(57)【要約】【課題】プレ増幅することなく、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、複数種類の標的塩基配列を同時に定量的に増幅する方法の提供。【解決手段】複数のチャンネルを備えた基板を用いて、同時に複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われること、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出すること、を特徴とする、塩基配列の増幅方法、及び、前記検出を、前記ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光強度を測定することによって行うことを特徴とする塩基配列の増幅方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のチャンネルを備えた基板を用いて、同時に複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、
１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われること、
少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、
前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出すること、
を特徴とする、塩基配列の増幅方法。
【請求項２】
前記検出を、前記ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光強度を測定することによって行うことを特徴とする請求項１記載の塩基配列の増幅方法。
【請求項３】
前記ＰＣＲが、１のチャンネルにおいて、１種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲであることを特徴とする請求項１又は２記載の塩基配列の増幅方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルを、前記チャンネルに、毛細管現象を利用して供給することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の塩基配列の増幅方法。
【請求項５】
前記チャンネルに前記ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルが供給される前に、前記ＰＣＲに用いられる１又は複数種類のプライマーセットが、前記チャンネルに固定されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の塩基配列の増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量のＤＮＡサンプルから、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、複数種類の標的塩基配列を同時に定量的に増幅する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトをはじめとするさまざまな生物のゲノム等の塩基配列解析が精力的に進められ、その結果、遺伝子を解析して、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断、治療方針の設定、治療後の管理、予後予想等が行われている。また別の分野では、遺伝子を解析することにより、食肉、穀物等の食品の流通管理も行われている。
これらの遺伝子解析では、解析対象となる標的塩基配列を増幅することにより解析が行われることが多く、該塩基配列の増幅には、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ポリメラーゼ連鎖反応）法が最も一般的に用いられている。
【０００３】
ＰＣＲ法の一つにリアルタイムＰＣＲ法がある。リアルタイムＰＣＲ法は、ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物量を、蛍光物質等を用いて経時的（リアルタイム）に検出する方法である。ＰＣＲでは、１サイクル毎にＰＣＲ産物が２倍ずつ指数関数的に増幅し、やがてプラトーに達するが、この指数関数的増幅域では、正確な定量が可能である。このため、ＰＣＲ産物を経時的に検出することにより、ＰＣＲ反応溶液中の鋳型となる核酸量を定量的に解析することができる。リアルタイムＰＣＲ法は、定量的な解析を必要とする場合のみならず、標的核酸配列の存在の有無を調べる定量的な解析においても、非常に優れている。ＰＣＲと同時にＰＣＲ産物量を検出するため、ＰＣＲ後に電気泳動等によりＰＣＲ産物を検出する必要がなく、迅速に解析結果を得ることができる上に、コンタミネーションの危険性も低減されるためである。
