(57)【要約】【課題】近年、免疫研究が進むにつれて、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスが病気の発症や進展に重要な働きを持つと推測されている。最近では、生活環境からＴｈ２の亢進する傾向が強く、例えば、癌、免疫不全、喘息、皮膚炎、アレルギー疾患、腎炎、感染症等が、そのＴｈ２の機能亢進が関与し発症すると考えられている。本発明は、副作用などの問題が無く、ヘルパーＴ細胞型産生サイトカイン調節することのできる安全性の高い新規なＴｈ１誘導剤を提供することを目的とする。【解決手段】免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施すことにより上記課題を解決する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施すことで、抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生能を増強する方法。
【請求項２】
請求項１記載の処置を施した免疫抗原物質を有効成分とするＴｈ１誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施すことで、抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生能を増強する方法と、当該処置を施したＴｈ１誘導剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈと略す）は、機能的にI型ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ１と略す）とＩＩ型ヘルパーＴ細胞（以下、Ｔｈ２と略す）に分けられる。
【０００３】
Ｔｈ１は、ＩＦＮ-γ、ＩＬ−１２（インターロイキン−１２）等のＴｈ１型サイトカインを産出し、細菌やウイルスなどの異物を攻撃、破壊して感染を防御し、さらにマクロファージも活性化する。なお、ＩＬ−１２は、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞からも分泌されるサイトカインで、ガン細胞を直接攻撃するナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）や、ラック細胞（ＬＡＫ細胞）、キラーＴ細胞（ＣＴＬ細胞）を活性化したり、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生を増強したりする、非常に強力な免疫活性物質として知られている。
【０００４】
一方、Ｔｈ２は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０等などのＴｈ２型サイトカインを産出し、カビやダニなどに反応してＢ細胞にＩｇＥ抗体を作らせる液性免疫に関与することが知られている。
【０００５】
なお、Ｔｈ１型サイトカインはＴｈ２を抑制し、逆にＴｈ２型サイトカインはＴｈ１を抑制し、この２つは免疫全体のバランスを保つために互いに関係し合っている。
【０００６】
近年、免疫研究が進むにつれて、Ｔｈ１とＴｈ２のバランスが病気の発症や進展に重要な働きを持つと推測されている。最近では、生活環境からＴｈ２の亢進する傾向が強く、例えば、癌、免疫不全、喘息、皮膚炎、アレルギー疾患、腎炎、感染症等が、そのＴｈ２の機能亢進が関与し発症すると考えられている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２１（３），１９９９及び最新医学「自己免疫疾患の臨床１９９８」，３２，１９９８
【０００７】
このような疾患を治療あるいは予防するためにはＴｈ２の活性化の制御、ひいては、Ｔｈ産生サイトカインの調節が非常に重要であると考えられている。
【０００８】
その方法のひとつに、抗原提示細胞に対する免疫抗原刺激によってＴｈ産生サイトカインを調節する方法が開示されている（特許文献１―３参照）。
【特許文献１】特開平成11-228425号公報
【特許文献２】特開2006-016336号公報
【特許文献３】特開2006-131623号公報
【０００９】
たとえば、乳酸菌を免疫抗原物質として用いた場合、マクロファージによる乳酸菌貪食率と、ＩＬ−１２産生誘導能との間には、正の相関関係が存在することが開示されている（非特許文献２参照）。
【非特許文献２】若林英行ら，マウス細胞およびヒト末梢血単核球を用いたL.paracasei  KW3110株の抗アレルギー効果の解析，日本農芸化学会２００６年３月２６日発表
【００１０】
さらに、抗原提示細胞による粒子の貪食とその粒子径との関係については、ラテックスビーズを用いた研究によって、パイエル板に取り込まれる抗原総重量は、その粒子径が１１ミクロンまでは増加し、それ以上になると減少して粒子径が２１ミクロン以上になると全く取り込まれなくなることが開示されている（非特許文献３参照）。
【００１１】
しかし、抗原粒子総数の場合には、小さい粒子径の方が多くなり、粒子径が０．６ミクロン程度の場合に最も取込量が多くなることが開示されている（非特許文献３参照）。
【００１２】
