(57)【要約】      （修正有）【課題】置換法を用いて爆薬成分であるＴＮＴなどの爆薬成分を高感度、かつ高精度で測定するために複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との結合条件を最適化した測定方法と、当該方法を用いた測定装置を提供する。【解決手段】複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合の自然解離による飽和解離率が８％〜１２％となるような複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体のペアを用いたＴＮＴ測定方法、及び測定装置。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板表面上に複合体抗原を固定化する複合体抗原固定化工程と、
当該複合体抗原が固定化された基板を複合体抗原と抗原抗体反応によって結合する抗ＴＮＴモノクローナル抗体を含むバッファ中に浸漬する抗体結合工程と、
抗体結合工程の後、前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに基板を浸漬して前記結合を部分的に解離する部分解離工程と、
部分解離工程後、測定物を通したバッファに基板を浸漬して当該バッファ中の抗原の測定を行う測定工程と、
を含むＴＮＴ測定方法であって、
前記部分解離工程での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率が検出部の測定で８％〜１２％であることを特徴とするＴＮＴ測定方法。
【請求項２】
前記測定工程は、ＳＰＲ測定法、又はＱＣＭ測定法により測定を行う請求項１に記載のＴＮＴ測定方法。
【請求項３】
基板表面上に固定化された複合体抗原と、当該複合体抗原と抗原抗体反応によって結合させた抗ＴＮＴモノクローナル抗体とを有するセンサ部と、
センサ部での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との解離量を測定する測定部と、
を有するＴＮＴ測定装置であって、
基板を前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに浸漬したときの前記複合体抗原とＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率が８％〜１２％であることを特徴とするＴＮＴ測定装置。
【請求項４】
前記測定部は、ＳＰＲ測定手段、又はＱＣＭ測定手段を有する請求項３に記載のＴＮＴ測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、爆薬成分を高感度、かつ高精度に検出する方法とその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
無差別的に人を殺傷する地雷や爆弾テロは、国際社会の保安上、大きな問題となっている。爆発物の使用は、非人道的手段であるにもかかわらず、製造コストが安価なこと、設置が容易なこと、除去コストが高いことなどの戦略的有用性から未だに後を絶たない。このような爆発物による被害を未然に防止するためには、迅速、かつ正確な爆発物の探知・除去技術が必要となってくる。
【０００３】
現在、使用されている主な爆発物探知法には、爆発物探知犬に爆薬のにおいを探知させる方法，金属探知機により爆弾に含まれる金属部品を探知する方法、Ｘ線検査装置により爆発物の形状を検知する方法などがある。いずれの方法も有用である反面、解決すべき課題も多い。例えば、爆発物探知犬による探知は、信頼性は高いものの犬の体調や個体差によって検出感度に差が生じる他、一匹の探知犬の育成や訓練に多額の費用と膨大な時間が必要という問題がある。金属探知機による探知は、金属製の爆弾に対する検出感度は高いが、金属を含まないプラスチック製の爆発物などは検出できない他、爆発物以外の金属に対しても誤反応する問題がある。Ｘ線検査装置は、低コストで扱いやすい反面、特殊な形状の爆発物を検知できない可能性がある他、据え置き型の大型装置が多く、可搬性に欠けるという問題がある。そこで、測定が簡便、かつ迅速であり、測定感度とその測定結果の信頼性が高く、小型・軽量化が可能な爆発物探知技術が求められている。
【０００４】
ところで、爆発物からは爆薬成分が微量ながら空気中に漏洩している。この空気中に漏洩した爆薬成分を抗原抗体反応を用いて選択的、かつ特異的に測定することで、信頼性の高い測定結果を得ることができる。また、抗原抗体反応による測定では置換法を用いることで簡便、かつ迅速な測定が可能となる。特許文献１は、このような方法の利用を前提とした置換反応用の固体担体上の被覆された金属表面などに関する発明である。当該文献には、ＴＮＴをはじめとする爆発物を検出する分析装置も開示されている。
【０００５】
しかし、検出感度や検出精度を向上させるために置換法で用いる抗原と抗体との結合条件を最適化する技術については知られていない。
【特許文献１】特願２００５−５３０１７６
【非特許文献１】森泉豊榮，中本高道，（１９９７）センサ工学，昭晃堂．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低分子である爆薬成分を迅速、かつ簡便に測定できる置換法を用いて、代表的な爆薬成分であるＴＮＴ（ＴｒｉＮｉｔｒｏＴｏｌｕｅｎｅ；トリニトロトルエン）などを高感度、かつ高精度で測定するために、複合体抗原と抗体との結合条件を最適化した測定方法と、当該方法を用いた測定装置を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは前記置換法を用いた測定方法において基板に固定化する複合体抗原と抗体との結合親和性に関する研究を行った。その結果、複合体抗原と抗体との結合力が所定の範囲内にあるときに抗原であるＴＮＴを最も高感度、かつ高精度に測定できることを見出した。本願はかかる研究結果に基づくものであり、以下に示す発明に関する。
【０００８】
第１の発明は、基板表面上に複合体抗原を固定化する複合体抗原固定化工程と、当該複合体抗原が固定化された基板を複合体抗原と抗原抗体反応によって結合する抗ＴＮＴモノクローナル抗体を含むバッファ中に浸漬する抗体結合工程と、抗体結合工程の後、前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに基板を浸漬して前記結合を部分的に解離する部分解離工程と、部分解離工程後、測定物を通したバッファに基板を浸漬して当該バッファ中の抗原の測定を行う測定工程と、を含むＴＮＴ測定方法であって、前記部分解離工程での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率が検出部の測定で８％〜１２％であることを特徴とするＴＮＴ測定方法である。
