(57)【要約】【課題】焦点調整を行った後の蛍光検出時に焦点のずれが生じることを抑え、精度良く蛍光検出を行う。【解決手段】蛍光検出装置が、投影光学系２９と、焦点検出光学系３４と蛍光検出光学系３３を有する。投影光学系２９は、レーザー光源１ａからのレーザー光を集光してＤＮＡアレイ３１に照射する。焦点検出光学系３４は、レーザー光がＤＮＡアレイ３１の焦点合わせ位置に照射された際に生じる反射光を、光電変換器であるＰＭＴ１１に導く。蛍光検出光学系３３は、レーザー光がＤＮＡアレイ３１のＤＮＡプローブ３１ａに照射された際に、ＤＮＡプローブに捕捉された蛍光物質から発せられた蛍光をＰＭＴ１１に導く。蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４は、いずれか一方が穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間に選択的に位置するように切り替え可能であり、焦点検出光学系３４は蛍光検出光学系３３よりも浅い焦点深度を有する。【選択図】図１
2008039605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源からの光を集光して被検面に光を照射する投影光学系と、前記被検面に存在する蛍光物質に前記光が照射されて発生した蛍光を、蛍光フィルターを通過させて受光装置に導く蛍光検出光学系と、前記光が前記被検面により反射されて生じる反射光を前記受光装置に導く焦点検出光学系とを有し、
前記焦点検出光学系は前記蛍光検出光学系よりも浅い焦点深度を有する、蛍光検出装置。
【請求項２】
前記投影光学系は対物レンズを含み、前記蛍光検出光学系は、開口を有する蛍光検出用ピンホール部材と前記蛍光フィルターを含み、前記焦点検出光学系は、前記蛍光検出用ピンホール部材の前記開口よりも小さな開口を有する焦点検出用ピンホール部材を含み、
前記対物レンズから前記被検面までの距離を調整する焦点調整装置と、
前記対物レンズと前記被検面を、前記対物レンズから前記被検面に至る光軸に対して実質的に垂直な平面内で相対的に移動させる２次元走査装置と、
前記蛍光検出光学系と前記焦点検出光学系のいずれか一方を選択的に、前記対物レンズから前記受光装置に至る光路上に位置させて、前記焦点検出用ピンホール部材の前記開口または前記蛍光検出用ピンホール部材の前記開口が前記対物レンズの焦点位置と光学的に共役な関係になるように、前記蛍光検出光学系と前記焦点検出光学系を移動させる駆動装置と、
をさらに含む、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記蛍光検出光学系は、前記対物レンズおよび前記蛍光フィルターを通過した前記蛍光を受光装置に集光する蛍光検出用の集光レンズを含み、前記蛍光検出用ピンホール部材の前記開口と前記蛍光フィルターは前記蛍光検出用の集光レンズの光軸上に位置しており、
前記焦点検出光学系は、前記対物レンズを通過した前記反射光を受光装置に集光する焦点検出用の集光レンズを含み、前記焦点検出用ピンホール部材の前記開口は前記焦点検出用の集光レンズの光軸上に位置している、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記焦点検出光学系が前記対物レンズから前記受光装置に至る光路上に位置している状態で、前記受光装置は前記反射光の強度を求め、前記焦点調整装置は、前記光が前記被検面上に合焦するように、前記対物レンズから前記被検面までの距離を調整し、
前記蛍光検出光学系が前記対物レンズから前記受光装置に至る光路上に位置している状態では、前記２次元走査装置が前記光を前記被検面上を２次元的に走査させつつ、前記受光装置が前記蛍光を検出して、前記被検面の蛍光画像を形成する、
請求項２または３に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記焦点調整装置は、前記被検面上の、蛍光検出に寄与しない部分の複数個所において焦点検出を行い、
前記受光装置には、前記複数箇所におけるそれぞれの焦点検出データから焦点面を演算する演算装置が接続されている、
請求項２から４のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記焦点検出光学系は焦点検出鏡筒内に格納され、前記蛍光検出光学系は蛍光検出鏡筒内に格納されており、前記焦点検出鏡筒と前記蛍光検出鏡筒は、前記対物レンズと前記受光装置の間に交換可能に配置される、請求項１から５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記光源は、実質的に均一な偏光面を有するレーザー光源であり、
前記焦点検出光学系は、偏光面が前記レーザー光源の前記偏光面と直交する偏光フィルターを含む、
請求項１から６のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
前記光源は、異なる波長を有する複数のレーザー光源であり、前記受光装置に前記蛍光または前記反射光を集光する集光レンズは、前記複数の波長において同一の焦点距離を有する色消しレンズである、請求項１から７のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記受光装置が前記焦点検出光学系を介して求めた前記被検面の位置と、前記蛍光の最良像面の位置の差を記憶しておく記憶装置をさらに有する、請求項１から８のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記焦点検出光学系が前記対物レンズから前記受光装置に至る光路上に位置している状態では、前記被検面上の焦点合わせ位置にのみ前記光源からの光を導く制御装置をさらに有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項１１】
