(57)【要約】【課題】試料中の溶質分子群の分離、検出、回収、分析（測定）を、短時間で簡易に、かつ、高精度に実施できる新規な二次元分離泳動技術を提供する。【解決手段】円盤状をなす基板１に設けられた試料導入部２と、前記試料導入部２に連通し、等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子を分離可能な一次元目分離路３と、前記一次元目分離路３に連通し、前記基板の半径方向外側へ延設された二次元目分離路４と、前記二次元目分離路４から分離溶液を回収する回収部５と、を少なくとも備えた物質分析用基板、並びに同基板を扱うシステムを提供する。【選択図】  図１
2008128774.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
円盤状をなす基板に設けられた試料導入部と、
前記試料導入部に連通し、等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子を分離可能な一次元目分離路と、
前記一次元目分離路に連通し、前記基板の半径方向外側へ延設されたキャピラリからなる二次元目分離路と、
前記二次元目分離路から分離溶液を回収する回収部と、
を少なくとも備えた物質分析用基板。
【請求項２】
前記基板を回転させた際に得られる遠心力によって、沈降平衡時の分子量に依存した濃度勾配が前記二次元目分離路内に形成される構成であることを特徴とする請求項１記載の物質分析用基板。
【請求項３】
請求項１記載の物質分析用基板を扱うシステムであって、
前記基板を所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動手段と、
前記試料導入部に対する試料供給手段と、
前記一次元目分離路に対する電圧印加手段と、
前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路内に分離させた溶質分子を検出する検出手段と、
を少なくとも備える物質分析システム。
【請求項４】
（１）前記一次元目分離路から前記二次元分離路への試料の移行を制御可能な手段、
（２）前記二次元目分離路からの試料の回収を制御可能な手段、
以上（１）、（２）のいずれか一方又は両方を備えることを特徴とする請求項３記載の物質分析システム。
【請求項５】
前記検出手段は、
前記二次元目分離路の選択された位置へ蛍光励起光を照射する手段と、
前記二次元目分離路に存在する蛍光標識分子から発せられた蛍光を捕捉する手段と、
を少なくとも備える手段であることを特徴とする請求項３記載の物質分析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基板上で実施可能な溶質分子の新規な二次元分離とその検出技術に関する。より詳細には、円盤状の基板上で等電点電気泳動に続いて沈降分離（遠心分離）を実施し、分離された溶質分子を正確に検出等する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板に所定形状に形成された領域や流路において、種々のハイブリダイゼーションや分子間の相互作用又は反応などの生化学的プロセスを進行させ、これを検出する技術がある。ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）やタンパクチップと称されるセンサーチップはその代表的なものである。このようなセンサーチップ用基板の形態や構造は目的に応じて様々であるが、その中には、円盤状をなす基板上に反応場や流路を形成したものが提案されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、円盤状をなしている基板上に、放射状をなす溝構造が複数形成された構成のバイオアッセイ用基板が開示されている。このバイオアッセイ用基板の用途の一つはＤＮＡチップである。
【０００４】
特許文献２には、円盤状基板上に配設した反応場に電界印加を行うように工夫した技術が開示されている。この技術は、ハイブリダイゼーション反応の精度向上をひとつの目的としている。
【０００５】
特許文献３には、基板上に形成したキャピラリ内をゲル状の媒体を充填しおいて、試料の電気泳動を実施する技術が開示されている。キャピラリは、基板の内径側から外径側に延びており、遠心力によりキャピラリ内にゲルの流れを形成し、このゲルの流れと逆の方向に電気泳動を行う。
【特許文献１】特開２００４−２８９９２号公報。
【特許文献２】特開２００４−４５３７６号公報。
【特許文献３】特開２００４−３６１１９８号公報。
