(57)【要約】【課題】アルツハイマーアミロイドβと親和性の高い糖鎖を用いた糖鎖修飾電極と、これを利用したアルツハイマー病の早期診断方法を提供する。【解決手段】所定の化学式で示されるアミロイドβ結合糖質を基板に結合したアミロイドβ結合糖質薄膜又はアミロイドβ結合糖質修飾基板。これを用いた、インピーダンス測定又は電気化学測定法によるアルツハイマーアミロイドβ蛋白質測定法。【選択図】図５
2008101949.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイドβ蛋白と特異的に結合する反応性物質が膜又は基板に固定された構造部分を備えることを特徴とするアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項２】
前記反応性物質が糖構造体又はその誘導体であることを特徴とする請求項１に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項３】
前記糖構造体又はその誘導体が、下記の化1式で表されるものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【化１】
2008101949.tif 000019
【請求項４】
前記糖構造体又はその誘導体が、下記の化２式で表されるものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【化２】
2008101949.tif 000020
【請求項５】
前記糖構造体又はその誘導体が、前記化1式又は化２式における硫酸化糖部分が下記の化３式に列挙する（I）〜（VII）のいずれか、あるいは下記の化４式に列挙する（VIII）〜（XIV）のいずれかと置換されているものであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【化３】
2008101949.tif 000021
――――（I）
2008101949.tif 000022
――――（II）
2008101949.tif 000023
――――（III）
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――――（IV）
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――――（V）
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――――（VI）
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――――（VII）
【化４】
2008101949.tif 000028
――――（VIII）
2008101949.tif 000029
――――（IX）
2008101949.tif 000030
――――（X）
2008101949.tif 000031
――――（XI）
2008101949.tif 000032
――――（XII）
2008101949.tif 000033
――――（XIII）
2008101949.tif 000034
――――（XIV）
【請求項６】
前記反応性物質が自己組織化膜を形成して固定されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれかに記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項７】
前記反応性物質が、その一部に備えた結合性官能基を介して、前記膜又は基板に設けた導電性材料に結合・固定されていることを特徴とする請求項１〜請求項６のいずれかに記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項８】
前記反応性物質が、その一部に備えた結合性官能基を介して前記膜又は基板に固定されていることを特徴とする請求項１〜請求項７のいずれかに記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項９】
前記膜又は基板が導電性材料からなり、又は電気絶縁性の基板材料上に導電性材料を配設した構造を持ち、これらの導電性材料に対して前記反応性物質が固定されていることを特徴とする請求項１〜請求項８のいずれかに記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項１０】
前記膜又は基板が電気絶縁性の基板材料上に導電性材料を配設した構造を持つ場合において、この導電性材料が、任意の方法により形成された特定のパターンを持つ電極を構成していることを特徴とする請求項９に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項１１】
前記特定のパターンを持つ電極が電極印刷法により形成された印刷電極であることを特徴とする請求項１０に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項１２】
前記印刷電極の構成材料の主体が金ペースト、カーボンペースト又は銀ペーストをであることを特徴とする請求項１１に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項１３】
前記特定のパターンを持つ電極が金属蒸着された金属によって構成されていることを特徴とする請求項１０に記載のアミロイドβ結合用ベース体。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のいずれかに記載のアミロイドβ結合用ベース体を用いて、被検試料中のアミロイドβ蛋白の検出又は定量を行うことを特徴とするアミロイドβ蛋白の測定方法。
【請求項１５】
前記アミロイドβ蛋白の検出又は定量を行う手段が電気化学的測定方法であることを特徴とする請求項１４に記載のアミロイドβ蛋白の測定方法。
【請求項１６】
