(57)【要約】  【課題】  唾液分泌量の少ない被験者の場合であっても、唾液緩衝能を迅速正確に測定できる方法を提供する。  【解決手段】  唾液を孔径０．８〜２μｍの濾材によって濾材上に保持される成分と濾液に分離し、該濾材上の成分を利用して齲蝕原因菌数を測定し、さらに濾液をｐＨ指示薬を含む検査試薬を担持させた吸収性担体に接触させてｐＨを測定して唾液緩衝能を測定することにより、唾液分泌量の少ない被験者であっても迅速かつ正確に唾液緩衝能を測定することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
唾液を孔径０．８〜２μｍの濾材で濾過し該濾材上に保持される成分より齲蝕原因菌数を測定する際に生じる唾液の濾液を用いて、該唾液の緩衝能を測定することを特徴とする唾液緩衝能の測定方法。
【請求項２】
濾液緩衝能の測定を、ｐＨ指示薬を含む検査試薬を担持させた吸収性担体に、該濾液を接触させてｐＨを測定することにより実施する請求項１記載の唾液緩衝能の測定方法。
【請求項３】
濾過に供する、被験者から採取した唾液量が０．３〜０．５ｍＬ        である請求項１または請求項２記載の唾液緩衝能の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は唾液の緩衝能を測定し、齲蝕発生のリスクを診断する方法に関する。詳しくは、齲蝕原因菌数を測定するために、唾液を濾材で濾過することで生じる濾液により唾液緩衝能を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトの口腔内の齲蝕発生のリスクを判定し、齲蝕を予防しようとする試みがなされている。齲蝕発生リスクの判定は、齲蝕発生に関与する因子（齲蝕リスク因子）を測定し、これらの結果を総合的に判断することで判定される。齲蝕リスク因子として、唾液中のミュータンスレンサ球菌、ラクトバチラス菌等の齲蝕原因菌数、唾液分泌量や唾液緩衝能といった唾液の性状、歯垢の付着量、食事回数やフッ化物の使用状況といった生活習慣等の各項目が調べられている（例えば非特許文献１参照）。
【０００３】
上記の各項目を調べる方法として、以下のような方法が開発されている。ミュータンスレンサ球菌数やラクトバチラス菌数の測定は、選択培地を使用した培養法により実施されており、例えばミュータンスレンサ球菌数の測定では、選択培地としてミチス・サリバリウス・バシトラシン固体培地等が使用されている。唾液分泌量の測定は、一定時間に分泌される唾液を計量カップ等に採取することで実施されている。唾液緩衝能の測定は、一定量の酸と一定量の唾液を混合後のｐＨを、ｐＨ指示薬の色調変化を調べる方法で実施されている。歯垢の付着量、食事回数やフッ化物の使用状況といった生活習慣等は、歯科医の視診や患者への問診等で実施されている。
【０００４】
一部の歯科医院では、上記の各検査項目を全て検査、点数化し、患者の口腔内の齲蝕リスク因子の総和を一定レベル以下に押さえ込む方法により齲蝕を予防する試みがなされており、一定の成果を挙げている（例えば非特許文献１参照）。
【０００５】
上記の各齲蝕リスク因子の中で、特にミュータンスレンサ球菌数と唾液分泌量、及び唾液緩衝能は齲蝕リスクと密接に関係していると言われている。食物中に含まれる炭水化物やその分解産物である糖は歯垢中に存在するミュータンスレンサ球菌によって速やかに代謝されて酸が作られ、その結果、歯垢中のｐＨが下がり、歯の表面からカルシウムイオン、リン酸イオンが歯垢や唾液中に溶出する（脱灰）。しかし、上記のように、ミュータンスレンサ球菌の作用により歯の脱灰がおこっても、唾液の洗浄作用や緩衝作用により歯垢中のｐＨが中性付近に戻ると、唾液や歯垢中のカルシウムイオン、リン酸イオンが再び歯面に沈着する（再石灰化）。齲蝕とは、脱灰、再石灰化のバランスが崩れエナメル質表層下の脱灰が進む現象である。上記の理由から、齲蝕発生のリスクの判定には、ミュータンスレンサ球菌数に加えて、唾液の分泌量と唾液緩衝能を測定することが重要である。
【０００６】
例えば、唾液中のミュータンスレンサ球菌数が多くても、唾液分泌量と唾液緩衝能が高い人と低い人では齲蝕発生のリスクが異なるし、唾液分泌量、または唾液緩衝能が低い場合でも、口腔内のミュータンスレンサ球菌数の多い人と少ない人では齲蝕発生のリスクは異なる。従って、齲蝕発生のリスクを判定するためには、口腔内のミュータンスレンサ球菌数と唾液分泌量、唾液緩衝能を同時に測定して、総合的に判定することが重要である。
【０００７】
口腔内のミュータンスレンサ球菌数、唾液分泌量、唾液緩衝能は日内変動することが知られている。唾液を採取する時間によって齲蝕リスク因子の測定結果が変動するので、採取時期の異なる唾液を使用して、ミュータンスレンサ球菌数と唾液緩衝能を測定し比較しても正確に口腔内の状況を判定できない。このような理由から、齲蝕原因菌数、唾液分泌量、唾液緩衝能を測定する際には、同一のサンプルを使用して同時に測定することが望ましいといえる。
【０００８】
唾液中の齲蝕原因菌の測定は、従来培養法によって実施されているが、結果が判明するまでに２日以上という比較的長時間を要するという欠点があったが、免疫学的測定方法が開発され検査時間が大幅に短縮された。免疫学的測定方法は微生物が有する特異的な抗原に対する抗体を利用して該微生物を高感度に検出するという方法である（非特許文献２、３）。培養法で齲蝕原因菌を測定する場合、０．０１〜０．１ｍＬ程度の唾液が必要だが、免疫学的測定法を実施する場合、培養法より多量の唾液（０．３〜０．５ｍＬ程度）の唾液が必要である（例えば非特許文献３）。この理由は以下の通りである。免疫学的測定法では、通常、齲蝕原因菌の表面に存在する抗原に対する抗体を使用する。唾液中の齲蝕原因菌は歯垢で覆われているので、このままでは抗体が接触できず、抗原抗体反応がおこらない。抗原抗体反応をおこすためには、何らかの前処理を行い、歯垢を除去して抗原を露出させるか、または菌体より抗原を抽出する必要がある。しかし、前処理を行っても、歯垢が完全に除去できない、全ての抗原を抽出することができない、前処理により一部の抗原が破壊される、等の理由により、齲蝕原因菌に存在する全ての抗原が測定可能な状態になるわけではないので、培養法に比べて多量の唾液が必要になる。
