(57)【要約】  【課題】  感度および特異性の双方が高い腫瘍マーカを提供する。  【解決手段】  本発明の腫瘍マーカは、下記（Ａ）の腫瘍マーカおよび下記（Ｂ）の腫瘍マーカの少なくとも一方を含む腫瘍マーカである。（Ａ）ヒト由来ＰＧＡＭ、抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体、ヒト由来ＰＧＡＭ遺伝子およびヒト由来ＰＧＡＭｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。（Ｂ）ヒト由来ＴＰＩ、抗ヒト由来ＴＰＩ抗体、ヒト由来ＴＰＩ遺伝子およびヒト由来ＴＰＩｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。例えば、組換えPGAM1を抗原として、被験者の血清中の自己抗体をＣＬＥＩＡ法により測定すれば、図１のグラフに示すように、高感度かつ高特異性で癌を判定できる。【選択図】  図１
2008026290.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）の腫瘍マーカおよび下記（Ｂ）の腫瘍マーカの少なくとも一方を含む腫瘍マーカ。
（Ａ）ヒト由来ＰＧＡＭ、抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体、ヒト由来ＰＧＡＭ遺伝子およびヒト由来ＰＧＡＭｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
（Ｂ）ヒト由来ＴＰＩ、抗ヒト由来ＴＰＩ抗体、ヒト由来ＴＰＩ遺伝子およびヒト由来ＴＰＩｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
【請求項２】
前記抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体および前記抗ヒト由来ＴＰＩ抗体が、ヒト血清中の自己抗体である請求項１記載の腫瘍マーカ。
【請求項３】
前記ヒト由来ＰＧＡＭが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来ＴＰＩが、ヒト由来TPI1である請求項１または２記載の腫瘍マーカ。
【請求項４】
膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のための腫瘍マーカである請求項１から３のいずれか一項に記載の腫瘍マーカ。
【請求項５】
血清ＥＬＩＳＡ法または血清ＣＬＥＩＡ法を用いた腫瘍診断キットであって、ヒト由来ＰＧＡＭおよびヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方の腫瘍特異的抗原と、前記腫瘍特異的抗原に対する自己抗体を認識する標識二次抗体とを含む腫瘍診断キット。
【請求項６】
前記ヒト由来ＰＧＡＭが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来ＴＰＩが、ヒト由来TPI1である請求項５記載の腫瘍診断キット。
【請求項７】
前記ヒト由来ＰＧＡＭおよび前記ヒト由来ＴＰＩが、組換タンパク質である請求項５または６に記載の腫瘍診断キット。
【請求項８】
膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のためのキットである請求項５から７のいずれか一項に記載の腫瘍診断キット。
【請求項９】
腫瘍マーカの測定方法であって、前記腫瘍マーカが、ヒト由来ＰＧＡＭおよびヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方のタンパク質に対するヒト血清中の自己抗体であり、前記ヒト由来ＰＧＡＭおよび前記ヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方のタンパク質に、前記タンパク質に対する前記自己抗体を結合させて複合体を形成させ、前記複合体を測定する腫瘍マーカの測定方法。
【請求項１０】
前記複合体の測定が、前記複合体の前記自己抗体に標識二次抗体を結合させ、前記二次抗体の前記標識を測定する方法である請求項９記載の腫瘍マーカの測定方法。
【請求項１１】
前記ヒト由来ＰＧＡＭが、ヒト由来PGAM1であり、前記ヒト由来ＴＰＩが、ヒト由来TPI1である請求項９または１０記載の腫瘍マーカの測定方法。
【請求項１２】
前記ヒト由来ＰＧＡＭおよび前記ヒト由来ＴＰＩが、組換えタンパク質である請求項９から１１のいずれか一項に記載の腫瘍マーカの測定方法。
【請求項１３】
前記腫瘍マーカが、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌からなる群から選択される少なくとも一つの癌の診断のための腫瘍マーカである請求項９から１２のいずれか一項に記載の腫瘍マーカの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍マーカ、腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の診断においては、Ｘ線による画像診断が従来から実施されてきたが、最近では、血清中の腫瘍マーカを利用した診断が多用されるようになってきた。腫瘍マーカとは、癌細胞が産生する物質、または癌細胞と反応して体内の正常細胞が産生する物質のなかで、それを血液、組織、排泄物中から検出することが、癌の診断または治療の目印として役立つものをいう。これまでに、種々の生体物質が腫瘍マーカとして有効であることが報告されている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。例えば、肝臓癌の腫瘍マーカとして、ＡＦＰおよびＰＩＶＫＡＩＩ等、膵癌の腫瘍マーカとして、ＣＡ１９−９等、前立腺癌の腫瘍マーカとして、ＰＳＡ等、扁平上皮癌の腫瘍マーカとして、ＳＣＣおよびＣＹＦＲＡ等が使用されている。これらの腫瘍マーカの測定は、診断対象患者から血清を採取し、前記血清中の前記腫瘍マーカの濃度を測定することにより実施され、その陽性および陰性が判断される。
