(57)【要約】      （修正有）【課題】原発性悪性中枢神経系（ＣＮＳ）新生物(特に神経芽細胞腫）は脳の攻撃的かつ広範囲な浸潤および抗癌処置への耐性に起因して非常に致命的である。ＣＮＳ癌ならびに他の癌タイプの根底にある病原機構の解明と腫瘍特異的治療アプローチおよび診断方法を提供する。【解決手段】哺乳動物由来の体液をヒトアスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）ポリペプチドに結合する抗体と接触させ哺乳動物における悪性新生物を診断、およびＨＡＡＨを阻害することにより悪性新生物を処置する。腫瘍細胞をＨＡＡＨアンチセンス核酸と接触させ腫瘍増殖を阻害する。哺乳動物において悪性新生物を診断するための方法に関し、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）ポリペプチドに結合する抗体と抗原−抗体複合体を形成するのに十分な条件下で接触させるおよび該抗原−抗体複合体を検出する工程を包含する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において悪性新生物を診断するための方法であって
、該哺乳動物由来の体液を、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキ
シラーゼ（ＨＡＡＨ）ポリペプチドに結合する抗体と、抗原−抗体複合体を形成
するのに十分な条件下で接触させる工程、および該抗原−抗体複合体を検出する
工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記新生物が内胚葉組織に由来する、請求項１に記載の方法
。
【請求項３】
前記新生物が、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、および胆管
の癌からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記新生物が中枢神経系（ＣＮＳ）の癌である、請求項１に
記載の方法。
【請求項５】
前記体液が、ＣＮＳ由来体液、血液、血清、尿、唾液、痰、
肺滲出液、および腹水からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方
法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体がＦＢ５０である、請求項６に記載
の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体が、５Ｃ７、５Ｅ９、１９Ｂ、４８
Ａ、７４Ａ、７８Ａ、８６Ａからなる群から選択される、請求項６に記載の方法
。
【請求項９】
哺乳動物の悪性新生物の予後のための方法であって、
（ａ）該哺乳動物由来の体液を、ＨＡＡＨポリペプチドに結合する抗体と、抗
原−抗体複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程、および該抗原−
抗体複合体を検出する工程；
（ｂ）複合体の量を定量し、該体液におけるＨＡＡＨレベルを決定する工程；
および
（ｃ）該体液におけるＨＡＡＨレベルを、正常コントロールＨＡＡＨレベルと
比較する工程であって、ここで経時的なＨＡＡＨレベルの増加が有害な予後を示
す、工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該哺
乳動物に、ＨＡＡＨの発現を阻害する化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記化合物が、ＨＡＡＨアンチセンス核酸である、請求項
１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸が１０〜５０ヌクレオチド
の長さである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の前記配列が、ＨＡＡＨ遺
伝子の５’非翻訳領域である核酸配列に対して相補的である、請求項１０に記載
の方法。
【請求項１４】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＣＡＴ  Ｔ
ＣＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＴ  ３’（配列番号１０）を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＴＴＡ  Ｃ
ＧＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧ  ３’（配列番号１１）を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＣＴＧ  Ｇ
ＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＧ  ３’（配列番号１２）を含む、
請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物がリボザイムである、請求項１０に記載の方法
。
【請求項１８】
前記腫瘍が内胚葉組織に由来する、請求項１０に記載の方
法。
【請求項１９】
前記腫瘍が、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、および胆管
の癌からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍がＣＮＳの腫瘍である、請求項１０に記載の方法
。
【請求項２１】
ＨＡＡＨアンチセンス核酸であって、ここで該核酸が、Ｈ
ＡＡＨ遺伝子の配列に相補的である配列を含む、核酸。
【請求項２２】
ＨＡＡＨアンチセンス核酸であって、ここで該核酸が、Ｈ
ＡＡＨ遺伝子の非コード配列に相補的である配列を含む、核酸。
【請求項２３】
ＨＡＡＨアンチセンス核酸であって、ここで該核酸が、Ｈ
ＡＡＨ遺伝子の５’非翻訳領域の配列に相補的である配列を含む、核酸。
【請求項２４】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＣＡＴ  Ｔ
ＣＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＴ  ３’（配列番号１０）を含む、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＴＴＡ  Ｃ
ＧＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧ  ３’（配列番号１１）を含む、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２６】
前記ＨＡＡＨアンチセンス核酸の配列が、５’ＣＴＧ  Ｇ
ＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＧ  ３’（配列番号１２）を含む、
請求項２３に記載の核酸。
【請求項２７】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該哺
乳動物に、ＨＡＡＨの酵素活性を阻害する化合物を投与する工程を包含する、方
法。
【請求項２８】
前記酵素活性がヒドロキシラーゼ活性である、請求項２７
に記載の方法。
【請求項２９】
前記化合物がＨＡＡＨのドミナントネガティブ変異体であ
る、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＨＡＡＨのドミナントネガティブ変異体が、ＨＡＡＨ
の触媒ドメインにおける変異を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物がＨＡＡＨ特異的イントラボディである、請求
項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物がＬ−ミモシンである、請求項２７に記載の方
法。
【請求項３３】
前記化合物がヒドロキシピリドンである、請求項２７に記
載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該哺
乳動物に、ＩＲＳシグナル伝達経路を介するシグナル伝達を阻害する化合物を投
与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記化合物が、ＩＲＳリン酸化を阻害する、請求項３４に
記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が、ＨＡＡＨプロモーター配列へのＦｏｓまた
はＪｕｎの結合を阻害する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法であって、該哺
乳動物に、ＮＯＴＣＨポリペプチドのＨＡＡＨ水酸化を阻害する化合物を投与す
る工程を包含する、方法。
【請求項３８】
前記化合物が、ＮＯＴＣＨポリペプチドにおけるＥＧＦ様
反復配列の水酸化を阻害する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
腫瘍細胞を殺傷する方法であって、該腫瘍細胞を、ＨＡＡ
Ｈ特異的抗体に連結された細胞傷害剤と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項４０】
ＨＡＡＨのエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項４１】
前記エピトープが、ＨＡＡＨの触媒部位内にある、請求項
４０に記載の抗体。
【請求項４２】
前記モノクローナル抗体が、５Ｃ７、５Ｅ９、１９Ｂ、４
８Ａ、７４Ａ、７８Ａ、８６Ａからなる群から選択される、請求項４０に記載の
抗体。
【請求項４３】
前記モノクローナル抗体が、ＨＡ２３８Ａ、ＨＡ２２１、
ＨＡ２３９、ＨＡ２４１、ＨＡ３２９、またはＨＡ３５５からなる群から選択さ
れる、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４４】
ＨＡＡＨのエピトープに結合するモノクローナル抗体を含
む組成物であって、該抗体は、細胞傷害剤に連結されており、ここで該組成物が
、非腫瘍細胞に比較して腫瘍細胞を優先的に殺傷する、組成物。
【請求項４５】
哺乳動物における腫瘍の診断のためのキットであって、請
求項２９に記載の抗体を含む、キット。
【請求項４６】
前記抗体が、固相に固定化される、請求項４５に記載のキ
ット。
【請求項４７】
前記固相が、アッセイプレート、アッセイウェル、ニトロ
セルロースメンブレン、ビーズ、ディップスティック、および溶出カラムのコン
ポーネントからなる群から選択される、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
候補化合物がＨＡＡＨ酵素活性を阻害するか否かを決定す
る方法であって、
（ａ）ＨＡＡＨポリペプチドを提供する工程；
（ｂ）ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドを提供する工程；
（ｃ）該ＨＡＡＨポリペプチドまたは該ＮＯＴＣＨポリペプチドを、該候補化
合物と接触させる工程；
（ｄ）工程（ｂ）の該ポリペプチドの水酸化を決定する工程であって、該候補
化合物の存在下における水酸化の該化合物の不在下における水酸化と比較した減
少が、該化合物がＨＡＡＨ酵素活性を阻害することを示す、工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
候補化合物がＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害するか否
かを決定する方法であって、
（ａ）ＨＡＡＨを発現する細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞を、該候補化合物と接触させる工程；および
（ｃ）該細胞の核への活性化ＮＯＴＣＨの転移を測定する工程であって、該化
合物の存在下における転移の該化合物の不在下における転移と比較した減少が、
該化合物がＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害することを示す、工程
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本願は、１９９９年１１月８日に出願された特許出願、米国出願番号０９／４
３６，１８４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
（連邦政府支援研究に関する声明）
本発明は、国立衛生研究所認可ＣＡ−３５７１１、ＡＡ−０２６６６、ＡＡ−
０２１６９、およびＡＡ１１４３１による米国政府支持のもとでなされた。本政
府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の背景）
原発性悪性中枢神経系（ＣＮＳ）新生物（特に、神経膠芽細胞腫）は、脳の攻
撃的かつ広範な浸潤および抗癌処置への耐性に起因して非常に致死的である。Ｃ
ＮＳ癌ならびに他の癌タイプの根底にある病原機構の解明が進行しているが、腫
瘍特異的治療アプローチおよび診断方法は、大いに捕らえどころがなかった。
【発明の開示】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物由来の体液を、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）β−
ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）ポリペプチドに結合する抗体を、抗原−抗体複合
体を形成するのに十分な条件下で接触させ、そしてこの抗原−抗体複合体を検出
することによる、哺乳動物における悪性新生物を診断するための方法を特徴とす
る。このようにして検出される悪性新生物は、内胚葉組織に由来する新生物、例
えば、結腸癌、乳癌、膵臓癌、肝臓癌、および胆管の癌を包含する。中枢神経系
（ＣＮＳ）の新生物（例えば、ニューロン細胞および神経膠細胞起源の両方の原
発性悪性ＣＮＳ新生物ならびに転移性ＣＮＳ新生物）もまた検出される。患者由
来組織サンプル（例えば、固形腫瘍の生検）ならびに体液（例えば、ＣＮＳ由来
体液、血液、血清、尿、唾液、痰、肺滲出液、および腹水）は、ＨＡＡＨ特異的
抗体と接触される。
【０００５】
アッセイフォーマットはまた、悪性疾患の予後のために使用される時間的デー
タを生成するために有用である。哺乳動物の悪性新生物の予後のための方法は、
（ａ）哺乳動物由来の体液を、ＨＡＡＨポリペプチドに結合する抗体と、抗原−
抗体複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程、およびこの抗原−抗
体複合体を検出する工程；（ｂ）この複合体の量を定量し、体液中のＨＡＡＨの
レベルを決定する工程；および（ｃ）体液中のＨＡＡＨのレベルを、ＨＡＡＨの
正常コントロールレベルと比較する工程によって実施される。経時的なＨＡＡＨ
のレベルの増大は、疾患の進行性の悪化、および従って有害な予後を示す。
【０００６】
本発明はまた、ＨＡＡＨに結合する抗体を包含する。この抗体は、好ましくは
、ＨＡＡＨのカルボキシ末端触媒ドメインの部位に結合する。あるいは、この抗
体は、細胞の表面に露出されるエピトープに結合する。この抗体は、ポリクロー
ナル抗血清またはモノクローナル抗体である。本発明は、インタクトなモノクロ
ーナル抗体のみならず、免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂま
たは（Ｆａｂ）2フラグメント）；操作された単鎖Ｆｖ分子；またはキメラ分子
（例えば、ある抗体（例えばマウス起源の）の結合特異性、および別の抗体（例
えば、ヒト起源の）の残りの部分を含む抗体）もまた包含する。好ましくは、こ
の抗体は、ＦＢ５０、５Ｃ７、５Ｅ９、１９Ｂ、４８Ａ、７４Ａ、７８Ａ、８６
Ａ、ＨＡ２３８Ａ、ＨＡ２２１、ＨＡ  ２３９、ＨＡ２４１、ＨＡ３２９、また
はＨＡ３５５のようなモノクローナル抗体である。それらのモノクローナル抗体
と同じエピトープに結合する抗体もまた、本発明の範囲内にある。
【０００７】
ＨＡＡＨ特異的イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）は、標的細胞（例えば
、腫瘍細胞）の内部で発現される組換え単鎖ＨＡＡＨ特異的抗体である。このよ
うなイントラボディは、内因性細胞内ＨＡＡＨに結合し、そしてＨＡＡＨ酵素活
