(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子発現において、改良された発現および送達のシステムの提供。【解決手段】（ａ）複製能力を破壊することなく、構造タンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列の一部を置換する発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができるフラビウイルス起源のレプリコンであって、フラビウイルスコアタンパク質コード領域の少なくとも一部が存在するレプリコンと、（ｂ）該レプリコンを感染性フラビウイルス様粒子にパッケージングするのに必要なフラビウイルス構造タンパク質を発現することができる少なくとも第２のベクターとを含み、該レプリコンが存在する場合、そのベクターが該レプリコンとの組換えを防ぐように設計されていることを特徴とする遺伝子発現および送達のシステム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複製能力を破壊することなく、構造タンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列の一部を置換する発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができるフラビウイルス起源のレプリコンであって、フラビウイルスコアタンパク質コード領域の少なくとも一部が存在するレプリコンと、
（ｂ）該レプリコンを感染性フラビウイルス様粒子にパッケージングするのに必要なフラビウイルス構造タンパク質を発現することができる少なくとも第２のベクターと
を含み、
該レプリコンが存在する場合、そのベクターが該レプリコンとの組換えを防ぐように設計されていることを特徴とする遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２】
上記フラビウイルス起源のレプリコンが、フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要な、フラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列と、上記フラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域の一部または全てと、フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルス３'ＵＴＲの一部またはすべてとを含む、請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項３】
上記レプリコンがフラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）および上記フラビウイルスコアタンパク質の５'コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドを含有する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項４】
上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、クンジンウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）、およびクンジンウイルスコアタンパク質の５'コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドを含有する、請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項５】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が構造タンパク質コード領域内に挿入することができる、請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項６】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、その３'末端に終止コドンと内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列とを有する請求項１に記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項７】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、その３'末端に、フット・アンド・マウス病ウイルスの２Ａオートプロテアーゼ配列を有する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項８】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、その５'末端にマウスユビキチン配列を有する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項９】
上記レプリコンが、フラビウイルス３'非翻訳領域（ＵＴＲ）の下流に、肝炎デルタウイルスの抗ゲノムリボザイムとＳＶ４０ポリアデニル化信号とを含む配列カセットを含有する請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１０】
上記レプリコンがＲＮＡに基づくベクター内にある請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１１】
上記レプリコンが、バクテリオファージのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、該レプリコン配列の上流に対応するバクテリオファージプロモータを取り込んでいるプラスミドＤＮＡからインビトロ転写反応において産生されたＲＮＡに基づくベクター内にある、請求項１０記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１２】
上記レプリコンがＤＮＡに基づくベクター内にある請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１３】
上記レプリコンが、該ベクターが、細胞性のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより、細胞中で該レプリコンの上流に哺乳動物発現プロモーターを取り込んでいるプラスミドＤＮＡからレプリコンＲＮＡを製造することができるＤＮＡに基づくベクター内にある、請求項１２記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１４】
上記レプリコンが単一のフラビウイルス種に由来する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１５】
上記レプリコンがクンジンウイルスに由来する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１６】
上記第２のベクターがレプリコンの起源間で異種である請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１７】
上記第２のベクターが、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、牛痘ウイルスからなる群から選択されるウイルスに由来する請求項１６記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１８】
上記第２のベクターがＤＮＡ発現カセットを哺乳動物細胞へ送達するのに適したバクロウイルスに由来する請求項１６記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項１９】
上記第２のベクターがプラスミドＤＮＡに由来し、哺乳動物細胞において遺伝子の一時的な発現、連続的な発現、または誘導性の発現を可能とする、請求項１６記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２０】
上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、上記第２のベクターがセムリキ森林熱ウイルスに由来する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２１】
上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、上記第２のベクターがシンドビスウイルスに由来する請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２２】
上記レプリコンが、フラビウイルスゲノムの少なくとも最初の１５０ヌクレオチドと、Ｅタンパク質の少なくとも最後の６０ヌクレオチドと、非構造タンパク質コード領域と、３'非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部またはすべてとの一部またはすべてを含むのに適した請求項１記載の遺伝子発現達および送達のシステム。
【請求項２３】
上記レプリコンが、クンジンウイルスゲノムの最初の１５７ヌクレオチドと、Ｅタンパク質の最後の６６ヌクレオチドと、全ての非構造タンパク質コード領域と、３'非翻訳領域（ＵＴＲ）のすべてとの一部またはすべてを含むのに適した請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２４】
上記レプリコンがフラビウイルスコアタンパク質を除くすべてのフラビウイルス構造タンパク質をコードし、上記の第２のベクターがクンジンウイルスのＣタンパク質をコードするセムリキ森林熱ウイルス由来の発現ベクターである請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２５】
上記レプリコンがフラビウイルスコアタンパク質をコードし、上記の第２のベクターがクンジンウイルスのｐｒＭＥタンパク質をコードするセムリキ森林熱ウイルス由来の発現ベクターである請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２６】
上記レプリコンがいずれのフラビウイルス構造タンパク質もコードせず、上記の第２のベクターがクンジンウイルスのｐｒＭＥタンパク質及びＣタンパク質をコードするセムリキ森林熱ウイルス由来の発現ベクターおよびクンジンウイルスのコアタンパク質の最初の１０５個のアミノ酸をコードするセムリキ森林熱ウイルス由来の発現ベクターである請求項１記載の遺伝子発現および送達のシステム。
【請求項２７】
（ｉ）複製能力を破壊することなく、構造タンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列の一部を置換する発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができるフラビウイルス起源のＤＮＡに基づくレプリコンまたはＲＮＡに基づくレプリコンであって、フラビウイルスコアタンパク質コード領域の少なくとも一部が存在するレプリコンを細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）細胞増殖およびＲＮＡ複製を可能とする条件下でその細胞系を培養するステップと
を含むレプリコンＲＮＡを永続的に生産することができる安定な細胞系の生産方法。
【請求項２８】
（ｉ）複製能力を破壊することなく、構造タンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列の一部を置換する発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができるフラビウイルス起源のＤＮＡに基づくレプリコン、またはＲＮＡに基づくレプリコンであって、フラビウイルスコアタンパク質コード領域の少なくとも一部が存在するレプリコンを含む自己複製ベクターを細胞に導入するステップと、
（ｉｉ）自己複製発現ベクターをフラビウイルスのウイルス性粒子にパッケージングするのに必要なフラビウイルス構造タンパク質を発現することができる第２のベクターをレプリコン含有細胞に導入するステップであって、該第２のベクターは、自己複製ベクターが存在する場合、自己複製ベクターとの組換えを妨げるように設計されているステップと、
（ｉｉｉ）該レプリコンを含有するウイルス様粒子を回収するステップと
を含むフラビウイルス様粒子の生産方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により製造されたフラビウイルス様粒子。
【請求項３０】
上記粒子が、ＤＮＡに基づくレプリコンベクターと、ＲＮＡに基づくレプリコンベクターとからなる群から選択されるベクター由来のレプリコンを含有する請求項２９記載のフラビウイルス様粒子。
【請求項３１】
フラビウイルス起源のＤＮＡに基づくレプリコンベクターであって、該ベクターが、（ａ）その複製能力を破壊することなく、構造タンパク質コード領域をコードするヌクレオチド配列の一部を置換する発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができるフラビウイルス起源の相補的なＤＮＡ配列であって、フラビウイルスコアタンパク質コード領域の少なくとも一部が存在するレプリコンを含むＤＮＡ配列と、（ｂ）フラビウイルス起源の相補的なＤＮＡ配列に対し５'位にある哺乳動物発現プロモーターと、（ｃ）レプリコンＲＮＡの正確な３'末端とともに転写を終了させることができる少なくとも第二のヌクレオチド配列とを含み、
上記プロモーターと上記第二のヌクレオチド配列とが、トランスフェクトされた細胞の核の中で、フラビウイルスＲＮＡの転写を促進および終了することが可能であるフラビウイルス起源のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３２】
上記相補的なＤＮＡ配列が、フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要な、フラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルス３'ＵＴＲの一部または全部とを含む、請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３３】
上記哺乳類発現プロモーターが、サイトメガロウイルス初期エンハンサープロモーターである請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３４】
上記レプリコンが、その３'末端に、レプリコンＲＮＡを正確な３'末端とともに効率的に複製するのに必要な肝炎デルタウイルスの抗ゲノムリボザイムまたはサルウイルス４０ポリアデニル化シグナルカセットを含有する請求項３１のいずれかに記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３５】
上記レプリコンが、フラビウイルス５'ＵＴＲに相補的なＤＮＡ配列と、上記フラビウイルスコアタンパク質の５'コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドとを含有する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３６】
上記レプリコンが、クンジンウイルスに由来し、クンジンウイルス５'ＵＴＲに相補的なＤＮＡ配列と、クンジンウイルス５'コアタンパク質コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドとを含有する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３７】
フラビウイルス非構造タンパク質のプロセッシングおよびＲＮＡ複製に影響を与えないレプリコン中のいずれの点においても、発現可能な異種ヌクレオチド配列を挿入することができる、請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３８】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列がレプリコンの３'ＵＴＲに挿入可能である請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項３９】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が構造タンパク質コード領域内に挿入可能である請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４０】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、構造タンパク質コード領域の一部または全てを置換するように挿入可能である、請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４１】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列につづいて、終止コドンと内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列とが存在する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４２】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、その３'末端にフット・アンド・マウス病ウイルスの２Ａオートプロテアーゼ配列を有する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４３】
上記発現可能な異種ヌクレオチド配列が、その５'末端にマウスユビキチン配列を有する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４４】
レプリコンが単一のフラビウイルス種に由来する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４５】
レプリコンがクンジンウイルスに由来する請求項３１記載のＤＮＡに基づくレプリコンベクター。
【請求項４６】
増強された特異的感染力を有するフラビウイルス起源のウイルス様粒子を産生する方法であって、
（ｉ）フラビウイルス起源のレプリコンのＤＮＡコピーから１または複数の増幅産物を得るステップと、
（ｉｉ）上記１または複数の増幅産物から、増強された特異的感染力を有するフラビウイルス起源のレプリコンをコードする少なくとも１を選択するステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で得られたフラビウイルス起源のレプリコンを、ステップ（ｉ）で得られたフラビウイルス起源のレプリコンをパッケージングすることで得られるウイルス様粒子と比較して、より増強された特異的感染力を有するウイルス様粒子へとパッケージングするステップと
を含む方法。
【請求項４７】
フラビウイルス起源のウイルス様粒子の特異的感染力が、少なくとも１０3ＰＦＵ／μｇ  ＲＮＡに等しい、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
増強された複製効率を有するレプリコンを産生する方法であって、
（ｉ）フラビウイルス起源のレプリコンのＤＮＡコピーから１または複数の増幅産物を得るステップと、
（ｉｉ）上記１または複数の増幅産物から、ステップ（ｉ）で増幅されたフラビウイルス起源のレプリコンと比較して、増強された複製効率を有するフラビウイルス起源のレプリコンをコードする少なくとも１を選択するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
上記フラビウイルス起源のレプリコンが、クンジンウイルスレプリコンである、請求項４６，４７または４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、遺伝子発現の分野、特にフラビウイルス遺伝子発現および送達のシステムならびにこのようなシステムによって生産されたウイルス様粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換え遺伝子発現を最大化する方法の改良のために、当業者によって絶え間無い努力がなされている。特に興味深いのは、商業的に有用な量の生物学的に活性なタンパク質を生産するのに適した安全なベクターにおいて、哺乳類動物遺伝子の組換え発現を最大化する方法の開発である。
【０００３】
現在、遺伝子の発現で利用することができる多数の発現システムがある。原核生物および酵母発現システムは使用するのにおおいに効果的で、容易であるが、これらの発現システムは、タンパク質をグリコシル化できないこと、タンパク質からの「プレ」または「プレプロ」配列の効果的でない切断（例えば、効果的でない翻訳後修飾）、およびタンパク質を一般的には分泌できないことを含めた、多数の不利な点がある。
【０００４】
広く利用することができるもう一つの発現システムはバクロウイルス発現システムである。この系は、論証上、タンパク質生産の最も効果的なもののひとつであるが、昆虫細胞系での使用に限定されている。あいにく、昆虫細胞系は哺乳動物細胞系とは異なってタンパク質をグリコシル化し、従って、この系は多くの哺乳動物タンパク質の生産で有用であることは証明されていない。この系のもうひとつの不利な点は、それが組換えウイルスストックの構築のために異種組換えを用いることである。従って、非常に多数の遺伝子変異体を分析しなければならない場合、この系はしばしば非常に労力を要する。
【０００５】
これらの問題に鑑みて、先行技術は哺乳動物タンパク質生産のために、真核生物宿主系、典型的には、哺乳動物宿主細胞系を必要としてきた。このような系のひとつの特徴は、生産されたタンパク質が天然のタンパク質種と非常に似た構造を有し、タンパク質は生物学的に活性な形態で培養培地に分泌させることができるので、たいていは精製が容易であるということである。
【０００６】
最も効果的な哺乳動物細胞系発現システムのうちのひとつはワクシニアウイルスに基づいている。しかし、この系に関する主な問題は、この系が感染に際して、異種遺伝子を発現する組換えウイルスを使用することである。従って、いったんそれが放出されると当該ウイルスに対しては制御できない。
【０００７】
