(57)【要約】【課題】流体に含まれる試料を濃縮させ、該試料を定量的にマイクロ流路に注出することができる試料濃縮装置を提供する。【解決手段】試料を含む流体を濃縮する濃縮装置であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを有し、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出する試料濃縮装置。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を含む流体を濃縮する濃縮装置であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを有し、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする試料濃縮装置。
【請求項２】
前記振動波発生手段は、超音波発生源と反射板、または２つの超音波発生源からなり、前記共有部に超音波の定在波の節または腹を付与することを特徴とする請求項１に記載の試料濃縮装置。
【請求項３】
前記試料は、細胞、粒子または粒子に吸着した分子であることを特徴とする請求項１または２に記載の試料濃縮装置。
【請求項４】
前記流路の断面寸法の幅および深さの少なくとも１つが、０．１μｍ以上１０００μｍ以下である請求項１乃至３のいずれかの項に記載の試料濃縮装置。
【請求項５】
試料を含む流体を濃縮する濃縮方法であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを用いて、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする試料濃縮方法。
【請求項６】
前記試料の導入量が、共有部の容積より小さい、等しいまたは大きいことを特徴とする請求項５に記載の試料濃縮方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流路における微量な試料を含む流体を濃縮する試料濃縮装置および試料濃縮方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微細構造を有する分析装置は、机上サイズの機器と比べ、感度の向上、試料量の低減、高速分析という利点が挙げられている。また、マイクロ・トータル・アナリシス・システム（μ−ＴＡＳ）と呼ばれる、微小空間を利用して検体採取から各種工程を経て分析までを行うというコンセプトの発展により、それらに関する技術が注目を集めている。生体試料の分析において、質量分析法、電気泳動法などが用いられるが、それらの技術もマイクロチップ化することができる。
【０００３】
しかし、マイクロ流体デバイスにおける分析は微細な構造を有しているため、従来の大きさのフローインジェクション装置において扱える最小量をも下回る試料量が必要とされることが多い。従来の電気泳動チップにおいては、図３における微量の試料４７を注出する際に、デバイス上でマイクロ流路を注入用流路４４と本流路４５を十字型に交差させるように形成し、共有部４６の容積相当の試料量を注出する方法が採られていた（特許文献１参照）。この注出時において、まず注入用流路４４方向に電位勾配を付与し、試料４７を最低でも共有部４６部分まで満たしたうえで、試料の流れを印加電圧を調整して本流路４５方向に切り換えることにより一定容積の試料４８を注出するという作業が必要となる。
【０００４】
また、図４に、従来技術の流路共有部において試料を吸着させてから注出する方法を示す。まず、注入用流路５２を流れてきた試料５４を、共有部５５において流路表面に固定化されているプローブに吸着させる。次に、本流路５３方向に移送するときには、試料５４を脱着させて試料５６を注出するという方法もある。この方法は、共有部５５において注入用流路５２に注入された試料を濃縮させたうえで本流路５３方向へと注出していることになる（特許文献２参照）。
【０００５】
さらに、メンブレンを用いる従来技術として、図５に示す様に、注入用流路６０内でメンブレン６３方向へレザーバ５７より試料６４を移送し続けることにより共有部６２において試料６４を濃縮させる。そして、流れを本流路６１方向に切り換えて、微量試料を注出する方法もある（非特許文献１参照）。
【０００６】
また、メンブレンフィルタ、吸着分子などを利用せずに試料を濃縮する従来技術として、図６における、超音波発生源６７、６８を用いて定在波７０を付与し、試料６９を流路６６内の一定範囲に集めて所望の流路７１へ注出する方法が開示されている（特許文献３参照）。
【特許文献１】米国特許第５９００１３０号明細書（第２項、図１ａ、４ｂ）
【特許文献２】特開２００５−２７４４０５号公報（第１７項、図１）
【特許文献３】特開平９−１２２４８０号公報（第７項、図６）
