(57)【要約】【課題】２種類の分析対象物質を同時に捕捉物質に相互作用させた時の結合様式が、競合的結合様式であるか独立的結合様式であるかどうかを判定するために用いる解離定数を算出する。【解決手段】化合物ＡおよびＢの総モル濃度が一定であり、当該化合物ＡおよびＢの組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる化合物ＡおよびＢが、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す溶媒補正レスポンス値を複数の試料溶液ごとに取得するパラメータ算出部１１と、競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と溶媒補正レスポンス値との関係から、捕捉物質に対する化合物Ｂの解離定数を算出する競合モデルパラメータ算出部１３とを備えている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得手段と、
上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得手段が取得した実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出手段とを備えることを特徴とする解離定数算出装置。
【請求項２】
上記競合モデル定数算出手段は、上記競合モデル式として、下記（１）式
ＲＵ＝ＣＡ×ＲｍａｘＡ／（ＣＡ＋ＫｄＡ＋ＫｄＡ×ＣＢ／ＫｄＢ）
＋ＣＢ×ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ／（ＣＢ＋ＫｄＢ＋ＫｄＢ×ＣＡ／ＫｄＡ）
・・・（１）
（ただし、上記（１）式において、ＲＵは、上記実測結合量であり、ＣＡは、上記第１分析対象物質の試料溶液中のモル濃度であり、ＣＢは、上記第２分析対象物質の試料溶液中のモル濃度であり、ＫｄＡは、上記第１解離定数であり、ＫｄＢは、上記第２解離定数であり、ＲｍａｘＡは、上記第１最大結合量であり、ＭＷＡは、上記第１分析対象物質の分子量であり、ＭＷＢは、上記第２分析対象物質の分子量である。）
を用いることを特徴とする請求項１に記載の解離定数算出装置。
【請求項３】
上記競合モデル定数算出手段は、上記（１）式の右辺に、測定誤差による変動を表す定数項が加えられた競合モデル式を用いることを特徴とする請求項２に記載の解離定数算出装置。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の解離定数算出装置を動作させる解離定数算出プログラムであって、コンピュータを上記各手段として機能させるための解離定数算出プログラム。
【請求項５】
請求項４に記載の解離定数算出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【請求項６】
上記実測結合量を取得し、上記第１および第２分析対象物質が上記１種類の捕捉物質に対して独立的結合様式を示す場合の数学モデル式である独立モデル式であって、上記第１解離定数と、上記第１最大結合量と、上記第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２解離定数を変数とする独立モデル式を用いて、第１および第２分析対象物質の総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と取得した実測結合量との関係から上記第２解離定数を独立第２解離定数として算出する独立モデル定数算出手段と、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の解離定数算出装置が算出した第２解離定数である競合第２解離定数を取得し、取得した競合第２解離定数と、上記独立モデル定数算出手段が算出した独立第２解離定数とが、それぞれ所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する判定手段とを備えることを特徴とする結合様式判定装置。
【請求項７】
上記判定手段は、上記競合第２解離定数および上記独立第２解離定数がともに上記所定の範囲内のものであると判定した場合に、上記関係が上記競合モデル式にどの程度一致するかを示す第１規準値と、上記関係が上記独立モデル式にどの程度一致するかを示す第２規準値とを比較することにより、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定することを特徴とする請求項６に記載の結合様式判定装置。
【請求項８】
解離定数算出装置における解離定数算出方法であって、
第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得工程と、
上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得工程において取得された実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出工程とを含むことを特徴とする解離定数算出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、捕捉物質と分析対象物質との結合量に基づいて、捕捉物質と分析対象物質との結合様式を判定する結合様式判定装置、当該結合様式の判定に用いる、捕捉物質に対する分析対象物質の解離定数を算出する解離定数算出装置および解離定数算出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
血漿中の薬物は、血漿タンパク質と結合している状態では薬理効果を現わさないため、薬効や副作用の強さは、薬物総濃度よりむしろ非結合型薬物濃度と良く相関する。よって、薬効や副作用の強さを調べるために、血漿中の非結合型薬物濃度を推定することが好ましい。血漿中の非結合型薬物濃度を推定するための方法として、薬物とタンパク質との結合能を測定する方法が挙げられる。
【０００３】
薬物を投与する場合、１種類の薬物のみが投与されることは少なく、複数の薬物が同時に投与されることが多い。上述のように薬効や副作用の発現に関連するのは非結合型薬物濃度であるため、２種類以上の薬物を共存させることにより非結合型薬物濃度が増加すれば、予期せぬ副作用が発現する可能性が高まる。
【０００４】
従って、併用が想定される薬物が血漿タンパク質結合に与える影響を予め調べておくことが好ましい。なお、その際、薬物が血漿タンパク質に結合する結合サイトが明らかであれば、同一結合サイトに結合する薬物は、競合的に結合する（他の薬物の結合を阻害する）可能性が高いことが予想できる。
【０００５】
タンパク質に対する２種類の薬物の結合様式は、独立的結合様式、競合的結合様式およびアロステリック的結合様式に分類できる。独立的結合様式の場合には、２種類の薬物を同時に投与しても、血漿中における各薬物の非結合型薬物濃度は、１種類のみを投与した場合と比較して増加しない。
【０００６】
一方、競合的結合様式およびアロステリック的結合様式の場合には、２種類の薬物を同時に投与すると、血漿中における少なくとも一方の薬物の非結合型薬物濃度は、当該薬物のみを投与した場合と比較して増加する。
【０００７】
競合的結合様式においては、結合サイトが特定されている場合があるが、アロステリック的結合様式の場合には、結合サイトは、ほとんど特定されておらず、薬物が酵素の活性中心以外のサイトに結合するという程度しか分かっていない場合が多い。当該活性中心以外のサイトに結合する２種類の薬物を共存させた場合、それらの薬物は互いに競合する可能性が高い。
【０００８】
ここで、タンパク質と薬物との相互作用を観察するための従来の手法について説明する。捕捉物質（リガンド）（例えば、タンパク質）と、当該捕捉物質に結合する分析対象物質（アナライト）（例えば、薬物）との結合状態を検出する手法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用する方法（以下、ＳＰＲ法と称する）が用いられている。
【０００９】
このＳＰＲ法では、金属薄膜からなるセンサー表面に捕捉物質を結合したセンサーチップを用いて、当該捕捉物質と分析対象物質との結合状態を表面プラズモン共鳴により生じる表面プラズモン共鳴シグナル（ＳＰＲシグナル）の変化として検出する。そして、検出されたＳＰＲシグナルの変化に対応するデータを解析することにより、捕捉物質と分析対象物質との相互作用を予測する。
【００１０】
より具体的には、ＳＰＲ法を用いたタンパク質と薬物との相互作用を観察するための方法では、タンパク質が、薬物と結合するための１種類の結合サイトを持つことを前提とした数学モデルを用いて、検出されたＳＰＲシグナルの変化に基づき、当該数学モデルにおける各々の結合パラメータを算出し、算出した結合パラメータにより、タンパク質に対する薬物の結合重量を算出する。このようなＳＰＲ法は、例えば、特許文献１および非特許文献１に記載されている。
【００１１】
上述のＳＰＲ法を用いてタンパク質に対する２種類の薬物の結合様式を判定する方法として非特許文献２に記載の方法を挙げることができる。この非特許文献２に記載の方法では、１種類のタンパク質に対して、２種類の薬物を別々に相互作用させた時のＳＰＲシグナルの変化量と、２種類の薬物を同時に上記タンパク質に相互作用させた時のＳＰＲシグナルの変化量とを測定している。
【００１２】
この非特許文献２に記載の方法では、タンパク質と２種類の薬物との間において、結合阻害が起こっているのかどうかを判定することができる。すなわち、タンパク質と２種類の薬物との間の結合様式が、１）独立的結合様式なのか、２）競合的結合様式、または競合的結合様式以外の結合阻害が生じる結合様式（例えば、アロステリック的結合様式）なのかを判定することができる。
【００１３】
また、タンパク質と薬物との結合様式を判定するための別の手法として、平衡透析や限外ろ過法が知られている。この限外ろ過法とは、溶液中に溶解している薬物を分離膜を用いて分離することにより、タンパク質と結合していない薬物の濃度を算出する方法である。
【００１４】
なお、特許文献２には、タンパク質が薬物との２種類以上の結合サイトを持つことが表現された数学モデルを利用して、ＳＰＲ法において、センサーチップの使用回数や使用日数等に応じた、当該センサーチップの劣化による解析結果への影響を回避する方法が記載されている。
【特許文献１】国際公開第００／７９２６８号パンフレット（２０００年１２月２８日公開）
【特許文献２】特開２００４−２５７７４１号公報（２００４年９月１６日公開）
【非特許文献１】Asa Frostell-Karlsson et. al.，Journal of Medical Chemistry, March 29, 2000, Vol.43, No.10, p.1986-1992.
