(57)【要約】【課題】DNA塩基配列の電気化学的解読装置において、溶液中に残存する未反応のヌクレオチド５’−三リン酸誘導体までも電極上で電気化学的に変換されてしまうことに起因する誤シグナルを低減する。【解決手段】導電性基体と、導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなるポリメラーゼ固定化電極を構成するに際して、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と導電性部分とが、（１）ポリメラーゼ部分、アンカー部分、導電性部分の順、もしくは（２）ポリメラーゼ部分、導電性部分、アンカー部分の順、で連結されて構成されたポリメラーゼユニットを用い、かつ、ポリメラーゼユニットの導電性基体への固定はアンカー部分によってなし、導電性部分の導電性基体に固定されていない側の端部がポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置させる。【選択図】図２
2008026311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導電性基体と、該導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなるポリメラーゼ固定化電極であって、
前記ポリメラーゼユニットが、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と前記導電性部分とが、
前記ポリメラーゼ部分、前記アンカー部分、前記導電性部分の順、
もしくは、
前記ポリメラーゼ部分、前記導電性部分、前記アンカー部分の順で、
連結されて構成されており、
前記ポリメラーゼユニットの前記導電性基体への固定が前記アンカー部分によってなされており、
前記導電性部分が有する端部のうち前記アンカー部分側の端部とは反対側の端部が前記ポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置することを特徴とするポリメラーゼ固定化電極。
【請求項２】
前記ポリメラーゼユニットが、前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と前記導電性部分とがこの順で連結されて構成されており、
前記アンカー部分のうちの前記導電性部分側の端部から前記導電性部分の自由端までの長さと、前記アンカー部分の前記ポリメラーゼ部分側の端部から前記ポリメラーゼ部分の活性部位までの長さがほぼ等しいことを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項３】
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分との間にポリヒスチジンタグおよび前記ポリヒスチジンタグが配位する金属が存在し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分との連結が前記ポリヒスチジンタグと前記ポリヒスチジンタグが配位する金属との配位結合によってなされていることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項４】
前記ポリメラーゼユニットが、前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分と前記アンカー部分とがこの順で連結することによって構成されており、
前記導電性部分と前記ポリメラーゼ部分とが直接結合していることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項５】
前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分との間にポリヒスチジンタグおよび前記ポリヒスチジンタグが配位する金属が存在し、
前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分との連結が前記ポリヒスチジンタグと前記ポリヒスチジンタグが配位する金属との配位結合によってなされていることを特徴とする請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項６】
前記導電性部分がπ共役金属錯体からなる基である請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項７】
前記導電性部分が核酸を含む請求項１に記載のポリメラーゼ固定化電極。
【請求項８】
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸とプライマーとが二本鎖化した試料と、ポリメラーゼ固定化電極と、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを用意する工程と、
前記試料と、前記ポリメラーゼ固定化電極と、前記ヌクレオチド誘導体と、を溶媒中で共存させる工程と、
前記プライマーに前記ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを電気化学反応を用いて検出する工程と、
を有し、
前記ポリメラーゼ固定化電極が、導電性基体と、該導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなり、
前記ポリメラーゼユニットが、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と導電性部分とが、
ポリメラーゼ部分、アンカー部分、導電性部分の順、
もしくは、
ポリメラーゼ部分、導電性部分、アンカー部分の順で
連結されて構成されており、
前記ポリメラーゼユニットの前記導電性基体への固定が前記アンカー部分によってなされており、
前記導電性部分が有する端部のうち前記アンカー部分側の端部とは反対側の端部が前記ポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置することを特徴とする塩基配列に関する情報取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電気化学反応を用いて核酸の塩基配列情報を取得するために好適に使用できるポリメラーゼ固定化電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、核酸の塩基配列を解析する方法として、ダイデオキシ法が記載されている。また、特許文献１には、ダイデオキシ法を用いて核酸塩基配列を決定する方法が記載されている。また、特許文献２には、標的一本鎖核酸と、該一本鎖核酸のＳＮＰ部位の下流にあるヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な一本鎖核酸プローブが固定された基板とを、ＤＮＡポリメラーゼおよび標識ｄｄＮＴＰの存在下で反応させて検出する方法が記載されている。
【非特許文献１】Proceedings of National Academy of Sciences,USA,74:5463 〜5467 (1977)
【特許文献１】特開平０５−１６８５００号公報
【特許文献２】特開２００３−１８９８９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、特許文献１に記載のダイデオキシ法を用いた塩基配列の解析方法では、電気泳動による伸長ＤＮＡ鎖の分離という工程を含むため、解析結果を得るまでに長時間を要する。また、特許文献２に記載の検出方法では、未反応の標識ｄｄＮＴＰの洗浄が必要であり、かつ、判別可能な塩基数が一塩基のみであるという問題がある。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、高感度に検出することができるポリメラーゼ固定化電極および該ポリメラーゼ固定化電極を用いた塩基配列の情報取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、
導電性基体と、該導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなるポリメラーゼ固定化電極であって、
前記ポリメラーゼユニットが、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と前記導電性部分とが、
前記ポリメラーゼ部分、前記アンカー部分、前記導電性部分の順、
もしくは、
前記ポリメラーゼ部分、前記導電性部分、前記アンカー部分の順で
連結されて構成されており、
前記ポリメラーゼユニットの前記導電性基体への固定が前記アンカー部分によってなされており、
前記導電性部分が有する端部のうち前記アンカー部分側の端部とは反対側の端部が前記ポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置することを特徴とするポリメラーゼ固定化電極である。
【０００６】
前記ポリメラーゼユニットが、前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と前記導電性部分とがこの順で連結されて構成されており、
前記アンカー部分のうちの前記導電性部分側の端部から前記導電性部分の自由端までの長さと、前記アンカー部分の前記ポリメラーゼ部分側の端部から前記ポリメラーゼ部分の活性部位までの長さがほぼ等しいことが好ましい。
【０００７】
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分との間にポリヒスチジンタグおよび前記ポリヒスチジンタグが配位する金属が存在し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分との連結が前記ポリヒスチジンタグと前記ポリヒスチジンタグが配位する金属との配位結合によってなされていることが好ましい。
前記ポリメラーゼユニットが、前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分と前記アンカー部分とがこの順で連結することによって構成されており、
前記導電性部分と前記ポリメラーゼ部分とが直接結合していることが好ましい。
【０００８】
前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分との間にポリヒスチジンタグおよび前記ポリヒスチジンタグが配位する金属が存在し、
前記ポリメラーゼ部分と前記導電性部分との連結が前記ポリヒスチジンタグと前記ポリヒスチジンタグが配位する金属との配位結合によってなされていることが好ましい。
【０００９】
前記導電性部分がπ共役金属錯体からなる基であることが好ましい。
【００１０】
前記導電性部分が核酸を含むことが好ましい。
また、別の本発明は、
塩基配列に関する情報取得方法であって、
標的核酸とプライマーとが二本鎖化した試料と、ポリメラーゼ固定化電極と、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを用意する工程と、
前記試料と、前記ポリメラーゼ固定化電極と、前記ヌクレオチド誘導体と、を溶媒中で共存させる工程と、
前記プライマーに該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを電気化学反応を用いて検出する工程と、を有し、
前記ポリメラーゼ固定化電極が、導電性基体と、該導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなり、
前記ポリメラーゼユニットが、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と導電性部分とが、
ポリメラーゼ部分、アンカー部分、導電性部分の順、
もしくは、
ポリメラーゼ部分、導電性部分、アンカー部分の順で
連結されて構成されており、
前記ポリメラーゼユニットの前記導電性基体への固定が前記アンカー部分によってなされており、
前記導電性部分が有する端部のうち前記アンカー部分側の端部とは反対側の端部が前記ポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置することを特徴とする塩基配列に関する情報取得方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のポリメラーゼ固定化電極を用いることで、塩基配列に関する情報を電気信号として効率良く、かつ高感度に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、導電性基体と、該導電性基体の表面に固定されたポリメラーゼユニットとからなるポリメラーゼ固定化電極であって、
前記ポリメラーゼユニットが、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とを有し、
前記ポリメラーゼ部分と前記アンカー部分と導電性部分とが、
前記ポリメラーゼ部分、前記アンカー部分、前記導電性部分の順、
もしくは、
前記ポリメラーゼ部分、前記導電性部分、前記アンカー部分の順で
連結されて構成されており、
前記ポリメラーゼユニットの前記導電性基体への固定が前記アンカー部分によってなされており、
前記導電性部分が有する端部のうち前記アンカー部分側の端部とは反対側の端部が前記ポリメラーゼ部分の活性部位近傍に位置することを特徴とするポリメラーゼ固定化電極である。
【００１３】
第一の形態のポリメラーゼ固定化電極は、前記ポリメラーゼ固定化電極において、前記ポリメラーゼユニットが有するポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とがこの順で連結することによって構成されているポリメラーゼ固定化電極である。
【００１４】
以下、第一の形態のポリメラーゼ固定化電極について説明する。
【００１５】
図１（Ａ）に、第一の形態のポリメラーゼ固定化電極に用いるポリメラーゼユニット（ａ）の構造の一例を模式的に示す。図１（Ａ）では、ポリメラーゼ部分１、アンカー部分２及び導電性部分３がこの順に（直列に）連結されていることによってポリメラーゼユニット（ａ）が構成されている。
【００１６】
また、図２（Ａ）にポリメラーゼユニット（ａ）を用いたポリメラーゼ固定化電極の例を模式的に示す。ポリメラーゼ固定化電極は、ポリメラーゼ１と、アンカー部分２と、導電性部分３とをこの順に有するポリメラーゼユニット（ａ）と、導電性基体５によって構成されている。そして、ポリメラーゼユニット（ａ）は、ポリメラーゼユニット（ａ）が有するアンカー部分２によって導電性基体５に固定されている。ポリメラーゼ固定化電極は、ポリメラーゼ固定化電極が有する鋳型である標的核酸に相補的な核酸を合成する際に、末端に伸長されたヌクレオチドの塩基種別を電気化学的に判別することができるものである。