蛍光標識された被検体を第一の領域に固定した基板を載置する載置部と、前記基板に対し光源からの光を集光して被検面に光を照射する投影光学系と、前記被検面に存在する蛍光物質に前記光が照射されて発生した蛍光を、蛍光フィルターを通過させて受光装置に導く蛍光検出光学系と、前記光が前記被検面により反射されて生じる反射光を前記受光装置に導く焦点検出光学系とを有し、
前記蛍光検出時には、前記被検体と光の集光点を相対的に移動させて前記第一の領域を２次元走査し、前記焦点検知時には、前記第一の領域以外の部分に集光点を移動させて光軸方向の距離を変化させる
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床検査におけるＤＮＡ診断等に用いられる蛍光検出装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡマイクロアレイ中に検体を注入し、ＤＮＡマイクロアレイのプローブに捕捉された標識物質の発する蛍光強度を検出することによって検体の分析を行うための蛍光検出装置が用いられている。このような蛍光検出装置において高精度の蛍光検出を行うためには、励起光をＤＮＡマイクロアレイに照射する際、また、蛍光を受光装置にて受光する際に、それぞれ合焦している必要がある。そのため、このような蛍光検出装置には焦点調整装置が設けられており、公知の焦点調整装置の例としては、以下のものが挙げられる。第１の例は、操作者が蛍光強度を実際に検出しながら焦点合わせをする装置である。第２の例は、受光光学系から分岐した光路上に専用の焦点検出光学系を有し、励起光を走査させながら焦点位置を検出しリアルタイムに焦点調整を行う装置（特許文献１参照）である。第３の例は、ＤＮＡマイクロアレイ上に位置合わせマークを形成しておき、その位置合わせマークからの蛍光の強度に基づいて焦点位置を検出する装置（特許文献２参照）である。
【特許文献１】特開２００１−２４２０８１号公報
【特許文献２】特開２００１−３０５０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記した従来例のうち、操作者が蛍光強度を実際に検出しながら焦点合わせをする装置では、焦点合わせに時間がかかり、しかも熟練を要するため、再現性が悪いという問題があった。
【０００４】
専用の焦点検出光学系を用いる装置では、光路分岐装置と、蛍光検出用と焦点検出用にそれぞれ別個に設けられたセンサーおよび光学系と、リアルタイムに焦点合わせをするためのボイスコイル等の機構が必要である。したがって、構造が複雑で高価であるという問題があった。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイ上の位置合わせマークからの蛍光強度によって焦点位置を検出する装置では、褪色により蛍光強度が、時間とともに弱くなるため、正確にピント位置を検知できないという問題があった。また、蛍光検出光学系と焦点検出光学系の焦点深度が等しく、焦点合わせの精度が悪いという問題があった。すなわち、各光学系から、蛍光物質を捕捉した各プローブまでの距離が、被検面中の位置によって異なる場合には、全てのプローブを両光学系の焦点深度の範囲内に適正に配置することが困難である。したがって、実際の蛍光強度の変化と、ピントずれによる測定値の変動との判別が困難になり、蛍光強度の測定精度が低下するという問題があった。
【０００６】
そこで本発明の目的は、構造が簡単で安価に製造でき、焦点調整を行った後の蛍光検出時に焦点のずれが生じることを抑え、精度良く蛍光検出を行うことができる蛍光検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の蛍光検出装置は、光源からの光を集光して被検面に光を照射する投影光学系と、被検面に存在する蛍光物質に光が照射されて発生した蛍光を、蛍光フィルターを通過させて受光装置に導く蛍光検出光学系と、光が被検面により反射されて生じる反射光を受光装置に導く焦点検出光学系とを有し、焦点検出光学系は蛍光検出光学系よりも浅い焦点深度を有する。
【０００８】
また、本発明の蛍光検出装置は、蛍光標識された被検体を第一の領域に固定した基板を載置する載置部と、基板に対し光源からの光を集光して被検面に光を照射する投影光学系と、被検面に存在する蛍光物質に光が照射されて発生した蛍光を、蛍光フィルターを通過させて受光装置に導く蛍光検出光学系と、光が被検面により反射されて生じる反射光を受光装置に導く焦点検出光学系とを有し、蛍光検出時には、被検体と光の集光点を相対的に移動させて第一の領域を２次元走査し、焦点検知時には、第一の領域以外の部分に集光点を移動させて光軸方向の距離を変化させる構成であってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の蛍光検出装置は、焦点深度の深い蛍光検出光学系と焦点深度の浅い焦点検出光学系を有している。焦点深度の浅い焦点検出光学系を用いて高精度に焦点位置を合わせた後に、焦点深度の深い蛍光検出光学系を用いて蛍光検出を行うため、蛍光検出時に受光装置へ至る光が、深い焦点深度の範囲内から外れるおそれが非常に小さくなる。これにより、装置の構造を複雑にしなくても、距離が均一でない被写体を用いる場合にも焦点ずれが問題にならずに精度良く蛍光強度を検出することができる。
