(57)【要約】【課題】  ＤＮＡマイクロアレイの反応結果をＣＣＤ等のエリアセンサを使って観察する際に、センサ画素不良の影響を低減可能とした検査装置を提供する。【解決手段】  ＤＮＡマイクロアレイを撮像するエリアセンサと、前記エリアセンサと前記マイクロアレイとを相対的に移動させる手段と、前記エリアセンサ上の不良画素位置を記憶する記憶回路と、前記不良画素位置の情報に基づいて前記移動手段を制御する制御手段とを備える。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロアレイの検査装置において、
前記マイクロアレイを撮像するエリアセンサと、前記エリアセンサと前記マイクロアレイとを相対的に移動させる手段と、前記エリアセンサ上の不良画素位置を記憶する記憶回路と、前記マイクロアレイ上の反応エリアと前記不良画素位置との重なりをスコア計算し、前記計算結果に基づいて前記移動手段を制御する制御手段とを備えることを特徴とする検査装置。
【請求項２】
前記制御手段は、スコアが最小となるように前記マイクロアレイとエリアセンサとの相対位置を調整することを特徴とする請求項１に記載の検査装置。
【請求項３】
前記記憶回路は、前記マイクロアレイ上のスポットエリアの中心位置座標、スポット径の情報を記憶していることを特徴とする請求項２に記載の検査装置。
【請求項４】
前記マイクロアレイはＤＮＡマイクロアレイであることを特徴とする請求項１に記載の検査装置。
【請求項５】
前記エリアセンサは、ＣＭＯＳセンサであることを特徴とする請求項１に記載の検査装置。
【請求項６】
前記エリアセンサの不良画素位置の情報は更新されることを特徴とする請求項１に記載の検査装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロアレイの検査装置に関し、特に、ＤＮＡマイクロアレイをＣＣＤ等のエリアセンサにより観察する検査装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の検査装置に利用されるエリアセンサとしてＣＣＤセンサ、ＣＭＯＳセンサなどを用いたものがある。これらは各画素の光電変換素子であるホトダイオードに蓄積された信号電荷を各々の方式によって増幅し、画像情報として読み出すものである。特許文献１にはＣＣＤセンサを用いてＤＮＡマイクロアレイの蛍光を読み取る核酸分析装置が開示されている。この特許文献１に開示された装置は、ＤＮＡマイクロアレイの各プローブを発光ダイオードによって照射して励起し、各プローブの蛍光をＣＣＤセンサにより検出している。この装置によりＤＮＡマイクロアレイの各プローブの蛍光強度を一度に測定することが可能になる。さらに、各プローブの測定条件がほぼ同一となり、測定精度も向上する。また、読取機構が省スペース、安価となり、故障率も低下し、メンテナンスがほとんど不要となる。
【特許文献１】特開２００５−１８１１４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ところで、ＣＣＤ等のエリアセンサには、ホトダイオードの不良等により一部の画素に不良画素が存在している場合がある。このような不良画素からは正常な信号電荷情報は読み出せない。マイクロアレイの１種であるＤＮＡマイクロアレイのプローブをハイブリダイゼーション反応させた蛍光画像を撮像する場合、上記不良画素がプローブのスポット上にかかっていると正常な蛍光強度を検出できない。
【０００４】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、エリアセンサの不良画素の影響を低減する検査装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記問題点を解決するために本発明の検査装置は、前記マイクロアレイを撮像するエリアセンサと、前記エリアセンサと前記マイクロアレイとを相対的に移動させる手段と、前記エリアセンサ上の不良画素位置を記憶する記憶回路と、前記マイクロアレイ上の反応エリアと前記不良画素位置との重なりをスコア計算し、前記計算結果に基づいて前記移動手段を制御する制御手段とを備える。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、マイクロアレイの反応結果を撮像する場合、センサ画素不良の影響を低減可能である。その結果、良好な撮像画像を取得でき、正確な反応結果の判定が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
図１は本発明によるセンサ画素不良回避方法の手順を示すフローチャートである。
【０００８】
はじめに、センサ画素不良情報の検出を行う（１０１）。この処理はセンサに光の入らないよう遮断した状態で撮像した黒画像と、全画素が飽和するよう十分にセンサを露光した白画像を比較して、黒または白以外の値になっている不良画素を検出する。次に、１０１で得られたセンサ画素不良情報のメモリへの取り込みを行う（１０２）。１０１と１０２の処理は適時行うことができ、センサ画素不良情報を適宜更新することができる。次に、撮像するＤＮＡマイクロアレイのスポット情報の取り込みを行う（１０３）。スポット情報にはスポットの中心座標、スポットの直径、プローブの重要度情報が含まれる。次に、１０２と１０３で取り込んだセンサ画素不良情報とＤＮＡマイクロアレイのスポット情報を比較して画素不良の影響をあらわすスコアの計算を行う（１０４）。スコア計算はセンサの撮像可能エリアすべての位置で行う。そして、スコアが最小となる撮像位置を選択する（１０５）。もし、スコアが最小となる撮像位置が複数ある場合、センサの検出エリアの中心から最も近い撮像位置を選択する。図１のセンサ画素不良回避方法の手順は、後ほど詳細に説明する。
【０００９】
