(57)【要約】【課題】微生物を用いたピロロキノリンキノン定量方法を提供する。【解決手段】ピロロキノリンキノン要求性メチロトローフをサンプル存在下で培養し、培養後の前記メチロトローフの生育度を測定し、当該生育度を指標として、前記サンプル中のピロロキノリンキノン量を定量することを特徴とする、ピロロキノリンキノン定量方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピロロキノリンキノン要求性メチロトローフをサンプル存在下で培養する工程と、
培養後の前記メチロトローフの生育度を測定する工程と、
を含み、前記生育度を指標として、前記サンプル中のピロロキノリンキノン量を定量することを特徴とする、ピロロキノリンキノン定量方法。
【請求項２】
上記ピロロキノリンキノン要求性メチロトローフがピロロキノリンキノン生合成遺伝子破壊株であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ピロロキノリンキノン生合成遺伝子がpqqC遺伝子であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
上記ピロロキノリンキノン生合成遺伝子破壊株が受領番号FERM AP-21171で特定される微生物であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記生育度が培養物の濁度又はATP量を指標とすることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記培養に用いられる培地が無機塩培地にC1化合物を加えた培地であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
上記C1化合物がメタノールであることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ピロロキノリンキノン要求性メチロトローフを含むことを特徴とする、ピロロキノリンキノン測定キット。
【請求項９】
無機塩培地をさらに含むことを特徴とする、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピロロキノリンキノンの微生物学的定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピロロキノリンキノン(以下、「PQQ」という)は、最近では新規のビタミンとしての可能性も示唆されている物質である。
【０００３】
従来のPQQ測定方法としては、酵素活性を用いた測定方法及びガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)法が知られている。
【０００４】
酵素活性を用いたPQQ測定法としては、大腸菌(Escherichia coli)又はアシネトバクター・カルコアセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)由来のキノプロテインであるグルコース脱水素酵素のアポタンパク質のPQQ依存酵素活性を指標として測定する方法が報告されている(非特許文献１〜３)。これらの報告では、nMまでのPQQ濃度の定量性が報告されている。
【０００５】
一方、GC/MS法では、13Cを導入したPQQを内部標準として用いる方法が感度が高く、数十pgレベルまでのPQQの測定が可能である(非特許文献４〜６)。しかしながら、このGC/MS法では大きな装置を必要とし、簡便な方法ではない。
【０００６】
さらに、PQQの測定方法としては、PQQを3-[1-メチル-3,5-ジ(メトキシカルボニル)ピロール-2-イル)-2,4,6-トリ(メトキシカルボニル)ピリジンに変換させた後、変換後の当該化合物量を測定することでPQQを定量する方法が開示されている(特許文献１及び２)。
【０００７】
しかしながら、今日まで、PQQの定量を微生物学的定量方法により行ったとの報告はなされていない。
【０００８】
【特許文献１】特開平1-312461号公報
【特許文献２】特開平4-145360号公報
【非特許文献１】Ameyama M.ら, 「Anal. Biochem.」, 1985年, 第151巻, p.263-267
【非特許文献２】Van Kleef M.A.G.ら, 「Anal. Biochem.」, 1987年, 第162巻, p.143-149
【非特許文献３】Geiger O.ら, 「Anal. Biochem.」, 1987年, 第164巻, p.418-423
【非特許文献４】Kumazawa T.ら, 「Biochem. Biophys. Acta」, 1992年, 第1156巻, p.62-66
【非特許文献５】Kumazawa T.ら, 「Biochem. Biophys. Res. Commum.」, 1993年, 第193巻, p.1-5
【非特許文献６】Kumazawa T.ら, 「Biochem. J.」, 1995年, 第307巻, p.331-333
