(57)【要約】【課題】  ダイオキシン分解能力を有する粗酵素と酵素賦活剤とを環境ホルモンで汚染された土壌中や汚染水中に直接投与しても、前記の粗酵素や酵素賦活剤の効力が長期間持続し、土壌中や汚染水中のダイオキシン類を効果的に分解除去することができるダイオキシン類分解剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】  ダイオキシン分解能力を持つ菌から抽出した粗酵素をコア成分とし、前記粗酵素を活性化させる酵素賦活剤をシーズ成分とする環境ホルモン分解剤であって、前記コア成分と前記シーズ成分を夫々イオン透過機能を有する半透膜で被覆して多重カプセル構造としたことを特徴とする多重カプセル環境ホルモン分解剤及びその製造方法。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダイオキシン分解能力を持つ菌から抽出した粗酵素をコア成分とし、前記粗酵素を活性化させる酵素賦活剤をシーズ成分とする環境ホルモン分解剤であって、前記コア成分をイオン透過機能を有する被膜で被覆すると共に、その回りに前記シーズ成分を配置し、更にその回りをイオン透過機能を有する被膜で被覆して多重カプセル構造としたことを特徴とする多重カプセル環境ホルモン分解剤。
【請求項２】
前記菌は白色腐朽菌であって、この白色腐朽菌がフザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株、カワタケ属２６７菌株、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株、コウヤクタケ科に属する微生物、カワタケ属コウヤタケ科に属する微生物、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１の内、いずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の多重カプセル環境ホルモン分解剤。
【請求項３】
前記シーズ成分は、１-ヒドロキシベンゾトリアゾールと界面活性剤とから成る酵素賦活剤と、硫酸マンガンとを含有していることを特徴とする請求項１に記載の多重カプセル環境ホルモン分解剤。
【請求項４】
前記被膜は、アルギン酸カルシウム、若しくはκ-カラギーナンカリウム、又はι-カラギーナンカルシウムがゲル化した半透膜から成ることを特徴とする請求項１に記載の多重カプセル環境ホルモン分解剤。
【請求項５】
粗酵素を溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて混合してコア成分原料液とし、これを塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に滴下してその回りに被膜を形成して一重カプセル化した固定化酵素と成し、次いで、酵素賦活剤を溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて溶解した酵素賦活剤成分液に前記一重カプセル化した固定化酵素を浸漬してその回りにシーズ成分を付与し、しかる後に再度塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に浸漬又は滴下してその回りに被膜を形成して二重カプセルを備えた構造としたことを特徴とする多重カプセル環境ホルモン分解剤の製造方法。
【請求項６】
粗酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコースを溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて混合してコア成分原料液とし、これを塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に滴下し、その回りに被膜を形成して一重カプセル化した固定化酵素と成し、次いで、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール、界面活性剤、硫酸マンガンを溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて溶解した酵素賦活剤成分液に前記一重カプセル化した固定化酵素を浸漬してシーズ成分を付与し、しかる後に再度塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に浸漬又は滴下してその回りに被膜を形成し、二重カプセルを備えた構造としたことを特徴とする多重カプセル環境ホルモン分解剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイオキシン分解能力を有する粗酵素と酵素賦活剤とをカプセル構造に形成して、ダイオキシン類を始めとする環境ホルモンで汚染された土壌中や水中に直接投与しても、前記の粗酵素や酵素賦活剤の効力が長期間持続し、汚染土壌中や汚染水中のダイオキシン類を効果的に分解除去することができるようにした多重カプセル環境ホルモン分解剤及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ダイオキシン類を始めとする環境ホルモンによる環境汚染が大きな社会問題となっている。
