(57)【要約】【課題】フォトクロミック分子を含む試料を、蛍光抑制効果を確実に誘起して、残留蛍光成分を生じることなく超解像で観察できる試料観察方法および顕微鏡を提供する。【解決手段】少なくとも第１安定状態Ｓ０および第２安定状態Ｓ３の量子状態を有するフォトクロミック分子を含む試料を観察するにあたり、フォトクロミック分子を第１安定状態Ｓ０から光応答可能な第１励起状態Ｓ１に励起する第１の光と、フォトクロミック分子を第１励起状態Ｓ１から他のエネルギー準位の第２励起状態Ｓ２に励起する第２の光とを用い、第１の光および第２の光を一部重ね合わせて試料に照射し、第１の光および第２の光が重ね合わされて照射された領域のフォトクロミック分子を第２励起状態Ｓ２を経て第２安定状態Ｓ３に遷移させ、第１の光のみが照射された領域のフォトクロミック分子を第１励起状態Ｓ１に遷移させて、試料を観察する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも第１安定状態Ｓ０および第２安定状態Ｓ３の量子状態を有するフォトクロミック分子を含む試料を観察するにあたり、
上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から光応答可能な第１励起状態Ｓ１に励起する第１の光と、上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１から他のエネルギー準位の第２励起状態Ｓ２に励起する第２の光とを用い、
上記第１の光および上記第２の光を一部重ね合わせて上記試料に照射し、上記第１の光および上記第２の光が重ね合わされて照射された領域の上記フォトクロミック分子を上記第２励起状態Ｓ２を経て上記第２安定状態Ｓ３に遷移させ、上記第１の光のみが照射された領域の上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１に遷移させて、上記試料を観察することを特徴とする試料観察方法。
【請求項２】
少なくとも第１安定状態Ｓ０および第２安定状態Ｓ３の量子状態を有するフォトクロミック分子を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から光応答可能な第１励起状態Ｓ１に励起する第１の光を出射する第１の光源と、
上記フォトクロミック分子を上記励起状態Ｓ１から他のエネルギー準位の第２励起状態Ｓ２に励起する第２の光を出射する第２の光源と、
上記第１の光および上記第２の光を一部重ね合わせて上記試料に集光して照射する光学系と、
上記光学系により上記第１の光および上記第２の光が重ね合わされて照射される領域の上記フォトクロミック分子を上記第２励起状態Ｓ２を経て上記第２安定状態Ｓ３に遷移させ、上記第１の光のみが照射される領域の上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１に遷移させるように、上記光学系を経て照射される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記第１励起状態Ｓ１に励起された上記フォトクロミック分子から発生する光応答を検出する検出手段と、を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
上記第１の光の光子エネルギーをＥ１、上記第２の光の光子エネルギーをＥ２、上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から上記第２安定状態Ｓ３へ変異させる際の障壁エネルギーをＥｔ、上記フォトクロミック分子を上記第２安定状態Ｓ３から上記第１安定状態Ｓ０へ変異させる際の障壁エネルギーをＥｃとするとき、
Ｅ２＜Ｅ１＜Ｅｔ＜Ｅ１＋Ｅ２、かつＥ１＜Ｅｃ
を満足することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記第１の光の照射により上記第１励起状態Ｓ１に励起された上記フォトクロミック分子が緩和しない間に、上記第２の光の照射を開始するように、上記第１の光および上記第２の光の照射タイミングを制御することを特徴とする請求項２または３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記試料の各観察点において、上記第１の光および上記第２の光を照射してから、上記第１の光を単独照射するように、上記第１の光および上記第２の光の照射タイミングを制御し、