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上述した実情に鑑み、高感度のPQQの微生物学的定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、PQQ生合成遺伝子を破壊したメチロトローフ(「C1化合物資化性細菌」とも呼ばれる)をPQQ存在下で培養することで、PQQ量に応じて当該メチロトローフの生育度が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は以下を包含する。
（１）PQQ要求性メチロトローフをサンプル存在下で培養する工程と、培養後の前記メチロトローフの生育度を測定する工程とを含み、前記生育度を指標として、前記サンプル中のPQQ量を定量することを特徴とする、PQQ定量方法。
（２）上記PQQ要求性メチロトローフがPQQ生合成遺伝子破壊株であることを特徴とする、（１）に記載の方法。
（３）上記PQQ生合成遺伝子がpqqC遺伝子であることを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）上記PQQ生合成遺伝子破壊株が受領番号FERM AP-21171で特定される微生物であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）上記生育度が培養物の濁度又はATP量を指標とすることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法。
【００１２】
（６）上記培養に用いられる培地が無機塩培地にC1化合物を加えた培地であることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）上記C1化合物がメタノールであることを特徴とする、（６）に記載の方法。
（８）PQQ要求性メチロトローフを含むことを特徴とする、PQQ測定キット。
（９）無機塩培地をさらに含むことを特徴とする、（８）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡便で、且つ非常に高感度なPQQ定量方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
メチロトローフ(C1化合物資化性細菌)は、メタノール、メチルアミン等のC1化合物を炭素源/エネルギー源として生育できる細菌である。メチロトローフとしては、例えば、通性メチロトローフ及び偏性メチロトローフが挙げられる。このうち通性メチロトローフは、C-C結合を含む化合物（糖、アルコールなど）を炭素源/エネルギー源としてでも生育できる。一方、偏性メチロトローフはC1化合物でのみ生育できる細菌である。メチロトローフをメタノール存在下で生育した場合には、メタノール脱水素酵素を誘導する。
【００１５】
メチロトローフにおいて、メタノール脱水素酵素はメタノールでの生育に必須であり、補酵素としてPQQを要求する。メチロトローフはPQQ生合成遺伝子群を有し、自身でPQQを生産できる。
【００１６】
これまでに、PQQ生合成遺伝子群が幾つかの細菌において解析されており、PQQ生合成遺伝子群はpqqA遺伝子、pqqB遺伝子、pqqC遺伝子、pqqD遺伝子、pqqE遺伝子及びpqqF遺伝子で構成されることが知られている(Goosen, N. et al., (1989) J. Bacteriol., 171, 447-455; Biville, F. et al., (1989) J. Gen. Microbiol., 135, 2917-2930; Morris, C. J. et al., (1994) J. Bacteriol., 176, 1746-1755; Meulenberg, J. J. et al., (1992) Mol. Gen. Gent. 232, 284-294; Toyama, H. et al., (1997) Microbiology, 143, 595-602;及びFelder, M. et al., (2000) FEMS Microbiol. Lett., 193, 231-236)。通性メチロトローフでは、メチロバクテリウム・エクストークエンス(Methylobacterium extorquens)AM1及びメチロバクテリウム・オルガノフィラム(Methylobacterium organophilum)においてPQQ生合成遺伝子群が解析されている。また、偏性メチロトローフにおいては、メチロバチルス・フラゲラタム(Methylobacillus flagellatum)のpqqAB(DG)遺伝子群とpqqC遺伝子の一部においての塩基配列が報告されている(Gomelsky, M. et al., (1996) FEMS Microbiol. Lett., 141, 169-176)。
【００１７】
PQQ生合成遺伝子の解析により、メチロバクテリウム・エクストークエンスAM1及びクレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)においてpqqC遺伝子破壊株がPQQ合成の中間体を蓄積することから、pqqC遺伝子は合成の最終段階に関与し、合成に必須であることが知られている(Toyama, H. et al., (1997) Microbiology, 143, 595-602及びVelterop, J. S. et al., (1995) J. Bacteriol., 177, 5088-5098)。
