(57)【要約】      （修正有）【課題】現在その存在が判明している２種類のグリシン輸送体の内の１種である、ＧｌｙＴ２のヒトにおける遺伝子を発見、取得し、ヒトにおいてグリシンの関与する病気の解明、治療、予防に更に幅広く貢献することが望まれている。【解決手段】動物がヒトグリシンＴ−２輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法であり、動物からの抗体試料又は動物からの体液を、ヒトグリシンＴ−２輸送体を含むかあるいは該グリシン輸送体から誘導されるポリペプチド抗原と接触させることからなるもので、該ポリペプチド抗原は配列番号：２７及びその置換体アミノ酸配列を有するか配列番号：２６の核酸配列、又はその置換体配列でコードされるものである方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物がヒトグリシンＴ−２輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法であり、動物からの抗体試料又は動物からの体液を、ヒトグリシンＴ−２輸送体を含むかあるいは該グリシン輸送体から誘導されるポリペプチド抗原と接触させることからなる方法。
【請求項２】
ヒトグリシンＴ−２輸送体が、配列番号：２７の蛋白質配列である基準配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列と同一の配列と、少なくとも９６％の配列同一性を有するものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ヒトグリシンＴ−２輸送体が、配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列でコードされるものである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、次の同時係属出願：「グリシン輸送体感染細胞及びその用途」、代理人整理番号３１７７４３−１０５、出願番号０８／６５５，８３６、１９９６年５月３１日出願；「神経障害及び神経精神障害治療用医薬」、代理人整理番号３１７７４３−１０３、出願番号０８／６５６，０６３、１９９６年５月３１日出願；「神経精神障害治療用医薬」、代理人整理番号３１７７４３−１０６、出願番号０８／６５５，９１２、１９９６年５月３１日出願；及び「神経障害及び神経精神障害治療用医薬」、代理人整理番号３１７７４３−１０７、出願番号０８／６５５，８４７、１９９６年５月３１日出願と関連しており、本発明は、ヒトグリシン輸送体系列の“ＧｌｙＴ―２”構成員をコードする核酸、その核酸によってコードされた単離蛋白質及び薬剤発見の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
シナプス伝達は、シナプス前神経細胞及びシナプス後神経細胞の両方において、分化された構造の可成りの配列（considerable array of specialized structures）を含む細胞間伝達の複雑な形態である。高親和性神経伝達物質輸送体は、１つのそのような成分であり、シナプス前終末上及びグリア細胞の周囲に位置している（非特許文献１Kanner 及び Schuldiner、CRC Critical Reviews in Biochemistry, 22, 1032 (1987)）。輸送体は、神経伝達物質をシナプスから隔離し、それによって、シナプス内での神経伝達物質の持続時間の他に、そのなかでの神経伝達物質の濃度を制御し、それらは共にシナプス伝達の大きさに影響を及ぼす。更に、伝達物質が隣接シナプスへ拡がるのを防ぐことによって、輸送体は、シナプス伝達の適合度を維持する。更に、放出された伝達物質をシナプス前終末内へ隔離することによって、輸送体は伝達物質の再利用を可能にする。
神経伝達物質輸送は、細胞外ナトリウム及び膜の両側の電圧差に依存し、例えば、発作中などのような強い神経ファイアリング（firing）の状態では、輸送体は、カルシウムに依存しない非エキソサイティックな方法で神経伝達物質を放出して、逆に機能することができる（非特許文献２Attwell 等、Neuron, 11, 401-407 (1993)）。神経伝達物質輸送体の薬理学的変調は、このようにシナプス活性を改変する手段を提供し、それは、神経障害及び精神障害の治療のための有用な治療法を提供するものである。
アミノ酸グリシンは、哺乳動物の中枢神経系における重要な神経伝達物質であり、抑制性及び興奮性シナプスの両方で機能する。“神経系”という語句は、その神経系の中枢及び末梢部分の両方を意味する。グリシンの異なる抑制性及び興奮性機能は、２つの異なるタイプの受容体によって媒介され、それぞれが、異なる種類のグリシン輸送体と関連している。グリシンの抑制作用は、痙攣性アルカロイドストリキニンに対して感受性であるグリシン受容体によって媒介され、従って、“ストリキニン感受性”と呼ばれる。このような受容体は、グリシンが受容体に結合した際に開く固有のクロライドチャネルを含んでおり、クロライドコンダクタンスを高めることによって、活動電位の励起（firing）の閾値が高くなる。ストリキニン感受性グリシン受容体は、主として脊髄及び脳幹内で見出されており、従って、このような受容体の活性化を促進する薬物は、これらの領域内での抑制性神経伝達を高めるであろう。
グリシンは、中枢神経系における主要な興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸塩の作用を変調することによって、興奮性伝達において機能する。非特許文献３Johnson 及び Ascher、Nature, 325, 529-531 (1987); 非特許文献４Fletcher 等、Glycine Transmission,（Otterson 及び Storm-Mathisen、編者、1990）、１９３〜２１９頁参照。具体的には、グリシンは、Ｎ―メチル―Ｄ―アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）受容体と呼ばれる種類のグルタミン酸塩受容体において、絶対共作動薬である。ＮＭＤＡ受容体を神経細胞上で活性化することによって、ナトリウム及びカルシウムコンダクタンスが上昇し、神経細胞を脱分極して、活動電位を励起（fire）するであろうという可能性を高めることになる。ＮＭＤＡ受容体は、脳全体に広く分布しており、大脳皮質及び海馬体に、特に高密度で分布している。
分子クローニングから、哺乳動物の脳の中には、ＧｌｙＴ―１及びＧｌｙＴ―２と呼ばれる２種類のグリシン輸送体が存在することが分かっている。ＧｌｙＴ―１は、主に前脳で見出されており、その分布は、グルタミン酸塩作動経路及びＮＭＤＡ受容体の分布に対応する（非特許文献５Smith 等、Neuron, 8, 927-935 (1992)）。ＧｌｙＴ−２の分布は異なり、この輸送体は、主に脳幹及び脊髄で見出されており、その分布は、ストリキニン感受性グリシン受容体の分布に密接に対応している。非特許文献６Liu 等、J. Biol. Chem., 268, 22802-22808 (1993)；非特許文献７Jursky 及び Nelson、J. Neurochem., 64, 1026-1033 (1995)。これらの観察は、グリシンのシナプスレベルを制御することによって、ＧｌｙＴ―１及びＧｌｙＴ―２が、ＮＭＤＡ受容体及びストリキニン感受性グリシン受容体の活性に、それぞれ優先的に影響を及ぼすという考えと一致する。
ＧｌｙＴ―１とＧｌｙＴ―２の配列の比較から、これらのグリシン輸送体は、例えば、γ―アミノ―ｎ―酪酸（ＧＡＢＡ）に特異的な輸送体などを含むナトリウム依存性神経伝達物質輸送体のより広い系列の構成員であることが分かった。非特許文献８Uhl、Trends in Neuroscience, 15, 265-268 (1992)；非特許文献９Clark 及び Amara、BioEssays, 15, 323-332 (1993)。全体的に、これらの輸送体は、それぞれ、主として疎水性アミノ酸を含む１２個の推定膜内外領域を含有する。リップマン−ピアソン（Lipman-Pearson）ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、ラットＧｌｙＴ―１をラットＧｌｙＴ―２と比較すると、５１％のアミノ酸配列同一性及び５５％の核酸配列同一性があることが分かる。ヒトＧｌｙＴ―１とヒトＧｌｙＴ―２との比較から、５１％のアミノ酸配列同一性及び５３〜５５％の核酸配列同一性があることが分かり、核酸配列については、ＣｌｙＴ―１に３つの変異体形態が存在することに起因して、数値に幅がある。
グリシン輸送体を抑制又は活性化する化合物は、受容体の機能を変え、種々の病状において治療上の恩恵を与えるものと期待されるであろう。例えば、ＧｌｙＴ―２の抑制は、グリシンのシナプスレベルを高め、これらの受容体によって媒介されることが分かっている、脊髄での痛みに関する（即ち、侵害受容の）情報の伝達を低減させることによって、ストリキニン感受性グリシン受容体を有する神経細胞の活性を低下させるのに用いることができる。非特許文献１０Yaksh、Pain, 37, 111-123 (1989)。更に、脊髄内で、ストリキニン感受性グリシン受容体を介して、抑制性グリシン作動伝達を高めることを、筋肉機能亢進の低減に用いることができ、これは、痙性、ミオクロヌス（急激な筋肉痙攣に関係する）、てんかんなどの筋肉収縮の増大に関連する病気又は状態を治療するのに有用である（非特許文献１１Truong 等、Movement Disorders, 3, 77-87 (1988)；非特許文献１２Becker、FASEB J., 4, 2767-2774 (1990)）。グリシン受容体の変調によって治療することができる痙性は、てんかん、発作、頭部外傷、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症及び神経系の病気、損傷のその他の状態と関係している。
【非特許文献１】Kanner 及び Schuldiner、CRC Critical Reviews in Biochemistry, 22, 1032 (1987)
【非特許文献２】Attwell 等、Neuron, 11, 401-407 (1993)
【非特許文献３】Johnson 及び Ascher、Nature, 325, 529-531 (1987)
【非特許文献４】Fletcher 等、Glycine Transmission,（Otterson 及び Storm-Mathisen、編者、1990）、１９３〜２１９頁
【非特許文献５】Smith 等、Neuron, 8, 927-935 (1992)
【非特許文献６】Liu 等、J. Biol. Chem., 268, 22802-22808 (1993)
【非特許文献７】Jursky 及び Nelson、J. Neurochem., 64, 1026-1033 (1995)
【非特許文献８】Uhl、Trends in Neuroscience, 15, 265-268 (1992)
【非特許文献９】Clark 及び Amara、BioEssays, 15, 323-332 (1993)
【非特許文献１０】Yaksh、Pain, 111-123 (1989)
【非特許文献１１】Truong 等、Movement Disorders, 3, 77-87 (1988)
【非特許文献１２】Becker、FASEB J., 4, 2767-2774 (1990)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在その存在が判明している２種類のグリシン輸送体の内の１種である、ＧｌｙＴ２のヒトにおける遺伝子を発見、取得し、ヒトにおいてグリシンの関与する病気の解明、治療、予防に更に幅広く貢献することが望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の要旨
第一の実施態様においては、本発明は、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列と、少なくとも約９６％の配列同一性を有するグリシン輸送体をコードする核酸を提供する。好ましくは、配列同一性は、少なくとも約９７％であり、更に好ましくは、少なくとも約９８％であり、更に一層好ましくは、少なくとも約９９％であり、更に一層好ましくは、少なくとも約９９．５％である。本発明の一実施態様では、配列同一性が１００％である。好ましくは、コードされたグリシン輸送体は、基準蛋白質配列のアミノ酸２００から７９７までの領域において、アミノ酸の相違が４つ以下であり、ここで、基準配列とは、配列番号：２７、又は上記置換の１つを有することを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列である。より好ましくは、コードされたグリシン輸送体は、このような相違が２つ以下である。
本発明は、上記核酸を含むベクターを提供するものでもある。１つの実施態様においては、このベクターは、細菌細胞又は真核細胞の少なくとも１つにおいて、グリシン輸送体ｍＲＮＡを発現するのに有効である。本発明の他の実施態様においては、このベクターは、酵母細胞、哺乳類細胞又は鳥類細胞の少なくとも１つにおいて、このｍＲＮＡを発現するのに有効である。
【０００５】
更に、本発明は、本発明によって形質転換された細胞から誘導された単離グリシン輸送体を提供するものであり、該輸送体は、上記核酸によってコードされたアミノ酸配列、又はこのような核酸によってコードされたアミノ酸配列の１つ又は２つの近接部分からなり、ここで、蛋白質は、グリシン輸送体活性を有し、ラット輸送体配列の配列部分とは配列が異なるものである。“近接配列”という語句は、ここで用いられる場合、関連する基準核酸又はアミノ酸配列の連続部分を意味する。好ましくは、本発明のグリシン輸送体蛋白質は、ラット輸送体配列の配列部分とは、少なくとも２つのアミノ酸で配列が異なり、更に好ましくは、少なくとも４つのアミノ酸で異なる。好ましくは、近接配列は、少なくとも約６００のアミノ酸からなり、更に好ましくは、少なくとも約７００のアミノ酸からなり、更に好ましくは、少なくとも約７５０のアミノ酸からなる。１つの実施態様においては、輸送体蛋白質は、上記核酸によってコードされた蛋白質配列の全てを含む。好ましくは、輸送体蛋白質は、配列番号：２７の蛋白質配列において述べたアミノ酸配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102に代えてＳｅｒ、（２）Ｓｅｒ124に代えてＰｈｅ、（３）Ｉｌｅ279に代えてＡｓｎ、（４）Ａｒｇ393に代えてＧｌｙ、（５）Ｌｙｓ457に代えてＡｓｎ、（６）Ａｓｐ463に代えてＡｓｎ、（７）Ｃｙｓ610に代えてＴｙｒ、（８）Ｉｌｅ611に代えてＶａｌ、（９）Ｐｈｅ733に代えてＳｅｒ、（１０）Ｉｌｅ735に代えてＶａｌ、（１１）Ｐｈｅ245に代えてＬｅｕ、（１２）Ｖａｌ305に代えてＬｅｕ、（１３）Ｔｈｒ366に代えてＩｌｅ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400に代えてＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列、又はこれらの配列の１〜２の近接部分からなるアミノ酸配列からなる。１つの好ましい実施態様においては、本発明は、グリシン輸送体並びに関連核酸、ベクター及び方法を提供し、ここで、蛋白質配列は、（１）Ｓｅｒ102、（２）Ｐｈｅ124、（３）Ａｓｎ279、（４）Ｇｌｙ393、（５）Ａｓｎ457、（６）Ａｓｎ463、（７）Ｔｙｒ610、（８）Ｖａｌ611、（９）Ｓｅｒ733、（１０）Ｖａｌ735、（１１）Ｌｅｕ245、（１２）Ｌｅｕ305、（１３）Ｉｌｅ366及び（１４）Ｐｒｏ400の少なくとも１つを含む。好ましくは、この配列は、これらのアミノ酸残基の少なくとも２つを含み、更に好ましくは、少なくとも４つ、更に一層好ましくは、これらのアミノ酸残基の全てを含む。
