(57)【要約】【課題】効率的に、かつ工業的規模でアミノ脂質を得ることができる、アミノ脂質の製造方法、例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産を簡便に、高い効率で向上させることができる、アミノ脂質の生産向上方法、および例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産量を簡便に、かつ安価に向上させることができる、アミノ脂質生産向上剤を提供すること。【解決手段】グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、アミノ脂質の製造方法、カザミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、アミノ脂質の生産向上方法、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、アミノ脂質の生産向上方法、ならびにフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を有効成分として含有するグルコノアセトバクター・キシリナスのためのアミノ脂質生産向上剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の製造方法。
【請求項２】
（Ａ）グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する工程、および
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた培養物からアミノ脂質を得る工程
を含む、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
セルロース生成条件下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、請求項１〜３いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
カザミノ酸存在下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、請求項１〜４いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の富化条件下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、請求項１〜５いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
セルラーゼの存在下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、請求項１〜６いずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
該アミノ脂質が、タウロオルニチン脂質またはオルニチン脂質である、請求項１〜７いずれか１項記載の製造方法。
【請求項９】
カザミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法。
【請求項１０】
該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項９記載のアミノ脂質の生産向上方法。
【請求項１１】
フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法。
【請求項１２】
該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた少なくとも１種である、請求項１１記載のアミノ脂質の生産向上方法。
【請求項１３】
フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を有効成分として含有してなる、グルコノアセトバクター・キシリナスのためのアミノ脂質生産向上剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ脂質の製造方法、アミノ脂質の生産向上方法およびアミノ脂質生産向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酢酸菌は、酢、バクテリアセルロース、セルロースゲルなどの製造などの用途に用いられている。具体的には、前記酢酸菌の用途としては、例えば、前記酢酸菌を用いて、酢酸発酵を行ない、食酢を製造すること（例えば、特許文献１〜３などを参照のこと）、セルロース生産能を有する酢酸菌を培養してセルロースを生産すること（例えば、特許文献４などを参照のこと）、酸素透過性素材を含む素材から形成された中空体を、培養液中に浸漬し、セルロースを産生する酢酸菌を培養することにより、任意の形状のセルロース製品を製造すること（例えば、特許文献５などを参照のこと）、セルロース産生能を有する酢酸菌と酵母とを用いた静置培養を行ない、可食性ゲルを製造すること（例えば、特許文献６などを参照のこと）などが知られている。
【０００３】
一方、前記酢酸菌に属するグルコノバクター・セリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｕｓ）に、膜成分として、アミノ脂質であるオルニチン脂質およびタウロオルニチン脂質が存在することが確認されている（例えば、非特許文献１、２などを参照のこと）。
【０００４】
しかしながら、前記非特許文献１および２には、グルコノバクター・セリウス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｕｓ）の膜成分の同定が行なわれているに過ぎず、微量のアミノ脂質しか得られていないのが現状である。
【特許文献１】特開平６−２２７４１号公報
【特許文献２】特開平６−２２７４２号公報
【特許文献３】特開２００６−２３０３２９号公報
【特許文献４】特開平６−９７０３号公報
【特許文献５】特開２００５−３２０６５７号公報
【特許文献６】特開平７−７９７９７号公報
【非特許文献１】タハラ（Ｔａｈａｒａ  Ｙ）ら、「バイオキミカ  エ  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ）」、１９７６年１１月１９日、第４５０巻、ｐ．２２５−２３０
【非特許文献２】タハラ（Ｔａｈａｒａ  Ｙ）ら、「アグリカルチュラル  アンド  バイオロジカル  ケミストリー（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９７６年、第４０巻、ｐ．２４３−２４４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的に、かつ工業的規模でアミノ脂質を得ることができる、アミノ脂質の製造方法を提供することを１つの課題とする。また、本発明は、例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産を簡便に、高い効率で向上させることができる、アミノ脂質の生産向上方法を提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産量を簡便に、かつ安価に向上させることができる、アミノ脂質生産向上剤を提供することをさらに他の課題とする。本発明の他の課題は、本明細書の記載から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕  グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の製造方法、