前記電気化学的測定方法がインピーダンス法であることを特徴とする請求項１５に記載のアミロイドβ蛋白の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイドβタンパク質凝集体の検出に関し、これを迅速に検出する技術に関するものである。更にはアミロイドβと結合する、硫酸化糖鎖またはシアル酸の利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、１９０７年にドイツの神経病理学者アルツハイマー（Ａｌｏｉｓ   Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ）によって報告された疾患である。発症年齢は初老以降であり、進行性の痴呆が症状の中核となる疾患である。痴呆とは正常であった知的機能が徐々に障害された結果、日常生活に障害をきたしてくる状態をいう。アルツハイマー病の場合に症状として最初に現れてくるものは、物忘れに代表されるような記憶力の障害である。さらに、失語、失認、失行などを含む様々な知的機能の障害も加わり、徐々に進行性の経過をとり、末期には寝たきり、失禁など高度の痴呆状態へと至る。病理学的には脳のび漫性の萎縮と神経細胞の脱落に加え、老人班、神経原線維変化と呼ばれる特徴的な構造物が数多く観察される。これらの変化は特に海馬において著しい傾向にある。
【０００３】
神経原線維変化はＡｌｚｈｅｉｍｅｒが初めて記載した変化で、神経細胞全体の嗜銀性の線維状構造物の蓄積を指す。老人班は元来、中心に密集したアミロイド線維があり、その周囲に変成しつつある神経突起、アストロサイトなどが集まった構造全体を定義していた。アミロイド線維は種々の溶媒に不溶であるので、この性質を利用してアルツハイマー病脳の髄膜血管および脳実質から精製され、その構成成分が分子量約４ｋＤの新しいペプチドであるアミロイドβ蛋白質（Ａβ）と同定された。
【０００４】
その後、単離されたＡβから抗Ａβ抗体が作製され、アルツハイマー病患者の脳を抗体染色したところ、以前から知られていた球状の老人班の他に多くの形態で のＡβの存在が観察され、アミロイド沈着はこれまでの考えよりも遙かに広範に渡っていることが明らかとなった。アミロイド沈着のなかにはその程度が軽く、変成神経突起を伴わないものがある。これはび慢性老人班と名付けられ、アルツハイマー病の初期病理像であると考えられ、アルツハイマー病に特異的なものとして広く支持されている。
【０００５】
近年、アルツハイマー病やプリオン病などの致死性のアミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ：アミロイドが細胞周囲や組織間隙に沈着し機能障害をおこす 疾患）において、蛋白質のミスフォールド体形成やアミロイド線維形成が重要な段階であることが明らかになりつつあり、アミロイド線維を検出することはアミロイドーシスの診断において極めて重要である。
【０００６】
Ａβとはアミノ酸４０残基もしくは４２残基で構成されるペプチドで、それぞれＡβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）と呼ばれ、アルツハイマー病の発症過程において重要な役割を果たしていると考えられている。Ａβはアミノ酸６９５残基から７７０残基で構成される一回膜貫通蛋白質であるＡＰＰから酵素（α− ｓｅｃｒｅｔａｓｅ，γ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ）によって切り出されて生成し、健康な人の脳内には0.1nM〜10ｎＭ程度の濃度でモノマーのＡβ（１− ４０）が存在しているとされ、α−ｓｅｃｒｅｔａｓｅによって分解され代謝される。
【０００７】
Ａβ（１−４０）は生理的条件下においてランダムコイル状態で存在し、Ａβ（１−４０）が生成する場合は脳内に沈着することなくα−ｓｅｃｒｅｔａｓｅに よって代謝される。しかしＡβ（１−４２）は生理的条件下において、ランダムコイル状態から集合化してα−ヘリックス構造を経由しβシート構造をとる。その後βシート構造のＡβは更に重合しアミロイド線維化してプロテアーゼ耐性を獲得する。そして不溶化して脳内に沈着し老人班を形成する。このことがアルツ ハイマー病発症過程において重要であると考えられている。    
【０００８】
アルツハイマー病の診断は、初期段階ではＤＳＭ−４（米国精神医学協会から公示されたアルツハイマー病の診断基準）等を用いた精神医学的な手法が大部分を占めている。しかし精神医学的な手法ではアルツハイマー病初期段階における確定診断が難しく、またアルツハイマー病患者およびその家族がその症状に気付く頃にはその病状がかなり進行していることが多い。また、中期段階以降はＭＲＩにより脳の萎縮を判定することで診断が可能だが、ごく初期段階においては脳の萎縮が始まっていないので診断することは難しい。
【０００９】
またその他の診断法として低濃度のトロピカミド（アセチルコリン受容体アンタゴニスト；アルツハイマー病患者はアセチルコリン受容体が減少するのでアセチルコリン受容体アンタゴニストに対して過敏になる（下記の特許文献１）、点眼に対する瞳孔の散大（下記の特許文献２）、および固視による記憶力テスト（アルツハイマー病においては海馬の損傷が著しく、それをテストする）（下記の特許文献３）などがあるが、現時点では信頼性が低く、副次的な診断法としてしか用いられていない。現時点では、ごく初期段階のアルツハイマー病の診断は非常に難しく、そのことがアルツハイマー病の治療をより一層困難なものとしている。
【特許文献１】特表平１０−５０３２０９
【特許文献２】特開２００２−２８２２０８
【特許文献３】特開２００５−１３１３９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
即ち、これまで、アミロイドβ蛋白質とその凝集状態を直接的に検出する方法が存在しなかった。そこで、本発明では、アミロイドβと親和性の高い糖鎖に着目し、アミロイドβ親和性電極を作成し、その糖鎖修飾電極を利用した、アミロイドβの検出方法の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはアミロイドβ蛋白の凝集および沈着の生理活性現象を鋭意検討し、アミロイドβ蛋白質と相互作用する糖質を利用した電極を作成した（特願2005−028198）。また、アミロイドβ蛋白質自体が電気化学的に検出可能であること（下記の非特許文献１）が既に報告されている。そこで、これらを融合させることで、アミロイドβ親和性電極を利用した高感度な、アルツハイマーアミロイドβの検出法を開発するに至った。
【非特許文献１】民谷ら、J. Am. Chem. Soc., 2005,  127, 11892
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
すなわち、本発明は、下記の化１の式で表されるパラニトロフェノキシド-6-硫酸化N-アセチルグルコサミンを成分として有し、末端にAu-S結合を介して、電極と結合する。
【００１３】
