(57)【要約】【課題】検査試料中の核酸濃度を所定の核酸濃度を閾値として所定の濃度より高いか低いかを正確に判定可能にすること。【解決手段】核酸を含む検査試料の吸光度を測定することにより所定の濃度を閾値として、検査試料の核酸濃度が所定の濃度より高いか低いかを判定するにあたり、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の濃度を波長２６０ｎｍに換算した値より高く、かつ波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度より高い場合に、検査試料の核酸濃度が所定の濃度より低いと判定する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも高いか低いかを判定する方法において、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項２】
検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも高いか低いかを判定する方法において、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より小さい場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項３】
前記所定の核酸濃度を１〜１００ｎｇ／μＬの値に設定することを特徴とする請求項１または２記載の検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項４】
前記所定の核酸濃度を３〜５０ｎｇ／μＬの値に設定することを特徴とする請求項１または２記載の検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項５】
前記検査試料が尿由来の抽出核酸であることを特徴とする請求項１または２記載の検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項６】
前記核酸がゲノムＤＮＡであることを特徴とする請求項１または２に記載の検査試料中の核酸濃度の判定方法。
【請求項７】
波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、検査試料の分取量または投入量を調節するステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸分析方法。
【請求項８】
検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも高いか低いかを判定する方法において、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より小さい場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、検査試料の分取量または投入量を調節するステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸分析方法。
【請求項９】
波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度より低い場合、検査結果の採否の判定を行うステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸分析方法。
【請求項１０】
検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも高いか低いかを判定する方法において、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より小さい場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度より低い場合、検査結果の採否の判定を行うステップを含むことを特徴とする検査試料中の核酸分析方法。
【請求項１１】
波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、この検査試料を希釈または濃縮するステップを含むことを特徴とする試料中の核酸分析方法。
【請求項１２】
検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも高いか低いかを判定する方法において、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲における検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より小さい場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップの後、この検査試料を希釈または濃縮するステップを含むことを特徴とする試料中の核酸分析方法。
【請求項１３】
