(57)【要約】【課題】生産性に優れた細胞電気生理センサの構造を実現し、漏れ電流が少ない状態で高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】第一の貫通孔５を有するウエル１と、第二の貫通孔６を有した保持プレート２と、液体の流入口１６と流出口１７を両端に備えた空洞８を有した流路プレート３を積層して当接し、第二の貫通孔６の内部にセンサチップ４を当接した細胞電気生理センサであって、保持プレート２を親水性を有するガラスとし、センサチップ４をシリコンとし、ガラス溶着によって保持プレート２とセンサチップ４を接合した構成とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、前記保持プレートを親水性を有するガラスとし、センサチップをシリコンとし、前記センサチップと保持プレート２をガラス溶着によって接合した細胞電気生理センサ。
【請求項２】
ガラスを、二酸化ケイ素を含むガラスとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
ガラスの軟化点を５００〜９００℃とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
ガラスを、ホウケイ酸ガラス、アルミノケイ酸塩ガラス、またはホウケイ酸鉛ガラスとした請求項２に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
ガラスを、紫外線を透過するガラスとした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
ガラスと水との接触角を１０度以下とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
ウエル、および／または流路プレートを環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが共重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレンからなる材料から選択される請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項８】
ウエルとガラス、および／または流路プレートとガラスの接合を紫外線硬化型樹脂にて接合した請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項９】
第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、前記保持プレートを親水性に優れたガラスとし、センサチップをシリコンとし、ガラス溶着によって前記センサチップと保持プレート２を接合した細胞電気生理センサの製造方法であって、ダイアフラムに貫通孔を設けたセンサチップを作製する工程と、このセンサチップの表面を水で濡らす工程と、第二の貫通孔を形成したガラスからなる保持プレートを作製する工程と、前記センサチップを第二の貫通孔の内部へ挿入してセルフアライメントする工程と、熱処理によってセンサチップと保持プレートをガラス溶着によって接合する工程を少なくとも含む細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１０】
接合する工程において、熱処理温度をガラスの軟化点以上とした請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１１】
接合する工程において、セルフアライメントしたセンサチップが第二の貫通孔の内部で移動しない状態で静置して熱処理を行う請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１２】
センサチップの外壁面と第二の貫通孔の内壁面との隙間を５０μｍ以下とした請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【請求項１３】
前記センサチップを第二の貫通孔の内部へ挿入し、セルフアライメントする工程において、水との接触角が１０度以下のガラスを用いる請求項９に記載の細胞電気生理センサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要とせず、減圧を行うだけで自動に細胞を固定・測定を行うことができ、自動化システムとして適している。
【０００５】
例えば、平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、電極で電位依存性のイオンチャンネル活性を測定する技術を開示している（特許文献１参照）。
【０００６】
また、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置について開示している（特許文献２参照）。
