(57)【要約】【課題】  顕著なコラーゲン産生促進能を有する新規組成物を提供すること。【解決手段】  本発明は、（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）で表されるペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物を提供する。本発明はさらに、（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有し且つ細胞におけるコラーゲン産生促進能を有するペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物を提供する。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、
（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）で表されるペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種
とを含有する組成物。
【請求項２】
（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、
（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有し且つ細胞におけるコラーゲン産生促進能を有するペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種
とを含有する組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが３〜１０残基のアミノ酸長を有する、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
細胞におけるコラーゲン産生を促進するために使用され得る、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
外用組成物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進能を有する有用な新規組成物ならびにそれに関連する発明に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、動物の結合組織には、その主要成分として、コラーゲン、ヒアルロン酸、エラスチン、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ラミニンなどが含まれていることが分かっている。なかでもコラーゲンは、結合組織において後述のような重要な役割を果たしている。
【０００３】
コラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要蛋白質であり、特にヒトの体の総蛋白質の３０％近くをコラーゲンが占める。コラーゲンの主たる機能は、生体組織の骨格構造の形成にあるので、動物の組織形態の骨格構造を構成する主成分として皮膚、軟骨組織、角膜、心臓、肝臓等に広く分布する。コラーゲンは、各種細胞の接着、細胞の分化や増殖に対して特異的に作用し、細胞機能の調節因子としての役割も持っているため、コラーゲンの減少は、角膜潰瘍等の角膜障害、リューマチ、関節炎、変形性関節炎、骨関節炎等の関節障害、炎症性疾患等の様々な疾患を引き起こすことがある。
【０００４】
また皮膚真皮細胞外マトリックスでは、コラーゲン線維が網目状の束を形成することにより組織形態を維持している。コラーゲン線維は、成熟し増殖して架橋形成が進行すると太く直線的な線維束となり、若い皮膚での適度なハリを与えている。しかし老化した皮膚では、真皮細胞外マトリックスのコラーゲン線維が著しく減少し、本来の弾力性に富むハリが失われてしまう。その結果、皮膚にはシワやタルミが形成される。光老化によるヘアレスマウスのコラーゲン線維束構造の変化が詳細に検討され（非特許文献１参照）、ＵＶＢを照射したヘアレスマウスには、シワが形成され、シワの形成と一致するようにコラーゲン線維束構造が崩壊し皮膚弾力性が低下していくことが示されている。また、コラーゲンは水分保持機能に優れていることも知られている。
【０００５】
コラーゲンの減少による状態を改善するために、種々のコラーゲン合成促進物質が見出されている。例えば、レチノイン酸（非特許文献２）、グリシン及びプロリン及びアラニンからなる３種アミノ酸（特許文献１）、カンゾウ、ソウハクヒ、アロエ、スギナ、キンギンカ、オウバク、ガイヨウ又はゲンチアナなどの植物抽出物（特許文献２）、ＴＧＦ−β、アスコルビン酸類等が知られている。アスコルビン酸類にはコラーゲン等の生体成分の合成促進による細胞賦活効果があることが知られている。
【０００６】
更にアスコルビン酸類に、低分子ベタインを併用することによって（特許文献３）、又はδ−トコフェリルレチノエートを併用することによって（特許文献４）、コラーゲン合成促進作用が増強されることも報告されている。
【特許文献１】特開平７−１９４３７５号公報
【特許文献２】特開２００１−２０６８３５号公報
【特許文献３】特開２００５−２３９６４５号公報
【特許文献４】特開２００５−２６３７９４号公報
【非特許文献１】Fragrance Journal、4、p36-37、1998
【非特許文献２】R. Marksら、 British Journal of Dermatology、122、91-98、1990
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のような生体におけるコラーゲンの果たす役割の重要度に鑑み、顕著なコラーゲン産生促進能を有する更なる有用な新規組成物の開発が望まれている。本発明はかかる従来の問題に鑑み、顕著なコラーゲン産生促進能を有する有用な新規組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、アスコルビン酸類と特定のアミノ酸配列を有する特定ペプチド類とを併用して用いることにより、アスコルビン酸類を単独で用いるよりも細胞におけるコラーゲン産生促進能が顕著に促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
従って、本発明は以下を提供する。
（１）（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）で表されるペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物。
（２）（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有し且つ細胞におけるコラーゲン産生促進能を有するペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物。
（３）前記ペプチドが３〜１０残基のアミノ酸長を有する、項目（２）記載の組成物。
（４）細胞におけるコラーゲン産生を促進するために使用され得る、項目（１）〜（３）のいずれか一項に記載の組成物。
（５）外用組成物である、項目（１）〜（４）のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、顕著なコラーゲン産生促進能を有する有用な新規組成物が提供される。本発明の組成物は、細胞におけるコラーゲン産生を促進するために使用することができ、例えば、抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物、関節障害の予防又は治療用組成物、炎症性疾患の予防又は治療用組成物などとして有益に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中において使用される用語は、特に他に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられていることが理解されるべきである。
