(57)【要約】【課題】高危険度ＨＰＶ型を検出するための経済的な方法を提供すること。【解決手段】病原生物の改変体を検出および／またはタイピングする工程を包含する方法。これらの方法は、ＨＰＶに関連する核酸を検出するために使用され、これは次いで、医学的な診断および処置のための基礎を提供する。これらの方法は、２つのアプローチを通じて当該分野の問題を解決する：第１のアプローチは、関心がある全ての改変体（例えば、病原生物の全ての高危険度株）をスクリーニングするために必要とされるプローブの量を最少にする。第２のアプローチは、増幅ベース（例えば、ＰＣＲベース）の検出方法によって、増幅される株を限定する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル細胞中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
ＨＰＶの標的核酸を含み得るサンプル細胞を細胞保存溶液中に懸濁する工程；
該サンプル細胞から該標的核酸を分離する工程であって、該分離された標的核酸は、該細胞保存溶液中に残り、該細胞保存溶液は、該サンプル細胞を凝集させることなく保存するために充分な量のアルコールを含む、工程；
該細胞保存溶液中にある該標的核酸を、少なくとも１つのペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、該少なくとも１つのプローブは、複数のＨＰＶ型の核酸の部分と実質的に相補的である、工程；
該細胞保存溶液中に該標的核酸が存在する場合に、該少なくとも１つのプローブが該標的核酸とハイブリダイズするのを可能にする工程；および
該少なくとも１つのプローブと、該溶液中の該標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程；
を包含し、
該ハイブリダイゼーションの検出は、サンプル細胞におけるＨＰＶの標的核酸の存在を示す、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記サンプル細胞は、被験体に由来し、
前記標的核酸配列の存在は、該被験体における腫瘍増殖の危険を示す、
方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、
前記腫瘍増殖は、子宮頸癌または子宮頸管内癌腫のうちのいずれかに関連する、
方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸配列の存在は、ＨＰＶの特定の型の存在を示す、
方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、
前記ＨＰＶの特定の型は、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、および７０型からなる群より選択される、
方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸配列が存在しないことが、ＨＰＶによる感染が存在しないことの診断特徴である、
方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸配列が存在しないことが、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、および７０型からなる群より選択されるＨＰＶ型による感染が存在しないことの診断特徴である、
方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸配列が存在しないことが、高危険度型のＨＰＶによる感染が存在しないことの診断特徴である、
方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸の増幅
をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、
前記増幅工程は、ポリメラーゼ連鎖反応を行うことを包含する、
方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、
前記標的核酸を、ＰＮＡ−ＤＮＡ相互作用を介して固体支持体上へ捕捉させる工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つのプローブの各々は、少なくとも８塩基を含む、
方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つのプローブは、ＰＮＡとは異なるヌクレオチドを含む、
方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つのプローブは、配列番号１〜配列番号５からなる群より選択される、
方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つのプローブは、検出可能マーカーで標識されている、
方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つのプローブは、分子標識プローブを含む、
方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、
前記ハイブリダイゼーションを認識するために抗体を使用する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、
前記細胞保存溶液は、抗集塊剤と、該溶液を約４〜約７の範囲内のｐＨに維持する緩衝剤とをさらに含む、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、２０００年４月３日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１９４，３０４号、および２０００年８月１５日に出願された同第６０／２２５，５２４号に基づく。
【０００２】
（政府の権利）
本明細書中に記載される研究は、国立癌研究所によって授与された、ＳＢＩＲ助成金番号１Ｒ４３ＣＡ８０４０１−０１によって支援された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
疫学研究は、長い間、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を、頸部の新形成および癌の主要な原因として関連づけてきた。それにも関わらず、頸部の新形成および癌の病因におけるＨＰＶの原因的役割を裏づけるための証拠の大半が生じてきたのは、わずかここ１０年に過ぎない。７０種類を超える型のＨＰＶが同定されている。しかしながら、全てのＨＰＶ型が子宮頸癌に関連しているわけではない。いくつかの型（１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５３型、５２型、５６型、５８型、５９型、６６型、６８型、および７０型を含む）が頸部の疾患についての高危険度（ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ）に関係していた。ＨＰＶのこれらの高危険度型の検出は、ＨＰＶ関連疾患の正確かつ時宜を得た診断に重要である。
【０００４】
結果的に、ＨＰＶの高危険度型の検出のための種々の方法が考案されてきた。これらの多くは、ＨＰＶゲノムにおける固有の配列の検出に基づく。例えば、特定の高危険度ＨＰＶ株の遺伝子の一部分に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、患者サンプル中の高危険度ＨＰＶの特定の株の存在をスクリーニングするのに有用であるとして、Ｌｏｒｉｎｃｚの特許文献１（本明細書中において参考として援用される）中に報告されている。Ｍａｎｏｓの特許文献２（本明細書中において参考として援用される）は、縮重または混合されたコンセンサスプライマーを使用してＨＰＶ  ＤＮＡを増幅および検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、その後の遺伝子型特異的ＤＮＡプローブの混合物を用いるタイピングの使用を報告する。ＰＣＲ増幅は、ＨＰＶ  ＤＮＡを検出するさらに高感度な方法を提供する。しかし、既存のＰＣＲコンセンサスプライマーは、ＨＰＶの高危険度型および低危険度型の両方にハイブリダイズするので、引き続きタイピングする必要がなお存在する。一方で、種々の高危険度遺伝子型に対して特異的なプローブのカクテルを使用する場合、コストが高く、時間を費やし、そして多くの量の試薬およびサンプルＤＮＡを必要とする。それゆえ、関心がある全ての高危険度ＨＰＶ型を検出するさらに経済的な方法についての必要性が存在する。
