(57)【要約】      （修正有）【課題】凍結保存成分を洗い流すことを必要とすることなく、保存された細胞の使用を可能にする創傷修復のための培養された上皮および間葉細胞を含む移植可能組織および該組織の保存方法。【解決手段】細胞外相によって取り囲まれた培養された哺乳動物上皮または間葉細胞を含み、該細胞外相が凍結保護量の単糖または二糖を含有する移植可能な組織および該組織の保存方法。該組織は、創傷床に対して組織を適用する前に組織から洗浄する必要のある量の物質を含まず、創傷治癒の妨げになる量の外因性物質、ジメチルスルホキシド、ポリビニルピロリドン、グリセロールおよび非ヒト血清アルブミンを含まない。該組織は、特に、凍結乾燥されたシートであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植可能な組織であって、 細胞外相によって取り囲まれた培養された哺乳動物上皮または間葉細胞を含み、該細胞外相が凍結保護量の単糖または二糖を含有する上記組織。
【請求項２】
細胞外相が、創傷床に対して組織を適用する前に組織から洗浄する必要のある量の物質を含まない請求項１に記載の組織。
【請求項３】
細胞外相が、創傷床に対して適用された場合に創傷治癒の妨げになる量の外因性物質を含まない請求項１に記載の組織。
【請求項４】
細胞外相が、ジメチルスルホキシド、ポリビニルピロリドン、グリセロールおよび非ヒト血清アルブミンを含まない請求項１に記載の組織。
【請求項５】
細胞が培養上皮細胞のシートである請求項２に記載の組織。
【請求項６】
前記単糖または二糖がグルコースである請求項２に記載の組織。
【請求項７】
組織が凍結された請求項２に記載の組織。
【請求項８】
組織が凍結乾燥された請求項１に記載の組織。
【請求項９】
組織が凍結乾燥された請求項２〜６のいずれかに記載の組織。
【請求項１０】
組織が乾燥された請求項１に記載の組織。
【請求項１１】
組織が乾燥された請求項２〜６のいずれかに記載の組織。
【請求項１２】
組織が前記単糖または前記二糖を含有する最小量の溶液中で凍結された請求項１に記載の組織。
【請求項１３】
組織が前記単糖または前記二糖を含有する最小量の溶液中で凍結された請求項２〜６のいずれかに記載の組織。
【請求項１４】
凍結保存された創傷修復用組織であって、−２０℃〜−７０℃で３か月間貯蔵され且つ患者の創傷表面に適用された後に、患者の創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的および機能的特性を維持している、凍結された培養哺乳動物上皮または間葉細胞を含む上記組織。
【請求項１５】
細胞が、密集した培養上皮細胞のシートである請求項１４に記載の組織。
【請求項１６】
組織が最小量の溶液中で凍結された請求項１４に記載の組織。
【請求項１７】
保存された創傷修復用組織であって、乾燥状態で貯蔵され且つ患者の創傷表面に対して適用された後に、患者の創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的および機能的特性を維持している、乾燥した培養哺乳動物上皮または間葉細胞を含む上記組織。
【請求項１８】
細胞が、密集した培養上皮細胞のシートである請求項１７に記載の組織。
【請求項１９】
培養された哺乳動物上皮または間葉細胞を保存する方法であって、前記細胞を、凍結保護量の単糖または二糖を含有する溶液中でインキュベートし、過剰の溶液を該細胞から除去して最小量にした後、前記最小量の溶液中、該凍結保護量の単糖または二糖の存在下に該細胞を凍結させるか、乾燥させるか、または凍結乾燥させることによって、細胞を保存することを含む上記方法。
【請求項２０】
前記溶液が、創傷床に対して適用された場合に創傷治癒の妨げになる量の外因性物質および創傷床に対して細胞を適用する前に細胞から洗浄する必要がある量の物質を含まない請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞を凍結させる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細胞を凍結乾燥させる請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を乾燥させる請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
過剰の溶液を吸引することによってまたは過剰液を排出することによって除去する請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
細胞を、約０．０５Ｍ〜３．５Ｍグルコースを含有する溶液中でインキュベートする請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液が、ヒト血清アルブミン０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌを更に含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