【００１２】
本発明は、（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）で表されるペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物である。
【００１３】
本発明はまた、（Ａ）アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種と、（Ｂ）Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有し且つ細胞におけるコラーゲン産生促進能を有するペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種とを含有する組成物である。
【００１４】
本発明に用いられる、アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩〔以下、本明細書においてこれらを総称して「アスコルビン酸類」ということがある〕は、医薬品、医薬部外品、化粧品または食品の分野において用いられ得るものであれば特に限定されない。本発明には、アスコルビン酸類のＤ体、Ｌ体、ＤＬ体をいずれも用いることができるが、好ましくはＬ体が用いられる。
【００１５】
アスコルビン酸誘導体としては、具体的には、Ｌ−アスコルビン酸モノリン酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸ジリン酸エステル及びＬ−アスコルビン酸トリリン酸エステル等のＬ−アスコルビン酸のリン酸エステル誘導体；パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、ジパルミチン酸アスコルビル等の脂溶性アスコルビン酸誘導体；アスコルビン酸グルコシド等の糖誘導体；Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステル、Ｌ−アスコルビン酸−２−スルホン酸エステル、テトライソパルミチン酸アスコルビル（ＶＣＩＰ）、アスコルビン酸-２-リン酸-6-パルミチン酸エステル（ＡＰＰＳ）等が用いられ得る。
【００１６】
アスコルビン酸及びアスコルビン酸誘導体の塩としては、具体的には、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム，カルシウム及びバリウム等のアルカリ土類金属塩、並びにアルミニウム等の多価金属塩などの各種の金属塩：アンモニウムやトリシクロヘキシルアンモニウム等のアンモニウム塩、モノエタノールアミン，ジエタノールアミン，トリエタノールアミン，モノイソプロパノールアミン，ジイソプロパノールアミン，及びトリイソプロパノールアミン等の各種のアルカノールアミン塩等が用いられ得る。
【００１７】
本発明では、アスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩として、好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸，Ｌ−アスコルビン酸のリン酸エステル誘導体，パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、Ｌ−アスコルビン酸−２−硫酸エステル、アスコルビン酸−２−グルコシド、テトライソパルミチン酸アスコルビル（ＶＣＩＰ）、アスコルビン酸-２-リン酸-6-パルミチン酸エステル（ＡＰＰＳ）及びそれらの塩（例えば、Ｌ−アスコルビン酸モノリン酸エステルナトリウム塩やリン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウムなど）が用いられる。本発明の組成物を外用組成物として用いる場合には、皮膚や粘膜に対する安全性と作用効果の高さから、特に好ましくは、Ｌ−アスコルビン酸，Ｌ−アスコルビン酸モノリン酸エステル及びそれらの塩（例えば、Ｌ−アスコルビン酸モノリン酸エステルナトリウム塩など）、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸−２−グルコシド、テトライソパルミチン酸アスコルビル（ＶＣＩＰ）、アスコルビン酸-２-リン酸-6-パルミチン酸エステル（ＡＰＰＳ）、リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウムが用いられる。
【００１８】
本発明において、上記のアスコルビン酸、その誘導体及びそれらの塩は、１種単独で使用しても、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
本発明の組成物に配合するアスコルビン酸類の配合量は、本願効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は組成物全体に対して０．００００１重量％以上、好ましくは０．００１重量％以上、より好ましくは、０．０１重量％以上、さらに好ましくは０．１重量％以上、特に好ましくは１重量％以上であり、配合上限は好ましくは３５重量％以下、より好ましくは２５重量％以下、さらに好ましくは２０重量％以下、特に好ましくは１５重量％以下とするのがよい。
【００２０】
本発明にはさらに、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）で表されるペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種、或いはＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ（式Ｉ）のアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有し且つ細胞におけるコラーゲン産生促進能を有するペプチド、その誘導体及びそれらの塩からなる群より選択される少なくとも一種が用いられる〔以下、本明細書においてこれらを総称して「特定ペプチド類」ということがある〕。
【００２１】
本明細書中において、「ペプチドの誘導体」とは、例えば、ペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、またはアセトアセチル化した誘導体等をいう。この中でもパルミトイル化は、細胞への浸透性が高くなることが期待されるので好ましく、またN末端のアセチル化、C末端のアミド化、C末端のメチル化は、末端からペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性が付与され、生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。
【００２２】
本明細書において、ペプチドまたはその誘導体の塩とは、ペプチドまたはその誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩および有機塩を含む）をいい、例えば、ペプチドまたはその誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられ、好ましくは、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩および酢酸塩であり、より好ましくはアンモニウム塩および酢酸塩である。