検査試料の吸光度を測定する機構と、測定した検査試料の吸光度を全て記憶する機能と、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度と所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度を比較する機能と、本比較により検査試料の吸光度が高い場合に検査試料の波長２６０ｎｍと検査試料の波長２２０ｎｍ以上波長２６０ｎｍ未満の全ての吸光度を比較する機能と、検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の全ての吸光度が検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度よりも高い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する機能を有することを特徴とする検査試料の核酸濃度の判定装置。
【請求項１４】
検査試料の吸光度を測定する機能と、測定した検査試料の吸光度を全て記憶する機能と、測定した波長２６０ｎｍの吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０よりも低い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する機能を有することを特徴とする検査試料の核酸濃度の判定装置。
【請求項１５】
判定した検査試料の核酸濃度に応じて検査試料の分取量または投入量を調節する機構を有することを特徴とする請求項１３または１４記載の判定装置。
【請求項１６】
判定した検査試料の核酸濃度に応じて検査結果の採否を決定する機能を有することを特徴とする請求項１３または１４記載の検査試料の核酸濃度の判定装置。
【請求項１７】
判定した検査試料の核酸濃度に応じて検査試料を希釈または濃縮する機構を有することを特徴とする請求項１３または１４記載の検査試料の核酸濃度の判定装置。
【請求項１８】
前記所定の核酸濃度を１〜１００ｎｇ／μＬの値に設定する手段を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の検査試料中の核酸濃度の判定装置。
【請求項１９】
前記所定の核酸濃度を３〜５０ｎｇ／μＬの値に設定する手段を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の検査試料中の核酸濃度の判定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸光度測定法を用いて検査試料中の核酸濃度を判定する方法、検査方法およびその装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料より抽出した核酸を用いて遺伝子検査を行う場合、核酸量が検査精度、検査成功率に大きく関わる。例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により検査領域を増幅し、増幅した対立遺伝子の量比を検査するＬＯＨ検査の場合、ゲノムＤＮＡ量が低下すると正確な検査結果が得られない。そこで検査結果の信頼性を維持するために、定量性の高い濃度測定が必要である。また、ＤＮＡシーケンサを用いるフラグメント解析において、ある一定値以上の核酸濃度の検査試料を用いた場合、測定値が検出レンジを超過するため、検査試料を希釈して再度解析しなければならない。また、個人鑑定におけるＳＴＲ検査では、ＳＴＲ反応の確実性を高めるため、ヒトゲノムＤＮＡで０．２５ｎｇ〜２ｎｇ程度の狭い範囲での核酸試料溶液濃度が要求される（非特許文献１）。
【０００３】
上記例に示すように検査試料の核酸濃度が検査結果に影響する場合、検査試料中の核酸濃度の測定が必要である。従来の核酸濃度の測定方法としては２本鎖核酸または１本鎖核酸に特異的に結合する蛍光物質を用いた蛍光発光測定法や蛍光分子の結合したプローブを核酸にハイブリダイゼーションする方法を用いた核酸濃度測定法や、プローブをハイブリダイゼーションし、増幅反応後、増幅反応の副産物であるピロリン酸を化学発光法や電気化学的に検出する方法等が用いられている。これらの測定法は、検査試料中に蛋白等の混入があっても極めて高い精度で核酸濃度を測定できる。しかし、測定に試薬の添加が必要なため測定コストが高く、また、検査試料が測定範囲に入らない場合、検査試料の濃度を変えて再測定を行う必要があり、測定に手間や時間のかかる方法である。また、濃度を測定した後に濃度測定に用いた検査試料は検査に使用できず、希少な検査試料の損失に繋がる問題があった。
【０００４】
一方、吸光度測定法は、検査試料の吸光度を測定し、波長２６０ｎｍにおける吸光度（以下、Ａ２６０）から核酸濃度を換算できる。また、波長２６０ｎｍと波長２８０ｎｍの吸光度比（以下、Ａ２６０／Ａ２８０）から核酸純度を評価できる（非特許文献２）。当該試料に、蛋白成分が混入した場合は、波長２８０ｎｍの吸光度が上昇し、糖質、ペプチド、低分子成分が混入した場合は、波長２３０ｎｍでの吸光度が上昇する（非特許文献３）。当該測定法は簡便で試薬添加の必要もない低コストな方法であるが、検査試料中の蛋白成分や糖質、ペプチド、フェノール等の芳香族化合物等の混入も吸光度に影響するため、正確な核酸濃度の測定が困難な場合がある。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．２００１  Ｍａｙ；４６（３）：６４７−６０．
