(57)【要約】【課題】尿路結石関連遺伝子の遺伝子多型を利用して尿路結石の発症リスクを正確に予測することが可能な判定方法を提供することにある。【解決手段】上記課題を解決する手段は、核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法である。あるいは、上記課題を解決する別の手段は、核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２３番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法である。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項２】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２３番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項３】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型及び２１２３番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項４】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型、２１２３番目の塩基の多型、３２２１番目の塩基の多型及び３２８７番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項５】
前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がチミン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、請求項４に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項６】
前記２１２２番目の塩基がグアニン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がシトシン、前記３２８７番目の塩基がアデニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、請求項４に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項７】
前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが低いと判定する、請求項４に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項８】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型及び１６５２番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項９】
前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、請求項８に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項１０】
核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型、１６５２番目の塩基の多型、２１２２番目の塩基の多型、２１２３番目の塩基の多型、３２２１番目の塩基の多型及び３２８７番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項１１】
第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がチミン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、請求項１０に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項１２】
第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がグアニン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がシトシン、前記３２８７番目の塩基がアデニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、請求項１０に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項１３】
第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せ以外の組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが低いと判定する、請求項１０に記載の尿路結石症の発症リスク判定方法。
【請求項１４】
オステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片のうちの少なくともいずれかを含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【請求項１５】
オステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、３２２１番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び３２８７番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【請求項１６】
オステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び１６５２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【請求項１７】
前記核酸断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるプライマーである、請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路結石症の発症リスクを判定する方法、及びそれに用いる発症リスク判定用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
尿路結石は多くの要因によって発症する疾患であり、遺伝要因と環境要因とが重なることで発症すると考えられている。尿路結石には全人口の５〜１０％がその生涯にて罹患すると考えられている（非特許文献１）。食事による尿中成分の変化などが結石形成の契機になると考えられるが、健常人の場合、尿中の蓚酸、カルシウムなどの排泄量が増加しても結石の形成には至らない。一方、結石患者には何らかの遺伝的素因があるため、結石の発症に至ると考えられる。
【０００３】
また、尿路結石は再発率が高いこと、家族歴があることなどが報告されており、これらのことからも尿路結石の発症における遺伝要因の存在が示唆される。結石は結晶の核形成、凝集、成長を経て形成されると考えられているが、近年、結石形成時に腎臓で多くの蛋白の発現が増強することが報告されている（非特許文献２〜５）。これらの蛋白は健常人においても結石患者においても検出されるが、尿細管細胞での発現が結石形成に影響を及ぼすと考えられている（非特許文献３、６〜８）。また、蓚酸カルシウム結晶と尿細管細胞との接着も結石形成に重要と考えられ、この過程についても蛋白が作用すると考えられている（非特許文献９〜１２）。
【０００４】
ところで、尿路結石に関連する蛋白が従来いくつか知られており、その中でもオステオポンチン（OPN）は最も重要なものの１つと考えられている。OPNは糖鎖を伴うリン酸化蛋白であって、多くの機能を持っている。OPN遺伝子は第４染色体長腕に存在し、７つのエクソンより成る（非特許文献１３）。本発明者らは、結石形成時にOPNが遠位尿細管で過剰に発現することを報告してきた（非特許文献２、１４）。最近マイクロアレイを用いた研究でも、OPNがカルシウム結石ラットにおいて他の高分子蛋白よりも有意に発現が増強されたことが報告されている（非特許文献１５）。しかしながら、OPNの発現が結石形成に作用するのか、抑制に作用するのかは明らかではなく、結石形成の様々な過程で重要な役割を果たすと考えられている。生体内の石灰化を伴う部位ではOPNの発現が観察されているのみならず、結石形成時には結晶形成、結晶の尿細管細胞への付着や結晶の凝集、成長にも作用すると考えられている（非特許文献３、１６、１７）。結石形成の初期過程を想定した尿細管細胞への蓚酸暴露や蓚酸カルシウムへ暴露によってOPNの発現が増加していることも報告されている（非特許文献１８、１９）。家族歴のある結石患者は再発歴が有意に高いことが報告されており、この報告は遺伝素因の存在を示唆している（非特許文献２０）。また、結石患者は健常者に比較して尿中OPN排泄が少ないことが報告されており、この報告はOPNと結石との関連を示唆している（非特許文献２１）。しかしながら、OPN遺伝子要因が結石にどのように関連しているかの詳細については明らかではない。