【００１０】
また、本発明の蛍光検出装置は、蛍光検知領域以外の位置に光学系を固定して励起光の反射光を用いて焦点検知を行うため、蛍光標識を褪色させることなく、共通の検出器を用いた簡単な構成で正確な焦点検出が可能になり、精度良く蛍光強度を検出することができる
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して詳細に説明する。
【００１２】
（蛍光検出装置の構成）
図１は、本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるＤＮＡアレイスキャナーの構成図である。このＤＮＡアレイスキャナーは、レーザー光源１ａ，１ｂと、波長分離ミラー２と、穴明きミラー３と、ミラー４と、対物レンズ５とから構成されているレーザー光投影光学系２９を有している。レーザー光源１ａ，１ｂの光軸上には、開閉可能なシャッター２７，２８がそれぞれ配置されている。シャッター２７，２８は必要に応じて開閉してレーザー光の通過と遮断を切り替える制御装置である。レーザー光源１ａの偏光面と、レーザー光源１ｂの偏光面はほぼ一致するように調整されている。波長分離ミラー２はレーザー光源１ａの光軸とレーザー光源１ｂの光軸の交点に位置している。波長分離ミラー２は、レーザー光源１ａから出射する波長λaの光は透過し、レーザー光源１ｂから出射する波長λbの光は反射する分光特性を有し、両レーザー光源１ａ，１ｂからの光をいずれも穴明きミラー３およびミラー４へ導く。ミラー４による反射方向に対物レンズ５が位置し、ミラー４と対物レンズ５は、主走査駆動装置６および駆動ベルト７に駆動されて一体的にＸ方向に往復運動可能である。
【００１３】
穴明きミラー３の反射方向の光軸近傍には、２つの受光光学系が配置されている。一方の受光光学系は、蛍光フィルター８と、蛍光検出用の集光レンズ９と、蛍光検出用のピンホール部材（共焦点絞り）１０とから構成されている蛍光検出光学系３３である。他方の受光光学系は、偏光フィルター（偏光板）１２と、焦点検出用の集光レンズ１３と、焦点検出用のピンホール部材（共焦点絞り）１４とから構成されている焦点検出光学系３４である。この蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４は、選択的に、穴明きミラー３の反射方向の光軸上に位置するように、不図示の駆動装置によって移動可能である。図示しないが、蛍光検出光学系３３は蛍光検出鏡筒内に格納され、焦点検出光学系３４は焦点検出鏡筒内に格納されて、それぞれ鏡筒ごと移動して切り替えられる構成であってもよい。偏光フィルター１２は、レーザー光源１ａ，１ｂの偏光面を有する光を遮断するように角度が調整されて配置されている。
【００１４】
蛍光検出光学系３３が穴明きミラー３の反射方向の光軸上に位置している状態（図１参照）では、蛍光検出用のピンホール部材１０の開口（ピンホール）が対物レンズ５の焦点位置とほぼ共役関係にある。焦点検出光学系３４が穴明きミラー３の反射方向の光軸上に位置している状態（図５参照）では、焦点検出用のピンホール部材１４の開口（ピンホール）が対物レンズ５の焦点位置とほぼ共役関係にある。焦点検出用のピンホール部材１４の開口は蛍光検出用のピンホール部材１０の開口よりも小さい。
【００１５】
穴明きミラー３の反射方向の光軸上であって、蛍光検出光学系３３または焦点検出光学系３４を通過した位置に、光電変換器であるＰＭＴ１１が設けられている。ＰＭＴ１１には、増幅回路１５と、画像ボード１６と、モニター１７が接続されている。これらを総称して、ここでは受光装置という。なお、画像ボード１６は、画像メモリー１８、ＭＰＵボード１９、メモリー（記憶装置）２０、キーボード２１、およびマウス２２とともに、システムバス２３に接続されている。
【００１６】
対物レンズ５の光軸上には、基準位置にカセット３０を配置可能なカセット置台２４が設けられている。カセット置台２４と対物レンズ５の距離を調節するための焦点調整装置２４ａが設けられており、カセット置台２４上のカセット３０は、焦点調整装置２４ａによって、対物レンズ５の光軸上をＺ方向（図１上下方向）に往復移動可能である。また、カセット置台２４は、副走査駆動装置２５によって、ガイドレール２６に沿ってＹ方向（図１の紙面に対して垂直な方向）に移動可能である。一方、ミラー４および対物レンズ５は、主走査駆動装置６およびベルト７によってＸ方向（図１左右方向）に移動可能である。すなわち、主走査駆動装置６およびベルト７と、副走査駆動装置２５およびガイドレール２６によって、カセット置台２４上のカセット３０と対物レンズ５とを相対的に２次元的に移動させるＸＹ走査装置（２次元走査装置）が構成されている。
【００１７】
図２は、カセット３０を拡大して示す図である。カセット３０の下面にあたる位置にはＤＮＡアレイ３１が設けられ、ＤＮＡアレイ３１の上面には多数のＤＮＡプローブ３１ａが設けられている。この面が被検面となる。ＤＮＡアレイ３１とカセット３０の上面の間には、標識された検体が注入された時にＤＮＡプローブ３１ａとの間でハイブリダイゼーション反応が行われる反応場となるチャンバー３２が形成されている。
【００１８】
（蛍光検出方法）
次に、このような構成のＤＮＡアレイスキャナーを用いて、ＤＮＡアレイ３１のＤＮＡプローブ３１ａに捕捉された検体の蛍光標識から発せられる蛍光の強度を測定する方法について、図３のフローチャートを参照して説明する。
【００１９】