上記第１の光の単独照射により上記フォトクロミック分子から発生する光応答を上記検出手段で検出することを特徴とする請求項２〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項６】
上記フォトクロミック分子を上記第２安定状態Ｓ３から上記第１安定状態Ｓ０に変異させる際の障壁エネルギーＥｃよりも大きい光子エネルギーをもつ第３の光を出射する第３の光源を有し、上記試料の各観察点において、上記フォトクロミック分子から発生する光応答の検出後に、当該観察点に上記光学系を経て上記第３の光を照射して、上記第２安定状態Ｓ３にある上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０に復帰させることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料観察方法および顕微鏡、特にフォトクロミック分子を含む試料を、第１の光および第２の光により照明して、超解像で観察する試料観察方法および顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図７〜図１０を参照して説明する。図７は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図７に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図８に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図９に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１０に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図９の吸収過程や図１０の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図８のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図９のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図９の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図７に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１１は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１１はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１１に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１２は、図１１と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１２において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１２の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、近年では、生物学的に興味深いフォトクロミック分子をプローブとする超解像技術が提案されている。この分子は、特定の波長の光刺激より、蛍光発光特性をもつ第１安定状態から蛍光発光性の無い第２安定状態に変異する（光異性化）。また、他の変異の過程として特定の化学結合が切断または接合したり、電荷移動を起こしたりすることでも光異性化が起きる。基本的には、光異性化が起きると分子構造が全く変化するので、その光学的性質も変化する。
【００１８】
例えば、フォトクロミック部位をもつ蛍光タンパクＦＰ５９５は、第１安定状態において波長５９５ｎｍ近傍の黄色い光を照射すると、これより長波長領域の赤い蛍光を発光する。ところが、波長４５８ｎｍ以下の短波長の光を照射すると第２安定状態に変異して、もはや黄色い光を照射しても、光学的性質が全く変化して蛍光は発しない。一度、第２安定状態に変異をすると、その状態は安定で、外部からエネルギー刺激を強制的に与えないと短時間内に第１安定状態には戻らない性質がある。
【００１９】
フォトクロミック分子をプローブとする超解像技術では、上記のようなフォトクロミック分子の特性を一種の蛍光抑制効果として応用しようとするもので、生物用顕微鏡への応用が期待されている。
【００２０】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
