(57)【要約】【課題】異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物を提洪すること、及び実質的な親和性をもってヒト抗原に結合するヒト配列抗体を作る方法を提供することを本発明の課題とする。【解決手段】（Ａ）機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンの少なくとも一つのコピーを含む、トランスジェニックマウスを得ること、（Ｂ）トランスジェニックマウスを所定の抗原により免疫化すること、を包含するヒト配列免疫グロブリンポリペプチドを作製する方法を提供することによって、上記課題が解決された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも２×１０９Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）を有する免疫グロブリンを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１】
2008239630.tif 000002
【０００２】
【数２】
2008239630.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
【数３】
2008239630.tif 000004
【０００４】
【数４】
2008239630.tif 000005
【０００５】
【数５】
2008239630.tif 000006
【０００６】
【数６】
2008239630.tif 000007
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、次のものがある。
【非特許文献１】Lewis およびGellert(l989)，Cell，59.585-588
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は以下を提供する：
（項目１）  下記工程を含むヒト配列免疫グロブリンポリペプチドを作る方法
（Ａ）トランスジェニックマウスを得ること、ここで該トランスジェニックマウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンの少なくとも一つのコピーを含む、
（Ｂ）該トランスジェニックマウスを所定の抗原により免疫化すること、ここで免疫応答が誘発され、そしてそれによりマウスのトランスジェンがＶ-Ｄ-Ｊ再配列を受け、それにより再配列されたトランスジェンが作られる、
Ｃ）再配列されたトランスジェンの可変領域の少なくとも一部をエンコードする核酸を単離しかつ配列決定し、そして該再配列されたトランスジェンの配列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、
（Ｄ）第２の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工的遺伝子を作ること、ここで該第２の免疫グロブリンポリペプチドは、上記再配列されたトランスジェンの配列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に同じアミノ酸配列を有する、
（Ｅ）該人工的遺伝子を転写プロモーター配列に結合すること、そして
（Ｆ）該人工的遺伝子を細胞内へ導入すること、これによりヒト配列免疫グロブリンポリペプチドが作られる
（項目２）  第２の免疫グロブリンポリペプチドが、再配列されたトランスジェンの配列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む、項目１の方法
（項目３）  工程（Ｃ）の核酸が、ヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマから単離される項目１の方法
（項目４）  再配列されたトランスジェンがヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンである項目１の方法
（項目５）  人工的遺伝子がガンマイソタイプ定常領域をエンコードする項目４の方法
（項目６）  工程（Ｆ）の細胞中に第２の人工的遺伝子を導入することを更に含み、ここで該第２の人工的遺伝子は、再配列されたトランスジェンがヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンであることを除いては項目４の工程（Ａ）〜（Ｅ）に従って作られ、かつここで細胞は免疫グロブリンを作るところの項目４の方法
（項目７）  ヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェン及びヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンが、トランスジェニックマウスからの単一のＢ細胞を１つの不死細胞へ融合させることにより作られたハイブリドーマ内で発現される項目６の方法
（項目８）  細胞が、少なくとも約108Ｍ-1の親和性定数（Ｋa）で所定の抗原を結合する免疫グロブリンを作る項目６の方法
（項目９）  項目１の方法により作られた免疫グロブリン
（項目10）  免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部をエンコードする少なくとも１つの人工的遺伝子を含む細胞において、該細胞は所定のヒト抗原を結合する免疫グロブリンの検出可能量を作り、該免疫グロブリンポリペプチドはトランスジェニックマウスから得られたハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンポリペプチドと実質的に同じ配列を有し、該マウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンの少なくとも一つのコピーを含むところの、細胞
（項目11）  項目10の真核細胞
（項目12）  免疫グロブリンが、ヒトＣＤ４またはその抗原的フラグメントを結合する、項目11の細胞
（項目13）  ヒトＣＤ４を特異的に結合する免疫グロブリンにおいて、該免疫グロブリンが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号10によりエンコードされるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含むヒト配列軽鎖可変領域を含むところの、免疫グロブリン
（項目14）免疫グロブリンが配列番号６１又は配列番号62の配列を含む、項目13の免疫グロブリン
（項目15）  予め選択された抗原を特異的に結合するヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを選択する方法において、
（ａ）トランスジェニックマウスからＢ細胞を得ること、ここで該トランスジェニックマウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びμならびに非μセグメントをエンコードする配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンの少なくとも一つのコピーを含み、かつここで該マウスは該所定の抗原により予め免疫化されている、
（ｂ）該Ｂ細胞を不死細胞に融合させること、ここでハイブリドーマが作られる、
（ｃ）非μ、非δイソタイプ免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマの第１群を同定すること、
（ｄ）ハイブリドーマの第２群を同定すること、ここで該第２群は、ハイブリドーマの第１群のサブセットであり、第２群内のハイブリドーマは所定の抗原を特異的に結合する免疫グロブリンを分泌する、
（ｅ）ハイブリドーマの第２群から、予め選択された抗原に特異的に結合するヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを選択することの各工程を含む方法
（項目16）  ハイブリドーマの第１の群がＩｇＧ免疫グロブリンを分泌する、項目15の方法
（項目17）  工程（ｅ）のヒト配列免疫グロブリンが、少なくとも約109Ｍ-1の親和性定数（Ｋa）で所定の抗原を結合する、項目15の方法
（項目18）  ヒトからのＣＤ４を特異的に結合し、かつ少なくとも１つの非ヒト霊長類からのＣＤ４を特異的に結合する、ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリン
（項目19）  非ヒト霊長類がリーサスモンキー、シノモルガスモンキー、又はチンパンジーである項目18の免疫グロブリン
（項目20）  ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、リーサスモンキー及びシノモルガスモンキーの両者からのＣＤ４を特異的に結合する項目19の免疫グロブリン
（項目21）  ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、リーサスモンキー、シノモルガスモンキー及びチンパンジーからのＣＤ４を特異的に結合する項目19の免疫グロブリン
（項目22）  ＶＨ４−３４セグメント、ＤＸＰ’１セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列番号６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目23）  ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ２セグメント、及び配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列番号６４）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目24）  ＶＨ４−３４セグメント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列番号６５）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目25）  ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目26）  ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目27）  ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹＰＱＬＴ（配列番号６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目28）  ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目29）  ＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＹＴ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
（項目30）  免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマにおいて、免疫グロブリンが、ＶＨ４−３４セグメント、ＤＸＰ’１セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列番号６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ２セグメント、及び配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列番号６４）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶＨ４−３４セグメント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列番号６５）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（配列番号６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列番号６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹＰＱＬＴ（配列番号６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；
ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（配列番号６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン：及び
ＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＹＴ（配列番号７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリンより成る群から選ばれるところのハイブリドーマ。
【０００８】
【数７】
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【０００９】
【数８】
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【００１０】
【数９】
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【００１１】