【００１７】
第一の形態のポリメラーゼ固定化電極は、図２（Ａ）に示すように、ポリメラーゼ部分１と導電性部分３との間に存在するアンカー部分２によってポリメラーゼユニット（ａ）が固定化される。このような構成とすることにより、ポリメラーゼユニット（ａ）の導電性部分３をポリメラーゼ部分１の近傍に配置させることができる。
【００１８】
具体的には、以下の（Ａ）と（Ｂ）の長さがほぼ等しくなるように設計することで、導電性部分３の前記導電性基体５に固定されていない側の端部が前記ポリメラーゼ部分（ａ）の活性部位近傍に位置しやすくなる。
（Ａ）アンカー部分２の導電性部分３側の端部から導電性部分３の自由端（導電性部分の固定されていない側の端部）までの長さ
（Ｂ）アンカー部分２のポリメラーゼ部分１側の端部からポリメラーゼ部分１の活性部位までの長さ（アンカー部分２のポリメラーゼ部分１側の端部からポリメラーゼ部分における3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体までの長さ）
より好ましい設計としては、（Ａ）の長さが（Ｂ）の長さよりも短く、（Ａ）と（Ｂ）との長さの差が５ｎｍ以内となる設計である。これは、（Ｂ）の長さが（Ａ）の長さよりも長い場合、ヌクレオチドが、導電性部分の立体障害により、ポリメラーゼ部分に捕捉されにくくなる場合があるからである。
【００１９】
ここで、本発明において、「近傍」とは５ｎｍの以内のこととする。また、（Ａ）と（Ｂ）との長さが略等しいとは（Ａ）の距離と（Ｂ）の距離の差が５ｎｍ以内のこととする。
【００２０】
ここで、アンカー部分２の導電性部分３側の端部から導電性部分３の自由端までの長さとは、アンカー部分２と導電性部分３とが直接結合している場合は、アンカー部分２と導電性部分３との結合部分から自由端までの長さである。また、アンカー部分２と導電性部分３との間に第１のリンカーが存在する場合は、アンカー部分と第１のリンカーとの結合部分から自由端までの長さのことを示すものとする。
【００２１】
これにより、従来のものより低い過電圧で3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換が可能になる。その結果、溶液中に残存する未反応のヌクレオチド５’−三リン酸誘導体までも電極上で電気化学的に変換されてしまうことに起因する誤シグナルを低減することができる。なお、誤シグナルの寄与をより低減させる目的で、ポリメラーゼユニットを導電性基体に固定化した後に、導電性基体にブロッキング処理を施してもよい。このようなブロッキング処理としては、例えば、ウシ血清アルブミンやカゼイン等のタンパク質水溶液にポリメラーゼユニットを固定した導電性基体を浸漬する方法等が利用できる。また、アンカー部分と同じ結合様式をもつ類似化合物、例えばアンカー部分がジスルフィドである場合には、ジスルフィドやチオールを官能基としてもつ化合物を含む水溶液にポリメラーゼユニットを固定した導電性基体を浸漬する方法が利用できる。
【００２２】
以下、ポリメラーゼ固定化電極を構成する各部について図２（Ａ）を用いて説明する。
【００２３】
前述したように、ポリメラーゼユニットは、ポリメラーゼ部分１と、アンカー部分２と、導電性部分３を基本要素とする。ポリメラーゼ部分１は標的核酸を鋳型としてこれに相補的な核酸を合成する部分であり、ポリメラーゼで構成される。このようなポリメラーゼは、情報を取得しようとする核酸の種類に応じて選択される。例えば、情報を取得しようとする核酸の種類がDNAである場合には、ポリメラーゼは、DNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase、EC 2.7.7.7)または、DNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependent RNA polymerase、EC 2.7.7.6)を選択する。ポリメラーゼがＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼである場合は、以下の（１）の反応を触媒し、ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼである場合は、以下の（２）の反応を触媒する酵素である。
deoxynucleoside triphosphate + DNA(n) = diphosphate + DNA(n+1)  （１）
nucleoside triphosphate + RNA(n) = diphosphate + RNA(n+1)  （２）
また、情報を取得しようとする核酸の種類がRNAである場合には、ポリメラーゼは、RNA依存的DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase、EC 2.7.7.49）または、RNA依存的RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase、EC 2.7.7.48）を選択する。ポリメラーゼがＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼである場合には、以下の（３）の反応を触媒し、RNA依存性DNA ポリメラーゼである場合には以下の（４）の反応を触媒する酵素である。
nucleoside triphosphate + RNA(n) = diphosphate + RNA(n+1)  （３）
deoxynucleoside triphosphate + DNA(n) = diphosphate + DNA(n+1)  （４）
なお、ポリメラーゼの由来については限定されない。また、ポリメラーゼは、3'→5'エキソヌクレアーゼ活性が欠失していることが望ましい。これは、ヌクレオシド5´-三リン酸が枯渇しても伸長された核酸鎖が分解されないためである。
【００２４】
また、ポリメラーゼ部分１におけるポリメラーゼ活性部位とは、ポリメラーゼのpalmドメインに存在する2つのアスパラギン酸およびそれに相同な残基で、使用するポリメラーゼのアミノ酸配列を、タンパク質ファミリーとドメインに関する配列相同性データベースPfam（Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, Database issue D247？D251）におけるDNA polymerase family A; pfam00476にアライメントしたとき、
モチーフ配列：Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu [配列番号１１]
及びモチーフ配列：Arg Met Leu Leu Gln Val His Asp Glu Leu [配列番号１２]
に相同性を有するアミノ酸配列部位である。
【００２５】
アンカー部分２は、ポリメラーゼユニット（ａ）を導電性基体５の表面に固定化する機能を有する。すなわち、ポリメラーゼユニット（ａ）は、アンカー部分２によって導電性基体５の表面に固定される。
【００２６】
アンカー部分２は、導電性基体に固定されている部位のこととする。このようなアンカー部分２としては、導電性基体と共有結合を形成しうる原子、原子団もしくは官能基であっても良く、導電性基体に親和性を有する生体分子などであっても良い。
【００２７】
より具体的には、導電性基体と共有結合を形成しうる原子、原子団及び官能基としては、ジスルフィド基などを用いることができる。導電性基体と共有結合を形成し得る官能基がジスルフィド基である場合、導電性基体は金を含む材料で形成されていることが好ましい。また、導電性基体に親和性を有する生体分子としては、ペプチド、抗体断片、核酸、アプタマー、糖鎖などを用いることができる。なお、ペプチドなどの一部が導電性基体に固定されている場合には、固定されている部分はアンカー部分とし、固定に関与していない部分はリンカーの一部と定義する。
【００２８】
また、アンカー部分２は、使用するポリメラーゼ部分の種類により適宜長さを調整することが可能であるが、ポリメラーゼ部分１よりも小さいことが好ましい。なお、アンカー部分２がポリメラーゼ部分１よりも小さいとは、具体的には、アンカー部分２内に存在する線分のうち最大のものがポリメラーゼ部分１の直径よりも小さいことである。ここで、ポリメラーゼ部分１の直径（φ）とは、ポリメラーゼ部分に外接する球の直径、またはポリメラーゼ部分の露出表面積を表面積としてもつ球の直径のいずれか大きい値、またはポリメラーゼ部分の結晶構造が知られていない場合には、ポリメラーゼ部分の分子量をMとした時、
【００２９】
【数１】
2008026311.tif 000003
【００３０】
によって定義されるものとする(単位はnmである)。
【００３１】
アンカー部分２がポリメラーゼ部分１の直径よりも大きい場合、導電性基体５の表面（以下、電極面と呼ぶ場合がある）に対するポリメラーゼ部分１の密度が低下してしまい、結果としてシグナル強度が減少してしまう場合がある。また、電極面のうちポリメラーゼ部分１で覆われていない部分の量が多くなるため（電極面が露出するため）、未反応のヌクレオチド誘導体の電極へのアクセスが容易となりノイズが増大する可能性がある。
【００３２】
例えば、ポリメラーゼ部分１として大腸菌ＤＮＡポリメラーゼIのKlenow fragmentを用いる場合には、8.2 nm以下とすることが望ましい。
【００３３】
また、アンカー部分２での導電性基体５への固定化を容易にするという観点から考えれば、ポリメラーゼユニット（ａ）が有するアンカー部分２の導電性基体５への結合性を、ポリメラーゼユニット（ａ）のうちのアンカー部分２以外の部分（ポリメラーゼ部分１及び導電性部分３を含む部分）の導電性基体５への結合性よりも相対的に高い構成とすることが好ましい。このような構成とすることにより、アンカー部分２によって導電性基体５への固定を容易に行うことができる。好ましくは、ポリメラーゼ部分１および導電性部分３が導電性基体５と結合し難く、アンカー部分２が導電性基体５と結合し易くなるようにこれらの部分の構成を調整することが好ましい。
【００３４】
なお、ポリメラーゼ部分１、導電性部分３が導電性基体５と結合し難く、アンカー部分２が導電性基体５と結合し易くなるようにこれらの部分の構成を調整することが困難な場合であっても、本発明の構成は有効である。例えば、アンカー部分よりも導電性基体に対する結合性が相対的に高い部分を除いた、アンカー部分を含むポリメラーゼユニットの一部を先に電極表面に固定化する。この後にアンカー部分よりも導電性基体に対する結合性が相対的に高い部分を、先に固定した部分に連結する。このようにすることで、ポリメラーゼユニットを導電性基体にアンカー部分から結合させた状態を構築することができる。
【００３５】
次に導電性部分３について説明する。
【００３６】
導電性部分３は、ポリメラーゼ部分１と導電性基体５との間の電子の授受を担う部分であり、導電性基体５に結合しているアンカー部分２と接続し、導電性基体５と導通している。ポリメラーゼユニット（ａ）が導電性部分３を有することにより、電気化学的に変換し得る部分（詳細は後述する）を有するヌクレオチド誘導体を用いた情報取得を行う場合に、伸長鎖の3'末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換を、低過電圧で実行することが可能となる。ここで、「ＡとＢが導通している」とはＡとＢとの間の電気抵抗値が１．０×１０20Ω以下のことを示す。
【００３７】
導電性部分３とアンカー部分２とは直接結合していても良いし、リンカーを介して間接的に結合していても良い。このような導電性部分３としては、例えば、以下のいずれかのような分子からなる基を用いて形成することができる。
即ち、
＜１＞導電性物質と、導電性を有する棒状有機分子で構成される構造体
ここで、棒状とは円柱もしくは四角柱に近い形状であり、円柱もしくは四角柱における高さに相当する部分の長さが他の部分である辺もしくは直径に比べて２倍以上長い形状である。また、「導電性を有する」とは導電率が１０-6S／cm以上のものとする。
＜２＞前記導電性物質が前記棒状有機分子の内部、端部もしくは周側面の少なくともいずれかに担持されている前記＜１＞に記載の構造体＜３＞
＜３＞棒状有機分子がα−ヘリックス、ＤＮＡもしくはアミロースから選択される前記＜１＞または＜２＞に記載の構造体
＜４＞前記導電性物質が金属原子、金属酸化物、金属硫化物、カーボン化合物、から選択される少なくとも１種を含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の構造体。
＜５＞前記導電性物質が、芳香族π共役高分子のドーピングに用いられるドーパントである前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の構造体。
＜６＞前記ドーパントが、ポリアリニン、ポリチオフェン、ポリピロール、ポリフェニレンビニレン、ポリアセン等の導電性高分子、ルイス酸、プロトン酸、遷移金属ハライド、アルカリ金属、アルキルアンモニウムイオン、界面活性剤、またはアミノ酸のうち選択される少なくとも一つである前記＜５＞に記載の構造体。
＜７＞前記導電性物質がπ共役金属錯体分子（錯体の骨格が、錯体の中心金属とπ共役配位子によって構成されている錯体分子）である＜１＞〜＜６＞に記載の構造体。錯体の中心金属としては、遷移金属元素が好適に用いられる。例としては、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｒｈ、Ｐｄ、Ｉｒが挙げられる。π共役配位子としては、分子の骨格にπ共役が広がっており、水溶液中、電極が使用される条件において充分な化学的安定性と配位能を有する化合物であれば、好適に使用できる。例としては、配位子部位としては、ビピリジン、ターピリジン、フェナントロリン、ポルフィリン、フタロシアニンおよびこれらの誘導体が挙げられる。
【００３８】