【００１８】
また、メチロバチルス・フラゲラタムのpqqB遺伝子破壊株及びクレブシエラ・ニューモニエのpqqB遺伝子破壊株又はpqqF遺伝子破壊株では、微量のPQQが合成されていることが示された(Gomelsky, M. et al., (1996) FEMS Microbiol. Lett., 141, 169-176及びVelterop, J. S. et al., (1995) J. Bacteriol., 177, 5088-5098)。
【００１９】
さらに、pqqA遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエ(Meulenberg, J. J. et al., (1992) Mol. Gen. Gent. 232, 284-294)及びアシネトバクター・カルコアセチカス(Goosen, N. et al., (1992) J. Bacteriol., 174. 1426-1427)では必須であり、一方、メチロバクテリウム・エクストークエンスAM1(Toyama, H. et al., (1998) Microbiology, 144, 183-191)では必須ではないという報告がなされている。
【００２０】
pqqD遺伝子及びpqqE遺伝子は、機能が未知であるが、PQQ合成に必須であると考えられている。
【００２１】
以上のような知見に基づき、本願発明者等は、メチロトローフのpqqC遺伝子破壊株はメチルアミンでの生育では影響がみられないが、メタノールでの生育能が失われており、このpqqC遺伝子破壊株が培地中のPQQ量に応じて生育することを見出した。さらには、PQQ生合成遺伝子を破壊したPQQ遺伝子破壊株等のPQQ要求性メチロトローフの生育度と、その培養下に存在するPQQ量とが相関することによりPQQ要求性メチロトローフの生育度を用いてPQQ量を定量できることを示した。
【００２２】
すなわち、本発明に係るPQQ定量方法は、PQQ要求性メチロトローフをサンプル存在下で培養し、培養後の当該メチロトローフの生育度を測定し、この生育度を指標として、サンプル中のPQQ量を定量する方法である。
【００２３】
ここで、PQQ要求性メチロトローフは、PQQ不在下では生育できないメチロトローフを意味する。メチロトローフとしては、例えば、通性メチロトローフ(メチロバクテリウム属細菌、ハイホミクロビウム属細菌)及び偏性メチロトローフ(メチロモナス属細菌、メチロバチルス属細菌、メチロフィラス属細菌）が挙げられる。PQQ要求性メチロトローフは、天然にPQQ要求性であるか、あるいは人為的にPQQ要求性としたものであってよい。
【００２４】
人為的にメチロトローフをPQQ要求性とする方法としては、例えば、PQQ生合成遺伝子を破壊する方法及びPQQ生合成遺伝子の発現を抑制する方法が挙げられる。ここで、破壊又は発現抑制の対象とするPQQ生合成遺伝子としては、pqqC遺伝子、pqqD遺伝子及びpqqE遺伝子が挙げられ、特にPQQ合成の最終段階に関与する事が知られているpqqC遺伝子が好ましい。なお、これらPQQ生合成遺伝子のうち1種又は複数種(2又は3種)を破壊又は発現抑制に供することで、メチロトローフをPQQ要求性とすることができる。
【００２５】
PQQ生合成遺伝子を破壊する方法によれば、PQQ生合成遺伝子破壊株が作製される。PQQ生合成遺伝子の破壊は、例えば、当該PQQ生合成遺伝子に変異を導入することにより行われる。具体的には、PQQ生合成遺伝子のエキソンの一部に薬剤耐性遺伝子等の外来遺伝子を例えば相同組換え法により挿入することによって、PQQ生合成遺伝子を破壊することができる。
【００２６】
例えば、図１には、偏性メチロトローフである、メチロモナス・エスピー(Methylomonas sp.)J株(メチロモナス属細菌に属する)、バクテリウム(Bacterium)D19株、バクテリウムC1014株及びバクテリウムSA15株の4株のPQQ生合成遺伝子群の模式図が示される。また、図２〜５は、それぞれメチロモナス・エスピーJ株(図２(図２−１及び図２−２))、バクテリウムSA15株(図３(図３−１〜図３−３))、バクテリウムD19株(図４(図４−１〜図４−３))、バクテリウムC1014株(図５(図５−１及び図５−２))のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。メチロモナス・エスピーJ株のゲノム(図１及び２)においてPQQ生合成遺伝子群(配列番号１)は、pqqA遺伝子(アミノ酸配列：配列番号２)、pqqB遺伝子(アミノ酸配列：配列番号３)、pqqC遺伝子(アミノ酸配列：配列番号４)、pqqD遺伝子(アミノ酸配列：配列番号５)、pqqE遺伝子(部分アミノ酸配列：配列番号６)の順序で並んでいる。