しかしながら、従来報告されているフォトクロミック分子に関する超解像技術では、分光学的に蛍光抑制効果の発現が弱いために、超解像効果の発現が二重共鳴吸収過程と比較して弱いと言う問題がある。また、光異性化が遅いために、蛍光抑制および第１安定状態への復帰が遅く、計測時間がかかる問題があった。
【００２２】
以下、この点について説明する。図１３（ａ）は、従来の二重共鳴吸収過程を用いた超解像法の場合の分光ダイヤグラム、図１３（ｂ）は、フォトクロミック分子の蛍光抑制効果を利用した超解像法の場合の分光ダイヤグラムを示しており、横軸は核間距離を、縦軸はエネルギー強度を示している。
【００２３】
二重共鳴吸収過程を利用する超解像法では、図１３（ａ）に示すように、基底状態（Ｓ０）の分子を、光子エネルギーＥ２１のポンプ光照射により蛍光発光可能な第１励起状態（Ｓ１）に励起し、さらに蛍光抑制させるために、光子エネルギーＥ２２のイレース光照射により上位の励起状態（Ｓ３）に遷移させて、Ｓ３からは熱緩和により蛍光を抑制している。この時の光反応過程は、全てナノ秒以下であり非常に高速である。
【００２４】
これに対し、フォトクロミック分子は、図１３（ｂ）に示すように、第１安定状態（Ｓ０）および第２安定状態（Ｓ３）に対応する２つの準安定なローカルミニマムのポテンシャルを持っている。このため、フォトクロミック分子の蛍光抑制効果を利用する超解像法では、一般には、第１安定状態である基底状態（Ｓ０）にあるフォトクロミック分子を、光子エネルギーＥ３１のポンプ光照射により蛍光発光可能な第１励起状態（Ｓ１）に励起し、さらに蛍光抑制させるために、第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）への変異に不可欠な障壁エネルギーＥｔを超える光子エネルギーＥ３２のイレース光照射により上位の第２励起状態（Ｓ２）に遷移および経由させることで、第２安定状態（Ｓ３）に変異させるようにしている。
【００２５】
しかし、この場合、第２安定状態（Ｓ３）に変異させるイレース光の強度に関しては、あまり強くすると、一度は第１安定状態（Ｓ１）から第２安定状態（Ｓ３）に変異したものの、再びイレース光によって励起されて第１安定状態（Ｓ１）に戻り、再びポンプ光励起により蛍光が発せられて、残留蛍光成分が生じることになる。
【００２６】
この現象は、幾らイレース光強度を強くしても、蛍光抑制が確実に誘起できないことを意味しており、超解像法の結像性能に好ましくない影響を与えることになる。この点について、図１４に示す２次元点像分布関数を参照して説明する。
【００２７】
超解像法では、ガウシアンタイプのポンプ光に、光軸直交平面における断面形状がドーナッツ形状のイレース光を空間的に同軸上に重ね合わせて試料に照射する。この際、二重共鳴吸収過程を用いる場合には、イレース光強度が十分なポンプ光の辺縁部においては蛍光が完全に抑制されるので、得られる蛍光スポットパターンすなわち２次元点像分布関数は、図１４に符号Ｉで示すように、非常に幅の細いローレンツタイプ関数なる。
【００２８】
これに対し、フォトクロミック分子の蛍光抑制効果を利用する場合には、幾らイレース光強度を強くしても蛍光抑制が確実に誘起されないため、ポンプ光の辺縁部で蛍光抑制が不完全となる。その結果、得られる２次元点像分布関数は、図１４に符号IIで示すように、先尖のみでスポットサイズの収縮が起こり、裾野では蛍光抑制が空間的に十分にできていない関数形となる。なお、図１４において、符号IIIは、ポンプ光の２次元点像分布関数を示している。
【００２９】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、フォトクロミック分子を含む試料を、蛍光抑制効果を確実に誘起して、残留蛍光成分を生じることなく超解像で観察できる試料観察方法および顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
上記目的を達成する請求項１に係る試料観察方法の発明は、少なくとも第１安定状態Ｓ０および第２安定状態Ｓ３の量子状態を有するフォトクロミック分子を含む試料を観察するにあたり、
上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から光応答可能な第１励起状態Ｓ１に励起する第１の光と、上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１から他のエネルギー準位の第２励起状態Ｓ２に励起する第２の光とを用い、
