(57)【要約】  【課題】  この発明は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）感染の血清診断に有用な特異的試薬を得ることを目的とする。  【解決手段】  本発明は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）に対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド、該ペプチドに対する（モノクローナル）抗体、及びモノクローナル抗体を産生し得る細胞系に係わる。本発明は更に、ＥＢＶまたは抗ＥＢＶ抗体を検出する免疫学的な試薬及び方法にも係わる。【選択図】  図３
2008188017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ４７−５４タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号１、２、４または５に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項２】
エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ４７−５４タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号５に示したアミノ酸配列の少なくとも一部と連結された、配列番号４に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項３】
配列番号６に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ１３８タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号７、８、９または１０に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むことを特徴とするペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドをコードする核酸配列。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸配列を含む組み換えベクター分子。
【請求項７】
請求項６に記載の組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載のペプチドに対する抗体。
【請求項９】
モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＥＢＶ−ＥＡ  ｐ４７−５４タンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗体であって、前記エピトープはｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｒｕｅ（ＥＣＡＣＣ），  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に受託番号第９５０５１６２２号及び同第９５０５１６２１号の下にそれぞれ寄託された、ハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ１４ＥまたはＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎによって認識されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１１】
ＥＢＶ−ＥＡ  ｐ１３８タンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗体であって、前記エピトープはｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｒｕｅ（ＥＣＡＣＣ），  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に受託番号第９５０５１６１９号及び同第９５０５１６２０号の下にそれぞれ寄託された、ハイブリドーマ細胞系によって産生されるモノクローナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ１３ＢまたはＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄによって認識されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載のモノクローナル抗体を産生し得る不死化細胞系。
【請求項１３】
ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｒｕｅ（ＥＣＡＣＣ），  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に受託番号第９５０５１６１９号、同第９５０５１６２０号、同第９５０５１６２１号または同第９５０５１６２２号の下に寄託された不死化細胞系。
【請求項１４】
請求項１から４に記載のペプチドのうちの１種以上を含有する免疫化学試薬。
【請求項１５】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の抗体を含有する免疫化学試薬。
【請求項１６】
試料中のエプスタイン−バールウイルスを検出する方法であって、試料を請求項８から１１のいずれか１項に記載の抗体と接触させ、その後形成された免疫複合体の存在を検出することを含む方法。
【請求項１７】
試験液体中の抗エプスタイン−バールウイルス抗体を検出する方法であって、請求項１４に記載の免疫化学試薬を試験液体と接触させ、試験液体中に形成された免疫複合体の存在を検出することを特徴とする方法。
【請求項１８】
試験液体中のエプスタイン−バールウイルスを検出する方法であって、請求項１４に記載の免疫化学試薬を試験液体と接触させ、これに抗エプスタイン−バールウイルス抗体を接触させ、形成された免疫複合体の存在を検出することを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１６から１８のいずれか１項に記載の方法を実施するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）に対する抗体と免疫化学的に反応するペプチド、該ペプチドに対する（モノクローナル）抗体、及びモノクローナル抗体を産生し得る細胞系に係わる。本発明は更に、ＥＢＶまたは抗ＥＢＶ抗体を検出する免疫学的な試薬及び方法にも係わる。
【背景技術】
【０００２】
エプスタイン−バールウイルスは、最初バーキットリンパ腫（ＢＬ）のアフリカ（風土病即ちｅ）型に関連して発見された遍在性ヒトヘルペスウイルスである。このウイルスは後に上咽頭癌（ＮＰＣ）との関連でも見出され、また伝染性単核細胞症（ＩＭ）の原因物質であることが判明した。感染は普通幼児期早期に起こり、その場合通常は無症状で、時に軽微な症状を伴う。しかし、青年期や成人期の感染はＩＭを誘発する恐れが有り、ＩＭは末梢血中に異型リンパ球が存在することを特徴とする。異型リンパ球の多くはＴリンパ球であるが、ＥＢＶに感染したＢリンパ球の小集団も含まれる。Ｂリンパ球の感染はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生起させることも可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させた細胞は形質転換され、培養すると無限に増殖するようになるが、これは‘不死化’、‘潜伏感染した’、または‘増殖転換された（ｇｒｏｗｔｈ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）’と呼称されている。知られているかぎりでは、ＥＢＶに感染した個体は総て終生潜伏感染したままである。このことは、循環末梢血リンパ球中に少数のＥＢＶゲノム陽性転換Ｂ細胞が終生継続して存在すること、及び中咽頭においてウイルスが周期的に継続して放出されることに基づく。
【０００３】
大抵の場合、ＥＢＶ感染はリンパ系増殖疾患を誘発し、この疾患は一時的に衰弱をもたらし得るが常に良性で、かつ自己限定性である。しかし、或る種の免疫抑制個体では完全に悪性な疾患が誘発される恐れが有る。このような事態は強度に免疫抑制された個体、特にシクロスポリンＡで治療されている、臓器移植を受けた小児において、またはＨＩＶ感染個体が日和見感染した場合、もしくは遺伝的にＸＬＰ（Ｘ染色体関連リンパ系増殖症候群）遺伝子を有する雄性個体が感染した場合に生起する。これらの場合に誘発される悪性疾患は、ＥＢＶ感染Ｂ細胞のポリクローナル増殖に起因する。加えて、上記のような患者では口内毛様白斑症（ｏｒａｌ  ｈａｉｒｙ  ｌｅｕｋｏｐｌａｋｉａ）の病変においてウイルスの非抑制的な上皮複製が検出され得る。即ち、ＥＢＶ感染の抑制では免疫応答が中心的な役割を果たす。
