(57)【要約】【課題】  内部標準として適切な遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法と、該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡのｃＤＮＡを効果的に増幅するためのプライマとを提供する。【解決手段】  ＬＡＭＰ法によりリブロース２リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン１Ａ（Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 1A：ＲＢＣＳ−１Ａ）遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＭＰ法によりリブロース２リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン１Ａ（Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 1A：ＲＢＣＳ−１Ａ）遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ。
【請求項２】
前記遺伝子がアラビドプシス属植物由来である請求項１記載の核酸増幅用プライマ。
【請求項３】
以下に示す１）〜５）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出する核酸増幅用プライマ；
１）配列番号１で表される塩基配列の５０〜５３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜４５の何れかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）の何れか一つに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマ機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１０〜４５で表される塩基配列の何れかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ。
【請求項５】
前記核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項３又は４に記載の核酸増幅用プライマ。
【請求項６】
以下に示す１）〜５）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマから少なくとも二種を選択することを特徴とするＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号１で示される塩基配列の５０〜５３０及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜４５の何れかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）の何れか一つに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマ機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項６記載の核酸増幅用プライマセット。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマから少なくとも四種を選択することを特徴とするＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための請求項６又は７に記載の核酸増幅用プライマセット。
【請求項９】
前記核酸増幅用プライマセットに含まれる核酸増幅用プライマのうち少なくとも二種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々二カ所の領域を認識することを特徴とする請求項６〜８の何れかに記載の核酸増幅用プライマセット。
【請求項１０】
前記核酸増幅用プライマセットに含まれる核酸増幅用プライマが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも六ヶ所の領域を認識することを特徴とする請求項６〜９の何れかに記載の核酸増幅用プライマセット。
【請求項１１】
配列番号１０〜４５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出する核酸増幅用プライマであって、（ａ）配列番号３７〜４０及び（ｂ）配列番号４１〜４４に分類した場合の、各分類から一つの核酸増幅用プライマを選択した組み合わせを含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸増幅用プライマセットと、（ｃ）配列番号１０〜１３及び（ｄ）配列番号２３〜２７及び４５に分類した場合の、各分類から一つの核酸増幅用プライマを選択した組み合わせと、を含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
【請求項１３】
請求項１２に記載の核酸増幅用プライマセットと、（ｅ）配列番号２８〜３１及び（ｆ）配列番号３２〜３６に分類した場合の、各分類から一つのプライマを選択した組み合わせと、を含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
【請求項１４】
次に示す１）〜５）の何れかからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号３８，４２，１１，及び２５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
２）配列番号３７，４１，１０，及び２４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
３）配列番号３７，４１，１０，及び２３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
４）配列番号４０，４４，１３，及び２７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
５）配列番号３９，４３，１２，及び２６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
【請求項１５】
次に示す１）〜６）の何れかからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号３８，４２，１１，２５，２９，及び３４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
２）配列番号３８，４２，１１，２５，２９，及び３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
３）配列番号３７，４１，１０，２４，２８，及び３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
４）配列番号３７，４１，１０、２３、２８、及び３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