最近、研究者は、インビトロおよびインビボでの異種遺伝子の発現のためのベクターとして、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ），シンドビス（ＳＩＮ）ウイルス、およびポリオウイルスのごとき正の鎖（positive strand）のＲＮＡウイルスの使用を開発し始めた。これらの発現システムの成功は、主として、構造タンパク質によってパッケージングされた組換えレプリコンＲＮＡを含有する「偽」感染性粒子の高力価ストックを生産する各ウイルスの能力に基づいてきた。商業的に入手可能なセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）およびシンドビスウイルス発現システムにおいて、レプリコンＲＮＡと、構造遺伝子を発現するがパッケージングシグナルを欠く欠陥ヘルパーＲＮＡとの、同時形質移入によって達成される。レプリコンＲＮＡの発現は、ＲＮＡ複製用の酵素および両ＲＮＡの転写を提供し、ヘルパーＲＮＡは、そのサブゲノム領域の発現を介してレプリコンＲＮＡのパッケージングのための構造タンパク質の生産を支持する。これらの発現システムに関する主要な問題は、発現システムで使用されるウイルスが病原体であって、しばしば宿主タンパク質合成と競合することである。これらの系におけるもうひとつの主な不利な点は、レプリコンおよびヘルパーＲＮＡの間の組換えの確立が高いために起こる、パッケージングされた全長ゲノムＲＮＡ（換言すれば感染性ウイルス）を含有する感染性粒子とのコンタミネーションの可能性を含むことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は先行技術系に関連する問題のいくつかを少なくとも緩和する、改良された発現および送達のシステムを提供することを目的とする。
【０００９】
特記しない限り、本明細書を通じて、用語「含む（comprise）」、「含む（comprises）」または「含んでいる（comprising）」のような変形は述べられた整数または整数の群を含めることを意味すると理解されるが、方法工程を含めたいずれの他の整数または整数の群も排除されない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、（ａ）その複製能力を破壊することなく少なくともヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンと、（ｂ）フラビウイルス構造タンパク質および自己発現ベクターをフラビウイルスのウイルス粒子にパッケージングするのに必要ないずれかの他のタンパク質を発現できる少なくとも第２のベクターを含み、ここに、該第２ベクターが存在する場合、該ベクターが該自己複製ベクターとの組換えを防ぐように設計されていることを含む、遺伝子発現システムを提供する。
【００１１】
いずれのフラビウイルスＲＮＡに由来するいずれのレプリコン（自己複製発現ベクター）も本発明で用いることができる。しかしながら、レプリコンは十分な量のフラビウイルス５'ＵＴＲおよびコアタンパク質についての５'フラビウイルスコード領域の少なくとも一部をコードすべきであり、その各々はＲＮＡ複製に必要である。フラビウイルスゲノムの５'ＵＴＲおよび５'コアタンパク質コード領域は共にフラビウイルスＲＮＡ複製に必要な調節エレメントを含有する。フラビウイルス５'ＵＴＲおよび５'コアタンパク質コード領域はこれらの領域で突然変異または欠失を含有することができ、依然として複製することができるのが認識されよう。好ましくは、レプリコンはフラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域からの少なくとも約６０および８０の間のヌクレオチドを含有すべきである。ＲＮＡ複製のためのレプリコンで必要な５'コアタンパク質コード領域からのヌクレオチドの相対的な数は、ベクターで使用されるフラビウイルスのタイプに大いに依存するであろう。例えば、レプリコンがクンジンウイルスに由来する場合、それは５'コアタンパク質コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドを含有しなければならない。
【００１２】
本発明のひとつの特別の実施例において、（ａ）フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要である、フラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルス３'ＵＴＲの３'末端配列の一部またはすべてとを含むフラビウイルス起源のレプリコンであって、該レプリコンベクターがその複製能力を破壊することなく少なくともヌクレオチド配列を受容するのに適することと、（ｂ）フラビウイルス構造タンパク質およびフラビウイルスのウイルス粒子に自己複製発現ベクターをパッケージングするのに必要ないずれかの他のタンパク質を発現できる第２のベクターであって、該第２のベクターはそれが存在する場合、自己複製ベクターとの組換えを防ぐように設計されていることを含む遺伝子発現システムが提供される。
【００１３】
本発明によると、フラビウイルス起源のレプリコンは少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適する。このようなヌクレオチド配列のレプリコンへの挿入は、フラビウイルスタンパク質のプロセッシングを行わないレプリコンのいずれかの点においても達成することができる。例えば、構造遺伝子内または欠失された構造遺伝子の箇所内にて、異種遺伝子をフラビウイルスレプリコンの３'ＵＴＲに挿入することができる。好ましくは、欠失された構造遺伝子の代わりに異種遺伝子を構造遺伝子に挿入する。これは、そのような挿入は一般に、より高いレベルの発現を生じ、一般にレプリコンの複製効率に影響しないからである。しかし、もしヌクレオチド配列が３'ＵＴＲに挿入されれば、それらは内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列が先行してもよい。本発明の実施例において、３'ＵＴＲはＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（ネオマイシントランスフェラーゼ）またはＩＲＥＳ−ｐａｃ（ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）配列でのみ使用される。このような挿入は、抗生物質（例えば、ゲノチシンまたはピューロマイシン）選択を介して外来性遺伝子を永続的に発現する安定な細胞系の創製を可能とする。
【００１４】
本発明のもう１つの好ましい実施例において、ａ）フラビウイルス５'ＵＴＲについてのヌクレオチド配列と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'ヌクレオチドコード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質についてのヌクレオチドコード領域と、該ゲノム物質の自己複製に必要なフラビウイルス３'ＵＴＲの全てまたは一部の３'末端領域と、フラビウイルス構造タンパク質についてのヌクレオチドコード配列とを含むフラビウイルス起源のレプリコンであって、（ｉ）該レプリコンベクターは当該ベクターの複製能力を破壊することなく少なくともヌクレオチド配列を受容するのに適し、（ｉｉ）該ヌクレオチド配列は、フラビウイルス構造タンパク質についてコードするであろう少なくとも遺伝子の発現の脱活性化するように該ベクターに挿入され、（ｉｉｉ）該挿入されたヌクレオチド配列は、それが脱活性化する構造タンパク質配列についてコードせず、（ｂ）（ｉ）レプリコンによって発現されないフラビウイルス構造タンパク質を発現することができ、（ｉｉ）第２のベクターが存在する場合、自己複製ベクターとの組換えを妨げるように設計されている少なくとも第２のベクターとを含む遺伝子発現システムが提供される。
【００１５】
ヌクレオチド配列がレプリコンに挿入される場合、それは、ベクターのコード配列のオープンリーディングフレームのフレームシフトを回避するようにベクターに挿入されるべきである。これは、外来性ヌクレオチド配列またはベクターを適合させて、ベクターコード配列のリーディングフレームが維持されていることを確認することによって達成される。代替配置において、外来性ヌクレオチド配列は、それにベクターの非構造タンパク質の翻訳の開始を保証する終止コドンおよび内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）が続くならば、ベクターのオープンリーディングフレームを保持することなく挿入することができる。
【００１６】
フラビウイルス構造タンパク質および非構造タンパク質をコードするレプリコンはＲＮＡまたはＤＮＡに基づくものであってよい。但し、それは自己複製でき、フラビウイルス構造および非構造タンパク質コーディング情報をコードするものとする。レプリコンがＲＮＡ配列である場合、フラビウイルスゲノムをまず相補的ＤＮＡ配列に転写する。次いで、ヌクレオチド配列を相補的ＤＮＡ配列に挿入し、次いで、宿主細胞への送達に先立ってゲノム配列を逆にＲＮＡに転写する。ベクターがＤＮＡに基づくものである場合、フラビウイルスゲノムをまず相補的ＤＮＡ配列に転写し、次いで、ヌクレオチド配列を転写された相補的配列に挿入し、次いで、相補的配列を宿主細胞に導入する。
【００１７】
レプリコンは多くの場合、フラビウイルスの一本鎖から調製されるが、ある状況では、１を超えるフラビウイルス株からのヌクレオチド配列を単一ベクター中に一緒にすることができる。好ましくは、レプリコンは単一フラビウイルス種のゲノム配列に由来するものである。最も好ましくは、レプリコンは（クンジンウイルス（ＫＵＮ）のごとき）単一フラビウイルス種に由来し、その株の全てまたは実質的に一部を含み、ゲノムはその構造タンパク質の少なくとも１において修飾されて、ヌクレオチド配列の構造タンパク質ヌクレオチド配列への挿入が構造タンパク質の一部または全てについてのコードを破壊するようにヌクレオチド配列を許容する。
【００１８】
レプリコンに挿入することができるヌクレオチド配列は、例えば、フラビウイルスまたは非フラビウイルスｃＤＮＡ遺伝子配列の一部を含む。しかしながら、レプリコンに挿入されるヌクレオチド配列は少なくとも構造タンパク質の発現を破壊しなければならず、従って、ウイルスゲノムのパッケージングを妨げる。望ましくは、挿入されたヌクレオチド配列は非フラビウイルスヌクレオチド配列（以後、「異種ヌクレオチド配列」という）である。異種ヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をコードする配列のみに限定されないが、アミノ酸配列をコードする配列の複製または発現を促進するのに適した配列を含むこともできる。
【００１９】
異種ヌクレオチド配列のレプリコンへの挿入は、フラビウイルス構造タンパク質のいずれの点においても、またはこのようなタンパク質が、タンパク質が欠失していない天然フラビウイルス配列で通常は発現されるであろうヌクレオチド配列のいずれの領域においても起こり得る。本発明の１つの実施例において、異種ヌクレオチド配列は、その遺伝子を脱活性化する構造遺伝子の少なくとも１つに挿入される。他の実施例において、少なくとも構造遺伝子がベクターから欠失され、欠失部位は異種遺伝子配列のための挿入部位として働くのに適する。最も好ましくは、ヌクレオチド配列は、少なくとも１の構造遺伝子が欠失された箇所に挿入される。
【００２０】
天然フラビウイルスの構造遺伝子についてコードしうるレプリコン中の、１以上の箇所内に異種ヌクレオチド配列を位置させることによって、レプリコンはウイルスパッケージングのための構造タンパク質を生産することができない。
【００２１】
ウイルスパッケージングを誘導するために、本発明は、レプリコン内の組換えを防ぐように設計された第２のベクターを使用する。好ましくは、第２のベクターはレプリコンの起源に対して起源が異種である。レプリコン内の組換えを防ぐように設計されたいずれの非フラビウイルスベクターも発現システムで使用して、レプリコン中で脱活性化されるフラビウイルス構造タンパク質を送達することができる。例えば、もしＫＵＮレプリコンを自己複製発現ベクターで使用するならば、第２のベクターはフラビウイルス以外のウイルスに由来するものであってもよい。例えば、第２のベクターはＳＦＶまたはＳＩＮのごときアルファウイルスに、あるいはアデノウイルス、鶏痘ウイルス、またはワクシニアウイルスのごときＤＮＡウイルスに由来するものであり得る。通常の当業者であれば、この役割に使用することができる他のベクターを知っているであろう。本発明の高度に好ましい形態において、レプリコンはＫＵＮに由来し、いっぽうＫＵＮのＲＮＡとＳＦＶのＲＮＡの間での組換えが不可能であることを考慮して、第２のベクターはＳＦＶに由来する。
【００２２】
本発明の別の実施例において、第２のベクターはプラスミドＤＮＡ発現ベクターであってもよい。例えば、高度に有効なパッケージングは哺乳動物細胞へのカセットの非常に効果的な送達を供するバクロウイルス発現ベクターに挿入されたＣＭＶに基づくＤＮＡ発現カセットに構造遺伝子を挿入することによって達成することができる（例えば、Ｓｈｏｊｉら、（１９９７） J. Gen. Virol, 78 :2657-2664およびpBacMam-1 vector discribed on the Novagen homepage）。他の例において、第２のベクターは誘導性プラスミドＤＮＡ発現ベクター（例えば、テトラサイクリン誘導性ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））であってよく、これはインキュベーション培地中のテトラサイクリンの添加または除去に応答してのＫＵＮ構造タンパク質を発現するパッケージング細胞系の選択を可能とする。
【００２３】
また、本発明は、ｉ）その複製能力を破壊することなく少なくともヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンを細胞に導入するステップと、（ｉｉ）細胞の増殖および複製を可能とする条件下で細胞系を培養するステップとを含む、永続的にレプリコンＲＮＡを生産できる安定な細胞系の生産方法を提供する。
【００２４】
細胞の増殖および複製を可能とする条件は当業者に知られている。特に、該条件は当該方法で使用される細胞のタイプに応じて変化するであろう。このような細胞系を調製するには、記載されたベクターは、好ましくは、ＩＲＥＳ−ＮｅｏまたはＩＲＥＳ−ｐａｃカセットを３'ＵＴＲに挿入することによって選択可能な形態で構築される。
【００２５】
他の実施例において、本発明は（ｉ）その複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンを細胞に導入するステップと、（ｉｉ）フラビウイルス構造タンパク質およびフラビウイルスのウイルス粒子へ自己複製発現ベクターをパッケージングするのに必要ないずれかの他のタンパク質を発現することができる第２のベクターをレプリコン含有細胞に導入するステップと、（ｉｉｉ）レプリコンの含有するウイルス様粒子を回収するステップとを含む、ここに記載されたレプリコンを含有するフラビウイルス様粒子を生産する方法を提供する。
【００２６】
好ましくは、本方法によって調製されたウイルス様粒子を含有するレプリコンは、動物に導入された場合に有害な免疫学的または生理学的反応を引き起こしうる細胞およびウイルスタンパク質ならびに核酸から精製される。このようなウイルス粒子を精製する方法は当業者に公知である。最も好ましくは、レプリコン含有ウイルス様粒子は、細胞およびウイルスタンパク質、脂質および核酸を含めたすべての汚染物質が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％存在しないことである。
【００２７】
さらなる実施例において、本発明は、その複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルスレプリコンを含有するフラビウイルス様粒子を提供する。のぞましくは、該ウイルス様粒子は、動物に導入された場合に、有害な免疫学的または生理学的反応を引き起こしうる細胞およびウイルス核酸ならびにアミノ酸配列から精製される。このような粒子は治療剤として使用することができる。当業者であれば、記載されたウイルス粒子を用いて、レプリコンに挿入された対象のいずれのヌクレオチド配列をも送達できることを認識するであろう。例えば、ウイルス様粒子内レプリコンを使用して、例えば、対象に対する保護免疫応答を誘導することができる１以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達することができる。
【００２８】
さらなる実施例において、本発明は、その複製能力を破壊することなく、少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適した、フラビウイルス起源のＤＮＡレプリコンを提供する。該ＤＮＡレプリコンは、裸のベクターとして（すなわち、フラビウイルス構造タンパク質はそれを包囲しない）、あるいは記載された方法に従って調製されたウイルス様粒子にて、細胞に導入することができる。ＤＮＡレプリコンが裸のベクターとして調製されたか、ウイルス様粒子中にて調製されたかにかかわらず、それは動物への導入へ先立って、その動物において有害な免疫学的または生理学的反応をひきおこしうる細胞およびウイルス核酸から精製されるべきである。このような粒子は治療剤として使用することができる。当業者であれば、レプリコンに挿入された対象のいずれかのヌクレオチド配列を使用するのに、記載されたウイルス粒子を用いることができるのを認識するであろう。本発明の特に好ましい形態において、レプリコンはＤＮＡ形態で調製され、ウイルス様粒子にて細胞に投与される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明はタンパク質を生産する方法を記載するが、用語「タンパク質」は、ペプチドおよびポリペプチド配列のようなタンパク質のその範囲部分内に含まれると理解されるべきである。
【００３０】
使用に際して、遺伝子発現およびタンパク質生産が起こる宿主細胞にレプリコンが導入される。ベクターは自己複製できるので、レプリコンの複数コピーもまた精製される。これは、宿主細胞におけるレプリコンの数の指数関数的増加ならびに生産されるタンパク質の量の指数関数的増加に導く。
【００３１】
ウイルス粒子を生産するのに必要な構造遺伝子を含有する第２のベクターの導入に際して構造タンパク質が生産される。これらのタンパク質は、もうひとつの細胞の内側で異種タンパク質を生産できるにすぎない「偽」組換えウイルスをその中で形成するレプリコンをカプセル化する。しかしながら、構造タンパク質の生産に必要な遺伝子は当該レプリコン中に設けられていないため、ウイルスは複製して新しいウイルス粒子を生産することができない。構造遺伝子を担うレプリコンおよびベクターの同時的な形質移入が起こる場合に、偽ウイルスストックが生産されるにすぎないからである。
【００３２】
本発明の使用に関連したいくつかの利点は以下のものを含む。（１）フラビウイルス発現システムは真核生物細胞系において比較的高レベルのタンパク質発現を有する。（２）フラビウイルス発現システムは、広く種々の哺乳動物細胞系および細胞タイプでタンパク質を発現することができる。（３）フラビウイルス発現システムで使用されるレプリコンは、宿主細胞において長期の非病理性複製を生じる。宿主の翻訳プロセスに対して観察可能な影響はない。またフラビウイルスレプリコンのこの特徴は、抗生物質（例えば、ネオマイシントランスフェラーゼ（Ｎｅｏ），ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）に対する抵抗性を確認する遺伝子を発現するレプリコンベクターを用いての、他の遺伝子を継続的に発現する安定な細胞系の選択を可能とする。（４）フラビウイルス発現システムは、宿主のゲノム配列へのウイルスゲノム物質の組込を行わないＲＮＡ系である。
【００３３】
フラビウイルスの複製は他のウイルスとはかなり異なる。例えば、フラビウイルスは、それらのゲノム構造（ゲノムの５'末端に位置した構造遺伝子）によって、およびサブゲノムＲＮＡの合成の不存在によって、（ＳＦＶおよびＳＩＮのような）アルファウイルスとは異なる。さらに、現在、フラビウイルスＲＮＡのパッケージングについてのデータはない。
【００３４】
哺乳動物細胞発現システムの開発における実質的な進歩が過去１０年間でなされ、これらの系の特徴の多くの態様が十分に評価された。有用な細胞系、タンパク質発現−促進配列、マーカー遺伝子、遺伝子増幅方法を含めた、哺乳動物細胞における外来性タンパク質の生産の技術水準についての詳細な総説は、Bendig, M., (1998)Genetic Engineering 7:91-127に開示されている。
【００３５】
少なくとも１の構造遺伝子を欠き、少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したいずれかのフラビウイルスＲＮＡに由来するいずれのレプリコンも、本発明で使用されることが認識されよう。好ましくは、本発明で使用されるレプリコンは以下の、フラビウイルスゲノムの少なくとも約最初の１５０ヌクレオチドと、Ｅタンパク質少なくとも約最後の６０ヌクレオチドと、非構造領域の実質的にすべてと、３'ＵＴＲの一部またはすべてとのうちの一部またはすべてを含むように適合させるべきである。フラビウイルスゲノムの複製は、転写および翻訳の間に存在するゲノムの非構造領域中の遺伝子に依存する。好ましくは、非構造領域になされたいずれの修飾も、ゲノムの非構造領域内の遺伝子の機能的活性に干渉すべきでない。本発明の高度に好ましい形態において、レプリコンはＫＵＮに由来し、ＫＵＮゲノムの最初の１５７ヌクレオチドと、Ｅタンパク質の最後の６６ヌクレオチドと、全非構造領域と、３'ＵＴＲとのすべてを含む。
【００３６】
真核生物細胞への形質移入のための最適なフラビウイルスレプリコンの設計は、適当な転写開始、終止、およびエンハンサー配列を含めた、注目する異種遺伝子の発現を促進するための配列と、コザックコンセンサス配列のごとく翻訳効率を増強する配列と、ピコルナウイルスの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）と、アルファウイルスレプリコンＲＮＡを用いるのであれば挿入された遺伝子の発現を増強するためのアルファウイルスサブゲノム２６Ｓプロモーターとを含むであろう。
【００３７】
従って、ヌクレオチド配列をレプリコン中のフラビウイルス調節機構制御下におくことができるが、別法として、発現を促進することができる１以上の別の調節エレメントによって制御することができる。そのようなエレメントは当業者によく知られているであろう。本発明のひとつの例において、レプリコンはＱＵＮウイルスに由来し、ＫＵＮ  ５'ＵＴＲの上流の（ＣＭＶまたはハイブリッドＣＭＶエンハンサー−ニワトリβアクチンプロモーター「ＣＡＧ」のような）真核生物プロモーター配列、およびＳＶ４０に続くデルタウイルスリボザイム配列、ウシ成長ホルモン、またはＫＵＮ  ３'ＵＴＲの下流にあるウサギβグロビン転写ターミネーター配列を含有する。細胞中で得られたプラスミドＤＮＡの形質移入は、その効果的な複製で好ましい、細胞ＲＮＡポリメラーゼIIによるオーセンティック５'末端、およびデルタウイルスリボザイムによって切断されたオーセンティック３'末端を持つＫＵＮレプリコンＲＮＡ転写体の生産を保証するであろう。
【００３８】
