(57)【要約】      （修正有）【課題】イネ科植物においてＧＡＤタンパク質を種子（胚乳部）に効率良く蓄積させることが可能な発現ベクターを提供し、可食部にＧＡＢＡを集積させることが可能な技術を提供すること。【解決手段】  特定なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、若しくは、特定なアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換イネ。また、この形質転換イネから得られ、ＧＡＢＡを少なくとも３０ｍｇ／１００ｇ含有した血圧降下作用を有する白米。【選択図】図９
2008000129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、若しくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換イネ。
【請求項２】
前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡがイネグルテリン遺伝子のプロモーター領域の下流側に連結している請求項１に記載の形質転換イネ。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の形質転換イネから得られ、ＧＡＢＡを少なくとも３０ｍｇ／１００ｇ含有した血圧降下作用を有する白米。
【請求項４】
イネグルテリン遺伝子のプロモーター領域と、
配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、
を連結した遺伝子を有し、胚乳部のＧＡＢＡ含量を高めるイネ用ベクター。
【請求項５】
イネグルテリン遺伝子のプロモーター領域と、
配列番号２に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、
を連結した遺伝子を有し、玄米のミネラル、遊離アミノ酸、または、ビタミン含量、を高めるイネ用ベクター。
【請求項６】
配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列、をコードするＤＮＡを有する機能性成分強化米開発用ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主にイネにおけるグルタミン酸脱炭酸酵素を特定の組織において高濃度に蓄積させるための発現ベクターの作製、これを用いた形質転換イネ植物の作製、および、これらの利用ないし利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２１世紀に入り、肥満、高脂血症、高血圧などの生活習慣病に苦しむ患者が全世界で急激に増加している。従って、生活習慣病を予防し、その症状を改善するための対策は、緊急の課題である。我が国においては、生活習慣病の予防のために、高齢者は降圧剤を大量に服用している実情がある。その薬剤費は2004年に8千億円と試算され、医療財政の圧迫のみならず、その副作用に対する懸念も指摘されている。
【０００３】
近年γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は血圧降下、肥満防止、内蔵機能の改善などの優れた効能を持つために健康成分として注目され、発芽玄米などＧＡＢＡを富化した様々な食品やサプリメントが広く商品化されている。すなわち、医食同源の観点からＧＡＢＡを富化させた発芽玄米を米飯に混ぜて毎日食べたり、ＧＡＢＡサプリメントを日常的に摂取することで血圧上昇の予防など健康増進への効果が期待される。
【０００４】
なお、ＧＡＢＡは、グルタミン酸からの不可逆的な合成を触媒するグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）により合成される。このＧＡＤは、大腸菌からヒト、イネにいたるまで生物に普遍的に存在する酵素タンパク質の一種である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２９００６９号公報
【非特許文献１】Kazuhito Akama,Takashi Akihiro,MasatoKitagawa,Fumio Takaiwa(2001)Rice(Oryza sativa)  contains a novel isoformof glutamate decarbyoxylase  that  lacks an authenticcalmodulin-binding domain at the C-terminus. Biochemica et Biophysica Acta1522,147-150.
【非特許文献２】Fumio Takaiwa,Kiyoharu Oono,David Wing and Akira Kato(1991) Sequenceof three members and expression of a new major subfamily of glutelin genes fromrice.Plant Molecular Biology 17(4),875-885.
【非特許文献３】Elizabeth E.Hood,Jenifer M.Murphy and Robert C.Pendleton(1993)Molecularcharacterization of maize extensin expression.Plant Molecular Biology,23(4),685-695.
【非特許文献４】Yukoh Hiei,Shozo Ohta,Toshihiko Komari and TAkahashiKumashiro(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.) mediated byAgorbacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The PlantJournal,6(2),271-282.
【非特許文献５】Jeff J.Doyle and Jane I.Doyle(1990)Isolation  of  plant  DNAfrom fresh tissue.Focus,12,135-137.
