(57)【要約】【課題】Pim-1蛋白の機能を阻害し，腫瘍血管新生を阻害して抗がん活性を発揮する癌の予防剤・治療剤の提供、antisense DNAやshort interfering RNAを用いてPim-1産生抑制を介した癌の予防・治療剤の提供、ユビキチン・プロテアソームによる蛋白分解系の活性化によるPim-1蛋白分解の亢進を介する癌の予防・治療剤の提供、およびPim-1産生を抑制することにより、癌を予防・治療するための癌の予防・治療剤のスクリーニング方法の提供、を目的とする。【解決手段】低酸素下でほぼすべての固型癌細胞中に発現亢進するするタンパク質（セリン／スレオニンキナーゼPim-1）を見出し、さらにその蛋白がユビキチン・プロテアソーム系にて分解されていることを見出し、さらにdominant negative Pim-1によって腫瘍血管新生が抑制されることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３で表されるセリン／スレオニンキナーゼPim-1を阻害して癌の予防・治療に用いるPim-1のN-terminalポリペプチドを除去したDominant negative Piom-1およびPim-1発現を阻害する配列番号：１１−１３で表されるanti-sense DNAと配列番号：５−１０で表されるshort interference RNA。
【請求項２】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1の抗アポトーシス阻害作用，および腫瘍血管申請作用を阻害することによって癌の予防・治療に用いられるセリン／スレオニンキナーゼPim-1のN-terminal部分の1-81ポリペプチドを除去した短縮型ポリペプチドDominant negative Piom-1（配列番号：４）およびPim-1発現を阻害する配列番号：１１−１３で表されるanti-sense DNAと配列番号：５−１０で表されるshort interference RNA。
【請求項３】
Pim-1のN-terminalポリペプチドを除去したDominant negative Piom-1をコードする遺伝子配列（配列番号：３）をプラスミド型発現ベクターに組み込んだnaked DNA。
【請求項４】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1の抗アポトーシス阻害作用，および腫瘍血管新生作用を阻害することによって癌の予防・治療に用いられるセリン／スレオニンキナーゼPim-1のN-terminal部分の1-81ポリペプチドを除去した短縮型ポリペプチドDominant negative Piom-1をコードする遺伝子配列（配列番号：３）を組み込んだプラスミド型発現ベクターに組み込んだnaked DNA。
【請求項５】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1の蛋白発現を阻害する配列番号：１１−１３で表されるanti-sense DNAと配列番号：５−１０で表されるshort interference RNAによる固型癌の予防・治療剤。
【請求項６】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1の蛋白発現を阻害する配列番号：１１−１３で表されるanti-sense DNAと配列番号：５−１０で表されるshort interference RNAによる腫瘍血管新生阻害を介する固型癌の予防・治療剤。
【請求項７】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1遺伝子の転写を制御する転写因子の阻害物質，Pim-1蛋白の分解に関与するheat shock protein，ユビキチン・プロテアソーム分解系の阻害物質によるPim-1蛋白の作用を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項８】
Pim-1蛋白の腫瘍血管新生作用を阻害する血管内皮細胞上の受容体との相互作用を阻害するペプチドおよび阻害物質，血管新生にいたる信号伝達を阻害する化合物又はその塩を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項９】
癌が膵臓癌である、請求項５，６，７および８に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項１０】
Pim-1蛋白の作用を阻害する化合物によるセリン／スレオニンキナーゼPim-1蛋白の発現を阻害し，腫瘍血管新生阻害作用を有する，セリン／スレオニンキナーゼPim-1の蛋白発現を阻害するanti-sense DNA，short  interference RNA，セリン／スレオニンキナーゼPim-1遺伝子の転写を制御する転写因子の阻害物質，Pim-1蛋白の分解に関与するheat shock protein，ユビキチン・プロテアソーム分解系の阻害物質と癌化学療法剤を含有してなる固形癌予防、治療剤。
【請求項１１】
Pim-1蛋白の作用を阻害する化合物によるセリン／スレオニンキナーゼPim-1蛋白の発現を阻害し，腫瘍血管新生阻害作用を有する，セリン／スレオニンキナーゼPim-1の蛋白発現を阻害するanti-sense DNA，short interference RNA，セリン／スレオニンキナーゼPim-1遺伝子の転写を制御する転写因子の阻害物質，Pim-1蛋白の分解に関与するheat shock protein，ユビキチン・プロテアソーム分解系の阻害物質と癌化学療法剤を併用してなる固形癌予防、治療方法。
【請求項１２】
癌が膵臓癌である、請求項１０に記載の癌の予防・治療剤。
【請求項１３】
癌が膵臓癌である、請求項１１に記載の癌の予防・治療方法。
【請求項１４】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1のプロモーター領域をレポーター発現ベクターにつないだ、Pim-1発現の阻害物質探索を用いる癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１５】
セリン／スレオニンキナーゼPim-1のプロモーター領域をレポーター発現ベクターにつないだ、Pim-1蛋白発現の阻害物質探索を用いて血管新生阻害作用を有する物質を探索する方法を用いた癌の予防・治療剤のスクリーニング方法。
【請求項１６】
請求項１４及び１５に記載のスクリーニング方法に用いるキット。
【請求項１７】
請求項１６に記載のスクリーニング用キットを用いて得られる癌の予防・治療剤。
【請求項１８】
癌が膵臓癌である、請求項１６に記載のスクリーニング用キットを用いて得られる癌の予防・治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療・予防剤に関し、更に詳細には、抗癌剤が効かなくなった癌細胞や固形癌に対しても有効な癌の治療・予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、癌による死亡例は心疾患についで第2位を占める重要な原因となっている。癌の治療は通常手術療法，放射線療法，化学療法，免疫療法，温熱療法などによって行われている。これらの癌治療法は，すべての癌細胞を除去するか死に至らしめることを通じて達成されると考えられている。手術療法が不可能と判断された場合には，放射線療法や化学療法などが選択される。現在化学療法に用いられている抗癌剤としては多くの種類のものが知られている。しかしながら臨床的に用いられている抗癌剤の多くが固型癌に対しては多くの問題点を抱えている。いったんは効果のあった抗癌剤が効かなくなるという抗癌剤耐性癌細胞が出現したり、最初から固型癌に効きにくいという点が指摘されている。従来より酸素分圧の低い癌ほど抗癌剤が効きにくいことが報告されているが，最近癌内部が低酸素状態であることが，固型癌が抗癌剤に効きにくい原因と考えられている。