図２は本発明の検査装置に含まれる情報処理装置の構成を示すブロック図である。センサ画素不良回避方法は、外部記憶装置２０１、中央処理装置（ＣＰＵ）２０２、メモリ２０３、入出力装置２０４から構成される装置に実装される。外部記憶装置２０１は、本発明を実現するプログラムや、ハイブリダイゼーション反応の結果、輝度レベルを保持する。中央処理装置（ＣＰＵ）２０２は本発明を実現するプログラムを実行したり、すべての装置の制御を行なったりする。メモリ２０３は中央処理装置（ＣＰＵ）２０２が使用するプログラム、及びサブルーチンや画素不良データ、撮像画像データ等のデータを一時的に記録する。入出力装置２０４は、ユーザーとのインタラクションを行う。多くの場合、本発明の生物種判定方法を実現するプログラム実行のトリガーはこの入出力装置を介してユーザーが出す。また、ユーザーの結果確認、プログラムのパラメータ制御は、この入出力装置を介して行う。
【００１０】
図３は本発明の検査装置の全体構成を示した図である。この検査装置は図２で示した情報処理装置３０１、ＣＭＯＳセンサ３０４を内蔵し蛍光フィルター３０５を付属する撮像装置３０３、ＤＮＡマイクロアレイの励起光源３０６、ＤＮＡマイクロアレイ３０７を支持するＤＮＡマイクロアレイ支持基盤３０８、外部からの光を遮断する暗箱３０２で構成される。ハイブリダイゼーション反応を行ったマイクロアレイ３０７を励起光源３０６で励起し、発せられた蛍光を蛍光フィルター３０５を通じて撮像装置３０３で撮像する。撮像装置３０３はＵＳＢケーブルで接続された情報処理装置３０１の入出力装置から操作する。ＤＮＡマイクロアレイ支持基盤３０８は縦方向、横方向に移動することができ、図１の１０５で示したスコアが最小となる撮像位置へ移動して撮像する。
【００１１】
図４はＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションの様子を示した図である。生体内でほとんどの場合、ＤＮＡは２重らせん構造をしていて、その２本鎖の間の結合は塩基間の水素結合で実現されている。一方、ＲＮＡは１本鎖で存在する場合が多い。塩基の種類はＤＮＡの場合はＡＴＧＣの４種類、ＲＮＡの場合はＡＵＧＣの４種類であり、それぞれ水素結合ができる塩基対はＡ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｃのペアとなっている。一般にハイブリダイゼーション反応とは、１本鎖状態の核酸分子同士がその中にある部分塩基配列を介して部分的に結合する状態をいう。本発明で想定している反応は、図３の上側の基板にくっついた核酸分子（プローブ）の方が下側のサンプル中にある核酸分子より短い。よって、サンプル中に存在する核酸分子がプローブの塩基配列を含む場合は、このハイブリダイゼーション反応はうまくいき、サンプル中のターゲット核酸分子はＤＮＡマイクロアレイにトラップされることとなる。
【００１２】
次に図５を用いてＤＮＡマイクロアレイを用いる操作手順全般について説明する。５０１の“サンプル”とは対象としている核酸が含まれているはずの液体や個体である。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿及び糞便のような排出物等細菌が存在すると思われるあらゆる物がサンプルとなる。また、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、細菌による汚染が引き起こされる可能性のある媒体がサンプルとして用いられることもある。さらに、輸出入時における検疫等の動植物も検体としてその対象となる。
【００１３】
次に、５０２の“生化学的増幅”方法を用いて５０１のサンプル増幅する。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、１６ｓ  ｒＲＮＡ検出用に設計されたＰＣＲ反応用プライマーを用いてＰＣＲ法によって対象核酸を増幅したり、或いはＰＣＲ増幅物を元にさらにＰＣＲ反応等を行って調整したりする。また、ＰＣＲ以外のＬＡＭＰ法などの増幅方法により調整してもよい。
【００１４】
その後で、増幅されたサンプル、または５０１のサンプルそのものに、可視化のために各種標識法により標識する。この標識物質としては、通常Ｃｙ３，Ｃｙ５，Ｒｏｄａｍｉｎなどの蛍光物質が用いられる。また、５０２の生化学的増幅の実験手順の中で、標識分子を混入することもある。
【００１５】
そして、標識分子が付加された核酸は、５０４のＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーション反応（５０５）を行う。この様子は、図３に示した通りである。例えば感染症の原因菌の特定をするために本発明を適用した場合、５０４のＤＮＡマイクロアレイは、原因菌に特異的な塩基配列を持つプローブ（人工核酸）を基板に固定したものとなる。各菌のプローブの設計は、例えば１６ｓ  ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように行う。５０４のＤＮＡマイクロアレイのプローブを固定する担体（基板）は、ガラス基板、プラスチック基板、シリコンウェハー等の平面基板が考えられる。また、凹凸のある三次元構造体、ビーズのような球状のもの、棒状、紐状、糸状のもの等を用いても、本発明の実施形態、効果には影響ない。
【００１６】