【非特許文献６】L.Q.Qu,Y.Tada and F.Takaiwa (2003) In  situ westernhybridization: a new, highly sensitive technique to detect foreign andendogenous protein distribution in rice seeds.Plant Cell Reports,22,282-285.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、発芽玄米の場合は、食味が必ずしも優れず恒常的な摂取が困難であるとう問題点があった。また、米の場合、ＧＡＢＡは糠部分に蓄積され、玄米であれば摂取量がある程度確保されるものの、精米したものは数分の一未満まで低減してしまうという問題点があった。サプリメントの場合も摂取の煩わしさと高コストであるという問題点があった。
【０００７】
本発明は上記に鑑みてなされたものであって、ＧＡＢＡ含有量の多い白米を提供可能にすることを目的とする。より詳しくは、イネ科植物においてＧＡＤタンパク質を種子（胚乳部）に効率良く蓄積させることが可能な発現ベクターを提供し、可食部にＧＡＢＡを集積させることが可能な技術を提供することにある。
【０００８】
また、ＧＡＢＡに限らず遊離アミノ酸、ミネラル、または、ビタミンの豊富な玄米を提供可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の形質転換イネは、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、若しくは、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入したものである。
【００１０】
また、請求項２に記載の形質転換イネは、請求項１に記載の形質転換イネにおいて、前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡがイネグルテリン遺伝子のプロモーター領域の下流側に連結しているものである。
【００１１】
なお、イネグルテリン遺伝子は、Ａ遺伝子族、Ｂ遺伝子族が挙げられるが、そのうち、ＧｌｕＢ−１が好ましい。ＧｌｕＢ−１のプロモーター領域としては、標準的な２．３ｋｂの長さを用いることができる。
【００１２】
また、請求項３に記載の白米は、請求項１または請求項２に記載の形質転換イネから得られ、ＧＡＢＡを少なくとも３０ｍｇ／１００ｇ含有した血圧降下作用を有する白米である。
【００１３】
また、請求項４に記載のイネ用ベクターは、イネグルテリン遺伝子のプロモーター領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたは配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、を連結した遺伝子を有し、胚乳部のＧＡＢＡ含量を高めるベクターである。
【００１４】
また、請求項５に記載のイネ用ベクターは、イネグルテリン遺伝子のプロモーター領域と、配列番号２に記載のアミノ酸配列または配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡと、を連結した遺伝子を有し、玄米のミネラル、遊離アミノ酸、または、ビタミン含量、を高めるベクターである。
【００１５】
また、請求項６に記載の機能性成分強化米開発用ベクターは、配列番号２に記載のアミノ酸配列、または、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列、をコードするＤＮＡを有するベクターである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、発現ベクターにコードされているＧＡＤをイネの白米部分に高レベルに発現させ、同時にその生産物であるＧＡＢＡを高濃度に蓄積させることができる。従って、この形質転換イネから得られた精白米を食することによりＧＡＢＡが作用し、様々な生活習慣病の予防ないし治療に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明するが、本発明はここに記載した形態のみに限定されるものではなく、本明細書の記載および当分野で公知の技術に基づいて、当業者が容易に修飾や改変可能な技術に関しては本発明の範囲内に含まれるものとする。
【００１８】
ＧＡＤはグルタミン酸の脱炭酸反応によるＧＡＢＡの生産を触媒する。ＧＡＤは大腸菌からヒトにいたるまで生物が普遍的に持つ酵素の一種であるが、植物のＧＡＤのみがそのＣ末端領域にカルモジュリン結合部位（ＣａＭＢＤ）を持ち、この部位とＣａＭとの相互作用が酵素活性の調節に重要な役割を担っている。