ＰＣＲ産物の量を経時的に検出する方法として、主に、蛍光物質を用いて、ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光強度を測定する方法がとられている。蛍光物質を用いることにより、非常に高感度にＰＣＲ産物を検出することができる。
【０００４】
一塩基多型（ＳＮＰ）検出、遺伝的変異の検出、及び感染したウィルスの特定等の遺伝子解析では、１のＤＮＡサンプル中に、標的塩基配列が複数存在する場合が多く、また、非常に多くのＤＮＡサンプルを処理しなければならない場合も多い。このような解析を通常のＰＣＲ法で行う場合には、ＤＮＡサンプルを小分けし、それぞれの標的塩基配列に特異的なプライマーセットを用いて、別々にＰＣＲによる増幅を行うことになる。しかしながら、ＤＮＡサンプルが大量に必要とされるため、ＤＮＡサンプルが微量しか得られない場合には解析が困難である。また、標的塩基配列の数だけ反応容器が必要となり、同時に処理できるサンプル数が限られる、という問題もある。このため、微量のＤＮＡサンプルから、複数種類の標的塩基配列を増幅する方法の改良が望まれている。
【０００５】
微量のＤＮＡサンプルから、複数種類の標的塩基配列を増幅する方法の１つに、マルチプレックスＰＣＲ法がある。通常のＰＣＲ法では、１の反応容器に、１種類のプライマーセットを用いて標的塩基配列の増幅を行うが、マルチプレックスＰＣＲ法では、１の反応容器に、複数種類のプライマーセットを用いて、複数種類の標的塩基配列の増幅を行う。この手法により、鋳型とするＤＮＡサンプルが少量しか得られない場合であっても、多種類のＰＣＲを同時に行うことが可能であり、また、同一の反応容器で反応を行うことにより、検出の定量性の向上も期待できる。
【０００６】
その他にも、例えば、（１）担体に固定化されたＤＮＡサンプルを用意し、第１のプライマー対を用いて第１の標的領域をプレ増幅して、第１のプレ増幅産物を生成し、第１のプレ増幅産物を第１の容器に移し、第２のプライマー対を用いて第２の標的領域をプレ増幅して、第２のプレ増幅産物を生成し、第２のプレ増幅産物を第２の容器に移し、そして、第１の容器中の第１のプレ増幅産物と第２の容器中の第２のプレ増幅産物とを同時にＰＣＲ増幅することにより、１のＤＮＡサンプルから２又はそれ以上の標的領域をＰＣＲにより増幅する方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開２００５−１９８５８１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、多くの種類のプライマーセットを同時に用いるマルチプレックスＰＣＲ法では、プライマーが標的塩基配列以外にアニールするミスアニーリングや、プライマー同士がアニールすることによるプライマー二量体の形成等を防止しつつ、複数種類の標的塩基配列を、それぞれ特異的に増幅するようにプライマーを設計しなくてはならないため、１種類のプライマーセットのみを用いる通常のＰＣＲ法に比べ、プライマー設計が非常に困難であるという問題がある。
また、マルチプレックス・リアルタイムＰＣＲ法において、得られた複数種類のＰＣＲ産物の量を、蛍光を利用してそれぞれ経時的に検出する場合には、検出に用いる蛍光物質が、標的塩基配列の種類の数だけ必要となる。各蛍光物質の蛍光が、互いにクロストークすると、正確に定量することができないためである。しかしながら、現状では、蛍光物質の数は限られているため、同時に経時的に検出することができる標的塩基配列の種類は、せいぜい５種類程度でしかない。
【０００８】
一方、上記（１）の方法においては、複数種類の標的塩基配列を、それぞれ別の反応容器中で増幅させるため、マルチプレックスＰＣＲ法が有するようなプライマー設計上の困難性は解消できる。しかしながら、全ての標的塩基配列を、それぞれプレ増幅する必要があるため、操作が煩雑となり、コンタミネーションの危険性も高くなる。また、プレ増幅産物を移動させるために、大掛かりな装置が必要であり、同時に処理できるサンプル数が限られてしまうという問題もある。
【０００９】