通常、前記基板の表面はプローブＤＮＡの固定化が可能なように処理したものが使用される。特に、表面に化学反応が可能となるように官能基を導入した物は、ハイブリダイゼーション反応の過程でプローブが安定に結合している為に、再現性の点で好ましい形態である。本発明に用いられる固定化方法は、例えば、マレイミド基とチオール（−ＳＨ）基との組合わせを用いる例が挙げられる。即ち核酸プローブの末端にチオール（−ＳＨ）基を結合させておき、固相表面がマレイミド基を有するように処理しておくことで、固相表面に供給された核酸プローブのチオール基と固相表面のマレイミド基とが反応して核酸プローブを固定化する。マレイミド基の導入方法としては、まず、ガラス基板にアミノシランカップリング剤を反応させ、次にそのアミノ基とＥＭＣＳ試薬（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：Ｄｏｊｉｎ社製）との反応によりマレイミド基を導入する。ＤＮＡへのＳＨ基の導入は、ＤＮＡ自動合成機上５’−Ｔｈｉｏｌ−ＭｏｄｉｆｉｅｒＣ６（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いる事により行なうことができる。固定化に利用する官能基の組合わせとしては、上記したチオール基とマレイミド基の組合わせ以外にも、例えばエポキシ基（固相上）とアミノ基（核酸プローブ末端）の組合わせ等が挙げられる。また、各種シランカップリング剤による表面処理も有効であり、該シランカップリング剤により導入された官能基と反応可能な官能基を導入したオリゴヌクレオチドが用いられる。さらに、官能基を有する樹脂をコーティングする方法も利用可能である。
【００１７】
ハイブリダイゼーション反応を行った後、５０４のＤＮＡマイクロアレイの表面を洗浄し、プローブと結合していない核酸を剥がした後で、（通常は）乾燥し、５０５の蛍光量を測定する。そして、ＤＮＡマイクロアレイの基板に励起光を照射し、センサで蛍光画像を撮像（５０６）する。得られたＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像（５０７）のプローブ蛍光強度を算出する。
【００１８】
次に、図６を用いて感染症の菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を示す。図６で示したＤＮＡマイクロアレイは、例えば、黄色ブドウ球菌を特定する目的で作られていると仮定する。
【００１９】
左の列は、黄色ブドウ球菌野生株由来の処理系列であり、右の列は大腸菌野生株由来の処理系列である。例えば、左は黄色ブドウ球菌に感染した患者の血液を処理する流れで、右は大腸菌に感染した患者の血液を処理する流れだと考えてよい。
【００２０】
どちらも基本的には同じ処理を行う。つまり、まず初めに例えば菌感染患者の血液や、痰などからＤＮＡを抽出する。この際に、一般的には、患者の体細胞由来の人間のＤＮＡも含まれる可能性がある。
【００２１】
抽出されたＤＮＡが少ない場合、ＰＣＲ法などの方法で増幅を行う。この際に蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させるのが一般的である。
【００２２】
増幅をしない場合は、抽出されたＤＮＡを用いて、相補鎖を作りながら蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として混入させる、または、そのまま直接抽出されたＤＮＡに蛍光物質もしくは蛍光物質を結合させることができる物質を標識として付加させる。
【００２３】
通常、ＰＣＲ増幅を行う場合、感染症の菌特定目的であれば、いわゆる１６ｓ  ｒＲＮＡといわれるリボゾームＲＮＡを構成する塩基配列の部分を増幅するのが一般的である。この場合、左の黄色ブドウ球菌のＰＣＲプライマーと右の大腸菌のＰＣＲプライマーはほとんど同じものを使うこととなる。より具体的には、どんな菌の１６ｓ  ｒＲＮＡをコーディングしている部分でも増幅させることができるプライマーセットを用いて、マルチプレックスＰＣＲを行う。
【００２４】
黄色ブドウ球菌を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応する。
【００２５】
これと全く同じように、大腸菌の存在を判定する目的のために設計されたＤＮＡマイクロアレイが正しく動作するならば、左のハイブリ溶液では、スポットがネガティブに反応し、右のハイブリ溶液では、スポットがポジティブに反応する。もちろん、いろんな菌に対してそれぞれ特異的に反応する数種類のスポットを同時に並べたＤＮＡマイクロアレイを用いて、感染菌の判定を行ってもかまわない。
【００２６】
以下、図５を用いて説明した操作の流れを感染症の原因菌特定の目的を想定した具体的操作として説明する。なお、本発明にかかわる生物種類判定方法は、以下に述べる感染症の原因菌特定に限ったものではなく、ＭＨＣなどの人間の体質判定や、癌などの疾病に関わるＤＮＡ、ＲＮＡの解析に用いてもよい。
【００２７】
＜プローブＤＮＡの準備＞
Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ菌検出用Ｐｒｏｂｅとして表１に示す核酸配列（Ｉ−ｎ）（ｎは数字）を設計した。
【００２８】
具体的には、１６ｓ  ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分より、以下に示したプローブ塩基配列を選んだ。これらのプローブ塩基配列群は、当該菌に対し非常に特異性が高く、十分かつそれぞれのプローブ塩基配列で“出来るだけ”ばらつきのないハイブリダイゼーション感度が期待できるように設計されている。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
表中に示したプローブは、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、合成後、定法に従って核酸の５’末端にチオール基を導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷凍庫に保存した。
【００３１】
