(57)【要約】【課題】ササ属植物の葉緑体遺伝子のＤＮＡを、プライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡの一部を増幅させ、その時に生じるＤＮＡ断片の塩基配列を解析することによる、ササ属植物の新種の特定や、系統の同定を行う方法の提供。【解決手段】ササ属植物の系統を同定する方法において、被検体物の葉緑体ＤＮＡの特定領域をＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーセットを用いて増幅させ、増幅断片の多型解析を行い、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の系統の同定方法である。【選択図】図１
2008113614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ササ属植物の系統を同定する方法において、被検体物の葉緑体ＤＮＡの特定領域をＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーセットを用いて増幅させ、増幅断片の多型解析を行い、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の系統の同定方法。
【請求項２】
プライマーセットが下記の塩基配列を有する配列番号１及び配列番号２で表されるLF3及びIR22である請求項１に記載の同定方法。
LF3：5'-AGCAGTTACGAAATGCAG-3'          配列番号１
IR22：5'-TCTACCTACTTCCACATG-3'          配列番号２
【請求項３】
プライマーセットが下記の塩基配列を有する配列番号３及び配列番号４で表されるSasaF及びSasaRである請求項１に記載の同定方法。
SasaF：5'-TGAACTAGCCGCAGCTTGTG-3'        配列番号３
SasaR：5'-AATGCGCCCATTTCGAATCC-3'        配列番号４
【請求項４】
ＤＮＡの増幅領域が、rbcLとORF106間のイントロン領域及びORF106の前半部分である請求項１、２又は３に記載の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ササ属植物における種や系統の同定方法に関するものである。詳細には、ササ属植物の葉緑体遺伝子のＤＮＡを、プライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡの一部を増幅させた時に生じるＤＮＡ断片の塩基配列を解析することにより、ササ属植物の種や系統の同定を行う方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
牧野及び柴田により、ササ類は植物分類上タケ科（Bambusaceae）またはイネ科（Gramineae）タケ亜科（Bambusoideae）に属するものとされ、これまでに、日本を始め、サハリン、千島列島、及び朝鮮半島にわたり多くの種類が分布していることが確認されている（非特許文献１）。
１９７８年以前の研究では、例えば、非特許文献２においては、日本のササ属植物は６４種（species）がリストされていたが、新たに鈴木博士によりタケ科（Bambusaceae）植物の再編成が行われ、５属（genus）３５種（species）に分類されている（非特許文献１）。
【０００３】
今日においても、ササ属植物の分類は、茎長、葉或いは葉鞘上の毛の有無、葉の厚さの程度、葉表面の光沢の程度等を根拠に行われている。しかし、これらの外部的な形質は、同じ種に属するササ属植物であっても、その生育年数、生育環境、例えば、温度、湿度、標高差などによって異なってくる。また植物種の同定には花や果実の形態的特徴が極めて重要であるにもかかわらず、ササ類の開花や結実は一般に不定であり、それらを直接見る機会はかなり限定される。したがって、その種の同定にあたっては葉や茎の特性だけから判断することにならざるを得ないが、個々の種の形態は極めて類似している。したがって、ササ類の種の同定にはかなりの専門性と熟練を要し、ササ属植物を利用するにあたり非常に大きな障害となっている。
さらに、ササ類では種間あるいは属間における自然交配が容易であり、隣接する場所に生育する同一種であっても、その系統を異にすることが多い。その結果、現在ではかなりの数に及ぶササ属類の交雑種が自然界に存在するものと考えられている。
【０００４】
ところで、ササ属植物は、日本においては観葉、或いは食品装飾物（例えば、鮨或いは弁当）として、さらには、古来より「万病に効く薬用葉」として伝承され、幅広く用いられている。特に、ササ属植物のなかでもいわゆる「クマザサ」（隈笹）の葉は民間薬として利尿剤などに使用されてきた。しかしこの「クマザサ」は俗称であり、植物学上でいうところのクマザサではなく、ササ類の同定の難しさを物語っている。
また、ササ属植物の成分についての薬理学的な研究報告がいくつかある（非特許文献３〜５など）。
【０００５】
「クマザサ」の葉には葉緑素、リグニン、多糖体、鉄、カルシウム、ビタミン群など多くの有用成分が含まれ、薬用として民間利用されてきた。今日でも葉を乾燥させた後に微細化し、その細胞膜を高温熱加水分解し得られた抽出エキスが、細胞賦活作用、抗潰瘍作用、口臭防止効果などを有する健康食品として、発売、使用されている。
