(57)【要約】      （修正有）【課題】多種の大腸菌が存在する試料の中から、特異的に大腸菌Ｃ株の増殖をコントロールしたり、大腸菌Ｃ株を検出する方法の提供。【解決手段】バクテリオファージΦＸ１７４由来のスパイクＧタンパク質に、ヒスチジンタグを付加した五量体Ｇタンパク質。五量体を形成させる事により、大腸菌Ｃ株に結合させてその増殖をコントロールしたり、さらには大腸菌Ｃ株の検出に用いる事ができる。【選択図】図８
2008063243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バクテリオファージφＸ１７４のＧタンパク質において、当該のＧタンパク質は５量体であることを特徴とするＧタンパク質。
【請求項２】
Ｃ末端にヒスチジンタグを持たせることによって５量体を形成することを特徴とする請求項１記載Ｇタンパク質の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載Ｇタンパク質を用いることを特徴とする特定大腸菌増殖の抑制方法。
【請求項４】
請求項１記載Ｇタンパク質を用いることを特徴とする特定大腸菌の検出方法。
【請求項５】
特定大腸菌がＣ株大腸菌であることを特徴とする請求項３及び４に記載の抑制方法及び検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージに由来し大腸菌の増殖を抑制するスパイクＧタンパク質５量体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、バクテリオファージゲノミクスに基づき新規のタンパク質を作製し、当該のタンパク質を用いて特定の細菌と結合させ、その細菌の繁殖を防ぐ技術が報告されている。例えば特許文献特表２００２−５３１１０７がある。又、特定の細菌を検出する方法としてバクテリオファージに蛍光性タンパク質を融合する技術が公知であり、例えば特開２００４−２８３００３がある。又、φＸ１７４のスパイクＧタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグ配列を連結した組み替えタンパク質の調製技術が公知であり、例えば、非特許文献１及び２が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特表２００２−５３１１０７号公報
【特許文献２】特開２００４−２８３００３号公報
【非特許文献１】Kawaura,T., Inagaki, M., Kariata, S., Kato, M., Nishikawa, S., Kashimura, N.,Recognition of receptor lipopolysacharides by spike G protein of bacteriophage φX174, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (9), 1993-1997 (2000).
【非特許文献２】Inagaki,M., Kawaura, T., Wakashima, H., Kato, M., Nishikawa, S., Kashimura, N.,Different contributions of the outer and inner R-core residues of lipopolysaccharideto the recognition by spike H and G proteins of bacteriophage φX174, FEMS Microbiol. Lett., 226 (2), 221-227 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記特許文献１において、Staphilococcus
aureusバクテリオファージ７７、３Ａ、９６、４４ＡＨＪＤ、Enterococcusバクテリオファージ１８２、Streptococcus pheumoniaeバクテリオファージＤｐ&#8722;１を利用した記載があるが、大腸菌ファージφＸ１７４及びその遺伝子を、抗菌を目的に利用した技術はなかった。特許文献２において、大腸菌Ｏ１５７及びＫ１２と特異的に吸着する、標識されたバクテリオファージを用いてそれらの大腸菌を検出する技術に関する記載があるが、大腸菌Ｃ株を検出する技術はなかった。
【０００５】
又、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したスパイクＧタンパク質（ＨｉｓＧ）は、ヒスチジンタグ配列が立体的な障害になり、５量体を形成できないことが知られている（非特許文献１及び２）。それに対して本発明は、良好に５量体を形成し、５量体の中心部に菌の内部と外部を繋ぎえる通路を備える、新規５量体Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）によって上記課題を解決するものである。
【０００６】
大腸菌には多数の種類があり、大腸菌Ｃ株は人体への影響がほとんど無いが、特定の大腸菌の増殖をコントロールしたり、検出することは大腸菌やバクテリオファージ等の研究を進める場合極めて重要な意味を持っている。又、本発明をさらに発展させることによって、新しい診断薬や遺伝子組み換え等の生命科学における重要な技術を開発できる可能性が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
バクテリオファージφＸ１７４のＧタンパク質において、当該のＧタンパク質は５量体となっていることを特徴とする。
【０００８】
Ｃ末端にヒスチジンタグを持たせることによって５量体を形成することを特徴とするＧタンパク質５量体の製造方法である。
【０００９】
当該のＧタンパク質５量体を用いることを特徴とする特定大腸菌増殖の抑制方法である。
【００１０】
当該のＧタンパク質５量体を用いることを特徴とする特定大腸菌の検出方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来報告の無い大腸菌Ｃ株について、その増殖の抑制や検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
バクテリオファージφＸ１７４は、ミクロウイルス科に属する小型正二十面体ウイルスで、Escherichia coli（大腸菌）、Salmonella（サルモネラ菌）、Shigella（赤痢菌を含む）などのグラム陰性の腸内細菌科の中で、菌体の表面を覆っているリポ多糖のコア糖鎖が完全に保存されたRa型菌に好んで感染し、その感染スペクトル域が狭いことが特徴の１つである。
【００１３】
バクテリオファージφＸ１７４は、正二十面体の１２カ所の頂点にスパイクと呼ばれる突起を持っており、宿主菌に感染する際には、そのスパイク部分で菌体に結合することにより、特定の細菌を選び出して感染し、その細菌内部で増殖し、ついには、その細菌を破壊（溶菌）して外へ出てくる。
【００１４】
従来は、バクテリオファージの持つ溶菌タンパク質などの細菌障害性タンパク質あるいは、その遺伝子を利用する技術があった。しかし、そうした細菌障害性タンパク質は、細菌に感染侵入したバクテリオファージが細菌内で増殖した後に発現作用するものであって、バクテリオファージの一番の特徴である厳密に細菌を選択する能力には、関与していない。