さらに、７ミクロン程度の粒子径がＴｈ２型サイトカインによって誘導されるＩｇＧ、ＩｇＡといった抗体を効率よく産生する上で最も好ましいことが開示されている（非特許文献３参照）。
【非特許文献３】Tabata  Y，Inoue  Y，Ikada  Y．Vaccine．1996；14：1677-1685
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
Ｔｈ産生サイトカインを調節する方法には、抗ヒスタミン薬や、ステロイド剤、抗アレルギー剤などが用いられているが、患者の負担や薬の過剰投与による腸内細菌叢の破壊による下痢などの副作用などの問題があり、予防及び治療のいずれの面においても、未だ完全な方法が開発されていないのが現状である。
【００１４】
また、抗原提示細胞に対する免疫抗原刺激によってＴｈ産生サイトカインを調節する方法においても、抗原提示細胞におけるＩＬ−１２の産生は、抗原物質の貪食が阻害されると抑制されてしまうという課題があった（非特許文献３参照）。
【非特許文献２】田野智之ら，癌と化学療法31巻11号，ｐ．１７６７−１７８９．
【００１５】
しかし、抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生能が何に依存するかについては全く情報が開示されていないのが現状である。
【００１６】
このように、抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生能を効率よく増強する方法とＴｈ１誘導剤の提供が強く渇望されている。
【００１７】
そこで、本発明の目的は、従来の問題を解決し、抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生能を効率よく増強する方法とＴｈ１誘導剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、抗原提示細胞によるＩＬ−１２産生能が何に依存するかを鋭意検索した。
【００１９】
その過程で、抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生が免疫抗原粒子の抗原提示細胞への取込総数に依存することを発見し、免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集を防止する加工を施すことで、抗原提示細胞に効率よく取り込ませられるようになり、その結果ＩＬ−１２産生能が増強されることを見出した。
【００２０】
これは、Ｔｈ２型サイトカインによって誘導されるＩｇＧ，ＩｇＡといった抗体産生が免疫抗原粒子の抗原提示細胞への取込総重量に相関することとは異なるメカニズムによるものであり、これに関する知見は当業者のあいだには未だ知られていないことであった。
【００２１】
かくして本発明者は、抗原提示細胞からのＩＬ−１２産生能を増強する方法を完成し、Ｔｈ１誘導剤を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明について詳細に説明する。先ず、本発明は、免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施すことで、抗原提示細胞に効率よく取り込ませられるようになり、その結果ＩＬ−１２産生能を増強し得る方法を提供するものである。その方法のフローを図１に示し、以下詳細に説明する。
【００２３】
本発明の「免疫抗原物質」とは、具体的には免疫抗原となり得る物質であれば、既知、未知を問わず、動物、植物、微生物等の起源や、生体、死体、乾燥体等の形態を限定するものではない。
【００２４】
たとえば、細菌、酵母、糸状菌等の微生物、茸類、植物、動物等が挙げられ、それらから公知の方法で抽出された蛋白質及びグルカン等の構成物質、あるいはそれらが分泌する物質等も含まれる。また、それらの組み合わせであってもよい。
【００２５】
本発明の免疫抗原物質に使用できる細菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus  acidphilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・マリ（L.mali）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus  subtilis）、バチルス・コアグランス（B.coagulans）等のバチルス属細菌、クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium  butilicum）等のクロストリジウム属細菌が例示される。
【００２６】
本発明の免疫抗原物質に使用できる酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyses  cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora  delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等が例示される。
【００２７】
