(57)【要約】【課題】優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用を有する天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を提供する。【解決手段】オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を提供する。さらに、オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を含む組成物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項５】
オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を含む組成物。
【請求項６】
外用組成物または経口用組成物である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
老化防止改善用皮膚外用剤である請求項５または６記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤に関し、さらに詳しくはオオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞の機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、細胞賦活剤としてポンカンのエッセンス（特許文献１）、美白剤として白鶴霊芝の水および／又は有機溶媒抽出物（特許文献２）、抗酸化剤としてサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献３）が知られている。
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献３】特開平１０−１８２４１３号公報参照
【０００４】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、抗炎症作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用を有する天然由来成分の開発、ならびに、それらの効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤等を提供することを課題とする。
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来その効果が知られていなかったオオハマボウに優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、または抗炎症剤に関する。
別の本発明は、オオハマボウ（Glias nueberthii）またはその抽出物を含む組成物に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、オオハマボウまたはその抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を提供することができる。
これらの抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、および抗炎症剤を化粧料、外用医薬品等の皮膚外用剤（または外用組成物）や食品等の経口用組成物に配合することにより、シワ、タルミ、皮膚の弾力低下、シミ、くすみといった種々の皮膚症状の発現防止や改善に優れた効果を発揮する、様々な組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
オオハマボウ（Glias nueberthii）（学名Hibiscus tiliaceus）は、アオイ目アオイ科フヨウ属に属する常緑高木であり、琉球列島以南の亜熱帯〜熱帯地域に分布する。
オオハマボウまたはその抽出物には、分析しきれないほどの非常に多くの種類の成分が含まれており、これらが総合的に作用して本発明の効果が得られるものと推測される。
【０００９】
このオオハマボウを使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、根、樹皮、葉、花弁などの任意の部位を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
それらはそのまま粉砕して使用することもできるが、それらの部位からの抽出物を用いることが好ましい。
【００１０】
抽出には、オオハマボウのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、葉や樹皮などを用いるとよい。その際、複数の部位を用いて抽出物を得るようにしてもよい。また、異なる溶媒を用いて抽出された抽出物を２種以上混合して用いてもよい。
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１１】
抽出方法としては、室温、冷却または加温した状態で、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬させて抽出する方法、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、生の植物から圧搾して抽出物を得る圧搾法等が例示できる。これらの任意の方法を単独で、または２種以上を組み合わせて、抽出を行うことができる。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。
【００１２】
抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
抽出の際の植物と溶媒との比率は特に限定されるものではないが、植物１に対し、溶媒０．５〜１０００重量倍が好ましく、特に抽出操作、効率の点で０．５〜１００重量倍が好ましい。
【００１３】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１４】
オオハマボウの上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間放置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。あるいは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。オオハマボウの上記抽出物やその処理物および分画物は、各処理および分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１５】
オオハマボウまたはその抽出物は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、および抗炎症作用を有し、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤として好ましく利用することができる。
これらの各剤は、オオハマボウまたはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他の成分の配合の有無等については、何ら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤、分散剤等）を任意に含むことができる。
【００１６】
オオハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れた細胞賦活効果、コラーゲン産生作用、およびアロマターゼ活性促進作用を有し、老化症状の防止改善に優れた効果を発揮する。アロマターゼは、エストロゲンを産生する際に働く酵素であり、アロマターゼ活性促進作用によりエストロゲンの産生が促進されると、女性ホルモンによる美肌効果や抗老化効果が期待できる。
【００１７】
オオハマボウまたはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたメラニン産生抑制効果およびチロシナーゼ活性阻害効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。
【００１８】
オオハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたフリーラジカル消去効果、およびスーパーオキサイドアニオンの消去効果を有し、皮膚の光老化等を防止して、優れた抗酸化作用を発揮する。
【００１９】
オオハマボウまたはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害効果、およびホスホリパーゼＡ２活性阻害効果を有し、皮膚の炎症を抑え優れた抗炎症作用を発揮する。
【００２０】
これらの抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、または抗炎症剤は、皮膚に外用するだけではなく、毛髪等への利用や経口摂取も可能であり、外用組成物、経口用組成物などの各種組成物に応用することが可能である。
ここで、外用組成物とは、化粧料、皮膚外用剤、医薬部外品、外用医薬品等のいずれかのカテゴリーに限定されることはなく、皮膚または毛髪に外用される全ての組成物を意味している。経口用組成物についても、医薬品、食品、飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２１】