【０００６】
第二の実施態様においては、本発明は、配列番号：２７のアミノ酸配列の全て若しくは１〜２の近接部分、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当するアミノ酸配列の１〜２の近接部分と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する輸送体蛋白質をコードする核酸を提供するものでもあり、ここで、コードされた蛋白質は、グリシン輸送体活性を有している。好ましくは、近接配列は、少なくとも約６００のアミノ酸からなり、更に好ましくは、少なくとも約７００のアミノ酸からなり、更に好ましくは、少なくとも約７５０のアミノ酸からなる。本発明は、この核酸を含むベクターを提供するものでもある。１つの実施態様においては、このベクターは、細菌細胞又は真核細胞などの原核細胞の少なくとも１つにおいて、グリシン輸送体ｍＲＮＡを発現するのに有効である。本発明の他の実施態様においては、このベクターは、酵母細胞、哺乳類細胞又は鳥類細胞の少なくとも１つにおいて、このｍＲＮＡを発現するのに有効である。
【０００７】
更に、本発明は、第一の実施態様による第一の外因的に誘導された核酸、又は配列番号：２７の蛋白質配列の１〜２の近接部分、若しくは次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列の１〜２の近接部分と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する輸送体蛋白質をコードする第二の外因的に誘導された核酸を含む細胞を提供し、ここで、コードされた蛋白質は、グリシン輸送体活性を有している。１つの実施態様において、この細胞は、核酸からグリシン輸送体を発現する。本発明の一実施態様においては、プロモーターが誘発性プロモーターである。
本発明は、前のパラグラフで説明した細胞を成長させることからなるグリシン輸送体の製造方法を提供するものでもある。この方法は、更に、（ａ）グリシン輸送体を含む膜を該細胞から単離すること、又は（ｂ）グリシン輸送体を含む蛋白質画分を該細胞から抽出することの少なくとも１つを含むことができる。
本発明の一実施態様は、神経系障害若しくは状態の治療用生理活性剤を確認又は同定する方法において、（ａ）（ｉ）上述のような細胞、又は（ｉｉ）上述の第一又は第二の外因的に誘導された核酸によりコードされたアミノ酸配列からなる単離グリシン輸送体蛋白質を含む第一の測定組成物を与え、（ｂ）その第一の測定組成物を生理活性剤又は予期される（prospective）生理活性剤と接触させ、その測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を測定することからなる方法を提供する。好ましくは、この方法は、更に、第一の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を、生理活性剤又は期待される生理活性剤と接触させないこと以外は、第一の測定組成物と同じに処理された第二の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量と比較することを含む。この方法は、神経系障害又は状態が、（ａ）痛み、（ｂ）痙性、（ｃ）ミオクロヌス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進又は（ｆ）てんかんからなる群の１つである生理活性剤を確認するのに用いることができる。好ましい実施態様においては、生理活性剤が確認される痙性は、発作、頭部外傷、神経細胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症と関係している。
【０００８】
更に、本発明は、（ａ）ラット若しくはマウスＧｌｙＴ―２輸送体のための配列又は（ｂ）哺乳類ＧｌｙＴ―１輸送体のための配列とのハイブリダイゼーションを排除するのに十分なストリンジェンシー（stringency）の条件下で、配列番号：２６である基準核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列と交雑する核酸を提供する。好ましくは、この核酸配列は、長さが少なくとも約１８個のヌクレオチドであり、基準核酸配列にはめ込まれた配列と少なくとも約９５％の配列同一性を有している。好ましくは、この核酸配列は、長さが少なくとも約４０個のヌクレオチドであり、更に好ましくは、長さが少なくとも約１００個のヌクレオチドである。好ましくは、この核酸配列は、上記基準配列と少なくとも約９７％の配列同一性を有し、更に好ましくは、９９％の配列同一性を有する。好ましくは、この核酸は、ＰＣＲプライマーであり、ストリンジェント（stringent）条件は、ヒトＧｌｙＴ―２配列を増幅するのには有効であるが、（ａ）ラット若しくはマウスＧｌｙＴ―２輸送体のための配列又は（ｂ）哺乳類ＧｌｙＴ―１輸送体のための配列を増幅するには有効でないＰＣＲ条件である。
更に、本発明は、ヒトＧｌｙＴ―２遺伝子又はｃＤＮＡのコーディング又は非コーディングストランドからの近接配列を含む、長さが少なくとも約１８個のヌクレオチドの核酸を提供し、ここで、この近接配列は、この近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも１つの配列相違を有しているものである。好ましくは、この核酸配列は、長さが少なくとも約４０個のヌクレオチドであり、更に好ましくは、長さが少なくとも約１００個のヌクレオチドである。好ましくは、この近接配列は、この近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも２つ、更に好ましくは、３つの配列相違を有している。
【０００９】
更に、本発明は、細胞、組織、器官又は動物に投与した場合、その細胞又はその組織、器官若しくは動物の細胞内でのＧｌｙＴ―２の発現を低下させるのに有効なＧｌｙＴ―２のためのヒト遺伝子又はｃＤＮＡのコーディング又は非コーディングストランドからの近接配列を含むアンチセンス分子を提供し、ここで、この近接配列は、該近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも１つの配列相違を有しているものである。好ましくは、この近接配列は、この近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも２つ、更に好ましくは、３つの配列相違を有している。“アンチセンス分子”という語句は、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡと結合して、ｍＲＮＡ安定性を妨げることを始め、転写又は翻訳を妨害するように設計された分子を意味するのに用いられる。好ましくは、この近接配列は、長さが少なくとも約１５個のヌクレオチドである。近接伸長（contiguous stretch）は、基準核酸配列のコーディング又は非コーディングストランドに含まれていることが好ましい。好ましくは、近接伸長（contiguous stretch）は、配列番号：２６の核酸配列のコーディング又は非コーディングストランド内にある。本発明は、更に、このようなアンチセンス分子を含む発現ベクターを提供する。
本発明は、組織又は細胞に、ＧｌｙＴ―２発現低減有効量のこのようなアンチセンス分子、又はＧｌｙＴ―２発現低減有効量の、組織又は細胞内でこのようなアンチセンス分子を発現させる発現ベクターを適用することからなる、組織又は細胞内でのＧｌｙＴ―２発現を低減させる方法を提供するものでもある。また、本発明は、ヒトの患者の組織又は細胞に、神経系障害若しくは状態治療有効量のこのようなアンチセンス分子、又は神経系障害若しくは状態治療有効量の、組織又は細胞内でこのようなアンチセンス分子を発現させる発現ベクターを適用することからなる、神経系障害又は状態を治療する方法を提供する。
【００１０】
更に、本発明は、動物がグリシン輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法を提供し、この方法は、動物からの抗体試料又は動物からの体液を、グリシン輸送体を含むかあるいはグリシン輸送体から誘導されるポリペプチド抗原と接触させることからなる。ポリペプチド抗原は、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列によりコードされた近接配列を含むことが好ましい。好ましくは、近接配列は、長さが少なくとも約６個のアミノ酸であり、更に好ましくは、長さが少なくとも約１０個のアミノ酸であり、更に一層好ましくは、長さが少なくとも約１５個のアミノ酸である。本発明の１つの実施態様においては、ペプチド抗原は、ＧｌｙＴ―１輸送体あるいはＧｌｙＴ―２輸送体に対する抗原について選択的である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で見出された新規なヒトＧｌｙＴ２により、ヒトにおけるグリシンの関与する病気の解明、治療、予防に有効な生物活性剤の探索が可能となり、また動物がグリシン輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法を提供することに成功した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
定義
本出願のためには、次の用語は、以下に示す意味を有するものとする。
○生理活性剤
生理活性剤は、細胞、ウイルス、組織、器官又は生体に作用することができる化学薬品などの物質であり、細胞、ウイルス、器官又は生体の機能化に変化をもたらす薬剤（即ち、医薬）が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましくは、生体は哺乳動物であり、更に好ましくは、ヒトである。本発明の好ましい実施態様においては、本発明の生理活性剤を同定する方法は、分子量が約１５００以下の有機分子に適用される。
○外因的に誘導された核酸
外因的に誘導された核酸は、細胞内に見出される核酸であって、その細胞、その細胞の親若しくは祖先、又はその細胞が組み換え技術によって誘導される遺伝子導入動物に導入されたものである。
○核酸と機能的に関連する外因性プロモーター
蛋白質をコードする核酸用の外因性プロモーターは、その蛋白質のための核酸を発現するのに現実に用いられるものとは別のプロモーターである。プロモーターと両立しうる細胞内で、プロモーターが作用して核酸を転写させることができれば、プロモーターは、核酸と機能的に関連する。
○核酸特異性
核酸特異性は、異なる核酸分子を区別するのに用いることができる性質である。このような性質には制限は無く、（ｉ）分子の全て又は一部のヌクレオチド配列、（ｉｉ）例えば、電気泳動で求めた分子の大きさ、（ｉｉｉ）核酸を断片化する化学薬品での処理によって生ずるか、あるいはヌクレアーゼにより生ずる切断パターン、及び（ｉｖ）分子又はその断片が、特定の核酸プローブと交雑するか、あるいは特定のプライマーとアンプリコン（amplicon）を作る能力が挙げられる。
○予期される剤（prospective agent）
予期される剤は、グリシン輸送に影響を及ぼすかどうかを決定するために、本発明のスクリーニング法によって試験されている物質である。
○配列同一性
技術上知られているように、“同一性”とは、配列を比較することにより求められた場合、特にこのような配列のストリング（strings）間の合致により求められた場合、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。“同一性”は、公知の方法（A.M. Lesk 編、計算分子生物学、Oxford University Press, New York (1988)、D.W. Smith 編、バイオコンピューティング：情報科学及びゲノムプロジェクト、Academic Press, New York (1993)、A.M. Griffin 及び H.G. Griffin 編、配列データのコンピューター解析、第一部、Humana Press, New Jersey (1994)、G. von Heinje、分子生物学における配列解析、Academic Press (1987)、及び M. Gribskov 及び J. Dcvereux 編、配列解析プライマー、M. Stockton Press, New York (1991)）により容易に計算される。２つの配列間の同一性を測定するには、多くの方法が存在するが、この用語は、当業者に周知である（例えば、分子生物学における配列解析、配列解析プライマー、及び H. Carillo 及び D. Lipman、SIAM J. Applied Math., 48,1073 (1988) 参照）。配列間の同一性を求めるのに一般に用いられる方法としては、H. Carillo 及び D. Lipman、SIAM J. Applied Math., 48,1073 (1988)、又は、好ましくは、Needleman 及び Wunsch、J. Mol. Biol., 48, 443-445 (1970) に記載されているものが挙げられ、そこでは、パラメーターがＤＮＡＳＩＳ（Hitachi Software Engineering Co., San Bruno, CA）のバージョン２にセットされているものであるが、これらに限定されるものではない。同一性を求めるためのコンピュータープログラムは、公然と入手可能である。２つの配列間の同一性を求める好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（J. Devereux 等、Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（S.F. Altschul 等、J. Molec. Biol., 215, 403-410 (1990)）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩ（blast@ncbi.nlm.nih.gov.）及びその他の情報源（BLAST Manual, S. Altschul 等、NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul 等、J. Molec. Biol., 215, 403-410 (1990)）から公然と入手可能である。
【００１３】
発明の詳細な説明