レプリコンに挿入されたヌクレオチド配列は、その中にヌクレオチド配列が挿入された構造タンパク質配列、またはその代わりにヌクレオチド配列が挿入された構造タンパク質配列を除き、いずれかの天然タンパク質または組換えタンパク質の一部またはすべてをコードできることが認識されよう。例えば、ヌクレオチド配列は、当該配列の各々がアミノ酸配列として発現した場合に、それらの同一性を保持するように、単一のポリペプチド配列または一緒に連結させた複数の配列をコードすることができる。ヌクレオチド配列が複数のペプチドをコードする場合、該ペプチドは、発現された場合に各々がその同一性を保持するように一緒に連結するべきである。このようなポリペプチドは、別々のポリペプチドまたはペプチド配列が得られるように作成された融合タンパク質として生産することができる。
【００３９】
ベクターを用いてヌクレオチド配列を宿主細胞に送達して、免疫原性ポリペプチドの宿主細胞発現を可能とする場合、該ヌクレオチド配列は、Ｔ細胞活性に寄与するある範囲のエピトープと組み合わせた１以上の免疫原性ポリペプチドをコードすることができる。このような状況において、異種ヌクレオチド配列は、好ましくは、Ｔヘルパー細胞応答または細胞抑制Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答のいずれかあるいは双方を誘導することができるエピトープをコードする。
【００４０】
本明細書に記載するレプリコンは、免疫応答の生成を増強させるサイトカインまたは他のイムノモジュレーターと共に複数の抗原を同時発現させるように、複数のタンパク質ヌクレオチド配列を発現するように作成することもできる。このようなレプリコンは、同時にまたは遺伝子治療適用において、例えば、種々のタンパク質の生産で特に有用であろう。
【００４１】
その例として、ヌクレオチド配列のみが、以下のｃＤＮＡ配列の１以上をコードすることができる。配列は次の通りである。マラリア表面抗原、ベータガラクトシダーゼ、主要抗原性ウイルス抗原（例えば、インフルエンザウイルスからのヘマグルチニン、またはＨＩＶ ｇｐ１２０およびＨＩＶ ｇａｇタンパク質、またはその一部からのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ））、哺乳動物ポリペプチドのような真核細胞ポリペプチド（例えばキモシンまたはガストリックリパーゼのような酵素、例えばメタロプロテイナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）のような酵素阻害剤、例えば成長ホルモンのようなホルモン、例えばインターフェロンのようなリンホカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６など）のようなサイトカイン、例えばマクロファージ炎症性タンパク質２のようなケモカイン、例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）またはプロウロキナーゼのようなプラスミノーゲンアクチベーター）、または抗体−酵素または抗体−トキシンキメラのごとき二重の活性を有するキメラ免疫グロブリンを含む、天然の修飾された、またはキメラの免疫グロブリンまたはその断片。
【００４２】
また、ヌクレオチド配列は発現させるべきタンパク質の効果を増強させるように働く１以上のアミノ酸配列をコードすることができる。例えば、ＤＮＡベクターから発現されたウイルスタンパク質のユビキチン化の結果、免疫化後に細胞毒性Ｔリンパ球誘導および抗ウイルス保護が増強される。従って、本発明の好ましい実施例において、レプリコンは、発現させるべきタンパク質と組み合わせてユビキチンをコードすることができ、従って、効果的なプロセッシングおよびＭＨＣクラスＩ複合体のためのプロテオソームに対して得られた融合タンパク質を標的化する。
【００４３】
フラビウイルスレプリコンがコードしたタンパク質以外のタンパク質のユビキチンのＣ末端へのインフレーム融合の結果、ユビキチンの最後のＣ末端残基後でこのような融合タンパク質が効果的に切断され、従って、注目する遊離タンパク質を放出する。好ましくは、ユビキチン配列はレプリコンベクターに挿入される。その例として、ユビキチン配列のみが、好ましくは、異種遺伝子配列の５'末端の前にあるいは異種遺伝子配列の３'末端にて挿入される。
【００４４】
フラビウイルス構造遺伝子を含有する第２のベクターは、自己複製発現ベクターとの組換えを防ぐように設計すべきであろう。この目的を達成するひとつの手段は、自己複製発現ベクターの起源に対して起源的に異種である遺伝子物質から第２のベクターを調製することである。例えば、第２のベクターは、レプリコンがＫＵＮウイルスから調製される場合、ＳＦＶから調製することができる。
【００４５】
フラビウイルス構造遺伝子の発現を最適化するには、第２のベクターは適当な転写開始、終止、およびエンハンサー配列を含めた注目する遺伝子の発現を促進する配列、ならびにコザックコンセンサス配列のごとき翻訳効率を促進する配列のような配列を含む。好ましくは、第２のベクターはベクターによって発現された異なる構造遺伝子の各々と組み合わせた別々の調節エレメントを含有する。最も好ましくは、フラビウイルスＣ遺伝子およびｐｒＭＥ遺伝子は、ベクター中の別々の調節エレメントの制御下におく。
【００４６】
細胞中のウイルス複製の間のフラビウイルス構造タンパク質のプロセッシングは複雑であって、宿主およびウイルスプロテアーゼによる多数の翻訳後切断を要する。Ｃ−ｐｒＭ領域のプロセッシングについての多数のイン・ビトロおよびイン・ビボ実験は、ふたつの切断事象、つまり成熟ビリオンＣタンパク質のカルボキシ末端を生じるウイルスＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼによる二塩基性切断部位における切断を確立し、これは細胞シグナラーゼによってｐｒＭのＮＨ2末端での効果的な切断の前提要件のようである。フラビウイルスの非構造領域を形成する遺伝子の発現の間にレプリコンによってウイルスプロテアーゼが発現される場合、第２のベクターはウイルスＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼをコードする遺伝子を含むようにも適用できることが認識されよう。
【００４７】
自己切断されたペプチドによって分離されたＣおよびｐｒＭ遺伝子が、例えば、フット・アンド・マウス病の２Ａ自己プロテアーゼを好んで、ＫＵＮウイルスがコードしたＮＳ２Ｂ−ＮＳ３プロテアーゼの不存在下でＣ−ｐＭ領域の適当なプロセッシングを保証する場合のみ、さらなるＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子は単一カセットとして発現させることができる。
【００４８】
また、本発明はレプリコンＲＮＡを永続的に生産することができる安定な細胞系を提供する。このような細胞系を調製するには、ＩＲＥＳ−ＮｅｏまたはＩＲＥＳ−ｐａｃカセットを３'ＵＴＲに挿入することによって、記載されたベクターは好ましくは選択可能な形態で構築される。
【００４９】
本発明の方法で有用であると考えられる宿主細胞系は、不死化させることができる、すなわち、増殖速度またはタンパク質生産の有意な減少なくして複数の継代（例えば５０世代を超える）の間生きているいずれの真核生物細胞系も含む。また、有用な細胞系は形質移入するのが容易であり、配置されない配列を含む外来性ＲＮＡを安定して維持することができ、効果的な転写、翻訳、翻訳後修飾、およびタンパク質の分泌に必要な細胞成分を有するべきである。現在好ましい細胞は、単純な培地成分要件を有し、懸濁培養に適合させることができるものである。最も好ましいのは低血清または無血清培地中で増殖するのに適合させることができる哺乳動物細胞である。代表的な宿主細胞系はＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）ＶＥＲＯ、Ｃ６−３６、ＣＯＳ、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ミエローマ、ＨｅＬａ、繊維芽細胞、胚性および種々の組織細胞、例えば、腎臓、肝臓、肺等を含む。望ましくは、細胞系は以下の、ＢＨＫ２１（ハムスター）、ＳＫ６（ブタ）、ＶＥＲＯ（サル）、Ｌ２９２（マウス）、ＨｅＬａ（ヒト）、Ｈｅｋ（ヒト）、２ｆＴＧＨ細胞、ＨｅｐＧ２（ヒト）のうちから選択される。有用な細胞はAmerican Type Culture Collection (ATCC),Rock Ville,Md.から、またはEuropean Collection of Animal Cell Cultures,Porton Down,Salisbury Sp40JG,U.K.から得ることができる。
【００５０】
本発明の実施で使用される形質移入プロセスに関しては、細胞に核酸を導入するためのすべての手段は、限定されるものではないが、ＣａＰＯ4共沈殿、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥデキストラン媒介摂取、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リポフュージョンを含むと考えられる。さらに、本発明では、ＲＮＡ配列を含有するベクターでの宿主細胞での同時または順次の形質移入が考えられる。ひとつの好ましい実施例において、宿主細胞は少なくともふたつのリンクしていないベクター（そのうちのひとつは異種遺伝子を発現するフラビウイルスレプリコンを含有し、そのうちの他方は構造遺伝子を含有する）で順次に形質移入する。
【００５１】
また、本発明は、フラビウイルスレプリコンを含有するウイルス様粒子およびこのような粒子を生産する方法を提供する。フラビウイルス由来レプリコンを含有するウイルス様粒子は、いずれかのヌクレオチド配列を細胞に送達するのに用いることができるのは当業者によって認識されるであろう。さらに、レプリコンは構造がＤＮＡまたはＲＮＡいずれかのものであってよい。このような粒子でのひとつの特別の用途は、免疫応答を刺激するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を送達することである。このような粒子は治療剤として使用することができるか、あるいは保護免疫応答を誘導することができるペプチドをヌクレオチド配列がコードする状況下においてそれらはワクチンとして使用することができる。このような粒子についてのもうひとつの用途は、不足しているかまたは細胞中で不十分な量で生産されているタンパク質をコードする主題のヌクレオチド配列に挿入することである。
【００５２】
有効成分としての免疫原生ポリペプチドについての配列をコードするヌクレオチドを含有するフラビウイルス様粒子を含むレプリコンは、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製することができ、注射に先立って溶液または懸濁液に適した固体形態を調製することができる。また、フラビウイルスレプリコン治療剤は、医薬上許容され、レプリコンカプセル化ウイルス粒子に適合する賦形剤と混合することもできる。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロースグリセロール、エタノール等およびそれらの組合せである。加えて、所望であれば、治療剤は湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤または治療剤、またはそれらの両方の有効性を増強するアジュバントのごとき少量の補助物質を含有することができる。
【００５３】
フラビウイルス様粒子を含有するレプリコンは、通常、例えば皮下または筋肉内いずれかにて注射によって非経口投与することができる。他の様式の投与に適したさらなる処方は、坐薬および、ある場合には経口処方を含む。坐薬では、伝統的なバインダーおよび担体は例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ、このような坐薬は０．５％ないし１０％、好ましくは１％ないし２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。
【００５４】
経口処方は例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等としてのこのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方または粉末の形態をとり、１０％ないし９５％、好ましくは２５％ないし７０％のウイルス様粒子を含有する。
【００５５】
フラビウイルス様粒子は中性または塩形態としてワクチンに処方することができる。医薬上許容される塩は例えば塩酸またはリン酸のごとき無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸のごとき有機酸で形成される（ペプチドの遊離アミノ基で形成された）酸付加塩を含む。カルボキシル基で形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、第二鉄の水酸化物のごとき無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のごとき有機塩基に由来するものであってもよい。
【００５６】
フラビウイルス様粒子は、予防または治療的に、またはその両方に効果的であるような量にて、投与処方に適合するように投与することができる。投与すべきウイルス粒子の用量は、治療すべき対象、投与すべきヌクレオチド配列のタイプおよびその配列の発現効率のタイプ、ならびにヌクレオチド配列が免疫原生ペプチドおよびポリペプチドをコードする場合は所望の回復の程度に依存する。投与すべき必要な有効成分の正確な量は実行者の判断に依存し、各対象に特有であろう。
【００５７】
フラビウイルス様粒子は単一の送達スケジュール、または好ましくは複数の送達スケジュールによって対象に投与することができる。複数送達スケジュールは、送達の第一のコースが１ないし１０の別々の投与であって、その後に求める効果を維持し、必要な効果を増強するのに必要な用量が引き続き時間間隔をあけて投与され、必要であれば数カ月後に引き続いて投与することができる。また、送達の処方計画は少なくとも部分的には個体の必要性によって決定され、実行者の判断に依存する。
【００５８】
［好ましい実施例の態様］
本発明のさらなる特徴は以下の実施例でより十分記載される。以下の実施例は発明の例示目的だけで含めることが理解されるべきであり、前記した広い記載に対する制限では断じてないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００５９】
［細胞］
ＢＨＫ２１細胞は、３７℃にて、ＣＯ2インキュベーター中、１０％胎児ウシ血清を補足した最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のダルベッコの修飾中で増殖させた。
【００６０】
［レプリコンおよびベクターの構築］
［（ｉ）Ｃ２０ｒｅｐ］
全ての欠失構造体は、適当なプライマーおよび通常のクローニングを用いるＰＣＲ特異的突然変異誘発によって感染性ＫＵＮ  ＲＮＡ（ＫｈｏｍｙｋｈおよびＷｅｓｔａｗａｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８：４５８０−４５８８）の創製のためのプラスミドｐＡＫＵＮの構築で使用されるｃＤＮＡクローンから調製した。ｄＭＥ ｃＤＮＡおよびその誘導体は４１７から２４０４のヌクレオチドから欠失し、これは、ＮＳ１についてのシグナル配列に先行する、Ｅ中のコドン４７９における回復されたオープンリーディングフレームと共に、今や１０７アミノ酸に減少したＣのカルボキシ末端のシグナル配列の喪失、ｐｒＭおよびＥの欠失を表す。Ｃ２０ｒｅｐよびＣ２ｒｅｐ  ｃＤＮＡは、ｄＭＥにおけるごとく、Ｅ中のコドン４７９において継続したオープンリーディングフレームと共に、各々、Ｃの２０または２アミノ酸のみを残すＣのコード配列における進行的インフレーム欠失を表す。
【００６１】
［（ｉｉ）ＦＬＳＤＸ］
全てのＲＴ反応は、１００から２００ｎｇの精製されたＫＵＮビリオンＲｎＡ、または１μｇの全細胞ＲＮＡおよび適当なプライマーを用い、製造業者によって実質的に記載されているごとくにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）で行った。６８９５ｂｐ  ＤＮＡ断片のＲＴ後のＰＣＲ増幅は、以下のように、１／２５容量のＲＴ反応および適当なプライマーを用い、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）で行った。酵素混合物（３つの部分のＴａｑポリメラーゼおよび１つの部分のＰｗｏポリメラーゼ）を除いて全ての必要な成分を含有するＰＣＲ反応混合物を９５℃で５分間予熱し、次いで、酵素混合物を添加し、以下の１５秒間の９５℃および６分間の７２℃の１０サイクル、続いての１５秒間の９５℃および６分間の７２℃の６サイクルを行い、各サイクルにおいて２０秒間の７２℃での伸長時間を自動増加させた。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）での全てのＰＣＲ反応は、１／２５から１／１０容量のＲＴ反応および適当なプライマーを用い製造業者に実質的に記載されているごとくに行った。
【００６２】
図１に示される全てのプラスミドは、ＰＣＲ増幅用のプライマーに取り込まれた存在する特異的な制限部位を用い、精製されたＫＵＮ  ＲＮＡのＲＴおよびＰＣＲ増幅によって得られたものとの元のｃＤＮＡ断片の置換によって従前に記載されている安定なＫＵＮ全長ｃＤＮＡクローンｐＡＫＵＮ（ＫｈｒｏｍｙｋｈおよびＷｅｓｔａｗａｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８：４５８０−４５８８）から得られた。
【００６３】
最初に、適当なプライマーを用い、精製されたＫＵＮビリオンＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡからのＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキットを用いて増幅された断片で、ｐＡＫＵＮクローン中のＳａｃＩＩ1481からＤｒａＩＩＩ8376（６８９５ｂｐ）断片（図１）を置き換えた。得られたｃＤＮＡクローン（ＦＬＳＤ）から転写されたＲＮＡは、ＡＫＵＮ  ＲＮＡについて１０μｇ当たりわずか１から５ＰＦＵであるのと比較して、１μｇ当たり〜２×１０3ＰＦＵの特異的感染度を有した（図１）。次いで、高適合度Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でのＰＣＲによってゲノムの残りの置き換えを開始した。従って、ＮＳ５遺伝子および３'ＵＴＲのほとんどをカバーする２６４５ｎｔｓ  ＤｒａＩＩＩ8376からＸｈｏＩ11021断片をＦＬＳＤ  ｃＤＮＡに挿入してＦＬＳＤＸを得（図１）、その結果、現在では、〜１０4ＰＦＵ／μｇのＲＮＡと同等の元の特異的感染性の１０4から１０5倍改良となった（図１）。Ｃ、ｐｒＭおよびＥ配列の部分をカバーする１３９２ｔｓ  Ｂｇ／ＩＩ89からＳａｃＩＩ1481断片のさらなる置き換えは、得られたＦＬＢＳＤＸ  ＲＮＡの特異的適合度を顕著には改良しなかった（データは示さず）。従って、最も感染性のＦＬＳＤＸクローンを全てのさらなる実験で用いた。
【００６４】
［（ｉｉｉ）Ｃ２０ＤＸｒｅｐ．］
ＫＵＮレプリコンｃＤＮＡ構造体Ｃ２０ＤＸｒｅｐは、全非構造領域および３'ＵＴＲをコードする配列を表すＳｐｈＩ2467からＸｈｏＩ11021断片を安定な全長ＫＵＮ  ｃＤＮＡクローンＦＬＳＤＸからの対応する断片で置き換えることによって前記Ｃ２０ｒｅｐから構築した。ＢＨＫ細胞の５から１０μｇのＣ２０ＤＸｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入の結果、同一量のＣ２０ｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入の後に、〜１０％に過ぎない陽性であったのと比較して、〜８０％のレプリコン陽性の細胞が検出された。
【００６５】
［（ｉｖ）ＳＦＶ−Ｃ．］
ＫＵＮコア（Ｃ）遺伝子を発現するＳＦＶレプリコン構造体は、プラスミドｐＣｌＮｅｏＣ１０７（Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ａ．Ａ．およびＥ．Ｇ．Ｗｅｓｔａｗａｙ，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，１４１：６８５−６９９）からの、ＫＵＮ  ５'ＵＴＲの最後の７ヌクレオチドの配列およびＫＵＮ  Ｃタンパク質の１２３アミノ酸の最初の１０７をコードする配列を表すＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＳＦＶレプリコン発現ベクターｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬは図２に示す）にクローニングすることによって得られた。
【００６６】
［（ｖ）ＳＦＶ−ｐｒＭＥ．］
ＫＵＮ  ｐｒＭＥ配列は、ＢｇｌＩＩ部位が取り込まれた適当なプライマーを用い、ＦＬＳＤＸ（これは他のところで記載されるであろう）から修飾されたもう１つの高度に効果的な全長ＫＵＮ  ｃＤＮＡクローンＦＬＳＤＸからＰＣＲ増幅した。増幅された断片をＢｇｌＩＩで消化し、ＳＦＶレプリコン発現ベクターｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位にクローン化してＳＦＶ−ｐｒＭＥ構造体を得た（図２）。
【００６７】
［（ｖｉ）ＳＦＶ−ｐＭＥ−Ｃ．］
ＫＵＮ  ｐｒＭＥおよびＫＵＮ  Ｃ遺伝子を共に発現するＳＦＶレプリコン構造体は、ＳＦＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、ＫＵＮ  Ｃ配列およびＳＦＶ  ３'ＵＴＲを含有するＳＦＶ−ＣプラスミドからのＭｓｃＩ−ＳｐｅＩ断片を、ＳｍａＩおよびＳｐｅＩで消化したＳＦＶ−ｐｒＭＥベクターにクローニングすることによって得られた（図２）。従って、最終二重サブゲノム構造体ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−ＣはＳＦＶレプリコンＲＮＡを生じるはずであり、これは、ＢＨＫ細胞への形質移入に際して、ＫＵＮ  ｐｒＭＥおよびＫＵＮ  Ｃ遺伝子を発現する２つのサブゲノムＲＮＡの合成を指令するであろう。
【００６８】
［ＲＮＡ転写および形質移入］
ＲＮＡ転写体は、ＸｈｏＩで線状化したＣ２０ＤＸｒｅｐプラスミドＤＮＡから、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いＳｐｅＩで線状化したＳＦＶプラスミドから調製した。ＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのエレクトロポレーションを行った。略言すれば、１０から２０μｇのインビトロ転写されたＲＮＡを、Ｂｉｏ−ＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置を用い、０．２ｃｍキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）中、４００μｌ中、ＢＨＫ２１の２×１０6の細胞にエレクトロポレーションした。