【００２３】
本明細書において用語「アミノ酸の保存的置換」とは、以下の表１の各群内におけるアミノ酸間の置換をいう。
【００２４】
【表１】
2008001661.tif 000002
【００２５】
この中で、好ましいアミノ酸の保存的置換としては、アスパラギン酸（D）とグルタミン酸（E）との間での置換、アルギニン（R）とリジン（K）とヒスチジン（H）との間での置換、トリプトファン（W）とフェニルアラニン（F）との間での置換、フェニルアラニン（F）とバリン（V）との間での置換、ロイシン（L）とイソロイシン（I）とアラニン（A）との間での置換、グリシン（G）とアラニン（A）との間での置換等が挙げられる。
【００２６】
１個以上のアミノ酸の保存的置換とは、好ましくは１個または数個のアミノ酸の保存的置換をいい、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個、さらにより好ましくは１個のアミノ酸の保存的置換をいう。
【００２７】
１個以上のアミノ酸の欠失とは、好ましくは１個のアミノ酸の欠失である。
【００２８】
１個以上のアミノ酸の付加とは、好ましくは１〜６個、より好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸の付加をいう。
【００２９】
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ(本明細書では、ペプチド配列をアミノ酸の一文字略号により表記する場合があり、例えば本ペプチドをＬＥＨＡという場合がある)において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有するペプチドとしては、例えば、ＬＥＨＡ配列に１個以上のアミノ酸の保存的置換を含むもの(例えば、ＩＥＨＡ、ＬＤＨＡ、ＬＤＫＡ、ＬＥＫＡ等）、ＬＥＨＡ配列に１個以上のアミノ酸の欠失を含むもの(例えば、ＬＥＨ、ＥＨＡ、ＬＨＡ、ＬＥＡ等）、およびＬＥＨＡ配列に１個以上のアミノ酸を付加したもの（例えば、ＬＥＨＡＷ、ＬＥＨＡＦ、ＬＥＨＡＶ、ＬＥＨＡＬ、ＬＥＨＡＩ、ＬＥＨＡＭ、ＬＥＨＡＧ、ＬＥＨＡＳ、ＬＥＨＡＴ、ＡＬＥＨＡ、ＧＬＥＨＡ、ＳＬＥＨＡ、ＭＬＥＨＡ、ＴＬＥＨＡ、ＦＬＥＨＡ、ＧＬＥＨＡＬ、ＤＬＥＨＡＬ、ＱＬＥＨＡＫ、ＳＬＥＨＡＤ、ＱＬＥＨＡＲ、ＥＦＬＥＨＡ、ＬＥＨＡＶＶ、ＤＰＥＬＥＨＡ、ＨＬＥＨＡＡＳ、ＬＥＨＡＳＶＤ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。この中で好ましいペプチドとしては、ＩＥＨＡ、ＬＤＨＡ、ＬＤＫＡ、ＬＥＫＡ、ＬＥＨ、ＬＥＨＡＦ、ＦＬＥＨＡ、ＧＬＥＨＡＬ、ＤＬＥＨＡＬ、ＱＬＥＨＡＫ、ＳＬＥＨＡＤ、ＱＬＥＨＡＲ、ＥＦＬＥＨＡ、ＬＥＨＡＶＶ、ＤＰＥＬＥＨＡ、ＨＬＥＨＡＡＳ、ＬＥＨＡＳＶＤ等が挙げられ、より好ましくはＬＥＫＡ、ＬＤＨＡ、ＬＥＨ、ＬＥＨＡＦである。
【００３０】
さらに例えば、ＬＥＨＡペプチドにおいてアミノ酸の保存的置換および付加を有するペプチドとしては、特に限定されないが、ＩＥＨＡＦ、ＬＤＨＡＦ、ＬＤＫＡＦ、ＬＥＫＡＦ等が好適な例として挙げられる。
【００３１】
本明細書において用語「細胞におけるコラーゲン産生促進能を有する」とは、被験物を細胞に作用させた場合に、当該被験物を細胞に作用させない場合と比較して、細胞におけるコラーゲンの産生量が増加することを意味する。特定の態様では、当該用語における細胞とは線維芽細胞を意味し、さらに特定の態様では皮膚線維芽細胞を意味する。
【００３２】
本発明に用いられるペプチドは、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、本発明のペプチドは、化学合成方法（例えば、固相法（例えば、Ｆｍｏｃ法）、液相法等）により合成されてもよく、また遺伝子組換え発現等の方法により作製されてもよい。なお本発明のペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体であってもＤ体であってもよいが、好ましくはＬ体である。
【００３３】
さらに本発明のペプチドは、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドをプロテアーゼ処理等の公知の手段によって切り出すことによっても調製され得る。例えば、ＬＥＨＡ配列を含むタンパク質としては、以下の表２に示すようなタンパク質が挙げられる。
【００３４】
【表２】
2008001661.tif 000003
【００３５】
当業者は、プロテアーゼの配列特異性等を考慮して、目的のアミノ酸配列を含むタンパク質のアミノ酸配列中から、目的のアミノ酸配列からなるペプチドを切り出すために適切なプロテアーゼを適宜選択し得る。例えば、上記ニンジン由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、サーモリシン（Bacillus thermoproteolyticus由来）とキモトリプシン（ウシ膵臓由来）とを併用することなどが挙げられる。また、例えば、上記ジャガイモ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、プロテアーゼM「アマノ」G（Aspergillus oryzae 由来：天野エンザイム（株）製）と前記サーモリシンとを併用することなどが挙げられる。また、例えば、上記イネ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、前記プロテアーゼM「アマノ」Gと前記サーモリシンとを併用することなどが挙げられる。また、例えば、上記ダイズ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、前記サーモリシンを使用することなどが挙げられる。また、例えば、上記インゲンマメ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、前記キモトリプシンと前記サーモリシンとを併用することなどが挙げられる。また、例えば、上記キャッサバ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、前記キモトリプシンと前記サーモリシンとを併用することなどが挙げられる。また、例えば、上記カワヤツメ由来の配列からＬＥＨＡ配列を切り出すためには、トリプシン（ブタ膵臓由来）と前記サーモリシンとを併用することなどが挙げられる。目的のアミノ酸配列を含むタンパク質とプロテアーゼの組合せは、上記の組合せに限定されないが、好ましい組合せとしては、ダイズタンパク質とサーモリシンの組合せが挙げられる。
【００３６】
タンパク質をプロテアーゼで加水分解する場合に用いられる反応条件は、特に制限されず、技術常識に従って当業者により適宜選択され得る。例えば、市販のプロテアーゼを使用する場合には、その使用説明書に従って反応条件を選択することができる。一般的には、３０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、より好ましくは５０〜６０℃の反応温度が使用され得る。また一般的には、２〜３０時間、好ましくは３〜２４時間、より好ましくは１０〜２０時間、特に好ましくは１２〜１８時間の反応時間が使用され得る。反応ｐＨとしては、使用するプロテアーゼの至適ｐＨ付近であることが好ましい。反応の停止手段についても、特に制限はなく、公知の手段を用いることができる。かかる手段としては、例えば、８５℃で１５分間加熱や１００℃で５分間加熱等の加熱処理等が挙げられる。
【００３７】