【０００３】
ダイオキシンは、有機塩素化合物の一種で、２個のベンゼン環が１個又は２個の酸素原子によって結び付けられた骨格構造を持つジベンゾフラン又はシベンゾ−Ｐ−ダイオキシンの総称で、塩素原子の置換のされ方によって、理論的には夫々１３５種類及び７５種類の異性体が存在するとされる。毒性は、塩素の置換位置と数により大きく変化し、中でも２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−Ｐ−ダイオキシンの毒性が最も高いとされている。また、環境ホルモンは、生体内において、ホルモンのような働きをし、体内の機能を狂わせる内分泌撹乱物質として知られている。
【０００４】
ダイオキシン類は急性毒性の他に、慢性毒性、催奇形性、発ガン性などの毒性をもっている。ダイオキシン類は、主として物質の燃焼などによって、非意図的に生産されている。現在、発生源の一つであるゴミ類の焼却などの規制が実施されている。しかし、ゴミ類の焼却によるダイオキシン類の発生を完全に抑制することは現実問題として不可能である。ダイオキシン類はゴミ類の焼却によって焼却灰や排ガス或いは飛散灰中に存在し、飛散灰は近くの土壌に落下する。また排ガスは、より遠くへ気流に乗って放散され、やがて近隣の地上へ落下する。土壌へ落下したダイオキシン類は、化学的安定性のため土壌中に長期間分解されずに残存し、その一部は河川に流れ、海洋に到達して拡散する。土壌、河川や海洋に拡散されたダイオキシン類は、食物連鎖による生物濃縮によって高濃度となり、やがて人体に蓄積されることになる。それに伴う発ガン性や偏奇形性が、大きな社会問題として懸念されるところである。そのため、環境中のダイオキシン類を分解し、浄化するための技術の確立が強く望まれている。
【０００５】
これら環境中のダイオキシン類を分解除去する技術として、物理・化学的あるいは生物的手法などの様々な方面から検討されている。物理・化学的な方法は汚染物質が集中して存在する場合には有効な方法であるが、処理コストが高い、あるいは適用範囲が狭いといった問題がある。一方、微生物を用いて環境浄化を行うバイオレメディエーションは、物理・化学的な手法に比べると、低コスト・持続的効果、環境負荷の軽減などの利点があり、土壌中のダイオキシン類などの低濃度で広範囲に拡散した汚染物質の浄化には適した方法である。
【０００６】
ダイオキシンを効果的に分解できる微生物としては、既に特開平１１−３４１９７８号公報や特開２００１−１６１３４９号公報で、ダイオキシン分解能力の高い新規微生物を得て公表されている。特開平１１−３４１９７８号公報では、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株と、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株と、カワタケ属２６７菌株と、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株と、コウヤタケ科（特にカワタケ属）に属する微生物が紹介されている。特開２００１−１６１３４９号公報では、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２と、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１が紹介されている。
【０００７】
かくして見出されたダイオキシン分解能力を有する微生物は、農地等の土壌中に投与すると、その土壌中の雑菌により前記微生物の生息が阻害される場合が多いので、雑菌の多い土壌中では思うようにダイオキシン類の分解が進行しない場合が多い。前記の微生物が直接ダイオキシン類を分解するのではなくて、この微生物が産生する酵素がダイオキシン類を分解できる。
【０００８】
しかし、前記微生物が産生する酵素は一般的に不安定であり、酸、アルカリ、有機溶媒や雑菌類よって、またその他の物理的、化学的要因によって、その活性が失われるので、酵素を直接農地等の土壌中に投与しても、ダイオキシン類分解能力は短期間で失われる。
【０００９】
この対策として、特開２００１−２３２３４６号公報には、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水に、磁性体微粒子に固定化された塩素化ダイオキシン分解酵素を接触させて、塩素化ダイオキシン類で汚染された土壌又は水を浄化する方法が開示されている。
【００１０】
しかしながら、この塩素化ダイオキシン分解酵素は磁性体微粒子の表面に付着しているだけであり、酵素が雑菌の多い汚染された土壌と直接接触して、酵素の活性を長期間持続できない。
【００１１】
また、この対策として、本発明者等は、特開２００４−３５１２６３号公報にて、白色腐朽菌を培養した培養物中から粗酵素を抽出し、得られた粗酵素を包括法により固定化した顆粒状ダイオキシン類分解剤を汚染土壌に施し、酵素の活性を長期間維持することにより、土壌中のダイオキシン類を効果的に分解除去する土壌浄化方法を公表している。この発明により粗酵素を包括法により固定化した顆粒状ダイオキシン類分解剤は、土壌中に直接投与しても、固定化した顆粒状ダイオキシン類分解剤の活性が長期間持続するようになった。しかしながら、前記顆粒状ダイオキシン類分解剤を使用する際には、酵素賦活剤をこの汚染土壌に同時に、かつ、両者の相互作用が効果的に得られる形で添加しなければならず、その種施工方法の実施が難しかった。その上、この酵素賦活剤は前記酵素と接触する前に汚染土壌に分散接触されるのでその効力が低下して、酵素賦活剤の効果が有効に活用されない欠点があった。