性を阻害するか、またはＨＡＡＨが細胞内リガンドに結合することを妨害する。
ＨＡＡＨ特異的イントラボディは、細胞内シグナル伝達を阻害し、そして結果と
して、ＨＡＡＨを過剰発現する腫瘍の増殖を阻害する。
【０００８】
哺乳動物における腫瘍の診断のためのキットは、ＨＡＡＨ特異的抗体を含む。
診断アッセイキットは、標準的な２抗体結合フォーマットで優先的に処方される
。ここでは、１つのＨＡＡＨ特異的抗体が、患者サンプルにおけるＨＡＡＨを捕
捉し、そして別のＨＡＡＨ特異的抗体が、捕捉されたＨＡＡＨを検出するために
使用される。例えば、この捕捉抗体は、固相（例えば、アッセイプレート、アッ
セイウェル、ニトロセルロースメンブレン、ビーズ、ディップスティック、また
は溶出カラムのコンポーネント）に固定化される。二次抗体（すなわち、検出抗
体）は、代表的には、検出可能標識（例えば、比色剤または放射性同位体）でタ
グ化される。
【０００９】
哺乳動物における腫瘍増殖を阻害する方法もまた、本発明の範囲内にある。こ
の方法は、哺乳動物に、ＨＡＡＨの発現または酵素活性を阻害する化合物を投与
することによって行われる。好ましくは、この化合物は、実質的に純粋な核酸分
子（例えば、ＨＡＡＨアンチセンスＤＮＡ）であり、その配列は、ＨＡＡＨのコ
ード配列に相補的である。ＨＡＡＨの発現は、哺乳動物細胞（例えば、腫瘍細胞
）を、ＨＡＡＨアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、合成ＨＡＡＨアンチ
センスオリゴヌクレオチド）と接触させることにより阻害される。アンチセンス
の配列は、ＨＡＡＨ遺伝子のコードまたは非コード領域に相補的である。例えば
、この配列は、ＨＡＡＨ遺伝子の５’非翻訳領域におけるヌクレオチド配列に相
補的である。哺乳動物細胞においてＨＡＡＨ発現を阻害するＨＡＡＨアンチセン
スオリゴヌクレオチドの例は、配列番号１０、１１、または１２を含むオリゴヌ
クレオチドを包含する。ＨＡＡＨアンチセンス核酸は、ＨＡＡＨを過剰発現する
神経膠芽細胞腫細胞または他の腫瘍細胞に導入される。標的細胞におけるアンチ
センス核酸のＨＡＡＨ転写物への結合は、細胞によるＨＡＡＨ産生の減少を生じ
る。用語「アンチセンス核酸」とは、ｍＲＮＡの一部に相補的であり、そしてｍ
ＲＮＡにハイブリダイズし、そしてこの翻訳を妨害する核酸（ＲＮＡまたはＤＮ
Ａ）を意味する。好ましくは、アンチセンスＤＮＡは、５’調節配列またはＨＡ
ＡＨ  ｍＲＮＡのコード配列の５’部分（例えば、シグナルペプチドをコードす
る配列またはＨＡＡＨ遺伝子のエキソン１内の配列）に相補的である。アンチセ
ンスＤＮＡを細胞に導入するための標準的な技術が使用され得る。これらは、ア
ンチセンスＤＮＡが、アンチセンスＲＮＡが転写されるテンプレートである技術
を包含する。この方法は、ＨＡＡＨの発現がアップギュレートされる（例えば、
細胞の悪性形質転換の結果として）腫瘍を処置するものである。オリゴヌクレオ
チドの長さは、少なくとも１０ヌクレオチドであり、天然に生じるＨＡＡＨ転写
物と同程度の長さであり得る。好ましくは、この長さは、１０ヌクレオチドと５
０ヌクレオチドとの間（両数値を含む）である。より好ましくは、この長さは、
１０ヌクレオチドと２０ヌクレオチドとの間（両数値を含む）である。
【００１０】
「実質的に純粋なＤＮＡまたはＲＮＡ」とは、この核酸が、本発明のＤＮＡが
由来する生物の天然に生じるゲノムではＨＡＡＨ遺伝子に隣接している遺伝子を
含まないことを意味する。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律複製プ
ラスミドもしくはウイルス、またはその天然部位以外の部位で原核生物もしくは
真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれるか；あるいは他の配列と独立した別個の
分子（例えば、ｃＤＮＡ、または、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化に
よって生成されたゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換え
核酸を包含する。それはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリ
ッド遺伝子の一部である組換え核酸（例えば、キメラポリペプチドをコードする
核酸（例えば、細胞傷害性ポリペプチドに連結された抗体フラグメントをコード
する核酸））を包含する。あるいは、ＨＡＡＨ発現は、リボザイム、またはＨＡ
ＡＨプロモーター配列へのＦｏｓまたはＪｕｎの結合を阻害する化合物を投与す
ることにより阻害される。
【００１１】
ＨＡＡＨの酵素活性を阻害する化合物は、哺乳動物における腫瘍増殖を阻害す
るために有用である。ＨＡＡＨの酵素活性とは、ポリペプチドの上皮増殖因子（
ＥＧＦ）様ドメインの水酸化を意味する。例えば、ＥＧＦ様ドメインは、コンセ
ンサス配列ＣＸ7ＣＸ4ＣＸ10ＣＸＣＸ8Ｃ（配列番号１）を有する。ＨＡＡＨヒ
ドロキシラーゼ活性は、細胞内で阻害される。例えば、ＨＡＡＨのドミナントネ
ガティブ変異体（またはこのような変異体をコードする核酸）が投与される。こ
のドミナントネガティブＨＡＡＨ変異体は、天然に生じるＨＡＡＨ配列のヒスチ
ジンの第一鉄の鉄結合部位を、非鉄結合アミノ酸に変更する変異を含み、それに
よりＨＡＡＨのヒドロキシラーゼ活性を廃止する。変異される（例えば、欠失ま
たは置換される）ヒスチジンは、ＨＡＡＨのカルボキシ末端触媒ドメイン中に位
置する。例えば、この変異は、ネイティブＨＡＡＨ配列のアミノ酸６５０〜７０
０の間（例えば、Ｈｉｓモチーフ、配列番号２の下線配列）に位置する。例えば
、変異は、配列番号２の残基６７１、６７５、６７９、または６９０にある。Ｈ
ＡＡＨ特異的イントラボディはまた、ＨＡＡＨに結合し、そして細胞内ＨＡＡＨ
酵素活性を阻害する（例えば、ＨＡＡＨの触媒ドメイン内のエピトープに結合す
ることにより）のに有用である。他の化合物（例えば、Ｌ−ミモシン（ｍｉｍｏ
ｓｉｎｅ）またはヒドロキシピリドン）は、ＨＡＡＨヒドロキシラーゼ活性を阻
害するために、腫瘍部位に直接、または全身的に投与される。
【００１２】
（表１：ＨＡＡＨのアミノ酸配列）
【００１３】
【表１】
2008292486.tif 000002
（配列番号２；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｓ８３３２５；Ｈｉｓモチーフに下線
を引く；触媒ドメイン内の保存された配列は、太字で示す）。
【００１４】
例えば、ＨＡＡＨ水酸化を阻害する化合物は、ＨＡＡＨリガンドに結合するが
、細胞内シグナルを伝達しないポリペプチド、またはＨＡＡＨの触媒部位に変異
を含むポリペプチドである。このようなポリペプチドは、天然に生じるＨＡＡＨ
アミノ酸配列またはそれらのフラグメントに少なくとも５０％同一であり、そし
てＥＧＦ様反復配列を含む基質のＨＡＡＨ水酸化を阻害する能力を有するアミノ
酸配列を含む。より好ましくは、このポリペプチドは、配列番号２に対して、少
なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは少なくと
も９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
実質的に純粋なＨＡＡＨポリペプチドまたはＨＡＡＨ由来ポリペプチド（例え
ば、変異ＨＡＡＨポリペプチド）は、好ましくは、このポリペプチドをコードす
る組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学合成することによって、
得られる。ポリペプチドまたはタンパク質は、それが、その天然状態でこれに付
随する夾雑物（タンパク質および他の天然に生じる有機分子）と分離されている
とき、実質的に純粋である。代表的には、このポリペプチドは、それが、調製に
おけるタンパク質の少なくとも６０重量％を占めるとき、実質的に純粋である。
好ましくは、調製におけるタンパク質は、重量基準で、少なくとも７５％、より
好ましくは、少なくとも９０％、および最も好ましくは、少なくとも９９％のＨ
ＡＡＨである。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析）によって測定される
。従って、実質的に純粋なポリペプチドは、真核生物に由来するがＥ．ｃｏｌｉ
もしくは別の原核生物、またはこのポリペプチドが由来した以外の真核生物にお
いて産生される組換えポリペプチドを包含する。
【００１６】
このようなＨＡＡＨまたはＨＡＡＨ由来ポリペプチドをコードする核酸分子も
また、本発明の範囲内にある。
【００１７】
（表２：ＨＡＡＨ  ｃＤＮＡ配列）
【００１８】
【表２】
2008292486.tif 000003
（配列番号３；ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｓ８３３２５；開始メチオニンをコード
するコドンに下線を引く）。
【００１９】
腫瘍増殖を阻害する方法はまた、ＮＯＴＣＨポリペプチドのＨＡＡＨ水酸化を
阻害する化合物を投与する工程を包含する。例えば、この化合物は、ＮＯＴＣＨ
ポリペプチドにおけるＥＧＦ様システインリッチ反復配列（例えば、コンセンサ
ス配列ＣＤＸＸＸＣＸＸＫＸＧＮＧＸＣＤＸＸＣＮＮＡＡＣＸＸＤＧＸＤＣ（配
列番号４）を含む配列）の水酸化を阻害する。ＥＧＦ様システインリッチ反復配
列を含むポリペプチドは、内因性ＮＯＴＣＨの水酸化をブロックするために投与
される。
【００２０】
ＨＡＡＨを過剰発現する腫瘍の増殖はまた、インスリンレセプター基質（ＩＲ
Ｓ）シグナル伝達経路を介するシグナル伝達を阻害する化合物を投与することに
よって阻害される。好ましくは、この化合物は、ＩＲＳリン酸化を阻害する。例
えば、この化合物は、配列番号５の残基４６、４６５、５５１、６１２、６３２
、６６２、７３２、９４１、９８９、または１０１２に結合し、そしてリン酸化
を阻害するペプチドまたは非ペプチド化合物である。化合物は、ポリペプチド（
例えば、ＩＲＳリン酸化部位（例えば、Ｇｌｕ／Ｔｙｒ部位）をブロックするポ
リペプチド）を包含する。抗体（例えば、リン酸化部位を含むＩＲＳのカルボキ
シ末端ドメインに結合する抗体）は、ＩＲＳリン酸化をブロックし、そして結果
としてこの経路に沿ったシグナル伝達をブロックする。ＩＲＳリン酸化の阻害は
、順に、細胞増殖の阻害に至る。ＩＲＳリン酸化を阻害する他の化合物は、ビタ
ミンＤアナログＥＢ  １０８９およびワートマニン（Ｗｏｒｔｍａｎｎｉｎ）を
包含する。
【００２１】
ＨＡＡＨ過剰産生腫瘍細胞は、腫瘍細胞の細胞内および表面上の両方でＨＡＡ
Ｈを発現することが示された。従って、腫瘍細胞を殺傷する方法は、このような
腫瘍細胞をＨＡＡＨ特異的抗体に連結された細胞傷害剤と接触させることより行
われる。ＨＡＡＨ特異的抗体（抗体フラグメント、または細胞外ＨＡＡＨに結合
するリガンド）は、腫瘍細胞の表面にキメラ分子を指向させ、この細胞傷害剤が
、この抗体が結合される腫瘍細胞を損傷または殺傷させることを可能にする。モ
ノクローナル抗体は、ＨＡＡＨのエピトープ（例えば、細胞の表面上もしくはＨ
ＡＡＨの触媒部位に露出されたエピトープ）に結合する。細胞傷害性組成物は、
非腫瘍細胞に比較して腫瘍細胞を優先的に殺傷する。
【００２２】
ＨＡＡＨを過剰発現する腫瘍の増殖を阻害する抗腫瘍剤を同定するためのスク
リーニング方法もまた、本発明の範囲内にある。候補化合物がＨＡＡＨ酵素活性
を阻害するか否かを決定するために使用されるスクリーニング方法は、以下の工
程を包含する：（ａ）ＨＡＡＨポリペプチド（例えば、ＨＡＡＨのカルボキシ末
端触媒部位を含むポリペプチド）を提供する工程；（ｂ）ＥＧＦ様ドメインを含
むポリペプチドを提供する工程；（ｃ）ＨＡＡＨポリペプチドまたはＥＧＦ様ポ
リペプチドを、候補化合物と接触させる工程；および（ｄ）工程（ｂ）のＥＧＦ
様ポリペプチドの水酸化を決定する工程。候補化合物の存在下でのこの化合物の
不在下に比較した水酸化の減少は、この化合物が、ＮＯＴＣＨのようなタンパク
質におけるＥＧＦ様ドメインのＨＡＡＨ水酸化を阻害することを示す。
【００２３】
ＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害する抗腫瘍剤は、（ａ）ＨＡＡＨを発現す
る細胞を提供する工程；（ｂ）この細胞を候補化合物と接触させる工程；および
（ｃ）この細胞の核への活性化ＮＯＴＣＨの転移を測定する工程によって同定さ
れる。転移は、ＮＯＴＣＨの１１０ｋＤａ活性化フラグメントに結合する抗体の
ような試薬を使用することによって測定される。候補化合物の存在下でのこの化
合物の不在下に比較した転移の減少は、この化合物が、ＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活
性化を阻害し、それによりＮＯＴＣＨ媒介シグナル伝達およびＨＡＡＨ過剰発現
腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【００２４】
本明細書中に記載のヌクレオチドおよびアミノ酸比較は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ
ソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）
を用いて実施された。使用されるＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールは、Ｃｌｕｓｔａ
ｌ  Ｖ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５（２）：１５１−
１５３）であった。使用されるパラメーターは、ギャップペナルティー１０、ギ
ャップ長さペナルティー１０であった。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、標準的な技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌらに記載
の技術（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９８９））を用いて
実施される。「高いストリンジェンシー」とは、高温および低塩濃度（例えば、
０．１×ＳＳＣの塩濃度で６５℃での洗浄条件）によって特徴付けられる核酸ハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件をいう。「低」から「中程度の」ストリン
ジェンシーとは、低温および高塩濃度（例えば、１．０×ＳＳＣの塩濃度で６０
℃未満での洗浄条件）によって特徴付けられるＤＮＡハイブリダイゼーションお
よび洗浄条件をいう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、５０％ホルムア
ミドの存在下の４２℃でのハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣおよび１％ＳＤ
Ｓの存在下での６５℃での第一の洗浄；続いて、０．１％×ＳＳＣの存在下での
６５℃での第二の洗浄を包含する。ＨＡＡＨ遺伝子配列に対して約５０％配列同
一性を有するＤＮＡ配列を検出するために適したより低いストリンジェンシー条
件は、例えば、ホルムアミドの不在下での約４２℃でのハイブリダイゼーション
；４２℃、６×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳでの第一の洗浄；ならびに５０℃、６
×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳでの第二の洗浄によって検出される。
【００２６】
本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい実施形態の説明、および特許
請求の範囲から明らかである。
【００２７】
（詳細な説明）
ＨＡＡＨは、コラーゲン生合成において鍵となる役割を演じるプロリルおよび
リジルヒドロキシラーゼの（α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼファミ
リーに属するタンパク質である。この分子は、第一鉄の鉄の存在下でいくつかの
タンパク質のＥＧＦ様ドメインにおけるアスパラギン酸またはアスパラギン残基
を水酸化する。これらのＥＧＦ様ドメインは、保存されたモチーフを含む。この
モチーフは、タンパク質（例えば、凝固因子、細胞外細胞間質タンパク質、ＬＤ