５）配列番号４０，４４，１３，２７、３１，及び３６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
６）配列番号３９，４３，１２，２６、３０、及び３５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
【請求項１６】
請求項３又は４に記載の核酸増幅用プライマから必要な核酸増幅用プライマを選択し、又は請求項５〜１５の何れか一つに記載の核酸増幅用プライマセットを選択して使用することによる核酸検出方法。
【請求項１７】
核酸検出のためにＬＡＭＰ法を用いる請求項１６に記載の核酸検出方法。
【請求項１８】
請求項１６又は１７に記載の核酸検出方法に使用される試薬。
【請求項１９】
請求項１６又は１７に記載の核酸検出方法に使用される試薬キット。
【請求項２０】
内部標準としてＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを用いることを特徴とする検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ（以下、単にプライマともいう）と、内部標準として該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査とは、核酸や染色体などを分析して遺伝性疾患に関連する変異や核型などの有無を臨床目的で検査することである。遺伝子検査の一例として、癌のリンパ節転移診断がある。癌細胞は、原発巣を離れ、血管やリンパ管を経由して全身に転移する。癌の手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合いに応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中の癌細胞のリンパ節転移診断は極めて重要な意義を有している。癌のリンパ節転移診断の一手法として、癌マーカーの核酸を検出する方法がある。近年の遺伝子解析技術の発展により、生体から切除したリンパ節組織に含まれる癌マーカーに関する核酸を増幅し、検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった。さらに、核酸増幅法によって癌マーカーの核酸を増幅する際、増幅反応が急速に進み、核酸のコピー数が急増するまでの時間（増幅立ち上がり時間）をリアルタイムで測定することにより、リンパ節組織中の癌マーカーの核酸を定量することも可能である。
【０００３】
上述の核酸を増幅する方法として、ＬＡＭＰ法が知られている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマを含む複数のプライマによる遺伝子増幅法である。先ず、初期反応において、二種類のインナープライマ（ＦＩＰ，ＲＩＰ）と二種類のアウタープライマ（Ｆ３プライマ、Ｒ３プライマ）及び鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから両端に一本鎖ループ部分を持つダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの身長・合成反応が進む。増幅産物は標的核酸の塩基配列に由来する相補的な配列が相互に繰り返す構造を有する。ＬＡＭＰ法は、鋳型ＤＮＡの二本鎖から一本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応は全て等温で連続的に進行することが特徴である。鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＬＡＭＰ法又はＲＴ−ＬＡＭＰ法では、３０分程度で検出に充分な増幅産物が得られる。従って、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。また、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用が可能である。
【０００４】
癌マーカーに対応するｍＲＮＡを検出する際、内部標準物質としてβアクチン遺伝子のｍＲＮＡを用いる方法が知られている（特許文献２）。βアクチン遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを内部標準として使用することにより、癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡの抽出効率やｃＤＮＡの増幅効率を考慮しなくても相対的な癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡの検出が可能である。
【０００５】
しかしながら、βアクチンに関しては生体から切除したリンパ節中のもともとの発現量が分からないため、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡを内部標準として用いても、リンパ節中の増幅阻害物質が癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡのｃＤＮＡの増幅に影響を与えているかどうかを確認できないことがある。さらに、増幅阻害物質が核酸増幅に影響を与える場合、癌マーカーの核酸増幅に与える阻害の程度と、ハウスキーピング遺伝子の核酸増幅に与える阻害の程度とが相違するため、この内部標準物質に基づいて癌マーカー遺伝子のｍＲＮＡのｃＤＮＡの増幅立ち上がり時間を補正するのは困難である。
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ００／２８０８２号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ  ０３／７０９３５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、内部標準として適切な遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法と、該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡのｃＤＮＡを効果的に増幅するためのプライマとを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、内部標準物質としてヒトゲノム中に存在せず、阻害物質によって受ける阻害の程度が癌マーカーの核酸増幅が受ける阻害の程度と同程度である核酸が用いられることを見出した。この内部標準物質は核酸増幅の際に阻害物質が癌マーカー遺伝子の核酸の増幅に影響を与えているかどうかを確認し、さらに阻害物質の影響を受けていた場合、癌マーカー遺伝子の核酸の増幅立ち上がり時間を補正することができる。さらに、ヒトゲノム中に存在せず、阻害物質によって受ける阻害の程度が癌マーカーの核酸増幅が受ける阻害の程度と同程度である核酸として、ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡが適しているということが判明した。
【０００９】
