(57)【要約】【課題】HIF-1αの安定性を制御し得る化合物のスクリーニング方法の提供。【解決手段】HIF-1αのタンパク質断片及びHaloTagタンパク質を含有する融合タンパク質を発現させた細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるHaloTagタンパク質による蛍光を検出することにより、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物をスクリーニングすることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片並びにHaloTagタンパク質を含有する融合タンパク質を発現させた細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるHaloTagタンパク質による蛍光を検出することを含む、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
HIF-1αタンパク質断片が、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
HIF-1αタンパク質断片が、HIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第574番のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
HIF-1αタンパク質断片が、HIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第641番のアミノ酸配列を含むタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
HIF-1αが以下の(a)又は(b)のタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
(a) 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で示されるアミノ酸配列において第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質
【請求項６】
HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片並びにHaloTagタンパク質を含有する融合タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
哺乳動物細胞である、請求項９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
請求項８に記載の組換えベクターが導入された融合タンパク質安定発現細胞。
【請求項１２】
HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片。
【請求項１３】
請求項１２に記載のHIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HIF-1α（以下「HIF-1αタンパク質」と称する場合もある）の安定性を制御し得る化合物のスクリーニング方法、並びに当該方法に使用可能な融合タンパク質、DNA、ベクター及び細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸素は、生物が生命を維持する上で欠くことのできない重要な因子である。通常、細胞における酸素の需要と供給のバランスは保たれているが、多細胞生物においてはしばしばそのバランスが崩れ、細胞の酸素供給量が需要量を下まわり、いわゆる低酸素が引き起こされることがある。そして、この低酸素は種々の疾患、病態に関係することが知られている。
【０００３】
生物は、低酸素に応答するために、種々の遺伝子の発現を制御する因子として細胞低酸素応答装置を備えており、その最も重要な装置の一つとしてHIF-1（Hypoxia-inducible factor-1）が知られている。
HIF-1は転写因子であり、HIF-1αとHIF-1β（Arnt）とからなるヘテロ二量体を形成する。通常の酸素分圧下では、HIF-1αとHIF-1βはそれぞれ細胞質と核に別々に存在するが、細胞が低酸素状態になることにより、HIF-1αは細胞質から核に移行し、核においてHIF-1βと結合し、転写因子として機能するようになる。すなわち、HIF-1βの存在部位は主に核であるのに対し、HIF-1αの存在部位は一定ではなく、酸素分圧によって厳密に制御されている。通常の酸素分圧下の細胞では、HIF-1αは細胞質でユビキチン化酵素pVHL（von Hippel-Lindau protein）と会合することによりユビキチン化され、プロテアソームで速やかに分解される。一方、低酸素分圧下では、HIF-1αとpVHLとの会合が阻害され、その結果、HIF-1αはプロテアソームで分解されることなく安定化し、細胞内に蓄積する。そして、HIF-1αは核へ移行し、そこでHIF-1βと二量体を形成し、HRE（低酸素分圧応答エレメント）に結合し、他の活性化因子と共同して標的遺伝子の転写スイッチをオンにする（図１）。
【０００４】
このような機序を介して、HIF-1は各種解糖系酵素、グルコース輸送タンパク質、血管内皮増殖因子（VEGF）、造血因子エリスロポイエチンなど、多くの遺伝子の発現を転写レベルで制御し、細胞から組織・個体にいたる全てのレベルの低酸素適応を制御している。
【０００５】
また、転写因子HIF-1αに代表される生体の低酸素応答装置は、低酸素が関与する種々の病態の成立に密接に関わっていることが明らかにされている。そのため、HIF-1の活性を制御する薬剤は、がん、虚血性心疾患、脳血管障害、慢性炎症性疾患などの疾患の治療剤となることが予想される（非特許文献１〜４）。
【０００６】
これまでに、HIF-1αなどの細胞内低酸素応答装置を制御する薬剤のスクリーニングは、主に、細胞抽出液の調製を要する免疫ブロット法又は免疫細胞染色法などの手法により行われていた。しかし、これらの手法は煩雑な工程を含むため、薬剤ライブラリーのハイスループット解析などには適していない。また、免疫ブロット法では、タンパク質の挙動をリアルタイムで観察することはできない。そのため、迅速に大量の薬剤の処理が可能な、細胞内低酸素応答装置を制御する薬剤のスクリーニング方法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Han, J. Y., S. H. Oh, F. Morgillo, J. N. Myers, E. Kim, W. K. Hong, and H. Y. Lee. 2005. Hypoxia-inducible factor 1alpha and antiangiogenic activity of farnesyltransferase inhibitor SCH66336 in human aerodigestive tract cancer. J Natl Cancer Inst 97:1272-86.
【非特許文献２】Isaacs, J. S., Y. J. Jung, D. R. Mole, S. Lee, C. Torres-Cabala, Y. L. Chung, M. Merino, J. Trepel, B. Zbar, J. Toro, P. J. Ratcliffe, W. M. Linehan, and L. Neckers. 2005. HIF overexpression correlates with biallelic loss of fumarate hydratase in renal cancer: novel role of fumarate in regulation of HIF stability. Cancer Cell 8:143-53.
【非特許文献３】Lu, H., C. L. Dalgard, A. Mohyeldin, T. McFate, A. S. Tait, and A. Verma. 2005. Reversible inactivation of HIF-1 prolyl hydroxylases allows cell metabolism to control basal HIF-1. J Biol Chem 280:41928-39.
【非特許文献４】Selak, M. A., S. M. Armour, E. D. MacKenzie, H. Boulahbel, D. G. Watson, K. D. Mansfield, Y. Pan, M. C. Simon, C. B. Thompson, and E. Gottlieb. 2005. Succinate links TCA cycle dysfunction to oncogenesis by inhibiting HIF-alpha prolyl hydroxylase. Cancer Cell 7:77-85.
【非特許文献５】Pereira, T., X. Zheng, J. L. Ruas, K. Tanimoto, and L. Poellinger. 2003. Identification of residues critical for regulation of protein stability and the transactivation function of the hypoxia-inducible factor-1alpha by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product. J Biol Chem 278:6816-23.
【非特許文献６】Temes, E., S. Martin-Puig, J. Aragones, D. R. Jones, G. Olmos, I. Merida, and M. O. Landazuri. 2004. Role of diacylglycerol induced by hypoxia in the regulation of HIF-1alpha activity. Biochem Biophys Res Commun 315:44-50.
【非特許文献７】Kallio, P. J., W. J. Wilson, S. O'Brien, Y. Makino, and L. Poellinger. 1999. Regulation of the hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol Chem 274:6519-25.