【数１０】
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【００１２】
【数１１】
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【００１３】
【数１２】
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【００１４】
【数１３】
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【数１４】
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【００１６】
【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【００２４】
【数２３】
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【００２５】
【数２４】
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【００２６】
【数２５】
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【数２６】
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【数２７】
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【数２９】
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【００３１】
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【数３９】
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【数４０】
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【数４１】
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【数４３】
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【数４４】
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【数４５】
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【数４６】
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【数４７】
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【数４８】
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【数５４】
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【数５５】
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【数５６】
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【数５７】
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【数５８】
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【数５９】
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【００６１】
【数６０】
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【数６１】
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【数６２】
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【数６４】
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【数６５】
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【数６６】
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【数６７】
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【数６８】
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【００７０】
【数６９】
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【数７０】
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【００７２】
【数７１】
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【００７３】
【数７２】
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【００７４】
【数７３】
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【数７４】
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【数７５】
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【数７６】
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【数７７】
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【００７９】
【数７８】
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【数７９】
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【００８１】
【数８０】
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【００８２】
【数８１】
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【００８３】
【数８２】
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【００８４】
【数８３】
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【００８５】
【数８４】
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【００８６】
【数８５】
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【００８７】
【数８６】
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【００８８】
【数８７】
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【００８９】
【数８８】
2008239630.tif 000089
【００９０】
【数８９】
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【実施例】
【００９１】
【数９０】
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【００９２】
【数９１】
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【００９３】
【数９２】
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【００９４】
【数９３】
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【００９５】
【数９４】
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【００９６】
【数９５】
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【００９７】
【数９６】
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【００９８】
【数９７】
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【００９９】
【数９８】
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【０１００】
【数９９】
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【０１０１】
【数１００】
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【０１０２】
【数１０１】
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【０１０３】
【数１０２】
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【０１０４】
【数１０３】
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【０１０５】
【数１０４】
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【０１０６】
【数１０５】
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【０１０７】
【数１０６】
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【０１０８】
【数１０７】
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【０１０９】
【数１０８】
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【０１１０】
【数１０９】
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【０１１１】
【数１１０】
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【０１１２】
【数１１１】
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【０１１３】
【数１１２】
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【０１１４】
【数１１３】
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【数１１４】
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【０１１６】
【数１１５】
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【０１１７】
【数１１６】
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【０１１８】
【数１１７】
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【０１１９】
【数１１８】
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【０１２０】
【数１１９】
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【０１２１】
【数１２０】
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【０１２２】
【数１２１】
2008239630.tif 000122
【０１２３】
【数１２２】
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【０１２４】
【数１２３】
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【０１２５】
【数１２４】
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【０１２６】
【数１２５】
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【０１２７】
【数１２６】
2008239630.tif 000127
【０１２８】
【数１２７】
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【０１２９】
【数１２８】