【０００３】
進行性の癌においては、癌細胞内部の増殖速度が周囲の正常細胞よりも速いため、新しく生成された血管の供給が足りず、血液の供給が不十分となり、低酸素状態になると考えられる。例えば、非特許文献１〜６には、低酸素状態にある癌細胞が、高い酸素状態にある癌細胞よりも、化学療法、放射線療法に対して耐性を有しており、低酸素状態が、固形癌細胞において薬剤耐性を誘導することが開示されている。
【０００４】
一方、セリン／スレオニンキナーゼであるPim-1（アミノ酸配列／配列番号：１、塩基配列／配列番号：２）は、最初はマウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）によって引き起こされるＴ細胞リンパ腫内において白血病ウイルスの挿入によってしばしば活性化される遺伝子として同定されたセリン／スレオニンキナーゼである（非特許文献７）。また、細胞質内のPim-1が種々の造血細胞内においてアポトーシスを阻害するための因子として機能することが報告されている（非特許文献８）。しかしながら固型癌におけるPim-1の機能については知られていない。
【０００５】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Teicher, B.A. Hypoxia and drug resistance. Cancer Metastasis Rev., 13:139-168, 1994
【非特許文献２】Brown, J.M. & Giaccia, A.J. The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy. Cancer Res., 58:1408-1416, 1998
【非特許文献３】Brown, J.M. Exploiting the hypoxic cancer cell: mechanisms and therapeutic strategies. Mol. Med. Today, 6:157-162, 2000
【非特許文献４】Luk, C.K., Veinot-Drebot, L., Tjan, E. & Tannock, I.F. Effect of transient hypoxia on sensitivity to doxorubicin in human and murine cell lines. J Natl. Cancer Inst., 82:684-692, 1990
【非特許文献５】Sakata, K., Kwok, T.T., Murphy, B.J., Laderoute, K.R., Gordon, G.R., Sutherland, R.M. Hypoxia-induced drug resistance: comparison to P-glycoprotein-associated drug resistance. Br. J Cancer, 64:809-814, 1991
【非特許文献６】Sanna, K. & Rofstad, E.K. Hypoxia-induced resistance to doxorubicin and methotrexate in human melanoma cell lines in vitro. Int. J Cancer, 58:258-262, 1994
【非特許文献７】Cuypers, H.T., Selten, G., Quint, W., Zijlstra, M., Maandag, E.R., Boelens, W., van Wezenbeek, P., Melief, C., Berns, A. Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis: integration of proviruses in a distinct chromosomal region. Cell, 37:141-150, 1984
【非特許文献８】Selten, G., Cuypers, H.T. & Berns, A. Proviral activation of the putative oncogene Pim-1 in MuLV induced T-cell lymphomas. EMBO J, 4:1793-1798, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明においては、Pim-1蛋白の機能を阻害し，腫瘍血管新生を阻害して抗がん活性を発揮する癌の予防剤・治療剤を提供することを目的とする。また， antisense DNAやshort interfering RNAを用いてPim-1産生抑制を介した癌の予防・治療剤を提供する。また、ユビキチン・プロテアソームによる蛋白分解系の活性化によるPim-1蛋白分解の亢進を介する癌の予防・治療剤を提供する。また、本発明は、Pim-1産生を抑制することにより、癌を予防・治療するための癌の予防・治療剤のスクリーニング方法等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、低酸素下でほぼすべての固型癌細胞中に発現亢進するするタンパク質（セリン／スレオニンキナーゼPim-1）を見出し、さらにその蛋白がユビキチン・プロテアソーム系にて分解されていることを見出し、さらにdominant negative Pim-1によって腫瘍血管新生が抑制されることを見出し，この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００８】
本発明は上記知見に基づいてなされたものであり、癌の予防・治療剤となるセリン／スレオニンキナーゼPim-1の部分ペプチド又はその塩（以下、本明細書において、「dominant negative Pim-1」ともいう）を提供する。また，セリン／スレオニンキナーゼPim-1の部分ペプチド又はその塩をプラスミドベクターに組み込んだ発現ベクターであるnaked DNAを提供する。また，Pim-1産生抑制を介した癌の予防・治療剤となるantisense DNAやshort  interfering RNAを提供する。また、heat shock  protein，ユビキチン・プロテアソームなどの蛋白分解系の活性化によるPim-1蛋白分解の亢進を解するPim-1蛋白発現低下やPim-1中和抗体と癌化学療法剤を含有してなる固形癌予防、治療剤を提供する。またPim-1産生抑制予防・治療剤のスクリーニング方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、Pim-1産生抑制予防・治療剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼPim-1のプロモーター活性を用いることを特徴とする、アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼPim-1のプロモーター活性を含有してなるアポトーシス誘導剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、アポトーシス誘導効果をもつ配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼPim-1もしくはその部分ペプチド又はその塩に対する抗体を含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼPim-1もしくはその部分ペプチド又はその塩を用いることを特徴とする、抗癌剤増強剤のスクリーニング方法を提供する。
