(57)【要約】【課題】同一タンパク質に由来するペプチド種を重複して分析することを回避することができる質量分析システムを提供する。【解決手段】１回目の分析において、MS２マススペクトルから試料に含まれるタンパク質のうちタンパク質データベースに既に格納されているタンパク質候補をリアルタイムにて推定する。２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、タンパク質候補に含まれるペプチドを親イオンの選択対象から除外する。【選択図】図１
2008039608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を分離する試料分離部と、分離した試料をイオン化するイオン化部と、イオン化した試料の質量分析を行う質量分析部と、質量対電荷比（ｍ/z）毎にイオン強度を測定するイオン検出部と、タンパク質に関するデータを格納したタンパク質データベースと、を有し、
試料をイオン化するイオン化処理、該イオン化した試料を質量分析してMSマススペクトルを得るMS質量分析処理、該MSマススペクトルのピークから親イオンを選択して解離する親イオン選択及び解離処理、及び、解離した親イオンを質量分析してMS２マススペクトルを得るMS２質量分析処理、を含む分析を繰り返して実行するとき、
１回目の分析において、上記MS２マススペクトルを用いて試料に含まれるタンパク質のうち上記タンパク質データベースに格納されているタンパク質候補をリアルタイムにて推定し、
２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記タンパク質候補に含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とする質量分析システム。
【請求項２】
請求項１記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記タンパク質候補を推定するとき、上記MS２マススペクトルのピークからアミノ酸配列を解読し、該解読したアミノ酸配列を検索キーとして上記タンパク質データベースを検索することを特徴とする質量分析システム。
【請求項３】
請求項１記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記タンパク質候補の推定精度を計算し、２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記推定精度が所定の閾値より大きいタンパク質候補に含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とする質量分析システム。
【請求項４】
請求項３記載の質量分析システムにおいて、上記推定精度は、上記タンパク質データベースから検索したタンパク質候補の全アミノ酸配列に対して、MSマススペクトルから解読したアミノ酸配列が含まれる割合によって表わされることを特徴とする質量分析システム。
【請求項５】
請求項３記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記推定精度が所定の閾値より大きいタンパク質候補に含まれるペプチドに関する情報を取得してペプチドリストを作成し、２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、該ペプチドリストに含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とする質量分析システム。
【請求項６】
請求項５記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記ペプチド情報を取得するとき、上記タンパク質候補を酵素によって分解し、得られたペプチドの質量を各アミノ酸の質量から計算することを特徴とする質量分析システム。
【請求項７】
請求項５記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記ペプチド情報を取得するとき、試料に既知のタンパク質が含まれている場合には、該既知のタンパク質のペプチドを上記ペプチドリストに登録することを特徴とする質量分析システム。
【請求項８】
請求項１記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記タンパク質候補を推定するとき、既知のタンパク質について検定用のMS２マススペクトルを予め求め、それを上記タンパク質データベースに登録し、この検定用のMS２マススペクトルと、１回目の分析で取得したMS２マススペクトルを比較することにより、タンパク質候補の推定を行うことを特徴とする質量分析システム。
【請求項９】
請求項１記載の質量分析システムにおいて、１回目の分析において、上記MS２マススペクトルからタンパク質候補を推定するとき、推定精度が低い場合には、該MS２マススペクトルのピークから親イオンを選択して解離する親イオン選択及び解離処理、及び、解離した親イオンを質量分析してMS３マススペクトルを得るMS３質量分析処理、を行うことを特徴とする質量分析システム。
【請求項１０】
請求項１記載の質量分析システムにおいて、
１回目の分析において、上記タンパク質候補の推定精度を計算し、上記タンパク質候補に含まれるペプチドに関する情報を取得し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値より大きいタンパク質候補のペプチドに関する情報を第１のペプチドリストに登録し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値に満たないタンパク質候補のペプチドに関する情報を第２のペプチドリストに登録し、２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記第１のペプチドリストのペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１１】
