(57)【要約】【課題】シート形状などに成形してハンドリングのよい医療材料などに利用することができ、生体適合性に優れ、感染の恐れがないハイブリッドポリマー及びハイブリッドポリマーシートの製造方法を提供する。【解決手段】本ハイブリッドポリマーは、式（１）：H-Gly-Xaa-Gly-Val-Pro-OH（Xaaは、Val、Ile、Lys、Glu、Ala、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）で示される第１ペプチド成分の重合体である第１ポリマーと、式（２）：H-Pro-Yaa-Gly-OH（Yaaは、Hyp、Pro、Gly、Ala、Leu、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）で示される第２ペプチド成分の重合体である第２ポリマーとが直列に連結されてなり、式（３）：H-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)m-(Pro-Yaa-Gly)n-OH（m,nは自然数である。）、又は式（４）：H-(Pro-Yaa-Gly)m-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)n-OH（m,nは自然数である。）で示される。【選択図】図１
2008001683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示される第１ペプチド成分の重合体である第１ポリマーと、式（２）で示される第２ペプチド成分の重合体である第２ポリマーとが直列に連結されてなる式（３）又は式（４）で示されるハイブリッドポリマー。
式（１）：H-Gly-Xaa-Gly-Val-Pro-OH（Xaaは、Val、Ile、Lys、Glu、Ala、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（２）：H-Pro-Yaa-Gly-OH（Yaaは、Hyp、Pro、Gly、Ala、Leu、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（３）：H-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)m-(Pro-Yaa-Gly)n-OH（m,nは自然数である。）
式（４）：H-(Pro-Yaa-Gly)m-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)n-OH（m,nは自然数である。）
【請求項２】
上記第１ポリマー及び第２ポリマーは、第１ペプチド成分又は第２ペプチド成分の８量体以上である請求項１に記載のハイブリッドポリマー。
【請求項３】
上記第１ポリマーに対して、上記第２ペプチド成分が重合されたものである請求項１又は２に記載のハイブリッドポリマー。
【請求項４】
上記第２ポリマーに対して、上記第１ペプチド成分が重合されたものである請求項１又は２に記載のハイブリッドポリマー。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマーを含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られるポリマーゲル。
【請求項６】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマーを含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化するポリマーゲルの製造方法。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマーを含む水溶液を５０〜９０℃に加熱して所望の形状にキャストし、４〜５０℃で水分を蒸発させることによりシート形状に成形して得られるハイブリッドポリマーシート。
【請求項８】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマーを含む水溶液を５０〜９０℃に加熱して所望の形状にキャストし、４〜５０℃で水分を蒸発させることによりシート形状に成形するハイブリッドポリマーシートの製造方法。
【請求項９】
引張り強度が０．２ｋｇ／ｃｍ２以上である請求項７に記載のハイブリッドポリマーシート。
【請求項１０】
請求項７又は９に記載のハイブリッドポリマーシートが、基材上に積層されたポリマー積層体。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマー及び薬剤を含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られる当該薬剤を内包する薬剤内包ポリマーゲル。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドポリマー及び薬剤を含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化して、当該薬剤をゲルに内包させる薬剤内包ポリマーゲルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスチンの構成単位であるポリペプチドと、コラーゲンの構成単位であるポリペプチドとを含むハイブリッドポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、真皮、靱帯、腱、骨、軟骨などを構成するタンパク質の一つであり、多細胞動物の細胞外マトリクスの主成分である。また、エラスチンも、細胞外マトリクスの一つである。コラーゲン及びエラスチンは、食品や化粧品の原料として利用されている。また、生体適合性に優れることから、医療用として人工臓器や細胞培養基材への利用が提案されている（例えば、特許文献１から特許文献３）。
【０００３】
天然のコラーゲンは、トリペプチド配列が反復する一次構造を有する。具体的には、グリシン−プロリン−ヒドロキシプロリンである。このトリペプチド配列が、例えばＩ型コラーゲンでは１０１４アミノ酸残基繰り返されてα鎖と称されるポリペプチド鎖（ポリマー）をなしている。このポリペプチド鎖の分子量は約１０万程度である。コラーゲンの多くは、このポリペプチド鎖が３重らせん構造を形成してなる。また、このようなコラーゲン構造又は類似構造を有する合成ポリマーが検討されている（例えば、特許文献４）。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−３３６６１号公報
【特許文献２】特表２００６−５１２１５４号公報
【特許文献３】特表２００６−５０６１１０号公報
【特許文献４】特表２０００−５００４６７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
天然のコラーゲンは、工業的には牛や豚などを原料として製造される。しかし、狂牛病のように感染の恐れがある疾病に牛などが罹患している場合には、安全性確保のために原料の変更が必要な場合が生じるおそれがある。一方、合成コラーゲンでは、そのような懸念がない。
【０００６】
コラーゲンを培養基材などとして用いる場合には、適度な強度を有する形状に成形される必要がある。例えば、コラーゲンが水分を含むことによりゲル状になることが知られているが、培養基材のような用途を考慮すると、例えば合成樹脂シートの如く、一定形状を維持して容易に破断しないシート形状に成形できることが望まれる。しかし、ゲル状のコラーゲンから水分を蒸発させたとしても、その保湿性からコラーゲンは依然として水分を多く含んだ弾性体であり、表面が粘着質であって一定形状を維持することができず、また、容易に破断する。つまり、医療材料などに用いるにはハンドリングが悪いという問題がある。
【０００７】