溶液が、ジメチルスルホキシド、ポリビニルピロリドンおよびグリセロールを含まない請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、培養上皮細胞のシートである請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１９に記載の方法によって製造された、保存された創傷修復用組織。
【請求項３０】
請求項２０〜２８のいずれかに記載の方法によって製造された、保存された創傷修復用組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養された上皮細胞のシートおよびそれらに由来する関連生産物を凍結保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞技術の主な業績は、貴重な材料の長期貯蔵が向上することから、生きた細胞および組織の凍結保存に最適な条件の確立にある。凍結保存により、（ｉ）単離組織の限られた貯蔵寿命および（ii）研究および臨床的用途のための細胞源としての組織の限られた利用可能性のような生体材料の取扱いに関係した固有の技術的または実際的問題は減少しまたは回避される。この見地から、生きた細胞および組織の保存プロトコルの開発は、移植しやすい組織に対して極めて重要となった。
【０００３】
凍結の際に細胞の損傷を防止するグリセロールの成功した使用を報告した凍結保存についての初期の研究（ポルジ（Polge）ら、1949年，Nature 164:666）後、細胞および組織の構造、生存能力および代謝を保存するいくつかの方法が試みられてきた。細胞および組織を保存する方法には、特別な等張緩衝液；特別な融解計画；凍結保護物質の使用；および緩慢、急速または超高速凍結を含む方法；
【０００４】
生きた試料の取扱いによる他には避けられない破壊を防止するための全てが含まれる。概して、凍結法を用いる場合、氷生成は、電解質濃度およびｐＨの変化、脱水並びに不明の他の因子によって達成されるので、組織損傷の原因になる主要因子は相変化（液体−結晶質固体水）である。これらの有害な作用は、凍結保護物質の添加によっておよび注意深く制御された凍結プロトコルによって減少した。
【０００５】
凍結保護物質は２種類に分かれる。一つの種類は、細胞膜を透過し且つ細胞内水分濃度を減少させることによって作用する（例えば、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、並びにマンノース、キシロース、グルコース、リボースおよびフルクトースなどの単糖）。
【０００６】
もう一つは非透過性物質であり、その作用機序は明らかでない。一般的に用いられる非透過性凍結保護物質には、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、二糖（スクロースなど）および糖アルコール（マンニトールなどのポリアルコール）が含まれる。最近になって、透過性および非透過性物質両方を組合わせる凍結プロトコルが開発された。
【０００７】
単離された細胞の凍結は、優先的に存在する凍結保護物質であるグリセロールおよびＤＭＳＯを用いて常套手段になっている（コリール（Coriell），L.L.，1979年，Methods in Enzymology LVIII,29-36頁；ドイル（Doyle）ら、1994年，Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures．ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（J.Wiley & Sons），4C:1.1-4C:2.4）。動物の胚もまた、グリセロールの存在下でうまく保存された（ホイッティンガム（Whittingham）ら、1972年，Science 178:411-414；ニーマン（Niemann）ら、1993年，Mol.Reprod.Develop.36:232-235）。
【０００８】
また一方では、乾燥および凍結乾燥が、生きた哺乳動物細胞または組織以外の生物材料を保存するのに用いられ場合にだけ優れた結果を与えた。例えば、凍結乾燥は、タンパク質、タンパク質混合物および細菌に対して現在広く用いられているが；しかしながら、哺乳動物細胞および組織の凍結乾燥の最初の試みは不成功であった（グリーブズ（Greaves），R.I.N.、1960年，Ann.N.Y.Acad.Sci.85:723-728）。
【０００９】
生きた生物が完全な脱水（脱水仮死）（クロウ（Crowe）およびマディン（Madin）、1975年，J.Exp.Zool.193:323-334；ウォマースリー（Womersley）およびスミス（Smith），1981年，Comp.Biochem.Physiol.70B:579-586；ウォマースリーによる総説、1981年，Comp.Biochem.Physiol.70B:679-678）または凍結（コンスタンツォ（Constanzo）ら、1993年，J.Exp.Zool.181:245-255；キング（King）ら、1993年，Am.J.Physiol.265:R1036-R1042；カロウ（Karow）ら、1991年，BioScience 41:155-160；ストーリー（Storey）、1990年，Am.J.Physiol.258:R559-R568）から生き残る生化学的適応についての最近の知見は、哺乳動物細胞または組織の保存のための新規な方法を示唆した。