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：４７４−４８１
【非特許文献３】Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｏｒ  ＲＮＡ．ＭｏｌｅｃｕＬａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ３：Ａ８．２０−Ａ８．２１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の遺伝子検査における課題として、生体試料から抽出した検査試料において蛋白成分や糖質、ペプチド、低分子等が混入した場合、検査試料中の核酸濃度を正確に測定できない問題があった。特に、検査試料中の核酸濃度が低い場合に従来法の波長２６０ｎｍの吸光度を用いた核酸濃度の測定法では、実際の核酸濃度よりも測定値が高くなる問題が発生することが判明した。したがって、従来法のみでは測定した濃度に従って検査に求められる濃度範囲になるように検査試料濃度を調整しても、測定範囲内で検査できずに検査不良となる問題があった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、検査試料中の核酸濃度が所定の値よりも高いか低いかを判定するに当たり、少なくとも波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下で検査試料の吸光度を測定し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度と所定の核酸濃度から波長２６０ｎｍにおける吸光度に換算した換算値よりも低い場合に、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する従来の判定方法に加え、従来の判定方法で検査試料の核酸濃度が高いと判定された場合、検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合に、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップと、測定した波長２６０ｎｍの吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満におけるいずれかの吸光度が０より低い場合、検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定するステップを実施する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検査試料を所定の濃度を閾値として所定の濃度より高いか低いかを、従来の方法よりも高い精度で判定することが可能になる。特に、検査試料中の核酸濃度が低い場合、従来法では実際の核酸濃度よりも測定値が高く判定される問題を回避することが可能となる。したがって、前もって測定範囲外の検査試料群の濃度を調節できるようになるので、検査回数を減らして検査コストを低減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の好ましい実施形態の１つは、吸光度測定法により検査試料の吸光度を少なくとも波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲で測定し、（Ａ）検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度と所定の核酸濃度を波長２６０ｎｍにおける吸光度に換算して比較し、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度が所定の濃度からの換算値よりも低い場合に、検査試料の核酸濃度が上記所定の濃度よりも低いと判定する判定条件に加え、（Ｂ）検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の範囲における全ての吸光度が、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度よりも高い場合に、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する判定条件を含み、さらに、（Ｃ）波長２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より小さい場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する。そして、いずれの判定条件においても、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度より低いと判定されない場合は、検査試料の核酸濃度は所定の核酸濃度より高いと判定する。
【００１０】