【化１】
2008101949.tif 000003
【００１４】
また、本発明は、下記の化２の式で表される、N-アセチルノイラミン酸を成分として有し、末端にAu-S結合を介して、電極と結合する。
【００１５】
【化２】
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【００１６】
上記の化１の式と化２の式で表される、糖鎖修飾基板は公知のmercapt  S-(10-{2-[2-(2-prop-2-ynloxy-ethoxy)-ethoxy]-decyl}ester  の金基板上自己組織化膜に対して、銅を触媒とする、公知の環状化合物形成反応によって修飾される(Langmuir 2004, 20, 3844)。
【００１７】
本発明に関わる硫酸化糖鎖は公知の方法（Sasaki, Kら  Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 第１３巻２８２１−２８２３頁、Bioorganic & Medicinal Chemistry 第１２巻１６３７−１３７５頁）によって合成される化合物である。
【００１８】
なお、本発明に当たって、硫酸化糖は各種のＮ−アセチル化糖鎖に適用することができ、前記化1で表される硫酸化糖のみならず、N-アセチル化グルコサミン誘導体、下記化３の式で表される N-アセチルガラクトサミン誘導体、下記化４の式で表される硫酸化糖への展開が可能である。糖鎖の選択はその目的によって適宜選択される。
【００１９】
【化３】
2008101949.tif 000005
――――（I）
2008101949.tif 000006
――――（II）
2008101949.tif 000007
――――（III）
2008101949.tif 000008
――――（IV）
2008101949.tif 000009
――――（V）
2008101949.tif 000010
――――（VI）
2008101949.tif 000011
――――（VII）
【００２０】
【化４】
2008101949.tif 000012
――――（VIII）
2008101949.tif 000013
――――（IX）
2008101949.tif 000014
――――（X）
2008101949.tif 000015
――――（XI）
2008101949.tif 000016
――――（XII）
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――――（XIII）
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――――（XIV）
【００２１】
また、同様に本発明に当たって、シアル酸はN-アセチルノイラミン酸に限らず、各種のシアル酸を適用可能である。糖鎖の選択はその目的によって、適宜選択される。
【００２２】
また、各種糖とベンゾトリアゾール骨格をつなぐ、エチレングリコール鎖は、いかなるオリゴエチレングリコール鎖、アルキル鎖でも適用可能である。薄膜のオリゴエチレングリコール骨格、アルキル骨格はその目的によって適宜選択される。
【００２３】
本発明における電気化学測定では、金電極を用いて、インピーダンス測定、サイクリックボルタンメトリーが測定できる装置ならばいずれの装置でも可能である。但し、事前に金基板をアルキン鎖末端の自己組織化膜の形成、糖鎖の固定化を行っておく必要がある。アルツハイマーアミロイドβの測定において必要な、サンプルの量については用いる電気測定装置の測定サイズによって異なる。微小電極を用いることで0.5μl程度のサンプルから測定が可能である。
【００２４】
［発明の効果］
本発明によって、アミロイドβと親和性の高い糖鎖と、これを用いたアミロイドβ親和性電極とが提供され、、その糖鎖修飾電極を利用したアミロイドβの検出方法によってアルツハイマー病の信頼性ある早期診断が可能となる。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明の実施例を示し、本発明を更に具体的に明らかにするが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例の記載によって何等の制約をも受けるものでないことはいうまでもないところである。また、本発明には、以下の実施例の他にも、更には上記した発明の実施の形態における記述以外にも、本発明の趣旨を逸脱し得ない限りにおいて、当業者の知識に基づいて、種々なる変更、修正、改良等を加え得るものであることが理解されるべきである。
【００２６】
本発明で用いた、mercapt  S-(10-{2-[2-(2-prop-2-ynloxy-ethoxy)-ethoxy]-decyl}ester  は公知の図１のスキームに従い合成した。図１について以下に説明する。
【００２７】
2-[2-(10-enyloxy-ethoxy)-ethoxy]- 2-undecanol 
Triethyleneglycol (関東化学社製品、3.65mL, 27.0mmol)をDMF(関東化学社製品、30mL) に溶かし、NaH (関東化学社製品、140mg, 5.83mmol)を氷冷下で加え、30分放冷したのち、80℃で30分攪拌した。その後、11-Bromo-  1-undecene (和光純薬社製品、1.0mL, 4.6mmol)を加え、24時間攪拌した。さらにNaH (30mg, 1.25mmol)、18-crown-6-ether（東京化成社製品、catalytic amount）を加え、90℃で2日攪拌した。反応の終了後、DMFを減圧蒸留で除き、シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル、ヘキサン）により精製した。
収量 832mg    収率 64%
1H-NMR (300MHz, CDCl3) δ5.77 (1H, m, 2-CH), 4.93 (2H, t, J =12, 1-CH2), 3.70-3.54 (2H×6, m, 13-, 14-, 16-, 17-, 19- and 20-CH2), 3.42 (2H, t, J =6, 11-CH2), 2.01 (2H + 1H, q, 3-CH2 and OH), 1.55 (2H, q, 10-CH2), 1.25 (2H×5, s, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- and 9-CH2).