【００１０】
炭水化物（特に、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、スクロース、グルコース、フルクトースなど）およびポリオール（ソルビトールおよびミオイノシトールなど）は、脱水保護（ウォマースリーおよびスミス、上記）および凍結寛容性（ストーリーおよびストーリー、1988年，Physiol.Rev.68:27-84）を、部分的には細胞膜周囲の水置換によって与えるらしいと考えられる（クロウら、1984年，Arch.Biochem.Biophys.232:400-407；クロウら、1984年，Biochem.Biophys.Acta 769:141-150）。耐脱水性および凍結寛容性に関与しているらしい最も興味深い炭水化物の一つはグルコースである。
【００１１】
脊椎動物細胞の代謝において極めて重要な機能を有しているこの単糖は、様々なカエル種における凍結寛容性に重要な役割を有すると考えられる（キングら、1993年、上記；コンスタンツォら、1993年、上記；ストーリーおよびストーリー、1988年，上記）。凍結寛容性種の分析から得られたデータは、それらの動物の凍結の際に、（ｉ）グルコースの血中濃度が有意に増加し；（ii）グルコースは、凍結によって与えられた無酸素および虚血状態においてエネルギー源となりうるし；そして（iii）グルコースは代謝抑制物質として機能するかもしれないということを示唆する（ストーリーおよびストーリー、1988年，上記）。
【００１２】
スクロースは、角膜組織貯蔵（マドン（Madden）ら、Cryobiology 30:135-157；リッチ（Rich）およびアーミテッジ（Armitage）、1991年，Cryobiology 28:159-170；マッカリー（McCarey）ら、1973年，Cryobiology 10:298-307）および胚組織凍結（イサチェンコ（Isachenko）ら、1993年，Cryobiology 30:432-437）に用いられる凍結保存液中の成分として用いられてきた。
【００１３】
更に、グルコースおよび他の炭水化物は、赤血球凍結乾燥に用いられてきた（グッドリッチ（Goodrich）ら、米国特許第4,874,690号明細書；同第5,171,661号明細書および第5,178,884号明細書）。しかしながら、赤血球保存には、組織移植に必要と考えられる組織型構造体制を維持する必要がない。上記方法において、赤血球生存能力は、赤血球溶解の定量、ヘモグロビン回収率または解糖酵素の検定によってのみ決定され（グッドリッチら、米国特許第4,874,690号明細書および第5,178,884号明細書を参照されたい）、細胞完全性および組織体制、例えば、タンパク質合成および分泌に関するパラメーターによらなかった。
【００１４】
グリーン（Green）および共同研究者は、ヒト表皮ケラチノサイトを培養する方法を記載したが（ラインワルド（Rheinwald）およびグリーン、1975年，Cell6:331-343）、それは他の培養された上皮細胞に対しても行われた。このような培養条件下では、大きな熱傷表面、潰瘍および他の皮膚創傷への移植に適した重層上皮シートが得られる（ギャリコー（Gallico）ら、1984年，New Eng.J.Med.311:448-451；ハイトン（Heighten）ら、1986年，J.Am.Acad.Dermatol.14:399-405）。
【００１５】
この方法によって得られた培養上皮もまた、一時的創傷包帯用の同種移植片として用いられた（T.J.フィリップス（Phillips）ら、1989年，J.Am.Acad.Derm.21:191;ボリバー・フロレス（Bolivar-Flores）ら、1990年，Burns 16:3-8）。上皮細胞培養は、体表面再構成のための強力な手段になったが、しかしながら、それらの限られた貯蔵寿命は、それらの使用を、生産の容易さからあまりかけ離れないそれらの医学的便宜に限定してきた。
【００１６】
病院への輸送のための上皮シートのディスパース（dispase）剥離後の貯蔵寿命は短い。したがって、培養されたシートの保存法の確立は、それらを銀行に預けることを可能にするはずであるし、更には、世界中への輸送を可能にするはずである。
【００１７】
この点で、いくつかの戦略が試みられてきた。数人の著者は、独特の凍結プロトコルにしたがう凍結保護物質としてのグリセロールまたはジメチルスルホキシドの使用に基く凍結保存法を開発した（カンセダ（Cancedda）およびデ・ルカ（De Luca）、1994年，米国特許第5,298,417号明細書を参照されたい）。
【００１８】