【０００９】
唾液緩衝能は、唾液に一定量の酸を添加し、ｐＨを測定することで測定できる。ｐＨ指示薬の呈色を目視で確認し、予め作製された各ｐＨ値での標準比色表と比較する方法は、特に機器を必要とせず測定できるため、簡便性、迅速性の点から特に好ましい実施形態の一つであると言える。例えば、山田らは、ｐＨ指示薬と酸性緩衝剤を吸収性担体に保持させ、該担体に唾液をたらし色調を目視で確認する方法、いわゆる試験紙法、を提案している（特許文献１）。この方法は、０．００５〜０．０３ｍＬ程度のごく少量の唾液で唾液緩衝能が測定できるが、唾液が担体に染み込み試薬と混合されて初めて緩衝能の測定が可能になるため、粘度の高い唾液では担体への唾液の浸透が不均一になりやすいので、ｐＨ指示薬の呈色がまだらになり唾液緩衝能の判定が困難になる場合があるという欠点を持つ。一般的に、唾液分泌量の少ない被検者から採取した唾液は粘度が高いことが知られており、このような場合、上記理由により試験紙法による唾液緩衝能の測定は困難な場合が多いが、このような試験紙法において、測定に供する唾液について、濾過処理により唾液中の不純物やムチン等の粘性物質を取り除いて供することが知られている（特許文献２）。しかしながら、この従来例において具体的に使用されている濾材はグラスファイバーフィルターＡＰ１５（ミリポア社製）であり、その孔径はカタログ値で０．２〜０．６μｍの微小のものである。しかして、このように孔径が小さい場合、後述の実施例で示されるように、唾液中の不溶物により濾材が目詰まりを起こしやすく、少量の唾液しか濾過できない。唾液緩衝能のみを測定する場合には特に問題なく使用できるが、同一の唾液からミュータンスレンサ球菌数を測定する場合には、測定に必要な量の唾液が濾過できないためミュータンスレンサ球菌数が正確に測定できないという問題がある。さらに、岡崎らは、予め試薬（乳酸、ｐＨ指示薬）の乾燥粉末を入れたテストチューブに唾液を加え、蓋をして振盪して試薬を溶解し、ｐＨ指示薬の色調を目視で判定するという方法、いわゆる判定チューブ法、を提案している（非特許文献４）。この方法では試薬を担体に染み込ませる必要がないため、粘度の高い唾液であっても比較的容易に唾液緩衝能の測定が可能であるが、０．５〜２ｍＬ程度の唾液が測定に必要である。
【００１０】
被験者が高齢者である場合、または幼児の場合、唾液の分泌量が少ない、唾液をうまく吐き出せない等の理由により、０．５ｍＬ以下の唾液しか採取できない場合があり、齲蝕原因菌と唾液緩衝能の両方が測定できないという問題があった。
【００１１】
【非特許文献１】クリニカル  カリオロジー、  熊谷崇著、  医歯薬出版株式会社  １９９６年
【非特許文献２】日本生化学会編集，新生化学実験講座１２  分子免疫学ＩＩＩ  抗原・抗体・捕体，東京化学同人，１９９２年
【非特許文献３】ヘルスケア歯科診療室発  予防歯科のすぐれモノ１７＋α、株式会社デンタルダイアモンド社、２００６年
【非特許文献４】岡崎好秀  他，小児歯科学雑誌，３８巻６１５−６２１頁，２０００年
【特許文献１】特許第１５７４９８１号公報
【特許文献２】特開２００２−３２３４９３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、齲蝕原因菌と唾液緩衝能とを測定し、これら両方の測定値から齲蝕発生リスクを判定する際において、少ない唾液量で唾液緩衝能までを、迅速且つ正確に測定できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は上記課題を解決するために、鋭意検討してきた。その結果、孔径０．８〜２μｍの濾材により唾液を濾過することにより、齲蝕原因菌を含む不溶物を除去した濾液によっても唾液緩衝能が正確に測定可能であり、しかも、この方法によれば、該唾液の粘性が低下し、試験紙法においても吸収性担体への該唾液濾液の浸透の均一性が向上するため、ｐＨの判定が容易になり好ましいことを見出した。そして、さらに検討を進め、本発明を完成するに至った。
【００１４】
即ち、本発明は、唾液を孔径０．８〜２μｍの濾材で濾過し該濾材上に保持される成分より齲蝕原因菌数を測定する際に生じる唾液の濾液を用いて、該唾液の緩衝能を測定することを特徴とする唾液緩衝能の測定方法である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の測定方法によれば、唾液を濾過し、該濾材上に保持される齲蝕原因菌数と濾液の緩衝能とを測定することにより、齲蝕発生リスクを効率的に評価することができる。被験者から採取した唾液は、常法により採取した場合（被験者にガム等の咀嚼物を５分間噛ませ分泌してきた唾液を集める）０．３ｍＬ〜２０ｍＬ程度であり、この採取したものを本発明の方法に適用すればよい。齲蝕原因菌数と唾液緩衝能の両方の測定に供することができるため、本発明の方法は、唾液量が少ない場合、例えば、０．３ｍＬ〜０．５ｍＬであっても、十分に両方の測定が実施可能であり好適である。
【００１６】