本発明の免疫抗原物質に使用できる糸状菌としては、Aspergillius属あるいはMonascus属、好ましくはA．awamori、A．oryzae、A．niger、A．sojae、A．usami、A．kawachii、A．saitoi等の麹菌が例示される。また、これらの菌株から製造した麹であってもよい。
【００２８】
本発明の免疫抗原物質に使用できる茸類としては、ハナビラタケ、マイタケ、アガリクス、シイタケ、エノキダケ、マツタケ等の菌糸体及び子実体が例示される。
【００２９】
本発明の免疫抗原物質に使用できる動物の分泌物質としては、哺乳動物の母乳に含まれるラクトフェリン、アナツバメが自らの唾液を糸状にして作る巣（燕窩）等が例示される。
【００３０】
本発明の免疫抗原物質に使用できる細菌による分泌物質としては、Lactococcus  lactis  subsp．cremoris乳酸菌及びアウレオバシジウム属（Aureobasidium  sp.）に属する微生物等が細胞外に産生する粘性物質等が例示される。
【００３１】
さらに本発明における免疫抗原物質は、上述の素材にデンプン、カラギーナン、寒天、ゼラチン、蛋白質等の基材を加えて人工的に粒子したものであってもよい。
【００３２】
本発明の「免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化」するとは、免疫抗原物質の平均粒子径が１ミクロン(マイクロメータ)未満のナノメータ（ｎｍ）サイズ、好ましくは０．６ミクロン程度になるまで粉砕あるいは分散することを指す。この粉砕処理と分散処理を別々に行うこともできれば、同時に行うこともできる。なお、当該粒子径が１ミクロン未満であるかどうかは、粒度分布計あるいは電子顕微鏡等で測定することができる。
【００３３】
本発明の「免疫抗原物質の粒度を１ミクロン未満にまで微粒子化」する方式としては、湿式・乾式を問わず、攪拌、ミキサー、ボールミル、ビーズミル、ジェットミル、ホモゲナイザー、ジェネレーター等の公知の手法が挙げられる。
【００３４】
たとえば、細菌のような場合には、細菌培養液を湿式で１５０ｋｇｆ／ｃｍ２程度の高圧ホモゲナイザー等で微粒子化できる。一方、高分子ポリマー性の免疫刺激物質の場合には、当該物質を乾式で微粒子化した場合、それに水を添加すると水分を吸収して数倍に体積が膨張して粒子径がナノメータサイズではなくなることがあるので、湿式で１，０００〜２，５００ｋｇｆ／ｃｍ２程度の高圧ジェネレーターで微粒子化することが好ましい。
【００３５】
本発明の「当該粒子に再凝集防止処理を施す」とは、１ミクロン未満に粉砕・分散した微粒子の再凝集を防止するために、粉砕・分散した粒子に、公知の分散剤あるいは賦形剤を添加し、再びミキサー、ホモゲナイザー等で分散処理を施すことを指す。この場合、粉砕・分散処理するときに分散剤あるいは賦形剤をあらかじめ添加しておいてもよい。
【００３６】
この場合、使用する分散剤・賦形剤の添加量は、免疫抗原物質の性状によって変化するが、重量換算で１〜１００倍量、好ましくは４〜１０倍量が例示できる。
【００３７】
なお、本発明のＴｈ１誘導剤を最終的に粉末として得る場合には、公知の分散剤・賦形剤等で粒子が再凝着しないような処理を施してから凍結乾燥あるいは減圧噴霧乾燥すると分散性に優れた粉末を得ることができる。
【００３８】
つぎに、本発明はＴｈ１誘導剤をも提供するものである。
【００３９】
本発明における「Ｔｈ１誘導」とは、抗原提示細胞からＩＬ−１２を効率よく産生させることで、Ｔｈ０細胞（ナイーブＴｈ細胞）のＴｈ１への分化を促進し、生体内でＴｈ１優位の状態をつくり出すことを指す。
【００４０】
本発明の「Ｔｈ１誘導剤」は、１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施した免疫抗原物質を有効成分とすることを特徴とする。
【００４１】
本発明の「Ｔｈ１誘導剤」は、そのままでも製品とすることもできるが、一般には、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。
【００４２】
本発明の「Ｔｈ１誘導剤」に添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味のＴｈ１誘導剤を得ることができる。
【００４３】
また、本発明の「Ｔｈ１誘導剤」に添加することのできるフレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から０.０５〜０.５質量％、特に０.１〜０.３質量％程度が好ましい。
【００４４】
以上説明した「Ｔｈ１誘導剤」は、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。
【００４５】
本発明の「Ｔｈ１誘導剤」は、医薬的に受容な塩、賦形剤、保存剤、着色剤、矯味剤等とともに、医薬品あるいは食品の製造分野において公知の方法によって、飲料、顆粒、錠剤、カプセル剤等の種々の形態で使用することができる。
【００４６】
また、本発明における「Ｔｈ１誘導剤」は、健康食品に利用することができる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康維持・増進等の目的とした食品を意味し、例えば、液体又は半固形、固形の製品、具体的には、クッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、栄養飲料、スープ等が挙げられる。
