(57)【要約】【課題】生体内での予期しないウイルスの増殖を安全かつ確実に制御し得る組換えＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７を提供すること。【解決手段】本発明のＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。また、本発明のＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターであって、
ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項２】
ＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターであって、
ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項３】
上記チミジンキナーゼが、アルファヘルペスウイルス亜科に属するウイルスが有するキナーゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項４】
上記チミジンキナーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項５】
上記チミジンキナーゼが、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされていることを特徴とする請求項１または２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項６】
上記Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７およびＵ８遺伝子、ならびにＵ２４およびＵ２５遺伝子が、配列番号３で示される塩基配列の第９０４１番目〜第１７４４６番目ならびに第３６２５０番目〜第３７７７５番目に存在することを特徴とする請求項１に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項７】
上記Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６およびＵ７遺伝子の一部が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする請求項１または６に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項８】
上記Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７およびＵ８遺伝子、ならびにＵ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子が、配列番号４で示される塩基配列の第１０５５８番目〜第１８４８３番目ならびに第３４７４４番目〜第３６１１８番目に存在することを特徴とする請求項２に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項９】
上記Ｕ３、Ｕ４およびＵ７遺伝子の一部が、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする請求項２または８に記載の組換えウイルスベクター。
【請求項１０】
ＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターであって、
ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項１１】
ＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターであって、
ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドによって組み換えられていることを特徴とする組換えウイルスベクター。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の組換えウイルスベクターを用いて哺乳類の細胞を形質転換する工程を包含する細胞の形質転換方法であって、
該哺乳類が、ヒト、ヒト以外の霊長類、またはＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７が感染可能な宿主であることを特徴とする細胞の形質転換方法。
【請求項１３】
上記細胞が、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞またはナチュラルキラー細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の細胞の形質転換方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の方法によって形質転換された形質転換細胞。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の組換えウイルスベクターを個体へ投与する工程を包含することを特徴とする遺伝子治療方法。
【請求項１６】
請求項１４の形質転換細胞を個体へ投与する工程を包含することを特徴とする遺伝子治療方法。
【請求項１７】
ガンシクロビル（ＧＣＶ）またはアシクロビル（ＡＣＶ）を投与することによって個体における組換えウイルスベクターの増殖を制御する工程を、さらに包含することを特徴とする請求項１５または１６に記載の遺伝子治療方法。
【請求項１８】
易感染性細胞に対するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を予防すること、および／または癌を免疫の賦活化によって治療することを特徴とする請求項１７に記載の遺伝子治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えウイルスベクターおよびその利用に関し、より詳細には、本発明は、ヘルペスウイルス科に属するＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７ウイルス由来の組換ウイルスベクター、ならびにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、分子生物学および分子遺伝学などの研究成果の蓄積、ならびに研究に用い得る機器や手法の開発によって、生命現象に関する、より多くのかつ詳細な情報を得ることが容易になってきた。
【０００３】
新たに得られた生命現象に関する情報に基づいて、医療や産業への応用を目指した研究開発が活発に行われている。例えば、遺伝子機能の解析結果に基づいて、所望の外来遺伝子を細胞や生物個体に導入するためのツールに関する研究開発がなされている。所望の外来遺伝子を細胞や生物個体に導入することによって、細胞や生物個体への有用形質導入、および細胞や生物個体における有用な遺伝子産物の産生などが可能になる。
【０００４】
細胞や生物個体へ有用形質を導入する方法によって、病気に強い植物やストレス耐性植物などを得ることができる。上記有用形質導入の動物に対する利用としては、医療への応用などを挙げることができる。特に、癌、免疫疾患および糖尿病など、遺伝子の機能の欠失または変異が病因となり得る疾患を治療するための遺伝子治療用の形質導入方法は、その開発が望まれているものの１つである。
【０００５】
従来の形質導入方法としては、たとえば、所望の外来遺伝子を含む配列を遊離ＤＮＡとして標的細胞または標的器官へ単に添加すること、標的細胞へＤＮＡが取込まれるようにデザインされた特異的タンパク質と所望の外来遺伝子との複合体を標的細胞または標的器官とインキュベーションすること、リポソームまたはその他の脂質に封入された所望の外来遺伝子を標的細胞または標的器官のインキュベーションすることなどを挙げることができる。しかし、これら従来の形質導入方法は、導入効率が低い傾向があるうえに、導入された遺伝子の発現効率が低いなどの問題がある。
【０００６】
現在、遺伝子治療用の形質導入方法としては、ベクターを用いて所望の外来遺伝子を標的細胞または標的器官へ導入する方法が一般的であり、この方法に用いるベクターは遺伝子治療用ベクターと呼ばれる。これまで、遺伝子治療用のベクターの候補となるのもが数多く開発されているが、導入効率、発現効率ならびに導入される細胞または器官に対する選択性などの観点から、ウイルスを利用したベクター（ウイルスベクター）が注目されている。
【０００７】
ウイルスベクターは、公知のベクターの中でも、外来遺伝子をタンパク質として発現し得るように細胞へ導入することが容易なベクターである。これは、ウイルスベクターが細胞への侵入、細胞におけるタンパク質の発現、ＤＮＡの複製およびさまざまな感染の態様（増殖感染、潜伏感染、不念感染を含む）などのウイルスが本来有している機構を利用して、外来遺伝子の感染細胞への導入、およびプロモーター制御下の外来遺伝子の発現を行うためである。
【０００８】
ウイルスベクターとしては、ウイルスが有する増殖に非必須な遺伝子領域を所望の外来遺伝子を用いて組み換えた組換えウイルス、および組換えウイルスベクターが挙げられる。組換えウイルスベクターは、増殖に必須な遺伝子を保持しているので、野生株と同等の宿主細胞への感染性および遺伝子を発現する機構などを有している。このため、組換えウイルスベクターは、効率的に所望の外来遺伝子を所望の細胞に導入すること、および効率的に遺伝子を発現させることができる。
【０００９】
一方で、有用な組換えウイルスベクターの構築には、副作用（病原性）を抑えること、組換え可能な領域をなるべく大きく確保すること、ウイルスの細胞に対する選択性、ならびに外来遺伝子の導入効率および発現効率の向上などさまざまな点について検討する必要がある。従来の組換えウイルスベクターの課題について、ヒトに対して実際に使用された組換えウイルスベクターを例に挙げて、以下に説明する。
【００１０】
レトロウイルスは、発癌性ウイルスであり、遺伝子治療に用いた時の発癌性が指摘されている。さらに、レトロウイルスベクターは、導入し得る遺伝子が小さいこと、および遺伝子を導入し得る細胞種に制限があることなどの問題点を有している。
【００１１】
アデノウイルスは、ウイルスベクターとしてヒトに接種した場合、強いアレルギー反応を引き起こすことによってショック死することがある。実際、アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療によって死亡した例が報告されている。さらに、アデノウイルスベクターは、血液細胞に対する遺伝子導入の効率が低いため、使用範囲が限定されてしまう。
【００１２】
アデノ随伴ウイルスは、形質導入できる遺伝子の大きさが小さい、遺伝子の発現効率が低い、およびベクターの作製が困難であるという欠点を有する。さらに、ウイルスＤＮＡが宿主のゲノムに組み込まれてしまうので、発癌性を否定することができない。
【００１３】
このように、組換えウイルスベクターに要求されるのは安全性の高さである。安全性の高い組換えウイルスベクターとして採用し得るウイルスの条件としては、病原性が低いこと、および治療法が確立されていることなどが挙げられる。病原性や治療法といった観点から、ヘルペスウイルスを用いたウイルスベクターの研究開発が行われている。
【００１４】