【００６９】
［免疫蛍光分析］
エレクトロポレーション後、およびパッケージング実験中のＢＨＫ細胞の感染後に、ＫＵＮレプリコンＲＮＡ  Ｃ２０ＤＸｒｅｐの複製を、ＫＵＮ  ＮＳ３タンパク質に対する抗体での免疫蛍光（ＩＦ）によってモニターした。ＳＦＶ−ｐｒＭＥおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡでのエレクトロポレーション後におけるＫＵＮ  Ｅの発現は、ＫＵＮ  Ｅタンパク質に対するマウスモノクローナル抗体のカクテルでのＩＦによって検出した。３．９１Ｄ、１０Ａ１、および３．６７Ｇと命名されたこれらの抗体は、一般に、ＲｏｙＨａｌｌ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＱｕｅｅｎｌａｎｄ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａによって供された。全ての３つの抗体を等容量で混合し、この混合物の１／１０希釈物をＩＦ分析で用いた。ＳＦＶ−ＣおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡでのエレクトロポレーション後におけるＫＵＮ  Ｃプロイテンの発現および局所化は、ＫＵＮ  Ｃプロイテンに対するウサギポリクローナル抗体でのＩＦ分析によってモニターした。
【００７０】
［代謝標識および標識免疫沈殿分析］
エレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞の35Ｓメチオニン／システインでの代謝標識は、いくつか重要でない修飾を施して、ＳＦＶＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＭａｎｕａｌに実質的に記載されているごとく行った。略言すれば、ＳＦＶ  ＲＮＡｓ（ＫＵＮレプリコンＲＮＡでの先行するエレクトロポレーション有りまたは無し）でのエレクトロポレーション１８時間後の細胞を、35Ｓメチオニン／システインで４時間、または１から２時間パルス標識し、続いて過剰の未標識メチオニン／システインを含む培地中で異なる時間インキュベーションした。細胞培養液を、電気泳動および標識免疫沈殿（ＲＩＰ）による分泌タンパク質の分析のために回収した。標識した細胞は、１％ノニデットＰ４０（ＮＰ４０）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液中で溶解させ、核を低速遠心によって除去し、溶解物上清を培養液での平行分析で使用した。
【００７１】
ＲＩＰ分析では、標識細胞培養液をまず０．４５μｍフィルター（ＳａｒｔｏｒｉｓＡｇ社製，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ）を通し、３７℃で３０分間、ＲＮａｓｅＡ（１ｍｌ当たり２０μｇ）で消化して、膜粒子物質および裸のＲＮＡの除去を確実にした。濾過し、ＲＮａｓｅ処理した培養液、または未処理細胞溶解物を次いで１／２０容量のプールされた抗Ｅモノクローナル抗体（前記参照）と、またはウサギ抗Ｃ抗体と混合し、ミクロ遠心管中で一定回転させて、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを次いで約１％の最終濃度まで添加し、インキュベーションを４℃でさらに１時間継続した。ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム塩［ＤＯＣ］、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］）での３回の洗浄およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）での１回の洗浄の後、ビーズをＳＤＳゲル試料に再懸濁させ、５分間沸騰させ、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動に付した。電気泳動の後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フイルムに曝露した。
【００７２】
［ノーザンブロットハイブリダイゼーション］
ＫＵＮ構造タンパク質を発現するＣ２０ＤＸｒｅｐ  ＲＮＡおよびＳＦＶ  ＲＮＡｓで二重に形質移入された細胞から回収した培養液で感染させたＢＨＫ２１細胞からのトリゾール試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて単離された５μｇの全ＲＮＡをノーザンブロットのために電気泳動に付した。ハイブリダイゼーションプローブは、３'ＵＴＲ領域（図６Ｂおよび図７参照）、およびＳＦＶ  ＮＳＰ２領域（図６Ｃ参照）を含めたＫＵＮゲノムの３'末端７６１ヌクレオチドを表す［32Ｐ］標識ｃＤＮＡ断片であった。
【００７３】
［組換えＳＦＶ−ＣレプリコンによるＫＵＮ  Ｃ遺伝子の発現］
ｐＳＦＶ１ベクターでＫＵＮ  Ｃ遺伝子を発現させるために、プラスミドｐＣＩＮｅｏＣ１０７からのＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＦＶ１のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした（図２）。このフラグメントは、カルボキシ末端疎水性配列を除去した、Ｃの成熟形に等価である、ＫＵＮ  Ｃタンパク質の最初の１０７個のアミノ酸をコードする配列を示す。ＳＦＶ−Ｃ構造体はまた、ｐＣＩＮｅｏＣ１０７プラスミド由来のＫＵＮ５'ＵＴＲの７個の過剰ヌクレオチドおよびＳＦＶベクター配列由来のカルボキシ末端での４個の過剰コドンと共に天然ＫＵＮ開始コドンを含む（図２）。
【００７４】
ＳＦＶ−Ｃ  ＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのエレクトロポレーションにより、ＫＵＮ  Ｃタンパク質に対する抗体を用いてＩＦにより判断したところ、ほぼ１００％の細胞においてＫＵＮ  Ｃタンパク質が発現された（図３Ａ、パネル１）。ＳＦＶ−Ｃ  ＲＮＡ形質移入細胞で発現したＫＵＮ  Ｃタンパク質は細胞質（図３Ａ、パネル３はアセトン固定）、およびまた核（図３Ａ、パネル５はホルムアルデヒド−メタノール固定）に局在した。ＳＦＶ−Ｃ形質移入細胞の放射標識可溶化液でのＫＵＮ  Ｃタンパク質の同定は困難であるので（図３Ｂ）、抗Ｃ抗体を用いた放射標識可溶化液の免疫沈降を実施した。ＫＵＮ  Ｃタンパク質の移動と一致する標識バンドは、ＳＦＶ−Ｃの可溶化液では見られたが、ＳＦＶ１形質移入細胞では見られなかった（図３ＢでＳＦＶ−ＣとＳＦＶ１を比較）。
【００７５】
［組換えＳＦＶ−ｐｒＭＥレプリコンによるＫＵＮ  ｐｒＭＥ遺伝子の発現］
我々のＳＦＶ−ｐｒＭＥ構造体（図２参照）における全長のｐｒＭＥ配列と先のシグナル配列をレプリコンに組み入れた。ｐｒＭＥ遺伝子のｃＤＮＡ源として、全長ＫＵＮ  ｃＤＮＡクローンＦＬＢＳＤＸを使用した。開始および終結コドン、並びに慣用的なクローニングのためのＢｇｌＩＩ部位を、ＰＣＲ増幅のためにプライマーに取込んだ（図２参照）。ＰＣＲ増幅中に生じ得るミスマッチの量を最小限にするため、高い適合度のＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を全ての我々のＰＣＲ反応に使用した。
【００７６】
ＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡをＢＨＫ２１細胞にエレクトロポレーションした場合、ほぼ１００％の細胞が、エレクトロポレーションしてから１２から１８時間後のＫＵＮ  Ｅタンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたＩＦ解析において陽性であった（図４Ａ、パネル１）。形質移入細胞におけるＫＵＮ  ｐｒＭおよびＥタンパク質の発現を確認し、ｐｒＭＥの組織培養液への分泌を検出するために、形質移入細胞を35Ｓメチオニン／システインで１時間標識し、次いで、追跡期間を延ばすためにインキュベートした。ＫＵＮ  Ｅタンパク質に対応する強く標識されたバンドが、全ての時間において、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ形質移入細胞の培養液および細胞溶解液の両方で見られた（図４Ｂの培養液および細胞参照）。ＫＵＮ  ｐｒＭタンパク質に対応する標識バンドは、細胞溶解液でのみ検出された（図４Ｂの細胞）。ＫＵＮ  ｐｒタンパク質の推定分子量の移動に対応する標識バンドは、形質移入細胞の培養液のみに検出された（図４Ｂの培養液）。
【００７７】
培養液におけるＥおよびおそらくｐｒタンパク質の標識強度の見かけ上の増加（図４Ｂ、培養液）、および細胞溶解液におけるＥおよびｐｒＭタンパク質の標識強度の同時減少（図４Ｂ、細胞）が、追跡期間中に観察された。標識培養液を示すレーンは、細胞溶解液を示すレーンよりも約５倍長くＸ線フィルムに曝露したので、Ｅおよびｐｒタンパク質の分泌効力は低かった（図４の説明文参照）。
【００７８】
ＳＦＶ−ｐｒＭＥレプリコンを用いたパルス標識実験のサンプルを、ＫＵＮ抗Ｅモノクローナル抗体を用いて免疫沈降した場合、ＥおよびｐｒＭは形質移入細胞溶解液から共沈降した（図４Ｃ、レーン６から９）。Ｅタンパク質（図４Ｃ、レーン３から５）およびある実験において痕跡量のｐｒＭタンパク質（結果は示していない）は、形質移入細胞の培養液からも沈降した。分子量が小さいために、Ｍタンパク質はおそらく、電気泳動中にゲルから出てしまい、その結果検出できないのだろう。形質移入細胞の培養液における免疫沈降標識Ｅタンパク質量の漸増が、追跡期間を通じて観察され（図４Ｃ、レーン３から５）、Ｅタンパク質の分泌が進行していることが確認された。培養液中の免疫沈降標識Ｅタンパク質の増加と、細胞溶解液から免疫沈降した標識ＥおよびｐｒＭタンパク質の予期される減少の間に相関がないことは（図４Ｃのレーン３から５を図４Ｂの対応する培養液レーンと、および図４Ｃのレーン６から９を図４Ｂの対応する細胞レーンと比較）、おそらく、比較的短い追跡期間中に細胞に保持された、大過剰の発現タンパク質の免疫沈降に使用された、抗体の量が不適切であることにより説明できる。総合すると、直接的パルス標識およびＲＩＰ解析の結果により、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡをＢＨＫ２１細胞に形質移入後の、細胞におけるｐｒＭＥポリタンパク質の正確なプロセシングおよび、Ｅ、おそらくｐｒおよびＭタンパク質の培養液への分泌の両方が確認された。
【００７９】
［組換えＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃレプリコンによる全３つのＫＵＮ構造タンパク質の発現］
ＫＵＮレプリコンは、ｐｒＭＥおよびＣ遺伝子を別々に発現する２つのＳＦＶ  ＲＮＡを用いた形質導入を使用してパッケージングしたが（次の実施例の結果参照）、パッケージングの効率は低かった。パッケージングの効率を上げ、方法を簡単にするために、ｐｒＭＥ遺伝子およびＣ遺伝子を同時に発現する単一のＳＦＶレプリコン構造体を調製した。全Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ領域をｐＳＦＶ１ベクターにクローニングするのは困難であり（結果の最初の章参照）、また、フラビウイルスプロテアーゼＮＳ２Ｂ−ＮＳ３の非存在下でのＣのカルボキシ末端における切断に関する不確定性を回避するために、２つの別々の２６Ｓプロモーターの制御下でｐｒＭＥおよびＣ遺伝子を発現するＳＦＶレプリコンを調製した（図２のＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ参照）。
【００８０】
抗Ｅおよび抗Ｃ抗体を用いたＳＦＶ−ｐｒＭＥ−ＣエレクトロポレーションしたＢＨＫ細胞のＩＦ解析により、形質移入から１８時間後にほぼ１００％の細胞にＥおよびＣタンパク質の両方の発現が示された（結果は示していない）。ＥおよびＣタンパク質の両方が、同一細胞に発現された（図５Ａの抗Ｃおよび抗Ｅ抗体による二重標識を比較）。形質移入細胞を、35Ｓメチオニン／システインでパルス標識し、可溶化液をＫＵＮ抗Ｅモノクローナル抗体で免疫沈降した場合、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡの形質移入後に観察されたのと同じように、ＥおよびｐｒＭタンパク質の両方が共沈降した（図４Ｂと図５Ｂを比較）。培養液中の免疫沈降標識Ｅタンパク質の漸増、および細胞溶解液中の免疫沈降標識ＥおよびｐｒＭタンパク質の対応する減少が、追跡期間中に観察された（図５Ｂ）。抗Ｃ抗体を用いた標識細胞溶解液の免疫沈降により、形質移入細胞におけるＣタンパク質の発現が確認され、追跡期間中に沈降Ｃの量の漸減が示された（図５Ｃ）。抗Ｃ抗体を使用した、洗浄剤で処理していない、培養液のＲＩＰ解析の結果は陰性であり（結果は示していない）、これは、遊離Ｃタンパク質は、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ形質移入細胞の培養液には全く分泌されなかったことを示す。後の実験において（図８Ｃ、レーン２参照）、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのみを用いて形質移入した細胞から分泌された粒子を精製し、抗Ｅ抗体を用いて沈降させると、ここでも、分泌されたＣは検出されなかった。
【００８１】
総括すると、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いて形質移入した細胞の免疫蛍光および標識パターンは、ｐｒＭＥおよびＣタンパク質を別々に発現する２つの異なるＲＮＡを用いて形質移入した細胞で観察されたものと非常に類似しており（図５を図３および図４と比較）、これは、組換えＳＦＶレプリコンから発現させた場合の、全３つのＫＵＮ構造タンパク質の適切なプロセシングおよび成熟を示唆する。
【実施例２】
【００８２】
［キャプシド形成粒子の調製およびその力価の決定］
キャプシド形成粒子を用いた全ての感染において、細胞培養液を、０．４５μｍのろ紙（ＳａｒｔｏｒｉｓＡｇ社製，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，ドイツ）を通してろ過し、ＲＮａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）で０．５時間室温で処理した（次いで、細胞感染中、１．５時間３７℃でインキュベート）。部分精製した粒子を調製するために、ろ過およびＲＮａｓｅＡ処理した形質移入した細胞からの培養液を、マイクロ遠心機で１５分間４℃で１６，０００ｇで遠心分離して清澄にし、得られた上清液から、４０，０００ｒｐｍで２時間４℃でソーバールＯＴＤ５５Ｂ遠心機のＡＨ６５０ローターでの超遠心により粒子をペレット化した。ペレットは、ＲＮＡｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）を補充した５０μｌＰＢＳに再懸濁し、一晩４℃で溶解し、次いで、ＢＨＫ２１細胞の感染に、またはＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。キャプシド形成粒子の力価を決定するために、１．３ｃｍ2カバーガラス上のＢＨＫ２１細胞を、細胞培養液の、またはペレット化した材料の連続１０倍希釈の１００から２００μｌを用いて１．５時間、３７℃で感染させた。次いで、液体を２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地１ｍｌと交換し、細胞を２４時間３７℃でＣＯ2インキュベーター中でインキュベートし、次いで、上記の抗ＮＳ３抗体を用いてＩＦ解析にかけた。パッケージングした粒子の感染力価は、以下の式を使用して計算した。
初期感染細胞２×１０6あたりの力価（ＩＵ）＝Ｎ×（ＳＷ：ＳＩＡ）×１０n×（Ｖ：ＶＩ）
式中、Ｎは、カバーガラスの異なる部分の５つの像領域から計算した、像領域における抗ＮＳ陽性細胞の平均数であり、ＳＷは、２４ウェルプレートのウェルの表面であり（２００ｍｍ2）、ＳＩＡは、像領域の表面であり（ワイルドＭＰＳ４６／５２フォトオートマット［ワイルドライツ社製、ハーバーグ、ドイツ］のマニュアルに従って計算した、一定の拡大パラメーターを使用して１．２５ｍｍ2）、Ｖは、２×１０6個の初期エレクトロポレーションしたＢＨＫ２１細胞の個体群から集めた培養液の全容量であり（６０ｍｍ皿あたり通常３から５ｍｌ）、ＶＩは、カバーガラスの感染に使用した容量であり（通常１００から２００μｌ）、１０nは希釈係数である。
【００８３】
［組換えＳＦＶレプリコンから発現するＫＵＮ構造タンパク質による、伝播性「感染性」粒子へのＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージング］
ＫＵＮレプリコン構造体Ｃ２０ｒｅｐは、僅か１０から２０％の細胞にしかうまく形質移入できないため、より形質移入効率の高いＫＵＮレプリコンを使用して、二重に形質移入する細胞へのパッケージングを試みた（すなわち、ＫＵＮレプリコン、およびＫＵＮ構造タンパク質を発現する組換えＳＦＶレプリコン）。これにより、レプリコン構造体Ｃ２０ＤＸｒｅｐを使用するＢＨＫ２１細胞への形質移入効率は約８０％まで顕著に改善し、これを全てのパッケージング実験に使用した。上記したように、パッケージング実験の全細胞培養液は、ろ過して大きな膜断片を除去し、ＲＮａｓｅＡで処理して裸ＲＮＡを除去した。
【００８４】
初期の同時形質移入実験は、Ｃ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡおよび、ＫＵＮ構造タンパク質を発現するＳＦＶ  ＲＮＡの同時期の形質移入では、感染性粒子は検出されないことを示した。その結果、エレクトロポレーション間に１２時間またはそれ以上の遅延期間を次の実験では使用して、ＫＵＮレプリコンが、ＳＦＶ  ＲＮＡｓのエレクトロポレーション前に蓄積できるようにした。Ｃ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡを用いた最初のエレクトロポレーションから２７時間後、および組換えＳＦＶ  ＲＮＡを用いた第二のエレクトロポレーションから２６時間後に集めた組織培養液を用いて感染させたＢＨＫ細胞のＩＦおよびノーザンブロット解析により、２つのＳＦＶ  ＲＮＡ、ＳＦＶ−ｐｒＭＥおよびＳＦＶ−Ｃを用いて得られたものと比較して、単一のＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを使用した場合の方が高いパッケージング効率が示された（図６Ａのパネル１および２、並びに図６Ｂのレーン１および２をそれぞれ比較）。有意には、ＩＦおよびノーザンブロット解析により、複製適格性ＳＦＶ  ＲＮＡを含む、放出感染性粒子は、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡ単独、またはＳＦＶ−ｐｒＭＥとＳＦＶ−Ｃ  ＲＮＡｓは、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの前記の形質移入体と共に（図６Ｃ、レーン２および３）、または伴わずに形質移入した場合、全く産生されないことが示された。これらの結果により、挿入ＫＵＮ構造遺伝子を含む組換えＳＦＶレプリコンＲＮＡは、ＫＵＮ構造タンパク質によりパッケージングできず、従って、パッケージングはＫＵＮ  ＲＮＡに特異的であることが明らかに実証された。また、パッケージ化ＫＵＮレプリコンＲＮＡを含む感染性粒子は、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡのみをＣ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡを用いるパッケージング実験に使用した場合には、全く検出されず（図６Ａのパネル３）、これは、Ｃタンパク質の同時発現は、分泌感染性粒子の形成には絶対に不可欠であることを実証する。
【００８５】
ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いる同時形質移入実験におけるＣ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡの効率的パッケージングの条件を最適化するために、エレクトロポレーション間の時間を変えて（図７Ａ）、第二のエレクトロポレーションと感染性粒子の回収の時間を変えて（図７Ｂ）、実験した。初めに、２つのエレクトロポレーション間の時間の最適化を、感染性粒子の捕集の時間を一定にして研究した。等量の細胞を、Ｃ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡを用いた最初のエレクトロポレーション後に細胞培養皿に接種し、細胞をその後、１２時間、１８時間、２４時間、または３０時間のインキュベート間隔でＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした。次いで、培養液を、第二のエレクトロポレーションから２４時間後に各皿から回収し、連続希釈を使用してＢＨＫ２１細胞を感染した。抗ＮＳ３抗体を用いたこれらの細胞のＩＦ解析により、エレクトロポレーション間の１２時間から２４時間に感染性粒子の漸増的蓄積が示され、最も高い力価は、初期形質移入細胞の２×１０6個から、２４時間で、３．８×１０6個の感染性粒子に到達した（図７Ａ）。標識ＫＵＮ特異的ｃＤＮＡプローブを用いた感染細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロット解析により、ＫＵＮレプリコンＲＮＡないしＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡの最適時間間隔は、１８時間ないし３０時間であることが示された（図７Ａ）。エレクトロポレーション間の間隔が、３６時間および４８時間に延びた場合、産生された感染性粒子の収量は減少した。
【００８６】
別々の研究において、ＢＨＫ細胞を、Ｃ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡを用いたエレクトロポレーション後、３０時間目に、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いてエレクトロポレーションし、１つの６０ｍｍ培養皿に接種した。次いで、培養液の１つのアリコート（全３ｍｌ中１ｍｌ）を、第二のエレクトロポレーションから２４時間、３０時間および４２時間目に集めた。各アリコート除去後の残りの培養液の容量を、新鮮な培地を加えることにより元の容量に調整し、細胞を再インキュベートした。次いで、集めたアリコートを使用して、ＢＨＫ細胞を感染し、これらの感染細胞から２４時間目に回収した全細胞ＲＮＡを、次いで、抗ＮＳ抗体を用いるＩＦ解析並びに標識ＫＵＮ特異的ｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、相対量の増幅ＫＵＮレプリコンＲＮＡについて解析した。ノーザンブロット解析により検出した、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いた第二のエレクトロポレーションから２４時間から４２時間後の増幅ＫＵＮレプリコンＲＮＡの漸増（図７Ｂ）は、抗ＮＳ３抗体を用いた新しく感染した細胞のＩＦ解析により示される放出感染性粒子の増加と一致した。