【非特許文献８】Macpherson, G. R., S. S. Ng, S. L. Forbes, G. Melillo, T. Karpova, J. McNally, T. P. Conrads, T. D. Veenstra, A. Martinez, F. Cuttitta, D. K. Price, and W. D. Figg. 2003. Anti-angiogenic activity of human endostatin is HIF-1-independent in vitro and sensitive to timing of treatment in a human saphenous vein assay. Mol Cancer Ther 2:845-54.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物を選別するためのスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、本発明は、前記スクリーニング方法に使用可能な融合タンパク質、DNA、ベクター及び細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために、鋭意研究を行った。本発明者は、HIF-1αとpVHLとの会合によりHIF-1αの分解が引き起こされる点に着目し、HIF-1αの安定化又は分解を制御し得る化合物のスクリーニング方法を見出した。すなわち、HIF-1αのpVHL結合部位をタグタンパク質との融合タンパク質として細胞に発現させ、この細胞を各化合物で処理した後、タグタンパク質を指標に用いて細胞内のHIF-1α融合タンパク質を検出することにより、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物をスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片並びにHaloTagタンパク質を含有する融合タンパク質を発現させた細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるHaloTagタンパク質による蛍光を検出することを含む、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物のスクリーニング方法。
（２）HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片並びにHaloTagタンパク質を含有する融合タンパク質。
（３）上記（２）に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（４）上記（３）に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
（５）上記（４）に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
ここで、前記形質転換体には、例えば、哺乳動物細胞を挙げることができる。
（６）上記（４）に記載の組換えベクターが導入された融合タンパク質安定発現細胞。
（７）HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片。
（８）上記（７）に記載のHIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチド。
【００１０】
前記HIF-1αタンパク質断片は、好ましくは酸素依存性被分解活性を有するタンパク質である。
また、前記HIF-1αタンパク質断片としては、例えば、HIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第574番のアミノ酸配列を含むタンパク質、又はHIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第641番のアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
また、前記HIF-1αには、以下の(a)又は(b)のタンパク質を挙げることができる。
(a) 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２で示されるアミノ酸配列において第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物を、HIF-1α融合タンパク質の発現を指標に選別する方法が提供される。また、本発明により、前記方法に使用可能なタンパク質、DNA、ベクター及び細胞が提供される。
本発明の方法により選択された化合物は、例えば、HIF-1α分解促進剤（抗HIF-1α剤）又はHIF-1α分解阻害剤（HIF-1増強剤）として有用である。
また、本発明の方法により選択された化合物は、例えば、がん、虚血性心疾患、脳血管障害、慢性感染症疾患などの疾患の治療薬の候補となり得る。
【００１２】
本発明の方法は、少量の細胞で実施することが可能であり、また、煩雑な操作を必要としないため、短時間のうちに結果を得ることができる。そのため、本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、多数の化合物を短時間に試験するハイスループット解析に用いることが可能である。そして、この態様において、HIF-1αの安定化又は分解を制御し得る化合物を迅速かつ高効率に選択することが可能となった。
【００１３】
また、本発明の好ましい態様において、HIF-1α融合タンパク質を安定発現する細胞を樹立することにより、解析間差が小さく、かつ簡便な高感度解析が可能となった。
さらに、本発明の好ましい態様において、HIF-1αの安定性をリアルタイムに解析することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．概要
本発明者は、生細胞においてHIF-1αの安定性に対する化合物の効果をモニターするために、HIF-1αタンパク質断片とHaloTagタンパク質との融合タンパク質（HIF-1αODD-HaloTagTM融合タンパク質）を発現する安定細胞株を確立した。また、本発明者は、前記細胞をHIF-1αの安定性を制御する所定の化合物で処理することにより、HIF-1αODD-HaloTagTM融合タンパク質の安定化と急速な分解の両方をモニターできることを見出した。したがって、本発明は、HIF-1αODD-HaloTagTM融合タンパク質発現細胞を用いたスクリーニングシステムであって、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物を選択することが可能なスクリーニングシステムを提供する。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法により選択された薬剤／化合物は、HIF-1αを標的とする疾患の治療において極めて有用である。すなわち、HIF-1α安定化剤は、心臓発作、脳卒中、及び末梢血管疾患などの虚血性疾患の治療に有効であり、HIF-1α分解促進剤は、癌及び増殖性網膜症ならびに慢性免疫疾患などの治療に有効である。
以下、詳細に本発明を説明する。
【００１６】
２．HIF-1α
（１）HIF-1α
HIF-1αは、HIF-1βとともにHIF-1（hypoxia-inducible transcription factor-1）を構成するタンパク質である。図１に示すように、通常酸素条件下では、HIF-1αの酸素依存性被分解ドメイン（ODD）における第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンが、プロリルヒドロキシラーゼ（PHD）によりヒドロキシル化される。そして、プロリンのヒドロキシル化が引き金となり、pVHLの結合、ポリユビキチン化及びプロテアソーム分解が誘導される。このように、酸素の存在がキーとなってタンパク質が分解される活性を、「酸素依存性被分解活性」という。一方、低酸素条件下では、酸素の欠如によりPHDは不活性化するため、プロテアソーム系によるHIF-1αの分解は誘導されない。そして、細胞質に蓄積したHIF-1αは核に移行し、HIF-1βとダイマーを形成し、形成した複合体（HIF-1）は標的遺伝子の転写を促進する。
ここで、「通常酸素条件」とは、細胞培養環境の酸素濃度が、（地球上）1気圧大気中の酸素濃度（約20.9％）と同等である条件をいう。培養環境酸素濃度は酸素濃度計（ガスモニター）により連続的に測定される。
【００１７】
本発明において、HIF-1αとは、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を含有するものである。HIF-1αには、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は、例えば、配列番号１で示される塩基配列の第29番目から第2509番目までの塩基配列（以下、「配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列」とも称する）を含むポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１で示される塩基配列は、GenBank accession number：U22431に記載されており、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、GenBank accession number：AAC50152に記載されている。