【０００４】
先に述べたように、ＥＢＶはヘルペスウイルスの一つである。このウイルスは次の構造的特徴を有する。
―ＥＢＶゲノムは線状２本鎖ＤＮＡ分子（１７２，０００塩基対）から成る。
―ビリオンは、正二十面体キャプシドによって囲繞されたコア（タンパク質及びＤＮＡ）と、キャプシドを包囲する膜エンベロープとから成る。正二十面体キャプシドは六量体及び五量体キャプソメアによって構成されている。膜エンベロープは、その外表面にスパイクを具えたタンパク質／脂質二重層膜から成る。キャプシドシェルとエンベロープとの間隙は、テグメントと呼称される非晶質タンパク質で満たされている。
―あらゆるヘルペスウイルス同様、ＥＢＶもその宿主において、一次感染後終生にわたる潜伏感染を確立し得る。このような潜伏期はウイルスとヒト宿主との、宿主の免疫系によって制御された完全なバランスを表わすものである。
【０００５】
これまで、ほとんどの生化学的及び生物学的研究はＥＢＶの三つの原型株、即ちＢ９５−８（マーモセット細胞系で産生される形質転換ウイルス）、Ｐ３ＨＲ１（バーキットリンパ腫細胞系で産生される非形質転換ウイルス）及びＲａｊｉ（バーキットリンパ腫細胞系中の潜伏ウイルス）について行なわれてきた。
【０００６】
最近数年の間に、原型ウイルス株Ｂ９５−８の全ＤＮＡ配列が決定された。この配列の分析の結果、８０を越える読み取り枠（ＯＲＦ）が同定された（Ｂａｅｒ等，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０，  ｐｐ．２０７−２１１，  １９８４）。
【０００７】
ＥＢＶの生物学的研究では研究者に特別の問題が提起され、なぜならこのウイルスの生物学的特性（潜伏感染）が従来のウイルス分析に適さないからである。そのうえ、ＥＢＶが有効に感染する細胞及び宿主の範囲はヒト（及び数種の比較的高等な霊長類）のＢリンパ球及び上皮細胞に限られており、これらの細胞は通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養が不可能である。加えて、ウイルスがその中で溶解複製する完全許容型の細胞が存在しないことが、大量のウイルスを生産する可能性を甚だしく制限している。
【０００８】
Ｂ９５−８、Ｐ３ＨＲ１及びＲａｊｉ単離物のＤＮＡ分子は、詳細な制限エンドヌクレアーゼ地図作成、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）プラスミド及びλファージへのクローニング、並びにヌクレオチド配列決定のための原型とされている。
【０００９】
ＥＢＶゲノムは、ユニークかつタンデム反復型のＤＮＡ要素によって構成されたただ１個の２本鎖ＤＮＡ分子から成る。ＤＮＡ分子の各末端は幾つかの末端配列を有し、これらの配列によってゲノムの共有結合及び環化が可能となる。ウイルス粒子中では、ＥＢＶゲノムは線状形態でのみ検出され得る。これに対して、潜伏感染細胞の核中では前記ゲノムは環状エピソームとして存在し、場合によっては宿主細胞の染色体に組み込まれる。
【００１０】
ＥＢＶゲノムは内部反復配列ＩＲ１〜ＩＲ４によって五つのユニークな領域に分割される。Ｕ２及びＵ３領域は異なるＥＢＶ単離物間で著しく変化し、Ｕ２領域はＥＢＶのＰ３ＨＲ１株ではほぼ完全に欠失する。
【００１１】
ＥＢＶ読み取り枠の命名は、当該読み取り枠のウイルスゲノム中での位置に基づく。名称は、発現が開始されるＢａｍＨＩまたはＥｃｏＲＩ制限断片の頭文字で始まる。名称中の第三の文字はＬまたはＲであり、これは発現が標準的な地図上で左方向であるか右方向であるかに依る。（従ってＢＬＬＦ２なら、ＢａｍＨＩ制限断片Ｌにおいて開始する第二の左方向読み取り枠である）。
【００１２】
ＥＢＶ生産サイクルにおけるウイルス抗原の血清学的分類は、様々な蛍光利用技術に基づく。
【００１３】
固定した潜伏感染Ｂ細胞（例えばＲａｊｉ細胞）の核中に抗補体（ａｎｔｉ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）免疫蛍光法で特異的に検出される抗原は、エプスタイン−バール核抗原（ＥＢＮＡ）として分類される。
【００１４】
ウイルス遺伝子発現を化学的因子またはウイルス因子によって活性化すると、その合成がウイルスＤＮＡ合成の抑制によって遮断されない一群の初期抗原（ＥＡ）が検出される。用いる固定液の種類（メタノールまたはアセトン）に応じて異なる２組のＥＡ、即ちＥＡＲ及びＥＡＤが検出され得る。ＥＡは間接免疫蛍光法によって、誘導細胞の細胞質及び核中に検出され得る。ウイルスＤＮＡ合成の開始に続いて（かつそれに依存して）ウイルス構造タンパク質（ＶＣＡ）が合成され、このタンパク質は間接免疫蛍光法によって、ウイルス産生細胞（例えばＰ３ＨＲ１細胞）の細胞質及び核中に検出され得る。生存可能な感染細胞の表面では、ウイルス産生のために誘導された１組の抗原（ＭＡ）が間接免疫蛍光法によって検出され得る。これらの抗原はウイルスエンベロープ上にも見出され得、ウイルス中和のための重要な標的である。
【００１５】
ヒト血清におけるＥＢＶ特異的抗体の検出は、Ｈｅｎｌｅ及びＨｅｎｌｅが述べている血清学的技術（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ５，  ｐｐ．５５１−５６５，  １９７４）によって通常のように行ない得る。
【００１６】
生化学的データ及び免疫蛍光法データに基づき、異なる５群の抗原分子を区別することが可能である。異なるウイルスポリペプチドがその分子量によって示され、その独自の表記を可能にするべく、あらゆるＥＢＶタンパク質に共通する命名法は確立されていない。
【００１７】
異なる５群の抗原は次のとおりである。
Ａ．潜伏状態の間に発現される抗原群（ＥＢＮＡ及びＬＭＰ）。
Ｂ．ゲノム活性化、及びウイルス複製の初期誘導の原因となる抗原群（ＩＥＡ）。
Ｃ．ＩＥＡ遺伝子産物によって誘導される、ウイルスＤＮＡの複製に必要な抗原群で、そのほとんどがウイルス酵素である抗原群（ＥＡ）。
Ｄ．ウイルス粒子の構造構成要素であり、ウイルス複製サイクル後期においてウイルスＤＮＡ合成開始後に発現される抗原群（ＶＣＡ）。
Ｅ．感染細胞の細胞膜において発現される抗原群（ＭＡ）。
【００１８】
エプスタイン−バール初期抗原（ＥＢＶ−ＥＡ）
ＥＢＶ初期抗原（ＥＡ）はウイルスＤＮＡ合成開始前のＥＢＶ産生細胞において発現され、そのような細胞をウイルスＤＮＡポリメラーゼの阻害剤（例えばホスホノ酢酸）で処理した場合に特異的に研究可能である。あるいは他の場合には、ＥＡはＥＢＶに頓挫感染した細胞や、ＩＵｄＲもしくはＢＵｄＲ、またはＴＰＡ及びブチレートなどの化学薬剤で活性化された、ＥＢＶ産生体でないリンパ芽球様（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）細胞（例えばＲａｊｉ細胞）において検出され得る。
【００１９】
ＥＡ抗原は、宿主の巨大分子合成の停止とウイルスＤＮＡ合成の開始との両方に必要な一群のウイルスタンパク質を表わす。
【００２０】
総てのＥＡ複合タンパク質の正確な性質は現在でも未知であるが、その幾つかの構成要素については、近年その分子構造が解明されている。
【００２１】
ヒトの血清とモノクローナル抗体との両方を用いる免疫蛍光（ＩＦ）分析によって、アセトン及びメタノールなどの固定液に対する感度の異なる２組の初期抗原が説明される。一方のＩＦパターンは拡散型（Ｄ）で、核と細胞質との両方が染色されるが、他方のＩＦパターンは細胞質中の繊維状物質のみに限定される（Ｒ）。Ｒ型構成要素はメタノールまたはエタノール固定によって破壊されるが  アセトンには耐性であり、一方Ｄ型構成要素はこれらの固定液に対して耐性であることが判明した。
【００２２】
ＥＡ−Ｄ複合体は少なくとも、ＥＢＶゲノムによってコードされる次のタンパク質：  ＤＮＡポリメラーゼ関連タンパク質Ｐ４７−５４（ＢＭＲＦ１）、主要ＤＮＡ結合タンパク質Ｐ１３８（ＢＡＬＦ２）、ＤＮＡポリメラーゼｐ１１０（ＢＡＬＦ５）、アルカリＤＮアーゼｐ５５（ＢＧＬＦ５）、チミジンキナーゼＰ６５（ＢＸＬＦ１）及び初期トランスアクティベーターＰ５２（ＢＭＬＦ１）を含む。
【００２３】
ＥＡ−Ｒ複合体は少なくとも次のＥＢＶタンパク質：  リボヌクレオチドレダクターゼ大型サブユニットＰ８５（ＢＯＲＦ２）、ＲＲ小型サブユニットｐ３０（ＢａＲＦ１）及びＢｃｌ−２相同体Ｐ１７（ＢＨＲＦ１）を含む。
【００２４】