他の者は、細胞浸透性ガラス形成物質（具体的には、グリセロール）および非浸透性保護物質（好ましくは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、デキストランまたはヒドロキシエチルデンプン）両方を含有する培地を用いて培養上皮シートを凍結保存した（トゥボ（Tubo）ら、1992年，米国特許第5,145,770号明細書を参照されたい）。
【００１９】
しかしながら、これらの方法は、独特の且つ緻密な凍結プロトコル、並びに臨床分野でのこれらの組織の広範囲の使用の難しさ；またはこのような上皮シートを用いるのに必要な融解および洗浄プロトコルの難しさによる医学的有効性の潜在的減損を与えると考えられる融解プロトコルを必要とする。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
発明の概要
本発明は、創傷修復のための培養された上皮および間葉細胞を保存する方法および生産物を提供する。それは、凍結保存成分を洗い流すことを必要とすることなく保存された細胞の使用を可能にする。
【００２１】
更に、それは、先行技術に特有の厄介な取扱い、凍結および融解プロトコルの必要性を免れる。本発明は、更に、先行技術に相対して高い温度で保存された細胞の貯蔵を可能にし、そしてなお、組織の乾燥保存および貯蔵を可能にする。前述のことはいずれも、患者の創傷修復において保存された細胞を使用させるのに必要な構造的および機能的特性を維持しながら達成される。
【００２２】
タンパク質合成および細胞生産物（例えば、成長因子および細胞外基質成分）の分泌などの細胞機能は、標準的な方法によって凍結された細胞または組織に特有のそれらの活性とほぼ同様であるかまたはよりはるかに良い。
【００２３】
本発明の一つの態様により、培養された哺乳動物または間葉上皮細胞を保存する方法を提供する。細胞は、凍結保護量の単糖または二糖を含有する溶液中でインキュベートされる。次に、過剰の溶液を該細胞から除去し、そして細胞を、該凍結保護量の存在下において凍結させる、乾燥させるまたは凍結乾燥させることによって保存する。好ましくは、細胞は、培養された上皮ケラチノサイトのシートである。
【００２４】
一つの実施態様において、細胞はヒト細胞である。好ましくは、過剰の溶液は吸引によってまたは排出によって除去される。このような場合、溶液は、培養されたケラチノサイトのシート５０ｃｍ2につき３０ｍｌ以下で存在し、そして更に典型的には、測定できないほどの少量で存在する。
【００２５】
好ましいインキュベーション溶液は、０．０５〜３．５Ｍグルコースおよびヒト血清アルブミン０．１ｍｇ〜４０ｍｇ／ｍｌを含有する。最も好ましくは、該溶液は、創傷床に対して適用された場合に創傷治癒の妨げになると考えられるおよび創傷床に対して適用する前に細胞から洗浄する必要がある外因性物質の量を含まない。したがって、該溶液は、ＤＭＳＯ、ＰＶＰ、グリセロールおよび非ヒト血清アルブミンなどの物質を含まなくてよい。
【００２６】
本発明のもう一つの態様により、前述の方法によって製造された生産物を提供する。一つのこのような生産物は、移植可能な組織である。該組織は、培養された哺乳動物上皮または間葉細胞であり、好ましい実施態様においては、培養された上皮細胞のシートである。
【００２７】
該細胞は、細胞外相によって取り囲まれ、その細胞外相は凍結保護量の単糖または二糖を含有する。更に、細胞外相は、上記のように、創傷治癒の妨げになるまたは創傷床に対して適用された場合に組織から洗浄する必要がある物質を含まなくてよい。細胞は、例えば、単糖および／または二糖を含有する最小量の溶液中で凍結させることができる。同様に、細胞を乾燥させるかまたは凍結乾燥させることができる。
【００２８】
本発明のもう一つの態様により、凍結保存された創傷修復用組織を提供する。
該組織は、−２０℃〜−７０℃で３か月間、６か月間または更にそれ以上貯蔵された後、患者の創傷表面に適用された場合に、患者の創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的および機能的特性を維持している、凍結された培養哺乳動物上皮または間葉細胞である。該細胞は、好ましくは、密集した培養上皮細胞のシートである。
【００２９】
本発明のもう一つの態様は、乾燥した培養哺乳動物上皮または間葉細胞であって、このような乾燥状態で貯蔵され且つ患者の創傷表面に対して適用された後、患者の創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的および機能的特性を維持している上記細胞である。また更に、密集した培養哺乳動物上皮細胞のシートが好ましい実施態様である。
【００３０】
本発明のこの態様により、その材料は、乾燥状態で創傷に対して適用することができるしまたは創傷に対するその適用に先だって再水和させることができる。したがって、本発明は、更に、前述の生産物のいずれかを含めた患者の治療法に関し、特に、限定されないが、創傷床に対する培養上皮細胞の乾燥シートの適用を包含する。
【００３１】