本発明は、かかる事情に鑑みてなされたものであり、シート形状などに成形してハンドリングのよい医療材料などに利用することができ、生体適合性に優れ、感染の恐れがないハイブリッドポリマー及び当該ハイブリッドポリマーを利用した種々のものを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
(1)  本発明にかかるハイブリッドポリマーは、式（１）で示される第１ペプチド成分の重合体である第１ポリマーと、式（２）で示される第２ペプチド成分の重合体である第２ポリマーとが直列に連結されてなる式（３）又は式（４）で示されるものである。
式（１）：H-Gly-Xaa-Gly-Val-Pro-OH（Xaaは、Val、Ile、Lys、Glu、Ala、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（２）：H-Pro-Yaa-Gly-OH（Yaaは、Hyp、Pro、Gly、Ala、Leu、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（３）：H-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)m-(Pro-Yaa-Gly)n-OH（m,nは自然数である。）
式（４）：H-(Pro-Yaa-Gly)m-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)n-OH（m,nは自然数である。）
【０００９】
(2)  上記第１ポリマー及び第２ポリマーは、第１ペプチド成分又は第２ペプチド成分の８量体以上であることが好ましい。
【００１０】
(3)  上記ハイブリッドポリマーとして、上記第１ポリマーに対して、上記第２ペプチド成分が重合されたものが考えられる。
【００１１】
(4)  上記ハイブリッドポリマーとして、上記第２ポリマーに対して、上記第１ペプチド成分が重合されたものが考えられる。
【００１２】
(5)  本発明にかかるポリマーゲルは、上記ハイブリッドポリマーを含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られるものである。
【００１３】
(6)  本発明にかかるポリマーゲルの製造方法は、上記ハイブリッドポリマーを含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化する工程を含む。
【００１４】
(7)  本発明にかかるハイブリッドポリマーシートは、上記ハイブリッドポリマーを含む水溶液を５０〜９０℃に加熱して所望の形状にキャストし、４〜５０℃で水分を蒸発させることによりシート形状に成形して得られるものである。
【００１５】
(8)  本発明に係るハイブリッドポリマーシートの製造方法は、上記ハイブリッドポリマーを含む水溶液を５０〜９０℃に加熱して所望の形状にキャストし、４〜５０℃で水分を蒸発させることによりシート形状に成形する工程を含む。
【００１６】
(9)  上記ハイブリッドポリマーシートは、引張り強度が０．２ｋｇ／ｃｍ２以上であることが好ましい。
【００１７】
(10)  本発明にかかるポリマー積層体は、上記ハイブリッドポリマーシートが、基材上に積層されたものである。
【００１８】
(11)  本発明にかかる薬剤内包ポリマーゲルは、上記ハイブリッドポリマー及び薬剤を含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られる当該薬剤を内包するものである。
【００１９】
(12)  本発明にかかる薬剤内包ポリマーゲルの製造方法は、上記ハイブリッドポリマー及び薬剤を含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化して、当該薬剤をゲルに内包させる工程を含む。
【発明の効果】
【００２０】
本発明にかかるハイブリッドポリマーは、式（１）で示される第１ペプチド成分の重合体である第１ポリマーと、式（２）で示される第２ペプチド成分の重合体である第２ポリマーとが直列に連結されてなるので、コラーゲンの生体適合性などの特性とエラスチンの凝集特性とを併有する。これにより、シート形状などに成形することが容易であり、生体適合性に優れ、感染の恐れがないハイブリッドポリマーが得られる。
【００２１】
本発明にかかるポリマーゲルは、上記ハイブリッドポリマーを含む水溶液をゲル化して得られるので、上記ハイブリッドポリマーの特性を有する。このポリマーゲルは、薬剤を徐放する基材や、細胞を培養する基材などとして有用である。
【００２２】
本発明にかかるハイブリッドポリマーシートは、上記ハイブリッドポリマーがシート形状を保持するので、上記ハイブリッドポリマーの特性を有し、かつハンドリングに優れたものとなる。
【００２３】
本発明にかかるポリマー積層体は、上記ハイブリッドポリマーの特性を有し、基材の形状に合わせて３次元にゲル層を形成することができるので、ポリマーゲルで被覆された３次元構造体を形成することができる。
【００２４】
本発明にかかる薬剤内包ポリマーゲルは、上記ハイブリッドポリマーの特性を有し、薬剤の徐放を目的とするドラッグデリバリーシステムとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に、本発明の好ましい実施形態が説明される。なお、本実施形態は本発明の一実施態様にすぎず、本発明の要旨を変更しない範囲で実施態様が変更されてもよいことは言うまでもない。
【００２６】
［ハイブリッドポリマー］
本発明において第１ペプチド成分と称されるものは以下の式（１）で示される構造を有する。
式（１）：H-Gly-Xaa-Gly-Val-Pro-OH（Xaaは、Val、Ile、Lys、Glu、Ala、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（１）において、Glyはグリシン、Valはバリン、Proはプロリン、Ileはイソロイシン、Lysはリジン、Gluはグルタミン酸、Alaはアラニン、Serはセリン、Thrはトレオニン、Asnはアスパラギン、Glnはグルタミンを意味する。第１ペプチド成分は、前述された５つのアミノ酸からなるペンタペプチドであり、エラスチン由来の配列といえる。
【００２７】
本発明において第２ペプチド成分と称されるものは以下の式（２）で示される構造を有する。
式（２）：H-Pro-Yaa-Gly-OH（Yaaは、Hyp、Pro、Gly、Ala、Leu、Ser、Thr、Asn、Glnよりなる群から選ばれるいずれか１つである。）
式（２）において、Proはプロリン、Glyはグリシン、Hypはヒドロキシプリン、Proはプロリン、Glyはグリシン、Alaはアラニン、Leuはロイシン、Serはセリン、Thrはトレオニン、Asnはアスパラギン、Glnはグルタミンを意味する。第２ペプチド成分は、前述された３つのアミノ酸からなるトリペプチドであり、コラーゲン由来の配列といえる。
【００２８】
第１ペプチド成分及び第２ペプチド成分は、化学合成法や酵素合成法などの既に確立されたペプチド合成法により生成することができる。また、自動ペプチド合成装置を用いて行うこともできる。ペプチド合成は、通常、Ｃ末端側からＮ末端側へ向かって進められ、未反応のアミノ基はＦＭＯＣ基やＢＯＣ基などに代表される保護基によって保護される。また、アミドの反応収率を高くするためにブタノールやＷＳＣＩ（水溶性ＤＣＣ）などの保護基が用いられてもよい。ペプチド合成により得られた第１ペプチド成分及び第２ペプチド成分の構造確認は、例えば、質量分析装置（Applied Biosystems、商品名：Voyager）により行うことができる。また、第１ペプチド成分及び第２ペプチド成分のアミノ酸組成は、アミノ酸分析装置（株式会社日立製作所、商品名：Ｌ−８５００）により行うことができる。
【００２９】
