(57)【要約】【課題】生体内で安全と考えられているポリシロキサンを主成分とする高分子会合体を用いた、安全な、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤，及びそれを用いた一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を提供すること。【解決手段】ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物を構成成分として含む粒子の、少なくとも１種を含むことを特徴とする、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤である。（Ａ）脂肪酸由来アシル基（Ｂ）糖あるいは糖類似の置換基【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物を構成成分として含む粒子の、少なくとも１種を含むことを特徴とする、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
（Ａ）脂肪酸由来アシル基
（Ｂ）糖あるいは糖類似の置換基
【請求項２】
ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物が、一分子内に、下記（Ｉ）で表されるモノマー単位をｘ個，（II）で表されるモノマー単位をｙ個，及び（III）で表されるモノマー単位をｚ個含む化合物であることを特徴とする、請求項１記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【化１】
2008280260.tif 000010
【化２】
2008280260.tif 000011
【化３】
2008280260.tif 000012
（尚、式中、Ｒ0は、炭素数２〜７の飽和又は不飽和の炭化水素基を表し、Ｒ1は、炭素数９〜１９の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ2は単糖又はオリゴ糖由来の、糖あるいは糖類似の置換基を表す。また、ｘは０以上の整数，ｙ及びｚは１以上の整数，Ｒ0の導入されたモノマー単位の総数（ｘ＋ｙ＋ｚ）は、ポリシロキサンの重合度（ｎ）＝３０〜１００以下の数であり、モノマー単位（Ｉ），(II)，（III）は、ケイ素原子が、同種の又は他種のモノマー単位中の、いずれかの酸素原子と結合し、酸素原子が同種の又は他種のモノマー単位中のケイ素原子と結合している。）
【請求項３】
粒子が、２以上の分子の会合体であることを特徴とする、請求項１又は２記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【請求項４】
粒子が、動的光散乱測定法で測定した平均粒径が５〜１０００ｎｍのものであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【請求項５】
粒子が、動的光散乱測定法で測定した平均粒径の分散度が０．４以下のものであることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれかに記載の粒子を含むことを特徴とする、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤，及び一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高血圧は、心筋梗塞や脳梗塞等の原因となるが、この高血圧には、一酸化窒素の欠乏が一因として知られている。また、一酸化窒素の欠乏は、動脈硬化等の原因とも言われている。
【０００３】
一酸化窒素は、一酸化窒素合成酵素（Nitric Oxide Synthase：以下、「NOS」と記載することがある。）により、生体内で産生されることが知られている。
【０００４】
NOSには、神経型一酸化窒素合成酵素（nNOS : neuronal NOS : NOS1），誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS : cytokine inducible NOS : NOS2），血管内皮型一酸化窒素合成酵素(eNOS : endothelial NOS : NOS3）があり、このうち、eNOSは、細胞膜表面の窪み（カベオラ）に存在するカベオリン−１と呼ばれる蛋白質と結合した状態では、不活性化されている。
【０００５】
そして、例えばカルシウムイオン等の作用によって、カベオリン−１との会合状態から解離すると、このeNOSが活性化し、一酸化窒素が合成される。
【０００６】
従って、一酸化窒素の欠乏に起因する疾病の予防や治療には、一酸化窒素の基質となるＬ−アルギニンや、補酵素であるテトラヒドロビオプテリン等を添加する方法や、一酸化窒素合成酵素自体の活性を高める方法等が考えられる。
【０００７】
例えば、従来から、アセチルコリン，サブスタンＰ，ブラジキニン，セロトニン，トロンビン等の生理活性物質を投与する方法等が知られている。
【０００８】
しかしこれらは、「本発明で意図している一酸化窒素合成促進」以外の複数の機能を有する生理活性物質を投与することにより、他の作用を引き起こすという危険を含んでいる。
【０００９】
一方、ある種のポリシロキサン骨格を有する両親媒性高分子が、会合体粒子を形成する事等が知られており、本発明で用いられる化合物も知られている（非特許文献１）。
【００１０】
