(57)【要約】【課題】ネコ免疫不全ウイルス（FIV）の感染の予防又は治療、及びネコAIDS発症の予防又はネコAIDSの治療に有効なポリペプチド、ならびに該ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する。【解決手段】ネコ免疫不全ウイルス膜融合タンパク質のHR2領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた、抗FIV作用を有するポリペプチド及び該FIV剤を含有する医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記表Iで表される順序でアミノ酸を含有するポリペプチド。
【表１】
2008063275.tif 000005
（表I中、
XAは、同一又は異なって、グルタミン酸、アスパラギン酸及びシステイン酸からなる群より選択されるいずれかの酸性アミノ酸を表す； 
XBは、同一又は異なって、リジン、アルギニン、オルニチン及びヒスチジンからなる群より選択されるいずれかの塩基性アミノ酸を表す；
また、Ａ、Ｄ及びＥ列の１５個のアミノ酸のうち、１〜３個のアミノ酸が下記（i）〜（xiii）の法則に従って置換されていてもよい。
(i) XLeu1は、同一又は異なって、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表す；
（ii）XLeu2は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（iii）XAsn1は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（iv）XAsn2は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、システイン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アルギニン、グリシン、トリプトファン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（v）XTrpは、トリプトファン、システイン、ロイシン、セリン、アルギニン及びグリシンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（vi）XTyrは、チロシン、フェニルアラニン、セリン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（vii）XThrは、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（viii）XGlnは、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、プロリン、アルギニン、リジン及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（ix）XPheは、フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（x）XIleは、同一又は異なって、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジン、セリン、アルギニン、フェニルアラニン、ロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表す；
（xi）XValは、バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アルギニン及びセリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（xii）XGlyは、グリシン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸表す；
（xiii）このとき、置換されていないアミノ酸はそれぞれ以下のように定義される。
XLeu1はロイシン；
XTrpはトリプトファン；
XTyrはチロシン；
XThrはスレオニン；
XGlnはグルタミン；
XPheはフェニルアラニン；
XIleはイソロイシン；
XAsn1はアスパラギン；
XGlyはグリシン；
XAsn2はアスパラギン又はセリン；
XValはグリシン又はバリン；
XLeu2はイソロイシン又はロイシン；
また、表Iに示されるアミノ酸は、A列第１行（1Aと表す）のXLeu1をN末端として、以下の順序で結合している。
1A-1B-1C-1D-1E-1F-1G-2A-2B-2C-2D-2E-2F-2G-3A-3B-3C-3D-3E-3F-3G-4A-4B-4C-4D-4E-4F-4G-5A-5B-5C-5D-5E-5F-5G）
【請求項２】
XLeu1がロイシン；
XTrpがトリプトファン；
XTyrがチロシン；
XThrがスレオニン；
XGlnがグルタミン；
XPheがフェニルアラニン；
XIleがイソロイシン；
XAsn1がアスパラギン；
XGlyがグリシン；
XAsn2がアスパラギン又はセリン；
XValがグリシン又はバリン；
XLeu2がイソロイシン又はロイシン
である請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記表Iにおいて、1A位のXLeu1のアミノ基が、アシル基又は１〜７個のアミノ酸残基に結合している、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記表Iにおいて、5G位のXBのC末端のカルボニル基が、アミノ基又は１〜７個のアミノ酸残基に結合している、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
下記（a）〜（d）のいずれかのアミノ酸配列を有する請求項１に記載のポリペプチド。
(a)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Val-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2（配列番号３）；
(b)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2（配列番号４）；
(c)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2（配列番号５）；
(d)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2（配列番号６）
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗FIV剤。
【請求項７】
請求項６に記載の抗FIV剤を、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ネコ免疫不全ウイルス（FIV）作用を有するポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ネコ免疫不全ウイルス(Feline immunodeficiency virus, FIV)はネコに感染し、免疫不全症候群（ネコAIDS）を引き起こすレンチウイルスである。しかしながら、現在のところ、このウイルスに対する有効なワクチンや治療剤がなく、ネコAIDSの治療は、対症療法に限られている。FIVに感染したネコは、最終的に免疫機能が低下して死に至る。疫学的には野良猫の約７割以上がFIVに感染しているとされており、さらなる感染の拡大が懸念されている。
【０００３】
