(57)【要約】【課題】レチノイドとビタミンＡとビタミンＡ前駆体が哺乳類に誘発する毒性を治療または予防し、かつレチノイド類で哺乳類を処置する際の有害なもしくは望ましくない副作用を予防しまたは改善する。さらに、他のレチノイド類およびステロイドホルモン類の生物活性を増大しかつリガンド未結合のレチノイン酸受容体の基礎活性を阻害する。【解決手段】レチノイドネガティブホルモン様生物活性および／またはレチノイド拮抗薬用生物活性を有するアリール置換ベンゾピラン、ベンゾチオピラン、1,2-ジヒドロキノリンおよび5,6-ジヒドロナフタレンの誘導体を投与する。【選択図】図８
2008280346.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で示される化合物：
【化１】
2008280346.tif 000035
（式中、
Xは、S、O、NR'、ここでR'はHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、または、Xは、［C(R１)２］ｎ、ここでR１は独立してHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、およびｎは０〜２の整数；
R２は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキル、F、Cl、Br、I、CF３、炭素原子数１〜６のフッ素置換アルキル、OH、SH、炭素原子数１〜６のアルコキシ、または炭素原子数１〜６のアルキルチオ；
R３は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキルまたはF；
ｍは、０〜３の整数；
ｏは、０〜３の整数；
Ｙは、フェニルもしくはナフチル基、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリルおよびピラゾリルからなる群より選択されるヘテロアリール、ここで、フェニルおよびヘテロアリール基は場合により１または２のＲ２基で置換される；
Ａは、（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、炭素原子数３〜６の低級分岐鎖アルキル、炭素原子数３〜６のシクロアルキル、炭素原子数２〜６で１または２の二重結合を有するアルケニル、炭素原子数２〜６で１または２の三重結合を有するアルキニル、
Ｂは、水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＲ１１、ＣＨ２ＯＣＯＲ１１、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ１２）２、ＣＨＯＲ１３Ｏ、ＣＯＲ７、ＣＲ７（ＯＲ１２）２、ＣＲ７ＯＲ１３Ｏ、またはトリ低級アルキルシリル、ここでＲ７は炭素原子数１〜５のアルキル、シクロアルキルもしくはアルケニル基、Ｒ８は炭素原子数１〜１０のアルキル基もしくはトリメチルシリルアルキル、ここでアルキル基は１〜１０の炭素原子を有する、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、あるいはＲ８は、フェニルまたは低級アルキルフェニル、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素、炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、またはフェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１１は低級アルキル、フェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１２は低級アルキル、およびＲ１３は炭素原子数２〜５の2価アルキル基、および
Ｒ１４は、（Ｒ１５）ｒ−フェニル、（Ｒ１５）ｒ−ナフチル、または（Ｒ１５）ｒ−ヘテロアリール、ここでヘテロアリール基はＯ、ＳおよびＮからなる群より選択される１〜３のヘテロ原子を有し、ｒは０〜５の整数、および
Ｒ１５は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ８）２、Ｎ（Ｒ８）ＣＯＲ８、ＮＲ８ＣＯＮ(Ｒ８)２、ＯＨ、ＯＣＯＲ８、ＯＲ８、ＣＮ、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のフッ素置換アルキル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の二重結合を有するアルケニル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の三重結合を有するアルキニル基、またはトリアルキルシリルもしくはトリアルキルシリルオキシ基、ここでアルキル基は独立して１〜６の炭素原子を有する;
Ｒ１６は、Ｈまたは炭素原子数１〜６の低級アルキル；
Ｒ１７は、Ｈ、炭素原子数１〜６の低級アルキル、ＯＨまたはＯＣＯＲ１１；および
ｐは０または１で、ｐが１のときＲ１７置換基は存在せず、ｍが０〜２の整数である。）。
【請求項２】
Ｙがフェニル、ピリジル、チエニルまたはフリルである請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｙがフェニルである請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
フェニル環が１，４（パラ）置換されている請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｙがピリジルである請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｙがチエニルまたはフリルである請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１４が（Ｒ１５）ｒフェニルである請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１４が（Ｒ１５）ｒヘテロアリールである請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１４が（Ｒ１５）ｒヘテロアリールであり、ヘテロアリール基が１または２のヘテロ原子を有する５または６員環である請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
ヘテロアリール基が２−ピリジル、３−ピリジル、２−チエニルおよび２−チアゾリルから選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ１５基がＨ、ＣＦ３、Ｆ、低級アルキル、低級アルコキシ、ヒドロキシまたは塩素である請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｘが［Ｃ（Ｒ１）２］ｎである請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１がＣＨ３、ｎが１である請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
ＸがＳ、ＯまたはＮＲ’である請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
Ａが（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、ＢがＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８またはＣＯＮＲ９Ｒ１０である請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
ｐが０である請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】
ｐが１である請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】
下記式で示される化合物：
【化２】
2008280346.tif 000036
（式中、R１は独立してHまたは炭素原子数１〜６のアルキル；
R２は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキル、F、Cl、Br、I、CF３、炭素原子数１〜６のフッ素置換アルキル、OH、SH、炭素原子数１〜６のアルコキシ、または炭素原子数１〜６のアルキルチオ；
R３は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキルまたはF；
ｍは、０〜２の整数；
ｏは、０〜３の整数；
Ａは、（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、炭素原子数３〜６の低級分岐鎖アルキル、炭素原子数３〜６のシクロアルキル、炭素原子数２〜６で１または２の二重結合を有するアルケニル、炭素原子数２〜６で１または２の三重結合を有するアルキニル、
Ｂは、水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＲ１１、ＣＨ２ＯＣＯＲ１１、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ１２）２、ＣＨＯＲ１３Ｏ、ＣＯＲ７、ＣＲ７（ＯＲ１２）２、ＣＲ７ＯＲ１３Ｏ、またはトリ低級アルキルシリル、ここでＲ７は炭素原子数１〜５のアルキル、シクロアルキルもしくはアルケニル基、Ｒ８は炭素原子数１〜１０のアルキル基もしくはトリメチルシリルアルキル、ここでアルキル基は１〜１０の炭素原子を有する、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、あるいはＲ８は、フェニルまたは低級アルキルフェニル、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素、炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、またはフェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１１は低級アルキル、フェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１２は低級アルキル、およびＲ１３は炭素原子数２〜５の2価アルキル基；
Ｒ１５は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ８）２、Ｎ（Ｒ８）ＣＯＲ８、ＮＲ８ＣＯＮ(Ｒ８)２、ＯＨ、ＯＣＯＲ８、ＯＲ８、ＣＮ、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のフッ素置換アルキル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の二重結合を有するアルケニル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の三重結合を有するアルキニル基、またはトリアルキルシリルもしくはトリアルキルシリルオキシ基、ここでアルキル基は独立して１〜６の炭素原子を有する;
ｒは、０〜５の整数；
Ｒ１６は、Ｈまたは炭素原子数１〜６の低級アルキル；
Ｒ１７は、Ｈ、炭素原子数１〜６の低級アルキル、ＯＨまたはＯＣＯＲ１１；および
ｐは０または１で、ｐが１のときＲ１７置換基は存在せず、ｍが０〜２の整数である。）。
【請求項１９】
ｐが１である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
ｐが０である請求項１８に記載の化合物。
【請求項２１】
Ａが（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、ＢがＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８またはＣＯＮＲ９Ｒ１０である請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１がＣＨ３である請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１６およびＲ１７が水素である請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１５がＨまたはＣＨ３であり、Ｒ１５がＣＨ３の場合、フェニル環の４位を占める請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
４−［３−オキソ−３−（７，８−ジヒドロ−５−（４−メチルフェニル）−８，８−ジメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸または４−［３−オキソ−３−（７，８−ジヒドロ−５−フェニル−８，８−ジメチル−２−ナフタレニル）−１−プロペニル］安息香酸である請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
元のレチノイド受容体のＤＮＡ結合ドメインに対し炭素末端側に位置するタンパク質ドメインを少なくとも有する組み換えレチノイド受容体の結合に転写で応答するリポーター遺伝子を含有するトランスフェクトされた細胞を得る工程；
添加レチノイドの不存在下において増殖した未処理のトランスフェクトされた細胞におけるリポーター遺伝子の発現の基本レベルを測定する工程；
トランスフェクトされた細胞をネガティブホルモン活性について試験すべきレチノイド化合物で処理する工程；
処理細胞におけるリポーター遺伝子の発現のレベルを測定する工程；
処理された細胞および未処理細胞において測定されたリポーター遺伝子の発現のレベルを比較する工程；および
未処理細胞において測定されたリポーター遺伝子の発現の基本レベルと比較して低いレベルで、処理細胞においてリポーター遺伝子を発現させるレチノイド化合物をレチノイドネガティブホルモンとして同定する工程
を含んでなるレチノイドネガティブホルモンを同定する方法。
【請求項２７】
元のレチノイド受容体が、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγからなる群より選択されるレチノイン酸受容体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
元のレチノイド受容体が、ＲＸＲα、ＲＸＲβおよびＲＸＲγからなる群より選択されるレチノイドＸ受容体である請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
組み換えレチノイド受容体が、ＲＡＲおよびＲＸＲからなる群より選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
組み換えレチノイド受容体が、構成転写アクチベータードメインを有するキメラレチノイド受容体である請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
構成転写アクチベータードメインが実効負電荷を有する複数のアミノ酸を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
構成転写アクチベータードメインがウイルス転写アクチベータードメインのアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ウイルス転写アクチベータードメインがヘルペス単純ウイルスＶＰ−１６転写アクチベータードメインである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
構成転写アクチベータードメインが実効負電荷を有し、組み換えレチノイド受容体がそこからＤＮＡ結合ドメインを除いたものである請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
組み換えレチノイド受容体が、レチノイン酸応答エレメント以外のシス制御エレメントに特異的なＤＮＡ結合ドメインを有する請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
レチノイン酸応答エレメント以外のシス制御エレメントがエストロゲン応答エレメントである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
トランスフェクトされた細胞が、内在性レチノイドが実質的に除かれた増殖培地において増殖される請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
増殖培地が活性炭抽出血清を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
リポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子であり、測定工程に発光測定を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
リポーター遺伝子がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子であり、測定工程にβ−ガラクトシダーゼ検定法を含む請求項２６に記載の方法。
【請求項４１】
トランスフェクトされた細胞がトランスフェクトされた哺乳動物細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項４２】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞が一時的トランスフェクト哺乳動物細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞がトランスフェクトされたミドリザル細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞がトランスフェクトされたヒト細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物にステロイドスーパーファミリー受容体作動薬とともに投与するための組成物であって、薬学的有効量のレチノイドネガティブホルモンを含んでなり、前記ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬の薬理学的活性を増幅させる組成物。
【請求項４６】
前記ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬の薬理学的活性が抗増殖活性である請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
抗増殖活性が網膜色素上皮においてみられる請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬が、レチノイド受容体作動薬、ビタミンＤ受容体作動薬、グルココルチコイド受容体作動薬、甲状腺ホルモン受容体作動薬、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体作動薬およびエストロゲン受容体作動薬からなる群より選択される請求項４５に記載の組成物。
【請求項４９】
受容体作動薬がＲＡＲ作動薬である請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ＲＡＲ作動薬が、オールトランスレチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、４−［［（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）カルボニル］アミノ］安息香酸（Ａｍ５８０）および（Ｅ）−４−［２−（５，６，７，８−テトラヒドロ−５，５，８，８−テトラメチル−２−ナフタレニル）−２−プロペニル］安息香酸（ＴＴＮＰＢ）からなる群より選択される請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
受容体作動薬がＲＸＲ作動薬である請求項４５に記載の組成物。
【請求項５２】
ＲＸＲ作動薬が、９−シスレチノイン酸、４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）−１−エテニル］安息香酸および４−［（３，５，５，８，８−ペンタメチル−５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフタレニル）−１−シクロプロピル］ピリジン−５−カルボン酸からなる群より選択される請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
受容体作動薬が１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である請求項４５に記載の組成物。
【請求項５４】
受容体作動薬がデキサメタゾンである請求項４５に記載の組成物。
【請求項５５】
受容体作動薬が３，３'，５−トリヨードチロニンである請求項４５に記載の組成物。
【請求項５６】
レチノイドネガティブホルモンがＲＡＲ特異的レチノイドネガティブホルモンである請求項４５に記載の組成物。
【請求項５７】
ＲＡＲ特異的レチノイドネガティブホルモンが約３０ｎＭまたはそれ以下の解離定数を有する請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
ＲＡＲ特異的レチノイドネガティブホルモンが、ＡＧＮ193109、ＡＧＮ193385、ＡＧＮ193389およびＡＧＮ193871からなる群より選択される請求項５７に記載の組成物。
【請求項５９】
薬学的に有効量のレチノイドネガティブホルモンを含む組成物が、ステロイドスーパーファミリー作動薬と組み合わされる請求項４５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レチノイドネガティブホルモン様生物活性および／またはレチノイド拮抗薬用生物活性を有する新規な化合物に関する。さらに詳しくは、本発明は、置換3-オキソ-1-プロペニル基で置換されてもよい4-アリール置換ベンゾピラン、4-アリール置換ベンゾチオピラン、4-アリール置換1,2-ジヒドロキノリンおよび8-アリール置換5,6-ジヒドロナフタレンの誘導体に関する。これらの新規な化合物は、レチノイド拮抗薬様活性を有し、レチノイドとビタミンＡとビタミンＡ前駆体が哺乳類に誘発する毒性を治療または予防するのに有用であり、かつレチノイド類で哺乳類を処置する際の有害なもしくは望ましくない副作用を予防しまたは改善する助剤として有用である。さらに、本発明は、他のレチノイド類およびステロイドホルモン類の生物活性を増大しかつリガンド未結合（unliganded）のレチノイン酸受容体の基礎活性を阻害するレチノイドネガティブホルモン類（retinoid negative hormones）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
レチノイド様活性を有する化合物は、当該技術分野では公知であり、米国およびその外の国の多数の特許、および科学刊行物に記載されている。レチノイド様活性は、多種類の疾患と病状に伴う症状を治癒または改善するためヒトを含む哺乳類を治療するのに有用であると、一般に知られ、認識されている。
【０００３】
レチノイド類（ビタミンＡとその誘導体）は、各種の生体系で、細胞の増殖と分化に対する作用を含む広範囲の活性を有していることが知られている。この活性があるため、レチノイド類は、皮膚科の障害と癌を含む各種の疾患を治療するのに有用になっている。従来技術によって、レチノイド様生物活性を有する化学化合物が多数開発されており、これら化合物が記載されている多数の特許および化学文献がある。関連する特許文献としては次のものがある。すなわち、米国特許第4,980,369号、同第5,006,550号、同第5,015,658号、同第5,045,551号、同第5,089,509号、同第5,134,159号、同第5,162,546号、同第5,234,926号、同第5,248,777号、同第5,264,578号、同第5,272,156号、同第5,278,318号、同第5,324,744号、同第5,346,895号、同第5,346,915号、同第5,348,972号、同第5,348,975号、同第5,380,877号、同第5,399,561号、同第5,407,937号（本願と同じ譲受人に譲渡されている）およびそれらにおいて引用されている特許と刊行物があるが、それらは特に、レチノイド様生物活性を有するクロマン、チオクロマンおよび1,2,3,4-テトラヒドロキノリン誘導体を記載しまたは、これら化合物に関するものである。さらに、本願の譲受人に譲渡され、レチノイド様活性を有するその外の化合物に関するいくつもの出願が係属中である。
【０００４】
米国特許第4,740,519号（Shrootら）、同第4,826,969号（Maignanら）、同第4,326,055号（Loeligerら）、同第5,130,335号（Chandraratnaら）、同第5,037,825号（Klausら）、同第5,231,113号（Chandraratnaら）、同第5,324,840号（Chandraratna）、同第5,344,959号（Chandraratna）、同第5,130,335号（Chandraratnaら）；ヨーロッパ特許願公開第0176034A号（Wuestら）、同第0350846A号（Klausら）、同第0176032A号（Frickelら）、同第0176033A号（Frickelら）、同第0253302A号（Klausら）、同第0303915A号（Bryceら）；英国特許願第GB2190378A号（Klausら）；ドイツ特許願第DE3715955A1号（Klausら）、同第DE36024731A1号（Wuestら）；および論文類：J. Amer. Acad. Derm.、15巻、756〜764頁、1986年（Spornら）、Chem. Pharm. Bull.、33巻、404〜407頁、1985年（Shudoら）、J. Med. Chem.、31巻、2182〜2192頁、1988年（Kagechikaら）、「Chemistry and Biology of Synthetic Retinoids」、CRC Press Inc.、 1990年、334〜335頁、354頁（Dawsonら著）は、テトラヒドロナフチル部分を含有し、レチノイド様のまたはレチノイドに関連する生物活性を有する化合物を記載しまたはこれら化合物に関するものである。米国特許第4,391,731号（Bollerら）には、液晶組成物に用いて有効なテトラヒドロナフタレン誘導体が記載されている。
【０００５】
Kagechikaらの論文：J. Med. Chem. 32巻、834頁、1989年には、レチノイド様活性を有する特定の6-（3-オキソ-1-プロペニル）-1,2,3,4-テトラメチル-1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン誘導体および類縁フラボン化合物が記載されている。Shudoらの論文：Chem. Pharm. Bull.、33巻、404頁、1985年およびJettenらの論文：Cancer Research、47巻、3523頁、1987頁は、その外の3-オキソ-1-プロペニル誘導体（カルコン化合物）およびそれらのレチノイド様もしくは類縁の生物活性を記載しまたはこれらに関するものである。
【０００６】
あいにく、レチノイド様活性を有する化合物（レチノイド類）は、処置投与量のレベルで、頭痛、催奇形、皮膚粘膜毒性、筋骨格系毒性、異常脂肪血症（dyslipidemias）、皮膚刺激、頭痛および肝毒性を含む多くの望ましくない副作用も起こす。これらの副作用のため、疾患を処置する場合のレチノイドの受容性と有用性が制限されている。
【０００７】
哺乳類（および他の生物）中に、２種の主要な型のレチノイド受容体が存在していることは、現在、当該技術分野で公知である。その２種の主要な型またはファミリーの受容体は、それぞれＲＡＲおよびＲＸＲと呼称されている。これら各型の中には亜型があり、ＲＡＲファミリー中の亜型はＲＡＲ−α、ＲＡＲ−βおよびＲＡＲ−γと呼称され、ＲＸＲファミリー中の亜型はＲＸＲ−α、ＲＸＲ−βおよびＲＸＲ−γと呼称されている。両ファミリーの受容体は、それらのリガンド結合特異性に基づいて互いに識別できる転写因子である。オール-trans-ＲＡ（ＡＴＲＡ）は、ＲＡＲ−α、ＲＡＲ−βおよびＲＡＲ−γを含むクラスのレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）と結合して活性化する。異なるリガンドの9-cis-ＲＡ（９Ｃ−ＲＡ）は、ＲＡＲおよびレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ファミリーのメンバーの両者に結合して活性化する。
【０００８】
また、上記２種の主要型レチノイド受容体といくつかの亜型は、哺乳類動物の各種の組織と臓器に均一に分布していないことは当該技術分野で確認されている。さらに、レチノイドの多くの有害作用が、１種以上のＲＡＲ受容体の亜型によって仲介されることも当該技術分野で一般に容認されている。したがって、レチノイド受容体において作動薬様活性を有する化合物の中で、受容体の主要な型もしくはファミリーの一つに対する特異性もしくは選択性、さらには受容体のファミリー内の１種以上の亜型に対する特異性もしくは選択性を有するものは、医薬特性が望ましいと考えられる。
【０００９】
ＲＡＲ受容体の作動薬によって引き起こされる応答を引き起こすことなくＲＡＲ受容体に結合する化合物が当該技術分野で比較的最近に開発されている。したがって、「レチノイド」応答を引き起こさずにＲＡＲ受容体に結合するこれらの化合物または薬剤は、生物学的検定法および生物系でＲＡＲ作動薬の活性を（多少）遮断することができる。さらに詳しく述べると、この技術分野の科学文献と特許文献に関して、ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ94／14777号には、ＲＡＲレチノイド受容体に結合する特定の複素環式カルボン酸誘導体が記載され、これら化合物は、該出願において、例えば痙瘡、乾癬、リウマチ様関節炎およびウイルス感染症などの特定の疾患または病状を治療するのに有用であると述べられている。Yoshimuraらの論文：J. Med. Chem.、38巻、3163〜3173頁、1995年に類似のことが開示されている。Kanekoら、Med. Chem. Res.、1巻、220〜225頁、1991年；Apfelら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻、7129〜7133頁、Augusty 1992 Cell Biology；Eckhardtら、Toxicology Letters、70巻、299〜308頁、1994年；Keidelら、Moleculay and Cellular Biology、14巻、287〜298頁、1994年；およびEyrollesら、J. Med. Chem.、37巻、1508〜1517頁、1994年には、１種以上のＲＡＲレチノイド亜型において拮抗薬様活性を有する化合物が記載されている。
【００１０】
レチノイド化合物による治療の望ましくない副作用に加えて、ビタミン剤の過剰服用または高レベルのビタミンＡを含有する特定の魚と動物の肝臓の摂取が原因で、ビタミンＡまたはビタミンＡ前駆体の過量によって重篤な症状がときどき起こる。ビタミンＡ過剰症症候群にみられる慢性または急性の毒性としては、頭痛、皮膚剥離、骨毒性、異常脂肪血症などがある。近年、ビタミンＡ類似体すなわちレチノイド類による毒性は、高ビタミンＡ症症候群の毒性を事実上再現しており、このことは、共通の生物学的原因、すなわちＲＡＲの活性化を示唆していることが明らかになってきている。これらの毒性は現在、主として、補助的（supportive）手段によって、および原因物質がたとえ肝臓、ビタミン剤またはレチノイド類であろうと、これら物質にそれ以上さらされるのをひかえることによって治療されている。これら毒性のいくつかは、時間の経過によって消失するが、他の毒性（例えば、早期骨端板閉鎖）は永久的である。
【００１１】
一般的に述べると、特定の解毒薬が医薬による中毒に対する最高の治療法であるが、既存の何千もの化学薬剤のうち、わずかに約24種の化学薬剤もしくは化学薬剤のクラスしか、特異的な公知の解毒薬がない。特異的な解毒剤は、過ビタミンＡ症およびレチノイド毒性を処置するのに価値があることはたしかである。実際に、臨床で使用される強力なレチノイド類が増加しているので、レチノイド中毒に対する特異的な解毒薬は人命を助ける薬剤でもある。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
本発明は、下記式１で示される化合物に関する：
【化１】
2008280346.tif 000003
（式中、
Xは、S、O、NR'、ここでR'はHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、または、Xは、［C(R１)２］ｎ、ここでR１は独立してHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、およびｎは０〜２の整数；
R２は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキル、F、Cl、Br、I、CF３、炭素原子数１〜６のフッ素置換アルキル、OH、SH、炭素原子数１〜６のアルコキシ、または炭素原子数１〜６のアルキルチオ；
R３は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキルまたはF；
ｍは、０〜３の整数；
ｏは、０〜３の整数；
Ｚは、−Ｃ≡Ｃ−、
−Ｎ＝Ｎ−、
−Ｎ＝ＣＲ１−、
−ＣＲ１＝Ｎ−、
−（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｎ ’ −、ここでｎ’は０〜５の整数、
−ＣＯ−ＮＲ１−、
−ＣＳ−ＮＲ１−、
−ＮＲ１−ＣＯ、
−ＮＲ１−ＣＳ、
−ＣＯＯ−、
−ＯＣＯ−、
−ＣＳＯ−、
−ＯＣＳ−；
Ｙは、フェニルもしくはナフチル基、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリルおよびピラゾリルからなる群より選択されるヘテロアリール、ここで、フェニルおよびヘテロアリール基は場合により１または２のＲ２基で置換される、あるいは、Ｚが−（ＣＲ１＝ＣＲ１）ｎ ’ −およびｎ’が３、４または５の場合、Ｙは前記−（ＣＲ２＝ＣＲ２）ｎ ’ −基とＢとの間の直接原子価結合；
【００１３】
Ａは、（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、炭素原子数３〜６の低級分岐鎖アルキル、炭素原子数３〜６のシクロアルキル、炭素原子数２〜６で１または２の二重結合を有するアルケニル、炭素原子数２〜６で１または２の三重結合を有するアルキニル、
Ｂは、水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＲ１１、ＣＨ２ＯＣＯＲ１１、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ１２）２、ＣＨＯＲ１３Ｏ、ＣＯＲ７、ＣＲ７（ＯＲ１２）２、ＣＲ７ＯＲ１３Ｏ、またはトリ低級アルキルシリル、ここでＲ７は炭素原子数１〜５のアルキル、シクロアルキルもしくはアルケニル基、Ｒ８は炭素原子数１〜１０のアルキル基もしくはトリメチルシリルアルキル、ここでアルキル基は１〜１０の炭素原子を有する、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、あるいはＲ８は、フェニルまたは低級アルキルフェニル、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素、炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、またはフェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１１は低級アルキル、フェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１２は低級アルキル、およびＲ１３は炭素原子数２〜５の2価アルキル基、および
Ｒ１４は、（Ｒ１５）ｒ−フェニル、（Ｒ１５）ｒ−ナフチル、または（Ｒ１５）ｒ−ヘテロアリール、ここでヘテロアリール基はＯ、ＳおよびＮからなる群より選択される１〜３のヘテロ原子を有し、ｒは０〜５の整数、および
Ｒ１５は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、Ｎ(Ｒ８)２、ＮＨ(Ｒ８)、ＣＯＲ８、ＮＲ８ＣＯＮ(Ｒ８)２、ＯＨ、ＯＣＯＲ８、ＯＲ８、ＣＮ、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のフッ素置換アルキル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の二重結合を有するアルケニル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の三重結合を有するアルキニル基、またはトリアルキルシリルもしくはトリアルキルシリルオキシ基、ここでアルキル基は独立して1〜６の炭素原子を有する。)。
【００１４】
更に、本発明は、下記式１０１で示される化合物にも関する：
【化２】
2008280346.tif 000004
（式中、
Xは、S、O、NR'、ここでR'はHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、または、Xは、［C(R１)２］ｎ、ここでR１は独立してHまたは炭素原子数１〜６のアルキル、およびｎは０〜２の整数；
R２は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキル、F、Cl、Br、I、CF３、炭素原子数１〜６のフッ素置換アルキル、OH、SH、炭素原子数１〜６のアルコキシ、または炭素原子数１〜６のアルキルチオ；
R３は、水素、炭素原子数１〜６の低級アルキルまたはF；
ｍは、０〜３の整数；
ｏは、０〜３の整数；
Ｙは、フェニルもしくはナフチル基、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリルおよびピラゾリルからなる群より選択されるヘテロアリール、ここで、フェニルおよびヘテロアリール基は場合により１または２のＲ２基で置換される；
【００１５】
Ａは、（ＣＨ２）ｑ、ここでｑは０〜５、炭素原子数３〜６の低級分岐鎖アルキル、炭素原子数３〜６のシクロアルキル、炭素原子数２〜６で１または２の二重結合を有するアルケニル、炭素原子数２〜６で１または２の三重結合を有するアルキニル、
Ｂは、水素、ＣＯＯＨもしくは薬学的に許容できるその塩、ＣＯＯＲ８、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＲ１１、ＣＨ２ＯＣＯＲ１１、ＣＨＯ、ＣＨ（ＯＲ１２）２、ＣＨＯＲ１３Ｏ、ＣＯＲ７、ＣＲ７（ＯＲ１２）２、ＣＲ７ＯＲ１３Ｏ、またはトリ低級アルキルシリル、ここでＲ７は炭素原子数１〜５のアルキル、シクロアルキルもしくはアルケニル基、Ｒ８は炭素原子数１〜１０のアルキル基もしくはトリメチルシリルアルキル、ここでアルキル基は１〜１０の炭素原子を有する、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、あるいはＲ８は、フェニルまたは低級アルキルフェニル、Ｒ９およびＲ１０は独立して水素、炭素原子数１〜１０のアルキル基、または炭素原子数５〜１０のシクロアルキル基、またはフェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１１は低級アルキル、フェニルもしくは低級アルキルフェニル、Ｒ１２は低級アルキル、およびＲ１３は炭素原子数２〜５の2価アルキル基、および
Ｒ１４は、（Ｒ１５）ｒ−フェニル、（Ｒ１５）ｒ−ナフチル、または（Ｒ１５）ｒ−ヘテロアリール、ここでヘテロアリール基はＯ、ＳおよびＮからなる群より選択される１〜３のヘテロ原子を有し、ｒは０〜５の整数、および
Ｒ１５は、独立して、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ２、Ｎ(Ｒ８)２、Ｎ(Ｒ８)ＣＯＲ８、ＮＲ８ＣＯＮ（Ｒ８）２、ＯＨ、ＯＣＯＲ８、ＯＲ８、ＣＮ、炭素原子数１〜１０のアルキル基、炭素原子数１〜１０のフッ素置換アルキル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の二重結合を有するアルケニル基、炭素原子数１〜１０で１〜３の三重結合を有するアルキニル基、またはトリアルキルシリルもしくはトリアルキルシリルオキシ基、ここでアルキル基は独立して１〜６の炭素原子を有する;
Ｒ１６は、Ｈまたは炭素原子数１〜６の低級アルキル；
Ｒ１７は、Ｈ、炭素原子数１〜６の低級アルキル、ＯＨまたはＯＣＯＲ１１；および
ｐは０または１で、ｐが１のときＲ１７置換基は存在せず、ｍが０〜２の整数である。）。
【００１６】
本発明の化合物は、ある種の疾患または病状の治療または予防のために投与されるレチノイド類のある種の望ましくない副作用を予防するのに有効である。この目的を達成するため、本発明の化合物はレチノイド類と同時に投与してもよい。また、本発明の化合物は、レチノイド医薬またはビタミンＡの過量または中毒で起こる急性または慢性の毒性を処置するのに有用である。
【００１７】
さらに本発明は、哺乳類を含む生体系のＲＡＲ受容体部位のすべてまたはいくつかを遮断して前記受容体部位に対するＲＡＲ作動薬の作用を防止もしくは低下させるためのＲＡＲ拮抗薬の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、レチノイド（ビタミンＡまたはビタミンＡ前駆体を含む）の慢性または急性の毒性およびレチノイド療法の副作用の(a)予防および(b)治療のためのＲＡＲ拮抗薬の使用に関する。
【００１８】
本発明の特定の一態様で、哺乳類の病状の処置法が提供される。処置される症状はレチノイン酸受容体の活性に関連がある。この方法では、以下のレチノイン酸受容体の亜型：ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγのうちの一つに結合できるレチノイド拮抗剤またはネガティブホルモンを哺乳類に投与する。この拮抗剤またはネガティブホルモンは、哺乳類の病状に対して処置効果を与える医薬として有効な量で投与する。
【００１９】
急性もしくは慢性のレチノイドもしくはビタミンＡによる中毒に対する解毒剤として、ＲＡＲ拮抗薬を、哺乳類に対し、経腸ですなわち胃内挿管法もしくは食物／水の混合物によって、または非経口で、例えば腹腔内、筋肉内、皮下、局所などに投与することができる。投与経路にとって唯一必要なことは、拮抗薬を標的組織まで送達しなければならないことである。ＲＡＲ拮抗薬は、それ自体だけでまたは賦形剤と混合して配合することができる。ＲＡＲ拮抗薬は、例えば経腸で使用する場合、配合物中で溶液である必要はない。
【００２０】
ＲＡＲ拮抗薬は、レチノイドによる処置に対する助剤として、および投与されるレチノイド医薬の１種以上の副作用を予防するため、同様に経腸または非経口で投与することができる。ＲＡＲ拮抗薬およびＲＡＲ作動薬は、同じ投与経路で投与する必要はない。重要なことは、対象の組織がＲＡＲ作動薬に暴露されている間、充分な量のＲＡＲ拮抗薬が、対象の組織中に連続的に存在していることである。レチノイドの毒性を予防するには、ＲＡＲ作動薬で処置するのと同時にまたはその処置を行う前に、ＲＡＲ拮抗薬を投与することが最も望ましい。多くの場合、ＲＡＲ拮抗薬は、ＲＡＲ作動薬とは異なる経路で投与される。例えば経腸投与されるレチノイドの皮膚に対する望ましくない作用は、局所投与されるＲＡＲ拮抗薬によって予防または改善できる。
【００２１】
本発明の他の態様は、レチノイドネガティブホルモン類の同定方法である。この方法は以下のステップで構成されている。すなわち組換えレチノイド受容体の結合に転写で応答するリポーター遺伝子を含有するトランスフェクトされた細胞を得て、その組換えレチノイド受容体は元の（intact）レチノイド受容体のDNA結合ドメインに対しC末端側に位置するタンパク質ドメインを少なくとも有し；未処理のトランスフェクトされた細胞でのリポーター遺伝子の発現の基本レベルを測定し、その未処理のトランスフェクトされた細胞はレチノイドを添加せずに増殖させ；トランスフェクトされた細胞を、ネガティブホルモン活性について試験されるレチノイド化合物で処理し；処理された細胞内でのリポーター遺伝子の発現のレベルを測定し；処理された細胞内および未処理細胞内で測定されたリポーター遺伝子の発現のレベルを比較し；次いで未処理細胞内で測定されたリポーター遺伝子の発現の基本レベルと比べて低いレベルで、処理された細胞内でリポーター遺伝子を発現させるレチノイド化合物をレチノイドネガティブホルモンとして同定する；ステップで構成されている。この方法の特定の好ましい実施態様で、元の受容体はRAR-α、RAR-βまたはRAR-γの亜型である。他の実施態様では、元の受容体がRXR-α、RXR-βまたはRXR-γの亜型である。組換え受容体は組換えRAR受容体でもRXR受容体でもよい。いくつかの実施態様では、組換え受容体が、構成転写アクチベータードメイン（constitutive transcription activator domain）を有するキメラレチノイド受容体である。前記構成転写アクチベータードメインは、実効負電荷を有する複数のアミノ酸を有し得るが、または例えば単純ヘルペスウイルスVP-16転写アクチベータードメインのようなウイルスの転写アクチベータードメインのアミノ酸配列を有していてもよい。構成転写アクチベータードメインが実効負電荷を有する実施態様では、レチノイド受容体は、組換え体で、かつそれから、レチノイン酸応答要素以外のcis-調節要素に対して特異的なDNA結合ドメインのようなDNA結合ドメインを除いたものでもよい。これらの要素としてはエストロゲン応答要素がある。前記トランスフェクトされた細胞は、内在性レチノイド類を実質的に欠いた増殖培地、例えば活性炭で抽出した血清を含有する増殖培地の中で増殖させることが好ましい。この方法の場合、リポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子であってよい。この場合、その測定ステップは発光測定で行うことができる。また、リポーター遺伝子はβ-ガラクトシダーゼ遺伝子でもよく、この場合、測定ステップとしてβ-ガラクトシダーゼ検定法を利用する。トランスフェクトされた細胞は、例えばミドリザルの細胞またはヒトの細胞などのトランスフェクトされた哺乳類の細胞でよい。
【００２２】
本発明の他の態様は、哺乳類に投与されたステロイドスーパーファミリー受容体作動薬の薬理活性を高める方法である。この方法では、ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬を、前記ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬の薬理活性を高めるのに医薬として有効な投与量のレチノイドネガティブホルモンを含有してなる組成物と同時に、哺乳類に投与する。その薬理活性は、生体外でのリポーター遺伝子トランスアクチベーション検定法で、例えば抗-AP-1活性を測定することによって測定できる。高められる薬理活性は、例えば網膜色素上皮で測定可能な種類の活性などの抗増殖活性でよい。ステロイドスーパーファミリー受容体作動薬は、以下のものであってよい：レチノイド受容体作動薬、ビタミンD受容体作動薬、グルココルチコイド受容体作動薬、甲状腺ホルモン受容体作動薬、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体作動薬（peroxisome  proliferator-activated receptor agonist）またはエストロゲン受容体作動薬。レチノイド受容体作動薬は、例えばオールトランス-レチノイン酸または13-cisレチノイン酸などのRAR作動薬であってよい。また、レチノイド受容体作動薬はRXR作動薬でもよい。好ましいビタミンD受容体作動薬は1,25-ジヒドロキシビタミンD３である。好ましいグルココルチコイド受容体作動薬はデキサメタゾンである。好ましい甲状腺ホルモン受容体作動薬は3,3',5-トリヨードチロニンである。レチノイドネガティブホルモンはRAR特異的レチノイドネガティブホルモンであり、解離定数が30nMより低いかまたはほぼ等しいものが好ましい。RAR特異的レチノイドネガティブホルモンの例としては、AGN193109,AGN193385,AGN193389およびAGN193871がある。レチノイドネガティブホルモンの医薬として有効な投与量を含有する組成物は、ステロイドスーパーファミリー作動薬と同時に投与することができ、かつ同時投与する前に混合しておいてもよい。また、これらは別個の組成物として同時に投与してもよい。
【００２３】
発明の詳細な説明
定義
本発明において、RAR拮抗薬を、1ミクロモルより小さいKd（Kd＜1μM）でRAR亜型の1種以上と結合するが、受容体同時トランスフェクション検定法で、RAR亜型調節遺伝子の有意な転写活性化を起こさない化学薬剤と定義する。通常、拮抗薬は作動薬の活性を阻害する化学薬剤である。したがって受容体拮抗薬の活性は通常、作動薬の活性を阻害するその性能によって測定される。
【００２４】
RAR作動薬は、1ミクロモルより小さいKd（Kd＜1μM）でRAR受容体亜型の1種以上に結合し、かつ受容体同時トランスフェクション検定法でRAR亜型調節遺伝子の転写活性化を起こす化学薬剤と定義する。用語”RAR薬剤”には、RAR例えばRXR受容体に加えて他の受容体に結合しおよび／またはこれら受容体を活性化し得る化学薬剤が含まれる。
【００２５】
本願で用いる場合、ネガティブホルモンあるいは逆作動薬は、受容体を、どのリガンドも存在しないときにおこる基本的状態に比べて不活性な状態にする、その受容体のリガンドである。したがって、拮抗薬は作動薬の活性を阻害できるが、ネガティブホルモンは、作動薬が存在していないときに受容体のコンフォメーションを変えることができるリガンドである。ネガティブホルモンすなわち逆作動薬の概念はBondらが研究してNature、374巻、272頁、1995年に報告したものである。さらに具体的に述べると、Bondらは、リガンド未結合のβ２-アドレナリン受容体が、不活性なコンフォメーションと自発的に活性なコンフォメーションの間の平衡状態で存在しているということを提案した。作動薬は、受容体を、活性コンフォメーションに安定化すると提案されている。逆に、逆作動薬は、不活性な受容体のコンフォメーションを安定化すると考えられている。したがって、拮抗薬は、作動薬を阻害することによってその活性を示すが、ネガティブホルモンは、さらに、作動薬が存在しないときに、リガンド未結合受容体が活性コンフォメーションに自発的に変換するのを阻害することによって、その活性を示すことができる。拮抗薬の一部だけがネガティブホルモンとして作動し得る。本願で開示されているように、AGN193109は、拮抗薬でありかつネガティブホルモンである。現在まで、ネガティブホルモン活性を有するレチノイド類は外に報告されていない。
【００２６】
本願で用いる場合、2種の医薬として活性な化合物の同時投与という用語は、2種の別個の化学物質を生体外または生体内にかかわらず送達することを意味する。同時投与とは、別個の薬剤の同時送達；薬剤の混合物の同時送達；および最初の薬剤を送達し次に第二の薬剤を送達することを意味する。すべての場合、同時投与される薬剤は、互いに協同して作動させることを目的とする薬剤である。
【００２７】
用語アルキルは、直鎖アルキル、分枝鎖アルキルおよびシクロアルキルとして知られているすべての基を意味しカバーしている。用語アルケニルは、1個以上の不飽和部位を有する直鎖アルケニル、分枝鎖アルケニルおよびシクロアルケニル基を意味しカバーしている。同様に、用語アルキニルは、1個以上の三重結合を有する直鎖アルキニルおよび分枝鎖アルキニル基を意味しカバーしている。
【００２８】
低級アルキルは、上記広い定義を有するものであって、直鎖低級アルキルの場合は1〜6個の炭素原子を有するアルキル基、および低級分枝鎖アルキル基とシクロアルキル基の場合は3〜6個の炭素原子を有する基を意味する。低級アルケニルは、同様に、直鎖低級アルケニル基の場合は2〜6個の炭素原子を有する基、分枝鎖およびシクロ低級アルケニル基の場合は3〜6個の炭素原子を有する基と定義する。低級アルキニルも同様に、直鎖低級アルキニル基の場合は2〜6個の炭素原子を有する基、分枝鎖低級アルキニル基の場合は4〜6個の炭素原子を有する基と定義する。
【００２９】
本願で用いられる用語”エステル”は、有機化学で古典的に使用されているような用語の定義内に入る化合物を意味しカバーしている。このエステルという用語には有機と無機のエステルが含まれている。（式1または式101の）Bが-COOHの場合、この用語は、この官能基を、アルコール類またはチオール類で、好ましくは1〜6個を炭素原子を有する脂肪族アルコール類で処理して誘導される生成物をカバーしている。エステルがBが-CH２OHである化合物から誘導される場合、この用語は、リンをベースとする酸および硫黄をベースとする酸を包含するエステルを生成可能な有機酸から誘導される化合物；または式：-CH２OCOR１１（式中、R１１は置換もしくは未置換の脂肪族、芳香族、ヘテロ芳香族また脂肪族芳香族の基であって好ましくはその脂肪族部分に1〜6個の炭素原子を有する基である）で表される化合物をカバーしている。
【００３０】
本願で特にことわらない限り、好ましいエステル類は、10個以下の炭素原子を有する飽和脂肪族のアルコール類もしくは酸類、または5〜10個の炭素原子を含有する環式もしくは飽和脂肪族環式のアルコール類と酸類から誘導される。特に好ましい脂肪族エステルは、低級アルキルの酸とアルコールから誘導されるエステルである。また、フェニルもしくは低級アルキルフェニルのエステル類も好ましい。
【００３１】
アミド類は、有機化学においてこの用語に古典的に与えられた意味をもっている。この場合、この用語には、未置換アミド類およびすべての脂肪族と芳香族のモノ−とジ−置換アミド類が含まれている。本願では特にことわらない限り、好ましいアミド類は、10個以下の炭素原子を有する飽和脂肪族基または5〜10個の炭素原子を有する環式基もしくは飽和脂肪族環式基から誘導されるモノ−およびジ−置換アミド類である。特に好ましいアミド類は、置換および未置換の低級アルキルアミンから誘導されるアミド類である。置換および未置換のフェニルアミン類または低級アルキルフェニルアミン類から誘導されるモノ−およびジ−置換アミド類も好ましい。未置換アミド類も好ましい。
【００３２】
アセタール類とケタール類は、式：-CK（式中Kは(-OR)２である）で表される基を含有している。ここでRは低級アルキルである。Kは-OR７Oでもよく、そのR７は2〜5個の炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖の低級アルキルである。
【００３３】
医薬として許容される塩は、塩を形成できる官能性、例えば酸官能性を有する本発明のどの化合物にも製造できる。医薬として許容される塩は、親化合物の活性を保持し、かつそれが投与される患者およびそれが投与される状況で有害なまたは不利な作用を与えない塩である。
【００３４】
医薬として許容される塩は有機または無機の塩基から誘導することができる。その塩は一価または多価のイオンであり得る。特に重要なのは、無機イオンのナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムである。有機塩は、アミン類、特にモノ−、ジ−およびトリ−アルキルアミン類またはエタノールアミン類のようなアンモニウム塩で製造することができる。塩類は、カフェイン、トロメタミンおよび類似分子でも製造することができる。酸付加塩を形成することができるほど十分に塩基性の窒素が存在している場合、酸付加塩は無機もしくは有機の酸またはヨウ化メチルのようなアルキル化剤で製造することができる。好ましい塩は、塩酸、硫酸またはリン酸のような無機酸で製造することができる。例えばモノ−、ジ−またはトリ−酸などの多数の簡単な有機酸のどれでも使用ができる。
【００３５】
本発明の化合物のいくつかにはtransとcis（EとZ）の異性体がある。さらに、本発明の化合物は、1個以上のキラル中心をもち得るので、エナンチオマーおよびジアステレオマーの形態で存在し得る。本発明の範囲は、このようなすべての異性体自体、ならびにcis異性体とtrans異性体の混合物、ジアステレオマーの混合物およびエナンチオマー（光学異性体）のラセミ混合物を含むものとする。本願において、化合物（または不斉炭素原子）の立体配置（cis、transまたはRもしくはS）について特に言及していない場合、かような異性体の混合物または異性体のいずれか一方を意味するものとする。
【００３６】
レチノイド拮抗薬様生物活性を有するアリール置換のベンゾピラン、ベンゾチオピラン、1,2-ジヒドロキノリンおよび5,6-ジヒドロナフタレンの誘導体
本発明の好ましい化合物は、式1における記号Yがフェニル、ピリジル、チエニルまたはフリルである化合物である。さらに好ましいのはYがフェニルまたはピリジルの化合物でありさらに一層好ましいのはYがフェニルの化合物である。Y（フェニル）基およびY（ピリジル）基の置換に関する限り、前記フェニル基がZ基とA-B基によって1,4（パラ）置換されている場合、および前記ピリジン環がZ基およびA-B基によって2,5置換されている場合の化合物が好ましい（”ピリジン”命名法における2,5位の置換は、”ニコチン酸”命名法の6位の置換に相当する）。本発明の好ましい化合物において、Y基に対する任意のR２置換基はないかまたは任意のR２置換基はフッ素（F）である。
【００３７】
好ましい化合物のA-B基は（CH２）n-COOHまたは（CH２）n-COOR８（式中、nとR８は前記定義されているとおりである）である。さらに好ましくは、nがゼロでR８が低級アルキルであるか、またはnがゼロでBがCOOHもしくはCOOHの医薬として許容される塩である。
【００３８】
本発明の好ましい化合物例の大部分で、Xが[C(R１)２]nであり、そのnが1である。しかし、nがゼロである化合物（インデンの誘導体）およびXがSまたはOである化合物（ベンゾチオピランおよびベンゾピランの誘導体）も好ましい。Xが[C(R１)２]nでnが1の場合、R１は、好ましくは1〜6個の炭素原子を有するアルキルであり、さらに好ましくはメチルである。
【００３９】
式1の化合物のテトラヒドロナフタレン、ベンゾピラン、ベンゾチオピランまたはジヒドロキノリンの部分の芳香族部分に結合されるR２基は好ましくはH、FまたはCF３である。R３は、好ましくは水素またメチルであり、さらに好ましくは水素である。
【００４０】
好ましい複数の例において、式1で表される本発明の化合物の基Zはアセチレン結合（Z=-C≡C-）である。しかし、ジアゾ基（Z=-N=N-)；オレフィン基もしくはポリオレフィン基（Z=-(CR１=CR１)n’)；エステル（Z=-COO-）、アミド（Z=-CO-NR２-)もしくはチオアミド（Z=-CS-NR２-)結合のような”リンカー基”Zも好ましい。
【００４１】
R１４基については、R１４がフェニル、2-ピリジル、3-ピリジル、2-チエニルおよび2-チアゾリルである化合物が好ましい。R１５基（R１４基の置換基）は好ましくはH、低級アルキル、トリフルオロメチル、塩素、低級アルコキシまたはヒドロキシである。
【００４２】
最も好ましい本発明の化合物群を式2、3、4、5および5aに関して表1に示す。
【化３】
2008280346.tif 000005
【００４３】
【表１−１】
2008280346.tif 000006
【００４４】
【表１−２】
2008280346.tif 000007
【００４５】
レチノイド拮抗薬様生物活性を有するアリールおよび（3-オキソ-1-プロペニル）置換ベンゾビラン、ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリンおよび5,6-ジヒドロナフタレン誘導体
式101における記号Yについて、本発明の好ましい化合物は、Yがフェニル、ピリジル、チエニルまたはフリルの化合物である。さらに好ましいのはYがフェニルまたはピリジルの化合物であり、さらに一層好ましいのはYがフェニルの化合物である。Y（フェニル）基およびY（ピリジル）基の置換に関する限り、そのフェニル基が-CR１６＝CR１７-基およびA-B基で1,4（パラ）置換されている場合、およびそのピリジン環が-CR１６＝CR１７-基およびA-B基で2,5置換されている場合が好ましい（”ピリジン”命名法の2,5位の置換は”ニコチン酸”命名法の6位置換に相当する）。本発明の好ましい化合物には、Y基に任意のR２置換基がない。
【００４６】
好ましい化合物のA-B基は-(CH２)n-COHHまたは-(CH２)n-COOR８でありそのnとR８は前記定義のとおりである。さらに好ましくはnがゼロでありR８が低級アルキルであるか、またはnがゼロでBが-COOHもしくは-COOHの医薬として許容される塩である。
【００４７】
本発明の化合物の好ましい例において、Xは[C(R１)２]nでありそのnは1である。しかし、XがSまたはOである化合物（ベンゾチオピランおよびベンゾピランの誘導体）も好ましい。Xが[C(R１)２]nでnが1である場合、R１は好ましくは1〜6個の炭素原子を有するアルキルであり、さらに好ましくはメチルである。
【００４８】
式101で表される化合物のテトラヒドロナフタレン、ベンゾピラン、ベンゾチオピランまたはジヒドロキノリン部分の芳香族部分に結合されるR２基は、好ましくはH、FまたはCF３である。R３は好ましくは水素またはメチルであり、さらに好ましくは水素である。