請求項１０記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、ＭＳマススペクトルのピークに対する第２のペプチドリストのペプチドの含有率を計算し、該含有率が所定の閾値を超えているペプチドを第２のペプチドリストから第１のペプチドリストに移転することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１２】
請求項１０記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記第１のペプチドリストのペプチドを親イオンの選択対象から除去し、更に、MSマススペクトルの残ったピークに対して親イオンを選択するための優先順位を設定することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１３】
請求項１２記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、親イオンを選択するための優先順位を設定するとき、MSマススペクトルの残ったピークを第２のペプチドリストのペプチドと比較し、一致するピークに対してボーナスを与え、タンパク質候補毎に、このような比較とボーナスの付与を行い、MSマススペクトルの残った全てのピーク毎のボーナスの累計値を求め、この累計値の大きい順を、上記優先順位とすることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１４】
試料を分離する試料分離部と、分離した試料をイオン化するイオン化部と、イオン化した試料の質量分析を行う質量分析部と、質量対電荷比（ｍ/z）毎にイオン強度を測定するイオン検出部と、タンパク質に関するデータを格納したタンパク質データベースと、を有し、
試料をイオン化するイオン化処理、該イオン化した試料を質量分析してMSマススペクトルを得るMS質量分析処理、該MSマススペクトルのピークから親イオンを選択して解離する親イオン選択及び解離処理、及び、解離した親イオンを質量分析してMS２マススペクトルを得るMS２質量分析処理、を含む分析を繰り返して実行するとき、
１回目の分析において、上記MS２マススペクトルから試料に含まれるタンパク質のうち上記タンパク質データベースに既に格納されているタンパク質候補をリアルタイムにて推定し、上記タンパク質候補の推定精度を計算し、上記タンパク質候補に含まれるペプチドに関する情報を取得し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値より大きいタンパク質候補のペプチドに関する情報を第１のペプチドリストに登録し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値に満たないタンパク質候補のペプチドに関する情報を第２のペプチドリストに登録し、
２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記第１のペプチドリストのペプチドを親イオンの選択対象から除外し、更に、MSマススペクトルの残ったピークに対して親イオンを選択するための優先順位を設定することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１５】
請求項１４記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、ＭＳマススペクトルのピークに対する第２のペプチドリストのペプチドの含有率を計算し、該含有率が所定の閾値を超えているペプチドを第２のペプチドリストから第１のペプチドリストに移転することを特徴とする質量分析システム。
【請求項１６】
請求項１４記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、親イオンを選択するための優先順位を設定するとき、MSマススペクトルの残ったピークを第２のペプチドリストのペプチドと比較し、一致するピークが多い順を、上記優先順位とすることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１７】
請求項１４記載の質量分析システムにおいて、２回目の分析において、親イオンを選択するための優先順位を設定するとき、MSマススペクトルの残ったピークを第２のペプチドリストのペプチドと比較し、一致するピークに対してボーナスを与え、タンパク質候補毎に、このような比較とボーナスの付与を行い、MSマススペクトルの残った全てのピーク毎のボーナスの累計値を求め、この累計値の大きい順を、親イオンとして選択する優先順位とすることを特徴とする質量分析システム。
【請求項１８】
試料をイオン化するイオン化処理、該イオン化した試料を質量分析してMSマススペクトルを得るMS質量分析処理、該MSマススペクトルのピークから親イオンを選択して解離する親イオン選択及び解離処理、及び、解離した親イオンを質量分析してMS２マススペクトルを得るMS２質量分析処理、を含む分析を繰り返して試料に含まれるタンパク質を同定するタンデム型質量分析方法において、
１回目の分析において、上記MS２マススペクトルから試料に含まれるタンパク質のうち上記タンパク質データベースに既に格納されているタンパク質候補をリアルタイムにて推定し、
２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記タンパク質候補に含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【請求項１９】
請求項１８記載のタンデム型質量分析方法において、１回目の分析において、上記タンパク質候補の推定精度を計算し、上記タンパク質候補に含まれるペプチドに関する情報を取得し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値より大きいタンパク質候補のペプチドに関する情報を第１のペプチドリストに登録し、上記タンパク質候補のうち上記推定精度が所定の閾値に満たないタンパク質候補のペプチドに関する情報を第２のペプチドリストに登録し、２回目の分析において、ＭＳマススペクトルのピークに対する第２のペプチドリストのペプチドの含有率を計算し、該含有率が所定の閾値を超えているペプチドを第２のペプチドリストから第１のペプチドリストに移転し、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、上記第１のペプチドリストに含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択することを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【請求項２０】