ＥＢＶ−ＥＡ複合タンパク質に対する抗体は通常、活性な（急性または慢性）ＥＢＶ感染下に有る患者において検出され得、その際抗ＥＡ−Ｒ抗体は見掛け上健康な供血者においてより頻繁に検出され得る。
【００２５】
急性期の単核細胞症においてＥＡ−Ｄ複合タンパク質に対するＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡクラスの抗体が検出され、これらのうちＩｇＭ及びＩｇＡは回復期にＩｇＧより急速に消失した。（重篤な）慢性ＥＢＶ感染ではＥＡ−Ｄ複合体とＥＡ−Ｒ複合体との両方に対するＩｇＧ抗体が高力価で見出され、時にはＩｇＡも見出されるが、ＩｇＭは存在しない。上咽頭癌ではＥＡ−Ｄに対するＩｇＧとＩｇＡとの両方が高力価で見出され、その際ＩｇＡは診断上、また予後においても疾患監視のために重要である。これに対して、別のＥＢＶ関連悪性疾患であるバーキットリンパ腫はしばしば、ＥＡ−Ｒ構成要素に対する高力価のＩｇＧとの間に関連性を有する。
【００２６】
大抵の場合、上述の抗体応答は、ＥＡ発現を誘導し、アセトンまたはメタノールで固定した様々なＥＢＶ細胞系において間接免疫蛍光技術を用いて研究されている。分子をより良く解明する血清学的研究は最近始められたばかりである。
【００２７】
現在、ＥＡ−Ｄ及びＥＡ−Ｒ複合体に対する上記のように異なる免疫応答の（１種以上の）基礎機構は解明されておらず、また様々なＥＢＶ疾患症候群においてヒト抗体により検出されるのがＥＡ−Ｄタンパク質とＥＡ−Ｒタンパク質とのいずれであるかも明らかに解明されてはいない。
【００２８】
先に述べたように、ＥＡ−Ｄ及びＥＡ−Ｒ複合体成分の分子特性の幾つかは近年或る程度説明されてきており、そのコーディング読み取り枠のウイルスゲノム上での位置も特定されている。
【００２９】
しかし、これらの構成要素をＥＢＶ産生細胞から生産することは煩雑であり、また細胞培養におけるこれらのタンパク質の発現レベルの低さから収量は低い。このような事実によって、面倒でかつ主観的なＩＦに基づく血清学的試験に替わるものとしての、より単純な診断法の開発が妨げられてきた。
【００３０】
解明した構成要素を代替宿主系において発現させることが開示されているが、この方法を診断試験に通常のように適用するには、潜在的に干渉性である宿主タンパク質（例えばＥ．  ｃｏｌｉ）を除去するための高レベルの精製が必要となる。
【００３１】
現在、ＥＢＶ特異的な血清診断は、どちらかというと主観的な免疫蛍光試験によって行なわれる。より単純かつ一律な診断法（例えばＥＬＩＳＡ）への進歩は妨げられ、なぜならウイルス抗原の大量生産及び精製は標準的なウイルス産生細胞系を用いては不可能であるからである。
【００３２】
上記のような生産及び精製を行なう唯一の方策は、別様に調製される（１種以上の）ＥＢＶ抗原を用いることである。前記ＥＢＶ抗原は遺伝子操作技術または合成ペプチド技術によって調製し得る。
【００３３】
様々な段階のＥＢＶ感染において確実な診断を可能にする特異的でかつ高感度の方法を開発するには、免疫優性（ｉｍｍｕｎｏ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）なウイルスタンパク質とそのエピトープとを同定することがきわめて重要である。
【００３４】
今回、ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ４７−５４（ＢＭＲＦ１）の幾つかの免疫反応性（ペプチド）ドメインが該タンパク質のＣ末端領域に局在することが患者の血清を用いて見出されたが、個体によっては前記タンパク質のいずれか他の箇所に位置するドメインに対する抗体も有する（図１）。
【００３５】
ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ１３８（ＢＡＬＦ２）の免疫反応性（ペプチド）ドメインは該タンパク質の複数の部位に配置されており、そのほとんどはアミノ酸配列４９０〜６００と、Ｃ末端のアミノ酸配列１０００〜１１２８とに限定される（図２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
本発明は、診断試験において完全なタンパク質に替わり得る、ＥＡタンパク質の免疫優性ドメインに相当する合成ペプチドフラグメントを解明することを目的とする。
【００３７】
合成ペプチドは、化学的に十分解明されている、即ち診断アッセイへの適用に十分適した、高収量で容易かつ再現可能な生産が可能であるという利点を有し、比較的高い再現性の下に製造及び使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明は、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ４７−５４タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号１、２、４または５に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドを提供する。
【００３９】
本発明はまた、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ４７−５４タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号５に示したアミノ酸配列の少なくとも一部と連結された、配列番号４に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドも提供する。
【００４０】
本発明は、配列番号６に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドも提供する。
【００４１】
更に本発明は、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応する、ＥＡ−ｐ１３８タンパク質の少なくとも一部を含むペプチドであって、配列番号７、８、９または１０に示したアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドも提供する。
【００４２】
天然ＥＢＶとは異なり、本発明によるペプチドには、その起源が非感染性で安全であるという一大利点が有る。
【００４３】
本発明によるペプチドとそのフラグメントは、試料中のＥＢＶまたはＥＢＶ抗体の存在を測定する診断法に用いるのに特に適当であることが判明した。そのうえ、本発明によるペプチドとそのフラグメントは適当な医薬投与形態でＥＢＶ関連疾患の治療に用いることができる。このようにして得られる、活性成分としペプチドまたはそのフラグメントを含有するワクチンの製造は当業者には公知である。
【００４４】
免疫試薬に含有させる本発明によるペプチドは、現在入手可能なＥＡ（Ｄ）試薬に比較して改善された反応性及び特異性（性能）を有する。
【００４５】
従って、上記のような免疫試薬を血清学的試験に用いることによって、活性ＥＢＶ感染下に有る患者のより優れた鑑別診断を可能にするアッセイの開発が可能となる。
【００４６】
本発明者は、特定のＥＡ（Ｄ）ペプチドに対する抗体の存在が活性ＥＢＶ感染と相関するということも発見した。
【００４７】
ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ４７−５４及びＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ１３８由来の選択ドメインは、活性ＥＢＶ感染下に有る患者における抗体検出に用い得る。前記抗体は健康な個体には実質的に存在しない。
【００４８】
このことは、世界各地出身の健康なＥＢＶ血清反応陽性供血者の血清をＥＡ（Ｄ）  Ｐ４７−５４及びＰ１３８由来のペプチドに対するＩｇＧ反応性に関して分析することにより更に証明される（図５）。
【００４９】
図５から、（無症状の）ＥＢＶ潜伏感染下に有る健康なＥＢＶ血清反応陽性供血者は特定のＥＡ（Ｄ）ペプチドに対する抗体をまれにしか有しないと結論することができる。
【００５０】
本発明者は、様々なＥＢＶ疾患においてＥＡ（Ｄ）に対するＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡ抗体サブクラスを検出するのに本発明によるペプチドを単独でも、また組み合わせても用い得ることも発見した。
【００５１】
伝染性単核細胞症（ＩＭ）患者の血清中にＥＢＶ−ＶＣＡ及びＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）反応性ＩｇＭ抗体を検出することは、感染の急性期及び回復初期を示すものであり、従って重要な診断パラメーターである。ＩｇＧ抗ＥＡ（Ｄ）抗体はＩＭの急性期に一時的に存在し、回復期には低い、もしくは検出不能なレベルまで減少する。ＩｇＧ−ＥＡ（Ｄ）は、慢性または再活性化ＥＢＶ感染下に有る患者、及びＥＢＶ関連悪性疾患に罹患した患者から成る特定グループでは再出現する場合も有る。従って、ＩｇＧ抗ＥＡ（Ｄ）の存在は、様々な臨床環境での（再）活性ＥＢＶ感染診断のためのマーカーとして有用である。
