(57)【要約】【課題】生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度よりも高い温度では疎水性となる温度応答性を有した遺伝子導入剤を提供する。【解決手段】分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤。該ポリマーは、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である。ポリマー材料は、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体よりなるホモポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック重合させたものである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有するポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、
該ポリマー材料は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記ポリマー材料は、少なくともカチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体との共重合ブロックを有する重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、カチオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項２又は３において、前記ポリマー材料は、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とのブロック共重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、非イオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項２ないし５のいずれか１項において、該ポリマー材料の分子量が3,000〜600,000であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項２ないし７のいずれか1項において、前記ブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくとも前記カチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項８において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項８又は９において、カチオン性モノマーがビニル系モノマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなることを特徴とする核酸複合体。
【請求項１３】
請求項１１の核酸複合体を基材に担持させてなる遺伝子導入材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体及び遺伝子導入材料とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、カチオン性のスター型ポリマーがＷＯ２００４／０９２３８８に記載されている。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記ＷＯ２００４／０９２３８８では、核酸と遺伝子導入剤との核酸複合体は、水溶液中に分散しているため、生体内の一定部位に長期にわたって定置させることができない。
【０００５】
本発明は、上記従来の問題点を解消し、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度よりも高い温度では疎水性となる温度応答性を有した遺伝子導入剤と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体及び遺伝子導入材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の遺伝子導入剤は、分岐鎖を有したポリマー材料よりなる遺伝子導入剤において、該ポリマー材料は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性であることを特徴とするものである。
なお、本発明でいうポリマーとは、モノマーの２量体などのオリゴマーも包含するものとする。
【０００７】
前記ポリマー材料は、少なくともカチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体との共重合ブロックを有する重合体であることが好ましく、カチオン性モノマーと非イオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体との共重合体であってもよい。
【０００８】
このカチオン性ポリマーブロックの分子量は、2,000〜500,000が好ましく、非イオン性ポリマーブロックの分子量が2,000〜500,000であることが好ましい。
【０００９】
この重合体（ブロック共重合体）の分子量は、3,000〜600,000であることが好ましい。
【００１０】
前記所定温度（Ｔ）は、25〜35℃の間の温度であることが好ましい。
【００１１】
このブロック共重合体は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにカチオン性モノマーとしてビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。
【００１２】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１３】
このビニル系モノマーは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される１種以上が好ましい。
【００１４】
本発明の核酸複合体は、かかる本発明の遺伝子導入剤と核酸との複合体よりなるものである。
本発明の遺伝子導入材料は、この核酸複合体を基材に担持させたものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子導入剤は、上記所定温度よりも低い温度では親水性であり、水溶性であるため、これを水に溶解させて核酸と複合させ、生体に投与するか、基材に担持（例えば塗布）し、その後、所定温度よりも高い温度とすることにより、疎水性（水不溶性）となり、生体あるいは基材に付着する。
【００１６】
生体に投与された場合、生体の体温によって遺伝子導入剤が水不溶性となるので、投与された部位に核酸複合体が長期にわたって定置されることになる。この遺伝子導入剤は、有機溶媒を用いていないので、ハイブリッド材料よりなる基材に対しても適用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の遺伝子導入剤は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では親水性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では疎水性である、分岐鎖を有するポリマー材料よりなる。
【００１８】
上記のポリマー材料としては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これに少なくともカチオン性モノマーとＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体とを光照射リビング重合させた分岐型重合体が好適である。
【００１９】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２０】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に３個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２１】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００２２】
このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、ビニル系モノマー、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等、とりわけビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びメトキシエチル（メタ）アクリレートからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
【００２３】
本発明の一態様では、イニファターに対し、まずカチオン性モノマーを重合させてカチオン性ホモポリマーを得、これにＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させる。
【００２４】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びモノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しモノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２５】
このモノマーの該原料溶液中の濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５〜２．５Ｍが好適である。
【００２６】
イニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００２７】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００２８】
なお、この光照射工程（第１の光照射工程）の後にさらに第２の光照射工程を行ってもよい。すなわち、この反応生成物を含む溶液をアルコール、好ましくは上記モノマーのアルコール溶液で希釈する。このアルコールとしてはメタノール又はエタノール、特にメタノールが好適である。アルコール溶液中のモノマー濃度としては、終濃度として、１００ｍＭ〜５Ｍ程度が好適である。
【００２９】
上記第１の光照射工程からの反応生成物含有液１体積部に対し、このアルコール溶液５〜５００体積部を添加するのが好ましい。
【００３０】
このようにアルコール溶液で希釈した希釈液を、第２の光照射工程に供し、上記反応生成物に対しさらに上記モノマーを重合させる。この際の照射光源としては２４０〜４００ｎｍの波長の光を含むものであればよく、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光照射時間は１０分〜１２０分程度が好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製して分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得る。
【００３２】
このカチオン性ホモポリマーの分子量は分岐鎖の鎖数によるが、2,000〜500,000、特に2,000〜150,000、とりわけ2,000〜100,000程度が好ましい。
【００３３】