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−２４０７７４号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２２（９）：２１８２〜２１９０，Ｏｃｔ．，１９８７
【非特許文献２】ＣＡＮＣＥＲ  Ｍａｒｃｈ  １，１９９９／Ｖｏｌ．８５／Ｎｏ．５／１０１８−１０２５
【非特許文献３】臨床病理  ５３：５・２００５，４３７−４４５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、従来の腫瘍マーカは、感度の点で問題があり、良性疾患等で偽陽性を示すことも少なくない。また、従来の腫瘍マーカは、早期癌を検出することが困難なもの（陰性を示すもの）もあった。このため、感度および特異性の高い腫瘍マーカの開発が望まれている。
【０００５】
そこで、本発明は、感度および特異性の高い新規な腫瘍マーカ、前記腫瘍マーカを利用した腫瘍診断キットおよび前記腫瘍マーカの測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の腫瘍マーカは、下記（Ａ）の腫瘍マーカおよび下記（Ｂ）の腫瘍マーカの少なくとも一方を含むことを特徴とする。
（Ａ）ヒト由来ＰＧＡＭ、抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体、ヒト由来ＰＧＡＭ遺伝子およびヒト由来ＰＧＡＭｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
（Ｂ）ヒト由来ＴＰＩ、抗ヒト由来ＴＰＩ抗体、ヒト由来ＴＰＩ遺伝子およびヒト由来ＴＰＩｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも一つを含む腫瘍マーカ。
【０００７】
本発明の腫瘍診断キットは、血清ＥＬＩＳＡ法または血清ＣＬＥＩＡ法を用いた腫瘍診断キットであって、ヒト由来ＰＧＡＭおよびヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方の腫瘍特異的抗原と、前記腫瘍特異的抗原に対する自己抗体を認識する標識二次抗体とを含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明の腫瘍マーカの測定方法は、前記腫瘍マーカが、ヒト由来ＰＧＡＭおよびヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方のタンパク質に対する血清中の自己抗体であり、前記ヒト由来ＰＧＡＭおよび前記ヒト由来ＴＰＩの少なくとも一方のタンパク質に、前記タンパク質に対する前記自己抗体を結合させて複合体を形成させ、前記複合体を測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明者等は、感度および特異性の高い新規な腫瘍マーカを得るために、一連の研究を重ねたところ、前記（Ａ）の腫瘍マーカおよび前記（Ｂ）の腫瘍マーカの少なくとも一方が、感度および特異性の高い腫瘍マーカとなり得ることを見出し、本発明に到達した。本発明の腫瘍マーカは、例えば、後述の実施例等に示すように、感度が高いため偽陽性率が低く、しかも特異性が高いため早期癌を高精度で検出することが可能である。また、本発明の腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法によれば、癌を高感度で特異的に測定することができ、高精度かつ早期診断が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、前記（Ａ）の腫瘍マーカおよび前記（Ｂ）の腫瘍マーカは、それぞれ単独で用いても良いし、二つを併用してもよく、併用することが好ましい。
【００１１】
ＰＧＡＭは、正式名称が、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｍｕｔａｓｅ）であり、解糖系の酵素である。また、ＴＰＩは、正式名称が、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｒｉｏｓｅ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）であり、解糖系の酵素である。
ＰＧＡＭには、下記に示すように３種類のアイソザイムがある。これらの中でも、Ｂ型（脳型）のＰＧＡＭが好ましく、より好ましくはＢ型のPGAM1である。