【特許文献１】特開平１１−３４１９７８号公報、第１頁
【特許文献２】特開２００１−１６１３４９号公報、第１頁
【特許文献３】特開２００１−２３２３４６号公報、第１頁
【特許文献４】特開２００４−３５１２６３号公報、第２頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、ダイオキシン分解能力を有する粗酵素と酵素賦活剤とを環境ホルモンで汚染された土壌中や汚染水中に直接投与しても、前記の粗酵素や酵素賦活剤の効力が長期間持続し、土壌中や汚染水中のダイオキシン類を効果的に分解除去することができる多重カプセル環境ホルモン分解剤及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意工夫した結果、酵素賦活剤をも包含してカプセル化、特に容易に製造できて効果的に機能を果たすことができる多重カプセル構造とすることを見出して本発明に到達した。即ち、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤は、ダイオキシン分解能力を持つ菌から抽出した粗酵素をコア成分とし、前記粗酵素を活性化させる酵素賦活剤をシーズ成分とする環境ホルモン分解剤であって、前記コア成分をイオン透過機能を有する被膜で被覆すると共に、その回りに前記シーズ成分を配置し、更にその回りをイオン透過機能を有する被膜で被覆して二重カプセル構造としたことを特徴とする。
【００１４】
これにより、酵素及び酵素賦活剤を夫々カプセル構造とした上で粗酵素及び酵素賦活剤を常時共存させた関係を保つことができるので、環境ホルモンで汚染された水や土壌の施工対象の状態、状況に拘わらず、施工と同時に最も効果的にダイオキシン類を分解できる固形の多重カプセル構造によるので、施工が容易で、商品化に適し、各種環境ホルモンで汚染された部位に施工できる。
【００１５】
具体的な土壌への適用方法を示すと、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤は直径を６〜１０ｍｍの大きさに形成し、これをダイオキシン類で汚染された田畑を含む土壌を耕してから、乾燥土壌１ｋｇに対して対し１，０００〜１０，０００Ｕに相当する量の酵素を含む多重カプセル環境ホルモン分解剤を散布し、カプセルがつぶれないように軽く混合する。その後も、月に１〜２回軽く混合するのがよい。ここで言うＵとは、酵素量を表すために規定された量で、酵素活性の強さ、すなわち一定条件において、一定時間に酵素によって触媒された反応量で表される。通常、１分間に１μ ｍｏｌの変化をおこなう酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）とする。
【００１６】
尚、本発明でいうイオン透過機能を有する被膜とは、後述するＭｎ３＋イオン等の金属イオンが透過可能な被膜であり、大半の半透膜がこれに該当する。
【００１７】
本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤において、前記ダイオキシン分解能力を持つ菌は白色腐朽菌であって、この白色腐朽菌がフザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株、カワタケ属２６７菌株、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株、コウヤクタケ科に属する微生物、カワタケ属コウヤタケ科に属する微生物、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１の内、いずれか１つを含むことを特徴とする多重カプセル環境ホルモン分解剤とすることができる。
【００１８】
また、本発明の環境ホルモン分解剤において、前記シーズ成分は、１-ヒドロキシベンゾトリアゾールと界面活性剤とから成る酵素賦活剤と、硫酸マンガンとを含有していることを特徴とする。
【００１９】
また、本発明の環境ホルモン分解剤において、前記シーズ成分は、１-ヒドロキシベンゾトリアゾールと界面活性剤とから成る酵素賦活剤と、硫酸マンガンとを含有していることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤において、前記被膜が、アルギン酸カルシウム、若しくはκ-カラギーナンカリウム、又はι-カラギーナンカルシウムがゲル化した半透膜から成ることを特徴とする。この被膜は食品に利用されている材料であり、安全で、しかもイオン透過被膜として最も効果的に作用する。
【００２１】