本発明は、プレ増幅することなく、微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、複数種類の標的塩基配列を同時に定量的に増幅する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、反応容器として、キャピラリーのような非常に孔径の小さなチャンネルを用いることにより、ＤＮＡサンプルが微量であっても、プレ増幅することなく、多くの反応容器において、別個にＰＣＲによる増幅を行うことが可能であることを見出した。そして、さらに検討した結果、反応容器として用いるチャンネルを、複数まとめて備えている基板を用いることにより、非常に簡便に、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、複数種類の標的塩基配列を同時に定量的に増幅できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
すなわち、本発明は、複数のチャンネルを備えた基板を用いて、同時に複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）が、各チャンネルにおいて行われること、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出すること、を特徴とする、塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、前記検出を、前記ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光強度を測定することによって行うことを特徴とする塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＰＣＲが、１のチャンネルにおいて、１種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲであることを特徴とする塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、前記ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルを、前記チャンネルに、毛細管現象を利用して供給することを特徴とする塩基配列の増幅方法を提供するものである。
また、本発明は、前記チャンネルに前記ＰＣＲの鋳型となるＤＮＡサンプルが供給される前に、前記ＰＣＲに用いられる１又は複数種類のプライマーセットが、前記チャンネルに固定されていることを特徴とする塩基配列の増幅方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の塩基配列の増幅方法を用いることにより、ＤＮＡサンプルが微量であっても、多くのチャンネルにおいて、別個にリアルタイムＰＣＲによる増幅を行うことが可能となる。したがって、従来と異なり、非常に多くの種類のＰＣＲ産物を同時に経時的に検出することができるため、多種類の標的塩基配列を、一度のリアルタイムＰＣＲにより、定量的に増幅することが可能となる。特に、チャンネル毎に１種類の標的塩基配列を増幅することにより、１種類の蛍光物質のみを用いることによっても、同時に複数種類の標的塩基配列の定量的解析が可能となる。また、１の反応容器内で全ての標的塩基配列の増幅を行うよりも、プライマー設計が著しく容易になる。非特異的な塩基配列の増幅も顕著に抑制できることから、遺伝子解析の精度の向上も期待できる。さらに、プレ増幅等の煩雑な操作を必要とせず、操作が簡便となるため、多サンプルの解析も容易にする上に、コンタミネーションの危険性も低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明におけるチャンネルは、キャピラリーのような非常に孔径の小さな円筒状の構造である。孔径が数〜２００μｍで、かつ、厚さが０．４〜数十ｍｍのものが好ましい。ポリメラーゼ等が付着することを防止するため、チャンネルの内壁は、タンパク質吸着阻害作用を有する物質で覆われていることが好ましい。該タンパク質吸着阻害作用を有する物質として、例えば、ウシ血清アルブミン等がある。該タンパク質吸着阻害作用を有する物質の量は特に限定されないが、ポリメラーゼ濃度に対して過剰であることが好ましい。
【００１４】
本発明における基板の素材は、耐熱性の高い素材であることが好ましい。ＰＣＲの反応容器として用いるものであるためである。例えば、ガラス製やシリコン製の素材から構成される基板が好ましい。本発明の基板の形状は、複数の前記チャンネルを備えている限り、特に限定されるものではない。好ましくは、複数の前記チャンネルが規則正しく二次元的に配列された板状構造である。円形でも角形でもよいが、市販のサーマルサイクラーに設置可能な大きさ・形状であることが好ましい。
