(57)【要約】  【課題】  短時間で反応が完結でき、且つ多量の酵素を必要としない、ニトリルヒドラターゼ（ニトリル化合物を水和する活性を持つ酵素）による４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を提供する。  【解決手段】  ４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをあらかじめ加熱処理した後、前記ニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。前記４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドが光学活性であることを含む前記４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加熱処理した後、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
【請求項２】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドが、光学活性体である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノール及び、青酸又は青酸のアルカリ金属塩から製造されたものである請求項１又は２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法に関する。４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、例えば、カルニチン、３，４−ジヒドロキシブタン酸などの種々の生理活性物質、医薬品、農薬などの合成原料として使用される。
【背景技術】
【０００２】
一般にニトリルの水和によるアミドの製造法としては、塩酸などの鉱酸やアルカリを使用する方法、アルカリと過酸化水素を併用する方法などが知られているが、これらの方法では工程が煩雑となり、対応する酸が副生し収率が低下してしまうなどの問題がある（特許文献１）。また、生物学的反応としては、ニトリルヒドラターゼの作用によりニトリル化合物を水和してアミド化合物を製造する方法が知られている。例えば、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させて４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造する方法については特許文献２に示されている。しかし、特許文献２記載の製造方法では、反応時間が長く、尚且つ、ニトリルヒドラターゼを大量に必要とするという問題があった。
【０００３】
一方、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法としては、エピハロヒドリンと青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法（特許文献３）、エピハロヒドリンと青酸を反応させる方法（特許文献４）、１，３−ジハロ−２−プロパノールに青酸または青酸のアルカリ金属塩を反応させる方法（特許文献５）などが知られている。
【０００４】
しかし、上記方法では、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成した後、反応液中に未反応の青酸が残存する。よって、次いでニトリルヒドラターゼにより、アミド化反応を実施する場合、残存している青酸により酵素が失活してしまうため、青酸を除去する必要がある。更に、青酸を例えば１ｐｐｍ以下に除去しても、アミド化反応の反応速度が非常に遅く、反応速度を上昇させるためには大量の酵素を必要とする場合があった。
【特許文献１】特開平１−２８７０６５
【特許文献２】特開平４−３６５４９１
【特許文献３】特開昭６３−３１６７５８
【特許文献４】特開２００２−２４１３５７
【特許文献５】特開平５−２１９９６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、短時間で反応が完結でき、且つ多量の酵素を必要としない、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者らが、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、予め加熱処理をした４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルにニトリルヒドラターゼを作用させることで、煩雑な精製操作を必要とせずに、円滑にアミド化反応を進行させることができ、多量の酵素を必要とせず、短時間で４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造できることを見出し本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加熱処理した後、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法であり、
（１）４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加熱処理した後、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法。
【０００８】
（２）  ４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドが、光学活性体である前記（１）記載の製造方法。
【０００９】
（３） ４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノール及び、青酸又は青酸のアルカリ金属塩から製造されたものである前記（１）又は前記（２）に記載の製造方法。
【００１０】
である。
【発明の効果】