本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤の製造方法は、粗酵素を溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて混合してコア成分原料液とし、これを塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に滴下してその回りに被膜を形成して一重カプセル化した固定化酵素と成し、次いで、酵素賦活剤を溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて溶解した酵素賦活剤成分液に前記一重カプセル化した固定化酵素を浸漬してその回りにシーズ成分を付与し、しかる後に再度塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に浸漬又は滴下してその回りに被膜を形成して二重カプセルを備えた構造としたことを特徴とする。これにより、容易、安全に多重カプセル構造を作ることができる。
【００２２】
また、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤を製造する好ましい方法として、粗酵素、グルコースオキシダーゼ、グルコースを溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて混合してコア成分原料液とし、これを塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に滴下し、その回りに被膜を形成して一重カプセル化した固定化酵素と成し、次いで、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール、界面活性剤、硫酸マンガンを溶解したマロン酸緩衝液に、アルギン酸ナトリウム、若しくはκ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを加えて溶解した酵素賦活剤成分液に前記一重カプセル化した固定化酵素を浸漬してシーズ成分を付与し、しかる後に再度塩化カルシウム溶液又は塩化カリウム溶液に浸漬又は滴下してその回りに被膜を形成し、二重カプセルを備えた多重構造とすることができる。
【００２３】
ダイオキシン類の分解において、白色腐朽菌が産生する酵素としては、マンガンペルオキシターゼ（以下ＭｎＰという）、リグニンペルオキシターゼ（以下ＬｉＰという）、ラッカーゼ（以下Ｌａｃという）、カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ、カテコール２，３−ジオキシゲナーゼ等があり、ダイオキシン類の分解には、ＭｎＰ、ＬｉＰ及びＬａｃが関与していると考えられる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明は、ダイオキシン分解能力を持つ菌から抽出した粗酵素を含有したコア成分と、前記粗酵素を活性化させる酵素賦活剤をシーズ成分とし、夫々イオン透過機能を有する膜で被覆した多重カプセル環境ホルモン分解剤なので、取り扱い性が良く、ダイオキシン類を始めとする環境ホルモンで汚染された土壌や水に対してそのまま容易に施工できる。また、施工された本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤中の粗酵素や酵素賦活剤は、汚染土壌、汚染水や外気に直接触れることが無いので、粗酵素や酵素賦活剤の機能が持続する。更に、前記粗酵素と前記酵素賦活剤は前記イオン透過機能を有する被膜を介して接触しているので、粗酵素に対して酵素賦活剤が有効に作用して粗酵素のダイオキシン類分解能力を向上させる効果がある。
【００２５】
本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤は、多重カプセル構造とされるので、汚染水や汚染土壌に対して容易に施工できる。
【００２６】
前記シーズ成分には、硫酸マンガンが含有されているので、前記硫酸マンガンのＭｎ２＋イオンが、粗酵素のＭｎＰによってＭｎ３＋イオンとなりダイオキシン類を分解する。
【００２７】
また、カプセル化させる被膜が、アルギン酸カルシウム、若しくはκ-カラギーナンカリウム、又はι-カラギーナンカルシウムがゲル化した半透膜、特にアルギン酸カルシウムがゲル化した半透膜なので、ダイオキシン類を始めとする環境ホルモンで汚染された土壌中や汚染水中でも、前記粗酵素や前記酵素賦活剤の機能をより長期間持続させることができると共に、前記のＭｎ３＋等のイオンが前記半透膜を透過してダイオキシン類を分解除去することができる。
【００２８】
更に、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤の製造方法は、アルギン酸ナトリウム等のカプセル化剤を含有した成分原料液を塩化カルシウム等の塩化物溶液に滴下することにより、その界面で前記カプセル化剤と前記塩化物とが反応して生じたアルギン酸カルシウム等の反応物のゲル化半透膜でカプセル化する手法なので、極めて容易にカプセル化することができ、高品質の多重カプセル環境ホルモン分解剤を効率良く安価に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
次に、本発明を実施するための最良の形態について二重カプセルの例を挙げて説明する。二重以外の三重構造については後述するが、本発明では二重を含めて、それ以上の多重構造を提案するものである。
【００３０】
