(57)【要約】【課題】爪真菌症の起因菌を正確に検出できる診断法の提供。【解決手段】爪検体から抽出したＤＮＡに対し第１回ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う爪真菌症の診断法であって、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを用い、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット並びにスコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いることを特徴とする爪真菌症の診断法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
爪検体から抽出したＤＮＡに対し第１回ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う爪真菌症の診断法であって、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを用い、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット並びにスコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いることを特徴とする爪真菌症の診断法。
【請求項２】
第１回ＰＣＲのプライマーセットが、真菌の２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５を増幅し得るプライマーセットである請求項１記載の診断法。
【請求項３】
第１回ＰＣＲのプライマーセットが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項２記載の診断法。
【請求項４】
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーセットが、トリコフィトン・ルブルムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、トリコフィトン・メンタグロファイテスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー及びフサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーである請求項１〜３のいずれか１項記載の診断法。
【請求項５】
トリコフィトン・ルブルムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項４記載の診断法。
【請求項６】
トリコフィトン・メンタグロファイテスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項４記載の診断法。
【請求項７】
スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項４記載の診断法。
【請求項８】
アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項４記載の診断法。
【請求項９】
フサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、及び配列番号１５と１６で表される塩基配列からなるプライマーセットから選ばれる１種又は２種以上のプライマーセットである請求項４記載の診断法。
【請求項１０】
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲによる爪真菌症の診断薬であって、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを含有し、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット並びにスコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを含有することを特徴とする爪真菌症診断薬。
【請求項１１】
第１回ＰＣＲのプライマーセットが、真菌の２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５を増幅し得るプライマーセットである請求項１０記載の診断薬。
【請求項１２】
第１回ＰＣＲのプライマーセットが、配列番号１及び２で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項１１記載の診断薬。
【請求項１３】
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーセットが、トリコフィトン・ルブルムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、トリコフィトン・メンタグロファイテスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー、アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー及びフサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーである請求項１０〜１２のいずれか１項記載の診断薬。
【請求項１４】
トリコフィトン・ルブルムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号３及び４で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項１３記載の診断薬。
【請求項１５】
トリコフィトン・メンタグロファイテスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号５及び６で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項１３記載の診断薬。
【請求項１６】
スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号７及び８で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項１３記載の診断薬。
【請求項１７】
アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなるプライマーセットである請求項１３記載の診断薬。
【請求項１８】
フサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４、及び配列番号１５と１６で表される塩基配列からなるプライマーセットから選ばれる１種又は２種以上のプライマーセットである請求項１３記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、起因菌を正確に同定することのできる爪真菌症の診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
爪真菌症は、爪白癬を含む爪の真菌感染症であり、重症になると爪が白又は黄褐色に変色し、肥厚し、爪床から離れていく。原因となる真菌は皮膚糸状菌だけでなく、スコプラリオプシス、アスペルギルス、フサリウム、カンジダなど広範囲に及ぶ。爪真菌症の治療には、グリセオフルビン、テルビナフィン、イトラコナゾール等の経口抗真菌薬やイミダゾール系、ベンジルアミン系、アリルアミン系、チオカルバミン酸系等の外用抗真菌薬が用いられている。
【０００３】
しかしながら、爪真菌症は、通常の皮膚真菌症に比べて完治し難く、特に外用の抗真菌薬の有効性が低いという問題がある。この原因は、主に、通常の外用抗真菌薬の爪内部への浸透性が低いことによるとされている。
【０００４】
一方、爪真菌症を含む真菌症の診断は、患部から爪や角層等の試料を採取し、顕微鏡で観察して菌要素の有無を確認する直接鏡検と、選択培地上で数週間培養して、コロニーや菌の微細構造を観察することにより菌種を同定する培養検査がある。しかし、培養には数週間という長い時間を要し、培養陽性率も低い。また真菌の中には形態学的に類似するものもあり、その同定は容易ではなく熟練を必要とする（非特許文献１）。
【非特許文献１】標準微生物学（株式会社医学書院発行）、ｐ．３３４−３４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、完治が困難といわれている爪真菌症の起因菌を正確に同定することができ、治療方針の策定に有用な爪真菌症の診断法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、爪真菌症の遺伝子診断法について種々検討してきたところ、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ法を採用し、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーを用い、かつｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌に特異的なプライマーだけでなく、スコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムに特異的なプライマーを組み合せて用いることにより、９４％以上もの高率で爪真菌症の起因菌を検出できること、さらには、皮膚糸状菌だけでなくスコプラリオプシス、アスペルギルス、フサリウム、カンジダ等の非皮膚糸状菌も爪真菌の原因となっていることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、爪検体から抽出したＤＮＡに対し第１回ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行う爪真菌症の診断法であって、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを用い、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット並びにスコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いることを特徴とする爪真菌症の診断法を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲによる爪真菌症の診断薬であって、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを含有し、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット並びにスコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを含有することを特徴とする爪真菌症診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の診断法により、従来爪真菌症の起因菌は、トリコフィトン・ルブルム、トリコフィトン・メンタグロファイテス等の皮膚糸状菌とされていたが、非皮膚糸状菌であるスコプラリオプシス、アスペルギルス、フサリウム等が原因となる場合も少なからずあることが判明した。これにより、従来の抗真菌薬が有効でなかった爪真菌症の起因菌が明確になり、当該起因菌に有効な新たな治療薬を投与することにより治療が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の爪真菌症の診断方法は、患者又は患者の疑いのあるヒトの爪を検体とする。爪検体は、ニッパー、爪切り等で切り取ればよい。爪検体からＤＮＡを抽出するには、例えば爪を粉砕し、１００℃で１０分間煮沸等により殺菌した後、フェノール抽出し、エタノール沈澱することにより行うことができる。
【００１１】
本発明の診断法は、第１回ＰＣＲを行い、そのＰＣＲ産物の内側の塩基配列を増幅し得るプライマーで第２回ＰＣＲを行う、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより行う。ここで、第１回ＰＣＲのプライマーとして真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の真菌共通プライマーセットを用い、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーとして皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットだけでなく、スコプラリオプシス、アスペルギルス及びフサリウムの非皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを用いる。
【００１２】
第１回ＰＣＲのプライマーセットとしては、真菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の共通プライマーセットであればよいが、真菌の２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５を増幅し得るプライマーが好ましい。特に配列番号１及び２で示されるプライマーセットが好ましい。当該プライマーセットを用いれば、ほとんど全真菌が検出できる。
【００１３】