2008239630.tif 000129
【０１３０】
【数１２９】
2008239630.tif 000130
【０１３１】
【数１３０】
2008239630.tif 000131
【０１３２】
【数１３１】
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【０１３３】
【数１３２】
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【０１３４】
【数１３３】
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【０１３５】
【数１３４】
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【０１３６】
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【数２５０】
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【数２６０】
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【数２６１】
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【数２６４】
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【数２６７】
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【数２６８】
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【０２７０】
【数２６９】
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【０２７１】
【数２７０】
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【０２７２】
【数２７１】
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【０２７３】
【数２７２】
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【０２７４】
【数２７３】
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【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロプリン重鎖遣伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。
【図２】図２はヒトλ鎖鎮遺伝子座を表す。
【図３】図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。
【図４】図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。
【図５】図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５kb断片に次いでラット鎖３’エンハンザ−配列を含む７００bp断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。
【図６】図６は、生体内相同キ目同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。
【図７】図７はｐＧＰ１の作製を示す。
【図８】図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカ−の構成を示す。
【図９】図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。
【図１０】図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。
【図１１】図１１は、ｏＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。
【図１２】図１２は ｐＨＩＧ３’およびｐＣＯＮの作製を示す。
【図１３】図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。
【図１４】図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。
【図１５】図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包含する断片を示す。
【図１６】図１６はｐＥμの構造を示す。
【図１７】図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。
【図１８】図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図１９】図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２０】図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２１】図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２２】図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２３】図２３は、マウスの内因性免役グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図２４】図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２５】図２５はκ軽鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２６】図２６はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２７】図２７はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２８】図２８はべクターｐＧＰｅの地図を示す。
【図２９】図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。
【図３０】図３０はベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。
【図３１】図３１はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。
【図３２】図３２はｐγｅ２の構造を示す。
【図３３】図３３はｐＶＧＥ１の構造を示す。
【図３４】図３４はｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。
【図３５】図３５はｐＪＣＫ１の構造を示す。
【図３６】図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。
【図３７】図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＭ1，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。
【図３８】図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１．ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。
【図３９】図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。
【図４０】図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
【図４１】図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図４２】図４２はプラスミドｐＢＣＥ１の略図である。
【図４３】図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（４３Ａ）．ＫＬＨ（４３Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（４３Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。
【図４４】図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４５】図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４６】図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１．ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４７】図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定了ミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文宇で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４８】図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４９】図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細抱トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５０】図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５１】図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定了ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５２】図５２は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するvk65.3と命名されたヒトDNA断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５３】図５３はＶκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えングナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５４】図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５５】図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５６】図５６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換ええによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。
【図５７】図５７は、抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクロ−ナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５８】図５８は、ヒトＶＤＪ及びフウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図５９】図５９は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。
【図６０】図６０は、３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウスμについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６１】図６１は、３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウスκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６２】図６２は、３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。
【図６３】図６３は、４つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒトκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６４】図６４は、免疫化されていない0011マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。
【図６５】図６５は、さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。
【図６６】図６６は、００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。
【図６７】図６７は、ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗休力価を示す。
