(57)【要約】【課題】本発明は、食生活に簡便に組み込むことが可能であり、肥満の予防及び／又は改善に有用な、生体組織の脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制し得る素材を開発するとともにこれを産業上有効活用できる態様の組成物を提供することを課題とした。【解決手段】ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなり、脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制する脂肪蓄積抑制剤が提供され、これを含有してなる、脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための経口組成物、望ましくは飲食品が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤。
【請求項２】
水性成分がツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂物を水及び／又は低級アルコールで抽出処理して得られる抽出物である請求項１に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項３】
脂肪蓄積抑制が脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制することである請求項１又は２に記載の脂肪蓄積抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の脂肪蓄積抑制剤を含有してなることを特徴とする、脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための経口組成物。
【請求項５】
経口組成物が飲食品である請求項４に記載の脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤、及びこれを含有してなることを特徴とする脂肪細胞の脂肪蓄積を抑制するための経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】近年、我国においても肥満者や肥満体質の者が増加しており、肥満が健康上の重要な関心事となっている。肥満が注目される理由は、肥満あるいはその傾向にある者に心疾患、動脈硬化、高血圧、糖尿病等のいわゆる生活習慣病を発症する頻度が多く、これらの疾病による死亡率が高いという事実が背景にある。肥満は糖尿病、高脂血症、高血圧、脂肪肝、動脈硬化症を誘発する大きな要因であることが知られている。日本人の主な死亡病因の順位は癌、心臓病、脳卒中であるが、心臓病と脳卒中は動脈硬化が主たる原因であることを考慮すれば、動脈硬化型疾患による死因が極めて多いことが理解できる。【０００３】肥満の状態とは、一般的に、摂取エネルギーのうち運動等の諸活動によっても消費されない糖質や脂質等のエネルギー源が生体組織とくに皮下脂肪組織や臓器周辺組織に異常に蓄積された結果、体重が骨格系あるいは生理機能の限界を超えて増加した状態をいう。そして、エネルギー源が生体内に脂肪として蓄積される蓄積脂肪の分布状態について、これが前記各種疾病との関連において重要であることが明らかになり、とりわけ内蔵脂肪型肥満（内臓肥満、腹部肥満ともいう）に高血糖症、高血圧症、高脂血症のうち２つ以上を合併した状態をメタボリックシンドローム（代謝症候群）と呼び、各症状が軽度であっても、複数の症状が重なることにより相乗的に動脈硬化性疾患の発症頻度が高まるため、ハイリスク群としてこの予防と治療に注目が集まっている。【０００４】肥満を防止するために、医療分野における治療や予防はもとより、日常的に摂取する食事や各種飲食品を通して肥満を予防する試みもこれまでに数多くなされてきた。例えば、摂取する脂質の代謝を調節したり、体脂肪の燃焼を促進したり蓄積を抑制することをねらった食用素材として、Ｌ−カルニチン又はこれを含む畜肉ペプチド（特許文献１、２及び３）、藻類の抽出物（特許文献４）、カロテノイド（特許文献５）、アントシアニジン類（特許文献６）、緑茶カテキン（特許文献７）、ポルフィラン改質低分子化合物（特許文献８）等が提案されている。【０００５】しかしながら、実用面を含めて肥満症状を有効に予防及び／又は改善し得るものは数少なく、十分満足できるものはほとんど見当たらないのが実状であった。したがって、食事中の脂肪の吸収を阻害し、体内で脂肪蓄積を抑制し、あるいは体脂肪を燃焼促進又は代謝促進する素材が強く求められていた。【０００６】後述するツバキについては次のようなことが知られている。すなわち、ツバキは古来より観賞用園芸植物として利用されてきた歴史があり、種子から採取した油脂は燃料油、整髪料、高級食用油等に、木部は灰化して日本酒の醸造に、又、実の脱脂粕は農作物の肥料等に利用されてきた。脱脂粕にはサポニンやタンニンが含まれ、これを加工して殺虫防虫剤（特許文献９）、農園芸用線虫防除剤（特許文献１０）等となす提案もある。しかしながら、ツバキの成分を肥満防止のために用いる例は見当たらない。【０００７】