FIVは標的細胞に感染する際、ウイルスと標的細胞との膜融合において、Type-I型膜融合促進蛋白質（fusion protein）を利用すると推定されている。FIVの場合、ウイルスの表面蛋白質の一つであるgp40が、Type-I型fusion proteinに分類される。Type-I型fusion proteinの機能解析研究より、FIV gp40の膜融合時における機能として次のようなことが推定されている。（１）gp40には、α-helix性の高い2つの領域が存在する（N末側からHR1, HR2と呼ばれることが多い）。（２）gp40のN末側が、まず標的細胞膜にアンカリングされ、次いで3つのHR1が相互作用し、3-helix bundleを形成する。（３）この3本鎖α-helical coiled-coilに対して、さらに3つのHR2が外側から取り囲むように逆並行型に結合し、6-helix bundleが形成される。（４）その結果、FIVおよび標的細胞膜が近接し、膜融合が成立するという動的超分子機構である。従って、FIV gp40のHR2のアミノ酸配列に基づいて、6-helix bundleの形成を阻害し得る抗FIVペプチドは、ウイルスと宿主細胞の膜融合を阻害し、抗ウイルス活性を示すと予想された。
【０００４】
そこで、FIV gp40の配列解析より、HR1及びHR2に相当する配列の検索、同定、さらにはこれらペプチド配列の抗FIV活性の評価の検討が、いくつかの研究グループにより行われている。ヒト免疫不全ウイルスについても同様の研究が行われており、抗HIV剤を抗FIV剤として使用することも検討されたが、HIV由来のHR2ペプチド類は抗FIV活性が充分ではなかった（例えば、非特許文献１）。この様な背景から、優れた抗ウイルス活性を有する抗FIV剤及び該抗FIV剤を含有するFIV感染の予防／治療剤が求められている。
【非特許文献１】Medinas RJ, Lambert DM, Tompkins WA. C-Terminal gp40 peptide analogs inhibit feline immunodeficiency virus: cell fusion and virus spread. J Virol. 2002 Sep;76(18):9079-86.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、FIV感染を予防又は治療し得るポリペプチド、該ポリペプチドを有効成分とする抗FIV剤、及び該抗FIV剤を含有する医薬組成物を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
レンチウイルスにおいてHR1及びHR2領域の相互作用は、宿主細胞への感染に関わる膜融合プロセスにおいて必須の過程である。この過程の阻害によりウイルス粒子は宿主細胞への侵入が不可能になることから、HR1およびHR2 に相当するペプチドもしくはその類縁体は有力な抗ウイルス剤（膜融合阻害剤）の候補化合物になるものと考えられてきた。
【０００７】
しかしながら、HR1およびHR2領域のアミノ酸配列は、ウイルスごとに著しく異なることから、ウイルス種、場合によってはウイルスの株ごとに、特異的な配列を有するペプチドのデザインが膜融合阻害剤開発のために要求される。従って、抗FIV活性を有するポリペプチドを得るためには、予測されるFIVのHR1又はHR2領域のアミノ酸配列に基づいて実際にポリペプチドを作製し、抗FIV活性を評価する必要がある。
【０００８】
従来の研究によると、FIV HR2領域由来のポリペプチドのFIVに対する特異性と、HIVに対する特異性を比較したところ（例えば、R. J. Medinas et al., Journal of Virology, Sept. 2002, p. 9079-9086等）、FIV HR2領域由来のポリペプチドのHIVに対する膜融合阻害作用は、FIVに対する膜融合阻害作用よりも極めて低い（1/88000倍）ことが明らかとなった。一方、HIV HR2領域由来のポリペプチドは、HIVに対しては優れた膜融合阻害作用を示すのに対し、FIVに対しては効果が1/38倍と低くなった。すなわち、HIVに対して優れた膜融合阻害作用を有する化合物（ポリペプチド）であっても、FIVに対して優れた効果を発揮するわけではないことが示された。
【０００９】
本発明者らは、以前にα−へリックス構造において疎水性の面と親水性の面を形成するようにアミノ酸残基を置換し、α−へリックス構造の安定化を促進した抗HIV剤を得ている（特開２００３−１７６２９８）。本発明者らは、今回の発明において、FIVのHR2ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、抗HIV剤と同様の手法によってポリペプチドを得た。前記の従来の知見に基づけば、α−へリックス構造の安定化に関して抗ＨＩＶ剤と同じ概念によって、ＦＶＩ  ＨＲ２領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた本発明のポリペプチドは、ＦＩＶに対して充分な抗ウイルス活性を有していないものと予測された。しかしながら、本発明者らは、この様なポリペプチドが、極めて優れた抗ＦＩＶ活性を有していることを見出した。
【００１０】
本発明では、FIV gp40のHR2領域のアミノ酸配列をもとにポリペプチドをデザインし、特異的にFIVの宿主細胞への侵入を抑制する、以下のポリペプチド、抗FIV剤及び該抗FIV剤を含有する医薬組成物を提供する。
項１．下記表Iで表される順序でアミノ酸を含有するポリペプチド。
【００１１】
【表１】
2008063275.tif 000002
【００１２】
（表I中、
XAは、同一又は異なって、グルタミン酸、アスパラギン酸及びシステイン酸からなる群より選択されるいずれかの酸性アミノ酸を表す； 
XBは、同一又は異なって、リジン、アルギニン、オルニチン及びヒスチジンからなる群より選択されるいずれかの塩基性アミノ酸を表す；
また、Ａ、Ｄ及びＥ列の１５個のアミノ酸のうち、１〜３個のアミノ酸が下記（i）〜（xiii）の法則に従って置換されていてもよい。
(i) XLeu1は、同一又は異なって、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表す；
（ii）XLeu2は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（iii）XAsn1は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（iv）XAsn2は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、システイン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アルギニン、グリシン、トリプトファン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（v）XTrpは、トリプトファン、システイン、ロイシン、セリン、アルギニン及びグリシンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（vi）XTyrは、チロシン、フェニルアラニン、セリン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（vii）XThrは、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（viii）XGlnは、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、プロリン、アルギニン、リジン及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（ix）XPheは、フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（x）XIleは、同一又は異なって、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジン、セリン、アルギニン、フェニルアラニン、ロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表す；