【００１８】
本発明において、HIF-1αには、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して９０％以上、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつ、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質も含まれる。ただし、前記タンパク質では、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンは保存され、いずれもプロリンである。
【００１９】
ここで、「酸素依存性被分解活性」とは、図１に示すように、酸素の存在下でユビキチン−プロテアソーム系で分解される活性を意味する。本発明において、HIF-1αの活性の程度は特に限定されないが、例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性の約１０％以上、好ましくは２０％、より好ましくは３０％以上であればよい。
酸素依存性被分解活性は、分解時に生じる様々なシグナルを解析することにより測定することができる。分解時に引き起こされるシグナルには、例えば、第402番目のプロリン及び／又は第564番目のプロリンのヒドロキシル化、pVHLの結合、ユビキチンの結合、プロテアソームによるHIF-1α又はHIF-1αタンパク質断片の分解などを挙げることができる。
これらのシグナルは、SDS-PAGE、ウエスタンブロットなどの免疫化学的方法、免疫組織化学的方法、質量分析法などの方法にしたがって測定することができる。
【００２０】
また、本発明において、HIF-1αには、配列番号２で示されるアミノ酸配列のうち第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く１又は数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質も含まれる。
【００２１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列うち第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除くアミノ酸において、１又は数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、(i) 配列番号２で示されるアミノ酸配列（第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く）中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列（第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く）中の１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iii) 配列番号２で示されるアミノ酸配列（第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く）に１〜９個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸は配列、(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列などが挙げられる。
【００２２】
配列番号２で示されるアミノ酸配列（第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを除く）において１又は数個のアミノ酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））、Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz（1987）Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel（1988）Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。
【００２３】
また、上記のような変異を有するタンパク質を調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００２４】
さらに、本発明において、HIF-1αには、他のペプチド配列により付加された融合タンパク質が含まれる。HIF-1αに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素（HA）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）、多重ヒスチジンタグ（6×His、10×His等）、マルトース結合タンパク質（MBP）、免疫グロブリン定常領域断片、c-myc断片、FLAG等のタンパク質の識別を容易にする配列等を選択することができる。
【００２５】
また、本発明において、HIF-1αには、配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質であって、酸素依存性被分解活性を有するタンパク質も含まれる。ただし、前記タンパク質では、配列番号２で示されるアミノ酸配列における第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンは保存され、いずれもプロリンである。
【００２６】
このようなポリヌクレオチドは、配列番号１で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーの作製方法については、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））等を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。
【００２７】
本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。
【００２９】
また、本明細書において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドには、例えば、配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性（相同性）を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。同一性を示す値は、BLASTなどの公知のプログラムを利用することにより算出することができる。
【００３０】
また、配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
ここで、配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列において１個又は数個の核酸に欠失、置換又は付加などの変異の生じた塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、(a) 配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が欠失した塩基配列、(b) 配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が他の核酸で置換された塩基配列、(c) 配列番号１（第29番〜第2509番）で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）の核酸が付加した塩基配列、(d)上記(a)〜(c)の組合せにより変異された塩基配列などが挙げられる。
【００３２】
本発明において、HIF-1αをコードするポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１で示される塩基配列を基にプライマーを設計し、ヒトのcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから遺伝子増幅技術（PCR）（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（1987）Section 6.1-6.4）により得ることができる。
【００３３】
本発明において、塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al.（1977）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。