図１は、本発明の一実施形態に係わる二重カプセル環境ホルモン分解剤を示す断面図である。二重カプセル環境ホルモン分解剤１のコア成分２にはダイオキシン分解能力を持つ菌から抽出した粗酵素が１０〜１００Ｕ（ＭｎＰから換算）含有されている。
【００３１】
前記ダイオキシン分解能力を持つ菌は白色腐朽菌であって、この白色腐朽菌がフザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルド６５菌株、フザリウム・アベナセウム（コルダ：フライズ）サッカルドＰＣ×６５菌株、カワタケ属２６７菌株、カワタケ属ＰＣ×２６７菌株、コウヤクタケ科に属する微生物、カワタケ属コウヤタケ科に属する微生物、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１又はヒラタケ２、タコウキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１の内、いずれか１つを含んでいる。
【００３２】
前記コア成分２には、前記粗酵素の外にグルコースオキシダーゼ、グルコースが含有されている。このグルコースオキシダーゼとグルコースが反応して過酸化水素が発生し、発生した過酸化水素の存在下で粗酵素のＭｎＰがダイオキシン類を分解する。
【００３３】
シーズ成分３には、１-ヒドロキシベンゾトリアゾールとＴｗｅｅｎ８０等の界面活性剤とから成る酵素賦活剤と、硫酸マンガンとを含有している。前記酵素賦活剤は粗酵素のダイオキシン分解能力を向上させる効果があり、また、前記硫酸マンガンのＭｎ２＋イオンは、粗酵素のＭｎＰによってＭｎ３＋イオンとなってダイオキシン類を分解する効果がある。
【００３４】
コア成分２と、シーズ成分３の周囲には、夫々イオン透過機能を有する内側被膜（内膜ともいう）４と外側被膜（外膜ともいう）５が形成されている。このイオン透過機能を有する被膜は、アルギン酸カルシウム、若しくはκ-カラギーナンカリウム、又はι-カラギーナンカルシウムがゲル化した半透膜、特にアルギン酸カルシウムがゲル化した半透膜が好ましく用いられる。このアルギン酸カルシウムがゲル化した半透膜は、前記粗酵素や前記酵素賦活剤は透過できないので、その機能を長期間持続させることができ、ダイオキシン分解能力を持つ前記Ｍｎ３＋イオンが前記半透膜を透過して、ダイオキシン類を効果的に分解除去することができる。
【００３５】
本発明の二重カプセル環境ホルモン分解剤１の大きさは、外径Ｄ2が６〜１０ｍｍであり、その他の寸法は表１に示す通りなので、製造し易く、且つ、取り扱い性が良く、汚染土壌に容易に散布して混合することができる。
【表１】
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【００３６】
次に、本発明の二重カプセル環境ホルモン分解剤の製造方法を説明する。まず、菌の培養物基材として楢又は及びブナの木紛からなる菌床を用いる。液体培地としてはグルコース、コハク酸ナトリウム六水和物、第一リン酸カリウム等からなるＫｉｒｋの培地を用いる。
【００３７】
これらの培養物基材に白色腐朽菌と、この白色腐朽菌を繁殖させるのに必要な量の栄養源を加える。栄養源としては、米糠又は及び小麦ふすまを加える。白色腐朽菌としては前記のとおりであるが、ヒラタケ科ヒラタケ属に属するヒラタケ１若しくはヒラタケ２又はタコンキン科シュタケ属に属するヒイロタケ１が好適に用いられる。ここでは、これをＰＬ１菌と称す。このＰＬ１菌を菌糸蔓延した状態まで培養した後、この菌体にリン酸緩衝液を加えて摩砕し、粗酵素を濾過抽出する。
【００３８】
次に前記で得られた粗酵素を用いて、外径約８ｍｍの二重カプセル分解剤１００個作成する場合について具体的に説明する。
【００３９】
濾過抽出した粗酵素１，２００〜４，８００Ｕ（ＭｎＰから換算）、グルコース５〜５００ｍｇ、グルコースオキシダーゼ２４〜１，２００Ｕを１０〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液５〜１０ｍｌに溶解し、これに１．０〜５．０ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウム０．０５〜０．５ｇを加えて溶解して粗酵素原料液を得る。
【００４０】
図２は、本発明の二重カプセル環境ホルモン分解剤１を実験室的に製造するフローを示す説明図である。図２（ａ）に示すように、前記で得られた粗酵素原料液６をホールピペット７に入れて、軽く撹拌している０．１〜０．２Ｍの塩化カルシウムを溶解した２０〜５０ｍＭマロン酸緩衝液２０〜５０ｍｌに滴下する。滴下された粗酵素原料液は略球状体となり、その表面では前記アルギン酸ナトリウムと前記塩化カルシウムが反応してアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜の内膜４が形成される。これを引き上げることにより一重カプセルの固定化酵素９が得られる。
【００４１】