まず、操作者はカセット３０を、蛍光標識された検体とのハイブリダイゼーション反応が完了したＤＮＡプローブ３１ａを有するＤＮＡアレイ３１が対物レンズ５側に位置するように、カセット置台２４上に配置する（ステップ１０１）。
【００２０】
そして、ＤＮＡアレイ３１の下面（裏面）からレーザー光（励起光）を照射して蛍光画像の取得を行うが、その前に、カセット３０毎に焦点合わせを行わなければならない。これは、ＤＮＡアレイ３１をカセット置台２４の基準位置に当接させてカセット３０を配置しても、ＤＮＡアレイ３１の板厚や平行度の誤差の影響により、ＤＮＡプローブ３１ａから対物レンズ５までの距離に誤差が生じるからである。
【００２１】
そこで、操作者は、モニター１７の画面を見ながら、標識として用いられた蛍光材の励起波長に応じてレーザー光源１ａ，１ｂのいずれかを選択し（ステップ１０２）、スタートボタン１７ａをクリックする。これにより、ＭＰＵボード１９は、以下に記す焦点検出動作（ステップ１０３）を開始する。
【００２２】
（焦点検出）
焦点検出動作（ステップ１０３）について図４のフローチャートを参照して説明する。
【００２３】
まず、ＭＰＵボード１９が、不図示の駆動装置を作動させて、図５に示すように焦点検出光学系３４を穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間に位置させる（ステップ１０３ａ）。また、主走査駆動装置６と副走査駆動装置２５を駆動して、対物レンズ５とＤＮＡアレイ３１の相対位置を調整する。それによって、励起光であるスポット光が、図６に示すＤＮＡアレイ３１上の、多数のＤＮＡプローブ３１ａが配置されている領域（第一の領域）の外側に位置する第１の焦点合わせ位置３１ｂに照射されるようにする（ステップ１０３ｂ）。なお、図６では、多数のＤＮＡプローブ３１ａが配置されている領域全体を符号３１ａで概略的に示している。それから、焦点調整装置２４ａによりカセット置台２４を移動して、あらかじめ設定されたＺ方向走査開始位置にカセット３０を位置させる。さらに、ＰＭＴ１１のゲインをメモリー２０より読み出し、焦点検出用の値に設定する（ステップ１０３ｃ）。
【００２４】
次に、レーザー光源１ａまたは１ｂからレーザー光を照射する。具体的には、前記したように、標識として用いられた蛍光材の励起波長に応じたレーザー光源を選択する。レーザー光源１ａを選択した場合にはシャッター２７を開き（ステップ１０３ｄ）、レーザー光源１ｂを選択した場合にはシャッター２８を開く。なお、以下の説明ではレーザー光源１ａを選択した場合について述べるが、レーザー光源１ｂが選択された場合の動作も実質的に同じである。
【００２５】
レーザー光源１ａから出射された平行光であるレーザー光は、波長分離ミラー２を透過し、穴明きミラー３の開口部３ａを通り、ミラー４により反射され、対物レンズ５に入射する。そして、このレーザー光は対物レンズ５によってＤＮＡアレイ３１の焦点合わせ位置３１ｂ付近に集光させられる。焦点合わせ位置３１ｂで反射された光（反射光）は、対物レンズ５を通って平行光にされ、ミラー４により反射され、穴明きミラー３の開口部３ａの周囲の部分により下方に反射され、偏光フィルター１２に達する。偏光フィルター１２に到達した光のうち、ＤＮＡアレイ３１による鏡面反射成分は偏光フィルター１２によって遮断される。偏光フィルター１２によって遮断されなかった光（拡散反射成分）は、集光レンズ１３によって焦点検出用ピンホール部材１４の開口に集光され、この開口を通過してＰＭＴ１１に至る。ＰＭＴ１１に入射した光は電気信号に変換され、電気信号は増幅回路１５で増幅され、画像ボード１６によりデジタルデータに変換されてメモリー２０に記憶される。
【００２６】
こうして、メモリー２０に記憶されたデジタルデータに基づいて、焦点調整装置２４ａにより、対物レンズ５とＤＮＡアレイ３１の距離、すなわち焦点位置を調整する。具体的には、予めメモリー２０に記憶されている焦点検出時のＺ方向走査開始点ＺsとＺ方向走査終了点Ｚeと移動ステップＺincのデータに基づいてカセット置台２４をＺ方向（図５上下方向）に移動させる。カセット置台２４を走査開始点Ｚsから走査終了点Ｚeまで移動ステップＺincずつ断続的に移動させつつ、その都度、ＤＮＡアレイ３１による反射光の拡散反射成分をＰＭＴ１１に入射させる。そして、増幅回路１５および画像ボード１６を介してデジタルデータを得てメモリー２０に記録する。このデジタルデータにより、Ｚ方向の各位置に対応した光強度の情報が得られる。Ｚ位置と光強度の関係の一例を図７に示しており、図７の横軸はカセット３０のＺ方向の位置であり縦軸は光強度である。
【００２７】
焦点検出用のピンホール部材１４の開口は、対物レンズ５の焦点位置とほぼ共役関係にあり、その開口径は対物レンズ５を通って照射されるスポット光の像よりも小さくなるように形成されている。したがって、ＤＮＡアレイ３１の表面と対物レンズ５の焦点位置とが一致したときに、焦点検出用のピンホール部材１４を通過してＰＭＴ１１に達する光量が最大になる。Ｚ方向の走査範囲を適切に設定すると、図２に示すＤＮＡアレイ３１の裏面３１ｒと、ＤＮＡアレイ３１の表面において、それぞれ光量のピークを示す。図７では、一方のピーク（Ｚ＝Ｚｆの位置）がＤＮＡアレイ３１の表面の位置を示し、他方のピーク（Ｚ＝Ｚｒの位置）がＤＮＡアレイ３１の裏面３１ｒの位置を示している。したがって、Ｚ＝Ｚｆの光量のピークを示す位置にカセット３０の高さを決定すれば、ＤＮＡアレイ３１の表面の位置に、スポット光の焦点を合せることができる。
【００２８】