（xi）XValは、バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アルギニン及びセリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表す；
（xii）XGlyは、グリシン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸表す；
（xiii）このとき、置換されていないアミノ酸はそれぞれ以下のように定義される。
【００１３】
XLeu1はロイシン；
XTrpはトリプトファン；
XTyrはチロシン；
XThrはスレオニン；
XGlnはグルタミン；
XPheはフェニルアラニン；
XIleはイソロイシン；
XAsn1はアスパラギン；
XGlyはグリシン；
XAsn2はアスパラギン又はセリン；
XValはグリシン又はバリン；
XLeu2はイソロイシン又はロイシン；
また、表Iに示されるアミノ酸は、A列第１行（1Aと表す）のXLeu1をN末端として、以下の順序で結合している。
1A-1B-1C-1D-1E-1F-1G-2A-2B-2C-2D-2E-2F-2G-3A-3B-3C-3D-3E-3F-3G-4A-4B-4C-4D-4E-4F-4G-5A-5B-5C-5D-5E-5F-5G）
項２．
XLeu1がロイシン；
XTrpがトリプトファン；
XTyrがチロシン；
XThrがスレオニン；
XGlnがグルタミン；
XPheがフェニルアラニン；
XIleがイソロイシン；
XAsn1がアスパラギン；
XGlyがグリシン；
XAsn2がアスパラギン又はセリン；
XValがグリシン又はバリン；
XLeu2がイソロイシン又はロイシン
である項1に記載のポリペプチド。
項３．前記表Iにおいて、1A位のXLeu1のアミノ基が、アシル基又は１〜７個のアミノ酸残基に結合している、項１又は２に記載のポリペプチド。
項４．前記表Iにおいて、5G位のXBのC末端のカルボニル基が、アミノ基又は１〜７個のアミノ酸残基に結合している、項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
項５．下記（a）〜（d）のいずれかのアミノ酸配列を有する項１に記載のポリペプチド。
(a)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Val-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2（配列番号３）；
(b)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2（配列番号４）；
(c)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2（配列番号５）；
(d)Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2（配列番号６）
項６．項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗FIV剤。
項７．項６に記載の抗FIV剤を、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に含有する医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のポリペプチドは、FIVと宿主の細胞膜融合に必要なgp40蛋白質に親和性が高く、膜融合を阻害することによってFIV感染を予防することができる。さらに、本発明のポリペプチドによれば、FIV感染を治療することができ、FIVに感染した動物がネコAIDSを発症することを防ぐことができる。
【００１５】
また、これまでFIVに有効な治療剤又はワクチンが無く、FIVに感染した動物には対症療法でしか対応できなかったが、本発明によれば、優れた抗FIV剤及びネコAIDS治療のための医薬組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明のポリペプチド、ならびに該ポリペプチドを含有する抗FIV剤及び該FIV剤を含有する医薬組成物について説明する。
【００１７】
１．抗FIV作用を有するポリペプチド
α-へリックスを形成するHR2領域のペプチドは、HR1領域と相互作用する面（以下、相互作用面と記載することがある）と、溶媒に接触する面（以下、溶媒接触面と記載することがある）の２つに分けられ、α-へリックス形成を介してHR1との相互作用に必要なアミノ酸残基（Xとする）は、相互作用面に提示される。本発明者らは、α-ヘリックス構造の安定化が、最終的に抗ウイルス活性を増大すると考え、HR2ペプチドの溶媒接触面にα-へリックス形成促進機能を加えれば、より強力な抗ウイルス活性を有するペプチドを創製できると予想した。
【００１８】
一般に、α-へリックス構造は、７アミノ酸残基の繰り返し構造（heptad repeat配列）によって構成されることが知られている。そこで、本発明者らは、HR2ペプチドに、X-XA-XA-X-X-XB-XB（Xは、HR1領域と相互作用する残基であり、天然配列をそのまま利用する；XA及びXBは親水性アミノ酸であって、XAは酸性アミノ酸であり、XBは塩基性アミノ酸である）で表される人工heptad repeat配列を導入する方法を採用して人工ペプチドを合成した場合、片方の面にX残基が集まって相互作用面を形成し、他面に親水性アミノ酸残基が集まって溶媒接触面を形成すると考えた。ここで、Xは、天然配列と同じであり、疎水性を中心としたアミノ酸残基である。すなわち、Xは、α-へリックスの立体構造において連続的に並び、全体として疎水性の面（相互作用面に相当する）を形成していると考えられる。一方、親水性アミノ酸（XA及びXB）は、側鎖のイオン的な相互作用によって、α-へリックス構造の安定化に寄与するものと考えられる。
【００１９】
本発明者らは、上記のような考えに基づけば、予測されたある配列が活性を有し、その必須残基が不明であった場合でも、X-XA-XA-X-X-XB-XBをα-へリックスを構成する7アミノ酸残基の１単位（フレーム）として、このフレーム中の3つのXが相互作用面を構成するように7アミノ酸の繰り返し配列を含む誘導体を合成し、該誘導体の活性を比較検討すれば、活性発現に必要な残基、すなわち、相互作用面を構成するアミノ酸残基を同定することができると考えた。以下、このX-XA-XA-X-X-XB-XBフレームを用いて、α-へリックス構造を有するペプチドの活性発現に必要なアミノ酸残基を同定する方法論を、X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャン（X、XA及びXBは、上記と同様に定義される）と記載する。
【００２０】
