(57)【要約】【課題】            ヒアルロニダーゼ阻害作用に優れたヒアルロニダーゼ阻害剤を提供する。【解決手段】        ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物から選択される１種又は２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物から選択される１種又は２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）フタバナヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ  Ｂｌ．）、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ (Ｌ．) Ｌａｍ．）、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）ハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｌｂａ  Ｊ．Ｓｍ．）から選択される１種又は２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロニダーゼの活性を阻害する、ヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミンとＤ−グルクロン酸が交互に結合して形成された直鎖状の高分子多糖であり、コラーゲン，フィブロネクチン，プロテオグリカンとともに細胞外マトリックスを構築し、細胞の保持，組織の潤滑性の保持，物理的傷害などの外力への抵抗，細菌感染の防止など、多くの機能を有している。特に皮膚真皮においては、線維芽細胞により産生され、皮膚の弾性保持や創傷の治癒過程に関与することが知られている。また、特異的な受容体を介して、細胞接着や細胞の移動を制御していることも知られている。
【０００３】
加齢や紫外線曝露等、種々の外的ストレスによるヒアルロン酸の分解や、線維芽細胞のヒアルロン酸産生能の低下が、皮膚弾性の低下やしわの形成といった皮膚の老化症状の進行の一因となり、創傷の治癒の遅延にも関与すると考えられる。また、慢性関節リウマチ，化膿性関節炎，通風性関節炎，外傷性関節症，骨関節炎，変形性関節症といった疾病においては、ヒアルロン酸の異常分解が観察される。それゆえ、かかる皮膚の老化症状の防止や改善、創傷治癒の促進、或いはヒアルロン酸の異常分解を伴う疾病の治療において、ヒアルロン酸を外用等により補充する試みがなされてきた。
【０００４】
皮膚外用剤の分野においては、外用剤基剤にヒアルロン酸又はその塩を含有させて適用する試みが多くなされ（特許文献１〜３参照）、上記ヒアルロン酸の異常分解を伴う疾病の治療においては、ヒアルロン酸の関節注入療法が行われている。しかしながら、ヒアルロン酸類を含有する皮膚外用剤の適用については、ヒアルロン酸が高分子量の多糖類であって経皮吸収されにくい、経時的にヒアルロン酸が分解されて皮膚外用剤の粘度が低下するといった問題があった。また、ヒアルロン酸の関節注入療法においては、長期にわたる治療が必要で、医師の処方を必要とするため、日常行う処置には向かないといった問題があった。
【０００５】
そこで、皮膚外用剤においてヒアルロン酸の粘度低下を抑制して製剤の安定性を向上させたり（特許文献４、５参照）、低分子量のヒアルロン酸を用いたり（特許文献６参照）、ヒアルロン酸の誘導体を用いたりする（特許文献７〜９参照）試みの他、生体のヒアルロン酸産生を促進させたり、又はヒアルロニダーゼの活性を阻害して、ヒアルロン酸の分解を抑制する試みも多く開示されている。
【０００６】
かかるヒアルロン酸産生促進剤としては、アオサ科アオサ属，アオノリ属、フノリ科フノリ属、ダービリア科ダービリア属等の海藻の抽出物（特許文献１０〜１２）、コケ類の抽出物（特許文献１３〜１７参照）、黒砂糖エキス（特許文献１８参照）、ウミブドウ抽出物（特許文献１９参照）等を含有するものが開示されている。一方ヒアルロニダーゼ阻害剤としては、ボタン，シャクヤクの抽出物（特許文献２０参照）、ロズマリン酸（特許文献２１参照）、メリッサ抽出物（特許文献２２参照）、グレープリース、サンショウ、レンゲソウ等の抽出物（特許文献２３参照）、ハマスゲ抽出物（特許文献２４参照）等を含有するものが開示されている。
【０００７】
しかしながら、上記したような従来のヒアルロン酸産生促進剤やヒアルロニダーゼ阻害剤においては、ヒアルロン酸産生促進効果又はヒアルロニダーゼ阻害効果，品質，安定性又は安全性のいずれかの面で不十分なものも存在しており、さらに新規なヒアルロニダーゼ阻害作用を有するものが求められているのが実状であった。
【０００８】
また、ヤエヤマヒルギ属、オヒルギ属の属するヒルギ科植物の利用としては、ヒルギ科植物を含有する皮膚外用剤（特許文献２５参照）、並びにヤエヤマヒルギ属植物抽出物を有効成分とする細胞賦活剤、抗酸化剤（特許文献２６参照）、ヒルギ属植物抽出物を有効成分とする、細胞賦活剤，抗酸化剤、老化防止及び肌荒れ改善用皮膚外用剤（特許文献２７参照）が開示されているが、ヒルギ科植物がヒアルロニダーゼ阻害作用を発揮することはこれまで知られていない。ハマザクロ属植物の利用としては、ハマザクロ属の属するハマザクロ科植物を含有する皮膚外用剤（特許文献２８参照）が開示されているが、ハマザクロ属植物がヒアルロニダーゼ阻害作用を発揮することはこれまで知られていない。
【０００９】
【特許文献１】特公昭６０−１９７２５号公報
【特許文献２】特公昭６１−３８１６８号公報
【特許文献３】特公昭６２−５３４８４号公報
【特許文献４】特公平１−７０４３号公報
【特許文献５】特公平１−１０４８５号公報
【特許文献６】特許第２５４９１１９号公報
【特許文献７】特許第２５６９０１２号公報
【特許文献８】特許第２６０４９３０号公報
【特許文献９】特許第２６４８３０８号公報
【特許文献１０】特開平７−１０１８７１号公報
【特許文献１１】特開平８−１９８７４１号公報
【特許文献１２】特開平９−１７６０３６号公報
【特許文献１３】特開２００５−６０３４１号公報
【特許文献１４】特開２００５−６０３４２号公報
【特許文献１５】特開２００５−６０３４３号公報
【特許文献１６】特開２００５−６０３４４号公報
【特許文献１７】特開２００５−６０３４６号公報
【特許文献１８】特開２００３−１３７７６６号公報
【特許文献１９】特開２００３−１２８５７３号公報
【特許文献２０】特開平１−１２８９３３号公報
【特許文献２１】特開平９−６７２５１号公報
【特許文献２２】特開平９−２４１１４２号公報
【特許文献２３】特開２００３−３４２１８４号公報
【特許文献２４】特開２００３−１３７７２６号公報
【特許文献２５】特開２００３−３３５６５３号公報
【特許文献２６】特開２００４−１０５５７号公報
【特許文献２７】特開２００３−３４２１４８号公報
【特許文献２８】特開２００３−３３５６２０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明においては、優れたヒアルロン酸産生促進作用を有するヒアルロン酸産生促進剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物から選択される１種又は２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤である。
【００１２】