【００８７】
別々の実験において、我々は、ｐｒＭＥ遺伝子並びにＫＵＮコアタンパク質の最初の１０５個のアミノ酸を正確にコードしているＣ遺伝子を発現する、ＳＦＶレプリコンＲＮＡ ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５を使用したパッケージングの効率と、ｐｒＭＥ遺伝子並びにＫＵＮコアタンパク質の最初の１０７個のアミノ酸とベクター由来の過剰の４個のアミノ酸をコードするＣ遺伝子を発現する、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのそれとを比較した（図２参照）。キャプシド形成ＫＵＮレプリコン粒子の回収量が、これらの２つのＲＮＡのいずれかを使用して得られ（データは示していない）、これは、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡ（図２参照）から発現したコアタンパク質に存在する過剰の６個のアミノ酸は、そのパッケージング効率を妨害しなかったことを示唆する。その結果、両方のＲＮＡを、キャプシド形成粒子の効率的な産生に使用できる。
【００８８】
［感染性粒子の特性評価］
Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５ＲＮＡを用いて形質移入した細胞の培養液に分泌された感染性粒子は、事実、ＫＵＮ構造タンパク質を取込んだウイルス様粒子であることを証明するために、ウイルス中和試験を実施した。既知の中和活性を有するＫＵＮ  Ｅタンパク質に対するモノクローナル抗体の反応混液の１／１０希釈と共に、３７℃で組織培養液を１時間インキュベートすると、ほぼ完全に感染性が消失したが（図８Ａのパネル１）、一方、抗体の非存在下、類似の条件下でインキュベートした対照サンプルには感染性の消失は全く観察されなかった（図８Ａのパネル２）。抗体と共にインキュベートを室温または４℃で実施した場合、類似の結果が得られた。
【００８９】
感染性粒子は、ペレット化により濃縮できることを示すために、同時形質移入細胞の清澄培養液を、超遠心にかけた。超遠心後のペレットおよび上清を使用して、ＢＨＫ細胞を感染させ、これを後（２４時間目）に抗ＮＳ３抗体を用いてＩＦにより解析した場合、実質上全ての感染性粒子が、ペレット化材料に存在していた（図８Ｂのパネル１と２を比較）。
【００９０】
組換え感染性粒子における、タンパク質を同定し、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの存在を検出するために、それらを、抗Ｅ抗体を使用して同時形質移入および放射標識した細胞の培養液から洗浄剤の非存在下で免疫沈降させた。免疫沈降サンプルの半分を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの分離に使用し、片方の半分を、タンパク質キナーゼＫ消化によるＲＮＡの抽出に使用した。ポリアクリルアミドゲルのラジオオートグラフィーにより、連続的にＣ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを用いて形質移入するか、またはＫＵＮウイルスを用いて感染させた細胞から集めた培養液の免疫沈降物におけるＥ、ｐｒＭおよびＣタンパク質の存在が示された（図８Ｃ、それぞれレーン１および３）。ＥおよびｐｒＭタンパク質が、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのみを用いて形質移入した細胞の培養液から免疫沈降したが、Ｃタンパク質は全くせず（図８Ｃ、レーン２）、これは、ＫＵＮレプリコンＲＮＡないしＫＵＮ  Ｃタンパク質の特異的相互作用が、分泌感染性粒子の会合には必要であることを示唆する。分泌フラビウイルスはしばしば、図８Ｃに観察されたように、有意な量の非切断ｐｒＭを含むことに注意されたい。
【００９１】
免疫沈降物から抽出したＲＮＡは、逆転写し、ＫＵＮ特異的プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。推定サイズ（〜７００ｂｐ、ＮＳ２Ａ領域）のＤＮＡフラグメントが、図６のように連続的にＣ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡの両方を用いて形質移入するか（図８Ｄ、レーン２）、またはＫＵＮウイルスを用いて感染した（図８Ｄ、レーン４）細胞から集めた培養液の免疫沈降物から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ反応で観察された。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのみを用いて形質移入した細胞から集めた培養液の免疫沈降物から抽出したＲＮＡからは全く得られなかった（図８Ｄ、レーン３）。
【００９２】
これらの解析は、パッケージング実験から回収した感染性ＲＮＡは、ＫＵＮ構造タンパク質によりキャプシド形成した粒子に明白にパッケージングされることを確立した。
【００９３】
レプリコンＲＮＡを含むパッケージ化粒子のさらなる特性評価を、沈殿解析により実施した。ＫＵＮビリオンと平行して（両方共、超遠心により濃縮）、それらを、５から２５％スクロース密度勾配により沈殿させた。０．５ｍｌ画分を集め、希釈し、ＫＵＮビリオンでは１８時間目に、レプリコン粒子では２４時間目に抗ＮＳ３抗体を使用して、ＩＦアッセイにより感染性についてアッセイした（図９Ａの説明文参照）。レプリコン粒子の最大感染性は、画分５から７に濃縮され、ピーク力価は〜１．３×１０5ＩＵ／ｍｌ（画分６）であり、一方、感染性ＫＵＮビリオンは、画分２から４にほとんど濃縮し、ピーク力価は〜２．８×１０7ＩＵ／ｍｌ（画分３は図９Ａ）であった。各勾配からのこれら３つの画分を合わせ、抗Ｅ抗体と共にインキュベートし、ビリオンおよびキャプシド形成粒子を凝集し、電子顕微鏡用に超遠心により濃縮した（実験の詳細については図９Ｂの説明文参照）。勾配沈殿結果から期待されるように（図９Ａ）、キャプシド形成レプリコンＲＮＡを含む粒子は、ＫＵＮビリオンよりも小さく、ビリオン粒子の直径〜５０ｎｍと比べ直径〜３５ｎｍであった（図９Ｂ）。レプリコンおよびビリオン粒子の両方が、球形でサイズが均一であるように見え、表面の詳細は、いくつかの抗Ｅ抗体分子の付着のために、解像されなかった（図９Ｂ）。
【実施例３】
【００９４】
［修飾ＫＵＮレプリコンベクターの構築および異種遺伝子の発現］
［細胞］
ＢＨＫ２１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ修飾最少必須培地（ＤＭＥＭ、ギブコ  ＢＲＬ社製）中で増殖させた。ベロ細胞を、５％ＦＢＳを補充したＭ１９９培地（ギブコ  ＢＲＬ社製）中で増殖させた。
【００９５】
［プラスミドの構築］
［（１）２０ＤＸｒｅｐＮｅｏ］
レプリコン発現ＢＨＫ細胞（ｒｅｐＢＨＫ）の産生に使用したジシストロン性レプリコン構造体Ｃ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏは、Ｉｒｅｓ−Ｎｅｏカセットを、ポリタンパク質終結コドンの３'ＵＴＲ２５ヌクレオチド下流にクローニングすることにより、Ｃ２０ＤＸｒｅｐから調製した。ＫＵＮ配列のヌクレオチド１０２６０から１０４２２、続いてＩＲＥＳ−ＮｅｏカセットおよびＫＵＮ配列の最後の５２２個のヌクレオチドを示すΔＭＥ／７６Ｎｅｏプラスミド（ＫｈｒｏｍｙｋｈおよびＷｅｓｔａｗａｙ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９７、７１：１４９７−１５０５）からのＸｍａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを使用して、Ｃ２０ＤＸｒｅｐ構造体のＸｍａＩ10260からＸｈｏＩ11021フラグメントを置換した。ＩＲＥＳ−Ｎｅｏカセットは、初めに哺乳動物発現ベクターｐｌｒｅｓＮｅｏ１（Ｓ．Ｒｅｅｓにより提供された、ｐＣＩＮ１の誘導体（Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９６、２０：１０２−１１０））由来であった。このＩＲＥＳ−ＮｅｏカセットにおけるＩＲＥＳエレメントのＣ末端のヌクレオチド配列は、Ｎｅｏ発現レベルを減少させるために著者により修飾され、従って、この（ｐｌｒｅｓＮｅｏ１）ベクターおよび高濃度の抗生物質Ｇ４１８を使用した場合に高レベルの挿入遺伝子のみを発現する細胞が選択される。
【００９６】
［（ｉ）Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏ．］
ＫＵＮレプリコンベクター、Ｃ２０ＤＸｒｅｐから発現した異種遺伝子のサイトゾル切断を確かめるために、Ｃ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏ構造体を、ＫＵＮポリタンパク質オープンリーディングフレームを保持する各プラスミドにおける、ＫＵＮ  Ｃの最初の２０個のアミノ酸ないしＫＵＮ  Ｅタンパク質の最後の２２個のアミノ酸に、食物、および口腔疾病ウイルス（ＦＭＤＶ−２Ａ）の２Ａオートプロテアーゼをコードする配列を挿入することにより修飾した（Ｃ２０ＤＸ２Ａｒｅｐ、図１０Ａ）。ＦＭＤＶ−２Ａペプチドは、１９個のアミノ酸の特異的配列を示し、これはそれ自体グリシン−プロリンジペプチド間のＣ末端で切断し、人工的ポリタンパク質の切断を仲介するために使用されてきた。ＫＵＮレプリコンｃＤＮＡ構造体Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏ（図１０Ａ）は、プラスミドpT3CAT2A/NAmodII(Percy et al., J.Virol., 1994, 68: 4486-4492, Peter Paleseから得る）からＰＣＲ増幅したＦＭＤＶ−２Ａ配列を、ＭｌｕＩ−ＳｐｅＩ制限部位が取込まれた正プライマーおよびＥａｇＩ−ＭｌｕＩ制限部位が取込まれた逆プライマーを使用して、前記したＣ２０ＤＸｒｅｐおよびＣ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏプラスミドのＡｓｃＩ部位にクローニングすることによりそれぞれ調製した（図１０Ａ）。高適合度のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）を、全ＰＣＲ反応に使用した。
【００９７】
外来遺伝子のクローニングのための２つの特異的な部位もまた、これらのベクターに取込んだ。それは、（１）Ｃタンパク質の最初の２０個のアミノ酸ないし２Ａ配列のＳｐｅＩ部位、および（２）２Ａ配列ないしＫＵＮレプリコン配列の残りの部分とのＥａｇＩ部位である。ＳｐｅＩ部位へのクローニングにより、ＫＵＮポリタンパク質配列の残りの部分からのＣ２０−ＦＧ−２Ａ融合タンパク質の正確な切断が確実となる。ＥａｇＩ部位へのクローニングにより、正確なＮ末端切断が可能となるが、それはＥタンパク質の２２ａａに融合したＣ末端は有する。
【００９８】
［（ｉｉｉ）Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＮｅｏ．］
ＦＭＤＶ−２Ａ−ＣＡＴ配列は、ＭｌｕＩ制限部位が取込まれたＦＭＤＶ−２Ａ増幅逆プライマーおよび正プライマーと同じものを使用して、プラスミドpT3CAT2A/NAmodII(Percy et al.，J.Virol.1994、68:4486-4492）からＰＣＲ増幅し、Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＣ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏプラスミドのＡｓｃＩ部位にクローニングし、それぞれ、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＮｅｏ構造体を得た（図１０Ｂ）。
【００９９】
［（ｉｖ）Ｃ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ．］
Ｃ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐは、ΔＭＥ／７６Ｎｅｏプラスミド（KhromykhおよびWestaway、J.Virol.，1997、71:1497-1505）からＰＣＲ増幅したＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列を、ＡｓｃＩ（正プライマー）およびＭｌｕＩ（逆プライマー）制限部位を取込んだ適当なプライマーを使用して、Ｃ２０ＤＸｒｅｐプラスミドのＡｓｃＩ部位にクローニングすることにより構築した。Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ構造体は、ＭｌｕＩ制限部位が取込まれたプライマーを使用して、プラスミドpT3CAT2A/NAmodII(Percy et al.，J.Virol.1994、68:4486-4492）からＰＣＲ増幅したＣＡＴ遺伝子を、Ｃ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐプラスミドのＡｓｃＩ部位にクローニングすることにより調製した（図１０Ｃ）。
【０１００】
［（ｖ）C20DX/GFP/2Arep、C20DX/GFP/2ArepNeo、C20DX/hcvCORE160/2Arep、C20DX/hcvCORE191/2Arep、C20DX/hcvNS3/2Arep、C20DX/VSV-G/2Arep、C20DX/β-GAL/2Arep．］
全てのこれらの構造体（図１０Ｂ）は、以下のように類似の方法で調製した。異種遺伝子は、ＳｐｅＩおよび／またはＸｂａＩ制限部位が取込まれたプライマーを使用して（プライマーの配列は、対応する著者から得られる）、対応するプラスミドからＰＣＲ増幅し、Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐまたはＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏのＳｐｅＩ部位にクローニングした（図１０Ａ）。上記遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーは、ＧＦＰ−ｐＥＧＦＰ（クロンテック）、ｈｃｖＣＯＲＥ−ｐｃＤＮＡ３／ＨＣＶ−ＣＯＲＥ（Eric Gowans、Sir Albert Sakzewski Virus Research Center、Brisbaneから得る）、ｈｃｖＮＳ３−ｐ３Ｂ−２７１（Ｅｒｉｃ  Ｇｏｗａｎｓから得る）、VSV-G-pHCMV19(Michael Bruns, Heinrich-Pette-Institute, University of Hamburg)、β-GAL-pSFV3/LacZ（ギブコ  ＢＲＬ社製）であった。
【０１０１】
［ＲＮＡ転写およびエレクトロポレーション］
組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡ転写物は、ＸｈｏＩで線形化した対応する組換えＫＵＮレプリコンプラスミドＤＮＡから、またはＳｐｅＩで線形化したＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５プラスミドから、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを使用して調製した。ＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのエレクトロポレーションは、実施例１に記載の方法に従って実施した。
【０１０２】
［免疫蛍光解析］
エレクトロポレーションまたは感染細胞の免疫蛍光（ＩＦ）解析は、発現タンパク質に特異的な抗体またはＫＵＮ抗ＮＳ３抗体を使用して、記載の通りに実施した。ウサギポリクローナル抗ＣＡＴ抗体は、５プライム→３プライム（ボウルダー、コロラド、米国）から購入し、ウサギポリクローナル抗ＶＳＶ−Ｇ抗体は、Michael Bruns (Heinrich-Pette-Institut, Hamburg、Germany)から得、ヒト抗ＨＣＶポリクローナル血清は、Eric Gowans (Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre, Brisbane, Australia）により提供された。ＫＵＮ抗ＮＳ３抗体の調製および特性評価は前記した（Westaway et al., J.Virol., 1997, 71:6650-6661）。
【０１０３】
［インサイチューのβ−ガラクトシダーゼ染色およびβ−ガラクトシダーゼアッセイ］
Ｃ２０ＤＸ／β−ＧＡＬ／２ＡｒｅｐＲＮＡを用いてエレクトロポレーションするか、またはキャプシド形成Ｃ２０ＤＸ／β−ＧＡＬ／２ＡｒｅｐＲＮＡを含むＶＬＰを用いて感染したＢＨＫ２１細胞のＸ−ｇａｌ染色、並びに細胞溶解液におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の決定を、実質的に製造に記載したように、市販のβ−ＧＡＬ酵素アッセイ系キット（プロメガ社製、マディソン、ウィスコンシン、米国）を使用して実施した。
【０１０４】
［ＣＡＴアッセイ］
ＴＲＣＡＴおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＲＮＡｓを用いてエレクトロポレーションするか、またはキャプシド形成Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＲＮＡを含むＶＬＰを用いて感染した後のＢＨＫ２１細胞の可溶化液の、またはＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＮｅｏＲＮＡを発現する安定な細胞系のＣＡＴ活性は、前記したようにＴＬＳまたはＬＳＣアッセイを使用して決定した（KhromykhおよびWestaway、J.Virol., 1997, 71:1497-1505）。
【０１０５】
［キャプシド形成粒子の調製およびその力価の決定］
ＣＡＴ、ＧＦＰおよびＶＳＶ−Ｇタンパク質を発現する組換えＶＬＰの調製およびその力価の決定は、実施例１に記載のように実施した。
【０１０６】
［異種産物の発現の最適時間］
この系を使用して異種産物の発現のレベルおよび最適時間を推断するために、並びに、複製に対する挿入配列のサイズの効果および得られた組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージング効率を評価するために、ＣＡＴ（２１８アミノ酸）、ＧＦＰ（２３７アミノ酸）、およびβ−Ｇａｌ（１０１７ａａ）遺伝子を発現するＫＵＮレプリコンを、Ｃ２０ＤＸ２Ａｒｅｐベクターに調製した（図１０Ｂ）。加えて、ＣＡＴ遺伝子はまた、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ  ＲＮＡを産生するＣ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐベクターに挿入した（図１０Ｃ）。我々の系における発現糖タンパク質の適切なグリコシル化を実証するために、ＶＳＶ Ｇグリコプロテインを発現するＣ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２Ａｒｅｐ構造体（図１０Ｂ）を調製した。エレクトロポレーションしたＢＨＫ２１細胞におけるこれらの遺伝子の発現は、初めに、ＣＡＴおよびＶＳＶ−Ｇタンパク質のための特異的な抗体を用いたＩＦ解析により（図１１Ａ）、ＧＦＰタンパク質のための生非固定細胞の蛍光解析により（図１１Ｂのパネル１）、およびβ−Ｇａｌタンパク質のためのＸ−ｇａｌ染色により（図１１Ｂのパネル２）実証された。これらの実験における発現している細胞の比率は、エレクトロポレーションから、２４から４８時間後に、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ  ＲＮＡの〜１０％、Ｃ２０ＤＸ／β−Ｇａｌ／２Ａｒｅｐ、Ｃ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡｓの〜２０％から、Ｃ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２Ａ  ＲＮＡの〜５０％まで変化した（データは示していない）。別々の実験において、〜８０から９０％の細胞を、Ｃ２０ＤＸ／β−Ｇａｌ／２ＡｒｅｐＲＮＡを用いて形質移入した。
【０１０７】
［ＨＣＶタンパク質の発現］
ＫＵＮレプリコン系を使用してＨＣＶタンパク質を発現させるために、オーストラリアのＨＣＶ単離物（TrowbridgeおよびGowans、Arch.Virol.、1998、143:501-511）のコアおよびＮＳ５３遺伝子を、レプリコンベクターＣ２０ＤＸ２Ａｒｅｐを使用して発現させた。ほとんどのＨＣＶ ＮＳ５３細胞毒性Ｔ細胞エピトープを含む、ＨＣＶ ＮＳ３遺伝子の切断短縮形（アミノ酸１８３から６１７をコード）を、Ｃ２０ＤＸ２Ａｒｅｐベクターにクローニングした。組換えＣ２０ＤＸ／ｈｃｖＮＳ３／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡのＢＨＫ２１細胞への形質移入により、形質移入細胞の〜２０から３０％にＨＣＶ  ＮＳ３遺伝子の発現が検出された（図１１Ｃのパネル２）。ＨＣＶコア遺伝子は、２つの形で発現した：全長遺伝子（１９１個のアミノ酸をコード、Ｃ２０ＤＸ／ｈｃｖ−ｆｌコア／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡ、図１０Ｂ）および切断短縮遺伝子（最初の１６０個のアミノ酸をコード、Ｃ２０ＤＸ／ｈｃｖ−ｔｒコア／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡ、図１０Ｂ）。両方のＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのエレクトロポレーションにより、形質移入細胞の〜６０から７０％にＨＣＶコアタンパク質が（データは示していない）、ヒト抗ＨＣＶ抗血清を用いたＩＦの強度により判断したところ、類似したレベルで発現された（図１１Ｃ、パネル３および４）。有意には、他の系でのＨＣＶコアの異なる形の発現に関する報告と類似して、ＫＵＮレプリコンベクターから発現した切断短縮ＨＣＶコアは、核に局在したが、全長のコアは局在しなかった（データは示していない）。
【０１０８】
［ＫＵＮレプリコンベクターを使用した異種タンパク質の発現、プロセシングおよびグリコシル化の動態］