【００２８】
2) (10-{2-[2-(2-acetyl-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}undecyl) thioacetate 
2-[2-(10-enyloxy-ethoxy)-ethoxy]-undecanolにチオ酢酸(関東化学社製品、3.5μl、2.5 mmol)とAIBN(和光純薬社製品、54.2mg, 0.166mmol)を入れ、THF2.8μlを加え、窒素雰囲気下、75℃で24時間攪拌した。TLCで反応を確認した後、メタノールを注ぎ、2時間冷却した後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒: 酢酸エチル、ヘキサン）によって精製した。
収量200mg, 収率67%
1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ3.62(2Hx7, t, J=12Hz, CH2), 2.84(2H, t, J=7.2, CH2), 2.30(6H, m, CH3, CH2, and OH), 1.55(2H, m, CH2), 1.25(2Hx5, m, CH2). 
【００２９】
1-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-11-(11-{2-[2-(2-prop-2-ynyloxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-undecyldisulfanyl)-undecane disulfide  
ω-(11-{2-[2-(2- hydroxyl ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-undecyl) disulfide (77mg, 1.14mmol, 3eq) をTHF 8mLに溶かし、氷冷下でNaH (10mg, 0.4mmol, 1eq)を加え30分攪拌し、室温でさらに30分攪拌した後、3-bromo-propyne (300μL, 3.99 mmol, 9eq) を加え窒素雰囲気下で攪拌した。6時間後、反応の終了をTLCで確認し、ヘキサンを加え抽出を行った。次にヘキサン層を純水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥を行い、減圧濃縮にかけたものをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。
収量 52mg   収率 61%
【００３０】
本発明で用いた、硫酸化糖鎖（p-nitrophenyl 2-acetamide-2-deoxy-6-sulfonate β-D-glucopyranoside）は図2の方法に従い、合成した。図２について以下に説明する。
【００３１】
１）Chloro  2-acetamide-3,4,6-tri-O-acetyl-deoxy-α-D-glucopyranosideの合成
N- Acetylglurosamine（東京化成社製品、4.90g, 20.9mmol）に塩化酢酸（東京化成社製品、30ｍl）を加え、２４時間攪拌した、反応液に氷水を加え、反応を停止させ、クロロホルムで抽出し、その後、飽和ＮａＨＣＯ３水で２回、氷水で１回洗浄した。硫酸化マグネシウムで乾燥後、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：メタノール＝50:1&#224;
クロロホルムのみ）で精製した。
収量  560mg, 収率6.9 %
1HNMR (CDCl3, 500MHz.)：δ 6.19(d, J=4.0, 1H, H-1), 5.76(d, J=8.5, 1H, CONH), 5.32(dd, J=9.10, 1H, H-3), 5.22(m, 1H, H-4), 4.53(ddd, J=3.5, 9.0, 10.5, 1H, H-2), 4.30-4.25(m, 2H, H-5, H-6ProR), 4.16-4.12(m, 1H, H-6proS), 2.05(dd, 12H, Ac). IR(KBr):1747(C=O), 1228(C-O), 601(Cl).
【００３２】
２）p-Nitrophenyl 2-acetamide-3,4,6-tri-O-acetyl-2-deoxy-β-D-glycopyranosideの合成
Chloro  2-acetamide-3,4,6-tri-O-acetyl-deoxy-α-D-glucopyranoside（560mg, 1.53mmol）をメチレンクロライド5mlに溶解させ、1N NaOH 5ml、Bu4NBr（東京化成社製、490mg, 1.5mmol）とp-nitorophenol（東京化成社製、４30mg, 3.1mmol）を加え、１２時間攪拌した。その後、酢酸エチルで抽出し、1N NaOH、飽和食塩水、水で洗浄した。その後、シリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：クロロホルム：メタノール=100:1）で精製した。
収量290mg, 収率40％
1HNMR (CDCl3, 500MHz)：δ 8.20(dt, 2H, Ph), 7.07(dt, 2H, Ph), 5.60(1H, NHCO), 5.47(d, 1H, H-1), 5.46(t, J=10.5Hz, 1H, H-3), 5.15(t, J=9.5Hz, 1H, H-4), 4.29(dd, J=5.5, 12.0Hz, 1H, H-6proR), 4.20(dd, J=2.0, 5.5, 9.5 Hz, 1H, H-5), 4.10(ddd, J=8.5, 8.5, 10.5 Hz, 1H, H-2), 3.94(ddd, J=2.0, 5.5, 9.5 Hz, 1H, H-5), 2.08, 2.067(sxs, s, 3H, OAc), 1.97(s, 3H, NHAc). 