本発明者らは、FIV（UK8株：subtype A）gp40のアミノ酸配列に基づいて、P.S. Kimら（J. Mol. Biol. 1999, 290, 1031-1041）によって公開されているLearnCoil-VMFを用い、FIVのHR1領域と実際に結合するサイトとして703-737の35アミノ酸残基を予想した。以下、この35アミノ酸残基を、FIV-C35と記載する。LearnCoil-VMFは、HR1領域やHR2領域がα-へリックスを形成する際にheptad repeat配列をとるという傾向に基づいて、HR1領域及びHR2領域の二次構造を予測するソフトである。その後、本発明者らが、FIV-C35ペプチドについて抗FIV活性を確認したところ、このペプチドが抗FIV活性を有することを見出した。FIV-C35ペプチド（UK8株）HR2領域から得られた、抗FIV活性を有するアミノ酸配列（配列番号１）を以下に示す。
【００２１】
【表２】
2008063275.tif 000003
【００２２】
LearnCoil-VMFによれば、HR1領域及びHR2領域の二次構造をある程度予測することはできるものの、相互作用に必要な残基の情報は、充分に得ることはできない。そこで、本発明者らは、X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンに基づき、FIV-C35ペプチドの改変体（FIV-C35EK1（UK8））を作成したところ、これらの改変体が高い抗ウイルス活性を有することを見出した。
【００２３】
α-へリックスを模式的に図示した場合、α-へリックスを構成する７アミノ酸残基は、図1の様な位置関係で表される。
【００２４】
改変体
図１中のAをN末端として得られた改変体において、D、A及びEには、天然型と同一のアミノ酸が並び、α-へリックス構造における疎水性の面（相互作用面）を形成している。また、この改変体は、B及びCに位置するアミノ酸が酸性アミノ酸であり、且つF及びGに位置するアミノ酸が塩基性アミノ酸である。このB,F,C及びGに位置するアミノ酸によって溶媒接触面が形成される。すなわち、該改変体は、図2で表される（配列番号２）。また、この様にして得られる改変体のアミノ酸配列を表Iに示す。
【００２５】
【表３】
2008063275.tif 000004
【００２６】
上記表Iのアミノ酸配列中に記載されるXA及びXBは親水性アミノ酸であり、XAは同一又は異なる酸性アミノ酸を表し、XBは同一又は異なる塩基性アミノ酸を表す。
【００２７】
ここで、酸性アミノ酸（XA）としては、好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸又はシステイン酸等であり、より好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸であり、さらに好ましくはグルタミン酸である。
【００２８】
塩基性アミノ酸（XB）としては、好ましくはリジン、アルギニン、オルニチン又はヒスチジン等であり、より好ましくはリジン、アルギニン又はオルニチンであり、さらに好ましくはリジン又はアルギニンであり、さらに好ましくはリジンである。上記酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸の組み合わせの中でも、グルタミン酸−リジンの組み合わせがより好ましい。
【００２９】
また、Ａ、Ｄ及びＥ列の１５個のアミノ酸のうち、１〜３個のアミノ酸が下記（i）〜（xii）の法則に従って置換されていてもよい。
(i) XLeu1は、同一又は異なってロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表し、好ましくはロイシンである；
（ii）XLeu2は、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、メチオニン、バリン、セリン、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グルタミン、スレオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはイソロイシン又はロイシンである；
（iii）XAsn1は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはアスパラギンである；
（iv）XAsn2は、アスパラギン、リジン、イソロイシン、スレオニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、アラニン、システイン、ロイシン、フェニルアラニン、プロリン、アルギニン、グリシン、トリプトファン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはアスパラギン又はセリンである；
（v）XTrpは、トリプトファン、システイン、ロイシン、セリン、アルギニン及びグリシンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはトリプトファンである；
（vi）XTyrは、チロシン、フェニルアラニン、セリン、システイン、ヒスチジン、アスパラギン及びアスパラギン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはチロシンである；
（vii）XThrは、スレオニン、セリン、プロリン、アラニン、イソロイシン、メチオニン、アスパラギン、リジン及びアルギニンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはスレオニンである；
（viii）XGlnは、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、プロリン、アルギニン、リジン及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはグルタミンである；
（ix）XPheは、フェニルアラニン、セリン、チロシン、システイン、ロイシン、イソロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはフェニルアラニンである；
（x）XIleは、同一又は異なって、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、アスパラギン、リジン、セリン、アルギニン、フェニルアラニン、ロイシン及びバリンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸を表し、好ましくはイソロイシンである；
（xi）XValは、バリン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アルギニン及びセリンからなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸を表し、好ましくはグリシン又はバリンである；
（xii）XGlyは、グリシン、システイン、トリプトファン、アルギニン、セリン、バリン、アラニン、アスパラギン酸及びグルタミン酸からなる群より選択されるいずれか一種のアミノ酸表し、好ましくはグリシンである；
上記の法則に従ってＡ、Ｄ及びＥ列の１５個のアミノ酸のうち、１〜３個のアミノ酸が置換された場合、その他の置換されていないアミノ酸はそれぞれ以下のように定義される。
【００３０】
XLeu1はロイシン；
XTrpはトリプトファン；
XTyrはチロシン；
XThrはスレオニン；
XGlnはグルタミン；
XPheはフェニルアラニン；
XIleはイソロイシン；
XAsn1はアスパラギン；
XGlyはグリシン；
XAsn2はアスパラギン又はセリン；
XValはグリシン又はバリン；
XLeu2はイソロイシン又はロイシン。
【００３１】