なお、反射強度の強いカセットの裏面３０ｒ（図２参照）がＺ方向の走査範囲に含まれている場合には、ＤＮＡアレイの表面と、ＤＮＡアレイ３１の裏面３１ｒと、カセット３０の裏面３０ｒとに対応する３点においてそれぞれ光量のピークを示す。したがって、２つめのピークを示す位置にカセット３０の高さを決定すれば、ＤＮＡアレイ３１の表面にスポット光の焦点を合わせることができる。しかし、ＤＮＡアレイ３１の形状および寸法の誤差は、ＤＮＡアレイ３１の裏面３１ｒからカセット３０の裏面３０ｒまでの距離に対して十分小さい。従って、図７に示すように、カセットの裏面３０ｒを含まないようにＺ方向の走査範囲を設定すると、効率良く焦点位置を求めることができる。
【００２９】
以上のようにして焦点合わせ位置３１ｂにおけるＺ方向の焦点位置を求めて、そのＺ方向の座標をメモリー２０に記憶する（ステップ１０３ｅ）。そして、シャッター２７を一旦閉じる（ステップ１０３ｆ）。
【００３０】
次に、主走査駆動装置６およびベルト７と、副走査駆動装置２５およびガイドレール２６からなる２次元走査装置（ＸＹ走査装置）を作動させる。それによって、対物レンズ５の光軸が、ＤＮＡアレイ３１のもう１つの焦点合わせ位置３１ｃに位置するように位置調整する（ステップ１０３ｇ）。シャッター２７を開き（ステップ１０３ｈ）、再びカセット置台３１をＺ方向の走査開始点Ｚsから走査終了点Ｚeまで移動ステップＺincずつ断続的に移動させ、その都度、ＤＮＡアレイ３１による拡散反射成分をＰＭＴ１１に入射させる。そして、各位置に対応した出力値を求め、前記した焦点合わせ位置３１ｂの焦点位置検出と同様な方法で、焦点合わせ位置３１ｃの焦点位置検出を行う（ステップ１０３ｉ）。シャッター２７を閉じ（ステップ１０３ｊ）、ＰＭＴ１１のゲインをリセットする（ステップ１０３ｋ）。
【００３１】
このように、２つの焦点合わせ位置３１ｂ，３１ｃにおいて反射光量のピークを求め、それぞれのＺ方向の焦点位置Ｚａ，Ｚｂを求めたら、その中間位置Ｚｃ＝（Ｚａ＋Ｚｂ）／２を算出する。この中間位置Ｚｃは、ＤＮＡアレイ３１の表面を表しているが、蛍光画像を取得するための最良像面とは限らない。ＤＮＡプローブ３１ａに捕捉されている蛍光標識は、ＤＮＡアレイ３１の表面から一定の距離だけ離れて位置しており、さらに、蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４の調整誤差、および、励起光と蛍光の波長差による色収差があるからである。焦点検出光学系３４により求めた中間位置Ｚｃと最良像面との誤差（ずれ量）は常に一定量であるため、あらかじめこのずれ量δＺをメモリー２０に記憶しておくことができる。そして、このずれ量δＺをメモリー２０から読み出して、前記したように求めた中間位置Ｚｃに加算して、補正位置Ｚｃ＋δＺを算出する（ステップ１０３ｌ）。焦点調整装置２４ａによって、カセット３０をこの補正位置Ｚｃ＋δＺに移動させる（ステップ１０３ｍ）。なお、このずれ量δＺは、レーザーの波長毎に設定しておくとさらに精度が向上する。このように複数の焦点合わせ位置３１ｂ，３１ｃにおけるそれぞれの焦点検出データから最適焦点面を求めるための様々な計算は、ＭＰＵボード１９に含まれている演算装置によって行われる。
【００３２】
本実施形態では、図６に示すようにＤＮＡプローブ３１ａが設けられている領域の外部に焦点合わせ位置３１ｂ，３１ｃを設けて焦点検出を行う。本来、ＤＮＡプローブ３１ａが設けられている領域の真中で焦点調整を行うと、最も高精度の焦点合わせが行える。しかし、蛍光検出前のＤＮＡプローブ３１ａに光を当てると、退色により蛍光が弱められるという現象が発生する。したがって、焦点調整時に光が照射されたＤＮＡプローブ３１ａと、光が照射されていないＤＮＡプローブ３１ａとが混在すると、両ＤＮＡプローブ３１ａの間に蛍光強度の測定誤差が生じる。このため本実施形態では、焦点検出時にはＤＮＡプローブ３１ａに光が当たらないように、ＤＮＡプローブ３１ａが設けられている領域の外部に焦点合わせ位置３１ｂ，３１ｃを設けている。また、本実施形態においては、ＤＮＡアレイ３１上の２点で焦点検出を行ったが、より多くの点で測定をおこなうことにより精度が向上することはいうまでもない。
【００３３】
なお、焦点検出光学系３４が穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間に位置している状態では、シャッター２７は、レーザー光が対物レンズ５から焦点合わせ位置３１ｂ，３１ｃに導かれる時にのみ開き、それ以外は閉じる制御装置として働く。
【００３４】
（蛍光検出動作）
次に蛍光検出動作（ステップ１０４、図３参照）を行う。この蛍光検出動作の蛍光画像スキャンのフローチャートを図８に示している。
【００３５】
蛍光検出を行うにあたって、メモリー２０にあらかじめ記憶されている蛍光検出用のＰＭＴ１１のゲインを読み出して設定する（ステップ１０４ａ）。そして、図１に示すように蛍光検出光学系３３を穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間の光軸上に配置する（ステップ１０４ｂ）。図９に示す２次元（ＸＹ方向）走査の開始位置３１ｓにスポット光を照射するように、２次元走査装置（ＸＹ走査装置）を駆動する。蛍光検出光学系３３の移動とカセット３０の相対位置調整の間は、ＤＮＡプローブ３１ａへの光の照射を避けるために、シャッター２７を閉じてレーザー光を遮断しておく。
【００３６】