【００１５】
つまり、数多くの細菌のなかから、標的とする細菌だけをまさに精密に選択するためには、スパイクを構成するタンパク質を利用する必要がある。
【００１６】
バクテリオファージφＸ１７４粒子のスパイクにＧタンパク質が含まれる場合には、その５量体の中心部分の孔は、他のタンパク質でふさがっており、これが菌体表面と結合して変形することによって、いわば栓が抜け、内部のファージＤＮＡが飛び出す仕組みである。
【００１７】
そこで、Ｇタンパク質のみを遺伝子工学的に大量に調製し、かつ、取り出した溶液中で５量体構造を取り得るとしたら、その５量体Ｇタンパク質の中央部に孔が空き、その孔は５量体Ｇタンパク質が細菌の膜に突き刺さった時には、内部物質の流出孔として機能すると推定できる。したがって、５量体スパイクＧタンパク質を細菌に対して投与するならば、細菌を死に至らしめる、あるいは、増殖を抑制する抗菌性物質として機能すると考えられる。
【００１８】
本発明では、当該遺伝子を含有する組み換えベクターを調製し、当該ベクターをコンピタントセルに導入して形質転換体を作出する。そして、その形質転換体の培養物から５量体スパイクＧタンパク質を精製することができる。
具体的に本発明によるタンパク質の作成方法の概要を以下に示す。
【００１９】
（新規５量体スパイクＧタンパク質をコードする遺伝子のクローニング）
本発明のタンパク質の遺伝子のクローニングは、次のようにして行った（図１）。発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社）にＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するために、バクテリオファージφＸ１７４
ＲＦ ＤＮＡ（東洋紡社）を鋳型とするＰＣＲ法により目的遺伝子領域を増幅した。
【００２０】
使用したプライマーは、Ｇタンパク質遺伝子の開始コドンの上流にＡｆｌＩＩＩ切断サイト（ＡＣＡＴＧＴ）を導入するためのフォワードプライマー：５‘−ＡＡＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴ−３’、及び、Ｇタンパク質遺伝子の停止コドンを削除し、そのすぐ下流にＢａｍＨＩ切断サイト（ＣＣＴＡＧＧ）を導入するためのリバースプライマー：５‘−ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧ−３’を用いた。
【００２１】
増幅されたＧタンパク質遺伝子断片をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に対してＴＡクローニングを行い、コンピタントセル大腸菌ＩＮＶα株（インビトロジェン社）を形質転換した。形質転換菌をＸ&#8722;ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でカラーセレクションし、目的のＧタンパク質遺伝子をもつ組み替え体を選抜し、プラスミドの塩基配列を確認した。
【００２２】
塩基配列が確認されたプラスミドをＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩＩにより切断し、得られたＤＮＡ断片をｐＱＥ−６０（キアゲン社）のＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩサイトに連結して、目的タンパク質の発現のためのプラスミドｐＱＥｃＧを得た。
【００２３】
さらに、大腸菌ＪＭ１０９株をｐＱＥｃＧにより形質転換し、選抜した組み替え体からプラスミドを得て、全塩基配列とそれにコードされた全アミノ酸配列が目的のタンパク質の配列と一致することを確認した。
【００２４】
（ｐＱＥｃＧを持つ大腸菌によるｃＨｉｓＧタンパク質の発現）
タンパク質の発現は次のようにして行う（図２）。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地中において、対数増殖期前期にまで培養したｐＱＥｃＧを持つ大腸菌ＪＭ１０９株に対して、終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、以後１時間毎に培養液を２５０
μＬ採取して集菌し、その菌体に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認した。
【００２５】
ｐＱＥｃＧを持つ大腸菌ＪＭ１０９株は、ＩＰＴＧ添加前には目的タンパク質に対応する２２ｋＤａのバンドが認められないが、ＩＰＴＧ添加後には、１、２、３、５時間が経過するにつれ目的のタンパク質バンドが発現・蓄積することが確認された。
【００２６】
（ｃＨｉｓＧの精製）
Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ&#8722;ニトリロトリ酢酸）ゲルによる親和性クロマトグラフィーによるｃＨｉｓＧの精製を通常法に従って行った（図３）。５０μｇ/ｍＬのアンピシリンナトリウムを含む２５０ｍＬのＬＢ液体培地中で、ｐＱＥｃＧによって形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を対数増殖期前期にまで培養し、終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３７℃で５時間振盪培養し。５０００×ｇ、１０分間遠心分離を行い集菌した菌体を破砕緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ８．０）に懸濁し、−３０℃で一晩、凍結保存した。
【００２７】
凍結した菌体懸濁液を氷上で融解し、超音波照射によって粉砕し、１００００×ｇで３０分間遠心分離を行い上清を採取した。あらかじめ破砕緩衝液で平衡化した約３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡゲルをこの上清に加え、１時間氷上で攪拌し、目的タンパク質をゲルに吸着させた。
【００２８】
タンパク質が吸着したゲルをカラム（１５ｍｍφ×７ｃｍ）に充填し、破砕緩衝液を流速０．５ｍＬ/分で流出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０１以下になるまで流し、さらに、洗浄緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ７．０）を同様に流出物の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０１以下になるまで流した。
【００２９】
０．０５〜０．５Ｍの１０段階のイミダゾール濃度勾配を含む４０ｍＬの洗浄緩衝液を用いて目的タンパク質を溶出し、溶出画分に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認し、目的タンパク質を含む分画を回収した。
【００３０】
ＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍ陽イオン交換クロマトグラフィーによりｃＨｉｓＧを精製した（図４）。Ｎｉ&#8722;ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーより得られた、ｃＨｉｓＧを含む分画を１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析した。
【００３１】
１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した、約６ｍＬのＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍゲルを充填したカラム（１５ｍｍφ×７ｃｍ）に、上述のｃＨｉｓＧを含む分画を添加し、１０ｍＬの１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した。０．１〜１．０Ｍの１０段階の塩化ナトリウム濃度勾配を含む１０ｍＬの１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、目的タンパク質を溶出し、溶出画分に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認し、目的タンパク質を含む分画を回収した。
【００３２】
（新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の５量体形成に関する解析）
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによってＧタンパク質の５量体を観察した（図５）。ＳＤＳサンプル緩衝液５μＬにｃＨｉｓＧ溶液（１．１７ｍｇ/ｍＬ）５μＬを混ぜ、加熱する、あるいは加熱せずにその３μＬを電気泳動に供した。標準分子量マーカーは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ用タンパク質マーカー（１０倍濃縮）（ナカライテスク社）を使用した。
【００３３】
その結果、加熱せずに泳動したＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、１１０ｋＤａ付近に単一のバンドが確認された。これは、単量体のＧタンパク質の分子量である、２２ｋＤａの丁度５倍の分子量であり、このことから、Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、溶液中で５量体を形成していることが示唆された。
【００３４】
次に、Ｎａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥを用いて、ＳＤＳ非存在下での新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の溶液内均一性を観察した（図６）。ＳＤＳが含まれていないＮａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥサンプル緩衝液５μＬに対して、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）（５８．６μＭ）溶液５μＬを混合し、その３μＬを電気泳動に供した。
【００３５】
又、比較対象として、非特許文献１に記載されている方法によって調製した、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したＧタンパク質（ＨｉｓＧ）（４３μＭ）を同様の操作で電気泳動に供した。さらに、主に単量体として、一部二量体として存在することが一般的に知られているタンパク質として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（ナカライテスク社）（５ｍｇ／ｍＬ）を同様の操作で電気泳動に供した。
【００３６】
その結果、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したＧタンパク質（ＨｉｓＧ）では、１から３量体に対応する複数種類のタンパク質バンドが確認されたのに対して、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は単一の大きなバンドが確認された。これによって、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、溶液内で従来のＧタンパク質（ＨｉｓＧ）よりも大きなサイズのただ一種類の多量体を形成していることが判った。
【００３７】
上述の２種類の電気泳動実験（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、 Ｎａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥ）の結果から、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は溶液内で５量体を形成している可能性が示唆されたため、ｃＨｉｓＧをセファクリルＳ&#8722;２００高分解能カラム（１６ｍｍφ×６０ｃｍ）を用いたゲルろ過分析に供し、分子量を推定した。
【００３８】
あらかじめＴＢＳ（１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラムに対して、１ｍＬのｃＨｉｓＧを含むＴＢＳ溶液（１．１７ｍｇ／ｍＬ）、又は、分子量標準マーカーとなるチログロブリン、γ&#8722;グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、ビタミンＢ１２を含む、ゲル濾過標準試料（バイオラッド社）を添加して、流速０．４０ｍＬ/分でＴＢＳを流した。標準試料の分子量の対数（ｌｏｇ分子量）をＸ軸として、分配係数ＫａｖをＹ軸として描いた検量線（図７）を得て、ｃＨｉｓＧの分配係数からその分子量を比較推定した。
【００３９】
その結果、ｃＨｉｓＧは、約１１７ｋＤａに相当する位置に溶出され、ゲル濾過法によっても、本発明の新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）が溶液中で５量体を形成していることを確認できた。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の好適な実施の形態を実施例によって説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。
（大腸菌Ｃ株の増殖抑制）
５量体スパイクＧタンパク質は、バクテリオファージφＸ１７４が宿主菌に感染する際にファージ遺伝子を通す通路として働くと考えられている。従って、本発明によって得られた溶液内で５量体を形成する能力を有する新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、宿主大腸菌Ｃ株の膜に突き刺さり、その中心部の孔から細菌の内容物が流出する結果、大腸菌を死滅させる、あるいは、増殖を阻害する能力があると考えられる。
【００４１】