【００１５】
本発明における標的塩基配列とは、遺伝子上に存在する特定の領域の塩基配列であって、ＰＣＲが可能な程度に塩基配列が明らかになっているものであれば、特に限定されるものではない。例えば、動物や植物の染色体や、細菌やウィルスの遺伝子に存在する塩基配列等がある。
【００１６】
本発明において用いられるＤＮＡサンプルは、標的塩基配列の存在の検出や配列の同定等が望まれるものであり、ＰＣＲにおいて鋳型となるものであれば、特に限定されるものではない。天然由来のものであってもよく、合成されたものであってもよい。また、ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成されたｃＤＮＡであってもよい。例えば、血液や体液等の生体試料や、培養細胞溶液等から、通常用いられる方法により抽出されたＤＮＡ等がある。このような抽出法として、例えば、チオシアン酸グアニジンを用いた方法や、酸性フェノール及びクロロホルムを用いた方法等がある。また、市販の核酸抽出試薬を、製造業者の指示に従って用いることによっても、核酸を抽出することができる。
【００１７】
本発明における基板は、複数種類の標的塩基配列を同時に増幅するために用いられる基板であって、前記基板は、複数のチャンネルを備えており、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲが、各チャンネルにおいて行われるものであり、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、を特徴とするものである。ＤＮＡサンプルを、複数の容量の小さいチャンネルに供給することにより、通常ＰＣＲの反応容器として用いられる１．５ｍＬチューブや０．６ｍＬチューブ等を使用する場合と異なり、ＤＮＡサンプルが微量の場合であっても、反応容器毎に別個にＰＣＲを行うことが可能となる。
【００１８】
各チャンネル内で行われるＰＣＲは、１種類の標的塩基配列を増幅するものであってもよく、複数種類の標的塩基配列を増幅するものであってもよい。１種類の蛍光物質のみを用いることにより、増幅により得られたＰＣＲ産物の量を経時的に検出することができること、プライマーの設計が容易であること、及び、非特異的な塩基配列の増幅も顕著に抑制できることから、１のチャンネルにおいて、１種類の標的塩基配列を増幅することが好ましい。
一方、各チャンネルにおいて複数種類の標的塩基配列を増幅することにより、従来のリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ法よりも、非常に多種類の標的塩基配列を同時に定量的に解析することが可能となる。１のチャンネルにおいて増幅することができる標的塩基配列の種類は、各ＰＣＲ産物を検出するための蛍光物質の種類を考慮し、適宜決定することができるが、５種類以下であることが好ましい。ＰＣＲ産物量を経時的に検出するためには、各チャンネル内の各ＰＣＲ産物の種類毎に異なる蛍光物質が必要であるが、６種類以上の互いに蛍光がクロストークしない蛍光物質を揃えることは、現状では困難であるためである。さらに、６種類以上の蛍光を経時的に検出するための装置は非常に高価であり、経済的にも好ましくない。
【００１９】
但し、増幅する標的塩基配列の種類の異なるチャンネルが、基板全体として、少なくとも２以上有することが必要である。全てのチャンネルにおいて、同一種類の標的塩基配列を増幅するのであれば、わざわざチャンネル毎に別個にＰＣＲを行う必要は無いためである。
【００２０】
本発明におけるプライマーセットとは、標的塩基配列の一方の端と相補的なプライマーと、標的塩基配列の他方の端と相同的なプライマーのセットであって、標的塩基配列をＰＣＲ法により増幅できるものであれば、特に限定されるものではない。プライマーセットの各プライマーの設計や合成は、当該技術分野においてよく知られている方法のいずれを用いても行うことができる。また、それぞれのプライマーは、標的塩基配列と相補的な配列以外にも、ＰＣＲによる増幅を阻害しない程度において、付加的な配列を有することができる。
【００２１】
標的塩基配列を増幅するために用いられるプライマーセットを、チャンネルに固定しておいてもよい。予めプライマーセットが固定された基板を用いることにより、より簡便に、標的塩基配列を増幅することができるためである。
【００２２】