また、表Iに示されるアミノ酸は、A列第１行（1Aと表す）のLeuをN末端として、以下の順序で結合している。
1A-1B-1C-1D-1E-1F-1G-2A-2B-2C-2D-2E-2F-2G-3A-3B-3C-3D-3E-3F-3G-4A-4B-4C-4D-4E-4F-4G-5A-5B-5C-5D-5E-5F-5G
さらに、本発明のポリペプチドは、1A位のXLeu1から5G位のXBで表される35アミノ酸残基が前記の順序で結合したポリペプチドからなるものであってもよいが、1A位のXLeu1のアミノ基が、アシル基に結合していてもよく、また5G位のXBのC末端のカルボニル基がアミノ基に結合していてもよい。
【００３２】
従って、上記表Iに表される1A位のLeuのN末端のアミノ基には、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシカルボニル基、フタリル基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基、ベンジル基等のアシル基が結合していてもよく、好ましくはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、ベンゾイル基、フタリル基、ホルミル基、トリフルオロアセチル基が結合し、より好ましくはアセチル基が結合する。
【００３３】
また、上記表Iに表されるポリペプチドの1A位のLeuに、1〜7個のアミノ酸残基が結合していてもよい。この1〜7個のアミノ酸残基とは、FIV gp40タンパク質の696〜702に位置する7アミノ酸残基（すなわち、Trp-Asn-His-Gly-Asn-Ile-Thr）のうち、702位のアミノ酸残基からN末端方向に数えて1〜7個のアミノ酸残基を指す。また、前記1〜7個のアミノ酸残基は、前記X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャン（X、XA及びXBは上記と同様に定義される）により改変されたものであってもよい。
【００３４】
上記表Iに表される5G位のXBのC末端のカルボニル基には、NH2、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ベンジルアミノ基等のアミノ基が結合していてもよく、好ましくはNH2、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基が結合し、より好ましくはNH2が結合する。
【００３５】
また、上記表Iに表されるポリペプチドの5C位のアミノ酸残基に、1〜7個のアミノ酸残基が結合していてもよい。この1〜7個のアミノ酸残基とは、FIV gp40タンパク質の738〜744に位置する7アミノ酸残基（すなわち、Leu-Gln-Glu-Trp-Glu-Asp-Trp）うち、738位のアミノ酸残基からC末端方向に数えて1〜7個のアミノ酸残基を指す。また、前記1〜7個のアミノ酸残基は、前記X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャン（X、XA及びXBは上記と同様に定義される）により改変されたものであってもよい。
【００３６】
本発明のFIV-C35ペプチドの改変体は、好ましくはアミノ酸を21〜49残基有しており、より好ましくは35〜42残基有している。例えば、FIV-C35の改変体が、28アミノ酸残基から構成される場合は、第１改変体の法則に従って改変された、gp40タンパク質の703〜730又は710〜737に位置するアミノ酸28残基を改変したアミノ酸配列からなることが好ましい。また、35残基以上のポリペプチドとする場合は、α-へリックス部分には、FIV gp40タンパク質の703〜737に位置するアミノ酸35残基を改変したアミノ酸配列が含まれていることが好ましい。
【００３７】
本発明の改変体において使用されるアミノ酸は、L体（Lアミノ酸）が好ましいが、D体を用いても良い。D体を用いる場合には、全ての光学活性アミノ酸をD体にすることが好ましい。
【００３８】
前記UK8株以外についてもX-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンを行うことによって、各株に基づく改変体を得ることができる。前記UK8以外の株としては、例えば、FIVのShizuoka株、Petaluma株、Sendai 1株等が挙げられる。
【００３９】
本発明におけるFIV-C35の改変体の好ましい具体例としては、以下（a）〜（d）のようなアミノ酸配列を例示できる（Acはアセチル基を表す）。（a）〜（d）は、それぞれFIVのUK8株、Shizuoka株、Petaluma株、Sendai 1株に基づいて得られるポリペプチドである。
（a）FIV-C35EK1（UK8）（配列番号３）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Val-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2
（b）FIV-C35EK1（Shizuoka）（配列番号４）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2
（c）FIV-C35EK1（Petaluma）（配列番号５）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2
（d）FIV-C35EK1（Sendai-1）（配列番号６）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2
上記FIV-C35EK1誘導体のアミノ酸配列において、N末端がアセチル化され、且つC末端がアミド化されていた方が、安定なα-へリックス構造を形成することができる。また、本発明のペプチド改変体は、N末端とC末端は互いに結合しておらず、非環状であることが好ましい。
【００４０】
本発明の限定的解釈を望むものではないが、本発明者らは次のように考える。すなわち、本発明の1個又は2個の改変体は、2個又は1個のHR2ペプチドと3量体を形成し、FIVと標的細胞の膜融合を阻害する。これにより、FIVの感染を阻止し得ると考えられる。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチド合成法、特に液相合成法あるいは固相合成法によって製造することができる。また、本発明のポリペプチドをコードするDNAを遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入し、発現させる方法によっても合成することができる。
【００４２】
例えば、固相合成法では、最もC末端に対応するアミノ酸のアミノ基を９-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）基などのウレタン型保護基で保護したN-保護アミノ酸のカルボキシル基を、アミノ基を有する不溶性樹脂に結合させた後、アミノ基の保護基を除去し、N末端方向に順次保護アミノ酸を縮合させ、次いで不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱保護させて、本発明のポリペプチドを得ることができる。
【００４３】
前記のアミノ基を有する不溶性樹脂としては、特に限定されないが、Fmoc-NH-SAL樹脂(4-(2',4'-ジメトキシフェニル-Fmoc-アミノエチル)フェノキシリンカー樹脂)が好ましく、開裂によって直接目的物を与えることができる。
【００４４】