【特許文献１】米国特許第４，８４９，３３２号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７０５，６２７号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の方法は、病原生物の改変体を検出および／またはタイピングする工程を包含する。好ましい実施形態において、これらの方法は、ＨＰＶに関連する核酸を検出するために使用され、これは次いで、医学的な診断および処置のための基礎を提供する。本発明の方法は、２つのアプローチを通じて当該分野の問題を解決する：第１のアプローチは、関心がある全ての改変体（例えば、病原生物の全ての高危険度株）をスクリーニングするために必要とされるプローブの量を最少にする。第２のアプローチは、増幅ベース（例えば、ＰＣＲベース）の検出方法によって、増幅される株を限定する。
【０００６】
本発明の１つの局面において、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）プローブを使用して生物学的サンプル中の特定のＨＰＶ標的核酸の存在を検出するための方法が提供される。好ましい方法は、溶液中にサンプル細胞を懸濁する工程；このサンプル細胞から、１つ以上のＨＰＶ標的核酸を単離する工程；この標的核酸を、少なくとも１つのＰＮＡプローブ（これは、検出が所望される核酸の少なくとも一部分に実質的に相補的である）と接触させる工程；およびＰＮＡプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程、を包含する。好ましくは、サンプル細胞を懸濁するための溶液は、アルコール（凝集することなくサンプル細胞を固定するために十分な量で）、抗集塊剤、および溶液を約４〜７の範囲内のｐＨで維持する緩衝剤を含む。
【０００７】
好ましい実施形態において、サンプル細胞中の標的核酸の存在は、ＨＰＶ感染を診断し、癌の危険（例えば、子宮頸管内の癌腫、子宮頸癌および新形成に関連する危険）を示し得る。
【０００８】
別の実施形態において、この標的核酸配列の存在は、特定の型のＨＰＶの存在を示す。より好ましい実施形態において、標的核酸配列は、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、および７０型より選択されるＨＰＶ株の存在を示す。
【０００９】
他の好ましい実施形態において、本発明の方法はさらに、ＰＮＡ−ＤＮＡ相互作用を用いて、標的核酸を固体支持体上に捕捉する工程を包含する。
【００１０】
本発明の代替的な実施形態は、サンプル中のＨＰＶの標的核酸の存在を検出するための方法を含み、この方法は以下の工程を包含する：少なくとも１つのＰＮＡプローブ（これは、１つ以上のＨＰＶ型の核酸の少なくとも一部分に実質的に相補的である）を使用して候補核酸を固体支持体上に捕捉する工程、次いでＰＮＡプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程。他の実施形態は、懸濁されたサンプル細胞を均一に表面上に移すことによって、サンプル中のＨＰＶの標的核酸をインサイチュで検出するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する；細胞中に含まれるＨＰＶの標的核酸を、少なくとも１つのＰＮＡプローブ（これは、１つ以上のＨＰＶ型の核酸の部分に実質的に相補的である）とインサイチュでハイブリダイズさせる工程；およびＰＮＡプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程。
【００１１】
本発明の他の局面は、標的核酸を増幅する工程、および検出が所望されない他の核酸の増幅をブロックする工程、を包含する標的核酸を検出する方法を提供する。このような方法は、一般的に、生物の少なくとも１つの選択された株由来の核酸、およびこの生物の少なくとも１つの選択されていない株由来の核酸を含み得るサンプルを提供する工程を包含する。この生物の選択された株および選択されていない株の両方に由来する核酸の部分に実質的に相補的である複数のプライマーもまた、提供される。このサンプルを、少なくとも１つの核酸アナログプローブ（これは、複数のプライマー間の全長増幅をブロックするに十分に少なくとも１つの選択されていない株由来の核酸の一部分に相補的である）に曝露する。少なくとも１つの選択された株由来の核酸は、この複数のプライマー間で増幅され、このような増幅産物の検出は、このサンプル中における少なくとも１つの選択された株の存在を示す。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、診断上で最も関連性がある病原生物の株または種に対するスクリーニングアッセイにバイアスをかけるために使用される。従って、本発明の方法は、生物学的サンプルを病原生物の選択された株または改変体に由来する核酸の増幅のためのプライマー対に曝露する工程、およびその生物の選択されていない株または改変体に由来する核酸の増幅をブロックする工程、を包含する。好ましくは、本発明の方法において使用されるプライマー対は、病原生物の全ての株の核酸を普遍的（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｌｙ）に増幅する。増幅は、生物の選択されていない株または改変体においてのみ、ブロックされ、その結果選択された株または改変体由来の核酸のみが増幅される。
【００１３】
非常に好ましい実施形態において、本発明の方法は、感染性生物の高危険度株を選択的に増幅するために使用される。このような方法において、感染性生物のゲノムの予め選択された領域の増幅のためのコンセンサスプライマーが使用される。単独で、これらのプライマーは、病原生物の株または改変体のほとんどまたは全てに由来する核酸を増幅し得る。しかしながら、本発明の方法において、選択されていない株または改変体の増幅はブロックされ、その結果、生成されるアンプリコンはいずれも、ブロックされなかった株または改変体のみを表す。
【００１４】
例えば、本発明の方法を使用して、ＨＰＶの高危険度株を選択的に検出する。ＨＰＶコンセンサスプライマー、およびＨＰＶの選択されていない低危険度株におけるプライマーの領域またはプライマー間の領域にのみハイブリダイズする、１つ以上のペプチド核酸（ＰＮＡ）ブロッキングプローブ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ）の存在下で増幅反応を行う。ＰＮＡブロッキングプローブは、低危険度株由来の核酸の増幅を阻止し（すなわち、プライマー間の全長増幅を阻止し）、一方このＰＮＡブロッキングプローブがハイブリダイズしない高危険度株由来の核酸は、増幅される。
【００１５】
本発明の方法は、任意の核酸増幅方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ローリングサークル複製系、分枝鎖増幅、核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｃｌｅａｖａｓｅ断片長多型（Ｃｌｅａｖａｓｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第５，７１９，０２８号を参照のこと）および核酸のキメラプライマー開始型等温増幅（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＩＣＡＮ）および分枝伸長増幅方法（Ｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ）（ＲＡＭ）（例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第５，７１９，０２８号、同第５，９４２，３９１号を参照のこと）。本発明の方法は、生物学的サンプル中の任意の病原生物（ウイルスおよび細菌（例えば、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、淋菌、ストレプトバシラス属菌、ＨＰＶ、ＨＩＶなどを含む）の存在を検出するのに有用である。
・本発明はまた、以下を提供する：
・（項目１）  サンプル中の生物の少なくとも１つの選択された株の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
生物の少なくとも１つの選択された株由来の核酸および上記生物の少なくとも１つの選択されていない株由来の核酸を含み得るサンプルを提供する工程；
上記生物の少なくとも１つの選択された株由来の上記核酸および上記生物の少なくとも１つの選択されていない上記株由来の核酸の両方の領域に対して実質的に相補的な複数のプライマーを提供する工程；