【０００９】
第２の発明は、前記測定工程が、ＳＰＲ測定法、又はＱＣＭ測定法により測定を行う第１の発明に記載のＴＮＴ測定方法である。
【００１０】
第３の発明は、基板表面上に固定化された複合体抗原と、当該複合体抗原と抗原抗体反応によって結合させた抗ＴＮＴモノクローナル抗体とを有するセンサ部と、センサ部での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との解離量を測定する測定部と、を有するＴＮＴ測定装置であって、基板を前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに浸漬したときの前記複合体抗原とＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率が８％〜１２％であることを特徴とするＴＮＴ測定装置である。
【００１１】
第４の発明は、前記測定部が、ＳＰＲ測定手段、又はＱＣＭ測定手段を有する第３の発明に記載のＴＮＴ測定装置である。
【発明の効果】
【００１２】
本実施形態のＴＮＴ測定方法及びＴＮＴ測定装置によれば、従来の置換法による測定方法及び測定装置に加えて、さらに複合体抗原と抗体の結合親和性の最適化によって高感度、かつ高精度に測定できるＴＮＴなどの爆薬成分の測定方法と測定装置を提供できる。さらに、本実施形態のＴＮＴ測定装置は、測定部にＳＰＲ測定手段やＱＣＭ測定手段を用いることで、小型・軽量なＴＮＴ測定装置を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下に、各発明を実施するための最良の形態を説明する。なお、本発明はこれらの実施の形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施しうる。以下、実施形態１は、主に請求項１、２に関する。実施形態２は、主に請求項３、４に関する。
【００１４】
<<実施形態１>>
【００１５】
<実施形態１：概要>
実施形態１はＴＮＴ測定方法に関する。本実施形態のＴＮＴ測定方法は、抗原抗体反応を利用した置換法に基づく方法であって、測定に使用する複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との自然解離による飽和解離率が８％〜１２％であることを特徴とする。当該飽和解離率を有する複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体のペアを使用することで、通常の置換法を用いた測定方法よりも、より高感度、かつ高精度でＴＮＴ分子などを測定できる。
【００１６】
<実施形態１：方法>
図１は、実施形態１の処理の流れを示している。この図で示すように、本実施形態のＴＮＴ測定方法は、複合体抗原固定化工程（Ｓ０１０１）と、抗体結合工程（Ｓ０１０２）と、部分解離工程（Ｓ０１０３）と、測定工程（Ｓ０１０４）と、からなる。この処理の流れからもわかるように本実施形態のＴＮＴ測定方法は、置換法に基づいている。
【００１７】
（置換法について）
【００１８】
「置換法」とは、基板表面上に固定化された抗原と、バッファ中に存在する検出対象の抗原との抗体に対する結合親和性を利用した測定方法であって、予め基板表面上に固定化された抗原に結合させた抗体をバッファ中に存在する検出対象の抗原によって解離させることを原理としている。
【００１９】
図２の概念図を用いて本実施形態における置換法について説明する。（ａ）：複合体抗原（０２０１）を基板（０２０２）表面上に固定化する（Ｓ０１０１  複合体抗原固定化工程に該当する。）。（ｂ）：（ａ）の複合体抗原に当該複合体抗原と抗原抗体反応によって結合する抗ＴＮＴモノクローナル抗体（０２０３）を結合させる（Ｓ０１０２  抗体結合工程に該当する。）。（ｃ）：基板上に残った非結合の抗ＴＮＴモノクローナル抗体などを抗原などを含まないバッファ（０２０４）によって洗浄する（Ｓ０１０３  部分解離工程に該当する。）。このとき（ｂ）で抗原抗体反応によって複合体抗原と結合していた抗ＴＮＴモノクローナル抗体の一部（０２０５）が解離する。このような、抗原などを含まないバッファへの浸漬によって生じる複合体抗原と抗体との解離であり、抗原どうしの競合によらない解離のことを、本願では「自然解離」と呼ぶ。（ｄ）：測定物質であるＴＮＴ分子など（０２０６）を含んだバッファに前記基板を浸漬することで、抗ＴＮＴモノクローナル抗体に対する複合体抗原とＴＮＴ分子などとの結合力の差により抗体と複合体抗原が解離する。この抗体解離による変化を捉えて定量する（Ｓ０１０４  測定工程に該当する）。以上の過程によって、本実施形態のＴＮＴ測定方法が実現できる。
【００２０】
（実施形態１の工程の説明）
実施形態１を構成する各工程について以下で詳細に説明をする。
【００２１】
「複合体抗原固定化工程」（Ｓ０１０１）は、基板表面上に複合体抗原を固定化する工程である。
【００２２】
「基板」とは、次に述べる複合体抗原を固定化するための支持体である。基板の材質は、後述する測定法に応じて定める。例えば、ＳＰＲ測定法やＱＣＭ測定法の場合、基板は金属薄膜で構成される。いずれの場合も金属種は特に限定しない。しかし、化学的に不活性であり、また信号の発生効率がよいなどの理由から金属薄膜としては金（Ａｕ）が好ましい。また、比色／蛍光法などの場合、基板の材質は複合体抗原を固定化できれば特に問わない。例えば、プラスチックやガラスなどが利用できる。
【００２３】
「複合体抗原」とは、ハプテンとキャリアタンパク質とを結合させた物質である。「ハプテン」とは、抗体との結合性を有するが、それ単独では抗体産生の免疫原性を持たない低分子の不完全抗原をいう。ハプテンの分子量は、通常、５０００よりも小さい。また、「キャリアタンパク質」とは、結合によってハプテンを完全抗原にする担体をいう。キャリアタンパク質としては、例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎｅ：ウシ血清アルブミン）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：卵白アルブミン）、乳タンパク質カゼイン、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）、サイログロブリン（Ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）のタンパク質が挙げられる。