【特許文献１】特開平７−１９６４８５号公報
【特許文献２】特開平１０−６６５１５号公報
【特許文献３】特開２０００−２５６２００号公報
【特許文献４】特開２０００−７２６４２号公報
【特許文献５】特開２００３−９５９３０号公報
【特許文献６】特開２００２−１５３２４０号公報
【特許文献７】特開２００６−１３１５１２号公報
【特許文献８】特開２００６−１０４１００号公報
【特許文献９】特許第１７００７１号明細書
【特許文献１０】特開平９−３０９１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】かかる実情に鑑み、本発明は、食生活に簡便に組み込むことが可能であり、肥満の予防及び／又は改善に有用な、とりわけ生体内の脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制し得る素材を開発するとともにこれを産業上有効活用できる態様の組成物を提供することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】前記課題を解決するために、本発明者らは、脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための素材について鋭意検討を重ねた結果、意外にもツバキが極めて有効であり、ツバキにはヒトや動物等の脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制し得る成分が含まれていること、更には、これを飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野に有効利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】すなわち、本発明によれば、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなることを特徴とする脂肪蓄積抑制剤が提供される。この水性成分は、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂物を水及び／又は低級アルコールで抽出処理して得られる抽出物であることが望ましい。又、脂肪蓄積抑制とは、生体中の脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制することが望ましい。【００１１】又、本発明によれば、前記の脂肪蓄積抑制剤を含有してなることを特徴とする、肥満脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための経口組成物が提供される。この経口組成物は飲食品であることが望ましい。
【発明の効果】
【００１２】本発明に係るツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分は、品質安定性に優れ、脂肪組織における脂肪の蓄積を抑制する効果を奏する。かかる効果は、本発明に係るツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の脱脂物の水性成分を有効成分として含有してなる脂肪蓄積抑制剤を経口的に摂取又は投与することによって顕著に発現される。したがって、本発明の脂肪蓄積抑制剤はとりわけ飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等の分野において、前記剤の態様のままで又は前記分野の従来の各種製品に配合した形態で、脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するために有効利用することが可能となる。本発明の脂肪蓄積抑制剤を化粧品、皮膚外用剤の分野の製品に適用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】以下に本発明を詳細に説明する。まず、本発明の脂肪蓄積抑制剤は、ヒトや動物の生体内の脂肪細胞に存在する脂肪、すなわち、食事等によって摂取される糖質や脂質が代謝されて貯蔵エネルギー源として蓄えられる脂肪の蓄積を抑制する機能を有するものであり、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）のツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなることを特徴とする。【００１４】ツバキ属に属する植物として、一般に、ツバキ節に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）等、チャ節に属するチャ（Ｃ．ｓｉｎｅｎｓｉｓ）等、サザンカ節に属するサザンカ（Ｃ．