本発明にかかる第１ポリマーは、上記第１ペプチド成分が重合されてなる直鎖状のポリマーである。つまり、第１ペプチド成分がアミド結合により重合されたものであり、好ましくは第１ペプチド成分の８量体以上であり、より好ましくは、１０量体以上、最も好ましくは、２０量体以上である。第１ペプチド成分の重合度を上記範囲とすることにより、エラスチンの凝集特性がハイブリッドポリマーにおいて有効に発揮される。
【００３０】
本発明にかかる第２ポリマーは、上記第２ペプチド成分が重合されてなる直鎖状のポリマーである。つまり、第２ペプチド成分がアミド結合により重合されたものであり、好ましくは第２ペプチド成分の８量体以上であり、より好ましくは、１０量体以上、最も好ましくは、２０量体以上である。第２ペプチド成分の重合度を上記範囲とすることにより、コラーゲンの保水性や生体適合性などの特性がハイブリッドポリマーにおいて有効に発揮される。
【００３１】
なお、第１ポリマー及び第２ポリマーの重合は、化学合成法のように既に確立されたペプチド合成方法により行うことができる。また、第１ポリマー及び第２ポリマーの確認は、例えば、液体クロマトグラフ質量分析装置（Applied Biosystems、商品名：Marinaer）により行うことができる。
【００３２】
本発明にかかるハイブリッドポリマーは、上記第１ポリマーと上記第２ポリマーとが直列に連結されてなる。具体的には、上記第１ポリマーに対して、上記第２ペプチド成分を重合してハイブリッドポリマーとする方法、又は上記第２ポリマーに対して、上記第１ペプチド成分を重合してハイブリッドポリマーとする方法のいずれかを採用することができる。これにより得られるハイブリッドポリマーは、以下の式（３）又は式（４）で示される構造を有する。
式（３）：H-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)m-(Pro-Yaa-Gly)n-OH（m,nは自然数である。）
式（４）：H-(Pro-Yaa-Gly)m-(Gly-Xaa-Gly-Val-Pro)n-OH（m,nは自然数である。）
【００３３】
第１ポリマー又は第２ポリマーに対して重合される第２ペプチド成分又は第１ペプチド成分は、ＤＰＰＡ（ジフェニルリン酸アジド）やＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）などのペプチド合成溶剤の環境下で、既知のペプチド合成方法により行うことができる。また、未反応のアミノ基はＦＭＯＣ基やＢＯＣ基などに代表される保護基によって保護される。また、ハイブリッドポリマーの確認は、例えば、質量分析及びアミノ酸分析により行うことができる。
【００３４】
上記ハイブリッドポリマーは、３重らせん構造を形成したものであってもよい。３重らせん構造は、上記ハイブリッドポリマーの保護体を、液中において室温付近で静置しておくことにより形成される。また、ハイブリッドポリマーは、糖鎖が付加されたものであってもよい。例えば、ハイブリッドポリマーがSer、Thr、Asn、Glnを有する場合に糖鎖を付加させることができる。
【００３５】
このように、本発明にかかるハイブリッドポリマーは、式（１）で示される第１ペプチド成分の重合体である第１ポリマーと、式（２）で示される第２ペプチド成分の重合体である第２ポリマーとが直列に連結されてなるので、コラーゲンの生体適合性などの特性とエラスチンの凝集特性とを併有する。これにより、シート形状などに成形することが容易であり、生体適合性に優れ、感染の恐れがないハイブリッドポリマーが得られる。
【００３６】
［ポリマーゲル］
本発明にかかるポリマーゲルは、前述されたハイブリッドポリマーを含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られるものである。その製造方法は、上記ハイブリッドポリマーを純水やエタノール、メタノールなどに約１〜１０００mg/mLで溶解してハイブリッドポリマー水溶液とする。ハイブリッドポリマーを溶解する溶媒は特に限定されないが、生体適合性の観点から純水が好ましい。また、ハイブリッドポリマーの濃度は、得られるポリマーゲルの均一性や強度を考慮して定められ、より好ましくは５０〜５００mg/mLである。ハイブリッドポリマーの濃度を上記範囲以内とすることにより、強度の高いポリマーゲルが得られる。ハイブリッドポリマーの濃度が上記範囲より低ければ、ポリマーゲルの強度が低くなり、高ければ均一なポリマーゲルが得られにくい傾向にある。
【００３７】
次いで、上記ハイブリッドポリマー水溶液を５０〜９０℃に加熱してゲル化する。加熱温度は、より好ましくは５５〜７５℃であり、特に好ましくは６０〜７０℃である。ハイブリッドポリマー水溶液が加熱されることにより、エラスチンの可逆的な凝集作用が生じる。一般に、エラスチンは、３０〜６０℃の範囲で凝集状態又は分散状態に可逆的に移行する。上記ハイブリッドポリマーは、エラスチン由来のアミノ酸配列とコラーゲン由来のアミノ酸配列とを有するものなので、加熱により凝集状態に移行した後、冷却された際に分散状態に移行する速度が遅い。具体的には、約５０℃以上に加熱されると凝集状態に移行し始めるが、分散状態への移行は約４０℃付近から緩やかに開始され、約３０℃以下になれば分散状態への移行速度が速まる。このようなハイブリッドポリマーの特性を考慮すると、加熱温度を上記範囲内とすることが好ましい。
【００３８】
加熱されたハイブリッドポリマー水溶液は、５０〜９０℃に保持されて、１〜１２時間放置されることによりゲル化される。これにより、本発明にかかるポリマーゲルが得られる。得られたポリマーゲルは、寒天状又はスポンジ状の形態となる。寒天状のポリマーゲルは、ハイブリッドポリマーを純粋に溶解して、前述された方法に基づいてゲル化することにより得られる。スポンジ状のポリマーゲルは、ハイブリッドポリマーを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に溶解して、前述された方法に基づいてゲル化することにより得られる。寒天状のポリマーゲルは、透明であって強度が比較的高く、薬剤を徐放する基材に好適である。スポンジ状のポリマーゲルは、白濁しており強度が比較的弱い。スポンジ状のポリマーゲルは、細胞培養の基材に好適であり、その空隙内で細胞が培養される。
【００３９】
［ハイブリッドポリマーシート］
本発明にかかるハイブリッドポリマーシートは、上記ハイブリッドポリマーがシート形状に成形されたものである。その製造方法は、上記ハイブリッドポリマーを純水やエタノール、メタノールなどに約１〜１０mg/mLで溶解してハイブリッドポリマー水溶液とする。ハイブリッドポリマーを溶解する溶媒は特に限定されないが、生体適合性の観点から純水が好ましい。また、ハイブリッドポリマーの濃度は、得られるハイブリッドポリマーシートの厚みや強度の観点から定められ、より好ましくは５〜１０mg/mLである。ハイブリッドポリマーの濃度を上記範囲以内とすることにより、ホールなどの欠如部位のない完全なハイブリッドポリマーシートを形成することができ、ハイブリッドポリマーシートに医療用などの所望の用途に応じた適切な強度を付与することができる。また、ハイブリッドポリマーの濃度を上記範囲以内とすることにより、ハイブリッドポリマー溶液に沈殿が生じない。
【００４０】
次いで、上記ハイブリッドポリマー水溶液を５０〜９０℃に加熱して所望の形状にキャストする。加熱温度は、より好ましくは７０〜９０℃であり、特に好ましくは８０〜９０℃である。ハイブリッドポリマー水溶液が加熱されることにより、エラスチンの可逆的な凝集作用が生じる。一般に、エラスチンは、３０〜６０℃の範囲で凝集状態又は分散状態に可逆的に移行する。上記ハイブリッドポリマーは、エラスチン由来のアミノ酸配列とコラーゲン由来のアミノ酸配列とを有するものなので、加熱により凝集状態に移行した後、冷却された際に分散状態に移行する速度が遅い。具体的には、約５０℃以上に加熱されると凝集状態に移行し始めるが、分散状態への移行は約４０℃付近から緩やかに開始され、約３０℃以下になれば分散状態への移行速度が速まる。このようなハイブリッドポリマーの特性を考慮すると、加熱温度を上記範囲内とすることが好ましい。
