(57)【要約】【課題】  本発明は、多様性の高いウイルスであるＨＩＶ−１に対し、効果的なＲＮＡ干渉作用を示し、かつオフターゲット効果の低いＲＮＡ干渉分子を提供することを課題とする。【解決手段】ＨＩＶ−１グループＭのゲノム配列４９５種をもとに、２１塩基の部分配列全てを生成し、Ui-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドラインに従って、設計条件を満たすＲＮＡ干渉分子を選択し、さらにｓｉＲＮＡ標的切断アッセイおよびＨＩＶ−１の増殖抑制効果を調べることにより、ＨＩＶ−１に対して最高度の保存領域を標的とし、効果的なＲＮＡ干渉分子を構築することができた。【選択図】図６
2008306962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２１塩基の塩基配列を含み、ＨＩＶ−１の保存領域を標的とし、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子。
【請求項２】
ＨＩＶ−１の保存領域が、ＨＩＶ−１の配列を少なくとも７０％以上保存する領域である請求項１に記載のＲＮＡ干渉分子。
【請求項３】
ＨＩＶ−１の保存領域が、非翻訳領域から選択される請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉分子。
【請求項４】
ＨＩＶ−１の非翻訳領域が、ウイルスの遺伝子発現に必要なTATA配列、ポリＡシグナル(AAUAAA)領域、逆転写に必要なprimer activation signal (PAS)領域、primer bindig site (PBS)領域、ウイルスのパッケージングに必要なpackaging signal（Ψ）領域、ゲノムの＋鎖ＤＮＡ合成に必要なcentral poly purine tract (cPPT)領域、central terminal sequence (CTS)領域、並びに3' poly purine tract (3'PPT)領域のいずれかから選択される領域である請求項３に記載のＲＮＡ干渉分子。
【請求項５】
ＨＩＶ−１の配列において、配列表の配列番号２〜２３５のいずれかに示す塩基配列を標的とし、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子。
【請求項６】
ＨＩＶ−１の配列において、配列番号７、１１、１２，１４、１７、２３、６１、６５、７１、９９、１０１、１０６、１０７、１１０、１２７、１３６、１３７、１３９、１５９、１７１、１７４、１９７、２１８〜２３５のいずれかに示す塩基配列部分を標的とする、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示す請求項５に記載のＲＮＡ干渉分子。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子の探索方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子の設計方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とするＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
【請求項１０】
センス鎖が、配列番号２３７〜２７７のいずれかに示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とする記載のＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
【請求項１１】
センス鎖が、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５１〜２５４、配列番号２６６〜２６８のいずれかに示す配列からなるｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とする請求項１０に記載のＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＨＩＶ−１ゲノム配列における最高度の保存領域に対して特異的に干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子に関する。より詳しくは、ＨＩＶ−１特異的に干渉効果を示し、オフターゲット効果を示さないＲＮＡ干渉分子、その探索方法および該ＲＮＡ干渉分子の設計方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（RNAinterference；ＲＮＡｉ）とは、細胞に導入した２本鎖ＲＮＡ（double-strand RNA；ｄｓＲＮＡ）が、相同な塩基配列をもつｍＲＮＡを特異的に切断することによって遺伝子発現を抑制する現象である。ＲＮＡｉの分子機構は、生体内においてはウイルスやトランスポゾンに対する防御機構の一部と考えられているほか、生体内で多数発現しているマイクロＲＮＡ（micro RNA；ｍｉＲＮＡ）による遺伝子発現の制御において重要な役割を担っている。また、人為的にｄｓＲＮＡを細胞内に導入することによって、任意の遺伝子を簡単にノックダウンできることから、ＲＮＡｉは遺伝子の機能解析に有効な手段として注目されている。
【０００３】
