(57)【要約】【課題】妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キットを提供する。【解決手段】第１の妊孕性診断キットは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基の欠失変異の有無を検出するための試薬を含んでいる。第２の妊孕性診断キットは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出するための試薬を含んでいる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基の欠失変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項２】
上記試薬は、
ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０２位及び第９０３位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、
上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、
を含んでいることを特徴とする請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項３】
上記試薬は、上記欠失変異の有無をインベーダー法によって検出するものであることを特徴とする、請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項４】
上記試薬は、上記欠失変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであることを特徴とする、請求項１に記載の妊孕性診断キット。
【請求項５】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基が欠失した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを有していることを特徴とする発現ベクター。
【請求項７】
請求項５に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項８】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基の欠失変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする変異検出方法。
【請求項９】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする妊孕性診断キット。
【請求項１０】
上記試薬は、
ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位及び第２０５位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、
上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、
を含んでいることを特徴とする請求項９に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１１】
上記試薬は、上記欠失変異の有無をインベーダー法によって検出するものであることを特徴とする、請求項９に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１２】
上記試薬は、上記欠失変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであることを特徴とする、請求項９に記載の妊孕性診断キット。
【請求項１３】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間にアデニン塩基が挿入した塩基配列からなることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを有していることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする変異検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キット、並びに、不妊症の治療方法の研究に用いられる変異型のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、少子化の問題が頻繁に取り上げられ、この問題を解消するために様々な対策が模索されている。少子化の対策として、不妊症により子供を授からない夫婦を救済することが重要であることは言うまでもない。
【０００３】
非特許文献１では、子供を望む夫婦のうちの約１５％が２年たっても妊娠できないという報告がなされている。近年では、体外受精（ＩＶＦ；In Vitro Fertilization）の技術発展により、精子の活動能が低い場合においても妊娠出産が可能になっているが、不妊の背後にある分子メカニズムは依然として明らかになっていないのが現状である。
【０００４】
非特許文献２によると、マウスにおける雄性不妊の研究により、妊孕性に影響を与える多くの遺伝子の存在が明らかになっており、これらの遺伝子の変異がヒトにおいても男性不妊を引き起こす一因となっている可能性がある。
【０００５】
哺乳類の雄性生殖細胞の成熟は、数々の構造的及び機能的変化を経てなされる。その過程は精子形成と呼ばれ、主として（１）精原細胞の増殖及び分化、（２）精母細胞の前期段階における減数分裂、及び（３）半数体円形精子細胞から精子への分化の際の急激な形態変化、の３つの段階を含んでいる。
【０００６】
上述した半数体生殖細胞の分化において、円形精子細胞は、細胞分裂を伴わずに精子へと形態を大きく変化させる。このとき、核は変形し、ミトコンドリアは再配置され、鞭毛が発達し、そしてアクロソームが形成される。
【０００７】
上述した半数体生殖細胞の分化には、この時期特異的に発現する数々のタンパク質が関与している。そのタンパク質として、セリン／スレオニンキナーゼファミリーに属するＴＳＳＫ２（testis-specific serine kinase 2）、及び、細胞周期の調節への関与が示唆するＨＡＳＰＩＮ（haploid germ cell-specific nuclear protein kinase）が報告されている（非特許文献３，４）。
【０００８】
ＴＳＳＫ２は、性成熟したオスの精巣に限定して発現するタンパク質であり、組織免疫染色により、後期精子細胞の細胞膜に局在し、残体（residual body）のような構造を形成することが分かっている。また、ＴＳＳＫ２は、脱離して精細管の内腔や精巣上体に存在する精子には存在しない。このように、ＴＳＳＫ２は、精子細胞の成熟期間の後期段階という短い期間に限定して発現するタンパク質である。
【０００９】
さらに、免疫沈降物のＩｎ  Ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイにより、ＴＳＳＫ２は、自身をリン酸化する機能は有していないものの、ＴＳＳＫ２と共沈するタンパク質のセリン残基をリン酸化することが分かっている。
【００１０】
なお、ＴＳＳＫ２は、マウスだけでなく、ヒトにおいても存在することが明らかになっている（非特許文献５）。
【００１１】
一方、ＨＡＳＰＩＮは、本願発明者らによって見出され、他の細胞に比べて半数体生殖細胞に極めて強く発現し、核に局在するタンパク質である。ＨＡＳＰＩＮは、通常のプロテインキナーゼが備える１２のサブドメインのうちの３つのサブドメインしか備えていないが、内在性のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有している。そして、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子は、体細胞に異所発現させると、細胞周期をＧ１期で停止させ、細胞増殖の停止を引き起こすことが分かっている。
【００１２】
なお、ＨＡＳＰＩＮもまた、マウスだけでなく、ヒトにおいても存在することが明らかになっている（非特許文献６）。
【００１３】
また、別の報告では、ＨＡＳＰＩＮを体細胞系の培養細胞に強制発現させる実験により、局在する箇所が核正体であることが突き止められている（非特許文献７）。この報告では、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏの実験において、強制発現したＨＡＳＰＩＮタンパク質が有糸分裂の際に中心体及び紡錘体に局在するとともに、ヒストンＨ３の第３位のスレオニンをリン酸化させることが示されている。このことは、ＨＡＳＰＩＮが減数分裂期の染色体及び紡錘体の機能の制御に関与していることを示唆している。
【００１４】
以上のように、ＴＳＳＫ２及びＨＡＳＰＩＮは、半数体生殖細胞の分化に重要な影響を及ぼすタンパク質であると考えられている。
【非特許文献１】de Kretser DM et al., J Clin Endocrinol Metab. 1999; 84: 3443-3450.
【非特許文献２】Matzuk MM et al., Nat Cell Biol. 2002; 4(Supp1): S41-S49 / Nat Med. 2002; 8 (Supp1): S33-S40.
【非特許文献３】Kueng P et al.,J Cell Biol. 1997; Dec 29; 139(7): 1851-1859.
【非特許文献４】Tanaka H et al., J Biol Chem. 1999; Jun 11; 274(24): 17049-17057.
【非特許文献５】Hao Z et al., Mol Hum Reprod. 2004; Jun; 10(6): 433-444.