【００１１】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加熱処理した後、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させることにより、煩雑な精製操作を必要とせずに、円滑にアミド化反応を進行させることができ、多量の酵素を必要とせず、短時間で４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを製造できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを加熱処理した後、前記ニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させることを含む、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの製造方法、である。以下、ニトリルヒドラターゼによる該ニトリルからアミドへの変換反応を、アミド化反応と称す。
【００１３】
本発明において、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミド、エピハロヒドリン、１，３−ジハロ−２−プロパノールの「ハロ」とはハロゲン元素を示し、具体的にはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素を示す。好ましくは、塩素、臭素である。
【００１４】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、例えば、特許文献３〜５に記載の方法により合成することできる。また、アズマックス社等で市販されているものを使用しても良い。
【００１５】
本発明では、エピハロヒドリン又は１，３−ジハロ−２−プロパノール及び青酸又は青酸のアルカリ金属塩とから酵素的に調製されたものを使用することが好ましい。
【００１６】
上記方法により得られた４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、反応終了後の溶液、その溶液から該ニトリルを抽出した抽出液、抽出液を濃縮した濃縮液、カラムクロマトグラフィー等の常法により精製された精製物等、いずれの状態で次に続く加熱処理に供しても構わない。いずれの状態を選択するかは、アミド化反応の際に使用するニトリルヒドラターゼの反応速度及び酵素の使用量等を考慮し、適宜選択することができる。
【００１７】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの加熱処理とは、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルそのもの、又はそれを含む溶液を加熱することをいう。
【００１８】
溶液で加熱処理を実施する場合、使用する溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、オクタンなどの炭化水素系溶媒、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチル、メタクリル酸メチルなどのエステル系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テロラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド等の有機溶媒、水などが挙げられる。これらの溶媒は、２種類以上の混合溶媒であっても構わない。
【００１９】
上記溶媒の内、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルイソブチルケトンなどのケトン系溶媒、酢酸エチル、プロピオン酸エチルなどのエステル系溶媒、ジクロロメタン、クロロホルムなどの塩素系溶媒、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テロラヒドロフラン、ジメチルスルフォキシド、又は水を使用することが好ましい。水を使用する場合、緩衝液を用いてもよい。例えば酸成分としては塩酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、アコニット酸、コハク酸、酢酸、クエン酸二水素カリウム、フタル酸水素カリウム、クエン酸水素二ナトリウム、マレイン酸、マレイン酸水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、塩化アンモニウム、炭酸水素ナトリウム、四ホウ酸ナトリウムなど、塩基成分としては酢酸ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸水素二ナトリウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、乳酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、四ホウ酸ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、酢酸ナトリウム、アンモニア、炭酸ナトリウム、Ｔｒｉｓなどが挙げられ、これら単独あるいは組み合わせで形成される緩衝液が挙げられる。
【００２０】
また前記溶媒に４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが完全に溶解する必要は必ずしもない。
【００２１】
加熱方法は、本発明の目的が達成されれば特に制限はなく、加圧、減圧、常圧条件下のいずれも選択できる。また４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルおよびその溶液を、その沸点以上に加熱し、還流又は留去する方法などが挙げられる。
【００２２】
加熱時間は、０．１〜１００時間程度で、０．５〜５０時間が好ましく、さらに好ましくは１〜１０時間である。
【００２３】
加熱温度は、４０℃程度から４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルが分解しない温度までの範囲で処理することが可能であり、６０〜１５０℃が好ましい。
【００２４】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの水溶液を加熱処理する時、その分解を防ぐため、ｐＨは中性〜酸性領域が好ましく、ｐＨ３〜７がより好ましい。