【０００５】
ヒトの多要因疾患の遺伝要因を考えるうえでは、その発症機序に注目する必要がある。そこで、遺伝子多型について多くの遺伝子で検討する試みが、癌、心血管病、糖尿病などで行われている。近年、尿路結石関連遺伝子（例えば、ビタミンＤレセプター遺伝子、Ｅカドヘリン遺伝子、ウロキナーゼ遺伝子、ＶＥＧＦ（vascular endothelial growth factor）遺伝子）について、遺伝子多型の研究が行われてきた。しかし、これらの遺伝子と尿路結石との関連性を明らかにすることはできなかった。それゆえ、尿路結石関連遺伝子の遺伝子多型を利用して尿路結石の発症リスクを判定する有効な方法は、従来提案されていなかった。
【０００６】
ちなみに、OPN遺伝子の遺伝子多型は、医療分野において従来全く利用されなかったわけではない。具体的には、個体に感染したウイルスや細菌がその個体に対してどの程度の障害をもたらし得るかを予測する方法、言い換えると感染症の程度を予測する方法において、OPN遺伝子の遺伝子多型を利用した例がある（特許文献１）。しかしながら、この従来方法は尿路結石とは全く異なるタイプの疾病を対象としていて、本発明者らが直接目的とするところのものではないので、殆ど参考に値しない。
【非特許文献１】Pak CY: Kidney stones. Lancet 351:1797-1801, 1998
【非特許文献２】Kohri K, Nomura S, Kitamura Y et al.: Structure and expression of the mRNA encoding urinary stone protein (osteopontin). J Biol Chem 268:15180-15184, 1993
【非特許文献３】Wesson JA, Johnson RJ, Mazzali M et al.: Osteopontin is a critical inhibitor of calcium oxalate crystal formation and retention in renal tubules. J Am Soc Nephrol 14:139-147, 2003
【非特許文献４】Shiraga H, Min W, VanDusen WJ et al.: Inhibition of calcium oxalate crystal growth in vitro by uropontin: another member of the aspartic acid-rich protein superfamily. Proc Natl Acad Sci U S A 89:426-430, 1992
【非特許文献５】Atmani F, Khan SR: Role of urinary bikunin in the inhibition of calcium oxalate crystallization. J Am Soc Nephrol 10 Suppl 14:S385-S388, 1999
【非特許文献６】Mo L, Huang HY, Zhu XH et al.: Tamm-Horsfall protein is a critical renal defense factor protecting against calcium oxalate crystal formation. Kidney Int 66:1159-1166, 2004
【非特許文献７】Qiu SR, Wierzbicki A, Orme CA et al.: Molecular modulation of calcium oxalate crystallization by osteopontin and citrate. Proc Natl Acad Sci U S A 101:1811-1815, 2004
【非特許文献８】Asokan D, Kalaiselvi P, Varalakshmi P: Modulatory effect of the 23-kD calcium oxalate monohydrate binding protein on calcium oxalate stone formation during oxalate stress. Nephron Physiol 97:23-30, 2004
【非特許文献９】Asplin JR, Parks JH, Nakagawa Y, Coe FL: Reduced crystallization inhibition by urine from women with nephrolithiasis. Kidney Int 61:1821-1829, 2002
【非特許文献１０】Nishio S, Hatanaka M, Takeda H et al.: Calcium phosphate crystal-associated proteins: alpha2-HS-glycoprotein, prothrombin F1, and osteopontin. Mol Urol 4:383-390, 2000
【非特許文献１１】Nishio S, Hatanaka M, Takeda H et al.: Calcium phosphate crystal-associated proteins: alpha-2-HS-glycoprotein, prothrombin fragment 1 and osteopontin. Int J Urol 8:S58-S62, 2001
【非特許文献１２】Asplin JR, Parks JH, Chen MS et al.: Reduced crystallization inhibition by urine from men with nephrolithiasis. Kidney Int 56:1505-1516, 1999
【非特許文献１３】Hijiya N, Setoguchi M, Matsuura K et al.: Cloning and characterization of the human osteopontin gene and its promoter. Biochem J 303 ( Pt 1):255-262, 1994
【非特許文献１４】Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K et al.: Molecular cloning and sequencing of cDNA encoding urinary stone protein, which is identical to osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 184:859-864, 1992
【非特許文献１５】Katsuma S, Shiojima S, Hirasawa A et al.: Global analysis of differentially expressed genes during progression of calcium oxalate nephrolithiasis. Biochem Biophys Res Commun 296:544-552, 2002
【非特許文献１６】Xie Y, Sakatsume M, Nishi S et al.: Expression, roles, receptors, and regulation of osteopontin in the kidney. Kidney Int 60:1645-1657, 2001
【非特許文献１７】Steitz SA, Speer MY, McKee MD et al.: Osteopontin inhibits mineral deposition and promotes regression of ectopic calcification. Am J Pathol 161:2035-2046, 2002
【非特許文献１８】Yamate T, Kohri K, Umekawa T et al.: Osteopontin antisense oligonucleotide inhibits adhesion of calcium oxalate crystals in Madin-Darby canine kidney cell. J Urol 160:1506-1512, 1998
【非特許文献１９】Yamate T, Kohri K, Umekawa T et al.: The effect of osteopontin on the adhesion of calcium oxalate crystals to Madin-Darby canine kidney cells. Eur Urol 30:388-393, 1996