【００４９】
R１４基については、R１４がフェニル、2-ピリジル、3-ピリジル、2-チエニルおよび2-チアゾリルである化合物が好ましい。R１５基（R１４基の置換基）は好ましくはH、低級アルキル、トリフルオロメチル、塩素、低級アルコキシまたはヒドロキシである。
【００５０】
本発明の好ましい化合物を、式102を参照して表2に示す。
【化４】
2008280346.tif 000008
【００５１】
【表２】
2008280346.tif 000009
【００５２】
生物活性、投与モード
上記のように、本発明の化合物は1種以上のRAR受容体亜型の拮抗薬である。このことは、本発明の化合物が1種以上のRAR受容体の亜型に結合するが、同じ受容体の作動薬が引き起こす応答を引き起さないことを意味する。本発明の化合物のいくつかは、3種のRAR受容体の亜型（RAR-α、RAR-βおよびRAR-γ）すべての拮抗薬であり、これらの化合物は”RAR汎拮抗薬（RAR pan antagonist）”と呼称される。他のいくつかはRAR受容体亜型の1種または2種のみの拮抗薬である。本発明の範囲内にあるいくつかの化合物は、1種もしくは2種のRAR受容体亜型の部分的作動薬でありかつ残りのRAR受容体亜型の拮抗薬である。本発明の化合物はRXR受容体類には結合しないので、RXRの作動薬でも拮抗薬でもない。
【００５３】
抑制または改善したい望ましくない副作用の部位と性質によって、本発明にしたがって使用される化合物は、1種または2種のRAR受容体亜型だけの拮抗薬であってもよい。本発明にしたがって使用されるいくつかの化合物は、1種もしくは2種のRAR受容体亜型の部分作動薬でかつ残りのRAR受容体亜型の拮抗薬であってもよい。このような化合物は、一般的に述べると、その拮抗薬作用が、過量投与による中毒または単一もしくは複数の望ましくない副作用の主原因である単一もしくは複数のRAR受容体亜型に対する作用である場合、本発明に有用である。これに関連して、一般的に述べると、以下に述べる同時トランスフェクション検定法において、化合物が、受容体調節リポーター遺伝子の有意な転写活性化を起こさず約1μMより小さいKdで受容体に結合するならば、その化合物はその受容体亜型の拮抗薬とみなされる。
【００５４】
化合物が、RAR拮抗薬でありしたがって本発明に有用であるかどうかは以下の検定法で試験することができる。
RAR-α、RAR-β、RAR-γ、RXR-αの受容体亜型の作動薬様活性を試験するキメラ受容体トランスアクチベーション検定法であって、Feigner P. L.とHolm M., Focus、 11巻、2号、1989年で刊行された研究に基づいた検定法は、1994年8月18日付けで公開されたPCT特許願公開第WO94/17796号に詳細に記載されている。後者の刊行物は、米国特許第5,455,265号として発行された1993年2月11日付け出願の米国特許願08/016,404号のPCT出願に相当するものである。化合物は、本発明に有用なRAR拮抗剤として適合するには、上記検定法において、与えられた受容体亜型（RAR-α、RAR-βまたはRAR-γ）を通じてリポーター遺伝子を有意に活性化させてはならない。
【００５５】
本発明の化合物の拮抗薬／作動薬様活性またはいくつものレチノイド受容体亜型に結合する性能をそれぞれ測定するホロ受容体トランスアクチベーション検定法とリガンド結合検定法は、1993年６月24日付けで公開されたPCT特許願公開第WO93/11755号（特に30〜33頁と37〜41頁）に記載されている。またホロ受容体トランスアクチベーション検定法は以下に説明する。
【００５６】
ホロ受容体トランスアクチベーション検定法
CV1細胞（5,000細胞／ウェル）を、自動化96ウェルフォーマットで、Heymanら、Cell、68巻、397〜406頁のリン酸カルシウム法によって、RAR発現ベクターのうちの一つ（10ng）とともにRARリポータープラスミドMTV-TREp-LUC（50ng）を用いてトランスフェクトした。RXR-αおよびRXR-γトランスアクチベーション検定法の場合、適当なRXR発現ベクター（10ng）とともにRXR応答性リポータープラスミドCRBPII-tk-LUC（50ng）を、Heymanらの前掲報告とAllegrettoら、J. Biol. Chem.、268巻、26625〜26633頁に記載されているのと実質的に同様に使用した。RXR-βトランスアクチベーション検定法の場合は、RXR-β発現ベクター（10mg）とともにRXR応答性リポータープラスミドCPRE-tkLUC（50mg）を上記のようにして使用した。これらのリポーターはそれぞれ、ヒトCRBPII由来のDRI要素およびプロモーター由来の特定のDRI要素を含有している（Mangelsdorfら著「The Retinoids: Biology, Chemistry and Medicine」、319〜349頁、米国ニューヨーク所在のRaven Press Ltd.および前掲Heymanらの報告参照）。β-ガラクトシダーゼ（50ng）発現ベクターを、トランスフェクションの内部対照として用いて、トランスフェクション効率の変動を正規化した。これらの細胞を３組、６時間トランスフェクトし、続いてレチノイド類とともに36時間インキュベートし、次いで抽出物を、ルシフェラーゼとβ-ガラクトシダーゼの活性について検定した。ホロ受容体のトランスアクチベーションの詳細な実験手順は、Heymanらの前掲報告およびAllegrettoらの前記引用報告に記載されている。この検定法で得られた試験結果はEC５０の数値で示し、このことはキメラ受容体トランスアクチベーション検定法でも同様である。リガンド結合検定法の試験結果はKdの数値で示す（Chengら、Biochemical Pharmacology、22巻、3099〜3108頁参照）。
【００５７】
化合物は、本発明に有用なRAR拮抗薬として適合するには、ホロ受容体トランスアクチベーション検定法において、与えられた受容体亜型（RAR-α、RAR-βまたはRAR-γ）を通じてリポーター遺伝子を有意に活性化してはならない。そして、化合物は、結合する受容体亜型の拮抗薬として機能できるためには、同じ受容体亜型がその化合物によって有意に活性化されないという条件で、リガンド結合検定法において、約１ミクロモルより小さいKd（Kd＜１μM）で、RAR受容体亜型の少なくとも一つと結合しなければならない。
【００５８】
本発明の化合物例について、表3はホロ受容体トランスアクチベーション検定法の試験結果を示し、表4は試験化合物の、オールトランスレチノイン酸と比較したこの検定法での有効性（％で示す）を示している。表5は本発明の化合物例のリガンド結合検定法の試験結果を示す。
【００５９】
【表３】
2008280346.tif 000010
表3に示す0.0は、その化合物が、この検定法において、オールトランスレチノイン酸と比べて活性（有効性）が20％未満であることを示す。
【００６０】
【表４】
2008280346.tif 000011
【００６１】
【表５】
2008280346.tif 000012
【００６２】
表3,4および5に要約した試験結果から分かるように、これらの表に示した本発明の化合物例は、RAR受容体亜型の拮抗薬であるが、RXR受容体亜型に対し親和力がない（本発明の他の化合物は、いくつかのRAR受容体亜型の拮抗薬であるがすべてのRAR受容体亜型の拮抗薬ではなく、そしてそのほか残りのRAR亜型の作動薬である）。このような特性のため、本発明の化合物は、生物学的検定法においてRAR作動薬の活性を遮断するのに使用できる。ヒトを含む哺乳類の場合、本発明の化合物は、RAR作動薬と同時に投与することができ、薬理学的選択性または部位特異的送達によって、RAR作動薬の有害作用を優先的に防止することができる。また、本発明の化合物は、ビタミンA剤の過剰服用または高レベルのビタミンAを含有する特定の魚と動物の肝臓の摂取が原因の急性または慢性のビタミンA過剰症を処置するのにも使用できる。さらに、本発明の化合物は、レチノイド薬物によって起こる急性または慢性の毒性を処置するのにも使用できる。ビタミンA過剰症候群に見られる毒性（頭痛、皮膚剥離、骨毒性、異常脂肪血症）は、他のレチノイド類にみられる毒性と類似しているかまたは同一であり、このことは共通の生物学的原因すなわちRAR活性化を示唆していることは当該技術分野で公知である。本発明の化合物は、RARの活性化を遮断するので前記毒性を処置するのに適している。
【００６３】
本発明の化合物は、皮膚の局所に同時投与すると、RAR作動薬のレチノイドによって誘発される皮膚刺激を実質的に防止することができる。同様に、本発明の化合物は、皮膚に局所投与して、RAR作動薬化合物を全身的に投与されている患者または動物の皮膚刺激を遮断することができる。本発明の化合物は、既発のレチノイド毒性からの回復を促進し、同時投与されるレチノイド類によって起こる高トリグリセリド血症を遮断し、かつRAR作動薬（レチノイド）によって誘発される骨毒性を遮断することができる。
【００６４】
一般的に述べると、本発明にしたがって哺乳類の処置のために用いる場合、これら拮抗薬化合物は、ビタミンA、ビタミンA前駆体に対する解毒剤として、または過量投与もしくは長期間の暴露が原因のレチノイド毒性に対する解毒剤として、原因因子（ビタミンA前駆体または他のレチノイド）の摂取を停止した後、経腸でまたは局所に投与することができる。あるいは、これら拮抗薬化合物は、本発明にしたがってレチノイド薬物と同時に投与され、この場合、レチノイド薬物が処置面で利点を提供し、かつ同時投与されている拮抗薬がレチノイドの1種以上の望ましくない副作用を改善もしくは除く。この種の利用の場合、拮抗薬は、同時投与されるレチノイドを経腸で投与しながら、例えば局所に塗布されるクリーム剤またはローション剤として、部位特異的な方法で投与することができる。
【００６５】
本発明にしたがって処置に用いる場合、拮抗薬化合物は、当該技術分野でそれ自体公知の医薬として許容される賦形剤と担体を用いて、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤などの医薬組成物中に組み込まれる。例えば、局所投与用配合物の製法は、”Remington's Pharmaceutical Science”第17版、米国ペンシルベニア州イーストン所在のMack Publishing Company発行に十分に記載されている。局所に適用する場合、これら拮抗薬化合物は粉末またはスプレーとして特にエアゾルの形態で投与することもできる。薬物を全身的に投与したい場合、薬物は、粉末薬、丸剤、錠剤など、または経口投与用に適したシロップ剤もしくはエリキシル剤として調合され得る。静脈内または腹腔内投与の場合、拮抗剤化合物は注射で投与できる液剤または懸濁剤として調製され得る。ある場合には、拮抗薬化合物を調合して注入剤にすることが有用であり得る。ある場合には、拮抗薬化合物を、坐剤の形態で、または皮下に保持する徐放性製剤として、または筋肉内注射剤として調合することが有用であり得る。
【００６６】
本発明の拮抗薬化合物は、本発明にしたがって処置上有効な投与量で投与される。処置濃度は、特定の症状（例えばレチノイドもしくはビタミンAに対する暴露が原因の毒性またはレチノイド薬物の副作用）を軽減するかまたはその拡大を防止する濃度であり得る。レチノイドが誘発する毒性または副作用を本発明にしたがって遮断するため拮抗薬化合物と同時に投与する場合、その拮抗薬化合物は、皮膚刺激のようなある種の症状の発症を防ぐため、予防用に使用されると解すべきである。
【００６７】
有用な治療濃度または予防濃度は、症状毎に変化し、そして場合によっては、処置症状の重症度および処置に対する患者の感受性によって変わり得る。したがって単一の濃度が等しく有効ではなく、慢性もしくは急性のレチノイド毒性または関連症状に応じて修正する必要があり得る。このような濃度は、ルーチン試験によって決めることができる。しかし、配合物1 ml当たり0.01〜1.0 mgの拮抗薬化合物を含有する配合物が、局所適用用に処置上有効であると考えられる。全身的に投与する場合、体重1 kg当たり毎日0.01〜5 mgの量が処置効果をもたらすと考えられる。
【００６８】
RAR作動薬が誘発する毒性の予防または治療に対するRAR拮抗薬の有用性の基礎は、RAR作動薬によるRAR受容体の活性化の競合阻害である。RAR拮抗薬のこれら二つの利用法の主な差は、レチノイドの毒性がすでに存在しているか否かという差である。すぐ後に述べる実施例の大部分は、レチノイドの毒性を予防するためレチノイド類を使用することに関するものであるが、ここに記載されている一般的方法は、すでに存在しているレチノイドの毒性を治療するのにも利用できる。
【００６９】
RAR拮抗薬を使用してレチノイドの毒性および／またはレチノイド薬物の副作用を予防または治療することを示す実験の説明
実施例１  局所投与アゴニストによって誘発される皮膚刺激の、局所投与アンタゴニストによる処置
ＡＧＮ１９１１８３と命名した化合物、４−[(Ｅ)−２−(５,６,７,８−テトラヒドロ−５,５,８,８−テトラメチルナフタレン−２−イル)プロペン−１−イル]安息香酸は、強力なＲＡＲアゴニスト(作動薬)として先行技術において既知である(例えば、米国特許第５３２４８４０号の発明の説明の部分および図２Ｂを参照)。ここで、「ＡＧＮ」番号は、化合物識別のために、本発明の法人譲受人によって使用される任意に指定された参照番号である。
【００７０】
４−[(５,６−ジヒドロ−５,５−ジメチル−８−(フェニル)−２−ナフタレニル)エチニル]安息香酸(ＡＧＮ１９２８６９、化合物６０ａとも言う)は、下記にその製造方法が記載される化合物である。この化合物はＲＡＲアンタゴニスト(拮抗薬)である。
【００７１】
無毛マウスにおいて、局所投与されるＲＡＲアゴニストＡＧＮ１９１１８３によって誘発される皮膚刺激を、これもまた局所投与されるＡＧＮ１９２８６９によってブロックすることができる。
【００７２】
より具体的には、皮膚の薄片剥離(flaking)および表皮剥離(abrasions)の毎日の主観的評価によって、半定量的尺度に基づいて、皮膚刺激を測定した。単一数の、局所刺激評点は、実験期間中に動物に誘発された皮膚刺激を要約するものである。局所刺激評点は下記のように計算される。局所刺激評点は、複合薄片剥離評点および複合表皮剥離評点の代数的合計である。薄片剥離および表皮剥離に関する複合評点は、それぞれ０〜９および０〜８であり、最大重度(maximum severity)、開始時間、および観察される薄片剥離および表皮剥離の平均重度を考慮に入れる。
【００７３】
薄片剥離の重度は、５点尺度で評点付けし、表皮剥離の重度は、４点尺度で評点付けし、より高い評点は重度が高いことを示す。複合評点の最大重度成分は、観察中の所定動物に割り当てられる日々の最も高い重度評点である。
【００７４】
複合評点の開始時間成分に関しては、０〜４の評点が下記のように割り当てられる。
【表６】
2008280346.tif 000013
【００７５】
複合評点の平均重度成分は、観察日数で割った、毎日の薄片剥離または表皮剥離評点の合計である。薬剤成分が初回処置時には効力を生じる場合が無かったので、処置の第一日目は数えない。
【００７６】
複合の薄片剥離および表皮剥離評点を計算するために、平均重度および開始時評点を合計し、２で割る。この結果を最大重度評点に加える。次に、複合の薄片剥離および表皮剥離評点を合計して、合計局所刺激評点を得る。各動物が局所刺激評点を与えられ、その値を、動物群の個々の評点の平均±ＳＤとして表す。
【００７７】
雌無毛マウス[Crl:SKH1-hrBR](８〜１２週齢、ｎ＝６)を、アセトン、ＡＧＮ１９１１８３、ＡＧＮ１９２８６９、またはＡＧＮ１９２８６９と１９１１８３との何らかの組み合わせによって、５日連続して局所的に処置した。各化合物の投与量を表７に示す。４ml/kg(約０.１ml)の全容量で、背側の皮膚に処置を施す。最後の処置、即ち第８日目以後、３日目まで(３日目を含む)、マウスを毎日観察し、薄片剥離および表皮剥離に関して評点を付けた。
【００７８】
【表７】
2008280346.tif 000014
【００７９】
実施例１に関する局所刺激評点が表７に示されている。アセトン(ビヒクル)およびＡＧＮ１９２８６９(アンタゴニスト)[１.５mg/kg/d(グループＦ)]のどちらも、観察できる局所刺激を生じなかった。ＡＧＮ１９１１８３、ＲＡＲアゴニストは、０.０２５mg/kg/dの投与量において、中度の局所刺激を生じさせた。しかし、ＡＧＮ１９１１８３誘発局所刺激は、ＡＧＮ１９２８６９によって投与量依存的に阻害され、５０倍モル過剰のＡＧＮ１９２８６９の存在下にほぼ完全に刺激を排除した。このことは、局所ＲＡＲアンタゴニストが、局所ＲＡＲアゴニストによって生じる皮膚刺激をブロックすることを示している。４−[(５,６−ジヒドロ−５,５−ジメチル−８−(４−メチルフェニル)−２−ナフタレニル)エチニル]安息香酸(ＡＧＮ１９３１０９、本出願において化合物６０とも言う)のように、ＲＡＲアンタゴニストがより強力である場合には、ＲＡＲアゴニスト誘発皮膚刺激の完全なブロックが、アンタゴニスト対アゴニストのより低いモル比を用いても達成することができる。
【００８０】
実施例２  経口投与アゴニストによって誘発される皮膚刺激の、局所投与アンタゴニストによるブロック
強力なＲＡＲアゴニストＡＧＮ１９１１８３(４−[(Ｅ)−２−(５,６,７,８−テトラヒドロ−５,５,８,８−テトラメチルナフタレン−２−イル)プロペン−１−イル]安息香酸)、および強力なＲＡＲアンタゴニスト、４−[(５,６−ジヒドロ−５,５−ジメチル−８−(４−メチルフェニル)−２−ナフタレニル)エチニル]安息香酸(ＡＧＮ１９３１０９、化合物６０)をこの実施例において使用し、被験動物(マウス)の体重を、全身性のＲＡＲアゴニスト曝露のマーカーとして使用した。
【００８１】
雌無毛マウス(８〜１２週齢、ｎ＝６)のグループを、コーン油、またはコーン油(５ml/kg)中に懸濁されたＡＧＮ１９１１８３(０.２６mg/kg)の胃内挿管によって処置した。同時に、ビヒクル(９７.６％アセトン／２.４％ジメチルスルホキシド)、またはビヒクル(６ml/kg)中のＡＧＮ１９３１０９の溶液を用いて、背側の皮膚において、マウスを局所的に処置した。種々の処置グループの具体的な投与量を、表８に示す。処置は、４日間連続して毎日行った。マウスの体重を計り、最後の処置から１日後（その日を含む）まで、実施例１に記載のように、局所刺激を毎日評価した。初期体重(第１日)から最終体重(第５日)を引き、初期体重で割り、１００％を掛けることによって、体重変化のパーセントを計算する。局所刺激評点を、実施例１と同様に計算する。
【００８２】
種々のグループの局所刺激評点および体重減少を、表８に示す。局所ビヒクルおよび経口ビヒクル、即ち、それぞれアセトンおよびコーン油を用いる組み合わせ処置は、局所刺激も体重減少も生じなかった。同様に、経口ビヒクルおよび局所アンタゴニストＡＧＮ１９３１０９を用いる組み合わせ処置も、局所刺激も体重減少も生じなかった。経口ＡＧＮ１９１１８３は単独で、実質的な体重減少および皮膚刺激を誘発した。ＡＧＮ１９１１８３誘発皮膚刺激は、より少ない投与量のＡＧＮ１９３１０９と組み合わせた場合に実質的に減少し、より多い投与量のＡＧＮ１９３１０９において完全にブロックされた。ＡＧＮ１９１１８３誘発体重減少も、局所ＡＧＮ１９３１０９によって、投与量に比例してブロックされたが、ブロックは完全ではなかった。従って、局所ＡＧＮ１９３１０９は、ＡＧＮ１９１１８３の皮膚毒性を、選択的にブロックした。おそらく、低レベルのＡＧＮ１９３１０９が全身的に吸収され、従って、ＡＧＮ１９１１８３によって誘発される体重減少を部分的にブロックしたのであろう。しかし、そのような吸収は、ヒトのような、より少ない浸透性の皮膚を有する種においては、かなり少ないと考えられる。または、ＡＧＮ１９３１０９による体重減少阻害は、ＡＧＮ誘発皮膚刺激の改善によるものであろう。
【００８３】
【表８】
2008280346.tif 000015
【００８４】
このように実施例２は、局所投与ＲＡＲアンタゴニストを用いて、経口投与されたＲＡＲアゴニストによって誘発される皮膚刺激を選択的にブロックし得ることを示す。
【００８５】
実施例３  局所投与アンタゴニストによる、既存のレチノイド毒性からの回復の促進
この実施例においては、ＲＡＲアゴニストＡＧＮ１９１１８３を用いて体重減少を誘発し、次に、被験動物を、ビヒクル、またはＲＡＲアンタゴニストＡＧＮ１９３１０９のどちらかを用いて局所的に処置する。
【００８６】
雌無毛マウス(８〜１２週齢、ｎ＝５)を、ビヒクル(９７.６％アセトン／２.４％ＤＭＳＯ、４ml/kg)中のＡＧＮ１９１１８３(０.１３mg/kg/d)を用いて、２日間、毎日、局所的に処置した。これらの同じマウスのグループ(ｎ＝５)を次に、ビヒクル、またはビヒクル(４ml/kg)中のＡＧＮ１９３１０９のどちらかを用いて、第３日目から開始して３日間連続して、毎日、局所的に処置した。第１日目〜第５日目、および第８日目にマウスの体重を計った。体重を、平均±ＳＤとして表す。平均値を、無対の２テールｔ−検定(unpaired,two-tailed t-test)を用いて、統計的に比較した。Ｐ＜０.０５において、差異が有意であると見なした。
【００８７】
【表９】
2008280346.tif 000016
【００８８】
実施例３の体重の時間推移を、表９に示す。マウスの両グループの体重が、第１日目および第２日目のＡＧＮ１９１１８３処置の結果として、第２日目および第３日目に対等に減少した。２つのグループの体重は、第１日目、第２日目、または第３日目において、有意な差異がなかった。しかし、ＡＧＮ１９３１０９処置は、第４日目および第５日目において、ビヒクル処置に比較して有意に体重を増加させた。これらのデータは、ＡＧＮ１９１１８３誘発体重減少からの回復が、続くＡＧＮ１９３１０９での処置によって促進されたことを示した。第８日目においては、マウスの２つのグループ間において体重に有意な差はなく、このことは、所定の充分な時間を与えられた両グループにおいて、充分な回復が達成されたことを示している。従って、ＲＡＲアゴニスト誘発毒性がＲＡＲアンタゴニスト処置に先行する場合でもさえも、即ち、ＲＡＲアゴニスト毒性シナリオにおいてさえも、ＲＡＲアンタゴニストは、ＲＡＲアゴニスト誘発毒性を軽減させるのに有効である。
【００８９】
実施例４  経口投与アンタゴニストによる、経口同時投与レチノイドアゴニストによって誘発される高トリグリセライド血症のブロック
５−[(Ｅ)−２−(５,６,７,８−テトラヒドロ−３,５,５,８,８−ペンタメチルナフタレン−２−イル)プロペン−１−イル]−２−チオフェンカルボン酸は、既知のＲＡＲ/ＲＸＲパン−アゴニスト(pan-agonist)であり(米国特許第５３２４８４０号、コラム３２を参照)、ＡＧＮ１９１６５９と命名されている。この化合物を、ラットにおいて、急性高トリグリセライド血症を誘発させるために経口的に使用し、ＡＧＮ１９３１０９、化合物６０を、経口的に同時投与して、ＡＧＮ１９１６５９誘発の高トリグリセライド血症をブロックした。
【００９０】
雄フィッシャーラット(６〜７週齢、ｎ＝５)を、コーン油(ビヒクル)、ＡＧＮ１９１６５９、ＡＧＮ１９３１０９、またはＡＧＮ１９１６５９とＡＧＮ１９３１０９との組み合わせを用いて、胃内挿管によって処置した。ＡＧＮ１９１６５９とＡＧＮ１９３１０９は、コーン油中の微細懸濁液として与えた。投与量を含む実験デザインを、表１０に示す。
【００９１】
二酸化炭素麻酔下に、下大静脈から採血した。低速遠心分離によって、血液から血清を分離した。キットとして市販されており、９６穴プレートフォーマットに適合された標準分光光度エンドポイントアッセイを用いて、合計血清トリグリセリド(トリグリセリド＋グリセロール)を測定した。血清トリグリセリドレベルを、平均±ＳＤとして表す。分散の一方向分析によって、平均値を統計的に比較し、有意な差異が見い出された場合には、Dunnett試験を引き続いて行った。Ｐ＜０.０５において、差異が有意であると見なした。
【００９２】
表１０に示すように、ビヒクル処置と比較して、ＡＧＮ１９１６５９は単独で、血清トリグリセリドの有意な増加を生じさせた。ＡＧＮ１９３１０９は単独で、血清トリグリセリドを有意に増加させなかった。重要なことに、１：１および５：１のモル比における、ＡＧＮ１９３１０９とＡＧＮ１９１６５９との組み合わせは、血清トリグリセリドを、対照標準と有意に異ならないレベルに減少させた。
【００９３】
【表１０】
2008280346.tif 000017
【００９４】
実施例４は、ＲＡＲアンタゴニストを使用して、同時投与レチノイドによって誘発される高トリグリセリド血症をブロックしうることを示す。
【００９５】
実施例５  非経口投与アンタゴニストによる、非経口同時投与したレチノイドアゴニストによって誘発される骨毒性の阻止
実施例５はRARアンタゴニストがRARアゴニストによって誘発される骨毒性を阻止しうることを示す。この実施例においては、モルモットに同時投与したRARアゴニストAGN 1931183によって引き起こされた早発骨端軟骨の閉鎖を阻止するためにAGN139109を使用する。
【００９６】
雄ハートレイモルモットの群(〜３週齢、n=4)に、ビヒクル(20 %ジメチルスルホキシド/80 %ポリエチレングリコール-300)、AGN 191183(0.06 mg/ml)またはAGN 193109(0.34 mg/ml)と組み合わせたAGN 191183(0.06 mg/ml)を含む浸透圧ポンプを腹腔内に埋め込んだ。該浸透圧ポンプは、メーカーによって、溶液を毎時〜５μlの流速で連続14日間送液するように設計されている。
【００９７】
埋め込みの14日後に、動物を二酸化炭素によって安楽死させた。左側脛骨を摘出し、10 %緩衝ホルマリンに入れた。その脛骨をギ酸/ホルマン溶液に3〜4日間曝露して脱灰し、それからパラフィン切片を作成した。標準法に従い、切片はヘマトキシリンとエオシンで染色した。近位の脛骨骨端軟骨を検査し、閉鎖の有無によって採点した。本発明において骨端軟骨の閉鎖とは、骨端成長軟骨の連続性に何らかの欠如、すなわち骨または線維芽細胞組織もしくは両者による置換を言う。
【００９８】
ビヒクルで処理した４匹のモルモットはいずれも、実験の終了時までに骨端軟骨の閉鎖を示さなかった。モルモットの脛骨の近位骨端軟骨は、普通、少なくとも10月齢まで閉鎖しないので、この結果は予想されたことである。AGN 191183で処置した全モルモット４匹が部分的または完全な骨端軟骨の閉鎖を示した。しかし、AGN 191183とAGN 193109の組み合わせで治療したモルモットはすべて骨端軟骨の閉鎖を示さなかった。このように、AGN 193109とAGN 191183を同時投与した場合、AGN191183によって誘発される骨毒性は、５倍モル過剰のAGN 193109によって完全に阻止された。
【００９９】
ＲＡＲアンタゴニスト化合物
化合物、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸(AGN 193109、化合物60)および4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(フェニル)2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸(AGN 192869、化合物60a)は、本発明に従ってRAR受容体をブロックするための上述の動物試験に使用されたRARアンタゴニストの例である。以下の式(式１)で示される化合物は、本発明に従って使用される他のRARアンタゴニスト化合物のさらに別の一般的な例となる。
【０１００】
【化５】
2008280346.tif 000018
【０１０１】
式１において、ＸはＳ、Ｏ、ＮＲ'(ここで、Ｒ'はＨまたは炭素数１〜６個のアルキルである)であるか、またはＸは[Ｃ(Ｒ１)２]ｎ(ここで、Ｒ１はＨまたは炭素数１〜６個のアルキルであり、ｎは０または１である)であり；
Ｒ２は水素、炭素数１〜６個の低級アルキル、Ｆ、ＣＦ３、炭素数１〜６個のフッ素置換アルキル、ＯＨ、ＳＨ、炭素数１〜６個のアルコキシ、または炭素数１〜６個のアルキルチオであり；
Ｒ３は水素、炭素数１〜６個の低級アルキルまたはＦであり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｏは０〜３の整数であり；
Ｚは、-Ｃ≡Ｃ-、
-Ｎ＝Ｎ-、
-Ｎ＝ＣＲ１、
-ＣＲ１＝Ｎ、
-(ＣＲ１＝ＣＲ１)ｎ'- (ここで、n'は０〜５の整数である)、
-ＣＯ-ＮＲ１-、
-ＣＳ-ＮＲ１-、
-ＮＲ１-ＣＯ、
-ＮＲ１-ＣＳ、
-ＣＯＯ-、
-ＯＣＯ-、
-ＣＳＯ-、
-ＯＣＳ-であり；
Ｙはフェニル基またはナフチル基、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、イミダゾリルおよびピラゾリルからなるグループから選ばれたヘテルアリール(該フェニル基およびヘテロアリール基は、任意に１個または２個のＲ２基で置換されていてもよい)であるか、または
Ｚが-(ＣＲ１＝ＣＲ１)ｎ'-であり、n'が３、４または５である場合、Ｙは該(ＣＲ２＝ＣＲ２)ｎ'基とＢの間の直接的な原子価結合を表し；
【０１０２】
Ａは(ＣＨ２)ｑ(ここで、ｑは０〜５である)、炭素数３〜６個の低級分岐鎖アルキル、炭素数３〜６個のシクロアルキル、炭素数２〜６個の１または２個の二重結合を持つアルケニル、炭素数２〜６個の１または２個の三重結合を持つアルキニルであり；
Ｂは水素、ＣＯＯＨまたはその薬学的に許容しうる塩、ＣＯＯＲ８、ＣＯＮＲ９Ｒ１０、-ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＯＲ１１、ＣＨ２ＯＣＯＲ１１、ＣＨＯ、ＣＨ(ＯＲ１２)２、ＣＨＯＲ１３Ｏ、-ＣＯＲ７、ＣＲ７(ＯＲ１２)２、ＣＲ７ＯＲ１３Ｏまたはトリ低級アルキルシリル(ここで、Ｒ７は１〜５個の炭素を含むアルキル、シクロアルキルまたはアルケニル基であり、Ｒ８は１〜10個の炭素を含むアルキル基、アルキル基が１〜10個の炭素を持つトリメチルシリルアルキル、または５〜10個の炭素を含むシクロアルキル基であるか、またはＲ８はフェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ９およびＲ１０はそれぞれ独立して水素、炭素数１〜10個のアルキル基または炭素数５〜10個のシクロアルキル基またはフェニル基または低級アルキルフェニル基であり、Ｒ１１は低級アルキル、フェニルまたは低級アルキルフェニルであり、Ｒ１２は低級アルキルであり、Ｒ１３は炭素数２〜５個の２価アルキル基である)であり、そして
Ｒ１４は(Ｒ１５)ｒ-フェニル、(Ｒ１５)ｒ-ナフチルまたはＯ、Ｓ、Ｎからなるグループから選んだ１〜３個のヘテロ原子を持つ(Ｒ１５)ｒ-ヘテロアリールであり、ｒは０〜５の整数であり、そして
Ｒ１５は独立してＨ、Ｆ、Ｃl、Ｂr、Ｉ、ＮＯ２、Ｎ(Ｒ８)２、Ｎ(Ｒ８)ＣＯＲ８、ＮＲ８ＣＯＮ(Ｒ８)２、ＯＨ、ＯＣＯＲ８、ＯＲ８、ＣＮ、１〜10個の炭素を含むアルキル基、１〜10個の炭素を持つフルオロ置換アルキル基、１〜10個の炭素および１〜３個の二重結合を持つアルケニル基、１〜10個の炭素および１〜３個の３重結合を持つアルキニル基、またはアルキル基がそれぞれ独立して１〜６個の炭素を持つトリアルキルシリルもしくはトリアルキルシリルオキシ基である。
【０１０３】
合成法−アリール置換化合物
式１で示される例示的なＲＡＲアンタゴニスト化合物は、ここに図示する化学合成経路によって作ることができる。合成化学の同業者は、ここに開示する条件が式１で表される化合物のすべてに一般化しうる特定態様であることを容易に理解するであろう。
【０１０４】
【化６】
2008280346.tif 000019
【０１０５】
【化７】
2008280346.tif 000020
【０１０６】
反応式１は、Z基がエチニル基(-C≡C-)であり、Xが[C(R１)２]ｎ（nは１である）である式１の化合物の合成を図示するものである。すなわち、反応式１は、本発明のエチニル置換ジヒドロナフタレン誘導体の合成を図示するものである。本反応式に従い、式６のテトラヒドロナフタレン-1-オン化合物を臭素化すると式７の臭素誘導体が得られる。式６の化合物は、式１に関連して上で定義した所要の置換基R１、R２およびR３を既に持っている。式６の化合物の好ましい例は、3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-1(2H)-ナフタレンであり、これは化学文献[Arnoldら、J. Am. Chem. Soc. 69: 2322-2325 (1947)]に記載されている。1-ブロモ-3-フェニルプロパンからこの化合物を合成するための現時点で好ましい経路を、本願の実験の項に記載する。
【０１０７】
次に、式７の化合物を(トリメチルシリル)アセチレンと反応させると式８に示す(トリメチルシリル)エチニル置換3,4-ジヒドロナフタレン-1(2H)-オン化合物が得られる。(トリメチルシリル)アセチレンの反応は、典型的には、不活性ガス(アルゴン)の雰囲気下、ヨウ化第一銅、適当な触媒、すなわち典型的なものとしてはPd(PPh３)２Cl２の式で表される触媒、および酸受容体(たとえばトリエチルアミン)の存在下に加熱下(約100℃)で実施される。典型的な反応時間は、約24時間である。次に、式８の(トリメチルシリル)エチニル置換 3,4-ジヒドロナフタレン-(2H)-オン化合物をアルコール溶媒、たとえばメタノール中で塩基(水酸化カリウムまたは炭酸カリウム)と反応させて、式９のエチニル置換3,4-ジヒドロ-1-ナフタレン-1(2H)-オンを得る。続いて、式９の化合物を、不活性ガス(アルゴン)の雰囲気下、ヨウ化第一銅、適当な触媒、すなわち典型的にはPd(PPh３)２Cl２、およびトリエチルアミンのような酸受容体の存在下に芳香族試薬またはヘテロ芳香族試薬X１-Y(R２)-A-B'(式10)とカップリングさせる。あるいは、別の方法として、式９の化合物の亜鉛塩(または他の適当な金属塩)をPd(PPh３)４またはそれと同類の錯体の存在下に式10の試薬とカップリングさせることもできる。典型的には、試薬X１-Y(R２)-A-B'(式10)とのカップリング反応は室温、または中程度に昇温した温度で実施される。一般的に言えば、エチニルアリール誘導体またはその亜鉛塩と式10の試薬のようなハロゲン置換アリールまたはヘテロアリール化合物のカップリングは米国特許第5,264,456号に記載されている。式11の化合物は、本発明の例示化合物またはその誘導体(B'基が保護され、その保護基を公知の反応によって容易に除去できる)の前駆体である。また、式11の化合物は、公知の反応および変換法によって、該例示化合物へのさらに別の前駆体に変換することもできる。この種の反応は、反応式１の中に、「同族体および誘導体」への変換として表示されている。いくつかの例示化合物の合成に使用されたそのような変換反応の１つは、エステル基(BまたはB'がエステル基の場合)を加水分解して遊離のカルボン酸またはその塩を与えるものである。
【０１０８】
式10のハロゲン置換アリールまたはヘテロアリール化合物は、一般的に言って、公知の反応によって得ることができる。そのような化合物の１例は、４-ヨード安息香酸エチルであり、この化合物は、たとえば４-ヨード安息香酸のエステル化によって得ることができる。別の例は、6-ヨードニコチン酸エチルであり、このエステルは6-クロロニコチン酸のハロゲン交換反応と、それに続くエステル化によって得ることができる。さらにもっと一般的に言えば、式11の化合物からの誘導体の合成および／または後に式９の化合物と反応させることができる式10のアリール化合物およびヘテロアリール化合物の合成に関しては、次に述べる公知の発表された一般的な原理と合成法を適用することができる。
【０１０９】
カルボン酸は、典型的には、適当なアルコールの溶液中で塩化水素または塩化チオニルのような酸触媒の存在下に当該の酸を還流させることによってエステル化することができる。別の方法として、当該のカルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に適当なアルコールと縮合することができる。エステルは常法によって回収し、精製することができる。アセタールとケタールは、March著、"Advanced Organic Chemistry”第２版、McGraw-Hill Book Company、第180ページに記載されている方法によって容易に製造される。アルコール、アルデヒドおよびケトンはすべて、たとえばMcOmie著、Plenum Publishing Press, 1973およびGreene編、Protecting Group、John Wiley & Sons, 1981に記載されているような公知の方法によって、それぞれエーテルおよびエステル、アセタールまたはケタールを形成させることにより保護してもよい。
【０１１０】
反応式１のカップリング反応を行う前に、式10の化合物のnの値を大きくするには(式10に相当する化合物を、市販品として入手することができない場合)、芳香族カルボン酸またはヘテロ芳香族カルボン酸をアルント−アイシュテルト反応条件または別の同族体化法によって順次処理して同族体に変換する。別の方法として、カルボン酸ではない誘導体を適切な方法で同族体化してもよい。次に、この同族体化した酸を、前節で概説した一般的な方法により、エステル化することができる。
【０１１１】
Aが１個または複数個の二重結合を持つアルケニル基である式10の化合物(または他の中間体または例示化合物)は、たとえば、有機合成化学を専門とする同業者に公知の合成反応式、たとえば、ウィッティッヒ反応とその類似反応、またはα-ハロアリールアルキルカルボン酸、エステルまたは同類のカルボキシアルデヒドからのハロゲンの脱離による二重結合の導入によって作ることができる。式10において、グループAが三重結合(アセチレン結合)を持つ化合物(または他の中間体または例示化合物)は、相当する芳香族メチルケトンと、たとえばリチウム ジイソプロピルアミドのような強塩基との反応、クロロリン酸ジエチルとの反応、そしてそれに続くリチウム ジイソプロピルジアミドの添加によって作ることができる。
【０１１２】
式11の化合物から誘導される酸および塩(または他の中間体または例示化合物)は相当するエステルから容易に得ることができる。アルカリ金属塩基で塩基性加水分解すれば当該の酸が得られる。たとえば、式11のエステル(またはその他の中間体または例示化合物)をアルカノールのような極性溶媒中、好ましくは不活性雰囲気下、室温で約３モル過剰の塩基、たとえば水酸化リチウムまたは水酸化カリウムによって溶解してもよい。溶液を、15時間〜20時間攪拌し、冷却し、酸性化し、常法によって加水分解物を回収する。
【０１１３】
アミドは、相当するエステルまたはカルボン酸から公知の適当なアミド化法によって生成させることができる。このような化合物を作る１つの方法は、酸を酸塩化物に変換し、それからその化合物を水酸化アンミニウムまたは適当なアミンで処理することである。
【０１１４】
アルコールは、相当する酸を塩化チオニルまたはその他の方法で酸塩化物に変換し(J.March、Advanced Organic Chemistry、第２版、McGraw-Hill Book Company)、それからその酸塩化物を水素化ホウ素ナトリウムで還元することにより(March、同書、1124ページ)、対応するアルコールが得られる。別の方法として、エステルを低温で水素化アルミニウムリチウムで還元しても良い。これらのアルコールをウィリアムソンの反応条件下で適当なハロゲン化アルキルでアルキル化すると対応するエーテルが得られる(March、同書、357ページ)。これらのアルコールは、酸触媒またはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に適当な酸と反応させることにより、エステルに変換することができる。
【０１１５】
アルデヒドは、相当する１級アルコールから、ジクロロメタン中でたとえばピリジニウム ジクロマート(Corey, E.J.,Schmidt, G., Tet. Lett. 399, 1979)、またはジクロロメタン中、ジメチルスルホキシド/オキサリルクロリド(Omura,K., Swern, D.,Tetrahedron 34: 1651(1978))のような穏和な酸化剤を使って合成することができる。
【０１１６】
ケトンは、適当なアルデヒドをアルキルグリニャール試薬で処理するかまたは類似の試薬で処理した後、酸化することによって調製することができる。
アセタールまたはケタールは相当するケトンまたはアルデヒドから文献(March著、同書、810ページ)に記載の方法によって調製することができる。
【０１１７】
Bが水素である式10の化合物(または他の中間体または例示化合物)は、相当するハロゲン化芳香族化合物またはヘテロ芳香族化合物、好ましくはハロゲンがヨウ素である化合物から調製することができる。
【０１１８】
ここで再び反応式１に戻って、式11の化合物に、テトラヒドロフランのようなエーテルタイプの不活性溶媒中、低温(-78℃および0℃)でナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミドおよび2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジンを反応させる。この反応は反応式１に示されているが、通常単離しないナトリウム塩中間体は式12のようにカッコ内に示してある。反応の結果、式13で表されているトリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体(Tf = SO２CF３)が生成する。次いで、式13の化合物を、アリール化合物またはヘテロアリール化合物R１４Hから誘導した有機金属化合物、すなわちR１４Met(Metは１価の金属)、好ましくはR１４Li(R１４は式１に関連して定義されている)と反応させることにより、式14で示される本発明の例示化合物に変換する。有機金属誘導体、好ましくは式R１４Liで示されるリチウム誘導体との反応は、通常、エーテルタイプの溶媒(たとえばテトラヒドロフラン)中、塩化亜鉛(ZnCl２)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)(Pd(PPh３)４)の存在下で行う。有機リチウムR１４Liが市販されていない場合は、公知の方法に従って、エーテルタイプの溶媒中で化合物R１４H(またはそのハロゲン誘導体R１４-X１;ここでX１はハロゲン)から調製することができる。試薬R１４Liと式13の化合物の間の反応の温度範囲は、一般的に言って、およそ-78℃から50℃の範囲である。式14の化合物は、上で述べた反応に従って、さらに同族体および誘導体に変換することができる。
【０１１９】
反応式１に示されている式７の中間体7-ブロモテトラヒドロナフタレン-1-オン化合物を、式R１４MgBr(R１４は式１と関連して定義されている)で表されるグリニャール試薬で変換すると、式15の三級アルコールが生成する。この三級アルコールを酸で処理すると脱水され、3,4-ジヒドロ-7-ブロモナフタレン誘導体が得られる。この誘導体は、本発明のさらに別の化合物を合成するための中間体として使用することができる(反応式６、７および８を参照)。
【０１２０】
【化８】
2008280346.tif 000021
【０１２１】
次に説明する反応式２では、式１においてXがS、OまたはNR'であり、Z基がエチニル基(-C≡C-)である化合物の合成経路について述べる。この一連の反応の出発原料は、式17に示されている構造のブロモフェノール、ブロモチオフェノールまたはブロモアニリンである。本明細書を簡単にするため、以下の記述でXは、たとえばベンゾチオピラン誘導体の合成の場合のように、主として硫黄を考えることができる。しかし、ここに記した反応式は、同業の専門家には容易に分かるような変更を加えることによって本発明のベンゾピラン(X = O)およびジヒドロキノリン(X = NR')化合物にも適していることを念頭に置いておくべきである。かくして、式17の化合物、好ましくはp-ブロモチオフェノール、p-ブロモフェノールまたはp-ブロモアニリンと式18で表される3-ブロモカルボン酸と塩基性条件で反応させる。この反応式で、記号は式１に関連して説明した意味を持つ。R３が水素である式18の試薬の例は、3-ブロモプロピオン酸である。式18の3-ブロモカルボン酸との反応により式19の化合物が生成する。後者の化合物を酸で処理すると環化して式20の6-ブロモチオクロマン-4-オン誘導体(XがSの場合)または6-ブロモクロマン誘導体(XがOの場合)が得られる。続いて、式20のブロモ化合物に、式７のブロモ化合物から本発明の化合物への変換に関して反応式１に記述されている類似の反応条件下で実質的に同じ一連の反応を行う。従って、ここでは簡潔に要約して述べる。式20のブロモ化合物を(トリメチルシリル)アセチレンと反応させ、式21の6-(トリメチルシリル)エチニル置換チオクロマン-4-オンまたはクロマン-4-オン化合物を得る。次に、式21の6-(トリメチルシリル)エチニル置換チオクロマン-4-オンを塩基(水酸化カリウムまたは炭酸カリウム)と反応させ、式22のエチニル置換6-エチニル置換チオクロマン-4-オンを得る。続いて、式22の化合物を芳香族試薬またはヘテロ芳香族試薬X１-Y(R２)-A-B'(式10)と、反応式１の類似反応に対して記述した条件と同様な条件下でカップリングさせて式23の化合物を得る。
【０１２２】
次に、式23の化合物を、やはり反応式１に記載した類似反応と同様な条件下にナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミドおよび2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジンと反応させ、式24に表される4-トリフルオロメチルスルホニルオキシベンゾチオピランまたはベンゾピラン誘導体を得る。次に、式24の化合物を、反応式１に関連して記述したように、アリールまたはヘテロアリール化合物R１４Hから誘導される有機金属誘導体と反応させ、式25に示す化合物に変換する。
【０１２３】
反応式１の式７で表される中間体7-ブロモテトラヒドロナフタレン-1-オン化合物の利用と同様に、式20で表される中間体6-ブロモチオクロマン-4-オン化合物も、以下の反応式６、７および８に述べる本発明の範囲内のさらに別の化合物の合成に使用することができる。式25の化合物も、反応式１に関連して述べた反応と同様の反応において、さらに別の同族体および誘導体に変換することができる。
【０１２４】
【化９】
2008280346.tif 000022
【０１２５】
反応式３は、式１においてXが[C(R１)２]ｎであり、nが０であり、そしてZ基がエチニル基(-C≡C-)である化合物の合成経路を示す。この反応式に従い、式26の6-ブロモ-2,3-ジヒドロ-1H-インデン-1-オン誘導体に、反応式１および２に関連して上で述べた反応と類似のトリメチルシリルアセチレンとの反応で始まる一連の反応を行い、式27〜30の中間体を経由して、式31のインデン誘導体を得る。反応式３の範囲内の好ましい態様において、出発原料は、化学文献(Smithほか、Org.Prep Pro-ced.Int., 1978, 10, 123-131を参照)に従って入手できる6-ブロモ-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オンである。式26の化合物、たとえば6-ブロモ-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オンは、以下に述べる本発明で使用するためのさらに別の例示化合物の合成にも使用することができる。
【０１２６】
【化１０】
2008280346.tif 000023
【０１２７】
次に、反応式４に沿って、式１において、Zが-(CR１=CR１)ｎ'-であり、n'が３、４または５であり、そしてYが(CR１=CR１)ｎ'基とBの間の直接原子価結合である例示化合物への合成経路を開示する。ここでは、X基が[C(R１)２]ｎであり、nが１である場合(ジヒドロナフタレン誘導体)を例として合成経路を述べる。しかし、反応式４およびそれに続く反応式に記述されている反応と方法は、同業者にとって容易に分かるような変更を加えることにより、XがS、O、NR'(ベンゾチオピラン、ベンゾピランまたはジヒドロキノリン誘導体)または[C(R１)２]ｎであってnが０の誘導体(インデン誘導体)にも適用することができることを認識すべきである。
【０１２８】
反応式４に従って、式32の1,2,3,4-テトラヒドロナフタレン誘導体を酸塩化物(R１COCl)とフリーデルクラフツ反応条件下で反応させ、生成したアセチル化物を、たとえばジョーンズ酸化反応によって酸化し、異性体混合物である式32の6-および7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン誘導体を得る。この反応の具体的な好ましい例において、式32の出発化合物は、本明細書の実験の部に記載したプロセスに従って合成することができる1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレン(既知化合物)である。式33の7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン誘導体を酸の存在下にエチレングリコールと反応させ、式34で表されるケタール誘導体として環外ケトン部分のオキソ基を保護する。次に、式34のケタールを式R１４MgBrで表されるグリニャール試薬(記号は式１に関連して定義されたものと同じである)と反応させ、式35の３級アルコールを得る。次に、ジオキソラン保護基を除去し、該３級アルコールを酸で処理して脱水し、式36の3,4-ジヒドロ-7-アセチルナフタレン誘導体を得る。式36の化合物のケトン基を式37のホスホナート試薬と強アルカリ条件下でホーナー−エモンス(またはそれと類似の)反応を行い、還元した後に式38のアルデヒド化合物を得る。強アルカリ条件下での式39の試薬とのさらに別のホーナー−エモンス(または類似の)反応により式40の化合物が生成する。後者は上に述べた反応に従ってさらに別の同族体および誘導体に変換することができる。好ましい化合物の合成に使用される式37のホーナー−エモンス試薬の具体例は、ジエチルシアノメチルホスホナートであり、式39のホーナー−エモンス試薬の例は、ジエチル-(E)-3-エトキシカルボニル-2-メチルアリルホスホナートである。
【０１２９】
【化１１】
2008280346.tif 000024
【０１３０】
反応式５は、Z基がアゾ基(-N=N-)である化合物の合成法を開示する。反応式４と同様、この方法はXが[C(R１)２]ｎであってnが１である例（ジヒドロナフタレン誘導体）について述べる。しかし、記述する合成法は、同業者にとって容易に分かるような変更を加えることによって、本発明に使用するためのすべてのアゾ化合物、すなわち、XがS、O、NR'(ベンゾチオピラン、ベンゾピランまたはジヒドロキノリン誘導体)または[C(R１)２]ｎであり、nが０(インデン誘導体)である化合物にも適用できることを認識しておくべきである。かくして、ニトロ化の標準的な条件下で式６の出発化合物にニトロ基を導入し、式41の3,4-ジヒドロ-7-ニトロ-1(2H)-ナフタレノン誘導体を得る。後者の化合物を還元して、式42の3,4-ジヒドロ-7-アミノ-1(2H)-ナフタレノン誘導体とし、それから、アゾ化合物を合成するために通常使用される条件(氷酢酸)下に、式ON-Y(R２)-A-Bのニトロソ化合物(式43)と反応させる。式43のニトロソ化合物は公知の方法に従って得ることができる。好ましい化合物の合成に使用されるそのような化合物の具体例は、4-ニトロソ安息香酸エチルである。次に、式44のアゾ化合物をナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミドおよび2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジンと反応させ、式45で表される4-トリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体を得る。次に、式45の化合物を、アリール化合物またはヘテロアリール化合物R１４Hから誘導される有機金属化合物と反応させ、式46で示されるアゾ化合物に変換する。これら最後の２つの反応、すなわち、4-トリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体への変換とそれに続く有機金属誘導体との反応は、反応式１、２および３に関連して上で述べてあり、例示のRARアンタゴニスト化合物に導く現時点で好ましいいくつかの合成法に使用される。
【０１３１】
【化１２】
2008280346.tif 000025
【０１３２】
反応式６は、式１において、Z基がCOO-またはCONR１(R１は好ましくはH)である化合物を合成するための好ましい合成法を開示する。これらのエステルおよびアミド誘導体は、反応式１で述べたようにして得ることができる式16の3,4-ジヒドロ-7-ブロモナフタレン誘導体から合成される。すなわち、式16の化合物を、不活性なエーテルタイプの溶媒、たとえばテトラヒドロフラン中で強塩基、たとえば、t-ブチルリチウムと低温で反応させ、次いで二酸化炭素(CO２)を加えると式47の5,6-ジヒドロ-2-ナフタレンカルボン酸誘導体が得られる。次に、式47の化合物を式:X２-Y(R２)-A-B[式中、X２はOHまたはNR１を表し、R１は好ましくは水素である]で示される化合物(式48)と反応させる。同業の専門家は、式48の化合物が、現在の技術水準に従って得ることができるアリールまたはヘテロアリールヒドロキシ誘導体またはアミノ誘導体であることを明確に理解するだろう。式47の化合物と式48の化合物の間の反応は、たとえば、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩および4-ジメチルアミノピリジンの存在下に両者をカップリングさせるような、様々な既知のエステルまたはアミド形成条件下で行うことができる。別の方法として、式47の化合物を対応する酸塩化物に変換し、それから塩基の存在下に式48の化合物とカップリングさせることができる。式49のアミド化合物またはエステル化合物は、上で述べたように、さらに別の同族体および誘導体に変換することができる。反応式６は、式１のXが[C(R１)2]ｎであり、nが１である例(ジヒドロナフタレン誘導体)に対して記述し、示すものであるが、ここに記述する方法はベンゾピラン、ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリンおよびインデン誘導体の合成にも適用することができる。
【０１３３】
式１において、Zが-OCO-、NR１CO、ならびに対応するチオエステルおよびチオアミド類似体である本発明の化合物は、臭素がアミノ基またはヒドロキシル基に置換されている式16の化合物から誘導される中間体から、米国特許第5,324,744号の教示に従って合成することができる。
【０１３４】
【化１３】
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【０１３５】
反応式７は、式１においてZが-(CR１=CR１)ｎ'-であり、n'が０である化合物を合成するための現時点で好ましい合成法について開示する。式50で表されるこれらの化合物は式16の化合物と式10のハロゲン化合物から誘導されるグリニャール試薬の間のカップリング反応で得ることができる。そのカップリング反応は典型的には、テトラヒドロフランのようなエーテルタイプの不活性溶媒中で、亜鉛塩とニッケル[Ni(0)]触媒の存在下に行われる。式50の化合物は上で述べたように、さらに別の同族体および誘導体に変換することができる。
【０１３６】
【化１４】
2008280346.tif 000027
【０１３７】
以下では反応式８において、Zが-(CR１=CR１)ｎ'-であり、n'が１である化合物を合成するための現時点で好ましい合成法について開示する。より具体的には反応式８は、Zがビニル基(-CH=CH)であってジヒドロナフタレン誘導体である化合物を合成するための現時点で好ましい方法を開示する。しかし、ここに開示する包括的な方法は、同業者にとって容易に分かるような変更を加えれば、同類のベンゾピラン、ベンゾチオピラン、ジヒドロキノリン化合物、およびビニル基が置換された化合物に拡張することができる。すなわち、反応式８に従い、式７の7-ブロモ-1(2H)-ナフタレノン誘導体と構造-CH２=CH-Y(R２)-A-B(式51)のビニル誘導体を、不活性ガス(アルゴン)雰囲気下、適当な触媒、典型的にはPd(PPh３)の式を持つ触媒、酸受容体(たとえばトリエチルアミン)の存在下に反応させる。この反応の条件は、式９のアセチレン誘導体と式10の試薬とのカップリングと類似しており(たとえば、反応式１を参照)、この反応形式はヘック反応として同業者には広く知られている。式51のビニル誘導体は、現在の技術水準に従って合成することができ、本発明に使用するのに好ましい化合物の合成に使用されるそのような試薬の例は4-ビニル安息香酸エチルである。
【０１３８】
ヘックのカップリング反応の生成物は式52のエテニル誘導体であり、次いでこれをナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミドおよび2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジンで処理して式53の4-トリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体を生成させ、さらに、上で述べたようにアリール化合物またはヘテロアリール化合物R１４Hから誘導される有機金属誘導体と反応させることにより、本発明で使用される化合物に変換する。生成する式54の化合物はさらに別の同族体および誘導体に変換することができる。
【０１３９】
式54の化合物は、ウィッティッヒ反応またはホーナー−エモンス(Horner Emmons)反応を利用する合成反応式を経由して得ることもできる。たとえば、式33の中間体(反応式４を参照)をトリフェニルホスホニウムブロミド(ウィッティッヒ)試薬、またはより好ましくは、米国特許第5,324,840において類似のホーナー−エモンス反応に関して記載されている構造(EtO)２PO-CH２-Y(R２)-A-Bのジエチルホスホナート（ホーナー−エモンス）試薬と反応させることができる。ここに挙げたホーナー−エモンス反応は、式52と構造が類似した中間化合物を与え、式52の化合物に対して反応式８で述べられている一連の反応によって式54の化合物に変換することができる。
【０１４０】
合成法−アリールおよび（3-オキシ-1-プロペニル）置換化合物
式101で表される例示のRARアンタゴニスト化合物は、ここに図示する化学合成経路に従って調製することができる。合成化学専門の同業者は、ここに示した条件が、式101によって表されるあらゆる化合物に一般化することができる具体例であることを容易に理解するだろう。
【０１４１】
【化１５】
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【０１４２】
【化１６】
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【０１４３】
反応式101は、Xが[C(R１)２]ｎであり、nが１であり、pがゼロであり、R１７がHまたは低級アルキルである式101の化合物の合成について説明する。すなわち、反応式101は、3,4-ジヒドロナフタレン誘導体である本発明の化合物の合成を図示する。この反応式に従えば、R３およびR２基（これらは式101に関連して定義されている）で適切に置換された式103のテトラヒドロナフタレン化合物が出発物質として使用される。式103の化合物の好ましい例は、1,3,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレンであり、これは化学文献に記載されている(Ma-thurら、Tetrahedron, 1985, 41:1509)。1-ブロモ-3-フェニルプロパンからこの化合物を合成する現時点で好ましい経路は、本明細書の実験の部にも記載してある。
【０１４４】
式103の化合物をR１６CH２COCl(R１６は式101に関連して定義されている)の構造式を持つ酸塩化物とフリーデルクラフツ条件で反応させ、次いで酢酸中、三酸化クロムで酸化すると異性体混合物6-および7-アシル-3,4-ジヒドロ-1(2H)-ナフタレノン誘導体が得られる。本発明において重要な6-アシル誘導体のみを反応式101に構造式(式104)で示してある。本発明の現時点で好ましい化合物の合成においては、R１基はメチル、R２、R３およびR１６はHであり、それゆえ、式104に相当する好ましい中間体は、3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-アセチル-1(2H)-ナフタレノンである。
【０１４５】
次に、式104の化合物の環外ケトン基を、たとえば、酸の中でジエチレングリコールで処理してケタールとして保護し、式105の1,3-ジオキソラニル誘導体を得る。続いて式105の化合物を式R１４MgBr(R１４は式101に関連して定義されている)で表されるグリニャール試薬と反応させると、式106の1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-ナフタレン誘導体が得られる。次に、式106の化合物の環外ケトン基を酸処理して脱保護し、脱水すると式107の化合物が得られる。
【０１４６】