上記第１の光および上記第２の光を一部重ね合わせて上記試料に照射し、上記第１の光および上記第２の光が重ね合わされて照射された領域の上記フォトクロミック分子を上記第２励起状態Ｓ２を経て上記第２安定状態Ｓ３に遷移させ、上記第１の光のみが照射された領域の上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１に遷移させて、上記試料を観察することを特徴とするものである。
【００３１】
さらに、上記目的を達成する請求項２に係る顕微鏡の発明は、少なくとも第１安定状態Ｓ０および第２安定状態Ｓ３の量子状態を有するフォトクロミック分子を含む試料を観察する顕微鏡であって、
上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から光応答可能な第１励起状態Ｓ１に励起する第１の光を出射する第１の光源と、
上記フォトクロミック分子を上記励起状態Ｓ１から他のエネルギー準位の第２励起状態Ｓ２に励起する第２の光を出射する第２の光源と、
上記第１の光および上記第２の光を一部重ね合わせて上記試料に集光して照射する光学系と、
上記光学系により上記第１の光および上記第２の光が重ね合わされて照射される領域の上記フォトクロミック分子を上記第２励起状態Ｓ２を経て上記第２安定状態Ｓ３に遷移させ、上記第１の光のみが照射される領域の上記フォトクロミック分子を上記第１励起状態Ｓ１に遷移させるように、上記光学系を経て照射される光と上記試料とを相対的に移動させて上記試料を走査する走査手段と、
上記第１励起状態Ｓ１に励起された上記フォトクロミック分子から発生する光応答を検出する検出手段と、を有することを特徴とするものである。
【００３２】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の顕微鏡において、上記第１の光の光子エネルギーをＥ１、上記第２の光の光子エネルギーをＥ２、上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０から上記第２安定状態Ｓ３へ変異させる際の障壁エネルギーをＥｔ、上記フォトクロミック分子を上記第２安定状態Ｓ３から上記第１安定状態Ｓ０へ変異させる際の障壁エネルギーをＥｃとするとき、
Ｅ２＜Ｅ１＜Ｅｔ＜Ｅ１＋Ｅ２、かつＥ１＜Ｅｃ
を満足することを特徴とするものである。
【００３３】
請求項４に係る発明は、請求項２または３に記載の顕微鏡において、上記第１の光の照射により上記第１励起状態Ｓ１に励起された上記フォトクロミック分子が緩和しない間に、上記第２の光の照射を開始するように、上記第１の光および上記第２の光の照射タイミングを制御することを特徴とするものである。
【００３４】
請求項５に係る発明は、請求項２〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記試料の各観察点において、上記第１の光および上記第２の光を照射してから、上記第１の光を単独照射するように、上記第１の光および上記第２の光の照射タイミングを制御し、
上記第１の光の単独照射により上記フォトクロミック分子から発生する光応答を上記検出手段で検出することを特徴とするものである。
【００３５】
請求項６に係る発明は、請求項２〜５のいずれか一項に記載の顕微鏡において、上記フォトクロミック分子を上記第２安定状態Ｓ３から上記第１安定状態Ｓ０に変異させる際の障壁エネルギーＥｃよりも大きい光子エネルギーをもつ第３の光を出射する第３の光源を有し、上記試料の各観察点において、上記フォトクロミック分子から発生する光応答の検出後に、当該観察点に上記光学系を経て上記第３の光を照射して、上記第２安定状態Ｓ３にある上記フォトクロミック分子を上記第１安定状態Ｓ０に復帰させることを特徴とするものである。
【００３６】
図１は、本発明の原理を説明するフォトクロミック分子の分光ダイヤグラムを示している。本発明では、従来のようにイレース光によりフォトクロミック分子を第１安定状態から第２安定状態へ直接変異させるのではなく、フォトクロミック分子に２色の第１の光および第２の光を照射することにより二重共鳴吸収を誘導させて、フォトクロミック分子を第１安定状態から第２安定状態へ変異させる。
【００３７】
このため、先ず、第１安定状態である基底状態（Ｓ０）にあるフォトクロミック分子を、光子エネルギーＥ１の第１の光（ポンプ光）照射により光応答可能な第１励起状態（Ｓ１）に励起遷移させる。この第１励起状態（Ｓ１）に遷移すると、フォトクロミック分子は、通常は、光応答過程により基底状態（Ｓ０）に緩和する。
【００３８】