上記複数のプライマー間での少なくとも１つの選択されていない株由来の上記核酸の全長増幅をブロックするに十分な程少なくとも１つの選択されていない株由来の上記核酸の一部分に相補的である少なくとも１つのプローブに、上記サンプルを曝露する工程であって、上記少なくとも１つのプローブが核酸アナログを含む、工程；
上記複数のプライマー間で、少なくとも１つの選択された株由来の上記核酸を増幅する工程；ならびに
少なくとも１つの選択された株由来の核酸の増幅産物を検出する工程、
を包含する、方法。
・（項目２）  上記少なくとも１つの選択された株が病原性株を含む、項目１に記載の方法。
・（項目３）  上記サンプルが被験体由来であり、かつ上記病原性株が上記被験体における癌性増殖の危険を示す、項目２に記載の方法。
・（項目４）  上記生物が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を含む、項目１に記載の方法。
・（項目５）  上記少なくとも１つのプローブがＰＮＡを含む、項目１に記載の方法。
・（項目６）  上記少なくとも１つのプローブがさらに、ＰＮＡとは異なるヌクレオチドを含む、項目５に記載の方法。
・（項目７）  上記少なくとも１つのプローブの各々が、少なくとも８塩基を含む、項目１に記載の方法。
・（項目８）  項目１に記載の方法であって、上記複数のプライマー間で、少なくとも１つの選択された株の上記核酸を増幅させる工程が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル複製、分枝鎖増幅、核酸に基づく配列増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｃｌｅａｖａｓｅ断片長多型、ＩＣＡＮおよびＲＡＭからなる群より選択される反応を行う工程を包含する、方法。
・（項目９）  上記核酸の両方の上記領域が、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ６およびＥ７領域からなる群より選択される領域の部分である、項目４に記載の方法。
・（項目１０）  上記少なくとも１つの選択されていない株が、既知の低危険度ＨＰＶ株のすべてに相当する、項目４に記載の方法。
・（項目１１）  上記少なくとも１つの選択されていない株が、ＨＰＶ株６、１１、４２、４３、および４４からなる群より選択される、項目４に記載の方法。
・（項目１２）  上記少なくとも１つの選択された株が、複数の高危険度ＨＰＶ株を含む、項目４に記載の方法。
・（項目１３）  上記複数のプライマーが、ＭＹ０９およびＭＹ１１（配列番号１０および１１）を含む、項目４に記載の方法。
・（項目１４）  上記少なくとも１つのプローブが配列番号６および配列番号７からなる配列群より選択される、項目４に記載の方法。
・（項目１５）  上記サンプルが頸部切屑である、項目１に記載の方法。
・（項目１６）  上記増幅産物を検出する工程が、上記産物のゲル内電気泳動工程および上記産物をエチジウムブロマイドで染色する工程を包含する、項目１に記載の方法。
・（項目１７）  サンプル細胞中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の標的核酸の存在を検出する方法であって、以下の工程：
サンプル細胞を溶液中に懸濁する工程；
上記サンプル細胞からＨＰＶの標的核酸を単離する工程；
上記標的核酸を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、上記少なくとも１つのプローブは、複数のＨＰＶ型の核酸の部分に実質的に相補的である、工程；および
上記少なくとも１つのプローブと上記標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
・（項目１８）  項目１に記載の方法であって、上記溶液が、凝集することなくサンプル細胞を固定するための十分な量のアルコール、抗集塊（ａｎｔｉ−ｃｌｕｍｐｉｎｇ）剤、および上記溶液を約４〜約７の範囲内のｐＨに維持する緩衝剤を含む、方法。
・（項目１９）  上記サンプル細胞が被験体由来であり、そしてここで、上記標的核酸配列の存在が上記被験体における腫瘍増殖の危険を示す、項目１に記載の方法。
・（項目２０）  上記腫瘍増殖が子宮頸癌または子宮頸管内癌腫のいずれかに関連する、項目４に記載の方法。
・（項目２１）  上記標的核酸配列の存在がＨＰＶの特定の型の存在を示す、項目３に記載の方法。
・（項目２２）  上記ＨＰＶの特定の型が、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、および７０型からなる群より選択される、項目７に記載の方法。
・（項目２３）  上記標的核酸配列の非存在が、ＨＰＶによる感染の非存在の診断となる、項目３に記載の方法。
・（項目２４）  上記標的核酸配列の非存在が、１６型、１８型、３１型、３３型、３５型、３９型、４５型、５１型、５２型、５６型、５８型、５９型、６８型、および７０型からなる群より選択されるＨＰＶ型による感染の非存在の診断となる、項目３に記載の方法。
・（項目２５）  上記標的核酸配列の非存在が、高危険度型のＨＰＶによる感染の非存在の診断となる、項目１に記載の方法。
・（項目２６）  さらに、上記標的核酸の増幅を包含する、項目１に記載の方法。
・（項目２７）  上記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を包含する、項目１２に記載の方法。
・（項目２８）  さらに、上記標的核酸分子を、ＰＮＡ−ＤＮＡ相互作用を介して、固体支持体上へ捕捉させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
・（項目２９）  上記少なくとも１つのプローブの各々が少なくとも８塩基を含む、項目１に記載の方法。
・（項目３０）  上記少なくとも１つのプローブがＰＮＡとは異なるヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
・（項目３１）  上記少なくとも１つのプローブが配列番号１〜５からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
・（項目３２）  上記少なくとも１つのプローブが検出可能マーカーで標識されている、項目１に記載の方法。
・（項目３３）  上記少なくとも１つのプローブが分子標識（ｂｅａｃｏｎ）プローブを含む、項目１７に記載の方法。
・（項目３４）  さらに、上記ハイブリダイゼーションを認識するための抗体を使用する工程を包含する、項目１に記載の方法。
・（項目３５）  サンプル中のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の標的核酸の存在を検出するための方法であって、以下の工程：
固体支持体上で、標的核酸を含む候補核酸を捕捉する工程；
上記候補核酸をペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む少なくとも１つのプローブと接触させる工程であって、上記少なくとも１つのプローブが複数のＨＰＶ型の核酸の部分に実質的に相補的である、工程；および
上記少なくとも１つのプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
・（項目３６）  候補核酸を捕捉する工程がＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を含む、項目３５に記載の方法。
・（項目３７）  サンプル中におけるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の標的核酸の存在に関するインサイチュでの検出のための方法であって、以下の工程：
懸濁されたサンプル細胞を均一に表面上へ移す工程；
上記細胞中に含まれるＨＰＶの標的核酸を、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む少なくとも１つのプローブとインサイチュでハイブリダイズさせる工程であって、上記少なくとも１つのプローブが複数のＨＰＶ型の核酸の部分に実質的に相補的である、工程；および
上記少なくとも１つのプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程、
を包含する、方法。
【００１６】
本発明のこれらおよび他の利点および局面は、以下の、これらの詳細な説明の考察に基づいて理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