プロテアーゼによる加水分解処理後には、当該分野で公知の手段によって精製することにより、目的のペプチドを得ることができる。かかる公知の手段としては、例えば、強酸性イオン交換樹脂やオクタデシルシリカ（ＯＤＳ）樹脂などが利用され得る。例えば、プロテアーゼ処理後のペプチド水溶液をＯＤＳ樹脂に吸着させて任意の濃度の有機溶媒（例えば、アセトニトリル等）で溶出することにより、目的のペプチドを精製することができる。あるいは、例えば、プロテアーゼ処理後のペプチド水溶液を強酸性イオン交換樹脂に吸着させて、約０．１８Ｍ〜０．２５Ｍ塩濃度の溶出液（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）、より好ましくは約０．２０Ｍ〜０．２３Ｍ塩濃度の溶出液で溶出することにより、目的のペプチドを精製することができる。
【００３８】
このように、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、化学合成方法で製造する場合よりもコスト面から有利となる。さらに、天然のタンパク質をプロテアーゼで加水分解して得られるペプチドは、生体に対してより安全であると考えられる。従って、このようにして得られたペプチドは、生体への適用に対しより高い安全性が求められる内服剤や食品、敏感肌用化粧料、飼料などに好適に使用され得る。
【００３９】
本発明のペプチドの誘導体は、Ｆｍｏｃ法による固相合成法（L.A.Carpino, G.Y.Han, J.Am.Chem.Soc., 92, 5748 (1970)）等に従って、当該分野で公知の方法により作製され得る。
【００４０】
本発明のペプチドの塩もまた、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって作製され得る。
【００４１】
本発明において、上述のような特定ペプチド類は、１種単独で使用しても、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【００４２】
本発明の組成物に配合する特定ペプチド類の配合量は、本願効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は組成物全体に対して０．００００１〜７０重量％程度とするのがよい。特に本願組成物が外用組成物である場合には、上記配合量は少なくてもよく、例えば、０．００００１〜５重量％、より好ましくは０．０００１〜１重量％、さらに好ましくは０．０００１〜０．１重量％、特に好ましくは０．００１〜０．１重量％としても十分な本願効果が得られる。
【００４３】
一態様において、本発明の組成物は、前記特定ペプチド類が、例えば０．０５重量％以上、好ましくは０．０８重量％以上、より好ましくは０．１重量％以上、さらに好ましくは０．１２重量％以上となるようにいったん精製されたものを、前記配合量になるように配合することにより調製され得る。
【００４４】
また、本発明の組成物におけるアスコルビン酸類と特定ペプチド類との重量比は、本願効果を奏し得る限り特に制限されないが、通常は、アスコルビン酸類１重量部に対して特定ペプチド類が０．００００１〜１５００重量部、好ましくは０．０００１〜１０００重量部、より好ましくは０．００１〜７００重量部、さらに好ましくは０．０１〜６００重量部の範囲内とするのがよい。
【００４５】
本発明の組成物には、前述したようなアスコルビン酸類及び特定ペプチド類に加えて、アスコルビン酸類又は特定ペプチド類の作用を増強または補足する目的で、あるいは本願組成物に他の有用な作用を付加するため、美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、ニキビ改善成分、ヒアルロン酸等の生体成分合成促進成分、血行促進成分、保湿成分、老化防止成分等の各種成分を１種または２種以上組み合わせて配合することができる。好ましくは美白成分、抗炎症成分、抗菌成分、細胞賦活化成分、収斂成分、抗酸化成分、老化防止成分または保湿成分の１種または２種以上の成分である。これらの各成分としては、医薬品、医薬部外品、食品または化粧品分野において使用され得るものであれば特に制限されず、任意のものを適宜選択し使用することができる。
【００４６】
例えば、美白成分としては、プラセンタ；アルブチン；コウジ酸；エラグ酸；フィチン酸；ルシノール；カモミラＥＴ；ビタミンＡ又はその誘導体、パントテン酸又はその誘導体等のビタミン類等が挙げられる。このうち、好ましいものとしては、パントテン酸又はその誘導体、エラグ酸、フィチン酸、ビタミンＡ又はその誘導体を挙げることができる。これらの美白成分は１種または２種以上を用いてもよい。
【００４７】
美白作用を有する植物成分を美白成分として用いてもよく、かかる植物成分としては、イリス（アイリス）、アーモンド、アロエ、イチョウ、ウーロン茶、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、オドリコソウ、海藻、カッコン、クチナシ、クジン、クロレラ、ゴバイシ、コムギ、コメ、コメハイガ、オリザノール、コメヌカ、サイシン、サンショウ、シソ、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、ダイズ、納豆、茶、トウキ、トウキンセンカ、ニンニク、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、ヨクイニン、トウキ、アメジスト、アセンヤク、アセビワラビ、イヌマキ、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、キササゲ、クロマメ、ゲンチアナ、ゲンジン、サルサ、サヤインゲン、ショクマ、ジュウロウ、セージ、ゼンコ、ダイコン、ツツジ、ツクシハギ、トシン、ニガキ、パセリ、ヒイラギ、ホップ、マルバハギ、チョウジ、カンゾウ等の植物に由来する成分が挙げられる。好ましくは、イリス（アイリス）、アロエ、イチョウ、ウーロン茶、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、オドリコソウ、海藻、カッコン、クチナシ、クジン、ゴバイシ、コムギ、コメ、コメヌカ、サイシン、サンショウ、シソ、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、茶、トウキ、トウキンセンカ、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、ヨクイニン、アメジスト、アセンヤク、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、キササゲ、クロマメ、ゲンチアナ、サルサ、サヤインゲン、ジュウロウ、セージ、ゼンコ、ダイコン、ツツジ、ツクシハギ、トシン、ニガキ、パセリ、ヒイラギ、ホップ、チョウジ、カンゾウ及びトウキの植物由来成分であり、より好ましくは、イリス（アイリス）、アロエ、イチョウ、エイジツ、オウゴン、オウレン、オトギリソウ、クチナシ、クジン、コメ、コメヌカ、サイシン、シャクヤク、センキュウ、ソウハクヒ、茶、トウキ、トウキンセンカ、ハマメリス、ベニバナ、ボタンピ、アメジスト、アセンヤク、エノキ、カキ(Diospyros kaki)、セージ、ダイコン、ツツジ、パセリ、ホップ、カンゾウ及びヨクイニンの植物由来成分が挙げられる。これらの植物成分を本発明の組成物に用いる場合、植物成分の形態は特に制限されないが、通常は植物エキス（植物抽出物）や精油などの態様で使用することができる。なお、上記植物成分中に記載の（ ）内は、その植物の学名、別名または生薬名である。
【００４８】
上記美白成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００４９】