【非特許文献２０】Ljunghall S: Family history of renal stones in a population study of stone-formers and health subjects. Br J Urol 51:249-252, 1979
【非特許文献２１】Kleinman JG, Wesson JA, Hughes J: Osteopontin and calcium stone formation. Nephron Physiol 98:43-47, 2004
【特許文献１】特開２００５−９５０４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、尿路結石関連遺伝子の遺伝子多型を利用して尿路結石の発症リスクを正確に予測することが可能な判定方法を提供することにある。また、本発明の別の目的は、上記方法を実施するのに好適な発症リスク判定用キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために本願発明者らは、尿路結石関連遺伝子の中でも尿路結石のマトリクスを構成するOPN蛋白をコードするOPN遺伝子に注目した。そして本願発明者らは、OPN遺伝子の遺伝子異常が尿路結石に関連し、その遺伝子多型が尿路結石発症リスクに何らかの影響を及ぼすであろうと想定して、鋭意研究を行った。具体的には、多数の結石患者及び多数の健常者のそれぞれについて約１１KbpからなるOPN遺伝子の全体をシークエンスし、このシークエンスによって見付けたいくつかの一遺伝子多型（SNPs: single nucleotide polymorphisms）と尿路結石の発症との関連性を調査した。この調査の結果、本願発明者らは、OPN遺伝子における特定部位の一遺伝子多型と尿路結晶の発症との間で統計的に有意な相関があることを新規に知見し、この新規な知見に基づいて最終的に本発明を完成させるに至ったのである。
【０００９】
そして、本発明の方法によって尿路結晶の発症リスクの判定ができるようになれば、不必要な検査を受ける必要がなくなり、患者の身体的及び経済的な負担を確実に軽減することができる。従って、本発明の方法は、臨床において尿路結石の発症リスクを判定するうえで第１の選択肢となりうるものである。また、発症リスク判定の際にOPN遺伝子における特定部位の一遺伝子多型がわかれば、その一遺伝子多型をターゲットとして何らかの治療（例えば遺伝子治療等）を施すことにより、尿路結石高リスク者に対して適切な発症予防措置を講じることも十分可能になるであろうと考えられる。
【００１０】
ここで、上記課題を解決するための手段を以下に列挙する。
【００１１】
［手段１］核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１２】
［手段２］核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２３番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１３】
［手段３］、核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型及び２１２３番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１４】
［手段４］核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型、２１２３番目の塩基の多型、３２２１番目の塩基の多型及び３２８７番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１５】
［手段５］手段４において、前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がチミン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１６】
［手段６］手段４において、前記２１２２番目の塩基がグアニン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がシトシン、前記３２８７番目の塩基がアデニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１７】
［手段７］手段４において、前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが低いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１８】
［手段８］核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型及び１６５２番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００１９】
［手段９］手段８において、前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００２０】
［手段１０］核酸試料中に含まれるオステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型、１６５２番目の塩基の多型、２１２２番目の塩基の多型、２１２３番目の塩基の多型、３２２１番目の塩基の多型及び３２８７番目の塩基の多型を解析する工程を含む、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００２１】
［手段１１］手段１０において、第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がチミン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００２２】
［手段１２］手段１０において、第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がグアニン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がシトシン、前記３２８７番目の塩基がアデニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが高いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００２３】
［手段１３］手段１０において、第１ハプロタイプブロックに属する前記５２０番目の塩基がアデニン、前記１６５２番目の塩基がチミンの組合せ以外の組合せであり、かつ、第２ハプロタイプブロックに属する前記２１２２番目の塩基がチミン、前記２１２３番目の塩基がグアニン、前記３２２１番目の塩基がチミン、前記３２８７番目の塩基がグアニンとなる組合せの場合、前記尿路結石症の発症リスクが低いと判定する、尿路結石症の発症リスク判定方法。
【００２４】
［手段１４］オステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片のうちの少なくともいずれかを含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【００２５】
［手段１５］オステオポンチン遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、３２２１番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び３２８７番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【００２６】
［手段１６］オステオポンチン遺伝子の５２０番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び１６５２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含む、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【００２７】
［手段１７］手段１４乃至１６のいずか１項において、前記核酸断片は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いられるプライマーである、尿路結石症の発症リスク判定用キット。
【発明の効果】
【００２８】
以上詳述したように、請求項１〜１３に記載の発明によると、尿路結石関連遺伝子の一種であるOPN遺伝子の遺伝子多型を利用して尿路結石の発症リスクを正確に予測することが可能な判定方法を提供することができる。また、請求項１４〜１７に記載の発明によると、上記方法を実施するのに好適な発症リスク判定用キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
