(57)【要約】【課題】分析の妨げとなる分子量の大きなペプチド断片を排除し、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によってタンパク質同定を行う。【解決手段】タンパク質同定装置１は、目的タンパク質をペプチド断片化し、ペプチド断片化したペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定装置であり、ペプチド断片化後のペプチド混合物からペプチド断片をトラップする濃縮用ＲＡＭカラム２と、濃縮用ＲＡＭカラム２にトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離するペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラム３ｂと、濃縮用ＲＡＭカラムへのペプチド混合物の導入と、濃縮用ＲＡＭカラムからトラップしたペプチド断片を導出する切り替えバルブ４と、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムで分離したペプチドを導入し質量分析する質量分析装置５とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定方法において、
ペプチド断片化後のペプチド混合物を濃縮用ＲＡＭカラムに導入し、
分子量の小さなペプチド断片を濃縮用ＲＡＭカラムにトラップし、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用ＲＡＭカラムで素通りさせて廃棄し、
濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入して逆相分離し、分離したペプチド断片を質量分析に導入することを特徴とする、タンパク質同定方法。
【請求項２】
前記ペプチド断片化は、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化する酵素消化ペプチド断片化であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質同定方法。
【請求項３】
前記ペプチド断片化は、化学断片化であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質同定方法。
【請求項４】
目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定装置において、
ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用ＲＡＭカラムと、
前記濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離するペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと、
ペプチド混合物を導入する導入ポートと、排出ポートと、濃縮用ＲＡＭカラムと接続する２つの接続ポートと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートを有し、ペプチド混合物の濃縮用ＲＡＭカラムへの導入と、濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムへの導出とを切り替える切り替えバルブと、
前記ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムで分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置とを備え、
前記濃縮用ＲＡＭカラムは、
分子量の小さなペプチド断片を濃縮用ＲＡＭカラムにトラップさせ、
分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用ＲＡＭカラムで素通りさせることを特徴とするタンパク質同定装置。
【請求項５】
前記濃縮用ＲＡＭカラムは接触制限充填材を充填することを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質同定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド断片分析によるタンパク質同定方法およびタンパク質同定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能を決定するには、タンパク質の一次構造を解析する必要がある。このタンパク質の一次構造解析には、タンパク質を切断し、ペプチド化する必要があるが、タンパク質は多様であるため、画一的にペプチド化させることは困難である。
【０００３】
タンパク質を効率よく分解し、ペプチドを収量良く回収するには、（１）タンパク質を変性させ立体構造障害による分解の不均一性を減少させること、（２）還元してタンパク質分子内にある分子間のＳ−Ｓ結合を切断し、生成した反応性に富むシステイン残基ＳＨ基を保護すること、（３）残基特異性の高いタンパク質分解酵素を用いることが重要であり、このために、タンパク質化学では、タンパク質試料を変性、還元アルキル化した後にタンパク質分解酵素により消化することで断片化ペプチド試料を調整することが一般的である。
【０００４】
この変性剤やアルキル化剤などは、多くのタンパク質分解酵素を阻害するため、溶液状態で操作する場合には、酵素が許容できる変性剤・アルキル化剤濃度まで希釈するか、あるいは、逆相クロマトグラフィー法、透析法、有機溶媒沈殿法などで変性剤、アルキル化剤を除去することが必要であることが知られている。（特許文献１参照）
【０００５】
逆相クロマトグラフィー法を用いたものとして、酵素消化ペプチド断片を逆相クロマトグラフィーカラムで濃縮・脱塩した後、カラムにトラップさせ、その後逆相クロマトグラフィー−質量分析計に導入する構成が提案されている。（非特許文献１参照）
【特許文献１】特開２００４−３０１７１５号公報（段落０００５、０００６）