【００３４】
（２）本発明のHIF-1αタンパク質断片
本発明において、HIF-1αタンパク質断片として、HIF-1αタンパク質のうち酸素依存性被分解活性を有する領域を選択することができる。
【００３５】
酸素依存性被分解活性を有する領域としては、一般に酸素依存性被分解ドメイン（以下、「ODD」ともいう）といわれる領域を挙げることができる。代表的な酸素依存性被分解ドメインは、HIF-1αのアミノ酸配列のうち第401番から第603番までのアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。
【００３６】
本発明のHIF-1αタンパク質断片としては、例えば、HIF-1αのアミノ酸配列において少なくとも第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンを含むタンパク質を挙げることができる。本発明において、第564番目のプロリンだけでなく少なくとも第402番目のプロリンを含むHIF-1αタンパク質断片は、第402番目のプロリンを含有しないHIF-1αタンパク質断片と比較して、本発明のスクリーニング方法におけるHIF-1α安定性の検出感度が向上する点で望ましい。
【００３７】
以下に、本発明のHIF-1αタンパク質断片の例を挙げる。
(i) HIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第574番のアミノ酸配列を含むタンパク質
(ii) HIF-1αのアミノ酸配列の第378番から第641番のアミノ酸配列を含むタンパク質
(iii) HIF-1αのアミノ酸配列の第401番から第603番のアミノ酸配列を含むタンパク質
【００３８】
HIF-1αタンパク質断片は、HIF-1αを分解、消化等の処理をすることにより、HIF-1αから取得することができる。
【００３９】
また、HIF-1αタンパク質断片は、配列番号１又は２で示される配列から、所望の断片を得られるプライマー又はプローブを設計し、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー、ゲノムライブラリーなどの核酸から得ることができる。ライブラリーの作製方法は、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。さらに、前記のプライマーを利用して、HIF-1αをコードする遺伝子を含むポリヌクレオチドから、所望の断片をPCR法により増幅することにより取得することもできる。この際、プライマーには、適当な制限酵素配列などを付加させてもよい。
【００４０】
（３）HaloTag タンパク質
HaloTagタンパク質は、分子量33kDaのタンパク質である。HaloTagタンパク質を細胞に発現させることにより細胞のイメージングが可能となるため、融合タンパク質の翻訳後修飾の解析などに使用することができる。
HaloTagリガンドは、細胞膜を透過し、高い親和性でHaloTagタンパク質又は融合タンパク質と共有結合することができる。この結合は非常に安定であるため、HaloTagタンパク質はさまざまな条件下での細胞イメージングに適用することができる。
【００４１】
本発明において、HaloTagタンパク質をコードする遺伝子を含有するベクターは、プロメガ社からHaloTagTM pHT2 Vectorを購入することで入手できる。
本発明において、HaloTagリガンドは、迅速に細胞膜を透過する赤及び緑の蛍光リガンド並びに透過性の異なる2種類のビオチンリガンドを用いることができる。HaloTagリガンドは、プロメガ社から購入することで入手できる。
【００４２】
本発明の特徴の１つは、HIF-1αタンパク質断片と融合させるタンパク質としてHaloTagタンパク質を用いている点である。
実施例に示すように、本発明では、HIF-1αタンパク質断片とHaloTagとの融合タンパク質を用いることにより、HIF-1αの安定性を検出することができることが初めて示された。タグタンパク質として汎用されるGFPは、融合タンパク質を安定化するため、HIF-1α融合タンパク質の安定性を検出するのには適さないことが示された（図７パネルＢ〜Ｅ）。
また、ルシフェラーゼの場合は、発光させるために細胞を溶解させる必要があるために、生細胞を用いたリアルタイムな検出には適さないといえる。これに対し、本発明の場合は、HaloTagリガンドの蛍光により、生細胞をリアルタイムに観察することができる。
【００４３】
（４）融合タンパク質及び組換えベクター
本発明は、本発明のHIF-1αタンパク質断片及びHaloTagタンパク質を含む融合タンパク質及び前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本発明の融合タンパク質は、後述するように、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物のスクリーニングに有用である。
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、HIF-1αタンパク質断片及びHaloTagタンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター（以下、「本発明のベクター」とも称する）を用いて発現させることができる。
本発明のベクターは、HIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチド及びHaloTagタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、融合タンパク質が発現するように組み込んだベクターである。
【００４５】
本発明のベクターを作製するには、HIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターに、HaloTagタンパク質をコードするポリヌクレオチドをHIF-1αタンパク質断片のフレームを考慮して挿入すればよい。または、HaloTagタンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれたベクターに、HIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチドをHaloTagのフレームを考慮して挿入すればよい。あるいは、HIF-1αタンパク質断片をコードするポリヌクレオチドとHaloTagタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを、同時にベクターに挿入すればよい。ここで、フレームを考慮するとは、HIF-1αタンパク質断片とタンパク質とHaloTagタンパク質とが融合タンパク質として発現するように、ベクターに挿入するポリヌクレオチドの位置、長さを調整することを意味する。
【００４６】
ベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、リガーゼ反応、トポイソメラーゼ反応等を利用することができる。例えば、精製されたポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断し、得られた断片をベクター中の適当な制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することでベクターに連結する方法などが採用される。
【００４７】
本発明のベクターは、融合タンパク質を発現し得る限り、その基本となるベクターの由来には限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスもしくはバキュロウイルスなどの無毒化した動物又は昆虫ウイルスを使用することができる。また、例えば、pcDNA3などの市販のベクターを使用することもできる。
【００４８】
本発明のベクターは、融合タンパク質を発現させ得る限り、マルチクローニングサイト、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、選択マーカーカセットなどを含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドを挿入する際に必要であれば、適宜リンカーを付加してもよい。
【００４９】
プロモーターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に組み込むことができる。プロモーターは、宿主において本発明の融合タンパク質を適切に発現できるものであれば、特に限定させないが、例えば、trpプロモーター、lacプロモーター、CMVプロモーター、EF1αプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、CAGプロモーター等を使用することができる。
ターミネーターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの下流に組み込むことができる。
【００５０】