また、本発明において、濾材により濾過した唾液は、不溶物含量および粘度が共に低下するため、濾過前の唾液に比べて、唾液緩衝能の測定が容易に実施できる。被験者の中には、ガム等の咀嚼物を５分間被験者に噛ませながら採取した刺激唾液量が上記０．３ｍＬ〜０．５ｍＬしかない者も珍しくないため、このような被験者の齲蝕発生リスクを評価する場合に、本発明の上記効果は顕著に発揮される。
【００１７】
そしてこの効果は、前記試験紙法にて唾液緩衝能を測定するときに、より顕著に発揮させることができる。すなわち、上記濾過により唾液の粘性は低下し、測定の操作性が改善される。特に、唾液の粘度が高い場合には、上記濾過することにより粘性が低下した濾液は試験紙への浸透性が大きく向上し、ｐＨ指示薬の呈色を均一にさせることができるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の唾液緩衝能の測定方法では、唾液を濾過することで齲蝕原因菌を含む不溶物と濾液に分離し、該濾液を使用して唾液緩衝能を測定する。
【００１９】
本発明では、安静時唾液、刺激唾液の両方を使用することができるが、検体採取の再現性、容易さ等の理由から、刺激唾液を使用することが好ましい。刺激唾液は、例えば、ガム、パラフィンペレット等の咀嚼物を一定時間被験者に噛ませながら唾液を吐き出させることで採取することができる。
【００２０】
本発明の方法に供する唾液は、粘度の高いものであるのが、唾液緩衝能の測定において、改善効果が顕著に発揮されるため好ましい。一般的に唾液の粘度と濾過に要する時間は比例関係にある。後述する本発明の実施例に従って唾液を濾過する場合、具体的には、孔径が１μｍのガラス繊維濾紙（例えば、アドバンテック東洋社のＧＡ−１００）をセットし作製した、図１の構造の濾過装置（濾過面の面積０．９５ｃｍ２）に唾液を０．３ｍＬ添加し、２．５ｍＬシリンジ（例えばテルモ社製）のプランジャーを外した状態で濾過装置に装着した後に、シリンジ外筒にプランジャーを挿入し下まで押し下げた状態で保持することにより加圧することで濾過を行った場合に、添加した唾液全量の濾過に要する時間が２０秒以上となるような場合（唾液分泌量が比較的多く粘度の低い唾液の場合は、濾過に要する時間は数秒〜１０秒程度である）、粘度の高い唾液といえる。本発明では、濾過に供する、被験者から採取した唾液の粘度が上述のように濾過に要する時間が２０秒以上、より好ましくは２５〜６０秒である場合にも、良好な測定が実施できる。
【００２１】
本発明において齲蝕原因菌とは、齲蝕発生、または進展に深く関わっている口腔内に存在する微生物を指す。具体例として、ミュータンスレンサ球菌、ラクトバチラス菌を挙げることができるが、齲蝕の発生との関連性が特に高いといわれている、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）を測定することが特に好ましい。
【００２２】
齲蝕原因菌の測定は、例えば、齲蝕原因菌より抗原を抽出し、該抽出抗原を免疫学的測定法により測定することで、迅速かつ正確に測定することができる。例えば、唾液を濾過することで齲蝕原因菌を濾材上に濃縮し、抗原を抽出することで、高感度な免疫学的測定が可能になる。抽出法としては公知の方法が何ら制限なく使用できるが、好適な例として、亜硝酸抽出法を示すことができる。亜硝酸抽出法は、公知の方法（例えば特開２００３−２１５１２６号公報記載の方法）により実施することができる。以下、亜硝酸抽出法について説明する。亜硝酸抽出法は亜硝酸塩水溶液と酸水溶液を濾材に滴下し、亜硝酸を形成させ、生じた亜硝酸水溶液中に糖鎖抗原を抽出するという方法である。亜硝酸塩水溶液としては、例えば、０．５〜８Ｍの亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が、酸水溶液としては、０．５〜４Ｍの酢酸、硝酸、塩酸、クエン酸等が使用できる。上記のような亜硝酸塩水溶液と酸水溶液を例えば、０．００５〜０．０５ｍＬずつ濾材に添加し、１５〜５０℃で１〜１０分放置することで濾材上で反応を行わせる。反応後の抽出液は、唾液の濾過と同様の方法により加圧することで回収すれば良い。反応液は強酸性であるので例えば１〜３Ｍ水酸化ナトリウム、０．５〜２Ｍトリス、０．５〜１Ｍ炭酸水素ナトリウム等の塩基性水溶液を添加し抽出液のｐＨを７．０〜８．５に調整するのが好ましい。塩基水溶液は抗原抽出液を濾材から回収した後に添加しても良いし、抽出液を回収する前に濾材に添加した後に抽出液を回収しても良いが、免疫学的測定法での感度の観点から、回収前に濾材に添加することがより好適である。または、亜硝酸塩水溶液と酸水溶液を予め混合して、亜硝酸水溶液（０．２〜４Ｍ  亜硝酸ナトリウム、０．５〜４Ｍ  酢酸）を調製し、該亜硝酸水溶液で濾過膜を濾過することで亜硝酸抽出を実施することもできる。この場合は、亜硝酸ナトリウム水溶液と酢酸水溶液を混合し調製した亜硝酸水溶液を０．２〜０．５ｍＬ添加して濾過し、５〜５０℃で１〜１０分放置することで亜硝酸抽出を行い、反応後の中和は０．５〜１．０Ｍトリスを１００〜８００μＬ濾過膜に添加し、加圧濾過することで糖鎖抗原抽出液を回収する。
【００２３】
本発明の唾液緩衝能の測定法で使用する濾材としては、上記抽出操作において安定な、膜状、層状の濾材が制限なく使用することができる。このような濾材を例示すると、メンブランフィルター等のスクリーンフィルターや、濾紙、ガラス繊維濾紙等のデプスフィルターが挙げられる。
【００２４】
本発明での濾材の孔径とは、スクリーンフィルターの場合は、日本工業規格（ＪＩＳ  Ｋ  ３８３２）記載の液体で濡れたメンブランフィルターの孔を通って空気が押し出されるときの圧力より算出される数値（バブルポイント法）であり、デプスフィルターの場合は、日本工業規格（ＪＩＳ  Ｐ  ３８０１）記載の硫酸バリウム等を自然濾過したときの漏洩粒子径により求めた数値である。一般的には、濾材がメンブランフィルターの等のスクリーンフィルターである場合は、市販濾材カタログに表示されている孔径が上記方法で求めた本発明の孔径に相当し、濾材がガラス繊維濾紙や濾紙のようなデプスフィルターの場合は、市販濾材カタログに表示されている保留粒子径、粒子保持能が本発明の孔径に相当する。