また、バクテリウムSA15株のゲノム(図１及び３)においてPQQ生合成遺伝子群(配列番号７)は、pqqA遺伝子(アミノ酸配列：配列番号８)、pqqB遺伝子(アミノ酸配列：配列番号９)、pqqC遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１０)、pqqD遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１１)、pqqE遺伝子(部分アミノ酸配列：配列番号１２)の順序で並んでいる。さらに、バクテリウムD19株のゲノム(図１及び４)においてPQQ生合成遺伝子群(配列番号１３)は、pqqB遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１４)、pqqC遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１５)、pqqD遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１６)、pqqE遺伝子(部分アミノ酸配列：配列番号１７)の順序で並んでいる。バクテリウムC1014株のゲノム(図１及び５)においてPQQ生合成遺伝子群(配列番号１８)は、pqqB遺伝子(アミノ酸配列：配列番号１９)、pqqC遺伝子(アミノ酸配列：配列番号２０)、pqqD遺伝子(アミノ酸配列：配列番号２１)、pqqE遺伝子(部分アミノ酸配列：配列番号２２)の順序で並んでいる。このようなPQQ生合成遺伝子群において、pqqC遺伝子、pqqD遺伝子及びpqqE遺伝子から選択される1以上のPQQ生合成遺伝子に変異を導入することで、メチロトローフをPQQ遺伝子破壊株とし、本発明におけるPQQ要求性メチロトローフとして使用することができる。
【００２７】
なお、メチロモナス・エスピーJ株のゲノム(図１及び２)においてpqqC遺伝子中にカナマイシン耐性遺伝子(図１及び２のBpu1102I部位)を挿入したpqqC遺伝子破壊株(Methylomonas sp. J ΔpqqC::Km)が、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1中央第6)に平成19年(2007年)1月30日付で寄託されており、その受領番号はFERM AP-21171である。
【００２８】
一方、PQQ生合成遺伝子の発現抑制とは、対象のメチロトローフに内在するPQQ生合成遺伝子の転写又は翻訳レベルでの抑制を意味する。このような発現抑制により、対象のメチロトローフにおいて、抑制対象のPQQ生合成遺伝子からコードされるタンパク質の活性又は機能を抑制することができる。
【００２９】
PQQ生合成遺伝子の転写レベルでの抑制方法としては、例えば、PQQ生合成遺伝子の転写を阻害するリプレッサータンパク質を高発現させる方法又はPQQ生合成遺伝子の調節領域(例えば、プロモーター領域、シャイン・ダルガーノ配列(SD配列)等)を改変する方法が挙げられる。リプレッサータンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを、対象のメチロトローフに導入し、発現させる。このようにして、高発現させたリプレッサータンパク質が行う負の調節により、PQQ生合成遺伝子の転写が抑制される。一方、プロモーター領域又はSD配列等のPQQ生合成遺伝子の調節領域を改変することによりPQQ生合成遺伝子の転写が抑制される。
【００３０】
PQQ生合成遺伝子の翻訳レベルでの抑制方法としては、例えば、アンチセンスRNAを用いる方法が挙げられる。抑制対象のPQQ生合成遺伝子のmRNAに対するアンチセンスRNAを転写する遺伝子を、メチロトローフに組み込み、当該アンチセンスRNAを過剰発現させることで、抑制対象のPQQ生合成遺伝子のmRNAの翻訳が抑制される。
【００３１】
本発明では、以上に説明したPQQ要求性メチロトローフを用いて、PQQ定量対象サンプル中のPQQ濃度を定量する。本発明において、PQQ定量対象サンプルとしてはいずれのものであってもよく、例えば、菌体培養液、生体試料(例えば、血清など)、食品抽出液(例えば、野菜や果物などより抽出したサンプル)が挙げられる。
【００３２】
本発明に係るPQQ定量方法では、先ず上述したPQQ要求性メチロトローフを培養し、PQQ要求性メチロトローフを準備する。この準備段階の培養(前培養)条件としては、使用するメチロトローフに応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素源としてメチルアミンを含有する培地において、温度20〜30℃(好ましくは、28〜30℃)、pH6.0〜7.5(好ましくは、pH6.8〜7.0)下である。この前培養物から炭素源(例えば、メチルアミン)を遠心分離等によって除き、試料菌体液として使用する。
【００３３】