しかし、この非特許文献１の会合体粒子が、カベオラを経由して細胞内に取りこまれ、一酸化窒素の合成に関与することは、知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】ガラクトース残基を有する両親媒性ポリシロキサンの合成（日本化学会春季年会要旨集，別府孝太郎等，２００６年３月発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者等は、特定のポリシロキサン骨格を有する両親媒性高分子を含む会合体粒子が、細胞のカベオラを通って細胞質内に入る際に、eNOSが刺激されて活性化されることで、一酸化窒素を発生すること，及びそのことによって、高血圧ラットの血圧が、有意に低下することを見出し本発明に到達したものであって、その目的とするところは、生体内で安全と考えられているポリシロキサンを主成分とする高分子会合体を用いた、安全な、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤，及びそれを用いた一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を提供するにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上述の目的は、下記第一の発明から第六の発明によって、達成される。
【００１４】
＜第一の発明＞
ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物を構成成分として含む粒子の、少なくとも１種を含むことを特徴とする、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
（Ａ）脂肪酸由来アシル基
（Ｂ）糖あるいは糖類似の置換基
【００１５】
＜第二の発明＞
ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物が、一分子内に、下記（Ｉ）で表されるモノマー単位をｘ個，（II）で表されるモノマー単位をｙ個，及び（III）で表されるモノマー単位をｚ個含む化合物であることを特徴とする、第一の発明に記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
【化２】
2008280260.tif 000004
【００１８】
【化３】
2008280260.tif 000005
【００１９】
（尚、式中、Ｒ0は、炭素数２〜７の飽和又は不飽和の炭化水素基を表し、Ｒ1は、炭素数９〜１９の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ2は単糖又はオリゴ糖由来の、糖あるいは糖類似の置換基を表す。また、ｘは０以上の整数，ｙ及びｚは１以上の整数，Ｒ0の導入されたモノマー単位の総数（ｘ＋ｙ＋ｚ）は、ポリシロキサンの重合度（ｎ）＝３０〜１００以下の数であり、モノマー単位（Ｉ），(II)，（III）は、ケイ素原子が、同種の又は他種のモノマー単位中の、いずれかの酸素原子と結合し、酸素原子が同種の又は他種のモノマー単位中のケイ素原子と結合している。）
【００２０】
＜第三の発明＞
粒子が、２以上の分子の会合体であることを特徴とする、第一の発明又は第二の発明に記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【００２１】
＜第四の発明＞
粒子が、動的光散乱測定法で測定した平均粒径が５〜１０００ｎｍのものであることを特徴とする、第一乃至第三の発明のいずれかに記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【００２２】
＜第五の発明＞
粒子が、動的光散乱測定法で測定した平均粒径の分散度が０．４以下のものであることを特徴とする、第一乃至第四の発明のいずれかに記載の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤。
【００２３】
＜第六の発明＞
第一乃至第五の発明のいずれかに記載の粒子を含むことを特徴とする、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤は、試験・研究用途，あるいは、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤の有効成分として、利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
＜１＞本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤
【００２６】
（構造）
本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤は、「ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物」を構成成分として含む粒子を、有効成分として含んでいる。
【００２７】
（Ａ）脂肪酸由来アシル基
【００２８】
（Ｂ）糖あるいは糖類似の置換基
（糖類似の置換基とは、糖から誘導されて得られる置換基であり、例えば糖ラクトンが開環して得られる置換基や糖アルコール等を言う。）
【００２９】
また、この「ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物」としては、下記（Ｉ）で表されるモノマー単位をｘ個，（II）で表されるモノマー単位をｙ個，及び（III）で表されるモノマー単位をｚ個含む化合物が好ましいものとして挙げられる。
ここで、アミノ炭化水素塩とは、アルキルアミノ塩，アルケニルアミノ塩，アルキニルアミノ塩等を意味する。
【００３０】
【化４】
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【００３１】
【化５】
2008280260.tif 000007
【００３２】
【化６】
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【００３３】