哺乳動物で、ＲＮＡ干渉実験を行うには、標的遺伝子と相同な、化学合成した約２１塩基対の短いｄｓＲＮＡ（short-interfering RNA；ｓｉＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡを発現するベクターを細胞に導入する方法が一般的に用いられる。しかし、ｓｉＲＮＡの配列はどのようなものでも細胞内で機能するわけではなく、無作為に設計したｓｉＲＮＡの７〜８割はＲＮＡ干渉作用を示さない。目的の遺伝子を十分に抑制させるために、標的遺伝子に対するｄｓＲＮＡをin vitro転写により合成し、ｄｓＲＮＡ切断酵素により切断した様々な配列のｓｉＲＮＡ混合物を利用する方法が報告されている（非特許文献１）。
【０００４】
有効性の高いｓｉＲＮＡについて、ホタルルシフェラーゼ遺伝子に対する１６種類のｓｉＲＮＡを無作為に設計し、そのＲＮＡ干渉効果をホタルルシフェラーゼ活性を指標として種々の培養細胞で測定した結果について報告がある。哺乳動物においてＲＮＡ干渉効果の高い順にｓｉＲＮＡを並べてみると、一定のパターンが認められた。即ち、効果の高いｓｉＲＮＡは、１）アンチセンス鎖の5'末端がアデニン（Ａ）またはウラシル（Ｕ）であり、２）センス鎖の5'末端がグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）であった。また、３）アンチセンス鎖の5'の７塩基中の４塩基以上はＡまたはＵである点が共通していた。一方、効果を示さないｓｉＲＮＡは、１）〜３）の条件を全て満たさないという対称的な特性を示していることが確認された（非特許文献２）。
【０００５】
また、ｓｉＲＮＡの長さは約２１塩基対と短いため、標的遺伝子とは全く無関係な遺伝子にも相同部分が存在する確立が高い。そのような場合、ｓｉＲＮＡによって標的とは無関係な遺伝子の発現まで抑制してしまう可能性がある。この現象は、ｓｉＲＮＡのオフターゲット効果と呼ばれており、ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子機能解析や、ｓｉＲＮＡを医薬に応用する上で深刻な問題の一つとなっている。オフターゲット効果を回避するためには、標的以外のすべての遺伝子に対して相同性が最小となるｓｉＲＮＡを選択することが望ましい。一般的には、設計したｓｉＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴで検索し、無関係な遺伝子がヒットしないものを選択すればよいと考えられる。しかし、個々のｓｉＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴで検索するのは、時間と労力を要し、ｓｉＲＮＡのような短い配列の検索では見落としが多いという重大な欠点がある。このような欠点を解消するためのプログラムとして、ｓｉＲＮＡ設計ウェブサーバも公開されている（http://design.RNAi.jp/)。
【０００６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に関し、ＲＮＡ干渉作用を示すｄｓＲＮＡ分子について、報告がある（特許文献１）。ここでは、特に感染した細胞においてウイルスの複製を阻害するｓｉＲＮＡを開示し、特に好ましいｄｓＲＮＡ分子は、ＨＣＶ核酸に対応し、肝細胞においてＨＣＶの複製を阻害することが報告されている。また、もう一つの局面において、ヌクレアーゼ分解に耐性である修飾されたｓｉＲＮＡについても開示がある。しかしながら、本文献ではＨＣＶの複製の阻害に関し、効果的なＲＮＡｉ作用を有するｓｉＲＮＡについての言及はなく、オフターゲット効果についての問題点も指摘されていない。
【０００７】
後天性免疫不全症候群を引き起こすヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus；ＨＩＶ）は高率に変異を起こし、これが抗ＨＩＶ薬剤耐性のみならず、ＨＩＶ−１感染やワクチンに対する宿主の獲得免疫応答をウイルスが回避する原因となっている。ＨＩＶやＨＣＶなどのＲＮＡウイルスは、ゲノム多様性が著しく高く、１種類のｓｉＲＮＡを単独で用いた場合、そのｓｉＲＮＡに耐性をもつ変異ウイルスが容易に出現しうることが報告されている（非特許文献３、４）。そこで、多様性の高いウイルスであるＨＩＶ−１に対する対策の一つとして、効果的なｓｉＲＮＡの提供が望まれている。
【非特許文献１】Nature Methods. 2: p.779-784 (2005)
【非特許文献２】バイオテクノロジージャーナル、1-2 p.23-28 (2006)
【非特許文献３】J. Virol. 77, 11531-11535 (2003a)
【非特許文献４】J. Virol. 78, 2601-2605 (2004)
【特許文献１】特開2006-320327号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、多様性の高いウイルスであるＨＩＶ−１に対し、効果的にＲＮＡ干渉作用を示し、かつオフターゲット効果の低いＲＮＡ干渉分子を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＨＩＶ−１グループＭのゲノム配列４９５種をもとに、２１塩基の部分配列（以下、単に「21-mer」と呼ぶ。）全てを生成し、有効性の高いＲＮＡ干渉分子を構築するための設計条件を満たす21-merを選択し、標的切断アッセイおよびＨＩＶ−１の増殖抑制効果を調べることにより、ＨＩＶ−１に対して効果的なＲＮＡ干渉分子を構築することができ、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．少なくとも２１塩基の塩基配列を含み、ＨＩＶ−１の保存領域を標的とし、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子。