Ｍ型（ＭＭ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）：成人の骨格筋（一般に筋型）
Ｂ型（ＢＢ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）：脳、肝臓、腎臓（一般に脳型）
ＭＢ型（ＭＢ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）：心筋
ＴＰＩは、下記に示すように、２種類のアイソザイムが存在するが、ヒトでの報告はTPI1のみである。
１型（TPI1）：解糖系酵素
２型（TPI2）：機能不明
【００１２】
本発明において、ヒト由来ＰＧＡＭおよびヒト由来ＴＰＩは、天然（ヒト）から分離したタンパク質および遺伝子工学により作製された組換えタンパク質のいずれであってもよい。ヒト由来ＰＧＡＭとして好ましいのは、ヒト由来PGAM1であり、ヒト由来ＴＰＩとして好ましいのは、ヒト由来TPI1である。本発明の腫瘍マーカとして好ましいのは、抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体および抗ヒト由来ＴＰＩ抗体である。本発明の腫瘍マーカとして好ましい抗ヒト由来ＰＡＧＭ抗体は、抗ヒト由来PGAM1抗体であり、好ましい抗ヒト由来ＴＰＩ抗体は、抗ヒト由来TPI1抗体である。
【００１３】
ヒト由来PGAM1としては、例えば、下記の（Ａ１）若しくは（Ａ２）のタンパク質があげられる。下記（Ａ２）のタンパク質のアミノ酸配列は、下記（Ａ１）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。また、下記（Ａ２）のタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１２７残基、好ましくは、１〜５０残基、より好ましくは、１〜２５残基である。
（Ａ１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ａ２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトPGAM1としての機能を有するタンパク質。
【００１４】
ヒト由来TPI1としては、例えば、下記の（Ｂ１）若しくは（Ｂ２）のタンパク質があげられる。下記（Ｂ２）のタンパク質のアミノ酸配列は、下記（Ｂ１）のアミノ酸配列との相同性が、例えば、５０％以上であり、好ましくは８０％以上であり、より好ましくは９０％以上である。また、下記（Ｂ２）のタンパク質のアミノ酸配列において、置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸残基の数は、例えば、１〜１２４残基、好ましくは、１〜４９残基、より好ましくは、１〜２４残基である。
（Ｂ１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ２）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が置換、付加、挿入もしくは欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ヒトTPI1としての機能を有するタンパク質。
【００１５】
本発明の腫瘍マーカにおいて、前記抗ヒト由来ＰＧＡＭ抗体、前記抗ヒト由来PGAM1抗体、前記抗ヒト由来ＴＰＩ抗体および前記抗ヒト由来TPI1抗体は、ヒト血清中の自己抗体であることが好ましい。
【００１６】
前述のように、本発明の腫瘍マーカは、ヒト由来ＰＧＡＭ遺伝子、ヒト由来ＰＧＡＭのｍＲＮＡ、ヒト由来TPI遺伝子およびヒト由来TPIのｍＲＮＡの少なくとも一つであってもよく、これらは天然（ヒト）から分離されたものであってもよいし、遺伝子工学により作製された組換え遺伝子ないし組換えＲＮＡであってもよい。前記遺伝子の発現ないしｍＲＮＡの転写を指標にしても、腫瘍を検出できるからである。前述と同様に、前記遺伝子およびｍＲＮＡで好ましいのは、ヒト由来PGAM1遺伝子およびそのｍＲＮＡ，ヒト由来TPI1遺伝子およびそのｍＲＮＡである。ヒト由来PGAM1遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、前記（Ａ１）または（Ａ２）のタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡがあげられ、前記ヒト由来TPI1遺伝子およびそのｍＲＮＡとしては、例えば、前記（Ｂ１）または（Ｂ２）のタンパク質をコードする遺伝子およびｍＲＮＡがあげられる。本発明において、これらの遺伝子およびそれに対応するｍＲＮＡは、従来公知の方法で検出可能であり、例えば、検出プローブを用いた方法、特異的プライマーを用いた核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法）等により検出することができる。
【００１７】
本発明の腫瘍マーカ、腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法において、その対象となる腫瘍は、例えば、膵癌、肝臓癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、大腸癌、胃癌、乳癌および口腔癌であるが、これら以外の癌も対象となる。前記口腔癌は、口腔扁平上皮癌であることが好ましい。