黄色ブドウ球菌（Ａ−ｎ）、表皮ブドウ球菌（Ｂ−ｎ）、大腸菌（Ｃ−ｎ）、肺炎桿菌（Ｄ−ｎ）、緑膿菌（Ｅ−ｎ）、セラチア菌（Ｆ−ｎ）、肺炎連鎖球菌（Ｇ−ｎ）、インフルエンザ菌（Ｈ−ｎ）、及びエンテロコッカス・フェカリス菌（Ｊ−ｎ）（ｎは数字）についても同様な手法により以下に示すプローブセットを設計した。
【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
2008039564.tif 000008
【００３７】
【表７】
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【００３８】
【表８】
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【００３９】
【表９】
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【００４０】
【表１０】
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【００４１】
＜検体増幅用ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒの準備＞
起炎菌検出用の為の１６ｓ  ｒＲＮＡ核酸（標的核酸）増幅用ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒとして表１１に示す核酸配列を設計した。
【００４２】
具体的には、１６ｓ  ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブセット、つまり約１５００塩基長の１６ｓ  ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分で、特異的な融解温度をできるだけ揃えたプライマーを設計した。なお、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ  ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように複数種類のプライマーを設計した。
【００４３】
【表１１】
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【００４４】
表中に示したＰｒｉｍｅｒは、合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製し、Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３種、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ３種を混合し、それぞれのＰｒｉｍｅｒ濃度が、最終濃度１０  ｐｍｏｌ／μｌ  となるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００４５】
＜Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ（モデル検体）の抽出＞
（微生物の培養＆Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  抽出の前処理）
まず、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  標準株を、定法に従って培養した。
【００４６】
この微生物培養液を１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに１．０ｍｌ（ＯＤ６００＝０．７）採取し、遠心分離で菌体を回収した。（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）上精を捨てた後、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐ．Ｈ．８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。再縣濁した菌液は、再度、遠心分離で菌体を回収した。（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）上精を捨てた後、回収された菌体に、以下の酵素溶液を加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ      ５０μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ  ＳＧ      ５０μｌ（０．２ｍｇ／ｍｌ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）
次に、酵素溶液を加え再縣濁した菌液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、細胞壁の溶解処理を行った。
【００４７】
（Ｇｅｎｏｍｅ抽出）
以下に示す微生物のＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ抽出は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて行った。
【００４８】
具体的には、まず、前処理した微生物縣濁液に溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ４０μｌを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌した。（ステップ１）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた。（ステップ２）