また、導電性部分３は、複数の性質が異なる領域で構成することもできる。なお、ここで「領域」とは、導電性などの性質により、お互いに区別することができる特定の範囲のこととする。導電性部分３がこのような構成である場合のポリメラーゼユニット（ａ）の別な例を図１（Ｂ）に模式的に示す。導電性部分３をアンカー部分２に近い側の第一の導電性領域９と自由端に近い側の第二の導電性領域（以降プローブ領域と呼ぶ場合がある）４とで構成とする。導電性部分３がプローブ領域４を有する場合の第一の形態のポリメラーゼ固定化電極の別な構成例としては、図２（Ｂ）に示すような構成とすることができる。このような構成とし、第二の導電性領域４を小さな構造とすることで、第一の導電性領域９の大きさが大きく、導電性部分を第一の導電性領域９のみで構成している場合には、ポリメラーゼ内の伸長鎖末端に付加されたヌクレオチド誘導体に対して導電性部分の自由端がアクセスし難い場合であっても、電子の授受を達成することができるようになる。なお、このような場合、前記プローブ領域４の自由端がポリメラーゼ部分１の核酸伸長反応部位の近傍に位置するように、第一の導電性領域９の長さを調整することが好ましい。そのような構成とすることで、導電性部分が一つの領域で構成されている場合と同様、導電性部分の自由端（第二の導電性領域の自由端）がポリメラーゼ分子内部の伸長鎖3'末端の物理的近傍に配置されて、伸長鎖の3'末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換の低過電圧での実行が更に容易となる。
【００３９】
すなわち、伸長末端の電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオチド誘導体の電気化学的な変換に要する過電圧を更に低減することが可能になる。
【００４０】
プローブ領域４は、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｐｄ、Ｒｈ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｔｉ、Ｃｕ、Ｗや、これらの合金等の金属微粒子や、例えばＡＣＮＱ(2-amino-3-carboxy-1,4-naphthoquinone)やフィロキノン、メナキノン、メナジオン等のキノン骨格を有する化合物、Ｏｓ、Ｒｕ、Ｆｅ、Ｃｏ等の金属錯体、ベンジルビオローゲン等のビオローゲン化合物、ニコチンアミド構造を有する化合物、リボフラビン構造を有する化合物、ヌクレオチド−リン酸構造を有する化合物等から形成することができる。また、必要に応じてこれらの材料の２種以上を組み合わせてプローブ領域４を構成することもできる。プローブ領域４は、ポリメラーゼ部分１内の伸長鎖末端に付加されたヌクレオチド誘導体に対してアクセスが可能である程度に小さいことが好ましく、0.5nmから2nm程度であることが好ましい。
【００４１】
導電性基体５は、導電性を有し、電極が使用される条件即ちポリメラーゼ部分１が酵素活性を有する条件において充分な電気化学安定性を有する材料を好適に使用することができる。このような導電性基体５の材料の例としては、金属、導電性高分子、金属酸化物、及び炭素材料などを挙げることができる。金属の例としては、Ａｕ、Ｐｔ、Ａｇ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｍｏ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｖ、Ｉｎ、Ｇａ、Ｗのうち少なくとも一種類の元素を含むものがあげられ、これらは、合金であっても、めっきを施したものであってよい。導電性高分子の例としては、ポリアセチレン類、ポリアリーレン類、ポリアリーレンビニレン類、ポリアセン類、ポリアリールアセチレン類、ポリジアセチレン類、ポリナフタレン類、ポリピロール類、ポリアニリン類、ポリチオフェン類、ポリチエニレンビニレン類、ポリアズレン類、ポリイソチアナフテン類のうち少なくともひとつの化合物を含むものが挙げられる。金属酸化物の例としては、Ｉｎ、Ｓｎ、Ｚｎ、Ｔｉ、Ａｌ、Ｓｉ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｇ、Ｂａ、Ｍｏ、Ｗ、Ｖ、Ｓｒのうち、少なくとも一種類の元素を含むものがあげられる。炭素材料の例としては、グラファイト、カーボンブラック、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーン、フラーレン化合物およびこれらの誘導体が挙げられる。
【００４２】
上記各部の連結（ポリメラーゼ部分１、アンカー部分２、導電性部分３の間での連結および導電性部分３内での第一の導電性領域と第二の導電性領域の間の連結）は、所望とする機能を損なわない範囲でリンカーが介在してもよい。隣り合う各部分間の結合は、各部分を構成する分子の種類、結合方法、ポリメラーゼ固定化電極の用途などに応じて選択できる。例えば、ポリメラーゼユニットの製造条件、電極上への固定化条件において、また水溶液中、電極が使用される条件において充分な化学的、電気化学的安定性を有する結合であれば特に制限されるものではない。各部を接続させる際の方法としては、共有結合や、配位結合、水素結合、静電的相互作用、疎水的相互作用、物理的吸着等の結合によって接続する方法が挙げられる。
【００４３】
ポリメラーゼ部分１とアンカー部分２はポリヒスチジンタグを利用して連結することもできる。図３（Ａ）にその一例を模式的に示す。この場合、ポリメラーゼ部分１とアンカー部分２との間のリンカーを、ポリヒスチジンタグ６と、およびポリヒスチジンタグ６が配位結合する金属（中心金属部分）８（図３（Ａ）では例としてニッケルイオン（Ｎｉ）を挙げている）と、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）７とで構成する。
【００４４】
これにより、ポリメラーゼ部分とポリヒスチジンタグとが融合した部分（ポリメラーゼ部分１とポリヒスチジンタグ６とからなるパーツ）と、プローブ修飾ポリメラーゼを構成する他の部分（プローブ部分４と導電性部分３とアンカー部分２とＮＴＡ７とからなるパーツ）とを別々に調製することが可能になり好適である。図４（Ａ）に、ポリヒスチジンタグを利用したポリメラーゼユニットを導電性基体に結合させた状態を模式的に示す。ポリヒスチジンタグを用いた場合でも、前述したように、プローブ領域４の自由端がポリメラーゼ部分１の活性部位近傍に位置するように設計する。したがって、アンカー部分２のプローブ領域４側の端部からプローブ領域４の自由端までの長さと、アンカー部分２のポリメラーゼ部分１側の端部からポリメラーゼ部分１における3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体に至るまでの長さを略等しくすることが好ましい。なお、この際の「略等しい」とは前述した定義と同様とする。
【００４５】
次に、第二の形態のポリメラーゼ固定化電極について説明する。
【００４６】
第二の形態のポリメラーゼ固定化電極に用いるポリメラーゼユニット（ｂ）は、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分とがこの順で連結することによって構成されているポリメラーゼ固定化電極である。第一の形態のポリメラーゼ固定化電極との違いは、第一の形態のポリメラーゼ電極が有するポリメラーゼユニットにおいて、ポリメラーゼ部分とアンカー部分と導電性部分が連結する順序であり、それ以外は第一の形態と同様とする。
【００４７】
図２（Ｃ）に第二の形態のポリメラーゼ固定化電極の一例を示す。また、第二の形態のポリメラーゼ固定化電極に用いるポリメラーゼユニット（ｂ）の一例を図１（Ｃ）に示す。
【００４８】
ポリメラーゼユニット（ｂ）は、ポリメラーゼ部分１と導電性部分３とアンカー部分２とがこの順で連結して構成され、アンカー部分２によって導電性基体５に固定されている。
【００４９】
第二の形態のポリメラーゼ固定化電極においても、導電性部分３がポリメラーゼ部分１の物理的近傍に位置することによって、第１のポリメラーゼ固定化電極と同様の効果を得ることができる。このような構成とするには、導電性部分３とポリメラーゼ部分１との結合部位がポリメラーゼ部分１のポリメラーゼ活性部位近傍とすることが好ましい。これにより、第一の形態のポリメラーゼ固定化電極と同様、導電性部分３がポリメラーゼ分子内部の伸長鎖3'末端の物理的近傍に配置され、伸長鎖の3'末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換の低過電圧での実行が容易となる。すなわち、従来より低い過電圧で3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換が可能になる。その結果、溶液中に残存する未反応のヌクレオチド５’−三リン酸誘導体までも電極上で電気化学的に変換されてしまうことに起因する誤シグナルを低減することができる。
【００５０】
なお、第一の形態のポリメラーゼ固定化電極と同様、ポリメラーゼユニット（ｂ）が有する導電性部分を、複数の領域で構成することができる。図１（Ｄ）のように、ポリメラーゼ部分１とアンカー部分２との間の導電性部分３を、アンカー部分側の第一の導電性領域９とポリメラーゼ部分側の第二の導電性領域（プローブ領域）４で構成する。このようなポリメラーゼユニットを用いたポリメラーゼ固定化電極を図２（D）に示す。このような構成とすることによって、伸長鎖の3'末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換の低過電圧での実行が更に容易となる。
【００５１】
ポリメラーゼ部分１と導電性部分３とは直接結合していることが好ましいが、リンカーを介して結合していても良い。リンカーが存在する場合は、リンカーの長さが２nmを超えない長さであることが好ましい。また、ポリメラーゼユニット（ａ）と同様、図３（Ｂ）に示すように、ポリメラーゼユニット（ｂ）においても、ポリメラーゼ部分１とプローブ部分４との連結をポリヒスチジンタグの金属への配位結合によって形成することができる。なお、図３（Ｂ）に示すポリメラーゼ部分（ｂ）を用いて形成したポリメラーゼ固定化電極は、図４（Ｂ）のような構成となる。
【００５２】
次に、ポリメラーゼ固定化電極（ａ）または（ｂ）を用いた塩基配列の取得方法について説明する。ポリメラーゼ固定化電極を用いた塩基配列の取得方法は、例えば、所定部分の塩基配列の確定診断などに適用できる。
【００５３】
本発明のポリメラーゼ固定化電極は、ポリメラーゼを利用したヌクレオチドの二本鎖核酸への取り込み（一方の鎖を鋳型とした相補鎖の３’末端の伸長部分へのヌクレオチドの取り込み）を利用した塩基配列に関する情報を取得する方法等に好適に利用できる。このような情報取得方法としては、以下の各態様を挙げることができる。なお、本発明の核酸の塩基配列の解析方法における各工程の例を、図５を適宜参照して説明するが、図５（１）〜（４）の詳細を、拡大図として図８（１）、図８（２）、図９（１）及び図９（２）に示している。  図８（１）は図５（１）の拡大図であり、図８（２）は図５（２）の各大豆である。また、図９（１）は図５（３）の拡大図であり、図９（４）は図５（４）の拡大図である。
【００５４】
Ａ）第１の実施形態
まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料（標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料）と、ポリメラーゼ固定化電極と、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを用意する（図５（１））。ここで、電気化学的な変換とは、導電性基体を通じた電子の授受に起因して、前記誘導体の一部が脱離することや、この電子の授受に起因して惹起される化学結合の切断や、再構成のことである。
【００５５】
ヌクレオチド誘導体とは、例えばヌクレオシド ５'-三リン酸誘導体であり、少なくとも以下のものが該当する。
・アデノシン ５'-三リン酸誘導体、
・シチジン ５'-三リン酸誘導体、
・グアノシン ５'-三リン酸誘導体、
・ウリジン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体、
・２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体
なお、Ｂ）以降の実施形態においても、ヌクレオチド誘導体としては、上記例示したものなどを用いることができる。なお、図では、複数種類のヌクレオチド誘導体を記載しているが、必要に応じて、複数種であっても良く、１種類であってもよい。
【００５６】
そして、該二本鎖化した試料と該ポリメラーゼ固定化電極と該ヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる（図５（１））。ここで、溶媒とは、前記試料と前記ポリメラーゼ固定化電極と前記ヌクレオチド誘導体とを保持する水溶性の液体もしくはゲル状の物質である。
該ヌクレオチドの塩基種と、該二本鎖化した試料におけるプライマーの３´末端に隣接する標的核酸の塩基種とが相補的である場合には、プライマーの３'末端に導入され（図５（２）（３））、相補的でない場合には、導入されない。その後、該プライマーに該ヌクレオチド誘導体が導入されているか否かを、電気化学反応を用いて検出する。
【００５７】
例えば、１種類のヌクレオチド誘導体のみを試料と共存させた場合に、試料にヌクレオチド誘導体が導入されていれば、当該ヌクレオチド誘導体に対応した塩基が所定部分にあることが分かる。一方、導入されていない場合、当該ヌクレオチド誘導体に対応した塩基は、少なくとも、所定部分には無いことが分かる。このような手法により、標的核酸の塩基配列に関する情報を取得することができる。
【００５８】
ここで、取得できる情報には、認識しようとする位置の塩基がアデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、チミン(Ｔ)などの内、何であるかという情報は勿論のこと、少なくとも何（例えば、Ａ）ではないという情報も含まれる。以下の実施形態においても、同様である。
【００５９】
また、ヌクレオチド誘導体の電気化学的に変換し得る部分における、「変換」は、導電性基体を通して行われる電子の授受によって生じる化学結合の切断や再構成を意味する。そして、前記「変換」には、前記部分および該部分を含む上位のグループのヌクレオチド誘導体からの脱離、置換、あるいは付加を受ける反応なども含まれる。前記ヌクレオチド誘導体において、電気化学的に変換し得る部分とは、前記電気化学反応により、前記ヌクレオチド誘導体から脱離するか、前記ヌクレオチド誘導体を置換するか、あるいは前記ヌクレオチド誘導体に付加される部位のことである。また、前記部分は、付加される反応が惹起される部分であると捉えることもできる。なお、電気化学的に活性な（導電性基体と電子の授受をする）官能基としては、例えば金属錯体からなる基がある。しかしながら、この金属錯体のように、中心金属の酸化あるいは還元により酸化数が変化するだけで、化学結合の切断や再構成を伴わないようなものは本発明においては電気化学的に変換し得る部分とは言わない。以下の実施形態でも同様である。
