(57)【要約】【課題】本発明は、標的細胞に対して高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現できるような、遺伝子導入システムを開発すること、特に、ウイルスベクターを用いた遺伝子導入療法において、上記システムの開発をすることを目的とする。【解決手段】本発明は、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、治療遺伝子を含む薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、
前記組織特異的抗原または前記抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した前記哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
前記ライブラリー由来の前記ハイブリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記細胞に感染させ、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
所望の抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、
前記抗原に対するモノクローナル抗体を取得する工程、および
前記モノクローナル抗体の存在下で、前記抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記抗原を発現する細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記細胞に感染させ、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
前記抗原を発現する細胞が、前記抗原を発現するベクターをトランスフェクトされた細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ライブラリー由来の前記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記細胞への感染が、
（Ａ）前記ライブラリー由来の前記ハイブリドーマ由来産物を、前記細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを前記細胞に接触させるか、
（Ｂ）前記ライブラリー由来の前記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、前記細胞に接触させるか、または
（Ｃ）前記ライブラリー由来の前記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、前記細胞に接触させること、
によって行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体の存在下での、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記細胞への感染が、
（Ａ）前記モノクローナル抗体を前記細胞と接触させた後、前記抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを前記細胞に接触させるか、
（Ｂ）前記モノクローナル抗体と、前記抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、前記細胞に接触させるか、または
（Ｃ）前記モノクローナル抗体と、前記抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、前記細胞に接触させること、
によって行われる請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現測定アッセイによって前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記細胞に対する前記感染効率を評価することを含み、ここで前記ファイバー変異型アデノウイルスは、前記感染の際に前記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、請求項１または４に記載の方法。
【請求項７】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項７または８のいずれかの方法により調製されたモノクローナル抗体。
【請求項１０】
抗ＰＡＰ２ａ抗体である、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記ファイバー変異型アデノウイルスが、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスウイルスである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞が、腺癌細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞が、膵癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織特異的抗原が、腫瘍特異的抗原である、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍特異的抗原が、ＰＡＰ２ａである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項２または３に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原が、ＣＥＡ、ヒトＣＤ４４、またはヒトＣＤ１４７である、請求項２または３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＡＰ２ａに対する抗体ならびにその診断的および治療的使用に関する。特に、本発明は、前立腺癌、膵癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌等を含む癌組織に高発現するＰＡＰ２ａに対して特異的に結合するモノクローナル抗体の作製、ならびにその診断的および治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、癌の遺伝子療法としては、治療ベクターを腫瘍内投与することが一般的に行われてきた。しかしながら、このような局所投与法は、転移腫瘍を有する患者の治療には有効ではないため、最近では、転移腫瘍を特異的に標的化し得、したがって、全身投与が可能なベクターの開発が行われている。
【０００３】
既に、ＢＨＫハムスター及びマウスにおいて転移した腫瘍細胞に特異的に感染し、アポトーシスを誘導し得るシンドビスウイルスベクター（非特許文献１：Ｔｓｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：７０−７７，２００４）、ｒａｓ遺伝子に変異を有する膵癌などに特異的に細胞毒性を示すＶＡＩ変異型アデノウイルス（非特許文献２：Ｃａｓｃａｌｌｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：５５４４−５５５０，２００３）等が、報告されている。
【０００４】
アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡをゲノムに有する正二十面体構造のウイルスであり、血清学的には幾つかに分類されている。ヒトの遺伝子治療に通常使用されるのは、ヒトアデノウイルス２型（Ａｄ２）および５型（Ａｄ５）である（例えば、特許文献１：特開２００２−３３０７８９）。アデノウイルスのウイルス核酸は、正二十面体構造を有するキャプシドと呼ばれる外被タンパク質に包まれており、キャプシドの表面には、その正二十面体構造の各頂点にテールとシャフトを、および末端にノブ（Ｋｎｏｂ）を有する１２本のファイバーが存在している。これらのファイバーは、アデノウイルスが細胞に感染するために必要であり、アデノウイルスは、これらのファイバーを介して細胞表面レセプターに結合する。そのような細胞表面レセプターとしてＣＡＲ（コクサッキーアデノウイルスレセプター）（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が知られており、実際、大部分のアデノウイルスは、細胞への接着のためにＣＡＲを利用すると考えられている。
【０００５】
アデノウイルスは、正常細胞を含む、ＣＡＲを発現する多くの細胞タイプに感染し得るため、ベクターとしての利用価値が高く評価されてきたが、反面、そのような宿主域の広さのために、アデノウイルスベクターを用いて遺伝子導入を行った場合に、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）のみならず、周囲の正常細胞にも感染してしまうという問題が指摘されている。その一方、膵癌細胞やメラノーマなどでは、ＣＡＲの発現が低いために、アデノウイルスが感染しにくいという問題があることも判明している。
【０００６】
そのため、本発明者らはこれまで、膵癌細胞などの標的細胞に高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現できるような癌標的化ウイルスベクターによる遺伝子導入系の開発を目指してきた。本発明者らは、これまでに、抗体のＦｃドメインに結合するＰｒｏｔｅｉｎＡのＺ３３モチーフをノブのＨＩループ部位に含むＦＺ３３ファイバー変異型Ａｄ５ウイルスを使用して、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどのレポーター遺伝子を発現するアデノウイルスを作製した。そして、ＣＡＲの発現を欠く白血病細胞に高発現する膜タンパク質分子ＣＤ４０、ＣＤ２０などに対する抗体を予め白血病細胞に付着させ、それらに対してベータ・ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルスＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を感染させ、遺伝子導入効率をβ−ｇａｌレポーター遺伝子発現を指標として測定した。その結果、使用した抗体のうちいくつかの場合について遺伝子発現がコントロールの数倍に増強されることがわかっている。しかしながら、膵癌細胞などの他の腫瘍細胞に選択的かつ効果的に遺伝子導入できるような標的化の候補分子は未だ見出されていない。
【０００７】
ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、ホスファチジン酸（ＰＡ）のジアシルグリセロール（ＤＧ）への変換を触媒する酵素である。ＰＡＰ２ａは、ホスファチジン酸ホスファターゼのアイソザイムであり、最初にブタおよびマウスにおいて同定され（非特許文献３：Ｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１（３１），１８９３１−１８９３８）、その後、ヒトにおいても同定された（非特許文献４：Ｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，２４５７２−２４５７８）。
【０００８】
ＰＡＰ２ａは、ヒトの正常組織（特に前立腺）、および前立腺癌で発現することが報告されているが（非特許文献５：Ｌｅｕｎｇ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８（４）：３７７−８５；  非特許文献６：Ｕｌｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（８）：４６６０−４６６５）、Ｌｅｕｎｇらは、多くの組織において腫瘍化によりＰＡＰ２ａがダウンレギュレートされることを示している。また、ＬｅｕｎｇらによるＰＣＴ出願（特許文献１：ＷＯ９８／４６７３０）に開示される発明も、ＰＡＰ２ａが癌抑制遺伝子であるとの知見に基づいている。Ｕｌｔｉｘらによれば、ヒト組織における発現は、偏在的であるが、最も高いレベルの発現が前立腺で確認されている（Ｕｌｔｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，前出）。ＵｌｔｉｘらによるＰＡＰ２ａの前立腺癌培養細胞株での発現は、アンドロジェン依存性であることが報告されているが（Ｕｌｔｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、このタンパク質の生物学的な重要性（例えば、なぜ膜表面に局在するのか、前立腺ないし前立腺癌細胞株でどのような役割を担っているのか等）は、依然不明のままである。
【特許文献１】特開２００２−３３０７８９
【特許文献２】ＷＯ９８／４６７３０
【非特許文献１】Ｔｓｅｎｇ，Ｊ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：７０−７７，２００４
【非特許文献２】Ｃａｓｃａｌｌｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：５５４４−５５５０，２００３
【非特許文献３】Ｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１（３１），１８９３１−１８９３８
【非特許文献４】Ｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２，２４５７２−２４５７８
【非特許文献５】Ｌｅｕｎｇ  ＤＷ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９８（４）：３７７−８５
【非特許文献６】Ｕｌｒｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３（８）：４６６０−４６６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したような状況において、ウイルスベクターを用いて、種々の標的細胞に対して高い選択性を有しかつ高効率で遺伝子を導入及び発現できるような、遺伝子導入系のさらなる開発およびそのような開発のための手法の確立が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、膵癌細胞その他の種々の癌細胞に抗体のＦｃドメインに結合するＦＺ３３モチーフを有するアデノウイルスを感染させる際に、マウスをハムスターＨａｓ細胞で免疫して作製したモノクローナル抗体を、その感染の際に併用することによって遺伝子導入効率を高めることができる当該モノクローナル抗体のスクリーニングを、レポーター遺伝子発現測定アッセイ法を用いて行った。その結果、本発明者らは、選択的にアデノウイルスの感染効率を高めることのできるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することができた。
【００１１】
さらに、そのモノクローナル抗体が特異的に認識する抗原を質量分析および相同性検索により同定した。その結果、上記モノクローナル抗体の認識する抗原がＰＡＰ２ａであることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のＰＡＰ２ａ抗体、および該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。
（１）ＰＡＰ２ａに対する抗体。
（２）モノクローナル抗体である、上記（１）に記載の抗体。
（３）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である、上記（２）に記載の抗体。
（４）上記（２）に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
（５）受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された上記（４）に記載のハイブリドーマ。
【００１３】
本発明はまた、以下に記載する抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する癌の診断薬を提供する。
（６）抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する、癌の診断薬。
（７）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマが産生する抗ＰＡＰ２ａ抗体である、上記（６）に記載の癌の診断薬。
（８）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、標識されている、上記（６）または（７）に記載の癌の診断薬。
（９）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素によって標識されている、上記（８）に記載の癌の診断薬。
（１０ａ）上記癌が、ＰＡＰ２ａ陽性の（ＰＡＰ２ａを高発現することによって特徴付けられる）癌である、上記（６）〜（９）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（１０ｂ）上記癌が、腺癌である、上記（１０ａ）に記載の癌の診断薬。
（１０ｃ）上記癌が、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（１０ａ）または（１０ｂ）に記載の癌の診断薬。
【００１４】
本発明はまた、以下に記載する癌の診断方法を提供する。
（１１）被験者由来の生体試料中のＰＡＰ２ａタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
（１２）被験者由来の生体試料中のＰＡＰ２ａタンパク質もしくはその断片を、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する、上記（１１）に記載の方法。
（１３）上記生体試料と抗ＰＡＰ２ａ抗体とを接触させる工程、および
該生体試料中のＰＡＰ２ａと該抗ＰＡＰ２ａ抗体との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、上記（１２）に記載の方法。
（１４）上記検出および／または定量する工程が、標識された抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、ＰＡＰ２ａと抗ＰＡＰ２ａ抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、上記（１３）に記載の方法。
（１５）上記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、精液、唾液、または汗である、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（１２）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマが産生する抗ＰＡＰ２ａ抗体である、上記（１１）〜（１６）のいずれかに記載の方法。
（１８ａ）上記癌が、ＰＡＰ２ａ陽性の癌である、上記（１１）〜（１７）のいずれかに記載の方法。
（１８ｂ）上記癌が、腺癌である、上記（１８ａ）に記載の方法。
（１８ｃ）上記癌が、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（１８ａ）または（１８ｂ）に記載の方法。
【００１５】
本発明はまた、以下の検出および／または定量方法を提供する。
（１９）ＰＡＰ２ａを細胞表面に発現した細胞を免疫学的に検出および／または定量する方法。
【００１６】
本発明はまた、以下に記載する抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する癌の治療薬を提供する。
（２０）抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する、癌の治療薬。
（２１）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生される抗ＰＡＰ２ａ抗体である、上記（２０）に記載の癌の治療薬。
（２２）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマが産生する抗ＰＡＰ２ａ抗体の機能的断片である、上記（２１）に記載の癌の治療薬。
（２３）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（２４）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、ウイルスベクターに結合されている、上記（２３）に記載の癌の治療薬。
（２５）上記ウイルスベクターが、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスである、上記（２４）に記載の癌の治療薬。
（２６）上記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、上記（２３）に記載の癌の治療薬。
（２７）上記リポソームベクターが、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、フォスファチジルコリン（ＰＣ）、フォスファチジルセリン（ＰＳ）、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群から選択されるリポソーム、または該リポソームの２種以上のいずれかの組み合わせからなるリポソームである、上記（２６）に記載の癌の治療薬
（２８）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＰＡＰ２ａ発現細胞を溶解または成長を阻害する、上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（２９）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、ＰＡＰ２ａ発現細胞をオプソニン化する、上記（２０）〜（２３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（３０ａ）上記癌が、ＰＡＰ２ａ陽性の癌である、上記（２０）〜（２９）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（３０ｂ）上記癌が、腺癌である、上記（３０ａ）に記載の癌の治療薬。
（３０ｃ）上記癌が、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（３０ａ）または（３０ｂ）に記載の癌の治療薬。
【００１７】
本発明はまた、以下に記載する抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いた標的指向化方法を提供する。
（３１）抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。
（３２）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生される抗ＰＡＰ２ａ抗体である、上記（３１）に記載の方法。
（３３）上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９またはＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体の機能的断片である、上記（３２）に記載の方法。
（３４）上記薬剤が、上記抗ＰＡＰ２ａ抗体と化学的または遺伝子工学的に結合している、上記（３１）〜（３３）のいずれかに記載の方法。
（３５）上記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、上記（３１）〜（３４）のいずれかに記載の方法。
（３６）上記治療遺伝子が、ウイルスベクターに担持されている、上記（３５）に記載の方法。
（３７）上記ウイルスベクターが、上記抗ＰＡＰ２ａ抗体が結合し得るファイバー変異型アデノウイルスである、上記（３６）に記載の方法。
（３８）上記標的部位が、ＰＡＰ２ａを特異的に発現している細胞、組織、または臓器である、上記（３１）〜（３７）のいずれかに記載の方法。
（３９）上記標的部位が、膵癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞である、上記（３１）〜（３８）のいずれかに記載の方法。
【００１８】
本発明はさらに、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いる以下の方法を提供する。
（４０）抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いてＰＡＰ２ａ発現細胞をオプソニン化する方法。
（４１）抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＰＡＰ２ａ発現細胞を溶解またはその成長を阻害する方法。
【００１９】
本発明はさらに、以下の組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体のスクリーニングまたは調製方法を提供する。
（４２）組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、
上記組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
（４２ａ）所望の抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングする方法であって、
上記抗原に対するモノクローナル抗体を取得する工程、および
上記モノクローナル抗体の存在下で、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記抗原を発現する細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
（４２ｂ）上記抗原を発現する細胞が、該抗原を発現するベクターをトランスフェクトされた細胞である、上記（４２ａ）に記載の方法。
（４３）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞への感染が、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、
によって行われる上記（４２）に記載の方法。
（４３ａ）上記モノクローナル抗体の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞への感染が、
（Ａ）上記モノクローナル抗体を上記細胞と接触させた後、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記モノクローナル抗体と、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記モノクローナル抗体と、該抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、
によって行われる上記（４２ａ）に記載の方法。
（４４）上記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現測定アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する上記感染効率を評価することを含み、ここで上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、上記（４２）または（４３）に記載の方法。
（４４ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（４４）に記載の方法。
（４４ｂ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（４４）に記載の方法。
（４４ｃ）上記（４４ａ）または（４４ｂ）のいずれかの方法により調製されたモノクローナル抗体。
（４４ｄ）抗ＰＡＰ２ａ抗体である、上記（４４ｃ）に記載の抗体。
（４５）上記ファイバー変異型アデノウイルスが、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスウイルスである、上記（４２）〜（４４）のいずれかに記載の方法。
（４６）上記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰである、上記（４５）に記載の方法。
（４７）上記細胞が腫瘍細胞である、上記（４２）〜（４６）のいずれかに記載の方法。
（４７ａ）上記腫瘍細胞が、腺癌細胞である、上記（４７）に記載の方法。
（４７ｂ）上記腫瘍細胞が、膵癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞である、上記（４７）または（４７ａ）に記載の方法。
（４７ｃ）上記組織特異的抗原が、腫瘍特異的抗原である、上記（４２）〜（４６）のいずれかに記載の方法。
（４７ｄ）上記腫瘍特異的抗原が、ＰＡＰ２ａである、上記（４７ｃ）に記載の方法。
（４７ｅ）上記細胞がＣＨＯ細胞である、上記（４２ａ）または（４２ｂ）に記載の方法。
（４７ｆ）上記抗原が、ＣＥＡ、ヒトＣＤ４４、またはヒトＣＤ１４７である、上記（４２ａ）または（４２ｂ）に記載の方法。
【００２０】
本発明はさらに、以下のような自己抗体を用いた癌の診断方法を提供する。
（４８）ＰＡＰ２ａに対する自己抗体を癌の診断マーカーとして使用する方法。
（４９）被験者由来の生体試料中の抗ＰＡＰ２ａ自己抗体を検出および／または定量する工程を包含する、上記（４８）に記載の方法。
（５０ａ）上記癌が、ＰＡＰ２ａ陽性の癌である、上記（４８）または（４９）に記載の方法。
（５０ｂ）上記癌が、腺癌である、上記（５０ａ）に記載の方法。
（５０ｃ）上記癌が、膵癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、または乳癌である、上記（５０ａ）または（５０ｂ）に記載の方法。
【００２１】
本発明はさらに、以下の抗ＰＡＰ２ａ抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、抗ＰＡＰ２ａ抗体の製造方法、およびそれにより製造される抗ＰＡＰ２ａ抗体を提供する。
（５１）抗ＰＡＰ２ａ抗体をコードするＤＮＡ。
（５２）抗ＰＡＰ２ａ抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）をコードするＤＮＡ。
（５３）上記（５１）または（５２）に記載のＤＮＡを含有するベクター。
（５４）上記（５３）に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（５５）上記（５４）に記載の形質転換体を適切な培地で培養する工程、および
【００２２】
該培養物から抗ＰＡＰ２ａ抗体を収集する工程
を包含する、抗ＰＡＰ２ａ抗体の製造方法。
（５６）上記（５５）に記載の方法により製造される、抗ＰＡＰ２ａ抗体。
（５７）Ｈ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）を含有する、上記（５６）の抗ＰＡＰ２ａ抗体。
【００２３】
本発明はまた、以下のような特徴を有する抗ＰＡＰ２ａ抗体を提供する。
（５８）特定の細胞に対するウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる、抗ＰＡＰ２ａ抗体。
（５９）抗ＰＡＰ２ａ抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含むヒト化抗ＰＡＰ２ａ抗体。
（６０）ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である、上記（５９）に記載のヒト化抗ＰＡＰ２ａ抗体。
（６１）抗ＰＡＰ２ａ抗体と放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤とを化学的または遺伝子工学的に結合させた誘導体。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、ＰＡＰ２ａ陽性の癌（特に腺癌）の診断および治療において有用である。
【００２５】
本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、少なくとも膵癌、肺癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、および乳癌を含むＰＡＰ２ａ陽性の癌の診断および治療において特に有用である。