次に、洗浄液９００μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁を行った。（ステップ３）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた。（ステップ４）
ステップ３、４を繰り返して２度目の洗浄（ステップ５）を行った後、７０％エタノール９００μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁した。（ステップ６）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を捨てた。（ステップ７）
ステップ６、７を繰り返して７０％エタノールによる２度目の洗浄（ステップ８）を行った後、回収された磁性粒子に純水１００μｌを加え、チューブミキサーで１０分間攪拌を行った。
【００４９】
次に分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ  Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集め、スタンドにセットした状態のまま、上精を新しいチューブに回収した。
【００５０】
（回収したＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの検査）
回収された微生物（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  株）のＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡは、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。
【００５１】
本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡが回収され、Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。
【００５２】
回収したＧｅｎｏｍｅ  ＤＮＡは、最終濃度５０ｎｇ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解し、以下の実施例に使用した。
【００５３】
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英のガラス基板（サイズ：２５ｍｍｘ７５ｍｍｘ１ｍｍ、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリのラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中で浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて基板を取り出し、軽く純水ですすいだ後、超純水中で２０分超音波洗浄をおこなった。次に８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。再び純水洗浄と超純水洗浄を行い、ＤＮＡチップ用の石英ガラス基板を用意した。
【００５４】
［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に溶解させ、２時間室温で攪拌した。続いて、先に洗浄したガラス基板をシランカップリング剤水溶液に浸し、２０分間室温で放置した。ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面を洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、カップリング剤処理を完結させ、基板表面にアミノ基を導入した。次いで同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ）（以下ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を用意した。ベークの終了したガラス基板を放冷し、調製したＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この処理により、シランカップリング剤によって表面に導入されたアミノ基とＥＭＣＳのスクシイミド基が反応し、ガラス基板表面にマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げたガラス基板を、先述のＭＣＳを溶解した混合溶媒を用いて洗浄し、さらにエタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で乾燥させた。
【００５５】
［３］プローブＤＮＡ
実施例１で作製した微生物検出用プローブを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように分注した後、凍結乾燥を行い、水分を除いた。
【００５６】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ吐出、および基板への結合
グリセリン７．５ｗｔ％、チオジグリコール７．５ｗｔ％、尿素７．５ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を用意した。続いて、先に用意した７種類のプローブ（表１）を上記の混合溶媒に規定濃度なるように溶解した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェット（登録商標）プリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０  キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【００５７】