ｓａｓａｎｑｕａ）等、カワリバツバキ節に属するグランサムツバキ（Ｃ．ｇｒａｎｔｈａｍｉａｎａ）等、ヤナギバサザンカ節に属するヤナギバサザンカ（Ｃ．ｓａｌｉｃｉｆｏｌｉａ）等、ヒメサザンカ節に属するヒメサザンカ（Ｃ．ｌｕｔｃｈｕｅｎｓｉｓ）等が知られているが、本発明ではツバキ節に属するものを用いる。この例としてヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、ユキツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）、リンゴツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｖａｒ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）、ホウザンツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｓｕｂｓｐ．ｈｏｚａｎｅｎｓｉｓ）、ホンコンツバキ（Ｃ．ｈｏｎｇｋｏｎｇｅｎｅｓｉｓ）、トウツバキ（Ｃ．ｒｅｔｉｃｕｌａｔａ）、サルウィンツバキ（Ｃ．ｓａｌｕｅｎｅｎｓｉｓ）、ピタールツバキのピタルディー種（Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ  ｖａｒ．ｐｉｔａｒｄｉｉ）及びユンナン種（Ｃ．ｐｉｔａｒｄｉｉ  ｖａｒ．ｙｕｎｎａｎｉｃａ）、金花茶（Ｃ．ｎｉｔｉｄｉｓｓｉｍａ）、ヤマツバキ（ヤブツバキと同種）、山茶花（ヤブツバキと同種）、ヤクシマツバキ（リンゴツバキと同種）等を挙げることができる。これらのツバキは日本列島、朝鮮半島、中国山東半島等で自生し又は栽培されているものを適宜に利用すればよい。【００１５】本発明では、前記のツバキの実及び／又は種子を圧搾処理、ヘキサンやヘプタン等の疎水性有機溶媒又は液化二酸化炭素、液化プロパン等の液化ガスを用いた超臨界抽出処理等に供して、常法により油分を抽出した残渣である脱脂物を、前記水性成分を採取するための原料とすることが望ましい。ここで、ツバキの実及び／又は種子は早熟実及び成熟実のいずれでもよく、これらの種子を用いてもよいが、脱脂物及び有効成分の収量の点から成熟実又はその種子を用いることが望ましい。より好ましくは種子を用いる。本発明では、成熟実から得られる種子を１〜２週間程度、天日等で乾燥させたものを用いるのがよい。【００１６】本発明に係る水性成分はツバキの実から任意の方法で製造することができるが、前記脱脂物から水及び／又は低級アルコールを用いて抽出処理するのが好ましい。低級アルコールは、その炭素数が大きくなると脱脂物中の油性成分が抽出される傾向が大きくなるため、炭素数が小さいものが望ましく、メタノール、エタノール、ノルマルプロパノール、イソプロパノール、ノルマルブタノール、イソブタノール等を例示できる。炭素数が大き��低級アルコールを使用する場合は、脱脂物中の油性成分の抽出を抑制するために含水率を高めるのがよい。例えば、プロパノールの場合の含水率は約２０重量％〜約５０重量％とし、ブタノールの場合の含水率は約４０重量％〜約７０重量％とする。望ましい抽出溶媒は水、メタノール及びエタノール、及びこれらの含水アルコール（含水率：０〜１００重量％）である。【００１７】脱脂物を抽出するには、脱脂物１重量部に対して前記抽出溶媒を約１重量倍〜約３０重量倍加え、常圧下又は１〜５気圧の加圧下、常温ないしは約１２０℃で、約１０分〜約３時間、必要に応じて撹拌して混合後、常温に冷却して濾過し、濾液を減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等の適当な手段により濃縮、乾燥する。尚、乾燥物は適宜に粉砕処理してもよい。このようにして本発明に係るツバキの実及び／又は種子の水性成分である淡黄色ないし黄色の固体を得ることができる。前記抽出方法は、一旦抽出処理した抽出残渣を繰り返し抽出処理したり、１〜３気圧の加圧下、約１００℃〜約１３０℃で行うことが望ましい。これにより本発明に係る水性成分の収量が増える。この水性成分はサポニン、タンニン、ケンフェロール、その配糖体等を含む。【００１８】本発明の脂肪蓄積抑制剤は、その有効成分としての前記水性成分を固体状、ペースト状又は液体状の形態となし、これをそのまま脂肪蓄積抑制剤としてよいが、必要に応じて本発明の脂肪蓄積抑制剤が利用される用途における公知の添加物を併用して、常法により含有せしめて組成物として調製することもできる。ここで、公知の添加物は経口摂取するために通常利用されるものが望ましく、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤剤、流動化剤、保存剤、界面活性剤、安定剤、希釈剤、溶解剤、等張化剤、殺菌剤、防腐剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料等の添加物質を使用でき、又、肥満改善作用、体重低減作用、ダイエット作用、食事性脂質吸収阻害作用、脂肪蓄積抑制作用、体脂肪燃焼促進作用等の肥満防止作用を有する既知成分やその含有素材を併用してもよい。