(57)【要約】【課題】特異的に、簡便に、迅速に、かつ、高感度にグアニル酸シクラーゼを検出する方法を提供すること。さらに、生理的環境に近い温和な条件下において、グアニル酸シクラーゼ活性測定による一酸化窒素を特異的に検出する方法、一酸化窒素合成酵素の活性測定する方法を提供すること。【解決手段】ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ等を含む生物発光試薬を用いて、グアニル酸シクラーゼによって生成するピロリン酸を測定することにより、簡便、迅速かつ高感度にグアニル酸シクラーゼ活性を測定する。さらに、そのグアニル酸シクラーゼ活性を測定する方法を用いて、一酸化窒素を検出し、一酸化窒素合成酵素の活性測定を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むグアニル酸シクラーゼ活性の測定法。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを発光法若しくは発色法により測定するステップ
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むグアニル酸シクラーゼ活性の測定法。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
【請求項３】
請求項１又は２記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素の検出方法。
【請求項４】
請求項１又は２記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素合成酵素の活性測定方法。
【請求項５】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを発光法若しくは発色法により測定するステップ
【請求項６】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ）を用いた試料中のグアニル酸シクラーゼ活性を簡便、迅速、かつ、高感度に検出する方法を提供することである。さらに、一酸化窒素（ＮＯ）を特異的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グアニル酸シクラーゼは、生体内においてシグナル伝達に関与する重要な酵素で、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）からセカンドメッセンジャーの一種であるサイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）とピロリン酸を生成する。グアニル酸シクラーゼには、心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体によって活性化されるもの（膜結合型グアニル酸シクラーゼ）や、ＮＯによって活性化されるもの（可溶型グアニル酸シクラーゼ）が知られている。
【０００３】
また、グアニル酸シクラーゼに関連する医薬品等も多数開発されており、グアニル酸シクラーゼの活性促進剤、活性抑制剤等の研究が盛んに進められている。グアニル酸シクラーゼの活性を簡便で迅速に測定することは、細胞刺激物質に対する各種細胞の応答を調べる上で非常に重要であり、医学、薬学、バイオ研究、医薬品開発等の分野において大きな意味を持つ。
【０００４】
従来、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するには、ｃＧＭＰに特異的な抗体を用いて、ｃＧＭＰの生成量を測定するラジオイムノアッセイ法やエンザイムイムノアッセイ法等が一般的に用いられている。しかし、いずれも標識したｃＧＭＰを競合的に反応させるアッセイ方法であるため、精度が悪く、微細な変化をとらえるのが困難である。また、作業も煩雑であるため、多大な時間と作業者の熟練を要する等の欠点がある。さらにラジオイムノアッセイ法では放射性物質を用いるため、作業者が被爆するおそれもあり、特別な施設も必要となる。
【０００５】
