(57)【要約】  【課題】  固定化核酸の活性が低下せずに、分子量の小さい物質であっても、相互作用を正確に検出できる固定化担体、物質間の相互作用の検出キット、および物質間の相互作用の検出方法を提供する。  【解決手段】  本発明の固定化担体は、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体が、前記第２の二本鎖核酸を介して基材に固定化されている。【選択図】  図２
2008292384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、
第２の二本鎖核酸と、
前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーと
を有する核酸結合体が、
前記第２の二本鎖核酸を介して基材に固定化されている固定化担体。
【請求項２】
前記リンカーは一本鎖核酸である、請求項１に記載の固定化担体。
【請求項３】
前記特異的応答塩基配列部位は、標的物質と検出物質との結合体と相互作用を生ずる、請求項１または２に記載の固定化担体。
【請求項４】
前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質である、請求項１ないし３のいずれかに記載の固定化担体。
【請求項５】
前記特異的応答塩基配列部位が、前記特異的応答塩基配列部位の一塩基ミスマッチ対合あるいは塩基変異している、請求項１ないし４のいずれかに記載の固定化担体。
【請求項６】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、
基材とが、
前記第２の二本鎖核酸の一部を介して固定化されている、物質間の相互作用の検出キット。
【請求項７】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、
基材とを、
含む、物質間の相互作用の検出キット。
【請求項８】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、
第２の二本鎖核酸と、
前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーと、
基材とを、
含む、物質間の相互作用の検出キット。
【請求項９】
前記特異的応答塩基配列部位は、標的物質と検出物質との結合体と相互作用を生ずる、請求項６ないし８のいずれかに記載の物質間の相互作用の検出キット。
【請求項１０】
前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質である、請求項９に記載の物質間の相互作用の検出キット。
【請求項１１】
前記特異的応答塩基配列部位が、前記特異的応答塩基配列部位の一塩基ミスマッチ対合あるいは塩基変異している、請求項６ないし１０のいずれかに記載の物質間の相互作用の検出キット。
【請求項１２】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する固定化担体に、物質を相互作用させて、物質間の相互作用を検出する物質間の相互作用の検出方法。
【請求項１３】
前記物質は、標的物質と検出物質との結合体である、請求項１２に記載の物質間の相互作用の検出方法。
【請求項１４】
前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質である、請求項１３に記載の物質間の相互作用の検出方法。
【請求項１５】
物質間の相互作用の検出と同時に、一塩基ミスマッチ対合、あるいは塩基変異を検出する、請求１２ないし１４のいずれかに記載の物質間の相互作用の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸で構成される、物質間の相互作用を検出するための、固定化担体、物質間の相互作用の検出キット、および物質間の相互作用の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ナノテクノロジーをはじめとする技術の進歩により、物質間の相互作用を検出する様々な技術（以下、「センシング技術」という）が開発・実用化されている。このセンシング技術を用いれば、体内に存在する、または体内で生成される極微量の物質を高感度に検出することができる。これにより、人の健康状態の診断・予測、創薬、その他の分野において、広範囲に活用することができる。センシング技術の検出対象となる標的物質としては、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、タンパク質、ペプチド、糖、脂質、ホルモンなどが挙げられる。
【０００３】