２．ＨＩＶ−１の保存領域が、ＨＩＶ−１の配列を少なくとも７０％以上保存する領域である請求項１に記載のＲＮＡ干渉分子。
３．ＨＩＶ−１の保存領域が、非翻訳領域から選択される請求項１または２に記載のＲＮＡ干渉分子。
４．ＨＩＶ−１の非翻訳領域が、ウイルスの遺伝子発現に必要なTATA配列、ポリＡシグナル(AAUAAA)領域、逆転写に必要なprimer activation signal (PAS)領域、primer bindig site (PBS)領域、ウイルスのパッケージングに必要なpackaging signal（Ψ）領域、ゲノムの＋鎖ＤＮＡ合成に必要なcentral poly purine tract (cPPT)領域、central terminal sequence (CTS)領域、並びに3' poly purine tract (3'PPT)領域のいずれかから選択される領域である請求項３に記載のＲＮＡ干渉分子。
５．ＨＩＶ−１の配列において、配列表の配列番号２〜２３５のいずれかに示す塩基配列を標的とし、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子。
６．ＨＩＶ−１の配列において、配列番号７、１１、１２，１４、１７、２３、６１、６５、７１、９９、１０１、１０６、１０７、１１０、１２７、１３６、１３７、１３９、１５９、１７１、１７４、１９７、２１８〜２３５のいずれかに示す塩基配列部分を標的とする、ＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示す請求項５に記載のＲＮＡ干渉分子。
７．請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子の探索方法。
８．請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子の設計方法。
９．請求項１〜６のいずれかに記載のＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とするＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
１０．センス鎖が、配列番号２３７〜２７７のいずれかに示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とする記載のＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
１１．センス鎖が、配列番号２３９、配列番号２４２、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２５１〜２５４、配列番号２６６〜２６８のいずれかに示す配列からなるｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とする請求項１０に記載のＨＩＶ−１増殖の抑制方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＨＩＶ−１特異的ＲＮＡ干渉分子は、ＨＩＶ−１ゲノムの多様性にもかかわらず、効果的にＨＩＶ−１の増殖を抑制することができる。これにより、抗ＨＩＶ−１治療薬のスクリーニングや、ＲＮＡ干渉分子を用いた抗ＨＩＶ−１治療薬の開発に対して貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、「ＲＮＡ干渉分子」とは、ＲＮＡ干渉効果を示す２本鎖のポリヌクレオチドまたはそれを発現しうる分子をいい、ｓｉＲＮＡおよびその一部が修飾されているもの、あるいはＤＮＡに置換されているものも含まれる。ポリヌクレオチドを発現しうる分子としては、例えばｓｈＲＮＡベクターも含まれる。
【００１３】
本発明のＲＮＡ干渉分子の標的部位は、以下の方法で選択することができる。本発明のＨＩＶ−１特異的ＲＮＡ干渉分子は、ＨＩＶ−１ゲノムの最高度の保存領域を標的とするものであり、該標的となりうる領域は、Los Alamos HIV Sequence Database(HIV sequence database, http://www.hiv.lanl.gov/)より入手可能なＨＩＶ−１グループＭのゲノム配列４９５種をもとに解析することができる（表１−１〜１−１０参照）。まず４９５種のＨＩＶ−１配列を構成するＨＩＶ−１ゲノムの２１塩基の部分配列である21-merを生成し、その各21-merが４９５種のうちの何種に共通であるかを調べ、前記ゲノム配列からＲＮＡ干渉分子の標的として有効な候補となりうる高度保存領域を同定する。
【００１４】
例えば、ある21-merが４９５種のＨＩＶ−１配列のうち３００種に共通であった場合、単純には、そのオリゴヌクレオチドの保存度(conservation)を、300/495×100＝60.6（％）と計算することができる。ただし、本解析に用いたＨＩＶ−１配列の多くは5'UTR部分の配列を欠いているため、5'UTR領域の保存度を計算する場合には、分母を４９５とすると保存度が過小に評価される場合がある。この場合には、5'UTR領域のうち、LTR部分について、3'LTRの配列を補完し、分母の適正値を算定することでより正確な保存度を計算することができる。
【００１５】
まず、４９５種のＨＩＶ−１配列を構成する21-merを生成したところ、合計で4,417,157種が得られ、配列の重複を除くと1,208,150種であることが確認される。４９５種のＨＩＶ−１配列から生成された全21-merが、重複を除いた際に４分の１程度にしかならない事実は、ＨＩＶ−１ゲノムの多様性が著しく高いことが示唆される。