グアニル酸シクラーゼによってＧＴＰから生成されるピロリン酸を検出することにより、グアニル酸シクラーゼ活性を測定する方法として、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．１）を用いる発光測定方法（例えば、特許文献１参照）が知られている。このほか、グアニル酸シクラーゼ活性に用いられた例はないが、簡便にピロリン酸を測定する方法としては、ＡＴＰスルフリラーゼ（ＥＣ  ２．７．７．４）を用いる方法（例えば、非特許文献１参照）が知られている。
ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼやＡＴＰスルフリラーゼを用いる方法では、連続的に測定を行った場合、ＡＭＰが蓄積されるに従い、発光量が減少していくため、定量性に問題がある。また、ＡＴＰスルフリラーゼを用いる方法では、ＡＴＰスルフリラーゼの基質であるアデニロホスホスルフェート（ＡＰＳ）がＡＴＰに構造が類似しているため、ルシフェラーゼに対しても基質となり、発光反応が起こる。このため、バックグラウンド発光量が高くなり、感度が悪いという問題点がある。
【０００６】
可溶型グアニル酸シクラーゼを活性化することが知られているＮＯは、生体内ではＮＯ生成酵素（ＮＯＳ）によってアルギニンと酸素とから合成され、生体内生理活性物質として重要な機能を有している。
例えば、血管内皮細胞は、ＮＯをシグナルとして周囲の平滑筋を弛緩させ、それにより動脈を拡張させて血流量を増大させる。このＮＯが有する生理活性作用を利用し、心臓の冠動脈を拡張させることにより血液供給を増大させる目的で、ニトログリセリン、亜硝酸アミル、一硝酸イソソルビド等の亜硝酸誘導体が心臓病の治療に用いられる。さらには、この生理活性作用を利用した発毛剤や勃起不全治療薬も開発されている。
【０００７】
免疫に関与する細胞の一種であるマクロファージは、病原体を殺傷するためにＮＯを産生する。逆に、敗血症では、マクロファージがＮＯを大量に産生し、それによる血管拡張が敗血症における低血圧症の主因になると考えられている。
また、ＮＯは、生体内の神経伝達物質としても働く。シナプス間隙のみで働く多くの神経伝達物質と異なり、ＮＯは広い範囲に拡散して直接接していない周辺の神経細胞にも影響を与える。このメカニズムは記憶形成にも関与すると考えられている。
すなわち、これらのＮＯ産生の活性促進剤、活性阻害剤等を高感度、かつ、簡便で迅速に測定することは、医学、薬学、バイオ研究、医薬品開発、化学安全性評価等の分野において非常に大きな意味を持つ。
【０００８】
ＮＯ量を測定する方法としては、電子スピン共鳴法、オゾン化学発光法、Ｇｒｉｅｓｓ法及び蛍光法が一般的に使用されている。電子スピン共鳴法は感度が悪く、オゾン化学発光法は気相に限られるという欠点がある。また、Ｇｒｉｅｓｓ法は、ＮＯが酸化するときに生じるＮＯ２−によるジアゾニウム塩化合物とナフチレンジアミンのアゾカップリングを利用して、ＮＯ量を間接的に検出する方法であり、ＮＯ量を直接的に測定する方法ではなく、生成している物質がＮＯ由来であるか又はＮＯ２−由来であるかを区別することができないという問題点を有している。
【０００９】
蛍光法としては、ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）やジアミノフルオレセイン（ＤＡＦ）などの蛍光色素を用いる方法が使用されているが、ともにＮＯが酸化された物質を検出しており、やはり直接的にＮＯ量を測定しているとは言えない。
また、ＤＡＮやＤＡＦは、両者ともに蛍光色素であるため励起光を必要とするため、励起光を必要としない化学発光、生物発光に比べて、検出装置が大型で、複雑で、かつ、高価になる等の問題点もある。
【００１０】
ＮＯは、短寿命の不安定ラジカル種であり、細胞から放出されるとすぐに二酸化窒素に変化してしまうため、上記のＧｒｉｅｓｓ法や蛍光法では、生体内で有効に作用しているＮＯ量を正確に測定することは困難である。特に、虚血剤開発等のようにＮＯ生成を促進させる化学物質をスクリーニングする場合には、生体内で有効に作用しているＮＯ量を直接的に測定できる特異性の高いＮＯ量の測定方法が求められている。
さらに、ＮＯ量の測定は、生理的環境に近い温和な条件下で検出できることが望ましいが、上記のＧｒｉｅｓｓ法や蛍光法では、生理的条件下での検出が困難である。
【００１１】