請求項１８記載のタンデム型質量分析方法において、２回目の分析において、上記第１のペプチドリストのペプチドを親イオンの選択対象から除外し、更に、MSマススペクトルの残ったピークに対して親イオンを選択するための優先順位を設定することを特徴とするタンデム型質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は質量分析システムおよび質量分析方法に関し、特にタンパク質、ポリペプチド等の生体高分子を分析するための質量分析システム、分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な質量分析方法では、対象となる試料をイオン化して、それらのイオンを質量分析装置へ送る。質量分析装置では、送られてきたイオンに対して質量（ｍ）と価数（ｚ）の比からなる質量対電荷比（ｍ/z）毎にイオン強度を測定する。この結果として、横軸が質量対電荷比（ｍ/z）、縦軸がイオン強度のマススペクトルを得ることができる。
【０００３】
質量分析方法には、試料をイオン化しそのまま測定するMS分析法と試料をイオン化して測定した後に、ある特定のイオンを選択し解離させて測定するタンデム質量分析法がある。タンデム質量分析法において解離の対象となるイオンを親イオンと呼ぶ。タンデム質量分析法では、解離させたイオンから得たマススペクトルから更に親イオンを選択し解離させて質量分析するといったように、多段に解離と質量分析を行う機能がある。以降、ｎ段目の質量分析をMSｎ質量分析と呼ぶ。また、試料をイオン化して測定して得られるマススペクトルをMSマススペクトル、MSマススペクトルより選択した親イオンを解離させて測定して得られるマススペクトルをMS２マススペクトル、MS２マススペクトルより選択した親イオンを解離させて測定して得られるマススペクトルをMS３マススペクトル等と呼ぶ。
【０００４】
タンデム質量分析が行えるほとんどの質量分析装置では、MSマススペクトルから親イオンを自動的に選択してイオン解離を行う機能を有する。
【０００５】
生体試料のような様々な成分を多く含む試料に対しては、クロマトグラフと質量分析装置を組み合わせたシステムが多用される。クロマトグラフにおいて物質のカラムへの吸着度の違い等から試料中の成分が時間的に分離されることにより、質量分析装置では分離が困難なイオン種の分離が可能となる。
【０００６】
質量分析システムでは、１度の測定において分析を繰り返して行う。このとき、同一タンパク質に由来するペプチド種を重複して解離して分析する。同成分を重複して分析することは試料や時間を浪費することとなる。そこで同成分の重複分析を行わないための手法が特許文献１や特許文献２に記載されている。
【０００７】
（１）特許文献１の方法では、タンデム質量分析においてN回目までに解離を行ったイオンの情報（イオン質量、イオン強度、マススペクトルの質など）をリアルタイムに内部データベースとして登録する。この内部データベースの情報を利用してN+１回目の測定において親イオン選択の制限を行う。
【０００８】
（２）特許文献２の方法では、タンデム質量分析において保持時間を用いて親イオンの選択を制限する。具体的には、MS２マススペクトルデータからアミノ酸配列を予測し、そのアミノ酸配列から予想される保持時間と実際の保持時間を比較する。比較の結果、一致する場合はそのアミノ酸配列を信頼性の高いデータとみなして測定を終了し、一致しない場合には他の親イオンの解離またはMS３質量分析を行いさらに情報の取得を行う。
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−９１３４４
【特許文献２】特開２００５−２４１２５１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
特許文献１に記載された方法では、親イオンの選択に制限を与えることができるのは、同一質量の成分のみである。タンパク質を酵素で分解し生成するペプチドは複数ある。あるペプチドを分析したときに、そこからタンパク質が十分に予想しうる場合は、そのタンパク質に由来するペプチド以外のものを分析することが効率的といえるが、特許文献１の方法では既に分析したペプチドしか選択の制限を行えない。
【００１１】
また、特許文献２に記載された方法では、特許文献１と同様に親イオンの選択の制限を行えるのはある質量の成分のみであり、同一タンパク質に由来するペプチドの選択の制限を行うことはできない。
【００１２】
本発明の目的は、同一タンパク質に由来するペプチド種を重複して解離して分析することを回避することができる質量分析システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によると、１回目の分析において、MS２マススペクトルを用いて試料に含まれるタンパク質のうちタンパク質データベースに既に格納されているタンパク質候補をリアルタイムにて推定する。２回目の分析において、親イオンの選択を行うとき、MSマススペクトルのピークのうち、タンパク質候補に含まれるペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、同一タンパク質に由来するペプチド種を重複して解離して分析することを回避することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下に本発明の実施例を示す。図１を参照して本発明による質量分析装置の概要を説明する。本例の質量分析装置は、試料分離部１２、イオン化部１３、質量分析部１４、イオン検出部１５、制御部１６、ユーザ入力部１７、表示部１８、データ処理部１９、及び、タンパク質データベース２０を有する。
【００１６】