【非特許文献２】Yasmina S.N. Day et. Al., Journal of Pharmaceutical Science, February, 2003, Vol.92, No.2, p333-343
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ところが、上記非特許文献２に記載の方法では、２種類の分析対象物質を同時に捕捉物質に相互作用させた時の結合様式を厳密に判定することは困難である。
【００１６】
例えば、非特許文献２に記載の方法では、捕捉物質と２種類の分析対象物質との間において、結合阻害が生じていることが判定できたとしても、その結合阻害が競合的結合によるものなのか、アロステリック的結合などの競合的結合以外の結合によるものなのかを判定することは困難である。
【００１７】
なぜなら、ＳＰＲ法では、２種類の分析対象物質を同時に捕捉物質に相互作用させた時に生じるＳＰＲシグナルは１つであるため、どちらの分析対象物質がどれだけ相互作用に関与しているのかを測定することが困難であるからである。
【００１８】
また、平衡透析や限外ろ過を用いる方法では、時間およびコストがかかるという問題がある。医薬品の開発初期段階では、非常に多種類の候補化合物が存在しているが、開発ステージが上がるにつれて、この集団から有望と思われる化合物が選抜されて化合物数が減少する。一般に医薬品開発では、開発ステージが上がるほど大きな開発コストがかかるため、望みのない候補化合物はできるだけ初期の段階で排除しておくことが求められている。
【００１９】
そのため、処理速度が遅い方法では、限られた化合物数しか処理できないため、処理速度が遅い方法は、必然的に開発ステージが高い段階での使用に限定される。
【００２０】
本発明は、上記の問題点を解決するためになされたもので、その目的は、２種類の分析対象物質を同時に捕捉物質に相互作用させた時の結合様式が、競合的結合様式であるか独立的結合様式であるかどうかを判定するために用いる解離定数を算出することができる解離定数算出装置、および当該解離定数を用いて、上記結合様式が競合的結合様式であるか独立的結合様式であるかどうかをハイスループットで判定することができる結合様式判定装置を提供することにある。なお、上記結合様式が競合的結合様式であるか独立的結合様式であるかどうかを判定できる結果、結合阻害現象が競合的結合によるものなのか、それ以外の結合様式によるものなのかを判定できるようになる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に係る解離定数算出装置は、上記の課題を解決するために、第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得手段と、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得手段が取得した実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出手段とを備えることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る結合解離定数算出方法は、上記の課題を解決するために、解離定数算出装置における解離定数算出方法であって、第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得工程と、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得工程において取得された実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出工程とを含むことを特徴としている。
【００２３】
上記の構成によれば、取得手段は、第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する。
【００２４】
競合モデル定数算出手段は、上記競合モデル式を用いて、取得手段が取得した実測結合量と、第１および第２分析対象物質の総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合（第２分析対象物質のモル分率）との関係から、第２分析対象物質の捕捉物質に対する解離定数（第２解離定数）を算出する。
【００２５】
上記第２解離定数を用いることにより、第１および第２分析対象物質が、捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定することができる。
【００２６】
２種類の分析対象物質を同時に１種類の捕捉物質に結合させたときの実測結合量は、例えば、ＳＰＲ法によって短時間で得られる。
【００２７】
それゆえ、第１および第２分析対象物質が、捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかの判定を、平衡透析、限外ろ過等を用いた従来の方法よりも短時間で行うことができる。
【００２８】
また、その結果、結合阻害現象が競合的結合によるものか、それ以外の結合様式によるものかを判定できる。
【００２９】
また、上記競合モデル定数算出手段は、上記競合モデル式として、下記（１）式
ＲＵ＝ＣＡ×ＲｍａｘＡ／（ＣＡ＋ＫｄＡ＋ＫｄＡ×ＣＢ／ＫｄＢ）
＋ＣＢ×ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ／（ＣＢ＋ＫｄＢ＋ＫｄＢ×ＣＡ／ＫｄＡ）
・・・（１）
（ただし、上記（１）式において、ＲＵは、上記実測結合量であり、ＣＡは、上記第１分析対象物質の試料溶液中のモル濃度であり、ＣＢは、上記第２分析対象物質の試料溶液中のモル濃度であり、ＫｄＡは、上記第１解離定数であり、ＫｄＢは、上記第２解離定数であり、ＲｍａｘＡは、上記第１最大結合量であり、ＭＷＡは、上記第１分析対象物質の分子量であり、ＭＷＢは、上記第２分析対象物質の分子量である。）
を用いることが好ましい。
【００３０】
上記の構成によれば、競合モデル定数算出手段は、上記競合モデル式を用いることにより第２解離定数を算出することができる。
【００３１】
また、上記競合モデル定数算出手段は、上記（１）式の右辺に、測定誤差による変動を表す定数項が加えられた競合モデル式を用いることが好ましい。
【００３２】
上記の構成によれば、競合モデル式に測定誤差による変動を表す定数項が加えられることにより、競合モデル定数算出手段は、第２解離定数をより正確に算出することができる。
【００３３】
本発明に係る結合様式判定装置は、上記の課題を解決するために、上記実測結合量を取得し、上記第１および第２分析対象物質が上記１種類の捕捉物質に対して独立的結合様式を示す場合の数学モデル式である独立モデル式であって、上記第１解離定数と、上記第１最大結合量と、上記第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２解離定数を変数とする独立モデル式を用いて、第１および第２分析対象物質の総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と取得した実測結合量との関係から上記第２解離定数を独立第２解離定数として算出する独立モデル定数算出手段と、上記解離定数算出装置が算出した第２解離定数である競合第２解離定数を取得し、取得した競合第２解離定数と、上記独立モデル定数算出手段が算出した独立第２解離定数とが、それぞれ所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する判定手段とを備えることを特徴としている。
【００３４】
上記の構成によれば、独立モデル定数算出手段は、上記独立モデル式を用いて、第１および第２分析対象物質の総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と取得した実測結合量との関係から、第２解離定数（独立第２解離定数）を算出する。判定手段は、競合第２解離定数と独立第２解離定数とが、それぞれ所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、第１および第２分析対象物質が捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する。
【００３５】
２種類の分析対象物質を同時に１種類の捕捉物質に結合させたときの実測結合量は、例えば、ＳＰＲ法によって短時間で得られる。
【００３６】
それゆえ、第１および第２分析対象物質が、捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかの判定を、平衡透析、限外ろ過等を用いた従来の方法よりも短時間で行うことができる。
【００３７】
また、上記判定手段は、上記競合第２解離定数および上記独立第２解離定数がともに上記所定の範囲内のものであると判定した場合に、上記関係が上記競合モデル式にどの程度一致するかを示す第１規準値と、上記関係が上記独立モデル式にどの程度一致するかを示す第２規準値とを比較することにより、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定することが好ましい。
【００３８】
上記の構成によれば、判定手段は、競合第２解離定数および独立第２解離定数がともに所定の範囲内のものであると判定した場合に、第１規準値と第２規準値とを比較することにより、第１および第２分析対象物質が捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する。
【００３９】
それゆえ、競合第２解離定数および独立第２解離定数がともに所定の範囲内のものである場合にも、結合様式の判定を行うことができる。
【００４０】
また、上記解離定数算出装置を動作させる解離定数算出プログラムであって、コンピュータを上記各手段として機能させるための解離定数算出プログラム、および当該解離定数算出プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体も本発明の技術的範囲に含まれる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明に係る解離定数算出装置は、以上のように、第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得手段と、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得手段が取得した実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出手段とを備える構成である。
【００４２】
本発明に係る解離定数算出方法は、以上のように、第１および第２分析対象物質の総モル濃度が一定であり、当該第１および第２分析対象物質の組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる上記第１および第２分析対象物質が、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の試料溶液ごとに取得する取得工程と、上記第１および第２分析対象物質が上記捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデル式である競合モデル式であって、上記第１分析対象物質と上記捕捉物質との解離定数である第１解離定数と、上記第１分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第１最大結合量と、上記第２分析対象物質が上記捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である第２最大結合量とを既知の値として含み、上記第２分析対象物質の上記捕捉物質に対する解離定数である第２解離定数を変数とする競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する第２分析対象物質のモル濃度の割合と上記取得工程において取得された実測結合量との関係から、上記第２解離定数を算出する競合モデル定数算出工程とを含む構成である。