本発明の凍結保護溶液としては、単糖および／または二糖の他に更に別の保護物質として、限定されないが、タンパク質またはタンパク質混合物を含めた他の凍結保護物質を挙げることができる。例えば、該溶液は、全血清または血清アルブミン、更には、組織生存力、構造および／または代謝活性を維持し且つ保護するのに有用な何等かの他の浸透性および非浸透性凍結保護物質を含んでいてよい。
【００３２】
一つの好ましい実施態様において、ヒトケラチノサイトは、グルコースおよびヒト血清アルブミンを含む凍結保護溶液中で培養され、ここにおいて、該溶液は、創傷床に対して該培養細胞を適用する前に洗い流す必要があるであろう凍結保護物質を全く含まない。したがって、本発明は、融解後および創傷床に対する適用前に洗浄することを全く必要としない、凍結された上皮細胞シートの融解および創傷床に対するそのシートの適用を考える。
【００３３】
培養された上皮細胞は、下層に対して付着していてよいしまたはしていなくてよいし、そして所望ならば支持材料と組合わされてよい。したがって、本発明は、培養された上皮シート、皮膚同等物、間葉由来組織および／または培養細胞の保存を考える。
【００３４】
本発明は、更に、一段階および二段階の簡単な凍結プロトコルと共に、引き続き組織の銀行への預入れおよび貯蔵を可能にする。組織が乾燥している場合、それは室温でも貯蔵することができるが、より低温が望ましい。組織が凍結されている場合、組織を−２０℃で貯蔵してよいが、より低温が望ましいことがありうる。
本発明のこれらのおよび他の態様および特徴を、以下に更に詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明は、（ｉ）表皮ケラチノサイト、角膜ケラチノサイト若しくは他の上皮細胞種類を培養することによって得られた培養上皮シート；（ii）培養されたが密集していない上皮細胞；（iii）皮膚代替物、同等物または類似物（コラーゲンまたはヒアルロン酸などの細胞外基質成分から製造されたゲル上での表皮ケラチノサイトの培養によって得られた上皮シートとしての皮膚同等物または脱表皮化真皮などの皮膚同等物と理解し且つ間葉細胞を含むかまたは含まない）；かまたは（iv）創傷修復のための間葉由来細胞または組織を保存する新規な方法に関する。
【００３６】
ヒト患者の創傷修復に有用な細胞を特に考える。前述の種類の細胞は、培養することができ、下層と分離してよいしまたはしなくてよいし、そして支持材料を組合わせて良いしまたは含まなくてよい。下層の例は、当業者に周知であり、ゲル、薄膜および、細胞外基質、例えば、ヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリングルーおよび合成生産物を含む。同様に、支持材料は当業者に周知であり、ガーゼ、プラスチック、シリコーン、ヒドロゲルおよびデキストランを含む。
【００３７】
保存される組織試料を、最初に、凍結保護量の単糖または二糖を含有する栄養培地または等張溶液であってよい溶液中でインキュベートする。典型的には室温で約５分間〜８時間のインキュベーション時間後、過剰の溶液を細胞から除去し、そして細胞を凍結保護物質の存在下で凍結させ、乾燥させまたは凍結乾燥させる。
【００３８】
単糖または二糖の凍結保護量とは、創傷床に対して適用された場合に創傷治癒の妨げになる外因性凍結保存剤を必要とすることなく本発明の方法にしたがって上皮または間葉細胞の凍結保存を可能にするであろう単糖単独、二糖単独、または単糖および／または二糖の混合物のその量である。
【００３９】
例えば、ＤＭＳＯおよびＰＶＰは、凍結保存において常套手段によって用いられるが、創傷床に対する組織移植片の適用前にその移植片から常に洗浄される。本発明は、このような物質を用いることなく凍結保存を可能にし、それによって余分の不必要な洗浄工程の必要性をなくした。好ましい単糖の場合、グルコースを約０．０５Ｍ〜３．５Ｍの濃度で用いる。下限は、血液、細胞外液または典型的な栄養培地中のグルコース濃度より約８〜１０倍大きく（０．００５５Ｍ）、そして最高濃度のグルコースを含む栄養培地中に存在する程度の約２倍（０．０２５Ｍ）である。
【００４０】
グルコースの好ましい量は、０．１Ｍ〜１Ｍの程度である。他の単糖および二糖の好ましい量は、用いられる具体的な条件、培養される具体的な細胞、およびヒト血清またはヒト血清アルブミンなどの任意の他の生体適合性保護物質の存在および濃度に依るであろう。いずれの場合にも、凍結保護量は、栄養培地等に存在する単糖および二糖の量の少なくとも２倍だけ多い。
【００４１】
本発明の溶液は、好ましくは、創傷床に対して適用された場合に創傷治癒の妨げになる外因性物質の量を含まない。このような外因性物質は当業者に周知であり、凍結保護物質として一般的に用いられる物質を含む。例えば、ＤＭＳＯ、ＰＶＰおよびポリヒドロキシ炭水化物は、しばしば凍結保護物質として用いられる。融解した組織を創傷床に対して適用する前に、洗浄によって該組織からこのような物質を除去することは慣例である。
【００４２】
同様に、デキストラン、およびアルブミンを含めたタンパク質の非ヒト源は、凍結保存プロトコルにおいて用いられ、そして保存された組織を創傷床に対して適用する前に完全に除去される。
【００４３】