ヘルペスウイルス科に属するウイルスの内、ヒトを自然宿主とするヘルペスウイルスとして、現在、８種類が同定されている。ヘルペスウイルスは大型のＤＮＡウイルスであり、進化の系統樹およびゲノムの構造などに従って、α、β、γの３つの亜科に分類される。
【００１５】
αヘルペスウイルスに分類されるヒト単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ−１）は、神経細胞において潜伏感染、再活性化を起こす神経向性のウイルスである。ＨＳＶ−１は、ヒトに感染すると生涯、ウイルスゲノムが排除されることはないが、その致死性は低い。また、選択性の高い抗ヘルペス剤であるガンシクロビル（以下、ＧＣＶと称する）またはアシクロビル（以下、ＡＣＶと称する）を用いて、ウイルス増殖を抑制することができる。ＨＳＶ−１は、病原性が低いこと、ウイルス増殖を制御する手段が確立されていること、および大きなゲノムを有することなどの理由から、組換えウイルスベクターへの応用を目指して研究開発が進められている。
【００１６】
また、βヘルペスウイルスには、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ：ヒトヘルペスウイルス５、ＨＨＶ−５）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ−７）が属している。このうち、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７は、比較的大きなゲノムを有し、病原性が低いウイルスである。さらに、Ｔ細胞やマクロファージなどの血液細胞においてよく増殖すること、マクロファージにおいて潜伏感染することなどが知られている。潜伏感染期には、宿主個体において抗体が産生されないなど、免疫反応が賦活化されないので、アレルギー反応を引き起こす可能性も低くなる。
【００１７】
このような背景から、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７は遺伝子治療に用いるウイルスベクターとして好適に用いることができると考えられ、本発明者らはＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７由来の組換ウイルスベクターを作製すべく、検討を重ねた。その結果、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の増殖と潜伏感染のために必須ではなく、欠失しても増殖能および潜伏感染能を保持し得るゲノム領域を発見し、当該領域を組換えに用いることによって、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７由来の複製能および潜伏感染能を保持した組換えウイルスベクターの完成させた（特許文献１および非特許文献１を参照のこと）。
【特許文献１】ＷＯ０５／０２１７４６  Ａ１（２００５年３月１０日公開）
【非特許文献１】Ｋｏｎｄｏ  Ｋ，  Ｎｏｚａｋｉ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｄａ  Ｋ，  Ｙａｍａｎｉｓｈｉ  Ｋ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ２００３  Ｏｃｔ；７７(１９)：１０７１９−２４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
しかし、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に対する有効な治療法は確立していない。このため、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターを生物個体に感染させた際に、組換えウイルスが予期しないような増殖を起こした場合、ウイルスの増殖を抑制し得る確実な対応手段がない。
【００１９】
ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に対する有効な治療法が確立していない理由としては以下の２点が挙げられる。ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７はＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性が低いので、副作用（細胞傷害性）が生じない投与量で抗ウイルス作用を得ることができない。さらに、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の病原性が低いため、治療法の確立が早急に必要なウイルスとして認識されていなかった。
【００２０】
ＧＣＶおよびＡＣＶは、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有しているチミジンキナーゼ（ＴＫ：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ）によってリン酸化を受けて活性型になるプロドラッグである。活性型のＧＣＶおよびＡＣＶは、ＤＮＡポリメラーゼを阻害すること、およびＤＮＡ鎖の伸張を止めるターミネーターとして機能することによってウイルスＤＮＡの複製を阻害する。
【００２１】
ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７がＧＣＶおよびＡＣＶに対して感受性が低い理由として、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７がＴＫをコードする遺伝子を有してないこと、およびＴＫ以外にＧＣＶおよびＡＣＶをリン酸化し得る酵素が発現しないことが挙げられる。
【００２２】
一方、ＧＣＶおよびＡＣＶは、宿主細胞側のＤＮＡポリメラーゼの阻害剤、およびＤＮＡ鎖の伸張を止めるターミネーターとしても機能し得る。つまり、ＧＣＶおよびＡＣＶは細胞傷害性を有している。ＴＫが発現している細胞において、特に、ＧＣＶの細胞傷害性は顕著である。
【００２３】
ＧＣＶおよびＡＣＶが有する細胞傷害性を利用して、腫瘍細胞を選択的に殺傷するために、腫瘍細胞にＴＫ遺伝子を導入する研究が行われている。腫瘍細胞へのＴＫ遺伝子の導入には、例えば、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターが用いられている（Ｔａｋａｍｉｙａ  Ｙ，  Ｓｈｏｒｔ  ＭＰ，  Ｅｚｚｅｄｄｉｎｅ  ＺＤ，  Ｍｏｏｌｔｅｎ  ＦＬ，  Ｂｒｅａｋｅｆｉｅｌｄ  ＸＯ，  Ｍａｒｔｕｚａ  ＲＬ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ．  １９９２  Ｎｏｖ；３３(３)：４９３−５０３およびＷｉｌｌｓ  ＫＮ，  Ｈｕａｎｇ  ＷＭ，  Ｈａｒｒｉｓ  ＭＰ，  Ｍａｃｈｅｍｅｒ  Ｔ，  Ｍａｎｅｖａｌ  ＤＣ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  ＲＪ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １９９５  Ｓｅｐ；２(３)：１９１−７を参照のこと）。腫瘍細胞を殺傷するためには、腫瘍細胞においてＧＣＶおよびＡＣＶのリン酸化が促進されることが必要であるため、発現したＴＫの活性は高いほどよく、かつその発現量も多い方がよい。従来、ウイルスベクターを用いたＴＫ遺伝子の導入は、ＧＣＶの細胞傷害性が特定の細胞において選択的に発揮されることを期待して行われることが一般的であった。
【００２４】
これまで、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７に対して、ＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性を高めるためにＴＫ遺伝子を導入するという試みはなされていない。さらに、上記のＴＫ遺伝子を有していないウイルスにＴＫ遺伝子を導入したウイルスベクターは、ＧＣＶの細胞傷害性を高かめることについてしか検討されていない。このため、ＴＫ遺伝子の発現によって、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の増殖を効果的に抑制し得るかどうか不明であった。つまり、低濃度のＧＣＶおよびＡＣＶの投与でＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７の増殖を抑制し得るのか、ならびにＧＣＶおよびＡＣＶがＴＫにリン酸化されることによって細胞傷害性を高めることがないのかについて不明であった。
【００２５】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、生体内での予期しないウイルスの増殖を安全かつ確実に制御し得る組換えＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
上記課題を解決するために、本発明のＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００２７】
上記課題を解決するために、本発明のＨＨＶ−７由来のウイルスベクターは、ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００２８】
上記構成を有するＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７由来のウイルスベクターを用いれば、抗ヘルペスウイルス剤であるＧＣＶまたはＡＣＶを用いて２種類の該組換えウイルスベクターの生体内における増殖を抑制することができる。２種類の上記組換えウイルスベクターの増殖を抑制し得るＧＣＶまたはＡＣＶの有効濃度は、ＨＣＭＶの増殖を抑制し得るＧＣＶの濃度、またはＶＺＶの増殖を抑制し得るＡＣＶの濃度と比較して同等または当該濃度よりも低い。
【００２９】
よって、安全かつ確実に生体内における増殖を抑制し得る組換えウイルスベクターを提供し得る。
【００３０】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記チミジンキナーゼが、アルファヘルペスウイルス亜科に属するウイルスが有するキナーゼであることが好ましい。
【００３１】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記チミジンキナーゼが、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００３２】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記チミジンキナーゼは、配列番号２で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされているポリペプチドであることが好ましい。
【００３３】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７およびＵ８遺伝子、ならびにＵ２４およびＵ２５遺伝子は、配列番号３で表されるＨＨＶ−６ゲノムのヌクレオチド番号９０４１〜１７４４６ならびに３６２５０〜３７７７５に存在している。
