(57)【要約】【課題】液体状態であるか乾燥状態であるかを問わず広く適用することが可能であって、抗体を長期にわたって安定化する方法を提供する。【解決手段】抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることを特徴とする、抗体の安定化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることを特徴とする、抗体の安定化方法。
【請求項２】
抗体が液体状態であることを特徴とする、請求項１記載の抗体の安定化方法。
【請求項３】
抗体が乾燥状態であることを特徴とする、請求項１記載の抗体の安定化方法。
【請求項４】
抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、請求項２記載の抗体の安定化方法。
【請求項５】
抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、請求項３記載の抗体の安定化方法。
【請求項６】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸または生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体の安定化方法。
【請求項７】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗体の安定化方法。
【請求項８】
抗体が、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存していることを特徴とする、組成物。
【請求項９】
抗体が液体状態であることを特徴とする、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
抗体が乾燥状態であることを特徴とする、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】
抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、請求項１０記載の組成物。
【請求項１３】
セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸または生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項記載の抗体の組成物。
【請求項１４】
セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、請求項８〜１２のいずれか１項記載の抗体の組成物。
【請求項１５】
抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させる工程を含むことを特徴とする、組成物の製造方法。
【請求項１６】
請求項８〜１４のいずれか１項記載の組成物を含むことを特徴とする診断薬。
【請求項１７】
請求項８〜１４のいずれか１項記載の組成物を含むことを特徴とするバイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体の安定化方法に関する。詳しくは、抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることにより、液体状態または乾燥状態で長期間安定化することが可能な抗体の安定化方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体は、その基質特異性の高さや簡便性から、免疫学的測定用試薬として、臨床診断をはじめ様々な用途に応用されてきた。具体的には例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬などである。これら試薬に適用する抗体は、各種化合物による標識や修飾などを受けることもある。そして、これら試薬は、目的や用途に応じて、液体状態、乾燥状態、または、抗体を担体に固定化し緩衝液などに浸漬した状態、あるいは、乾燥した状態で提供される。
【０００３】
上記のような抗体含有組成物の性能を長期にわたって維持するためには、言うまでもなく抗体の活性を安定に維持することが重要である。例えば、組成物中の抗体活性が時間経過により低下する場合には、所望の組成物の有効期間と抗体の活性低下速度に合わせて、予め過剰量の抗体を添加する方策があるが、多くの場合、このような方策では問題の根本的な解決にはならず、抗体のコストが嵩むことは避けられない。
【０００４】
そこで、一般のタンパク質を含む組成物と同様、抗体含有組成物中にリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩等の塩類、ラクトース、スクロース、トレハロース等の糖類、グリセロール、エチレングリコール、エリスリトール等の多価アルコール、アルギニン、リジン、グリシン等のアミノ酸、脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アルブミン、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質などを共存させることで、安定化を図る方法が多数提案されてきた（例えば、特許文献１〜７）。なかでも、牛血清アルブミンは、その優れた効果から、安定化剤として広く用いられてきた。
【０００５】
しかしながら、牛血清アルブミンは、供給源に制限があり非常に高価であるため、組成物のコスト上昇を招くことになる。また、牛血清アルブミンなどの動物性タンパク質は、ウイルスによる感染の危険があり、安全性が十分に確保できない虞がある。さらには、着色に対する配慮も必要となる。