【００４３】
それゆえ、上記第２解離定数を用いることにより、第１および第２分析対象物質が、捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明の実施の一形態について図１〜図１０に基づいて説明すれば、以下のとおりである。
【００４５】
（結合様式判定システム１の構成）
図１は、結合様式判定システム１の構成を示す機能ブロック図である。同図に示すように、結合様式判定システム１は、判定装置２、検出装置２１、出力装置２２を備えている。
【００４６】
結合様式判定システム１は、１種類の捕捉物質と、２種類の分析対象物質の混合物質との結合量を示すデータを解析する判定装置２を含むシステムであり、より詳細には、検出装置２１から出力された、捕捉物質と２種類の分析対象物質との結合に伴う表面プラズモン共鳴シグナルの変化を示すデータを判定装置２によって解析し、捕捉物質と２種類の分析対象物質との結合様式を判定するシステムである。
【００４７】
本実施形態において、捕捉物質とは、タンパク質であり、より具体的には、生体に含まれるタンパク質または当該タンパク質を人為的に改変したタンパク質である。これらのタンパク質は、生体から抽出されたものであってもよいし、人工発現系または人工合成系によって合成されたものであってもよい。
【００４８】
また、分析対象物質とは、捕捉物質と可逆的に結合する可能性が想定される低分子化合物である。当該低分子化合物の分子量は、概ね２０００未満である。
【００４９】
検出装置２１は、捕捉物質が結合されたセンサー表面を有するセンサーチップ３０（図２参照）に、分析対象物質を含む試料溶液を反応させることにより、捕捉物質と分析対象物質との結合状態を表面プラズモン共鳴シグナル（ＳＰＲシグナル）の変化として検出する検出装置である。検出装置２１の例として、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１０００（ビアコア社製：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｏｒｅ．ｃｏｍ）を挙げることができる。
【００５０】
なお、本明細書において用いる、「捕捉物質と分析対象物質との結合」という表現は、「捕捉物質と分析対象物質との相互作用」とも表現できる。つまり、上記「結合」とは、共有結合を意味しているわけではない。
【００５１】
図２は、検出装置２１が備えるセンサーチップ３０の構成を示す概略図である。同図に示すように、センサーチップ３０は、センサー表面３１、ガラス基板３２、凹部３４を有する流路系３３を備えている。凹部３４は、センサー表面３１で蓋をされて、フローセルを形成する。センサーチップ３０のセンサー表面３１上には、複数のフローセルが形成されており、複数のフローセルに同時に複数の試料を添加することができる。なお、センサーチップ３０の、センサー表面３１とは反対側の面には、プリズム３５が設けられている。
【００５２】
本実施形態では、検出装置２１は、センサーチップ３０のセンサー表面３１に１種類の捕捉物質を結合させ、２種類の分析対象物質（基準化合物および被験化合物）を含む試料溶液をセンサーチップ３０のフローセルに添加した時のＳＰＲシグナルの変化を検出する。センサーチップ３０に添加される試料溶液は、２種類の分析対象物質の、単位試料溶液当たりのモル数の比率がそれぞれ異なるものの、２種類の分析対象物質の、単位試料溶液当たりの総モル数は一定である複数の試料溶液である。
【００５３】
なお、本実施形態において、基準化合物とは、捕捉物質と結合する２種類の分析対象物質の一方であり、２種類の分析対象物質の混合試料を用いた結合様式判定実験の前に、捕捉物質に対する解離定数および最大結合量が求められている分析対象物質である。本実施形態では、便宜上、この基準化合物を化合物Ａ（第１分析対象物質）と称している。
【００５４】
一方、被験化合物とは、捕捉物質と結合する２種類の分析対象物質のうち、基準化合物とは異なる分析対象物質である。本実施形態では、便宜上、この基準化合物を化合物Ｂ（第２分析対象物質）と称している。
【００５５】
結合量をより精密に測定するために、２つのフローセルを用いる。すなわち、センサーチップ３０上の複数のフローセルのうちの１つに捕捉物質を化学的に固定し、他の１つのフローセルには何も固定化しない。捕捉物質を固定化したフローセルをアクティブセル、未処理のフローセルをリファレンスセルと称する。そして、これらアクティブセルおよびリファレンスセルの両方に同時に同じ試料溶液を添加する。後述するように、判定装置２は、アクティブセルから得られたデータをリファレンスセルから得られたデータで補正する。
【００５６】
なお、検出装置２１は、溶媒補正用検量線試料溶液をアクティブセルおよびリファレンスセルに添加した時のレスポンス値も出力する。上記溶媒補正用検量線試料とは、溶媒補正用の検量線を作成するための試料であり、化合物ＡおよびＢを含まない試料溶液、すなわち、溶媒のみの試料溶液であり、かつ、含有する有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド）の濃度を様々な段階に設定した試料溶液である。
【００５７】
上記溶媒には、生理的条件に近い緩衝液を使用する。当該溶媒として、例えば、ｐＨ
７．４のリン酸緩衝液を用いることができる。また、化合物ＡおよびＢの溶解補助剤として、少量の有機溶媒を溶媒に添加してもよい。当該有機溶媒として、例えば、ジメチルスルホキシドを１０％以下の濃度で、望ましくは７％以下の濃度で使用することができる。
【００５８】
出力装置２２は、判定装置２の判定結果を出力するものであり、例えば、レーザプリンタまたはディスプレイ装置である。
【００５９】
（判定装置２の構成）
図１に示すように、判定装置２は、取得部３、第１記憶部４、レスポンス増分算出部５、溶媒補正式導出部６、第２記憶部７、差レスポンス値算出部８、溶媒補正ファクター算出部９、溶媒補正レスポンス値算出部１０、パラメータ算出部（取得手段、競合モデル定数算出手段）１１、判定部（判定手段）１４、基準パラメータ判定部１９および出力制御部１８を備えている。
【００６０】
取得部３は、捕捉物質と化合物ＡおよびＢとの結合に伴うＳＰＲシグナルの変化を示すデータ（レスポンス値）を、各試料溶液の濃度と関連付けて検出装置２１から取得し、当該レスポンス値を第１記憶部４に格納する。より詳細には、取得部３は、化合物Ａ単独試料溶液、および化合物Ａと化合物Ｂとをともに含む混合試料溶液を添加する前後のレスポンス値を取得する。ＳＰＲシグナルの変化を示すデータ（レスポンス値）とは、具体的には、ＲＵ値（１０００ＲＵ≒１ｎｇ／ｍｍ２）として表示される、単位面積あたりの、分析対象物質の捕捉物質への結合量である。
【００６１】
検出装置２１から、２種類の分析対象物質の濃度の相対比率が異なる複数の試料溶液または溶媒補正用検量線試料溶液を添加した時の複数のレスポンス値が出力される。取得部３は、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして第１記憶部４に格納する。
【００６２】
レスポンス増分算出部５は、取得部３が取得した一群のレスポンス値のそれぞれについて、試料溶液を添加した後のレスポンス値から試料溶液を添加する前のレスポンス値を引いた値であるレスポンス増分を算出する。つまり、レスポンス増分算出部５は、試料溶液の添加に伴う実質的なレスポンス値の増分を算出する。
【００６３】
溶媒補正式導出部６は、センサーチップ３０に複数の溶媒補正用検量線試料溶液を添加した時の、各溶媒補正用検量線試料溶液の添加に対応したリファレンスセルのレスポンス値の増分（レスポンス増分）に対し、アクティブセルのレスポンス増分からリファレンスセルのレスポンス増分を引いた値（溶媒補正ファクターと称する）をプロットし、プロットした値に適当な関数（例えば１次の整関数）を回帰させて溶媒補正用検量線のための数式（以下、溶媒補正検量線用数式と称する）を導出する。理解を容易にするため、溶媒補正ファクターの算出方法を図３に、溶媒補正用検量線の一例を図４に示す。溶媒補正式導出部６は、導出した溶媒補正検量線用数式を第２記憶部７に格納する。
【００６４】
差レスポンス値算出部８は、アクティブセルのレスポンス値の増分からリファレンスセルのレスポンス値の増分を引いた値である差レスポンス値を算出し、算出した差レスポンス値を溶媒補正レスポンス値算出部１０へ出力する。
【００６５】
溶媒補正ファクター算出部９は、試料溶液添加に伴うリファレンスセルのレスポンス値の増分をレスポンス増分算出部５から取得し、取得したリファレンスセルのレスポンス値の増分に対応する溶媒補正ファクターを、第２記憶部７に格納された溶媒補正検量線用数式を用いて算出する。溶媒補正ファクター算出部９は、算出した溶媒補正ファクターを溶媒補正レスポンス値算出部１０へ出力する。
【００６６】
図５は、溶媒補正レスポンス値（実測結合量）を説明するための図である。溶媒補正レスポンス値算出部１０は、図５に示すように、差レスポンス値算出部８が算出した差レスポンス値から、溶媒補正ファクター算出部９が算出した溶媒補正ファクターを差し引いた値である溶媒補正レスポンス値を算出する。溶媒補正レスポンス値算出部１０は、算出した溶媒補正レスポンス値をパラメータ算出部１１または基準パラメータ判定部１９へ出力する。このとき、化合物Ａと化合物Ｂとをともに含む混合試料溶液の測定から得られた溶媒補正レスポンス値はパラメータ算出部１１に、化合物Ａ単独試料溶液の測定から得られた溶媒補正レスポンス値は基準パラメータ判定部１９へ出力される。
【００６７】
レスポンス増分算出部５、差レスポンス値算出部８、溶媒補正ファクター算出部９、溶媒補正レスポンス値算出部１０は、取得部３が取得した一群のデータとしての複数のレスポンス値のそれぞれについて、上述の各値の算出を行い、算出した各値を、当該値を得るに至った試料溶液中の分析対象物質Ａの濃度、または分析対象物質ＡおよびＢの割合と対応付けて出力する。レスポンス増分算出部５、溶媒補正式導出部６、差レスポンス値算出部８、溶媒補正ファクター算出部９、および溶媒補正レスポンス値算出部１０は、複数の試料溶液を、捕捉物質に対してそれぞれ添加することに伴う結合量の実質的な増分（実測結合量）を算出する増分算出部２０としての役割を果たす。
【００６８】
パラメータ算出部１１は、独立モデルパラメータ算出部（独立モデル定数算出手段）１２および競合モデルパラメータ算出部（解離定数算出装置、競合モデル定数算出手段）１３を備えている。
【００６９】
独立モデルパラメータ算出部１２は、溶媒補正レスポンス値算出部１０が算出した、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値に、２種類の分析対象物質が１種類の捕捉物質に対して独立的結合様式を示す場合の数学モデルである独立モデル式を非線形最小二乗法によって当てはめることで、当該独立モデル式のパラメータを算出する。
【００７０】
より詳細には、上記独立モデル式は、化合物Ａの捕捉物質に対する解離定数である解離定数Ａ（第１解離定数）と、化合物Ａが捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である最大結合量Ａ（第１最大結合量）と、化合物Ｂが捕捉物質へ結合し得る最大の結合量である最大結合量Ｂ（第２最大結合量）とを既知の値として含み、化合物Ｂの捕捉物質に対する解離定数（解離定数Ｂ（第２解離定数）と称する）を変数として含むものである。
【００７１】