【非特許文献６】Tanaka H et al., Mol Hum Reprod. 2001; Mar; 7(3): 211-218.
【非特許文献７】Dai J et al., Genes Dev. 2005; Feb 15; 19(4): 472-488.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述したように、ＴＳＳＫ２及びＨＡＳＰＩＮ遺伝子は、哺乳類において種を越えて保存され、かつ、半数体生殖細胞に特異的に発現するタンパク質をコードするものであることから、これらの遺伝子における変異は不妊を引き起こし得ると考えられる。しかしながら、現在までに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子又はヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の変異と不妊症との関係を示唆する症例は報告されていない。
【００１６】
ヒトＴＳＳＫ２遺伝子又はヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の変異と妊孕性との関係が明らかになれば、妊孕性の診断を簡易な遺伝子診断で行うことができるようになる。具体的には、被験者が不妊症に罹患する可能性が高いか否かの判定、或いは、不妊症患者の原因がこれらの遺伝子によるものか否かの判定を簡易に行うことができるようになる。
【００１７】
さらに、不妊症患者に見られる変異型ヒトＴＳＳＫ２タンパク質又は変異型ヒトＨＡＳＰＩＮタンパク質があれば、上記の変異型タンパク質に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤や治療法などの研究において極めて有用なツールとなる。
【００１８】
本発明は上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を可能にする妊孕性診断キットを提供することにある。
【００１９】
また、本発明の別の目的は、不妊症の治療方法を研究する際に有用なツールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本願発明者らは、後述する実施例に示すように、男性不妊症患者及び健常者男性からなる集団について、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の塩基配列を入念に解析した結果、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳開始点から数えて第９０２位又は第９０３位の塩基の欠失変異と不妊症とが関連することを見出した。
【００２１】
上記課題を解決するために、本発明に係る第１の妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基の欠失変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。
【００２２】
上記試薬は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０２位及び第９０３位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、を含むものであってもよい。
【００２３】
あるいは、上記試薬は、上記欠失変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【００２４】
さらにあるいは、上記試薬は、上記欠失変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【００２５】
また、本発明に係る第１のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基が欠失した塩基配列からなることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る第１の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを有していることを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る第１のポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００２８】
また、上記課題を解決するために、本発明に係る第１の変異検出方法は、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位のうちの一方の塩基の欠失変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【００２９】
さらに、本願発明者らは、後述する実施例に示すように、男性不妊症患者及び健常者男性からなる集団について、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の塩基配列を入念に解析した結果、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の翻訳開始点から数えて第２０４位と第２０５位との間の挿入変異と不妊症とが関連することを見出した。
【００３０】
上記課題を解決するために、本発明に係る第２の妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出するための試薬を含んでいることを特徴とする。
【００３１】
上記試薬は、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位及び第２０５位の塩基を含む領域を増幅させるためのプライマーの組と、上記領域の塩基配列を決定するための塩基配列決定試薬と、を含むものであってもよい。
【００３２】
あるいは、上記試薬は、上記欠失変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【００３３】
さらにあるいは、上記試薬は、上記欠失変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【００３４】
また、本発明に係る第２のポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間にアデニン塩基が挿入した塩基配列からなることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る第２の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを有していることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る第２のポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【００３７】
また、上記課題を解決するために、本発明に係る第２の変異検出方法は、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とする。
【発明の効果】
【００３８】
本発明に係る第１の不妊症キットには、不妊症患者に見られるＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位又は第９０３位の塩基の欠失変異の有無を検出する試薬が備わっているので、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。
【００３９】
また、本発明に係る第１のポリヌクレオチドは、上記の欠失変異を含むＴＳＳＫ２遺伝子を提供するものである。また、本発明に係る第１の発現ベクター及び第１のポリペプチドは、不妊症患者に見られるヒト欠失変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を提供するものである。従って、ＴＳＳＫ２遺伝子の欠失変異に起因した不妊症を研究する上で有用なツールとなる。
【００４０】
本発明に係る第２の不妊症キットには、不妊症患者に見られるＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位と第２０５位との間の挿入変異の有無を検出する試薬が備わっているので、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定を行うことができる。
【００４１】
また、本発明に係る第２のポリヌクレオチドは、上記の挿入変異を含むＨＡＳＰＩＮ遺伝子を提供するものである。また、本発明に係る第２の発現ベクター及び第２のポリペプチドは、不妊症患者に見られるヒト挿入変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を提供するものである。従って、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の欠失変異に起因した不妊症を研究する上で有用なツールとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（１．ヒトＴＳＳＫ２遺伝子における欠失変異）
ＴＳＳＫ２は、”testis-specific serine kinase 2”の略称であり、本明細書ではこの略称を用いることとする。ＴＳＳＫ２タンパク質は、上述したように、性成熟したオスの精巣に限定して発現し、後期精子細胞の細胞膜に局在することが報告されている。ＴＳＳＫ２は、自身をリン酸化する機能は有していないものの、自身と相互作用するタンパク質のセリン残基をリン酸化することが分かっている。
【００４３】
図１は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソース（Human Genome Resources: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/）によれば、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子は、イントロンを持たないレトロポゾン様遺伝子であり、ヒト２２番染色体長腕（２２ｑ１１．２１）に位置している。この遺伝子の転写産物は約１．３ｋｂである。
【００４４】
