(57)【要約】【課題】マイクロアレイ実験における遺伝子発現量の解析の精度を向上させる解析方法および解析装置を提供する。【解決手段】マイクロアレイに、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応した塩基配列を有する計測プローブと、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応しない塩基配列を有するランダムプローブとを配置する。ランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲット（バックグラウンドターゲット）の量（ｔns）を求める（Ｓ３３）。バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測する。計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）からクロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求める（Ｓ３４）。【選択図】図５
2008039475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のプローブが配置されたマイクロアレイを用いてサンプル溶液中に含まれるターゲットの濃度を求めるマイクロアレイの解析方法であって、
ａ）前記マイクロアレイは、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応した塩基配列を有する複数の計測プローブと、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応しない塩基配列を有する複数のランダムプローブとを含み、
ｂ）前記マイクロアレイの解析方法は、
ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせるステップと、
各プローブの蛍光強度を測定するステップと、
前記ランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求めるステップと、
前記バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、前記計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測するステップと、
前記計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）から前記クロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求めるステップとを含む
ことを特徴とするマイクロアレイの解析方法。
【請求項２】
プローブの取り得る状態間の平衡を示すモデルを定義し、前記モデルを用いて前記バックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求め、
前記モデルにおけるプローブの状態には、プローブが溶液中でフリーである状態、プローブとバックグラウンドターゲットとが非特異的に結合した状態、及びプローブが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態が含まれる、
ことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイの解析方法。
【請求項３】
解析対象のゲノムを断片化したサンプルのみをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせるステップと、
前記ハイブリダイゼーションによるランダムプローブの蛍光強度を測定するステップと、
その測定値に基づき、前記モデルの平衡定数を求めるためのパラメータ（ｗpf、εns）を決定するステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項２記載のマイクロアレイの解析方法。
【請求項４】
プローブとターゲットの取り得る状態間の平衡を示すモデルを定義し、
前記プローブの状態には、プローブが溶液中でフリーである状態、プローブが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態、ターゲットが溶液中でフリーである状態、ターゲットが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態、プローブとバックグラウンドターゲットとが非特異的に結合した状態、及びプローブとバックグラウンドターゲットとが特異的に結合した状態が含まれ、
前記結合エネルギーは前記モデルの平衡定数を求めるためのパラメータである
ことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイの解析方法。
【請求項５】
解析対象のゲノムを断片化したサンプルと、濃度の確定したDNAとの混合液をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせるステップと、
前記ハイブリダイゼーションによる計測プローブの蛍光強度を測定するステップと、
その測定値に基づき、前記結合エネルギーを求めるためのパラメータ（ｗtf、εs）を求めるステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項４記載のマイクロアレイの解析方法。
【請求項６】
前記複数のランダムプローブの一部のプローブと、前記一部のプローブの塩基配列に対応した塩基配列を持ち、濃度の確定したＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせるステップと、
前記一部のプローブの蛍光強度を測定するステップと、
前記一部のプローブの蛍光強度の測定値と、前記ＤＮＡの濃度の確定した値とに基づき、プローブの蛍光強度とターゲット濃度間の比例定数を決定するステップと
をさらに含むことを特徴とする請求項１記載のマイクロアレイの解析方法。
【請求項７】
複数のプローブが配置されたマイクロアレイからのシグナルを解析し、サンプル溶液中のターゲットの濃度を求めるマイクロアレイの解析装置であって、
ａ）前記マイクロアレイは、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応した塩基配列を有する複数の計測プローブと、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応しない塩基配列を有する複数のランダムプローブとを含み、
ｂ）前記解析装置は、
解析に用いるモデルに関する情報を格納するデータ格納手段と、
ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせた結果得られる各プローブの蛍光強度の測定値を入力する入力手段と、
前記モデルに関する情報を用いて、前記入力した蛍光強度の測定値からターゲット濃度（ｔti）を算出する処理手段とを備え、
ｃ）前記処理手段は、
入力したランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求め、
前記バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、前記計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測し、
前記計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）から前記クロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求める
ことを特徴とするマイクロアレイの解析装置。
【請求項８】