【００２４】
基板上に複合体抗原を固定化する理由は、複合体抗原はキャリアタンパク質を有することから、基板表面上への固定化が容易、かつ迅速に行えるためである。
【００２５】
基板表面上に固定化される複合体抗原は、後述する抗ＴＮＴモノクローナル抗体と抗原抗体反応によって結合可能であれば、ハプテン、及びキャリアタンパク質の種類については問わない。例えば、ハプテンはＴＮＴやＤＮＰ（ＤｉＮｉｔｒｏＰｈｅｎｙｌ）が利用できる。本実施形態の複合体抗原において重要な点は、後述するように抗ＴＮＴモノクローナル抗体との自然解離よる飽和解離率が８％〜１２％ということである。
【００２６】
基板表面上へ複合体抗原を固定化する方法は、物理的吸着法や化学的吸着法によって行えばよい。物理的吸着法であれば、基板表面の材質が金属の場合には金属とタンパク質との高い親和性によって固定化できる。また、化学的吸着法であれば、基板表面上に自己組織化単分子膜（Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｏｎｏｌａｙｅｒｓ；ＳＡＭｓ）を予め形成させておくと便利である。自己組織化単分子膜は基板表面上に種々の分子を自発的に配向させ、また集積させることが可能なため、複合体抗原を簡便に、高密度に、そして高配向で基板上に固定化できる。当該単分子膜は、チオール溶液中に基板を浸漬するだけで形成できる。複合体抗原は、例えば、キャリアタンパク質のアミノ基を介してアミノカップリング法によって基板表面上に修飾されたチオール化合物のカルボキシル基に固定化できる。具体的な方法については、実施例１で述べる。
【００２７】
「抗体結合工程」（Ｓ０１０２）は、当該複合体抗原が固定化された基板を複合体抗原と抗原抗体反応によって結合する抗ＴＮＴモノクローナル抗体を含むバッファ中に浸漬する工程である。
【００２８】
本実施形態の「抗ＴＮＴモノクローナル抗体」は、少なくともバッファ中のＴＮＴ分子、及び基板表面上に固定化された複合体抗原と抗原抗体反応によって結合可能なモノクローナル抗体をいう。ＴＮＴ分子は分子量が２２７．１しかないことから、前述のようにそれ単体では免疫原とはならない。したがって、当該抗ＴＮＴモノクローナル抗体は、ＴＮＴなどをハプテンとした複合体抗原を免疫原として作製されたものである。作製の際に使用されるキャリアタンパク質の種類は特に問わない。なお、抗ＴＮＴモノクローナル抗体は、市販の抗体を利用することもできる。本実施形態の抗ＴＮＴモノクローナル抗体において重要な点は、後述するように複合体抗原との自然解離による飽和解離率が８％〜１２％ということである。
【００２９】
「バッファ」は、抗体や抗原を安定な状態で保持可能な緩衝液である。バッファは、抗体や抗原を液相内に取り込み、また抗原抗体反応のための場を提供する機能も有する。バッファの組成は、前記機能を有するものであれば、特に限定はしない。例えば、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：１３７ｍＭ  ＨＣｌ、８．１ｍＭ  ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）／１％  エタノールや、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．９ｍＭ  ＮａＯＨ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０が挙げられる。
【００３０】
ここでいう「浸漬する」とは、少なくとも複合体抗原が固定化された基板表面をバッファに接触させることをいう。抗原抗体反応は、通常液相内にて行われる。したがって、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との結合には、基板をバッファに接触させる必要がある。当該浸漬において、基板上でバッファが静止しているか、流動しているかは問わない。いずれの状態であってもバッファに接触してさえいれば抗原抗体反応はできるからである。しかし、反応効率の向上、基板表面の洗浄などを考慮すると、測定作業の効率性や迅速性からバッファは流動性を有する方が好ましい。
【００３１】
「部分解離工程」（Ｓ０１０３）は、抗体結合工程の後、前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに基板を浸漬して前記結合を部分的に解離する工程である。本実施形態で最も特徴的な点は、後述するように、当該部分解離工程での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率が検出部の測定で８％〜１２％である点である。
【００３２】
「前記抗原抗体反応を生じる物質」とは、抗体結合工程（Ｓ０１０２）で使用した基板表面上の複合体抗原と抗原抗体反応を生じ得る抗体、及び抗体結合工程（Ｓ０１０２）で使用した抗ＴＮＴモノクローナル抗体と抗原抗体反応を生じ得る抗原をいう。
【００３３】
「前記結合」とは、抗体結合工程（Ｓ０１０２）で形成された基板表面上の複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合をいう。
【００３４】
「解離」とは、抗原（複合体抗原を含む）と抗体との抗原抗体反応による結合が解除され、両者が分離することをいう。また、「前記結合を部分的に解離」とは、抗体結合工程（Ｓ０１０２）で形成された抗原抗体反応による複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との複数の結合のうち、一部の解離を意味する。つまり、ここでいう部分解離は、一複合体抗原と一抗体との間の抗原抗体反応による結合が部分的に解離する意味ではない。
【００３５】
「解離率」とは、抗体結合工程（Ｓ０１０２）に形成された基板表面上の複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合のうち、測定直前の抗体結合量を１００とした時の解離の割合である。解離率は、測定工程における測定によって算出できる。
【００３６】
「飽和解離率」とは、ある状態下で飽和状態にあるときの解離率で、通常その状態下で最大値を示す。例えば、部分解離工程における飽和解離率とは、自然解離による抗原抗体反応の部分的な解離が飽和状態となったときの解離率をいう。