（尚、式中、Ｒ0は、炭素数２〜７の飽和又は不飽和の炭化水素基を表し、Ｒ1は、炭素数９〜１９の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ2は単糖又はオリゴ糖由来の、糖あるいは糖類似の置換基を表す。また、ｘは０以上の整数，ｙ及びｚは１以上の整数，Ｒ0の導入されたモノマー単位の総数（ｘ＋ｙ＋ｚ）は、ポリシロキサンの重合度（ｎ）＝３０〜１００以下の数であり、モノマー単位（Ｉ），(II)，（III）は、ケイ素原子が、同種の又は他種のモノマー単位中の、いずれかの酸素原子と結合し、酸素原子が同種の又は他種のモノマー単位中のケイ素原子と結合している。）
【００３４】
〈Ｒ0の具体例〉
Ｒ0は、炭素数２〜７の飽和又は不飽和の炭化水素基であるが、Ｒ1の疎水基やＲ2の親水基を無理なく導入するためには、炭素数２〜５のものが好ましく、更に好ましくは、炭素数３である。
【００３５】
ここで、Ｒ0は、直鎖状であっても、分岐していても良いが、Ｒ1の疎水基やＲ2の親水基を無理なく導入するためには、直鎖状であることが好ましい。
【００３６】
Ｒ0は、例えば、まず、アミノ炭化水素基としてアミノアルキル基を導入したアルコキシシランとして導入され、それが酸性条件下、重縮合されてアミノ炭化水素塩導入ポリシロキサンとなる。
【００３７】
アミノアルキル基の具体例としては、例えば、アミノエチル基，アミノプロピル基，アミノブチル基，アミノペンチル基，アミノヘキシル基，アミノヘプチル基等が挙げられる。
塩としては、塩化物等が挙げられる。
【００３８】
〈Ｒ1の具体例〉
Ｒ1は、炭素数９〜１９の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基であるが、炭素数が１１〜１７のものが好ましく、より好ましくは、１３〜１７である。
【００３９】
ここで、Ｒ1は、直鎖状であっても、分岐していても良いが、会合体の形成のためには、直鎖状が好ましい。
【００４０】
Ｒ1は、ポリシロキサンに「Ｒ1Ｃ＝Ｏ」の形で導入されるが、その具体例としては、Ｒ1の炭素数９のものとしてはカプリノイル基，炭素数１１のものとしてはラウロイル基，炭素数１３のものとしてはミリストイル基，炭素数１５のものとしてはパルミトイル基，炭素数１７のものとしてはステアロイル基，オレオイル基，又はリノレオイル基，炭素数１９のものとしてはイコサノイル基等が挙げられる。
【００４１】
上記のうち、会合体形成という点では、特に、ステアロイル基が好ましいと考えられる。
【００４２】
〈Ｒ2の具体例〉
Ｒ2は、オリゴ糖由来の、糖あるいは糖類似の置換基である。
糖類似の置換基とは、例えば、糖ラクトンが開環した置換基や糖アルコール等を意味する。
【００４３】
Ｒ2の、単糖由来の糖ラクトンとしては、化合物が安価に入手できると言う理由から、例えば、グルコースやガラクトース由来の糖ラクトン等が好ましいものとして挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
【００４４】
Ｒ2の、二糖由来の糖ラクトンとしては、化合物が安価に入手できると言う理由から、例えば、ラクトース，マルトース，セロビオース由来の糖ラクトン等が好ましいものとして挙げられるが、これらに限定されるものでは無い。
【００４５】
尚、ラクトース由来の糖ラクトンは、ラクトビオノラクトンと言う名称でも呼ばれ、本発明においては、ラクトビオノラクトンが開環してポリシロキサンの置換基となるものであり、その構造式は、下記式（IV）によって表されるものである。
【００４６】
【化７】
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【００４７】
〈ポリシロキサンの重合度（ｎ）〉
ポリシロキサンの重合度（ｎ）＝３０〜１００であるが、４０〜８０が好ましく、更に好ましくは、５０〜７０である。
尚、モノマー単位（Ｉ）の個数であるｘは０以上の整数，モノマー単位（II）及び（III）の個数であるｙ及びｚは１以上の整数を表し、Ｒ0の導入されたモノマー単位の総数（ｘ＋ｙ＋ｚ）は、当然、ポリシロキサンの重合度（ｎ）以下の数となる。
【００４８】
〈置換基導入前のポリシロキサンの分子量〉
本発明の化合物の原料として用いられる、アミノ炭化水素塩導入ポリシロキサン（（Ａ）及び（Ｂ）は未導入）の分子量としては、例えば、アミノ炭化水素塩が、塩化３−アミノプロピル基であった場合、プルランを分子量の標準試料とした、サイズ排除クロマトグラフィーによる測定値で、５０００〜２００００が好ましく、特に好ましくは、８０００〜１２０００である。
【００４９】
尚、本発明の化合物に用いられるポリシロキサンは、本発明の、会合体の形成や、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤としての性質に悪影響を及ぼさない範囲で、他の高分子の構成単位を用いて、ランダム共重合体等としても良く、また他の高分子とブレンドしても良い。
また、一つの種類のポリシロキサンを単独で用いても良く、複数種のポリシロキサンをブレンドして用いることもできる。
しかし、均一な会合体を形成させるためには、単一の構成単位を用いた高分子を一種類だけ用いることが好ましい。
【００５０】
共重合の場合の、シロキサン単位の含有比率は、特に限定されないが、均一な会合体を形成させるためには、高分子を構成するモノマー単位中、シロキサン単位として大凡７０％以上であることが好ましく、更に好ましくは８０％以上，特に好ましくは９０％以上である。
【００５１】
（本発明に用いられる化合物の製法）
本発明に用いられる、「ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物」は、まず、アミノアルキル基を導入したアルコキシシランの重縮合で得られたポリシロキサンに、公知の置換基導入方法によって（Ａ）及び（Ｂ）を導入することで製造することができる。
