(57)【要約】【課題】尿中1-β-D-リボフラノシルピリジン-4-オン-3-カルボキサミド濃度（クレアチニン補正値）の測定によって心疾患の発症した状態を検出する方法で、従来の方法より、患者からの採血の負担の回避、医療従事者の血液感染予防の向上を目指す。【解決手段】対象となる哺乳動物由来の尿中の1-β-D-リボフラノシルピリジン-4-オン-3-カルボキサミド（以下4,3-PCNRという）濃度を測定し、健常な哺乳動物由来の4,3-PCNR濃度と比較することによって、対象の哺乳類において心疾患が発症しているまたは心疾患を発症する可能性が高い状態であることを検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において心疾患を発症している状態を判定する方法であって：
（ａ）対象である哺乳動物から採取した尿中の1-β-D-リボフラノシルピリジン-4-オン-3-カルボキサミド（4,3-PCNR）の濃度を測定し；
（ｂ）測定した尿中の4,3-PCNR濃度と所定の基準レベルとを比較し；ついで
（ｃ）該4,3-PCNR濃度が所定の基準レベル以上である場合に、該哺乳動物が心疾患を発症している状態であると判定する
段階を含む前記方法。
【請求項２】
該所定の基準レベルが、健常な哺乳動物からなる群から採取した尿中の4,3-PCNR濃度群の平均値および標準偏差を基にして次式：
【数１】
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により決定される値である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、段階（ａ）と（ｂ）との間に、該4,3-PCNR濃度を同一尿中のクレアチニン濃度を用いて補正する段階を含む請求項１または２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患を発症している状態の判定に関する。より詳しくは、本発明は、哺乳動物から採取した尿中の1-β-D-リボフラノシルピリジン-4-オン-3-カルボキサミド（以下4,3-PCNRという）濃度に基づいて該哺乳動物が心疾患を発症しているか否かを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心疾患は、日本において、悪性新生物に続き2番目に多い死亡原因であり、厚生労働省人口動態統計によれば、虚血性心疾患の割合が年々増加している。この虚血性心疾患は、心筋梗塞および狭心症などの疾患を含み、冠動脈血管中の血流が悪くなることによって心筋に必要な酸素や栄養が供給されず、心臓の働きが低下し、ひいては、心筋が壊死した状態である。
【０００３】
一般に、急性心筋梗塞においては、発症してから15分後には心筋細胞が死滅し始め、約6時間経過すると心筋細胞の約半数が壊死する。また、心筋梗塞の死亡率は20％程度であるが、死亡例の約60％が発症後2時間以内、約40％が発症後1時間以内に集中している。したがって、かかる心疾患の発症の危険性を早期に発見し、また発症後は速やかに適切な治療を行うことが必要である。
【０００４】
心筋梗塞および狭心症のいずれの症状にも動脈硬化症が大きく関与していることが知られている。動脈硬化症は動脈壁の肥厚、弾力性の低下および内腔の狭窄を呈する動脈疾患で、その発症と進展には血清脂質が関与しており、心筋梗塞および狭心症などの冠動脈疾患における器質的狭窄を作る原因とされている。特にアテローム性動脈硬化症は、高い血清コレステロール値、低い血清HDLコレステロール値、高い血清LDLコレステロール値および変性LDL値の状態によって引き起こされると考えられている。したがって、これらの脂質マーカーが高脂血症、冠動脈疾患などの判定に利用されている。
【０００５】
従来の動脈硬化の判定方法としては、超音波検査、核磁気共鳴検査、脈波伝播速度測定などの機器を用いた方法（特許文献１）、判定マーカーとして血漿中変性LDLを測定する方法（特許文献２）などがあり、また、心疾患の早期発見の方法としてスフィンゴ脂質およびその代謝物を測定する方法（特許文献３）などがある。
【０００６】
【特許文献１】特許第３５３８４０９号明細書
【特許文献２】特許第３４９１７４８号明細書
【特許文献３】特表２００２−５０４９９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記の技術によれば、高価な医療用機器を新たに必要とし、また、血清中コレステロール値、変性LDL値、スフィンゴ脂質等の従来マーカーを測定する方法では、患者からの採血（注射針の穿刺）が必須であり、この行為は患者に苦痛を与えるばかりでなく、医療従事者の自身への誤穿刺による血液感染の危険性もはらんでいる。