【非特許文献１】LC PACKINGS Application  Note UltiMate Capillary and Nano LC system, Proteomics #8 “AUTOMATED 2D LC COUPLED TO ESI-MS/MS FOR THE ANALYSIS OF COMPLEX PEPTIED SAMPLES
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
タンパク質のペプチド化による断片化において、酵素消化が不十分であるため等によって断片化が不完全に行われる場合がある。このような不完全な断片化では、タンパク質の切れ残りなど分子量が大きなペプチド断片が生じることになる。
【０００７】
この分子量が大きなペプチド断片は、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着し分離に悪影響を及ぼす他、カラム自体も劣化させる原因となるという問題がある。
【０００８】
また、不完全な断片化で生じた分子量の大きなペプチド断片の存在は、質量スペクトルの複雑化や、同一の情報の二重取得といった測定誤差の要因となり、正確なペプチド断片の情報を得る上で妨げとなるという問題がある。
【０００９】
特に、導入したタンパク質をオンラインで還元アルキル化後、酵素消化を行い、ペプチド分離−質量分析を行うカラムスイッチングシステムでは、酵素消化が不十分なことも多く、上述した問題が顕著となる。
【００１０】
また、この不十分なペプチド断片化による分子量の大きなペプチド断片の発生の問題は、酵素消化によるペプチド断片化に限らず、化学的手法による化学断片化においても同様に発生するものである。
【００１１】
そこで、本発明は上記課題を解決して、分析の妨げとなる分子量の大きなペプチド断片を排除し、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によってタンパク質同定を行うことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、逆相クロマトグラフィー分離前の段階において、ＲＡＭカラムでペプチド混合物を濃縮させることによって、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着したり、タンパク質を同定する配列情報を複雑化・増加させない程度の、比較的小さな分子量のペプチド断片のみをＲＡＭカラムにトラップさせ、一方、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに吸着してペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りや、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片については、このＲＡＭカラムを通過させてトラップさせないことによって、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によるタンパク質の同定を行うという目的を達成する。
【００１３】
本発明は、タンパク質同定方法の方法態様と、タンパク質同定装置の装置態様とすることができる。
【００１４】
本発明のタンパク質同定方法の態様は、目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定方法において、ペプチド断片化後のペプチド混合物を濃縮用ＲＡＭカラムに導入する工程、分子量の小さなペプチド断片を濃縮用ＲＡＭカラムにトラップする工程、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用ＲＡＭカラムで素通りさせて廃棄する工程、濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入して逆相分離する工程、分離したペプチド断片を質量分析に導入する工程を有する。
【００１５】
濃縮用ＲＡＭカラムは、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を素通りさせ、分子量の小さなペプチド断片のみをトラップし、このトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムに導入することによって、ペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りが逆相クロマトグラフィー分離カラムに導入されることを防ぐことができ、また、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片が質量分析に導入されることを防ぐことができる。
【００１６】
また、ペプチド断片は酵素消化ペプチド断片化によって行う他、化学ペプチド断片化によって行うことができる。酵素消化ペプチド断片化では、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化して行う。
【００１７】
また、本発明のタンパク質同定装置は、目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物からペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離し、質量分析することでタンパク質を同定するタンパク質同定装置であり、ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用ＲＡＭカラムと、この濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離するペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと、濃縮用ＲＡＭカラムへのペプチド混合物の導入と、濃縮用ＲＡＭカラムからトラップしたペプチド断片を導出する切り替えバルブと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムで分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置とを備える。