【００５２】
尚、（Ａ）及び（Ｂ）の導入順序は特に限定されるものでは無いが、一般には、（Ｂ）の糖類よりも、（Ａ）の脂肪酸由来アシル基の方が、空間に占める割合が小さく、以降の置換において、立体的な障害となりにくいと考えられるため、先に（Ａ）を導入するのが好ましいと考えられる。
【００５３】
(1) アミノ炭化水素塩の導入
ポリシロキサンに、アミノ炭化水素塩を、側鎖として導入する方法としては、アミノアルキル基を導入したアルコキシシランを重縮合してポリシロキサンとする等の方法が挙げられる。
【００５４】
アミノ炭化水素塩の導入比率は、アミノ炭化水素基を導入したアルコキシシランの使用比率に相関するため、アミノ炭化水素基を含まないアルコキシシランとの使用比率を変化させることによって、導入比率を調整可能である。
導入比率は、技術的には、数％〜１００％程度まで可能であるが、十分量の（Ａ）や（Ｂ）をポリシロキサンに導入し、会合体を形成させるには、５０〜１００％が好ましく、更に好ましくは６０〜１００％，特に好ましくは７０〜１００％程度である。
【００５５】
(2)（Ａ）の導入
アミノ炭化水素塩への（Ａ）の導入方法としては、例えばトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）等の存在下、（Ａ）に関連する脂肪酸塩化物（脂肪酸クロライド等）等との反応による、アミド結合の生成反応等が挙げられる。
【００５６】
ここで、トリエチルアミンには、ポリシロキサンに導入された塩化アンモニウム（アミノ炭化水素塩由来）の、塩酸を除去する役割と、反応で生成する塩酸を除去する役割がある。
【００５７】
（Ａ）の導入比率は、（Ａ）の添加量に相関するため、添加量を変化させることによって、導入比率を調整可能である。
導入率は、技術的には、数％〜２０％程度まで可能であるが、ポリシロキサンに、確実に会合体を形成させるには、１〜１５％が好ましく、更に好ましくは２〜１０％程度である。
【００５８】
(3)（Ｂ）の導入
アミノ炭化水素塩への（Ｂ）の導入方法としては、例えばトリエチルアミン等の存在下、糖ラクトンのカルボニル炭素への開環反応等の方法が挙げられる。
【００５９】
ここで、トリエチルアミンには、ポリシロキサンに導入された塩化アンモニウム（アミノ炭化水素塩由来）の、塩酸を除去する役割がある。
【００６０】
（Ｂ）の導入比率は、（Ｂ）の添加量に相関するため、添加量を変化させることによって、導入比率を調整可能である。
導入比率は、技術的には、数％〜９５％程度まで可能であるが、ポリシロキサンに、確実に会合体を形成させるには、２０〜９０％が好ましく、更に好ましくは４０〜８０％程度である。
但し、（Ａ）を先に導入した場合には、残ったアミノ炭化水素塩にしか結合できないため、その場合には、上記の好ましい範囲は、低下することになる。
【００６１】
（性質）
例えば上記の様にして製造される、「ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物」は、溶液中で会合体粒子を形成し得るという性質を有しており、この粒子は、特別な細胞導入操作を行うことなく、細胞膜のカベオラを経由して細胞内に取りこまれるという性質を有している。
そしてこの粒子は、細胞内に取りこまれる際に、eNOSを活性化し、一酸化窒素の発生量を増加させる性質を有している。
【００６２】
（用途）
本発明で用いられる上記の粒子は、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤として用いることができる。
【００６３】
〈本発明に用いられる粒子〉
尚、本発明に用いられる粒子には、上記の、一分子内に、下記（Ｉ）で表されるモノマー単位をｘ個，（II）で表されるモノマー単位をｙ個，及び（III）で表されるモノマー単位をｚ個含む化合物等に代表される、「ポリシロキサンの側鎖として導入されたアミノ炭化水素塩の少なくとも一部が下記（Ａ）及び（Ｂ）で置換されている化合物」を、少なくとも一部に含んでいることが必要であるが、他の化合物とともに粒子を形成していても良い。
【００６４】
この粒子は会合体であることが好ましい。
会合体とは、複数の分子が、分子間に作用するファンデルワールス（Van der Waals）力，水素結合，疎水性相互作用などの非共有結合に基づく分子間相互作用によって緩く結合しているものを言い、その結合距離も、共有結合よりは長いものの、ある程度安定な状態を保っているものを言う。
【００６５】
本発明の粒子の原料として用いられる化合物は、それ自身に親水基と疎水基を併せ持つ、両親媒性高分子であるため、溶媒中に存在させるだけで、分子間相互作用により、自発的に会合体を形成することができるが、分子の溶媒への分散性を向上させるために、超音波処理などを行うこともある。
この会合体の大きさは、親水基と疎水基のバランス等によって決まるため、本発明の粒子の原料として用いられる化合物への、親水基と疎水基の導入量をコントロールすることによって、会合体粒子の大きさをコントロールすることも可能である。
【００６６】
〈粒子の平均粒径〉
本発明の粒子の動的光散乱測定法で測定した平均粒径は、５〜１０００ｎｍであることが好ましいが、粒子の取り込みがエンドサイトーシスの機構を利用するものであり、ミクロドメインであるカベオラを経由することが、NOS活性化の主たる原因であると考えられる点を考慮すると、カベオラのサイズに近い、１０〜１００ｎｍであることが好ましい。
【００６７】
動的光散乱測定法とは、公知の粒径測定方法であって、一定の媒体，一定の温度，一定の粘度であれば、一定のブラウン運動を示すと仮定し、溶液中の粒子のブラウン運動を光散乱法により検出し、粒子の大きさを算出する方法である。
具体的には、例えば、Malvern社製のZetasizer Nano等を用いて測定することができる。
【００６８】