選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、蛍光タンパク質、mycなどのタグタンパク質などを挙げることができる。
また、本発明のベクターには、SD配列、Kozak配列を含有させることができる。これらの配列は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの5'端に挿入してベクターに組み込んでもよいし、PCR法で前記ポリヌクレオチドに付加してベクターに組み込んでもよい。
【００５１】
（５）形質転換体
本発明のベクターを宿主に導入することで、形質転換体を作製することができる。このような形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用される宿主は、本発明のベクターが導入された後、目的の融合タンパク質を発現することができる限り特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などが挙げられる。当業者であれば、本発明のベクターに適した宿主を選択することができる。
本発明のスクリーニング方法（後述）には、宿主細胞として動物細胞を用いることが好ましい。
【００５２】
大腸菌としては、例えば、K12株、JM109株、XL1-Blue株などを挙げることができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ATCC）などから容易に入手することができる。枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。酵母としては、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等が用いられる。動物細胞としては、COS-7、CHO細胞、Hela細胞、293細胞、マウス脳血管内皮細胞（MBEC）等が用いられる。昆虫細胞としては、Sf9細胞、Sf21細胞等が用いられる。
【００５３】
宿主へのベクターの導入方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAE デキストラン法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等の公知の方法が挙げられる。また、ベクターがウイルスベクターの場合は、宿主細胞を培養し、培養液にウイルスベクターを添加し、さらに培養することで遺伝子を導入することができる。
【００５４】
例えば、宿主細胞に動物細胞を用いる場合は、リポフェクション法で遺伝子を導入することが好ましい。例えば、ベクターを培地に添加した後、１２時間後に培地を交換し、さらに２４時間培養することで細胞当たりの融合タンパク質の発現量を増やすことができる。
以上の方法により、本発明の形質転換体が提供される。本発明の形質転換体は、好ましくは哺乳動物由来の細胞である。
【００５５】
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法にしたがって行うことができる。培養培地は、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地が望ましく、当業者であれば公知の培地から適宜選択することができる。
例えば、宿主が動物細胞の場合は、DMEM、MEM、RPMI、F12等の培地を用いて、必要であれば血清、アミノ酸、グルコース、抗生物質などを添加することができる。
形質転換体の培養条件は、特に限定されないが、10℃〜45℃、好ましくは、10℃〜40℃の温度下で、5〜120時間、好ましくは5〜100時間程度行う。また、必要に応じて、培地の交換、通気、撹拌を行うこともできる。
【００５６】
本発明の融合タンパク質は、上記のように本発明の形質転換体の培養物から得ることもできる。本発明の形質転換体における融合タンパク質の発現は、HaloTagリガンドを用いて測定することができる（後述）。本発明の形質転換体において、本発明の融合タンパク質は、化合物によるHIF-1αの安定性の制御を検出し得るレベルで発現することができる。したがって、本発明の形質転換体は、本発明のスクリーニング方法において、非常に有用である。
【００５７】
さらに、宿主に動物細胞を用いた場合、本発明の形質転換体をクローニングを行い、安定発現細胞株を樹立することもできる。安定発現細胞株は、培養中にタンパク質の発現特性が偏ることが少なく、安定した化合物スクリーニングを行うことが可能である。
細胞のクローニングは、薬剤耐性カセットに対応する薬剤を利用した限界希釈法、セルソーティング法などの慣用の方法にしたがって行うことができる。クローニング後の細胞から、融合タンパク質の発現量、細胞の形態などを解析することにより、所望の安定発現細胞株を選択することができる。
【００５８】
HIF-1αは過剰発現により酸素依存性被分解活性を喪失することがあり、HIF-1αあるいはHIF-1α融合タンパク質の酸素依存性不安定性を観察するに際しては、その細胞内発現量を適切に設定する必要がある。特に、一過性遺伝子導入による細胞内タンパク質強制発現系においては各試行間の差異を生じさせない条件の設定は容易ではない。本発明は、酸素依存性被分解活性を保持したHalo-Tag-HIF-1αODD融合タンパク質を安定に発現する細胞を提供する。
【００５９】
本発明の形質転換体における融合タンパク質の発現量は、ウエスタンブロット、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、ELISA、フローサイトメトリーなどの免疫化学的方法によって測定することができる。
【００６０】
３．スクリーニング方法
本発明は、融合タンパク質を発現させた細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるHaloTagタンパク質による蛍光を検出することを含む、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法は、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物を選択するのに有用である。また、本発明のスクリーニング方法では、融合タンパク質の安定性をリアルタイムに解析することが可能である。さらにまた、本発明のスクリーニング方法は酸素濃度の調整を必要とせず、通常雰囲気下で実施することが可能である。
【００６１】
（１）融合タンパク質を発現させた細胞に被験物質を接触させる工程
本工程において、融合タンパク質を発現させた細胞は、本発明のベクターを導入させた形質転換体を用いることができる。融合タンパク質を発現させた細胞は、前述の融合タンパク質の安定発現細胞を用いることが好ましい。本工程において、安定発現細胞を用いることにより、解析間の差が小さく、かつ、簡便に高感度に解析することが可能となる。
本工程では、まず前記細胞を培養し、被験物質を細胞に接触させる。次に、細胞を、被験物質とともにさらに１〜１０時間、好ましくは４時間培養することにより接触させることができる。このとき、コントロールとして、被験物質を含まない細胞又はHIF-1αの安定性を制御することが知られている化合物を加えた細胞を用意してもよい。HIF-1αを安定化する化合物としては、2', 2'-dipyridyl（DP）、desferrioxamine、2-oxoglutarate（2-OG）、dimethyloxalylglycine（DMOG）、MG132などが挙げられる。これらの化合物は市販されているものを購入することで入手できる。
【００６２】
被験物質としては、ペプチド、タンパク質、核酸、化合物、細胞抽出物等を用いることができる。
【００６３】
（２）前記細胞におけるHaloTagタンパク質による蛍光を検出する工程
蛍光を検出するために、工程（１）で被験物質と接触させた細胞を、HaloTagリガンドでラベルする。
HaloTagリガンドによるラベルは、まず、所定の濃度に希釈したHaloTagリガンドを、細胞の培養液に添加し、さらに１０〜３０分間、好ましくは１５分間培養すればよい。蛍光を測定する前に、培養液中のHaloTagリガンドを除去することが好ましい。HaloTagリガンドの除去は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、トリス−塩酸緩衝液などの緩衝液で、細胞を１〜５回、好ましくは３回洗浄することにより行うことができる。リガンドの洗浄除去の後、細胞を新鮮な培養培地に置換し、さらに１５〜４５分間、好ましくは３０分間培養してもよい。ここで、洗浄液及び洗浄後の培養培地には、被験物質を工程（１）で用いた濃度と同一の濃度で含有させることが好ましい。
【００６４】
本発明のスクリーニング方法をPulse-labeling-chase方法で実施する場合は、洗浄後の培養培地には、被験物質を含有しないものを用い、被験物質を含有しない培養培地中で、所定の時間さらに培養を続ける。Pulse-labeling-chase方法では、ラベル後の細胞は被験物質に接触しないため、ラベル後の被験物質と融合タンパク質との反応による影響を考慮することなく、ラベルされた融合タンパク質の安定性を追跡することが可能である。したがって、この方法では、化合物によるHIF-1αの安定化をより詳しく特徴付けることができる。