【００３４】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６およびＵ７遺伝子の一部は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドによって組み換えられていることが好ましい。
【００３５】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７およびＵ８遺伝子、ならびにＵ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子は、配列番号４で表されるＨＨＶ−６ゲノムのヌクレオチド番号１０５５８〜１８４８３ならびに３４７４４〜３６１１８に存在している。
【００３６】
本発明の組換えウイルスベクターにおいて、上記Ｕ３、Ｕ４およびＵ７遺伝子の一部は、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチドによって組み換えられていることが好ましい。
【００３７】
本発明に係るＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００３８】
本発明に係るＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００３９】
上記構成を有するＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターは、ＴＫ遺伝子を選択マーカーとして用いることができる。よって、上記組換えウイルスベクターは、医学および生物学研究用の遺伝子導入ベクターとして用いることができる。
【００４０】
本発明に係る形質転換方法は、上記組換えウイルスベクターを用いて哺乳類の細胞を形質転換する工程を包含し、かつ該哺乳類が、ヒト、ヒト以外の霊長類、またはＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７が感染可能な宿主であってもよい。
【００４１】
本発明に係る形質転換方法において、上記細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞またはナチュラルキラー細胞であってもよい。
【００４２】
本発明に係る形質転換細胞は、上記形質転換方法によって形質転換される。
【００４３】
本発明に係る遺伝子治療方法は、上記組換えウイルスベクターを個体へ投与する工程を包含してもいてよい。
【００４４】
本発明に係る遺伝子治療方法は、上記形質転換細胞を個体へ投与する工程を包含していてもよい。
【００４５】
本発明に係る遺伝子治療方法は、ＧＣＶまたはＡＣＶを投与することによって個体における組換えウイルスベクターの増殖を制御する工程を、さらに包含してもよい。
【００４６】
本発明に係る遺伝子治療方法は、易感染性細胞に対するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を予防すること、および／または癌を免疫の賦活化によって治療する方法であってもよい。
【発明の効果】
【００４７】
本発明に係るＨＨＶ−６由来の組換えウイルスベクターは、上述の課題を解決するために、ＨＨＶ−６ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科のウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００４８】
また、本発明に係るＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターは、ＨＨＶ−７ゲノムにおけるＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７、Ｕ８、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子の一部が、ヘルペスウイルス科のウイルスが有するチミジンキナーゼをコードするポリヌクレオチドおよび外来性のポリヌクレオチドによって組み換えられている。
【００４９】
上記構成を有するＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７由来のウイルスベクターを用いることによって、抗ヘルペスウイルス剤であるＧＣＶまたはＡＣＶを用いて、２種類の該組換えウイルスベクターの生体における増殖を抑制し得る。２種類の上記組換えウイルスベクターの増殖を抑制し得るＧＣＶまたはＡＣＶの有効濃度は、生体内のＨＣＭＶまたは水痘帯状疱疹ウイルスの増殖を抑制し得ることが臨床的に実証されている濃度と同等または当該濃度よりも低い。
【００５０】
よって、組換えウイルスベクターの生体内における増殖を、安全かつ確実に抑制し得るという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
本発明は、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼをコードする遺伝子を組み込むことによって、抗ヘルペスウイルス剤（ＧＣＶおよびＡＣＶなど）に対する感受性を向上させたＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターを提供する。本発明に係る組換えウイルスベクターを用いれば、臨床的に実証されている有効濃度のＧＣＶおよびＡＣＶを感染細胞に作用させることによって組換えウイルスベクターの増殖を抑制することができるため、組換えウイルスベクターを用いた遺伝子治療の安全性を高めることができる。
【００５２】
一つの局面において、本発明は上記組換えウイルスベクターを用いて形質転換した細胞、および細胞の形質転換方法を提供する。上記組換えウイルスベクターを所望の細胞に感染させることによって形質転換した細胞を得ることができる。上記組換えウイルスベクターを用いた形質転換は、インビボで行われても、インビトロで行われてもよい。インビボで形質転換を行う場合、遺伝子治療を施すことを所望する個体内で所望の細胞を形質転換してもよく、遺伝子治療を施すことを所望する個体とは別の個体内で所望の細胞を形質転換してよい。また、形質転換した細胞を、一度生体外に取り出してもよい。
【００５３】
他の局面において、本発明は、上記組換えウイルスベクターまたは形質転換した細胞を用いた遺伝子治療方法を提供する。本発明に係る遺伝子治療方法は、組換えウイルスベクターの予期せぬ増殖を抑制するためにＧＣＶまたはＡＣＶを治療対象へ投与する工程を包含してもよい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ＨＨＶ−６」とは、ヒトヘルペスウイルス６（ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ６）のｖａｒｉａｎｔＡおよびＢを意味している。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「ＨＨＶ−７」とは、ヒトヘルペスウイルス６（ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ７）を意味している。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼ」とは、プロドラッグであるヌクレオシドアナログ（ＧＣＶおよびＡＣＶなど）を１リン酸化し得るチミジンキナーゼを意図している。
【００５７】
なお、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するチミジンキナーゼ、およびプロドラッグであるヌクレオシドアナログを１リン酸化し得るチミジンキナーゼを、特に断りがない場合、以下において単に「ＴＫ（チミジンキナーゼ）」と称し、ＴＫをコードするポリヌクレオチドを、特に断りがない場合、以下において単に「ＴＫ遺伝子」と称する。
【００５８】
上記プロドラッグであるヌクレオシドアナログとしては、ＧＣＶおよびＡＣＶの他に、ペンシクロビル、バラシクロビルなどを挙げることができ、臨床的に安全性および有効性が実証されているものであれば本発明に採用され得る。臨床的に安全性および有効性が実証されているとは、ウイルスの増殖を抑制し、かつ副作用（宿主細胞に対する傷害性）を生じないような薬剤の好ましい濃度、投与形態および剤形が経験的に確認されていることを意味している。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ウイルスベクター」とは、ウイルスが本来有する感染増殖機構を利用して、外来性の遺伝子を所望の細胞へ導入し、所望の細胞にて該遺伝子を発現させるためのウイルスであり、ゲノムに変異が導入されたウイルスを意味している。
【００６０】
ウイルスが本来有する感染増殖機構とは、細胞への侵入、遺伝子の発現、ウイルスゲノムの複製、ウイルス粒子の産生、およびウイルス粒子の細胞外への放出などである。また、細胞に感染したウイルスベクターは、感染細胞において増殖感染、潜伏感染および不念感染のいずれかの態様を示す。
【００６１】
増殖感染とは、細胞への侵入後、遺伝子の発現、ウイルスゲノムの複製、ウイルス粒子の産生、およびウイルス粒子の細胞外への放出が起こる増殖性の感染であり、溶解感染とも呼ばれる。
【００６２】
潜伏感染とは、細胞への侵入後、特定遺伝子の発現のみが観察され、ウイルスゲノムの複製が行われない感染態様を意味している。宿主の免疫系が異物として認識するためのウイルス粒子やウイルスタンパク質の産生が起こらないので、潜伏感染したウイルスのゲノムは排除されることはない。潜伏感染は、外部からの刺激を受けて再活性化することによって、増殖感染に移行し得る。
【００６３】
不念感染とは、細胞への吸着および侵入は可能であるが、遺伝子の発現、ウイルスゲノムの複製および／またはウイルス粒子の産生を正常に行うことができない不完全なウイルス粒子による感染である。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノム」とは、１つのウイルス粒子にパッケージングされているウイルスＤＮＡ全体を意味しており、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子の転写を促進するプロモーター配列、パッケージングのための切断領域など、通常野生体のウイルス粒子が有している１セットの塩基配列を意味している。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ウイルスＤＮＡ」とは、単に、ウイルス由来のＤＮＡを意味しており、その大きさ、構成、機能などを特に限定するものではない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「組換えウイルスベクター」とは、ウイルスゲノムの一部に所望のポリヌクレオチドを組み込んだウイルスであり、該所望のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを生体内の所望の細胞にて発現し得るウイルスを意味している。
【００６７】
上記「組換え」とは、ウイルスが本来有するゲノムの一部と所望のポリヌクレオチドとを置換すること、またはウイルスが本来有するゲノムに所望のポリヌクレオチドを挿入することを意味している。また、「組み込む」とは、組換えを行うことを意味している。