【００２５】
濾材の孔径は齲蝕原因菌が通過できない孔径であることが必要である。本発明の好適な測定対象であるストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスは、菌体自身の大きさは０．５〜０．９μｍの範囲にある。従って、これらの細菌を濾材上に保持するためには、上記菌体のサイズより十分に小さな孔径、具体的には、０．２２μｍ〜０．４５μｍの孔径を有する濾材が使用されるのが常法である。本発明においても、唾液の濾過は、上記小孔径を有する濾材を用いて行えば、ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスを良好に補足することができるが、このように小孔径であると、唾液の濾過速度が遅くなり、また、唾液には通常他の不溶物が含まれているので、目詰まりも生じやすくなる。そして、このように濾材に目詰まりが生じた場合、上記工程に続く濾材上に保持される上記細菌からの抗原の抽出工程においても、抽出効率がやや低下する。
【００２６】
このような背景から、本発明では、濾材として０．８〜２μｍ、更に好適には０．８〜１．６μｍの孔径のものを用いる。上記孔径は、濾材上に保持する前記ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスの大きさよりも大抵において若干上回るものになるが、これら齲蝕関連菌の場合においては、この程度に孔径が大きい濾材であってもほとんど流下させることなく補足できる。したがって、濾過速度も大幅に向上する。さらに、同じ面積の濾過膜を用いて、唾液を濾過する場合、孔径０．４５μｍの濾過膜と比べての孔径０．８〜２μｍの濾過膜では約１０倍量の唾液が濾過できることから分かるように、他の不溶物による目詰まりも極めて生じ難い。
【００２７】
目詰まりが生じにくいということは、齲蝕原因菌を高感度に測定するためには重要である。例えば、前記の亜硝酸抽出法により抗原を抽出する場合、濾材の濾過面の面積に比例して、亜硝酸抽出時に添加する試薬量も増加し、濾材より回収される糖鎖抗原抽出液量が増加する。免疫学的測定法で使用できる液量は限られているので（一般的に０．１５ｍＬ以下）、たとえ大量の唾液を濾過できたとしても、濾過面の面積が大きく、糖鎖抗原抽出液量が増えてしまった場合、その一部しか免疫学的測定法で分析できないので、高感度な測定が不可能になる。高感度な測定を実現するためには、濾過する唾液量と濾材の濾過面の面積の関係を好適な範囲にする必要がある。上述したように、濾材の面積あたりの濾過可能な唾液量は濾材の孔径に比例するので（孔径が小さいと濾過可能な唾液量が低下する）、適切な孔径の濾材、例えば０．８〜２μｍの濾材を使用する必要がある。
【００２８】
唾液の濾過は、例えば図１のような構造の濾過装置により実施できる。濾過装置本体及び蓋は柔軟な物質、例えばポリプロピレン等のプラスチックにより構成されることが好ましい。濾過装置本体の底面に濾材をセットし、唾液を注入した後に蓋を閉めて加圧することで濾過を行うが、濾材は接着剤により底面に保持されていても良いし、または特に接着をせずに摩擦力によってのみ底面に保持されていても良い。
【００２９】
本発明では上述のようにして調製した抗原抽出液に対して、通常は、免疫学的測定方法により定量することで、齲蝕原因菌数を測定する。免疫学的測定法の具体的手法は、免疫凝集法、光学免疫測定方法、標識免疫測定方法、およびこれらの組合わせ等の従来公知の方法が制限無く採用出来る。
【００３０】
以下、これら免疫学的測定方法について説明する。
[免疫凝集法]
該方法は、抗原抗体反応に基づく不溶性担体の凝集反応を利用して、糖鎖抗原抽出液中の抗原を検出、定量する方法である。半定量的方法としてはラテックス凝集法、マイクロタイター法等が、定量的測定方法としてはラテックス定量法等がある。
【００３１】
例えば、ラテックス凝集法を利用して糖鎖抗原抽出液中の抗原量を免疫学的に測定する場合には、ラテックスビーズに微生物の糖鎖抗原と結合する抗体（以下単に抗体ともいう）を固定化した抗体感作粒子からなる測定試薬を作製後、該測定試薬と糖鎖抗原抽出液を混合し、抗原抗体反応後における感作粒子の凝集の度合を、目視、或いは光学的測定方法等により検出することで測定することが出来る。
【００３２】
[光学免疫測定方法]
該方法は、抗体と糖鎖抗原抽出液とを接触させて抗原抗体反応を行った場合に、抗原抗体反応の結果生じる凝集物の濁度の変化を検出する方法、又は抗体を固定化した薄層（以下、抗体層ともいう。）に糖鎖抗原抽出液を接触させ、抗原抗体反応の結果生じる抗体層の屈折率の変化を透過光や表面プラズモン波等の変化として検出する方法等、抗原抗体反応の有無を光学的に検出する方法のことである。
【００３３】
[標識免疫測定方法]
該方法は、抗体に放射性物質、酵素、各種色素類、コロイド類、各種粒子等の各種標識物質を結合させて得た標識抗体を含む測定試薬と、糖鎖抗原抽出液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、糖鎖抗原抽出液中の抗原に結合した標識物質の量、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色等を測定することによって、糖鎖抗原抽出液中の抗原を検出、定量する方法である。
【００３４】