本発明のポリペプチドの合成に用いる保護アミノ酸は、官能基を公知の方法により公知の保護基で保護することにより得ることができるし、市販の保護アミノ酸を使用することもできる。保護基としては公知のものが使用でき、例えば、上記に例示したを使用できる。
【００４５】
保護アミノ酸を調製する場合には、例えば、DIPCDI(ジイソプロピルカルボジイミド)-HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)法等のような公知の方法を用いることができる。本縮合反応は公知の溶媒中で行うことができ、例えば、ジメチルホルムアミド等の有機溶媒が例示される。アミノ基の保護基の脱離試薬としては限定されず、ピペリジン／ジメチルホルムアミド等の公知の試薬によって、Fmoc基等の保護基を切断することができる。
【００４６】
また、合成の各段階における縮合反応の進行の程度は、例えばニンヒドリン反応法のような公知の方法によって確認することができる。
【００４７】
上記のようにして、所望のアミノ酸配列を有する保護ポリペプチドを得ることができる。
【００４８】
不溶性樹脂としてFmoc-NH-SAL樹脂を用いた場合、TMSBr(トリメチルシリルブロミド)やTFA(トリフルオロ酢酸)等で処理することにより、樹脂及び保護基を同時に脱離させることができる。
【００４９】
このようにして得られた本発明のポリペプチドは、例えば、抽出、再結晶、各種クロマトグラフィー(ゲルろ過、イオン交換、分配、吸着)、電気泳動、向流分配等、公知の手段により単離精製することができ、逆相高速液体クロマトグラフィーによる方法が好ましい。
【００５０】
本発明のポリペプチドは、FIVが生体内の宿主細胞（例えば、T細胞等）に侵入（感染）することを防ぐことができ、または感染したFIVが宿主細胞内で増殖し更なる感染を引き起こすことを防ぐことができるので、FIVの感染予防、AIDSの発症予防、更にはAIDSの治療等にも使用することができる。
【００５１】
２．抗FIV剤
本発明のポリペプチドには、その薬学的に許容される塩も包含される。かかる塩には、当業界で周知の方法により調製される、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムなどの無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等が包含される。更に上記塩には、本発明ポリペプチドと適当な有機酸乃至無機酸との反応による無毒性酸付加塩も包含される。代表的酸付加塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、ラウリン酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩（トシレート）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、ベンゼンスルホン酸塩及びメタンスルホン酸塩などを例示できる。本発明のポリペプチドを単独で有効成分とし、又は本発明のポリペプチドとその塩の１種もしくは２種以上を組み合わせて有効成分とし、抗FIV剤として使用することができる。また、上記ポリペプチドに等張化剤、無機塩類、緩衝剤、可溶化剤、キレート剤、抗酸化剤、香料、防腐剤、ｐＨ調整剤等の従来公知の添加剤を、本発明の効果を損なわない範囲で組み合わせて、本発明の抗FIV剤とすることもできる。
【００５２】
さらに、本発明は、前記抗FIV剤を有効成分とし、従来公知の薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤等と共に、抗FIV活性を有する医薬組成物をも提供するものである。
【００５３】
前記医薬組成物の製剤形態としては各種のものが治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとしては錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、カプセル剤、徐放性ミクロカプセル剤等の固形製剤、注射剤（液剤、懸濁剤など）等の経口又は非経口投与用の液状製剤が挙げられる。
【００５４】
例えば、錠剤の形態に成形するに際しては、上記製剤担体として乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、リン酸カリウムなどの賦形剤；水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤；カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの崩壊剤；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリドなどの界面活性剤；白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油などの崩壊抑制剤；第４級アンモニウム塩基、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤；グリセリン、デンプンなどの保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸などの吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコールなどの滑沢剤等を使用できる。
【００５５】
更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、フィルムコーティング錠、二重錠乃至多層錠等とすることができる。
【００５６】
丸剤の形態に成形するに際しては、製剤担体として例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルクなどの賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン、エタノールなどの結合剤；ラミナラン、カンテンなどの崩壊剤などを使用できる。
【００５７】
カプセル剤は、常法に従い通常本発明の有効成分を上記で例示した各種の製剤担体と混合して硬質ゼラチンカプセル、軟質カプセルなどに充填して調整される。
【００５８】
本発明の医薬組成物を経口投与用の液状製剤として調製する場合は、慣用される不活性希釈剤、例えば水、を含む医薬的に許容される溶液、エマルジョン、懸濁液、シロップ、エリキシルなどを包含し、更に湿潤剤、乳剤、懸濁剤などの助剤を含ませることができ、これらは常法に従い調製される。
【００５９】
本発明の医薬組成物を非経口投与用の液状製剤として調製する場合、希釈剤として例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル及びオリーブ油などの植物油などを使用でき、また注入可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルなどを配合できる。これらには更に通常の溶解補助剤、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、分散剤などを添加することもできる。滅菌は、例えばバクテリア保留フィルターを通過させる濾過操作、殺菌剤の配合、照射処理及び加熱処理などにより実施できる。また、これらは使用直前に滅菌水や適当な滅菌可能媒体に溶解することのできる滅菌固体組成物形態に調製することもできる。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、液状製剤の形態で調製する場合、凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時水、生埋的食塩水などを含む緩衝液などで溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００６１】