【０００６】
この健康食品に使用される「クマザサ」は、植物学上のクマザサという特定種ではなく、その地方に自生するササ類を利用したものである。
【０００７】
しかしながら、そこで利用されているササが植物学的に如何なるササ属植物なのか明確に把握、同定されていないのが現状である。また近縁のササ同士であればある程度同様の薬効を期待して健康食品を製造し得るものの、これまで利用されているササ類の同定には茎葉の形態的特徴を指標にして行っているに過ぎない。
【０００８】
すなわち、これらの健康食品に使用されるササ属植物は、外部形質的特徴を指標として判別されているが、上記した如く、同じ属種に属するササ属植物であっても、その変異が大きい上、きわめて類似した形態をしており、外部形質的特徴を根拠にササ属植物を分類、同定することは品質管理上好ましいものではない。
特に、民間薬あるいは健康食品としてササ類を利用する場合は、非常に重要な問題である。
【０００９】
【非特許文献１】S. Suzuki: Index to Japanese Bambusacae, Tokyo, Gakken 1978:1-69
【非特許文献２】J. Sugimoto: Keys to woody plants of Japan, Osaka, Rokugatsusha 1961:72-82
【非特許文献３】M. Shibata, et al., Yakugaku Zasshi 1978, 98:1436-40
【非特許文献４】M. Shibata, et al., Yakugaku Zasshi 1979, 99:663-8
【非特許文献５】M. Shibata, et al., Shoyakugaku Zasshi 1980, 34:274-9
【００１０】
かかる点を解決する手段として、本発明者等は、ササ属植物のＤＮＡプローブを用いた遺伝的な同一性に基づくササ属植物の系統の同定方法を検討した。
すなわち、個体の持つ遺伝的性質を同定することにより種の分類、系統解析、雑種の同定等に重要な手掛かりが得られることに着目した。
【００１１】
これについては、従来は、例えば、形態、アイソザイムに代表される生化学マーカー等が、個体の持つ遺伝的性質の同定手段として利用されてきたが、これに加えて近年では、分子遺伝学の成果に基づき、ＤＮＡ中に刻み込まれた特定の遺伝子情報に対応した塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブ（検索子）として用いることにより、個体の持つ遺伝学的な性質を同定することが可能となってきた。
殊に、ＤＮＡ上の高度変動性もしくは可変領域に対するプローブを用いることにより、個々の個体の遺伝的特徴をより詳細に解析することが可能となってきている。
加えて、最近になって、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、所望する特定の遺伝子の増幅法が確立し、この方法により、ごく僅かな遺伝子しか存在しない場合でも、これを検出することが可能となっている。
【００１２】
これらの点を勘案して本発明者等は、そのなかでもササ属植物の葉緑体ＤＮＡに着目した。この葉緑体ＤＮＡは光合成に関与している重要な遺伝子が数多く含まれている。葉緑体遺伝子を制限酵素で切断したときに得られるバンドパターンは、特に特異的なバンドパターンを示すことから、葉緑体ＤＮＡの構造解析は、植物の系統分類に有効な手法として用いられている。
【００１３】
すなわち、ＤＮＡは親から子へ伝わる遺伝情報であり、個々の個体や種ごとで不変の領域と異なる領域が存在している。したがってこの異なる領域を見つけることで、種の違いを判断することができる。また、ＤＮＡにはエクソンというタンパク質に翻訳される配列と、イントロンという非翻訳の介在配列がある。系統分類に重要なＤＮＡ多型の情報は一般に、生命活動への重要度が低いイントロン領域に多く観察される。
本発明では特に、葉緑体ＤＮＡ上にあり、光合成における炭酸固定の役目をする酵素「リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ」の遺伝子（rbcL遺伝子）に付随するイントロン（非翻訳領域）の塩基配列を、さまざまなササ属植物から決定し、これを比較して、ササ属植物ごとで異なっている領域を解析することで、ササ属植物の同定を行い得る方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって本発明は、ササ属植物の葉緑体遺伝子のＤＮＡを、プライマーを用いて、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡの一部を増幅させ、その時に生じるＤＮＡ断片の塩基配列を解析することによる、ササ属植物の新種の特定や、系統の同定を行う方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
かかる課題を解決するための基本的態様として、請求項１に記載の発明は、ササ属植物の系統を同定する方法において、被検体物の葉緑体ＤＮＡの特定領域の増幅をＤＮＡポリメラーゼ及び２個のプライマーからなるプライマーセットを用いて行い、その後、増幅断片の多型の解析を行い、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の系統の同定方法である。