プライマーセットをチャンネルに固定する方法は、ＰＣＲを阻害するものでなければ、特に限定されるものではない。例えば、プライマー水溶液をチャンネル内に供給した後、水分を蒸発させ、プライマーのみをチャンネル内壁に固定する方法がある。該方法のように、ＰＣＲ開始前にはチャンネル内壁にプライマーが固定されているが、ＰＣＲ反応溶液の供給等により、ＰＣＲ開始時にはプライマーをチャンネル内壁から剥がすことのできる固定方法が好ましい。ＰＣＲ中にプライマーが内壁に固定されていると、ＰＣＲ効率が落ちるおそれがあるためである。
【００２３】
プライマーセットは、必ずしも基板が備える全てのチャンネルに存在している必要はない。全てのチャンネルにおいて存在している場合には、ＤＮＡサンプルやＰＣＲのための試薬溶液等が有効に利用することができる。一方、ＰＣＲ産物の量の検出を、ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光物質の蛍光強度を測定することにより行う場合には、プライマーセットが存在しないチャンネルを、蛍光検出のためのネガティブコントロールとすることができる。
【００２４】
チャンネル毎に、異なる種類のプライマーセットが存在してもよく、複数のチャンネルにおいて同一種類のプライマーセットが存在してもよい。標的塩基配列が多種類である場合には、全てのチャンネルに異なる種類のプライマーセットを存在させ、チャンネル毎に異なる種類の標的塩基配列の増幅を行ってもよい。一方、標的塩基配列の種類があまり多くない場合には、複数のチャンネルに同一種類のプライマーセットを存在させ、複数のチャンネルにおいて同一種類の標的塩基配列を増幅してもよい。
【００２５】
本発明の塩基配列の増幅方法は、複数のチャンネルを備えた基板を用いて、同時に複数種類の標的塩基配列を増幅する方法であって、１又は複数種類の標的塩基配列を増幅するためのＰＣＲが、各チャンネルにおいて行われること、少なくとも２以上のチャンネルにおいて、増幅される標的塩基配列の種類が異なること、前記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出すること、を特徴とする方法である。
具体的には、まず、複数のチャンネルを備えた基板の各チャンネルに、プライマーセット、ＤＮＡサンプル、ＰＣＲ産物の検出に用いる蛍光物質、ポリメラーゼ等のリアルタイムＰＣＲに必要な試薬を供給する。予め、プライマーセットを固定しておいた基板を用いてもよい。
【００２６】
該供給方法は、特に限定されるものではない。例えば、ＤＮＡサンプル溶液を、マイクロピペッター等を用いて各チャンネルに供給する方法や、毛細管現象を利用して供給する方法等がある。分注機等の大掛かりな装置や、煩雑な手動のピペット操作も必要とせず、容易にＤＮＡサンプルを供給することができるため、毛細管現象を利用して供給する方法が好ましい。
【００２７】
ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の試薬と、ＤＮＡサンプルを、同時に調製したＰＣＲ溶液を作製し、該ＰＣＲ溶液を該基板のチャンネルに供給することが好ましい。リアルタイムＰＣＲに必要な試薬等をまとめて調製したＰＣＲ溶液を供給することにより、該基板のチャンネルに供給する操作の回数を減らすことができ、操作が簡便となるためである。
【００２８】
ポリメラーゼ、ヌクレオチド、反応バッファー等の、リアルタイムＰＣＲに用いられる試薬は、特に限定されるものではなく、通常ＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。ＤＮＡサンプルとプライマーセットの量も、通常用いられる量であれば、特に限定されるものではない。
【００２９】
ＰＣＲ産物の検出に用いる蛍光物質は、通常リアルタイムＰＣＲを行う場合に用いられるものを、通常用いられる量で用いることができる。該蛍光物質として、例えば、蛍光性のインターカレーターや、蛍光標識プローブ等がある。該基板上の各チャンネルにおいて得られる全種類のＰＣＲ産物を、１種類のインターカレーターで検出する場合には、該インターカレーターをＤＮＡサンプルやポリメラーゼ等の他の試薬とまとめて１のＰＣＲ溶液に調製することにより、プライマーセット以外の全ての試薬を一度の供給操作で行うことができる。また、１のチャンネルにおいて複数種類の標的塩基配列を増幅する場合のように、各ＰＣＲ産物に特異的な蛍光標識プローブを用いる場合には、プライマーセットと同様に、各チャンネルに対して個別に供給することもできる。
【００３０】