【非特許文献１】Ｊｕｌｉａ  Ｋｈａｎｄｕｒｉｎａ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｃ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ，  Ｌａｒｒｙ  Ｃ．Ｗａｔｅｒｓ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｆｏｏｔｅ，ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒａｍｓｅｙ，“Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｐｏｒｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｖｏｌ．７１，Ｎｏ．９，ｐｐ１８１５−１８１９，（第１８１７項、図３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前記十字型流路による微量試料注出方法において、注入用流路４４に多量の、最低でも注入口４１から共有部４６までの試料量を要するが、実際に本流路４５方向に注出される試料４８は、共有部４６の容積で決定された全試料量の一部である。そのため、注出に要するデッドボリュームが多いという課題がある。また、注出試料量がマイクロ流路の共有部の容積に限られるという制限もある。
【０００８】
また、前記共有部において試料を吸着させる方法おいては、注出される試料量は共有部５５における試料５４の吸着効率に依存するため、定量性に問題が生じる。
前記メンブレンを用いた方法において、電気浸透流以外の送液方法では、試料が本流路６１方向へ流れを切り換える以前に、本流路６１方向へ移送されてしまい、定量性に課題が生じる。
【０００９】
さらに、前記超音波を用いた注出方法において、試料６９の流路７１への回収は、定量性を考慮しておらず、試料６９の一部が所望の流路内に納まらない可能性もあるという問題がある。さらに、試料６９の回収方法は、キャピラリ７１を物理的に流路に挿入して試料６９をそのキャピラリ７１内に収納するため、流路はマイクロ流路ではなくキャピラリを動かすことのできるのに十分な大きさを有するものにしか適用できないという課題がある。
【００１０】
本発明は、この様な背景技術に鑑みてなされたものであり、注入用流路内におけるデッドボリュームを低減し、流体に含まれる微量な試料を濃縮させ、該試料を定量的にマイクロ流路に注出することができる試料濃縮装置および試料濃縮方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決する微量試料濃縮装置は、試料を含む流体を濃縮する濃縮装置であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを有し、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする。
【００１２】
上記の課題を解決する微量試料濃縮方法は、試料を含む流体を濃縮する濃縮方法であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを用いて、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、流体に含まれる試料を濃縮させ、該試料を定量的にマイクロ流路に注出することができる試料濃縮装置および試料濃縮方法を提供することができる。
本発明の試料濃縮装置および方法においては、マイクロ流路であるる注入用流路内に存在する流体に含まれる試料を共有部に濃縮することにより、バルブで閉じられた空間内の全試料量を効率的に本流路に注出できるという効果を有する。
【００１４】
また、注出する試料の容積は共有部の容積のみに制限されないので、注出する試料量の自由度が増加するという効果がある。
また、注入用流路の容積をバルブによって定めることにより、濃縮した試料を定量的に本流路に注出できるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る微量試料濃縮装置は、試料を含む流体を濃縮する濃縮装置であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを有し、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする。
【００１６】
前記振動波発生手段は、超音波帯の振動波を発生する手段であることが好ましいが、これに限定されない。具体的な振動波発生手段としては、超音波発生源と反射板、または２つの超音波発生源からなり、前記共有部に超音波の定在波の節または腹を付与することが好ましい。
【００１７】
前記試料は、細胞、粒子または粒子に吸着した分子であることが好ましく、分子はＤＮＡやたんぱく質を含んだ生体分子であってもよい。
前記流路の断面寸法の幅および深さの少なくとも１つが、０．１μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明に係る微量試料濃縮方法は、試料を含む流体を濃縮する濃縮方法であって、試料を含む流体を注入する少なくとも２つの注入用流路と、前記流体を注出する本流路と、前記注入用流路と本流路が接続する位置に設けられた共有部と、前記注入用流路から共有部を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブと、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に振動波を付与する振動波発生手段とを用いて、前記保持された流体に振動波を付与することにより流体に含まれる試料を濃縮し、濃縮した試料を共有部から本流路に注出することを特徴とする。
【００１９】
前記試料の注出量が、共有部の容積より小さい、等しいまたは大きいことが好ましい。