Ｌレセプター、ＮＯＴＣＨホモログ、またはＮＯＴＣＨリガンドホモログ）にお
ける反復配列を形成する。
【００２８】
α−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼであるアスパルチル（アスパラギ
ニル）β−ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）は、種々のタンパク質のＥＧＦ様ドメイ
ンにおける１つのアスパラギン酸またはアスパラギン残基を特異的に水酸化する
。ヒトＡｓｐＨ（（ｈＡｓｐＨ））をコードする４．３ｋｂ  ｃＤＮＡは、形質
転換細胞における２．６ｋｂおよび４．３ｋｂ転写物とハイブリダイズし、そし
てより大きな転写物の推定アミノ酸配列は、約８５ｋＤａのタンパク質をコード
する。インビボでの転写および翻訳、ならびにウェスタンブロット分析の両方と
も、触媒性Ｃ末端の翻訳後切断から生じ得る５６ｋＤａタンパク質もまた示す。
【００２９】
ＡＡＨの生理的機能は、ビタミンＫ依存性凝血タンパク質におけるアスパラギ
ン酸の翻訳後β水酸化である。しかしながら、いくつかの悪性新生物におけるＡ
ＡＨの豊富な発現、および多くの正常細胞における低いレベルのＡＡＨは、悪性
におけるこの酵素の役割を示す。ＡＡＨ遺伝子はまた、栄養膜細胞層において高
度に発現されるが、胎盤の合胞体栄養細胞層においてはあまり発現されない。栄
養膜細胞層は、胎盤移植を媒介する侵襲性細胞である。ヒト胆管癌、肝細胞癌、
結腸癌、および乳癌におけるＡＡＨ発現レベルの増大は、侵襲性または転移性の
病変に主に関連した。さらに、ＡＡＨの過剰発現は、ＤＮＡ合成の増大および細
胞増殖を厳密には反映しない。なぜなら、高レベルのＡＡＨ免疫反応性が１００
％の胆管癌において観察されたが、胆管の再生または非新生物性増殖と関連した
ヒトまたは実験的疾患プロセスにおいてはそうではなかったからである。ＡＡＨ
過剰発現および付随する高レベルのβヒドロキシラーゼ活性は、形質転換新生物
細胞の侵襲性増殖に至る。ＨＡＡＨ発現の増大の検出は、遺伝子産物を過剰発現
するとして特徴付けられている癌タイプの早期かつ信頼性ある診断に有用である
。
【００３０】
（悪性腫瘍の診断）
ＨＡＡＨは、正常非癌性細胞に比較して、内胚葉起源の多くの腫瘍およびＣＮ
Ｓ腫瘍の少なくとも９５％において過剰発現される。患者由来組織サンプル（例
えば、固体組織または体液）におけるＨＡＡＨ遺伝子産物の増大は、標準的な方
法（例えば、ウェスタンブロットアッセイ、またはＥＬＩＳＡのような定量アッ
セイによって）を用いて実施される。例えば、ＨＡＡ特異的抗体を用いる標準的
な競合ＥＬＩＳＡフォーマットが、患者ＨＡＡＨレベルを定量するために使用さ
れる。あるいは、捕捉抗体として第一の抗体および検出抗体として第二のＨＡＡ
Ｈ特異的抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡが使用される。
【００３１】
ＨＡＡＨを検出する方法は、体液の成分を固体基材（例えば、マイクロタイタ
ープレート、ビーズ、ディップスティック）に結合されたＨＡＡＨ特異的抗体と
接触させる工程を包含する。例えば、この固体基材は、体液の患者由来サンプル
中に浸漬され、洗浄され、そしてこの固体基材は、試薬と接触されて、この固体
基材に存在する免疫複合体の存在を検出する。
【００３２】
試験サンプルにおけるタンパク質は、固体基材上に固定化される（例えば、結
合される）。タンパク質を固体基材に共有結合的または非共有結合的に結合する
ための方法および手段は、当該分野において公知である。固体表面の性質は、ア
ッセイフォーマットに依存して変動し得る。マイクロタイターウェルにおいて実
施されるアッセイについては、固体表面は、マイクロタイターウェルまたはカッ
プの壁である。ビーズを用いるアッセイについては、固体表面は、ビーズの表面
である。ディップスティック（すなわち、繊維または紙のような有孔性または繊
維性材料から作製された固形物）を用いるアッセイにおいては、この表面は、デ
ィップスティックが作製された材料の表面である。有用な固体支持体の例は、ニ
トロセルロース（例えば、メンブレンまたはマイクロタイターウェル形態で）、
ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマクロタイターウェル）、ポリスチレン
ラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、ポリビニリジ
ンフルオライド（ＩＭＭＵＬＯＮTMとして公知）、ジアゾ化紙、ナイロンメンブ
レン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズを包含する。抗体を含む体支持
体は、代表的には、試験サンプルとの接触後、そして結合された免疫複合体の検
出前に洗浄される。試験サンプルとの抗体のインキュベーション後、検出可能標
識による免疫複合体の検出が行われる。例えば、この標識は、酵素、蛍光、化学
発光、放射能、または染料である。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセ
イもまた当該分野において公知であり、このようなアッセイとして、例えば、ビ
オチンおよびアビジンを利用するアッセイが挙げられる。
【００３３】
ＨＡＡＨ検出試薬（例えば、抗体）は、キットの形態でパッケージングされる
。これは、１つ以上のＨＡＡＨ特異的抗体、コントロール処方物（陽性および／
または陰性）、および／または検出可能標識を含む。アッセイは、当該分野にお
いて公知の標準的な２抗体サンドイッチアッセイフォーマットの形態であり得る
。
【００３４】
（ＨＡＡＨ特異的抗体の産生）
抗ＨＡＡＨ抗体は、当該分野において周知の技術によって得られた。このよう
な抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルである。ポリクローナル抗体は
、標準的な方法（例えば、Ｇｈｏｓｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ９３，  ３２６−３２７，  １９８３に記載の方法によ
り）を用いて得られた。ＨＡＡＨポリペプチド、またはそれらの抗原性フラグメ
ントは、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、またはげっ歯類の抗血清においてポリクローナ
ル抗体の産生を刺激するための免疫原として使用された。免疫原として有用なポ
リクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方の産生のための抗原性ポリペ
プチドは、ＨＡＡＨ触媒ドメインを含むポリペプチドを包含する。例えば、免疫
原性ポリペプチドは、全長成熟ＨＡＡＨタンパク質またはカルボキシ末端触媒ド
メインを含むＨＡＡＨフラグメント（例えば、配列番号２のＨｉｓモチーフを含
むＨＡＡＨポリペプチド）である。
【００３５】
本明細書中に開示した抗体と同じエピトープに結合する抗体は、当該分野で公
知の標準的な方法（例えば、競合結合アッセイ）を用いて同定される。
【００３６】
モノクローナル抗体は、標準的な技術によって得られた。１０μｇの精製組換
えＨＡＡＨポリペプチドは、完全フロイントアジュバント中でマウスに腹腔内投
与され、次いで最初の接種の３〜５ヶ月後に、静脈内で（尾静脈に）ブーストを
１回行った。抗体産生ハイブリドーマは、標準的な方法を用いて作製された。Ｈ
ＡＡＨポリペプチドについて高度に特異的である抗体を産生するハイブリドーマ
を同定するために、ハイブリドーマは、免疫に使用した同じポリペプチド免疫原
を用いてスクリーニングされた。ＨＡＡＨ結合活性を有するとして同定された抗
体はまた、以下に記載の酵素アッセイを使用してＨＡＡＨ触媒活性を阻害する能
力についてスクリーニングされる。好ましくは、この抗体は、少なくとも約１０
8リットル／ｍｏｌの結合親和力およびより好ましくは、少なくとも約１０9リッ
トル／ｍｏｌの親和力を有する。
【００３７】
モノクローナル抗体は、当該分野において公知の方法によってヒト化される。
例えば、所望の結合特異性を有するＭＡｂは、商業的にヒト化され得る（Ｓｃｏ
ｔｇｅｎｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【００３８】
ＨＡＡＨ特異的イントラボディは、以下のようにして産生される。適切なモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマの同定後、抗体をコードするＤＮＡが
クローニングされる。単鎖ＨＡＡＨ特異的抗体をコードするＤＮＡ（ここで、重
鎖および軽鎖可変ドメインがフレキシブルなリンカーペプチドによって分離され
る）が、公知の方法（例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、１９９３，Ｐｒｏｃ．  Ｎａ
ｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：７８８９−７８９３およびＭａｒ
ａｓｃｏら、１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１１−１５）を用いて
発現ベクターにクローニングされる。このような構築物は、例えば、抗体の細胞
内産生のための標準的な遺伝子送達技術を用いて、細胞に導入される。細胞内抗
体（すなわち、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ））が、ＨＡＡＨによるシ
グナル伝達を阻害するために使用される。ＨＡＡＨのカルボキシ末端触媒ドメイ
ンに結合するイントラボディは、ＥＧＦ様標的配列を水酸化するＨＡＡＨの能力
を阻害する。
【００３９】
腫瘍細胞の表面でＨＡＡＨの細胞表面露出エピトープに結合するＨＡＡＨ特異
的抗体（またはそのフラグメント）を連結する方法は、公知の方法を用いて、公
知の細胞傷害剤（例えば、リシンまたはジフテリア毒素）に連結される。
【００４０】
（悪性腫瘍を処置する方法）
ＨＡＡＨを過剰発現するとして特徴付けられた腫瘍（例えば、内胚葉起源の腫
瘍またはＣＮＳ腫瘍）を有する患者は、ＨＡＡＨアンチセンス核酸を投与するこ
とによって処置される。
【００４１】
アンチセンス療法は、肝細胞癌、胆管癌、神経膠芽細胞腫、および神経芽細胞
腫を罹患する患者においてＨＡＡＨの発現を阻害するために使用される。例えば
、ＨＡＡＨアンチセンス鎖（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）は、ｍＲＮＡ転写
物に結合し得る形態で細胞に直接的に導入される。あるいは、一旦標的細胞内に
あると、適切なアンチセンスｍＲＮＡに転写される配列を含むベクターが、投与
され得る。標的ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス核酸は、通常一本鎖
のｍＲＮＡ転写物と会合し、それにより翻訳および従ってタンパク質の発現を妨
害することにより、遺伝子によりコードされるポリペプチド産物の産生を減少ま
たは阻害する。例えば、プロモーター（例えば、組織特異的または腫瘍特異的プ
ロモーター）を含むＤＮＡは、ＤＮＡ配列（アンチセンステンプレート）（これ
は、アンチセンスＲＮＡに転写される）に作動可能に連結される。「作動可能に
連結される」とは、コード配列および調節配列（すなわち、プロモーター）が、
適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合されたときに遺
伝子発現を可能にするように接続されることを意味する。
【００４２】
ＨＡＡＨ  ｍＲＮＡの種々の部分に相補的なオリゴヌクレオチドは、標準的な
方法に従って、腫瘍細胞におけるＨＡＡＨの産生を減少させるその能力について
、インビトロで試験された（例えば、ＦＯＣＵＳ肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株を用
いて）。候補アンチセンス組成物と接触された細胞においてＨＡＡＨ遺伝子産物
の、候補組成物の不在下で培養された細胞に比較した減少は、ＨＡＡＨ特異的抗
体または他の検出戦略を用いて検出される。インビトロでの細胞に基づくアッセ
イまたは無細胞アッセイにおいてＨＡＡＨの産生を減少させる配列は、次いで、
悪性新生物を有する動物におけるＨＡＡＨ産生の減少を確認するために、ラット
またはマウスにおいてインビボで試験される。
【００４３】
アンチセンス療法は、標準的なベクターおよび／または遺伝子送達系によって
アンチセンス核酸を患者に投与することによって実施される。適切な遺伝子送達
系は、リポソーム、レセプター媒介送達系、裸のＤＮＡ、およびウイルスベクタ
ー（例えば、とりわけ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、
およびアデノ随伴ウイルス）を包含し得る。ＨＡＡＨ産生の減少は、ＩＲＳシグ
ナル伝達経路を介するシグナル伝達の減少を生じる。治療用核酸組成物は、薬学
的に受容可能なキャリアにおいて処方される。治療用組成物はまた、上記のよう
な遺伝子送達系を含み得る。薬学的に受容可能なキャリアは、動物への投与のた
めに適切な生物学的に適合性のビヒクルである：例えば、生理食塩水。化合物の
療有効量は、医学的に所望とされる結果（例えば、ＨＡＡＨ遺伝子産物の産生の
減少または処置動物における腫瘍増殖の減少）を生じ得る量である。
【００４４】
非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋内、および腹腔内送達経路）は、核酸
またはＨＡＡＨ阻害ペプチドまたは非ペプチド化合物を送達するために使用され
得る。ＣＮＳ腫瘍の処置のために、脳脊髄液への直接注入が有用である。血液脳
関門は、癌患者において補償され得、全身的に投与された薬物が関門を通ってＣ
ＮＳに通過することを可能にする。治療用化合物のリポソーム処方物もまた、血
液脳関門の通過を促進し得る。
【００４５】
任意の一患者のための投与量は、多くの要因（患者の大きさ、体表面積、年齢
、投与される特定の核酸、性、投与時間および経路、全体的な健康、および同時
に投与される他の薬物を含む）に依存する。核酸の静脈内投与のための投与量は
、およそ１０6〜１０22コピーの核酸分子である。
【００４６】
リボザイム療法もまた、癌患者においてＨＡＡＨ遺伝子発現を阻害するために
使用される。リボザイムは、特異的ｍＲＮＡに結合し、次いでそれを予め決定さ
れた切断点で切断し、それによって転写物を破壊する。これらのＲＮＡ分子は、
当該分野で公知の方法に従って、ＨＡＡＨ遺伝子の発現を阻害するために使用さ
れる（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９９４，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍ．１０３：
８５Ｓ−８９Ｓ；Ｃｚｕｂａｙｋｏら、１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６９：２１３５８−２１３６３；Ｍａｈｉｅｕら、１９９４，Ｂｌｏｏｄ  ８４
：３７５８−６５；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９４，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ
．５４：１２７１−１２７５）。
【００４７】
（ＮＯＴＣＨシグナル伝達の活性化）
ＮＯＴＣＨシグナル伝達は、ＡＡＨを高度に発現する細胞において活性化され
る。図１４Ａは、ウェスタンブロットを用いることによる１１０ｋＤａ  ＮＯＴ
ＣＨフラグメントの存在を示す。酵素活性ＡＡＨの過剰発現は、１００ｋＤａの
切断された活性ＮＯＴＣＨ−１の提示によって示される（レーン１、偽ＤＮＡト
ランスフェクトクローン；レーン２、クローン７；およびレーン３、クローン８
）。対して、ＮＯＴＣＨ−２は活性化されなかった。ＡＡＨを発現するクローン
において、偽ＤＮＡトランスフェクトクローンに比較した全長Ｊａｇｇｅｄリガ
ンドの発現の増強があった。チューブリンは、タンパク質ローディングのための
内部コントロールとして使用された。
【００４８】
Ｈｅｓ−１（公知の下流エフェクター遺伝子）の発現は、ＮＯＴＣＨシグナル
伝達によって活性化される（図１４Ｂ）。ＡＡＨ発現クローンのみが、転写因子
としてＮｏｔｃｈ発現を活性化し、続いて競合ＲＴ−ＰＣＲによって明らかにさ
れるように、Ｈｅｓ−１遺伝子発現を上方調節する。下のほうのパネルは、内部