また、判定条件Ａにおいて、検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度を核酸濃度に換算し、所定の核酸濃度と比較して、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低い場合でも、検査試料の核酸濃度が所定の濃度より低いと判定できる。また、判定条件Ｂにおいて、より好ましくは、波長２５０ｎｍから２３０ｎｍの全ての吸光度と所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍにおける吸光度を比較し、波長２５０ｎｍから２３０ｎｍの全ての吸光度が、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度よりも高い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する。
【００１１】
また、上記所定の濃度を１〜１００ｎｇ／μＬの値に設定することができ、特に３〜５０ｎｇ／μＬの値に設定することが好ましい。前記検査試料が尿由来の抽出核酸であっても良く、測定する核酸がゲノムＤＮＡであってもよい。
【００１２】
本発明の更に他の実施形態は、上記検査試料中の核酸濃度が所定の濃度より高いか低いかを判定した後、検査試料投入量を調節するステップを含む検査試料中の核酸分析方法である。更に又、上記検査試料中の核酸濃度の判定後、所定の核酸濃度より低い検査試料の検査結果の採否を判定することができる。また、上記検査試料中の核酸濃度の判定方法後、判定された検査試料を、希釈または濃縮するステップを含むことができる。
【００１３】
本発明の更に他の好ましい実施形態は、検査試料の吸光度を測定する機構と、得られた検査試料の吸光度を全て記憶する機能と、検査試料の濃度を判定するための閾値として予め決める所定の核酸濃度を設定する機能と、吸光度に対応した核酸濃度のデータベース機能、または、吸光度を核酸濃度に換算する、または核酸濃度を吸光度に換算する演算機能と、前記データベースまたは、演算機能を用いて、検査試料の核酸濃度と所定の核酸濃度を比較し、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低い場合に、検査試料の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する機能と、検査試料の濃度が所定の濃度よりも高いと判定された場合に、検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の全ての吸光度が、検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度よりも高い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する機能と、検査試料の濃度が所定の濃度よりも高いと判定された場合に、検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満のいずれか吸光度が０よりも低い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する機能を有する検査試料の核酸濃度判定装置である。
【００１４】
本発明は、生体試料より抽出された１８５種類のゲノムＤＮＡ溶液に対して波長２２０ｎｍから波長３５０ｎｍの範囲で吸光度曲線を精査した結果、低濃度の検査試料に特有のパターンを発見し、本発明に至ったものである。
【００１５】
すなわち、本発明は、生体試料より抽出された核酸を含む検査試料であり、かつ、当該試料の核酸濃度範囲が、次工程に求められる核酸濃度範囲と異なる検査試料に対して、図１に示す方法を用いて、より正確に所定の濃度を閾値として所定の濃度より高いか、低いかを判定し、次工程における検査不良を低減または検査信頼性を向上できる方法を提供する。以下、図を用いて、本発明の手順について説明する。
【００１６】
図１において、１は吸光度測定するステップ、２は吸光度を核酸濃度に換算するステップ、３は換算値を所定濃度と比較するステップ、４は吸光度比較ステップ、５は吸光度評価ステップ、６は所定濃度より高い試料と判定するステップ、７は所定濃度より低い試料と判定するステップである。
【００１７】
ステップ１：吸光度測定法を用いて、検査試料の波長を少なくとも２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下の範囲で測定する。
【００１８】
ステップ２：図１に示す判定条件Ａ、Ｂ、Ｃを用いて、検査試料を所定の濃度を閾値として、所定の濃度より高いか低いかを判定する。
【００１９】
（Ａ）検査試料のＡ２６０における核酸濃度換算値が所定の濃度より低い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する。
【００２０】
（Ｂ）波長２２０ｎｍ以上、２６０ｎｍ以下の吸光度の全ての値が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度より高いか、より好ましくは、波長２３０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の吸光度測定値の全ての値が、所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度より高い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する。
【００２１】