【特許文献１】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献２】特表２００３−５２７５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、前記従来の技術においては、複数の細胞の電気生理現象を一括して測定することは可能であるが、測定対象の細胞数を増加させていくとセンサチップがより多数個となり構造が複雑になるという課題があった。
【０００８】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、測定対象の細胞数が増えた場合であっても、生産性に優れた効率的な細胞電気生理センサの構造を実現し、漏れ電流が少ない状態で高精度に測定することができる細胞電気生理センサおよびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を有するウエルと、このウエルの下方に当接した第二の貫通孔を有した保持プレートと、この保持プレートの下方に液体の流入口と流出口を両端に備えた空洞を有した流路プレートを当接し、前記第二の貫通孔の内部に第三の貫通孔を備えたダイアフラムを有したセンサチップを当接した細胞電気生理センサであって、前記保持プレートを親水性を有するガラスとし、センサチップをシリコンとし、前記センサチップと保持プレートをガラス溶着によって接合した構成とするものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造方法は、センサチップを保持プレートに挿入する際、セルフアライメント性に優れるとともに、ガラス溶着にて接合することから、隙間からの液漏れによる漏れ電流を減少させることができることによって、高精度に測定することができるとともに生産性に優れた細胞電気生理センサおよびその製造方法を実現するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
【００１２】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は図１の要部拡大断面図である。また、図３はセンサチップをガラス溶着によって固着保持する方法を説明するための上面図であり、図４はその断面図である。
【００１３】
図１および図２において、１は樹脂よりなるウエルであり、このウエル１に細胞外液１８を貯留しておくための第一の貫通孔５を形成している。この第一の貫通孔５は断面形状をテーパー状に形成しておくことによって、電解液などの液体または細胞などを投入するときに効率が良い。
【００１４】
また、前記ウエル１の下方には第二の貫通孔６を設けた親水性を有するガラスよりなる保持プレート２を当接しており、この保持プレート２の第二の貫通孔６の内部には、少なくとも一つの第三の貫通孔７を有したダイアフラム９を備えたシリコンよりなるセンサチップ４がセットされている。このセンサチップ４はシリコンウエハをエッチング加工することによって形成することができる。例えば、シリコンウエハをエッチング加工することによってキャビティ１０を形成し、その後第三の貫通孔７を形成することによって、ダイアフラム９の厚みを１０〜１００μｍ、第三の貫通孔７の開口径を１〜３μｍφの寸法形状で半導体プロセスなどの微細加工技術を用いて一体的に加工することによってセンサチップ４を形成することができる。そして、この第三の貫通孔７の開口径は細胞２０の大きさによって適宜選択することができる。
【００１５】
なお、キャビティ１０または第三の貫通孔７を形成する順序はどちらが先であっても構わない。
【００１６】
このように、シリコンをセンサチップ４の構成材料とすることによって、半導体プロセスを用いて効率よく高精度に作製することができるとともに、その生産設備も入手が容易である。
【００１７】
さらに、前記保持プレート２の下方には、その両端に液体を流出入させるための空洞８を有した流路プレート３を当接して細胞電気生理センサを構成しており、第三の貫通孔７の上面に細胞２０を密着保持し、この細胞２０の電気生理現象を測定することができるようになっている。そして、前記空洞８には流出口１７から吸引ポンプなどを用いて吸引することによって細胞内液１９を充填することができる。
【００１８】