【００１９】
単子葉植物イネで少なくとも５種類のアイソフォームの存在が推定され、その中でもＯｓＧＡＤ２をコードする遺伝子（アクセッション番号：ＡＢ０５６０６１）は例外的にＣａＭＢＤを持たない（非特許文献１参照）。なお、以降においては、適宜ＯｓＧＡＤ２を単にＧＡＤ２と表記するものとする。
【００２０】
さらに、本願発明者によって明らかになったことであるが、ＧＡＤ２のＣ末端側ペプチド部分を欠如させることにより、酵素活性が５倍以上も上昇することが確認されている（特許文献１参照）。本願発明者は、さらにＧＡＤ２を研究し、鋭意検討の結果本願発明をなした。
【００２１】
＜概要＞
本願発明者は、イネのＧＡＤ２遺伝子（特許文献1）を改変し、種子特異的な遺伝子プロモーターで発現させるためのベクターを作製し、アグロバクテリウムを介して当該遺伝子を植物細胞に組み込み、組換えイネ個体を再生させて、ＧＡＢＡを高度に種子に蓄積させることに成功した。さらに、世代を進めることでその形質を固定した。開発した玄米は、期待された胚乳中へのＧＡＢＡ含量の向上のみならず、予想外にも、玄米全体のミネラル、遊離アミノ酸、および、ビタミン含量が向上したものであった。これを材料として混合飼料を作製して高血圧ラットに投与したところ、血圧降下の作用等を持つことを確認した。より詳細には、以下のとおりある。
【００２２】
＜発現ベクターの構築＞
植物発現ベクターの構築について、以下のとおりとした。まず、ＧＡＤ２をコードするｃＤＮＡを鋳型として特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ法により開始コドンから４６９番目までのアミノ酸に対応する塩基配列を増幅した。なお、ＧＡＤ２は、５００アミノ酸残基からなり、ＯｓＧＡＤ１に見られるＣａＭＢＤ（Ｃ末端側３１残基）がみられないが、酵素活性を調節すると考えられるＣａＭＢＤに相当する３１残基を欠失させ、酵素機能そのものを司る領域と考えられる４６９残基をコードするＤＮＡにてベクターを構築することを試みた。
【００２３】
このとき用いたセンスプライマーは配列番号３に示したように５’−ＣＧＴＧＣＧＴＡＧＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧ−３’、アンチセンスプライマーは配列番号４に示したように５’−ＡＡＡＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＣ−３’である。なお、下線部は前者がＮｃｏＩ認識配列を、後者がＳｐｈＩ認識配列を示す。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片は、ＧＡＤ２のＣ末端側の３１アミノ酸残基分を欠失させたものであり、以降では、このＤＮＡ断片を適宜ＧＡＤ２ΔＣ３１と称することとする。
【００２４】
得られたＧＡＤ２ΔＣ３１を大腸菌プラスミドに組み込み、その塩基配列を確認した。プラスミドは始めＳｐｈＩで切断してＴ４ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化後にＮｃｏＩで切断した。このＤＮＡ断片は、植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３０２（ＣＡＭＢＩＡ社製、オーストラリア）をＮｃｏＩ／ＰｌｍＩ切断することにより、内生の緑色蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ断片を取り除いてから、同じ位置に組み込んだ。
【００２５】
そして、イネグルテリン遺伝子（ＧｌｕＢ−１）のプロモーター領域２．３ｋｂ（非特許文献２）をＸｂａＩ／ＮｃｏＩで切り出し、上記ベクターを同一の制限酵素で処理することにより内生のカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターと置換した。本発明の一つの特徴は３５Ｓプロモーターでなく、ＧｌｕＢ−１プロモーターを用いたことにある。これは、本願発明者の検討の結果、汎用される３５Ｓプロモーターを用いた形質転換イネでは、不稔という不具合があったためである。すなわち、本発明の一つの特徴は、この遺伝子カセットを有する発現ベクターであるといえる。
【００２６】
このようにして作製した植物発現ベクターを、以降では適宜pCAMBIA GluB-1::GADΔC31と称することとする。なお、図１にこのベクター構築までの流れを示した。なお、本実施の形態では、ＧｌｕＢ−１プロモーターの下流に、人工的な配列を介さずＧＡＤ２ΔＣ３１を直接連結させている。