【００６８】
本明細書において用いる場合、「外来性の遺伝子」とは、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のゲノムが本来有していない遺伝子またはポリヌクレオチドを意味している。
【００６９】
本明細書において用いる場合、「遺伝子治療」とは、外来性の遺伝子を所望の細胞に導入することによって細胞が形質転換されることを利用した治療を意味しており、インビトロで細胞に遺伝子を導入することによって形質転換された細胞を作製し、当該細胞を生体内に投与する狭義の細胞治療や、個体の細胞へのウイルス感染によって産生される、ウイルス由来の産物（ウイルスタンパク質、ウイルスＤＮＡ、ウイルス粒子など）によって宿主細胞の機能が修飾（形質転換）されることを期待する狭義のウイルス治療をも包含する。
【００７０】
なお、本明細書において、本発明に係る配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＨＳＶ−１が有するＴＫ（以下、ＨＳＶ−１  ＴＫまたは単にＴＫと称する）と交換可能に使用され得る、本発明に係る配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、ＨＳＶ−１が有するＴＫ  遺伝子（以下、ＨＳＶ−１  ＴＫ遺伝子または単にＴＫ遺伝子と称する）と交換可能に使用され得る。
【００７１】
（Ｉ）ＴＫ遺伝子を組み込んだウイルスベクターの作製
本発明に係る、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のゲノムにＴＫ遺伝子を組み込んだウイルスベクターの作製方法について以下に説明する。
【００７２】
（Ｉ−１）本発明で用いられるＴＫ遺伝子
本発明で用いられるＴＫ遺伝子とは、ヌクレオシドアナログをリン酸化し得る酵素であって、宿主細胞においてチミジンを１リン酸化する酵素としての機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であればよい。すなわち、上記タンパク質とはＴＫである。
【００７３】
本発明で用いられるＴＫ遺伝子がコードするＴＫとしては、ヌクレオシドアナログをリン酸化し得るように、宿主細胞においてチミジンを１リン酸化する酵素としての機能を有していればよい。本発明に係るＴＫは、ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するＴＫであり、好ましくは、アルファヘルペス亜科に属するウイルスが有するＴＫであり、さらに好ましくは、ＨＳＶ−１が有するＴＫであるＵＬ２３遺伝子産物（以下、ＨＳＶ−１  ＴＫと称する）である。
【００７４】
なお、ＨＳＶ−１  ＴＫは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、ＨＳＶ−１  ＴＫ遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
【００７５】
ヘルペスウイルス科に属するウイルスが有するＴＫとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）が有するＵＬ２３遺伝子産物、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）が有するＯＲＦ３６の遺伝子産物などが挙げられる。
【００７６】
さらに、宿主細胞においてチミジンを１リン酸化する酵素としての機能を有するＴＫには以下のようなものを含む。例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、上記機能を有していれば本発明にて用いることができる。なお、上記の「配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」における「１個または数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。
【００７７】
また、上記ＴＫとしては、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、５０％以上、好ましくは６０％または７０％以上の相同性を有するタンパク質であって、かつ、宿主細胞においてチミジンを１リン酸化する酵素としての機能を有するタンパク質も含まれる。なお、ここで「相同性」とは、アミノ酸配列中に占める同じ配列の割合であり、この値が高いほど両者は近縁であるといえる。
【００７８】
すなわち、本発明に係るＴＫには、以上において例示した複数のＴＫが有するそれぞれのアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、ならびに複数のＴＫが有するそれぞれのアミノ酸配列と相同性を有し、かつ宿主細胞においてチミジンを１リン酸化する酵素としての機能を有するタンパク質が含まれる。
【００７９】
よって、本発明に係る組換えウイルスベクターの作製に用い得るＴＫ遺伝子は、遺伝暗号に基づいて、上記ＴＫのアミノ酸配列に対応するものであればよい。例えば、ヘルペスウイルス科に属するウイルスのゲノムが有するＴＫ遺伝子であり、好ましくは、アルファヘルペス亜科に属するウイルスのゲノムが有するＴＫ遺伝子であり、さらに好ましくは、ＨＳＶ−１のゲノムが有するＨＳＶ−１  ＴＫ遺伝子である。
【００８０】
アルファヘルペス亜科に属するウイルスのゲノムが有するＴＫ遺伝子としては、例えば、ＨＳＶ−２が有するＵＬ２３遺伝子、ＶＺＶのゲノムが有するＯＲＦ３６遺伝子などが挙げられる。
【００８１】
また、本発明で用いられるＴＫ遺伝子は、上記の例に限定されず、配列番号２に示される塩基配列と相同性を有する遺伝子であってもよい。具体的には、例えば、配列番号２に示される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、上記転写因子をコードする遺伝子等を挙げることができる。なお、ここでストリンジェントな条件でハイブリダイズするとは、６０℃で２×ＳＳＣ洗浄条件下にて結合することを意味する。
【００８２】
上記ハイブリダイゼーションは、従来公知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（ハイブリダイズしがたくなる）。
【００８３】
上記ＴＫ遺伝子を取得する方法は特に限定されず、従来公知の方法により、ヘルペスウイルス科に属するウイルスから単離することができる。例えば、既知のＴＫ遺伝子の塩基配列に基づき作製したプライマー対が用いられ得る。このプライマー対を用いて、ウイルスのｃＤＮＡ又はゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うこと等により上記遺伝子を得ることができる。また、上記ＴＫをコードする遺伝子は、従来公知の方法により化学合成して得ることもできる。
【００８４】
ここで、ＨＣＭＶはＴＫ遺伝子を有していないが、ＧＣＶに対する感受性が高い。ＨＣＭＶがＧＣＶに対する感受性が高いのは、ＨＣＭＶがＵＬ９７遺伝子を有しているからである。ＵＬ９７遺伝子産物が宿主細胞のヌクレオチドキナーゼ（チミジンキナーゼなど）をリン酸化することによって、該ヌクレオチドキナーゼを活性化する。活性化した上記ヌクレオチドキナーゼが、ＧＣＶを１リン酸化することが知られている。このため、ＨＣＭＶのＵＬ９７遺伝子はＴＫ遺伝子ではないが、宿主細胞においてヌクレオシドアナログの１リン酸化を引き起こす遺伝子産物をコードする遺伝子として、本発明に係るＴＫ遺伝子の代わりにＵＬ９７遺伝子を用いることができる。
【００８５】
（Ｉ−２）ＴＫ遺伝子とウイルスゲノムとの組換え
ウイルスゲノムへＴＫ遺伝子を組み込むための方法としては、ＴＫ遺伝子を組み込んだウイルスゲノムを有するウイルスベクター（以下、単に「組換えウイルスベクターと称する」）が感染細胞において、ＴＫを発現し得るようＴＫ遺伝子をウイルスゲノムに組み込む方法であれば特に限定されない。
【００８６】
ウイルスゲノムへＴＫ遺伝子を組み込むための方法としては、例えば、相同組換え法を挙げることができる。
【００８７】
相同組換え法を用いたＴＫ遺伝子とウイルスゲノムの組換えは、以下の工程：ウイルスゲノムに組み込むためのＴＫ遺伝子を含む配列を作製する工程；作製した該ＴＫ遺伝子を含む配列を挿入したベクターを作製する工程；該ベクターを細胞に導入する工程；該ベクターを導入した細胞にウイルスを感染させる工程；および組換えウイルスを選抜する工程を包含する。
【００８８】
（Ｉ−２−１）ウイルスゲノムに組み込むためのＴＫ遺伝子を含む配列を作製する工程
ウイルスゲノムに組み込むためのＴＫ遺伝子を含む配列は、該配列の両端にウイルスゲノムと相同性を有する配列と、ＴＫ遺伝子の発現を促進するプロモーターと、ＴＫをコードする遺伝子とを備えていればよいが、ウイルスの選抜を行うために、抗生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子と、該マーカー遺伝子の発現を促進するプロモーターとをさらに備えていることが好ましい。
【００８９】
上記配列の両端に配置するウイルスゲノムと相同性を有する配列は、組換えを行うウイルスゲノムの領域を挟みこむように設定すればよい。組換えを行うウイルスゲノムの領域は、欠失または組換えによってウイルスの増殖能および潜伏感染能が低下しないような領域から選択すればよい。ＨＨＶ−６のゲノムの内、組換え領域として選択し得る領域としては、例えば、増殖に非必須な遺伝子からなるＵ２−Ｕ８遺伝子クラスターまたはＵ２４−Ｕ２５遺伝子クラスターを挙げることができる。また、ＨＨＶ−７のゲノムの内、組換え領域として選択し得る領域としては、例えば、増殖に非必須な遺伝子からなるＵ２−Ｕ８遺伝子クラスターまたはＵ２４−Ｕ２５遺伝子クラスターを挙げることができる。
【００９０】
ＨＨＶ−６のゲノムにおける、上記Ｕ２−Ｕ８遺伝子クラスターはＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ５、Ｕ６、Ｕ７およびＵ８遺伝子の７つの遺伝子から構成される遺伝子クラスターであり、上記Ｕ２４−Ｕ２５遺伝子クラスターは、Ｕ２４およびＵ２５遺伝子から構成される遺伝子クラスターである。また、ＨＨＶ−７のゲノムにおける、上記Ｕ２−Ｕ８遺伝子クラスターはＵ２、Ｕ３、Ｕ４、Ｕ７およびＵ８遺伝子の５つの遺伝子から構成される遺伝子クラスターであり、上記Ｕ２４−Ｕ２５遺伝子クラスターは、Ｕ２４、Ｕ２４ａおよびＵ２５遺伝子から構成される遺伝子クラスターである。なお、ＨＨＶ−７のＵ７遺伝子は、エキソン１およびエキソン２を含んでおり、それぞれをＵ５およびＵ７と呼称することもある。
【００９１】
上記配列の両端に配置するウイルスゲノムと相同性を有する配列の塩基数は、相同組換えを起こすために十分な塩基数であれば特に制限されないが、例えば、５００ｂｐ、好ましくは７００ｂｐ、さらに好ましくは１０００ｂｐである。
【００９２】
ＴＫ遺伝子の発現を促進するプロモーターとしては、組換えウイルスベクターが感染した細胞において、ＴＫ遺伝子の発現を促進し得るプロモーターであれば特に制限されないが、ウイルス由来のプロモーターが好ましく、ヘルペスウイルス由来のプロモーターがより好ましく、ＨＣＭＶの前初期遺伝子の発現を促進するＣＭＶプロモーターが特に好ましい。
