(57)【要約】【課題】タンパク質のＮ末端をタンパク質合成時に修飾するためのtRNA及びタンパク質のＮ末端をタンパク質合成時に修飾する方法の提供。【解決手段】α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された開始tRNA、並びにα位に水酸基を有するαヒドロキシ酸であって少なくとも１つの標識物質で修飾されているαヒドロキシ酸が付加されたtRNA、及びこれらのtRNAを用いてＮ末端に前記カルボン酸又はαヒドロキシ酸が導入されたタンパク質を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された開始tRNA。
【請求項２】
α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された請求項１記載の開始tRNA。
【請求項３】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が少なくとも１つの標識物質で修飾されている、請求項１又は２に記載の開始tRNA。
【請求項４】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が少なくとも２つの標識物質で修飾されている、請求項３記載の開始tRNA。
【請求項５】
修飾が、蛍光物質、クエンチャー物質、クロスリンク物質、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、コレステロール、デスチオビオチン又はビオチンによる標識である請求項３又は４に記載の開始tRNA。
【請求項６】
カルボン酸として酢酸、ピログルタミン酸、パルミトイル酸又はミリストイル酸が付加された、請求項１に記載の開始tRNA。
【請求項７】
AUGを開始コドンとして認識する請求項１〜６のいずれか１項に記載の開始tRNA。
【請求項８】
UAG、UAA又はUGAを開始コドンとして認識する請求項１〜６のいずれか１項に記載の開始tRNA。
【請求項９】
AUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして認識する請求項１〜６のいずれか１項に記載の開始tRNA。
【請求項１０】
４塩基コドンを開始コドンとして認識する請求項１〜６のいずれか１項に記載の開始tRNA。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の開始tRNAを用いて、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入し、Ｎ末端にカルボン酸が導入されたタンパク質を作製する方法。
【請求項１２】
請求項３〜１０のいずれか１項に記載の標識物質で修飾されている開始tRNAを用いて、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸であって標識物質で標識されたカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入することにより、Ｎ末端が標識物質で修飾されたタンパク質を作製する方法。
【請求項１３】
タンパク質をコードするDNA又はmRNAであって、タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応するコドンとして４塩基コドン、AUG、UAG、UAA、UGA、又はAUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして含むDNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに請求項１〜１０のいずれか１項に記載の開始tRNAであってアンチコドン部位に前記DNA又はmRNAの開始コドンに対応する配列を有する開始tRNAを用いて、タンパク質生合成を行ない、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入し、Ｎ末端にカルボン酸が導入されたタンパク質を作製する方法。
【請求項１４】
タンパク質をコードするDNA又はmRNAであって、タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応するコドンとして４塩基コドン、AUG、UAG、UAA、UGA、又はAUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして含むDNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに請求項３〜１０のいずれか１項に記載の標識物質で修飾されている開始tRNAであってアンチコドン部位に前記DNA又はmRNAの開始コドンに対応する配列を有する開始tRNAを用いて、タンパク質生合成を行ない、標識物質で標識されたα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入することにより、Ｎ末端が標識物質で修飾されたタンパク質を作製する方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法で作製された、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をＮ末端に有するタンパク質であって、前記カルボン酸が標識物質で標識されているか又は標識されていないタンパク質。
【請求項１６】
α位に水酸基を有するαヒドロキシ酸であって少なくとも１つの標識物質で修飾されているαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
【請求項１７】
少なくとも２つの標識物質で修飾されている、請求項１６記載のtRNA。
【請求項１８】
修飾が、蛍光物質、クエンチャー物質、クロスリンク物質、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、コレステロール、デスチオビオチン、又はビオチンによる標識である請求項１６又は１７に記載のαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
【請求項１９】
４塩基コドン、終止コドン、人工コドン又は自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンを認識する請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
【請求項２０】
第１のタンパク質並びに第２のタンパク質又はペプチドをコードする融合DNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の標識物質で修飾されているαヒドロキシ酸が付加されたtRNAを用いて、第１のタンパク質のＮ末端と第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端が結合している融合タンパク質であって、第１のタンパク質のＮ末端部位であり第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端の隣に標識物質で修飾されているヒドロキシ酸を導入した融合タンパク質を作製し、第１のタンパク質のＮ末端のヒドロキシ酸と第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端のアミノ酸との間のエステル結合を加水分解し、Ｎ末端に標識物質で修飾されているヒドロキシ酸が導入された第１のタンパク質を単離することを含む、Ｎ末端が標識物質で標識されたタンパク質を製造する方法。
【請求項２１】
第２のタンパク質又はペプチドがタグペプチドである請求項２０記載のＮ末端が標識物質で標識されたタンパク質を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質のＮ末端を蛍光物質等の標識物質で修飾する方法に関し、詳細にはタンパク質のＮ末端を特定の修飾物質で修飾するためのtRNA及び該tRNAを用いてタンパク質のＮ末端を特定の修飾物質で修飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、化学修飾によってタンパク質のＮ末端のアミノ基を蛍光物質等の標識物質で標識することが行なわれている。しかしながら、化学修飾による方法においてはタンパク質中のリジン側鎖のアミノ基にも反応が起こるため、Ｎ末端特異的な修飾は困難であった。
【０００３】
タンパク質合成は、開始tRNAがリボソームに結合することによって始まり、開始tRNAに付加されていたα-アミノ酸又はアシル化α-アミノ酸がタンパク質のＮ末端アミノ酸になる。生体内のタンパク質合成において、Ｎ末端アミノ酸となるα-アミノ酸又はアシル化α-アミノ酸として、メチオニン若しくはバリン又はそれらのホルミル化されたものが利用される。
【０００４】
一方、天然の20種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸や、αアミノ基に蛍光標識分子を結合させたアシル化アミノ酸を人工的に導入できることが知られている。例えば、非天然アミノ酸をタンパク質へ導入する方法として、導入したい部位のコドンを４塩基コドンや終止コドンUAGに置換しておき、アンチコドンに前記４塩基コドンに対応する配列やCUAを持ち非天然アミノ酸でアミノアシル化されたtRNA存在下で翻訳する方法がある（非特許文献１から４を参照）。このような方法により、非天然型α-アミノ酸をタンパク質に導入することで、タンパク質の機能改変や構造機能解析が可能になる。
【０００５】
また、開始コドンに標識物質で標識したアミノ酸を割り当て、タンパク質のＮ末端に標識物質で標識したアミノ酸を導入する方法も報告されていた（非特許文献５を参照）。
【０００６】
しかし、従来の人工的にタンパク質のＮ末端に特定のアミノ酸を導入する方法において導入される分子は、α-アミノ酸、アシル化α-アミノ酸及びα-ヒドロキシ酸（非特許文献６を参照）に限られていた。これは、開始tRNAによって導入する分子としては、α位にアミノ基、アミド結合又はヒドロキシル基を持つカルボン酸のみが可能であったためである。このため、タンパク質Ｎ末端へ導入されるカルボン酸の分子構造には制限があった。また、人工的にタンパク質のＮ末端にアミノ酸を導入する場合、人工的に作製したアミノアシルtRNAを用いていたが、アミノアシルtRNAのα位のアミノ基の存在によりtRNA分子は不安定になってしまう。このため、tRNAが分解され、アミノ基に結合させた蛍光標識分子が脱離してしまう等の問題があった。
【０００７】
一方、生体内のタンパク質合成において、開始コドンはAUGまたはGUGであるが、これを終止コドンUAGに置換して、開始tRNAのアンチコドンを対応するCUAに置換することで、UAGを開始コドンとして、アミノ酸や標識アミノ酸を導入する方法が報告されている（非特許文献７及び８を参照）。
【０００８】
さらに、タンパク質合成の際に、終止コドンにヒドロキシ酸を割り当て、ヒドロキシ酸をアミノ酸の代わりにタンパク質に導入する方法についても報告があった（非特許文献９を参照）。しかしながら、標識物質で標識されたヒドロキシ酸を用いることにより標識ヒドロキシ酸を導入することについては、報告はなかった。
【０００９】
【非特許文献１】Science,244,p.182.1989
【非特許文献２】Nucleic Acids Res., 18, 83-88, 1989