配列番号１８及び２６のＧｌｙＴ―２核酸配列又は配列番号１９及び２７の対応するコードされた蛋白質配列は、Liu 等、J. Biol. Chem., 268, 22802-22808 (1992) に報告されているラットＧｌｙＴ―２配列のヒト類縁である。配列番号：２１、即ち、配列番号：２０の核酸配列によりコードされたＧｌｙＴ―２蛋白質配列は、配列番号：１９及び２７のアミノ酸配列とは異なり、おそらく、ヒトＧｌｙＴ―２の変異体を示しているであろう。配列番号：１〜３４に記載された他の配列は、更に変異を示すものである。これらの変異は、クローンを生成するためのいくつかのドナーについてプールされたｍＲＮＡからのｃＤＮＡの使用に主として起因する。全体で、単離された種々のヒトＧｌｙＴ―２由来核酸が、下記の配列変異を示す。
【００１４】
【表１Ａ】
2008281545.tif 000002
【表１Ｂ】
2008281545.tif 000003
【表１Ｃ】
2008281545.tif 000004
【表１Ｄ】
2008281545.tif 000005
【表１Ｅ】
2008281545.tif 000006
この変異の源になるものとは無関係に、ペプチド配列における点変異は、停止コドンを除いて、ＧｌｙＴ―２の機能に悪影響を与えないものと信じられている。配列番号：１９及び２７のＧｌｙＴ―２蛋白質配列が特に最も好ましく、配列番号：２７が最も好ましい。配列番号：２６の核酸配列は、大きいコンセンサス配列を提供するものと信じられている。
上記変異は、主にヒト個体間の配列変異を示すものである。上記核酸配列を生成させるのに用いられる物質は、特定の核酸配列に応じて、２６又は９２の個体からのプールを含んでいた。沈黙又は保存変異（silent or conservative substitutions）が優勢であることと共に、プールされた原料物質を使用することにより、変異が、増幅反応によって生ずる突然変異よりも、むしろヒト由来変異を反映するものであるという結論が支持される。
配列番号１８のヒトヌクレオチド配列とＧｌｙＴ―２のためのラットヌクレオチド配列との関係、及びそれらがコードする蛋白質配列の関係は、下記の表に示す通りである。これらの表に示された関連値（relatedness values）は、ピアソンとリップマン（Pearson and Lipman）によって記載されたＦＡＳＴＡコンピュータープログラム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988)）を用いて求めた。
【００１５】
【表２Ａ】
2008281545.tif 000007
【表２Ｂ】
2008281545.tif 000008
【００１６】
核酸−ググリシン輸送体をコードする核酸
グリシン輸送体をコードする天然に存在しない核酸を作るためには、未変性配列を出発点として用い、特定の要求に適するように変性することができる。例えば、配列を突然変異させて、有用な制限部位を取り入れることができる。Maniatis 等、分子クローニング、実験室マニュアル（Molecular Cloning, a Laboratory Manual）（Cold Spring Harbor Press, 1989）参照。このような制限部位は、“カセット”、即ち制限酵素と連結反応を用いて円滑に置換された核酸の領域を作るのに用いることができる。このカセットは、突然変異グリシン輸送体アミノ酸配列をコードする合成配列を置換するのに用いることができる。また、グリシン輸送体をコードする配列は、実質的又は完全に合成したものであることができる。例えば、Goeddel 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 106-110 (1979)参照。組み換え発現のためには、このような核酸が発現されることになる生体へのコドン使用優先（codon usage preferences）を、グリシン輸送体をコードする合成核酸を設計する際に考慮するのが好都合である。例えば、原核コドン優先（prokaryotic codon preferences）を取り入れる核酸配列を、National Biosciences, Inc. (Plymouth, MN) から入手できるオリゴ―４（Oligo-4）などのソフトウエアプログラムを用いて、哺乳類由来の配列から設計することができる。
本発明の核酸配列実施態様は、好ましくはデオキシリボ核酸配列であり、好ましくは２本鎖デオキシリボ核酸配列である。しかし、それらは、リボ核酸配列であってもよい。
蛋白質をコードする核酸配列から配列を欠失させるか、あるいはその核酸配列を突然変異させ、これらの欠失又は突然変異した配列によってコードされた蛋白質の機能を確認するには、多数の方法が知られている。従って、本発明は、グリシンへ特異的に結合する能力及び膜を通してグリシンを輸送する能力を保持する蛋白質をコードするヒト核酸配列の突然変異又は欠失したものに関するものでもある。これらの類似体は、ＧｌｙＴ―２の機能が保持される限り、Ｎ末端、Ｃ末端又は内部欠失があってもよい。残っているヒトＧｌｙＴ―２蛋白質配列は、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列に関して、約４つ以下のアミノ酸配列変異を有することが好ましく、好ましくは２つ以下のアミノ酸配列変異、更に好ましくは１つ以下のアミノ酸変異を有するであろう。これらの変異は、配列番号：１９又は２７の蛋白質配列に関連していることが更に好ましく、配列番号：２７が更に一層好ましい。１つの好ましい実施態様においては、本発明の蛋白質実施例が、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、若しくは（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列に関して、明らかにされている。点変異は、保存（conservative）点変異であることが好ましい。これらの類似体は、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列と、好ましくは、少なくとも約９６％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約９７％の配列同一性、更に好ましくは、少なくとも約９８％の配列同一性、更に一層好ましくは、少なくとも約９９％の配列同一性、更にもっと好ましくは、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有しているであろう。これらの変異は、配列番号：１９又は２７の蛋白質配列に関連していることが更に好ましく、配列番号：２７が更に一層好ましい。突然変異又は欠失のアプローチは、ヒトＧｌｙＴ―２蛋白質を発現する本発明の核酸配列の全てに適用されることができる。上で論じたように、保存（conservative）突然変異が好ましい。このような保存突然変異としては、下記の群の１つの範囲内で、１つのアミノ酸を他のアミノ酸に変換する突然変異が挙げられる。
１．小さい脂肪族非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ
２．極性で、負に帯電した残基及びそれらのアミド類：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ
３．極性で、正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ
４．大きい脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ
保存変異の好ましいリスティングは、次の通りである。
【００１７】
【表３】
2008281545.tif 000009
【００１８】
選択された変異の種類は、Schulz 等、Principles of Structure, Springer-Verlag (1978) によって開発された異なる種の同族蛋白質間のアミノ酸変異の頻度の解析、Chou 及び Fasman、Biochemistry, 13, 211 (1974) 並びに Adv. Enzymol, 47, 45-149 (1978) によって開発された構造形成ポテンシャルの解析、並びにEisenberg 等、Proc. Natl. Acad. USA, 81, 140-144 (1984)、Kyte & Doolittle、J. Molec. Biol., 157, 105-132 (1981) 及びGoldman 等、Ann. Rev. Biophys. Chem., 15, 321-353 (1986) によって開発された蛋白質における疎水性パターンの解析に基づけばよい。このパラグラフの参考文献は、全てそのまま、ここに参照のために記載する。
ここで同定された種々のヒトＧｌｙＴ―２ｍＲＮＡ間にアミノ酸置換を生成する１０の同定された点変異は、機能性ＧｌｙＴ―２を生成するのに有用であると信じられるので、これらの点変異の全ての組み合わせを取り込む蛋白質は、機能的であると信じられる。これらの変異は、本発明の範囲内である。
この適用のためには、本発明の核酸が、それが誘導される細胞又は組織の他の高分子から分離された場合は、その核酸が“単離”されたということである。この核酸を含む組成物は、もとの細胞の組成物よりも、核酸含有量に関して、少なくとも約１０倍高いことが好ましい。この核酸は、実質的に純粋であることが好ましく、これは、他の核酸に関して、少なくとも約６０％ｗ／ｗの純度を意味し、更に好ましくは約８０％、更に一層好ましくは約９０％、更にもっと好ましくは約９５％である。
【００１９】
ハイブリダイゼーションプローブ
グリシン輸送体のための核酸配列の多くの欠失又は突然変異類似体は、グリシン輸送体をコードする核酸に有効なハイブリダイゼーションプローブであろうと認められるであろう。従って、本発明は、ストリンジェント（stringent）条件下で、このようなグリシン輸送体をコードする核酸配列と交雑する核酸配列に関するものである。好ましくは、この核酸配列は、配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている核酸配列と交雑する。１つの実施態様においては、本発明の核酸（又は機能的同等物）実施例が、配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、若しくは（ｎ）Ａ2203をＧへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている核酸配列に関して明らかにされている。
“ストリンジェント（stringent）条件”とは、実質的に関連する核酸配列のハイブリダイゼーションを許容する条件を意味する。例えば、このような条件下では、一般に、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは 少なくとも約９０％の配列同一性、更に好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性で配列のハイブリダイゼーションが可能であろう。このようなハイブリダイゼーション条件は、Sambrook 等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press (1989) により記載されている。ハイブリダイゼーション条件及びプローブを、十分に特徴のある方法で調整して、ヒト由来プローブの選択的ハイブリダイゼーションを行うことができる。
ストリンジェント（stringent）条件下で、グリシン輸送体をコードする核酸へ交雑する核酸分子は、上で略述した方法を用い、あるいは、例えば、Sambrook 等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Press (1989) で総説されているハイブリダイゼーション方式を使用することにより、機能的に同定されることができる。
ハイブリダイゼーションプローブへの用途の例としては、制限はなく、ヒトＧｌｙＴ―２輸送体を発現する組織を同定することなどの組織化学的用途；ｍＲＮＡ濃度を測定して、例えばサンプルの組織の種類を同定するか、あるいは異常濃度のグリシン輸送体を発現する細胞を同定すること；及びグリシン輸送体遺伝子内の多形現象を検出することなどが挙げられる。ＲＮＡハイブリダイゼーション方法は、Maniatis 等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press (1989)）に記載されている。
【００２０】
ＰＣＲプライマー
ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）プライマーを設計する方式は、PCR Protocols, Cold Spring Harbor Press (1991) により総説されているように、現在、確立されている。変性（degenerate）プライマー、即ち、所定の配列場所で不均一なプライマー試料を、ヒトＧｌｙＴ―２核酸と高度に類似しているが、同一ではない核酸配列を増幅するように設計することができる。必要とするプライマーのうちの１つだけを公知の配列と特異的に交雑させる方策は、現在、利用可能である。Froman 等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998 (1988) 及び Loh 等、Science, 243, 217 (1989) 参照。例えば、適当な核酸プライマーを、増幅しようとする核酸に結合して、それらのプライマーのうちの１つのためのハイブリダイゼーションパートナーを提供することができる。この方法では、プライマーのうちの１つだけが、増幅しようとする核酸の配列に基づいていることが必要である。
核酸を増幅するＰＣＲ法は、少なくとも２つのプライマーを利用するであろう。これらのプライマーの一方は、増幅されるべき核酸の第一のストランドへ交雑することができ、酵素で行われる（enzyme-driven）核酸合成を第一の方向へ開始させる（prime）ことができるであろう。他方は、この第一のストランドの相互配列（もし、増幅されるべき配列が一本鎖のものであれば、この配列は、最初は仮定的であるが、第一の増幅サイクルで合成されるであろう）を交雑し、そのストランドから、第一の方向とは反対の方向で、第一のプライマーのためのハイブリダイゼーションの部位へ向かって、核酸合成を開始させることができるであろう。このような増幅を行うための条件、特に、好ましいストリンジェント（stringent）ハイブリダイゼーション条件は、よく知られている。例えば、PCR Protocols, Cold Spring Harbor Press (1991)参照。
【００２１】
ベクター