コントロールとして働くＧＡＰＤＩＩのＲＴ−ＰＣＲ産物である。図１４Ｃは、
ヒトＮＯＴＣＨ−１（ｈＮＯＴＣＨ−１）およびＪａｇｇｅｄ−１の発現を示し
、ここでＩＲＳ−１シグナル伝達はドミナントネガティブ変異体（ＤｈＩＲＳ−
１）によって減少される。このような細胞は、下方調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａ
ｔｉｏｎ）ＡＡＨ発現を示し、そしてウェスタンブロット分析によるＮＯＴＣＨ
−１およびＪａｇｇｅｄレベルの平行した減少を示す。チューブリンは、タンパ
ク質ローディングについての内部コントロールとして使用された。
【００４９】
（ＨＡＡＨ酵素活性を阻害する化合物を同定する方法）
アスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｌａ
ｓｅｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）（ＡＡＨ）活性は、インビトロまたはインビボで測
定される。例えば、ＨＡＡＨは、ＥＧＦ様ポリペプチドドメインのアスパルチル
およびアスパラギル残基のβ炭素の翻訳後修飾を触媒する。ヒドロキシラーゼ活
性を阻害する化合物を同定するためのアッセイは、化合物の不在下（または予め
決定されたコントロール値）での平行反応と比較して候補化合物が存在する酵素
反応における水酸化のレベルを比較することにより実施される。試験管において
実施される標準的なヒドロキシラーゼアッセイは、当該分野で公知である（例え
ば、Ｌａｖａｉｓｓｉｅｒｅら、１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８
：１３１３−１３２３；Ｊｉａら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７
：１４３２２−１４３２７；Ｗａｎｇら、１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６６：１４００４−１４０１０；またはＧｒｏｎｋｅら、１９９０，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５）。ヒドロキシラーゼ活性はまた
、９６ウェルマイクロタイタープレートフォーマットにおいて二酸化炭素を用い
て測定される（14ＣＯ2捕捉アッセイ）（Ｚｈａｎｇら、１９９９，Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７１：１３７−１４２）。これらのアッセイは、容易に自動
化され、そしてヒドロキシラーゼ阻害活性を有する化合物を同定するための候補
化合物の高処理能スクリーニングに適する。
【００５０】
ＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害する候補化合物は、ＨＡＡＨを発現するか
または過剰発現する細胞（例えば、ＦＯＣＵＳ  ＨＣＣ細胞）において活性化Ｎ
ＯＴＣＨの減少を検出することにより同定される。細胞は、候補化合物の存在下
で培養される。平行培養物が、候補化合物の不在下でインキュベートされる。こ
の化合物がＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害するか否かを評価するために、細
胞の核への活性化ＮＯＴＣＨの転移が測定される。転移は、細胞の核においてＮ
ＯＴＣＨの１１０ｋＤａ活性化フラグメントを検出することにより測定される。
活性化フラグメントは、活性化の際に大きな（およそ３００ｋＤａの）膜貫通Ｎ
ＯＴＣＨタンパク質から切断される。ＮＯＴＣＨ転移を測定する方法は、公知で
ある（例えば、Ｓｏｎｇら、１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：６９５９−６９６３またはＣａｐｏｂｉａｎｃｏら、１９
９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１７：６２６５−６２７３に記載の方法）
。候補化合物の不在下に比較した候補化合物の存在下の転移の減少は、この化合
物が、ＮＯＴＣＨのＨＡＡＨ活性化を阻害し、それにより、ＮＯＴＣＨ媒介シグ
ナル伝達およびＨＡＡＨ過剰発現腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。
【００５１】
ＩＲＳのリン酸化を阻害する化合物についてのスクリーニングの方法は、候補
化合物の存在および不在下でＩＲＳ発現細胞をインキュベートし、そしてこの細
胞におけるＩＲＳリン酸化レベルを評価することにより、実施される。化合物の
不在下に比較した、化合物の存在下で培養した細胞におけるリン酸化の減少は、
この化合物が、ＩＲＳ−１リン酸化および結果としてＨＡＡＨ過剰発現腫瘍の増
殖を阻害することを示す。あるいは、このような化合物は、当該分野で公知のイ
ンビトロリン酸化アッセイ（例えば、ポリ（Ｇｌｕ／Ｔｙｒ）のような合成基質
のリン酸化を測定したもの）において同定される。
【００５２】
（実施例１：ＨＡＡＨの発現増大は、悪性形質転換と関連する）
ＨＡＡＨは、形質転換関連タンパク質においてＥＧＦ様ドメインを水酸化する
高度に保存された酵素である。ＨＡＡＨ遺伝子は、多くの癌タイプ（ヒト肝細胞
癌および胆管癌を含む）において過剰発現される。ＨＡＡＨ遺伝子発現は、胆管
癌に比較して、ヒト疾患およびラットモデルの両方において胆管増殖の間に検出
不能であることが見出された。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＨＡＡＨの過剰発現
は、悪性表現型の生成と関連し、そして酵素活性は、細胞形質転換のために必要
とされることが見出された。以下に記載のデータは、ＨＡＡＨの過剰発現が胆上
皮細胞の細胞形質転換に連結されることを示す。
【００５３】
ヒト肝細胞起源の形質転換悪性細胞において特異的に過剰発現される分子を同
定するために、ＦＯＣＵＳ肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株を、悪性表現型と関連した
タンパク質を特異的または優先的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生
成する免疫原として使用した。ＨｅｐＧ２  ＨＣＣ細胞由来のλＧＴ１１  ｃＤ
ＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、そしてＦＯＣＵＳ細胞株に対して産
生されるＨＡＡＨ特異的ｍＡｂが、ＨＡＡＨ  ｃＤＮＡによりコードされるタン
パク質のエピトープを認識することが見いだされた。ＨＡＡＨ酵素は、いくつか
の異なるヒト形質転換細胞株および腫瘍組織において隣接するヒト組織対応物に
比較して上方調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）されることが見いだされた。異なる
ヒト悪性組織における過剰発現されたＨＡＡＨ酵素は、触媒的に活性であること
が見出された。
【００５４】
ＨＡＡＨ遺伝子発現を、増殖胆管において、およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におい
て試験した。悪性表現型の生成におけるその役割を、形質転換病巣の形成、足場
非依存性増殖の指標としてソフトアガーにおける増殖、およびヌードマウスにお
ける腫瘍形成によって測定した。形質転換表現型の誘導における酵素活性の役割
を、ヒドロキシラーゼ活性を廃する触媒部位における変異を有するｃＤＮＡ構築
物を用いることによって測定した。この結果は、ＨＡＡＨ遺伝子の発現の増加が
、胆管の悪性形質転換と関連することを示した。
【００５５】
以下の材料および方法を使用して、以下に記載するデータを生成した。
【００５６】
（抗体）
ＦＢ５０モノクローナル抗体を、ＦＯＣＵＳ  ＨＣＣ細胞でＢａｌｂ／Ｃマウ
スを細胞免疫することによって生成した。モノクローナル抗デング熱ウイルス抗
体を非関連コントロールとして使用した。ＨＢＯＨ２モノクローナル抗体を、５
２ｋＤａ組換えＨＡＡＨポリペプチドに対して生成した。これは、マウスおよび
ヒトタンパク質由来のβヒドロキシラーゼの触媒ドメインを認識する。ポリクロ
ーナル抗ＨＡＡＨ抗体は、ラットヒドロキシラーゼタンパク質と交差反応する。
コントロール抗体抗Ｅｒｋ−１をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ｉｎｃ．，ＣＡから購入した。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識した
ヒツジ抗マウス抗血清およびロバ抗ウサギ抗血清を、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌ
ｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬから入手した。
【００５７】
（構築物）
マウス全長ＡＡＨ構築物（ｐＮＨ３７６）および触媒活性が廃止された部位指
向性変異構築物（ｐＮＨ３７６−Ｈ６６０）を、真核生物発現ベクターｐｃＤＮ
Ａ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）にク
ローニングした。全長ヒトＡＡＨを、原核生物発現ベクターｐＢＣ−ＳＫ＋（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローニングした。全長ヒト
ＡＡＨ（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｓ８３３２５）をｐｃＤＮＡ３ベクターのＥｃ
ｏＲＩ部位にサブクローニングした。
【００５８】
（胆管増殖の動物モデル）
ラットを、グループ９を除いて各々３匹の動物の９つの別個の群に分けた。グ
ループ９は５匹のラットを含んだ。グループ１は、非手術コントロール群であり
、グループ２は、偽操作手術コントロールであった。残りのグループは、肝臓内
胆管増殖を誘導するために総胆管結紮（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を受け、そして表３
に示すように６、１２、２４、４８時間、および４、８および１６日目に評価し
た。動物をＣＯ2で窒息させ、そして肝臓サンプルを左側葉および中葉から採取
し、２％パラホルムアルデヒド中に固定化し、そしてパラフィン包埋した。肝臓
サンプル（５ｍ）を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色して、肝臓内
胆管増殖を評価した。免疫組織化学を、ラットタンパク質と交差反応するポリク
ローナル抗ＨＡＡＨ抗体を用いて実施し、タンパク質発現のレベルを決定した。
【００５９】
（原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）と関連した胆管増殖）
肝臓生検サンプルを、ＰＳＣおよび関連胆管増殖を有する７個体から得た。こ
れらの個体を、標準的な胃腸肝臓（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｏｌｏ
ｇｉｃａｌ）プロトコルに従って評価した。患者は、２２〜４６歳であり、そし
て男性が４人、女性が３人であった。４人は、炎症性腸疾患を伴った（３人が潰
瘍性大腸炎であり、そして１人がクローン大腸炎（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｃｏｌｉｔ
ｉｓ）である）。患者は全て、放射線医学評価（腹部超音波検査および内視鏡的
逆行性胆道膵管造影を含む）を受け、肝臓外胆管閉塞の診断を除いた。組織切片
を、パラフィン包埋ブロックから調製し、胆管増殖についてヘマトキシリンおよ
びエオシン染色によって評価した。ＨＡＡＨの発現を、ＨＡＡＨ特異的モノクロ
ーナル抗体（例えばＦＢ５０）を用いて免疫組織化学によって決定した。
（免疫組織化学）
肝臓組織切片（５μｍ）を、キシレン中で脱パラフィンし、そして等級化アル
コール（ｇｒａｄｅｄ  ａｌｃｏｈｏｌ）中で再水和した。内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を、６０％メタノール中での０．６％  Ｈ2Ｏ2での３０分処理によって
クエンチした。内因性ビオチンを、アビジン−ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅ
ｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とのイン
キュベーションによってマスキングした。ＦＢ５０ｍＡｂ（ＰＳＣサンプルにつ
いて）およびポリクローナル抗ＨＡＡＨヒドロキシラーゼ抗体（ラット肝臓サン
プルについて）を、４℃で一晩、加湿チャンバーにおいてスライドに添加した。
免疫組織化学染色を、色素原としてジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を有するＶｅ
ｃｔａｓｔａｉｎ  Ｋｉｔｓを用いる標準的なアビジン−ビオチン西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ）法を用いて、製造者の指示書（Ｖｅｃｔｏｒ  
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に従って
実施した。組織切片をヘマトキシリンで対比染色し、次いでエタノール中で脱水
した。切片を、胆管増殖およびＨＡＡＨタンパク質発現について光学顕微鏡によ
って試験した。胆管癌および胎盤のパラフィン切片を、陽性コントロールとして
使用し、そして肝臓脂肪症サンプル（ｈｅｐａｔｏｓｔｅａｔｏｓｉｓ  ｓａｍ
ｐｌｅｓ）を、陰性コントロールとして使用した。抗体結合特異性についてのコ
ントロールに、隣接切片を、一次抗体の不在下で、またはデング熱ウイルスに対
する非関連抗体を用いて免疫染色した。組織免疫反応性についての陽性コントロ
ールとして、全ての標本の隣接切片を、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼに対するモノクローナル抗体を用いて免疫染色した。
【００６０】
（ウェスタンブロット分析）
細胞溶解物を、プロテアーゼインヒビターを含む標準的な放射性免疫沈降アッ
セイ（ＲＩＰＡ）緩衝液において調製した。溶解物中のタンパク質の総量をＢｉ
ｏ−Ｒａｄ比色アッセイ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、続いて
１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）によって決定し、ＰＶＤＦメンブレンに転写し、そして、二次抗体として
の西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された一次ヒツジ抗マウスおよびロバ抗ウ
サギ抗血清としてのＦＢ５０、ＨＢＯＨ２、抗Ｅｒｋ−１（タンパク質ローディ
ングについての内部コントロールとして使用）を使用するウェスタンブロット分
析に供した。抗体結合を、増強された化学発光試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ，
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）
およびフィルムオートラジオグラフィーで検出した。免疫反応性のレベルを、Ｎ
ＩＨ画像ソフトウェアを用いる体積デンシトメトリーによって測定した。
【００６１】
（酵素活性アッセイ）
ＡＡＨ活性を、標準的な方法（例えば、Ｊｉａら、１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６７：１４３２２−１４３２７；Ｗａｎｇら、１９９１，Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１４００４−１４０１０；またはＧｒｏｎｋｅら、１
９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：８５５８−８５６５に記載の方法）
に従って、14Ｃ標識α−ケトグルタレートが14Ｃ含有ＣＯ2を放出するドメイン
を水酸化する基質としてウシプロテインＳの第一のＥＧＦ様ドメインを用いて細
胞溶解物中で測定した。インキュベーションを、４８μｇの粗細胞抽出タンパク
質および７５μＭ  ＥＧＦ基質を含む最終容量４０μｌで、３７℃で３０分間実
施した。