〈粒子径の分散度〉
粒子径の分散度とは、上述の動的光散乱測定法で求まる流体力学的半径（Stokes半径）の分布幅であり、キュムラント法解析により、PD.I=μ２/Γ2と定義される値である。
（Γは減衰定数を表し、μは二次のモーメントを表す。）
【００６９】
この値が大きくなるほど、粒子サイズのばらつきが大きいこと、つまりいろいろなサイズの粒子が存在することを意味する。
【００７０】
本発明に用いられる粒子の粒子径分散度については、一酸化窒素の発生量に影響を与えない範囲であれば、特に限定されるものでは無いが、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤として使用する場合には、品質の安定性等の観点から、分散度は０．４以下であることが好ましく、特に０．３以下であることが好ましい。
【００７１】
〈他の成分〉
本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤は、上記の粒子を、少なくとも１種含んでいることが必要であるが、他の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化作用を有する物質を含んでいても良く、また、血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化作用を阻害しない範囲で、他の一般の添加剤を用いても良い。
【００７２】
本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤を、実験・研究試薬等に用いる場合には、細胞内への粒子の取り込み量を確認できるように、粒子の原料として用いられる化合物に、フルオレセインその他の蛍光標識等を導入することが好ましい。
導入する位置としては、例えば、親水基と疎水基の導入後の際に余っているアミノ炭化水素塩等が考えられる。
【００７３】
＜２＞本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤
【００７４】
（主成分）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤は、上記＜１＞の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤に含まれるのと同様の粒子を含むことを特徴とする。
【００７５】
（濃度）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤中の、有効成分としての血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤の含有量は、特に限定されるものでは無いが、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤全量中、例えば０．０５〜１０ｍｇ／ｍｌ，好ましくは０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌ等とすることができる。
【００７６】
（第２成分）
また、本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤としての性質に悪影響を及ぼさない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，矯味矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤，充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。
【００７７】
賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。
【００７８】
（剤形）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤は、注射剤，カテーテル用液剤，経口用液剤，細胞処理液，組織処理液等の、液剤の形態が好ましく、中でも、移植細胞を処理する場合の細胞処理液，組織処理液が好ましい。
【００７９】
（製法）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤は、上記の主成分である血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤と、他の成分各々を、常温，常圧下で混合する等の方法によって、得ることができる。
【００８０】
＜３＞本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を用いた予防又は治療方法
【００８１】
（投与方法）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を、筋肉，血管，臓器その他の組織に投与する場合の投与方法としては、経口投与，カテーテル投与，静注等の静脈投与，筋肉内投与，経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与、吸入等が挙げられるが、安全かつ血中濃度を一定に保つという点では、静注等の静脈投与が好ましい。
マウスやラット等の実験動物への投与の場合には、尾静脈注射等の方法も挙げられる。
【００８２】
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を、試験・研究，あるいは再生治療等のため、培養細胞等の細胞内に投与するには、本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を、細胞を浸積した細胞処理液，組織処理液等の溶液に添加すれば良く、細胞内へ導入する操作を特別に行う必要は無い。
【００８３】
（投与形態）
