(57)【要約】【課題】安全性に優れ、日常的に長期間にわたり服用・摂取が可能な、免疫賦活剤を提供する。【解決手段】フコイダンと納豆菌菌体を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコイダンと納豆菌菌体を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】
飲食品である、請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
感染症の治療および予防を目的とする健康食品または特定保健用食品である、請求項２に記載の免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、基礎疾患を有する患者や高齢者にとって、生命にかかわる危険な感染症である。インフルエンザ対策として、従来ワクチンの予防接種が実施されているが、ウイルスの感染やインフルエンザの発症を完全に防ぐことはできず、その効果には限界がある。また、インフルエンザウイルス感染による症状の軽減を目的として、アマンタジン、ザナミビル、オセルタミビルなどを抗ウイルス剤として使用することが認められているが、副作用の恐れがあることが指摘されている。そこで、インフルエンザウイルスに感染しても、ウイルスを排除し回復することができるように、免疫機能を活性化することが重要との認識が広まっている。
【０００３】
一方、硫酸化多糖類の一種であるフコイダンについては、例えばフコイダンを有効成分として含有する免疫力強化剤（特許文献１参照）、フコイダン様多糖複合体を有効成分とすることを特徴とする免疫賦活剤（特許文献２参照）、新規なメカブ由来フコイダンを有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤（特許文献３参照）などが提案されている。しかし、フコイダンを単独で用いても免疫機能を活性化する作用には限界があり、より有効な免疫賦活剤が求められている。
【０００４】
【特許文献１】特開平１１−２２８６０２号公報
【特許文献２】特開２００１−１８１３０３号公報（請求項７）
【特許文献３】特開２００２−２６５３７０号公報（請求項６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、安全性に優れ、日常的に長期間にわたり服用・摂取が可能な、免疫賦活剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、フコイダンと納豆菌菌体とを併用することにより免疫機能が著しく向上することを見いだし、この知見に基づいて本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
（１）フコイダンと納豆菌菌体を有効成分として含有することを特徴とする免疫賦活剤、
（２）飲食品である、前記（１）に記載の免疫賦活剤、
（３）感染症の治療および予防を目的とする健康食品または特定保健用食品である、前記（２）に記載の免疫賦活剤、
からなっている。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫賦活剤に有効成分として含まれるフコイダンおよび納豆菌菌体は食経験のある原材料であり、日常的に長期間にわたり摂取しても全く問題は無い。
本発明の免疫賦活剤を摂取することにより、免疫機能が著しく活性化される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明で用いられるフコイダンは、褐藻類に含まれ、硫酸化フコースを構成糖として含む硫酸化多糖類であればよく、特に制限はない。該褐藻類としては、例えばコンブ目、ナガマツモ目、ヒバマタ目などに属する海藻類が挙げられ、具体的には、ガゴメコンブ、トロロコンブ、ワカメ、クロメ、アラメ、カジメ、ジャイアントケルプ、レッソニア  ニグレセンス、モズク、オキナワモズク、ヒバマタ、アスコフィラム  ノドサムなどが挙げられ、中でもオキナワモズク、ワカメ（芽株）などが好ましい。
【０００９】
褐藻類からフコイダンを抽出する方法に特に制限はなく、例えば藻体を酢酸または希塩酸の水溶液に懸濁させ、室温から約１００℃の範囲で抽出を行う酸抽出法、藻体を水に懸濁させ、約１００℃で抽出を行う熱水抽出法など自体公知の方法で行えばよい。抽出後固液分離し、酸抽出法の場合は得られた抽出液を中和し、抽出液に塩化カルシウムまたは酢酸バリウムなどの水溶液を加えて沈殿するアルギン酸を除去してもよい。更に所望により限外ろ過、透析などを行って低分子量物質を除去してもよい。本発明で用いられるフコイダンとしては、褐藻類由来のフコイダンを含む粗製品、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーなどにより精製した精製品、またこれらを含有する製剤などが挙げられ、いずれも好ましく用いることができる。本発明で用いられるフコイダンの好ましい形態としては、例えば上記藻体抽出液の濃縮液および該濃縮液を常法により真空凍結乾燥して得られる粉末などが挙げられる。