IR(KBr): 1745(C=O), 1523(NO2), 1344(NO2), 1228(C-O).
【００３３】
３）p-nitrophenyl 2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranosideの合成
p-nitrophenyl 2-acetamide-3,4,6-triO-acetyl-2-deoxy-b-D-glucopyranoside（130mg, 0.29mmol）をメタノール10mlに溶解させ、ナトリウムメトキシド（東京化成社製、10mg, 0.19 mmol）を加え、室温で2時間攪拌した。陽イオン交換樹脂（アンバーリスト、オルガノ社製）で中和し、ろ過した。ろ液を濃縮し、再結晶により目的化合物を得た。
収量 100 mg, 収率100%
1H NMR (D2O, 500MHz)：δ 8.26(dt, 2H, Ph), 7.20(dt, 2H, Ph), 5.32(d, J=8.5Hz, 1H, H-1), 4.03(dd, J=8.5, 10.5 Hz, H1, H-2), 3.96(dd, J=2.5, 12.5 Hz, H-1, H-6proS), 3.80(dd, J=5.5, 12.5 Hz, 1H, H-6proR), 3.69(m, 2H, H-3, H-5), 3.38(dd, J=9.0, 10.0 Hz, 1H, H-4), 2.01(s, 3H, Ac).
IR(KBr):3307(OH), 1521(NO2), 1346(NO2), 1250(C-O).
【００３４】
４） p-nitrophenyl 2-acetamide-2-deoxy-6-sulfonate-β-D-glucopyranosideの合成
30mlナスフラスコにp-nitrophenyl 2-acetamide-2-deoxy-β-D-glucopyranoside 200 mgを入れてDMF8 mlに溶かした。ソニケーターでよく溶解させた後、40℃のオイルバス中でDMF6 mlに溶かしたMe3N・SO3  3e.q.(シグマアルドリッチ社製、240.5 mg)を一滴ずつ加えて3時間攪拌した。その間TLCで反応を追跡していった（展開溶媒  クロロホルム：メタノール＝２：１）。反応終了後、メタノールを14 ml加えて室温で3時間攪拌し、エバポレーターで濃縮して逆相カラムで分離精製を行った。その後、得られた化合物を陽イオン交換樹脂を2 ml加えて3日間攪拌した。その後陽イオン交換樹脂をガラスフィルターでろ過して、液体を濃縮し凍結乾燥させた。
収量  123.1 mg     収率  47.2 %
1H NMR (500 MHz, D2O, 30 ℃)δ 8.02 (m, 2H, Hmetha of phenyl group), 7.00 (m, 2H, Hortho of phenyl group), 5.16 (d, 1H, J=8.5 Hz, H-1β), 4.27 (dd, 1H, J=2.0, 11.5 Hz, H-6pros), 4.11 (dd, 1H, J=5.5, 11.5 Hz, H-6proR), 3.92 (dd, 1H, J=8.5, 10.5 Hz, H-2), 3.80 (m, 1H, H-5), 3.58 (dd, 1H, J=10.5, 9.0 Hz, H-3), 3.48 (dd, 1H, J=9.0, 10.0 Hz, H-4), 2.74 (s, 9H, 3×Me), 1.89 (s, 3H, Ac)
【００３５】
本発明で用いた、糖鎖に結合させるリンカー分子は図3の方法に従い、合成した。図３について以下に説明する。
【００３６】
[2-(2-Chloroethoxy)ethoxy]acetic acid
[2-(2-Chloroethoxy)ethoxy]ethanol (2.20g, 13.0 mmol) をアセトン（30ml）に溶解させ、15% NaHCO3水溶液40 mlを加え、0°Cで攪拌した。KBr (0.312g, 2.60mmol)とTEMPO 0.040g(0.40mmol)を加えた後、Trichloroisocyanuric acid (6.10g, 26.2 mmol)を20分かけてゆっくり滴下した。室温に戻し、8時間攪拌した後、反応の終了をTLCによって確認した。2-Propanol 10mlを加えて、反応を停止させ、反応混合物をセライトでろ過した後、飽和Na2CO3水溶液で中和した。1H  HCl水溶液で酸性にした後、CHCl3で抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥した後、吸引ろ過によって硫酸マグネシウムを除去し、ろ液を減圧濃縮し、無色油状の化合物を得た。
収量  1.94g  収率  88.6%
1H-NMR (300MHz, r.t. CDCl3)：δ3.58-3.60(m, 2H, CH2) 3.64-3.68(m, 2H, CH2), 3.69-3.70(m, 2H, CH2), 3.71-3.76(m,2H, CH2), 4.18(s, 2H, CH2). 