外用組成物の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系やカラミンローション等の分散系、クリームや乳液などの乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤、パップ剤などの種々の剤型で提供することもできる。
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料、メーキャップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼布剤、パップ剤、等の様々な形態の医薬部外品や外用医薬品などが例示できる。
【００２２】
経口用組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。
具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００２３】
たとえば、オオハマボウまたはその抽出物を、化粧品、外用医薬品、医薬部外品等を含む皮膚外用剤に配合することにより、シワ、タルミ、皮膚の弾力低下、シミ、くすみといった種々の皮膚症状の防止・改善に優れた効果を発揮する外用組成物を得ることができ、保湿用皮膚外用剤あるいは美白用皮膚外用剤として用いることができる。特に、オオハマボウまたはその抽出物を含む老化防止改善用皮膚外用剤として使用することが好ましい。
さらに、オオハマボウまたはその抽出物は、美白等の美容、健康維持、又は栄養補給を目的とするような飲食品や健康食品（サプリメント）、機能性食品等にも用いることができる。
【００２４】
外用組成物または経口用組成物等の組成物には、オオハマボウまたはその抽出物の他に、その用途および必要に応じて、通常皮膚化粧料、毛髪用化粧料、医薬部外品、医薬品等の製剤に使用される任意の成分が含まれる。そのような成分としては、水、油剤（油性成分）、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防黴剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、アルコール類等が挙げられる。また、本発明の効果を損なわない範囲において、他の抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤、あるいはオオハマボウ以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。
飲食品の場合も、食品に用いられる各種成分との組合せにおいては、特に限定されるものはない。
【００２５】
外用組成物中または経口用組成物等の組成物中のオオハマボウまたはその抽出物の配合量は、組成物の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で０．０００１〜１０質量％が好ましく、より好ましくは０．００１〜５質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【実施例】
【００２６】
以下に、オオハマボウ抽出物の調製例、各作用を評価するための試験、皮膚外用剤等としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらによりなんら限定されるものではない。
【００２７】
＜抽出方法１：エタノール抽出物＞
オオハマボウの葉または樹皮を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０質量％エタノールを加え、室温で撹拌しながら２時間抽出した。得られた抽出液を濾過して不溶物を取り除き、減圧濃縮後、凍結乾燥を行って、抽出物を得た。
【００２８】
＜抽出方法２：熱水抽出物＞
オオハマボウの葉または樹皮を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加え、オートクレーブにより２０分間、１２０℃に加温して抽出した。得られた抽出液から、温度の高い状態を保ちながら吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って、抽出物を得た。
【００２９】
＜ヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のように真皮線維芽細胞賦活作用を評価した。
倉敷紡績（株）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表１に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ試薬）を４００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換し、約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値により表１に示す。
【００３０】
【表１】
2008063266.tif 000002
【００３１】
表１より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な真皮線維皮芽細胞賦活効果が認められた。
【００３２】
＜ヒト表皮細胞賦活作用の評価＞
上記抽出方法２で得られたオオハマボウ葉熱水抽出物を用いて、以下のように表皮細胞賦活作用を評価した。
ヒト表皮未全角化細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表２に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。上清を除いた後、ＭＴＴ試薬を１００μｇ／ｍｌ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにより抽出し、マイクロプレートリーダーで５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００としたときの相対値により表２に示す。
【００３３】
【表２】
2008063266.tif 000003
【００３４】
表２より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な表皮細胞賦活効果が認められた。
【００３５】
＜ヒト真皮繊維芽細胞コラーゲン産生作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のように真皮線維芽細胞コラーゲン産生作用を評価した。
正常ヒト真皮繊維芽細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表３に示す試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩコラーゲン定量にはＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）および過酸化水素を添加して反応させた後、マイクロプレートリーダーにより４０５ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表３に示す。
【００３６】
【表３】
2008063266.tif 000004
【００３７】
表３より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な真皮繊維芽細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００３８】
＜ヒト表皮細胞コラーゲン産生作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のように表皮細胞コラーゲン産生作用を評価した。
ヒト表皮未全角化細胞を、１ウェルあたり２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表４に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩＶコラーゲン定量には、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）およびビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、アビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼを添加し、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーにより６５０ｎｍの吸光度を測定した。
ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのタイプＩＶコラーゲン産生量を求めた。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量あたりのタイプＩＶコラーゲン産生量を１００としたときの相対値により表４に示す。
【００３９】
【表４】
2008063266.tif 000005
【００４０】