また本発明は、ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）フタバナヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ  Ｂｌ．）、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ (Ｌ．) Ｌａｍ．）、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）ハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｌｂａ  Ｊ．Ｓｍ．）から選択される１種又は２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ヒアルロニダーゼ阻害作用に優れたヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明はヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物、オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物、ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物から選択される１種または２種以上を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。
【００１５】
本発明で用いるヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物は、ヒルギ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａｃｅａｅ）の植物で、熱帯から亜熱帯地域の泥湿海岸地域に広く分布しており、ヒルギ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａｃｅａｅ）植物の共通した特長である胎生種子をつくり、マングローブ林の主要構成種となる。ヤエヤマヒルギ属（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ  Ｌ．）植物としては、フタバナヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ  Ｂｌ．），ヤエヤマヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ  Ｇｒｉｆｆ．），アメリカヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｍａｎｇｌｅ  Ｌ．），サモアヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓａｍｏｅｎｓｉｓ  （Ｈｏｃｈｒ．）  Ｓａｌｖｏｚａ），ハリソンヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｈａｒｒｉｓｏｎｉｉ  Ｌｅｅｃｈｍ．），オオバヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ  Ｌａｍｋ．）等が知られている。これらのヤエヤマヒルギ属植物の中でも、ヒアルロニダーゼ阻害作用の点から、フタバナヒルギ（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ  Ｂｌ．）を用いることが好ましい。
【００１６】
本発明で用いるオヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物は、マングローブ林の主要構成種であり、奄美大島を北限として、サモア諸島からオーストラリア北部，マレーシア，スリランカ，アフリカ東岸に囲まれた地域に広く分布しており、ヒルギ科（Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａｃｅａｅ）植物の共通した特長である胎生種子をつくる。オヒルギ属（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ）植物としては、オヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ (Ｌ．) Ｌａｍ．），シロバナヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ (Ｌ．) Ｂｌｕｍｅ），ニセオヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｅｘａｒｉｓｔａｔａ Ｄｉｎｇ Ｈｏｕ），ハイネッシイオヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｈａｉｎｅｓｉｉ Ｃ．Ｇ．Ｒｏｇｅｒｓ），ヒメヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ  (Ｒｏｘｂ．)  Ｗｉｇｈｔ  ｅｔ  Ａｒｎｏｌｄ  ｅｘ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ），ロッカクヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｓｅｘａｎｇｕｌａ(Ｌｏｕｒ．)  Ｐｏｉｒ．）等が知られている。これらのオヒルギ属植物の中でも、ヒアルロニダーゼ阻害作用の点からオヒルギ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ  (Ｌ．)  Ｌａｍ．）を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明で用いるハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物は、ハマザクロ科（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａｃｅａｅ）に属する植物で、熱帯、亜熱帯の多雨林または山地
林に生える高木である。ハマザクロ属（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ  Ｌ．ｆ．）植物としては、ハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｌｂａ  Ｊ．Ｓｍ．）、ナンヨウマヤプシキ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｃａｓｅｏｌａｒｉｓ  （Ｌ．）Ｅｎｇｌ．）、ムベンハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｐｅｔａｌａ  Ｂｕｃｈ．  Ｈａｍ．）、グリフィスハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｇｒｉｆｆｉｔｈｉｉ  Ｋｕｒｚ．）、グルンガイハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｇｌｕｎｇａｉ  Ｎ．Ｃ．Ｄｕｋｅ）、ホソバハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ  Ｂｌ．）、マルバマヤプシキ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ｏｖａｔａ  Ｂａｃｋ．）などが例示される。これらのハマザクロ属植物の中でも、ヒアルロニダーゼ阻害作用の点からハマザクロ（Ｓｏｎｎｅｒａｔｉａ ａｌｂａ  Ｊ．Ｓｍ．）を用いることが好ましい。
【００１８】