【００９３】
組換えウイルスの選抜のためのマーカー遺伝子としては、相同組換えを起こしたウイルスを選抜する指標になり得るものであれば特に制限されず、選抜方法として採用した方法に応じて適宜変更すればよい。上記マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質耐性遺伝子、酵素反応を利用して発色させることができるＬａｃＺ遺伝子、特定の励起光によって蛍光を発する蛍光タンパク質をコードする遺伝子を採用し得る。
【００９４】
上記マーカー遺伝子の発現を促進するプロモーターとしては、ＴＫ遺伝子の発現を促進するプロモーターと異なるプロモーターを採用することが好ましいが、マーカー遺伝子の発現を促進し得るプロモーターであれば特に制限されない。上記マーカー遺伝子の発現を促進するプロモーターとしては、例えば、ウイルス由来のプロモーターが好ましく、ＣＭＶプロモーターと組み合わせる場合、Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ（ＳＶ４０）のＳＶ４０プロモーターが好ましい。
【００９５】
ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のゲノムにおける、組換えによって増殖能および潜伏感染能が低下しないような領域の選択、および該領域に含まれる遺伝子の詳細については、特許文献１および非特許文献１を参照のこと。
【００９６】
（Ｉ−２−２）ＴＫ遺伝子を含む配列を挿入したベクターを作製する工程
上記ＴＫ遺伝子を含む配列を作製する工程において作製したＴＫ遺伝子を含む配列を挿入するためのベクターとしては、従来公知の種々のベクターを採用し得る。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等が用いられ得、組換えを起こさせるウイルスおよびベクターを導入する細胞に応じて適宜選択され得る。例えば、ｐＵＣ１８およびｐＨＳＧ３９８などのｐＵＣ系ベクターが挙げられ得る。特に、ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７の組換えを臍帯血Ｔ細胞など免疫系細胞において行う場合、クローニングに用いることができる制限酵素部位を多く有しているＬＩＴＭＵＳ  ２８ｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いることが好ましい。
【００９７】
上記ベクターへのＴＫ遺伝子を含む配列の挿入は、制限酵素処理とリガーゼを用いる方法など、従来公知の種々の方法を用いて行うことができる。
【００９８】
（Ｉ−２−３）ベクターを細胞に導入する工程
ＴＫ遺伝子を含む配列を挿入したベクターを細胞に導入する方法としては、細胞にベクターを導入し得る方法であれば特に制限されず、従来公知の方法から、用いる細胞に応じて適宜選択すればよい。採用し得る従来公知の方法としては、エレクトロポレーション法、リポフェクトアミンなどの脂質にベクターを封入して細胞に導入する方法、ジメチルスルフォキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を用いた細胞へのＤＮＡの導入方法などを挙げることができる。
【００９９】
（Ｉ−２−４）ベクターを導入した細胞にウイルスを感染させる工程
ベクターを導入した細胞にウイルスを感染させる方法は、ベクターを導入した細胞とウイルスとを共培養することによってウイルスを細胞に吸着させる方法であればよく、感染させる細胞に応じて従来公知の方法から適宜選択すればよい。ＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７を細胞に感染させる方法としては、免疫系の培養細胞など浮遊細胞への感染させる場合、遠心法などを採用することができる。
【０１００】
（Ｉ−２−５）組換えウイルスを選抜する工程
組換えウイルスを選抜する方法は、ＴＫ遺伝子を含む配列に含まれるマーカー遺伝子に応じて適宜選択すればよい。例えば、マーカー遺伝子として抗生物質に対する耐性遺伝子を用いた場合、組換えウイルスを含むウイルスを該抗生物質存在下において増殖させればよい。本発明に用い得る抗生物質としては、ピューロマイシン（ｐｙｕｒｏｍｙｃｉｎｅ）、Ｇ４１８（ネオマイシン、ｎｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）などを挙げることができる。さらに、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質を発現する遺伝子を選択した場合、組換えウイルスを含むウイルスを細胞に感染させることによってプラークを形成させた後、該蛍光タンパク質に応じた励起光を照射して、蛍光を発するプラークを選抜すればよい。上記蛍光タンパク質を発現する遺伝子は、従来公知の遺伝子から選択すればよく、例えば、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）やＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの蛍光タンパク質を発現する遺伝子を用いることができる。
【０１０１】
採用した組換えウイルスを選抜する方法を繰り返し行うことによって、ＴＫ遺伝子がゲノムに組み込まれた組換えウイルスのみを得ることができる。
【０１０２】
なお、組換えウイルスを選抜する工程の後に、選抜したウイルスのゲノムにＴＫ遺伝子が組み込まれているかを確認する工程を含んでいてもよい。ＴＫ遺伝子がウイルスのゲノムに組み込まれているかを確認する方法としては、例えば、ＰＣＲ法による確認やシークエンサーを用いた確認方法などを挙げることができる。
【０１０３】
以上に説明した方法を用いることによって、ＨＨＶ−６およびＨＨＶ−７のゲノムにＴＫ遺伝子を組み込んだウイルスベクター（以下において、それぞれＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７と称する）を作製することができる。なお、上記のウイルスベクターの作製方法に対して、必要に応じて適工程を追加すること、および／または工程を変更することは、当業者であれば容易に想到し得る。
【０１０４】
本実施例においては、相同組換え法を用いたウイルスベクターの作製方法について説明したが、所望の遺伝子とウイルスゲノムの所望の領域との組換えを行うことができる方法であれば、本発明に係るＴＫ組換えウイルスベクターの作製方法として採用し得る。
【０１０５】
（ＩＩ）ＴＫ遺伝子を組み込んだウイルスベクターの有用性および利用
（Ｉ）において作製したＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７を遺伝子治療用のベクターとして用いれば、ＧＣＶおよびＡＣＶといった臨床において実際に使用されている抗ヘルペス剤を用いて生体内におけるウイルスベクターの予期せぬ増殖を抑制することができる。後述の実施例で示すように、ＴＫ組換えＨＨＶ−６およびＴＫ組換えＨＨＶ−７のＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性は、ＨＣＭＶのＧＣＶに対する感受性、およびＶＺＶのＡＣＶに対する感受性と比較して同等以上である。すなわち、本発明に係る組換えウイルスベクターは、安全性の高い遺伝子治療用のベクターとして用いることができる。
【０１０６】
ＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７を用いれば、所望の外来性のポリヌクレオチドを所望の細胞に導入することができる。
【０１０７】
上記外来性のポリヌクレオチドはＤＮＡおよび／またはＲＮＡであり得る。上記外来性のポリヌクレオチドとしては、ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  （ＢＡＣ）、リボザイムおよびｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡなどを挙げることができる。上記外来性のポリヌクレオチドを本発明に係るウイルスベクターに組み込む方法については、ＴＫ遺伝子とウイルスゲノムとの組換えと同様に行うことができるので、繰り返し説明しない（（Ｉ）および特許文献１を参照のこと）。また、上記外来性のポリヌクレオチドとして、サイトカイン、免疫学的補助刺激分子、シグナル伝達分子、酵素または化学誘引物質をコードしているポリヌクレオチドを用いてもよい。
【０１０８】
ＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７を用いて外来性の遺伝子を導入し得る細胞としては哺乳類を挙げることができ、哺乳類のなかでも、ヒト、ヒト以外の霊長類、およびＨＨＶ−６もしくはＨＨＶ−７が感染可能な宿主を挙げることができる。ＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７を用いて外来性の遺伝子を導入し得る細胞の種類は、血液細胞、免疫細胞、上皮細胞などであり、具体的には、Ｔ細胞、マクロファージ、末梢血単核球細胞、血液幹細胞、肝細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、グリア細胞、アストロサイト、ＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞などである。特に、本発明に係る組換えウイルスベクターは血液細胞や免疫細胞などに対して導入効率が高い。血液細胞や免疫細胞などに対して高い導入効率を有する他のウイルスベクターは、生体内において重大な副作用を引き起こすものが多い。本発明に係る組換えウイルスベクターは、ＧＣＶまたはＡＣＶなどの抗ヘルペス剤を用いた増殖の制御が可能であるため、安全性が高く、かつ血液細胞や免疫細胞などに対する導入効率の高いウイルスベクターであるといえる。
【０１０９】
ＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７を用いて所望の外来性のポリヌクレオチドが導入された細胞は、組み込んだポリヌクレオチドに含まれる遺伝子などの発現によって形質転換される。すなわち、本発明に係る組換えウイルスベクターを用いて、形質転換細胞を作製することができる。また、本発明に係る組換えウイルスベクターを用いて作製した形質転換細胞を、生体内に投与することによって遺伝子治療を行うことができる。
【０１１０】
さらに、本発明の組換えウイルスベクターは、感染細胞においてＴＫ遺伝子を発現することができるので、（Ｉ−２−５）において説明したマーカー遺伝子としてＴＫ遺伝子を用いることができる。例えば、ＴＫ組換えＨＨＶ−６またはＴＫ組換えＨＨＶ−７のゲノムの内、ＴＫ遺伝子を含む領域と所望のポリヌクレオチドとの組換えを行う。組換えウイルスを選抜するために、得られたウイルスをＧＣＶまたはＡＣＶ存在下において増殖させる。組換えが起こったウイルスは、ＧＣＶまたはＡＣＶに対する感受性が低いため、組換えが起こらなかったウイルスと比較して増殖が早い。つまり、本発明に係る組換えウイルスベクターは、組換えウイルスの選抜を容易に行うことができるベクターとして利用し得る。
【０１１１】