【００１６】
ついで、各21-merの保存度を、siVirusプログラム(Naito et al., Nucleic Acids Res. 34, W448-W450 (2006))を用いて計算することができる。
【００１７】
ＨＩＶ−１を標的とするＲＮＡ干渉法の試みは、既に複数の研究グループより報告されているが、それらの研究で使用されているｓｉＲＮＡの多くは、保存度が低いことが示されている（表２−１〜２−３参照。）
【００１８】
しかしながら、21-merのうち、特定の領域に位置するものは高度に保存されていることが確認された。これらの領域の多くは、非翻訳領域内にあり、ウイルス遺伝子発現や増殖に必須な配列を含んでいた。すなわち、ウイルスの遺伝子発現に必要なTATA配列領域、ポリＡシグナル(AAUAAA)領域、逆転写に必要なprimer activation signal (PAS)領域、primer bindig site (PBS)領域、ウイルスのパッケージングに必要なpackaging signal（Ψ）領域、ゲノムの＋鎖ＤＮＡ合成に必要なcentral polypurine tract (cPPT)領域、central terminal sequence (CTS)領域、および3' polyurine tract (3'PPT)領域などに位置するものが高度に保存されていた。本発明のＲＮＡ干渉分子は、これらの非翻訳領域を標的とするＲＮＡ干渉効果を示す２本鎖のポリヌクレオチドまたはそれを発現しうる分子、ｓｉＲＮＡおよびその一部が修飾されているもの、あるいはＤＮＡに置換されているものから選択することができる。また、これらの非翻訳領域に限らず、高い保存度を有する部位を標的にするのであれば、本発明のＲＮＡ干渉分子とすることができる。ここにおいて、高い保存度とは、具体的にはLos Alamos HIV Sequence Database(HIV sequence database, http://www.hiv.lanl.gov/)より入手可能なＨＩＶ−１グループＭのゲノム配列４９５種のうち７０％以上、より好ましくは８０％以上の保存度をいう。
【００１９】
上記に例示される非翻訳領域は、すべてアミノ酸配列ではなくＲＮＡの配列自体もしくはＲＮＡの２次構造を通して機能を発揮するような領域であり、例えば、図３および図４に示す領域を標的とすることができる。例えば翻訳領域であり、アミノ酸配列のレベルで保存されているような領域の多くは、コドンの３番目の塩基の変異を許容するため、塩基配列レベルでは必ずしも保存されていない例が多い。
【００２０】
以上の解析により各21-merを同定し、保存度が７０％以上であるような21-merを調べた結果、配列表の配列番号２〜２３５に示す各配列が挙げられる（表３−１〜３−５、図５参照。）。これらの配列を標的とするＲＮＡ干渉分子のうち、３６種がUi-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドラインを満たし、哺乳動物細胞で有効と予測される。またReynoldsらのｓｉＲＮＡ設計法では３０種、Amarzguiouiらの設計方法では４４種がそれぞれ有効と予測することができる。
【００２１】
より具体的には、ＨＩＶ−１の配列において、配列表の配列番号２〜２３５のいずれかに示す塩基配列部分を標的とすることができる。さらには、ＨＩＶ−１の配列において、配列番号７、１１、１２，１４、１７、２３、６１、６５、７１、９９、１０１、１０６、１０７、１１０、１２７、１３６、１３７、１３９、１５９、１７１、１７４、１９７、２１８〜２３５のいずれかに示す塩基配列部分を標的とするのが好適である。
【００２２】
上述の標的部位に対するＨＩＶ−１特異的ＲＮＡ干渉分子のうち、特にｓｉＲＮＡの設計方法を、Ui-Teiら、Reynoldsら、およびAmarzguiouiらの方法に基づき説明する。
【００２３】
Ui-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドライン(Ui-Tei et al., Nucleic Acids Res. 32, 936-948 (2004))の概略は、以下のとおりである。ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖、アンチセンス鎖を、それぞれ単に、センス鎖、アンチセンス鎖とよぶ。
(i)アンチセンス鎖の5'末端が、ＡまたはＵである。
(ii)センス鎖の5'末端が、ＧまたはＣである。
(iii)アンチセンス鎖の5'端の７塩基のうち４塩基以上がＡまたはＵである。
(iv)配列中にG/Cが１０塩基以上連続しない。
【００２４】
Reynoldsらの判定方法(Reynolds et al., Nat. Biotechnol. 22, 326-330 (2004))の概略は以下のとおりであり、合計６点以上のｓｉＲＮＡを有効と判定する。
(I)ｓｉＲＮＡの２本鎖部分におけるG/Cの数が、１９塩基中７〜１０塩基の範囲であれば＋１点。
(II)アンチセンス鎖の5'端の５塩基におけるＡまたはＵの数を（０〜５）得点とする。
(III)２本鎖部分のＴｍが２０℃未満。
(IV)センス鎖の5'端から１９番目の塩基がＡであれば、＋１点。
(V)センス鎖の5'端から３番目の塩基がＡであれば、＋１点。
(VI)センス鎖の5'端から１０番目の塩基がＵであれば、＋１点。
(VII)アンチセンス鎖の5'末端がＧまたはＣであれば−１点。