〔２〕  （Ａ）グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する工程、および
（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた培養物からアミノ脂質を得る工程
を含む、前記〔１〕記載の製造方法、
〔３〕  該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた少なくとも１種である、前記〔１〕または〔２〕記載の製造方法、
〔４〕  セルロース生成条件下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、前記〔１〕〜〔３〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔５〕  カザミノ酸存在下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔６〕  フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の富化条件下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、前記〔１〕〜〔５〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔７〕  セルラーゼの存在下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する、前記〔１〕〜〔６〕いずれか１項に記載の製造方法、
〔８〕  該アミノ脂質が、タウロオルニチン脂質またはオルニチン脂質である、前記〔１〕〜〔７〕いずれか１項記載の製造方法、
〔９〕  カザミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法、
〔１０〕  該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた少なくとも１種である、前記〔９〕記載のアミノ脂質の生産向上方法、
〔１１〕  フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を用いて、グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法、
〔１２〕  該グルコノアセトバクター・キシリナスが、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕からなる群より選ばれた１種である、前記〔１１〕記載のアミノ脂質の生産向上方法、ならびに
〔１３〕  フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を有効成分として含有したものである、グルコノアセトバクター・キシリナスのためのアミノ脂質生産向上剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のアミノ脂質の製造方法は、効率的に、かつ工業的規模でアミノ脂質を得ることができるという優れた効果を奏する。また、本発明のアミノ脂質の生産向上方法は、例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産を簡便に、高い効率で向上させることができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のアミノ脂質生産向上剤は、例えば、酢酸菌によるアミノ脂質の生産量を簡便に、かつ安価に向上させることができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、１つの側面では、グルコノアセトバクター・キシリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ）を培養することを特徴とする、アミノ脂質の製造方法に関する。本発明のアミノ脂質の製造方法では、グルコノアセトバクター・キシリナスが用いられていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法は、効率的にアミノ脂質を製造することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の製造方法においては、前記グルコノアセトバクター・キシリナスが用いられているため、本発明の製造方法は、工業的規模でアミノ脂質を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【０００９】
また、本発明の製造方法は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスを培養し、それにより、アミノ脂質を製造することにも１つの大きな特徴がある。したがって、本発明の製造方法は、例えば、化学合成によりアミノ脂質を得る場合などに比べ、より高い効率で、安価にアミノ脂質を得ることができるという優れた効果を発揮する。
【００１０】
本発明の製造方法の１つの実施態様としては、具体的には、（Ｉ）グルコノアセトバクター・キシリナスを培養する工程、および
（ＩＩ）前記工程（Ｉ）で得られた培養物からアミノ脂質を得る工程
を含む方法が挙げられる。
【００１１】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスは、食品用途に用いられている微生物であるため、かかるグルコノアセトバクター・キシリナスを用いる本発明の製造方法は、同様に、食品用途に適した産物が得られうる点でも極めて有利である。前記グルコノアセトバクター・キシリナスとしては、一般に、グルコノアセトバクター・キシリナスに分類される微生物であればよく、特に限定されるものではないが、例えば、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕などが挙げられる。なかでも、より高いアミノ脂質の生産能を発揮する観点から、好ましくは、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕が望ましい。なお、これらの微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（郵便番号２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）から容易に入手される微生物である。
【００１２】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養は、酢酸菌の生育可能な条件下で行なわれる。