表４より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、有意な表皮細胞コラーゲン産生効果が認められた。
【００４１】
＜アロマターゼ活性促進作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のようにアロマターゼ活性促進作用を評価した。
表５に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液４μｌに、ＮＡＤＰ＋、ＭｇＣｌ２、グルコース−６−ホスフェート、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、およびコントロール昆虫細胞膜タンパクの混合溶液（ＣＰＹ１９／ＭＦＣ  ハイスループット・インヒビター・スクリーニングキット（High Throughput Inhibitor Screening Kit）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）９６μｌを添加し、１０分間３７℃に加温した。１５ｎＭ  ＣＰＹ１９（アロマターゼ）、５０μＭ  ７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリン（基質）溶液１００μｌを添加し、３０分間３７℃に加温した。１００ｍＭ トリス塩基７５μｌを添加し、反応を停止させた。
励起波長４０９ｎｍ、発光波長５３０ｎｍにおいて蛍光測定を行った。７−メトキシ−４−トリフルオロメチルクマリンはＣＹＰ１９により分解され、７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリンが生成して蛍光を生じるため、蛍光測定によりアロマターゼ活性促進能の定量を行った。
得られた結果を、試料無添加のコントロールにおけるアロマターゼ活性促進作用を１００としたときの相対値により、表５に示す。
【００４２】
【表５】
2008063266.tif 000006
【００４３】
表５より明らかなように、オオハマボウ抽出物には、有意なアロマターゼ活性促進作用が認められた。
【００４４】
＜ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のように表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。
正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェルあたり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、倉敷紡績（株）製Ｍｅｄｉｕｍ １５４Ｓを用いた。２４時間培養後、Ｍｅｄｉｕｍ  １５４Ｓにより表６に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μｌに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μｌを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μｌを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、各測定値を次式に導入して、生成されたドーパメラニン量を求めた。
ドーパメラニン生成量＝
｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔによりタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのメラニン生成量を求めた。試料無添加の場合をコントロールとした。
結果を表６に示す。
【００４５】
【表６】
2008063266.tif 000007
【００４６】
表６より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、メラニン産生量の低下が認められ、優れたチロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
【００４７】
＜Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のようにメラニン産生抑制作用を評価した。
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュあたり１．８×１０４個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地により表７に示す各試料濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理により細胞を剥離し、１．５ｍｌマイクロチューブに移して遠心操作して、細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物の色を、下記の判定基準に基づいて、その黒化状況を目視判定した。評価は５段階評価とし、ネガティブコントロール（判定５）に試料無添加の５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロール（判定１）に乳酸ナトリウムを５０ｍＭ含有する５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
また、メラニン産生量を評価するために、沈殿物に細胞溶解剤  Ｓｏｌｖａｂｌｅ（株式会社パーキンエルマージャパン）を加えて煮沸し、室温に戻して分光光度計（（株）日立ハイテクノロジーズ製分光光度計Ｕ−３０１０）により５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
得られた結果を表７に示す。
【００４８】
＜目視評価の判定基準＞
判  定      沈殿物の色
１      ポジティブコントロールと同程度（ほぼ白）
２      ポジティブコントロールより僅かに黒化する（うすい褐色）
３      ポジティブコントロールとネガティブコントロールの中間（褐色）
４      ネガティブコントロールと比べやや黒化が抑制されている（黒褐色）
５      ネガティブコントロールと同程度（ほぼ黒）
【００４９】
【表７】
2008063266.tif 000008
【００５０】
表７より明らかなように、オオハマボウ抽出物を添加した培地では、有意なメラニン産生抑制効果が認められた。
【００５１】
＜ＤＰＰＨラジカル消去による抗酸化作用の評価＞
上記抽出方法２で得られたオオハマボウ樹皮熱水抽出物を用いて、以下のようにＤＰＰＨラジカル消去による抗酸化作用を評価した。
５０質量％エタノールを用いて、表８に示す各試料濃度となるように試料溶液を調整し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μｌずつ添加し、よく混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。最後に、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。
試料を添加しなかった場合の吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を次式より求めた。
ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
結果を表８に示す。
【００５２】
【表８】
2008063266.tif 000009
【００５３】
表８より明らかなように、オオハマボウ抽出物には、優れたＤＰＰＨラジカル消去効果が認められた。
【００５４】
＜ＳＯＤ様活性評価（スーパーオキサイドアニオン消去能の評価）＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のようにＳＯＤ様活性を評価した。
０．２５ｍＭ  ＷＳＴ−１および１ｍＭ  Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μｌに、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液により表９に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液２５μｌを添加した。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μｌ（０．００７５ Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃、１５分間反応させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。サンプル溶液に代えてＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液のみを添加した場合の吸光度を（Ａ）、サンプル溶液を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式に定義される。
消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
得られた結果を表９に示す。
【００５５】
【表９】
2008063266.tif 000010
【００５６】
