(57)【要約】      （修正有）【課題】亜鉛イオンと特異的に結合し、かつ蛍光強度が十分に高く、かつレシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルが十分にシフトする化合物の提供。【解決手段】一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩。2008222563.tif 000015前記式（Ｉ）中、  Ｘ1は、水素原子等、  Ｘ2は、水素原子、又は低級アルキル基、  Ｘ3は、水素原子等、  Ｙは、式−（ＣＨ2）n−で表わされる基であり、ここでｎは１〜３の整数であり、  Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、等で表わされる基である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩。
【化１】
2008222563.tif 000012
前記式（Ｉ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【請求項２】
Ｙが−ＣＨ2−で表わされる基である一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の製造方法であって、
式（ＩＩ）で表わされるアミン誘導体と、ホルムアルデヒドと、一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物とを反応させることにより、Ｙが−ＣＨ2−で表わされる基である一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を得る製造方法。
【化２】
2008222563.tif 000013
前記式（Ｉ）および（ＩＩＩ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−ＣＨ2−で表わされる基であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【請求項３】
請求項１に記載のクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項４】
請求項３に記載の蛍光プローブを含む亜鉛量測定用試薬。
【請求項５】
亜鉛量を測定する方法であって、
前記方法が、
請求項４に記載の亜鉛量測定用試薬と試料とを混合し、
前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、
前記一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中の亜鉛の量を定量することを含む方法。
【化３】
2008222563.tif 000014
前記式（ＩＶ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗ’は、−Ｏ-、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−Ｓ-または−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【請求項６】
前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、
蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、
前記比に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われる請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われる請求項５または６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クマリン誘導体、前記クマリン誘導体の製造方法、前記クマリン誘導体を含む蛍光プローブおよび亜鉛量測定試薬、ならびに亜鉛量を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛は人の体内において鉄に次いで含有量が多い必須微量金属元素である。細胞内に存在する亜鉛は、ほとんど亜鉛イオンの形態である。この亜鉛イオンは、タンパク質と強固に結合し、その結果、タンパク質の構造保持や機能発現に関与している。
【０００３】
従来、体内の細胞中に存在する亜鉛の量を測定するため、蛍光プローブを用いる方法が知られている。この蛍光プローブとは、亜鉛イオンを特異的に捕捉して錯体を形成し、その錯体形成の結果蛍光を発する化合物を指す。
【０００４】
この蛍光プローブについては、細胞内に導入される蛍光プローブの濃度が細胞の種類によってばらついたり、細胞膜などの疎水性が高い部分に蛍光プローブが局在化する場合がある。また細胞膜の厚さの相違により、測定部位の違いによって蛍光強度に差が生じる場合がある。このような問題は、蛍光プローブを測定する際、１波長において蛍光強度を測定するため、解決が困難であった。
【０００５】
このような問題を解決するため、レシオ測定を用いた亜鉛の量を測定する方法が開発されている（例えば、非特許文献１参照）。このレシオ測定を用いた方法は、蛍光プローブの蛍光スペクトルまたは励起スペクトルについて、異なる２波長における蛍光強度を測定し、その比を得る工程を含んでいる。このように蛍光強度の比を得るため、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響をほとんど受けないという利点がある。この方法に用いるための蛍光プローブ用化合物が、報告されている（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００６】
しかし、亜鉛の量を測定するために必要な条件、すなわち、亜鉛イオンと特異的に結合し、かつ蛍光強度が十分に高く、かつ、レシオ測定が可能な程度に励起スペクトルまたは蛍光スペクトルが十分にシフトするという条件を満たすような化合物については見出されていなかった。
【特許文献１】特開２００５−２２９８５号公報
【特許文献２】特開２００５−１９２４４号公報
【特許文献３】特開２００５−３２５０７４号公報
【非特許文献１】Kawanishi Y.ら、Angew. Chem. Int. Ed., 2000年、39巻、19号、p.3438.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、亜鉛イオンと特異的に結合し、かつ蛍光強度が十分に高く、かつレシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトする化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩である。