配列番号１は、ジーンバンク（GenBank）にアクセッション番号gi34222349で登録されているヒトＴＳＳＫ２遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号１に示すように、ＴＳＳＫ２遺伝子は、１０７７ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号２は、ヒトＴＳＳＫ２タンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【００４５】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号１に示すヒトＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳領域における第９０３位のシトシン塩基（以下、単に「Ｃ」という）が片方のアレルにおいて欠失している患者がいることを見出した。一方、この第９０３位のＣの欠失は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。
【００４６】
なお、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子は、配列番号１に示すように、第９０２位と第９０３位が何れもＣとなっている。従って、上記の欠失は第９０２位の塩基に生じているともいえるが、本質的にはどちらでもよいため、以下では説明の便宜上、第９０３位の塩基が欠失していることとして説明する。
【００４７】
ヒトＴＳＳＫ２遺伝子に上記の欠失変異が起こると、正常なＴＳＳＫ２タンパク質が発現しない。それゆえ、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０３位におけるＣの欠失変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＴＳＳＫ２タンパク質の翻訳量の低下などに基づき不妊症を引き起こす可能性が高いと推測される。
【００４８】
よって、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子について上記の第９０３位のＣの欠失変異の有無を調べ、欠失変異が見つかった場合には、その被験者が不妊症或いは低妊孕性であると考えられる。そして、不妊症或いは低妊孕性であると判定された被験者に対しては、ＩＣＳＩ（Intracytoplasmic sperm injection；顕微授精）などの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
【００４９】
以上のことから、本発明に係る変異検出方法は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基の欠失変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とするものである。
【００５０】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基の欠失変異の有無を検出する試薬を含んでいることを特徴とするものである。
【００５１】
上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基の欠失変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。変異検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子が上記の欠失変異を含んでいることを検知するものであってもよいし、上記の欠失変異を含んでいないことを検知するものであってもよい。
【００５２】
上記変異検出方法及び妊孕性診断キットとしては、公知の各種手法、例えば、塩基配列決定法、インベーダー法、又はＳＭＭＤ法（simultaneous multiple mutation detection system）、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＭＡＳＡ法、塩基伸長法、Ｔａｑｍａｎプローブ法などに基づいたものを用いることができる。また、妊孕性診断キットには、使用方法が記載された取扱説明書が含まれていてもよい。
【００５３】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０２位及び第９０３位の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の欠失変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【００５４】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位の塩基を含む領域を増幅させるために、第９０２位及び第９０３位を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位よりも上流の塩基配列を有するプライマーと、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位よりも下流の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。
【００５５】
被験者のゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲ（polymerase chain reaction）を行えば、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位及び第９０３位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、欠失変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。塩基配列の決定は、例えばＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems Inc.）などを取扱説明書に従って使用することにより、簡単に実施することができる。
【００５６】
なお、それぞれのプライマーは、ＴＳＳＫ２遺伝子と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＴＳＳＫ２遺伝子と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【００５７】
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の第９０３位の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【００５８】
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の第９０３位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００５９】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記第９０２位及び第９０３位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記プライマーの組は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０２位及び第９０３位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【００６０】
上記のプライマーの組としては、例えば、それぞれ配列番号９，配列番号１０の塩基配列からなるプライマー（図１のＰｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（GenBank）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、National Bioscience Inc.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）などを用いてプライマーを設計することができる。
【００６１】
各プライマーは、例えばホスホロアミダイト法などの公知の方法によって合成することができ、例えばApplied Biosystems Inc.の３９２型シンセサイザーなどを取扱説明書に従って使用することによって簡単に合成することができる。
【００６２】
なお、上記の各プライマーには、蛍光標識が付されていてもよい。プライマーに蛍光標識が付されている場合、ダイプライマー法によって、放射性同位元素を用いることなく増幅領域の塩基配列を決定することができる。
【００６３】
一方、各プライマーに蛍光標識が付されていない場合、ダイターミネータ法によって塩基配列を決定することができる。この場合、上記妊孕性診断キットには、上記のプライマーの組に加えて、Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるデオキシリボ核酸、蛍光標識されＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃの各単量体からなるジデオキシリボ核酸（所謂ダイターミネータ）、及びポリメラーゼなどがさらに含まれていてもよい。
【００６４】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０３位の塩基の欠失変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。インベーダー法の詳細については、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖらによる論文（Lyamichev V et al., Nat biotechnol. 17, 292, 1999）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００６５】
図２は、インベーダー法の原理を説明する模式図である。インベーダー法では、非蛍光標識プローブのインベーダープローブ２及びシグナルプローブ３と、蛍光標識プローブのフレットプローブ５とが用いられる。
【００６６】