美白成分として美白作用のある植物成分を用いる場合は、目的に応じて１種もしくは２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。上記植物成分を美白成分として用いる場合、本願組成物への配合割合は、エキスや精油などの抽出物換算で、通常０．００００１〜２０重量％、好ましくは０．０００１〜１５重量％、より好ましくは０．００１〜１０重量％である。
【００５０】
抗炎症成分としては、アラントイン、カラミン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、酸化亜鉛、グアイアズレン、酢酸トコフェロール、塩酸ピリドキシン、メントール、カンフル、テレピン油、インドメタシン、サリチル酸又はその誘導体等が挙げられる。好ましくはアラントイン、グリチルリチン酸又はその誘導体、グリチルレチン酸又はその誘導体、グアイアズレン、メントールである。
【００５１】
上記抗炎症成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００５２】
抗菌成分としては、クロルヘキシジン、サリチル酸、塩化ベンザルコニウム、アクリノール、エタノール、塩化ベンゼトニウム、クレゾール、グルコン酸及びその誘導体、ポピドンヨード、ヨウ化カリウム、ヨウ素、イソプロピルメチルフェノール、トリクロカルバン、トリクロサン、感光素１０１号、感光素２０１号、パラベン、フェノキシエタノール、１，２-ペンタンジオール、塩酸アルキルジアミノグリシン等が挙げられる。好ましくは、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸及びその誘導体、イソプロピルメチルフェノール、トリクロカルバン、トリクロサン、感光素１０１号、感光素２０１号、パラベン、フェノキシエタノール、１，２-ペンタンジオール、塩酸アルキルジアミノグリシン等が挙げられる。さらに好ましくは、塩化ベンザルコニウム、グルコン酸及びその誘導体、塩化ベンゼトニウム、イソプロピルメチルフェノールである。
【００５３】
上記抗菌成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００５４】
細胞賦活化成分としては、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸などのアミノ酸類：レチノール、チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、パントテン酸類などのビタミン類：グリコール酸、乳酸などのα-ヒドロキシ酸類：タンニン、フラボノイド、サポニン、アラントイン、感光素301号などが挙げられる。好ましくは、γ-アミノ酪酸、ε-アミノカプロン酸などのアミノ酸類：レチノール、チアミン、リボフラビン、塩酸ピリドキシン、パントテン酸類などのビタミン類である。
【００５５】
上記細胞賦活化成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００５６】
収斂成分としては、ミョウバン、クロロヒドロキシアルミニウム、塩化アルミニウム、アラントインアルミニウム塩、硫酸亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の金属塩；タンニン酸、クエン酸、乳酸、コハク酸などの有機酸を挙げることができる。好ましくは、ミョウバン、クロロヒドロキシアルミニウム、塩化アルミニウム、アラントインアルミニウム塩、硫酸アルミニウムカリウム、タンニン酸である。
【００５７】
収斂成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、通常０.０００３〜１０重量％、好ましくは０．０１〜５重量％、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００５８】
抗酸化成分としては、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、亜硫酸水素ナトリウム、エリソルビン酸及びその塩、フラボノイド、グルタチオン、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ、カタラーゼ、スーパーオキサイドジスムターゼ、チオレドキシン、タウリン、チオタウリン、ヒポタウリンなどが挙げられる。好ましくは、チオタウリン、ヒポタウリン、チオレドキシン、フラボノイドである。
【００５９】
抗酸化成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、通常０.００００１〜１０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％、より好ましくは０．００１〜５重量％である。
【００６０】
老化防止成分としては、レチノイド（レチノール、レチノイン酸、レチナール等）、パンガミン酸、カイネチン、ウルソール酸、ウコンエキス、スフィンゴシン誘導体、ケイ素、ケイ酸、Ｎ−メチル−Ｌ−セリン、メバロノラクトン等が挙げられる。好ましくは、レチノイド（レチノール、レチノイン酸、レチナール等）、カイネチンである。
【００６１】
上記老化防止成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合は、好ましくは０．０００３〜１０重量％であり、より好ましくは０．０１〜５重量％である。
【００６２】
保湿成分としては、アラニン、セリン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、グルコサミン、テアニンなどのアミノ酸及びその誘導体；グリセリン、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどの多価アルコール；ソルビトールなどの糖アルコール；レシチン、水素添加レシチン等のリン脂質；ヒアルロン酸プロピレングリコール、ヘパリン、コンドロイチン等のムコ多糖；乳酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、尿素などのＮＭＦ由来成分等が挙げられる。好ましいものは、アラニン、セリン、グリシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、グルコサミン、テアニン、コラーゲン、コラーゲンペプチド、グリセリン、1,3-ブチレングリコール、水素添加レシチン、ヒアルロン酸プロピレングリコール、ヘパリン、コンドロイチン、乳酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウムである。
【００６３】
保湿成分を用いる場合、本願組成物に配合する割合としては、通常０．１〜１０重量％、好ましくは０．５〜５重量％、より好ましくは０．５〜５重量％を挙げることができる。
【００６４】
本発明の組成物は、上記各成分に加えて組成物の用途あるいは剤形に応じて、医薬品、医薬部外品、化粧品または食品の分野に通常使用される成分を適宜配合しても良い。配合できる成分としては、特に制限されないが、例えば、アミノ酸類、アルコール類、多価アルコール類、糖類、ガム質、多糖類などの高分子化合物、界面活性剤、可溶化成分、油脂類、経皮吸収促進成分、防腐・抗菌・殺菌剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、抗酸化剤、酵素成分、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動化剤、清涼化剤の他、ミネラル類、細胞賦活剤、滋養強壮剤、賦形剤、増粘剤、安定化剤、保存剤、等張化剤、分散剤、吸着剤、崩壊補助剤、湿潤剤または湿潤調節剤、防湿剤、着色料、着香剤または香料、芳香剤、還元剤、可溶化剤、溶解補助剤、発泡剤、粘稠剤または粘稠化剤、溶剤、基剤、乳化剤、可塑剤、緩衝剤、光沢化剤などをあげることができる。特に界面活性剤、可溶化成分または油脂類を配合することによって、製剤中におけるアスコルビン酸類の安定性を高めることができ、また外用組成物とする場合にはその製剤の使用感をより向上させることができる。また発明の組成物が外用組成物である場合には、さらに経皮吸収促進成分を配合するのが好ましい。
