(57)【要約】      （修正有）【課題】血液等の汚染を防止するための閉鎖系において、少量の血液や骨髄液から血液成分を効率的に分離できる方法を提供する。また、当該方法で使用するためのキット、および当該方法を用いる医療用細胞の製造方法を提供する。【解決手段】血液成分の分離方法は、血液または骨髄液を閉鎖されたチューブ内に導入する工程；当該チューブを螺旋形状とし、且つ、その外側末端周辺部を内側に向けて折り曲げる工程；および、外側末端周辺部を内側へ折り曲げた螺旋形状を維持したまま、当該螺旋形状の中心を軸として上記チューブを回転させる工程；を含むことを特徴とする。【選択図】図１
2008272368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液成分を分離する方法であって、
血液または骨髄液を閉鎖されたチューブ内に導入する工程；
当該チューブを螺旋形状とし、且つ、その外側末端周辺部を内側に向けて折り曲げる工程；および
外側末端周辺部を内側へ折り曲げた螺旋形状を維持したまま、当該螺旋形状の中心を軸として上記チューブを回転させる工程；
を含むことを特徴とする血液成分の分離方法。
【請求項２】
チューブを回転させるに当たり、チューブが上記形状を維持したまま嵌合され得る凹溝が形成された円形固定具にチューブを嵌め込む請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
上記円形固定具を２枚１組とし、１枚にチューブを嵌め込み、他の１枚を平面方向に１８０°回転させ重ね合わせる請求項２に記載の分離方法。
【請求項４】
チューブが嵌合された円形固定具の上下を閉鎖具により挟んで回転させる請求項２または３に記載の分離方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の血液成分の分離方法で使用するキットであり、
血液・骨髄液導入用チューブ；および
血液・骨髄液導入用チューブを固定するための円形固定具であって、螺旋形状であり、且つ、その外側末端周辺部が内側に向けて折り曲げられている形状で上記血液・骨髄液導入用チューブを嵌め込むための溝を有する円形固定具；
を含むことを特徴とする血液成分分離用キット。
【請求項６】
上記円形固定具を２枚含む請求項５に記載の血液成分分離用キット。
【請求項７】
さらに、上記円形固定具に積層して上記血液導入用チューブを固定するための閉鎖具を含む請求項５または６に記載のキット。
【請求項８】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法で分離した血液成分を培養する工程を含む、医療用細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液成分を分離するための方法に関するものである。また、本発明は、当該方法で使用するためのキット、および当該方法を用いる医療用細胞の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
血液には液体成分である血漿の他、赤血球や白血球などの血球が含まれている。これら成分のうち、生細胞である白血球等は長く保存することができない。また、医療現場で強く求められる血液成分は赤血球や血小板および血漿である。さらに、骨髄液には造血幹細胞が含まれており、かかる造血幹細胞は白血球等に分化するため、白血病等の治療に用いられる。
【０００３】
この様に、各血液成分は性質や有用性が異なるため、例えば全血を採取した後に各成分を分離していたのでは非常に無駄が多くなってしまう。そこで近年の献血現場ではドナーから特定の血液成分のみを分離採取し、その他の血液成分を返すという成分献血が行われている。
【０００４】