【０００９】
【化４】
2008222563.tif 000002
【００１０】
前記式（Ｉ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の化合物は、亜鉛イオンと特異的に結合し、かつ蛍光強度が十分に高く、かつレシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトするという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、前記のように、一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩である。
【００１３】
【化５】
2008222563.tif 000003
【００１４】
前記式（Ｉ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【００１５】
また、本発明は、Ｙが−ＣＨ2−で表わされる基である一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の製造方法であって、
式（ＩＩ）で表わされるアミン誘導体と、ホルムアルデヒドと、一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物とを反応させることにより、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩（ただし、Ｙが−ＣＨ2−で表わされる）を得ることを特徴とする。
【００１６】
【化６】
2008222563.tif 000004
【００１７】
前記式（Ｉ）および（ＩＩＩ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり、
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−ＣＨ2−で表わされる基であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【００１８】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブである。
【００１９】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含む亜鉛量測定用試薬である。
【００２０】
また、本発明は、亜鉛量を測定する方法であって、
前記方法は、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む亜鉛量測定用試薬と試料とを混合し、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、前記一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中の亜鉛の量を定量することを含むことを特徴とする。前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われるのが好ましい。また、前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、前記比に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われるのがさらに好ましい。また、前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われるのがさらに好ましい。
【００２１】
【化７】
2008222563.tif 000005
【００２２】
前記式（ＩＶ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗ’は、−Ｏ-、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−Ｓ-または−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【００２３】
本発明において、「低級」は、特に指示がなければ、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。
【００２４】
「低級アルキル基」としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基の好ましい例としては、炭素数１〜５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１〜５のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
【００２５】
「ヘテロアリール基」は、酸素原子、硫黄原子、窒素原子などのヘテロ原子を少なくとも１個有する飽和または不飽和の単環式または多環式複素環基を挙げることができる。ヘテロアリール基の例としては、窒素原子１〜４個を有する３〜８員環（好ましくは５また６員の不飽和複素単環基）であり、例えば硫黄原子１〜２個および窒素原子１〜３個を有する不飽和縮合複素環基、例えばベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾチアゾリル等を挙げることができる。前記ヘテロアリール基としては、ベンゾチアゾリルが好ましい。
【００２６】
「ハロゲン原子」としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられ、フッ素および塩素が好ましい。
【００２７】
「ハロゲン原子で置換された低級アルキル基」としては、前記低級アルキル基の１以上の水素原子が、前記ハロゲン原子で置き換えられたものを意味する。前記ハロゲン原子で置換された低級アルキル基の好ましい例としては、ヨウ化メチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル等が挙げられる。
【００２８】
前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体の塩は、前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体の、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。
【００２９】
本発明の化合物およびその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。
【００３０】
前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体およびその塩は、前記一般式（Ｉ）中、