【００１８】
ここで、切り替えバルブは、ペプチド混合物を導入する導入ポートと、排出ポートと、濃縮用ＲＡＭカラムと接続する２つの接続ポートと、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートを有する。この切り替えバルブは、濃縮用ＲＡＭカラムの接続ポートに導入ポートと排出ポートとを接続する切り替えによって、ペプチド混合物を濃縮用ＲＡＭカラムに導入し、分子量の小さなペプチド断片をトラップし、濃縮用ＲＡＭカラムの接続ポートとペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと接続する接続ポートとを接続する切り替えによって、濃縮用ＲＡＭカラムにトラップしたペプチド断片をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムへ導出する。
【００１９】
また、本発明の濃縮用ＲＡＭカラムは、分子量の小さなペプチド断片を濃縮用ＲＡＭカラムにトラップさせ、分子量の大きなペプチド断片および残余のタンパク質を濃縮用ＲＡＭカラムで素通りさせる。これによって、ペプチドの分離の悪影響を及ぼすタンパク質の切れ残りが逆相クロマトグラフィー分離カラムに導入されることを防ぎ、配列情報を複雑化・増加させるような分子量の大きなペプチド断片が質量分析に導入されることを防ぐ。この濃縮用ＲＡＭカラムは接触制限充填材を充填する構成とすることができる。
【００２０】
導入したタンパク質をオンラインで還元アルキル化後、酵素消化を行い、ペプチド分離−質量分析を行うカラムスイッチングシステムでは、酵素消化が不十分なことも多いため、本発明の濃縮用ＲＡＭカラム導入の効果はより顕著となる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、分析の妨げとなる分子量の大きなペプチド断片を排除し、分析に適した大きさの分子量のペプチド断片によってタンパク質同定を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明の実施の形態について、図を参照しながら詳細に説明する。
【００２３】
図１は、本発明のタンパク質同定装置の概略構成を説明するための図である。
【００２４】
図１において、本発明のタンパク質同定装置１は、ペプチド断片化後のペプチド混合物を導入してペプチド断片をトラップする濃縮用ＲＡＭカラム２と、この濃縮用ＲＡＭカラム２にトラップしたペプチド断片を導入してペプチドを分離してイオン化するイオン化部３と、イオン化部３で分離したペプチドを導入して質量分析を行う質量分析装置５と、ペプチド混合物の濃縮用ＲＡＭカラム２への導入と、濃縮用ＲＡＭカラム２にトラップしたペプチド断片をイオン化部３への導出を切り替える切り替えバルブ４を備える。
【００２５】
切り替えバルブ４は、ペプチド混合物を導入する導入ポート４ａと、排出ポート４ｂと、濃縮用ＲＡＭカラム２を接続するための２つの接続ポート４ｃ、４ｆと、イオン化部３を接続する接続ポート４ｅと、移動相を導入するためのポート４ｄを備える。
【００２６】
導入ポート４ａにはインジェクタ１４が接続される。このインジェクタ１４には、送液ポンプ１１により送られた試料導入液２１に同定対象の試料が注入され、切り替えバルブ４の導入ポート４ａに導入される。インジェクタ１４に注入される試料としては、例えば、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化する酵素消化ペプチド断片化、あるいは化学断片化で断片化した断片化ペプチドを用いる。
【００２７】
また、移動相を導入するためのポート４ｄには、送液ポンプ１２，１３により移動相２２，２３が導入される。送液ポンプ１２，１３とポート４ｄとの間には、グラジエントミキサ１５、抵抗管１７が接続されたジョイント１６が接続され、移動相２２，２３によるグラジエントを行うことができる。
【００２８】
なお、試料導入液２１，移動相液２２，２３と送液ポンプ１１、１２，１３との間にはデガッサ１８を設けてもよい。デガッサ１８を設けることで、試料導入液２１や移動相２２，２３中に含まれる酸素分子や窒素分子を排出し、下流側の流路中での気泡の発生を防ぐことができる。
【００２９】
接続ポート４ｃ、４ｆの両端には濃縮用ＲＡＭカラム２が接続される。また、排出ポート４ｂは、切り替えバルブ４を切り替えることで、濃縮用ＲＡＭカラム２の一端と接続され、試料導入液２１とともに濃縮用ＲＡＭカラム２を通過した大きな分子量のペプチド断片やタンパク質の切り残りを排出する。
【００３０】
また、導出ポート４ｆには、フィルタ１９を介してイオン化部３に接続され、切り替えバルブ４を切り替えることで、濃縮用ＲＡＭカラム２に接続され、移動相２２，２３とともに濃縮用ＲＡＭカラム２にトラップしたペプチド断片をイオン化部３に導入する。
【００３１】
イオン化部３は、濃縮用ＲＡＭカラム２から導入されたペプチド断片の多プロトン化分子をペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラムと兼用するエレクトロスプレーキャピラリ（以下では、ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラム３ｂとする）に通して分離した後、エレクトロスプレーユニット３ａでイオン化して質量分析装置５に導入する。
【００３２】
ここで、濃縮用ＲＡＭカラム２は、分子量の大きな高分子化合物は保持することなく通過させ、分子量の小さな低分子化合物をのみを保持する性質を備えるカラムであり、特殊な表面構造と細孔サイズにより、ある条件では低分子量の目的成分を保持しつつ、かつ細孔内に入らないタンパク質を素通りさせることができる。本発明は、この濃縮用ＲＡＭカラムを酵素消化ペプチド断片によるペプチドマッピングシステムに適用することで、切れ残りのタンパク質や、不完全な断片化で生じた分子量の大きなペプチド断片を選択的に取り除くことができる。