【００４１】
加熱されたハイブリッドポリマー水溶液は、適当な容器によりキャストされる。容器の形状によりハイブリッドポリマーシートの形状が決まるので、例えば、円形のハイブリッドポリマーシートを成形する場合には、内部空間が円柱形状の容器を用いればよい。容器の材質などは特に限定されず、加熱温度に対する耐性を有するものであればよく、例えば、ガラス製容器や樹脂製容器が想定される。ハイブリッドポリマー水溶液の加熱は、キャストを行う容器にハイブリッドポリマー水溶液を注入する前に行っても、キャストを行う容器内で加熱を行ってもいずれでもよい。
【００４２】
キャストされたハイブリッドポリマー水溶液は、４〜５０℃に保持されて、約５〜２４時間放置されることによりで水分が蒸発される。これにより、ハイブリッドポリマーシートが得られる。水分を蒸発させる際にハイブリッドポリマー水溶液を保持する温度は、ハイブリッドポリマーが分散状態に移行しない温度が好適であり、より好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３７〜５０℃である。また、水分の蒸発は、自然蒸発であっても熱風環境下におかれて強制的に蒸発されてもよい。これにより、ハイブリッドポリマーが凝集された状態で、水分が蒸発されるので、得られたハイブリッドポリマーシートの水分含有量が低く、ゲル状でないハンドリングに優れたものとなる。
【００４３】
上記ハイブリッドポリマーシートは、引張り強度が０．２ｋｇ／ｃｍ２以上であることが好ましく、より好ましくは０．３ｋｇ／ｃｍ２以上である。ハイブリッドポリマーシートの引張り強度が上記数値範囲内であれば、取り扱い時に破損しにくく、ハンドリングに優れる。
【００４４】
［ポリマー積層体］
本発明にかかるポリマー積層体は、上記ハイブリッドポリマーシートが、基材上に積層されたものである。基材は、ハイブリッドポリマーとは異なる別のポリマーであって、例えばポリ乳酸などの剛性の高いポリマーを３次元に構築したものである。基材の形状として、例えば平板や直方体が採用されるが、基材の形状やポリマー積層体の用途に応じて変更することができる。例えば、ポリマー積層体を細胞培養に使用するのであれば、基材の表面を形成したい細胞塊の形状にすればよい。基材とハイブリッドポリマーとの結合は、例えば、吸着による結合や、ガンマ線を照射することにより基材とハイブリッドポリマーシートとの間に共有結合を形成する結合があげられる。
【００４５】
［薬剤内包ポリマーゲル］
本発明にかかる薬剤内包ポリマーゲルは、上記ハイブリッドポリマー及び薬剤を含む水溶液を、５０〜９０℃に加熱してゲル化することにより得られる当該薬剤を内包するものである。その製造方法は、上記ハイブリッドポリマーを純水やエタノール、メタノールなどに約１〜１０mg/mLで溶解してハイブリッドポリマー水溶液とする。ハイブリッドポリマーを溶解する溶媒は特に限定されないが、生体適合性の観点から純水が好ましい。また、ハイブリッドポリマーの濃度は、得られるポリマーゲルの強度を考慮して定められ、より好ましくは５〜１０mg/mLである。ハイブリッドポリマーの濃度を上記範囲以内とすることにより、薬剤を内包しても強度が保たれたポリマーゲルを作製することが容易である。
【００４６】
このハイブリッドポリマー水溶液に、内包させる薬剤を溶解する。薬剤としては、例えば、インスリンなどのタンパク性の薬剤があげられる。薬剤の濃度は、使用される薬剤により異なるが、例えば、薬剤自身の溶解度から定められ、好ましくは０．０５〜１mg/mLである。薬剤の濃度を上記範囲以内とすることにより、薬剤の凝集による変性や徐放の際の不均一さが抑制される。
【００４７】
次いで、薬剤を含むハイブリッドポリマー水溶液を５０〜９０℃に加熱してゲル化する。加熱温度は、より好ましくは５０〜６０℃であり、特に好ましくは５０〜５５℃である。加熱されたハイブリッドポリマー水溶液は、４０〜５０℃に保持されて、１〜１２時間放置されることによりゲル化される。これにより、本発明にかかる薬剤内包ポリマーゲルが得られる。この薬剤内包ポリマーゲルを乾燥させることにより、長期保管に好適な薬剤を内包したシート状構造体が得られる。
【実施例】
【００４８】
以下に、本発明の実施例が説明される。実施例は、本発明の一実施形態であり、本発明が実施例に記載されたものに限定されないことは言うまでもない。
【００４９】
（第１ペプチド成分の合成）
・カップリング１
Ｃ末端側がＢｚｌ化されたグリシン（H-Gly-OBzl・Tos-OH、ＭＷ＝３３７．３、渡辺化学）３０ｍｍｏｌをＤＭＦ（和光純薬）に溶解し、Ｎ末端側がＢｏｃ化されたバリン（Boc-Val-OH、ＭＷ＝２１７．２、渡辺化学）３０ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン（東京化成工業）３０ｍｍｏｌ（１４０μＬ／１ｍｍｏｌ換算で４．２ｍＬ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・Ｈ２Ｏ（渡辺化学、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ）３６ｍｍｏｌを加え、この溶液が入ったナスフラスコを氷冷した。十分に冷やした後、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ）・塩酸（ＭＷ＝１９１．７、ペプチド研究所、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ））３３ｍｍｏｌを加えて３０分放置した後、室温に戻した。これを撹拌しながら室温で一晩放置した。
【００５０】
発生した結晶をＤＭＦで洗浄しながらろ過を行って除去した後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。この減圧濃縮残渣を酢酸エチル（和光純薬）に溶かして冷蔵庫内（設定温度４℃）で３０分間放置した。発生した結晶を酢酸エチルで洗浄しながらろ過を行って除去した後、分液ロートにより、水に対して２回、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に対して３回、水に対して１回、５％硫酸水素カリウム水溶液に対して３回、飽和食塩水に対して２回、洗浄を行った。その後、酢酸エチル層に硫酸ナトリウム（和光純薬、無水硫酸ナトリウム）３ｇを添加して一晩乾燥させた。
【００５１】
上記酢酸エチル層から硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。減圧濃縮残渣にヘキサン（和光純薬、ｎ−ヘキサン）３０ｍＬを加えて結晶化を行い、その結晶をろ過により採取してデシケータで減圧乾燥した。乾燥後のバリン・グリシンペプチド（Boc-Val-Gly-OBzl、Ｃ１９Ｈ２８Ｏ５Ｎ２、ＭＷ＝３６４．４４）の秤量値は９．７１ｇ（８８％）であった。
【００５２】
・脱Boc１
得られたBoc-Val-Gly-OBzl２６．５ｍｍｏｌを４Ｎ塩酸／ジオキサン７０ｍＬに溶解させ、室温で２時間静置した。その後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行い、ジエチルエーテルを加えて結晶化を行った。その結晶をろ過により採取した後、デシケータで減圧乾燥した。乾燥後の脱Bocされたバリン・グリシンペプチド（H-Val-Gly-OBzl・HCl）の秤量値は７．８５ｇ（９８％）であった。
【００５３】
・カップリング２