【００１３】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養は、該グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより増加させる観点から、好ましくは、セルロース生成条件下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することが望ましい。前記セルロース生成条件としては、特に限定されないが、例えば、ポリペプトン０．５質量％と酵母エキス０．５質量％とグルコース０．５質量％とマンニトール０．５質量％と硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％とエタノール（フィルター滅菌済）５容量％と水  残部とを含む培地（培養前ｐＨ６．６）による培養条件などが挙げられる。かかるセルロース生成条件は、本発明の目的を妨げない範囲で適宜濃度などを変動させてもよい。
【００１４】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いられる窒素源としては、例えば、ポリペプトン、各種アミノ酸などが挙げられる。
【００１５】
本発明の製造方法では、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、各種アミノ酸をさらに含む条件下に培養することが望ましい。かかる各種アミノ酸は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いる培地の窒素源として用いられうる。
【００１６】
本発明の製造方法では、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、前記各種アミノ酸として、カザミノ酸存在下に、該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することが好ましい。前記カザミノ酸は、カゼインを加水分解することにより得られるアミノ酸混合物である。培地中におけるカザミノ酸の含有量は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、好ましくは、０．２質量％以上、より好ましくは、０．４質量％以上であり、脂質生産効率をより高める観点から、好ましくは、３．０質量％以下、より好ましくは、２．５質量％以下、さらに好ましくは、１．０質量％以下、よりさらに好ましくは、０．６質量％以下であることが望ましい。なかでも、アミノ脂質の製造効率およびコスト負荷の低減の観点から、培地中におけるカザミノ酸の含有量は、好ましくは、０．４〜０．６質量％（例えば、０．５質量％など）が望ましい。
【００１７】
また、本発明の製造方法では、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、前記各種アミノ酸のなかでも、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸が富化された条件（富化条件）下に、前記グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することがより好ましい。
【００１８】
本明細書において、前記「フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸」は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸のそれぞれの単独、ならびに２種以上の組み合わせのいずれをも含む概念である。２種以上の組み合わせとしては、例えば、フェニルアラニンとトリプトファンとアスパラギンとの組み合わせ、フェニルアラニンとトリプトファンとの組み合わせ、フェニルアラニンとアスパラギンとの組み合わせ、トリプトファンとアスパラギンとの組み合わせなどが挙げられる。前記アミノ脂質のなかでも、タウロオルニチン脂質の割合をより増加させる場合、好ましくは、フェニルアラニンまたはアスパラギン酸が望ましく、よりタウロオルニチン脂質の割合を増加させる観点からは、より好ましくは、フェニルアラニンが望ましい。
【００１９】
なお、本明細書において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の富化条件とは、他の物質（例えば、他のアミノ酸など）の量に比べ、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の量が大きい条件をいう。ここで、前記富化条件は、例えば、他の物質（例えば、他のアミノ酸など）の量に比べ、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の量が、好ましくは少なくとも２倍である条件が望ましい。例えば、酢酸菌基本培地〔ポリペプトン０．５質量％、酵母エキス０．５質量％、グルコース０．５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％、残部  水（ｐＨ６．０）〕の場合、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の含有量は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、好ましくは、０．２質量％以上、より好ましくは、０．４質量％以上であり、アミノ脂質の生産効率を高める観点から、好ましくは、３．０質量％以下、より好ましくは、２．５質量％以下、さらに好ましくは、１．０質量％以下、よりさらに好ましくは、０．６質量％以下であることが望ましい。なかでも、アミノ脂質の製造効率およびコスト負荷の低減の観点から、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の含有量は、好ましくは、０．４〜０．６質量％（例えば、０．５質量％など）が望ましい。
【００２０】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いられる炭素源としては、特に限定されないが、例えば、グルコース、グリセロールなどが挙げられる。また、前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いられる培地は、硫酸マグネシウムなどがさらに配合された培地であってもよい。
【００２１】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いられる培地のｐＨは、培養前のｐＨとして、細胞の増殖能を十分に発揮させる観点から、好ましくは、ｐＨ５．０以上、より好ましくは、ｐＨ５．５以上であり、好ましくは、ｐＨ６．５以下であることが望ましい。なかでも、細胞の増殖能を十分に発揮させる観点から、培地のｐＨは、培養前のｐＨとして、ｐＨ６．０前後が望ましい。また、前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いられる培地のｐＨは、培養中、一定に維持されていることが望ましい。
【００２２】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養温度は、酢酸菌の生育可能な温度であればよく、特に限定されないが、良好なアミノ脂質の製造効率を達成する酢酸菌の増殖速度を得る観点から、好ましくは、２５〜３０℃が望ましい。
【００２３】
前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時間は、該グルコノアセトバクター・キシリナスにアミノ脂質を産生させるに十分な時間であればよく、特に限定されないが、脂質生産向上の観点から、４８時間以上であり、アミノ脂質の製造効率の観点から、７２時間以下、好ましくは、６０時間以下であることが望ましい。