式105の化合物から式107の化合物を得るための別の方法は、式105の化合物とナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミドおよび2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジン(Tf = SO２CF３)を、たとえばテトロヒドロフランのようなエーテルタイプの不活性な溶媒中、低温(-78℃および0℃)で反応させることである。この反応は、通常単離されない、それゆえ反応式101には示されていないナトリウム塩中間体を通って進行する。全体の反応の結果、トリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体が生成し、次いでこの誘導体を、アリール化合物またはヘテロアリール化合物R１４Hから誘導される、たとえばR１４Met(Metは１価の金属を表す)、好ましくはR１４Li(R１４は式101に関連して定義されている)で表される有機金属誘導体と反応させる。有機金属誘導体、好ましくは式R１４Liで表されるリチウム誘導体との反応は、通常、エーテルタイプの不活性溶媒中(たとえばテトラヒドロフラン)で塩化亜鉛(ZnCl２)とテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(Pd(PPh３)４)の存在下で行われる。有機リチウム試薬R１４Liは、市販品がなければ公知の方法に従ってエーテルタイプの溶媒中で化合物R１４H(またはそのハロゲン誘導体R１４−X１、ここでX１はハロゲン)から調製することができる。試薬R１４Liとトリフルオロメチルスルホニルオキシ誘導体の間の反応の温度範囲は、一般的に言えば、おおよそ-78℃ないし50℃である。
【０１４７】
本発明の化合物は、式107のケトン化合物と式108のアルデヒドまたはケトンとの間の縮合の結果として生成する。本発明の好ましい例示化合物の合成において、式108の試薬は4-カルボキシベンズアルデヒド(R１７−H)である。式108の範囲内にあって縮合反応および本発明の範囲内の化合物(式101)の合成に適するその他の試薬の例は以下の通りである：5-カルボキシ-ピリジン-2-アルデヒド、4-カルボキシ-ピリジン-2-アルデヒド、4-カルボキシ-チオフェン-2-アルデヒド、5-カルボキシ-チオフェン-2-アルデヒド、4-カルボキシ-フラン-2-アルデヒド、5-カルボキシ-フラン-2-アルデヒド、4-カルボキシアセトフェノン、2-アセチル-ピリジン-5-カルボン酸、2-アセチル-ピリジン-4-カルボン酸、2-アセチル-チオフェン-4-カルボン酸、2-アセチル-チオフェン-5-カルボン酸、2-アセチル-フラン-4-カルボン酸および2-アセチル-フラン-5-カルボン酸。後者の化合物は化学文献に従って入手することができる；たとえば、Decroixら、J. Chem. Res.(S), 4:134 (1978); Dawsonら、J. Med.Chem.29:1282 (1983); および Queguinerら、Bull. Soc. Chimique de France No.10,pp.3678-3683 (1969)。式107の化合物と式108の化合物の間の縮合反応は、アルコール系溶媒中で、塩基の存在下に行われる。好ましくは、反応は水酸化ナトリウムの存在下にエタノール中で行われる。同業の専門家はこの縮合反応がアルドール縮合であることを理解し、ここに記載されている好ましい例(式107のケトンと式108のアルデヒドの縮合)においてはクライゼン−シュミット反応であることがわかるだろう[March著、Advanced Organic Chemi-stry: Reactions, Mechanism, and Structure, pp694-695 McGraw Hill (1968)を参照]。式109の化合物は本発明の範囲内にあり、さらに反応させると本発明の別の化合物を生成する。別の方法として、式108のA-B基は、式101で定義されているような、本発明の範囲内にある基であり、有機化学の専門家に良く知られ、同業者が実施できるような種類の１つまたは複数の合成反応を行った後の基である。たとえば、A-B基に実施される反応は、脱保護段階、ホモローグ化(同族体生成)、エステル化、ケン化、アミドの生成などである。
【０１４８】
一般に、式109の化合物の誘導体化および／または式108のアリール化合物およびヘテロアリール化合物の合成(次いでこれを式107の化合物と反応させることができる）については、次に述べる公知の公表されている一般原理および合成法を使用することができる。
【０１４９】
前記のように、カルボン酸は典型的には、適当なアルコール溶液中で塩化水素または塩化チオニルなどの酸触媒の存在下に還流することによりエステル化される。別の方法として、カルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に適当なアルコールと縮合させることができる。常法によりエステルを回収し、精製する。アセタールとケタールは、March著、Advanced Organic Chemi-stry、第２版、McGraw Hill Book Company、p.810に記載されている方法によって容易に調製することができる。アルコール、アルデヒドおよびケトンはすべて、McOmie著、Plenum Publishing Press、1973およびGreene編、Protecting Group、John Wiley & Sons、1981に記載されているような既知の方法で、それぞれエーテルおよびエステル、アセタールまたはケタールを形成させ、保護することができる。
【０１５０】
反応式101の縮合反応を行う前に式108の化合物のnの値を大きくするには(式108に相当するそのような化合物が市販されていない場合)、芳香族カルボン酸またはヘテロ芳香族カルボン酸をアルント−アイシュテルト反応条件下に逐次処理することにより同族体化(アルデヒド基は保護したまま)するか、または他の同族体化法により同族体化を行うことができる。別の方法として、カルボン酸でない誘導体を適当な方法で同族体化してもよい。同族体化した酸は前節で概略説明した一般的な方法によってエステル化することができる。
【０１５１】
Aが１個または複数個の二重結合を持つアルケニル基である式108の化合物(または適用可能な化合物として、本発明における他の中間体)は、実験有機化学同業者によく知られている合成反応式、たとえばウィッティッヒ反応およびその同類反応またはα-ハロアリールアルキルカルボン酸、エステルまたは同類のカルボキシアルデヒドからのハロゲンの脱離による二重結合の導入によって調製することができる。A基が三重結合(アセチレン結合)を持つ式108の化合物(または、適用可能な化合物として、本発明における他の中間体)は、相当する芳香族メチルケトンとたとえばリチウム ジイソプロピルアミドのような強塩基との反応、クロロリン酸ジエチルとの反応およびそれに続くリチウム ジイソプロピルアミドの添加によって調製することができる。
【０１５２】
式109の化合物から誘導される酸および塩(または適用可能な化合物として、本発明における他の中間体または化合物)は、縮合反応の結果として直接的に、または相当するエステルから容易に得ることができる。アルカリ金属塩基を用いて塩基性の鹸化を行えば酸が得られる。たとえば、式109のエステル(または適用可能な化合物として、本発明における他の中間体または化合物)を、好ましくは不活性雰囲気下に室温で、３倍モル過剰の塩基、たとえば水酸化リチウムまたは水酸化カリウムと共に、たとえばアルカノールのような極性溶媒に溶解してよい。この溶液を15〜20時間にわたり長時間攪拌し、冷却し、酸性にし、そして加水分解物を常法によって回収する。
【０１５３】
アミドは、相当するエステルまたはカルボン酸から、公知の適当なアミド化法によって調製することができる。このような化合物を合成する１つの方法は、酸を酸塩化物に変換し、次いでこの化合物を水酸化アンモニウムまたは適当なアミンで処理することである。
【０１５４】
アルコールは、相当する酸を塩化チオニルまたはその他の手段で酸塩化物に変換し(J. March著、Advanced Organic Chemistry、第２版、McGraw Hill Book Company)、次いでこの酸塩化物を水素化ホウ素ナトリウムで還元(March、同書、1124ページ)することにより得られる。別の方法として、エステルを低温で水素化アルミニウムリチウムで還元してもよい。これらのアルコールをウィリアムソン反応の条件下で適当なハロゲン化アルキルでアルキル化すると相当するエーテルが得られる。これらのアルコールは、酸触媒またはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジメチルアミノピリジンの存在下に適当な酸と反応させることによってエステルに変換することができる。
【０１５５】
アルデヒドは、穏和な酸化剤、たとえばジクロロメタン中のピリジニウム ジクロマート(Corey, E. J., Schmidt, Tet. Lett.,399, 1979)またはジクロロメタン中のジメチルスルホキシド/オキサリルクロリド[Omura, K., Swern, D., Tetrahedron, 34:1651 (1978)]を用いて、相当する１級アルコールから調製することができる。
【０１５６】
ケトンは、適当なアルデヒドをアルキルグリニャール試薬または類似の試薬で処理し、次いで酸化することによって調製することができる。
アセタールまたはケタールは、相当するアルデヒドまたはケトンからMarch著、同書、810ページに記載の方法によって調製することができる。
【０１５７】
【化１７】
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【０１５８】
【化１８】
2008280346.tif 000031
【０１５９】
以下では、反応式102に沿って、式101においてpが０であり、縮合環構造の芳香環部分中のR２がOHであり、そしてR１７がOHである本発明の化合物への合成経路について記述する。この技術分野の同業者は、これらの化合物がエノール型のβ-ジケトンであることを容易に理解するだろう。反応式102は、pが１である本発明の化合物への合成経路をも記述している。この技術分野の同業者は、後者の化合物がフラボンであることを容易に認識するだろう。かくして、この反応式に従い、式110の1,2,3,4-テトラヒドロ-6-メトキシナフタレン-1-オン誘導体を、たとえばジクロロメタンのような適当な溶媒中で、四塩化チタンの存在下にジアルキル亜鉛(R１Zn)と反応させてオキソ基をgem-ジアルキル基R１R１で置換すると、R１が低級アルキル基である式111の化合物が得られる。反応式102に従って調製される本発明の化合物の好ましい態様においては、R３基は水素であり、R１基はメチル基である。従って、ジアルキル亜鉛試薬はジメチル亜鉛であり、式110の好ましい出発原料は1,2,3,4-テトラメチル-6-メトキシナフタレン-1-オンである。後者の化合物は市販されており、たとえばアルドリッチ社から入手することできる。次に、式111の1,2,3,4-テトラヒドロ-1,2-ジアルキル-6-メトキシナフタレン誘導体を酢酸および無水酢酸中で三酸化クロムで酸化すると、式112の1,2,3,4-テトラヒドロ-3,4-ジアルキル-7-メトキシナフタレン-1-オン誘導体が得られる。式112のケトン化合物をグリニャール試薬（R１４MgBr、R１４は式101に関連して定義されている）と反応させると式113の1-ヒドロキシ-1-アリール-3,4-ジヒドロ-3,4-ジアルキル-7-メトキシナフタレン誘導体が得られる。式113のヒドロキシ化合物を、好ましくは酸中で加熱することにより脱離反応を行うと、式114のジヒドロナフタレン化合物が得られる。式114の化合物を適当な溶媒中、たとえばジクロロメタン中で三臭化ホウ素で処理し、フェノール性メチルエーテル基からメチル基を除去する。続いて、R１６CH２CO基を導入するアシル化剤でフェノール性OH基をアシル化し、式115の化合物を得る。好ましい態様ではR１６はHであり、それゆえアシル化剤は塩化アセチルまたは無水酢酸である。アセチル化は塩基性溶媒、たとえばピリジン中で行う。式115のアシル化フェノール化合物を高温で塩化アルミニウムと反応させてフリース転位を行うと式116の1-アリール-3,4-ジアルキル-3,4-ジヒドロ-6-アシル-7-ヒドロキシナフタレン化合物が得られる。CO-Y(R２)-A-B基を導入するアシル化剤（たとえば酸塩化物）で式116の化合物のフェノール性ヒドロキシル基をアシル化すると式117の化合物が得られる。酸塩化物試薬Cl-CO-Y(R２)-A-B（または類似のアシル化剤）において、記号Y、R２およびA-Bは、式101と関連して定義されている意味を持つ。この反応式に従う本発明の好ましい化合物の合成において、この試薬はClCOC６H４COOEtである（テレフタル酸の半エチルエステル半酸クロリド）。
【０１６０】
式117の化合物をピリジン中でたとえば水酸化カリウムのような強塩基と反応させると、分子内クライゼン縮合反応の結果、式118の化合物が得られる。式118の化合物は本発明および式101の範囲内にあり、縮合環の芳香環部分の置換基R２がOHであり、そしてR１７がOHである。上記の反応（分子内クライゼン縮合）および前記のフリース転位に関連して、これらの可能性の高い反応機構は、本明細書中に記載した反応を詳しく説明するため、ならびに当業者が本明細書中に記載した反応を実施し、本発明の化合物を合成するのを容易にするために挙げたものであることに注意すべきである。しかし、本発明者らは、反応機構と理論に拘束されることを望まないし、それによって請求の範囲に記載した発明が制限されるべきではない。
【０１６１】
式118の化合物を、たとえば酢酸のような適当なプロトン性の溶媒中で、たとえば硫酸のような強酸と反応させると式119で表されるフラボン化合物が得られる。式119の化合物も、pが１である式101の範囲内にあり、本発明の化合物である。式118と式119の両化合物にさらに反応および変換を行えば、反応式101に関連して上で述べたように、同族体および誘導体が得られる。この点は、同族体および誘導体への変換として、反応式102の中に示してある。
【０１６２】
【化１９】
2008280346.tif 000032
【０１６３】
次いで、反応式103に沿って、式101においてXがS、OまたはNR'であり、pがゼロであり、そしてR１７がHまたは低級アルキル基である本発明の化合物を合成するための経路について述べる。ただし、反応式102に示した合成の一般的原理を適用することによって、XがS、OまたはNR'であってpが１であるか、あるいはXがO、S、NR'であってpがゼロであり、そして縮合環の芳香族部分中のR２基がOHであってR１７がOHである本発明の化合物を得るために、普通の同業者がここに示す合成法に変更を加えるか、あるいは適合させることができる。
【０１６４】
反応式103の出発化合物は式120のフェノール、チオフェノールまたはアニリン誘導体である。現時点で好ましい本発明の化合物においては、R２基およびR１６基が共に水素であり、そして式120の好ましい出発化合物は、化学文献において既知である3-エテニル-チオフェノールまたは3-エテニルフェノールである[Nuykenら、Polym.Bull(Berlin)11:165 (1984)]。本明細書を簡潔にするため、以下の記述では本発明のベンゾチオピラン誘導体の合成に見られるように、Xは主として硫黄と考えることができる。ただし、ここに記載する反応式も同業の専門家にとって容易に分かるような変更を加えれば、本発明の範囲内のベンゾピラン(X = O)およびジヒドロキノリン(X = NR')にも適することを念頭に入れておくべきである。かくして、式120の化合物を式121の3-ブロモカルボン酸と塩基性条件下で反応させる。この反応式に使用されている記号は、式101に関連して説明されている意味と同じ意味を持っている。R３が水素である式121の試薬の１つの例は3-ブロモプロピオン酸である。式121の3-ブロモカルボン酸との反応によって式122の化合物が得られる。後者を酸で処理して環化すると式123の7-エテニル-チオクロマン-4-オン誘導体(Xが硫黄の場合)または7-エテニルクロマン誘導体(Xが酸素の場合)が得られる。式123の7-エテニル-チオクロマン-4-オンまたは7-エテニル-クロマン-4-オン誘導体をPd(II)Cl２およびCuCl２の存在下に酸化すると式124の対応する7-アシル化合物(ケトン)が得られる。同業者には後者の反応がワッカー酸化であることが理解されるだろう。式124の化合物の環外ケトン基は、たとえば酸中でエチレングリコールにより処理することによってケタールの形で保護され、式125の1,3-ジオキソラニル誘導体を与える。次に、反応式101における式105の化合物に対して述べられているのと同様の一連の反応を式125の化合物に対して行う。すなわち、式125の1,3-ジオキソラニル誘導体を式R１４MgBrで表されるグリニャール試薬と反応させると式126の第３級アルコールが得られ、さらにこのアルコールを酸中で脱水すると式127のベンゾチオピラン（Xが硫黄 ）、ベンゾピラン（Xが酸素）またはジヒドロキノリン(XがNR')が生成する。次に、式127のケトン化合物を塩基の存在下に式108の試薬とアルドール縮合（クライゼン−シュミット）反応を行うと、式128で表される本発明の化合物が得られる。式128の化合物は、反応式101および102に関連して上で述べたように、さらに他の同族体および誘導体に変換することができる。
【０１６５】
具体的な実施例
2-ヒドロキシ-2-メチル-5-フェニルペンタン
無水エーテル200 mlにマグネシウム片13.16 g(0.541 mol)を入れた混合物に1-ブロモ-3-フェニルプロパン100.0 g(0.492 mol)を100 mlのエーテルに溶かした溶液を加えた。溶液5-10 ml加えたのち、グリニャール試薬の生成が進行するまで添加を中断した。それから残る臭化物を１時間かけて添加した。グリニャール試薬を35℃で20分間かきまぜ、それからアセトン31.64 g(0.54 mol)を45分かけて加えた。反応混合物を室温で一晩かき混ぜ、それから0℃まで冷却し、注意しながら20 %塩酸を加えて酸性にした。水層をエーテルで抽出し(3 x 200 ml)、有機層を合わせて水、それからさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去した後、残留物を蒸留して淡黄色の油状生成物63.0 g(72 %)を得た。bp 99-102℃/0.5 mm Hg。1H NMR(CDCl３):δ7.28-7.18(5H,m)、2.63(2H,t,J=7.5Hz)、1.68(2H,m)、1.52(2H,m)、1.20(6H,s)。
【０１６６】
1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレン
メタンスルホン酸400 ml中の五酸化リン(55.3 g, 0.390 mol)混合物を、105℃で固体が完全に溶解するまでアルゴン下で加熱した。生成した溶液を室温まで冷却し、かきまぜながら2-ヒドロキシ-2-メチル-5-フェニルペンタン(63.0 g, 0.354 mol)をゆっくり加えた。４時間後に、溶液を１Lの氷上に注意しながら注ぎだし、反応を停止させた。反応混合物をエーテルで抽出し(4 x 125 ml)、有機層を合わせて水で洗い、それからさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧濃縮し、蒸留して透明な無色油状の生成物51.0 g(90 %)を得た。bp 65〜67℃/1.1 mm Hg。1H NMR(CDCl３):δ7.32(1H,d,J=7.4Hz)、7.16-7.05(3H,m)、2.77(2H,t,J=6.3Hz)、1.80(2H,m)、1.66(2H,m)、1.28(6H,s)。
【０１６７】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物A)
氷酢酸350 mlと無水酢酸170 mlの溶液を０℃まで冷却し、注意しながら三酸化クロム25.0g(0.25 mol)を少しづつ加えた。生成した混合物を30分間攪拌したのち、ベンゼン120 mlを加えた。1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレンをベンゼン30 mlに溶かした溶液をゆっくり加えた。添加が終了したら、反応混合物を0℃で４時間攪拌した。溶液を水(200 ml）で希釈し、エーテル（5 x 50 ml）で抽出した。有機層を合わせ、水、それから飽和炭酸ナトリウム水溶液、そしてさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、蒸留して淡黄色の油状生成物16.0 g(74 %)を得た。bp 93-96℃/0.3 mm Hg。1H NMR(CDCl３):δ8.02(1H,dd,J=1.3,7.8Hz)、7.53(1H,m)、7.42(1H,d,J=7.9Hz)、7.29(1H,m)、2.74(2H,t,J=6.8Hz)、2.02(2H,t,J=6.8Hz)、1.40(6H,s)。
【０１６８】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ブロモ-1(2H)-ナフタレノン（化合物B)
効率の高い還流冷却器と乾燥管および滴下漏斗を取り付けた100 ml三つ口フラスコに塩化アルミニウム9.5 g(71.4 mmol)およびジクロロメタン3 mlの混合物を入れた。攪拌しながら3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-1(2H)-ナフタレノン(5.0 g, 28.7 mmol)を室温で混合物に滴下した（注意：発熱反応）。続いて、臭素5.5 g(34.5 mmol)を極めてゆっくり加え、生成した混合物を室温で２時間攪拌した（注：攪拌が停止すると、攪拌を再開するまで混合物の温度が70℃まで上昇するおそれがある）。次に、反応混合物に氷冷した6 M塩酸をゆっくり加えて反応を停止した。混合物をエーテルで抽出し、有機層を合わせて水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、そしてさらに飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、残留物を蒸留して放置すると固化する淡黄色油状の生成物5.8g(80%)を得た。bp 140℃/0.4 mm Hg。1H NMR(CDCl３):δ8.11(1H,d,J=3.0Hz)、7.61(1H,dd,J=3.0,9.0Hz)、7.31(1H,d,J=9.0Hz)、2.72(2H,t,J=6.0Hz)、2.01(2H,t,J=6.0Hz)、1.28(6H,s)。
【０１６９】
1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-（4-メチルフェニル）-4,4-ジメチル-7-ブロモナフタレン（化合物C)
THF 25 mlにマグネシウム片(648.0 mg, 27.0 mmol)を入れた混合物に4-ブロモトルエン(5.40 g, 31.8 mmol)のTHF 10 ml溶液を２回に分けて加えた。溶液２mlを加えることによって反応が開始し、そのあと残りの溶液を滴下漏斗を使用してゆっくり滴下した。混合物を室温で１時間攪拌し、それからカヌラを使用して溶液を別のフラスコに移した。生成したグリニャール試薬に3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ブロモ-1(2H)-ナフタレノン(化合物B）4.0 g(15.9 mmol)のTHF 15 ml溶液を加えた。生成した溶液を一晩加熱還流し、それから室温まで冷却し、反応混合物に氷冷した10 %塩酸を注意しながら加えて反応を停止させた。エーテルで抽出し、有機層を合わせて水、そして飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去して油状物を得た。これをカラムクロマトグラフィ(ヘキサン/酢酸エチル、96:4)にかけて無色の固体を得た。1H NMR(CDCl３):δ7.36(1H,dd,J=2.1,7.6Hz)、7.26(3H,m)、7.12(3H,s)、2.34(3H,s)、2.24-2.04(2H,m)、1.81(1H,m)、1.55(1H,m)、1.35(3H,s)、1.30(3H,s)。
【０１７０】
3,4-ジヒドロ-1-（4-メチルフェニル）-4,4-ジメチル-7-ブロモナフタレン（化合物D)
Dean-Starkのトラップを取り付けたフラスコに1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-ブロモナフタレン(化合物C)3.4g(9.85 mmol)とベンゼン40 mlを入れた。触媒量のp-トルエンスルホン酸１水和物を加え、得られた溶液を２時間加熱還流した。室温まで冷却した後、エーテルを加え、溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで洗い、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィ(100 %ヘキサン/シリカゲル)にかけて標題の化合物を無色の固体として得た。1H NMR(CDCl３):δ7.32(1H,dd,J=2.1,8.2Hz)、7.21(5H,m)、7.15(1H,d,J=2.1Hz)、5.98(1H,t,J=4.7Hz)、2.40(3H,s)、2.32(2H,d,J=4.7Hz)、1.30(6H,s)。
【０１７１】
7-エチニル-3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチルナフタレン-1(2H)-オン（化合物E)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ブロモ-1(2H)-ナフタレノン（化合物B）7 g(27.6 mmol)をトリエチルアミン150 mlに溶かした溶液（アルゴンを15分間通気しフラッシュしておく）にトリス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）クロリド0.97 gとヨウ化第一銅  0.26 g(1.3 mmol)を加えた。溶液混合物に５分間アルゴンを流してフラッシュし、それから（トリメチルシリル）アセチレン39 ml(36.6 mmol)を加えた。反応混合物を耐圧ガラス管に封入し、あらかじめ加熱しておいた油浴（100℃）中に24時間置いた。反応混合物をセライトを通して濾過し、エーテルで洗い、濾液を真空下に濃縮して粗製の7-（トリメチルシリル）エチニル-3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチルナフタレン-1(2H)-オンを得た。この粗製TMS-アセチレン化合物をメタノール50 mlに溶解した溶液に炭酸カリウム0.6 g(4.3 mmol)を加えた。混合物を室温で８時間攪拌してから濾過した。濾液を真空下に濃縮したのち、エーテルで希釈し、それから水、10 %塩酸および食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ(シリカ、10 %,酢酸エチル−ヘキサン)で精製して標題の化合物を白色の固体として得た。PMR(CDCl３):δ1.39(6H,s)、2.02(2H,t,J=7.0Hz)、2.73(2H,t,J=7.0Hz)、3.08(1H,s)、7.39(1H,d,J=8.2Hz)、7.61(1H,dd,J=1.8,8.2Hz)、8.14(1H,d,J=9 1.8Hz)。
【０１７２】
4-ヨード安息香酸エチル
4-ヨード安息香酸10 g(40.32 mmol)を無水エタノール100 mlに懸濁させた液に塩化チオニル２ mlを加え、混合物を３時間加熱還流した。溶媒を真空下に除き、残留物をエーテル100 mlに溶解した。エーテル溶液を飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を真空下に除去し、残留物をクーゲルロール（100℃; 0.55 mm）で蒸留して、標題化合物を無色油状物として得た。PMR(CDCl３):δ1.42(3H,t,J〜7Hz)、4.4(2H,q,J〜7Hz)、7.8(4H)。
【０１７３】
6-ヨードニコチン酸
アルゴン下でヨウ化ナトリウム（20.59 g, 137.40 mmol)を-78℃まで冷却し、それからヨウ化水素酸（97.13 g, 759.34 mmol）を加えた。冷却浴を除き、懸濁液を５分間攪拌した。この混合物に6-クロロニコチン酸（22.09 g, 140.20 mmol）を加え、生成した混合物を攪拌しながら室温までゆっくり昇温させた。混合物を125℃で24時間加熱還流させ、それから室温まで冷却し、0℃でアセトン中（500 ml）に注ぎ出した。黄色の固体を濾取し、1N 炭酸水素ナトリウム水溶液200 mlで洗浄した。メタノールから再結晶（結晶をエチルエーテルで洗浄した）して標題化合物の白色結晶を得た：mp 177-179℃[文献値：mp 187-192, New-komeら、"Reductive Dehalogenation of Electron-Poor Heterocycles: Nicotinic Acid Derivatives" J.Org.Chem. 51: 953-954(1986)]。1H NMR(DMSO-d6):δ8.81(1H,dd,J=0.8, 2.4Hz)、8.01(1H,dd,J=0.8, 8.2Hz)、7.91(1H,dd,J=2.4, 8.2Hz)。
【０１７４】
6-ヨードニコチン酸エチル
6-ヨードニコチン酸（23.38g 94.20 mmol）をジクロロメタン（100 ml）に懸濁させた液に1-（3-ジメチルアミノプロピル）-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（19.86 g, 103.6 mmol）のジクロロメタン（250 ml）溶液を加えた。この混合物にエタノール（12.40 g,269.27 mmol）を加え、それからジメチルアミノピリジン（1.16 g, 9.41 mmol）を加えた。混合物を50℃に24.5時間加熱し、真空下に濃縮し、水（200 ml）で希釈し、それからエーテル（550 ml）で抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮すると黄色固体が得られた。フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、10 %酢酸エチル−ヘキサン）で精製し、標題化合物を白色針状結晶として得た：mp 48-49℃。1H NMR(CDCl３):δ8.94(1H,d,J=2.1Hz)、7.91(1H,dd,J=2.1, 8.2Hz)、7.85(1H,d,J=8.2Hz)、4.41(2H,q,J=7.1Hz)、1.41(3H,t,J=7.1Hz)。
【０１７５】
4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物F)
アルゴン気流下で15分間フラッシュした7-エチニル-3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチルナフタレン-1(2H)-オン（化合物E）4 g(21.7 mmol)と4-ヨード安息香酸エチル6 g（21.7 mmol）のトリエチルアミン（100 ml）溶液にビス（トリフェニルホスホニウム）パラジウム（II）クロリド5 g(7.2 mmol)とヨウ化第一銅1.4 g (7.2 mmol)を加えた。混合物をアルゴンで５分間フラッシュし、室温で18時間攪拌した。反応混合物をセライトを通して濾過し、濾液を真空下に濃縮した。フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、10%酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、標題化合物を白色固体として得た。PMR(CDCl３):δ1.41(3H,t,J=7.2Hz)、1.41(6H,s)、2.04(2H,t,J=6.5Hz)、2.76(2H,t,J=6.5Hz)、4.40(2H,q,J=7.2Hz)、7.44(1H,d,J=8.2Hz)、7.59(2H,d,J=8.4Hz)、7.68(1H,dd,J=1.8, 8.2Hz)、8.04(2H,d,J=8.4Hz)、8.15(1H,d,J=1.8Hz)。
【０１７６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G)
ナトリウム ビス（トリメチルシリル）アミド291.6 mg(1.59 mmol)のTHF5.6 ml冷溶液(-78℃)に4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物F）500 mg(1.44 mmol)のTHF4.0 ml溶液を加えた。反応混合物を-78℃で35分間攪拌し、それから5-クロロ[2-ビストリフルオロメチルスルホニル]イミド601.2 mg(1.59 mmol)のTHF4.0 ml溶液を加えた。-78℃で１時間攪拌したのち、溶液を0℃まで昇温して２時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させた。混合物を酢酸エチル(50 ml)で抽出し、有機層を合わせて5 %水酸化ナトリウム、水および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、真空下で濃縮して黄色の油状物を得た。カラムクロマトグラフィ(シリカ、7 %酢酸エチル−ヘキサン)で精製して無色固体の標題化合物を得た。1H NMR(CDCl３):δ8.04(2H,dd,J=1.8, 8.4Hz)、7.60(2H,dd,J=1.8, 8.4Hz)、7.51(2H,m)、7.32(1H,d,J=8.0Hz)、4.40(2H,q,J=7.1Hz)、6.02(1H,t,J=5.0Hz)、2.44(2H,d,J=5.0Hz)、1.43(3H,t,J=7.1Hz)、1.33(6H,s)。
【０１７７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１)
t-ブチルリチウム（1.7 Mヘキサン溶液）189.9 mg(1.74 ml, 2.96 mmol)溶液を4-ブロモトルエン253.6 mg(1.482 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて4-リチオトルエン溶液を調製した。30分間攪拌したのち、塩化亜鉛269.4 mg(1.977 mmol)のTHF3.0 ml溶液を加えた。得られた溶液を室温まで昇温させ、30分間放置し、それからカニューレを通して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）472.9 mg(0.988 mmol)とテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）50 mg(0.04 mmol)のTHF4.0 ml溶液に加えた。得られた溶液を50℃に45分間加熱し、それから室温まで冷却し、そして飽和塩化アンモニウム溶液で希釈した。混合物を酢酸エチル（40 ml）で抽出し、有機層を合わせて水および食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し真空下に濃縮して黄色の油状物を得た。カラムクロマトグラフィ(シリカ、5 %酢酸エチル−ヘキサン)で精製し無色固体の標題化合物を得た。1H NMR(d6-アセトン):δ1.35(6H,s)、1.40(3H,t,J=7.1Hz)、2.36(2H,d,J=4.7Hz)、2.42(3H,s)、4.38(2H,q,J=7.1Hz)、5.99(1H,t,J=4.7Hz)、7.25(5H,m)、7.35(2H,m)、7.52(2H,d,J=8.5Hz)、7.98(2H,d,J=8.5Hz)。
【０１７８】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-フェニル-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物1a)
4-[(5.6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、フェニルリチウム（1.8 Mシクロヘキサン/ジエチルエーテル溶液）58.2 mg(0.38 ml, 0.69 mmol)、塩化亜鉛116.1 mg(0.85 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）13.8 mg(0.01 mmol)を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）203.8 mg(0.43 mmol)を標題化合物に変換した(無色の固体)。PMR(CDCl３):δ1.36(6H,s)、1.40(3H,t,J=7.1Hz)、2.37(2H,d,J=4.7Hz)、4.38(2H,q,J=7.1Hz)、6.02(1H,t,J=4.7Hz)、7.20(1H,d,J=1.5Hz)、7.27(1H,m)、7.39(6H,m)、7.52(2H,d,J=8.2Hz)、7.98(2H,d,J=8.2Hz)。
【０１７９】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物２)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛284.8 mg(2.090 mol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF 2.0 ml溶液および3-メチルフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）201.2 mg(1.86 ml, 3.14 mmol)を3-メチルブロモベンゼン274.0 mg(1.568 mmol)のTHF2.0ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）250.0 mg(0.522 mmol)を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.99(2H,d,J=8.4Hz)、7.51(2H,d,J=8.4Hz)、7.39-7.14(7H,m)、5.99(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.60(3H,s)、2.35(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１８０】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物３)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛199.4 mg(1.463 mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)24 mg(0.02 mmol)のTHF4.0ml溶液、および2-メチルフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）133.9  mg(1.23 ml, 2.09 mmol)を2-メチルブロモベンゼン178.7 mg(1.045 mmol)のTHF2.0ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルフォニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）を標題化合物に変換した(無色の固体)。1H NMR(CDCl３):δ7.97(2H,d,J=8.4Hz)、7.50(2H,d,J=8.4Hz)、7.49-7.19(6H,m)、6.81(1H,d,J=1.6Hz)、5.89(1H,t,J=4.5Hz)、4.36(2H,q,J=7.1Hz)、2.43-2.14(2H,dq,J=3.7, 5.4Hz)、2.15(3H,s)、1.39-1.34(9H,m)。
【０１８１】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3,5-ジメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物４)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛249.0 mg(1.827 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF2.0 ml溶液および 3,5-ジメチルフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）167.7  mg(1.54 ml, 2.62 mmol)を3,5-ジメチルブロモベンゼン249.0 mg(1.305 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）250 mg(0.522mmol)を標題化合物に変換した(無色の固体)。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.4Hz)、7.52(2H,d,J=8.4Hz)、7.40-7.33(2H,m)、7.20(1H,d,J=1.6Hz)、7.00(1H,s)、6.97(2H,s)、5.97(1H,t,J=4.8Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.36(6H,s)、2.34(2H,d,J=4.8Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.37(6H,s)。
【０１８２】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-エチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物５)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般合成法を適用し、塩化亜鉛249.0 mg(1.827 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF2.0 ml溶液および4-エチルフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）167.7 mg(1.54 mmol)を4-エチルブロモベンゼン244.0 mg(1.305 mmol)のTHF2.0 ml）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）を標題化合物(無色の固体)に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.99(2H,d,J=8.4Hz)、7.51(2H,d,J=8.4Hz)、7.42-7.24(7H,m)、5.99(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.71(2H,q,J=7.6Hz)、2.35(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１８３】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-(1,1-ジメチルエチル)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物６)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１)の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛142.2 mg(1.045 mmol)および4-t-ブチルフェニルリチウム[t-ブチルリチウム（1.5 Mペンタン溶液）100.6 mg(0.97 ml, 1.57 mmol)を4-t-ブチルブロモベンゼン167.0 mg(0.78 mmol)のTHF1.0 ml冷溶液（-78℃）に加えて調製した]を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-（トリフルオロメチルスルホニル）オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物G)250.0 mg(0.52 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.99(2H,d,J=8.4Hz)、7.55(2H,d,J=8.4Hz)、7.28-7.45(7H,m)、6.02(1H,t,J=4.9Hz)、4.38(2H,q,J=7.2Hz)、2.36(2H,d,J=4.9Hz)、1.59(3H,s)、1.40(3H,t,J=7.2Hz)、1.39(9H,s)、1.35(6H,s)。
【０１８４】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-クロロフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物７)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛249.0 mg(1.827 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 ml)のTHF2.0 ml溶液および4-クロロフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）167.7 mg(1.54 ml, 2.62 mmol)を4-クロロ-1-ブロモベンゼン252.4 mg(1.305 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液（-75℃）に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）を標題化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.4Hz)、7.53(2H,d,J=8.4Hz)、7.40-7.27(6H,m)、7.12(1H,d,J=1.6Hz)、6.00(1H,t,J=4.8Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.35(2H,d,J=4.8Hz)、1.40(2H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１８５】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メトキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物８)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の合成と同じ一般法を適用し、塩化亜鉛249.0 mg(1.827 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF2.0 ml溶液および4-メトキシフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）167.7 mg(1.54 ml, 2.62 mmol)を4-メトキシ-1-ブロモベンゼン244.1 mg(1.305 mmol)の冷溶液（-78℃）に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）を標題化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.5Hz)、7.52(2H,d,J=8.6Hz)、7.40-7.21(5H,m)、6.95(2H,d,J=8.7Hz)、5.97(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、4.34(3H,s)、2.34(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１８６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物９)
4-[(5,6-ジメチル-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛249.0 mg(1.827 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)および4-トリフルオロメチルフェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）167.7 mg(1.54 ml, 2.62 mmol)を4-トリフルオロメチルブロモベンゼン296.6 mg(1.305 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液（-78℃）に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ)-2-ナフタレニル）エチニル]安息香酸エチル（化合物G）を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.5Hz)、7.67(2H,d,J=8.3Hz)、7.54-7.36(6H,m)、7.10(1H,d,J=1.6Hz)、6.06(1H,t,J=4.8Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.38(2H,d,J=4.8Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.35(6H,s)。
【０１８７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物10)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフテニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛142.4 mg(1.045 mmpl)および2-リチオピリジン（t-ブチルリチウム（1.5 Mペンタン溶液）100.6 mg(0.97 ml, 1.57 mmol)を2-ブロモピリジン123.8 mg(0.784 mmol）のTHF1.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）250.0 mg(0.52 mmol)を標題の化合物(無色の固体)に変換した。1H NMR(d6-アセトン):δ8.64(1H,m)、7.99(2H,d,J=8.5Hz)、7.85(1H,ddd,J=1.8, 7.7, 9.5Hz)、7.58(2H,d,J=8.4Hz)、7.50(1H,d,J=7.7Hz)、7.47(2H,d,J=1.1Hz)、7.35(2H,m)、6.32(1H,t,J=4.8Hz)、4.34(2H,q,J=7.2Hz)、2.42(2H,d,J=7.4Hz)、1.35(3H,t,J=7.0Hz)、1.35(6H,s)。
【０１８８】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物11)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛142.4 mg(1.045 mmol)および3-リチオピリジン（t-ブチルリチウム（1.5 Mペンタン溶液）100.2 mg(0.92 ml, 1.56 mmol)を3-ブロモピリジン123.8 mg(0.784 mmol)のTHF1.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）170.0 mg(0.35 mmol)を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ8.63-8.61(2H,dd,J=1.7Hz)、7.99(2H,d,J=8.4Hz)、7.67(1H,dt,J=7.9Hz)、7.52(2H,d,J=8.4Hz)、7.43-7.34(3H,m)、7.10(1H,d,J=1.6Hz)、6.07(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.40(2H,d,J=4.7Hz)、1.390(3H,t,J=7.1Hz)、1.36(6H,s)。
【０１８９】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチル-5-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物12)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物１)の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛142.4 mg(1.045 mmol)および2-メチル-5-リチオピリジン[t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）100.5 mg(0.92 ml, 1.57 mmol)を2-メチル-5-ブロモピリジンのTHF1.0 ml冷溶液に加えて調製した]を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）を標題の化合物(無色の固体)に変換した。1H NMR(CDCl３):δ8.50(1H,d,J=2.2Hz)、7.99(2H,d,J=8.3Hz)、7.56(1H,dd,J=2.3, 8.0Hz)、7.53(2H,d,J=8.4Hz)、7.43(1H,dd,J=2.3, 8.0Hz)、7.37(2H,d,J=8.0Hz)、7.21(1H,d,J=8.1Hz)、7.11(1H,d,J=1.5Hz)、6.04(1H,t,J=4.7Hz)、4.38(2H,q,J=7.2Hz)、2.63(3H,s)、2.38(2H,d,J=4.6Hz)、1.40(3H,t,J=7.1Hz)、1.35(6H,s)。
【０１９０】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物H)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛150.0 mg(1.10 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF2.0 ml溶液、および3-((2,2-ジメチルエチル)ジメチルシロキシ)フェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）100.2 mg(0.92 ml, 1.564 mmol)を3-((2,2-ジメチルエチル)ジメチルシロキシ)ブロモベンゼン226.0 mg(0.787 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）150.0 mg(0.314 mmol)を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.4Hz)、7.51(2H,d,J=8.4Hz)、7.40-7.22(4H,m)、6.95(1H,d,J=7.6Hz)、6.84-6.82(2H,m)、6.00(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.35(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(3H,s)、0.99(9H,s)、0.23(6H,s)。
【０１９１】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物I)
4-[5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル）エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用して、塩化亜鉛209.0 mg(1.53 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.02 mmol)のTHF2,0 ml溶液および4-((2,2-ジメチルエチル)ジメチルシロキシ)フェニルリチウム（t-ブチルリチウム（1.7 Mペンタン溶液）140.3 mg(1.30 ml, 2.19 mmol)を4-((2,2-ジメチルエチル）ジメチルシロキシ)ブロモベンゼン315.0 mg(1.09 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液(-78℃)に加えることによって調製した）を使用して、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.4Hz)、7.51(2H,d,J=8.4Hz)、7.39-7.25(3H,m)、7.21(2H,d,J=8.5Hz)、5.87(2H,d,J=8.5Hz)、5.96(1H,t,J=4.7Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.33(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.33(6H,s)、1.01(9H,s)、0.25(6H,s)。
【０１９２】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-ヒドロキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物13)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)-フェニル)-2-ナフタレニル)]安息香酸エチル（化合物H）60.0 mg(0.114 mmol)の1.0 mlTHF溶液にテトラブチルアンモニムフルオリド（1M THF溶液）91.5 mg(0.35 ml, 0.35 mmol)を室温で加えた。一晩攪拌した後、溶液を酢酸エチルで希釈し、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、それからカラムクロマトグラフィ（4:1、ヘキサン−酢酸エチル）にかけて標題の無色固体化合物を得た。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=7.8Hz)、7.52(2H,d,J=8.3Hz)、7.39-7.21(4H,m)、6.93(1H,d,J=7.5Hz)、6.84(1H,d,J=7.1Hz)、6.83(1H,s)、6.01(1H,t,J=4.7Hz)、4.91(1H,s)、4.39(2H,q,J=7.1Hz)、2.35(2H,d,J=4.7Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１９３】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物14)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物I）50.0 mg(0.095 mmol)の1.0 mlTHF溶液にテトラブチルフルオリド（1M THF溶液）73.2 mg(0.29 ml, 0.29 mmol)を室温で加えた。一晩攪拌した後、溶液を酢酸エチルで希釈し、続いて水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、それからカラムクロマトグラフィ(4:1、ヘキサン−酢酸エチル)にかけ、無色固体の標題化合物を得た。1H NMR(CDCl３):δ7.98(2H,d,J=8.2Hz)、7.52(2H,d,J=8.3Hz)、7.41-7.20(5H,m)、6.88(2H,d,J=8.4Hz)、5.96(1H,t,J=4.5Hz)、4.37(2H,q,J=7.1Hz)、2.34(2H,d,J=4.5Hz)、1.39(3H,t,J=7.1Hz)、1.34(6H,s)。
【０１９４】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物15)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用して、塩化亜鉛150.0 mg(1.10 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）14 mg(0.012 mmol)の4.0 mlTHF溶液および5-メチルチアゾール-2-イルリチウム（n-ブチルリチウム（1.55 Mヘキサン溶液）53.2 mg(0.53 ml, 0.83 mmol)を5-メチルチアゾール82.0 mg(0.83 mmol)の5.0 mlTHF冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用し、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物Ｇ）264.0 mg(0.5552 mmol)を標題の化合物に変換した（無色の固体）。1H NMR (CDCl３):δ7.99 (2H,d,J=7.8Hz), 7.88 (1H,d,J=1.5Hz), 7.55 (2H,d,J=7.8Hz), 7.54 (1H,s), 7.45 (1H,dd,J=1.5, 8.0Hz), 7.35 (1H,d,J=7.9Hz), 6.48 (1H,t,J=4.8Hz), 4.38 (2H,q,J=7.1Hz), 2.51 (3H,s), 2.38 (2H,d,J=4.8Hz), 1.40 (3H,s), 1.32 (6H,s).