また、ウエル１と流路プレート３は樹脂で構成しておくと生産性の観点から都合が良く、特に熱可塑性樹脂を用いることが好ましい。これにより、これらの材料は射出成型などの手段を用いることによって生産性良く、高均質な成形体を得ることができ、それぞれの接合も効率良くできる。さらに好ましくは、これらの熱可塑性樹脂はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、オレフィンポリマー、ポリメタクリル酸メチルアセテート（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせを用いることである。これらの材料は、紫外線硬化型の接着剤を用いることによって容易にガラスからなる保持プレート２と接合することができる。さらに好ましくは、これら熱可塑性樹脂が環状オレフィンポリマー、線状オレフィンポリマー、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマー、またはポリエチレン（ＰＥ）からなる熱可塑性樹脂が作業性、製造コスト、材料の入手性の観点から好ましい。特に、環状オレフィンコポリマーは透明性、アルカリ・酸などの無機系薬剤に対する耐性が強く、本発明の製造方法もしくは使用環境に適している。またこれらの材料は紫外線を透過させることができるため、紫外線硬化型の接着剤を用いる時に効果を発揮する。
【００１９】
そして、この第三の貫通孔７の直径は５μｍ以下が望ましく、細胞２０を保持するために最適な大きさの貫通孔となっている。このように、センサチップ４と、保持プレート２を別々に作製しておいて、この保持プレート２の第二の貫通孔６にセンサチップ４をはめ込むことによって効率よく細胞電気生理センサを作製することができる。特に、不良のセンサチップ４があった場合においても、センサチップ４の交換を容易に行うことができる。
【００２０】
これに対して、例えば保持プレート２をシリコン基板から一体的に作製した場合、コストもかかり、歩留まりも悪くなるとともに、一部のセンサチップに不良が生じた場合であっても、リペア性も有しない構成となる。
【００２１】
一方、保持プレート２を樹脂で形成し、シリコンで形成したセンサチップ４を直接第二の貫通孔６の内部へ挿入固着した場合、前記センサチップ４は微小形状であることからその取り扱いが難しく、保持プレート２に形成した微小形状の第二の貫通孔６の内部へ挿入する際、乾燥状態で行うと静電気などの影響でセンサチップ４をうまく所定の位置へ挿入して固定することが難しかった。
【００２２】
この課題を克服するために、センサチップ４を純水などに浸漬しておいて、その状態で第二の貫通孔６へ挿入するとセンサチップ４の水の表面張力の作用によるセルフアライメント性を利用することによって、非常に効率良く作業ができることが分かった。そのため、微細加工によって作製したセンサチップ４は酸、アルカリなどの化学処理、あるいはプラズマ、ＵＶなどの物理処理による清浄化を行った後、親水性を保持しておくために純水中へ浸漬しておくことが好ましい。
【００２３】
そして、保持プレート２の第二の貫通孔６の内部へ挿入して組み立てる直前に、センサチップ４を純水中より取り出し、第二の貫通孔６の入り口へセンサチップ４の一部を挿入する。
【００２４】
このとき、センサチップ４の表面とキャビティ１０の内部には純水が十分に付着充填した状態とし、第二の貫通孔６の内壁面は親水性を有したガラスを用いて形成しておくことにより、このセンサチップ４は水の表面張力の作用によって図２に示した位置に均一にセルフアライメントすることを見いだした。
【００２５】
この作用を利用することによって、簡単にセンサチップ４の配置を均一に配置することが可能となっている。特に、マトリックス状に第二の貫通孔６を配置した複数のセンサチップ４を有する細胞電気生理センサを生産するときに非常に効率的に第二の貫通孔６の内部へセンサチップ４を配置することができる。
【００２６】
なお、センサチップ４の方向によるセルフアライメントの影響は無く、ダイアフラム９の面が上下いずれの面を向いていたとしても、センサチップ４は保持プレート２の一平面に沿うようにセルフアライメントすることが分かっている。
【００２７】
これに対して、乾燥した状態でセンサチップ４を第二の貫通孔６の内部へ挿入する従来の方法では、静電気などによってセンサチップ４が飛散させられてしまうことがあり、作業性があまり良くなく、挿入したセンサチップ４の挿入位置もばらつきがあり、整列配置に多くの時間を要していた。
【００２８】
また、親水性を高めるためには保持プレート２を構成するガラス組成に二酸化ケイ素を含んでいることが好ましい。
【００２９】
その後、このセンサチップ４が所定の位置から動かないように静置させるためには、センサチップ４と第二の貫通孔６が横方向に水平になるように固定（図１において、９０度回転させた状態）した後、熱処理炉などへ入れる。
【００３０】
そして、約１００℃にて付着した水を乾燥させた後、ガラスが溶着する所定の温度まで加熱をしてセンサチップ４と保持プレート２をガラス溶着によって接合する。これによって、生産性の高い細胞電気生理センサを実現することができる。
【００３１】
なお、熱処理炉を用いた例について説明してきたが、ヒータなどによる局部加熱、あるいは近赤外レーザなどによる局部加熱などによってセンサチップ４の近傍のみを加熱することによって溶着することができる。
【００３２】