なお、外来性のポリヌクレオチドを組み込んだ組換えウイルスはＧＣＶまたはＡＣＶに対する感受性が低いため、遺伝子治療用に用いるには安全性に問題がある。このため、ＴＫ遺伝子を選抜用のマーカー遺伝子として用いた場合、医学および生物学における研究用の遺伝子導入用ベクターして用いることが好ましい。
【０１１２】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。
【０１１３】
また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１１４】
〔実施例１：ＴＫ発現細胞の作製〕
ＧＣＶまたはＡＣＶ存在下におけるヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）および７（ＨＨＶ−７）の増殖能に対するＨＳＶ−１  ＴＫの影響を調べるために、ＨＳＶ−１  ＴＫ（以下、ＴＫと称する）を恒常的に発現する細胞を以下に示す手順によって作製した。
【０１１５】
ＨＳＶ−１  ＴＫ遺伝子（以下、ＴＫ遺伝子と称する）を含むポリヌクレオチドをＰＣＲ法によって増幅するために表１に示すプライマーを設計した。
【０１１６】
【表１】
2008113578.tif 000002
【０１１７】
プライマーＦｏｒｗａｒｄおよびプライマーＲｅｖｅｒｓｅを用い、ＨＳＶ−１の臨床分離株（ＭＨ−ＴＫ（＋））のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いた。以下の条件にてＰＣＲを行った：変性反応９４℃で２分間；変性反応９４℃で３０秒間、アニール反応６０℃で３０秒間、および伸長反応６８℃で２分間を２５サイクル；伸張反応６８℃で１分間。Ｂｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏ  Ｉで処理することによって、ＰＣＲの増幅産物をプライマーＦｏｒｗａｒｄおよびプライマーＲｅｖｅｒｓｅに含まれる制限酵素サイトで切断した。制限酵素で処理した上記増幅産物をＬＩＴＭＵＳ  ２８ｉに挿入した。ＬＩＴＭＵＳ  ２８ｉに挿入した上記増幅産物をシークエンサーにかけることによって、該増幅産物に含まれる塩基配列がＴＫ遺伝子（配列番号２）の塩基配列と一致していることを確認した。
【０１１８】
ＴＫ遺伝子を含むポリヌクレオチドを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、同様に制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩを用いて消化した。ＴＫ遺伝子を含むポリヌクレオチドおよびｐＱＣＸＩＰの制限酵素処理断片を混合し、市販のリガーゼを用いてライゲーション反応を行った。これによって、ｐＱＣＸＩＰへＴＫ遺伝子を挿入した。
【０１１９】
ＴＫ遺伝子を挿入したｐＱＣＸＩＰを、リン酸カルシウム法によってレトロウイルスベクターのパッケージング細胞であるＧＰ２（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）へ導入した。このＧＰ２細胞から、ＴＫ遺伝子を挿入したｐＱＣＸＩＰがパッケージングされた感染性粒子を得た。
【０１２０】
ＴＫ遺伝子を挿入したｐＱＣＸＩＰがパッケージングされた感染性粒子を、ＭＴ−４細胞（ＨＨＶ−６の標的細胞）とＳｕｐＴ１細胞（ＨＨＶ−７の標的細胞）とのそれぞれに感染させた。上記感染性粒子に感染したＭＴ−４細胞およびＳｕｐＴ１細胞のそれぞれを、１０％ウシ胎児血清およびｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  (５ｎｇ／ｍｌ)を含むＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて培養した。ＴＫ遺伝子を挿入したｐＱＣＸＩＰは、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を有しているので、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎを含む培地を用いることによって、ＴＫ遺伝子を挿入したｐＱＣＸＩＰがパッケージングされた感染性粒子に感染した細胞を選択的に培養することができる。これによって、ＴＫを恒常的に発現するＭＴ−４細胞およびＳｕｐＴ１細胞を得た。
【０１２１】
〔実施例２：ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−６の作製〕
ＨＨＶ−６にＴＫ遺伝子を組み込むことによって、ＨＨＶ−６のＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性の変化を調べるために、ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−６を作製した。
【０１２２】
ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−６の作製の手順について図１を参照して以下に説明する。図１はＨＨＶ−６のゲノム構造を示す模式図であり（上段）、相同組換えに用いたＴＫ遺伝子を含む組換え配列の構造を示す模式図である（下段）。
【０１２３】
図１に示すように、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列と相同組換えを起こさせるＨＨＶ−６ゲノムの遺伝子領域として、Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域を選択した。この選択は、上記Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域の欠失または組換えを行ったＨＨＶ−６の変異体が、野生体と同様の増殖能および感染の態様（潜伏感染が確立すること、および復帰感染を起こすことなど）を有しているという報告に基づいている（特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。
【０１２４】
（ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドの構築）
上記Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域と組換えを起こさせるためのＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドの構造およびその構築方法について説明する。
【０１２５】
ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を、ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットの両端に上記Ｕ２遺伝子領域の約１ｋｂｐの断片とＵ８遺伝子の約１ｋｂｐの断片とを挿入することによって作製した。ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットは、以下の構成：ヒトサイトメガロウイルスの主要な前初期エンハンサー−プロモーター（ＭＩＥＰ）；ＭＩＥＰの制御下にある、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＥＧＦＰ）（配列番号８）とＴＫ（配列番号１）との融合タンパク質を発現する遺伝子（ＥＧＦＰ−ＴＫ遺伝子）；ＳＶ４０初期プロモーター；およびＳＶ４０初期プロモーターの制御下にあるピューロマイシン耐性遺伝子、を有する遺伝子カセットである。
【０１２６】
ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットの内、ＭＩＥＰおよびＥＧＦＰ−ＴＫ遺伝子の作製にはｐＥＧＦＰ−Ｃ２（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を用いた。実施例１と同様にＴＫ遺伝子を含むポリヌクレオチドをＰＣＲによって増幅した後、ＴＫ遺伝子をベクターにクローニングした。ＴＫ遺伝子をクローニングしたベクターをＢｇｌ  ＩＩおよびＸｈｏ  Ｉで処理した。Ｂｇｌ  ＩＩおよびＳａｌ  Ｉで処理した、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１のＥＧＦＰ遺伝子（配列番号７）の３’末端側にＴＫ遺伝子を挿入した。これによって、Ｎ末端側にＥＧＦＰを、Ｃ末端側にＴＫをコードするＥＧＦＰ−ＴＫ遺伝子のｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）を作製した。ＴＫ遺伝子の翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）であるＡＵＧ、およびＥＧＦＰ遺伝子の終止コドンは除去されている。ｐＥＧＦＰ−Ｃ２のヌクレオチド番号８〜１６４０の配列、および挿入したＴＫ遺伝子を、ＭＩＥＰおよびＭＩＥＰ制御下にあるＥＧＦＰ−ＴＫ遺伝子として用いた。ｐＥＧＦＰ−Ｃ２のＰｓｔＩサイトを含むマルチクローニングサイトは除去されている。
【０１２７】
ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットのピューロマイシン−Ｎ−アセチル−転移酵素遺伝子（ｐａｃ）およびＳＶ４０前初期プロモーターとして、ｐＰＵＲ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のヌクレオチド番号−４０８〜１３９２を用いた。
【０１２８】
Ｕ２遺伝子は、プライマーＵ２  ＸｂａＩ（配列番号９）とＵ２  ＡｆｌＩＩ（配列番号１０）とを用いてＰＣＲによって増幅した。Ｕ８遺伝子は、Ｕ８  ＢａｍＨＩ（配列番号１１）とＵ８  ＥｃｏＲＩ（配列番号１２）とを用いてＰＣＲによって増幅した。ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットを、増幅したＵ２遺伝子およびＵ８遺伝子の間に挟みこむことによって、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を作製した。
【０１２９】
作製したＴＫ遺伝子を含む組換え配列をマルチクローニングサイトに改変を加えたＬＩＴＭＵＳ  ２８ｉに挿入することによって、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドを構築した。
【０１３０】
（ＨＨＶ−６ゲノムの組換え、およびＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−６の選択）
エレクトロポレーション法を用いてＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドを、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ：ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激した臍帯血由来のＴ細胞に導入した。上記プラスミドの臍帯血由来のＴ細胞への導入は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ドイツ）を用いて、推奨されるプロトコルに従って以下のように行った。
【０１３１】