そこで本発明者は、内部標準として用いることのできるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための効果的なプライマと、該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法とを提供する。
【００１０】
即ち、本発明は以下のI〜XXよりなる。
I．ＬＡＭＰ法によりリブロース２リン酸カルボキシラーゼスモールチェーン１Ａ（Ribulose bisphosphate carboxylase small chain 1A：ＲＢＣＳ−１Ａ）遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ。
II．前記遺伝子がアラビドプシス属植物由来であるＩ記載の核酸増幅用プライマ。
III．以下に示す１）〜５）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出する核酸増幅用プライマ；
１）配列番号１で表される塩基配列の５０〜５３０番目の領域及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜４５の何れかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）の何れか一つに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入、若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマ機能を有するオリゴヌクレオチド。
IV．配列番号１０〜４５で表される塩基配列の何れかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマ。
V．前記核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法であるIII又はIVに記載の核酸増幅用プライマ。
VI．以下に示す１）〜５）より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマから少なくとも二種を選択することを特徴とするＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号１で示される塩基配列の５０〜５３０及びその相補鎖の領域から選択され、配列番号１及び／又はその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜４５の何れかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）の何れか一つに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマ機能を有するオリゴヌクレオチド。
VII．前記核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法であるVI記載の核酸増幅用プライマセット。
VIII．前記オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマから少なくとも四種を選択することを特徴とするＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのVI又はVIIに記載の核酸増幅用プライマセット。
IX．前記核酸増幅用プライマセットに含まれる核酸増幅用プライマのうち少なくとも二種が、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の各々二カ所の領域を認識することを特徴とする請求項VI〜VIIIの何れかに記載の核酸増幅用プライマセット。
X．前記核酸増幅用プライマセットに含まれる核酸増幅用プライマが、配列番号１で表される塩基配列及び／又はその相補鎖の少なくとも六ヶ所の領域を認識することを特徴とする請求項VI〜IXの何れかに記載の核酸増幅用プライマセット。
XI．配列番号１０〜４５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを検出する核酸増幅用プライマであって、(a)配列番号３７〜４０及び（ｂ）配列番号４１〜４４に分類した場合の、各分類から一つの核酸増幅用プライマを選択した組み合わせを含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
XII．XIに記載の核酸増幅用プライマセットと、（ｃ）配列番号１０〜１３及び（ｄ）配列番号２３〜２７及び４５に分類した場合の、各分類から一つの核酸増幅用プライマを選択した組み合わせと、を含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
XIII．XIIに記載の核酸増幅用プライマセットと、（ｅ）配列番号２８〜３１及び（ｆ）配列番号３２〜３６に分類した場合の、各分類から一つのプライマを選択した組み合わせと、を含むことを特徴とする核酸増幅用プライマセット。
XIV．次に示す１）〜５）の何れかからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号３８，４２，１１，及び２５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
２）配列番号３７，４１，１０，及び２４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
３）配列番号３７，４１，１０，及び２３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
４）配列番号４０，４４，１３，及び２７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
５）配列番号３９，４３，１２，及び２６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
XV．次に示す１）〜６）の何れかからなるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するための核酸増幅用プライマセット；
１）配列番号３８，４２，１１，２５，２９，及び３４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
２）配列番号３８，４２，１１，２５，２９，及び３２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
３）配列番号３７，４１，１０，２４，２８，及び３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
４）配列番号３７，４１，１０、２３、２８、及び３３で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
５）配列番号４０，４４，１３，２７、３１，及び３６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
６）配列番号３９，４３，１２，２６、３０、及び３５で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドを核酸増幅用プライマとして含む核酸増幅用プライマセット。