【００２６】
本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体と、抗体のＦｃドメインへの結合ドメインを有する組換えアデノウイルスベクターとを組み合わせて使用することによって、原発性腫瘍のみならず、転移腫瘍に対してもアデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療の標的指向化が可能になる。
【００２７】
本発明の組織（例えば、癌）特異的抗原に対する抗体の同定方法は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補とそれに対する抗体の組み合わせを系統的に探索するために有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明により、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いて、標的細胞への遺伝子導入の効率を高めるモノクローナル抗体が同定された。さらに、本発明により、上記モノクローナル抗体に対する抗原が、ＰＡＰ２ａであることが確認された。
【００２９】
さらに本発明者らは、上記モノクローナル抗体を併用して、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いた種々の癌細胞への遺伝子導入を評価し、少なくとも膵癌細胞および前立腺癌細胞において遺伝子導入効率が顕著に高まることを見出した。したがって、本発明は、ＰＡＰ２ａをマーカーとして利用するこれらの癌の診断、および／またはＰＡＰ２ａを標的としたこれらの癌の標的化療法を提供する。
【００３０】
癌特異的抗原の同定および該抗原に特異的に結合し得る抗体を同定することにより、癌のイメージングおよび／または処置のために有用なシステムが提供される。
【００３１】
１．抗ＰＡＰ２ａ抗体
本発明は、ＰＡＰ２ａに対する抗体を提供する。
本明細書中、「ＰＡＰ２ａ（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２Ａ  ｉｓｏｆｏｒｍ  １）」、「ＰＡＰ２ａタンパク質」、または「ＰＡＰ２ａ抗原」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号ＮＰ＿００３７０２で登録されているアミノ酸配列（配列番号１）で特定される２８４アミノ酸残基のタンパク質、ならびに上記タンパク質の断片、またはこれらの誘導体を意味する。ここで、「誘導体」とは、ＰＡＰ２ａタンパク質またはその断片のアミノ酸配列において１または複数個（例えば、数個（例、６個））のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にＰＡＰ２ａタンパク質と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、ＰＡＰ２ａの発現によって特徴付けられる疾患の診断および／または治療に使用され得る程度に、抗ＰＡＰ２ａ抗体によって特異的に認識されるような特異性の程度を意味する。誘導体の典型的な例には、ＰＡＰ２ａ多型、スプライシングなどによる配列変化がある。ここで、「断片」の長さとしては、抗ＰＡＰ２ａ抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、好ましくは６アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは１０アミノ酸以上である。また、これらの断片は、ＰＡＰ２ａタンパク質の任意の部分であり得るが、ＰＡＰ２ａタンパク質のエピトープに対応するか、エピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。
【００３２】
本明細書中、「抗ＰＡＰ２ａ抗体」または「ＰＡＰ２ａに対する抗体」は、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。本発明に使用する抗体は、以下に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。
【００３３】
本明細書中、抗体があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋa）が少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、１０9Ｍ-1、さらにより好ましくは、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1、１０12Ｍ-1またはそれより高い、例えば、最高で１０13Ｍ-1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００３４】
本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得るが、モノクローナル抗体であることが好ましい。ＰＡＰ２ａに対するモノクローナル抗体の好適な例としては、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９およびＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に２００５年４月８日付で寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が挙げられる。
【００３５】
したがって、本発明はまた、ＰＡＰ２ａに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。特に、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９およびＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２００５年４月８日付で寄託されているハイブリドーマを提供する。
【００３６】
以下、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体の作製において利用し得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片等の一般的な作製方法について説明する。
【００３７】
（モノクロナール抗体の作製方法）
モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＰＡＰ２ａに対するモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。ＰＡＰ２ａを、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００３８】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  （１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：  ４９５）に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用し得るが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に、放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４０】
モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
【００４１】
（ポリクローナル抗体の作製方法）
ＰＡＰ２ａに対するポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質の抗原）と担体タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と担体タンパク質との複合体に関して、担体タンパク質の種類および担体とハプテンとの混合比は、担体に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、任意のものを任意の比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンと担体のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタールアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００４２】
（抗体断片または誘導体の製造方法）
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂは、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
【００４３】
Ｆ（ａｂ’）2は、ＩｇＧをタンパク質ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。
【００４４】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
【００４５】
上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’はまた、全長抗ＰＡＰ２ａ抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによっても製造することができる（例えば、Ｃｏ  Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ  Ａ．Ｈ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６；  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５；  Ｌａｍｏｙｉ  Ｅ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３；  Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９；  Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７等を参照）。
【００４６】
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと略すこともある）は、一本の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＨと略す）と一本の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＬと略す）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと略す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３を参照）。本発明の一本鎖抗体は、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。
【００４７】
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも略すこともある）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７，６９７  （１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるジスルフィド安定化Ｖ領域断片に含まれるＶＨおよびＶＬは、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００４８】
本発明のジスルフィド安定化Ｖ領域断片は、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることにより製造することができる。相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略す）を含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００４９】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００５０】
（ヒト化抗体）
ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体あるいはヒト型ＣＤＲ移植抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８１（２１），６８５１−６８５５，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｊｏｎｅｓ  Ｐ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，３２１（６０６９），５２２−５２５，１９８６）。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖）Ｃ領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定で、かつ抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃｏ  Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５），１１１８−１１２５，１９９６）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合に有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６（５），１３５１−１３６１，１９８７；  Ｂｉｎｄｏｎ  Ｃ．Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８（１），１２７−１４２，１９８８）、副作用を回避でき、しかもマウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ８５（４），６６８−６７４，１９９５）。さらに、蛋白質工学、遺伝子工学的手法を用いてヒト化抗体を含めた抗体から作製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ  （Ｂｉｒｄ  Ｒ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４２（４８７７），４２３−４２６，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｗｅｂｂｅｒ  Ｋ．Ｏ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２（４），２４９−２５８，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（６），２９６６−２９７１，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片を使用することもできる。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さいために、標的組織への移行性に優れており、有利である（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２−３４０８，１９９２）。
【００５１】
本発明のＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片）に、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体は、ＰＡＰ２ａに特異的に反応する抗体および抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには該抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、治療タンパク質あるいは低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる（例えば、抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４を参照）。
【００５２】
２．診断薬および治療薬
本発明は、別の態様において、抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する癌の診断薬を提供する。本発明はまた、抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する癌の治療薬を提供する。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。
【００５３】
本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体を含有する治療薬または診断薬は、ＰＡＰ２ａを高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（好ましくは、腺癌、特に、前立腺癌、肺癌、膵癌、卵巣癌、甲状腺癌、または乳癌を含む癌）の診断または治療に適している。
【００５４】
癌の診断または治療に使用するための本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。
【００５５】
また、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、あるいは標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）と化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。
【００５６】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断に使用するための抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、インジウム−１１１で標識した抗体とキレート剤との結合体（抗体−キレート剤）が、癌胎児性抗原を発現している腫瘍のラジオイムノシンチグラフィーによるイメージングでの使用に関して記述されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  １９９０  １７：２４７−２５４）。特にこれらの抗体−キレート剤は、再発性の結腸直腸癌を有する疑いのある患者において腫瘍を検出するのに用いられている（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃ．  １９９１  ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体もまた記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ，  Ｒ．Ｂ．  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９１  ２２：３３９−３４２）。
【００５７】
ＰＡＰ２ａに対する抗体も同様に用いることができる。すなわち、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する標識された抗体を、例えば、癌を有する疑いのある患者に、その患者の疾患の状態の診断または病期診断等の目的で注射することができる。用いる標識は、用いるイメージングの様式に応じて選択し得る。例えば、インジウム−１１１（111Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（99mＴｃ）またはヨウ素−１３１（131Ｉ）などの放射性標識は、平面スキャンまたはシングルフォトン断層撮影に用いることができる。フッ素−１８（18Ｆ）などのポジトロン放出標識をポジトロン断層撮影に用いることができる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを磁気共鳴イメージングに用いることができる。標識の局在性を検査することにより、癌の播種の判定をすることができる。また、器官または組織内の標識の量により、その器官または組織における癌の存在または欠如を決定することができる。
【００５８】
したがって、好ましくは、本発明の診断薬または治療薬中の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したウイルスベクター等と化学的にまたは遺伝子工学的に結合されている。
【００５９】
「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性診断薬あるいは放射性治療薬として広く利用し得る。例えば、125Ｉまたは131Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。
【００６０】
さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（67Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（90Ｙ）、レニウム−１８６（186Ｒｅ）またはレニウム−１８８（188Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。
【００６１】
「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、癌細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００６２】
「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編  １９９６年  癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法  昭和５７年  医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００６３】
「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクター（例えば、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルス）が使用し得る。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、癌）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＰＡＰ２ａ抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＰＡＰ２ａ抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＰＡＰ２ａ抗体が認識する抗原（すなわち、ＰＡＰ２ａ）が存在する部位に指向されることができる。
【００６４】
３．組換えアデノウイルスの作製方法
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルスベクターは、当該分野で周知の分子生物学的手法によって作製することができる。例えば、一般的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；  Ａｕｓｂｅｌ．  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；田村隆明編、改訂第２版  遺伝子工学実験ノート  上・下  羊土社  ２００１などを参照することができる。また、組換えアデノウイルスの作製のためには、ウイルスゲノムの両端に共有結合した末端タンパク質を保持したままのゲノム−末端タンパク質複合体（以下ＤＮＡ−ＴＰＣと略す）を用いる方法、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａらの方法（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：２５０３−１５１５  （１９９８））を利用することができる。これらの手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的な作製方法においては、まず、ｐＡｘＣｗ、ｐＡｘＣＡｗｔ等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する。一方、ウイルスからＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理したＤＮＡ−ＴＰＣを適切な宿主細胞、例えば２９３細胞にコトランスフェクションする。その後適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウイルス粒子として放出された組換えアデノウイルス粒子を回収することができる。
【００６５】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス粒子は、前述のように組換えアデノウイルス発現用核酸分子を適切な培養細胞にトランスフェクションし、その細胞を更に培養し、培養上清を回収することによって多量に調製することができる。必要であれば、回収したアデノウイルスを更に適切な宿主細胞で必要な回数だけ継代することによって更に大量のアデノウイルベクター粒子を調製することができる。アデノウイルスの増殖および回収のために適した細胞、トランスフェクションの条件、トランスフェクトした細胞の培養条件および培地等は当業者に良く知られたものである。例えば、通常よく使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域に欠損のあるアデノウイルスを増殖させる場合には、恒常的にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂを発現している２９３細胞等を使用すればよい。更に、必要に応じて、塩化セシウムの濃度勾配遠心法を用いて濃縮精製することもできる。濃縮することにより、１０９〜１０１１粒子／ｍｌ程度の高力価のウイルス液を得ることができる。
【００６６】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子は、外来遺伝子を組み込むことができ、組み込まれた外来遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。本発明において使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子に組み込む外来遺伝子としては、直接または間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）とガンシシクロビルの組み合わせ（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ（ＣＤ／５ＦＣ）、ウラシルフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰ）と５−フルオロウラシル（５ＦＵ）の組み合わせ（ＵＰ／５ＦＵ）、ＨＳＶｔｋとＵＰを組み合わせた系（ＵＰＴＫ／５ＦＵ＋ＧＣＶ）が挙げられる。このような外来遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのＥ１領域および／またはＥ３領域と置換され、またはこの領域に挿入される。
【００６７】
ファイバー変異型組み換えアデノウイルスの作製方法については、報告されている例を参照し得る（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９８；  Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００２；  Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００３など）。
【００６８】
本発明において好適に用いられるベクターの非限定的な例としては、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルス、アデノウイルスに抗体を任意の方法で結合（共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のアデノウイルスなどが挙げられる。ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスは、図２に模式的にその概要を示すように、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフ（ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号２１））をノブ（Ｋｎｏｂ）のＨＩループ部位（ｎｇｔｑｅｔｇｌｉｋ−−−−−ｉｄａｓｄｔｔｐｓａ）に含むＦＺ３３ファイバー変異型Ａｄ５ウイルスをベースとして、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどのレポーター遺伝子が組み込まれたアデノウイルスである。なお、これは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など各種ウイルスの外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した各種変異型ウイルス、または前記各種ウイルスに抗体を任意の方法で結合（例えば、共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターもまた、抗体を任意の方法で結合（ＦＺ３３などの抗体結合分子を結合させる方法、化学的共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターとすることによって、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。
【００６９】
本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターを使用する利点として、以下のような点が挙げられる。通常、ウイルスベクターを使用する場合、そのウイルスが本来認識する細胞表面のレセプター（例えば、アデノウイルスの場合のＣＡＲ、またはシンドビスウイルスの場合の高親和性ラミニンレセプター（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＡＭＲ）、ポリオウイルスの場合のＣＤ１５５、コクサッキーウイルスＡ２１の場合のＩＣＡＭ／ＤＡＦ、麻疹ウイルスの場合のＳＬＡＭ／ＣＤ４６など）を細胞表面に発現している細胞に対して標的化される。したがって、使用するウイルスに特異的な細胞表面レセプターを発現していないか、発現の程度が低い細胞に対しては、通常、ウイルスベクターを用いた遺伝子の効果的な標的指向化導入は困難である。しかしながら、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体と結合し得るかまたは結合するように改変されたウイルスベクターを用いれば、そのウイルスの本来の細胞表面レセプターを発現していない細胞であっても、その細胞がＰＡＰ２ａを発現する細胞であれば、その細胞に対してウイルスベクターを用いた治療遺伝子の標的指向化導入および発現が容易に可能となる。
【００７０】
なお、本発明において使用される組換えアデノウイルスの作製については、さらに下記文献を参照することができる。
【００７１】
Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ．，  Ｓａｄａｔａ  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ  Ｗ．，  Ｓｈｉｎｏｕｒａ  Ｎ．  ａｎｄ  Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  “Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｅｒ−ｍｕｔａｎｔ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．”  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ９（１７）：  ２５０３−２５１５，  １９９８．