また一方で、ヒト血清アルブミン、プロリン、スペルミン、ミリスチン酸、低濃度の亜鉛および多数の他の凍結保存剤などの物質は、創傷治癒の妨げにならない。したがって、本発明は、その好ましい実施態様において、創傷床に対する保存された組織の適用前に、追加の洗浄工程の原因とならない生体適合性保存溶液を考える。
【００４４】
本発明は、最小量の溶液中で組織を保存することを考える。これは、先行技術からの逸脱であり且つ本発明の利点である。一つの利点は、単純化された取扱いであり、それによって、組織をバッグまたは皿に入れることができ、そしてこぼれることを心配することなく、密封した皿を必要とすることなく、そして先行技術に特有の他の厄介なプロトコルを用いることなく保存することができる。
【００４５】
予想外の利点は、本発明の凍結保護物質を用いて培養細胞および組織を凍結乾燥する能力である。特に、本発明は、上皮細胞のシートを凍結乾燥し、貯蔵し、再水和させ（またはさせない）そして創傷修復に用いることを可能にする。貯蔵は比較的高い温度であることができ、輸送および遠隔地での使用が可能になり且つ不経済で限られた空間の−７０℃フリーザー空間の必要性がなくなる。
【００４６】
凍結乾燥は、最小量の液体を用いて凍結前に実行しうる程度に凍結保護溶液を除去し、凍結させ、乾燥させることによって促進され、そして融解は速やかに且つ細胞に対する最小限の機能的損傷によって進行する。
【００４７】
したがって、本発明は、乾燥状態で貯蔵され且つ患者の創傷表面に対して適用された後に、患者において創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的完全性および機能特性を維持している培養された上皮細胞の乾燥した密集したシートを含む保存された上皮創傷修復用組織を提供する。
【００４８】
最小量は、過剰の溶液を吸引することによっておよび／または細胞から溶液を重力排出することによって達成されうる。他の方法は、当業者に明らかであろう。組織移植片５０ｃｍ2につき３０ｍｌ以下の溶液があることは望ましいが、更に少量でも好ましい。
【００４９】
本発明によって有用な凍結保護物質には、透過性および非透過性物質、並びに創傷床に対する保存組織の適用前に洗浄除去する必要がある物質が含まれる（が、生体適合性である物質が好ましい）。
【００５０】
凍結保護物質として有用であることが知られている物質としては以下、単糖類（例えば、グルコース、フルクトース、マルトース、リボース、マンノース、キシロース）；二糖類（例えば、トレハロース、スクロース、セロビオース、ラクトース）；三糖類（例えば、ラフィノース）；糖アルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール、ミオイノシトール、リン酸化イノシトール、グリセロール）；多糖類（例えば、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、デキストラン、リン酸化デキストラン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロリン硫酸、アガロース）；カルボン酸（例えば、ピルビン酸、２，３−ジホスホグリセリン酸）；タンパク質およびタンパク質混合物（例えば、血液、動物血清、血漿、ヒトアルブミン、ウシアルブミン、ウシゼラチン、フィッシュゼラチン）がある。
【００５１】
好ましい凍結保存溶液は、単糖およびタンパク質またはタンパク質混合物を含む。好ましい単糖であるグルコースを０．０５〜３．５Ｍの濃度で加え、そしてタンパク質またはタンパク質混合物を０．１〜４０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で加える。最も好ましくは、該溶液は、０．１〜１．０Ｍグルコースおよびヒト血清アルブミン１．０〜５．０ｍｇ／ｍｌ（または血清０．０５〜４０ｍｇ／ｍｌ）最も好ましくは、ヒト）を含有する栄養培地から成る。
【００５２】
保存される材料を、５℃〜４０℃の温度範囲で、好ましくは、室温で該溶液中に浸漬する。インキュベーション時間は約５分〜８時間であり、更に長い時間も可能であるが、必ずしも望ましくない。インキュベーション後、溶液の全吸引または重力排出後に残っている最小量の溶液中で材料を凍結させる。吸引または重力排出は、組織５０ｃｍ2につき約３０ｍｌ以下の溶液を残し、更に典型的には、最小量（すなわち、測定することができないほど少ない量）を残す。材料を凍結させ、凍結乾燥させまたは乾燥させることができる。
【００５３】
慣用的な凍結、凍結乾燥および乾燥プロトコルを用いることができる。本発明の利点は、凍結させるための既知のプロトコルのいずれもが、本発明によって有用であるということである。簡単な二段階法は、特に適していることが判ったが、そこでは、培養された上皮シートを、最初に約−２０℃の温度で５〜１２時間維持し、その後、細胞を−８０℃まで約２時間にわたって凍結させる。次に、凍結した材料をこのような温度で貯蔵するかまたは銀行に預けることができる。
【００５４】
しかしながら、材料を一段階法で−２０℃の温度まで凍結させ且つその温度で貯蔵するかまたは銀行に預けることができることは理解されるはずである。培養された上皮シートは、−２０℃かまたは−８０℃で１年間首尾よく維持された。