表９より明らかなように、オオハマボウ抽出物には、優れたスーパーオキサイドアニオン消去効果が認められた。
【００５７】
＜ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害作用の評価）＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ樹皮エタノール抽出物を用いて、以下のようにホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）阻害作用を評価した。
最終濃度６０ｎｇ／ｍｌとなるよう調整したホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）と表１０に示す濃度に調製したサンプル、１０ｍＭとなるように調整したＤＴＮＢ（５，５−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を混合し、室温で１０分間静置した。さらに基質として１．６６ｍＭのジヘプタノイルチオ−ＰＣ（Ｄｉｈｅｐｔａｎｏｙｌ  Ｔｈｉｏ−ＰＣ）を添加し、室温で４５分間反応させた後、４１４ｎｍの吸光度を測定した。また、ＰＬＡ２溶液にかえてバッファーのみを添加した場合の吸光度を測り、両測定値の差を求めた。サンプル無添加のコントロールの値を（Ａ）、サンプル添加時の値を（Ｂ）としたとき、ＰＬＡ２酵素阻害作用は次式に定義される。
消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
得られた結果を表１０に示す。
【００５８】
【表１０】
2008063266.tif 000011
【００５９】
表１０より明らかなように、オオハマボウ抽出物には、優れたＰＬＡ２酵素阻害作用が認められた。
【００６０】
＜ヒアルロニダーゼ阻害作用の評価）＞
上記抽出方法１で得られたオオハマボウ葉エタノール抽出物を用いて、以下のようにヒアルロニダーゼ阻害作用を評価した。
市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍｌになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ ｕｎｉｔ／ｍｌとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。酵素溶液は用時調製とした。
緩衝液で表１１に示す各試料濃度に調製したサンプル溶液０．１ｍｌ、および酵素溶液０．０３ｍｌを試験管に入れ、３７℃で２０分間反応させた。次に、活性化剤を０．０６ｍｌ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに、基質溶液を０．１５ｍｌ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４ＮのＮａＯＨ水溶液０．０６ｍｌを加えて反応を停止させた後、すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍｌ添加し、３分間煮沸した後、さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド）溶液を２．０ｍｌ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプル無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると、分解産物であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。ヒアルロニダーゼ阻害作用は、次式に定義される。
阻害率（％）
＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
結果を表１１に示す。
【００６１】
【表１１】
2008063266.tif 000012
【００６２】
表１１より明らかなように、オオハマボウ抽出物には、優れたヒアルロニダーゼ活性の阻害作用が認められた。
【００６３】
続いて、上記各調製方法で得られたオオハマボウ抽出物を配合した皮膚外用剤の処方例を示す。
［実施例１］乳液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）
１．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（10）精製水                                        １００とする残部
（11）アルギニン（１質量％水溶液）                    ２０．０
（12）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ３．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００６４】
［実施例２］化粧水
（１）エタノール                                      １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．３
（３）香料                                              ０．１
（４）精製水                                        １００とする残部
（５）クエン酸                                          ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                ０．１
（７）グリセリン                                        １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
（９）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              ５．０
製法：（１）に（２）及び（３）を溶解する。溶解後、（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００６５】
［実施例３］クリーム
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）セタノール                                        ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（７）グリセリン                                      １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）                  １５．０
（10）精製水                                        １００とする残部
（11）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １５．０
（12）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、（11）を加え、冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００６６】
［実施例４］美容液
（１）精製水                                        １００とする残部(質量％)
（２）グリセリン                                      １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム(１質量％水溶液)            １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル                      １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル            ３．０
（８）N-ラウロイル-L-グルタミン酸ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）
２．０
（９）硬化パーム油                                      ２．０
（10）スクワラン（オリーブ由来）                        １．０
（11）ベヘニルアルコール                                ０．７５
（12）ミツロウ                                          １．０
（13）ホホバ油                                          １．０
（14）１、３−ブチレングリコール                      １０．０
（15）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）                ２．０