【００７２】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，  Ｓａｔｏ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  “Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．”  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １３（５）：  ６１３−６２６，  ２００２．
【００７３】
Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．，  Ｓａｔｏ  Ｋ．  ａｎｄ  Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  “Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｂｙ  ｂｏｔｈ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｅｒ−Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌａｃｅａｂｌｅ  ｓｈｏｒｔ  ｆｉｂｅｒ．”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７７（４）：  ２５１２−２５２１，  ２００３．
【００７４】
Ｕｃｈｉｄａ  Ｈ，  Ｔａｎａｋａ  Ｔ，  Ｓａｓａｋｉ  Ｋ，  Ｋａｔｏ  Ｋ，  Ｄｅｈａｒｉ  Ｈ，  Ｉｔｏ  Ｙ，  Ｋｏｂｕｎｅ  Ｍ，  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  Ｍ，  Ｔａｉｒａ  Ｋ，  Ｔａｈａｒａ  Ｈ，  Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  “Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ．”  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １０（１）：１６２−７１，  ２００４．
【００７５】
Ｖｏｌｐｅｒｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  “Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔａｉｎ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｉｄ．”  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：  ２０９３−２１０４，  ２００３．
【００７６】
Ｂｒａｉｓｔｅｄ  ＡＣ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ  “Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ  ａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：５６８８−５６９２，  １９９６．
【００７７】
４．薬剤の標的指向化
上記２．の説明からも明らかなように、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達することができる。したがって、本発明はまた、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達する方法を提供する。
【００７８】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」の例としては、既に説明した放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子などが挙げられる。
【００７９】
典型的な例として、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、抗ＰＡＰ２ａ抗体が結合し得る、治療遺伝子を組み込んだファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合される。これにより、アデノウイルス本来の受容体である（ＣＡＲ）に依存する感染のみの場合と比較して、標的細胞への感染効率を高めることができ、ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的部位への治療遺伝子の導入を効果的に行うことができる。
【００８０】
本発明において、「標的部位」は、ＰＡＰ２ａを正常細胞に比べて高発現している細胞、組織、臓器等であり、特に、ＰＡＰ２ａを正常細胞に比べて高発現している腫瘍細胞である。そのような細胞の非限定的な例として、好適には腺癌細胞が挙げられ、さらに膵癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、および乳癌細胞等が本発明の目的にとってより好適なものとして挙げられ得る。
【００８１】
５．本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いるエフェクター細胞を介在する疾患の治療およびオプソニン化
本発明はまた、１つの態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＰＡＰ２ａ抗体が、被験者に投与された場合に、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＰＡＰ２ａ発現細胞を溶解または成長を阻害するように作用する、ＰＡＰ２ａの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８２】
用語「免疫学的エフェクター細胞」は、当該分野で通常用いられる意味で本明細書中でも用いられるが、特に、免疫応答の認識及び活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言うものとする。免疫学的エフェクター細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ））、ＮＫ細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、多核白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）などが含まれる。例えば、本発明者の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、免疫学的エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合することができる。エフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現して、抗体の結合によって特異的な免疫機能を奏することができ、例えば、好中球は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。このように、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＰＡＰ２ａ発現細胞を貪食するか、または溶解させることができる。
【００８３】
本発明者はまた、さらに別の態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＰＡＰ２ａ抗体が、被験者に投与された場合に、ＰＡＰ２ａ発現細胞をオプソニン化するように作用する、ＰＡＰ２ａの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬、およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８４】
例えば、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体は、ＰＡＰ２ａに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異的または多重特異的分子であり得る。例えば、上記第２の標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ又はヒトＦｃα受容体などのＦｃ受容体であり得る。従って、本発明には、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＰＡＰ２ａを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。また上記第２の標的エピトープは抗ＰＡＰ２ａ抗体の補体結合部でもあり得る。抗ＰＡＰ２ａ抗体は補体を介して補体受容体を発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＰＡＰ２ａを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的または多重特異的分子は、ＰＡＰ２ａ発現細胞をエフェクター細胞に狙わせ、ＰＡＰ２ａ発現細胞のファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオン産生などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を惹起することができる。
【００８５】
６．ＰＡＰ２ａを検出および／または定量する方法
本発明は、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＰＡＰ２ａタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法を提供する。
【００８６】
本明細書中、「被験者」とは、ＰＡＰ２ａを高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、癌を罹患しているか、そのような疾患を罹患していると疑われるか、またはそのような疾患を罹患する危険性のある、ヒトの被験者を意味するものとする。本発明の目的に従う代表的な「癌」の例としては、好ましくは、腺癌が挙げられ、より好ましくは、膵癌、前立腺癌、肺癌、甲状腺癌、卵巣癌、および乳癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
本明細書中、「生体試料」とは、検査のために採取された被験者由来の細胞、組織、臓器、体液などを意味する。体液には、血液、リンパ液、精液、唾液、汗等が含まれ、血液には、全血の他、血清、血漿などの血液製剤も含まれるものとする。より具体的には、生体試料は、癌細胞（または癌組織）であり得、好ましくは、膵癌細胞、前立腺癌細胞、甲状腺癌細胞、肺癌細胞、卵巣癌細胞、または乳癌細胞であり、最も好ましくは膵癌細胞および肺癌細胞である。
【００８８】
本発明はまた、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＰＡＰ２ａを、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する方法を提供する。
【００８９】
好ましい態様に係る本発明の方法は、（１）生体試料と抗ＰＡＰ２ａ抗体とを接触させる工程、および（２）該生体試料中のＰＡＰ２ａと該抗ＰＡＰ２ａ抗体との結合を検出および／または定量する工程を包含する。
【００９０】
このような方法は、ＰＡＰ２ａを正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、腺癌、より好ましくは、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、卵巣癌、乳癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、ＰＡＰ２ａと抗ＰＡＰ２ａ抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、生体試料中のＰＡＰ２ａのレベル（または量）が評価される。生体試料中のＰＡＰ２ａのレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。通常、正常ヒトコントロールと比較して高いＰＡＰ２ａレベルは、癌の存在を示す。この場合、通常少なくとも２倍、好ましくは、５倍程度高いＰＡＰ２ａレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中のＰＡＰ２ａの存在そのものが、被験者における癌の存在を示し得る。
【００９１】
ヒト由来の生体試料において、ＰＡＰ２ａのようなタンパク質の発現レベルを決定するのに用いることができるアッセイ技術は、当業者によく知られている。このようなアッセイ方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、結合タンパク質競合アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、およびプロテオミクスアプローチ（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ）を含む。これらの中で、ＥＬＩＳＡが、生物学的液体における遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【００９２】
もし商業的に容易に入手できない場合、ＥＬＩＳＡ分析は、最初に、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、一般的に、ＰＡＰ２ａに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼなどの酵素試薬などの検出可能な試薬を付着している。
【００９３】
ＥＬＩＳＡを行う場合、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体は、例えば、ポリスチレンディッシュなどの、抗体を結合する固体支持体上でインキュベートされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位（ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）は、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより被覆される。次に、分析される試料は、ＰＡＰ２ａがポリスチレンディッシュに付着した特異抗体に結合する時間中、ディッシュ内でインキュベートされる。非結合試料はバッファーで洗い流される。ＰＡＰ２ａに対して特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬を連結したレポーター抗体がディッシュ内に設置され、該レポーター抗体がＰＡＰ２ａに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次に非結合レポーター抗体が洗い流される。比色基質を含むペルオキシダーゼ活性のための試薬が、次にディッシュに加えられる。抗ＰＡＰ２ａ抗体に連結した、固定化したペルオキシダーゼが着色反応産物を産生する。所定の時間内に発生した色素の量は、試料中のＰＡＰ２ａタンパク質の量に比例している。量的な結果は、通常標準曲線を参照して得られる。
【００９４】
競合アッセイもまた用いることができ、そこでは、ＰＡＰ２ａに特異的に結合する抗体が固体支持体に付着しており、標識したＰＡＰ２ａおよび患者またはヒト対照に由来する試料が固体支持体上を通過する。固体支持体に付着した検出標識量を試料中のＰＡＰ２ａの量に相関させることができる。
【００９５】
上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテインＡ免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。
【００９６】
ＰＡＰ２ａを診断マーカーとして使用する意味において、ＰＡＰ２ａの核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いた核酸法（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ）もまた、肺癌を含む癌のマーカーとしてのＰＡＰ２ａのｍＲＮＡを検出するのに用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列をもとにした増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）などのその他の核酸法を、様々な悪性腫瘍を診断およびモニタリングするための悪性細胞の検出に用いることができる。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、特定のｍＲＮＡ集団の存在を、何千ものその他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物の中で検出するために用いることができる強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、１種類のｍＲＮＡが、酵素である逆転写酵素を用いて最初に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にそのｃＤＮＡが標準的なＰＣＲ反応と同様に増幅される。このように、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることができる。したがって、このｍＲＮＡがそれを産生する細胞に高度に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲは、特定の種類の細胞の存在を同定するのに用いることができる。また、リアルタイムＰＣＲ法も、ＰＡＰ２ａをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を定量し、被験者と健常者との比較において、ＰＡＰ２ａをマーカーとして被験者の癌の診断を行うために使用することができる。
【００９７】
また、ＰＡＰ２ａをマーカーとして、被験者の癌の進展の経過あるいは治療経過をモニタリングすることもできる。そのような癌としては、ＰＡＰ２ａ陽性の癌であれば特に種類を問わず、ＰＡＰ２ａ陽性の腺癌、より具体的にはＰＡＰ２ａ陽性の肺癌、膵癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、乳癌などの診断に好適に使用することができる。例えば、抗体とマグネチックビーズとを用いた細胞の分別と濃縮（エンリッチメント）、ならびにＲＴ−ＰＣＲ法による高感度のｍＲＮＡの検出法を組み合わせることによって、例えば、５ｍｌの被験者の血液中に存在する数個の腫瘍細胞を検出することが可能である。血液中に存在する腫瘍細胞を検出すること、そのＰＡＰ２ａの発現量またはｍＲＮＡの量を検出または測定することによって、感度および特異性の高い腫瘍の診断が可能である。このような方法については、さらに以下の参考文献を参照することができる。
【００９８】
Ｚｉｅｇｌｓｃｈｍｉｄ  Ｖ，  Ｈｏｌｌｍａｎｎ  Ｃ，  Ｂｏｃｈｅｒ  Ｏ．  "Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．"  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ．  ２００５；４２（２）：１５５−９６．
【００９９】
Ｗａｇｕｒｉ  Ｎ，  Ｓｕｄａ  Ｔ，  Ｎｏｍｏｔｏ  Ｍ，  Ｋａｗａｉ  Ｈ，  Ｍｉｔａ  Ｙ，  Ｋｕｒｏｉｗａ  Ｔ，  Ｉｇａｒａｓｈｉ  Ｍ，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，  Ｆｕｋｕｈａｒａ  Ｙ，  Ａｏｙａｇｉ  Ｙ．  "Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ；  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｆｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．"  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００３  Ａｕｇ  １；９（８）：３００４−１１．
【０１００】
Ｚｈａｎｇ  ＹＬ，  Ｆｅｎｇ  ＪＧ，  Ｇｏｕ  ＪＭ，  Ｚｈｏｕ  ＬＸ，  Ｗａｎｇ  Ｐ．  "Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＫ２０ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．"  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ２００５  Ｆｅｂ  ２１；１１（７）：１０２３−７．
【０１０１】
Ｄｅｍｅｌ  Ｕ，  Ｔｉｌｚ  ＧＰ，  Ｆｏｅｌｄｅｓ−Ｐａｐｐ  Ｚ，  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｂ，  Ａｌｂｅｒｔ  ＷＨ，  Ｂｏｃｈｅｒ  Ｏ．  "Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓａｙ．"  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００４  Ｓｅｐ；２３（３）：４６５−８．
【０１０２】
固体支持体上に配列（すなわち、グリッド化（ｇｒｉｄｄｉｎｇ））されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもまた、その遺伝子の発現の検出および発現レベルの定量の両方に用いることができる。この手法では、ＰＡＰ２ａ遺伝子をコードするｃＤＮＡが基材に固定される。基材は、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない任意の好適な種類であってもよい。ＰＡＰ２ａ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部を基材に付着させ、次に、当該組織から単離したＲＮＡまたはＲＮＡのコピーである相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい検体とインキュベートする。基材に結合したＤＮＡと検体とのハイブリダイゼーションは、検体またはハイブリッド検出用の二次分子を放射性標識または蛍光標識することを含むがこれらに限定されないいくつかの手段で検出し定量することができる。本発明において使用し得る標識の非限定的な例としては、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素等が挙げられる。遺伝子の発現レベルの定量は、検体からの信号の強度を、既知の標準から決定したレベルと比較することによってなされる。標準は、標的遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写、収量の定量化、およびこの材料を用いて標準曲線を作成することにより得ることができる。
【０１０３】
プロテオミクスアプローチでは、２次元電気泳動が当業者によく知られた技術である。すなわち、血清などの試料からの個別のタンパク質は、通常ポリアクリルアミドゲル上で、タンパク質の異なる特性による分離を連続的に行うことによって単離することができる。最初に、タンパク質は電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均等に作用し、それにより、小さいタンパク質は大きいタンパク質よりもゲル上で早く移動する。第２次元では、第１次元に対して直角に電流をかけ、タンパク質を大きさに基づいてではなく、各タンパク質が有する特定の電荷に基づいて分離する。異なる配列の２つのタンパク質で大きさおよび電荷の両方に関して同一なものは存在しないため、２次元分離の結果は、各タンパク質が固有のスポットを占有する正方形のゲルとなる。該スポットの化学的プローブまたは抗体プローブによる分析、またはそれに引き続くタンパク質のマイクロシーケンスにより、所定のタンパク質の相対的な存在度を明らかにし、試料中のタンパク質の同定をすることができる。
【０１０４】
以上詳述した検出および／または定量方法は、組織生検材料および検死解剖材料を含む患者または被験者から得られた様々な細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジネートまたは可溶化した組織）に由来する試料について行うことができる。本発明に有用な体液は、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌物またはそれらの派生物を含む。血液は、全血、血漿、血清、または任意の血液の派生物を含む。
【０１０５】
７．抗ＰＡＰ２ａ自己抗体を検出および／または定量する方法
本発明はまた、別の態様において、被験者由来の生体試料中のＰＡＰ２ａに対する自己抗体（抗ＰＡＰ２ａ自己抗体）を検出および／または定量する方法を提供する。
【０１０６】
被験者からの生体試料中の抗ＰＡＰ２ａ自己抗体の検出は、任意の多くの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アッセイがあり、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテインＡ免疫検定法等が挙げられる。
【０１０７】
このような免疫アッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、ＰＡＰ２ａタンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗ＰＡＰ２ａ抗体の検出を包含する。本発明のアッセイに用いられるＰＡＰ２ａタンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって調製し得る。例えば、ＰＡＰ２ａタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、ＰＡＰ２ａタンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、ＰＡＰ２ａの標識、固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遺伝子操作される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を参照）。別法として、ＰＡＰ２ａタンパク質は天然の供給源から精製することができる。たとえば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺がん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが包含されるが、これらに限定されない。実際にはＰＡＰ２ａタンパク質の固体支持体としては、マイクロタイタープレートが好都合に使用される。
【０１０８】
８．薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索する方法
本明細書の実施例に、Ｓ１１、およびＴ１３を産生するハイブリドーマの作製ならびにそれに引き続く抗原の同定のために具体的に例示した方法は、一般的に、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索する方法として有用である。本発明の抗体スクリーニング方法によって、診断マーカーとして高感受性および高特異性の標的療法に極めて最適化された抗体および対応する抗原分子を直接かつ迅速にスクリーニングすることができる。
【０１０９】
したがって、本発明は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補を系統的に探索する方法を提供する。より具体的には、本発明は、組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法、および組織特異的抗原を同定する方法を提供する。好ましくは、上記組織は、腫瘍組織である。
【０１１０】
本発明は、１つの態様において、組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を提供し、この方法は、
【０１１１】
（１）組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、
【０１１２】
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、および
【０１１３】
（３）上記感染効率が上記ハイブリドーマ由来産物（抗体など）を上記細胞と接触させない場合と比較して増大したハイブリドーマを選択し、クローニングする工程
を包含する。
【０１１４】
本発明はまた、組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体をスクリーニングまたは調製する方法を提供する。このスクリーニング方法は、
【０１１５】
（１）組織特異的抗原または当該抗原を発現する細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
【０１１６】
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する。
【０１１７】
ここで、上記組織の好ましい例として腫瘍が、上記細胞の好ましい例としては、腫瘍細胞が挙げられる。
【０１１８】
なお、上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）として、既存の抗体（例えば、寄託機関に寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体または市販により入手可能な抗体など）を使用してもよい。その場合には、上記工程（１）は、既存の抗体を取得することから構成される。
【０１１９】
ここで、好ましくは、上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞への感染は、
【０１２０】
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
【０１２１】
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記細胞に接触させるか、または
【０１２２】
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記細胞に接触させること、によって行われる。
【０１２３】
なお、上記細胞の好ましい例としては、腫瘍細胞が挙げられる。
【０１２４】
上記スクリーニング方法では、感染効率を評価した結果、通常、感染効率がハイブリドーマ由来産物（抗体など）を細胞と接触させない場合と比較して増大したハイブリドーマを選択し、クローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。好ましくは、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程は、レポーター遺伝子発現測定アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記細胞に対する上記感染効率を評価することを含む。ここで、上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現することができるように作製されている。また、上記レポーター遺伝子発現測定アッセイは、例えば、分光光度計あるいはフローサイトメトリーを利用してレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現測定を行うことができる。ここで、上記発現効率の増大したハイブリドーマの選択においては、レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体を使用した場合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、最も好ましくは、少なくとも５０倍であるモノクローナル抗体が選択される。なお、ここでいう「コントロール抗体」とは、現在の一般的な手法で得られる抗体または現在一般に市販等により入手可能な抗体、例えば、ＣＥＡに対する抗体ならば、ＩＢＬ社（ｌｏｔ  Ｎｏ  ９Ｇ−７１７）のようなマウス抗ＣＥＡ抗体などのことをいう。
