(57)【要約】      （修正有）【課題】回転膜濾過器を使用して行う血球の再循環洗浄に関し、磁気血球選択装置による血球の再循環洗浄装置を提供する。【解決手段】頂部出口ポート２と底部入口ポート１を有する、血球を再循環洗浄するためのバッグ５または貯槽；およびバッグ５を、回転膜濾過器６とともに使用して、血球を再循環洗浄する方法を提供する。この本発明の方法は、磁気血球選択器機または独立型血球洗浄装置に利用できる。【選択図】図２
2008119474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
頂部ポートと底部ポート、および頂部ポートからバッグ中に延びる半剛性のプラスチック製メッシュのチューブからなる一体の粗いフィルターを有する血球の再循環洗浄用の可撓性プラスチック製のバッグまたは貯槽。
【請求項２】
頂部ポートと底部ポート、および頂部ポートからバッグ中に延びるプラスチック製配管からなる頂部の泡トラップを有する血球の再循環洗浄用の可撓性プラスチック製のバッグまたは貯槽。
【請求項３】
頂部ポートと底部ポート、頂部ポートからバッグ中に延びて底部末端が閉鎖されている半剛性プラスチック性メッシュのチューブからなる一体の粗いフィルター、および頂部ポートからバッグ中に、前記メッシュチューブの内側に延びるプラスチック製配管からなる、頂部に位置する泡トラップを有する血球の再循環洗浄用の可撓性プラスチック製バッグ。
【請求項４】
メッシュチューブが十分剛性であるから、バッグに減圧がかかって、バッグをしぼむ場合、メッシュチューブがバッグ内に開放経路を保持して、底部ポートに入る緩衝溶液中の血球が頂部ポートまで移動できる請求項３に記載のバッグ。
【請求項５】
頂部ポートおよび底部ポートを有する再循環洗浄バッグ；緩衝溶液中の血球希釈懸濁液用の入口ポート、濾液用の第一出口ポートおよび緩衝溶液中の血球濃縮懸液用の第二出口ポートを有する回転膜濾過器；および濾液バッグ、さらに緩衝溶液バッグ用の配管を含む関連配管を含んでなる血球の再循環洗浄用使い捨てセットであって；
プラスチック製配管が再循環洗浄バッグの頂部ポートを混合領域に接続し、一方の末端に緩衝溶液バッグのスパイクカプラーを有するプラスチック製配管が同じ混合領域に接続され、その混合領域が、プラスチック製配管によって、回転膜濾過器の入口ポートに接続され、回転膜濾過器の第一出口ポートが、プラスチック製配管によって、濾液バッグの入口ポートに接続され、そして、回転膜濾過器の第二出口ポートが、プラスチック製配管によって、再循環洗浄バッグの底部ポートに接続されている使い捨てセット。
【請求項６】
再循環洗浄バッグが、頂部ポートからバッグ中に延びる半剛性プラスチック製メッシュのチューブを含んでいる請求項５に記載の使い捨てセット。
【請求項７】
再循環洗浄バッグが、頂部ポートからバッグ中に延びるプラスチック製配管からなる泡トラップを、頂部に備えている請求項５に記載の使い捨てセット。
【請求項８】
再循環洗浄バッグが、頂部ポートからバッグ内に延びかつ底部末端が閉鎖されている半剛性プラスチック製メッシュのチューブ、および頂部ポートからバッグ中に、前記メッシュチューブの内側に延びるプラスチック製配管からなる頂部に位置する泡トラップを含んでいる一体の粗いフィルターを備えている請求項５に記載の使い捨てセット。
【請求項９】
緩衝溶液中の抗体懸濁液用バッグ、緩衝液によるペプチド解放剤の溶液用バッグ、緩衝溶液中の選択された血球の懸濁液用バッグ、および緩衝溶液中の選択されなかった血球の懸濁液用バッグを含めて、磁気血球選択器機に使用するバッグ類と関連配管も含む請求項５に記載の使い捨てセット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、回転膜濾過器（spinning membrame filter) を使用して行う血球の再循環洗浄に関し、詳しくは、磁気血球選択装置（magnetic cell selection apparatus ）による血球の再循環洗浄に関する。
【０００２】
1991年７月23日付けで発行されたFischel の米国特許第5,034,135 号および1991年10月１日付けで発行されたSchoendorferの米国特許5,035,121 号は、円筒形ハウジングと同心溝つき円筒形ローターを備えた回転膜濾過器を開示している。そのローターは膜で被覆されている。その膜は、ハウジングの内壁から間隔をおいて位置している。血液は、上記膜とハウジングの間の間隙に導入される。濾液は前記膜を通過して、前記ロータの溝に入り、その溝と連通しているチューブに入り、次いで、回転膜濾過器の底部中心から外に出る。
【０００３】
濃縮された血球は前記間隙から取り出される。上記Fischel の特許の図７と８は、前記膜と、ハウジングの内壁との間に、多孔質の壁が挿置された血球洗浄器の変形を示している。血液は、前記膜と多孔質壁の間の間隙に導入され、そして、等張洗浄溶液が前記多孔質壁と、ハウジングの内壁との間の間隙に導入される。前記Schoendorferの特許の図６は、洗浄溶液を血液とともに導入することを示している。1991年10月１日に発行されたSchoendorferらの米国特許第5,035,121号は、２台の回転膜濾過器を直列または並列で使用することを開示している。洗浄溶液は上記回転膜濾過器の少なくとも一方に導入される。
【０００４】
1993年８月10日付けで発行されたDuffの米国特許第5,234,608 号は、本発明と組み合わせて使用することが好ましいタイプの回転膜濾過器を開示している。その開示によれば、血球が豊富な濃縮物が、膜と、ハウジングの内壁との間の間隙の上部から取り出され、血球の少ない血漿濾液が、回転膜濾過器の底部中心から取り出される。原料血球の懸濁液が、血球の豊富な濃縮物と混合され、前記間隙領域の下部に導入される。
【０００５】
いずれも、Schoendorferらの特許である、1987年６月23日付け発行の米国特許第4,675,106 号、1988年６月28日付け発行の米国特許第4,753,729 号および1989年３月28日付け発行の米国特許第4,816,151 号は、回転膜濾過器用の駆動機構を開示している。