【非特許文献３】Chem. Biol., 3, 1033-1038, 1996
【非特許文献４】J.Am.Chem.Soc.,111,p.8013,1989
【非特許文献５】Gite S. et al., Anal. Biochem. 2000, 279, 218-225
【非特許文献６】Goto Y. et al., Nucleic Acids Symposium Series, 2006, 50, 293-294
【非特許文献７】Mamaev S. et al, Anal. Biochem. 2004, 326, 25-32
【非特許文献８】Varshney U. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990, 87, 1586-1590
【非特許文献９】JA Ellman et al, Science, 1992, 255, 197-200
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、タンパク質のＮ末端をタンパク質合成時に修飾するためのtRNA及びタンパク質のＮ末端をタンパク質合成時に修飾する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は４塩基コドンによる非天然アミノ酸の導入について種々の検討を行なってきたが、大きな蛍光基を有する非天然アミノ酸はタンパク質内部へは極めて低効率でしか導入できないという知見を得ていた。一方、これらの非天然アミノ酸を開始tRNAに結合させて、開始コドンAUGによりタンパク質Ｎ末端への導入を試みたところ、タンパク質内部へはほとんど導入されなかった大きな非天然アミノ酸であっても、タンパク質Ｎ末端へは導入可能であることを見出した。この結果より、翻訳伸長過程に比べて翻訳開始過程では、多様な種類の非天然アミノ酸を導入できることが予測された。
【００１２】
そこで、本来はα位にアミノ基又はアミド結合を持つαアミノ酸（すなわち、メチオニン又はホルミルメチオニン）が翻訳開始時の基質となっているが、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸であっても、基質になるのではないかと考えた。これを実際に検証したところ、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸は、確かに翻訳開始時の基質になることを見出した。
【００１３】
本発明者等は、さらに上記のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を用いて、タンパク質を合成する際にタンパク質のＮ末端を修飾する方法について鋭意検討を行なった。本発明者等は、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をtRNAに付加させた。tRNAとして開始tRNAを用いた場合、AUG及びUAGを開始コドンとして用いて上記のカルボン酸をタンパク質合成過程でタンパク質Ｎ末端へ導入できることを新たに見出した。さらに、AUGの開始コドンの代わりに、４塩基コドンやその他ののコドンを開始コドンとして用いて、上記カルボン酸をＮ末端に導入されたタンパク質が得られることを見出した。
【００１４】
本発明者等は、様々な分子骨格を有するカルボン酸が導入可能であること、特にアミノカルボン酸をスペーサーとした蛍光標識分子が効率良くタンパク質のＮ末端へ導入されることを見出した。さらに、α-ヒドロキシ酸の側鎖に標識分子を結合させておき、タンパク質へ導入した後に、エステル結合を加水分解することで、Ｎ末端に特異的に標識化α-ヒドロキシ酸が導入されたタンパク質が得られることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された開始tRNA。
[２]  α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された[１]の開始tRNA。
[３]  α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が少なくとも１つの標識物質で修飾されている、[１]又は[２]の開始tRNA。
[４]  α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が少なくとも２つの標識物質で修飾されている、[３]の開始tRNA。
[５]  修飾が、蛍光物質、クエンチャー物質、クロスリンク物質、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、コレステロール、デスチオビオチン又はビオチンによる標識である[３]又は[４]の開始tRNA。
[６]  カルボン酸としてが酢酸、ピログルタミン酸、パルミトイル酸又はミリストイル酸が付加された、[１]の開始tRNA。
[７]  AUGを開始コドンとして認識する[１]〜[６]のいずれかの開始tRNA。
[８]  UAG、UAA又はUGAを開始コドンとして認識する[１]〜[６]のいずれかの開始tRNA。
[９]  AUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして認識する[１]〜[６]のいずれかの開始tRNA。
[１０]  ４塩基コドンを開始コドンとして認識する[１]〜[６]のいずれかの開始tRNA。
【００１６】
[１１]  [１]〜[１０]のいずれかの開始tRNAを用いて、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入し、Ｎ末端にカルボン酸が導入されたタンパク質を作製する方法。
[１２]  [３]〜[１０]のいずれかの標識物質で修飾されている開始tRNAを用いて、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸であって標識物質で標識されたカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入することにより、Ｎ末端が標識物質で修飾されたタンパク質を作製する方法。
[１３]  タンパク質をコードするDNA又はmRNAであって、タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応するコドンとして４塩基コドン、AUG、UAG、UAA、UGA、又はAUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして含むDNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに[１]〜[１０]のいずれかの開始tRNAであってアンチコドン部位に前記DNA又はmRNAの開始コドンに対応する配列を有する開始tRNAを用いて、タンパク質生合成を行ない、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入し、Ｎ末端にカルボン酸が導入されたタンパク質を作製する方法。
[１４]  タンパク質をコードするDNA又はmRNAであって、タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応するコドンとして４塩基コドン、AUG、UAG、UAA、UGA、又はAUG、UAG、UAA及びUGA以外の３塩基コドンを開始コドンとして含むDNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに[３]〜[１０]のいずれかの標識物質で修飾されている開始tRNAであってアンチコドン部位に前記DNA又はmRNAの開始コドンに対応する配列を有する開始tRNAを用いて、タンパク質生合成を行ない、標識物質で標識されたα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をタンパク質Ｎ末端へ特異的に導入することにより、Ｎ末端が標識物質で修飾されたタンパク質を作製する方法。
[１５]  [１１]〜[１４]のいずれかの方法で作製された、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸をＮ末端に有するタンパク質であって、前記カルボン酸が標識物質で標識されているか又は標識されていないタンパク質。
【００１７】
[１６]  α位に水酸基を有するαヒドロキシ酸であって少なくとも１つの標識物質で修飾されているαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
[１７]  少なくとも２つの標識物質で修飾されている、[１６]のαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
[１８]  修飾が、蛍光物質、クエンチャー物質、クロスリンク物質、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、コレステロール、デスチオビオチン、又はビオチンによる標識である[１６]又は[１７]のαヒドロキシ酸が付加されたtRNA。
[１９]  ４塩基コドン、終止コドン、人工コドン又は自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンを認識する[１６]〜[１８]のいずれかのtRNA。
[２０]  第１のタンパク質並びに第２のタンパク質又はペプチドをコードする融合DNA又はmRNAを鋳型として用い、さらに[１６]〜[１９]のいずれかの標識物質で修飾されているαヒドロキシ酸が付加されたtRNAを用いて、第１のタンパク質のＮ末端と第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端が結合している融合タンパク質であって、第１のタンパク質のＮ末端部位であり第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端の隣に標識物質で修飾されているヒドロキシ酸を導入した融合タンパク質を作製し、第１のタンパク質のＮ末端のヒドロキシ酸と第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端のアミノ酸との間のエステル結合を加水分解し、Ｎ末端に標識物質で修飾されているヒドロキシ酸が導入された第１のタンパク質を単離することを含む、Ｎ末端が標識物質で標識されたタンパク質を製造する方法。
[２１]  第２のタンパク質又はペプチドがタグペプチドである[２０]のＮ末端が標識物質で標識されたタンパク質を製造する方法。
【発明の効果】
【００１８】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加された開始tRNAを用いることで、蛍光標識カルボン酸やビオチン標識カルボン酸をタンパク質Ｎ末端特異的に導入することができる。タンパク質のＮ末端は活性に関わらない場合が多いため、これによりタンパク質の活性を保持したまま蛍光標識やビオチン標識が可能である。通常の化学修飾による標識方法ではＮ末端特異的に標識することは困難であるため、本発明によりタンパク質のＮ末端特異的標識を効果的に行なうことができる。また、翻訳後修飾によってタンパク質のＮ末端に付加されるカルボン酸である、酢酸やピログルタミン酸やミリストイル酸などを導入した修飾タンパク質を翻訳後修飾によらず合成することも可能になる。これにより、Ｎ末端修飾タンパク質の構造機能解析を容易に行なうことができる。
【００１９】
