(57)【要約】【課題】抗生物質耐性菌、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対し優れた抗菌活性を有する抗菌剤を提供する。【解決手段】ハナビラタケの子実体又は菌糸体から溶媒抽出によって得られる化合物、１，５−ジヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロール−２−オン又は（３Ｒ＊，４Ｓ＊）−１−ヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロリジン−２，５−ジオンを有効成分とすることを特徴とする抗菌剤。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式１で示される化合物を有効成分とすることを特徴とする抗菌剤。
構造式１
【化１】
2008063245.tif 000009
【請求項２】
下記の構造式２で示される化合物を有効成分とすることを特徴とする抗菌剤。
構造式２
【化２】
2008063245.tif 000010
【請求項３】
抗生物質耐性菌に抗菌活性を示す請求項１又は２記載の抗菌剤。
【請求項４】
抗生物質耐性菌が、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌である請求項３記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌類、特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌等の抗生物質耐性菌に対する優れた抗菌活性を示す抗菌剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
人類は抗生物質によって細菌感染症を克服してきたが、近年では抗生物質に対する耐性を獲得した細菌が出現し、再び脅威となっている。特にメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（以下、ＭＲＳＡという。）は抗生物質の多用される病院内において発生して、高齢者や術後で免疫力の低下した患者に感染しやすく、呼吸器、腸管、尿路などの感染症を誘起し、死にいたらしめる場合もある。現在、ＭＲＳＡは院内感染菌として世界中に蔓延し、大きな医療問題となっている。ＭＲＳＡに感染した患者の治療には作用機序の異なるバンコマイシンなどの抗生物質が有効であるが、治癒前に感染菌がバンコマイシン耐性を獲得すれば、治療法が失われてしまう危険性もあり、治療が非常に困難である。
【０００３】
ＭＲＳＡに対する抗菌剤は種々報告されている。例えば、バンコマイシン（例えば、非特許文献１参照）、テイコブラニン、アルベカシンなどが挙げられる。
【０００４】
また、天然物由来成分としてヒノキチオール、茶カテキン、緑茶エキス（例えば、非特許文献２参照）、柿渋タンニン、プロポリス（例えば、非特許文献３参照）、キトサン（例えば、非特許文献４参照）などに抗ＭＲＳＡ活性のあることが報告されている。
【０００５】
また、衛生管理手法が発達するにつれて、食中毒は減少するものと思われているが、依然として毎年多くの食中毒事件が発生しているのが現状である。近年は１件あたりの患者数が増加し、事件が大型化する傾向にある。食中毒菌としては黄色ブドウ球菌やサルモネラ菌、大腸菌などが知られている。１９９６年に流行した病原性大腸菌Ｏ−１５７による集団感染事件などは幼少児や老人関連施設などで大規模な感染が起こる危険性を示しており、社会問題ともなっている。
【０００６】
食中毒を防ぐ手段として古くからわさびやからしが利用され、近年その抗菌成分が同定されるようになった（例えば、非特許文献５参照）。また、茶（例えば、特許文献１および特許文献２参照）やイ草（例えば、特許文献３参照）、乳酸菌産生物質（例えば、非特許文献６参照）に抗菌成分のあることが報告されている。
【０００７】
合成抗菌剤も種々利用されているが、人体への副作用の問題から、上述したような天然成分による抗菌活性が注目されている。
【０００８】
一方、きのこ類は古くから食用として利用されているが、最近その成分の生理活性が明らかにされ、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン（いずれも商品名）などは、医薬品としてその有用性が認められおり、アガリクス、メシマコブ、霊芝などは抗腫瘍作用を期待して、子実体や菌糸体の乾燥物や抽出物を健康食品素材として利用することが試みられている。きのこ類から得られる抗菌剤としては、ホウネンタケ子実体から抽出単離される新規なセスキテルペン系化合物（例えば、特許文献４参照）、カノデルマ属菌類から得られるガノマイシンと呼ばれる抗生物質（例えば、特許文献５参照）が知られている。
【０００９】