前記データ格納手段は、プローブの取り得る状態間の平衡を示すモデルに関する情報を格納し、
前記モデルにおけるプローブの状態には、プローブが溶液中でフリーである状態、プローブとバックグラウンドターゲットとが非特異的に結合した状態、及びプローブが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態が含まれ、
前記処理手段は、前記モデルを用いて前記バックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求める、
ことを特徴とする請求項７記載のマイクロアレイの解析装置。
【請求項９】
前記処理手段は、解析対象のゲノムを断片化したサンプルのみをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせたときの、ランダムプローブの蛍光強度の測定値に基づき、前記モデルの平衡定数を求めるためのパラメータ（ｗpf、εns）を決定する
をさらに含むことを特徴とする請求項８記載のマイクロアレイの解析装置。
【請求項１０】
前記データ格納手段は、プローブとターゲットの取り得る状態間の平衡を示すモデルに関する情報を格納し、
前記プローブの状態には、プローブが溶液中でフリーである状態、プローブが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態、ターゲットが溶液中でフリーである状態、ターゲットが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態、プローブとバックグラウンドターゲットとが非特異的に結合した状態、及びプローブとバックグラウンドターゲットとが特異的に結合した状態が含まれ、
前記結合エネルギーは前記モデルの平衡定数を求めるためのパラメータである
ことを特徴とする請求項７記載のマイクロアレイの解析装置。
【請求項１１】
前記処理手段は、解析対象のゲノムを断片化したサンプルと、濃度の確定したDNAとの混合液をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせたときの、計測プローブの蛍光強度の測定値に基づき、前記結合エネルギーを求めるためのパラメータ（ｗtf、εs）を求める
ことを特徴とする請求項１０記載のマイクロアレイの解析装置。
【請求項１２】
前記処理手段は、前記複数のランダムプローブの一部のプローブと、前記一部のプローブの塩基配列に対応した塩基配列を持ち、濃度の確定したＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせたときの、前記一部のプローブの蛍光強度の測定値と、前記ＤＮＡの濃度の確定した値とに基づき、プローブの蛍光強度とターゲット濃度間の比例定数を決定する
ことを特徴とする請求項７記載のマイクロアレイの解析装置。
【請求項１３】
複数のプローブが配置されたマイクロアレイからのシグナルを解析し、サンプル溶液中のターゲットの濃度を求める処理をコンピュータに実行させるための解析プログラムであって、
ａ）前記マイクロアレイは、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応した塩基配列を有する複数の計測プローブと、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応しない塩基配列を有する複数のランダムプローブとを含み、
ｂ）前記解析プログラムは、
ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせた結果得られる各プローブの蛍光強度の測定値を入力するステップと、
入力したランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求めるステップと、
前記バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、前記計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測するステップと、
前記計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）から前記クロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求めるステップと
をコンピュータに実行させる、ことを特徴とするマイクロアレイの解析プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマイクロアレイ実験により得られたデータの解析方法及び解析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
Affymetrix社のGeneChip型をはじめとするマイクロアレイは、DNAチップとも呼ばれ、数千種のDNA/RNAの濃度を同時に、かつ定量的に計測することを可能とするものであり、ガラスやシリコン製の小基盤上にDNA分子（プローブ）を高密度に配置して形成される。
【０００３】
マイクロアレイ上のプローブと、解析対象とするターゲットとをハイブリダイゼーションさせ、各プローブから得られるシグナルを測定し、数値化して解析することで、ターゲットの濃度を知ることができる。従来より、マイクロアレイ実験におけるデータ解析技術として種々の装置及び方法が研究、開発されている（特許文献１〜３等参照）。
【０００４】
マイクロアレイを用いてトランスクリプトームのような非常に多種類のDNAの断片を測定する場合、プローブの配列に対応する相補的なターゲットではなく、その配列と部分的にマッチするさまざまなターゲットが結合（非特異的な結合、以下「クロスハイブリダイゼーション」という。）してしまうことがある。
【０００５】
このクロスハイブリダイゼーションにより、目的のターゲットがプローブに結合した真のシグナル値に加算されるため、測定値においてノイズ成分として扱われる。特にサンプル中の目的のターゲットの濃度が低い場合には、真のターゲットに起因するシグナル成分と、クロスハイブリダイゼーションの影響によるシグナル成分とを区別することが困難であり、測定結果の信頼度を下げる大きな要因となっている。
【０００６】
このような問題を解決する方法として、Affymetrix社の解析ソフトウェアに実装されている、ミスマッチプローブを用いたアルゴリズムがある。
【０００７】
Affymetrix社のGeneChip(登録商標)マイクロアレイには、目的のターゲットと相補的な配列を持つプローブ（Perfect Match (PM)プローブ）に加えて、ＰＭプローブの配列と一塩基だけ異なる配列を持ったミスマッチ(MisMatch (MM))プローブが合成されている。このアルゴリズムでは、PMプローブとMMプローブの間ではクロスハイブリダイゼーションの効果にあまり差がないと見なし、PMプローブのシグナル値からMMプローブのシグナル値を減算することで、クロスハイブリダイゼーションの影響をキャンセルできるという考えに基いている。
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−０１６１３１号公報
【特許文献２】特開２００４−０１３５７３号公報
【特許文献３】国際公開第ＷＯ２００２／００１４７７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、実際には、クロスハイブリダイゼーションの影響はPMプローブとMMプローブとでは大きく異なる場合が多いため、上記のアルゴリズムで求めた値は、必ずしもクロスハイブリダイゼーションの影響を除いたシグナルの値を適切に反映しているわけではない。その結果、その誤差が大きなノイズとして現れてしまい、データの信頼性を低下させる要因となっている。特に、濃度の低いターゲットは、測定されるシグナルがノイズに埋もれてしまうことから、従来、測定が困難であった。
【００１０】