核酸を検出する手段として、多数のプローブ核酸を基材に固定したＤＮＡチップが知られている。検体から抽出し標識化した核酸若しくはその複製物を、プローブ核酸に反応させ、ハイブリダイゼーションさせて基材上に固定化する。基材上の標識のシグナルを検出して、物質間の相互作用の有無を検出する。
【０００４】
また、タンパク質を検出する場合には、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸−タンパク質相互作用を用いて、基材上に固定化する。これにより、特定のタンパク質をセンシングすることができる。
【０００５】
一方、物質のサイズや構造などによっては、物質間で生じた相互作用を感度よく検出できない場合がある。例えば、疎水性ホルモンなどのような分子量の小さい物質が標的となる物質の場合は、相互作用による質量変化や誘電率変化が十分に大きくない。このため、分子量の小さい物質では、高精度な検出ができない。
【０００６】
ホルモンは、生体内外の情報に応じて、特定の細胞で生産され、分泌される。分泌されたホルモンは、体液を介して情報を他の細胞へ伝達する。このようなホルモンとしては、ペプチド・タンパク質系ホルモン、ステロイド系ホルモン、アミノ酸誘導体系ホルモンなどが知られている。これらのホルモンは、様々な環境変化に対応する体内調整システムとしての役割を担っている。
【０００７】
ホルモン（リガンド）は、ホルモンレセプターと結合し、ホルモン／ホルモンレセプター複合体を形成する。このホルモン／ホルモンレセプター複合体は、ＤＮＡの特異的塩基配列を認識して結合することが知られている。図1は、ステロイド系ホルモンであるグルココルチコイド（以下、「ＧＣ」という）の生体内での機能を説明するための図である。図1に示すように、副腎皮質より産生されたＧＣ２は、核内レセプターであるグルココルチコイドレセプター１（以下、「ＧＣＲ」という）と結合し、ＧＣ／ＧＣＲ複合体３を形成する。ＧＣ／ＧＣＲ複合体３は、ホモ二量体４を形成する。このホモ二量体４は、ＤＮＡの特異的塩基配列５を認識して結合する。ＧＣ／ＧＣＲ／核酸複合体は、核内に存在するコアクチベータに活性化され、ＤＮＡの特異的塩基配列の下流に存在する標的遺伝子の発現を促進する。これにより、様々な生理活性が誘発される。
【０００８】
このように、リガンドとレセプターとの複合体がＤＮＡの特異的塩基配列を認識して結合することを用いて、分子量の小さい物質における物質間の相互作用を検出することが試みられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００９】
この文献では、基材表面に末端部位が固定化された一本鎖ＤＮＡと相補結合することにより形成された二本鎖ＤＮＡが設けられており、物質間の相互作用の発生に応答して特異的塩基配列の下流に存在する二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離するものが、開示されている。
【特許文献１】特開２００５−２５７６６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、特許文献１に記載された核酸固定化基板は、ＧＣ／ＧＣＲ／核酸複合体が結合してＤＮＡの特異的塩基配列の下流に存在する標的遺伝子の発現が促進される際に、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離することを利用するため、立体障害により十分に解離できない。また、基材表面固定化された一本鎖ＤＮＡに二本鎖ＤＮＡを結合しているため、作用部位が基板上に吸着することがありうる。これらの原因により、固定化核酸の活性が低下するという問題がある。
【００１１】
本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、その目的は、固定化核酸の活性が低下せずに、分子量の小さい物質であっても、相互作用を正確に検出できる固定化担体、物質間の相互作用の検出キット、および物質間の相互作用の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をした結果、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する、核酸結合体を基材に固定化した固定化担体を用いることにより、二本鎖核酸が相互作用する活性が保持されることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
本発明の固定化担体は、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体が、前記第２の二本鎖核酸を介して基材に固定化されている。
【００１４】