【００５５】
本発明の一つの態様により、培養された上皮シートを凍結乾燥させる。得られた材料は、乾燥状態で保存された最初に培養された上皮シートであり、それは、長期間貯蔵された後でも、創傷表面に対して適用することができ、創傷治癒を引き起こすのに十分な構造的完全性および機能特性を維持している。上述のように、乾燥した上皮シートを創傷に対して直接的に適用することも可能であり、体液が上皮シートを再水和させる。
【００５６】
凍結乾燥の場合、単糖類および／または二糖類を凍結保護物質として用い且つ細胞を最小量の凍結保護溶液中で凍結させること以外は慣用法を用いる。したがって、上皮シートは、例えば、−７０℃まで約２０分間冷却することによって凍結させることができ、そして引き続き、凍結した上皮を慣用的な装置中で凍結乾燥させることができる。
【００５７】
次に、凍結乾燥した上皮シートを、ヒートシールバッグ中で維持し且つ銀行に預けるかまたは例えば４℃で貯蔵することができる。これは、有用な創傷修復用生産物を生じる培養上皮細胞の凍結乾燥について最初に知られた例である。
或いは、細胞を凍結させることなく一定範囲の温度で乾燥させることができる。
【００５８】
前述の貯蔵条件下において、in vitro で生じた組織は、先行技術の方法によって保存された組織で見出されるのとほぼ同様のまたはより高い生合成活性を維持している。構造的完全性、タンパク質合成および細胞分泌能力は、当業界で知られた方法によって保存された細胞での該当する特徴と同様にまたはより高く維持される。
【００５９】
好ましい保存溶液は、無毒性で且つ非免疫原性である凍結保護物質を用いるので、先行技術の方法に特有の培養細胞の洗浄、培養上皮シートまたは皮膚同等物は不要である。同様に、凍結過程において最小限の溶液を用いるので、融解は、材料を３７℃浴中で加温することによって最小量の時間内（１分以内と同程度）に起こる。材料は、当然ながら、融解用基剤中に直接的に浸漬することができる。
【００６０】
下記の具体的な実施例は、培養された表皮シートの保存に対して適応された場合に本発明の方法を例証するであろう。しかしながら、上記のように、同様の手順が、（表皮、角膜または別の上皮細胞種類からのヒトまたは非ヒト上皮細胞の培養によって得られた）培養上皮シート、皮膚代替物または他の培養された細胞種類の保存に対して拡大される。
【実施例】
【００６１】
実施例１
表皮シートは、ラインワルドおよびグリーン（1975年、上記）によって開発された方法を用いてヒト新生児包皮ケラチノサイトを培養することによって得られた。
上皮シートを、ディスパース（Dispase）II（ベーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim））を最終濃度２．５ｍｇ／ｍｌで用いて培養皿から剥離した。培養皿から剥離した後、上皮シートをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）によって室温で洗浄し、支持材料中に固定し、そしてグルコースおよびヒト血清アルブミンを指示された濃度で含有するダルベッコ・フォクト（Dulbecco-Vogt）修飾最小必須培地（ＤＭＥＭ）から成る保存溶液と一緒に１０分間インキュベートし；所望ならば、保存溶液を２０．０ｍＭ ＨＥＰＥＳによって緩衝させてよい。
【００６２】
インキュベーション後、上皮が入っている容器中に最小量の溶液を残して保存溶液を吸引する。その後、支持材料上に固定されていてよい上皮をヒートシールバッグ中に入れ且つ二段階法にしたがって凍結させる。すなわち、それらを最初に−２０℃で５時間保持し；次に、−７０℃まで一晩中冷却する。最後に、凍結した上皮を銀行に預けるかまたは−７０℃で貯蔵する。
【００６３】
上皮シートを培地（ダルベッコ・フォクト修飾最小必須培地、ＤＭＥＭ）中またはトレハロースおよび血清アルブミン含有緩衝食塩水中で融解させ、そして培地に放出されたタンパク質中への［35Ｓ］−メチオニン取込みの定量化によって生存能力を決定した。融解した上皮を、［35Ｓ］−メチオニン（４．０μＣｉ／ｍｌ）含有低メチオニン（６μｇ／ｍｌ）ＤＭＥＭと一緒に３７℃でインキュベートし、そしてＴＣＡ感受性材料中に取込まれた放射能を培地のアリコート中で測定した。
【００６４】
表Ｉは、この実験で得られた結果を示す。放射能取込み値を規格化するために、対照として用いられた培養上皮シートを、１０％（ｖ／ｖ）動物またはヒト血清および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール（標準法）を含有するＤＭＥＭと一緒に１０分間インキュベートし、そして上記二段階法にしたがって凍結させた。融解後、放出されたタンパク質中への［35Ｓ］−メチオニン取込みを測定することによって上皮生存能力を決定し、そしてこれらの対照上皮からの結果をその単位と称した。それは、三重反復試験上皮からの平均値を示す。
【００６５】
【表１】
2008188434.tif 000002
【００６６】
実施例２
