート１０の底面４０（第２面）に第２カバーシート１４を貼り付ける。流路プレート１０の材質は弾力性のあるＰＤＭＳであり，第２カバーシート１４の材質は柔軟なポチエチレンテレフタレートであるので，第２カバーシート１４を流路プレート１０の底面４０に押し付けるだけで，流路を気密に封止するだけの密着性がある。次に，マイクロピペットを用いて，ゲル導入口２６にゲル４２を導入する。ゲル４２はゲル導入口２６から通路２０ｃの内部へと広がっていく。ゲルの導入量は，沈殿剤導入口２２及び空気抜き穴２８のところにゲル４２が見え始めるまでとする。次に，図７（Ｂ）に示すように，マイクロピペットを用いて，沈殿剤導入口２２に沈殿剤４４を導入する。沈殿剤４４の導入量は，沈殿剤導入口２２の開口付近まで沈殿剤４４を満たすまでとする。次に，マイクロピペットを用いて，タンパク質溶液導入口２４にタンパク質溶液４６を導入する。タンパク質溶液４６は細い通路２０ｃの内部を進んでいくが，タンパク質溶液４６が空気抜き穴２８のところに到達すると，空気抜き穴２８の内部を上昇する。タンパク質溶液４６の導入量は，タンパク質溶液導入口２２及び空気抜き穴２８の開口付近までタンパク質溶液４６を満たすまでとする。もし，空気抜き穴２８が無いとすると，特に流路２０ｃの幅が狭い場合には，充填済みのゲル４２と，導入するタンパク質溶液４６との間に，空気溜まりができてしまうおそれがある。空気抜き穴２８があると，空気溜まりができるおそれはなく，空気が容易に逃げていく。
【００３５】
沈殿剤４４とタンパク質溶液４６の導入が完了したら，図７（Ｃ）に示すように，流路プレート１０の上面３８（第１面）に第１カバーシート１２を貼り付ける。第１カバーシート１２も，第２カバーシート１４と同様に，柔軟なポリエチレンテレフタレートでできているので，第１カバーシート１２を流路プレート１０の上面３８に押し付けるだけで，タンパク質溶液導入口２４の開口，沈殿剤導入口２２の開口，ゲル導入口２６の開口，及び，空気抜き穴２８の開口を，気密に封止するだけの密着性がある。カバーシート１２，１４の材質であるポリエチレンテレフタレートは，水分の透過性が低いので，水分の蒸発による結晶化はほとんど起きないと考えられる。タンパク質の結晶化は，ゲル４２を通して，タンパク質溶液４６が沈殿剤４４に拡散し，沈殿剤４４がタンパク質溶液４６に拡散していく過程で，タンパク質溶液４６中でタンパク質の濃度が過飽和になることで達成されると考えられる。
【００３６】
二つのカバーシート１２，１４に挟まれた状態の流路プレート１０は，図１に示すように，ケース１６の中に収容する。その後，ケース蓋１８を閉じる。流路プレート１０を収容したケース１６は，恒温装置の中にセットして，所定時間だけ静置しておき，タンパク質が結晶化するのを待つ。ケース１６，ケース蓋１８，流路プレート１０，二つのカバーシート１２，１４は，すべて透明なので，外部からタンパク質の結晶化の様子を確認できる。十分な大きさの結晶ができたことを確認できたら，以下に述べる方法で，流路から結晶を取り出す。なお，図７（Ｃ）では，タンパク質の結晶４８が流路内２０ｃ内に析出された状態を模式的に示している。
【００３７】
本発明の結晶作製器具は，ゲル導入口，沈殿剤導入口及びタンパク質溶液導入口に，それぞれ，ゲル，沈殿剤及びタンパク質溶液を導入するだけでセットアップが完了するので，非常に簡便であり，サンプル量が微量であっても，再現性が良好である。空気抜き穴がある場合は，ゲルとタンパク質溶液を導入する際に，加圧注入しなくてもよい。ひとつの流路当たり（ひとつの条件当たり）のサンプル量は非常に少なくて済み，例えば，最も少ない量で０．１μリットル未満でも実験が可能である。
【００３８】
ゲルを用いない場合は，図２の第１の流路２０ａ，第２の流路２０ｂ，及び，第５の流路２０ｅ〜第８の流路２０ｈのいずれかを用いて，結晶化の実験をすることができる。その場合は，まず，沈殿剤を通路の途中までに導入し，その後，タンパク質溶液を通路に導入して，両者が直接接触するようにする。
【００３９】
図８はタンパク質の結晶を取り出す方法を示す斜視図であり，カバーシートの一部を切り取って示している。流路２０内に結晶４８が析出された状態の流路プレート１０は，二つのカバーシート１２，１４に挟まれた状態のままでケースから取り出して，これを裏返しにする。これにより，第２カバーシート１４が上に来る。次に，カッターナイフ（図示せず）を用いて，結晶４８を取り囲むように第２カバーシート１４に切込み５０を入れる。切込み５０は，ＰＤＭＳ製の流路プレート１０まで到達するようにする。そして，切込み５０のところから，第２カバーシート１４の切片５２を流路プレート１０の底面４０から剥がす。これにより，流路プレート１０の流路２０が露出する。次に，結晶取出器具５４を用いて，結晶４８を取り出す。このように，第２カバーシート１４を透明でかつ柔軟なシートで形成したことにより，第２カバーシート１４を所望の箇所で切り取ることで，流路内の結晶を露出させることができ，結晶の取出しが容易になる。取り出した結晶は，Ｘ線結晶構造解析などの分析に供することができる。流路プレート１０は，通常は，使い捨てであり，カッターで傷を付けても構わない。