カップリング１と同様にして、脱Bocされたバリン・グリシンペプチド（H-Val-Gly-OBzl・HCl）２６ｍｍｏｌをＤＭＦに溶解し、Ｎ末端側がＢｏｃ化されたグリシン（Boc-Gly-OH、ＭＷ＝１７５．１９、渡辺化学）２６ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン３．６４ｍＬ、ブタノール・Ｈ２Ｏ３１．２ｍｍｏｌを加え、氷冷後、ＷＳＣｌ・ＨＣｌ２８．６ｍｍｏｌを加えてから室温に戻した。撹拌しながら一晩放置した後、カップリング１と同様に、結晶除去、減圧濃縮、減圧濃縮残渣の溶解、結晶除去、洗浄、乾燥、硫酸ナトリウムの除去、減圧濃縮、結晶化、減圧乾燥により、グリシン・バリン・グリシンペプチド（Boc-Gly-Val-Gly-OBzl、Ｃ２１Ｈ３１Ｏ６Ｎ３、ＭＷ＝４２１．４９）を得た。秤量値は９．２ｇ（８３％）であった。
【００５４】
・脱Bzl１
得られたグリシン・バリン・グリシンペプチド（Boc-Gly-Val-Gly-OBzl）１５ｍｍｏｌ（６．３ｇ）をＭｅＯＨ溶液（和光純薬、メタノール）３０ｍＬに溶解し、５％パラジウム炭素（ナカライテスク）８ｇを加えた。この溶液にＨＣＯＯＮＨ４（ＭＷ＝６３．０６、和光純薬、ギ酸アンモニウム）６０ｍｍｏｌを加えて、常温で１時間撹拌した後、ろ過によりパラジウム炭素を除去した。この溶液を濃縮して、ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解した。これをジエチルエーテル１０ｍＬで２回洗浄し、その水層に１０％クエン酸溶液を加えて、容器のｐＨを３以下に調整した。これを酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出を行い、酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄してから硫酸ナトリウムを加えて一晩放置した。
【００５５】
上記酢酸エチル層から硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。減圧濃縮残渣にエーテル（和光純薬、ジエチルエーテル）３０ｍＬを加えて結晶化を行い、その結晶をろ過により採取してデシケータで減圧乾燥した。乾燥後の脱Bzlされたグリシン・バリン・グリシンペプチド（Boc-Gly-Val-Gly-OH、Ｃ１４Ｈ２５Ｏ６Ｎ３、ＭＷ＝３３１．３６）の秤量値は３．１ｇ（６３％）であった。
【００５６】
・カップリング３
Ｃ末端側がＢｚｌ化されたプロリン（H-Pro-OBzl・HCl、ＭＷ＝241.7、渡辺化学）３０ｍｍｏｌをＤＭＦに溶解し、Ｎ末端側がＢｏｃ化されたバリン３０ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン４．２ｍＬ、ブタノール・Ｈ２Ｏ３６ｍｍｏｌを加え、この溶液が入ったナスフラスコを氷冷した。十分に冷やした後、ＷＳＣｌ・ＨＣｌ３３ｍｍｏｌを加えて３０分放置した後、室温に戻した。これを撹拌しながら室温で一晩放置した。
【００５７】
発生した結晶をＤＭＦで洗浄しながらろ過を行って除去した後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。この減圧濃縮残渣を酢酸エチルに溶かして冷蔵庫内（設定温度４℃）で３０分間放置した。発生した結晶を酢酸エチルで洗浄しながらろ過を行って除去した後、カップリング１と同様に、分液ロートを用いて洗浄を行い、酢酸エチル層に硫酸ナトリウムを５ｇを添加して一晩乾燥させた。
【００５８】
上記酢酸エチル層から硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。減圧濃縮残渣にヘキサン３０ｍＬを加えて結晶化を行い、その結晶をろ過により採取してデシケータで減圧乾燥した。乾燥後のバリン・プロリンペプチド（Boc-Val-Pro-OBzl、Ｃ２２Ｈ３２Ｏ５Ｎ２、ＭＷ＝４０４．５０）の秤量値は９．７ｇ（８０％）であった。
【００５９】
・脱Boc２
得られたBoc-Val-Pro-OBzl１３ｍｍｏｌを４Ｎ塩酸／ジオキサン３５ｍＬに溶解させ、室温で２時間静置した。その後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行い、ジエチルエーテルを加えて結晶化を行った。その結晶をろ過により採取した後、デシケータで減圧乾燥した。乾燥後の脱Bocされたバリン・プロリンペプチド（H-Val-Pro-OBzl・HCl、Ｃ１７Ｈ２４Ｏ３Ｎ２・ＨＣｌ、ＭＷ＝３０４．３８＋３６．４６）の秤量値は４．４ｇ（９９％）であった。
【００６０】
・カップリング４
カップリング１と同様にして、脱Bocされたバリン・プロリンペプチド（H-Val-Pro-OBzl・HCl）９ｍｍｏｌをＤＭＦに溶解し、脱Bzlされたグリシン・バリン・グリシンペプチド（Boc-Gly-Val-Gly-OH）９ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン１．２６ｍＬ、ブタノール・Ｈ２Ｏ１０．８ｍｍｏｌを加え、氷冷後、ＷＳＣｌ・ＨＣｌ９．９ｍｍｏｌを加えてから室温に戻した。撹拌しながら一晩放置した後、カップリング１と同様に、結晶除去、減圧濃縮、減圧濃縮残渣の溶解、結晶除去、洗浄、乾燥、硫酸ナトリウムの除去、減圧濃縮、結晶化、減圧乾燥により、グリシン・バリン・グリシン・バリン・プロリンペプチド（Boc-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OBzl、Ｃ３１Ｈ４７Ｏ８Ｎ５、ＭＷ＝６１７．７３）を得た。秤量値は３．２５ｇ（６３％）であった。
【００６１】
（第２ペプチド成分の合成）
・カップリング１
Ｃ末端側がＢｚｌ化されたグリシン２０ｍｍｏｌをＤＭＦに溶解し、Ｎ末端側がＢｏｃ化されたヒドロキシプロリン（Boc-Hyp(Bzl)-OH、ＭＷ＝３２１．３６、渡辺化学）２０ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン２．８ｍＬ、ブタノール・Ｈ２Ｏ２４ｍｍｏｌを加え、この溶液が入ったナスフラスコを氷冷した。十分に冷やした後、ＷＳＣｌ・ＨＣｌ２２ｍｍｏｌを加えて３０分放置した後、室温に戻した。これを撹拌しながら室温で一晩放置した。
【００６２】
発生した結晶をＤＭＦで洗浄しながらろ過を行って除去した後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。この減圧濃縮残渣を酢酸エチルに溶かして冷蔵庫内（設定温度４℃）で３０分間放置した。発生した結晶を酢酸エチルで洗浄しながらろ過を行って除去した後、分液ロートにより、水に対して２回、０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液に対して３回、水に対して１回、５％硫酸水素カリウム水溶液に対して３回、飽和食塩水に対して２回、洗浄を行った。その後、酢酸エチル層に硫酸ナトリウム５ｇを添加して一晩乾燥させた。
【００６３】
上記酢酸エチル層から硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。減圧濃縮残渣にヘキサン４０ｍＬを加えて結晶化を行い、その結晶をろ過により採取してデシケータで減圧乾燥した。乾燥後のヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（Boc-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl、Ｃ２６Ｈ３２Ｏ６Ｎ２、ＭＷ＝４６８．５３）の秤量値は７．１２ｇ（７６％）であった。
【００６４】
・脱Boc１
得られたBoc-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl１５ｍｍｏｌを４Ｎ塩酸／ジオキサン４０ｍＬに溶解させ、室温で１時間静置した。その後、エバポレータを用いて減圧濃縮を行い、エーテルを加えて結晶化を行った。その結晶をろ過により採取した後、デシケータで減圧乾燥した。乾燥後の脱Bocされたヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（H-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl・HCl、Ｃ２１Ｈ２４Ｏ４Ｎ２・ＨＣｌ、ＭＷ＝３６８．４２＋３６．４６）の秤量値は５．６ｇ（９２％）であった。