１つの局面において、本発明の方法は、少なくとも１つのＰＮＡプローブを使用して、高危険度ＨＰＶ改変体の存在について、患者サンプルをスクリーニングする工程を包含する。好ましい実施形態において、複数のＨＰＶ型の核酸の部分にハイブリダイズするＰＮＡプローブが使用される。従って、本発明はＨＰＶの複数の株または型の同時検出を可能にする。
【００１８】
いくつかのＰＮＡプローブは、複数のＨＰＡ株由来の核酸と交差ハイブリダイズすることが示された。従って、いくつかの例において、単一のプローブまたはプローブ混合物が使用され、単一のサンプルにおける複数の株の存在がスクリーニングされ得る。また本発明に従って、単一のＨＰＶ株の核酸にのみハイブリダイズするＰＮＡプローブが使用され、サンプル中の株を特異的に同定および／またはタイピングし得る。このように高い特異性のプローブは、例えばプローブに統合された識別可能なマーカーを利用することによって、連続してかまたは並行して使用され得る。このような高い特異性のプローブの混合物、またはこのような高い特異性のプローブおよび交差ハイブリダイズするプローブの混合物が使用され、ＨＰＶの複数の株（好ましくは、全ての高危険度な株であり、かつ高危険度な株のみ）が同定され得る。
【００１９】
上記に記載されるようなハイブリダイゼーションスクリーニングはまた、保存溶液（例えば、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））の中で行われ、そうすることにより患者サンプル（例えば、パパニコラウスミア）の細胞学的スクリーニングとＨＰＶスクリーニングとを組み合わせ得る。ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液は、本明細書中において参考として援用される、共有に係る米国特許第５，２５６，５７１号において記載される。
【００２０】
本発明の方法に従って、ＰＮＡプローブは、１つ以上のＨＰＶ型の核酸の部分に実質的に相補的であるように設計される。ＨＰＶ  ＤＮＡ配列は、多数の公的データベース（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ）において見出され得る。本発明の使用のためのＰＮＡプローブは、１つ以上のＨＰＶ株の相同領域にハイブリダイズするように設計された。好ましい実施形態において、高危険度ＨＰＶ株の間では共通するが低危険度ＨＰＶ株の間では共通しない株の相同性が選択され、ＨＰＶ  ＤＮＡの高危険度型のみに対するＰＮＡプローブの特異性を確実にする。
【００２１】
好ましい相同性領域は、ＨＰＶ  Ｌ１コンセンサス領域である。このＬ１領域は、ＨＰＶの主要なカプシドタンパク質をコードし、細胞内でウイルスの組み込みが起こる場合に常に、保持される。ウイルスゲノム内の他の領域（例えば、Ｅ６オープンリーディングフレーム、本明細書中において参考として援用されるＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎらの米国特許第５，８８８，７２４号に記載される）もまた、相同性を生じるよう使用され得る。
【００２２】
種々のＨＰＶ型のＬ１領域のＤＮＡ配列を、ＧＥＮＢＡＮＫからダウンロードした。次いで、高危険度ＨＰＶ型のＬ１領域を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて比較し、相同性領域を確立した。その後、既知の高危険度型のＨＰＶの間で共通しているが、低危険度型のＨＰＶの間では共通していない相同性領域を選択した。これは、このように構築されたＰＮＡプローブはいずれも、高危険度型のＨＰＶに対して最大の特異性を示すが、低危険度型のＨＰＶに対しては最小の特異性を示すかまたは全く特異性を示さないことを裏付けた。次いで、選択された配列を、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムを用いて分析して、顕著な２次構造（例えば、ヘアピン）を形成する任意の配列を切り捨てた。
【００２３】
次いで、相同性領域を用いて、スクリーニングアッセイに有用なＰＮＡプローブを作製した。作製したこれらのプローブの例を、配列番号１〜５に示す。代表的に、これらのプローブは、溶液中にそのまま存在するために十分に短くあるべきである（すなわち、１８塩基または１９塩基未満）。これらのプローブを構築することにおいて、好ましくは、配列において１０塩基の任意のストレッチについて、プリンが６つ以下で存在すべきである。また、列を成す４〜５つのプリン、特に列を成す３つのグアニンは、好ましくは避けられるべきである。ＰＮＡプローブの好ましい長さは、８以上のユニットである。本発明はまた、目的の複数の株を検出するためのプローブとして、ＰＮＡと他の核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）との間のハイブリッドの使用を企図する。Ｕｈｌｍａｎｎの“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  （ＰＮＡ）  ａｎｄ  ＰＮＡ−ＤＮＡ  Ｃｈｉｍｅｒａｓ：Ｆｒｏｍ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｔｏｗａｒｄｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，３７９（８−９）：１０４５−５２（この開示を、本明細書中で参考として援用する）に記載されるように、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、本発明の方法において有用であり得る。
【００２４】
一旦、ＰＮＡプローブの配列を完成させると、プローブを、当業者に公知の方法に従って、合成し、精製し、そして標識し得る。例えば、このような方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７０２、Ｎｅｉｌｓｅｎ等による米国特許第５，５３９，０８２号、およびＧａｒｎｅｒによる米国特許第５，７３１，４１６号に開示されており、これらの全ては、本明細書中で参考として援用される。ＰＮＡプローブのこのような合成、標識化（例えば、ビオチンを用いて）および精製はまた、販売業者（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ））から手配し得る。
【００２５】
「分子標識（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）」プローブはまた、本発明の方法において、プローブと標的テンプレートとの間のハイブリダイゼーションの直接的な可視化のために用いてもよい。分子標識プローブは、Ｔｙａｇｉ等のＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１３３９９およびＴｙａｇｉ等のＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／３９００８に記載されており、これら両方ともが、本明細書中で参考として援用される。分子標識は、ステムループ（ｓｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ）構造を保有する一本鎖の核酸プローブである。ここで、この分子のループの部分は、標的核酸配列に相補的なプローブ配列である。このステムは、このプローブの配列のいずれかの末端にそれぞれ位置する、２つの相補的なアーム配列のアニーリングによって生じる。これらのアーム配列は、標的配列に関連せず（すなわち、相補的でない）、そして、各アームは、その末端で標識される。一方のアームに対して、蛍光部分が結合し（すなわち、５’末端のリン酸塩にて）、そして、他方に対して、非蛍光性消光化分子（すなわち、３’末端のヒドロキシル基にて）が結合する。その発生期において、この分子標識は、蛍光を発しない。これは、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）によって得られたエネルギーが、その消光剤に移動し、そして熱として分散する（蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）という出来事）ように、蛍光消光剤の対が選択されるからである。Ｔｍをわずかに超える温度で、分子標識のステム部分が展開され、そして標的鎖に対するこの分子のプローブ部分を露出する。一旦露出されると、この標識と標的とがハイブリダイズする。
【００２６】