例えば、開始コドンとしてAUGを認識するtRNAにTAMRA-アミノプロピオン酸（TAMRA-AC3）を結合させたものを、ストレプトアビジン遺伝子DNAとともに大腸菌無細胞翻訳系に加えることにより、TAMRA-AC3をＮ末端に導入したストレプトアビジンを合成することができる。
【００２０】
別の効果として、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を開始tRNAに結合させることで、カルボン酸とtRNAの間のエステル結合が分解されにくくなり、長時間のタンパク質合成が可能になる。これは、α位にアミノ基又はアミド結合を持つ場合は、そのアミノ基又はアミド結合の影響を受けてエステル結合が分解されやすい状態にあるが、α位にアミノ基及びアミド結合を持たないカルボン酸ではその影響を受けないために、エステル結合が安定なためである。
【００２１】
一方、αヒドロキシ酸は翻訳系においてαアミノ酸と同様にタンパク質に導入されることが知られている。しかしその結果生じるエステル結合は、アミド結合（ペプチド結合）に比べて加水分解を受けやすいため、αヒドロキシ酸の直前で切断されたタンパク質が生成する。これにより、αヒドロキシ酸をタンパク質のＮ末端に持つタンパク質が得られることになる。そこで、αヒドロキシ酸の側鎖に蛍光標識やビオチンなどの標識分子を結合させておくことで、それをＮ末端に持つタンパク質を合成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸は、例えば一般式（I)
COOH-Ｘ-Ｙ-R1              （I)
で表わされる。
【００２３】
一般式（I)中、Ｘは二価基であり、好ましくは-CH2-である。Ｘに含まれるＣがα炭素である。α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸とはα炭素にアミノ基及びヒドロキシル基が結合しておらず、α炭素がアミド結合により他の基と結合していないカルボン酸をいう。Ｘが、-C(NH2)-又は-C-NH-又は-C(OH)-であることはない。
【００２４】
本発明は、さらにα位のみでなくα位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を包含する。α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を、上記一般式（I)をCOOH−Ｘ-Ｘ’-Ｙ’で表わした場合（Ｘは１個の炭素を含む二価基であり、好ましくは-CH2-である）、Ｘ’に含まれるＣがβ炭素である。α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸とはα炭素及びβ炭素にアミノ基及びヒドロキシル基が結合しておらず、α炭素及びβ炭素がアミド結合により他の基と結合していないカルボン酸をいう。Ｘ’は、-C(NH2)-又は-C-NH-又は-C(OH)-であることはなく、Ｘ’は好ましくは-CH2-である。本発明において、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸という場合、α位及びβ位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を含む場合がある。
【００２５】
上記一般式（I)のＹは、カルボン酸を標識物質で修飾する場合に、カルボン酸と標識物質の間のスペーサーとして機能する。「スペーサー」という用語は、標識物質を結合させた標識化カルボン酸分子におけるカルボン酸部と標識物質とを連結している部分を指す。即ち、標識化カルボン酸分子内の側鎖と標識物質が直接結合しているのではなく、側鎖と標識物質との間に１つ以上の原子が存在する場合、該標識化カルボン酸のカルボン酸部と標識物質はスペーサーを介して連結しているという。上記一般式（I)中のＹで表わされるスペーサーは、その主鎖部分にC、O、N及びSのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいればよい。ただしＸに隣接する原子はN及びO以外のものである（N又はOが隣接している場合、これらはα-アミノ酸およびα-ヒドロキシ酸の誘導体にそれぞれ相当する）。またスペーサーの主鎖構造は、上記原子が２〜30個、好ましくは２〜20個、さらに好ましくは２〜10個、さらに好ましくは３〜８個が直鎖状に結合したものが好ましく、直鎖構造内には、二重結合が1つ以上含まれていてもよい。さらに、スペーサーは、ベンゼン環及び/又はシクロヘキシル環などの環状構造を１〜数個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個、有していてもよい。また、ベンゼン環やシクロヘキシル環などの環状構造、若しくは環状構造と上記直鎖構造とが組み合わされた構造のものでもよい。例えば、Ｙは、芳香族炭化水素環（アリール）、アルカン、アルケン又はアルキン由来の二価基である。
【００２６】
さらに、スペーサー部が側鎖を有しており、該側鎖に他の標識物質が結合していてもよい。
【００２７】
標識物質の種類によっては、導入されたタンパク質内においてその機能をより効果的に発揮するために、スペーサーを介してカルボン酸と結合することが有利なものもある。例えば、標識物質の種類によっては、スペーサーを介して結合している方が、導入されたタンパク質内での該標識化合物への立体障害が軽減されるということが考えられる。
【００２８】
Ｙの具体例として、例えば、-CH2-、-（CH2）m-(mは、１〜７）、-（CH2)o-NH-CO-(CH2)p-（oは、１〜７、pは１〜５）、-O-(CH2)2-O-（CH2)2-、-（CH2)q-C6H4-(qは、１〜３）等が挙げられるが、これらには限定されない。
【００２９】
なお、一般式(I)をCOOH−Ｘ-Ｘ’-Ｙ’で表わした場合、Ｙ’はＹからＸ’で表わされる二価基を除いた化学式で表わされる。
【００３０】
R1は、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基などの官能基であり、好ましくはアミノ基である。
【００３１】
R1がアミノ基の場合、アミノカルボン酸と呼ぶことがある。また、ＹがCH2であり、R1がアミノ基の場合、アミノプロピオン酸と呼ぶことがある。
【００３２】
２つの標識物質で修飾されたαアミノ酸は、例えば一般式（II)、
COOH-CH(N-R2)-Ｙ-R1              （II)
で表わされる。
【００３３】
一般式（II)において、N-R2は標識されたアミノ基を示す。例えば、N-R2はアミノ基にスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、NBD-ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物を利用して標識物質を結合させた構造を有する。結合させる標識物質は限定されないが、例えばビオチンが挙げられる。ビオチンとカルボン酸の間にC、O、N及びSのうちの少なくとも１種を少なくとも１つ以上含んでいる主鎖構造からなるスペーサーを含んでいてもよい。例えば、リジンの構造に相当する基を含んでいてもよい。
一般式（II)におけるＹ及びR1は、それぞれ上記一般式（I)のＹ及びR1と同じである。
【００３４】
また、α位に水酸基を有するαヒドロキシ酸は、例えば一般式（III)、
COOH-CH(OH)-Ｚ-R1              （III)
で表わされる。
【００３５】
一般式（III)中、Ｚはαアミノ酸での側鎖に相当する部分である。リボソームに取り込まれやすいという点において、好ましくは-CH2-C6H4-である。
一般式（III)におけるR1は、上記一般式（I)のR1と同じである。
【００３６】
本発明において、上記一般式（III)で表わされるα位に水酸基を有するαヒドロキシ酸は、少なくとも１つの標識物質で標識されており、標識物質は例えばR1を介して結合している。本発明のα位に水酸基を有するαヒドロキシ酸は、α位にアミノ基及びアミド結合を有することはない。
【００３７】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するヒドロキシ酸をtRNAに付加するには、カルボン酸又はヒドロキシ酸のカルボキシル基にジヌクレオチド（pdCpA）を結合させ、3’末端のCAジヌクレオチドを欠落させたtRNA（ｔRNA(-CA)）とT4リガーゼ等のリガーゼを用いて結合させることにより作製することができる。人工tRNAの作製は、国際公開第WO2004/009709号パンフレット等に記載されている人工アミノ酸を含むtRNAの作成方法の記載に従って行うことができる。
【００３８】
用いるtRNAは限定されず、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を導入するための開始tRNAとしては大腸菌、酵母、マイコプラズマ・カプリコラム(Mycoplasma capricolum)、バシルス・ハロドランス（Bacillus halodouranns）及びマイコプラズマ・プネウモニア(Mycoplasma pneumoniae)等の開始tRNAを用いることができる。また、αヒドロキシ酸を導入するためのtRNAとしては、酵母フェニルアラニン用tRNA（Science,244,p.182.1989；Nucleic Acids Res., 18, 83-88, 1989）、大腸菌アスパラギン用tRNA、デトラヒメナグルタミン用tRNA（Chem. Biol., 3, 1033-1038, 1996）及び大腸菌グリシン用tRNA（J.Am.Chem.Soc.,111,p.8013,1989）等を用いることができる。また、大腸菌、マイコプラズマ・カプリコラム(Mycoplasma capricolum)、バシルス・ハロドランス（Bacillus halodouranns）、バシルス・サブチリス(Bacillus subtillis)、ボレイア・バーグドルフェリ(Borreiia burgdorferi)、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマ・プネウモニア(Mycoplasma pneumoniae)及びスタフィロコッカス・アウレウスN315(Staphylococcus aureus N315)等の微生物由来のトリプトファンに対応したtRNAも用いることもできる。
【００３９】
これらのtRNAのアンチコドンを、利用するコドンに対応したものに改変して用いればよい。
【００４０】
本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加されたtRNA及びα位に水酸基を有するαヒドロキシ酸が付加されたtRNAは、好ましくは少なくとも１つ又は２つの標識物質で修飾されている。
【００４１】
標識物質は、当業者には公知の色素化合物、蛍光物質、化学/生物発光物質、酵素基質、補酵素、抗原性物質及びタンパク質結合性物質である。さらに、クエンチャー物質、クロスリンク物質、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール、コレステロール、デスチオビオチン、ビオチン等が挙げられる。ここで、クエンチャー物質（消光物質）とは、蛍光物質に近接した位置に存在するときに蛍光物質が蛍光を発するのを抑制する物質をいい、具体例としてはジニトロベンゼン、ジメチルアミノアゾベンゼン、Cy5Q、Cy7Q、が挙げられる。また、クロスリンク物質とは、光照射などによって近接した物質と共有結合を形成することのできる物質をいい、具体例としてはベンゾフェノン、ソラレン、トリフルオロメチルフェニルジアジリンが挙げられる。