【０００８】
そこで、本発明では、高価な医療用機器（エコー、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＷＶ等）を必要とせず、尿中の特定の物質を測定することによって、対象に苦痛を与えることなく、心疾患を発症している状態を判定することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、尿中の4,3-PCNR濃度と心疾患の発症との間に相関関係があり、その4,3-PCNR濃度を測定することにより心疾患を発症している状態を判定することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、
［１］哺乳動物において心疾患を発症している状態を判定する方法であって：
（a）対象である哺乳動物から採取した尿中の1-β-D-リボフラノシルピリジン-4-オン-3-カルボキサミド（4,3-PCNR）の濃度を測定し；
（ｂ）測定した尿中の4,3-PCNR濃度と所定の基準レベルとを比較し；ついで
（ｃ）該4,3-PCNR濃度が所定の基準レベル以上である場合に、該哺乳動物が心疾患を発症している状態であると判定する
段階を含む前記方法；
［２］該所定の基準レベルが、健常な哺乳動物からなる群から採取した尿中の4,3-PCNR濃度群の平均値および標準偏差を基にして次式：
【００１１】
【数１】
2008292178.tif 000003
【００１２】
により決定される値である前記［１］に記載の方法；
［３］さらに、該4,3-PCNR濃度を同一尿中のクレアチニン濃度を用いて補正する段階を含む前記［１］または［２］に記載の方法
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、高価な医療用機器（エコー、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＷＶ等）を必要とせず、また対象に苦痛を与えることなく、対象が心疾患を発症しているか否かを判定することができる。また、尿中の4,3-PCNR濃度は心疾患の発症前にも経時的に上昇していると考えられるため、この4,3-PCNR濃度による判定は心疾患発症の予知および予防方法にも利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法においては、１または複数の健常な哺乳動物由来の尿中の4,3-PCNR濃度、および、対象となる哺乳動物由来の尿中の4,3-PCNR濃度を一般的な方法で測定し、健常な哺乳動物の4,3-PCNR測定値に基づいて決定した基準レベルと対象となる哺乳動物の4,3-PCNR測定値とを比較することによって、対象の哺乳動物が心疾患を発症しているか否かを判定する。
【００１５】
本発明の方法の対象となる哺乳動物には、齧歯類、霊長類などを含むすべての哺乳動物が含まれるが、好ましくはヒトである。
また、本明細書において「健常な哺乳動物」という場合は、冠動脈疾患（狭心症および心筋梗塞）等の心疾患のいずれにも罹患したことのない哺乳動物を意味し、哺乳動物がヒトである場合は特に「健常人」という場合がある。
また、本明細書において「対象の哺乳動物」という場合は、本発明の方法を適用して心疾患を発症している状態を判定する哺乳動物をいう。
【００１６】
また、本発明の方法において測定する尿中の4,3-PCNR濃度は、24時間あたりの総尿量に含まれる4,3-PCNR量などで表すことができ、排出された尿の一定量を限外濾過し（分子量10000）、その濾液を8-ブロモグアノシン溶液（内部標準液）で希釈したものを分析試料とし、予め作成した検量線を用いて尿中の4,3-PCNR量を定量することができる。
【００１７】
検量線の作成に用いる4,3-PCNRは、以下に記載するような化学合成法または生化学的手法により得ることができる。
化学合成法
1,4-ジヒドロ-4-オキソ-3-ピリジンカルボキサミド（0.5g、3.62mmol）を無水アセトニトリル（20mL）に懸濁させる。その懸濁液を５℃まで冷却した後に、N,O-ビス-(トリメチルシリル)アセトアミド（BSA）（1.77mL、7.24mmol）を加える。徐々に室温に戻しながら20分間攪拌後に、1-O-アセチル-2,3,5-トリ-O-ベンゾイル-β-D-リボフラノース（2.19g、4.34mmol）、トリメチルシリル・トリフルオロメタンスルホネート（TMSOTf)を加える（20℃）。60℃付近で1.5時間加熱後、TLCによりリボフラノースのスポットがほぼ消失していることを確認し、反応を終了する。アセトニトリルを減圧下留去し、得られた残渣をAcOEtに溶解し、飽和NaHCO3水溶液を加えて抽出する。AcOEt層を飽和塩水、水で洗浄し、MgSO4を用いて乾燥する。溶媒を減圧下留去して白色固体を得、それをカラムクロマトグラフィー（カラム:Wakogel C-200、溶媒CHCl3=100%-CHCl3/AcOEt=10:1）を用いて精製して白色固体を得る（1.82g、86.3%、E717-28-1,-2）。