ＰＣＲに必要な全ての試薬をチャンネルに供給した後、チャンネルの両端を密封する。該密封方法は、チャンネルが独立したＰＣＲ反応容器として機能するように、チャンネルの開口部を密封できる方法であって、得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出することができる方法であれば、特に限定されない。例えば、基板の両面を弾力があり、かつ、チャンネル内部の蛍光の検出を妨げない板を用いて、チャンネルの両端を密封する方法がある。該板は、透明なシリコンゴム板が好ましい。耐熱性に優れ、かつ、内部の蛍光の検出が容易であるためである。
【００３１】
チャンネルの両端を密封した基板を、サーマルサイクラーと分光光度計が一体となったリアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラー等に設置し、リアルタイムＰＣＲを行う。該リアルタイムＰＣＲ用サーマルサイクラーは、市販のものであってもよく、該基板の設置部の上部蓋等を透明にすること等の、該基板の蛍光を外部から検出することが可能となるような調整を施したサーマルサイクラーに、蛍光強度の測定が可能な蛍光顕微鏡を組み合わせた装置であってもよい。なお、リアルタイムＰＣＲは、使用するポリメラーゼの種類、プライマーのＴｍ、標的塩基配列の長さ等に基づいて決定される反応条件で、通常行われる方法により行うことができる。該反応条件の決定方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００３２】
ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物の量を、経時的に検出することにより、ＤＮＡサンプル中の標的塩基配列を定量的に解析することができる。該検出の方法は、特に限定されるものではないが、ＰＣＲ産物の量に依存して変化する蛍光強度を測定することによって行うことが好ましい。具体的には、増幅サイクル毎の各チャンネルの蛍光強度を検出することにより、それぞれのＰＣＲ産物の量を測定する。例えば、検出のための蛍光物質としてインターカレーターを用いた場合には、ＰＣＲ産物量に依存して蛍光強度が増大するため、各サイクルの蛍光強度を検出して得られた増幅曲線と、既知濃度のＤＮＡサンプルを用いて得られた検量線とから、各ＤＮＡサンプル量を定量することができる。また、ＰＣＲ増幅が生じない場合には、各チャンネルの蛍光強度はサイクル毎に変化せず、ほぼ一定値となるため、標的核酸配列の存在の有無を迅速に調べることができる。
【００３３】
増幅された標的塩基配列を有するＰＣＲ産物を、該基板から回収し、その後の遺伝子解析等に用いてもよい。該回収方法は、特に限定されるものではないが、簡便であるため、チャンネルの一端から加圧することにより、回収する方法が好ましい。具体的には、チャンネルを密封していた弾力のある板をはずし、チャンネルの開口部の一端から空気を挿入することにより、ＰＣＲ産物をチャンネルから回収することができる。
【００３４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
複数のチャンネルを備えた基板として、浜松ホトニクス社製のキャピラリープレート（型名：J5022-09）を用いた。該キャピラリープレートを図１に示す。該キャピラリープレート１は、外縁部１ｂの内部に、孔径６μｍ、厚さ１ｍｍのチャンネル１ａが、開孔比５５％以上で規則正しく二次元的に配列されたガラス板である。
【００３６】
ＤＮＡサンプルとして、白血球から抽出したゲノムＤＮＡを用いた。該白血球は、採血した末梢血液から、遠心分離法により、単離した。該白血球からのゲノムＤＮＡの抽出は、ＱＩＡａｍｐ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＺＧＥＮ社製 cat.#.5１１83）を用いて、該キットに添付の方法に従い、行った。
【００３７】
９６種類のプライマーセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行った。該９６種類のプライマーセットのうち、偶数番号の４８種類は該ゲノムＤＮＡに特異的なプライマーセットであり、奇数番号の４８種類は該ゲノムＤＮＡに非特異的なプライマーセットである。
【００３８】
９６種類のプライマーセットをチャンネル１ａに固定するために、図２に示すようにキャピラリープレート１の中心の円形部Ｐｎｃを除く部分を、９６等分（Ｐ１〜Ｐ９６）し、各１領域につき１種類のプライマーセットを固定した。具体的には、１００μＭに調整したプライマーセット水溶液を、インクジェットプリンターを用いて、チャンネルに吐出させた。つまり、図２のように、例えば、領域Ｐ１にプライマーセット１の水溶液を吐出させた。吐出されたプライマーセット水溶液は、それぞれの領域Ｐに含まれるチャンネル１ａの開口部に付着後、毛細管現象によりチャンネル１ａ内に供給された。その後、室温で放置することにより、水が蒸発し、プライマーのみチャンネル１ａ内壁に固定された。