このようなきのこ類に属するハナビラタケは、カラマツ等の針葉樹に生えるきのこであって、非常に希少なきのこである。歯ごたえがよく、その純白の色合いと葉牡丹のような形態が特徴である食用きのこである。これまで、このハナビラタケは成長が遅く人工栽培は非常に困難であるとされてきたが、最近になって、比較的短期間で栽培可能な新しい栽培法が確立され、商業規模での供給が可能となってきている。
【００１０】
このハナビラタケの子実体または菌糸体から有機溶媒で抽出される画分を有効成分とする抗菌剤が知られている（特許文献６参照）。
【非特許文献１】高麗寛紀ほか著、「わかりやすい殺菌・抗菌の基礎知識」、オーム社、２０００年、ｐ．１２９〜１３０
【非特許文献２】「メディカルトリビューン（Medical Tribune）」、メディカルトリビューン、１９９６年８月２日
【非特許文献３】「プロポリス中の抗ＭＲＳＡ活性物質について」、ミツバチ科学、玉川大学ミツバチ科学研究施設、１６（４）、ｐ．１７５-１７７（１９９５）
【非特許文献４】西野敦編著、「抗菌剤の科学」Part２、工業調査会（１９９７）、ｐ．９８〜１０１
【非特許文献５】西野敦編著、「抗菌剤の科学」Part２、工業調査会（１９９７）、ｐ．１０８〜１１０
【特許文献１】特開平２−２７６５６２号公報
【特許文献２】特開平８−３８１３３号公報
【特許文献３】特開２００２−２４９４３６号公報
【非特許文献６】「フード・テクノロジー（Food Technology）」、Ｊａｎ．，１９８９、ｐ．１６４-１６７
【特許文献４】特開平９−２１６８８０号公報
【特許文献５】特表２００２−５３８２１５号公報
【特許文献６】特開２００５−９７１２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
近年、抗生物質が頻繁に用いられるようになったことに伴い、病原菌の薬剤耐性が大きな問題となっている。特にＭＲＳＡは院内感染の原因菌として重要である。この問題を克服するためには新しい抗菌剤の開発が重要である。本発明は、抗生物質耐性菌、特にＭＲＳＡに優れた抗菌効果を有する抗菌剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、このような理由から、抗菌活性を有する天然物質のスクリーニングをハナビラタケに着目して行ったところ、各種菌類、特に抗生物質耐性菌に対する優れた抗菌活性を有する化学物質を見いだし、本発明に到達した。
【００１３】
すなわち、本発明の第一は、下記の構造式１で示される化合物を有効成分とすることを特徴とする抗菌剤を要旨とするものである。
【００１４】
構造式１
【００１５】
【化３】
2008063245.tif 000002
また、本発明の第二は、下記の構造式２で示される化合物を有効成分とすることを特徴とする抗菌剤を要旨とするものである。
【００１６】
構造式２
【００１７】
【化４】
2008063245.tif 000003
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、抗生物質耐性菌、特にＭＲＳＡに対し優れた抗菌活性を有する抗菌剤を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明の抗菌剤のうち、上記の構造式１で示される１，５−ジヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロール−２−オン（1,5-dihydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)-phenyl]-pyrrol-2-one）は新規物質であり、また上記の構造式２で示される（３Ｒ＊，４Ｓ＊）−１−ヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロリジン−２，５−ジオン（(3R*,4S*)-1-hydroxy-3-isobutyl-4-[4-(3-methyl-2-butenyloxy)-phenyl]-pyrrolidine-2,5-dione）はアントロディア属のカビによって生産することが知られている抗腫瘍物質であるが（ドイツ特許出願２００４−２０２００４００３７１４号参照）、抗菌活性を有することは知られていない。
【００２１】
本発明の抗菌剤は、ハナビラタケの子実体又は菌糸体から抽出することにより得ることができ、また、他の菌類や食品等から抽出することにより、また、化学合成を行うことにより得ることができる。以下、ハナビラタケの子実体又は菌糸体から抽出する方法について説明する。
【００２２】
本発明において用いられるハナビラタケ子実体は、天然のものでも人工栽培されたものでもよい。人工栽培の方法としては、人工栽培用の菌床を作成することにより行うことができる（例えば、特開平１１−５６０９８号公報、特開２００２−３６９６２１号公報、特開２００２−１２５４６０号公報参照）。