【００６０】
Ｂ）第２の実施形態
標的核酸の塩基配列を読み取る方法について説明する。まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料と、ポリメラーゼ固定化電極と、各々の電気特性が異なり電気化学的に変換し得る部分を有する複数種類のヌクレオチド誘導体と、を用意する。電気特性が異なるとは、それぞれのヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に要する電子の数や印加電圧などがそれぞれ異なり、通常の電気化学的測定手段により識別し得ることである。
【００６１】
該試料と、該ポリメラーゼ固定化電極と、該複数種類のヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる。これにより、標的核酸の塩基に相補的な塩基をもつヌクレオチド誘導体がプライマーの３'末端に重合される。この際、ヌクレオチド誘導体に導入されている電気化学的に変換し得る部分の存在により、ポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分によるプライマーの更なる伸長反応が阻害されるようにしておく。これにより、標的核酸が複数分子存在しているとしても、一塩基伸長される毎に重合反応が停止するので、全体の合成反応を同期させることが可能になる。
【００６２】
そして、該複数種類のヌクレオチド誘導体の内、該プライマーの３'末端に導入されているヌクレオチド誘導体を、その電気化学的に変換し得る部分を電気化学的に変換することにより同定する。この際、ヌクレオチド誘導体に導入されている電気化学的に変換し得る部分は、電気化学的変換に起因して惹起される脱離、置換もしくは付加反応によって、ポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分による伸長反応が再度可能になるようにしておく。
【００６３】
同定後、ポリメラーゼ部分による伸長反応は自発的に再開することとなる。したがって、ポリメラーゼ部分が一塩基分伸長反応をするのに必要な時間だけ待った後に、次の塩基の同定のために前記工程を繰り返し行うことで、標的核酸の塩基配列を逐次読み取ることができる。一般にポリメラーゼによる伸長反応は一塩基あたり500分の1秒で終了するので、高速な塩基配列の解読が可能である。
【００６４】
Ｃ）第３の実施形態
まず、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料(標的核酸にプライマーがハイブリダイズした試料)と、ポリメラーゼ固定化電極と、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体とを溶媒中で共存させる。そして、該溶媒と電気的に接続されている（溶媒と接触している）導電性部材から電気信号を検出する。ここでいう電気信号は、前記プライマーに導入された前記ヌクレオチド誘導体の前記部分を、電気化学反応により変換することに起因する信号である。
【００６５】
以下に前記第１〜第３の態様に記載した塩基配列の情報取得方法の具体例について更に説明する。
【００６６】
本発明に用いる標的核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、デオキシリボオリゴヌクレオチド（deoxyribooligonucleotides）、リボオリゴヌクレオチド(ribooligonucleotides)等を挙げることができる。これら標的核酸は一本鎖であっても良く、二本鎖であっても良い。また、標的核酸は必ずしも精製されている必要はない。すなわち、検体は、標的核酸を含む生体試料であってもよい。
【００６７】
本発明に用いるプライマーは、標的核酸がＤＮＡ、またはＲＮＡである場合に、標的核酸とハイブリダイゼーションするオリゴヌクレオチドである。その長さについては限定されないが、１５merから６０mer程度の長さのオリゴヌクレオチドであることが望ましい。プライマーは、標的核酸の情報を取得したい位置にある塩基配列よりも３'側の下流領域（３'側領域）を二本鎖化（ハイブリダイゼーション）するために用いられる。プライマーは、この３'側領域の全域を認識する塩基配列を有するものでもよいし、この３'側領域の一部を認識するものでもよい。３'側領域の一部を認識するプライマーを用いる場合は、情報取得対象の塩基に対して３'側で１つ隣り（下流）の塩基まで必要に応じた伸長反応を行ってから、後述するポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分によるヌクレオチド誘導体の取り込み反応に用いる。
【００６８】
例えば、図６（ａ）に示すように、情報取得対象の塩基配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６より３'側の領域が「Ｇ〜ＡＡＣＡＴ」である場合に、これに相補的である「Ｃ〜ＴＴＧＴＡ」の塩基配列からなるプライマーを塩基Ｘ１より３'側の領域に結合させる。これにより、情報を取得したい領域の３'側領域を二本鎖化できる。また、図６（ｂ）に示すように、情報を取得したい領域の３´側領域が「Ｇ〜ＡＡＣＡＴ」である場合に、情報取得対象の塩基配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６のＸ1より二つ前の塩基を含む３'側領域を認識するプライマー「Ｃ〜ＴＴＧＴ」を情報取得対象の塩基配列Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６の３'側領域に結合させてから、伸長反応を行い「Ａ」を付加する。これにより、情報取得対象の一つである塩基Ｘ１より３'側の領域を二本鎖化できる。なお、図６（ｂ）の場合において、Ｘ1より３つ以上前までの３'側領域を認識するプライマーを用いた場合は、その３'末端をＸ1より一つ前の塩基まで順次伸長反応を行う。
【００６９】
３'側領域の全域を認識する塩基配列を有するプライマーを用いた情報取得方法としては、以下の工程を有する方法を挙げることができる。
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域全体を認識し該３'側領域の二本鎖化のためのプライマーと、ポリメラーゼ固定化電極と、測定用の置換基を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する工程
（２）前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域に前記プライマーを結合させて二本鎖化する工程
（３）前記二本鎖化した部分を有する標的核酸に、前記ポリメラーゼ固定化電極の存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を共存させて反応させる工程
（４）前記ヌクレオチド誘導体の有する測定用の置換基を利用して、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する工程。（具体的には、前記標的核酸の二本鎖うちの前記プライマーを含む鎖の３'末端の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出する工程）
３'側領域の一部を認識するプライマーを用いた情報取得方法としては、以下の工程を有する方法を挙げることができる。
（１）標的核酸と、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での二つ前の塩基を含む３'側領域を認識し該３'側領域の二本鎖化を可能とするプライマーと、ポリメラーゼ固定化電極と、測定用の置換基を有するヌクレオチド誘導体と、を用意する工程
（２）前記標的核酸に前記プライマーを結合させる工程
（３）前記標的核酸に結合したプライマーの３'末端を伸長させ、該標的核酸の塩基配列中の情報取得対象位置にある塩基の３'方向での一つ前の塩基を含む３'側領域を二本鎖化する工程
（４）前記伸長後のプライマーが結合した標的核酸に、前記ポリメラーゼ固定化電極の存在下で、前記ヌクレオチド誘導体を反応させる工程
（５）前記ヌクレオチド誘導体の有する測定用の置換基を利用して、前記情報取得対象位置にある塩基に関する情報を取得する工程（具体的には、前記標的核酸の前記情報取得対象位置にある塩基に対応する位置への前記ヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を検出する工程）
本発明では、標的核酸と伸長される核酸の種類によりポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分の種類が選択される。前述したように、伸長される核酸がＤＮＡの場合はＤＮＡポリメラーゼ（核酸依存的DNAポリメラーゼ）が、伸長される核酸がＲＮＡである場合にはＲＮＡポリメラーゼ（核酸依存的RNAポリメラーゼ）が選択される。
【００７０】
標的核酸がDNA、またはデオキシリボオリゴヌクレオチドである場合には、DNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase)またはDNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependent RNA polymerase)を選択して用いる。また標的核酸がRNA、またはリボオリゴヌクレオチドである場合には、RNA依存的DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase）またはRNA依存的RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）を選択して用いる。
【００７１】
本発明では、標的核酸の情報取得対象の塩基に対応する位置へのヌクレオチド誘導体の取り込みの有無を測定することで、この塩基に対する情報を得ることができる。この取り込みの有無は、ヌクレオチド誘導体に付与した電気化学的に変換し得る部分を利用することにより行われる。すなわち、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体の、標的核酸上のプライマーあるいはプライマー伸長物の３'末端（例えば、図６における「Ｙ」の位置）への取り込みを、電気化学的に変換し得る部分の取り込みにより判定する。例えば、伸長される核酸がＤＮＡである場合には、以下に例示されるヌクレオチド誘導体の１種以上をプライマーにより二本鎖が形成されている標的ＤＮＡに反応させる。
【００７２】
ヌクレオチド誘導体としては、例えば、各々が区別し得る電気化学的に変換し得る部分を有する２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体が挙げられる。
【００７３】
ここで、用いるヌクレオチド誘導体の種類を選択することで、以下に示す塩基に関する情報取得を行うことができる。
【００７４】
（１）図６に示す「Ｘ1」が「Ａ」である場合に、２'-デオキシアデノシン ５'-三リン酸誘導体、２'-デオキシシチジン ５'-三リン酸誘導体及び２'-デオキシグアノシン ５'-三リン酸誘導体の少なくとも１種を反応系に添加しておく。すると、電気化学的に変換し得る部分の「Ｙ」の位置への取り込みは測定されない。したがって、「Ｘ１」には反応系に添加したヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは存在しないと結論付けることができる。
（２）一方、図６に示す「Ｘ1」が「Ａ」である場合に、少なくとも２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体を反応系に添加しておくと、電気化学的に変換し得る部分の「Ｙ」の位置へ２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体が取り込まれる。そして、この取り込みを２'-デオキシチミジン ５'-三リン酸誘導体の有する電気化学的に変換し得る部分を利用して測定することができる。したがって、「Ｘ１」が「Ａ」であると結論付けることができる。
【００７５】
なお、伸長される核酸がＲＮＡである場合は、ヌクレオチド誘導体として、以下の誘導体を１種以上用いる。即ち、各々の電気特性が異なる測定用の置換基を有するアデノシン ５'-三リン酸誘導体、シチジン ５'-三リン酸誘導体、グアノシン ５'-三リン酸誘導体及びウリジン ５'-三リン酸誘導体である。
【００７６】
ヌクレオチド誘導体に付与される電気化学的に変換し得る部分は、電気化学的変換に起因して構造変化が生じるものである。この構造変化により、ポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分による伸長反応が停止していた状態から、伸長反応が再開可能な状態になる。この構造変化としては、ヌクレオチド誘導体からの電気化学的に変換可能な部分を含む置換基の不可逆的な脱離であることが更に好ましい。
【００７７】
以下、電気化学的に変換可能な部分を有するヌクレオチド誘導体について説明する。
【００７８】
本発明における「電気化学的に変換し得る部分」とは、例えば、ヌクレオシド ５'−三リン酸を構成する何れかの原子に対して結合した、原子若しくは原子団である。したがって、電気化学的に変換可能な部分を有するヌクレオチドとは次の（１）から（３）の性質を有するヌクレオチドであるものである。すなわち、
（１）標的核酸とプライマーとの相補的結合対、あるいは標的核酸とプライマーから伸長された伸長鎖との相補的結合対における、プライマー若しくは伸長鎖の３'末端の水酸基に対して、ポリメラーゼの酵素触媒作用によるリン酸エステル結合を形成し得る。
（２）上記（１）の結果、プライマー若しくは伸長鎖の３'末端の水酸基に対してリン酸エステル結合を介して結合した後には、ポリメラーゼの酵素触媒作用による他のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体との更なるリン酸エステル結合の形成を阻害する。すなわち、本発明において使用するヌクレオチド誘導体は、キャッピングとしての機能を有する。
（３）電気化学的に還元若しくは酸化され得る部分を含む。
【００７９】
なお、上記の（１）から（３）の性質に加え、更に（４）の性質を有しているのが良い。