ハイブリダイゼーションの際、分子標識は、標的と相互作用し、コンフォメーション変化を起こし、これによって、この標識のアーム配列が強制的に離れ、その結果、蛍光団と消光剤とが、お互いにかつそれぞれのもとの位置から物理的に離れる。蛍光団が消光化分子の近くにもはや存在しない限り、ＦＲＥＴは、もはや不可能であり、次いで、蛍光団は、励起された場合、適切な波長の検出可能な光を放つ。本発明に従うＰＮＡプローブが、分子標識分子（標的核酸に相補的なＰＮＡのループ部分を有する）として構築される場合、このプローブと標的テンプレートとの間のハイブリダイゼーションは、蛍光読み取り装置を用いて、「リアルタイム」または「終点」様式のいずれかにおいて、検出され得る。
【００２７】
本発明のＰＮＡプローブは、ＨＰＶ遺伝物質の任意の検出アッセイにおいて有用であるよう企図される。１つの実施形態において、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ溶液中に先に懸濁された頸部標本から単離されたサンプルＤＮＡは、コンセンサスプライマー（ＭＹ０９およびＭＹ１１）の対を用いるＰＣＲを用いて、最初にかつ必要に応じて、増幅される。これらのプライマーは、ＨＰＶ  ＤＮＡのＬ１領域の異なるセグメントに結合し、そして高危険度ＨＰＶ株および低危険度ＨＰＶ株の両方のＤＮＡを増幅する。次いで、増幅産物を、高危険度ＨＰＶ株のＤＮＡに特異的なビオチン標識化ＰＮＡプローブと接触させ、そしてハイブリダイズさせる。次いで、ハイブリダイズさせたＰＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を含む溶液を、アビジンコートしたマイクロタイタープレートに適用する。適切なインキュベーションおよび洗浄の後、他の核酸複合体からＰＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を区別し得る標識化抗体を、任意のハイブリダイゼーションの可視化のために用いる。このような抗体は、当該分野で公知であり、以下に記載される：例えば、Ｈａｎｓｅｎ等：“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＮＡ／ＤＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ
ｆｒｏｍ  ａ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７  ２０３（２）：１９９−２０７（本明細書中で参考として援用される）。この抗体は、以下が挙げられるがこれらに限定されない検出可能なマーカーを用いて標識され得る：放射性同位体、または熱量マーカー（例えば、ジゴキシゲニン）、発光マーカー、蛍光マーカーまたは酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）。このようなマーカーは、当該分野で公知である。さらに、一次抗体は、検出目的のために標識された二次抗体によって次に認識され得る。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、ビオチン標識ＤＮＡプローブ（例えば、ＡＬＵプローブ）を最初に用いて、アビジンコートしたマイクロタイタープレート上に全ての型のＨＰＶ  ＤＮＡをハイブリッドさせて捕捉する（ｈｙｂｒｉｄ−ｃａｐｔｕｒｅ）。適切なインキュベーションおよび洗浄後、ＰＮＡプローブを、ハイブリダイゼーションのためにプレートに添加する。ハイブリダイゼーションの検出を、先の段落で記載されるように、抗体を用いて実施し得る。
【００２９】
本発明はまた、本発明に従って作製されるプローブまたは保存溶液あるいはその両方を備えるキットを含み、そして、検出アッセイに必要とされる他の試薬を含み得る。例えば、キットは、頸部サンプルを取得するため、サンプルを保存するため、ならびにサンプルから遺伝物質を単離および精製するために、材料、機器、およびデバイスを備え得る。インビトロハイブリダイゼーションキットは、複数のプローブ（例えば、本発明に従って作製されたＰＮＡプローブおよびＡＬＵオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにハイブリダイゼーション反応に必要な他の試薬）を含み得る。これらのプローブのいずれかは、例えば、ビオチンまたは蛍光団で標識され得る。本発明に従って作製されたキットは、ヌクレオチド増幅反応のための酵素、プライマー（例えば、ＭＹ０９／ＭＹ１１）、緩衝液および他の試薬をさらに備え得る。インサイチュハイブリダイゼーションキットは、インサイチュハイブリダイゼーションにおいて利用されるスライド調製、シグナル増幅および他の技術に必要とされる、酵素、固定化溶液、緩衝液および他の試薬を備え得る。キットはまた、標的分子の標識化、検出および可視化のために必要とされる酵素、抗体、基質および他の試薬を備え得る。このようなキットはまた、さらなるＨＰＶのタイピングのために必要とされるプローブおよび試薬を備え得る。
【００３０】
本発明の別の局面において、方法および材料は、選択されていない改変体の増幅をブロックすることによって選択された核酸改変体の１つ以上を同定する生物学的サンプルの臨床アッセイのために提供される。好ましい実施形態において、疾患生物体の選択された株または改変体（例えば、細菌、酵母、他の微生物、またはウイルスの、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の１つ以上を検出するための方法が使用される。これらの方法は、疾患生物体の核酸を、その生物体のいくつかおよび好ましくは全ての株または改変体由来の核酸を増幅し得るコンセンサスプライマー（一方、このプライマーは、選択されていない株由来の核酸の増幅をブロックする）を用いて増幅する工程を包含する。増幅産物の存在は、選択された株の存在を示す。標識プローブは必要でない。目的の株に特徴的な配列とハイブリダイズするいかなるプローブも必要でない。好ましい実施形態において、ＰＣＲを用いて核酸を増幅し、そしてＰＮＡから作製されたブロッキングプローブを用いる。
【００３１】
好ましい実施形態において、婦人科学的細胞のサンプルを、子宮頸癌の高危険度を示すＨＰＶの株についてスクリーニングするために女性被験体から得る。このようなサンプルは、例えば、ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）保存溶液中に懸濁され得る。このサンプル由来のＤＮＡを、当業者に周知のキットおよび方法を用いて単離および精製する。
【００３２】
次いで、コンセンサスプライマーの対（ＭＹ０９およびＭＹ１１）は、図１に例示されるようにＰＣＲ反応のためのプライマーとして選択される。プライマーＭＹ０９およびＭＹ１１（配列番号１０および配列番号１１）は、ＨＰＶ  ＬＩコンセンサス領域の一部分に結合する。ＬＩコンセンサス領域は、ウイルスの組込みが細胞内で生じる場合はいつでも保持されるので、好ましい。しかし、ＨＰＶウイルスゲノムにおける他の領域（例えば、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ６およびＥ７オープンリーディングフレーム）はまた、増幅のための候補領域として有用である。ＨＰＶ特異的ＰＮＡブロッキングプローブは、公開されたＨＰＶ  ＤＮＡ配列（例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ提供）に基づいて構築される。本発明に従って、ＰＮＡを含むブロッキングプローブは、低危険度ＨＰＶ株のみのＬ１領域における一部（プライマーＭＹ０９およびＭＹ１１に対するハイブリダイゼーション部位間）に実質的に相補的であるよう設計される。次のＰＣＲは、高危険度株由来のＤＮＡのみを選択的に増幅する。なぜなら、低危険度株の指数関数的増幅は、ＰＮＡプローブによってブロックされるからである。低危険度株におけるブロックされる領域に至るまでのこれらのプライマーのハイブリダイゼーション部位間のセグメントは、指数関数様式よりもむしろ線形様式で複製され、このため、アンプリコンの検出可能な量を生じない。好ましい実施形態において、プローブは、プライマーハイブリダイゼーション部位に隣接する領域にハイブリダイズし、短縮された増幅産物さえ除去する。従って、本発明の方法において、増幅産物（すなわち、ベースラインレベルを超える多くの核酸）は、慣用的なＤＮＡ検出方法（例えば、エチジウムブロマイド染色、ＣＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ染色および他のＤＮＡ染色）によって検出可能である。アンプリコンの存在は、サンプル中に高危険度株が存在することを示す。このアンプリコンのサイズは、簡単なゲル電気泳動または他の方法によって決定され得、高危険度株の存在をさらに実証するために用いられる。逆に、増幅産物が存在しないことは、サンプル中に高危険度株を欠くことを示す。
【００３３】