他の実験では、保存溶液中でのインキュベーション後、上皮を凍結乾燥させるかまたは乾燥させた。培養上皮シートを剥離し、支持材料中に固定し、そして上記のように保存溶液中でインキュベートする。保存溶液を吸引して、上皮が入っている容器に最小量の溶液を残す。次に、上皮を−７０℃で少なくとも２０分間冷却することによって凍結させる。
【００６７】
その後、凍結した上皮をリフロック（Lyphlock）６フリーズドライ／シェル（Shell）フリーズシステム（ラブコンコ（Labconco））中で凍結乾燥させる。凍結乾燥した上皮は、ヒートシールバッグ中に入れ且つ銀行に預けるかまたは４℃で貯蔵することができる。少なくとも４８時間保存後、上皮をＤＭＥＭ中に浸漬することによって再構成し、そして上皮生存能力を実施例Ｉで記載のように検定した。結果を表ＩＩで示す。
【００６８】
この例証実験において、［35Ｓ］−メチオニン取込み値を、更に、ＤＭＥＭおよび１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを対照として用いるプレインキュベーション後に凍結された上皮シートを用いて規格化した。
リン酸緩衝溶液、または血清アルブミンおよび／または単糖類若しくは二糖類含有等張食塩水などの他の溶液を上皮シート、皮膚同等物または細胞の再構成に用いた場合、同様の結果が得られた。
【００６９】
【表２】
2008188434.tif 000003
【００７０】
実施例３
細胞成長パラメーターまたは特異な染料染色によって細胞生存能力を決定する方法は、細胞シートをトリプシン化して単一細胞にする必要があるし、しかもこのトリプシン化の方法それ自体が、細胞損傷を引き起こし且つ細胞生存能力および細胞成長能力を低下させるので、培養されたヒト表皮ケラチノサイトは、指数的成長期中に、トリプシン０．１５％およびＥＤＴＡ ０．０２％の（１：１）混合物を用いて採取された。細胞を培地によって十分に洗浄し且つペレットにした。次に、細胞を保存用培地によって再懸濁させ且つインキュベートした。
【００７１】
インキュベーション後、細胞を上記の二段階法にしたがって凍結させるかまたは実施例２の場合と同様に凍結乾燥させた。凍結保存された細胞懸濁液を約−２０℃またはそれより低い温度で貯蔵し、そして凍結乾燥された細胞を周囲温度またはそれより低い温度で少なくとも２４時間貯蔵した。細胞を融解させまたは培地によって再構成させ、そしてアリコートを用いて、トリパンブルー色素排除によって細胞生存能力を決定した。この種類の実験からの結果を示す。
【００７２】
【表３】
2008188434.tif 000004
【００７３】
実施例４
実施例３で示されたのと同様の実験で、ヒト表皮ケラチノサイトを集め、洗浄し、そしてペレットにした後、ＤＭＥＭおよび０．００５Ｍ〜３．５Ｍグルコースおよび血清アルブミン０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０．０ｍｇ／ｍｌおよび１．０％〜１０％（ｖ／ｖ）グリセロールかまたは１％〜１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯから成る保存培地によって細胞を再構成し且つインキュベートした。
【００７４】
インキュベーション後、細胞を上記の段階法にしたがって凍結させるかまたは実施例２の場合と同様に凍結乾燥させた。凍結保存された細胞懸濁液を約−２０℃またはそれより低い温度で貯蔵し、そして凍結乾燥された細胞を周囲温度またはそれより低い温度で少なくとも２４時間貯蔵した。細胞を融解させまたは培地によって再構成させ、そして培養して細胞増殖能力を決定した。これらの実験から得られた  結果は、実施例１で示されたのと同様である。
上記で例証された方法は、凍結させるか、凍結乾燥させるかまたは乾燥させることによって培養上皮シートまたは上皮細胞懸濁液の保存に首尾よく用いられた。
【００７５】
いずれの場合にも、包帯、細胞または組織試料は、グルコース（０．００５Ｍ〜３．５Ｍ）および血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍｌ〜４０．０ｍｇ／ｍｌ）
またはグルコース（０．００５Ｍ〜４．０Ｍ）および動物若しくはヒト血清（０．０５ｍｇ／ｍｌ〜４０．０ｍｇ／ｍｌ）かまたは、グルコース（０．００５Ｍ〜３．５Ｍ）および血清アルブミン０．１〜４０．０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＳＯ（１％〜１０％）若しくはグリセロール（１％〜１０％）を含有する凍結保存溶液と一緒にインキュベートされた。
【００７６】
開示された方法は、細胞／組織構造の完全性並びに（成長因子または細胞外基質成分の例として）タンパク質合成および放出などの代謝活性を確実にする。これらの方法は、表皮、角膜若しくは他の上皮細胞種類からのヒトまたは非ヒト上皮細胞、皮膚代替物または別の培養細胞種類の培養によって得られた上皮シートを保存するのに有用であり；したがって、それらは、治療的、薬理学的、そして更には研究用などの多数の分野にとって価値があるはずである。
様々な修飾および同等物は当業者に明らかであろう。