かかる血液成分の分離では、各血液成分の比重の違いを利用する遠心分離法が用いられている。例えば、ドナーから得られた全血を血液成分分離装置に導入し、血液凝固を阻害するクエン酸ナトリウム・リン酸ナトリウム・ブドウ糖液を加えた後に遠心分離し、分離された必要成分のみを採血バッグに貯める。一方、保存し難い生細胞や不要成分等はドナーへ戻される。しかし、かかる操作で血液成分を完全に分離できるわけではなく、他成分の混入は避けられない。そこで、改良技術が考案されている。
【０００５】
例えば特許文献１には、細胞分離装置用の遠心分離室であって、螺旋形状の分離流路を有するものが開示されている。より詳しくは、当該遠心分離室において、全血は分離流路の中間付近から供給され遠心分離される。遠心力は回転半径に比例することから、比重の重い赤血球等は螺旋形状の分離流路のより外側へ移動し、それに対して比重の軽い血漿等は内側へ移動する。その結果、赤血球は外側の末端部に存在する赤血球用出口から取り出され、血漿は内側の末端部に存在する血漿用出口から取り出される。
【特許文献１】特開２０００−９３５０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、癌患者の血液からリンパ球や単球を分離し、活性化しつつ培養した後に患者へ戻すことにより癌を治療する、いわゆる免疫細胞療法が開発されている。また、骨髄液から造血幹細胞を分離して白血病等の治療に使用する場合もある。
【０００７】
本発明者らは、免疫細胞療法に適用するために全血からの血液成分の分離を試みた。その際、少量の血液を閉鎖された医療用チューブへ導入し、この医療用チューブを螺旋形状に固定して遠心分離した。閉鎖された無菌チューブを用いた理由は、血液の汚染を防止するためである。また、免疫細胞療法のために血液から分離すべきリンパ球等はわずかでよいので、最低でも２００ｍＬ程度の血液を要する血液成分分離装置では、少量の血液を効率的に分離できないことも理由の一つであった。
【０００８】
ところが、遠心分離中にシールされた医療用チューブの末端が破裂して全ての血液が漏れ出し、遠心分離機の内壁に付着するという事態が生じて目的の血液成分を分離することができなかった。
【０００９】
そこで、本発明が解決すべき課題は、血液の汚染を防止するための閉鎖系において、少量の血液から各血液成分を効率的に分離できる方法を提供することにある。また、本発明は、当該方法で使用するためのキット、および当該方法を用いる医療用細胞の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を進めた。その結果、血液等を導入したチューブを螺旋形状に固定して遠心分離するに当たり、外側の末端周辺部を内側に向けて折り曲げて偏位させることによって、最も強い遠心力がチューブの末端ではなく側面にかかるようにすれば遠心分離中における血液の漏出を抑制できることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
本発明に係る血液の分離方法は、血液または骨髄液を閉鎖されたチューブ内に導入する工程；当該チューブを螺旋形状とし、且つ、その外側末端周辺部を内側に向けて折り曲げる工程；および、外側末端周辺部を内側へ折り曲げた螺旋形状を維持したまま、当該螺旋形状の中心を軸として上記チューブを回転させる工程；を含むことを特徴とする。
【００１２】
上記方法においては、チューブを回転させるに当たり、チューブが上記形状を維持したまま嵌合され得る凹溝が形成された円形固定具にチューブを嵌め込むことが好ましい。また、当該固定板を、閉鎖板により挟んで回転させることも好適な態様である。医療分野で用いられる血液・骨髄液導入用チューブは柔らかいことから、遠心分離中に形状を維持するためにチューブを固定する必要があるからである。
【００１３】
上記円形固定具を２枚１組とし、１枚にチューブを嵌め込み、他の１枚を平面方向に１８０°回転させ重ね合わせる態様も好適である。螺旋形状の凹溝が形成された円形固定具では、その回転中心と重心とが一致せず、良好に遠心分離できない場合があるが、上記態様であれば円形固定具の重心が回転中心に近づいて良好な遠心分離が可能になる。