適当な発現ベクターは、宿主細胞に含まれているＧｌｙＴ―２コードＤＮＡの発現を促進することができ、真核性、真菌性又は原核性であることができる。なかでも、適当な発現ベクターとしては、ｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen, San Diego, CA）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（Invitrogen）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、Ｚａｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｃｔｏｒ（Stratagene Cloning Systems, LaJolla, CA）、ｐＢｋ／ＣＭＶ又はｐＢｋ−ＲＳＶベクター（Stratagene）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ  ＋／−  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Stratagene）、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（Stratagene）、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭ  ｎｅｏ（Clontech, Palo Alto, CA）、ｐＫＳＶ１０（Pharmacia, Piscataway, NJ）、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）及びｐＣＲ２．１（Invitrogen）が挙げられる。有用な酵素発現系としては、例えば、ｐＹＥＵｒａ３（Clontech）が挙げられる。有用なバキュロウイルスベクターとしては、ｐＶＬ１３９３、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｌｕＢａｃ２、ｐＢｌｕＢａｃＨｉｓ  Ａ、Ｂ又はＣなどの Invitrogen（San Diego, CA）からのウイルス性ベクターや、ｐｂａｃＰＡＣ６（Clontech から）が挙げられる。
【００２２】
細胞
本発明の１つの実施態様においては、輸送体は、哺乳類の細胞系内で発現されるのが好ましく、株化細胞培養履歴を有する形質転換細胞内で発現されるのが好ましい。この実施態様においては、特に好ましい細胞系としては、ＣＯＳ―１、ＣＯＳ―７、ＬＭ（ｔｋ−）、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＣＨＯ、Ｒａｔ―１及びＮＩＨ３Ｔ３が挙げられる。他の好ましい細胞としては、ＱＴ―６細胞などの鳥類細胞が挙げられる。用いることのできる他の細胞としては、ショウジョウバエ細胞などの昆虫細胞、魚類細胞、両生類細胞及び爬虫類細胞が挙げられる。
他の実施態様においては、細菌細胞系や酵素細胞系などの、哺乳類細胞系よりも安価に維持され、成長する細胞系内で発現される。
【００２３】
単離されたグリシン輸送体
本発明は、好ましくは、蛋白質に関して少なくとも約８０％、好ましくは９０％、更に好ましくは９５％の純度で、本発明の核酸の任意のものによりコードされたヒトＧｌｙＴ―２蛋白質を規定するものでもある。純度は、例えば、下記のような蛋白質精製方法を、本発明による組み換え細胞の溶解産物に適用することにより達成される。
上のパラグラフのヒトＧｌｙＴ―２変異株は、ヒトＧｌｙＴ―２活性を生ずる生体又は細胞を作るのに使用されることができる。関連分子生物学法を始めとする精製方法を次に述べる。
【００２４】
グリシン輸送体を製造する方法
本発明の核酸の１つの指示（direction）のもとで生体により合成されたポリペプチドを単離する１つの単純化された方法は、融合パートナーが円滑にアフィニティ精製されている融合蛋白質を組み換え的に発現させることである。例えば、融合パートナーとしては、グルタチオンＳ―トランスフェラーゼを挙げることができ、これは、市販の発現ベクター（例えば、Pharmacia, Piscataway, NJ から入手できるベクターｐＧＥＸ４Ｔ３）上でコードされる。次いで、この融合蛋白質を、グルタチオンアフィニティカラム（例えば、Pharmacia, Piscataway, NJ から入手できるもの）で精製することができる。その他の融合パートナーも、例えば、Invitrogen （Carlsbad, CA）で販売されている種々の発現ベクターにおいて使用できる。勿論、このような融合パートナー無しに、ＧｌｙＴ―２に結合する適当な抗体を用いて、組み換えポリペプチドをアフィニティ精製することができる。このような抗体を製造する方法は、ＧｌｙＴ―２発現系及び既知の抗体製造法のここでの十分な記載に照らしてみれば、当業者にとって利用できるものである。例えば、Ausubel 等、Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1992) 参照。融合蛋白質を使用する場合は、融合パートナーとＧｌｙＴ―２との間のリンカーなどのような構造ができていない領域を優先的に攻撃する部分蛋白分解消化法により、融合パートナーを除去することができる。例えば、Chou 及び Fasman、Biochemistry, 13, 211 (1974) 並びに Chou 及び Fasman、Adv. in Enzymol., 47, 45-147 (1978) によって開発された二次構造形成ポテンシャルの方式を用いて、構造が存在しないようにリンカーを設計することができる。トリプシンにより切断された部位を規定するアミノ酸であるアルギニン及びリシン残基、又は、例えば、ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓなどの、リシン残基の後で切断されたエンテロキナーゼ標的配列のような、プロテアーゼ標的アミノ酸を導入するように、リンカーを設計することもできる。リンカーを作るためには、標準サブクローニング方法論と共に、オリゴヌクレオチドを作る標準合成法を用いることができる。ＧＳＴ以外にも、他の融合パートナーを用いることができる。真核細胞、特に哺乳類細胞を利用する方法は、これらの細胞が蛋白質を翻訳後に改変して、天然蛋白質と高度に類似しているか、あるいはそれと機能的に同一である分子を作るので好ましい。
用いることができる他の精製技術としては、制限はなく、予備電気泳動、ＦＰＬＣ（Pharmacia, Uppsala, Sweden）、ＨＰＬＣ（例えば、ゲル濾過、逆相又は弱疎水性カラムを用いる）、ゲル濾過、分別沈殿（例えば、“塩析”沈殿）、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィーが挙げられる。
ＧｌｙＴ―２は膜蛋白質であり、関連輸送体蛋白質との類似により１２の膜内外配列を持っていいると信じられているため、単離方法では、洗浄剤、一般には非イオン性洗浄剤を用いて、蛋白質の適当な二次又は三次構造を維持することが多いであろう。例えば、Lopez-Corcuera 等、J. Biol. Chem., 266, 24809-24814 (1991) 参照。可溶化された輸送体を膜内に再統合する方法の記載については、Lopez-Corcuera 等、J. Biol. Chem., 266, 24809-24814 (1991) 参照。
ＧｌｙＴ―２の単離は、ＧｌｙＴ―２を発現するために形質転換された細胞から膜を単離することを含むことができる。このような細胞は、膜画分内のＧｌｙＴ―２の量が、自然にＧｌｙＴ―２を発現する細胞からの比較しうる膜に見られるものよりも少なくとも約１０倍、更に好ましくは、その量が少なくとも約１００倍高くなるような十分な複製数でＧｌｙＴ―２を発現することが好ましい。
この蛋白質は、実質的に純粋であることが好ましく、これは、他の蛋白質に関して、少なくとも６０％の純度を意味する。この適用のためには、ＧｌｙＴ―２が、それが誘導される細胞又は組織の他の高分子から分離された場合は、ＧｌｙＴ―２が“単離”されたということである。ＧｌｙＴ―２を含む組成物は、もとの細胞の組成物よりも、蛋白質含有量に関して、少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約１００倍高いことが好ましい。
【００２５】
ＲＮＡ挿入によるＧｌｙＴ―２の発現
ｍＲＮＡを細胞に挿入するという簡単な方法で、ヒトＧｌｙＴ―２を発現させることができるということが認められるであろう。ＧｌｙＴ―２活性を有する蛋白質をコードする核酸を、ＳＰ６又はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターなどの、高効率生体外転写用プロモーターを含むベクターへサブクローニングすることにより、これらの用途のＲＮＡを調製することができる。このベクターからのＲＮＡの製造は、例えば、Ausubel 等、Short Protocols in Molecular Biology, pp. 10-63 から 10-65 まで、John Wiley & Sons, New York (1992) に記載されている方法で行うことができる。アフリカツメガエル由来の卵母細胞へのＲＮＡの挿入が、例えば、Liu 等、FEBS Letters, 305, 110-114 (1992) 及び Bannon 等、J. Neurochem., 54, 706-708 (1990) に記載されている。
一方、ｍＲＮＡを、膜含有翻訳系であってもよい生体外翻訳系に挿入するという簡単な方法で、ヒトＧｌｙＴ―２を発現させることができるということが認められるであろう。生体外での蛋白質の発現は、例えば、Ausubel 等、Short Protocols in Molecular Biology, pp. 10-63 から 10-65 まで、John Wiley & Sons, New York (1992) に記載されている。Guastella 等、Science, 249, 1303-1306 (1990) （輸送体の生体外発現）も参照。生体外で膜蛋白質を製造するのに、細胞下膜様物質を使用することが、Walter 及び Blobel、Meth. Enzymol., 96, 84 (1983) （ウサギ網状赤血球翻訳系について）並びに Spiess 及び Lodish、Cell, 44, 177 (1986) （小麦胚芽翻訳系について）に記載されている。
【００２６】
剤を確認又は同定する方法
神経系障害若しくは状態に関連する病気若しくは状態の治療用生理活性剤を分析又はスクリーニングする方法は、第一及び第二の細胞を別々に培養することからなり、ここで、その第一及び第二の細胞は、好ましくは同一種のもの、更に好ましくはその同一株のものであり、ここで述べられているようなグリシン輸送体をコードする外因性核酸を含んでいる。この剤を治療のために使用できる神経系障害又は状態としては、（ａ）痛み、（ｂ）ミオクロヌス、（ｃ）筋痙攣、（ｄ）筋機能亢進、（ｅ）てんかん又は（ｆ）発作、頭部外傷、神経細胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症と関係しているものなどの痙性が挙げられるが、これらに限定されるものではない。この方法では、第一の細胞を、好ましくは3Ｈや14Ｃなどの放射性同位元素を取り入れているグリシンの存在下で、好ましくはペプチド又は有機化合物などの化合物である生理活性剤又は予期される剤（prospective agent）と接触させる。次いで、第一の細胞を、その化合物と接触させなかった第二の細胞（即ち、対照細胞）へのグリシン輸送と比較して、第一の細胞へのグリシン輸送の促進又は抑制について試験する。このような分析又はスクリーニングには、好ましくは所見、学習、発見、測定、同定又は確認の活性（activities of finding, learning, discovering, determining, identifying or ascertaining ）が含まれる。
一方で、細胞の代わりに、単離されたＧｌｙＴ―２輸送体を含む化合物を測定に用いることができる。このような単離された輸送体の試料は、好ましくは小胞内に膜又は脂質二重層を含むことが好ましく、その小胞は、内部と外部とを有し、その外部を横切って輸送を測定することができる。例えば、Kanner、Biochemistry, 17, 1207-1211 (1978) 参照。
試験の終わりにおいて、細胞内、小胞内又はその他に輸送されたグリシンの量が、剤と接触させなかった組成物よりも、剤と接触させた組成物の方が大きい場合は、生理活性剤はグリシン輸送取り込みの促進剤であり、逆に、細胞内又は小胞内グリシンの量が、他方と比較して、剤と接触させなかった組成物の方が大きい場合は、生理活性剤は、グリシン輸送の抑制剤である。試験される第一の組成物と対照の第二の組成物との間のグリシン取り込みの差は、好ましくは少なくとも約２倍、更に好ましくは少なくとも約５倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍以上である。
ＧｌｙＴ―２輸送体に関する抑制剤又は促進剤である生理活性剤は、ＧｌｙＴ―１輸送体の１つなどの他のグリシン輸送体については、中立又は反対の影響を有する。好ましい生理活性剤は、ＧｌｙＴ―２輸送体を促進又は抑制する特異性を有し、他のグリシン輸送体に及ぼす影響は、中立又は無視できるものである。生理活性剤は、第二のグリシン輸送体に及ぼすその影響と比較して、ＧｌｙＴ―２輸送体によって媒介されたグリシン取り込みを抑制又は促進する際に、ＩＣ50値などの濃度依存性パラメーターに反映して、大きさが少なくとも１オーダー大きい効力を持っていることが好ましい。より好ましい剤は、グリシン輸送体の１つについて、他のものと比較して、少なくとも約１００倍大きい効力を有している。
生理活性剤は、輸送体と接触するように拡散することができる形でグリシン輸送体に供与できれば、どのような化合物、物質、組成物、混合物又は化学薬品であってもよい。このような生理活性剤としては、好ましくは長さが２から約２５までのアミノ酸、より好ましくは２から約１０まで、更に一層好ましくは長さが２から約５のアミノ酸のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明に関連する他の適当な生理活性剤としては、好ましくは分子量が約１００ダルトンから約５，０００ダルトンまでの小さい有機化合物が挙げられ、アルキル、アリール、アルケン、アルキン、ハロ、シアノ及びその他の基のような機能性（functionalities）からなり、ヘテロ原子は含んでいても含まなくてもよい。このような有機化合物としては、単純糖（simple sugar）を始めとする炭水化物、アミノ又はイミノ酸、核酸、ステロイドなどを挙げることができる。予期される剤（prospective agent）として試験される化学薬品は、当該技術分野において知られている組み合わせ化学プロセス又は化学合成の従来からの手段を用いて、調製することができる。生理活性剤が、神経系障害又は状態の治療用薬剤として有用であることが好ましい。
ＧｌｙＴ―１又はＧｌｙＴ―２媒介輸送を抑制するいくつかの化合物は、ストリキニン感受性受容体のグリシン結合部位又はＮＭＤＡ受容体のグリシン結合部位へも結合する。ストリキニン感受性受容体へのこのような結合は、例えば、脊髄や脳幹組織からの膜画分から調製されることができるような、ストリキニン感受性受容体の試料と接触して、放射線標識ストリキニンを置くことによる結合測定法により同定することができる。膜画分は、例えば、均質化及び遠心分離の方法を含む通常の方法を用いて調製することができる。