XVI．III又はIVに記載の核酸増幅用プライマから必要な核酸増幅用プライマを選択し、又は請求項V〜XVの何れか一つに記載の核酸増幅用プライマセットを選択して使用することによる核酸検出方法。
XVII．核酸検出のためにＬＡＭＰ法を用いるXVIに記載の核酸検出方法。
XVIII．XVI又はXVIIに記載の核酸検出方法に使用される試薬。
XIX．XVI又はXVIIに記載の核酸検出方法に使用される試薬キット。
XX．内部標準としてＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は前記遺伝子のｍＲＮＡを用いることを特徴とする検査方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのより効果的なプライマと、内部標準として該遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを用いた検査方法とが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜ＲＢＣＳ−１Ａについて＞
ＲＢＣＳ−１Ａはリブロース２リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕｂｉｓＣＯ）のスモールサブユニットの一つであり、その遺伝子の塩基配列は既に決定されている（Theologis et. al, Nature, 2000 Dec. 14; 408 (6814): 816-820. 参照）。ＲｕｂｉｓＣＯは空気中の無機二酸化炭素から有機炭素を作り出す酵素である。この酵素はヒトには存在しないが、多くの光合成生物の細胞に多量に見出される。植物、藻類、シアノバクテリアなどのＲｕｂｉｓＣＯは一個又は複数個のラージサブユニットと一個又は複数個のスモールサブユニットとからなり、光合成細菌のＲｕｂｉｓＣＯはラージサブユニットのみからなる。ラージサブユニットはクロロプラストゲノムにコードされ、スモールサブユニットは核ゲノムにコードされている。
本発明に用いられるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡは、アラビドプシス属（Arabidopsis spp.）に属する植物に由来するものが好ましく、さらにArabidopsis thaliana由来のものがより好適に用いられる。
【００１３】
＜プライマの設計＞
本発明は、ＬＡＭＰ法に適用可能であり、ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子及び／又は該遺伝子のｍＲＮＡを検出するためのプライマを提供するものである。
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマ設計の基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。具体的には、増幅すべき標的核酸の、３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという核酸領域及び５’末端側からＲ３，Ｒ２，Ｒ１という核酸領域を設定し、少なくともこの六つの核酸領域に対し、実質的に同一な塩基配列又は実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマを設計する。
なお、標的核酸の相補鎖も標的核酸となる。この相補鎖は３’末端側からＲ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃという核酸領域及び５’末端側からＦ３，Ｆ２，Ｆ１という核酸領域を有する。ここで、Ｒ３ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ１ｃ、Ｆ３、Ｆ２、Ｆ１の各核酸領域は、それぞれ上記標的核酸のＲ３、Ｒ２、Ｒ１、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの核酸量域と相補的な塩基配列を有する。
【００１４】
実質的に同一な塩基配列とは、次のような意味で用いられる。ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、このある塩基配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、Ｒ２に対して実質的に同一な塩基配列とは、Ｒ２と全く同一な塩基配列に加えて、Ｒ２にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００１５】
他方、実質的に相補的な塩基配列とは、ストリンジェントな条件化でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる塩基配列を意味する。
【００１６】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、或いは相補的という用語は何れも完全に同一、或いは完全に相補的であることを要しない。即ち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。
【００１７】
本発明のプライマは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境の下で必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を持つ。具体的には、５〜２００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、１０塩基以上の長さを維持するのが好ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００１８】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものにすぎない。即ち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることもできる。
【００１９】
本発明において選択されるプライマは、各々ＦＩＰ（Forward Inner Primer）、Ｆ３プライマ（Forward Outer Primer）、ＲＩＰ（Reverse Inner Primer及びＲ３プライマ（Reverse Outer Primer）の何れかを構成する。
【００２０】
ＦＩＰは、増幅しようとする標的核酸のＦ２ｃ領域と実質的に相補的なＦ２領域の塩基配列を３’末端側に持ち、５’末端側に標的核酸のＦ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列を持つように設計する。この場合において、Ｆ２及びＦ１ｃの配列間に標的核酸に依存しない配列が介在してもよい。この標的核酸に依存しない配列の長さは０〜５０塩基、好ましくは０〜４０塩基であれば許容しうる。
【００２１】
Ｆ３プライマは、標的核酸のＦ３ｃ領域と実質的に相補的なＦ３領域と実質的に同じ塩基配列を持つように設計する。
【００２２】
ＲＩＰは、標的核酸のＲ２ｃ領域と実質的に相補的なＲ２領域の塩基配列を３’末端に持ち、５’末端に標的核酸のＲ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列を持つように設計する。ＲＩＰもＦＩＰと同様に、Ｒ２及びＲ１ｃの配列の間に標的核酸に依存しない配列が介在していてもよい。