【００５２】
最後に、ＩｇＡ抗ＥＡ（Ｄ）の検出は或る種のＥＢＶ関連悪性疾患に関連し、この検出は上咽頭癌において診断上、また予後においても有用であることが判明した。
【００５３】
本明細書中に用いた‘ペプチド’という語は、生物活性を有するアミノ酸の分子鎖を意味し、特定長の産物を意味するものではない。従って特に、タンパク質、融合タンパク質またはペプチド、オリゴペプチド及びポリペプチドが含まれる。
【００５４】
必要であれば、本発明によるペプチドは例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化によりｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで修飾可能である。従って、本発明によるペプチドの例えば酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル、及びＮ−アシル誘導体などの機能性変形例も本発明の一部とみなす。本発明に含まれる特定のタンパク質またはポリペプチドには自然の改変が存在することも有り得ると理解される。そのような改変は、配列全体の中にみられる（一つ以上の）アミノ酸の相違によって、または（１個以上の）アミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加によって明示され得る。生物活性及び免疫活性を実質的に変更しないと考えられるアミノ酸置換が開示されている。関連するアミノ酸間でのアミノ酸置換、もしくは進化の過程でしばしば生起した置換は特に、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｍ．  Ｄ．  Ｄａｙｈｏｆ，  “Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．，  ｖｏｌ．５，  ｓｕｐｐｌ．３，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．  Ｃ．，  １９７８参照）。この情報に基づき、Ｌｉｐｍａｎ及びＰｅａｒｓｏｎは迅速かつ高感度のタンパク質比較法を開発し（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，  ｐｐ．１４３４−１４４１，  １９８５）、相同タンパク質同士の機能類似度を測定した。
【００５５】
本明細書中に用いた‘少なくとも一部’という語は、本発明のペプチドのサブ配列から成るアミノ酸配列を意味する。上記一部もしくはフラグメントとは、ＥＢＶ−ＥＡタンパク質の免疫原決定基を１個以上有するペプチドのことである。フラグメントは特に前駆体分子の酵素切断によって製造され得、その際ＤＮＡには制限エンドヌクレアーゼ、ポリペプチドにはプロテアーゼが用いられる。他の方法にはフラグメントの化学合成や、ＤＮＡフラグメントによるペプチドフラグメントの発現などが有る。
【００５６】
本発明によるペプチドの、１個以上のエピトープを有する適当な免疫原フラグメントは国際特許出願公開第８６／０６４８７号、Ｈ．  Ｍ．  Ｇｅｙｓｅｎ等，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１，  ｐｐ．３９９８−４００２，  １９８４及びＨ．  Ｍ．  Ｇｅｙｓｅｎ等，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  １０２，  ｐｐ．２５９−２７４，  １９８７に開示された、いわゆるｐｅｐｓｃａｎ法に基づく方法によって見出すことができ、その際完全な当該ポリペプチドの部分配列に対応する一連の部分重複ペプチドを合成し、それらの抗体との反応性を調べる。
【００５７】
加えて、ペプチドの幾つかの領域を理論的な要件に基づきエピトープと呼称し得るが、前記理論的要件の予測的な価値は限られる。上記領域の決定は、Ｈｏｐｐ及びＷｏｏｄｓによる親水性基準（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ７８，  ｐｐ．３８２４−３８２８，  １９８１）とＣｈｏｕ及びＦａｓｍａｎによる二次構造アスペクト（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ４７，  ｐｐ．４５−１４８，  １９８７）との組み合わせに基づく。
【００５８】
本発明によるペプチドまたはそのフラグメントは、公知の有機化学的ペプチド合成方法のいずれかで、または組み換えＤＮＡ技術を用いて調製できる。
【００５９】
有機化学的ペプチド合成方法は、必要なアミノ酸同士を均質相中で、またはいわゆる固相を用いて縮合反応により結合させることを含む。
【００６０】
縮合反応は、
ａ）  遊離カルボキシル基を有し、その他の反応性基は保護されている化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基を有し、その他の反応性基は保護されている化合物（アミノ酸、ペプチド）と、縮合剤存在下に縮合させるか、または
ｂ）  活性化されたカルボキシル基を有し、その他の反応性基は遊離であるか、または保護されている化合物（アミノ酸、ペプチド）を、遊離アミノ基を有し、その他の反応性基は遊離であるか、または保護されている化合物（アミノ酸、ペプチド）と縮合させる
ことによって実施し得る。
【００６１】
カルボキシル基の活性化は特に、カルボキシル基を酸ハロゲン化物、アジド、酸無水物、イミダゾリド、またはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールもしくはｐ−ニトロフェニルエステルなどの活性化エステルに変換することによって行なう。
【００６２】
上記縮合反応を生起させる最も普通の方法は、カルボジイミド法、アジド法、混合酸無水物法、並びにＥ．  Ｇｒｏｓｓ及びＪ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｓ．１−３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  １９７９，  １９８０，  １９８１に記載されているような活性化エステルを用いる方法である。
【００６３】
本発明による上述のペプチドの適当なフラグメントを、‘固相法’を用いて調製する方法は、例えばＪ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ｐ．２１４９，  １９６３及びＩｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３５，  ｐｐ．１６１−２１４，  １９９０に記載されている。調製するべきペプチドのアミノ酸の結合は普通、カルボキシル末端側から始まる。この方法の場合、反応性基を担持するか、またはその上に反応性基が導入され得る固相が必要である。固相は、例えばベンゼン及びジビニルベンゼンと反応性クロロメチル基とのコポリマーか、またはヒドロキシメチルもしくはアミン官能基と反応する性質を付与されたポリマー固相であり得る。
【００６４】
特に適当な固相は、例えばＪ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９５，  ｐ．１３２８，  １９７４にＷａｎｇが述べているｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（４−ヒドロキシ−メチル−フェノキシ−メチル−コポリスチレン−１％ジビニルベンゼン樹脂）である。合成後、ペプチドは上記固相から穏和条件下に分離され得る。
【００６５】
所望のアミノ酸配列の合成後、続いて樹脂からペプチドを、例えばトリフルオロメタンスルホン酸、またはトリフルオロ酢酸に溶解させたメタンスルホン酸で分離する。ペプチドは、低級アルコール、好ましくはメタノールまたはエタノールを用いるエステル交換反応によっても支持体から分離でき、この場合ペプチドの低級アルキルエステルが直接生成する。同様に、アンモニアを用いる分離によって本発明によるペプチドのアミドが得られる。
【００６６】
縮合反応に関与しない反応性基は、先に述べたように、酸、塩基を用いる加水分解または還元によってきわめて容易に再度除去することができる基によって有効に保護する。即ち、カルボキシル基であれば、例えばメタノール、エタノール、ｔ−ブタノール、ベンジルアルコールまたはｐ−ニトロベンジルアルコールとのエステル化、及び固体支持体に結合したアミンによって有効に保護し得る。