上述のように、質量分析方法には、試料をイオン化し、それを質量分析し、MSマススペクトルを得るMS質量分析法と、MSマススペクトルから１個のペプチドを親イオンとして選択し、それを解離させ、質量分析し、MS２マススペクトルを得るタンデム質量分析法がある。タンデム質量分析法は、解離段階ごとに親イオンの分子構造情報を得られるため、親イオンの構造を推定する上で有効となる。以下では、タンデム質量分析法について説明する。
【００１７】
試料分離部１２は、液体クロマトグラフ（LC）、ガスクロマトグラフ（GC）等によって構成される。イオン化部１３は、エレクトロスプレーイオン化（ESI）、大気圧化学イオン化（APCI）、電子イオン化（EI）、化学イオン化（CI）等のイオン化方法を用いてイオン化を行う。これらのイオン化法のうち、分析の対象とする試料や分析の目的に応じたイオン化法が選択される。
【００１８】
質量分析部１４は、タンデム質量分析が可能な四重極型質量分析装置、イオントラップ型質量分析装置等によって構成される。親イオンの解離方法には、衝突解離（Collision  Induced  Dissociation）法や電子捕獲解離（Electron  Capture  Dissociation）法などがある。衝突解離法はヘリウムなどのバッファーガスをイオンに衝突させて解離する方法であり、電子捕解離法は、低エネルギーの電子を照射し、親イオンに多量に低エネルギー電子を捕獲させることにより解離する方法である。イオン検出部１５は、質量対電荷比（ｍ/z）毎にイオン強度を測定する。
【００１９】
制御部１６は、タンデム質量分析法の一連の分析過程を制御する。ユーザ入力部１７は、分析処理や装置を制御するためのユーザインターフェースである。表示部１８は、マススペクトル等の分析結果を表示する。データ処理部１９は、MSマススペクトルの生成、親イオンの選択、MS２マススペクトルの生成等を行う。タンパク質データベース２０は、タンパク質に関する既知のデータを格納する。
【００２０】
図２を参照して、タンデム質量分析法によってタンパク質を測定する一般的な処理の概要を説明する。先ずステップＳ１０１にて、試料分離部１２に、試料を含む溶液を導入する。ステップＳ１０２にて、試料分離部１２は、試料を分離する。上述のように、試料の分離法には、液体クロマトグラフ（LC）、ガスクロマトグラフ（GC）等がある。図３（ａ）は、試料の分離結果を示す。上述のようにカラムへの吸着度等の差から、時間的に分離された成分の強度のピークが現れる。このように試料の時間的な分離結果をクロマトグラム３０１と呼ぶ。
【００２１】
ステップＳ１０３にて、イオン化部１３は、このように時間的に分離された試料をイオン化する。ステップＳ１０４にて、質量分析部１４は質量分析を行う。これをMS質量分析と称する。ステップＳ１０５にて、MS質量分析の結果を得る。これをMSマススペクトルと称する。ステップＳ１０６にて、MSマススペクトルより、１個のペプチドを親イオンとして選択して解離する。通常、MSマススペクトルのピークのうち最も強度が大きいピークを親イオンとして選択する。ステップＳ１０７にて、解離したイオンを質量分析部１４によって質量分析を行う。これをMS２質量分析と称する。ステップＳ１０８にて、MS２質量分析の結果を得る。これを、MS２マススペクトルと称する。
【００２２】
MSマススペクトル及びMS２マススペクトルは、横軸が質量対電荷比（ｍ/ｚ）、縦軸がイオン強度のピーク（細い棒グラフ）である。MS２マススペクトルには、試料のタンパク質の分子構造を推定するための情報が含まれており、この情報を元にしてタンパク質を推定することが可能である。
【００２３】
ステップＳ１０３のイオン化から、ステップＳ１０４のMS質量分析、ステップＳ１０５のMSマススペクトルの取得、ステップＳ１０６の親イオンの選択及び解離、ステップＳ１０７のMS２質量分析、ステップＳ１０８のMS２マススペクトルの取得までの一連の処理を分析と称する。ステップS１０９にて、再分析を行うか否かを判定する、再分析を行う場合にはステップS１０３に戻る。再分析を行わない場合には、ステップＳ１１０に進む。ステップＳ１１０にて、MS２マススペクトル対する後処理を行う。後処理では、ノイズ除去、ピーク判定、同位体ピーク除去等を行い、既知のタンパク質の情報が蓄積されたタンパク質データベース２０を検索して、タンパク質の同定を行う。
【００２４】
図３（ａ）は、上述のように試料分離部１２によって得られたクロマトグラム３０１の例を示す。クロマトグラムは、時間的に分離された成分強度のピークを含む。図３（ｂ）は、クロマトグラフ３０１と分析サイクルの関係を示す。分析３０２は、図２のステップＳ１０３のイオン化から、ステップＳ１０８のMS２マススペクトルの取得までの一連の処理である。図示のように、クロマトグラムが得られると、各成分毎に分析３０２が繰返し行われていることが判る。１回の分析３０２に要する分析時間３０３は、分析条件や装置条件等により異なる。１回の測定で多くの分析３０２を行うためには、分析時間３０３は短いことが望ましい。
【００２５】
このように時間的に分離して得られるクロマトグラフ３０１に対して、繰り返し分析３０２を行うことで、様々なイオンのMS２マススペクトルが取得できる。それによって、試料に含まれるタンパク質の構造情報を蓄積していくのが一般的である。
【００２６】
タンデム質量分析方法では、タンパク質の同定結果の精度や同定するタンパク質の数は、MS２マススペクトルに依存し、MSマススペクトルからどのように親イオンを選択するかが重要となる。
【００２７】
そこで、本発明では、１回目の分析にて、MS２マススペクトルを取得すると、そのアミノ酸解読を行い、リアルタイムで、タンパク質データベースを検索する。タンパク質データベース２０に、同一のアミノ酸配列が存在する場合には、そのアミノ酸配列が由来するタンパク質は既に実験済みであると考える。そこで、２回目の分析にて、そのタンパク質に由来する全てのペプチドを親イオンの選択対象から除外する。即ち、そのタンパク質に由来するペプチド以外のペプチドを親イオンとして選択する。こうして、既に、タンパク質データベース２０に格納されているタンパク質に由来するペプチドの重複測定を回避することができる。
【００２８】