また、塩類やアミノ酸を溶液中で用いると、溶解度の低さや保存中の析出により、十分量添加することができず、所望の効果が得られない場合がある。また、糖類やアミノ酸を診断薬に適用すると、試薬系に共存する若しくは抗体中に混在する夾雑物質と安定化剤とが意図しない反応を引き起こす場合がある。また、多価アルコールや界面活性剤は、抗原との反応を妨げる場合がある。
さらに、従来提案されている安定化剤の多くは、抗体の種類により安定化効果に差があり、汎用性を欠くものであった。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−３５２６３号公報
【特許文献２】特表昭６３−５００５６２号公報
【特許文献３】特開平６−１８６２３０号公報
【特許文献４】特開平９−８００５１号公報
【特許文献５】特開平１０−２７９５９４号公報
【特許文献６】特表２００１−５０３７８１号公報
【特許文献７】特開２００３−２１５１２７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はこのような現状に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、液体状態であるか乾燥状態であるかを問わず広く適用することが可能であって、抗体を長期にわたって安定化する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成する為に種々検討した結果、抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることにより、抗体を効果的に安定化できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のようなものである。
（１）抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることを特徴とする、抗体の安定化方法。
（２）抗体が液体状態であることを特徴とする、（１）記載の抗体の安定化方法。
（３）抗体が乾燥状態であることを特徴とする、（１）記載の抗体の安定化方法。
（４）抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、（２）記載の抗体の安定化方法。
（５）抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、（３）記載の抗体の安定化方法。
（６）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸または生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体の安定化方法。
（７）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗体の安定化方法。
【００１０】
本発明の別の態様によれば、安定化された抗体を含む組成物が提供される。すなわち、
（８）抗体が、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存していることを特徴とする、組成物。
（９）抗体が液体状態であることを特徴とする、（８）記載の組成物。
（１０）抗体が乾燥状態であることを特徴とする、（８）記載の組成物。
（１１）抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、（９）記載の組成物。
（１２）抗体が担体に固定化されていることを特徴とする、（１０）記載の組成物。
（１３）セリシンおよび／またはその加水分解物が、繭糸または生糸から抽出した天然セリシンに由来するものであることを特徴とする、（８）〜（１２）のいずれかに記載の抗体の組成物。
（１４）セリシン同等物が遺伝子工学的手法により得られたものであることを特徴とする、（８）〜（１２）のいずれかに記載の抗体の組成物。
【００１１】
本発明のさらに別の態様によれば、前記組成物の製造方法が提供される。すなわち、
（１５）抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させる工程を含むことを特徴とする、組成物の製造方法。
【００１２】
本発明のさらにまた別の態様によれば、前記組成物を含む診断薬およびバイオセンサーが提供される。すなわち、
（１６）（８）〜（１４）記載の組成物を含むことを特徴とする診断薬。
（１７）（８）〜（１４）記載の組成物を含むことを特徴とするバイオセンサー。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることにより、液体状態、乾燥状態の如何に関わらず抗体の安定性を効果的に向上させることができる。したがって、抗体を含む組成物の有効性を長期にわたって維持することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の抗体の安定化方法は、抗体を、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物と共存させることを要旨とするものである。
【００１５】
本発明において、抗体は液体状態または乾燥状態にいずれであってもよい。また、抗体は担体に固定化されていてもよい。本明細書において、「液体状態」とは、抗体が液体中に存在することをいい、抗体が液体に完全に溶解している状態、懸濁液のように液体に分散している状態、担体に固定化され、液体に浸漬された状態も包含するものとする。
【００１６】
本発明において「安定化」とは、抗体がある物質と共存した場合（ａ）と共存していない場合（ｂ）において、抗体を一定期間保存した後の該抗体の保持する残存機能が（ａ）＞（ｂ）となるような状態をいう。
例えば、抗体が液体状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
また、抗体が乾燥状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