独立モデルパラメータ算出部１２は、この独立モデル式を用いて、各試料溶液中の化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合（換言すれば、複数の試料溶液に含まれる各化合物の濃度）と、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値との関係から解離定数Ｂを算出する。
【００７２】
また、独立モデルパラメータ算出部１２は、各試料溶液中の化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値との関係に独立モデル式を当てはめた時の、残差平方和および最適オフセット値を算出する。独立モデル式の詳細については後述する。
【００７３】
競合モデルパラメータ算出部１３は、溶媒補正レスポンス値算出部１０が算出した、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値に、２種類の分析対象物質が１種類の捕捉物質に対して競合的結合様式を示す場合の数学モデルである競合モデル式を当てはめることによって当該競合モデル式のパラメータを算出する。
【００７４】
より詳細には、上記競合モデル式は、解離定数Ａと、最大結合量Ａと、最大結合量Ｂとを既知の値として含み、解離定数Ｂを変数として含むものである。
【００７５】
競合モデルパラメータ算出部１３は、この競合モデル式を用いて、各試料溶液中の化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値との関係から、解離定数Ｂを算出する
また、競合モデルパラメータ算出部１３は、各試料溶液中の化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と、複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値との関係に競合モデル式を当てはめた時の、残差平方和および最適オフセット値を算出する。競合モデル式の詳細については後述する。
【００７６】
パラメータ算出部１１は、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した独立モデル式由来の残差平方和、解離定数Ｂおよび最適オフセット値、および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した競合モデル式由来の残差平方和、解離定数Ｂおよび最適オフセット値を判定部１４へ出力する。
【００７７】
なお、パラメータ算出部１１は、溶媒補正レスポンス値、化合物ＡおよびＢの試料溶液中の濃度、解離定数Ａおよび最大結合量Ａを取得する取得部としての機能も有している。換言すれば、パラメータ算出部１１は、化合物ＡおよびＢの総モル濃度が一定であり、当該化合物ＡおよびＢの組成比が互いに異なる複数の試料溶液に含まれる化合物ＡおよびＢが、１捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を複数の試料溶液ごとに取得する。
【００７８】
判定部１４は、競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）（競合第２解離定数）と、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）（独立第２解離定数）とが、それぞれ所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、化合物ＡおよびＢが捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する。判定部１４は、第１比較部１５、第２比較部１６および第３比較部１７を備えている。
【００７９】
第１比較部１５は、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した、解離定数Ｂおよび最適オフセット値を取得し、これらの値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定する。
【００８０】
第２比較部１６は、競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値を取得し、これらの値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定する。
【００８１】
第３比較部１７は、競合モデルの残差平方和と独立モデルの残差平方和とが一定比率以上離れているかどうかを判定する。
【００８２】
判定部１４は、第１比較部１５、第２比較部１６および第３比較部１７の判定結果から、２種類の分析対象物質が、捕捉物質に対して独立的結合様式を示すのか、競合的結合様式を示すのか、アロステリック的結合様式を示すのかという最終的な判定を行い、判定結果を出力制御部１８へ出力する。判定部１４における判定方法の詳細については後述する。
【００８３】
基準パラメータ判定部１９は、基準パラメータ算出部１９ａおよび判定部１９ｂを備えている。
【００８４】
基準パラメータ算出部１９ａは、後述する（２）式を用いて、溶媒補正レスポンス値算出部１０が算出した、濃度の異なる化合物Ａ（基準化合物）の複数の試料溶液ごとの溶媒補正レスポンス値および当該試料溶液における化合物Ａの濃度から、化合物Ａの捕捉物質に対する解離定数（解離定数Ａと称する）、化合物Ａの捕捉物質に対する最大結合量（最大結合量Ａと称する）および最適オフセット値を算出する。基準パラメータ算出部１９ａは、算出した各パラメータを判定部１９ｂへ出力する。
【００８５】
判定部１９ｂは、基準パラメータ算出部１９ａが算出した各パラメータが所定の範囲内のものであるかどうかを判定する。判定部１９ｂにおける判定方法の詳細については後述する。判定部１９ｂは、判定結果を出力制御部１８へ出力する。
【００８６】
出力制御部１８は、判定部１４および判定部１９ｂから出力された判定結果を出力装置２２を制御することによりユーザに報知する。
【００８７】
（数学モデル式の導出）
（独立モデルの導出）
捕捉物質と分析対象物質との一対一の結合（独立的結合）を仮定したときの溶媒補正レスポンス値を表す数学モデル式（独立モデル式）の導出方法について以下に説明する。
【００８８】
固定化タンパク質（捕捉物質）と試料溶液中の化合物（分析対象物質）とが一対一で結合しうる時、ＳＰＲ法において観測されるレスポンス値は下記の（１）式で表される。
【００８９】
Ｒｅｑ＝Ｃ×Ｒｍａｘ／（Ｃ＋Ｋｄ）      ・・・（１）
ただし、上記（１）式において、Ｒｅｑは、平衡時のレスポンス値（ＲＵ）であり、Ｃは、添加試料溶液中の化合物濃度であり、Ｒｍａｘは、化合物の固定化タンパク質に対する最大結合量（ＲＵ）であり、Ｋｄは、化合物の固定化タンパク質に対する解離定数（ｍｏｌ/Ｌ）である。
【００９０】
単一の化合物と固定化タンパク質との間の一対一の結合を評価する場合には、測定誤差によるベースライン変動を表す定数項（ｏｆｆｓｅｔ）を追加した下記（２）式を用いる。
【００９１】
Ｒｅｑ＝Ｃ×Ｒｍａｘ／（Ｃ＋Ｋｄ）＋ｏｆｆｓｅｔ      ・・・（２）
一方、固定化タンパク質と結合することが出来る化合物ＡおよびＢが添加試料溶液中に２種類共存し、それらの化合物ＡおよびＢが互いに相手の結合に影響しない時、観測される結合量（ＲＵ値）は（１）式表される化合物Ａの結合量（ＲｅｑＡ）と、（１）式で表される化合物Ｂの結合量（ＲｅｑＢ）との和で表現することができる（下記（３）式）。
【００９２】
Ｒｕ＝ＲｅｑＡ＋ＲｅｑＢ
＝ＣＡ×ＲｍａｘＡ／（ＣＡ＋ＫｄＡ）＋ＣＢ×ＲｍａｘＢ／（ＣＢ＋ＫｄＢ）  ・・・（３）
ここで化合物Ａ及び化合物Ｂの最大結合量（ＲｍａｘＡおよびＲｍａｘＢ）は、化合物ＡおよびＢの濃度をそれぞれ無限に大きくした時に観測される、化合物Ａ及び化合物Ｂの固定化タンパク質への結合量（ＲＵ値）である。換言すれば、最大結合量とは、分析対象物が捕捉物質へ結合することができる最大の結合量である。
【００９３】
ところで、ＳＰＲ法におけるレスポンスは、センサーチップへ結合した物質の質量に概ね依存することが知られている。よって、化合物ＡおよびＢがともに固定化タンパク質と一対一で結合する条件下において、化合物Ａ及びＢの最大結合量をモル量で表記すると、これらの値は、下記（４）式および（５）式のように表現できる。
【００９４】
化合物Ａの最大結合量（ｍｏｌ）＝ＲｍａｘＡ／ＭＷＡ      ・・・（４）
化合物Ｂの最大結合量（ｍｏｌ）＝ＲｍａｘＢ／ＭＷＢ      ・・・（５）
上記（４）式において、ＭＷＡは化合物Ａの分子量であり、上記（５）式において、ＭＷＢは化合物Ｂの分子量である。
【００９５】
また同時に、下記（６）式が成立する。
【００９６】
タンパク質の固定化量（ｍｏｌ）＝化合物Ａの最大結合量（ｍｏｌ）
＝化合物Ｂの最大結合量（ｍｏｌ）・・・（６）
この（６）式の第２辺と第３辺とに着目すると、ＲｍａｘＢは、ＲｍａｘＡと化合物Ａ及びＢの分子量とを用いて表現できることがわかり、その式は、下記（７）式として表すことができる。
【００９７】
ＲｍａｘＢ＝ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ      ・・・（７）
上記（７）式を（３）式に代入し、測定誤差によるベースライン変動を表す定数項（ｏｆｆｓｅｔ）を追加すると下記（８）式（独立モデル式）が得られる。
【００９８】
Ｒｕ＝ＲｅｑＡ＋ＲｅｑＢ
＝ＣＡ×ＲｍａｘＡ／（ＣＡ＋ＫｄＡ）＋ＣＢ×ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ／（ＣＢ＋ＫｄＢ）＋ｏｆｆｓｅｔ      ・・・（８）
（競合モデル式の導出）
捕捉物質に対する、基準化合物と被験化合物との競合的結合阻害を仮定したときの溶媒補正レスポンス値を表す数学モデル式である競合モデル式の導出方法について以下に説明する。
【００９９】
添加試料溶液中に化合物ＡとＢとの２種類が共存し、それらの化合物が互いに相手の結合を競合的に阻害する時の状況を図６に示す。同図に示すように、固定化タンパク質のうち、化合物ＡおよびＢのいずれとも結合していないフリーのタンパク質は存在しうるが、化合物ＡとＢとは競合するので、両者が１つの固定化タンパク質分子に同時に結合することはない。今、化合物ＡもＢも結合していない固定化タンパク質（フリーの部分）の全てに化合物Ａが結合している仮想的状況を考える時、化合物Ａの最大結合量（モル量）は下記（９）式で表される。
【０１００】
ＲｍａｘＡ／ＭＷＡ＝（ＲｅｑＡ＋ＲｆＡ）／ＭＷＡ＋ＲｅｑＢ／ＭＷＢ    ・・・（９）
上記（９）式において、ＲｆＡは、フリーの固定化タンパク質の全てに化合物Ａが結合した場合に得られる結合量である。
【０１０１】
（９）式におけるＲｅｑＢを下記（１０）式および（１１）式を用いて消去する。
【０１０２】
ＫｄＢ＝ＲｆＢ×ＣＢ／ＲｅｑＢ      ・・・（１０）
ＲｆＡ／ＭＷＡ＝ＲｆＢ／ＭＷＢ      ・・・（１１）
上記（１１）式において、ＲｆＢは、フリーの固定化タンパク質の全てに化合物Ｂが結合した場合に得られる結合量である。
【０１０３】
その結果、下記（１２）式が得られる。
【０１０４】
ＲｍａｘＡ＝ＲｅｑＡ＋ＲｆＡ（１＋ＣＢ／ＫｄＢ）        ・・・（１２）
次いで、（１２）式のＲｆＡを下記（１３）式を用いて消去する。
【０１０５】
ＫｄＡ＝ＲｆＡ×ＣＡ／ＲｅｑＡ      ・・・（１３）
その結果、下記（１４）式が得られる。
【０１０６】
ＲｍａｘＡ＝ＲｅｑＡ（１＋ＫｄＡ／ＣＡ＋ＫｄＡ×ＣＢ／（ＣＡ×ＫｄＢ））        ・・・（１４）
化合物Ｂについても上記と同様の導出を行うと、次式（１５）が得られる。
【０１０７】
ＲｍａｘＢ＝ＲｅｑＢ（１＋ＫｄＢ／ＣＢ＋ＫｄＢ×ＣＡ／（ＣＢ×ＫｄＡ））        ・・・（１５）
実験で観測される溶媒補正レスポンスは、平衡時の化合物Ａの結合量と平衡時の化合物Ｂの結合量との和であるが、これを（１４）式、（１５）式および（７）式を用いて整理すると下記（１６）式で表わされる。