【００４７】
本発明におけるＴｈ１誘導剤の使用量は、使用した免疫抗原物質の種類及び品質、あるいは年齢、症状等によって異なる。例えば、予防のために用いるには、成人１回につき固形分換算で０．０１〜１０ｇ程度が挙げられ、食前３０分位に１日３回服用するのが望ましい。また、健康食品としての使用時には、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば、対象となる食品１ｋｇに対し、固形分換算で０．１〜１００ｇ程度の範囲で用いることが適当である。
【００４８】
さらに、本発明におけるＴｈ１誘導剤は、ローション（化粧水）、化粧用クリーム類、乳液、化粧水、パック剤、スキンミルク（乳剤）、ジェル剤、パウダー、リップクリーム、口紅、アンダーメークアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディリンス、石鹸、クレンジングフォーム、軟膏、貼付剤、ゼリー剤、エアゾール剤等種々の製品形態で皮膚外用剤に利用することもできる。
【００４９】
また、本発明のＴｈ１誘導剤には、下記に示されるような化粧品、医薬部外品、医薬品において通常用いられる各種成分や添加剤を必要に応じて適宜配合することができる。
【００５０】
即ち、グリセリン、ワセリン、尿素、ヒアルロン酸、ヘパリン等の保湿剤；ＰＡＢＡ誘導体（パラアミノ安息香酸、エスカロール５０７等）、桂皮酸誘導体（ネオヘリオパン、パルソールＭＣＸ、サンガードＢ等）、サリチル酸誘導体（オクチルサリチレート等）、ベンゾフェノン誘導体（ＡＳＬ−２４、ＡＳＬ−２４Ｓ等）、ジベンゾイルメタン誘導体（パルソールＡ、パルソールＤＡＭ等）、複素環誘導体（チヌビン系等）、酸化チタン等の紫外線吸収剤・散乱剤；エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、リンゴ酸、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤；サリチル酸、イオウ、カフェイン、タンニン等の皮脂抑制剤；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン等の殺菌・消毒剤；塩酸ジフェンヒドラミン、トラネキサム酸、グアイアズレン、アズレン、アラントイン、ヒノキチオール、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルリチン酸誘導体、グリチルレチン酸等の抗炎症剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（Ｂ1，Ｂ2，Ｂ6，Ｂ12，Ｂ15）、葉酸、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン、ビタミンＣ、ビタミンＤ群（Ｄ2，Ｄ3）、ビタミンＥ、ユビキノン類、ビタミンＫ（Ｋ1，Ｋ2，Ｋ3，Ｋ4）等のビタミン類；アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、リジン、グリシン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、アルギニン、ピロリドンカルボン酸等のアミノ酸及びその誘導体；レチノール、酢酸トコフェロール、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、胎盤抽出液等の美白剤；ブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル等の抗酸化剤；塩化亜鉛、硫酸亜鉛、石炭酸亜鉛、酸化亜鉛、硫酸アルミニウムカリウム等の収斂剤；グルコース、フルクトース、マルトース、ショ糖、トレハロース、エリスリトール、マンニトール、キシリトール、ラクチトール等の糖類；甘草、カミツレ、マロニエ、ユキノシタ、芍薬、カリン、オウゴン、オウバク、オウレン、ジュウヤク、イチョウ葉等の各種植物エキス等の他、油性成分、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色素等を適宜配合することができる。
【００５１】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例１】
【００５２】
〔Ｔｈ１誘導剤の調製〕
乳酸菌Lactobacillus  brevis菌株ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３を公知の方法で培養した。当該培養液から加熱処理菌体を調製し、菌体に対して重量換算で０倍量（無添加），０．５倍量，１倍量，２倍量，４倍量，９倍量のデキストリンを賦形剤として添加し、そのまま凍結乾燥する試料（番号ＡからＦ）と、ミキサーで分散してから凍結乾燥する試料（番号ＧからＬ）を調製した。これらの凍結乾燥試料をそれぞれ乾燥菌体換算で１０ｍｇ／ｍｌになるように精製水を加えて菌体分散液を調製した。手でよく振って攪拌し、１８時間冷蔵庫内に安置した。その結果を図２―Iに示す。