【０００６】
次に、試料溶液中に含まれる複数種の溶質分子をその性質や分子量に基づいて分離（分画）する方法として、「二次元電気泳動法」が知られている。この二次元電気泳動法は、広義には、順番に二つの方向（次元）へ電気泳動を行って溶質分子の分離・解析を行う方法を指すが、狭義には、等電点電気泳動を行い、続く二次元目にＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下略称、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）を行う方法を意味し、現在この方法は、特に、多種類のタンパク質の分離・分析に広く利用されている。なお、等電点電気泳動は、ｐＨ勾配の存在下で溶質分子（両性電解質）を電気泳動すると等電点（電荷が０となる点）まで移動して止まって、各溶質分子が等電点の順に並ぶという原理であり、ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、アクリルアミドとN,N’-メチレンビスアクリルアミドの混合溶液中で重合形成した分子ふるい中を、溶質分子にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を結合して分子量に対応する負電荷を与え、これにより陽極側へ移動させて分画する原理である。
【０００７】
近年では、上記二次元電気泳動法を基板上で行う技術が提案されている。例えば、第１の電気泳動分離媒体と第２の電気泳動分離媒体が互いに間隔をおいて形成された基板を用いて、第１の電気泳動分離媒体に電場を形成した後、この第１の電気泳動分離媒体の長手方向に対して垂直方向に電場を与えることにより、第２の分離媒体に分離する技術が提案されている（特許文献４参照）。また、マイクロチップの分離チャンネルに泳動電場を形成し、微量のタンパク質試料を、分子量と等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法も提案されている（特許文献５参照）。
【特許文献４】特開２００６−１６２４０５号公報。
【特許文献５】特開２００４−１５０８９９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明では、円盤状基板の形態的特性を有効に活用して、試料中の溶質分子群の分離、検出、回収、分析（測定）を、短時間で簡易に、かつ、高精度に実施できる新規な二次元分離泳動技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、まず、円盤状をなす基板の所定箇所に設けられた試料導入部と、前記試料導入部に連通し、等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子を分離可能な一次元目分離路と、前記一次元目分離路に連通し、前記基板の半径方向外側へ延設されたキャピラリからなる二次元目分離路と、前記二次元目分離路から分離溶液を回収する回収部と、を少なくとも備えた物質分析用基板を提供する。
【００１０】
この発明では、試料導入→等電点電気泳動による一次元目分離→キャピラリ内での二次元目分離→キャピラリ（二次元目分離路）からの試料回収、という一連の作業工程を、同一基板上で、各工程の実行タイミングを制御しながら行うことが可能となる。
【００１１】
本発明では、前記二次元目分離路における試料分離手段や方法は、特に限定していないが、例えば、この二次元目分離路では、前記基板を回転させた際に得られる遠心力によって、沈降平衡時の分子量に依存した濃度勾配が形成される構成としてもよい。即ち、二次元目分離を沈降平衡法に基づいて行うようにしてもよい。
【００１２】
この「沈降平衡法」は、遠心力の作用によって溶質分子が沈降して濃度勾配が生じると、その濃度勾配に逆らう拡散力が働き、最終的には遠心力と核酸力の釣り合い（沈降平衡）に基づいて分子量に依存した濃度勾配が形成されるという原理に基づいた方法であって、所定のデータ解析によって、溶質分子の分子量、解離定数（あるいは平衡定数）、化学量論、さらには、分子量と沈降係数から求めた摩擦係数により分子形状の推測も可能である。
【００１３】