ＮＯ生成酵素（ＮＯＳ）は、Ｌ−アルギニンと酸素を基質とし、ＮＡＤＰＨ、ＦＭＮ、ＦＡＤ、テトラヒドロビオプテリンを補酵素として、Ｌ−シトルリンとＮＯの生成を触媒する酵素である。ＮＯＳ活性は、慢性閉塞性肺疾患や動脈硬化などの疾患に関係しているといわれている。ＮＯＳには、酵素学的にもタンパク質分子としても異なる３種類のアイソフォームが存在し、それぞれ誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）、血管内皮型ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）、神経型ＮＯ合成酵素（ｎＮＯＳ）と呼ばれている。
ＮＯＳ活性を測定する方法として、ＮＯの生成を測定する他に、Ｌ−[ｇｕａｎｉｄｉｎｏ−１４Ｃ]ａｒｇｉｎｉｎｅを基質として用いて、Ｌ−[ｇｕａｎｉｄｉｎｏ−１４Ｃ]ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅの放射能を測定する方法が知られている。この方法は、高感度ではあるが、放射性物質を使用する方法であり、作業者が被爆するおそれがあり、特別な施設を必要とするばかりでなく、ａｒｇｉｎａｓｅによって同じ物質ができるため注意が必要である。
また、グアニル酸シクラーゼ活性測定に基づくＮＯＳの活性測定も報告されているが（例えば、特許文献２参照）、ｃＧＭＰの検出に基づく方法であり、精度が悪く、煩雑で、感度が悪い等の問題がある。
【００１２】
【特許文献１】特表２００３−５０９６０１号公報
【特許文献２】特表２００７−５１２０１１号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５年  １５１巻（２）、  ｐ５０４-５０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、特異的に、簡便に、迅速に、かつ、高感度にグアニル酸シクラーゼを検出する方法を提供することである。さらに、当該グアニル酸シクラーゼ活性測定によるＮＯを検出する方法、ＮＯＳ活性を測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、このような課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ＰＰＤＫを含む試薬を用いて、グアニル酸シクラーゼによって生成するピロリン酸を測定することにより、特異的に、簡便に、迅速に、かつ、高感度にグアニル酸シクラーゼ活性を測定することが可能であることを見出した。さらに、当該グアニル酸シクラーゼ活性を測定する方法を用いて、ＮＯを検出すること、ＮＯＳ活性を測定することにより上記課題を解決しうることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
【００１５】
（１）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むグアニル酸シクラーゼ活性の測定法。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを発光法若しくは発色法により測定するステップ
（２）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むグアニル酸シクラーゼ活性の測定法。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
（３）上記（１）又は（２）記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素の検出方法。
（４）上記（１）又は（２）記載のグアニル酸シクラーゼ活性測定法を用いた、一酸化窒素合成酵素の活性測定方法。
（５）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを発光法若しくは発色法により測定するステップ
（６）以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップを含むことを特徴とする、グアニル酸シクラーゼ活性を測定するためのキット。
（ｉ）グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを、ルシフェラーゼの触媒活性の下で、ルシフェリンと反応させることによって発生するする発光量を測定するステップ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）グアニル酸シクラーゼの活性測定ステップ