そして、シャッター２７を開き（ステップ１０４ｃ）、ＤＮＡアレイ３１上をＸＹ方向にレーザー光を走査しつつ、蛍光の光強度を求める（ステップ１０４ｄ）。図９は、ＤＮＡアレイ３１上を２次元走査する（第一の領域を２次元走査する）時の軌跡３１ｐを示している。ＸＹ方向の走査開始点３１ｓから方向転換点３１ｔまでは、主走査駆動装置６を駆動して対物レンズ５とミラー４を移動する。そのとき副走査駆動装置２５は停止している。主走査駆動装置６が方向転換点３１ｔを通過したことを検出すると、副走査駆動装置２５を駆動して対物レンズ５とミラー４をＹ方向に１ライン分移動させて停止させる。それとともに、主走査駆動装置６を減速させて逆転させ、Ｘ方向の反対側への駆動を開始する。このようにして、次のラインの端部の点３１ｕから端部の点３１ｖまで対物レンズ５とミラー４をＸ方向へ移動させる。このような対物レンズ５とミラー４のＸ方向の走査とＹ方向の走査を繰返して、レーザー光を、ＤＮＡアレイ３１上を走査開始点３１ｓから走査終了点３１ｅまで走査する。
【００３７】
レーザー光源１ａからのレーザー光（励起光）は、ＤＮＡアレイ３１上を走査される間、ＤＮＡプローブ３１ａの位置に集光する。複数のＤＮＡプローブ３１ａは、チャンバー３２内に蛍光標識された検体が注入されてハイブリダイゼーション反応が行われた際に、それぞれ様々な割合で検体と結合している。蛍光標識された検体と多く結合しているＤＮＡプローブ３１ａほど強い蛍光を発する。すなわち、蛍光光量を測定することによりそれぞれのＤＮＡプローブ３１ａに結合している検体の量を求めることができる。
【００３８】
前記したようにレーザー光を走査すると、レーザー光によって励起された蛍光物質は蛍光を発する。この蛍光とレーザー光は、ＤＮＡアレイ３１の基板によって反射される。この反射光は、前記した焦点検出工程と同様に、対物レンズ５を通って略平行光にされ、ミラー４により反射され、穴明きミラー３の開口部３ａの周囲の部分により下方に反射され、蛍光フィルター８に達する。蛍光フィルター８は、レーザー光の波長を遮断し蛍光のみを透過する特性を有しているため、蛍光のみが、集光レンズ９によって蛍光検出用のピンホール部材１０の開口に集光され、この開口を通過してＰＭＴ１１に至る。ＰＭＴ１１に入射した蛍光は電気信号に変換され、電気信号は増幅回路１５で増幅され、画像ボード１６によりデジタルデータに変換されて画像メモリー１８に記憶される。
【００３９】
レーザー光の、走査開始点３１ｓから走査終了点３１ｅまでの走査が完了し、その間の蛍光の光強度のデータが求められて記憶されたら、シャッター２７を閉じる（ステップ１０４ｅ）。そして、ＰＭＴ１１のゲインをリセットする（ステップ１０４ｆ）。
【００４０】
レーザー光の、走査開始点３１ｓから走査終了点３１ｅまでの走査の間に、蛍光の光強度を求めた結果をモニター１７に画像表示する（ステップ１０４ｇ）。モニター１７に表示される画像の例が図１０に示されている。
【００４１】
ＤＮＡアレイ３１には、多数のＤＮＡプローブ３１ａが２次元マトリクス状に略等間隔に配列されており、図１０に白いドットで示すように蛍光像は画像の明部となって現れる。その他の部分からの蛍光は微量であるため、暗部を形成する。この画像を、ＭＰＵボード１９によって既知の画像解析手法を用いて解析することにより、各ＤＮＡプローブ３１ａの輝度をそれぞれ検出することができる。その検出結果に基づき、各ＤＮＡプローブ３１ａと蛍光標識のそれぞれの特性を考慮することによって、チャンバー３２に注入された検体の種類を判定することができる（ステップ１０５、図３参照）。
【００４２】
なお、蛍光物質は、１種類ではなく、用途に応じて複数種類用いられることがある。したがって蛍光物質に合わせて、波長の異なるレーザー光源１ｂ（図１参照）を選択することにより、異なる種類の蛍光物質に対応することができる。その場合にも、点灯するレーザー光源１ａまたは１ｂと、開閉するシャッター２７または２８が異なるのみであり、前記した一連の動作は共通である。
【００４３】
ただし、２種類の光源として固体レーザーと半導体レーザーを用いる場合にはその特性に合わせて駆動制御する必要がある。すなわち、出力が安定するまでに時間がかかる固体レーザーは、実際に画像スキャンを行うよりも所定時間だけ前に点灯して、消灯させることなく、シャッターの開閉を制御して、焦点検出および蛍光検出を行えばよい。一方、半導体レーザーの場合には、長時間点灯し続けると、温度上昇により波長が長波長側にシフトするという性質がある。波長が長波長側にシフトすると、レーザー光が蛍光フィルター８のカットオフ波長に近づくため、レーザー光が漏れ光となって蛍光フィルター８を透過してしまい、画像のコントラストが低下する。したがって半導体レーザーを用いる場合は、レーザーの点灯時間をできるだけ短くするため、必要なときにのみレーザー光源をオンするように制御するとよい。
【００４４】
蛍光フィルター８は、基体上に屈折率の異なる誘電体を何層も蒸着した、いわゆる干渉フィルターからなる構成である。干渉フィルターの特性として、光の入射角により分光透過特性が異なる。そのため、様々な角度の光線が通過する光路上にこの蛍光フィルター８を配置すると、レーザー光の一部が透過して漏れ光となり、画像のコントラスト低下の原因となる。そこで、蛍光フィルター８は、図１に示すように、ほぼ全ての光線が光軸と平行である、受光光学系中の穴明きミラー３と集光レンズ７の間に配置するのがよい。
【００４５】
（焦点深度）