【００２３】
また、本発明においては、ハナビラタケの菌糸体も用いることができる。菌糸体は液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機または有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができることから好ましい。培養期間は菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。
【００２４】
このようにして得られたハナビラタケは、そのままで次の抽出工程に移してもよいし乾燥してから抽出工程に移してもよい。また、乾燥後粉砕して用いることができる。
【００２５】
本発明の抗菌剤である化合物は、ハナビラタケに微量しか含まれていないため、単離して濃縮することが望ましい。ハナビラタケの子実体又は菌糸体から本発明の抗菌剤である化合物を単離する方法としては、一般の天然有機化合物の精製の手段に準じて行うことができる。例えば、ハナビラタケの子実体又は菌糸体の乾燥物を有機溶剤により抽出し抽出物を順相クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーにより分離することによりこれらを得ることができる。抽出に用いられる有機溶剤としてはアルコール、アセトニトリル、酢酸エチル、エーテル、ＴＨＦ、アセトン、塩化メチレン、クロロホルムなどが挙げられる。抽出に用いる溶剤の量に特に制限はないが、ハナビラタケ重量に対して２〜２０倍量を用いることが好ましい。２倍量以下では操作性が、２０倍量以上では作業効率が悪い。
【００２６】
また、抽出は１種または複数種の溶剤を用いて、複数回行うこともできる。複数回行う場合は、ハナビラタケからの抽出でもよいし、ハナビラタケから得られた抽出画分をさらに抽出してもよい。また、それらを組み合わせて行うことができる。
【００２７】
抽出操作の際の温度は特に制限はないが１０℃以上溶媒の沸点以下が好ましい。１０℃以下では抽出効率が悪い。抽出時間にも特に制限はないが、１時間〜３日間程度が好ましい。１時間以下では抽出量が少なく、３日間以上では作業効率が低い。また、抽出は静置のまま行うこともできるが、撹拌または振盪することによって抽出効率を高めることができる。
【００２８】
以上のようにして得られた化合物をそのまま、または使用しやすい形態に加工して本発明の抗菌剤とすることができる。また、本発明の抗菌剤は、当業者に公知の任意の方法に従って製剤することが出来る。その形態は投与経路等に応じて適宜選択することが出来、例えば、経口投与のための製剤としては、たとえば、錠剤、カプセル剤、細粒剤、粉末剤、顆粒剤、口腔内崩壊錠、液剤、シロップ剤などが挙げられ、非経口投与のための製剤としては、たとえば、注射剤、点滴剤、坐薬、吸入剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤などが挙げられる。尚、これら薬剤にはその形態等に応じて、製薬業界において通常使用されるような、当業者に公知の任意の各種補助物質を適宜含むことが出来る。又、これら薬剤中の活性成分の含有量は、その形態等にもよるが、通常、０．１〜１０重量％程度である。
【００２９】
本発明の抗菌剤は各種の細菌、真菌に加えて、抗生物質耐性菌、特にＭＲＳＡに対して有効である。
【００３０】
本発明の抗菌剤を用いて治療する際の患者への投与経路は特に限定されず、経口投与若しくは非経口投与（たとえば、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経皮投与、鼻腔などへの粘膜投与、または吸入投与など）のいずれでもよい。
【００３１】
本発明の抗菌剤の有効な投与量は、症状の程度、患者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与の時期、間隔、医薬製剤の性質、調剤などを総合的に勘案して適宜選択することができる。投与量は、特に限定されないが、通常成人１日あたり約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは約１〜１０００ｍｇであり、より好ましくは１０〜５００ｍｇであり、これを、通例、１日１〜４回にわけて投与する。投与量合計が０．０１ｍｇ以下では予防治療効果が得られず、投与量合計が２０００ｍｇ以上にしても予防治療効果の向上は認められない。
【００３２】
また、本発明の抗菌剤を食品や化粧品に混合し、細菌の繁殖を防ぐことも可能である。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
【００３４】
実施例１〔ハナビラタケからの抽出・精製〕
人工栽培により収穫されたハナビラタケ子実体の乾燥粉末１０ｋｇをヘキサン７０Ｌで２回、続いて酢酸エチル７０Ｌで３回抽出を行った。それぞれを減圧下で濃縮し、ヘキサン可溶部１２２．７ｇ、酢酸エチル可溶部７５．１ｇを得た。以下、抗ＭＲＳＡ活性を指標に単離操作を進めた。