【０１０８】
Ｒｕ＝ＲｅｑＡ＋ＲｅｑＢ
＝ＲｍａｘＡ／（１＋ＫｄＡ／ＣＡ（１＋ＣＢ／ＫｄＢ））
＋ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ／（１＋ＫｄＢ／ＣＢ（１＋ＣＡ／ＫｄＡ））      ・・・（１６）
最後に、この（１６）式の右辺に測定誤差によるベースライン変動を表す定数項（ｏｆｆｓｅｔ）を加え、さらに整理すると次の競合モデル式（１７）が得られる。
【０１０９】
Ｒｕ＝ＣＡ×ＲｍａｘＡ／（ＣＡ＋ＫｄＡ＋ＫｄＡ×ＣＢ／ＫｄＢ）
＋ＣＢ×ＲｍａｘＡ×ＭＷＢ／ＭＷＡ／（ＣＢ＋ＫｄＢ＋ＫｄＢ×ＣＡ／ＫｄＡ）
＋ｏｆｆｓｅｔ      ・・・（１７）
（結合様式判定システム１における処理の流れ）
（溶媒補正用検量線作成のための処理の流れ）
図７は、結合様式判定システム１における溶媒補正用検量線作成処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【０１１０】
まず、ユーザは、溶媒補正用検量線試料溶液を、捕捉物質（例えば、ヒト血清由来アルブミン）を固定化したセンサーチップと固定化していないセンサーチップとに同時に添加する。
【０１１１】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、溶媒補正用検量線試料溶液の添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間および溶媒補正用検量線試料溶液に含まれる有機溶媒の濃度と対応づけて判定装置２へ出力する（Ｓ１）。
【０１１２】
判定装置２の取得部３は、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして取得し、当該レスポンス値を第１記憶部４に格納する。
【０１１３】
レスポンス増分算出部５は、第１記憶部４から一群のレスポンス値を取得し、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、溶媒補正用検量線試料溶液の添加直前のレスポンス値に対する、溶媒補正用検量線試料溶液添加後のレスポンス値の増分を、溶媒補正用検量線試料溶液ごとに算出する（Ｓ２）。
【０１１４】
例えば、レスポンス増分算出部５は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、溶媒補正用検量線試料の添加１０秒前のレスポンス値に対し、試料溶液添加終了５秒前のレスポンス値の増分を算出する。レスポンス増分算出部５は、算出した増分を溶媒補正式導出部６へ出力する。
【０１１５】
溶媒補正式導出部６は、リファレンスセルのレスポンス増分に対し、溶媒補正ファクターをプロットし、プロットした溶媒補正用検量線試料溶液ごとの各点に適当な関数を回帰させて溶媒補正検量線用数式を導出し（Ｓ３）、導出した溶媒補正検量線用数式を第２記憶部７に格納する。
【０１１６】
（解離定数Ａを算出するための処理の流れ）
次に、独立および競合モデル式を利用して結合様式の判定を行うために必要な、化合物Ａ（基準化合物）の捕捉物質に対する解離定数（解離定数Ａ）および化合物Ａの捕捉物質に対する最大結合量（最大結合量Ａ）を算出するための処理の流れについて説明する。図８は、解離定数Ａおよび最大結合量Ａを算出する処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【０１１７】
まず、ユーザは、化合物Ａを含む試料溶液を、アクティブセルとリファレンスセルとに同時に添加する。
【０１１８】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、試料溶液添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間および試料溶液に含まれる化合物Ａの濃度と対応づけて判定装置２へ出力する（Ｓ１１）。
【０１１９】
取得部３は、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして取得し、当該レスポンス値を第１記憶部４に格納する。
【０１２０】
レスポンス増分算出部５は、第１記憶部４から一群のレスポンス値を取得し、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、試料溶液添加直前のレスポンス値に対する、試料溶液添加後のレスポンス値の増分を試料溶液ごとに算出する（Ｓ１２）。レスポンス増分算出部５は、算出した、試料溶液ごとの、アクティブセルおよびリファレンスセルのレスポンス増分を差レスポンス値算出部８へ出力し、リファレンスセルのレスポンス増分を溶媒補正ファクター算出部９へ出力する。
【０１２１】
差レスポンス値算出部８は、試料溶液ごとに、アクティブセルのレスポンス値の増分からリファレンスセルのレスポンス値の増分を差し引き、この値を差レスポンス値として溶媒補正レスポンス値算出部１０へ出力する（Ｓ１３）。
【０１２２】
溶媒補正ファクター算出部９は、第２記憶部７に格納された溶媒補正検量線用数式を用いて、レスポンス増分算出部５から出力されたリファレンスセルのレスポンス増分に対応する溶媒補正ファクターをそれぞれ算出する（Ｓ１４）。溶媒補正ファクター算出部９は、算出した試料溶液ごとの溶媒補正ファクターを溶媒補正レスポンス値算出部１０へ出力する。
【０１２３】
溶媒補正レスポンス値算出部１０は、差レスポンス値算出部８から出力された差レスポンス値から、溶媒補正ファクター算出部９から出力された溶媒補正ファクターを差し引き、溶媒補正レスポンス値を試料溶液ごとに算出する（Ｓ１５）。溶媒補正レスポンス値算出部１０は、算出した溶媒補正レスポンス値を基準パラメータ判定部１９へ出力する。
【０１２４】
基準パラメータ判定部１９の基準パラメータ算出部１９ａは、化合物Ａの濃度に対して溶媒補正レスポンス値をプロットし、プロットした各点に上記（２）式を回帰させ、解離定数Ａ（ＫｄＡ）、最大結合量Ａ（ＲｍａｘＡ）および最適オフセット値（ＯｆｆｓｅｔＡ）を算出する（Ｓ１６）。基準パラメータ算出部１９ａは、算出した各値を判定部１９ｂへ出力する。
【０１２５】
判定部１９ｂは、解離定数Ａ、最大結合量Ａおよび最適オフセット値（ＯｆｆｓｅｔＡ）が所定の範囲内のものであるかどうかを判定する（Ｓ１７）。すなわち、判定部１９ｂは、化合物Ａの解離定数が文献値等の既知の値と概ね同等か、最大結合量は一対一の結合にふさわしい値の範囲内であるか、オフセット値は０に近い値か、の３つの観点で判定を行う。
【０１２６】
以下に上記所定の範囲の例を挙げる。解離定数Ａの範囲は、文献値の１０-２〜１０３倍以内であり、望ましくは１０-２〜１０２倍以内である。最大結合量の範囲は、２０ＲＵ以上４００ＲＵ以下であり、望ましくは３０ＲＵ以上２００ＲＵ以下である。最適オフセット値の範囲は、±３０ＲＵ以内であり、望ましくは±２０ＲＵ以内である。
【０１２７】
判定部１９ｂは、上記各値のすべてが基準範囲以内であれば（Ｓ１７にてＹＥＳ）、実験結果は適切であると判定し（Ｓ１８）、上記各値の少なくとも１つが基準値以内でなければ（Ｓ１７にてＮＯ）、実験結果は不適切であると判定する（Ｓ１９）。判定部１９ｂは、判定結果を出力制御部１８へ出力するとともに、実験結果が適切であると判定した場合には、基準パラメータ算出部１９ａが算出した解離定数Ａ（ＫｄＡ）および最大結合量Ａ（ＲｍａｘＡ）を第２記憶部７に格納する。
【０１２８】
出力制御部１８は、出力装置２２を介して判定部１９ｂの判定結果をユーザに報知する。
【０１２９】
なお、判定部１９ｂは、最適オフセット値（ＯｆｆｓｅｔＡ）については判定せず、解離定数Ａおよび最大結合量Ａが所定の範囲内のものであるかどうかを判定してもよい。
【０１３０】
（結合様式を判定するための処理の流れ）
次に、結合様式を判定するための処理の流れの一例について説明する。図９は、結合様式判定システム１における、結合様式を判定するための処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【０１３１】
まず、ユーザは、化合物Ａと化合物Ｂとの複数種類の混合試料溶液をセンサーチップ３０のアクティブセルとリファレンスセルとに同時に添加する。上記複数種類の混合試料溶液とは、混合試料溶液における化合物Ａの濃度と化合物Ｂの濃度との総和は一定であり、化合物Ａと化合物Ｂとの組成比が互いに異なる混合試料溶液である。
【０１３２】
化合物Ａと化合物Ｂとの総濃度は１０〜２００μＭであり、望ましくは４０〜８０μＭである。また、化合物Ａと化合物Ｂとのモル比は、１：９〜９：１の範囲であることが好ましい。また、捕捉物質の量（固定化量）は３０００〜２００００ＲＵであり、望ましくは６０００〜１８０００ＲＵである。捕捉物質の量が３０００〜２００００ＲＵであれば、結合量を測定する感度が優れるため、捕捉物質の量を当該範囲内のものにすることが好ましい。
【０１３３】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、混合試料溶液添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間および混合試料溶液の濃度の割合と対応づけて判定装置２へ出力する（Ｓ２１）。
【０１３４】
取得部３は、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして取得し、当該レスポンス値を第１記憶部４に格納する。これ以降、図に示すＳ２２からＳ２５までの処理の流れは、図に示すＳ１２からＳ１５までの処理の流れと同様のため、その説明を省略する。
【０１３５】
溶媒補正レスポンス値算出部１０から溶媒補正レスポンス値を受け取ると、パラメータ算出部１１の競合モデルパラメータ算出部１３は、溶媒補正レスポンス値を、化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合（以下、化合物Ｂのモル分率と称する）に対してプロットし、プロットした各点に、競合モデル式（上記（１７）式）を回帰させ、残差平方和（ＳＳｃｏｍｐ）、解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）および最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｃｏｍｐ）を算出する（Ｓ２６）（競合モデル定数算出工程）。
【０１３６】
このとき、競合モデルパラメータ算出部１３は、第２記憶部７から、解離定数Ａ（ＫｄＡ）、最大結合量Ａ（ＲｍａｘＡ）を取得し、上記各値の算出のために利用する。また、競合モデルパラメータ算出部１３は、化合物Ｂの最大結合量Ｂ（ＲｍａｘＢ）を、化合物Ａの最大結合量Ａに化合物Ｂの分子量と化合物Ａの分子量との比を乗ずることによって算出する。すなわち、競合モデルパラメータ算出部１３は、競合モデル式（上記（７）式）を用いて最大結合量Ｂを算出する。化合物ＡおよびＢの分子量は、予め第２記憶部７に格納されている。なお、最大結合量Ｂを算出する機能ブロック（最大結合量算出部）を競合モデルパラメータ算出部１３とは別に設けてもよい。
【０１３７】
競合モデル式と独立モデル式とのパラメータ数が異なる場合には、競合モデル式から得られた残差平方和の代わりに「赤池の情報量規準（ＡＩＣ）」を用いてもよい。残差平方和および赤池の情報量規準は、試料溶液の濃度の割合と溶媒補正レスポンス値との関係が競合モデル式にどの程度一致するかを表す値（第１規準値）である。
【０１３８】
競合モデルパラメータ算出部１３は、算出した各値を判定部１４へ出力する。
【０１３９】
続いて、溶媒補正レスポンス値算出部１０から溶媒補正レスポンス値を受け取ると、パラメータ算出部１１の独立モデルパラメータ算出部１２は、化合物Ｂのモル分率に対して溶媒補正レスポンス値をプロットし、プロットした各点に独立モデル式（上記（８）式）を回帰させ、残差平方和（ＳＳｉｎｄ）、解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）および最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｉｎｄ）を算出する（Ｓ２７）。