【００６５】
・カップリング２
カップリング１と同様にして、脱Bocされたヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（H-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl・HCl）１３．５ｍｍｏｌをＤＭＦに溶解し、Ｎ末端側がＢｏｃ化されたプロリン（Boc-Pro-OH、ＭＷ＝２１５．２５、渡辺化学）１３．５ｍｍｏｌを添加した。さらに、トリエチルアミン１．９ｍＬ、ブタノール・Ｈ２Ｏ１６．２ｍｍｏｌを加え、氷冷後、ＷＳＣｌ・ＨＣｌ１４．９ｍｍｏｌを加えてから室温に戻した。撹拌しながら一晩放置した後、カップリング１と同様に、結晶除去、減圧濃縮、減圧濃縮残渣の溶解、結晶除去、洗浄、乾燥、硫酸ナトリウムの除去、減圧濃縮した。減圧濃縮残渣の結晶化を試みたが結晶化しなかった。減圧濃縮残渣を、クロロホルム：酢酸エチル＝７：１の溶離液を用いてシリカゲルクロマトグラフィを行った。得られたプロリン・ヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（Boc-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl、Ｃ３１Ｈ３９Ｏ７Ｎ３、ＭＷ＝５６５．６７）を得た。秤量値は７．６４ｇ（１００％）であった。
【００６６】
・脱Bzl１
得られたプロリン・ヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（Boc-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OBzl）８ｍｍｏｌ（４．５ｇ）をＭｅＯＨ溶液２０ｍＬに溶解し、５％パラジウム炭素８ｇを加えた。この溶液にＨＣＯＯＮＨ４３２ｍｍｏｌを加えて、常温で２時間撹拌した後、ろ過によりパラジウム炭素を除去した。この溶液を濃縮して、ＮａＨＣＯ３水溶液に溶解した。これをジエチルエーテル１０ｍＬで２回洗浄し、その水層に１０％クエン酸溶液を加えて、容器のｐＨを３以下に調整した。これを酢酸エチル１０ｍＬで３回抽出を行い、酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄してから硫酸ナトリウムを加えて一晩放置した。
【００６７】
上記酢酸エチル層から硫酸ナトリウムをろ過により取り除き、エバポレータを用いて減圧濃縮を行った。減圧濃縮残渣にヘキサン３５ｍＬを加えて結晶化を行い、その結晶をろ過により採取してデシケータで減圧乾燥した。乾燥後の脱Bzlされたぷろりん・ヒドロキシプロリン・グリシンペプチド（Boc-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH、Ｃ２４Ｈ３３Ｏ７Ｎ３、ＭＷ＝４７５．５３）の秤量値は３．４１ｇ（８４％）であった。
【００６８】
（実施例１）
上記第１ペプチド成分（H-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OH）４２７ｍｇ (１ｍｍｏｌ)を  ＤＭＳＯ（和光純薬、ジメチルスルホキシド）４ｍＬに溶解した。この溶液を氷冷し、トリエチルアミン１４０μＬ（１ｍｍｏｌ）、ブタノールブタノール  (183 mg; 1.2 mmol)、ＷＳＣＩ・塩酸２１０ｍｇ（１．１ｍｍｏｌ）を順次加え、反応を開始した。３０分経過後、溶液を室温に戻し、さらに反応させた。１週間経過後、純水３６ｍＬを加えて排除分子量３５００の透析膜に移し０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行って第１ポリマーの保護体を得た。第１ポリマーの収量は３８１ｍｇであり、収率は８９％であった。
【００６９】
第２ペプチド成分（H-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH）３７５ｍｇ (１ｍｍｏｌ）、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ）２５８μＬ（１．２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４０８μＬ（２．４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液１ｍＬを氷冷下で調製し、１５分経過後に上記第１ポリマー８．５ｍｇのＤＭＳＯ溶液１ｍＬと混合させて、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈して、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬで３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマーの保護体を得た。ハイブリッドポリマーの収量は３８０ｍｇであり、収率は９９％であった。
【００７０】
上記ハイブリッドポリマー保護体３８０ｍｇを氷冷下で１Ｍトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）のＴＦＡ溶液（５Ｖ／Ｖ％のm-Cresol含有）に溶かし、１時間後に、エーテルを加えて固化させた。固化物を０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)１０ｍＬに溶かし、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、純水２０ｍＬで希釈した後、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマー（H-(Pro-Hyp-Gly)m-(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n-OH）を３６０ｍｇ得た。得られたハイブリッドポリマーは６０℃でコアセルベート（凝集）を形成した。
【００７１】
上記ハイブリッドポリマー３６０ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で純水に溶かし、６０℃に加熱した後、テフロン（登録商標）ケース内にキャストして、３７℃で一晩放置することにより、１５ｍｍ×２５ｍｍのハイブリッドポリマーシートを得た。このハイブリッドポリマーシートのＳＥＭ画像を図１に示す。
【００７２】
（実施例２）
第２ペプチド成分（H-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH）３７５ｍｇ (１ｍｍｏｌ)、ＤＰＰＡ２５８μＬ(１．２ｍｍｏｌ)、ＤＩＥＡ４０８μＬ（２．４ｍｍｏｌ)のＤＭＳＯ溶液 １ｍＬを氷冷下で調製し、反応を開始した。４時間後に室温に戻して、さらに反応させた。６日間後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行って第２ポリマーの保護体を得た。第２ポリマーの収量は３７０ｍｇであり、収率９９％であった。
【００７３】
第１ペプチド成分（H-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OH）４２７ｍｇ (１ｍｏｌ)、ＤＰＰＡ２５８μＬ (１．２ｍｍｏｌ)、ＤＩＥＡ ４０８μＬ（２．４ｍｍｏｌ)のＤＭＳＯ溶液１ｍＬを氷冷下で調製し、１５分間経過後に上記第１ポリマー８．５ｍｇのＤＭＳＯ溶液１ｍＬと混合させ、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマーの保護体を得た。ハイブリッドポリマー保護体の収量は４３０ｍｇであり、収率は９７％であった。
【００７４】