本発明では、第１励起状態（Ｓ１）が緩和しない間に、光子エネルギーＥ２の第２の光（イレース光）照射により、フォトクロミック分子を第１励起状態（Ｓ１）から、それよりも高い量子レベルの第２励起状態（Ｓ２）に励起遷移させる。この第２励起状態（Ｓ２）に遷移させる際の光子エネルギーＥ２は、第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）への変異に不可欠な障壁エネルギーＥｔ以上で、かつ、第２安定状態（Ｓ３）において、フォトクロミック分子がポンプ光およびイレース光の照射によって二重共鳴吸収を起こさないことが条件となる。
【００３９】
このため、本発明では、フォトクロミック分子が第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）へ変異すると、分子構造が変化して光学的性質も変わることに着目し、ポンプ光およびイレース光による励起によって、第２安定状態（Ｓ３）では二重共鳴吸収の共鳴条件から外れるように、それぞれの光の光子エネルギーＥ１およびＥ２を設定する。このようにすれば、ポンプ光およびイレース光の照射によっては、第２安定状態（Ｓ３）から第１安定状態（Ｓ０）への変異は起きないので、残留蛍光成分は生じない。もちろん、ポンプ光またはイレース光の単独励起では、第２安定状態（Ｓ３）の分子の励起は不可能なので、蛍光発光は生じない。
【００４０】
さらに、本発明の好適実施の形態では、第２安定状態（Ｓ３）から第１安定状態（Ｓ０）への変異を確実に阻止するため、選択するフォトクロミック分子がもつ量子状態間のエネルギー間隔を、下記の条件を満たすようにする。
【００４１】
１）大前提として、第１安定状態（Ｓ０）にあるフォトクロミック分子を光応答可能な第１励起状態（Ｓ１）に励起するポンプ光の光子エネルギーＥ１は、第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）への変性が起こらないエネルギーとする。すなわち、第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）への変異に要する障壁エネルギーＥｔよりも小さくする。
【００４２】
２）フォトクロミック分子を第２励起状態（Ｓ２）に励起するポンプ光の光子エネルギーＥ１と、イレース光の光子エネルギーＥ２との和は、少なくとも第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）への変異に要する障壁エネルギーＥｔよりも大きくする。
【００４３】
３）残留蛍光成分が発生しないようにするため、すなわち第２安定状態（Ｓ３）に変異したフォトクロミック分子が、第２安定状態（Ｓ３）から第１安定状態（Ｓ０）へ戻らないようにするため、ポンプ光による光子エネルギーＥ１は、第２安定状態（Ｓ３）から第１安定状態（Ｓ０）への変異に要する障壁エネルギーＥｃよりも小さくする。
【００４４】
以上の条件を整理すると、Ｅ２＜Ｅ１＜Ｅｔ＜Ｅ１＋Ｅ２、かつＥ１＜Ｅｃとなる。
【００４５】
なお、イレース光は、ポンプ光の照射によりＳ１状態に励起されたフォトクロミック分子が緩和しない間に、照射を開始することが不可欠である。なぜなら、ポンプ光の照射が止まり、フォトクロミック分子が第１安定状態である基底状態（Ｓ０）に緩和してしまうと、イレース光の照射では光子エネルギーが障壁エネルギーＥｔより遥か小さくなって、フォトクロミック分子を第１安定状態（Ｓ０）から第２安定状態（Ｓ３）へ効率的に変異できなくなるからである。
【００４６】
以上の条件を満たすように、ポンプ光とイレース光とを空間的に重ね合わせてフォトクロミック分子を含む試料に照射すれば、ポンプ光とイレース光とが照射された部分では、フォトクロミック分子は第２安定状態（Ｓ３）に変性して、ポンプ光で励起されても蛍光を発しない。これに対し、イレース光が照射されていない部分では、障壁エネルギーＥｔを乗り越えることができないので、観察に必要な蛍光領域の強度が損なわれることがなくなる。
【発明の効果】
【００４７】
したがって、本発明によれば、フォトクロミック分子を含む試料を、蛍光抑制効果を確実に誘起して、残留蛍光成分を生じることなく観察できるので、従来の二重共鳴吸収過程を利用した超解像顕微鏡法に勝るとも劣らない結像性能を得ることができる。また、二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡法では、非蛍光緩和の過程が熱緩和のパスのみであったのに対して、フォトクロミック分子の場合には、フォトクロミック光反応も非蛍光緩和の過程に加わるので、弱い強度の第２の光（イレース光）で蛍光抑制を実現することができるとともに、生体試料へのダメージも大幅に低減することができる。その結果、商用顕微鏡装置の構成を考える際に、超解像顕微鏡のもつ高いパフォーマンスをもちつつ、しかもシステム構成が簡単な商品コンセプトを提示することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