該方法では、例えば抗体を固定化した不溶性担体（粒子、メンブレン、イムノプレート等）からなる測定試薬と糖鎖抗原抽出液とを接触させて抗原抗体反応を行った後に、抗体を標識物質で標識した標識抗体を含む別の測定試薬を接触させて更に抗原抗体反応を行った後に、標識物質の量を測定することによって、又は糖鎖抗原抽出液と標識物質で標識した糖鎖抗原とを混合し、抗体を固定化した不溶性担体からなる測定試薬に接触させて抗原抗体反応を行った後に、抗体に結合した標識物質の量を測定することによって糖鎖抗原抽出液中の抗原を検出、定量することができる。
【００３５】
標識物質としては、放射性物質として放射性ヨード、放射性炭素等が、酵素としてペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ等が、各種色素類として、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミン等の蛍光色素類が、コロイドとして金コロイド、炭素コロイド等が、各種粒子としては着色ラテックス粒子等が使用出来る。なお、酵素標識を行う場合は、チオール基とマレイミド基、アミノ基とアルデヒド基等の共有結合により直接標識する、或いはビオチン−アビジン複合体を介し標識する等の方法が使用可能である。また、標識酵素としてアルカリホスファターゼ及びパーオキシダーゼを使用し、さらに前者の酵素の場合にはジオキセタン誘導体等の化学発光物質を、また後者の酵素の場合にはルミノール誘導体等の化学発光物質を酵素の基質として使用した場合には、該基質の発光を検出することも出来る。
【００３６】
これら各種標識免疫測定方法における操作、手順等は一般に採用されているそれらと特に異ならず、公知の非競合法や競合法、サンドイッチ法等に準じることが出来る。また、抗体と共に、上記の各標識物質で標識した二次抗体、プロテインＡ等の抗体に結合可能な物質を使用して糖鎖抗原の検出・定量に用いることもできる。
【００３７】
該標識免疫測定方法では、用いる標識に応じて従来使用されている方法が特に限定無く使用できるが、中でも放射性物質を標識として使用する放射免疫測定方法、酵素を標識として使用する酵素免疫測定方法、色素、特に蛍光色素を標識として利用する蛍光免疫測定方法、酵素の基質としての化学発光物質を標識として利用する化学発光免疫測定方法等は定量性が高いので、高精度の定量測定を行なう場合にはこれら測定方法を採用するのが好適である。また、コロイドまたは各種粒子を標識として使用するフロースルー免疫測定方法、免疫クロマト法、並びにラテックス凝集法は、操作が簡便であるという特徴がある。
【００３８】
本発明では、唾液を濾材で濾過して調製した濾液を使用して唾液緩衝能を測定する。このように唾液を濾過した濾液について、その緩衝能を測定しても、測定結果は、唾液を直接測定に供する場合と実質的に等しい結果が得られる。
【００３９】
唾液緩衝能の測定は前記のように調製した唾液の濾液と検査試薬とを接触させ、ｐＨを目視等により判定することによって実施される。濾液の緩衝能の測定は、唾液に一定量の酸を添加し、これにｐＨ指示薬を直接滴下してその呈色の状態でｐＨを確認して実施しても良いが、前記したように唾液の濾液は粘度が低下しているため、ｐＨ指示薬を含む検査試薬を担持させた吸収性担体に、該濾液を接触させてｐＨを測定する方法により実施するのが好ましい。すなわち、これら試験紙法に代表される方法は、特に、粘度の高い唾液を供する場合等にあっては、該担体に吸収し難くなり発色にバラツキが生じるが、上記濾液を用いた場合、この問題が緩和され、正確な判断が行えるようになる。
【００４０】
本発明でｐＨ指示薬とは、酸塩基反応によりプロトン付加・脱離して変色する試薬を指し、公知のものが何ら制限なく使用できる。このようなｐH指示薬の具体例として、新実験化学講座９  分析化学ＩＩ（１９７７年発行  丸善株式会社  日本化学会編集）１８１ページの表（中和滴定用指示薬）記載の指示薬（クロロフェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、クロロフェノールレッド等）を例示できる。
【００４１】
ここで、ｐＨ指示薬を含む検査試薬としては、通常、上記ｐＨ指示薬の他、乳酸、塩酸、クエン酸、酒石酸等の酸により構成されている。また、必要に応じて、唾液の試験紙への浸透を促進するために、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系等）等の湿潤剤を上記検査試薬成分に含ませることもできる。これらの検査試薬が担持された紙等の吸収性担体と濾液との接触方法は、試薬形態に適した方法で実施することができる。例えば、検査試薬が酸、ｐＨ指示薬等が短冊状の吸収性担体に乾燥状態で保持されたストリップである場合には、判定部が十分湿潤する量の唾液（０．００５〜０．０３ｍＬ程度）の濾液を滴下することで実施できる。この他、濾液の緩衝能の測定は、容器に濾液を入れ、ストリップの判定部を容器中の濾液中に挿入することで接触させても良い。
【００４２】
ｐＨの測定は、検査試薬と唾液の濾液を接触させた後の色調を目視で確認することで実施される。予め各ｐＨでの色調を調べて比色表を作成し、この比色表と比較することでｐＨを判定し、唾液緩衝能を判定すれば良い。例えば、酒石酸とクロロフェノールレッドにより検査試薬を調製した場合、該検査薬と唾液の混合液は、ｐＨに依存して以下の表に示したような色調を呈す。唾液緩衝能が高いほど、上記混合液のｐＨも高くなるため。従って、その色調に応じて表１に示したように判定することができる。
【００４３】
【表１】
2008128797.tif 000002
【００４４】