【００１９】肥満防止作用が既知の成分や素材としては、前記の特許文献に記載のもの以外に、緑茶カテキン、大豆油不けん化物、大豆イソフラボン、α−リポ酸、カルニチン、コエンザイムＱ１０、ファセオラミン、カフェ酸、ジヒドロキシカルコン類、分岐アミノ酸（バリン、ロイシン、イソロイシン）、アントシアニジン、レバン、ベタイン、エラジタンニン、低分子化キトサン、ロスマリン酸及びそのエステル、共役ポリエン酸、クルクミン、レスベラトロール、フォルスコリン、ベルゲニン、スクレロチオリン、ジアシルグリセロール、ポルフィランの低分子化合物、クロロゲン酸、カロテノイド（リコピン、ルテイン、ゼアキサンチン等）、ギムネマ酸、ヒドロキシクエン酸、アスチルビン、加熱改質アラビアガム、ヘスペリジン、分子量５万〜１５万の低分子化ペクチン、ビール酵母産生マンナン、ウリジン、オレアノール、オレアノール酸、オイゲノール、テアフラビン、フェニル−Ｏ−Ｄ−グルコース、３，４，６−トリメトキシ−Ｏ−Ｄ−グルコース、イタコン酸及びその塩、ヒドロキシプロリン及びそのＮ−アシル誘導体、α化澱粉とショ糖脂肪酸エステルとの結合物、プロシア���ジン、重合度３〜１９の環状及び鎖状ポリ乳酸、α−メチル−Ｄ−キシロシド、キシロオリゴ糖、Ｌ−アラビノース、難消化性デキストリン、バロネア酸及びその配糖体、カプサイシン、ポリフェノール、サラシノール、ガノデリン酸、大豆ペプチド、ホエーペプチド、牛肉ペプチド、ふすま、米糠、サイリウム種皮、分離大豆蛋白等を挙げることができる。【００２０】又、次に掲げる植物、海藻、茸類等の各部位の乾燥物、それらの水又は低級アルコール抽出物を例示できる。すなわち、グアバ葉、ギムネマシルベスタ葉、ガルシニアカンボジア果皮、シソ葉又は種子、月見草種子、キラヤ樹皮、ユーカリ葉、シャクヤク花、トチュー葉、黒米、ピーナッツ渋皮、ウーロン茶葉、バナナ果皮、イタドリ茎、ブドウ種子又果皮、カシス果実、キキョウ根、黄杞葉、オリーブ葉、ケイヒ樹皮、アスナロ全草、栗渋皮、クマザサ葉、シラカバ樹皮、アムラ果実、クワ葉、ヒヨコマメ、アカショウマ根、コレウス・フォルスコリ根、カワラケツメイ葉又はサヤ、ウコン根、海藻、クローブ蕾、オレガノ全草、アカメガシワ樹皮、ウラジロガシ樹皮、オトギリソウ全草、サラシアレティキュラータ根、エビスグサ全草、アロエ葉肉、エゾウコギ根、霊芝・マイタケ・エノキタケ・カバノアナタケ、アガリクス茸等の子実体及び菌糸体、脱脂米胚芽、ケール葉等である。尚、本発明の脂肪蓄積抑制剤はこれらの例示によって何ら制限されるものではない。【００２１】本発明の脂肪蓄積抑制剤を組成物とする場合の形態は、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤等の経口用製剤となすことが可能である。かかる製剤組成物における前記水性成分の含有量は、併用原料の種類や含有量等により一律に規定し難いが、概ね０．０１重量％〜９０重量％程度、より望ましくは約０．１重量％〜約７０重量％である。前記含有量が約０．０１重量％を下回ると本発明の所望効果が認められなくなり、約９０重量％を超えると実用的な製剤組成物を調製することが難しくなる。本発明の脂肪蓄積抑制剤は、これを望ましくは経口的に摂取又は投与する態様で利用する。経口摂取又は投与する場合の本発明の脂肪蓄積抑制剤の好適な量の目安は、該剤に含まれる前記水性成分ベースで、ヒト成人１日あたり約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ〜約３００ｍｇである。【００２２】本発明の脂肪蓄積抑制剤が有用性を示す大きな特徴は、これが体重の増加防止や低減促進はもとより、生体組織の脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制し、これに加えて食事等で摂取する脂肪の吸収を阻害し、あるいは、体脂肪の燃焼若しくは代謝を促進することにある。したがって、本発明の脂肪蓄積抑制剤は、肥満の評価指標のひとつである体重の増加予防や低減促進に基づく肥満症状の予防及び／又は改善のために適用され、又、脂肪細胞における脂肪の蓄積抑制、食事性脂肪の吸収阻害、及び／又は、生体の内臓脂肪や皮下脂肪等の体脂肪の燃焼促進若しくは代謝促進に基づく肥満症状の予防及び／又は改善のためにより好適に適用される。【００２３】本発明においては、前述した脂肪蓄積抑制剤をそのままの形態で飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料、その他産業分野の様々な製品として利用することがで��、あるいは該各種製品の配合原料の一部として使用する態様でも利用できる。とりわけ脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するための経口組成物となすことが好ましく、この経口組成物の最も好適な態様は飲食品である。