手段１にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型（以下「SNP2122T/G」と表記する）を解析する工程を含むことを特徴とする。SNP2122T/Gという表記は、OPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型が、Ｔ（チミン）またはＧ（グアニン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP2122T/GはOPN遺伝子のプライマー領域に存在するものであって、本願発明者が今回新規に見付けたものである。
【００３０】
手段２にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子の２１２３番目の塩基の多型（以下「SNP2123G/T」と表記する）を解析する工程を含むことを特徴とする。SNP2123G/Tという表記は、OPN遺伝子の２１２３番目の塩基の多型が、Ｇ（グアニン）またはＴ（チミン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP2123G/TはOPN遺伝子のプライマー領域に存在するものであって、本願発明者が今回新規に見付けたものである。
【００３１】
手段３にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるSNP2122T/G及びSNP2123G/Tの２つを解析する工程を含むことを特徴とする。先に挙げた手段１及び手段２では、OPN遺伝子における１つのSNPを利用して発症リスクの判定を行うが、手段３のように２つのSNPsを利用すれば判定精度を高くすることができる。
【００３２】
手段４にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子のSNP2122T/G及びSNP2123G/Tの解析に加えて、さらに３２２１番目の塩基の多型（以下「SNP3221C/T」と表記する）及び３２８７番目の塩基の多型（以下「SNP3287A/G」と表記する）を解析する工程を含むことを特徴とする。SNP3221C/Tという表記は、OPN遺伝子の３２２１番目の塩基の多型が、Ｃ（シトシン）またはＴ（チミン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP3221C/TはOPN遺伝子のプロモーター領域に隣接した第１イントロンに存在するものであって、既知のものである（refSNP ID: rs2853749）。SNP3287A/Gという表記は、OPN遺伝子の３２８７番目の塩基の多型が、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP3287A/GはOPN遺伝子のプロモーター領域に隣接した第１イントロンに存在するものであって、既知のものである（refSNP ID: rs2853750）。先に挙げた手段３では、OPN遺伝子における２つのSNPsを利用して発症リスクの判定を行うが、手段４のように４つのSNPsを利用すれば判定精度をより高くすることができる。
【００３３】
また、手段８にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子の５２０番目の塩基の多型（以下「SNP520A/G」と表記する）及び１６５２番目の塩基の多型（以下「SNP1652G/T」と表記する）を解析する工程を含むことを特徴とする。SNP520A/Gという表記は、OPN遺伝子の５２０番目の塩基の多型が、Ａ（アデニン）またはＧ（グアニン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP520A/GはOPN遺伝子のプロモーター領域に存在するものであって、既知のものである（refSNP ID: rs2728127）。SNP1652G/Tという表記は、OPN遺伝子の１６５２番目の塩基の多型が、Ｇ（グアニン）またはＴ（チミン）という２つの遺伝子型からなることを意味している。SNP1652G/TはOPN遺伝子のプロモーター領域に存在するものであって、既知のものである（refSNP ID: rs2853744）。
【００３４】
また、手段１０にかかる尿路結石症の発症リスク判定方法は、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子のSNP520A/G、SNP1652G/T、SNP2122T/G、SNP2123G/T、SNP3221C/T及びSNP3287A/Gを解析する工程を含むことを特徴とする。この方法によれば、OPN遺伝子における６つのSNPsを利用して発症リスクの判定を行っているため、判定精度を極めて高くすることができる。
【００３５】
なお、OPN遺伝子の塩基配列は、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）が提供する公共のデータベースであるGenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）やMolecular Databases（例えばdbSNP：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）に登録されている（GenBank受付番号D14813）（配列番号１）。同様にOPN遺伝子の塩基配列は、Molecular Databases（例えばdbSNP：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）にも登録されている。これらのデータベースには基本的に誰もが自由にアクセスすることが可能であり、それゆえOPN遺伝子の塩基配列情報を取得することができる。
【００３６】
本発明において「核酸試料」とは、核酸を含む試料のことを意味し、具体的にここではOPN遺伝子の多型を含む試料のことを意味している。なお、この場合の「核酸」とは、必ずしもDNAに限定されず、mRNAのようなRNAも含むものである。このような試料としては、医師等によってあらかじめ被験体である哺乳類から採取され、または調製されたものが使用される。ここで、本発明の発症リスク判定方法が適用されるべき最も好適な「被験体」はヒトである。ただし、ヒト以外の哺乳類（例えばラット、マウス、ウサギ、ハムスター、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ等）を、核酸試料が採取されるべき被験体としても勿論構わない。また、哺乳類から核酸を含む試料は、細胞組織、体液、分泌物、排泄物などのいずれからも採取可能であるが、これらの中でも例えば血液等の体液から採取することが好適である。即ち、血液からの試料採取は、技術的に比較的容易であることに加え、被験体に与える負担も比較的小さいからである。
【００３７】
本発明の方法では、まず、上記試料から核酸試料を調製する。生体成分から核酸を抽出する方法は、当業者に周知であり、いずれの方法を使用してもよいが、たとえばフェノール抽出、エタノール沈殿等によって行うことができる。具体的には、例えば市販のゲノム抽出用キットを用いて、全血試料からゲノムDNAを抽出することができる。
【００３８】
本発明において「多型を解析する」とは、解析対象の多型部位に関して核酸試料がどのような遺伝子の型を有しているのかを調査することを意味し、多型存在部位の塩基の種類を調査することと同義である。本発明において「遺伝子の型」とは、特定のアリルの存否で表される分類、またはアリルの組合せである遺伝子型で表される分類のことをいう。従って、本発明における「多型を解析する工程」では、核酸試料中における特定の多型のアリルの存否、または遺伝子型（アリルの組合せ）が調査、決定される。
【００３９】
各遺伝子多型を解析する方法は特に限定されるものではなく、例えばアリル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法による増幅、及び増幅産物の多型を蛍光又は発光によって解析する方法や、PCR(polymerase chain reaction)法を利用したPCR-RFLP(restriction fragment length polymorphism：制限酵素断片長多型)法、PCR-SSCP(single strand conformation polymorphism：単鎖高次構造多型)法(Orita,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2766-2770(1989)等)、PCR-SSO(specific sequence oligonucleotide：特異的配列オリゴヌクレオチド)法、PCR-SSO法とドットハイブリダイゼーション法を組み合わせたASO(allele specific oligonucleotide：アリル特異的オリゴヌクレオチド)ハイブリダイゼーション法(Saiki, Nature, 324, 163-166(1986)等)、またはTaqMan-PCR法(Livak, KJ, Genet Anal,14,143(1999),Morris, T. et al., J. Clin. Microbiol.,34,2933(1996))、Invader法(Lyamichev V et al., Nat Biotechnol,17,292(1999))、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法(Haff LA, Smirnov IP, Genome Res 7,378(1997))、RCA(rolling cycle amplification)法(Lizardi PM et al., Nat Genet 19,225(1998))、DNAチップまたはマイクロアレイを用いた方法(Wang DG et al., Science 280,1077(1998)等)、プライマー伸長法、サザンブロットハイブリダイゼーション法、ドットハイブリダイゼーション法（Southern,E., J. Mol. Biol. 98, 503-517(1975)）等、公知の方法を採用することができる。さらに、解析対象の多型部分を直接シークエンスすることにより解析してもよい。なお、これらの方法を任意に組み合わせて多型解析を行ってもよい。また、PCR法またはPCR法を応用した方法などの核酸増幅法により核酸試料をあらかじめ増幅（核酸試料の一部領域の増幅を含む）した後、上記いずれかの解析方法を適用することもできる。