【００３７】
Methyl 2-[2-(2-Chloroethoxy)ethoxy]acetate
[2-(2-Chloroethoxy)ethoxy]acetic acid  (0.312g, 1.78mmol)をDMF2mlに溶解させ、0°CでNaH(0.530g, 2.22mmol)を加え、30分攪拌した。MeI(0.649g, 3.33mmol)を加えて、室温で22.5時間攪拌した。反応の終了をTLCにて確認した。ＤＭＦを減圧留去し、CHCl3に溶解した後、1H  HCl水溶液、飽和NaHCO3水溶液、飽和食塩水で2回ずつ有機層を除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：酢酸エチル、ヘキサン）で精製し、無色油状の化合物を得た。
収量  0.242g, 収率74.4%
1H-NMR(300MHz, r.t, CDCl3)：δ 3.62(t, 2H, J=6Hz, CH2), 3.71-3.72(m, 2H, CH2), 3.72-3.74(m, 2H, CH2), 3.73(s. 3H, CH3), 3.74-3.76(m, 2H, CH2), 4.16(s, 2H, CH2).  
【００３８】
[2-(2-azidoethoxy)ethoxy]acetic acid
Methyl 2-[2-(2-Chloroethoxy)ethoxy]acetate  (0.22g, 1.15mmol)を1N NaOH水溶液15mlに溶解させて室温で16時間攪拌した。反応の終了をTLCによって確認した。1N HCl 水溶液で中和の後、酸性条件下でCHCl3で抽出した。有機層を硫酸マグネシウムによって乾燥した後、吸引ろ過によって硫酸マグネシウムを除去した。ろ液を減圧濃縮して、無色油状の化合物を得た。
収量0.172g, 収率84.4%
1H-NMR (300MHz, CDCl3): d3.41(t, 2H, J=4.8Hz, J=5.1Hz, CH2), 3.67-3.69(m, 2H, CH2), 3.70-3.71(m, 2H, CH2), 3.75-3.78(m, 2H, CH2), 4.16(2, 2H, CH2).
【００３９】
p-nitorophenyl [2-(2-azidoethoxy)ethoxy]amidophenyl 2-acetoamido-2-deoxy-6-sulfate β-D-glucopyranoside 
p-nitropheny 2-acetoamido-2-deoxy-6-sulfate b-D-glucopyranoside（0.10g, 0.29mmol）をMeOHに溶解し、Pd/Cを0.010g加え、水素雰囲気下11時間攪拌した。次いで、Pd/Cをガラス繊維ろ紙にてろ過し、ろ液を減圧濃縮した（p-aminophenyl 2-acetoamido-2-deoxy-6-sulfate β-D-glucopyranoside）。減圧濃縮したろ液に、DMF３ｍｌを加え、0℃で攪拌しながら、HATU(ペプチド研究所社製品、0.103g, 0.44mmol)、N,N-diisopropylethylamine (東京化成社製品、0.74μl, 0.44mmol)の順で加えた。室温に戻し、4時間攪拌した。反応の終了をTLCによって確認した。DMFを減圧留去し、逆相シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒、水、メタノール）によって精製した。
収量0.134g, 収率96.0%
1H-NMR (500MHz, CD3OD):d1.93(s, 3H, OCOCH3), 3.10-3.34(m, 2H, CH2), 3.12-3.14(m, 1H, 5H),3.10-3.34(m, 1H, H4), 3.67-3.69(m,2H, CH2),3.46(dd, 1H, J=9.0Hz, 8.5Hz H3), 3.59-3.63(m, 2H, CH2), 3.64-3.66(m, 2H, CH2), 3.79-3.83(m, 1H, H2), 4.90(d, 1H, J=8.5Hz H1), 3.67-3.69(m, 2H, H6), 6.95(d, 2H, J=8.7Hz, PhH), 7.43(d, 2H, J=9.0Hz, PhH). 
【００４０】
本発明で用いたシアル酸誘導体分子は、図４の方法に従い、合成した。図４について以下に説明する。
【００４１】
5-Acetamide-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid methyl ester
5-Acetamide-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid (東京化成社製品、3.00g, 9.70mmol)にMeOH(50ml)、Amberlist 50(H+)(ダウケミカル社製品、2.00g)を加えて静かに磁気攪拌した。反応の進行をTLCで追跡した。9.5 時間後、反応を止めて、Amberlist (H+)をろ過して濃縮した。これをMeOHに溶解させ、ジエチルエーテルで再結晶させることで、白色粉状の化合物を得た。
収量  2.96g, 収率94％
1HNMR (500MHz, CD3OD) d 4.02(m, 1H, H-4), 3.98(dd, 1H, J=1.5, 11.0Hz, H-6), 3.75-3.81(m, 2H, H-5 and H-9), 3.76(s, 3H, Ch3), 3.69(m, 1H, H-8), 3.60(dd, 1H, J=5.5, 11.0Hz, H-9), 3.45(dd, 1H, J=1.5, 9.0Hz, H-7), 2.20(dd, 1H, J=5.0, 12.5Hz, H-3), 2.00(s,3H, Ac), 1.88(dd, 1H, J=11.5, 13.5Hz, H-3).