【００３３】
このカラムとしては、例えば、Shim-pack MAYI-ODS（島津製作所）、ISPR-GFF(Regis Technologies inc),Lichrospher PR-18 ADS(Merck)がある。Shim-pack MAYI-ODSでは、シリカゲルの外表面を親水性ポリマーでコーティングし、細孔内部のみをオクタデシル基（ODS）で化学装飾る表面構造であり、タンパク質のような高分子は細孔内部に入れず、また、外表面の親水性ポリマーにブロックされるため、固定相ODSには保持されずに溶出され、一方、誘起低分子化合物は細孔内部に浸透し、内部表面の固定相に保持されるものである。
【００３４】
次に、本発明のタンパク質同定装置の動作例について、図２，３を用いて説明する。
【００３５】
はじめに、切り替えバルブ４を切り替えることで、導入ポート４ａにインジェクタ１４の流路を接続しておく（図２中のＡ）。目的タンパク質をペプチド断片化し、このペプチド断片化で得られたペプチド混合物を用意しておき、このペプチド混合物をインジェクタ１４から注入し、試料導入液２１とともに導入ポート４ａに導入する。
【００３６】
ペプチド断片化は、例えば、目的タンパク質を還元アルキル化後、タンパク質分解酵素により消化する酵素消化ペプチド断片化、あるいは、化学的手法による化学断片化を用いることができる（図２中のＢ）。
【００３７】
導入ポート４ａから導入されたペプチド混合物（タンパク質酵素消化物）は、接続ポートｆから濃縮用ＲＡＭカラム２内に導入され、接続ポート４ｃ、排出ポート４ｂを通して排出される（図２中のＤ）。送液ポンプ１１を駆動して試料導入液２１を送液し続けることによって、濃縮用ＲＡＭカラム２では、導入されたペプチド混合物に対して、脱塩、切り残りのタンパク質の除去、分子量の大きなペプチド断片の除去を行うとともに、低分子量のペプチド断片を濃縮して保持する（図２中のＣ）。
【００３８】
次に、切り替えバルブ４を切り替えて、導入ポート４ｄにグラジエントミキサ１５の流路を接続する（図３中のＥ）。送液ポンプ１２，１３を駆動して移動相２２，２３の送液を開始し、接続ポート４ｄ、４ｃを通して濃縮用ＲＡＭカラム２に移動相を導入し（図３中のＦ）、濃縮用ＲＡＭカラム２にトラップされているペプチド断片を移動相とともに、接続ポート４ｆ、導出ポート４ｅを通してイオン化部３に導入する（図３中のＧ）。
【００３９】
イオン化部３は、導入されたペプチド断片を分離してイオン化し、質量分析装置５に導入する（図３中のＨ）。
【００４０】
上記図１〜３に示す例では、ペプチド断片を逆相クロマトグラフィーにより分離した後、質量分析計で検出する構成において、質量分析計のイオン化をエレクトロスプレー法で行う形態を示しているが、エレクトロスプレー法に限らず、逆相クロマトグラフィーで分離した後、フラクションコレクタで分取し、ＭＡＬＤＩ法（Matrix Asssisted Laser Desortion/Ionization（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法））でイオン化する形態としてもよい。
【００４１】
図４は、本発明のタンパク質同定装置の概略構成の別例を説明するための図である。なお図４において、フィルタ１９までの構成は図１に示した構成と同様であるため、フィルタ１９の構成について説明する。図１に示した構成はオンラインによる構成であるのに対して、図４に示す構成はオフラインによる構成である。
【００４２】
ＲＡＭカラム４にトラップされているペプチド断片を移動相とともに接続ポート４ｆ、導出ポート４ｅを通して分析カラム３１へ導入する。分析カラム３１は、導入されたペプチド断片を分離し、ＵＶ等の検出器３２を通す。検出器３２で検出されたピーク又は時間によって分取し。フラクションコレクタ又はＭＡＬＤＩプレートスポッター３３に導入する。
【００４３】
フラクションコレクタ又はＭＡＬＤＩプレートスポッター３３に分取されたペプチド成分あるいは画分は、ＭＡＬＤＩ（Matrix Asssisted Laser Desortion/Ionization）−ＴＯＦＭＳ（Time of Flight Mass Spectrometry（飛行時間型質量分析））装置３４に導入する。なお、フラクションコレクタとしては、例えば、島津FRC-10A（商品名）があり、ＭＡＬＤＩプレートスポッターとしては、例えば、島津AccuSpot（商品名）がある。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のタンパク質同定装置の概略構成を説明するための図である。
【図２】本発明のタンパク質同定装置の動作例を説明するための図である。
【図３】本発明のタンパク質同定装置の動作例を説明するための図である。
【図４】本発明のタンパク質同定装置の概略構成の別例を説明するための図である。
【符号の説明】
【００４５】
１…タンパク質同定装置、２…濃縮用ＲＡＭカラム、３…イオン化部、３ａ…ペプチド断片をエレクトロスプレーユニット、３ｂ…ペプチド分離用逆相クロマトグラフィーカラム、４…切り替えバルブ４、４ａ…導入ポート、４ｂ…排出ポート、４ｃ…接続ポート、４ｄ…移動相導入ポート、４ｅ…導出ポート、４ｆ…接続ポート、５…質量分析装置、１１，１２，１３…送液ポンプ、１４…インジェクタ、１５…グラジエントミキサ、１６…Ｔジョイント、１７…抵抗管、１８…デザッサ、２１…試料導入液、２２，２３…移動相、３１…分析カラム、３２…検出器、３３…フラクションコレクタ、ＭＡＬＤＩプレートスポッター、３４…ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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