これらの植物を使用する際は、抽出物を用いるのが一般的である。抽出には、植物の幹，枝，果実，葉，花，種子，樹皮，樹液，根，芽などのいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、葉や種子を用いるとよい。抽出の際は、生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切，乾燥，粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。抽出は、抽出溶媒に浸漬するか、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌や抽出溶媒中でホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１９】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール，エタノール，プロパノール，イソプロパノール等の低級アルコール、１，３−ブチレングリコール，プロピレングリコール，ジプロピレングリコール，グリセリン等の多価アルコール、エチルエーテル，プロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル，酢酸ブチル等のエステル類、アセトン，エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができ、これらより１種又は２種以上を選択して用いる。また、生理食塩水，リン酸緩衝液，リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素，エチレン，プロピレン，エタノール，メタノール，アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界流体や亜臨界流体を用いてもよい。
【００２０】
これらの植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、濃縮，乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解したり、或いはこれらの生理作用を損なわない範囲で脱色，脱臭，脱塩等の精製処理を行ったり、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。これらの植物の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００２１】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、皮膚に外用するだけではなく、経口摂取も可能であり、食品、飲料、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。
【００２２】
また、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を皮膚外用剤に配合することにより、肌のシワ、タルミ、ハリ等の皮膚老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができる。さらに、発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、美容、健康維持、又は栄養補給を目的とするような食品や飲料にも用いることもできる。
【００２３】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を皮膚外用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２５．０質量％である。
【００２４】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の詳細を実施例を用いて説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１〜５］
表１に示した植物の乾燥粉砕物１００ｇを、２．０ｋｇの５０容量％エタノール水溶液に、分散させ、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出上清を濾別したのち、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、実施例１〜５を得た。
【００２７】
【表１】
2008024664.tif 000002
【００２８】
実施例１〜実施例５を用いて、ヒアルロニダーゼ阻害作用の評価を行った。
【００２９】
「ヒアルロニダーゼ阻害作用」
市販のヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。市販のヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。なお酵素溶液は用時調製とした。試験管に、緩衝液で各濃度に調製したサンプル溶液０．１ｍＬ、及び酵素溶液０．０３ｍＬをとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４規定のＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ジメチルベンズアルデヒド（ｐ−ＤＡＢＡ）溶液溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、各試験管から９６ウェルマイクロプレートに移しかえ、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、サンプルを溶かすのに用いた緩衝溶液のみを加えたものを用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し。ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。このことを利用し、阻害活性は次式より求めた。結果を表２にまとめる。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
【００３０】
【表２】
2008024664.tif 000003
【００３１】
表２に示した通り、本発明のフタバナヒルギ、オヒルギ、ハマザクロは、濃度依存的に、高いヒアルロニダーゼ阻害作用を示した。
【００３２】
本発明を実施した処方例を示す。
【００３３】
［処方例］美容液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）    １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（10）精製水                                          ５３．８５
（11）アルギニン（１質量％水溶液）                    ２０．０
（12）表３に示す成分                                    ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（10）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。乳化終了後、冷却を開始し、（11）と（12）を順次加え、均一に混合する。
【００３４】
各試料について、乾燥による肌荒れや小ジワ症状を有する３０〜４０才代の乾燥肌の女性パネラー１０名をそれぞれ一群とし、ブラインドにて２週間使用させ、使用前後の皮膚状態の変化を観察して評価した。皮膚症状の指標として、乾燥による肌荒れについて、「改善：２点」、「やや改善：１点」、「変化なし：０点」の三段階で評価、点数化し、それぞれの合計点を算出し、表３に示した。
【００３５】
【表３】
2008024664.tif 000004
【００３６】
表３に示したとおり、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤を含有する美容液を皮膚に適用することにより、乾燥や小ジワの改善が認められた。