【００１４】
本発明に係る血液成分分離用キットは、上記方法で用い得るキットであって、血液・骨髄液導入用チューブ；および、血液・骨髄液導入用チューブを固定するための円形固定具であって、螺旋形状であり、且つ、その外側末端周辺部が内側に向けて折り曲げられている形状で上記血液・骨髄液導入用チューブを嵌め込むための溝を有する円形固定具；を含むことを特徴とする。
【００１５】
上記キットとしては、上記円形固定具を２枚含むもの、また、円形板に積層して上記血液導入用チューブを固定するための閉鎖具を含むものが好適である。
【００１６】
また、本発明に係る医療用細胞の製造方法は、上記本発明方法で分離した血液成分を培養する工程を含む。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る血液成分の分離方法によれば、少量の血液または骨髄液から、閉鎖系で各血液成分を効率的に分離することができる。従って本発明は、例えば癌の免疫細胞療法などにおいて、リンパ球や単球などの血液成分を清潔な環境下で効率的に分離できることから非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明に係る血液の分離方法は、
血液または骨髄液を閉鎖されたチューブ内に導入する工程；
上記チューブを螺旋形状とし、且つ、その外側末端周辺部を内側に向けて折り曲げる工程；および
外側末端周辺部を内側へ折り曲げた螺旋形状を維持したまま、当該螺旋形状の中心を軸として上記チューブを回転させる工程；を含むことを特徴とする。以下では、実施の順番に従って、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１９】
（１）  血液の採取工程
本発明方法では、先ず、採取した血液または骨髄液を閉鎖されたチューブ内へ導入する。ここで、従来の連続血液成分分離装置では、血液成分を分離するためには少なくとも２００ｍＬ程度の血液が必要である。しかし、癌の免疫細胞療法などに適用する場合では、必要な血液成分は培養により増やすので分離すべき各血液成分は少ないが、従来の連続血液成分分離装置では必要な血液成分を必要な量だけ効率的に分離するということは困難であった。それに対して本発明方法では、必要となる全血は通常で１０〜５０ｍＬ程度でよい。
【００２０】
本発明で用いるチューブとしては、医療分野で血液採取に用いられているチューブを用いればよい。例えば、ポリ塩化ビニル製やポリエチレン製の無菌チューブを用いることができる。但し、分離効率を高めるためにはチューブの内径は直径５ｍｍ以下にすることが好ましい。一方、チューブを過剰に細くするほどチューブ長さを長くする必要があるので、好適には直径１ｍｍ以上にする。また、チューブの内壁は、血液が凝固しない様に事前にヘパリン処理を施しておいてもよい。
【００２１】
チューブの長さは、チューブの内径やチューブ内に導入する血液または骨髄液の量などにより決まるが、通常は９０〜１５０ｃｍ程度である。
【００２２】
閉鎖されたチューブ内に血液または骨髄液を導入する方法としては、常法を用いればよい。例えば、チューブ内に汚染された空気が入らない様に、厚生労働省監修の「医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準」を満たすクリーンベンチ内で、血液または骨髄液を採取したシリンジから針を外してチューブに接続し、血液または骨髄液をチューブ内に導入する。次いで、チューブ内に閉じ込められた空気が過剰に多くならない程度にシリンジと反対側のチューブ端をチューブシーラー等により適切な長さに切断しつつ密閉する。さらにシリンジを外し、開放側（密閉した側と反対側のチューブ端）へ空気を移動させ、開放側もチューブシーラー等により切断しつつ密閉すればよい。また、末梢血をチューブへ導入する場合には、それぞれヘパリン処理した注射針、チューブおよびシリンジを接続し、末梢血を被験者からチューブへ直接導入することも可能である。