【００２５】
また加熱処理後にはニトリルヒドラターゼが高活性を示す至適ｐＨに再度調節してから、アミド化反応に移ることが好ましい。
【００２６】
次に上記のごとく加熱処理を行った４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルをニトリルヒドラターゼと接触させる。
【００２７】
使用するニトリルヒドラターゼ（国際的な酵素分類によればリアーゼに属する酵素）は特に限定されないが、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのニトリルをアミドへ変換する反応を触媒する酵素であれば良い。
【００２８】
本発明で使用するニトリルヒドラターゼは、例えば、アクロモバクターAchromobacter）属、アシドボラックス（Acidovorax）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター(Arthrobacter)属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、バークホルデリア（Burkholderia）属、キャンディダ（Candida）属、カセオバクター(Caseobacter) 属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ディーツィア（Dietzia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エルビニア（Erwinia）属、ジオバチルス（Geobacillus）属、ゴルドナ（Gordona）属、クレブシエラ（Klebsiela）属、ミクロアスカス（Microascus）モルガネラ（Morganella）属、パントエア（Pantoea）属、プロテウス（Proteus）属、シュードモナス(Pseudomonas) 属、シュードノカルディナ（Pseudonocardia）属、ロドコッカス(Rhodococcus) 属、リゾビウム（Rhizobium）属、セラチア（Serratia）属、シクタリジウム（Syctalidium）属、ツカムレラ（Tukamurella）属、に属する微生物が産生するニトリルヒドラターゼである。具体的には、アースロバクター  グロビフォルミス(Arthrobacter globi-formis)IFO 12138、ブレビバクテリウム  ヘルボラム(Brevibacterium helvolum)ATCC 11822 、コリネバクテリウム  フラベシエンス(Corynebacterium flaves-cens)IAM 1642 、ロドコッカス  エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)IFO 12540 およびIFO 12539 、ストレプトマイセスアルボグリセルス（Streptomyces albogriseolus）HUT 6045、ストレプトマイセス クリゾマルス（Streptomyces chrysomallus）HUT 6141、ストレプトマイセス シネレオルバー（Streptomyces cinereouruber）HUT6142、ストレプトマイセス ヂアスタチカス（Streptomyces diastaticus）HUT 6116、ストレプトマイセス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）HUT 6061、ストレプトマイセス ルブロシアノヂアスタチカス（Streptomyces rubrocyanodiastaticus）HUT 6117、クレブシエラ ニュウモニアエ（Klebsiella pneumoniae）IFO 12019、IFO 3319、IFO12059、IAM 1063、クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) NH-36T2株、セラチア ピリムシカ（Serratia plymuthica）IFO 3055、セラチア マルセッセンス（Serratia marcescens ）IAM 1105、エルビニア キャロトボラ（Erwinia carotovora）IFO 3057、ツカムレラ ポーロメタボラム（Tukamurella paurometabolum）JCM 3226、ゴルドナ ルブロペルチンクタス（Gordona rubropertinctus）JCM 3227、モルガネラ モルガニ（Morganella morganii）IFO 3848、プロテウス ブルガリス（Proteus vulgaris）IFO 3167、エンテロバクター エアロジェネス（Enterobacter aerogenes）IFO 12010、ミクロアスカス デスモスポラス(Microascus desmosporus)IFO6761、キャンディダ グイリエモンディー（Candida guilliermondii）NH-2株(FERM P-11350 号)、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomerans）NH-3株(FERM P-11349 号)などが産生するニトリルヒドラターゼである。
【００２９】
なお、ＡＴＣＣ番号が付与された微生物菌株は、各々アメリカンタイプカルチァーコレクション（ＡＴＣＣ）、から容易に入手することができる。また、ＩＦＯ番号の付された微生物は、（財）醗酵研究所（ＩＦＯ）発行の「List of Cultures、第８版、第１巻（１９８８）」に記載されており、現在は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門遺伝資源保存課から入手できる。ＩＡＭ番号の付された微生物は東京大学応用微生物学研究所から入手できる。ＪＣＭ番号の付された微生物は、理化学研究所 系統微生物保存機関発行の「Catalogue of strains 第４版（１９８９）」に記載されており、理化学研究所 系統微生物保存機関より入手できる。ＨＵＴ番号の付された微生物は、日本微生物保存連盟（ＪＦＣＣ）発行の「 Catalogue of Cultures、第４版（１９８７）」に記載されており、広島大学工学部から入手できる。FERM番号の付された微生物は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターから入手できる。