【００１０】
本発明で用いられるフコイダンは、フコイダンに存在する硫酸基やカルボキシル基を公知の方法により塩に変換することで得られる薬理学的に許容されうる塩であってもよい。このような塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの金属の塩、ピリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミンなどの医薬的に許容される有機アミノ化合物の塩などが挙げられる。
【００１１】
本発明で用いられる納豆菌菌体は、納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏ）を培地に接種し、培養することにより得られる。該納豆菌として特に制限はないが、好ましくは通常納豆工業で使用されている納豆菌であり、例えば高橋菌（高橋祐蔵研究所製、山形）、成瀬菌（成瀬醗酵化学研究所製、東京）、宮城野菌（宮城野納豆製造所製、仙台）、朝日菌（朝日工業製、東京）、日東菌（日東薬品工業製、京都）、目黒菌（目黒研究所製、大阪）などが挙げられる。
【００１２】
納豆菌を培養するための培地として、固体培地または液体培地のいずれを用いてもよいが、好ましくは液体培地である。該培地は、納豆菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩およびその他の栄養素を含有する培地であればよく、特に制限はない。培地のｐＨは、通常ｐＨ約６．０〜９．５、好ましくはｐＨ約７．０〜８．５である。固体培地による培養は、菌を接種した培地を恒温器または恒温室内に保つことにより行われる。また、液体培地による培養は、菌を接種した培地を振盪機にて振盪するか、または通気攪拌培養することにより行われるのが好ましい。その際、培養温度は、通常約２０〜４５℃、好ましくは約３７〜４２℃である。培養時間は、通常約６〜７２時間、好ましくは約１２〜３６時間である。培養終了後、所望により滅菌処理を実施してもよい。
【００１３】
本発明で用いられる納豆菌菌体は、固体培地による培養では、培養菌体を培地ごと乾燥し、粉砕することにより得ることができる。また液体培地による培養では、自体公知の方法にて固液分離し、回収した培養菌体をそのまま乾燥するか、または回収した培養菌体を賦形剤を含む水溶液に懸濁させ、次に噴霧乾燥することにより得ることができる。
【００１４】
本発明の免疫賦活剤は、上記フコイダンおよび納豆菌菌体をそのまま、あるいは製薬学的に許容される添加物、食品素材、食品原料、さらに必要に応じて食品添加物などを適宜混合し、常法に従い例えば散剤、顆粒剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセルまたはハードカプセルなどの製剤および飲食品として製造される。該飲食品は、固形食品、クリーム状またはジャム様の半固形食品、ゲル状食品、飲料などあらゆる食品形態をとることが可能である。具体的には、例えば清涼飲料、クッキー、プリン、ゼリー菓子、キャンディ、ドロップ、チューインガム、チョコレート、ヨーグルト、アイスクリーム、マーガリン、ショートニング、マヨネーズおよびドレッシングなどが挙げられる。これら各種製剤および飲食品は、免疫賦活効果、感染症の治療および予防を目的とする健康食品または特定保健用食品として有用である。
【００１５】
上記製剤および飲食品の製造に用いられる添加物、食品素材、食品原料および食品添加物としては、例えば賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステルなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液など）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０など）、甘味料（砂糖、果糖、ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテームなど）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビンなど）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウムなど）、増粘剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウムなど）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロールなど）、香料（ハッカ、ストロベリー香料など）、酸味料（クエン酸、乳糖、ＤＬ−リンゴ酸など）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウムなど）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルなど）、ｐＨ調整剤（クエン酸、クエン酸三ナトリウムなど）、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類などが挙げられる。