（第１実施の形態）
本実施の形態では、フォトクロミック分子として蛍光タンパクＦＰ５９５を含む試料を観察する。蛍光タンパクＦＰ５９５は、第１安定状態（Ｓ０）で波長５６８ｎｍの光（ポンプ光）を照射すると、波長６０５ｎｍに蛍光発光ピークをもち、波長４５８ｎｍの光（イレース光）を照射すると、障壁エネルギーを乗り越えて、第２安定状態（Ｓ３）に変性し、一度、第２安定状態（Ｓ３）に変性するとポンプ光を照射しても蛍光を発しないが、イレース光の照射では蛍光を発光する特性を有している。
【００４９】
蛍光タンパクＦＰ５９５を含む試料の場合、ポンプ光波長を勘案すると、Ｓ０状態から光応答としての蛍光発光可能な第１励起状態Ｓ１へ励起遷移させるために必要な光子エネルギーＥ１は、２．２ｅＶとなる。一方、イレース光単独で第１安定状態（Ｓ０）から障壁エネルギーを越えて第２安定状態（Ｓ３）へ変異させるのに必要な光子エネルギーＥ３２（図１３（ｂ）参照）は、２．７ｅＶである。したがって、少なくとも２．７ｅＶ以上の光子エネルギーをもつ光がイレース光として利用できる。
【００５０】
ここで、ポンプ光とイレース光との光子エネルギーの差は、０．５ｅＶである。すなわち、第１励起状態Ｓ１を基準にすると、そこから０．５ｅＶの上位のエネルギー準位として第２励起状態Ｓ２が存在する。一般に、第２励起状態Ｓ２以上の電子状態はエネルギー間隔が密に存在し、しかもそれに帰属する振動・回転準位も広く分散するので、第１励起状態Ｓ１の分子に０．５ｅＶ以上の光子エネルギーを有する光を照射すると、障壁エネルギーＥｔを超えて第２安定状態（Ｓ３）に変性させることができる。これは、波長換算すると、２．４μｍとなる。
【００５１】
したがって、イレース光として、０．５ｅＶ以上で、かつ２．２ｅＶ（ポンプ光の光子エネルギー）以下の光子エネルギーを有する光を用いれば、第１安定状態（Ｓ０）の蛍光タンパクＦＰ５９５を第１励起状態Ｓ１に励起して、さらに効率的に第２安定状態（Ｓ３）に変性させることがきる。言い換えると、波長が５６８ｎｍより長く２．４μｍより短い光源を選べば、イレース光として用いることができる。このような波長帯域で発振できるレーザとしては、例えば、Ｔｉ：サファイヤレーザや、手軽な近赤外の各種半導体レーザが知られている。
【００５２】
従来の二重共鳴吸収過程のみを用いた超解像顕微鏡法においては、イレース光源として先頭値の高いレーザ光が必要であった。そのため、ピコ秒、フェムト秒といった極短パルスレーザ光を、取り扱いが難しい各種非線形結晶を用いて波長変換を行っていた。その結果、顕微鏡システムが非常に大掛かりとなって、生物系の一般ユーザには使いにくいものとなっていた。
【００５３】
これに対し、本実施の形態の蛍光タンパクＦＰ５９５を用いた超解像顕微鏡法では、イレース光強度がμＷクラスでも使えるので、光源の選択の幅が広がるのと同時に、生体試料へのダメージも大幅に低減できる。
【００５４】
図２は、本実施の形態による超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。この超解像顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット１０、スキャンユニット３０および顕微鏡ユニット５０からなっている。
【００５５】
光源ユニット１０は、例えば波長５６８ｎｍのポンプ光を出射するアルゴン・クリプトンレーザからなる第１の光源１１と、波長１０６４ｎｍのイレース光を出射するＮｄ：ＹＡＧレーザからなる第２の光源１２と、イレース光空間変調用の位相板１３と、イレース光およびポンプ光を同軸上に重ね合わせるためのビームコンバイナ１４とを有している。位相板１３は、図３にか拡大平面図を示すように、光軸対称の位置で通過したイレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜を蒸着して構成されている。図３では、光軸の周りに独立した４つの領域を有し、イレース光波長に対して４分１ずつ位相が異なっている。この位相板１３を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００５６】