（16）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              ５．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（14）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、５０℃にて（15）を加える。さらに４０℃まで冷却し、（16）を加え、均一に混合する。
【００６７】
［実施例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー                          ０．５（質量％）
（２）精製水                                        １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）              ０．５
（４）エタノール                                      １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（６）香料                                              ０．１
（７）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              ３．０
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解させた（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００６８】
［実施例６］クレンジング料
（１）スクワラン                                      ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル    １５．０
（３）精製水                                        １００とする残部
（４）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、樹皮）            ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）と（４）を順次加え、均一に混合する。
【００６９】
［実施例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸                                    １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸                                    １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（４）グリセリン                                      ２５．０
（５）水酸化ナトリウム                                  ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン                １．０
（７）精製水                                        １００とする残部
（８）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、樹皮）            ５．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合撹拌する。冷却を開始し、４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００７０】
［実施例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン                                      １０．２(質量％)
（２）セタノール                                        ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル      ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル                  １．０
（５）プロピレングリコール                            １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（７）精製水                                        １００とする残部
（８）酸化チタン                                        １．０
（９）ベンガラ                                          ０．１
（10）黄酸化鉄                                          ０．４
（11）香料                                              ０．１
（12）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（10）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００７１】
［実施例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン                              ２．０(質量％)
（２）スクワラン                                        ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      ５．０
（４）セタノール                                        １．０
（５）ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）ソルビタンモノステアリン酸エステル
１．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．７
（７）１、３−ブチレングリコール                        ８．０
（８）キサンタンガム                                    ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）精製水                                        １００とする残部
（11）酸化チタン                                        ９．０
（12）タルク                                            ７．４
（13）ベンガラ                                          ０．５
（14）黄酸化鉄                                          １．１
（15）黒酸化鉄                                          ０．１
（16）香料                                              ０．１
（17）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ４．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（10）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（11）〜（15）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（16）と（17）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００７２】
［実施例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン                                  ３４．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）ワセリン                                          ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル                    ５．０
（５）塩化ナトリウム                                    １．３