なおここで用いたバブルジェット（登録商標）プリンターは平板への印刷が可能なように改造を施したものである。またこのバブルジェット（登録商標）プリンターは、所定のファイル作成方法に従って印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【００５８】
続いて、この改造バブルジェット（登録商標）プリンターを用いて、１枚のガラス基板に対して、印字操作を行い、アレイを作製した。印字が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、ガラス基板表面のマレイミド基と核酸プローブ末端のチオール基とを反応させた。
【００５９】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流し、ガラス基板表面に一本鎖ＤＮＡが固定したＤＮＡマイクロアレイを得た。
【００６０】
＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞
検体となる微生物ＤＮＡの増幅、および、標識化反応を以下に示す。
Ｐｒｅｍｉｘ  ＰＣＲ  試薬（ＴＡＫＡＲＡ  ＥｘＴａｑ）  ２５μｌ
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ  ２μｌ（１００ｎｇ）
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ  ２μｌ（２０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅ  ｅａｃｈ）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ  ２μｌ（２０ｐｍｏｌ／ｔｕｂｅ  ｅａｃｈ）
Ｃｙ−３  ｄＵＴＰ  （１ｍＭ）    ２μｌ（２ｎｍｏｌ／ｔｕｂｅ）
Ｈ２０                            １７μｌ
Ｔｏｔａｌ                        ５０μｌ
上記組成の反応液を以下のプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーで増幅反応を行った。
【００６１】
【数１】
2008039564.tif 000014
【００６２】
反応終了後、精製用カラム（ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてＰｒｉｍｅｒを除去した後、増幅産物の定量を行い、標識化検体とした。
【００６３】
＜ハイブリダイゼーション＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイと＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体を用いて検出反応を行った。
【００６４】
（ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング）
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）を１ｗｔ％となるように１００ｍＭ  ＮａＣｌ／１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、この溶液に＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２ｘＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ６Ｈ５Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ）３０ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスしてからスピンドライ装置で水切りを行った。
【００６５】
（ハイブリダイゼーション）
水切りしたＤＮＡマイクロアレイをハイブリダイゼーション装置（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｉｏｎ）にセットし、以下に示すハイブリダイゼーション溶液、条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
【００６６】
＜ハイブリダイゼーション溶液＞
６  ｘ  ＳＳＰＥ／１０％  Ｆｏｒｍ  ａｍｉｄｅ／Ｔａｒｇｅｔ  （２ｎｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ全量）
（６ｘＳＳＰＥ：ＮａＣｌ  ９００ｍＭ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ  ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ６ｍＭ、ｐ．Ｈ．７．４）
＜ハイブリダイゼーション条件＞
６５℃  ３ｍｉｎ→９２℃  ２ｍｉｎ→４５℃  ３ｈｒ→Ｗａｓｈ  ２ｘＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ  ａｔ  ２５℃→Ｗａｓｈ  ２  ｘ  ＳＳＣ  ａｔ  ２０℃→（Ｒｉｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｈ２Ｏ：Ｍａｎｕａｌ）→Ｓｐｉｎ  ｄｒｙ