【０００６】
Moubayedらの米国特許第5,536,475 号は、選択すべき血球と特異的に結合する抗体などの結合剤をコートした常磁性ビーズを用いて血球を選択するための半自動式器機を開示している。その器機は、一次容器（primary container ）に関連する一次磁石（primary magnet）と、二次容器に関連する二次磁石とを備えている。血球、液体およびビーズを、一次容器内で撹拌して、前記ビーズと選択された血球との接合体（conjugate ）を生成させる。次に、一次磁石を、一次容器に隣接した位置に移動させて、ビーズ／血球接合体を、磁気で捕獲し、次に、選択されなかった血球と液体は除去する。次に、一次磁石を、一次容器から離れた位置に移動させて、前記ビーズ／血球接合体を解放する。
【０００７】
洗浄溶液を加えて、一次容器の内容物を撹拌し、次に、第一磁石を一次容器に隣接した位置に移動させて、ビーズ／血球接合体を再び捕獲し、次いで洗浄溶液を除去する。一次磁石を一次容器から離れた位置に再び移動させて、ビーズ／血球接合体を開放させる。選択された血球をビーズから解放する薬剤を含有する液体を添加して、内容物を再び撹拌する。一次磁石を、一次容器に隣接した位置に再び移動させてビーズを捕獲する。上記解放された血球および液体を二次容器に導入する。二次容器を、二次磁石に隣接した位置に配置して、一次磁石に捕獲されなかったビーズを捕獲する。この器機は、プラスチック製配管で相互に接続された、洗浄液、血球懸濁液およびビーズ懸濁液それぞれに用いるプラスチック製バッグを備えた使い捨てセットとともに使用する。
【０００８】
Moubayedらの特許に開示された前記半自動式器機は、Baxter Healthcare Corporation が登録商標Isolex300SA で市販されている。この器機の一変型が、登録商標Isolex300iで、Baxter Healthcare Corporation が市販している。この300iは、完全に自動化されており、そして選択された血球を洗浄し、かつ選択を行う前に原料の血球から血小板を除くのにも使用する回転膜濾過器を備えている点で300SA とは異なっている。
【０００９】
1995年５月26日付けで公開されたChapman らの国際特許願公開第WO95/13837号は、登録商標Isolex300SA および登録商標Isolex300iの器機において液体を取り出すのに使われる型の蠕動ポンプアセンブリーを開示している。1995年５月26日付けで公開されたDeniega らの国際特許願公開第WO95/14142号は、登録商標Isolex300SA および登録商標Isolex300iの器機で、前記蠕動ポンプアセンブリーとともに使用される型のオルガナ  イザーフレーム（organizer frame ）を開示している。
【００１０】
そのオルガナイザーフレームは、全血から血小板を分離する機械にも使用される。Deniage は、回転膜濾過器および血小板が少ない濃縮血球用の貯槽を含む配管セットを開示している。その貯槽は、頂部ポートと底部ポートを備えている。回転膜濾過器の出口からでた濃縮血球は、貯槽に、頂部入口ポートを通じて入る。患者からの全血は、底部の入口ポートを通じて入る。
【００１１】
選択された血球の再循環洗浄は、入口ポートと出口ポートの両方を底部に備え頂部にはポートがない再循環洗浄バッグとともに回転膜濾過器を利用するIsolex300iで実施される。そのバッグは 600mlのバッグであり、入口ポートと出口ポートは約２インチ離れている。そのバッグは、約 400miで通常始まる血球懸濁液を濃縮することができた。このバッグは時々マッサージしてやると、良好に機能した。これは、バッグ中の約５×1010を超える血球を処理する唯一の方法である。
上記の米国特許および国際特許願公開公報は各々、本願に援用するものである。
【発明の開示】
【００１２】
発明の要約
本発明には、血球を再循環洗浄するのに用いる方法、バッグおよび使い捨てセットが含まれている。本発明は、磁気血球選択器機で血球を洗浄するのに使用できるが、全血または他の血球製品を洗浄するのに使用することもできる。
本発明の再循環洗浄バッグは、頂部ポートと底部ポートを有する可撓性プラスチック製バッグである。一実施態様で、半剛性プラスチックメッシュのチューブからなる一体の粗いフィルターが、頂部ポートからバッグ内中に延びている。このフィルターは、より大きな血球凝集体に対し、ゆるやかな抵抗を与える。
【００１３】
他の実施態様で、このバッグは、バッグ内に頂部ポートから延びる配管からなる泡トラップを頂部に備えている。好ましい実施態様で、このバッグは、半剛性の一体フィルターと泡トラップの両者を有し、泡トラップの配管は前記プラスチック製メッシュチューブの内側にはめこまれて、その配管のまわりに空気をためる空間を提供する。前記バッグを組み込まれたシステムに、緩衝溶液を注入するとき、バッグを減圧にする。前記フィルターは、半剛性であるから、さもないとぺしゃんこになるバッグを通って、血球が頂部ポートまで移動する開放経路を保持する。
【００１４】
本発明の方法は、可撓製プラスチック製再循環洗浄バッグと回転膜濾過器を利用する。その回転膜濾過器は、緩衝溶液中の血球希釈懸濁液用の入口ポート、濾液用の第一出口ポート、および緩衝溶液中の血球濃縮懸濁液用の第二出口ポートを備えている。本発明の再循環洗浄バッグは、頂部出口ポートと底部入口ポートを有している。その再循環洗浄バッグは、好ましくは、一体の粗いフィルターおよび泡トラップを備えている。
【００１５】