次いで、得られた試料菌体液をPQQ定量対象サンプル含有培地において培養する。この際、使用する培地としては、無機塩培地に特定のC1化合物を混合したものが挙げられる。ここで、本明細書における「無機塩培地」とは炭素源を含まない菌体培養用培地を意味し、例えば以下の組成から成る培地が挙げられる：(培地1L当たり)NaH2PO4・12H2O, 2490mg; K2HPO4, 1360mg; MgSO4, 290mg; EDTA, 202mg; (NH4)6Mo7O24・4H2O, 186mg; CaCl2・2H2O, 66mg; MnSO4・4H2O, 15mg; ZnSO4・7H2O, 11mg; FeSO4・7H2O, 7mg; Co(NO3)2・6H2O, 0.25mg; Na2B4O7・10H2O, 0.18mg;及びCuSO4・5H2O, 0.4mg。また、C1化合物としては、例えば、メタノールが挙げられる。培地に対するC1化合物添加量は、使用するC1化合物、培地やPQQ要求性メチロトローフに応じて適宜決定することができるが、例えば、C1化合物がメタノールである場合には、培地1Lに対して、1.0ml〜50ml、好ましくは5.0ml〜20mlである。さらに、C1化合物含有培地に対するPQQ定量対象サンプルの混合量は、例えば、C1化合物含有培地1mlに対して、0.001ml〜0.5ml、好ましくは0.001ml〜0.01mlである。
【００３４】
一方、PQQ定量対象サンプルに対する試料菌体液中のPQQ要求性メチロトローフ量は、例えば、PQQ定量対象サンプル1ml当たり、600nmのODが1の菌体0.2μl〜30μl(濁度を測定する場合は、好ましくは5μl〜30μl、特に好ましくは10μl〜20μl；ATP量を測定する場合は、好ましくは0.2μl〜10μl、特に好ましくは0.5μl〜5.0μl)とする。培養条件としては、使用するメチロトローフに応じて適宜選択することができるが、例えば、炭素源としてメタノールを含有する培地において、温度20〜30℃(好ましくは、28〜30℃)、pH6.0〜7.5(好ましくは、pH6.8〜7.0)下である。また、培養時間は、例えば、20〜144時間(好ましくは、48〜96時間)である。
【００３５】
さらに、PQQ定量対象サンプル存在下での培養後、PQQ要求性メチロトローフの生育度を測定する。測定方法は、測定値を指標として生育度を測定できるものであればいずれの方法であってもよいが、例えば、培養物の濁度を測定する方法、培養物中のATP量を測定する方法又は定量PCRで特定の遺伝子の遺伝子量(遺伝子数)を測定する方法などが挙げられる。
【００３６】
濁度は、例えば、分光光度計、濁度計、プレートリーダー等を用いて、600nmで測定することができる。
【００３７】
ATP量は例えばBacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay(プロメガ社製)を用いて測定することができる。生育度をATP量で換算すると、PQQ定量対象サンプル中のPQQ濃度が低くとも(例えば、PQQ定量対象サンプル中のPQQ濃度0.1pg/ml以上(特に1pg/ml以上))高感度にPQQ濃度を定量することができる。また、上述した培養において、菌体は少ない量で行うことができる(例えば、PQQ定量対象サンプル1ml当たり、600nmのODが1の菌体0.5μl〜20μl)。
【００３８】
定量PCRで特定の遺伝子の遺伝子量(遺伝子数)を測定する方法では、例えば、測定対象の遺伝子に特異的な蛍光プローブを用いたリアルタイムPCR法等により、PQQ定量対象サンプル存在下での培養後のPQQ要求性メチロトローフに存在する当該遺伝子の遺伝子量(遺伝子数)の定量を高感度で行うことができる。当該遺伝子量(遺伝子数)が生育度の指標となる。測定対象の遺伝子としては、例えば、PQQ要求性メチロトローフに存在する遺伝子(例えば、メチルアミン脱水素酵素遺伝子、メタノール脱水素酵素遺伝子)が挙げられる。
【００３９】
このようにして測定したPQQ要求性メチロトローフの生育度を、PQQ定量対象サンプル中のPQQ量(PQQ濃度)に換算することができる。例えば、既知のPQQ量存在下でのPQQ要求性メチロトローフの生育度を用いて検量線を作成する。当該検量線に対して、PQQ定量対象サンプル存在下でのPQQ要求性メチロトローフの生育度を比較することで、PQQ定量対象サンプル中のPQQ量を定量することができる。なお、PQQ要求性メチロトローフの生育度がメタノール依存の生育度(すなわち、PQQ依存の生育度)であるとするために、メタノール存在下で培養したPQQ要求性メチロトローフの生育度からメタノール不在下で培養したPQQ要求性メチロトローフの生育度(バックグラウンド)を差し引いて、PQQ量を算出することが好ましい。
【００４０】
以上に説明した本発明に係るPQQ定量方法によれば、従来使用されているPQQ定量方法に比べて、簡便に、且つ高感度にPQQ量を定量することができる。
【００４１】
一方、本発明に係るPQQ測定キットは、上述したPQQ要求性メチロトローフを含むキットである。当該キットには、PQQ要求性メチロトローフ以外に、例えば、上述した無機塩培地、PQQ要求性メチロトローフの培養物の濁度や培養物中のATP量を測定するための試薬(例えば、ATP量を測定するためのルシフェリンやルシフェラーゼ等)、又は定量PCR用試薬を含むことができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕pqqC遺伝子破壊株の作製