【００６７】
アミノ基を有効に保護し得る基は、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシ−カルボニル（ｔ−ｂｏｃ）もしくはｐ−メトキシ−ベンジルオキシカルボニル基であるか、またはベンゼン−スルホニルもしくはｐ−トルエン−スルホニル基などの、スルホン酸に由来する酸基であるが、置換または非置換アリールまたはアラルキル基、例えばベンジル及びトリフェニルメチルや、オルト−ニトロフェニル−スルフェニル及び２−ベンゾイル−１−メチル−ビニルなどの基のような他の基を用いることも可能である。特に適当なα−アミノ保護基は、例えば塩基感受性の９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基（Ｃａｒｐｉｎｏ及びＨａｎ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ９２，  ｐ．５７４８，  １９７０）である。
【００６８】
用い得る保護基についてのより広範な記述が、Ｇｒｏｓｓ，  Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｓ．１−９，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，  １９７９−１９８７中に見出され得る。
【００６９】
リシンのε−アミノ基を保護することも必要であり、またアルギニンのグアニジン基は保護することが適当である。このような保護に通常用いられる保護基は、リシンの場合はＢｏｃ基、アルギニンの場合はＰｍｃ基、Ｐｍｓ基、Ｍｂｓ基またはＭｔｒ基である。
【００７０】
保護基は、当該基の性質に応じて様々な通常方法で、例えばトリフルオロ酢酸を用いて、または水素とパラジウムなどの触媒とを用いる穏和な還元によって、または氷酢酸中のＨＢｒを用いて除去可能である。
【００７１】
本発明による免疫反応性ペプチドは、複数を組み合わせてただ１個の分子とすることもできる。２個以上のペプチドを共有結合させて混成ペプチドまたは複合ペプチドとすることは、例えば先に述べた方法を用いてペプチド配列を固相ペプチド合成することにより可能であり、その際個々のペプチドのアミノ酸配列は互いに整列させる。個々のペプチド配列間にはリンカー配列を挿入することもできる。そのようなリンカー配列は、例えばグリシンの２〜５残基の伸長部（ｓｔｒｅｔｃｈ）であり得る。
【００７２】
混成または複合ペプチドは、フラグメント縮合技術を用いる固相合成によっても調製可能である。（その配列が本発明の個々のペプチドの配列に対応し得る）複数のフラグメントを個別に調製及び精製するこの方法は、比較的長い混成または複合ペプチド配列を合成する場合に好ましい。比較的長いペプチドを調製する方法は当業者に公知であり、例えばＴｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌｓ．１−９（上記参照）に記載されている。
【００７３】
あるいは他の場合には、適宜修飾した本発明のペプチド同士を結合させることによって混成または複合ペプチドを調製し得る。
【００７４】
システインアミノ酸を欠いた２個の異なるペプチド配列を結合させる好ましい方法ではペプチドを、カルボキシル末端かまたはアミノ末端に付加的なシステイン残基を有する誘導体に変換する。その後、一方のペプチドを単一システインチオール官能基において２，２′−ジチオジピリジンで活性化する。得られたピリジル−ジチオ−ペプチド誘導体を、システインチオール基を有する第二のペプチドと反応させて、個別のペプチドがジスルフィド結合によって連結された混成ペプチドを得る。
【００７５】
他の多くの混成ペプチド調製方法も実施可能である。タンパク質−タンパク質結合の分野で開発された化学的方法も用い得る。このような方法についてはＭｅａｎｓ及びＦｅｅｎｅｙ（Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  １，  ｐｐ．２−１２，  １９９０）を参照されたい。例えば、良く知られたホモまたはヘテロ二官能架橋剤を用いれば、個々のペプチドをジスルフィド結合、またはチオエーテル結合、またはアミド結合等で結合させることができる。
【００７６】
先に触れたように、本発明によるペプチドは組み換えＤＮＡ技術を用いても調製し得る。この可能性は、ペプチドを反復配列中に（‘タンデムに’）組み込む場合、またはペプチドを（はるかに大きい）タンパク質またはポリペプチドの構成要素として、もしくは例えばβ−ガラクトシダーゼ（の一部）との融合タンパク質として調製し得る場合特に重要である。従って、上記のようなペプチドも本発明の範囲内である。この調製方法では、組み換えＤＮＡの構成要素として、本発明によるペプチドをコードする核酸配列であってしかも、天然のＥＢＶゲノムにおいて該配列に隣接（ｆｌａｎｋ）する核酸セグメントを実質的に含まない核酸配列を用いる。
【００７７】
上記方法は、宿主として適当な微生物において調製したい１種以上のペプチドをコードする核酸配列を含む組み換えポリヌクレオチドを発現させることにより所望のペプチドを調製することを含む。
【００７８】
本発明によるペプチドをコードする核酸配列は、該配列が天然には会合または連結しない様々な複製実現ＤＮＡ配列と連結させていわゆる組み換えベクター分子とすることができ、この分子は適当な宿主の形質転換に用い得る。有用な組み換えベクター分子は好ましくは、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コスミドまたはウイルスに由来する。
【００７９】
核酸配列のクローニングに用い得る特異的ベクターまたはクローニングビヒクルは当業者に公知であり、特にｐＢＲ３２２、様々なｐＵＣ、ｐＧＥＭおよびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドなどのプラスミドベクター、バクテリオファージ、例えばｋｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ  ２８及びＭ１３由来ファージ、またはＳＶ４０、アデノウイルスもしくはポリオーマウイルスなどのウイルスベクターを含む（Ｒ．  Ｌ．  Ｒｏｄｒｉｑｕｅｚ及びＤ．  Ｔ．  Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，  １９８８；  Ｊ．  Ａ．  Ｌｅｎｓｔｒａ等，  Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １１０，  ｐｐ．１−２４，  １９９０も参照されたい）。組み換えベクター分子の構築に用いるべき方法は当業者に公知であり、特にＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ等が提示している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８９）。
【００８０】
例えば、本発明によるペプチドをコードする核酸配列をクローニングベクターに挿入することは、遺伝子と所望のクローニングビヒクルとの両方を（１種以上の）同じ制限酵素で切断すれば、それによって相補的ＤＮＡ末端が形成されるので容易に実施可能となる。
【００８１】
組み換えベクター分子は、ｐＢＲ３２２のアンピシリン及びテトラサイクリン耐性、並びにｐＵＣ８のアンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチドをコードする領域の活性のような、所望の形質転換体の選択に用い得る１種以上のマーカー活性を付加的に有していてもよい。
【００８２】
当然ながら、形質転換宿主が１個以上の免疫原決定基を有するポリペプチドを産生するかぎり、クローニングベクターの選択した部位に挿入するヌクレオチド配列は本発明のペプチドをコードする完全な核酸配列の断片しか含まなくてもよいと理解されるべきである。
【００８３】
本発明のペプチドに対する抗体も本発明の一部である。
【００８４】
上述のように調製したペプチドまたはそのフラグメントは、ポリクローナルとモノクローナルとの両方の抗体の製造に用い得る。本発明によるペプチドに対するモノクローナル抗体は、当業者には容易に製造可能である。
【００８５】
従って、本発明のモノクローナル抗体はＥＢＶ感染診断のための新規な手段を提供する。
【００８６】