なお、超遠心分析には、比較的低速の遠心で行う前記沈降平衡法と、高速で行う沈降速度法がある。この「沈降速度法」は、前記沈降平衡法に較べて短時間（１−２時間）で行える方法であって、分子の均一性に関しては平衡法よりも敏感である。このため、一般に、試料の均一性の検定に用いられ、同時に各成分の沈降係数を決定することもできる。沈降係数と分子量が与えられると分子の大まかな形状も推定することができる。原理的には沈降界面の形状の経時変化を調べることによって、沈降係数だけでなく、拡散係数を同時に測定でき、その結果、Svedbergの式から分子量を求めることもでき、界面の形状の経時変化をLammの方程式の数値解でシミュレートし、最小自乗法で沈降係数ｓと拡散係数Ｄを同時に求めることによって、分子量を比較的正確に求める方法（"SVEDBERG"、後述）なども提案されている。この方法は、長時間遠心している間に会合が徐々に進んだりする系で沈降平衡法が応用できないときなどに、採用することができ、分子量がそれほど大きくなければ比較的よい分子量の推定値を得ることができる。
【００１４】
次に、本発明では、上記構成の物質分析用基板を扱うシステムを提供する。具体的には、前記円盤状基板を目的に沿う所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動手段と、前記試料導入部に対する試料給手段と、前記一次元目分離路に対する電圧印加手段と、前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路内に分離させた溶質分子を検出する検出手段と、を少なくとも備える物質分析システムを提供する。
【００１５】
この物質分析システムは、基板への試料供給→一次元目分離路で等電点分離を行う際の電圧印加→基板を回転させて得られる遠心力による沈降平衡（二次元目分離）→沈降平衡により濃度勾配を形成した分離された溶質分子の検出、という一連の作業工程を、同一基板上で、各工程の実行タイミングをコンピュータで制御しながら自動で行うことができる。
【００１６】
さらに本システムでは、（１）前記一次元目分離路から前記二次元目分離路への試料の移行を促進させる手段、（２）前記二次元分離路からの試料の回収を促進させる手段、以上（１）、（２）のいずれか一方又は両方を備えるように工夫してもよい。（１）、（２）のいずれの促進手段もその具体的な方法は特に限定されない。これらの手段を採用すると、一次元目分離路から前記二次元目分離路への試料の移行を円滑に行ったり、前記二次元分離路からの試料の回収を円滑に実施したりすることができる。
【００１７】
また、本システムの前記検出手段としては、例えば、前記二次元分離路の選択された位置へ蛍光励起光を照射する手段と、前記二次元分離路に存在する蛍光標識分子から発せられた蛍光を捕捉する手段と、を少なくとも備える手段を採用することが可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、分析目的の溶質分子を含む試料の導入（供給）、溶質分子群の二次元分離、二次元分離された溶質分子の検出・回収・分析（測定）等を、短時間で簡易に、かつ、高精度に基板上で実施することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る物質分析用基板の実施形態例ついて、添付図面を参照にしながら説明する。まず、図１は、本発明に係る物質分析用基板の構成を簡略化して示す図（上方視、平面図）である。
【００２０】
図１中に符号１で示された物質分析用基板（以下、単に「基板」と称する。）は、上方外観視、円盤状を呈す形態を備えている。この基板１の口径サイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、基板上の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変形可能である。
【００２１】
この基板１は、所定波長の励起光（例えば、蛍光励起光）を透過可能な材料で形成されており、例えば、石英等のガラス、ポリカーボネートやポリスチレン等の合成樹脂材料で形成されている。なお、射出成形可能な合成樹脂材料を採用すると、ランニングコストの低減を達成できる。
【００２２】
同基板１には、後述する等電点泳動を一次元目分離路で行なう目的で、基板１中に所定個所に配置される正負電極に導通しており、外部電源（図示せず。）からの電圧を前記正負電極に送り込むための導体層が設けられている（図示せず。）。この導体層は、例えば、ＩＴＯ（インジウム−スズ−オキサイド）やアルミニウムなどの光透過性があり、かつ導電性を有する材料によって形成することができる。例えば、ＩＴＯやアルミニウムをスパッタリングや電子ビーム蒸着等によって、所定厚（例えば、１５０ｎｍ程度）に成膜する。この導体層に光透過性があるので、基板裏面側からの光ピックアップを採用することが可能となる。
【００２３】