【００１８】
本発明の腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法において、対象となるのは、ヒト血清中の自己抗体である。前記自己抗体は、例えば、血清ＥＬＩＳＡ法または血清ＣＬＥＩＡ法により測定する。また、本発明の腫瘍診断キットは、前記抗原タンパク質および前記二次抗体に加え、ＥＬＩＳＡ法またはＣＬＥＩＡ法に必要な各種試薬や器具を含んでいても良い。
【００１９】
本発明の腫瘍診断キットおよび腫瘍マーカの測定方法において、前記標識二次抗体は、例えば、酵素標識抗体、蛍光標識抗体、放射能標識抗体があるが、酵素標識抗体が好ましい。前記酵素標識抗体としては、例えば、パーオキシダーゼ標識ヒト由来抗体、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヒト由来抗体がある。前記ヒト由来抗体の種類は、特に制限されず、例えば、ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ等がある。
【００２０】
本発明の腫瘍マーカの測定方法において、前記複合体の測定方法は、例えば、前記複合体の前記自己抗体に標識二次抗体を結合させ、前記標識二次抗体の標識を測定する方法である。
【００２１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例によってなんら制限されない。
【実施例】
【００２２】
本実施例は、癌患者の血清中に、腫瘍マーカであるヒト由来PGAM1およびヒト由来TPI1のそれぞれに対する自己抗体が存在することを確認すると共に、組換えタンパク質であるヒト由来PGAM1およびヒト由来TPI1を用いて、被験者の血清中の前記自己抗体を腫瘍マーカとして、癌の判定を行った実施例である。なお、本実施例において、被険者の血清の採取は、本人の同意を得た上で行った。
【００２３】
（血清の調製）
血清は、５７例の悪性疾患患者（癌患者）、１４例の良性疾患患者、１７例の健常者より、全て同意を得た上で採血し、至適条件にて遠心分離した後、血清のみを採取し解析に用いた。癌患者（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）の内訳は、胃癌（Ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａ．）：７例、大腸癌（Ｃｏｌｏ−ｒｅｃｔａｌ  ｃａ．）：１７例（結腸癌：９例、直腸癌：８例）、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａ．）：７例、膵癌（Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａ．）：１３例、肝・胆道系癌（Ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａ．  ＆  ＨＣＣ）：３例（肝細胞癌：１例、胆管癌：２例）、口腔扁平上皮癌（ＯＣ．ＳＣＣ）：１０例であり、男女比２９（男）：２８（女）、平均年齢６８．５歳（３８〜８５歳）である。良性疾患患者（ｂｅｎｉｇｎ）の内訳は、慢性膵炎：１例、胆石症：４例、口腔良性疾患：９例であり、男女比６（男）：８（女）、平均年齢５４．４歳（２４〜７０歳）である。健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）は、男女比１１（男）：６（女）、平均年齢４６．９歳（２３〜８０歳）である。なお、自己抗体の存在を確認するために用いたのは、前記悪性疾患患者（癌患者：５７例）である。また、癌患者は、初発または再発を問わない。
【００２４】
（細胞株）
細胞株として、ヒト膵臓癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ  ＩＩを用いた。ヒト膵癌細胞株ＭＩＡＰａＣａ  ＩＩを、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ  ｍｅｄｉｕｍ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、５％ＣＯ２インキュベータにて培養した。
【００２５】
（１）  癌患者血清中の癌特異的自己抗体の存在の確認
【００２６】
（電気泳動用サンプル調製）
培養したヒトＭＩＡＰａＣａ  ＩＩ細胞を回収し、可溶化バッファー（８Ｍ  Ｕｒｅａ、４％ＣＨＡＰＳ、６０ｍＭ  ＤＴＴ、２％ＩＰＧ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＩ：３−１０）、０．００２％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）と混和し、超音波破砕処理をした後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ／４℃／１２ｍｉｎ）し、上清を泳動用サンプルとした。また、リン酸化を促進させタンパク質の抗原性を高めたモデルでは、培養液中にＰＭＡ（Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３−ａｃｅｔａｔｅ）を加え一晩培養し、その後同様の条件でサンプル調製した。
【００２７】
（２次元電気泳動およびゲルの染色）