第１回ＰＣＲは、鋳型ＤＮＡを含む検体に、プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びヌクレオチド及び反応バッファーを加え、変性、アニール、ＤＮＡ伸長のそれぞれの温度条件でインキュベーションすればよい。例えば９４℃４分の予備加熱、９４℃１分、５５℃２分、７２℃１．５分を３０サイクルで増幅反応を行い、７２℃１０分で停止反応を行うことができる。第１回ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡは、例えば電気泳動後、染色することにより確認できる。
【００１４】
第１回ＰＣＲで増幅された遺伝子産物には、検体中の真菌のほとんどが含まれると考えられる。次いで、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行えば、当該真菌の遺伝子産物中の、特定の菌種の遺伝子のみが増幅される。従って、真菌２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５の範囲内の塩基配列中の、各真菌に特異的な配列を増幅し得るプライマーセットが必要になる。本発明者は、当該２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５の塩基配列中から、（１）皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット、（２）スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット、（３）アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット、（４）フサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット及び（５）カンジダの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを見出し、かつ、このうち少なくとも（１）〜（４）の４種を組み合せてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲを行うことにより、ほとんどの爪真菌症の起因菌が検出同定できることを見出したのである。これらのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲに用いるプライマーは、各菌種の２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５の内側にあって、各菌種に特異的な塩基配列を増幅できるプライマーである。
【００１５】
（１）皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーとしては、トリコフィトン・ルブルム（Trichophyton rubrum）の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマー及びトリコフィトン・メンタグロファイテス（Trichophyton mentagrophytes）の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーが挙げられる。トリコフィトン・ルブルムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットとしては、配列番号３及び４で示されるプライマーが好ましい。トリコフィトン・メンタグロファイテスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットとしては、配列番号５及び６で示されるプライマーが好ましい。
【００１６】
（２）スコプラリオプシスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットとしては、スコプラリオプシス・ブレビカウリス（Scopulariosis brevicaulis）の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットが挙げられ、配列番号７及び８で示されるプライマーが好ましい。
【００１７】
（３）アスペルギルスの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットとしては、アスペルギルス属（Aspergillus spp.）の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットが挙げられ、具体的には配列番号９及び１０で示されるプライマーが好ましい。
【００１８】
（４）フサリウムの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットとしては、フサリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）及びフサリウム・モニリホルム（Fusarium moniliforme(正式名Gibberella fujikuroi)）から選ばれる１種又は２種以上の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットが挙げられる。これらのプライマーセットの具体例としては、配列番号１１及び１２（フサリウム・ソラニ）、配列番号１３及び１４（フサリウム・オキシスポルム）、配列番号１５及び１６（フサリウム・モニリホルム）で示されるプライマーが挙げられる。
【００１９】
また、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにおいては、さらに（５）カンジダの２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセットを追加することもできる。当該カンジダに特異的なプライマーセットとしては、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等の２８ＳｒＤＮＡに特異的なプライマーセット、例えば配列番号１７及び１８（カンジダ・アルビカンス）、配列番号１９及び２０（カンジダ・トロピカリス）で示されるプライマーが好ましい。
【００２０】
また、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲのプライマーセットとして、皮膚糸状菌の２８ＳｒＤＮＡ由来の共通プライマーセットを追加することもできる。この皮膚糸状菌共通プライマーセットを用いることにより、第１回ＰＣＲの結果を増幅して皮膚糸状菌の有無を確認することができる。このような皮膚糸状菌共通プライマーとしては、配列番号２１及び２２で示されるプライマーが好ましい。
【００２１】