（Ｃ）測定した波長２６０ｎｍの吸光度が所定の核酸濃度から換算した波長２６０ｎｍの吸光度よりも高く、かつ波長２６０ｎｍ未満の吸光度が０より低い場合に検査試料中の核酸濃度が所定の核酸濃度よりも低いと判定する。
【００２２】
さらに、いずれの判定条件においても検査試料中の核酸濃度が所定の濃度より低いと判定されない場合は、検査試料中の核酸濃度が所定の濃度より高いと判定する。
【００２３】
ステップ３：上記の判定法により核酸濃度の決定された検査試料を、次工程に応じて、希釈または濃縮、または次工程への検査試料投入量の調節、次工程において所定の濃度が検査可否の閾値の場合、検査可否の判定を行う。
【００２４】
さらに、本発明による検査試料中の核酸濃度を判定するための装置の概略について図２を用いて説明する。図２に示す線図において、１０は吸光光度計、１１は吸光度と核酸濃度の換算機能、１２は第１比較判定機能、１３は第２比較判定機能、１４は吸光度評価判定機能、１５は出力装置、１６はデータベース、１７は記憶装置である。各機能は図１に示す各ステップの作業を行う。
【００２５】
吸光光度計１０は、検査試料の吸光度測定を行い、測定結果を記憶装置１７に記憶し、換算機能１１により２６０ｎｍにおける吸光度を核酸濃度に換算する。換算により得られた核酸濃度と、データベース１６から与えられる所定の濃度とを比較し、第１比較判定機能１２において図１の判定条件Ａの判定を行う。判定の結果、換算して得られた検査試料の核酸濃度が所定の濃度よりも高ければ、第２比較判定機能１３において、図１の判定条件Ｂの判定を行う。より好ましくは、当該機能は２３０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下にわたる全域の吸光度を検査試料の波長２６０ｎｍの吸光度と比較する。判定の結果、検査試料の核酸濃度が所定の濃度よりも高ければ、吸光度評価判定機能１４において、図１の判定条件Ｃ判定を行う。いずれの判定条件においても所定の濃度より高いと判定された場合は、検査試料の濃度は所定の濃度よりも高いと判定する。以上の比較、判定の結果を全て記憶装置１７に記憶し、必要なデータを出力装置１５に出力する。
【００２６】
本発明における生体試料とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診試料や、病院における外来・入院患者の血液、組織、尿、また、動物、植物、微生物等、特に限定されず全ての核酸を含む生物試料、及び当該生物試料の付着した物質が対象となる。また、本発明における核酸とは、該試料から抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡを含む全ての核酸が対象となる。
【００２７】
生体試料より該核酸を抽出する方法は公知の方法によって行うことができる。より好ましくは、シリカカラムに核酸を吸着させて洗浄後、核酸溶解液を用いて核酸を溶出させる方法を用いる。
【００２８】
また、本発明における検査試料とは、例えば検査に供する核酸を含む試料であればいかなる試料でもよい。また、本発明における検査とは、本発明の判定方法に引き続いて適用される、核酸を分析する検査であり、分析に供する核酸量が測定結果に影響する分析方法であればいかなる分析方法でもよい。具体的には、核酸濃度を正確に測定する定量検査、一塩基多型を検出するＳＮＰ検査、ゲノムのメチル化部位を検出するメチル化検査、染色体の欠失を検出するＬＯＨ検査、マイクロサテライト多型を利用して個人を同定するＳＴＲ検査（個人識別検査）等が挙げられるが、適用できる検査はこれらに限定されるものではない。
【００２９】
また、本発明における検査試料群とは、複数の個体から得られた複数の検査試料、または、ある同一の個体から経時的に採取された複数の検査試料を意味するが、これらの複数の検査試料は本発明に同時に供される必要はなく、ある１時点においては１つの検査試料のみが本発明の判定方法に供されてもよい。
【００３０】
本発明における所定の濃度とは、検査試料を判定する閾値の濃度を意味し、少なくとも１ｎｇ／μＬから１００ｎｇ／μＬが好ましく、従来法より高い判定効果で判定することができる。しかし、所定の濃度が低い場合では、所定の濃度より高い検査試料の適中度が減少し、所定の濃度が高い場合では、所定の濃度より低い検査試料の適中度が減少する。実施例の結果から、所定の濃度が１ｎｇ／μＬ未満では所定の濃度より高い検査試料の適中度や特異度が約４０％低下し、所定の濃度が１００ｎｇ／μＬを超えると所定の濃度より低い検査試料の適中度が半分以下となる。より好ましくは、所定の濃度を３ｎｇ／μＬから５０ｎｇ／μＬと定めるのが望ましい。
【００３１】
本発明に用いる装置としては、波長３５０ｎｍ〜１８０ｎｍ、少なくとも波長２６０ｎｍ〜２２０ｎｍの吸光度を測定できればいかなる装置でもよい。具体的には吸光度測定装置、分光光度計が挙げられる。より具体的には、日立ダイオードアレイ型バイオ光度計（日立ハイテクノロジーズ社製）、１μＬ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）等が挙げられるが、本発明では、検査試料中の核酸の吸光度を測定できればよく、上述の分析装置に限定されない。
【００３２】