また、本発明は、セリン／スレオニンキナーゼPim-1もしくはその部分ペプチド又はその塩を含有してなる抗癌剤増強剤のスクリーニング用キットを提供する。
また、本発明は、上記スクリーニング方法又はスクリーニング用キットを用いて得られる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、抗癌剤増強剤として働く配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、以下の（ａ）及び（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターを提供する。
また、本発明は、上記発現ベクターを保持する宿主細胞を提供する。
また、本発明は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収する工程を含む、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩の製造方法を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は組換ベクターを含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
また、本発明は、PIｍ−１蛋白産生抑制を介した癌の予防・治療剤として働く配列番号：１１−１３で代表されるPim-1蛋白産生抑制につながるアンチセンスDNAや、配列番号：５−１０で代表されるshort interfering RNAを提供する。
また、本発明は、アポトーシス誘導剤として働く上記アンチセンスDNAやshort interfering RNAを提供する。
また、本発明は、抗癌剤増強剤として働く上記アンチセンスDNAやshort interfering RNAを提供する。
また、本発明は、プロテアソーム阻害剤がPIｍ−１蛋白発現を誘導することから、プロテアソームなどの蛋白分解系が蛋白発現に重要であることが予想されるが、heat shock proteinやユビキチン・プロテアソーム系等の蛋白分解系の活性化やPim-１中和抗体と化学療法剤を含有してなる癌の予防・治療剤を提供する。
また、本発明は、heat shock proteinやユビキチン・プロテアソーム系等の蛋白分解系の活性化やPim-１中和抗体と化学療法剤を併用する癌の予防・治療法を提供する。
また、本発明は、heat shock proteinやユビキチン・プロテアソーム系等の蛋白分解系の活性化やPim-１中和抗体と化学療法剤を含有してなるアポトーシス誘導剤を提供する。
また、本発明は、heat shock proteinやユビキチン・プロテアソーム系等の蛋白分解系の活性化やPim-１中和抗体と化学療法剤を含有してなる抗癌剤増強剤を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
Ｐｉｍ−１タンパク質、又はＰｉｍ−１遺伝子の機能を阻害することにより、癌の治療、アポトーシス誘導、抗癌剤増強効果を発揮することが可能であり、従って、ドミナントネガティブＰｉｍ−１及びＰｉｍ−１の機能や蛋白発現をを阻害する化合物は癌の治療等に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明について説明する。
本発明において、「セリン／スレオニンキナーゼPim-1」（以下、本明細書において、「Pim-1」ともいう）とはセリン／スレオニンキナーゼ活性を有するポリペプチドである。また、Pim-1は、マウス白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）によって引き起こされたＴ細胞リンパ腫内でＭｕＬＶの挿入によって活性化される遺伝子として同定された（Cuypers, H.T., Selten, G., Quint, W., Zijlstra, M., Maandag, E.R., Boelens, W., van Wezenbeek, P., Melief, C., Berns, A. Murine leukemia virus-induced T-cell lymphomagenesis: integration of proviruses in a distinct chromosomal region. Cell, 37:141-150, 1984）。
Pim-1の活性を阻害する化合物は、アポトーシスを誘導する薬剤の候補となり、癌の治療・予防への応用、抗癌剤の増強剤としての応用が考えられる。
【００１２】
本発明の癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤は、Pim-1の部分ペプチド又はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる（配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドと同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列よりなるポリペプチド）が挙げられる。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を有するＰｉｍ−１のキナーゼ活性ドメインを欠失したポリペプチドであり、配列番号：１の１〜８０番目のアミノ酸残基を欠失したポリペプチドである。配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、キナーゼ活性ドメインを欠失したポリペプチドであり、このポリペプチドが存在すると、Pim-1の活性が阻害され、その結果、このポリペプチドは癌治療・予防剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤として用いることができる。
【００１３】
また、Pim-1の活性を阻害する化合物としては、Pim-1をコードする遺伝子、すなわち配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡ（以下、本明細書においてshort  interfering RNAともいう）（配列番号：５−１０）、アンチセンスヌクレオチドが挙げられる（配列番号：１１−１３）。配列は代表例を列挙しており，配列は異なっていてもPim-1発現を阻害するshort  interfering RNAとアンチセンスを含む。
【００１４】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一なポリペプチドは、合成ポリペプチドであってもよい。
【００１５】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
【００１６】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドとしては、例えば、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば、１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質、配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１又は２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜３０個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するペプチド、又はそれらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質等も含まれる。上記のアミノ酸の挿入、置換、欠失がなされている場合、その挿入、置換、欠失の位置は、とくに限定されない。