−８０℃に保存した大腸菌Ｃ株フリーズストックを１白金耳取り、５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で約３．５時間、６００ｎｍにおける吸光度が０．４５になるまで振盪培養した。この培養液をＬＢ液体培地で段階希釈し、２．２５×１０３ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌が存在するように調整した。希釈した菌体液１００μＬにｃＨｉｓＧを終濃度で２０μＭ、及び２７μＭになるように添加し、これらを３７℃で３０分保温した。
【００４２】
その後、混合物を新しいＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。２０μＭのｃＨｉｓＧタンパク質を加えた場合には、大腸菌Ｃ株のコロニーが減る傾向が見られた。又、２７μＭのｃＨｉｓＧタンパク質を加えた場合には、大腸菌Ｃ株のコロニーはわずか２個に減少した。これらの結果は、５量体スパイクＧタンパク質が大腸菌Ｃ株の増殖を顕著に抑制する能力をもつことを示す。
【００４３】
本発明による新規５量体Ｇタンパク質は、宿主細菌の膜に突き刺さり、５量体の中心に空いた孔から菌の内容物を流出させることを作用機作として、菌の増殖を２０μＭの濃度で中程度に、そして、２７μＭの濃度でほぼ完全に抑制する。
【００４４】
これまで、長い生物の歴史上でバクテリアに感染するファージが継続的に存在してきた事実を考えると、本発明の５量体スパイクＧタンパク質に対して、細菌が耐性を獲得する可能性は極めて低いと考えられ、従って、本発明による新規５量体スパイクＧタンパク質は、これまでにない新しい方法論によって特定の細菌の増殖を抑制することを可能にした、極めて有用な抗菌物質になる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明による５量体スパイクＧタンパク質は、例えば次のようにして利用することができる。食品、若しくは飲料に当該タンパク質を添加する、当該タンパク質を含有する溶液を抗菌作用を発揮させたい対象にスプレー等を用いて噴霧する、当該タンパク質を含有する溶液に食器、布、若しくは器具等を浸漬する、又は当該タンパク質を含有する乳液を、物質や皮膚に塗布する等が挙げられる。
【００４６】
又、本発明のｃＨｉｓＧに対して、ＦＩＴＣやダンシルによる蛍光誘導体化、あるいは、ビオチン修飾などを施すことによって、顕微鏡下や試験管内あるいは、多穴試験プレート上において、蛍光を発する性質を利用する、あるいは、ビオチン&#8722;アビジン反応を利用するなどにより、特定の細菌を検出する方法に応用することもできる。
【００４７】
さらに、本発明の利用形態は、そのタンパク質であることに由来する水溶性や生分解性、毒性や抗原性が事実上無視できる特性、あるいは、特定の宿主菌に優れた選択性を示す特性を活かして利用されるのであれば、上記に限られるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】バクテリオファージφＸ１７４由来の５量体スパイクＧタンパク質を遺伝子工学的手法により、組み換え大腸菌ＪＭ１０９株において大量発現するための発現プラスミドを作成する方法を示す概略図である。
【図２】ｐＱＥｃＧによって形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株に対してＩＰＴＧによる組み替えタンパク質誘導と発現の経時的変化を示すＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図３】Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ&#8722;ニトリロトリ酢酸）親和性クロマトグラフィーによるＧタンパク質の精製過程を分析したＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図４】ＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍ陽イオン交換クロマトグラフィーによるＧタンパク質の精製過程を分析したＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図５】ＳＤＳ／ＰＡＧＥによりスパイクＧタンパク質５量体が形成されていることを確認した結果を示す写真である。
【図６】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）と５量体を形成しない従来のＧタンパク質（ＨｉｓＧ）をＮａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥによって比較分析した結果を示す写真である。
【図７】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の分子量をゲルろ過によって推定したグラフである。
【図８】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）による大腸菌Ｃ株に対する増殖抑制効果を確認した結果を示す写真である。
【図１】
2008063243.tif 000003
【図２】
2008063243.tif 000004
【図３】
2008063243.tif 000005
【図４】
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【図５】
2008063243.tif 000007
【図６】
2008063243.tif 000008
【図７】
2008063243.tif 000009
【図８】
2008063243.tif 000010
【配列表】
2008063243000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月6日(2006.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージに由来し大腸菌の増殖を抑制するスパイクＧタンパク質５量体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、バクテリオファージゲノミクスに基づき新規のタンパク質を作製し、当該のタンパク質を用いて特定の細菌と結合させ、その細菌の繁殖を防ぐ技術が報告されている。例えば特許文献特表２００２−５３１１０７がある。又、特定の細菌を検出する方法としてバクテリオファージに蛍光性タンパク質を融合する技術が公知であり、例えば特開２００４−２８３００３がある。又、φＸ１７４のスパイクＧタンパク質のＮ末端にヒスチジンタグ配列を連結した組み替えタンパク質の調製技術が公知であり、例えば、非特許文献１及び２が知られている。
【０００３】
【特許文献１】特表２００２−５３１１０７号公報
【特許文献２】特開２００４−２８３００３号公報
【非特許文献１】Kawaura, T., Inagaki, M., Kariata, S., Kato, M., Nishikawa, S., Kashimura,N., Recognition of receptor lipopolysacharides by spike G protein ofbacteriophage φX174, Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (9), 1993-1997 (2000).