本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤の剤形は、注射剤やカテーテル用液剤，経口用液剤等の形態が挙げられるが、必ずしもこれらに限られるものでは無い。
【００８４】
（投与量）
投与量は、標的となる組織や細胞の種類，数，疑われている疾患の種類，進行度，患者の年齢，性別，体重等により適宜調整することができ、必ずしも限定されるものでは無いが、一般に、下記の量が選択し得る。
【００８５】
経口，経皮，注射等によって、組織に投与する際には、１回の投与量は、通常粒子量として、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０００ｍｇ、より好ましくは０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。
【実施例】
【００８６】
以下、本発明を、実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限られるものでは無い。
【００８７】
［実施例１］
(1)両親媒性高分子の製造
アミノ炭化水素塩含有ポリシロキサンを用い、図１〜図３に示した、下記のステップからなる合成スキームに従い、本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤の成分である粒子の、構成成分となる、両親媒性高分子を製造し（ステップ１〜２）、更にそれに蛍光標識を導入した（ステップ３）。
【００８８】
尚、このスキームでは、糖あるいは糖類似の置換基として、ラクトビオノラクトンを用いているが、これに限定されるものでは無い。
また、各ステップにおいて、酸素原子とケイ素原子の結合を表している波線（〜〜〜）は、モノマー単位中のケイ素原子が、隣接するモノマー単位中の、いずれかの酸素原子と結合していること，及び酸素原子が隣接するモノマー単位中のケイ素原子と結合していることを示している。
このスキームでは、ポリシロキサンの出発原料として、アミノ炭化水素基を導入したアルコキシシランのみを用いている例を示しており、ポリシロキサンの重合度（ｎ）は、Ｒ0の導入されたモノマー単位の総数（ｘ＋ｙ＋ｚ）と一致しているが、本発明の化合物が、このように全てのシロキサン単位にＲ0が導入されたものに限定される訳では無い。
【００８９】
［ステップ１］疎水基（Ａ：脂肪酸由来アシル基）の導入（図１）
アミノ炭化水素塩（図中のＲ0ＮＨ3Ｃｌ）として、３−アミノプロピル基含有ポリシロキサンを用い、これに対し、水／ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）混合溶媒中、トリエチルアミンの存在下、室温にて脂肪酸塩化物（図中のＲ1ＣＯの塩化物）として、塩化ステアロイルを反応させることにより、長鎖アルキル基含有ポリシロキサンを得た。
【００９０】
［ステップ２］親水基（Ｂ：糖類）の導入（図２）
次に、ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）中、トリエチルアミンの存在下、８０℃で、ラクトビオノラクトンを反応させることにより、両親媒性ポリシロキサンを得た。
【００９１】
［ステップ３］蛍光標識の導入（図３）
更に、ＤＭＳＯ中、トリエチルアミンの存在下、６０℃で、フルオレセインイソチオシアネートを反応させることによって、蛍光標識化両親媒性ポリシロキサンを製造した。
【００９２】
この蛍光標識化両親媒性ポリシロキサンに導入された３−アミノプロピル基への、Ａ，Ｂ，及び蛍光標識の導入比率は、下記の通りであった。
【００９３】
Ａ（ステアロイル）：１０．８％
Ｂ（ラクトビオノラクトン）：４１％
蛍光標識：９．３％
残存アミノプロピル基：３８．９％
【００９４】
(2)会合体の形成
ヒト大動脈由来血管内皮細胞（Human aortic endothelial cells :以下、「ＨＡＥＣｓ」と記載することがある。）の培養に適した液体培地（ＥＧＭ−２：Cambrex 社製，牛血清２％含有）に、上記で製造した蛍光標識化両親媒性ポリシロキサンを加えて３時間攪拌し、超音波処理（２５Ｗ，４５ｋＨｚ，５分間）を２回行った。
この分散液を、フィルター（ポアサイズ：０．４５μｍ及び０．２２μｍ）で濾過することにより、滅菌処理を行った。
【００９５】
フルオレセインラベル化親水性ポリシロキサン溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を標準試料とし、フルオレセインの発光強度のポリマー濃度依存性を測定することにより、分散液中の、本発明の両親媒性ポリシロキサンの濃度を定量したところ、６０μｇ／ｍｌであった。
【００９６】
この分散液中のポリマー会合体の粒子径を、動的光散乱法により評価した。
会合体の粒子径は、１２４ｎｍ／分散度０．２８５であった。
【００９７】
［試験例１：eNOS活性化剤のカベオラ経由による細胞内取り込みの確認試験］
１２ウェルプレートの各ウェルに、ＨＡＥＣｓ用の液体培地（ＥＧＭ−２：Cambrex 社製）を１ｍｌ加えた。
ＨＡＥＣｓ（Lot 3F1346：Cambrex 社製）の細胞懸濁液（０．５５×１０6cells/ml：生存率８０％）をプレートの各ウェルに１０μｌずつ入れることによって、細胞を播種した。
細胞播種後、プレートをインキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）に移して、培養を開始した。
【００９８】
培養開始より４８時間後、各ウェルの培地を取り除き、上記実施例１のポリマー分散液を各ウェルに６００μｌずつ加え、蛍光標識化両親媒性ポリシロキサンの細胞への取り込みの観察を開始した。ポリマー含有培地に交換後、ポリマーとの相互作用を観察するため、１時間，３時間，６時間後，２４時間の各段階で、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡観察を行った。