基板１上には、本発明の目的沿って、所定形状の領域や流路を形成するが、例えば、基板上層をポリイミド樹脂によって形成すると、ＳｉＯ２などの無機酸化膜などで形成する場合よりも、原材料コスト面で有利であり、また、厚膜形成も前記無機酸化膜などに比較して容易であるので、成膜コストも安いという利点がある。
【００２４】
特に、基板上層を感光性ポリイミド樹脂で形成すると、フォトレジストを用いた表面処理を行うことによって、所定形状及びサイズの領域、キャピラリ、流路等などを簡易に形成することができる。例えば、感光性ポリイミド樹脂をスピンコート等で５μｍ程度の厚さに基材に塗布し、レーザービーム露光装置等を用いて、パターン露光及び現像することによって、所定形状及びサイズの領域、キャピラリ、流路等などを簡易に形成することができる。
【００２５】
続いて、具体的に基板上の形態構成について具体的に説明する。まず、基板１の中央には、同基板１を保持して回転させることが可能な回転軸（図示せず。）が導入され得る中心孔Ｈが設けられている。なお、前記回転軸を電圧供給手段とし、中心孔Ｈの内周壁面に露出させた上記導体層へ通電してもよい。
【００２６】
中心孔Ｈの近傍には、所定容量の試料を導入することができる試料導入部２が設けられており、この試料導入部２は、流路２１を介して一次元目分離路３に連通している。この一次元目分離路３は、例えば、キャピラリをなすように形成されており、このキャピラリ内で等電点電気泳動によって前記試料中の溶質分子群（例えば、両性電解質であるタンパク質群）を分離可能な構成となっている。
【００２７】
ここで、等電点電気泳動の手順について図２及び図３に基づいて説明する。図２は、等電点電気泳動の作業手順を示したワークフロー図であり、図３は、一次元目分離路５の構成概念と等電点電気泳動の原理を示す図である。なお、図２中の「電気泳動路」は、一次元目分離路を意味する。
【００２８】
まず、第１のステップ（図２中のＳ１）では、一次元目分離路３内へ等電点電気泳動によって分離したい溶質分子群を含む試料を、上記試料導入部２から導入する。試料中の溶質分子群は両性電解質であれば分離の対象とすることができ、通常はタンパク質が被分離物質とされる場合が多い。
【００２９】
次に、第２のステップ（図２中のＳ２）では、一次元目分離路３内に電圧印か可能に配置された正極３１側に酸性溶液３１１、負極３２側に塩基性溶液３２１を注入する。酸性溶液３１１としてはリン酸溶液、塩基性溶液３２１としては水酸化ナトリウム溶液が汎用されるが、それぞれ酸性、塩基性の溶液であれば用いることができる。続いて、第３のスタップ（図２中のＳ３参照）において、正極３１及び負極３２に対して外部電源Ｖから電圧を印加する。
【００３０】
以上のステップＳ１〜Ｓ３により、一次元目分離路３内には、正極３１側を酸性、負極３２側を塩基性としたｐＨ勾配が形成され、溶質分子群Ｐはそれぞれの溶質分子の等電点に相当する泳動位置へフォーカシングされる。
【００３１】
ここで、一般に等電点電気泳動は、定電流条件下において行なわれるが、等電点電気泳動開始後、イオン勾配の形成が進んで、一次元目分離路（等電点電気泳動路）３の正極３１及び負極３２間を移動するイオン性物質が減少してくると、該一次元目分離路３の電気的抵抗は次第に大きくなることから、上記定電流を維持するためには、正極３１及び負極３２間には大きな電圧を印加する必要があり、この際、一次元目分離路３内では多量のジュール熱が発生する。
【００３２】
このジュール熱は、一次元目分離路１内に対流を発生させてイオン勾配を不安定化するとともに、特に分離対象の溶質分子群Ｐがタンパク質である場合には、その化学的性状に変化を及ぼすおそれがある。
【００３３】
図３に示すように、一次元目分離路３には温度管理ユニットＵを設けておいて前記ジュール熱を放熱し、イオン勾配の不安定化及び被分離物質の熱変性を防止できるように工夫する。温度管理ユニットＵは、熱伝導部Ｕ１と熱交換部Ｕ２とから構成し、熱伝導部Ｕ１には銅板やヒートパイプ等の熱伝導性素材を、熱交換部Ｕ２にはペルチェ素子やヒートポンプ、放熱板とファン等の熱交換手段を、それぞれ特に限定されることなく採用することが可能である。
【００３４】
さらに、温度管理ユニットＵには、ジュール熱の放熱機能のみならず、一次元目分離路３全体を一定温度に保つ機能を付与することが好ましい。これにより、等電点電気泳動ごとの温度条件のバラつきをなくし、等電点電気泳動の再現性を高めることが可能となる。
【００３５】
次に、一次元目分離路（等電点電気泳動路）３の内壁表面の好適な構成について、図４に基づいて説明する。この一次元目分離路３の内壁表面３３には、いわゆる両性担体３４を固相化しておくようにする。図４では、一次元目分離路３の内壁面３３に固相化された両性担体および該両性担体の有するカルボキシル基とアミノ基を模式的に示している。