【００２３】
Ｒ３プライマは、標的核酸のＲ３ｃ領域と実質的に相補的なＲ３領域と実質的に同じ塩基配列を持つように設計する。
【００２４】
また、ＬＡＭＰ法では、少なくとも一種以上のループプライマを併用することで増幅時間を短縮することができる（国際公開ＷＯ  ０２／２４９０２号パンフレット参照）。ループプライマとは、ダンベル構造の５’末端側のループの一本鎖部分、具体的には例えばＲ１領域とＲ２領域の間、或いはＦ１領域とＦ２領域の間に相補的な配列を持つプライマをいう。ループプライマを用いることにより核酸合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマは、核酸合成過程でできたＦＩＰ又はＲＩＰがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２５】
＜ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子又は／及びｍＲＮＡ検出用プライマの設計＞
ＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子又は／及びｍＲＮＡ検出用プライマ（以下、ＲＢＣＳ−１Ａプライマとする）は、既知の配列番号１に表される８７８塩基からなる塩基配列及び／又はその相補的な配列から、連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。なお、本実施形態ではArabidopsis thaliana由来のＲＢＣＳ−１Ａ（Genbank Accession No. NM_105379）を用いているが、その由来とする生物は特に限定されない。
【００２６】
ＲＢＣＳ−１Ａプライマは、塩基組成、ＧＣ含量、二次構造、Ｔｍ値などに注意し、プライマによって認識される標的核酸のＤＮＡ領域の長さは塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは１０〜３０塩基、より好ましくは１７〜２５塩基のものを選択することができる。Ｔｍ値は、一般的にNearest Neighbor法で求めることができる。プライマによって認識されるＤＮＡ領域は、Ｔｍ値が５５〜６５℃、好ましくは５８〜６４℃のものを選択し、ＧＣ含量が４０〜７０％、好ましくは５０〜６５％のものを選択することができる。
【００２７】
このような条件により、本発明で選択されたプライマ領域は、配列番号１で表される塩基配列の第５０〜５４０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれる。
【００２８】
ＲＢＣＳ−１Ａプライマは、１）配列番号１で表される塩基配列の第５０〜５４０番目の領域及び／又はその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号２〜４５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）又は２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）の何れか一つに記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、又は、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、から選択され、設計される。
【００２９】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。或いは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、或いは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９  ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、一個乃至七個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組み換え法、プライマ伸長法又はＰＣＲ法を単独又は適宜組み合わせて利用することができる。
【００３０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、及び２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件が挙げられる。
【００３１】
＜プライマセット＞
本発明のプライマを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも二種を組み合わせてプライマセットして使用する。ＬＡＭＰ法又はＲＴ−ＬＡＭＰ法では、少なくとも四種のプライマ（ＦＩＰ、Ｆ３プライマ、ＲＩＰ、及びＲ３プライマ）を組み合わせてプライマセットとして使用する。さらに一種以上のループプライマを組み合わせて、プライマセットとして使用することもできる。
【００３２】
＜ＲＴ−ＬＡＭＰ法＞
ＬＡＭＰ法がＤＮＡを鋳型とする核酸増幅法であるのに対し、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＮＡを鋳型とするＬＡＭＰ法の一種である。ＬＡＭＰ法の基本的な考え方は特許文献１に記載の通りである。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では一つの溶液中で、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しながら、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。具体的には次の（１）のステップを経た後、（２）〜（５）のステップの繰り返しにより、ＬＡＭＰ法の増幅サイクルの起点構造が形成される。
（１）鋳型ＲＮＡ鎖のＦ２ｃ領域にＦＩＰの３’末端側がアニールし、逆転写酵素が鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。逆転写酵素としては、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来のものを用いることができる。
（２）鋳型ＲＮＡ鎖のＦ３ｃ領域にＦ３プライマがアニールし、上記（１）で合成したＦＩＰからのＤＮＡ鎖を鋳型ＲＮＡから剥がしながら、逆転写酵素が鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。
（３）上記（２）で剥がされたＤＮＡ鎖のＲ２ｃ領域（鋳型ＲＮＡ鎖のＲ２に相補的な領域）に、ＲＩＰの３’末端側がアニールしてＤＮＡ鎖が伸長する。
（４）ＤＮＡ鎖のＲ３ｃ領域（鋳型ＲＮＡ鎖のＲ３領域に相補的な領域）にＲ３プライマがアニールし、上記（３）で伸長したＲＩＰからのＤＮＡ鎖をＲ３プライマが剥がしながら、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってＦＩＰからのＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長し、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。