【００６２】
（細胞トランスフェクション研究）
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ  
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１％Ｌ−グルタミン、
１％非必須アミノ酸および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  
ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌ
ａｎｄ，ＮＹ）を補充した、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｍｅｄｉ
ａｔｅｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）中で培養した。サブコンフルエント
なＮＩＨ−３Ｔ３細胞（３×１０5細胞／６０ｍｍディッシュ）を、以下のプラ
スミドの１つ（１０μｇ）でトランスフェクトした；１）非組換えｐｃＤＮＡ３
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（
陰性コントロールとして）；２）ｐＮＨ３７６−Ｈ６６０（その触媒ドメインを
変異させそしてＣＭＶプロモーター駆動のｐｃＤＮＡ３ベクターにクローニング
した、マウスＡＡＨ  ｃＤＮＡ）；３）ｐＮＨ３７６（ｐｃＤＮＡ３ベクターに
クローニングした野生型マウスＡＡＨ  ｃＤＮＡ）；４）ｐＣＤＨＨ（ｐｃＤＮ
Ａ３ベクターにクローニングした野生型ヒトＡＡＨ  ｃＤＮＡ）；または５）ｐ
ＬＮＣＸ−ＵＰ１（ｖ−ＳｒｃオンコジーンをコードするｃＤＮＡ）（ポジティ
ブコントロール）。細胞を、製造業者（５  Ｐｒｉｍｅ−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉ
ｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）の指示書に従って、リン酸カルシウムトランス
フェクションキットを用いてトランスフェクトした。細胞トランスフェクション
効率の比較を、これらの種々の構築物で評価した。この手順のために、トランス
フェクション後４８時間で得たコンフルエントなプレートを分けて、１２個の別
々の６ｃｍディッシュに再播種した。これらの内の６個は、４００μｇ／ｍｌの
Ｇ−４１８（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｇｒａｎｔ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有する培地の存在下で増殖させた
。Ｇ−４１８耐性病巣の数を、トランスフェクション後１４日目に測定し、そし
てトランスフェクション効率における任意の変動性について補正するために使用
した。
【００６３】
（形質転換アッセイ）
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、これらの種々の構築物でトランスフェクトし、そして
上記のように４８時間後にコンフルエントに到達させた。各６ｃｍディッシュを
分け、そして１２個の異なる６ｃｍディッシュに播種した。このうち６個を、ト
ランスフェクション効率を検出するためにＧ−４１８の存在下で増殖させ、他の
６個を、Ｇ４１８を含まない完全培地中で、４日毎に培地交換を行って増殖させ
た。形質転換病巣の数を、Ｇ−４１８を含まないこれらのプレートにおいてカウ
ントし、そして１μｇのトランスフェクトしたＤＮＡあたりの形質転換病巣とし
て表した。
【００６４】
（足場非依存性細胞増殖アッセイ）
限界希釈技術（平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり０．１５細胞）を、
ウエスタンブロット分析およびヒドロキシラーゼ活性の酵素アッセイによって測
定されるような、異なるレベルのＨＡＡＨ活性を有する細胞クローンを単離する
ために、Ｇ−４１８中で増殖させたトランスフェクト体に対して行った。クロー
ン化した細胞株（１．０×１０4細胞）を、０．４％低融点アガロース（Ｓｅａ
Ｐｌａｑｕｅ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ；ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒ
ｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）を含む完全培地中に懸濁し、０．５３％低融点ア
ガロースを含む完全培地からなるボトムアガー混合物上に重層した。各クローン
を、３連でアッセイした。クローンを、これらの条件下で藩種し、そして１０日
後、病巣のサイズ（陽性の増殖＞０．１ｍｍ  直径）および数を測定した。
【００６５】
（ヌードマウスにおける腫瘍形成能）
この足場非依存性増殖アッセイで評価したクローンと同じクローンを、ヌード
マウスに注射し、そして腫瘍形成について観察した。腫瘍形成能を、各４グルー
プの１０匹の動物（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ．，Ｗｉｌｍｉｎｇ
ｔｏｎ，ＭＡ）を用いて評価した。グループ１には、偽ＤＮＡで安定にトランス
フェクトした１×１０7細胞を与え、グループ２〜４には、ｐＮＨ３７６で安定
にトランスフェクトしそして種々のレベルのマウスＨＡＡＨタンパク質を発現す
るクローンの、１×１０7細胞を与えた。ヌードマウスを、標準的な動物施設中
、無病原体条件下で維持した。腫瘍細胞接種の３０日後、動物を、イソフルオラ
ン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（Ａｃｒｒａｎｃ，Ａｎａｑｕｅｓｔ，ＮＪ）を
含むチャンバを使用して屠殺し、そして腫瘍を注意深く取り出し、重量を測定し
た。
【００６６】
（胆管増殖の動物モデル）
総胆管の結紮後、肝臓内胆管増殖が、４８時間で明らかになった。総胆管結紮
後８日および１６日に得た組織サンプルは、表３に示されるように過剰な胆管の
増殖を示した。
【００６７】
【表３】
2008292486.tif 000004
免疫組織化学的染色では、いかなる時間での増殖中の胆管中にＨＡＡＨの存在
を検出できなかった。偽性の外科的コントロール由来の胆管におけるＨＡＡＨ発
現の分析もまた陰性であったが、全てのサンプルは、グリセルアルデヒド３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼに対するコントロール抗体との陽性の免疫反応性を示した
。従って、胆管増殖は、この標準的な動物モデル系においてＨＡＡＨ発現の増加
に関連しなかった。
【００６８】
（ＰＳＣにおけるＨＡＡＨ発現）
ＰＳＣを有する患者由来の肝臓生検標本は、管周辺（ｐｅｒｉｄｕｃｔａｌ）
線維症を伴う胆管増殖および形成異常を示さない単核炎症細胞浸潤を示した。Ｈ
ＡＡＨ特異的モノクローナル抗体を用いて免疫染色した隣接切片は、増殖中の胆
管における検出可能なＨＡＡＨ免疫反応性を有さなかった。対照的に、同じ抗体
をおよび検出試薬を使用して同時に免疫染色した胆管癌の切片は、ほとんど全て
の腫瘍細胞においてＨＡＡＨの免疫反応性の強力なレベルを示したが、胆管癌の
隣接切片は、デング熱ウイルスに対するモノクローナル抗体でネガティブな免疫
染色反応を示した。これらの知見は、ＨＡＡＨ発現が、肝臓内胆管の非癌性細胞
増殖よりもむしろ悪性の形質転換と関連することを示す。
【００６９】
（ＮＩＨ−３Ｔ３細胞のＨＡＡＨ関連形質転換）
マウスおよびヒトのＡＡＨ遺伝子、ならびに酵素活性を有さないマウスＡＡＨ
変異体構築物の形質転換能力を、偽ＤＮＡ（ネガティブコントロール）およびｖ
−Ｓｒｃ（ポジティブコントロール）をトランスフェクトしたＮＩＨ−３Ｔ３細
胞に対して比較した。マウスＡＡＨの形質転換能力は、図１に示されるように、
ベクターＤＮＡコントロールの能力の２〜３倍であることが見出された。このヒ
ト遺伝子の形質転換能力は、マウスＡＡＨで観察された能力よりも高かった（そ
れぞれ、３２±１．５  対  １３±２．６個の形質転換病巣）。マウスおよびヒ
トのＡＡＨをトランスフェクトした細胞は、大きい病巣を形成し、これは、ｖ−
Ｓｒｃをトランスフェクトした線維芽細胞の病巣と類似する。対して、ベクター
ＤＮＡをトランスフェクトした細胞において時折はるかに小さい病巣が観察され
、これは、線維芽細胞株の接触阻害を示す。酵素活性を有さない変異体ｐＮＨ３
７６−Ｈ６６０構築物を使用して行った並行実験は、形質転換活性を全く示さな
かった。この知見は、ＨＡＡＨの酵素活性が、このＨＡＡＨ遺伝子によって示さ
れる形質転換活性に必要であることを示す。
【００７０】
（足場非依存性細胞増殖アッセイ）
マウスＡＡＨ構築物での一過的トランスフェクション後、いくつかの異なる形
質転換病巣を、希釈クローニング実験のために単離し、異なるレベルのＨＡＡＨ
遺伝子発現を有する安定にトランスフェクトされた細胞クローンを確立した。９
個の異なるクローン化した細胞株を、さらなる研究のために選択した。ＨＡＡＨ
タンパク質の発現レベルを、ウエスタンブロット分析によって測定した。クロー
ン７および１８は、ＨＡＡＨタンパク質発現の穏やかな増加を有し、ソフトアガ
ー中に大きいコロニーを形成した（図２）。抗Ｅｒｋ−１モノクローナル抗体で
のこの同じ膜の免疫ブロットによって示されるように、全てのレーンにおいてタ
ンパク質ロード量は等価であった。タンパク質発現の増加は、図３に示されるよ
うな、酵素活性の増加に関連した。これらのクローンがソフトアガー中での足場
非依存性の細胞増殖を示す能力を、図３に示す。ＨＡＡＨ遺伝子発現の増加を有
する全３個のクローンは、偽ＤＮＡ単独をトランスフェクトしたクローンと比較
して、足場非依存性の細胞増殖を示した。
【００７１】
（ヌードマウスにおける腫瘍形成）
ＨＡＡＨ遺伝子発現の増加を有するこの３個のクローンを、ヌードマウスにお
いて腫瘍を形成する能力について評価した。クローン１８を与えたマウスにおけ
る腫瘍サイズを、偽ＤＮＡをトランスフェクトしたクローンと比較した。クロー
ン７、１６および１８は、このアッセイにおいて高度に形質転換され、そしてそ
れぞれ、２．５、０．９および１．５グラムの平均重量を有する大きい腫瘍を生
じた（図４）。これらのデータは、ＨＡＡＨの過剰発現が、インビボでの悪性の
表現型の誘導および維持に寄与することを示す。
【００７２】
（高レベルのＨＡＡＨ発現は悪性の指標である）
ＨＡＡＨ発現が、細胞交替の増加よりもむしろ悪性に関連するか否かを決定す
るために、胆管増殖の２つのモデルを研究した。この動物モデルにおいて、総胆
管の連結は、広範な肝臓内胆管増殖を誘導したが、表３に示されるように、これ
らの実験条件下でのＨＡＡＨ遺伝子発現は見られなかった。ＰＳＣは、肝臓内お
よび肝臓外の胆管の破壊ならびに増殖に関連する自己免疫肝臓疾患であるので、
同様に、ＨＡＡＨ遺伝子発現を、胆管増殖に関連するヒト疾患モデルにおいて評
価した。ＰＳＣは、前悪性疾患であり、そして罹患した個体の有意な割合が、結
果的に胆管癌を発症する。しかし、広範な胆管増殖の存在下でのＨＡＡＨ遺伝子
発現の増加についての証拠は存在しなかった。
【００７３】
ＨＡＡＨタンパク質レベルが、胆管癌において上昇し、そして正常または増殖
中の胆管において上昇しないことが確認されたので、悪性表現型の発生における
ＨＡＡＨの役割を研究した。ＨＡＡＨ遺伝子を、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞にトランス
フェクトし、そして細胞変化（例えば、形質転換病巣の形成の増加、ソフトアガ
ー中のコロニー増殖、および悪性形質転換に関連するヌードマウスにおける腫瘍
形成）を評価した。全長のマウスおよびヒトのＡＡＨ遺伝子を、発現構築物にク
ローニングし、そしてＮＩＨ−３Ｔ３細胞に一過的にトランスフェクトした。偽
ＤＮＡをトランスフェクトしたコントロールと比べて、形質転換病巣の数の増加
が、マウスおよびヒトのＡＡＨ遺伝子をトランスフェクトした細胞において検出
された。トランスフェクション効率を制御した後の、この形質転換病巣の数の増
加は、ｖ−Ｓｒｃ遺伝子をトランスフェクトした細胞（ポジティブコントロール
として使用した）と比較して高くなかった。ＨＡＡＨ遺伝子の酵素活性は、悪性
表現型に必要とされた。なぜなら、触媒部位を欠く変異体構築物は、形質転換特
性を有さなかったからである。ＨＡＡＨタンパク質レベルおよび酵素活性におけ
る穏やかな増加を有する、いくつかの安定なトランスフェクト体およびクローン
化ＮＩＨ−３Ｔ３細胞株を確立した。このような細胞株を、ソフトアガー中に置
き、この悪性表現型の別の特性として、足場非依存性の細胞増殖を試験した。全
ての細胞株が、偽ＤＮＡトランスフェクトコントロールと比較して、ソフトアガ
ー中で増殖し、そしてＨＡＡＨ遺伝子発現の細胞レベルと形成されたコロニーの
数およびサイズとの間に、ポジティブな相関が存在した。これらのクローン化し
た細胞株のうち３つが、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成した。ＨＡＡＨ発現の
増加を有する３つ全ての細胞株は、形質転換表現型の別の周知の特徴としての大
きい腫瘍の発達によって示されるように、腫瘍形成性であった。
【００７４】
ＨＡＡＨの過剰発現によって誘導される細胞変化が、酵素機能に関連するか否
かを決定するために、部位特異的変異誘発をこの遺伝子に導入した。この変異誘
発は、マウスＨＡＡＨの鉄イオン結合部位である６６０番目のヒスチジンをリジ
ンに変化し、これによって、このマウスＨＡＡＨのヒドロキシラーゼ活性を消失
させた。ＨＡＡＨにおける対応する変異を、ＨＡＡＨヒドロキシラーゼ活性を阻
害するためのドミナントネガティブ変異体として使用した。このｐＮＨ３７６−
Ｈ６６０構築物は、形質転換活性を有さず、これは、過剰発現によって誘導され
るこの悪性表現型の細胞変化が、このタンパク質の酵素活性に依存することを示
す。
【００７５】
Ｎｏｔｃｈレセプターおよびそれらのリガンドは、β−水酸化についての推定
コンセンサス配列を含む、Ｎ末端領域中のいくつかのＥＧＦ様ドメインを有する
。Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の重要なエレメントであ
り、このリガンドとのＮｏｔｃｈの相互作用は、両分子のＥＧＦ様ドメインによ
って生じる。ＨＡＡＨによるβ−水酸化の標的であるＥＧＦ様ドメインの、アス
パラギン酸残基またはアスパラギン残基に及ぼされる点変異は、下流のシグナル
伝達経路の活性化に関与するカルシウム結合およびタンパク質−タンパク質相互
作用を減少する。ＨＡＡＨの過剰発現およびＨＡＡＨによるＮｏｔｃｈタンパク
質の水酸化は、悪性に寄与する。腫瘍増殖は、ＨＡＡＨによるＮｏｔｃｈタンパ
ク質の水酸化を減少することによって阻害される。
【００７６】
本明細書中に示されるデータは、高レベルのＨＡＡＨ発現が、悪性形質転換に
関連するという証拠である。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＨＡＡＨ  ｃＤＮＡの
発現の増加は、形質転換病巣の数の増加、足場非依存性増殖、およびヌードマウ
ス中の腫瘍形成によって表される、形質転換表現型を誘導した。さらに、インタ
クトなＨＡＡＨ酵素が、ＨＡＡＨ関連形質転換に必要とされることが見出された
。従って、内因性ＨＡＡＨの酵素活性または発現の２０％程度の少ない阻害だけ
で、治療的利点を付与する。例えば、臨床的利点は、未処理の癌細胞または正常
な非癌性細胞に関連するレベルと比較した、ＨＡＡＨ阻害性化合物の投与後の５
０％〜７０％のＨＡＡＨの発現または活性の阻害によって達成される。
【００７７】
ＨＡＡＨは、転写レベルで調節される。ＨＡＡＨの発現および酵素活性におけ
るほんの穏やかな増加が、細胞の形質転換に必要とされた。これらは、ＨＡＡＨ
の遺伝子発現および酵素活性の増加が、形質転換表現型の発生または維持に寄与
すること、およびＨＡＡＨ遺伝子の転写の減少またはＨＡＡＨ遺伝子産物の酵素
活性の減少が、悪性の減少を導くことを示す。従って、ＨＡＡＨ転写は、ＨＡＡ
Ｈプロモーター配列へのＦｏｓおよび／またはＪｕｎ（ＨＡＡＨ転写を調節する
エレメント）の結合を減少する化合物を投与することによって阻害される。
【００７８】
ＨＡＡＨは、胆管上皮の悪性形質転換を伴って上方調節され、そしてＨＡＡＨ
免疫反応性が、腫瘍細胞表面膜上で検出可能であるので、ＨＡＡＨはまた、細胞