本発明の方法は、緩衝溶液中の血球懸濁液を、再循環洗浄バッグから頂部ポートを通じて取り出し、その懸濁液を追加の緩衝溶液と混合して、緩衝溶液中の血球希釈懸濁液をつくり、その希釈懸濁液を、回転膜濾過器中に入口ポートを通じて送り、緩衝溶液を含有する濾液を、回転膜濾過器から、第一出口ポートを通じて取り出し、緩衝溶液中の血球濃縮懸濁液を、回転膜濾過器から、第二出口ポートを通じて取り出し、その濃縮懸濁液を、前記バッグ中に、底部ポートを通じて送り、そして所望の量の洗浄が達成されるまで、再循環洗浄を続けることを含んでなる方法である。“残留物（residual）”の推定量に基づいて、所望量の洗浄が、いつ達成されたかを決定する方法を以下に述べる。残留物とは、減らすべき目標成分（例えば、以下に述べるような血小板、抗体など）である。
【００１６】
本発明の方法の一実施態様では、再循環洗浄バッグの頂部ポートを通じて取り出された血球懸濁液を、緩衝溶液のみならず未洗浄血球と混合した後、その希釈された懸濁液を回転膜濾過器中に送る。この実施態様の一つの側面で、未洗浄の血球は血小板を含有し、濾液は緩衝溶液中の血小板懸濁液を含有し、そして、再循環洗浄は、血球の濃縮懸濁液の血小板含有量が所望のレベルまで減少するまで続けられる。
【００１７】
本発明の方法の他の実施態様で、再循環洗浄法を開始する際に、再循環洗浄バッグに、血球に加えて、特定の血球の抗原に特異的に結合する抗体が入っており、濾液が緩衝溶液中の抗体懸濁液を含有し、そして血球の濃縮懸濁液が、所望量の過剰の未結合抗体を含有するに至るまで再循環洗浄が続けられる。
本発明の他の実施態様では、再循環洗浄法を開始する際に、再循環洗浄バッグに、磁気血球選択法で選択された血球、および選択された血球を、血球／磁気ビーズ接合体から解放させるのに使用したペプチド解放剤が入っており、濾液は緩衝溶液によるペプチド解放剤の溶液を含有し、そして血球の濃縮懸濁液のペプチド解放剤の含有量が、所望のレベルまで減少するまで再循環洗浄が続けられる。
【００１８】
本発明の使い捨てセットは、前記複数のポートを有する再循環洗浄バッグと回転膜濾過器および濾液バッグ、さらに緩衝溶液バッグ用配管を含む関連配管を含んでいる。プラスチック製配管が、再循環洗浄バッグの頂部ポートを混合領域に接続している。緩衝溶液バッグのスパイクカプラーを一方の末端に有するプラスチック製配管が同じ混合領域に接続されている。その混合領域は、プラスチック製配管によって、回転膜濾過器の入口ポートに接続されている。回転膜濾過器の第一出口ポートは、プラスチック製配管によって、濾液バッグの入口ポートに接続されている。回転膜濾過器の第二出口ポートは、プラスチック製配管によって、再循環洗浄バッグの底部ポートに接続されている。
【００１９】
また、本発明の使い捨てセットは、例えば、緩衝溶液中の抗体緩衝溶液用のバッグ、緩衝溶液によるペプチド解放剤の溶液用のバッグ、緩衝溶液中の選択されなかった血球の懸濁液用のバッグ、および洗浄剤血球用の最終製品バッグなどの、磁気血球選択器機に用いる他のバッグおよび関連配管を含んでいてもよい。未洗浄血球用バッグ（血球原料のバッグとも呼称する）および／または緩衝溶液用バッグは、前記セットに含まれていてもよいが、好ましい実施態様では、これらの部材は別個に供給される。
【００２０】
頂部と底部にポートを有し、かつ底部から頂部への流れを有する可撓性再循環洗浄バッグを使用すると、現在、Isolex300iに使用されているような、底部に入口ポートと出口ポートを有するバッグと比べて、いくつもの利点が提供される。第一に、可撓性バッグを使用すると、血球数に応じて、容積を変えることができる。頂部からの流出することは、密度の低い上澄み液を、優先的に取り出すという利点がある。これは、濃縮比を高めるのに役立つ（高い濃縮比が重要であることは、以下に考察する）。容積が大きいかまたは流量が低い場合、より大きい血球をいくらか沈降させると、出口ポートにおける血球濃度を低下させるのに役立つ。
【００２１】
そのシステムは、底部に、最高に洗浄されかつ最高に濃縮された血球を有し、頂部に、洗浄が最も少なくかつ濃縮が最低の血球を有しているという利点がある。追加の利点としては以下のことがある。すなわち、（１）正確な残留物の推定が可能になり、その結果、正確な減少量の代わりに、最適の残留物のレベルの推定が可能になる；（２）血球のより均一な処理が行われて、選択プロセスに対してより均一な生成物をもたらす；（３）洗浄中、バッグの手作業によるマッサージが不要であり、手を使用しない操作が可能になる利点である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
IsoFlow （商標）再循環洗浄バッグ
図１に、IsoFlow （商標）バッグ全体を番号５で示してある。そのバッグは例えば可撓性プラスチックで製造され、底部ポート１と頂部ポート２を備えている。半剛性のプラスチック製メッシュで製造されたチューブ３からなる一体の目の粗いフィルターが、頂部ポートからバッグ内に、バッグの底部から約0.5〜３インチ以内、好ましくは約１インチまで延びている。
【００２３】
前記メッシュチューブは、直径が約 0.5〜約 1.5インチで、好ましくは約１インチであり、そしてその下端は閉じていることが好ましい。そのチューブのメッシュ（開口）の大きさは、約80〜400 ミクロンの範囲内で、約 230ミクロンが、好ましい。そのバッグは頂部に泡トラップを有し、そのトラップは、頂部ポートに、長さが 0.5〜３インチ、好ましくは約 1.5インチの配管４を挿入することによってつくることができる。
【００２４】
製造するのに適切な材料としては、バッグ用にポリ塩化ビニル（PVC ）、メッシュチューブフィルター用にはポリエステル〔例えば、Cleartuf（登録商標）shell 〕、および配管用にPVC がある。バッグの容積は変えることができるが一般に 100〜1500miである。Isolex300iに使用するために現在設計されているように、上記バッグは容積が 400miである。上記メッシュは、底部から頂部へ容易に流動できる他の半剛性の、剛性のまたは組み合わせた構造体で代替することができる。
【００２５】
Isolex300i血球洗浄システム