ＰＨＡ刺激した臍帯血由来のＴ細胞５×１０６個、上記プラスミド５μｇおよびＴ細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）溶液１００μｇを混和した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、プログラムＵ−１４の条件で混和した溶液をエレクトロポレーションした。
【０１３２】
６時間後、上記プラスミドを導入した細胞に、遠心法を用いて感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）０．５のＨＨＶ−６  ｖａｒｉａｎｔ  Ｂ（ＨＳＴ株）を感染させた。感染Ｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地（すべての実施例において、説明の便宜上、上記組成を有する培地を単に「培地」と呼ぶ）で３日間培養した。培養後、感染細胞を凍結させることによって組換えウイルスのストックを得た。
【０１３３】
組換ウイルスを選択的に増やすために、以下のようにウイルスの継代を行った。ＰＨＡで刺激した臍帯血由来のＴ細胞に上記組換えウイルスのストックを感染させ、培地で１日間培養した。７．５μｇ／ｍｌピューロマイシンをさらに含む培地で、さらに１日間培養した。ピューロマイシンをさらに含む培地を除去し、感染細胞を培地で洗浄した。洗浄した感染細胞を３日間培養した。感染細胞を凍結させることによって新たな組換えウイルスのストックを得た。
【０１３４】
上記ウイルスの継代を５回行うことによって、組換えウイルスの選択を行った。９６穴のプレートで培養した臍帯血由来のＴ細胞を用いた限界希釈培養法によって、選択した組換えウイルス（ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−６）をクローン化した。
【０１３５】
ＰＣＲ法を用いてクローン化した組換えウイルスのゲノムＤＮＡにＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットが挿入されていることを確認した（図示せず）。
【０１３６】
〔実施例３：ＨＳＶ−１  ＴＫ存在下におけるＨＨＶ−６の増殖に対するＧＣＶおよびＡＣＶの効果〕
ＧＣＶおよびＡＣＶのＨＳＶ−１  ＴＫ存在下におけるＨＨＶ−６の増殖に対する影響を比較するために、ＧＣＶまたはＡＣＶ存在下において、ＴＫ組換えＨＨＶ−６を臍帯血由来のＴ細胞に、ＨＨＶ−６野生株（ＨＳＴ株）を臍帯血由来のＴ細胞、ＭＴ−４細胞およびＴＫ発現ＭＴ−４細胞のそれぞれに感染させ、一段増殖後の培養上清のウイルス力価を測定した。
【０１３７】
ＧＣＶに対するウイルスの増殖能への影響を調べるために、０、０．３３、１、３．３、１０および３３μｍｏｌ／ｌ（μＭ）の濃度のＧＣＶを含む６種類の培地を、前培養およびウイルス感染後の培養に用いた。ＡＣＶに対するウイルスの増殖能への影響を調べるために、０、１、３．３、１０、３３および１００μＭの濃度のＡＣＶを含む６種類の培地を、前培養およびウイルス感染後の培養に用いた。薬剤のそれぞれは１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地に添加しており、前培養および感染後に用いた培地中の薬剤の濃度は同一である。
【０１３８】
臍帯血由来のＴ細胞、ＭＴ−４細胞およびＴＫ発現ＭＴ−４細胞は、ウイルスに感染させる前に、薬剤（ＧＣＶまたはＡＣＶ）を含む培地を用いて前培養を行った。１×１０６個の細胞にＭＯＩ０．１のウイルス液を加え、遠心法を用いてウイルスを感染させた（３７℃、３０００ｒｐｍ、３０分間）。上述のようにウイルスの感染を行うことによって実質的なＭＯＩが１以上になる。この結果、ほとんど全ての細胞がウイルスに感染した。
【０１３９】
ウイルスを感染させた後、ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて感染細胞を洗浄することによって、非感染細胞を取り除いた。前培養と同じ薬剤濃度の培地を用い、５％ＣＯ２条件下で感染細胞を培養した。感染後の培養には６穴プレートを用い、１穴当たり２ｍｌの培地を加えた。感染２日後、一段増殖後のウイルスを含む培養上清を回収した。
【０１４０】
ＴＫ組換えＨＨＶ−６を臍帯血由来のＴ細胞に、臍帯血由来のＴ細胞において増殖させたＨＳＴ株を臍帯血由来のＴ細胞に、ＴＫ発現ＭＴ−４細胞において増殖させたＨＳＴ株をＭＴ−４細胞に、ＭＴ−４細胞において増殖させたＨＳＴ株をＭＴ−４細胞に、それぞれ接種した。接種から１時間、３７℃で細胞にウイルスを吸着させた。１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、５％ＣＯ２条件下で３６時間、感染細胞を培養した。培養には６穴プレートを用いた。培養後、ＨＳＴ株感染細胞のそれぞれの数を、ＨＨＶ−６に特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法によって計測した。ＴＫ組換えＨＨＶ−６感染細胞の数を、ＥＧＦＰに特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法によって計測した。
【０１４１】
図２は一段増殖後の培養上清のウイルス力価と培地中のＧＣＶの濃度（ａ）およびＡＣＶの濃度（ｂ）との関係を示したグラフである。縦軸は薬剤を添加していない状態のＨＳＴ株のウイルス力価を１としたときの相対的なウイルス力価を示しており、横軸は添加した薬剤の濃度（μＭ）を示している。グラフの右に示すように、菱形はＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株のウイルス力価（野生株）であり、四角はＴＫ発現ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株のウイルス力価（ＴＫ（＋））であり、三角は臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−６のウイルス力価（ＨＨＶ−６  ＴＫ）である。
【０１４２】
図２（ａ）に示すように、ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株に対するＧＣＶの有効濃度（ＥＤ５０：５０％  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）は１４μＭであった。これに対し、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−６に対するＧＣＶのＥＤ５０は０．３μＭであった。また、ＴＫ発現ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株に対するＧＣＶのＥＤ５０は０．９μＭであった。なお、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＨＳＴ株のウイルス力価は、ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株のウイルス力価とほぼ同程度であった（図示せず）。
【０１４３】
図２（ｂ）に示すように、ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株に対するＡＣＶのＥＤ５０は４８μＭであった。これに対し、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−６に対するＡＣＶのＥＤ５０は８．６μＭであった。また、ＴＫ発現ＭＴ−４細胞に感染させたＨＳＴ株に対するＡＣＶのＥＤ５０は１６μＭであった。
【０１４４】
ＨＨＶ−６に対するＧＣＶおよびＡＣＶの抗ウイルス作用は、ＴＫが存在することよって１０倍以上に向上した。ＴＫ発現ＭＴ−４細胞に感染させたＨＨＶ−６よりも、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−６の方がＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性が高かった。
【０１４５】
ここで、ＧＣＶはＨＣＭＶ患者の治療に、また、ＡＣＶはＶＺＶ患者の治療に用いられている抗ヘルペス剤である。生体外におけるＨＣＭＶに対するＧＣＶのＥＤ５０は、４．０〜６，８μＭであり、生体外におけるＶＺＶに対するＡＣＶのＥＤ５０は５〜２０μＭである。ＴＫ組換えＨＨＶ−６のＧＣＶに対する感受性はＨＣＭＶより高く、また、ＴＫ組換えＨＨＶ−６のＡＣＶに対する感受性はＶＺＶ比較して同等である、または高いことが分かった。生体内におけるＴＫ組換えＨＨＶ−６の増殖は、ＧＣＶまたはＡＣＶを用いて安全かつ確実に制御し得ると考えられる。
【０１４６】
以上の結果から、臨床的に安全が確認されているＧＣＶまたはＡＣＶを用いてＴＫ組換えＨＨＶ−６の増殖を抑制（制御）することができることが明らかになった。
【０１４７】
〔実施例４：ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−７の作製〕
ＨＨＶ−７にＴＫ遺伝子を組み込むことによって、ＨＨＶ−７のＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性の変化を調べるために、ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−７を作製した。
【０１４８】
ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−７の作製の手順について図３を参照して以下に説明する。図３はＨＨＶ−７のゲノム構造を示す模式図であり（上段）、相同組換えに用いたＴＫ遺伝子を含む組換え配列の構造を示す模式図である（下段）。
【０１４９】
図３に示すように、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列と相同組換えを起こさせるＨＨＶ−７ゲノムの遺伝子領域として、Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域を選択した。この選択は、上記Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域の欠失または組換えを行ったＨＨＶ−７の変異体が、野生体と同様の増殖能および感染の態様（潜伏感染が確立すること、および復帰感染を起こすことなど）を有しているという報告に基づいている（特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。
【０１５０】
（ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドの構築）
上記Ｕ２〜Ｕ８遺伝子領域と組換えを起こさせるためのＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドの構造およびその構築方法について説明する。
【０１５１】
ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を、ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットの両端に上記Ｕ２遺伝子領域の約１ｋｂｐの断片とＵ８遺伝子の約１ｋｂｐの断片とを挿入することによって作製した。ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットの構成は、実施例２において作製したＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットと同一の構成なので、ここでは説明を省略する。
【０１５２】
Ｕ２遺伝子は、プライマー７Ｕ２ＦＢａｍ（配列番号１３）と７Ｕ２ＲＳｐｅ（配列番号１４）とを用いてＰＣＲによって増幅した。Ｕ８遺伝子は、７Ｕ８ＦＳａｌ（配列番号１５）と７Ｕ８ＲＢａｍＨＩ（配列番号１６）とを用いてＰＣＲによって増幅した。ＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットを、増幅したＵ２遺伝子およびＵ８遺伝子の間に挟みこむことによって、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を作製した。
【０１５３】
作製したＴＫ遺伝子を含む組換え配列をプラスミドに挿入することによって、ＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドを構築した。
【０１５４】
（ＨＨＶ−７ゲノムの組換え、およびＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−７の選択）
エレクトロポレーション法を用いてＴＫ遺伝子を含む組換え配列を含むプラスミドを、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ：ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で刺激した臍帯血由来のＴ細胞に導入した。上記プラスミドの臍帯血由来のＴ細胞への導入は、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ドイツ）を用いて、推奨されるプロトコルに従って以下のように行った。
【０１５５】
ＰＨＡ刺激した臍帯血由来のＴ細胞５×１０６個、上記プラスミド５μｇおよびＴ細胞用Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）溶液１００μｇを混和した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＴＭ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、プログラムＵ−１４の条件で混和した溶液をエレクトロポレーションした。
【０１５６】
６時間後、上記プラスミドを導入した細胞に、遠心法を用いて感染多重度（ＭＯＩ：ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）０．５のＨＨＶ−７（ＫＨＲ株）を感染させた。感染Ｔ細胞を培地で３日間培養した。培養後、感染細胞を凍結させることによって組換えウイルスのストックを得た。
【０１５７】
組換ウイルスを選択的に増やすために、以下のようにウイルスの継代を行った。ＰＨＡで刺激した臍帯血由来のＴ細胞に上記組換えウイルスのストックを感染させ、培地で１日間培養した。７．５μｇ／ｍｌピューロマイシンをさらに含む培地で、さらに１日間培養した。ピューロマイシンをさらに含む培地を除去し、感染細胞を培地で洗浄した。洗浄した感染細胞を３日間培養した。感染細胞を凍結させることによって新たな組換えウイルスのストックを得た。
【０１５８】
上記ウイルスの継代を５回行うことによって、組換えウイルスの選択を行った。９６穴のプレートで培養した臍帯血由来のＴ細胞を用いた限界希釈培養法によって、選択した組換えウイルス（ＴＫ遺伝子を有する組換えＨＨＶ−７）をクローン化した。
【０１５９】
ＰＣＲ法を用いてクローン化した組換えウイルスのゲノムＤＮＡにＴＫ遺伝子を含む遺伝子カセットが挿入されていることを確認した（図示せず）。
【０１６０】
〔実施例５：ＨＳＶ−１  ＴＫ存在下におけるＨＨＶ−７の増殖に対するＧＣＶおよびＡＣＶの効果〕
ＧＣＶおよびＡＣＶのＨＳＶ−１  ＴＫ存在下におけるＨＨＶ−７の増殖に対する影響を比較するために、ＧＣＶまたはＡＣＶ存在下において、ＴＫ組換えＨＨＶ−６を臍帯血由来のＴ細胞に、ＨＨＶ−７野生株（ＫＨＲ株）を臍帯血由来のＴ細胞、ＳｕｐＴ１細胞およびＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞のそれぞれに感染させ、一段増殖後の培養上清のウイルス力価を測定した。
【０１６１】
ＧＣＶに対するウイルスの増殖能への影響を調べるために、０、０．３３、１、３．３、１０および３３μＭの濃度のＧＣＶを含む６種類の培地を、前培養およびウイルス感染後の培養に用いた。ＡＣＶに対するウイルスの増殖能への影響を調べるために、０、１、３．３、１０、３３および１００μＭの濃度のＡＣＶを含む６種類の培地を、前培養およびウイルス感染後の培養に用いた。薬剤のそれぞれは１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地に添加しており、前培養および感染後に用いた培地中の薬剤の濃度は同一である。
【０１６２】
臍帯血由来のＴ細胞、ＳｕｐＴ１細胞およびＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞は、ウイルスに感染させる前に、薬剤（ＧＣＶまたはＡＣＶ）を含む培地を用いて前培養を行った。１×１０６個の細胞にＭＯＩ０．１のウイルス液を加え、遠心法を用いてウイルスを感染させた（３７℃、３０００ｒｐｍ、３０分間）。上述のようにウイルスの感染を行うことによって実質的なＭＯＩが１以上になる。この結果、ほとんど全ての細胞がウイルスに感染した。
【０１６３】
ウイルスを感染させた後、ＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて感染細胞を洗浄することによって、非感染細胞を取り除いた。前培養と同じ薬剤濃度の培地を用い、５％ＣＯ２条件下で感染細胞を培養した。感染後の培養には６穴プレートを用い、１穴当たり２ｍｌの培地を加えた。感染２日後、一段増殖後のウイルスを含む培養上清を回収した。
【０１６４】
ＴＫ組換えＨＨＶ−６を臍帯血由来のＴ細胞に、臍帯血由来のＴ細胞において増殖させたＫＨＲ株を臍帯血由来のＴ細胞に、ＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞において増殖させたＫＨＲ株をＳｕｐＴ１細胞に、ＳｕｐＴ１細胞において増殖させたＫＨＲ株をＳｕｐＴ１細胞に、それぞれ接種した。接種から１時間、３７℃で細胞にウイルスを吸着させた。１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地を用いて、５％ＣＯ２条件下で３６時間、感染細胞を培養した。培養には６穴プレートを用いた。培養後、ＫＨＲ株感染細胞のそれぞれの数を、ＨＨＶ−７に特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法によって計測した。ＴＫ組換えＨＨＶ−７感染細胞の数を、ＥＧＦＰに特異的な抗体を用いた間接蛍光抗体法によって計測した。
【０１６５】
図４は一段増殖後の培養上清のウイルス力価と培地中のＧＣＶの濃度（ａ）およびＡＣＶの濃度（ｂ）との関係を示したグラフである。縦軸は薬剤を添加していない状態のＫＨＲ株のウイルス力価を１としたときの相対的なウイルス力価を示しており、横軸は添加した薬剤の濃度（μｇ／ｍｌ）を示している。グラフの右に示すように、菱形はＳｕｐＴ１細胞に感染させたＫＨＲ株のウイルス力価（野生株）であり、四角はＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞に感染させた野生株のウイルス力価（ＴＫ（＋））であり、三角は臍帯血由来のＴ細胞ＳｕｐＴ１細胞にＴＫ組換えＨＨＶ−７のウイルス力価（ＨＨＶ−７  ＴＫ）である。
【０１６６】
図４（ａ）に示すように、ＳｕｐＴ１細胞に感染させたＫＨＲ株に対するＧＣＶのＥＤ５０は２１μＭであった。これに対し、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−７に対するＧＣＶのＥＤ５０は０．７μＭであった。また、ＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞に感染させたＨＨＶ−６に対するＧＣＶのＥＤ５０は１．０μＭであった。
【０１６７】
図４（ｂ）に示すように、ＳｕｐＴ１細胞に感染させたＫＨＲ株に対するＡＣＶのＥＤ５０は３３０μＭであった。これに対し、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−７に対するＡＣＶのＥＤ５０は９．５μＭであった。また、ＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞に感染させたＨＨＶ−６に対するＡＣＶのＥＤ５０は１９μＭであった。
【０１６８】
ＨＨＶ−７に対するＧＣＶおよびＡＣＶの抗ウイルス作用は、ＴＫが存在することよって１０倍以上に向上した。ＴＫ発現ＳｕｐＴ１細胞に感染させたＨＨＶ−７よりも、臍帯血由来のＴ細胞に感染させたＴＫ組換えＨＨＶ−７の方がＧＣＶおよびＡＣＶに対する感受性が高かった。
【０１６９】
ＴＫ組換えＨＨＶ−７のＧＣＶに対する感受性はＨＣＭＶより高く、また、ＴＫ組換えＨＨＶ−７のＡＣＶに対する感受性はＶＺＶと比較して同等であることまたは高いことが分かった。生体内におけるＴＫ組換えＨＨＶ−７の増殖は、ＧＣＶまたはＡＣＶを用いて安全かつ確実に制御し得ると考えられる。
【０１７０】
以上の結果から、臨床的に安全が確認されているＧＣＶまたはＡＣＶを用いてＴＫ組換えＨＨＶ−７の増殖を抑制（制御）することができることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明によって、感染細胞においてＴＫ遺伝子を発現するＨＨＶ−６またはＨＨＶ−７由来の組換えウイルスベクターを提供することができる。本発明は安全性の高い遺伝子治療用ベクターとして用いることができる。本発明は研究用の遺伝子導入用のベクターとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】ＴＫ組換えＨＨＶ−６の組換え領域とゲノム構造を説明する模式図である。
【図２】（ａ）はＨＨＶ−６野生株およびＴＫ組換えＨＨＶ−６に対するガンシクロビルの抗ウイルス活性を示すグラフであり、（ｂ）はＨＨＶ−６野生株およびＴＫ組換えＨＨＶ−６に対するアシクロビルの抗ウイルス活性を示すグラフである。
【図３】ＴＫ組換えＨＨＶ−７の組換え領域とゲノム構造を説明する模式図である。
【図４】（ａ）はＨＨＶ−７野生株およびＴＫ組換えＨＨＶ−７に対するガンシクロビルの抗ウイルス活性を示すグラフであり、（ｂ）はＨＨＶ−７野生株およびＴＫ組換えＨＨＶ−７に対するアシクロビルの抗ウイルス活性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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