【００３５】
このうちの酢酸エチル可溶部を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（silica gel 60N,900g,Φ7×50cm）に供し、ヘキサン／酢酸エチル＝9:1、7:3、6:4、5:5、ジクロロメタン／メタノール＝10:0、8:2、5:5、酢酸エチル／メタノール＝9:1、5:5、0:10（各２〜４Ｌ）で順次溶出を行いSCE1からSCE12の１２画分を得た。そのうちSCE2-8（6.501g）をＯＤＳカラム（ULTRA PACK ODS-S-50D、Φ5×30cm、80%メタノール）を用いた中圧カラムクロマトグラフィーにより分画し、SCE2-8-1からSCE-2-8-10の10画分を得た。各画分を抗ＭＲＳＡ活性試験に供したところ、SCE2-8-2及びSCE2-8-3で活性が確認された。
【００３６】
このうちのSCE2-8-2（212.1mg）をＯＤＳカラム（Wako pak Wakosil、70%メタノール）を用いたＨＰＬＣにより分画し、SCE2-8-2-1からSCE2-8-2-28の２８画分を得た。そのうちSCE2-8-2-26（56.3mg）をＣ３０カラム（Deverosil C30-UG-5、Φ20×250mm、70%メタノール）を用いたＨＰＬＣにより更に分画し、SCE2-8-2-26-1からSCE2-8-2-26-15の１５画分を得た。
【００３７】
一方で、SCE2-8-3（31.1mg）をＯＤＳカラム（AQUASIL SS-5251(60)、Φ20×250mm、70%メタノール）を用いたＨＰＬＣにより分画し、SCE2-8-3-1からSCE2-8-3-24の２４画分を得た。
【００３８】
上記の分画物のうち、SCE2-8-2-26-14、SCE2-8-3-15およびSCE2-8-3-18の３画分を併せ、分取ＴＬＣ（silica gel 60 F254 クロロホルム／メタノール＝97.5:2.5、97.5:2.5、90:10）によりSCE2-8-2-26-41/54-1からSCE2-8-2-26-41/54-24に分画し、SCE2-8-2-26-41/54-8（６．２ｍｇ）を単離した。この化合物を１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子社製）、１３Ｃ−ＮＭＲ（日本電子社製）により測定したところ、表１のような結果が得られたことから、下記構造式２を有する（３Ｒ＊，４Ｓ＊）−１−ヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロリジン−２，５−ジオンであると同定された。
【００３９】
【表１】
2008063245.tif 000004
構造式２
【００４０】
【化５】
2008063245.tif 000005
また、SCE2-8-2-26-41/54-19とSCE2-8-2-26-41/54-20を併せ、シリカゲルカラム（Sen shu Pak SS-5251(60)AQ、クロロホルム／メタノール＝95:5）を用いたＨＰＬＣにより、SCE2-8-2-26-41/54-19.20-1からSCE2-8-2-26-41/54-19.20-8に分画し、SCE2-8-2-26-41/54-19.20-6（３．４ｍｇ）を単離した。この化合物を１Ｈ−ＮＭＲ（日本電子社製）、１３Ｃ−ＮＭＲ（日本電子社製）により測定したところ、表２のような結果が得られたことから、下記構造式１を有する１，５−ジヒドロキシ−３−イソブチル−４−〔４−（３−メチル−２−ブテニロキシ）−フェニル〕−ピロール−２−オンであると同定された。
【００４１】
【表２】
2008063245.tif 000006
構造式１
【００４２】
【化６】
2008063245.tif 000007
【００４３】
試験例１〔ＭＲＳＡに対する抗菌効果〕
本発明の抗菌剤について、ＭＲＳＡに対する抗菌活性をＭＩＣを指標として検討した。
〔ＭＩＣの判定〕
９６穴プレートの各ウェルに最終菌体濃度１重量％となるようＭＲＳＡ（methicillin−resistant Staphylococcus aureus 2932株）を含んだＴＳＢ培地を分注した。次に、ＤＭＳＯに溶解した本発明の抗菌剤である２つの化合物を、終濃度１０００、５００、２５０、１２５、６３、３２、１６、８μＭとなるよう、各ウェルに添加し、３７℃のインキュベーター内で２０時間培養した。培養２０時間後、肉眼的に菌体の発育の無い最低濃度を最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。各々の化合物のＭＩＣを表３に示した。表３の結果から、上記２種の化合物は高い抗ＭＲＳＡ活性を有することが分かった。
【００４４】
【表３】
2008063245.tif 000008