【００２７】
＜発現ベクターのアグロバクテリウム株への導入＞
作製したベクターをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウム株ＥＨＡ１０５へ導入した（非特許文献３参照）。バクテリア懸濁液は１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン，０．５％酵母エキス，０．５％ＮａＣｌ，１．５％寒天）を用い、２８℃で２日間培養した。形成されたコロニーは滅菌ループでかき取り、上と同じ濃度のカナマイシンを含むＡＢ培地（非特許文献４参照）に接種し、２８℃で２〜３日間培養した。
【００２８】
＜イネ玄米の２Ｎ６培地でのカルス誘導＞
イネ品種「キタアケ」の種籾を脱穀し、約５０粒の玄米を、２倍希釈したブリーチ（花王製）を用いて３０分間滅菌処理した。その後、玄米を滅菌水により５回洗浄し、２Ｎ６カルス誘導培地（非特許文献４参照）に置床した。これを、グロースチャンバー内（２８℃，明：暗＝１６時間：８時間）で２〜３週間培養し、胚盤由来のカルスを形成させた。
【００２９】
＜アグロバクテリウムを介したイネカルス細胞の形質転換＞
アグロバクテリウムを用いたイネの形質転換をおこなった。その方法、または、形質転換に際して使用する各種試薬は、通常の方法ないし試薬であるが、たとえば、イネに関して汎用される非特許文献４に開示の方法ないし試薬を用いることができる。
【００３０】
目的の発現ベクターを運ぶアグロバクテリウムをＮ６ＣＯ液体培地に懸濁した。これに対して直径２〜３ｍｍに増殖したカルスを適量入れた。カルスを取り出し、滅菌した濾紙の上で余分な水分を除いた後にＮ６ＣＯ寒天培地に静置し、２３℃、３日間暗所で培養した。
【００３１】
菌が充分に増殖したカルスを取り出し、除菌剤を含むＮ６ＣＯ液体培地でカルスを振とうさせながら洗浄した。この操作は５回繰り返した。カルスは滅菌濾紙上で余分な水分を除き、ハイグロマイシンを含むＮ６ＳＥ培地（選抜培地）に移しグロースチャンバー内（２８℃，明：暗＝１６時間：８時間）で３〜４週間培養した。
【００３２】
＜耐性カルスの選抜と固体再生＞
ハイグロマイシン耐性のカルスをＭＳＲＥ培地（再分化培地）に移して、シュートが出現するまで培養を行った。発根したシュートは試験管内につくったホルモンフリーのＭＳ培地に移し、植物体の成長を促した。
【００３３】
＜鉢上げ＞
続いて、試験管から植物体を取り出して、根に付着した寒天を取り除き育苗用培土を入れたポットに移し、特定網室内で栽培を行い、次世代の種子（米）を収穫して各種の分析に供した。
【００３４】
＜形質転換イネ植物体の外来遺伝子組み込みの確認＞
種子（Ｔ１世代）を籾摺り後、玄米を滅菌して５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含むＭＳ寒天培地に播種した（非特許文献４参照）。約１０日後に耐性植物体の葉片を材料としてＣＴＡＢ法により全ＤＮＡを抽出した（ＤＮＡ抽出技術については、たとえば非特許文献５に開示の技術を参照できる）。選択マーカーのハイグロマイシン耐性遺伝子配列を元にして作製したプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。なお、用いたセンスプライマーを配列番号５に、アンチセンスプライマーを配列番号６に示した。
【００３５】
続いて、変性（９５℃，３０秒）→アニーリング（６０℃，３０秒）→伸長（７２℃，６０秒）を３０サイクル繰り返した。反応サンプルは２％アガロースゲル電気泳動法により分画した。
【００３６】
この結果、図２に示したように、野生型ＤＮＡではＰＣＲ増幅が観察されなかったのに対して、組換え植物から抽出したＤＮＡを鋳型として用いたものでは、いずれも予想される８００ｂｐに対応する位置に増幅産物が観察された。このことから、調査した全ての植物体は目的の遺伝子が組み込まれていることが確認できた。
【００３７】
＜ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた玄米におけるＧＡＤ２ΔＣ３１のＲＮＡレベルでの発現解析＞
形質転換植物の登熟過程で目的の遺伝子の発現が起きていることを調べるために、未熟種子（Ｔ１世代）を液体窒素下で破砕後にＲＮＡ抽出試薬セパゾールＲＮＡＩ（ナカライテスク社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡと相補プライマーを混合し、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ存在下で逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を用いてｃＤＮＡ合成を４２℃で１時間行った。なお、用いた相補プライマーを配列番号７に示した。