【００４２】
また、通常、翻訳後修飾によって、酢酸、ピログルタミン酸、パルミトイル酸、ミリストイル酸等のカルボン酸がタンパク質のＮ末端に付加され、タンパク質がその正常な機能を発揮するようになる。本発明のカルボン酸を付加した開始tRNAは、酢酸、ピログルタミン酸、パルミトイル酸、ミリストイル酸等のカルボン酸を付加した開始tRNAをも包含する。これらの開始tRNAを用いることにより、タンパク質の翻訳合成時にＮ末端に酢酸、ピログルタミン酸、パルミトイル酸、ミリストイル酸等のカルボン酸を導入することができる。
【００４３】
本発明に利用可能な蛍光物質としては、基本骨格としてRhodamine、Cy、Coumarine、EvoBlueを有する蛍光物質が挙げられる。具体的に本発明のカルボン酸に結合させる蛍光物質として適したものとして、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、EVOblue10、EVOblue30、SFX、RhoX、TexX、TAMX、５TAM、FAM等が挙げられる。さらに、これらの蛍光物質の誘導体も含まれる。また、naphthalene、biphenyl、anthracene、phenenthrene、pyrene、carbazoleを有する蛍光物質又はその誘導体も含まれる。
【００４４】
また、これ以外の蛍光物質、具体的には、BFL、BFLC5、B493、BR6G、B558、B564、B576、B581、BFL（以下に、商標名及び／又は一般名を記す）も用いることができる。
BFL  :  BODIPY FL(商標名),
4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
BFLC5  :  BODIPY FL C5(商標名),
4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-  indancene-3-pentanoic acid
B493  :  BODIPY 493/503(商標名),
4,4-difluoro-1,3,5,7-tetramethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-8-propionic acid
BR6G  :  BODIPY R6G(商標名),
4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
B558  :  BODIPY 558/568(商標名),
4,4-difluoro-5-(2-thienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
B564  :  BODIPY 564/570(商標名),
4,4-difluoro-5-styryl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
B576  :  BODIPY 576/589(商標名),
4,4-difluoro-5-(2-pyrrolyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
B581  :  BODIPY 581/591(商標名),
4,4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-3a,4a-diaza-s-indancene-3-propionic acid
Cy3(商標名)、Cy3B(商標名)、Cy3.5(商標名)、Cy5(商標名)、Cy5.5(商標名)、Cy5Q(商標名)、Cy7Q(商標名)、EvoBlue10(商標名)、EvoBlue30(商標名)
SFX  :  SFX(商標名)はスクシイミドエステルの結合しているときの商標名であり、FAM-Xがエステルなしの商標名である。
RhoX  :  Rhodamine Red-X(商標名)
TexX  :  Texas Red-X(商標名)
TAMX  :  5(6)-TAMRA-X(商標名)
5TAM  ：  ５ TAMRA(商標名)
【００４５】
標識物質として用いる蛍光物質としては、可視光域内（400〜700nm付近）に励起波長を有し、さらに可視光域内に発光波長を有するものが好ましく、水溶液中での発光強度が強いものが特に好ましい。
【００４６】
ルシフェリン、ルミジェン等の化学若しくは生物発光物質又はその誘導体も標識物質として本発明に用いることができる。
【００４７】
さらに、補酵素類、抗原性を有する物質及び特定のタンパク質に結合することが判っている物質などの中から、対象とするタンパク質に付与したい機能に応じて適宜選んで、それを標識物質として本発明に用いることができる。例えば、特定の酵素に対する基質（例えば、アルカリホスファターゼ又はβガラクトシダーゼに対する基質等）を導入すれば、その酵素による呈色反応を利用して検出することができる。また、抗原性を有する物質、特定のタンパク質に結合することが判っている物質で標識されたタンパク質は、抗体又は結合するタンパク質を用いた間接的検出法に用いることができ、さらに、精製が簡便であるという利点を有している。例えば、本発明の方法を用いてビオチンでＮ末端を修飾した機能性タンパク質は、ビオチンを介してアビジン又はストレプトアビジンと結合するという機能を有しており、この機能を利用すれば、本発明の方法により、あるいは化学的に蛍光物質等で標識したアビジン又はストレプトアビジンとの結合を利用して特定の物質の検出系を確立することが可能である。この他、種々の色素、並びに、さまざまな生化学的、化学的又は免疫化学的な検出方法で検出可能な物質を標識物質に用い得ることが、当業者には理解できる。
【００４８】
カルボン酸又はヒドロキシ酸と標識物質との結合は、本発明のカルボン酸又はヒドロキシ酸に結合させた上記一般式（I)のR1部分の官能基と標識物質の官能基の結合を利用すればよい。すなわち、一般式（I)で表わされるカルボン酸又は一般式（III)で表わされるヒドロキシ酸に結合させた上記スペーサーのR1部分として、タンパク質合成の際にペプチド伸長反応に関与しない、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アリル基、ハロゲン化アルキル基などの官能基を導入しておき、該官能基にスペーサーを介して標識物質を結合させることができる。R1部分がアミノ基の場合、アミノ基標識用プローブとしてスクシンイミドエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、NBD-ハライド、ジクロロトリアジンなどの化合物が、R1部分がチオール基の場合、チオール基標識用プローブとしてアルキルハライド、マレイミド、アジリジンなどの化合物が、R1部分がカルボキシル基の場合、カルボキシル基標識用プローブとしてジアゾメタン化合物、脂肪族臭化物、カルボジイミドなどが利用できる。例えば、標識物質にスペーサーを介してスクシンイミドエステルを導入し、カルボン酸に結合させたスペーサー中の芳香環にアミノ基を導入しアミド結合により両者を結合させることができる。官能基同士を結合させる方法は、例えば、「新生化学実験講座１  タンパク質VI  構造機能相関」の記載等を参照すればよい。
【００４９】
α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するヒドロキシ酸が付加されたtRNAであって、さらに標識物質で修飾されているtRNAを作製する場合、あらかじめカルボン酸又はヒドロキシ酸を標識物質で修飾した後に、pdCpAを結合させてtRNAに付加してもよいし、カルボン酸又はヒドロキシ酸をtRNA又はpdCpAに付加した後にカルボン酸又はヒドロキシ酸部を標識物質で標識してもよい。
【００５０】
本発明において、COOH-(CH2)n-1-NH-F（Fは標識物質、nは自然数）で表わされる化合物をF-ACnと、COOH-(CH2)n-1-NH-CO-(CH2)5-NH-F（F及びｎは上記と同様）で表わされる化合物をF-X-ACnと呼ぶ場合がある。また、COOH-(CH2)n-1-B-NH-F（Bは芳香環、F及びｎは上記と同様）で表わされる化合物をF-ABCnと、COOH-CH2-O-(CH2)2-O-(CH2)2-NH-F（Fは上記と同様）で表わされる化合物をF-TEGと呼ぶことがある。さらに、α位に水酸基を有するCOOH-CH(OH)-CH2-C6H4-NH-F(Fは上記と同様）をF-AFLと呼ぶことがある。また、COOH-CH(OH)-CH2-C6H4-NH-CO-(CH2)5-NH-F（Fは上記と同様）をF-X-AFLと呼ぶことがある。
【００５１】
図１A〜図１Dに標識物質としてTAMRAを結合した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を示す。図１E及びFは、比較対象となるα位にアミノ基を持つもの（図１E)及びアミド結合を持つもの（図１F）である。
【００５２】
図２A〜図２Eに標識物質としてBODIPY FLを結合した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を示す。図２F及びGは、比較対象となるα位にアミノ基（図２F)を持つもの及びアミド結合を持つもの（図２G）である。
【００５３】
図３A〜図３Eに標識物質として種々の蛍光物質（BODIPY FL、FAM、TAMRA、Cy3及びCy5）を結合した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を示す。
【００５４】
図４AにTAMRA及びビオチンの２つの標識物質で標識されたαアミノ酸を示す。図４Bはα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸であって、TAMRA及びビオチンの２つの物質で標識されたカルボン酸を示す。
【００５５】
図５B及び図５Dにα位に標識物質としてBODIPY FL又はTAMRAを結合した、ヒドロキシ酸を示す。図５A及びCは比較対象となるα位にアミノ基を有するαアミノ酸である。
【００５６】
例えば、図１A〜図１Eで表わされる構造を有する化合物において、COOH-CH2-Ｙ-NH-CO-Ｆ（Ｙは上記一般式（I)で表わされる化合物におけるＹと同じであり、Fは標識物質である）で表わされる部分から標識物質を脱離させたものが一般式（I)のR1がNH2であるCOOH-CH2-Ｙ-NH2で表わされるα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸に相当する。
【００５７】
図６にpdCpAを結合させたカルボン酸の構造の一例(BODIPY FL-ABC3-pdCpA)を示す。