【００４０】
多数の核酸試料を解析する場合には、アリル特異的PCR法、アリル特異的ハイブリダイゼーション法、TaqMan-PCR法、Invader法、プライマー伸長法を用いたMALDI-TOF/MS(matrix)法、RCA(rolling cycle amplification)法、DNAチップまたはマイクロアレイを用いた方法等、多数の検体を比較的短時間で解析できる解析方法を用いることが特に好ましい。
【００４１】
ここに列挙した方法においては、それぞれの方法に応じたプライマーやプローブ等の核酸断片（以下「多型解析用核酸断片」とも呼ぶ）が使用される。多型解析用核酸断片の例としては、解析対象の多型を含む遺伝子において、当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有する核酸断片を挙げることができる。また、解析対象の多型を含む遺伝子において当該多型部位を含む一定領域（部分DNA領域）に相補的な配列を有し、当該多型部分を含むDNAフラグメントをPCR等の手段により特異的に増幅できるように設計された核酸断片（プライマー）を挙げることができる。
【００４２】
例えば、OPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、２１２２番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の２１２２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または２１２２番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の２１２２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４３】
例えば、OPN遺伝子の２１２３番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、２１２３番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の２１２３番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または２１２３番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の２１２３番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４４】
例えば、OPN遺伝子の５２０番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、５２０番目の塩基がＡ（アデニン）であってOPN遺伝子の５２０番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または５２０番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の５２０番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４５】
例えば、OPN遺伝子の１６５２番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、１６５２番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の１６５２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または１６５２番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の１６５２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４６】
例えば、OPN遺伝子の３２２１番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、３２２１番目の塩基がＣ（シトシン）であってOPN遺伝子の３２２１番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または３２２１番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の３２２１番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４７】
例えば、OPN遺伝子の３２８７番目の塩基の多型が解析対象である場合、解析に使用される前記核酸断片としては、３２８７番目の塩基がＡ（アデニン）であってOPN遺伝子の３２８７番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または３２８７番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の３２８７番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片が該当する。
【００４８】
また、多型解析用核酸断片の他の具体例としては、解析対象の多型部位がいずれかの遺伝子型である場合にのみ当該多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットを挙げることができる。より具体的には解析対象の多型部位を含む部分DNA領域を特異的に増幅するように設計された核酸セットであって、多型部位がいずれかの遺伝子型であるアンチセンス鎖の当該多型部位を含む部分DNA領域に対して特異的にハイブリダイズするセンスプライマーと、センス鎖の一部領域に対して特異的にハイブリダイズするアンチセンスプライマーとからなる核酸セットを例示することができる。ここで、前記多型解析用核酸により増幅される部分DNA領域の長さは、その検出に適した範囲で適宜設定されることが可能であり、例えば50bp〜200bp、好ましくは80bp〜150bpである。
【００４９】
なお、先に列挙した多型解析用核酸断片（プローブ、プライマー）は単なる一例であり、プライマーであれば目的の増幅反応を支障なく行える限度において、あるいはプローブであれば目的のハイブリダイゼーション反応を支障なく行える限度において、一部の塩基配列に改変が施されていてもよい。ここでの「一部の塩基配列の改変」とは、塩基の一部が欠失、置換、挿入及び／または付加されていることを意味する。改変にかかる塩基数は例えば１〜７個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは、１〜３個である。このような改変は、原則として多型部位に対応する塩基以外の部分において行われるべきである。
【００５０】
多型解析用核酸断片（プローブ、プライマー）としては、解析方法に応じて適宜DNA断片またはRNA断片が用いられる。多型解析用核酸断片の塩基長はそれぞれの機能が発揮される程度であればよく、当該核酸断片がプライマーである場合の塩基長の好適例としては10〜50bp程度、好ましくは15〜40bp程度、さらに好ましくは15〜30bp程度である。
【００５１】
なお、多型解析用核酸断片がプライマーである場合には増幅対象（鋳型）に特異的にハイブリダイズし、目的のDNAフラグメントを増幅することができる限り、鋳型となる配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。多型解析用核酸断片がプローブである場合も同様に、検出対象の配列と特異的なハイブリダイズが行える限り、検出対象の配列に対して多少のミスマッチがあってもよい。ミスマッチの程度としては、１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個である。勿論、このような多型解析用核酸断片（プライマー、プローブ）は、当業者であれば、例えばホスホジエステル法など公知の方法によって比較的容易に合成することができる。