次に、図１１を参照して、蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４の焦点深度について説明する。図１１（ａ）は、穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間に蛍光検出光学系３３を配置した状態における、蛍光検出用ピンホール部材１０の開口像１０’を概略的に示している。この開口像１０’の直径はＣ１である。これに対し、図１１（ｂ）は、穴明きミラー３とＰＭＴ１１の間に焦点検出光学系３４を配置した状態における、焦点検出用ピンホール部材１４の開口像１４’を概略的に示している。この開口像１４’の直径は、Ｃ１よりも小さいＣ３である。本実施形態の蛍光検出光学系３３および焦点検出光学系３４は略共焦点光学系である。すなわち、投影光学系２９の対物レンズ５の焦点位置と、焦点検出光学系３４または蛍光検出光学系３３のピンホール部材１０，１４の開口は光学的に共役な関係にある。
【００４６】
図１１（ａ），（ｂ）に示すように、光ｒ１は対物レンズ５の中心領域を通ってスポット光として被写体（例えばＤＮＡアレイ３１）に投射される。投射光束は、図示しているように、対物レンズ５のレンズ径に比べてかなり細い。被写体により反射された光および被写体の発する蛍光は、下向きの矢印で図示されているように、対物レンズ５のほぼ全面を通り略平行光に変換される。
【００４７】
蛍光検出用ピンホール部材１０の開口は大きいため、蛍光検出用ピンホール部材１０に遮られずに開口を通過してＰＭＴ１１に到達するのは、合焦面を中心とした比較的広い範囲である。すなわち、この場合の焦点深度Ｃ２は深い。これは、開口像１０’の直径Ｃ１が大きいと、焦点位置から多少ずれた位置からの光も、焦点位置からの光と同様に開口を通過してＰＭＴ１１に受光されるからである。
【００４８】
一方、焦点検出用ピンホール部材１４の開口は小さいため、焦点検出用ピンホール部材１４に遮られずに開口を通過してＰＭＴ１１に到達するのは、合焦面を含むごく狭い範囲である。すなわち、この場合の焦点深度Ｃ４は、Ｃ２よりも浅い。これは、開口像１４’の直径Ｃ３が小さいと、焦点位置の直近の光しか開口を通過せず、ＰＭＴ１１により受光されないからである。
【００４９】
なお、被写体に照射される光束ｒ１のビーム径は、集光レンズ９，１３の開口数（ＮＡ（Numerical Aperture）値）に対して細いため、焦点深度Ｃ２，Ｃ４の範囲内では、そのビームウェストは略均一である。従って、絞り（ピンホール部材１０，１４）の開口径を大きくして焦点深度を深くしても解像力はあまり低下しない。
【００５０】
このように、本発明の蛍光検出光学系３３は焦点深度が深く、焦点検出光学系３４は焦点深度が浅い。焦点検出光学系３４の焦点深度が浅いため、焦点検出時にはＤＮＡアレイ３１の表面の位置を高い精度で検出することができ、高精度に焦点合わせができる。こうして精度良く焦点調整した後に、蛍光検出に移行する。
【００５１】
図１２に示すように、ＤＮＡアレイ３１の裏面を対物レンズ５に対して精度よく配置しても、ガラス等からなるＤＮＡアレイ３１の基板は厚み誤差と傾き誤差を持っているため、ＤＮＡプローブ３１ａの位置はＤＮＡアレイ３１毎に異なる。さらに、基板の傾きによって１つのＤＮＡアレイ３１の中でも、各ＤＮＡプローブ３１ａの位置はそれぞれ異なる。本実施形態の蛍光検出光学系３３は焦点深度が深いため、最も遠くに位置するＤＮＡプローブ３１ａｆからの蛍光も最も近くに位置するプローブ３１ａｎからの蛍光も、集光レンズ９によってＰＭＴ１１上に集光する際に焦点深度Ｃ２の中に入れることができる。したがって、画像全面にわたってコントラストの高い画像が得られる。
【００５２】
ただし、焦点深度を深くするにも限界がある。すなわち、あまり焦点深度を深く設定し過ぎると、ＤＮＡプローブ３１ａからの蛍光にカセット３０の下面３０ｒの発する蛍光が混入し、画像のコントラストが低下する。また、レーザー光のビームウェストとビーム径は密接な関係があり、焦点深度を深くするに連れ、ビーム径が大きくなり、画像の解像力が低下する。したがって、必要以上に焦点深度を深くすることは画質の低下を招く。焦点深度は、ＤＮＡアレイ３１の基板の形状誤差を吸収できる最小限の深さに設定することが望ましい。そのためには、基板の形状誤差によってＤＮＡプローブ３１ａの位置がずれたとしても、そのＤＮＡプローブ３１ａの位置が効率的に焦点深度の中に収まるように焦点位置を調整する必要がある。
【００５３】
本発明においては、焦点検出光学系３４の焦点深度は浅く設定してあるため、ＤＮＡプローブ３１ａの位置を精度よく検出できる。焦点深度が浅い焦点検出光学系３４によってシビアに焦点合わせした後に、焦点深度が深く多少の誤差を許容し得る蛍光検出光学系３３によって蛍光検出を行う。したがって、焦点検出光学系３４から蛍光検出光学系３３の切り替えに伴う誤差や、その他の様々な誤差が生じたとしても、蛍光検出時に、広い焦点深度の範囲から外れるほど大きな誤差になることはほとんどない。こうして、本実施形態によると、ＤＮＡプローブ３１ａの位置を、蛍光検出時の焦点深度の範囲内に配置することが容易かつ効率的に行え、信頼性が非常に高い。
【００５４】
（偏光フィルター）
焦点検出光学系には、ＤＮＡアレイ３１の基板の表裏両面およびカセット３０の下面３０ｒにより反射された反射光が入射する。これらの反射光は、焦点検出のためのＺ方向走査時に干渉を生じ、焦点検出のために求められる反射光量の変化量に誤差を生じさせることがある。このような誤差を除くため、偏光フィルター１２が焦点検出光学系３４に、レーザー光の偏光方向と直交する向きに配置されている。すなわち、レーザー光源１ａ，１ｂの偏光面と、偏光フィルター１２の偏光面が直交している。これにより、さらに精度よく焦点を検出することができる。
【００５５】