【００２４】
本発明の製造方法では、前記グルコノアセトバクター・キシリナスの増殖速度を向上させ、かつ増殖を増大させ、アミノ脂質の生産量を増大させる観点から、セルラーゼの存在下に該グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することが好ましい。培地中におけるセルラーゼの量は、グルコノアセトバクター・キシリナスにより生産されうるセルロースの分解に十分な量であればよく、特に限定されないが、セルラーゼ活性を十分に発揮させる観点から、活性単位（Ｕ）として、１ｍｌあたり、好ましくは、０．１Ｕ以上であり、脂質生産向上の観点から、０．５Ｕ以下であることが望ましい。なお、前記セルラーゼ活性は、セルラーゼの至適温度で、１時間の反応で１μｍｏｌのグルコースに相当する還元力を生成する酵素量とする。
【００２５】
本発明の製造方法により得られるアミノ脂質としては、タウロオルニチン脂質、オルニチン脂質などが挙げられる。前記タウロオルニチン脂質は、一般式（Ｉ）：
【００２６】
【化１】
2008113590.tif 000002
【００２７】
（式中、Ｒ1は、例えば、炭素数１２〜２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基を示す）
で表される化合物である。なお、前記Ｒ1は、さらに修飾基を有していてもよい。また、前記オルニチン脂質は、一般式（ＩＩ）：
【００２８】
【化２】
2008113590.tif 000003
【００２９】
（式中、Ｒ2は、例えば、炭素数１２〜２０の直鎖または分枝鎖のアルキル基を示す）
で表される化合物である。
【００３０】
本発明の製造方法においては、前記グルコノアセトバクター・キシリナスの培養後に得られた培養物からアミノ脂質が分離される。
【００３１】
培養物からのアミノ脂質の分離は、例えば、培養物から脂質試料を抽出し、抽出された脂質試料から、必要によりアミノ脂質を分離することにより行なわれる。
【００３２】
培養物から脂質試料の抽出は、具体的には、特に限定されないが、例えば、
（ｂ１）得られた培養物を、遠心分離して、菌体を回収する工程、
（ｂ２）前記工程（ｂ１）で得られた菌体から凍結乾燥菌体を製造する工程、および
（ｂ３）前記工程（ｂ２）で得られた凍結乾燥菌体を、クロロホルム−メタノール抽出に供して、脂質試料を得る工程、
を含むプロセスにより行なわれうる。ここで、クロロホルム−メタノール抽出は、例えば、クロロホルム−メタノール〔２：１（容量比）〕を用いて行なわれうる。前記クロロホルム−メタノール抽出では、目的の脂質試料は、クロロホルム層から回収される。
【００３３】
また、アミノ脂質を得るために、さらに分離工程を行なう必要がある場合、例えば、ケイ酸カラムクロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどを行なえばよい。例えば、前記ケイ酸カラムクロマトグラフィーにより、前記脂質試料からアミノ脂質の分離を行なう場合、特に限定されないが、前記脂質を適切な大きさのケイ酸カラムに供し、クロロホルムとメタノールとの容量比のステップワイズ勾配により抽出を行なうことにより、クロロホルム−メタノール（５０：５０容量比）で抽出されるフラクションとしてアミノ脂質を得ることができる。
【００３４】
本発明の製造方法により得られるアミノ脂質は、特に限定されないが、例えば、Ｍａｎｄｌｅ法に従い、ニンヒドリン反応でアミノ基の存在を検出することによりアミノ脂質の存在を評価すること、必要により、リンの非存在を評価することなどにより確認されうる。
【００３５】
本発明は、他の側面では、カザミノ酸を用いて、前記グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法（以下、本明細書において、「アミノ脂質の生産向上方法１」ともいう）に関する。本発明のアミノ脂質の生産向上方法１は、グルコノアセトバクター・キシリナスの培養が、カザミノ酸を用いて行なわれていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のアミノ脂質の生産向上方法１は、グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産を簡便に、高い効率で向上させることができるという優れた効果を発揮する。
【００３６】
グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時におけるカザミノ酸の濃度は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、好ましくは、０．２質量％以上、より好ましくは、０．４質量％以上であり、脂質生産効率をより高める観点から、好ましくは、３．０質量％以下、より好ましくは、２．５質量％以下、さらに好ましくは、１．０質量％以下、よりさらに好ましくは、０．６質量％以下であることが望ましい。なかでも、アミノ脂質の製造効率およびコスト負荷の低減の観点から、グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時におけるカザミノ酸の濃度は、培地中の含有量として、好ましくは、０．４〜０．６質量％（例えば、０．５質量％など）であることが望ましい。
【００３７】
また、本発明は、他の側面では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を用いて、前記グルコノアセトバクター・キシリナスを培養することを特徴とする、アミノ脂質の生産向上方法（以下、本明細書において、「アミノ脂質の生産向上方法２」ともいう）に関する。本発明のアミノ脂質の生産向上方法２は、グルコノアセトバクター・キシリナスの培養が、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を用いて行なわれていることに１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のアミノ脂質の生産向上方法２は、グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産を簡便に、高い効率で向上させることができるという優れた効果を発揮する。
【００３８】
グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の濃度は、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、培地中における他の物質（例えば、他のアミノ酸など）の濃度に比べて大きくなる濃度であればよく、例えば、他の物質（例えば、他のアミノ酸など）の濃度に比べ、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の濃度が、好ましくは少なくとも２倍であることが望ましい。グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の濃度は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、好ましくは、０．２質量％以上、より好ましくは、０．４質量％以上であり、脂質生産効率をより高める観点から、好ましくは、３．０質量％以下、より好ましくは、２．５質量％以下、さらに好ましくは、１．０質量％以下、よりさらに好ましくは、０．６質量％以下であることが望ましい。なかでも、アミノ脂質の製造効率およびコスト負荷の低減の観点から、グルコノアセトバクター・キシリナスの培養時におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の濃度は、好ましくは、０．４〜０．６質量％（例えば、０．５質量％など）が望ましい。