【００３６】
一次元目分離路３の内壁面３３には、両性担体３４が均一に固相化されている。両性担体３４は、例えば、グリシン、ギリシルグリシン、アミン、エピクロロヒドリン等が重合した高分子化合物であって、その分子構造中にカルボキシル基とアミノ基を有するものである。図４では、両性担体３４に関してカルボキシル基とアミノ基を各１つ有する構成を模式的に示しているが、両性担体３４が有するカルボキシル基とアミノ基はそれぞれ複数であってよい。
【００３７】
両性担体３４の分子構造中に存在するカルボキシル基は、一次元目分離路３内の溶媒のｐＨに依存して、水素イオンを電離して放出する。一方、アミノ基は同溶媒のｐＨに依存して、溶媒中の水素イオンを配位結合により取り込み、溶媒中に水酸化物イオンが多い状態を形成する。
【００３８】
上述したように、一次元目分離路３の正極３１及び負極３２に電圧を印加すると（図２中のＳ３参照）、この一次元目分離路３内に正極３１側を酸性、負極３２側を塩基性としたｐＨ勾配が形成される。このとき両性担体３４のカルボキシル基及びアミノ基は、ｐＨ勾配の形成に伴って周囲の溶媒のｐＨが変化すると、上記したように、溶媒溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、ｐＨ勾配の形成を促進する機能を発揮する。そして、一旦形成されたｐＨ勾配が何らかの要因で変化した場合にも、同様に溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、ｐＨ勾配を安定して維持する機能を発揮する。
【００３９】
このように、両性担体３４を一次元目分離路３の内壁面３３に固相化した構成では、一次元目分離路３の溶媒に迅速にｐＨ勾配を形成することができ、この結果、安定して精度の高い等電点電気泳動を行なうことが可能となる。
【００４０】
ここで、再び図１を参照すると、基板１には、上記一次元目分離路３に連通するように設けられた二次元目分離路４が配設されている。この二次元目分離路４は、基板１の半径方向（図１中の矢印Ｘ参照）に延設されており、複数設けられた二次元目分離路４群は、上方視、放射状を呈している（図１参照）。
【００４１】
この二次元目分離路４は、遠心力を利用した二次元目分離工程を行なうことができるように構成されたキャピラリである。すなわち、基板１は、その中心部に中心孔Ｈを備えており（既述）、この中心孔６に図示しない回転軸を挿着させた上で、図１中の矢印Ｒ方向へ所定速度で回転させると、基板１の半径方向に形成された二次元目分離路４に遠心力を加えることができる。なお、図１においては、二次元目分離路４は計８つのみ図示しているが、二次元目分離路４の数は任意に設計することが可能である。
【００４２】
ここで、さらに、基板１を用いた二次元分離方法について、図１及び図５を参照しながらより具体的に説明する。
【００４３】
まず、基板１の中央領域に、上方視、円形（リング）状に設けられた一次元目分離路（電点電気泳動路）３には、その分離路内の一箇所に絶縁部３３（図１参照）が設けられており、該絶縁部３３を隔てて正極３１と負極３２が配設されている。図２に示した作業ステップ（既述）に従って、一次元目分離路（電点電気泳動路）３内へ試料、酸性溶液３１１及び塩基性溶液３１２を注入し、正極３１と負極３２対して電圧を印加すると、正極３１と負極３２間にｐＨ勾配が形成され、前記試料中の溶質分子群Ｐ（図３参照）は、各溶質分子の等電点にフォーカシングされ、一次元目分離路（電点電気泳動路）３内に配列する。
【００４４】
このような一次元目分離に続いて、一次元目分離路（電点電気泳動路）３内において周方向に配列されている溶質分子群Ｐを、二次元目分離路４へ導入する。この二次元目分離４においては、基板１を回転させて得られる遠心力を利用する二次元目分離を行なう。
【００４５】
この際、溶質分子群Ｐを含む等電点分離液（一次元目分離液）を、一次元目分離路３から二次元目分離路４へ導入する。この等電点分離液の導入方法は、毛細管現象を利用して移動させる方法、遠心力によって移動させる方法、負圧吸引、正圧押出、又は親媒性原理を利用する制御方法などを、特に限定されず採用することができる。
【００４６】
このうち、親媒性原理を利用する制御方法は、一次元目分離路（電点電気泳動路）３と二次元目分離路４との接続部Ｍ（図１、図５参照）に、溶質分子の通過を親媒性原理によって制御可能な領域を設けて、一次元目分離路３から二次元目分離路４への等電点分離液の移動を制御する方法である。
【００４７】