【００４２】
5-Acetamide-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid methyl ester
5-Acetamide-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid methyl etser (961mg, 2.97mmol)にAc2O(5.0ml)、pyridine (7.0ml)を加えて、氷浴中で塩化カルシウム管をつけて磁気攪拌した。反応の進行をTLCによって追跡した。23時間後、反応を止めて酢酸エチルで抽出(1N HCl x 2, NaHCO3aq x 2, H2O x 2)した。硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒：トルエン、酢酸エチル＝1/3）で精製、濃縮して、無色透明の油状化合物47％を得た。
1HNMR(500MHz, CDCl3)：δ 5.37(dd, 1H, J=1.5, 5.5Hz, H-7), 5.23-5.28(m, 2H, NH and H-4), 5.08(ddd, 1H, J=2.5, 5.5, 7.0Hz, H-8), 4.49(dd, 1H, J=3.0, 12.5Hz, H-9), 4.10-4.14(m, 3H, H-5, H-6, and H-9), 3.80(s, 3H, CH3), 2.55(dd, 1H, J=5.0, 13.0, H-3), 2.15(s, 3H, Ac), 2.10(dd, 1H, H-3), 2.07(s, 3H, Ac), 2.04(s, 3H, Ac), 2.04(s, 3H, Ac), 1.90(s, 3H, Ac).
【００４３】
Phenyl-5-acetamide-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-thio-b-D-glycero-D-galacto-2-nonuloxonic acid methyl ester
5-Acetamide-2,4,7,8,9-penta-O-acetyl-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid methyl ester(504.7mg, 0.946 mmol)をメチレンクロライド（9.5 ml）に溶解させ、ベンゼンチオール（108.7μl, 1.04mmol）、(C2H5)2O BF3（632.0μl, 2.34mmol）を加えて室温で磁気攪拌した。クロロホルムで抽出した後、NaHCO3水溶液、水で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥した。溶液を濾過、濃縮して、シリカゲルクロマトグラフィー（溶媒、トルエン、酢酸エチル）で精製、能職して、白色固体状の化合物を得た。
収量  413mg, 収率75%
1HNMR (500MHz, CDCl3) δ7.27-7.46(m, 5H, Ph), 5.57(d, 1H, H-7), 5.39(ddd, 1H, H-8), 4.95(m, 1H, H-4), 4.63(dd, 1H, H-6), 4.99(dd, 1H, H-9), 4.14(m, 2H, H-5 and NH), 4.01(dd, 1H, H-9), 3.61(s, 3H, CH3), 2.62(dd, 1H, H-3), 2.11(s, 3H, Ac), 2.08(s, 3H, Ac), 2.06(m,1H, H-3), 2.05(s, 3H, Ac), 1.97(s, 3H, Ac), 1.91(s, 3H, Ac).
【００４４】
Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate 
二口ナスフラスコにスターラーチップとモレキュラーシーブス3Aをいれ、３方コック、セプタムで栓をして脱水した後、窒素置換した。アセトニトリル（10ml）にPhenyl 5-acetamide-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-thio-b-D-glycero-D-galacto-2-nonuloxonic acid methyl ester (500mg, 0.857mmol), NIS(386mg, 1.71mmol)を溶解させて、シリンジで加え、2-2-2-Chloroethoxyethoxyethanol (872μl, 6.00mmol)を加えた後、１時間磁気攪拌した。-35℃においてシリンジでTfOH（30μl）を加えて反応を開始させ、8時間攪拌した。トリエチルアミン数滴を加えて反応を停止し、セライトで濾過をしてクロロホルムで抽出し、（NaHCO3+Na2SO3 溶液、食塩水、水）で洗浄、硫酸マグネシウムで乾燥した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶媒、トルエン、酢酸エチル）で精製、能職して、白色固体状の化合物を得た。
収量  362mg、収率362.4mg
1HNMR (500MHz, CDCl3) δ5.39(m, 1H, H-4), 5.32(dd, 1H, H-7), 5.25(m, 1H, NH), 4.89(ddd, 1H, H-8), 4.30(dd, 1H, H-9), 4.10(m, 3H, H-5, H-6 and H-9), 3.89-3.97(m, 2H,CH2), 3.80(s,3H, CH3), 3.63-3.69(m, 10H, CH2x5), 2.15(s, 3H, Ac), 2.06(m, 1H, H-3), 2.03(s, 3H, Ac), 1.88(s, 3H, Ac)
【００４５】
Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate 
Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-chloroethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate  (362.4mg, 0.564mmol)をDMF(10ｍｌ)に溶解させ、アジ化ナトリウム（183.5mg, 2.82mmol）を加えて、70度で磁気攪拌させた。その後、反応混合物を濾過、濃縮し、残渣を酢酸エチルで抽出し、食塩水、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。
1HNMR (500MHz, CDCl3) δ5.39(m, 1H, H-4), 5.32(dd, 1H, H-7), 5.23(m, 1H, NH), 4.89(ddd, 1H, H-8), 4.30(dd, 1H, H-9), 4.06(m, 3H, H-5, H-6 and H-9), 3.80(s, 3H, CH3), 3.63(m, 10H, CH2x5), 2.62(dd, 1H, H-3), 2.15(s, 3H, Ac), 2.14(s, 3H, Ac), 2.06(m, 1H, H-3), 2.04(2, 3H, Ac), 2.03(s, 3H, Ac), 1.88(s, 3H, Ac). 