【００５２】
本発明の方法における「発症リスク判定」とは、尿路結石症が発症するリスクが高いか低いかを判定することを意味する。このような発症リスク判定は、通常、所定の発症リスク判定用プログラムが格納されたコンピュータを用いて行われることがよい。具体的には以下のような手法による。
【００５３】
例えば、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子のSNP2122T/G、SNP2123G/T、SNP3221C/T及びSNP3287A/Gを解析する工程を含む発症リスク判定方法である場合について述べる。SNP2122T/G、SNP2123G/T、SNP3221C/T及びSNP3287A/Gは同じハプロタイプブロック（以下「第２ハプロタイプブロック」と呼ぶ）に属していると把握できる。
【００５４】
そして、第２ハプロタイプブロックに属するSNP2122T/Gの塩基がＴ（チミン）、SNP2123G/Tの塩基がＴ（チミン）、SNP3221C/Tの塩基がＴ（チミン）、SNP3287A/Gの塩基がＧ（グアニン）となる組合せの場合、あるいは、SNP2122T/Gの塩基がＧ（グアニン）、SNP2123G/Tの塩基がＧ（グアニン）、SNP3221C/Tの塩基がＣ（シトシン）、SNP3287A/Gの塩基がＡ（アデニン）となる組合せの場合には、尿路結石症の発症リスクが高いと判定する。これに対し、第２ハプロタイプブロックに属するSNP2122T/Gの塩基がＴ（チミン）、SNP2123G/Tの塩基がＧ（グアニン）、SNP3221C/Tの塩基がＴ（チミン）、SNP3287A/Gの塩基がＧ（グアニン）となる組合せの場合には、尿路結石症の発症リスクが低いと判定する。
【００５５】
また、これとは別のものとして、例えば、核酸試料中に含まれるOPN遺伝子のSNP520A/G及びSNP1652G/Tを解析する工程を含む発症リスク判定方法である場合について述べる。SNP520A/G及びSNP1652G/Tは、同じハプロタイプブロック（以下「第１ハプロタイプブロック」と呼ぶ）に属していると把握できる。そして、第１ハプロタイプブロックに属するSNP520A/Gの塩基がＡ（アデニン）、SNP1652G/Tの塩基がＴ（チミン）の組合せである場合には、尿路結石症の発症リスクが高いと判定する。これに対し、第１ハプロタイプブロックに属するSNP520A/Gの塩基がＡ（アデニン）、SNP1652G/Tの塩基がＴ（チミン）の組合せ以外の組み合わせである場合には、尿路結石症の発症リスクが低いと判定する。
【００５６】
なお、第１ハプロタイプブロックのみに基づく発症リスク判定、第２ハプロタイプブロックのみに基づく発症リスク判定に代えて、第１ハプロタイプブロック及び第２ハプロタイプブロックの両方に基づく発症リスク判定を行うようにしてもよい。
【００５７】
また本発明は、上述した尿路結石症の発症リスク判定方法にて使用するのに好適な発症リスク判定用キットを提供するものである。この発症リスク判定用キットは、OPN遺伝子における１つのSNPまたは２つ以上のSNPsの解析を行うための所定の核酸断片を含むことを特徴とする。その第１の態様は、OPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含むキットである。具体的にいうと当該キットは、２１２２番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の２１２２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または２１２２番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の２１２２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。
【００５８】
第２の態様は、OPN遺伝子の２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含むキットである。具体的にいうと当該キットは、２１２３番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の２１２３番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または２１２３番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の２１２３番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。
【００５９】
第３の態様は、OPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片及び２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片の両方を含むキットである。
【００６０】
第４の態様は、OPN遺伝子の２１２２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、３２２１番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び３２８７番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含むキットである。２１２２番目の塩基の多型及び２１２３番目の塩基の多型を解析するための核酸断片の具体例については、既に示したため、ここでは説明を省略する。具体的にいうと当該キットは、３２２１番目の塩基がＣ（シトシン）であってOPN遺伝子の３２２１番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または３２２１番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の３２２１番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。また、当該キットは、３２８７番目の塩基がＡ（アデニン）であってOPN遺伝子の３２８７番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または３２８７番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の３２８７番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。
【００６１】
第５の態様は、OPN遺伝子の５２０番目の塩基の多型を解析するための核酸断片、及び１６５２番目の塩基の多型を解析するための核酸断片を含むキットである。具体的にいうと当該キットは、例えば、OPN遺伝子の５２０番目の塩基の多型が解析対象である場合、５２０番目の塩基がＡ（アデニン）であってOPN遺伝子の５２０番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または５２０番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の５２０番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。また、当該キットは、例えば、OPN遺伝子の１６５２番目の塩基の多型が解析対象である場合、１６５２番目の塩基がＧ（グアニン）であってOPN遺伝子の１６５２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片、または１６５２番目の塩基がＴ（チミン）であってOPN遺伝子の１６５２番目の塩基を含む部分DNA領域に相補的な配列を有する核酸断片を含んでいてもよい。
【００６２】
なお、本発明の発症リスク判定用キットは、SNPの解析に必要な上記核酸断片を含む試薬を構成要素として成立しているが、この試薬のほか、使用方法に応じてさらに他の試薬（バッファー等）、反応容器、使用説明書などを構成要素として成立していてもよい。
【００６３】
SNPの解析に必要な試薬の好適例としては、解析対象の多型部分を含むDNA領域またはそれに対応するmRNAを、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により特異的に増幅できる多型解析用核酸断片（即ちプライマー）を含む試薬を挙げることができる。また、SNPの解析に必要な試薬の別の好適例としては、解析対象の多型部分を含むDNA領域またはそれに対応するmRNAを特異的に検出できる多型解析用核酸断片（即ちプローブ）を含む試薬を挙げることができる。
【００６４】