【００２３】
（２）  チューブ形状固定化工程
次に、チューブを螺旋形状とし、且つ、その外側末端周辺部を内側に向けて折り曲げて偏位させる。
【００２４】
本発明において、螺旋形状とは渦巻状の曲線をいう。即ち、ある中心点から半径が段階的または連続的に大きくなる曲線をいう。半径が段階的に大きくなる螺旋形状は、例えば、ある中心点から１〜３ｃｍ程度離れた点から出発して、４５〜１００°ごとに半径を０．５〜３ｃｍ程度ずつ大きくした半曲線を繋げることにより作成することができる。より具体的な例としては、先ず、ある中心点において中心角９０°を為す２つの各直線上に、中心点から２ｃｍ離れた点と３ｃｍ離れた点をマークし、これら２つの点をこれら距離の平均、即ち２．５ｃｍを半径とする円弧で結ぶ。次いで、中心点から３ｃｍ離れた点と中心点とを結ぶ直線と中心点において９０°（２ｃｍ離れた点と中心点を結ぶ直線とは１８０°）を成す直線上に中心点から４ｃｍ離れた点をマークし、中心点から３ｃｍ離れた点と４ｃｍ離れた点を半径３．５ｃｍの円弧で結ぶ。同様の操作を繰り返すことによって、半径が段階的に大きくなる螺旋形状を描くことができる（図１を参照）。上記例では中心点からの距離を１ｃｍずつ大きくしているが、当該増加分を途中から増やしていってもよい。
【００２５】
半径が連続的に大きくなる螺旋形状のうち、隣り合う曲線間の距離が一定であるアルキメデス螺旋（図２）は、ｒ＝ａθ（式中、ｒは半径；ａは定数；θは、曲線状のある点における接線と動径の成す角をψとした場合、θ＝ｔａｎψの関係を満たす角をいう）で表される。このアルキメデス螺旋は、半直線が中心点の周りを一定の角速度ωで回転するとき、その半直線上を一定速度ｖで運動する点の描く曲線と定義することができ、上記定数ａはｖ／ωとなる。また、半径が連続的に大きくなる螺旋形状のうち、隣り合う曲線間の距離が連続的に大きくなる等角螺旋（図３）は、ｒ＝ｅｘｐ（ａθ）（式中、ｒ、ａ、θは、上記と同義を示す）で表される。
【００２６】
上記螺旋形状のうち、半径が段階的に大きくなる螺旋形状では、遠心分離中において、半径が異なる曲線の連結部に細胞成分が引っ掛かるおそれがあるので、半径が連続的に大きくなる螺旋形状がより好ましい。また、遠心力は半径に比例することから、隣り合う曲線間の距離が外側ほど大きくなる螺旋形状が好適である。
【００２７】
上記螺旋形状は平面上に形成された螺旋形状のように二次元的なものであってもよいし、円錐形の側面上に形成された螺旋形状のように高さ方向にふくらみをもつ三次元的なものであってもよい。これら何れかにするかは、使用する遠心分離機により決定すればよい。好適には、二次元的な螺旋形状とする。
【００２８】
本発明では、血液または骨髄液を導入したチューブの末端のうち外側の末端の周辺部を内側に折り曲げることによって、当該チューブのうち回転中心から最も離れた部分、即ち最も大きな遠心力がかかる部分を、末端ではなくチューブの側面に位置せしめる。具体的には、図４で模式的に示す通り、上述した様な規則に従った螺旋形状において、外側末端周辺部２のみを、その直ぐ内側の曲線に触れない程度に螺旋形状の内側へ折り曲げて、チューブの外側末端１が、螺旋形状の中心から最も遠い最外部３に位置しないようにする。
【００２９】
遠心力は、回転中心からの距離に比例する。よって、単なる螺旋形状のチューブを回転させた場合、チューブ内の液体にかかる遠心力は、回転中心から最も遠い外側末端で最も大きくなる。ところがその場合、外側末端に血液の出口が設けられている連続血液成分分離装置では問題は起こらないが、閉鎖されたチューブの場合、最も弱い外側末端に極めて強い遠心力がかかることになり、遠心分離中に血液が漏出する。そこで本発明では、外側末端の周辺部を内側に折り曲げることにより、最も強い遠心力が構造的に強いチューブ側面にかかるようにする。