ＮＭＤＡ受容体へのこのような結合は、例えば、神経細胞や脳組織からの膜画分から調製されることができるような、ＮＭＤＡ受容体の試料と接触して、放射線標識グリシンを置くことによる結合測定法により同定することができる。Grimwood 等、Molec. Pharmacol., 41, 923-930 (1992)。このような膜内に置かれたＮＭＤＡ受容体は、約０．１％〜約０．５％サポニンなどの弱い洗浄剤で処理されて、どのような内因性グリシン又はグルタミン酸塩でも除去する。
このような結合測定法で用いられるリガンドは、炭素又は水素の放射性同位元素のような、任意の検出可能な同位元素で放射線標識されている。次いで、放射線標識リガンドの特異的結合を、放射線標識リガンドの全（即ち、特異的及び非特異的）結合による放射能から非特異的結合による放射能を引くことにより求める。非特異的結合による放射能は、放射線標識リガンド及び１００倍過剰のように著しく過剰の非放射線標識リガンドの両方に接触したストリキニン感受性又はＮＭＤＡ受容体含有膜画分と結合した放射線標識の量を測定することにより求められる。放射線標識リガンドの全結合による放射能は、非放射線標識リガンドの不存在下で、受容体試料に結合した放射線標識の量を測定することにより求められる。ＮＭＤＡ受容体については、例えば、ジクロロキヌレン酸又はＬ―６８９，５６０などのアミノ酸の標識類似体を用いて、受容体のグリシン部位への結合を測定することもできる。例えば、Grimwood 等、Molec. Pharmacol., 41, 923-930 (1992)参照。
カルシウムフラックス（ＮＭＤＡ受容体試料について）若しくは塩化物フラックス（ストリキニン感受性受容体試料について）を促進又は抑制することに関して、本発明によって同定された化合物の効果を測定するのに、機能性イオンフラックス測定法（functional ion-flux assay）が用いられる。この試験は、膜結合ＮＭＤＡ受容体又はストリキニン感受性受容体とグリシン輸送体を有する細胞培養で行われる。このような細胞は、神経細胞を含み、一般には、脳幹及び脊髄のもの、それらから誘導された細胞株及びＮＭＤＡ受容体又はストリキニン感受性受容体を発現するように誘導又はトランスフェクトされた他の任意の細胞を含む。このような試験に用いられるカルシウムは、カルシウムキレーター（chelator）と結合した蛍光である、カルシウム結合蛍光などの他のカルシウム測定技術を同様に用いることもできるが、一般には、45Ｃａ同位元素である。このような試験に用いられる塩化物は、通常、同位元素36Ｃｌが挙げられる。どの方法でカルシウム又は塩化物をモニターしても、本発明の生理活性剤を別に添加すれば、その結果、イオンフラックスを促進又は抑制することができる。この方式の利点は、受容体とグリシン輸送体の両方のグリシン部位に相互作用する化合物のＮＭＤＡ受容体又はストリキニン感受性受容体機能に及ぼす正味の影響をモニターできるという点にある。
ストリキニン感受性受容体アゴニストでもあるＧｌｙＴ―２抑制剤は、グリシン輸送体の抑制、そしてストリキニン感受性受容体活性を直接高めることで、ストリキニン感受性受容体発現シナプスにおけるグリシン濃度を増大させることにより、上記適応症（indications）において作用する。ストリキニン感受性受容体アンタゴニストでもあるグリシン輸送体抑制剤は、例えば、グリシン輸送体抑制によるグリシンの増加が、ストリキニン感受性受容体拮抗作用よりも優勢であれば、それにもかかわらず、これらの適応症を治療する際に活性を保持することができる。ストリキニン感受性受容体アンタゴニスト活性が、グリシン輸送体の抑制に起因する細胞外グリシン増加効果よりも優勢である場合は、これらの化合物は、重症筋無力症などの筋肉活性の低下に関連する状態を治療するのに有用である。
【００２７】
上述のごとく、本発明の生理活性剤は、多数の薬理作用を持つことができる。これらの化合物の相対的有効性は、下記のものを含む多くの方法で評価することができる。
１．ＧｌｙＴ―１及びＧｌｙＴ―２輸送体により媒介された活性を比較すること。この試験は、（ａ）ＧｌｙＴ―１輸送体に対してより活性であり、従って、精神分裂症を治療若しくは予防し、認識を増進し、記憶を増強するのにより有用な、又は（ｂ）ＧｌｙＴ―２輸送体に対してより活性であり、従って、てんかん、痛み若しくは痙性を治療若しくは予防するのにより有用な生理活性剤を同定する。
２．ストリキニン感受性受容体又はＮＭＤＡ受容体結合の試験。この試験は、このような結合の薬理学的効果を更に調べることを保証するのに十分な結合がこの部位にあるかどうかを決定する。
３．一次組織培養におけるイオンフラックス、例えば、ストリキニン感受性受容体により媒介された塩化物イオンフラックス若しくはＮＭＤＡ受容体により媒介されたカルシウムイオンフラックスを促進又は低減させる際に、化合物の活性を試験する。イオンフラックスを増大させる生理活性剤は、（ａ）ストリキニン感受性受容体にアンタゴニストをほとんど持たないかあるいは全く持っておらず、ＧｌｙＴ―２輸送体抑制によるグリシン活性の増強におそらく影響を与えないものであるか、又は（ｂ）ストリキニン感受性受容体との直接の相互作用がほとんどない比較ＧｌｙＴ―２抑制剤との結果に著しい増加が認められれば、その剤は、受容体アゴニストである。
本発明の剤分析法は、生理活性剤が、ＮＭＤＡ受容体とＧｌｙＴ―２輸送体とが関係している適応症を治療するのに有用であるかどうかを確認するのに用いられることがあるであろう。この場合、一般に、ストリキニン感受性受容体とＧｌｙＴ―２輸送体に関する活性の程度が低いほど、望ましい。
【００２８】
アンチセンス治療法
本発明の１つの態様は、上で確認されたもののような神経性適応症を治療するための“アンチセンス”核酸の使用に関するものである。このアプローチは、ＧｌｙＴ―２をコードするｍＲＮＡに結合して、そのｍＲＮＡの翻訳を停止又は抑制するか、あるいはＧｌｙＴ―２遺伝子に結合して、その転写を妨げるように設計されたアンチセンス分子の使用を含むものである。ゲノムＤＮＡに結合して、転写を妨げるヌクレオチド配列の設計の議論については、Helene、Anti-Cancer Drug Design, 6, 569 (1991) 参照。結合されようとするｍＲＮＡ配列が分かれば、ワトソン−クリック（Watson-Crick）塩基対合則によりセンスストランドに結合して、ＤＮＡ二重らせんと類似の二重構造を形成するアンチセンス分子を設計することができる。Erikson 及び Ixzant 編、遺伝子調節：アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生物学（Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA）、Raven Press, New York (1991)；Helene、Anti-Cancer Drug Design, 6, 569 (1991)；Crooke、Anti-Cancer Drug Design, 6, 609 (1991)。
アンチセンス技術を十分に利用することに対する重大な障害は、標的ｍＲＮＡの翻訳又はＤＮＡの機能を有効に妨げるのに十分な数のアンチセンス分子を細胞内に効率的に導入するという問題である。この問題を克服するのに用いられている１つの方法は、アンチセンスポリ核酸分子の５’又は３’末端を疎水性置換基により共有結合で変性することである。これらの変性核酸は、一般に、一層効率よく細胞内に入り込む。例えば、Boutorin 等、FEBS Lett., 23, 1382-1390 (1989)；Shea 等、Nucleic Acids Res., 18, 3777-3783 (1990) 参照。更に、アンチセンス分子のリン酸塩バックボーンは、負の電荷を除去又は低減させるように変性されており（例えば、Agris 等、Biochemistry, 25, 6268 (1986)；Mol 及び Van der Krol 編、アンチセンス核酸と蛋白質：基礎と応用（Antisense Nucleic Acids and Proteins: Fundamentals and Applications) における Cazenave 及び Helene、４７頁以降、Marcel Dekker, New York (1991) 参照）、又はプリン若しくはピリミジン塩基が変性されている（例えば、Mol 及び Van der Krol 編、アンチセンス核酸と蛋白質：基礎と応用、４７頁以降、Marcel Dekker, New York (1991)；Huber 及び Laso 編、腫瘍疾患の遺伝子治療（Gene Therapy For Neoplastic Diseases）におけるMilligan 等、２８８頁以降、New York Academy of Sciences, New York (1994) 参照）。細胞透過障害を克服する他の方法としては、少ないコピー数で細胞内に挿入されることができるが、細胞内では、細胞機構（cellular machinery）を支配して、より多くの可成りの量のアンチセンスポリ核酸分子を合成することができる発現ベクターにアンチセンスポリ核酸配列を導入することが挙げられる。例えば、Farhood 等、Ann. N.Y. Acad. Sci., 716, 23 (1994) 参照。この方策は、アンチセンス配列が取り込まれた発現部位を有する組み換えウイルスを使用することを含むものである。例えば、Boris-Lawrie 及び Temin、Ann. N.Y. Acad. Sci., 716, 59 (1994) 参照。その他にも、アンチセンス分子又は他の核酸分子の負の電荷をポリカチオンで中和することにより、膜透過性を高めることが試みられている。例えば、Wu 及び Wu、Biochemistry, 27, 887-892 (1988)；Behr 等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, 6982-6986 (1989) 参照。
アンチセンス治療などの遺伝子治療に関しては、細胞からなくなっているか、あるいは更に大量に発現すれば細胞や生体にとって有用である蛋白質の合成を支配することができるＤＮＡベクターを、１つ又はそれ以上の種類の生体に取り込もうとする試みが、医学研究者によってしばしば行われている。ＤＮＡを導入して、細胞が新しい蛋白質又はより多くの蛋白質を生成するようにさせる方法は、“トランスフェクション”法と呼ばれる。一般には、Huber 及び Lazo 編、腫瘍疾患（Neoplastic Diseases）、New York Academy of Science, New York (1994)；Feinger、Adv. Drug Deliv. Rev., 5, 163 (1990)；MacLachlin 等、Progr. Nucl. Acids Rev. Mol. Biol., 38, 91 (1990)；Karlsson、S. Blood, 78, 2481 (1991)；Einerhand 及び Valerio、Curr. Top Microbiol. Immunol., 177, 217-235 (1992)；Makdisi 等、Prog. Liver Dis., 10, 1 (1992)；Litzinger 及び Huang、Biochim. Biophys. Acta., 1113, 201 (1992)；Morsy 等、J.A.M.A., 270, 2338 (1993)；Dorudi 等、British J. Surgery, 80, 566 (1993) 参照。
核酸を細胞に取り込む他の一般的な方法としては、核酸のリン酸カルシウム沈殿及び標的細胞でのインキュベーション（Graham 及び Van der Eb、Virology, 52, 456 (1983)）、核酸、ＤＥＡＥ―デキストラン及び細胞の混合インキュベーション（Sompayrac 及び Danna、Proc. Natl. Acad. Sci., 12, 7575 (1981)）、核酸の存在下における細胞のエレクトロポレーション（Potter 等、Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 7161-7165 (1984)）、核酸をウイルス膜内に取り込んで、トランスフェクション小胞を作る方法（Gitman 等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82, 7309-7313 (1985)）及びリポソームに取り込まれた核酸と共に細胞をインキュベートする方法（Wang 及び Huang、Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7851-7855 (1987)）が挙げられる。遺伝子治療に対する１つのアプローチは、細胞内に導入しようとする遺伝子を、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス又はレトロウイルスなどのウイルスに取り込むことである。例えば、Akli 等、Nature Genetics, 3, 224 (1993) 参照。
【００２９】
本発明の核酸組成物は、例えば、経口、局所、直腸、経鼻、経膣、例えば、エアロゾルの使用による吸引、又は、例えば、筋肉内、皮下、腹腔内、心室内若しくは静脈内などの非経口で投与される。この核酸組成物は、単独で投与されるか、あるいは標準的な医薬慣例に従って、薬理学的に許容されうる担体又は賦形剤と組み合わせられることができる。経口様式の投与では、核酸組成物は、錠剤、カプセル、ロゼンジ、トローチ、粉剤、シロップ、エリキシル、水溶液、懸濁液などの形で用いられる。錠剤の場合、用いられることができる担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム及びリン酸の塩が挙げられる。澱粉などの種々の崩壊剤及びステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルクなどの滑沢剤が、一般に、錠剤に用いられる。カプセル形態での経口投与に関しては、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。経口用に水性懸濁液が必要な場合は、核酸組成物を乳化及び懸濁剤と組み合わせることができる。所望であれば、ある種の甘味剤及び／又は着香剤を添加することができる。非経口投与に関しては、通常、接合体の無菌溶液を調製し、その溶液のｐＨを適当に調整、緩衝する。静脈使用については、溶質の全濃度を調節して、製剤を等張性にしなければならない。目への投与に関しては、塗布具又は点眼瓶などの公知の目搬送系（ocular delivery systems）により、軟膏又は点眼液を供給することができる。このような組成物としては、ヒアルロン酸、硫酸コンドロイチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリビニルアルコールなどのムコミメチック（mucomimetics）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロムなどの防腐剤、並びに通常量の希釈剤及び／又は担体を挙げることができる。肺投与については、エアロゾルを形成させるのに適当なように、希釈剤及び／又は担体を選択することになるであろう。
一般に、核酸組成物は、有効量で投与されるであろう。医薬用途については、有効量は、（１）治療しようとする適応症の症状を軽減するか、あるいは（２）治療しようとする適応症を治療又は予防するのに適切な薬理学的変化をもたらすのに有効な量である。