その結果を、図４に示す。
【００９９】
ポリマーの取り込み開始後、経時的に、細胞からの発光強度が次第に強くなることと（図示せず）、発光の生じている部分が細胞膜近傍から細胞質内（核周辺）へと移動していること（図４）が確認できた。
尚、両親媒性粒子が存在する環境下における細胞の基板からの脱着，細胞死などの現象は、観察されなかった。
【０１００】
さらに、カベオラを形成するタンパク質であるカベオリン−１に対する、抗カベオリン−１抗体およびこれに対するローダミンラベル化二次抗体による免疫染色により、両親媒性粒子は血管内皮細胞の膜ミクロドメインであるカベオラを経由するエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれることが明らかとなった。
【０１０１】
尚、エンドサイトーシスによる、本発明の両親媒性粒子会合体の細胞内への取り込みの様子を表すイメージ図を、図５に示した。
【０１０２】
［試験例２：eNOSの活性化確認試験］
（eNOS活性化剤分散液の細胞内への取込）
直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ上で、ヒト大動脈由来血管内皮細胞を、ＥＧＭ−２培地で培養した後、このＥＧＭ−２培地を、本発明のeNOS活性化剤分散液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含む、ＥＧＭ−２培地で交換し、６時間インキュベートした。
【０１０３】
（eNOSの局在化の確認）
eNOSの細胞内での位置を確認するため、eNOSに対する免疫染色を行い、蛍光顕微鏡観察を行った結果を図１０に示す。
【０１０４】
また、同じ位置について、位相差顕微鏡法で撮影した写真に、図１０の蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた結果を、図１１に示す。
これによって、eNOSの局在位置が、核周辺であることが一層明確になった。
【０１０５】
尚、コントロールとして、本発明のeNOS活性化剤分散液添加前の様子を観察した結果を、図６，図７に示した。
【０１０６】
また、比較のため公知のeNOS活性化剤であるブラジキニン（１μＭ）の添加５分後の様子を観察した結果を、図８，図９に示した。
【０１０７】
ブラジキニンと本発明のeNOS活性化剤の場合で、添加から観察までの時間が異なるのは、ブラジキニンの場合、添加後５〜２０分を超えると、eNOSが再び細胞膜に結合して不活性化してしまうため、活性化状態で比較するには、この間に観察する必要があるからである。
【０１０８】
（図６〜１１の考察）
図１０から分かる通り、本発明のeNOS活性化剤添加６時間後に、コントロールでは細胞の周縁部分に存在していたeNOS（図６）が、細胞核の周辺に局在していた（図１０）。
【０１０９】
尚、本発明のeNOS活性化剤を添加した場合の図１０，１１は、公知のeNOS活性化剤であるブラジキニンの添加５分後に観察した図８，９に極めて類似していた。
【０１１０】
つまり、以上の結果から、本発明のeNOS活性化剤の取り込みによって、ブラジキニンによる刺激の場合と同様に、細胞の周縁部分に局在していたeNOSが活性化を受け、それに伴って細胞質に移行し、核の周辺に局在することが分かった。
【０１１１】
［試験例３： eNOS活性化剤による一酸化窒素発生量増加確認試験］
実施例１のポリマー分散液（０．１ｍｇ／ｍｌ）と、公知のeNOS活性化剤であるブラジキニン（１μＭ）の、NO産生誘導効果を比較した。
【０１１２】
（eNOS活性化剤分散液の細胞内への取込）
直径３５ｍｍのポリスチレンディッシュ上で、ヒト大動脈由来血管内皮細胞を、ＥＧＭ−２培地で培養した後、このＥＧＭ−２培地を、本発明のeNOS活性化剤分散液（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含む、ＥＧＭ−２培地で交換し、６時間インキュベートした。
【０１１３】
NO産生量の測定は、下記の方法で行った。
【０１１４】
（一酸化窒素（NO）の検出）
NO検出試薬として、「DAR-4M AM」（第一化学薬品株式会社製：Diaminorhodamine-4M acetoxymethyl ester）を用いた。
【０１１５】
「DAR-4M AM」は、細胞膜を透過する性質を有しているが、細胞内に入ると、エステラーゼにより加水分解され、細胞膜を透過しにくい「DAR-4M」に変化する。そしてこの「DAR-4M」が、細胞内に産生されたNOと反応して、「DAR-4M T」を発生する。
つまり、この「DAR-4M T」を検出することで、細胞内でのNO発生を観察できる。
【０１１６】
「DAR-4M AM」（５０μＭ）溶液で、eNOS活性化剤分散液を交換し、１０分間インキュベーションを行った。
【０１１７】
細胞内に取り込まれなかった余分なDAR-4M AMを除去するため、ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地：フェノールレッド及び血清は含まない）で、「DAR-4M AM」溶液を交換し、更に１５分間インキュベーションを行った。
【０１１８】
この試料を、顕微鏡ステージに設置した保温プレート上に置き、細胞の産生するNOと反応した結果生じる「DAR-4M T」に由来する、赤色の蛍光強度を測定し、その結果を、図１２に示す。
【０１１９】
図１２から、実施例１のポリマー分散液でも、ブラジキニンと同程度にNO産生が誘導されていることが確認された。
尚、図中のL-NAME（Nω-Nitro-L-arginine methyl ester）とは、eNOS阻害剤のデータ（コントロール）である。
【０１２０】
［試験例４］