【００３７】
部分解離工程は、抗体結合工程後の基板表面の洗浄工程に相当する。抗体結合工程（Ｓ０１０２）後には、通常、非抗原抗体反応によって結合している抗ＴＮＴモノクローナル抗体が基板表面上に存在する。このような抗体は、ＴＮＴなどの測定上の誤差要因となり得る。そこで、部分解離工程は、測定工程に先立ち、基板表面を前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファで洗浄し、非抗原抗体反応によって結合している抗ＴＮＴモノクローナル抗体を除去することを目的としている。
【００３８】
ところで、部分解離工程では、前述のようにバッファによる洗浄で複合体抗原と抗原抗体反応によって結合している一部の抗ＴＮＴモノクローナル抗体が自然解離する。自然解離の度合は、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合親和性によって左右される。
【００３９】
前述のように置換法は抗原や抗体が示す結合親和性を利用する方法である。測定対象分子であるＴＮＴ分子などを検出するためには、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の結合力が、ＴＮＴ分子などの抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の結合力を下回る必要がある。複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の結合力の方が強い場合、抗原の置換が生じない測定感度上の問題が生じる。。
【００４０】
一方、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との結合力が弱過ぎる場合、抗ＴＮＴモノクローナル抗体の多くが抗原と結合する前に自然解離してしまう。その結果、測定工程において抗原量が実際の量よりも過大評価されてしまい、測定誤差が大きくなるなどの測定精度上の問題が生じる。
【００４１】
したがって、置換法を用いたＴＮＴ分子などの高感度、かつ高精度な検出には、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合力が所定の強さの範囲内にあることが必要である。当該結合力は、自然解離による飽和解離率として評価できる。本実施形態のＴＮＴ測定法では、自然解離による飽和解離率が８％以上１２％以下であることを構成要件とする。自然解離による飽和解離率が８％を下回ると、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合親和性が強くなり結果、ＴＮＴ分子などの測定感度が低下するため好ましくない。また、自然解離による飽和解離率が１２％を上回ると、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との抗原抗体反応による結合が不安定となる結果、ＴＮＴ分子などの測定誤差が大きくなり、測定精度が低下するため好ましくない。
【００４２】
実際の測定では、部分解離工程で必ずしも解離率の値が飽和解離率の値に達している必要はない。部分解離工程での飽和解離率の範囲が８％〜１２％であることが予め判明している複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体のペアであれば、結合親和性は解離が飽和する前後で原則として不変なためである。
【００４３】
なお、部分解離工程での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との飽和解離率は、解離率が飽和状態に達するまで前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファで基板表面を所定の時間浸漬して、洗浄することで求めることができる。ここでいう洗浄は、液流洗浄、あるいは微弱な超音波洗浄であればよい。また、浸漬する所定の時間は、複合体抗原と抗体との組合せや、バッファの流動状態などによって異なるため、適宜定めることが好ましいが、通常は約２〜４分ほどでよい。
【００４４】
「測定工程」（Ｓ０１０４）は、部分解離工程後、測定物を通したバッファに基板を浸漬して当該バッファ中の抗原の測定を行う工程である。すなわち、測定物中の抗原の有無を検出し、それを定量する工程である。
【００４５】
「測定物」とは、本実施形態の測定に供する気体、若しくは液体である。「測定物を通した」とは、測定物を接触させて、バッファに抗原を取り込むことをいう。バッファ中に測定物を通す方法については、特に限定しない。例えば、測定物が液体の場合には、その液体をバッファに混合すればよい。また、測定物が気体の場合には、単にバッファを当該気体に接触させる方法、バッファ中に管を差し込み、当該管より気体を気泡状に放出する方法、バッファと気体とを撹拌する方法が挙げられる。
【００４６】
ここでいう「抗原」とは、前記抗体結合工程で使用した抗ＴＮＴモノクローナル抗体と抗原抗体反応によって結合できる抗原であって、測定物をバッファに通すことでバッファ内に取り込まれた抗原をいう。このような抗原を本願では、「ＴＮＴ分子など」と呼ぶ。例えば、ＴＮＴ分子、抗ＴＮＴモノクローナル抗体の免疫原とされた複合体抗原が該当する。本実施形態の趣旨を鑑みれば、ここでいう抗原は、ＴＮＴ分子やＤＮＴ（ＤｉＮｉｔｒｏＴｏｌｕｅｎｅ；ジニトロトルエン）分子などの爆薬成分分子であることが好ましい。
【００４７】
前述のように本実施形態のＴＮＴ測定法方が置換法に基づく。したがって、「バッファ中の抗原の測定」は、バッファ中の抗原による抗ＴＮＴモノクローナル抗体の複合体抗原から解離の度合を測定できる方法であれば、特に限定しない。例えば、ＳＰＲ測定法、ＱＣＭ測定法、比色／蛍光法が挙げられる。以下、それぞれの測定方法について説明をする。
【００４８】
（ＳＰＲ測定法を用いた測定法）
【００４９】