Ｘ1が、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2が、水素原子、メチル基、またはトリフルオロメチル基であり
Ｘ3は、水素原子またはベンゾチアゾリル基であり、
Ｙは、式−ＣＨ2−、−（ＣＨ2）2−または−ＣＨ2−ＮＨ−（ＣＨ2）2−で表わされる基であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基であるのが好ましい。
【００３１】
また、前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体およびその塩は、前記一般式（Ｉ）中、
Ｘ1が、水素原子または塩素原子であり、
Ｘ2が、水素原子であり
Ｘ3は、水素原子であり、
Ｙは、式−ＣＨ2−で表わされる基であり、
Ｗは、−ＯＨで表わされる基であるのがより好ましい。
【００３２】
具体的には、前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、６−クロロ−８−（２，２’−ジピコリルアミノメチル）−７−ヒドロキシクマリン、または８−（２，２’−ジピコリルアミノメチル）−７−ヒドロキシクマリンがより好ましい。
【００３３】
次に、本発明の式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体またはその塩を製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来にはない化学構造を有する、本発明のクマリン誘導体の製造が可能になった。なお、本発明の式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体は、以下の方法以外の方法で製造されてもよい。
【００３４】
本発明の式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体（ただしＹが−ＣＨ2−で表わされる基である）の製造方法の一例を説明する。その製造方法は、式（ＩＩ）で表わされる化合物と、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物と、ホルムアルデヒドとを反応させ、式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を得る工程を含む（スキーム１参照）。
【００３５】
【化８】
2008222563.tif 000006
【００３６】
前記式（Ｉ）および（ＩＩＩ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−ＣＨ2−で表わされる基であり、
Ｗは、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−ＳＨまたは−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【００３７】
前記式（ＩＩＩ）中、ハロゲン原子、低級アルキル基、ハロゲン原子で置換された低級アルキル基、ヘテロアリール基の定義は前記のとおりである。
【００３８】
前記製造方法において、式（ＩＩ）で表わされる化合物と、ホルムアルデヒドと、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物との反応は、例えば２工程、具体的には、式（ＩＩ）で表わされる化合物と、ホルムアルデヒドとを予め反応させ（第１工程）、その反応物に式（ＩＩＩ）で表わされる化合物を反応させる（第２工程）ことができる。前記２工程で行う場合、まず、第１工程は、式（ＩＩ）で表わされる化合物と、ホルムアルデヒドとを、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、溶媒中で行うことができる。次に第２工程は、第１工程で得られた化合物と、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物とを、不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、溶媒中で行うことができる。
【００３９】
前記製造方法の第１工程および第２工程において、反応溶媒は限定されないが、例えば、ＣＨ2Ｃｌ2、クロロホルム、ＣＣｌ4等の塩素で置換された炭化水素類、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、エチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エタノール等のアルコール類等が挙げられる。前記第１工程における前記溶媒としては、アルコール類から選択されるのが好ましく、エタノールがさらに好ましい。前記第２工程における前記溶媒としては、アルコール類から選択されるのが好ましく、エタノールがさらに好ましい。また、前記製造方法の第１工程の後、第１工程で用いた反応溶媒を除去して、別の反応溶媒を用いてもよい。
【００４０】
前記製造方法の第１工程および第２工程において、反応温度は限定されないが、例えば４０℃〜１４０℃である。前記第１工程における反応温度は、好ましくは４０℃〜１２０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃である。前記第２工程における反応温度は、好ましくは４０℃〜１２０℃、より好ましくは５０℃〜１００℃である。
【００４１】
前記製造方法の第１工程および第２工程において、反応時間は限定されないが、例えば１０分〜１６時間である。前記第１工程における反応時間は、好ましくは２０分〜２時間、よりこのましくは３０分〜１時間である。前記第２工程における反応時間は、好ましくは４時間〜１２時間、より好ましくは６時間〜１０時間である。
【００４２】
前記製造方法の第１工程において、式（ＩＩ）で表される化合物に対し使用されるホルムアルデヒドのモル比（式（ＩＩ）で表される化合物：ホルムアルデヒド）は、例えば１：１〜５である。また、前記製造方法の第２工程において、式（ＩＩ）で表される化合物に対し使用される式（ＩＩＩ）の化合物のモル比（式（ＩＩ）で表される化合物：式（ＩＩＩ）で表わされる化合物）は、例えば１：０．８〜２、好ましくは１：０．９〜１.５である。
【００４３】
前記製造方法において、前記式（ＩＩ）で表される化合物は、市販で入手してもよいし、公知文献を参照して自家製造してもよい。