ウイルス遺伝子治療ベクターに関しては、投与量は、一般に、体重１ｋｇ当たり核酸が約１μｇから約１ｍｇまでであろう。非感染遺伝子治療ベクターについては、投与量は、一般に、体重１ｋｇ当たり核酸が約１μｇから約１００ｍｇまでであろう。アンチセンスオリゴヌクレオチド投与量は、、一般に、体重１ｋｇ当たり核酸が約１μｇから約１００ｍｇであろう。
【００３０】
自己免疫異常
グリシン輸送体に対して抗体が作られる自己免疫異常は、病気の状態と関連していると予想することができる。例えば、ＧｌｙＴ―２輸送体については、このような異常が、筋肉活性の低下、例えば、臨床的には重症筋無力症とよく似た状態を示す筋肉活性の低下と関連しているか、あるいは痛み知覚の低下と関連している予想することができる。神経伝達に含まれる分子（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）に対する自己抗体による病気の例については、Nathan 等、J. Neurosci. Res., 40, 134-137 (1995) 参照。
これらの抗体の存在は、ここに述べた核酸又は他のところで報告されている関連グリシン輸送体から得られる蛋白質配列を用いた、確立された免疫学的方法により、測定することができる。例えば、Kim 等、Mol. Pharmacol., 45, 608-617 (1994) 及び Liu 等、J. Biol. Chem., 268, 22802-22808 (1992) 参照。このような免疫学的方法は、例えば、Ausubel 等、分子生物学における簡単プロトコル（Short Protocols in Molecular Biology）、John Wiley & Sons, New York (1992) に記載されている。
次の実施例は、本発明を更に説明するものであるが、いずれにせよ、その範囲を限定するものと解釈されるべきでないことは勿論のことである。
【実施例】
【００３１】
実施例１Ａ−ＧｌｙＴ―２クローニング
ヒトＧｌｙＴ―２をコードするｃＤＮＡを、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ―ＰＣＲ）により２段階で生成した。第１段階では、ヒト脊髄ポリＡｍＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）からのｃＤＮＡ合成を開始するのに、２５４０から２５２１まで（５’―ＧＧＲＴＣＤＡＴＣＡＴＲＴＴＹＴＴＲＴＡ）のラットＧｌｙＴ―２ヌクレオチド配列に相当する変性プライマーを使用した。ラット配列についてここに列挙されたナンバーリングは、Liu 等、J. Biol. Chem., 268, 22802-22808 (1992) に報告されたナンバーリングによる。次いで、ＰＣＲ反応に下記のプライマー対を使用した。
プライマーＡ１：５’―ＣＣＮＡＡＲＧＡＲＡＴＧＡＡＹＡＡＲＣＣＮＣＣ
（配列番号：３７；ラット配列のＮＴ２２３−２４５に基づく）
プライマーＡ２：５’―ＧＣＮＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＮＣＣ
（配列番号：３８；ラット配列のＮＴ１４９０−１４６８に基づく）
プライマーＢ１：５’―ＣＣＮＡＡＲＧＡＲＡＴＧＡＡＹＡＡＲＣＣＮＣＣ
（配列番号：３９；ラット配列のＮＴ２２３−２４５に基づく；プライマーＡ１と同じプライマー）
プライマーＢ２：５’―ＧＧＣＹＴＣＮＧＧＧＴＡＡＲＣＣＡＣＲＡＡＮＧＣ
（配列番号：４０；ラット配列のＮＴ１８７２−１８４９に基づく）
“Ｒ”の表示は、オリゴヌクレオチド組成物が、示された位置において、アデノシンとグアノシンの混合物を有していることを示し“Ｎ”は、示された位置において、全部で４つの塩基の組み合わせを有する混合オリゴヌクレオチドに関するものであり、“Ｙ”は、シトシンとチミジンの混合物に関するものであり、“Ｋ”は、グアノシンとチミジンの混合物に関するものであり、“Ｄ”は、アデノシン、グアノシン及びチミジンの混合物に関するものである。
Ａ１＋Ａ２プライマー及びＢ１＋Ｂ２プライマーにより生成した断片を、ｐＣＲｓｃｒｉｐｔ（Stratagene, La Jolla, CA）又はｐＣＲ２．１（Invitrogen, San Diego, CA）の中に別々にクローン化し、得られたクローンから、オートリード（AutoRead）配列決定（sequencing）キット（Pgarmacia, Piscataway, NJ）を用いて配列決定された（sequenced）。リップマン―ピアソン（Lipman-Pearson）ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、これらの配列をラットＧｌｙＴ―２と比較したところ、８９％の同一性であることが分かり、これらの配列がヒトＧｌｙＴ―２をコードしていることを確認した。Ａ１＋Ａ２プライマー対は、クローンｐｈＧ２―１を作り、それは、その挿入物として、配列番号：５の核酸配列を有している。Ｂ１＋Ｂ２プライマー対は、クローンｐｈＧ２―２を作り、それは、その挿入物として、配列番号：７の核酸配列を有している。
第２段階については、ランダム６量体（Promega, Madison, WI）を用いて、ヒト脊髄又は小脳ｍＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）からｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ用クローンｐｈＧ２―１及びｐｈＧ２―２の配列に基づいて、更に追加のプライマーを設計した。ヒトＧｌｙＴ―２ｃＤＮＡの５’及び３’末端を増幅するのに、次のプライマー対を用いた。
プライマーＣ１：５’―ＣＧＧＴＴＣＡＡＴＣＴＧＴＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＣＡＴＧ
（配列番号：４１；ラット配列のＮＴ１８１−２１０に基づく）
プライマーＣ２：５’―ＧＣＡＧＧＣＴＣＧＣＧＣＧＴＣＣＧＣＴＧ
（配列番号：４２；ヒト配列のＮＴ２１０−１９１に基づく）
プライマーＤ１：５’―ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＣＧＴＡＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＧ
（配列番号：４３；ヒト配列のＮＴ１２８４−１３１６に基づく）
プライマーＤ２：５’―ＣＣＮＣＣＲＴＧＮＧＴＤＡＴＣＡＴＮＧＧＲＡＡＮＣＣＣ
（配列番号：４４；ラット配列のＮＴ２０８７−２０６１に基づく）
プライマーＥ１：５’―ＣＣＣＧＴＡＴＧＴＣＧＴＡＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＧ
（配列番号：４３；ヒト配列のＮＴ１２８４−１３１６に基づく）
プライマーＥ２：５’―ＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＹＹＡＲＣＡＹＴＧＮＧＴＮＣＣ
（配列番号：４５；ラット配列のＮＴ２６２４−２５９３に基づく）
プライマーＦ１：５’―ＣＡＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＧ
（配列番号：４６；ヒト配列のＮＴ１４１７−１４４６に基づく）
プライマーＦ２：５’―ＧＧＲＴＣＤＡＴＣＡＴＲＴＴＹＴＴＲＴＡＮＣＫＹＴＣＮＣＣ
（配列番号：４７；ラット配列のＮＴ２５４０−２５１２に基づく）
プライマーＧ１：５’―ＣＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧＴＧＣＣＡＣＡＡＧＣ
（配列番号：４８；ヒト配列のＮＴ１５１７−１５３９に基づく）
プライマーＧ２：５’―ＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＴＧＧＡＹＹＡＲＣＡＹＴＧＮＧＴＮＣＣ
（配列番号：４５；ラット配列のＮＴ２６２４−２５９３に基づく）
プライマーＨ１：５’―ＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＡＣＧＣＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＣ
（配列番号：４９；ヒト配列のＮＴ１７８４−１８０８に基づく）
プライマーＨ２：５’―ＧＧＡＴＴＡＡＴＡＣＧＧＧＡＣＣＡＴＣＣＡＣＡＣＴＡＣＴ
（配列番号：５０；ラット配列のＮＴ２６３８−２６１１に基づく）
Ｃ１＋Ｃ２プライマー対は、それらの挿入物として、配列番号１及び３の核酸配列をそれぞれ有するクローンｐｈＧ２―３―ａ及びｐｈＧ２―３―ｂを作った。Ｄ１＋Ｄ２プライマー対は、それらの挿入物として、配列番号１０及び１２の核酸配列をそれぞれ有するクローンｐｈＧ２―４―ａ及びｐｈＧ２―４―ｂを作った。Ｅ１＋Ｅ２プライマー対は、ヌクレオチド１３１７−２３７９を包含すると信じられるクローンを作った。Ｆ１＋Ｆ２プライマー対は、ヌクレオチド１４４７−２２９８を包含すると信じられるクローンを作った。Ｇ１＋Ｇ２プライマー対は、クローンｐｈＧ２―７―ａを作り、それは、その挿入物として、配列番号：１４の核酸配列を有しており、また、クローンｐｈＧ２―７―ｂを作り、それは、その挿入物として、配列番号：１６の核酸配列を有している。Ｈ１＋Ｈ２プライマー対は、それらの挿入物として、配列番号２２及び２４の核酸配列をそれぞれ有するクローンｐｈＧ２―８―ａ及びｐｈＧ２―８―ｂを作った。
ＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１（Invitrogen）の中にクローン化した。図１は、ヒトＧｌｙＴ―２配列全体に関するクローン化されたｃＤＮＡのそれぞれの場所を示す。クローンｐｈＧ２―３及びｐｈＧ２―８ｂは、ヒト小脳ｍＲＮＡから得られ、一方、残りは、脊髄から得られた。ｃＤＮＡ挿入物は、オートリード配列決定キット（Pgarmacia）及びアルフェックスプレス（ALFexpress）TM自動配列決定装置（Pharmacia）を用いて配列決定した。これらの配列は、アミノ酸配列において、１０点の変異を示した。配列番号：１８のヒトＧｌｙＴ―２ＤＮＡ配列をラットＧｌｙＴ―２配列と比較すると、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いて、８９％の核酸同一性及び９４．４％のアミノ酸同一性があることが分かった。
【００３２】
実施例１Ａ−更なるＧｌｙＴ―２クローニング
次のプライマーも使用した。
プライマーＩ１：５’―ＡＧＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＡＧ
（配列番号：５１；ヒト配列のＮＴ２７６−２９５に基づく）
プライマーＩ２：５’―ＧＴＡＣＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＧＴＣＴＴＧ
（配列番号：５２；ヒト配列のＮＴ１２４５−１２６９に基づく）
プライマーＪ１：５’―ＡＧＣＴＣＴＧＣＧＧＧＡＣＴＴＧＡＧＡＧ
（配列番号：５１；ヒト配列のＮＴ２７６−２９５に基づく）
プライマーＪ１：５’―ＣＣＴＴＧＧＴＣＴＧＣＣＡＣＡＴＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＧ
（配列番号：５３；ヒト配列のＮＴ１５９９−１６２５に基づく）
Ｉ１＋Ｉ２プライマー対は、それらの挿入物として、配列番号２９、３１及び３３の核酸配列をそれぞれ有するクローンｐｈＧ２―９―ａ、ｐｈＧ２―９―ｂ及びｐｈＧ２―８―ｃを作った。Ｊ１＋Ｊ２プライマー対は、配列番号：３５の核酸配列を有するクローンｐｈＧ２―１０を作った。
【００３３】
実施例２−全長クローン
次いで、ヒトＧｌｙＴ―２ｃＤＮＡを用いて、全長ヒトＧｌｙＴ―２コーディング配列を作り、それをｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）の中へクローン化した。このクローンは、配列番号：２０の核酸配列を取り込み、ｐＨＧＴ２―ａと表示された。３５４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ―ＮａｒＩ断片を、クローンｐｈＧ２―３から予めＨｉｎｄＩＩＩとＮａｒＩで消化されたクローンｐｈＧ２―１へ挿入することによって、ｃＤＮＡの５’末端を作った。ＨｉｎｄＩＩＩ―ＨｉｎｃＩＩ断片をｐｈＧ２―２から、ＨｉｎｃＩＩ―ＸｂａＩ断片をクローンｐｈＧ２―７から、予めＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化されたｐｃＤＮＡ３ベクターへ挿入することによって、ｃＤＮＡの３’末端を作った。最後に、５’末端クローンからのＨｉｎｄＩＩＩ―ＮｒｕＩ断片及び３’末端クローンからのＮｒｕＩ―ＸｂａＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩで消化されたｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）の中へクローン化した。このようにして得られたｐＨＧＴ２―ａ発現クローンは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で、１から２３９７までのヒトＧｌｙＴ―２の配列を含んでいる。この発現クローンにおいては、ｎｔｓ１−１７３がクローンｐｈＧ２―３から誘導され、ｎｔｓ１７４−８２３がクローンｐｈＧ２―１から誘導され、ｎｔｓ８２４−１５９９がクローンｐｈＧ２―２から誘導され、ｎｔｓ１６００−２３９７がクローンｐｈＧ２―７から誘導された（図２参照）。
【００３４】
実施例３Ａ−第二の全長クローン
配列番号：１８の核酸配列を含む発現クローンは、ＮＴ３０４をＧからＡへ変え、ＮＴ３７１をＴからＣへ変え、ＮＴ８３６をＡからＴへ変え、ＮＴ１１１６をＧからＡへ変え、ＮＴ１８３１をＧからＡへ変え、ＮＴ２３８２をＴからＣへ変え、ＮＴ２３８８をＡからＧへ変え、ＮＴ２３９１をＴからＣへ変え、ＮＴ２３９４をＡからＧへ変える特定部位の突然変異誘発により、配列番号：２０を含む発現クローンから作られる。突然変異誘発は、Ausubel 等、分子生物学における現代のプロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、pp. 8.1.1-8.1.6., John Wiley and Sons, New York (1995) により記載されているオリゴヌクレオチド指向方法論（oligonucleotide-directed methodology）によって行われる。
実施例３Ｂ−第三の全長クローン
ヒトＧｌｙＴ―２ｃＤＮＡを用いて、他の全長ヒトＧｌｙＴ―２コーディング配列を作り、それをｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）の中へクローン化した。ｐＨＧＴ２―ｂで表されるクローンが、配列番号：２８の核酸配列を取り込み、配列番号：２７をコードした。まず、ｐｈＧ２―３ａ（配列番号：１）からの２５４ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ―ＮａｒＩ断片を、予め、ＨｉｎｄＩＩＩ―ＮａｒＩで消化したクローンｐｈＧ２―２（配列番号：７）へ挿入して、中間体１を作った。中間体１からの１．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ―ＨｉｎｃＩＩ断片及びクローンｐｈＧ２―７ｂからの８００ｂｐのＨｉｎｃＩＩ―ＸｂａＩ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩで消化しておいたｐｃＤＮＡ内に結合して、中間体２を作った。