また、センサチップ４の外壁面と第二の貫通孔６の内壁面との隙間を５０μｍ以下とすることによって確実に溶着接合を行うことができる。５０μｍを超える隙間を有していると、ガラスによる溶着接合の確実性が低下するという問題があった。
【００３３】
さらにまた、接合性、作業温度および信頼性の観点から、例えば保持プレート２をホウケイ酸ガラス（コーニング；＃７０５２、＃７０５６）、またはホウケイ酸鉛ガラス（＃８１６１）などを用いることが好ましい。
【００３４】
そして、本実施の形態１における第二の貫通孔６の内壁面は親水性を有していることが重要である。
【００３５】
また、センサチップ４と保持プレート２を接合するために都合の良い温度はガラスの軟化点以上とすることが好ましく、５００〜９００℃の範囲であることがより望ましい。５００℃より低いガラスを保持プレート２に用いると強度が不十分であり、９００℃を越えると作業性が悪くなるからである。
【００３６】
また、親水性を付与するために第二の貫通孔６の内壁面を化学的、あるいは物理的な処理を行って親水性を高めておいても良い。あるいは、さらに親水性を高めるための親水性膜などを形成することによっても、よりその効果を高めることができる。さらに、別の親水性を付与する方法としては、酸素プラズマによる炭素化合物の除去、紫外線照射による有機物の分解除去、あるいは硫酸、過酸化水素などによる湿式処理などによる炭素原子を含む有機物質の分解除去が非常に効果的であり、生産性にも優れている。
【００３７】
そして、少なくとも第二の貫通孔６の内壁面の親水性は、接触角表示で１０度以下が好ましい。その接触角とは、固体表面の上に純水などの液滴を乗せ，平衡になった状態で、液滴表面と固体表面のなす角度をいう。そして、その測定方法は一般的にθ／２法を用いることができる。その方法は液滴の左右端点と頂点を結ぶ直線の、固体表面に対する角度から接触角を求めることができる。または分度器などを用いて測ることも可能である。
【００３８】
また、図１に示すように第一の電極１４と第二の電極１５を設けているが、これらの電極１４，１５は細胞の電気生理現象によって発生する電気的指標、例えば電位、電流などを測定するためのものであるが、これらの形状、材質は特に限定するものではない。
【００３９】
次に、本発明の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理活動を測定する方法について簡単に述べる。
【００４０】
まず、ウエル１に細胞外液１８を充填し、細胞内液１９をウエル１の流入口１６から流出口１７にかけて吸引することで空洞８に充填する。ここで、細胞外液１８とはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液であり、細胞内液１９とは、例えば哺乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。この状態で、ウエル１の内部に設置した第一の電極１４と空洞８の内部に設置した第二の電極１５との間で、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の導通抵抗値を観測することができる。これは細胞内液１９あるいは細胞外液１８が浸透し、第一の電極１４と第二の電極１５の間で電気回路が形成されるからである。
【００４１】
次にウエル１側から細胞２０を投入する。なお、センサチップ４を第二の貫通孔６の内部に設置する方向として、ダイアフラム９が第一の貫通孔５側へ近くなるように配置しても良い。この選択は測定する細胞２０の性質によって最適に決定されるべきである。
【００４２】
そして最後に、ウエル１の流入口１６または流出口１７の一方を減圧すると、細胞２０は第三の貫通孔７に引き付けられ、細胞２０が第三の貫通孔７を塞ぐことによって、ウエル１側と空洞８側の電気抵抗がＧΩ以上の十分に高い状態となる（ギガシールと呼ぶ）。このギガシールの状態において、細胞２０の電気生理活動によって細胞内外の電位が変化した場合には、わずかな電位差あるいは電流であっても高精度な測定が可能となる。
【００４３】
以上のように構成した細胞電気生理センサについて、以下にその製造方法を説明する。
【００４４】
まず始めに、図３および図４に示すようにセンサチップ４はフォトリソグラフィー、ドライエッチング等の半導体加工技術を用いて、シリコンウエハなどからダイアフラム９を形成した後、このダイアフラム９に第三の貫通孔７を形成する。そして、個片化することによって一括して多数のセンサチップ４を作製することができる。
【００４５】
その後、必要に応じて親水性を高めるために、酸素の介在した雰囲気中でのシリコンの熱酸化処理、あるいはＣＶＤ、スパッタ法などの薄膜プロセスを用いてシリコン化合物を成膜して親水性を高めることも可能である。その後、このセンサチップ４を純水中に浸漬して保管する。
【００４６】
一方、保持プレート２は、厚みが０．７５ｍｍのホウケイ酸ガラスを準備し、その後、例えばエッチング加工によって穴開けを行い第二の貫通孔６を形成する。