【００１７】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ-)、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。また、エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル等の炭素数が１〜６個のアルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどの炭素数が３〜８個のシクロアルキル基、フェニル、α−ナフチル等の炭素数が６〜１２個のアリール基、ベンジル、フェネチル等のフェニル−アルキル基、α−ナフチルメチル等のα−ナフチル−アルキル基、炭素数が７〜１４個のアラルキル基、ピバロイルオキシメチル基等が挙げられる。配列番号：１で表わされるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものであってもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が挙げられる。さらに、配列番号：３で表わされるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、生体内で切断されて生成されるＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基等の炭素数が１〜６個のアルカノイル基等の炭素数が１〜６個のアシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質などでもよい。
【００１８】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、塩の形態であってもよく、このような塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩が挙げられる。本発明で用いられるポリペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞又は組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできる。また、タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：4で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、公知のペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸等を用いて抽出を行ない、得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
【００１９】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、公知のペプチド合成法によって合成することもできる。ペプチド合成については、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂等を挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらの塩を取得する。上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
【００２０】
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２１】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化等によって保護することができる。セリンの水酸基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（炭素数が１〜６個）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される置換基等を用いることができる。また、エーテル化に適する置換基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチル等が用いられる。ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃ等が用いられる。
【００２２】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕等を用いることができる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが挙げられる。保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素等の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジン等による塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元等を用いることが可能である。このような酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤を添加することが有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上述した１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によって除去することできる。
【００２３】
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化は公知の置換基又は公知の手段から適宜選択しうる。タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２４】
本発明で用いられるＰｉｍ−１の部分ペプチドまたはそれらの塩は、公知のペプチド合成法に従って製造することができる。又は、本発明で用いられるＰｉｍ−１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。
【００２５】
また、上述したＰｉｍ−１を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。
【００２６】
また、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドは、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上述した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上述した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡ等が挙げられる。ライブラリーに用いられるベクターとしては、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等が用いられる。また、上述した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
【００２７】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号：４で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有するＤＮＡであれば何れのものであってもよい。