スキャンユニット３０は、光源ユニット１０から出射される同じ光学軸を共有するポンプ光とイレース光とを、ハーフミラー３１を通過させた後、２枚のガルバノミラー３２および３３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット５０に出射するようになっているとともに、顕微鏡ユニット５０で検出された蛍光を、往路とは逆の経路を辿ってハーフミラー３１で分岐し、その分岐された蛍光を投影レンズ３４、ピンホール３５、ノッチフィルタ３６および３７を経て光電子増倍管３８で受光するようになっている。図２では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー３２，３３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ３６および３７は、蛍光に混入したポンプ光およびイレース光を除去するものである。また、ピンホール３５は、共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００５７】
顕微鏡ユニット５０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット３０から入射するポンプ光およびイレース光をハーフミラー５１で反射させて、対物レンズ５２により蛍光タンパクＦＰ５９５を含む試料５３上に集光させるとともに、試料５３で発光した蛍光を、再び対物レンズ５２でコリメートしてハーフミラー５１で反射させることにより、再び、スキャンユニット３０に戻すと同時に、ハーフミラー５１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ５４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００５８】
本実施の形態では、ポンプ光およびイレース光を試料５３に連続的に照射しながら試料５３を走査して、中空状のイレース光の中央部を蛍光観察領域として超解像で観察する。したがって、本実施の形態の場合には、イレース光の照射によって第２安定状態に変性される領域が、熱緩和により第１安定状態に復帰する時間に同期させて、試料５３を走査する。
【００５９】
（第２実施の形態）
本発明の第２実施の形態では、第１実施の形態の超解像顕微鏡において、第１の光源１１からのポンプ光および第２の光源１２からのイレース光を、蛍光タンパクＦＰ５９５が変性したときの寿命の長さに着目して、図４に示すタイミングで試料５３にパルス状に照射する。
【００６０】
すなわち、試料５３の各観察点において、先ず、ポンプ光およびイレース光を同時照射して、信号検出に必要ない領域にある分子を第２安定状態に変性させ（超解像記録）、続いて、熱緩和によって第２安定状態から第１安定状態に戻る前に、ポンプ光を単独照射し、そのポンプ光の単独照射に同期して回折限界以下の狭い領域にある第１安定状態の蛍光タンパクＦＰ５９５からの蛍光を読み出す。
【００６１】
このように、本実施の形態によれば、ポンプ光単独照射時の蛍光信号を計測するので、イレース光の散乱光が混入せず、良好なＳ／Ｎで試料５３を超解像で観察することができる。
【００６２】
なお、パルス状のポンプ光およびイレース光は、第１の光源１１および第２の光源１２の駆動を制御して、それらの出力光自体をオン・オフして得るか、あるいは第１の光源１１および第２の光源１２からはそれぞれＣＷのポンプ光およびイレース光を出射させ、ビームコンバイナ１４と第１の光源１１および第２の光源１２との間の光路中に、それぞれ電気光学変調素子や音響光変調素子等からなる強度変調手段を配置して、対応する強度変調手段の駆動を制御することにより、パルス状のポンプ光およびイレース光を得る。
【００６３】
（第３実施の形態）
図５は、本発明の第３実施の形態による超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。本実施の形態は、図２に示す構成において、光源ユニット１０に、蛍光タンパクＦＰ５９５が第２安定状態から第１安定状態に復帰するのを促進する第３の光（復帰光）を出射する第３の光源１５と、この第３の光源１５からの復帰光を、その光軸をポンプ光やイレース光の光軸と一致させてスキャンユニット３０に入射させるビームコンバイナ１６とを付加したものである。その他の光学系の構成は、図２と同様である。
【００６４】