【００４６】
Methyl(5-acetamido-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate  
Methyl(5-acetamido-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate  (209.6mg, 0.323mmol) をメタノール（7.0ml）に溶解させ、NaOMe（2.9mg, 0.323 mmol）を加えて磁気攪拌した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。
収量  94.4mg, 収率  61％
1HNMR (500MHz, CDCl3) δ3.92(m, 1H, H-4), 3.50-3.81(m, 4H, H-6, H-5 and CH2), 3.78(dd, 1H, H-9), 3.74(m, 1H, H-8), 3.56(m, 9H, H-9, CH2), 3.64(s, 3H, CH3), 3.31(m, 2H, Ch2), 2.70(dd, 1H, H-3), 2.00(s, 3H, Ac), 1.75(dd, 1H, H-3)
【００４７】
5-Acetamido-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonic acid
Methyl(5-acetamido-3,5-dideoxy-2-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)ethoxy)-β-D-glycero-D-galacto-2-nonulopuranosid)onate (94.4mg, 0.196 mmol)に0.2M NaHCO3を加えて60度で磁気攪拌した。反応終了後、アンバーリストで中和して混合物をろ過し、濃縮、凍結乾燥した。
収量140mg
1HNMR (500MHz, CDCl3) δ3.42-3.85(m, 5H, H-4, H-5, H-6 and CH2), 3.50-3.66(m, 11H, H-8, H-9, H-9 and CH2), 3.43-3.45(m, 3H, H-7 and Ch2), 2.67(dd, 1H, H-3), 1.96(s, 3H, Ac), 1.61(dd, 1H, H-3). 
【００４８】
［薄膜の形成］
1-{2-[2-(2-Prop-2-ynyloxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-11-(11-{2-[2-(2-prop-2-ynyloxy-ethoxy)-ethoxy]-ethoxy}-undecyldisulfanyl)-undecane disulfide  (6.41mg)にエタノール1mLを入れ、0.01mmol/Lの溶液を作った。その溶液を、洗浄した金基板上に表面を覆うように数滴滴下し、12時間室温で放置した。12時間後、金基板をエタノールに数回浸して洗浄した。
純水（333μL）とエタノール（167μL）に、 p-nitorophenyl [2-(2-azidoethoxy)ethoxy]amidophenyl 2-acetoamido-2-deoxy-6-sulfate β-D-glucopyranoside（44.5mg, 0.6mmol）、アスコルビン酸 （0.99mg, 5mol%）とCuSO4（0.16,mg 1mol%）を加え、0.2 M溶液を作成した。その溶液を、薄膜形成した金基板上に数滴滴下し、基板上で反応させ、結合させた。薄膜の形成は反射赤外スペクトルおよび、X線分光解析によって確認した。
【００４９】
以下の実施例において用いるアミロイドβ蛋白質として、アミロイドβ１−４２ペプチド、（Bachem社製品）を用いた。アミロイドβペプチドは0.02%アンモニウム水溶液200μM溶液として調整し、20000gで15分間遠心精製した後、上澄を用い、所定の濃度に希釈して用いた。
電気化学測定はビーエイエス社製品  ALS600、電極は北斗産業のプリント微小電極を使用した。アミロイドβは20μMに調整し、37℃で加温した。所定時間放置後、アミロイドβ溶液5μlを電極にアプライし、1分間吸着させた。その後、純水（MilliQ水）10mlにて電極表面を洗浄した。洗浄後、窒素ガスで表面を乾かし、電気メディエーターとして0.1Mol-K4[Fe3(CN)6]／K3[Fe4(CN)6] (in 1mol-KCl)を30μl滴下し、表面を覆い、インピーダンス測定を行った。その結果を図５に示す。
【００５０】
図５は、２時間インキュベートした後、測定したインピーダンス測定の結果である。濃度に伴って、インピーダンスが上昇することが分かった。また、BSA,トリプシンを参照タンパク質として用いたところ、糖鎖結合性がないため、インピーダンス変化は殆ど観測されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明によれば、アミロイドβと親和性の高い糖鎖と、これを用いたアミロイドβ親和性電極と、その糖鎖修飾電極を利用したアミロイドβの検出方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】実施例で用いた化合物の合成スキームを説明する図である。
【図２】実施例で用いた硫酸化糖鎖の合成スキームを説明する図である。
【図３】実施例で用いた、糖鎖に結合させるリンカー分子の合成スキームを説明する図である。
【図４】実施例で用いたシアル酸誘導体分子の合成スキームを説明する図である。
【図５】実施例で行ったインピーダンス測定の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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