上記試料および従来装置を用いて検査試料は一般的に次のように検査される。すなわち、核酸検査に限らず、検査機器には測定範囲が設けられており、検査試料群の濃度範囲が検査機器の測定範囲と異なる場合、最初から検査試料の濃度を複数の濃度で準備する。そして、準備した濃度の試料の全てを検査するか、初期濃度で測定範囲内の検査をできなかった検査試料に対して、濃度を変えて再測定を行う。あるいは、低濃度の検査試料が検査機器で測定不可能な場合、検査機器の測定下限以下の検査は無駄となる。また、ゲノム核酸中の対立遺伝子の量比を測定したい場合、検査試料中の核酸量が検査精度に関わる。これらの例のように、検査試料を濃度測定なしに、検査したとき、検査精度低下、コスト増大、スループット低下に繋がる。
【００３３】
このため、検査の前に簡便で低コストな方法での検査試料濃度の測定が求められている。このような濃度測定法として、吸光度を測定し、検査試料中の核酸濃度を測定する方法が挙げられる。しかし、この方法は検査試料中に核酸だけでなく生体試料成分、より具体的には、蛋白成分、ペプチド、芳香族アミノ酸等の有機化合物を含む場合、これらが核酸を検出する波長（２６０ｎｍ）の近傍に検出されるため、正確な核酸の濃度を測定できない問題があった。
【００３４】
本発明による核酸濃度の判定方法によれば、検査試料をより正確に所定の濃度より高いか低いかを決定することができる。これによって、測定範囲より高いか、または低い検査試料を前もって決定し、測定範囲内に希釈または濃縮することが可能である。もしくは、測定範囲より低く検査対象外となる検査試料を決定し、無駄な検査を防ぐことが可能となる。
【００３５】
本発明によれば、（１）吸光度測定法を用いて、検査試料群の波長を２２０ｎｍから２６０ｎｍまで測定するステップと、（２）図１に示す判定法に従って、検査試料群を所定の濃度を閾値として、所定の濃度より高い検査試料群と所定の濃度より低い検査試料群に決定するステップと、（３）検査試料の検査の測定条件に合わせて、ステップ２で決定された検査試料群を希釈または濃縮、検査可否の判定、または次ステップへの検査試料投入量の調節を行うステップの３つのステップにより、核酸検査の検査精度向上、またはコストの低下、スループットの向上を図ることができる。
【００３６】
以下、各ステップに従って、本発明を適用する条件を詳細に記述するが、記述する試料、装置等は、後述の方法に限定されない。
【００３７】
ステップ１では、検査試料に光を照射し、少なくとも波長２２０ｎｍから２６０ｎｍの吸光度を測定する。当該方法には従来用いられている吸光度測定法を用い、分析装置として分光光度計を用いることができるが、本工程では、少なくとも波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ以下における検査試料の吸光度を測定できればよく、上述の測定手順、測定方法、測定装置に限定されない。
【００３８】
ステップ２では、検査試料のＡ２６０を核酸濃度に換算して、所定の濃度と比較し、換算濃度が所定の濃度より低い検査試料を所定の濃度より低いと判定する判定条件Ａ、波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の波長帯において得られた吸光度と検査試料のＡ２６０を比較して、当該波長帯の全ての吸光度が検査試料のＡ２６０よりも高い検査試料を所定の濃度より低い検査試料と判定する判定条件Ｂにより、少なくとも１ｎｇ／μＬから１００ｎｇ／μＬを所定の濃度として検査試料の濃度判定の精度を高めることができる。また、検査試料の波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満のいずれかの吸光度が０より低い検査試料を所定の濃度より低い検査試料とする判定条件Ｃを用いることで、後述する実施例の結果より明らかなように、所定の濃度５ｎｇ以下において、判定の精度をより高めることができる。
【００３９】
すなわち、本発明における判定方法は、少なくとも判定条件Ａ、Ｂどちらかを満たす検査試料を所定の濃度より低い検査試料であると判定し、より好ましくは判定条件Ａ、Ｂ、Ｃのどれかを満たす検査試料を所定の濃度より低い検査試料と判定することを特徴とする。なお、判定条件Ａ、Ｂ、Ｃは上述した判定条件の順番で用いられる必要はなく任意の順番で用いることができる。以下、各判定条件Ａ、Ｂについてより詳細に記述する。
【００４０】
判定条件Ａにおいて、測定された検査試料の波長２６０ｎｍにおける吸光度を核酸濃度に換算する方法としては、公知の方法を用いることができる。より具体的には、検査試料溶液の溶媒が中性から弱アルカリ性で、測定光路長が１ｃｍの条件でＡ２６０＝１．０のとき、２本鎖ＤＮＡ核酸は５０μｇ／ｍＬ、１本鎖ＲＮＡは４０μｇ／ｍＬ、１本鎖ＤＮＡは３３μｇ／ｍＬであることが知られており、核酸濃度をここから換算することが可能であるが、本方法は波長２６０ｎｍにおける吸光度から核酸濃度に換算できればよく、上記条件に限定されない。また、上述の吸光度から核酸濃度へ換算する方法とは反対に、所定の濃度を吸光度に換算して、検査試料のＡ２６０と比較できるのは言うまでもない。
【００４１】