【００５３】
また、各試料の液面下１５ｍｍの上清０．１ｍｌを取り、精製水０．９ｍｌに加え、よく攪拌してからＯＤ６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を図２―IIに示す。
【００５４】
乳酸菌体の浮遊率は、菌体に対して重量換算でデキストリンを賦形剤として４倍量加え、さらにミキサーで分散してから凍結乾燥した試料Ｋにおいて、沈殿物が最も少なく（図２―I）、浮遊率が８８．９％と最も高くなり（図２―II）、粉砕・分散処理と再凝集防止処理の相乗効果が現われていることがわかった。
【００５５】
なお、粒度が小さい粒子の占める割合が高いほど浮遊率が高くなる関係があるので、試料Ｋにおいて粒度が小さい粒子の占める割合が最も高くなったことを示している。そこで、試料Ａ及びＫの全液における菌体粒子の粒度分布を測定した。その結果を図３に示す。
【００５６】
図３に示すように、試料Ａにおいては、粒度重量換算分布の平均値が１，０３６．３±７３．７ｎｍと２，６０７．４±１２６．５ｎｍの２つの粒度ピークが存在し、全体としての平均値は１，７２８．２±７８６．３ｎｍであった。一方、試料Ｋにおいては、粒度重量換算分布の平均値は５５５．８±４０．６ｎｍと、０．６ミクロン付近のごく狭い範囲にしか粒子が分布していなかったことがわかった。これは恐らく試料Ｋにおける０．６ミクロン付近の粒子が乳酸菌体の一次粒子に相当し、それが試料Ａにおいては２倍体と４倍体になって混在しているものと推察される。
【００５７】
〔ＩＬ−１２産生能の比較〕
ＩＬ−１２誘導活性の測定は以下の方法で行った。
（１）試薬の調製
ＰＢＳ：ＮａＣｌ  ８０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ２９ｇ、ＫＣｌ  ２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇを蒸留水に溶解し１Ｌとした。
ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ）：冷凍保存してあるＦＣＳを５６℃ウォーターバスに４０分処理により非働化し、氷冷する。７０μｍセルストレーナーを通し、滅菌容器に入れ冷蔵保存し、１〜２ヵ月程度で使用した。
ＥＴ（−）ＲＰＭＩ１６４０Ｍｅｄｉｕｍ：ＲＰＭＩ１６４０  ３１．２ｇ、ＮａＨＣＯ３３．７５ｇ、ペニシリンＧ−Ｋ（萬有製薬１００万単位）０．１８ｇ、カナマイシン０．１８ｇを注射用水３Ｌに溶解後ＣＯ２ガスを吹き込んだ後０．４５μｍのフィルターでろ過した。
Ｔｕｒｃ染色後：０．０１％ゲンチアナバイオレット水溶液：酢酸：水＝１：１：９８に混合し、冷蔵保存した。
【００５８】
（２）マクロファージの調製
雄のＩＣＲマウス（４〜８Ｗ）の腹腔内に１ｇ／１００ｍｌ濃度のグリセリン溶液を０．４ｍｌ注射し１晩飼育した。マウスを頚椎脱臼で屠殺した後、冷却したＰＢＳを５ｍｌ腹腔内に注射し腹をよくもんだ後、腹腔内液を約４ｍｌ注射器で取り出した。シリコンコートしたスピッツ管に腹腔内液を入れ、冷却遠心機で１２００ｒｐｍ、５分遠心し、上清及び壁面の赤血球を除去した。冷ＰＢＳを加えピペッティングで分散し、８００ｒｐｍ、５分遠心した。上清及び壁面の赤血球を除去した。この操作を更に１回繰り返し最後に１％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェイン社製）を１ｍｌ／マウス加えた。この液を５０μｌとチェルク染色液５０μｌを混合し、血球計算板にて生細胞数を数えた。この数値から１％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０Ｍｅｄｉｕｍを用いて細胞数を１×１０６／ｍｌに調整した（マクロファージ液）。９６穴平底プレートにマクロファージ液を２００μｌずつ入れ、１．５〜５時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【００５９】
（３）ＩＬ−１２の誘導
試料を菌末換算で１ｍｇ／ｍｌになるよう５％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０Ｍｅｄｉｕｍで調整した後、超音波で菌体を分散させた。この液を５％ＦＣＳ加ＥＴ−ＲＰＭＩ１６４０Ｍｅｄｉｕｍで１００倍に希釈し、９６穴Ｕ型プレートに２５０μｌに入れてＣＯ２インキュベーターで１時間保温した。
【００６０】
上記（２）で得たマクロファージ液の上清を抜き、３７℃に保温したＰＢＳで２回洗浄する。これに上記の希釈した菌末液を２００μｌ加え、ＣＯ２インキュベーターで２２時間培養してＩＬ−１２を誘導した。
【００６１】
（４）ＩＬ−１２の測定
ＢＩＯ ＳＯＵＲＣＥ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ社製マウスＩＬ−１２測定キット「Ｃｙｔｏｓｃｒｅｅｎ」を用いて行った。なお、マクロファージのロット差を調整するためにサンプルと同濃度のＯＫ４３２を測定し、その測定値との比活性として表した。なお、ＯＫ４３２とは、「ピシバニール」（商品名、中外製薬株式会社製）として市販されている抗悪性腫瘍剤であり、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群３型）Ｓｕ株をペニシリンＧの存在下、一定条件で処理し、凍結乾燥して得られる菌体製剤である。ＯＫ４３２は、免疫活性測定の際の指標となる物質として当業界で広く使用されているものである。