本発明は、振動波を用いて流体に含まれる試料を濃縮するが、その原理は振動波発信源より生ずる音響反射波を用いるものである。定在波を構成したさいの節または節からの距離ｘに存在する粒子が受ける力Ｆは
【００２０】
【数１】
2008292260.tif 000003
【００２１】
と表現される。ここで、ｐ0は音圧振幅、Ｖcは粒子の体積、λは音波波長、ｋは波数ベクトルであり、φ、β、およびρは、
【００２２】
【数２】
2008292260.tif 000004
【００２３】
で表され、ρcは粒子の密度、ρwは溶媒の密度、βcは粒子の圧縮率、βwは溶媒の圧縮率である。ここで、φはφ因子と呼ばれ、正の値においては粒子が定在波の節に集積され、負の値においては粒子が定在波の腹に集積される。
【００２４】
本発明は上記原理を利用して、注入用流路内に存在する試料を注入用流路と本流路で構成される共有部に濃縮させ、その後に本流路に注出する。
図１は本発明の試料濃縮装置の一実施態様を示す概念図である。以下、図１を用いて詳細に説明する。
【００２５】
本発明の試料濃縮装置は、試料を含む流体を注入する２つの注入用流路４、５と、前記流体を注出する本流路６と、前記注入用流路４、５と本流路６が接続する位置に設けられた共有部７と、前記注入用流路から共有部７を通過して本流路へ流れる流体の流れを開閉するバルブ１０、１１、１２、１３と、前記バルブにより注入用流路の一部と共有部に保持された流体に超音波を付与する超音波発生手段８０とを有する。
【００２６】
注入用流路４、５、および本流路６はマイクロ流路からなる。本発明において好ましいマイクロ流路の断面寸法としては、幅および深さの少なくともいずれかの断面寸法が０．１μｍ以上１０００μｍ以下である。幅および深さの両方の断面寸法は異なっても、同じでもよい。注入用流路４と流路６との接触地点から、注入用流路５と本流路６との接触地点までの流路を共有部７とする。また、マイクロ流路の構成が、注入用流路４と本流路６の延長方向に注入用流路５が存在する、すなわち十字型の流路構成となってもかまわない。また、本流路６は濃縮、分析目的だけに用いられる必要はなく、試料注出後のいかなる工程を経るものであってもよい。
【００２７】
本発明の試料濃縮装置は、材質はガラス、セラミック、金属、プラスチック、またはそれらのハイブリッドなど特に限定を設ける必要はないが、できる限り超音波を吸収しにくい部材であることが望ましい。
【００２８】
バルブ１０、１１、１２、１３は特に形態に制限を設ける必要がないが、ダイヤフラムによって流路を塞ぐ形態などの複数回開閉動作を行うことができる形態が好ましい。バルブ１０は注入用流路４が共有部７方向へ曲がる直前に位置し、バルブ１１は本流路６におけるレザーバ２の方向への共有部７との境に位置する。バルブ１２は注入用流路５において共有部７より離れる方向に曲がった直後に配置され、バルブ１３は本流路６におけるレザーバ２の方向と反対側の共有部７との境に配置されている。
【００２９】
また、注入用流路４におけるレザーバ１よりバルブ１０までの距離、および注入用流路５におけるバルブ１２よりレザーバ３までの距離は、必要な試料量を低減するために、できる限り短いことが好ましい。
【００３０】
前記超音波発生手段８０は、超音波発生源８と、反射板または超音波発生源９とからなる。超音波発生源８は少なくとも共有部７の本流路６方向の長さ以上の長さを有し、バルブ１０、１１、１２および１３で閉じられた空間全体を覆う幅で超音波を発振することができ、できる限り注入用流路４に近い位置に設置される。図１における注入用流路５にできる限り近い位置に設置された反射板または超音波発生源９は、超音波発生源８と同じ大きさのもう一つの超音波発生源であるか、または超音波発生源８からの音波を反射する反射板でもよく、超音波発生源８と対になって、定在波を構成できればよい。
【００３１】
試料溶液１５は、ビーズ、細胞またはビーズに固定化された分子などが適切な濃度で溶媒に稀釈されたものが挙げられる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を示し本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１
図１を用いて、実施例１を説明する。
【００３３】
まず、バルブ１０、１２を開放し、レザーバ１から注入用流路４、共有部７、注入用流路５を経て、レザーバ３方向へあらかじめ濃度が調整された試料を含有する試料溶液１５を注入する。なお、バルブ１１、１３は閉じている。このときの、試料溶液の移送方法は、マイクロ流路における毛細管現象を利用する方法、外部ポンプによるレザーバ１への加圧、またはレザーバ３における減圧による圧力流、レザーバ１とレザーバ３間での電気浸透流や誘電泳動など、特に方法を限定する必要はない。試料溶液１５の流れがバルブ１２を通過した後にバルブ１２、バルブ１０の順でバルブを閉じる。
【００３４】
次に、超音波発生源８を作動させて注入流路方向へ音波を発振する。図１における注入用流路５に近い位置に設置された９において、９が反射板であるとすると、超音波発生源８のみの周波数制御によって、共有部７に定在波の節または腹を構成することができる。また、９がもう一つの超音波発生源とすると、超音波発生源８から発振された音波と超音波発生源９から発振された波の重ね合わせにより、共有部７に定在波の節または腹を構成することができる。また、共有部７以外の位置においても、音波の重ね合わせにより節または腹を構築することができ、その場合超音波の節または腹で試料溶液１５をトラップしたまま共有部７へと移送させても良い。