食塩感受性ラットDahl-S（日本SLCより入手）に対し、高塩分の餌を与え、１９週齢まで飼育し、血圧２００mmHg以上の高血圧ラットを得た。
【０１２１】
このラットに対する、本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤の投与実験を行った。
本発明のeNOS活性化剤を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する生理食塩水（１ｍｌ）を、ラットの尾静脈より投与し、血圧の変化を投与後２４時間にわたり、経時的に観察し、その結果を図１３に示す。
尚、図中の「個体−１，２，３」とは、本試験で用いたラットに便宜的に付与した、個体番号である。
【０１２２】
図から分かる通り、投与後、３時間経過するころから血圧の低下がみられ、投与後、１２時間において収縮期血圧（図中の実線）が２１０ｍｍＨｇであったのが１７０−１５０ｍｍＨｇに、拡張期血圧（図中の破線）が１５０ｍｍＨｇであったのが、１００ｍｍＨｇまで低下することが明らかとなった。２４時間経過後も、収縮期血圧が１８０ｍｍＨｇ、拡張期血圧が１１０−１００ｍｍＨｇを維持していることが判明した。
【０１２３】
この結果は、本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤が、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤として有用であることを示している。
【０１２４】
尚、正常血圧を示すラットに対しても、上記と同様に、本発明のeNOS活性化剤の投与実験を行い、投与後６時間まで観察した。
その結果、本発明のeNOS活性化剤の投与によっても、収縮期，及び拡張期ともに、非投与群と比べて血圧の変化は見られなかった。
これは、本発明のeNOS活性化剤が、毒性その他の副作用を持たず、安全である可能性が高いことを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明は、NOSの一酸化窒素発生能力に関わる各種実験・研究の試験試薬としての利用のほか、一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】アミノ炭化水素塩含有ポリシロキサンに、疎水基を導入し、長鎖アルキル基含有ポリシロキサンを得る、合成スキーム（ステップ１）を表す図である。
【図２】長鎖アルキル基含有ポリシロキサンに、親水基であるラクトビオノラクトンを導入し、両親媒性高分子を得る合成スキーム（ステップ２）を表す図である。
【図３】両親媒性高分子に蛍光標識を導入する合成スキーム（ステップ３）を表す図である。
【図４】蛍光標識を付した本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤が、細胞膜のカベオラを経由してエンドサイトーシスによって細胞内に取りこまれる様子を示す顕微鏡写真を表す図である。
【図５】本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤が、細胞内に取り込まれる様子を表す、イメージ図である。
【図６】血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤を細胞に取りこませる前の、eNOSの細胞における局在化の状況を示した、免疫染色法による蛍光顕微鏡観察（コントロール）の結果を表す図である。
【図７】血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤を細胞に取りこませる前の、位相差顕微鏡法で撮影した写真に、図６の蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた結果を表す図である。
【図８】公知の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤であるブラジキニンが細胞に取りこまれた５分後に、eNOSが、細胞核周辺に局在化している状況を示す、免疫染色法による蛍光顕微鏡観察の結果を表す図である。
【図９】公知の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤であるブラジキニンが細胞に取りこまれた５分後の、位相差顕微鏡法で撮影した写真に、図８の蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた結果を表す図である。
【図１０】本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤が細胞に取りこまれた６時間後、eNOSが、細胞核周辺に局在化している状況を示す、免疫染色法による蛍光顕微鏡観察の結果を表す図である。
【図１１】本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤が細胞に取りこまれた６時間後の、位相差顕微鏡法で撮影した写真に、図１０の蛍光顕微鏡写真を重ね合わせた結果を表す図である。
【図１２】本発明の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤によって、血管内皮細胞の一酸化窒素の産生量が、公知の血管内皮型一酸化窒素合成酵素活性化剤であるブラジキニンと同程度に増加したことを示す図である。
【図１３】本発明の一酸化窒素欠乏に起因する疾病の予防又は治療剤を投与した場合、高血圧ラットの血圧が有意に低下したことを示す図である。図中の実線は、収縮期血圧，破線は拡張期血圧を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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