このようにして生成した分岐型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて目的とするポリマー材料とする。このＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のポリマー鎖は、低温度では親水性、高温では疎水性となる温度依存性を有し、これにより上記ポリマー材料が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３４】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させるには、上記のようにして合成した分岐型重合体をメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中における分岐型ポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体の濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３５】
本発明の別の一態様では、上記イニファターに対し、まずＮ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体を重合させてホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに上記ビニル系モノマーなどのカチオン性モノマーをブロック共重合させて遺伝子導入剤を得るようにしてもよい。
【００３６】
本発明のさらに別の一態様では、モノマーとして、カチオン性モノマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体と、非イオン性モノマーとを用いる。イニファターに対する重合の順序は、任意である。即ち、１つの分岐鎖を構成するカチオン性ブロック、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体のブロック、非イオン性ポリマーブロックの配列順序は任意である。
【００３７】
非イオン性モノマーとしては、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。非イオン性ポリマーブロックの分子量は、２，０００〜５００，０００が好適である。
【００３８】
このブロック共重合体（ポリマー材料）の分子量は３，０００〜６００，０００、特に３，０００〜１５０，０００であることが好ましい。
【００３９】
このポリマー材料よりなる遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で水不溶性であり、約３０℃よりも低い温度で水溶性である。
【００４０】
従って、約３０℃よりも低い温度例えば10〜25℃程度の、核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液（濃度は好ましくは、3〜150ｍｇ／ｍＬ程度）を生体に投与すると、生体の体温によって昇温し、水不溶性となる。そのため、核酸を複合した遺伝子導入剤が生体内の投与された特定部位に長期にわたって定置されることになり、その部位の周囲に局部的に長期にわたって核酸が供給されることになる。
【００４１】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、３０℃よりも高い温度に昇温させ、必要に応じ乾燥させることにより、水不溶性の、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００４２】
このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなる遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４３】
カチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４４】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４５】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。また、上記のようなＤＮＡの導入、遺伝子発現のみならず、細胞内のｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ干渉をｓｉＲＮＡの導入で行うことも可能である。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４６】
核酸含有複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４７】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４８】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４９】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００５０】
本発明のベクターを用いた核酸含有複合体は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５１】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５２】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５３】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５４】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５５】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００５６】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり厚さが０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましい。円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００５７】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００５８】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００５９】
実施例１
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
2008195681.tif 000003
【００６３】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのクロロホルムへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）５．０ｇを加えて混合し、全量をクロロホルムで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を２０分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより１６，０００と測定された。
【００６５】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
【化２】
2008195681.tif 000004
【００６７】
iii)カチオン性ホモポリマーへのＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合によるポリマー材料（４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）−ブロック−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭと記すことがある。）の合成を行った。
【００６８】
即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー全量を２０ｍＬのメタノールへ溶解し，Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）０．１ｇを混合して全量をメタノールで６０ｍＬに調整した。ii）と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍとポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＭ）とのブロックポリマーよりなるポリマー材料ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭを得た。分子量はＧＰＣにより１９，０００と測定された。
【００６９】
【化３】
2008195681.tif 000005
【００７０】
＜材料表面に遺伝子導入活性を付与する処理剤組成物の調製＞
調製は環境温度２０〜２５℃に制御されたクリーンベンチ内で行った。ここでの調製に使用した緩衝溶液、生理食塩水などすべての溶液も２０〜２５℃に温調した。ＤＮＡはホタルルシフェラーゼをコードするプラスミド（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロールベクター）を使用した。
【００７１】
ＤＮＡを濃度０．０３３μｇ／μＬのＴＥバッファー溶液とし、４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ＮＩＰＡＭブロックポリマーは生理食塩水に溶解し、その濃度を０．０５μｇ／μＬ、０．１５μｇ／μＬ、０．２５μｇ／μＬ、０．５０μｇ／μＬまたは０．７５μｇ／μＬに調整した。ＤＮＡ溶液９００μＬと各濃度の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍ−ｂ−ＮＩＰＡＭブロックポリマー溶液をそれぞれ６００μＬずつを混合して本発明の材料表面に遺伝子導入活性を付与する処理剤組成物を調製した。
【００７２】
＜材料表面の遺伝子導入活性の評価＞
２４Ｗｅｌｌ培養プレートの各Ｗｅｌｌへ先に調製した本発明の材料表面に遺伝子導入活性を付与する処理剤組成物を２００μＬずつ加え、プレートを軽く振盪して全体に引延ばし、３７℃で３０分間インキュベートした。
１００ｍｍディッシュで培養したＣＯＳ−１細胞をトリプシンで処理し、完全培地で希釈し、ビルケルチルク血算板で細胞数を６×１０4個／ｍＬに調整して細胞浮遊液を得た。
【００７３】
先に作成した２４Ｗｅｌｌ培養プレートの各Ｗｅｌｌを３７℃に加温したＰＢＳで１回リンスし、ここへ３７℃に加温した細胞浮遊液を１ｍＬずつ加えそのまま４８時間培養した。培養４８時間後に培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄後に各Ｗｅｌｌに細胞溶解剤２００μＬを加え４℃で３０分間放置し、遺伝子導入活性評価用の試料とした。
【００７４】
遺伝子導入活性の評価をルシフェラーゼアッセイで行った結果を図１に示す。ホタルルシフェラーゼ活性はプロメガ社のアッセイキットを使用し、補正はタンパク濃度で行った。タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。
【００７５】
＜比較例＞
４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーを生理食塩水に溶解し０．７５μｇ／μＬ濃度の溶液を得た。濃度０．０３３μｇ／μＬのＤＮＡのＴＥバッファー溶液と混合し、実施例と同様に２４Ｗｅｌｌ培養プレートへコーティングして同様の手法で遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
図１より本発明により材料表面に遺伝子導入活性を付与できる組成物が得られたことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【図１】
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