以上により、齲蝕原因菌数と唾液緩衝能が効率的に測定される。本発明において測定される齲蝕原因菌数と唾液緩衝能を考慮しての齲蝕発生リスクの評価は次のようにして行われる。すなわち、齲蝕は単一の原因で発症するわけではなく、齲蝕発生を促進する複数の因子（齲蝕リスク因子）が齲蝕発生に適した状態になったときに発生することが知られている。従って、なるべく多くの齲蝕リスク因子を測定し、これらの結果から齲蝕発生のリスクを総合的に判定れば、判定の確度を上げることになる。齲蝕リスク因子として、唾液中の齲蝕原因菌数、唾液分泌量や唾液緩衝能といった唾液の性状、歯垢の付着量、食事回数やフッ化物の使用状況といった生活習慣等が知られており、これらの齲蝕リスク因子を同時に測定し、総合的に判断することにより、個々の齲蝕リスク因子の測定結果だけから判定するより、はるかに正確に被験者の齲蝕発生のリスクを判定することができる。これらの齲蝕リスク因子中、歯垢の付着量、食事回数やフッ化物の使用状況は従来歯科で行われてきた検査（視診、問診等）により把握することができるが、齲蝕原因菌数、唾液分泌量、唾液緩衝能は従来歯科で行われてきた検査では測定できない。刺激唾液を採取し唾液分泌量を測定し、次いで、例えば、本発明の方法に従って齲蝕原因菌数と唾液緩衝能を測定する必要がある。本発明の唾液緩衝能の測定方法によれば、従来、齲蝕原因菌数と唾液緩衝能を同時に測定することが困難であった唾液分泌量の少ない被検者であっても、両方を同時に測定することが可能である。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００４６】
製造例１［ストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の作製］
（１）［菌体試料懸濁液の調製］
ブレインハートインフュージョン（以下「ＢＨＩ」と略すこともある）（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍＬの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍＬ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ２：Ｈ２：ＣＯ２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。
【００４７】
次いで、沈殿物を５ｍＬのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ６００＝１．０に調整しＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０９個／ｍＬであった。
【００４８】
（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
免疫は以下のように実施した。即ち、第１週は０．５ｍＬのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は１．０ｍＬの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は２．０ｍＬの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。
【００４９】
（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１Ｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、１２時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍＬのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
【００５０】
Ｉｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を２０ｍＬのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。次いで２０ｍＬの０．１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更に２０ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ６００＝１２．５）を調製した。
【００５１】
次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した抗血清０．５ｍＬとを混合し、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、菌体を回収した。この菌体を１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。
【００５２】
次いで、０．５ｍＬの０．１Ｍ  グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。
【００５３】
次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍＬのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍＬ洗浄後、５ｍＬの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ２８０を測定することで確認した。ＩｇＧ画分を回収し、０．０１Ｍリン酸緩衝液に対して透析を行った（４℃、３日）。
【００５４】
以上により、抗血清（０．５ｍＬ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体を約１ｍｇ得た。