【００１６】
上記製剤および飲食品１００質量％中の各成分の含有量は、フコイダン（乾燥物換算）が通常約１〜８０質量％、好ましくは約１〜５０質量％、納豆菌菌体（菌体乾燥物換算）が通常約０．１〜８０質量％、好ましくは約０．１〜５０質量％である。フコイダン（乾燥物換算）量に対する納豆菌菌体（菌体乾燥物換算）量の比率は、通常約０．１〜１、好ましくは約０．１〜０．５である。
【００１７】
上記製剤および飲食品を経口的に摂取する場合、成人1日当たりの用量は、有効成分（フコイダンと納豆菌菌体）の乾燥物換算量で約０．０１〜１０００ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１〜５００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲である。この用量を、1回または数回に分けて摂取するとよい。但し、実際の用量は、目的や摂取者の状況（性別、年齢、健康状態など）を考慮して決められるべきである。
【００１８】
以下に本発明を実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００１９】
［試験例1］
フコイダン、納豆菌菌体およびフコイダンと納豆菌菌体の混合物を経口投与して飼育したマウスにインフルエンザウイルスを感染させ、感染後のウイルス量に及ぼす試料投与の効果を試験した。同時に、対照として試料を投与しない群についても試験した。結果を表１に示す。
【００２０】
（ａ）実験材料
（１）供試試料
・フコイダン（商品名：理研メカブフコイダン（粉末）；理研ビタミン社製，フコース含有量２０％以上，硫酸基含有量２５％以上）
・納豆菌菌体（日東薬品工業社製，菌数約５０億個／ｇ）
・フコイダンと納豆菌菌体の混合物（フコイダン：納豆菌菌体＝５：１（質量部））
（２）投与方法
〈フコイダン投与区〉フコイダン５ｍｇを０．２ｍＬの蒸留水に懸濁させ、１日２回に分けて、感染前７日間および感染後７日間の計１４日間投与した。
〈納豆菌菌体投与区〉納豆菌菌体１ｍｇを０．２ｍＬの蒸留水に懸濁させ、１日２回に分けて、感染前７日間および感染後７日間の計１４日間投与した。
〈混合物投与区〉    フコイダン５ｍｇおよび納豆菌菌体１ｍｇを０．２ｍＬの蒸留水に懸濁させ、１日２回に分けて、感染前７日間および感染後７日間の計１４日間投与した。
〈対照区〉          ０．２ｍＬの蒸留水を１日２回に分けて、感染前７日間および感染後７日間の計１４日間投与した。
（３）供試動物
ＢＡＬＢ／ｃマウス（生後５〜６週齢  雌）を７日間予備飼育した後実験に供した。マウスは予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のＳＰＦバリア飼育室（照明時間８時〜１８時、換気回数１８回／時）で飼育し、市販の固形飼料（ＭＦ）と滅菌蒸留水をそれぞれ自由摂取させた。
（４）供試動物数
〈フコイダン投与区〉  ５匹
〈納豆菌菌体投与区〉  ５匹
〈混合物投与区〉      ５匹
〈対照区〉            ５匹
【００２１】
（ｂ）試験方法
マウスの鼻腔内にインフルエンザウイルスＮＷＳ株（Ｈ１Ｎ１）を接種（２×１０6ＰＦＵ／５０μＬ／マウス）して感染させた。感染５日後に気管・気管支洗浄液を採取し、洗浄液中のウイルス量をＭＤＣＫ細胞を用いて、プラークアッセイ法にて測定した。
【００２２】
［気管・気管支洗浄液の調製方法］
１）麻酔下でマウスの気管を切開し、頭部側を鉗子で挟む。
２）プラスチックカニューレ型穿刺針を鉗子のすぐ近くに設置し、内針を抜き取る。
３）液漏れを防ぐために接着剤（商品名：アロンアルフア；東亞合成株式会社製）で穿刺部位を塞ぐ。
４）４℃に冷却したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を０．８ｍＬ入れた１ｍＬシリンジをカニューレに接続する。
５）ゆっくりと液を注入後、３回洗浄する。
６）滅菌マイクロチューブ（１．５ｍＬ容）に洗浄液を入れ、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。
７）上清を別の滅菌マイクロチューブ（１．５ｍＬ容）に移し、−８０℃で保存する。