さらに、抗体が担体に固定化され、かつ、液体に浸漬状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
さらにまた、抗体が担体に固定化され、かつ、乾燥状態で、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）で、適当な温度で一定時間保存した後の残存活性の比率が、（ａ）＞（ｂ）となる状態をいう。
【００１７】
安定化の評価は、例えば、ある物質を共存させた場合（ａ）と、共存させない場合（ｂ）についてそれぞれ残存活性を経時的に測定し、半減期を比較することによって行うことができる。
「適当な温度で一定時間保存」の条件は、上記（ａ）と（ｂ）で残存活性に差があらわれる条件であれば特に限定されないが、好ましくは、診断薬などでの長期保存安定性を念頭に置いた加速（苛酷）試験の条件が選択される。具体的には、「４０℃で２週間保存」、「５０℃で１週間保存」などが挙げられる。時間が許せば、抗体を含む診断薬などが実際に長期保存される温度として汎用される２℃〜１０℃の冷蔵条件下で６ヶ月間以上の保存を選択してもよい。
【００１８】
本発明の一実施態様としては、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２〜７．５）中で、抗体を５０℃で６日間保存した後の残存活性率を、セリシンを共存させることによって、セリシンを共存させない場合に比べて向上させる方法である。
本発明の別の実施態様としては、抗体をポリ塩化ビニル製のアッセイプレートに固定化し、乾燥した状態で、５０℃で８日間保存した後の残存活性率を、セリシンを共存させることによって、セリシンを共存させない場合に比べて向上させる方法である。
上記実施態様において、セリシンに替えてセリシン加水分解物またはセリシン同等物を
用いても良い。また、本発明が上記実施態様に限定されないことは言うまでもない。
【００１９】
ここでセリシンとは、繭糸または生糸に存在する非結晶性の天然タンパク質であり、本明細書においては特に、繭糸または生糸から非加水分解物の状態で抽出されたものをいうものとする。セリシンは、国際公開第２００２／０８６１３３号パンフレットに開示されるアミノ酸配列を有し、３８アミノ酸からなる機能性ペプチドを反復配列として含んでなる。加水分解物とは、該機能性ペプチドを含む天然物由来セリシンを、酸やアルカリなどにより加水分解したものである。また、同等物とは、少なくとも１以上の機能性ペプチドを含むように化学合成されたものや、遺伝子工学的手法により得られたものをいう。さらに、これらにおいては、本発明の安定化作用を損なわない範囲内で、あるいはその特性を改善する目的で、天然型アミノ酸配列に対して、アミノ酸残基が欠失、置換、挿入、付加されたものであってもよい。本発明に用いるセリシンやその加水分解物、その同等物は、国際公開第２００２／０８６１３３号パンフレットに開示される公知の方法に従って得ることができる。
本発明の実施例においては、入手が容易な加水分解物を用いている。なお、加水分解物の分子量は、安定化作用を有する限り特に限定されないが、取扱い性の点から、重量平均分子量が５，０００〜１００，０００、特には１０，０００〜５０，０００の範囲にあるものが好ましく用いられる。
【００２０】
セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物の使用量は、使用する抗体の種類、抗体の濃度、抗体を含む組成物の形態などによって適宜設定すればよい。例えば、組成物が液体状態である場合、０．１〜２００ｇ／Ｌ、好ましくは０．１〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは０．２〜２０ｇ／Ｌの濃度で添加することができる。このとき、抗体と、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物の重量比は、１：１〜１：１０，０００，０００、好ましくは１：１０〜１：１，０００，０００、より好ましくは１：１００〜１：１００，０００とすることができる。
【００２１】
本発明の対象となる抗体は特に限定されるものではないが、典型的には臨床診断に用いられる抗体である。具体的には例えば、マウスＩｇＧや免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）、また、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＴＬＶ（成人Ｔ細胞白血病ウイルス）、ＨＩＶ（エイズウイルス）、インフルエンザウイルス、クラミジア、梅毒トレポネーマ、トキソプラズマ等の各種感染症の病原体を抗原とする抗体などを挙げることができる。抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体の混合物であってもよい。また、酵素処理や遺伝子工学的に断片化されたＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ等の抗体フラグメントであってもよい。
さらに抗体は、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の各種酵素や、蛍光色素、金属コロイド、着色ラテックス粒子などで標識されていてもよい。
本発明の対象となる抗体の保存状態は特に限定されるものではなく、液体状態であっても、凍結状態であっても、乾燥状態であってもよく、任意の状態で保存されたものが使用でき、一度乾燥したものを液体に再溶解または再懸濁させたものを包含するものとする。
【００２２】