本発明の好ましい抗体は、ＥＢＶ−ＥＡ  ｐ４７−５４タンパク質のエピトープに結合するモノクローナル抗体であり、前記エピトープはｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｒｕｅ（ＥＣＡＣＣ），  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ（ＵＫ）に受託番号第９５０５１６１９号、同第９５０５１６２０号、同第９５０５１６２１号及び同第９５０５１６２２号の下に寄託されたハイブリドーマ細胞系が産生するモノクローナル抗体によって認識される。
【００８７】
本発明のモノクローナル抗体を分泌し得る不死化細胞系も本発明の一部である。
【００８８】
モノクローナル抗体を産生する細胞系の製造は、例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの技術［Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎは、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの形成をもたらす技術を創案した（Ｇ．  Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ｐｐ．４９５−４９７，  １９７５；  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，  ｐｐ．５１１−５１９，  １９７６）］、エプスタイン−バールウイルスを用いる形質転換、もしくはオンコジーンＤＮＡでのＢリンパ球の直接形質転換、またはヒトＢリンパ球とヒトもしくはマウス−ヒト雑種骨髄腫細胞系である融合相手との直接融合、もしくはＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系と前記骨髄腫細胞系との直接融合によって実施し得る。
【００８９】
本発明の好ましい細胞系は、受託番号９５０５１６１９、９５０５１６２０、９５０５１６２１及び９５０５１６２２でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，  Ｐｏｒｔｏｎ  Ｄｏｗｎ  （ＵＫ）に寄託された細胞系である。
【００９０】
これらのハイブリドーマ細胞系は、骨髄腫細胞を、ＥＢＶ産生細胞由来のＥＢＶ−ＥＡタンパク質を予め接種したマウスに由来するリンパ球と融合させて産生された。
【００９１】
ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）複合体のタンパク質に対するモノクローナル抗体は、精製目的のために、またこれらのタンパク質の機能研究のための様々な生化学／免疫分析技術のために、細胞及び細胞抽出物でのＥＡ（Ｄ）発現をｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で検出するのに有用な手段である。
【００９２】
ＥＢＶ−ＥＡタンパク質に対するモノクローナル抗体が産生され、ＢＭＲＦ１によってコードされるＥＡ（Ｄ）タンパク質Ｐ４７−５４の特定のペプチドドメイン内のエピトープと反応することが判明した。
【００９３】
これらのモノクローナル抗体の２種（ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎ及びＥＢＶ．ＯＴ１４Ｅと称する）のためのＰ４７−５４タンパク質上の結合ドメインはそれぞれＡＡ位置３４０−３４６及び３４６−３５０にマッピングされた（図８Ａ）。
【００９４】
このような抗体を使用して、潜伏感染細胞（図８Ｂ、レーンＸ５０／７）ではなく、増殖感染細胞（図８Ｂ、レーンＶＣＡ及びＥＡ）で発現されるＢＭＲＦ１によってコードされるＰ４７−５４タンパク質をインタクトなリン酸化及び非リン酸化形態で検出することができる。抗体はＥＢＶ  Ｐ４７−５４に特異的であり、ＥＢＶ陰性細胞の細胞成分とは交差反応しない（図８Ｂ、レーンＢＪＡＢ）。
【００９５】
ＥＢＶ−ＥＡタンパク質に対するモノクローナル抗体が産生され、ＢＡＬＦ２によってコードされるＥＡ（Ｄ）タンパク質Ｐ１３８の特定ペプチドドメイン内のエピトープと反応することが判明した。
【００９６】
これらのモノクローナル抗体の２種（ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂ及びＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄと称する）のためのＰ１３８タンパク質上の結合ドメインはそれぞれＡＡ位置５１５−５２１及び１０９２−１０９８にマッピングされた（図９Ａ）。
【００９７】
このような抗体を使用して、潜伏感染細胞（図９Ｂ、レーンＸ５０／７）ではなく、増殖感染細胞（図９Ｂ、レーンＶＣＡ及びＥＡ）で発現される、ＢＡＬＦ２によってコードされるＰ１３８タンパク質をインタクトな形態で検出することができる。抗体はＥＢＶ  Ｐ１３８に特異的であり、ＥＢＶ陰性細胞の細胞成分とは交差反応しない（図９Ｂ、レーンＢＪＡＢ）。
【００９８】
本発明は更に、試験液又は組織試料中の全長タンパク質の検出を目的とする免疫学的及び生化学的方法での前記ペプチドに対する抗体の使用を包含する。
【００９９】
本発明以前では、ＥＢＶ感染細胞の初期抗原の検出は、ヒト血清を抗ＥＢＶ−ＥＡ抗体源として使用する間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）を用いて実施されていた。擬陽性反応や擬陰性反応が頻繁に見られるために、これは複雑である。
【０１００】
ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂ、１３Ｄ、１３Ｎ、１４Ｅ抗体によって、間接免疫蛍光法や同様の技術による種々のＥＢＶ感染細胞中のＥＢＶ−ＥＡの高感度検出が可能となる。
【０１０１】
本発明のペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は、組織試料中のその場での検出のための診断や免疫細胞化学法に非常に適しており、中和抗体は受動免疫治療に非常に有用である。
【０１０２】
問題のモノクローナル抗体の「人体適応化（ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ）」も本発明の一部となる。「人体に適応した」モノクローナル抗体の産生技術は当業界では公知である。
【０１０３】
本発明のペプチド又は抗体を１種以上含む免疫化学試薬も本発明の一部である。
【０１０４】
本発明の「免疫化学試薬」という用語は通常、本発明の１種以上のペプチド及び適切な支持体又は標識物質からなる。
【０１０５】
使用できる支持体は例えば、マイクロ試験ウェル又はキュベットの内壁、管又は細管、膜、フィルター、試験ストリップ又は粒子［例えばラテックス粒子、アルデヒド粒子（例えば活性アルデヒド表面基を有するセラミック磁化性粒子）］の表面、赤血球、色素ゾル、金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物，ＢＳＡ又はＫＬＨのようなキャリヤータンパク質である。
【０１０６】
使用できる標識物質はとりわけ、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、色素ゾル、金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。
【０１０７】
試料中のＥＢＶに対する抗体の検出方法では、本発明の免疫化学試薬を試料と接触させる。その後、試料中のペプチドと抗体との間に生成した免疫複合体の存在を検出し、この検出によって試料中のＥＢＶ抗体の存在を確認し、定量することができる。
【０１０８】
免疫化学試薬の種類や更なる特徴によっては、生起する免疫化学反応はいわゆるサンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又は阻害反応である。
【０１０９】
試料中のＥＢＶ検出のために、本発明のペプチドを１種以上含む本発明の免疫化学試薬を試料及び抗ＥＢＶと接触させ、その後、生成した免疫複合体の存在を検出し、これから試料中のＥＢＶの存在を調べることができる。
【０１１０】
試料中ＥＢＶの特に適した検出方法は、標識物質を備えた本発明のペプチドと（試料中に存在する）ＥＢＶ抗原との間の競合反応に基づき、ペプチド及び抗原は固体支持体に結合したＥＢＶに対する抗体と競合する。
【０１１１】
本発明は更に、本発明の抗体を試料と接触させた後に、生成した免疫複合体の存在を検出し、これが試料中のエプスタイン−バールウイルスの存在の尺度となることを特徴とする試料中のエプスタイン−バールウイルスの検出方法を包含する。
【０１１２】