【０１２５】
また、レポーター遺伝子発現測定アッセイの代替的な実施方法としては、例えば、レポーター遺伝子としてｌａｃＺを使用する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーター測定キット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。また、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販のルシフェラーゼ定量システムとして、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ  Ｎｏ．Ｅ１５００）などを使用して測定し得る。
【０１２６】
上記方法において、抗体に結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスとしては、例えば、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフをノブのＨＩループ部位に含むＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスが挙げられる。上記方法においては、ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスに限らず、抗体とある程度以上のアフィニティー（例えば、結合定数（Ｋa）が少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、１０9Ｍ-1以上であるような結合親和性）をもって結合できる性質を付与したベクターであれば、その種類を問わない。例えば、アデノウイルスにＺ３３などの抗体結合分子もしくはペプチドを任意の方法で結合（Ｚ３３などを共有結合、Ｚ３３などをビオチン−アビジンによって架橋、Ｚ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させたＦＺ３３などの修飾型のアデノウイルス、などが挙げられる。
【０１２７】
また、アデノウイルスのファイバーのＣＡＲ受容体との結合部位を欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｋｉｒｂｙ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：  ９５０８−９５１４，  １９９９．；  Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：  ７６９−７７６，  ２００２．；  ＲｏｅｌｖｉｎｋＰＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８６：  １５６８−１５７１，  １９９９．などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターも同様に本発明の目的のために使用することができる。
【０１２８】
図１３−３は、そのようなアデノウイルスのファイバーのＣＡＲ受容体との結合部位を欠いたファイバー変異型アデノウイルスＡｄｖ−ＦｄＺを用いた標的化分子探索の概念図である。
【０１２９】
図１３−４は、Ａｄｖ−ＦｄＺのファイバー部分の構造を示した模式図であり、ここで、ヒト５型アデノウイルスのファイバーのＮ末端から４８９から４９２番目のアミノ酸ＴＡＹＴが欠損している。また、図１３−５は、この欠損ファイバーを有するアデノウイルスを作製するためのプラスミドベクターの一例を示す模式図である。ここに示したｐＡｘ３ｉＦｄＺプラスミドは、Ｅ１を置換したクローニングサイトにＩ−ＳｃｅＩ制限酵素サイトを有すること、４８９から４９２番目のアミノ酸ＴＡＹＴを欠損させていることの２点を除けば、ｐＡｘ３−ＦＺ３３と同じものである。このプラスミドｐＡｘ３ｉＦｄＺを用いることによって、ＣＡＲ受容体との結合部位を欠く、標的選択性の高い遺伝子導入が可能なアデノウイルスベクターを作製することが可能である。Ａｄｖ−ＦｄＺは、ＣＡＲ受容体との結合部位を欠くため、より選択性の高い遺伝子導入が可能である。
【０１３０】
また、アデノウイルスのインテグリン分子群との反応性を欠いた、ペントンベースタンパク変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスの肝臓への取り込みを欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｓｍｉｔｈ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ  （Ｓｍｉｔｈ  ＴＡ，  Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ  Ｎ，  Ｒｏｌｌｅｎｃｅ  ＭＬ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ  Ｊ，  Ｋｉｍ  Ｊ，  Ｍｕｌｇｒｅｗ  Ｋ，  Ｎｅｍｅｒｏｗ  ＧＲ，  Ｋａｌｅｋｏ  Ｍ，  Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ＳＣ．    Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈａｆｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．    Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００３  Ｍａｙ  ２０；１４（８）：７７７−８７．）などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターも同様に本発明の目的のために使用することができる。
【０１３１】
なお、これらは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など）の外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した変異型ウイルス、または上記各種ウイルスにＺ３３などの抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（Ｚ３３などを共有結合、Ｚ３３などをビオチンーアビジンによって架橋、Ｚ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の方法に使用し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターに、抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（抗体結合分子を化学的に共有結合させる、ビオチンーアビジンによって架橋させる、抗体結合分子を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターも、本発明において有利に使用することができる。
【０１３２】
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのレポーター遺伝子は、当業者に周知のレポーター遺伝子アッセイ系を用いて検出し得る。例えば、ｌａｃＺを発現するように調製されたＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスの感染効率は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーターキット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。ルシフェラーゼ定量システムとしては、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ  Ｎｏ Ｅ１５００）などを使用して測定し得る。ＥＧＦＰなどの蛍光タンパクは、分光光度計あるいはフローサイトメトリーによって発現量を測定し得る。
【０１３３】
なお、上記した薬剤の標的指向化療法に使用するためのモノクローナル抗体の作製および精製については、さらに以下の文献を参照することができる。
【０１３４】
Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  “Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  １７０−  ｔｏ  １８０−ｋＤａ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：  ７７８５−７７８９，  １９８６．
【０１３５】
Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ａ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １６０：  ４８３−４８８，  １９８７．
【０１３６】
Ｈａｍａｄａ  Ｈ．，  Ｈａｇｉｗａｒａ  Ｋ．，  Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｔ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  “Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｒ  １７０，０００  ｔｏ  １８０，０００  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｖｅｒａｐａｍｉｌ，  ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ，  ａｎｄ  ｐｈｏｒｂｏｌ  ｅｓｔｅｒｓ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ４７：  ２８６０−２８６５，  １９８７．
【０１３７】
Ｈａｍａｄａ  Ｈ．  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ．  “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  １７０−  ｔｏ  １８０  ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：  Ｔｈｅ  １７０−  ｔｏ  １８０−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ＡＴＰａｓｅ．”  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６３：  １４５４−１４５８，  １９８８．
【０１３８】
Ｍｉｓｈｅｌｌ  ＢＢ，  Ｓｈｉｉｇｉ  ＳＭ  ｅｄｓ．  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  １９８０．（邦訳  細胞免疫実験操作法、今井ら訳、理工学社、１９８２）
Ｂｉｒｃｈ  ＪＲ  ａｎｄ  Ｌｅｎｎｏｘ  ＥＳ  ｅｄｓ．  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９５．
【０１３９】
Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．”  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９８３．
【０１４０】
Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ  “Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．”  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  １９９６
【０１４１】
本発明は、さらなる態様において、組織（例えば、腫瘍）特異的抗原を同定する方法を提供する。本発明の組織特異的抗原を同定する方法は、上記ハイブリドーマ由来産物から精製されたモノクローナル抗体に特異的に結合する抗原タンパク質を同定し、そのアミノ酸配列を決定する工程、および上記決定されたアミノ酸配列に対して、配列データベース上で相同性検索を行うことにより、上記抗原タンパク質を同定する工程を包含する。
【０１４２】
上記抗原タンパク質を同定する工程は、抗原と上記モノクローナル抗体との免疫沈降、ウエスタンブロット分析等を含む。そのアミノ酸配列を決定する工程は、任意の公知のアミノ酸配列決定法（例えば、気相シークエンサー（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９０ｃＬＣ  ＡＢＩ社、ＨＰ２４１  ＨＰ社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドのＨＰＬＣによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置によるＨＰＬＣで分離されたペプチドのアミノ酸配列分析等）による配列決定により行われ得るが、好ましくは、質量分析によりアミノ酸配列が決定される。
【０１４３】
上記方法において、配列データベース上での相同性検索は、当業者に周知のプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＡＳＣＯＴなど）および配列データベース（例えば、ＰＩＲ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＮＣＢＩなど）を利用して行うことができる。
【０１４４】
上記の組織特異的抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法、および組織特異的抗原を同定する方法により、特定の細胞、例えば、癌細胞に対する標的化治療に実用化可能な標的と抗体との組み合わせを系統的に探索するための方法論が提供される。
９．標的化療法における標的分子および抗体の配列決定およびクローニング
【０１４５】
本発明の上記方法により、同定された抗体および標的分子のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当業者に周知の配列決定法により決定することができる。
【０１４６】
アミノ酸配列決定法としては、気相シークエンサー（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９０ｃＬＣ  ＡＢＩ社、ＨＰ２４１  ＨＰ社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドのＨＰＬＣによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置によるＨＰＬＣで分離されたペプチドのアミノ酸配列分析等が使用され得る。核酸配列の決定方法としては、ＰＣＲを用いたサイクルシークエンス法などのような当業者に周知の核酸配列の決定法が使用され得る。
【０１４７】
得られた標的分子またはそれに対する抗体のＤＮＡの塩基配列が決定されれば、それに基づいて遺伝子工学的手法により、本発明の抗体を作製したり、他の分子との融合体を作製したりすることができる。目的とするＤＮＡは、プラスミドベクターによるクローニング法等の当業者に周知の分子生物学的手法を用いて大量に得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９等を参照）。
【０１４８】
１０．製剤化および製剤の投与方法
本発明の抗体を含有する治療薬、本発明の抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療薬は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。
【０１４９】
本発明の治療薬の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【０１５０】
本発明の治療薬の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分としてのＰＡＰ２ａタンパク質の機能（または発現）阻害物質は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【０１５１】
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【０１５２】
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１５３】
本発明の治療剤は、対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されないが、好ましくは、腺癌、より好ましくは、前立腺、膵蔵、肺、甲状腺、卵巣、および乳房などの腺癌の治療に用いることが好ましい。
【０１５４】
また、本発明において典型的に使用されるウイルスベクター粒子は、医薬組成物の成分の一つとして、抗ＰＡＰ２ａ抗体と組み合わせて、治療、特に腫瘍の治療のために使用することができる。組換えアデノウイルス粒子と抗ＰＡＰ２ａ抗体との組み合わせを治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０3〜１０15個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＰＡＰ２ａ抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＰＡＰ２ａ抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。
【０１５５】
以下、実施例によって本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されない。
【実施例】
【０１５６】
（実施例１．  アデノウイルスＦＺ３３シリーズの作製）
基本的には、Ｖｏｌｐｅｒｓら（Ｖｏｌｐｅｒｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：２０９３−２１０４，２００３）の方法に従い、Ｙｏｓｈｉｄａら（Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ９（１７）：２５０３−２５１５，１９９８）、Ｎａｋａｍｕｒａら（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １３（５）：６１３−６２６，２００２）などに記載の材料および方法を用いて、本発明者らの研究室において、ＦＺ３３変異型アデノウイルスを遺伝子工学的に作製した。Ｚ３３モチーフの配列としては、Ｂｒａｉｓｔｅｄら（Ｂｒａｉｓｔｅｄ  ＡＣ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：５６８８−５６９２，１９９６）に報告されているアミノ酸配列Ｚ３３を用いた。
【０１５７】
（Ａ．  ＲＧＤ変異型ファイバーとアデノウイルスの左端のゲノムを含むプラスミドｐＡｘ３の作製）
図１３−１は、本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのプラスミドベクターｐＡｘ３の模式図である。ｐＡｘ３プラスミドは、ヒト５型アデノウイルスのゲノムの左端ｎｔ１−３５７の３５７ｂｐを含み、ｎｔ３５８−３３２８を欠損し、ファイバーのＨＩループにＦ−ＲＧＤ変異（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２（前出））を含む。
【０１５８】
具体的には、以下に記載するようにアデノウイルスベクターｐＡｘ３を作製した。
【０１５９】
まず、プライマーとして以下のものを使用し、ＰＣＲ法によって、後段に記載するような塩基配列を有するアデノウイルスゲノム左端３５７ｂｐを含む３９９ｂｐのＤＮＡ断片を作製した。
５’側のプライマー：
ＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡ（配列番号２）
３’側のプライマー：
ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＣ（配列番号３）
を用いた。
【０１６０】
５’側プライマーは、ｃａａｔｔｇのＭｕｎＩ、ＴＴＡＡＴＴＡＡのＰａｃＩ、ｇｇａｔｃｃのＢａｍＨＩ、それぞれの制限酵素認識配列を含んでいる。
【０１６１】
３’側プライマーは、端にＡＴＣＧＡＴのＣｌａＩ、ＡＴＴＴＡＡＡＴのＳｗａＩ、ＡＧＡＴＣＴのＢｇｌＩＩ、それぞれの制限酵素認識配列を含んでいる。
【０１６２】
上記プライマーを用いてヒト５型アデノウイルス組換えウイルス（ｐＡｘ−ＦＲＧＤウイルス（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２（前出）を参照））のゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、アデノウイルスゲノム左端３５７ｂｐを含む配列番号４に示される４０１ｂｐのＰＣＲフラグメントを得た。
ｃｃｇｃａａｔｔｇＴＴＡＡＴＴＡＡｇｇａｔｃｃｃＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＧＴＴＴＧＴＧＡＣＧＴＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＧＴＧＧＧＡＡＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＧＡＣＧＴＡＧＴＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＡＡＧＴＧＴＧＧＣＧＧＡＡＣＡＣＡＴＧＴＡＡＧＣＧＡＣＧＧＡＴＧＴＧＧＣＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＧＣＣＧＧＴＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＧＣＧＧＴＴＴＴＡＧＧＣＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴＡＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＴＣＡＴＡＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＣＣＧＣａｇａｔｃｔａｔｔｔａａａｔｃｇａｔｇｇ（配列番号４）
【０１６３】
上記のＰＣＲフラグメントをＭｕｎＩ（ＭｆｅＩ）およびＣｌａＩで制限酵素消化し、得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＷＥ３５７ＰａｃＩの作製に用いた。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のプラスミドｐＷＥ１５を購入して用い、このＥｃｏＲＩとＣｌａＩサイトに上記の断片を組み込んだ。（ＥｃｏＲＩとＭｕｎＩは、スティッキーエンドがＡＡＴＴとなり、ライゲーションが可能である。）得られたプラスミドをｐＷＥ３５７ＰａｃＩと名付けた。
【０１６４】
次いで、プラスミドｐＷＥ３５７ＰａｃＩのＣｌａＩ／ＲｓｒＩＩサイト（アデノウイルス左端３５７ｂｐを含むＣｌａＩ／ＲｓｒＩＩ断片）に、ｐＡｘ−ＦＲＧＤ（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２（前出）記載のプラスミド）からのヒト５型アデノウイルスのゲノム約２４ｋｂを含むＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩ断片、並びに、ＦＲＧＤファイバー部分６．７ｋｂのアデノウイルスゲノムを含むＥｃｏＲＩ／ＲｓｒＩＩ断片を用いて、３断片のライゲーションを行い、ｐＡｘ３プラスミドを得た。なお、この名称はｐＡｘ３５７の略称である。
【０１６５】
ｐＡｘ３プラスミドのファイバーは野生型ではなく、ＦＲＧＤ変異型となっている。Ｆ／ＲＧＤ変異（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）を含むＨＩループ部分の１６６ｂｐは、配列番号５に示すとおりであり、制限酵素サイトとして、ＳａｃＩＩ（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）、ＡｓｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、ＳａｌＩと連なって含んでいる。
【０１６６】
ＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴ（配列番号５）
【０１６７】
（Ｂ．  ＦＺ３３ファイバー変異を含むプラスミドの作製）
１）ＨＩループのＰＣＲ
ヒト５型アデノウイルスのファイバーノブのＨＩループにＺ３３モチーフのフラグメントを挿入することを目的として、ＨＩループの内部にクローニングに便利なＡｇｅＩサイト（ＡＣＣＧＧＴ）とＮｈｅＩサイト（ＧＣＴＡＧＣ）をもつＨＩループを含むフラグメントをＰＣＲにより、人工的に作製した。
【０１６８】
ａ）ｈｉＡＮフラグメントの前半部分の作製
下記プライマー＃２０９１と＃２０９２とを、それぞれ５’プライマーおよび３’プライマーとして、ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２（前出）に記載されたプラスミド）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、前半部分のフラグメントを作製し、これをＫｐｎＩとＥｃｏＲＩとで制限酵素消化して、ｐＳＫＩＩ＋  ｈｉＡＮの作製に用いた。
【０１６９】
プライマー＃２０９１および＃２０９２の塩基配列は、以下の通りである。
＃２０９１  （ＫｐｎＩ），  ３７ｂ
ｃｇｇｇｇｔａｃｃａａｔａｔｃｔｇｇａａｃａｇｔｔｃａａａｇｔｇｃｔｃａｔ（配列番号６）
＃２０９２  （ＦＺ３３，ＡｇｅＩ），  ４７ｂ
ｃｇｇａａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔａｃｃｇｔｔｔａｇｔｇｔａａｔｇ（配列番号７）
上記ＰＣＲにより得られた産物３１４ｂｐの塩基配列は、配列番号８に示す通りである。
【０１７０】
ｃｇｇｇｇｔａｃｃａａＴＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡａｃｃｇｇｔｇｇｃｇｃｇｃｃｇａａｔｔｃｃｇ（配列番号８）
【０１７１】
ｂ）ｈｉＡＮフラグメントの後半部分の作製
下記プライマー＃２０９３と＃２０６８とをそれぞれ５’プライマーおよび３’プライマーとして、ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９８（前出）に記載されたプラスミド）をテンプレートとしてＰＣＲを行い、後半部分のフラグメントを作製し、これをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで制限酵素消化して、ｐＳＫＩＩ＋  ｈｉＡＮの作製に用いた。
【０１７２】
プライマー＃２０９３および＃２０６８の塩基配列は、以下の通りである。
【０１７３】
＃２０９３  （ＦＺ３３，ＮｈｅＩ），  ５２ｂ
ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔ（配列番号９）
＃２０６８  （２６ｂ）
ａｔａｔｇｇｔａｃｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｔｇａａｔｔａ（配列番号１０）
＃２０９３および＃２０６８を用いた上記ＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物９７４ｂｐは、配列番号１１に示す通りである。
【０１７４】
ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＡＴＡＧＣＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＣＡＣＣＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＴＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＴＡＧＴＡＴＴＣＡＡＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＣＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧＧＴＡＡＣＡＧＡＣＡＴＡＴＴＣＴＴＡＧＧＴＧＴＴＡＴＡＴＴＣＣＡＣＡＣＧＧＴＴＴＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＣＡＡＡＣＧＣＴＣＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＣＴＣＣＣＣＧＧＧＣＡＧＣＴＣＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＡＴＧＴＣＧＣＴＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＧＣＧＧＴＴＧＣＴＣＡＡＣＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣＡＴＡＡＴＣＧＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＴＡＧＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧＡＡＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＡＧＣＧＡＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＧＣＣＴＴＧＴＣＣＴＣＣＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＴＣＡＧＣＡＣＡＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＡＧＧＣＧＣＴＧＴＡＴＣＣＡＡＡＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＡＣＡＧＡＡＣＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＡＣＣＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＧＴＡＧＡＴＴＡＡＧＴＧＧＣＧＡＣＣＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＡＣＧＣＴＧＧＡＣＡＴＡＡＡＣＡＴＴＡＣＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧＴＡＣＣａｔａｔ（配列番号１１）
【０１７５】
また、上記フラグメントをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩとで切り出した１３６ｂｐのフラグメントの塩基配列は、以下の通りである。
ｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１２）
【０１７６】
２）ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミドの作製
上記１）で得たｈｉＡＮフラグメントの前半部分のフラグメント、後半部分のフラグメント、およびｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＫｐｎＩとＢａｍＨＩとで制限酵素消化しアルカリホスファターゼＣＩＡＰ（子牛の腸管由来のアルカリホスファターゼ、以下、ＣＩＡＰと略す）処理した約３ｋｂのフラグメントの３者をライゲーションし、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミドの作製を行った。
【０１７７】