複数のブロッキングプローブは、選択されていない株の異なるサブセット由来の核酸に対する特異性を用いて構築され得る。これらの複数のブロッキングプローブが、増幅反応において「カクテル」として用いられる場合、これらのプローブは共に、全ての選択されていない株の増幅をブロックする。従って、特に好ましい実施形態において、プローブは、いかなる高危険度株の増幅もブロックせず、できるだけ多数の低危険度ＨＰＶ株（例えば、１１型、１６型、および４２〜４４型）をブロックするよう構築される。さらに好ましい実施形態において、少なくとも１つのプローブは、増幅が企図される領域内で低危険度ＨＰＶ  ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって低危険度ＨＰＶ株全ての増幅をブロックする。増幅産物（これは、プライマーセット間の全長である）の次の検出は、サンプル中に高危険度株の存在することを示すが、一方、増幅産物が存在しないことは、高危険度株を欠くことを示す。
【００３４】
図２を参照すると、核酸アナログプローブは、少なくとも１つのプライマー対のハイブリダイゼーション部位と部分的にかまたは完全にハイブリダイズするよう構築される。好ましい実施形態において、プローブは、ＰＮＡ分子またはＰＮＡと別のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）との間のキメラから作製されている。配列特異的ハイブリダイゼーションを介した増幅をブロックするプローブの他の型もまた、用いられ得る。そして、このブロッキングプローブは、（図１または図２のいずれかに従って用いられる）は、先に記載されたように、分子標識となるよう構築され得る。分子標識ブロッキングプローブは、このブロッキングプローブと選択されていない株のテンプレートとの間のハイブリダイゼーションのリアルタイムの検出を可能にする。
【００３５】
ＤＮＡまたはＲＮＡと比較して、ＰＮＡは、実質的に相補的な核酸テンプレートに対してより高い親和性を有する。従って、ＰＮＡプローブが、ＤＮＡプライマーまたはＲＮＡプライマーと、ハイブリダイゼーション部位の一部または全てに対して競合する状況において、ＰＮＡプローブと核酸テンプレートとの間のハイブリダイゼーションが支持される。結果として、このプライマーセットのハイブリダイゼーション部位間の全長増幅は、阻害される。Ｂｕｃｈａｒｄｔらによる米国特許第５，８９１，６２５号を参照のこと（この全体の開示は、本明細書中で参考として援用される）。
【００３６】
図２に例示された実施形態において用いられるブロッキングプローブは、１つまたは複数（「カクテル」）ブロッキングプローブを含み得る。図１に関連した実施形態に記載されることに類似して、増幅産物の検出は、選択された株（例えば、ＨＰＶの高危険度株）の存在を示す。
【００３７】
（頸部切屑中のＨＰＶを検出するための例示的な方法）
（Ａ．ＰＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ）
本発明の方法を用いて、幾人かの女性患者由来の頸部切屑中のＨＰＶの存在についてスクリーニングする。切屑を、綿棒で集めることによって得て、そして１ｍｌあたり約２．０×１０５個の細胞の濃度でＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液を塗布してこの中に置く。細胞を含む溶液をボルテックスによって混合し、そして、Ｌａｐｉｄｕｓ等による米国特許第５，１４３，６２７号（参考として本明細書中で援用される）に記載されるように、このサンプルのアリコートを取得して、細胞学的分析のために「ＴｈｉｎＰｒｅｐ」スライドを作製する。特に、このスライド（ここに、サンプル細胞を均一に移す）を、ＴｈｉｎＰｒｅｐ
Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ２０００（登録商標）（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ）を用いて調製する。
【００３８】
サンプル溶液の第２のアリコートを、ＨＰＶ分析のために得る。Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）のＢｕｃｃａｌ  Ｓｗａｂ  ＤＮＡキットをＤＮＡ抽出のために用いる。ＭＹ０９／ＭＹ１１コンセンサスプライマー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を、ＰＣＲ増幅のために用いる。
【００３９】
ＰＣＲについて、１００ｎｇ（または、５μｌ）の標的ＤＮＡを混合し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５−ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ２、２２μＭのｄＮＴＰ、５０ｐｍｏｌｅのプライマー、５ｐｍｏｌｅのβ−グロビンプライマーＰＣ０４およびＧＨ２０、ならびに２．５ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｔｕｓ，Ｐ．Ｗ．Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）有する総容積５０μｌにする。β−グロビン遺伝子の増幅を、コントロールとして実施して、このサンプルがＰＣＲによるＨＰＶ検出にふさわしいかどうかを決定する。ＰＣＲパラメーターを、３５サイクル（９５℃−６０秒／５５℃−６０秒／７２℃−６０秒）に設定する。増幅産物を、エチジウムブロマイドで染色される１％のアガロースゲルでの反応混合物の５分の１の容積の電気泳動によって検出する。次いで、サンプルＤＮＡをゲルから抽出し、そしてインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ（以下に記載されるように）を用いてＨＰＶ状態を評価する。
【実施例】
【００４０】
（実施例）
（実施例１：ＰＮＡプローブの構築および試験）
いくつかの高危険度型のＨＰＶ  ＤＮＡに相補的なビオチン標識化ＰＮＡプローブを、作製した。ＰＮＡプローブ配列は、ＧＥＮＢＡＮＫデータベースからの情報を用いて設定したＭＹ０９／ＭＹ１１縮重プライマーによって増幅されたＬ１コンセンサス領域中に見出される相同性領域に基づいた。５つのＰＮＡ配列を、以下の配列番号１〜５として同定する。ビオチン標識化ＰＮＡ（１４〜１５塩基長）を、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）による使用説明書に従って合成した。
【００４１】
ＨＰＶに感染した婦人科学的サンプルを、メタノールベースのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）溶液（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）中で保存した。これらのサンプル由来のＤＮＡを、以下の工程をともなうＥｐｉｃｅｎｔｅｒのＢｕｃｃａｌ  ｓｗａｂ  ＤＮＡ抽出キット（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて単離して精製した：２ｍｌのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）懸濁液を、８，０００×ｇにて５分間、遠心分離することによってペレット化した。この上清を除去し、このペレットをＥｐｉｃｅｎｔｅｒのＤＮＡ抽出液中に再懸濁し、そして６０℃にて３０分間、９８℃にて１０分間インキュベートし、そして氷上で５分間、冷却した。抽出されたＤＮＡを含む得られた上清を、８，０００×ｇにて５分間の遠心分離によって回収した。
【００４２】
残りのＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標）細胞懸濁液のＨＰＶ  ＤＮＡ遺伝子型を、まず、２つの別々の方法によって決定した。第１のタイピング方法は、ＨＰＶコンセンサスプライマー（ＭＹ０９／ＭＹ１１）−ＨＰＶの増幅されたＬ１コンセンサス領域の、ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）分析であった。ＰＣＲ−ＲＦＬＰを、Ｌｕｎｇｏ等，”Ｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ＨＰＶ