【０１９５】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物15a)
チアゾール53.4 mg(0.63 mmol)のTHF1.0 ml冷溶液(-78℃)にn-ブチルリチウム（1.5 Mヘキサン溶液）41.2 mg(0.42 ml, 0.63 mmol)を加えて2-リチオチアゾール溶液を調製した。その溶液を30分間攪拌し、それから塩化亜鉛113.9 mg(0.84 mmol)をTHF1.5 mlに溶解した溶液を加えた。得られた溶液を室温まで昇温し、30分間攪拌し、それからカニューレを通して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）12.4 mg(0.01 mmol)のTHF1.5 ml溶液に有機亜鉛化合物を添加した。生成した溶液を50℃に45分間加熱し、それから室温まで冷却し飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈した。混合物を酢酸エチル(40 ml)で抽出し、有機層を合わせて水および食塩水で洗った。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥して減圧濃縮し、黄色油状物を得た。カラムクロマトグラフィによって精製し（シリカ、20% 酢酸エチル−ヘキサン）標題の無色油状化合物を得た。PMR (CDCl３):δ1.35 (6H,s), 1.40 (3H,t,J=7.1Hz), 2.42 (2H,d,J=4.8Hz), 4.38 (2H,q,J=7.1Hz), 6.57 (1H,t,J=4.8Hz), 7.33 (1H,d,J=3.3Hz), 7.36 (1H,d,J=8.0Hz), 7.46 (1H,dd,J=1.7, 8.1Hz), 7.55 (2H,d,J=8.4Hz),7.87 (1H,d,J=1.7Hz),7.92 (1H,d,J=3.3Hz),8.00 (2H,d,J=8.4Hz).
【０１９６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物16)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用して、塩化亜鉛168.0 mg(1.23 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）12 mg(0.011 mmol)の6.0 mlTHF溶液および4-メチルチアゾール-2-イル リチウム（n-ブチルリチウム（1.55 Mヘキサン溶液）59.6 mg(0.60 ml, 0.93 mmol)を4-メチルチアゾール92.0 mg(0.93 mmol)のTHF6.0 ml冷溶液(-78℃)を加えて調製した）を使用し、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物G) 295.0 mg(0.617 mmol)を標題の化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR (CDCl３):δ8.00 (2H,d,J=8.4Hz), 7.80 (1H,d,J=1.7Hz), 7.55 (2H,d,J=8.4Hz), 7.45 (1H,dd,J=1.7, 8.0Hz), 7.35 (1H,d,J=8.0Hz), 6.87 (1H,s), 6.52 (1H,t,J=4.7Hz), 4.37 (2H,q,J=7.2Hz), 2.54 (3H,s), 2.39 (2H,d,J=4.7Hz), 1.40 (3H,t,J=7.2Hz), 1.33 (3H,s).
【０１９７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物17)
4-[5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛110.0 mg(0.84 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）12 mg(0.011 mmol)の2.0 mlTHF溶液および4,5-ジメチルチアゾール-2-イル リチウム（n-ブチルリチウム（1.55 Mヘキサン溶液）40.2 mg(0.39 mmol)を4,5-ジメチルチアゾール71.0 mg(0.63 mmol)のTHF2.0 ml冷溶液(-78℃)に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）200.0 mg(0.418 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR (CDCl３):δ8.00 (2H,d,J=8.4Hz), 7.82 (1H,d,J=1.7Hz), 7.54 (2H,d,J=8.4Hz), 7.43 (1H,dd,J=1.7, 8.0Hz), 7.33 (1H,d,J=8.0Hz), 6.45 (1H,t,J=4.9Hz), 4.38 (2H,q,J=7.1Hz), 2.41 (3H,s), 2.40 (3H,s), 2.37 (2H,d,J=4.9Hz), 1.40 (3H,t,J=7.1Hz), 1.32 (6H,s).
【０１９８】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチル-5-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物18)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチル-5-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物12）81.7 mg(0.194 mmol)およびLiOH・H２O 40.7 mg(0.969 mmol)をTHF/水（3:1 v/v）3 ml中、室温で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて水および食塩水で洗浄し、それから硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ8.41 (1H,d,J=1.9Hz), 7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.63 (1H,dd,J=2.3, 7.9Hz), 7.59 (2H,d,J=8.3Hz), 7.49 (2H,m), 7.33 (1H,d,J=7.8Hz), 6.95 (1H,s), 6.11 (1H,t,J=4.5Hz), 2.52 (3H,s), 2.37 (2H,d,J=4.6Hz), 1.31 (6H,s).
【０１９９】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物19)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物10）80.0 mg(0.196 mmol)およびLiOH・H２0 20.6 mg(0.491 mmol)をTHF/水３ ml中で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて水と食塩水で洗浄し、それから硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ8.64 (1H,m), 7.94 (2H,d,J=8.3Hz), 7.87 (1H,dt,J=1.7, 7.8Hz), 7.58 (2H,d,J=8.3Hz), 7.50 (1H,d,J=8.2Hz), 7.47 (2H,s), 7.37 (1H,m), 7.25 (1H,s), 6.30 (1H,t,J=4.6Hz), 2.39 (2H,d,J=4.6Hz), 1.31 (6H,s).
【０２００】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物20)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物２）30.0 mg(0.071 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）28.0 mg(0.70 mmol, 0.7 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧下に除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,J=8.5Hz), 7.59 (2H,d,J=8.5Hz), 7.46 (2H,s), 7.32-7.13 (4H,m), 7.10 (1H,s), 6.98 (1H,t,J=4.5Hz), 2.34 (3H,s), 2.31 (2H,d,J=4.5Hz), 1.30 (6H,s).
【０２０１】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-エチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物21)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-エチニルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物５）47.0 mg(0.108 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）28.0 mg(0.70 mmol, 0.7 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.59 (2H,d,J=8.3Hz), 7.46 (2H,s), 7.29-7.21 (4H,m), 7.02 (1H,s), 6.01 (1H,t,J=4.5Hz), 2.64 (2H,q,J=7.5Hz), 2.33 (2H,d,J=4.5Hz), 1.29 (6H,s), 1.22 (3H,t,J=7.5Hz).
【０２０２】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メトキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物22)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メトキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物８）80.0 mg(0.183 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）40.0 mg(1.00 ml, 1.0 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 % 塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後溶媒を減圧除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.60 (2H,d,J=8.3Hz), 7.45 (2H,s), 7.24 (2H,d,J=8.6Hz), 7.02-6.89 (3H,m),5.98 (1H,t,J=4.4Hz), 3.79 (3H,s), 2.31 (2H,d,J=4.7Hz), 1.29 (6H,s).
【０２０３】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物23)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-トリフルオロメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物９）70.0 mg(0.148 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）60.0 mg(1.50 mmol, 1.5ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,j=8.3Hz), 7.80 (2H,d,J=8.1Hz), 7.61-7.47 (6H,m), 6.97 (2H,s), 6.16 (1H,t,J=4.5Hz), 2.37 (2H,d,J=4.6Hz), 1.30 (6H,s).
【０２０４】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3,5-ジメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物24)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3,5-ジメチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物４）40.0 mg(0.207 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）48.0 mg(1.20 mmol, 1.20 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,J=8.2Hz), 7.59 (2H,d,J=8.2Hz), 7.45 (2H,s), 7.00 (1H,s), 6.97 (1H,s), 5.97 (1H,t,J=4.5Hz), 2.31 (2H,d,J=4.5Hz), 2.30 (6H,s), 1.29 (6H,s).
【０２０５】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-クロロフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物25)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-クロロフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物７）80.0 mg(0.181 mmol)をEtOH 3mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）48.0 mg(1.20 mmol, 1.2 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.60 (2H,d,J=8.3Hz), 7.51-7.48 (4H,m), 7.34 (2H,d,J=8.4Hz), 6.97 (1H,s), 6.07 (1H,t,J=4.5Hz), 2.34 (2H,d,J=4.6Hz), 1.29 (6H,s).
【０２０６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物26)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-ピリジル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物11）45.0 mg(0.110 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）48.0 mg(1.20 mmol, 1.2ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却後、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体を得た。1H NMR (DMSO):δ8.60 (1H,d,J=4.6Hz), 8.55 (1H,s), 7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.76 (1H,d,J=7.5Hz), 7.60 (2H,d,J=8.3Hz), 7.51-7.46 (3H,m), 6.94 (1H,s), 6.14 (1H,t,J=4.5Hz), 2.37 (2H,d,J=4.5Hz), 1.31 (6H,s).
【０２０７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物27)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物３)80.0 mg(0.190 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）60.0 mg(1.50 mmol, 1.5 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (DMSO):δ7.89 (2H,d,J=8.4Hz), 7.57 (2H,d,J=8.4Hz), 7.46 (2H,s), 7.29-7.14 (4H,m), 6.59 (1H,s), 5.90 (1H,t,J=4.7Hz), 2.39 (2H,m), 2.60 (3H,s), 1.39 (3H,s), 1.29 (3H,s).
【０２０８】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-ヒドロキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物28)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(3-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物H）40.0 mg(0.076 mmol) をEtOH 3mlおよびTHF2 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム(1.0M水溶液）40.0 mg(1.00 mmol, 1.00 ml)を加えた。その溶液を50℃で２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10%塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-アセトン):δ7.90 (2H,d,J=8.3Hz), 7.49 (2H,d,J=8.4Hz), 7.35 (2H,s), 7.15-7.07 (2H,m), 6.77-6.69 (3H,m), 5.92 (1H,t,J=4.7Hz), 2.25(2H,d,j=4.7Hz), 1.23 (6H,s).
【０２０９】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-ヒドロキシフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物29)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-((2,2-ジメチルエチル)-ジメチルシロキシ)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物I）75.0 mg(0.143 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム（1.0 M水溶液）60.0 mg(1.50 mmol, 1.50 ml)を加えた。その溶液を50℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、10 %塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-acetone):δ8.01 (2H,d,J=8.3Hz), 7.59 (2H,d,J=8.4Hz), 7.45 (2H,s), 7.20-7.17 (3H,m), 6.92-6.89 (2H,m), 5.97 (1H,t,J=4.7Hz), 2.35 (2H,d,J=4.7Hz), 1.34 (6H,s).
【０２１０】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物30)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物15）(100 mg, 0.23 mmol)をEtOH 3 mlおよびTHF 2 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム水溶液（1 ml, 1 M, 1 mmol）を加えた。その溶液を50℃に１時間加温し、それから減圧濃縮した。残留物をジクロロメタンとエーテル(5:1)の溶液に懸濁させ、1 M塩酸でpH ５にした。分液し、有機層を食塩水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥、濾過し、それから溶媒を減圧で除去して標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ7.96 (1H,d,J=1.7Hz), 7.95 (2H,d,J=8.0Hz), 7.65 (2H,d,J=8.0Hz), 7.64 (1H,s), 7.53 (1H,dd,J=1.7, 8.0Hz), 7.46 (1H,d,J=8.0Hz), 6.59 (1H,t,J=4.5Hz), 2.50 (3H,s), 2.39 (2H,d,J=4.5Hz), 1.27 (6H,s).
【０２１１】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物30a)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物15a）33.9 mg(0.08 mmol)とLiOH ・H２O 8.5 mg(0.20 mmol)をTHF/水(3:1 V/V)３ mlに溶かした溶液を室温で一晩攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、水および食塩水で洗浄し、それから硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して標題化合物を無色の固体として得た。PMR (d6-DMSO):δ1.29 (6H,s), 2.42 (2H,d,J=4.6Hz), 6.68 (1H,t,J=4.6Hz), 7.51 (2H,m), 7.62 (2H,d,J=8.2Hz), 7.77 (1H,d,J=3.3Hz), 7.93 (2H,d,J=8.2Hz), 7.98 (1H,d,J=3.3Hz).
【０２１２】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物31)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物16）(145.0 mg, 0.34 mmol)をエタノール４ mlに溶かした溶液に室温で水酸化ナトリウム水溶液（1 ml, 1 M, 1mmol）を加えた。得られた溶液を50℃に１時間加温し、それから減圧濃縮した。残留物をジクロロメタンとエーテル（5:1）の溶液に懸濁させ、1 Mの塩酸でpHを５にした。分液し、有機層を水および食塩水で洗浄し、それから硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後減圧濃縮して標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ7.94 (2H,d,J=8.1Hz), 7.87 (2H,d,J=1.6Hz), 7.63 (2H,d,J=8.3Hz), 7.50 (1H,dd,J=1.6, 8.1Hz), 7.45 (1H,d,J=8.1Hz), 7.27 (1H,s), 6.58 (1H,t,J=4.8Hz), 2.43 (3H,s), 2.37 (2H,d,J=4.8Hz), 1.26 (6H,s).
【０２１３】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物32)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物17）（58.0 mg, 0.13 mmol）をエタノール４ mlに溶かした溶液に室温で水酸化ナトリウム（1 ml, 1 M, 1mmol）を加えた。得られた溶液を50℃に１時間加温し、減圧濃縮した。残留物をジクロロメタンとエーテル（5:1）の溶液に懸濁させ、1 Mの塩酸でpHを５にした。分液し、有機層を食塩水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過後溶媒を減圧除去し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ7.94 (2H,d,J=8.4Hz), 7.86 (1H,d,J=1.6Hz), 7.61 (2H,dd,J=8.3Hz), 7.50 (1H,dd,J=1.6, 8.0Hz), 7.45 (1H,d,J=8.0Hz), 6.51 (1H,t,J=4.9Hz), 2.37 (3H,s), 2.36 (2H,d,J=4.6Hz), 2.32 (3H,s), 1.26 (6H,s).
【０２１４】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチル-2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物33)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛202.0 mg(1.48 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24 mg(0.022 mmol)のTHF２ ml溶液および5-メチル-2-リチオチオフェン（n-ブチルリチウム（2.5 Mヘキサン溶液）58.65 mg(0.38 ml, 0.915 mmol)を2-メチルチオフェン89.8 mg(0.915 mmol)の2.0 mlTHF冷溶液（-78℃）に加えて調製した）を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）170.0 mg(0.366 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。1H NMR (CDCl３):δ8.00 (2H,d,J=8.3Hz), 7.59 (1H,d,J=1.7Hz), 7.55 (2H,d,J=8.2Hz), 7.43 (1H,dd,J=1.7, 8.0Hz), 7.35 (1H,d,J=8.0Hz), 6.87 (1H,d,J=3.5Hz), 6.74 (1H,d,J=2.8Hz), 6.15 (1H,t,J=4.8Hz), 4.38 (2H,q,J=7.1Hz), 2.52 (3H,s), 2.32 (2H,d,J=4.8Hz), 1.40 (3H,t,J=7.1Hz), 1.32 (6H,s).
【０２１５】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物33a)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛186.8 mg(1.37 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）37.1 mg(0.03 mmol)および2-リチオチオフェン（n-ブチルリチウム（1.5 Mヘキサン溶液）65.9 mg,(0.69 ml, 1.03 mmol)をチオフェン86.5 mg(1.03 mmol)の1.0 mlTHF冷溶液（-78℃）に加えて調製した）を使用して4-[（5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物G）250.0 mg(0.52 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。PMR (CDCl３):δ1.33 (6H,s), 1.36 (3H,t,J=7.1Hz), 2.38 (2H,d,J=4.7Hz), 4.34 (2H,q,J=7.2Hz), 6.25 (1H,t,J=4.7Hz), 7.13 (2H,m), 7.47 (4H,m), 7.62 (2H,d,J=8.5Hz), 8.00 (2H,d,J=8.5Hz).
【０２１６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチル-2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物34)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(5-メチル-2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物33）（35.0 mg, 0.082 mmol)のEtOH 3 mlおよびTHF 2 ml溶液に室温で水酸化ナトリウム(1 ml, 1 M)を加えた。得られた溶液を室温で一晩攪拌し、それから10 % 塩酸で酸性にした。酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧除去し標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-acetone):δ8.03 (2H,d,J=8.6Hz), 7.63 (2H,d,J=8.6Hz), 7.54-7.48 (3H,m), 6.89 (1H,m), 6.18 (1H,t,J=4.7Hz), 2.49 (3H,s), 2.35 (2H,d,J=4.7Hz), 1.32 (6H,s).
【０２１７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物34a)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-８-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物30a）の場合と同じ一般的合成法を適用し、LiOH・H２O 17.8 mg(0.42 mmol)を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チエニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物33a）70.0 mg(0.17 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。PMR (d6-DMSO):δ1.27 (6H,s), 2.33 (2H,d,J=4.9Hz), 6.23 (1H,t,J=4.9Hz), 7.14 (2H,m), 7.38-7.56 (4H,m), 7.61 (2H,d,J=8.3Hz), 7.92 (2H,d,J=8.3Hz).
【０２１８】
5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレンカルボン酸(化合物K)
3,4-ジヒドロ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-ブロモナフタレン（化合物D）(250.0 mg, 0.764 mmol)のTHF2.0 ml溶液を-78℃まで冷却し、t-ブチルリチウム1.0 ml(1.68 mmol, 1.7 Mペンタン溶液)をゆっくり加えた。-78℃で１時間攪拌したのち、（ドライアイスを蒸発させて発生させ、乾燥管中を通した）CO２ガスを反応液に１時間通じた。それから、溶液を室温に戻し、10 %塩酸を加えて反応を停止した。酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせ水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除き、そして固体をヘキサンで洗い、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ7.94 (1H,dd,J=1.8, 8.1Hz), 7.76 (1H,d,J=1.8Hz), 7.45 (1H,d,J=8.1Hz), 7.24 (4H,m), 6.01 (1H,t,J=4.7Hz), 2.40 (3H,s), 2.36 (2H,d,J=4.7Hz), 1.35 (6H,s).
【０２１９】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物35)
5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレンカルボン酸（化合物K）170.0 mg(0.58 mmol)、4-アミノ安息香酸エチル115.0 mg(0.70 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩145.0 mg(0.76 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン92.4 mg(0.76 mmol)のDMF6.0 ml溶液を室温で一晩攪拌した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、クロマトグラフィ（10 %ないし15 % 酢酸エチル/ヘキサン）によって生成物を無色の結晶として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.02 (2H,d,J=8.7Hz), 7.72 (2H,m), 7.65 (2H,d,J=8.7Hz), 7.52 (1H,d,J=1.8Hz), 7.48 (1H,d,J=8.0Hz), 7.25 (4H,m), 6.15 (1H,t,J=4.9Hz), 4.36 (2H,q,J=7.1Hz), 2.40 (3H,s), 2.38 (2H,d,J=4.9Hz), 1.39 (3H,t,J=7.1Hz), 1.37 (6H,s).
【０２２０】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸（化合物36)
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物35）26.5 mg(0.06 mmol)のEtOH3.0 mlおよびTHF4.0 mlの溶液に水酸化ナトリウム240.1 mg(6.00 mmol, 2 M水溶液3.0 ml)を加えた。室温で72時間攪拌したのち、10 %塩酸を加えて反応を停止させた。酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下に除去すると固体が得られた。これをアセトニトリルから再結晶し、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-DMSO):δ10.4 (1H,s), 7.91-7.81 (5H,m), 7.54 (1H,d,J=8.1Hz), 7.45 (1H,d,J=1.7Hz), 7.23 (4H,s), 6.04 (1H,t,J=4.7Hz), 2.35 (5H,s), 1.33 (6H,s).
【０２２１】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]オキシ]安息香酸エチル（化合物37)
5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレンカルボン酸（化合物K）25.0 mg(0.086 mmol)、4-ヒドロキシ安息香酸エチル17.5 mg(0.103 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩21.4 mg(0.112 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン12.6 mg(0.103 mmol)のDMF2.0 ml溶液を室温で一晩攪拌した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去したのち、カラムクロマトグラフィ（10 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけ、生成物を淡黄色の結晶として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.08 (2H,d,J=8.1Hz), 8.05 (1H,dd,J=1.8, 8.1Hz), 7.89 (1H,d,J=1.8Hz), 7.50 (2H,d,J=8.1Hz), 7.22 (5H,m), 6.05 (1H,t,J=4.7Hz), 4.37 (2H,q,J=7.1Hz), 2.39 (2H,d,J=4.7Hz), 2.38 (3H,s), 1.39 (3H,t,J=7.1Hz), 1.37 (6H,s)
【０２２２】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]オキシ]安息香酸 2-トリメチルシリルエチル（化合物38)
5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレンカルボン酸（化合物K）83.5 mg(0.320 mmol)、4-ヒドロキシ安息香酸 2-トリメチルシリルエチル76.0 mg(0.319 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩80.0 mg(0.417 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン51.0 mg(0.417 mmol)のDMF4.0 ml溶液を室温で一晩攪拌した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、カラムクロマトグラフィによって（５ %酢酸エチル/ヘキサン）生成物を無色の固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.08 (2H,d,J=8.8Hz), 8.05 (1H,dd,J=1.8, 8.1Hz), 7.50 (1H,d,J=8.1Hz), 7.26-7.18 (6H,m), 6.05 (1H,t,J=4.7Hz), 4.42 (2H,t,J=8.4Hz), 2.40 (2H,d,J=4.7Hz), 2.39 (3H,s), 1.38 (6H,s), 0.09 (9H,s)
【０２２３】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]オキシ]安息香酸（化合物39)
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]オキシ]安息香酸 2-トリメチルシリルエチル（化合物38）110.0 mg(0.213 mmol)およびテトラブチルアンモニウムフルオリド167.3 mg(0.640 mmol、１M THF溶液0.64 ml)のTHF2.0 ml溶液を室温で22時間攪拌した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、残留固体を酢酸エチルおよびアセトニトリルで洗浄して、標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (d6-アセトン):δ8.10 (2H,d,J=8.8Hz), 8.06 (1H,dd,J=2.0, 8.1Hz), 7.82 (1H,d,J=1.9Hz), 7.64 (1H,d,J=8.1Hz), 7.35 (2H,d,J=8.6Hz), 7.25 (4H,m), 6.08 (1H,t,J=4.7Hz), 2.42 (2H,d,J=4.7Hz), 2.35 (3H,s), 1.39 (6H,s).
【０２２４】
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物40)
5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレンカルボン酸（化合物K）115.0 mg(0.41 mmol)、2-フルオロ-4-アミノ安息香酸エチル89.0 mg(0.49 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩102.0 mg(0.53 mmol)および4-ジメチルアミノピリジン65.0 mg(0.53 mmol)のDMF5.0 ml溶液を50℃で１時間攪拌し、それから室温で一晩攪拌した。酢酸エチルを加え、得られた溶液を水、飽和炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウムで洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を癌圧下に除去したのち、カラムクロマトグラフィ（20 %酢酸エチル/ヘキサン）によって生成物を無色の固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ7.96 (1H,s), 7.89 (1H,t,J=8.4Hz), 7.70 (2H,m), 7.52 (1H,d,J=1.9Hz), 7.45 (1H,d,J=8.1Hz), 7.23 (5H,m), 6.04 (1H,t,J=4.8Hz), 4.36 (2H,q,J=7.1Hz), 2.38 (3H,s), 2.35 (2H,d,J=4.8Hz), 1.39 (3H,t,J=7.1Hz), 1.36 (6H,s).
【０２２５】
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸（化合物41)
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物40）41.6 mg(0.091 mmol)のエタノール2.0 mlおよびTHF2.0 ml溶液に水酸化ナトリウム40.0 mg(1.00 mmol, 1 M水溶液1.0 ml)を加えた。室温で一晩攪拌したのち、10 %塩酸を加えて反応を停止させた。 酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、それから溶媒を減圧下に除去して固体を得た。アセトニトリルから再結晶し、標題化合物を淡黄色固体として得た。1H NMR (d6-アセトン):δ9.84 (1H,s), 7.94-7.83 (3H,m), 7.64 (1H,dd,J=2.0Hz), 7.53 (2H,d,J=8.1Hz), 7.23 (4H,s), 6.04 (1H,t,J=4.7Hz), 2.38 (2H,d,J=4.7Hz), 2.36 (3H,s), 1.35 (6H,s).
【０２２６】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物42)
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル(化合物35）110.0mg(0.25 mmol)および[2,4-ビス(4-メトキシフェニル)-1,3-ジチア-2,4-ジホスフェタン-2,4-ジスルフィド](Lawesson試薬)121.0 mg(0.30 mmol)のベンゼン12.0ml溶液を一晩還流させた。室温まで冷却したのち混合物を濾過し、濾液を減圧濃縮した。クラマトグラフィ(10%から20%酢酸エチル/ヘキサン)にかけ、標題化合物を黄色固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.92 (1H,s), 8.06 (2H,t,J=8.5Hz), 7.88-7.70 (3H,m), 7.42 (2H,d,J=8.1Hz), 7.18 (4H,m), 6.03 (1H,t,J=4.7Hz), 4.37 (2H,q,J=7.1Hz), 2.38 (3H,s), 2.36 (2H,d,J=4.7Hz), 1.56 (3H,t,J=7.1Hz), 1.35 (6H,s).
【０２２７】
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸（化合物43)
4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物42）84.0 mg(0.184 mmol)のEtOH 2.0 mlおよびTHF 2.0 ml溶液に水酸化ナトリウム60.0 mg（1.50 mmol, 1 M水溶液1.5 ml）を加えた。室温で一晩攪拌した後、10 %塩酸を加えて反応を停止させた。酢酸エチルで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、そして溶媒を減圧除去して固体を得た。アセトニトリルから再結晶して標題化合物を黄色固体として得た。1H NMR (d6-アセトン):δ10.96 (1H,s), 8.05 (4H,m), 7.72 (1H,dd,J=2.0, 8.0Hz), 7.54 (1H,s), 7.46 (1H,d,J=8.1Hz), 7.20 (4H,m), 6.04 (1H,t,J=4.7Hz), 2.38 (2H,d,J=4.7Hz), 2.33 (3H,s), 1.35 (6H,s).
【０２２８】
2-アセチル-6-ブロモナフタレン（化合物L)
2-ブロモナフタレン44.0 g(0.212 mol)および塩化アルミニウム34.0 g(0.255 mol)を入れたニトロベンゼン400 mlの冷混合物（-10℃）に塩化アセチル21.0 g(267 mmol)を加えた。反応混合物を攪拌機で攪拌しながら室温まで昇温させ、それから40℃に18時間加熱した。氷浴中で0℃まで冷却し、12 M塩酸（70 ml）を加えて反応を停止させた。分液し、有機層を水および薄い炭酸ナトリウム水溶液で洗った。クーゲルロールで蒸留し、それから10 %酢酸エチル−ヘキサンで再結晶を行い淡褐色の標題化合物23 gを得た。1H NMR (CDCl３):δ8.44 (1H,br,s), 8.04-8.10 (2H,m), 7.85 (1H,d,J=8.5Hz), 7.82 (1H,d,J=8.8Hz), 7.64 (1H,d,J=8.8Hz), 2.73 (3H,s).
【０２２９】
6-ブロモ-2-ナフタレンカルボン酸（化合物M)
次亜塩素酸ナトリウム溶液（62 ml, 5.25 w/w %水溶液、3.6 g, 48.18 mmol）に水50 mlに溶かした水酸化ナトリウム(6.4 g, 160.6 mmol)と1,4-ジオキサン50 mlに溶かした2-アセチル-6-ブロモナフタレン（化合物L）4 gを加えた。その黄色溶液を油浴中70℃に２時間加熱し、それから室温まで冷却し、エチルエーテル(2 x 50 ml)で抽出した。水層を炭酸水素ナトリウム溶液で希釈し（KI指示溶液が着色しなくなるまで）、それから1 N硫酸で酸性（pH＜２）にすると白色の沈殿が生成した。混合物をエチルエーテルで抽出し、有機層を合わせて飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、それから硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して固体の標題化合物3.54 g(88 %)を得た。1H NMR (DMSO-d6):δ8.63 (1H,br,s), 8.32 (1H,d,J=2.0Hz), 8.10 (1H,d,J=8.8Hz), 8.00-8.05 (2H,m), 7.74 (1H,dd,J=2.0, 8.8Hz).
【０２３０】
6-ブロモ-2-ナフタレンカルボン酸エチル（化合物N)
6-ブロモ-2-ナフタレンカルボン酸（化合物M）3.1 g(12.43 mmol)のエタノール（30 ml, 23.55 g, 511.0 mmol）溶液に18 M硫酸(２ ml)を加えた。溶液を30分間還流させ、そして室温まで冷却し、それから反応混合物をペンタン(100 ml)と水(100 ml)の間に分配させた。水層をペンタン(100 ml)で抽出し、合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム(  100 ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して白色固体を得た。フラッシュクロマトグラフィ（シリカ、10 %酢酸エチル−ヘキサン）によって精製し、標題化合物を白色固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ8.58 (1H,br,s), 8.10 (1H,dd,J=1.7, 9Hz), 8.06 (1H,d,J=2Hz), 7.83 (1H,d,J=9Hz), 7.80 (1H,d,J=9Hz), 7.62 (1H,dd,J=2, 9Hz).
【０２３１】
(E)-4-[2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物O)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ブロモ-1(2H)-ナフタレノン（化合物B）520.0 mg(2.00 mmol)および4-ビニル安息香酸エチル510.0 mg(2.90 mmol)のトリエチルアミン4.0 ml溶液（アルゴンを25分間通気して脱ガス）にトリス（2-メチルフェニル）ホスフィン124.0 mg(0.40 mmol)を加え、それから酢酸パラジウム（II）を加えた。生成した溶液を95℃に2.5時間加熱し、そのあと室温まで冷却し、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィで精製し、標題化合物を無色固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ8.19 (1H,d,J=2.0Hz), 8.03 (2H,d,J=8.4Hz), 7.69 (1H,dd,J=2.0, 8.2Hz), 7.57 (2H,d,J=8.4Hz), 7.45 (1H,d,J=8.2Hz), 7.20 (2H,s), 4.39 (2H,q,J=7.1Hz), 2.76 (2H,t,J=6.5Hz), 2.04 (2H,t,J=6.5Hz), 1.41 (3H,t,J=7.1Hz および 6H,s).
【０２３２】
(E)-4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物P)
ビス（トリメチルシリル）アミド ナトリウム440.0 mg(2.40 mmol)のTHF10.0 ml冷溶液（-78℃）に(E)-4-[2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物Ｏ）700.0 mg(2.00 mmol)のTHF25.0 ml溶液として加えた。-78℃で1.5時間攪拌したのち、2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジン960.0 mg(2.40 mmol)を１度に加えた。30分後に溶液を  0℃まで昇温し３時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。抽出液を合わせて5 %水酸化ナトリウム水溶液で洗い、つづいて硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下に除いた。カラムクロマトグラフィ（7%酢酸エチル/ヘキサン）によって標題化合物を無色固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.04 (1H,d,J=8.4Hz), 7.57 (2H,d,J=8.4Hz), 7.52 (1H,s), 7.49 (1H,d,J=8.0Hz), 7.33 (1H,d,J=8.0Hz), 7.20 (1H,d,J=16.4Hz), 7.10 (1H,d,J=16.4Hz), 6.00 (1H,t,J=4.9Hz), 4.39 (2H,q,J=7.1Hz), 2.43 (2H,d,J=4.9Hz), 1.41 (3H,t,J=7.1Hz), 1.32 (6H,s).
【０２３３】
(E)-4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物44)
4-ブロモトルエン374.5 mg(2.20 mmol)のTHF2.5ml溶液にt-ブチルリチウム130.7 mg（2.04 mmol; 1.7 M ペンタン溶液1.20 ml）を-78℃で加えて4-リチオトルエン溶液を調製した。30分後に塩化亜鉛313.4 mgをTHF2.0 mlに溶かした溶液を添加した。得られた溶液を室温まで昇温させ、1.25時間攪拌し、それからカニュ-レを通して(E)-4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物P）285.0 mgおよびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）29.0 mgをTHF2.0 mlに溶かした溶液に添加した。生成した溶液を室温で１時間、そして55℃で２時間攪拌した。室温まで冷却し飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させた。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせて5 %水酸化ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、続いて硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ（10 % 酢酸エチル/ヘキサン）により標題化合物を無色の固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ7.96 (2H,d,J=8.1Hz), 7.47 (2H,d,J=8.1Hz), 7.43-7.16 (7H,m), 7.07 (1H,d,J=16.3Hz), 6.93 (1H,d,J=16.3Hz), 5.97 (1H,t,J=4.7Hz), 4.39 (2H,q,J=7.0Hz), 2.41 (3H,s), 2.33 (1H,d,J=4.7Hz), 1.38 (3H,t,J=7.0Hz), 1.33 (6H,s).
【０２３４】
(E)-4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸（化合物45)
(E)-4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物44）65.0 mg(0.190 mmol)のTHF4.0 ml溶液にLiOH 30.0 mg（0.909 mmol, 1.1 M 溶液1.0 ml）とメタノール1.0 mlを加えた。得られた溶液を55℃に３時間加熱し、室温まで冷却し、それから減圧濃縮した。残留物を水に溶かし、ヘキサンで抽出した。水層を10 %塩酸でpH１まで酸性にし、それからエーテルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、酢酸エチルで希釈すると透明な溶液が得られ、これを硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下に除去すると標題化合物が無色固体として得られた。1H NMR (d6-DMSO):δ7.86 (2H,d,J=8.4Hz), 7.66 (2H,d,J=8.4Hz), 7.58 (1H,dd, J=1.7, 8.1Hz), 7.41 (1H,d,J=8.1Hz), 7.28 (1H,d,J=16.5Hz), 7.23 (4H,s), 7.08 (1H,d,J=1.7Hz), 7.07 (1H,d,J=16.5Hz), 5.97 (1H,t,J=4.6Hz), 2.35 (3H,s), 2.31 (1H,d,J=4.6Hz), 1.29 (6H,s).
【０２３５】
4-[2-(1,1-ジメチル-3-(4-メチルフェニル)-5-インデニル)エテニル]安息香酸エチル（化合物47)
4-ブロモトルエン32.0 mg(0.187 mmol)のTHF1.0 ml溶液を-78℃まで冷却し、t-ブチルリチウム24.0 mg（0.375 mmol, 1.7 M ペンタン溶液0.22 ml）をゆっくり加えた。黄色の溶液を30分間攪拌し、塩化亜鉛29.8 mg(0.219 mmol)のTHF１.0 ml溶液として加えた。生成した溶液を室温まで昇温し、39分後に4-[2-(1,1-ジメチル-3-(トリフルオロメチルスルホニル）オキシ-5-インデニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物FF）29.0 mg(0.062 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）2.9 mgのTHF1.0 ml溶液を入れた第２のフラスコに加えた。生成した溶液を50℃に１時間加温し、それから室温で４時間攪拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させ、エーテルで抽出した。有機層を合わせて水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ（10 % 酢酸エチル/ヘキサン）により標題化合物を無色の油状物として単離した。1H NMR (300 MHz CDCl３):δ8.03 (2H,d,J=8.5Hz), 7.66 (1H,s), 7.58 (2H,d,J=8.5Hz), 7.50 (2H,d,J=8.0Hz), 7.46 (1H,d,J=7.9Hz), 7.38 (1H,d,J=7.7Hz), 7.28 (2H,d,J=9Hz), 6.43 (1H,s), 4.40 (2H,q,J=7.2Hz), 2.43 (3H,s), 1.41 (3H,t; 6H,s).
【０２３６】
4-[2-(1,1-ジメチル-3-(4-メチルフェニル)-5-インデニル)エチニル]安息香酸(化合物48)
4-[2-(1,1-ジメチル-3-(4-メチルフェニル)-5-インデニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物47)10.0 mg(0.025 mmol)の0.5mlTHF/水(3:1 V/V)溶液にLiOH・H２O 5.2mg(0.12 mmol)を加えた。室温で48時間攪拌した後、溶液をヘキサンで抽出し、水層を飽和塩化アンモニウムで酸性にした。固体の塩化ナトリウムを添加し、得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮すると標題化合物が無色の固体として得られた。1H NMR (300 MHz d６-DMSO):δ7.95 (2H,d,J=8.3Hz), 7.65 (2H,d,J=8.3Hz), 7.57 (2H,m), 7.49 (3H,m), 7.30 (2H,d,J=7.9Hz), 6.61 (1H,s), 2.36 (3H,s), 1.36 (6H,s).
【０２３７】
3-(4-ブロモチオフェノキシ)プロピオン酸
脱ガスした水(アルゴンを通気）20.0 mlに水酸化ナトリウム1.44 g(35.7 mmol)を溶かした溶液に4-ブロモチオフェノール6.79 g(35.7 mmol)を添加した。その混合物を室温で30分間攪拌した。第２のフラスコに炭酸カリウム2.20 g(16.3 mmol)と脱ガスした水15 mlを入れた。この溶液に3-ブロモプロピオン酸5.00 g(32.7 mmol)を（何回かに分けて）加えた。得られたカルボン酸カリウム溶液をナトリウムチオラート溶液に加え、その混合物を室温で48時間攪拌した。混合物を濾過し、濾液をベンゼンで抽出し、有機層は合わせて廃棄した。水層を10 %塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。得られた固体をエーテル−ヘキサンから再結晶し、標題化合物を少し色を帯びた白色結晶として得た。1H NMR (CDCl３):δ7.43 (2H,d,J=8.4Hz), 7.25 (2H,d,J=8.4Hz), 3.15 (2H,t,J=7.3Hz), 2.68 (2H,t,J=7.3Hz).
【０２３８】
2,3-ジヒドロ-6-ブロモ-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン
3-(4-ブロモチオフェノキシ)プロピオン酸3.63 g(13.9 mmol)のメタンスルホン酸60 ml溶液を75℃に1.5時間加熱した。室温まで冷却後、溶液を水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて2Nの水酸化ナトリウム水溶液、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し黄色の固体を得た。これをカラムクロマトグラフィにかけ（３ %酢酸エチル−ヘキサン）、生成物を淡黄色固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ8.22 (1H,d,J=2.1Hz), 7.48 (1H,dd,J=2.1, 8.3Hz), 7.17 (1H,d,J=8.5Hz), 3.24 (2H,t,J=6.4Hz), 2.98 (2H,t,J=6.7Hz).
【０２３９】
2,3-ジヒドロ-6-(2-トリメチルシリルエチニル)-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン
ＴＨＦ15.0 ml中の2,3-ジヒドロ-6-ブロモ-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン1.00 g(4.11 mmol)およびCuI78.3 mg(0.41 mmol)、およびジエチルアミン6.0 mlの溶液にアルゴンを５分間通じた。この溶液に(トリメチルシリル)アセチレン2.0ml(1.39g, 14.2 mmol)を加え、さらに続いてビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド288.5 mg(0.41 mmol)を加えた。生成した暗色の溶液を室温で３日間攪拌し、それからセライトの層を通して濾過し、酢酸エチルで洗浄した。濾液を水および飽和食塩水で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。カラムクロマトグラフィ（４ %酢酸エチル/ヘキサン）により、標題化合物として橙色油状物を得た。1H NMR (CDCl３):δ8.13 (1H,d,J=1.9Hz), 7.36 (1H,dd,J=2.1, 8.2Hz), 7.14 (1H,d,J=8.2Hz), 3.19 (2H,d,J=6.3Hz), 2.91 (2H,d,J=6.3Hz), 0.21 (9H,s).
【０２４０】
2,3-ジヒドロ-6-エチニル-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン
2,3-ジヒドロ-6-(2-トリメチルシリルエチニル)-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン600.0 mg(2.25 mmol)および炭酸カリウム100.0 mg(0.72 mmol)を含むメタノール15.0 ml溶液を室温で20時間攪拌した。溶液を水で希釈し、エーテル抽出した。有機層を合わせて水および飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、標題化合物を橙色固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ8.17 (1H,d,J=1.8Hz), 7.40 (1H,dd,J=1.8, 8.2Hz), 7.19 (1H,d,J=8.2Hz), 3.22 (2H,t,J=6.3Hz), 3.08 (1H,s), 2.94 (2H,t,J=6.3Hz).
【０２４１】
4-[2-(6-(2,3-ジヒドロ-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オニル)エチニル]安息香酸エチル
2,3-ジヒドロ-6-エチニル-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オン405.0 mg(2.15 mmol)および4-ヨード安息香酸エチル594.0 mg(2.15 mmol)をトリエチルアミン15 mlとTHF3 mlに溶かした溶液に15分間アルゴンを通じて脱気した。この溶液にビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド503.0 mg(0.72 mmol)およびCuI137.0 mg(0.72 mmol)を加えた。この溶液を室温で20時間攪拌し、それからセライトの層を通して濾過し酢酸エチルで洗った。溶媒を減圧で除去し褐色の固体を得た。カラムクロマトグラフィ(3%酢酸エチル/ヘキサン）にかけ、標題化合物を橙色固体として得た。1H NMR (d６-アセトン):δ8.15 (1H,d,J=2.0Hz), 8.02 (2H,d,J=8.5Hz), 7.69 (2H,d,J=8.5Hz), 7.61 (1H,dd,J=2.1, 8.3Hz), 7.40 (1H,d,J=8.2Hz), 4.35 (2H,q,J=7.1Hz), 3.40 (2H,t,J=6.3Hz), 2.96 (2H,t,J=6.3Hz), 1.37 (3H,t,J=7.1Hz).