中間体２からのＮｄｅＩ―ＭｓｃＩ断片（１ｋｂ）及びＢｓｍＩ―ＮｄｅＩ断片（６．９ｋｂ、ｐｃＤＮＡ３含有）を、ｐｈＧ２―１（配列番号：５）からの４３４ｂｐのＭｓｃＩ―ＢｓｍＩ断片に結合して、中間体３を作った。中間体３からの３．８ｋｂのＢｓｓＨＩＩ断片をクローンｐＨＧＴ２―ａ（実施例２参照）の４．０ｋｐのＢｓｓＨＩＩ断片に結合して、ｐＨＧＴ２―ｂを作った。ｐＨＧＴ２―ｂにおいては、ｎｔｓ１−１７３がクローンｐｈＧ２―３ａ（配列番号：１）から誘導され、ｎｔｓ１７４−５２３及び９６２−１５９９がクローンｐｈＧ２―２（配列番号：７）から誘導され、ｎｔｓ５２４−９６１がクローンｐｈＧ２―１（配列番号：５）から誘導され、ｎｔｓ１６００−２３９７がクローンｐｈＧ２―７ｂ（配列番号：１６）から誘導された。
【００３５】
実施例４−ＧｌｙＴ―２発現
実施例２及び３Ｂのクローンを、実施例５に述べる方法を用いて、ＱＴ―６細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、受付番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ―１７０８から）内にトランスフェクトした。実施例６に述べるグリシン輸送体測定法を用いて、グリシン輸送活性が、トランスフェクションによりこの細胞へ与えられたことを確認した。
【００３６】
実施例５−トランスフェクション
この実施例は、ＱＴ―６細胞を成長及びトランスフェクトさせる方法並びに材料を述べるものであり、その細胞は、ウズラ由来の鳥線維芽細胞である。ｐＨＧＴ２―ａによるトランスフェクションを、ＧｌｙＴ―１ベクターによるトランスフェクションと同様にして行った。なお、この後者のトランスフェクションは、別の時点で行った。
ＱＴ―６細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（受付番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ―１７０８）から入手した。ＱＴ―６を成長させるための完全ＱＴ―６培地は、培地１９９（Sigma Chemical Company, St. Louis, MO、以下、“Sigma”という）であり、１０％リン酸トリプトース（tryptose phosphate）、５％ウシ胎児血清（Sigma）、１％ペニシリン―ストレプトマイシン（Sigma）及び１％無菌ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Sigma）を含有している。ＱＴ―６細胞を成長又はトランスフェクトさせるのに必要な他の溶液としては、次のものが挙げられる。
ＤＮＡ／ＤＥＡＥ混合物：ＴＢＳ４５０μｌ、ＤＥＡＥデキストラン（Sigma）４５０μｌ、ＤＮＡ（４μｇ）のＴＥ溶液１００μｌ、ここで、ＤＮＡは、適当な発現ベクター中に、ＤＮＡをコードするＧｌｙＴ―１ａ、ＧｌｙＴ―１ｂ、ＧｌｙＴ―１ｃ又はＧｌｙＴ―２を含んでいた。使用されるＤＮＡは、次に定義される通りである。
ＰＢＳ：標準リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４、１ｍＭＣａＣｌ2及び１ｍＭＭｇＣｌ2含有、０．２μｍフィルターで滅菌。
ＴＢＳ：溶液Ｂ１ｍｌ、溶液Ａ１０ｍｌ；蒸留水で１００ｍｌとする；濾過滅菌して４℃で保存。
ＴＥ：０．０１Ｍのトリス、０．００１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０。
ＤＥＡＥデキストラン：Sigma、＃Ｃ―９８８５。ＤＥＡＥデキストランの１％（１ｍｇ／ｍｌ）ＴＢＳ溶液からなる原液を調製した。この原液を濾過滅菌して、１ｍｌずつ凍結した。
クロロキン：Sigma、＃Ｃ―６６２８。１００ｍＭクロロキン水溶液からなる原液を調製した。この原液を濾過滅菌して、０．５ｍｌずつ凍結して保存した。
溶液Ａ（１０×）
ＮａＣｌ          ８．００ｇ
ＫＣｌ            ０．３８ｇ
Ｎａ2ＨＰＯ4      ０．２０ｇ
トリス塩基        ３．００ｇ
この溶液をＨＣｌでｐＨ７．５に調整し、蒸留水で１００．０ｍｌとし、濾過滅菌して、室温で保存した。
溶液Ｂ（１００×）
ＣａＣｌ2―２Ｈ2Ｏ        １．５ｇ
ＭｇＣｌ2―６Ｈ2Ｏ        １．０ｇ
この溶液を蒸留水で１００ｍｌとして、濾過滅菌した；次いで、この溶液を室温で保存した。
ＨＢＳＳ：１５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＣａＣｌ2、１０ｍＭグルコース、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ2―Ｈ2Ｏ；ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整。
使用した成長及び継代（passaging）方法は、次の通りであった。細胞は、２２５ｍｌのフラスコ内で成長させた。継代については、細胞を温ＨＢＳＳで２度洗浄した（各洗浄５ｍｌずつ）。２ｍｌの０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を加え、培養液をかき混ぜ、次いで、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を速やかに吸引した。次いで、培養液を約２分間（細胞が持ち上がる（lift offする）まで）インキュベートし、その後、１０ｍｌのＱＴ―６培地を加え、フラスコをかき混ぜ、その底をこつこつ叩くことにより、細胞を更に取り外した。その細胞を取り除き、１５ｍｌの三角チューブに移し、１０００×ｇで１０分間遠心分離して、１０ｍｌのＱＴ―６培地に再懸濁させた。計数のためにサンプルを取り除き、次いで、ＱＴ―６培地を用いて、細胞を更に１×１０５個／ｍｌの濃度に希釈し、継代細胞（passaged cells）の２２５ｍｌフラスコ当たり６５ｍｌの培養液を加えた。
次のようにして調製したｃＤＮＡを用いて、トランスフェクションを行った。
ヒトＧｌｙＴ―２発現に関しては、上に述べたｐＨＧＴ２―ａクローンを用いた。
ヒトＧｌｙＴ―１ａ（ｈＧｌｙＴ―１ａ）クローンは、Kim 等、Mol. Pharmacol., 45, 608-617 (1994) に記載されたようなＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ断片として、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター（Invitrogen, San Diego, CA）中にクローン化されたヌクレオチド位置１８３〜２１０８のｈＧｌｙＴ―１ａの配列を含んでいた。この Kim 等の論文に報告されているＧｌｙＴ―１ａ配列の最初の１７個のヌクレオチド（最初の６個のアミノ酸に対応する）は、実際には、ラット配列に基づくものである。ヒトＧｌｙＴ―１ａの配列がこの領域で異なっているかどうかを求めるために、ヌクレオチド１から２１２までのｈＧｌｙＴ―１ａの５’領域を、Gibco BRL (Gaithersburg, MD) により供給されている５’ＲＡＣＥ方法を用いて、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（rapid amplification）により得た。ＧｌｙＴ―１ａのこの５’領域の配列決定から、コーディング配列の最初の１７個のヌクレオチドが、ヒト及びラットＧｌｙＴ―１ａにおいて同一であることが確認された。
ヒトＧｌｙＴ―１ｂ（ｈＧｌｙＴ―１ｂ）クローンは、Kim 等、上記に記載されたようなＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ断片として、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター中にクローン化されたヌクレオチド位置２１３〜２２７４のｈＧｌｙＴ―１ｂの配列を含んでいた。
ヒトＧｌｙＴ―１ｃ（ｈＧｌｙＴ―１ｃ）クローンは、Kim 等、上記に記載されたようなＨｉｎｄＩＩＩ―ＸｂａＩ断片として、ｐＲｃ／ＣＭＶベクター（Invitrogen）中にクローン化されたヌクレオチド位置２１３〜２３３６のｈＧｌｙＴ―１ｃの配列を含んでいた。このクローンからのｈＧｌｙＴ―１ｃのＨｉｎｄＩＩＩ―Ｘｂａ断片が、ｐＲｃ／ＲＳＶベクター中に更にクローン化された。ｐＲｃ／ＲＳＶ及びｐＲｃ／ＣＭＶ発現ベクターの両者中で、ＧｌｙＴ―１ｃによりトランスフェクション実験をおこなった。
トランスフェクションには、下記の４日法を用いた。
１日目は、１００ｍｍの皿の中に、完全ＱＴ―６培地１０ｍｌ当たり１×１０6個の細胞密度で、ＱＴ―６細胞をプレートした。
２日目は、培地を吸引し、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで１０ｍｌのＴＢＳで洗浄した。ＴＢＳを吸引し、次いで、１ｍｌのＤＥＡＥ／ＤＮＡ混合物をプレートへ添加した。このプレートをフード内で５分毎にかき混ぜた。３０分後、８０μＭクロロキンのＱＴ―６培地液８ｍｌを加え、培養液を３７℃、５％ＣＯ2で２．５時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、細胞を完全ＱＴ―６培地で２回洗浄し、その後、１００ｍｌの完全ＱＴ―６培地を加えて、細胞をインキュベーターへ戻した。
３日目は、上述のように、トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を除去し、９６ウエルの測定プレートのウエル内に、約２×１０5細胞／ウエルでプレートした。
４日目に、実施例６で述べるようにしてグリシン輸送体を測定した。
【００３７】
実施例６−グリシン取り込み
この実施例は、トランスフェクトされた培養細胞によるグリシン取り込みを測定する方法を説明するものである。
実施例５に従って成長させた一過性のＧｌｙＴでトランスフェクトされた細胞又は対照細胞を、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ）で３回洗浄した。トランスフェクション操作で、ｃＤＮＡを省略したこと以外は、ＧｌｙＴでトランスフェクトされた細胞と厳密に同様にして、対照細胞を処理した。この細胞を、３７℃で１０分間インキュベートし、その後、５０ｎＭ［3Ｈ］グリシン（１７．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び（ａ）非潜在的拮抗剤（no potential competitor）、（ｂ）１０ｍＭ非放射性グリシン又は（ｃ）ある濃度の予期される剤（prospective agent）を含む溶液を添加した。予期される剤（prospective agent）の濃度範囲は、５０％の効果（例えば、グリシン取り込みを５０％だけ抑制する剤の濃度であるＩＣ50）となる濃度を計算するためのデータを作るのに用いられる。次いで、細胞を３７℃で更に２０分間インキュベートし、その後、細胞を氷冷ＨＢＳで３回洗浄した。この細胞に閃光体（scintillant）を加え、この細胞を３０分間振とうし、シンチレーヨンカウンターをもちいて、細胞中の放射能を計数した。予期される剤（prospective agent）と接触した細胞と接触しなかった細胞との間でデータを比較し、用いられる測定法に応じて、適切なところで、ＧｌｙＴ―１活性を有する細胞をＧｌｙＴ―２活性を有する細胞と対比して、データを比較した。
ヒトＧｌｙＴ―２クローン、ｐＨＧＴ２―ａ、でトランスフェクトされたＱＴ―６細胞におけるグリシン輸送体活性の発現を図５に示し、ここでは、［3Ｈ］グリシン取り込みを、模擬（mock）とｐＨＧＴ２―ａでトランスフェクトされた細胞とについて示す。ｐＨＧＴ２―ａでトランスフェクトされたＱＴ―６細胞は、模擬トランスフェクトされた対照細胞に比較して、グリシン輸送に顕著な増加を示す。結果は、３回行われた代表的な実験の平均値±ＳＥＭとして示されている。ｐＨＧＴ２―ｂと実質的に同様な結果が得られた。
ｐＨＧＴ２―ａでトランスフェクトされた細胞におけるグリシン輸送の濃度依存性を、図６に示す。ｐＨＧＴ２―ｂと実質的に同様な結果が得られた。ヒトＧｌｙＴ―２でトランスフェクトされたＱＴ―６細胞を、５０ｎＭ［3Ｈ］グリシン及び表示濃度の非標識グリシンで２０分間インキュベートし、細胞に取り込まれた放射能をシンチレーション計数によって求めた。データポイントは、４回行われた実験からの平均値±ＳＥＭを示すものである。結果は、４０μＭのＩＣ50を示した。
【００３８】
実施例７−カルシウムフラックス
この実施例は、細胞内でのカルシウムフラックスを測定するプロトコルを説明するものである。
カルシウムフラックス測定は、無菌解離器具（dissecting equipment）、顕微鏡及び特定の培地を必要とする操作及び技術を用いて調製した一次細胞培養液において、一般に行った。用いたプロトコルは、わずかな変更はあるが、Lu 等、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 88, 6289-6292 (1991) によって記載されたものと実質的に同じであった。
実施例８−ストリキニン感受性受容体への結合
ストリキニン感受性受容体へのストリキニンの結合は、White 等、J. Neurochem, 35, 503-512 (1989) 及び Becker 等、J. Neurosci., 6, 1358-1364 に記載されているようにして、これにわずかな変更を加えて測定した。
配列番号によってここに表される核酸（Ｎ．Ａ．）又はアミノ酸配列は、以下に示す通りである。
要約すると、配列リスチング（Sequence Listing）の配列は、次の通りである。
【００３９】
【表４Ａ】
2008281545.tif 000010
【表４Ｂ】
2008281545.tif 000011
【００４０】
**  配列番号：２８は、若干のコドン使用の違いはあるが、配列番号：２６と同じ蛋白質をコードする。
ここに述べた核酸配列、及びその結果、それらから誘導された蛋白質配列を注意深く配列決定した。しかし、核酸配列決定技術が多少の誤差を受けやすいことは、当業者の認めるところであろう。当業者は、当の核酸配列を単離する方法のここでの十分な記載に基づいて、これらの配列を確認し、補正することができ、本開示によって容易に利用できるような変更は、本発明に含まれるものである。更に、後からの明確化研究によって配列決定の誤りが確認されようがされまいが、ここに報告されたこれらの配列は、本発明内のものである。
本発明は、好ましい実施態様を強調して説明しているが、好ましい装置及び方法を変更したものを用いてもよいこと、及びここで特定的に記載されているのとは別のようにして本発明を実施しようとすることは、当業者にとって自明であろう。従って、本発明は、次の実施態様によって限定されている本発明の精神及び範囲内に包含される全ての変更を含むものである。