前記リンカーは一本鎖核酸であると好ましい。
【００１５】
前記特異的応答塩基配列部位は、標的物質と検出物質との結合体と相互作用を生ずるものであるとよい。前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質であるとよい。
【００１６】
前記特異的応答塩基配列部位が、前記特異的応答塩基配列部位の一塩基ミスマッチ対合あるいは塩基変異していてもよい。
【００１７】
本発明の物質間の相互作用の検出キットは、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、基材とが、前記第２の二本鎖核酸の一部を介して固定化されている。
【００１８】
また、本発明の物質間の相互作用の検出キットは、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、基材とを、含むものであってもよい。
【００１９】
また、本発明の物質間の相互作用の検出キットは、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーと、基材とを、含む。
【００２０】
前記特異的応答塩基配列部位は、標的物質と検出物質との結合体と相互作用を生ずるものであればよい。また、前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質であればよい。前記特異的応答塩基配列部位が、特異的応答塩基配列部位の一塩基ミスマッチ対合あるいは塩基変異しているものであってもよい。
【００２１】
本発明の物質間の相互作用の検出方法は、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と前記第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する固定化担体に、物質を相互作用させて、物質間の相互作用を検出する。
【００２２】
前記物質は、標的物質と検出物質との結合体であればよい。また、前記標的物質が、ステロイドホルモンまたは脂溶性生理活性物質であればよい。物質間の相互作用の検出と同時に、一塩基ミスマッチ対合、あるいは塩基変異を検出してもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明では、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体が、前記第２の二本鎖核酸を介して基材に固定化されている、固体化担体を用いる。
【００２４】
本発明では、基材への固定化を、二本鎖核酸を用いて行う。このため、基材表面に密に、かつ安定に核酸結合体を固定できる。
【００２５】
また、第１の二本鎖核酸は、リンカーを介して、第２の二本鎖核酸と結合している。この結果、作用部位が基板上に吸着しにくい。
【００２６】
さらに、物質が第1の二本鎖核酸の特異的応答塩基配列部位と相互作用を生じた状態の物質間の相互作用を直接検出する。この結果、解離等の問題を生じないので、立体障害の問題を考慮しなくてもよい。
【００２７】
したがって、固定化核酸の活性が低下せずに、分子量の小さい物質であっても、相互作用を正確に検出できる固定化担体、物質間の相互作用の検出キット、および物質間の相互作用の検出方法を得ることができる。また、１つの塩基変異であるＳＮＰｓについても、同時に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に、本発明を実施するための好適な形態について、図面を用いて説明する。図２は、本発明の固定化担体を説明する図である。
【００２９】
［核酸結合体］
図２に示すように、本発明の固定化担体は、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸６と、第２の二本鎖核酸８と、前記第1の二本鎖核酸６と第２の二本鎖核酸８とを結合するリンカー７とを有する核酸結合体が、基板と相互作用可能な官能基１０を介して基材９に固定化されている。
【００３０】
（物質間の相互作用）
本発明で、物質間の「相互作用」とは、物質間の、非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学結合あるいは解離を広く意味する。具体的には、イオン間相互作用、水素結合、双極子相互作用、ファンデルワールス相互作用などが挙げられる。また、二分子間で電子が移動し、クーロン力によって錯体を作る電荷移動相互作用や、芳香環の間に働く、特に強い分散力であるπ−π相互作用であってもよい。さらに、熱力学的要因に基づく疎水的相互作用であってもよい。疎水的相互作用は、超分子の形成、液体や液晶の物性、生体高分子（ＤＮＡ、タンパク質など）の構造などにおいて、重要な役割を果たしている。