得られた白色固体（E717-28-1,-2、1.27g、2.18mmol）を2.0Mアンモニアを含有するメタノール溶液（30mL)に溶解させ、室温（22℃）で15時間攪拌した後、TLCにより原料の消失を確認して反応を終了する。メタノールを減圧下留去し、得られた残渣にCHCl3を入れて室温で3時間攪拌する。沈降した白色固体を吸引濾過により取り出して白色固体を得た。エタノールを用いて再結晶を行い精製された4,3-PCNRの白色結晶を得る。
得られた4,3-PCNRは以下のような物理学的特性を有する。
【００１８】
融点：214.0-215.5℃
1H-NMR (400MHz, D2O, TSP）δ3.86 (1H, dd, J 12.8 and 4.1, 5'-H), 3.94 (1H, dd, J 12.8 and 2.9, 5'-H), 4.27-4.32(2H, m, 3'-, 4'-H), 4.36-4.38 (1H, m, 2'-H), 5.69(1H, d, J 5.8, 1'-H), 6.76 (1H, d, J 7.7, 5-H), 8.08 (1H, dd, J 7.7 and 2.2, 6-H), 8.82 (1H, d, J 2.6, 2-H)
MS(FAB) m/z: 271(M+H)+, 136
元素分析  C11H14N2O6として：  計算値C, 48.89; H, 5.22; N, 10.37
実測値C, 48.73; H, 5.39; N, 10.08
参考文献
Snib P. Dutta et al., Nucleic Acid Chem., 4, 152-4 (1991)
Tun-cheng chien et al., Journal of Medicinal Chemistry, 47, 5743-5752 (2004)
【００１９】
生化学的手法
また、4,3-PCNRは、Life Sciences, Vol. 24, pp. 1381-1388 (1979)に記載されている以下の手順に従って、哺乳動物の尿から得ることができる。
一定時間あたりに哺乳動物から採取した尿を、チャコール−セライトカラムに通した後、洗浄液が塩化物を含まなくなるまで水で洗浄し、ついで2N  NH4OHを含む50%エタノール水溶液でカラムに結合した物質を溶出する。溶出液を濃縮し、ついでAg-1-x-8-ホルメートのカラムに通す。その後、カラムを水で洗浄し、カラムに結合した物質を3Nギ酸で溶出する。カラムの水洗浄液を濃縮し、0.14Mホウ酸で平衡化したDEAEセルロースカラムに通す。そのカラムを最初に0.14Mホウ酸で洗浄した後、0.70Mホウ酸で溶出して目的のヌクレオシド画分を得る。得られたヌクレオシド画分にメタノールを添加して蒸発乾固させ、この手順を4回繰り返す。このヌクレオシド画分からの残渣を、Whatman  3MM濾紙上のペーパークロマトグラフィー（展開液：酢酸エチル：2-エトキシエタノール：16%ギ酸(4:1:2))に付す。濾紙上の紫外線吸収バンドを切り取り、水で溶出する。RF値0.35を有するバンドをWhatman  No.1（酸洗浄済み）濾紙上の再クロマトグラフィーに付し、溶媒を用いて順次展開する。ペーパークロマトグラフィーで精製した物質をDowex-1-x-2（OH-）樹脂のカラムに通し、そのカラムを30%メタノール水溶液で洗浄し、60%メタノール水溶液を用いてカラムに結合した物質をシャープなピークを有する画分として溶出する。溶出液を蒸発乾固させて4,3-PCNRを得る。このようにして得られる4,3-PCNRは下式（Ｉ）：
【００２０】
【化１】
2008292178.tif 000004
【００２１】
によって表される。
本発明の方法においては、上記の手順によって対象から得た4,3-PCNRを従来から知られている方法、例えばFPLCまたはHPLC、LC/MS/MS、比色定量、ならびに特異的抗体を用いたRIAおよび酵素免疫測定（ELISA)などを用いて従来公知の方法によって定量することができる。
また、4,3-PCNRに対する特異的抗体は、ハプテンを用いた抗体作製方法に従って調製することができる。
【００２２】
本発明の方法において使用する、対象が心疾患を発症している状態であると判定するための所定の基準レベルは、複数の健常な哺乳動物からなる群から採取した尿中の4,3-PCNR濃度を測定した結果から得られる平均値および標準偏差に基づいて、次式：