具体的には、上記接続部Ｍを疎水性領域としておき、親水性の溶質分子の通過を遮断しておき、適切なタイミングで、当該疎水性領域を親水性へ変換して親水性の溶質分子を通過させる。好適な一例としては、疎水性領域を酸化チタンによって形成する方法が挙げられる。
【００４８】
酸化チタンは、通常は疎水性であるが、紫外線を照射することにより親水性へと変化する物質である。そのため、接続部Ｍを酸化チタンで形成すれば、一次元目分離工程を行っている段階における等電点分離液の二次元目分離路４への移動を遮断することができ、一次元目分離工程終了後に、接続部Ｍを狙って紫外線を照射して疎水性を親水性へと変換することにより、等電点分離液を二次元目分離路４へ確実、かつ円滑に導入することが可能となる。
【００４９】
このようにして、一次元目分離３から二次元目分離路４へ導入された等電点分離液は、二次元目分離路５において、基板１の回転によって得られる遠心力を利用した遠心分離法、あるいは沈降平衡法による二次元目分離工程に供される。
【００５０】
「遠心分離法」においては、被分離物質の分子量に基づいた分離を行なう。一例として、ショ糖濃度勾配遠心法がある。このショ糖濃度勾配遠心法によれば、二次元目分離路４内にショ糖溶液を充填し、遠心してショ糖濃度勾配を形成することで、該濃度勾配中において、被分離物質をそれぞれの分子量に基づいて分離することができる。このようにして、二次元目分離が行なわれた溶質分子群は、二次元目分離路４より分取され、例えば、質量分析計による同定等の後段の解析に供することができる。
【００５１】
また、「沈降平衡法」は、溶媒中に存在する物質（溶質）を遠心力の作用によって沈降させて、この沈降力とこれに逆らう溶質の拡散力とが平衡（沈降平衡）した時における溶質の濃度分布を、干渉光学系あるいは光電走査装置等により測定し、溶質の分子量を求める方法である。
【００５２】
この沈降平衡法で求められる分子量は、溶質の分子構造によらないのが特徴であり、高度に荷電している溶質であっても、精度良く分子量を計測することができる。従って、沈降平衡法は、等電点電気泳動後の二次元目分離工程に好適に採用することができ、二次元目分離路４において行なう二次元目分離工程として適した方法ということができる。沈降平衡法により、分子量を計測された溶質分子は、分子量に基づく物質同定解析等の後段の解析に供することができる。なお、本発明では、沈降速度法を用いてもよい。
【００５３】
図５は、二次元目分離路４内に、沈降平衡によって溶質分子が濃度勾配を形成している様子と、二次元分離路４内の所定濃度位置に存在する溶質分子を検出する概念を示す図である。
【００５４】
二次元目分離路４内のいかなる濃度位置に溶質分子が存在するかを検出することによって、当該溶質分子の分子量等を知ることができる。検出手段の一例を挙げると、一次元目分離路３と二次元目分離路４の接続部Ｍに蛍光物質を存在させておく。なお、この作業は、例えば、二次元目分離路４におけるショ糖勾配設定後に行うことができる。
【００５５】
そして、一次元目分離路３から二次元目分離路４に対して溶液を強制的に送り込み、遠心力によって溶質分子（例えば、タンパク質）が沈降していく過程で前記蛍光物質を結合させる。そして、蛍光物質によって標識された溶質分子、あるいは蛍光を発生するように改変された溶質分子に対して、光源５から所定波長の蛍光励起光Ｑを、二次元分離路４の所定濃度位置４ａを狙って照射し、該二次元目分離路４から戻ってくる蛍光励起光Ｆをディテクタ６で検出することができる。この蛍光検出によって、試料中に所定分子量の溶質分子が存在するか否か、あるいは蛍光強度分析により当該溶質分子の存在量などを知ることができる。
【００５６】
蛍光標識によって沈降平衡の精度に悪影響が出ることが予想されるが、溶質分子と蛍光物質が結合したものの密度は、溶質分子と蛍光物質の平均密度程度になっていることが予想されるので、これを基に補正を行うことができる。なお、溶質物質の光吸収やレイリー散乱などの原理によって、二次元分離路４内の所定濃度位置に存在する溶質分子を検出することも可能である。
【００５７】
以上のような二次元目分離を経た状態の分離液を、二次元目分離路４から回収して、二次元目分離路４に連通する回収部５に貯留する。なお、二次元目分離路４から回収部５への二次元分離液の移行方法は、毛細管現象を利用して移動させる方法、遠心力によって移動させる方法、負圧吸引、正圧押出、又は親媒性原理を利用する制御方法などを、特に限定されず採用することができる。
【００５８】