【００３１】
本発明では、まず、標的物質と検出物質とが相互作用をする。また、検出物質と特異的応答塩基配列部位とが相互作用をする。
【００３２】
（標的物質）
本発明で、標的物質（リガンド）とは、相互作用の標的となる物質、あるいは相互作用の標的となる可能性のあるスクリーニング対象となる物質をいう。具体的には、ホルモンや生理活性物質、内分泌撹乱物質などを少なくとも含む。
【００３３】
ホルモンとしては、細胞膜貫通型のレセプターに直接働きかけるもの（水溶性ホルモン：ペプチド・タンパク質系ホルモンなど）、細胞核内のレセプターに直接働きかけるもの（脂溶性ホルモン：ステロイド系ホルモン、甲状腺ホルモンなどのカテコールアミン系ホルモンなど）が含まれる。
【００３４】
生理活性物質としては、レチノイド、ビタミンＤなどの生理活性脂質や、上記ホルモンのレセプターに結合するタモキシフェン、ラロキシフェンなどの選択的ＥＲ（エストロジェン）モジューレータなどが挙げられる。
【００３５】
内分泌攪乱物質とは、ヒトの性ホルモンであるエストロゲン等と同様の作用を持ち、生体に作用する物質であって、いわゆる「環境ホルモン」と称される物質を意味する。本来、生体に存在するホルモンが結合するはずのホルモンレセプターに外界から入り込んだ化学物質が結合することによって、本来のホルモン様の作用がもたらされたり（アゴニスト作用）、逆に本来のホルモン作用が阻害されたり（アンタゴニスト作用）する。例えば、ビスフェノール、ノニフェノール、ＤＤＴは、エストロゲンレセプターに結合することでエストロゲンと類似の反応をもたらすと言われている。その他、抗エストロゲン作用を示す物質として、ダイオキシン類、抗アンドロゲン作用を示す物質として、ピンクロゾリン、ＤＤＥ、甲状腺ホルモン攪乱物質として、ＴＣＤＤ，ＰＣＢなどが知られている。
【００３６】
（検出物質）
本発明では、検出物質は、標的物質（リガンド）と、直接または間接に相互作用を示す物質である。検出物質は、さらに、第1の二本鎖核酸中の特異的応答塩基配列部位と、直接または間接に結合等の作用を示す物質である。検出物質は、標的物質（リガンド）との相互作用に関係なく、特異的応答塩基配列部位と結合等をするリガンド非依存性の物質であってもよく、標的物質（リガンド）と相互作用すると立体構造が変化して、特異的応答塩基配列部位に対して、直接または間接に結合等をするリガンド依存性の物質であってもよい。本発明の検出物質は、ホルモンレセプターを少なくとも含む。
【００３７】
（第1の二本鎖核酸）
第1の二本鎖核酸は、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む。特異的応答塩基配列部位とは、上記検出物質が結合可能な塩基配列部位を意味する。例えば、ホルモン応答遺伝子の上流に位置するプロモータ領域にあるホルモン応答部位に該当する配列などが例示できる。特異的応答塩基配列部位には、標的物質（リガンド）と結合した検出物質であるレセプターが結合する。
【００３８】
特異的応答塩基配列部位を含む第１の二本鎖核酸は、検出物質が結合できるものであれば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれであってもよい。
【００３９】
（リンカー）
第１の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとしては、第１の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合することができるものであれば、特に制限はない。例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖類など生体内に存在する物質及びその合成物、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧ誘導体、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール誘導体などの合成物などが使用できる。好ましくは、一本鎖核酸である。また、標的物質若しくは検出物質は、親水性の物質の場合は、水溶性のリンカーを用いるのが、好ましい。
【００４０】
（第２の二本鎖核酸）
第２の二本鎖核酸は、基材に固定できるものであれば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれであってもよい。また、第２の二本鎖核酸は、上記第１の二本鎖核酸と同一の塩基配列であっても、上記第１の二本鎖核酸とは異なる塩基配列であってもよい。第２の二本鎖核酸が上記第１の二本鎖核酸と同一の塩基配列である場合、第２の二本鎖核酸は基材側に位置する。このため、第２の二本鎖核酸では物質間の相互作用を生じにくいからである。より好ましいのは、第２の二本鎖核酸が、上記第１の二本鎖核酸とは異なる塩基配列を有する場合である。