【０１４０】
このとき、独立モデルパラメータ算出部１２は、第２記憶部７から、解離定数Ａ（ＫｄＡ）、最大結合量Ａ（ＲｍａｘＡ）を取得し、上記各値の算出のために利用する。また、独立モデルパラメータ算出部１２は、化合物Ｂの最大結合量Ｂ（ＲｍａｘＢ）を、化合物Ａの最大結合量Ａに化合物Ｂの分子量と化合物Ａの分子量との比を乗ずることによって算出する。すなわち、独立モデルパラメータ算出部１２は、上記（７）式を用いて最大結合量Ｂを算出する。化合物ＡおよびＢの分子量は、予め第２記憶部７に格納されている。なお、最大結合量Ｂを算出する機能ブロック（最大結合量算出部）を独立モデルパラメータ算出部１２とは別に設けてもよい。
【０１４１】
競合モデル式と独立モデル式とのパラメータ数が異なる場合には、独立モデル式から得られた残差平方和の代わりに「赤池の情報量規準（ＡＩＣ）」を用いてもよい。残差平方和および赤池の情報量規準は、試料溶液の濃度の割合と溶媒補正レスポンス値との関係が独立モデル式にどの程度一致するかを表す値（第２規準値）である。
【０１４２】
独立モデルパラメータ算出部１２は、算出した各値を判定部１４へ出力する。
【０１４３】
判定部１４は、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した、解離定数Ｂおよび最適オフセット値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定する（Ｓ２８）（判定工程）。すなわち、判定部１４は、化合物Ｂの解離定数が化合物Ａの解離定数と概ね同等か、オフセット値は０に近い値か、の２つの観点で判定を行う。
【０１４４】
以下に上記所定の範囲の例を挙げる。解離定数Ｂの範囲は、解離定数Ａの１０-２〜１０３倍以内であり、望ましくは１０-２〜１０２倍以内である。最適オフセット値の範囲は、±３０ＲＵ以内であり、望ましくは±２０ＲＵ以内である。
【０１４５】
化合物Ａの捕捉物質に対する親和性と化合物Ｂの捕捉物質に対する親和性との間に著しい（１０-２〜１０３倍以内に入らないような）違いがあるとき、例えば、化合物Ａに比べ化合物Ｂの親和性が低すぎるときには、化合物Ａと化合物Ｂとの混合試料溶液を用いて測定しても、化合物Ｂの寄与はほとんど検出されず、化合物Ａ単独で測定したときと似た測定結果が得られる。このため競合モデル式（（１７）式）および独立モデル式（（８）式）は、どちらも化合物単独溶液の解析モデル式（（２）式）と類似した曲線を与え、結合様式の違いを識別することが困難となる。化合物Ａと化合物Ｂとの親和性の大小関係が逆の場合でも、同様のことが言える。
【０１４６】
したがって、解離定数Ｂの範囲が、解離定数Ａの１０-２〜１０３倍以内であるかどうかを判定することが好ましい。
【０１４７】
なお、解離定数Ｂの比較対象となる解離定数Ａは、基準パラメータ算出部１９ａが算出したものであることが好ましいが、文献値であってもよい。
【０１４８】
判定部１４における判定処理の詳細については、別のフローチャートを参照しつつ説明する。
【０１４９】
出力制御部１８は、出力装置２２を介して判定部１４の判定結果をユーザに報知する（Ｓ２９）。
【０１５０】
（判定部１４における判定処理の流れ）
判定部１４における判定処理の流れの一例について説明する。図１０は、判定部１４における判定処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【０１５１】
独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３から算出された各値を判定部１４が受け取ると、まず、第１比較部１５は、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した、解離定数Ｂおよび最適オフセット値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定し（Ｓ３１）、判定結果を第３比較部１７へ出力する。
【０１５２】
続いて、第２比較部１６は、競合モデルパラメータ算出部１３が算出した、解離定数Ｂおよび最適オフセット値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定し（Ｓ３２）、判定結果を第３比較部１７へ出力する。
【０１５３】
第３比較部１７は、第１比較部１５および第２比較部１６から出力された判定結果を受け取ると、当該判定結果を自らが利用可能なメモリ（不図示）に格納する。そして、第３比較部１７は、第１比較部１５および第２比較部１６の判定結果に基づいて、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値のすべてが所定の範囲内のものであるかどうかを判定する（Ｓ３３）。
【０１５４】
上記各値のすべてが所定の範囲内のものである場合には（Ｓ３３にてＹＥＳ）、第３比較部１７は、競合モデルの残差平方和が、独立モデルの残差平方和よりも一定比率（例えば３倍）以上大きいかどうかを判定する（Ｓ３４）。
【０１５５】
競合モデルの残差平方和が、独立モデルの残差平方和よりも一定比率以上大きい場合には（Ｓ３４にてＹＥＳ）、第３比較部１７は、化合物ＡおよびＢは、捕捉物質に対して独立結合様式を示す旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ３５）。なお、第３比較部１７は、独立モデルで得られた解離定数の最適解（ＫｄＢ，ｉｎｄ）は化合物Ｂと捕捉タンパク質との結合における解離定数であるとの判定結果を出力してもよい。
【０１５６】
一方、競合モデルの残差平方和が、独立モデルの残差平方和よりも一定比率以上大きくない場合には（Ｓ３４にてＮＯ）、第３比較部１７は、独立モデルの残差平方和が、競合モデルの残差平方和よりも一定比率（例えば、３倍）以上大きいかどうかを判定する（Ｓ３６）。
【０１５７】
独立モデルの残差平方和が、競合モデルの残差平方和よりも一定比率以上大きい場合には（Ｓ３６にてＹＥＳ）、第３比較部１７は、化合物ＡおよびＢは、捕捉物質に対して競合的結合様式を示す旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ３７）。なお、第３比較部１７は、競合モデルで得られた解離定数の最適解（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）は化合物Ｂと捕捉物質との結合における解離定数であるとの判定結果を出力してもよい。
【０１５８】
一方、独立モデルの残差平方和が、競合モデルの残差平方和よりも一定比率以上大きくない場合には（Ｓ３６にてＮＯ）、第３比較部１７は、化合物ＡおよびＢは、捕捉物質に対してアロステリック的結合様式を示す旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ３８）。
【０１５９】
一方、Ｓ３３において、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の少なくとも１つが所定の範囲内のものではない場合（Ｓ３３にてＮＯ）、第３比較部１７は、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の両方が所定の範囲内のものである場合には（Ｓ３９にてＹＥＳ）、化合物ＡおよびＢは、捕捉物質に対して独立結合様式を示す旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ４０）。
【０１６０】
一方、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の少なくとも一方が所定の範囲内のものでない場合（Ｓ３９にてＮＯ）、第３比較部１７は、競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の両方が所定の範囲内のものである場合には（Ｓ４１にてＹＥＳ）、化合物ＡおよびＢは、捕捉物質に対して競合的結合様式を示す旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ４２）。
【０１６１】
一方、競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の少なくとも一方が所定の範囲内のものでない場合には（Ｓ４１にてＮＯ）、第３比較部１７は、測定結果が不適切である旨の判定結果を出力制御部１８へ出力する（Ｓ４３）。
【０１６２】
出力制御部１８は、判定部１４から出力された判定結果を、出力装置２２を介してユーザに報知する。
【０１６３】
上記の処理の流れを別の観点から説明すると以下のようになる。すなわち、第３比較部１７は、ステップＳ３３、３９、４１において、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３がそれぞれ算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、化合物ＡおよびＢが、捕捉物質に対して競合的結合様式を示すか独立的結合様式を示すかを判定する。
【０１６４】
ただし、ステップＳ３３において、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値のすべてが所定の範囲内のものである場合（Ｓ３３にてＹＥＳ）には、解離定数Ｂおよび最適オフセット値が所定の範囲内のものであるかどうかを判定するだけでは、結合様式の判定はできない。そのため、第３比較部１７は、ステップＳ３４およびＳ３６において、残差平方和の比較を行うことにより結合様式の判定を行っている。
【０１６５】
なお、上述の説明では、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３がそれぞれ算出した解離定数Ｂおよび最適オフセット値の両方を結合様式の判定に用いているが、解離定数Ｂのみを結合様式の判定に用いてもよい。ただし、この場合には、結合様式の判定精度が低下する可能性がある。そのため、解離定数Ｂおよび最適オフセット値の両方を結合様式の判定に用いることが好ましい。
【０１６６】
（適用可能性）
本発明の手法が適用可能である固定化タンパク質の一例として、アルブミン、α１-酸性糖タンパク質（イミプラミン、プロプラノロール、ジソピラミドなど）を挙げることができる。
【０１６７】
また、本発明の手法が適用可能である基準化合物（または被験化合物）の一例として、アルブミンのサイトＩに結合するワルファリン、フェニルブタゾン、サイトIIに結合するナプロキセン、イブプロフェン、サイトIIIに結合するジギトキシンを挙げることができる。
【０１６８】
上記のタンパク質および基準化合物（または被験化合物）は、あくまで一例であり、その他のタンパク質および基準化合物に本発明を適用しても構わない。
【０１６９】
（効果）
以上のように、結合様式判定システム１では、ハイスループットで１種類の捕捉物質に対する２種類の分析対象物質の結合様式を判定することができる。それゆえ、薬物の開発ステージの低い段階で多種類の化合物を迅速に評価することができ、タンパク結合能の側面から開発困難と思われる化合物を早期に排除することができる。
【０１７０】
（変更例）
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【０１７１】
例えば、増分算出部２０、基準パラメータ判定部１９、独立モデルパラメータ算出部１２、競合モデルパラメータ算出部１３および判定部１４を独立した装置として実現してもよい。
【０１７２】