インベーダープローブ２は、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａと対応するように設計される。一方、シグナルプローブ３は、ターゲット遺伝子１とは無関係な塩基配列であるフラップ５ａと、ターゲット遺伝子１と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がターゲット遺伝子１の変異（又は一塩基多型）検出部位１ａに対応するように設計されたヌクレオチド５ｂとが連結したものである。ここで、フラップ５ａは、ヌクレオチド５ｂの５’末端側に連結されている。
【００６７】
このように設計されたプローブ２・３をターゲット遺伝子１とハイブリダイゼーションさせると、変異検出部位１ａでは、ターゲット遺伝子１、インベーダープローブ２及びシグナルプローブ３が３重鎖を形成する。すると、フラップエンドヌクレアーゼ（「クリアベース（cleavase）」ともいう）４がこの３重鎖を認識し、シグナルプローブ３を３重鎖の３’側で切断する。その結果、フラップ３ｂと変異検出部位とが連結したフラップ遊離体３ｃが生成される。
【００６８】
フレットプローブ５は、５’末端側が自身とハイブリダイゼーションでき、かつ、３’末端側がフラップ３ｂとハイブリダイゼーションできるヌクレオチド５ａと、蛍光色素５ｂと、クエンチャー（発光抑制体）５ｃとからなる。ここで、ヌクレオチド５ａは、５’末端がフラップ遊離体３ｃの変異検出部位と相補的な塩基配列となっている。また、蛍光色素５ｂは、ヌクレオチド５ａの５’末端に結合している。ただし、フレットプローブ５においては、クエンチャー５ｃにより蛍光色素５ｂの蛍光が抑制されている。
【００６９】
このようなフレットプローブ５に対してフラップ遊離体３ｃがハイブリダイゼーションすると、フラップ遊離体３ｃの変異検出部位について、再び３重鎖が形成される。その結果、上述のフラップエンドヌクレアーゼ４がこの３重鎖を再び認識し、フレットプローブ５の５’末端部分が切断される。その結果、フレットプローブ５の５’末端に結合していた蛍光色素５ｂが遊離し、蛍光が生じる。
【００７０】
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の欠失変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ２、シグナルプローブ３及びフレットプローブ５などが含まれることが好ましい。
【００７１】
欠失変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ２は、配列番号１に示す塩基配列からなるヒトＴＳＳＫ２遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位の塩基と対応するように設計される。また、シグナルプローブ３のヌクレオチド３ａは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基がヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基と対応するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記シグナルプローブ３が変異型ＴＳＳＫ２遺伝子とハイブリダイズして３重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体５ｃを検出できるように設計される。
【００７２】
上記の構成により、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基が欠失している場合は、オリゴヌクレオチド３ａの３’末端とインベーダープローブ２の５’末端とがオーバーラップすることにより３重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子が野生型である場合は、プローブの末端部分で３重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
【００７３】
また、上記の例では、被験者の有するＴＳＳＫ２遺伝子が欠失変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＴＳＳＫ２遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、欠失変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよく、様々に改変することができる。
【００７４】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の上記第９０３位の塩基の欠失変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。ＳＭＭＤ法の詳細については、Ｗａｋａｉらによる論文（Wakai J et al., Nucleic Acids Res., 2004. 32(18), e141.）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００７５】
図３は、ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。ＳＭＭＤ法は、電気化学的反応を利用して一塩基多型、置換変異、欠失変異、又は挿入変異などを検出するものである。まず、図１に示すように、被験者のゲノムＤＮＡ１１を鋳型として変異検出部位を含む領域をＰＣＲによって増幅させるため、カウンタープライマー１３と特別プライマー１２とを１：４の割合で用いて非対称ＰＣＲを行う（工程Ａ）。ここで、特別プライマー１２は、変異を検出したい遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、遺伝子１１の変異検出部位１１ａよりも１塩基下流の塩基から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする塩基よりも１塩基上流の塩基までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結されている。
【００７６】
上記の非対称ＰＣＲの結果、工程Ｂに示すＰＣＲ産物１４が生成される（工程Ｂ）。このＰＣＲ産物１４のうち、特別プライマー５を含む一本鎖の非対称ＰＣＲ産物１４は、タグ１２ｂを含んでいるため、自己ループを形成して特別ターゲットを形成する（工程Ｃ・Ｄ）。
【００７７】
次に、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０を用意する。プローブ２０・３０は、ともに、変異を検出したい遺伝子１１と同一の塩基配列を有し、かつ、変異検出部位１１ａ・１１ｂを３’末端とするオリゴマーを金電極２５に固定したものである。ここで、変異型プローブ２０はオリゴマーの３’末端が変異型の塩基配列（図中ではＣ）となっているのに対して、野生型プローブ３０はオリゴマーの３’末端が野生型の塩基配列（図中ではＡ）となっている。これらの変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、オリゴマーが上述した特別ターゲット１５の３’末端側と相補的な塩基配列を有しているため、特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションすることができる。なお、金電極２５にオリゴマーを固定するための詳細な方法は、Ｔａｋｅｎａｋａらによる論文（Takenaka S et al., Anal Chem., 2000, 72, 1334-1341）に記載されており、本明細書ではこれを援用する。
【００７８】
プローブ２０・３０を特別ターゲット１５とハイブリダイゼーションさせる前に、フェロセニルナフタレンジイミド（ferrocenylnaphtalene diimide；以下「ＦＮＤ」と略称する）を含む溶液中で、予めバックグラウンド応答を行い、電流Ｉ０を測定しておく（工程Ｅ）。
【００７９】
そして、特別ターゲット１５と変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０とのハイブリダイゼーション及びライゲーションを行う。ここで、特別ターゲット１５が変異型のものである場合（すなわち、被験者が変異型遺伝子を有している場合）、特別ターゲット１５は変異型プローブ２０と塩基配列が完全に一致するのでライゲーションが行われる一方で、野生型プローブ３０とは塩基配列が末端部分で相違するのでライゲーションが行われない（工程Ｆ）。
【００８０】
その後、変性処理を行うと、野生型プローブ３０と変異型の特別ターゲット１５との組では、野生型プローブ３０から変異型特別ターゲット１５が解離する。一方、変異型プローブ２０と変異型の特別ターゲット１５との組では、ライゲーションが行われているので、解離が起こらない（工程Ｇ）。
【００８１】
そして、それぞれのサンプルを洗浄して余剰のＤＮＡを除去し、ＦＮＤを添加して、ＦＮＤ分子の電気化学的電流Ｉ１を測定する（工程Ｈ）。ここで、２本鎖ＤＮＡを有する電極では、１本鎖ＤＮＡを有する電極に比べて電流Ｉ１が大きくなる（工程Ｉ）。
【００８２】
これにより、被験者のゲノムＤＮＡが変異型であるか野生型であるかを測定した電流値に基づいて判定することができる。なお、ＳＭＭＤ法では、上記の変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０をＥＣＡ（Electrochemial array）チップとしてアレイ状に形成することにより、多数の変異を同時進行的に検出することができる。
【００８３】
従って、本発明に係る妊孕性診断キットがＳＭＭＤ法により上記の欠失変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー１２、カウンタープライマー１３、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、何れか一方のみでもよい。
【００８４】
上記特別プライマー１２ａは、配列番号１に示すヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位よりも下流の所定領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０４位から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結される。一方、上記カウンタープライマー１３は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０２位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