このうち、親媒性原理を利用する制御方法は、二次元目分離路４と回収部５の接続部Ｎ（図１参照）に、溶質分子の通過を親媒性原理によって制御可能な領域を設けて、二次元目分離路４から回収部５への二次元分離液の移動を制御する方法である。
【００５９】
具体的には、上記接続部Ｎの場合と同様に、接続部Ｎを疎水性領域としていて親水性の溶質分子の通過を遮断しておき、適切なタイミングで、当該疎水性領域を親水性へ変換して親水性の溶質分子を通過させる。好適な一例としては、疎水性領域を酸化チタンによって形成する方法が挙げられる。酸化チタンは、通常は疎水性であるが、紫外線を照射することにより親水性へと変化する物質である。そのため、接続部Ｍを酸化チタンで形成すれば、二次元目分離工程を行っている段階における分離液の回収部５への移動を遮断することができ、二次元目分離工程終了後に、接続部Ｎを狙って紫外線を照射して疎水性を親水性へと変換することにより、二次元分離液を回収部５へ確実、かつ円滑に導入することが可能となる。
【００６０】
なお、選択した二次元目分離路４の接続部ＭやＮだけを狙って紫外線を照射すると、当該二次元目分離路４の二次元分離液だけを一つの回収部５に回収することが可能となる。
【００６１】
次に、図６は、本発明に係る物質分析用基板の別の実施形態例（符号１０）を示す図である。基板の材料構成、層構造、接続部の構成等は、図１に示す基板１と同様であるので、説明を割愛する。
【００６２】
図６に示された基板１０は、中心孔Ｈの周辺に、二つの試料導入部２，２が設けられているとともに、回収部５，５と、導入制御部６，６が設けられている。それぞれの配置箇所は、中心孔Ｈを囲んで周方向均等な位置であって、かつ、中心孔Ｈからの距離も同じとなる位置が選択されている。円盤状をなす基板の形態的均一性を確保するためである。
【００６３】
ここで、試料導入部２，２からは分析目的の溶質分子群を含む試料のほかに、一次元目分離路３での等電点分離で使用する酸性溶液３１１や塩基性溶液３１２、あるいは、二次元目分離路４に対するショ糖溶液の導入などにも使用される。
【００６４】
また、本実施形態においては、全ての二次元目分離路４群は、基板１０の最外周側に形成された回収流路５１に連通しており、そして、この回収流路５１は、基板１０の中央に位置する回収部５，５に連通している。したがって、二次元目分離路４からの二次元分離液は、共通する一つの回収流路５１を通過して、回収部５，５に集められる構成となっている。なお、本実施形態において、基板１（図１）の接続部Ｎに相当する部分は、例えば、回収流路５１と二次元目分離路４の接続部分に形成することができる。
【００６５】
導入制御部６，６は、加圧や吸引等の手段によって、試料溶液やその他の溶液（例えば、一次元目分離路３への酸性溶液３１１や塩基性溶液３１２、二次元目分離路へのショ糖溶液、洗浄溶液など）を目的に応じて所定個所に導入するときに使用される。
【００６６】
次に、図７に基づいて、本発明に係る物質分析用システムについて説明する。本システムは、上記説明した基板１（図１）や基板１０（図６）を扱うシステムであり、基板１（又は１０）を所定速度に制御しながら回転させ得る基板回転駆動部Ａと、前記試料導入部２に対する試料供給部Ｂと、前記一次元目分離路３（の電極３１，３２）に対する電圧印加部Ｃ（図３参照）と、前記回転によって得られた遠心力に基づいて、前記二次元目分離路４内で分離させた溶質分子を検出する検出部Ｄ（図５の符号５、６に相当）と、を備え、さらに、検出手段Ｄで得た生データ（例えば、蛍光強度信号）を解析する解析部Ｅを備えている。
【００６７】
基板回転駆動部Ａは、回転軸Ａ１と、この回転軸Ａ１に所定の回転駆動を与える駆動部Ａ２と、回転速度を制御する制御部（図示せず。）等を有している。また、試料供給部Ｂは、試料貯留部Ｂ１、等電点ｐＨ勾配形成用溶液貯留部Ｂ２、ショ糖溶液貯留部Ｂ３、洗浄溶液貯留部（図示せず。）などの貯留部から所定の溶液を選択して、基板１（又は１０）の試料導入部２に対して、それぞれ所定のタイミングで供給（導入）を行う役割を果たす。
【００６８】
電圧印加手段Ｃは、基板上の一次元目分離路（等電点分離路）３（の電極３１，３２）に対する電圧を印加する役割を果たし、その構成は、例えば、図３に示すとおりである。
【００６９】
検出部Ｄは、既述した蛍光励起光を出射する光源５やディテクタ６、さらには、蛍光励起光Ｑや二次元目分離路から取得される蛍光Ｆの光進路途中に配置される光学系部材（波長選択や進路変更などを目的とすり部材）等から構成されている。解析部Ｅは、検出部Ｄから送られてくる生データ（例えば、蛍光強度信号）を解析することによって、検出された溶質分子の種類、分子量、量などを解析し、溶質分子に係わる情報リストやデータベースなどを作成する。なお、図８は、本発明に係る基板やシステムを用いて解析を行うまでの主なフローを示す図である。