【００４７】
その後、必要に応じて第二の貫通孔６の内壁面の親水性を確認し、保持プレート２を水平に保持した後、前記純水中に保管していたセンサチップ４を取り出し、センサチップ４に純水が付着した状態で、保持プレート２の上面から第二の貫通孔６の入り口へセンサチップ４の一部を挿入する。挿入されたセンサチップ４は純水の表面張力の相互作用によって図３および図４に示すような位置にセルフアライメントによって静置する。
【００４８】
なお、センサチップ４を挿入する方向として上下の位置関係を反転させた状態でも同様のようにセルフアライメントすることを確認している。また、セルフアライメントする位置は下から挿入した場合には、図４の保持プレート２の下面側でセルフアライメントすることも確認している。
【００４９】
その後、保持プレート２を９０度回転させて、センサチップ４と第二の貫通孔６が水平方向になるように固定する（第二の貫通孔６の内壁面でセンサチップ４を支えるように配置させる）。このような位置関係とすることによって、純水が無くなることによって水の表面張力が無くなり、センサチップ４が動きやすくなることを防止するためである。
【００５０】
このような配置をしたまま、熱処理炉へ入れ、加熱する。加熱の方法は適宜最適な条件を設定することができるが、特に乾燥させるための熱処理条件とガラスによって溶着接合するための熱処理条件とが重要である。乾燥させるための熱処理条件としては８０〜１２０℃の範囲が好ましい。そして、前記ホウケイ酸ガラス（コーニング；＃７０５２、＃７０５６）を用いた場合の溶着接合温度としては７００〜７５０℃の条件が好ましい。
【００５１】
そして、この乾燥処理と溶着接合処理は一括して行うことが好ましい。一括して行うことによってセンサチップ４の動きを抑制することができる。
【００５２】
このとき、センサチップ４と第二の貫通孔６の隙間は５０μｍ以下であればガラス溶着による接合が可能であることを確認している。例えば、センサチップ４の外形が７００μｍとし、第二の貫通孔６の内径を７５０μｍとしてガラス溶着を行った結果、効率良く確実にガラス溶着による接合を行うことができた。そのときの溶着温度は７１８℃で１０秒以下の熱処理条件によって行うことができた。
【００５３】
その後、薄膜技術、めっき技術などによって配線パターンを形成し、さらにＡｇとＡｇＣｌを混合した電極をディスペンスまたはスクリーン印刷等の手法により第一の電極１４と第二の電極１５を形成する。なお、エッチング加工などによる穴開けと、電極形成の工程順序は違っていてもよい。
【００５４】
次に、ウエル１と流路プレート３はアクリル樹脂などを用いて射出成型などによって作製し、図１に示したような形状を有する構成とすることができる。
【００５５】
次に、保持プレート２とウエル１の接合を行う。この接合の方法としては紫外線硬化型接着剤による接合が好ましい。
【００５６】
その後、流路プレート３の接合を行い、図１に示すような細胞電気生理センサを作製することができる。
【００５７】
なお、保持プレート２と流路プレート３を同時に保持プレート２に一括して接合することも可能であり、いずれかの方法を適宜採用することができる。
【００５８】
そして、前記接着剤は紫外線硬化型の接着剤を用いることが好ましく、保持プレート２を紫外線光が透過するガラスとすることによって、いずれの方向からでも紫外線を照射し、紫外線硬化型樹脂を用いて接合することが可能となり、紫外線照射時に確実に接着剤を硬化させることができ、確実に保持プレート２と、ウエル１あるいは流路プレート３との接合を行うことによって液漏れの少ない構造を実現することができ、これによって細胞２０の測定を確実に行うことができる細胞電気生理センサを実現することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の細胞電気生理センサおよびその製造法は、複数の細胞を一括して効率よく測定できる細胞の電気生理現象の測定に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】同要部拡大断面図
【図３】同センサチップを固着保持する方法を説明するための上面図
【図４】同断面図
【符号の説明】
【００６１】
１  ウエル
２  保持プレート
３  流路プレート
４  センサチップ
５  第一の貫通孔
６  第二の貫通孔
７  第三の貫通孔
８  空洞
９  ダイアフラム
１４  第一の電極
１５  第二の電極
１６  流入口
１７  流出口
１８  細胞外液
１９  細胞内液
２０  細胞
【図１】
2008039625.tif 000003
【図２】
2008039625.tif 000004
【図３】
2008039625.tif 000005
【図４】
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