【００３９】
前記アミノ脂質のなかでも、タウロオルニチン脂質の生産を向上させる場合、好ましくは、フェニルアラニンまたはアスパラギン酸が望ましく、よりタウロオルニチン脂質の生産を向上させる観点からは、より好ましくは、フェニルアラニンが望ましい。
【００４０】
本発明は、別の側面では、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を有効成分として含有する、グルコノアセトバクター・キシリナスのためのアミノ脂質生産向上剤に関する。本発明のアミノ脂質生産向上剤は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸を有効成分として含有するため、グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量を簡便に、かつ安価に向上させることができるという優れた効果を発揮する。
【００４１】
本発明のアミノ脂質生産向上剤は、前記有効成分を、グルコノアセトバクター・キシリナスの培養に用いる培地、生理的食塩水などに配合して得られた液体組成物であってもよく、前記有効成分の乾燥物であってもよい。
【００４２】
本発明のアミノ脂質生産向上剤中における有効成分の含有量は、使用形態に応じて、適宜設定されうる。例えば、本発明のアミノ脂質生産向上剤が、前記有効成分を培地に配合して得られた液体組成物である場合、例えば、液体組成物中における他の物質（例えば、他のアミノ酸など）の量に比べて大きくなる量であればよい。例えば、前記培地が、酢酸菌基本培地〔ポリペプトン０．５質量％、酵母エキス０．５質量％、グルコース０．５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％、残部  水（ｐＨ６．０）〕である場合、液体組成物中における前記有効成分の含有量は、前記グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産量をより向上させる観点から、好ましくは、０．２質量％以上、より好ましくは、０．４質量％以上であり、生産効率を高める観点から、好ましくは、３．０質量％以下、より好ましくは、２．５質量％以下、さらに好ましくは、１．０質量％以下、よりさらに好ましくは、０．６質量％以下であることが望ましい。なかでも、アミノ脂質の製造効率およびコスト負荷の低減の観点から、培地中におけるフェニルアラニン、トリプトファンおよびアスパラギン酸からなる群より選ばれた少なくとも１種のアミノ酸の含有量は、好ましくは、０．４〜０．６質量％（例えば、０．５質量％など）が望ましい。また、本発明のアミノ脂質生産向上剤は、例えば、使用時において、本発明のアミノ脂質生産向上剤を培地などに添加して、グルコノアセトバクター・キシリナスによるアミノ脂質の生産時に用いられる培地中における前記有効成分の含有量が、前記含有量の範囲となる量となるように用いてもよい。
【００４３】
また、本発明のアミノ脂質生産向上剤は、本発明の目的を妨げないものであれば、種々の助剤をさらに含有していてもよい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４５】
（実施例１）
各種酢酸菌を、酢酸菌基本培地〔ポリペプトン０．５質量％、酵母エキス０．５質量％、グルコース０．５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％、残部  水（ｐＨ６．０）〕またはセルロース膜生成培地〔組成：ポリペプトン０．５質量％、酵母エキス０．５質量％、グルコース０．５質量％、マンニトール０．５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％、エタノール（フィルター滅菌済）５容量％、水  残部、（培養前ｐＨ６．６）〕で、２５℃で定常期になるまで培養した。得られた培養物を、遠心分離して、各菌体を回収し、得られた菌体を、超純水１０ｍｌに懸濁した。その後、得られた懸濁物それぞれを、凍結乾燥機に供して、凍結乾燥菌体を得た。得られた凍結乾燥菌体１０〜５０ｍｇをガラス製遠沈管に入れ、１ｍｌの１質量％ＫＣｌ溶液を添加して、該凍結乾燥菌体を懸濁した。得られた懸濁物に、メタノール２．５ｍｌとクロロホルム１．２５ｍｌとを添加した。得られた混合物を２分間十分に攪拌し、ついで、室温で１０分間放置した。得られた産物に、クロロホルムを１．２５ｍｌ添加し、約３０秒間攪拌した。その後、得られた産物に、クロロホルムを１．２５ｍｌ添加し、さらに３０秒間攪拌し、その後、得られた産物を、７００×ｇ、２５℃で５分間、遠心分離した。下層のクロロホルム層を回収した。また、さらに収率を高めるために、上層にクロロホルムを１ｍｌ添加し、前記と同様の操作を行ない、クロロホルム層を回収した。クロロホルム層の溶液を、窒素気流下で、エバポレーターを用いて蒸発乾固した。得られた産物を、クロロホルム−メタノール〔２：１（容量比）〕に溶解し、脂質試料を得た。
【００４６】
前記脂質試料を、薄層プレート〔商品名：Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｐｌａｔｅ、メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫＧａＡ製〕に供し、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール：２５容量％アンモニア水溶液〔７：３：４（容量比）〕の溶液で展開させることにより、薄層クロマトグラフィーを行なった。なお、標品として、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、カルジオリピンを用いた。展開後の薄層プレートについて、ニンヒドリン試薬およびＤｉｔｔｍｅｒ試薬それぞれを用いて、アミノ基の有無およびリン酸基の有無を評価し、それにより、アミノ脂質の存在を確認した。
【００４７】
さらに、前記脂質試料の一定量を、蓋付ガラス試験管に入れた。前記蓋付ガラス試験管中の脂質試料に、５質量％ピリジン溶液および１質量％ニンヒドリン溶液それぞれを、該脂質試料の２倍容量混合し、沸騰水浴中で、２５分間煮沸した。その後、得られた産物に、該脂質試料の６倍容量の蒸留水を添加し、攪拌した。得られた産物について、分光光度計を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定して、アミノ基を定量し、それにより、アミノ脂質の量を定量化した。なお、検量線として、同様に、グルタミン酸を用いて得られた検量線を用いた。
【００４８】