図１に示すように、波長の異なる２種類のレーザー光源１ａ，１ｂが用いられる場合には、それぞれのレーザー光の偏光方向を調整して合わせる。これにより、どちらのレーザー光源を使った場合にも、一つの偏光フィルター１２で鏡面反射成分を取り除ける。このようにして、１つの投影光学系２９で２種類のレーザー光源を使う場合にも精度よく焦点調整できる。また、集光レンズ１３として、２種類のレーザー光の波長に対する焦点距離が略等しく設計された貼り合わせレンズ（色消しレンズ）を用いると、共通の共焦点絞り（ピンホール部材）を用いることができるため効率が良い。ただし、共通の共焦点絞りは開口径が可変であることが好ましい。
【００５６】
以上説明した実施形態では、２種類のレーザー光を用いる場合について説明したが、レーザー光の種類がさらに増えても同様にして対応可能である。
【００５７】
（ＰＭＴゲイン）
蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４は、前記した通り、フィルターと絞り径（ピンホール部材の開口径）等が異なるため、ＰＭＴ１１に達する光量も異なる。従って、光学系の切り替えに連動してＰＭＴ１１の光増幅のゲインを切換えると、アナログ／デジタル変換のダイナミックレンジを効率良く利用することができるため、蛍光画像の画質を損なうことなく、焦点検出の精度を向上することができる。表１は、３種類のレーザー光を用いる場合の、ＰＭＴゲインの設定方法の一例を示している。ここでは、ゲインは無単位の相対値として示している。
【００５８】
【表１】
2008039605.tif 000003
【００５９】
（共焦点絞り）
前記した実施形態においては、フィルターと集光レンズとピンホール部材（絞り）を一体化した２つの光学系、すなわち、蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４を切換える構成にした。焦点検出光学系３４は共焦点光学系であり、焦点検出用ピンホール部材１４の開口径（絞りの直径）はφ０．１ｍｍ程度と小さく、集光レンズ１３との偏心に厳しい精度が要求される。これに対し、焦点検出用ピンホール部材１４の開口と集光レンズ１３の位置精度さえ保証できれば、集光レンズ１３の光軸と偏光フィルター１２の偏心精度は緩くてもよい。
【００６０】
安価で精度のよい光学系を得るためには、前記した実施形態のように、集光レンズとピンホール部材を一体に構成し、さらにフィルターも一体に移動させる構成が好ましい。しかし、各ピンホール部材と各集光レンズの偏心精度が保証できるならば、焦点検出光学系３４と蛍光検出光学系３３で共通の集光レンズを用いることもできる。すなわち、１つの集光レンズを固定して配置し、ピンホール部材１０，１４とフィルター８，１２のみをそれぞれ一体的に移動させて、蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４を切換える構成にしてもよい。また、ピンホール部材１０，１４として、カメラレンズ用の絞りのような、開口径可変の絞りを用いれば、ピンホール部材１０，１４の切り替えに伴う偏心を未然に防ぐことができる。さらに、ピンホール部材１０，１４の退避用の空間を確保する必要がないため、装置全体を小型化することができる。
【００６１】
なお、仮に蛍光検出光学系３３と焦点検出光学系３４が共焦点光学系でないとしても、焦点検出光学系３４の焦点深度が蛍光検出光学系３３よりも浅いことは有効である。すなわち、高精度に焦点検出ができ、蛍光検出時に被検面の一部が焦点深度の範囲外になることがかなり抑えられるからである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるＤＮＡアレイスキャナーの蛍光検出状態を示す概略構成図である。
【図２】図１に示すＤＮＡアレイスキャナーによって処理される被検体であるカセットの拡大断面図である。
【図３】図１に示すＤＮＡアレイスキャナーを用いた蛍光検出方法を示すフローチャートである。
【図４】図３に示す蛍光検出方法の焦点検出動作を示すフローチャートである。
【図５】図１に示すＤＮＡアレイスキャナーの焦点検出状態を示す概略構成図である。
【図６】図２に示すカセットのＤＮＡアレイを示す拡大平面図である。
【図７】図２に示すカセットのＺ方向の位置と、検出された光強度の関係を示すグラフである。
【図８】図３に示す蛍光検出方法の蛍光検出動作を示すフローチャートである。
【図９】図６に示すＤＮＡアレイの２次元走査の経路を示す拡大平面図である。
【図１０】蛍光検出結果を表す画像の一例を示す図である。
【図１１】（ａ）は蛍光検出光学系の焦点深度を示す説明図、（ｂ）は焦点検出光学系の焦点深度を示す説明図である。
【図１２】ＤＮＡアレイ上の様々なＤＮＡプローブの位置を示す拡大正面図である。
【符号の説明】
【００６３】
１ａ，１ｂ      レーザー光源
８        蛍光フィルター
１１      ＰＭＴ（光電変換器）
２９      投影光学系
３３      蛍光検出光学系
３４      焦点検出光学系
【図１】
2008039605.tif 000004
【図２】
2008039605.tif 000005
【図３】
2008039605.tif 000006
【図４】
2008039605.tif 000007
【図５】
2008039605.tif 000008
【図６】
2008039605.tif 000009
【図７】
2008039605.tif 000010
【図８】
2008039605.tif 000011
【図９】
2008039605.tif 000012
【図１０】
2008039605.tif 000013
【図１１】
2008039605.tif 000014
【図１２】
2008039605.tif 000015