競合モデルパラメータ算出部１３を判定装置２とは独立した解離定数算出装置として実現した場合、当該解離定数算出装置を以下のように表現することができる。すなわち、解離定数算出装置は、化合物ＡおよびＢの総モル濃度が一定であり、当該化合物ＡおよびＢの組成比が互いに異なる複数の混合試料溶液に含まれる化合物ＡおよびＢが、１種類の捕捉物質に可逆的に結合した量を示す実測結合量を上記複数の混合試料溶液ごとに取得する取得部（不図示）と、競合モデル式を用いて、上記総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と取得部が取得した実測結合量との関係から、解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）を算出する競合モデルパラメータ算出部１３とを備えている。
【０１７３】
また、競合モデルパラメータ算出部１３を判定装置２とは独立した解離定数算出装置として実現した場合、判定装置２は、以下のように表現することができる。すなわち、
判定装置２は、上記実測結合量を取得し、独立モデル式を用いて、化合物ＡおよびＢの総モル濃度に対する化合物Ｂのモル濃度の割合と上記実測結合量との関係から解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）を算出する独立モデルパラメータ算出部１２と、解離定数算出装置が算出した解離定数Ｂである解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）を取得し、取得した解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）と、独立モデルパラメータ算出部１２が算出した解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）とが、それぞれ所定の範囲内のものであるかどうかを判定することにより、化合物ＡおよびＢが捕捉物質に対して競合的結合様式または独立的結合様式を示すかどうかを判定する判定部１４とを備えている。
【０１７４】
また、上述した判定装置２の各ブロック、特にパラメータ算出部１１および判定部１４は、ハードウェアロジックによって構成してもよいし、次のようにＣＰＵを用いてソフトウェアによって実現してもよい。
【０１７５】
すなわち、判定装置２は、各機能を実現する制御プログラムの命令を実行するＣＰＵ（central processing unit）、上記プログラムを格納したＲＯＭ（read only memory）、上記プログラムを展開するＲＡＭ（random access memory）、上記プログラムおよび各種データを格納するメモリ等の記憶装置（記録媒体）などを備えている。そして、本発明の目的は、上述した機能を実現するソフトウェアである判定装置２の制御プログラム（結合様式判定プログラム）のプログラムコード（実行形式プログラム、中間コードプログラム、ソースプログラム）をコンピュータで読み取り可能に記録した記録媒体を、判定装置２に供給し、そのコンピュータ（またはＣＰＵやＭＰＵ）が記録媒体に記録されているプログラムコードを読み出し実行することによっても、達成可能である。
【０１７６】
上記記録媒体としては、例えば、磁気テープやカセットテープ等のテープ系、フロッピー（登録商標）ディスク／ハードディスク等の磁気ディスクやＣＤ−ＲＯＭ／ＭＯ／ＭＤ／ＤＶＤ／ＣＤ−Ｒ等の光ディスクを含むディスク系、ＩＣカード（メモリカードを含む）／光カード等のカード系、あるいはマスクＲＯＭ／ＥＰＲＯＭ／ＥＥＰＲＯＭ／フラッシュＲＯＭ等の半導体メモリ系などを用いることができる。
【０１７７】
また、判定装置２を通信ネットワークと接続可能に構成し、上記プログラムコードを通信ネットワークを介して供給してもよい。この通信ネットワークとしては、特に限定されず、例えば、インターネット、イントラネット、エキストラネット、ＬＡＮ、ＩＳＤＮ、ＶＡＮ、ＣＡＴＶ通信網、仮想専用網（virtual private network）、電話回線網、移動体通信網、衛星通信網等が利用可能である。また、通信ネットワークを構成する伝送媒体としては、特に限定されず、例えば、ＩＥＥＥ１３９４、ＵＳＢ、電力線搬送、ケーブルＴＶ回線、電話線、ＡＤＳＬ回線等の有線でも、ＩｒＤＡやリモコンのような赤外線、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、８０２．１１無線、ＨＤＲ、携帯電話網、衛星回線、地上波デジタル網等の無線でも利用可能である。なお、本発明は、上記プログラムコードが電子的な伝送で具現化された、搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号の形態でも実現され得る。
【実施例】
【０１７８】
〔実施例１〕
本発明の一実施例について図１１〜図１４に基づいて説明すれば、以下のとおりである。本実施例は、捕捉物質としてヒト血清由来アルブミン（A3782、シグマ社製）を用い、分析対象物質としてワルファリン（基準化合物）とフェニルブタゾン（被験化合物）とを用いた場合の例である。また、検出装置２１として、Biacore T100（ビアコア社製）を用い、センサーチップとして、Series S sensor chip CM5を用いた。
【０１７９】
（１．捕捉物質のセンサーチップへの固定）
センサーチップ上の２つのフローセルのうちの一方にヒト血清由来アルブミン（約１００００ＲＵ）を化学的に固定した。ヒト血清由来アルブミンの固定化は、アミンカップリング（約７分、１０μＬ／ｍｉｎ）にて行った。他方のフローセルには何も固定化しない。タンパク質を固定化したフローセルをアクティブセル、未処理のフローセルをリファレンスセルと称する。
【０１８０】
固定化用緩衝液として、ｐＨ７．４の６７ｍＭリン酸ナトリウム等張緩衝液を用いた。
【０１８１】
（２．センサーチップの平衡化）
ヒト血清由来アルブミンを固定化したセンサーチップをランニング緩衝液で平衡化した。ランニング緩衝液には生理的条件に近い緩衝液を用いた。この緩衝液の一例として、約５％のジメチルスルホキシドを含むｐＨ７．４の６７ｍＭリン酸ナトリウム等張緩衝液を用いた。溶解補助剤として用いられるジメチルスルホキシドの濃度は、約３〜１０％の間で変更可能であり、約７％以下が望ましい。
【０１８２】
ニードル洗浄液として５０％のジメチルスルホキシドを用いた。
【０１８３】
（３．溶媒補正用検量線試料溶液の添加）
溶媒補正用検量線試料溶液を、ヒト血清由来アルブミンを固定化したセンサーチップと固定化していないセンサーチップとに同時に添加した。添加時間は概ね数十秒間である。本実施例では、３０秒間添加した。溶媒補正用検量線試料溶液には、例えばランニング緩衝液が約５％のジメチルスルホキシドを含むｐＨ７．４のリン酸ナトリウム等張緩衝液である場合、約４〜６％の複数段階の濃度のジメチルスルホキシドを含むｐＨ７．４のリン酸ナトリウム等張緩衝液を使用する。本実施例では、４〜６％の間の１１段階の濃度のジメチルスルホキシドを含むｐＨ７．４のリン酸ナトリウム等張緩衝液を使用した。測定する検量線試料溶液の有機溶媒濃度水準数は４以上、望ましくは７以上である。なお、上記有機溶媒濃度水準数とは、検量線作成に用いる、異なる濃度の有機溶媒を含む溶媒補正用検量線試料溶液の数である。
【０１８４】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、溶媒補正用検量線試料溶液の添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間および溶媒補正用検量線試料溶液の有機溶媒の濃度と対応づけて判定装置２へ出力する。
【０１８５】
（４．溶媒補正用検量線の作成）
判定装置２の取得部３は、検出装置２１から出力された、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして取得し、当該レスポンス値を第１記憶部４に格納する。これ以降、溶媒補正検量線用数式を導出するまでの処理の流れは、上述したものと同様のため、その説明を省略する。本実施例において得られた検量線を図４に示す。
【０１８６】
（５．基準化合物の添加）
ワルファリンの単独試料溶液（濃度：０〜８０μＭの間の１４段階）を数十秒間（より具体的には、３０秒間）、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方に同時に添加した。これらアクティブセルおよびリファレンスセルは、溶媒補正用検量線の作成のために用いたものと同じものである。各濃度の単独試料溶液を２度添加し、流速は、ワルファリンの供給が相互作用の律速要因とならないように設定し、例えば約３０μＬとする。単独試料溶液の添加終了後、ランニング緩衝液を同一の流速で送液した。
【０１８７】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、ワルファリンの単独試料溶液の添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間およびワルファリンの濃度と対応づけて判定装置２へ出力する。
【０１８８】
（７．溶媒補正レスポンス値の算出）
判定装置２の取得部３は、検出装置２１から出力された、これら複数のレスポンス値、測定時間およびワルファリンの濃度が対応付けられたデータを一群のデータとして取得し、当該一群のデータを第１記憶部４に格納する。
【０１８９】
レスポンス増分算出部５は、第１記憶部４から上記一群のデータを取得し、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、試料溶液添加１０秒前のアクティブセルのレスポンス値に対する、試料溶液添加終了５秒前のアクティブセルのレスポンス値の増分を、異なる濃度のワルファリンの単独試料溶液ごとに算出する。
【０１９０】
これ以降、溶媒補正レスポンス値の算出までの処理の流れは、上述したものと同量であるため、その説明を省略する。
【０１９１】
図１１は、ワルファリン単独溶液の測定時に得られたセンサーグラムを示す図である。同図において、縦軸は、レスポンス値（アクティブセルのレスポンス値とリファレンスセルのレスポンス値との差）を表しており、横軸は、経過時間（秒）を表している。また、ワルファリン濃度を０、１、２、４、８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、８０μＭとふって、各濃度において二回測定している。試料溶液注入時間は、３０秒間であり、時刻０点（試料添加前の時点）を試料添加開始１０秒前とし、結合量測定ポイントを試料添加終了５秒前としている。
【０１９２】
（８．解離定数、最大結合量及びオフセット値の最適値の算出）
溶媒補正レスポンス値を受け取ると、基準パラメータ判定部１９の基準パラメータ算出部１９ａは、ワルファリン濃度に対する溶媒補正レスポンス値をプロットし、プロットした各点に、一対一の結合を仮定したときの溶媒補正レスポンス値を表す数学モデル式（上記（２）式））を回帰させ、解離定数Ａ（ＫｄＡ）、最大結合量Ａ（ＲｍａｘＡ）および最適オフセット値（ＯｆｆｓｅｔＡ）を算出する。独立モデルパラメータ算出部１２は、算出した各値を判定部１９ｂへ出力する。
【０１９３】
（９．解離定数、最大結合量及びオフセット値の最適値の妥当性の判定）
判定部１９ｂは、解離定数Ａ、最大結合量Ａおよび最適オフセット値（ＯｆｆｓｅｔＡ）が所定の範囲内のものであるかどうかを判定する。図１２は、ワルファリン濃度に対する溶媒補正レスポンス値をプロットしたグラフである。同図に示す本実施例の実験結果では、ワルファリンのヒト血清由来アルブミンに対する解離定数Ａは、３４．５μＭであり、文献値（１２μＭ）と概ね一致する値が得られた。また、ワルファリンのヒト血清由来アルブミンに対する最大結合量は、４８ＲＵであり、好ましい範囲内のものであった。さらに、最適オフセット値は、３．３ＲＵであり、好ましい範囲内のものであった。
【０１９４】
（１０．混合試料溶液の添加）