【００２８】
配列番号：４で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：４で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法又はそれに準じる方法に従って行うことができる。例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法等に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合には、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が１９〜４０ｍＭ、好ましくは１９〜２０ｍＭで、温度が５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が１９ｍＭで温度が６５℃の場合が最も好ましい。
【００２９】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅してもよく、又は適当なベクターに組み込んだＤＮＡを配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）２nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、MutanTM-superExpress Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LAPCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
【００３０】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド、例えば、配列番号：４で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有する組換ベクターは、上記ポリヌクレオチド断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することによって製造することができる。ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８またはｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５またはｐＣ１９４）、酵母由来のプラスミド（例えばｐＳＨ１９またはｐＳＨ１５）、λファージ等のバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルス等のウイルス等の動物ウイルスの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等が用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター、ｌｐｐプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、araBADプロモーター等が、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、penPプロモーター、XYLプロモーター、HWPプロモーター、CWPプロモーター等が好ましく、宿主が枯草菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が好ましく、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が好ましい。動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーター等が好ましく用いられる。また、昆虫細胞を宿主として用いる場合はポリヘドリンプロモーター、OplE2プロモーター等が用いられる。
【００３１】
組換ベクターには、所望により当該技術分野で公知の、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒgdｉと略称する場合がある）等を付加することができる。また、必要に応じて、本発明のＤＮＡにコードされたタンパク質を他のタンパク質（例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼおよびプロテインＡ）との融合タンパク質として発現させることも可能である。このような融合タンパク質は、部位特異的プロテアーゼを使用して切断し、それぞれのタンパク質に分離することができる。  上記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞等が用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１（Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６０巻，１６０(１９６８)），ＪＭ１０３（Nucleic Acids Research，９巻，３０９(１９８１)），ＪＡ２２１（Journal of Molecular Biology，１２０巻，５１７(１９７８)），ＨＢ１０１（Journal of Molecular Biology，４１巻，４５９(１９６９)）、Ｃ６００（Genetics, 39巻，４４０（１９５４）、ＤＨ５αおよびＪＭ１０９等が用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４（Gene，２４巻，２５５(１９８３)），２０７−２１〔Journal of Biochemistry，９５巻，８７(１９８４)〕およびバチルス・ブレビス等が用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Schizosaccaromyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Pichia pastoris）Ｍ７１およびハンセヌラ・ポリモーファ(Hansenula polymorpha)等が用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞等が用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）等が用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）等が用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が用いられる〔前田ら、ネイチャー（Nature），３１５巻，５９２(１９８５)〕。哺乳動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖero，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞等が用いられる。  また、必要に応じて、宿主細胞に適したシグナル配列をコードするポリヌクレオチドを、dominant negative Pim-1をコードするポリヌクレオチドの５’末端側に付加してもよい。宿主細胞としてエシェリヒア属菌を用いる場合は、PhoＡ・シグナル配列、OmpＡ・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞としてバチルス属菌を用いる場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として酵母を用いる場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列等が用いられ、宿主細胞として動物細胞を用いる場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列等のシグナル配列が用いられる。このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