当該キットの構成要素である多型解析用核酸断片は、必ずしも試薬に含まれる形態で、言い換えると溶液の状態で提供されなくてもよい。例えば、上記多型解析用核酸断片は、不溶性支持体に固定化した状態で用いられることもできる。固定化に使用する不溶性支持体をチップ状、ビーズ状などに加工しておけば、これら固定化核酸断片を用いて多型の解析をより簡便に行うことができる。つまり、当該キットは、SNPの解析に必要な上記多型解析用核酸断片を含むDNAチップ、DNAアレイを構成要素として成立していてもよい。
【実施例１】
【００６５】
［１．材料と方法］
１−１．対象：
【００６６】
名古屋市立大学に受診している５５名のカルシウム結石患者と５４名の健常者（非結石患者）とを本研究の対象とした。患者の臨床特徴を図１の表１に示す。なお、患者はいずれも日本人である。
【００６７】
２４時間尿中カルシウム排泄量を測定し、高カルシウム尿症の有無を診断した。結石の数は腹部レントゲン検査等によって、結石成分は赤外線分光法にて確認した。上皮小体機能亢進症（Hyperparathyroidism）、尿路感染及び非カルシウム結石の患者は除外した。尿路結石の病歴と家族歴なしの５４人の健常人は、コントロールグループとした。この研究は名古屋市立大学倫理審査委員会によって承認され、患者の承諾を得て行った。ゲノムDNAは、市販のQIAampキット（登録商標、QIAGEN社製）を使用して、採血した白血球から抽出した。
１−２．Long PCR：
【００６８】
１０９人（結石患者５５名、健常者５４名）の全ＯＰＮ遺伝子配列をシークエンスした。本実施例では、校正機能を持つプラチナTaq DNAポリメラーゼのキット(Invitrogen社製)を使用するとともに、300ngのゲノムDNAをテンプレートとして使用した。プライマーは公表されているヒトＯＰＮ遺伝子(GenBank no. D14813)（配列番号１）の配列から設計した。具体的には図２の表２に示すとおりである。試薬の濃度は2mM MgSO4、0.2mMプライマー、2.5 単位プラチナTaq DNA Polymerase、0.2μM dNTPsであった。PCR反応は94℃,30 秒後、94℃,30秒、55℃,30秒、35回の後、68℃,12分で行った。なお、Long PCR用のプライマーの塩基配列は以下のとおりである。
順方向（Forward）：5'-ACCTCCCCGATAGTCAGAAT-3'（配列番号２）
逆方向（Reverse）：5'-AACTTGGTCATGCCCTTGGAT-3'（配列番号３）
１−３．Genotyping（遺伝子型の決定）：
【００６９】
109名のDNAサンプルについてPCRを行った。図２の表２に示すSequence PCR用のプライマーは、Primer Premier 5.0（商品名）で設計した。各々のプライマーの間隔はおよそ450bpである。いくつかのものについては、順方向のプライマー（Forward Primer）だけでなく、補足のための逆方向のプライマー（Reverse Primer）も設計した。使用したSequence PCR用プライマーを以下に具体的に示す。
プライマー１（Forward）：5'-TCAACTCCAAAGCATCCCAGAC-3'（配列番号４）
プライマー２（Forward）：5'-CTTTTTTCAGAAATGCTGCC-3'（配列番号５）
プライマー３（Forward）：5'-AATGTTCATGAAACCTATG-3'（配列番号６）
プライマー４（Forward）：5'-CTTTACATACCTTGGGAG-3'（配列番号７）
プライマー５（Forward）：5'-CTCTCAGTCAGAAACTGC-3'（配列番号８）
プライマー６（Forward）：5'-AACCAGAGGGGGAAG TGTGG-3'（配列番号９）
プライマーＲ６（Reverse）：5'-TCTGATTAGCATCGGTGG-3'（配列番号１０）
プライマー７（Forward）：5'-ACTTAAAAATACTTCCACTGG-3'（配列番号１１）
プライマー８（Forward）：5'-GTACATGTTGGAAAAATGG-3'（配列番号１２）
プライマー９（Forward）：5'-CACTACCATGAGAATTGC-3'（配列番号１３）
プライマー１０（Forward）：5'-TATGATGAGTTATCGCATG-3'（配列番号１４）
プライマー１１（Forward）：5'-GTTCAATTCCAGTTGAACAG-3'（配列番号１５）
プライマー１２（Forward）：5'-GTTAGGATTACTGGGTGGT-3'（配列番号１６）
プライマーＲ１２（Reverse）：5'-TCCTTGCTTTAAGAAGATG-3'（配列番号１７）
プライマー１３（Forward）：5'-CTGGGATTACAGGCGTAGC-3'（配列番号１８）
プライマーＲ１３（Reverse）：5'-CAGTTCCTCAGTTGCACTAG-3'（配列番号１９）
プライマー１４（Forward）：5'-CATATGGCTATTGAGCACTC-3'（配列番号２０）
プライマーＲ１４（Reverse）：5'-GCACATCTAAACCAGAAGTG-3'（配列番号２１）
プライマー１５（Forward）：5'-CTTCTTGTTCCATGGACTG-3'（配列番号２２）
プライマー１６（Forward）：5'-TTTTTCCATTCATCCCTAC-3'（配列番号２３）
プライマー１７（Forward）：5'-ACAAGAGGTAAGTTCTCAT-3'（配列番号２４）
プライマー１８（Forward）：5'-AGCAAGTTAGATAAATTACC-3'（配列番号２５）
プライマー１９（Forward）：5'-GCCATGGTATGTACTGTG-3'（配列番号２６）
プライマー２０（Forward）：5'-GCAGACCTGACATCCAGG-3'（配列番号２７）
プライマー２１（Forward）：5'-CTAACAATTCACTTCCTCT-3'（配列番号２８）
プライマー２２（Forward）：5'-CCACAGCCACAAGCAGTC-3'（配列番号２９）
プライマー２３（Forward）：5'-TGTCTATGTTCATTCTATAG-3'（配列番号３０）
プライマー２４（Forward）：5'-CTTGTCATTTATTTGTGCTG-3'（配列番号３１）
プライマー２５（Forward）：5'-TGGGCACAAATCTGAATAG-3'（配列番号３２）
【００７０】
そして、ABI  BigDye Terminator Cycle sequencing Ready Reaction Kit（商品名）でsequencing PCR反応を行った。反応産物はエタノール沈殿で精製してから、ABI3100（商品名）でシークエンスした。この後、精製されたDNAの塩基配列をSeqScape V2.1ソフト（商品名）で確認した。
１−４.統計方法：
【００７１】
ハーディ・ワインベルグ平衡（Hardy-Weinberg平衡）を計算するために、カイ二乗検定（chi-square test）あるいはフィッシャーの直接確率検定（Fisher’s exact test）を使用した。１％頻度以上の各SNPの対立遺伝子の配分をカイ二乗検定を使用して評価した。また、確率(OR)と95%信頼区間(CI)とを計算した。Pair-wise linkage disequilibrium(LD)はHaploviewのソフトウエアで評価した。また、タギングSNPsを識別し、LD Blockを計算した。患者と健常人との間にハプロタイプと遺伝子型の配分の関連性を比較するために、カイ二乗検定あるいはフィッシャーの直接確率検定で検定を行った。統計ソフトはStatistical Package for Social Sciences(SPSS)を使用した。P＜0.05をもって有意差ありとした。
２.結果
２−１．OPNの遺伝子多型
【００７２】
上記のような遺伝子型の決定を行ったところ、６９個の多型が認識された（６４個のSNPsと5個の欠失（deletion）多型）。2113, 2317, 2337, 2514及び2515の位置の多型については、ハーディ・ワインベルグ平衡からかなり逸脱したので(p<0.001)、次の統計から取り除いた。新規に見つかった１１個の多型を含む残った６４個の多型は、ハーディ・ワインベルグ平衡になった。その中に、２３カ所のSNPsの対立遺伝子の頻度が１％以上であることが、対立遺伝子の頻度とLD平衡とを計算することで示すことができた。非同義的な（nonsynonymous）SNPは、観察されなかった。なお、図３の表３においては、対立遺伝子の頻度が１％以上である２３個のSNPsを上段に示し、５個の欠失多型を下段に示している。
【００７３】
図３の表３に示すように、2122の位置にあるSNP及び2123の位置にあるSNPの２つ（即ちSNP2122T/GとSNP2123G/T）については、患者と健常人との間に有意差が認められた（p<0.01）。SNP2122T/GにあるTT、あるいはTGと、SNP2123G/TにあるGG、あるいはTGの対立遺伝子の頻度は、結石患者と健常人とでそれぞれ69.1％と30.9％、90.7％と9.3％であった。SNP2122T/Gにある対立遺伝子のGを持つ人あるいはSNP2123G/Tにある対立遺伝子のTを持つ人は、4.4倍の結石発症リスクがあると計算された。特に男性に限ってみると結石発症リスクが6.3倍であった。その他のSNPsには有意差が認められなかった。