【００６２】
本発明者は、実施例１で調製した試料Ａ及びＫについてＩＬ−１２誘導能を比較した。その結果を図４に示す。
【００６３】
図４から、試料Ｋには試料Ａの３．５倍強のＩＬ−１２誘導能があることがわかった。このことは、菌体の粒度が小さくなることによって、マクロファージへの抗原取込率が３．５倍に増えたことを意味する。
【００６４】
これらの結果より、乳酸菌の菌体に重量換算で４倍量程度の賦形剤を添加してから分散処理を施し、凍結乾燥することによって分散性に優れた粉末を得ることができ、この粉体をもってマクロファージから効率的にＩＬ−１２を産生させることができるようになることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
このように１ミクロン未満にまで微粒子化し、当該粒子に再凝集防止処理を施した免疫抗原物質を有効成分とするＴｈ１誘導剤は、生体内でＴｈ１優位の状態をつくり出す上で非常に有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】Ｔｈ１誘導剤の製造法を示した図である。
【図２】微粒子化・再凝集防止処理が粒子浮遊率に及ぼす影響を示した図である。
【図３】試料Ａ及びＫの粒度重量換算分布を比較した図である。
【図４】試料Ａ及びＫのＩＬ−１２誘導能を比較した図である。
【符号の説明】
【００６７】
図１―Iにおいて、図中の試料瓶に記載した番号は、デキストリンを賦形剤として添加し、そのまま凍結乾燥した試料（番号ＡからＦ）と、ミキサーで粉砕してから凍結乾燥した試料（番号ＧからＬ）とを示す。なお、デキストリンの添加量については、菌体に対して重量換算で、番号ＡとＧは０倍量（無添加）、番号ＢとＨは０．５倍量、番号ＣとＩは１倍量、番号ＤとＪは２倍量、番号ＥとＫは４倍量、番号ＦとＬは９倍量である。
【図１】
2008195631.tif 000003
【図２】
2008195631.tif 000004
【図３】
2008195631.tif 000005
【図４】
2008195631.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月6日(2007.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
さらに、抗原提示細胞による粒子の貪食とその粒子径との関係については、生分解性ポリ乳酸ビーズを用いた研究によって、パイエル板に取り込まれる抗原総重量は、その粒子径が１１ミクロンまでは増加し、それ以上になると減少して粒子径が２１ミクロン以上になると全く取り込まれなくなることが開示されている（非特許文献３参照）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
さらに、７ミクロン程度の粒子径がＴｈ２型サイトカインによって誘導されるＩｇＧ、ＩｇＡといった抗体を効率よく産生する上で最も好ましいことが開示されている（非特許文献３参照）。一方、脂質ビーズを用いた実験では、粒子径はマクロファージからのＩＬ−１２産生能に影響を及ぼさないことが開示されている（非特許文献４参照）。
【非特許文献３】Tabata  Y，Inoue  Y，Ikada  Y．Vaccine．1996；14：1677-1685.
【非特許文献４】Scholer  N，Hahn  H，Muller  RH，Liesenfeld  O．Int.J.Pharm．2002；231：167-176.
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
また、抗原提示細胞に対する免疫抗原刺激によってＴｈ産生サイトカインを調節する方法においても、抗原提示細胞におけるＩＬ−１２の産生は、抗原物質の貪食が阻害されると抑制されてしまうという課題があった（非特許文献５参照）。
【非特許文献５】田野智之ら，癌と化学療法31巻11号，ｐ．１７６７−１７８９．
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明の免疫抗原物質に使用できる細菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus  acidphilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・マリ（L.mali）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）等のエンテロコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus  subtilis）、バチルス・コアグランス（B.coagulans）等のバチルス属細菌、クロストリジウム・ブチリカム（Clostoridium  butilicum）等のクロストリジウム属細菌が例示される。