【００３９】
プライマーセット以外にＰＣＲに必要な全ての試薬を調製したＰＣＲサンプル２として、最終濃度５ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを含むＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）の２倍希釈溶液を調製した。該ＰＣＲサンプル２には、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩが含まれており、核酸の二重鎖があるとインターカレートし蛍光を発する。この時の蛍光特性は、励起波長が４９４ｎｍ、蛍光波長が５２１ｎｍである。
２００μＬの該ＰＣＲサンプル２を、図３に示すように、ＰＣＲサンプル容器３に分注し、その上部にキャピラリープレート１を設置した。これにより、ＰＣＲサンプル２は、毛細管現象によりチャンネル１ａに供給された。
【００４０】
ＰＣＲサンプル２が供給されたキャピラリープレート１を、図４に示すように、透明なシリコンゴム板４で挟みこみ、チャンネル１ａの両端を密封した。シリコンゴム板４で密封されたキャピラリープレート１を、図５に示すように、サーマルサイクラー５（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）に設置した。対物レンズ６、ミラーユニット７、ＣＣＤカメラ８、光源９を備えた研究用マクロズーム顕微鏡ＭＶＸ１０（オリンパス社製）を、キャピラリープレート１を上方より観察できるように調整して、図５に示すようにサーマルサイクラー５に対して設置した。なお、対物レンズ６は０．６３倍のレンズを、ミラーユニット７はＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎＩの検出に適したミラーユニットＷＩＢＡを、ＣＣＤカメラ８はＣｏｏｌ  ＳＮＡＰ（ＲＯＰＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を、光源９はメタルハライドランプを、それぞれ用いた。
【００４１】
その後、９５℃で１０分間の変性、次に９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル、からなる反応条件によりＰＣＲを行った。各サイクルの７２℃の反応時間内に、キャピラリープレート１の上方より４９４ｎｍの励起光を照射し、露光時間１秒で蛍光画像を撮影した。
【００４２】
得られた蛍光画像を解析し、各チャンネル内の蛍光強度を測定した。図６は、該測定の結果に得られた、プライマーセット１、２、４、６のそれぞれを固定したチャンネルの、サイクル毎の蛍光強度を示した図である。ゲノムＤＮＡに特異的な偶数番号のプライマーセットを固定したチャンネルでは、図６中のプライマーセット２、４、６を固定したチャンネルと同様に、ＰＣＲサイクルの増加とともに蛍光強度が強くなっていた。この結果から、ゲノムＤＮＡに特異的な４８種類のプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅がなされたことが明らかである。但し、各チャンネルの蛍光増幅曲線は、固定されたプライマーセットの種類毎に異なっており、例えば、プライマーセット２、４、６では、プライマーセット２が最も早いサイクルで蛍光が検出され始め、プライマーセット６が最も遅いサイクルで蛍光が検出され始めた。このように、チャンネル毎に蛍光増幅曲線が得られるため、予め濃度既知の核酸試料を用いたリアルタイムＰＣＲによりそれぞれのプライマーセットの検量線を作成しておくことにより、核酸試料中の標的核酸の濃度を高精度に定量することができる。
一方、ゲノムＤＮＡに非特異的な奇数番号のプライマーセットを固定したチャンネルでは、図６中のプライマーセット１を固定したチャンネルと同様に、ＰＣＲサイクルが増加しても、蛍光強度はほとんど変化しなかった。なお、中央のＰｎｃ領域内のチャンネルも、奇数番号の領域内にあるチャンネルと同様に、ＰＣＲサイクルが増加しても、蛍光強度はほとんど変化しなかった。この結果から、ゲノムＤＮＡに非特異的な奇数番号のプライマーセットを固定したチャンネルでは、非特異的なＰＣＲ増幅が生じなかったことが明らかである。