【００４１】
（核酸結合体の作製）
本発明の核酸結合体は、例えば以下のようにして作製する。図３は、本発明の核酸結合体の製造方法の一例を説明する図である。図３に示すように、リンカー７に一本鎖核酸１１（Ａ、Ｂ）とが結合しているものに、一本鎖核酸１１（Ａ、Ｂ）とにそれぞれ相補的な一本鎖核酸１２（Ａ’、Ｂ’）を溶液中で混合することにより得られる。図３の例では、一本鎖核酸Ａと一本鎖核酸Ａ’と、一本鎖核酸Ｂと一本鎖核酸Ｂ’とが、ハイブリダイゼーションしている。この図の例では、相補的な一本鎖核酸Ａ’とＢ’とを同時にハイブリダイゼーションするが、それぞれ別個にハイブリダイゼーションしてもよい。
【００４２】
あるいは、それぞれ形成した第１の２本鎖核酸と第２の２本鎖核酸とを、化学結合などによりリンカーに連結させてもよい。例えば、一方の二本鎖核酸の一端をアミノ基修飾し、他方の二本鎖核酸の一端をチオール基修飾する。これらを一方の末端にマレイミド基を有し、他方の末端にスクシンイミド基を有するリンカーとを反応させて結合する。
【００４３】
（固定化）
第２の二本鎖核酸の一端を用いて、基材に固定化する。使用できる基材としては、基板やビーズなどが挙げられる。
【００４４】
基材への固定化は、例えば以下の方法により行う。一つの方法は、特開２００３−４３０３７号公報に記載されている核酸単分子膜の作製方法を用いる。図４は、核酸単分子膜の作製方法を説明する図である。この方法では、第２の二本鎖核酸８の一端に基材９表面と相互作用をする官能基１０を導入して、核酸単分子膜を作製する。この方法を用いれば、基材に固定化された二本鎖核酸８は凝集構造を有しているため、基材上に安定に固定できる。また、リンカー７部分が一本鎖であるので、可動空間を有する。この結果、物質の相互作用を容易に生じることができる。
【００４５】
このような核酸単分子膜は、例えば以下のようにして作製する。金属基材または基材表面が金属被覆されている基材９に、第２の二本鎖核酸８のうちリンカーに結合していない核酸鎖の一端にチオール基を導入したものを用いて、核酸結合体を基材に固定化する。あるいは、基材表面にカルボキシル基が導入されているものを用いる。この場合には、第２の二本鎖核酸のうちリンカーに結合していない核酸鎖の一端をアミノ基修飾したものを用いる。カルボジイミド誘導体などの縮合剤を用いてアミド基を形成することにより、安定に固定化できる。
【００４６】
核酸結合体の基材への固定化は、基材表面をストレプトアビジンを用いて表面処理をしたものを用いてもよい。この場合には、第２の二本鎖核酸８の末端をビオチン化したものを用いて、アビジン−ビオチン結合を用いて、核酸結合体を基材表面に固定化する。
【００４７】
（相互作用の発生）
図５に示すように、本発明の固定化担体に、標的物質／検出物質複合体を作用させると、標的物質／検出物質複合体は、第１の二本鎖核酸６の特異的応答塩基配列部位に結合する。この図の例では、標的物質／検出物質複合体４が、第１の二本鎖核酸に結合している。このように、第１の二本鎖核酸の特異的応答塩基配列部位に結合した標的物質／検出物質複合体は、以下のようにして検出する。
【００４８】
（相互作用の検出）
本発明の核酸結合体を用いれば、物質間の相互作用の検出は、標識を用いずに検出することができる。具体的には、水晶振動子法（ＱＣＭ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、エリプソメータなどを用いる。
【００４９】
ＱＣＭによる場合は、特開平７−７２０６０号公報に記載されているように、基材上への物質の吸着量の変化から生ずる振動数変化を重量に換算して、吸着量（第１の２本鎖核酸に相互作用した物質の量）を定量する。
【００５０】
ＳＰＲやエリプソメータで測定する場合は、それぞれ特開２００２−５１７７４号公報、特開２００２−１８９０２８号公報に記載されている方法に準じて、側定する。具体的には、基材上へ吸着した物質の吸着量は、吸着物の反射率の変化から吸着物の平均膜厚に換算して、吸着量を定量する。
【００５１】
その他、電気化学的手法を用いて、物質間の相互作用前後の酸化還元電位の差により吸着量を定量することができる（Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  １６、１９９９（２００４））。
【００５２】
［ＳＮＰｓの検出］