【００４４】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、蛍光プローブとして有用である。前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、それ自体で強い蛍光を発する性質を有している。さらに、前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、酸性または塩基性条件下で一般式（Ｉ’）で表わされるクマリン誘導体に変換され、その一般式（Ｉ’）で表わされるクマリン誘導体が亜鉛イオンを捕捉して亜鉛錯体を形成すると、一般式（ＩＶ）で表わされる錯体を形成すると考えられる（スキーム２参照）。従って、本発明の一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、亜鉛イオンと特異的に結合する。さらに、前記一般式（ＩＶ）で表わされる錯体も、強い蛍光を発する性質を有しており、亜鉛イオンの濃度が変化するにつれ、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体の蛍光スペクトルまたは励起スペクトルと比較して、１点を中心にして増減する性質を有している。従って、本発明の一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトしており、レシオ測定に用いることが可能である。従って、本発明の一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブは、亜鉛量測定用試薬として用いることができる。この亜鉛量測定用試薬は、例えば、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩それ自体、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩の溶液等が挙げられる。前記溶液の場合、溶媒としては、生理食塩水、緩衝液等の水性溶媒、またはエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の水混和性有機溶媒と、前記水性溶媒との混合物などを用いることができる。また、前記蛍光プローブおよび前記亜鉛量測定用試薬は、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩が含まれること以外は限定されず、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、酸化防止剤、金属イオン濃度調節剤、無機塩等をさらに含んでもよい。
【００４５】
【化９】
2008222563.tif 000007
【００４６】
前記式（Ｉ’）および（ＩＶ）中、
Ｘ1は、水素原子またはハロゲン原子であり、
Ｘ2は、水素原子、低級アルキル基、またはハロゲン原子で置換された低級アルキル基であり
Ｘ3は、水素原子またはヘテロアリール基であり、
Ｙは、式−（ＣＨ2）n−または−（ＣＨ2）n−ＮＨ−（ＣＨ2）m−で表わされる基であり、ここでｎまたはｍは互いに独立して１〜３の整数であり、
Ｗ’は、−Ｏ-、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−Ｓ-または−ＳＲで表わされる基であり、ここでＲは低級アルキル基である。
【００４７】
前記式（Ｉ）中の、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、ＹおよびＷについては前記のとおり。
【００４８】
本発明の亜鉛量を測定する方法は、前記のように、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含む亜鉛量測定用試薬と試料とを混合し、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、前記一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中の亜鉛の量を定量することを含むことを特徴とする。
【００４９】
前記測定方法において、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む亜鉛量測定用試薬と試料とを混合する工程は、例えば、一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩を含む亜鉛量測定用試薬を、細胞、組織等の試料を含む緩衝液中に添加することにより行うことができる。次に、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量する工程は、例えば、前記試料の蛍光スペクトルを測定することにより行うことができる。具体的には、前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われるのが好ましい。また、前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、前記比に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われるのがさらに好ましい。また、前記測定方法において、前記亜鉛量測定用試薬中の一般式（Ｉ）で表されるクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＶ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量することにより行われるのがさらに好ましい。
【００５０】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
【００５１】
種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
蛍光スペクトル：日立株式会社製F-4500蛍光スペクトロフォトメーター、
1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲ：日本電子株式会社製、JEOL JNM-EX270および日本電子JEOL JNM-AL400、
吸収スペクトル：株式会社島津製作所製、UV-1650PC spectrophotometer。
【実施例１】
【００５２】
６−クロロ−８−（２，２’−ジピコリルアミノメチル）−７−ヒドロキシクマリン（２）の製造
（ｉ）  ６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン（１）の製造
【００５３】
【化１０】
2008222563.tif 000008
【００５４】
４−クロロレゾルシノール（２．３ｇ）とプロピオール酸（２．０ｍｌ）の混合物に氷冷下硫酸を加え、その混合物を１１０℃で撹拌した。１時間後、反応液を冷却し、ＮａＨＣＯ3で硫酸を中和した。生じた固形物をろ取した。その固形物をアセトンから再結晶して、標題の化合物を得た（ピンク色の固体）（収率：１６％）。
【００５５】
1H NMR (DMSO-d6, 270MHz)δ6.24(d, J = 9.7Hz, 1H, d), 6.85(s, 1H, c), 7.76(s, 1H, b), 7.89(d, J = 9.7Hz, 1H, a).