傷害剤を標的化する（例えば、腫瘍細胞の表面上に発現されるＨＡＡＨに結合す
る化合物への、細胞傷害剤の連結によって）ための分子でもある。生物学的液体
（例えば、胆汁）または細胞（微細なニードルでの吸引によって得られる）のい
ずれかにおけるＨＡＡＨタンパク質レベルのアッセイは、ヒト胆管癌の診断マー
カーである。
【００７９】
（実施例２：ＡＡＨの発現ならびに悪性ＣＮＳ新生物の増殖および浸潤）
ＡＡＨは、癌腫および栄養膜細胞において豊富に発現されるが、ほとんどの正
常細胞（ＣＮＳ起源の細胞を含む）においては豊富に発現されない。高レベルの
ＡＡＨ発現が、１６個の神経膠芽細胞腫のうちの１５個、９個の退形成型乏突起
膠腫のうちの８個、および１２個の未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ）のうち
の１２個において観察された。高レベルのＡＡＨ免疫反応性は、腫瘍の中央部よ
りもむしろ浸潤中の縁部分で主に局在される。二重標識免疫組織化学的染色は、
ＡＡＨとテネイシン（ＡＡＨ酵素活性の基質）との間の相互関係を実証した。ホ
ルボールエステルミリステートまたはレチノイン酸で処理し、ニューライト伸長
および侵襲性増殖を刺激したＰＮＥＴ２ニューロン細胞株は、高レベルのＡＡＨ
発現を示し、一方、Ｈ2Ｏ2誘導性のニューライト収縮が、ＡＡＨの下方調節を生
じた。ヒトＡＡＨ  ｃＤＮＡを安定に過剰発現したＰＮＥＴ２ニューロン細胞は
、ＰＣＮＡおよびＢｃｌ−２のレベルを増加し、そしてｐ２１／Ｗａｆ１および
ｐ１６のレベルを減少し、これは、ＡＡＨ過剰発現が、病理学的細胞増殖、細胞
周期進行、およびアポトーシスに対する耐性の増強を生じることを示唆する。さ
らに、ＡＡＨトランスフェクト体に観察されたｐ１６のレベルの減少は、ＡＡＨ
過剰発現が、新生物細胞の侵襲性の増殖の増強を付与することを示す。なぜなら
、このｐ１６遺伝子の欠失または下方調節は、神経膠芽細胞腫のより攻撃的かつ
侵襲性のインビボ増殖と相関するからである。増加されたＡＡＨ免疫反応性は、
原発性悪性ＣＮＳ新生物の浸潤中の縁部分で検出され、これは、腫瘍侵襲性にお
けるＨＡＡＨの役割をさらに示す。
【００８０】
以下の材料および方法を使用して、以下に記載のデータを作成した。
【００８１】
（原発性ヒト悪性ＣＮＳ新生物におけるＡＡＨ免疫反応性の分析）
ＡＡＨ免疫反応性を、神経膠芽細胞腫（Ｎ＝１６）、退形成型乏突起膠腫（Ｎ
＝９）、および未分化神経外胚葉性腫瘍（ＰＮＥＴ；テント上神経芽細胞腫（Ｎ
＝３）および髄芽細胞腫（Ｎ＝９））の外科的切除標本において試験した。これ
らの組織病理学的切片を再評価して、標準的判断基準を使用してその診断を確か
めた。それぞれの生存固形腫瘍または隣接するインタクトな組織を有する腫瘍の
サンプルを含むブロックからのパラフィン切片を、研究した。正常な成体の死後
の脳（ｎ＝４）由来の切片を、ネガティブコントロールとして含んだ。ＡＡＨ免
疫反応性を、ＨＡＡＨ特異的モノクローナル抗体を使用して検出した。免疫反応
性は、色素原として３−３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（２４）および対比
染色としてヘマトキシリンを使用する、アビジン−ビオチン西洋ワサビペルオキ
シダーゼ複合体法（Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって明らかに
した。
【００８２】
テネイシンおよびラミニンは、おそらく、これらの分子内のＥＧＦ様反復の存
在に起因して、ＡＡＨについての基質である。二重免疫染色研究を行い、テネイ
シンまたはラミニンと共にＡＡＨを同時局在化した。ＡＡＨ免疫反応性を、色素
原としてＤＡＢを用いるＡＢＣ法によって検出し、そしてテネイシンまたはラミ
ニンの免疫反応性を、基質としてＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いるアビジン−ビオチン
アルカリホスファターゼ複合体法（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって検出した。ポジティブコントロールおよ
びネガティブコントロールとして、隣接切片を、神経膠原線維酸性タンパク質（
ＧＦＡＰ）およびＢ型肝炎表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いて免疫染
色した。全ての標本を、同じ抗体希釈度および免疫検出試薬を用いて、バッチ免
疫染色した。
【００８３】
（細胞株および培養条件）
ＡＡＨ発現が、悪性新生物の浸潤性増殖と共に生じる、ニューライト（糸状足
（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ））伸長（出芽）によって調節されるか否かを決定するた
めに、研究を行った。ヒトＰＮＥＴ２  ＣＮＳ由来およびＳＨ−Ｓｙ５ｙの神経
芽細胞腫細胞を培養し、そして０、１、２、３、５または７日目に１００ｎＭの
ホルボール１２−エステル１３−アセテートまたは１０μＭのレチノイン酸で刺
激して、出芽を誘導した。さらに、ＡＡＨ発現に際するニューライト収縮の効果
を試験するために、サブコンフルエントな培養物を、低濃度（１０〜４０μＭ）
のＨ2Ｏ2で２４時間処理した。両方の研究について、ＡＡＨ発現を、ＨＡＡＨ特
異的抗体を使用するウエスタンブロット分析によって評価した。
【００８４】
（ＰＮＥＴ２  ＡＡＨトランスフェクトクローンの作製）
全長ヒトＡＡＨ  ｃＤＮＡ（配列番号３）を、ｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現
ベクターに連結した。この発現ベクターにおいて、遺伝子発現は、ＣＭＶプロモ
ーターの制御下にある（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇ
ｏ，ＣＡ）。ＰＮＥＴ２細胞を、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲ
Ｌ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を使用して、ｐＨＡＡＨまたはｐｃＤＮ
Ａ３（ネガティブコントロール）のいずれかでトランスフェクトした。ネオマイ
シン耐性クローンを選択し、構成的レベルのＡＡＨタンパク質発現が、ウエスタ
ンブロット分析によって検出した場合に、コントロール（ｐｃＤＮＡ３）と比較
して少なくとも２倍増加したか否かを研究した。ＡＡＨの過剰発現が、その形質
転換表現型を調節する遺伝子の発現をどれほど変更するかを決定するために、増
殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ｐ５３、ｐ２１／Ｗａｆ１、Ｂｃｌ−２およびｐ１
６のレベルを、ＡＡＨ（Ｎ＝５）およびｐｃＤＮＡ３（Ｎ＝５）を安定にトラン
スフェクトしたクローンのサブコンフルエントな培養物由来の細胞溶解調製物に
おいて測定した。ＰＣＮＡを、細胞増殖のマーカーとして使用した。ｐ５３、ｐ
２１／Ｗａｆ１、およびＢｃｌ−２のレベルを、ＡＡＨを過剰発現する細胞が、
細胞周期進行へのより高い傾向があり、かつアポトーシスに対するより高い耐性
を有するか否かを決定するために試験した。ｐ１６のレベルを、ＡＡＨ過剰発現
が、腫瘍侵襲性における役割を有するか否かを決定するために評価した。
【００８５】
（ウエスタンブロット分析）
１０ｃｍ2ディッシュにおいて増殖させた細胞を、溶解し、そしてプロテアー
ゼおよびホスファターゼのインヒビターを含有する標準的な放射免疫沈降アッセ
イＲＩＰＡ緩衝液中に均質化した。不溶性細片を除去するためにサンプルを１２
，０００×ｇで１０分間の遠心分離した後に収集した上清を、ウエスタンブロッ
ト分析に使用した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して測定した。６０μｇ
のタンパク質を含むサンプルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、そしてウエスタンブロット分析に供し
た。二連のブロットを、個々の抗体でプローブした。免疫反応性を、西洋ワサビ
ペルオキシダーゼ結合体化ＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，
Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で検出し、そして化学発光試薬で増強した。タンパク
質発現のレベルを定量するために、不飽和オートラジオグラフを、ＮＩＨ  Ｉｍ
ａｇｅソフトウエアバージョン１．６を使用する容量デンシトメトリー（ｖｏｌ
ｕｍｅ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）に供した。ｐＨＡＡＨとｐｃＤＮＡ３をト
ランスフェクトした細胞間の統計学的比較を、スチューデントＴ検定を使用して
行った。
【００８６】
（抗体）
ＦＯＣＵＳ肝細胞癌細胞に対して作製したＨＡＡＨ特異的モノクローナル抗体
を使用して、ＡＡＨ免疫反応性を検出した。テネイシンおよび神経膠原線維酸性
タンパク質に対するモノクローナル抗体、ならびにラミニンに対するウサギポリ
クローナル抗体を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し
た。ヒトｐ１６に対するウサギポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ．ＣＡ）から購
入した。Ｂ型肝炎表面抗原に対する５Ｃ３ネガティブコントロールモノクローナ
ル抗体を、組換えタンパク質を使用して作製し、そしてネガティブコントロール
として使用した。
【００８７】
（原発性悪性脳腫瘍におけるＡＡＨ免疫反応性）
神経膠芽細胞腫１６のうち１５、未分化乏突起細胞腫９のうち８、そしてＰＮ
ＥＴの１２全てにおいて、ＡＡＨ免疫反応性を検出した。ＡＡＨ免疫反応性は、
細胞質、核および細胞突起に局在した。ＡＡＨ免疫反応性の組織分布は、腫瘍と
インタクトな脳との間の界面に局在した強力な標識化に著しく、そして腫瘍の中
央部分内の免疫反応性の目立って低いレベルであった。高いレベルのＡＡＨ免疫
反応性はまた、軟膜下の領域、軟膜、フィルヒョー−ロバン血管周囲腔隙に分布
した新形成細胞において、および実質組織に浸潤した新形成細胞の個体または小
集団において、観察された。対照的に、ＡＡＨ免疫反応性は、正常な脳では検出
されなかった。有糸分裂における核の密度（１〜５％）は、腫瘍の中央部分およ
び末端部分において類似していたので、ＡＡＨ免疫反応性の分布は、ＤＮＡ合成
と厳密には関連していないようである。
【００８８】
（神経膠芽細胞腫におけるＡＡＨとテネイシン免疫反応性との間の関係）
テネイシンは、悪性神経膠腫において発現された細胞外細胞間質関連抗原であ
る。テネイシンは、分子内に、ＨＡＡＨ水酸化の基質である、ＥＧＦ様ドメイン
を含む。悪性脳腫瘍におけるテネイシン免疫反応性に関してＡＡＨを局在化する
ため、二重標識免疫組織化学染色を実施し、ここで褐色色素原（ｂｒｏｗｎ  ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎ）（ＤＡＢ）、およびテネイシン、青色色素原（ｂｌｕｅ  ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎ）（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）を用いてＡＡＨを検出した。隣接部位
を同様に二重標識して、ＣＮＳ中に発現された細胞外細胞間質分子を含む別のＥ
ＧＦドメインであるラミニンを用いてＡＡＨを同時局在化した。血管周囲結合組
織において、および内皮細胞のグロメルロイド（ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｉｄ）増殖
に関連して、テネイシン免疫反応性の強力なレベルが観察された。二重標識試験
によって、高レベルのＡＡＨが、低テネイシンまたは検出不能なテネイシンと関
連しており、そして低レベルのＡＡＨが、豊富なテネイシン免疫反応性を関連し
ているような、ＡＡＨとテネイシンの免疫反応性の間の相反する関係が実証され
た。ラミニンはまた、分子内のＥＧＦ反復に起因してＡＡＨ酵素活性の基質であ
るようであるが、二重標識試験では、腫瘍全体を通じて、そして腫瘍とインタク
トな組織との間の界面でごく低いレベルのラミニン免疫反応性が示された。
【００８９】
（ＰＭＡまたはＲＡで処理したニューロン細胞株におけるＡＡＨの分析）
ニューライト出芽／糸状仮足伸長は、新生物のニューロン細胞の侵襲性の増殖
を特徴付ける。ＰＭＡは、ニューライト出芽に関与するプロテインキナーゼＣシ
グナル伝達経路を活性化する。レチノイン酸はそれ自体のレセプターに結合し、
そしてリガンド−レセプター複合体は、核に移動し、ここでニューライト成長に
関与する標的遺伝子のプロモーター／エンハンサー領域に存在する特定のコンセ
ンサス配列に結合する。ＰＮＥＴ２細胞およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞の両方とも、
ＰＭＡ（６０〜１２０ｎＭ）またはレチノイン酸（５〜１０μＭ）での処理によ
って出芽するように誘導され得る。図５Ａ〜Ｄは、代表的なウエスタンブロット
のオートラジオグラフィーからのデータを示す；棒グラフは、３つの実験から得
た結果の平均±Ｓ．Ｄ．に相当する。ＦＢ５０抗体を用いたウエスタンブロット
分析により、約８５ｋＤａの分子量を有するタンパク質に相当する二重のバンド
を検出した。未処理のＰＮＥＴ２細胞は、比較的低レベルのＡＡＨ免疫反応性を
有した（図５Ａ）が、未処理のＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞は、容易に検出されるＡＡＨ
発現を有した（図５Ｂ）。未処理のＰＮＥＴ２細胞は、粗い、短い半径方向細胞
突起を有する多角形の形態を示したが、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞は、わずかに伸長さ
れ、細く尖った突起を自ら伸長した。両方の細胞株とも、ＲＡ（図５Ａおよび５
Ｂ）またはＰＭＡ（図５Ｃ）のいずれかの刺激およびニューライト伸長後、ＡＡ
Ｈ免疫反応性のレベルにおいて、時間依存性の増大を表した。ＰＮＥＴ２細胞に
おいては、ＲＡまたはＰＭＡに対する暴露の２４時間後少なくとも２倍までＡＡ
Ｈタンパク質のレベルが増大し、そして試験の７日間を通じて高いレベルのＡＡ
Ｈが維持された。ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞においては、ＡＡＨ発現において、ＲＡ刺
激またはＰＭＡ刺激の増大が、より漸増的に生じ、そして処理の７日後に最高で
あった（図５Ｂ）。
【００９０】
ニューライト収縮に対するＡＡＨ発現の効果を試験するため、ＰＮＥＴ２およ
びＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞を低濃度（８〜４０μＭ）のＨ2Ｏ2で処理した。４０μＭ
までのＨ2Ｏ2に対する暴露の２４時間後、ほとんどの細胞は、生きていた（トリ
パンブルー色素排除）が、それらは、ニューライトの収縮および丸まりを示した
。ＦＢ５０抗体を用いるウエスタンブロット分析により、ＡＡＨタンパク質のレ
ベルにおけるＨ2Ｏ2の用量依存性の減少が実証された（図５Ｄ）。
【００９１】
（ＰＮＥＴ２細胞におけるＡＡＨ過剰発現の効果）
悪性の表現型に対するＡＡＨ過剰発現の役割を直接評価するため、ＣＭＶプロ
モーター（ｐＨＡＡＨ）の制御下で遺伝子発現を有するヒト全長ｃＤＮＡを用い
てＰＮＥＴ２細胞を安定にトランスフェクトした。ネオマイシン耐性ｐｃＤＮＡ
３偽（ｍｏｃｋ）クローンに対して少なくとも２倍高いレベルのＡＡＨ免疫反応
性を有するネオマイシン耐性クローンを研究した。悪性新生物の攻撃的な挙動は
、ＤＮＡ合成の増大、細胞周期進行、アポトーシスに対する耐性、および侵襲的
増殖に関連しているので、ＡＡＨの構成的な過剰発現に関連する表現型の変化が
、ＰＣＮＡ、ｐ２１／Ｗａｆ１，ｐ５３，Ｂｃｌ−２、およびｐ１６に関して特
徴づけられた。ＰＣＮＡを、ＤＮＡ合成および細胞増殖の係数として用いた。ｐ
２１／Ｗａｆ１は細胞周期のインヒビターである。ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の発現
は、アポトーシスの前に増大するが、ｂｃｌ−２は、アポトーシスを阻害し、そ
して神経細胞の生存を増強する。ｐ１６は、しばしば、悪性新生物に対する浸潤