また、本発明の医薬組成物には、通常の蛋白製剤などに使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、リン脂質などを適宜使用して調製され得る。
【００６２】
尚、本発明の医薬組成物中には、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などや他の医薬品などを含有させることもできる。
【００６３】
本発明の抗FIV剤又は抗FIV活性を有する医薬組成物の投与方法は、特に制限がなく、各種製剤形態、疾患の程度などに応じて決定される。例えば錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤及びカプセル剤は経口投与され、注射剤は単独で又はブドウ糖やアミノ酸などの通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じ単独で筋肉内、皮内、皮下もしくは腹腔内投与される。
【００６４】
上記医薬組成物の投与量は、特に限定されず、所望の治療効果、投与法、治療期間、患畜の年齢などに応じて適宜選択されるが、一般的には、通常成獣１匹に対して有効成分量が、1日体重1kg当り、1pg〜1g程度、好ましくは約1pg〜10mg程度、より好ましくは1pg〜1mg程度とするのがよく、該製剤は1日に1回又は数回に分けて投与することができる。
【００６５】
また、FIVの感染予防もしくは治療、又はネコAIDSの治療において、本発明のポリペプチド、抗FIV剤又は抗FIV剤を含有する医薬組成物は、例えば、現在臨床の現場で行われている多剤療法（HAART：Highly Active Anti-retroviral Therapy）等の公知の療法と併用することも可能である。
【００６６】
また、FIVはネコ科の哺乳類に特異的に感染することから、本発明のポリペプチド、抗FIV剤又は医薬組成物は、トラ、ライオン、ヒョウ、ジャガー、チーター、オオヤマネコ、ピューマ等のネコ以外のネコ科に属する動物に対しても有効に作用すると考えられる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００６８】
１．gp40アミノ酸配列由来ペプチド（FIV−C35（UK8））
［配列予測］
FIV（UK8株）のgp40タンパク質のアミノ酸配列情報（配列番号１）はNCBI （米国国立バイオテクノロジー情報センター）より入手した。LearnCoil-VMFを利用して配列予測を行い、HR2領域として可能性の高い配列（FIV-C35（UK8））を導き出した。
［ペプチド合成］
以下に示す方法に従って、HR2領域をカバーする35残基のペプチド（FIV-C35（UK8））の合成を行った。
【００６９】
NovaSyn TGR resin (Novabiochem社)上、通常のFmoc型固相合成法により保護ペプチド樹脂を構築した。N末端は無水酢酸 (10 eq.), pyridine  (10 eq.) を加えDMF溶媒中2 hr 攪拌することで、アセチル化を行った。この樹脂 (200 mg)を、m-cresol : ethanedithiol : thioanisole : H2O : TFA = 5 : 5 : 5 : 5 : 80 (v/v, 10 mL)で室温、2.5 hr処理した。樹脂を濾去した後、窒素気流で溶媒を留去し、氷冷下で残渣にエーテルを加えてペプチドを析出させた。ペプチドは遠心分離器で沈殿させエーテルを除去し、この洗浄操作を３回繰り返した。粗ペプチドを0.1 % TFA in H2O-MeCN (1 : 2 v/v, 5 mL)に溶かし、HPLCにて分取精製し、目的とするペプチドを得た。
【００７０】
FIV-C35の天然配列は以下の通りである（配列番号１）。
Ac-Leu-Gly-Glu-Trp-Tyr-Asn-Gln-Thr-Lys-Glu-Leu-Gln-Gln-Lys-Phe-Tyr-Glu-Ile-Ile-Met-Asn-Ile-Glu-Gln-Asn-Asn-Val-Gln-Val-Lys-Lys-Gly-Leu-Gln-Gln-NH2
イオンスプレーマススペクトル(IS-MS)(トリプルステージ四重極型質量分析装置APIII (Perkin-Elmer ScieX)を使用) によって得られた、FIV-C35の質量分析の結果を以下に示す。
[α]D (c 0.4: 0.1 N AcOH): 
計算値：4325.9 (MH+)、実測値：4327.0(MH+)。
【００７１】
２．改変体ポリペプチドの製造
FIV-C35（UK8）の天然配列に、X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンを適用したアミノ酸配列に基づいて、FIV-C35EK1（UK8）（配列番号３）、FIV-C35EK1（Shizuoka）（配列番号４）、FIV-C35EK1（Petaluma）（配列番号５）及びFIV- C35EK1（Sendai-1）（配列番号６）をデザインし、前記の通りペプチド合成を行った。
【００７２】
FIV-C35の天然配列に、X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンを適用して得た改変体のアミノ酸配列は、以下の通りである。なお、上記FIV-35と同様の方法により、各改変体について質量分析を行った。結果を、各アミノ酸配列の下に示す。
【００７３】
FIV-C35EK1（UK8）（配列番号３）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Val-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2
（IS-MS；、計算値：4422.1(MH+)、実測値：4422.0(MH+)。
【００７４】
FIV-C35EK1（Shizuoka）（配列番号４）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Leu-Lys-Lys-NH2
（IS-MS；、計算値：4380.0(MH+)、実測値：4380.0(MH+)）。
【００７５】
FIV-C35EK1（Petaluma）（配列番号５）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Asn-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2
（IS-MS；、計算値：4380.0(MH+)、実測値：4380.0(MH+)）。
【００７６】
FIV-C35EK1（Sendai-1）（配列番号６）
Ac-Leu-Glu-Glu-Trp-Tyr-Lys-Lys-Thr-Glu-Glu-Leu-Gln-Lys-Lys-Phe-Glu-Glu-Ile-Ile-Lys-Lys-Ile-Glu-Glu-Asn-Ser-Lys-Lys-Gly-Glu-Glu-Gly-Ile-Lys-Lys-NH2
（IS-MS；、計算値：4353.0(MH+)、実測値：4352.0(MH+)）。
【００７７】
３．培養細胞
FIV持続感染CRFK細胞(CRFK/FIV)は、培養液として、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、0.1mgストレプトマイシン/mL、100IUペニシリン/mL及び2mM L-グルタミンを添加したDMEM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)を用い、37℃、5%CO2の条件下で培養した。