【００２３】
［気管・気管支洗浄液のウイルス量測定方法］
（１）準備するもの
・２ｘＭＥＭ培地
培地（粉末）９．４ｇに蒸留水５００ｍＬを加えて溶解し、高圧蒸気法により滅菌後４℃に保存する。
・インフルエンザウイルスのプラークアッセイ用培地
以下のＡ液（６０ｍＬ）とＢ液（４０ｍＬ）を合わせて１００ｍＬとする。
Ａ液：蒸留水                              ８．１４ｍＬ
２ｘＭＥＭ培地                    ４３．４  ｍＬ
７．５％重曹液                      ３．０  ｍＬ
Ｌ‐グルタミン液（ア）              １．０  ｍＬ
１０％ＢＳＡ（イ）                  ２．０  ｍＬ
１０％グルコース（ウ）              １．０  ｍＬ
１％ＤＥＡＥ‐デキストラン（エ）    １．０  ｍＬ
１００ｘビタミン混液（オ）          ０．１  ｍＬ
葉酸液（カ）                        ０．１  ｍＬ
ビオチン液（キ）                    ０．１  ｍＬ
トリプシン液（ク）                  ０．１６ｍＬ
Ｂ液：寒天（粉末）０．８ｇに蒸留水４０ｍＬを加えて溶解し、高圧蒸気法により滅菌したもの。
【００２４】
上記Ａ液に配合される（ア）〜（ク）の詳細は以下の通りである。
（ア）Ｌ‐グルタミン６０ｇに蒸留水１０００ｍＬを加え５０〜６０℃に加熱して溶解し、溶液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いて熱時ろ過滅菌したもの。得られたろ液は５０ｍＬチューブに３０ｍＬづつ分注し、−２０℃に保存される。
（イ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０ｇにＰＢＳ１００ｍＬを加えて溶解し、溶液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したもの。得られたろ液は１００ｍＬのガラス瓶に入れ、４℃に保存される。
（ウ）グルコース１０ｇに蒸留水１００ｍＬを加えて溶解し、溶液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したもの。得られたろ液は１５ｍＬチューブに分注し、−２０℃に保存される。
（エ）ＤＥＡＥ‐デキストラン１ｇに蒸留水１００ｍＬを加えて溶解し、高圧蒸気法により滅菌したもの。得られた溶液は４℃に保存される。
（オ）１００ｘ  ｖｉｔａｍｉｎｓ  ｆｏｒ  ＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ（市販品）
（カ）葉酸１００ｍｇに蒸留水１００ｍＬを加えて溶解し、高圧蒸気法により滅菌したもの。得られた溶液は１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、−２０℃に保存される。
（キ）ビオチン１００ｍｇに蒸留水１００ｍＬを加えて溶解し、高圧蒸気法により滅菌したもの。得られた溶液は１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、−２０℃に保存される。
（ク）トリプシン（Ｔｔｐｅ  ＩＩＩ；Ｓｉｇｍａ社製）２００ｍｇに蒸留水１００ｍＬを加え４℃で一晩攪拌して溶解し、溶液を孔径０．４５μｍのメンブレンフィルターを用いてろ過滅菌したもの。得られた溶液は１．５ｍＬマイクロチューブに分注し、−８０℃に保存される。
・クリスタルバイオレット液
クリスタルバイオレット３００ｍｇにエタノール１００ｍＬおよび蒸留水４００ｍＬを加えて溶解し、室温で保存する。
【００２５】
（２）ウイルス量の測定
１）プラスチック製培養皿（径３５ｍｍ）にＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓上皮細胞由来の培養細胞）を単層状に培養する。
２）冷凍保存しておいた気管・気管支洗浄液を室温で解凍後、ＰＢＳで１０〜１０5倍に希釈する。
３）２）で得た各希釈洗浄液を１）の培養皿に１皿当たり１００μＬ入れ、室温で１時間静置しウイルスを吸着させる。
４）約４０〜４５℃に保温したプラークアッセイ用培地を３）の培養皿に１皿当たり２ｍＬ入れ、重層する。
５）寒天が固まった後、３７℃のＣＯ2インキュベーターに入れ培養する。
６）２日後に、プラークが適当な大きさになっていることを確認して後寒天を除去し、クリスタルバイオレット液を１皿当たり約１ｍＬ加え、１０分間染色する。
７）顕微鏡にてプラーク数を数え、その値をウイルス量とした。
【００２６】
【表１】
2008063241.tif 000002
【００２７】
表１に示した通り、フコイダンと納豆菌菌体の混合物投与により、インフルエンザウイルスの増殖を顕著に抑制する効果が得られる。