【図６８Ａ】図６８は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６８Ｂ】図６８は、ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６９】図６９は、Storb et al．（1989）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。
【図７０】図７０は、相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。
【図７１】図７１は、「免疫グロブリン遺伝子」、Honjo，T，AIt，FW，及びRabbits TH（eds）Academic Press，NY（1989）p129 から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。
【図７２】図７２は、マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図７３】図７３は、マウス重鎖遺伝子座Ｊ4遺伝子内に２つのbpフレームソフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。
【図７４】図７４は、高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。
【図７５】図７５は、クラススイッチ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。
【０２７６】
２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃ１／Ｓｆｉ１消化されたＤＮＡのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ−５Ｈ１−５、ヒトγ１+／μ-；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１+／μ-；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１-．μ+。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３’半部分にまたがる２．３kbのＢｇIII／ＳｆｉＩ［ＤＮＡフラグメントから誘導されたブローブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つのγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１kb及び５．３kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩ［フラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。
【図７６】図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを決失するべく組換えできる４００bpの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４kbι11,;bのＰａｃ１／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えによるクラススイッテは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４kbと７kbの間のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッテ領域の間で組換えを受けていると思われる。
【図７７】図７７は、トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ筋のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。
【図７８−１】図７８および図７９は、再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。
【０２７７】
図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図７８−２】図７８および図７９は、再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。
【０２７８】
図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図７９−１】図７８および図７９は、再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。
【０２７９】
図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図７９−２】図７８および図７９は、再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。
【０２８０】
図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８bp）。
【図８０】図８０および図８１は、広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。
【０２８１】
図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８１−１】図８０および図８１は、広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。
【０２８２】
図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８１−２】図８０および図８１は、広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。
【０２８３】
図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８２Ａ】図８２は、ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。
【０２８４】
単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８２Ｂ】図８２は、ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。
【０２８５】
単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８３】図８３は、分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ÷／−，ＪＣκ÷／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０÷，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒトμ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細抱のヒストグラム（対数螢光：Ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基づくｅ−パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０÷細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの百分率として与えられている。
【図８４】図８４は、２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。
【０２８６】
内因性重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４２重トランスＡジェニックマウスからのマウスγ及びλ及びヒトμ．
γ及びκ。マウス：（÷）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（〇）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピ）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７。
【図８５】図８５および図８６は、ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告されている。
【０２８７】
図８６：インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８６】図８５および図８６は、ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告されている。
【０２８８】
図８６：インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８７】図８７は、ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。
【図８８】図８８は、トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４ＩｇＭａｎｆ ＩｇＧを示す。
【図８９】図８９は、トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。
【図９０】図９０は、培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。
【図９１】図９１は、遺伝子、例えば重鎖定常領域遺伝子を欠失するための相同組換えターゲティングトランスジーンの構造を概略的に示す。
【図９２】図９２は、は、HCo7トランスジーンを構成するプラスミド挿入部 （inserts）の重複する組を示す。
【図９３Ａ】図９３Ａは、pGP2bプラスミドベクターのヌクレオチド配列および制限酵素地図を示す。
【図９３Ｂ】図９３Ｂは、pGP2bプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。
【図９４】図９４（部分ＡおよびＢ）は、大きいトランスジーンを組み立てるためのクローニング法を示す。
【図９５】図９５は、大きな挿入部が、高複写（high-copy）pUC誘導プラスミドにおいて不安定であることを示す。
【図９６】図９６は、ファージP1クローンP1-570を示す。挿入部は、スウイッチ要素と共に、γ３およびγ１をカバーするヒト重鎖定常領域の部分に及ぶ。N、NotI；S、SalI、X、XhoI。
【図９７】図９７は、HCo7トランスジェニック創立動物におけるヒトμおよびγ１の血清発現を示す。
【図９８】図９８は、HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウスにおけるヒト免疫グロブリンの血清発現を示す。
【図９９】図９９は、HCo7トランスジェニックマウス脾臓RNAにおけるヒトγ１およびγ３転写のRT PCR欠失を示す。
【図１００】図１００は、インビトロでのLPSおよびIL−4によるヒトIgG1およびIgG3の誘導を示す。
【図１０１】図１０１は、YAC DNAの濃縮のためのアガロースゲル電気泳動装置。
【図１０２】図１０２は、HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの骨髄細胞の二色FACS分析。B220+／CD43-、B220+／CD43+およびB220+／IgM+ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０３】図１０３は、HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの脾臓細胞の二色FACS分析。B220明るい／IgM+およびB220曇っている／IgM+ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０４】図１０４は、IgGk抗-nCD4モノクローナル抗体のCD4＋ SupT1細胞への結合。
【図１０５】図１０５は、フローサイトメトリーによるIgG抗-nCD4モノクローナル抗体のエピトープ測定。SupT1細胞は、緩衝液（左のカラム）、2.5mg／ml RPA−T4（真中のカラム）または2.5mg／ml Leu3a（右のカラム）で、次いで10のヒトIgGモノクローナル抗体（１：２に希釈した上清中）の１つまたはキメラLeu3aで、プレインキュベートされた。３つの典型的ヒトIgGモノクローナル抗体についての結果をこの図に示す。
【図１０６】図１０６は、ヒトIgGk抗-CD4モノクローナル抗体によるMLRの阻害。
【０２８９】
本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイフリドーマを作製する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０】
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【図８１−１】
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【図８１−２】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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