次に、図２（ｂ）に示すように、１-ヒドロキシベンゾトリアゾール（以下ＨＢＴという）１〜２００ｍｇ、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ８０ １０〜２００ｍｇ、硫酸マンガン０．１〜１００ｍｇを２０〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液１５〜２０ｍｌに溶解し、これに１．０〜５．０ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウム０．１５〜１．０ｇを加えて溶解して酵素賦活剤成分液１０を準備する。次いで、前記一重カプセルの固定化酵素９を添加してシーズ成分を付与し、軽く撹拌している０．１〜０．２Ｍの塩化カルシウムを溶解した２０〜５０ｍＭのマロン酸緩衝液３０〜５０ｍｌに滴下する。滴下されたカプセル剤は、前記の一重カプセルの固定化酵素９の場合と同様に、アルギン酸カルシウムのゲル化半透膜の外膜５が形成される。これを引き上げることにより二重カプセル環境ホルモン分解剤１が製造される。
【００４２】
前記の１．０〜５．０ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウムの代わりに、１．０〜５．０ｗｔ％に相当するκ-カラギーナンを用いてもよく、この場合は、前記０．１〜０．２Ｍに相当する塩化カルシウムの代わりに０．５〜１．０Ｍに相当する塩化カリウムを用いる。また、前記の１．０〜５．０ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウムの代わりに、１．０〜５．０ｗｔ％に相当するι-カラギーナンを用いてもよく、この場合は、前記０．１〜０．２Ｍの塩化カルシウムをそのまま用いる。前記κ-カラギーナン、又はι-カラギーナンを用いるよりも、アルギン酸ナトリウムを用いる方が、環境ホルモン分解率が大幅に向上するので好ましい。
【実施例】
【００４３】
［実施例１］
固定化酵素の包括剤として、アルギン酸ナトリウムとκ-カラギーナンとι-カラギーナンを用いた一重カプセルの固定化酵素の酵素活性保持能力比較テストを下記要領で実施した。
【００４４】
テストサンプルの準備：前記の要領でＰＬ１菌から抽出した粗酵素２，４００Ｕ（ＭｎＰ活性から換算）、グルコース２００ｍｇ、グルコースオキシダーゼ６００Ｕを３０ｍＭのマロン酸緩衝液３０ｍｌに溶解させ、これに１．５ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウムを加えて混合して得た粗酵素原料液６を図２に示すホールピペット７に入れて、０．１Ｍ塩化カルシウムを溶解した３０ｍＭのマロン酸緩衝液３０ｍｌに滴下した後引き上げて、アルギン酸カルシウムのゲル化半透膜で粗酵素を包括した一重カプセルの固定化酵素９のサンプルＡを得た。
【００４５】
前記１．５ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウムの代わりに、１．５ｗｔ％に相当するκ-カラギーナンを、更に、前記０．１Ｍ塩化カルシウムの代わりに１．０Ｍの塩化カリウムを用いた外は前記と同じ要領にて粗酵素をκ-カラギーナンカリウム膜で包括した一重カプセルの固定化酵素９のサンプルκを得た。
【００４６】
また、前記１．５ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウム代わりに、１．５ｗｔ％に相当するι-カラギーナンを用いた以外は、サンプルＡと同じ要領にて粗酵素をι-カラギーナンカルシウム半透膜で包括した一重カプセルの固定化酵素９のサンプルιを得た。
【００４７】
酵素活性保持能力テスト実施：前記の方法で得た一重カプセルの固定化酵素９のサンプルＡ、サンプルκ、サンプルιを夫々、２００ｍｌの三角フラスコに入れた５０ｍＭのマロン酸緩衝液４０ｍｌ（ｐＨ４．５）に加え、２５℃の暗所で１２０ｒｐｍの条件下で０，２４，４８，７２時間処理を行った。処理期間後吸引濾過を行い、濾液と固定化酵素に分けて下記の方法でＭｎＰ活性とＬｉＰ活性を測定した。
【００４８】
ＭｎＰ活性の測定：５０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）１７５０μｌ、２０ｍＭの硫酸マンガン水溶液１２５μｌ、粗酵素液１０００μｌをセルに入れ、２ｍＭのＨ２Ｏ２を３００ｍｌ加えて、波長４７０ｎｍの吸光度を２８℃で１分間測定した。（モル吸光度係数ε：４９６００ｍｏｌ−１ｃｍ−１）を１分間後の数値を読み取り、Ｆ．Ｈ．Ｐｅｒｉｅらの方法（Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５７（８），２２４０−２２４５（１９９１））によってＭｎＰ活性を算出した。
【００４９】
ＬｉＰ活性の測定：ベラトリルアルコール０．４ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ８０の０．１％を含む０．１Ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）２０００μｌ、粗酵素液１０００μｌをセルに入れ、２ｍＭのＨ２Ｏ２を３００μｌ加えて、波長３１０ｎｍの吸光度を３７℃で５分間測定した。（モル吸光度係数ε：９３００ｍｏｌ−１ｃｍ−１）５分後の数値を読み取り、Ｔ．Ｋ．Ｋｉｒｋらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，２２８０−２２８４（１９８４））によってＬｉＰ活性を算出した。
【００５０】