上記ハイブリッドポリマー保護体を氷冷下で１ＭＴＭＳＯＴｆのＴＦＡ溶液（５ｖ／ｖ％のm-Cresol含有）に溶かし、１時間経過後、エーテルを加え固化させた。固化物を０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)１０ｍＬに溶かし、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、純水２０ｍＬで希釈した。この溶液を凍結乾燥して、白色綿状のハイブリッドポリマー（H-(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n-(Pro-Hyp-Gly)m-OH）４３０ｍｇを得た。得られたハイブリッドポリマーは、５５℃でコアセルベートを形成した。
【００７５】
上記ハイブリッドポリマー４３０ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で純水にとかし、５５℃に加熱した後、テフロン（登録商標）ケース内にキャストし、３７℃で一晩放置することにより、２０ｍｍ×２７ｍｍのハイブリッドポリマーシートを得た。このハイブリッドポリマーシートのＳＥＭ画像を図２に示す。
【００７６】
（実施例３）
第１ペプチド成分（H-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OH）４２７ｍｇ (１ｍｍｏｌ)を  ＤＭＳＯ４ｍＬに溶解した。この溶液を氷冷下で、トリエチルアミン１４０μＬ（１ｍｍｏｌ）、ブタノール１８３ｍｇ(１．２ｍｍｏｌ)、水溶性カルボジイミド・塩酸２１０ｍｇ (１．１ｍｍｏｌ)を順次加え、反応を開始した。３０分間経過後、室温に戻し、そのまま反応させた。１週間経過後、純水３６ｍＬを加えて排除分子量３５００の透析膜に移した。これを０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行って第１ポリマーの保護体を得た。第１ポリマーの収量は３８１ｍｇであり、収率は８９％であった。
【００７７】
第２ペプチド成分（Boc-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH）９６１ｍｇ (２．５ｍｍｏｌ)、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）３４５ｍｇ（３ｍｍｏｌ）、水溶性カルボジイミド・塩酸５７５ｍｇ（３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液５ｍＬを氷冷下で調製し、１５分経過後に室温に戻し、そのまま１時間攪拌した。その後、水を加えて固化させ、固化物をろ過により採取して、デシケーター中で一晩乾燥させた。これを氷冷下でトリフルオロ酢酸に溶解し、３０分間経過後に濃縮し、ジエチルエーテルを加えて固化させたものをろ過により採取した。これをＤＭＳＯ１ｍＬに溶かし、ジイロプロピルアミン（ＤＩＥＡ）４０８μＬ（２．４ｍｍｏｌ）を加えた後、第１ポリマー８．５ｍｇと混合させ、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマーの保護体を得た。ハイブリッドポリマー保護体の収量は９５３ｍｇであり、収率は９８％であった。
【００７８】
上記ハイブリッドポリマー保護体９５３ｍｇを氷冷下で１Ｍトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（ＴＭＳＯＴｆ）のＴＦＡ溶液（５ｖ／ｖ％のm-Cresol含有）に溶かし、脱保護を行った。１時間経過後、エーテルを加えて固化させた。固化物を０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)１０ｍＬに溶かし、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、純水２０ｍＬで希釈した後、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマー（H-(Pro-Hyp-Gly)m-(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n-OH）９５０ｍｇを得た。
【００７９】
（実施例４）
第２ペプチド成分（H-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH）３７５ｍｇ (１ｍｍｏｌ)、ＤＰＰＡ２５８μＬ(１．２ｍｍｏｌ)、ＤＩＥＡ４０８μＬ(２．４ｍｍｏｌ)のＤＭＳＯ溶液 １ｍＬを氷冷下で調製し、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行って第２ポリマーの保護体を得た。第２ポリマーの収量３６９ｍｇであり、収率は９９％であった。
【００８０】
第１ペプチド成分（Boc-Gly-Val-Gly-Val-Pro-OH）１ｇ（２．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）３４５ｍｇ（３ｍｍｏｌ）、水溶性カルボジイミド・塩酸５７５ｍｇ（３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液５ｍＬを氷冷下で調製し、１５分間経過後に室温に戻し、そのまま１時間攪拌した。その後水を加えて固化させ、固化物をろ過により採取し、デシケーター中で一晩乾燥させた。これを氷冷下でトリフルオロ酢酸に溶解し、３０分間経過後に濃縮し、ジエチルエーテルを加え固化させたものをろ過により採取した。これをＤＭＳＯ１ｍＬに溶かし、ＤＩＥＡ４２５μＬ（２．５ｍｍｏｌ）を加えた後、上記第２ポリマー８．５ｍｇのＤＭＳＯ溶液１ｍＬと混合させ、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行ってハイブリッドポリマーの保護体を得た。ハイブリッドポリマー保護体の収量は３５０ｍｇであり、収率は９８％であった。
【００８１】
上記ハイブリッドポリマー保護体を氷冷下で１ＭＴＭＳＯＴｆのＴＦＡ溶液（５ｖ／ｖ％のm-Cresol含有）に溶かし、１時間経過後、エーテルを加え固化させた。固化物を０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)１０ｍＬに溶かし、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、純水２０ｍＬで希釈した。この溶液を凍結乾燥して、白色綿状のハイブリッドポリマー（H-(Gly-Val-Gly-Val-Pro)n-(Pro-Hyp-Gly)m-OH）３３９ｍｇを得た。
【００８２】
（比較例１）
第２ペプチド成分（H-Pro-Hyp(Bzl)-Gly-OH）３７ｍｇ (１ｍｍｏｌ)、ＤＰＰＡ２５８μＬ（１．２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ４０８μＬ（２．４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ溶液１ｍＬを氷冷下で調製し、反応を開始した。４時間経過後に室温に戻し、さらに反応させた。６日間経過後、反応液を純水１８ｍＬに希釈し、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、凍結乾燥を行って第２ポリマーの保護体を得た。第２ポリマーの収量は３７１ｍｇであり、収率は９９％であった。
【００８３】
上記第２ポリマーを氷冷下で１ＭＴＭＳＯＴｆのＴＦＡ溶液（５ｖ／ｖ％のm-Cresol含有）に溶かし、１時間後、エーテルを加えて固化させた。固化物を０．５Ｍの炭酸水素アンモニウム水溶液(ｐＨ７．８)１０ｍＬに溶かし、０．５Ｍ炭酸水素アンモニウム水溶液 (ｐＨ７．８)２００ｍＬに対して３０分間、５００ｍＬに対して１時間、さらに１Ｌに対して終夜で透析した。得られた溶液を透析チューブから回収し、純水２０ｍＬで希釈した。この溶液を凍結乾燥して、白色綿状のコラーゲンポリマー３６８ｍｇを得た。このコラーゲンポリマーは加熱してもコアセルベートを形成することはなかった。