【００６５】
ここで用いられる界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（以下、ＰＯＥという）−オクチルドデシルアルコールやＰＯＥ−２−デシルテトラデシルアルコール等のＰＯＥ−分岐アルキルエーテル；ＰＯＥ −オレイルアルコールエーテルやＰＯＥ−セチルアルコールエーテル等のＰＯＥ−アルキルエーテル；ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノイソステアレート及びソルビタンモノラウレート等のソルビタンエステル；ＰＯＥ−ソルビタンモノオレエート、ＰＯＥ−ソルビタンモノイソステアレート、及びＰＯＥ−ソルビタンモノラウレート等のＰＯＥ−ソルビタンエステル；グリセリンモノオレエート、グリセリンモノステアレート、及びグリセリンモノミリステート等のグリセリン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−グリセリンモノオレエート、ＰＯＥ−グリセリンモノステアレート、及びＰＯＥ−グリセリンモノミリステート等のＰＯＥ−グリセリン脂肪酸エステル；ＰＯＥ−ジヒドロコレステロールエステル、ＰＯＥ−硬化ヒマシ油、及びＰＯＥ−硬化ヒマシ油イソステアレート等のＰＯＥ−硬化ヒマシ油脂肪酸エステル；ＰＯＥ−オクチルフェニルエーテル等のＰＯＥ−アルキルアリールエーテル；モノイソステアリルグリセリルエーテルやモノミリスチルグリセリルエーテル等のグリセリンアルキルエーテル；ＰＯＥ−モノステアリルグリセリルエーテル、ＰＯＥ−モノミリスチルグリセリルエーテル等のＰＯＥ−グリセリンアルキルエーテル；ジグリセリルモノステアレート、デカグリセリルデカステアレート、デカグリセリルデカイソステアレート、及びジグリセリルジイソステアレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル、等の各種非イオン界面活性剤：あるいはレシチン、水素添加レシチン、サポニン、サーファクチンナトリウム、コレステロール、胆汁酸などの天然由来の界面活性剤等を例示することができる。これらの界面活性剤は、１種単独で使用してもまた２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。
【００６６】
界面活性剤を使用する場合、本願組成物への配合割合としては、本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、通常は本願組成物中に０．０１〜３０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができる。本願組成物中の有効成分の安定性等の観点からは、好ましくは０．１〜２０重量％、より好ましくは０．５〜１０重量％の範囲を挙げることができる。
【００６７】
可溶化成分としては、例えば、エタノール等の低級アルコール、グリセリン，エチレングリコール等の多価アルコール、水素添加大豆リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、水素添加大豆リン脂質、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンラノリンアルコール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、より好ましくは、エタノール、グリセリン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、水素添加大豆リン脂質である。これらの可溶化成分は、１種単独で使用しても、または２種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。
【００６８】
これらの可溶化成分を使用する場合、本願組成物への配合割合としては、本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、通常は本願組成物中に０．０１〜７０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができる。本願成物中の有効成分の安定性等の観点からは、好ましくは０．１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜３０重量％の範囲を挙げることができる。
【００６９】
油脂類としては、例えば、中鎖脂肪酸トリグリセリド等の合成油脂；大豆油、米油、菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、ヒマシ油、オリーブ油、カカオ油、椿油、ヒマワリ油、パーム油、アマ油、シソ油、シア油、サル油、ヤシ油、木ロウ、ホホバ油、グレープシード油、及びアボガド油等の植物油脂；ミンク油、卵黄油、牛脂、乳脂、及び豚脂等の動物油脂；ミツロウ、鯨ロウ、ラノリン、カルナウバロウ、キャンデリラロウ等のロウ類；流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、マイクロクリスタリンワックス、セレシンワックス、パラフィンワックス、ワセリン等の炭化水素類；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、ベヘニン酸等の天然及び合成脂肪酸；セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルデカノール、ラウリルアルコール等の天然及び合成高級アルコール；ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、コレステロールオレート等のエステルやエーテル類；シリコーン油等が挙げられる。これらの油脂類は、１種単独で使用しても、または２種以上を任意に組み合わせて用いてもよい。
【００７０】
これらの油脂類を使用する場合、本願組成物への配合割合としては、本発明の効果を妨げないことを限度として特に制限されず、通常は本願組成物中に０．０１〜７０重量％の割合で含まれるような範囲で適宜選択して使用することができる。本願組成物中の有効成分の安定性等の観点からは、好ましくは０．１〜６０重量％、より好ましくは０．１〜５０重量％の範囲を挙げることができる。
【００７１】
本発明の組成物は、その用途に応じて、医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に通常使用される剤形をとることができ、通常、固形剤、半固形剤または液剤である。具体的には、錠剤（口腔内側崩壊錠、咀嚼可能錠、発泡錠、トローチ剤、ゼリー状ドロップ剤などを含む）、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、ドライシロップ剤、液剤（ドリンク剤、懸濁剤、シロップ剤を含む）、ゲル剤、リポソーム剤、エキス剤、チンキ剤、レモネード剤、軟膏剤、ゼリー剤などの公知の形態をとることができる。また、必要に応じてその他の溶媒や通常使用される基剤等を配合することによって、ペースト状、ムース状、ジェル状、液状、乳液状、クリーム状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状などの各種所望の形態に調製することができる。