【００３０】
より詳しくは、外側末端周辺部２のみを内側へ折り曲げれば、外側末端周辺部２中に存在する血液にかかる遠心力の方向は外側末端１から内側へ向かう方向になるため、外側末端には強い遠心力がかからなくなり、遠心分離中の血液漏出を抑制することが可能になる（図４を参照）。一方、回転中心から最も遠くに位置する最外部３には外側末端１からと内側からの遠心力の両方がかかることになるが、チューブの側面の強度は高いため血液が漏出することはない。
【００３１】
チューブにおいて、最外部とする位置、即ちチューブを折り曲げる位置は、チューブの長さ等にもよるが、例えば、外側末端から６〜１１ｃｍ程度内側、全体の１／１５〜１／８程度内側の位置にすることができる。最外部が外側末端から６ｃｍ未満、全体の１／１５未満であると、チューブの外側末端に遠心力がかかり、遠心分離中に血液または骨髄液が漏出するおそれがある。逆に最外部が外側末端から１１ｃｍ超、全体の１／８超であると、血液成分が十分に分離できない場合があり得る。
【００３２】
本発明では、遠心分離中に上記形状を維持するためにチューブを固定する。その固定方法は、特に制限されない。例えば、ダンボールなど強度の高い紙製、木製、金属製などの円形固定具に使用するチューブの上記形状と同様の溝を作製し、血液または骨髄液を導入したチューブを嵌合した上で遠心分離中にチューブが飛び出さない様に閉鎖具を積層すればよい。或いは、チューブの形状に合わせた金属製の骨組みに固定器具によりチューブを固定化してもよい。また、円形固定具の材質によっては、円形固定具の溝に嵌合したチューブを単にビニールテープ等により固定するのみでもよい。
【００３３】
当該円形固定具の形状は、使用する遠心分離機により決定すればよい。例えば、遠心分離中におけるチューブの螺旋形状が二次元的に保たれるのであれば、同様に平面形状とすればよい。一方、遠心分離中におけるチューブの螺旋形状が三次元的になるのであれば、円形固定具は円錐形上にすればよい。即ち、円形固定具の円形とは、上から見た形状のことをいう。また、円形固定具に嵌合されたチューブが遠心分離中に外れないように固定するための閉鎖具は、円形固定具に積層できるように円形固定具と同様の形状とする。
【００３４】
円形固定具は螺旋形状の凹溝が形成されているため、その重心が回転中心とずれている場合がある。そのような場合には、遠心分離が良好に行えないおそれがある。よって、同様の円形固定具を２枚用意し、１枚にはチューブを嵌め込み、他の１枚を平面方向に１８０°回転させ重ね合わせることにより両者の重心を回転中心に近付け、遠心分離を行うことが好ましい。これら２枚の円形固定具の積層方法は特に制限されず、公知方法を適用することができる。例えば、円形固定具の周辺部分に凹溝と重ならないように穴を明け、２枚の円形固定具を紐等で固定すればよい。また、一方の円形固定具の周辺部分に逆Ｌ字形の鍵状突起を設け、他方の円形固定具には当該鍵状突起の底面部に合わせた穴を設け、当該穴に鍵状突起を嵌めこんだ後に穴を設けた円形固定具をずらすことにより両者が固定されるようにしてもよい。なお、この場合においては、固定した場合に両者がずれないように穴の位置を決定する。
【００３５】
（３）  血液分離工程
本発明では、血液を導入したチューブの上記形状を維持したまま、上記螺旋形状の中心を軸としてチューブを回転させることにより血液成分を分離する。なお、回転の中心は厳密な意味での螺旋形状の中心でなくてもよく、遠心分離が可能であれば回転中心は螺旋形状の略中心、即ち螺旋形状の中心付近に設定してもよい。
【００３６】
回転の条件は、分離すべき血液成分、チューブ内に導入した血液または骨髄液の量、チューブの内径などにより適宜調節すればよいが、例えば、１５００〜２０００ｒｐｍで１５〜３０分間程度遠心分離すればよい。