製造例２［免疫クロマトデバイスの製造］
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（ＥＹ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）１０ｍＬに１００ｍＭＫ２ＣＯ３を８８μL添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝１．０であった。
【００５５】
次いで、１ｍｇ／ｍＬに調整した製造例１で調製した抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μLを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍＬ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍＬの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ５２０＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識抗体」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
【００５６】
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン上の検出ラインおよびコントロール判定ライン上に、それぞれ１ｍｇ／ｍＬの製造例１で調製した抗体および抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＩＣＮファーマシューティカルズ社）１μLをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。
【００５７】
また、コンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ５２０＝１．０に調整した金コロイド標識抗体を２５μL添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。
【００５８】
このように調製した、図２に示すような免疫クロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図３に示すような免疫クロマト法ストリップを組み立てた。
参考例１［唾液と濾液による唾液緩衝能の測定］
５人の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）にパラフィンペレットを５分間噛ませ、唾液を採取した。唾液分泌量を表２に示した。
【００５９】
一方、ＳＣカートリッジ（マルエム社）に、孔径（日本工業規格（ＪＩＳ  Ｐ  ３８０１）記載の硫酸バリウム等を自然濾過したときの漏洩粒子径により求めた数値）が１．０μｍのガラス繊維濾紙「ＧＡ−１００」（アドバンテック東洋社製）をセットし（濾過面の面積０．９５ｃｍ２）、図１の構造の濾過装置を作製した。この濾過装置に、上記５人の被検者から採取した唾液をそれぞれ０．７ｍＬずつを添加し、蓋を閉めシリンジにより加圧して濾過した。
【００６０】
唾液と濾液の緩衝能を判定チューブ法試薬であるオーラルテスターバッファ（トクヤマデンタル）により唾液緩衝能を測定した。測定法はキットの取り扱い説明書に従い、唾液または濾液を０．５ｍＬ判定チューブに添加し、判定チューブ中の試薬と良く混合して緩衝能を判定した。判定は３人の判定者（ア、イ、ウ）により実施し、黄色が低緩衝能、橙が中緩衝能、赤紫が高緩衝能と判定した。結果を表２に示した。
【００６１】
唾液の粘度の影響を受けにくい判定チューブ法で測定した唾液と濾液の緩衝能は同じ結果であった。このことから、濾液を使用しても唾液と同様に緩衝能が測定できることが明らかとなった。
【００６２】
【表２】
2008128797.tif 000003
【００６３】
実施例１
（１）唾液の採取と培養法によるミューストレプトコッカス・ミュータンス菌数の測定
前記参考例１の被験者Ａと、他の４人の被験者（Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ）にパラフィンペレットを５分間噛ませ、唾液を採取した。それぞれの被験者の唾液分泌量を表３に示した。
【００６４】
採取した唾液を適宜希釈して０．０５ｍＬをＭＳＢ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳＢ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、唾液の希釈率から、ミュータンスレンサ球菌濃度を個／ｍＬとして算出し、表４に示した。ＭＳＢ培地上のストレプトコッカス・ミュータンスの識別は、コロニーの形態学的分類、および形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法および、糖発酵試験等の生化学的方法によりストレプトコッカス・ミュータンスの同定を行った。
（２）唾液の濾過と糖鎖抗原抽出液の調製
唾液Ａ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊの０．３ｍＬを参考例１と同様にＧＡ−１００で濾過し、濾液を採取した。０．３ｍＬの唾液全量が濾過できた。唾液の濾過に要した時間を表３に示した。
【００６５】
【表３】
2008128797.tif 000004
【００６６】