【００８５】
また、上記変異型プローブ２０は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第９０２位の塩基が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ３０は、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、第９０３位の塩基が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
【００８６】
上記の構成によれば、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子が欠失型の場合、特別ターゲット１５は、変異型プローブ２０とライゲーションできるが、野生型プローブ３０とは、１塩基分のオーバーラップが生じるためにライゲーションできない。一方、被験者のＴＳＳＫ２遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット１５は、野生型プローブ３０とライゲーションできるが、変異型プローブ３０とは、１塩基分の隙間が生じるためにライゲーションできない。
【００８７】
なお、上記の各方法において、ＴＳＳＫ２遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって欠失変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【００８８】
本明細書では、ヒト野生型ＴＳＳＫ２遺伝子の代表的な塩基配列として、配列番号１に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトＴＳＳＫ２遺伝子」は、配列番号１に示された塩基配列のみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載のヒトＴＳＳＫ２遺伝子には、配列番号１に示される塩基配列のみならず、配列番号１に示される塩基配列において一塩基多型により１又は複数の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。このことは、ヒト欠失変異型ＴＳＳＫ２遺伝子についても同様である。
【００８９】
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第９０３位の塩基が欠失した塩基配列からなることを特徴とするものである。
【００９０】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号３に示す塩基配列に限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号３に示される塩基配列のみならず、配列番号３に示される塩基配列において一塩基多型により１又は複数の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【００９１】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」、または「核酸分子」と同義であり、ヌクレオチドの重合体を指す。本明細書において、「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と同義であり、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。
【００９２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の何れであってもよい。さらに、ＤＮＡの場合、二本鎖、一本鎖の何れであってもよい。さらに、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）でもよいし、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）でもよい。
【００９３】
なお、本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’末端又は３’末端に、タグ標識（タグ配列又はマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドが連結されていてもよい。
【００９４】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。具体的には、上記第９０３位の塩基が欠失した変異型ＴＳＳＫ２遺伝子を有している人のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、野生型ＴＳＳＫ２遺伝子から得ることもできる。
【００９５】
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【００９６】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドからヒト変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【００９７】
上記発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【００９８】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を回収・精製することができる。
【００９９】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１００】
上記組換えベクターを使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を選択的に合成することができる。
【０１０１】
また、本発明に係る発現キットは、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を細胞に発現させるために用いられるキットである。
【０１０２】
上記発現キットには、上記の組換えベクター以外の他の試薬を含んでいてもよい。他の試薬としては、例えば、組換えベクターを宿主細胞に導入するための導入用試薬、その宿主細胞、組換えベクターが宿主細胞内に導入されているかどうかを検定するためのプローブ群などが挙げられるがこれに限定されない。つまり、変異型ＴＳＳＫ２タンパク質の発現実験を、確実かつ簡便にできるように支援する試薬であればどのようなものが含まれていてもよい。本発明に係る発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型ＴＳＳＫ２タンパク質を発現させることができる。
【０１０３】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係る第１のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするものである。
【０１０４】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号４に示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号４に示されるアミノ酸配列において一塩基多型により１又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。
【０１０５】
本明細書において、「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と同義である。また、本発明に係るポリペプチドは、天然供給源より単離したものであっても、化学合成したものであってもよい。
【０１０６】
「単離した」ポリペプチドとは、天然の環境から取り出されたポリペプチドを指す。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生ポリペプチドは、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドの利用方法に従って取得することができる。
【０１０７】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）において組換え技術によって産生された産物を含む。なお、本発明に係るポリペプチドは、組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、グリコシル化されたり、非グリコシル化されたりしたものであってもよい。さらに、本発明に係るポリペプチドは、宿主媒介プロセスの結果として、翻訳開始を示すメチオニン残基が改変されたものであってもよい。
【０１０８】
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる欠失変異型ＴＳＳＫ２タンパク質が得られる。従って、ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位の塩基の欠失変異に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を開発する上で、極めて有用なツールを得ることができる。
【０１０９】
（２．ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子における欠失変異）
ＨＡＳＰＩＮは、”haploid germ cell-specific nuclear protein kinase”の略称であり、本明細書ではこの略称を用いることとする。なお、ＨＡＳＰＩＮは、ＧＳＧ２（germ cell-specific gene 2; germ cell associated 2）と称されることもある。ＨＡＳＰＩＮタンパク質は、上述したように、半数生殖細胞の核に局在し、減数分裂期の染色体及び紡錘体の機能の制御に関与していると考えられている。
【０１１０】
図４は、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の構造を示す模式図である。ヒトゲノムプロジェクトによって構築されたヒトゲノムリソースによれば、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子は、イントロンを持たないレトロポゾン様遺伝子であり、ヒト１７番染色体短腕（１７ｐ１３）に位置している。この遺伝子の転写産物は約２．８ｋｂである。
【０１１１】