【００７８】
Hela細胞は、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FCS)、0.1mgストレプトマイシン/mL、100IUペニシリン/mL及び2mM L-グルタミンを添加したDMEM(high-glucose)(Wako, Osaka, Japan)を用いて培養した。
【００７９】
下記4.(a)に記載される評価においては、CRFK/FIVを、CXCR4発現Hela細胞と共培養したものを用いた。
【００８０】
FIVに感受性のある、ネコＴ−リンパ球細胞株MYA-1は、10%(v/v)FCS、0.1mgストレプトマイシン/mL、100IUペニシリン/mL、2mM L-グルタミン、0.05mM 2-メルカプトエタノール及び100UヒトリコンビナントIL-2/mL(Pharma Biotechnologie, Hannover, Germany)を添加したRPMI-1640培地(Sigma-Aldrich)で培養した。このMYA-1細胞を、下記4.(b)に記載される評価において使用した。
【００８１】
４．抗FIV活性の評価
(a)シンシチウム形成
(1)Hela細胞を、48ウェルプレートに2.2×104細胞の濃度(0.22mL培地／ウェル)で播種し、37℃にて一晩培養した。
(2)CRFK/FIV細胞の表面に発現しているFIV gp40と抗FIV剤（FIV-C35又はFIV-C35EK1(UK8)）を結合させるため、FIV-C35又はFIV-C35EK1(UK8)(2.5μM)と共にCRFK/FIV細胞を37℃で1時間、インキュベートした。
(3)Hela細胞の培養培地を除去した後、(2)で前処理をしたCRFK/FIV細胞を、12000細胞／ウェル(0.33mL培地／ウェル)の濃度で添加した。24時間のインキュベーションの後、細胞をメタノールで固定し、ライト・ギムザ染色を行った。結果を、図３に示す。
【００８２】
図３に示すように、FIV-C35を添加しない場合は、多数のシンシチウムが形成されたのに対し、FIV-C35を添加した場合はシンシチウム形成が79%阻害された。また、FIV-C35EK1（UK8）を添加した場合では、85%というさらに高い阻害率が確認された。
【００８３】
(b)RT活性
(1)Sendai-1 FIV又はShizuoka FIVストックソリューション(逆転者酵素(RT)活性:5000cpm/mL)を、37℃で3時間、抗FIV剤（FIV-C35又はFIV-C35EK1(UK8) (2.5μM)）で前処理した。
(2)MYA-1細胞(2×106細胞/mL)と、(1)で前処理されたSendai-1 FIV又はShizuoka FIVストックソリューション (最終濃度でのRT活性:5000cpm/mL)を、37℃で3時間インキュベーションし、FIVをMYA-1細胞に吸着（感染）させた。
(3)吸着（感染）後、MYA-1細胞をPBSで2度洗浄し、最終濃度5×105細胞/mLになるように懸濁した。細胞を、3日毎に継代し、5×105細胞/mLの濃度になるように希釈した。FIV吸着（感染）の6日後、無細胞の上清を採取した。
(4)無細胞培養上清(0.01mL)を、0.05mLのRTバッファー(5 μgポリ(A)(Sigma-Aldrich)/mL;0.16 μgオリゴ(dT) (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)/mL;0.1%ノニデットP-40;60mM Tris-HCl(pH7.8);75mM KCl;5mM MgCl2;1mM EDTA;1M DTT及び370kBqの[32P]-dTTP(Amersham Parmacia Biotech, Buckinghamshire, IN)/mLを含む)に添加した。37℃で3時間インキュベーションした後、この混合液0.01mLを、DAEA濾紙(Wallac Oy, Truku, Finland)に滴下し、2×SSC(0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム)で4回洗浄し、99%エタノールで1回洗浄した。その後、この濾紙を乾燥し、濾紙上の放射能活性をオートラジオグラフィーで計測した。
【００８４】
その結果、FIV-C35及びFIV-C35EK1（UK8）で処理したFIVのRT活性は低く、優れたFIV増殖抑制効果を示した（図４）。
【００８５】
さらに、Sendai-1 FIV（subtype A）を、FIV-C35EK1(UK8) 2.5μM、250nM、25nM又は2.5nMの濃度で処理し、前記と同様にRT活性を評価したところ、濃度依存的なFIV増殖抑制の傾向を示した（図５）。 
【００８６】
また、異なるFIV株(Shizuoka株 subtype D)を用いて、同様にRT活性を評価したところ、FIV株の種類が異なっても優れたFIV増殖抑制効果を確認した（図６）。
【００８７】
本実施例において、統計学的解析には、JMP4.0.5プログラム(SAS institute inc, Cary, NC, USA)を用いた。シンシチウム及び放射能活性の比における有意な差の検出には、One-Way analysis of variance(ANOVA)を使用した。Student’s t testで有意差があった場合、Turkey’s Honeysly Significant Difference testを行い、どの組み合わせが有意差を示しているのかを決定した。また、統計学的有意差は、P<0.05として規定した。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンの概略図を示す。
【図２】Aの位置にN末端がくるようにX-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンを適用した場合の概略図を示す。図中黒丸はX：HR1領域と相互作用するHR2の天然配列を表す；白丸はXA：親水性アミノ酸且つ酸性アミノ酸を表す；四角は、XB：親水性アミノ酸且つ塩基性アミノ酸を表す。
【図３】FIV介在性のシンシチウム形成に対するFIV-C35及びFIV-C35EK1（UK8）の効果を示す。
【図４】MYA-1細胞におけるFIV-C35（図中C35）及びFIV-C35EK1（UK8）（図中EK1）のFIV（Sendai-1株）増殖抑制効果を示す。
【図５】MYA-1細胞におけるFIV-C35EK（UK8）の濃度依存的なFIV（Sendai-1株）増殖抑制効果を示す。
【図６】MYA-1細胞におけるFIV-C35（図中C35）又はFIV-C35EK1（UK8）（図中EK1）のFIV（Shizuoka株）増殖抑制効果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１は、ネコ免疫不全ウイルス（UK8株）のHR2領域から得られた抗FIV活性を有するアミノ酸配列である。
配列番号２は、X-XA-XA-X-X-XB-XBスキャンによって得られる改変体アミノ酸配列を表す。
配列番号３は、FIV-C35EK1(UK8)のアミノ酸配列を表す。
配列番号４は、FIV-C35EK1(Shizuoka)のアミノ酸配列を表す。
配列番号５は、FIV-C35EK1(Petaluma)のアミノ酸配列を表す。
配列番号６は、FIV-C35EK1(Sendai-1)のアミノ酸配列を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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