本発明において、前記第１の二本鎖核酸中に、生体成分等から抽出した特異的応答塩基配列部位を含む構成としてもよい。生体成分等に含まれる特異的応答塩基配列部位に一塩基ミスマッチ対合、あるいは塩基変異が存在する場合には、標的物質と検出物質との複合体が結合しない。したがって、一塩基ミスマッチ対合、あるいは塩基変異が存在すれば、吸着量が低下するので、これらの存在を検出することができる。例えば、固定化担体上に、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸を含む核酸結合体と、標的物質と検出物質との複合体が結合する生体成分等から抽出した特異的応答塩基配列を含む第1の二本鎖核酸を含む核酸結合体とを、区分けして固定した固定化担体を用いれば、物質間の相互作用の測定とＳＮＰｓの測定を１つの固定化担体上で行うことができる。
【００５３】
［検出キット］
本発明の物質間の相互作用の検出キットは、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸とは異なる塩基配列を有する第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、基材とが、前記第２の二本鎖核酸の一部を介して固定化されている。
【００５４】
また、本発明の物質間の相互作用の検出キットは、物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸とは異なる塩基配列を有する第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーとを有する核酸結合体と、基材とを、含むものであってもよい。この場合には、使用前に核酸結合体を基材に固定化する、あるいは核酸結合体と物質とを相互作用させた後に基材に固定化することができる。
【００５５】
物質間の相互作用を生ずる特異的応答塩基配列部位を含む第1の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸とは異なる塩基配列を有する第２の二本鎖核酸と、前記第1の二本鎖核酸と第２の二本鎖核酸とを結合するリンカーと、基材とを、含むものであってもよい。
【００５６】
人がストレスを受けると、副腎皮質からＧＣが血液中に放出され、血液中や唾液中でのＧＣの濃度が上昇する。したがって、ＧＣの放出量は、ストレスの指標として注目されている。本発明の固定化担体や物質間の相互作用の検出キットを用いると、ＧＣ／ＧＣＲ複合体量を容易に測定できる。すなわち、本発明の固定化担体や物質間の相互作用の検出キットを用いると、ストレスセンサ、環境ホルモン検出センサなどの各種バイオセンサに適用することができる。
【００５７】
あるいは、物質間の相互作用が容易に調べられるので、ホルモン依存性腫瘍、骨粗しょう症、炎症疾患、糖尿病、肥満などに対する新規治療薬の評価を行うことができる。
【実施例】
【００５８】
以下本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５９】
（実施例１）
（リンカーを介して結合した二本鎖核酸の調整）
以下の配列のDNAを合成した。合成は日本バイオサービス株式会社にて受託した。
【表１】
2008292384.tif 000003
【００６０】
配列番号１から６のＤＮＡを表１の組み合わせで等モルずつ混合し、検出用核酸ＩからＶを調整した。検出用核酸ＩはＧＣ/ＧＣＲ複合体の二量体が特異的に結合する配列を含む二本鎖核酸を検出部分として有し（野生型）、ＩＩは検出部分が一本鎖核酸であり（一本鎖型）、ＩＩＩはＩの検出部分の配列に対してミスマッチ部位を有し（ミスマッチ型）、ＩＶはＩの検出部分対して４箇所の変異部位を有し（変異型）、Ｖは2つの二本鎖核酸の間に一本鎖核酸のリンカーを有していない配列である（リンカー無し型）。
【表２】
2008292384.tif 000004
【００６１】
なお、配列番号１〜３の四角で囲った部分は、配列番号７とハイブリダイゼーションし、第２の二本鎖核酸を形成した。配列番号１から３の下線部分は、配列番号４から６の下線部分とハイブリダイゼーションし、物質の相互作用の検出部位（特異的塩基配列）として用いた。
【００６２】
これら検出用核酸は、以下のようにして調整した。配列番号１から6のＤＮＡに純水を加え１００μmol／Lとした。塩化マグネシウム・６水和物（ＭｇＣｌ２・６(Ｈ２Ｏ)、分子量２０３．３、ＳＩＧＭＡ社製、以下、「ＭｇＣｌ２」と記す）０．４０６ｇを１００ｍｌの純水に溶解させ、濃度を２０ｍＭとした。各ＤＮＡを１３３μｌ採取し、ＭｇＣｌ2水溶液を加え、２ｍｌ（ＤＮＡ終濃度６．６５μＭ）とした。これら混合ＤＮＡをＰＣＲチューブに１００μｌずつ分注し、サーマルサイクラー（バイオラッド社製Ｍｙ  Ｃｙｃｌｅｒ）を用いて95℃で3分間加熱し、室温まで徐冷した。二本鎖部分の形成は１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて確認を行った。