【００４１】
本発明の実施態様として次のものが挙げられる。
１．配列番号：２７の蛋白質配列である基準配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列と、少なくとも約９６％の配列同一性を有するグリシン輸送体をコードする組み換え核酸。
２．基準配列が、配列番号：２７の蛋白質配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、若しくは（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列である上記１の核酸。
３．該配列同一性が、少なくとも約９７％である上記１の核酸。
４．該配列同一性が、少なくとも約９８％である上記１の核酸。
５．核酸が、基準配列を有するグリシン輸送体をコードする上記１の核酸。
６．配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列を含む上記１の核酸。
７．配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、若しくは（ｎ）Ａ2203をＧへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列を含む上記１の核酸。
８．上記１の核酸及び機能的にこれと関連する外因性プロモーターを含むベクター。
９．基準アミノ酸配列の全て若しくは１〜２の近接部分と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するグリシン輸送体蛋白質をコードする核酸において、その基準配列が、配列番号：２７のアミノ酸配列、又は次のアミノ酸置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列である核酸。
１０．１〜２の近接配列部分が、少なくとも約６００のアミノ酸からなる上記９の核酸。
１１．下記の細胞：
（ａ）上記８による第一のベクターで形質転換され、該核酸を含むか、又は
（ｂ）第二のベクターで形質転換され、配列番号：２７である基準蛋白質配列、若しくは次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列に相当する配列の１〜２の近接部分と、少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する輸送体蛋白質をコードする第二の核酸を含み、ここで、コードされた蛋白質は、グリシン輸送体活性を有している。
１２．上記１１の細胞を成長させることからなるグリシン輸送体の製造方法。
１３．（ａ）グリシン輸送体を含む膜を該細胞から単離すること、又は（ｂ）グリシン輸送体を含む蛋白質画分を該細胞から抽出することの少なくとも１つを更に含む上記１２の方法。
１４．上記１１による細胞から単離され、第一又は第二の外因的に誘導された核酸により発現されたグリシン輸送体。
１５．神経系障害若しくは状態の治療用生理活性剤を確認又は同定する方法において、（ａ）（ｉ）上記１０による細胞、又は（ｉｉ）該第一又は第二の外因的に誘導された核酸によりコードされたアミノ酸配列からなる単離グリシン輸送体蛋白質を含む第一の測定組成物を与え、（ｂ）その第一の測定組成物を生理活性剤又は予期される（prospective）生理活性剤と接触させ、その測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を測定することからなる方法。
１６．第一の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を、生理活性剤又は期待される生理活性剤と接触させないこと以外は、第一の測定組成物と同じに処理された第二の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量と比較することを更に含む上記１５の方法。
１７．は、神経系障害又は状態が、（ａ）痛み、（ｂ）痙性、（ｃ）ミオクロヌス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進又は（ｆ）てんかんからなる群の１つである上記１５の方法。
１８．痙性が、発作、頭部外傷、神経細胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症である上記１７の方法。
１９．（ａ）ラット若しくはマウスＧｌｙＴ―２輸送体のための配列又は（ｂ）哺乳類ＧｌｙＴ―１輸送体のための配列とのハイブリダイゼーションを排除するのに十分なストリンジェンシー（stringency）の条件下で、配列番号：２６である基準核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列と交雑する核酸。
２０．この核酸は、ＰＣＲプライマーであり、ストリンジェント（stringent）条件は、ヒトＧｌｙＴ―２配列を増幅するのには有効であるが、（ａ）ラット若しくはマウスＧｌｙＴ―２輸送体のための配列又は（ｂ）哺乳類ＧｌｙＴ―１輸送体のための配列を増幅するには有効でないＰＣＲ条件である上記１９の核酸配列。
２１．ヒトＧｌｙＴ―２遺伝子又はｃＤＮＡのコーディング又は非コーディングストランドからの近接配列を含む、長さが少なくとも約１８個のヌクレオチドの核酸であり、ここで、この近接配列は、この近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも１つの配列相違を有しているものである核酸。
２２．細胞、組織、器官又は動物に投与した場合、その細胞又はその組織、器官若しくは動物の細胞内でのＧｌｙＴ―２の発現を低下させるのに有効なＧｌｙＴ―２のためのヒト遺伝子又はｃＤＮＡのコーディング又は非コーディングストランドからの近接配列を含むアンチセンス分子であり、ここで、この近接配列は、該近接配列と並べたラットＧｌｙＴ―２遺伝子配列と比較した場合、少なくとも１つの配列相違を有しているアンチセンス分子。
２３．配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列のコーディング又は非コーディングストランド内に、近接伸長（contiguous stretch）が含まれている上記２２のアンチセンス分子。
２４．上記２２の核酸を含む発現ベクター。
２５．（ａ）ＧｌｙＴ―２発現低減有効量の上記２２の核酸、又は（ｂ）ＧｌｙＴ―２発現低減有効量の、該組織又は細胞内で該核酸を発現させる発現ベクターを、組織又は細胞に適用することからなる、組織又は細胞内でのＧｌｙＴ―２発現を低減させる方法。
２６．ヒトの患者の組織又は細胞に、神経系障害若しくは状態治療有効量の上記２２の核酸、又は神経系障害若しくは状態治療有効量の、該組織又は細胞内で該核酸を発現させる発現ベクターを適用することからなる、神経系障害又は状態を治療する方法。
２７．動物がグリシン輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法であり、動物からの抗体試料又は動物からの体液を、グリシン輸送体を含むかあるいはグリシン輸送体から誘導されるポリペプチド抗原と接触させることからなる方法。
【００４２】
本発明の更なる実施態様として次のものが挙げられる。
１．配列番号：２７の蛋白質配列である基準配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列と同一の配列と、少なくとも９６％の配列同一性を有するグリシン輸送体をコードする組み換え核酸。
２．配列番号：２７の蛋白質配列である基準配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、若しくは（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列と同一の配列である上記１の核酸。
３．該配列同一性が、少なくとも９７％である上記１の核酸。
４．該配列同一性が、少なくとも９８％である上記１の核酸。
５．核酸が、配列番号：２７の蛋白質配列である基準配列、又は次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列と同一の配列を有するグリシン輸送体をコードする上記１、２、３または４の核酸。
６．配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列を含む上記１、２、３、４または５の核酸。
７．配列番号：２６の核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、若しくは（ｎ）Ａ2203をＧへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列を含む上記１、２、３、４または５の核酸。
８．上記１、２、３、４、５、６または７の核酸及び機能的にこれと関連する外因性プロモーターを含むベクター。
９．基準アミノ酸配列の全て若しくは基準アミノ酸配列中の連続した少なくとも６００のアミノ酸からなる配列部分と、少なくとも９９．５％の配列同一性を有するグリシン輸送体蛋白質をコードする核酸において、その基準配列が、配列番号：２７のアミノ酸配列、又は次のアミノ酸置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列である核酸。
１０．下記の細胞：
（ａ）上記８による第一のベクターで形質転換され、該核酸を含むか、又は
（ｂ）第二のベクターで形質転換され、配列番号：２７である基準蛋白質配列、若しくは次の置換、即ち（１）Ｇｌｙ102をＳｅｒへ、（２）Ｓｅｒ124をＰｈｅへ、（３）Ｉｌｅ279をＡｓｎへ、（４）Ａｒｇ393をＧｌｙへ、（５）Ｌｙｓ457をＡｓｎへ、（６）Ａｓｐ463をＡｓｎへ、（７）Ｃｙｓ610をＴｙｒへ、（８）Ｉｌｅ611をＶａｌへ、（９）Ｐｈｅ733をＳｅｒへ、（１０）Ｉｌｅ735をＶａｌへ、（１１）Ｐｈｅ245をＬｅｕへ、（１２）Ｖａｌ305をＬｅｕへ、（１３）Ｔｈｒ366をＩｌｅへ、若しくは（１４）Ｌｅｕ400をＰｒｏへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることを除いて、配列番号：２７の蛋白質配列と同一の配列のアミノ酸配列中の連続した少なくとも６００のアミノ酸からなる配列部分と、少なくとも９９．５％の配列同一性を有する輸送体蛋白質をコードする第二の核酸を含み、ここで、コードされた蛋白質は、グリシン輸送体活性を有している。
１１．上記１０の細胞を成長させることからなるグリシン輸送体の製造方法。
１２．（ａ）グリシン輸送体を含む膜を該細胞から単離すること、又は（ｂ）グリシン輸送体を含む蛋白質画分を該細胞から抽出することの少なくとも１つを更に含む上記１１の方法。
１３．上記１０による細胞から単離され、第一又は第二のベクターにより発現されたグリシン輸送体。
１４．神経系障害若しくは状態の治療用生理活性剤を確認又は同定する方法において、（ａ）（ｉ）上記１０による細胞、又は（ｉｉ）該第一又は第二の外因的に誘導された核酸によりコードされたアミノ酸配列からなる単離グリシン輸送体蛋白質を含む第一の測定組成物を提供し、（ｂ）その第一の測定組成物を生理活性剤又は予期される（prospective）生理活性剤と接触させ、（ｃ）その測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を測定することからなる方法。
１５．第一の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量を、生理活性剤又は期待される生理活性剤と接触させないこと以外は、第一の測定組成物と同じに処理された第二の測定組成物によって示されたグリシン輸送の量と比較することを更に含む上記１４の方法。
１６．神経系障害又は状態が、（ａ）痛み、（ｂ）痙性、（ｃ）ミオクロヌス、（ｄ）筋痙攣、（ｅ）筋機能亢進又は（ｆ）てんかんからなる群の１つである上記１４または１５の方法。
１７．痙性が、発作、頭部外傷、神経細胞死、多発性硬化症、脊髄損傷、失調症、ハンチントン病又は筋萎縮性側索硬化症である上記１６の方法。
１８．配列番号：２６である基準核酸配列、又は次の置換、即ち（ａ）Ｔ6をＣへ、（ｂ）Ｇ304をＡへ、（ｃ）Ｃ371をＴへ、（ｄ）Ｃ571をＴへ、（ｅ）Ｔ836をＡへ、（ｆ）Ａ1116をＧへ、（ｇ）Ａ1117をＧへ、（ｈ）Ｇ1371をＣへ、（ｉ）Ｇ1387をＡへ、（ｊ）Ｇ1829をＡへ、（ｋ）Ａ1831をＧへ、（ｌ）Ｇ2103をＡへ、（ｍ）Ｔ2198をＣへ、（ｎ）Ａ2203をＧへ、（ｏ）Ｃ342をＧへ、（ｐ）Ｃ352をＴへ、（ｑ）Ｔ733をＣへ、（ｒ）Ａ777をＧへ、（ｓ）Ｇ913をＣへ、（ｔ）Ｇ951をＡへ、（ｕ）Ｃ1097をＴへ、若しくは（ｖ）Ｔ1199をＣへ置換することの１つ若しくはそれ以上が行われていることで、配列番号：２６の核酸配列と異なっている配列とハイブリダイズする、配列番号：４２，４３，４６，４８，４９，５１〜５３のいずれか１つのＰＣＲプライマーである核酸。
１９．動物がヒトグリシンＴ−２輸送体に対する自己免疫抗体を持っているかどうかを検出する方法であり、動物からの抗体試料又は動物からの体液を、ヒトグリシンＴ−２輸送体を含むかあるいは該グリシン輸送体から誘導されるポリペプチド抗原と接触させることからなる方法。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ヒトＧｌｙＴ―２遺伝子のいくつかの遺伝子断片の配列を示す。
【図２】配列番号：２０の核酸配列を取り込むクローン、ヒトＧｌｙＴ―２遺伝子の全長クローン、を作るのにどの断片クローンを用いたかを説明するものである。
【図３Ａ】配列番号：１８の核酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図３Ｂ】配列番号：１８の核酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図３Ｃ】配列番号：１８の核酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図３Ｄ】配列番号：１８の核酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図３Ｅ】配列番号：１８の核酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図４Ａ】配列番号：１９のアミノ酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図４Ｂ】配列番号：１９のアミノ酸配列とラットＧｌｙＴ―２配列との比較を示す。
【図５】ヒトＧｌｙＴ―２発現ベクターでトランスフェクトされるか、あるいは模擬トランスフェクトされたＱＴ―６細胞内でのグリシン輸送体の測定を示す。
【図６】ヒトＧｌｙＴ―２でトランスフェクトされたＱＴ―６細胞内でのグリシン輸送体の濃度依存性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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