【００３０】
さらに山田らが土壌より分離したロドコッカス  ロドクロウス Ｊ-１〔FERM BP-1478号〕、及び本発明者らの一部が土壌より分離したアースロバクター ｓｐ．ＳＫ１０３〔FERM P-11300号〕、カセオバクター ｓｐ． ＢＣ２３ 〔FERM P-11261号〕、シュードモナス ｓｐ． ＢＣ１５-２ 〔FERM BP-3320号〕、シュードモナス ｓｐ． ＳＫ３１ 〔FERM P-11310号〕、シュードモナス ｓｐ． ＳＫ８７ 〔FERM P-11311号〕、シュードモナスｓｐ． ＳＫ１３ 〔FERM BP-3325号〕、ロドコッカス ｓｐ． ＳＫ７０ 〔FERM P-11304号〕、ロドコッカス ｓｐ． ＨＲ１１ 〔FERM P-11306号〕およびロドコッカス ｓｐ． ＳＫ４９〔FERM P-11303号〕などが産生するニトリルヒドラターゼも挙げられる。これらの細菌は、それぞれ上記寄託番号にて独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３１】
また、上記微生物のニトリルヒドラターゼ遺伝子をクローニングし、形質転換（導入）した微生物も、上記のニトリルヒドラターゼを産生する微生物として含まれる。例えば、米国特許第5807730号に記載のシュードノカルディア（Pseudonocardia）属のニトリルヒドラターゼ遺伝子で形質転換した大腸菌（MT-10822株（FERM BP-5785））、特開平8-266277号公報記載のアクロモバクター（Achromobacter）属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌（ＭＴ−１０７７０株（FERM P-14756））、特開平４−２１１３７９号公報記載のロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）種のニトリルヒドラターゼで形質転換した微生物などが挙げられる。
【００３２】
ニトリルヒドラターゼを産生する微生物を培養するための培地組成としては、微生物が生育でき、所望の酵素を産生するのであれば特に限定はない。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトースなどの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、タンパク質加水分解物、アミノ酸類などの天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩などが使用でき、このほか、無機塩、微量金属、ビタミンなどが必要に応じて適宜使用される。また場合により、酵素活性を誘導させるために、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、プロピオニトリル、イソブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド、プロピオンアミド、イソブチルアミドなどの各種アミド化合物などを培地に添加しても良い。上記微生物の培養は常法によればよく、例えば ｐＨ ４〜１０、温度１０〜４５℃の範囲にて好気的に１０〜１８０ 時間培養する。培養は液体培養、固体培養のいずれでも行うことができる。
【００３３】
アミド化反応に際し、上記のようにして得た微生物菌体は、培養液そのまま、遠心分離などにより得た菌体の懸濁液、菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物など）、常法により固定化した菌体または菌体処理物として使用することができる。上記のようにして得た菌体は、アミド化反応時に一括添加又は分割添加して反応を実施する。
【００３４】
なお、アミド化反応が発熱反応であることから菌体の懸濁液を基質の水溶液に添加することが好ましい。反応液中の基質濃度は特に限定されないが、０．０１ 〜５０（Ｗ/Ｖ） ％程度が通常で、０．１〜４０％程度がより好ましい。反応温度は０〜５０℃程度で、０〜３０℃程度がより好ましい。反応液のｐＨは４〜１０の範囲で、６〜８程度で行うことがより好ましい。反応時間は基質濃度、菌体濃度あるいはそのほかの反応条件によって変わるが、通常０．５〜１２０ 時間で終了するように条件を設定することが好ましく、副反応の進行を抑制するためにも、０．５〜２４時間程度で終了するように設定することがより好ましい。
【００３５】
以上のようにして合成した４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドは、抽出、カラム分離、再結晶等の定法に従い、単離精製することができる。
【００３６】
４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、エピハロヒドリンには不斉炭素が存在するが、本発明ではラセミ体、光学活性体のどちらでも実施可能である。本発明において光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを出発として反応を行った場合、光学純度を低下させることなく対応する光学活性な４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドを生成することができる。４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドはカルニチン（４−トリメチルアミノ−３−ヒドロキシ酪酸）や３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン合成の中間体として使用することができる。４−ハロ−３−ヒドロキシブチルアミドの光学活性体は、Ｌ−カルニチンの合成中間体として使用することが可能であるため非常に有用である。
【実施例】
【００３７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明する。