【００４０】
次に，結晶を実際に作製したときの条件を説明する。タンパク質溶液としては，リゾチーム溶液とソーマチン溶液を準備した。リゾチーム溶液は，濃度８０ｍｇ／ｍｌのＨＥＷ−リゾチーム（Lysozyme）（和光純薬製）で，５０ｍＭ酢酸Ｎａ（和光純薬製），ｐＨ４．７に溶解したものである。リゾチーム用の沈殿剤は，１０％ＮａＣｌ（和光純薬製），５０ｍＭ酢酸Ｎａ（和光純薬製），ｐＨ４．７である。
【００４１】
ソーマチン溶液は，濃度２０ｍｇ／ｍｌのソーマチン（Thaumatin）（ＳＩＧＭＡ製）である。ソーマチン用の沈殿剤は，CrystalScreen 1-29 [0.8 M Potassium Sodium Tartrate tetrahydrate, 0.1M HEPES-Na, pH 7.5]（HamptonResearch製）である。
【００４２】
ゲルは，１％（ｗ／ｖ）アガロース（Agarose）（和光純薬製），０．０４％ＮａＮ３（和光純薬製）である。
【００４３】
図９に示す一覧表はタンパク質の結晶化の実験結果を示すものである。流路幅の異なる４種類の流路プレートを用いて，各流路プレートについて第１流路２０ａから第４流路２０ｄまでを用いて，リゾチームまたはソーマチンを結晶化したものである。実験番号１〜４番は流路幅２００μｍの流路プレートを用いたものであり，実験番号５〜８番は流路幅１００μｍの流路プレートを用いたものであり，実験番号９〜１２番は流路幅５０μｍの流路プレートを用いたものであり，実験番号１３〜１６番は流路幅２０μｍの流路プレートを用いたものである。各流路プレートについて，図２に示す第１の流路２０ａから第４の流路２０ｄまでを用いて実験を行った。使用したタンパク質溶液は，リゾチーム溶液またはソーマチン溶液である。
【００４４】
「Set up」の欄は，流路にゲルとタンパク質溶液及び沈殿剤をうまく充填できたかどうかを示している。○印はうまく充填できたことを示している。
【００４５】
日数の欄には，その経過日数のときに流路内に結晶が確認できたかどうかを示している。「Ｃ」と記入された箇所は，結晶が確認できたことを示している。「Ａ」と記入された箇所は，アモルファスの析出物が確認できたことを示している。何も記入されていない箇所は，観察した限りでは何も変化がなかったことを示している。
【００４６】
上述の実施例では，二つのカバーシート１２，１４の平面形状は流路プレート１０の平面形状と同じにしているが，カバーシートはもっと小さくてもよい。すなわち，第１のカバーシート１２は，少なくともタンパク質溶液導入口の開口，沈殿剤導入口の開口，空気抜き穴の開口及びゲル導入口の開口を気密に覆うことができるような大きさであれば足りる。その場合に，１枚のカバーシートにしないで，小さなサイズのものを複数個用意してもよい。同様に，第２のカバーシート１４も，少なくとも流路プレートの底面側における各流路の開口部を覆うことができるような大きさであれば足りる。この場合も，１枚のカバーシートにしないで，細長いサイズのものを複数個用意してもよい。
【００４７】
二つのカバーシート１２，１４の材質としては，上述のポリエチレンテレフタレートのほかに，ポリイミドまたはポリテトラフルオロエチレンを使うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本発明の結晶作製器具の一実施例の分解斜視図である。
【図２】流路プレートの上面（第１面）を示した平面図である。
【図３】第３の流路の一部の斜視図である。
【図４】第３の流路を流路プレートの底面側から見た平面図と，その流路の切断端面図である。
【図５】第５の流路を流路プレートの底面側から見た平面図と，その流路の切断端面図である。
【図６】図４（Ａ）の６Ａ−６Ａ線断面図と６Ｂ−６Ｂ線断面図である。
【図７】結晶作製器具の使用方法を説明する切断端面図である。
【図８】タンパク質の結晶を取り出す方法を示す斜視図である。
【図９】タンパク質の結晶化の実験結果を示す一覧表である。
【符号の説明】
【００４９】
１０  流路プレート
１２  第１カバーシート
１４  第２カバーシート
１６  ケース
１８  ケース蓋
２０  流路
２２  沈殿剤導入口
２４  タンパク質溶液導入口
２６  ゲル導入口
２８  空気抜き穴
３０  第１の狭い通路
３２  第１の広い通路
３４  第２の狭い通路
３６  第２の広い通路
３８  流路プレートの上面（第１面）
４０  流路プレートの底面（第２面）
４２  ゲル
４４  沈殿剤
４６  タンパク質溶液
４８  結晶
５０  切込み
５２  切片
５４  結晶取出器具
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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