対応する組換えレプリコンＲＮＡｓのＢＨＫ２１細胞へのエレクトロポレーション後、２つの異なるサイズのリポーター遺伝子ＣＡＴ（２１８個のアミノ酸）およびβ−Ｇａｌ（１０１７個のアミノ酸）の発現動態を、適当なリポーター遺伝子アッセイにより比較した。複製ＫＵＮレプリコンＲＮＡの検出に関する以前の結果と類似して、両方のリポーター遺伝子の検出可能な発現に約１０から１６時間の遅延が観察された（図１２）。エレクトロポレーションした細胞をさらにインキュベートすると、ＣＡＴタンパク質は迅速に蓄積し、形質移入後から３０時間で最大に達し（図１２Ａ）、一方、β−Ｇａｌタンパク質の蓄積は、僅かに遅延し、形質移入後から、３６から４０時間で最大に達した（図１２Ｂ）。平行実験において、ＳＩＮレプリコンからのＣＡＴ遺伝子の発現（図１２ＡのＴＲＣＡＴ）およびＳＦＶレプリコンからのβ−ＧＡＬ遺伝子の発現（図１２ＢのＳＦＶ３／ＬａｃＺ）は、形質移入後初期に（６から８時間）最大レベルに達し、実験中ほぼ同じレベルを維持した。同量のアルファウイルスレプリコンＲＮＡおよび対応するＫＵＮレプリコンＲＮＡを用いてエレクトロポレーションした細胞におけるＣＡＴおよびβ−ＧＡＬ遺伝子の発現の最大レベルは類似していた（図１２ＡおよびＢ）。β−ＧＡＬ発現の定量解析により、１０6個の初期形質移入細胞あたり、〜６から７μｇおよび〜７から８μｇのβ−ＧＡＬタンパク質が、それぞれ、エレクトロポレーションしたＣ２０ＤＸ／β−ＧＡＬ／２ＡｒｅｐおよびＳＦＶ３／ＬａｃＺ  ＲＮＡｓの〜５μｇから産生されたことが示された（図１２Ｂ）。重要なことには、ＳＦＶレプリコンＲＮＡからのβ−ＧＡＬを発現する細胞の大量破壊とは対照的に（データは示していない）、ＫＵＮレプリコンからのβ−ＧＡＬを発現する細胞は極めて健康に見えた（例えば図１１Ｂ参照）。
【０１０９】
エレクトロポレーションした細胞において組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡの翻訳中に、ＦＭＤＶ−２Ａプロテアーゼにより仲介される適切なタンパク質分解性切断が生じるがどうかを検証するために、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡから発現する放射標識タンパク質産物のサイズを、抗ＣＡＴ抗体を用いる放射免疫沈降法（ＲＩＰ）解析を使用して検証した。Ｃ２０／ＣＡＴ／２Ａ融合タンパク質（２５７個のアミノ酸）の推定サイズに相当する〜３０ｋＤａの強い放射標識バンドが観察され（図１３Ａ、レーン１）、これは、ＦＭＤＶ−２Ａ切断が実際に生じたことを示唆する。Ｃ２０／ＣＡＴ／２Ａ／２２Ｅ融合タンパク質（２８６個のアミノ酸）の推定サイズに相当する〜３３ｋＤａの非常に弱いバンドの存在もまた観察され（図１３Ａ、レーン１）、これは、ＦＭＤＶ−２Ａプロテアーゼによる切断は完全ではなかったことを示唆する。しかし、これらの２本のバンドの相対強度を比較解析することにより、ほとんどの融合タンパク質（〜９５％から９８％）が効率的に切断したことが明らかに実証された。２２ＥなからＮＳ１の間の切断は（図１０Ａ）、細胞性シグナルペプチドプチダーゼにより仲介されることを記載する。
【０１１０】
ジシストロン性ＫＵＮレプリコンベクターＣ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐからの異種遺伝子の発現および適切なプロセシングは、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ  ＲＮＡ（図１３Ａ、レーン２）を用いて形質移入したＢＨＫ２１細胞の可溶化液からの抗ＣＡＴ免疫沈降物における、Ｃ２０ＣＡＴタンパク質（２４０個のアミノ酸）の推定サイズに相当する〜２７．５ｋＤａの放射標識バンドの検出により実証された。ＫＵＮレプリコンから発現したＶＳＶ−Ｇグリコプロテインのグリコシル化は、Ｃ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡを用いて形質移入したＢＨＫ２１細胞の放射標識可溶化液から免疫沈降した、エンドグリコシダーゼＦ処理ＶＳＶ−Ｇタンパク質のサイズの減少の観察により実証された（図１３Ｂのレーン１と２を比較）。
【０１１１】
［組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡの偽感染性ウイルス様粒子へのパッケージング］
比較的高いレベルの異種遺伝子発現が、組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡのエレクトロポレーション後にＢＨＫ２１細胞で達成されたが、異なる細胞系の形質移入の効率は著しく変化することはよく知られている。その結果、発現に使用できる細胞の範囲を広げるために、キャプシド形成組換えレプリコンＲＮＡｓを含む、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のストックを調製することが望ましかった。本発明により、ＫＵＮレプリコンＲＮＡ並びにＫＵＮ構造遺伝子を発現するＳＦＶレプリコン  ＲＮＡ  ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５を用いた連続的な形質移入を使用して、ＫＵＮ構造タンパク質によりキャプシド形成されたＫＵＮレプリコンＲＮＡを含むＶＬＰの産生が可能となる、異種パッケージング系が開発された。最も高い力価のＶＬＰは、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５  ＲＮＡを用いた第二のエレクトロポレーションを、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの最大複製時に実施した場合に達成された（〜２４から２７時間の遅延）。その結果、組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡを用いたパッケージング実験では、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５ＲＮＡを用いた第二のエレクトロポレーションを、組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡの最大複製が推定される時間に実施した（時間間隔については図１４の説明文参照）。
【０１１２】
実質的に全ての組換えレプリコンＲＮＡを、効率は異なるが、ＶＬＰにパッケージングした（図１４）。最も低い効率のパッケージングが、ＨＣＶコアタンパク質を発現するレプリコンＲＮＡで得られ（〜１０3感染単位（ＩＵ）／ｍｌ、結果は示していない）、これは、ＨＣＶコア遺伝子配列またはそのタンパク質産物が、組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡのキャプシド形成を強く妨害することを示唆する。他の組換えＲＮＡを用いてパッケージング実験で回収した細胞外ＶＬＰの力価は、感染性アッセイに使用した細胞の型（ベロまたはＢＨＫ２１）および挿入配列に応じて、全て１０5から１０6ＩＵ／ｍｌの範囲であった（結果は示していない）。一般に、感染性アッセイをＢＨＫ２１細胞よりもベロ細胞で実施した場合に、およびパッケージングを高い初期形質移入／複製効率を有する組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡを用いて実施した場合に、より高い力価が得られた。類似の量の感染性ＶＬＰがまた、形質移入細胞の可溶化液から回収された（結果は示していない）。
【０１１３】
［Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏベクターを使用したＣＡＴおよびＧＦＰ遺伝子を発現する安定な細胞系の確立］
異種遺伝子を発現する安定な細胞系の確立のためのジシストロン性ＫＵＮ−Ｎｅｏレプリコンベクターの有用性を実証するために、ＣＡＴおよびＧＦＰ配列を、Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏベクターのＳｐｅＩ部位にクローニングすることにより、２つの構造体、Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２ＡｒｅｐＮｅｏおよびＣ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２ＡｒｅｐＮｅｏを調製した（図１０ＡおよびＢ）。得られたＲＮＡｓのＢＨＫ２１細胞への形質移入、および続けてこれらの細胞を１ｍｇ／ｍｌＧ４１８（ジェネチシン（Geneticin））を補充した培地中でインキュベートすることにより、ＣＡＴおよびＧＦＰ遺伝子を発現する細胞が急速に濃縮された（それぞれ、ｒｅｐＣＡＴ−ＢＨＫおよびｒｅｐＧＦＰ−ＢＨＫについては図１５に示す）。全細胞個体群のほとんどの細胞が、比較的高レベルの異種タンパク質を産生していた（例えば図１５Ａ参照）。重要には、発現レベルは、さらなる細胞の継代中にも安定であり続けた（図１５Ｂの継代６および１７でのｒｅｐＣＡＴ−ＢＨＫ細胞のＣＡＴ発現を比較）。
【０１１４】
上記の例により、非細胞変性フラビウイルスＫＵＮレプリコンベクターは哺乳動物細胞における異種遺伝子の一過性または安定な発現に使用できることが示される。それらはまた、異種遺伝子を発現する組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡが、ＫＵＮ構造遺伝子を発現するＳＦＶレプリコンＲＮＡを用いて続けて形質移入することにより、偽感染性ウイルス様粒子にキャプシド形成できることを示す。これらのウイルス様粒子は、組換え自己複製ＲＮＡを、広範囲の細胞または動物に送達するために使用でき、よって異種タンパク質が長期に産生される。重要なことには、開発したパッケージング系の異種性質のために、感染性ウイルスを産生するＫＵＮないしＳＦＶ  ＲＮＡの組換えは全く生じ得ない。
【０１１５】
ＫＵＮレプリコンベクターを使用して産生された異種タンパク質の量は、アルファウイルスレプリコンベクターを使用して報告されたものより少ないが、アルファウイルスレプリコンと比べてＫＵＮレプリコンの複製は、細胞において全く細胞変性効果を生じなかった。この非細胞変性性質およびＫＵＮレプリコン複製の持続により、ＩＲＥＳ−ＮｅｏカセットをＣ２０ＤＸ２Ａｒｅｐレプリコンの３'ＵＴＲに挿入することにより異種遺伝子を連続的に発現する安定な細胞系の産生のためのベクターの開発が可能となった。このような選択ベクター（Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏ）を使用して、ＧＦＰおよびＣＡＴ遺伝子を連続的に発現する安定なＢＨＫ細胞系が、抗生物質Ｇ４１８による形質移入細胞の選択により迅速に確立された。確立された細胞系におけるこれらの遺伝子の発現は、少なくとも１７継代において同レベルに維持された。
【実施例４】
【０１１６】
［ユビキチン遺伝子を含むレプリコンベクターの構築］
マウスユビキチン遺伝子は、プラスミドｐＲＢ２６９（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．,ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６９：２５３８１−２５３８６）から、特異的なクローニング部位（図１６Ａ参照）を取込んだ適当なプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。次いで、５'末端にＸｂａＩ部位および３'末端にＳｐｅＩ部位を含む得られたＰＣＲフラグメントを、Ｃ２０ＤＸ２ＡｒｅｐプラスミドのＳｐｅＩ部位にクローニングし（図１０Ａ参照）、Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａｒｅｐベクターを産生した（図１６）。従って、目的の遺伝子を、Ｃ２０ないしユビキチンまたはユビキチンないしＦＭＤＶ２Ａプロテアーゼ配列のいずれかにクローニングできる（図１６Ａ）。異種配列をＣ２０ないしユビキチンに挿入した場合、得られる産物は、プロテオソーマへ効率的に標的化する、Ｎ末端でＣ２０と、およびＣ末端でユビキチンと融合したものとなろう。異種配列をユビキチンないしＦＭＤＶ２Ａに挿入した場合、得られる産物は、正しく処理されたＮ末端を有するであろうが、Ｃ末端に融合したＦＭＤＶ２Ａペプチドを含むだろう。Ｃ２０ＤＸＵｂ２ＡｒｅｐＲＮＡのＢＨＫ２１細胞への形質移入により、Ｃ２０ＤＸｒｅｐＲＮＡの複製と類似した効率を有する複製が生じた（図１６Ｂ）。
【実施例５】
【０１１７】
［ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列を有する修飾クンジンレプリコンベクター］
標準３'末端を有するＫＵＮレプリコン転写物を産生するために、我々は、肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）抗ゲノムリボザイム配列（ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５０：４３４−４３６）、次いでサルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル（ＨＤＶリボ／ＳＶ４０ポリＡ）を、ＫＵＮレプリコン配列の最後のヌクレオチドのすぐ下流に取込んだ（図１７Ａ）。デルタウイルスリボザイムは、インビトロ転写反応中または細胞への形質移入後にそれ自体が切断除去し、従って、ＫＵＮレプリコンＲＮＡの正確な３'末端が放出され、これはＫＵＮ  ＲＮＡ複製の効率的な開始に重要である。ＫＵＮレプリコン配列の最後の１３３１ヌクレオチド、次いでＨＤＶリボ／ＳＶ４０ポリＡカセットを含むフラグメントを、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）、適切なプライマーおよび２つのプラスミドＤＮＡ ｐＴＭＳＶ５Ａ（Tom Macnaughton、Sir Albert Sakzewski Virus Research Center、Brisbane、Australiaから得た）およびＣ２０ＤＸｒｅｐを鋳型として使用して、融合ＰＣＲ反応（Karreman、1998、Bio Techniques 24:736-742）により産生された。プライマーはＮＳ５ｄＧＤＤ＿Ｆ（ＫＵＮ  ＮＳ５配列、正）-5'-CTG GTT AAC TGT GTG GTA AAG CCC TT-3';3'UTRHDV(ＫＵＮ３'末端およびＨＤＶリボザイムの接合部）-5'-GAG AAC ACA GGA TCT GGG TCG GCA TGG CAT CT-3';SV40pA#R(ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、逆）-5'-GGC CTC GAG CAA TTG TTG TTG TTA ACT T-3'であった。
【０１１８】
得られたＰＣＲ産物は、ＸｍａＩ（５'末端）およびＸｈｏＩ（３'末端）で消化し、ＸｍａＩ／ＸｈｏＩ消化Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａｒｅｐ  ＤＮＡにクローニングし、Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａ＿ＨＤＶｒｅｐベクターを産生した（図１７Ａ）。
【０１１９】
この構造体から転写した〜５から１０μｇＲＮＡのエレクトロポレーションにより、同量の親Ｃ２０ＤＸＵｂ２ＡｒｅｐＲＮＡを用いて形質移入した後に得られた〜６０％の陽性細胞と比較して、〜１００％のＢＨＫ２１細胞で効率的な複製がなされた。
【実施例６】
【０１２０】
［ＤＮＡを基本としたクンジンレプリコン発現ベクター］
対応するプラスミドＤＮＡの形質移入後に、細胞性ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるＫＵＮレプリコンＲＮＡのインビボ転写を可能とするために、我々は、サイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサー／プロモーター領域をＫＵＮレプリコン配列のすぐ上流に挿入することにより、現存するＫＵＮレプリコンベクターＣ２０ＤＸＵｂ２Ａ＿ＨＤＶｒｅｐを修飾した。ＣＭＶ−ＩＥプロモーター配列、次いでＫＵＮレプリコン配列の５'末端を含むフラグメントを、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、適切なプライマーおよびｐＣＩ（プロメガ）およびＣ２０ＤＸＵｂ２ＡｒｅｐプラスミドＤＮＡを鋳型として使用して、融合ＰＣＲ反応（Karreman、1998、Bio Techniques 24:736-742）で産生した。プライマーは、ＣＭＶ＿Ｆ（ＣＭＶ ＩＥプロモーター、正）-5'-GCG CTT AAG ACA TTG ATT ATT GAC TAG TTA-3';CMV5'UTR（ＣＭＶプロモーターおよびＫＵＮ配列の５'ＵＴＲの接続部）-5'-CGT TTA GTG AAC CGA GTA GTT CGC CTG TGT GA-3';FMDV2AR（ＦＭＤＶ−２Ａオートプロテアーゼ配列、逆）-5'-GTG ACG CGT CGG CCG GGC CCT GGG TTG GA-3'であった。得られたＰＣＲ産物は、ＥａｇＩ（３'末端）で消化し、ＮｒｕＩ（平滑）／ＥａｇＩ消化Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａ＿ＨＤＶｒｅｐプラスミドにクローニングし、ｐＫＵＮＲｅｐ１ベクターを産生した（図１８Ａ）。ＳＶ４０ポリＡ配列は、ＨＤＶ抗ゲノムリボザイム配列の下流に前もって取り込み（図１７Ａ参照）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写の終結を確認した。
【０１２１】
ＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬（ベーリンガーマンハイム）を使用したプラスミドＤＮＡ ｐＫＵＮＲｅｐ１のＢＨＫ２１細胞への形質移入により、形質移入から４２時間目に、ＫＵＮ  ＮＳ３タンパク質（複製ＫＵＮレプリコンＲＮＡの指標）の発現の検出に成功した（図１８Ｂ）。
【実施例７】
【０１２２】
［キャプシド形成Ｃ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２ＡｒｅｐＲＮＡを含む組換えＫＵＮ  ＶＬＰを用いて鼻腔内免疫化後のマウス肺上皮におけるＧＦＰの発現］
２匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＧＦＰを発現する組換えＫＵＮ  ＶＬＰの〜１０6ＩＵ／マウスを用いて免疫化した（ＶＬＰ調製およびその力価の決定の詳細については実施例３参照）。マウスを免疫化する前に、腹膜内経路を介して、ケタミン／キシラジン（マウス重量２０ｇあたり１００μｌ）を用いて麻酔した。免疫化後２日および４日目に、マウスをＣＯ2を用いて安楽死させ、その肺を集め、ＰＢＳで濯ぎ、４％パラホルムアルデヒド中で２から４時間４℃で固定した。肺はまた、対照非免疫化マウスから同法を使用して集めた。全標本はパラフィン包埋し、ミクロトームで〜５ミクロンに切片化し、顕微鏡スライドにのせ、ＦＩＴＣフィルターを使用して紫外線光下で解析した。強いＧＦＰ蛍光が、組換えＫＵＮ  ＶＬＰを用いて免疫化したマウスから調製した肺切片の気道路を裏打ちする上皮細胞に観察されたが、対照マウスから調製した肺切片には観察できなかった（図１９）。これらの結果は、組換えＫＵＮ  ＶＬＰを使用したインビボでの異種遺伝子の効率的な送達および発現を明らかに実証する。
【実施例８】
【０１２３】
［マウスのＫＵＮレプリコンＶＬＰの免疫原性特性］
ＫＵＮレプリコンＶＬＰの免疫原性特性を評価するために、３匹のＢＡＬＢ／Ｃマウスを、パッケージ化したＣ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２ＡｒｅｐＲＮＡを含むＶＬＰの〜５×１０5ＩＵを用いて皮内（尾の基底部に）免疫化した（実施例３参照）。免疫化から２週間後、その血清を、精製ＧＦＰタンパク質を用いてエリザ（ＥＬＩＳＡ）により抗ＧＦＰ抗体の存在について解析した。各マウスにおける５０％終点滴定（エリザｔ50）の結果は、１番のマウスは１／２００、２番のマウスは１／１３０、３番のマウスは１／１００であった。これらの結果は、ＫＵＮレプリコンベクターによりコードされた異種タンパク質への特異的体液性免疫応答は、組換えＫＵＮ  ＶＬＰを用いたわずか１回の免疫化から２週間後という早さで発達できることを明らかに実証する。抗体応答は、第二の免疫化後に大きく増強するであろうことが予期される。
【０１２４】
上記した原理、好ましい実施形態および実施例を含む本発明の前述の記載は、本発明を説明するものであり、その範囲を限定するものではないことを理解されたい。本発明として記載されたものの精神から逸脱することなく、本発明に変形および変更を他者により施し得、この範囲内に該当するこのような全ての変形および変化はそれを単に説明するためのものであることを意図するものである。
【０１２５】
（１）  （ａ）複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンと、（ｂ）フラビウイルス構造タンパク質および該レプリコンを感染性フラビウイルス様粒子にパッケージングするのに必要ないずれかの他のタンパク質を発現できる少なくとも第２のベクターとを含み、該第２のベクターが存在する場合、そのベクターが該レプリコンとの組換えを防ぐように設計されていることを特徴とする遺伝子発現および送達のシステム。