各種酢酸菌におけるアミノ脂質であるオルニチン脂質およびタウロオルニチン脂質の存在を確認した結果の一例を図１に示す。図中、パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。図１において、レーン１は、ホスファチジルエタノールアミン、レーン２は、ホスファチジルグリセロール、レーン３は、脂質試料、レーン４は、ホスファチジルコリン、レーン５は、カルジオリピンを示す。また、各種酢酸菌から、タウロオルニチン脂質高生産微生物を探索した結果の一例を図２に示す。
【００４９】
その結果、図１の点線で囲まれた部分に、アミノ脂質であるオルニチン脂質およびタウロオルニチン脂質が確認できた。また、図２に示されるように、実験番号：１〜１８の酢酸菌のなかでも、実験番号：１５〜１７の酢酸菌には、タウロオルニチン脂質が、より多く存在していた。なお、前記実験番号１５〜１７の酢酸菌は、それぞれ、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７３）〕（実験番号：１５）、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕（実験番号：１６）、およびグルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３７７２）〕（実験番号：１７）であった。かかる実験番号１５〜１７の微生物には、それぞれ、従来、膜成分中にタウロオルニチン脂質が存在することが示されていた微生物であるグルコノアセトバクター・リクエファシエンス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ（ＮＢＲＣ１２２５７）〕（実験番号：１）、グルコノバクター・セリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ３２６２）〕（実験番号：３）、アセトバクター・パスツリアヌス〔Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ（ＮＢＲＣ３２９９）〕（実験番号：１１）およびアセトバクター・アセチ〔Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ（ＮＢＲＣ３２８１）〕（実験番号：１４）に比べ、より多くタウロオルニチン脂質が存在していた。
【００５０】
次に、前記脂質試料に、十分量の６Ｎ塩酸を添加して、よく撹拌し、得られた混合物を、１００℃で２４時間加熱した。得られた産物に、ヘキサンを添加して、非水溶性物質を除去し、塩酸層の溶液を回収した。得られた溶液を、エバポレーターで蒸発乾固させた。得られた産物を、超純水に溶解させ、酸加水分解試料を得た。得られた酸加水分解試料を、セルロース薄層プレート〔メルク株式会社製〕に供し、展開溶媒として、イソプロパノール：２５容量％アンモニア水溶液〔７０：３０（容量比）〕の溶液で展開させることにより、薄層クロマトグラフィーを行なった。また、標品として、タウリン（和光純薬株式会社製、カタログ番号２０３−００１１１）、タウロオルニチン（関西大学工学部微生物工学研究室による合成標品）、およびＬ−オルニチン（和光純薬株式会社製、カタログ番号１５４−００３７２）を用いた。前記グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕（実験番号：１６）から得られた酸加水分解試料の薄層クロマトグラフィーの結果を図３に示す。図中、レーン１は、酸加水分解試料単独、レーン２は、酸加水分解試料とタウリン標品との混合物、レーン３は、酸加水分解試料とオルニチン標品との混合物、レーン４は、酸加水分解試料とタウロオルニチン標品との混合物、レーン５は、タウリン標品とオルニチン標品とタウロオルニチン標品との混合物、レーン６は、タウリン標品、レーン７は、オルニチン標品、レーン８は、タウロオルニチン標品を示す。
【００５１】
その結果、図３に示されるように、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕から得られた酸加水分解試料には、タウロオルニチンが検出されたため、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕は、タウロオルニチン脂質を産生していることがわかった。
【００５２】
（実施例２）
グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕を、酢酸菌基本培地〔ポリペプトン０．５質量％、酵母エキス０．５質量％、グルコース０．５質量％、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％、残部  水（ｐＨ６．０）〕で、２５℃で７２時間培養した。得られた培養物から前記実施例１と同様の手法により、脂質試料を得た。
【００５３】
得られた脂質試料を、ケイ酸カラム〔カラム内径：３０ｍｍ、カラム長：３００ｍｍ、担体ベッド高：２５０ｍｍ、ケイ酸粉末ＡＲ  １００ｍｅｓｈ、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．製〕に供し、クロロホルムとメタノールとの容量比をステップワイズで、勾配させて、抽出を行ない、１０ｍｌずつ分画した。抽出溶媒として、順に、クロロホルム、クロロホルム−メタノール（９５：５容量比）、クロロホルム−メタノール（９０：１０容量比）、クロロホルム−メタノール（８０：２０容量比）、クロロホルム−メタノール（７０：３０容量比）、クロロホルム−メタノール（６０：４０容量比）、およびクロロホルム−メタノール（５０：５０容量比）をそれぞれ用いた。フラクション１〜２０は、クロロホルム、フラクション２１〜３５は、クロロホルム−メタノール（９５：５容量比）、フラクション３６〜４５は、クロロホルム−メタノール（９０：１０容量比）、フラクション４６〜５５は、クロロホルム−メタノール（８０：２０容量比）、フラクション５６〜６５は、クロロホルム−メタノール（７０：３０容量比）、フラクション６６〜７５は、クロロホルム−メタノール（６０：４０容量比）、フラクション７６〜８５は、クロロホルム−メタノール（５０：５０容量比）をそれぞれ用いて抽出されたフラクションである。
【００５４】
得られたフラクション１．２５ｍｌをメジウム管に入れ、エバポレーターで蒸発乾固させた。ついで、得られた産物に、溶媒〔クロロホルム−メタノール（１：２容量比）〕０．２５ｍｌを添加し、濃縮液を得た。得られた濃縮液に、５質量％ピリジン溶液および１質量％ニンヒドリン溶液それぞれを、該濃縮液の２倍容量混合し、沸騰水浴中で、２５分間煮沸した。その後、得られた産物に、該濃縮液の６倍容量の蒸留水を添加し、攪拌した。得られた産物について、分光光度計を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定して、アミノ基を定量し、それにより、アミノ脂質の量を定量化した。なお、検量線には、同様に、グルタミン酸を用いて得られた検量線を用いた。
【００５５】
また、前記フラクション３ｍｌを、サンプリングチューブに入れ、溶媒を蒸発させた。得られた産物に、７０容量％過塩素酸０．４ｍｌを添加し、得られた混合物を、ブロックヒーターを用いて、１００℃で４分間加熱した。得られた産物に、蒸留水４．２ｍｌと、５容量％モリブデン酸アンモニウム０．２ｍｌとアミドール試薬０．２ｍｌとを添加し、混合し、得られた混合物を沸騰水浴中で７分間加熱した。得られた産物を冷却し、１５分後に８３０ｎｍの吸光度を測定した。なお、検量線として、同様に、リン酸塩溶液を用いて得られた検量線を用いた。その結果のクロマトグラムを図４に示す。