図２に示す本発明の使い捨てセットは、IsoFlow バッグ５、および回転膜濾過器６と緩衝溶液が入っているバッグを接続するための配管を含む関連配管を備えている。回転膜濾過器６（時には、単に、“回転膜”または“スピナー（spinner ）”と呼ぶ）は、Duffの米国特許第5,234,608 号の図２に示す構造を有している。その膜は、公称４ミクロンのポリカーボネート製膜である。
【００２６】
緩衝溶液のバッグは図示していないが番号７で示してあり、そのバッグは、底部出口ポートを有する標準の可撓製プラスチック製バッグであり、別個に供給される。IsoFlow バッグ５の頂部ポート２は、サンプリング装置８ａを有する配管８によって、クランプマニホルド９の底部右チャネル9b（点線で示してある）に接続されている。チャネル9bは、IsoFlow バッグ５からの血球を、バッグ７からの緩衝溶液および（以下に述べる血小板分離ステップにおいて）バッグ44からの未洗浄血球と混合する混合領域である。クランプマニホルド９のチャネル９ｂは、配管10によって、回転膜濾過器６の入口ポート11に接続されている。
【００２７】
IsoFlow バッグ５の底部ポート１は、配管12によって、クランプマニホルド９の底部左チャネルに接続され、そして配管13が、クランプマニホルド９の底部左チャネルを、回転膜濾過器６の出口ポート14に接続している。配管15が緩衝溶液のバッグ７の出口ポートをクランプマニホルド16の頂部右チャネルに接続し；配管17が、クランプマニホルド16の頂部右チャネルを、クランプマニホルド１８の底部左チャネルに接続し；配管19が、クランプマニホルド18の底部左チャネルを、クランプマニホルド18の底部右チャネルに接続し；そして配管20が、クランプマニホルド18の底部右チャネルを、クランプマニホルド９の底部右チャネル9bに接続する。
【００２８】
配管15は、緩衝溶液バッグスパイクカプラー（buffer bag spike coupler）21および滅菌フィルター22に接続されている。配管23は、回転膜濾過器６の濾液出口ポート２４を、クランプマニホルド25の頂部右チャネルに接続する。配管26は、クランプマニホルド２５の頂部右チャネルを、Ｙ−コネクター27と接続する。配管28は、Ｙ−コネクター２７、濾液（廃液）バッグ30の入口ポート29に接続する。
【００２９】
配管28にクランプ31がある。配管32は、Ｙ−コネクター27をＹ−コネクター33に接続する。配管32はクランプ40を保持している。配管34は、Ｙ−コネクター33を廃液バッグ36の入口ポート35に接続する。配管37は、Ｙ−コネクター33を、廃液バッグ39の入口ポート38に接続する。配管41は、クランプマニホルド25の頂部右チャネルを、圧力変換器のプロテクター42に接続する。
【００３０】
図２には、クランプマニホルドの三つの配置構成を示してある。すべての配置構成は、クランプを通過する配管を、マニホルドの中心の平坦なプラテン（図示せず）で閉鎖できるクランプを備えている。クランプマニホルドの上部および／または低部の点線はマニホルド内のチャネルの位置を示す。クランプマニホルド45の中の点線は、底部チャネルが四つの配管すべてを接続していることを示す。クランプマニホルド９と18の中の点線は、二つの底部チャネルがあって、左チャネルが二つの右側チューブを接続し、そして右の底部チャネルが二つの右側チューブを接続することを示している。クランプマニホルド16と25の中の点線は、底部左チャネルが左側のチューブを接続し、そして頂部右チャネルが右側の管を接続することを示している。
【００３１】
図２に示す好ましい実施態様の本発明の使い捨てセットは、Isolex300iなどの磁気血球分離器機で使用するように構成された他のバッグと容器および関連配管も備えている。配管43は、血球原料バッグ（図示していないが、番号44で示す）を、クランプマニホルド45の底部チャネルと接続する。配管46は、クランプマニホルド45の底部チャネルを、クランプマニホルド18の底部左チャネル18aと接続する。チャネル18aは、バッグ７からの緩衝溶液と、バッグ44からの未洗浄血球との混合領域である。配管43は、出発血球のスパイクカプラー47に接続されている。
【００３２】
バッグ48は、Isolex300iにおいて、選択したい血球と特異的に反応する抗体に用いるバッグである。例えば、CD34+ 血球を選択したい場合、バッグ48には抗CD34抗体が入っている。バッグ48は、抗体溶液を注入するための注入部位49、および滅菌フィルター51に接続される出口ポート50を有している。配管52は、滅菌フィルター51を、クランプマニホルド45の底部チャネルに接続する。
【００３３】
バッグ53は、血球が磁気で選択された後、その血球から抗体をはずすペプチド解放剤用のバッグである。バッグ53は、ペプチドの溶液を注入するための注入サイト54aおよび滅菌フィルター55に接続される出口ポート54を有している。配管56は、滅菌フィルター55を、クランプマニホルド45の底部チャネルに接続する。
【００３４】
シリンダー５７は一次磁石分離チャンバーである。このシリンダーは、ベントフィルター59、およびバッグ48内の抗体に特異的に結合する抗体でコートされた常磁性マイクロビーズを注入するための注入サイト58を備えている。前記シリンダーは、血球懸濁液の入口および出口として働く底部ポート60を備えている。前記シリンダーは、使用中、Moubayedらの米国特許第5,536,475 号に記載されているようなロッカー機構に取り付けられている。ポート60は、配管61によって、クランプマニホルド16の底部左チャネルに接続されている。
【００３５】
そのチャネルは、配管62によって、クランプマニホルド16の頂部右チャネルに接続されている。マニホルド16の頂部右チャネルは、配管72によって、クランプマニホルド25の頂部右チャネルに接続されている。また、クランプマニホルド16の底部左チャネルは、配管63によってＹ−コネクター64にも接続され、そしてそのコネクターは、配管65によって、クランプマニホルド45の底部チャネルに接続されている。また、Ｙ−コネクター64は、配管66によって、圧力変換器プロテクター67にも接続されている。