【００３８】
４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下ＣＨＢＮと略す）及び４−クロロ−３−ヒドロキシブチルアミド（以下ＣＨＢＡと略す）の化学純度は、下記ＨＰＬＣ定量結果より算出した。
【００３９】
本発明において使用したＨＰＬＣは日本分光製ＬＣ−２０００シリーズであり、詳細を以下に示す。
【００４０】
[ＨＰＬＣ分析条件]
試料調製方法              : 反応液を移動相に溶解
カラム                    : Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-３Ｖ， 
４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ、 粒径５μｍ
（ＧＬサイエンス製）
カラムオーブン温度                : ４０℃
移動相                    : ０．０５％  トリフルオロ酢酸水溶液、１ｍＬ/ｍｉｎ
検出器                    : 示差屈折計(日本分光製ＲＩ-２０３１)
保持時間                   ：ＣＨＢＮ  １１．０  ｍｉｎ
：ＣＨＢＡ    ６．７  ｍｉｎ
（ＣＨＢＮの標品は、アズマックス株式会社製(化学純度９８．９％)を用いた。ＣＨＢＡの標品は、前記アズマックス株式会社製ＣＨＢＮを原料とし、ニトリルヒドラターゼを用いて合成、酢酸エチルにより抽出後、シリカゲルカラムにより精製したＣＨＢＡを用いた。）
（Ｒ）−ＣＨＢＮの光学純度は、以下のようにして測定した。
【００４１】
（Ｒ）−ＣＨＢＮ１μｌにジクロロメタン２０μｌ、ピリジン２０μｌを加えた後、（Ｒ）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（ＭＴＰＡ）２μｌを添加し、そのまま室温で５時間撹拌を行った。反応終了液にジイソプロピルエーテル３００μｌを添加し、続いて１Ｎ  ＨＣｌ水溶液３５０μｌを用いて洗浄、有機層を回収した。さらに有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液３５０μｌで洗浄し、有機層を減圧乾燥、残渣をイソプロパノールに溶解させ、これをＨＰＬＣで分析を行った。
【００４２】
本分析に用いたＨＰＬＣシステムは以下の通りである。
【００４３】
[ＨＰＬＣ分析条件]
（Ｒ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル
（Ｓ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル
カラム: Ｐａｒｔｉｓｉｌ−５（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）
４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
カラムオーブン温度  : ４０℃
移動相: ヘキサン：イソプロパノール＝９９：１
流量：１ｍｌ／ｍｉｎ
検出器: ＵＶ  ２５４ｎｍ
保持時間：（Ｒ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル：１１．９ｍｉｎ
：（Ｓ）−ＣＨＢＮ  ＭＴＰＡエステル：１３．０ｍｉｎ
＜参考例１＞
本発明で使用したニトリルヒドラターゼは、以下のようにして調製した。
【００４４】
（培養及び洗浄菌体の調製方法）
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス  ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)Ｊ−１(FERM BP-1478)を、３０Ｌ容ジャーファーメンター（高杉製作所社製）にてグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む、２０Ｌの培地（ｐＨ７．０）に植菌し、温度３０℃で好気的に６０時間培養した。上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．７）にて２回洗浄後、懸濁することで保存菌体液とした。
＜実施例１＞
【００４５】
アヅマックス社製（化学純度９８．９質量％、光学純度９９．２％ｅｅ）の（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下（Ｒ）−ＣＨＢＮと略す）をナス型フラスコに入れ、１３０℃のオイルバス中で３時間加熱を行った。加熱終了液から１．０ｇ（８．３６ｍｍｏｌ）を採取し、３０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．９）：９．０ｇを加え、参考例１で調製したＪ−１菌を２００μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応結果は表１のようになった。
【表１】
2008067626.tif 000002
【００４６】
＜比較例１＞
アヅマックス社製（Ｒ）−ＣＨＢＮ：１．０ｇ（８．３６ｍｍｏｌ）に３０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．９）：９．０ｇを加え、参考例１で調製したＪ−１菌を２００μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応結果は表２のようになった。
【表２】
2008067626.tif 000003
＜実施例２＞
【００４７】
エピクロロヒドリンと青酸とから４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下ＣＨＢＮと略す）を合成し、ニトリルヒドラターゼによるアミド化反応を行った。詳細を以下に示す。
【００４８】
ｉ）ＣＨＢＮの合成
攪拌機、温度計、ジムロート冷却菅を備えた３Ｌセパラブルフラスコに、エピクロロヒドリン２７４．９３ｇ（２．９７ｍｏｌ）、水１２７１．３ｇ、硫酸ナトリウム１９１．７５ｇ（１．３５ｍｏｌ）を仕込み、温水浴中で攪拌しながら内温５０〜６０℃でシアン化水素７２．３ｇ（２．７０ｍｏｌ）を１時間かけて反応液中に直接供給した。その後、内温５０〜６０℃で熟成を６時間行った。