（ｉｉ）  ６−クロロ−８−（２，２’−ジピコリルアミノメチル）−７−ヒドロキシクマリン（２）の製造
【００５６】
【化１１】
2008222563.tif 000009
【００５７】
エタノール（２０ｍｌ）に懸濁させた２，２’−ジピコリルアミン（０．３０ｇ；１．５ｍｍｏｌ）と３７％ホルムアルデヒド水溶液（０．２３ｍｌ；３．０ｍｍｏｌ）との混合物を、アルゴン雰囲気下６０℃で３０分撹拌した。その後、エタノール（１０ｍｌ）に懸濁させた６−クロロ−７−ヒドロキシクマリン（１）（０．３０ｇ；１．５ｍｍｏｌ）を前記混合物に加え、さらに６０℃で８時間撹拌した。その後前記混合物からエタノールを留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、得られた化合物を酢酸エチルを用いて再結晶して標題の化合物を得た（白色固体）（収率２３％）。
【００５８】
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz)  δ3.89(s, 4H, i) δ4.02(s, 2H, h), 6.25(d, J = 9.5Hz, 1H, g), 7.28(t, J = 6.2Hz, 2H f), 7.36(d, J = 7.8Hz, 2H, e) δ7.69(s, 1H, d), 7.76(dt, J = 1.7, 6.4Hz, 2H, c), 7.87(d, J = 9.5Hz, 1H, b), 8.52(dd, J = 1.0, 4.1Hz, 2H, a).
13C NMR (DMSO-d6, 100MHz)   δ 47.7, 58.3, 111.0, 110.2, 112.0, 116.9, 122.5, 123.0, 127.5, 137.0, 143.8, 148.3, 151.6, 156.9, 157.0, 159.7.
HRMS (C22H19Cl1N3O3, ESI+) ; 測定値 408.1115 ; 計算値 ; 408.1117.
元素分析 ; 測定値 ; H 4.43 C 64.61 N 10.24 Cl 8.70
計算値 ; H 4.45 C 64.79 N 10.30 Cl 8.69.
【実施例２】
【００５９】
８−（２，２’−ジピコリルアミノメチル）−７−ヒドロキシクマリン（ＤＰＨＣ）の製造
エタノール（２０ｍｌ）に懸濁させた２，２’−ジピコリルアミン（０．１３ｇ；０．６６ｍｍｏｌ）と３７％ホルムアルデヒド水溶液（０．０４７ｍｌ；０．６３ｍｍｏｌ）との混合物を、アルゴン雰囲気下６０℃で３０分撹拌した。その後、エタノール（１０ｍｌ）に懸濁させた７−ヒドロキシクマリン（０．１０ｇ；０．６３ｍｍｏｌ）を前記混合物に加え、さらに６０℃で８時間撹拌した。その後前記混合物からエタノールを留去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、得られた化合物をエーテルおよびｎ−ヘキサンを用いて再結晶して標題の化合物を得た（白色固体）（収率１１％）。
【００６０】
1H-NMR (CDCl3, 270 MHz) δ8.57 (d, J = 5.2 Hz, 2H, a) 7.65 - 7.58 (m, 3H, b), 7.37 - 7.16 (m, 5H, c), 6.86 (d, J = 8.6 Hz, 1H, d), 6.18 (d, J = 9.5 Hz, 1H, e), 4.12 (s, 2H, f), 3.92 (s, 4H, g).
MS (CI) 374 (M+).
元素分析 ; 測定値 ; H 5.03 C 70.61 N 11.33 
計算値 ; H 5.13 C 70.76 N 11.25.