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、第１回ＰＣＲと同様に変性、アニール、ＤＮＡ伸長反応を行えばよい。例えば、９４℃４分の予備加熱、９４℃１分、５５℃１５秒、７２℃１５秒を２５サイクルで増幅反応を行い、７２℃１０分で停止反応を行うことができる。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡは、例えば電気泳動後、染色することにより、菌種特異的な遺伝子を検出することができる。
【００２２】
本発明の診断薬は、前記診断法に用いられるプライマーセットを含有する。また、前記のプライマーセット以外に、第１回ＰＣＲ及びｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲに必要な試薬、例えば耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNAポリメラーゼ）、ヌクレオチド（dNTP混合物）及び反応バッファーを含有させてもよい。
【００２３】
本発明の診断法によれば、従来法では検出できなかった又は検出が困難であった爪真菌症の起因菌が正確に検出でき、正確な診断が可能となる。特に、従来爪真菌症の起因菌とされていなかった、スコプラリオプシス、アスペルギルス、フサリウム、カンジダによる爪真菌症が少なからず存在することを見出した点は、治療薬の選定に極めて重要である。
【実施例】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれら実施例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（１）検体の調製
爪真菌症未治療の皮膚科患者に、直接鏡検を行い、感染の有無を確認した。感染が確認された患者の爪に対してエタノール消毒後、爪用の遠位側を爪切り、ニッパーで除去して回収した。回収された爪をビーズショッカーで粉砕した。粉砕した爪を、糸状菌バッファー（200mM Tris-HCl, pH 8.0, 25mM EDTA, 0.5％ SDS, 250mM NaCl）中で１００℃１０分間煮沸後、フェノール抽出し、次いでエタノール沈澱してＤＮＡを抽出した。ＤＮＡを５０μＬの超純水に溶解して保存した。得られたＤＮＡ含有液２５μＬを鋳型ＤＮＡサンプルとした。
【００２６】
（２）第１回ＰＣＲ
総量を１００μＬとし、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．３）、５０mM  ＫＣｌ、１．５mL  ＭｇＣｌ2、２００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、各30pmolプライマー、１．０Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（GE Health Care社製）、２５μＬ爪抽出ＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）を含む反応液で、ＤＮＡサーマルサイクラー（TAKARA社製）により、９４℃４分予備加熱後へ９４℃１分、５５℃２分、７２℃１．５分を３０回のＰＣＲ反応を行い、７２℃１０分の停止反応を行った。
【００２７】
（３）ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ
鋳型ＤＮＡとして第１回ＰＣＲ産物を用いる以外は第１回ＰＣＲと同じ反応液組成とした。なお、第１回ＰＣＲ産物を電気泳動で確認した結果、ＰＣＲ産物が存在する場合には、ＰＣＲ産物を１００倍希釈してその１μＬを使用した。ＰＣＲ産物がなかった場合は、その原液１μＬを使用した。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、９４℃４分予備加熱後、９４℃１分、５５℃１５秒、７２℃１５秒を２５回のＰＣＲ反応を行い、７２℃１０分の停止反応を行った。
【００２８】
使用したプライマーセットを表１に示す。
【００２９】
【表１】
2008067605.tif 000002
【００３０】
各プライマーの設計は次のようにして行った。すなわち、ＧＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を用い、各真菌の２８ＳｒＤＮＡシークエンスを解析した。そして、第１回ＰＣＲのプライマーは、２８ＳｒＤＮＡの塩基番号１−６３５を認識するプライマー、すなわち塩基番号１−２０と６１８−６３５を認識する配列を合成した。また、各真菌の特異的なプライマーは、２８ＳｒＤＮＡの１−６３５の内側から、各菌種に特異的な配列を検索して設計した。
【００３１】
（４）プライマーの特異性の検討
ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物を電気泳動し、バンドの有無によりプライマーの各菌種のＤＮＡとの結合を認識した。その結果、配列番号１及び２は、ほとんどの真菌のＤＮＡを検出可能であった。また、その他のプライマーは、各真菌のＤＮＡに特異的であった（図１〜図４）。
【００３２】
（５）未治療の爪真菌症患者の臨床検体５０例に対し、本発明のＰＣＲを施行した。その結果を表２及び表３に示す。
【００３３】
【表２】
2008067605.tif 000003
【００３４】
【表３】
2008067605.tif 000004
【００３５】
表２及び表３より、起因菌の検出率は９４％（４７／５０）であった。そのうち、皮膚糸状菌の検出率は８３．０％（３９／４７）であり、非皮膚糸状菌の検出率が３６．２％（１７／４７）であった。このうち、皮膚糸状菌と非皮膚糸状菌の重複例は１９．１％（９／４７）であり、非皮膚糸状菌単独例が１７．０％（８／４７）も存在することが判明した。また、カンジダ感染剤も存在した。
【００３６】
また、各プライマー別の検出率は表４のとおりであった。
【００３７】
【表４】
2008067605.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】F. oxysporumプライマーの特異性を示す図である。
【図２】T. rubrumプライマーの特異性を示す図である。
【図３】F. solaniプライマーの特異性を示す図である。
【図４】Candida albicans及びCandida tropicalisプライマーの特異性を示す図である。
【図１】
2008067605.tif 000006
【図２】
2008067605.tif 000007
【図３】
2008067605.tif 000008
【図４】
2008067605.tif 000009
【配列表】
2008067605000001.app