【００５６】
その結果、図４に示されるように、クロロホルム−メタノール（５０：５０容量比）による抽出により得られたフラクション（フラクション７６〜８５）中に、アミノ脂質が存在することがわかった。
【００５７】
また、前記図４のクロマトグラム中、アミノ基の量のピークを示す各フラクションについて、薄層プレート〔商品名：Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  Ｐｌａｔｅ、メルク（Ｍｅｒｃｋ）ＫＧａＡ製〕に供し、展開溶媒として、クロロホルム：メタノール：２５容量％アンモニア水溶液〔７：３：４（容量比）〕の溶液で展開させることにより、薄層クロマトグラフィーを行なった。なお、標品として、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、カルジオリピンを用いた。展開後の薄層プレートについて、ニンヒドリン試薬およびＤｉｔｔｍｅｒ試薬それぞれを用いて、アミノ基の有無およびリン酸基の有無を評価し、それにより、アミノ脂質の存在を確認した。その結果を図５に示す。図中、パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。また、図中、レーン番号は、図４のクロマトグラムにおけるフラクション番号に対応する。
【００５８】
その結果、図５のパネル（Ａ）および（Ｂ）に示されるように、フラクション７８および８１に、オルニチン脂質およびタウロオルニチン脂質が存在することがわかった。
【００５９】
さらに、前記フラクション７８および８１それぞれの酸加水分解試料について、商品名：ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ  ８０〔カラム寸法４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製〕を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、オルニチンの定量を行なった。具体的には、前記フラクション７８に、十分量の６Ｎ塩酸を添加して、よく撹拌し、得られた混合物を、１００℃で２４時間加熱した。得られた産物に、ヘキサンを添加して、非水溶性物質を除去し、塩酸層の溶液を回収した。得られた溶液を、エバポレーターで蒸発乾固させた。得られた産物を、超純水に溶解させ、酸加水分解試料を得た。また、同様に、フラクション８１から、酸加水分解試料を得た。得られた酸加水分解試料を商品名：ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ  ８０〔カラム寸法４．６ｍｍ内径×２５０ｍｍ、東ソー株式会社製〕に供し、２２０ｎｍにおける吸光度によりモニターを行ないながら、流速：０．８ｍｌ／分、温度：室温で溶出を行なった。なお、溶離液（Ａ）〔０．１容量％トリフルオロ酢酸／水〕、および溶離液（Ｂ）〔０．０８容量％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル〕を溶離液として用い、溶離液（Ｂ）７０容量％〜４０容量％（２５分）の濃度勾配で溶出を行なった。なお、検量線には、同様に、オルニチンを用いて得られた検量線を用いた。検量線と、前記薄層クロマトグラフィーのスポットの濃度とに基づき、オルニチン脂質の量とタウロオルニチン脂質の量とを求めた。なお、前記薄層クロマトグラフィーのスポットの濃度は、画像解析ソフトウェアＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ（米国国立衛生研究所供給）を用いて求めた。
【００６０】
その結果、フラクション７５以降のフラクション中におけるオルニチン脂質とタウロオルニチン脂質の存在比は、１：１．７５（質量比）であることがわかった。
【００６１】
（試験例１）
実施例２において、培地として、酢酸菌基本培地の代わりに、カザミノ酸〔ディフコ（ＤＩＦＣＯ）社製、カタログ番号：５２７−００１６５〕０質量％（試験番号１）、０．１質量％（試験番号２）、０．５質量％（試験番号３）、１．０質量％（試験番号４）または２．５質量％（試験番号５）と、ポリペプトン０．５質量％と、酵母エキス０．５質量％と、グルコース０．５質量％と、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％と、残部  水（ｐＨ６．０）とからなる培地を用いたことを除き、実施例２と同様に、脂質試料を得た。
【００６２】
得られた脂質試料の一定量を、蓋付ガラス試験管に入れた。前記蓋付ガラス試験管中の脂質試料に、５質量％ピリジン溶液および１質量％ニンヒドリン溶液それぞれを、該脂質試料の２倍容量混合し、沸騰水浴中で、２５分間煮沸した。その後、得られた産物に、該脂質試料の６倍容量の蒸留水を添加し、攪拌した。得られた産物について、分光光度計を用いて、５７０ｎｍの吸光度を測定して、アミノ基の量を定量した。なお、検量線として、同様に、グルタミン酸を用いて得られた検量線を用いた。結果を表１に示す。
【００６３】
【表１】
2008113590.tif 000004
【００６４】
その結果、表１に示されるように、カザミノ酸０．５〜２．５質量％（試験番号３〜５）、特に、０．５質量％（試験番号３）を含む培地で培養した場合、アミノ基の量が増大したため、アミノ脂質含量が高くなることがわかった。
【００６５】
（試験例２）
試験例１において、用いた培地の培養前ｐＨを、６．５（試験番号６）、６．０（試験番号７）、６．０一定に調整（試験番号８）、５．５（試験番号９）、５．０（試験番号１０）または４．５（試験番号１１）としたことを除き、試験例１と同様に、脂質試料を得た。得られた脂質試料について、前記試験例１と同様に、アミノ基の量を定量した。結果を表２に示す。
【００６６】
【表２】
2008113590.tif 000005
【００６７】
その結果、表２に示されるように、ｐＨ５．０〜６．５（試験番号６〜１０）、特に、ｐＨ６．０（試験番号７）の培地で培養した場合、アミノ基の量が増大したため、アミノ脂質含量が高くなることがわかった。
【００６８】
（試験例３）
試験例１において、培地として、酢酸菌基本培地の代わりに、各種アミノ酸試料０．５質量％と、ポリペプトン０．５質量％と、酵母エキス０．５質量％と、グルコース０．５質量％と、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％と、残部  水（ｐＨ６．０）とからなる培地を用いたことを除き、試験例１と同様に、脂質試料を得た。なお、アミノ酸試料として、グループ１：リシンとアルギニンとメチオニンとシステインとの混合物〔１：１：１：１（質量比）〕（試験番号１２）；グループ２：ロイシンとイソロイシンとバリンとの混合物〔１：１：１（質量比）〕（試験番号１３）；グループ３：フェニルアラニンとトリプトファンとアスパラギン酸との混合物〔１：１：１（質量比）〕（試験番号１４）；グループ４：ヒスチジンとグルタミン酸とプロリンとトレオニンとの混合物〔１：１：１：１（質量比）〕（試験番号１５）；グループ５：アラニンとグリシンとセリンとヒドロキシプロリンとの混合物〔１：１：１：１（質量比）〕（試験番号１６）；アスパラギン酸（試験番号１７）、トリプトファン（試験番号１８）、およびフェニルアラニン（試験番号１９）を用いた。また、混合物の場合、培地中の濃度は、全アミノ酸の量としての値である。得られた脂質試料について、前記試験例１と同様に、アミノ基の量を定量した。結果を表３に示す。