【００７２】
これらの剤形は当該分野の通常の方法にて製造することができる。例えば、半固形剤であれば、上述のようなアスコルビン酸類と特定ペプチド類に加えて必要に応じて上記各任意成分を配合混合し、さらに必要に応じてその他の溶媒や通常使用される外用組成物の基剤等を配合することによって、ペースト状、ムース状、ジェル状、液状、乳液状、クリーム状、シート状（基材担持）、エアゾール状、スプレー状などの各種所望の形態に調製することができる。
【００７３】
本発明の組成物は、本発明の効果を奏すれば特に限定されないが、例えば医薬品、医薬部外品、食品［菓子、健康食品、栄養補助食品（バランス栄養食、サプリメントなど）を含む）、栄養機能食品、特定保健用食品を含む］などとすることができ、また化粧品ではファンデーション、口紅、マスカラ、アイシャドウ、アイライナー、眉墨及び美爪料等のメーキャップ化粧料；乳液、クリーム、ローション、オイル及びパックなどの基礎化粧料；洗顔料やクレンジング、ボディ洗浄料などの洗浄料、入浴剤などとすることができる。
【００７４】
本発明の組成物は内服用組成物として用いられても外用組成物として用いられてもよいが、外用組成物として使用されることが好ましい。
【００７５】
本発明の組成物は顕著なコラーゲン産生促進能を有するので、細胞におけるコラーゲン産生を促進するために好適に使用され得る。例えば、本発明の組成物は、コラーゲン減少に伴う各種障害（角膜潰瘍などの角膜障害、リューマチ，関節炎，変形性関節炎，骨関節炎などの関節障害、炎症性障害等）の治療又は予防用組成物、美容上の問題を予防又は治療するための組成物（例えば、紫外線曝露や加齢等による皮膚のシワもしくはタルミの予防および／または改善のための組成物、皮膚の弾力性もしくはハリの低下に対する予防および／または改善のための組成物等）として好適に用いることができる。
【実施例】
【００７６】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
実施例１
ＬＥＨＡペプチドの調製
ペプチドを、ペプチド自動合成装置(島津製作所社製：ＰＳＳＭ８)を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成法により合成した。次いで、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することにより、ＬＥＨＡペプチドを得た。
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフィー［カラム：μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ  ５μ  Ｃ１８−１００Å (内径： 3.9mm、長さ： 150mm) 、Ｗａｔｅｒｓ社製、；移動相：溶媒Ａ（0.１％トリフルオロ酢酸）および溶媒Ｂ（0.１％トリフルオロ酢酸、９０％アセトニトリル）のグラジエント（０分（溶媒Ｂ＝１２％）〜２０分（溶媒Ｂ＝１７％））；流速：1 ml／分；検出法：波長 220nmにおける吸光度］に付したところ、12.8分に単一の鋭いピークが示され、純度は99％であった。
【００７８】
実施例２
皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン産生検定
ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（ＣＲＬ−１８３６）を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１．０×１０４細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で２日間培養を行った。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル４００μｌずつ使用した。次いで、ＦＢＳを添加しない上記培養液すなわち無血清培地に交換し、さらに１日間培養した。その後、培養液を除去し、下記の表３に示す被験薬をそれぞれの濃度で溶解した４００μｌの無血清培地に交換して培養した。一方、Ｌ−アスコルビン酸もＬＥＨＡペプチドも添加しない無血清培地を４００μｌ添加したものをコントロールとして用いた。３日間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたタイプＩコラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅＩ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社製）で定量した。定量結果をもとに、コントロール培養液中のタイプＩコラーゲン量を100％として各被験培養液中のコラーゲン量を算出した。この結果を表３に纏める。
【００７９】
【表３】
2008001661.tif 000004
【００８０】
この結果から、Ｌ−アスコルビン酸とＬＥＨＡペプチドとを併用した培養液で培養した細胞では、Ｌ−アスコルビン酸単独の培養液で培養した場合よりもコラーゲン産生量が顕著に増加し、ＬＥＨＡペプチドがＬ−アスコルビン酸のコラーゲン産生促進能を飛躍的に増強し得ることが実証された。
また、Ｌ−アスコルビン酸とＬＥＨＡペプチドとを組み合わせることにより得られるコラーゲン産生促進作用は、相乗効果的なものであることも同時に認められた。
【００８１】
さらに培養液を採取した後の細胞についてＷＳＴ−１法により生細胞数を計測した。より詳細には、４００μｌ培地中１０μｌの割合でＷＳＴ−１試薬を添加したものに培地交換し、次いで４５分間培養後、その上清を２００μｌ分取し吸光度を測定した。その結果、Ｌ−アスコルビン酸とＬＥＨＡペプチドとを併用した培養液で培養されることによる生細胞数の有意な減少は認められず、生体に対して安全に使用できるものであることが確認された。
【００８２】
実施例３
他の特定ペプチド類の調製
ＬＥＨＡ以外の他の特定ペプチド類によっても、Ｌ−アスコルビン酸のコラーゲン産生促進能を増強し得るかどうかを探るため、被験材料として、ＬＥＨＡペプチドの他に、ＬＥＨＡペプチドの誘導体並びにＬＥＨＡペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有するペプチドをそれぞれ調製した。
【００８３】
ＬＥＨＡペプチドの誘導体としては、Ｎ末端アセチル化ＬＥＨＡとＣ末端アミド化ＬＥＨＡを常法により調製した。またＬＥＨＡペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有するペプチドとしては、ＬＥＨ、ＬＥＫＡ、ＬＤＨＡ、ＬＥＨＡＦを常法により調製した。詳細には、上記誘導体も上記ペプチドも、当該分野で周知のＦｍｏｃ法による固相合成法（L.A.Carpino, G.Y.Han, J.Am.Chem.Soc., 92, 5748 (1970)）により合成し、分取ＨＰＬＣで未反応物を除去して精製することによって調製を行った。
【００８４】
実施例４
他の特定ペプチド類のコラーゲン産生促進能検定
実施例３において調製した他の特定ペプチド類を用いて、コラーゲン産生促進能を検定した。