「ＳＰＲ測定法」（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ法）とは、表面プラズモン共鳴測定法とも呼ばれ、金属薄膜上の質量変化を高感度に検出する方法である。図３を用いて、ＳＰＲ測定法の原理を説明する。図３（ａ）は、実施形態２で述べるＳＰＲ手段の構成の一例を示している。まず、ＳＰＲ現象について説明をする。プリズム（０３０２）上、又は図示しないガラス板上に蒸着された金属薄膜（０３０１）の裏面に対して光源（０３０３）からレーザーなどで光（０３０８）を照射すると、金属薄膜裏面で光が全反射（０３０９）をすると同時に金属薄膜でエバネッセント波（図示せず）が発生する。このとき、金属薄膜表面側では表面プラズモン（図示せず）が発生する。このエバネッセント波と表面プラズモンのそれぞれの波数・周波数が一致した際、共鳴により光子エネルギーが表面プラズモンの電子を励起するために消費される。そのため、ある入射角で光を入射すると反射光が減衰する現象が生じる。これがＳＰＲ現象であり、このときの入射角θ（０３１０）を共鳴角と呼ぶ。当該共鳴角は金属薄膜表面近傍の状態によって変化し、この変化は質量変化に対応している。ＳＰＲ測定法の原理は、共鳴角の質量変化による変化を利用して金属薄膜表面上の吸着物を測定するものである。図３（ｂ）及び（ｃ）は、入射角変化と、共鳴角変化をそれぞれ示している。図３（ｂ）で金属薄膜表面上の質量変化に伴う共鳴角変化について例を示して説明する。金属薄膜表面上の物質の吸着の有無は、その前後の共鳴角度θの変化として捕らえることができる。例えば、金薄膜表面に何も吸着していない状態の共鳴角度をθ０とする時、金属薄膜が硫化物をはじめとする金属吸着性の分子をその表面に吸着した状態では共鳴角度がθ１に変化する。この場合、θ１とθ０との差であるΔθの値の変化（ｃ）を見ることにより、金属薄膜がその表面にどれほどの分子を吸着したのかを測定することが可能となる。
【００５０】
図４を用いて、本実施形態における共鳴角の変化について説明をする。本実施形態では、抗体結合工程（Ｓ０１０２）直後のΔθ値が最大値（Δθ０とする）となる（０４０１）。この図では、Δθ０が飽和状態に達している場合を示しているが、Δθ０は必ずしも飽和状態である必要はない。例えば、対数増加期のある時点であっても構わない。続く、部分解離工程では、抗原などを含まないバッファを流すことによって一部の抗体が自然解離することから、Δθ値は若干減少する（０４０２）。このときのΔθ値をΔθ１とする。Δθ１の値が最大となる状態が部分解離工程での飽和解離状態に該当する。本実施形態のＴＮＴ測定方法は、Δθ０の値を１００としたときの飽和解離状態時のΔθ１の値が８〜１２となる複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体を使用することを構成要件としている。さらに、測定工程において抗原をバッファと共に流入すると、抗原の量に応じた抗体の解離によってΔθ値はΔθ１の値からさらに減少する（０４０３）。この時のΔθ値をΔθ２とする。すなわち、測定物中の抗原であるＴＮＴの量はΔθ２で表される。各種濃度のＴＮＴを含むバッファに対するΔθ２値を予め決定し、検量線を作成しておくことによって、測定物中のＴＮＴの量を定量できる。
【００５１】
（ＱＣＭ測定法を用いた測定法）
【００５２】
「ＱＣＭ測定法」（ｑｕａｒｔｚ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ法）は、水晶振動子マイクロバランス測定法とも呼ばれ、水晶振動子に取り付けた電極表面への物質が吸着するとその質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用して、共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえる質量測定方法である。ＱＣＭ測定法における吸着物の質量測定は、Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの式に基づいて行う。当該方法によれば、単原子層レベルで電極に吸着した物質の質量をナノグラムレベルで測定できる。
【００５３】
ＱＣＭ測定法は公知の方法であり、本実施形態で用いるＱＣＭ測定法も非特許文献１に記載の方法などに準じて行えばよい。
【００５４】
（比色／蛍光法を用いた測定法）
【００５５】
「比色／蛍光法」とは、基質プローブを抗体などに担持させておき、抗原抗体反応によって生じる発色濃度や蛍光強度を吸光光度計やルミノメータなどにより定量する方法である。基質プローブの状態が変化して発色、若しくは蛍光を発するのを利用して、その発色濃度や蛍光強度によって標的分子を定量できる。一般的に基質プローブが発色物質を生じる場合には比色法、また蛍光物質を生じる場合には蛍光法と呼ぶ。
【００５６】
置換法に基づく本実施形態のＴＮＴ測定法では、例えば、抗体結合工程（Ｓ０１０２）で用いる抗ＴＮＴモノクローナル抗体が発色物質や蛍光物質を担持していればよい。部分解離工程（Ｓ０１０３）後の発色濃度や蛍光強度を基準として、測定工程（Ｓ０１０４）における抗体の解離によって減少した発色濃度や蛍光強度を測定することで、バッファ中の抗原を定量できる。
【００５７】
<実施形態１：効果>
本実施形態のＴＮＴ測定方法によれば、従来の置換法による測定方法のメリットに加えて、複合体抗原と抗体の結合親和性の最適化により高感度、かつ高精度に測定できるＴＮＴの測定方法と測定装置を提供できる。
【００５８】
<<実施形態２>>
【００５９】
<実施形態２：概要>
実施形態２はＴＮＴ測定装置に関する。本実施形態のＴＮＴ測定装置は、置換法を用いた測定装置であって、基板を抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに浸漬したときの飽和解離率が８％〜１２％である複合体抗原とＴＮＴモノクローナル抗体をセンサ部に使用することを特徴としている。本実施形態で使用される測定方法は、主に前記実施形態１のＴＮＴ測定方法を基本としている。本実施形態のＴＮＴ測定装置によれば、より高感度でＴＮＴ分子などを測定できる。
【００６０】
<実施形態２：構成>
実施形態２の構成について説明する。実施形態２のＴＮＴ測定装置は、センサ部と測定部とを有している。さらに、測定部は、ＳＰＲ測定手段、又はＱＣＭ測定手段を有していてもよい。以下、それぞれの構成について説明をする。なお、各部などの構成要件の説明のうち、前記実施例１で既に説明したものに関しては、その説明を省略する。
【００６１】
「センサ部」は、基板上に固定化された複合体抗原と、当該複合体抗原と抗原抗体反応によって結合させた抗ＴＮＴモノクローナル抗体とを有するように構成されている。当該センサ部は、抗原抗体反応の場であり、測定物中に含まれる抗原を検出するセンサとしての機能を有する。各構成は前記実施形態１で述べた方法によって実現できる。すなわち、複合体抗原の基板上への固定化は、複合体結合工程（Ｓ０１０１）に記載の方法に従えばよい。また、当該複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体とを抗原抗体反応によって結合させる方法については、抗体結合工程（Ｓ０１０２）に記載の方法に従えばよい。