(VIII)センス鎖の5'端から１３番目の塩基がＧであれば−１点。
【００２５】
Amarzguiouiらの判定方法(Amarzguioui et al., Biotchem. Biophys. Res. Commun. 316, 1050-1058 (2004))の概略は以下のとおりであり、合計３点以上のｓｉＲＮＡを有効と判定する。
(1)△Ｔ３：アンチセンス鎖の5'端の３塩基におけるＡまたはＵの数（０〜３）から、センス鎖の5'端の３塩基におけるＡまたはＵの数（０〜３）を引いた値を得点とする。（−３から＋３までの値をとりうる。）
(2)センス鎖の5'末端ＧまたはＣであれば、＋１点。
(3)センス鎖の5'末端がＵであれば−１点。
(4)センス鎖の5'端から６番目の塩基がＡであれば、＋１点。
(5)センス鎖の5'端から１９番目の塩基がＧであれば、−１点。
(6)アンチセンス鎖の5'末端がＡまたはＵであれば＋１点。
【００２６】
上記の設計方法により選別されるｓｉＲＮＡ分子は、一般的な方法、例えばオリゴヌクレオチド合成法によって製造することができる。また、本発明のＲＮＡ干渉分子には、ｓｉＲＮＡおよびその一部が修飾されているものも含まれ、ｓｉＲＮＡ分子は修飾ヌクレオチド塩基を含ませることもできる。例えば、修飾塩基は、既に市販されている一般的なものを使用することができる。修飾塩基の使用により、ｓｉＲＮＡ分子の安定性を増大させ、それによって所望の効果をもたらすのに必要とされる量を低減させることができる。また、ｓｉＲＮＡ分子がＤＮＡに置換されているものについても、同様の合成方法により得ることができる。
【００２７】
さらに、本発明のＲＮＡ干渉分子には、上述のポリヌクレオチドを発現しうる分子としては、例えばｓｈＲＮＡベクターも含まれる。このようなベクターは、具体的には、例えばGenScript社、iGENE社、Ambion社など各社が既に市場で受注している方法で作製することができる。
【００２８】
本発明の本発明のＲＮＡ干渉分子の効果は、本発明のＲＮＡ干渉分子自体が備える標的切断活性により評価することができる。本発明のＲＮＡ干渉分子が本来の標的とは別の遺伝子の相同部分を認識し、その遺伝子を抑制してしまうオフターゲット効果は、ＲＮＡ干渉分子に対応するｓｉＲＮＡ配列と標的とするｍＲＮＡ配列との間に、どの程度の相同性があると生じるかを検討し、任意の標的配列に対するｓｉＲＮＡの標的切断活性により評価することができる。
【００２９】
さらに、本発明は本発明のＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いることを特徴とするＨＩＶ−１増殖の抑制方法にも及ぶ。具体的には、ＲＮＡ干渉分子におけるｓｉＲＮＡのセンス鎖が、配列表の配列番号２３７〜２７７の何れかに示す塩基配列からなるｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を用いたＨＩＶ−１増殖の抑制方法が挙げられ、より具体的には配列番号２３９（ｓｉ５１０）、配列番号２４２（ｓｉ５２１）、配列番号２４７（ｓｉ７６４）、配列番号２４８（ｓｉ７７０）、配列番号２５１〜２５４（ｓｉ２０７５、ｓｉ２３２９、ｓｉ２３３０、ｓｉ２３３３）、配列番号２６６〜２６８（ｓｉ４７５０、ｓｉ４７５１、ｓｉ４７５３）のいずれかに示すｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を１種または複数種用いるＨＩＶ−１増殖の抑制方法が挙げられる。
【００３０】
さらに本発明のＲＮＡ干渉分子は、標的が異なる複数のｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子を同時に用いることできる。本発明のＲＮＡ干渉分子２種を組み合わせて同時に用いることにより、ＨＩＶ−１の多様な変異株に対し、９７％以上のＨＩＶ−１株に効果が認められる（図１０参照）。
【００３１】
本発明は、上記説明したＨＩＶ−１特異的にＲＮＡ干渉効果を示すＲＮＡ干渉分子の他、該ＲＮＡ干渉分子の探索方法、設計方法にも及び、さらには該ＲＮＡ干渉分子を用いたＨＩＶ−１増殖の抑制方法にも及ぶ。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例および実験例を示して、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
【００３３】
（実施例１）ＨＩＶ−１に対するＲＮＡ干渉分子の標的領域の特定
本発明のＨＩＶ−１のゲノム配列は、Los Alamos HIV Sequence Database (HIV sequence database, http://www.hiv.lanl.gov/)より入手可能なＨＩＶ−１グループＭのゲノム配列４９５種をもとにした（表１−１〜１−１０参照）。前記ゲノム配列からｓｉＲＮＡの標的として有効な候補となりうる高度保存領域を同定した。まず４９５種のＨＩＶ−１配列を構成する21-mer全てを生成し、そのひとつの21-merが、４９５種のうちの何種に共通であるかを調べた。
【００３４】