においてダウンレギュレートされるかまたは変異されるかのいずれかである癌抑
制遺伝子である。
【００９２】
５つのｐＨＡＡＨおよび５つのｐｃＤＮＡ３のクローンを研究した。ＰＨＡＡ
ＨトランスフェクトしたクローンにおけるＡＡＨ発現のレベルの上昇を、ウエス
タンブロット分析（図６）およびノーザンブロット分析により確認した。７０〜
８０％コンフルエントになった培養物由来の細胞溶解物を用いたウエスタンブロ
ット分析により、ｐＨＡＡＨトランスフェクト細胞におけるＡＡＨ発現（約８５
ｋＤａ；ｐ＜０．０５）の構成的に増大したレベルがＰＣＮＡ（約３５ｋＤａ；
ｐ＜０．０１）およびＢｃｌ−２（約２５ｋＤａ；ｐ＜０．０５）の有意に増大
したレベル、ならびにｐ２１／Ｗａｆ１（約２１ｋＤａ；ｐ＜０．００１）およ
びｐ１６（約１６ｋＤａ；ｐ＜０．００１）の減少したレベルに関連することが
実証された（図６）。しかし、ｐＨＡＡＨ安定トランスフェクト体はまた、より
高いレベルの野生型ｐ５３（約５３〜５５ｋＤａ）を示した。安定なトランスフ
ェクト体におけるＡＡＨ発現（８５ｋＤａタンパク質）は、わずか７５〜１００
％までしか増大しなかったが、ｐ１６およびｐ２１／Ｗａｆ１のレベルは、はっ
きり減少し、そしてＰＣＮＡは、２倍近くまで増大した（図６）。
【００９３】
（ＡＡＨ発現の増大は、悪性ＣＮＡ新生物の増殖および侵襲の指標である）
本明細書に記載されるデータは、ＡＡＨ過剰発現が、診断ツール（これによっ
てニューロン細胞起源および神経膠細胞起源の両方の原発性悪性ＣＮＳ新生物を
同定する）であることを実証する。免疫組織化学染色研究により、ＡＡＨ過剰発
現が、固形腫瘍と正常組織との間の境界において、ならびに軟膜下領域、軟膜、
血管周囲腔、および実質組織に分布した新生物細胞への浸潤において、主に検出
可能であることが実証された。インビトロ実験において、ＡＡＨ遺伝子発現がニ
ューライト（糸状仮足）伸長および侵襲で調節され、そしてニューライト収縮で
ダウンレギュレートされることが実証された。さらに、ＡＡＨ  ｃＤＮＡで安定
にトランスフェクトされたＰＮＥＴ２細胞は、ＰＣＮＡおよびｂｃｌ−２の増大
を示し、そしてＷａｆ１／ｐ２１およびｐ１６発現の減少を示した。従って、Ａ
ＡＨ過剰発現は、細胞増殖および細胞周期進行を促進するか、アポトーシスを阻
害するか、または腫瘍細胞侵襲を増強する他の遺伝子の発現を調節することによ
ってＣＮＳ細胞のトランスフォームされた表現型に寄与する。
【００９４】
このデータは、ＰＮＥＴ２細胞およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞において、ただし正
常な脳にはない、容易に検出可能なＡＡＨ  ｍＲＮＡ転写物（４．３ｋＢおよび
２．６ｋＢ）およびタンパク質（８５ｋＤａおよび５０〜５６ｋＤａ）を実証し
た。これに対して、高レベルのＡＡＨ免疫反応性が、研究された悪性の原発性Ｃ
ＮＳ由来新生物中において３７のうち３５で観察された、一方、４つの正常なコ
ントロールの脳は、検出可能なＡＡＨ免疫反応性を有さなかった。浸潤する周辺
での、そして一般には腫瘍の中央部にはない、高レベルＡＡＨ免疫反応性の存在
は、ＡＡＨ過剰発現がＣＮＳ新生物の侵襲的増殖に関与することを示す。ＡＡＨ
発現または酵素活性を減少する化合物の投与は、ＡＡＨを過剰発現するＣＮＳ腫
瘍の増殖、ならびに他の組織型へのＣＮＳ腫瘍の転移を阻害する。
【００９５】
ＡＡＨ酵素は、多数のタンパク質のＥＧＦドメインを水酸化する。テネイシン
（悪性神経膠腫において大量に発現される細胞外細胞間質分子）は、ＥＧＦ様ド
メインを含む。テネイシンは腫瘍細胞侵襲を促進するので、神経膠芽細胞腫にお
けるテネイシンの大量の発現は、悪性神経膠細胞新生物中のＥＧＦまたはＥＧＦ
様レセプターの高頻度の過剰発現に対する腫瘍細胞増殖の増強の自己分泌機構を
示す。テネイシンの機能的ドメインの分析は、このファミリーの分子の分裂促進
効果が、フィブロネクチンドメインによって大きく媒介されること、およびＥＧ
Ｆ様ドメインが増殖、細胞突起伸長、および細胞間質侵襲を阻害することを示し
た。従って、ＡＡＨによるＥＧＦ様ドメインの水酸化は、腫瘍細胞侵襲における
重要な調節要因を示す。
【００９６】
二重標識免疫組織学的染色研究によって、腫瘍の周辺に存在する高レベルのＡ
ＡＨ免疫反応性が、低レベルのテネイシンと関連しており、そして低レベルのＡ
ＡＨが、しばしば高レベルのテネイシンと関連しているような、ＡＡＨとテネイ
シンの免疫反応性の間の相反する関係が実証された。これらの関係は、テネイシ
ンのＥＧＦ様ドメインのＡＡＨ水酸化が、テネイシンタンパク質の免疫反応性を
変更すること、およびそうした場合、隣接する正常組織および血管周囲腔への悪
性ＣＮＳ新生物の侵襲的増殖を促進することを示した。
【００９７】
ＰＭＡまたはレチノイン酸でニューライト伸長を受けるように、または低用量
のＨ2Ｏ2への暴露によってニューライト収縮を受けるように、誘導されたＰＮＥ
Ｔ２およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ神経細胞において、ＡＡＨ免疫反応性を試験した。Ａ
ＡＨ発現は、ＰＭＡ誘導またはレチノイン酸誘導によるニューライト（糸状仮足
）伸長によって、はっきりと増大し、そしてＨ2Ｏ2誘導性ニューライト収縮およ
び細胞の丸まりにより阻害された。ニューライトまたは糸状仮足の伸長および細
胞外細胞間質への付着は、ＣＮＳにおける腫瘍細胞侵襲に必要である。テネイシ
ンのＥＧＦ様ドメインは、発生の間、細胞間質へのニューライトおよびグリア細
胞の増殖を阻害する。
【００９８】
トランスフォームされた表現型に対するＡＡＨ過剰発現の役割を直接評価する
ため、ＤＮＡ合成、細胞周期進行、アポトーシス、および腫瘍侵襲で調節された
遺伝子を、ヒトＡＡＨ  ｃＤＮＡを安定に過剰発現する神経細胞クローン中で試
験した。ＰＣＮＡ免疫反応性の増大およびＷａｆ１／ｐ２１免疫反応性の減少の
知見は、ＡＡＨの過剰発現が、細胞増殖および細胞周期進行を増強することを示
した。さらに、Ｂｃｌ−２発現の増大の知見は、ＡＡＨ過剰発現がアポトーシス
に対する細胞の耐性の増大によって、形質転換された表現型に寄与することを示
した。ＡＡＨを過剰発現した細胞におけるより高レベルのｐ５３という明らかに
矛盾した知見は、未熟な神経細胞における高レベルの野生型ｐ５３が、アポトー
シスではなくニューライト成長（侵襲）に関連しているという観察によって説明
される。ｐ１６のレベルは（正常細胞に比べて）減少したか、またはＡＡＨを構
成的に過剰発現した細胞において実質的に検出不能であった；ｐ１６遺伝子の欠
失変異体は、侵襲的増殖およびより迅速な悪性新生物（ＣＮＳ起源のものを含む
）の進行に関連していた。これらのデータは、ｐ１６発現がＡＡＨによって調節
されることを示す。
【００９９】
（実施例３：ＨＡＡＨ産生の増大およびＩＲＳ媒介シグナル伝達）
ＩＲＳ−１媒介シグナル伝達経路は、隣接する無関係の肝臓組織に比べ、ヒト
ＨＣＣ腫瘍の９５％において活性化される。ＨＡＡＨは、このシグナル伝達経路
に関与する下流エフェクター遺伝子である。ＨＡＡＨ遺伝子アップレギュレーシ
ョンは、免疫組織化学染色およびウエスタンブロット分析によって表されるよう
に、ＨＣＣ腫瘍におけるＩＲＳ−１の過剰発現に密接に関連している。高レベル
のＨＡＡＨタンパク質が、正常な肝細胞および胆管に比して、ＨＣＣおよび胆管
癌において発現される。これらの腫瘍の両方とも、免疫組織化学染色によって、
ＩＲＳ−１の高レベルの発現を示す。ＩＲＳ−１のＣ末端短縮型ドミナントネガ
ティブ変異体で安定にトランスフェクトしたＦＯＣＵＳ  ＨＣＣ細胞クローン（
インスリンおよびＩＧＦ−１刺激シグナル伝達をブロックする）は、肝臓におけ
るＨＡＡＨ遺伝子発現の顕著な減少に関連していた。対照的に、ＩＲＳ−１を過
剰発現するトランスジェニックマウスは、ウエスタンブロット分析により、ＨＡ
ＡＨ遺伝子発現の増大を実証する。無血清培地におけるＦＯＣＵＳ  ＨＣＣ細胞
のインスリン刺激（２０および４０Ｕ）および１６時間後の血清枯渇により、Ｈ
ＡＡＨ遺伝子発現のアップレギュレーションが実証された。これらのデータは、
ＨＡＡＨ遺伝子発現が、ＩＲＳ−１シグナル伝達経路の下流エフェクターである
ことを示す。
【０１００】
（実施例４：悪性表現型の特徴に対するＨＡＡＨ発現レベルの効果）
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞におけるＩＲＳ−１の過剰発現は、形質転換を誘導する。
全長マウスＨＡＡＨ構築物を、ｐｃＤＮＡ３真核生物発現ベクター中にクローニ
ングした。第二のマウス構築物は、部位指向性変異によって触媒活性を廃したＨ
ＡＡＨをコードした。全長ヒトＨＡＡＨ  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３発現ベクター
、および形質転換活性のためのポジティブコントロールとして用いられたｖ−ｓ
ｒｃをコードするプラスミド中にクローニングした。ヌードマウスにおいて、Ｎ
ＩＨ  ３Ｔ３細胞のトランスフェクション、トランスフェクション効率のコント
ロール、ＨＡＡＨ酵素活性のアッセイ、病巣形成の分析による形質転換、足場非
依存性細胞増殖アッセイ、および腫瘍形成能の分析のためには、標準的方法を用
いた。このデータは、ＨＡＡＨの過剰発現が悪性の表現型の生成に関連すること
を示した。
【０１０１】
表４：酵素的に活性なＨＡＡＨの過剰発現は悪性腫瘍を示す。
【０１０２】
【表４】
2008292486.tif 000005
ａ．酵素的に活性なＨＡＡＨ
ｂ．Ｐ＜０．０１（偽および変異マウスＨＡＡＨに比して）
ｃ．Ｐ＜０．０１（偽に比して）
ｄ．クローン１８は、約２倍まで、ヒトＨＡＡＨを過剰発現する、安定なクロー
ニングされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株である。
ｅ．クローン１６は、約５０％までヒトＨＡＡＨを過剰発現する、安定なクロー
ニングされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株である。
【０１０３】
これらのデータは、ＨＡＡＨの過剰発現が形質転換された病巣の形成に関連す
ることを示す。酵素的活性は、細胞性の形質転換が生じるのに必要である。ヒト
ＨＡＡＨ遺伝子発現の増大を伴うクローニングされたＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株は、
ヌードマウスにおける固体腫瘍と同様に増殖する。ＨＡＡＨは、ＩＲＳ−１シグ
ナル伝達経路の下流エフェクター遺伝子である。
【０１０４】
（実施例５：ＨＡＡＨ遺伝子発現の阻害）
ＦＯＣＵＳ  ＨＣＣ細胞株（ここからヒトＨＡＡＨ遺伝子が最初にクローニン
グされた）は、正常肝臓において見出されるレベルよりも約３〜４倍高いレベル
のＨＡＡＨ発現レベルを有する。ＨＡＡＨアンチセンス構築物を作成するため、
全長ヒトＨＡＡＨ  ｃＤＮＡを、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むレトロウイルスベク
ター中に反対方向に挿入し、そしてアンチセンスＲＮＡをこの細胞中で産生した
。また、より短いＨＡＡＨアンチセンス核酸（例えば、ＨＡＡＨ遺伝子のエキソ
ン１に対応する核酸）も用いてＨＡＡＨ発現を阻害する。
【０１０５】
ＦＯＣＵＳ細胞をこのベクターで感染させて、ウエスタンブロット分析により
ＨＡＡＨのレベルを決定した。ＨＡＡＨ遺伝子発現の減少を観察した。コントロ
ールとして、これもまた反対方向に挿入された、非関連緑色（グリーン）蛍光タ
ンパク質（ｎｏｎｒｅｌｅｖａｎｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）を含有する、レトロウイルスで感染させた細胞の増殖
速度および形態学的外観（図８）。細胞（ＨＡＡＨアンチセンス構築物を保有す
る）は、細胞質対核の比における増大により特徴付けられる形態学の実質的な変
化を示し、そしてこのことは培養における正常な成体肝細胞を連想させる細胞形
状の変化を仮定する。ＨＡＡＨレベルが減少している細胞は、図８に示されるよ
うに、アンチセンス（ＧＦＰ）を発現するレトロウイルス感染細胞（コントロー
ル）よりも実質的に遅い速度で増殖する。ＨＡＡＨ遺伝子発現の減少は、より分
化した非癌性の「肝細胞様」の表現型に関連していた。ＨＡＡＨアンチセンス配
列の発現を用いて腫瘍増殖速度を阻害する。ＨＡＡＨ細胞レベルの減少は、トラ
ンスフォームされた病巣の形成の低下により特徴付けられる表現型、ソフトアガ
ーにおける低レベル増殖または足場非依存性増殖がないこと、光学顕微鏡および
位相差顕微鏡により決定される分化した肝細胞の形態学的特徴、を生じ、そして
腫瘍形成を生じない（ヌードマウスへの細胞の接種により試験した場合）。
【０１０６】
（実施例６：ＡＡＨアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＡＡＨ発現の阻害
）
ＡＡＨ遺伝子発現を阻害するオリゴヌクレオチドを、標準的な方法を用いて設
計し、そして合成した。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（２０マー）
を設計してＡＡＨ  ｍＲＮＡの５’領域に結合し、そしてＡＵＧ開始コドンと重
複させた（表５）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらがＡＵＧ（メチ
オニン）コドンの「Ａ」から上流（前）に開始する１（位置−１）、６（位置−
６）、または１１（位置−１１）ヌクレオチド配列に相補的であるように選択し
た。さらに、位置−３で開始するセンスオリゴヌクレオチドを作成した。
【０１０７】
表５：例示的オリゴヌクレオチド分子の配列
位置（−１）
５’ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＴ３’（配列番号１
０）
位置（−６）
５’ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＴＧＧ  ＧＣＣ  ＡＴＴ  ＧＣＡ  ＣＧ３’（配列番号１
１）
位置（−１１）
５’ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＣＧ３’（配列番号１
２）
センス
５’ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  Ａ３’（配列
番号１３）
図１０は、ＡＡＧ遺伝子の領域（これに、表５に記載されるアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが結合する）を示す。全てのオリゴヌクレオチドを、ＭａｃＶｅ
ｃｔｏｒ６．５．３ソフトウェアを用いて設計した。
【０１０８】
試験したＡＡＨアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＡＨ遺伝子発現を阻害
することが見出された。インビトロ無細胞転写翻訳アッセイ（ＴＮＴ  Ｑｕｉｃ
ｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用い、ヒトＡＡＨ  ｃＤＮＡ（ｐＨＡＡ
Ｈ）を用いてＡＡＨタンパク質を合成した。反応混合物中に含まれたウサギ赤血
球溶解物を用いてインビトロ翻訳を達成した。反応緩衝液、ＲＮＡポリメラーゼ
、アミノ酸混合物、およびリボヌクレアーゼインヒビター（ＲＮＡｓｉｎ）の存
在下で［35Ｓ］メチオニンを用いて、翻訳された産物を標識した。この産物をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてオートラジオグラフィーによって分析した。ルシ
フェラーゼ（Ｌｕｃ）発現プラスミドをポジティブコントロールとして用いた。
第二レーンおよび第三レーンにおいて、約８５ｋＤ  ＡＡＨタンパク質の合成を
示す（ＡＡＨ、矢印）。ここで、ｍＲＮＡを生成するため、テンプレートとして
１または２μｇのプラスミド、およびＴ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプ
ライマー／プロモーターを用いた。１００×または１０００×過剰のアンチセン
スオリゴヌクレオチドプライマーの添加により、ＡＡＨタンパク質合成の漸増的
に増大する程度の阻害を得たが、同じ量のセンスオリゴヌクレオチドの封入は、
ＡＡＨタンパク質合成には影響を有さなかった。さらなる試験により、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチドのみによる、ＡＡＨタンパク質合成の完全な阻害が実証