本発明の抗体の安定化方法によれば、安定化された抗体を含む組成物が提供される。組成物の存在状態は、液体状態であっても、乾燥状態であってもよく、特に限定されない。また、抗体が担体に固定化されていてもよく、この状態で液体に浸漬した状態であっても、乾燥した状態であってもよい。なお、組成物が液体状態である場合、抗体が液体に完全に溶解している状態のみならず、懸濁液のように液体に分散している状態も包含するものとする。
このような組成物は、チップ状、スリット状などの形態に加工される場合もある。そして、適当な容器に入れられたり、適当なデバイスに搭載されたりして、例えば、分子生物学用途の分析試薬、生化学用途の分析試薬、体外診断薬、バイオセンサー、医薬品などとして、またこれらを含むキットとして提供される。
【００２３】
組成物は、安定化、形状改善などの目的で、さらに他の物質を含んでいてもよい。
液体状態の組成物は、少なくとも、目的とする抗体と、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物を、水、生理食塩水、各種水性緩衝液などの液体に溶解または懸濁することによって調製することができる。このとき、抗体の濃度は特に限定されるものではないが、通常、０．００１〜１００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬである。また、水性緩衝液として具体的には、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液など、分子生物学あるいは生化学の分野で公知の緩衝液を挙げることができる。このような組成物は硫安、燐安、食塩、塩化カリウム等の塩類を含んでいてもよい。また、グリセロール、エチレングリコール等の多価アルコール類、アルキルグルコシド、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、脂肪酸アルコールエステル等の界面活性剤を含んでいてもよい。さらに、アジ化物、１，１‘−Ｍｅｔｈｙｌｅｎ−ｂｉｓ［３−（１−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−２，４−ｄｉｏｘｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎ−５−ｙｌ）−ｕｒｅａ］、２−Ｍｅｔｈｙｌ−３（２Ｈ）−ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、５−Ｂｒｏｍｏ−５−ｎｉｔｒｏ−１，３−ｄｉｏｘａｎｅ、２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ、２−Ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｅ等の防腐剤を含んでいてもよい。
【００２４】
乾燥状態の組成物は、前記液体状態の組成物を、定法により乾燥、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥することによって調製することができる。このような組成物は、一般的な安定剤や形状改善剤として、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、ラクトース、シュークロース、ラフィノース、トレハロース、シクロデキストリン、プルラン、イヌリン、可溶性デンプン等の糖類、グルシトール、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール類、グリシン、アラニン、セリン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リジン、ヒスチジン等のアミノ酸およびアミノ酸塩、グリシルグリシン、グリシルグリシルグリシン等のペプチド類、リン酸塩、ホウ酸塩、硫酸塩、トリス塩等の無機塩類、ゼラチン、カゼイン、アルブミン等のタンパク質、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等の界面活性剤などを含んでいてもよく、乾燥前の液体状態の段階で添加しておけばよい。
【００２５】
前記液体状態および乾燥状態の組成物において、抗体が特に酵素標識されている場合にあっては、標識した酵素を安定化させる目的で、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰ、ＧＭＰ、ＦＡＤやＦＭＮ、ビオチン、ナイアシン、コバラミン、ＰＱＱ等の補酵素類、ナトリウム、カリウム、亜鉛、マグネシウム、カルシウム、リチウム、銅、鉄、マンガン等の金属塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ホウ酸塩、トリス塩等の塩類、チオール化合物、セレン化合物、アミノ酸及びアミノ酸塩、糖および配糖体を含んでいてもよい。また、フェノール系およびアニリン系の各種トリンダー試薬、カプラーである４−アミノアンチピリン、テトラゾリウム塩類、フエナジンメトサルフェート等の電子キャリヤー、ロイコ系試薬等の色素類、基質類を含んでいてもよい。さらに、非特異反応防止剤を含んでいてもよい。非特異反応防止剤としては、特に限定されるものではないが、標識抗体と同種の抗体、標識抗体と同種の酵素を含むことができる。同種の抗体としては、マウスＩｇＧ、マウスＩｇＭ、高分子量化されたマウスＩｇＧ重合体、ヤギＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ、ウマＩｇＧ、ラットＩｇＧ、ウサギＩｇＧ等を挙げることができる。これらは、動物血清、腹水など体液のまま添加することもできるが、ウイルス不活化処理、補体非働化処理、脱脂処理などを行って添加することが望ましい。同種の酵素としては、ペルオキシダーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等を挙げることができる。
【００２６】