本発明の試験キットは、上述したような免疫化学試薬を主成分として含んでいる。ＥＢＶ抗体検出のためのサンドイッチ反応を実施する際に、試験キットは例えば、固体支持体（例えばマイクロ試験ウェルの内壁）に被覆された本発明のペプチド、及び本発明の標識ペプチド又は標識抗抗体を含み得る。
【０１１３】
競合反応実施のために、試験キットは、固体支持体に被覆された本発明のペプチド、及びＥＢＶに対する標識抗体、好ましくは前記ペプチドに対するモノクローナル抗体を含み得る。
【０１１４】
凝集反応では、試験キットは、粒子又はゾルに被覆された本発明のペプチドを含み得る免疫化学試薬を包含する。
【０１１５】
試験キットの他の実施態様は例えば、固体支持体に被覆されたＥＢＶに対する抗体上の結合部位に対する検出すべきＥＢＶ抗原との競合反応で本発明の標識ペプチドを免疫化学試薬として使用することである。
【０１１６】
（実施例）
以下の実施例で本発明を更に詳しく説明する。
【０１１７】
実施例に記載のペプチドコードは、下記のように定義する。
＃４９６（Ｐ４７−５４）：配列番号１
＃４９７（Ｐ４７−５４）：配列番号２
＃４９８（Ｐ４７−５４）：配列番号３
＃４９９（Ｐ４７−５４）：配列番号４
＃５００（Ｐ４７−５４）：配列番号５
＃５０１（Ｐ４７−５４）：配列番号６
Ｇ−３４−Ｒ（Ｐ１３８）：配列番号７
Ｄ−２８−Ｓ（Ｐ１３８）：配列番号８
Ａ−２７−Ｇ（Ｐ１３８）：配列番号９
Ｇ−２１−Ｖ（Ｐ１３８）：配列番号１０
【実施例１】
【０１１８】
ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４（ＢＭＲＦ１）上の免疫反応性（ペプチド）ドメインの局在。
【０１１９】
長さが１２アミノ酸（ＡＡ）で、完全ＢＭＲＦ１読み取り枠のＡＡ配列の１１ＡＡが重複したペプチドを、最初にＧｅｉｊｓｅｎ等が記載したように（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，ＵＳＡ，８３（１９９４）ｐ．３９９８−４００２）、化学的に活性化したピン上で自動化固相ペプチド合成によって合成した。
【０１２０】
Ｍｉｄｄｅｌｄｏｒｐ及びＭｅｌｏｅｎが記載する方法（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ２１（１９８８）ｐ．１４７ー１５９）で、ＥＢＶ特異抗体の免疫反応性を調べた。
【０１２１】
活性ＥＢＶ感染した個体の４つの血清でのこのようなＰＥＰＳＣＡＮ分析の結果を図１に示す。
【０１２２】
大半の血清が、タンパク質のＣ末端領域に位置する領域（ドメイン）と反応性の抗体を含んでいたが、タンパク質の他のドメインに対する抗体を更に有する個体もあることがこの図から判明し得る。
【０１２３】
ＥＢＶ患者血清の別の試料では同様のデータが見出されたが、健康な対照の血清ではこのような反応性は見出されなかった。
【実施例２】
【０１２４】
ＢＶ−ＥＡ（Ｄ）Ｐ１３８（ＢＡＬＦ２）上の免疫反応性（ペプチド）ドメインの局在。
【０１２５】
ＢＡＬＦ２の全読み取り枠に由来するペプチドを実施例１に記載のように合成して分析した。
【０１２６】
１個のＥＢＶ患者血清の結果を図２に示す。
【０１２７】
抗体反応性領域がタンパク質ＡＡ配列上の複数の部位に見出され、大半がＡＡ４９０−６００及びＡＡ１０００−１１２８のＣ末端に局限されることがこの図から判明し得る。
【０１２８】
ＥＢＶ患者の別の血清でも同様のデータが見出された。
【実施例３】
【０１２９】
ヒト血清抗体との反応性の改善のためのＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４由来の可溶性合成ペプチドの使用。
標準的な固相法（（Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９（１９６３）；Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ３５，  １６１−２１４（１９９０））を用いて特定のペプチド（配列表を参照されたい）を合成して、複数のＰＥＰＳＣＡＮ反応性ドメインを組み合わせて単一分子とした。これらのペプチドを、通常は被覆用緩衝液中１μｇ／ｍｌで、９６ウェルミクロＥＬＩＳＡプレートのウェル中で固相上に被覆し、未結合位置を被覆用緩衝液中１％ウシ血清アルブミンでブロックした。
【０１３０】
全ての場合で、ペプチドを０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で固相上に被覆した。
【０１３１】
ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）で洗浄した後に、標準的な手順を用いてヒト血清の血清希釈液（通常１：１００）で抗体反応性を分析した。
【０１３２】
このような分析の結果を図３に示す。
【０１３３】
ペプチド＃４９９のＣ末端にシステイン残基を導入し、ペプチド＃５００のＮ末端にシステイン残基を導入してペプチド＃５０１（ペプチドの＃４９９と＃５００とを組み合わせたもの）を構築して、これらのペプチドをジスルフィド結合で結合する。ペプチドの組み合わせ又は結合については他の同様の技術（例えば標準的な固相合成による）が公知である。標準的な固相合成技術を使用する場合、２個のシステイン残基の導入は不要であり、従ってこれら２個の残基をアミノ酸配列から除去することができる（配列番号６；ＡＡ２０及び２１）。
【０１３４】
ペプチドの＃５００及び＃５０１が、ＥＢＶ感染患者の血清との陽性抗ＥＡ（Ｄ）反応と、ＥＢＶに潜伏感染した（ＪＭ及び２１９）又はＥＢＶ陰性（ＴＲ）の健康な対照ドナーの血清との陰性反応との間の最良の識別を示していることがこの図から判明し得る。ペプチドの＃４９６及び＃４９７は、当業者によって抗体反応性ＡＡ配列を含むことが判明している（Ｊ.  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ａｎａｌ．  １（１９８７）ｐ．１４０−１４５）、Ｐ４７−５４ペプチドのＮ末端伸長である基準ペプチド＃４９８と同様の性能を示した。
【０１３５】
従って、特にペプチドの＃５００及び＃５０１は、抗ＥＡ（Ｄ）抗体検出のために改善された反応性を示す新たな試薬となる。
【実施例４】
【０１３６】
ヒト血清抗体との反応性を改善するためのＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ１３８由来の合成ペプチドの使用。
【０１３７】
特定の合成ペプチド試薬を実施例３に記載した同様の方法で製造してＰ１３８（配列表を参照されたい）の免疫反応性ドメインを含ませ、これらを標準的な手順を用いてＥＬＩＳＡで試験した。
【０１３８】
いずれの場合も、炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）を用いてペプチドを固相上に被覆し、血清は１：１００の希釈度で試験した。
【０１３９】
図４ＡはペプチドをｐＨ９．６で固相に被覆した実験の結果を示し、図４ＢはｐＨ９．６ではなくｐＨ７．２で被覆すると、これらのペプチドの一つの反応性が改善されることを示している。
【０１４０】
これらの研究から、（被覆条件に依存して）ＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ１３８由来の特定ペプチドを使用して、とりわけＥＢＶ患者の血清で抗ＥＡ（Ｄ）抗体を検出できることが判明し得る。ＥＢＶに潜伏感染した健康な対照の血清は、ＥＢＶ血清陰性ドナーと同様の陰性反応を示す。
【実施例５】
【０１４１】
感度改善のための単一アッセイでの選択ペプチドの組み合わせ
特定試薬の付加的な利点は、単一アッセイに種々のＥＡ（Ｄ）タンパク質のペプチドを組み合わて、抗ＥＡ（Ｄ）抗体検出の総感度を改善できることである。
【０１４２】
これは、単独で又は１：１で組み合わせて同一ウェル内に被覆したペプチド＃５０１（Ｐ４７−５４；配列番号６）及びＧ−３４−Ｒ（Ｐ１３８；配列番号７）に対する無作為の単核細胞症患者の血清ＩｇＧ反応性を示した図５で分かる。
【０１４３】
更には、図６−図７には単一アッセイでの特定ペプチドの組み合わせが明示されている（実施例３−４による臨床環境でのＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡ抗ＥＡ（Ｄ）の検出は図７Ａ−Ｃに明示されている）。
【０１４４】
特定のペプチドを組み合わせると抗ＥＡ（Ｄ）抗体の検出感度が増したことがこれらの図面から明白である。
【実施例６】
【０１４５】
モノクローナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂ、ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄ、ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎ及びＥＢＶ．ＯＴ１４Ｅのイムノブロット分析。