酵素活性保持能力テスト結果：図３は、各カプセル基剤によるカプセル中の酵素ＭｎＰの活性率の経時変化を示す棒線グラフであり、図４は各カプセル基剤によるカプセル中の酵素ＬｉＰの活性率の経時変化を示す棒線グラフである。図中Ａ−１〜Ａ−４は、カプセル被膜としてアルギン酸カルシウムを、κ−１〜κ−４はカプセル被膜としてκ-カラギーナンカリウムを、ι−１〜ι−４はカプセル被膜としてι-カラギーナンカルシウムを夫々用いた場合を示している。図３及び図４から明らかなように、カプセル被膜としてはアルギン酸カルシウム膜が最も優れていることが分かる。特にＭｎＰの活性率の場合その傾向は顕著である。ＭｎＰの活性率の場合はι−２、ι−３、ι−４の値が小さいけれども、ＬｉＰの活性率の場合は、カプセル膜としてκ-カラギーナンカリウムやι-カラギーナンカルシウムの値が高く、これも利用可能であることが示されている。
【００５１】
［実施例２］
一重カプセルと二重カプセルの環境ホルモン分解剤を用いて、環境ホルモン分解能力の比較テストを下記要領で実施した。
【００５２】
テストサンプルの準備：前記一重カプセルの固定化酵素９のサンプルＡと同一条件で作成したものをサンプルＳとした。
【００５３】
次に、ＨＢＴ１０．６ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ４０ｍｇ、２０ｍＭ硫酸マンガン（３．０２ｍｇ）溶液１ｍｌを５０ｍＭのマロン酸緩衝液１０ｍｌに溶解し、１．５ｗｔ％に相当するアルギン酸ナトリウムを加えて溶解した酵素賦活剤成分液１０を準備して、これに前記一重カプセルの固定化酵素９のサンプルＳの半数を浸漬してシーズ成分を付与し、しかる後に、０．１Ｍ塩化カルシウムを５０ｍＭのマロン酸緩衝液３０ｍｌに溶解した溶液１１に滴下して引き上げてアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜による外膜５を形成した二重カプセルの環境ホルモン分解剤１のサンプルＷを作成した。
【００５４】
一重カプセルの固定化酵素の水中ＤＤＴ分解テストの実施：２００ｍｌの三角フラスコにＨＢＴ１０．６ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ４０ｍｇ、２０ｍＭ硫酸マンガン３．０２ｍｇを含む５０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）４０ｍｌ加え、そこに前記で作成した一重カプセルの固定化酵素サンプルＳを添加した。その後２００μｌのＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦという）に溶かしたＤＤＴを０．０１ｍＭとなるように添加し、２５℃の暗所に１２０ｒｐｍの条件下１２、２４、４８時間処理を行って、その分解率を調べた。
【００５５】
二重カプセルの環境ホルモン分解剤の水中ＤＤＴ分解テストの実施：２００ｍｌの三角フラスコに５０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）４０ｍｌ加え、そこに前記で作成した二重カプセルの環境ホルモン分解剤（サンプルＷ）を添加した。その後２００μｌのＤＭＦに溶かしたＤＤＴを０．０１ｍＭとなるように添加し、２５℃の暗所に１２０ｒｐｍの条件下１２、２４、４８時間処理を行って、その分解率を調べた。
【００５６】
一重カプセルと二重カプセルの水中ＤＤＴ分解比較テスト結果：図５は一重カプセルと二重カプセルの環境ホルモン分解剤の水中でのＤＤＴ分解率を示す棒線グラフである。図中Ｓ−１，Ｓ−２，Ｓ−３は比較例の一重カプセルの固定化酵素９であり、Ｗ−１，Ｗ−２，Ｗ−３は本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤１である。この図から明らかなように、本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤１は、一重カプセルの固定化酵素９よりも環境ホルモンＤＤＴ分解率が２〜６％も高く、２４時間で３４％、４８時間で３８％分解することが分かった。
【００５７】
一重カプセルの環境ホルモン分解剤の土壌中ＤＤＴ分解テスト実施：２００ｇの土壌（乾燥重量換算）中に、ＨＢＴ１０．６ｍｇ、Ｔｗｅｅｎ８０  ４０ｍｇ、２０ｍＭ硫酸マンガン３．０２ｍｇを含む５０ｍＭマロン酸緩衝液（ｐＨ４．５）４０ｍｌ加え、更に、Ｔｗｅｅｎ８０を５０μｌ含む５ｍｌの水と０．２ｍｇのＤＤＴを溶かした２００μｌのＤＭＦを混合して添加した。これを軽く振り、玉ができたら潰した。撹拌後、前記で作成したサンプルＳを散布して撹拌した。その後、Ｔｗｅｅｎ８０を５０μｌ含む５ｍｌの水を土壌に散布して、軽く振り、玉を潰してから７日、１５日処理を行って、その分解率を調べた。
【００５８】
二重カプセルの環境ホルモン分解剤の土壌中ＤＤＴ分解テスト実施：２００ｇの土壌（乾燥重量換算）中に、Ｔｗｅｅｎ８０を５０μｌ含む５ｍｌの水と０．２ｍｇのＤＤＴを溶かした２００μｌのＤＭＦを混合して添加した。これを軽く振り、玉ができたら潰した。撹拌後、二重カプセルの環境ホルモン分解剤のサンプルＷを散布して撹拌した。その後、Ｔｗｅｅｎ８０を５０μｌ含む５ｍｌの水を土壌に散布して、軽く振り、玉を潰してから７日、１５日処理を行って、その分解率を調べた。