【００１６】
より具体的な請求項２に記載の発明は、２個のプライマーからなるプライマーセットが、下記の配列を有する配列番号１及び配列番号２で表されるLF3及びIR22である上記請求項１に記載の同定方法である。
LF3：5'-AGCAGTTACGAAATGCAG-3'      （配列番号１）
IR22：5'-TCTACCTACTTCCACATG-3'     （配列番号２）
【００１７】
すなわち、ササ属葉緑体ＤＮＡの種属ごとによって異なっている特定領域を見つけ、これを利用し、上記のプライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、増幅させ、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の系統の同定方法である。
【００１８】
更に具体的な請求項３に記載の発明は、２個のプライマーからなるプライマーセットが下記の配列を有する配列番号３及び配列番号４で表されるSasaF及びSasaRである請求項１に記載の同定方法である。
SasaF：5'-TGAACTAGCCGCAGCTTGTG-3'      （配列番号３）
SasaR：5'-AATGCGCCCATTTCGAATCC-3'      （配列番号４）
【００１９】
すなわち、本発明においては、特に貯蔵期間の長い古いササ属植物では、２回の異なるＰＣＲを行うことによりその特徴的なＤＮＡパターンを検出するが、第１回目のＰＣＲでは、上記した配列番号３及び配列番号４のプライマーを使用し、その後の２回目のＰＣＲでは先の配列番号１及び配列番号２のプライマーを用い、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の同定方法である。
【００２０】
また、更に具体的な請求項４に記載の発明は、増幅領域をrbcLとORF106間のイントロン領域及びORF106の前半部分であるササ属植物の同定方法である。
【００２１】
ササ属植物の葉緑体ＤＮＡ上にあり、光合成における炭酸固定の役目をする酵素「リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ」の遺伝子（rbcL遺伝子）に付随するイントロンの塩基配列は、それぞれの種属によって異なるものであり、遺伝的特徴を表す部分である。また、ORF106は、コード領域ではないかと予想されるＤＮＡ領域であるオープン・リーディング・フレーム（ORF）であり、その間を増幅領域として増幅させることにより、ササ属植物の遺伝的系統を同定できる特徴的なＤＮＡパターンを検出することができるのである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、これまで、外部形質的特徴により分類していたササ属植物を遺伝的に系統化することが可能となる。
したがって、本発明方法によりササ属植物から得られる多糖体成分について、均一な品質管理を効率的に行うことが可能となり、安定した効果を有する健康食品を提供することが可能となる利点を有している。
【００２３】
特に、同じ種に属するササ属植物であっても、その生育年数、生育場所の環境によってその遺伝的特徴は異なっていることより、その系統を同定することは、統一した原料の調達の一助となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明が提供する同定方法は、基本的には、ササ属植物の葉緑体ＤＮＡの特定領域をＤＮＡポリメラーゼ及び２個のプライマーを用いて増幅させ、特徴的なＤＮＡパターンを検出することを特徴とするササ属植物の系統の同定方法である。
【００２５】
本発明において使用するプライマーは、配列番号１〜４に示す塩基配列を有するものである。本発明においては、これらのプライマーをそれぞれ、LF3、IR22、SasaF及びSasaRと称する。すなわち、LF3の塩基配列は配列番号１に、IR22の塩基配列は配列番号２に、SasaFの塩基配列は配列番号３に、またSasaRの塩基配列は配列番号４にそれぞれ表示される。
【００２６】
これらのプライマーは、市販されているＤＮＡシンセサイザーにより容易に合成することができる。なお、本発明にあっては、これらのプライマーがそれぞれの塩基配列を有していることがポイントであり、その合成機器の種類、方法等により本発明の効果等が左右されるものではない。
【００２７】
本発明においては、上記した４個のプライマー；LF3、IR22、SasaF及びSasaRから、異なる２つのプライマー（プライマーセット）を選択し、これを用いてササ属植物から抽出してゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、特定領域を増幅させる。
【００２８】
プライマーセットを構成するプライマーの選択に当たっては、増幅させるＤＮＡを抽出したササ属植物がある程度新鮮なものである場合には、LF3及びIR22の２個のプライマーを組み合わせたプライマーセットにより一般的な増幅反応でＤＮＡを増幅することが可能である。
【００２９】