図４、図５及び図６を参照して本発明によるタンデム質量分析方法の第１の例を説明する。ステップＳ２０１からステップＳ２０８までは、図２を参照して説明した従来のタンデム質量分析方法と同一であってよい。即ち、ステップＳ２０１にて、試料分離部１２に、試料を含む溶液を導入する。ステップＳ２０２にて、試料分離部１２は、試料を分離する。ステップＳ２０３にて、イオン化部１３は、試料をイオン化する。ステップＳ２０４にて、質量分析部１４は、MS質量分析を行う。ステップＳ２０５にて、MSマススペクトルを得る。ステップＳ２０６にて、MSマススペクトルより１個のペプチドを親イオンとして選択し、解離する。ステップＳ２０７にて、質量分析部１４は、解離した親イオンに対してMS２質量分析を行う。ステップＳ２０８にて、MS２マススペクトルを得る。
【００２９】
ステップＳ２０９にて、データ処理部１９は、MS２マススペクトルを用いてタンパク質候補の推定を行う。即ち、MS２マススペクトルからアミノ酸配列を解読し、それをタンパク質データベース２０から検索する。検索結果として、そのアミノ酸配列を含むと推定されるタンパク質を列挙する。こうしてタンパク質候補のリストを得る。タンパク質候補は、タンパク質データベース２０を検索して得られたものである。このようなタンパク質に関するデータは十分に得られていると考えられる。従って、このようなタンパク質候補については重複して分析を行う必要はない。そこで、２回目の分析にて、タンパク質候補に含まれるペプチドを親イオンの選択対象から除外する。
【００３０】
タンパク質候補の推定方法の例は、後に、図７を参照して説明する。データ処理部１９は、各タンパク質候補の推定精度を計算する。
【００３１】
ステップＳ２１０にて、データ処理部１９は、推定精度が閾値Xより大きいタンパク質候補があるか否かを判定する。推定精度が閾値Xより大きいタンパク質候補がある場合には、ステップS２１１に進み、推定精度が閾値Xより大きいタンパク質候補がない場合には、１回目の分析は終了し、次の２回目の分析に移る。
【００３２】
ステップＳ２１１にて、データ処理部１９は、推定精度が閾値Xよりも大きいタンパク質候補のペプチド情報の取得を行う。即ち、推定精度が閾値Ｘよりも大きいタンパク質候補に由来するペプチドの質量を求める。ペプチド情報の取得処理の詳細は、後に、図８を参照して説明する。
【００３３】
ステップＳ２１２にて、データ処理部１９は、ペプチド情報の登録を行う。即ち、ペプチドの質量（ｍ）をペプチドリスト６００に登録する。ペプチドリスト６００は、図６（ａ）に示すように、ペプチド名６０１、そのアミノ酸配列６０２、及び、その質量６０３のリストである。
【００３４】
こうして、MS２マススペクトルを用いてタンパク質候補を推定し、推定したタンパク質候補に関するペプチド情報の取得及び登録処理が終了すると、１回目の分析は終了し、次の２回目の分析に移る。
【００３５】
図５を参照して本発明による質量分析方法の第１の例の２回目の分析を説明する。ステップＳ３０１にて、イオン化部１３は、試料をイオン化する。ステップＳ３０２にて、質量分析部１４は、MS質量分析を行う。ステップＳ３０３にて、MSマススペクトルを得る。
【００３６】
ステップＳ３０４にて、データ処理部１９は、MSマススペクトルのピークのうち、ペプチドリスト６００に含まれるデータを親イオンの選択対象より除外する。図６（ｂ）は、MSマススペクトルを示す。この例では、×印のデータの質量がペプチドリストに含まれる。従って、×印のデータを親イオンの選択対象から除外する。
【００３７】
ステップＳ３０５にて、MSマススペクトルより１個のペプチドを親イオンとして選択し、解離する。上述のように、MSマススペクトルのピークからペプチドリスト６００のデータと同一のデータは除外されている。ステップＳ３０６にて、質量分析部１４は、解離した親イオンに対してMS２質量分析を行う。ステップＳ３０７にて、MS２マススペクトルを得る。ステップＳ３０８にて、MS２マススペクトルの後処理を行い、タンパク質を同定する。
【００３８】
こうして、２回目の分析が終了する。図４の１回目の分析と図５の２回目の分析を比較すると、図５の２回目の分析ではステップＳ３０４の処理が付加されている点が異なる。
【００３９】
図６を参照して、本発明の質量分析方法の主要部を説明する。図６（ａ）は、ペプチドリスト６００の例を示す。ペプチドリスト６００は、ペプチド名６０１、ペプチド配列６０２、ペプチド配列の質量６０３のデータを含み、タンパク質候補毎に作成される。従って、各ペプチドリスト６００にはタンパク質名が付与されている。ステップＳ３０３にて得られるMSマススペクトルは、横軸が質量対電荷比（ｍ/ｚ）、縦軸がイオン強度のピーク（細い棒グラフ）である。本発明によると２回目以降の分析では、ステップＳ３０５の親イオンの選択の処理の前に、ステップＳ３０６にてペプチドリスト６００を参照し、そこに登録されている質量（ｍ）と同一のマススペクトルのピークを除外する。ペプチドリスト６００に登録されているデータは、タンパク質データベース２０から得たものである。従って、そのようなペプチド由来のタンパク質に関しては既に、十分に情報が得られていると考えられる。従って、このようなペプチドリスト６００に登録されているペプチドを、親イオンの選択対象から除去することにより、重複した分析を回避することができる。
【００４０】
図６の例では、MSマススペクトルにて×印のピークの質量がペプチドリストに含まれる。従って、×印のピークを、親イオンの選択対象から除去する。
【００４１】
尚、MSマススペクトルのピークの横軸は質量対電荷比（ｍ/ｚ）である。一方、ペプチドリストにはペプチドの質量が登録されている。そこで、両者を比較するには、MSマススペクトルのピークの質量対電荷比（ｍ/ｚ）を質量（ｍ）へ変換する必要がある。そこでMSマススペクトル上に現れる同位体ピーク同士のピーク間隔より価数（ｚ）を求め、それを質量対電荷比（ｍ/ｚ）に乗算すればよい。
【００４２】
また、MSマススペクトルのピークの質量とペプチドリストの質量は完全に一致している必要は無く、略等しければよい。例えば、MSマススペクトルのピークの質量ｍが求められたら、それを中心とする質量範囲（ｍ±Δｍ）を設定する。ペプチドリストの質量が、質量範囲（ｍ±Δｍ）に含まれる場合には、一致すると判定してよい。
【００４３】