ＫｐｎＩとＢａｍＨＩとの間に入るＰＣＲフラグメントの長さは約４３９ｂｐとなる。確認されたＫｐｎＩとＢａｍＨＩとの間の塩基配列は、配列番号１３に示す通りである。
【０１７８】
ｇｇｔａｃｃａａＴＡＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＡＴＴＴＧＡＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡＧＴＧＣＴＡＣＴＡＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＴＡＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＡＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＡＴＣＣＡＡＡＡＴＣＴＣＡＣＧＧＴＡＡＡＡＣＴＧＣＣＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＡＡＧＴＴＴＡＣＴＴＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣＣＴＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡａｃｃｇｇｔｇｇｃｇｃｇｃｃＧＡＡＴＴＣｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１３）
【０１７９】
３）ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミドの作製
Ｚ３３モチーフを含むＡｇｅＩサイトとＮｈｅＩサイトとを両端に有するＤＮＡフラグメントは、プライマー＃２０８５（４８  ｂａｓｅ）と＃２０８６（４８  ｂａｓｅ）とを、それぞれ５’プライマーおよび３’プライマーとして、合成オリゴヌクレオチド＃２０８７（８６  ｂａｓｅ）をテンプレートとして用いてＰＣＲを行い、１３２ｂｐのＰＣＲフラグメントを得た。ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミドのＡｇｅＩサイトとＮｈｅＩサイトとの間に、このＺ３３モチーフフラグメントのＡｇｅＩおよびＮｈｅＩ制限酵素消化産物をクローニングし、塩基配列を確認して、ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミドを得た。
【０１８０】
プライマー＃２０８５および＃２０８６、ならびにテンプレートの＃２０８７の塩基配列は、それぞれ以下の通りである。
【０１８１】
＃２０８５  （Ｚ３３），  ４８ｂ
ｇａａａｃｃｇｇｔｃｔｃａｔｃａａｇｔｔｔａａｃａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃ（配列番号１４）
＃２０８６  （Ｚ３３），  ４８ｂ
ｇｔｃｇｃｔａｇｃａｔｃｔａｔｇｔｃｇｔｃｇｃｇａａｔｇｃｔｃｔｔａａｔｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｃｇ（配列番号１５）
＃２０８７（Ｚ３３），  ８６ｂ
ａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｃｃｃｃａａｃｃｔｇａａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃｇｃａａｃｇｃｃａａｇａｔｔａａｇａｇｃａｔｔｃｇ（配列番号１６）
【０１８２】
また、ＰＣＲによって得られた上記１３２ｂｐのフラグメントの塩基配列は、以下の通りである。
ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号１７）
【０１８３】
これを、コードするアミノ酸配列に翻訳すると、以下の通りである。
ＥＴＧＬＩＫＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＩＤＡＳＤ（配列番号１８）
【０１８４】
また、ＨＩループを含むＫｐｎＩからＢａｍＨＩまでの５３８ｂｐの塩基配列は、以下の通りである。
【０１８５】
ｇｇｔａｃｃａａｔａｔｃｔｇｇａａｃａｇｔｔｃａａａｇｔｇｃｔｃａｔｃｔｔａｔｔａｔａａｇａｔｔｔｇａｃｇａａａａｔｇｇａｇｔｇｃｔａｃｔａａａｃａａｔｔｃｃｔｔｃｃｔｇｇａｃｃｃａｇａａｔａｔｔｇｇａａｃｔｔｔａｇａａａｔｇｇａｇａｔｃｔｔａｃｔｇａａｇｇｃａｃａｇｃｃｔａｔａｃａａａｃｇｃｔｇｔｔｇｇａｔｔｔａｔｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃａｇｃｔｔａｔｃｃａａａａｔｃｔｃａｃｇｇｔａａａａｃｔｇｃｃａａａａｇｔａａｃａｔｔｇｔｃａｇｔｃａａｇｔｔｔａｃｔｔａａａｃｇｇａｇａｃａａａａｃｔａａａｃｃｔｇｔａａｃａｃｔａａｃｃａｔｔａｃａｃｔａａａｃｇｇｔａｃａｃａｇｇａａＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔｇｇｇａｃｔｇｇｔｃｔｇｇｃｃａｃａａｃｔａｃａｔｔａａｔｇａａａｔａｔｔｔｇｃｃａｃｃｔｃｇａｇｔｔａｃａｃｔｔｔｔｔｃａｔａｃａｔｔｇｃｃｃａａｇａａｔａａｇｇａｔｃｃ（配列番号１９）
【０１８６】
下線を引いた部分は、ＡＣＣＧＧＴ、すなわち、ＡｇｅＩサイトおよびＧＣＴＡＧＣ、すなわち、ＮｈｅＩサイトである。大文字で表した部分がＰＣＲによって作製されたＺ３３をコードする部分を含む塩基配列である。
【０１８７】
上記の塩基配列を、それがコードするアミノ酸配列に翻訳すると、以下のような配列になる。
ＶＰＩＳＧＴＶＱＳＡＨＬＩＩＲＦＤＥＮＧＶＬＬＮＮＳＦＬＤＰＥＹＷＮＦＲＮＧＤＬＴＥＧＴＡＹＴＮＡＶＧＦＭＰＮＬＳＡＹＰＫＳＨＧＫＴＡＫＳＮＩＶＳＱＶＹＬＮＧＤＫＴＫＰＶＴＬＴＩＴＬＮＧＴＱＥＴＧＬＩＫＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＩＤＡＳＤＴＴＰＳＡＹＳＭＳＦＳＷＤＷＳＧＨＮＹＩＮＥＩＦＡＴＳＳＹＴＦＳＹＩＡＱＥ（配列番号２０）
【０１８８】
下線を付したＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号２１）の３３アミノ酸が報告されているＺ３３のアミノ酸配列である。さらに下線を引いたところは、ＡＣＣＧＧＴ、ＡｇｅＩサイト、およびＧＣＴＡＧＣ、ＮｈｅＩサイト、のそれぞれによってコードされるアミノ酸配列（それぞれ、ＴＧおよびＡＳ）である。
【０１８９】
４）ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３プラスミドの作製
ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２プラスミドのファイバーのＮ末端部分をコードする領域を含むＸｂａＩからＢｓｔＸＩフラグメント、ｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２プラスミドのヒト５型アデノウイルスのゲノムの右端までの領域を含むＢａｍＨＩからＸｂａＩフラグメント、ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミドのＺ３３モチーフを含むＢｓｔＸＩからＢａｍＨＩフラグメントの３者をライゲーションし、ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３プラスミドを得た。
【０１９０】
５）ｐＡｘ３−ＦＺ３３コスミド・プラスミドの作製
ｐＡｘ３のＲｓｒＩＩからＣｌａＩまでのヒト５型アデノウイルスのゲノムの左端３５７ｂｐを含むフラグメント（３９５６ｂｐのフラグメント）、ｐＡｘ３のＣｌａＩからＥｃｏＲＩまでのヒト５型アデノウイルスの中央部分約２４ｋｂｐのフラグメント、アデノウイルスゲノムの右手のファイバー部分を含むｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３のＥｃｏＲＩからＲｓｒＩＩまでのフラグメント、の３者をライゲーションし、ｐＡｘ３−ＦＺ３３コスミド・プラスミド（約３５ｋｂｐ）を得た。その模式図を図１３−２に示す。
【０１９１】
６）ｐＡｘ３−ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３の作製
ベータ・ガラクトシダーゼを発現するｐＣＡＺ３プラスミドは、Ｎａｋａｍｕｒａら、２００２（前出）に記載されているプラスミドである。ｐＣＡＺ３プラスミドからベータ・ガラクトシダーゼ発現カセットをＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで制限酵素消化してから、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで断端をブラントエンドとしたフラグメント（約５１５３ｂｐ）を、ｐＡｘ３−ＦＺ３３コスミド・プラスミドのＳｗａＩサイト（ＣＩＡＰ処理）にクローニングした。ベータ・ガラクトシダーゼ発現カセットの転写の方向がアデノウイルスのＥ１ゲノムの転写方向に対して逆向き、すなわち左方向に向かっているものを選択し、ｐＡｘ３−ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３とした。
【０１９２】
７）ｐＡｘ３−ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３の作製
ｐＣＡＥＧＦＰは以下のようにして得た。ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする領域は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のｐＥＧＦＰ−Ｎ１を購入して使用し、ＮｏｔＩ制限酵素消化したのちにＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼで断端を平滑化し、さらにＥｃｏＲＩ制限酵素処理した。このＥＧＦＰを含む断片を、Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９８（前出）に記載されているｐＣＡｃｃプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素消化したのちにＴ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼで断端を平滑化し、さらにＥｃｏＲＩ制限酵素処理したＤＮＡとライゲーションし、ｐＣＡＥＧＦＰプラスミドを得た。
さらに、上記ｐＣＡＥＧＦＰから、ＥＧＦＰ発現カセットをＣｌａＩ制限酵素消化して約２９８６ｂｐのＤＮＡ断片として切り出し、ｐＡｘ３−ＦＺ３３コスミド・プラスミドのＣｌａＩサイト（ＣＩＡＰ処理）にライゲーションし、ＥＧＦＰ発現カセットの転写の方向がアデノウイルスＥ１ゲノムの転写方向に対して逆向すなわち左方向に向かっているようなものを選択し、ｐＡｘ３−ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３とした。
【０１９３】
（Ｃ．  組換えアデノウイルスの作製）
ベータ・ガラクトシダーゼを発現する組換えアデノウイルスＡｘ３−ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３、ならびにＥＧＦＰを発現する組換えアデノウイルスＡｘ３−ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３を、それぞれ以下のように作製した。
【０１９４】
コスミド・プラスミドｐＡｘ３−ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３、ならびに、ｐＡｘ３−ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３をそれぞれＰａｃＩ制限酵素消化したＤＮＡを、すでに報告されている方法（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １０（１）：１６２−１７１、２００４）を用いてアデノウイルス産生細胞ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、組換えアデノウイルスを得た。
【０１９５】
具体的には、組換えアデノウイルスの作製のために、各コスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、リポフェクションにより２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした２９３細胞から生じるプラークを単離し、ウイルスゲノムの制限酵素消化および発現ユニットの配列決定により評価した。得られたアデノウイルスベクターを、２９３細胞において拡大し、塩化セシウム超遠心分離によって精製した。精製したウイルスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１０％グリセロールとともに透析し、使用するまで−７０℃で保存した。ウイルスの濃度（ｖｐ／ｍｌ）を決定するために、ウイルス溶液を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中でインキュベートし、Ａ260を測定した（Ｃ．Ｎｙｂｅｒｇ−Ｈｏｆｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｔｉｔｅｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．３（１９９７），ｐｐ．８０８−８１１）。濃度を、ｖｐ／ｍｌ＝Ａ260×（１．１×１０12）として決定した。使用前に、ウイルスストック中の複製コンピテントウイルスによる汚染を、
Ｅ１Ａに特異的なプライマー：
【０１９６】
フォワードプライマー：５′−ＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣ−３′（配列番号２２），
リバースプライマー：５′−ＣＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＡ−３′（配列番号２３）；
Ｅ１Ｂに特異的なプライマー：
フォワードプライマー：５′−ＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ−３′（配列番号２４），
リバースプライマー：５′−ＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＡＧＡＧＣＣ−３′（配列番号２５）；
Ｅ２Ｂに特異的なプライマー（陽性コントロール）：
フォワードプライマー：５′−ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ−３′（配列番号２６），
リバースプライマー：５′−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ−３′（配列番号２７）
を用いるＰＣＲ分析によって排除した（Ｗ．Ｗ．  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＣＲ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（１９９５），ｐｐ．４４４−４４７）。アデノウイルスの感染は、基本的に以前に記載されているように行った（Ｈ．  Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ５−Ｆｌｕｏｕｒａｃｉｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−８  ｉｎ  ＤＬＤ−１  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５（２００３），ｐｐ．２８７−２９９）。
【０１９７】
組み換えアデノウイルスＡｄｖ−ＦＺ３３シリーズの作製においては、適宜、明細書中で引用した文献が参照される。
【０１９８】
（実施例２．  モノクローナル抗体ライブラリーの作製）
ハムスター細胞株Ｈａｓ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、Ｈａｓ細胞に対するモノクローナル抗体のライブラリーを作成した。すなわち、４回以上にわたって、１週間から２週間おきに、約百万個のＨａｓ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。最終免疫（ブースト）は、同量の細胞をマウス尾静脈から静脈注射した。最終免疫後３日目に、マウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）とポリエチレングリコールを用いて細胞融合しハイブリドーマを作成した。細胞融合の方法、ＨＡＴ選択培地によるハイブリドーマの選択、ハイブリドーマのサブクローニング、ハイブリドーマをマウス腹腔中に投与してマウス腹水癌を作製する方法、マウス腹水からマウス免疫グロブリンの精製、などの方法は、すべて、すでに報告されたスタンダードな方法（例えば、文献Ｈａｍａｄａ  Ｈ  ａｎｄ  Ｔｓｕｒｕｏ  Ｔ，  ＰＮＡＳ  ８３（２０）：７７８５−９，１９８６）に従って行った。
【０１９９】
以下は、マウス腹水からマウス免疫グロブリンを精製する手順を示す。
【０２００】
（抗体の精製方法）
（１）マウスの腹水を回収する
（２）１５００ｒｐｍで５分間遠心分離する
（３）上清を回収する
（４）３０００ｒｐｍで５分間遠心分離する
（５）上清を回収する（約１０ｍｌ）
（６）回収した上清をフィルター（孔径：０．４５μｍ）にかけて濾過する
（７）濾液を１ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲルを用いて、室温で３０分間バッチ法で反応させる
（８）１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄する
（９）洗浄したゲルをカラムにアプライする
（１０）１０ｍｌの結合緩衝液で洗浄する
（１１）６ｍｌの溶出緩衝液で溶出し、回収する（各フラクションは、１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して１ｍｌを回収する）
（１２）ＯＤ280＝０．３以上のフラクションを回収する
（１３）回収したフラクションをＰＢＳで一晩透析する
（１４）孔径０．２２μｍのフィルターで濾過する
（１５）ＯＤ280を測定する
（ＩｇＧの場合、ＯＤ280  １．５＝１ｍｇ／ｍｌ）
上記モノクローナル抗体ライブラリーの作製においては、適宜明細書中で引用した文献が参照される。
【０２０１】
（実施例３．  標的化抗体のスクリーニング）
（ベータ・ガラクトシダーゼの染色ならびに化学蛍光アッセイ）
得られた抗体（ハイブリドーマの上清）を、９６ウェルプレートに予め播種してあるＨａｓ細胞に反応させた後、レポーター遺伝子としてＬａｃＺを発現するＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を感染させた。２４時間ないし４８時間後、化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  β−Ｇａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ）によって発現を確認し、高発現だったハイブリドーマのクローニングを行った。２回サブクローニングを繰り返して、２種類の異なるクローンから得られたハイブリドーマのクローンをそれぞれＳ１１、Ｔ１３と名付けた。なお、Ｓ１１ハイブリドーマおよびＴ１３ハイブリドーマは、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ：ＩＰＯＤ）に、それぞれ、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９９および受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０４９８で、２００５年４月８日付で寄託されている。
【０２０２】
より具体的な手順を、以下に示す。
（１）Ｄａｙ  −１：
・Ｈａｓ細胞を３×１０3個／ウェルで９６ウェルプレートに播種する
（２）Ｄａｙ  ０：
・ハイブリドーマ上清を５０μｌ／ウェルでウェルに添加し、４℃で１時間反応させる
・ウェル当たり１００μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ（−））で２回洗浄する
・細胞当たり３×１０3個のＡｘ３ＣＡＺ−ＦＺ３３粒子を感染させる
・ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ（−）で１回洗浄する
・培地を交換し〔培養液（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ  １００μｌ／ウェル）を加え〕、３７℃で２４時間（または４８時間）インキュベートする
（３）Ｄａｙ  １または２：
・ケミルミネッセンスβ−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを行う。測定は、Ｇａｌａｃｔｏ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：（Ｒｏｃｈｅ：Ｔ１０１１）を用いて、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ）にて行った。以下、実施例２〜３に記載されるような抗体とＡｄｖ−ＦＸ３３アデノウイルスとを用いる抗体の調製方法を、「本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法」と呼ぶことがある。
【０２０３】
（実施例４．  抗体Ｓ１１および抗体Ｔ１３の抗原の同定）
抗体Ｓ１１およびＴ１３の抗原の同定を以下のような手順に従って行った：
（１）得られた抗体が、どのような細胞に発現しているのかをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．）を用いたフローサイトメトリーにて確認した。
（２）細胞表面をビオチンラベル後、各抗体と反応させて免疫沈降させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタンブロットで膜にブロッティングし、Ａｎｔｉ−ａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰにてビオチンラベルされたタンパクを染色し、抗原の分子量を同定した。
（３）約１×１０9個の細胞Ｈａｓ細胞を用いて、免疫沈降を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、銀染色を行って可視化し、上記の抗原の分子量の大きさに相当する目的の抗原バンドを切り出した。
（４）このゲルを、トリプシン消化し脱塩後、ＴＯＦ測定、ＭＳ／ＭＳ測定し、データベース検索しタンパク質同定を行った。
【０２０４】
以下、主な手順および結果を具体的に説明する。
（Ａ．  フローサイトメトリー）
得られた抗体がどのような細胞に発現しているのかを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．）を用いてフローサイトメトリーによって確認した。細胞を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで２回洗浄した。細胞をＳ１１ないしＴ１３、ないしコントロールマウスＩｇＧ１などのモノクローナル抗体と反応させ、次いで、二次抗体としてフルオレッセインイソチオシアネートと結合体化させたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で標識した。アイソタイプの整合するコントロールとして、マウスＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐ３株）を用いた。結果を、図３−１、図３−２、および図３−３に示す。
【０２０５】
図３−１は、Ｓ１１の各種培養細胞株との反応性を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。Ｈａｓ細胞、ヒト膵癌の一部、すなわちＡｓＰＣ１、Ｍｉａｐａｃａ２、前立腺癌の一部２２Ｒｖ１、ＬＮＣａｐ、ヒト肺癌の一部ＬＣ−２／ａｄで陽性を示した。ＰＣ３前立腺癌およびＰＤＦ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）線維芽細胞、ＰＣ１４肺癌，ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ肺癌で弱陽性を示した。その他の細胞では、陰性であった。Ｓ１１抗体により認識される陽性細胞とＳ１１抗体により認識されない陰性細胞の区別が明確に存在するため、Ｓ１１抗体を用いたＰＡＰ２ａをマーカーとした診断法の感受性および特異性が高いこと、ならびにＳ１１抗体を用いたＰＡＰ２ａをターゲットとした標的治療の特異性が高いことが、強く裏付けられた。このように、本実施例により、本発明の抗体スクリーニング方法を用いて、診断マーカーとして感受性および特異性のいずれも高く、標的療法に極めて最適化された抗体および抗原分子を直接かつ迅速にスクリーニングできることが示された。なお、図中、Ｈａｓはハムスター細胞株、Ｍｉａｐａｃａ２はヒト膵癌細胞、Ｐａｎｃ１はヒト膵癌細胞、ＢｘＰＣ３はヒト膵癌細胞、ＡｓＰＣ１はヒト膵癌細胞、ＰＣ３はヒト前立腺癌細胞、２２Ｒｖ１はヒト前立腺癌細胞、ＬＮＣａｐはヒト前立腺癌細胞、Ｈｓ６９５Ｔはヒト悪性黒色腫細胞、Ａ３７５はヒト悪性黒色腫細胞、ＭＫＮ７４はヒト胃癌細胞、ＭＫＮ４５はヒト胃癌細胞、ＴＴｎはヒト食道癌細胞、ＰＤＦはヒト初代培養線維芽細胞、Ｈｅｌａは、ヒト子宮癌細胞、ＬＣ−２／ａｄはヒト肺癌細胞、ＰＣ１４はヒト肺癌細胞、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪはヒト肺癌細胞を示す（以下の図においても同様）。
【０２０６】
図３−２は、Ｔ１３の各種培養細胞株との反応性を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。Ｔ１３は、Ｓ１１と全く同じ染色パターンを示した。Ｈａｓ細胞、膵癌の一部ＡｓＰＣ１、Ｍｉａｐａｃａ２、前立腺癌の一部２２Ｒｖ１、ＬＮＣａｐ、ヒト肺癌の一部ＬＣ−２／ａｄで陽性を示した。ＰＣ３前立腺癌、ＰＤＦ（Ｐｒｉｍａｒｙ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）線維芽細胞、ＰＣ１４肺癌，ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪ肺癌で弱陽性を示した。その他の細胞では、陰性であった。Ｔ１３抗体により認識される陽性細胞とＴ１３抗体により認識されない陰性細胞の区別が明確に存在するため、Ｔ１３抗体を用いたＰＡＰ２ａをマーカーとした診断法の感受性および特異性が高いこと、ならびにＴ１３抗体を用いたＰＡＰ２ａをターゲットとした標的治療の特異性が高いことが、強く裏付けられた。このように、本実施例により、本発明の抗体スクリーニング方法を用いて、診断マーカーとして感受性および特異性のいずれも高く、標的療法に極めて最適化された抗体および抗原分子を直接かつ迅速にスクリーニングできることが示された。
【０２０７】
図３−３は、Ｓ１１抗体の各種培養細胞株との反応性を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。ヒト膵癌Ｍｉａｐａｃａ２、前立腺癌２２Ｒｖ１、ヒト肺癌Ａ５４９、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３で陽性を示した。ヒト卵巣癌細胞ＲＭＧ−１で弱陽性、ヒト乳癌細胞ＳＫ−Ｂｒ−３細胞では、陰性であった。なお、図中、ＭＩＡＰａｃａ２はヒト膵癌細胞、２２Ｒｖ１はヒト前立腺癌細胞、Ａ５４９はヒト肺癌細胞、ＲＭＧ−１はヒト卵巣癌細胞、ＳＫ−ＯＶ−３はヒト卵巣癌細胞、ＳＫ−Ｂｒ−３はヒト乳癌細胞を示す（以下の図においても同様）。
【０２０８】
図３−４は、Ｔ１３抗体の各種培養細胞株との反応性を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。Ｔ１３抗体は、図３−３に示したＳ１１抗体の反応性と全く同じ染色パターンを示した。すなわち、ヒト膵癌Ｍｉａｐａｃａ２、前立腺癌２２Ｒｖ１、ヒト肺癌Ａ５４９、ヒト卵巣癌細胞ＳＫ−ＯＶ−３で陽性を示した。ヒト卵巣癌細胞ＲＭＧ−１で弱陽性、ヒト乳癌細胞ＳＫ−Ｂｒ−３細胞では、陰性であった。
【０２０９】
（Ｂ．  細胞表面タンパクのビオチン化）
Ｈａｓ細胞表面のタンパク質について、以下の手順でビオチン標識した。１×１０7個の細胞に対して１．５ｍｇのＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（ＰＩＥＲＣＥ社、製品番号：２１２１７）を１５ｍｌ  ＰＢＳ（−）中で使用した。細胞とビオチンとの混合物を、室温３０分で反応させ、１００ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ  ＰＢＳ（−）にて洗浄することによって反応を停止させた。
【０２１０】
（Ｃ．  免疫沈降）
ビオチン標識したＨａｓ細胞１１×１０7個を回収し、氷冷Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））にて洗浄し、最終的に５０ｍｌチューブに遠心によって細胞を回収した。次いで、２０ｍｌの氷冷Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビターカクテルとしてＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ：カタログ番号１１  ８７３  ５８０  ００１）を使用した）に細胞を懸濁し、氷上にて１時間静置し、可溶化した。次いで、この細胞可溶化液を遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、１５０００ｒｐｍ（×１７３６０ｇ）、４℃で３０分間遠心し、上清を新しい５０ｍｌチューブに移した。この上清に、１ｍｌの５０％（ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：コード番号１７−０６１８−０２）を加え、ロータリーシェイカーにこの溶液の入ったチューブを固定し、４℃で２時間回転して攪拌した。遠心機（ＫＵＢＯＴＡ：８９００：ローターＲＳ−３０１０Ｍ）において、１５００ｒｐｍ（４７０×ｇ）、４℃で５分間遠心した後、上清を新しい１５ｍｌチューブに６ｍｌずつ移した。
【０２１１】
次いで、Ｓ１１抗体（ＩｇＧ１ｋ）、Ｔ１３抗体（ＩｇＧ１ｋ）、およびコントロール抗体としてＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１ｋ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ＣｌｏｎｅＰ３：＃１６−４７１４−８５）の各抗体５μｇを、上清に加えた後、４℃で１時間反応させた。この混合溶液に５０μｌの５０％（ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを加え、さらに、ロータリーシェイカーにチューブを固定し、４℃で１時間回転して攪拌した。次いで、遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、上記混合溶液を、５７００ｒｐｍ（２５００×ｇ）、４℃で１分間遠心した後、上清を除去した。
【０２１２】
氷冷Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１０ｍｌ加えて攪拌した後、遠心機でＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズを沈殿させ、上清を除去した。この洗浄の操作を計６回繰り返した。
【０２１３】
遠心によって集めたビーズに、２５μｌの（×１）ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ−５％２ＭＥを加え、１００℃に熱したヒートブロック上で５分間熱処理した。遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、５７００ｒｐｍ（２５００×ｇ）、４℃で、１分間遠心後、上清を免疫沈降用サンプルとして使用した。