（４）上記（３）の結果、電気化学的に還元若しくは酸化されたことに起因する脱離・置換・もしくは付加反応が惹起され、ポリメラーゼの酵素触媒作用による更なるリン酸エステル結合を形成が可能となる。
【００８０】
電気化学的に変換可能な部分によるキャッピングは、その電気化学的性質の違いによって、電気化学的に脱離可能な脱離基、電気化学的に置換可能な置換基に分類される。いずれの分類でも、前記（１）から（３）の性質（好ましくは（４）も含む。）を満たすならば本発明に用いることができる。電気化学的に脱離可能な脱離基は、式１に示すR2、あるいは式３に示すR６のように２電子還元により脱離を受ける原子または原子団である。また、式２に示すR４、あるいは式４に示すR８のように２電子酸化により脱離を受ける原子または原子団である。
【００８１】
【化１】
2008026311.tif 000004
【００８２】
ただしR1、R3、R５及びR７はヌクレオチドであり、R2、 R4、R6及びR8は電気化学的に脱離可能な脱離基である。脱離基の例としては、ホウ素などの典型金属を含む基、遷移有機金属錯体からなる基等を挙げることができる。
【００８３】
電気化学的に置換可能な置換基は式５及び式６に示すR10のような１電子還元により、ラジカルあるいはアニオンとして脱離を受ける原子または原子団である。あるいは式７及び式８に示すR12のような1電子酸化により、ラジカルあるいはカチオンとして脱離を受ける原子または原子団である。
【００８４】
【化２】
2008026311.tif 000005
【００８５】
ただし、R9およびR11はヌクレオチドであり、R10およびR12は電気化学的に置換可能な置換基である。この置換基の具体例としては、ハロゲン、アルキルチオ、スルフィニル、ヒドロキシ、アシルオキシ、アミノ、過酸化、スルホニウムである。また、この置換基として、有機金属錯体、ニトロキシ、2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxyl（TEMPO）、ハイドロキノリル、メトキノリル、フェノチアジル等を挙げることもできる。
【００８６】
ヌクレオチド誘導体は、前記電気化学的に脱離可能な脱離基あるいは電気化学的に置換可能な置換基によって修飾されたヌクレオシド ５'−三リン酸である。具体的には本発明のポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分の種類に応じて選択されるものであり、ポリメラーゼが、DNA依存的DNAポリメラーゼ(DNA-dependent DNA polymerase)またはRNA依存性DNA ポリメラーゼ（RNA-dependent DNA polymerase）である場合には、以下の４種の少なくとも１種を用いる。
・  2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸誘導体(dATP derivative)
・  2'-デオキシシチジン5'-三リン酸誘導体(dCTP derivative)
・  2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸誘導体(dGTP derivative)
・  2'-デオキシチミジン5'-三リン酸誘導体(dTTP derivative)
また本発明のポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分がDNA依存的RNAポリメラーゼ(DNA-dependentRNA polymerase)またはRNA依存性RNA ポリメラーゼ（RNA-dependent RNA polymerase）である場合には以下の４種の少なくとも１種を用いる。
・  アデノシン5'-三リン酸誘導体(ATP derivative)
・  シチジン5'-三リン酸誘導体(CTP derivative)
・  グアノシン5'-三リン酸誘導体(GTP derivative)
・  ウリジン5'-三リン酸誘導体(UTP derivative)
ヌクレオチド誘導体における電気化学的に脱離可能な脱離基の付加される原子、すなわち、式１におけるR1及び式２におけるR3を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質が満たされれば特に制限されない。
【００８７】
例えば、2'-デオキシアデノシン5'-三リン酸 (dATP)、2'-デオキシシチジン5'-三リン酸 (dCTP)、2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸 (dGTP)、および2'-デオキシチミジン5'-三リン酸 (dTTP)に対しては、それらのリボースの１'、２'、４'位の炭素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。また、アデノシン5'-三リン酸 (ATP)、シチジン5'-三リン酸 (CTP)、グアノシン5'-三リン酸 (GTP)、およびウリジン5'-三リン酸 (UTP)に対しては、それらのリボースの２'位水酸基の酸素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。
【００８８】
また、式３におけるR5、式４におけるR7を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの３'位の炭素が挙げられ、またATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位の炭素、３'位の炭素などが挙げられる。
【００８９】
ヌクレオチド誘導体における電気化学的に置換可能な置換基の付加される原子、すなわち式５におけるR９、式６におけるR９を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの１'、２'、４'位の炭素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。またATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位水酸基の酸素、３'位水酸基の酸素などが挙げられる。
【００９０】
また、式７におけるR11、式８におけるR11を構成する原子としては、キャッピングに関する前記（１）から（４）の性質がすべて満たされるのであれば制限されない。例えば、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPに対しては、それらのリボースの３'位の炭素が挙げられる。また、ATP、CTP、GTP、およびUTPに対しては、それらのリボースの２'位の炭素、３'位の炭素などが挙げられる。
【００９１】
本発明に用いられる電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオチド誘導体は、対応するヌクレオチドあるいはヌクレオシドを原料として製造することが可能である。すなわち、キャッピングを結合させる原子以外の、プリン、ピリミジンなどの塩基部分と糖水酸基を選択的に適宜保護した後、電気化学的に脱離可能な脱離基あるいは置換可能な置換基の付加を行うことにより合成することができる。
【００９２】
それぞれのヌクレオシド ５'−三リン酸のキャッピングに用いられる電気化学的に変換可能な構造は、電気化学的に変換可能な部分の電気化学的変換と、これにより惹起されるこの部分を含む構造の構造変換により、この構造を有するヌクレオチドを区別できるものであればよい。例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）およびチミン（Ｔ）あるいはウラシル（Ｕ）の各々に対応して、それぞれのキャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位が相異なる値であればよい。この条件を満たす範囲で、４種のヌクレオチド誘導体の有する測定用置換基としては、異なる４種の測定用置換基を用いても、重複して同じ種類のものを用いてもよい。これは、変換可能な構造が同一種類のものであっても、塩基の種類に対応してキャッピングの結合する原子の位置がそれぞれ相異なるものとすることで電位の大きさを変えることが一般に可能であるからである。さらに、たとえ導入される原子の位置が同じであっても、リボース又はデオキシリボースに結合した塩基の種類に対応してそれぞれのキャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位が相異なる値であれば、電気化学的に変換可能な構造として同一種類のものを用いることができる。
【００９３】
キャッピングの電気化学的還元若しくは酸化を受ける電位については、使用する電極の種類や、溶媒により規定されるそれら電極系の電位窓内にあればその値は限定されないが、−１００Ｖから＋１００Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）である。好ましくは、−１０Ｖから＋１０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）であり、更に好ましくは、−１．２Ｖ〜＋１．０Ｖ（ｖｓ．ＳＣＥ）程度が好ましい。
【００９４】
（解析方法）
次に本発明の核酸塩基配列の解析方法の手順について説明する。本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程に先立ち、標的核酸とプライマーとのハイブリダイゼーションによる相補的結合対を形成する。具体的な形成方法としては、標的核酸とプライマーとを混合し、熱処理によってそれらの二次構造を破壊した後、プライマーの融解温度（Tm）以下の温度にまで冷却する。なお、本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程に先立ち、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を調製することができる。このような試料は、プロモーター配列を含むプライマーを用いたPCR増幅によって、あるいはプロモーター配列と標的核酸をライゲーションした後に適当な宿主を用いてクローニングすることによって、調製することができる。
【００９５】
本発明の核酸塩基配列の解析方法における第１の工程では、標的核酸とプライマーとの相補的結合対もしくはRNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料とポリメラーゼ固定化電極を用意する。そして、前記試料とポリメラーゼ固定化電極を溶液中で共存させる。標的核酸とプライマーとの相補的結合対もしくは前記ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料は、ポリメラーゼ固定化電極を構成するポリメラーゼ部分により捕捉される。
【００９６】
なお、前記試料とポリメラーゼ固定化電極とを共存（接触）させてポリメラーゼ固定化電極に前記試料を捕捉させる場合は、捕捉させた後にポリメラーゼ固定化電極を洗浄し、ポリメラーゼ固定化電極に捕捉されなかった試料を除去することが好ましい。このヌクレオチド誘導体の塩基部分は、アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、及びチミン(Ｔ)（又はウラシル(U)）の各々に対応して、電気化学的測定手段にて得られる電気信号が相異なる構造でキャッピングされている。勿論、同定できるのであれば、複数種のヌクレオチド誘導体を同じ構造体でキャッピングしておいても構わない。ヌクレオチド誘導体としては、例えば、ヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体や、ヌクレオシド ５'−二リン酸誘導体や、ヌクレオシド ５'−モノリン酸誘導体や、ヌクレオシド ３'−リン酸誘導体が挙げられる。ポリメラーゼ固定化電極とヌクレオチド誘導体を含む混合物においては、各種ヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を相等しい濃度で含むことが好ましい。
【００９７】
この結果、標的核酸とプライマーとの相補的結合対を試料とした場合には、標的核酸とプライマー（またはその伸長物）との相補的結合対におけるプライマー側の３'末端の水酸基と、標的核酸と相補的な塩基を含むヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体における５'リン酸基との間で、リン酸エステル結合が形成される。その際に、ピロリン酸が脱離する。
【００９８】
ポリメラーゼによる、1塩基伸長反応は通常1秒以内、特に大腸菌のDNAポリメラーゼIIIを利用した場合には最短500分の１秒で終了することが知られている。これまでのプロセスの一例を図５（１）から（３）に示す。また、RNAポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む試料を用いた場合には、プロモーター下流の転写開始点より転写が開始される。
【００９９】
次に、核酸塩基配列の解析方法における第２の工程では、ポリメラーゼ固定化電極に対して時間と共に漸次変化する電圧を印加する。電圧を変化させる方向は、還元反応を行う場合には自然電位より負の方向、また酸化反応を行う場合には正の方向である。変化のさせ方は自然電位から一定速度で印加する電圧を増加させる、もしくはステップ状にあるいはパルス状に印加電圧を増加させていく。電位の絶対値を常に増加させる方向に変化させることによって、ヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に依存して、それらの電気化学的変換に要する電圧の絶対値が小さいものから順に、変換がおきることになる。この電気化学的反応の一例を、図５（４）に示す。ヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に際しては、反応液中にポリメラーゼの活性を阻害しない種類および濃度の支持塩を添加しておいてもよい。支持塩としてはＮａ2ＨＰＯ4、ＮａＨ2ＰＯ4、ＫＣｌ等を挙げることができるが、Ｎａ2ＨＰＯ4及びＮａＨ2Ｐ０4を用いれば同時に緩衝液としても作用するのでこれらを用いるのが好ましい。
【０１００】
次に、第２の工程における印加した電圧値と、そのとき電極系に流れる電流値をモニターする。標的核酸と相補的な塩基を含むヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に依存した電圧で、還元反応または酸化反応が惹起され、この反応に伴う電流を観測することができる。反応にともなう電流を観測した時点での電極に印加されている電圧は、ヌクレオチド誘導体に結合したキャッピングの種類に応じて異なるので、この電圧の値から伸長鎖の３'末端の塩基の種類を知ることができ、これによって該塩基と相補的である標的核酸の塩基の種類を知ることができる。