グアニル酸シクラーゼの活性測定には、原理的に以下の３つのステップが含まれる。
（ｉ）  ピロリン酸を生成させるステップ
具体的には、グアニル酸シクラーゼを含む試料とＧＴＰとを反応させ、試料中に含まれるグアニル酸シクラーゼによってＧＴＰを変換してｃＧＭＰとピロリン酸を生成させるステップ
（ｉｉ）  ＡＴＰを生成させるステップ
具体的には、上記（ｉ）で生成させたピロリン酸を、ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの触媒活性の下で、ホスホエノールピルビン酸、ＡＭＰと反応させることによってＡＴＰを生成させるステップ
（ｉｉｉ）  ＡＴＰを測定するステップ
具体的には、上記（ｉｉ）で生成させたＡＴＰを発光法若しくは発色法により測定するステップ
これらの（ｉ）〜（ｉｉｉ）のステップは、それぞれ別に行わせてもよいし、（ｉ）〜（ｉｉ）を同時に行ったり、（ｉｉ）〜（ｉｉｉ）を同時に行ったり、さらには（ｉ）〜（ｉｉｉ）を同時に行ったりすることも可能である。
【００１７】
（２）グアニル酸シクラーゼ
本発明の（ｉ）ピロリン酸を生成させるステップにおいて、試料中の測定対象となるグアニル酸シクラーゼには、可溶型グアニル酸シクラーゼ及び膜結合型グアニル酸シクラーゼがある。さらに、さまざまな由来や複数のアイソフォームのグアニル酸シクラーゼがあるが、グアニル酸シクラーゼは、その種類を問わない。
【００１８】
可溶型グアニル酸シクラーゼを試薬として一定濃度加え、サンプルに含まれるＮＯを検出することやＮＯＳの活性測定を行うことも可能である。
ＮＯによる可溶型グアニル酸シクラーゼの活性化は、ＮＯによる特異的な反応であり、二酸化窒素等も含めた窒素酸化物を測定する方法よりも、生体内で真に有効に作用しているＮＯをより正確に検出することが可能になる。
ＮＯの検出やＮＯＳの活性測定で用いられる可溶型グアニル酸シクラーゼには、ＮＯによって活性化される性質を持つ任意の可溶型グアニル酸シクラーゼが用いられる。可溶型グアニル酸シクラーゼにはいくつかのアイソフォームがあるが、ＮＯによって活性化する性質をもっていればいずれも使用できる。また、これらを遺伝子組換えにより製造したもの等が挙げられる。
【００１９】
（３）ＧＴＰ
本発明の（ｉ）ピロリン酸を生成させるステップにおいて使用するＧＴＰは、ルシフェラーゼを用いた発光法の場合、ＡＴＰと構造が類似しているため、わずかではあるがルシフェラーゼの基質となり発光し、バックグラウンドとなる。
したがって、ＧＴＰ濃度は、測定器の感度やルシフェラーゼ濃度等にあわせて最適化することが望ましく、１×１０−９〜１×１０−３Ｍが望ましい。
ＧＴＰの代わりに、ルシフェラーゼに対して反応性はＧＴＰより比較的低いが、グアニル酸シクラーゼへの反応性を維持したＧＴＰ誘導体を使用しても構わない。
ＧＴＰ誘導体を用いる場合には、１×１０−７〜１×１０−１Ｍが望ましい。ＧＴＰの代わりにＧＴＰ誘導体を用いることにより、ＧＴＰがルシフェラーゼの基質となり、発光してしまうことによるバックグラウンドを抑制することが可能となる。
【００２０】
発色法の場合においても、ＡＴＰを変換するキナーゼや脱水素酵素等の基質特異性により、ＧＴＰによるバックグラウンド発色への影響が異なるため、ＧＴＰ濃度は最適化することが望ましい。この場合もＧＴＰの代わりにＧＴＰ誘導体を使用しても構わない。ＧＴＰ濃度は、１×１０−９〜１×１０−３Ｍが望ましく、ＧＴＰ誘導体を用いる場合には、１×１０−７〜１×１０−１Ｍが望ましい。
【００２１】
（４）ピルベートオルトホスフェートジキナーゼ
本発明の（ｉｉ）ＡＴＰを生成させるステップにおいて使用するピルベートオルトホスフェートジキナーゼ（ＰＰＤＫ；ＥＣ２．７．９．１）は、マグネシウムイオン存在下で、ＡＭＰ、ホスホエノールピルビン酸及びピロリン酸に作用して、ＡＴＰ、ピルビン酸及びリン酸を生じる反応を触媒し、その逆の反応も触媒する酵素である。その理化学的性質及び製法についても既に知られており、入手は比較的に容易である。ＰＰＤＫには、植物由来又は微生物由来のＰＰＤＫが知られている。
【００２２】
植物由来のＰＰＤＫとしては、例えば、トウモロコシ葉由来［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２、ｐ２８６２−２８６７  （１９７３）］及びサトウキビ葉由来［Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１４、ｐ１１７−１２５（１９６９）］のＰＰＤＫが挙げられる。