ｂｙ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌ１  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ＲＦＬＰ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ，第１０巻，ｌ４５〜５２頁，１９９２（本明細書中で参考として援用される）によって記載された方法に従った標本で実施した。特に、精製したＤＮＡをＰ−３２標識化ＣＴＰ（および他の適切なＮＴＰ）の存在下で増幅し、次いで、このアンプリコンを、Ｐｓｔ  Ｉ、Ｒｓａ  Ｉ、およびＨａｅ  ＩＩＩを用いて同時に消化した。制限消化産物をポリアクリルアミドゲルで分析し、そしてＨＰＶ型サイズをＨＰＶ  ＤＮＡ標準物に基づいて割り当てた。検出を、Ｘ線フィルムに露光することによって達成した。ＰＣＲ−ＲＦＬＰに加えて、各ポジティブ標本を、市販のハイブリダイゼーションＨＰＶ  ＤＮＡタイピングキット（Ａｌｐｈａｇｅｎｉｃｓ  Ｄｉａｃｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｔｒｉｅｓｔｅ，Ｉｔａｌｙ）を製造業者の指示書に従って用いる第２の方法によってタイピングした。精製したサンプルＤＮＡを、まず、ＤＩＧ標識化ＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いて増幅した。このアンプリコンを、各型のＨＰＶ  ＤＮＡに対して特異的なビオチン標識化ＤＮＡプローブを用いて、続けてハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされた二重鎖を、アビジンコートしたマイクロタイタープレートに捕捉し、そしてＤＩＧ標識化核酸を認識する酵素結合抗体を用いて検出した。
【００４３】
サンプルＤＮＡの特定のアリコートを、これらの２つの方法によって独立してタイピングした後、このＤＮＡをＭＹ０９／ＭＹ１１プライマーを用いて増幅し、その後、構築したＰＮＡプローブとハイブリダイズさせた。種々の型のＨＰＶのＰＣＲ増幅したＤＮＡサンプルを、０．８％アガロースゲルの異なる列にロードし、そしてＰＡＧＥを行った。ＨＰＶ  Ｌ１コンセンサスアンプリコンのサイズおよび存在を、ＰＡＧＥサンプルのエチジウムブロマイド染色によって決定した。このゲル中のアンプリコンを、脱プリン化し、洗浄し、次いで室温にて変性させた。次いで、このゲルを、室温にて中和（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／１．５ＭのＮａＣｌ）させ、そしてこのＤＮＡを、毛細管拡散（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を介してアガロースゲルからナイロン膜（Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＰＡＬＬ）に一晩転写した。好首尾の転写を、処理したゲル上にエチジウムブロマイドのバンドが存在しないことから決定した。その後、このＤＮＡを８０℃にて３０分間加熱することによって膜に固定した。この膜を、２×ＳＳＣ中で再水和させ、そしてブロッキング溶液（１００ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ／５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／０．１％のＳＤＳ）を用いて６８℃にて３０分間、予めハイブリダイズさせた。続いてこの膜を、２０ｎＭの変性ビオチン標識化ＰＮＡプローブを用いて、６５℃にて一晩、ハイブリダイズさせた。
【００４４】
この膜をハイブリダイゼーション溶液から取り出して洗浄した後、ビオチン標識したＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの存在を、触媒としてホスファターゼ酵素に依存する化学発光基質アッセイによって確証した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ提供のＰｈｏｔｏｔｏｐｅ  Ｓｔａｒ検出キット）。最終的な検出を、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に対するサザンブロットの露光によって得た。
【００４５】
表１は、ＰＮＡプローブのいくつかについての試験結果を示す。＋の表示は、顕著なハイブリダイゼーションが、特定の配列番号（行）に従って構築したＰＮＡプローブと特定の型のＨＰＶ（列）との間で認められたことを示す。−の表示は、このような知見が認められなかったことを示す。この表中の空白の欄は、ハイブリダイゼーション反応を、規定のようにまだ行っていないことを示す。
【００４６】
【表１】
2008188019.tif 000002
ゲル電気泳動前の、標識化ＰＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションを通して、ＨＰＶの標的核酸の検出もまた試験した。ＰＣＲ増幅したＤＮＡ（１μｌ）を、変化させた希釈のハイブリダイゼーション緩衝液中にビオチン標識したＰＮＡプローブＩ（配列番号１）（２０ｐＭ）と混合した。アンプリコンをＰＮＡプローブ存在下で９５℃にて１０分間変性させ、迅速にアニーリングさせ、そしてＰＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を３％のアガロースゲル上で単離した。ＤＮＡの存在を、エチジウムブロマイド染色することによって決定し得る。この後、このＤＮＡを、変性させずに、毛細管拡散を介してナイロン膜に転写した。ナイロンへの定着を、先に記載したように実施した。ＤＮＡ：ＰＮＡ二重鎖を、先に記載したように、化学発光基質およびＸ線フィルムを用いて検出して可視化した。ハイブリダイゼーション緩衝液の１：１〜１：１０００の範囲の希釈において、顕著なハイブリダイゼーションは、プローブＩとＣａｓｋｉ細胞由来の１６型ＨＰＶ  ＤＮＡとの間で認められたが、同じプローブとＨｅｌａ細胞由来の１８型ＨＰＶ
ＤＮＡとの間では認められなかった。前もったゲルハイブリダイゼーションは、ゲル中での変性および緩慢なハイブリダイゼーションならびにストリンジェンシー洗浄の必要性を排除し、検出アッセイのための作業時間を短縮化し、相対的に少量のＰＮＡプローブを必要とし、そしてＰＣＲ産物に対して良好に作用する。
【００４７】
（実施例２：インサイチュハイブリダイゼーション）
（工程１：スライド調製）
ＴｈｉｎＰｒｅｐスライドに固定した細胞を、タンパク質分解酵素（すなわち、２×ＳＳＣ中の１０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ  ５００μｌ、または０．０５％〜０．１５％のペプシンを含有する０．２Ｎの塩酸溶液  ５００μｌ）を用いて、３７℃にて３０分間、消化する。次いで、これらのスライドを、２分間、２×ＳＳＣで洗浄し、エタノールで脱水し、そして風乾させた。１〜２０ｎＭのＰＮＡプローブを含有したハイブリダイゼーション混合物の１５〜２０μｌを各スライドに適用する。次いで、スライドを、ガラス製のカバーガラスでカバーし、封着する。
【００４８】
（工程２：ハイブリダイゼーション）
ＰＮＡプローブおよび標的ＤＮＡを、サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）内にスライドを置き、そして素早く移動してサーモサイクラーの温度を３分間８０℃に維持することによって、同時に変性させる。その後、内部の温度を３７℃まで急速に低下させ、そして１５分から２時間、このインキュベーションを続行させる。次に、これらのスライドをサーモサイクラーから取り出し、このカバーガラスをピンセットで取り外し、そしてスライドを、７５℃にて５分間、２×ＳＳＣで洗浄する。次いで、スライドを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水  ４０ｍｌを含むＣｏｐｌｉｎ瓶に２分間、移す。
【００４９】
（工程３：ハイブリダイゼーション後の洗浄およびＴＳＡ増幅）