判定条件Ｂにおいて、Ａ２６０と比較する吸光度は、少なくとも波長２２０ｎｍ以上波長２６０ｎｍ未満の波長帯から得られた吸光度を用いる。より好ましくは、波長２３０ｎｍ以上、波長２５０ｎｍ未満の波長帯における吸光度を用いることで、判定の精度を高めることが可能である。本条件の判定方法としては上記波長帯における吸光度と検査試料のＡ２６０と比較して、上記波長帯の全ての吸光度が検査試料のＡ２６０より高い検査試料を所定の濃度より低い検査試料であると判定する。
【００４２】
ステップ３では、本発明における次工程の検査の必要に応じて、検査試料の濃度や分取する量を調整する。より具体的な例を挙げると、次工程の検査が核酸濃度２０ｎｇ／μＬから０．２ｎｇ／μＬの測定範囲の検査である場合、所定の濃度２０ｎｇ／μＬで検査試料群を判定し、２０ｎｇ／μＬより高い濃度の検査試料群に対して、一律に希釈操作を行う。本例において、５０倍希釈を行った場合、最大１０００ｎｇ／μＬの検査試料濃度まで、次工程の検査の測定範囲内で測定可能となる。しかし、本工程では、次工程の検査に応じて検査試料を希釈、濃縮、分取量の調節、検査可否の判定が行われればよく上述の例に限定されない。
【００４３】
以下、本発明の選定条件を決定した実施例および、本発明を用いる代表的な用途を示すが本発明はこれらの例に限定されない。
【００４４】
（実施例）尿より抽出されたヒトゲノム核酸の核酸濃度による決定
１．検査試料の準備
本実験では、１８５人の自然尿より抽出したゲノム核酸を検査試料として用いた。採取された自然尿は、採取後直ちに４℃に保存され、その後２日以内に３０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳにて１ｍｌに懸濁した。本懸濁液の核酸抽出には、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、抽出方法は、公知の方法を用いた。より詳細には、臨床検体を溶解試薬で溶解し、これをシリカカラムに吸着させた。次に、洗浄試薬を用いて洗浄し、核酸溶出試薬を用いて、シリカカラムから溶出させ、これを濃度測定に用いる検査試料とした。
【００４５】
２．ＰｉｃｏＧｒｅｅｎによる核酸濃度の定量測定
本発明者らは尿より抽出された１８５種類の検査試料群の正確な２本鎖核酸濃度を定量するために、２本鎖核酸にのみ結合する蛍光試薬であるＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて核酸濃度を定量した。本定量方法は公知の方法を用いた。より詳細には、標準核酸を用いて希釈系列を作製し、作製した希釈系列の濃度範囲に入るように検査試料を希釈した。次に、2本鎖核酸とのみ結合する蛍光試薬を添加し、蛍光発光量を測定した。この結果、本検査試料群の核酸濃度は１５００ｎｇ／μＬから０．０１ｎｇ／μＬの濃度範囲であった。
【００４６】
３．吸光度測定法による濃度測定
本発明者らは吸光度測定法を用いて、検査試料中の核酸濃度を測定した。測定装置は１μＬ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用い、検査試料から試料溶液を１μ?分取し、吸光度測定を行った。この結果、１８５種類の検査試料について波長３５０ｎｍから２２０ｎｍの範囲で吸光度曲線を得て、波長２６０ｎｍの吸光度から２本鎖核酸の濃度に換算し、約１９００ｎｇ／μＬから０．０９ｎｇ／μＬの濃度範囲の測定結果が得られた。
【００４７】
４．検査試料の決定
検査試料群に対して７つの所定の濃度（１．０ｎｇ／μＬ、３．０ｎｇ／μＬ、５．０ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ）を用いて表１に示す判定条件を複数用いて判定し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより定量した結果を基準値として各判定手段の適中数を調べ、表２に示した。なお、本発明法における判定手段は表１に示す判定条件を複数用い、各判定条件を表す表記を並列に記載して示した。
【００４８】
【表１】
2008113583.tif 000003
【００４９】
【表２】
2008113583.tif 000004
【００５０】
表２より、従来法では、所定の濃度を１０ｎｇ／μＬとして判定したとき、１４８種類の所定濃度未満の検査試料中６０種類に及ぶ当該試料が１０ｎｇ／μＬ以上であると判定された。一方、本発明法では、１４８種類の所定濃度未満の検査試料中１４種類の当該試料が１０ｎｇ／μＬ以上であると判定された。
【００５１】
次工程の検査に１０ｎｇ／μＬ以上の検査試料が必要な場合、上記結果を用いると、従来法では９７種類の検査試料の検査が必要であるのに対し、本発明法では５０種類の検査試料を検査すればよい。従って、本例において、検査のスループットは２倍に向上し、コストは１／２に低減できる。
【００５２】
５．判定結果の評価
判定結果の評価法として、スクリーニングの効果指標を用いた。スクリーニングとは、ある状態とそうでない状態を可能なかぎり判定することを意味する。本スクリーニングの能力を表すために、感度、特異度、適中度、有効度の指標を用いた。以下、各指標について説明する。各指標にあるアルファベットは表４に示すスクリーニングによる判定結果の数を表す。そして、各指標の説明に本アルファべットを用いて、算定式を示した。
【００５３】
【表３】
2008113583.tif 000005
【００５４】