本実施の形態では、第１の光源１１からのポンプ光、第２の光源１２からのイレース光および第３の光源１５からの復帰光を、図６に示すタイミングで試料５３にパルス状に照射する。すなわち、図４に示した第２実施の形態と同様に、試料５３の各観察点において、先ず、ポンプ光およびイレース光を同時照射して、信号検出に必要ない領域にある分子を第２安定状態に変性させ（超解像記録）、続いて、熱緩和によって第２安定状態から第１安定状態に戻る前に、ポンプ光を単独照射し、そのポンプ光の単独照射に同期して回折限界以下の狭い領域にある第１安定状態の蛍光タンパクＦＰ５９５からの蛍光を読み出す。その後、超解像計測が終了した当該観察点に、第３の光源１５からの復帰光を照射して、第２安定状態から第１安定状態への復帰を促進させる。
【００６５】
ここで、パルス状の復帰光は、パルス状のポンプ光およびイレース光を得る場合と同様に、第３の光源１５の駆動を制御して、その出力光自体をオン・オフして得るか、あるいは第３の光源１５からはＣＷの復帰光を出射させ、ビームコンバイナ１６と第３の光源１５との間の光路中に強度変調手段を配置し、その駆動を制御してパルス状の復帰光を得る。また、第３の光源１５から出射させる復帰光は、第２の光源１２から出射されるイレース光よりも短い波長で、かつ蛍光タンパクＦＰ５９５を第２安定状態から第１安定状態へ復帰するための障壁エネルギーＥｃ（図１参照）より大きい光子エネルギーを持つものとする。
【００６６】
このように、本実施の形態によれば、超解像計測が終了した試料５３の観察点に、第３の光源１５からの復帰光を照射して、蛍光タンパクＦＰ５９５の第２安定状態から第１安定状態への復帰を促進させるようにしたので、第２実施の形態の効果に加えて、第１安定状態への復帰を早めることができる。その結果、試料５３の走査を早めることができ、大幅な計測時間の短縮が図れる。
【００６７】
なお、上記実施の形態では、蛍光タンパクＦＰ５９５を例にとって説明したが、本発明は蛍光タンパクＦＰ５９５を含む試料に限らず、他のフォトクロミック分子を含む試料を観測する場合も有効に適用することができ、フォトクロミック分子の光学特性に応じて、第１の光（ポンプ光）および第２の光（イレース光）、さらには第３の光（復帰光）を適宜設定すればよい。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の原理を説明するフォトクロミック分子の分光ダイヤグラムである。
【図２】本発明の第１実施の形態による超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図３】図２の位相板を示す拡大平面図である。
【図４】本発明の第２実施の形態による超解像顕微鏡におけるポンプ光およびイレース光の照射タイミングを示すタイミングチャートである。
【図５】本発明の第３実施の形態による超解像顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図６】第３実施の形態による超解像顕微鏡におけるポンプ光、イレース光および復帰光の照射タイミングを示すタイミングチャートである。
【図７】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図８】図１６の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図９】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１０】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１１】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１２】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１３】二重共鳴吸収過程を用いた超解像法の場合の分光ダイヤグラムおよびフォトクロミック分子の蛍光抑制効果を利用した超解像法の場合の分光ダイヤグラムである。
【図１４】二重共鳴吸収過程を用いた超解像法と、フォトクロミック分子の蛍光抑制効果を利用した超解像法とによる２次元点像分布関数を示す図である。
【符号の説明】
【００６９】
１０  光源ユニット
３０  スキャンユニット
５０  顕微鏡ユニット
１１  第１の光源
１２  第２の光源
１３  位相板
１４，１６  ビームコンバイナ
１５  第３の光源
３１  ハーフミラー
３２，３３  ガルバノミラー
３４  投影レンズ
３５  ピンホール
３６，３７  ノッチフィルタ
３８  光電子増倍管
５１  ハーフミラー
５２  対物レンズ
５３  試料
５４  接眼レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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