【０２４２】
4-[2-(6-(4-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ)-(2H)-1-ベンゾチオピラニル)エチニル]安息香酸エチル
-78℃に冷却したナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミド221.9mg(1.21 mmol)のTHF3.0 ml溶液に、4-[2-(6-(2,3-ジヒドロ-(4H)-1-ベンゾチオピラン-4-オニル)エチニル)]安息香酸エチル370.0mg(1.10 ml)のTHF4.0 mlを加えた。30分後に2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジンのTHF4.0 ml溶液をゆっくり加えた。反応混合物を室温までゆっくり昇温し、それから５時間後に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を5 %水酸化ナトリウム、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィにかけて標題化合物の淡黄色固体を得た。1H NMR (d６-アセトン):δ 8.12 (2H, d, J=8.5Hz), 7.66 (2H, d, J=8.5Hz), 7.56 (1H, d, J=1.7Hz), 7.49 (1H, dd, J=1.7, 8.1Hz), 7.40 (1H, d, J=8.1Hz), 6.33 (1H, t, J=5.7Hz), 4.35 (2H, q, J=7.1Hz), 3.82 (2H, d, J=5.7Hz), 1.37 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２４３】
4-[2-(6-(4-(4-メチルフェニル)-(2H)-1-ベンゾチオピラニル))エチニル]安息香酸エチル（化合物49)
4-ブロモトルエン120.0 mg(0.70 mmol)のTHF2.0 ml溶液に-78℃でt-ブチルリチウム88.4 mg(1.38 mmol, 1.7 Mペンタン溶液 0.81 ml)を添加した。30分後に、塩化亜鉛131.6 mg(0.97 mmol)のTHF2.0 ml溶液を加え、生成した淡黄色溶液を室温まで昇温した。40分間攪拌を続け、それからこの溶液を、4[2-(6-(4-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-(2H)-1-ベンゾチオピラニル))エチニル]安息香酸エチル129.2 mg(0.28 mmol)、テトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(０)14.0 mg(0.012 mmol)およびTHF2.0 mlを入れた第２のフラスコに加えた。得られた溶液を50℃に５時間加熱し、室温まで冷却し、それから飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止した。混合物を酢酸エチルで抽出し、それから有機層を合わせて水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して橙色油状物を得た。カラムクロマトグラフィ(3〜5%酢酸エチル−ヘキサン）にかけ、標題化合物を無色固体として単離した。1H NMR (d６-アセトン):δ 7.98 (2H, d, J=8.3Hz), 7.58 (2H, d, J=8.2Hz), 7.44-7.38 (2H, m), 7.26-7.15 (5H, m), 6.14 (1H, t, J=5.8Hz), 4.34 (2H, q, J=7.1Hz), 3.53 (2H, d, J=5.8Hz), 2.37 (2H, s), 1.35 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２４４】
4-[2-(6-(4-(4-メチルフェニル)-(2H)-1-ベンゾチオピラニル))エチニル]安息香酸（化合物50)
4-[2-(6-(4-(4-メチルフェニル)-(2H)-1-ベンゾチオピラニル))エチニル]安息香酸エチル（化合物49）29.0 mg(0.07 mmol)をTHF2.0 mlとEtOH2.0 mlに溶かした溶液に160.0 mg(4.00mmol,2 M水溶液2.0 ml)を加えた。得られた溶液は35℃で２時間攪拌し、それから室温まで冷却し、さらに２時間攪拌した。10 %塩酸を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去して得られる固体をアセトニトリルで洗い、高真空で乾燥して標題化合物の淡黄色固体を得た。1H NMR (d６-DMSO):δ 7.90 (2H, d, J=8.4Hz), 7.59 (2H, d, J=8.4Hz), 7.40 (4H, m), 7.25-7.13 (4H, m), 7.02 (1H, d, J=1.7Hz), 6.11 (1H, t, J=5.7Hz), 3.54 (2H, d, J=5.7Hz), 2.34 (3H, s).
【０２４５】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物R）および3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-アセチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物S)
塩化アルミニウム(26.3 g, 199.0 mmol)とジクロロメタン(55 ml)の冷混合物（０℃）に塩化アセチル(15 g, 192 mmol)および1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレン(24.4 g, 152 mmol)のジクロロメタン(20 ml)溶液を添加した。反応混合物を室温まで昇温し、４時間攪拌した。反応フラスコに氷(200 g)を加え、混合物をエーテル(400 ml)で希釈した。分液し、有機層を合わせて10 %塩酸(50 ml)、水(50 ml)、10 %炭酸水素ナトリウムおよび飽和塩化ナトリウム水溶液(50 ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して黄色油状物を得、それをベンゼン(50 ml)に溶解した。
【０２４６】
アルゴン雰囲気下、酢酸(240 ml)と無水酢酸(120 ml)の冷溶液（0℃）に三酸化クロム(50 g, 503 mmol)を少量づつ20分かけて加えた。混合物を０℃で30分間攪拌し、そしてベンゼン(120 ml)で希釈した。攪拌しながら、上で調製したベンゼン溶液を滴下漏斗を使って20分間で加えた。８時間後にイソプロピルアルコール(50 ml)、それから水(100 ml)を注意しながら0℃で加えて反応を停止させた。15分後に反応混合物をエーテル(1100 ml)および水(200 ml)で希釈し、それから炭酸水素ナトリウム(200 g)で中和した。エーテル層を水(100 ml)および飽和塩化ナトリウム水溶液(2 x 100 ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去してジケトンの異性体混合物を得た。これをカラムクロマトグラフィ(5 % 酢酸エチル/ヘキサン)で分離した。
【０２４７】
（化合物R）：1H NMR (CDCl３):δ 8.55 (1H, d, J=2.0Hz), 8.13 (1H, dd, J=2.0, 8.3Hz), 7.53 (1H, d, J=8.3Hz), 2.77 (2H, t, J=6.6Hz), 2.62 (3H, s), 2.05 (2H, t, J=6.6Hz), 1.41 (6H, s).
（化合物S）：1H NMR (CDCl３):δ 8.10 (1H, d, J=8.1Hz), 8.02 (1H, d, J=1.6Hz), 7.82 (1H, dd, J=1.6, 8.1Hz), 2.77 (2H, t, J=7.1Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J=7.1Hz), 1.44 (6H, s).
【０２４８】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))-1(2H)-ナフタレノン（化合物T)
3.4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物R）(140.0 mg, 0.60 mmol)、エチレングリコール(55.0 mg, 0.90 mmol)、p-トルエンスルホン酸１水和物(4 mg)およびベンゼン(25 ml)をDean-Stark装置を使って12時間還流させた。10 %炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止させ、エーテルで抽出した(2 x 75 ml)。有機層を合わせて水(5 ml)および飽和塩化ナトリウム水溶液(5 ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、標題化合物を無色油状物として得た。1H NMR (CDCl３):δ 8.13 (1H, d, J=2.0Hz), 7.64 (1H, dd, J=2.0, 8.2Hz), 7.40 (1H, d, J=8.2Hz), 3.97-4.10 (2H, m), 3.70-3.83 (2H, m), 2.73 (2H, t, J=6.5Hz), 2.01 (2H, t, J=6.5Hz), 1.64 (3H, s), 1.39 (6H, s).
【０２４９】
1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))ナフタレン（化合物U)
p-トルイルマグネシウムブロミド(1.0 ml; 1 Mエーテル溶液)195.4 mg(1.00 ml)のTHF２ml溶液に3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))-1(2H)ナフタレン(化合物T）135.0 mg(0.52 mmol)のTHF5 ml溶液を加えた。その溶液を16時間還流させたのち、室温まで冷却し、エーテル(50 ml)で希釈した。溶液を水(5 ml)および飽和塩化アンモニウム(5 ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、カラムクロマトグラフィ（5 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけて固体標題化合物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.37 (2H, d), 7.21 (1H, s), 7.13 (2H d, J=8.5Hz), 7.08 (2H, d, J=8.5Hz), 3.88-3.99 (2H, m), 3.58-3.75 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.12-2.30 (2H, m), 1.79-1.90 (1H, m), 1.57 (3H, s), 1.48-1.58 (1H, m), 1.38 (3H, s), 1.31 (3H, s).
【０２５０】
3,4-ジヒドロ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-アセチルナフタレン（化合物V)
1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル)ナフタレン(化合物U）130.0mg(0.38 mmol)、p-トルエンスルホン酸１水和物(4mg)およびベンゼン(5ml)の混合物を16時間還流させた。室温まで冷却し、反応混合物をエーテル(100ml)で希釈した後、10%炭酸水素ナトリウム、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧で除去し、固体標題化合物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.83 (1H, dd, J=1.8, 8.0Hz), 7.66 (1H, d, J=1.8Hz), 7.45 (1H, d, J=8.0Hz), 7.25 (2H, d, J=8.5Hz), 7.22 (2H, d, J=8.5Hz), 6.03 (1H, t, J=6.3Hz), 2.47 (3H, s), 2.41 (3H, s), 2.37 (2H, d, J=6.3Hz), 1.36 (6H, s).
【０２５１】
(E)-3-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2-ブテンニトリル（化合物W)
水素化ナトリウム(48.0 mg, 2.00 mmol)のTHF(6 ml)スラリーにジエチルシアノメチルホスホナート(450.0 mg, 2.50 mmol)を加えた。40分後に3,4-ジヒドロ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-アセチルナフタレン（化合物V）95.0 mg(0.33 mmol)のTHF(10 ml)溶液を添加した。混合物を16時間攪拌し、エーテル(100 ml)で希釈し、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、カラムクロマトグラフィ（3 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけて固体標題化合物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.39 (1H, d, J=1H), 7.32 (1H, dd, J=2.0, 8.1Hz), 7.20-7.25 (4H, brs), 7.15 (1H, d, J=2.0Hz), 6.03 (1H, t, J=6.0Hz), 5.44 (1H, s), 2.42 (3H, s), 2.36 (2H, d, J=6.0Hz), 2.35 (3H, s), 1.35 (6H, s).
【０２５２】
(E)-3-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2-ブタナール（化合物X)
(E)-3-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2-ブテンニトリル（化合物W）84.0 mg(0.29 mmol)のジクロロメタン(4 ml)冷溶液（-78℃）に水素化ジイソブチルアルミニウム（1 Mジクロロメタン溶液）0.50 ml(0,50 mmol)を加えた。１時間攪拌後、-78℃で2-プロパノール(1 ml)を加えて反応を停止させ、エーテル(100 ml)で希釈した。室温まで昇温し、溶液を水、10 %塩酸および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗った。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、油状の標題化合物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 10.12 (1H, d, J=7.9Hz), 7.43 (2H, s), 7.19-7.28 (5H, m), 6.27 (1H, d, J=7.9Hz), 6.03 (1H, t, J=4.8Hz), 2.47 (3H, s), 2.42 (3H, s), 2.37 (2H, d, J=4.8Hz), 1.37 (6H, s).
【０２５３】
(E,E,E)-3-メチル-7-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2,4,6-オクタトリエン酸エチル（化合物51)
(E)-3-エトキシカルボニル-2-メチルアリルホスホン酸ジエチル[J. Org. Chem. 39: 821(1974)に従って合成した]264.0 mg(1.00 mmol)の冷THF(２ml)溶液にn-ブチルリチウムのヘキサン溶液(1.6 M溶液)26.0 mg(0.41 mmol, 0.65 ml)を加え、すぐ引き続いて(E)-3-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2-ブテナール（化合物X）82.0 mg(0.26 mmol)のTHF(3 ml)溶液を加えた。１時間後に、反応混合物をエーテル(60 ml)で希釈し、水(5 ml)および飽和塩化ナトリウム水溶液(5 ml)で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、クロマトグラフィ(5 % 酢酸エチル/ヘキサン)、それからさらにHPLC(1 %酢酸エチル/ヘキサン)によって油状の標題化合物を単離した。1H NMR (d6-アセトン):δ 7.36-7.43 (2H, m), 7.18-7.27 (4H, m), 7.17 (1H, d, J=1.7Hz), 7.08 (1H, dd, J=11.2, 15.2Hz), 6.46 (1H, d, J=11.2Hz), 6.38 (1H, d, J=15.2Hz), 5.98 (1H, t, J=4.7Hz), 5.78 (1H, s), 4.10 (2H, q, J=7.1Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (3H, s), 2.32 (2H, d, J=4.7Hz), 2.12 (3H, s), 1.31 (6H, s), 1.22 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２５４】
(E,E,E)-3-メチル-7-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2,4,6-オクタトリエン酸（化合物52)
(E,E,E)-3-メチル-7-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)-2,4,6-オクタトリエン酸エチル（化合物51）85.0 mg(0.20 mmol)のTHF(1 ml)およびメタノール(1 ml)溶液にLiOH (0.5 ml, 1 M溶液) 12.0 mg(0.50 mmol)を加えた。混合物を６時間攪拌し、エーテル(60 ml)で希釈後、10 %塩酸(1 ml)で酸性にした。溶液を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、アセトンから再結晶して固体として標題化合物を得た。1H NMR (d6-アセトン):δ 7.35-7.45 (2H, m), 7.19.7.28 (4H, m), 7.17 (1H, d, J=1.8Hz), 7.09 (1H, dd, J=11.5, 15.1Hz), 6.48 (1H, d, J=11.5Hz), 6.42 (1H, d, J=15.1Hz), 5.99 (1H, t, J=4.7Hz), 5.82 (1H, s), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J=4.7Hz), 2.32 (3H, s), 2.13 (3H, s), 1.32 (6H, s).
【０２５５】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ニトロ-1(2H)-ナフタレノン（化合物Y)
-５℃で硫酸1.7 ml(3.0 g, 30.6 mmol, 18 M)に3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-1(2H)-ナフタレノン783.0 mg(4.49 mmol)をゆっくり加えた。硝酸426.7 mg(6.88 mmol, 0.43 ml, 16 M)および硫酸1.31 g(0.013 mol, 0.74 mi, 18 M)の溶液をゆっくり加えた。20分後に、氷を加え、生成した混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出液を合わせて減圧濃縮し、その残留物をクロマトグラフィ（10 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけて標題化合物の淡黄色固体を単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.83 (1H, d, J=2.6Hz), 8.31 (1H, dd, J=2.8, 8.9Hz), 7.62 (1H, d, J=8.7Hz), 2.81 (2H, t, J=6.5Hz), 2.08 (2H, t, J=6.5Hz), 1.45 (6H, s).
【０２５６】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アミノ-1(2H)-ナフタレノン（化合物Z)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-ニトロ-1(2H)-ナフタレノン（化合物Y）230.0 mg(1.05 mmol)の酢酸エチル5.0 ml溶液を触媒量の10 %Pd-Cと共に１気圧の水素下で、室温で  24時間攪拌した。セライトの層を通して触媒を濾別し、濾液を減圧濃縮して標題化合物の暗色油状物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.30 (1H, d, J=2.7Hz), 7.22 (1H, d, J=8.4Hz), 6.88 (1H, dd, J=2.7, 8.5Hz), 2.70 (2H, t, J=6.6Hz), 1.97 (2H, t, J=6.6Hz), 1.34 (6H, s).
【０２５７】
4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル（化合物AA)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アミノ-1(2H)-ナフタレノン（化合物Z）198.7 mg(1.05 mmol)の酢酸5.0 ml溶液に4-ニトロソ安息香酸エチル180.0 mg(1.00 ml)を加えた。生成した溶液を室温で一晩攪拌し、それから減圧濃縮した。残留油状物をクロマトグラフィ（15 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけ、生成物として赤色固体を単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.57 (1H, d, J=2.0Hz), 8.19 (2H, d, J=8.4Hz), 8.07 (1H, d, J=8.0Hz), 7.94 (2H, d, J=8.4Hz), 7.58 (1H, d, J=8.6Hz), 4.41 (2H, q, J=7.1Hz), 2.79 (2H, t, J=6.6Hz), 2.07 (2H, t, J=7.02Hz), 1.44 (6H, s), 1.42 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２５８】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル（化合物BB)
ナトリウム ビス(トリメチルシリル)アミド90.4mg(0.48 mmol, 1.0M THF溶液O.48 ml)のTHF2.0ml溶液に4-[(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5-ジメチル-8-オキソ-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル(化合物AA）153.0mg(0.437 mmol)のTHF2.0ml溶液を-78℃で加えた。暗赤色の溶液を-78℃で30分間攪拌し、次いで2-[N,N-ビス(トリフルオロメチルスルホニル)アミノ]-5-クロロピリジン204.0mg(0.520 mmol)をTHF 2.0ml溶液として加えた。反応混合物を室温まで昇温し、３時間後に水を加えて反応を停止させた。有機層を減圧濃縮して赤色油状物を得た。カラムクロマトグラフィ(25 %酢酸エチル/ヘキサン)にかけ生成物を赤色油状物として単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.21 (2H, d, J=8.6Hz), 7.96 (2H, d, J=8.6Hz), 7.94 (2H, m), 7.49 (1H, d, J=8.2Hz), 6.08 (1H, t, J=2.5Hz), 4.42 (2H, q, J=7.1Hz), 2.49 (2H, d, J=4.8Hz), 1.44 (3H, t, J=7.1Hz), 1.38 (6H, s).
【０２５９】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル（化合物46a)
4-ブロモトルエン84.0 mg(0.491 mmol)のTHF1.0 ml冷溶液(-78℃)にt-ブチルリチウム(1.7 Mペンタン溶液)62.9 mg(0.58 ml, 0.98 mmol)を加えることにより、4-リチオトルエン溶液を調製した。30分間攪拌した後、塩化亜鉛107.0 mg(0.785 mmol)のTHF2.0 ml溶液を加えた。生成した溶液を室温まで上げ、30分間攪拌し、それからカニューレを通して、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル（化合物BB）94.7 mg(0.196 mmol)およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）25 mg(0.02 mmol)のTHF2.0 ml溶液に加えた。生成した溶液を50℃に1.5時間加熱し、それから室温まで冷却し、飽和塩化アンモニウム水溶液で希釈した。混合物を酢酸エチル(40 ml)で抽出し、有機層を合わせて水と食塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥したのち減圧濃縮し、カラムクロマトグラフィ（25 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけて標題化合物を赤色固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.21 (2H, d, J=8.6Hz), 7.96 (2H, d, J=8.6Hz), 7.94 (2H, m), 7.49 (1H, d, J=8.2Hz), 6.08 (1H, t, J=2.5Hz), 4.42 (2H, q, J=7.1Hz), 2.49 (2H, d, J=4.8Hz), 1.44 (3H, t, J=7.1Hz), 1.38 (6H, s).
【０２６０】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸（化合物46b)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)アゾ]安息香酸エチル（化合物46a）16.5 mg(0.042 mmol)のTHF(2 ml)およびエタノール(1 ml)溶液に水酸化ナトリウム（2.0 ml, 1 M水溶液）80.0 mg(2.00 mmol)を加えた。混合物を室温で12時間攪拌し、10 %塩酸で酸性にし、それから酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、残留物を酢酸エチル/ヘキサンから再結晶して標題化合物の赤色固体を得た。1H NMR (d6-アセトン):δ 8.19 (2H, d, J=8.4Hz), 7.92 (2H, d, J=8.5Hz), 7.88 (2H, dd, J=2.1, 6.1Hz), 7.66 (1H, s), 7.64 (2H, d, J=2.3Hz), 7.28 (4H, d, J=3.0Hz), 6.09 (1H, t, J=2.5Hz), 2.42 (2H, d, J=4.8Hz), 2.39 (3H, s), 1.40 (6H, s).
【０２６１】
6-(2-トリメチルシリル)エチニル-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オン（化合物CC)
6-ブロモ-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オン（Smithら、Org. Prep. Proced. Int. 1978 10 123-131を参照）815.0 mg(3.41 mmol)の脱ガスした（アルゴンを20分間通気）トリエチルアミン100 ml溶液にヨウ化銅（I）259.6 mg(1.363 mmol)、ビス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（II）クロリド956.9 mg(1.383 mmol)および（トリメチルシリル）アセチレン3.14 mg(34.08 mmol)を加えた。この混合物を70℃に42時間加熱し、それから室温まで冷却し、シリカゲルの層を通して濾過し、エーテルで洗浄した。濾液を水、1 M塩酸、そして最後に飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を減圧下に濃縮し、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル；10 %エーテル/ヘキサン）にかけて標題化合物の褐色油状物を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl３):δ 7.79 (1H, d, J=1.4Hz), 7.69 (1H, dd, J=1.6, 8.3Hz), 7.42 (1H, d, J=8.5Hz), 2.60 (2H, s), 1.41 (6H, s), 0.26 (9H, s).
【０２６２】
6-エチニル-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オン（化合物DD)
6-(2-トリメチルシリル)エチニル)-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オン（化合物CC）メタノール28 ml溶液に炭酸カリウム197.3 mg(1.43 mmol)を１度に加えた。室温で６時間攪拌した後、混合物をセライトの層を通して濾過し、濾液を減圧濃縮した。残留した油状物をシリカゲルカラムに注入し、5 %酢酸エチル/ヘキサンで溶離して無色油状の標題化合物を得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3):δ 7.82 (1H, s), 7.72 (1H, dd, J=1.6, 7.8Hz), 7.47 (1H, d, J=8.4Hz), 3.11 (1H, s), 2.61 (2H, s), 1.43 (6H, s).
【０２６３】
4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-7-オキソ-2-インデニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物EE)
6-エチニル-2,3-ジヒドロ-3,3-ジメチル-1H-インデン-1-オン（化合物DD）280.0 mg(1.520 mmol)および4-ヨード安息香酸エチル419.6 mg(1.520 mmol)のトリエチルアミン5 ml溶液にアルゴンを40分間通気した。この溶液にトリフェニルホスフィン271.0 mg(0.076 mmol)、ヨウ化銅(I）53.5 mg(0.281 mmol)およびビス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(II)クロリド53.5 mg(0.076 mmol)を加えた。得られた混合物を2.5時間還流させ、それから室温まで冷却し、エーテルで希釈した。セライトの層を通して濾過した後、濾液を水、1 M塩酸、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、そして減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ(15%酢酸エチル/ヘキサン)によって標題化合物を淡黄色固体として単離した。1H NMR (300 MHz, d6-アセトン):δ 8.05 (2H, d, J=8.6Hz), 7.87 (1H, dd, J=1.4, 8.1Hz), 7.75 (2H, m), 7.70 (2H, d, J=8.5Hz), 4.36 (2H, q, J=7.1Hz), 2.60 (2H, s), 1.45 (6H, s), 1.37 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２６４】
4-[2-(1,1-ジメチル-3-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-5-インデニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物FF)
ナトリウム ビス（トリメチルシリル）アミド88.0 mg(0.48 mmol)のTHF88.0 ml溶液を-78℃に冷却し、4-[2-(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-7-オキソ-2-インデニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物EE）145.0 mg(0.436 mmol)をTHF１,0 ml溶液として加えた。30分後に2-(N,N-ビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミノ)-5-クロロピリジン181.7 mg(0.480 mmol)をTHF1.0 ml溶液として加えた。反応混合物を室温までゆっくり昇温させ５時間後に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて反応を停止させた。混合物を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせ5 %水酸化ナトリウム、水および飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ（10 %エーテル/ヘキサン）にかけ、生成物を無色固体として単離した。1H NMR (300 MHz, d6-アセトン):δ 8.05 (2H, d, J=8.3Hz), 7.69 (2H, d, J=8.4Hz), 7.63 (2H, s), 7.55 (1H, s), 4.36 (2H, q, J=7.1Hz), 1.44 (6H, s), 1.37 (3H, t, J=7.1Hz).
【０２６５】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物60)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物１)142.6 mg(0.339 mmol)およびLiOH・H２O 35.6 mg(0.848 mmol)のTHF/水(4:1 v/v)12 ml溶液を室温で一晩攪拌した。反応混合物をヘキサンで抽出し、そしてヘキサン層を5%水酸化ナトリウムで抽出した。水層を合わせ、1M塩酸で酸性にし、それから酢酸エチルおよびエーテルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮し標題化合物を無色固体として得た。1H NMR (d６-DMSO):δ 7.91 (2H, d, J=8.4Hz), 7.60 (2H, d, J=8.4Hz), 7.47 (2H, s), 7.23 (4H, q, J=8.1Hz), 7.01 (1H, s), 6.01 (1H, t, J=4.6Hz), 2.35 (3H, s), 2.33 (2H, d, J=4.8Hz), 1.30 (6H, s).
【０２６６】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-フェニル-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物60a)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物30a）の場合と同様の一般的な方法を適用し、LiOH・H２O 5.9 mg(0.14 mmol)を使用して4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-フェニル-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物１a)27.0 mg(0.07 mmol)を標題化合物に変換した（無色の固体)。PMR (d６-DMSO):δ 1.31 (6H, s), 2.35 (2H, d, J=4.5Hz), 6.05 (1H, t, J=J=J=4.5Hz), 7.00 (1H, s), 7.33 (2H, d, J=6.2Hz), 7.44 (4H, m), 7.59 (2H, d, J=8.1Hz), 7.90 (2H, d, J=8.1Hz).
【０２６７】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-(1,1-ジメチルエチル)フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物61)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-(1,1-ジメチルエチル）フェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル(化合物６）80.0 mg(0.173 mmol)およびLiOH・H２O 18.1 mg(0.432 mmol)のTHF/水(3:1 V/V)６ ml溶液を室温で一晩攪拌した。反応混合物をヘキサンで抽出し、残った水層を1 M塩酸で酸性にし、それから酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧乾燥し標題化合物の無色固体を得た。1H NMR (d６-DMSO):δ 7.82 (2H, d, J=8.2Hz), 7.44 (6H, m), 7.25 (2H, d, J=8.3Hz), 7.02 (1H, s), 6.01 (1H, t, J=4.6Hz), 2.32 (2H, d, J=4.7Hz), 1.32 (9H, s), 1.29 (6H, s).
【０２６８】
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物62)
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)カルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物40）54.4 mg(0.119 mmol)および[2,4-ビス(4-メトキシフェニル)-1,3-ジチア-2,4-ジホスフェタン-2,4-ジスルフィド]（Lawesson試薬）57.7 mg(0.143 mmol)のベンゼン12.0 ml溶液を一晩還流させた。混合物を室温まで冷却し、濾過し、濾液を減圧濃縮した。カラムクロマトグラフィ(10〜25% EtOAc/ヘキサン)によって標題化合物を黄色固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ 9.08 (1H, s), 7.92 (1H, br s), 7.90 (1H, t, J=8.2Hz), 7.66 (1H, dd, J=2.0, 6.0Hz), 7.38 (3H, m), 7.18 (4H, m), 6.01 (1H, t, J=4.7Hz), 4.35 (2H, q, J=7.1Hz), 2.36 (3H, s), 2.33 (2H, d, J=4.7Hz), 1.38 (3H, t, J=7.1Hz), 1.33 (6H, s).
【０２６９】
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸（化合物63)
2-フルオロ-4-[[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)チオカルボニル]アミノ]安息香酸エチル（化合物62）46.5 mg(0.098 mmol)をエタノール1.0 mlとTHF1.0 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム55 mg(1.4 mmol)と水1.0 mlを加えた。室温で一晩攪拌した後、酢酸エチルを加え、それから10 %塩酸を加えて反応を停止させた。酢酸エチルで抽出後、有機層を合わせて水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、残留した固体をアセトニトリルから再結晶し、標題化合物を淡黄色固体として得た。1H NMR (d６-アセトン):δ 11.05 (1H, s), 8.02 (1H, m), 7.99 (1H, t, J=8.3Hz), 7.75 (1H, m), 7.69 (1H, dd, J=2.0, 6.1Hz), 7.52 (1H, s), 7.46 (1H, d, J=8.1Hz), 7.21 (4H, m), 6.04 (1H, t, J=4.8Hz), 2,37 (2H, d, J=4.8Hz), 2.33 (3H, s), 1.36 (6H, s).
【０２７０】
5',6'-ジヒドロ-5',5'-ジメチル-8'-(4-メチルフェニル)-[2,2'-ビナフタレン]-6-カルボン酸エチル（化合物64)
3,4-ジヒドロ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-7-ブロモナフタレン(化合物D）0.45g(1.40 mmol)とTHF(2.1 ml)の溶液にアルゴン下、室温でマグネシウム片(0.044 g, 1.82 mmol)を加えた。エチレンジブロミドを２滴加えると徐々に濁って黄色になり、その溶液を1.5 時間加熱還流させた。第２のフラスコに塩化亜鉛(0.210 g, 1.54 mmol)を入れ、高真空下に溶融し、それから室温まで冷却し、THF(3 ml)に溶解した。第２のフラスコにグリニャール試薬を加え、室温で30分後に6-ブロモ-2-ナフタレンカルボン酸エチル(化合物N）0.293 mg(1.05 mmol)およびTHF(2 ml)の溶液を加えた。次のようにして第３のフラスコにおいてNi(PPh３)４とTHFの溶液を調製する。すなわち、NiCl２(PPh３)２(0.82 g, 1.25 mmol)およびPPh３(0.66 g, 2.5 mmol)のTHF(3.5 ml)溶液に水素化アルミニウムジイソブチルとヘキサンの1 M溶液(2.5 ml, 2.5 mmol)を加え、生成した溶液をTHFで希釈して全量を15 mlとし、室温で15分間攪拌した。Ni(PPh３)４溶液を第２のフラスコに0.60 mlづつ15分間隔で３回加えた。生成した懸濁液を室温で２時間攪拌した。1 Nの塩酸水溶液５mlを加えて反応を停止させ、１時間攪拌した後、生成物を酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過して溶媒を減圧除去した。残留物をヘキサンから再結晶して純粋な物質を130 mg得た。母液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（95:5 ヘキサン-酢酸エチル）によって精製し、さらに170 mgの標題化合物を無色の固体として得た（通算収率＝300 mg, 64 %）。1H NMR (CDCl３):δ 8.57 (s, 1H), 8.05 (dd, 1H, J=1.7, 8.0Hz), 7.84-7.95 (overlapping d's, 3H), 7.66 (dd, 1H, J=1.7, 8.5Hz), 7.58 (dd, 1H, J=2.0, 8.0Hz), 7.48 (d, 1H, J=8.0Hz), 7.43 (d, 1H, J=2.0Hz), 7.32 (d, 2H, J=8.0Hz), 7.21 (d, 2H, J=8.0Hz), 6.04 (t, 1H, J=4.8Hz), 4.44 (q, 2H, J=7.1Hz), 2.40 (s, 3H), 2.39 (d, 2H, J=4.8Hz), 1.45 (t, 3H, J=7.1Hz), 1.39 (s, 6H).
【０２７１】
5',6'-ジヒドロ-5',5'-ジメチル-8'-(4-メチルフェニル)-[2,2'-ビナフタレン]-6-カルボン酸（化合物65)
5',6'-ジヒドロ-5',5'-ジメチル-8'-(4-メチルフェニル)-[2,2'-ビナフタレン]-6-カルボン酸エチル（化合物64）0.19 g(0.43 mmol)、エタノール(8 ml)および1 N水酸化ナトリウム(2 ml)の溶液を60℃に３時間加熱した。溶液を０℃まで冷却し、1 Nの塩酸水溶液で酸性にした。生成物を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせて水と食塩水で洗い、硫酸マグネシウムで乾燥後濾過し、溶媒を減圧除去した。残留物をTHF/酢酸エチルから０℃で再結晶させ、35 mgの純品を得た。母液を減圧濃縮し、残留物をシリカゲルクロマトグラフィ（100 %酢酸エチル）で精製し、さらに125 mgの標題化合物を無色の固体として得た（通算収率＝160 mg, 90 %）。1H NMR (DMSO-d６)δ 8.57 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J=8.7Hz), 7.96-7.82 (重なったd, 3H), 7.65 (d, 2H, J=7.6Hz), 7.50 (d, 1H, J=7.9Hz), 7.28 (s, 1H), 7.26 (d, 2H, J=8.3Hz), 7.21 (d, 2H, J=8.3Hz), 6.01 (t, 1H, J=4.5Hz), 3.34 (br s, 1H), 2.31 (s, 3H), 2.31 (d, 2H, J=4.5Hz), 1.31 (s, 6H).
【０２７２】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-フリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物66)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(4-メチルフェニル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物１）の場合と同じ一般的合成法を適用し、塩化亜鉛142.4 mg(1.045 mmol)、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）24.1 mg(0.02 mmol)および2-リチオフラン[n-ブチルリチウム（1.5 Mヘキサン溶液）53.4 mg(0.52 ml, 0.78 mmol)をフラン53.4 mg(0.784 mmol)の冷溶液(-78℃)に加えて調製した]を使用して、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(トリフルオロメチルスルホニル)オキシ-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物G）250.0mg（0.52 mmol)を標題化合物（無色の固体）に変換した。PMR (CDCl３):δ 1.32 (6H, s), 1.41 (3H, t, J=7.1Hz), 2.35 (2H, d, J=5.0Hz), 4.39 (2H, q, J=7.1Hz), 6.41 (1H, t, J=5.0Hz), 6.50 (2H, s), 7.36 (1H, d, J=8.0Hz), 7.45 (1H, dd, J=1.7, 8.0Hz), 7.49 (1H, s), 7.57 (2H, d, J=8.2Hz), 7.63 (1H, d, J=1.7Hz), 8.02 (2H, d, J=8.2Hz).
【０２７３】
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-フリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物67)
4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-チアゾリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸（化合物30a）の場合と同じ一般的合成法を適用し、LiOH 16.0 mg(0.38 mmol)の水溶液を使用して、4-[(5,6-ジヒドロ-5,5-ジメチル-8-(2-フリル)-2-ナフタレニル)エチニル]安息香酸エチル（化合物66）を標題化合物（無色の固体）に変換した。PMR (d６-DMSO):δ 1.26 (6H, s), 2.33 (2H, d, J=4.9Hz), 6.41 (1H, t, J=4.9Hz), 6.60 (2H, m), 7.45-7.53 (3H, m), 7.64 (2H, d, J=8.3Hz), 7.75 (1H, d, J=1.6Hz), 7.93 (2H, d, J=8.3Hz).
【０２７４】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン(化合物 100C)および3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-アセチル-1(2H)-ナフタレノン(化合物 100D)
塩化アルミニウム(26.3 g, 199.0 mmol)とジクロロメタン(55 ml)の冷混合物(-78℃)に塩化アセチル(15 g, 192 mmol)および1,2,3,4-テトラヒドロ-1,1-ジメチルナフタレン(24.4 g, 152 mmol)のジクロロメタン(20 ml)溶液を20分間で加えた。反応混合物を室温まで温め、４時間攪拌した。反応フラスコに氷(200 g)を加え、混合物をエーテル(400 ml)で希釈した。水層と有機層を分離し、有機層を10 %塩酸(50 ml)、水(50 ml)、10 %炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和塩化ナトリウム水溶液(50 ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去し、黄色油状物を得た。これをベンゼン(50 ml)に溶かした。
【０２７５】
アルゴン下、酢酸(240 ml)と無水酢酸(120 ml)の冷溶液(0℃)に三酸化クロム(50 g, 503 mmol)を20分かけて少しづつ加えた。混合物を0℃で30分間攪拌し、ベンゼン(120 ml)で希釈した。攪拌しながら、上で調製したベンゼン溶液を滴下漏斗から20分間で加えた。８時間経過後、イソプロピルアルコールを注意しながら０℃で加え、それから水を加えて反応を停止させた。15分後に反応混合物をエーテル(1100 ml)および水(200 ml)で希釈し、それから、固体炭酸水素ナトリウム(200 g)で中和した。エーテル層を水(100 ml)および飽和塩化ナトリウム水溶液(2 x 100 ml)で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧除去しジケトンの異性体混合物を得た。そしてこれをクロマトグラフィ（5 %酢酸エチル/ヘキサン）で分離した。
【０２７６】
（化合物 100C）：1H NMR (CDCl３):δ 8.55 (1H, d, J=2.0Hz), 8.13 (1H, dd, J=2.0, 8.3Hz), 7.53 (1H, d, J=8.3Hz), 2.77 (2H, t, J=6.6Hz), 2.62 (3H, s), 2.05 (2H, t, J=6.6Hz), 1.41 (6H, s).
（化合物 100D）：1H NMR (CDCl３):δ 8.10 (1H, d, J=8.1Hz), 8.02 (1H, d, J=1.6Hz), 7.82 (1H, dd, J=1.6, 8.1Hz), 2.77 (2H, t, J=7.1Hz), 2.64 (3H, s), 2.05 (2H, t, J=7.1Hz), 1.44 (6H, s).
【０２７７】
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル)-1(2H)-ナフタレノン（化合物 100E)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-7-アセチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物 100C）；および3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-アセチル-1(2H)-ナフタレノン（化合物 100D）の１:５混合物1.80 g(8.34 mmol)のベンゼン50 ml溶液とエチレングリコール517.7 mg(8.34 mmol)およびp-トルエンスルホン酸１水和物20.0 mg(0.11 mmol)を混合した。生成した溶液を18時間加熱還流し、室温まで冷却した後、減圧濃縮した。クロマトグラフィ（10 %酢酸エチル−ヘキサン）によって標題化合物を無色油状物として単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.01 (1H, d, J=8.2Hz), 7.51 (1H, s), 7.43 (1H, dd, J=1.7, 6.4Hz), 4.07 (2H, m), 3.79 (2H, m), 2.74 (2H, t, J=6.5Hz), 2.04 (2H, t, J=7.1Hz), 1.67 (3H, s), 1.46 (6H, s).
【０２７８】
1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-6-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))ナフタレン（化合物 100F)
p-トルイルマグネシウムブロミド（2.54 ml, 1 M エーテル溶液）496.2 mg(2.54 mmol)のTHF2.0 ml溶液に3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))-1(2H)-ナフタレノン（化合物 100E, 200.0 mg, 0.769 mmol）のTHF(5 ml)溶液を加えた。溶液を16時間加熱還流し、室温まで冷却した後、水および飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を減圧で除去し、カラムクロマトグラフィ（10 %酢酸エチル/ヘキサン）にかけて標題化合物を無色の固体として得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.49 (1H, d, J=1.7Hz), 7.19 (2H, m), 7.10 (2H, d, J=7.9Hz), 7.04 (1H, d, J=8.2Hz), 4.05 (2H, m), 3.80 (2H, m), 2.34 (3H, s), 2.21 (1H, m), 2.10 (1H, m), 1.88 (1H, m), 1.65 (3H, s), 1.54 (1H, m), 1.39 (3H, s), 1.33 (3H, s).
【０２７９】
3,4-ジヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-6-アセチルナフタレン（化合物 100G)
1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ヒドロキシ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-6-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル)ナフタレン（化合物 100F）160.0 mg(0.52 mmol)、p-トルエンスルホン酸１水和物(4 mg)およびベンゼン30 mlの溶液を12時間還流した。室温まで冷却した後、反応物をエーテル(100 ml)で希釈し、10 %炭酸水素ナトリウム、水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、カラムクロマトグラフィ（10% 酢酸エチル−ヘキサン）にかけて黄色油状の標題化合物を得た。1H NMR (CDCl３):δ 7.97 (1H, d, J=1.8Hz), 7.67 (1H, dd, J=1.7, 6.4Hz), 7.22 (4H, s), 7.13 (1H, d, J=8.1Hz), 6.10 (1H, t, J=4.5Hz), 2.59 (3H, s), 2.40 (3H, s), 2.38 (2H, d, J=4.7Hz), 1.38 (6H, s).
【０２８０】
4-[3-オキソ-3-(7,8-ジヒドロ-5-(4-メチルフェニル)-8,8-ジメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]安息香酸（化合物101)
3,4-ジヒドロ-1-(4-メチルフェニル)-4,4-ジメチル-6-アセチルナフタレン（化合物100G）78.7 mg(0.272 mmol)のメタノール4.0 ml溶液に4-カルボキシベンズアルデヒド53.1 mg(0.354 mmol)および80 mg水酸化ナトリウム（2.00 mmol, 1 M水酸化ナトリウム水溶液2.0 ml）を加えた。生成した溶液を室温で12時間攪拌したのち減圧濃縮し、残留油状物を酢酸エチルに溶解した。溶液を10 %塩酸で処理し、有機層を水および飽和塩化ナトリウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、アセトニトリルから再結晶して精製し、標題化合物の無色固体を得た。1H NMR (d6-アセトン):δ 8.00 (7H, m), 7.83 (1H, d, J=15.6Hz), 7.24 (4H, s), 7.13 (1H, d, J=8.1Hz), 6.12 (1H, t, J=4.5Hz), 2.42 (2H, d, J=4.8Hz), 2.38 (3H, s), 1.41 (6H, s).
【０２８１】
3,4-ジヒドロ-1-フェニル-4,4-ジメチル-6-アセチルナフタレン(化合物 100H)
3,4-ジヒドロ-4,4-ジメチル-6-(2-(2-メチル-1,3-ジオキソラニル))-1(2H)-ナフタレノン(化合物100E）508.0mg(1.95mmol)のTHF10ml溶液にフェニルマグネシウムブロミド496.2mg(2.54mmol, 1Mエーテル溶液2.54ml)を加えた。生成した溶液を８時間加熱還流し、水を加えて30分間加熱を続けた。THFを減圧で除去し、残留水溶液を溶媒で抽出した。有機層を合わせ、硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧濃縮した。残留物をカラムクロマトグラフィ(10 %酢酸エチル−ヘキサン)にかけ、標題化合物を無色油状物として単離した。1H NMR (CDCl３):δ 7.97 (1H, d, J=1.8Hz), 7.67 (1H, dd, J=2.1, 8.0Hz), 7.34 (5H, m), 7.10 (1H, d, J=8.1Hz), 6.12 (1H, d, J=4.6Hz), 2.59 (3H, s), 2.39 (2H, d, J=4.8Hz), 1.38 (6H, s).
【０２８２】
4-[3-オキソ-3-(7,8-ジヒドロ-5-フェニル-8,8-ジメチル-2-ナフタレニル)-1-プロペニル]安息香酸（化合物103)
3,4-ジヒドロ-1-フェニル-4,4-ジメチル-6-アセチルナフタレン（化合物 100H）115.0 mg(0.42 mmol)および4-ホルミル安息香酸65.0 mg(0.43 mmol)をエタノール5.0 mlおよびTHF1.0 mlに溶かした溶液に水酸化ナトリウム120.0 mg(3.00 mmol,1 M水溶液3.00 ml)を加えた。生成した黄色の溶液を室温で12時間攪拌した。溶液を6 %塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥し減圧濃縮した、後カラムクロマトグラフィ（50 %酢酸エチル−ヘキサン）にかけ、標題化合物を淡黄色固体として単離した。1H NMR (CDCl３):δ 8.13 (2H, d, J=7.7Hz), 8.04 (1H, s), 7.81 (1H, d, J=15.5Hz), 7.75 (3H, m), 7.60 (1H, d, J=15.5Hz), 7.35 (5H, m), 7.14 (1H, d, J=8.1Hz), 6.15 (1H, t, J=4.2Hz), 2.41 (2H, d, J=4.2Hz), 1.41 (6H, s).