（２）  上記フラビウイルス起源のレプリコンが、フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要な、フラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）ヌクレオチド配列と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルス３'ＵＴＲの３'末端配列の一部またはすべてとを含み、レプリコンベクターがその複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適した（１）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（３）  上記レプリコンが十分な量のフラビウイルス５'ＵＴＲおよび十分な量のＲＮＡ複製に必要なコアタンパク質についての５'フラビウイルスコード領域を含有する（１）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（４）  上記レプリコンがフラビウイルス５'ＵＴＲおよびフラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域からの少なくとも約６０から８０の間のヌクレオチドを含有する（１）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（５）  上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、クンジンウイルス５'ＵＴＲおよびクンジンウイルス５'コアタンパク質コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドを含有する、（１）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（６）  （ａ）フラビウイルス５'ＵＴＲについてのヌクレオチド配列と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'ヌクレオチドコード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質についてのヌクレオチドコード領域と、フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要なフラビウイルス３'ＵＴＲの十分な量の３'末端領域と、フラビウイルス構造タンパク質についてのヌクレオチドコード配列とを含むフラビウイルス起源の自己複製する発現ベクターと、ここで、（ｉ）該ベクターは当該ベクターの複製能力を破壊することなく、少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適し、（ｉｉ）該ヌクレオチド配列は、フラビウイルス構造タンパク質についてコードするであろう少なくとも１の遺伝子の発現を脱活性化するように該ベクターに挿入され、（ｉｉｉ）該挿入されたヌクレオチド配列は、それが脱活性化する構造タンパク質配列についてコードせず、（ｂ）（ｉ）レプリコン発現ベクターによって発現されないフラビウイルス構造タンパク質を発現することができ、（ｉｉ）第２のベクターが存在する場合、自己複製ベクターとの組換えを妨げるように設計されている少なくとも第２のベクターとを含む遺伝子発現および送達のシステム。
（７）  上記レプリコンが、フラビウイルスタンパク質およびＲＮＡ複製のプロセッシングを行わない複製中のいずれの点においても、少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適した（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（８）  上記ヌクレオチド配列がレプリコンの３'ＵＴＲに挿入された（７）記載の遺伝子発現及び送達のシステム。
（９）  上記レプリコンの３'ＵＴＲに挿入されたヌクレオチド配列がＩＲＥＳ配列によって先行されている（８）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１０）  上記ヌクレオチド配列が構造遺伝子内に挿入された（６）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１１）  上記ヌクレオチド配列が少なくとも１の欠失された構造遺伝子の箇所内に挿入された（６）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１２）  上記レプリコンの欠失された構造タンパク質の代わりに挿入されたヌクレオチド配列に続いて、終止コドンおよびＩＲＥＳ配列がある（１１）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１３）  上記レプリコンがＲＮＡに基づくベクターである（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１４）  上記レプリコンがＤＮＡに基づくベクターである（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１５）  上記レプリコンが単一のフラビウイルス種に由来する（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１６）  上記レプリコンがクンジンウイルスに由来する（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１７）  上記レプリコンが以下のベクター、C20rep、C20DXrep、C20DXrepNeo、C20DX2Arep、C20DX2ArepNeo、C20DX/CAT/2Arep、C20DX/CAT/2ArepNeo、C20DXIRESrep、C20DX/CAT/IRESrep、C20DX/GFP/2Arep、C20DX/GFP/2ArepNeo、C20DX/hcvCORE160/2Arep、C20DX/hcvCORE191/2Arep、C20DX/hcvNS3/2Arep、C20DX/VSV-G/2Arep、C20DX/β-GAL/2Arep、C20DXUb2A#HDVrep、pKUNRep1のうちの１から選択される（１６）記載の遺伝子発現システム。
（１８）  上記第２のベクターがレプリコンの起源間で異種である（１）または（２）記載の遺伝子発現および送達のシステム。
（１９）  上記第２のベクターがアルファウイルスに由来する（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（２０）  上記第２のベクターがセムリキ森林熱ウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２１）  上記第２のベクターがシンドビスウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２２）  上記第２のベクターがアデノウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２３）  上記第２のベクターが鶏痘ウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２４）  上記第２のベクターが牛痘ウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２５）  上記第２のベクターがＤＮＡ発現カセットを哺乳動物細胞への送達するのに適したバクロウイルスに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２６）  上記第２のベクターが哺乳動物細胞において遺伝子の連続的な発現または誘導性の発現を可能とするプラスミドＤＮＡに由来する（１７）記載の遺伝子発現システム。
（２７）  上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、上記第２のベクターがセムリキ森林熱ウイルスに由来する（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（２８）  上記レプリコンがクンジンウイルスに由来し、上記第２のベクターがシンドビスウイルスに由来する（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（２９）  上記レプリコンが、フラビウイルスゲノムの少なくとも最初の約１５０ヌクレオチドと、Ｅタンパク質の少なくとも最後の約６０ヌクレオチドと、実質的にすべての非構造領域と、３'ＵＴＲの一部またはすべてとの一部またはすべてを含むのに適した（１）または（２）記載の遺伝子発現達システム。
（３０）  上記レプリコンが、ＫＵＮゲノムの最初の１５７ヌクレオチドと、Ｅタンパク質の最後の６６ヌクレオチドと、全ての非構造領域と、３'ＵＴＲのすべてとの一部またはすべてを含むのに適した（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（３１）  上記レプリコンが以下のベクター、C20rep、C20DXrep、C20DXrepNeo、C20DX2Arep、C20DX2ArepNeo、C20DX/CAT/2Arep、C20DX/CAT/2ArepNeo、C20DXIRESrep、C20DX/CAT/IRESrep、C20DX/GFP/2Arep、C20DX/GFP/2ArepNeo、C20DX/hcvCORE160/2Arep、C20DX/hcvCORE191/2Arep、C20DX/hcvNS3/2Arep、C20DX/VSV-G/2Arep、C20DX/β-GAL/2Arep、C20DXUb2A#HDVrep、pKUNrep1の群から選択される（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（３２）  上記レプリコンがフラビウイルスコアタンパク質を除くすべてのフラビウイルス構造タンパク質をコードし、前記の第２のベクターがＳＦＶ−Ｃである（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（３３）  上記レプリコンがフラビウイルスコアタンパク質をコードし、前記の第２のベクターがＳＦＶ−ｐｒＭＥである（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（３４）  上記レプリコンがいずれのフラビウイルス構造タンパク質もコードせず、前記の第２のベクターがＳＦＶ−ｐｒＭＥ−ＣおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５である（１）または（２）記載の遺伝子発現システム。
（３５）  C20DX2Arep、C20DX2ArepNeo、C20DX/CAT/2Arep、C20DX/CAT/2ArepNeo、C20DXIRESrep、C20DX/CAT/IRESrep、C20DX/GFP/2Arep、C20DX/GFP/2ArepNeo、C20DX/hcvCORE160/2Arep、C20DX/hcvCORE191/2Arep、C20DX/hcvNS3/2Arep、C20DX/VSV-G/2Arep、C20DX/β-GAL/2Arep、C20DXUb2A#HDVrep、pKUNrep1から選択されるフラビウイルスレプリコン。
（３６）  （３５）記載の少なくとも１のレプリコンを含有する安定して形質転換された細胞系。
（３７）  （２８）記載の少なくとも１のレプリコンを含有する安定して形質転換された細胞系であって、該レプリコンが３'ＵＴＲ中にＩＲＥＳ−ＮｅｏまたはＩＲＥＳ−ｐａｃカセットを含む該細胞系。
（３８）  （ｉ）複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンを細胞に導入するステップと、（ｉｉ）細胞増殖および複製を可能とする条件下でその細胞系を培養するステップとを含むレプリコンＲＮＡを永続的に生産することができる安定な細胞系の生産システム。
（３９）  （ｉ）複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のレプリコンを細胞に導入するステップと、（ｉｉ）フラビウイルス構造タンパク質、および自己複製発現ベクターをフラビウイルスのウイルス性粒子にパッケージングするのに必要ないずれかの他のタンパク質を発現することができる第２のベクターをレプリコン含有細胞に導入するステップであって、該第２のベクターは、それが存在する場合、自己複製ベクターとの組換えを妨げるように設計されているステップと、（ｉｉｉ）該レプリコンを含有するウイルス様粒子を回収するステップとを含むフラビウイルス様粒子の生産システム。
（４０）  複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルスレプリコンを含有するフラビウイルス様粒子。
（４１）  上記レプリコンがＤＮＡレプリコンである（４０）記載のフラビウイルス様粒子。
（４２）  上記レプリコンがＲＮＡレプリコンである（４０）記載のフラビウイルス様粒子。
（４３）  複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適したフラビウイルス起源のＤＮＡレプリコン。
（４４）  フラビウイルス起源のレプリコンがフラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要な、フラビウイルス５'非翻訳領域（ＵＴＲ）についてのヌクレオチド配列と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、フラビウイルス３'ＵＴＲの３'末端配列の一部または全部とを含み、そのベクターがその複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適した（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（４５）  十分な量のフラビウイルス５'ＵＴＲ、および十分な量のＲＮＡ複製に必要なコアタンパク質についての５'フラビウイルスコード領域を含有する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（４６）  フラビウイルス５'ＵＴＲ、およびフラビウイルスコアタンパク質についての５'コード領域からの少なくとも約６０から８０のヌクレオチドを含有する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（４７）  クンジンウイルスに由来し、クンジンウイルス５'ＵＴＲおよびクンジンウイルス５'コアタンパク質コード領域の少なくとも６０ヌクレオチドを含有する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（４８）  上記レプリコンが、フラビウイルス５'ＵＴＲについてのヌクレオチド配列と、フラビウイルスコアタンパク質についての５'ヌクレオチドコード領域の少なくとも一部と、フラビウイルス非構造タンパク質についてのヌクレオチドコード領域と、フラビウイルスゲノム物質の自己複製に必要なフラビウイルス３'ＵＴＲの十分な量の３'末端領域と、フラビウイルス構造タンパク質についてのヌクレオチドコード配列とを含み、ここで、（ｉ）レプリコンベクターは該ベクターの複製能力を破壊することなく少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適し、（ｉｉ）フラビウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１の遺伝子の発現を脱活性化するように該ヌクレオチド配列がベクターに挿入され、（ｉｉｉ）該挿入されたヌクレオチド配列が、それが脱活性化する構造タンパク質配列をコードしない（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（４９）  フラビウイルスタンパク質およびＲＮＡ複製のプロセッシングを行わないレプリコン中のいずれの点においても、少なくとも１のヌクレオチド配列を受容するのに適した（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５０）  ヌクレオチド配列がレプリコンの３'ＵＴＲに挿入される（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５１）  レプリコンの３'ＵＴＲに挿入されたヌクレオチド配列がＩＲＥＳ配列によって先行される（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５２）  上記ヌクレオチド配列が構造遺伝子内に挿入される（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５３）  上記ヌクレオチド配列が少なくとも１の欠失した構造遺伝子の箇所内に挿入される（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５４）  レプリコンの欠失した構造タンパク質の代わりに挿入されたヌクレオチド配列につづいて、終止コドンおよびＩＲＥＳ配列が存在する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５５）  上記レプリコンが単一のフラビウイルス種に由来する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５６）  上記レプリコンがクンジンウイルスに由来する（４３）記載のＤＮＡレプリコン。
（５７）  （１）から（５６）のいずれか一に記載のフラビウイルスレプリコンを含有する治療剤。
（５８）  （１）から（５７）のいずれか一に記載のフラビウイルスレプリコンを含有するワクチン。
（５９）  （１）から（５８）のいずれか一に記載の遺伝子発現システム。
【０１２６】
本発明のさらなる特徴は、以下の図面および実施例でより十分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】全長ＫＵＮ  ｃＤＮＡの構築および特異的感染性、ならびにＫＵＮレプリコンＲＮＡを示す。全長および欠失された（レプリコン）構造体の模式的表示は、ＫＵＮビリオンＲＮＡ（陰影ボックス）からＲＴ−ＰＣＲによって得られた類似の断片でのＡＫＵＮクローン（テキスチャードボックス）におけるｃＤＮＡ断片の構成的置換を示す。図面の右側のＰＦＵ力価は、ＢＨＫ２１細胞への転写されたＲＮＡのエレクトロポレーション後に得られ、プラークアッセイによって測定された（これらの実験からの）平均を表す、精製された野生型ＫＵＮ  ＲＮＡの力価は〜１０5から１０6ＰＦＵ／μｇＲＮＡであった。Ｂｇｌ（８９）、Ｓａｃ（１４８１）、Ｓｐｈ（２４６７）、Ｄｒａ（８３７６）、Ｘｈｏ（１１０２１）は、ＫＵＮ配列におけるヌクレオチド数を表す括弧中の数にて置換クローニング使用される制限酵素部位を示す。Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、ＦＬＳＤおよびＦＬＳＤＸ構造体における６８９５ヌクレオチドの示されたｃＤＮＡ断片を得るのに使用し、ＦＬＳＤＸ中の「Ｐｆｕ  ＰＣＲ」は、２６４５ヌクレオチドのこのｃＤＮＡ断片がＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて得られたことを示す。Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＣ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏ構造体は、実施例１（Ｃ２０Ｄｒｅｐ）および実施例４（Ｃ２０ＤＸｒｅｐＮｅｏ）にて後記するごとくに調製した。塗りつぶしていないボックスはゲノムの欠失された部分を表し、Ｉｒｅｓは脳脊髄炎ウイルスＲＮＡの内部リボソームエントリー部位であり、Ｎｅｏはネオマイシントランスフェラーゼ遺伝子である。
【図２】組換えＳＦＶ構造体の模式的表示を示す。全ての構造体における実線は多重クローニング部位に近接するＳＦＶレプリコンゲノムのセグメントを表し、塗りつぶしていないボックスは示された挿入されたＫＵＮ構造遺伝子Ｃ、ｐｒＭおよびＥを示し、２６ＳはサブゲノムＳＦＶプロモーターの位置を示し、ＫＵＮ  ｐｒＭおよびＥ遺伝子における塗りつぶしたまたは部分的に塗りつぶしたボックスは、各々、疎水性シグナルおよびアンカー配列を表す。ヌクレオチド配列における大文字は真性ＫＵＮヌクレオチドを示し、小文字はｐＳＦＶ１ベクターに由来し、またはＫＵＮ遺伝子のＰＣＲ増幅で使用したプライマーでコードされたヌクレオチドを示す。太い文字およびイタリック文字は開始（ＡＴＧ）および終止（ｔａａ、ｔａｇ）コドンを示す。矢印付きの数字はＫＵＮポリタンパク質中のアミノ酸位置を表す。Ｍｓｃ、Ｓｍａ、Ｓｐｅ、ＢａｍおよびＢｇｌは特異的制限部位を表す。星印は、これらの制限部位がクローニング手法の間に破壊されたことを示す。
【図３】組換えＳＦＶ−ＣレプリコンによるＫＵＮ  Ｃタンパク質の発現を示す。Ａ）ＫＵＮ抗Ｃ抗体を用いるＳＦＶ−Ｃ  ＲＮＡ（ＳＦＣ−Ｃ、パネル１、３および５）での形質移入後１８時間におけるＢＨＫ２１細胞の免疫蛍光分析である。ＳＦＶ１（パネル２、４および６）は、ｐＳＦＶ１ベクターから調製した対照ＳＦＶ１  ＲＮＡで形質移入された細胞のＩＦを表す。パネル１および２における細胞はアセトン固定についての略語であり、Ｆ＋Ｍｅはホルムアルデヒド−メタノール固定についての略語である。Ｂ）35Ｓメチオニン／システインでの代謝標識およびＳＦＶ−ＣおよびＳＦＶ１形質移入ＢＨＫ２１細胞のＣタンパク質に対する抗体（＋抗Ｃ）での標識イムノ沈殿分析。形質移入後１８時間における６０ｍｍ培養皿におけるＢＨＫ２１細胞は、４時間、５０μＣｉ／ｍｌの35Ｓメチオニン／システインで継続的に標識した。標識した細胞溶解物および標識イムノ免疫沈殿を調製し、試料を１５％ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動に付した。試料容量はＳＦＶ−Ｃにおける５００μｌのうちの１μｌ、ＳＦＶ１における３００μｌのうちの０．５μｌ、ＳＦＶ−ＣおよびＳＦＶ１（＋抗Ｃ）細胞溶解物双方の１６０μｌからの３０μｌ標識イムノ免疫沈殿のうちの１０μｌであった。点線は放射標識したＫＵＮ感染細胞溶解物における（頂部から底部へと）ＫＵＮタンパク質ＮＳ５、ＮＳ３、Ｅ、ＮＳ４Ｂ、ｐｒＭ、ＮＳ２Ａ、ＣおよびＮＳ４Ａ／ＮＳ２Ｂの位置を示す。矢印はＫＵＮ  Ｃタンパク質の位置を示す。数字は低範囲プレ染色Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質標準の分子量を示す。これおよび以下の図面は、１５０ｌｐｉ分解におけるマッキントッシュ用のＦｏｔｏＬｏｏｋソフトウェア（Ａｇｆａ社製）を用いてＡｒｃｕｓＩＩスキャナー（Ａｇｆａ社製）で全てのオリジナルのデータ（スライド、オート標識グラム等）をスキャンし、続いてＭｉｃｒｏｓｏｆｔＰｏｗｅｒＰｏｉｎｔ９７ソフトウェアを用いてモンタージュを組み立て、Ｅｐｓｏｎ  ｐｈｏｔｏ  ｑｕａｌｉｔｙインクジェット紙を用いて７２０から１４４０ｄｐｉ分解にてＥｐｓｏｎＳｔｙｌｕｓＣｏｌｏｒ８００プリンター上に印字することによって調製した。
【図４】組換えＳＦＶレプリコンによるＫＵＮ  ｐｒＭＥ遺伝子の発現を示す。Ａ）ＫＵＮモノクローナル抗Ｅ抗体を用いる形質移入１８時間後におけるＳＦＶ−ｐｒＭＥおよびＳＦＶ１形質移入ＢＨＫ２１細胞のＩＦ分析である。（Ｂ）および（Ｃ）は、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ形質移入ＢＨＫ２１細胞の、各々、ＫＵＮモノクローナル抗Ｅ抗体でのパルス追跡標識および標識イムノ沈殿分析の結果を示し、ここに、ＣＦ（培養液）およびＣ（細胞）は追跡時間の間に回収した試料を表す。（Ｂ）におけるレーン１ないし９および（Ｃ）は、１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで直接電気泳動させた（Ｂ）、または抗Ｅ抗体での標識イムノ沈殿、続いての１２．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に付した（Ｃ）同一試料を表す。レーン２および９は、対照ＳＦＶ１  ＲＮＡでの形質移入後の、各々、細胞流体および細胞からの４時間の追跡時間後に回収された試料を示す。レーン３、４および５は、各々、追跡時間が１時間、４時間および６時間後に回収した培養液試料を示し、レーン６、７および８は細胞からの対応する追跡した試料を示す。（Ｂ）において、培養液の合計７００μｌのうちの１０μｌおよび細胞溶解物の合計３０μｌのうちの５μｌを電気泳動で使用した。（Ｃ）において、細胞溶解物の１５０μｌから、または培養液の３５０μｌから調製した免疫沈殿の合計１０μｌを電気泳動で用いた。細胞溶解物についての乾燥ゲルの暴露時間は培養液について１日および５日であった。（Ｂ）および（Ｃ）のレーン１中の点線は、図２Ｂにおけるごとく、放射標識ＫＵＮ細胞溶解物中のＫＵＮタンパク質を示す。数字は低い範囲の予備染色したＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質標準における分子量を表す。