本発明のカルボン酸のタンパク質のＮ末端への導入は、開始コドンに本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸を割り当てることにより行なうことができる。すなわち、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加されたtRNAのアンチコドンを開始コドンに対応させればよい。開始コドンとは、mRNAがタンパク質に翻訳されるとき、タンパク質合成の開始点となるコドンをいう。一般にはAUGが開始コドンになるが、本発明においては、AUGに限定されず、目的のタンパク質を合成するために用いるmRNAに４塩基コドン、終止コドン、人工コドンその他の３塩基コドンの任意のコドンを開始コドンとして利用することができる。この場合、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加されたtRNAのアンチコドン部を、開始コドンとして用いるコドンに対して相補的な配列にすることにより、前記tRNAが任意のコドンを開始コドンとして認識する。開始コドンを認識し、タンパク質の合成過程において、最初に働くtRNAを開始tRNAという。例えば、mRNA中のタンパク質をコードする領域の5'末端の任意のコドンが開始コドンとなり得る。開始コドンを本発明のカルボン酸に割り当てた場合、合成されるタンパク質のＮ末端に、本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が導入される。この際、標識物質で修飾されたカルボン酸を用いることによりタンパク質のＮ末端が該標識物質で修飾される。
【００５８】
上記のように、通常はアミノ酸が割り当てられていないコドン、具体的には４塩基コドン、終止コドン、人工コドンにカルボン酸を割り当てコドンを拡張することができる。４塩基コドンは、Hohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 118, 9778-9779, 1996及びHohsaka T., et al., J. Am. Chem. Soc., 121, 34-40, 1999の記載を参考にして用いることができる。また、終止コドンは、Science,244,p.182.1989及びJ.Am.Chem.Soc., 111,p.8013,1989、人工塩基コドンは、Hirao, I., et al., Nature Biotech., 20, 177-182, 2002の記載を参考にして用いることができる。
【００５９】
４塩基コドンを用いる場合、４塩基コドンを構成する塩基は限定されないが、４塩基コドンとして例えば、CGGG、CTCT(CUCU)、CTCA(CUCA)、CCCT(CCCU)、CGGT(CGGU)、AGGT(AGGU)及びGGGT(GGGU)が好適に用いられる。終止コドンとしては、UAA、UAG、UGAが挙げられる。
【００６０】
４塩基コドン法を利用する場合、Ｎ末端を修飾しようとする目的のタンパク質をコードするDNA又はmRNAの5'末端のコドン部位に４塩基コドンを組み込む。また、本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が付加されたtRNAのアンチコドン部位を対応する４塩基に置換しておく。これらを用いてタンパク質合成を行うと、４塩基コドンに置換した部分ではリボソームの中で４塩基のコドン・アンチコドンペアが形成され、tRNAに結合させたα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸がＮ末端に存在するタンパク質の合成が開始される。一方、その他の部分は通常通り３塩基ずつ翻訳されるので、最終的に得られるタンパク質には４塩基コドンで指定したＮ末端部分にのみカルボン酸が導入されていることになる。なお、４塩基コドン法においては、４つの連続した塩基からなるコドンだけではなく、５以上の連続した塩基からなるコドンも用いることができる。例えば、５、６又は７つの連続した塩基からなるコドンが挙げられる。５以上の連続した塩基からなるコドンを用いる場合、tRNAのアンチコドン部位を対応する５以上の塩基に置換すればよい。本発明において、４塩基コドンという場合、４つの連続した塩基からなるコドンを５以上の連続した塩基からなるコドンに変更したものも含む。
【００６１】
また、自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンを用いることもできる。この場合、タンパク質の導入において、カルボン酸と天然のアミノ酸が競合し、Ｎ末端にカルボン酸が導入されたタンパク質の生成効率は低くなる可能性がある。この際、自然界での使用頻度が低いレアコドンにカルボン酸を割り当てれば、生成効率を上げることができる可能性がある。レアコドンは、利用する翻訳系により異なり、例えば大腸菌の翻訳系を用いる場合、大腸菌におけるレアコドンを用いればよい。大腸菌のレアコドンとして、AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA、CGG等が挙げられる。
【００６２】
４塩基コドン法、終止コドン法、人工コドン法のいずれかの方法を用いる場合、又は自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンを用いる場合、これらのコドンを合成しようとするタンパク質をコードするDNA又はmRNAの5'末端に組み込めばよい。
【００６３】
同様に、本発明のα-ヒドロキシ酸が付加されたtRNAを用いる場合、合成しようとするタンパク質をコードするDNA又はmRNAの5'末端側に他のタンパク質又はペプチドをコードするDNA又はmRNAを融合させ、合成しようとするタンパク質をコードするDNA又はmRNAの5'末端側に開始コドン以外の伸長用コドンである４塩基コドン、終止コドン、人工コドン又は自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンを組み込めばよい。ここで、合成しようとする目的のタンパク質を第１のタンパク質と呼び、他のタンパク質又はペプチドを第２のタンパク質と呼ぶ。この場合、タンパク質合成が進行すると最初に第２のタンパク質が翻訳され、翻訳が終了した後に、上記の４塩基コドン、終止コドン、人工コドン又は自然界でアミノ酸が割り当てられているコドンに対応した本発明のα-ヒドロキシ酸が付加されたtRNAがコドン部分に結合する。すると、第２のタンパク質のＣ末端のアミノ酸のカルボキシル基とαヒドロキシ酸の水酸基がエステル化反応により結合するので、第１のタンパク質と第２のタンパク質の融合タンパク質が生成する。該融合タンパク質において、ヒドロキシ酸は第１のタンパク質のＮ末端であって、第２のタンパク質のＣ末端の隣に導入される。この場合、該融合タンパク質を加水分解処理することにより、第２のタンパク質又はペプチドのＣ末端のアミノ酸とヒドロキシ酸との間のエステル結合が切断され、Ｎ末端にヒドロキシル酸が導入された第１のタンパク質、すなわちＮ末端が標識物質で標識された第１のタンパク質を得ることができる。加水分解処理は、酸又は塩基を触媒として加水分解反応を行なわせればよい。第２のタンパク質の種類によっては、自動的に加水分解が進み遊離の目的のタンパク質であるＮ末端が修飾された第１のタンパク質を得ることができる。本発明において、「加水分解する」とは人為的に加水分解処理を行なう場合も、自動的に加水分解が起こる場合も含む。ここで、第２のタンパク質である他のタンパク質又はペプチドは限定されないが、アミノ酸の数の小さいものでよく、例えば、一般にタグペプチドとして用いられているペプチドを用いることができる。タグペプチドとして、２〜12個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジンタグ、T7タグ、RGSHis3タグ、VSV-Gタグ、Aviタグ（ビオチン受容ペプチドからなるタグ）、Glu-Glu(E.E.）タグ、FLAGタグ、HAタグ等が例示できる。また、タンパク質としてはグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST)、マルトース結合タンパク質（MBP）等が例示できる。
【００６４】
なお、第１のタンパクをコードするDNA又はmRNAの5'末端側に本発明のヒドロキシ酸に割り当てられた４塩基コドンを連結して用いる場合、４塩基コドンの下流に目的のタンパク質である第２のタンパク質を連結する際に、４塩基コドンの上流に＋１フレームでストップコドンに対応する配列を含ませ、４塩基コドンの下流に＋２フレームでストップコドンに対応する配列を含ませてもよい。また、４塩基コドンの上流＋１フレームのストップコドンに対応する配列と４塩基コドンの間、及び下流＋２フレームのストップコドンに対応する配列と４塩基コドンの間に２＋３×Ａ個の塩基が挿入されていてもよい。このような塩基を挿入することにより、タンパク質の翻訳過程においてフレームシフトが生じたときにタンパク質の翻訳が停止するので、不要なタンパク質の合成を避けることができる。ストップコドンはTAA若しくはUAA、TAG若しくはUAG、又はTGA若しくはUGAの３塩基で表される。上記の「２＋３×Ａ」において、Ａは０又は正の整数であり、Ａの数に上限はなく、最終的にタンパク質合成が停止すればよい。ただし、フレームシフトが生じたタンパク質の合成を早く停止させる観点から、あまり大きくないほうがよい。好ましくはＡは10、９、８、７、６、５、４、３又は２以下、あるいは１又は０である。
【００６５】
本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するヒドロキシ酸のタンパク質のＮ末端への導入法においては、生細胞を用いた合成系及び無細胞タンパク質合成系を利用することができるが、無細胞タンパク質合成系を利用することが好ましい。
【００６６】
生細胞によるタンパク質合成系によりα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するヒドロキシ酸をＮ末端に導入したタンパク質を得るには、tRNA及びmRNAを細胞内へマイクロインジェクションにより注入する方法（Science, 268, p.439, 1995）を利用して生細胞に本発明のタンパク質を発現させることができる。
【００６７】
無細胞翻訳系による合成は、発現させようとする遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入することなく、in vitroで必要な試薬と混合し遺伝子を発現させることにより行うことができる(Spirin, A.S. et al, (1988)“A continuous cell-free translation system capable of production polypeptides in high yield” Science 242, 1162； Kim, D.M., et al., (1996)“A highly efficient cell-free protein synthesis system from E.coli” Eur.J.Biochem. 239, 881-886)。無細胞タンパク質合成系は、mRNAの有する遺伝情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系のみをさす場合もあるし、DNAをテンプレートとしてRNAを合成する無細胞転写系と前記無細胞翻訳系の両方を包含するものをさす場合もある。無細胞翻訳系においては、生物抽出液が用いられる。生物抽出液とは、リボソーム、20種類のアミノアシルtRNA合成酵素、メチオニル-tRNAトランスフォルミラーゼ、３種類の翻訳開始因子（translation initiation factor；IF1、IF2、IF3）、３種類の翻訳伸長因子（translation elongation factor；EF-G、EF-Tu、EF-Ts）、３種類の翻訳終結因子（translation termination factor；RF1、RF2、RF3）、リボソームリサイクリング因子（RRF）、RNAポリメラーゼ等のタンパク質合成に必要な成分を含む生物の抽出液をいう。