すなわち、実施例１の結果から、本発明の塩基配列の増幅方法により、微量のＤＮＡサンプルから、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、簡便に、複数種類の標的塩基配列を特異的かつ定量的に増幅し得ることが明らかである。
【００４３】
（比較例１）
１のＰＣＲ反応容器に、１のプライマーセットを用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。ＤＮＡサンプルとして実施例１で用いたゲノムＤＮＡを、プライマーセットとして実施例１で用いたと９６種類のプライマーセットを、ＰＣＲ装置として７９００ＨＴ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を、それぞれ用いた。
具体的には、該ＰＣＲ装置の専用の９６ウェルマイクロタイタープレートの１ウェルに、１９μＬのｍｉｌｌｉＱ水に、２５μＬのＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）、１μＬのフォワードプライマー（１０μＭ）、１μＬのリバースプライマー（１０μＭ）、４μＬのゲノムＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）を加え、ＰＣＲサンプルを調製した。その後、実施例と同じようにＰＣＲを行い、蛍光画像を撮影した。
得られた蛍光画像を解析し、各ウェル内の蛍光強度を測定したところ、実施例１と同様に、ゲノムＤＮＡに特異的な偶数番号のプライマーセットを添加したウェルでは、ＰＣＲサイクルの増加とともに蛍光強度が強くなっていた。一方、ゲノムＤＮＡに非特異的な奇数番号のプライマーセットを添加したウェルでは、ＰＣＲサイクルが増加しても、蛍光強度はほとんど変化しなかった。
比較例１の結果から、偶数番号の４８種類のプライマーセットのそれぞれを用いて、特異的に標的塩基配列を増幅することができること、及び、奇数番号の４８種類のプライマーセットのそれぞれを用いて、非特異的なＰＣＲ増幅が生じないことが、明らかであり、これらのプライマーセットの特異性が証明された。
但し、比較例１では、実施例１と異なり、ＰＣＲサンプル量が各プライマーセットに対して１のＰＣＲサンプルを調製する必要があるため、非常に大量のＤＮＡサンプルや試薬等が必要であり、また、分注操作等が煩雑であった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明の塩基配列の増幅方法を用いることにより、複雑なプライマー設計を行うことなく、また、大掛かりな装置や煩雑な操作を必要とせずに、極微量のＤＮＡサンプルから、簡便に、リアルタイムＰＣＲ法を用いて、複数種類の標的塩基配列を同時に定量的に増幅することができるため、医療機関等における検体の遺伝子解析等の分野で利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】実施例１において用いた複数のチャンネルを備えた基板（キャピラリープレート）を示した斜視図である。
【図２】実施例１において、プライマーセットを固定するために、キャピラリープレート１の中心の円形状の領域Ｐｎｃと、Ｐｎｃ以外の部分を９６等分した領域（Ｐ１〜Ｐ９６）を、模式的に示す平面図である。
【図３】実施例１において、キャピラリープレート１に、ＰＣＲサンプル容器３に入ったＰＣＲサンプル２を供給する様子を、模式的に示す平面図である。
【図４】実施例１において、チャンネル１ａの両端を透明なシリコンゴム板４で挟みこんで密封したキャピラリープレート１を模式的に示す平面図である。
【図５】実施例１において、キャピラリープレート１をサーマルサイクラー５に設置した状態の概略構成図である。
【図６】実施例１において、プライマーセット１、２、４、６のそれぞれを固定したチャンネルの、サイクル毎の蛍光強度を示した図である。
【符号の説明】
【００４６】
１…キャピラリープレート、１ａ…チャンネル、１ｂ…外縁部、Ｐｎｃ…キャピラリープレート１の中心の円形状の領域、Ｐｎ（ｎ＝１〜９６）…キャピラリープレート１のＰｎｃ以外の領域を９６等分した領域、２…ＰＣＲサンプル、３…ＰＣＲサンプル容器、４…シリコンゴム板、５…サーマルサイクラー、６…対物レンズ、７…ミラーユニット、８…ＣＣＤカメラ、９…光源
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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