図７を参照して、図４のステップＳ２０９のタンパク質候補の推定処理の詳細を説明する。ステップＳ７１にて、データ処理部１９は、MS２マススペクトルよりアミノ酸配列の解読を行う。即ち、親イオンとして選択したペプチドのアミノ酸配列の解読を行う。アミノ酸解読の対象となるMS２マススペクトルは、今回の分析にて取得したMS２マススペクトルばかりでなく前回の分析にて取得したMS２マススペクトルも含む。例えば、今回の分析が２回目の分析なら、１回目から２回目までに取得したMS２マススペクトルを用いる。
【００４４】
分析毎に、その回に得られたMS２マススペクトルよりアミノ酸配列の解読を行ってもよいが、分析毎に、過去の回から今回までに得られた全てのMS２マススペクトルよりアミノ酸配列の解読を行ってもよい。
【００４５】
アミノ酸配列の解読には、de novoシーケンス法を用いてよい。この方法では、MS２マススペクトルに存在するピーク間隔を読み取ることによりアミノ酸配列の解読する。
【００４６】
ステップＳ７２にて、データ処理部１９は、解読されたアミノ酸配列をキーにして、タンパク質データベース２０を検索する。即ち、MS２マススペクトルより解読して得たアミノ酸配列を含むタンパク質をタンパク質データベース２０から検索し、それをタンパク質候補とする。
【００４７】
データ処理部１９は、タンパク質候補リスト７００を作成する。タンパク質候補リスト７００は、タンパク質名７０１、その推定精度７０２、及びそのタンパク質を構成するアミノ酸配列７０３を含む。
【００４８】
本例では、推定精度は、タンパク質データベース２０から検索して得たタンパク質に含まれるアミノ酸に対するMS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列の含有率である。例えば、「タンパク質１」の推定精度は３０％である。これは、「タンパク質１」に含まれるアミノ酸配列のうち、MS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列の割合が３０％であり、残りの７０％はMS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列以外のアミノ酸配列であることを意味する。
【００４９】
図８を参照して、ステップＳ２１１のタンパク質候補に関するペプチド情報の取得処理を説明する。ペプチド情報の取得処理では、タンパク質候補をペプチドに分解する。ただし、過去の分析において既にペプチド分解され、ペプチドリストに登録されたタンパク質候補については、重複となるため除外する。タンパク質は消化酵素によって切断され、断片化する。この断片化されたものがペプチドである。消化酵素によって切断されるアミノ酸が決まっているため、消化酵素によってどのようにタンパク質がペプチド化されるかがわかる。
【００５０】
図８は、消化酵素としてトリプシンを使用した例を示す。トリプシンを消化酵素として用いると、タンパク質のアミノ酸配列は、リシン（K）とアルギニン（R）の間で切断される。図示のように、タンパク質候補８０１は、トリプシンによって切断され、複数のペプチド８０２が生成される。これらのペプチド８０２に含まれるアミノ酸の質量は既知だから、各ペプチドの質量を算出８０３することができる。ステップＳ２１２にて、各タンパク質候補に対して、タンパク質名、アミノ酸名、アミノ酸配列、及び、質量をペプチドリスト６００へ登録する。
【００５１】
図９に、本発明による質量分析システムのユーザインターフェース（ＵＩ）、即ち、表示部１８の入力画面の例を示す。本例の入力画面９００は、ピーク排除実施条件９０１及びタンパク質検索条件９０４を含む。ピーク排除実施条件９０１は、推定精度閾値（％）９０２、及び、質量一致精度（ａｍｕ）９０３を含む。タンパク質検索条件９０４は、MS２解析質量精度（ａｍｕ）９０５、消化酵素９０６、タンパク質データベース９０７、及び、分類（Ｔａｘｎｏｍｙ）９０８を含む。
【００５２】
ピーク排除実施条件９０１は、分析全体に関わるパラメータを設定するフィールドである。推定精度閾値（％）９０２は、図４のステップＳ２１０の推定精度の比較処理に用いる閾値Xを設定するフィールドである。質量一致精度（ａｍｕ）９０３は、図５のステップＳ３０４のMSマススペクトルのピークのうちペプチドリストにあるデータを親イオンの選択対象から除去する処理に用いる。即ち、MS２マススペクトルのピークとペプチドリストのペプチドの質量を比較する際の質量範囲（Δｍ）を指定するためのフィールドである。
【００５３】
タンパク質検索条件９０４は、図４のステップＳ２０９のMS２マススペクトルからタンパク質候補を推定する処理に関するパラメータ等を設定するフィールドである。MS２解析質量精度（ａｍｕ）９０５は、図７のステップＳ７１のアミノ酸配列の解読処理において、MS２マススペクトルのピーク間隔とアミノ酸質量を一致とみなす質量誤差範囲を指定するフィールドである。消化酵素フィールド９０６、タンパク質データベースフィールド９０７、分類（Ｔａｘｎｏｍｙ）フィールド９０８は、図７のステップＳ７２のデータベース検索処理において、タンパク質データベース２０の検索を行う条件を指定するフィールドである。本例では、タンパク質データベース２０の検索条件として３つの条件を用いるが、他の条件、例えば、使用した装置の種類やタンパク質の修飾の条件等を用いることも可能である。但し、消化酵素９０６は、ステップＳ２１１のペプチド情報の取得処理において、タンパク質のアミノ酸配列からペプチド配列を取得する際にも使用するため、必須の指定項目である。
【００５４】
図１０に、本発明による質量分析システムのユーザインターフェース（ＵＩ）、即ち、表示部１８の出力画面の例を示す。本例の出力画面１０００は、タンパク質リスト１００１、クロマトグラム表示部１００５、ＭＳマススペクトル表示部１００６、及び、MS２マススペクトル表示部１００７を有する。タンパク質リスト１００１には、タンパク質１００２が順に表示され、最後に、その他１００３が表示される。タンパク質１００２は、図７に示したタンパク質候補リスト７００のタンパク質７０１である。
【００５５】