【００２３】
微生物由来のＰＰＤＫとしては、例えば、プロピオニバクテリウム・シェルマニ（Propionibacterium shermanii）［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １０、ｐ７２１−７２９（１９７１）］、アセトバクタ−・キシリナム（Acetobacter xylinum）［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７０）］、バクテロイデス・シンビオサス（Bacteroides symbiosus）［Ｍｅｔｏｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４２、ｐ１９９−２１２（１９７５）］及びミクロビスポ−ラ属［例えば、ミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ（Microbispora thermorosea）ＩＦＯ１４０４７］等に属する微生物の生産するＰＰＤＫが挙げられる。特に、ミクロビスポ−ラ・サ−モロ−ザ由来のＰＰＤＫは、非常に熱安定性に優れており、このＰＰＤＫを用いることにより、安定性に優れた生物発光試薬を開発することが可能になる。本発明に用いられるＰＰＤＫの濃度は、０．００１〜１００Ｕ／ｍｌ（終濃度）であることが望ましい。また、ホスホエノールピルビン酸の濃度は、０．０１〜０．５ｍＭ（終濃度）であることが望ましい。ＡＭＰの濃度は、０．００１〜０．１ｍＭ（終濃度）であることが望ましい。本発明に用いられる他の金属イオンとは、２価の陽イオンが好ましく、具体的にはマンガンイオンなどが挙げられる。マグネシウムイオン、マンガンイオンなどの金属イオンの濃度は、０．００１〜１００ｍＭ（終濃度）であることが望ましい。
【００２４】
本発明の（ｉｉｉ）ＡＴＰを測定するステップには、発色法と発光法がある。
（５）発色法
発色法には、ピロリン酸からＡＴＰを生成する酵素を用いてＡＴＰを生成させ、該ＡＴＰにヘキソキナーゼ又はグリセロールキナーゼ等のキナーゼ及びグルコ−ス６リン酸脱水素酵素又はグリセロール３リン酸脱水素酵素等の脱水素酵素を用い、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを生成させ、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨにテトラゾリウム塩の存在下、フェナジンメト硫酸塩（ＰＭＳ）、１−メトキシフェナジンメト硫酸塩（１−ｍＰＭＳ）、フェナジンエト硫酸塩（ＰＥＳ）、９−ジメチルアミノベンゾ―α―フェナゾキソニウムクロライド（メルドラブルー）又はジアフォラーゼ等の電子伝達体を作用させ、生成するホルマザン色素を測定したり、該ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子伝達体を経由して生成する電子を酸素に受容させることにより過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定したりする方法がある（特開２００６−１８７２５１号公報）。
発光法と比較すると、感度や測定可能範囲の点で劣るが、発光検出装置（ルミノメーター）よりも広く普及している吸光度計を使用することができるため、すでに吸光度計を所有する測定者にとっては発光検出装置の導入コストを抑えられるという利点を有する。
【００２５】
（６）発光法
ＰＰＤＫを用いた発光法は、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応によるＡＴＰ測定法とＰＰＤＫを組み合わせたサイクリング法であり（米国特許５８９１６５９、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００４年、３３３号、ｐ２９６−３０２）、高感度で、かつ、１．６×１０−１０〜１×１０−７Ｍという幅広い濃度範囲のピロリン酸を測定できるため、高感度で、かつ、幅広い濃度範囲のグアニル酸シクラーゼ活性測定に適している。