一方、増幅させるＤＮＡを抽出したササ属植物が長期間に亘り貯蔵された状態のものにあっては、上記のプライマーセットを用いた一般的な増幅反応ではＤＮＡを増幅することはできなかった。そこで、Nested法による１回目のＰＣＲを、SasaF及びSasaRの２個のプライマーを組み合わせたプライマーセットを用いて行い、その結果得られたＤＮＡ断片に対して更に２回目のＰＣＲをLF3及びIR22のプライマーを組み合わせたプライマーセットにより一般的な増幅反応で、ＤＮＡを増幅することが可能となった。
したがって、本発明においては、系統を同定する被験体物の新鮮さの程度により適宜プライマーセットを選択し、ＰＣＲを行えばよい。
【００３０】
本発明が提供する方法において、プライマーセットを用いてＰＣＲにより増幅する領域は、rbcLとORF106間のイントロン領域、及びORF106の前半部分である（図１を参照）。
このrbcL（rbcL遺伝子）は光合成における炭酸固定の役目をする酵素「リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ」の遺伝子である。
一方、ORF106は、コード領域ではないかと予想されるＤＮＡ領域であるオープン・リーディング・フレーム（ORF）である。
【００３１】
本発明にあっては、このrbcL遺伝子と、オープン・リーディング・フレーム間のＤＮＡを増幅し、その特徴的なＤＮＡパターンを検出、検討することによりササ属植物の系統の同定が可能となる。
【００３２】
なお、本発明で使用するササ属植物からのゲノミックＤＮＡの抽出は、例えば、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）で行うことができる。
また、それ以外に、古典的なＣＴＡＢ法やＳＤＳ法等の常法、或いはこれらを適宜組み合わせた方法によっても行うことができる。
【００３３】
本発明の方法にあっては、このように抽出したＤＮＡを、ＰＣＲ反応用緩衝液中で、前記したように選択されたプライマーセット、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの総称）及びＤＮＡポリメラーゼと混合し、この混合物を適当な温度サイクルを繰り返し反応させることにより行えばよい。
なお、このときのＰＣＲの条件は、当該反応の結果得られたＤＡＮ断片の塩基配列の解析において良好な結果が得られるように、適宜選択すればよい。
【００３４】
通常は、ＤＮＡ２５〜５０ｎｇ、１０×ＰＣＲ反応用緩衝液５〜１０μＬ、プライマーをそれぞれ０．２５μＭ、ｄＮＴＰ２００μＭ、ＤＮＡポリメラーゼ１．５〜２．５Ｕを混合した後、全液量が５０〜１００μＬとなるように希釈したものについて、例えば以下に記載する温度サイクルで反応させればよい。
【００３５】
具体的には、比較的新鮮なササ属植物から抽出した葉緑素ＤＮＡの場合には、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa、Tokyo）により、９４℃（２分）を１サイクル、続いて３５サイクルの９４℃（３０秒）→５４℃（３０秒）→７２℃（６０秒）を繰り返すことにより行うのがよい。
【００３６】
一方、増幅させるＤＮＡを抽出したササ属植物が長期間に亘り貯蔵された状態のものにあっては、Nested法による１回目のＰＣＲを、SasaF及びSasaRのプライマーを組み合わせたプライマーセットを用いて行い、その結果得られたＤＮＡ断片に対して更に２回目のＰＣＲをLF3及びIR22のプライマーを組み合わせたプライマーセットにより一般的な増幅反応でＤＮＡを増幅することとなるが、第１回目のＰＣＲは、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa、Tokyo）により、９４℃（２分）を１サイクル、続いて３５サイクルの９４℃（３０秒）→５４℃（３０秒）→７２℃（６０秒）を繰り返すことにより行い、反応液をWizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）で精製し、次いで、２回目のＰＣＲを、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（TaKaRa、Tokyo）により、９４℃（２分）を１サイクル、続いて３５サイクルの９４℃（３０秒）→５４℃（３０秒）→７２℃（６０秒）を繰り返すことにより行うのがよい。
【００３７】
ＰＣＲの反応液の精製と、サイクルシーケンス反応は、具体的には、Wizard SV Gel and PCR Clean-up System（Promega）で反応液を精製し、BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を使用して行うことができる。
【００３８】
かくして増幅したＤＮＡポリメラーゼの増幅断片長の塩基配列の解析は、PRISM 377-1 DNA Sequencing System（ABI, Foster City, CA, USA）により解析すればよい。
本発明にあっては、採取場所が判明し、各種の学術名が付されている５１の検体（系統の同定種３９検体、論文報告４検体、未同定種８検体の合成５１検体）について葉緑素特定領域ＤＮＡポリメラーゼの増幅断片長の多型の塩基配列の解析を行った結果、配列の長さは、７５９塩基対から８２１塩基対であり、塩基配列はおよそ２０種類のパターンに収束できるものであった。
【００３９】