【００３６】
バッグ68は、Moubayedらの米国特許第5,536,475 号に記載されている二次磁石分離バッグである。このバッグは、入口ポート69と出口ポート70を備えている。入口ポート69は、配管71によって、クランプマニホルド18の底部左チャネルに接続されている。出口ポート70は、配管73によって、クランプマニホルド18の底部右チャネルに接続されている。
【００３７】
バッグ74は、選択された血球の洗浄バッグである。この洗浄バッグは二つの底部ポートを備えている。入口ポート75は、サンプリング装置77aを有する配管77によって、クランプマニホルド９の底部右チャネル9bに接続されている。出口ポート76は、配管78によって、クランプマニホルド９の底部左チャネルに接続されている。所望により、上記選択された血球の洗浄バッグの代わりに、IsoFlow バッグを使用できる。
【００３８】
バッグ79は最終製品のバッグである。このバッグは注入サイト80と入口ポート81を有している。サンプリング装置82aとクランプ83を保持する配管８２が、入口ポート81を、クランプマニホルド45の底部チャネルと接続している。
【００３９】
フレーム84は、Chapman らの国際特許願公開第WO95/13837号に記載されているような蠕動ポンプアセンブリー（図示せず）とともに使用される、Deniega らの国際特許願公開第WO95/14142号に記載されているようなオルガナイザーフレームである。配管13，15，26および46が各々、上記蠕動ポンプアセンブリーの四つのポンピングモジュールのうちの一つを通過する。
【００４０】
これらバッグの容積は、処理したい血球の容積に応じて変えることができる。市販のIsolex300i器機において、バッグ30，36および39は各々、容積が2000mlであり、バッグ48，53および79は各々、容積 150mlであり、そしてバッグ74は容積が 600miである。このシステムに使用する場合、IsoFlow バッグ５は、容積が 400miである。
【００４１】
血球の選択を開始するとき、図２に示す使い捨てセットを、Isolex300iに配置する。緩衝液が入っているバッグ７および原料血球が入っているバッグ44が取り付けられる。原料血球は、一般に、Fenwall3000CS などの血球分離装置で得られる白血球分離法による生成物である。緩衝溶液バッグは、容量が4000mlであり、そして出発容積が少なくとも3500miである。血球原料バッグは、容量が1000mlであり、そして出発容積が約 500miである。
【００４２】
配管13，15および46の、クランプマニホルドのクランプおよびポンプの適当な作動によって、緩衝溶液を、以下の諸エレメントと配管に加えて、システムすなわちIsoflow バッグ５、二次磁石パウチ68、回転膜濾過器６、濾液バッグ30、選択された血球の洗浄バッグ74、解放剤バッグ53、抗体バッグ４８、血球原料バッグ44、に充填する。充填中、流体はIsoflow バッグに加えられ、空気は、このバッグの頂部から除き、さらに流体を底部を通じて加えて、過剰の空気を、配管８を通じて廃棄物バッグ30に放出する。
【００４３】
この時点で、上記システムは、本発明の方法を使用して、血球原料のバッグ44の中の白血球分離法による生成物から、血小板を除去する準備ができている。以下の説明を行うため、クランプマニホルド45のクランプをクランプC1，C2，C3，C4と呼称し、クランプマニホルド９のクランプをC5，C6，C7，C8と呼称し、クランプマニホルド16のクランプをC9，C10，C11，C12と呼称し、クランプマニホルド18のクランプをC13，C14，C15，C16と呼称し、クランプマニホルド25のクランプをC17，C18，C19，C20と呼称し、配管46のポンプをP1（血球原料ポンプ）と呼称し、配管15のポンプをP2（緩衝溶液ポンプ）と呼称し、配管13のポンプをP3（再循環ポンプ）と呼称し、配管26のポンプをＰ４（濾液ポンプ）と呼称し、そして、回転膜濾過器６のローターをポンプP5と呼称する。
【００４４】
血球の洗浄を開始する前に、クランプC6，C8，C10，C11，C12，C14，C16およびC20を開いてポンプP2，P3，P4およびP5を作動させる。この操作によって、緩衝溶液が、バッグ７から回転膜濾過器６の入口ポート11に入り、次いで出口ポート14と24からでて、IsoFlow バッグ５の底部ポート１に入り、次に頂部ポート２からでて濾液バッグ30に入って循環する。
【００４５】
血球を再循環洗浄して血小板を除くため、クランプC1，C6，C8，C12，C14，C16およびC20を開いて、ポンプP1，P2，P3，P4およびP5を作動させる。未洗浄血球の懸濁液を、血球原料バッグ４４から、配管43を通じて取り出してクランプマニホルド45の底部チャネルに送り、次いでその底部チャネルから、配管46を通じてクランプマニホルド18の底部左チャネル18aに送り、そこで緩衝溶液と混合される。その緩衝溶液は、緩衝溶液バッグ７から配管15を通じて、クランプマニホルド16の頂部右チャネルに送られ、次いでそのチャネルから配管17を通じて、クランプマニホルド18の底部左チャネル18aに送られる。
【００４６】
その緩衝溶液中の希釈血球懸濁液は、底部左チャネル18aから、配管19を通じて、クランプマニホルド18の底部右チャネルに流入し、次いでそのチャネルから配管20を通じてクランプマニホルド９の底部右チャネル９ｂに入り、そのチャネルで、バッグ５の頂部ポート２からの追加の緩衝溶液と混合される。その緩衝溶液中の希釈血球懸濁液は、チャネル9bから配管10を通じて、回転膜濾過器６の入口ポート11に流入する。
【００４７】
血小板、少量の赤血球および緩衝溶液が、回転膜を通過し、出口ポート24からでて、配管23を通じて、クランプマニホルド25の頂部右チャネルに流入し、次いでそのチャネルからでて配管26と28を通じて濾液バッグ30に入る（クランプ３１開放、クランプ40閉鎖）（使用した公称４ミクロンの膜は、白血球分離法による生成物から、約95％の血小板を除去するが、約50％赤血球も除去する）。