本発明では、上記課題を解決すべくなされたものであり、その目的とするところは、マイクロアレイ実験におけるシグナル値からノイズの影響を除去することで遺伝子発現量の解析の精度を向上させる解析方法および解析装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様において、複数のプローブが配置されたマイクロアレイを用いて溶液中に含まれるターゲットの濃度を求めるマイクロアレイの解析方法が提供される。
【００１２】
その解析方法においてマイクロアレイは、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応した塩基配列を有する複数の計測プローブと、解析対象とするターゲットの塩基配列に対応しない塩基配列を有する複数のランダムプローブとを含む。
【００１３】
マイクロアレイの解析方法は以下のステップを含む：
１）ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせるステップ、
２）各プローブの蛍光強度を測定するステップと、ランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求めるステップ、
３）バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測するステップ、
４）計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）からクロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求めるステップ。
【００１４】
上記マイクロアレイの解析方法において、プローブの取り得る状態間の平衡を示すモデルを定義し、そのモデルを用いてバックグラウンドターゲットの量（ｔns）が求められてもよい。モデルにおけるプローブの状態には、プローブが溶液中でフリーである状態、プローブとバックグラウンドターゲットとが非特異的に結合した状態、及びプローブが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態が含まれてもよい。この場合、マイクロアレイの解析方法はさらに、解析対象のゲノムを断片化したサンプルのみをマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせるステップと、ハイブリダイゼーションによるランダムプローブの蛍光強度を測定するステップと、その測定値に基づき、前記モデルの平衡定数を求めるためのパラメータ（ｗpf、εns）を決定するステップとを含んでもよい。
【００１５】
または、プローブの状態には、さらに、ターゲットが溶液中でフリーである状態、ターゲットが自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれ二次構造をとっている状態、及びプローブとバックグラウンドターゲットとが特異的に結合した状態が含まれてもよい。このとき、結合エネルギーはモデルの平衡定数を求めるためのパラメータである。この場合、マイクロアレイの解析方法はさらに、解析対象のゲノムを断片化したサンプルと、濃度の確定したDNAとの混合液をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせるステップと、ハイブリダイゼーションによる計測プローブの蛍光強度を測定するステップと、その測定値に基づき、結合エネルギーを求めるためのパラメータ（ｗtf、εs）を求めるステップと含んでもよい。
【００１６】
上記マイクロアレイの解析方法において、複数のランダムプローブの一部のプローブと、一部のプローブの塩基配列に対応した塩基配列を持ち、濃度の確定したＤＮＡとをハイブリダイゼーションさせるステップと、一部のプローブの蛍光強度を測定するステップと、一部のプローブの蛍光強度の測定値と、ＤＮＡの濃度の確定した値とに基づき、プローブの蛍光強度とターゲット濃度間の比例定数を決定するステップとをさらに含んでもよい。
【００１７】
本発明の第２の態様において、複数のプローブが配置されたマイクロアレイからのシグナルを解析し、サンプル溶液中のターゲットの濃度を求めるマイクロアレイの解析装置が提供される。
【００１８】
解析装置は、解析に用いるモデルに関する情報を格納するデータ格納手段と、ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせた結果得られる各プローブの蛍光強度の測定値を入力する入力手段と、モデルに関する情報を用いて、前記入力した蛍光強度の測定値からターゲット濃度（ｔti）を算出する処理手段とを備える。処理手段は、入力したランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求め、バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測し、計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）からクロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求める。
【００１９】
本発明の第３の態様において、複数のプローブが配置されたマイクロアレイからのシグナルを解析し、サンプル溶液中のターゲットの濃度を求める処理をコンピュータに実行させるための解析プログラムが提供される。
【００２０】
解析プログラムは、ターゲットを含む溶液とマイクロアレイの各プローブとをハイブリダイゼーションさせた結果得られる各プローブの蛍光強度の測定値を入力するステップと、入力したランダムプローブの蛍光強度の測定値から、プローブに非特異的に結合するターゲットであるバックグラウンドターゲットの量（ｔns）を求めるステップと、バックグラウンドターゲットの量と各プローブの結合エネルギーとに基づき、計測プローブの蛍光強度の測定値におけるクロスハイブリダイゼーションの影響度（NSi）を予測するステップと、計測プローブの蛍光強度の測定値（Ｉmi）からクロスハイブリダイゼーションの影響度を除外して、解析対象とするターゲットの量（ｔti）を求めるステップとをコンピュータに実行させる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、解析対象のターゲットに対応しない塩基配列を持つプローブ（ランダムプローブ）の蛍光強度から、クロスハイブリダイゼーションを生じるターゲット（バックグラウンドターゲット）の量を算出し、算出したバックグラウンドターゲット量と、各プローブの結合エネルギーとに基づいて、蛍光強度におけるバックグラウンドターゲットの影響を評価し、この影響を排除した形で解析対象のターゲットの濃度を求める。この方法によれば、蛍光強度の測定値においてバックグラウンドターゲットによる影響（ノイズ）を排除できるため、真のターゲット濃度を精度よく求めることができる。特に、従来クロスハイブリダイゼーションによるノイズに埋もれて測定不能であった低い濃度のターゲットに対して、適切に評価することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、添付の図面を参照して本発明のマイクロアレイの解析方法及び解析装置の実施の形態を説明する。
【００２３】
本発明のマイクロアレイの解析方法及び解析装置は、マイクロアレイのプローブの塩基配列の結合エネルギーに基づいてクロスハイブリダイゼーション（非特異的な結合）の影響の大きさを予測し、実際の蛍光強度のシグナル値から除外することで、精度よく解析対象とするターゲットの濃度を得ることを可能とする。なお、以下の説明では、目的のターゲットの塩基配列と関係なくランダムにプローブに結合してくるようなサンプル内のRNA/DNA断片を「バックグラウンドターゲット」と呼ぶ。
【００２４】
１．マイクロアレイ