その塩基配列を相互に比較検討することにより、報告検体或いは同定種検体をベースにして、それぞれのササ属植物について、系統の同定を行うことが可能となった。
すなわち、塩基配列のパターン化を行い、そのパターンに基づいて属種の同定を行うことが可能となった。
また、新たに採取したササ属植物について、その外部形質的特徴によらず、その系統を同定することができた。
そのような塩基配列の特徴的検討については、後記する実施例を参照にされたい。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明を具体的実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例：
各種の学術名が付されているか、その同定が判明しないものを含む５１の検体（同定種３９検体、論文報告４検体、未同定種８検体の合成５１検体）について、上記した方法に基づいて、その被検体物の葉緑体ＤＮＡの特定領域をＤＮＡポリメラーゼ及び２個のプライマーを用いて増幅させ、その増幅断片の多型解析を行った。
の増幅断片長の多型の解析を、２個のプライマーを用いて行った。
検体からのＤＮＡの抽出は、DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen, Valencia, CA, USA）により、行った。
その抽出したＤＮＡを用いたプライマーの設計とＤＮＡ増幅法の概略を図１に示した。
【００４１】
なお、検体として用いたササ属植物は下記表に記載のとおりのものである。
表１は属種が同定されている採取時の古いササ属植物であり、表２は属種が同定されている採取時の比較的新しいササ属植物でありは、表３は未同定種ササ属植物であり、であり、表４は論文報告により種属が同定されているササ属植物である。
【００４２】
【表１】
2008113614.tif 000003
【００４３】
【表２】
2008113614.tif 000004
【００４４】
【表３】
2008113614.tif 000005
【００４５】
【表４】
2008113614.tif 000006
【００４６】
これらの５１検体についてプライマーセットを用いてＤＮＡの増幅、配列の解析をおこなった。すなわち、表１に記載する貯蔵期間の長い古い検体については、Nested法による１回目のＰＣＲを、SasaF及びSasaRのプライマーを組み合わせたプライマーセットを用いて行い、その結果得られたＤＮＡ断片に対して更に２回目のＰＣＲをLF3及びIR22のプライマーを組み合わせたプライマーセットにより増幅反応を行った。
また、表２及び表３の新しい検体については、LF3及びIR22のプライマーを組み合わせたプライマーセットにより増幅反応を行った。
【００４７】
その結果、得られたＤＮＡ断片の塩基配列の長さは、７５９塩基対から８２１塩基対の間にあり、その塩基配列は、タイプ１〜タイプ２０の２０種類に収束できた。なお、解析した配列の最上流（左側）を１番目とする。
それらのタイプをまとめてみると、
（１）塩基配列において、３８番目から４５番目に、チミン（Ｔ）が連続する領域を認めた（タイプ１〜タイプ１０、タイプ３を除く）。
この領域のチミン（Ｔ）のうち、４０番目から４５番目がアデニン（Ａ）に置換している検体もあった（タイプ１１〜タイプ２０）。
タイプ２とタイプ１６は４５番目の塩基が欠失していた。
タイプ３のようにＴ（チミン）とＡ（アデニン）が混在している場合があり、これは葉緑体が２種類存在していることを示唆しており、２つの群の中間的な関係であると考えられた。
（２）塩基配列を比較すると、１４９番目から１７９番目の３１塩基は、繰り返し単位となる領域であった（タイプ２とタイプ１６は１４８番目から１７８番目）。
この繰り返しは、タイプ１、２、３、６、１１、１２、１３及び１６は、１７９番目（又は１７８番目）の次にもう一度３１塩基が繰り返し挿入されているものであり、タイプ１５及び１７は、一塩基異なるものがもう一度挿入されていた。
【００４８】
これらのデータをベースにして、系統の同定として、系統樹を構築することにより、ササ属植物の系統を同定することができた。
なお、系統樹の構築には、ソフトウェアーPAUP 4.0B10（Sinauer Associates Inc., Sunderland，MA, USA）により、最節約法により分子系統樹を構築すればよい。
以上のように、ＤＮＡの増幅、配列の解析を行うことにより、ササ属植物の系統の同定が可能となった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
以上記載のように、本発明方法により、これまで、外部形質的特徴により分類していたササ属植物を遺伝的に系統化することが可能となった。したがって、本発明方法によりササ属植物から得られる多糖体成分について、均一な品質管理を効率的に行うことが可能となり、安定した効果を有する健康食品を提供することが可能となり、その系統を同定することは、統一した原料の調達の一助となる点で産業上の利用可能性は多大なものである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】本発明におけるプライマーの設計とＤＮＡ増幅法の概略を示す図である。
【図１】
2008113614.tif 000007
【配列表】
2008113614000001.app