【００８４】
上記コラーゲンポリマー３６８ｍｇを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で純水に溶かし、３７℃で一晩放置することにより、１０ｍｍ×１０ｍｍのコラーゲンシートを得た。コラーゲンシートのＳＥＭ画像を図３に示す。
【００８５】
（比較例２）
コラーゲン原料のトリペプチドと、エラスチン原料のトリペプチドとを、モル比で７：３となるように１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解させた。これに、水溶性カルボジイミド１９ｍｇ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１３ｍｇを加えて、室温で撹拌して２日間重合させ、得られた溶液を水に対して１２時間透析した（ＭＷＣＯ３０００）。これにより、モル比７：３でランダム重合された平均分子量１５０，０００のポリマーを得た。このポリマー溶液を実施例１と同様にしてポリマーシートとした。なお、このポリマーはゲル化することができなかった。
【００８６】
（評価試験）
実施例１及び実施例２で得られたハイブリッドポリマーシート、比較例で得られたコラーゲンシートについて、表面性、ハンドリング、加温によるゲル化、引張り強度、細胞接着性を評価した。これらの評価方法を以下に示す。また、評価結果を表１に示す。
【００８７】
（１）表面性
各シートの表面に凹凸があるか否かを目視により確認した。シートの厚みに明らかなムラが認められる場合に「×」とし、認められない場合に「○」と判断した。
【００８８】
（２）ハンドリング
各シートを手に持って基板上に拡げた際に、シートに割れや欠けが生じれば「×」と判断し、生じなければ「○」と判断した。
【００８９】
（３）加温によるゲル化
各シートを水中に浸し、ヒータ付きセルホルダを装着した紫外可視分光高度計（日本分光、商品名：ＵＢｅｓｔ５６０）を用いて、温度を変えて４００ｎｍの濁度を測定することによりゲル化した温度を求めた。
【００９０】
（４）引張り強度
各シートから短冊状の試験片を採取し、該試験片の両端を一対のクリップで挟み、一方のクリップを固定し、他方のクリップにバネ計りを連結した。バネ計りを毎分１ｍｍで移動させて試験片を引張り、試験片に亀裂が生じた際のバネ計りの目盛りを読み取った。この読取値に対して、比較例１のコラーゲンシートの引張り強度を１（実測値：０．１ｋｇ）として、実施例１及び実施例２のハイブリッドポリマーシートの引張り強度を比として算出した。また、比較例２のポリマーシートについても同様の引張り試験を行ったが、引張り強度が０．１ｋｇに達する前に破断した。
【００９１】
（５）細胞接着性１
各シートを１０ｍｍ×１０ｍｍに裁断してγ線滅菌を施してから、浮遊性細胞培養用のフラスコ（Nunc、２５cm2型）に入れた。このフラスコに、１０％ＦＢＳ（大日本製薬）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）を５ｍＬ加えた。さらに、ＰＣ１２細胞１×１０５個を加え、３７℃に温度設定されたＣＯ２インキュベータ内に静置して培養を行った。１日経過後に細胞の有無を確認し、４日経過後にシートを取り出した。取り出したシートをトリプシン処理して細胞を剥離させて個数を計数した。
【００９２】
（６）細胞接着性２
実施例１のハイブリッドポリマーを１０ｍｇ／ｍＬを純水に溶解した。この水溶液を５０℃の加熱してゲル化した。得られたポリマーゲルを１０ｍｍ×１０ｍｍのセラミック基板にスピンコートして３７℃で乾燥し、ポリマーゲルで被膜されたセラミック基板を得た。このセラミック基板をガンマ線滅菌し、浮遊細胞培養用のフラスコ（Ｎｕｎｃ、２５ｃｍ２型、商品名：Ｎｕｎｃ浮遊細胞用フラスコ）に入れた。このフラスコに、１０％ＦＢＳ（大日本製薬）入りＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）を５ｍＬ入れ、さらにＰＣ１２細胞１×１０５個を加えて、ＣＯ２インキュベータ内に静置して３７℃で培養した。１日経過後に、目視によりポリマーゲルに細胞の接着が確認された。４日経過後に、セラミック基板をフラスコから取り出し、トリプシン処理によりポリマーゲルから細胞を剥離させて個数を計測した。その結果、８×１０５個の細胞が計測された。
【００９３】
（７）細胞接着性３
実施例１のハイブリッドポリマーを１０ｍｇ／ｍＬを純水に溶解した。この水溶液を５０℃の加熱してゲル化した。得られたポリマーゲルを３０ｍｍ×１０ｍｍのポリ乳酸基板にスピンコートして３７℃で乾燥し、ポリマーゲルで被膜されたポリ乳酸基板を得た。このポリ乳酸基板をガンマ線滅菌し、浮遊細胞培養用のシャーレ（Ｎｕｎｃ、９０ｍｍ型、商品名：Ｎｕｎｃ浮遊細胞用シャーレ）に入れた。このシャーレに、１０％ＦＢＳ（大日本製薬）入りＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ）を５ｍＬ入れ、さらにＰＣ１２細胞１×１０５個を加えて、ＣＯ２インキュベータ内に静置して３７℃で培養した。１日経過後に、目視によりポリマーゲルに細胞の接着が確認された。４日経過後に、ポリ乳酸基板をフラスコから取り出し、トリプシン処理によりポリマーゲルから細胞を剥離させて個数を計測した。その結果、３×１０６個の細胞が計測された。
【００９４】
（８）徐放性試験
実施例１のハイブリッドポリマー１０ｍｇ／ｍＬを純水に溶解した。さらに、この水溶液に、インスリン１００μｇを加えて溶解し、６０℃に加熱してゲル化させ、その後、徐々に乾燥させてインスリンを内包するハイブリッドポリマーシートを作製した。得られたインスリン内包ハイブリッドポリマーシートは、縦横が１０ｍｍ×１５ｍｍ、厚みが０．３ｍｍであった。このインスリン内包ハイブリッドポリマーシートをリン酸緩衝液１０ｍＬ中に浸潤させて、ＨＰＬＣにより緩衝溶液中に放出されたインスリン量を測定した。
【００９５】
（１）表面性、（２）ハンドリング、（３）ゲル化温度、（４）引張り強度、（５）細胞接着性１、（６）細胞接着性２、（７）細胞接着性３の評価結果を表１に示す。また、（８）徐放性試験の評価結果を表２に示す。
【００９６】
【表１】
2008001683.tif 000003
【００９７】
【表２】
2008001683.tif 000004
【００９８】
表１に示されるように、実施例１及び実施例２のハイブリッドポリマーシートは、比較例１のコラーゲンシートに比べて表面性、ハンドリング、及び引張り強度に優れることが確認された。また、比較例１のコラーゲンシート及び比較例２のポリマーシートは６０℃付近まで加温してもゲル化しないことが確認された。細胞接着性１においては、ハイブリッドポリマーシートは、コラーゲンシートと同様に細胞培養が可能であることが確認された。細胞接着性２及び細胞接着性３においては、ポリマーゲルが基材に積層されたポリマー積層体を用いて細胞培養が可能であることが確認された。徐放性試験においては、薬剤内包ポリマーゲルが乾燥されてなるハイブリッドポリマーシートを薬剤を徐放させる基材として使用できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、実施例１のハイブリッドポリマーシートのＳＥＭ画像である。
【図２】図２は、実施例２のハイブリッドポリマーシートのＳＥＭ画像である。
【図３】図３は、比較例１のコラーゲンシートのＳＥＭ画像である。
【図１】
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【図２】
2008001683.tif 000006
【図３】
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