タンパク質１００２の１つをクリックすると、そのタンパク質候補に含まれるアミノ酸配列のうち、MS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列１００４が表示される。タンパク質候補１００２の１つをダブルクリックすると、図１１に示すように、そのタンパク質の全アミノ酸配列１１００が別ウインドウに表示される。例えば、「タンパク質２」に含まれるアミノ酸配列の３０％は、MS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列であり、７０％は、MS２マススペクトルから解読したアミノ酸配列以外のアミノ酸配列である。「タンパク質２」をクリックすると３０％のアミノ酸配列が表示され、「タンパク質２」をダブルクリックすると全てのアミノ酸配列が別ウインドウに表示される。
【００５６】
その他１００３には、MS２マススペクトルから解読されたアミノ酸配列のうち、どのタンパク質にも由来しないアミノ酸配列が表示される。
【００５７】
アミノ酸配列１００４の１つを選択すると、それが太字表示に切り替えられ、このアミノ酸配列を解読したときに用いられたMS２マススペクトルがMS２マススペクトル表示部１００７に表示され、親イオンを選択するときに用いられたMSマススペクトルがMSマススペクトル表示部１００６に表示され、試料の分離結果であるクロマトグラムがクロマトグラム表示部４２に表示される。
【００５８】
ＭＳマススペクトル画面１００６において、親イオンとして選択されたピークは他のピークとは異なる色で表示され、その質量の値が表示される。MS２マススペクトル画面１００７では、ピーク間隔に対して読み取ったアミノ酸配列が表示される。
【００５９】
次に本発明による質量分析方法の第２の例を説明する。図４及び図５に示した第１の例では、ステップＳ２０９にて、de novoシーケンス法を用いてMS２マススペクトルからアミノ酸配列の解読を行い、タンパク質候補の推定を行った。本例では、既知のタンパク質から検定用のMS２マススペクトルを予めタンパク質データベース２０に用意する。この検定用のMS２マススペクトルと、分析で取得したMS２マススペクトルを比較することにより、タンパク質候補の推定を行う。例えば、ＭＡＳＣＯＴにおけるＭＳ/ＭＳ  Ｉｏｎ  Ｓｅａｒｃｈを用いる。
【００６０】
次に本発明による質量分析方法の第３の例を説明する。図４及び図５に示した第１の例では、MS質量分析とMS２質量分析の２段の質量分析を行った。本例では、ステップＳ２０９のタンパク質候補の推定処理において、推定精度が低い場合には、３段以上の質量分析を行う。上述のように、ステップＳ２０９のタンパク質候補の推定処理の詳細は図７に示されている。図７のステップＳ７１のアミノ酸配列の解読処理において、MS２マススペクトルから十分にアミノ酸配列が解読できない場合には、MS３質量分析を行う。即ち、MS２マススペクトルから１個の親イオンを選択し、解離し、MS３質量分析を行う。
【００６１】
本例によると、図７のステップＳ７１のアミノ酸配列の解読処理において、アミノ酸配列の解読数の閾値Ｎを設定する。この閾値Ｎは、固定値でも構わないが、図９に示した入力画面９００にてユーザが設定できることが好ましい。
【００６２】
ステップＳ２０９のタンパク質候補の推定処理において、MS２マススペクトルを解読して得たアミノ酸数を閾値Ｎと比較し、閾値Ｎを満たさない場合は、MS３質量分析を行う。図７を参照して説明したように、ステップＳ７１にて、データ処理部１９は、MS２マススペクトル及びMS３マススペクトルよりアミノ酸配列の解読を行う。解読数が閾値Ｎ以上である場合には、ステップＳ２１０に進む。解読数が閾値Ｎに満たない場合は、MS４質量分析を行う。MS２マススペクトル、MS３マススペクトル及びMS４マススペクトルよりアミノ酸配列の解読を行う。こうして、解読数が閾値Ｎ以上となるまで、MSｎ質量分析を繰り返す。これにより、MS２質量分析では、十分に分解されないようなイオンについて対応することができる。
【００６３】
次に本発明による質量分析方法の第４の例を説明する。図４及び図５に示した例１では、ステップＳ２１１にて、推定精度が高いタンパク質候補に対してペプチド情報の取得を行い、ステップＳ２１２にてペプチドの質量（ｍ）をペプチドリスト６００に登録した。しかしながら、本例では、試料に既知のタンパク質が含まれている場合には、それをペプチドリストに登録する。それ以外のタンパク質については、図７に示した方法によりペプチド情報を取得して登録する。また、同一試料について繰り返し分析を行う場合は、過去のペプチドリストを継続して利用することにより、重複分析を回避し効率のよい試料の測定を行うことができる。
【００６４】
図１２及び図１３を参照して、本発明による質量分析方法の第５の例を説明する。第１の例では、ステップＳ３０５にて、ＭＳマススペクトルのピークから１つのピークを選んで、それを親イオンとした。１回の分析では、ＭＳマススペクトルに現れた一つペプチドのアミノ酸配列の情報のみが得られる。従って、ＭＳマススペクトルのピークのうち親イオンとして選択されたピーク以外のピークの情報が有効的に利用されていない。そこで、本例では、ＭＳマススペクトルの情報を効率的に利用する。
【００６５】
図１２を参照して本発明による質量分析方法の第５の例の１回目の分析を説明する。ステップＳ４０１〜ステップＳ４０９までは、図４に示した第１の例のステップＳ２０１〜ステップＳ２０９までと同様であってよい。
【００６６】
本例によると、ステップＳ４１０にて、推定した全てのタンパク質候補についてペプチド情報の取得を行う。図４に示した第１の例では、推定精度が閾値Xよりも大きいタンパク質候補についてペプチド情報を取得した。しかしながら、本例では、全てのタンパク質候補についてペプチド情報の取得を行う。
【００６７】
ステップＳ４１１にて、ペプチド情報を２つのペプチドリストに振り分ける。タンパク質候補の推定精度を予め設定した閾値Ｙと比較する。ステップＳ４１２にて、推定精度が閾値Ｙよりも大きいタンパク質候補のペプチドの質量を、第１のペプチドリストに登録する。ステップＳ４１３にて、推定精度が閾値Ｙ以下のタンパク質候補のペプチドの質量を、第２のペプチドリストに登録する。こうして１回目の分析を終了し、次に２回目の分析を行う。
【００６８】
図１３を参照して本発明による質量分析方法の第５の例の２回目の分析を説明する。ステップＳ５０１にて、イオン化部１３は、試料をイオン化する。ステップＳ５０２にて、質量分析部１４は、MS質量分析を行う。ステップＳ５０３にて、MSマススペクトルを得る。