【００４９】
反応液を水浴で冷却した後、酢酸エチル１Ｌで１回抽出を行った。有機層を減圧下に濃縮し、ＣＨＢＮの粗生成物を２４９．３３ｇ得た。ＧＣ分析の結果、純度８０．９質量％、収率６２．５％であった。→（抽出ＣＨＢＮ）
ｉｉ）単蒸留
上記ｉ）の抽出ＣＨＢＮ（粗生成物）を単蒸留により精製を行い、精製品１８７．５１ｇを得た。この精製品のＣＨＢＮの純度は９９．２質量％であった。→（単蒸留ＣＨＢＮ）
ｉｉｉ）アミド化反応
上記、ｉ）→  ｉｉ）で合成した単蒸留ＣＨＢＮを１３０℃で１〜４時間加熱処理を行った。加熱処理後ＣＨＢＮ３．０ｇ（２５．２ｍｍｏｌ）を採取し、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）７．０ｇを加え、参考例１で調製したＪ−１菌を１９０μＬ滴下し３０℃で反応を開始した。反応結果は表３のようになった。
【表３】
2008067626.tif 000004
【００５０】
＜比較例２＞
ｉ）抽出ＣＨＢＮのアミド化反応
実施例２のｉ）で合成した抽出ＣＨＢＮ：３．７ｇ（純度８０％として２５．２ｍｍｏｌ）を採取し、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）７．０ｇを加え、参考例１で調製したＪ−１菌を１９０μＬ滴下し３０℃で反応を開始した。反応結果は表４のようになった。
【表４】
2008067626.tif 000005
【００５１】
ｉｉ）単蒸留ＣＨＢＮのアミド化反応
実施例２のｉ）→ｉｉ）で合成した単蒸留ＣＨＢＮ：３．０ｇ（２５．２ｍｍｏｌ）を採取し、２０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）７．０ｇを加え、参考例１で調製したＪ−１菌を１９０μＬ滴下し３０℃で反応を開始した。反応結果は表５のようになった。
【表５】
2008067626.tif 000006
＜実施例３＞
【００５２】
以下のようにしてハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養を行い、それを用いて１，３−ジクロロ−２−プロパノールから（Ｒ）−ＣＨＢＮを合成し、ニトリルヒドラターゼによるアミド化反応を行った。詳細について順に示す。
【００５３】
ｉ）ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換微生物の培養
ハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ大腸菌(Escherichia coli) ＪＭ１０９/ｐＳＴ１１１（ＦＥＲＭ  Ｐ-１２０６５、特開平５−３１７０６６号参照）を、ＬＢ培地(１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５０μｇ/ｍｌアンピシリン)を １００ｍＬ入れた５００ｍＬ容三角フラスコに植菌し、３７℃で２０時間振盪培養した。前記培養菌体を遠心分離により集菌し、集菌した菌体を５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）で懸濁した。この菌体懸濁液０．２５ｇを５０ｍＭ トリス−硫酸緩衝液（ｐＨ ８．０）１００ｍＬに加え、さらに５０ｍＭとなるように１，３-ジクロロ-２-プロパノールを加え、２０℃で１０分間反応した。ＨＰＬＣにより反応液中のエピクロロヒドリンの量を測定したところ、１１ｍＭであった。
【００５４】
ｉｉ）１，３−ジクロロ−２−プロパノールからの（Ｒ）−ＣＨＢＮの合成
ｐＨ電極、ならびにｐＨコントローラーにより制御されたアルカリ投入配管を装着した３００ｍＬ４つ口フラスコに水１２７．５５ｇ、ＨＣＮ４．４１ｇ（０．１６３２ｍｏｌ）を入れ、３０％ＮａＯＨ ０．６５ｇ（０．００４９ｍｏｌ）で、ｐＨ７．５に調整した。１，３-ジクロロ-２-プロパノール１０．００ｇ（０．０７７５ｍｏｌ）を入れ、均一に溶解するまで攪拌した。
【００５５】
上記ｉ）の方法により調製したハロヒドリンエポキシダーゼ活性を持つ菌体懸濁液２０．００ｇを加え、２０℃で反応を開始した。系内のｐＨを７．５〜７．６に維持するよう、３０％ＮａＯＨを投入するようにｐＨコントローラーを設定し、投入されたＮａＯＨとほぼ等モルの割合で１，３-ジクロロ-２-プロパノール， ＨＣＮを追加していくことで、系内の１，３-ジクロロ-２-プロパノールの濃度を０．５ｍｏｌ/ｋｇを超えないよう、また、系内のシアンイオン濃度を１．１ｍｏｌ/ｋｇを超えないようにした。
【００５６】
２３時間後、４-クロロ-３-ヒドロキシブチロニトリルを０．７５３ｍｏｌ/ｋｇ蓄積することができ、その光学純度は９４．８％ｅ．ｅ．の（Ｒ）−体過剰であった。反応により消費された１，３-ジクロロ-２-プロパノールからの収率は９６．３％であった。
【００５７】
この反応液を塩酸でｐＨ＝５．０に調節し、６０℃、１４０ｔｏｒｒで減圧して１１時間ＨＣＮの除去を行い、反応系内のＨＣＮを硝酸銀で滴定、１ｐｐｍ以下であることを確認した。
【００５８】
ｉｉｉ）アミド化反応
上記ｉ）→ｉｉ）で合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮの反応終了水溶液を還流装置中、６０℃、８０℃、１００℃で３時間加熱させ、加熱処理後水酸化ナトリウムを用いてｐＨ＝７．２の水溶液とした。その水溶液（（Ｒ）−ＣＨＢＮ９．６ｗｔ％）１０ｇを採取し、参考例１で調製したＪ−１菌を２００μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応結果は表６のようになった。
【表６】
2008067626.tif 000007
【００５９】
＜比較例３＞
実施例３のｉ）→ｉｉ）で合成した（Ｒ）−ＣＨＢＮの反応終了水溶液（（Ｒ）−ＣＨＢＮ９．６ｗｔ％）１０ｇを採取し、加熱処理せずに参考例１で調製したＪ−１菌を２００μＬ滴下し２℃で反応を開始した。反応結果は表７のようになった。
【表７】
2008067626.tif 000008