【００６５】
上記のように処理した細胞における融合タンパク質による蛍光を検出するには、共焦点レーザー顕微鏡（例えば、Olympus Fluoview FV500 confocal laser microscope）を用いることが好ましい。フィルターセットは、HaloTagリガンドに適するものを使用することができ、当業者であれば適宜選択することができる。
【００６６】
細胞の蛍光量が対照細胞の蛍光量と比較して大きいときは、当該被験物質はHIF-1αを安定化する化合物であると判断することができる。また、細胞の蛍光量が対照細胞の蛍光量と比較して小さいときは、当該被験物質はHIF-1αを不安定化する、又はHIF-1αの分解を促進する化合物であると判断することができる。
ここで、対照細胞は、被験物質を添加していない細胞などを用いることができる。
また、実験成立の適否を判断するには、融合タンパク質を発現していない細胞、HaloTagタンパク質のみを発現する細胞などを用いることができる。
【００６７】
本発明の方法により選択された化合物は、がん、虚血性心疾患、脳血管障害、慢性感染症疾患などの治療薬の候補となり得る。すなわち、HIF-1αの安定化剤は、心臓発作及び末梢血管疾患などの虚血性疾患、並びに脳卒中などの脳血管障害の治療に有効である。HIF-1α分解促進剤は、がん、増殖性網膜症、慢性感染症疾患ならびに慢性免疫疾患の治療に有効である。
【００６８】
また、Pulse-labeling-chase方法において、被験物質を洗浄除去した後に蛍光量が減少した場合は、当該被験物質は融合タンパク質と可逆的に反応するものと判断することができる。一方、被験物質を洗浄除去した後も蛍光量に大きな変化のない場合は、当該被験物質は融合タンパク質と非可逆的に反応するものと判断することができる。
【００６９】
（３）キット
本発明は、本発明のスクリーニング方法に用いるための、安定発現細胞の蛍光量を測定するためのキットを提供する。本発明のキットは、被験物質をスクリーニングするために使用される安定発現細胞、試薬、バッファー、容器、使用説明書などを含めることができる。本発明のキットは、HIF-1αの安定性を制御し得る化合物をスクリーニングするのに有用である。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本実施例は本発明を限定するものではない。
１．材料と方法
（１）ベクターの構築
HIF-1αODDとHaloTagタンパク質との融合タンパク質用の発現ベクターを以下のように構築した。
まず、HIF-1αアミノ酸配列の第517番〜第641番のアミノ酸、第378番〜第641番のアミノ酸又は第378番〜第574番のアミノ酸をコードするcDNAフラグメントを、Bam HI リンカーと共にPCRによりヒトHIF-1α遺伝子を含有するベクターから単離した。得られたDNA断片を、HaloTagTM タンパク質の開始コドンのフレームにあわせてHaloTagTM pHT2 ベクター（プロメガ社）のBam HI サイトに組み込んだ。得られた融合タンパク質発現ベクター（HaloTagTM-HIF1αODD pHT2）は、HaloTagタンパク質と、HIF-1αの第517番〜第641番のアミノ酸、第378番〜第641番のアミノ酸又は第378番〜第574番のアミノ酸との短い融合タンパク質を発現した（図１）。
【００７１】
次に、HaloTagTM-HIF1αODD pHT2からBgl II−Not I断片を切り出し、得られた断片をBgl II−Not Iで開環したpCDNA3ベクター中に挿入した。得られたベクターを、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/517-641（以下、「HaloTagTM-HIF1αODD/517-641発現ベクター」とも称する）、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641（以下、「HaloTagTM-HIF1αODD/378-641発現ベクター」とも称する）又はpCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-574（以下、「HaloTagTM-HIF1αODD/378-574発現ベクター」とも称する）とした。
【００７２】
コントロールベクター（pCDNA3-HaloTagTM又は「HaloTagTM発現ベクター」とも称する）は、HaloTagTM pHT2ベクターからBgl II−Not I断片を切り出し、得られた断片をBgl II−Not I で開環したpCDNA3ベクターにサブクローニングすることで作製した。コントロールベクターは、HIF-1αODDに融合していないHaloTagタンパク質を発現する。
なお、本実施例で用いたpCDNA3ベクターは、ネオマイシン耐性カセットを有しているため、トランスフェクションした細胞をG418で選択するのに適したベクターである。
【００７３】
（２）細胞培養、トランスフェクション及び細胞の処置
マウス脳血管内皮細胞（MBEC）は、10% FCS及び抗生物質を含有したHam's F-12培地で維持した。
60 mmディッシュで50−70 % コンフルエントのときに、細胞を3μgのpCDNA3-HaloTagTM、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/517-641、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又はpCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-574、でトランスフェクトした。トランスフェクションは、リポカチオニック試薬であるTransIt-LT1（登録商標）を用いて、12時間、製造元のプロトコールにしたがって行った。
【００７４】
一過性のトランスフェクションでは、トランスフェクションの24時間後に細胞を剥離、回収し、続いて48ウェルプレートに播種した。
【００７５】
融合タンパク質を安定に発現する細胞を樹立するために、前記のようにマウス脳血管内皮細胞をpCDNA3-HaloTagTM、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又はpCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-574でトランスフェクションした。その後、トランスフェクトした細胞を500μMのG418硫酸塩で処置し、G418への耐性に対してHaloTagTM-HIF1αODD融合タンパク質又はHaloTagTMタンパク質を安定に発現する細胞を選択するために培養を続け、安定発現細胞を選択した。
【００７６】
細胞は48ウェル培養プレートに播種し、完全培養培地中、2', 2'-dipyridyl (DP)（100μM）、DMOG（500μM）、MG132（5μM）などの薬剤で４時間処置した。
【００７７】
（３）タンパク質のHaloTagTM ラベル及び顕微鏡解析
トランスフェクトした細胞を、DPなどの薬剤の存在下で完全成長培地で４時間培養した後、HaloTagTM融合タンパク質を、製品マニュアルの指示にしたがってHaloTagTM TMRリガンドでラベリングした。すなわち、1:500に希釈したHaloTagTM TMRリガンドを培養液に添加し、さらに、１５分間培養した。次に、細胞をPBS（phosphate buffered saline）で３回洗浄することによりリガンドを除去した。新鮮な培養培地に置換した後、細胞をさらに３０分間培養した。HaloTagTM ラベリング及び洗浄プロセスに用いたPBS又は培養培地は、細胞を処置したときと同じ濃度で、HIF-1安定化効果を試験した試薬（DPなどの薬剤）を含有させた。
【００７８】
図５に示す実験では、DPなどの試薬の存在下に細胞を４時間培養した後、上記のように培地から試薬を除去した。さらに、当該試薬を含まない新鮮な培養培地中で細胞を２時間培養した後、TMRリガンドでラベリングした。
【００７９】
図６に示すpulse-labeling and chase analysisでは、DPの存在下に細胞を４時間培養した後、上記のようにHaloTagTMRリガンドで15分ラベリングした。次に、細胞をDPを含有させたPBSで３回洗浄することによりリガンドを除去し、DPを含有させた新鮮な培地中で、さらに３０分間培養を続けた。一度細胞を以下のように蛍光顕微鏡解析した後、再度細胞を洗浄してDPを除去した。DPを含有しない培地中で細胞を２時間培養した後、細胞の蛍光を蛍光顕微鏡で確認した。
【００８０】
ラベル及び洗浄処理に続いて、HaloTagTM-HIF1aODD融合タンパク質を検出するために、Olympus Fluoview FV500 confocal laser microscopeで、TMRリガンドに適したフィルターセットを用いて、連続モードにより細胞を蛍光顕微鏡解析に供した。