【０２１４】
（Ｄ．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記免疫沈降用サンプルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動漕には、ミニプロテアン３セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６３−３３０１）を使用した。ポリアクリルアミドゲル（５〜２０％グラディエント）には、Ｒｅａｄｙ  ＧｅｌｓＪ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６１−Ｊ３７１）を用いた。分子量マーカーには、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６１−０３７４）を使用した。定電流２０ｍＡで５０分間で泳動した。
【０２１５】
（Ｅ．  銀染色）
銀染色ＭＳキット（和光：コード番号２９９−５８９０１）を用いた。
図４は、免疫沈降サンプルのウエスタンブロットおよび銀染色の結果を示す電気泳動写真である。Ｓ１１とＴ１３は同じパターンを示すことが示された。３０ｋＤａと３７ｋＤａの二つのバンドが認められ、これらが、抗体によって認識される抗原である。Ｓ１１で免疫沈降されてくるバンドの内、約３０キロダルトンのバンドを質量分析に用いた。
【０２１６】
（Ｆ．  質量分析および相同性検索）
株式会社日立サイエンスシステムズにアウトソーシングで依頼した。
【０２１７】
簡単に説明すれば、上記ウエスタンブロットからのバンドを切り出し、トリプシン消化し、脱塩後、ＴＯＦ測定およびＭＳ／ＭＳ測定し、データベース検索を行った。
【０２１８】
質量分析、データベース検索に使用した機種、検索用ソフト、およびデータベースは、以下の通りである。
【０２１９】
質量分析器：ＭＵＬＤＩ−Ｑｑ−ＴＯＦ  ＭＳ／ＭＳ  ＱＳＴＡＲ  Ｐｕｌｓａｒ  Ｉ（アプライドバイオシステム）
データベース検索ソフト：  ＭＡＳＣＯＴ
データベース：  ＮＣＢＩｎｒ  （Ｈｕｍａｎ）
【０２２０】
図５は、質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになった２つのペプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒトＰＡＰ２ａのアミノ酸配列の一部と一致することがわかった（図５において、相同性検索でヒットした配列を下線で示す）。これにより、Ｓ１１およびＴ１３に対する抗原が、ＰＡＰ２ａである可能性が非常に高いことが示された。
【０２２１】
（実施例５．  抗原の同定：質量分析および相同性検索の結果を確認するための実験１）
（Ａ．  免疫沈降用サンプルの調製）
ビオチン標識したＨａｓ細胞７×１０7個を回収し、氷冷Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））にて洗浄し、最終的に１５ｍｌチューブに遠心によって細胞を集めた。次いで、３．５ｍｌの氷冷ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、プロテアーゼインヒビターカクテルとしてＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ：カタログ番号１１  ８７３  ５８０  ００１）を使用）に細胞を懸濁し、氷上に３０分間静置し、可溶化した。次いで、この細胞可溶化液を遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、１５０００ｒｐｍ（×１７３６０ｇ）、４℃で３０分間遠心し、上清を新しい１５ｍｌチューブに移した。この上清（上清Ａとする）から、細胞可溶化液の一部（１００μｌ）を取り分けて、（×３）ＳＤＳｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ−１５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２ＭＥ）  ５０μｌ加え、ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅのサンプルとした。残りの上清Ａに２００μｌの５０％（ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  （ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ：コード番号１７−０６１８−０２）を加えた。
【０２２２】
ロータリーシェイカーに、上記サンプルの入ったチューブを固定し、４℃で２時間回転して攪拌した。遠心機（ＫＵＢＯＴＡ：８９００：ローターＲＳ−３０１０Ｍ）において、１５００ｒｐｍ（４７０×ｇ）、４℃で、５分間遠心した後、上清を新しい１．５ｍｌチューブに５００μｌずつ移した。この上清に、以下の各抗体５μｇを加えた：
・抗ＰＡＰ２ａ抗体（ウサギポリクローナル抗体）
・抗ＰＡＰ２ｂ抗体（ウサギポリクローナル抗体）
・Ｓ１１抗体（ＩｇＧ1k）
・Ｔ１３抗体（ＩｇＧ1k）、ならびに
【０２２３】
コントロール抗体として、
・マウスＩｇＧ1k アイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ＣｌｏｎｅＰ３：＃１６−４７１４−８５）、および
・正常ウサギ血清（ＤＡＫＯ：コード番号Ｘ０９０２）。
【０２２４】
４℃で１時間反応させた。それぞれの液に、４０μｌの５０％（ｖ／ｖ）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  を追加し、ロータリーシェイカーにチューブを固定して、４℃で１時間回転して攪拌した。遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、５７００ｒｐｍ  （２５００×ｇ）、４℃で１分間遠心した後、上清を除去した。
【０２２５】
氷冷Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１ｍｌ加えて攪拌した後、遠心機でＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズを沈殿させ、上清を除去した。この洗浄の操作を計６回繰り返した。
【０２２６】
遠心によって集めたビーズに、２０μｌの（×１）ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ−５％２ＭＥを加え、１００℃に熱したヒートブロック上で５分間熱処理した。遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、５７００ｒｐｍ（２５００×ｇ）、４℃で、１分間遠心後、上清を免疫沈降ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析用サンプルとして使用した。
【０２２７】
（Ｂ．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
上記免疫沈降用サンプルを使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動漕はミニプロテアン３セル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６３−３３０１）を使用した。ポリアクリルアミドゲル（５〜２０％グラディエント）は、Ｒｅａｄｙ  ＧｅｌｓＪ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６１−Ｊ３７１）を用いた。分子量マーカーには、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｒ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ：  カタログ番号１６１−０３７４）を使用した。定電流２０ｍＡで５０分間泳動した。
【０２２８】
（Ｃ．  免疫ブロッティング法（ウエスタンブロット法））
ウエスタンブロット法による免疫ブロッティングは、常法に従い、以下の材料を用いて行った。
・セミドライ式トランスファー装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ：  ＥＢ−１５０）
・ＰＶＤＦメンブレン  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｐｎ−Ｐ（０．４５μｍ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ：ＩＰＶＨ２０２００）
・定電流１００ｍＡで６０分間でトランスファー。
【０２２９】
ブロッキングは以下の溶液で行った：
・ブロッキング液（５％スキムミルク／ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で室温２時間
【０２３０】
１次抗体反応は、以下の抗体：
・抗ＰＡＰ２ａ抗体（１μｇ／ｍｌ−ブロッキング液）および
・抗ＰＡＰ２ｂ抗体（１μｇ／ｍｌ−ブロッキング液）
を用いて、シェイカーに載せ４℃でオーバーナイトで反応させることによって行った。
【０２３１】
２次抗体反応は、以下の抗体：
・Ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ，Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｆ（ａｂ’）2  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：コード番号ＮＡ９３４０）を用いて行った。
【０２３２】
化学発光による検出は、以下の試薬を用いて行った：
・ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：コード番号ＲＰＮ２１０６）。
【０２３３】
結果を、図６に示す。各抗体で免疫沈降し、抗ＰＡＰ２ａポリクローナル抗体（上のカラム）、抗ＰＡＰ２ｂポリクローナル抗体（下のカラム）、それぞれで免疫ブロット解析した。これらのポリクローナル抗体は、札幌医科大学の生化学第２講座、加納英雄教授から供与していただいたウサギ抗血清である。
【０２３４】
上のカラム：抗ＰＡＰ２ａポリクローナル抗体は４，６，７と反応した。
【０２３５】
下のカラム：抗ＰＡＰ２ｂポリクローナル抗体は、５のみと反応した。
すなわち、Ｓ１１、Ｔ１３で濃縮されて免疫沈降されてくる約３０キロダルトンのバンドは、抗ＰＡＰ２ａポリクローナル抗体と反応する。これにより、Ｓ１１とＴ１３抗体の認識する抗原はＰＡＰ２ａであることが確認された。
【０２３６】
（実施例６．  抗原の同定：質量分析および相同性検索の結果を確認するための実験２）
（Ａ．  フローサイトメトリー）
ＣＨＯ細胞に、ＰＡＰ２ａ（ＬＰＰ１）、ＰＡＰ２ｂ（ＬＰＰ３）、およびＰＡＰ２ｃ（ＬＰＰ２）をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、Ｓ１１抗体およびＴ１３抗体がＰＡＰのどのアイソフォームに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した。
【０２３７】
ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）を、６ウェルのＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ（ＩＷＡＫＩ：３８１０−００６）に５×１０5個播種した。翌日、ＣＨＯ細胞に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：１１５１４−０１５）を用いて、以下のプラスミドの遺伝子導入をそれぞれ行った。
・ｐｈＰＡＰ２ａＹＦＰ
・ｐｈＰＡＰ２ｂＹＦＰ
・ｐｈＰＡＰ２ｃＹＦＰ
【０２３８】
遺伝子導入４８時間後、ウェルの培養液を除去し、各細胞をＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＳＩＧＭＡ：Ｔ３９２４）にて浮遊させ回収した。その後、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））にて洗浄した。次いで、各遺伝子導入したＣＨＯ細胞を、３×１０5／１００μｌ／１．５ｍｌ  ｔｕｂｅに調整し、これに１次抗体としてＳ１１抗体またはＴ１３抗体を、それぞれ１μｇ加え、氷上で３０分間反応させた。コントロール抗体としてＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ１ｋ  Ｉｓｏｔｙｐｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  （ｅＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ、Ｐ３株）を使用した。
【０２３９】
反応後、遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、２５００ｒｐｍ（４００×ｇ）で５分間遠心した。上清を除き、細胞ペレットをＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁洗浄し、再度２５００ｒｐｍ（４００×ｇ）で５分間遠心した。これを２回繰り返した。
【０２４０】
細胞洗浄後、各細胞をＰＢＳ（−）１００μｌにて懸濁し、これに２次抗体としてＡｎｔｉｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＲＰＥ（フィコエリスリン），Ｇｏａｔ  Ｆ（ａｂ’）2  （ＤＡＫＯ：Ｒ  ０４８０）を０．５μｇ加え、氷上で３０分間反応させた。反応後、遠心機（ＴＯＭＹ：ＭＸ−１５０：ローターＴＭＰ−１１）において、２５００ｒｐｍ（×５００ｇ）で５分間遠心した。上清を除き、細胞ペレットをＰＢＳ（−）１ｍｌに懸濁洗浄し、再度２５００ｒｐｍ（５００ｇ）で５分間遠心した。これを２回繰り返した。
【０２４１】
細胞洗浄後、細胞をＰＢＳ（−）  ５００μｌに懸濁し、セルストレーナーキャップ付き５ｍｌポリスチレンラウンドチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：３５  ２２３５）に移した。調整した各サンプルを、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）にて解析した。結果を、図７−１および図７−２に示す。
【０２４２】
図７−１は、ＰＡＰ２ａ（ＬＰＰ１）、ＰＡＰ２ｂ（ＬＰＰ３）、およびＰＡＰ２ｃ（ＬＰＰ２）をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、Ｓ１１抗体がＰＡＰのどのアイソフォームに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。上のカラムは各プラスミドのトランスフェクション効率である。中のカラムは各トランスフェクタントに対してＳ１１を用いてＦＡＣＳ解析を行った結果である。
下のカラムは、中のカラムのデータで、コントロール（プラスミドをトランスフェクトしないＣＨＯ細胞）のデータ（中のカラムの一番左）を各トランスフェクタントのデータと重ね合わせたものである。ＰＡＰ２ａをコードするｃＤＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞だけが、Ｓ１１抗体との反応性を獲得することが示された。これにより、Ｓ１１抗体の抗原はＰＡＰ２ａであることが確認された。
【０２４３】
図７−２は、ＰＡＰ２ａ（ＬＰＰ１）、ＰＡＰ２ｂ（ＬＰＰ３）、およびＰＡＰ２ｃ（ＬＰＰ２）をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、Ｔ１３抗体がＰＡＰのどのアイソフォームに反応するかをフローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。上のカラムは各プラスミドのトランスフェクション効率である。下のカラムは各トランスフェクタントに対してＴ１３を用いてＦＡＣＳ解析を行った結果である。ＰＡＰ２ａをコードするｃＤＮＡを発現するプラスミドをトランスフェクトした細胞だけが、Ｔ１３抗体との反応性を獲得することが示された。これにより、Ｔ１３抗体の抗原はＰＡＰ２ａであることが確認された。
【０２４４】
（Ｂ．  免疫組織染色（蛍光染色と共焦点レーザー顕微鏡による観察））
一次抗体として、ＰＡＰ２ａ（Ｓ１１：ＩｇＧ１）を、二次抗体として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ：  Ａ−１１０２９）を使用した。２ウェルのカルチャースライド（ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ：カタログ番号３５４１１２）に、Ｈａｓ細胞を１×１０4個／ウェルで播種し、翌日、ＰＢＳ（−）で２回洗浄し、次いで、下記の各固定液で、示された時間、固定した。
【０２４５】
４％  Ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  室温３０分
１０％中性緩衝ホルマリン液  室温３０分
【０２４６】
次いで、上記カルチャースライドをＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ（ＰＢＳ（−））とともに、室温で５分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳ（−）中の１０％正常ヤギ血清（Ｎｏｒｍａｌ  ｇｏａｔ  ｓｅｒｕｍ）（以下、「ＮＧＳ」と呼ぶ）とともに、室温で３０分インキュベートした。
【０２４７】
次いで、一次抗体と反応させるために、上記カルチャースライドをＮＧＳ中、５μｇ／ｍｌ  抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１またはコントロールマウスＩｇＧ１（Ｐ３株）とともに室温で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。次いで、二次抗体と反応させるために、上記カルチャースライドをＮＧＳ中の５μｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ：  Ａ−１１０２９）とともに、室温で３０分間インキュベートし、その後ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
【０２４８】
次いで、カルチャースライドを、ＤＡＰＩ（４’，６  ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いてＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（登録商標）（ＶＥＣＴＯＲ：Ｈ−１２００）にて核カウンター染色して、マウントし、正立型共焦点顕微鏡において、ＢＩＯＲＡＤ／Ｒ２１００ＡＧ２にて観察した。結果を、図８および図９に示す。
【０２４９】
図８は、抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１による免疫組織染色の写真である。図８の上段の写真は、Ｓ１１による染色、下段の写真は、コントロールマウスＩｇＧ１（Ｐ３株）による染色を示す。この図から、Ｈａｓ細胞，２２Ｒｖ１はＰＡＰ２ａ陽性であることがわかる。このように、Ｓ１１抗体は、ＰＡＰ２ａが陽性の細胞を、組織染色で染めることが可能である。
【０２５０】
図９は、各種固定法を用いたＨａｓ細胞でのＰＡＰ２ａ発現の状況を示す免疫組織染色の写真である。図９の上段の写真は、Ｓ１１による染色、下段の写真は、コントロールマウスＩｇＧ１による染色であり、この写真から、Ｓ１１を用いた場合、組織の固定法としては、パラフォルムアルデヒド、１０％フォルマリンなどで固定しても、それぞれＰＡＰ２ａの染色が可能であることが示された。Ｔ１３抗体を用いた場合も同様の結果が得られた。
【０２５１】
（Ｃ．  化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ）
図１０は、Ｈａｓ細胞をＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を用いて感染した場合の、Ｈａｓ細胞に対するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の感染効率を、化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイの結果を示すグラフである。この実験は、以下に示す手順に従って行った。
（１）Ｈａｓ細胞を１×１０4個／１００μｌ／ウェルの濃度で９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＩＷＡＫＩ）に分注する
（２）３７℃で２４時間インキュベートする
（３）培養液を除去する
（４）ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ（−）で１回洗浄する
（５）抗体Ｓ１１またはＴ１３を、ＰＢＳ（−）中０．１μｇ／ウェル／１００μｌでウェウに添加し、４℃で１時間インキュベートする
（６）ウェル当たり２００μｌのＰＢＳ（−）で１回洗浄する
（７）Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を感染（１０００  ｖｐ／ｃｅｌｌ）させる
（８）４℃で１時間インキュベートする
（９）ＰＢＳ（−）で２回洗浄する
（１０）培養液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）をウェル当たり１００μｌ加える
（１１）３７℃で２４時間インキュベートする。
【０２５２】
上記サンプルを用いて、Ｇａｌａｃｔｏ  Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ：（Ｒｏｃｈｅ：コード番号Ｔ１０１１）を用いて、化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを行った。測定は、Ｗａｌｌａｃ  １４２０  ＡＲＶＯ  （Ｐｅｒｋｉｎ  ｅｌｍｅｒ  ）にて行った。なお、各サンプルのタンパク量は、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ  （ＰＩＥＲＣＥ：  ２３２２７）にて測定した。
【０２５３】
図１０中、ＮＴは、処理なしの場合、Ａｄは、Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３アデノウイルスのみを用いた場合、ＩｇＧ１は抗体としてコントロールマウスＩｇＧ１を用いた場合、Ｓ１１およびＴ１３は、それぞれ抗体としてＳ１１およびＴ１３モノクローナル抗体を用いた場合を示す。図１０に示されるように、Ｓ１１抗体、Ｔ１３抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによるＬａｃＺレポーター遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、約７０倍と非常に高いＬａｃＺレポーター遺伝子導入発現の増加が得られた。この結果から、Ｓ１１およびＴ１３抗体がアデノウイルスベクターを用いた遺伝子導入に有用であることが示された。
【０２５４】
図１１−１Ａは、Ｈａｓ細胞に対するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の感染効率を、予め抗体を用いて処理していない場合（左から２列目）、ＩｇＧ１で処理した場合（左から３列目）、およびＳ１１を用いて処理した場合（左から４列目）について、それぞれ３００ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｖｐ）／ｃｅｌｌ、および１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量でＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を用いてＨａｓ細胞を感染させ、ＥＧＦＰを発現させた場合の、化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子発現アッセイの結果を示すグラフである。示されるように、３００ｖｐ／ｃｅｌｌの場合、Ｓ１１を用いたときには、７８．１％感染したのに対して、コントロールマウスＩｇＧ１を用いたときは、３．９％の感染があるのみであった。同様に、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌの場合、Ｓ１１を用いたときには、９５．５％感染したのに対して、コントロールマウスＩｇＧ１を用いたときは、１５．９％の感染があるのみであった。
【０２５５】
この結果から、Ｓ１１抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、きわめて高いＥＧＦＰ遺伝子導入発現効率の増加が得られることが示された。
【０２５６】
図１１−１Ｂは、膵癌細胞であるＭｉａｐａｃａ２に対するアデノウイルスベクターの感染効率を、図１１−１Ａの場合と同様に、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を用いてフローサイトメトリーで評価した結果を示すグラフである。示されるように、コントロールマウスＩｇＧ１で予め処理したＭｉａｐａｃａ２では、３００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量で１２．３％の感染を示し、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量では４５．６％の感染効率を示したのに対して、Ｓ１１で予め処理したＭｉａｐａｃａ２では、３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量でそれぞれ、３５．５％および７６．５％という上昇した感染効率を示した。
【０２５７】
この結果から、Ｓ１１抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、高いＥＧＦＰ遺伝子導入発現効率の増加が得られる。
【０２５８】
図１１−１Ｃは、Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１に対する感染効率を、Ｓ１１で細胞を前処理した場合と、コントロールマウスＩｇＧ１で細胞を前処理した場合とで比較して示す、フローサイトメトリー実験から得られたグラフである。示されるように、コントロールマウスＩｇＧ１で予め処理した２２Ｒｖ１では、３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量のときに、それぞれ５６．８％および８９．８％の感染を示したのに対して、Ｓ１１で予め処理した２２Ｒｖ１では、３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量のときに、それぞれ６９．１％および９２．３％の感染を示した。このように、コントロールマウスＩｇＧ１で予め処理した場合と、Ｓ１１で予め処理した場合とで、Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３の２２Ｒｖ１に対する感染効率は、いずれも高いものであるが、これらの間に実質的な差違は見出されなかった。すなわち、もともとアデノウイルスによる遺伝子導入効率が高い前立腺癌２２Ｒｖ１のような細胞では、あまり顕著な感染効率の上昇は得られないものと推察された。
【０２５９】
図１１−１Ｄは、別のヒト前立腺癌細胞であるＰＣ３に対するＡｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３の感染を、該細胞をコントロールマウスＩｇＧ１で前処理した場合とＳ１１で前処理した場合とで比較した場合の、フローサイトメトリー実験から得られた結果を示すグラフである。示されるように、コントロールマウスＩｇＧ１を用いた場合（左から３列目；６．５％）も、Ｓ１１を用いた場合（左から４列目；９．３％）も、ＰＣ３に対する感染効率は、抗体による前処理を施していない場合（左から２列目；４．３％）とほとんど変化していないという結果が得られた。このように、この前立腺癌ＰＣ３のようなＰＡＰ２ａ弱陽性ないし陰性の細胞では、Ｓ１１抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなっても、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、有意に高いＥＧＦＰ遺伝子導入発現効率の増加は得られない。換言すれば、この抗体の選択性が高いということであり、ＰＡＰ２ａ弱陽性ないし陰性の正常細胞への影響も少ないことが期待される。
【０２６０】
図１１−２Ａは、Ｈａｓ細胞に対するＦＺ３３アデノウイルスの感染効率に対するＴ１３の効果を、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を用いて、ベクター用量３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。示されるように、Ｔ１３で細胞を前処理した場合（３００ｖｐ／ｃｅｌｌで７６．９％；１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで９４．５％）、コントロールマウスＩｇＧ１で前処理した場合（３００ｖｐ／ｃｅｌｌで３．９％；１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで１５．８％）と比較して、顕著に感染効率が増大することがわかる。この結果は、Ｈａｓ細胞の場合、Ｔ１３抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、きわめて高いＥＧＦＰ遺伝子導入発現効率の増加が得られることを示す。
【０２６１】
図１１−２Ｂは、膵癌細胞であるＭｉａｐａｃａ２に対するＦＺ３３アデノウイルスの感染効率に対するＴ１３の効果を、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を用いて、ベクター用量３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。示されるように、Ｔ１３で細胞を前処理した場合（３００ｖｐ／ｃｅｌｌで３３．４％；１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで７８．３％）、コントロールマウスＩｇＧ１で前処理した場合（３００ｖｐ／ｃｅｌｌで１２．２％；１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで４５．１％）と比較して、感染効率が増大することがわかる。この結果は、Ｍｉａｐａｃａ２細胞に対して、Ｔ１３抗体を用いて、ＦＺ３３アデノウイルスによる遺伝子導入をおこなうと、コントロール（アデノウイルス単独Ａｄ、コントロールのＩｇＧ１を加えたもの）に比較して、高いＥＧＦＰ遺伝子導入発現効率の増加が得られることを示す。
【０２６２】