まず、固定化ｐＨ勾配ゲル（商品名：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ，７ｃｍ，ｐＨ３−１０／Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用し、等電点電気泳動を行った（商品名：Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＩ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。次に、２次元目にポリアクリルアミドゲル（１０％  Ｒｅａｌ  Ｇｅｌ  ｐｌａｔｅ  ／  ＢＩＯ  ＣＲＡＦＴ社）を使用しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルはＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）にて染色した。
【００２８】
（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
２次元電気泳動後のゲル上のタンパク質をＳｅｍｉ−ｄｒｙ  ｂｌｏｔｔｅｒを用いて電気的にＰＶＤＦ（ｐｏｌｙ  ｖｉｎｉｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ）膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写した。転写したＰＶＤＦ膜をブロッキングバッファー（５％  ｎｏｎｆａｔ  ｍｉｌｋ−ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ）を用いて室温１時間インキュベートした後、１次抗体として癌患者のヒト血清（１０００倍希釈／５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ）を室温１時間反応させ、その後洗浄した。次に２次抗体として５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎにて１００００倍希釈したパーオキシダーゼ標識ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ社）を室温１時間反応させ、その後洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて化学発光させ、Ｘ線フィルムに露光させた。
【００２９】
（２）  癌特異的自己抗体認識抗原タンパク質の同定
【００３０】
（抗原タンパク質（ＰＧＡＭ）の決定）
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにて観察される癌患者血清と反応を示すバンドと、ＣＢＢ染色した２次元電気泳動ゲルを比較し、一致するタンパク質スポットをゲルより切り出した。そして、下記の条件により、ゲルの染色液の脱色、ゲルの脱水、ゲル内消化およびペプチド抽出の一連の操作を行い、ペプチドの質量解析を行った。その結果、前記癌患者血清と特異的に反応したタンパク質として、ＰＧＡＭ（PGAM1）が同定された。この質量解析の結果を図１３に示す。
【００３１】
染色液の脱色：５０％ＡＣＮ／２５ｍＭ  ＮＨ４  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ溶液１００μＬを使用し、１５分間適宜震盪した。この操作を３回繰り返し施行した。
【００３２】
ゲルの脱水：ゲルを１００％ＡＣＮ溶液３０μＬに５分間浸し、溶液を除去した後、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃにて約１５分間乾燥させ完全脱水を行った。
【００３３】
ゲル内消化：脱水乾燥したゲルに、凍結保存してあるトリプシン溶液（１０μｇ／ｍＬ  Ｔｒｙｐｓｉｎ／５０ｍＭ  ＮＨ４  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０μＬを入れ、３７℃にて一晩インキュベートして酵素処理を行った。
【００３４】
ペプチド抽出：酵素処理後のゲルに７５μＬの抽出液（５０％ＡＣＮ／５％ＴＦＡ）を添加し、ゲル内のペプチドを抽出した（１時間震盪）。抽出液をＳｐｅｅｄ  Ｖａｃで５〜１０μＬまで濃縮し、商品名ＺｉｐＴｉｐ  Ｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮抽出液の脱塩と同時にペプチドを回収し、質量解析用マトリックス溶液に溶出して解析用試料とした。
【００３５】
解析：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量解析装置（商品名Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ  Ｐｒｏ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し質量解析をし、そのデータを元にＰｅｐｔｉｄｅ  ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ法（検索サイト：ＭＳ  Ｆｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／）、検索ｄａｔｅ  ｂａｓｅ  ：  ＮＣＢＩ）にてタンパク質を同定した。