図１に、本発明のマイクロアレイ解析方法で使用するマイクロアレイのプローブ構成を示す。マイクロアレイ１０は、計測プローブ１１、ランダムプローブ１３及びコントロールプローブ１５の３種類のプローブが含まれるよう設計されている。
【００２５】
計測プローブ１１は、本来の計測に用いるための、対象となる細胞のゲノムと相補的な塩基配列をもったプローブであり、基本的に従来のマイクロアレイのプローブと同じものを用いることができる。
【００２６】
ランダムプローブ１３は、クロスハイブリダイゼーションの影響を評価するためのプローブである。ランダムプローブは、対象となる細胞のゲノム上に対応する塩基配列が含まれないように、乱数をもとに人工的に作られた配列を持つプローブである。「対象となる細胞のゲノム上に対応する配列が含まれない」ことの指標として、各ランダムプローブと、対象となる細胞のゲノムとのアライメントをとり、連続してマッチした部分配列の平均の長さがプローブ長の1/2以下となるものとする。計測するサンプル中に対応するDNA/RNAが含まれないため、このランダムプローブ１３の示す蛍光強度は完全にクロスハイブリダイゼーションの影響のみによるものと考えられる。
【００２７】
ランダムプローブ１３の一部がコントロールプローブ１５として割り当てられる。コントロールプローブ１５はシグナルの強度とターゲット濃度の絶対量とを比較するために使用される。すなわち、コントロールプローブに対して、対応する配列を持ったオリゴヌクレオチドを人工的に合成し、これを一定の濃度でサンプルに加えてコントロールプローブと結合させる。このときにコントロールプローブから得られるシグナルの強度と、対応する配列を持ったオリゴヌクレオチドの濃度の絶対量とを比較することで、シグナル強度とターゲット濃度の絶対量の相関を得る。
【００２８】
２．マイクロアレイ解析方法
以下、本発明のマイクロアレイ解析方法の詳細を説明する。
【００２９】
２．１  クロスハイブリダイゼーションの影響の評価
本発明では、まず、クロスハイブリダイゼーションによって結合するターゲットの量を予測する。具体的には、一種類のプローブに対して不特定多数のターゲットが部分的に結合する際の、結合量の総和を、それら不特定多数のターゲットの平均的な結合エネルギーの形でモデル化する。その上で、予備実験を行い、予備実験による実測値とモデルによる予測値との誤差を最小化するようにモデルの各種のパラメータを数値解析的手法で最適化して求める。そのパラメータをもとに各プローブへのクロスハイブリダイゼーションの影響を評価しながら、実際の測定値を補正する。
【００３０】
２．１．１  モデル
最初に、クロスハイブリダイゼーションによる影響を評価するためのモデルについて説明する。
【００３１】
プローブi（ｉ番目のプローブ）の塩基配列が与えられたとき、プローブiの蛍光強度を予測するためのモデルを説明する。ここでは、クロスハイブリダイゼーションの影響によるランダムプローブ１３の蛍光強度のモデルを考え、ランダムプローブ１３の塩基配列に対応する塩基配列を持つターゲットはサンプル溶液中に含まれないものとする。
【００３２】
本実施形態では、プローブの取り得る状態として、図２に示すように、溶液中でフリーな状態Pfri（図２の（ａ））、クロスハイブリダイゼーションによってバックグラウンドターゲット（非特異的なターゲット）と非特異的に結合した状態PTnsi（図２の（ｃ））、及び自己ハイブリダイゼーションによって折り畳まれた二次構造をとっている状態Ｐfoi（図２の（ｂ））の三つの状態を考える。そして、モデルにおいて以下の３つの平衡を考える。
【００３３】
−プローブの自己ハイブリダイゼーションによる直鎖／折り畳み状態の間の平衡（式（１）参照）
−プローブとターゲットとのクロスハイブリダイゼーションによる一本鎖／二本鎖の間の平衡（式（２）参照）。
【数１】
2008039475.tif 000003
【００３４】
上式の関係から次式が得られる。
【数２】
2008039475.tif 000004
【００３５】
平衡定数Ｋpfi、Ｋnsiは、それぞれの反応の自由エネルギーΔＧが与えられれば、次式で求められる。
【数３】
2008039475.tif 000005
Ｒは気体定数、Ｔはハイブリダイゼーション条件の絶対温度である。
【００３６】
マイクロアレイ１０上でサンプルとプローブが相互作用する実効的な空間の体積をvとする。プローブiの総量はｐtｖで表せる。ｐtｖはプローブの種類によらない定数であると考える。空間ｖの中でのフリー状態のプローブの実効的な濃度[Ｐfri]をｐiとし、プローブiと非特異的に相互作用するターゲット全体の実効的な濃度[Ｔns]をｔnsとおく。バックグラウンドターゲットの総量ｔnsｖはプローブiの総量ｐtｖより十分に多いと考えられるので、ｔnsは一定と見なすと、式（３）、（４）及び質量保存則より次式が得られる。
【数４】
2008039475.tif 000006
【００３７】
プローブの蛍光強度が、結合したターゲットの量[PTnsi]ｖに比例すると仮定すると、式（４）、（６）から、クロスハイブリダイゼーションによるプローブiの蛍光強度は次式で得られる。
【数５】
2008039475.tif 000007
ここで、Ｃはスケーリングの比例定数、bgは計測機器の機械的な影響によるバックグラウンドを表す。
【００３８】
Ｃ、ｐt、bgは実験に依存しない定数と考えることができる。bgの値は単純に全シグナル値の最小値であたえられ、また積Ｃ・ｐtはターゲットが過剰に存在し、プローブが飽和している場合の最大の蛍光強度に相当する。よって、バックグラウンドターゲットの量ｔnsと、プローブiのＫpfi、Ｋnsiが分かれば、予想される蛍光強度Ｉnsiを算出することができる。
【００３９】
２．１．２  折り畳み状態の自由エネルギーの評価
折り畳み状態にあるプローブの量を評価するための平衡定数Ｋpfiを計算するため、プローブの二次構造の自由エネルギーΔＧpfiを求める。先行研究により、RNAやDNAの二次構造の自由エネルギーは、与えられた塩基配列からダイナミカルプログラミングの手法を用いて予測できることが示されており（D. Mathews, J. Sabina, M. Zuker, and D. Turner. Expanded sequence dependence of thermodynamic parameters improves prediction of rna secondary structure. J. Mol. Biol., 288(5):91140, 1999.参照）、そのアルゴリズムをもとにした予測プログラムMFOLD1が公開されている。本発明ではこのプログラムを用いて各プローブのDNAの二次構造を予想し、その自由エネルギーから求めた平衡定数をプローブの二次構造の影響の評価に用いるものとする。ただし、MFOLD1で用いられるモデルは、溶液中で自由なDNA分子を対象とした実験に基づいており、マイクロアレイのプローブのような固体表面上に固定された分子とは条件が異なる、このため、本発明では、MFOLD1で求めた自由エネルギーに、重み付けの係数ｗpfを乗じた値を実際の評価に用いている。
評価に用いる自由エネルギーΔＧpfi
＝（ＭＦＯＬＤ１で求めたプローブの二次構造の自由エネルギー）×ｗpf
【００４０】
２．１．３  非特異的Nearest Neighbor モデル
非特異的に結合するプローブの量を評価するための平衡定数Ｋnsiを計算するため、プローブ／バックグラウンドターゲット間のクロスハイブリダイゼーションの結合エネルギーΔＧnsiを求める。
【００４１】
先行研究により、プローブ／ターゲット間のハイブリダイゼーションの結合エネルギーは、プローブの塩基配列からNearest Neighbor(NN) モデルと呼ばれる計算法により予測できることが知られている（J. SantaLucia. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide dna nearest-neighbor thermodynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(4):14605, 1998. 参照）。本発明ではこのモデルの考え方を拡張し、プローブと不特定多数のターゲットとが部分的に結合するその総量を、それらの平均的な結合エネルギーの形で近似的に求める。