先ず、C1化合物のみでしか生育できない偏性メチロトローフであるメチロモナス・エスピーJ株(以下、「J株」という)、バクテリウムSA15株(以下、「SA15株」という)、バクテリウムD19株(以下、「D19株」という)及びバクテリウムC1014株(以下、「C1014株」という)の4株において、PQQ生合成遺伝子群をクローン化した。なお、J株からはEcoRI断片10.3kb、SA15株からはSacI断片9.5kb、D19株からはEcoRI断片8.5kb、C1014株からはEcoRI断片5.0kbをクローン化した。各々のクローンからpqqC遺伝子を含む領域をサブクローン化し、塩基配列を決定した(図１〜５)。
【００４３】
図１は、J株、D19株、C1014株及びSA15株の4株のPQQ生合成遺伝子群の模式図を示す。また、決定した塩基配列を図２〜５に示す。図２〜５は、それぞれJ株(図２(図２−１及び図２−２))、SA15株(図３(図３−１〜図３−３))、D19株(図４(図４−１〜図４−３))、C1014株(図５(図５−１及び図５−２))のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【００４４】
次いで、J株においてサブクローン化したHindIII-SacI(2.6kb)断片(図１)のpqqC遺伝子中のBpu1102I部位にTn5のカナマイシン耐性遺伝子を挿入した。挿入後のHindIII-SacI断片を、J株の野生株に電気穿孔法を用いて導入し、相同組換えによりpqqC遺伝子破壊株を取得した。
【００４５】
同様に、SA15株においてはサブクローン化したSacI-XhoI(6.5kb)断片(図１)のpqqC遺伝子中のPmaCI部位に、D19株においてはEcoRI-EcoRV(4.3kb)断片(図１)のpqqC遺伝子中のAatII部位に、C1014株においてはEcoRI-XhoI(2.6kb)断片(図１)のpqqC遺伝子中のPmaCI部位に、相同組換えによりそれぞれカナマイシン耐性遺伝子を挿入し、pqqC遺伝子破壊株を取得した。
【００４６】
得られた各pqqC遺伝子破壊株はカナマイシン耐性であり、且つメチルアミンでは生育できるがメタノールでの生育能を欠損していた。しかし、培地中にPQQを相補することによりメタノールでの生育は回復した。このように得られた各pqqC遺伝子破壊株を用い、下記の実施例では、PQQ量の違いによる生育を調べた。
【００４７】
各pqqC遺伝子破壊株の培養は、30℃で、カナマイシンを含む無機塩培地を用いて行った。下記の実施例において、培養に使用した培地組成は以下の通りであった(培地1L当たり)：NaH2PO4・12H2O, 2490mg; K2HPO4, 1360mg; MgSO4, 290mg; EDTA, 202mg; (NH4)6Mo7O24・4H2O, 186mg; CaCl2・2H2O, 66mg; MnSO4・4H2O, 15mg; ZnSO4・7H2O, 11mg; FeSO4・7H2O, 7mg; Co(NO3)2・6H2O, 0.25mg; Na2B4O7・10H2O, 0.18mg;及びCuSO4・5H2O, 0.4mg。炭素源としてメチルアミンを用いるときは、メチルアミン5g/l及び硫酸アンモニウム500mg/lを加えた。炭素源としてメタノールを用いるときは、メタノール5ml/l及び硫酸アンモニウム5400mg/lを加えた。
【００４８】
〔実施例２〕pqqC遺伝子破壊株の濁度とPQQ濃度との相関
実施例１で得られた各pqqC遺伝子破壊株をメチルアミンを唯一の炭素源/エネルギー源として含む培地(カナマイシン50μg/ml)で3日間培養した後、各pqqC遺伝子破壊株の培養液3mlを滅菌したチューブに入れ、遠心により集菌した。次いで、炭素源を含まない培地で懸濁し、遠心により集菌した。これを3回繰り返して行い、メチルアミンを除いた。さらに得られた各pqqC遺伝子破壊株の懸濁液を30℃の浸透培養器で3〜5時間浸透することにより、完全にメチルアミンを除いた。これを集菌し、炭素源を含まない培地で懸濁し、600nmの濁度を測定して試料菌体液とした。
【００４９】
一方、12mlの培養チューブに、PQQの終濃度が100pg/ml〜1ng/mlになるように100〜200pg/ml刻みでPQQを加えた。あるいは、12mlの培養チューブに、PQQの終濃度が1ng/ml〜10ng/mlになるように1〜2ng/ml刻みでPQQを加えた。次いで、これら培養チューブ中の溶液を、滅菌蒸留水と合わせて1mlに調整した。さらに、試料菌体液を2倍に調整した無機塩培地（カナマイシン50μg/ml）に加え、それぞれの培養チューブに1mlずつ加え、総量2ml/培養チューブとなるように調整した。このとき、菌体の濃度は、600nmにおけるODが1の菌体10μl〜20μl/培養チューブとなるようにした。これら菌体を含む培養チューブを、30℃で3〜6日間振盪培養した後、600nm又は595nmの濁度を分光光度計で測定した。あるいは、培養液100μlを96穴プレートに移し、プレートリーダーで濁度を測定した。
【００５０】