抗体が担体に固定されている場合において、用いられる担体は特に限定されるものではなく、免疫測定用として用いられているものから適宜選択すればよい。例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成高分子化合物、多孔性ガラス、ガラスビーズ、磁性粒子等の無機物質などを挙げることができる。またその形態としては、チューブ、プレート、マイクロタイタープレート、微粒子等を挙げることができる。
担体への抗体の固定化は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、グルタルアルデヒド、ビスジアゾベンジジン、トリレンジイソシアネート、ジフロロニトロベンゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム、タンニン酸等のいわゆるカップリング剤を用いた化学的結合法、抗体と担体を水、生理食塩水、各種水性緩衝液などの液体中で接触させる物理的吸着法などを挙げることができる。いずれの方法においても、抗体を担体に固定化した後、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物を共存させる。
組成物は、抗体が担体に固定化されていない組成物同様、各種添加剤を含んでいてもよい。
かくして、抗体が担体に固定化され、かつ、液体に浸漬状態の組成物を調製することができる。
【００２７】
抗体が担体に固定化され、かつ、乾燥状態の組成物は、前記液体に浸漬状態の組成物を、定法により乾燥、例えば自然乾燥、通気乾燥、真空乾燥、凍結乾燥することによって調製することができる。このとき、セリシンおよび／またはその加水分解物、もしくはその同等物による安定化効果を有効に発揮させるため、乾燥前に、４℃で６〜２４時間、好ましくは１０〜２０時間、または２５℃で２〜８時間、好ましくは４〜６時間、さらにまたは３７℃で１０分間〜３時間、好ましくは３０分間〜２時間の浸漬時間をとることが望ましい。
組成物は、抗体が担体に固定化されていない組成物同様、各種添加剤を含んでいてもよい。
【実施例】
【００２８】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２９】
試験例１〜３において、セリシン加水分解物は、以下の方法に従って調製した。
［セリシン加水分解物の調製］
繭（家蚕（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）が作ったもの）１ｋｇを、０．２％炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１１〜１２）５０Ｌ中で９５℃にて２時間処理し、セリシンを部分加水分解して抽出した。得られた抽出液を平均孔径０．２μｍのフィルターを用いてろ過し、凝集物を除去した後、濾液を逆浸透膜により脱塩し、０．２％濃度の無色透明の精製液を得た。この精製液をエバポレーターを用いて濃度が約２％になるまで濃縮させた後、凍結乾燥処理を行って、純度９０％以上で、平均分子量２０，０００であるセリシン加水分解物の粉体１００ｇを得た。
【００３０】
［試験例１］
溶液状抗体に対する安定化試験
（１）溶液状マウスＩｇＧの調製および保存
安定化剤として、セリシン加水分解物およびウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡと表記、ナカライテスク社製）を試験した。各試験物質を、１３６ｍＭ塩化ナトリウム、８ｍＭリン酸水素二ナトリウム、３ｍＭ塩化カリウムおよび１ｍＭリン酸二水素カリウムからなるリン酸緩衝生理食塩水（以下ＰＢＳと表記、ｐＨ７．２〜７．５）で１０ｇ／L濃度に溶解した後、０．２２μｍフィルターでろ過し、試験物質溶液とした。４００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ溶液（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を上記試験物質溶液で５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、保存安定性を評価した。すなわち、調製当日（ｄａｙ０）、および５０℃または４℃で保存して６日目におけるマウスＩｇＧの活性を（２）の方法に従い測定し、残存活性率を求めた。各マウスＩｇＧ希釈溶液は、測定前に室温に戻して、活性測定に供した。
【００３１】
（２）マウスＩｇＧの活性測定方法
９６ウェルアッセイプレート（平底タイプ、ファルコン社製）の各ウェルに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍＬのヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去した。そこへ、ＰＢＳで調製した５％（ｗ/ｗ）のスキムミルク溶液を１８０μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体でコーティングされていない部分のプレートのウェル表面をコーティングした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、０．１％（ｗ/ｗ）のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（以下、Ｔ−ＰＢＳと表記）でプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、（１）で調製した各マウスＩｇＧ希釈溶液を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより抗原抗体反応を行った。
【００３２】
インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＰＢＳで希釈した１．７μｇ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと表記）標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体溶液（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＨＲＰの基質として２ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸溶液を７５μＬ添加し、２５℃で４０分間反応させた。反応終了後、発色の程度を波長４９０ｎｍ（対照波長６００ｎｍ）で測定した。
【００３３】
各試験物質ともに、試料調製当日（ｄａｙ０）の吸光度からブランクにおける吸光度を差し引いた値（以下、吸光度差と表記）に対する、保存６日目における吸光度差の百分率（％）を求め、残存活性率とした。
結果を表１に示した。
【００３４】
（３）結果
５０℃、６日間の保存において、マウスＩｇＧの残存活性率は、無添加では０％、ＢＳＡでは８９％であった。一方、セリシン加水分解物では８４％であり、ＢＳＡと同程度の値を示した。
これらの結果から、セリシン加水分解物は溶液状抗体に対して、ＢＳＡと同等の優れた抗体安定性を持つことが示された。
【００３５】
【表１】
2008239512.tif 000002
【００３６】
［試験例２］
乾燥状固定化抗体に対する安定化試験−マウスＩｇＧ定量系−
（１）乾燥状固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体プレートの調製および保存
安定化剤として、セリシン加水分解物、ＢＳＡ（ナカライテスク社製）、スキムミルク（ナカライテスク社製）およびコムギ由来タンパク加水分解物（Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を試験した。各試験物質をＰＢＳで１ｇ／Ｌ濃度に溶解した後、０．２２μｍフィルターでろ過し、試験物質溶液とした。
９６ウェルアッセイプレート（平底タイプ、ファルコン社製）の各ウェルに、ＰＢＳで希釈した１μｇ／ｍＬのヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体溶液（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去した。そこへ、上記試験物質溶液を１８０μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより、ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体でコーティングされていない部分のプレートのウェル表面をコーティングし、固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体プレートとした（ｄａｙ０）。その後、５０℃のインキュベーター内で乾燥させ、保存安定性を評価した。すなわち、調製当日（ｄａｙ０）、および５０℃で保存して１１日目における固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の活性を（２）の方法に従い測定し、残存活性率を求めた。
【００３７】
（２）固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の活性測定方法
（１）で調製した固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体プレートのうち、ｄａｙ０のものは、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄して、活性測定に供した。
【００３８】
まず、４００μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１％（ｗ／ｗ）のスキムミルク溶液で希釈し、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬおよび０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製し、固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体プレートに１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより抗原抗体反応を行った。
【００３９】
インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＰＢＳで希釈した１．７μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体溶液（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＨＲＰの基質として２ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸溶液を７５μＬ添加し、２５℃で４０分間反応させた。反応終了後、発色の程度を波長４９０ｎｍ（対照波長６００ｎｍ）で測定した。
【００４０】
各試験物質ともに、試料調製当日（ｄａｙ０）の吸光度からブランクにおける吸光度を差し引いた値（以下、吸光度差と表記）に対する、保存１１日目における吸光度差の百分率（％）を求め、残存活性率とした。このうち、５０ｎｇ／ｍＬのマウスＩｇＧを添加した場合の残存活性率を表２に示した。
【００４１】
（３）結果
５０℃、１１日間の保存において、固定化ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体の残存活性率は、無添加では０％、ＢＳＡでは７３％、スキムミルクでは７６％、コムギ由来タンパク加水分解物では８０％であった。一方、セリシン加水分解物では９３％であり、検討した安定化剤の中で最も高い値を示した。また、図１に示すように、セリシン加水分解物で保存した場合には、マウスＩｇＧに対する定量性も維持していた。