【００３６】
（３）  癌の判定
【００３７】
（遺伝子クローニングおよび組換えタンパク質の作製）
ヒトＭＩＡＰａＣａ  ＩＩ培養細胞株よりＲＮＡを抽出し、商品名ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。特異的プライマーを用いＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法にて目的ＤＮＡを増幅して回収した。このＤＮＡをタンパク発現用ベクター（ｐＧＥＸ  ６ｐ２  ｖｅｃｔｏｒあるいはｐＭＡＬ  ｃ２  ｖｅｃｔｏｒ）に組み込み、大腸菌発現系（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ：ＢＬ２１）を用いて融合タンパク質を発現させた。組換えＰＧＡＭ１はアフィニティーゲル（Ａｍｙｌｏｓｅ  Ｒｅｓｉｎ）にて精製し、融合タンパク質ＭＢＰ−ＰＧＡＭ１として溶出し回収した。組換えＴＰＩ１はアフィニティーゲル（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ｇｅｌ）にて精製し融合タンパク質ＧＳＴ−ＴＰＩ１として回収した後、２％Ｐｒｅｓｃｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてＧＳＴ部を切断分離し、遠心分離（２５００ｒｐｍ／ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐ．／５ｍｉｎ）後の上清をＴＰＩ１として回収した。前記両組換えタンパク質は、いずれも１０％ＰＢＳに対して透析をした後、組換えタンパク質溶液として回収した。得られた抗原タンパク質は、ＭＢＰ−PGAM1およびTPI1である。なお、前記ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の操作および条件は、下記のとおりである。
【００３８】
（ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ法の操作および条件）
PGAM1およびTPI1のクローニングは、データベースよりそれぞれのタンパク質の全長ｃＤＮＡ配列を検索し、ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅを基に配列を設計し、これに基づきカスタムプライマーを購入（Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ社）し、使用した。プライマーの配列を下記に示す。括弧内はアニーリング温度を示す。反応液のＤＮＡポリメラーゼは、商品名ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ  ｂｉｏ  社）を使用し、下記に示すＷＦ／ＷＢ  ｐｒｉｍｅｒを使用して１回目のＰＣＲを行った後、そのＰＣＲ産物をテンプレートとし、下記に示すアダプターをつけたｎｅｓｔｅｄ  ｐｒｉｍｅｒを用いて２回目のＰＣＲを行い、全長のＰＧＡＭ１およびＴＰＩ１をクローニングした。ＰＣＲのプログラムは、９４℃×１０ｓｅｃ、アニーリング（下記の括弧内の温度）×１５ｓｅｃおよび７２℃×１２０ｓｅｃの一連のサイクルを３５サイクル行い、反応後は、４℃で保存した。
【００３９】
（PGAM1：１回目ＰＣＲプライマー）
ＷＦ：５’−aatctgctaatcccagtcggtgcc−３’（配列番号３）
ＷＢ：５’−actcgcaaaaacccaagtcactac−３’（配列番号４）
（５７℃）
【００４０】
（PGAM1：２回目ＰＣＲプライマー）
Ｆ−ＢａｍＨ１：５’−cgcggatccatggccgcctacaaactg−３’（配列番号５）
Ｂ−ＥｃｏＲ１：５’−ccggaattctcacttcttggccttgcc−３’（配列番号６）
（６５℃）
【００４１】
（TPI1：１回目ＰＣＲプライマー）
ＷＦ：５’−caagaagggggaacgtcgg−３’（配列番号７）
ＷＢ：５’−atatgcagggaaagggcagttac−３’（配列番号８）
（５７℃）
【００４２】
（TPI1：２回目ＰＣＲプライマー）
Ｆ−ＢａｍＨ１：５’−cgcggatccatggcgccctccagg−３’（配列番号９）
Ｂ−Ｘｈｏ１：５’−ccctcgagtcattgtttggcattg−３’（配列番号１０）
（５７℃）
【００４３】
（患者血清中の癌特異的自己抗体のスクリーニング）
精製組換えタンパク質をＣａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（０．２Ｍ  ，  ｐＨ：９．５）を用いて濃度調整し、９６穴プレートに１００ｎｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌにて固相化（４℃  ，  ｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔ）した。
【００４４】