【００７０】
図９は、本発明に係る基板やシステムを用いて、二次元目分離路４内から取得された溶質分子を同定する方法の概念を示す図である。二次元目分離路４内に分離された溶質分子を回収し、例えば、質量分析器を利用して当該溶質分子の構造を同定（物質同定）する（図９の１００）。
【００７１】
次に、同定された溶質分子（物質）と二次元目分離路４の観測位置（検出位置）との間を関係付けて、変換テーブルとしてデータベース化する（図９の１０１）。この変換テーブルの例を図１０に示す。また、このとき、検出された蛍光強度と物質の量関係を取得し、例えば、図１１のように関数化しておいてもよい。また、実際の測定段階では、計測生データから発現プロファイルイメージを形成し、上記変換テーブルを用いて、試料内に存在する全ての物質の種類とその存在量に係わる情報リストを作製してもよい。図１２には、当該情報リストのファーマット例を示す。
【００７２】
次に、図１３は、基板１や１０にｎ本配設されている二次元目分離路群４-１〜４−ｎのそれぞれにおける溶質分子の検出位置（存在位置）の分布を示す例を示す。この図１３に示す例では、二次元目分離路４−２において一箇所、二次元目分離路４−３において二個所において検出スポットがある。別途行った質量分析器による物質同定と蛍光強度検出と物質量との間の関数（図１１参照）を利用して、各二次元目分離路に分散する確率を求めることができる。
【００７３】
次に図１４においては、各蛍光強度データから物質量を推定する方法の一例を示す。ある複数の二次元目分離路４において同じ位置（例えば、図１３の２０１、３０１）、ないしは近い位置に検出スポットがある物質について、各々の存在確率（図１４の２０１−Ａ，３０１−Ａ参照９を基にした平行列をかけることによって、各々の物質量の存在量を推定することができる（図１４の４００参照）。なお、図１５は、各蛍光強度データから物質の存在量を推定する方法概念を一般化した内容を示した図である。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、分析目的の溶質分子を含む試料の導入（供給）、溶質分子群の二次元分離、二次元分離された溶質分子の検出・回収・分析（測定）等を、短時間で簡易に、かつ、高精度に基板上で実施する技術として利用できる。二次元分離した溶質分子は質量分析器等によって同定できる。例えば、生体内で発現しているタンパク室の網羅的解析（プロテオーム解析）に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明に係る物質分析用基板の構成を簡略化して示す図（上方視、平面図）である。
【図２】等電点電気泳動の作業手順を示したワークフロー図である。
【図３】一次元目分離路５の構成概念と等電点電気泳動の原理を示す図である。
【図４】一次元目分離路（３）の内壁面（３３）に固相化された両性担体および該両性担体の有するカルボキシル基とアミノ基を模式的に示す図である。
【図５】二次元目分離路（４）内に、沈降平衡によって溶質分子が濃度勾配を形成している様子と、二次元分離路４内の所定濃度位置に存在する溶質分子を検出する概念を示す図である。
【図６】本発明に係る物質分析用基板の別の実施形態例（符号１０）を示す図である。
【図７】本発明に係る物質分析用システムの構成概念を簡略に説明した図である。
【図８】本発明に係る基板やシステムを用いて解析を行うまでの主なフローを示す図である。
【図９】本発明に係る基板やシステムを用いて、二次元目分離路４内から取得された溶質分子を同定する方法の概念を示す図である。
【図１０】同定された溶質分子（物質）と二次元目分離路４の観測位置（検出位置）との間を関係付けする変換テーブルの例を示す図である。
【図１１】検出された蛍光強度と物質の量的関係を関数化したイメージ図である。
【図１２】試料内に存在する全ての物質の種類とその存在量に係わる情報リストのファーマット例を示す図である。
【図１３】基板（１又は１０）にｎ本配設されている二次元目分離路群４-１〜４−ｎのそれぞれにおける溶質分子の検出位置（存在位置）の分布例を示す図である。
【図１４】各蛍光強度データから物質量を推定する方法の一例を示す図である。
【図１５】各蛍光強度データから物質の存在量を推定する方法概念を一般化した内容を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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