【００２８】
［試験例２］
フコイダン、納豆菌菌体およびフコイダンと納豆菌菌体の混合物を経口投与して飼育したマウスにインフルエンザウイルスを感染させ、感染後の血清の中和抗体価に及ぼす試料投与の効果を試験した。同時に、対照として試料を投与しない群についても試験した。結果を表２に示す。
【００２９】
（ａ）実験材料
（１）供試試料
試験例１と同じ。
（２）投与方法
試験１と同じ。
（３）供試動物
試験１と同じ。
（４）供試動物数
〈フコイダン投与区〉  ９匹
〈納豆菌菌体投与区〉  ８匹
〈混合物投与区〉      ９匹
〈対照区〉            ３匹
【００３０】
（ｂ）試験方法
マウスの鼻腔内にインフルエンザウイルスＮＷＳ株（Ｈ１Ｎ１）を接種（２×１０5ＰＦＵ／５０μＬ／マウス）して感染させた。感染４週間後に伏在静脈から血液を採取して血清を得、一定量のウイルスと血清希釈液を３７℃で１時間処理し、残存するウイルス量をＭＤＣＫ細胞を用いてプラークアッセイ法にて測定し、その数値を基に中和抗体価を算出した。
【００３１】
［血清の調製方法］
１）マウスの伏在静脈から常法により血液を採取する。
２）血液を室温で約３０分間保ち、血液を凝固させる。
３）凝固した血液を常法により遠心分離し、上清として血清を得た。
【００３２】
［血清の中和抗体価測定方法］
（１）準備するもの
試験例１と同じ。
【００３３】
（２）ウイルス量の測定
１）血清を５６℃で３０分間非働化処理する。
２）処理した血清を、ＰＢＳで２０倍、１００倍、５００倍、２５００倍、１２５００倍および６２５００倍に希釈する。
３）インフルエンザウイルスＮＷＳ株（Ｈ１Ｎ１）を２０００ＰＦＵ／ｍＬに調整し、その１００μＬを、２）で得た各希釈血清１００μＬと混合する。同時に、希釈血清に替えてＰＢＳ１００μＬと混合したものを作製し、コントロールとした。
４）３）の混合液を３７℃で１時間処理する。
５）プラスチック製培養皿（径３５ｍｍ）にＭＤＣＫ細胞（イヌ腎臓上皮細胞由来の培養細胞）を単層状に培養し、４）の処理液を１皿当たり１００μＬ入れ、室温で１時間静置しウイルスを吸着させる。
６）約４０〜４５℃に保温したプラークアッセイ用培地を５）の培養皿に１皿当たり２ｍＬ入れ、重層する。
７）寒天が固まった後、３７℃のＣＯ２インキュベーターに入れ培養する。
８）２日後に、プラークが適当な大きさになっていることを確認して後寒天を除去し、クリスタルバイオレット液を１皿当たり約１ｍＬ加え、１０分間染色する。
９）顕微鏡にて、プラーク数を数える。
【００３４】
（３）中和抗体価の算出
１）コントロールのプラーク数を１００％として、各希釈液のプラーク数の比率（％）を計算する。
２）各血清について、各希釈倍率に対応する希釈液のプラーク数の比率（％）をグラフ上にプロットし、得られた曲線からプラーク数の比率（％）が５０％のときの血清の希釈倍率を求め、その値を中和抗体価とした。
【００３５】
【表２】
2008063241.tif 000003
【００３６】
表２に示した通り、フコイダンと納豆菌菌体の混合物投与により、中和抗体価が顕著に大きくなっている。このことから、フコイダンまたは納豆菌菌体の単独投与区のマウスに比べて、混合物投与区のマウスの免疫機能がより活性化されていると推察される。
【００３７】
［実施例1］
フコイダン（商品名：理研メカブフコイダン；理研ビタミン社製）４０質量部、納豆菌菌体（日東薬品工業社製）８質量部、乳糖（商品名：フローラック；サンフコ社製）５１質量部、ショ糖脂肪酸エステル（商品名：リョートーシュガーエステルＳ−３７０Ｆ；三菱化学フーズ社製）１質量部を均一に混合し、試料とした。該試料を回転式小型打錠機（型式：ＡＰ−ＳＳ；畑鐵工所社製）を用い、１錠２５０ｍｇ、１０ｍｍφ、打錠圧１００ＭＰａで打錠し、１錠当たりフコイダン約１００ｍｇ、納豆菌菌体約２０ｍｇ含む錠剤を得た。
【００３８】
[実施例２]
ミツロウ（商品名：脱臭精製ミツロウ；セラリカＮＯＤＡ社製）８．３質量部、グリセリン脂肪酸エステル（商品名：ポエムＳ−１００;理研ビタミン社製）１．７質量部およびサフラワーサラダ油（商品名：ハイオレイックサフラワーオイル；サミット製油社製）６０．８質量部を混合し、約７０℃に加熱して溶解する。得られた溶液を室温まで冷却し、その中にフコイダン（商品名：理研メカブフコイダン；理研ビタミン社製）１４．３質量部、納豆菌菌体（日東薬品工業社製）０．７質量部、ビフィズス菌菌体（日東薬品工業社製）７．１質量部およびアシドフィルス菌菌体（日東薬品工業社製）７．１質量部を加えて均一に混合し、充填液を得た。該充填液３５０ｍｇを常法によりソフトカプセルに充填し、１カプセルあたりフコイダン５０ｍｇ、納豆菌菌体２．５ｍｇ、ビフィズス菌菌体２５ｍｇ、アシドフィルス菌菌体２５ｍｇを含むソフトカプセルを得た。