ここに挙げた以外のタンパク質を効率的な翻訳のために添加してもよく、当業者ならばより効率的な添加のために如何なるタンパク質を添加すればよいか決定できる。生物抽出液は、大腸菌由来のもの、コムギ胚芽由来のもの、ウサギ網状赤血球由来のもの、動物細胞や昆虫細胞由来のものいずれを用いてもよい。生物抽出液はフレンチプレスによる破砕又はグラスビーズを用いた破砕等によって得ることができる。大腸菌由来微生物抽出液としてはS30エクストラクトがあり、例えばPrattらの方法により得ることができる（Pratt, Transcription and Translation - a practical approach, Henes, B. D. and Higgins, S. J. ed., IRL Press, Oxford., 179-209 [1984]）。S30エクストラクトは、リボソーム、20種類のアミノアシルtRNA合成酵素、メチオニル-tRNAトランスフォルミラーゼ、３種類の翻訳開始因子（translation initiation factor；IF1、IF2、IF3）、３種類の翻訳伸長因子（translation elongation factor；EF-G、EF-Tu、EF-Ts）、３種類の翻訳終結因子（translation termination factor；RF1、RF2、RF3）、リボソームリサイクリング因子（RRF）等を含む。無細胞タンパク質合成系は、上記生物抽出液の他、ATP再生系、プロモーター及び発現させようとするタンパク質をコードする核酸を含むプラスミド又は発現させようとするタンパク質をコードするmRNA、tRNA、RNAポリメラーゼ、RNAアーゼ阻害剤、ATP、GTP、CTP、UTP等のエネルギー源、緩衝剤、アミノ酸、塩類、抗菌剤等を含んでいてもよく、それぞれの濃度は適宜決定すればよい。
【００６８】
ATP再生系は限定されず、公知のリン酸ドナー及びキナーゼの組合せを用いることができる。この組合せとして例えば、ホスホエノールピルビン酸（PEP）-ピルビン酸キナーゼ（PK）の組合せ、クレアチンリン酸（CP）-クレアチンキナーゼ（CK）の組合せ、アセチルリン酸（AP）-アセテートキナーゼ（AK）の組合せ等が挙げられ、これらの組合せでATP再生系を無細胞タンパク質合成系に加えればよい。
【００６９】
無細胞タンパク質合成系には製造しようとするタンパク質をコードするmRNAも必要である。該mRNAは無細胞タンパク質合成系に核酸を転写する系、すなわち該タンパク質をコードするmRNAを産生する系を包含させてもよい。この場合は、DNAを添加する。また、別途mRNAを転写等により合成し、得られたmRNAを本発明の無細胞タンパク質合成系に含ませてもよい。mRNAの産生は、適当なプロモーター及び該プロモーターの下流に位置する製造しようとするタンパク質をコードするDNAを含むプラスミド並びに該プロモーターに作用するRNAポリメラーゼにより達成できる。ここで、用いるプラスミドは限定されず、公知のものが用いられ、公知の遺伝子工学的手法により、適当なプロモーターやリボソーム結合部位等を導入して用いることができる。当業者ならば、本発明で用いるプラスミドを適宜選択し、また自ら設計して構築することができる。プロモーターは無細胞タンパク質合成系で用いる微生物が有する内在性のプロモーターを用いてもよいし、外来性のプロモーターを用いてもよい。プロモーターとしては、上記Trcプロモーター、T7プロモーターやTacプロモーターが効率の面で優れており好適に用いられる。
【００７０】
市販の無細胞発現キットを用いてタンパク質を発現させることができる。このようなキットとして例えば、Rapid Translation System (RTS) (Roche)やExpressway In Vitro Protein Synthesis System (Invitrogen)等がある。この際、用いる発現ベクターは限定されないが、それぞれの無細胞翻訳系に適したベクターがあるのでそれを使用すればよい。前者のキット用発現ベクターとして、pIVEX2.2bNdeが挙げられ、後者のキット用発現ベクターとして、pEXP1やpEXP2が挙げられる。
【００７１】
本発明のtRNAを用いることにより、タンパク質のＮ末端に、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するヒドロキシ酸を導入することができ、該カルボン酸又はヒドロキシ酸が標識物質で修飾されている場合、タンパク質のＮ末端を該標識物質で修飾することができる。
【００７２】
合成されたＮ末端が修飾されたタンパク質は、そのタンパク質の特性に応じて適宜精製することができる。例えば、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動やゲルろ過により分子量により精製することができる。また、荷電状態により、イオン交換クロマトグラフィーにより精製することができる。さらに、目的のタンパク質に特異的に結合する物質、例えば特異的抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７３】
タンパク質のＮ末端を標識物質で修飾した場合、タンパク質の活性は標識物質の影響を受けにくいので、そのタンパク質本来の活性を保持した修飾タンパク質を得ることができる。
【００７４】
また、タンパク質合成を行なう場合、標識物質を結合させた標識アミノ酸等の人工アミノ酸を付加したtRNAを用いると、該tRNAは遊離のα-アミノ基を有しており、tRNAとアミノ酸の間のエステル結合が加水分解され易い。本発明のα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸又はα位に水酸基を有するαヒドロキシ酸が付加されたtRNAであって、標識物質を結合させたtRNAは、分解されにくいので、効率的にＮ末端を修飾したタンパク質を作製することができる。
【００７５】
本発明のtRNAを用いることにより、あらゆるタンパク質のＮ末端を修飾することができる。
【実施例】
【００７６】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００７７】
実施例１  α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸が少なくとも１つの標識物質で修飾されているtRNAの合成
（１）アミノカルボン酸-pdCpAの合成
アミノカルボン酸100mgに対してNaHCO3 2当量、水2mL、Dioxane 2ml加え、氷冷下で撹拌しながら(Boc)2O 1.5当量/Dioxane 200μLを滴下して、18時間反応させた。酢酸エチルを加え、5%硫酸水素カリウムで3回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。その後、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水し、ろ過後、遠心エバポレーターにより乾燥させBoc-アミノカルボン酸を得た。
【００７８】
得られたBoc-アミノカルボン酸100mgに対してAcetonitrile 2mL、Trieｔhylamine 500μLを加え、氷冷下で撹拌しながらChloroacetonitrile 200μLを滴下して、18h反応させた。酢酸エチルを加え、5％硫酸水素カリウムで3回、4％炭酸水素ナトリウムで3回、飽和食塩水で1回洗浄した。その後、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水し、ろ過後、遠心エバポレーターにより乾燥させてBoc-アミノカルボン酸のシアノメチルエステル体を得た。
【００７９】
pdCpAのDMF溶液15μL（0.66μmol）に対して、5当量のBoc-アミノカルボン酸シアノメチルエステルを加え、室温で3時間反応させた（ただし、AC2は氷上で30分間、AC12は室温で72時間、ABC2〜ABC4は37℃で3時間反応させた）。ジエチルエーテル600μLを加えて撹拌し、遠心後エーテルを取り除いた。沈殿をエーテル600μLで２回洗浄した後、減圧乾燥させた。続いてトリフルオロ酢酸200μLを加え氷上で15分間放置し、Bocをはずした。遠心エバポレーターで減圧濃縮後、エーテル600μLを加えて撹拌し、遠心後エーテルを取り除いた。この操作をさらに2回繰り返して洗浄した後、減圧乾燥した。得られたアミノカルボン酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。
【００８０】
（２）TAMRA-アミノカルボン酸-pdCpAの合成（ABC2〜ABC4以外）
アミノカルボン酸-pdCpAのDMSO溶液30μL（66nmol）と5-TAMRA-SEの50mM DMSO溶液3μL（150 nmol）をDMSO 27μLと混合した。続いて、等量の0.1M NaHCO3を加え、氷上で1h反応させた後、1M AcOH 9μLを加えて中和した。クロロホルムを200μL加えて撹拌し、遠心後クロロホルム相を除去し、この操作をさらに５回繰り返した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたTAMRA-アミノカルボン酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。
【００８１】
（３）TAMRA-アミノカルボン酸-pdCpAの合成（ABC2〜ABC4）
アミノカルボン酸-pdCpA 40μL（88nmol）と5,6-TAMRA-X-SEの50mM DMSO溶液4μL（200nmol）を混合した。続いて、等量の1M Pyridine-HCl水溶液（pH5.0）を加え、37℃で3時間反応させた。クロロホルムを200μL加えて撹拌し、遠心後クロロホルム相を除去し、この操作をさらに５回繰り返した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたTAMRA-アミノフェニルカルボン酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。
【００８２】
図１A〜DにTAMRA-アミノカルボン酸の構造を示す。TAMRA-アミノカルボン酸-pdCpAは、該カルボン酸のカルボキシル基を介してpdCpAが結合している。
【００８３】
（４）BODIPY FL-アミノカルボン酸-pdCpAの合成（ABC2〜ABC4以外）
アミノカルボン酸-pdCpAのDMSO溶液15μL（33nmol）とBODIPY FL-SEの100mM DMSO溶液1.5μL（150nmol）（X-AC12の場合はBODIPY FL-X-SEを使用）をDMSO 13.5μLと混合した。続いて、0.1M NaHCO3 30μLを加え、氷上で1h反応させた後、1M AcOH 4.5μLを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたBODIPY FL-アミノカルボン酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。
【００８４】
（５）BODIPY FL-アミノカルボン酸-pdCpAの合成（ABC2〜ABC4）