【００３７】
所望の血液成分が存在する部分は、公知方法により閉鎖的に切り取り、単離することが好ましい。例えば、血液から単核球（リンパ球と単球）を単離する場合、Ａｍｅｒｓｈａｍ製の「Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ」などの単核球分離剤が無菌的に導入された閉鎖チューブを別途用意し、ＴＥＲＵＭＯ社製のＴＳＣＤなどの無菌接合装置などを用い、白血球層（バフィーコート）が存在する部分と単核球分離剤が導入された閉鎖チューブとを閉鎖系で接合する。次いで、接合した閉鎖チューブをアルミチューブなどに挿入して固定した上で遠心分離することにより、単核球を単離することができる。
【００３８】
本発明に係る血液成分分離用キットは、上記方法で用い得るキットであって、血液・骨髄液導入用チューブ；および、血液・骨髄液導入用チューブを固定するための円形固定具であって、螺旋形状であり、且つその外側末端周辺部が内側に向けて折り曲げられている形状で上記血液・骨髄液導入用チューブを嵌め込むための溝を有する円形固定具；を含むことを特徴とする。上記キットとしては、さらに、円形固定具に積層して上記血液・骨髄液導入用チューブを固定するための閉鎖具を含むものが好適である。
【００３９】
これら血液・骨髄液導入用チューブや円形固定具、閉鎖具は、上記本発明方法の説明で述べたものと同様のものを用いることができる。
【００４０】
本発明に係る医療用細胞の製造方法は、上記本発明方法で分離した血液成分を培養する工程を含む。分離すべき血液成分は、その目的により選択すればよい。例えば癌の免疫細胞療法では、患者から採取した血液から単核球または単球のみを分離し、癌に対する抵抗性を持たせたり樹状細胞に分化させつつ培養した上で患者に投与する。また、白血病の治療目的では、骨髄液から造血幹細胞を分離して培養すればよい。
【００４１】
ここで本発明に係る血液成分の分離方法を用いれば、従来方法のように大規模なクリーンルームを用いなくても、閉鎖系で血液成分を分離できることから、汚染無く単核球などを効率的に分離することができる。さらに、分離した血漿成分を常法により不活性化し、当該不活性化血漿を含むチューブと分離した単核球等が含まれるチューブとを無菌接合装置などにより閉鎖系で接合した上で、さらに閉鎖系で培地へ注入すれば、無菌的に単核球等を培養することができる。
【００４２】
本発明によれば、血液や骨髄液を外気に接触させることなく、少量の血液または骨髄液から効率的に血液成分を分離することができる。従って、癌の免疫細胞療法など医療に適用することが可能である。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例により制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４４】
実施例１
ヘパリン処理したシリンジを用いて、被験者から血液１０ｍＬを採取した。クリーンベンチ内でシリンジから注射針を外し、外径約４．５ｍｍ、内径約３．１ｍｍ、長さ１５５ｃｍのポリ塩化ビニル製チューブ（ＴＥＲＵＭＯ製、製品名「サフィード延長チューブ（輸血用ポンプ用ｘｘ−ＢＰＨ１６Ｌ）」）に接続し、血液を導入した。次いで、チューブの両末端を、チューブシーラー装置（ＴＥＲＵＭＯ製、製品名「テルモチューブシーラー  ＡＣ−１５７」）を用いて閉鎖した。
【００４５】