【０２８３】
核レセプター作動薬を増強する方法
概説および緒言
我々は、ネガティブホルモン活性を示すレチノイド拮抗薬(アンタゴニスト)のサブセットが、他のレチノイドおよびステロイド受容体（レセプター）スーパーファミリーホルモンの生物活性の増強に使用できることを発見した。これらの他のレチノイドおよびステロイド受容体スーパーファミリーホルモンは、内因性ホルモンでもよいし、医薬物質でもよい。従って、たとえばレチノイドネガティブホルモンと組み合わせて使用すると、医薬レチノイド作動薬(アゴニスト)のある種の活性が、特定の生物学的な効果を誘導するのをより活発にすることができる。この組み合わせ法を薬物投与に採用することにより、効果を高めながら医薬レチノイドの用量を減らすことが可能となるので、医薬レチノイドの望ましくない副作用を最少限に抑えることができるという利点が生まれる。
【０２８４】
より具体的には、図１に示す構造を持つ合成レチノイドAGN 193109がユニークかつ予想外の薬理活性を示すことを発見した。AGN 193109は核レセプターを活性化したりレチノイド応答遺伝子の転写を刺激することなく、これらレセプターのＲＡＲサブクラスに高い親和性を示す。しかしそれよりも、AGN 193109はレチノイド作動薬によるＲＡＲの活性化を抑制し、レチノイド拮抗薬として働く。
【０２８５】
さらに、レチノイド作動薬またはステロイド系ホルモンを同時投与しなくても、レチノイドネガティブホルモンがある種の病状を抑えることを発見した。もっと具体的に言えば、ここに開示するレチノイドネガティブホルモンは、リガンドが結合していないＲＡＲに応答する遺伝子の高レベルな基礎転写を下方調節することができる。たとえば、制御されない細胞増殖が、リガンドが結合していないＲＡＲに応答する遺伝子の活性に起因しているときには、ＲＡＲを不活性化するレチノイドネガティブホルモンを投与することによって該遺伝子の活性を抑えることができる。従って、リガンドが結合していないＲＡＲの活性に依存する細胞増殖をネガティブホルモンによって抑制することができる。従来の拮抗薬ではリガンドが結合していないＲＡＲを抑制することはできない。
【０２８６】
AGN 193109がＲＡＲの基本活性を抑制することができ、また、他のレチノイドおよびステロイド受容体のスーパーファミリーホルモン作動薬の活性を増強することもあることを、我々が発見したことは重要である。本発明においては、ネガティブホルモンの存在下に低濃度の作動薬が、作動薬単独で得られる応答と実質的に同じ強さの応答を誘導する場合、ホルモン作動薬はAGN 193109のようなネガティブホルモンによって増強されると言う。たとえば、定量的な応答はインビトロでのリポーター遺伝子アッセイで測定することができる。すなわち、治療用レチノイドを単独で使用したときの治療用レチノイドの用量または濃度が高い場合と実質的に同じ効果が、AGN 193109と組み合わせることによって、より少ない用量または低い濃度で得られるなら、特定の用量または濃度で使用した時に所望の応答を誘導する治療用レチノイドはAGN 193109によって増強される。AGN 193109と一緒に投与することにより増強される作動薬にはＲＡＲ作動薬、ビタミンＤ受容体作動薬、糖質コルチコイド受容体作動薬および甲状腺ホルモン受容体作動薬が含まれる。さらに具体的に述べると、同時投与で増強されうる特定の作動薬として：ＡＴＲＡ、13-シス-レチノイン酸、合成ＲＡＲ作動薬のAGN 191183、1,25-ジヒドロキシビタミンＤ３、デキサメタゾンおよび甲状腺ホルモン(3,3',5-トリヨードチロニン)が含まれる。さらに、AGN 193109との同時投与によって増強されうる他のホルモンを同定するために使用できる方法もここに開示する。
【０２８７】
このように、AGN 193109は、単純なレチノイド拮抗薬では予想されない様式で、核レセプターのファミリーに属する様々な構成員の活性を増強しうるネガティブホルモンとして挙動する。我々は、AGN 193109のネガティブホルモン活性と他の核レセプターリガンドの活性を増強する能力の両方を説明する可能な機構についても論じる。この機構には、レチノイド依存的なシグナル経路に関与していることが分かっている要素が含まれ、さらに新しいネガティブな調節成分も含まれている。
【０２８８】
普通の同業者であれば、AGN 193109と結合する親和性の高い標的であるＲＡＲが、様々なレチノイド応答遺伝子の発現を調節する転写因子であることを理解するだろう。レチノイド依存的に転写調節される遺伝子の近くに、ＲＡＲに対するシス-調節性ＤＮＡ結合部位が同定されている。このようなＤＮＡ部位に結合するＲＡＲはよく分かっており、レチノイン酸応答要素(ＲＡＲＥ)として知られている。重要なことは、ＲＡＲＥが１つのＲＡＲと１つのＲＸＲからなるヘテロ二量体と結合することである。ヘテロ二量体のＲＸＲ成分は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量体とＲＡＲＥの間の親和性の高い相互作用を促進する働きをする[Spornら編、「レチノイド：生物学、化学および医薬」、第２版、Raven Press,Ltd., New Yorkに収載されている、Mangelsdorfら、The Retinoid Receptors]。
【０２８９】
下で詳しく述べるように、AGN 193109のネガティブホルモン活性に関係するわれわれの知見は、推定上のネガティブ同時活性化タンパク質(ＮＣＰ)とＲＡＲとの相互作用を含む機構と一致している。提案した機構に従えば、この相互作用がAGN 193109によって安定化される。
【０２９０】
さらに、我々の結果は、AGN 193109によって占有されるＲＡＲ以外の核レセプターとの相互作用にＮＣＰが細胞内で利用を、AGN 193109が調節しうることを示唆している。このことから、ＮＣＰと結合する能力をＲＡＲと共有する核レセプターが関係する転写調節経路を、AGN 193109が増強しうるということになる。この点で、AGN 193109は核レセプターの様々な経路を調節する能力、すなわち、従来のレチノイド拮抗薬には予想できないような活性を発揮する。従って、AGN 193109は、内因性のホルモンおよび処方された治療薬の両者を含む、核レセプターリガンドの活性を高める薬物として有用である。この具体的な態様は、あらゆる核レセプターネガティブホルモンがＮＣＰと競争的に結合する他の核レセプターの活性を高めるであろうという、より一般的な原理を示すものである。
【０２９１】
本明細書中に記述されているものと類似または同等な他の材料および方法を本発明の実施または試験に使用することは可能であるが、ここでは、より好ましい材料と方法について述べることにする。本明細書中に記述されている様々な核酸の取扱いおよび操作を行うために使用できる方法についての一般的な参照は、Mo「分子クローニング：実験室マニュアル」[Samrockら編、Cold Spring  Harbor Lab Publ. 1989]および「分子生物学における最新のプロトコール」[Ausubelら編、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience]の中に紹介されている。本発明を創造するに至った実験と結果について、以下に記述する。
【０２９２】
実施例６は、ＡＧＮ１９３１０９が３種類のＲＡＲと高い親和性を示して結合したが、レチノイドに依存的な遺伝子発現を活性化しなかったことを明らかにするために適用した方法について記す。
【０２９３】
実施例６  ＡＧＮ１９３１０９は高親和性を伴ってＲＡＲと結合するが、レチノイド依存性遺伝子発現をトランス活性化(transactivate)しない
Allegrettoら[J. Biol. Chem. 268:26625(1993)]が記載している方法に本質的に従って、バクロウイルス発現系を用いて、ヒトＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β、およびＲＡＲ−γレセプターを組換えタンパク質として別々に発現させた。Heymenら[Cell 68:397(1992)]が記載している[３Ｈ]−ＡＴＲＡ置換アッセイ(displacement assay)を用いて、ＡＧＮ１９３１０９結合親和性を測定するために、この組換えレセプタータンパク質を、別々に使用した。Chengら[Biochemical Pharmacology 22:3099(1973)]が記載している方法に従って、解離定数(Ｋd)を求めた。
【０２９４】
ＲＡＲ発現ベクターおよびレチノイド反応性リポーター遺伝子構築物によって一時的に同時トランスフェクションしたＣＶ−１細胞中で、ＲＡＲをトランス活性化する能力に関しても、ＡＧＮ１９３１０９を試験した。レセプター発現ベクターｐＲＳｈＲＡＲ−α[Giguereら、Nature 330:624(1987)]、ｐＲＳｈＲＡＲ−β[Benbrookら、Nature 333:669(1988)]およびｐＲＳｈＲＡＲ−γ[Isikawaら、Mol Endocrinol. 4:837(1990)]を、△ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−Ｌｕｃリポータープラスミドを用いて、別々に同時トランスフェクションした。このルシフェラーゼリポータープラスミドの使用は、Heymanら[Cell 68:397(1992)]が記載している。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）リポーター遺伝子が、ホタル-ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列によって置換されたこと以外は、△ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−Ｌｕｃプラスミドは、Umesonoら[Nature 336:262(1988)]が記載している△ＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴリポーター構築物と本質的に同じである。Molecular Cloning: A Laboratory Manual[Sambrookら編、Cold Spring Harbor Lab Publ. 1989]に記載されている燐酸カルシウム共沈法を用いて、グリーンモンキーＣＶ−１の細胞のトランスフェクションを実施した。ＣＶ−１細胞を４ｘ１０４/穴の密度で、１２穴の多穴プレート中で培養し、標準実験操作に従って、０.７μｇのリポータープラスミドおよび０.１μｇのレセプタープラスミドを含有する燐酸カルシウム沈殿物を用いて、一時的にトランスフェクションした。１８時間後に細胞を洗浄して沈殿物を除去し、１０％の活性炭抽出ウシ胎児血清（Gemini Bio-Products）を含有するDulbecco修飾イーグル培地（DMEM）（Gibco）を再度添加した。ビヒクルのみ（エタノール）またはＡＧＮ１９３１０９（１０−９〜１０−６Ｍ）を用いて、１８時間、細胞を処置した。細胞溶解物を、０.１Ｍ ＫＰＯ４(ｐＨ７.８)、１.０％  TRITON X-100、１.０mM  ＤＴＴ、２mM  ＥＤＴＡ中に調製した。ホタルルシフェリン(Analytical Luminescence Laboratory)およびEG&G Berthold ９６穴プレートルミノメーターを用いて、Wetらによって、Mol.Cell. Biol.7:725(1987)に記載のように、ルシフェラーゼ活性を測定した。報告したルシフェラーゼ値は、三回測定の平均±SEMである。
【０２９５】
表１１に示される結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、高親和性でＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β、およびＲＡＲ−γのそれぞれに結合したが、レチノイド依存性遺伝子発現を活性化しなかったことを示した。より詳しくは、ＡＧＮ１９３１０９は、２〜３nMの範囲のＫｄ値で３つのレセプターのそれぞれに結合した。この強い結合にもかかわらず、ＡＴＲＡによって刺激された誘発と比較した場合に、ＡＧＮ１９３１０９は遺伝子発現を活性化しなかった。従って、ＡＧＮ１９３１０９の半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、測定不可能であった。表には示されていないが、ＡＧＮ１９３１０９がＲＸＲに関して測定可能な親和性を持たないことも、我々は見い出した。
【０２９６】
【表１１】
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【０２９７】
実施例７は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＡＴＲＡ依存性遺伝子発現のアンタゴニストであることを示すために使用される方法を記載している。
【０２９８】
実施例７  ＡＴＲＡによるＲＡＲトランス活性化の、ＡＧＮ１９３１０９依存性阻害
Sambrookらの燐酸カルシウム共沈法[Molecular Cloning: A  Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab Publ.1989]によって同時トランスフェクションしたＣＶ−１細胞において、ＡＴＲＡ媒介ＲＡＲ活性化に拮抗するＡＧＮ１９３１０９の能力を調べた。真核発現ベクターｐＲＳｈＲＡＲ−α[Giguereら、Nature 330:624(1987)]、ｐＲＳｈＲＡＲ−β[Benbrookら、Nature 333:669(1988)]、およびｐＲＳｈＲＡＲ−γ[Ishikawaら、Mol. Endocrinol.4:837(1990)]を、Hollenbergら[Cell 55:899(1988)]によって記載されている△−ＭＴＶ−Ｌｕｃリポータープラスミドを同時トランスフェクションした。注意すべきことは、リポータープラスミドが、ＴＲＥ−回文性応答要素（TRE-palindromic response element）の２つのコピーを含んでいたことである。燐酸カルシウムトランスフェクションを、実施例６と全く同様に実施した。ビヒクル(エタノール)のみ、ＡＴＲＡ（１０−９〜１０−６Ｍ）、ＡＧＮ１９３１０９（１０−９〜１０−６Ｍ）、またはＡＧＮ１９３１０９（１０−９〜１０−６Ｍ）と組み合わせた１０−８Ｍ ＡＴＲＡを、１８時間、細胞に投与した。細胞溶解物およびルシフェラーゼ活性の測定も、実施例６と同様に行った。
【０２９９】
これらの操作の結果を、ルシフェラーゼ値が三回測定の平均±ＳＥＭで表される図２Ａ〜２Ｆに示す。特に、図２Ａ、２Ｃおよび２Ｅに示される結果は、ＡＴＲＡを用いるトランスフェクション細胞の刺激が、ルシフェラーゼ活性の用量応答増加を導くことを示した。このことは、ＡＴＲＡが、この実験系において３つのＲＡＲのそれぞれを活性化し、アンタゴニストの活性を検出する比較基準を提供することを確認するものであった。図２Ｂ、２Ｄ、および２Ｆに示されるグラフによる結果は、１０nM ＡＴＲＡおよび増加濃度のＡＧＮ１９３１０９によるトランスフェクション細胞の同時処理が、ルシフェラーゼ活性の阻害を導くことを示した。特に、ＡＧＮ１９３１０９およびＡＴＲＡの等しい用量が、３つの全てのＲＡＲサブタイプに対して、ＡＴＲＡ単独と比較して、５０％を越える阻害を与えた。種々の濃度のＡＧＮ１９３１０９の存在下のＡＴＲＡ用量応答の比較は、ＡＴＲＡがＡＧＮ１９３１０９によって競合的に阻害されることを示した。注目すべきことに、図２に示される全グラフの水平軸が、レチノイド濃度の対数を表す。これらの結果は、ＡＧＮ１９３１０９が強力なＲＡＲアンタゴニストであることを証明するものであった。
【０３００】
次に我々は、ＡＧＮ１９３１０９のアンタゴニスト活性の基礎をなすメカニズムを解明するための実験を行った。この分野の精通者は、核レセプター活性化が、リガンド結合によって誘発されるリセプターのコンホメーション変化に関係していると考えられていることを認めるであろう。事実、プロテアーゼ保護アッセイの結果は、核ホルモンアゴニストおよびアンタゴニストがレセプタータンパク質に異なるコンホメーションを取らせることを確認した[Keidelら、Mol. Cell. Biol. 14:287(1994)；Allanら、J. Biol. Chem. 267:19513(1992)]。ＡＧＮ１９３１０９およびＡＴＲＡが、ＲＡＲ−αに異なるコンホメーションを取らせるかどうかを判断するために、我々はそのようなアッセイを用いた。ＡＧＮ１９３５８３、ＲＡＲ−α選択性アンタゴニストが、プロテアーゼ感受性のアンタゴニスト特異パターンを与えることが既知の正の対照標準として含まれた。
【０３０１】
実施例８は、ＡＧＮ１９３１０９結合から生じるＲＡＲ−αにおけるコンホメーションの変化を検出するために用いられた１つの方法を記載している。下記に示すように、この方法の結果は意外にも、ＡＧＮ１９３１０９は、ＡＴＲＡ、ＲＡＲアゴニストによって誘発されるものと実質的に同じであるが、モデルＲＡＲアンタゴニストによって誘発されるものとは異なるトリプシン感受性パターンを導くことを示した。
【０３０２】
実施例８  プロテアーゼ保護分析
ベクターｐＧＥＭ３Ｚ(Pharmacia)中に構成され、ＲＡＲ−α ｃＤＮＡ[Giguereら、Nature 330:624(1987)]を含有するプラスミドを、ＴＮＴ結合網状赤血球溶解物インビトロ転写−翻訳系(Promega)と共に用いて、[３５Ｓ]−メチオニン標識ＲＡＲ−αを調製した。標識プロテインＲＡＲ−αの制限タンパク質消化を、Keidelら[Mol.Cell.Biol.14:287(1994)]の記載の方法に従って行った。[３５Ｓ]−メチオニン標識ＲＡＲ−αを含有する網状赤血球溶解物の一部を、ＡＴＲＡ、ＡＧＮ１９３５８３、またはＡＧＮ１９３１０９のいずれかを用いて、氷上で４５分間、合計容量９μlでインキュベートした。全試験のレチノイド最終濃度は、ＡＴＲＡおよびＡＧＮ１９３１０９に対しては１００nMであり、ＡＧＮ１９３５８３に対しては１０００nMであった。レチノイドの最終濃度間の差異は、ＡＴＲＡおよびＡＧＮ１９３１０９（それぞれ２および１０nMのＲＡＲ−αのＫｄを有する）と、ＡＧＮ１９３５８３（＞１００nMのＲＡＲ−αのＫｄを有する）との相対親和力における約１０倍の差異によるものであった。リガンド結合の後、適切な濃度のトリプシン１μlを混合物に加えて、２５、５０、または１００μg/mlの最終濃度を得た。サンプルを室温で１０分間インキュベートし、ＳＤＳ−サンプル緩衝剤の添加によってトリプシン消化を停止した。サンプルを標準法に従って、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフにかけた。
【０３０３】
アゴニストおよびアンタゴニストの両方が、非配位レセプターの消化によって得られる結果とは異なるトリプシン感受性の明確なパターンを導いた。オートラジオグラフの結果は、２５、５０、および１００μg/mlのトリプシン濃度が、放射能標識ＲＡＲ−αを、室温において、添加レチノイドの不存在下に、１０分間で完全に消化したことを示した。ＡＴＲＡの予備結合は、２つの主要なプロテアーゼ耐性種の出現を導いた。ＲＡＲ−α選択性アンタゴニストＡＧＮ１９３５８３の予備結合は、ＡＴＲＡ予備結合から生じるよりも低い分子量のプロテアーゼ耐性種を出現させた。この結果は、レチノイドアゴニストおよびアンタゴニストが、変化したトリプシン感受性によって検出可能なコンホメーション変化を導くことを示した。驚くべきことに、ＡＧＮ１９３１０９の予備結合は、ＡＴＲＡの予備結合によって生じるパターンとは区別できないプロテアーゼ保護パターンを生じた。
【０３０４】
前記の結果は、ＡＧＮ１９３１０９がＲＡＲ−αに結合し、そのコンフォメーションを変化させたことを確認するものであった。興味あることに、このコンフォメーション変化の性質は、アンタゴニスト（ＡＧＮ１９３５８３）結合によって生じる変化よりも、アゴニスト（ＡＴＲＡ）の結合から生じるものに、より類似していた。明らかに、ＡＧＮ１９３１０９依存性拮抗作用のメカニズムは独特であった。
【０３０５】
ＡＧＮ１９３１０９のアンタゴニスト活性を説明できる可能なメカニズムについて、我々は考慮した。特に、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲ/ＲＸＲヘテロダイマー形成を乱すかどうか、あるいはＲＡＲとその同種ＤＮＡ結合部位との間の相互作用を阻害するかどうかを試験するために、標準ゲルシフトアッセイを使用した。
【０３０６】
実施例９は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲ/ＲＸＲ二量化を阻害することもないし、ダイマーの標的ＤＮＡへの結合を阻害することもないことを示すために使用したゲル電気泳動の移動度シフトアッセイを記載している。
【０３０７】
実施例９  ゲルシフト分析
インビトロ翻訳ＲＡＲ−αを、３５Ｓ標識メチオニンを除いた以外は実質的に実施例８に記載されたようにして調製した。インビトロ転写体を生成させるためにテンプレートとして、Mangelsdorfら[Nature、第345巻：224〜229頁（1990)]に記載のＲＸＲ−α ｃＤＮＡを含むpBluescript（II）（SK）系ベクターを用いて、同様に、インビトロ翻訳ＲＡＲ−αを調製した。標識ＲＡＲ−αおよびＲＡＲ−αを、単独または組み合わせて、あるいはＡＧＮ１９３１０９（10−６Ｍ）の単独または組合わせと予め結合させて、配列：5'-TCAGGTCACCAGGAGGTCAGA-3'（配列番号１)を有する末端標識ＤＲ−５ ＲＡＲＥ二本鎖プローブと相互作用させた。結合混合物を、標準実験法に従って、非変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させ、オートラジオグラフにかけた。ゲル上の全てのレーンに共通であるオートラジオグラフ上に現れる単一遅延種は、網状赤血球溶解物中に存在する明確ではないプローブ結合因子を表わす。ＲＡＲ／ＲＸＲの組み合わせのみが、レチノイドレセプター特異性遅延種を生成させた。ＲＡＲ単独もＲＸＲ単独もプローブに結合してこのシフト種を生成させることがなかった。ＡＧＮ１９３１０９の存在はその相互作用を弱めなかった。
【０３０８】
これらの結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲ−αのホモまたはヘテロ二量化特性のいずれも実質的に変化させないことを示した。さらにＡＧＮ１９３１０９は、同系結合部位を含むＤＮＡセグメントとレセプター二量体との相互作用を抑制しなかった。
【０３０９】
ＡＧＮ１９３１０９を特徴付けるこの独特の特性を考慮して、我々は、この拮抗薬が、非配位ＲＡＲの活性をさらに抑制し得るかどうか検討した。これを決めるために用いたレセプター／リポーター系は、添加レチノイド作用薬の不存在下に高水準の構成性活性を有利に示した。より具体的には、これらの操作は、ＥＲ−ＲＡＲキメラレセプターおよびＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃリポーター系を用いた。ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃプラスミドは、Klein-Hitpassら[Cell、第46巻：1053〜1061（1986年版)]が記載しているＸenopusビテロゲニン(vitellogenin)Ａ２遺伝子のエストロゲン反応性５'-境界領域の−397〜−87領域であって、プラスミドｔｋ−Ｌｕｃのルシフェラーゼリポーター遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼプロモーターの上流に連結された領域を含む。ＥＲ−ＲＡＲキメラレセプターは、ＲＡＲの「Ｄ-Ｅ-Ｆ」ドメインに融合しているエストロゲンレセプターＤＮＡ結合ドメインからなっていた。当業者は、この「Ｄ-Ｅ-Ｆ」ドメインが、レチノイドと結合し、レチノイド誘発性トランス活性化機能を提供し、ＲＸＲとのヘテロ二量化のための接触部位を提供するように機能することを知っている。すなわち、このレセプター系におけるルシフェラーゼ発現は、トランスフェクションされたキメラレセプター構築物の活性化に依存していた。
【０３１０】
実施例１０は、ＡＧＮ１９３１０９が、非配位ＲＡＲに起因する基本遺伝子活性を抑制することを示すために用いられた方法を記載している。これらの操作は、添加レチノイド作用薬の不存在下に行った。以下の結果は、ＡＧＮ１９３１０９がネガティブホルモン活性を表わすことを最初に示した。
【０３１１】
実施例１０  一時的に同時トランスフェクションされた細胞系におけるレチノイド調節リポーターの基本遺伝子活性の抑制
ＣＶ-１細胞を、ＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃリポータープラスミドと、ＥＲ-ＲＡＲ-α、ＥＲ-ＲＡＲ-βまたはＥＲ-ＲＡＲ-γ発現プラスミドで同時トランスフェクションした。ＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃプラスミドは、Ｘenopus laevisビテロゲニンＡ２遺伝子のエストロゲン反応性プロモーター要素を含んでおり、ルシフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列によりＣＡＴリポーター遺伝子が置換された以外は、Klein-Hitpassら[Cell、第46巻：1053頁（1986)]に記載されたリポータープラスミドと実質的に同一であった。同時トランスフェクションにおいて用いられたＥＲ-ＲＡＲ-α、ＥＲ-ＲＡＲ-βまたはＥＲ-ＲＡＲ-γキメラレセプターコード化ポリヌクレオチドは、Graupnerら[Biochem. Biophys. Res. Comm.、第179巻：1554頁（1991)]により記載されている。これらのポリヌクレオチドを、Ellisら[Cell、第45巻：721頁（1986)]が記載しているｐＥＣＥ発現ベクター内に連結し、ＳＶ-４０プロモーターの転写制御下に発現させた。リポータープラスミド0.5μg／ウエルおよびレセプタープラスミド0.05μg、0.10μgまたは0.2μg／ウエルを用いて実施例６に記載の通りにして燐酸カルシウムトランスフェクションを行った。細胞に、ビヒクル単独(エタノール)、ＡＴＲＡ(10−９〜10−６Ｍ)またはＡＧＮ１９３１０９(10−９〜10−６Ｍ)を18時間投与した。細胞溶解物およびルシフェラーゼ活性の測定を実施例６に記載のように行った。
【０３１２】
図３Ａ、４Ａおよび５Ａに示す結果は、ＡＴＲＡが、全てのトランスフェクション体においてルシフェラーゼ発現を強力に誘発したことを示した。３つのトランスフェクションされたキメラＲＡＲ異性型についてのルシフェラーゼの基本水準発現は、約7000〜40000の相対光単位(rlu)に及び、トランスフェクションで用いられるレセプタープラスミドの量にある程度依存していた。すなわち、３つのキメラレセプターは、予想されたようにＡＴＲＡにより活性化された。より詳しくは、３つの全てのレセプターがＡＴＲＡに結合し、ＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃプラスミド上に保持されたルシフェラーゼレセプター遺伝子の転写を活性化した。
【０３１３】
図３Ｂ、４Ｂおよび５Ｂは、いずれかの外因性レチノイド作用薬の不存在下に得られるＡＧＮ１９３１０９用量反応曲線を表わす。興味深いことに、ＥＲ−ＲＡＲ−α（図３Ｂ）は、ＡＧＮ１９３１０９により実質的に影響を受けず、ＥＲ−ＲＡＲ−βおよびＥＲ−ＲＡＲ−γキメラレセプター（それぞれ図４Ｂおよび５Ｂ）はルシフェラーゼリポーター活性のＡＧＮ１９３１０９用量反応性減少を示した。
【０３１４】
我々は、さらに、構成性転写アクチベータードメインを有するように加工されたキメラＲＡＲ-γレセプターにより媒介される遺伝子発現を抑制する能力を試験することにより、ＡＧＮ１９３１０９のネガティブホルモン活性を研究した。より詳しくは、２つのタイプのルシフェラーゼレセプター系において、我々は、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６と呼ばれるＨＳＶ ＶＰ-１６の酸性アクチベータードメインに融合している構成的活性ＲＡＲ-γキメラレセプターを用いた。第１のものは、ＥＲ-ＲＡＲおよびＥＲ-ＲＸＲ-αで同時トランスフェクションされたＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃリポーターからなっていた。第２のものは、ＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃリポーターの代わりに△ＭＴＶ-ＴＲＥｐ-Ｌｕｃリポーターを利用した。
【０３１５】
実施例１１は、ＲＡＲの転写アクチベータードメインの活性をＡＧＮ１９３１０９が抑制し得ることを示すための方法を記載している。以下に示す結果は、作用薬の不存在下においてＲＡＲ依存性遺伝子発現をＡＧＮ１９３１０９が抑制し得ることを示すものであり、ＡＧＮ１９３１０９がネガティブホルモン活性を示すことを確認するものである。
【０３１６】
実施例１１  一時的にトランスフェクションされた細胞におけるＲＡＲ−ＶＰ−１６活性の抑制
ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃルシフェラーゼリポータープラスミド0.5μg／ウエル、ＥＲ−ＲＸＲ−αキメラリポーター発現プラスミド0.1μg／ウエル、およびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６発現プラスミド０μgまたは0.1μg／ウエルを用いて実施例６に記載の燐酸カルシウム共沈殿法によりＣＶ−１細胞を一時的に同時トランスフェクションした。キメラレセプターＥＲ−ＲＸＲ−αは、エストロゲンＤＮＡ結合ドメイン[Graupnerら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、第179巻：1554頁（1991)]に融合したＲＸＲ−α[Mangelsdorfら、Nature、第345巻：224〜229頁（1990)]のホルモン結合ドメイン（アミノ酸181〜458）からなっており、Ellisら[Cell、第45巻：721頁（1986)]が記載しているＳＶ−４０系発現ベクターｐＥＣＥから発現させた。ＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６は、Nagpalら[EMBO J.、第12巻：2349頁（1993)]が記載しているＶＰ１６ＲＡＲ−γ１発現プラスミドに同一であり、全長ＲＡＲ−γのアミノ末端に融合したＨＳＶのＶＰ−１６タンパク質の活性化ドメインを有するキメラタンパク質をコード化する。トランスフェクション18時間後に、細胞を燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）で濯ぎ、木炭で抽出してレチノイドを除去した10％ＦＢＳ（Gemini Bio-Products製）を含むＤＭＥＭ（Gibco-BRL製）を供給した。細胞に、エタノール単独またはエタノールビヒクル中のＡＧＮ１９３１０９またはＡＴＲＡの適切な希釈液を18時間投与し、次に、ＰＢＳで濯ぎ、0.1Ｍ ＫＰＯ４（pH 7.8）、1.0％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、1.0 ｍＭ ＤＴＴおよび2 ｍＭ ＥＤＴＡを用いて溶解した。ルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェリン（Analytical Luminescence Laboratory）およびEG ＆ G Berthold 96-ウエルプレート蛍光測定器を用いてWetら［Mol. Cell. Biol. 第7巻：725頁（1987)]に記載の方法に従って測定した。ルシフェラーゼ値は、3回測定の平均±SEMを表わしていた。
【０３１７】
図６に示すように、ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃレセプター構築物およびＥＲ−ＲＡＲ−αキメラ発現プラスミドによりトランスフェクションされたＣＶ−１細胞は、おそらく、ＲＸＲのための天然配位子[Heymanら、Cell、第68巻：397頁（1992)]である９Ｃ−ＲＡへのＡＴＲＡの異性化により、ＡＴＲＡによるルシフェラーゼ活性の弱い活性化を示した。リポーターおよびキメラレセプタープラスミドの同じ混合物でトランスフェクションし、ＡＧＮ１９３１０９で処理した細胞は、フシフェラーゼ活性に何の効果も示さなかった。ＡＧＮ１９３１０９はＲＸＲに結合しないので、この後者は予想されていた。ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃリポーターで同様にトランスフェクションしたがＥＲ−ＲＸＲ−αをＥＲ−ＲＡＲキメラレセプター発現プラスミドで置換したＣＶ−１細胞は、ＡＴＲＡ処理に続いてルシフェラーゼ活性の強度の誘発を示した。
【０３１８】
これに対して、ＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６発現プラスミドをＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃプラスミドと共にトランスフェクション混合物中に含むことにより、任意の添加レチノイドの不存在下に測定したときに基本的ルシフェラーゼ活性が大きく増加した。ＥＲ−ＲＸＲ−α／ＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６同時トランスフェクション体について観察された基本的ルシフェラーゼ活性のこの増加は、ＥＲ−ＲＸＲ−α単独でトランスフェクションした細胞を用いて得られた結果と比較して、組み換えＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６タンパク質がヘテロ二量化し得ることを示した。ヘテロ二量体とシス調節性エストロゲン反応性要素との相互作用により、ＶＰ−１６活性化ドメインが、ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃリポーターのプロモーター領域を標的化した。そのような３重トランスフェクションされた細胞をＡＴＲＡで処理すると、ルシフェラーゼ活性が高い基本水準よりも僅かに増加した。しかし、３重トランスフェクション体をＡＧＮ１９３１０９で処理すると、ルシフェラーゼ活性が用量依存的に減少する。重要なことに、図6は、ＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６で同時トランスフェクションした細胞をＡＧＮ１９３１０９で処理するとルシフェラーゼ活性が抑制され、最大抑制がＡＧＮ１９３１０９ 約10−８Ｍで起こることを示している。
【０３１９】
ＲＸＲの存在下にＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６の構成性転写活性化機能をＡＧＮ１９３１０９が抑制するという我々の観察は、トランス作用性ネガティブコアクチベータータンパク質の結合を容易化するネガティブコンフォーメーションを安定化させるＲＡＲにおけるコンフォーメーション変化を、ＡＧＮ１９３１０９のＲＡＲへの結合が誘発するモデルにより説明された。ＡＧＮ１９３１０９／ＲＡＲ複合体がＮＣＰにより結合される場合、ＲＡＲは、活性化ＲＡＲに普通に反応性である遺伝子の転写を上方制御することができない。我々のモデルは、さらに、ＮＣＰの細胞内貯蔵部が、ある関係において制限された濃度を有し、ＡＧＮ１９３１０９刺激されたＲＡＲとの複合化のゆえに使い果され得ることを提案する。
【０３２０】
図６に示す結果は、さらに、10−６ＭのＡＧＮ１９３１０９であっても、ＥＲ−ＲＸＲ−αとＲＡＲ―γ―ＶＰ−１６タンパク質とが相互作用して、リポーター遺伝子の転写を活性化するのにコンピテントなヘテロ二量体を形成するように相互作用し得ることを示した。より詳しくは、ＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ―γ―ＶＰ−１６でトランスフェクションすると共に、最大抑制を提供するのに充分である濃度（10−８〜10−６Ｍ）においてＡＧＮ１９３１０９で処理した細胞は、約16000 rluのルシフェラーゼ活性を提供した。逆に、ＥＲ−ＲＸＲ−αのみでトランスフェクションし、次に10−６Ｍの高い濃度でＡＧＮ１９３１０９で処理した細胞は、約8000 rluのルシフェラーゼ活性水準しか示さなかった。10−６ＭのＡＧＮ１９３１０９の存在下においても、ＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６の両方を発現する細胞において高水準のルシフェラーゼ活性が得られた事実は、二つの組み換えレセプター間の相互作用の持続を示した。ＡＧＮ１９３１０９によるＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６活性の抑制は、ＮＣＰ相互作用の調整を、ＶＰ−１６活性化によって同時支配し得ることを示した。従って、我々は、普通はＡＧＮ１９３１０９に依存してレチノイドにより調節されない遺伝子の発現を調整することが可能であることを理解した。
【０３２１】
ＡＧＮ１９３１０９調節可能遺伝子の候補は、ＲＡＲと結合または二量化する非ＲＡＲ因子（この非ＲＡＲ因子は活性化のためにＲＡＲ作用薬を必要としない）からなる転写因子複合体により活性化される遺伝子を含む。ＲＡＲ作用薬による刺激はそのような遺伝子の発現に実質的に影響を有さないが、ＡＧＮ１９３１０９の投与は、ＡＧＮ１９３１０９／ＲＡＲ／ＮＣＰを含む不活性転写複合体の形成を促進することができる。従って、ＡＧＮ１９３１０９レチノイドネガティブホルモンの添加は、それ以外ではレチノイド非感受性遺伝子の転写を下方制御することができる。
【０３２２】
この同じ機構は、ＨＬ−６０細胞中の組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧアーゼ）遺伝子の活性をＡＧＮ１９３１０９が抑制し得るという観察を説明することができる。５および７の塩基対をおいて離れている３つの基本レチノイド半部位を含んでいるレチノイド反応要素が、この遺伝子の転写制御領域において同定された。ＴＧアーゼはＲＸＲ選択的作用薬により誘発し得るが、それはＲＡＲ選択的作用薬に反応性ではない。ＴＧアーゼレチノイド反応要素は、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロ二量体（Daviesら、印刷中）により結合される。興味深いことに、ＡＧＮ１９３１０９は、ＲＸＲ作用薬により誘発されるＴＧアーゼ活性を抑制することができる。このＡＧＮ１９３１０９媒介抑制は、このネガティブホルモンが、ヘテロ二量体のＲＡＲ成分にＮＣＰを封鎖し、それにより結合ＲＸＲの活性を抑制する能力により説明することができる。
【０３２３】
また我々は、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６およびＥＲ-ＲＸＲ-α発現構築物をＥＲＥ-ｔｋ-Ｌｕｃリポータープラスミドと組み合わせる代わりに、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６および発現構造物ならびに△ＭＴＶ-ＴＲＥｐ-Ｌｕｃリポータープラスミドを用いて、実施例１１により示される結論と同一の結論を支持する結果を得た。前述の結果と一致するように、我々は、△ＭＴＶ-ＴＲＥｐ-ＬｕｃリポーターにおけるＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６活性がＡＧＮ１９３１０９により抑制されることを発見した。従って、ＡＧＮ１９３１０９は、このキメラレセプターが、レポータープラスミドのプロモーター領域においてエストロゲン反応要素に間接的に結合する代わりにレチノイン酸レセプター反応要素に直接結合したときに、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６活性を抑制した。これらの発見は、ネガティブホルモン活性を有する試薬を同定するためのアッセイが、特別のリポータープラスミドの使用により限定される必要がないことを示した。その代わりに、レチノイドネガティブホルモンの同定に有用な実験系により具現化された重要な特徴は、構成性転写活性化ドメインを含むように加工されたＲＡＲの活性を抑制する化合物の能力を検出することを含む。
【０３２４】
通常、レチノイドネガティブホルモンは、レセプターのＤＮＡ結合ドメインのＣ末端に位置しているレチノイドレセプターの少なくともドメインを含むキメラレセプターまたはレチノイドレセプターによる直接または間接の結合に転写的に反応性であるリポーター遺伝子の基本水準発現を、トランスフェクションされた細胞中において抑制するレチノイド化合物のサブセットとして同定することができる。この手段は、レチノイドネガティブホルモンの同定のために有用なスクリーニング法に適用される。発明されたスクリーニング法の種々の態様において、ネガティブホルモンに求められるレセプターの構造は様々である。より詳しくは、レチノイドレセプターは、ＲＡＲまたはＲＸＲサブタイプであってよい。レセプターは、要すれば、構成性転写アクチベータードメインを含むように加工することができる。ネガティブホルモンのスクリーニングに使用されるレチノイドレセプターは、要すれば、天然レセプターに内因的なＤＮＡ結合ドメインの代用として異質ＤＮＡ結合ドメインを含む。しかし、スクリーニング法において第２のレセプターを使用する場合、および第２のレセプターがネガティブホルモンに求められるレチノイドレセプターと二量体を形成し得る場合、そのレチノイドレセプターは、それ自体が転写制御領域に結合される第２のレセプターとの二量化を介して間接的にリポーター遺伝子の転写制御領域に結合することができるので、ＤＮＡ結合ドメインを必要としない。
【０３２５】
スクリーニング法の実際において、リポーターの基本発現を抑制する化合物の能力は、通常、インビトロアッセイにより測定される。基本発現は、外因的な添加レチノイド作用薬が存在しない条件下におけるトランスフェクションされた細胞におけるリポーター発現の基本水準を表わす。要すれば、インビトロで細胞を培養するのに用いられる血清の木炭抽出のような操作を介して、トランスフェクションされた細胞の環境から内因性レチノイド配位子を除去するための工程を設けて良い。
【０３２６】
スクリーニング法に関して有用なリポーター遺伝子の例は、免疫化学的手段により検出することができるルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼまたは細胞表面抗原をコードする遺伝子を含む。実際、リポーター遺伝子の性質は、方法の操作性に重要であるとは考えられない。しかし、リポーター構築物の転写調節領域は、ネガティブホルモンに求められている転写因子の標的である一つまたはそれ以上のシス調節性要素を含んでいなければならない。例えば、ＲＡＲネガティブホルモンを同定しようとする場合、リポーター構築物の転写調節領域は、ＲＡＲ含有タンパク質により結合され得るシス調節性要素を含むことができる。この例においては、ＲＡＲのＤＮＡ結合ドメインと、リポーター構築物の転写調節領域のシス調節性要素とが一致すべきである。すなわち、シス調節性エストロゲン反応性要素を結合することができるＤＮＡ結合ドメインおよび構成性転写アクチベータードメインを有するキメラＲＡＲがスクリーニング法において用いられる場合、リポーター構築物の転写調節領域は、エストロゲン反応性要素を含むべきである。
【０３２７】
リポーターアッセイとの関係において有用なレチノイドレセプター(ＲＡＲＥ)と直接結合するシス調節性要素の例は、Mangelsdorfら[The Retinoid Receptors、The Retinoids: Biology，Chemistry and Medicine、第2版、Spornら編、Raven Press, Ltd., New York (1994)]が開示している。キメラレセプターを間接的に結合するシス調節性要素の例には、レチノイドレセプターに結合したＤＮＡ結合ドメインからなるキメラレセプター中にタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを組み込むことのできる任意のＤＮＡ結合タンパク質のためのＤＮＡ結合部位が含まれる。加工してキメラレセプターに入れることができ異質シス調節要素を認識する異質ＤＮＡ結合ドメインの具体例は、エストロゲン反応性要素を認識するものを含む。すなわち、スクリーニング法に関して有用なキメラレセプターのレチノイドレセプター部分は、レチノイドレセプターのＤＮＡ結合を含む必要がないが、少なくとも、レチノイドレセプターの配位子結合ドメインを含まなくてはならない。
【０３２８】
シス調節性要素に結合する間接レチノイドレセプターの別の例には、シス調節性要素と結合しレチノイドレセプターを二量化することのできるタンパク質の使用が含まれる。この場合、レチノイドレセプターは、ＤＮＡ結合に係わるタンパク質との結合によってのみ、シス調節性要素と結合する。そのような系の例は、ＲＡＲとの二量化に係わるＲＸＲのドメインを少なくとも含む、ＲＸＲに融合した異質ＤＮＡ結合ドメインからなる融合タンパク質の使用を含む。一緒に導入されたＲＡＲは、シス調節性要素に結合したそのような融合タンパクと二量化することができる。我々は、ＲＡＲと二量化してＲＡＲとシス調節性要素との間接結合を生じる任意のシス調節性要素結合タンパク質も、ネガティブホルモンスクリーニング法に用いるのに好適であると考える。
【０３２９】
スクリーニング法の好ましい態様において、レチノイドネガティブホルモンは、増加した基本活性を有する加工ＲＡＲ転写因子の基本発現を抑制するレチノイドと同定される。スクリーニング法の操作性に必須ではないが、以下の実施例で用いられる加工ＲＡＲは、構成性転写活性化ドメインを含んでいた。このキメラレセプターの使用は、いかなるレチノイドも存在しない状態でリポーター遺伝子の基本発現を向上させることのできる手段を有利に提供した。我々は、先に詳細に記載した操作において一時的トランスフェクションを用いたが、キメラレセプターを構成的に発現する安定にトランスフェクションされたセルラインもスクリーニング法に有用である。
【０３３０】
以下の実施例に記載するように、構成性転写アクチベータードメインを有するキメラレチノイドレセプターは、エストロゲン反応性シス調節性要素に特異的なＤＮＡ結合ドメインを含むように加工された第2のレセプターとヘテロ二量化が可能であった。この場合、構成性転写アクチベータードメインを有するキメラレチノイドレセプターは、ＤＮＡ標的配列と結合する第2のレセプターへの結合を介して間接的にリポーター遺伝子発現を制御するシス調節性領域と結合する。より詳しくは、第2のレセプターを、エストロゲン反応性要素を認識するＤＮＡ結合ドメインを含むように加工した。有利には、上流プロモーター領域にエストロゲン反応性要素を有するリポーター遺伝子は、構成性転写アクチベータードメインを有するトランスフェクションしたキメラレセプターの不存在下においてレチノイド作用薬に非反応性である。従って、全てのリポーター遺伝子活性は、トランスフェクションされたレセプターに起因する。エストロゲン反応性要素ＤＮＡ結合ドメインとエストロゲン反応性要素シス調節性要素とを組み合わせて用いるのは、説明のみを意図したものである。当業者は、非ＲＡＲＥシス調節性要素に特異性を有する加工レセプターの他の組み合わせも、本発明のスクリーニング法の実際において有用であることを理解する。
【０３３１】
スクリーニング法に有用な細胞は、トランスフェクションすることのできる真核細胞である。細胞は、ヒト、霊長類またはげっ歯類細胞のような動物細胞である。我々は、ＣＶ−１を用いて非常に優れた結果を達成したが、他の培養細胞系（セルライン）も良好に用い得ることが合理的に予想される。構成性転写アクチベータードメインを有するキメラレチノイドレセプターをコードする発現構築物を導入するために、当分野において知られている多くの従来の転写法のいずれも使用することができる。
【０３３２】
構成性転写アクチベータードメインは、中性pＨ条件下に陰電荷により示され、全体として酸性特性を有するような複数のアミノ酸からなる。例えば、構成性転写アクチベータードメインは、ウイルス性転写因子においても見られるアミノ酸配列を有していてよい。構成性転写アクチベータードメインを有するウイルス性転写因子の一例は、ヘルペス単純ウイルス１６である。しかし、他のウイルス性または合成転写アクチベータードメインも、構成性転写アクチベータードメインを有するキメラレチノイドレセプターをコードする発現構築物の構築に有用である。
【０３３３】
以下に記載しているように、我々は、レチノイドネガティブホルモンを同定するのに有用な一般化スクリーニング法を開発した。このスクリーニング法は、ネガティブホルモンから単純な拮抗薬を区別する手段を提供する。表１２は、ＲＡＲ−γへの強力な親和性を示す幾つかのレチノイド化合物を列挙しているが、ＡＲＴＡを除いて、一時的な同時トランスフェクショントランス活性化アッセイにおいてこのレセプターをトランス活性化しなかった。従って、我々は、どれがＲＡＲ−γ拮抗薬であり、存在する場合は、これら拮抗薬のどれがネガティブホルモン活性を示すかを決めるためにこれらの化合物を試験した。
【０３３４】
実施例１２は、拮抗薬であるレチノイド化合物、およびネガティブホルモン活性を示す拮抗薬のサブセットを同定するために用いた方法を記載する。
【０３３５】
実施例１２  レチノイドネガティブホルモンのためのアッセイ
４×10４のＣＶ−１細胞を、ERE-tk-Lucリポータープラスミド0.5μgおよびER-RAR-γ[Graupnerら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、第179巻：1554頁（1991年版)]キメラ発現プラスミド0.1μgを用いて、Molecular Cloning：A Laboratory Manual[Sambrookら編、Cold Spring Harbor Lab Publ., 1989年版]に記載の燐酸カルシウム共沈殿法によりトランスフェクションした。18時間後、細胞を、ＰＢＳで濯ぎ、10％活性炭抽出ＦＢＳ（Gemini Bio-Products製）を含むＤＭＥＭ（Bibco-BRL製）を供給した。細胞を、エタノール中の10−８Ｍ ＡＴＲＡまたはエタノール単独で処理した。さらに、ＡＴＲＡ処理細胞を、10−９、10−８、10−７または10−６ Ｍの表１２に列挙する化合物で処理した。18時間後、細胞をＰＢＳで濯ぎ、0.1 Ｍ KPO４、(pＨ7.8）、1.0％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、1.0 ｍＭ ＤＴＴ、2 ｍＭ ＥＤＴＡ中で溶解した。ルシフェラーゼ活性を、deWetら[Mol. Cell. Biol. 第7巻：725頁（1987年版)]の記載のように測定した。
【０３３６】
【表１２】
2008280346.tif 000034
【０３３７】
図７および表１２に示す結果により示されるように、ＡＴＲＡを除いて、表１２中に列挙する化合物の全てがＲＡＲ−γのレチノイド拮抗薬であった。
【０３３８】
次に、表１２中に挙げたＲＡＲ-γ拮抗薬をスクリーニングして、存在する場合はどれがレチノイドネガティブホルモンでもあるかを決めた。４×10４のＣＶ-１細胞を、ＥＲＥ-tk-Ｌucリポータープラスミド0.5μgならびにＥＲ-ＲＡＲ-α[Graupnerら、Biochem. Biophys. Res. Comm.、第179巻：1554頁（1991年版)]0.1μgおよびＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６[Nagpalら、EMBO J. 第12巻：2349頁（1993年版)]0.2μgキメラ発現プラスミドを用いて、「分子クローニング：実験室マニュアル」[Sambrookら編、Cold Spring Harbor Lab Publ., 1989年版]に記載の燐酸カルシウム法によりトランスフェクションした。18時間後、細胞を、ＰＢＳで濯ぎ、10％活性炭抽出ＦＢＳ(Gemini Bio-Products製)を含むＤＭＥＭ(Bibco-BRL製)を供給した。細胞を、10−９、10−８、10−７または10−６Ｍの表１２に列挙する各化合物で処理した。エタノールビヒクル単独での処理はネガティブ対照として用いた。18時間後、細胞をＰＢＳで濯ぎ、0.1Ｍ ＫＰＯ４、(pＨ7.8)、1.0％ ＴＲＩＴＯＮ Ｘ-１００、1.0ｍＭ ＤＴＴ、2ｍＭ ＥＤＴＡ中で溶解した。ルシフェラーゼ活性を、deWetら[Mol. Cell. Biol. 第7巻：725頁（1987年版)]の記載のように測定した。
【０３３９】