【０１０１】
一塩基多型のような単一の塩基を解析する場合には、使用するプライマーを解析したい部位に隣接する３'側塩基配列の逆相補鎖を含む配列とすることで、上記第一の工程および第二の工程により解析することができる。この際使用するヌクレオシド５'−三リン酸誘導体は、塩基部分がＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴ若しくはU全ての混合物である必要はなく、解析したい多型を構成する塩基の少なくとも１種類を使用すればよい。これに対応して、一塩基多型を解析する場合には、ポリメラーゼ固定化電極に対して印加する電圧を時間と共に漸次変化させることは必ずしも必要ではなく、使用したヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に必要な電圧を印加すればよい。
【０１０２】
引き続き標的核酸の塩基を連続して知りたい場合、すなわち解析したい領域の塩基配列を測定する場合には、上記の第一の工程および第二の工程を繰返せばよい。ここで、第一の工程と第二の工程との間には、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を除去する操作は、必ずしも必要ではない。また、最初に系に添加するヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体の量が十分であれば、第二の工程から第一の工程に戻って繰返す場合にもヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を補充する必要はない。
【０１０３】
なお、3'伸長末端のヌクレオチドに修飾されたキャップ構造を電気化学的に変換するために電圧を印加すると、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体までも電極上で電気化学的に変換されてしまう場合がある。しかしながら溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体が電極上で電気化学的に変換されてしまうことによる「誤シグナルの寄与」は、例えば、次のようにして、排除若しくは低減することができる。
【０１０４】
一般に、ポリメラーゼのようなタンパク質内部の誘電率は水の誘電率とは異なる。このため、伸長鎖の３'末端に付加しているヌクレオチド誘導体のキャップ構造を電気化学的に変換するための電位と、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体のキャップ構造を電気化学的に変換するための電位との間には相違が生じる。この相違を印加電圧の違いとして識別することにより、誤シグナルの寄与を排除することが可能となる。
【０１０５】
また、伸長鎖の３'末端に付加しているヌクレオチド誘導体は導電性基体の近傍に捕捉される。一方、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体は溶液中を浮遊している。このため、両者の拡散係数の間には相違が生じる。そこで、この拡散係数の違いを利用して誤シグナルの寄与を低減させることが可能となる。例えば、印加電圧の時間変化を急峻にすることによって、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体が導電性基体に拡散して到達する前に、導電性基体の近傍に捕捉されているヌクレオチド誘導体の電気化学反応を実行する方法などがある。なお、拡散係数の違いは、例えば、インピーダンス法により測定することが可能である。
【０１０６】
さらに溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体におけるリン酸基は、通常ポリメラーゼが触媒活性を有する条件で解離し、負電荷を有している。このため、伸長鎖末端の誘導体を例えば還元するために電極に負の電圧を印加すると、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体は電極との間で静電的反発が生じ、未反応のヌクレオシド５´−三リン酸誘導体は電極に近づけないことになる。したがって、伸長鎖末端の誘導体を還元して検出する場合には、本来的に誤シグナルの寄与は少ないと考えられる。また、伸長鎖末端の誘導体を酸化して検出する場合であっても、酸化電位の印加の前に一旦電極電位を負側に一定時間保持することによって、溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を電極近傍から遠ざけることが出来、これにより誤シグナルの寄与を低減させることが可能となる。
【０１０７】
更に、一塩基多型を解析する場合には、電極の洗浄操作によって溶液中に残存する未反応のヌクレオシド ５'−三リン酸誘導体を取り除くことも有効である。
【０１０８】
以上の塩基配列の情報取得方法に用いる情報取得装置としては、以下の構成のものを挙げることができる。
【０１０９】
（情報取得装置）
情報取得装置は、標的核酸とプライマーとにより二本鎖化した試料とヌクレオチド誘導体とをポリメラーゼ固定化電極の存在下で反応させるための反応領域と、電圧印加部と、電気信号取得部と、を有して構成することができる。電圧印加部は、電気化学的に変換し得る部分を有するヌクレオチド誘導体を取り込んだ試料に電圧を印加するための部分（例えば、導電性部材で構成される第１の電極）である。電気信号取得部は、ヌクレオチド誘導体の該部分を電気化学的に変換することに起因する電気信号を取得するための部分（例えば、第２の電極）である。この装置の場合、電気信号取得部からの信号を用いて、ヌクレオチド誘導体を同定するための同定部を有することも好ましい。
【実施例】
【０１１０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明の方法は、これらの実施例のみに限定されるものではない。
【０１１１】
（実施例１）
本実施例では導電性基体としては金基板を用い、ポリメラーゼ部分としてはクローニングされたＮ末端にポリヒスチジンタグを融合した改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを用い、アンカー部分としてジスルフィド基を用いる。また、第一の導電性領域としてπ共役金属錯体、第二の導電性領域として粒径１．４nmの金ナノ微粒子をそれぞれ用いる。これらがポリメラーゼ部分、アンカー部分、第一の導電性領域、第二の導電性領域の順で連結されたポリメラーゼユニットとしてのプローブ修飾ポリメラーゼを用いてポリメラーゼ固定化電極を作製する。ポリメラーゼユニットの導電性基体である金基板への固定は、アンカー部分であるジスルフィドと金基板とのＡｕ−Ｓ結合形成によって行う。
以下、詳細について説明する。
【０１１２】
（Ｉ）導電性部分の合成
まず、以下の各錯体配位子を合成する。
＜１＞錯体配位子の合成（１）
下記式（１）で表される錯体配位子（４’−（４−ａｎｉｌｉｎｏ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅ）を次のようにして合成する。
【０１１３】
【化３】
2008026311.tif 000006
【０１１４】
１０００ｍＬのナスフラスコに還流管をつけ、９．７ｇの４−アミノベンズアルデヒド、２２ｍＬの２−アセチルピリジン、７５ｇの酢酸アンモニウム、１００ｇのアセトアミドを加え、空気雰囲気下３時間還流を行う。反応溶液を空冷し、２００ｍＬの水に５０ｇの水酸化ナトリウムを溶かして加え、２時間還流させる。反応溶液を空冷、溶液をデカンテーションで除き、残った油状の固体を３度水洗する。残留物を溶解可能な最少量の熱臭化水素酸に溶かし、室温で１日間放置する。生じた濃茶色の沈殿を濾過し、３００ｍＬの水に加え、溶液が塩基性になるまで炭酸水素ナトリウムを加える。得られた固体をクロロホルムで抽出し、減圧溜去で溶液を濃縮した後に、シリカを充填剤、クロロホルムを溶媒としてフラッシュカラムをかけ、３番目のフラクションを取得する。これを減圧溜去で濃縮し、クロロホルム／メタノール混合溶媒から再結晶させることで、式（１）で表される錯体配位子を得る。
【０１１５】
＜２＞錯体配位子の合成（２）
下記式（２）で表される錯体配位子を次のようにして合成する。
【０１１６】
【化４】
2008026311.tif 000007
【０１１７】
１００ｍＬの三口フラスコに温度計、還流管をつけ、０．７９ｇの式（１）で表される錯体配位子、０．１５ｇの塩化アンモニウム、５ｍＬの水を加え、スターラで強攪拌下、０．３７２ｇの亜鉛粉末を徐々に加える。自動的に反応が進行するので、氷浴で反応温度が５３℃になるように調整し２０分間反応させる。反応溶液を濾過し、残った亜鉛を３ｍＬの湯で洗浄し、洗浄液を濾液に加え、多量の砕氷に注ぎ、溶液を充分に冷やす。充分な氷を含んだ溶液に０．７５ｍＬの濃硫酸を加える。この溶液に０．１７ｇのニクロム酸ナトリウムを加えた０．７５ｍＬの水を加え、３分間攪拌、生じた沈殿を回収し、繰返し水洗する。デシケータ中、塩化カルシウムで乾燥することで、４’−（４−ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅを得る。
【０１１８】
１００ｍＬのナスフラスコに、１．３６ｇの４’−（４−ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅを加え、５ｍＬの酢酸で溶解させる。この溶液に０．５０ｇの４−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｅｎｅｔｈｉｏｌを加え室温で１２時間攪拌する。２０ｍＬの水を加え、炭酸ナトリウムをさらに加えて中和し、生成物を１５０ｍＬのクロロホルムで抽出する。減圧溜去で溶液を濃縮した後、アルミナを充填剤、クロロホルム−ジメチルアミンの２０／１混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られた溶液を減圧溜去、乾燥させることで式（２）で表される錯体配位子を得る。
【０１１９】
＜３＞錯体配位子の合成（３）
下記式（３）で表される錯体配位子を次のようにして合成する。
【０１２０】
【化５】
2008026311.tif 000008
【０１２１】
１００ｍＬの三口フラスコに温度計、還流管をつけ、０．７９ｇの式（１）で表される錯体配位子、０．１５ｇの塩化アンモニウム、５ｍＬの水を加え、スターラで強攪拌下、０．３７２ｇの亜鉛粉末を徐々に加える。自動的に反応が進行するので、氷浴で反応温度が５３℃になるように調整し２０分間反応させる。反応溶液を濾過し、残った亜鉛を３ｍＬの湯で洗浄し、洗浄液を濾液に加え、多量の砕氷に注ぎ、溶液を充分に冷やす。充分な氷を含んだ溶液に０．７５ｍＬの濃硫酸を加える。この溶液に０．１７ｇのニクロム酸ナトリウムを加えた０．７５ｍＬの水を加え、３分間攪拌、生じた沈殿を回収し、繰返し水洗する。デシケータ中、塩化カルシウムで乾燥することで、４’−（４−ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅを得る。
【０１２２】
１００ｍＬのナスフラスコに１．３６ｇの４’−（４−ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅを加え、５ｍＬの酢酸で溶解させる。この溶液に０．５０ｇの４，４’−ｄｉｔｈｉｏｄｉａｎｉｌｉｎｅを加え室温で１２時間攪拌する。２０ｍＬの水を加え、炭酸ナトリウムをさらに加えて中和し、生成物を１５０ｍＬのクロロホルムで抽出する。減圧溜去で溶液を濃縮した後、アルミナを充填剤、クロロホルム−ジメチルアミンの２０／１混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られた溶液を減圧溜去、乾燥させることで、式（３）で表される錯体配位子を得る。
【０１２３】
＜４＞錯体配位子の合成（４）
下記式（４）で表される錯体配位子を次のようにして合成する。
【０１２４】
【化６】
2008026311.tif 000009
【０１２５】
１００ｍＬのナスフラスコに０．６５ｇの式（１）で表される錯体配位子を加え、５ｍＬの酢酸で溶解させる。この溶液に０．６８ｇの４’−（４−ｎｉｔｒｏｓｏｂｅｎｚｅｎｅ）−２，２’：６’，２’’−ｔｅｒｐｙｒｉｄｉｎｅを加え室温で１２時間攪拌する。１０ｍＬの水を加え、炭酸ナトリウムをさらに加えて中和し、生成物を１５０ｍＬのクロロホルムで抽出する。減圧溜去で溶液を濃縮した後、アルミナを充填剤、クロロホルム−ジメチルアミンの２０／１混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、最初の燈色の成分を回収することで式（４）で表される錯体配位子を得る。
（ＩＩ）電極の作製
次に、上記式（１）から（４）で表される錯体配位子を用いて電極を作製する。
【０１２６】
＜５＞錯体配位子とMaleimido-C3-NTAの結合
Maleimido-C3-NTA（株式会社  同仁化学研究所製）と式（２）で表される錯体配位子とを業者の取扱説明書にしたがって結合させる。Maleimido-C3-NTAはN-[5-(3'-Maleimidopropylamido)-1-carboxypentyl]iminodiacetic acid, disodium salt, monohydrateである。
【０１２７】
【化７】
2008026311.tif 000010
【０１２８】
＜６＞金微微粒子と錯体配位子の結合
金微粒子Ｍｏｎｏ-Ｓｕｌｆｏ-ＮＨＳ-Ｎａｎｏｇｏｌｄ（登録商標、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製、粒径１．４nm）と式（１）に示す錯体配位子とを業者の取扱説明書にしたがってアミド結合させる。
【０１２９】
【化８】
2008026311.tif 000011
【０１３０】
＜７＞鉄の一配位錯体の調製
エチレングリコール中で、＜５＞で調製した錯体配位子とＦｅ（ＢＦ4）2を等モル混合し還流する。アルミナを充填剤、クロロホルム−ジメチルアミンの２０／１混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行うことによって、鉄の一配位錯体を分取する。
【０１３１】
＜８＞鉄の二配位錯体の調製