【００８１】
２．結果と考察
（１）組換えベクターの構築
「１．材料と方法」に記載したとおり、HaloTagTM-HIF1αODD/517-641発現ベクター、HaloTagTM-HIF1αODD/378-641発現ベクター、HaloTagTM-HIF1αODD/378-574及びHaloTagTM発現ベクターを構築した（図２）。各ベクターの塩基配列は、DNAシークエンシングにより確認した。
【００８２】
HaloTagTM-HIF1αODD/517-641ベクターから発現する融合タンパク質は、HIF-1αの第402番目のプロリンを含有しない。これに対して、HaloTagTM-HIF1αODD/378-641ベクターから発現する融合タンパク質及びHaloTagTM-HIF1αODD/378-574ベクターから発現する融合タンパク質は、いずれも第402番目のプロリンと第564番目のプロリンの両方のプロリンを含有する。
【００８３】
（２）MBECへの一過性のトランスフェクション
MBECをpCDNA3-HaloTagTMで一過性にトランスフェクションすると、HaloTagTM タンパク質が効果的に発現した（図３パネルＡ）。pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/517-641を細胞に導入した場合は、融合タンパク質からの蛍光は、パネルＡと比較して減少したものの、なお観察された（図３パネルＢ）。この蛍光の減少は、融合タンパク質HIF1αODD/517-641の不安定性を示している。
【００８４】
一方、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又は-HIF1αODD/378-574でトランスフェクションした細胞では、発現した融合タンパク質を反映する蛍光は、パネルＡと比較してほとんど観察されなかった（図３パネルＣ、Ｄ）。このことは、HIF-1αODD/378-641とHaloTagTMタンパク質との融合タンパク質、又はHIF1αODD/378-574とHaloTagTMタンパク質との融合タンパク質の減少を示し、通常酸素条件下での培養により、HaloTagTMタンパク質が急速に分解されたことを意味している。ここで、酸素条件は、1気圧大気中の酸素濃度（20.9％）と同等とした。
【００８５】
ところで、2', 2'-dipyridyl（DP）やdesferrioxamineといったイオンキレーターは、PHD酵素の活性化部位に結合した鉄イオンの量を減らすことにより、HIF−PHD間の作用を阻害し、HIF-1αを安定化することが知られている。この知見をもとに、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又は-HIF1αODD/378-574でトランスフェクトした細胞をDPで処置した。
その結果、DP処理によって、DP非処理細胞（図３パネルＣ、Ｄ）と比較して、細胞内に融合タンパク質が蓄積した（図３パネルＧ、Ｈ）。このことは、DPにより、HIF-1αODDが効果的に安定化し、融合タンパク質の寿命が延びたことを示している。
【００８６】
一方、コントロールであるpCDNA3-HaloTagTMでトランスフェクトした細胞をDPで処理すると、DP非処理細胞（パネルＡ）と比較して同程度の蛍光量を示した（図３パネルＥ）。
また、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/517-641でトランスフェクトした細胞のタンパク質の安定性は、DP処理をしてもDP非処理細胞（図３パネルＢ）に比べてほとんど向上しないことが示された（図３パネルＦ）。
【００８７】
以上の結果から、HaloTagTM-HIF1αODD/378-641融合タンパク質及びHaloTagTM-HIF1αODD/378-574融合タンパク質は、通常酸素条件下において、より効率的に分解されることが示された。そして前記タンパク質は、第402番目のプロリン及び第564番目のプロリンの両方を含有することにより、HIF1αの安定性を制御し得る化合物の効果を反映することが示された。したがって、本発明の融合タンパク質及び前記タンパク質を発現させた細胞は、HIF-1αの安定性や発現を制御し得る薬物／化合物をスクリーニング又は評価するための適切なツールとなることが示された。
【００８８】
（３）安定発現細胞
本実施例では、融合タンパク質の発現レベルを、効果的に、かつ再現よく解析することを目的として、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641及び-HIF1αODD/378-574を安定に組み込んだ細胞をそれぞれ確立した。
pCDNA3-HaloTagTMで安定的にトランスフェクトした細胞では、一過性のトランスフェクションでの実験の結果（上記（２））と同様に、HaloTagTMタンパク質の発現が確認された（図４パネルＡ）。
【００８９】
一方、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又は-HIF1αODD/378-574でトランスフェクトした細胞の蛍光は、通常の酸素条件での培養下では、パネルＡの蛍光と比較してほとんど検出されなかった（図４パネルＢ、Ｃ）。しかし、この蛍光の消失は、DPで細胞を処理することにより顕著に回復し、蛍光が確認された（図４パネルＥ、Ｆ）。
このことは、HIF1αODD/378-641又はHIF1αODD/378-574と融合したことによりHaloTagTMタンパク質が急速に減衰すること、及びDPで処理することによりHIF-1αODDが効果的に安定化することを示している。
【００９０】
一方、コントロールであるHaloTagTMタンパク質を発現させた細胞をDPで処理しても、未処理細胞（図４パネルＡ）に比べて蛍光レベルの変化は観察されなかった（図４パネルＤ）。これは、DPはHIF-1αODDを有する融合タンパク質に特異的に作用することを示している。
【００９１】
（４）HIF-1αの安定性を制御する化合物の効果
次に、HaloTagTM融合タンパク質の発現に対する種々の試薬の効果とその可逆性について観察した。上述したようにDPで処理することによりHaloTagTM-HIF1αODD/378-641は顕著に安定化する（図５パネルＨ（無処理）、Ｉ（処理））。DP存在下で４時間インキュベーションした後、細胞を洗浄してDPを除去すると、融合タンパク質の蛍光が消失した（図５パネルＩ（洗浄前）、Ｌ（洗浄後））。このことは、HIF-1αODDはDPにより可逆的な制御を受けることを示している。
【００９２】
ところで、HIF-PHDの活性化を制御する重要な因子として、酵素補基質である2-oxoglutarate（2-OG）を挙げることができる。ここで、dimethyloxalylglycine（DMOG）などの2-OCアナログは、HIF-PHDを阻害することにより、HIF-1αの分解を阻害することが示されている。この知見に基づいて、細胞をDMOGで処理すると、無処理の細胞（図４パネルＨ）に比べて、HaloTagTM-HIF1αODD/378-641融合タンパク質が安定化した（図４パネルＪ）。
そして、興味深いことに、DMOG処理を中止しても、融合タンパク質の安定性も蛍光も消失しなかった（図５パネルＪ（洗浄前）、Ｍ（洗浄後））。このことは、DMOGはDPとは異なったメカニズムでHIF1αODD/378-641を修飾することを示している。
【００９３】
また、MG132などのプロテアソーム阻害剤で細胞を処置すると、HIF-1αの安定化を導くことが知られている。この知見に基づいて、細胞をMG132で処理すると、無処理の細胞（図５パネルＨ）に比べて、HaloTagTM-HIF1αODD/378-641融合タンパク質の蓄積が誘導された（図５パネルＫ）。そして、このような蓄積効果は、MG132試薬を培養培地から洗浄除去することにより消失した（図５パネルＫ（洗浄前）、Ｎ（洗浄後））。
【００９４】
コントロールであるHaloTagTMタンパク質を発現する細胞をDPで処理した場合（図５パネルＢ）、DMOGで処理した場合（図５パネルＣ）、又はMG132で処理した場合（図５パネルＤ）及びこれらの処理を細胞洗浄により中止した場合（図５パネルＥ、パネルＦ、パネルＧ）は、いずれの場合も一定の蛍光量を示した。したがって、本実施例で用いたDP、DMOG及びMG132による効果は、HIF-1αODDを含む融合タンパク質に特異的なものであるといえる。
【００９５】
（５）pulse-labeling and chase analysis
本実施例では、蓄積した融合タンパク質のpulse-labeling and chase analysisを実施した。細胞をDP存在下で４時間培養した後、細胞中に発現した融合タンパク質を、HaloTagTM TMRリガンドで「１．材料と方法」に記載した方法でラベルした。続いて細胞を洗浄し、DPを含有しない培地中で培養した。
【００９６】