ＰＰＤＫを用いてピロリン酸を測定する場合、基質となるホスホエノールピルビン酸やＡＭＰはルシフェラーゼの基質とならないため、バックグラウンド発光量を低値に抑え、高感度にピロリン酸を測定することが可能になり、結果として高感度なグアニル酸シクラーゼ活性測定が可能になる。
また、ＰＰＤＫとルシフェラーゼのサイクリング反応によるピロリン酸測定では、発光阻害物であるＡＭＰもサイクリングされるため、ＡＭＰ濃度は一定であり、反応が進むにつれて、ＡＭＰが蓄積されて、発光量が低下することはなく、定量性に優れた測定が可能である。
このように優れた特徴を有するＰＰＤＫを使用することにより、高感度で、簡便で、スループット性に優れたグアニル酸シクラーゼ活性測定法が可能となり、さらに、この方法を用いてグアニル酸シクラーゼの活性促進剤や活性抑制剤等、活性に影響を与える物質のスクリーニングを行うことが可能となる。
【００２６】
（７）ルシフェラーゼ
ルシフェラーゼとしては、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系によるＡＴＰ測定に用いられている任意のルシフェラーゼが挙げられる。ルシフェラーゼは、例えば、ゲンジボタル、ヘイケボタル、アメリカボタル等由来のルシフェラーゼ、あるいはこれらのルシフェラーゼを遺伝子組換えにより製造したもの等が望ましい。
ルシフェラ−ゼの濃度は、０．１μｇ／ｍｌ（終濃度）以上、好ましくは１〜１０００μｇ／ｍｌ（終濃度）が望ましい。ルシフェリンの濃度は、０．１μＭ（終濃度）以上、好ましくは１〜１０，０００μＭ（終濃度）が望ましい。
【００２７】
（８）試薬
なお、本発明の試薬には、酵素反応、発光反応を円滑に行わせるために、種々の化合物を添加してもよい。このような化合物としては、例えば、安定化剤、界面活性剤、賦活剤等が挙げられる。すなわち、ＰＰＤＫの賦活剤としては、塩化マンガンや硫酸アンモニウム（０．１〜１００ｍＭ（終濃度））を使用することができる。また、ルシフェラーゼの安定剤として、ジチオスレイトール（０．１〜１０ｍＭ（終濃度））、ＥＤＴＡ（０．１〜１０ｍＭ（終濃度））、ＢＳＡ（０．０１〜１０％（終濃度））などを使用することができる。そして、反応系の安定化剤としてＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液やＨＥＰＥＳ緩衝液（２０〜２００ｍＭ（終濃度））などを使用することができる。
【００２８】
（９）検出装置
本発明は、蛍光物質を使用する方法ではなく、発光検出による方法であるため、高価で大型な励起光照射装置を必要とせず、検出装置を低価格化、小型化することができる。
また、本発明に使用しているＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ発光試薬のＡＴＰ−ピロリン酸のサイクリング反応は、発光反応で消費したＡＴＰをＡＭＰとピロリン酸を使ってＡＴＰに再生されるため、発光量が持続する。高濃度のルシフェラーゼを試薬に添加することにより、高発光、かつ、持続型の発光試薬を作製することができる。そのため、高価で高感度な光電子増倍管のような検出部は必要とならない。すなわち、感度的には若干劣るが、低価格で小型のフォトダイオードを使用した装置やＣＣＤカメラを使用したイメージング装置でも十分安定して測定することができる。
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２９】
１．＜試薬の調製＞
以下の物質を各終濃度になるように添加溶解して調製し、実験に使用した。
【００３０】
（１）基質溶液（ｐＨ７．７）
１×１０−７Ｍ  グアノシン三リン酸（オリエンタル酵母社製）
２ｍＭ  塩化マンガン（和光純薬工業社製）
１ｍＭ  ジチオトレイトール（和光純薬工業社製）
０．１％  ＢＳＡ（シグマ社製）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）
【００３１】
（２）ＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ発光試薬（ｐＨ６．７）
０．２３４Ｕ／ｍｌ  ＰＰＤＫ（キッコーマン社製）
５．５ＧＬＵ／ｍｌ  ルシフェラーゼ（キッコーマン社製）
１０ｍＭ  酢酸マグネシウム（和光純薬工業社製）
０．２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリン（ＹＭＣ社製）