＜７＞で調製した鉄の一配位錯体と式（３）に示す錯体配位子の等モルを混合し、還流する。アルミナを充填剤、クロロホルム−ジメチルアミンの２０／１混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーを行うことによって、鉄の二配位錯体を分取する。
【０１３２】
【化９】
2008026311.tif 000012
【０１３３】
＜９＞アンカー部分、第一の導電性領域及び第二の導電性領域を有する構造体の調整  直径０．５ｍｍの金線の先端２ｃｍをコンタクトとして残してフッ素樹脂の熱収縮チューブで覆い、金電極とした。これを１Ｍの水酸化カリウムで８０℃、６時間加熱後、濃硫酸に１２時間浸漬、濃硝酸に１５分浸漬した後、超純水で洗浄乾燥する。＜８＞で調製した鉄の二配位錯体のクロロホルム溶液に、洗浄した金電極を５分間浸漬し、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを、０．１ＭのＦｅ（ＢＦ4）2の水溶液に３時間浸漬、水で洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを０．１Ｍの式（４）で表される錯体配位子のクロロホルム溶液に３時間浸漬したのち、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。さらに０．１ＭのＦｅ（ＢＦ4）2の水溶液に３時間浸漬、水で洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを０．１Ｍの式（４）で表される錯体配位子のクロロホルム溶液に３時間浸漬したのち、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。さらに０．１ＭのＦｅ（ＢＦ4）2の水溶液に３時間浸漬、水で洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを０．１Ｍの式（４）で表される錯体配位子のクロロホルム溶液に３時間浸漬したのち、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。さらに０．１ＭのＦｅ（ＢＦ4）2の水溶液に３時間浸漬、水で洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを＜６＞で調製した金ナノ微粒子と錯体配位子との結合物のクロロホルム溶液に３時間浸漬したのち、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。以上の工程で作製される構造体のアンカー部分（スルフィド）から第二導電性領域である金ナノ微粒子までの距離は9.2nmである。
【０１３４】
＜１０＞ポリメラーゼ部分の調製
Enterobacteria phage T7のゲノムDNA（GenBank Accesion No.V01146）よりgene 5, DNA polymeraseの情報を用いる。この遺伝子(T7 gene5)をpET-14bベクターのNdeI/BamHIサイトにクローニングする。T7のゲノムDNAを鋳型にして、以下の２種の合成オリゴDNAをプライマーとして用いてPCRを行い、2136ｂｐのDNA増幅産物を得る。
5'-aataatcatatgatcgtttctgacatcgaa-3' (NdeI)[配列番号1]
5'-aataatggatcctcagtggcaaatcgccca-3' (BamHI)[配列番号2]
このDNA増幅産物を制限酵素NdeIおよびBamHIで消化切断する。得られた断片をpET-14b(Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入する。このことによって、ポリヒスチジンタグの融合したT7 gene5, DNA polymerase発現ベクターpET-14-T7g5を作製する。
【０１３５】
次にT7 gene 5, DNA polymeraseのLys118からArg145までの28残基のアミノ酸を欠失するように、この遺伝子DNAの対応する一部を欠失させる。このようにして３´→５´エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ末Ｈｉｓタグ付き）の発現ベクターpET-14-T7g5(D28)[配列番号3]を作製する。
【０１３６】
作製した発現ベクターpET-14-T7g5(D28)を常法に従い大腸菌E.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１３７】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。
【０１３８】
＜１１＞ポリメラーゼ固定化電極の作製
＜９＞の工程で作製した金電極を、100mM NiSO4水溶液に20分間浸漬し、ニトリロ三酢酸部分にニッケルイオンをキレートさせる。その後、水で電極を洗浄し余分のニッケルイオンを除去する。次に前記＜１０＞の工程で調製したHisタグ融合タンパク質である改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのPBS緩衝液系での精製試料を添加し、4℃で20分間静置する。その後PBS緩衝液で洗浄することにより電極上に捕捉されなかった余分のポリメラーゼを除去する。次に大腸菌チオレドキシン（Thioredoxin from Escherichia coli（Ｓｉｇｍａ社製））のPBS溶液を加え4℃で20分間静置し、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを活性型とする。電極上に捕捉されたかった余分のチオレドキシンをPBS緩衝液で電極を洗浄することにより除去する。以上の工程で作製されるポリメラーゼ固定化電極のアンカー部分からポリメラーゼの活性中心までの距離は約10nmである。したがって、アンカー部分から第二導電性領域である金ナノ微粒子までの長さと、アンカー部分からポリメラーゼの活性部位までの長さは略等しい。
【０１３９】
（実施例２）
本実施例では、導電性基体として金基板、ポリメラーゼ部分としてクローニングされた改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、アンカー部分としてシステインをそれぞれ用いる。また、第一の導電性領域として二本鎖ＤＮＡ、第二の導電性領域として粒径１．４nmの金ナノ微粒子をそれぞれ用いる。これらがこの順序で連結されたプローブ修飾ポリメラーゼが、アンカー部分であるシステインと金基板とのＡｕ−Ｓ結合形成を介して該導電性基体上に固定化されている電極を作製する。
【０１４０】
＜１＞アンカー部分を融合した改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの調製
以下の２種の5'末端リン酸化合成オリゴDNAをTEバッファー中で、等量混合し、加熱後徐冷することによってアニーリングする。
5'- TAGCAAAAAAAAATGTTGCTGTTC -3' [配列番号4]
5'- TAGAACAGCAACATTTTTTTTTGC-3' [配列番号5]
このDNA断片を、実施例１で調製した改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎ末Ｈｉｓタグ付き）の発現ベクターpET-14-T7g5(D28)[配列番号3]のNdeI認識サイトに挿入する。このことによって、発現ベクターpET-14-C3T7g5(D28) [配列番号6]を作製する。作製した発現ベクターpET-14-C3T7g5(D28)を常法に従い大腸菌E.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１４１】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4~12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除く。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現されたHisタグ融合タンパク質をニッケルキレートカラムを用いて精製する。N末端のポリヒスチジンタグはトロンビンにより切断・除去する。
＜２＞導電性部分としての二本鎖ＤＮＡの連結
＜１＞で調製したアンカー部分を融合した改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸
配列にはN末端近くにLys残基が新たに導入されている。その結果、例えば水溶性架橋剤Sulfo-EMCS（株式会社  同仁化学研究所製）を用いることによってSH基を有する分子と効率的に架橋結合させることができる。Sulfo-EMCSはN-(6-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide, sodium saltである。
【０１４２】
改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼと5'末端チオール化合成オリゴDNA：5'- acagcatcgcca
gtc -3' [配列番号7]とを業者の取扱説明書にしたがって架橋結合させる。また、5'末端チオール化合成オリゴDNA：5'- gactggcgatgctgt -3' [配列番号8]における末端チオール基と金微粒子とを業者の取扱説明書にしたがって結合させる。金微粒子としてはMONOMALEIMIDO NANOGOLD（登録商標、Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ製）を用いる。
【０１４３】
配列番号７で表される1本鎖DNAに連結された改変型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼと、配列番号8で表される1本鎖DNAに連結された金微粒子とを混合し、室温で放置することによってこれらをハイブリダイズさせて相補的2本鎖DNAを形成させる。
【０１４４】
改変型Ｔ７ DNAポリメラーゼに連結された二本鎖ＤＮＡに対して、メタロインターカレータ複合体のインターカレートさせることによって二本鎖DNA部分へ導電性を付与する。すなわち、改変型Ｔ７ DNAポリメラーゼに連結された二本鎖ＤＮＡに対して、ジクロロ(2,2':6',2''−テルピリジン)白金(II)（Sigma-Aldrich社製、製品番号288098）の水溶液を加える。ジクロロ(2,2':6',2''−テルピリジン)白金(II)は、ＤＮＡに対して、結合することが知られている（Peyratout et al.(1995) Inorg.Chem. 34, 4484）。この結合は、テルピリジンリガンドをＤＮＡにインターカレートさせ、続いて共有結合の形成、すなわち、プラチネーションによって得ることができる。
【０１４５】
＜３＞電極への結合
直径０．５ｍｍの金線の先端２ｃｍとコンタクトを残してフッ素樹脂の熱収縮チューブで覆い、金電極とした。これを１Ｍの水酸化カリウムで８０℃、６時間加熱後、濃硫酸に１２時間浸漬、濃硝酸に１５分浸漬した後、超純水で洗浄乾燥した。これに＜２＞の工程で作製したプローブ修飾ポリメラーゼのPBS緩衝液系での精製試料を添加し、4℃で20分間静置することによりポリメラーゼのアミノ酸配列におけるＮ末近辺のシステインを元にした金電極上への固定化を行う。その後PBS緩衝液で洗浄することにより電極上に捕捉されなかった余分のポリメラーゼを除去する。次に大腸菌チオレドキシン（Thioredoxin from Escherichia coli（Ｓｉｇｍａ社製））のPBS溶液を加え4℃で20分間静置し、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼを活性型とする。電極上に捕捉されたかった余分のチオレドキシンをPBS緩衝液で電極を洗浄することにより除去する。以上の工程で作製されるポリメラーゼ固定化電極のアンカー部分からポリメラーゼの活性中心までの距離は約10nmである。また、アンカー部分から第二導電性領域である金ナノ微粒子までの長さは約8nmであり、アンカー部分からポリメラーゼの活性部位までの長さと略等しい。
【０１４６】
（実施例３、比較例１）
実施例１および実施例２で作製したポリメラーゼ固定化電極と、対照としてＴ７ ＤＮＡポリメラーゼとチオレドキシンからなる活性型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの固定化電極を用いて、3'伸長末端の電気化学的変換に要する過電圧を比較する（比較例１）。対電極として白金線を、参照電極として銀／塩化銀電極を用いて３極セルを構成する（図７参照）。これらをポテンショスタットに接続する。電極電位設定のためのファンクションジェネレーター、および計測およびデータ処理のためのコンピュータを更にポテンショスタットに接続する。ポリメラーゼ固定化電極に印加される電圧は、ファンクションジェネレーターによりプログラムされており、ポテンショスタットを経て印加される。印加された電圧とこのとき観測される電流値はコンピュータに送られ収集される。
【０１４７】
標的核酸として、配列番号９で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドをモデルとして用いる。また、プライマーとして配列番号１０で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる。
【０１４８】
まず、１０ピコモルの標的核酸と１０ピコモルのプライマーとを50マイクロリットルのTEバッファー中で混合し、96℃で20秒加熱後、25℃で放置する。
【０１４９】
次に、アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、およびチミン(Ｔ) の各々に対応して相異なる電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオチド５´−三リン酸誘導体として以下のものを用いる。
・2'-iodo-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate(2'I-dATP)
・2'-bromo-2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate(2'Br-dGTP)
・2'-chloro-2'-deoxythymidine-5'-triphosphate(2'Cl-dTTP)