【非特許文献２】Inagaki, M., Kawaura, T., Wakashima, H., Kato, M., Nishikawa, S.,Kashimura, N., Different contributions of the outer and inner R-core residuesof lipopolysaccharide to the recognition by spike H and G proteins ofbacteriophage φX174, FEMS Microbiol. Lett., 226 (2), 221-227 (2003).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記特許文献１において、Staphilococcus aureusバクテリオファージ７７、３Ａ、９６、４４ＡＨＪＤ、Enterococcusバクテリオファージ１８２、Streptococcus pheumoniaeバクテリオファージＤｐ−１を利用した記載があるが、大腸菌ファージφＸ１７４及びその遺伝子を、抗菌を目的に利用した技術はなかった。特許文献２において、大腸菌Ｏ１５７及びＫ１２と特異的に吸着する、標識されたバクテリオファージを用いてそれらの大腸菌を検出する技術に関する記載があるが、大腸菌Ｃ株を検出する技術はなかった。
【０００５】
又、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したスパイクＧタンパク質（ＨｉｓＧ）は、ヒスチジンタグ配列が立体的な障害になり、５量体を形成できないことが知られている（非特許文献１及び２）。それに対して本発明は、良好に５量体を形成し、５量体の中心部に菌の内部と外部を繋ぎえる通路を備える、新規５量体Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）によって上記課題を解決するものである。
【０００６】
大腸菌には多数の種類があり、大腸菌Ｃ株は人体への影響がほとんど無いが、特定の大腸菌の増殖をコントロールしたり、検出することは大腸菌やバクテリオファージ等の研究を進める場合極めて重要な意味を持っている。又、本発明をさらに発展させることによって、新しい診断薬や遺伝子組み換え等の生命科学における重要な技術を開発できる可能性が高い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
バクテリオファージφＸ１７４のＧタンパク質において、当該のＧタンパク質は５量体となっていることを特徴とする。
【０００８】
Ｃ末端にヒスチジンタグを持たせることによって５量体を形成することを特徴とするＧタンパク質５量体の製造方法である。
【０００９】
当該のＧタンパク質５量体を用いることを特徴とする特定大腸菌増殖の抑制方法である。
【００１０】
当該のＧタンパク質５量体を用いることを特徴とする特定大腸菌の検出方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来報告の無い大腸菌Ｃ株について、その増殖の抑制や検出が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
バクテリオファージφＸ１７４は、ミクロウイルス科に属する小型正二十面体ウイルスで、Escherichia coli（大腸菌）、Salmonella（サルモネラ菌）、Shigella（赤痢菌を含む）などのグラム陰性の腸内細菌科の中で、菌体の表面を覆っているリポ多糖のコア糖鎖が完全に保存されたRa型菌に好んで感染し、その感染スペクトル域が狭いことが特徴の１つである。
【００１３】
バクテリオファージφＸ１７４は、正二十面体の１２カ所の頂点にスパイクと呼ばれる突起を持っており、宿主菌に感染する際には、そのスパイク部分で菌体に結合することにより、特定の細菌を選び出して感染し、その細菌内部で増殖し、ついには、その細菌を破壊（溶菌）して外へ出てくる。
【００１４】
従来は、バクテリオファージの持つ溶菌タンパク質などの細菌障害性タンパク質あるいは、その遺伝子を利用する技術があった。しかし、そうした細菌障害性タンパク質は、細菌に感染侵入したバクテリオファージが細菌内で増殖した後に発現作用するものであって、バクテリオファージの一番の特徴である厳密に細菌を選択する能力には、関与していない。
【００１５】
つまり、数多くの細菌のなかから、標的とする細菌だけをまさに精密に選択するためには、スパイクを構成するタンパク質を利用する必要がある。
【００１６】
バクテリオファージφＸ１７４粒子のスパイクにＧタンパク質が含まれる場合には、その５量体の中心部分の孔は、他のタンパク質でふさがっており、これが菌体表面と結合して変形することによって、いわば栓が抜け、内部のファージＤＮＡが飛び出す仕組みである。
【００１７】
そこで、Ｇタンパク質のみを遺伝子工学的に大量に調製し、かつ、取り出した溶液中で５量体構造を取り得るとしたら、その５量体Ｇタンパク質の中央部に孔が空き、その孔は５量体Ｇタンパク質が細菌の膜に突き刺さった時には、内部物質の流出孔として機能すると推定できる。したがって、５量体スパイクＧタンパク質を細菌に対して投与するならば、細菌を死に至らしめる、あるいは、増殖を抑制する抗菌性物質として機能すると考えられる。
【００１８】
本発明では、当該遺伝子を含有する組み換えベクターを調製し、当該ベクターをコンピタントセルに導入して形質転換体を作出する。そして、その形質転換体の培養物から５量体スパイクＧタンパク質を精製することができる。
具体的に本発明によるタンパク質の作成方法の概要を以下に示す。
【００１９】
（新規５量体スパイクＧタンパク質をコードする遺伝子のクローニング）