【００３８】
１０分の１容量のｃＤＮＡサンプルを鋳型として、プライマーセットを用いてＰＣＲを行った。用いたセンスプライマーを配列番号８に示した。アンチセンスプライマーは、配列番号７に示したものと同じものを用いた。なお、反応条件は、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（３０秒）であり、これを３５サイクル繰り返した。適量の反応サンプルを２％アガロースゲル電気泳動法により分画した。その結果、図３に示したように、コントロールとして用いた野生型種子ではＧＡＤ２が発現していないか、あるいは非常に低いレベルであるのに対して、組換え植物由来の種子では高レベルのＧＡＤ２ΔＣ３１の発現が観察された。
【００３９】
＜ウエスタン法によるタンパク質レベルでのＧＡＤ２ΔＣ３１発現解析とＧＡＢＡ分析＞
同一の形質転換植物の複数の種子（Ｔ１世代）を採取して、導入遺伝子のタンパク質レベルでの発現とＧＡＢＡ蓄積との関係を調べた。まず、玄米をマイクロチューブに入れて液体窒素で凍結破砕後に抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を加えて懸濁した。
【００４０】
遠心分離（２０，０００ｇ，２０分間，４℃）後に上澄みを新しいチューブに移した。サンプルを２等分し、一方をタンパク質分析用に、もう一方をアミノ酸分析用に用いた。タンパク質のウエスタン分析は以下のように行った。タンパク質サンプル（約１０μｇ）を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分画し、タンパク質をセミドライブロッティング装置でメンブレンに転写した。
【００４１】
ＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５，０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に５，０００倍希釈したウサギ抗ＧＡＤ２ポリクローナル抗体液にメンブレンを浸して、３０分間振とうした。ＴＢＳＴで５分間ずつ３回メンブレンを洗浄し、ＴＢＳＴで５，０００倍希釈した抗ウサギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼに浸し３０分間振とうした。メンブレンはＴＢＳＴで５分間ずつ３回洗浄し、検出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に移して平衡化した。検出バッファーで２００倍希釈したＣＳＰＤ（ロッシュ社製）でメンブレンを浸して５分間反応を行い、紫外線ランプ下で観察した。
【００４２】
一方、遊離アミノ酸を抽出するために、サンプルに対して最終濃度８％（ｖ／ｖ）になるようにトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて撹拌した。遠心分離後、上澄みを新しいチューブに移し、等量のジエチルエーテルを加えて撹拌した。遠心分離を行い、上層のジエチルエーテルを除いた。この操作をさらにもう一度繰り返した。ドラフト内で完全にジエチルエーテルを揮発させ、一部を分析に用いた。
【００４３】
アミノ酸サンプルをマイクロチューブに入れ、これに対して、１００ｍＭピロリン酸ナトリウム（ｐＨ９．０），０．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋，０．６ｍＭ  α−ケトグルタル酸，１．２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール，０．００５ユニットＧＡＢａｓｅ（シグマ社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。
【００４４】
反応後にＧＡＢＡ合成に伴う還元型補酵素ＮＡＤＰＨを紫外線照射により可視化、あるいは分光光度計（３４０ｎｍ）で定量分析した。この結果を図４に示す。図から明らかなように、玄米中に目的の酵素タンパク質ＧＡＤ２ΔＣ３１が高度に蓄積しているものでは、ＧＡＢＡ含量も同様に高いレベルにあることが確認できた。
【００４５】
以上から、ＧＡＤ２ΔＣ３１遺伝子の種子中での過剰発現の結果、細胞内でＧＡＤ酵素活性の上昇が引き起こされ、ＧＡＢＡの高濃度蓄積がもたらされることが確認できた。