【００４２】
本実施形態ではプローブの各塩基毎の非特異的結合エネルギーεnsをその塩基及びその前後の塩基の組み合わせに依存した量として考え、その総和で全体の結合エネルギーΔＧが求められるものとして計算する。プローブにおけるk番目の塩基の種類がbkで与えられているとすると、結合エネルギーΔＧnsは次式で得られる。
【数６】
2008039475.tif 000008
【００４３】
例えば塩基配列"ATGCTTCG"が与えられた場合、そのプローブの平均的結合エネルギーは次式のように計算する。
【数７】
2008039475.tif 000009
【００４４】
三つの塩基組み合わせは、全ての組み合わせ６４通りのうち"ATG"と"CAT"のように反転させることで同じ組み合わせと見なせる配列を同一とすると３２通りとなる。これに加えて"AT"のように配列の末端が含まれる場合を別の組み合わせとして考えると、必要なパラメータεnsは４８個となる。
【００４５】
２．２  クロスハイブリダイゼーションの影響を排除したシグナルの評価
次に、前述のクロスハイブリダイゼーションの評価モデルをもとに、実際の測定における蛍光強度からクロスハイブリダイゼーションの影響を排除したシグナル（ターゲットのハイブリダイゼーションによる蛍光強度の測定値）を求めるためのモデルを説明する。
【００４６】
２．２．１  モデル
プローブiの配列に対応するターゲットがサンプル中に含まれるとき、その蛍光強度をクロスハイブリダイゼーションの影響を含めて予測するモデルを構成する。モデルにおいて以下の４つの平衡を考える。
【００４７】
−プローブの自己ハイブリダイゼーションによる、直鎖（図２の（ａ））／折り畳み状態（図２の（ｂ））の間の平衡（式（１０）参照）
−ターゲットの自己ハイブリダイゼーションによる、直鎖（図２の（ｆ））／折り畳み状態（図２の（ｅ））の間の平衡（式（１１）参照）
−プローブと目的のターゲットとの特異的ハイブリダイゼーションによる、一本鎖（図２の（ａ）、（ｆ））／二本鎖（図２の（ｄ））の間の平衡（式（１２）参照）
−プローブとバックグラウンドターゲットとのクロスハイブリダイゼーションによる、一本鎖（図２の（ａ）、（ｇ））／二本鎖（図２の（ｃ））の間の平衡（式（１３）参照）
【数８】
2008039475.tif 000010
【００４８】
これらの状態遷移のモデルより次の関係が得られる。
【数９】
2008039475.tif 000011
【００４９】
２．１節と同様、マイクロアレイ１０上でサンプルとプローブが相互作用する実効的な空間の体積をｖ、プローブiの総量をｐtｖで表せるとし、ｐtｖはプローブの種類によらない定数であると考える。空間ｖの中でのフリー状態のプローブの実効的な濃度[Ｐfri]をｐiとおき、プローブiと非特異的に相互作用するターゲット全体の実効的な濃度[Ｔns]をｔnsとおく。投入したサンプル中のプローブiと特異的に相互作用するターゲットの濃度をｔtiとし、溶液中でフリーなターゲットの濃度をｔfriで表すとすると、式（１４）〜（１７）と質量保存則より次の関係が成り立つ。
【数１０】
2008039475.tif 000012
ただし、バックグラウンドターゲットの総量ｔnsｖはプローブiの総量ｐtｖより十分に多いと考えられるのでｔnsは一定と見なしている。プローブの蛍光強度Ｉsiは、特異的に結合したターゲットの量とクロスハイブリダイゼーションの量の和([ＰＴsi]+[ＰＴnsi])ｖに比例すると考えると、実効的な平衡定数Ｋefiを用いて式（２１）〜式（２３）で得られる。
【数１１】
2008039475.tif 000013
【数１２】
2008039475.tif 000014
【００５０】
よって、バックグラウンドターゲットの量ｔns、計測の目的となるプローブと相補的なターゲットの量ｔti、とプローブiのＫpfi、Ｋtfi、Ｋnsi、Ｋsiが分かれば、特異的ハイブリダイゼーションとクロスハイブリダイゼーションを合わせた蛍光強度Ｉsiを予想することができる。逆に、ｔti以外のパラメータの値と実際の蛍光強度Ｉsiが与えられれば、ターゲットの量ｔti、すなわち、サンプル中のターゲットの濃度を求めることができる。
【００５１】
そこで、本発明では、予備実験を行ってｔti以外のパラメータの値を事前に決定しておき、その後、蛍光強度の実測値Ｉsiから、決定したパラメータを用いてサンプル中のターゲットの濃度を求める。このようにして求めたターゲットの濃度はクロスハイブリダイゼーションの影響を排除して求められるため、精度のよい値となる。
【００５２】
２．２．２  折り畳みの自由エネルギーの評価
平衡定数Ｋtfi、を計算するため、ターゲットの二次構造の自由エネルギーΔＧtfiを求める。ターゲットとなるDNA分子は配列がプローブと相補的であるため、その二次構造は基本的にプローブの二次構造の取り方とほぼ同じとなることが予想される。ただし、実際のターゲットは長さが様々に異なる塩基配列の断片である点、溶液中で自由に運動できる点、などの条件がプローブとは異なる。そのため推定の元となるデータとしては前節と同じくプローブの配列からMFOLD1を用いて計算した二次構造の自由エネルギーの値を用いるが、重み付けの係数をｗpfの代わりにｗtfとしたものをターゲットの二次構造の自由エネルギーとする。
評価に用いる自由エネルギーΔＧtfi
＝（ＭＦＯＬＤ１で求めたターゲットの二次構造の自由エネルギー）×ｗtf
【００５３】
２．２．３  Nearest Neighbor モデル
非特異的結合の場合と同様、特異的結合によるハイブリダイゼーションの自由エネルギーは配列の組み合わせから近似的に求められるものと考える。前節でのεnsとは別にもう１組、４８個のパラメータεsを用意し、前節と同じように各塩基対からの寄与の総和として計算する。
【数１３】
2008039475.tif 000015
【００５４】
２．３  パラメータの決定手法
以上のモデルにおけるパラメータのうちｔnsを除いたｗpf、ｗtf、εs及びεnsの値は実験に依存しない定数と考えられる。このため、予備実験として以下の実験１、２を行うことによりこれらのパラメータの値を事前に決定する。以下パラメータの決定手法について説明する。
【００５５】
＜実験１＞
最初に、マイクロアレイ１０を用いて目的の細胞のゲノムを断片化したサンプルのみをハイブリダイゼーションさせ、その結果得られるランダムプローブ１３の蛍光強度に基づき、クロスハイブリダイゼーションのモデルにおけるパラメータ（ｗpf、εns）を決定する。
【００５６】
実験に用いるマイクロアレイ１０に含まれるランダムプローブ１３の本数をＮrとする。ランダムプローブ１３を含むマイクロアレイ１０を用いて目的となる細胞のサンプルを測定し、その測定で得られたランダムプローブ１３の蛍光強度をＩri (1 ≦ i ≦ Ｎr)とする。このＩriと、モデルによる予想値Ｉnsi（式（７）参照）との誤差Ｒrを考える。なお、モデルによる予想値Ｉnsiは式（７）で得られるが、式（７）において比例定数Ｃには仮の値を設定する。
【数１４】
2008039475.tif 000016
【００５７】
そして、誤差Ｒrが最小となるような、ｔns、ｗpf、及び４８個のεnsの値をニュートン法、準ニュートン法、Nelder-Mead法等の数値的最適化の手法を用いて決定する。具体的には以下のプロセスを行う。
（１）ｔns、ｗpf及びεnsに適当な初期値を与え、Ｒrを計算する。
（２）そして、Ｒrが減少するようにそれぞれのパラメータの値を変更する。
（３）再びＲrを計算する。