【００６２】
センサ部は、ＴＮＴ測定装置から着脱することもできる。このとき、次の測定部で述べる必要なプリズム（０３０２や水晶振動子（０４０１）とともに着脱できるようにしてもよい。
【００６３】
本実施形態のＴＮＴ測定装置では、基板を前記抗原抗体反応を生じる物質を含まないバッファに浸漬したときの飽和解離率が８％〜１２％となるような複合体抗原とＴＮＴモノクローナル抗体とを使用することを特徴とする。実施形態１で述べた理由により、当該複合体抗原とＴＮＴモノクローナル抗体とを使用することでＴＮＴの測定感度を向上できる。
【００６４】
「測定部」は、センサ部での複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との解離量を測定するように構成されている。具体例としては、後述するＳＰＲ測定手段、ＱＣＭ測定手段、若しくはそれらの組合せが該当する。ただし、測定部は、当該解離量を測定できる手段であればよく、これらの手段に限定はされない。以下、ＳＰＲ測定手段、ＱＣＭ測定手段について説明をする。
【００６５】
（ＳＰＲ測定手段）
【００６６】
「ＳＰＲ測定手段」とは、前記センサ部における複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の解離による質量変化をＳＰＲ測定法によって検出するように構成されている。
【００６７】
ＳＰＲ測定手段の基本構成は、公知のＳＰＲ測定装置と同様の構成でよい。具体的には、図３（ａ）で示すように、金属薄膜（０３０１）、光源（０３０３）、光検出器（０３０４）、必要なプリズム（０３０２）などから構成されている。
【００６８】
金属薄膜（０３０１）は、センサ部の基板でもあることから、その表面の一方には複合体抗原（０３０５）が固定化されている。金属薄膜は数十ｎｍの厚さが適当である。これは、金属薄膜が厚すぎると、入射光が金属膜の反射面と反対側の表面プラズモンを励起することができなくなり、逆に金属薄膜が薄すぎると、表面プラズモンを共鳴させても表面プラズモンとして伝播する前に全反射光に変換されてしまうためである。なお、複合体抗原が固定化された金属薄膜面は、バッファ（０３１１）が接触可能なように構成されている。検出対象物である抗原（０３０７）は、バッファに取り込まれてセンサ部に導入される。
【００６９】
光源（０３０３）は、前記金属薄膜の複合体抗原が固定化された面と反対の裏面に対して光を入射するための機能を有する。通常、ＬＥＤやレーザーなどが使用される。このとき、光源からの光の金属薄膜表面への入射角度を制御するために反射板などを有していてもよい。
【００７０】
光検出器（０３０４）は、前記光源から入射され前記金属薄膜裏面で反射した反射光の強度を検出する器である。通常、（フォト）ダイオードアレイ検出器などが使用される。
【００７１】
ＳＰＲ測定手段は、この他にも混合室やＳＰＲ解析器を有していてもよい。混合室は、測定物が気体である場合にセンサ部に導入するバッファと混合し、気体中に含まれるＴＮＴ分子などの抗原を取り込むように構成されている。また、ＳＰＲ解析器は、コンピュータなどの計算機が該当し、前記光源の入射光強度と前記光検出器で検出される反射光強度とに基づいて反射率、及び共鳴角を算出する機能を有する。
【００７２】
ＳＰＲ測定手段は、市販の装置が利用できる。その際、フローシステム採用のＳＰＲ測定装置が便利である。流速、及び流通時間はバッファの導入量などに応じて適宜定めればよい。例えば、１００μl〜２００μlのバッファを導入する場合であれば、流速５〜２０μl／ｍｉｎで十数分間流すとよい。ただし、上記は一例であって、この数値などに限定はされない。なお、市販のＳＰＲ測定装置を用いて測定する場合には、装置に付属のマニュアルなどに従って行えばよい。
【００７３】
ＳＰＲ測定手段は、微量なサンプルをリアルタイムで測定できる上に、小型・軽量化が可能である。したがって、ＳＰＲ測定手段を測定部に用いることで、ＴＮＴ測定装置全体の小型・軽量化、携帯化が可能となる。さらに、測定に要するコストが低額で済み、置換法と組み合わせることで測定も短時間で行えるなど、本実施形態のＴＮＴ測定装置として優れている。
【００７４】
（ＱＣＭ測定手段）
【００７５】
「ＱＣＭ測定手段」とは、前記センサ部における複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の解離による質量変化をＱＣＭ測定法によって検出するように構成されている。
【００７６】
ＱＣＭ測定手段の基本構成は、公知のＱＣＭ測定装置と同様の構成を有する。具体的には、図５で示すように、水晶振動子（０５０１）、電極（０５０２）、補助電極（０５０３）などから構成されている。
【００７７】
水晶振動子（０５０１）は、水晶体で構成されている。
【００７８】
電極（０５０２）は、水晶振動子（０５０１）の表面に蒸着された金属薄膜で構成されている。当該電極は、センサ部の基板でもあり、その表面には複合体抗原（０５０４）が固定化されている。
【００７９】
補助電極（０５０３）は、電極（０５０２）との間で電流を流すための電極である。通電は電解質を含むバッファ（０５０７）中にて行われる。
【００８０】
ＱＣＭ測定手段は、この他にも混合室（図示せず）、電流制御器（０５０８）、遷移制御器（０５０９）、周波数測定器（０５１０）、ＱＣＭ解析器（０５１１）を有していてもよい。混合室の構成については、ＳＰＲ測定手段で述べたものと同様であることから、説明は省略する。電流制御器（０５０８）は、前記水晶振動子に対して必要な電流を流す機能を有する。具体的な例としては、ポテンショスタットが該当する。なお、当該電流制御器は、次の遷移制御器（０５０９）によってその電流の出力を制御されている。遷移制御器（０５０９）は、前記水晶振動子の周波数を複数の値に遷移させるために、水晶振動子の金属電極に印加する電流値を制御する機能を有する。具体的な例としては、発振器などが該当する。印加する電流値を所望の値に遷移させる場合は、遷移制御器にインストールされた電流値遷移プログラムを実行することで実現できる。所望の電流値を予め入力しておけば、当該プログラムがその入力した複数の電位値に従って前記電流制御器を制御するように実行できる。周波数測定器（０５１０）は、水晶振動子から得られる周波数を測定する機能を有する。ＱＣＭ解析器（０５１１）は、水晶振動子から得られる発振周波数の変化を算出する機能を有する。具体的な例としては、コンピュータなどの計算機が該当する。
【００８１】
