(57)【要約】      （修正有）【課題】クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する未知の毒素、及び、この毒素及び／又はそのトキソイドを用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌用ワクチン及び毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法の提供。【解決手段】未知の毒素として、クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株培養液の濃縮液から得られたマウスに対する未知の致死成分を精製して大腸菌に組み込み、発現蛋白を毒素のモノクローナルで特定した特定なアミノ酸配列からなるタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質。
【請求項３】
細胞毒性を有することを特徴とする請求項１〜２に記載のタンパク質。
【請求項４】
クロストリジウム・パーフリンゲンスが産生することを特徴とする請求項１〜３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜２に記載のタンパク質のいずれかをコードするＤＮＡ。
【請求項６】
配列番号１に記載の遺伝子の一部あるいは全部を遺伝子組換え技術で作製した組換えタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜２に記載のタンパク質のいずれかに対する抗体。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１〜４のタンパク質またはその免疫原性誘導体を含有するクロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌感染症ワクチン。
【請求項１０】
請求項１〜４のタンパク質を検出することを特徴とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・パーフリンゲンスのうち、多くのＣ型菌が産生する新規な毒素に関する。またこの毒素及び／又はそのトキソイドを用いたクロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌用ワクチン及び毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出方法に関わる。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・パーフリンゲンスは芽胞形成、偏性嫌気性のグラム陽性大桿菌で、α、β、ε及びι毒素の４種の毒素の産生パターンでＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥの５つの型に分けられる。この中でＣ型菌は子豚、子牛、子羊、鳥に対して出血性腸炎や毒血症を引き起こし、動物を死亡させることもある（非特許文献１、２を参照。）。 
【０００３】
これまでクロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌のワクチンには、β毒素を主体とする毒素をホルマリンで無毒化した免疫原性誘導体（トキソイド）が用いられてきた（非特許文献３などを参照。）。β毒素以外ではＡ型菌においてα毒素の特定なアミノ酸からなるペプチドをヒト又は動物に投与し感染防御免疫応答を誘発するワクチン組成物の報告がある（特許文献１を参照。）。一般にホルマリンによる無毒化は蛋白変性によって免疫原性の低下が避けられず、β毒素においても顕著に影響を受けるとされているが、これを回避するためにクロストリジウム・パーフリンゲンスの非毒性変異株及びその断片を用いるワクチンが報告されている（特許文献２を参照。）。またクロストリジウムワクチン投与の副作用軽減するためアジュバントにサポニン使用した２種以上のクロストリジウムバクテリンまたはトキソイドからなる多成分系ワクチンが報告されている（特許文献３を参照。）。しかしながら、これら報告には、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する新規な毒素に関する記載はない。
【０００４】
【特許文献１】特許第３３７０６７２号公報
【特許文献２】特表平８−５１０２０６号公報
【特許文献３】特開平１１−１０３８７２号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９７．３５：ｐ２２８−２３２
【非特許文献２】Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１．８２：ｐ１−９
【非特許文献３】ヨーロッパ薬局方１９９７
【非特許文献４】Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９２．１７４：ｐ６７０７−６７１０
【非特許文献５】Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．２０００．６８：ｐ６３７８−６３８３
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７．２７２：ｐ１１０７４−１１０７８
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００．２７５：ｐ１３２２８−１３２３４
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４．２７９：ｐ４９８７６−４９８８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生する毒素は、α，β，ε及びι毒素をはじめとする約１０種が知られているに過ぎない。より効果的なワクチンを開発するためにはクロストリジウム・パーフリンゲンスが産生する毒素の全てを明らかにすることが望ましく、未知の毒素の発見及び解明が待たれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、クロストリジウム・パーフリンゲンスの５つの毒素型の内、Ｃ型菌の培養液から培養細胞に対して強い毒性を示し、哺乳動物に対して致死性を有する未知の毒素を発見した。さらに、この毒素を精製し、アミノ酸配列及びこのアミノ酸をコードする塩基配列を決定した。この毒素の産生能をＣ型菌５株について調べたところ、全ての株がその毒素を産生し、毒素の産生は確認できなかったものの、Ｂ型菌にもその遺伝子が確認された。本毒素の生理活性は不明であるが、毒素あるいはトキソイドを含むワクチンへの利用、毒素を指標とするクロストリジウム・パーフリンゲンスの検出、医薬品への応用等が期待される。 