【実施例３】
【００６１】
実施例１および２で得られたクマリン誘導体の蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを以下のようにして測定した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社、生化学用）に溶解して５ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液と所定濃度の亜鉛溶液（溶媒は超純水、溶質は硝酸亜鉛六水和物）とを混合し、その混合液の吸収スペクトル、蛍光スペクトル（励起波長は３６７ｎｍ）、励起スペクトル（蛍光波長は４４９ｎｍ）を２５℃で各々測定した。図１ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図１ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを、図１ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを、図２ａは、実施例２のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図２ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを、図２ｃは、実施例２のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す。
【００６２】
前記図１ｃ、２ｃより、亜鉛イオンの存在に応じて本発明のクマリン誘導体の励起スペクトルのシフトが確認できた。また本発明のクマリン誘導体の蛍光強度は十分に大きいことが確認できた。さらに本発明のクマリン誘導体の等蛍光点を有することが確認でき、この点を有することから２波長以上におけるレシオ測定が可能であることが確認できた。
【実施例４】
【００６３】
実施例１および２で得られたクマリン誘導体の蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを以下のようにして測定した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社、生化学用）に溶解して５ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（種々のｐＨ）で５μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液の吸収スペクトル、蛍光スペクトル（励起波長は実施例１のクマリン誘導体については３５７ｎｍ、実施例２のクマリン誘導体については３３０ｎｍ）、励起スペクトル（蛍光波長は実施例１のクマリン誘導体については４４９ｎｍ、実施例２のクマリン誘導体については４５０ｎｍ）を２５℃で各々測定した。図３ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図３ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを、図３ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを、図４ａは、実施例２のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図４ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを、図４ｃは、実施例２のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す。
【００６４】
図３および４から、溶液のpHに応じて本発明のクマリン誘導体の吸収・蛍光・励起スペクトルの変化が確認された。以上より、本発明のクマリン誘導体を用いて亜鉛イオンを検出する際には、ｐH緩衝剤によって溶液のpHを一定に保つことが必要であることが確認できた。
【実施例５】
【００６５】
実施例１および２で得られたクマリン誘導体の蛍光スペクトルおよび吸収スペクトルを以下のようにして測定した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社、生化学用）に溶解して５ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液と所定濃度の亜鉛溶液（溶媒は超純水、溶質は硝酸亜鉛六水和物）とを混合し、その混合液の蛍光強度（励起波長：３６７ｎｍ、蛍光波長：４４９ｎｍ）を２５℃で各々測定した。図５ａは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光強度を、図５ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光強度を示す。
【００６６】
図５ａおよび５ｂから、実施例１および実施例２のクマリン誘導体はいずれも速やかに亜鉛イオンと配位が完了する化合物であることが確認できた。
【実施例６】
【００６７】
実施例１で得られたクマリン誘導体の亜鉛イオンに対する解離定数を以下のようにして得た。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（生化学用）（和光純薬工業 株式会社）に溶解して１ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（１０ｍＭ ＮＴＡ（ニトロ酢酸）液と０．９ｍＭ ＺｎＳＯ4を含む）で１μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液と所定濃度の亜鉛溶液（溶媒は超純水、溶質は硝酸亜鉛六水和物）とを混合し、その混合液の蛍光強度（励起波長：３６７ｎｍ、蛍光波長：４４９ｎｍ）を２５℃で各々測定した。得られた蛍光強度を亜鉛濃度を横軸に、蛍光強度を縦軸にとり、プロットした。そしてそのプロットから下記式中のＫｄを算出した。図６に、実施例１のクマリン誘導体の蛍光強度のプロットを示す。得られたＫｄは、６．５７ｐＭであった。このＫｄ値より、本発明のクマリン誘導体は、亜鉛濃度のわずかな変化にも感度良く応答することが確認できた。