【００３２】
上述した宿主細胞の形質転換は、当該技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換する方法が記載されている。Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ，６９巻，２１１０(１９７２)； Gene，１７巻，１０７(１９８２)；Molecular & General Genetics，１６８巻，１１１(１９７９)；Methods in Enzymology，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）；Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ），７５巻，１９２９(１９７８)；細胞工学別冊８ 新 細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）；及び Virology，５２巻，４５６(１９７３)。
【００３３】
大腸菌等の細菌への組換ベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al.:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69:2110(1972)、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３４】
酵母を宿主とする場合は、酵母への組換ベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００３５】
動物細胞を宿主とする場合は、動物細胞への組換ベクターの導入方法は、動物細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００３６】
昆虫細胞を宿主とする場合は、昆虫細胞への組換ベクターの導入方法は、昆虫細胞にＤＮＡを導入することのできる方法であれば特に限定されず、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３７】
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法としては、例えばＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色し、次いで増幅産物を１本のバンドとして検出し、形質転換されたことを確認することができる。予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出してもよい。更に、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させた後、蛍光又は酵素反応を用いて増幅産物を確認する方法を用いることもできる。
【００３８】
配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩は、上記宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、得られた培養物からポリペプチドを回収する工程を含む。
【００３９】
具体的には、上述した宿主細胞をホモジナイズした後、酸等で抽出を行い、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせことによる公知のタンパク質の精製方法によって実施することができる。
【００４０】
得られたポリペプチドが遊離体である場合には、公知の方法によって適当な塩に変換することができる。また、塩として得られた場合には、公知の方法によって遊離体又は他の塩に変換することができる。
【００４１】
本発明の、上記配列番号：３で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする塩基配列からなるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能なｃＤＮＡであるポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含有する組換ベクターは、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、及び抗癌剤増強剤として用いることができる。
【００４２】
また、アンチセンスヌクレオチド（配列番号：１１−１３）、二本鎖ＲＮＡとしては、２１〜２３塩基対のshort interfering ＲＮＡ（配列番号：５−１０）は癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、及び抗癌剤増強剤として用いることができる。配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡは、同じ配列を有する遺伝子の発現を抑制し、従って、配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドの発現を抑制するため、Ｐｉｍ−１の発現が抑制され、Ｐｉｍ−１の活性を阻害することができる。このような二本鎖ＲＮＡとしては、２１〜２３塩基対のshort interference ＲＮＡが好ましい。二本鎖ＲＮＡの調製法としては、従来公知の方法を特に制限なく用いることができ、例えば、Silencer si RNA construction kit（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて製造することができる。
【００４３】
配列番号：２で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aaugaugaagucgaagagaucccugucuc-3'）と、配列番号：６で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aagaucucuucgacuucaucaccugucuc-3'）とからなる二本鎖ＲＮＡ、配列番号：７で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aaaucuaaugagaugcugacaccugucuc-3'）と、配列番号：８で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aaugucagcaucucauuagauccugucuc-3'）とからなる二本鎖ＲＮＡ、配列番号：９で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aaauccauggaugguucuggaccugucuc-3'）と、配列番号：１０で表わされる配列からなるポリヌクレオチド（5'-aauccagaaccauccauggauccugucuc-3'）とからなる二本鎖ＲＮＡが挙げられる。
【００４４】