【００４８】
緩衝溶液中の濃縮血球懸濁液は、回転膜濾過器の出口ポート14からでて、配管13を通じて、クランプマニホルド９の底部左チャネルに流入し、次いで配管12を通じてそのチャネルからでて、底部ポート１を通じてIsoflow バッグ５に流入する。上記プロセスが続くとき、緩衝溶液中の血球懸濁液は、Isoflow バッグ５の頂部から流出する。これらの血球は、混合領域９ｂにおいて、原料バッグ４４からの未洗浄血球と混合され、次いで回転膜濾過器６によって再循環される。再循環洗浄は、所望のレベルの血小板が除去されるまで続行される。
【００４９】
血小板を除去した後、緩衝溶液中の抗体を、Isoflow バッグ５に入っている、緩衝溶液中の血球濃縮懸濁液中に導入する。抗体溶液を、バッグ48からIsoflow バッグ５に導入するため、クランプC3，C6，C8，C14，C16およびC20を開いて、ポンプP1，P3およびP5を作動させる。その抗体と血球は、混合領域９ｂ内で混合される。次に抗体の配管を緩衝溶液で洗浄し、その間、抗体／血球懸濁液が、Isoflow バッグ５および回転膜濾過器６を通じて循環する。
【００５０】
この循環は、クランプC6，C8，C10，C11，C14，C16およびC20を開いて、ポンプP1，P2，P3およびP5を作動させることによって起こる。次に、抗体/細胞懸濁液を、Isoflow バッグ５および回転膜濾過器６を通じて循環させて、抗体と結合させることによって血球を感作する（sensitize ）。この感作は、クランプC6，C8およびC20を開き、ポンプP3と P5を作動させることによって達成できる。
【００５１】
血球を、抗体と結合させることによって感作させた後、本発明の方法を利用して洗浄し、過剰の未結合抗体を除去する。クランプC6，C8，C12，C14，C16およびC20を開いて、ポンプP2，P3，P4およびP5を作動させることによって、過剰の未結合抗体を含有する、緩衝溶液中の血球懸濁液を、Isoflow バッグ５から、頂部ポート２を通じて取り出し、クランプマニホルド９の混合領域9bに流入させる。
【００５２】
緩衝溶液は、先に述べたように、緩衝液バッグ７から、配管15、クランプマニホルド16、配管17、クランプマニホルド18（左チャネル）、配管19、クランプマニホルド18（右チャネル）および配管20を通じて、混合領域9b中に引き出され、その混合領域9bにおいて、Isoflow バッグ５からの血球懸濁液と混合されて、過剰の未結合抗体を含有する血球希釈懸濁液が生成する。この希釈懸濁液は、配管10を通じて、回転膜濾過器６の入口ポート１１に流入する。
【００５３】
緩衝溶液中に抗体を含有する濾液が、出口ポート24から、配管23、クランプマニホルド25、配管26、配管28およびポート29を通じて、濾液バッグ30中に流入する。緩衝溶液中の血球濃縮懸濁液が、回転膜濾過器６の出口ポート14から、配管13、クランプマニホルド９（底部左チャネル）、配管12および底部ポート１を通じて、Isoflow バッグ５の中に、流入する。この再循環洗浄は、血球懸濁液が所望のレベルの未結合抗体を含有するまで続行する。
【００５４】
抗体の感作および過剰の未結合抗体の除去を行った後、血球を、一次磁石分離チャンバー５７に移す。抗体をコートされた常磁性マイクロビーズを、上記血球と混合して、上記マイクロビーズと前記感作された血球との接合体を生成させ、その接合体を、磁気で、非感作血球から分離し、その非感作血球を廃棄物バッグ３６に移し、バッグ５３からのペプチド解放剤をチャンバー５７に添加して、選択された血球を解放させ、その選択された血球を、二次磁石分離バッグに移し、そのバッグ内で、残りのマイクロビーズを磁気で分離し、次いで選択された血球を、選択血球洗浄バッグ７４に移す。
【００５５】
次に、その選択された血球を、全く従来の方式で、再循環洗浄して、回転膜濾過器６を使用し過剰のペプチド解放剤を除く。所望によって、選択血球洗浄バッグはIsoflow バッグでもよく、そして、ペプチド解放剤を除去する再循環洗浄は、本発明の方法を利用して実施できる。ペプチド解放剤を除いた後、選択された血球を、最終生成物のバッグ７９に移す。
【００５６】
独立型血球洗浄システム
図３は、独立型血球洗浄装置、すなわち、Isolex300i器機の磁気血球選択機能のような血球選択機能をもっていない装置に使用するように構成された本発明の使い捨てセットを示す。
その使い捨てセットは、頂部ポート２と底部ポート１を有するIsoflow バッグ５；血球の希釈懸濁液用の入口ポート11、血球の濃縮懸濁液用の出口ポート１４および濾液用の出口ポート24を有する回転膜濾過器６；ならびに入口ポート29を有する濾液バッグ３０を具備している。
【００５７】
また、該使い捨てセットは、出口ポート81を有する洗浄済血球バッグ79、出口ポート47を有する未洗浄血球のバッグ44、および出口ポート21を有する緩衝溶液バッグ７を一つ以上備えている。Isoflow バッグ５の頂部ポート２は、配管８によって、コネクター89に接続されている。緩衝液バッグ７のポート21は、配管15によってＹ−コネクター95に接続され、そのコネクター95は、クランプC1を保持する配管20によって、コネクター89に接続されている。
【００５８】
未洗浄血球バッグのポート47は、クランプC3を保持する配管43によってＹ−コネクター93に接続され、次に、配管91によってコネクター89に接続されている。コネクター89は、バッグ44からの緩衝溶液中の未洗浄血球の混合領域として働き、バッグ５からの緩衝溶液中の血球およびバッグ７からの緩衝溶液を再循環する。コネクター89は、配管10によって、回転膜濾過器６の入口ポート11に接続されている。
【００５９】