【００６８】
【数１】
2008222563.tif 000010
【００６９】
前記式中、Fは、蛍光強度であり、
Fmaxは、最大蛍光強度であり、
F0は、Zn2+を加えていないときの蛍光強度であり、
[Zn2+]fは、遊離のZn2+である（Perrin, D. D.; Dempsey, B. 著、辻啓一訳「緩衝液の選択と応用」、講談社サイエンティフィック、1981年に記された方法により算出）。
【実施例７】
【００７０】
実施例１で得られたクマリン誘導体の蛍光量子収率を以下のようにして確認した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（生化学用）（和光純薬工業株式会社）に溶解して１μＭ溶液を調製した。その溶液の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（励起波長は３４７ｎｍ）を２５℃で各々測定した。図７ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図７ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す。また、そのクマリン誘導体の溶液と、１μＭの亜鉛溶液（溶媒は超純水、溶質は硝酸亜鉛六水和物）とを混合し、その混合液の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルも同様にして測定した。その吸収スペクトルは、図７ａに、蛍光スペクトルは図７ｂに示す。また、標準試料として１μＭの硫酸キニーネの溶液（溶媒は１N 硫酸水溶液）についても、その吸収スペクトルおよび蛍光スペクトルも同様にして測定した。その吸収スペクトルは、図７ａに、蛍光スペクトルは図７ｂに示す。得られたスペクトルおよび標準試料の硫酸キニーネの蛍光量子収率０．５５と比較することにより、実施例１で得られたクマリン誘導体の蛍光量子収率を以下の式から算出した。得られた蛍光量子収率は、クマリン誘導体単独では０．４８、クマリン誘導体と亜鉛の混合物は０．７３であった。
【００７１】
【数２】
2008222563.tif 000011
【００７２】
前記式中、STは、標準試料であり、
SMは、未知試料であり、
Aは、吸光度であり、
Ｉは、励起光の強度であり、
nは、溶媒の屈折率であり、
Ｆは、全蛍光の単位時間あたりの光量子数である。
【００７３】
この蛍光量子収率より、本発明のクマリン誘導体の感度が優れていることが確認できた。また、亜鉛と配位することにより蛍光量子収率が増加することが確認できた。
【実施例８】
【００７４】
実施例１で得られたクマリン誘導体の金属選択性を以下のようにして確認した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社、生化学用）に溶解して５ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液と所定濃度の種々の金属イオン溶液（溶媒は超純水、溶質としては、亜鉛の場合は硝酸亜鉛六水和物、カドミウムの場合は硝酸カドミウム四水和物、銅の場合は硝酸銅三水和物、ニッケルの場合は硝酸ニッケル六水和物、コバルトの場合は硝酸コバルト六水和物、鉄の場合は硝酸鉄九水和物、マンガンの場合は硝酸マンガン六水和物、マグネシウムの場合は硝酸マグネシウム六水和物、カルシウムの場合は硝酸カルシウム四水和物、カリウムの場合は硝酸カリウム、ナトリウムの場合は硝酸ナトリウム）とを混合し、その混合液の吸収スペクトル、蛍光スペクトル（励起波長は３６７ｎｍ）、励起スペクトル（蛍光波長は４４９ｎｍ）を２５℃で各々測定した。図８ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを、図８ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを、図８ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す。
【００７５】
この図８ａおよび図８ｂより、実施例１のクマリン誘導体の蛍光は亜鉛、カドミウム、マグネシウムイオンによってスペクトルが変化し、ナトリウム、カリウム、カルシウムイオンによっては影響を受けず、ニッケル、銅、コバルト、マンガンイオンによって消光されることが確認できた。
【実施例９】
【００７６】
実施例１で得られたクマリン誘導体の亜鉛選択性を以下のようにして確認した。具体的には、前記クマリン誘導体をジメチルスルホキシド（和光純薬工業株式会社、生化学用）に溶解して５ｍＭ溶液を調製し、その溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ−Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．４）で５μＭの濃度まで希釈した。その希釈溶液と所定濃度の種々の金属イオン溶液（溶媒は超純水、溶質としては、亜鉛の場合は硝酸亜鉛六水和物、銅の場合は硝酸銅三水和物、ニッケルの場合は硝酸ニッケル六水和物、コバルトの場合は硝酸コバルト六水和物、鉄の場合は硝酸鉄九水和物、マンガンの場合は硝酸マンガン六水和物、マグネシウムの場合は硝酸マグネシウム六水和物、カルシウムの場合は硝酸カルシウム四水和物、カリウムの場合は硝酸カリウム、ナトリウムの場合は硝酸ナトリウム）とを混合し、その混合液の３６３ｎｍおよび３８８ｎｍにおける蛍光強度の比を得た。得られた比を図９に示す。図９において、「Ｚｎ2+」は５μＭの亜鉛溶液を、「Ｎａ+」、「Ｋ+」、「Ｃａ2+」および「Ｍｇ2+」はそれぞれ５ｍＭのナトリウム溶液、カリウム溶液、カルシウム溶液およびマグネシウム溶液を意味する。また、「Ｍｎ2+」、「Ｆｅ3+」、「Ｃｏ2+」、「Ｎｉ2+」、「Ｃｕ2+」および「Ｃｄ2+」は、それぞれ５μＭのマンガン溶液、鉄溶液、コバルト溶液、ニッケル溶液、銅溶液およびカドミウム溶液を意味する。また、「Ｎａ+＋Ｚｎ2+」、「Ｋ+＋Ｚｎ2+」、「Ｃａ2+＋Ｚｎ2+」および「Ｍｇ2+＋Ｚｎ2+」は、それぞれ５μＭの亜鉛溶液と５ｍＭのナトリウム溶液、カリウム溶液、カルシウム溶液およびマグネシウム溶液との混合液を意味する。