図１２は、Ｓ１１で前処理した場合の各種細胞に対するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３の感染効率を示す実験のうち、Ｈａｓ細胞及びＰＤＦの混合培養について解析した結果を示す。予め、ＰＡＰ２ａ弱陽性のヒトＰＤＦ細胞（初代培養ヒト・ファイブロブラスト、線維芽細胞）にブルーの色素（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ  ＣＭＡＣ（７−ａｍｉｎｏ−４ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、５ｍｌ  ＤＭＥＭ−ＦＢＳ（−）  １０ｍＭ  ＣＭＡＣ中で２×１０5個のＰＤＦを加え、３７℃で４５分間インキュベートすることにより、取り込ませた。次いで、２ウェルのカルチャースライド（ＣｕｌｔｕｒｅＳｌｉｄｅ）に、１ウェル当たり２×１０4個のＰＤＦ及び２×１０4個のＨａｓ細胞を混合して播種した。翌日、抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１併用でアデノウイルスＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３（ＥＧＦＰ発現）を感染させた。具体的には、１ウェルにつき５００μｌ当たり１μｇのＳ１１抗体（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ（−））と、Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を１ウェル当たり３００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量で（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ（−））混合し、４℃で１時間インキュベートした。培地を交換して培養を続け、翌日、細胞を、１次抗体としてＳ１１抗体（５μｇ／ｍｌ）とともに室温で３０分間インキュベートし、洗いの後、２次抗体としてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ヤギ−抗マウスＩｇＧ抗体（５μｇ／ｍｌ）とともに室温で３０分間インキュベートすることによって、抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１に反応する細胞すなわちＨａｓ細胞を赤色に染めた。Ｈａｓ細胞とＰＤＦ細胞とは同数ずつ播いても、増殖性の差から、２日後にはＨａｓ細胞の方が多くなる。遺伝子導入の有無は、ＥＧＦＰ発現（図では緑色の蛍光）でモニターした。
【０２６３】
図１２に示す遺伝子導入された細胞（すなわち、緑の蛍光を発する細胞）はすべて、赤色（ＰＡＰ２ａ陽性のＨａｓ細胞）細胞であり、ブルーのＰＤＦ細胞には遺伝子導入されていない。このことから、Ｓ１１抗体を用いた遺伝子導入法によって、ＰＡＰ２ａ陰性ないし弱陽性の細胞と区別して、ＰＡＰ２ａ陽性の細胞に選択的に、しかも高い効率で遺伝子導入を行うことができることが示された。このような選択的な遺伝子導入法は、癌の治療に有効と考えられる。
【０２６４】
（実施例７．抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いた免疫組織染色に基づく膵癌の診断）
図１４−１および図１４−２は、ヒト膵癌臨床例からの手術標本の抗ＰＡＰ２ａ抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。免疫組織染色の方法を簡単に記すと以下の通りである。
【０２６５】
ホルマリン固定・パラフィン包埋した外科手術標本を、キシロール・エタノールにより脱パラフィン化し、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．４）に浸して１２１℃で５分間オートクレーブ処理した。次に、１０％正常ウサギ血清を１−２滴滴下し、組織にくまなく広げて室温で１０分間反応させ、非特異的反応を阻止した。次に、Ｓ１１抗ＰＡＰ２ａ抗体（１−２μｇ／ｍｌ）を標本1枚につき５０−１００μｌのせて、組織にくまなく広げて湿潤箱に静置し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳで洗浄し、ビオチン化標識ウサギ抗マウス二次抗体（二次抗体はＶｅｃｔｏｒ社、ＤＡＫＯ社、ニチレイ、などから市販されている）をのせ、室温で1時間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｃｔｏｒ社のペルオキシダーゼ・アビジン・ビオチン複合体（Ａｖｉｄｉｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ、ＡＢＣ）染色キットのアビジン・酵素試薬を適量のせ、室温で一時間反応させた。ＰＢＳで洗浄し、ＤＡＢ溶液（１００ｍｌの０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、に対し、５ｍｇのＤＡＢを溶かし、０．１−０．２ｍｌの０．３％過酸化水素水を加えたもの）に1分間ほどスライドを入れ、肉眼ないし顕微鏡で観察して発色を見ながら蒸留水で反応を止めた。さらにヘマトキシリン溶液で３５秒間、核染色を行い、脱水・透徹・封入を行った。この方法によれば、ＤＡＢ発色により、抗原陽性部位が茶褐色に発色する。
【０２６６】
図１４―１および図１４−２中のＡ、Ｂ、Ｃはそれぞれ別々の患者３例（症例Ａ、症例Ｂ、症例Ｃ）の手術標本からの免疫組織染色の結果である。上のカラムの写真は、膵癌組織を含む部分、下のカラムの写真は、同一のプレパラート上の膵癌組織周辺の非癌部の染色である。図１４に示すように、ヒト膵癌臨床例からの手術標本では、Ｓ１１抗体を用いることにより、膵癌組織が強陽性に染色された。一方で、膵癌組織周辺の非癌細胞からなる組織では、Ｓ１１抗体を用いることにより、陰性ないし弱陽性（腺部）に染色された。すなわち、ＰＡＰ２ａ抗原分子は、ヒト膵癌組織に特異的に強い発現が見られることが示された。従って、Ｓ１１抗体などの抗ＰＡＰ２ａ抗体による膵癌の診断が可能であり、また、Ｓ１１抗体などの抗ＰＡＰ２ａ抗体による標的化治療がヒトの膵癌の治療に有効であることが示された。
【０２６７】
（実施例８  ヒト臨床の各種組織サンプルの抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１による免疫組織染色）
ＰＡＰ２ａが腫瘍組織に特異的に発現すること、および本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体がそのような腫瘍組織の検出（腫瘍の診断）および腫瘍の治療に有用であることをさらに実証するために、各種ヒト腫瘍組織（前立腺癌組織、ヒト甲状腺癌組織、ヒト卵巣癌組織、およびヒト肺癌組織）、ならびに各種ヒト正常組織（リンパ節組織、脾臓組織、骨髄組織、肝臓組織、大腸粘膜組織、膀胱組織、甲状腺組織、大動脈組織、心臓組織、および骨格筋組織）を用いて、本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１による免疫組織染色実験を行った。
【０２６８】
（方法）
腫瘍組織および正常組織の標本は、札幌医科大学病理診断部のホルマリン固定パラフィン包埋のブロック標本から脱パラフィン切片プレパラートとして作製した。抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１を一次抗体として、ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリンを二次抗体として使用して、上記切片プレパラートと反応させ、ＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine, tetrahydrochloride；３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）で発色させた。
【０２６９】
結果を、図１５〜２９、および図３１〜４０に示す。
【０２７０】
（結果）
図１５は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者０３−１０１６−９）を免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。
【０２７１】
図１６は、前立腺癌の症例からの手術標本（図１５と同じ患者０３−１０１６−９）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。Ｓ１１染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、Ｓ１１染色は、前立腺肥大前立腺組織および正常前立腺組織で弱陽性、間質組織で陰性である。
【０２７２】
図１７は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者０３−２２１５−１）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。Ｓ１１染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２７３】
図１８は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者０３−２３４２−１３）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。Ｓ１１染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２７４】
図１９は、前立腺癌の症例からの手術標本（患者０３−２７６７−１４）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。Ｓ１１染色は前立腺癌細胞で陽性である。一方、前立腺肥大の前立腺組織および正常前立腺組織および間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２７５】
図２０は、免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。写真の向かって右手が前立腺癌（ＰＡＰ２ａ陽性）であり、左手は炎症細胞浸潤である（ＰＡＰ２ａ陰性）。ＰＡＰ２ａ抗体は、正常リンパ球や好中球などの宿主の炎症細胞とは反応せず、前立腺癌の診断および標的化治療に有用であることが示唆される。
【０２７６】
図２１は、甲状腺癌の症例からの手術標本（甲状腺の濾胞状腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の患者（アレイＡ７）由来のＳ11抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。Ｓ１１染色は甲状腺癌細胞では陽性である。
【０２７７】
図２２は、図２１とは別の甲状腺癌の症例からの手術標本（濾胞状腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、患者２（アレイＢ１１）由来のサンプルのＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。濾胞内部の茶色の染色はバックグラウンド染色である。
【０２７８】
図２３は、卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−２４１−５）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２７９】
図２４は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−８３０−１）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２８０】
図２５は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−１２５２−１３）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。
【０２８１】
図２６は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−２８８１−４）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。
【０２８２】
図２７は、別の卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−３６５５−９）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。腺腔を形成する分化腺癌でＳ１１染色陽性である。一部に腺腔を形成しない未分化の腫瘍細胞の固まりの形成も見られ、この部分もＳ１１染色陽性である。
【０２８３】
図２８は、図２７の標本と同じプレパラート上の別の視野の写真である。Ｓ１１染色は卵巣癌細胞で陽性である。一方、間質組織では、Ｓ１１染色は陰性である。未分化な浸潤腫瘍組織もＳ１１染色で強陽性である。
【０２８４】
図２９は、ヒト肺癌の症例（アレイＢ３）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。腫瘍細胞の染色（陽性）が認められる。
【０２８５】
図３０は、各種ヒト肺癌臨床サンプルから樹立された細胞やヒト肺癌のＳ１１抗体によるＦＡＣＳ解析の結果を示す。解析は、実施例６の場合と同様に行った。使用した細胞の内訳は以下の通りである。
【０２８６】
１８：肺、腺癌、心滲出液中からの臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陰性。
２７：肺、大細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陽性。
８１：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陽性。
１３３：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陽性。
１４２：肺、腺癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陽性。
１４６：肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陽性。
１４８：肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陰性。
１５４：肺、小細胞癌、胸水臨床サンプル由来の肺癌細胞。Ｓ１１染色は陰性。（図中の表を参照。）
【０２８７】
ＬＣ−２／ａｄ、ＰＣ１４、およびＲＥＲＦ−ＬＣ−ＫＪの３種は、ＡＴＣＣから購入したヒト肺癌細胞株である。３例ともＳ１１染色は陽性であった。図２９および図３０に示される肺癌組織の免疫組織染色、臨床サンプル由来の肺癌細胞のＦＡＣＳ解析、ヒト肺癌細胞株のＦＡＣＳ解析などのデータから、Ｓ１１抗体で肺癌細胞に発現するＰＡＰ２ａの発現を検出することができること、肺癌で陽性例が多いこと、Ｓ１１がＰＡＰ２ａを指標とした診断に用いることが可能なこと、およびＳ１１を用いてＰＡＰ２ａを標的とした治療への応用が可能であることが確認できた。
【０２８８】
次に、正常組織においてＳ１１を用いた免疫組織染色を試みた結果は以下の通りである。
【０２８９】
図３１は、ヒト正常リンパ節の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９０】
図３２は、ヒト正常の脾臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９１】
図３３は、ヒト正常の骨髄の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９２】
図３４は、ヒト正常肝臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９３】
図３５は、正常ヒト大腸粘膜の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９４】
図３６は、ヒト正常の膀胱の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９５】
図３７は、正常ヒト甲状腺の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。甲状腺組織がＳ１１染色では弱陽性である。濾胞内部が茶色に染まっているが、これはバックグラウンド染色である。
【０２９６】
図３８は、正常ヒト大動脈の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９７】
図３９は、ヒト正常の心臓の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９８】
図４０は、ヒト正常の骨格筋の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。Ｓ１１染色は陰性である。
【０２９９】
以上の結果から、Ｓ１１を用いた免疫組織染色アッセイにおいて、腫瘍（特に腺癌）組織が陽性であり、正常組織が陰性であることが示された。したがって、ＰＡＰ２ａが腫瘍組織（特に腺癌組織）に特異的に発現すること、および本発明の抗ＰＡＰ２ａ抗体がＰＡＰ２ａ陽性の腫瘍組織の検出（腫瘍の診断）および腫瘍の治療に有用であることが示された。なお、上記でＳ１１染色について陰性〜弱陽性と、陽性との違いは当業者ならば容易に目視等により区別することができる。
【０３００】
（実施例９．抗ＰＡＰ２ａ抗体をイムノトキシンとして用いたＳａｐｏｒｉｎ結合２次抗体による細胞増殖阻害効果）
実験に用いた材料は、以下の通りである。
・Ｈａｓ細胞（ＰＡＰ２ａ陽性細胞株）
・抗ＰＡＰ２ａモノクローナル抗体（Ｓ１１，  １ｍｇ／ｍｌの濃度で調製）
・サポリンをコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（Ｓａｐｏｒｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ、Ｍａｂ−ＺＡＰ、ＦＵＮＡＫＯＳＨＩより購入）
・ＤＭＥＭ  １０％ＦＣＳ  メディウム
・ＷＳＴ−１  （ＴＡＫＡＲＡより購入）
・９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
【０３０１】
実験の手順は、以下の通りである。
１，対数増殖期にあるＨａｓ細胞を培養シャーレからＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ溶液で回収する。
２，ＤＭＥＭメディウムを用いて遠心洗浄する。
３，細胞数を測定する。
４，２ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し１５ｍｌチューブに１ｍｌずつ分注（２本）
５，ａ）アイソタイプコントロールのマウスＩｇＧ１を１０μｇ、ｂ）抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１を１０μｇ、それぞれ添加する。
６，４℃で３０分反応させる。
７，ＤＭＥＭメディウムを１０ｍｌ添加し遠心洗浄し過剰抗体を除去する。
８，細胞密度２ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍｌにＤＭＥＭメディウムで調製する。
９，９６ウェルプレートにし１００μｌ／ｗｅｌｌずつ細胞を播く。
１０，各濃度に希釈したＳａｐｏｒｉｎ結合２次抗体（Ｍａｂ−ＺＡＰ）を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加する。
１１，３７℃で７２時間培養する。
１２，培地をアスピレータで取り除きＷＳＴ−１溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌずつ添加する。
１３，３７℃で２時間培養する。
１４，プレートリーダーで吸光度測定（測定４１５ｎｍ，対象６５５ｎｍ）。
【０３０２】
図４１は、上記のような方法によって、抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１をイムノトキシンとして用いた、Ｈａｓ細胞傷害治療実験の結果を示すグラフである。この図に示すように、抗ＰＡＰ２ａ抗体Ｓ１１をイムノトキシンとして用いて、Ｈａｓ細胞などのＰＡＰ２ａ陽性細胞をＳ１１特異的に強く傷害することができる。この結果から、抗ＰＡＰ２ａ抗体を用いたＰＡＰ２ａを標的とした免疫治療が、ＰＡＰ２ａを高発現する癌などの治療に、選択性が高く、有効であることが示された。
【０３０３】
（実施例１０  抗体８Ａ９の抗原の同定）
本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法により取得した８Ａ９抗体の抗原の同定を、実施例４〜６に記載される手順と同様に行った。その結果を図４２Ａ〜Ｃに示す。
【０３０４】
図４２Ａは、免疫沈降および銀染色の結果を示す図である。左のレーンは、ビオチン化標識細胞の８Ａ９抗体による免疫沈降、右のレーンは免疫沈降産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色の結果を示す。図中、四角で囲った部分のバンドを切り出して質量分析に供した。
【０３０５】
図４２Ｂは、その質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになったペプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒトＣＤ４４のアミノ酸配列の一部と一致することがわかった。したがって、８Ａ９抗体による免疫沈降産物は、ヒトＣＤ４４抗原分子であることが判明した。
【０３０６】
さらに、ヒトＣＤ４４が８Ａ９抗体の抗原分子であることを確認するために、ヒトＣＤ４４抗原を発現するプラスミドベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に８Ａ９抗体を接触させ、ＦＡＣＳで解析した。結果を図４２Ｃに示す。
【０３０７】
図４２Ｃの右のグラフは、８Ａ９抗体を用いた場合、左のグラフは、コントロールとしてＩｇＧ1Kを用いた場合の結果を示す。図に示されるように、８Ａ９抗体は、ヒトＣＤ４４を高発現するＣＨＯ細胞を認識することから、８Ａ９抗体の抗原がヒトＣＤ４４であることが確認できた。
【０３０８】
なお、図４２Ｃに示す実験では、以下の材料および方法を使用した。
【０３０９】
（材料）
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣより購入）を使用した。培養は１０％ＦＣＳとペニシリンＧカリウム（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培養液で５％ＣＯ２を含む空気中で３７℃のインキュベーター中で行った。プラスミド：ｐＴａｒｇｅｔ−ｈＣＤ４４を使用した。
【０３１０】
ｈＣＤ４４のｃＤＮＡは、Ｈｅｌａ細胞の総ＲＮＡを調製し（ＲＮｅａｓｙ：ＱＩＡＧＥＮ）、ＲＴ−ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて得た。プライマーとして、＃２１８７  ＧＣＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＴＡＣＣ、および＃２１８８  ＧＧＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＣを用いた。
【０３１１】
得られたｈＣＤ４４  ｃＤＮＡを発現ベクターｐＴａｒｇｅｔ（ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションし、ｐＴａｒｇｅｔ−ｈＣＤ４４を得た。プラスミド：ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＣＤ１４７は、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍより購入した。
【０３１２】
（方法）
ＣＨＯ細胞を６ｗｅｌｌ（ウェル）プレートに５ｘ１０5／ｗｅｌｌで播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、細胞に各プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて説明書に従い遺伝子導入を行った。４８時間後、細胞を回収した。各１次抗体を４℃で、３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。２次抗体としてのＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ−ＲＰＥ（Ｄａｋｏ）を４℃で、３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。その後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）にて測定した。
【０３１３】
（実施例１１  ＡｘＣＡＺ３−Ｚ３３と数種の抗ヒトＣＤ４４抗体を用いた遺伝子導入発現量の比較）
上記のとおり調製した８Ａ９抗体と他の数種の抗ヒトＣＤ４４抗体をＡｘＣＡＺ３−Ｚ３３と共に用いて、遺伝子導入発現量の比較検討を行った。材料および方法は以下の通りである。
【０３１４】
（材料）
細胞はヒト前立腺癌細胞株、ＰＣ３（ＡＴＣＣより購入）を使用した。培養は１０％ＦＣＳとペニシリンＧカリウム（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培養液で５％ＣＯ2を含む空気中で３７℃のインキュベーター中で行った。
【０３１５】
使用した抗体は、抗ヒトＣＤ４４（Ｒ＆Ｄ社：２Ｃ５）、抗ヒトＣＤ４４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社：ＤＦ１４８５）、および抗ヒトＣＤ４４（本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗体：８Ａ９）の３種類であった。アイソタイプコントロール抗体として、マウスＩｇＧ1Kアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社：Ｐ３）を使用した。
【０３１６】
アデノウイルスにはβ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを発現するＡｘＣＡＺ３−ＦＺ３３を使用した。
【０３１７】
Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  ＡｓｓａｙにはＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて説明書に従って使用した。
【０３１８】
（方法）
ＰＣ３細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｘ１０4／ｗｅｌｌで播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、ＰＢＳ（−）にてウェルを１回洗浄した。次に、各抗体を、０．０００１μｇ、０．００１μｇ、０．０１μｇ、０．１μｇ、および１μｇの濃度で４℃、１時間反応させた。その後ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。次に、ＡｘＣＡＺ３−ＦＺ３３を、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで４℃、１時間反応させた。その後ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。細胞培養培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。２４時間後Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  を用いてＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙを行いβ−ｇａｌの発現量を測定した。
【０３１９】
（結果）
結果を、図４３に示す。本発明の方法で得られた抗ヒトＣＤ４４抗体８Ａ９は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、市販の抗ヒトＣＤ４４抗体に比し、ＥＤ５０値において５〜３０倍以上の活性を示した。言い換えれば、当出願の方法を用いることにより、市販の抗ヒトＣＤ４４抗体よりも５〜３０倍以上優れた抗体を見分けて樹立することが可能であった。
【０３２０】
（実施例１２  抗体１０Ｄ８および抗体８Ｄ１２の抗原の同定）
本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法により取得した１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体の抗原の同定を、実施例４〜６に記載される手順と同様に行った。その結果を図４４Ａ〜Ｃに示す。
【０３２１】
図４４Ａは、免疫沈降および銀染色の結果を示す図である。左のレーンは、ビオチン化標識細胞の１０Ｄ８抗体による免疫沈降、右のレーンは免疫沈降産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色の結果を示す。図中、四角で囲った部分のバンドを切り出して質量分析の解析に供した。
【０３２２】
図４４Ｂは、その質量分析の結果を示す。質量分析により明らかになったペプチド断片のアミノ酸配列が、データベース上での相同性検索の結果、ヒトＣＤ１４７のアミノ酸配列の一部と一致することがわかった。したがって、１０Ｄ８抗体による免疫沈降産物は、ヒトＣＤ１４７抗原分子であることが判明した。
【０３２３】
さらに、ヒトＣＤ１４７が１０Ｄ８抗体（および８Ｄ１２）の抗原分子であることを確認するために、ヒトＣＤ１４７抗原を発現するプラスミドベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞に１０Ｄ８抗体（および８Ｄ１２抗体）を接触させ、ＦＡＣＳで解析した。結果を図４４Ｃに示す。
【０３２４】
図４４Ｃの中央のグラフは、１０Ｄ８抗体を用いた場合、右のグラフは、８Ｄ１２抗体を用いた場合、および左のグラフは、コントロールとしてＩｇＧ1Kを用いた場合の結果を示す。図に示されるように、１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体はいずれも、ヒトＣＤ１４７を高発現するＣＨＯ細胞を認識することから、１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体の抗原がヒトＣＤ１４７であることが確認できた。
【０３２５】
なお、図４４Ｃに示す実験では、以下の材料および方法を使用した。
【０３２６】
（材料）
チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣより購入）を使用した。培養は１０％ＦＣＳとペニシリンＧカリウム（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培養液で５％ＣＯ２を含む空気中で３７℃のインキュベーター中で行った。プラスミド：ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６−ｈＣＤ１４７は、ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍより購入した。
【０３２７】
（方法）
ＣＨＯ細胞を６ｗｅｌｌ（ウェル）プレートに５ｘ１０5／ｗｅｌｌで播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、細胞に各プラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて説明書に従い遺伝子導入を行った。４８時間後、細胞を回収した。各１次抗体を４℃で、３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。２次抗体としてのＡｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ−ＲＰＥ（Ｄａｋｏ）を４℃で、３０分間反応させた後、ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。その後、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）にて測定した。
【０３２８】
（実施例１３  ＡｘＣＡＺ３３−Ｚ３３と数種の抗ヒトＣＤ１４７抗体を用いた遺伝子導入発現量の比較）
上記のとおり調製した１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体と他の数種の抗ヒトＣＤ１４７抗体をＡｘＣＡＺ３−Ｚ３３と共に用いて、遺伝子導入発現量の比較検討を行った。材料および方法は以下の通りである。
【０３２９】
（材料）
細胞はヒト前立腺癌細胞株、ＰＣ３（ＡＴＣＣより購入）を使用した。培養は１０％ＦＣＳとペニシリンＧカリウム（１００Ｕ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０培養液で５％ＣＯ2を含む空気中で３７℃のインキュベーター中で行った。
【０３３０】