スピナー６の濾液出口ポート24は、配管23によってＹ−コネクター94に接続され、かつ配管26によって、濾液バッグ30の入口ポート29に接続されている。コネクター95は、クランプC2を保持する配管92によって、コネクター94に接続されている。コネクター94は、配管41によって、圧力変換器90に接続されている。スピナー６の出口ポート14は、配管１３によって、Isoflow バッグ５の底部ポート１に接続されている。Ｙ−コネクター93は、クランプC4を保持する配管82によって、洗浄済血球のバッグ79の入口ポート81に接続されている。
【００６０】
再循環洗浄中、緩衝液中の血球懸濁液が、Isoflow バッグ５から、頂部ポート２を通じて取り出され配管８によって、混合領域89に流入する。緩衝溶液中の未洗浄血球が、バッグ44から、ポート47を通じて取り出され、次いで（クランプC3を開き、クランプC4を閉鎖して）配管43によってＹ−コネクター93に送られ、次いで、配管91を通じて、移送ポンプP1によって混合領域89に送られる。緩衝溶液が、バッグ７から、ポート21と配管15を通じて取り出され、緩衝溶液ポンプP2によって、コネクター95に送られる。
【００６１】
クランプC1を開くと、緩衝溶液が、配管20によって混合領域89に流入する。緩衝溶液中の血球希釈懸濁液は、混合領域89から、配管10を通じて、スピナー６の入口ポート11に流入する。緩衝溶液中の血球濃縮懸濁液が、再循環ポンプP3によって、スピナー６の出口ポート14を通り、次に配管13と入口ポート１を通じて、Isoflow バッグ５に流入する。濾液が、スピナー６の出口ポート24および配管23を通じて、コネクター94に流入し、次に、クランプC2を閉じると、配管26と入口ポート29を通じて、ポンプP4によって、濾液バッグ30に流入する。
【００６２】
再循環洗浄は、所望量の標的成分が血球から除去されるまで続けられる。次に、クランプC1，C2およびC3を閉じかつクランプC4を開き、ポンプP1の方向を逆にすると、洗浄済血球の懸濁液が、バッグ５から、配管８，91および82ならびにポート81を通じて、洗浄済血球バッグ79に流入する。次に、これらの配管、バッグおよびスピナーは、クランプC1とC3を閉じ、クランプC4とC2を開いてポンプP1とP3と直列のポンプP2で緩衝液をポンプ輸送して、スピナー、Isoflow バッグおよび配管を洗浄することによって洗浄される。
【００６３】
システムの制御
本発明の再循環洗浄法を実施する場合、濾液流量（ｆ）は一般に、約70ml／min に固定される。血球を洗浄回路内に移送中、再循環流量（ｒ）によって、一次圧力調整が（以下に述べる濃度比を利用して）行われ、その流量は14ml／min から70ml／min まで変動する。再循環段階において、再循環流量は約24〜70ml／min の範囲内である。緩衝溶液の流量（ｂ）は、０〜70ml／min の範囲内であり、最小スケールの容積を、二次圧力調整機構として維持する。回転膜濾過器のローターは、通常の処理を行っている間、最高3700RPM と最低約2340RPM で作動する。
【００６４】
Isolex300iシステムは、マイクロプロセッサを使用して自動的に制御される。これらのマイクロプロセッサは、４クランプ各々（クランプC1〜C20）の５バンク、ポンプ（P1〜P4）の１バンク、１スピナーのモーター駆動P5（回転膜濾過器６のローターの駆動部）、および磁気ビーズの分離を容易にするための、一体の磁石台（magnet carriage ）を有する容器57に対する１ロッカーアセンブリー（Moubayedらの米国特許第5,536,475 号には図示されていないが記載されている）をインターン制御（in-turn control ）する。
【００６５】
上記システムは、６重量スケール（図示せず）、２圧力変換器（図示されていないが67においてライン66におよび42においてライン41に取り付けられている）、ならびに３セットの流体と配管の検出器（図示されていないがライン61，66および41に取り付けられている）からのフィードバックを利用する。Isolex300iを使用中、バッグ44，53，48および79はそれぞれ重量スケール１，２，３および４につり下げられている。
【００６６】
緩衝溶液バッグ74と５はともに重量スケール５につり下げられている。緩衝溶液バッグ７は重量スケール５につり下げられている。緩衝溶液バッグ７は重量スケール６につり下げられている。バッグ36，39および30は、スケールにつり下げられていない。重量スケール５を用いて、Isoflow バッグが空のときの基準重量を差引くことによって、洗浄回路内の血球生成物の容積を求める。これらの重量スケールは、Isolex300mi 器機のタワーの中にある。
【００６７】
また、上記独立型血球洗浄システムは、マイクロプロセッサを使用して、自動的に作動する。これらのマイクロプロセッサは、４クランプ各々の１バンク、４ポンプの１バンクおよび１スピナーのモーター駆動部を順に制御する。このシステムは、４重量スケール、２圧力変換器および３ヒットの流体と配管の検出器からのフィードバックを必要とする。
【００６８】
血球塊（cell mass ）の大きさは、濃縮比（CR）をできるだけ増大することによって、最小限にする。CRは、回転膜濾過器に入る未洗浄でかつ未希釈の血球の容積の量／回転膜濾過器からでる洗浄済血球の容積の量の比率である。この洗浄回路には、CRを制御する四つの変数、すなわち、再循環流量（ｒ）、緩衝溶液の流量（ｂ）、血球原料の流量（ｃ）および濾液の流量（ｆ）がある。その関係は、c+b=r+f およびCR=c/r=1+(f-b)/rである。
【００６９】
Isolex300iで上記独立型システムの両者の場合、血球は自動的に濃縮・洗浄される。我々は、濃縮し、希釈し、次に再び複数回濃縮することによって、容積を、より一定に制御できることを見出した。したがって、スピナー（すなわち回転膜濾過器）によるあらゆる他の血球生成物のサイクル間で、血球の容積は希釈され、再濃縮される。行われるサイクルの数が2.5サイクル未満であると予想される場合、その希釈は停止する。希釈中、濾液ポンプP4は停止させ、緩衝溶液ポンプP2が固定流量で作動し、そして再循環ポンプP3は緩衝溶液の流量の約 110％の流量で作動する。このようにして、回転膜を洗浄することができ、かつ血球濃縮物が、ポートを通じて、より濃縮された血球で希釈される。