ワルファリンとフェニルブタゾンとの混合試料溶液を約３０〜５０秒間アクティブセルおよびリファレンスセルの両方に同時に添加した。これらアクティブセルおよびリファレンスセルは、溶媒補正用検量線の作成のために用いたものと同じものである。混合試料溶液の濃度は、例えば、ワルファリン濃度を８〜７２μＭとし、フェニルブタゾン濃度を７２〜８μＭとし、ワルファリン濃度とフェニルブタゾン濃度とを合わせた濃度が８０μＭとなるようにする。
【０１９５】
流速は、化合物の供給が律速要因とならないように設定し、一例として約３０μＬとした。混合試料溶液の添加終了後、ランニング緩衝液を同じ流速で送液した。
【０１９６】
検出装置２１は、アクティブセルおよびリファレンスセルの両方について、混合試料溶液の添加の前後の結合量（レスポンス値）を測定時間および混合溶液におけるワルファリン濃度とフェニルブタゾン濃度との割合と対応づけて判定装置２へ出力する。
【０１９７】
（１１．溶媒補正レスポンス値の算出）
判定装置２の取得部３は、検出装置２１から出力された、これら複数のレスポンス値を一群のデータとして取得し、当該一群のレスポンス値を第１記憶部４に格納する。これ以降、溶媒補正レスポンス値を算出するまでの処理の流れは、上述したものと同様のため、その説明を省略する。
【０１９８】
図１３は、ワルファリンおよびフェニルブタゾン混合溶液の測定時に得られたセンサーグラムを示す図である。同図において、縦軸は、レスポンス値（アクティブセルのレスポンス値とリファレンスセルのレスポンス値との差）を表しており、横軸は、経過時間（秒）を表している。ワルファリン濃度を８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２μＭとし、フェニルブタゾン濃度をそれぞれ７２、６４、５６、４８、４０、３２、２４、１６、８μＭと設定して、各濃度において二回測定している。試料溶液注入時間は、３０秒間であり、時刻０点（試料添加前の時点）を試料添加開始１０秒前とし、結合量測定ポイントを試料添加終了５秒前としている。
【０１９９】
（１２．残差平方和、解離定数及びオフセット値の最適値の算出）
溶媒補正レスポンス値を受け取ると、パラメータ算出部１１の競合モデルパラメータ算出部１３は、溶媒補正レスポンス値を、混合試料溶液におけるワルファリンおよびフェニルブタゾンの総モル濃度に対するフェニルブタゾンのモル濃度の割合（以下、フェニルブタゾンのモル分率と称する）に対してプロットし、プロットした各点に、ワルファリンとフェニルブタゾンとの競合的結合阻害を仮定したときの溶媒補正レスポンス値を表す競合モデル式（上記（１７）式）を回帰させ、残差平方和（ＳＳｃｏｍｐ）、解離定数（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）および最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｃｏｍｐ）を算出する。
【０２００】
また、溶媒補正レスポンス値を受け取ると、パラメータ算出部１１の独立モデルパラメータ算出部１２は、溶媒補正レスポンス値を、フェニルブタゾンのモル分率に対してプロットし、プロットした各点に独立モデル式（上記（８）式）を回帰させ、残差平方和（ＳＳｉｎｄ）、解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）および最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｉｎｄ）を算出する。
【０２０１】
（１９．解離定数及びオフセット値の最適解の妥当性の判定）
判定部１４は、独立モデルパラメータ算出部１２および競合モデルパラメータ算出部１３が算出した、解離定数（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）、最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｃｏｍｐ）、解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）、最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｉｎｄ）が所定の範囲内のものであるかどうかを判定するとともに、残差平方和（ＳＳｃｏｍｐ）と残差平方和（ＳＳｉｎｄ）とが一定比率以上離れているかどうかを判定する。この判定処理は、上述したものと同様であるため、その説明を省略する。
【０２０２】
図１４は、ワルファリンとフェニルブタゾンとが競合結合様式を示すことを示すグラフである。同図に示す、本実施例の実験結果では、競合モデル式から算出された、フェニルブタゾンのヒト血清由来アルブミンに対する解離定数（ＫｄＢ，ｃｏｍｐ）は、３．５７μＭであり、基準パラメータ算出部１９ａが算出した、ワルファリンのヒト血清由来アルブミンに対する解離定数Ａ（３４．５μＭ）の１０-２〜１０３倍以内であった。また、最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｃｏｍｐ）は、３．３ＲＵであり、好ましい範囲内のものであった。
【０２０３】
一方、独立モデル式から算出された解離定数Ｂ（ＫｄＢ，ｉｎｄ）は、３９．３μＭであり、最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔｉｎｄ）は、３．３ＲＵであった。
【０２０４】
また、競合モデル式から算出された残差平方和（ＳＳｃｏｍｐ）は、２４．３であり、独立モデル式から算出された残差平方和（ＳＳｉｎｄ）は、３５１であった。つまり、残差平方和（ＳＳｉｎｄ）は、残差平方和（ＳＳｃｏｍｐ）よりも３倍以上大きかった。
【０２０５】
換言すれば、溶媒補正レスポンス値を、フェニルブタゾンのモル分率に対してプロットした各点は、独立モデル式よりも競合モデル式によりフィットした。
【０２０６】
よって、判定部１４は、ワルファリンとフェニルブタゾンとは競合結合様式を示すと判定した。
【０２０７】
〔実施例２〕
本発明の別の実施例について図１５〜図１８に基づいて説明すれば、以下のとおりである。
【０２０８】
ヒト血清由来アルブミン（以下、単にアルブミンと称する）を捕捉物質とし、ワルファリンを基準化合物とし、被験化合物を、アルブミンに結合することが知られている様々な物質とした場合の実験結果について以下に説明する。
【０２０９】
図１５は、被験化合物がバルプロ酸（valproic acid）である場合の実験結果を示すグラフである。図１６は、競合モデル式（競合）および独立モデル式（独立）を用いて実施例の実験から得られた解離定数Ｂ（ＫｄＢ）、最適オフセット値（Ｏｆｆｓｅｔ）、残差平方和（ＳＳ）の各値を示す図である。図１５に示す実験結果では、図１６に示すように、競合モデル式から算出された、バルプロ酸のアルブミンに対する解離定数は、２．９４ｍＭであり、基準パラメータ算出部１９ａが算出した、ワルファリンのヒト血清由来アルブミンに対する解離定数Ａ（３４．５μＭ）の１０-２〜１０３倍以内であった。また、溶媒補正レスポンス値を、ワルファリンおよびバルプロ酸の総モル濃度に対するバルプロ酸のモル濃度の割合に対してプロットした各点は、独立モデル式よりも競合モデル式によりフィットした。
【０２１０】
よって、判定部１４は、ワルファリンとバルプロ酸とはアルブミンに対して競合的結合様式を示すと判定した。
【０２１１】
図１７は、被験化合物がクマリン（coumarin）である場合の実験結果を示すグラフである。図１７に示す実験結果では、図１６に示すように、競合モデル式から算出された、クマリンのアルブミンに対する解離定数は、４１５μＭであり、基準パラメータ算出部１９ａが算出した解離定数Ａ（３４．５μＭ）の１０-２〜１０３倍以内であった。また、溶媒補正レスポンス値を、ワルファリンおよびクマリンの総モル濃度に対するクマリンのモル濃度の割合に対してプロットした各点は、独立モデル式よりも競合モデル式によりフィットした。
【０２１２】
よって、判定部１４は、ワルファリンとクマリンとはアルブミンに対して競合的結合様式を示すと判定した。
【０２１３】
図１８は、被験化合物がジアゼパム（diazepam）である場合の実験結果を示すグラフである。図１８に示す実験結果では、図１６に示すように、独立モデル式から算出された、ジアゼパムのアルブミンに対する解離定数は、８８．９μＭであり、基準パラメータ算出部１９ａが算出した解離定数Ａ（３４．５μＭ）の１０-２〜１０３倍以内であった。また、溶媒補正レスポンス値を、ワルファリンおよびジアゼパムの総モル濃度に対するジアゼパムのモル濃度の割合に対してプロットした各点は、競合モデル式よりも独立モデル式によりフィットした。
【０２１４】
よって、判定部１４は、ワルファリンとジアゼパムとはアルブミンに対して独立的結合様式を示すと判定した。
【産業上の利用可能性】
【０２１５】
２種類の分析対象物質を同時に捕捉物質に相互作用させた時の結合様式が、競合的結合様式であるかどうかをハイスループットで判定することができるため、医薬品の開発過程において、タンパク質と２種類の薬物との結合様式を迅速に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る結合様式判定システムの構成を示す機能ブロック図である。
【図２】検出装置が備えるセンサーチップの構成を示す概略図である。
【図３】溶媒補正ファクターの算出方法を説明するための図である。
【図４】溶媒補正用検量線の一例を示すグラフである。
【図５】溶媒補正レスポンス値を説明するための図である。
【図６】添加試料溶液中に含まれる２種類の化合物が互いに相手の、固定化タンパク質に対する結合を競合的に阻害する時の状況を示す図である。
【図７】上記結合様式判定システムにおける溶媒補正用検量線作成処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図８】解離定数Ａおよび最大結合量Ａを算出する処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図９】上記結合様式判定システムにおける、結合様式を判定するための処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図１０】判定部における判定処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図１１】ワルファリン単独溶液の測定時に得られたセンサーグラムを示す図である。
【図１２】ワルファリン濃度に対する溶媒補正レスポンス値をプロットしたグラフである。
【図１３】ワルファリンおよびフェニルブタゾン混合溶液の測定時に得られたセンサーグラムを示す図である。
【図１４】ワルファリンとフェニルブタゾンとが競合結合様式を示すことを示すグラフである。
【図１５】被験化合物がバルプロ酸である場合の実験結果を示すグラフである。
【図１６】競合モデル式および独立モデル式を用いて実施例の実験から得られた解離定数Ｂ、最適オフセット値、残差平方和の各値を示す図である。
【図１７】被験化合物がクマリンである場合の実験結果を示すグラフである。
【図１８】被験化合物がジアゼパムである場合の実験結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【０２１７】
１  結合様式判定システム
２  判定装置（結合様式判定装置）
１１  パラメータ算出部（解離定数算出装置、取得手段、競合モデル定数算出手段）
１２  独立モデルパラメータ算出部（独立モデル定数算出手段）
１３  競合モデルパラメータ算出部（解離定数算出装置、競合モデル定数算出手段）
１４  判定部（判定手段）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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