【００６９】
【表３】
2008113590.tif 000006
【００７０】
その結果、表３に示されるように、フェニルアラニンとトリプトファンとアスパラギン酸との混合物（試験番号１４）で、アミノ基の量が増大したため、アミノ脂質の量が増大したことがわかる。
【００７１】
また、前記試験番号１７〜１９の脂質試料について、実施例２と同様の手法により、薄層クロマトグラフィーを行なった。その結果を図６に示す。図６中、パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。図中、レーン１は、アスパラギン酸を含む培地での培養で得られた脂質試料（試験番号１７）、レーン２は、トリプトファンを含む培地での培養で得られた脂質試料（試験番号１８）、レーン３は、フェニルアラニンを含む培地での培養で得られた脂質試料（試験番号１９）、レーン４は、ホスファチジルエタノールアミン、レーン５は、ホスファチジルグリセロール、レーン６は、ホスファチジルコリン、レーン７は、カルジオリピンを示す。さらに、前記試験番号１７〜１９の脂質試料について、実施例２と同様の手法により、オルニチン脂質の量とタウロオルニチン脂質の量とを定量した。その結果を、表４に示す。
【００７２】
【表４】
2008113590.tif 000007
【００７３】
その結果、図６および表４に示されるように、フェニルアラニンを含む培地を用いた場合（試験番号１９）、タウロオルニチン脂質の割合が増大することがわかった。また、アスパラギン酸を含む培地を用いた場合（試験番号１７）、最もアミノ脂質含有量（オルニチン脂質とタウロオルニチン脂質との合計量）が高くなることがわかった。
【００７４】
（試験例４）
酢酸菌基本培地（試験番号２０）、ポリペプトン０．５質量％と、酵母エキス０．５質量％と、グルコース０．５質量％と、硫酸マグネシウム７水和物０．１質量％と、１ｍｌあたり０．１〜０．５Ｕのセルラーゼ（和光純薬株式会社製、商品名：セルラーゼ  トリコデルマ由来  生化学用）を含む酢酸菌基本培地（「セルラーゼ含有培地」ともいう）（試験番号２１）、または１ｍｌあたり０．１〜０．５Ｕのセルラーゼ（和光純薬株式会社製、商品名：セルラーゼ  トリコデルマ由来  生化学用）を含み、かつポリペプトンの濃度と酵母エキスの濃度とグルコースの濃度と硫酸マグネシウム７水和物の濃度とが、酢酸菌基本培地の２倍である培地（「セルラーゼ含有高濃度培地」ともいう）（試験番号２２）を用い、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕を、３０℃で培養した。その後、ＯＤ６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果を、表５に示す。
【００７５】
【表５】
2008113590.tif 000008
【００７６】
その結果、表５に示されるように、酢酸菌基本培地（試験番号２０）を用いた場合に比べ、前記セルラーゼ含有培地（試験番号２１）で培養した場合、培養２日目における吸光度が、０．３２から０．８５に増大することがわかった。また、前記セルラーゼ含有高濃度培地（試験番号２２）を用いた場合、培養２日目にもかかわらず、吸光度が、２．２６となり、前記酢酸菌基本培地を用いた場合に比べ、生育がより良好になることがわかった。
【００７７】
（実施例３）
前記セルラーゼ含有培地において、培地中の酵母エキスの含有量を２倍以上にしたところ、対応して、アミノ脂質の生産量が向上し、培地中の酵母エキスの含有量を４倍以上にした場合、生産量の増加率は、ほぼ一定となることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、例えば、アミノ脂質の機能の解析、該アミノ脂質の応用用途の開発などに用いられうる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、各種酢酸菌におけるアミノ脂質であるオルニチン脂質およびタウロオルニチン脂質の存在を確認した結果の一例を示す図である。パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。図中、レーン１は、ホスファチジルエタノールアミン、レーン２は、ホスファチジルグリセロール、レーン３は、脂質試料、レーン４は、ホスファチジルコリン、レーン５は、カルジオリピンを示す。
【図２】図２は、各種酢酸菌から、タウロオルニチン脂質高生産微生物を探索した結果の一例を示す。
【図３】図３は、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕から得られた酸加水分解試料の薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。図中、レーン１は、酸加水分解試料単独、レーン２は、酸加水分解試料とタウリン標品との混合物、レーン３は、酸加水分解試料とオルニチン標品との混合物、レーン４は、酸加水分解試料とタウロオルニチン標品との混合物、レーン５は、タウリン標品とオルニチン標品とタウロオルニチン標品との混合物、レーン６は、タウリン標品、レーン７は、オルニチン標品、レーン８は、タウロオルニチン標品を示す。
【図４】図４は、グルコノアセトバクター・キシリナス  サブスピーシーズ  キシリナス〔Ｇｌｕｃｏｎｏａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｉｎｕｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｘｙｌｉｎｕｓ（ＮＢＲＣ１３６９３）〕から得られた脂質試料のケイ酸カラムクロマトグラフィーのクロマトグラムを示す図である。
【図５】図５は、ケイ酸カラムクロマトグラフィーによる分画物の薄層クロマトグラフィーの結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。図中、レーン番号は、図４のクロマトグラムにおけるフラクション番号に対応する。
【図６】図６は、アスパラギン酸、トリプトファンおよびフェニルアラニンによるアミノ脂質生産への影響を調べた結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ニンヒドリン反応によるアミノ基の検出結果、パネル（Ｂ）は、Ｄｉｔｔｍｅｒ試薬によるリン酸基の検出結果を示す。図中、レーン１は、アスパラギン酸を含む培地での培養で得られた脂質試料、レーン２は、トリプトファンを含む培地での培養で得られた脂質試料、レーン３は、フェニルアラニンを含む培地での培養で得られた脂質試料、レーン４は、ホスファチジルエタノールアミン、レーン５は、ホスファチジルグリセロール、レーン６は、ホスファチジルコリン、レーン７は、カルジオリピンを示す。
【図１】
2008113590.tif 000009
【図２】
2008113590.tif 000010
【図３】
2008113590.tif 000011
【図４】
2008113590.tif 000012
【図５】
2008113590.tif 000013
【図６】
2008113590.tif 000014