インサイチュアッセイにおける増幅を、ＮＥＮの市販のＴＳＡ−Ｉｎｄｉｒｅｃｔキット（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｔ  Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いることによって実施し得る。Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎシステムは、“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ｔｒｙａｍｉｄｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ”，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １９９８；１１：１９−２３においてＳａｎｏ等によって記載される（本明細書中で参考として援用される）。基本工程を、以下の通り実施し得る：先の工程からの各スライドを、１００μｌのＴＮＢブロッキング緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、および０．５％のブロッキング試薬）とともに、湿潤チャンバー（ｈｕｍｉｄ  ｃｈａｍｂｅｒ）中で３０分間室温にてインキュベートする。プラスチック製のカバーガラスを、蒸発を減ずるためにスライドの上に使用する。各スライドは、１００μｌのストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ試薬（ＴＮＢブロッキング緩衝液中での１：１００の希釈）を受け、そして、その後、カバーガラスによってカバーしたまま、室温にて３０分間、インキュベートする。次に、スライドを、ＴＮＴ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｗｅｅｎを含有する０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で撹拌しながら、室温にて洗浄し、そして、各スライドに対して３００μｌのビオチン標識したチラミド（ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ｔｙｒａｍｉｄｅ）を添加する。室温にて３〜１０分間インキュベーション後、これらのスライドをＴＮＴ緩衝液でもう１回洗浄する。
【００５０】
（工程４：色素産生性検出）
約１００μｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（ＴＮＢ緩衝液中で１：１００の希釈）を、各スライドに添加する。スライドを、５〜１０分間室温にてカバーしたまま、湿潤チャンバー中でインキュベートし、次いで、各スライドをＴＮＴ緩衝液で洗浄する。ハイブリダイズしたＰＮＡプローブを、製造業者の指示書に従って、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ検出システムによって検出する。
【００５１】
（工程５：対比染色およびマウンティング（Ｍｏｕｎｔｉｎｇ））
スライドを、蒸留水で洗浄し、次いで、エオシンを用いて対比染色し、カバーガラスをつけて、マウントした。
【００５２】
（Ｂ．ＨＰＶ  ＤＮＡの選択的増幅におけるＰＮＡの使用）
「ＴｈｉｎＰｒｅｐ」スライドおよびサンプルＤＮＡを、Ａの部分に記載されるように、懸濁した頸部切屑標本から調製した。
【００５３】
ＧＥＮＢＡＮＫより利用可能なＨＰＶ株のＬ１コンセンサス領域のＤＮＡ配列を用いて、第２のアリコートから抽出したＤＮＡテンプレートの増幅の選択的ブロッキングにおいて有用なＰＮＡプローブを作製する。用いたＰＮＡプローブを、配列番号６〜８に示す。代表的に、これらのプローブは、溶液中に存在するために十分に短くあるべきである（すなわち、１９塩基未満）。これらのプローブを構築することにおいて、配列における１０塩基の任意のストレッチについて、プリンが約７つ未満で存在することが理想的である。
【００５４】
次いで、ＰＣＲ増幅反応を、ＭＹ−０９／ＭＹ−１１プライマーセット（配列番号１０および配列番号１１）またはその改変を用いてプローブの存在下または非存在下で、以下の条件下で実施する：９５℃にて５分間の開始変性工程、次いで、３５サイクルの９５℃−３０秒／５４℃−３０秒／７２℃−６０秒、７２℃にて２分間の最終伸長工程。他の熱サイクリング条件もまた、本願のために使用し得た（例えば、９５℃にて５分間の開始変性工程、次いで３５サイクルの９５℃−３０秒／４℃−６０秒／５５℃−３０秒／７２−６０秒、７２℃にて２分間の最終伸長）。さらなる代替工程は、４℃の工程に代わる２５℃のＰＮＡアニーリング温度、ならび４℃の工程を６０秒から３０秒に短縮することを含み得る。ＨＰＶ  ＬＩ領域を増幅しかつ配列決定するためのＭＹ０９およびＭＹ１１プライマーの使用は、Ｂａｕｅｒ等の“Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｔｕｄｅｎｔｓ  Ａｓ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ｂｙ  Ａ  ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ”，ＪＡＭＡ  １９９１；２６５：４７２−４７７により詳細に記載される（本明細書中で参考として援用される）。
【００５５】
ＰＣＲマスター混合物は、２０μｌの最終容積であり、そしてこれは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、１００ｎｍｏｌｅの各ＨＰＶ  Ｌ１コンセンサスプライマー、１．０ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ）および１００〜７５０ｎｇの精製した細胞のＤＮＡから構成される。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍと２８０ｎｍとの読み取り値の間の比を算出することによるＵＶ分光光度法によって決定する。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０は、核酸の純度の評価を提供する。最終ＰＮＡ濃度を、通常、１０μＭに定める。増幅産物を、エチジウムブロマイドで染色される２％のアガロースゲル上での反応混合物の４分の３の電気泳動によって検出し得る。
【００５６】
（実施例）
（実施例３：図１に図示される実施形態に従って構築されたＰＮＡプローブの試験）
２つのＰＮＡプローブ（ＶＩおよびＶＩＩ）（配列番号６〜７）を、図１に図示される実施形態に従って構築した。両方のＰＮＡプローブ（ＶＩおよびＶＩＩ）の配列は、低危険度ＨＰＶ株６および１１の相同的な部分に対して実質的に相補的である。両方のプローブは、プライマーセットＭＹ０９／ＭＹ１１に対する結合部位の間の部分に結合する。
【００５７】
既知のＨＰＶ株のＤＮＡ溶液を用いて、本発明に従って両方のプローブの選択的ブロッキング能を試験する。図３に示されるように、ＰＣＲアンプリコンは、ＨＰＶプローブのＶＩおよびＶＩＩのいずれを用いた場合でも、ＨＰＶ株１１のＤＮＡサンプル中で全く認められなかった。予測した長さのＰＣＲアンプリコンを、プローブＶＩまたはＶＩＩのいずれかの存在下で、ＨＰＶ株１６または１８のＤＮＡのエチジウムブロマイド染色によって検出した。これらの結果は、プローブＶＩおよびＶＩＩが、（それらが設計されたように）ＨＰＶ株１１（１６でも１８でもなく）の増幅をブロックし得たことを示した。
【００５８】
（実施例４：図２に図示された実施形態に従って構築されたＰＮＡプローブの試験）
改変されたコンセンサスプライマーＭＣ０１（配列番号９）を、ＭＹ０９との結合に用いられるように構築し、そして株１８を含む複数のＨＰＶ株を増幅し得た。ＰＮＡプローブＶＩＩＩ（配列番号８）を、２塩基対の改変を有するプライマーＭＣ０１の一部を含むよう設計した。このプローブは、ＨＰＶ株１８のＤＮＡに対して１００％相補的なプローブであり、かついかなる他の株に対しても相補的ではないプローブとなる。ＰＮＡプローブＶＩＩＩは、ＨＰＶ株１８のＤＮＡに結合するために改変されたコンセンサスプライマーＭＣ０１と競合すると予測された。
【００５９】
図４に示されるように、ＨＰＶ株１８のＤＮＡ溶液を用いて、ＨＰＶプローブＶＩＩＩを試験した。種々の濃度のＨＰＶプローブＶＩＩＩを用いた場合、ＰＣＲアンプリコンは全く認められなかった。予測された長さのＰＣＲアンプリコンを、ＰＮＡプローブＶＩＩＩの非存在下で、ＤＮＡサンプルのエチジウムブロマイド染色によって検出した。これらの結果は、プローブＩＩＩがＨＰＶ株１８の増幅と競合し、かつブロックし得たことを示した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
これらの図面は、必ずしも縮尺を意図するものではなく、本発明の原理を図示することに重点をおき、代わりに概して位置付けられる。
【図１】図１は、本発明の特定の方法の概略図を提供する。
【図２】図２は、本発明のさらなる方法の概略図を提供する。
【図３】図３は、図１によって図示される本発明の方法に従ってＰＮＡプローブを使用する選択的増幅を示す、エチジウムブロマイド染色ゲルである。
【図４】図４は、図２によって図示される本発明の方法に従って、ＰＮＡプローブによってブロックされるＤＮＡ増幅を示す、別のエチジウムブロマイド染色ゲルである。（配列表）
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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