ついで、各21-merの保存度を、siVirusプログラム(Naito et al., Nucleic Acids Res. 34, W448-W450 (2006))を用いて計算した。保存度０％から１００％の点で示したところ、それらの殆どが０％に近く、ＨＩＶ−１ゲノムの大部分の領域は、21-merの単位では保存されていないことが明らかになった（図１参照）。具体的には、保存度が７０％以上の21-merは全体のわずか１．６％であり、保存度が５０％以上の21-merでも、全体の５．２％に過ぎなかった（図２参照）。また、すべてのＨＩＶ−１配列に共通な、保存度が１００％であるような21-merは存在しなかった。これらの結果は、ＨＩＶ−１を標的とするｓｉＲＮＡを無作為に設計しても、高い多様性をもつＨＩＶ−１を効率よく標的とすることが難しいことが示唆された。ＨＩＶ−１を標的とするＲＮＡｉ法の試みは既に複数の研究グループより報告されているが、それらの研究で使用されているｓｉＲＮＡの多くは、保存度が低かった（表２−１〜２−３参照。）
【００３５】
以上の解析により保存度が７０％以上であるような21-merを調べたところ、配列表の配列番号２〜２３５に示す標的配列を確認した。これらの２３４の標的配列に対応するｓｉＲＮＡのうち、３６種がUi-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドラインを満たし、哺乳動物細胞で有効と予測された。またReynoldsらのｓｉＲＮＡ設計法では３０種、Amarzguiouiらの設計方法では４４種がそれぞれ有効と予測された。
【００３６】
ｓｉＲＮＡの抗HIV-1効果を検証するため、Ui-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドラインを満たす３６種のｓｉＲＮＡから、感染性分子クローンpNL4-3(GenBank:M19921)と配列が完全一致するものを２３種選択し、また保存度が中程度でUi-TeiらのｓｉＲＮＡ設計ガイドラインを満たし、かつpNL4-3(GenBank:M19921)と配列が完全一致するものを１８種選択し、計４１種類選択した。
【００３７】
選択したｓｉＲＮＡの標的部位は、配列表の配列番号７、１１、１２，１４、１７、２３、６１、６５、７１、９９、１０１、１０６、１０７、１１０、１２７、１３６、１３７、１３９、１５９、１７１、１７４、１９７、２１８〜２３５に示す塩基配列からなり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列表の配列番号２３７〜２７７に示す塩基配列からなり、アンチセンス鎖は、配列表の配列番号２７９〜３１９に示す塩基配列からなる。これらの各塩基配列を図５に示した。ｓｉＲＮＡそのものは、図５におけるｓｉに続く番号表示からも識別することができる。
【００３８】
（実施例２）ＨＩＶ−１特異的ＲＮＡ干渉分子の作製
図５に示すｓｉＲＮＡのセンス鎖（配列表の配列番号２３７〜２７７）を化学合成し、２本鎖にアニーリングしたものをＲＮＡｉ社（東京）より購入した。siControl（配列番号２７８）は、Ui-Teiらのガイドラインを満たし、かつヒトの全転写産物に３ミスマッチ以内で相同な配列が存在しないネガティブコントロールである。
【００３９】
ＨｅＬａ細胞を、１０％非動化ウシ胎児血清を含有するDulbecco's modified Eagle medium（ＤＭＥＭ；Gibco社）に抗生物質を添加して３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、２４ウェルプレートにおいて、Lipofectamine 2000 (Invitrogen社）を用いて同製品のマニュアルに記載の方法で行った。細胞に導入するプラスミドは、Qiagen Plasmid Midi またはQIAwell 96 Ultra (Qiagen社）を用いて抽出した。
【００４０】
（実験例１）ＨＩＶ−１逆転写酵素活性の測定
実施例２で得た４１種類のｓｉＲＮＡについて、ＨＩＶ−１に対する増殖抑制効果を、サブタイプB, B', C, CRF01_AEに属する４種のＨＩＶ−１感染性分子クローンで評価した。評価に使用した４種のクローンの概要を表４に示した。これら３種のサブタイプはアジア領域におけるＨＩＶ−１流行の主要な原因となっており、また塩基配列の上では相互に隔たりのあるクラスタを形成している。
【００４１】
本実験例では、それぞれの感染性分子クローンを各ｓｉＲＮＡとともにＨｅＬａ細胞に導入し、４８時間後に培地上清を回収してＨＩＶ−１由来の逆転写酵素活性を測定し、ウイルスの増殖を評価した。
【００４２】
その結果を図６Ａに示した。各ｓｉＲＮＡを５ｎＭで導入した場合、４１種のＲＮＡ干渉分子のうち２６種が、すべてのＨＩＶ−１株の増殖を２０％以下に抑制した。残りの１５種のｓｉＲＮＡのうちｓｉ４７９４およびｓｉ４８８８を除く１３種は、標的切断アッセイにおいて活性が認められた。またｓｉ６９０、ｓｉ４７９４およびｓｉ４８８８を除く１２種は少なくとも１種のＨＩＶ−１株の増殖を２０％以下に抑制していることから、それらのｓｉＲＮＡ自体は有効であると考えられた。
【００４３】
しかし、ｓｉＲＮＡ配列と標的配列との間に１塩基〜数塩基のミスマッチが存在する場合は、それらのＨＩＶ−１株の増殖を抑制することができなかった。一方、塩基の置換がｓｉＲＮＡの末端に近い場合にはｓｉＲＮＡの効果が保持される場合があった。このように末端に近い位置においてミスマッチの影響が少ないという結果は、以下の実験例２に示すオフターゲット効果の解析結果とおおむね一致した。
【００４４】
図７において、本発明の４１種類のｓｉＲＮＡ配列と、各感染性クローンの標的配列のアラインメントを示した。ｓｉＲＮＡ配列は、アンチセンス鎖の２１塩基に対応するセンス側の配列を示した。いずれもＲＮＡ分子であるが、塩基配列はGenBankに収録された各データにあわせ、ATGCの４文字を用いて記載した。
【００４５】