この例を以下に述べるが、本発明はこれにより限定されるものではない。【００２４】飲食品の具体例として、野菜ジュース、果汁飲料、清涼飲料、茶等の飲料類、スープ、ゼリー、プリン、ヨーグルト、ケーキプレミックス製品、菓子類、ふりかけ、味噌、醤油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、植物性クリーム、焼肉用たれや麺つゆ等の調味料、麺類、うどん、蕎麦、スパゲッティ、ハムやソーセージ等の畜肉魚肉加工食品、ハンバーグ、コロッケ、ふりかけ、佃煮、ジャム、牛乳、クリーム、バター、スプレッドやチーズ等の粉末状、固形状又は液状の乳製品、マーガリン、パン、ケーキ、クッキー、チョコレート、キャンディー、グミ、ガム等の各種一般加工食品のほか、粉末状、顆粒状、丸剤状、錠剤状、ソフトカプセル状、ハードカプセル状、ペースト状又は液体状の栄養補助食品、特定保健用食品、機能性食品、健康食品、濃厚流動食や嚥下障害用食品の治療食等を挙げることができる。【００２５】尚、本発明の飲食品においては、これがツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）のツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなる旨、生体組織の脂肪細胞における脂肪の蓄積抑制のためのものである旨のうち少なくとも１の表示を付した態様とすることができる。【００２６】これらの飲食品を製造するには、本発明の脂肪蓄積抑制剤と公知の原材料を用い、あるいは公知の原材料の一部を前記の脂肪蓄積抑制剤で置き換え、常法によって製造すればよい。例えば、本発明の脂肪蓄積抑制剤を、必要に応じてグルコース（ブドウ糖）、デキストリン、乳糖、澱粉又はその加工物、セルロース粉末等の賦形剤、ビタミン、ミネラル、動植物や魚介類の油脂、たん白（動植物や酵母由来の蛋白質、その加水分解物等）、糖質、色素、香料、酸化防止剤、界面活性剤、その他の食用添加物、各種栄養機能成分を含む粉末やエキス類等の食用素材とともに混合して粉末、顆粒、ペレット、錠剤等の形状に加工したり、常法により前記例の一般加工食品に加工処理したり、これらを混合した液状物をゼラチン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース等の被覆剤で被覆してカプセルに成形したり、飲料（ドリンク類）の形態に加工して、栄養補助食品や健康食品として利用することは好適である。とりわけ錠剤、カプセル剤やドリンク剤が望ましい。【００２７】かかる飲食品に配合する本発明の脂肪蓄積抑制剤の比率は、飲食品の形態、本発明の脂肪蓄積抑制剤中の前記水性成分（ツバキ科ツバキ属ツバキの実及び／又は種子の水性成分）の含量、他の配合原料の種類や成分や配合量等のちがいにより一律に規定しがたいが、飲食品中の前記水性成分の含量が約０．０１重量％〜約９０重量％、より望ましくは約１重量％〜約５０重量％となるように、本発明の脂肪蓄積抑制剤をその他の飲食品製造用公知原料と適宜に組み合わせて処方を設計し、常法に従い目的とする飲食品を調製すればよい。前記水性成分の含量が約０．０１重量％を下回るような飲食品では前記水性成分による所望効果を期待するために多量の当該飲食品を摂取しなければならず、一方、前記水性成分の量が約９０重量％を超えると実用的な飲食品を製造することが困難になることがある。本発明の飲食品は、ヒト成人の場合１日あたりの前記水性成分の摂取量の目安を約１０ｍｇ〜約１，０００ｍｇ、望ましくは約３０ｍｇ〜約５００ｍｇ、更に望ましくは約５０ｍｇ〜約３００ｍｇとして任意の方法、例えば、食事の摂取と同時又は前後に、経口摂取、経管投与等の方法で体内に取り込むことができる。
【実施例】
【００２８】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれによって何ら限定されるものではない。各例において、％、部及び比率は特に表示しない限り全て重量基準である。【００２９】製造例１
長崎県五島産ヤブツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｖａｒ．ｊａｐｏｎｉｃａ）の乾燥種子を粗粉砕して蒸煮後、圧搾して圧搾油を分離した圧搾粕を得、次いで圧搾粕にノルマルヘキサンを加えて常法により抽出処理し、抽出液を分離して抽出粕を採取した。この抽出粕をノルマルヘキサンで洗浄して油分を取り除き脱脂物を採取した。この脱脂物１００ｇに水３００ｍＬを加え、常圧下、８５℃に加熱して１時間適宜に撹拌した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水性成分を含む粉末（試料１とする）１５．７ｇを得た。この粉末は、これを加水分解してＨＰＬＣ分析したところ、サポニンのアグリコンであるサポゲニンを１６．１％、フラボノールの一種であるケンフェロールを２．０％含むものであった。【００３０】製造例２