使用した抗体は、抗ヒトＣＤ１４７抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社：１Ｇ６．２）、抗ヒトＣＤ１４７抗体（Ａｂｃａｍ社：ａｂ６６６）、抗ヒトＣＤ１４７抗体（本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗体：８Ｄ１２）、および抗ヒトＣＤ１４７抗体（本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗体：１０Ｄ８）の４種類であった。アイソタイプコントロール抗体として、マウスＩｇＧ1Kアイソタイプコントロール（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社：Ｐ３）を使用した。
【０３３１】
アデノウイルスにはβ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを発現するＡｘＣＡＺ３−ＦＺ３３を使用した。
【０３３２】
Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  ＡｓｓａｙにはＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて説明書に従って使用した。
【０３３３】
（方法）
ＰＣ３細胞を９６ｗｅｌｌプレートに１ｘ１０4／ｗｅｌｌで播種した。翌日、プレートに細胞が接着していることを確認し、ＰＢＳ（−）にてウェルを１回洗浄した。次に、各抗体を、０．０００１μｇ、０．００１μｇ、０．０１μｇ、０．１μｇ、および１μｇの濃度で４℃、１時間反応させた。その後ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。次に、ＡｘＣＡＺ３−ＦＺ３３を、１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで４℃、１時間反応させた。その後ＰＢＳ（−）にて２回洗浄した。細胞培養培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２にて培養した。２４時間後Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  を用いてＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙを行いβ−ｇａｌの発現量を測定した。
【０３３４】
（結果）
結果を、図４５に示す。本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗ヒトＣＤ１４７抗体の１０Ｄ８および８Ｄ１２抗体は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、市販の抗ヒトＣＤ１４７抗体に比し、著明に高い活性を示した。言い換えれば、本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法を用いることにより、市販の抗ヒトＣＤ１４７抗体よりも著明に優れた抗体を見分けて樹立することが可能となった。
【０３３５】
なお、１Ｇ６．２抗体（ケミコン社）は、標的化遺伝子発現を指標とした場合、ほとんど活性を示さない抗体であった。ＡＢ６６６抗体（Ａｂｃａｍ社）は、本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗体と、ＥＤ５０値においてはほぼ同等の性状を示すものの、抗体濃度を増加させても最大活性値（発現量）は頭打ちとなり、当出願の方法で得られた抗ヒトＣＤ１４７抗体の１０Ｄ８および８Ｄ１２抗体の５０％程度の活性値に到達できたのみであった。
【０３３６】
また、本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法で得られた抗ヒトＣＤ１４７抗体の１０Ｄ８および８Ｄ１２抗体を比較すると、１０Ｄ８抗体の方が８Ｄ１２抗体よりも活性の立ち上がりが早く、より高い標的化活性を持つ抗体であることが示された。
【０３３７】
（実施例１４  マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いたＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較）
本発明者らはまた、各種マウス抗ＣＥＡ（ヒト癌胎児性抗原）モノクローナル抗体を用いて、Ａｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を行った。手順を以下に説明する。
【０３３８】
感染の１日前（Ｄａｙ−１）に、ＭＫＮ−４５細胞株を６ウェルプレートに、１×１０5細胞／ウェルで播種した。Ｄａｙ  ０において、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉ（Ｆｕｋｕｏｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供されたか、または市販の各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中に３μｇ／ｍｌの濃度で調節し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加した。陽性コントロールとして、ヒト型抗ＣＥＡ抗体であるＣ２−４５を使用した。Ｉｓｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして、それぞれ、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ｃｌｏｎｅ  Ｐ３）、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ｃｌｏｎｅ  ｅＢＭ２ａ）、Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  ｃｌｏｎｅ  ｅＢＭＧ２ｂ）、およびＭｏｕｓｅ  ＩｇＧ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ  Ｎｏ  ５５３４８４）を使用した。抗体を添加後、１０００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。次いで、無血清ＲＰＭＩ−１６４０にてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を１０００ＶＰ／細胞の濃度に希釈し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって感染させた。インキュベーション後、１０００μｌの無血清ＰＲＭＩ−１６４０にて２回洗浄し、さらに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。Ｄａｙ  １において、ＧＦＰ活性をＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｅｒによって測定した。
【０３３９】
図４６は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒの測定結果を示すグラフである。マウス抗ＣＥＡ抗体やキメラ方抗体でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。中でもＣ２−４５は、他のマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体と比較して、１０〜１００倍以上ＥＧＦＰ遺伝子の導入効率が高いことが示された。
【０３４０】
図４７は、ＣＥＡを発現するように遺伝子導入したＣＨＯ細胞で、種々の抗ＣＥＡ抗体とＡｄｖ−ＦＺ３３  ｌａｃＺアデノウイルスとを用いて遺伝子導入を行ったばあいの、ｌａｃＺ遺伝子発現量の比較を示すグラフである。マウス抗ＣＥＡ抗体やキメラ方抗体でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。しかし、とりわけＣ２−４５は、他抗ＣＥＡモノクローナル抗体と比較して、１０〜１００倍以上ＥＧＦＰ遺伝子の導入効率が高いことが示された。すなわち、当アッセイ法を用いれば、極めて高Ｓ／Ｎ（シグナル・ノイズ比の高い）かつダイナミックレンジの広い抗体の活性の比較が可能であることが示されている。これは、ＦＡＣＳ法やＥＬＩＳＡ法などの従来の方法と比較して格段に高Ｓ／Ｎ（シグナル・ノイズ比の高い）かつダイナミックレンジの広い抗体の活性の比較方法になっていることが判明した。
【０３４１】
図４６および図４７に示す結果はまた、このようにファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、ＥＧＦＰ遺伝子のようなマーカー遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を用いることによって、特に優れた「高性能標的化抗体」を他の凡庸な活性の抗体と区別して選別することができることを実証する。このように、本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法は、従来の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法など）に比べて格段に優れた「高性能・標的化抗体」を選別することができる高Ｓ／Ｎ（シグナル・ノイズ比の高い）かつダイナミックレンジの広いアッセイ方法である。
【０３４２】
なお、図４６および図４７に結果を示す実験で使用したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、以下の通りである。
１．  Ｆ３３−１０４（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG1 (k）
Affinity constant: 3.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml）
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０３４３】
２．  Ｆ３３−６０（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2a (k）
Affinity constant: 3.4 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml）
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０３４４】
３．  Ｆ８２−８１（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2b (k）
Affinity constant: 9.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml）
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0  
【０３４５】
４．  Ｆ１１−１２（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG3 (k）
Affinity constant: 11.2 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml）
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０３４６】
５．  Ｃｈ  Ｆ１１−３９  （Ｌｏｔ  ２）（Arakawa F. et al, Hybridoma 12: 365-379, 1993.）
Class: 同上
Affinity constant: 同上
OD=2.10 (Ab Conc.= 1.5 mg/ml）
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 0.75 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０３４７】
６．  ＩＢ２  （ＩＢＬ社より購入：ｌｏｔ  Ｎｏ  ９Ｇ−７１７）
class: IgG2a
Ab Conc. = 1mg/ml
【０３４８】
７．  Ｂ６．２／ＣＤ６６  （ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入：  ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ  ５５１３５５）
Class：  IgG1
Ab Conc. 0.5mg/ml
【産業上の利用可能性】
【０３４９】
本発明の抗体は、膵癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、および乳癌を含むＰＡＰ２ａ陽性の癌（特に転移癌、腺癌）の標的化療法等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、アデノウイルスの感染効率を高めることから、上記ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的化遺伝子導入に有用である。
【０３５０】
さらに標的化抗体として抗癌剤のコンジュゲートやＡＤＣＣを利用した抗体療法などの様々な用途においても有用である。
【０３５１】
本発明の方法により同定された癌特異的抗原は、診断マーカーとしてのみならず、標的化治療のための標的として、あるいは、ワクチン製剤の成分等としてもまた有用である。
【０３５２】
また、本発明の抗体は、免疫沈降、ＦＡＣＳなどの免疫学的試験が容易に行い得、組織染色も可能であるため、癌の治療用のみならず、診断用としても有用である。
【０３５３】
本発明の癌特異的抗原およびそれに対する抗体の同定方法は、薬剤の標的指向化療法における標的となる分子候補とそれに対する抗体との組み合わせを系統的に探索してゆくために有用である。
【０３５４】
さらに、本発明の所望の抗原に対するモノクローナル抗体のスクリーニング方法は、標的細胞への治療物質のターゲッティング効率などを従来よりも格段に高めることができる高性能抗体を取得するために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０３５５】
【図１】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルスベクター、Ａｄｖ−ＦＺ３３アデノウイルスを用いた標的化遺伝子導入の模式図である。
【図２】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルスベクター、Ａｄｖ−ＦＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。
【図３−１】Ｓ１１抗体の各種細胞株との反応を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３−２】Ｔ１３抗体の各種細胞との反応を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３−３】Ｓ１１抗体の各種細胞株との反応を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３−４】Ｔ１３抗体の各種細胞株との反応を示すＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４】免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。
【図５】Ｓ１１抗体の認識する抗原についての質量分析の結果を示す図である。
【図６】質量分析の結果の確認するためのウエスタンブロットを示す電気泳動写真である。
【図７−１】ＰＡＰ２ａ（ＬＰＰ１）、ＰＡＰ２ｂ（ＬＰＰ３）、およびＰＡＰ２ｃ（ＬＰＰ２）をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、Ｓ１１抗体がＰＡＰのどのアイソフォームに反応するか否かを、フローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。
【図７−２】ＰＡＰ２ａ（ＬＰＰ１）、ＰＡＰ２ｂ（ＬＰＰ３）、およびＰＡＰ２ｃ（ＬＰＰ２）をそれぞれ発現するプラスミドをそれぞれ遺伝子導入し、Ｔ１３抗体がＰＡＰのどのアイソフォームに反応するか否かを、フローサイトメトリーにて検討した結果を示すグラフである。
【図８】Ｓ１１抗体の培養細胞株との反応性を示す免疫組織染色の写真である。
【図９】Ｓ１１抗体の組織染色のための固定法の検討結果を示す免疫組織染色の写真である。
【図１０】Ｈａｓ細胞をＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を用いて感染した場合の、Ｈａｓ細胞に対するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３の感染効率を、化学発光β−Ｇａｌレポーター遺伝子アッセイによって評価した結果を示すグラフである。
【図１１−１Ａ】Ｈａｓ細胞に対するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の感染効率を、予め抗体を用いて処理していない場合（左から２列目）、ＩｇＧ１で処理した場合（左から３列目）、およびＳ１１を用いて処理した場合（左から４列目）について、それぞれ３００ｖｉｒａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ｖｐ）／ｃｅｌｌ、および１０００ｖｐ／ｃｅｌｌのベクター用量でＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を用いてＨａｓ細胞に感染させ、ＥＧＦＰを発現させた場合の、ＥＧＦＰ蛍光レポーター遺伝子発現のフローサイトメトリー解析の結果を示すグラフである。
【図１１−１Ｂ】膵癌細胞であるＭｉａｐａｃａ２に対するアデノウイルスベクターの感染効率を、図１１−１Ａの場合と同様に、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を用いてフローサイトメトリーで評価した結果を示すグラフである。
【図１１−１Ｃ】Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３のヒト前立腺癌細胞２２Ｒｖ１に対する感染効率を、Ｓ１１で細胞を前処理した場合と、ＩｇＧ１で細胞を前処理した場合とで比較して示す、フローサイトメトリー実験から得られたグラフである。
【図１１−１Ｄ】別のヒト前立腺癌細胞であるＰＣ３に対するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３の感染を、該細胞をコントロールマウスＩｇＧ１で前処理した場合とＳ１１で前処理した場合とで比較した場合の、フローサイトメトリー実験から得られた結果を示すグラフである。
【図１１−２Ａ】Ｈａｓ細胞に対するＦＺ３３アデノウイルスの感染効率に対するＴ１３の効果を、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を用いて、ベクター用量３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。
【図１１−２Ｂ】膵癌細胞であるＭｉａｐａｃａ２に対するＦＺ３３アデノウイルスの感染効率に対するＴ１３の効果を、ＥＧＦＰを発現するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を用いて、ベクター用量３００ｖｐ／ｃｅｌｌおよび１０００ｖｐ／ｃｅｌｌで、フローサイトメトリーを用いて評価した結果を示すグラフである。
【図１２】Ｓ１１で前処理した場合の各種細胞に対するＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３の感染効率を示す実験のうち、Ｈａｓ細胞及びＰＤＦの混合培養についての結果を解析した結果を示す免疫蛍光組織染色の写真である。
【図１３−１】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのプラスミドベクターｐＡｘ３の模式図である。
【図１３−２】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのプラスミドベクターｐＡｘ３−ＦＺ３３の模式図である。
【図１３−３】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルスベクターＡｄｖ−ＦｄＺの概念図である。
【図１３−４】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルスベクターＡｄｖ−ＦｄＺのファイバー部分の構造の模式図である。
【図１３−５】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのプラスミドベクターｐＡｘ３i−ＦｄＺの模式図である。
【図１４−１】ヒト膵癌の臨床例Ａ、Ｂの２症例の手術標本のＳ１１抗体による免疫組織染色を示す写真である。上のカラムは膵癌組織を含む部分、下のカラムは同一のプレパラート上の膵癌組織周辺の非癌部の顕微鏡写真を示す。
【図１４−２】ヒト膵癌の臨床例Ｃ症例の手術標本のＳ１１抗体による免疫組織染色を示す写真である。上のカラムは膵癌組織を含む部分、下のカラムは同一のプレパラート上の膵癌組織周辺の非癌部の顕微鏡写真を示す。
【図１５】前立腺癌の症例からの手術標本（患者０３−１０１６−９）をＳ１１抗体による免疫組織染色した結果を示す顕微鏡写真である。
【図１６】前立腺癌の症例からの手術標本（図１５と同じ患者０３−１０１６−９）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１７】前立腺癌の症例からのＳ１１抗体による手術標本（患者０３−２２１５−１）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１８】前立腺癌の症例からのＳ１１抗体による手術標本（患者０３−２３４２−１３）の免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１９】前立腺癌の症例からのＳ１１抗体による手術標本（患者０３−２７６７−１４）の染色である。
【図２０】前立腺癌の症例からの手術標本のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。向かって右半分の前立腺癌組織はＰＡＰ２ａ陽性であるが、左半分の正常組織と浸潤炎症細胞はＰＡＰ２ａ陰性である。
【図２１】甲状腺癌の症例からの手術標本（甲状腺の濾胞状腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の患者（アレイＡ７）由来のサンプルのＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２２】図２１とは別の甲状腺癌の症例からの手術標本（濾胞状腺癌（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）の患者（アレイＢ１１）由来のサンプルのＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２３】卵巣癌の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−２４１−５）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２４】卵巣癌の別の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−８３０−１）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２５】卵巣癌の別の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−１２５２−１３）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２６】卵巣癌の別の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−２８８１−４）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２７】卵巣癌の別の症例からの手術標本（ＯｖＣａ  患者０３−３６５５−９）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図２８】図２７の標本と同じプレパラート上の別の視野の写真である。
【図２９】ヒト肺癌の症例（アレイＢ３）のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３０】各種ヒト肺癌細胞のＳ１１抗体によるＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図３１】ヒト正常リンパ節のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３２】ヒト正常の脾臓のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３３】ヒト正常の骨髄のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３４】ヒト正常肝臓のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３５】正常ヒト大腸粘膜のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３６】ヒト正常の膀胱のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３７】正常ヒト甲状腺のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３８】正常ヒト大動脈のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図３９】ヒト正常の心臓のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図４０】ヒト正常の骨格筋のＳ１１抗体による免疫組織染色の結果を示す顕微鏡写真である。
【図４１】抗ＰＡＰ２ａ抗体とＳａｐｏｒｉｎ結合２次抗体による細胞増殖阻害の実験結果を示すグラフである。
【図４２−Ａ】８Ａ９抗体の抗原決定における免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。
【図４２−Ｂ】８Ａ９抗体の抗原決定における質量分析の結果を示す図である。
【図４２−Ｃ】８Ａ９抗体の抗原決定におけるＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４３】本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法により得た８Ａ９抗体と他の数種の抗ヒトＣＤ４４抗体との間でのＡｘＣＡＺ３−Ｚ３３を用いた遺伝子導入発現量の比較を示すグラフである。
【図４４−Ａ】１０Ｄ８抗体の抗原決定における免疫沈降および銀染色の結果を示す電気泳動写真である。
【図４４−Ｂ】１０Ｄ８抗体の抗原決定における質量分析の結果を示す図である。
【図４４−Ｃ】１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体の抗原決定におけるＦＡＣＳ解析の結果を示す図である。
【図４５】本発明のＡｄｖ−ＦＺ３３スクリーニング法により得た１０Ｄ８抗体および８Ｄ１２抗体と他の数種の抗ヒトＣＤ１４７抗体との間でのＡｘＣＡＺ３−Ｚ３３を用いたｌａｃＺ遺伝子発現量の比較を示すグラフである。
【図４６】ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒの測定結果を示すグラフである。
【図４７】ＣＥＡを発現するように遺伝子導入したＣＨＯ細胞での、種々の抗ＣＥＡ抗体とＡｄｖ−ＦＺ３３  ｌａｃＺアデノウイルスとを用いて遺伝子導入をおこなった時のベータ・ガラクトシダーゼ遺伝子発現量（β−ｇａｌの発現量）の比較を示すグラフである。
【図１】
2008163029.tif 000002
【図２】
2008163029.tif 000003
【図３−１】
2008163029.tif 000004
【図３−２】
2008163029.tif 000005
【図３−３】
2008163029.tif 000006
【図３−４】
2008163029.tif 000007
【図４】
2008163029.tif 000008
【図５】
2008163029.tif 000009
【図６】
2008163029.tif 000010
【図７−１】
2008163029.tif 000011
【図７−２】
2008163029.tif 000012
【図８】
2008163029.tif 000013
【図９】
2008163029.tif 000014
【図１０】
2008163029.tif 000015
【図１１−１Ａ】
2008163029.tif 000016
【図１１−１Ｂ】
2008163029.tif 000017
【図１１−１Ｃ】
2008163029.tif 000018
【図１１−１Ｄ】
2008163029.tif 000019
【図１１−２Ａ】
2008163029.tif 000020
【図１１−２Ｂ】
2008163029.tif 000021
【図１２】
2008163029.tif 000022
【図１３−１】
2008163029.tif 000023
【図１３−２】
2008163029.tif 000024
【図１３−３】
2008163029.tif 000025
【図１３−４】
2008163029.tif 000026
【図１３−５】
2008163029.tif 000027
【図１４−１】
2008163029.tif 000028
【図１４−２】
2008163029.tif 000029
【図１５】
2008163029.tif 000030
【図１６】
2008163029.tif 000031
【図１７】
2008163029.tif 000032
【図１８】
2008163029.tif 000033
【図１９】
2008163029.tif 000034
【図２０】
2008163029.tif 000035
【図２１】
2008163029.tif 000036
【図２２】
2008163029.tif 000037
【図２３】
2008163029.tif 000038
【図２４】
2008163029.tif 000039
【図２５】
2008163029.tif 000040
【図２６】
2008163029.tif 000041
【図２７】
2008163029.tif 000042
【図２８】
2008163029.tif 000043
【図２９】
2008163029.tif 000044
【図３０】
2008163029.tif 000045
【図３１】
2008163029.tif 000046
【図３２】
2008163029.tif 000047
【図３３】
2008163029.tif 000048
【図３４】
2008163029.tif 000049
【図３５】
2008163029.tif 000050
【図３６】
2008163029.tif 000051
【図３７】
2008163029.tif 000052
【図３８】
2008163029.tif 000053
【図３９】
2008163029.tif 000054
【図４０】
2008163029.tif 000055
【図４１】
2008163029.tif 000056
【図４２−Ａ】
2008163029.tif 000057
【図４２−Ｂ】
2008163029.tif 000058
【図４２−Ｃ】
2008163029.tif 000059
【図４３】
2008163029.tif 000060
【図４４−Ａ】
2008163029.tif 000061
【図４４−Ｂ】
2008163029.tif 000062
【図４４−Ｃ】
2008163029.tif 000063
【図４５】
2008163029.tif 000064
【図４６】
2008163029.tif 000065
【図４７】
2008163029.tif 000066
【配列表】
2008163029000001.app