パラメータを変更しながら、誤差Ｒrが０に近い所定値以下になるまで（２）、（３）のプロセスをくり返し、最終的に収束した値を各パラメータの値とする。
【００５８】
以上により、パラメータｗpf、及びεnsが求まる。
【００５９】
＜実験２＞
次に、マイクロアレイに目的の細胞のゲノムを断片化したサンプルと、コントロールプローブ１５に対する濃度の確定したDNA（以下「コントロール用サンプル」という。）とを混合した溶液をハイブリダイゼーションさせ、パラメータｗtfとεsの値を最適化する。
【００６０】
（１）まず、実験２の結果得られるランダムプローブ１３の蛍光強度の実測値に基づきバックグランドターゲットの濃度を見積る。具体的には、実験１で求めたパラメータｗpf、及びεnsをもとに各プローブのＫpfi、Ｋnsiを計算し、さらに、式（２５）から求まるＲrが最小になるように、ｔnsの値を数値的最適化によって求める。このようにして求めたｔnsの値をバックグラウンドダーゲットの実効的な総量とする。
【００６１】
（２）細胞のゲノムを断片化したものの濃度を測定しているため、すべての測定プローブに対応するターゲットの濃度ｔtiは一定であると仮定することができる。実験１及び実験２の（１）で求めたパラメータの値を用いて最適なｔti、ｗtf、εsの値を求める。具体的には、次式（２６）を用いて、蛍光強度の実測値Ｉiと予想値Ｉsiとの誤差Ｒsが最小となるようにｔti、ｗtf、εsの値を最適化する。なお、予想値Ｉsiは式（２３）により与えられる。
【数１５】
2008039475.tif 000017
【００６２】
以上により、バックグラウンドダーゲットの量ｔns、並びにパラメータｗtf、及びεsが求まる。
【００６３】
（３）最後に、最適化により求めたパラメータｗtf、εsと、コントロールプローブ１５の蛍光強度の測定値とから、コントロール用サンプルの濃度を計算する。計算した濃度と、実際に投入したコントロール用サンプルの濃度とが等しくなるように、スケーリングの比例定数Ｃの値を決定する。
【００６４】
２．４  ターゲット濃度の評価
以上のようにしてパラメータを決定した後、実際にマイクロアレイの蛍光強度を測定し、その実測値Ｉmiから上記パラメータを用いて、解析対象とするターゲットの量ｔtiすなわちサンプル中のターゲットの濃度を求める。具体的には以下のとおりである。
【００６５】
（１）既に求めたパラメータｗpf、εns等に基づき各プローブの結合エネルギーΔＧpfi、ΔＧnsi、ΔＧtfi、ΔＧsiを計算する。それらの結合エネルギーから平衡定数Ｋpfi、Ｋnsi、Ｋtfi、Ｋsiを求める。
【００６６】
（２）サンプル中に対応する配列を持たないランダムプローブ１３の蛍光強度の測定値から、式（７）を用いて、バックグラウンドとして非特異的に各プローブに結合してくるバックグラウンドターゲットの量ｔnsを求める。
【００６７】
（３）各計測プローブ１１の蛍光強度の測定値Ｉmiから、バックグラウンドターゲットの量ｔnsと上記で算出した各値とを用いて、ターゲットの濃度ｔtiの値を求める。具体的には、式（２６）において、各計測プローブ１１の蛍光強度の測定値Ｉmiと、目的のターゲットによる蛍光強度の理論値Ｉsiとの差が最小となるように、ターゲットの濃度ｔtiの値を数値解析的に求める。目的のターゲットによる蛍光強度の理論値Ｉsiは、バックグラウンドのターゲット量ｔns、ステップＳ３２で求めた平衡定数、及びその他の既知の値（比例定数Ｃ等）とを用いて式（２０）〜（２３）から算出する。
【００６８】
このようにして求めたターゲットの濃度ｔtiの値は、計測プローブ１１のシグナルＩmiから、バックグラウンドターゲットの影響（ＮＳi）すなわちノイズ成分を排除したものとなり、目的のターゲットと計測プローブ１１の特異的な結合のみに依存する精度のよい値となる。
【００６９】
３．マイクロアレイ解析システム
３．１  システム構成
上記のマイクロアレイ解析方法を適用したマイクロアレイ解析システムについて説明する。図１に本発明のマイクロアレイ解析システムの構成例を示す。マイクロアレイ解析システム１００は、マイクロアレイ１０の各プローブの蛍光状態を読み取り、その画像情報を電気信号（シグナル）として出力するスキャナ２０と、スキャナ２０からの画像情報を処理する解析装置５０とを含む。
【００７０】
解析装置５０は、測定データや解析結果等を画面に表示する表示部５１と、所定のデータを格納するデータ格納部５３と、制御プログラムにしたがい解析処理を実行するプロセッサ５５と、使用者が解析装置の操作を行うための操作部５７と、スキャナ２０から画像情報を入力するスキャナインタフェース５８と、外部機器等とデータのやりとりを行う外部インタフェース５９とを含む。
【００７１】
表示部５１は液晶表示装置（LCD）等で構成され、入力データや解析結果の表示が可能である。プロセッサ５５は例えばMPUやCPUであり、所定のプログラムを実行することで解析装置５０全体の動作を制御する。操作部５７は、操作ボタン、スイッチ、キーボート、マウス等で構成され、使用者は操作部５７を介して解析装置５０の操作を行う。外部インタフェース５９は、解析装置と、ネットワークやプリンタ等の外部機器との間でデータの送受信を可能とするインタフェースである。解析装置５０は例えばパーソナルコンピュータで構成される。スキャナ２０と解析装置５０は一体化されて構成されてもよい。
【００７２】
データ格納部５３はハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体記憶装置、CD、DVD等の記録媒体で構成され、測定データ、解析結果、制御プログラム等、解析装置５０の処理に必要なデータを格納する。また、データ格納部５３は、モデル情報として前述の解析に使用するモデルに関する数式の情報やパラメータを格納する。
【００７３】
３．２  処理フロー
マイクロアレイ解析システム１００の具体的な動作について説明する。
【００７４】
３．２．１  パラメータ決定処理
図４のフローチャートを参照し、マイクロアレイ解析システム１００のパラメータ決定処理を説明する。
【００７５】
まず、目的の細胞のゲノムを断片化したサンプルのみを、マイクロアレイ１０のプローブとハイブリダイゼーションさせる（実験１）。
【００７６】
スキャナ２０によりその実験１によるランダムプローブ１３の蛍光強度が読み込まれる。プロセッサ５０は、蛍光強度の測定値を電気信号としてスキャナ２０から入力する（Ｓ１１）。入力した蛍光強度の測定値はデータ格納部５３に格納される。
【００７７】
プロセッサ５０は、入力したランダムプローブ１３の蛍光強度の測定値に基づき、式（２５）を用いた数値的最適化の手法によりパラメータ（ｗpf、εns）を決定する（Ｓ１２）。
【００７８】
次に、目的の細胞のゲノムを断片化したサンプルと、コントロールプローブ１５に対する、濃度の確定したDNA（コントロール用サンプル）とを混合した溶液を、マイクロアレイ１０のプローブとハイブリダイゼーションさせる（実験２）。
【００７９】
プロセッサ５５はその実験２による蛍光強度の測定値をスキャナ２０から入力し（Ｓ１３）、入力したランダムプローブ１３の蛍光強度の測定値と既に求めたパラメータに基づき、式（２５）を用いてバックグラウンドターゲットの濃度ｔnsを求める（Ｓ１４）。
【００８０】
プロセッサ５５は、測定した計測プローブ１１の蛍光強度と既に求めたパラメータに基づき、式（２５）を用いてパラメータ（ｗtf、εs）を決定する（Ｓ１５）。最後に、コントロールプローブ１５の蛍光強度の測定値と、コントロール用サンプルの濃度の測定値と理論値とに基づき比例定数Ｃを決定する（Ｓ１６）。以上のようにしてモデルに使用する各パラメータが決定され、データ格納部５３に格納される。
【００８１】
３．２．２  濃度解析処理
図５のフローチャートを参照し、マイクロアレイ解析システム１００の濃度解析処理を説明する。
【００８２】
目的の細胞のゲノムを断片化したサンプルをマイクロアレイ１０のプローブとハイブリダイゼーションさせる。
【００８３】