配列番号５は、ジーンバンク（GenBank）にアクセッション番号gi56790918で登録されているヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の転写産物の塩基配列の中から、翻訳領域のみを抽出したものである。配列番号５に示すように、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子は、２３９７ｂｐからなる翻訳領域を有している。また、配列番号６は、ヒトＨＡＳＰＩＮタンパク質の推定アミノ酸配列を示すものである。
【０１１２】
本願発明者らは、後述する実施例に示す調査の結果、男性不妊症患者からなる集団の中に、配列番号５に示すヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の翻訳領域の第２０４位のＣと第２０５位のＣとの間にアデニン塩基（以下、単に「Ａ」という）が挿入されている患者がいることを見出した。この挿入は、片方のアレルにおいてのみ生じていた。一方、この第２０４位のＣと第２０５位のＣとの間へのＡの挿入は、妊孕性が確認されている男性からなる集団では全く見られなかった。
【０１１３】
ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子に上記の挿入変異が起こると、正常なＨＡＳＰＩＮタンパク質は発現しない。それゆえ、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位と第２０５位の間へのＡの挿入変異は、たとえ片方のアレルのみに起こっている場合であっても、正常なＨＡＳＰＩＮタンパク質の翻訳量の低下などに基づき不妊を引き起こす可能性が高いと考えられる。
【０１１４】
よって、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子について上記挿入変異の有無を調べ、挿入変異が見つかった場合には、その被験者が不妊症或いは低妊孕性であると考えられる。そして、不妊症或いは低妊孕性であると判定された被験者に対しては、ＩＣＳＩなどの現存の治療法の適格な選択を提示することができる。
【０１１５】
以上のことから、本発明に係る変異検出方法は、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出する工程を含んでいることを特徴とするものである。
【０１１６】
また、本発明に係る妊孕性診断キットは、翻訳開始コドンをコードするアデニンを第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出する試薬を含んでいることを特徴とするものである。
【０１１７】
以下では、（１．ヒトＴＳＳＫ２遺伝子における欠失変異）の項で述べ、そのまま本項にも適用できる事項については説明を省略する。
【０１１８】
上記変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間の挿入変異の有無を検出するものであれば、その態様は特に限定されるものではない。変異検出方法及び妊孕性診断キットは、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子が上記の挿入変異を含んでいることを検出するものであってもよいし、上記の挿入変異を含んでいないことを検出するものであってもよい。
【０１１９】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位及び第２０５位の塩基を含む領域の塩基配列を決定することにより、上記の挿入変異の有無を検出するものであってもよい。塩基配列の決定には、サンガー法やこれを応用した公知の各種手法を用いることができる。
【０１２０】
この場合、妊孕性診断キットには、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位及び第２０５位の塩基を含む領域を増幅させるために、上記第２０４位及び第２０５位の塩基を挟むようにして設計されたプライマーの組が含まれることが好ましい。このプライマーの組には、より詳細には、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位よりも上流の塩基配列を有するプライマーと、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位よりも下流の塩基配列と相補的な塩基配列を有するプライマーとが含まれる。被験者のゲノムＤＮＡを鋳型として上記のプライマーの組を用いてＰＣＲを行えば、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位及び第２０５位の塩基を含む領域がＤＮＡフラグメントとして増幅され、さらに、上記のプライマーの組の一方又は両方のプライマーを用いて塩基配列の決定を行えば、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間に起こる挿入変異の有無を確実かつ簡便に検出することができる。
【０１２１】
なお、それぞれのプライマーは、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と同一の塩基配列、或いは相補的な塩基配列を少なくとも１０塩基以上有することが好ましく、１５塩基以上有することがより好ましく、１８塩基以上有することがさらに好ましく、２０塩基以上有することが特に好ましい。ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と同一の（或いは相補的な）塩基配列の長さを長くすることにより、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位及び第２０５位の塩基を含む目的の領域のみを確実に増幅させることができる。
【０１２２】
また、上記のプライマーの組は、互いのプライマーによって挟まれる領域の長さが５ｋｂ以下であることが好ましく、３ｋｂ以下であることがより好ましく、２ｋｂ以下であることがさらに好ましく、１．５ｋｂ以下であることが特に好ましい。互いのプライマーによって挟まれる領域の長さを短くすることによって、上記の第２０４位及び第２０５の塩基を含む領域の増幅を効果的に行うことができる。
【０１２３】
また、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の第２０４位の塩基から２ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．５ｋｂ以内の位置に設定されることが好ましく、１．０ｋｂ以内の位置に設定されることがより好ましく、０．７ｋｂ以内の位置に設定されることが特に好ましい。上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１２４】
さらに、塩基配列の決定に用いるプライマーは、上記の第２０４位の塩基から２０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが好ましく、３０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがより好ましく、４０ｂｐ以上離れた位置に設定されることがさらに好ましく、５０ｂｐ以上離れた位置に設定されることが特に好ましい。また、上記のプライマーの組は、また、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の上記第２０４位及び第２０５位の塩基を含む２０ｂｐ以上の領域を増幅させるものであることが好ましい。プライマーの近傍は、塩基配列の決定結果が不正確になる傾向にあるが、上記の構成により、塩基配列の決定を正確に行うことができる。
【０１２５】
上記のプライマーの組としては、例えば、配列番号１１及び配列番号１２の塩基配列からなるプライマーの組（図４のＰｒｉｍｅｒ３及びＰｒｉｍｅｒ４）を用いることができるが、本発明に用いることのできるプライマーの塩基配列がこの配列に限定されないことはいうまでもない。ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の塩基配列及びその周辺の塩基配列は、当業者であれば上述したヒトゲノムリソースやジーンバンク（GenBank）から容易に入手することができるので、入手した塩基配列を基に、Ｏｌｉｇｏ（登録商標、National Bioscience Inc.）又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発）などを用いてプライマーを設計することができる。
【０１２６】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子における挿入変異の有無をインベーダー法によって検出するものであってもよい。
【０１２７】
本発明に係る妊孕性診断キットがインベーダー法により上記の挿入変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、インベーダープローブ２、シグナルプローブ３及びフレットプローブ５などが含まれることが好ましい。
【０１２８】
挿入変異が有る場合に蛍光が生じるようにする場合、インベーダープローブ２は、配列番号７に示す塩基配列からなる変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、３’末端の塩基が変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位の塩基（野生型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子にはない挿入塩基）と対応するように設計される。また、シグナルプローブ３のヌクレオチド３ａは、変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と相補的な塩基配列を有し、かつ、５’末端の塩基が変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位の塩基と対応するように設計される。そして、フレットプローブ５は、上記インベーダープローブ２及び上記シグナルプローブ３が変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子とハイブリダイズして３重鎖構造が形成された場合にフラップエンドヌクレアーゼ４によって切断されるフラップ遊離体５ｃを検出できるように設計される。