アミノカルボン酸-pdCpA 30μL（66 nmol）とBODIPY FL-SEの100mM DMSO溶液3μL（300 nmol）を混合した。続いて、1M Pyridine-HCl水溶液（pH 5.0） 33μLを加え、37℃で3時間反応させた。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたBODIPY FL-アミノカルボン酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。
【００８５】
【表１】
2008193911.tif 000002
【００８６】
図２A〜EにBODIPY-アミノカルボン酸の構造を示す。BODIPY-アミノカルボン酸-pdCpAは、該カルボン酸のカルボキシル基を介してpdCpAが結合している。
【００８７】
（６）BODIPY FL-pdCpAの合成
BODIPY FLの0.5M アセトニトリル溶液10uLと1,1’-Carbonyl diimidazoleの1M アセトニトリル溶液0.5μLとを混合して、室温で5分間静置した。続いてpdCpAの水溶液10μL（0.44μmol）を加えて混合し、30分間静置して反応させた。1mLのジエチルエーテルを加えて、15000rpmで遠心後、上精を除去し、この操作を2回繰り返した。遠心エバポレーターによりジエチルエーテルを除去した後、0.38％ギ酸を50μL、アセトニトリル50μLを加えた。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたBODIPY FL-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は16nmol（3.6％）であった。
【００８８】
（７）FAM-AC3-pdCpAの合成
AC3-pdCpA 100μL(0.22μmol）を5-FAM-SEの100mM DMSO溶液 10μL（1μmol）と混合した。続いて、0.1M NaHCO3 110μLを加え、氷上で1時間反応させた後、1M AcOH 16.5μLを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたFAM-AC3-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は54nmolであった（収率25%）。
【００８９】
図３Bに、FAM-AC3の構造を示す。FAM-AC3-pdCpAは、該カルボン酸のカルボキシル基を介してpdCpAが結合している。
【００９０】
（８）Cy3-AC3-pdCpAの合成
AC3-pdCpA 120μL(0.26μmol)をCy3-SEの100mM DMSO溶液12μLと混合した。続いて、0.01M NaHCO3 132μLを加え、氷上で5時間反応させた後、1M AcOHを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたCy3-AC3-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は3.1nmolであった（収率1.2%）。
【００９１】
図３Dに、Cy3-AC3の構造を示す。Cy3-AC3-pdCpAは、該カルボン酸のカルボキシル基を介してpdCpAが結合している。
【００９２】
（９）Cy5-AC3-pdCpAの合成
AC3-pdCpA 80μL(0.18μmol)をCy5-SEの100mM DMSO溶液8μLと混合した。続いて、0.05M NaHCO3 88μLを加え、氷上で3h反応させた後、1M AcOHを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたCy5-AC3-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は82nmolであった（収率46％）。
【００９３】
図３Eに、Cy5-AC3の構造を示す。Cy5-AC3-pdCpAは、該カルボン酸のカルボキシル基を介してpdCpAが結合している。
【００９４】
（１０）Alexa488-AC3-pdCpAの合成
AC3-pdCpA 20μL(0.044μmol)をAlexaFluor488-SEの100mM DMSO溶液2μLと混合した。続いて、0.05M NaHCO3 22μLを加え、氷上で3時間反応させた後、1M AcOHを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたAlexa488-AC3-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は10nmolであった（収率23％）。
【００９５】
（１１）Biotin-TAMRA-X-AF-pdCpAの合成
アミノフェニルアラニン-pdCpA(AF-pdCpA)の5mM DMSO溶液1.56mL(7.8μmol)をTAMRA-X-SEの50mM DMSO溶液323μLとDMSO 167μLと混合した。続いて、1M Pyridine-HCl水溶液(pH 5)2mL加え、37℃で5時間反応させた。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたTAMRA-X-AF-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は1.8μmolであった（収率23％）。
【００９６】
TAMRA-X-AF-pdCpA 50μL(0.11μmol)をBiotin-SEの50mM DMSO溶液30μLとDMSO 30μLと混合した。続いて、0.1M NaHCO3 10μLを加え、氷上で21時間反応させた後、1M AcOHを加えて中和した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたBiotin-TAMRA-X-AF-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させた。収量は75nmolであった（収率68％）。
【００９７】
（１２）カルボン酸-tRNAの合成
5×Ligation Buffer(275mM Hepes-Na pH7.5, 75mM MgCl2, 16.5mM DTT, 5mM ATP) 4μL、200μM tRNA(-CA)（アンチコドンをCUAに置換した大腸菌fMet tRNAであって3’末端のCとAを欠損させたもの、配列番号１）2.5μL、カルボン酸-pdCpAのDMSO溶液2μL、0.1％ BSA 0.4μL、T4 RNA Ligase (25units/μL)1.2μL、水9.9μLを混合し、4℃で12時間反応させた。3M AcOK pH4.5を2μL加えた後、エタノール66μLを加え、軽く混合し、-30℃で1時間置いた。15000rpm 30分間 4℃で遠心した後、上清を除き、-30℃で保存してある70％エタノール200μLを加え、15000rpm 4℃で5秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。1mM 酢酸カリウムpH4.5 2μLに溶解させた。
【００９８】
実施例２  標識物質を結合した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
（１）TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
反応液（10μL）に、55mM Hepes-KOH (pH 7.5), 210mM グルタミン酸カリウム, 6.9mM 酢酸アンモニウム, 1.7mM ジチオスレイトール, 1.2mM ATP, 0.28mM GTP, 26mMホスホエノールピルビン酸, 1mMスペルミジン, 1.9％ポリエチレングリコール-8000, 35μg/mL Folinic acid, 12mM 酢酸マグネシウム, 0.1mMの20種類のアミノ酸、ストレプトアビジンmRNA（開始コドンをUAGに置換したもの、配列番号２）8μg/μLを1μL、大腸菌抽出液（Promega社製）を2μL、カルボン酸-tRNA溶液を1μL混合した。37℃で1時間翻訳反応を行なった。翻訳反応液1μLにRNaseA(10mg/ml)を1μL加え、37℃で15分間反応させた後、水9μLと2×サンプルバッファー10μLを加え、95℃5分間加熱した。このうちの5μLを15％SDS-PAGEに流し、終了後、蛍光スキャナー（日立ソフトウェアエンジニアリング社製FMBIO-III、励起光532nm、蛍光フィルター580nm）で観察した。TAMRAを付加したα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸-tRNAを加えた場合は、TAMRAが導入されたストレプトアビジンのバンドが確認された。図７にSDS-PAGEの結果を示す。図８にストレプトアビジンのバンドの蛍光強度を示す。用いたtRNAの配列を配列番号１に示す。
【００９９】
（２）BODIPY FLを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸の場合と同様にして行なった。ただし蛍光スキャナーの設定は励起光488nm、蛍光フィルター530nmとした。BODIPY FLを付加したα位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸-tRNAを加えた場合、BODIPY FLが導入されたストレプトアビジンのバンドが確認された。図９にSDS-PAGEの結果を示す。図１０にストレプトアビジンのバンドの蛍光強度を示す。
【０１００】
（３）種々の蛍光基を付加した3-アミノプロピオン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸の場合と同様にして行なった。ただし蛍光スキャナーの設定は、励起光488nm/蛍光フィルター530nm、励起光532nm/検出フィルター605nm、励起光635nm/検出フィルター670nmとした。種々の蛍光基を付加した3-アミノプロピオン酸-tRNAを加えた場合、それぞれの蛍光基が導入されたストレプトアビジンのバンドが確認された。図１１にSDS-PAGEの結果を示す。
【０１０１】
（４）TAMRA及びビオチンを付加したカルボン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
Flagタグペプチドを付加した脂肪酸結合タンパク質（FABP）の開始コドンをUAGに置換したmRNA（配列番号３）を使用して、TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸の場合と同様にして行なった。ただし蛍光スキャナーの設定は、励起光532nm/検出フィルター605nmとし、精製前、精製後の泳動サンプルに1mM ストレプトアビジンを1μL加えた場合についてもSDS-PAGEを行なった。精製はMagneHis Ni-particles（Promega社製）を使用し、推奨プロトコールに従って行なった。図１２にSDS-PAGEの結果を示す。図１２に示すように、ビオチンとTAMRAの両方で標識されたアミノ酸がタンパク質のＮ末端に導入された。ビオチンの導入はストレプトアビジン添加によるバンド位置のシフトから確認された。
【０１０２】
（５）4塩基コドンを開始コドンとした場合のBODIPY FL-3-アミノプロピオン酸のタンパク質Ｎ末端への導入