屋久島産ヤクシマツバキ（Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ  ｖａｒ．ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）の乾燥種子を製造例１に記載の方法で脱脂して脱脂物を採取した。この脱脂物１００ｇに水３００ｍＬを加え、２気圧の加圧下、１２０℃で２５分間加熱した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度水２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水性成分を含む粉末（試料２とする）１６．７ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１４．８％であり、ケンフェロール含量は２．３％であった。【００３１】製造例３
製造例１に記載の方法で得た脱脂物１００ｇに含水エタノール（含水率５０％）２５０ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度含水エタノール（含水率５０％）２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水性成分を含む粉末（試料３とする）１１．９ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１２．５％であり、ケンフェロール含量は２．５％であった。【００３２】製造例４
製造例２に記載の方法で得た脱脂物１００ｇにエタノール（純度９９．５％）２００ｍＬを加え、８０℃で１時間加熱還流した後、室温まで冷却し、濾過して濾液を分離した。この濾過残渣に再度エタノール（純度９９．５％）２００ｍＬを加えて同様に加熱し、冷却後、濾過して濾液を採取した。両濾液を合わせて減圧下に濃縮し、凍結乾燥及び粉砕して、本発明に係る水性成分を含む粉末（試料４とする）４．８ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１４．３％であり、ケンフェロール含量は２．８％であった。【００３３】製造例５
製造例１において、乾燥種子を未熟実（種子を含む実全体）におきかえること以外は同様に処理して、脱脂粕を得た後、これから水性成分を含む粉末（試料５とする）１３．４ｇを得た。該粉末を製造例１と同様に加水分解してＨＰＬＣ分析した結果、サポゲニン含量は１３．８％であり、ケンフェロール含量は２．２％であった。【００３４】試験例１：脂肪細胞における脂肪蓄積抑制作用
本発明の脂肪蓄積抑制剤（試料１〜試料５）が脂肪細胞の脂肪蓄積作用に及ぼす影響を以下に述べる方法で調べた。すなわち、ペトリディッシュ（φ１０ｃｍ）を用い、３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス胎児由来肥満前駆脂肪細胞：大日本住友製薬（株）製、３Ｔ３−Ｌ１。以下、単に細胞という。）を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）添加Ｄ−ＭＥＭ培地（シグマ社製、高グルコース）に１．４×１０５個播き、サブコンフルエント（約８０％密度）になるまで３日間培養した。次いで、培地を除去し、細胞をＰＢＳ５ｍＬで２回洗浄し、更に０．０２％ＥＤＴＡ（シグマ社製、試薬）溶液５ｍＬで洗浄した後、０．２５％トリプシン溶液（ナカライテスク（株）製、試薬）５ｍＬを用いて細胞を回収し、遠心分離（４℃、１，０００ｒｐｍ、５分）して上清を除き、ＰＢＳで２回洗浄して細胞を得た。この細胞を前記条件下で繰り返し培養して１０世代継代培養した。【００３５】２４穴２ｃｍ２細胞培養プレート（旭テクノグラス（株）製）を用いて、前記継代培養細胞を前記の１０％ウシ胎児血清添加Ｄ−ＭＥＭ培地中に１．５×１０５個／ｃｍ２の密度で播き、２日間培養した。次いで、培地を除去し、１０％ウシ胎児血清（第一化学薬品（株）製、試薬）、０．５ｍＭ１−メチル−３−イソブチルキサンチン（シグマ社製、試薬）、０．２５μＭデキサメタゾン（シグマ社製、試薬）、０．１μＭトログリタゾン（シグマ社製、試薬）及び５μｇ／ｍＬインスリン（シグマ社製、試薬）を含むＤ−ＭＥＭ培地を添加して脂肪細胞への分化を刺激した。これを３日間培養後、培地を除去し、終濃度が１０、３０又は１００μｇ／ｍＬとなるように前記試料を添加した１０％ウシ胎児血清及び５μｇ／ｍＬインスリン含有Ｄ−ＭＥＭ培地中で培養を続け、２日毎に前記同培地に交換して６日間培養した。培養終了後、培地を除き、細胞をＰＢＳ１ｍＬで３回洗浄して培養脂肪細胞を得た。尚、上記方法において、Ｄ−ＭＥＭ培地はペニシリン（終濃度１００ＩＵ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加したものとし、細胞培養はすべてＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２強化気相下）で行った。