【００４６】
＜玄米中の遊離アミノ酸の分析＞
次に、玄米中の各種遊離アミノ酸の含量を定量するために、ＴＣＡ法で抽出したアミノ酸サンプルを自動アミノ酸分析装置（日本電子社製ＪＬＣ−３００）にかけて定量分析を行った。この結果を図５に示す。図５−１のチャートに示すように、組換え玄米（Ｔ１世代）では野生型玄米に比べ、驚くべきことにＧＡＢＡのみならず多くの種類のアミノ酸でその含量が増加していることが判明した。図５−２は野生型玄米と幾つかの組換え玄米（Ｔ１世代）のＧＡＢＡとタンパク質性のアミノ酸含量を定量しまとめたものである。ＧＡＢＡの蓄積度が高いものほど、全体的にアミノ酸含量が高まる傾向にあることが確認できた。
【００４７】
なお、この結果はＴ１世代であり、ばらつきが多いものの、必須アミノ酸では、２倍か１４倍もの含量増が認められた。特に、リシンは、穀物中の含量増が望まれているアミノ酸の一種であり、チャートでは、少なくとも４倍増、多い系統では１４倍増となっている。また、遊離アミノ酸の総量が３０倍程度も増えており、これは、一つの遺伝子を操作したことからは想定できない、多面的な効果を引き起こしたものと考えられる。
【００４８】
＜特異抗体を用いた、組換え玄米中でのＧＡＤ２ΔＣ３１タンパク質とＧＡＢＡの免疫組織化学的検出＞
種子中での導入遺伝子産物とそれにより作り出されたＧＡＢＡの局在を調べるために、免疫組織化学的な手法を用いた検出を行った。なお、実施にあたっては、非特許文献６に開示されている手法に主に基づいて行った。
【００４９】
まず、一晩水に浸した種子をメスで縦方向に２分割して、３％スキムミルクを含むＴＢＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で３時間以上ブロッキングした。一次抗体として、ウサギ抗ＧＡＤ２ポリクローナル抗体、あるいはウサギ抗ＧＡＢＡモノクローナル抗体を、１％スキムミルクを含むＴＢＳで２００倍希釈して用いた。
【００５０】
一晩反応させた後に、ＴＢＳＴで１５分間３回洗浄した。二次抗体として、ＴＢＳＴで２，０００倍に希釈した抗ウサギＩｇＧ−アルカリフォスファターゼを用い２時間反応させた。検出反応はWestern Blue Stabilized Substrate for Alkaline Phosphatase（プロメガ社製）を用いて行い、実体顕微鏡を用いて染色の様子を観察した。図６は実体顕微鏡で得られた画像である。図に示したように、ＧＡＤ２とＧＡＢＡに対するいずれの特異抗体を用いた場合でも、組換え玄米ではこれらの局在を示す青い染色が胚乳組織において認められた。
【００５１】
＜玄米の各種成分の分析＞
遊離アミノ酸以外の玄米中の各種成分分析をおこなうために、Ｔ３世代の玄米の化学成分分析を行った。その結果を図７に示した。水分と可溶無機窒素物（主にデンプン）を除き、ビタミン類および各種ミネラルはいずれの分析項目ともに組換え玄米が野生型を上回る値であった。その上昇率は１．３倍〜２．５倍であり、ＧＡＤの直接の影響があるとは考えられない各種項目が著しく上昇していることが確認できた。
【００５２】
特に、ミネラル分では、カリウムが２倍以上増えているため、ＧＡＢＡに加え血圧抑制作用が期待できる。また、ビタミンＢ１は糖質を分解する酵素を助け、ビタミンＢ６はタンパク質の代謝を促し、ビタミンＥは過酸化脂質がつくられるのを防ぐため、これらが約２倍に増えていることも、好適に人体に影響を及ぼすこと期待できる。
【００５３】
すなわち、図７の結果も図５の結果も全く想定外であり、これらの数値は、有意に上昇したとしてもせいぜい数項目について１．５倍程度までであると考えられるため、本発明の発現ベクターは、単にＧＡＢＡの増加をもたらすのみならず、細胞内の代謝経路の活性化を引き起こすベクターであるといえる。
【００５４】
＜Ｔ２世代とＴ３世代の組換えイネ系統に関してのＧＡＢＡ含量の分析＞
ＧＡＢＡの蓄積について遺伝的に安定した系統を開発するために、組換えイネ系統の当代（Ｔ０世代）の自家受粉によって得られた種子（Ｔ１世代）の自殖によるＴ２世代の種子１２粒ずつをＧＡＢａｓｅを用いた方法で分析した。
【００５５】
その結果、図８Ａに示すように、多くの系統で野生型や発芽玄米に比べて、高いＧＡＢＡ蓄積が確認された。これらの中からバラツキの少ない系統を選抜し、さらに世代を進めてＴ３世代におけるＧＡＢＡ分析を行った。図８Ｂに示したように、Ｔ３世代でも、野生型と同程度の玄米重量を持ちながら（小粒化することなく）、ＧＡＢＡ含量が発芽玄米の２〜９倍のものが得られた。換言すれば、本発明の組換えイネ系統株は、世代の更新によっても稔性が維持されており、かつ、玄米重量も従来品種と同程度であるので、収量も保証された品種開発を可能とする。