図８に示すように、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６キメラレチノイドレセプターの構成性転写活性化機能への影響によって、表１２のレチノイド拮抗薬を２つのクラスに分けることができた。ＡＧＮ１９３１７４、ＡＧＮ１９３１９９およびＡＧＮ１９３８４０を含む１つの群は、ＡＴＲＡ拮抗薬であってもＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６を抑制しなかった。これに対して、ＡＧＮ１９３１０９、ＡＧＮ１９３３８５、ＡＧＮ１９３３８９およびＡＧＮ１９３８７１は、ＲＡＲ-γ-ＶＰ-１６構成性活性の用量依存的な抑制を示した。従って、両群の化合物はＲＡＲ-γ拮抗薬であるが、第２の群の化合物のみがネガティブホルモン活性を示した。このアッセイは、単純レチノイド拮抗薬からレチノイドネガティブホルモンを有利に区別した。
【０３４０】
前記実験結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、ネガティブホルモンを定義する基準に合致することを示した。より詳しくは、実施例１１に表わす結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、外因性添加レチノイド配位子の不存在下においてさえＲＡＲの抑制活性を示す能力を有することを示した。このように、この化合物は、ＡＴＲＡやＡＧＮ１９１１８３のような作動薬とＲＡＲの間の相互作用のブロックに依存しない生物学的活性を有していた。これらの発見により、我々は、ＡＧＮ１９３１０９がＲＡＲとＮＣＰとの間の相互作用を安定化させると結論した。図９に示すように、ＮＣＰ／ＲＡＲ／ＰＣＰ相互作用は、平衡状態にある。作動薬は、ＰＣＰ相互作用を増加させ、ＮＣＰ相互作用を低下させるように作用し、逆作動薬またはネガティブホルモンはＮＣＰを安定化させＰＣＰ相互作用を低下させる。先に述べたように、我々の実験結果は、他のレセプターのためのＮＣＰの細胞内利用性はＡＧＮ１９３１０９投与により調整することができることを示した。より詳しくは、我々は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＮＣＰとＲＡＲとの複合化を促進し、それによりＲＡＲ以外の転写因子との相互作用に利用できるＮＣＰの細胞内貯蔵部を減少させることができることを発見した。
【０３４１】
次に、我々は、ＡＰ−１依存性遺伝子発現の作動薬媒介抑制へのＡＧＮ１９３１０９の効果を試験した。Pfhal[Endocr. Rev. 第14巻：651頁（1993年版)]は、レチノイド作動薬剤が遺伝子発現を下方制御し得ることを開示した。Pfhal[Endocr. Rev. 第14巻：651頁（1993年版)]は、ＡＰ−１活性の抑制を含む機構によりレチノイド作動薬が遺伝子発現を下方制御し得ることを開示した。我々は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＡＰ−１活性を測定するように設計されたモデル系においてレチノイド作動薬と組み合わせて使用した場合に、２つの効果のうちのいずれかを有し得ると仮定した。第１に、ＡＧＮ１９３１０９は、おそらく、作動薬の作用に拮抗し、それによりＡＰ−１活性の作動薬依存抑制を除くことができる。また、ＡＧＮ１９３１０９は、作動薬活性を強化し、それによりＡＰ−１活性の作動薬依存性抑制を大きくすることができる。
【０３４２】
実施例１３は、ＡＧＮ１９３１０９が、レチノイド作動薬の抗ＡＰ−１活性を強化することを示すために用いた方法を記載している。以下に記載するように、ＡＧＮ１９１１８３レチノイド作動薬は、ＡＰ−１依存性遺伝子発現を弱く抑制する。ＡＧＮ１９３１０９とレチノイド作動薬との組み合わせは、ＡＰ−１依存性遺伝子発現を強く抑制した。それ自体、ＡＧＮ１９３１０９は抗ＡＰ−１活性を実質的に有していなかった。
【０３４３】
実施例１３  ＡＧＮ１９３１０９はレチノイド作動薬の抗ＡＰ−１活性を強化する
LIPOFECTAMINE（Life Technologies, Inc.）を用いて、Giguereら[Nature 第33巻：624頁（1987年版)]の記載のプラスミドｐＲＳ−ｈＲＡＲα 0.2μgおよびＳｔｒ−ＡＰ１−ＣＡＴリポーター遺伝子構築物 1μgでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。ｐＢＬＣＡＴ３[Luckowら、Nucl. Acids Res. 第15巻：5490頁（1987年)]のＨindIII−ＢamＨＩ部位の間に、ラットストロメリシン(stromelysin)−１プロモーター[Matrisianら、Mol. Cell. Biol. 第6巻：1679頁（1986年)]の-84〜+1位に相当するＤＮＡフラグメントをクローニングすることにより、Ｓｔｒ−ＡＰ１−ＣＡＴを調製した。ストロメリシン−１プロモーターのこの配列は、ＡＰ１モチーフを、その唯一のエンハンサー要素[Nicholsonら、EMBO J. 第９巻：4443頁（1990年)]として含む。以下の配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによりプロモーター配列を調製した。
【０３４４】
5'-AGAAGCTTATGGAAGCAATTATGAGTCAGTTTGCGGGTGACTCTGCAAATACTGCCACTCTATAAAAGTTGGGCTCAGAAAGGTGGACCTCGAGGATCCAG-3' (配列番号２）および
5'-CTGGATCCTCGAGGTCCACCTTTCTGAGCCCAACTTTTATAGAGTGGCAGTATTTGCAGAGTCACCCGCAAACTGACTCATAATTGCTTCCATAAGCTTCT-3'（配列番号３）
【０３４５】
トランスフェクション、適当な化合物での処理およびＣＡＴ活性の測定を含む操作を、Nagpalら[J. Biol. Chem. 第270巻：923頁（1995年版)]に記載のように実施した。
【０３４６】
これらの操作の結果は、ＡＧＮ１９３１０９がレチノイド作動薬ＡＧＮ１９１１８３の抗ＡＰ−１活性を強化することを示した。より詳しくは、10−１２〜10−１０ Ｍの濃度範囲において、ＡＧＮ１９１１８３は、ＴＰＡ−誘発Ｓｔｒ−ＡＰ１−ＣＡＴ発現を抑制しなかった。10−１０〜10−８ Ｍの濃度範囲におけるＡＧＮ１９３１０９での処理は、ＡＰ−１媒介リポーター活性を実質的に抑制しなかった。しかし、図10に表わす結果は、ＡＧＮ１９３１０９（10−８ Ｍ）と10−１２〜10−１０ Ｍの濃度範囲のＡＧＮ１９１１８３との組み合わせでトランスフェクションしたものを刺激すると、実質的に、ＴＰＡ誘発Ｓｔｒ−ＡＰ１−ＣＡＴ発現を12％〜21％抑制することを示した。従って、ＡＧＮ１９３１０９は、このレチノイド作動薬が通常、ＡＰ−１活性を抑制しない条件下においてＡＧＮ１９１１８３の抗ＡＰ−１活性を強化する。
【０３４７】
我々は、ＲＡＲ上へのＮＣＰのＡＧＮ１９３１０９依存性隔離が関与すると考えられる機構により、ＡＧＮ１９３１０９がＡＰ−１活性の作動薬媒介抑制を強化することの理由付けをした。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、グルココルチコイド、甲状腺ホルモン、エストロゲンおよびプロゲステロンのレセプターも含む核レセプターの上科にＲＡＲは属する。ＮＣＰを結合する能力が、核レセプター上科の異なる構成員の間で共有されるというのは合理的な仮定である。これにより我々は、ＡＧＮ１９３１０９が、核レセプターのこの上科と相互作用する配位子の一つまたはそれ以上の抗ＡＰ−１活性を強化し得ると考えた。
【０３４８】
前記実施例に表わされる結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、レチノイド作動薬の抗ＡＰ−１活性を強化することを明らかに示した。より詳しくは、ＡＧＮ１９３１０９は、ＡＧＮ１９１１８３の抗ＡＰ−１活性を検出することのできる閾値を低下させた。ＡＧＮ１９３１０９は、それ自体が抗ＡＰ−１活性を実質的に有さないので、核レセプター作動薬に対するその効果は協力的なものである。我々は、ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンが、ビタミンＤ３レセプターへの天然配位子である１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗ＡＰ−１活性を強化することも発見した。
【０３４９】
前記実施例におけるＡＧＮ１９３１０９とＡＧＮ191183との間の観察された協力作用は、必然的に、レチノイド作動薬の抗ＡＰ−１活性およびその活性のＡＧＮ１９３１０９媒介能力強化は異なる機構から生じるに違いないことを意味している。２つの試薬の作用の機構が同一であるなら、ＡＧＮ１９３１０９と作動薬との組み合わせの効果が付加的であるということになる。その代わりに、組み合わせは、いずれかの試薬単独よりも一層効果的であることが示され、その効果はこの発見に前もって予想されていなかった。
【０３５０】
重要なことに、ＲＡＲ作動薬のＡＧＮ１９３１０９媒介能力強化は、レチノイド作動薬よりも約１００倍モル過剰のＡＧＮ１９３１０９を用いて行われた。従って、ＲＡＲの大部分が、作動薬結合に利用できるＲＡＲを殆ど残すことなくＡＧＮ１９３１０９により結合されたに違いない。この事実に拘わらず、ＡＧＮ１９３１０９により結合されないＲＡＲの集団は、レチノイド作動薬と結合し、リポーター遺伝子発現の抑制として測定することのできる作動薬依存反応を激しく刺激することができた。すなわち、我々のデータは、ＡＧＮ１９３１０９により誘発されるＲＡＲの可能な異質性を示唆した。
【０３５１】
ＲＡＲとＮＣＰとの相互作用を促進するその能力に起因するＡＧＮ１０３１０９のネガティブホルモン活性は、ＡＧＮ１９３１０９とレチノイド作動薬との間の協力作用の理解の基礎を提供した。我々の結果は、細胞のＡＧＮ１９３１０９処理がＲＡＲおよびＮＣＰの結合を促進し、それにより細胞内の遊離ＮＣＰおよび遊離ＲＡＲの数が減らされるモデルと充分に一致した。これにより、機能的に異なるＲＡＲの２つの集団が生じる。最初の集団はＮＣＰと結合するＲＡＲにより示される。そのようなＡＧＮ１９３１０９／ＲＡＲ／ＮＣＰ複合体は、レチノイド作動薬によって活性化することができない。第2の集団は、ＮＣＰによって結合されず、作動薬との相互作用への利用性を維持するＲＡＲからなる。この後者の集団は、実質的にＮＣＰが消費されつくした環境中における遊離ＲＡＲを示す「ＲＡＲ＊」と表わされる。
【０３５２】
ＲＡＲ＊は、平衡結合によりＮＣＰと結合する可能性が低下しており、例えば抗ＡＰ−１活性として測定され得るレチノイド作動薬への増加した感受性を有する。この理由は、ＮＣＰの細胞内貯蔵部はＡＧＮ１９３１０９投与ゆえに消去され、ＰＣＰの貯蔵部は消去されていないからである。従って、遊離ＲＡＲ＊は、レチノイド作動薬を結合することができ、実質的にＮＣＰが消費された環境内でＰＣＰ因子と相互作用することができる。ＡＧＮ１９３１０９が、他の核レセプターのそれぞれの作動薬への感受性を増加させる能力は、これらの異なる核レセプターが、ＡＧＮ１９３１０９／ＲＡＲ複合体と相互作用する同じＮＣＰと相互作用する能力に起因し得る。核レセプターファミリー構成員へのＮＣＰの利用性のＡＧＮ１９３１０９媒介調整のこのモデルを、図１１に概略的に表わす。
【０３５３】
この機構モデルにより、我々は、レチノイド作動薬以外の核レセプター配位子の活性をＡＧＮ１９３１０９が調整し得ると予想した。以下の実施例に示すように、我々は、インビトロトランス活性化アッセイにおいて１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の活性をＡＧＮ１９３１０９が強化することを確認した。
【０３５４】
実施例１４は、トランス活性化アッセイにおいて１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の活性をＡＧＮ１９３１０９が向上させることを示すために用いられる方法を記載する。
【０３５５】
実施例１４  ＡＧＮ１９３１０９は１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３活性を強化する
Felgnerら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第84巻：7413頁（1987年版)]により記載されたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション法を用いて、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクションした。５×10４の細胞を、12ウエル複ウエルプレートに入れ、10％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で増殖させた。LIPOFECTAMINE試薬（Life Technologies, Inc.製）2μg／ウエルを用い、さらにリポータープラスミド△ＭＴＶ−Ｌｕｃ[Heymanら、Cell 第68巻：397頁（1992年版)]中に連結したマウスオステオポンチン（osteopontin）遺伝子[Ferraraら、J. Biol. Chem. 第269巻：2971頁（1994年版)]からの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３反応要素5'-GTACAAGGTTCACGAGGTTCACGTCTTA-3'（配列番号４）の２つのコピーを含むリポータープラスミドＭＴＶ−ＶＤＲＥ−Ｌｕｃ 0.7μg、およびＤＮＡの最終濃度を1.0μg／ウエルにするためのキャリアＤＮＡとしてのプラスミドｐＧＥＭ３Ｚ（Pharmacia, Inc.製）0.3μgを用いて、血清非含有培地中、細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクションの６時間後、細胞に、最終濃度10％で木炭抽出ＦＢＳを含む増殖培地を供給した。トランスフェクション後８時間において、細胞をビヒクル単独（エタノール）または最終濃度10−８または10−７ Ｍでのエタノール中ＡＧＮ１９３１０９で処理した。6時間後、最終濃度10−１０または10−７ Ｍになるようにエタノールに１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を加えた。１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３処理後８時間で、細胞を溶解し採取した。ルシフェラーゼ活性を、前述のように測定した。この実験系により、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３依存遺伝子発現をモニターし定量する都合の良い方法が得られる。
【０３５６】
図１２に表わす結果は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３単独を用いて得られた結果と比較したときに、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３と同時投与したＡＧＮ１９３１０９が用量反応曲線を左にシフトさせたことを示した。このことにより、ＡＧＮ１９３１０９が、インビトロトランス活性化アッセイにおいて１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の効果を強化することを確認した。より詳しくは、図１２は、10〜100 ｎＭと低いＡＧＮ１９３１０９の濃度が、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を約10倍より活性にしたことを図示している。約2000 rluのルシフェラーゼ発現を得るのに10−８ Mの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度が必要であるが、10−８〜10−７ Ｍの濃度でＡＧＮ１９３１０９をビタミンと共に投与した場合、同じルシフェラーゼ出力を得るのに、1/10の１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３しか必要なかった。図１２のグラフには示していないが、10−９および10−８ Ｍの濃度のＡＧＮ１９３１０９を用いて実質的に同じ結果が得られた。すなわち、ＡＧＮ１９３１０９と同時投与することは、ネガティブホルモンの不存在下において同様の結果を得るのに必要な１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の量を大きく低下させた。
【０３５７】
興味深いことに、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）発現プラスミドの同時トランスフェクションと共に前述の操作を繰り返した場合、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の活性を強化するＡＧＮ１９３１０９の能力がそれに対して減少した。我々は、この結果を、ＶＤＲの過剰発現が、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の活性を強化するＡＧＮ１９３１０９の能力に影響を与え得ることを示していると解釈する。すなわち、組織特異的に異なり得る配位子レセプターの細胞内濃度は、レセプターを結合する配位子の活性を強化するＡＧＮ１９３１０９の能力に影響を与え得る。このことは、やはり、滴定できる量のＮＣＰがビタミンＤ３反応の調節に貢献するモデルに一致し、前述のモデルを支持する。
【０３５８】
以下の実施例に示すように、我々は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗ＡＰ−１活性をＡＧＮ１９３１０９が強化することも確認した。ＡＧＮ１９３１０９作用の活性のための我々のモデルは、この薬物の存在下にＮＣＰが強くＲＡＲと結合することを考慮してこの観察を説明する。ＨｅＬａ細胞中に存在する内因性ビタミンＤレセプターは、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３に対してより感受性になり、その結果、Ｓｔｒ−ＡＰ１−ＣＡＴリポーターからの発現を抑制するこの配位子の能力が増大される。
【０３５９】
実施例１５は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗ＡＰ−１活性をＡＧＮ１９３１０９が強化することを示すために用いられる方法を記載する。
【０３６０】
実施例１５  ＡＧＮ１９３１０９は１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の抗ＡＰ−１活性を強化する
Nagpalら[J. Biol. Chem. 第270巻：923頁（1995年版)]の記載の方法により、LIPOFECTAMINEを用いて、Ｓｔｒ-ＡＰ１-ＣＡＴ１μgでＨｅｌａ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、ＡＧＮ１９３１０９単独（10−９〜10−７ Ｍ)、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３単独（10−１２〜10−７ Ｍ）または10−８ MのＡＧＮ１９３１０９の存在下での１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（10−１２〜10−７ Ｍ）で処理した。
【０３６１】
これらの操作の結果、ＡＧＮ１９３１０９は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がＴＰＡ誘発ＡＰ−１活性を抑制する能力を強化することを示した。10−９〜10−７ Ｍの濃度範囲で単独で用いた場合、ＡＧＮ１９３１０９は、検出できる抗ＡＰ−１活性を有していなかった。図１３に表わす結果は、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が、10−８〜10−７ Ｍの濃度範囲においてのみＴＰＡ刺激活性を表わすことを示した。10−８ MのＡＧＮ１９３１０９の存在下におけるＴＡＰ刺激ＣＡＴ活性の１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３媒介発現の分析は、抗ＡＰ−１活性が10−１０〜10−９ Ｍの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３において検出され、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３単独処理と比較して10−８および10−７ Ｍにおいて活性が増加することを示した。１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３媒介抗ＡＰ−１活性のＡＧＮ１９３１０９依存性調整は、ＲＡＲへのＮＣＰの隔離により、ＮＣＰが他の核レセプターファミリー要素との相互作用に利用できなくなった我々のモデルに一致した。従って、レセプターは、１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３処理に対してより感受性になった。
【０３６２】
ＲＡＲ媒介トランス活性化および抗ＡＰ−１活性の基礎をなす機構は異なっているようである。この結論は、ＡＧＮ１９３１０９の高投与は、抗ＡＰ−１活性を実質的に抑制することなくトランス活性化を完全に抑制するという我々の観察に基づく。従って、我々は、ＡＧＮ１９３１０９処理により媒介されるＲＡＲ＊形成の我々のモデルを支持するための更なる証拠を得ようとした。これを達成するために、我々は、インビトロトランス活性化アッセイにおいてＲＡＲ特異的作動薬ＡＧＮ１９１１８３の活性をＡＧＮ１９３１０９が強化し得るかどうか検討した。
【０３６３】
実施例１６は、ＲＡＲ特異的作動薬ＡＧＮ１９１１８３の活性をＡＧＮ１９３１０９が強化することを示すために用いられる方法を記載している。この操作の結果は、特定の環境下において、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲ特異的レチノイドの強さを高めたことを示し、ＡＧＮ１９３１０９がＲＡＲ＊形成を促進したことの強力な証拠を提供した。
【０３６４】
実施例１６  ＡＧＮ１９３１０９の同時投与によるレチノイド効果の強化
Felgnerら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第84巻：7413頁（1987年版)]により記載されたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション操作を用いて、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクションした。５×10４の細胞を、12ウエル複ウエルプレートに入れ、10％ＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で増殖させた。LIPOFECTAMINE試薬（2μg／ウエル、Life Technologies, Inc.製）用い、さらにリポータープラスミド△ＭＴＶ−Ｌｕｃ[Heymanら、Cell 第68巻：397頁（1992年版)]中に挿入したＴＲＥｐａｌ反応要素 5'-TCAGGTCATGACCTGA-3'（配列番号５）の２つのコピーを含むリポータープラスミドＭＴＶ−ＴＲＥｐ−Ｌｕｃ 0.7μg、およびＲＡＲ−γ発現プラスミドｐＲＳｈＲＡＲ−γ[Ishikawaら、Mol. Endocrinol. 第4巻：837頁（1990年版)] 0.1μgを用いて、血清非含有培地中、細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクション６時間後、細胞に、最終濃度10％で木炭抽出ＦＢＳを含む増殖培地を供給した。トランスフェクション後８時間において、細胞をビヒクル単独（エタノール）または最終濃度10−１１〜10−８ Ｍでのエタノール中ＡＧＮ１９３１０９で処理した。６時間後、最終濃度10−１０または10−９ ＭになるようにエタノールにＡＧＮ１９１１８３を加えた。ＡＧＮ１９１１８３処理後８時間で、細胞を溶解し採取し、ルシフェラーゼ活性を、前述のように測定した。
【０３６５】
予備実験は、10−９ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９が、ＨｅＬａ細胞中の10-９ Ｍ ＡＧＮ１９１１８３の反応を抑制するのに比較的効果が無いことを示した。これは、ＣＶ−１細胞中において10−８ Ｍ ＡＴＲＡを抑制する10−９ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９の能力と対照的である（図２）。
【０３６６】
図１４に示す結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲ＊の形成を刺激するという予測を支持した。ＡＧＮ１９３１０９の拮抗薬およびネガティブホルモン活性の我々の特徴付けに一致して、ＡＧＮ１９３１０９での処理により２相の投与反応曲線が得られた。ＡＧＮ１９３１０９の最低量投与(10−１１および10−１０)により、ＡＧＮ１９１１８３単独の場合を超える、ルシフェラーゼ活性の刺激が得られた。この効果は、ＲＡＲ＊がＡＧＮ１９３１０９により生成されることを示している。興味深いことに、このことはＡＧＮ１９３１０９処理単独の場合にも見られ、ＲＡＲ＊が内因性配位子に反応し得ることを示している。ＡＧＮ１９１１８３は、合成レチノイド作動薬であり、ＡＴＲＡと同様に、ＲＡＲを介して転写を活性化する。実施例７においてＡＴＲＡをＡＧＮ１９１１８３で置換することは、定量的に類似の結果を与える(すなわち、ＡＧＮ１９３１０９は10nＭ ＡＧＮ１９１１８３の作用に拮抗する)。実施例１６は、ＡＧＮ１９３１０９はＲＡＲ作動薬の拮抗薬として機能することができるが、ＡＧＮ１９３１０９同時投与がＲＡＲ作動薬により媒介される活性化を強化する場合に、投与条件を容易に同定し得ることを示している。実施例１６で用いられる化合物の投与量が、実施例７で記載の操作において用いられる投与量より実質的に少ないことを注目することが重要である。我々は、ＡＧＮ１９３１０９処理が、ＲＡＲ＊に対して、ＲＡＲ異質性ＲＡＲを導き得ることを提案した。見かけの異質性(すなわち、強化能力)は、トランス活性化対ＡＰ−１抑制において異なる様相を有するようである。曲線が２相である理由は、ＡＧＮ１９３１０９の量が増加すると、作動薬の結合に有用なＲＡＲが比例して少なくなるからである。このことは、ＡＰ−１抑制の場合には現れず、我々は、この相違が、同じレセプター種によるトランス活性化およびＡＰ−１抑制のための２つの異なる機能を反映するに違いないと考えた。
【０３６７】
臨床結果は、一部のレチノイドが、前悪性および悪性頚部病巣の増殖を抑制するのに有用であることを確認した。この結果を支持する実験的研究が、Grahamら[West. J. Med. 第145巻：192頁（1986年版)]、Lippmanら[J. Natl. Cancer Inst. 第84巻：241頁（1992年版)]、およびWeinerら[Invest. New Drugs 第4巻：241頁（1986年版)]により公表された。
【０３６８】
同様の結論が、種々のレチノイドの抗増殖効果を定性するために培養細胞を用いたインビトロ研究の結果により支持される。より詳しくは、Agarwalら[Cancer Res. 第51巻：3982頁（1991年版)]は、頚部形成異常の初期段階をモデル化するためにＥＣＥ１６−１細胞系を用い、レチノイン酸が、上皮成長因子（ＥＧＦ）依存細胞増殖を抑制し得ることを示した。
【０３６９】
実施例１７は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＥＣＥ１６−１細胞系の増殖を抑制するＡＧＮ１９１１８３レチノイド作動薬の活性に拮抗し得ることを示すために用いられる方法を記載する。
【０３７０】
実施例１７  ＥＣＥ１６−１細胞におけるレチノイドの抗増殖効果にＡＧＮ１９３１０９が拮抗する
ＥＣＥ１６−１細胞を、ＤＭＥＭ：Ｆ１２(３：１)、非必須アミノ酸、５％ＦＢＳ、５μg／mlトランスフェリン、２nＭの3,3',5-トリヨードチロニン(甲状腺ホルモンまたは「Ｔ３」)、0.1 nMコレラ毒素、２mＭ L-グルタミン、1.8×10−４ Mアデニンおよび10 ng／ml ＥＧＦを含む完全培地において１×10４細胞／cm２の密度で播種した。細胞を、一晩、プレートに付着させ、次に、ＤＭＥＭ：Ｆ１２(３：１)、２ mM L-グルタミン、非必須アミノ酸、0.1％子ウシ血清アルブミン、1.8×10−４ Mアデニン、５μg／mlトランスフェリン、２ nM Ｔ３、50 μg／mlアスコルビン酸、100ug／mlストレプトマイシン、100単位／mlペニシリンおよび50 μg／mlゲンタマイシンを含む規定培地に移した。規定培地（ＤＭ）には10ng／ml ＥＧＦを追加した。ＥＧＦ処理細胞には、ＡＧＮ１９１１８３レチノイド作動薬10 nMを０、0.1、1.0、10、100、1000 nMのＡＧＮ１９３１０９と組み合わせて、あるいは1000 nMのＡＧＮ１９３１０９単独を与えた。３日間処理した後、細胞を、Hembreeら[Cancer Res. 第54巻：3160頁（1994年版)]の記載のように採取し、細胞数をCOULTER計数器を用いて測定した。
【０３７１】
図１５に表わす結果は、ＥＣＥ１６−１細胞がＥＧＦに反応して増殖したが、強化培地単独においては増殖しなかったことを示した。このことは、Andreatta-van Leyenら[J. Cell. Physio. 第160巻：265頁（1994年版)]およびHembreeら[Cancer Res. 第54巻：3160頁（1994年版)]により発行された発見を確認するものであった。10nＭ ＡＧＮ１９１１８３および０nＭ ＡＧＮ１９３１０９の添加は、ＥＧＦ媒介増殖を完全に抑制した。すなわち、ＡＧＮ１９１１８３は、強力な抗増殖性レチノイドである。ＡＧＮ１９３１０９濃度を０nＭから10nＭに増やすと、ＡＧＮ１９１１８３濃度媒介増殖抑制が約50％拮抗された。10倍モル過剰のＡＧＮ１９３１０９は、ＡＧＮ１９１１８３の抗増殖効果を完全に逆転した。1000nＭ ＡＧＮ１９３１０９単独で細胞を処理することは、ＥＧＦ媒介増殖増加に効果が無かった。これらの結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、レチノイドの抗増効果に拮抗するが、ＡＧＮ１９１１８３のようなレチノイドによる増殖抑制に感受性の頚部上皮を代表する細胞を処理するために使用したときに、それ自体の抗増殖活性は実質的に有していないことをことを証明した。注目すべきことに、ＥＣＥ１６−１モデル系を用いてＡＧＮ１９１１８３作動薬の抗増殖活性をＡＧＮ１９３１０９が強化する証拠はない。
【０３７２】
ＥＣＥ１６−１細胞系により示されるモデル系と対照的に、頚部病巣に関与する細胞増殖がレチノイド作動薬により抑制することができない他の例がある。例えば、Agarwalら[Cancer Res. 第54巻：2108頁（1994年版)]は、レチノイド処理に反応性のない頚部腫瘍のモデルとしてＣａＳｋｉ細胞を使用することを記載している。以下に記載のように、細胞増殖を抑制するのではなく、レチノイド治療は、ＣａＳｋｉ細胞の増殖速度に実質的に影響を有さない。以下の実施例は、この細胞系の増殖速度へのＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンの効果を示す。結果は、予想外にも、ＡＧＮ１９３１０９が、レチノイド作動薬の抗増殖効果に非反応性である頚部腫瘍細胞の増殖を抑制し得ることを示した。
【０３７３】
実施例１８は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＡＧＮ１９１１８３のような他のレチノイドの抗増殖効果に反応しない頚部腫瘍細胞系の増殖を抑制することを示すために用いられる方法を記載する。重要なことは、ＡＧＮ１９３１０９が添加レチノイドの不存在下に抗増殖活性を示すことである。
【０３７４】
実施例１８  ＣａＳｋｉ頚部癌誘導細胞系の増殖速度をＡＧＮ１９３１０９が抑制する
我々は、ＣａＳｋｉ細胞増殖へのＥＧＦの効果を、単独または10−６ Ｍの濃度でＡＧＮ１９１１８３レチノイド作動薬および／またはＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンと組み合わせて試験した。細胞増殖アッセイを、前述のようにＥＣＥ１６−１細胞が関与する研究のために行った。ＥＧＦをレチノイド処理培養物に添加して最終濃度を20 ng／mlにした。細胞を、10−６ M ＡＧＮ１９３１０９の存在または不存在下にＡＧＮ１９１１８３（10−１０〜10−６ Ｍ）で、合計３日間、処理した。培地を、適切な場合は毎日、新らしい培地および２つのレチノイド化合物の各々に取り替えた。細胞数を、前述のようにCOULTER計数器を用いて決めた。
【０３７５】
図１６に表わす結果は、ＣａＳｋｉ細胞がレチノイド作動薬の効果に実質的に耐性であり、ＡＧＮ１９３１０９が添加レチノイドの不存在下に抗増殖活性を示すことを示した。培養物中にＥＧＦが存在することはＣａＳｋｉ細胞増殖を刺激する。この結論は、ＡＧＮ１９１１８３を表わさないストリップバーと規定増殖培地(「ＤＭ」)単独を表わすオープンバーの比較に基づく。ＡＧＮ１９１１８３処理は、ＣａＳｋｉ腫瘍細胞系に抗増殖活性を有さなかった。我々は、レチノイド作動薬濃度の1000倍増殖が、僅か20％の増殖速度の上昇にしか関与しないので、レチノイド作動薬剤に関する細胞増殖速度の僅かな増加は考慮しなかった。すなわち、ＡＧＮ１９１１８３作動薬は、ＣａＳｋｉ細胞の増殖速度に実質的に効果を有していなかった。
【０３７６】
図１６に示す結果は、ＣａＳｋｉ頚部上皮細胞系の増殖をＡＧＮ１９３１０９が抑制することを示した。この結論は、「Ｏ」ＡＧＮ１９１１８３ブラックバーおよび「Ｏ」ＡＧＮ１９１１８３ストリップバーとして現れる測定結果の比較に基づく。すなわち、ＡＧＮ１９３１０９は、ＡＧＮ１９１１８３のようなレチノイド作動薬により増殖抑制されない頚部腫瘍細胞を処理するために使用された場合、添加レチノイド作動薬の不存在下に生物学的反応を刺激することができる。
【０３７７】
ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンが細胞増殖を抑制し得るという我々の発見は、増殖に要求される遺伝子の発現を非配位ＲＡＲが媒介するモデルに一致する。ＡＧＮ１９１１８３のようなＲＡＲ作動薬は実質的に効果を有さないか、またはおそらく細胞増殖を僅かに促進するが、ＡＧＮ１９３１０９は抗増殖効果を有していた。ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンはおそらくＲＡＲと結合し、それによりＮＣＰ結合促進し、ＲＡＲに不活性コンフォーメーションを採らせる。我々のモデルによれば、これは、非配位ＲＡＲによりポジティブに調節される遺伝子活性を抑制する。非配位ＲＡＲの活性を下方制御するＡＧＮ１９３１０９のこの能力は、おそらくＲＡＲおよびＮＣＰの結合を促進するその能力から生じる。
【０３７８】
当業者は、網膜剥離に続く望ましくない細胞増殖の結果を制御するのに一部のレチノイド作動薬が有用であることを知っている。網膜剥離後、網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、脱分化し、増殖し、網膜下空間に移動する。この過程は、網膜再付着を目指す外科操作の成功にネガティブな衝撃を与え得る。Campochiaroら[Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 第32巻：65頁（1991年版)]は、ＡＴＲＡのようなＲＡＲ作動薬が、一次ヒトＲＰＥ培養物の増殖に抗増殖効果を示すことを示した。レチノイド作動薬は、網膜再付着手術の後の網膜剥離の発生を低下させることも示された[Fekratら、Opthamology 第10巻：412頁（1994年版)]。以下の実施例に開示するように、我々は、ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンが、一次ヒトＲＰＥ培養物における増殖を抑制する能力を分析した。
【０３７９】
実施例１９は、ＡＧＮ１９３１０９が、ヒト網膜色素上皮の一次培養物におけるレチノイド拮抗薬の抗増殖効果を強化することを示すために用いられる方法を記載する。
【０３８０】
実施例１９  ＡＴＲＡの抗増殖活性をＡＧＮ１９３１０９が強化する
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）の一次培養物を、Campochiaroら[Invest. Opthal ＆ Vis. Sci. 第32巻：65頁（1991年版)]に記載の方法に従って調製した。５％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（Gibco製）内の24ウエル複ウエルプレートの16 mmウエルに入れた。細胞を、エタノールビヒクル単独、エタノール中ＡＴＲＡ（10−１０〜10−６ Ｍ）、エタノール中ＡＧＮ１９３１０９（10−１０〜10−６ Ｍ）、またはＡＴＲＡ（10−１０〜10−６ Ｍ）および10−６ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９で擬処理した。細胞に、これらの化合物を適当な濃度で含む新しい培地を、２日毎に合計５日間供給した。細胞を、トリプシンで穏やかに消化することによりプレートから除去し、細胞の数を電気細胞計数器で数えた。
【０３８１】
図１７に表わす結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＰＥ細胞上のＡＴＲＡの抗増殖活性を劇的に強化することを示した。ＡＴＲＡで一次ＲＰＥ細胞を処理すると、ＲＰＥ細胞増殖が、対照培養物に対して、10−６ Ｍ ＡＴＲＡで、用量依存的に約40％減少した。ＡＧＮ１９３１０９処理は、この操作で試験したいかなる濃度でもＲＰＥ細胞の増殖速度を実質的に変化させなかった。予想外に、ＡＴＲＡ（10−１０〜10−６ Ｍ）と10−６ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９との組み合わせはＡＴＲＡ単独よりも強力な抗増殖活性を有していた。すなわち、ＡＧＮ１９３１０９同時処理は、ＡＴＲＡの抗増殖効果を強化した。より詳しくは、図に示される結果は、10−８ Ｍ ＡＴＲＡの抗増殖効果が、10−１０ Ｍ のＡＴＲＡを10−７ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９と組み合わせて使用するだけで得られることを示した。すなわち、ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンは、ＡＴＲＡの抗増殖活性を約100倍向上させた。
【０３８２】
独立した実験において、ＡＴＲＡ（10−１１〜10−６ Ｍ）の抗増殖効果とＡＴＲＡおよび10−６ Ｍ ＡＧＮ１９３１０９の効果との比較は、再度、ＡＧＮ１９３１０９の存在下におけるＡＴＲＡへの一次ＲＰＥ細胞の感受性の明らかな増加を示した。この系において、ＡＧＮ１９３１０９は、単独で用いた場合、レチノイド作動薬としても機能せず、抗増殖効果も示さなかった。しかし、ＡＧＮ１９３１０９の同時投与は、レチノイド作動薬の抗増殖活性を強化した。
【０３８３】
ＡＧＮ１９３１０９を、前述のＲＰＥ細胞増殖を測定するための条件および方法を用いて、一次ＲＰＥ培養物における13-シスレチノイン酸（13-シスＲＡ）の抗増殖効果を強化する能力について試験した。注目すべきことに、13-シスＲＡは臨床的に重要である。より詳しくは、13-シスＲＡは、にきびを含む種々の病状の治療に有用であり[Pechら、N. Engl. J. Med. 第300巻：329頁（1977年版)；Jonesら、 Br. J. Dermatol, 第108巻：333頁（1980年版)]、インターフェロン２ａと組み合わせて皮膚および頚部の鱗状細胞ガンの治療に有用である[Lippmanら、J. Natl. Cancer Inst. 第84巻：241頁（1992年版)：Mooreら、Seminars in Hamatology 第31巻：31頁（1994年版)]。
【０３８４】
図１８に表わす結果は、ＲＡ(10−１２〜10−６ Ｍ）およびＡＴＲＡ(10−１２〜10−６ Ｍ）の両方がＲＰＥ細胞増殖を効果的に抑制することを示した。注目すべきことに、13-シス異性体は、ＡＴＲＡと比較すると、このアッセイにおいて約２倍の水準で効果が低かった。ＡＧＮ１９３１０９とＡＴＲＡの同時投与（前記）を用いて得られる結果と同様に、ＡＧＮ１９３１０９（10−８または10−６ Ｍ）を13-シスＲＡ（10−１２〜10−６ Ｍ）と同時投与することは、ＲＰＥ細胞増殖の抑制の媒介において13-シスＲＡの強さを劇的に増加させた。13-シスＲＡ単独での処理と対照的に、ＡＧＮ１９３１０９の同時投与は、13-シスＲＡの強さを上昇させた。すなわち、ＡＧＮ１９３１０９は、13-シスＲＡの抗増殖活性を強化した。
【０３８５】
次に、我々は、一次ＲＰＥ細胞培養物において他の核レセプターホルモンの活性をＡＧＮ１９３１０９が強化する能力を試験した。合成グルココルチコイドレセプター作動薬であるデキサメタソンは、強力な抗炎症および免疫抑制特性のために臨床的に使用されている化合物群の一員である。甲状腺ホルモン(Ｔ３；3,3',5'-トリヨードチロシン）は、主に甲状腺機能低下の治療におけるホルモン置換治療のために用いられる天然甲状腺ホルモンレセプター作動薬である。これらの実験において用いられる方法は、ＡＴＲＡおよび13-シスＲＡを用いる操作のために前述したものと同一である。
【０３８６】
これらの操作の結果は、ＡＧＮ１９３１０９と核レセプター作動薬との同時投与は、核レセプター作動薬の抗増殖活性を強化することを示した。より詳しくは、図１９に表す結果は、デキサメタソン(10−１１〜10−６ Ｍ)またはＡＴＲＡ(10−１２〜10−６ Ｍ)のいずれかによるＲＰＥ細胞の単一試薬処理は、ＲＰＥ細胞増殖を実質的に抑制できないことを示した。しかし、ＲＰＥ細胞をデキサメタソン(10−１１〜10−６ Ｍ）および10−８または10−６ ＭのＡＧＮ１９３１０９で処理すると、ＡＴＲＡでの処理により得られる抑制と同程度にＲＰＥ細胞増殖を抑制した。同様に、図２０に表わす結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、甲状腺ホルモンの抗増殖活性を強化することを示した。デキサメタソンを用いて得られた結果と同様に、ＲＰＥ細胞の増殖は、甲状腺ホルモン（10−１１〜10−６ Ｍ）での単一試薬処理に耐性であった。しかし、ＲＰＥ細胞を甲状腺ホルモン（10−１１〜10−６ Ｍ）およびＡＧＮ１９３１０９（10−８または10−６ Ｍ）で同時処理すると、甲状腺ホルモンに依存するようにＲＰＥ細胞増殖を抑制した。我々は、ＡＧＮ１９３１０９が、一次ＲＰＥ培養物を、これらの核レセプター作動薬の抗増殖効果に感受性にしたと結論した。ＡＧＮ１９３１０９がこれらの効果を媒介する機構には、ＮＣＰ／ＲＡＲ相互作用の調整が関与しているようである。
【０３８７】
我々はさらに、レチノイド作動薬に感受性の他の実験系におけるマーカー遺伝子の発現へのＡＧＮ１９３１０９の効果を試験した。ＭＲＰ８およびストロメリシン遺伝子の両方が、種々の生物学的系においてレチノイド作動薬により抑制されることが知られている。例えば、Wilkinsonら[J. Cell Sci. 第91巻：221頁（1988)]およびMadsenら[J. Invest. Dermatol. 第99巻：299頁（1992)]は、ＭＲＰ８遺伝子発現が乾癬において上昇することを開示した。逆に、ＭＲＰ８遺伝子は、ヒト乾癬皮膚[Nagpalら、1995年発行]、ヒトケラチノサイト大量培養物[Chandraratnaら、J. Invest. Dermatol. 第102巻：625頁（1994)]および培養ヒト新生包皮ケラチノサイト[Thacherら、J. Invest. Dermatol. 第10巻：594頁（1995)]においてレチノイド作動薬ＡＧＮ１９０１６８により抑制される。Nagpalら[J. Biol. Chem. 第270巻：923頁（1995)]は、ストメリシンｍＲＮＡ水準が、培養ヒト新生包皮ケラチノサイト内においてＡＧＮ１９０１６８のようなレチノイド作動薬により抑制されることを開示した。我々は、ＡＧＮ１９１１８３レチノイド作動薬またはＡＧＮ１９３１０９での培養ヒト新生包皮ケラチノサイトの処理に続いて、これらの遺伝子の調節された発現を分析した。
【０３８８】
実施例２０は、ＡＧＮ１９３１０９が、培養ケラチノサイトにおいてＭＲＰ８発現を抑制することを示すために用いられる方法を記載する。
【０３８９】
実施例２０  角化細胞においてＡＧＮ１９３１０９はＭＲＰ−８発現を阻害する
一次包皮角化細胞(Primary foreskin keratinocytes)を、Nagpalら[J.Biol.Chem. 270:923 (1995)]の記載の方法に従って単離し、Cloneticsから購入した角化細胞増殖培地（ＫＧＭ）において培養した。ＡＧＮ１９１１８３（１０−７Ｍ）またはＡＧＮ１９３１０９（１０−６Ｍ）を用いた３日間の処置の後に、処置したおよび対照標準の角化細胞から、全細胞ＲＮＡを標準法に従って単離した。ｍＲＮＡがｃＤＮＣに逆転写され、次に、それが、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ(ＧＡＰＤＨ)ハウスキーピング遺伝子またはＭＲＰ−８のどちらかに特異的なプライマーを用いるＰＣＲ増幅プロトコールにおける、鋳型として機能した。ＧＡＰＤＨプライマーは、配列：
5'-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3'（配列番号６）、および
5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3'（配列番号７）
を有していた。ＭＲＰ−８プライマーは、配列：
5'-ACGCGTCCGGAAGACCTGGT-3'（配列番号８）、および
5'-ATTCTGCAGGTACATGTCCA-3'（配列番号９）
を有していた。ＭＲＰ−８増幅反応からの一部（１０μl）を、１２サイクルから開始して２１サイクルで終わるＰＣＲ増幅のサイクル毎に採取した。同様に、ＧＡＰＤＨ増幅反応の一部を、１５サイクルから開始して２４サイクルで終わるＰＣＲサイクル毎に採取した。サンプルを、２％アガロースゲル上で電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色によって分離された増幅生成物を検出した。増幅生成物の染色強度は、所定のプライマーセットに特異的な出発ｍＲＮＡの量の量的尺度として機能した。
【０３９０】
この方法の結果は、ＡＧＮ１９１１８３およびＡＧＮ１９３１０９の両方が、それぞれ、角化細胞におけるＭＲＰ−８の発現を阻害することを示した。染色されたＧＡＰＤＨ増幅生成物の強度は、対照標準、ＡＧＮ１９１１８３、およびＡＧＮ１９３１０９で処置された角化細胞から単離された出発物質を表すゲルのレーンにおいて、実質的に同等であった。ＧＡＰＤＨ増幅生成物を表す弱いバンドが、ＰＣＲ増幅の１８サイクルの後に除去されたサンプルに対応するレーンにおいて、初めに検出された。ゲルの種々のレーン間の同等の染色強度は、出発物質の同等の量が、全サンプルに使用されたことを示す。従って、ＭＲＰ−８増幅生成物を表す染色バンドにおける強度の差異は、種々の出発サンプル間のＭＲＰ−８ ｍＲＮＡ発現の差異を示すものであった。予期した通り、ＭＲＰ−８増幅シグナルが、未処理の対照標準と比較して、ＡＧＮ１９１１８３（１０−７Ｍ）で処置された培養物において阻害された。培養された角化細胞のＡＧＮ１９３１０９(１０−６Ｍ)処置もまた、染色された増殖生成物の低い強度から判断して、ＭＲＰ−８の発現を抑制した。
【０３９１】
下記実施例に例示されるように、ＡＧＮ１９３１０９は、角化細胞における第二マーカー遺伝子の発現も阻害した。Nagpalら[J.Biol.Chem. 270:923 (1995)]は、ストロメリジン(stromelysin) ｍＲＮＡ発現が、培養された新生ヒト包皮角化細胞において、ＲＡＲ特異性アゴニストによって下方制御されることを記載している。Nicholsonら[EMBO J. 9:4443 (1990)]は、ＡＰ−１プロモーター成分が、ストロメリジン−１遺伝子の、レチノイド依存性の負の制御において、役割を担うことを記載している。従って、ＡＧＮ１９３１０９がこの遺伝子の発現を変化させることができるかどうかを判定することは興味あることであった。
【０３９２】
実施例２１は、ＡＧＮ１９３１０９が、外因的に添加されるレチノイドアゴニストの不存在下に、ストロメリジン−１遺伝子の発現を阻害することを示すために使用される方法を記載している。
【０３９３】
実施例２１  ＡＧＮ１９３１０９は培養角化細胞におけるストロメリジン−１の発現を阻害する
一次包皮角化細胞を、模擬処置(mock treated)するか、あるいはＲＡＲアゴニストＡＧＮ１９１１８３（１０−７Ｍ）またはＡＧＮ１９３１０９（１０−６Ｍ）を用いて、２４時間処置した。模擬処置された、およびレチノイド処置された、角化細胞から調製された合計ＲＮＡを逆転写し、得られるｃＤＮＡを、β−アクチンまたはストロメリジン−１オリゴプライマーを用いて、Nagpalら[J.Biol.Chem. 270:923 (1995)]の記載と同様にＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅反応からのサンプル（１０μl）を、ＰＣＲ増幅の１８サイクルから開始して、３サイクル毎に、採取した。サンプルを２％アガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色後に検出した。
【０３９４】
これらの方法の結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、外因的に添加されるレチノイドアゴニストの不存在下に、ストロメリジン−１遺伝子の発現を阻害することを示した。特に、β−アクチン増殖生成物を表すエチジウム染色バンドは、ＰＣＲの１８サイクル後に、アガロースゲル中に容易に検出された。全てのバンド強度が、増殖反応の追加サイクルと共に増加するが、一方、ＡＧＮ１９１１８３処置細胞のサンプルにおいては幾分弱かった。このことは、ＡＧＮ１９１１８３で処置した細胞に対応する出発サンプル中に、わずかに少ない量のＲＮＡが存在したことを示した。この結果はまた、ＰＣＲ増殖の３３サイクルにおいて開始して、ストロメリジン−１ ｍＲＮＡが模擬処置された角化細胞において検出されたことも示す。予期したとおり、模擬処置サンプルから誘導されるサンプルと比較した場合の、より弱いバンド強度から判断して、ストロメリジン−１ ｍＲＮＡ発現が、ＡＧＮ１９１１８３（１０−７Ｍ）処置の後に阻害された。β−アクチン増殖生成物の強度に標準化させた、ＭＲＰ−８の発現の測定において得られる結果と一致したときに、角化細胞のＡＧＮ１９３１０９（１０−６Ｍ）処置が、ストロメリジン−１ ｍＲＮＡレベルの下方制御を生じた。事実、ＡＧＮ１９３１０９処置によって刺激された下方制御は、ＲＡＲアゴニストＡＮＧ１９１１８３を用いた角化細胞の処置によって生じた下方制御と識別できなかった。
【０３９５】
本明細書に開示するように、ＡＧＮ１９３１０９は、同時投与ステロイド上科アゴニストの活性を調節することに関して、３つの可能な効力のいずれかを有することができる。最初に、ＡＧＮ１９３１０９が効力を有さない。第二に、ＡＧＮ１９３１０９がアゴニストの効力に拮抗し、それによって、アゴニストの活性の減少に導く。最後に、ＡＧＮ１９３１０９がアゴニストの活性を強化し、それによって、アゴニストによって生じる測定効果の刺激に導く。
【０３９６】
ＡＧＮ１９３１０９によって調節し得る活性を有する化合物は、レチノイドレセプターアゴニスト、およびステロイドレセプター上科の他の構成員に結合するアゴニストを包含する。アゴニストの後者の種類は、ビタミンＤレセプター、グルココルチコイドレセプター、および甲状腺ホルモンレセプターアゴニストを包含する。ペルオキシソームプロリフェレーター(proliferator)活性化レセプター、エストロゲンレセプター、および現在未知のリガンドを有するオーハン(orphan)レセプターも、ＡＧＮ１９３１０９によって強化される。ステロイド上科アゴニストがＲＡＲアゴニストである場合には、ＡＧＮ１９３１０９は、そのアゴニストに拮抗するか、または強化するかのいずれかである。ＡＧＮ１９３１０９と組み合わせて使用されるアゴニストが、ＲＡＲ以外の核レセプターに結合し得る化合物である場合には、ＡＧＮ１９３１０９の同時投与は効力を有さないか、または、その系をアゴニストに感受性にし、それによりアゴニストの活性が強化される。
【０３９７】
特定の系において、ＡＧＮ１９３１０９が３つの可能な活性のうちのどれを有するかを判断するための、一般的な例示的方法を下記に記載する。この記載は、ステロイドレセプター上科アゴニストとＡＧＮ１９３１０９との同時投与に関する可能な結果の各々を例示する。核レセプターアゴニストの活性を調節するＡＧＮ１９３１０９の能力を評価するのに有用な生物学的系は、確立された組織培養細胞系、ウイルス性形質変換細胞系、インビトロ一次培養細胞、および生体を使用するインビボ研究を包含するが、それらに限定されない。そのような系におけるＡＧＮ１９３１０９の生物学的効力の測定は、種々の生物学的終了点(biological endpoint)のいずれかを判定することを含む。これらの終了点は、以下のものを包含する：細胞増殖の分析、プログラムされた細胞死(アポトーシス)の分析、遺伝子発現アッセイによる細胞の分化状態の分析、ヌードマウスにおける細胞の腫瘍形成能力の分析、およびリポーター遺伝子構築物の一時的または安定導入後の遺伝子発現の分析。