＜微生物の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後のＤＮＡマイクロアレイを図３の装置を用いて蛍光画像の撮像を行った。この結果得られたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の蛍光画像を図７に示す。ここでプローブのスポットについて蛍光輝度を数値化することで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの存在の有無を判定する。なお、この判定は目視によっても可能であるが、感染症の原因菌の各々に対応した基準パターンをデータベースに蓄積しておき、取得画像とその基準パターンとの比較により自動的に判定する構成としても良い。このような画像解析技術は公知なものを適用可能である。
【００６７】
図８はセンサ画素不良の検出方法を説明するものであり、図１の１０１の詳細説明にあたる。８０１はセンサの全ての画素が飽和するよう十分な時間、センサを露光して撮像した白画像である。この白画像から飽和していない白以外の値を持つ画素を不良画素として検出する。８０２はセンサに光が入らないよう光を遮断した状態で撮像した黒画像である。同様にこの黒画像から暗電流等によるノイズ成分よりも大きな黒以外の値を持つ画素を不良画素として検出する。８０３は８０１の白画像と８０２の黒画像から検出した不良画素の情報を組み合わせた画素不良情報である。これらの画素不良情報の例を表１２に示す。画素不良情報は番号、Ｘ座標、Ｙ座標の画素位置情報であらわされる。図１の１０１と１０２の処理は適時行うことができ、センサ画素不良情報を更新することができる。
【００６８】
【表１２】
2008039564.tif 000015
【００６９】
図９はＤＮＡマイクロアレイのスポットエリア重要度を説明するものである。スポットの中心座標（ｘ１，ｙ１）からスポット輝度を計測する場合の使用頻度が高い中心付近のエリアをＲ１とし、Ｒ１を設定するための円の直径を輝度径とする。Ｒ１を除くスポットのエリアをＲ２とし、Ｒ２を設定するための円の直径をスポット径とする。スポット外周辺の一定範囲のバックグラウンドエリアをＲ３とし、Ｒ３を設定するための円の直径をＢＧ径とする。なお、スポットの中心座標（ｘ１、ｙ１）はＤＮＡマイクロアレイ上でのスポッティング精度が高ければ予め固定値として良い。なお、スポット径はＤＮＡマイクロアレイ作成時のＤＮＡ溶液量から決定される。輝度径はスポット径より小さい範囲でスポット輝度計測に使用する値を設定する。ＢＧ径はスポット径より大きい範囲でバックグラウンド輝度計測に使用する値を設定する。これらの値はメモリ２０３に記憶されている。
【００７０】
図１の１０３でメモリ２０３から取り込まれるスポット情報には、表１３の例に示す輝度径、スポット径、ＢＧ径と、表１４の例に示すスポットの中心座標、および表１５の例に示すプローブの重要度情報が含まれる。スポットの中心座標はＤＮＡマイクロアレイの基準点からの距離とする。プローブの重要度情報はＤＮＡマイクロアレイのプローブの重要度に応じてスポットに係数を設定し、より重要なスポットの係数を高くする。
【００７１】
また、センサ１画素に対応する撮像サイズ［μｍ］はセンサ１画素のサイズを撮像倍率で除した値になる。例えば、センサ１画素のサイズ６．７μｍ撮像倍率２．６倍で撮像した場合、
１画素の撮像サイズ＝６．７μｍ÷２．６倍≒２．５８μｍとなる。
【００７２】
輝度径、スポット径、ＢＧ径のサイズ［μｍ］と対応する画素数［画素］を表１６に示す。
【００７３】
センサ画素不良位置とＤＮＡマイクロアレイのスポットエリアの座標合わせは次のように行う。最初に、センサ上に投影されたＤＮＡマイクロアレイの撮像（＝撮像エリア）の左上に位置する基準プローブ（ポジティブコントロールプローブ）に対応した画素を撮像基準画素とし、ＤＮＡマイクロアレイの基準点と一致させる。次に、センサ画素不良の位置がＤＮＡマイクロアレイ上のどの領域に相当するかを計算する。このとき、センサ１画素に対応する撮像サイズ［μｍ］によって計算する。最後に上記センサ画素不良の領域がスポットエリアに含まれるかどうかを計算する。表１２のセンサ画素不良情報を使用した座標合わせの例を表１７に示す。ここでは、撮像基準画素の座標をＸ：３００  Ｙ：２００、１画素のサイズを２．５８［μｍ］として計算している。
【００７４】
【表１３】
2008039564.tif 000016
【００７５】
【表１４】
2008039564.tif 000017
【００７６】
【表１５】
2008039564.tif 000018
【００７７】
【表１６】
2008039564.tif 000019
【００７８】
【表１７】
2008039564.tif 000020
【００７９】
図１０はセンサ画素とスポットエリアの対応を説明するためのものである。センサ画素の領域がスポットエリア（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）の円に少しでも含まれている、または接している場合に該当するスポットエリアの画素と判定される。また、どのスポットエリアに含まれるかはＲ１、Ｒ２、Ｒ３の優先順で判定される。例えば、中心Ｐ座標（Ｐｘ，Ｐｙ）、半径ｒとしたときのスポットエリアＲ１の円領域を式１、センサ画素の一つを点Ａ座標（ｘ１，ｙ１）、点Ｂ座標（ｘ１，ｙ２）、点Ｃ座標（ｘ２，ｙ２）、点Ｄ座標（ｘ２，ｙ１）を結ぶ正方形の領域とした場合のそれぞれの線分を式２、３、４、５に示す。円Ｒ１にそれぞれの線分のうち一つでも含まれる、または接するものがあった場合、その画素はＲ１エリアと判定される。
【００８０】
【数２】
2008039564.tif 000021
【００８１】
【数３】
2008039564.tif 000022
【００８２】
【数４】
2008039564.tif 000023
【００８３】
【数５】
2008039564.tif 000024
【００８４】
【数６】
2008039564.tif 000025
【００８５】