【００５６】
＜玄米とその精白米でのＧＡＢＡ蓄積の比較分析＞
組換えイネから得られた玄米で胚乳組織にＧＡＢＡが蓄積していることをさらに検証するために、玄米（Ｔ３世代）を小型精米器（ケット科学社製）にかけて精白米にし、玄米とその精白米を粉砕してＴＣＡ法により遊離アミノ酸を抽出し、ＧＡＢａｓｅを用いた間接法によりＧＡＢＡ含量を測定した。その結果を図９に示す。図示したように、野生型では精米処理によりＧＡＢＡ含量が５分の１以下に低下したのに対して、組換えイネでは玄米とその精白米でのＧＡＢＡ含量はほとんど差が認められず、かつ、驚くほど多量に精白米自体（可食部である胚乳組織）にＧＡＢＡが含有していることが確認できた。
【００５７】
すなわち、系統によって異なるが、白米中のＧＡＢＡ含有量は少なくとも３０ｍｇ／１００ｇであり、多いものでは６０ｍｇ／１００ｇまで上昇した。野生型の白米が多くても０．５ｍｇ／１００ｇであるため、６０倍以上上昇することが確認できた。なお、野生型の玄米では２．９ｍｇ／１００ｇであるため、これと比較しても１０倍以上上昇することが確認できた。なお、この結果は、図６に示した結果と一致する。なお、本結果は、形質的にある程度安定化したＴ３世代における評価であるので、品種固定された場合であっても、同様の結果を期待できる。
【００５８】
＜高血圧ラットを用いた臨床試験＞
特定網室で試験栽培・収穫された組換えイネ系統の玄米（Ｔ３世代）を脱穀後に籾摺り機にかけて玄米にした。玄米はブレンダーを用いて粉砕し、マウス・ラット用精製飼料ＡＩＮ−９３Ｇ（オリエンタル酵母社製）をベースにして、これに含まれる４０％コーンスターチを同量比の玄米粉と配合変更することで特注飼料を作製した。
【００５９】
組換え玄米の効果を調べるための臨床試験は以下のように行った。株式会社日本チャールズリバー社より購入した、９週齢のオスの本態性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ／ＮＣｒｌＣｒｌｊ）を普通食にて１週間馴化後に、８匹ずつ２群に分けて、Ａ群には野生型玄米粉の添加飼料を、Ｂ群には組換え玄米粉の添加試料を、Ｃ群には野生型玄米粉に発芽玄米と同程度となるように精製ＧＡＢＡを添加した添加試料を、それぞれ自由摂餌させて、食餌実験の開始前と１週間毎に５週目まで体重と血圧を測定した。
【００６０】
その結果、５週目では、Ａ群は平均血圧が２３５ｍｍＨｇであり、Ｂ，Ｃ群はともに２２０ｍｍＨｇ以下となり、有意な血圧降下作用が確認できた。このほか、血液生化学的には、Ａ群に比較してＢ群では、総コレステロール、中性脂肪、ＧＯＴ、ＧＰＴの低下が確認された。
【００６１】
＜他の形質転換イネ植物体の作成および評価＞
次に、上記「キタアケ」と同様にして、イネ品種「日本晴」に対して、形質転換イネを作出した。
Ｔ４世代における精白米の遊離アミノ酸含有量を自動アミノ酸分析装置により分析した結果を図１０に示す。ＧＡＢＡに関しては野生型に比し３〜３０倍の含有量の上昇が見られた。また、キタアケの結果と同様、ＧＡＢＡの蓄積度が高いものほど、全体的にアミノ酸含量が高まる傾向にあることが確認できた。
【００６２】
次に、ＧＡＢＡ含有量の多いこのＴ４世代の（４７−５２）系統と（７８−８７）系統に関し、遊離アミノ酸以外の白米中各種成分分析を行った結果を図１１に示す。ビタミン類および各種ミネラルはいずれの分析項目ともに組換え米が野生型を上回る値であった。ここでも、ＧＡＤ高発現の直接の影響があるとは考えられない各種項目が著しく上昇していることが確認できた。
【００６３】
キタアケに導入した結果（図７）と同様に、特に、ミネラル分では、カリウムが２倍以上増えているため、ＧＡＢＡに加え血圧抑制作用が期待できる。また、ビタミンＢ１は糖質を分解する酵素を助け、ビタミンＢ６はタンパク質の代謝を促し、ビタミンＥは過酸化脂質がつくられるのを防ぐため、これらが約２倍に増えていることも、好適に人体に影響を及ぼすこと期待できる。
【００６４】
＜高血圧ラットへの経口投与試験＞
次に、高血圧ラットであるＳＨＲ／Ｉｚｍへ、（４７−５２）系統の白米をすり潰した餌を一日一回5週間与えて、血圧変化を観察した。ＳＨＲ／Ｉｚｍは、一般に５，６週齢から高血圧の傾向が現れ始め、おおよそ１１週齢あたりで高血圧状態への移行が完了する。評価に際しては９週齢から６匹ずつ３グループに分け、
・標準餌＋すり潰した通常精白米投与（コントロール群）
・標準餌＋個体１ｋｇに対してＧＡＢＡ量換算で０．１ｍｇの投与となるようにすり潰した（４７−５２）系統の白米投与