２−２．連鎖不平衡とLDブロック分析
【００７４】
対立遺伝子の頻度が１％以上の23SNPsで、連鎖不平衡とLDブロック分析とを行った。大半のペアは高度の連鎖不平衡になった（D’＞0.8）。ハプロタイプ（haplotype;  ht）の数は121個であり、この中から４つのLDブロックと16個のhtSNPs（ハプロタイプ・タギングSNPs）とを検出した。ブロック１はSNP520A/G及びSNP1652G/Tを含んでいる（図４，図５ではそれぞれSNP2,SNP4と表現されている）。ブロック２はSNP2122T/G, SNP2123G/T, SNP3221C/T及びSNP3287A/G を含んでいる（図４，図５ではそれぞれSNP10,SNP11,SNP22,SNP23と表現されている）。ブロック３はSNP4825T/A及びSNP4839A/Tを含んでいる（図４，図５ではそれぞれSNP28,SNP29と表現されている）。ブロック４はSNP5764A/G, SNP6352C/T, SNP7282A/G, SNP7600A/G, SNP7803C/T, SNP8090C/T, SNP8588C/G及びSNP9250C/Tを含んでいる（図４，図５ではそれぞれSNP35,SNP37,SNP41,SNP42,SNP45,SNP49,SNP52,SNP59と表現されている）。なお、近隣のブロックは互いに強い連鎖不平衡を示した。
【００７５】
そこで、ハプロタイプと毎ブロックの遺伝子型を分析した。ブロック１には3通りのハプロタイプが認められ、ブロック２には４通りのハプロタイプが認められ、ブロック３には主に４通りのハプロタイプが認められ、ブロック４には主に６通りのハプロタイプが認められた（図４，図５の表４参照）。
【００７６】
４つのブロックのハプロタイプの遺伝子型配分は、ハーディ・ワインベルグ平衡から逸脱しなかった。図５の表４及び図７の表６に示すように、ブロック１のハプロタイプc (A-T)(p=0.000057)、ハプロタイプe (T-T-T-G) (p=0.016), f (G-G-C-A) ( p=0.035)及びブロック２のハプロタイプg (T-G-T-G) (p=0.000003)については、患者と健常人との間に有意差が認められた。尿路結石患者ではハプロタイプc,e及びｆの頻度が高いのに対し、ハプロタイプｇの頻度が低かった。ハプロタイプc,e,ｆを持つヒトは結石発症リスクが著しく増加するが、ハプロタイプgを持つヒトはリスクが著しく減少することが示唆された。
【００７７】
そして、ブロック１のハプロタイプc（A-T）は、ハプロタイプa(A-G)、b(G-T)より結石発症リスクを増加させることがわかった。また、ブロック２のハプロタイプeは、ハプロタイプdまたはgより4.4倍結石発症リスクを増加させることもわかった。また、ハプロタイプのｇが著しくリスクを減少させることもわかった。ブロック３及びブロック４については、結石患者と健常者との間に有意差が認められなかった。以上の結果は図６の表５に示されている。当該表においてノン・リスク・ハプロタイプ（即ち結石発症リスクを減少させるハプロタイプ）を薄い網掛けで表し、リスク・ハプロタイプ（即ち結石発症リスクを増加させるハプロタイプ）を濃い網掛けで表している。図７の表６においても同様である。
【００７８】
なお、尿路結石患者の性別、尿カルシウム排泄、結石成分、結石の数、結石の発生頻度などについても評価を行ってみたが、各ハプロタイプに特に有意差は認められなかった。
３．考察
【００７９】
高分子蛋白質が尿路結石形成に重要な役割を果たすことが示されている。OPNは結石の主要なマトリクス蛋白であり、結晶と相互作用する物質である。このため、本実施例では遺伝子多型と尿路結石とのリスクについて評価した。そこで本発明者らはOPNの全配列遺伝子に再度シークエンスを行い、新規なもの１４カ所を含む６９カ所の遺伝子多型を確認した。プロモーター領域にある２つのSNPsは、尿路結石との相関を示した。リスクアレルを持つものは尿路結石リスクを4.4倍に増加させるという結果も得た。また、リスクを増加させるハプロタイプと、減少させるハプロタイプと、をそれぞれ見い出した。
【００８０】
本発明者らは連鎖不平衡とハプロタイプとの分析を利用して、尿路結石と相関するハプロタイプを発見した。本発明者らの研究は以下のような特徴がある。(a) 調査された個人はすべてアジア日本民族であるため、民族間の混同の可能性が除去されている。従って、日本民族を対象として尿路結石症の発症リスク判定を行ったような場合には、比較的信頼度の高い判定を行うことが可能である。(b) サンプル数は必ずしも多くなかったが、既知のほぼ全ての遺伝子多型を検出し、LD及びハプロタイプの構造の分析が可能であった。(c) OPNの遺伝子全配列をシークエンスして遺伝子多型を解析しており、一部の既知の遺伝子多型に絞った検索でなく、信頼性の高い結果を得ることができた。(d)LR-PCRの不正確さを考慮し、一般的疾患から、極めて稀なSNPsの影響が少ないと考え、１％以下に見られるSNPsについては検討から外した。即ち、このことも判定の信頼度の向上に寄与しうる。
【００８１】
本発明者らの研究グループが１９９２年にOPN蛋白が尿路結石のマトリクスの主成分であることを発見して以来、他の多くの研究グループがOPNについて研究を行ってきた。しかし、OPN遺伝子多型についての研究はまだ少ない。Yamateらは、家族性尿路結石患者と健常人とを検討し、RFLP （restriction fragment length polymorphism）の方法を使用し、OPN遺伝子のエクソン７のSNP9250に対応するC/Tの変異を見つけた。彼らは、対立遺伝子Cが健常人で尿路結石患者より高い (0.528) (p<0.05) ことを示した。FrancoisらはOPNの遺伝子に近い三カ所のマイクロサテライトマーカーを検討したが、有意差が認められなかった。しかし、マイクロサテライトマーカーによる検討は、全SNPsに比較して検討すべき部位が極めて少ない。このため、得られた検討結果は疾患との相関性が無いことを示すものではないと考えられる。
【００８２】
実施例において本発明者らが識別した23カ所のSNPsは、どれもアミノ酸の突然変異を起こさない変異であった。また、結石発症リスクを増加させるハプロタイプ、及び結石発症リスクを減少させるハプロタイプは、全てOPN遺伝子のプロモーター領域及びそれに近い領域に存在していた。この結果より、プロモーター領域、つまり遺伝子発現制御の領域の変異が尿路結石の形成に影響している可能性が示唆された。GiacopelliらはOPN遺伝子のプロモーター領域にあるSNPsがOPNの転写活性を影響することを示している。WangらもOPN遺伝子のプロモーター領域がOPNの発現に対して重要な役割を果たすことを報告している。また本発明者らは、OPN遺伝子の上流5Kbpの領域の発現に際しての重要性を解析し、OPNに近い上流1.5kbpの重要性を示している。これらの報告は、いずれもOPNのプロモーター領域が結石形成に重要な役割を持つことを示すものである。
【００８３】
以上述べてきたように、本発明によると、OPN遺伝子のSNPsを利用して尿路結石の発症リスクを正確に予測することが可能な判定方法を提供することができる。そして、この方法による発症リスク判定が可能になれば、不必要な検査を受ける必要がなくなり、患者の身体的及び経済的な負担を確実に軽減することができる。ゆえに、本発明の尿路結石の発症リスク判定方法は、臨床上有意義なものであると言うことができる。
【００８４】
なお、本発明は上記の実施例のみに限定されることはなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において自由に変更することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】５５名のカルシウム結石患者の臨床特徴を示した表である（表１）。
【図２】使用されるOPN遺伝子用のプライマーを示した表である（表２）。
【図３】対立遺伝子の頻度が１％以上である２３個のSNPsと、５個の新規な欠失多型とを示した表である（表３）。
【図４】４つのブロックと１６個のhtSNPsとの位置関係を示した概念図である。
【図５】結石患者と健常者との間で、各ハプロタイプ及び各ブロックの遺伝子型を分析した結果を示した表である（表４）。
【図６】結石患者及び健常者の個々についての尿路結石症の発症リスクの高低を示した表である（表５）。
【図７】発症リスクを増加させるハプロタイプと、発症リスクを減少させるハプロタイプとをそれぞれ示した表である（表６）。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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