本発明のタンパク質の遺伝子のクローニングは、次のようにして行った（図１）。発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社）にＧタンパク質をコードするＤＮＡ断片を挿入するために、バクテリオファージφＸ１７４
ＲＦ ＤＮＡ（東洋紡社）を鋳型とするＰＣＲ法により目的遺伝子領域を増幅した。
【００２０】
使用したプライマーは、Ｇタンパク質遺伝子の開始コドンの上流にＡｆｌＩＩＩ切断サイト（ＡＣＡＴＧＴ）を導入するためのフォワードプライマー：５‘−ＡＡＡＣＡＴＧＴＴＴＣＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴ−３’、及び、Ｇタンパク質遺伝子の停止コドンを削除し、そのすぐ下流にＢａｍＨＩ切断サイト（ＣＣＴＡＧＧ）を導入するためのリバースプライマー：５‘−ＡＡＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧ−３’を用いた。
【００２１】
増幅されたＧタンパク質遺伝子断片をｐＣＲ２．１（インビトロジェン社）に対してＴＡクローニングを行い、コンピタントセル大腸菌ＩＮＶα株（インビトロジェン社）を形質転換した。形質転換菌をＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上でカラーセレクションし、目的のＧタンパク質遺伝子をもつ組み替え体を選抜し、プラスミドの塩基配列を確認した。
【００２２】
塩基配列が確認されたプラスミドをＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩＩにより切断し、得られたＤＮＡ断片をｐＱＥ−６０（キアゲン社）のＢａｍＨＩ及びＮｃｏＩサイトに連結して、目的タンパク質の発現のためのプラスミドｐＱＥｃＧを得た。
【００２３】
さらに、大腸菌ＪＭ１０９株をｐＱＥｃＧにより形質転換し、選抜した組み替え体からプラスミドを得て、全塩基配列とそれにコードされた全アミノ酸配列が目的のタンパク質の配列と一致することを確認した。
【００２４】
（ｐＱＥｃＧを持つ大腸菌によるｃＨｉｓＧタンパク質の発現）
タンパク質の発現は次のようにして行う（図２）。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンナトリウムを含むＬＢ液体培地中において、対数増殖期前期にまで培養したｐＱＥｃＧを持つ大腸菌ＪＭ１０９株に対して、終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、以後１時間毎に培養液を２５０
μＬ採取して集菌し、その菌体に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認した。
【００２５】
ｐＱＥｃＧを持つ大腸菌ＪＭ１０９株は、ＩＰＴＧ添加前には目的タンパク質に対応する２２ｋＤａのバンドが認められないが、ＩＰＴＧ添加後には、１、２、３、５時間が経過するにつれ目的のタンパク質バンドが発現・蓄積することが確認された。
【００２６】
（ｃＨｉｓＧの精製）
Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−ニトリロトリ酢酸）ゲルによる親和性クロマトグラフィーによるｃＨｉｓＧの精製を通常法に従って行った（図３）。５０μｇ/ｍＬのアンピシリンナトリウムを含む２５０ｍＬのＬＢ液体培地中で、ｐＱＥｃＧによって形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を対数増殖期前期にまで培養し、終濃度０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、３７℃で５時間振盪培養し。５０００×ｇ、１０分間遠心分離を行い集菌した菌体を破砕緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム及び１０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ８．０）に懸濁し、−３０℃で一晩、凍結保存した。
【００２７】
凍結した菌体懸濁液を氷上で融解し、超音波照射によって粉砕し、１００００×ｇで３０分間遠心分離を行い上清を採取した。あらかじめ破砕緩衝液で平衡化した約３ｍＬのＮｉ−ＮＴＡゲルをこの上清に加え、１時間氷上で攪拌し、目的タンパク質をゲルに吸着させた。
【００２８】
タンパク質が吸着したゲルをカラム（１５ｍｍφ×７ｃｍ）に充填し、破砕緩衝液を流速０．５ｍＬ/分で流出液の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０１以下になるまで流し、さらに、洗浄緩衝液（３００ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液ｐＨ７．０）を同様に流出物の２８０ｎｍにおける吸光度が０．０１以下になるまで流した。
【００２９】
０．０５〜０．５Ｍの１０段階のイミダゾール濃度勾配を含む４０ｍＬの洗浄緩衝液を用いて目的タンパク質を溶出し、溶出画分に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認し、目的タンパク質を含む分画を回収した。
【００３０】
ＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍ陽イオン交換クロマトグラフィーによりｃＨｉｓＧを精製した（図４）。Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーより得られた、ｃＨｉｓＧを含む分画を１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して一晩透析した。