された。さらに、試験した３つのアンチセンスオリゴヌクレオチド全てを用いて
、遺伝子発現の効果的な阻害が観察された。図１１は、ＡＡＨアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドのインビトロ転写／翻訳分析の結果を示し、そして試験したアン
チセンスオリゴヌクレオチドがＨＡＡＨ  ＲＮＡの翻訳、およびＨＡＡＨタンパ
ク質の引き続くタンパク質合成をブロックすることを示す。
【０１０９】
ＡＡＨ遺伝子発現の阻害をまた細胞において試験した。図１１は、Ｍｉｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ（ＭＩＬＱ）Ａｓｓａｙの結果を示し、そしてアンチセンスオリゴヌ
クレオチド含有細胞の実際の効果を実証する。ＨＡＡＨ遺伝子発現の実際の減少
を、細胞の培養培地にアンチセンスオリゴヌクレオチドを単に添加することによ
り検出した。ＭＩＬＱアッセイは、ＲＮＡ抽出の必要性なしに、培養細胞におけ
るインサイチュハイブリダイゼーション結合を定量する。ＭＩＬＱアッセイを用
いて、競合的アンチセンス結合阻害を研究し、ｍＲＮＡにハイブリダイズしたア
ンチセンスプローブがＳｈ−ＳｙＳｙ神経芽細胞腫内で内因性に発現したことを
例証した。この図では、特定の未標識アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて
、ＦＩＴＣ−標識化した位置６のアンチセンスオリゴヌクレオチドの阻害を示す
。結合の最小阻害は、非関連オリゴヌクレオチドで観察された。未標識特異的オ
リゴヌクレオチドは、ＦＩＴＣ結合体化した位置６プローブにより指定された結
合部位に効率的に競合し得たが、非関連プローブは、同じ分子濃度で有意に少な
い阻害を示した。ＦＩＴＣに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗体を
用いて、結合したプローブ（ＦＩＴＣ標識した）を検出し、そしてルミネセンス
（発光）試薬を用いて結合抗体を検出した。発光単位を細胞密度について補正し
たが、現実には随意である。これらのデータは、細胞が周囲の環境からアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドを効率的に取り入れること、そしてこの取り入れられた
オリゴヌクレオチドがＨＡＡＨ遺伝子発現を効率的かつ特異的に阻害することを
示す。
【０１１０】
ＨＡＡＨ遺伝子発現の阻害は、細胞をＨＡＡＨアンチセンスのホスホロチオエ
ート誘導体と接触させることによって強化される。当該分野で周知の方法を用い
てホスホロチオエートアンチセンス誘導体を作成する。図１３は、ＳＨ−ＳｙＳ
Ｙ神経芽細胞腫細胞へのアンチセンス（位置６）オリゴヌクレオチド遺伝子送達
に起因するＡＡＨ遺伝子発現の阻害を示す。ＭＩＬＱアッセイを用いて、アンチ
センスオリゴヌクレオチド遺伝子送達から生じる遺伝子発現を測定する。細胞を
ＡＡＨ位置６アンチセンスＤＮＡと接触させ、そして当該分野で公知の方法（例
えば、ＭＩＣＥアッセイ（ｄｅ  ｌａ  Ｍｏｎｔｅら、１９９９，Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ））を用いて、ＡＡＨタンパク質発現を測定して、これがオリゴ
ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって阻害されるか否かを決定した
。ＭＩＣＥアッセイを用いて、タンパク質を抽出する必要なしに培養細胞中で免
疫反応性を測定するかまたはゲル電気泳動を実施する。このアッセイは、ウエス
タンブロット分析よりも感受性である。ＭＩＣＥアッセイを用いて、非関連（ラ
ンダム）オリゴヌクレオチド配列、特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（位
置６）、およびホスホロチオエート位置６アンチセンスオリゴヌクレオチドでト
ランスフェクトした細胞においてＡＡＨ免疫反応性を評価した。このオリゴヌク
レオチドのホスホロチオエート化学修飾は、細胞内部でのＤＮＡの安定性をより
大きくすることが見出された。なぜなら、イオウ基は、ホスホロチオエート結合
および細胞核で通常生じる分解からＤＮＡを保護するからである。アンチセンス
ＡＡＨオリゴヌクレオチド（位置６）トランスフェクションは、ＡＡＨ免疫反応
性のレベルの減少を生じた。そしてホスホロチオエート連結位置６アンチセンス
オリゴヌクレオチドを用いて、ＡＡＨ遺伝子発現を阻害する効果は、ランダムオ
リゴヌクレオチドでトランスフェクトした細胞において観察されたレベルにかな
り比例した。ホスホロチオエート連結アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた
ＡＡＨ発現のより効果的な阻害は、ｍＲＮＡに対する有効な結合の保持とあわせ
た、分子のより大きい安定性に起因するようであった
（実施例７：ヒトＩＲＳ−１変異体）
ＨＣＣ細胞株におけるＨＡＡＨのインスリン／ＩＧＦ−１刺激発現。プレクス
トリン（ｐｌｅｘｔｒｉｎ）およびホスホトリオシン（ＰＴＢ）ドメインにおい
て変異したドミナントネガティブＩＲＳ−１  ｃＤＮＡ、ならびに分子のＣ末端
に位置するＧｒｂ２、ＳｙｐおよびＰＩ３Ｋ結合モチーフを構築した。ヒトＩＲ
Ｓ−１変異体構築物を生成して、ＨＡＡＨ遺伝子発現がＩＲＳ−１増殖因子シグ
ナル伝達カスケードの活性化によりどのように上方調節されるかを評価した。ｈ
ＩＲＳ−１分子のＣ末端における特定の変異は、Ｇｒｂ２，ＳｙｐおよびＰＩ３
ＫのようなＳＨ２エフェクタータンパク質に結合する種々のドメインを廃した。
ヒトＩＲＳ−１タンパク質は、ラットＩＲＳ−１タンパク質と同様に、それぞれ
、８９７ＹＶＮＩ（以下、表５に下線を付している）および１１８０ＹＩＤＬ（
以下、表５に下線を付している）の同じＧｒｂ２およびＳｙｐ結合モチーフを含
む。ｈＩＲＳ−１の変異体は、これらのモチーフにおいて、以下のプライマーを
請うオリゴヌクレオチド指向性変異誘発の使用によって、ＴＴＴコドン（フェニ
ルアラニン）でのＴＡＴコドン（チロシン）の置換により構築した：（それぞれ
、５’―ＧＧＧＧＧＡＡＴＴＴＧＴＣＡＡＴＡ−３’（配列番号８）および５’
−ＧＡＡＴＴＴＧＴＴＡＡＴＡＴＴＧ−３’（配列番号９））。ｈＩＲＳ−１（
野生型）および変異体（チロシン８９７〜フェニルアラニンおよびチロシン１１
８０〜フェニルアラニン）のｃＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶ発現ベクター中にサブク
ローニングして、ｈＩＲＳ−１−ｗｔ、８９７Ｆ、ΔＧｒｂ２）、１１８０Ｆ、
およびΔＳｙｐと名付けた。
【０１１１】
表６：ヒトＩＲＳ−１アミノ酸配列
【０１１２】
【化１】
2008292486.tif 000006
（配列番号５；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＪＳ０６７０；プレケストリンドメイン
は、１１〜１１３残基にまたがる（包括的）；リン酸結合残基は配列番号５の４
６、４６５、５５１、６１２、６３２、６６２、７３２、９４１、９８９、また
は１０１２を含む）。
【０１１３】
表７：ヒトＩＲＳ−１  ｃＤＮＡ
【０１１４】
【化２】
2008292486.tif 000007
2008292486.tif 000008
2008292486.tif 000009
（配列番号６；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＮＭ００５５４４）。
【０１１５】
制限酵素ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて１１８０Ｆの同じ領域による８９
７Ｆをコードする３’配列の置換によってチロシン８９７および１１８０の二重
変異体を構築し、そしてこの構築物を８９７Ｆ１１８０ＦまたはΔＧｒｂ２ΔＳ
ｙｐと呼んだ。発現プラスミドは、ＣＭＶプロモーター（ｈＩＲＳ−１−ｗｔ、
ΔＧｒｂ２、ΔＳｙｐ，ΔＧｒｂ２、ΔＳｙｐおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（偽））の
コントロール下であり、そしてＭｌｕＩ制限酵素によりポリＡシグナル配列の３
’末端で直線化され、次に精製された。類似のアプローチを用いて、６１３位置
と９４２位置でチロシン残基をフェニルアラニンに変化し、二重ＰＩ３Ｋ変異体
構築物（ΔＰＩ３Ｋ）を作製した。ｈＩＲＳ−１変異体は、ＰＣＲによってＣ末
端に付加されたＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号６）＋終止コ
ドン）を有する。このストラテジーにより、安定にトランスフェクトした細胞株
において、「野生型」ｈＩＲＳ−１から変異体タンパク質を識別することが可能
になる。この変異体を用いてＩＲＳシグナル伝達経路と下流エフェクター遺伝子
としてのＨＡＡＨの活性化との間の連絡を規定し、そしてＨＡＡＨ過剰発現によ
り特徴付けられる腫瘍の増殖を阻害するこの経路に沿う伝達を阻害する化合物を
同定する。リン酸化反応部位に結合するかまたはその部位でリン酸化反応を阻害
する抗体または他の化合物を用いて、シグナル伝達を阻害し、これによりＨＡＡ
過剰発現腫瘍の増殖を阻害する。
【０１１６】
他の実施形態は添付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１は、種々のアスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ（ＡＡＨ）ｃＤＮＡによるＮＩＨ−３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクションにより誘導されたコロニー形成を示す棒グラフである。コロニー形成を、１０ｇ  ＤＮＡによる一過性トランスフェクションによって誘導した。対して、酵素活性を有さない変異体マウスＡＡＨ構築物は、形質転換活性を有さない。データは、形質転換病巣平均数±ＳＥＭとして示す。
【図２】図２は、種々のマウスＡＡＨ安定トランスフェクト細胞クローンにより産生されたタンパク質のウェスタンブロットアッセイのデンシトメトリー分析の結果を示す棒グラフである。クローン７および１８において、ＨＡＡＨ遺伝子発現の穏やかな増加があり、クローン１６においては、より低い程度であったが過剰発現があった。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＨＡＡＨ酵素活性に比較したＨＡＡＨ安定トランスフェクトクローンにより示されたソフトアガーにおけるコロニー形成を示す棒グラフである。図３Ａは、クローン７、１６、および１８におけるマウスＡＡＨ酵素活性の測定を示し、そして図３Ｂは、クローン７、１６、および１８により示されたコロニー形成を示す。データは、播種１０日後のコロニー平均数±ＳＥＭとして示す。ＨＡＡＨ酵素活性において穏やかな増大があった（これは、タンパク質発現と相関した）３つのクローンは全て、足場非依存性増殖を示した。
【図４】図４は、マウスＡＡＨを過剰発現するトランスフェクトクローンを注射したヌードマウスにおける腫瘍形成を示す棒グラフである。腫瘍増殖は、３０日後に評価した。クローン７、１６、および１８を注射したマウスにおいて観察された平均腫瘍重量を偽ＤＮＡトランスフェクトクローンに対して比較した。ＨＡＡＨを過剰発現するクローンを注射した全ての動物は、腫瘍を発達させた。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、腫瘍細胞侵襲の間に生じるようなニューライト成長（ｎｅｕｒｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）を誘導するためにレチノイン酸（図５Ａ、５Ｂ）およびホルボールエステルミリステート（ＰＭＡ；図５Ｃ）で処置したＰＮＥＴ２（図５Ａ、５Ｃ）およびＳＨ−Ｓｙ５ｙ（図５Ｂ）細胞におけるＡＡＨ発現の増大を示す棒グラフである。細胞を、０、１、２、３、４、または７日間、１０Ｍレチノイン酸または１００ｎＭ  ＰＭＡで処理した。細胞溶解物を、ＨＡＡＨ特異的モノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析によって分析し、８５ｋＤａ  ＡＡＨタンパク質を検出した。免疫反応性のレベルは、体積デンシトメトリー（任意単位）によって測定した。このグラフは、３つの別個の実験から得られた結果の平均±Ｓ．Ｄ．を示す。図５Ｄにおいては、ＰＮＥＴ２細胞を、ニューライト収縮を誘導するために致死下濃度のＨ2Ｏ2で２４時間処理した。細胞の９０％より多くの生存度が、トリパンブルー染料排除によって示された。同様の結果が、ＳＨ−Ｓｙ５ｙ細胞について観察された。
【図６】図６は、抗アポトーシス分子（Ｂｃｌ−２）、細胞周期有糸分裂インヒビター分子（ｐ１６およびｐ２１／Ｗａｆ１）、および増殖分子（増殖細胞核抗原；ＰＣＮＡ）のレベルに関するＡＡＨ過剰発現の効果を示す棒グラフである。ＰＮＥＴ２ニューロン細胞をＡＡＨをコードする全長ヒトｃＤＮＡ（ｐＨＡＡＨ）または空ベクター（ｐｃＤＮＡ）で安定にトランスフェクトした。ＡＡＨ遺伝子発現は、ＣＭＶプロモーターの制御下にあった。ウェスタンブロット分析を、７０〜８０パーセントのコンフルエントである培養物から調製した細胞溶解物を用いて実施した。タンパク質ローディングは、各レーンにおいて等価であった。反復ブロットを、異なる抗体を用いてプローブした。棒グラフは、３つの実験において測定したタンパク質発現レベルの平均Ｓ．Ｄ．を示す。全ての差異は、スチューデントＴ検定分析によって統計学的に有意である（Ｐ＜０．０１〜Ｐ＜０．００１）。
【図７】図７は、ＩＲＳ−１シグナル伝達経路の成分を示す図である。
【図８】図８は、ＧＦＰを発現するコントロールに比較したアンチセンスＨＡＡＨ発現細胞において生じた増殖曲線を示す線グラフである。
【図９】図９は、ｈＩＲＳ−１タンパク質の機能的ドメインおよび点変異体の構造的構成を示す図である。全ての変異体および「野生型」ｈＩＲＳ−Ｉタンパク質構築物は、Ｃ末端にＦＬＡＧ（Ｆ）エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７）を含む。ＰＨおよびＰＴＢは、それぞれ、プレックストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）相同性領域およびホスホチロシン結合領域を示す。
【図１０】図１０は、ＡＡＨ  ｃＤＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合する位置を示す図である。示した位置は、ＡＡＨ  ｃＤＮＡのＡＵＧ開始部位に対してである。
【図１１】図１１は、アンチセンスオリゴヌクレオチドＤＮＡ分子によるＡＡＨ遺伝子発現の阻害を示す電気泳動ゲルの写真である。
【図１２】図１２は、神経芽細胞腫細胞におけるＡＡＨアンチセンスオリゴヌクレオチド結合を示す線グラフである。
【図１３】図１３は、神経芽細胞腫細胞へのＡＡＨアンチセンスオリゴヌクレオチド送達の結果としてのＡＡＨ遺伝子発現の阻害を示す棒グラフである。
【図１４】図１４Ａは、ＮＯＴＣＨタンパク質のウェスタンブロットアッセイ発現の写真である。図１４Ｂは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定されるようなＨｅｓ−１遺伝子発現を示す電気泳動ゲルの写真である。図１４Ｃは、ＩＲＳ−１シグナル伝達が減少する条件下でのＮＯＴＣＨ−１およびＪａｇｇｅｄ−１の発現を示すウェスタンブロットアッセイの写真である。
【図１】
2008292486.tif 000010
【図２】
2008292486.tif 000011
【図３】
2008292486.tif 000012
【図４】
2008292486.tif 000013
【図５】
2008292486.tif 000014
【図６】
2008292486.tif 000015
【図７】
2008292486.tif 000016
【図８】
2008292486.tif 000017
【図９】
2008292486.tif 000018
【図１０】
2008292486.tif 000019
【図１１】
2008292486.tif 000020
【図１２】
2008292486.tif 000021
【図１３】
2008292486.tif 000022
【図１４】
2008292486.tif 000023
【配列表】
2008292486000001.app