０．０４ｍＭ  ホスホエノールピルビン酸（シグマ社製）
０．０１２５ｍＭ  ＡＭＰ（オリエンタル酵母社製）
０．１％  ＢＳＡ（シグマ社製）
０．００２５Ｕ／ｍｌ  アピラーゼ（シグマ社製）
３０ｍＭ  ＢＥＳ（同仁化学社製）
【００３２】
（３）グアニル酸シクラーゼ溶液（ｐＨ７．７）
可溶型グアニル酸シクラーゼ（和光純薬工業社製）
２ｍＭ  塩化マンガン（和光純薬工業社製）
１ｍＭ  ジチオトレイトール（和光純薬工業社製）
０．１％  ＢＳＡ（シグマ社製）
２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ（同仁化学社製）
【００３３】
（４）ＮＯＣ７溶液
１０ｍＭ  ＮＯＣ７（同仁化学社製）
０．１Ｍ  ＮａＯＨ
【実施例２】
【００３４】
２．＜グアニル酸シクラーゼ活性測定＞
実施例１（１）記載の基質溶液１ｍｌに、実施例１（３）記載のグアニル酸シクラーゼ溶液（グアニル酸シクラーゼの終濃度：０、１０、５０、１００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌ）を加え、２５℃にて１０分間インキュベートした。インキュベート後に０．０１ｍｌずつサンプリングし、実施例１（２）記載のＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ発光試薬０．１ｍｌに添加し、そのとき生じる発光量をルミテスターＣ−１００Ｎ（キッコーマン社製）にて測定した。その結果を、図１に示した。図１の結果は、グアニル酸シクラーゼを含まないサンプルの発光量を差し引いた値を示した。
図１の結果から、グアニル酸シクラーゼ活性を１０−３，０００ｎｇ／ｍｌの間の幅広い濃度範囲で、簡便、かつ、高感度に測定することができ、さらには、グアニル酸シクラーゼの活性促進、活性抑制等の活性に影響を及ぼす物質のスクリーニングに応用することが可能になることがわかる。
【実施例３】
【００３５】
３．＜ＮＯの検出＞
実施例１（１）記載の基質溶液１ｍｌを２５℃にて予備加温し、そこに、終濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように実施例１（３）記載の可溶型グアニル酸シクラーゼ溶液を加え、さらに、実施例１（４）記載のＮＯＣ７溶液を０．０１ｍｌ加え、２５℃にてインキュベートした。ＮＯＣ７を添加した直後と１０分後に反応液を０．０１ｍｌずつサンプリングし、生じたピロリン酸を測定した。
ピロリン酸量の測定は、サンプリングした０．０１ｍｌの反応液を、実施例１（２）記載のＰＰＤＫ−ルシフェラーゼ発光試薬０．１ｍｌに添加し、発光量をルミテスターＣ−１００Ｎ（キッコーマン社製）にて測定した。
【００３６】
その結果を図２に示した。図２の発光量は、添加直後の発光量を１０分後の発光量から差し引いたものを示した。
図２の結果から、ＮＯ発生剤であるＮＯＣ７を添加したサンプル（図２中のＮＯＣ７（＋））のほうが、ＮＯＣ７を添加していないサンプル（図２中のＮＯＣ７（−））と比較して、約２５倍高い発光量を示した。この方法により、ＮＯを簡便、かつ、高感度に検出可能であることがわかる。また、可溶型グアニル酸シクラーゼの活性化は、ＮＯに対して特異的な反応であるため、発光量の増加もＮＯに対して特異的なものであり、その他の窒素酸化物も測定してしまう方法よりも優れていることがわかる。この方法は、ＮＯの測定ばかりでなく、ＮＯＳの活性測定やＮＯＳの活性促進剤や活性抑制剤等の活性に影響を与える物質のスクリーニング等へも応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】グアニル酸シクラーゼの検量線を示す。縦軸は、発光量（ＲＬＵ）グアニル酸シクラーゼ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【図２】ＮＯＣ７添加による発光量の変化を示す。ＮＯＣ７を添加したサンプル（ＮＯＣ７（＋））とＮＯＣ７を添加しないサンプル（ＮＯＣ７（−））を示す。
【図１】
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【図２】
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