・標準餌＋個体１ｋｇに対してＧＡＢＡ量換算で０．５ｍｇの投与となるようにすり潰した（４７−５２）系統の白米投与
で評価した。結果を図１２に示す。図示したように、コントロール群とＧＡＢＡ量が少ない群とは有意差は見られなかったが、ＧＡＢＡ量が多い群では、高血圧状態への移行抑制が確認できた。なお、３群とも、体重差は見られなかった。
【００６５】
次に、この（４７−５２）系統の組換え白米と野生型（日本晴）白米とを、かつ脳卒中易発症高血圧ラット（ＳＨＲＳＰ）へ経口投与した場合の血圧の経時変化を観察した。図１３に結果を示す。図から明らかなように投与後次第に血圧降下が観測され、８時間で最も血圧が下がり２４時間では略通常の高血圧状態に戻ることが確認できた。なお、投与量は、生体１ｋｇに対して０．５ｍｇのＧＡＢＡとなるような白米量とした。
【００６６】
図１２、図１３に示した結果から、組換え白米には、確かに白米摂取による血圧降下作用があることが分かった。
【００６７】
＜水浸漬処理によるＧＡＢＡ含有量の変化＞
ＧＡＢＡは、グルタミン酸がＧＡＤおよび補酵素ピリドキサルリン酸 (ＰＬＰ) の介在のもと、脱炭酸反応によって生成される。また、玄米は浸漬処理により発芽玄米としてＧＡＢＡ強化米として流通している。そこで、組み換えない日本晴（ＷｉｌｄＴｙｐｅ：ＷＴ）と（４７−５２）系統とを用いて、
・水浸漬するだけの群（ｗ／ｏ）
・グルタミン酸（Ｇｌｕ）添加＋水浸漬の群
・補酵素ＰＬＰ添加＋水浸漬の群
・グルタミン酸（Ｇｌｕ）添加＋補酵素ＰＬＰ添加＋水浸漬の群
でＧＡＢＡの含有量変化を観測した。結果を図１４に示す。図示したように、Ｇｌｕ＋ＰＬＰの両方を添加したものは、組み換えないものも組み換えたものも上昇率が大きいが、組換え体は上昇率および絶対量が極めて大きなことを確認した。ＰＬＰはビタミンであるので、たとえば、本発明の白米は、炊き込み御飯に用いたり、α化して非常食等への加工に適しているといえる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明は、生活習慣病患者の食事療法や中高年者以上の常用食として用いることができる。また、本発明のベクターを用いて、機能性成分強化米を開発することができる。ここで、機能性成分強化米とは、必須アミノ酸、および／または、ビタミン、および／または、ミネラルが、野生型ないし既存品種に比べて増強されている米をいう。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明にかかる植物発現ベクターpCAMBIA GluB-1::GAD2ΔC31の構築方法を示す工程図である。
【図２】Ｔ１世代の植物体における外来遺伝子の組み込みの確認をＰＣＲ法によって行った結果を示す電気泳動図である。
【図３】Ｔ１世代の未熟種子におけるＧＡＤ２ΔＣ３１遺伝子の転写レベルでの発現をＲＴ−ＰＣＲによって確認した電気泳動図である。
【図４】Ｔ１世代の玄米から抽出した、ＧＡＢＡ含量の分析の蛍光図とＧＡＤ２ΔＣ３１タンパク質のウエスタン解析の結果を示す図である。
【図５−１】Ｔ１世代の玄米から抽出した遊離アミノ酸の自動アミノ酸分析装置を用いて分析したチャートである。
【図５−２】野生型玄米と組換え玄米のアミノ酸分析の結果を比較して表にまとめたものである。
【図６】抗ＧＡＤ２抗体と抗ＧＡＢＡ抗体を用いて組換え玄米におけるＧＡＤ２ΔＣ３１タンパク質とＧＡＢＡの局在を免疫組織化学的手法によって明らかにした図である。
【図７】野生型玄米と組換え玄米に含まれる各種成分を定量分析した結果をもとめた表である。
【図８】後代（Ｔ２世代とＴ３世代）での玄米のＧＡＢＡ分析を行った結果である。
【図９】玄米とその精白米でのＧＡＢＡ含有量を調べて比較した図である。
【図１０】組換え日本晴のＴ４世代における精白米の遊離アミノ酸含有量を自動アミノ酸分析装置により分析した結果を示した図である。
【図１１】遊離アミノ酸以外の白米中の各種成分分析を行った結果である。
【図１２】高血圧ラットＳＨＲ／ＩｚｍへＧＡＢＡ強化米（白米）を経口投与した場合の血圧の長期変化を示した図である。
【図１３】ラットＳＨＲＳＰへＧＡＢＡ強化米（白米）を経口投与した場合の血圧の２４時間の変化の様子を示した図である。
【図１４】水浸漬とＧＡＢＡの変化を添加物を変えて測定した図である。なお、なお、自動アミノ酸分析装置を用いた精密な定量評価でないため、絶対値としては図１０と相違する。
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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