【０１２９】
上記の構成により、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位と第２０５位との間にＡが挿入されている場合は、オリゴヌクレオチド３ａの３’末端とインベーダープローブ２の５’末端とがオーバーラップすることにより３重鎖が形成されて蛍光が生じる。一方、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子が野生型である場合は、プローブの末端部分で３重鎖が形成されないので蛍光が生じない。
【０１３０】
また、上記の例では、被験者の有するＨＡＳＰＩＮ遺伝子が挿入変異型の場合に蛍光が生じる構成としたが、本発明はこれに限定されず、被験者の有するＨＡＳＰＩＮ遺伝子が野生型の場合に蛍光が生じ、挿入変異型の場合に蛍光が抑制される構成としてもよい。
【０１３１】
一実施形態において、本発明に係る変異検出方法及び妊孕性診断キットは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子における挿入変異の有無をＳＭＭＤ法によって検出するものであってもよい。
【０１３２】
本発明に係る妊孕性診断キットがＳＭＭＤ法により上記の挿入変異の有無を検出するものである場合、妊孕性診断キットには、特別プライマー１２、カウンタープライマー１３、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０などが含まれていることが好ましい。なお、変異型プローブ２０及び野生型プローブ３０は、何れか一方のみでもよい。
【０１３３】
上記特別プライマー１２ａは、配列番号５に示すヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位よりも下流の領域と相補的な塩基配列からなるオリゴマー１２ａと、タグ１２ｂとからなる。タグ１２ｂは、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位から、オリゴマー１２ａがハイブリダイゼーションする部位までの領域と相補的な塩基配列を有しており、オリゴマー１２ａの５’末端に連結される。カウンタープライマー１３は、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位よりも上流の所定領域と同一の塩基配列からなる。
【０１３４】
また、上記変異型プローブ２０は、配列番号７に示すヒト変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０５位の塩基が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。また、上記野生型プローブ３０は、野生型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子と同一の塩基配列からなり、かつ、野生型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位の塩基が３’末端になるオリゴマーを有するように設計される。
【０１３５】
上記の構成によれば、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子が挿入型の場合、特別ターゲット１５は、変異型プローブ２０とは配列がマッチしてライゲーションできるが、野生型プローブ３０とは、１塩基分の隙間が生じるためにライゲーションできない。一方、被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子が野生型の場合、特別ターゲット１５は、野生型プローブ３０とライゲーションできるが、変異型プローブ３０とは、１塩基分のオーバーラップが生じるためにライゲーションできない。
【０１３６】
なお、上記の各方法では、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子のセンス鎖（コドンをコードする側の鎖）を調べることによって挿入変異の有無を判定する構成について詳細に説明したが、アンチセンス鎖を調べることによっても同様に判定することができるのはいうまでもない。
【０１３７】
本明細書では、ヒト野生型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の代表的な塩基配列として、配列番号５に示す塩基配列を例示したが、特許請求の範囲に記載の「ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子」は、配列番号５に示された塩基配列のみに限定されない。なぜならば、ヒト遺伝子には多くの一塩基多型が存在し、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子においても例外ではないからである。従って、特許請求の範囲に記載のヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子には、配列番号５に示される塩基配列のみならず、配列番号５に示される塩基配列において一塩基多型により１又は複数の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。このことは、ヒト挿入変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子についても同様である。
【０１３８】
次に、本発明に係るポリヌクレオチドについて説明する。本発明に係るポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンをコードするアデニン塩基を第１位の塩基としたときに、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の翻訳領域の塩基配列において第２０４位の塩基と第２０５位の塩基との間にアデニン塩基が挿入した塩基配列からなることを特徴とするものである。
【０１３９】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号７に示す塩基配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号７に示す塩基配列のみに限定されない。本発明に係るポリヌクレオチドには、配列番号７に示される塩基配列のみならず、配列番号７に示される塩基配列において一塩基多型により１又は複数の塩基が置換された塩基配列のものも含まれる。
【０１４０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法としては、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。具体的には、上記第２０４位と第２０５位との間にＡが挿入した変異型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子を有している人のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって得ることもできるし、また、変異を入れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、野生型ＨＡＳＰＩＮ遺伝子から得ることもできる。
【０１４１】
また、上記ポリヌクレオチドは、組換えベクターに挿入されていてもよい。この組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１４２】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択できる。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドからヒト変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１４３】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を回収・精製することができる。
【０１４４】
上記組換えベクターを使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを生物または細胞に導入することができ、結果として当該生物または細胞中に変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を発現させることができる。さらに、上記組換えベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を選択的に合成することができる。
【０１４５】
また、本発明に係る発現キットは、上述した組換えベクターを含み、かつ、上述した変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を細胞に発現させるために用いられるキットである。本発明に係る発現キットを用いることにより、目的の宿主細胞において、確実に、かつ簡便に、変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質を発現させることができる。
【０１４６】
また、本発明に係るポリペプチドは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなることを特徴とするものである。
【０１４７】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列からなるものであってもよい。ただし、本発明に係るポリペプチドは、配列番号８に示すアミノ酸配列に限定されない。本発明に係るポリペプチドには、配列番号８に示されるアミノ酸配列のみならず、配列番号８に示されるアミノ酸配列において一塩基多型により１又は複数のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列のものも含まれる。
【０１４８】
本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター、又はポリペプチドによれば、ヒトの不妊症患者に見られる挿入変異型ＨＡＳＰＩＮタンパク質が得られる。従って、ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位と第２０５位との間の塩基の挿入変異に起因する不妊症の治療を目的とした薬剤及び治療方法を研究する上で、極めて有用なツールを得ることができる。