（６）塩化カリウム                                      ０．１
（７）プロピレングリコール                              ３．０
（８）１、３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（10）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ３．０
（11）精製水                                        １００とする残部
（12）香料                                              ０．１
製法：（５）と（６）を（11）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に撹拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに、（７）〜（10）を（11）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを撹拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（12）を加え、均一に混合する。
【００７３】
［実施例１１］パック
（１）精製水                                        １００とする残部(質量％)
（２）ポリビニルアルコール                            １２．０
（３）エタノール                                      １７．０
（４）グリセリン                                        ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）      ２．０
（６）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              ５．０
（７）香料                                              ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却を開始する。４０℃まで冷却し、（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【００７４】
［実施例１２］入浴剤
（１）香料                                              ０．３(質量％)
（２）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、樹皮）            ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム                              ５０．０
（４）硫酸ナトリウム                                  ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【００７５】
［実施例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸                                      ３．０(質量％)
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）セチルアルコール                                  ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン                        ２．０
（５）メチルポリシロキサン                              ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）メチルポリシロキサン共重合体
１．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（８）１、３−ブチレングリコール                        ７．５
（９）アルギニン                                        ０．７
（10）精製水                                        １００とする残部
（11）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、樹皮）            ４．０
（12）香料                                              ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（10）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。乳化終了後に冷却を開始し、４０℃にて（11）と（12）の成分を加え、均一に混合する。
【００７６】
［実施例１４］ヘアートニック
（１）エタノール                                      ５０．０(質量％)
（２）精製水                                        １００とする残部
（３）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ３．０
（４）香料                                              ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【００７７】
［実施例１５］錠剤
（１）コーンスターチ                                  ４４．０(質量％)
（２）結晶セルロース                                  ４０．０
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム              ５．０
（４）無水ケイ酸                                        ０．５
（５）ステアリン酸マグネシウム                          ０．５
（６）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）            １０．０
製法：（１）〜（６）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して、１錠２００ｍｇの錠剤を得る。
【００７８】
［実施例１６］散剤
（１）ケイ酸アルミン酸マグネシウム                    ９５．３(質量％)
（２）カルボキシメチルセルロースカルシウム              ４．５
（３）オオハマボウ抽出物（抽出方法１、葉）              ０．２
製法：（１）〜（３）の粉体を混合後、粉砕機にて粉砕し、均一に分散する。
【００７９】
［実施例１７］キャンデー
（１）白糖                                             ６０．０(質量％)
（２）水飴                                             ３９．５
（３）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）               ０．４
（４）香料                                               ０．１
製法：（１）と（２）を加熱混合・均一化した後冷却し、７０℃で成分（３）と（４）を添加し、混合均一化した後成型する。
【００８０】
［実施例１８］ドリンク剤
（１）アミノエチルスルホン酸                        １０００ｍｇ
（２）硝酸チアミン                                      １０ｍｇ
（３）リン酸リボフラビンナトリウム                        ５ｍｇ
（４）塩酸ピリドキシン                                  １０ｍｇ
（５）無水カフェイン                                    ５０ｍｇ
（６）クエン酸                                        ２５０ｍｇ
（７）Ｄ−ソルビトール液                                  ８ｇ
（８）オオハマボウ抽出物（抽出方法２、葉）              １０ｍｇ
（９）香料                                                微量
（10）精製水                            全体を１００ｍＬとする量
製法：（１）〜（９）を順次（10）に添加し、均質化する。