これらの結果から、セリシン加水分解物は固定化された抗体に対して、ＢＳＡ、スキムミルクおよびコムギ由来タンパク加水分解物より優れた抗体安定性を持つことが示された。
【００４２】
【表２】
2008239512.tif 000003
【００４３】
［試験例３］
乾燥状固定化抗体に対する安定化試験−ヒト血清アルブミン（以下、ＨＳＡと表記）定量系−
（１）乾燥状固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体プレートの調製および保存
安定化剤として、試験例２と同様の物質を試験した。各試験物質をＰＢＳで１ｇ／Ｌ濃度に溶解した後、０．２２μｍフィルターでろ過した溶液を試験物質溶液とした。
９６ウェルアッセイプレート（平底タイプ、ファルコン社製）の各ウェルに、ＰＢＳで希釈した８μｇ／ｍＬのヤギ由来抗ＨＳＡ抗体溶液（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去した。そこへ、上記試験物質溶液を１８０μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより、ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体でコーティングされていない部分のプレートのウェル表面をコーティングし、固相化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体プレートとした（ｄａｙ０）。その後、５０℃のインキュベーター内で乾燥させ、保存安定性を評価した。すわなち、調製当日（ｄａｙ０）、および５０℃で保存して８日目における固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体の活性を（２）の方法に従い測定し、残存活性率を求めた。
【００４４】
（２）固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体の活性測定方法
（１）で調製した固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体プレートのうち、ｄａｙ０のものは、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄して、活性測定に供した。
【００４５】
まず、ＨＳＡ（シグマ社製）を１％（ｗ／ｗ）のスキムミルク溶液で溶解し、４０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬおよび０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製し、固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体プレートに１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートすることにより抗原抗体反応を行った。
【００４６】
インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＰＢＳで希釈した２．５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識ヒツジ由来抗ＨＳＡ抗体溶液（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ社製）を１００μＬ添加し、３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルの溶液をデカンテーションにより除去し、Ｔ−ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。そこへ、ＨＲＰの基質として２ｍＭオルトフェニレンジアミン二塩酸溶液を７５μＬ添加し、２５℃で４０分間反応させた。反応終了後、発色の程度を波長４９０ｎｍ（対照波長６００ｎｍ）で測定した。
【００４７】
各試験物質ともに、試料調製当日（ｄａｙ０）の吸光度からブランクにおける吸光度を差し引いた値（以下、吸光度差と表記）に対する、保存８日目における吸光度差の百分率（％）を求め、残存活性率とした。このうち、４０ｎｇ／ｍＬのＨＳＡを添加した場合の残存活性率を表３に示した。
【００４８】
（３）結果
５０℃、８日間の保存において、固定化ヤギ由来抗ＨＳＡ抗体の残存活性率は、無添加では０％、ＢＳＡでは６％、スキムミルクでは５２％、コムギ由来タンパク加水分解物では５％であった。一方、セリシン加水分解物では６６％であり、検討した安定化剤の中で最も高い値を示した。また、図２に示すように、セリシン加水分解物で保存した場合には、ＨＳＡに対する定量性も維持していた。
これらの結果から、セリシン加水分解物は固定化された抗体に対して、ＢＳＡ、スキムミルクおよびコムギ由来タンパク加水分解物より優れた抗体安定性を持つことが示された。
【００４９】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明によれば、抗体の安定性を向上させ、抗体を含む組成物の有効性を長期にわたって維持することが可能となる。特に臨床検査分野で用いられる診断薬用途として優れており、産業界に寄与することが大である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】マウスＩｇＧに対する定量性を示すグラフである。
【図２】ＨＳＡに対する定量性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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