・2'-fluoro-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate(2'F-dCTP)
これらの一部は商業的に入手可能（JENA BIOSCIENCE社、あるいはTriLink BioTechnologies社など）である。また、以下の文献などに記載の公知の方法に従って合成することができる。
・特開平07-97391号公報。
・特公平08-5908号公報。
・Gruen M.他(Nucleosides Nucleotides 18, 137-151 (1999))。
・"Oligonucleotide Synthesis; a practical approach" M. J. Gait (ed), IRL PRESS, 
(1984)。
【０１５０】
標的核酸とプライマーとの混合物を添加し、ポリメラーゼ固定化電極に接触させる。37℃で5分間接触させた後、緩衝液Aで洗浄し、ポリメラーゼ固定化電極に捕捉されなかった標的核酸とプライマーとの混合物を除去する。
緩衝液Ａ：
・３３ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）
・６６ｍＭ 酢酸カリウム
・１０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．５ｍＭ ジチオトレイトール
・０．０１％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミン
次に、2'I-dATP、2'Br-dGTP、2'Cl-dTTP、2'F-dCTPの各々５０μＭ水溶液（ｐH７．０）を、ポリメラーゼ固定化電極と接触させ、３７℃で保持する。電圧の時間変化は、自然電位を基準とし、負の方向に一定速度で掃引していくフェーズと自然電位で保持するフェーズからなる変化の繰返しとする。この条件においては、電圧を掃引し始めてからピーク電流を観測するまでの時間によって、伸長反応後、3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に要する電圧を比較することができる。
【０１５１】
その結果、電気化学的変換に要する電圧の大きさの序列は、2'F-dCMP > 2'Cl-dTMP > 2'Br-dGMP > 2'I-dAMPで、ポリメラーゼ固定化電極の種類に依らない。しかし過電圧の大きさは、実施例１および実施例２で作製したポリメラーゼ固定化電極の方が、対照として用いたＴ７ ＤＮＡポリメラーゼとチオレドキシンからなる活性型Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼの固定化電極よりも低いことがわかる。また各ヌクレオチド誘導体の還元電流のピーク幅についても実施例１および実施例２で作製したポリメラーゼ固定化電極の方が、対照のポリメラーゼの固定化電極より狭いことがわかる。
【０１５２】
（実施例４）
本実施例では導電性基体として金基板、ポリメラーゼ部分としてクローニングされた好熱菌由来の改変型ＤＮＡポリメラーゼ、導電性部分としてπ共役金属錯体、またアンカー部分としてジスルフィドをそれぞれ用いる。これらがこの順序で連結されたポリメラーゼユニットとしてのプローブ修飾ポリメラーゼが、アンカー部分であるジスルフィドと金基板とのＡｕ−Ｓ結合形成を介して導電性基体上に固定化されている電極を以下のように作製する。
【０１５３】
＜１＞アンカー部分、及び導電性部分の調製を固定化した金電極の作製
直径０．５ｍｍの金線の先端２ｃｍとコンタクトを残してフッ素樹脂の熱収縮チューブで覆い、金電極とした。これを１Ｍの水酸化カリウムで８０℃、６時間加熱後、濃硫酸に１２時間浸漬、濃硝酸に１５分浸漬した後、超純水で洗浄乾燥する。
実施例１で調製した、下記式（２）で表される錯体配位子
【０１５４】
【化１０】
2008026311.tif 000013
【０１５５】
の０．１Ｍクロロホルム溶液に、洗浄した金電極を５分間浸漬した後、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。これを、０．１ＭのＦｅ（ＢＦ4）2の水溶液に３時間浸漬、水で洗浄し、窒素気流で乾燥させる。
これを実施例１で調製した、下記式（７）で表される錯体配位子
【０１５６】
【化１１】
2008026311.tif 000014
【０１５７】
の０．１Ｍクロロホルム溶液に３時間浸漬したのち、クロロホルムで洗浄し、窒素気流で乾燥させる。
【０１５８】
＜２＞ポリメラーゼ部分の調製
好熱菌Thermus aquaticus（ATCC 25104）より常法によりゲノムDNAを調製する。このゲノムDNAを鋳型にして、合成オリゴDNA：
5'- aataatccatggccctggaggaggccccctggcccccgccggaag -3' (Nco I)[配列番号１３]および
5'- aataatgtcgactcactccttggcggagagccagtcctcccctat -3' (Sal I)[配列番号１４]
をプライマーとして用いPCRを行い、DNAポリメラーゼのStoffel fragmentをコードする遺伝子を含む約1,646bpのDNA増幅産物を得る。
【０１５９】
このDNA増幅産物を制限酵素Nco IおよびSal Iで消化切断し、pET-45b(+) (Novagen社製)の同じ制限酵素サイトに挿入することによって、DNAポリメラーゼのStoffel fragment (TaqDP、配列番号１５)発現ベクターpET-TaqDP（配列番号１６）を作製する。
次に、DNAポリメラーゼの活性部位近傍に導電性部分を繋ぎ込むための、DNAポリメラーゼに部位特異的変異を導入する。pET-TaqDP（配列番号１６）に対して、956番目から958番目の塩基CGCをCATに、1034番目から1036番目の塩基CAGをCATに、1196番目から1198番目の塩基TTCをCATに、それぞれ置換する。部位特異的変異の導入は、QuikChange( Site-Directed Mutagenesis Kit（STRATAGENE(社製)を用いてPCR反応により同社プロトコルに従って行う。
【０１６０】
このようにしてDNAポリメラーゼ(TaqDP、配列番号１５)の296番目のアルギニン、322番目のグルタミン、376番目のフェニルアラニンをそれぞれヒスチジンに置換した変異型DNAポリメラーゼ（mTaqDP、配列番号１７）の発現ベクターpET-mTaqDP（配列番号１８）を調製する。
【０１６１】
発現ベクターpET-mTaqDPを常法に従いE.coli BL21(DE3)に形質転換する。形質転換体は抗生物質アンピシリンに対する耐性株として選別することができる。
【０１６２】
得られた形質転換体を抗生物質アンピシリンを添加したLB培地10mLで一晩プレ・カルチャーした後、その0.2mLを、100mLのLB-Amp培地に添加し、30℃、170rpmで4時間振とう培養する。その後IPTGを添加 (終濃度 1mM) し、37℃で4から12時間培養を続ける。IPTG 誘導した形質転換体を集菌 (8000×g、 2分、4℃) し、1/10 量の 4℃ PBSに再懸濁する。凍結融解およびソニケーションにより菌体を破砕し、遠心 (8000×g、 10分、4℃)して固形夾雑物を取り除くことにより、無細胞抽出液（cell-free extract）を調製する。目的の発現タンパク質が上清に存在することをSDS-PAGEで確認した後、誘導発現された変異型DNAポリメラーゼタンパク質を精製する。精製は、最初に上記無細胞抽出液を95℃の湯浴上で20分間恒温保持することで宿主である大腸菌由来のタンパク質を変性・凝固させ、これを遠心分離(8000×g、 10分、20℃)して除去する。次に、２００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ8.0）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ７５（アマシャムバイオサイエンス社）を用い、ゲルろ過を行うことで、目的のタンパク質を含むフラクションを得る。
【０１６３】
＜３＞ポリメラーゼ部分の固定化
＜１＞の工程で作製した金電極を、100mM NiSO4水溶液に20分間浸漬し、ニトリロ三酢酸部分にニッケルイオンをキレートさせる。その後、水で電極を洗浄し余分のニッケルイオンを除去する。次に前記＜２＞の工程で調製した好熱菌由来の変異型ＤＮＡポリメラーゼのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液系での精製試料を添加し、4℃で20分間静置する。その後Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄することにより電極上に捕捉されなかった余分のポリメラーゼを除去する。以上の工程により作製されるポリメラーゼ固定化電極では、ポリメラーゼ部分はその活性中心近傍に導入されたヒスチジン残基を介してπ共役金属錯体の端部に配位結合している。
【０１６４】
（実施例５）
実施例４で作製したポリメラーゼ固定化電極を用いて、3'伸長末端の電気化学的変換に要する過電圧を測定する（実施例５）。また、比較例１のDNAポリメラーゼ(TaqDP、配列番号１５)の固定化電極を、実施例５と同じ条件で、3'伸長末端の電気化学的変換に要する過電圧を測定する（比較例２）。これらをポテンショスタットに接続する。電極電位設定のためのファンクションジェネレーター、および計測およびデータ処理のためのコンピュータを更にポテンショスタットに接続する。ポリメラーゼ固定化電極に印加される電圧は、ファンクションジェネレーターによりプログラムされており、ポテンショスタットを経て印加される。印加された電圧とこのとき観測される電流値はコンピュータに送られ収集される。
【０１６５】
標的核酸としては、配列番号９で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドをモデルとして用いる。また、プライマーとしては、配列番号１０で表される合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる。
【０１６６】
まず、１０ピコモルの標的核酸と１０ピコモルのプライマーとを50マイクロリットルのTEバッファー中で混合し、96℃で20秒加熱後、25℃で放置する。
【０１６７】
次に、アデニン(Ａ)、シトシン(Ｃ)、グアニン(Ｇ)、およびチミン(Ｔ) の各々に対応して相異なる電気化学的に変換可能な構造でキャッピングされたヌクレオチド５´−三リン酸誘導体として以下のものを用いる。
・2'-iodo-2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate(2'I-dATP)
・2'-bromo-2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate(2'Br-dGTP)
・2'-chloro-2'-deoxythymidine-5'-triphosphate(2'Cl-dTTP)
・2'-fluoro-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate(2'F-dCTP)
標的核酸とプライマーとの混合物を添加し、電極系に接触させる。37℃で5分間保持し、その後、緩衝液Bで洗浄し、ポリメラーゼ固定化電極に捕捉されなかった標的核酸とプライマーとの混合物を除去する。
【０１６８】
緩衝液B：
・３３ｍＭ トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．９）
・６６ｍＭ 酢酸カリウム
・１０ｍＭ 酢酸マグネシウム
・０．０１％（ｗ/ｖ）ウシ血清アルブミン
次に、2'I-dATP、2'Br-dGTP、2'Cl-dTTP、2'F-dCTPの各々５０μＭ水溶液（ｐH７．０）を、ポリメラーゼ固定化電極と接触させ、７０℃で保持する。電圧の時間変化は、自然電位を基準とし、負の方向に一定速度で掃引していくフェーズと自然電位で保持するフェーズからなる変化の繰返しとする。この条件においては、電圧を掃引し始めてからピーク電流を観測するまでの時間によって、伸長反応後、3'伸長末端に付加されたヌクレオチド誘導体の電気化学的変換に要する電圧を比較することができる。
【０１６９】
その結果、電気化学的変換に要する電圧の大きさの序列は、2'F-dCMP > 2'Cl-dTMP > 2'Br-dGMP > 2'I-dAMPで、ポリメラーゼ固定化電極の種類に依らない。しかし過電圧の大きさは、実施例４で作製したポリメラーゼ固定化電極の方が、対照として用いたDNAポリメラーゼ(TaqDP、配列番号１５)の固定化電極（比較例２）よりも低いことがわかる。また各ヌクレオチド誘導体の還元電流のピーク幅についても実施例４で作製したポリメラーゼ固定化電極の方が、対照のポリメラーゼの固定化電極より狭いことがわかる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】本発明のポリメラーゼ固定化電極に用いるポリメラーゼユニットの構成例を示す模式図である。
【図２】本発明のポリメラーゼ固定化電極の構成例を示す模式図である。
【図３】本発明のポリメラーゼ固定化電極に用いるポリメラーゼユニットの別の構成例を示す模式図である。
【図４】本発明のポリメラーゼ固定化電極の別の構成例を示す模式図である。
【図５】本発明のポリメラーゼ固定化電極を用いた際の核酸の塩基配列の解析方法における各工程を説明する模式図である。
【図６】標的核酸上でのプライマーの認識位置を示す図である。
【図７】本発明の核酸の塩基配列の解析方法を実行するDNA塩基配列解析装置の構成例を示す模式図である。
【図８】図５（１）及び図５（２）の拡大図である。
【図９】図５（３）及び図５（４）の拡大図である。
【符号の説明】
【０１７１】
１  ポリメラーゼ部分
２  アンカー部分
３  導電性部分
４  第二の導電性領域（プローブ領域）
５  導電性基体
６  ポリヒスチジンタグ
７  錯体配位子部分
８  金属
９  第一の導電性領域
【図１】
2008026311.tif 000015
【図２】
2008026311.tif 000016
【図３】
2008026311.tif 000017
【図４】
2008026311.tif 000018
【図５】
2008026311.tif 000019
【図６】
2008026311.tif 000020
【図７】
2008026311.tif 000021
【図８】
2008026311.tif 000022
【図９】
2008026311.tif 000023
【配列表】
2008026311000001.app