【０００７】
本発明で開示する毒素（以下、本毒素という。）は、クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌から得られた配列番号１に示すアミノ酸からなるタンパク質である。このタンパク質の生理活性等は十分に解明されていないものの、高度な細胞毒性が認められることより毒素と認められる。配列番号１のアミノ配列から求めた分子量は１９１キロダルトンであり、クロストリジウム・パーフリンゲンスの産生毒素なかでは最も分子量が大きい。本毒素と異なる菌種の既知毒素との相同性は、クロストリジウム・ディフィシル  toxin A  （３０８キロダルトン）：３９％、クロストリジウム・ディフィシル  toxin B  （２６９キロダルトン） ：３８％ 、クロストリジウム・ソルデリー  lethal toxin   （２７０キロダルトン） ：３９％、クロストリジウム・ノビイ  α毒素  （２５０キロダルトン）：３０％ の値を示した。これら既知の毒素よりも小さい本毒素は、既知の毒素のＮ末端側から中央部に相同性を認め、既知の毒素のＣ末端側に相当する部分を認めなかった。既知の毒素は何れも糖転移酵素活性を有し、低分子量Ｇ蛋白の阻害作用を有する。そのアミノ酸配列には、その酵素活性に必要なＤＸＤモチーフを保存している。さらに、何れもＮ末端側に毒素活性、中央部に細胞に侵入するための構造、Ｃ末端側に細胞に結合するための構造を有している。本毒素のＮ末端側は既知の毒素に相同性を認めるだけでなく、このＤＸＤモチーフを保存しており、本毒素は糖転移酵素活性を有すると思われた。しかし、Ｃ末端側の細胞に結合するための構造を持たない本毒素は、それでも強い細胞毒性を示しており、糖転移酵素の研究の材料としては、非常に有用な毒素と考えられる。（既知の毒素の報告については、非特許文献４〜８を参照。）。
【０００８】
本毒素は、培養液上清濃縮液の電気泳動により見出された。実施例１に記載したように用いた手法は全て常法によるものである。本毒素に対するモノクローナル抗体も、一般的製法によって得たものである。得られたモノクローナル抗体をカラムの担体に結合し、アフィニティカラムに使用することも公知の手段である。このアフィニティカラムによって精製した本毒素は、マウスに対する致死性は高くないものの、培養細胞に対して強い毒性を示した。細胞毒性は、コロニー法等の常法により判定できる。例えばＶｅｒｏ細胞やＣＨＯ細胞において、約１．６ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞毒性を認めた。
【０００９】
本毒素の塩基配列は以下のように決定された。１）菌体から抽出したＤＮＡを酵素処理する。２）処理したＤＮＡをλファージに組み込む。３）λファージを感染させた大腸菌が発現する蛋白をモノクローナル抗体で検出する。４）毒素を産生するλファージをファージミドｐＢＫ−ＣＭＶに改変しクローニングサイトの塩基配列を決定する。アミノ酸配列はこの塩基配列に基づいて決定され、分子量はアミノ酸配列から決定した。クロストリジウム・パーフリンゲンスの既知毒素はもちろん、ＧｅｎＢａｎｋ等のデータベースにも該当配列は存在せず、本毒素は新規な物質であることが確認された。
【００１０】
クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株の培養液中から発見されたが、後にＣＰ４６、Ｓｈｉ２、Ｃｈｉ８及び３５１１−２の培養液にも産生が認められたことより、クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌全般の産生毒素の一つと考えられる。本毒素は、希釈又は無毒化してワクチンに使用できる。無毒化はホルマリン等の化学的処理が好ましい。適量の不活化毒素をマウスの筋肉内に注射すれば、約１ヶ月後に本毒素に対する血中抗体価の上昇が観測され、本毒素に対する免疫が誘導されたことが確認できた。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の毒素又はトキソイドを含有するワクチンを投与された動物は本毒素に対する抗体を付与されその毒素の影響から免れることができる。本毒素の精製に用いたモノクローナル抗体は、クロストリジウム・パーフリンゲンスの培養菌液中の毒素検出に有用であり、菌の同定にも利用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１３】
毒素の探索法
クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株培養液の除菌ろ過液を限外ろ過膜で濃縮し、これをＧ６０００ＰＷゲルろ過カラムで分画した。各分画の一部をマウスに注射し、マウスが死亡した分画を集めた。これをＤＥＡＥ−５ＰＷイオン交換クロマトグラフィーでさらに分画し、各分画のマウス致死性を確認した。その結果、一分画のみに致死性を認めた。この分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで構成蛋白について調べたところ、マーカー蛋白の分子量１７０〜２１２キロダルトンの間に一本の蛋白バンドを高純度で確認した。この蛋白バンドは他の分画には認められなかった。図１参照。
【実施例２】
【００１４】
毒素の性状
この毒素に対するモノクローナル抗体でアフィニティカラムを作製し、クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株培養液の除菌ろ過液から毒素を精製した。この精製した毒素のマウスに対する半数致死量は、体重１Ｋｇ当たり５４５μｇであった。この精製毒素を９６穴マイクロプレートに培養したＶｅｒｏ細胞に接種したところ、毒素濃度１．６ｎｇまで細胞毒性を認めた。
【実施例３】
【００１５】
塩基配列の決定法
クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株菌体からＥａｓｙ−ＤＮＡ ｋｉｔ （インビトロジェン）を用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ２０μｇを０．０６２５ ＵのＳａｕ３ＡIで３７℃１時間酵素処理し、これをλファージ  Ｚａｐ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖｅｃｔｏｒ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＢａｍＨI（ストラタジーン）に使用説明書に従って組み込んだ。このλファージを使用説明書に従って、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ'に感染させ、組み込んだＤＮＡに対する蛋白を発現させた。発見した毒素に対するモノクローナル抗体でその毒素遺伝子を組み込まれたλファージを検出した。毒素遺伝子を組み込まれたλファージは仕様書に従ってファージミドｐＢＫ−ＣＭＶに改変した。ファージミドのクローニングサイトの塩基配列をＢｉｇＤｙｅR Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （アプライド  バイオシステム）を用いて ３７３０ｘI ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ （アプライド  バイオシステム）で遺伝子配列を読み取った。塩基配列の推定アミノ酸配列から算出したこの蛋白の分子量は１９１キロダルトンであった。
【実施例４】
【００１６】
新毒素産生株の検討
本毒素の産生状況をＡ、Ｂ及びＣ型菌の計１８株についてイムノ・ドット・ブロット法で、この毒素に対するモノクロ−ナル抗体を使用して調べた。即ち、各培養上清の試料０．４ｍＬを、予め湿らせたＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ． Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の細片に塗布した。膜を、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム及び０．０１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２に溶解した５％脱脂粉乳のブロッキング溶液に入れ、ゆるやかに撹拌しながら室温で少なくとも１時間インキュベートした後、ブロッキング溶液をデカントした。検出は、抗毒素モノクローナル抗体、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体及び染色体基質ジアミノベンチジンを用い、標準法に従って実施した。その結果は表１に示すように、Ａ型菌１２株とＢ型菌1株はその毒素を産生せず、Ｃ型菌５株は全てその毒素を産生していることが確認された。
【００１７】
【表１】
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【実施例５】
【００１８】
本毒素遺伝子保有株の検討
実施例４と同一の株について本毒素の遺伝子保有状況を調べた。液体培地で培養した菌液を１０，０００×ｇで１０分遠心して上清を除去した後、菌を元の１／１０量の精製水で浮遊した。これを１０分間煮沸した後、再び遠心し、その上清をＰＣＲのテンプレートとした。プライマーは、配列番号１の配列を基に、以下のように設計した。：
Forward Primer： 5'- ATATAGAGTCAAGCAGTGGAG -3'
Reverse Primer： 5'- GGAATACCACTTGATATACCTG -3'
反応液は５０μＬ中、ＰＣＲ緩衝液（Ｍｇ2+ フリー）に２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ、２．５単位ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、５０ ｐＭ  プライマー及び５μＬのテンプレートを用いた。ＰＣＲは、９４℃５分処理の後、熱変性：94℃，１分、アニーリング：55℃，１分、伸長：72℃，１分を１サイクルとして３０回繰り返し、最後に７２℃、７分で行った。得られた増幅産物を１．５％アガロースで電気泳動を行い、４６６ｂｐのＤＮＡのバンドの有無を確認した。その結果、本毒素産生に関わる遺伝子はＣ型以外にもＢ型で認められ、他の型でも産生し得ることが判明した。
【００１９】
【表２】
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【実施例６】
【００２０】
ワクチンの製造
クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株を培地（トリプチケース・ペプトン ５％、酵母エキス １％、Ｌ−システイン塩酸塩 ０．０５％、ｐＨ７．４）に３７℃で静止期まで培養し、培養後ホルマリンを０．５％の割合で加え、３７℃、３日間感作してトキソイドを作成した。このトキソイドを１０，０００×ｇで３０分遠心して菌を除去し、その上清を限外濾過器で１０倍に濃縮した。濃縮液に水酸化アルミニウムゲルアジュバントを１０％の割合で加えてワクチンを作製した。
【実施例７】
【００２１】
ワクチンの投与及び抗体価測定
実施例６で得たワクチン０．２ｍＬをモルモットの筋肉内に３週間隔で２回注射した。２回目注射から２週後に被検モルモットから採血し、本毒素の中和抗体を９６穴マイクロプレートに培養したＶｅｒｏ細胞を用いて測定した。２．０×１０5個／ｍＬに調整した細胞を９６穴マイクロプレートに１穴当たり０．１ｍＬずつ分注し、一夜培養した。翌日、細胞毒性４単位の本毒素と２倍階段希釈した血清を当量混合し、３７℃、１時間感作した。感作後、Vero細胞の培養液を除き、そこに血清で感作した毒素を０．１ｍＬずつ加えた。これを炭酸ガス孵卵器に入れ細胞を３日間観察した。このモルモット血清には本毒素４単位の細胞毒性を血清２，５００〜５，０００倍希釈でも中和する抗体が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】クロストリジウム・パーフリンゲンスＣ型菌ＭＣ１８株培養液から得た致死性分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【図１】
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【配列表】
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