【００７０】
膜通過圧は、再循環ポンプＰ３を使用して濃縮比ＣＲを制御することによって調整される。濃縮比CRは、PID (Proportional/Integrative/Derivative）制御器を用いて、圧力測定値によって、目標圧力に制御される。これらの圧力測定値は、濾液ラインに接続された圧力変換器から得られ、流体に対する遠心作用について調節して、膜通過圧が得られる。バッグ容積が目標容積より小さくなると、CRはもはや制御パラメータではない。代わりに、スケール重量を緩衝溶液ポンプP2で制御して、CRはCR=c/rとして算出される。CRが与えられれば、再循環流量は、r=70/CR-1 （但しCRは≧２に制限される）として算出される。
【００７１】
濾液流量（ｆ）は、血球の処理時間を最小にするため、最大値に設定する。濾液圧は、回転膜濾過器の膜にそった血球濃度の指標である。しかし、スピナー６、緩衝溶液ポンプＰ２または再循環ポンプＰ３が基準速度まで達していない場合、濾液流量は低下させる。スピナー６、緩衝溶液ポンプまたは再循環ポンプの流量測定値／それぞれの指令流量（commanded rate）の比率が算出される。
【００７２】
次に濾液流量が、f1 =3/4 * MRR * TFR+1/4 * TFR （式中、ｆ1は、指令流量に対して、最小比率に調節された流量（ml／min ）であり、MRR は上記の最小流量比であり、TFR は目標の濾液流量（70ml／min ）である。濾液の流量は、上記の圧力誤差（Ep）が−５mmHg未満の場合、さらに低下させる。この条件に当てはまるとき、濾液流量は、f2 f1+Ep+5 に設定される（式中、ｆ2 は最終指令濾液流量であり、そして、ｆ1 は上記の最終比率に調節された濾液流量である）。希釈中、濾液流量はゼロに設定される。
【００７３】
再循環流量（ｒ）は一次調整変数である。緩衝溶液の流量（ｂ）を用いて、濃縮比CRを、１と２の値の間に調整する。緩衝溶液ポンプＰ２は、スケール重量管理制御器に対して一次調整を行う。Isoflow バッグ５の流体の容積重量が、目標値（20〜35ml）より低下すると、緩衝溶液は、約78ml／min まで指令される。この値は、濾液ポンプＰ４より約８ml／min 速い。その結果、バッグの重量が上昇する。バッグ重量が約５ml上昇すると、緩衝溶液は、濃縮比制御器に対して、もう一度二次的になり、緩衝溶液ポンプＰ２は、式：b=(70tf)/2-r*(CR-1)にしたがって調整される。
【００７４】
血球は応力によって損傷することがあるので、制御器は、回転膜濾過器のローターの回転速度を自動的に調節する。再循環流量（ｒ）が減少すると、回転膜濾過器内での血球の暴露時間ｔは以下のように増大する。すなわちt=ν(r+f）（式中ｔとνは、それぞれ回転膜濾過器内での時間と容積である）である。ｒが低いと、血球に対する応力が増大する。制御器は、ｒが低下すると、回転速度を直線的に低下させることによって、上記現象に対抗する。
【００７５】
洗浄の量は、“残留物（residual）”の推定量に基づいている。残留物は、減らすべき目標成分（例えば、血小板、抗体）を意味する。この推定は、IsoFlowバッグの混合特性によって可能になる。その推定値は、連続希釈が残留物を算出する方法と同様にして算出される。しかし、それは１秒当り数回再循環される。式は次のとおりである。
【００７６】
FSRi=FSRi-1-(Fi/(Bi+Ci)×(Ci/Vi)×FSRi-1×TA
式中、ｉ＝個別の時間間隔
FSRi＝時間ｔｉ  における出発残留物のフラクション
FSRi-1＝時間 ti-1における出発残留物のフラクション
Fi＝時間間隔 i-1〜i で測定された流量ｆ（単位：ml）で移動した濾液の容積
Bi＝時間間隔 i-1〜i で測定された流量ｂ（単位：ml）で移動した緩衝溶液の容積
Ci＝IsoFlow バッグ５からの流量、および未洗浄血球の追加流量（追加された場合）を含む時間間隔ｉで測定された流量ｅ（単位：ml）で移動した血球原料
Vi＝時間間隔ｉにおける血球生成物の容積（ml）
TA＝目標アドミタンス（Target Admittance ）
【００７７】
目標アドミタンスは、与えられた物質が、膜を通過する容易さを示す単位なしの定数（膜インピーダンスの逆数）である。血小板洗浄の場合の目標アドミタンスは、 0.5〜1.0 であり、好ましい設定値は0.7 であることが見出された。
抗体および解放剤を洗浄する場合の目標アドミタンスは、 0.7〜1.2 であり、好ましい設定値は１であることが見出された。Isolex300iでCD34+ を選択するのに利用される抗体の最適レベルは、50〜150 μｇの範囲内であることが見出された。
【００７８】
血球が回転膜を通過した平均時間の数値の推定値は、洗浄をいつ終了するかを決定するためのバッグアップとして働く。血球のサイクル数は下記式に基づいて推定される。
血球のサイクル数 Si= ∫(Rj+Fj+Bj)/Vj= ∫Cj/Vj
式中、
Rj＝時間間隔ｊで測定された流量ｒで移動した再循環容積（単位：ml）、および
血球のサイクル数Si＝血球生成物が時間間隔ｉで経験した、回転膜装置を通過するサイクル数。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、本発明の再循環洗浄バッグの好ましい実施態様を示す。以下に述べる説明では、図１に示す配置構成の再循環洗浄バッグはＩｓｏＦｌｏｗバッグと呼称されている。
【図２】図２は、Isolex300iなどの磁気血球選択装置で用いるように構成されている本発明の使い捨てセットを示す。
【図３】図３は、独立型血球洗浄装置に使用するように構成された本発明の使い捨て血球洗浄セットを示す。
【図１】
2008119474.tif 000003
【図２】
2008119474.tif 000004
【図３】
2008119474.tif 000005