配列番号１のtRNA(-CA)のアンチコドンをCCCGに置換したtRNA(-CA)（配列番号４）を用いて、カルボン酸-tRNAの合成法にしたがって、BODIPY FL-3-アミノプロピオン酸-tRNAを作成した。続いて、配列番号２のストレプトアビジンmRNAの開始コドンをCGGGに置換したmRNA（配列番号５）を用いて、TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸の場合と同様にして、4塩基コドンを開始コドンとした場合のBODIPY FL-3-アミノプロピオン酸のタンパク質Ｎ末端への導入を行なった。ただし蛍光スキャナーの設定は励起光488nm、蛍光フィルター530nmとした。図１３に開始コドンをCGGGに置換し、開始tRNAのアンチコドンをCCCGに置換した場合の結果を示す。図１３に示すように、開始コドンをCGGGに置換し、開始tRNAのアンチコドンをCCCGに置換した場合でも、タンパク質のＮ末端に蛍光標識アミノ酸を導入することができた。
【０１０３】
実験例３  蛍光標識ヒドロキシ酸のタンパク質Ｎ末端への導入
（１）p-N-Boc-アミノフェニル乳酸シアノメチルエステルの合成
p-ニトロ-L-フェニルアラニン 1.5g (7.1mmol)に対して水10mL、1M硫酸水溶液12mL、アセトン22.5mLを加え、氷冷下で撹拌しながら2.2M亜硝酸ナトリウム水溶液10mLを30分かけて滴下して、1.5時間氷冷下で反応させ、その後16時間室温で反応させた。反応後、アセトンのみをエバポレーターで除去し、酢酸エチルを加え、水で2回洗浄後、飽和食塩水で1回洗浄した。その後、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、ろ過後、エバポレーターにより酢酸エチルが少量残るまで溶媒を除去した。酢酸イソプロピルを加え、エバポレーターにより乾燥させた。ヘキサンを加え沈殿を懸濁させ、吸引ろ過により沈殿を回収した。沈殿を少量の酢酸イソプロピルと多量のヘキサンで洗浄し、その後減圧乾燥させ、p-ニトロフェニル乳酸を810mg (3.84mmol; 54%)得た。
【０１０４】
p-ニトロフェニル乳酸 507mg (2.40mmol)に対して10%パラジウム炭素を275mg加え、水素置換を行い、脱水エタノール10mL加えて、室温で1.5時間反応させた。反応液をろ過し、メタノールで沈殿を洗浄・回収し、エバポレーターで乾燥させ、p-アミノフェニル乳酸を174mg (0.96mmol; 40%)得た。
【０１０５】
p-アミノフェニル乳酸を36.1mg (0.20mmol)に対して、0.1M炭酸水素ナトリウム水溶液4.5mL、1,4-ジオキサン4.5mL、3.7M (Boc)2O 111μLを加え、室温で3時間反応させた。エバポレーターにより溶媒を除去し、酢酸エチルを加え、5%硫酸水素カリウム水溶液で1回洗浄後、無水硫酸マグネシウムを加えて脱水し、ろ過後、エバポレーターにより乾燥させ、p-N-Boc-アミノフェニル乳酸を44.6mg (0.16mmol; 80%)得た。
【０１０６】
p-N-Boc-アミノフェニル乳酸3.7mg (13.3μmol)に対して、脱水アセトニトリル230μL、トリエチルアミン111μL、クロロアセトニトリル84μLを加え、室温で3時間反応させた。酢酸エチルを加え、5%硫酸水素カリウムで2回洗浄し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去し、p-N-Boc-アミノフェニル乳酸シアノメチルエステルを1.9mg (5.9μmol; 44%)得た。
【０１０７】
（２）p-アミノフェニル乳酸-pdCpA（AFL-pdCpA）の合成
pdCpAのDMF溶液70.5μL（6.20μmol）に対して、p-N-Boc-アミノフェニル乳酸シアノメチルエステル5.9mg (18.4μmol)を3回に分けて加え、室温で6.5時間反応させた。ジエチルエーテル1mLを加え沈殿を回収し、さらにジエチルエーテルで2回洗浄した後、減圧乾燥させた。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。続いてトリフルオロ酢酸200μLを加え氷上で10分間放置し、Boc基をはずした。遠心エバポレーターで減圧濃縮後、ジエチルエーテル1mLを加えて撹拌し、遠心後ジエチルエーテルを除き、遠心エバポレーターで減圧乾燥した。得られたp-アミノフェニル乳酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させ、p-アミノフェニル乳酸-pdCpAのDMSO溶液697μL (70%)で得た。
【０１０８】
（３）p-N-BODIPYFL-アミノフェニル乳酸-pdCpA（BODIPYFL-AFL-pdCpA）の合成
p-アミノフェニル乳酸-pdCpAのDMSO溶液180μL (0.396μmol)に対して、50mM BODIPYFL-SEのDMSO溶液36μL (1.8μmol)、1Mピリジン-HCl水溶液(pH 5.0)を216μLを加え、37℃で反応させた。1.5時間経過後、50mM BODIPYFL-SEのDMSO溶液18μL (0.9μmol)を追加した。反応開始から3時間後、反応溶液を4本のチューブに分注し、ジエチルエーテル1mLずつ加えて撹拌し、遠心後ジエチルエーテル層を除去する操作を、さらに2回繰り返した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたp-N-BODIPYFL-アミノフェニル乳酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させ、p-N-BODIPYFL-アミノフェニル乳酸-pdCpAのDMSO溶液68.0μL(37%)得た。
【０１０９】
（４）p-N-TAMRAX-アミノフェニル乳酸-pdCpA（TAMRA-X-AFL-pdCpA）の合成
p-アミノフェニル乳酸-pdCpAのDMSO溶液45μL (99nmol)に対して、100mM TAMRAX-SEのDMSO溶液4.5μL (450nmol)、6Mピリジン-HClのDMSO溶液とピリジンを1:1で混合した溶液54μLを加え、37℃で12時間反応させた。反応溶液にクロロホルム1mLを加えて撹拌し、遠心後クロロホルム層を除去する操作を、さらに3回繰り返した。HPLCにより目的のピークを分取し、溶媒を遠心エバポレーターにより除去した。得られたp-N-TAMRAX-アミノフェニル乳酸-pdCpAの一部を0.1M NaOHにより加水分解して、生じたpdCpAのピーク面積から濃度を算出して、2.2nmol/μLとなるようにDMSOに溶解させ、p-N-TAMRAX-アミノフェニル乳酸-pdCpAのDMSO溶液9.1μL(20%)得た。
【０１１０】
（５）蛍光標識ヒドロキシ酸のタンパク質への導入
カルボン酸-tRNAの合成法にしたがって、蛍光標識ヒドロキシ酸-tRNAを合成した。続いて、配列番号６〜１１をストレプトアビジンのＮ末端（Asp1）の上流に付加したmRNAを用いて、TAMRAを付加した、α位にアミノ基、アミド結合及びヒドロキシル基を持たないカルボン酸の場合と同様にして、蛍光標識ヒドロキシ酸のタンパク質への導入を行なった。ただし蛍光スキャナーの設定は、BODIPY FLについては励起光488nm/蛍光フィルター530nm、TAMRAについては励起光532nm/検出フィルター605nm、励起光635nm/検出フィルター670nmとした。図１４にT7tag-ACT-ストレプトアビジンへの蛍光標識ヒドロキシ酸のタンパク質への導入の結果を示す。図１４に示すように、蛍光標識ヒドロキシ酸を導入した場合はT7タグが欠落したＮ末端蛍光標識ストレプトアビジンが得られることがわかった。
【０１１１】
図１５には、図１４で得られた未精製のタンパク質にNaHCO3を加えて、アルカリ加水分解を行なった結果を示す。図１５に示すように、アルカリ加水分解によって、T7タグが欠落したＮ末端蛍光標識ストレプトアビジンのみが得られることがわかった。
【０１１２】
図１６には、T7tag、RGSHis3、VGV-G、Avi、Glu-Glu(E.E.)のタグペプチドをストレプトアビジンの上流に付加した場合の、蛍光標識ヒドロキシ酸のタンパク質への導入の結果を示す。図１６に示すように、いずれのタグペプチドにおいても、蛍光標識ヒドロキシ酸を導入した場合はタグペプチドが除去されてＮ末端にBODIPY FL-AFLを持つストレプトアビジンが得られることがわかった。 
【産業上の利用可能性】
【０１１３】
本発明のtRNAを用いてＮ末端を特異的に蛍光物質等の標識物質で修飾したタンパク質を作製することができ、該Ｎ末端修飾タンパク質は標識タンパク質として種々の生物化学的解析に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】TAMRA標識カルボン酸の構造を示す図である。
【図２】BODIPY FL標識カルボン酸の構造を示す図である。
【図３】種々の蛍光物質で標識したカルボン酸の構造を示す図である。
【図４】TAMRA及びビオチンで標識したカルボン酸の構造を示す図である。
【図５】TAMRA及びBODIPY FLで標識したヒドロキシ酸の構造を示す図である。
【図６】pdCpAを結合させたカルボン酸(BODIPY FL-ABC2-pdCpA)の構造を示す図である。
【図７】TAMRA標識カルボン酸をＮ末端に導入したストレプトアビジンのSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図８】TAMRA標識カルボン酸をＮ末端に導入したストレプトアビジンのSDS-PAGEにおける蛍光バンド強度を示す図である。
【図９】BODIPY FL標識カルボン酸をＮ末端に導入したストレプトアビジンのSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図１０】BODIPY FL標識カルボン酸をＮ末端に導入したストレプトアビジンのSDS-PAGEにおける蛍光バンド強度を示す図である。
【図１１】種々の蛍光標識（Alexa488、BODIPY FL、Cy3、Cy5、FAM及びTAMRA）カルボン酸をN末端に導入したストレプトアビジンのSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図１２】TAMRA及びビオチンで標識したカルボン酸をＮ末端に導入したFABPのSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図１３】開始コドンとして４塩基コドンを用いて、Ｎ末端にBODIPY標識カルボン酸を導入した結果を示す図である。
【図１４】蛍光物質で標識したヒドロキシ酸を導入した融合タンパク質のSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図１５】蛍光物質で標識したヒドロキシ酸を導入した融合タンパク質を加水分解処理したもののSDS-PAGEの結果を示す図である。
【図１６】種々のタグとストレプトアビジンの融合タンパク質にヒドロキシ酸を導入した場合のSDS-PAGEの結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【０１１５】
配列番号２、４〜１１  合成
【図１】
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【図２】
2008193911.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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