プロセッサ５５は、そのハイブリダイゼーションによるプローブの蛍光強度の測定値をスキャナ２０から入力する（Ｓ３１）。プロセッサ５５は、データ格納部５３に格納されたパラメータ（ｗpf、εns等）に基づき各プローブの結合エネルギーΔＧpfi、ΔＧnsi、ΔＧtfi、ΔＧsiを計算する（Ｓ３２）。このとき、それらの結合エネルギーから平衡定数Ｋpfi、Ｋnsi、Ｋtfi、Ｋsiを求め、データ格納部５３に格納しておく。
【００８４】
続いて、プロセッサ５５は、式（７）を用いて、サンプル中に対応する配列を持たないランダムプローブ１３の蛍光強度の測定値Ｉriから、バックグラウンドとして非特異的に各プローブに結合してくるバックグラウンドターゲットの量ｔnsを求める（Ｓ３３）。
【００８５】
プロセッサ５５は、各計測プローブ１１の蛍光強度の測定値Ｉmiと、上記で算出した各値とに基づきターゲットの濃度ｔtiの値を求める。（Ｓ３４）。具体的には、式（２６）において、各計測プローブ１１の蛍光強度の測定値Ｉmiと、目的のターゲットによる蛍光強度の理論値Ｉsiとの差が最小となるように、ターゲットの濃度ｔtiの値を数値解析的に求める。目的のターゲットによる蛍光強度の理論値Ｉsiは、バックグラウンドのターゲット量ｔns、ステップＳ３２で求めた平衡定数及びその他の既知の値（比例定数Ｃ等）とを用いて式（２０）〜（２３）から算出する。
【００８６】
求められたターゲットの濃度は表示部５１上に表示されたり、外部インタフェース５９を介してデータとして出力されたりすることができる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明のマイクロアレイ解析方法を用いた具体的な実施例を説明する。
【００８８】
４．１  マイクロアレイの設計
本実施例では、大腸菌(Escherichia coli)のゲノムをもとに設計されたカスタムアレイを用いた。このマイクロアレイには大きく分けて次の２種類のプローブが載せられている。
１）大腸菌の遺伝子(glnA, 1410bp)を14merステップでカバーした計測プローブ
２）人工的に合成した塩基配列をもとにしたランダムプローブ
【００８９】
４．２  ランダムプローブの作成
このマイクロアレイに用いたランダムプローブの設計の手順を説明する。
１）Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのそれぞれのアルファベットが確率１／４で現れるような長さ２５の文字列を１０００種類、乱数を用いて生成する。
【００９０】
２）先行研究（J. SantaLucia. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide dna nearest-neighbor thermodynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(4):14605, 1998. 参照）のNearest Neighborモデルを用いて、各配列のハイブリダイゼーションの自由エネルギーを計算する。
【００９１】
３）１）で生成した配列の中から、２）で計算した自由エネルギーが、-28±0.5 kcal/mol, -32±0.5 kcal/mol, -36±0.5 kcal/molの三つの範囲に含まれるものをそれぞれ50本ずつ、計150本選び出す。もし、１つの範囲において、選び出した配列が50本に満たなければ、1)に戻って配列を追加する。
【００９２】
４）３）で得られた150本の配列をもとに、文字を左端から１文字削除したもの、２文字削除したもの・・・のように、１１文字目まで削除した長さ１４の配列まで、もとの配列と合わせて合計1800本の配列を生成する。
【００９３】
５）４）で作成した1800本の配列それぞれに対して、3’末端から5’までの各塩基に一塩基ずつ置換した、ミスマッチ配列を合成し、計110700本のプローブとする。
【００９４】
また、この実験では３）で生成した150本の各配列に相補的な25merのオリゴヌクレオチドを合成し、コントロールプローブ１５として利用できるようにした。
【００９５】
資料の調整、ハイブリダイゼーション、洗浄、スキャンの各過程はAffymetrix社のExpression Analysis Technical Manualに従った。ハイブリダイゼーションにはAffymetrix Hybridization Oven 640を用い、45Cで16時間、60rpmの条件で行った。洗浄にはAffymetrix Fluidics Station 450を用い、ProkGE_WS2_450スクリプトを用いた。マイクロアレイのスキャンにはAffymetrix GeneChip Scanner 3000 を用いて計測し、Microarray Suite 5.0 によってシグナル強度の値を求めた。
【００９６】
データの解析には統計計算言語Ｒ（R. Ihaka and R. Gentleman. R: A language for data analysis and graphics. Journal of Computational and Graphical Statistics, 5:299314, 1996 参照）を用い、オリジナルのスクリプトを作成して計算を行った。解析では特に断らない限り、各実験の蛍光強度は対数(log10)で扱うものとする。
【００９７】
４．３  実験
実験１：大腸菌の総ゲノムＤＮＡを抽出、断片化したものを計測した。
実験２：大腸菌の総ゲノムＤＮＡに、コントロール用サンプルとしてオリゴヌクレオチドを加えたサンプルを計測した。オリゴヌクレオチドの最終濃度が1.4fMから1.4nMまで10倍ずつ7段階に異なるサンプルを用意し、それぞれで２回ずつ、合計で１４回の計測を行った。
【００９８】
４．４  パラメータの決定
まず、ゲノムのみを計測した実験１により、クロスハイブリダイゼーションに関するパラメータを決定した。オリゴヌクレオチドは加えられていないため、ランダムプローブ１３のシグナルは全てクロスハイブリダイゼーションによるものと見なすことができる。測定に使用したデータ点数は110,700である。すなわち、110,700個のランダムプローブ１３を用いた。
【００９９】
Ｒの最適化関数を用いたフィッティングにより、バックグラウンドターゲット量ｔns、パラメータｗpf及び48個のεnsの値を決定した。最適化されたモデルによる予測値と実測値との散布図を図６に示す。このときの予測値の誤差Ｒnsは０．０４４であり、高い精度でクロスハイブリダイゼーションの量を予想できていると言える。
【０１００】
４．５  フィッティングの収束
パラメータ決定時のフィッティングに用いるデータ点数を変化させ、定量的なモデルを構築するために最低限必要なランダムプローブ１３の本数を見積もった。ランダムプローブ１３の中から乱数によって、50、100、200、400、800、1600、3200本のプローブをサンプリングする。それぞれのサンプルデータをもとにモデルのパラメータを決定し、そのパラメータを用いて残りの全ランダムプローブの蛍光強度を予測した場合の予測誤差を求める。図７に、予測誤差を、使用した本数に対してプロットした結果を示す。サンプルの取り方を変えた２回の検証の結果を重ねて表示してある。サンプルデータが少なすぎる場合はオーバーフィッティングにより予測誤差が大きくなっているが、十分に多くのサンプルがあれば誤差は収束していることが分かる。実験のばらつき等も考慮に入れると、定量的な解析のためには、およそ1000本以上のプローブを使用することが好ましい。
【０１０１】
４．６  コントロールプローブによる検量
次に実験２のデータを用いて、コントロールプローブ１５のシグナル値から本発明の方法を用いて元の濃度を計算し、サンプルに加えたオリゴヌクレオチドの実際の濃度との比較を行う。前節で求めたパラメータをもとに、オリゴヌクレオチドの濃度の異なる７組の実験それぞれに対して独立に濃度の値を求めた。計算には長さ25merのプローブ150本を用いた。実際の遺伝子発現の解析では同一の遺伝子の異なる箇所に複数のプローブがマッチするように設計されていることが通常であるので、便宜上150本のプローブを、５本ずつ３０組のプローブセットとして扱う。