別途、直径３６ｃｍのダンボール製円形板に、図１に示す通り、半径が段階的に大きくなる螺旋形状を描いた。具体的には、円形板の中心点において中心角９０°を為す２つの各直線上に、中心点から２ｃｍ離れた点と３ｃｍ離れた点をマークし、これら２つの点をこれら距離の平均、即ち２．５ｃｍを半径とする円弧で結んだ。次いで、中心点から３ｃｍ離れた点と中心点を結ぶ直線と中心点において９０°（２ｃｍ離れた点と中心点を結ぶ直線とは１８０°）を為す直線上に中心点から４ｃｍ離れた点をマークし、中心点から３ｃｍ離れた点と４ｃｍ離れた点を半径３．５ｃｍの円弧で結んだ。同様の操作を繰り返し、中心点からの距離が１ｃｍずつ増える点を中心点からの距離が７ｃｍの点まで円弧で結んでいった。次に、中心点からの距離を２ｃｍずつ増やした点を中心点からの距離が１７ｃｍの点まで円弧で結んだ。次いで、中心点からの距離が１７ｃｍの点から中心点に向かって半径３ｃｍの半円を描いた。当該螺旋形状に沿って、幅５ｍｍの溝を形成した。また、当該円形板の外周部付近には、円形板を遠心分離機に固定するための穴を互いに対向する位置に２組ずつ、一箇所につき２つずつ開けた。また、同様の円形板を用意した。
【００４６】
血液を導入した閉鎖チューブを一方の円形板の溝へ嵌め込んだ後、溝の上下にビニールテープを貼り付けることによりチューブを固定した。当該円形板に他方の円形板を互いに１８０°回転させて重ね、綿製の紐を固定用穴に通した上で、遠心分離機（クボタ製、製品名「遠心分離機  ＫＮ−７０」）の回転部に縛り付けて固定した。１５００ｒｐｍで約１５分間遠心分離した結果、白血球層が分離された。当該白血球層を含む部分（長さ：約５ｃｍ）を、無菌接合装置（ＴＥＲＵＭＯ製、製品名「ＴＳＣＤ」）を用いて、予め単球分離剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ製、製品名「Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ」）を導入しておいた別の同様のチューブ（長さ：５ｃｍ）と接合した。当該接合チューブを、遠心分離機（クボタ製、製品名「遠心分離機  ＫＮ−７０」）を用いてさらに１５００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより単核球を分離した。また、単核球層以外の血漿部分をシーラー（ＴＥＲＵＭＯ製、製品名「テルモチューブシーラーＡＣ−１５７」）で分離し、チューブに入れたまま６０℃で５分間加温して、血漿を不活性化した。
【００４７】
得られた単核球チューブと不活性化血漿チューブを、無菌接合装置（ＴＥＲＵＭＯ製、製品名「ＴＳＣＤ」）を用いて、抗ＣＤ３抗体を固定した炭酸ガス通気性バッグ（日本光電製、製品名「ガス透過性培養用バッグ」）に接合した。当該バッグを、３７℃、炭酸ガス濃度：５％の条件の炭酸ガス培養器に入れ、当該バッグ中に２０ｍＬの液体培地（細胞科学研究所製、製品名「ＡＬｙＳ２０３」）を加えて培養を開始し、細胞の増殖を勘案しながら液体培地（細胞科学研究所製、製品名「ＡＬｙＳ５０５」）を１日１回少量ずつ注入しつつ２週間培養した結果、増殖した単核球が得られた。当該単核球は、セルプロセッサ製の「サイトメイト」などの細胞洗浄装置を使って濃縮と洗浄した後、医療分野で使用することができる。
【００４８】
比較例１
上記実施例１において、血液を導入したチューブの外側末端の周辺部を内側へ折り曲げることなく、螺旋形状を維持したまま、同様の条件で遠心分離した。その結果、遠心分離から約３分後、外側末端から血液の漏出が始まったので、遠心分離を中止した。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１で作成した、半径が段階的に大きくなる螺旋形状を示す図である。図中の数字は、中心点からの距離（単位：ｃｍ）を示す。
【図２】アルキメデス螺旋を示す図である。
【図３】等角螺旋を示す図である。
【図４】本発明で使用する血液・骨髄液導入用チューブの外側末端部分の模式図である。
【符号の説明】
【００５０】
１：外側末端、  ２：外側末端周辺部、  ３：螺旋形状の中心から最も遠い最外部
【図１】
2008272368.tif 000003
【図２】
2008272368.tif 000004
【図３】
2008272368.tif 000005
【図４】
2008272368.tif 000006