結果を図６〜８に示す。図６は、C1014株及びSA15株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。図６において、Aは培地中に加えたPQQ量が0.1〜1.0ng/ml培地のときの600nmのODの値であり、Bは培地中に加えたPQQ量が1.0〜10ng/ml培地のときの600nmのODの値である。図７は、D19株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。図７において、Aは培地中に加えたPQQ量が0.1〜1.0ng/ml培地のときの600nmのODの値であり、Bは培地中に加えたPQQ量が1.0〜10ng/ml培地のときの600nmのODの値である。図８は、J株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。図８において、Aは培地中に加えたPQQ量が0.01〜0.1ng/ml培地のときの600nmのODの値であり、Bは培地中に加えたPQQ量が0.1〜1.0ng/ml培地のときの600nmのODの値であり、Cは培地中に加えたPQQ量が1.0〜10ng/ml培地のときの600nmのODの値である。図６〜８のグラフにおいて、縦軸は各pqqC遺伝子破壊株の濁度(OD600)であり、横軸はPQQ濃度(1mlの培地当たり)を示す。
【００５１】
図６〜８に示すように、PQQ量に比例した各pqqC遺伝子破壊株の濁度の増加が認められた。J株のpqqC遺伝子破壊株においては、PQQの終濃度が10〜100pg/mlの濃度においても定量性がみられた（図８）。
【００５２】
〔実施例３〕pqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量とPQQ濃度との相関
実施例２の結果よりもさらに感度を上げるために、生存する微量な菌体量をATP量として測定する方法を用いた。この測定にはプロメガ社のBacTiter-GloTM Microbial Cell Viability Assayを用いた。
【００５３】
先ず、実施例２と同様にして試料菌体液を調整した。次いで、12mlの培養チューブに、PQQの終濃度が1pg/ml〜10pg/mlになるように1pg/ml〜2.5pg/ml刻みでPQQを加えた。あるいは、12mlの培養チューブに、PQQの終濃度が10pg/ml〜100pg/mlになるように10pg/ml〜25pg/ml刻みでPQQを加えた。さらに、実施例２と同様にして試料菌体液を培養チューブに加え、総量2ml/培養チューブとなるように調整した。このとき、菌体濃度は、600nmにおけるODが1の菌体1μl〜10μl/培養チューブとなるようにした。これら菌体を含む培養チューブを30℃で1〜5日間振盪培養した後、菌体培養液100μlを96穴プレートに移した。次いで、各穴に、BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assayのルシフェラーゼ混合液を100μl加え、5分後の発光量を測定した。
【００５４】
結果を図９〜１１に示す。図９は、J株のpqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量の結果を示す。図９において、Aは培地中に加えたPQQ量が0〜10pg/ml培地のときの発光量であり、Bは培地中に加えたPQQ量が10〜100pg/ml培地のときの発光量である。図１０は、J株のpqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量(図９に示す濃度範囲よりさらに低濃度範囲のPQQ定量)の結果を示す。図１０において、Aは培地中に加えたPQQ量が0〜1.0pg/ml培地のときの発光量であり、Bは培地中に加えたPQQ量が1〜10pg/ml培地のときの発光量である。図１１は、D19株、SA15株及びC1014株の各pqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量の結果を示す。図９〜１１のグラフにおいて、縦軸は各pqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量(発光量(RLU))であり、横軸はPQQ濃度(1mlの培地当たり)を示す。
【００５５】
図９〜１１に示すように、1pg/ml濃度のPQQに比例したATP量の増加(生菌数の増加)が認められた。
【００５６】
〔実施例４〕ウシ血清におけるPQQの定量
ウシ血清中のPQQ量を測定した。
先ず、J株のpqqC遺伝子破壊株について、実施例２と同様にして試料菌体液を調整した。次いで、12mlの培養チューブに、55℃で30分間処理したウシ血清を終濃度0.1〜1.0％となるように加え、滅菌蒸留水と合わせて1mlに調整した。さらに、培養チューブに試料菌体液を1ml加え、総計2mlとした。この菌体を含むチューブを30℃で1〜5日間振盪培養した後、実施例３と同様にして培養物中のATP量(発光量)を測定した。なお、対照として、培養の際にメタノールを加えない培養物も準備し、同様に培養後、ATP量を測定した。また、同時に実施例３と同様にして、PQQ終濃度1pg/ml〜10pg/mlにおけるJ株のpqqC遺伝子破壊株の培養物中のATP量(発光量)を測定し、検量線として用いた。
【００５７】