（５）上記（４）で剥がされたＤＮＡ鎖の両端の配列は、同じＤＮＡ鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々自己アニールし、両端にループ部分を有する起点構造を形成する。
（５）以降、この起点構造が増幅サイクルの起点となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの身長・合成反応が進む。増幅サイクルが進行すると、増幅産物は標的核酸の塩基配列に由来する相補的な配列を単位として、この配列が相互に繰り返す構造がいろいろなサイズで合成される。
なお、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり（例えばBca DNA polymerase）、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は一つの酵素で実施することができる。
【００３３】
＜測定方法＞
ＬＡＭＰ法では、増幅されたＤＮＡ鎖は自己の配列に対して相補的な配列を持つので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、SYBER GREEN I、或いはPico Greenのような二本鎖インターカレータである蛍光色素の存在下で本発明のプライマを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。また、これをリアルタイムでモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である。
また、ＬＡＭＰ法では、増幅反応の過程で、副産物として不溶性のピロリン酸マグネシウムが生成し、白濁する。そこで、反応液の濁りを目視により確認する、或いは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度を測定する、又は反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的の核酸を検出することができる（国際公開ＷＯ  ０１／８３８１７号パンフレット参照）。反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度測定を行う場合、前記蛍光色素を用いた場合と同様に、濁度変化をリアルタイムでモニターすることによって閉鎖系でＤＮＡの増幅と濁度の増加が同時に追跡可能である。
【００３４】
＜試薬、試薬キット、その他＞
本発明のプライマを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマとして、或いは置換用のプライマとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
なお、上述の試薬のうち、逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼを同一の容器に収容してもよい。
また、上述の試薬のうち、ｄＮＴＰ、緩衝液、及び各種オリゴヌクレオチドを同一の容器に収容してもよい。
【００３５】
以下、本実施形態におけるＲＢＣＳ−１Ａ遺伝子領域の選択とプライマ設計とについてさらに具体的に説明する。
【００３６】
＜ＲＢＣＳ−１Ａ塩基配列からの遺伝子領域の選択＞
配列番号１に記載する塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切なＲＢＣＳ−１Ａの遺伝子領域の位置を検討した。遺伝子領域は、Ｆ１ｃ及びＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２及びＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３及びＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃の範囲内となるよう領域選択を行った。選択された各領域を以下に示す。
【００３７】
F1c: 配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
148-129 5'-gttagccttgcgggtggctg-3'（配列番号２）
179-158 5'-cgccgttgcttgtgatggaagt-3'（配列番号３）
403-382 5'-ccacattgtccagtaccgtcca-3'（配列番号４）
421-400 5'-accgaacaagggaagcttccac-3'（配列番号５）
【００３８】
F2: 配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
87-104  5'-tggtcgctcctttcaacg-3'（配列番号６）
107-125 5'-cttaagtcctccgctgcct-3'（配列番号７）
324-343 5'-tcgagttggagcacggattt-3'（配列番号８）
352-370 5'-tgagcacggtaactcaccc-3'（配列番号９）
【００３９】
F3: 配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
53-72   5'-gctactatggttgcctctcc-3'（配列番号１０）
80-97   5'-gccactatggtcgctcct-3'（配列番号１１）
294-313 5'-tccgcaacaagtggattcct-3'（配列番号１２）
330-349 5'-tggagcacggatttgtgtac-3'（配列番号１３）
【００４０】
R1c: 配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
186-207 5'-ttaactgcatgcaggtgtggcc-2'（配列番号１４）
186-209 5'-ttaactgcatgcaggtgtggcctc-3'（配列番号１５）
196-215 5'-gcaggtgtggcctccgattg-3'（配列番号１６）
407-428 5'-cttcccttgttcggttgcaccg-3'（配列番号１７）
425-445 5'-accgactccgctcaagtgttg-3'（配列番号１８）
【００４１】
R2: 配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
265-248 5'-ggaatcggtaaggtcagg-3'（配列番号１９）
267-248 5'-tcggaatcggtaaggtcagg-3'（配列番号２０）
484-465 5'-ggcattggggtactccttct-3'（配列番号２１）
494-475 5'-tcctaatgaaggcattgggg-3'（配列番号２２）
【００４２】
R3: 配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
296-276 5'-ggataaggtagtcaacttcct-3'（配列番号２３）
307-288 5'-ccacttgttgcggataaggt-3'（配列番号２４）