【００７７】
図９より、本発明のクマリン誘導体は、亜鉛への選択性が高いことが確認できた。また、本発明のクマリン誘導体はマグネシウムへの比較的高い選択性を有しているが、生体内ではマグネシウムの濃度はほとんど変動しないことが知られているため、本発明のクマリン誘導体の亜鉛への選択性に問題は生じない。又、生体内で濃度が変動することが知られているナトリウム、カリウムおよびカルシウムが共存する場合でも、本発明のクマリン誘導体の亜鉛への選択性に変化は無いことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
市販の蛍光顕微鏡システムを用いる亜鉛濃度測定にも適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１ａ】図１ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例３）。
【図１ｂ】図１ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例３）。
【図１ｃ】図１ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す（実施例３）。
【図２ａ】図２ａは、実施例２のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例３）。
【図２ｂ】図２ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例３）。
【図２ｃ】図２ｃは、実施例２のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す（実施例３）。
【図３ａ】図３ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例４）。
【図３ｂ】図３ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例４）。
【図３ｃ】図３ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す（実施例４）。
【図４ａ】図４ａは、実施例２のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例４）。
【図４ｂ】図４ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例４）。
【図４ｃ】図４ｃは、実施例２のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す（実施例４）。
【図５ａ】図５ａは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光強度を示す（実施例５）。
【図５ｂ】図５ｂは、実施例２のクマリン誘導体の蛍光強度を示す（実施例５）。
【図６】図６は、実施例１のクマリン誘導体の蛍光強度のプロットを示す（実施例６）。
【図７ａ】図７ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例７）。
【図７ｂ】図７ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例７）。
【図８ａ】図８ａは、実施例１のクマリン誘導体の吸収スペクトルを示す（実施例８）。
【図８ｂ】図８ｂは、実施例１のクマリン誘導体の蛍光スペクトルを示す（実施例８）。
【図８ｃ】図８ｃは、実施例１のクマリン誘導体の励起スペクトルを示す（実施例８）。
【図９】図９は、クマリン誘導体の蛍光強度の比を示す（実施例９）。
【図１ａ】
2008222563.tif 000016
【図１ｂ】
2008222563.tif 000017
【図１ｃ】
2008222563.tif 000018
【図２ａ】
2008222563.tif 000019
【図２ｂ】
2008222563.tif 000020
【図２ｃ】
2008222563.tif 000021
【図３ａ】
2008222563.tif 000022
【図３ｂ】
2008222563.tif 000023
【図３ｃ】
2008222563.tif 000024
【図４ａ】
2008222563.tif 000025
【図４ｂ】
2008222563.tif 000026
【図４ｃ】
2008222563.tif 000027
【図５ａ】
2008222563.tif 000028
【図５ｂ】
2008222563.tif 000029
【図６】
2008222563.tif 000030
【図７ａ】
2008222563.tif 000031
【図７ｂ】
2008222563.tif 000032
【図８ａ】
2008222563.tif 000033
【図８ｂ】
2008222563.tif 000034
【図８ｃ】
2008222563.tif 000035
【図９】
2008222563.tif 000036