結果を図１２に示す。図１２は、ウシ血清中のPQQ定量の結果を示す。図１２において、縦軸はJ株のpqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量(発光量(RLU))であり、横軸はウシ血清濃度(％)を示す。また、図１２の結果は、メタノールを加えて培養して得られた結果(OH+)から、メタノールを加えず培養して得られた結果(OH-)を差し引いた値をメタノール依存の生育(すなわち、PQQ依存の生育)としてPQQ量を算出した。
【００５８】
数回行った結果、ウシ血清中に1.06±0.68ng/mlのPQQが存在すると推定された。また、得られた直線の式の傾き(図１２)からPQQ濃度を算出すると、0.94±0.48ng/mlとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、メチロモナス・エスピーJ株、バクテリウムD19株、バクテリウムC1014株及びバクテリウムSA15株の4株のPQQ生合成遺伝子群の模式図を示す。
【図２−１】図２−１は、メチロモナス・エスピーJ株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図２−２】図２−２は、メチロモナス・エスピーJ株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３−１】図３−１は、バクテリウムSA15株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３−２】図３−２は、バクテリウムSA15株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３−３】図３−３は、バクテリウムSA15株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４−１】図４−１は、バクテリウムD19株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４−２】図４−２は、バクテリウムD19株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４−３】図４−３は、バクテリウムD19株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図５−１】図５−１は、バクテリウムC1014株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図５−２】図５−２は、バクテリウムC1014株のPQQ生合成遺伝子群の塩基配列及び各遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、バクテリウムC1014株及びSA15株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。
【図７】図７は、バクテリウムD19株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。
【図８】図８は、メチロモナス・エスピーJ株のpqqC遺伝子破壊株の濁度測定によるPQQ定量の結果を示す。
【図９】図９は、メチロモナス・エスピーJ株のpqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量の結果を示す。
【図１０】図１０は、メチロモナス・エスピーJ株のpqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量(図９に示す濃度範囲よりさらに低濃度範囲のPQQ定量)の結果を示す。
【図１１】図１１は、バクテリウムD19株、SA15株及びC1014株の各pqqC遺伝子破壊株培養物中のATP量測定によるPQQ定量の結果を示す。
【図１２】図１２は、ウシ血清中のPQQ定量の結果を示す。
【図１】
2008193978.tif 000002
【図２−１】
2008193978.tif 000003
【図２−２】
2008193978.tif 000004
【図３−１】
2008193978.tif 000005
【図３−２】
2008193978.tif 000006
【図３−３】
2008193978.tif 000007
【図４−１】
2008193978.tif 000008
【図４−２】
2008193978.tif 000009
【図４−３】
2008193978.tif 000010
【図５−１】
2008193978.tif 000011
【図５−２】
2008193978.tif 000012
【図６】
2008193978.tif 000013
【図７】
2008193978.tif 000014
【図８】
2008193978.tif 000015
【図９】
2008193978.tif 000016
【図１０】
2008193978.tif 000017
【図１１】
2008193978.tif 000018
【図１２】
2008193978.tif 000019
【配列表】
2008193978000001.app