【０１４９】
以下に、実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１５０】
（３．ヒトＴＳＳＫ２遺伝子における欠失変異の解析）
（３−１．材料及び方法）
（３−１−ａ．参加者）
不妊症の日本人男性被験者（Ｎ＝２８２）を精子形成の欠損の程度に基づいてサブグループに分割した。これらの不妊症被験者のうち、１９２人（６８％）は非閉塞性無精子症であり、９０人（３２％）は重症精子過少症（＜５×１０６細胞／ｍＬ）であった。遺伝的要因を調べたところ、これらの被験者は何れも原発性特発性不妊症であった（Birmingham A et al. Fertil Steril 2004; 9: 2313-2317）。
【０１５１】
一方、妊孕性が確認された男性のコントロールグループ（Ｎ＝２７０）として、産婦人科医院にいる妊婦のもとに生まれた子供の父親を選択した。
【０１５２】
なお、ドナーは、本研究において血液をゲノムＤＮＡの解析に使用することに同意した。
【０１５３】
（３−１−ｂ．ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＴＳＳＫ２遺伝子の変異の同定）
ゲノムＤＮＡは、プロテアーゼ処理及びフェノール抽出により血液サンプルから単離した（Sambrook J et al., Isolation of DNA from Mammalian Cells. New York: Cold Spring Harbor Press. 1989: pp. 9.16-9.21）。ＰＣＲに用いるプライマーの組としては、Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２を設計した（図１参照）。Ｐｒｉｍｅｒ１は、ＴＳＳＫ２遺伝子の＋６６２〜＋６８２（翻訳開始点を＋１とする）と同一の塩基配列（配列番号９；５’−ＴＣＡＧＧＡＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＴＡＴＣＣ−３’）からなる。Ｐｒｉｍｅｒ２は、ＴＳＳＫ２遺伝子の下流領域（ＴＳＳＫ２遺伝子の翻訳開始点を＋１とすると＋１２４９〜＋１２７３の領域）と相補的な塩基配列（配列番号１０；５’−ＧＧＴＣＡＧＴＡＡＧＧＡＡＣＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣ−３’）からなる。
【０１５４】
ＰＣＲは以下の条件で行った：９８℃で１０秒間変性、６２℃で３０秒間アニーリング、及び７２℃で１分間伸長を１サイクルとして、これを３５サイクル。ＰＣＲ増幅フラグメントはＳＵＰＲＥＣ  ＰＣＲスピンカラム（タカラバイオ）を用いて精製した。
【０１５５】
Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２からなるプライマーの組によって増幅したフラグメントに対して、同じＰｒｉｍｅｒ１，Ｐｒｉｍｅｒ２を用いて、それぞれ両端から配列を決定した。このとき、サーマルサイクルシーケンシングキット（アプライドバイオシステムズ）を用いて反応を行い、反応産物をＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ）によって解析した。両方向の決定結果を比較し、塩基配列を決定した。
【０１５６】
（３−２．結果）
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、血液サンプル由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ１及びＰｒｉｍｅｒ２からなるプライマーのセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングを行った。これにより、不妊被験者及び妊孕性確認被験者のＴＳＳＫ２遺伝子の塩基配列を解析した。
【０１５７】
その結果、ＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位のシトシン塩基が片方のアレルにおいて欠失している被験者が、不妊症被験者の中に１人見出された。この被験者は、無精子症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、上記の欠失変異が全く見出されなかった。
【０１５８】
配列番号１に示すヒトＴＳＳＫ２遺伝子の第９０３位のシトシン塩基が欠失すると、配列番号３に示す塩基配列となり、配列番号２に示すＴＳＳＫ２タンパク質の第３０２位以降のアミノ酸が変異する（配列番号４参照）。
【０１５９】
ＴＳＳＫ２遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞特異的に発現することから、ＴＳＳＫ２タンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考えられる。従って、欠失変異が見出された上記被験者は、正常なＴＳＳＫ２タンパク質の翻訳量が低減したことにより、無精子症になったものと推測された。
【０１６０】
なお、本研究により、上記の欠失変異以外にも様々な一塩基多型がＴＳＳＫ２遺伝子内見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、特に妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【実施例２】
【０１６１】
（４．ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子における欠失変異の解析）
（４−１．材料及び方法）
（４−１−ａ．参加者）
参加者については、実施例１と同様である。
【０１６２】
（４−１−ｂ．ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによるＴＳＳＫ２遺伝子の変異の同定）
ＰＣＲに用いるプライマーの組としては、Ｐｒｉｍｅｒ３及びＰｒｉｍｅｒ４を設計した（図４参照）。Ｐｒｉｍｅｒ３は、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の５’非翻訳領域における−３０〜−９（翻訳開始点を＋１とする）と同一の塩基配列（配列番号１１；５’−ＴＧＣＧＴＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧ−３’）からなる。Ｐｒｉｍｅｒ４は、ＨＡＳＰＩＮ遺伝子の＋６６１〜＋６８０と相補的な塩基配列（配列番号１２；５’−ＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧ−３’）からなる。
【０１６３】
それ以外については、実施例１と同様である。
【０１６４】
（４−２．結果）
不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のそれぞれについて、血液サンプル由来のゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｐｒｉｍｅｒ３及びＰｒｉｍｅｒ４からなるプライマーのセットを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ増幅ＤＮＡのダイレクトシーケンシングを行った。これにより、不妊症被験者及び妊孕性確認被験者のＨＡＳＰＩＮ遺伝子の塩基配列を解析した。
【０１６５】
その結果、片方のアレルにおいてＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位のシトシン塩基と第２０５位のシトシン塩基との間にアデニン塩基が挿入されている被験者が、不妊症被験者の中に１人見出された。この被験者は、無精子症であった。一方、妊孕性確認被験者からは、上記の挿入変異が全く見出されなかった。
【０１６６】
配列番号５に示すヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の第２０４位と第２０５位との間にアデニン塩基が挿入されると、配列番号７に示す塩基配列となり、配列番号６に示すＨＡＳＰＩＮタンパク質の第６９位以降のアミノ酸が変異する（配列番号８参照）。
【０１６７】
ＨＡＳＰＩＮ遺伝子は哺乳類に広く保存されていること、並びに、そのタンパク質が精巣の半数体生殖細胞において特に強く発現することから、ＨＡＳＰＩＮタンパク質の変異は、男性不妊を引き起こす（或いは引き起こしやすい）と考えられる。従って、挿入変異が見出された上記被験者は、正常なＨＡＳＰＩＮタンパク質の翻訳量が低減したことにより、無精子症になったものと推測された。
【０１６８】
なお、本研究により、上記の挿入変異以外にも様々な一塩基多型がＨＡＳＰＩＮ遺伝子内に見出されたが、これらの一塩基多型は、そのパターンが不妊症被験者と妊孕性確認被験者との間で有意な相違を見せず、妊孕性に影響を与えるものとは認められなかった。
【０１６９】
本発明は上述した実施形態及び実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明に係る妊孕性診断キットは、妊孕可能性の推定及び不妊症の原因の同定に用いることができるので、医療現場において利用可能である。
【０１７１】
また、本発明に係るポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、上述した遺伝子の変異に基づく不妊症患者において見られる変異型のポリペプチドを提供するものである。従って、この変異型のポリペプチドを利用して研究を行うことにより、有効な薬剤や治療法の確立が期待される。これらのポリヌクレオチド、発現ベクター及びポリペプチドは、研究現場へ販売することができ、十分に産業上利用可能である。また、これらをキット化することにより、産業上の利用可能性は一層向上する。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ヒトＴＳＳＫ２遺伝子の構造を示す模式図である。
【図２】インベーダー法の原理を説明する模式図である。
【図３】ＳＭＭＤ法の原理を説明する模式図である。
【図４】ヒトＨＡＳＰＩＮ遺伝子の構造を示す模式図である。
【図１】
2008067649.tif 000002
【図２】
2008067649.tif 000003
【図３】
2008067649.tif 000004
【図４】
2008067649.tif 000005
【配列表】
2008067649000001.app