【０３９８】
例示のために、ｍＲＮＡ "Ｘ"と呼ぶｍＲＮＡ種が、器官"Ｚ"から単離される一次培養"Ｙ"細胞中の遺伝子"Ｘ"から発現される。遺伝子"Ｘ"の発現を含む、いくつかの"Ｙ"細胞遺伝子マーカーが維持される標準培養条件下において、レチノイドアゴニストの添加が、豊富な"Ｘ"ｍＲＮＡの減少を導く。遺伝子Ｘの発現の分析は、細胞ｍＲＮＡの単離、ポリメラーゼ連鎖反応による豊富なＸ ｍＲＮＡレベルの測定、リボヌクレアーゼ保護またはＲＮＡブロット法、例えばノーザン分析によって、評価することができる。器官Ｚからの単離後、一次Ｙ細胞を適切な増殖培地で培養する。次に一次培養物を、細胞集団の拡大のために、組織培養プレートで培養する。この工程は、４つのサンプルグループに細胞を分離するのを容易にし、それによって種々の投与量のレチノイドアゴニストおよびＡＧＮ１９３１０９を加えることができる。第一グループは標準対照であり、ビヒクルのみを添加する。第二グループは、１０−１１〜１０−６Ｍの範囲の最終濃度を与えるのに充分な量で、エタノール中のＲＡＲアゴニスト レチノイン酸を与える。最低用量は、系の感受性に依存して経験的に決める必要がある。そのような決定は、当業者にとって日常実験の範囲に含まれる。第三グループは、グループ２の細胞の処置に使用したのと同様の投与量の核レセプターアゴニスト、および一定投与量のＡＧＮ１９３１０９の両方を投与する。グループ３の細胞の処置に使用されるＡＧＮ１９３１０９の投与量も経験的に決定する必要があるが、ＲＡＲ亜類型に関するＡＧＮ１９３１０９の親和定数(Ｋd)に近似している(即ち、少なくとも１０−８Ｍ)。第四グループは、グループ３のアゴニスト同時投与に使用される用量を最小限含む投与量でＡＧＮ１９３１０９を与える。 この投与計画に代わるものは、グループ２で指定したように、前記の例に記載されたレチノイドアゴニストに代わってＡＧＮ１９３１０９を用い、そして、グループ３および４に指定したように、ＡＧＮ１９３１０９の代わりに一定投与量のレチノイドアゴニストを用いる。適切なインキュベート期間の後、アゴニスト活性の指標として測定される生物学的終了点の決定に適した方法で、細胞を採取する。
【０３９９】
例えば、遺伝子発現のレチノイン酸依存性制御に関するＡＧＮ１９３１０９の効果の分析は、前記の４つのプロトコールの各々に従って処置される細胞から採取されるｍＲＮＡプールにおけるｍＲＮＡ種の量の比較を含む。対照標準細胞から誘導されるＲＮＡは、Ｘ ｍＲＮＡの基線発現を判定するのに使用され、無抑制に対応する条件を表す。このレベルと、レチノイン酸で処置した細胞から誘導されるｍＲＮＡプールにおいて測定されるレベルとの比較は、遺伝子発現におけるこのアゴニストの効力の判定を可能にする。レチノイン酸処置から生じる特異的ｍＲＮＡの抑制の数量化したレベルを次に、ＡＧＮ１９３１０９単独、またはレチノイン酸と組み合わせたＡＧＮ１９３１０９のどちらかを用いて同時に処置した細胞からのｍＲＮＡの量と比較することができる。この一般化した例は、レチノイドアゴニストによって抑制される遺伝子の発現における同時投与ＡＧＮ１９３１０９の効力の分析を例示し、一方で、この例は、レチノイドアゴニストによって誘起される遺伝子に対する同時投与ＡＧＮ１９３１０９の効力の分析も記載している。ＡＧＮ１９３１０９が、アゴニストとして、ネガティブホルモンとして、挙動するか、または特定の系において効力を有さないかどうかを判定するための重要な特徴は、ＡＧＮ１９３１０９の存在および不存在下の、効力の大きさの量的比較を含む。
【０４００】
ＡＧＮ１９３１０９が同時投与アゴニストの活性を強化させる例は、レチノイン酸とのＡＧＮ１９３１０９の同時処置が、レチノイン酸のみで処置した細胞において測定されるレベルと比較して、より強く抑制されているＸ ｍＲＮＡ発現レベルを生じた場合である。特に、Ｙ軸にプロットされる生物学的効力（即ち、Ｘ ｍＲＮＡ量の抑制）対Ｘ軸上のアゴニストの投与量（対数尺度）の、用量応答曲線の比較が、ＡＧＮ１９３１０９同時処置の存在または不存在下のＸ ｍＲＮＡ量のアゴニスト媒介抑制の比較を可能にする。アゴニストに対する生物学的応答を感受性にし、それによってアゴニストの活性を強化させるＡＧＮ１９３１０９の能力が、用量応答曲線における左方向のシフトによって示される。特に、ＡＧＮ１９３１０９の存在下において、アゴニストのみを用いて得られるのと同じ生物学的効力を得るために、より少ないアゴニストが必要とされる。
【０４０１】
同時投与アゴニストの拮抗作用を媒介するＡＧＮ１９３１０９の例は、レチノイン酸とのＡＧＮ１９３１０９の同時処置が、レチノイン酸のみで処置した細胞において測定されるレベルと比較して、より少なく抑制されているＸ ｍＲＮＡ発現レベルを生じた場合である。ＡＧＮ１９３１０９の存在または不存在下における、Ｘ ｍＲＮＡ発現対アゴニストの対数投与量の用量応答曲線の比較が、用量応答曲線における右へのシフトを説明する。特に、ＡＧＮ１９３１０９の存在下において、アゴニストのみでの単一剤処置で得られるのと同じ生物学的効力を得るために、より多くのアゴニストが必要である。
【０４０２】
ＡＧＮ１９３１０９が拮抗作用または効力強化のいずれかを媒介する前記の例は、レチノイドアゴニストを用いるＡＧＮ１９３１０９の同時投与に関する実験結果を記載している。しかし、ＡＧＮ１９３１０９と共に同時投与されるアゴニストが、ＲＡＲ以外のステロイドレセプター上科の構成員を結合および活性化することができるアゴニストである場合、アゴニストに拮抗する代わりに、ＡＧＮ１９３１０９がアゴニストの活性に効力を有さないということが可能になる。そのようなアゴニストを用いるＡＧＮ１９３１０９の同時処置が、アゴニストのみで処置された細胞において測定されるレベルと等しいｍＲＮＡ発現のレベルを生じる場合、ＲＡＲ：ＮＣＰ結合の促進によってＮＣＰの利用性に影響を及ぼすＡＧＮ１９３１０９の能力が、この系においては示されない。これは、ＡＧＮ１９３１０９が同時投与アゴニストに対して効力を有さない例である。
【０４０３】
拮抗作用の例
レチノイドアゴニストと共に同時投与されたＡＧＮ１９３１０９の効果を測定するための、前記の一般化された例に記載されている方法が、実施例７に記載の方法によって例示される。３つのレチノイン酸レセプターの１つ、およびレチノイドアゴニスト誘起性ＭＲＥｐ−Lucリポーター構築物を用いて同時トランスフェクションしたＣＶ−１細胞に、エタノール(対照標準、グループ１)、最終濃度１０−９〜１０−６ＭのＡＧＮ１９３１０９(グループ２)、１０−８Ｍのレチノイン酸と共に同時投与した最終濃度１０−９〜１０−６のＡＧＮ１９３１０９、またはレチノイン酸(１０−８Ｍ、グループ４)のいずれかを投与した。グループ１のルシフェラーゼ活性とグループ４のルシフェラーゼ活性との比較によって、添加ＡＧＮ１９３１０９の不存在下における、ルシフェラーゼリポーター遺伝子のレチノイドアゴニスト誘起発現のレベルの決定が可能になった。グループ３の細胞におけるルシフェラーゼリポーター遺伝子発現と、グループ４の細胞において測定されるルシフェラーゼリポーター遺伝子発現との比較は、ＡＧＮ１９３０９が、この系においてレチノイドアゴニストのアンタゴニストとして作用することを示した。
【０４０４】
拮抗作用の例
ＥＣＥ−１６−１形質変換頸部上皮細胞におけるＥＧＦ−刺激細胞増殖のレチノイドアゴニスト媒介発現のアンタゴニストとして、ＡＧＮ１９３１０９が機能することを、実施例１７において判定するために、レチノイドアゴニストと共に同時投与されるＡＧＮ１９３１０９の効力を判定する一般的な例において記載した方法を同様に使用した。この方法において、ＥＣＥ−１６−１細胞の処置は、ＥＧＦのみで処置された対照標準サンプル(グループ１)、最終濃度１０−６ＭのＥＧＦとＡＧＮ１９３１０９の組み合わせを用いて処置されたサンプル(グループ２)、１０−８ＭのレチノイドアゴニストＡＧＮ１９１１８３の単一投与と同時投与された最終濃度１０−１０〜１０−６ＭのＥＧＦとＡＧＮ１９３１０９の組み合わせを用いて処置されたサンプル(グループ３)、および１０−８ＭのＥＧＦとＡＧＮ１９１１８３の組み合わせを用いて処置されたサンプル(グループ４)を含む。処置の３日後、細胞増殖速度を求めた。ＥＧＦによって細胞が刺激されて増殖したという判定は、ＥＧＦを含有しない規定培地に細胞が曝露される追加の制御処置が含まれたので可能であった。グループ１の細胞の数とグループ４の細胞の数との比較によって、ＲＡＲアゴニストＡＧＮ１９１１８３が、ＥＣＥ−１６−１細胞のＥＧＦ刺激増殖を抑制したという判定を可能にした。グループ３とグループ４との比較は、この系において、ＡＧＮ１９３１０９がＲＡＲアゴニストの活性に拮抗することを示した。
【０４０５】
効力強化の例
１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３誘起性ＭＴＶ−ＶＤＲＥ−Ｌｕｃリポーター遺伝子を用いてトランスフェクションしたＨela細胞における、各レセプターアゴニストの活性を、ＡＧＮ１９３１０９が強化させたことを判定するために、レチノイドアゴニストと共に同時投与されたＡＧＮ１９３１０９の効力を判定するための一般的な例において記載した方法を、実施例１４においても使用した。トランスフェクションされた細胞の処置は、ビヒクルのみ(対照標準、グループ１)、最終濃度１０−１０〜１０−７Ｍの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（グループ２）、最終濃度１０−８Ｍまたは１０−７ＭのＡＧＮ１９３１０９と共に同時投与される最終濃度１０−１０〜１０−７Ｍの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（グループ３）、および最終濃度１０−８Ｍまたは１０−７Ｍの単一剤処置としてのＡＧＮ１９３１０９（グループ４）を含む。グループ１（対照標準）細胞において測定されたルシフェラーゼ活性と、グループ２細胞のルシフェラーゼ活性のと比較によって、１,２５−ジヒドロキシビタンＤ３刺激ルシフェラーゼ活性が、用量依存性であるという判定を可能にした。グループ４(ＡＧＮ１９３１０９単一剤処置)の細胞におけるルシフェラーゼ活性と、グループ３(ＡＧＮ１９３１０９同時投与)の細胞において測定されたルシフェラーゼ活性との比較も同様に、所定濃度のＡＧＮ１９３１０９の存在下の、用量依存性１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３刺激ルシフェラーゼ活性の判定を可能にした。この例において、ゼロの値は、ＡＧＮ１９３１０９のみで処置された細胞（グループ４）におけるルシフェラーゼ活性を表した。そのような投与計画は、３つの１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３用量応答曲線の比較を可能にした。ＡＧＮ１９３１０９の不存在下の１,２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の用量応答曲線と、ＡＧＮ１９３１０９（１０−８または１０−７Ｍ）の同時供与を表す曲線との比較は、半最大応答における左方向のシフトによって明らかであるように、アゴニスト活性の強化を示した。
【０４０６】
効力強化の例
ＡＧＮ１９２１０９がヒト網膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelium cells)の一次培養物において、ＲＡＲアゴニストの抗増殖活性を強化したことを、実施例１９において判定するために、レチノイドアゴニストと共に同時投与されるＡＧＮ１９３１０９の効力を判定するための一般例に記載された方法を、さらに使用した。細胞の処置は下記のものを含む：エタノールビヒクルのみ(グループ１)、最終濃度１０−１０〜１０−６Ｍのレチノイン酸(グループ２)、１０−６ＭのＡＧＮ１９３１０９と共に同時投与される最終濃度１０−１０〜１０−６Ｍのレチノイン酸(グループ３)、および最終濃度１０−１０〜１０−６ＭのＡＧＮ１９３１０９のみ(グループ４)。グループ１および２の細胞を用いて得られたアッセイ結果の比較は、レチノイン酸による、これらの細胞の増殖の用量依存性阻害の判定を可能にした。同様に、グループ３の細胞を用いて得られる結果と、グループ１の細胞を用いて得られる結果との比較は、同時投与ＡＧＮ１９３１０９の存在下の、レチノイン酸による、これらの細胞の増殖の用量依存性阻害の判定を、可能にした。グループ４は、ＡＧＮ１９３１０９が、単一処置剤として使用される場合には、これらの細胞の増殖速度を実質的に変化させることができないことを示した。グループ２および３において生じる細胞増殖のレチノイン酸媒介抑制の用量応答曲線の比較は、ＡＧＮ１９３１０９が、一次ＲＰＥ細胞を、ＲＡＲアゴニストの抗増殖効力に対して感受性にし、それによってＲＡＲアゴニストの活性を強化させるという結論に対する根拠を与える。
【０４０７】
前記に示すように、Agarwalら[Cancer Res. 54:2108 (1994)]は、ＣaＳki細胞増殖が、ＨＰＶ不死化ＥＣＥ−１６−１細胞の増殖と異なって、レチノイドアゴニストの処置によって阻害されなかったことを記載している。本明細書に開示するように、ＣaＳki細胞増殖が、レチノイドアゴニストの不存在下に、ＡＧＮ１９３１０９によって阻害されることを我々は意外にも見い出した。下記の実施例は、インビボで、ＣaＳki細胞腫瘍の増殖を阻害するために、ＡＧＮ１９３１０９をどのように使用し得るかを示すものである。
【０４０８】
実施例２２  ＡＧＮ１９３１０９の投与後のヌードマウスにおけるＣaＳki細胞腫瘍増殖の阻害。
１ｘ１０６ＣaＳki細胞を、ヌードマウスの各々のパネルに注入する。当業者に既知の技術を用いて、腫瘍形成を評価する。注入後、マウスを任意に、対照標準グループと被験グループとに分ける。対照標準グループには偽薬を与える。被験グループには、ＡＧＮ１９３１０９を投与する。偽薬を投与される動物は、コーン油の胃内挿管を受ける。被験動物には、処置の期間中、毎日、コーン油中のＡＧＮ１９３１０９を２０μMol/kgを投与する。腫瘍体積を、目盛付きカリパスを用いて測定する(立方ミリメートル)。腫瘍体積を、時間の関数としてプロットする。ＡＧＮ１９３１０９を投与されたマウスは、試験期間中の腫瘍寸法および数から判断して、対照標準マウスにおける腫瘍と比較して、増殖速度が有意に減少した腫瘍を示す。この結果は、レチノイドアゴニストの投与を包含する治療に耐性である進行頸癌の増殖を、ＡＧＮ１９３１０９が阻害することをインビボで立証するものである。
【０４０９】
前記に示すように、ＣaＳki細胞は、レチノイドアゴニスト治療に非反応性の頸癌のモデルである。しかし、レチノイドアゴニストを用いる処置の不存在下において、ＣaＳki細胞増殖がＡＧＮ１９３１０９によって阻害されたことを、我々は本明細書において開示した。ＣaＳki細胞の増殖を阻害するＡＧＮ１９３１０９の能力は、レチノイドアゴニスト治療に非感受性である頸癌を治療的に処置するために、ＡＧＮ１９３１０９を使用し得ることを示唆した。下記実施例は、頸癌の治療におけるＡＧＮ１９３１０９の治療的可能性を評価するために使用し得る１つの方法を例示するものである。
【０４１０】
実施例２３  頸癌患者における、ＡＧＮ１９３１０９の治療的可能性の評価
初めに、進行頸癌の患者を同定する。当業者に既知の方法に従って、頸部生検を得る。外植腫瘍からの細胞を、標準法に従って、組織培養で増殖させて、３つのサンプルグループに分割するのに充分な細胞数を得る。Agarwalら[Cancer Res. 54:2108 (1994)]の記載の培養条件を、この目的に使用する。第一グループは、対照標準として保存し、ビヒクル(エタノール)のみを与える。第二グループを、１０−１０〜１０−６Ｍの濃度のＲＡＲアゴニストレチノイン酸で処置する。第三グループを、１０−１０〜１０−６の範囲の投与量のＡＧＮ１９３１０９で処置する。細胞に新しい増殖培地を毎日与え、各サンプルグループに適切なように、前記のレチノイドを与える。３日後に、電気セルカウンターを用いて、細胞をカウントする。対照標準培養物における細胞の数と、レチノイン酸処置培養物における細胞数との比較は、ＲＡＲアゴニストが、培養された頸癌細胞の増殖速度を実質的に阻害しないことを示す。これと対照的に、ＡＧＮ１９３１０９で処置した細胞は、対照標準グループにおける細胞数と比較した場合、細胞数の用量依存性の減少を示す。ＡＧＮ１９３１０９処置が、培養頸癌細胞の増殖を阻害するこの結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、転移疾患を有する頸癌患者を治療するのに有効な治療薬であることを示している。
【０４１１】
一次腫瘍の除去のための手術を受け、転移疾患を現在有している頸癌患者を、この適応症におけるＡＧＮ１９３１０９の治療的有益性を立証しようとする無作為の臨床試験に加える。患者を２つのグループに分ける。第一のグループは、対照標準グループであり、一方、第二グループの構成員は、ＡＧＮ１９３１０９で処置される。ＡＧＮ１９３１０９を、医薬的に許容されるビヒクルと組み合わせて、当業者に既知の方法に全て従って、全身投与に適した組成物を製造する。対照標準グループには、偽薬製剤を投与し、被験グループには、ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンを含有する製剤を投与する。患者への投与は、最大許容用量において行い、３ヶ月〜１年の期間中、１日おきに行った。試験の結果を、経時における無疾患の生存者の計数によって、定量化した。ＡＧＮ１９３１０９を投与された患者は、無疾患生存において有意な増加を示し、この中には、転移疾患の完全な鎮静を示す不均衡数の患者を含む。この結果は、レチノイン酸のようなレチノイドアゴニストの抗増殖効果に非反応性である頸癌のインビボ治療に関して、ＡＧＮ１９３１０９が治療的有効性を有することを示す。
【０４１２】
前記のように、ＡＧＮ１９３１０９は、ヒト網膜色素上皮細胞の一次培養物において、ＲＡＲアゴニストの抗増殖活性を強化させた。従って、同じ治療的終了点を得るために、より少ない量のＲＡＲアゴニストが必要とされるので、ＡＧＮ１９３１０９とＲＡＲアゴニストとのインビボ同時投与が、アゴニストの治療的指数を増加させると考えることは合理的なことである。さらに、ＡＧＮ１９３１０９が、ヒト網膜色素上皮細胞の一次培養物を、グルココルチコイドおよび甲状腺ホルモンレセプターアゴニストの抗増殖効果に対して感受性にすることが立証された。ＡＧＮ１９３１０９と、ＲＡＲアゴニスト(１３−シス レチノイン酸)または甲状腺ホルモンレセプターアゴニストとのそれぞれの同時投与によって得られる増加した治療的指数を示すための２つの別の試験に、下記のＰＶＲのウサギモデルを使用する。注目すべきことに、インビボで一次ＲＰＥ細胞の増殖を阻害するレチノイドアゴニストが、インビボにおいて網膜剥離の頻度をも阻害することを示すために、Senら[Arch.Opthalmol. 106:1291 (1988)]に記載されている網膜再剥離のウサギモデルが使用されている[Araizら、Invest.Opthalmol. 34:522 (1993)]。従って、網膜剥離の防止における治療としての、それらの使用に関して、レチノイドアゴニストのインビトロ活性とインビボ活性との間の相関関係が、既に確立されている。下記実施例は、網膜剥離を防止する治療用途において、ＡＧＮ１９３１０９をどのように使用し得るかを示すものである。
【０４１３】
実施例２４  増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）の治療における、ステロイド上科レセプターアゴニストの治療的可能性を増加させるためのＡＧＮ１９３１０９の使用
第一試験においては、Senら[Arch.Opthalmol. 106:1291 (1988)]に記載されている方法に従って、ウサギの目の硝子体腔に、ヒトＲＰＥ細胞を注射する。硝子体内注射の後、ウサギを５つのグループに分ける。第一グループ（対照標準）には、硝子体内注射によってビヒクルのみを与える。第二グループには、単一治療剤としてのレチノイン酸（１００μg）を硝子体内注射によって与える。第三グループには、単一治療剤としてのＡＧＮ１９３１０９（１００μg）を硝子体内注射によって与える。第四グループには、グループ２に投与した量の１/１０の投与量で、ＲＡＲアゴニスト（レチノイン酸）を、硝子体内注射によって与える。第五グループには、ＡＧＮ１９３１０９（１００μg）とレチノイン酸（１０μg）との組み合わせを、硝子体内注射によって与える。動物は、ヒトＲＰＥ細胞の硝子体内注射の１日後に、適切な治療の、単一の硝子体内注射を受ける。７、１４、および２８日目に倒像検眼法によってウサギを検査し、牽引網膜剥離（tractional retinal detachment）の頻度および程度を評価した。１００μgのレチノイン酸を注射したグループのウサギは、対照標準ウサギ、あるいはＡＧＮ１９３１０９またはレチノイン酸（１０μg）のみのどちらかを投与されたウサギと比較して、網膜剥離の有意に減少した頻度および程度を示す。ＡＧＮ１９３１０９とレチノイン酸（１０μg）の組み合わせを投与されたグループのウサギは、対照標準、ＡＧＮ１９３１０９、またはレチノイン酸（１０μg）のいずれかのグループのウサギと比較して、網膜剥離の有意に減少した頻度および程度を示す。この結果は、ＰＶＲのインビボモデルにおいて、ＡＧＮ１９３１０９が、ＲＡＲアゴニストレチノイン酸の治療指数を向上させることを示す。
【０４１４】
第二試験においては、最初に、ウサギに、眼の硝子体腔へのヒトＲＰＥ細胞の注射を行い、次に４つのグループに分ける。第一グループ（対照標準）には、硝子体内注射によって、ビヒクルのみを与える。第二グループには、単一剤治療としての甲状腺ホルモン（１００μg）を硝子体内注射によって与える。第三グループには、単一剤治療としてのＡＧＮ１９３１０９（１００μg）を硝子体内注射によって与える。第四グループには、ＡＧＮ１９３１０９（１００μg）と甲状腺ホルモン（１００μg）との組み合わせを投与する。７、１４、および２８日目に倒像検眼法によってウサギを検査し、牽引網膜剥離の頻度および程度を評価した。４つのグループの網膜剥離の頻度および程度の比較は、ＡＧＮ１９３１０９または甲状腺ホルモンのどちらかによる単一剤治療が、対照標準ウサギと比較した場合に、網膜剥離を阻害しないことを示す。これと対照的に、ＡＧＮ１９３１０９と甲状腺ホルモンとの組み合わせを投与されたウサギのグループは、有意に減少した、網膜剥離の発生および程度を示す。この結果は、ＡＧＮ１９３１０９が、ＰＶＲのインビボモデルにおいて、甲状腺ホルモンの治療指数を向上させることを示す。
【０４１５】
下記実施例は、網膜再付着手術後に、ヒトの患者を治療するために使用されるＲＡＲアゴニストの治療指数を高めるために、ＡＧＮ１９３１０９をどのように使用し得るかを例示する。
【０４１６】
実施例２５  ＲＡＲアゴニスト １３−シス レチノイン酸の治療指数の増加
ＰＶＲから生じる網膜剥離を有する成人ボランティアの集団を最初に同定する。個体は、この分野において標準的である方法を用いて、剥離の外科的修復を受ける。次に、患者を５つのグループに分ける。対照標準グループは、網膜剥離の外科的修復を受ける患者から成り、レチノイド化合物を投与しない。第二グループは、４０mgの経口１３−シス レチノイン酸を、手術後４週間、１日に２回投与する。第三グループは、４０mgの経口ＡＧＮ１０３１０９を、手術後４週間、１日に２回投与する。第四グループは、４mgの経口１３−シス レチノイン酸と組み合わせた４０mgの経口ＡＧＮ１９３１０９を、手術後４週間、１日に２回投与する。治療プロトコールおよび薬効評価を、本質的に、Fekratら[Ophthalmology 102:412 (1995)]の記載のように行う。
【０４１７】
５グループ全ての術後患者における網膜再剥離の頻度および程度を、当業者に既知の眼科検査によって９ヶ月間監視する。４０mgの経口１３−シス レチノイン酸を投与された患者は、対照標準患者、４mgの経口１３−シス レチノイン酸を１日に２回、または４０mgの経口ＡＧＮ１９３１０９を１日に２回、投与された患者と比較した場合に、有意に減少した網膜再剥離の発生を示す。術後４週間、１日に２回の、４０mg経口ＡＧＮ１９３１０９と４mg経口１３−シス レチノイン酸との組み合わせを投与される患者グループの検査は、この患者グループの治療結果が、術後４週間、１日に２回の、４０mg経口１３−シス レチノイン酸を投与される患者と等しい、またはより優れていることを示す。この結果は、ＰＶＲ患者における網膜再剥離の頻度および程度が減少することによって、ＡＧＮ１９３１０９ネガティブホルモンが、ＲＡＲアゴニストの治療指数を向上させることを示す。
【０４１８】
核レセプターネガティブホルモンを同定する一般化アッセイ
ＲＡＲ核レセプターの基礎転写活性を抑制することができるネガティブホルモンとして、ＡＧＮ１９３１０９が機能し得ることを、我々は前記に示した。さらに我々は、単純なアンタゴニストであるＲＡＲリガンドを、ネガティブホルモン活性を有するものから識別するために、ＥＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃルシフェラーゼリポータープラスミドおよびＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６リセプター発現プラスミドで同時トランスフェクションしたＣＶ−１細胞を用いるアッセイを記載した。
【０４１９】
我々は、ＲＡＲとＮＣＰとの間の相互作用の増加を促進することによって、ＲＡＲネガティブホルモンが、ＲＡＲ媒介転写活性の抑制を媒介するとの結論に達した。さらに、核リセプターのステロイド上科の構成員間のＮＣＰの相互共有と一致する方法で、ＡＧＮ１９３１０９が、他の核レセプターのアゴニストの効果を強化することができることを我々は示した。このように、これらの非ＲＡＲ核レセプターにおいて、ネガティブホルモン活性を有する化合物を同定するために、リガンドをデザインし、スクリーニングすることができる。
【０４２０】
ＥＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃルシフェラーゼリポータープラスミドおよびＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６リセプター発現プラスミドで同時トランスフェクションしたＣＶ−１細胞の使用に基づく、ＲＡＲネガティブホルモンスクリーニングの１つの方法を、一般に、ＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６プラスミドのＲＡＲ−γ成分が、ペルオキシソームプロリフェレーター（proliferator）活性化レセプター（ＰＰＡＲ）、ビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモンレセプター（Ｔ３Ｒ）、またはＲＸＲとヘテロ二量体化し得る他のステロイド上科の核レセプターのそれに変換するように適合させることができる。そのようなプラスミドで同時トランスフェクションされたＣＶ−１細胞は、ルシフェラーゼ活性の高い基礎レベルを発現させる。ＲＡＲ−γ成分に置き換えられるレセプターの、リガンド結合ドメインを結合し得るリガンドは、ルシフェラーゼ活性を抑制するそれらの能力を測定することによって、ネガティブホルモン活性に関して容易にスクリーニングすることができる。
【０４２１】
ＲＸＲとヘテロ二量体化しないステロイド上科核レセプター（例えば、グルココルチコイドおよびエストロゲンレセプター）に関しては、ＧＲ−ＶＰ−１６またはＥＲ−ＶＰ−１６レセプター、および異質プロモーター成分に融合した適切なグルココルチコイドまたはエストロゲン応答性成分およびルシフェラーゼまたは他のリポーター遺伝子から成るルシフェラーゼリポータープラスミドを用いて、同様の最終結果が得られる。一般化されたネガティブホルモンスクリーニングアッセイの本質的な特徴は、それのために、逆アゴニストがスクリーニングされる特定の核レセプターのリガンド結合ドメインを少なくとも含むことであり、および、核レセプターリガンド結合ドメインをリポーター遺伝子のプロモーターに局在させる方法である。このことは、リセプターの天然のＤＮＡ結合部位を用いて、または、異質ＤＮＡ結合ドメインを有するキメラリセプターの構成、および異質ＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ制御要素の制御下にあるリポーター遺伝子の対応する使用によって、達成することができる。好ましい実施態様においては、逆アゴニストがそれのためにスクリーニングされる核リセプターを発現するプラスミドが、この核レセプターを、ＨＳＶ ＶＰ-１６活性化ドメインのような、構成性の活性化ドメインを含有する融合タンパク質として発現して、高い基礎活性を与える。この高い基礎活性は、効果的にアッセイ感度を増加させ、それによって、添加核リセプターアゴニストの不存在下に基礎転写活性を抑制する核リセプターリガンドの分析を可能にする。
【０４２２】
下記実施例は、甲状腺ホルモンレセプターにおいて、ネガティブホルモン活性を有する化合物に関してスクリーニングするために使用し得る１つの方法を例示する。
【０４２３】
実施例２６  甲状腺ホルモンレセプターネガティブホルモンを同定する方法
ＣＶ−１細胞を、ルシフェラーゼリポータープラスミドＥＲＥ−ｔｋ−ＬｕｃおよびプラスミドＥＲ−ＲＸＲ−αおよびＴ３Ｒ−ＶＰ−１６を用いて、同時トランスフェクションする。ＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６のＲＡＲ−γ成分が、甲状腺ホルモンレセプターｃＤＮＡによって置換されていることは除いて、Ｔ３Ｒ−ＶＰ−１６はプラスミドＲＡＲ−γ−ＶＰ−１６と同一である。このように、Ｔ３Ｒ−ＶＰ−１６は、甲状腺ホルモンレセプターのＮ末端を有するフレーム中に、ＨＳＶ ＶＰ−１６の活性化ドメインを含有する融合タンパク質を発現する。標準的なトランスフェクションおよび細胞培養方法を、この目的に使用する。トランスフェクション後に、細胞を濯ぎ、活性炭で抽出した１０％ウシ胎児血清を含有する増殖培地を与えた。細胞を、ビヒクルのみ（エタノール）、甲状腺ホルモン（１０−９〜１０−１０Ｍ）、または化合物ＴＲ−１（１０−９〜１０−６Ｍ）を用いて処置する。ＴＲ−１は、競合結合試験において、甲状腺ホルモンレセプターに対して強い親和性を示すが、甲状腺ホルモン反応性リポーター遺伝子および甲状腺ホルモンリセプター発現プラスミドを使用する一時的な同時トランスフェクショントランス活性化アッセイにおいて、トランスフェクションされた甲状腺ホルモンレセプターを活性化しない、合成甲状腺ホルモンレセプターリガンドである。さらに、ＴＲ−１は、甲状腺ホルモン媒介トランス活性化に拮抗することができ、従って、甲状腺リセプターアンタゴニストである。
【０４２４】
ＥＲＥ−ｔｋ−Ｌｕｃ、ＥＲ−ＲＸＲαおよびＴ３Ｒ−ＶＰ−１６を用いてトランスフェクションしたＣＶ−１細胞からのルシフェラーゼ活性の分析は、ビヒクル処置細胞におけるルシフェラーゼリポーター活性の高い基礎レベルを示す。甲状腺ホルモンで処置した細胞は、投与量に依存して、ルシフェラーゼ活性の僅かな増加を示す。ＴＲ−１で処置した細胞は、ルシフェラーゼ活性において、用量依存性の減少を示す。このことは、おそらくはＮＣＰと甲状腺ホルモンリセプターとの増加した相互作用によって、ＴＲ−１が甲状腺リセプター逆アゴニスト活性を示すことを示すものである。
【０４２５】
ヒト一次網膜色素上皮細胞の増殖速度が、ＲＡＲアゴニストでの処置によって抑制される。この観察の治療的価値が、網膜再付着手術後の術後使用レチノイド治療において例示されている。ＡＧＮ１９３１０９ＲＡＲネガティブホルモンが、一次ＲＰＥ細胞を、同時投与法におけるＡＴＲＡおよび１３−シス レチノイン酸の抗増殖効果に対して感受性にし得ることを、我々は前記に示した。さらに、ＡＧＮ１９３１０９はまた、ＲＰＥ細胞を、他の核レセプターアゴニストの抗増殖効果に対しても感受性にすることが示された。特に、ＡＧＮ１９３１０９は、ＲＰＥ細胞を、グルココルチコイドアゴニスト、デキサメタソン、および甲状腺ホルモンアゴニスト３,３',５−トリヨードチロニン、Ｔ３の抗増殖効果に対して感受性にした。このデータは、核レセプター種の構成員の間で共有されるＮＣＰの利用性をＡＧＮ１９３１０９が調節した我々のモデルと一致した。同様に、甲状腺ホルモンリセプター逆アゴニストＴＲ−１を用いるＲＰＥ細胞の処置は、共有されたＮＣＰの利用性を変化させ、それによって、ＲＡＲアゴニスト１３−シス レチノイン酸のような非甲状腺リセプターアゴニストを用いる同時投与が、単一処置剤としての１３−シス レチノイン酸と比較して、ＲＰＥ培養物への増加した抗増殖効果に導く。
【０４２６】
下記実施例は、一次ＲＰＥ細胞を、ＲＡＲアゴニストの抗増殖活性に対してより感受性にするために使用し得る１つの方法を例示する。注目すべきことに、この実施例は、いかにして、ネガティプホルモンとの同時投与によってＲＡＲアゴニストの活性を強化し得るかをさらに示す。
【０４２７】
実施例２７  ＴＲ−１甲状腺ホルモン逆アゴニストの同時投与によって、ＲＡＲアゴニストの抗増殖効果に対して、一次網膜色素上皮細胞を感受性にする
ヒト一次ＲＰＥ細胞を得、標準法に従って培養する。培養細胞を４つのグループに分け、下記のように処置する。グループ１には、ビヒクル(エタノール)のみを与える。グループ２は、１３−シス レチノイン酸で処置する。グループ３は、１０−１１〜１０−１Ｍの範囲の濃度の甲状腺ホルモン逆アゴニストＴＲ−１で処置する。グループ４は、１０−１１〜１０−６ＭＴＲ−１の範囲の濃度で、１３−シスレチノイン酸を用いて同時処置する。合計５日の処置中、２日毎に細胞に新たな増殖培地を与え、適切な化合物で再処置する。実験期間中の増殖速度を、電気細胞カウンターを用いて、培養物中の細胞数を測定することにより定量化した。
【０４２８】
ＴＲ−１処置細胞(グループ３)は、対照標準細胞(グループ１)と本質的に同じ細胞増殖速度を示し、培養物の測定増殖速度に対して、この逆アゴニストの影響はない。１３−シス レチノイン酸で処置した細胞(グループ２)は、細胞数において用量依存性の減少を示す。グループ４細胞(１３−シス ＲＡおよびＴＲ−１同時投与)の細胞増殖における用量依存性の減少と、グループ３において得られるそれとの比較は、グループ２細胞と比較したグループ４における、このＲＡＲアゴニストの用量応答曲線における左へのシフトによって判断されるように、ＲＰＥ培養物を１３−シス レチノイン酸の抗増殖効果に対して感受性にするＴＲ−１甲状腺ホルモンレセプター逆アゴニストの同時投与の能力を示す。
【０４２９】
配  列  表
(１)  一般的情報
(i)   特許出願人：  アラーガン
(ii)  発明の名称：  ネガティブホルモン活性および／または拮抗薬活性を有するレチノイド化合物の合成と使用
(iii) 配列の数：  ９
(iv)  連絡先：
(Ａ)  名宛人：Knobbe, Martens, Olson & Bear
(Ｂ)  通り：620 Newport Center Drive 16th Floor
(Ｃ)  市：Newport Beach
(Ｄ)  州：ＣＡ
(Ｅ)  国：アメリカ合衆国
(Ｆ)  ＺＩＰ：９２６６０
(v)   コンピューター解読書式：
(Ａ)  媒体型：ディスケット
(Ｂ)  コンピューター：ＩＢＭ互換性
(Ｃ)  オペレーティング・システム：ＤＯＳ
(Ｄ)  ソフトウエア：ＦastＳＥＱ、バージョン１.５
【０４３０】
(vi)  本出願のデータ：
(Ａ)  出願番号：
(Ｂ)  出願日：
(Ｃ)  分類：
(vii) 優先権主張出願のデータ：
(Ａ)  出願番号：０８／５２２,７７８
(Ｂ)  出願日：  １９９５年９月１日
(Ａ)  出願番号：０８／５２２,７７９
(Ｂ)  出願日：  １９９５年９月１日
(Ａ)  出願番号：０８／５４２,６４８
(Ｂ)  出願日：  １９９５年１０月１３日
(Ａ)  出願番号：０８／６１３,８６３
(Ｂ)  出願日：  １９９６年３月１１日
(viii)弁理士／代理人 情報：
(Ａ)  氏名：Ａltman, Ｄaniel Ｅ
(Ｂ)  登録番号：３４,１１５
(Ｃ)  参照／整理番号：ＡＬＲＧＮ．０５８Ａ
(ix)  電話連絡先情報：
(Ａ)  電話番号：７１４-７６０-０４０４
(Ｂ)  ファックス番号：７１４-７６０-９５０２
(Ｃ)  テレックス番号：
【０４３１】
（２）  配列番号１の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号１：
TCAGGTCACC AGGAGGTCAG A                                             21
【０４３２】
（２）  配列番号２の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１０１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号２：
AGAAGCTTAT GGAAGCAATT ATGAGTCAGT TTGCGGGTGA CTCTGCAAAT ACTGCCACTC   60
TATAAAAGTT GGGCTCAGAA AGGTGGACCT CGAGGATCCA G                      101
【０４３３】
（２）  配列番号３の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１０１塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号３：
CTGGATCCTC GAGGTCCACC TTTCTGAGCC CAACTTTTAT AGAGTGGCAG TATTTGCAGA   60
GTCACCCGCA AACTGACTCA TAATTGCTTC CATAAGCTTC T                      101
【０４３４】
（２）  配列番号４の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２８塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号４：
GTACAAGGTT CACGAGGTTC ACGTCTTA                                      28
【０４３５】
（２）  配列番号５の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：１６塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号５：
TCAGGTCATG ACCTGA                                                   16
【０４３６】
（２）  配列番号６の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号６：
CCACCCATGG CAAATTCCAT GGCA                                          24
【０４３７】
（２）  配列番号７の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２４塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号７：
TCTAGACGGC AGGTCAGGTC CACC                                          24
【０４３８】
（２）  配列番号８の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２０塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号８：
ACGCGTCCGG AAGACCTGGT                                               20
【０４３９】
（２）  配列番号９の情報
（i）   配列の特徴：
（Ａ）  長さ：２０塩基対
（Ｂ）  型：核酸
（Ｃ）  鎖の数：一本鎖
（Ｄ）  トポロジー：直鎖状
（ii）  配列の種類：ｃＤＮＡ
（iii） ハイポセティカル配列：Ｎo
（iv）  アンチセンス：Ｎo
（v）   フラグメント型：
（vi）  起源：
（xi）  配列：配列番号９：
ATTCTGCAGG TACATGTCCA                                               20
【図面の簡単な説明】
【０４４０】
【図１】図1はAGN193109の化学構造を示す。
【図２】図2A〜2Fは、AGN193109が、RARにおけるATRA依存性トランスアクチベーション（transactivation）を阻害したことを示す一連の線グラフである。図2Aと2BはRAR-α受容体における活性を示し；図2Cと2DはRAR-β受容体における活性を示し；図2Eと2FはRAR-γ受容体における活性を示す。図2A,2Cおよび2Eにおいて、白抜き四角印はレチノイン酸による処理を示しそして黒丸印はAGN193109による処理を示す。図2B,2Dおよび2Fにおける１本の線は10−８MのATRAおよび各種濃度のAGN193109で処理した後に測定したルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】図3Aと3Bは、リポータープラスミドERE-tK-Lucおよび発現プラスミドER-RAR-αでトランスフェクトされ、各種濃度のATRA（図3A）またはAGN193109（図3B）で処理されたCV-1細胞において検出されたルシフェラーゼ活性を示す線グラフである。データ点は、3個の独立のルシフェラーゼ測定値の平均値±SEMを示す。同時にトランスフェクトされるER-RAR-αの異なる量（0.05,0.1および0.2μg／ウエル）を用いて実施したトランスフェクションの結果を各図に示してある。
【図４】図4Aと4Bは、リポータープラスミドERE-tk-Lucおよび発現プラスミドER-RAR-βでトランスフェクトされ、各種濃度のATRA（図4A）またはAGN193109（図4B）で処理されたCV-1細胞内のルシフェラーゼ活性を示す線グラフである。データの点は、3個の独立のルシフェラーゼ測定値の平均値±SEMを示す。同時にトランスフェクトされるER-RAR-βの異なる量（0.05,0.1および0.2μg／ウエル）を用いて実施したトランスフェクションの結果を各図に示す。
【図５】図5Aと5Bは、リポータープラスミドERE-tk-Lucおよび発現プラスミドER-RAR-γでトランスフェクトされ、各種濃度のATRA（図5A）またはAGN193109（図5B）で処理されたCV-1細胞内で検出されたルシフェラーゼ活性を示す線グラフである。データ点は、3個の独立のルシフェラーゼ測定値の平均値±SEMを示す。同時にトランスフェクトされるER-RAR-γの異なる量（0.05,0.1および0.2μg／ウエル）を用いて実施したトランスフェクションの結果を各図に示してある。
【図６】図6は、ERE-tk-LucリポータープラスミドおよびER-RXR-αキメラ受容体発現プラスミド；またはERE-tk-LucリポータープラスミドおよびER-RXR-αキメラ受容体発現プラスミドにRAR-γ-VP-16発現プラスミドを組み合わせたもので、同時トランスフェクトされたCV-1細胞の、ATRAとAGN193109の用量応答を示す。ER-RXR-αで同時にトランスフェクトされた細胞を、ATRA（四角印）とAGN193109（菱形印）で処理した。ER-RXR-αとRAR-γ-VP-16を組み合わせたもので同時にトランスフェクトされた細胞をATRA（円形印）またはAGN193109（三角形印）で処理した。
【図７】図7は,ERE-tk-LucリポーターおよびER-RAR-γ発現構造体でトランスフェクトされ次にATRA（10−８M）および試験化合物（濃度は横軸に示す）で処理されたCV-1細胞の溶解物について記録されたルシフェラーゼ活性の測定値を示す線グラフである。試験化合物は、AGN193109（四角印）、AGN193357（白抜き菱形印）、AGN193385（丸形印）、AGN193389（三角形印）、AGN193840（黒四角印）およびAGN192870（黒菱形印）である。
【図８】図8は、ERE-tk-LucリポーターおよびRAR-γ-VP-16およびER-RXR-α発現の構造体でトランスフェクトされ次に横軸に示した濃度の試験化合物で処理したCV-1細胞の溶解物について記録されたルシフェラーゼ活性の測定値を示す線グラフである。試験化合物は、ATRA（白抜き四角印）、AGN193109（白抜き丸形印）、AGN193174（白抜き三角印）、AGN193199（黒四角印）、AGN193385（黒丸形印）、AGN193389（逆三角印）、AGN193840（黒菱形印）およびAGN193871（半黒菱形印）である。
【図９】図9A、9Bおよび9Cは、AGN193109が、RAR（陰影付きボックス）と負のコアクチベータータンパク質[negative coactivator protein (-)]との間の相互作用を調節できる機序を、トランスアクチベーション検定法に関連して示す模式図である。図9Aは負のコアクチベータータンパク質と正のコアクチベータータンパク質（＋）が、RARと結合平衡状態にあることを示す。リガンドがない場合、リポーター遺伝子の基本レベルの転写が起こる。図9Bに示すように、RAR作動薬を添加すると、正のコアクチベータータンパク質とRARの会合が促進されて、正に調節されたリポーター遺伝子転写が起こる。図9Cに示すように、AGN193109が添加されると、負のコアクチベータータンパク質とRARの会合が促進されて、リポーター遺伝子の転写が阻害される。
【図１０】図10は、AGN193109の濃度を10−８Mに一定に保持し、AGN191183の濃度（10−１０〜10−１２M）の関数として、TPAで誘発されるStr-AP1-CATの発現の阻害を示す棒グラフである。AGN191183だけで実施した試行で得た結果を、ハッチングをした棒で示し、一方、斜線付きの棒はAGN193109とAGN191183の組合せで処理した結果を示す。
【図１１】図11は、AGN193109がRARおよび他の核受容体ファミリーのメンバーの活性を高めることができる機序を示す模式図である。図11に示すように、導入されたRAR（AB-C-DEFドメインを有する白抜き長方形）は、負のコアクチベータータンパク質（ncp）（制限された供給で存在）が、RAR上に封鎖され、その結果、二つの集団；RAR+ncpとRAR-ncpが生成するので（RAR-ncpはリガンドに対する感受性が高い）、抗-AP1検定法においてRARリガンドに対する感受性が増大した。非RAR核因子（AB-D-DEFドメインを有する陰影付き長方形）は、ncpがAGN193109の活性によってRARに封鎖されたので、コグネイトリガンドに対する感受性が増大した。これら核受容体のモジュールドメインを、標準の命名法を用いて、”AB”（リガンド非依存性トラスアクチベーションドメイン）、”C”（DNA結合ドメイン）および”DEF”（リガンド調節トラスアクチベーションドメインおよび二量体化ドメイン）と命名する。
【図１２】図12は、MTV-DR3-LucリポータープラスミドでトランスフェクトされたCV-1細胞の1,25-ジヒドロキシビタミンD３用量応答に対するAGN193109の効果を示す。トランスフェクタント（transfectant）を、1,25-ジヒドロキシビタミンD３（黒四角印）、1,25-ジヒドロキシビタミンD３と10−８MのAGN193109（黒三角印）および1,25-ジヒドロキシビタミンD３と10−７MのAGN193109（黒丸印）で処理した。
【図１３】図13は、TPA誘発Str-AP1-CAT活性の1,25-ジヒドロキシビタミンD３仲介阻害反応に対するAGN193109（10nM）の同時投与の効果を示す棒グラフである。斜線の棒は、1,25-ジヒドロキシビタミンD３だけで処理した、トランスフェクトされた細胞のCAT活性の阻害を示す。白抜き棒は、1,25-ジヒドロキシビタミンD３とAGN193109を組み合わせたもので処理した、トランスフェクトされた細胞のCAT活性の阻害を示す。
【図１４】図14は、RAR-γおよびRAR応答性MTV-TREp-Lucリポーター構造体で同時トランスフェクトを行ったHeLa細胞に対する、AGN193109単独およびAGN191183を組み合わせたものの効果を示す線グラフである。このグラフに示す医薬処理は、AGN193109単独（四角印）、AGN193109と10−１０MのAGN191183の組合せ（菱形印）およびAGN193109と10−９MのAGN191183の組合せである。
【図１５】図15は、ECE16-1細胞が、EGF（黒四角印）に応答して増殖したが、規定培地だけ（白抜き丸形印）には応答して増殖しなかったことを示す線グラフである。AGN193109だけで処理した細胞は黒三角印で示す。黒丸印は、10nMのAGN191183と0〜1000nMのAGN193109で処理した細胞について得た結果を示す。
【図１６】図16は、AGN191183レチノイド作動薬の存在下または非存在下でのCaSki細胞の増殖に対するAGN193109の効果を示す棒グラフである。規定培地（DM）だけで増殖させたサンプル（白抜き棒）を除いた全サンプル群に20ng／mlの上皮増殖因子（EGF）を加えた。斜線付き棒はAGN193109なしで増殖させたサンプルを示す。陰影付き棒は1000nMのAGN193109の存在下で増殖させたサンプルを示す。この手順で使用したAGN191183の濃度は横軸に示してある。
【図１７】図17は、AGN193109が、網膜色素上皮（RPE）細胞に対するATRAの抗増殖活性を高めたということを示す用量応答曲線である。ATRAだけで処理したサンプルを黒四角印で示す。ATRAとAGN193109（10−７M）を組み合わせたもので処理したサンプルを黒丸印で示す。各種のサンプルを処理するのに使用したATRAの濃度は横軸に示してある。
【図１８】図18は、13-cis-RAとATRAの両者がRPE細胞の増殖を阻害したことおよびAGN193109が13-cis-RAの抗増殖活性を高めたことを示す用量応答曲線である。用量応答曲線に示す、サンプルの各種処理法は、13-cis-RAだけ（黒四角印）、13-cis-RAとAGN193109（10−６M）の組合せ（黒丸形印）、13-cis-RAとAGN193109（10−８M）の組合せ（黒三角印）およびATRA（黒菱形印）である。サンプルの処理に使用した13-cis-RAとATRAの濃度は横軸に示してある。
【図１９】図19は、AGN193109が、RPE細胞の初代培養物においてデキサメタゾンの抗増殖活性を高めたことを示す用量応答曲線である。用量応答曲線に示した、サンプルの各種処理法は、ATRA（黒四角印）、デキサメタゾンだけ（黒丸印）、デキサメタゾンとAGN193109（10−８M）の組合せ（黒三角印）、およびデキサメタゾンとAGN193109（10−６M）の組合せ（黒菱形印）である。サンプルの処理に使用したデキサメタゾンとATRAの濃度は横軸に示してある。
【図２０】図20は、AGN193109が、RPE細胞の初代培養物において甲状腺ホルモン（T3）の抗増殖活性を高めたことを示す用量応答曲線である。用量応答曲線に示す、サンプルの各種処理法は、ATRA（黒四角印）、T3だけ（黒丸印）、T3とAGN193109（10−８M）の組合せ（黒三角印）、T3とAGN193109（10−６M）の組合わせ（黒菱形印）である。サンプルの処理に使用したT3とATRAの濃度は横軸に示してある。
【図１】
2008280346.tif 000037
【図２】
2008280346.tif 000038
【図３】
2008280346.tif 000039
【図４】
2008280346.tif 000040
【図５】
2008280346.tif 000041
【図６】
2008280346.tif 000042
【図７】
2008280346.tif 000043
【図８】
2008280346.tif 000044
【図９】
2008280346.tif 000045
【図１０】
2008280346.tif 000046
【図１１】
2008280346.tif 000047
【図１２】
2008280346.tif 000048
【図１３】
2008280346.tif 000049
【図１４】
2008280346.tif 000050
【図１５】
2008280346.tif 000051
【図１６】
2008280346.tif 000052
【図１７】
2008280346.tif 000053
【図１８】
2008280346.tif 000054
【図１９】
2008280346.tif 000055
【図２０】
2008280346.tif 000056