【００３１】
１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で予め平衡化した、約６ｍＬのＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍゲルを充填したカラム（１５ｍｍφ×７ｃｍ）に、上述のｃＨｉｓＧを含む分画を添加し、１０ｍＬの１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄した。０．１〜１．０Ｍの１０段階の塩化ナトリウム濃度勾配を含む１０ｍＬの１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、目的タンパク質を溶出し、溶出画分に含まれるタンパク質を通常法によるＳＤＳ／ＰＡＧＥにより確認し、目的タンパク質を含む分画を回収した。
【００３２】
（新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の５量体形成に関する解析）
ＳＤＳ／ＰＡＧＥによってＧタンパク質の５量体を観察した（図５）。ＳＤＳサンプル緩衝液５μＬにｃＨｉｓＧ溶液（１．１７ｍｇ/ｍＬ）５μＬを混ぜ、加熱する、あるいは加熱せずにその３μＬを電気泳動に供した。標準分子量マーカーは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ用タンパク質マーカー（１０倍濃縮）（ナカライテスク社）を使用した。
【００３３】
その結果、加熱せずに泳動したＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、１１０ｋＤａ付近に単一のバンドが確認された。これは、単量体のＧタンパク質の分子量である、２２ｋＤａの丁度５倍の分子量であり、このことから、Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、溶液中で５量体を形成していることが示唆された。
【００３４】
次に、Ｎａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥを用いて、ＳＤＳ非存在下での新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の溶液内均一性を観察した（図６）。ＳＤＳが含まれていないＮａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥサンプル緩衝液５μＬに対して、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）（５８．６μＭ）溶液５μＬを混合し、その３μＬを電気泳動に供した。
【００３５】
又、比較対象として、非特許文献１に記載されている方法によって調製した、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したＧタンパク質（ＨｉｓＧ）（４３μＭ）を同様の操作で電気泳動に供した。さらに、主に単量体として、一部二量体として存在することが一般的に知られているタンパク質として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（ナカライテスク社）（５ｍｇ／ｍＬ）を同様の操作で電気泳動に供した。
【００３６】
その結果、Ｎ末端にヒスチジンタグ配列を連結したＧタンパク質（ＨｉｓＧ）では、１から３量体に対応する複数種類のタンパク質バンドが確認されたのに対して、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は単一の大きなバンドが確認された。これによって、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、溶液内で従来のＧタンパク質（ＨｉｓＧ）よりも大きなサイズのただ一種類の多量体を形成していることが判った。
【００３７】
上述の２種類の電気泳動実験（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、
Ｎａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥ）の結果から、新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は溶液内で５量体を形成している可能性が示唆されたため、ｃＨｉｓＧをセファクリルＳ−２００高分解能カラム（１６ｍｍφ×６０ｃｍ）を用いたゲルろ過分析に供し、分子量を推定した。
【００３８】
あらかじめＴＢＳ（１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．４）で平衡化したゲルろ過カラムに対して、１ｍＬのｃＨｉｓＧを含むＴＢＳ溶液（１．１７ｍｇ／ｍＬ）、又は、分子量標準マーカーとなるチログロブリン、γ−グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、ビタミンＢ１２を含む、ゲル濾過標準試料（バイオラッド社）を添加して、流速０．４０ｍＬ/分でＴＢＳを流した。標準試料の分子量の対数（ｌｏｇ分子量）をＸ軸として、分配係数ＫａｖをＹ軸として描いた検量線（図７）を得て、ｃＨｉｓＧの分配係数からその分子量を比較推定した。
【００３９】