【００６９】
ステップＳ５０４にて、データ処理部１９は、第２のペプチドリストのペプチドの質量に対応するピークがＭＳマススペクトルに存在するか否かを調べる。即ち、ＭＳマススペクトルにおける第２のペプチドリストのペプチドの含有率を算出する。ステップＳ５０５にて、その含有率が閾値Ｚを超えているタンパク質候補を抽出し、そのペプチドの質量を第２のペプチドリストから第１のペプチドリストに移転する。本例では、第２のペプチドリストのペプチドであっても、２回目の分析にて、ＭＳマススペクトルに対する含有率が閾値Ｚを超えている場合には、そのタンパク質候補は、タンパク質データベース２０に格納されていると考えられる。従って、このようなタンパク質候補については重複して分析を行う必要はない。こうして、第１のペプチドリストに移転されたペプチドは、親イオンの選択対象から除外される。
【００７０】
ステップＳ５０６にて、データ処理部１９は、MSマススペクトルのピークのうち、第１のペプチドリストに含まれるデータを親イオンの選択対象より除外する。ステップＳ５０７にて、MSマススペクトルより１個のペプチドを親イオンとして選択し、解離する。上述のように、MSマススペクトルのピークから第１のペプチドリストのデータと同一のデータは除外されている。
【００７１】
ステップＳ５０８からステップＳ５１０の処理は、ステップＳ３０６からステップＳ３０８の処理と同様であってよい。
【００７２】
こうして本例では、２回目の分析にて得られたＭＳマススペクトルの情報を有効に利用してタンパク質候補に由来するペプチドが他に存在するかについて判定を行うことができる。
【００７３】
図１４を参照して、本発明による質量分析方法の第６の例を説明する。第５の例では、２回目の分析において、第２のペプチドリストのペプチドは、ＭＳマススペクトルにおける含有率が高いものを第１のペプチドリストに移転する。本例では、２回目の分析において、第２のペプチドリストのペプチドを、親イオンの選択の優先順位を設定するために使用する。
【００７４】
本例では、１回目の分析は、第５の例と同様である。即ち、図１２のステップＳ４０１からステップＳ４１３が１回目の分析である。
【００７５】
図１４を参照して本発明による質量分析方法の第６の例の２回目の分析を説明する。ステップＳ６０１にて、イオン化部１３は、試料をイオン化する。ステップＳ６０２にて、質量分析部１４は、MS質量分析を行う。ステップＳ６０３にて、MSマススペクトルを得る。
【００７６】
ステップＳ６０４にて、データ処理部１９は、MSマススペクトルのピークのうち第１のペプチドリストにあるデータを親イオンの選択対象から除外する。ステップＳ６０５にて、データ処理部１９は、MSマススペクトルの残ったピークに対して親イオンを選択するための優先順位を設定する。優先順位は、MSマススペクトルの残った全てのピークに対して、第２のペプチドリストのペプチドの質量と比較する。一致するピークに対してボーナスを与える。タンパク質候補毎に、このような比較とボーナスの付与を行い、ピーク毎のボーナスの累計値を求める。この累計値の大きい順を、親イオンとして選択する優先順位とする。ここで、ピークとペプチドの質量が一致したときに与えるボーナスはある固定の値でも構わないが、タンパク質候補の推定精度等の条件よって変動するようなものが好ましい。例えば、推定精度が高いタンパク質候補の場合には、高いボーナスを設定し、推定精度が低いタンパク質候補の場合には、低いボーナスを設定する。このようにタンパク質候補の推定精度に基づいてボーナスを設定し、優先順位を与えることにより、試料中に含有している可能性が高いと考えられるタンパク質に由来するペプチドを親イオンとして選択することができる。
【００７７】
ステップＳ６０６にて、データ処理部１９は、親イオンを選択し、それを解離する。親イオンの選択対象は、MSマススペクトルのピークのうち第１のペプチドリストにあるデータを除外した残りのピークである。これらのピークから優先順位の最も高いピークを親イオンとして選択する。
【００７８】
ステップＳ６０７からステップＳ６０９は図１３のステップＳ５０８からステップＳ５１０の処理と同様であってよい。
【００７９】
以上、本発明の例を説明したが本発明は上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明の質量分析システムの構成を示す図である。
【図２】従来のタンデム質量分析方法の処理の概略を示す図である。
【図３】試料分離部によって得られるクロマトグラムと分析の繰返しを示す図である。
【図４】本発明のタンデム質量分析方法の第１の例の１回目の分析処理の概略を示す図である。
【図５】本発明のタンデム質量分析方法の第１の例の２回目の分析処理の概略を示す図である。
【図６】本発明のタンデム質量分析方法の第１の例の２回目の分析処理において、MSマススペクトルのピークから親イオンの選択対象から除外する処理を説明するための図である。
【図７】本発明のタンデム質量分析方法の第１の例の１回目の分析処理において、タンパク質候補の推定処理を説明するための図である。
【図８】本発明のタンデム質量分析方法の第１の例の１回目の分析処理において、ペプチド情報の取得処理を説明するための図である。
【図９】本発明の質量分析システムの入力画面の例を示す図である。
【図１０】本発明の質量分析システムの出力画面の例を示す図である。
【図１１】本発明の質量分析システムの出力画面において、分析結果のアミノ酸配列を表示する例を示す図である。
【図１２】本発明のタンデム質量分析方法の第５の例の１回目の分析処理を説明するための図である。
【図１３】本発明のタンデム質量分析方法の第５の例の２回目の分析処理を説明するための図である。
【図１４】本発明のタンデム質量分析方法の第６の例の２回目の分析処理を説明するための図である。
【符号の説明】
【００８１】
１２…試料分離部、１３…イオン化部、１４…質量分析部、１５…イオン検出部、１６…制御部、１７…ユーザ入力部、１８…表示部、１９…データ処理部、２０…タンパク質データベース
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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