【０１０２】
各セットに含まれる５本のプローブは同じ量のターゲットに対応すると仮定し、その共通のターゲットの濃度ｔtiを求める。必要なパラメータは既に求められているので、式（２６）で示した誤差が最小となるようにｔtiを最適化して求める。それぞれのセットに対し７段階の投入量に対して計算されたモデルからの推定濃度を独立に計算した。その推定量と、実際の投入量との関係を比較した結果が図８に示す。
【０１０３】
図８（ａ）に、既存の手法としてAffymetrix社のアルゴリズムをもとにした解析結果を示す。計算には上記の１５０本のプローブ、及び対応するミスマッチプローブのデータを用い、プローブセットとしては上記の５本ずつのセットを用いている。既存の手法ではデータのばらつきが大きく、低濃度側では特に分散が広くなっている。またAffymetrix 社のアルゴリズムではPMプローブよりMMプローブのシグナルが大きいデータは除かれるため、クロスハイブリダイゼーションの影響が大きいと、プローブセットのデータの信頼性が落ちる。
【０１０４】
特に最も濃度が低いところでは、除かれる点がプローブの半数近くにのぼっている。一方、図８（ｂ）に示すように、本発明では低濃度側から高濃度側まで、プロットした点がほぼ直線上に位置すると言え、投入量と推定量の間に高い一致をみせている（相関係数0.989）。また、プローブセット間での分散も少ないので信頼性が高いと言える。より少ないプローブの本数でより精度の高い測定が可能なため、この手法を用いて発現解析の解像度を上げることが可能になる。
【０１０５】
５．まとめ
本発明によれば、解析対象のターゲットと非特異的に結合するランダムプローブの蛍光強度からクロスハイブリダイゼーションを生じるターゲット（バックグラウンドターゲット）の量を算出し、算出したバックグラウンドターゲット量と、各プローブの結合エネルギーとに基づいて、バックグラウンドターゲットによる蛍光強度に対する影響を評価し、この影響を排除した形で目的のターゲットの濃度を求める。このようにバックグラウンドターゲットによる影響を排除できることから、真のターゲット濃度を精度よく求めることができる。特に、従来クロスハイブリダイゼーションによるノイズに埋もれて測定不能であった低い濃度のターゲットに対して、適切に評価することが可能になる。
【０１０６】
なお、上記モデルにおいて、プローブ及びターゲットの取り得る状態として他の状態を考慮してもよい。例えば、プローブ同士が結合した状態や、解析対象のターゲットとバックグラウンドターゲットとが結合した状態を考慮してもよい。
【０１０７】
また、上記モデルにおいて、特異的、及び、非特異的結合エネルギーを求めるために48個のパラメータを用いたNearest Neighborモデルを用いたが、このモデルには他のパラメータを考慮する、あるいは一部のパラメータを無視するなどしてもよい。たとえば、塩基の位置に依存した効果を加える、反転させた配列を同じものと見なさない、４塩基以上の組み合わせを考慮するなどの方法が考えられる。
【０１０８】
また、上記モデルにおいて、折りたたみの自由エネルギーを求めるためにMFOLDによる計算値を用いたが、この計算には他の方法を用いても良い。
【０１０９】
本実施形態では、ランダムプローブの設計に乱数を用いて人工的に作成した配列を用いたが、このランダムプローブには計測の対象となる細胞のゲノムに含まれなければ、異なる生物のゲノムに含まれる配列を用いてもよい。
【０１１０】
本実施形態では、細胞のゲノムをサンプルとしてハイブリダイゼーションさせたが、細胞から抽出したRNAを逆転写し、クローンDNAとしたもの、あるいはそこからさらにRNAを転写させることで増幅したものをサンプルとしてハイブリダイゼーションさせて測定することにより、もともとのRNAの細胞内の濃度、すなわち各遺伝子の発現量を解析することが可能である。
【０１１１】
また、本発明は、GeneChip型アレイに限らず、オリゴヌクレオチドプローブと、ターゲットのRNA/DNAとの間のハイブリダイゼーションに基づいた計測システム一般に応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明はマイクロアレイを用いた遺伝子発現の解析精度を向上でき、測定データの信頼性を上げることが可能である。
その効果として、
１）より少ないプローブ数のセットを用いて信頼できるデータを得られる。
２）低い濃度のターゲットもより正確に測定できるため、発現量の低い遺伝子の定量的な解析に有用である。
などのメリットがある。
【０１１３】
プローブセットに必要なプローブ数を少なくすることは、ひとつのマイクロアレイで解析できる遺伝子の種類を増やせるため、解析効率の向上が期待できる。また、少数のプローブから定量的に発現量を測定可能であることから、siRNA,miRNAなどの短いノンコーディングRNAの働きを解明するためにも有効であると言え、RNA干渉を利用した遺伝子操作、遺伝子治療への応用が考えられる。また、発現量の低い遺伝子の振る舞いを詳しく調べることが可能になるということは遺伝子制御のネットワークにおける転写因子の働きを解明するために大きな意味を持つ。たとえば、製薬産業ではゲノム創薬に多大な注目が寄せられており、中でも毒物または薬剤の作用機序を遺伝子発現レベルで網羅的に解析するトキシコゲノミクスの発展は非常に重要であるといえる。転写因子の発現解析およびそれに付随するゲノムネットワーク解析のためのツールとしてマイクロアレイによる解析が有望視されている。しかし、現状では転写因子など発現量の低い遺伝子群の解析を正確に行うことが困難であるため、データの質の低さにより様々な制約を受けている。本発明の解析手法を用いることにより詳細な発現解析がなされれば、トキシコゲノミクスの発展およびそれに付随するゲノム創薬産業の隆盛に大いに貢献できると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】本発明のマイクロアレイ解析方法で使用されるマイクロアレイのプローブ構成を示す図
【図２】サンプル溶液中のターゲットとプローブの取り得る状態を説明した図
【図３】本発明のマイクロアレイ解析システムの構成例を示す図
【図４】本発明のマイクロアレイ解析システムによるパラメータ決定処理のフローチャート
【図５】本発明のマイクロアレイ解析システムによる濃度解析処理のフローチャート
【図６】バックグラウンドターゲットによる蛍光強度の予測値と実測値の比較結果を示す図（横軸に予測値、縦軸に実測値、両軸とも単位は任意単位（AU）、スケールは対数(log10)、太い破線がy=x、細い破線がy=2x, x/2を示す。）
【図７】モデルの最適化に用いたデータの数と、モデルの予測誤差との関係を示す図
【図８】投入したコントロールの濃度と、シグナル値からモデルによって換算された濃度との比較結果を示す図（横軸に投入濃度、縦軸に推定量、両軸とも単位はfM、スケールは対数(log10)、太い破線はy=xを示す。（ａ）既存の手法による推定値を示した図、（ｂ）本発明による推定値を示した図）
【符号の説明】
【０１１５】
１０  マイクロアレイ
１１  計測プローブ
１３  ランダムプローブ
１５  ターゲットプローブ
２０  スキャナ
５０  解析装置
５１  表示部
５３  データ格納部
５５  プロセッサ
５７  操作部
５８  スキャナインタフェース
５９  外部インタフェース
【図１】
2008039475.tif 000018
【図２】
2008039475.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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