次いで、０．５ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を濾過装置に添加し濾過し、さらに０．５ｍＬのＰＢＳを濾過装置に添加し濾過することで、濾過膜上の微生物と濾過膜の洗浄を行った。１Ｍ  亜硝酸ナトリウム溶液と２Ｍ  酢酸溶液を１：１で混合し、亜硝酸水溶液を調製し、該亜硝酸水溶液０．３ｍＬを濾過装置に添加し濾過した。２分間室温で放置した後、０．０９ｍＬの０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む１Ｍ  トリス（ｐＨ未調製）を添加し、濾過装置をシリンジで加圧することで糖鎖抗原抽出液を回収した。
（３）免疫クロマトデバイスによる糖鎖抗原抽出液の測定
製造例２で製造した免疫クロマトデバイスのサンプルパッド上に、糖鎖抗原抽出液０．１ｍＬを添加し、１０分後にスポットの有無を判定した。判定は、検出用抗体スポット上に捕捉された金コロイドの程度を４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に目視で識別した。結果を表４に示した。
【００６７】
【表４】
2008128797.tif 000005
【００６８】
表４に示したように、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関するスポット発色強度が得られた。
（４）濾液による唾液緩衝能の測定
（２）で採取した濾液を使用して、試験紙法試薬であるＤｅｎｔｏｂｕｆｆ  Ｓｔｒｉｐ（オーラルケア）により唾液緩衝能を測定した。測定法はキットの取り扱い説明書に従い、試験紙の濾液を１滴滴下し、５分後の呈色を観察した。判定は黄色が低緩衝能、緑が中緩衝能、青が高緩衝能と判定した。判定は３人の判定者（ア、イ、ウ）により実施した。結果を表５に示した。
【００６９】
【表５】
2008128797.tif 000006
【００７０】
濾液を使用すると唾液の粘度が低下するので、試験紙へ濾液が均一に浸透した。３人の判定者で同じ結果となり容易に判定できた。
比較例１［孔径の小さい濾材を使用した場合におけるストレプトコッカス・ミュータンス菌数の測定］
濾材として、孔径が０．６μｍのガラス繊維濾紙「ＧＡ−５５」（アドバンテック東洋社製）を用いた以外は実施例１と同様の方法にて唾液を濾過した。次いで実施例１と同様に免疫クロマトデバイスにより菌数を測定した。結果を表６に示した。唾液は実施例１で使用したＡ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉを用いた。Ｊは残量が少ないため濾過できなかった。
【００７１】
ＧＡ−５５を用いた場合、０．１５ｍＬの唾液しか濾過できないためにＧＡ−１００の場合に比べてスポット発色が弱く、５×１０５個／ｍＬ以上の菌数でないと陽性にならなかった。ＧＡ−５５を用いた場合、感度が不足していた。
【００７２】
【表６】
2008128797.tif 000007
【００７３】
比較例２［唾液を直接用いての唾液緩衝能の測定］
唾液を濾過することなく用いて実施例１（４）と同様の方法にて唾液緩衝能を測定した。結果を表７に示した。この場合、粘性が高く濾過に時間がかかる唾液である被験者Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊからの唾液において、唾液が試験紙に均一に浸透しないので、発色がまだらになり判定し難い発色状態になった。その結果、判定者により結果が異なるものになった。
【００７４】
【表７】
2008128797.tif 000008
【００７５】
実施例２，比較例３
粘度の高い唾液である被験者Ｇより、実施例１（１）と同様の方法により唾液を採取した（唾液量２ｍＬ）。この唾液を用い、濾過装置として表８に示したガラス繊維濾紙、濾紙を用いた図１の構造のものを用いる以外は、実施例１（２）と同様にして０．３ｍＬの唾液の濾過、糖鎖抗原の抽出を行い、実施例１（３）と同様に糖鎖抗原抽出液を用いた免疫クロマト法によるストレプトコッカス・ミュータンスの菌数の測定を実施した。濾材の孔径が本発明の範囲である実験Ｎｏ．１〜４では実施例１と同様の結果であったが、濾材の孔径が本発明の範囲を越える実験Ｎｏ．５では、ミュータンス菌が濾材上に十分に保持されないためにスポットが検出されなかった。
【００７６】
次いで、各濾液について、実施例１（４）と同様にして緩衝能の測定を行い結果を表９に示した。濾材の孔径が本発明の範囲である実験Ｎ０．１〜４では、いずれも３人の判定者で同じ結果となり容易に判定できた。他方、濾材の孔径が本発明の範囲を超える実験Ｎｏ．５の場合、唾液の粘性が十分に低下していなかったことから、試験紙の発色がややまだらになり、３人の判定者の結果がばらついた。
【００７７】
【表８】
2008128797.tif 000009
【００７８】
【表９】
2008128797.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本図は、本発明の抗原の抽出方法で使用する濾過装置の該略図である。
【図２】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。
【図３】本図は、本発明の免疫クロマト法で使用するストリップの側面図である。
【符号の説明】
【００８０】
１・・・排液口
２・・・濾材
３・・・容器本体
４・・・シリンジ差込口
５・・・蓋部
６・・・濾過装置
７・・・ストリップ
８・・・サンプルパッド
９・・・コンジュゲートパッド
１０・・・展開メンブレン
１１・・・吸収パッド
１２・・・検出ライン
１３・・・コントロール判定ライン
【図１】
2008128797.tif 000011
【図２】
2008128797.tif 000012
【図３】
2008128797.tif 000013