ＱＣＭ測定手段も、小型・軽量化が可能である。したがって、ＱＣＭ測定手段を測定部に用いることで、ＴＮＴ測定装置の小型・軽量化が可能となる。
【００８２】
<実施形態２：効果>
本実施形態のＴＮＴ測定装置によれば、迅速、かつ簡便で、より高感度にＴＮＴ分子などを測定できるＴＮＴ測定装置を提供できる。また、本実施形態のＴＮＴ測定装置は、測定部にＳＰＲ測定手段を用いることで、小型・軽量なＴＮＴ測定装置を提供できる。
【実施例１】
【００８３】
以下の実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、本実施例は単に例示するのみであり、実施形態１はこの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００８４】
<<置換法における複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との結合親和性の最適化>>
【００８５】
（（目的））
本実施例では、ＳＰＲ測定法を用いた実施形態１のＴＮＴ測定方法において、複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体との結合親和性の最適値を求めるために、異なる複合体抗原と抗ＴＮＴモノクローナル抗体の自然解離による飽和解離率を求め、ＴＮＴ抗原の測定下限との関係を検証した。
【００８６】
<金属薄膜上への複合体抗原の固定化>
【００８７】
（（材料））
（１）複合体抗原    ・ＤＮＰ−ＯＶＡ（ＤＮＰ基数  ４；コスモ・バイオ社）
・ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎ（ＤＮＰ基数  １８；コスモ・バイオ社）
・ＤＮＰ−ＢＳＡ（ＤＮＰ基数  ３０；コスモ・バイオ社）
・ＤＮＰ−ＫＬＨ（ＤＮＰ基数  ４；コスモ・バイオ社）
（２）金薄膜          ＳＩＡ  Ｋｉｔ  Ａｕ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社）
（３）ＳＣ１洗浄液    超純水：過酸化水素：アンモニア＝５：１：１で混合した溶液
（４）１０ｍＭ  １６−ＭＨＤ（Ａ１６−ｍｅｒｃａｐｔｏｈｅｘａｄａｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ；アルドリッチ社）／エタノール
（５）０．４Ｍ  ＥＤＣ（Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｌａｍｉｎｅｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅｈｙｄｒｏｃｈｒｏｒｉｄｅ；Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）：０．４Ｍ  ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ；Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社）＝１：１混合液
（６）酢酸バッファ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社）
（７）１Ｍ  エタノールアミン塩酸（ｐＨ８．５）
【００８８】
（（方法））
【００８９】
（金薄膜の予備洗浄）
超音波洗浄器（ＵＳ−１；アズワン社）によってアセトンで１０分間、エタノールで２分間、２−プロパノールで２分間、それぞれ洗浄した後、ＳＣ１洗浄液に金薄膜を浸漬して９０℃で２０分間洗浄した。その後、金薄膜を超純粋でリンスし、予備洗浄を完了した。
【００９０】
（自己組織化単分子膜の形成）
１０ｍＭ  １６−ＭＨＤＡ／エタノール溶液に予備洗浄した金薄膜を浸漬した。この操作によって、金薄膜表面上にチオール基を集積、配向させた自己組織化単分子膜が形成される。浸漬時間はＤＮＰ−ＯＶＡ用で２４時間、ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎ用で４時間、ＤＮＰ−ＢＳＡ用で７．５時間、ＤＮＰ−ＫＬＨ用で６時間とした。前記浸漬時間後に溶液から金薄膜を取り出し、エタノールに入れて超音波洗浄器で５分間洗浄した。これは、金薄膜の表面に非特異吸着しているチオールを除去するための操作である。その後、金薄膜をエタノールから取り出して超純水でリンスし、自己組織化単分子膜の形成を完了した。
【００９１】
（アミンカップリング法による複合体抗原の固定化）
複合体抗原はアミンカップリング法を用いて金薄膜上に固定化した。まず、自己組織化単分子膜の形成後の金薄膜をＢｉａｃｏｒｅ社製の金薄膜固定プレートに貼りつけ、専用の測定ケースに入れた後、ＳＰＲ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ社；装置内は２５℃に設定）に装着した。次に、０．４Ｍ  ＥＤＣ＋０．４Ｍ  ＮＨＳ混合液を流速５μl／ｍｉｎで７分間センサ部に流入して、自己組織化単分子膜のカルボキシル基を活性化した。続いて、酢酸バッファで２００ｐｐｍに希釈した複合体抗原（ＤＮＰ−ＯＶＡ、ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎ、ＤＮＰ−ＢＳＡ、ＤＮＰ−ＫＬＨ）溶液を流速５μl／ｍｉｎで７分間〜１４分間センサ部に流入して、金薄膜表面に固定化した。それぞれの複合体抗原で固定化された金薄膜は、測定中に物質が未結合部位に非特異吸着することを防ぐため１Ｍ  エタノールアミン塩酸を７分間流通して未結合部位をブロッキングした。
【００９２】
<抗ＴＮＴモノクローナル抗体濃度の選定>
本実施例では、前記４種の異なる複合体抗原に対する条件をそろえるために、複合体抗原への抗体結合量は最大とした。そこで、まず抗ＴＮＴモノクローナル抗体の複合体抗原への結合量が飽和する抗体溶液濃度について検証した。
【００９３】
（（材料））
（１）抗ＴＮＴモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社）
（２）ＨＢＳバッファ  １０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
（３）ＴＮＴ（中国化薬社）
【００９４】
（（方法））