【００６３】
（検出用核酸固定化担体の作製）
ＳＰＲ用金薄膜蒸着ガラス基板（モリテックス社製）をエタノールで２回洗浄した。同基板上に上記検出用核酸のＭｇＣｌ２水溶液を４００μｌ滴下し、室温で１６時間放置した。その後、純水で２回基板表面を洗浄し窒素ガスで表面を乾燥させた。
【００６４】
（検出物質の調整）
標的物質として、グルココルチコイドの人工合成物としてデキサメタゾン（ＳＩＧＭＡ、分子量３９２．４７、以下「ＧＣ」と記す）を用いた。デキサメタゾン０．０３９ｍｇを１ｍｌエタノールに溶解し、ストック溶液とした。ストック溶液の濃度は１００μＭとした。上記ストック溶液を結合用のバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．９、６０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭジチオスレイトール、１０（ｗ／ｖ）％グリセロール）で希釈し１μＭとした。グルココルチコイドレセプター（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｏｎｅ、以下「ＧＣＲ」と記す）を上記結合用バッファーで濃度８ｎＭに希釈した。ＧＣとＧＣＲをエッペンドルフチューブ内で等液量混合し、３０分間２０℃でインキュベートし、検出物質検体とした。
【００６５】
（ＳＰＲ測定）
ＧＣ／ＧＣＲ複合体の上記核酸固定化担体への吸着は表面プラズモン共鳴測定装置（日本レーザー電子社製、Ｎａｎｏ  Ｓｅｎｓｏｒ）により測定を行った。測定には調製した検出物質の溶液２００μｌを注入した。測定温度は２０℃とし、サンプル注入はフランジポンプ（東洋紡績社製、Ｐ．Ｃ．Ｓ  Ｐｕｍｐ  Ｍｏｄｅｌ  ０２１）を用い、注入流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎとした。サンプル注入後４０分経過した時の信号強度の変化を表３に示す。信号強度の変化は核酸固定化担体への吸着が起こっていることを示す。
【表３】
2008292384.tif 000005
【００６６】
表３から検出用核酸Ｉ（信号強度：０．４３６）と比較し、検出用核酸ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖでは信号強度の変化が少なかった（信号強度：０．１３０、０．０３５、０．０１０、０．００７）ことから、ＧＣ／ＧＣＲ複合体が検出用核酸Ｉに特異的結合していることが示された。
【００６７】
また、検出用核酸ＩＩ（ミスマッチ型）やＩＩＩ（変異型）への結合がＩ（野生型）と比較し明らかに減少していることがわかる。このことから、本発明を用いれば、容易に一塩基ミスマッチや塩基変異を判別可能であることが示された。
【００６８】
さらに、検出物質が特異的に結合できる配列を有している検出核酸Ｖではほとんど吸着が見られなかった（信号強度：０．００７）ことから、一本鎖核酸では、結合能が低いことが示された。すなわち、リンカーである一本鎖核酸が２つの二本鎖核酸の間に存在することにより、ＧＣ／ＧＣＲ複合体との結合能が増大したことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、ステロイド系ホルモンであるグルココルチコイドの生体内での機能を説明するための図である。
【図２】図２は、標識核酸の繰り返し配列以外の部位に内部標準の導入方法を説明するための模式図である。
【図３】図３は、本発明の核酸結合体の製造方法の一例を説明する図である。
【図４】図４は、核酸単分子膜の作製方法を説明する図である。
【図５】図５は、固定化担体に、標的物質／検出物質複合体を作用させた際に、標的物質／検出物質複合体が結合する状態を説明する図である。
【符号の説明】
【００７０】
１    グルココルチコイドレセプター（ＧＣＲ）
２    グルココルチコイド（ＧＣ）
３    ＧＣ／ＧＣＲ複合体
４    ＧＣ／ＧＣＲ複合体のホモ二量体
５    ＤＮＡの特異的塩基配列
６    第1の二本鎖核酸
７    リンカー
８    第２の二本鎖核酸
９    基材と相互作用可能な官能基
１０    基材
１１    一本鎖核酸
１２    相補的な一本鎖核酸
１３    固定化担体
１４    標識
【図１】
2008292384.tif 000006
【図２】
2008292384.tif 000007
【図３】
2008292384.tif 000008
【図４】
2008292384.tif 000009
【図５】
2008292384.tif 000010
【配列表】
2008292384000001.app