その結果、ｃＨｉｓＧは、約１１７ｋＤａに相当する位置に溶出され、ゲル濾過法によっても、本発明の新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）が溶液中で５量体を形成していることを確認できた。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の好適な実施の形態を実施例によって説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態によって限定されるものでなく、その要旨を変更することなく様々に改変して実施することができる。
（大腸菌Ｃ株の増殖抑制）
５量体スパイクＧタンパク質は、バクテリオファージφＸ１７４が宿主菌に感染する際にファージ遺伝子を通す通路として働くと考えられている。従って、本発明によって得られた溶液内で５量体を形成する能力を有する新規Ｇタンパク質（ｃＨｉｓＧ）は、宿主大腸菌Ｃ株の膜に突き刺さり、その中心部の孔から細菌の内容物が流出する結果、大腸菌を死滅させる、あるいは、増殖を阻害する能力があると考えられる。
【００４１】
−８０℃に保存した大腸菌Ｃ株フリーズストックを１白金耳取り、５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌して、３７℃で約３．５時間、６００ｎｍにおける吸光度が０．４５になるまで振盪培養した。この培養液をＬＢ液体培地で段階希釈し、２．２５×１０３ｃｆｕ／ｍＬの大腸菌が存在するように調整した。希釈した菌体液１００μＬにｃＨｉｓＧを終濃度で２０μＭ、及び２７μＭになるように添加し、これらを３７℃で３０分保温した。
【００４２】
その後、混合物を新しいＬＢ寒天培地にまき、３７℃で一夜培養した。２０μＭのｃＨｉｓＧタンパク質を加えた場合には、大腸菌Ｃ株のコロニーが減る傾向が見られた。又、２７μＭのｃＨｉｓＧタンパク質を加えた場合には、大腸菌Ｃ株のコロニーはわずか２個に減少した。これらの結果は、５量体スパイクＧタンパク質が大腸菌Ｃ株の増殖を顕著に抑制する能力をもつことを示す。
【００４３】
本発明による新規５量体Ｇタンパク質は、宿主細菌の膜に突き刺さり、５量体の中心に空いた孔から菌の内容物を流出させることを作用機作として、菌の増殖を２０μＭの濃度で中程度に、そして、２７μＭの濃度でほぼ完全に抑制する。
【００４４】
これまで、長い生物の歴史上でバクテリアに感染するファージが継続的に存在してきた事実を考えると、本発明の５量体スパイクＧタンパク質に対して、細菌が耐性を獲得する可能性は極めて低いと考えられ、従って、本発明による新規５量体スパイクＧタンパク質は、これまでにない新しい方法論によって特定の細菌の増殖を抑制することを可能にした、極めて有用な抗菌物質になる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明による５量体スパイクＧタンパク質は、例えば次のようにして利用することができる。食品、若しくは飲料に当該タンパク質を添加する、当該タンパク質を含有する溶液を抗菌作用を発揮させたい対象にスプレー等を用いて噴霧する、当該タンパク質を含有する溶液に食器、布、若しくは器具等を浸漬する、又は当該タンパク質を含有する乳液を、物質や皮膚に塗布する等が挙げられる。
【００４６】
又、本発明のｃＨｉｓＧに対して、ＦＩＴＣやダンシルによる蛍光誘導体化、あるいは、ビオチン修飾などを施すことによって、顕微鏡下や試験管内あるいは、多穴試験プレート上において、蛍光を発する性質を利用する、あるいは、ビオチン−アビジン反応を利用するなどにより、特定の細菌を検出する方法に応用することもできる。
【００４７】
さらに、本発明の利用形態は、そのタンパク質であることに由来する水溶性や生分解性、毒性や抗原性が事実上無視できる特性、あるいは、特定の宿主菌に優れた選択性を示す特性を活かして利用されるのであれば、上記に限られるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】バクテリオファージφＸ１７４由来の５量体スパイクＧタンパク質を遺伝子工学的手法により、組み換え大腸菌ＪＭ１０９株において大量発現するための発現プラスミドを作成する方法を示す概略図である。
【図２】ｐＱＥｃＧによって形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株に対してＩＰＴＧによる組み替えタンパク質誘導と発現の経時的変化を示すＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図３】Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｎｉ−ニトリロトリ酢酸）親和性クロマトグラフィーによるＧタンパク質の精製過程を分析したＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図４】ＣＭ−セルロファインＣ−５００ｍ陽イオン交換クロマトグラフィーによるＧタンパク質の精製過程を分析したＳＤＳ／ＰＡＧＥの写真である。
【図５】ＳＤＳ／ＰＡＧＥによりスパイクＧタンパク質５量体が形成されていることを確認した結果を示す写真である。
【図６】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）と５量体を形成しない従来のＧタンパク質（ＨｉｓＧ）をＮａｔｉｖｅ／ＰＡＧＥによって比較分析した結果を示す写真である。
【図７】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）の分子量をゲルろ過によって推定したグラフである。
【図８】５量体スパイクＧタンパク質（ｃＨｉｓＧ）による大腸菌Ｃ株に対する増殖抑制効果を確認した結果を示す写真である。