例えば、癌の患者等に対して、（イ）上記ポリヌクレオチドを標的細胞内で機能し得るプロモーターの制御下においた発現ベクターを該患者に投与して生体内で本発明のポリペプチドを発現させることによって、（ロ）取り出した細胞に本発明のポリヌクレオチドを上記と同様に導入し、上記ポリペプチドを発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、上記効果を発揮させる。上記リヌクレオチドを上記目的に使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクター等の適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与してもよい。
【００４５】
実施例１に示したようにユビキチン・プロテアソームの蛋白分解系がPim-1蛋白の発現量の調節に関与しており、ユビキチン化やプロテアソーム等の蛋白分解系を活性化する化合物がPIｍ−１蛋白の消失を誘導する。またPim-1蛋白の消失が認められるheat shock protein の阻害剤であるGeldanamycinなどの蛋白分解系活性化と化学療法剤を併用する癌の治療・予防が効果的である。
【００４６】
本発明の癌の予防・治療剤のスクリーニング方法は、Pim-1のプロモーター領域（配列番号：１４）を用いることを特徴とする。具体的には、Pim-1のプロモーター領域をレポーター遺伝子の発現ベクターに連結し、これを宿主細胞に導入する。この形質転換細胞を低酸素下で被検物質と培養してレポーター活性を測定することでPim-1産生抑制物質を検出する工程を含む、方法である。
【００４７】
レポーター遺伝子としては、特に限定されないが、安定でかつ活性の定量が容易なものが好ましい。このようなレポーター遺伝子としては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ＨＩＳ３遺伝子、グリーンフルオレッセンスプロテイン（ＧＦＰ）等をコードするＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
すなわち、上述したスクリーニング方法においては、被検物質がPim-1産生を抑制する活性を有している場合、レポーター遺伝子の発現が抑制又は阻害されるので、そのレポーター遺伝子の発現を検出することにより、被検物質がPim-1産生を活性を促進又は阻害するか否かを検出することが可能となる。
【００４９】
被検物質の非存在下における活性と比較して、活性物質の存在を確認することによってスクリーニングを行う。この方法によって、アポトーシス誘導剤のスクリーニングの実施も可能である。
【００５０】
本発明のスクリーニング方法において用いられる被検試料としては、例えば、細胞抽出物、植物抽出物、精製又は粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物、遺伝子ライブラリー等が挙げられる。
【００５１】
次に、本発明のスクリーニング用キットについて説明する。
本発明のスクリーニング用キットは、Pim-1のプロモーター領域をレポーター遺伝子の発現ベクターに連結し、これを宿主細胞に導入した細胞を含有する。本発明のスクリーニング用キットは、Pim-1産生を阻害する化合物をスクリーニングするために用いられる。
【００５２】
上述した、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列よりなるポリペプチド等の、Ｐｉｍ−１の活性を阻害する化合物は、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化し、投与できる。上記ポリペプチドを癌の予防・治療、アポトーシス誘導、又は抗癌剤増強剤として使用する場合は、好ましくは９０％、更に好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上に精製されたポリペプチドを使用することが好ましい。上記ポリペプチドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、あるいはエアロゾル化して吸入剤の形で、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。
【００５３】
例えば、本発明のポリペプチドを生理学的に許容し得る担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定化剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム等の結合剤、結晶性セルロース等の賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等の膨化剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤等が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂等の液状担体を含有することができる。注射剤は、本発明のポリペプチドを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene（５０mol）adduct of hydrogenated castor oil）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００５４】
上記ポリヌクレオチドが挿入された組換ベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、温血動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等）に対して投与することができ、癌の予防・治療剤、アポトーシス誘導剤、又は抗癌剤増強剤として用いることができる。
【００５５】
上記癌治療・予防剤、抗癌剤増強剤の対象となる癌としては、例えば、膵臓癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍及び血液腫瘍等が挙げられ、また、細胞内の酸素濃度が低下している固形癌に特に有効である。
【００５６】
本発明の癌治療・予防剤、アポトーシス誘導剤、抗癌剤増強剤を用いる場合、患者に直接投与する以外に、公知の製剤学的方法によって製剤化して投与を行うことが可能である。例えば、薬理学上許容される担体又は媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤等と適宜組み合わせて製剤化して投与することができる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋肉的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【実施例】
【００５７】
以下に、実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５８】
実施例１
正常酸素分圧下において、Ｐｉｍ−１がプロテアーゼによって分解されているか否かを調べた。ＰＣＩ−４３細胞を、低酸素分圧下、及び正常酸素分圧下にて培養した。低酸素分圧下で培養した細胞については、培養前、培養開始４時間、１２時間及び２４時間経過後にサンプリングし、実施例５と同様に操作を行い、ウェスタンブロット解析を行った。また、正常酸素分圧下における培養においては、培地中にプロテアソーム阻害剤であるN-acetyl-L-leucinyl-L-leucinyl-L-norleucinal（ALLN）を５０μＭ濃度加えて培養を行った。正常酸素分圧下における培養においては、培養開始前、培養開始６時間、及び１２時間経過後にサンプリングし、ウェスタンブロット解析を行った。結果を図１に示す。図１に示すように、低酸素分圧下における培養においては、低酸素分圧に曝してからの時間経過に伴い、Ｐｉｍ−１の量が増加しており、正常酸素分圧下においても時間経過に伴いＰｉｍ−１の量が増加していた。これは、プロテアソーム阻害剤のない状況においては、Ｐｉｍ−１タンパク質が分解されていることを示す。