次に表１７番号１の不良画素が表１４Ｓｐｏｔ１のＲ１のスポットエリアに含まれているかどうかの計算例を示す。まず、線分ＡＢがＲ１に含まれているかどうかを計算する。Ｓｐｏｔ１の中心点の座標を（５０，８０）、半径（２５÷２）とした場合のＲ１の円領域を式６に示す。また、不良画素の点Ａの座標を（４３．８６，７４．８２）、点Ｂの座標を（４３．８６，７７．４０）とした場合の線分ＡＢを式７に示す。
【００８６】
【数７】
2008039564.tif 000026
【００８７】
【数８】
2008039564.tif 000027
【００８８】
式７のＸ＝４３．８６を式６に代入すると、下記に示す解が得られる。
【００８９】
【数９】
2008039564.tif 000028
【００９０】
Ｙは７４．８２から７７．４０の間の値をとるため、この不良画素はＳｐｏｔ１のＲ１のスポットエリアに含まれていると判定される。この例では同様に線分ＤＣ、ＡＤ、ＢＣについて計算を行った場合も円Ｒ１に含まれている解が得られる。
【００９１】
図１１はＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像の撮像エリアを説明するものである。センサのＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像の検出可能エリアにおいて、よりノイズによる影響が少ないとされる中央部を検出エリアとする。検出エリア内で撮像エリアを１画素ずつシフトして、すべての位置の撮像エリアにおいてセンサ画素不良のスコア計算を行う。このとき、撮像基準画素をＤＮＡマイクロアレイの基準点と一致させて一画素ずつシフトさせる。そして、スコアが最小となる位置の撮像エリアを選択する。もし、スコアが最小となる位置が複数ある場合、センサの検出エリアの中心から最も近い位置の撮像エリアを選択する。
【００９２】
図１２はセンサ画素不良のスコア計算例を説明するものである。表１２のセンサ画素不良情報と表１３、表１４、表１５のスポット情報を使用してスコアを計算する。Ｒ１に不良画素があった場合を１０ポイント、Ｒ２に不良画素があった場合を５ポイント、Ｒ３に不良画素があった場合を１ポイントとしたときのスコア計算結果例を示す。
【００９３】
【数１０】
2008039564.tif 000029
【００９４】
図１３はセンサとＤＮＡマイクロアレイの位置合わせを説明するものである。撮像時のＤＮＡマイクロアレイとセンサの位置合わせを正確に行うために試し撮像を行い、基準プローブの位置から基準点を認識し、現在の撮像位置を検出する。この基準プローブとしてはＤＮＡマイクロアレイ上にポジティブコントロールプローブを利用することができる。次に、センサ画素不良スコアが最小となる撮像位置を得るまでＤＮＡマイクロアレイ支持基盤の移動、蛍光画像の取得、スコア計算を繰り返す。
【００９５】
そして、センサ画素不良スコアが最小となる撮像位置が得られたら、その位置で取得された蛍光画像を使って画像解析（パターン解析）を行い、感染症の原因菌の判定を行う。この画像解析については公知な手法が適用可能である。
【００９６】
なお、上述の実施例では、センサ画素不良スコアが最小となる撮像位置を得るようにしているが、必ずしも最小でなくても許容できるスコア以下ならば良とするようにしても構わない。また、スコア計算は上述のアルゴリズムに限定されるものではなく、本発明の主旨を逸脱しない限りにおいて改変されたアルゴリズムでも構わない。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】本発明のセンサ画素不良回避処理の流れを示した図である。
【図２】本発明の検査装置に含まれる情報処理装置の構成を示すブロック図である。
【図３】本発明の検査装置の全体構成を示した図である。
【図４】ＤＮＡマイクロアレイ上のハイブリダイゼーションの様子を示した図である。
【図５】ＤＮＡマイクロアレイを用いたハイブリダイゼーション反応実験の実験手順全般について説明するための図である。
【図６】感染症の菌を特定するＤＮＡマイクロアレイの原理を説明するための図である。
【図７】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来のＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像を示した図である。
【図８】センサ画素不良の検出方法を説明するための図である。
【図９】ＤＮＡマイクロアレイのスポットエリア重要度を説明するための図である。
【図１０】センサ画素とスポットエリアの対応を説明するための図である。
【図１１】ＤＮＡマイクロアレイ蛍光画像の撮像可能エリアを説明するための図である。
【図１２】センサ画素不良のスコア計算例を説明するための図である。
【図１３】センサとＤＮＡマイクロアレイの位置合わせを説明するための図である。
【符号の説明】
【００９８】
３０２  暗箱
３０３  撮像装置
３０４  ＣＭＯＳセンサ
３０５  蛍光フィルター
３０６  励起光源
３０７  ＤＮＡマイクロアレイ
３０８  ＤＮＡマイクロアレイ支持基盤
【図１】
2008039564.tif 000030
【図２】
2008039564.tif 000031
【図３】
2008039564.tif 000032
【図４】
2008039564.tif 000033
【図５】
2008039564.tif 000034
【図６】
2008039564.tif 000035
【図７】
2008039564.tif 000036
【図８】
2008039564.tif 000037
【図９】
2008039564.tif 000038
【図１０】
2008039564.tif 000039
【図１１】
2008039564.tif 000040
【図１２】
2008039564.tif 000041
【図１３】
2008039564.tif 000042
【配列表】
2008039564000001.app