ヒト抗TPI1抗体の測定は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法にて行った。サンプル血清は、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎにて１０００倍に希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間室温で静置し、その後洗浄した。検出抗体は、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（ＨＲＰ）を用い０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎにて４０００倍希釈液をつくり、この希釈液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間室温静置し、その後洗浄した。ＴＭＢ（３，３’５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ  Ｂｅｎｚｉｄｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ／ＳＩＧＭＡ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、３０分室温静置の後、１０％Ｈ２ＳＯ４を５０μＬ／ｗｅｌｌ加え反応を停止させた。そして、各ｗｅｌｌについて、４５０ｎｍ／６２０ｎｍにて吸光度を測定した。
【００４５】
ヒト抗PGAM1抗体の測定は、ＣＬＥＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法にて行った。サンプル血清は、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎにて１０００倍に希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間室温静置し、その後洗浄した。検出抗体は、ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＡ  （ＨＲＰ）を用い０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ−０．０１％Ｔｗｅｅｎにて１０００倍希釈液をつくり、５０μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１時間室温静置し、その後洗浄した。ついで、発光基質（ＥＣＬ）を、５０μｌ／ｗｅｌｌ加え、１５分室温静置の後、ルミノメーターにて化学発光を測定した。
【００４６】
（結果１）
ＭＢＰ−PGAM1を用いたＣＬＥＩＡの結果を、図１から図５に示す。
【００４７】
図１は、全癌患者（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）、全良性疾患者（ｂｅｎｉｇｎ）および健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示すグラフと表である。図２は、癌の種類別にＣＬＥＩＡの結果を示したグラフである。図３は、癌の種類別に陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）および陽性率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅ（％））を示す表である。図１から図３では、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の判断の閾値（Ｃｕｔ  ｏｆｆ）を、健常者の平均値に標準偏差の２倍の値を足した値（ｃｏｎｔ．ｍｅａｎ＋２ＳＤ）にしたものである。この閾値を「第１の閾値」という。図１のグラフと表に示すように、全ての癌と、良性疾患および健常者とを高い確率で判別することができた。また、図２および図３に示すように、６種類の癌において、各癌と、良性疾患および健常者を高い確率で区別することができた。また、図３の表に示すように、膵臓癌、大腸癌、胃癌および肝・胆道系癌を合わせると、さらに陽性率が７０％に上昇した。図４は、癌の種類別にＣＬＥＩＡの結果を示したグラフである。図５は、癌の種類別に陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）および陽性率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅ（％））を示す表である。図４および図５では、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の判断の閾値（Ｃｕｔ  ｏｆｆ）を、健常者の平均値に標準偏差値を足した値（ｃｏｎｔ．ｍｅａｎ＋ＳＤ）にしたものである。この閾値を「第２の閾値」という。図４および図５に示すように、６種類の癌において、癌と、良性疾患および健常者を高い確率で区別することができた。また、図５の表に示すように、膵臓癌、大腸癌、胃癌および肝・胆道系癌を合わせると、さらに陽性率が７５％に上昇した。なお、図１、図２および図４のグラフの縦軸の「Ａ．Ｕ」．は、「ａｒｂｉｔｒａｒｙ  ｕｎｉｔ」を意味する。
【００４８】
（結果２）
TPI1を用いたＣＬＥＩＡの結果を、図６から図１０に示す。
【００４９】