前記「金属薄膜上への複合体抗原の固定化」で得られた金薄膜（４種）にＨＢＳバッファで５ｐｐｍから４００ｐｐｍに希釈した抗ＴＮＴモノクローナル抗体溶液を流速１０μl／ｍｉｎで５分間流通し、７分後の結合量をＳＰＲ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）で測定した。ランニングバッファは、ＨＢＳバッファを用いた。なお、結合した抗ＴＮＴモノクローナル抗体を強制解離させる再生溶液としては、５０ｍＭ  ＮａＯＨを用いた。
【００９５】
（（結果））
図６に結果を示す。縦軸はＳＰＲ測定による共鳴角変化であるが、ここでは抗体結合量を意味する。共鳴角変化の単位ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｃｅ  Ｕｎｉｔ）は、１０００ＲＵで０．１°の共鳴角変化量に相当する。これは金薄膜表面のタンパク質の質量変化に換算すると、約１ｎｇ／ｍｍ２の質量変化に相当する。
【００９６】
この図で示すように、抗ＴＮＴモノクローナル抗体の結合量が最大量、すなわち飽和する抗体濃度は、ＤＮＰ−ＯＶＡでは２５０ｐｐｍ、ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎでは２００ｐｐｍ、ＤＮＰ−ＢＳＡでは３００ｐｐｍ、ＤＮＰ−ＫＬＨでは２００ｐｐｍであることが判明した。なお、この時の各複合体抗原の金薄膜上の固定化量は、ＤＮＰ−ＯＶＡが１３９１．４ＲＵ、ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎが３０８５．４ＲＵ、ＤＮＰ−ＢＳＡが２３６．８ＲＵ、ＤＮＰ−ＫＬＨが８６８．０ＲＵであった。
【００９７】
<自然解離による飽和解離率とＴＮＴ測定感度との関係>
【００９８】
（（方法））
前記「金属薄膜上への複合体抗原の固定化」で得られた４種の金薄膜のそれぞれに対して、前記「抗ＴＮＴモノクローナル抗体濃度の選定」で得られた各飽和抗体濃度で処理したセンサ部を用いて、それぞれの自然解離による飽和解離率とＴＮＴに対する応答感度について検証した。抗体結合量、抗原結合量はＳＰＲ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）で測定した。また、いずれの測定も同一条件で３回行い、その平均値を求めた。
【００９９】
（自然解離による飽和解離率の測定）
抗ＴＮＴモノクローナル抗体を４種の複合体抗原が固定化された金薄膜のそれぞれに対して、前記「抗ＴＮＴモノクローナル抗体濃度の選定」で得られた各飽和抗体濃度で５分間流通した。その後、抗ＴＮＴモノクローナル抗体やＴＮＴを含まないＨＢＳバッファを７分間流通し、解離量をＳＰＲ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）で測定した。流速は、すべて１０μl／ｍｉｎで行った。この操作によって、複合体抗原に結合した一部の抗ＴＮＴモノクローナル抗体が解離（自然解離）する。後述の結果で示すように、ＨＢＳバッファの流通２分後にはいずれの複合体抗原の場合も自然解離はほぼ飽和状態に達した。抗体流通開始の５分後の抗体結合量（図４のΔθ０に相当）と、抗体の流通を停止して抗体や抗原を含まないＨＢＳバッファを７分間流通したときの抗体解離量（図４のΔθ１に相当）とから、自然解離による飽和解離率を算出できる。すなわち、自然解離による飽和解離率＝Δθ１／Δθ０×１００となる。
【０１００】
（ＴＮＴの測定）
ＴＮＴをＨＢＳバッファで０．1ｐｐｂから１００ｐｐｂに希釈した、異なる濃度のＴＮＴ抗体溶液を用いて置換法による測定を行った。基本的な測定手順については前記「自然解離による飽和解離率の測定」と同じである。ただし、ここでは各飽和抗体濃度で５分間流通した後、抗ＴＮＴモノクローナル抗体やＴＮＴを含まないＨＢＳバッファで２分間洗浄した。この間に、一部の抗体は自然解離している。その後、各濃度のＴＮＴ抗体溶液を５分間流通し、解離量をＳＰＲ装置（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｘ）で測定した。
【０１０１】
（（結果））
図７に自然解離の状態と、ＴＮＴ流入による解離状態の結果の一部を示す。この図はＤＮＰ−ＯＶＡを用いて、抗ＴＮＴモノクローナル抗体溶液を飽和抗体濃度で５分間流通した後、ＨＢＳバッファを流通したときの共鳴角変化と、抗体流通停止後２分後（２分間のＨＢＳバッファによる洗浄後）に、１０ｐｐｂのＴＮＴ溶液を流通した時の結果を示している。この図で示すように、図４とほぼ同様の結果が得られた。図示はしないが他の複合体の場合もグラフ全体の形状はほぼ同様であった。
【０１０２】
表１に各複合体抗原の自然解離による飽和解離率（ＴＮＴ濃度０のとき）と、各濃度のＴＮＴ溶液に対する飽和解離率を示す。数値記載のない欄は未測定を意味する。ＴＮＴ測定時の飽和解離率とＴＮＴ測定前の解離率（ここでは自然解離による飽和解離率が該当する）との差が大きいほど、測定感度が高いことを意味する。この表で示すように、使用した抗ＴＮＴモノクローナル抗体によるＴＮＴ測定下限（表１では該当する飽和解離率を太字で記載）は、ＤＮＰ−ＯＶＡが１０ｐｐｂなのに対して、ＤＮＰ−Ｃａｓｅｉｎ、ＤＮＰ−ＢＳＡは１００ｐｐｂ、ＤＮＰ−ＫＬＨは１００ｐｐｂよりも大と、ＤＮＰ−ＯＶＡを用いた時がＴＮＴに対する測定感度が最も高い。また、自然解離による飽和解離率は、ＤＮＰ−ＯＶＡを用いたときに他の複合体抗原を用いた場合よりも高く、約９．２％であった。すなわち、複合体抗原からの抗ＴＮＴモノクローナル抗体の自然解離による飽和解離率が１０％前後のときに検出感度が高くなることが示された。
【表１】
2008058176.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】実施形態１の処理の流れを示す図
【図２】置換法の原理と本実施形態の処理の流れの概念図
【図３】ＳＰＲ測定法の原理とＳＰＲ測定手段の構成を説明する図
【図４】実施形態１におけるＳＰＲ測定法の共鳴角の変化を説明する図
【図５】ＱＣＭ測定手段の構成を説明する図
【図６】実施例１における抗ＴＮＴモノクローナル抗体の複合体抗原への結合量変化
【図７】実施例１における自然解離とＴＮＴ流入による解離の結果
【符号の説明】
【０１０４】
０２０１：基板
０２０２：複合体抗原
０２０３、０３０６、０５０６：抗ＴＮＴモノクローナル抗体
０２０４：バッファ
０２０５：ＴＮＴ（抗原）
【図１】
2008058176.tif 000004
【図２】
2008058176.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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