また、ｓｉ６８９およびｓｉ６９０については、ｓｉＲＮＡ配列と標的配列とが完全に一致しているにもかかわらずＨＩＶ−１の増殖を抑制できなかった。この領域は、ＨＩＶ−１の5'UTRがとりうる２種類の２次構造(Huthoff et al., 2001)すなわちBMH (branched multiple hairpin)とLDI (long distance interaction)の両方において固く閉じており、ｓｉＲＮＡが標的配列に接近することを妨げている可能性が示唆された。さらにｓｉ５７５の効果がpNL4-3と93IN101とで異なる点が注目された。この理由は明らかでないが、一つの可能性として、各感染分子クローンで標的部分の２次構造に差異があり、ｓｉＲＮＡの接近のしやすさが異なるのかもしれない。
【００４６】
（実験例２）標的切断アッセイ
標的切断アッセイ系は、ｓｉＲＮＡの標的となる２１〜４０塩基の配列を組み込んだ発現ベクターとｓｉＲＮＡとを同時に培養細胞に導入して、ベクターから発現する標的ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡによって切断される効率を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量する方法による。ｓｉＲＮＡ配列と標的とするｍＲＮＡ配列との間に、どの程度の相同性があるとオフターゲット効果が生じるかを検討するため、標的切断アッセイ系により任意の標的配列に対するｓｉＲＮＡの標的切断活性を評価した。pCI-neo (Promega社）のNheI部位とXbaI部位との間に、Kozak配列およびいくつかの制限酵素部位を挿入して、pTRECベクターを構築した。挿入した配列は以下のとおりである。
[NheI site]-CACCATGGAATTCACGCGTCTCGAG-[XbaI site]（配列番号３２１）
【００４７】
本アッセイのために構築した標的ｍＲＮＡ発現ベクターpTREC（Target RNA Expression Constructの略）を用いた（図８参照）。本アッセイでは、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドをpTRECベクターのＭＣＳに挿入することにより、標的配列を自由に設定できるため、ある特定のｓｉＲＮＡに対して標的ｍＲＮＡの配列を１塩基ずつ変えていくような系統的な解析が可能となる。pTRECベクターから発現するｍＲＮＡの配列は、標的部分を除いて共通であるため、まったく同一の実験条件下でｓｉＲＮＡの標的切断活性を定量的に評価することができる。
【００４８】
構築したpTRECベクターのEcoRI部位とXhoI部位との間に、各ｓｉＲＮＡの標的配列を挿入した。各コンストラクト（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を、ｓｉＲＮＡ（終濃度５ｎＭ）とともにＨｅＬａ細胞に導入し、２４時間後に細胞を回収し、RNeasy96 (Qiagen社）で全ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを、オリゴｄＴをプライマーにSuperScript (Invitrogen社）で逆転写してｃＤＮＡを得た。リアルタイムＰＣＲは、ABI PRISM7000 (Applied Biosystems社）を使用して、SYBER Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社）で行った。
【００４９】
その結果を図６Ｂに示した。各ｓｉＲＮＡを５ｎＭで用いた場合、４１種のｓｉＲＮＡのうち３９種が標的ｍＲＮＡを４０％以下に抑制した。ｓｉ４７９４およびｓｉ４８８８は有効と予測されたにもかかわらず、５ｎＭの濃度において十分な抑制効果を示さなかった。この理由は明らかではないが、ｓｉ４７９４は配列中に連続するグアニン残基(GGGGGG)および連続するシトシン残基(CCCCCC)を含むためＲＮＡオリゴの化学合成が難しく、またｓｉ４８８８は配列中にAAAUUUUという回文配列が存在し、２次構造をとりやすいため、いずれも正しく塩基対を形成した２本鎖ｓｉＲＮＡの実効濃度が低下していた可能性がある。
【００５０】
以上の結果より、本発明により、ＨＩＶ−１の高度な多様性に対応しうるＲＮＡ干渉分子を高い確率で設計することができた。本発明のＲＮＡ干渉分子のうち、保存度が７０％以上であり、かつウイルス増殖を１０％以下に抑制できたｓｉＲＮＡは、以下であった。
【００５１】
ｓｉ５２１：ポリＡシグナルを標的とする。保存度は９４％であった。
ｓｉ７６４およびｓｉ７７０：Ψを標的とする。保存度は８８％であった。
ｓｉ５１０：TAR-ポリＡシグナルを標的とする。保存度は８４％であった。
ｓｉ２０７５：リボソームスリップサイト(ribosomal slip site)を標的とする。保存度は各々７０％であった。
ｓｉ２３２９、ｓｉ２３３０およびｓｉ２３３３：プロテアーゼ領域を標的とする。保存度は各々７７％であった。
ｓｉ４７５０、ｓｉ４７５１およびｓｉ４７５３：インテグラーゼ領域を標的とする。保存度は７１−７４％であった。
【００５２】
しかしながら、１種のｓｉＲＮＡ単独でデータベースに登録された全ＨＩＶ−１を標的とすることは不可能であった（図９参照）。これを克服するために、標的が異なる複数のｓｉＲＮＡに対応するｓｉＲＮＡを同時に用いることできる。本発明のＲＮＡ干渉分子２種を組み合わせて同時に用いることにより９７％以上のＨＩＶ−１に効果が認められた（図１０参照）。
【００５３】