図６は、全癌患者（ｍａｌｉｇｎａｎｔ）、全良性疾患者（ｂｅｎｉｇｎ）および健常者（ｃｏｎｔｒｏｌ）の結果を示すグラフと表である。図７は、癌の種類別にＣＬＥＩＡの結果を示したグラフである。図８は、癌の種類別に陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）および陽性率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅ（％））を示す表である。図６から図８では、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の判断の閾値（Ｃｕｔ  ｏｆｆ）を、前記第１の閾値（ｃｏｎｔ．ｍｅａｎ＋２ＳＤ）にしたものである。図６のグラフと表に示すように、全ての癌と、良性疾患および健常者とを、高い確率で判別することができた。また、図７および図８に示すように、６種類の癌において、各癌と、良性疾患および健常者を高い確率で区別することができた。図９は、癌の種類別にＣＬＥＩＡの結果を示したグラフである。図１０は、癌の種類別に陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）および陽性率（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒａｔｅ（％））を示す表である。図９および図１０では、陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）の判断の閾値（Ｃｕｔ  ｏｆｆ）を、前記第２の閾値（ｃｏｎｔ．ｍｅａｎ＋ＳＤ）にしたものである。図９および図１０に示すように、６種類の癌において、各癌と、良性疾患および健常者を高い確率で区別することができた。
【００５０】
（従来の腫瘍マーカとの比較）
図１１および図１２に従来の腫瘍マーカ（ＣＡ１９−９、ＣＥＡ）による癌の判別と本実施例による癌の判別を示す。ＣＡ１９−９は、膵癌、胆道癌等の各種消化器癌で上昇する腫瘍マーカであり、単位は、「Ｕ／ｍｌ」であり、閾値（ｃｕｔ  ｏｆｆ  値）は３７Ｕ／ｍｌである。ＣＥＡは、消化器癌、乳癌、肺癌等で上昇する腫瘍マーカであり、単位は、「ｎｇ／ｍｌ」であり、閾値（ｃｕｔ  ｏｆｆ  値）は５．０ｎｇ／ｍｌである。これら従来の腫瘍マーカでは、いずれも、血清中の前記マーカのタンパク質濃度が測定される。図１１は、腫瘍マーカ「ＣＡ１９−９」の病期別の判別の表と、本実施例のPGAM1およびTPI1の癌の判別の表とを示す。同図において、閾値は、前記第１の閾値および第２の閾値の双方を示す。同図に示すように、本実施例の前記二つ腫瘍マーカは、従来の腫瘍マーカ「ＣＡ１９−９」と同等以上の確率で各種癌を判別できたことが分かる。図１２は、膵臓癌の１３例において、従来の腫瘍マーカである「ＣＡ１９−９」と「ＣＥＡ」と、本実施例のPGAM1とTPI1との癌の判別を示す表である。同図において、「ｐａｔｉｅｎ」は癌患者を示し、癌患者１３名ごとに、前記各種マーカのスコアを示している。同図に示すように、「ＣＡ１９−９」の陽性率は、９２．３％であり、「ＣＥＡ」の陽性率は３３．３％であった。これに対し、本実施例の２つの腫瘍マーカであるPGAM1とTPI1を合わせた陽性率は、１００％であり、癌を完全に判別できた。なお、図１１および図１２の従来の腫瘍マーカの判別データは、「臨床検査ガイドライン  ２００５／２００６」（日本臨床検査医学会）による。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の腫瘍マーカは、感度および特異性の双方が高く、早期癌であっても高精度に検出できる。したがって、本発明の腫瘍マーカは、癌の診断、評価等に好ましく使用することができ、臨床分野、学術研究分野および治療薬や治療方法の研究開発の分野の全ての分野に広く用いることができ、その用途は制限されない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本発明の一実施例における癌の判定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、前記実施例における各癌の判定結果を示すグラフである。
【図３】図３は、前記実施例における各癌の判定結果を示す表である。
【図４】図４は、前記実施例における各癌のその他の判定結果を示すグラフである。
【図５】図５は、前記実施例における各癌のその他の判定結果を示す表である。
【図６】図６は、本発明のその他の実施例における癌の判定結果を示すグラフである。
【図７】図７は、前記実施例における各癌の判定結果を示すグラフである。
【図８】図８は、前記実施例における各癌の判定結果を示す表である。
【図９】図９は、前記実施例における各癌のその他の判定結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、前記実施例における各癌のその他の判定結果を示す表である。
【図１１】図１１は、本発明の腫瘍マーカと従来のマーカの癌の判定の比較の一例を示す表である。
【図１２】図１２は、本発明の腫瘍マーカと従来のマーカの癌の判定の比較のその他の例を示す表である。
【図１３】図１３は、本発明のさらにその他の実施例における質量解析の結果を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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