図６に示すように、DP存在下で４時間細胞を培養することにより、HIF-1αODD-HaloTagTM 融合タンパク質の蓄積が誘導された（図６パネルＢ）。次に、DPへの暴露を終了すると、細胞の蛍光が徐々に減少し、暴露終了2時間後までに標識されたタンパク質はほぼ消失した（図６パネルＣ）。このことは、本実験系により、パルスラベルしたタンパク質の減衰を有効に追跡できることを示している。
【００９７】
（６）GFPを用いた検討
一方、本発明者は、HIF-1αODD/331-641とgreen fluorescent protein (GFP)との融合タンパク質又はGFP単独を発現させた細胞を用いた実験を行った（図７Ａ）。その結果、GFP発現細胞では、DP処置又はDP無処置のいずれの条件においてもタンパク質が恒常的に発現した（図７パネルＢ、Ｃ）。さらに、GFP融合タンパク質発現細胞においても、GFP発現細胞と同様の結果を示した（図７パネルＤ、Ｅ）（参考文献２６を参照）。このことは、GFPはHIF-1αODDの不安定性を反映させるためのタグとしては適当でないことを示している。
【００９８】
以上の結果から、HIF-1αODD-HaloTagTM 融合タンパクシステムは、HIF-1αタンパク質の半減期に影響するさまざまな処理に対して、感度よく、HIF-1αタンパク質レベルに比例した蛍光を発現し得ることが明らかになった。
【００９９】
HIF-1αの安定性を制御し得る薬剤をスクリーニングする上で、HIF-1αODD-HaloTagTM 融合タンパク質システムは以下の点で非常に有効であると言える。
まず、本実施例において明らかにしているように、本発明のシステムでは、従来のイムノブロット法に比べて少ない細胞数で実施することができる（イムノブロットで必要な細胞数の約５〜１０％未満）。すなわち、48-96ウェル培養プレートスケールのアッセイによって、ハイスループット解析に適用可能であることが明確に示されている。小さな培養スケールでHIF-1α安定性に対する追跡アッセイが可能であれば、例えば、細胞を刺激するための化合物や、培養プレートの表面に固定化された抗体といった不必要な試薬の消費を回避することができる。
【０１００】
また、本発明の方法は、従来の方法と比べて工程が少なくすみ、短い時間で終了させることができる。つまり、本発明の方法に必要な標識ステップと３回の洗浄ステップを行っても、1時間もかからずに解析を終了させることができる。本発明の方法は、この点においてもハイスループット解析に好適であるといえる。
【０１０１】
さらに、本発明のシステムの利点は、生細胞におけるタンパク質の寿命をリアルタイムで解析できる点である。すなわち、本発明の方法（HaloTag法）では、細胞を固定化する必要がなく、様々な処置による効果を繰り返し試験することができる。本実施例において、化合物処理時及びそれに続く洗浄処理後に細胞を観察することにより、DMOGによる融合タンパク質の安定化は非可逆性であるが、DP又はMG132による安定化は試薬を洗浄することで消失することが明らかになった。したがって、本発明の方法により、化合物によるHIF-1αの安定性の制御を、より詳しく特徴付けることができる。
また、本発明の方法において、タンパク質のpulse-labelingは、新しく合成されたタンパク質による妨害を除いてタンパク質の寿命を追跡することができる。
【０１０２】
さらに、本発明により、有効なHIF-1αODD-HaloTagTM融合タンパク質発現システムを有する安定細胞株が樹立された。本発明の安定細胞は、再現性よく、感度のよい、ready-to-useな方法に提供され、時間と資源を節約することができる。
【０１０３】
HIF-1αシグナルの観点からいえば、本発明の方法は、pVHLを介したHIF-1αのユビキチン化とそれに続くプロテアソーム分解系を特異的に反映したものといえる。近年、多くの研究によって、HIF-1αタンパク質レベルを薬理学的に操作することが示されている。このような研究における薬剤又は処理のほとんどは、翻訳レベルを対象にして効果を示している。つまり、従来の研究は、HIF-1αに特異的な効果のみを検討していない可能性がある。また、HREを介した遺伝子の転写からHIF-1αの機能を制御する研究もある。しかし、これらの検討では、SP-1、NFkB及びその他の転写因子による非HIF依存的な転写制御の関与の可能性を否定することはできない。
臨床応用を考慮すると、本発明のスクリーニングシステムは、機能的に明確な標的を反映しているために、安全性の面から好ましい。したがって、本発明のHIF-1αODD-HaloTagTM 融合タンパク質システムは、HIF-1αを制御し得る薬剤のスクリーニングシステムとなり得る。
【０１０４】
本発明において、HaloTagTMタンパク質は、これに付加したタンパク質を安定化しないという特徴を有することが明らかになった。この特徴は、GFPなどの第一世代の蛍光タンパク質タグとは異なるものである。したがって、HaloTagTMタンパク質との融合タンパクシステムは、様々な条件下でタンパク質の半減期を評価するのに用いることができる。例えば、NFkB-阻害タンパク質であるIkBも、ユビキチン−プロテアソーム分解系により制御され、そのようなタンパク質の減衰は、多くの炎症関連疾患の惹起のステップにおいて重要である。よって、IkBの半減期を制御し得る薬剤の開発は、治療効果を維持させる観点からも非常に重要である。HaloTagTMシステムは、そのような薬剤のスクリーニング系の樹立にも有用である。
【０１０５】
（参考文献１〜６０）
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Hoffmann, A., and Baltimore, D. (2006) Immunol Rev 210, 171-186
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】HIF-1αの安定性がプロリルヒドロキシラーゼによって制御される機構を示す図である。
【図２】HIF-1α、HaloTagTM-HIF1αODD/517-641、-HIF1αODD/378-641、-HIF1αODD/378-574及びHaloTagTMタンパク質の一次構造の略図である。
【図３】HaloTagTM-HIF1αODD 融合タンパク質におけるHIF-1αの安定性の修飾効果を示す図である。pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/517-641、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641、pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-574又はpCDNA3-HaloTagTMベクターで一過性にトランスフェクトしたマウス脳血管内皮細胞（MBEC）を用いた。
【図４】HaloTagTM-HIF1αODD 融合タンパク質におけるHIF-1αの安定性の修飾効果を示す図である。安定発現細胞を48ウェル培養プレートで完全成長培地中で培養した。細胞をDPで４時間処置した後、HaloTagTMTMRリガンドでラベルした。
【図５】HaloTagTM-HIF1αODD融合タンパク質を安定に発現する細胞において、HIF-1αの安定性を制御する化合物の効果を示す図である。pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641又はpCDNA3-HaloTagTMのいずれかを安定に組み込んだマウス脳血管内皮細胞を用いた。HaloTagTM TMRリガンドで細胞をラベルする前に、細胞を表示した試薬と培養した。試薬を培地から除去し、細胞をさらに２時間培養した後、リガンドでラベルした。
【図６】HaloTagTM-HIF1αODD/378-641融合タンパク質のPulse-labeling and chaseの結果を示す図である。pCDNA3-HaloTagTM-HIF1αODD/378-641で安定的にトランスフェクトしたマウス脳血管内皮細胞を用いた。細胞を100μMのDPで4時間３７℃で処理した後、HaloTagTM TMRリガンドで15分ラベルした。細胞をPBSで３回洗浄することにより、リガンドを除去し、DPを含む新鮮な培地でさらに30分間培養を続けた後、蛍光顕微鏡下で細胞内蛍光を観察した。その後、再度細胞を洗浄しDPを除去し、DPを含有しない培地で２時間培養後、顕微鏡下で細胞内蛍光タンパク質の発現を解析した。
【図７】GFP-HIF-1αODD融合タンパク質の発現の解析結果を示す図である。Ａ：HIF1α、GFP-HIF1αODD/331-641及びGFPタンパク質の一次構造の略図である。Ｂ〜Ｅ：COS7細胞をGFP-HIF-1αODD/331-641又はGFP発現ベクターで一過性にトランスフェクションした。DP処置有り又はDP処置無しの条件下でトランスフェクトした細胞を6時間培養した。その後、GFPを検出するのに適したフィルターセットを装填した蛍光顕微鏡により細胞を観察した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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