まず、ヒト正常皮膚由来線維芽細胞（ＣＲＬ−１８３６；ＡＴＣＣ）を、４８ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、１２５００細胞／１ｃｍ２密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガスおよび９５％空気の環境下で約７２時間培養を行った。培養液は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）に牛胎仔血清（ＦＢＳ）を１０重量％の濃度で含有した培地を各ウェル５００μｌずつ使用した。細胞がコンフルエントになった時点で、培養液を除去し、下記の表４に示す被験特定ペプチド類を各濃度で添加したＤ−ＭＥＭ培地を５００μｌずつ添加した。なお、特定ペプチド類を添加しない培地を５００μｌ添加したものをコントロールとして用いた。７２時間培養した後、培養液を採取し、培養液中に分泌されたタイプＩコラーゲン濃度を、酵素結合免疫測定法（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅＩ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＩＡ  Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社製）で定量した。定量結果をもとに、コントロール培養液中のタイプＩコラーゲン量を100％として各被験培養液中のタイプＩコラーゲン量を算出した。結果を表４に纏める。
【００８５】
【表４】
2008001661.tif 000005
【００８６】
以上の結果に示されるように、ＬＥＨＡペプチド以外の他の特定ペプチド類、即ち、その誘導体やＬＥＨＡペプチドのアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸の保存的置換、欠失および／または付加を有するペプチドを用いる場合であっても、実施例２で実証されたＬＥＨＡペプチドと同様に、Ｌ−アスコルビン酸のコラーゲン産生促進能を増強できるものと認められた。
【００８７】
以下に製剤実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に限られるものではない。
【００８８】
製剤実施例１：乳液
〔成分〕                        〔比率〕
アスコルビン酸グルコシド        ２．０
ＬＥＨＡペプチド                ０．０１
スクワラン                      ２．０
流動パラフィン                  ５．０
セタノール                      ０．５
モノステアリン酸グリセリル      ２．０
ＰＯＥ（２５）セチルエーテル    ２．０
トリエタノールアミン            ０．８
グリセリン                      ４．０
１,３-ブチレングリコール        ６．０
防腐剤                          適量
香料                            適量
精製水                           適量        
１００．０重量％
【００８９】
製剤実施例２：クリーム
〔成分〕                                          〔比率〕
テトライソパルミチン酸アスコルビル（ＶＣＩＰ）    １．０
ＬＥＨＡペプチド                                  ０．０５
ワセリン                                          １．０
スクワラン                                        ５．０
流動パラフィン                                   １０．０
ステアリン酸                                      １．５
ステアリルアルコール                              ２．０
モノステアリン酸グリセリル                        ２．０
ＰＯＥ（２０）セチルエーテル                      ３．０
トリエタノールアミン                              １．０
グリセリン                                        ６．０
１,３-ブチレングリコール                          ８．０
防腐剤                                             適量
香料                                              適量
精製水                                             適量        
１００．０重量％
【００９０】
製剤実施例３：化粧水
〔成分〕                                              〔比率〕
Ｌ−アスコルビン酸モノリン酸エステルナトリウム塩      ０．２
ＬＥＨＡペプチド                                      ０．２
ＰＯＥ（２０）ソルビタンモノイソステアリン酸エステル  ０．３
コハク酸                                              ０．２
コハク酸ナトリウム                                    ０．５
エデト酸三ナトリウム                                  ０．０５
１,３-ブチレングリコール                              ６．０
防腐剤                                                 適量
香料                                                  適量
精製水                                                 適量        
１００．０重量％
【００９１】
製剤実施例４：飲料
〔成分〕                                              〔比率〕
Ｌ−アスコルビン酸                                    ０．５
ＬＥＨＡペプチド                                      ０．１
ビタミンＢ２                                          ０．００５
エリスリトール                                      １０.０
酸味料                                                １．０
甘味料                                                １．０
香料                                                  ０．０１
精製水                                                残量        
１００．０重量％
【配列表フリーテキスト】
【００９２】
配列番号１は、本発明に使用され得るペプチドである。
配列番号２は、本発明に使用され得るペプチドである。
配列番号３は、本発明に使用され得るペプチドである。
配列番号４は、本発明に使用され得るペプチドである。
【配列表】
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