【０１４６】
還元条件下で変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、数個の核抽出物（ウイルス構造タンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物（ＶＣＡ）、ウイルスＤＮＡ複製をＰＡＡにより阻止してＥＡタンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物（ＥＡ）、潜伏期ＥＢＶ遺伝子のみを発現するＸ５０／７細胞の核抽出物（Ｘ５０／７）及びＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞系ＢＪＡＢの核抽出物（ＢＪＡＢ））を分離し、当業界で公知の標準的な手順でニトロセルロースシートに移した。
【０１４７】
このイムノブロットから、上述のＥＢＶ核抽出物で、モノクローナル抗体ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂ（図９Ｂ）、ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄ（図９Ｄ）、ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎ（図８Ｂ）及びＥＢＶ．ＯＴ１４Ｅ（図８Ｂ）を用いてイムノブロット分析を実施した。
【０１４８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】４人の活性ＥＢＶ感染患者の血清中ＩｇＧ抗体と、１１アミノ酸が重複してＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ４７−５４（ＢＭＲＦ１）の完全ＡＡ配列を示す個々の１２量体ペプチドとの結合の同定。
【図２】１人の活性ＥＢＶ感染患者の血清中ＩｇＧ抗体と、１１アミノ酸が重複してＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）  Ｐ１３８（ＢＡＬＦ２）の完全ＡＡ配列を示す個々の１２量体ペプチドとの結合の同定。
【図３】ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４の免疫反応性ドメインの組み合わせを示す個々の合成ペプチドに対する（ＩｇＧ）抗体の検出。ペプチド配列は配列表に記載する。ＪＭ及び２１９：健康で血清陽性のＥＢＶ対照ドナーの血清。ＴＲ：健康で血清陰性のＥＢＶ対照ドナーの血清。ＩＭ：単核細胞症患者の血清。ＲＲ：重症慢性ＥＢＶ感染患者の血清。
【図４Ａ】ＥＡ（Ｄ）Ｐ１３８の免疫反応性ドメインの組み合わせを示す個々の合成ペプチドに対する（ＩｇＧ）抗体の検出。ペプチド配列は同定表に記載し、上述したようなＰ１３８  ＡＡ位置を示す。ＪＭ及びＱＣＤ２１９：健康で血清陽性のＥＢＶ対照ドナーの血清。ＴＲ：健康で血清陰性のＥＢＶ対照ドナーの血清。ＩＭ：単核細胞症患者の血清。ＲＲ：重症慢性ＥＢＶ感染患者の血清。
【図４Ｂ】ｐＨ９．６（０．１Ｍ炭酸塩緩衝液）又はｐＨ７．２（０．１Ｍリン酸塩緩衝液）で被覆したＰ１３８由来ペプチドＧ−２１−Ｖ（配列番号１０）及びＧ−３４−Ｒ（配列番号７）を用いて行った図４Ａと同一の分析。
【図５】ＥＡ（Ｄ）複合体又はそれを組み合わせたものの個々の成分に対する（ＩｇＧ）抗体の検出。この図では、ペプチド＃５０１（Ｐ４７−５４；配列番号６）及びＧ−３４−Ｒ（Ｐ１３８；配列番号７）を別個に又は１：１で組み合わせて固相上に直接被覆した。無作為の３８人の単核細胞症患者の血清を１：１００の希釈度で使用した。
【図６Ａ】香港（Ａ）及びＵＳＡ（Ｂ）の健康な血液ドナー集団で、ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４及びＰ１３８（即ち＃５００（配列番号５）及びＧ−３４−Ｒ（配列番号７））由来の特定ペプチドを別個に又は１：１で組み合わせて用いたＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）に対するＩｇＧ抗体の検出。
【図６Ｂ】香港（Ａ）及びＵＳＡ（Ｂ）の健康な血液ドナー集団で、ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４及びＰ１３８（即ち＃５００（配列番号５）及びＧ−３４−Ｒ（配列番号７））由来の特定ペプチドを別個に又は１：１で組み合わせて用いたＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）に対するＩｇＧ抗体の検出。
【図７Ａ】別個に固相上に被覆した又は１：１で組み合わせて同一ウェルに被覆した特定ペプチド（即ちＰ４７−５４の場合は＃５０１（配列番号６）及びＰ１３８の場合はＧ−３４−Ｒ（配列番号７））を用いた３８人の単核細胞症患者の血清中のＥＢＶ−ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４及びＰ１３８に対するＩｇＭ抗体の検出。
【図７Ｂ】前記試薬を用いた３８人の単核細胞症患者の血清中のＩｇＧ抗体の検出。
【図７Ｃ】前記試薬を用いた３８人の上咽頭癌患者の血清中のＩｇＡ抗体の検出。
【図８Ａ】重複する１２量体ペプチドによるＰＥＰＳＣＡＮ技術を用いた、ＢＭＲＦ１によってコードされるＥＢＶ  ＥＡ（Ｄ）Ｐ４７−５４上でのＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎ及びＥＢＶ．ＯＴ１４Ｅの結合ドメインの同定。
【図８Ｂ】ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｎ及びＥＢＶ．ＯＴ１４Ｅによるイムノブロット染色。Ｍ＝分子量マーカー。ＶＣＡ＝ウイルス構造タンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。ＥＡ＝ウイルスＤＮＡ複製をＰＡＡで阻止してＥＡタンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。Ｘ５０／７＝潜伏期ＥＢＶ遺伝子のみを発現するＸ５０／７細胞の核抽出物。ＢＪＡＢ＝ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞系ＢＪＡＢの核抽出物。
【図９Ａ】重複する１２量体ペプチドによるＰＥＰＳＣＡＮ技術を用いた、ＢＡＬＦ２によってコードされるＥＢＶ  ＥＡ（Ｄ）Ｐ１３８上でのＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂの結合ドメインの同定。
【図９Ｂ】ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｂによるイムノブロット染色。Ｍ＝分子量マーカー。ＶＣＡ＝ウイルス構造タンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。ＥＡ＝ウイルスＤＮＡ複製をＰＡＡで阻止してＥＡタンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。Ｘ５０／７＝潜伏期ＥＢＶ遺伝子のみを発現するＸ５０／７細胞の核抽出物。ＢＪＡＢ＝ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞系ＢＪＡＢの核抽出物。
【図９Ｃ】重複する１２量体ペプチドによるＰＥＰＳＣＡＮ技術を用いた、ＢＡＬＦ２によってコードされるＥＢＶ  ＥＡ（Ｄ）Ｐ１３８上でのＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄの結合ドメインの同定。
【図９Ｄ】ＥＢＶ．ＯＴ１３Ｄによるイムノブロット染色。Ｍ＝分子量マーカー。ＶＣＡ＝ウイルス構造タンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。ＥＡ＝ウイルスＤＮＡ複製をＰＡＡで阻止してＥＡタンパク質の発現のために誘導されたＨＨ５１４細胞の核抽出物。Ｘ５０／７＝潜伏期ＥＢＶ遺伝子のみを発現するＸ５０／７細胞の核抽出物。ＢＪＡＢ＝ＥＢＶ陰性バーキットリンパ腫細胞系ＢＪＡＢの核抽出物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月21日(2008.5.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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