まず、感度とは実際に所定の濃度未満の検査試料が本発明で正しく所定の濃度未満となる割合で、本発明による所定濃度未満を選び出す能力を表す。値が高いほど良い方法と言える。本指標は（式１）の方法で算出できる。
【００５５】
（式１）
感度＝本発明で正しく決定された所定濃度未満の検査試料の数／所定濃度未満の全検査試料の数
＝ａ／（ａ＋ｃ）×１００（％）
次に、特異度とは所定濃度以上の検査試料が本発明で正しく所定の濃度以上となる割合で、所定濃度以上の検査試料を所定濃度未満と間違えない能力を表す。値が高いほど良い判定方法と言える。本指標は（式２）の方法で算出できる。
【００５６】
（式２）
特異度＝本発明で正しく決定された所定濃度以上の検査試料の数／所定濃度以上の全検査試料の数
＝ｄ／（ｂ＋ｄ）×１００（％）
次に、有効度とは所定濃度未満の有無を正しく反映している割合を意味する。本指標は（式３）の方法で算出できる。
【００５７】
（式３）
有効度＝（ａ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００（％）
そして、適中度には所定濃度未満適中度と所定濃度以上適中度があり、敏感度や特異度は本発明法自体の有効性を示す指標であるが、所定濃度未満適中度は本発明により所定濃度未満と判定された検査試料が実際に所定濃度未満である確率を意味し、所定濃度以上適中度はその逆を意味する。本指標は（式４）、（式５）の方法で算出できる。
【００５８】
（式４）
所定濃度未満適中度＝実際に所定濃度未満の検査試料の数／所定濃度未満の全検査試料の数
＝ａ／（ａ＋ｂ）×１００（％）
（式５）
所定濃度以上適中度＝実際に所定濃度以上の検査試料の数／所定濃度以上の全検査試料の数
＝ｄ／（ｃ＋ｄ）×１００（％）
本発明の決定の効果を上述の５つの評価指標を用いて評価した結果を表５〜表１０に示す。
【００５９】
【表４】
2008113583.tif 000006
【００６０】
【表５】
2008113583.tif 000007
【００６１】
【表６】
2008113583.tif 000008
【００６２】
【表７】
2008113583.tif 000009
【００６３】
【表８】
2008113583.tif 000010
【００６４】
【表９】
2008113583.tif 000011
【００６５】
【表１０】
2008113583.tif 000012
【００６６】
本発明による判定方法の効果を評価した結果、いずれの本発明の判定方法も従来方法より高い有効性を示した。具体的には、判定条件Ｂでは４種類の波長帯のうち、（Ｂ−２）つまり波長２３０ｎｍ以上２５０ｎｍ以下の吸光度を用いたとき、最も高い有効度を示した。また、最も波長帯の範囲の広い（Ｂ−４）、つまり波長２２０ｎｍ以上２６０ｎｍ未満の波長帯でも従来法と比較して高い有効度が得られることが分かった。各所定濃度の判定の効果としては、所定濃度を低くすると、所定濃度以上の適中度が下がり、所定濃度を高くすると、所定濃度未満の適中度が低下する傾向があることがわかったが、いずれも従来法よりも高い有効度を示した。
【００６７】
本発明の実施形態による主な効果を簡単に説明すると、以下に示すとおりである。
【００６８】
（１）検査試料群の濃度範囲が、次工程の濃度範囲と異なる検査試料群を測定範囲内で検査するために、従来、複数濃度で測定、または１濃度で測定し、測定範囲外の検査試料の濃度を変えて再測定していた検査に対して、前もって測定範囲外の検査試料群の濃度を調節することができるようになり、１濃度で測定可能、または再測定の検査試料が減少し、検査コストを低減できる。
【００６９】
（２）検査に用いる核酸量が検査信頼性に影響する場合、従来の吸光度測定法と比較してより正確に低濃度の検査試料群を決定できるようになり、検査の信頼性が向上する。
【００７０】
なお、本発明による検査試料決定の効果指標として、スクリーニング効果の指標を用いて評価した。核酸濃度１０ｎｇ／μＬを所定の濃度として１８５検体の濃度を決定した結果では、従来法であるＡ２６０から換算した核酸濃度による決定結果と比較して、感度３２％向上（６０％⇒９２％）、核酸濃度１０ｎｇ／μＬ未満を適中させる確率は３７％向上（３８％⇒７５％）し、有効度は２６％向上（６７％⇒９３％）した。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】本発明の実施例による核酸分析法のフロー図。
【図２】本発明による検査試料中の核酸濃度判定装置の構成を示す線図。
【符号の説明】
【００７２】
１…吸光度測定するステップ、２…吸光度を核酸濃度に換算するステップ、３…換算値を所定濃度と比較するステップ、４…吸光度比較ステップ、５…吸光度評価ステップ、６…所定濃度より高い試料と判定するステップ、７…所定濃度より低い試料と判定するステップ、１０…吸光光度計、１１…吸光度の換算機能、１２…第１比較判定機能、１３…第２比較判定機能、１４…吸光度評価判定機能、１５…出力装置、１６…データベース、１７…記憶装置。
【図１】
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【図２】
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