【図５】組換えＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃレプリコンによる３つのＫＵＮ構造タンパク質の発現を示す。各々、テキサスレッド（ＴＲ）およびＦＩＴＣコンジュゲーテッド二次抗体にて、ＫＵＮ抗Ｃ（パネル１）および抗Ｅ（パネル）抗体を用いるＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡでの形質移入１８時間後におけるＢＨＫ２１細胞における同一視野の二重ＩＦ分析。（Ｂ）および（Ｃ）においては、（Ｂ）および（Ｃ）において、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡでの形質移入１８時間後の細胞を35Ｓメチオニン／システインで１時間パルスした。引き続いて、細胞溶解物（［Ｂ］および［Ｃ］における「Ｃ」）の（合計６００μｌからの）３００μｌおよび異なる追跡時間間隔（１時間、６時間および９時間）で回収した培養液（［Ｂ］において「ＣＦ」）の（合計２ｍｌからの）１ｍｌをＫＵＮモノクローナル抗Ｅ抗体（Ｂ）またはＫＵＮ抗Ｃ抗体（Ｃ）いずれかで免疫沈殿した。免疫沈殿した試料の１０μｌ（３０μｌの合計からの）を１２．５％（Ｂ）および１５％（Ｃ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。（Ｂ）における点線は図２Ｂにおけるごとく標識したＫＵＮ細胞溶解物中のＫＵＮタンパク質を示す。（Ｃ）における点線は、放射標識したＫＵＮ感染細胞溶解物における（頂部から底部にかけて）ＫＵＮタンパク質ｐｒＭ、ＮＳ２Ａ、ＣおよびＮＳ４Ａ／ＮＳ２Ｂを示す。数字は低い範囲の予備染色したＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質標識の分子量を示す。
【図６】組換えＳＦＶレプリコンから発現されたＫＵＮ構造タンパク質によるＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージングを示す。（Ａ）まずＣ２０ＤＸｒｅｐ  ＲＮＡおよび２６時間後のＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡ（パネル）（レーン１）での、またはＳＦＶ−ｐｒＭＥおよびＳＦＣ−Ｃ  ＲＮＡ（パネル）での、ＳＦＶ−ｐｒＭＥ  ＲＮＡ（パネル）での形質移入２６時間後にＢＨＫ２１細胞から回収した培養液で感染させたＢＨＫ２１細胞のＫＵＮ抗ＮＳ３細胞でのＩＦ分析を示す。（Ｂ）および（Ｃ）は、標識ＫＵＮ−特異的（Ｂ）およびＳＦＶ−特異的（Ｃ）ｃＤＮＡプローブを用いる（Ａ）に記載したごとく感染させたＢＨＫ２１細胞から単離したＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。（Ｂ）におけるレーン１および（Ｃ）におけるレーン２は（Ａ）におけるパネル１での細胞に対応する。（Ｂ）におけるレーン２および（Ｃ）におけるレーン３は（Ａ）におけるパネル２での細胞に対応する。（Ｃ）におけるレーン１はインビトロで合成されたＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡを示す。（Ｂ）および（Ｃ）における矢印は、ＢｓｔＥＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で消化したエチジウムブロミド−染色λＤＮＡの同一ゲルにおける移動に対して決定したＫＵＮレプリコンＲＮＡについての約８．８ｋｂおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのＲＮＡの位置を示す。
【図７】ＫＵＮレプリコンＲＮＡのパッケージングについての条件の最適化を示す。濾過し、ＲＮａｓｅ−処理した培養液試料で感染させたＢＨＫ２１細胞のノーザンブロット分析である。（Ａ）において、Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡの形質移入の間に示した異なる時間間隔を用い、（ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡでの）第２の形質移入から固定した（２４時間）後に試料を回収した。（Ｂ）において、（Ｃ２０ＤＸｒｅｐ  ＲＮＡでの）最初の形質移入から固定した時間（３０時間）後に起こる（ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡでの）第２の形質移入後に示された異なる時間に試料を回収した。（Ａ）および（Ｂ）双方におけるプローブはＫＵＮゲノムの最後の７６１ヌクレオチドを表す放射標識ｃＤＮＡ断片であった。ノーザンブロットにおけるレーン下で示した（Ａ）における力価は、感染で用いた培養液の対応する試料に含有され、抗ＮＳ３抗体でのＩＦ分析およびＩＦ陽性細胞の計数によって決定された感染単位（ＩＵ）の量を表す。
【図８】感染粒子の特徴を示す。（Ａ）ＫＵＮ抗Ｅモノクローナル抗体とのインキュベーションによって、（図６におけるごとく）順次Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＣ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡで形質移入した細胞から放出された、カプセル化粒子での感染の阻害。パネル１は形質移入後に回収した培養液で感染させ、３７℃で１時間抗Ｅモノクローナル抗体と共にインキュベートした細胞の抗ＮＳ３抗体でのＩＦを表す。パネル２は、抗Ｅ抗体の不存在下で同様の条件を用いてインキユベートした培養液の同一試料で感染させた細胞の抗ＮＳ３抗体でのＩＦを示す。（Ｂ）はＣ２０ＤＸｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｅ  ＲＮＡで形質移入し、超遠心に付した細胞から回収した培養液からの小さな割合の再懸濁ペレット（パネル１では合計容量５０μｌのうちの２μｌ）または上清流体（パネル２では合計容量５ｍｌからの２００μｌ）で感染させた細胞の抗Ｎ３抗体でのＩＦ分析。（Ｃ）ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡ（パネル２）で形質移入した（レーン２）、順次Ｃ２０ＤＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ−Ｃ  ＲＮＡで形質移入した（レーン１）、およびＫＵＮウイルスで感染させた（レーン３）培養液の抗Ｅ抗体での標識イムノ沈殿分析。点線は、レーン１で見える（元のオート標識グラムにおける）ＣおよびｐｒＭに対応するかすかなバンドを示し、しかしレーン２においてはｐｒＭについてのかすかなバンドのみである。（Ｄ）順次Ｃ２０ＳＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡ（レーン２）での形質移入、またはＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ  ＲＮＡのみでの形質移入（レーン３）、またはＫＵＮウイルスでの感染（レーン４）後に回収した培養液試料の抗Ｅ−免疫沈殿から抽出されたＲＮＡのＫＵＮに特異的なプライマーでのＲＴ−ＰＣＲ分析。レーン１はＨａｅＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で消化されたＰｈｉＸ１７４ＲＦ  ＤＮＡを表す。
【図９】ＫＵＮおよびビリオン粒子の沈降および電子顕微鏡分析を示す図である。（Ａ）平行スクロース密度勾配におけるビリオンおよびレプリコン粒子の沈降プロフィールである。粒子はＣ２０ＳＸｒｅｐおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０７  ＲＮＡでの順次の形質移入３５時間後、またはＫＵＮウイルスでの感染２４時間後いずれかのＢＨＫ細胞の培養液から回収し、材料および方法は記載したように超遠心によって濃縮した。ペレット化した粒子を４℃にて一晩３００μｌのＰＢＳ−０．１％ＢＳＡに再懸濁し、ミクロ遠心管中で１６，０００ｇにて１０分間の遠心によって清澄化した。上清を１２ｍｌの５から２５％スクロース密度勾配の頂部に重ね、ＳＷ４１ローター中、２０℃で３８，０００ｒｐｍにて７０分間遠心した。０．５ｍｌずつの画分を勾配の底部から回収し、抗Ｅ抗体を用い、感染の２４時間（レプリコン粒子）または１８時間（ＫＵＮビリオン）後にＢＨＫ細胞のカバーグラス培養上のＩＦによる感染性アッセイのために１：２（レプリコン粒子）または１：１００（ＫＵＮビリオン）希釈した。感染性粒子の力価は前記したごとくに測定した（（Ｂ）酢酸ウラニルで染色したビリオン（左側パネル）およびカプセル化レプリコン粒子（右側パネル）の電子顕微鏡写真を示す。（Ａ）における画分５から７のレプリコン粒子、および画分２から４のＫＵＮビリオンをプールし、２０℃で１時間抗Ｅ抗体の１／２０希釈物と共にインキユベートし、続いて一定回転で４℃で２時間インキユベートした。次いで、粒子を再度前記したごとくに濃縮し、ペレットを４℃で一晩ＰＢＳ−０．１％ＢＳＡの１７５μｌに再懸濁させた。次いで、再懸濁した粒子をＴｒａｎｓｓｏｎｉｃ ７００／ｈ音波処理水浴（ＣＡＭＬＡＢ社製， ドイツ）中で１分間音波処理し、８０，０００ｒｐｍにて１時間、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｉｒｆｕｇｅ中の１８゜固定角Ａ−１００ローターでの遠心によって炭素被覆ホルムバールグリッド上にペレット化した。グリッドを４％酢酸ウラニルで染色し、粒子を電子顕微鏡によって可視化した。棒線は２００ｎｍを表す。
【図１０】クンジンレプリコン発現ベクターおよび組換え構造体の模式的表示を示す図である。（Ａ）はＣ２０ＤＸ２Ａｒｅｐ（Ｎｅｏ）ベクターおよびその誘導体を示す。ＳＰ６はＳＰ６プロモーターの位置を示す。５'ＵＴＲおよび３'ＵＴＲは、各々、５'および３'非翻訳領域を示す。Ｃ２０はＫＵＮコアタンパク質の最初の２０のアミノ酸に対応する。２２ＥはＫＵＮ  タンパク質の最後の２つのアミノ酸に対応する。ＮＳ１−ＮＳ５はＫＵＮ非構造タンパク質をコードする配列に対応する。２Ａは、その切断部位が示された、フット・アンド・マウス病の２Ａ自己プロテアーゼをコードする配列を示す。ＩＲＥＳＮｅｏは脳脊髄炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＲＮＡの内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、続いてのネオマイシントランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）をコードする配列を表す。このカセットを３'ＵＴＲの示された位置に挿入して、ΔＭＥ／７６Ｎｅｏに似た（ＫｈｏｍｙｋｈおよびＷｅｓｔａｗａｙ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９７，７１：１４９７−１５０５））レプリコン発現細胞の安定な選択のためのＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏベクターを得た。ＳｐｅＩは異種遺伝子のクローニングのための特異的な制限部位を示す。（Ｂ）はＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐベクターのＳｐｅＩ部位に挿入された異種遺伝子を持つＫＵＮレプリコンのリストを示す。ｈｃｖ−ｔｒＣｏｒｅおよびｈｃｖ−ｆｌＣｏｒｅ−各々、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質の最初の１６０および１９１アミノ酸をコードする配列、ＣＡＴ−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質、ｈｃｖ−ＮＳ３−Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３タンパク質のアミノ酸１８３ないし６１７をコードする配列、ＶＧＶ−Ｇ−水泡性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ、β−ＧＡＬ−Ｅｓｃｈｅｉｃｈｉａ ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼである。ＣＡＴおよびＧＦＰと反対の＋ＩＲＥＳＮｅｏサインは、これらの遺伝子がＣ２０ＤＸ２ＡｒｅｐＮｅｏベクターに挿入されたことを示す。（Ｃ）ジシストロニックＣ２０ＤＸＩＲＥＳｒｅｐベクター、およびその誘導体構造体Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ。Ａｓｃｌ−Ｓｔｏｐは、異種遺伝子のクローニング用の特異的な部位、続いての転写終止コドン（Ｓｔｏｐ）を示す。他の略語は（Ａ）における略語と同様である。
【図１１】組換えＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ２１細胞における異種遺伝子の発現を示す図である。（Ａ）および（Ｃ）は、対応する抗体を用いる、異なる異種遺伝子（各パネル下で示される）を発現する組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡでの形質移入の２４ないし４０時間後におけるＢＨＫ２１細胞のＩＦ分析を示す。抗体の希釈は以下の通りであった。ウサギ抗ＣＡＴポリクローナル抗体については１／１００（Ａにおけるパネル１および２）、ウサギ抗ＶＳＶ−Ｇポリクローナル抗体については１／１５０（Ａにおけるパネル３および４）、ヒト抗ＨＣＶポリクローナル血清については１／４０（Ｃにおけるパネル１から４）。Ｍｏｃｋは非形質移入ＢＨＫ２１細胞の平行ＩＦ分析を示す。（Ｂ）ＧＦＰパネルは、Ｃ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２ｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入２４時間後における５つの未固定ＢＨＫ２１細胞の蛍光を示す。β−Ｇａｌパネルは実施例に記載されたごとくに行ったＣ２０ＤＸ／β−ＧＡＬ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入４６時間後におけるＢＨＫ２１細胞のＸ−ｇａｌ染色を表す。
【図１２】対応する組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡで形質移入された細胞におけるＣＡＴおよびβ−ＧＡＬ発現の経時分析を示す図である。（Ａ）ＫＵＮレプリコン（Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ）またはシンドビスレプリコン（ＴＲＣＡＴ）ＲＮＡの同一量（〜１０μｇ）での形質移入後の異なる時間におけるＢＨＫ２１細胞でのＣＡＴ発現の比較分析を示す。ＣＡＴ活性は、実施例に記載したようにＬＳＣ ＣＡＴアッセイによって測定した放射活性アセチル化クロラムフェニコールのｃｐｍ／分で表す。猛烈な細胞病理効果のため、ＴＲＣＡＴ  ＲＮＡで形質移入された細胞のインキュベーションは形質移入２４時間後に放棄した。（Ｂ）Ｃ２０ＤＸ／β−ＧＡＬ／２ＡｒｅｐまたはＳＦＶ３／ＬａｃＺ  ＲＮＡの同一量（〜５μｇ）での形質移入後におけるＢＨＫ２１細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現の比較分析を示す。β−ガラクトシダーゼの発現（１０6細胞当たりのμｇ）は、実質的には製造業者によって記載されているように（実施例参照）β−ＧＡＬ  ＥｎｚｙｍｅＡｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社製，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて形質移入された細胞溶解物およびβ−ガラクトシダーゼ酵素のβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果の比較から計算した。
【図１３】エレクトロポレーション下組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡから翻訳されたポリタンパク質のプロセッシングを示す図である。（Ａ）抗ＣＡＴ抗体を用いるＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ（レーン１）、Ｃ２０ＤＸＣＡＴ／ＩＲＥＳｒｅｐ（レーン２）およびＣ２０ＤＸ２Ａｒｅｐ（レーン３）ＲＮＡで形質移入された放射標識ＢＨＫ２１細胞の標識イムノ沈殿（ＲＩＰ）分析の結果を示す。対応するＲＮＡでのエレクトロポレーション４６時間後におけるＢＨＫ２１の６０ｍｍ直径組織培養を〜１００μＣｉの［35Ｓ］メチオニン−システインで５時間標識し、抗ＣＡＴ抗体の１／１００希釈物を用いて細胞溶解物のＲＮＡ分析を行った。ＲＩＰ分析後に回収された試料をＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に付した。矢印は対応するＣＡＴ融合タンパク質生成物の位置を示す。（Ｂ）Ｃ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２Ａｒｅｐ（レーン１および２）およびＣ２０ＤＸ２Ａｒｅｐ（レーン３）ＲＮＡでエレクトロポレーションしたＢＨＫ２１細胞のウサギ抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（１／１００希釈物）でのＲＩＰ分析の結果を示す。エレクトロポレーション３３時間後におけるＢＨＫ２１細胞の６０ｍｍ直径組織皿を〜５０μＣｉの［35Ｓ］メチオニン−システインで８時間標識した。Ｃ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２Ａｒｅｐ  ＲＩＰ試料の半分（１０μｌ）をエンドグリコシダーゼＦ（エンドＦ）で他のところで記載したごとくに処理し、両エンドＦ−処理および未処理試料をＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動に付した。矢印はグリコシル化（ｇＶＳＶ−Ｇ）および非グリコシル化（ＶＳＶ−Ｇ）タンパク質の位置を示す。
【図１４】組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡのパツケージングを示す図である。（Ａ）示された対応する抗体を用いる順次組換えＫＵＮレプリコンＲＮＡおよびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５  ＲＮＡで形質移入されたＢＨＫ２１細胞から回収された培養液での感染３５時間後におけるＢＨＫ２１およびＶｅｒｏ細胞のＧＦＰ蛍光およびＩＦ細胞を示す。形質移入間の時間間隔はＣ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２Ａｒｅｐで３０時間、Ｃ２０ＤＸ／ＶＳＶ−Ｇ／２Ａｒｅｐで３４時間、Ｃ２０ＤＸ／ｈｃｖ−ＮＳ３／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡで４２時間であった。ＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５  ＲＮＡでの第２の形質移入後における培養液の回収のための時間間隔は、各々、２４時間、３７時間および３８時間であった。（Ｂ）Ｃ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入後２６時間およびＳＦＶ−ｐｒＭＥ−Ｃ１０５  ＲＮＡでの形質移入後２６時間におけるＢＨＫ２１細胞から回収された培養液での感染３０時間後のＢＨＫ２１細胞（ＢＨＫ偽）またはＢＨＫ２１細胞からの溶解物のＣＡＴアッセイのオート標識グラムを示す。ＣＡＴアッセイは実施例に記載したように行った。
【図１５】ＧＦＰ（ｒｅｐＧＦＰ−ＢＨＫ）およびＣＡＴ（ｒｅｐＣＡＴ−ＢＨＫ）を発現する安定なＢＨＫ細胞系を示す図である。細胞系は、Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）１ｍｌ当たり１ｍｇを含有する培地中、各々、Ｃ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２ＡｒｅｐおよびＣ２０ＤＸ／ＣＡＴ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡで形質移入されたＢＨＫ２１細胞の選択によって確立した。（Ａ）継代６および１７におけるｒｅｐＣＡＴ−ＮＨＫ細胞からの溶解物のＣＡＴアッセイのオート標識グラムを示す。
【図１６】（Ａ）ユビキチン遺伝子を含有するＫＵＮレプリコン発現ベクターの模式的表示（Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａｒｅｐ）を示す図である。Ｕｂはユビキチン遺伝子を示し、全ての他の略語は図１０における通りである。（Ｂ）抗ＮＳ３抗体を用いるＣ２０ＤＸｒｅｐおよびＣ２０ＤＸＵｂ２Ａｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入２４時間後におけるＢＨＫ細胞のＩＦ分析を示す。
【図１７】（Ａ）は全長Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａ＿ＨＤＶｒｅｐベクターの構築を示す図である（図１７Ａ）。（Ｂ）は同一量の親Ｃ２０ＤＸＵｂ２Ａｒｅｐ  ＲＮＡでの形質移入後に得られた〜６０％陽性細胞と比較した〜１００％ＢＨＫ２１細胞におけるＣ２０ＤＸＵｂ２Ａ＿ＨＤＶｒｅｐ  ＲＮＡの効果的な複製を示す（図１７Ｂ）。
【図１８】（Ａ）はＤＮＡに基づくｐＫＵＮＲｅｐ１ベクターの構築を示す図である（図１８Ａ）。（Ｂ）はｐＫＵｎＲｅｐ１プラスミドでの形質移入４２時間後のＫＵＮ  ＮＳ３タンパク質（複製ＫＵＮレプリコンＲＮＡの指標）の発現の成功した欠失を示す（図１８Ｂ）。
【図１９】キャプシド化Ｃ２０ＤＸ／ＧＦＰ／２Ａｒｅｐ  ＲＮＡを含有する組換えＫＵＮ  ＶＬＰでの鼻孔内免疫化後におけるマウス肺内皮細胞中でのＧＦＰの発現を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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