このようにして得られた培養脂肪細胞は、このトリグリセリド含量及び蛋白質含量を定量するために、１％（ｗ／ｖ）トリトン（登録商標）Ｘ−１００（キシダ化学（株）製、試薬）２００μＬを加えて１５分間放置後、ピペッティングにより細胞破砕し、これを各定量測定のサンプルとした。【００３６】トリグリセリドの定量はアセチルアセトン法により行った。すなわち、前記サンプル０．１ｍＬにイソプロパノール３ｍＬを加えて混合した後、活性アルミナ（和光純薬工業（株）製、カラムクロマトグラフ用、約３００メッシュ）を０．４ｇ加え５分おきに３回混合した。その後、遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）した上清１ｍＬに５％（ｗ／ｖ）水酸化カリウム水溶液をパスツールピペットで２滴添加し、混合して３７℃で１５分間加熱した。次いで、これに酢酸アンモニウム緩衝液（２．４Ｍ酢酸アンモニウム、１１％イソプロパノール、ｐＨ５．５）１ｍＬを加えて混合した後、５０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を０．１ｍＬ添加して混合後、室温で１５分間静置した。これに発色液（９７ｍＭアセチルアセトン、６５％イソプロパノール）２ｍＬを加えて混合した後、３７℃で４０分間加温した。この後、流水で３分間冷却して反応を停止させ、４１０ｎｍにおける吸光度を測定した。培養細胞中のトリグリセリド含量は、グリセリン基準溶液（所定のトリオレイン濃度に相当するグリセリン２０．８ｍｇ／ｄＬ，イソプロパノール８％を含有。）を用いて作成した検量線から算出した。【００３７】蛋白質の定量はＢＣＡプロテイン・アッセイ・キット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて行った。細胞中の蛋白質量は細胞数と相関することが知られているため、培養脂肪細胞中に蓄積したトリグリセリド含量は細胞の蛋白質量を基準として求めた。【００３８】又、培養細胞中に蓄積した脂肪の状態を観察するために、前記培養条件で別途に培養し、培地を除き、細胞をＰＢＳ１ｍＬで洗浄後、１０％中性ホルマリン溶液（キシダ化学（株）製、試薬）５００μＬを用いて２時間固定した。次いで、ホルマリン溶液を除き、細胞を水洗し、オイルレッドＯ溶液（オイルレッドＯ（シグマ社製、試薬）を０．３５％（ｗ／ｖ）濃度になるようにイソプロパノールに溶解した原液と純水を６：４の割合で混合し、１０分間放置後フィルター濾過したもの）を２００μＬ添加後、１時間染色した。この後、オイルレッドＯ溶液を除き、水洗し、検鏡した。【００３９】この結果を表１に示す。同表において、数値は同時に実施した対照試験（試料を添加しない場合）の値を１００としたときの相対値で示した。表１のデータから、本発明に係る脱脂物の水性成分には脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制する作用があること、又、この作用は前記脱脂物を加熱して常圧下又は加圧下で水抽出した場合、加熱下で含水エタノール抽出した場合に顕著なものとなることを確認した。このことは、前述の脂肪染色検体の顕微鏡観察結果からも裏付けられた。【００４０】
【表１】
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【００４１】参考試験例１：食事性脂肪の吸収阻害作用
３週齢のＩＣＲ系雌性マウス（日本クレア（株）から購入）を温度及び湿度の管理下、１２時間明暗サイクルで、餌料（日本クレア（株）製、ＣＥ−２）及び飲用水を自由摂取させて１週間予備飼育した。この時点の全平均体重（ｇ）は１６．１±１．８（標準誤差）であった。この後、１群１４匹として高脂肪食餌料を８週間にわたり自由摂取させ、常法によりエーテル麻酔下で屠殺し、体重測定し、血漿中及び肝臓組織中の中性脂質量をそれぞれ測定した。ここで、対照群の高脂肪食餌料の組成は牛脂：４０部、カゼイン：３６部、コーンスターチ：１０部、砂糖：９部、ミネラル混合物（オリエンタル酵母（株）製、ＡＩＮ−７６）：４部、及びビタミン混合物（オリエンタル酵母（株）製、ＡＩＮ１９７７）：１部とし、試料添加群の場合は前記高脂肪食餌料のコーンスターチの一部を試料（試料１、試料３、試料４又は試料５とし、添加量は５％。）で置き換えた餌料とした。肝臓中の中性脂質含量は、摘出した肝臓組織の一部（０．５ｇ）をクレブス・リンガーのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４．５ｍＬ中でホモジナイズし、該ホモジネート０．２ｍＬをクロロホルム／メタノール（２／１：容量比）４ｍＬで抽出した後、窒素雰囲気下で濃縮、脱溶媒して抽出物を得、これを測定用サンプルとしてトリグリセリドＥテストキット（和光純薬工業（株）製）を用いて測定した。