具体的には、ｓｉ５０９とｓｉ４８８８、ｓｉ５１０とｓｉ４８８８、ｓｉ５１２とｓｉ４８８８、ｓｉ５１５とｓｉ４８８８、ｓｉ１５２１とｓｉ４８８８、ｓｉ５０９とｓｉ１８１７、ｓｉ５１０とｓｉ１８１７、ｓｉ５１２とｓｉ１８１７、ｓｉ５０９とｓｉ１６８９、ｓｉ５１０とｓｉ１６８９、ｓｉ５１２とｓｉ１６８９、ｓｉ５１５とｓｉ１６８９、ｓｉ５２１とｓｉ１６８９、ｓｉ６８９とｓｉ７６４、ｓｉ６８９とｓｉ７７０、ｓｉ５１５とｓｉ１８１７、ｓｉ５２１とｓｉ１７７０、ｓｉ５２１とｓｉ１８１７、ｓｉ５２１とｓｉ４６５２、ｓｉ５２１とｓｉ７６４、ｓｉ６８９とｓｉ１８１７、ｓｉ７６４とｓｉ１８１７、ｓｉ５２１とｓｉ１４９０、ｓｉ５２１とｓｉ２４８５、ｓｉ５２１とｓｉ２４８６、ｓｉ５２１とｓｉ４１７５、ｓｉ５２１とｓｉ４７９４、ｓｉ５２１とｓｉ５５４、ｓｉ６８９とｓｉ４８０９、ｓｉ６８９とｓｉ７６５３、ｓｉ６８９とｓｉ７６５８、ｓｉ７６４とｓｉ４８８８、ｓｉ７７０とｓｉ１８１７、ｓｉ５０９とｓｉ２０７５、ｓｉ５１０とｓｉ２０７５、ｓｉ５１２とｓｉ２０７５、ｓｉ５１２とｓｉ７７０、ｓｉ５１５とｓｉ７７０、ｓｉ５２１とｓｉ２０７５、ｓｉ５２１とｓｉ２３２９、ｓｉ５２１とｓｉ２３３０、ｓｉ５２１とｓｉ２３３３、ｓｉ５２１とｓｉ３０００、ｓｉ５２１とｓｉ３００５、ｓｉ５２１とｓｉ４７４５、ｓｉ５２１とｓｉ４７５０、ｓｉ５２１とｓｉ４７５１、ｓｉ５２１とｓｉ４７５３、ｓｉ５２１とｓｉ４８０６、ｓｉ５２１とｓｉ４８０９等の各ｓｉＲＮＡに対応するＲＮＡ干渉分子の組合せにより９７．９％以上の効果が得られた。
【００５４】
【表１−１】
2008306962.tif 000003
【００５５】
【表１−２】
2008306962.tif 000004
【００５６】
【表１−３】
2008306962.tif 000005
【００５７】
【表１−４】
2008306962.tif 000006
【００５８】
【表１−５】
2008306962.tif 000007
【００５９】
【表１−６】
2008306962.tif 000008
【００６０】
【表１−７】
2008306962.tif 000009
【００６１】
【表１−８】
2008306962.tif 000010
【００６２】
【表１−９】
2008306962.tif 000011
【００６３】
【表１−１０】
2008306962.tif 000012
【００６４】
【表２−１】
2008306962.tif 000013
【００６５】
【表２−２】
2008306962.tif 000014
【００６６】
【表２−３】
2008306962.tif 000015
【００６７】
【表３−１】
2008306962.tif 000016
【００６８】
【表３−２】
2008306962.tif 000017
【００６９】
【表３−３】
2008306962.tif 000018
【００７０】
【表３−４】
2008306962.tif 000019
【００７１】
【表３−５】
2008306962.tif 000020
【００７２】
【表４】
2008306962.tif 000021
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上詳述したように、本発明の最高度の保存領域に対する抗ＨＩＶ−１に対するｓｉＲＮＡは、ＨＩＶ−１のゲノムの多様性にもかかわらず、効果的にＨＩＶ−１の増殖を抑制することができる。これにより、抗ＨＩＶ−１治療薬のスクリーニングや、本ｓｉＲＮＡを用いた抗ＨＩＶ−１治療薬の開発に対して貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】４９５種のＨＩＶ−１配列における21-merの分布および保存度を示す図である。
【図２】４９５種のＨＩＶ−１配列における21-merの保存度を示す図である。
【図３】BMI(branched multiple hairpin)型の２次構造および本発明のｓｉＲＮＡの標的部位を示す図である。
【図４】LDI(long distance interaction)型の２次構造および本発明のｓｉＲＮＡの標的部位を示す図である。
【図５】本発明のＲＮＡ干渉分子の標的部位ならびにｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の塩基配列を示す図である。
【図６】本発明のＲＮＡ干渉分子の評価結果を示す図である。Ａ．ＨＩＶ−１逆転写酵素活性の測定結果を示す図である。Ｂ．標的切断アッセイ結果を示す図である。
【図７】本発明のＲＮＡ干渉分子に関し、各ＨＩＶ−１標的部位に対するアラインメントを示す図である。
【図８】本発明のＲＮＡ干渉分子の標的切断アッセイに用いるpTRECベクターの構造を示す図である。
【図９】本発明のＲＮＡ干渉分子を１種用いたときの、各ＨＩＶ−１変異株全体に対して抑制効果を認めた変異株の割合を示す図である。
【図１０】本発明のＲＮＡ干渉分子を２種用いたときの、各ＨＩＶ−１変異株全体に対して抑制効果を認めた変異株の割合を示す図である。
【図１】
2008306962.tif 000022
【図２】
2008306962.tif 000023
【図３】
2008306962.tif 000024
【図４】
2008306962.tif 000025
【図５】
2008306962.tif 000026
【図６】
2008306962.tif 000027
【図７】
2008306962.tif 000028
【図８】
2008306962.tif 000029
【図９】
2008306962.tif 000030
【図１０】
2008306962.tif 000031
【配列表】
2008306962000001.app