【００５９】
一重カプセルと二重カプセルの土壌中ＤＤＴ分解比較テスト結果：図６は、一重カプセルと二重カプセルの環境ホルモン分解剤の土壌中でのＤＤＴ分解率を示す棒線グラフである。図中Ｓ−１，Ｓ−２は比較例の一重カプセルの固定化酵素であり、Ｗ−１，Ｗ−２は本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤である。図６から明らかなように、本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤は一重カプセルの固定化酵素よりも土壌中での環境ホルモンＤＤＴ分解率が２％高く、７日間で２３％、１５日間で２５％分解率することが分かった。
【００６０】
［実施例３］
二重カプセルの環境ホルモン分解剤によるダイオキシン類3,3’,4,4’-テトラクロロビフェニール（以下ＴＣＢという）の水中分解テストを下記要領にて実施した。
【００６１】
テストサンプルの準備：前記サンプルＷの製造において、全て同一条件で作成した二重カプセルの環境ホルモン分解剤をサンプルＷ24とし、粗酵素の量を４８００Ｕにした以外は同一条件で作成した二重カプセルの環境ホルモン分解剤をサンプルＷ48として準備した。
【００６２】
二重カプセルの環境ホルモン分解剤の水中ＴＣＢ分解テスト実施：実施例１の水中ＤＤＴ分解テストにおいて、サンプルＳとサンプルＷの代わりにサンプルＷ24とサンプルＷ48を用い、ＤＤＴの代わりにＴＣＢを用いてその分解率を測定した以外は、全く同一条件で水中のＴＣＢ分解テストを行った。
【００６３】
二重カプセルの環境ホルモン分解剤の水中ＴＣＢ分解テスト結果：図７は、本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤１の水中でのＴＣＢ分解率を示す棒線グラフである。図７から明らかなように、本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤１は、水中でのダイオキシン類のＴＣＢ分解率においても、酵素量２４００Ｕの場合４８時間で２４％、７２時間で２５％、酵素量４８００Ｕの場合４８時間で３１％分解することが分かった。
【００６４】
以上の実施例の結果から、本発明の二重カプセルの環境ホルモン分解剤１は、一重カプセルの場合のようにＨＢＴ、Ｔｗｅｅｎ８０、硫酸マンガンを含むマロン酸緩衝液を汚染土壌中に加える必要がなく、また、汚染土壌中に直接投与しても酵素賦活剤は二重カプセル内にあって直接汚染土壌と接触しないので酵素賦活効果が持続し、更に、粗酵素と酵素賦活剤がイオン透過機能を有するアルギン酸カルシウムのゲル化半透膜を介して接触しているので、粗酵素に対して酵素賦活剤が有効に作用してダイオキシン類を始めとする環境ホルモンを効果的に分解除去することができることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
二重カプセル環境ホルモン分解剤１の例を例示したが、本発明は二重に限定されるものではなく、複数のコア成分による一重カプセルを一つのシーズ成分によるカプセルでまとめたり、二重カプセルの内又は外に、更に活性剤とか、分解剤とか、肥料等、他の成分を含めた多重カプセル構造とすることもできる。
【００６６】
二重、三重に構成された本発明の多重カプセル環境ホルモン分解剤は、その投与又は施工によって環境中のダイオキシン類を消滅させることができるので、汚染土壌、汚染水、その他汚染部位に適時、適切に適用できる。しかもカプセル構造であるので、容器に入れての販売が可能であり、従来の肥料と同様の感覚で散布施工可能であり、実用化できる。
【００６７】
本発明は、前記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で適宜設計的変更を行うことができ、各種態様で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の一実施形態に係わる二重カプセル環境ホルモン分解剤を示す断面図である。
【図２】本発明の二重カプセル環境ホルモン分解剤を実験室的に製造するフローを示す説明図である。
【図３】各カプセル基剤によるカプセル中の酵素ＭｎＰの活性率の経時変化を示す棒線グラフである。
【図４】各カプセル基剤によるカプセル中の酵素ＬｉＰの活性率の経時変化を示す棒線グラフである。
【図５】一重カプセルと二重カプセルの環境ホルモン分解剤の水中でのＤＤＴ分解率を示す棒線グラフである。
【図６】一重カプセルと二重カプセルの環境ホルモン分解剤の土壌中でのＤＤＴ分解率を示す棒線グラフである。
【図７】本発明の二重カプセル環境ホルモン分解剤の水中でのＴＣＢ分解率を示す棒線グラフである。
【符号の説明】
【００６９】
１  二重カプセル環境ホルモン分解剤
２  コア成分
３  シーズ成分
４  内幕
５  外膜
６  粗酵素原料液
７  ホールピペット
８，１１  塩化カルシウムを溶解したマロン酸緩衝液
９  一重カプセル固定化酵素
１０  酵素賦活剤溶液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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