血漿中の中性脂質含量も同様にして測定した。【００４２】この結果を表２に示す。同表において、数値は平均値±標準誤差を表わす（ｎ＝１４、ＡＮＯＶＡ統計処理）。尚、本試験の対象群及び試料添加群に摂取エネルギー量に有意差は認められなかった。表２のデータから、高脂肪食餌料を摂取した対照群と比べて試料添加群では体重増加量が有意に少なく、肝臓組織及び血漿中の中性脂肪含量も顕著に減少することが明らかになった。このことから、本発明に係る試料を摂取することにより食事に由来する脂肪の吸収が抑制されること及び体脂肪の代謝（燃焼）が促進されることが示唆され、本試験結果は後述する参考試験例２の結果を併せ考えると特に前者の寄与が大きいものと判断した。【００４３】
【表２】
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【００４４】参考試験例２：体脂肪の燃焼促進作用
３週齢のＩＣＲ系雌性マウス（日本クレア（株）から購入）を温度及び湿度の管理下、１２時間明暗サイクルで、餌料（日本クレア（株）製、ＣＥ−２）及び飲用水を自由摂取させて１週間予備飼育した後、参考試験例１に記載の高脂肪食餌料を自由摂取させて８週間飼育した。予備飼育後及び高脂肪食飼育後の全平均体重（ｇ）はそれぞれ１６．３±１．８（標準誤差）及び３８．５±３．２（標準誤差）であった。この後、１群１４匹として低脂肪食餌料を４週間にわたり自由摂取させ、常法によりエーテル麻酔下で屠殺し、体重測定し、血漿中及び肝臓組織中の中性脂質量をそれぞれ測定した。ここで、対照群の低脂肪食餌料の組成はコーンスターチ：６５部、カゼイン：２５部、精製大豆油：５部、セルロース：５部、ミネラル混合物（オリエンタル酵母（株）製、ＡＩＮ−７６）：４部、及びビタミン混合物（オリエンタル酵母（株）製、ＡＩＮ１９７７）：１部とし、試料添加群の場合は前記低脂肪食餌料のコーンスターチの一部を試料（試料１、試料３、試料４又は試料５とし、添加量は５％。）で置き換えた餌料とした。肝臓中及び血漿中の各中性脂質含量の測定は、参考試験例１に記載の方法で行った。【００４５】この結果を表３に示す。同表において、数値は平均値±標準誤差を表わす（ｎ＝１４、ＡＮＯＶＡ統計処理）。尚、本試験の対象群及び試料添加群に摂取エネルギー量に有意差は認められなかった。表３のデータから、低脂肪食餌料を摂取した対照群と比べて試料添加群では体重減少量が有意に多く、肝臓組織及び血漿中の中性脂肪含量も顕著に減少することが明らかになった。このことから、本発明に係る試料を摂取することにより食事に由来する脂肪の吸収が抑制されること及び体脂肪の代謝（燃焼）が促進されることが示唆され、本試験結果は前述した参考試験例１の結果を併せ考えると特に後者の寄与が大きいものと判断した。【００４６】
【表３】
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【００４７】試作例１
本発明の脂肪蓄積抑制剤としての試料１〜試料５のいずれか１種をカプセル充填機に供して、常法により１粒あたり内容量が１７５ｍｇのゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。その他の試料についても同様に処理して５種類のゼラチン被覆ハードカプセル製剤を試作した。これらのカプセル製剤は経口摂取が可能な栄養補助食品、医薬品等として利用できる。【００４８】試作例２
本発明の脂肪蓄積抑制剤としての試料３：３０部、グアバ葉抽出物（ビーエイチエヌ（株）製）：０．５部、α−リポ酸（カーギル社製）：５部、コーンスターチ（日本コーンスターチ（株）製）：１００部、リン酸三カルシウム（米山化学工業（株）製）：５０部及びリボフラビン（ＤＳＭニュートリション・ジャパン（株）製）：７部を混合機に仕込み、１０分間攪拌混合した。この混合物を直打式打錠機に供して直径７ｍｍ、高さ４ｍｍ、重量１５０ｍｇ／個の素錠を作成し、ついでコーティング機でシェラック被膜を形成させて錠剤形状の食品を試作した。【００４９】試作例３
市販のグレープフルーツジュース１Ｌに本発明の脂肪蓄積抑制剤としての試料４を１０ｇ加えて十分に混合し均質なグレープ風味飲料を試作した。これは冷蔵庫で３週間保存しても外観及び風味に異状及び違和感は認められなかった。尚、本品は、生体組織の脂肪細胞における脂肪の蓄積を抑制するためのものである旨の表示を付することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】本発明の、ツバキ科ツバキ属に属するツバキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）の実及び／又は種子の水性成分を有効成分として含有してなる脂肪蓄積抑制剤は、これを経口摂取することにより生体組織の脂肪細胞における脂肪の蓄積抑制等の作用を有するため、肥満症状を予防及び／又は改善するための飲食品、医薬品、医薬部外品、飼料等に有効利用できる。