【００３５】
注入用流路４、５内に超音波の節または腹が一つできる、つまり定在波１４に示されるような超音波発生源８と反射板９（または超音波発生源９）の距離を半波長とするように周波数を調節し、節または腹が共有部７に配置されるようにする。節を構成するか腹を構成するかは、濃縮したい試料のφ因子による。このとき、注入用流路４、５内のバルブ１０、１２、および本流路６内のバルブ１１、１３で閉じられた空間全体において、試料溶液１５は共有部７へ集積する方向１６、１７へ向かって力が働き、共有部７へと濃縮される。なお、図１においては定在波１４が共有部７において節を構成するように図示したが、腹を構成するようにすることもでき、本実施例と同様に試料を濃縮させることが可能である。
【００３６】
試料溶液１５が共有部７へ濃縮されたのち、バルブ１１、１３を開放して、本流路６に接続するレザーバ２より加圧して試料を本流路６へ注出する。また、加圧による圧力流だけでなく、電気浸透流、誘電泳動などの方法によって、試料は本流路６へ注出されてもよく、特に試料溶液１５の移送方法を限定する必要はない。
【００３７】
実施例２
実施例２として、複数の本流路において本発明の応用を、図２を用いて説明する。図２は本発明の試料濃縮装置の他の実施態様を示す概念図である。
【００３８】
注入用流路２２は両端においてレザーバ１８、２１を有し、レザーバ１８から共有部２５方向へ注入用流路２２が曲がる直前にバルブ２９、共有部２６からレザーバ２１方向へ注入用流路１９が曲がった直後にバルブ３２を設置する。共有部２５と本流路２３とのそれぞれの境にバルブ３０、３３を配置し、共有部２６と本流路２４とのそれぞれの境にバルブ３１、３４を配置する。
【００３９】
共有部２５とは、注入用流路２２と本流路２３が交差した部分の領域を指す。同様に、共有部２６は、注入用流路２２と本流路２４交差した部分の領域を指す。また、本実施例においては、注入用流路は１本の直線で図示されているが、実施例１のように交差せずに、接触しているだけでもかまわない。
【００４０】
試料溶液３６をバルブ２９、３２を開放して注入用流路２２に注入し、試料溶液がバルブ３２よりレザーバ２１方向へ進行した後、バルブ３２、２９の順に閉じる。超音波発生源２７と反射板あるいは超音波発生源である２８の間に共有部２５、２６に節または腹が存在するような周波数に調整された定在波３５を発振する。図２における、本流路が２本の場合、発振された超音波はちょうど１波長に相当する。
【００４１】
超音波による力が発生し、注入用流路内に存在する試料溶液３６は注入用流路２２の存在位置において矢印３７、３８、３９あるいは４０方向への力を受けて共有部２５、あるいは共有部２６に濃縮される。その後、バルブ３０、３３を開放して本流路２３に試料を注出し、バルブ３１、３４を開放して本流路２４に試料を注出する。本流路２３、２４方向への試料溶液３６の移送は、特に方法を限定する必要はなく、また、注出の時刻を同期させなくともよい。
【００４２】
実施例２は２本の本流路に試料を注出する方法について述べたが、３本以上の本流路においても各本流路を半波長間隔に設置すると、超音波発信源の周波数を調節して各共有部に節または腹を構成し、本発明の試料注出方法を使うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の試料濃縮装置は、流体に含まれる試料を濃縮させ、該試料を定量的にマイクロ流路に注出することができるので、マイクロ流路やキャピラリを用いた、細胞および生体分子を含んだ試料の分離および精製に用いられるためのマイクロフローインジェクションに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の試料濃縮装置の一実施態様を示す概念図である。
【図２】本発明の試料濃縮装置の他の実施態様を示す概念図である。
【図３】従来技術の十字型流路を用いた試料注出法を示す概念図である。
【図４】従来技術の試料濃縮法を用いた試料注出法を示す概念図である。
【図５】従来技術のフィルターを用いた試料注出法を示す概念図である。
【図６】従来技術の超音波を用いた試料濃縮法を示す概念図である。
【符号の説明】
【００４５】
１、２、３  レザーバ
４  注入用流路
５  注入用流路
６  本流路
７  共有部
８  超音波発生源
９  反射板または超音波発生源
１０  バルブ
１１  バルブ
１２  バルブ
１３  バルブ
１４  定在波
１５  試料溶液
１８、１９、２０、２１  レザーバ
２２  注入用流路
２３、２４  本流路
２５、２６  共有部
２７  超音波発生源
２８  反射板あるいは超音波発生源
２９、３０、３１、３２、３３、３４  バルブ
３５  定在波
３６  試料溶液
４４  注入用流路
４５  本流路
４６  共有部
４７  試料
４８  試料
５２  注入用流路
５３  本流路
５４  試料
５５  共有部
５６  試料
５７  レザーバ
６０  注入用流路
６１  本流路
６２  共有部
６４  試料
６６  流路
６７、６８  超音波発生源
６９  試料
７０  定在波
７１  流路
８０  超音波発生手段
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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