【００５９】
実施例２
Ｐｉｍ−１の役割りを明らかにするため、ドミナントネガティブＰｉｍ−１トランスフェクタントを確立した。Ｐｉｍ−１トランスフェクタントは、野生型Ｐｉｍ−１のキナーゼ活性ドメインを欠如したペプチド、すなわち配列番号：３で表わされるペプチドを生産するものである。
キナーゼ活性ドメインを欠失した、ドミナントネガティブＰｉｍ−１のｃＤＮＡは、ＰＣＩ−１０細胞から精製されたｍＲＮＡのＲＴ生成物から増幅し、ＰＣＲ４−ＴＯＰＯ中にクローニングした。プラスミドの配列決定は、ＡＢＩ３７７自動化配列決定装置（Applied Biosystems）を用い、DyeDeoxy Terminator kit（Perkin-Elmer）を用いて行った。クローニングされたフラグメント（Invitrogen）に結合した。なお、ＲＴ−ＰＣＲの方法を以下に簡単に説明する。
【００６０】
75mM KCl、50mM Tris-HCl(pH8.3)、3mM MgCl2、10mM ジチオスレイトール、0.5mM 各dNTP、2μM ランダムプライマー、及び1000U AMLVリバーストランスクリプターゼ(Gibco BRL)を含む反応混合物中で37℃、１時間インキュベーションすることにより、各RNA試料(5μg)からcDNAの増幅を行った。cDNAののPCR増幅は、50mM KCl、10mM Tris-HCl(pH9.0)、2.5mM MgCl2、0.1%Triton X-100、200μＭ  各dNTP、10μM  各特異的プライマー、及び１ＵのTaqポリメラーゼ（Gibco BrL）を含む反応混合物中で行った。PCRは、DNAサーマルサイクラー（Barnstead/Thermolyne）中で、35サイクル（94℃、１分、60℃、１分、72℃、２分）行った。
【００６１】
ＰＣＲプライマーとしては以下のものを用いた。
dnpim-1フォワード：5’-GTAGAATTCGCCACCATGCCTGCCTAATGGCACTCGAGTG-3’（配列番号：１５）
リバース：5’-GTACTATTTGCTGGGCCCCGGCGAC-3’（配列番号：１６）
【００６２】
得られたベクターを、ＰＣＩ−４３細胞に、リポフェクタミン（Life Technologies）を用いて発現ベクターに形質導入した。トランスフェクタントを、１，２００μｇ／ｍｌのＧ−４１８で選択した後、限界希釈法でクローニングし、ドミナントネガティブトランスフェクタントdnp3、dnp4及びdnp10を得た。次いで、トランスフェクタントを６００μｇ／ｍｌのＧ−４１８の存在下、維持した。
得られた形質転換細胞について、タンパク質の電気泳動を行った。試料の調製は、１％ＮＰ−４０ lysis buffer ( 50μM Tris PH 7.5, 150nM NaCl, 2μM EDTA, 1μM、EGTA, 50μM NaF, 1μM Na3VO4, 1μM PMSF) を用いておこなった。
コントロールとして、ベクターを形質転換したものについても行った。
【００６３】
結果を図２に示す。図２は、形質転換細胞のタンパク質電気泳動の結果である。図２に示すように、dnp3、dnp4及びdnp10は、キナーゼドメインを欠失したＰｉｍ−１の存在を表すピークが検出された。ベクターのみを形質転換したもの（ｖ３及びｖ４）については、このピークは検出されなかった。
【００６４】
実施例３
ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、Ｖ３、dnp3、dnp4及びdnp10を、それぞれ５×１０6個づつ皮下注射した。皮下注射後、３日毎に２１日目まで腫瘍の大きさを観察した。腫瘍の大きさの測定は腫瘍の大きさの測定は短径及び長径をノギスを用いて測定し、以下の計算式にて体積を算出し、腫瘍の大きさとした。
（短径）×（短径）×（長径）／
皮下注射後６日経過したマウスから腫瘍細胞を切除し、CD31陽性細胞の数を判断するために免疫組織化学染色を行った。結果を図３に示す。
【００６５】
図３において、ａはＶ３を皮下注射したマウスの腫瘍組織の抗CD31染色像であり、ｂはｄｎＰ４を皮下注射したマウスの腫瘍組織の抗CD31染色像染色像である。図３に示すように、ｖ３のCD31染色陽性細胞は認められたが、ｄｎＰ４のCD31染色陽性細胞は認められなかった。
【００６６】
実施例４
ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、膵癌細胞株BxPc3を、それぞれ５×１０6個づつ皮下注射した。皮下注射後、５日目より１４日おきに発現ベクターを大腿部筋肉内に投与し，３５日目まで腫瘍の大きさを観察した。腫瘍の大きさの測定は腫瘍の大きさの測定は短径及び長径をノギスを用いて測定し、以下の計算式にて体積を算出し、腫瘍の大きさとした。
（短径）×（短径）×（長径）／２
結果を図４に示す。図４は、各種ベクターを投与した場合の腫瘍の大きさの変化を示すグラフである。
【００６７】
図４のグラフにおいて、横軸は皮下注射後の経過日数であり、縦軸は腫瘍の大きさ（ｍｍ３）である。図４のグラフは、ＳＣＩＤマウス５匹を用いて行った実験における平均、及び標準偏差を示す。図４に示すように、ｖ３を投与した群においては、日数の経過とともに腫瘍の大きさは増加した。これに対し、ドミナントネガティブＰｉｍ−１を投与した群においては、投与後２０日目から腫瘍の大きさが減少した。このことより、ドミナントネガティブＰｉｍ−１が腫瘍形成能を欠失していることがわかる。
【００６８】
実施例５
図５はスクリーニング法を示す図である。図の上段にあるようにPim-1のプロモーター領域をルシフェラーゼなどのレポーター発言ベクター内に組み込んで細胞に発現させて，10,000個/wellにまき，被検物質を１−１０μM加えて２４時間培養する。一方下段にあるように正常細胞株２９３細胞を10,000個/wellにまき，同様に被検物質を加えて培養する。レポーター活性の低下が認められたwell内に加えた被検物質が候補物質となる。一方正常細胞に対する毒性を示した物質は候補物質から除外する。
【００６９】
以上詳述した通り、低酸素分圧下に曝された種々の癌細胞においては、Ｐｉｍ−１の量が増加しており、正常酸素分圧下においてはＰｉｍ−１は分解されていたが，蛋白分解系を阻害すると正常酸素分圧下でもＰｉｍ−１の量が増加した。ドミナントネガティブＰｉｍ−１によってＰｉｍ−１遺伝子の機能を阻害することにより、腫瘍血管新生が低下して腫瘍形成能が低下した。
【００７０】
これらのことより、Ｐｉｍ−１タンパク質、又はＰｉｍ−１遺伝子の機能を阻害することにより、癌の治療、アポトーシス誘導、抗癌剤増強効果を発揮することが可能であり、従って、ドミナントネガティブＰｉｍ−１及びＰｉｍ−１の機能や蛋白発現をを阻害する化合物は癌の治療等に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】プロテアソーム阻害剤存在下でのPim-1蛋白の発現亢進を示す写真である。
【図２】Dominant negative Pim-1導入株のDominant negative Pim-1 蛋白発現を示す写真である。
【図３】血管内皮細胞を染色した結果を示す写真である。
【図４】分泌型Dominant negative Pim-1による治療効果を示す図である。
【図５】スクリーニング法を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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