【００２３】
【数２】
2008292178.tif 000005
【００２４】
により決定する。この基準レベルは、健常な哺乳動物における尿中4,3-PCNR濃度の正規分布の上側確率が0.05となる値である。したがって、この基準レベルを超える4,3-PCNR濃度を示す対象を心疾患を発症していると判定する。
【００２５】
また、尿に含まれる成分は水分摂取や発汗などから大きく影響を受けて濃縮・希釈されるため、基準となる物質を用いて目的成分の濃度を補正することもできる。尿中のクレアチニンは、腎臓からの排出過程において尿細管での再吸収が少なく、また、比較的多量に存在するため生理的変動因子の影響を受けにくく、その尿中の存在量は、他の尿成分とは異なりほぼ一定である。そこで、本発明の方法においては、尿中の4,3-PCNR濃度を同一尿中のクレアチニン濃度で補正した値（クレアチニン補正値）を用いて補正することもできる。
本発明において、4,3-PCNR濃度のクレアチニン補正値とは、尿中の4,3-PCNRの分析機器測定値（測定濃度またはピークエリアまたはピーク高さまたは内部標準法：ピーク比等の値）を尿中のクレアチニン濃度で除した値をいう。
【実施例】
【００２６】
実施例：健常人および心疾患患者における尿中の4,3-PCNR濃度の比較
冠動脈疾患（狭心症、心筋梗塞等）を発症した患者（n＝22）、および健常人（n＝8）から同意を得て採取した尿200μLをミリポア社のウルトラフリー0.5 （UFV5BGC00）を用い、×9000g、10minで限外濾過し（分子量10000）、その濾液を8-ブロモグアノシン溶液（内部標準液10μg/mL）で10倍希釈したものを分析試料としてLC/MS/MSで測定した。
【００２７】
LC/MS/MS条件：HPLCの装置はWaters社のAlliance2695、カラムはDiscovery HS F5 (2.0x150mm、スペルコ社)を用い、カラムを温度40℃に設定、移動相は0.1%ギ酸/メタノール＝8/2を流速0.2mL/minで送液し、試料は2.5μLを注入する。MSに用いる装置はサーモエレクトロン社のTSQ  QUANTUM、モニターイオンはプリカーサーイオンおよびプロダクトイオンをそれぞれm/z271およびm/z139とした。
【００２８】
尿中の4,3-PCNRをHPLCで測定し、4,3-PCNRピーク面積を求めた。ついで、クレアチニン尿中濃度（市販キット、HPLCあるいは臨床検査機器などで測定）で除して4,3-PCNRのクレアチニン補正値を得た。
【００２９】
健常人および心疾患を発症している患者の尿中4,3-PCNRのクレアチニン補正値を表１および表２に示す。また、健常人と患者との間で比較したクレアチニン補正値の比較を図１に示す。
【００３０】
【表１】
2008292178.tif 000006
【００３１】
【表２】
2008292178.tif 000007
【００３２】
表１および２、ならびに図１から明らかなように、患者の尿中の4,3-PCNR濃度のクレアチニン補正値は健常人のそれよりも有意に高い値を示した（P＜0.005）。このことから、心筋梗塞および狭心症などの心疾患患者の尿中4,3-PCNR濃度は健常人よりも高いことが示された。また、基準レベルより高い患者は全患者の約73％（16例/全22例）を示した。これらの結果から明らかなように、心疾患を発症している患者においては尿中の4,3-PCNR濃度が健常人と比較して有意に上昇していることが明らかとなり、尿中の4,3-PCNR濃度のクレアチニン補正値は、心筋梗塞または狭心症を発症した状態を判定する指標の１つとなり、かつ、臨床現場において、患者および被験者の注射針穿刺の回避による負担の低減、ならびに医療従事者の血液感染に対する安全性確保の観点から本発明は優れた心疾患の判定方法の１つであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明によれば、高価な医療用機器を必要とすることなく、一般的な手法で4,3-PCNRの尿中濃度を測定して判定することにより、患者または被験者の採血による苦痛の低減および医療従事者の血液感染防止に関し、多大な貢献が期待される。また、尿中4,3-PCNR濃度が高い患者は、心疾患を発症するリスクが高いと考えられることから、心疾患発症の予防にも役立つ。また、尿中での検出という特徴を活かすことにより、市販kit化が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は健常人および心疾患患者の尿中の4,3-PCNR濃度をプロットして比較した図である。
【図１】
2008292178.tif 000009