307-286 5'-ccacttgttgcggataaggtag-3'（配列番号２５）
514-495 5'-ggtgttgtcgaatccgatga-3'（配列番号２６）
528-511 5'-cactggacttgacgggtg-3'（配列番号２７）
【００４３】
loop F: 配列番号１に記載する配列の相補鎖における遺伝子領域
125-107 5'-aggcagcggaggacttaag-3'（配列番号２８）
154-136 5'-gtcgttgttagccttgcgg-3'（配列番号２９）
366-349 5'-gagttaccgtgctcacgg-3'（配列番号３０）
394-376 5'-ccagtaccgtccatcatag-3'（配列番号３１）
【００４４】
loop R: 配列番号１に記載する配列上の遺伝子領域
220-240 5'-gaagaagtttgagactctctc-3'（配列番号３２）
223-244 5'-gaagtttgagactctctcttac-3'（配列番号３３）
226-245 5'-gtttgagactctctcttacc-3'（配列番号３４）
434-453 5'-gctcaagtgttgaaggaagt-3'（配列番号３５）
449-468 5'-gaagtggaagagtgcaagaa-3'（配列番号３６）
【００４５】
＜ＲＢＣＳ−１Ａプライマの設計＞
上述の選択された遺伝子領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用されるＲＢＣＳ−１Ａプライマが得られた。
【００４６】
FIP:（領域Ｆ１ｃの塩基配列と領域Ｆ２の塩基配列を連結したもの）
ARFI-25（配列番号３７）  配列番号２及び６の配列を連結
ARFI-936（配列番号３８）  配列番号３及び７の配列を連結
ARB-D2-FAd1（配列番号３９）  配列番号４及び８の配列を連結
ARB-D1-FAd1（配列番号４０）  配列番号５及び９の配列を連結
【００４７】
RIP:（領域Ｒ１ｃの塩基配列と領域Ｒ２の塩基配列を連結したもの
ARRI-25（配列番号４１）  配列番号１４及び２０を連結又は１５及び１９を連結
ARRI-936（配列番号４２）  配列番号１６及び１９の配列を連結
ARB-D2-RAd1（配列番号４３）  配列番号１７及び２１の配列を連結
ARB-D1-RAd1（配列番号４４）  配列番号１８及び２２の配列を連結
【００４８】
F3プライマ:（Ｆ３領域の塩基配列と同一の配列）
ARF0-25（配列番号１０）  
ARF0-936（配列番号１１）
ARB-D2-F3d1（配列番号１２）
ARB-D1-F3d1（配列番号１３）
【００４９】
R3プライマ:（Ｒ３領域の塩基配列と同一又は一部変異させた配列）
ARRO-936-dai2（配列番号２３）
ARRO-25（配列番号２４）
ARRO-936-F6（配列番号２５）
ARB-D2-R3d1（配列番号２６）
ARB-D1-R3d1（配列番号２７）
ARB-D1-R3d2 5'-cactgggcttgacgggtg-3'（配列番号４５）
(ARB-D1-R3d2はARB-D1-R3d1の７番目の塩基aをgに置換したものである)
【００５０】
ループプライマＦ：（loop F領域の塩基配列と同一の配列）
ARFL-25c-F2（配列番号２８）
ARFL-936c（配列番号２９）
ARB-D2-LPFd1（配列番号３０）
ARB-D1-LPFd1（配列番号３１）
【００５１】
ループプライマＲ：（loop R領域の塩基配列と同一の配列）
ARRL-936-d2（配列番号３２）
ARRL-936-F8R4（配列番号３３）
ARRL-936（配列番号３４）
ARB-D2-LPRd1（配列番号３５）
ARB-D1-LPRd1（配列番号３６）
【００５２】
（実験例１）
実験例１においては、各種ＲＢＣＳ−１Ａプライマを用いてＲＴ−ＬＡＭＰを行い、これらのプライマがＲＢＣＳ−１Ａを検出できるかどうか確認した。
【００５３】
i）ＲＮＡ試料の調製
ＲＢＣＳ−１Ａの塩基配列に基づいて設計したＰＣＲ用プライマを用いてＰＣＲを行うことにより、Arabidopsis thaliana cDNA（ニッポンジーン製）からＲＢＣＳ−１ＡのｃＤＮＡの一部（具体的には、配列番号１の塩基配列の２８〜５７１番目：以下、ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域とする）を増幅させた。このＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域をプラスミドベクター（pCRII-TOPO（Invitrogen製））に組み込み、このプラスミドベクターを大腸菌にトランスフォームした。さらにこの大腸菌を培養し、大腸菌からプラスミドベクターを精製した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システム（Riboprobe in vitro transcription system（Promega製））を用いて転写産物（ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域に対応するｍＲＮＡ）を含むＲＮＡ溶液を得た。この溶液のＲＮＡ濃度を吸光度測定（２６０ｎｍ）により算出し、この値をもとにＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡのコピー数が３７００００００、３７００００、及び３７００となるように５０ｎｇ／ｍＬ  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、これを本実験例で用いるテンプレートとした。
【００５４】
ii）プライマセット
各種プライマを表１に示す組み合わせ（プライマセット１〜６）で用いた。表中の各プライマの欄に示される数字は、配列番号を示し、各配列番号で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプライマをセットで使用したことを示す。
【００５５】
【表１】
2008000002.tif 000002
【００５６】
iii）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液組成
以下に示す濃度の各成分を以下に示す体積で混合し、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液を作成した。
分子生物学用精製水（エッペンドルフ製）                      ３．９７μＬ
７５０ｍＭ（ｐＨ８．０）Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ニッポンジーン製）１．００μＬ
１０×  ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（第一化学製）      ２．５０μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）              ２．００μＬ
１００ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ナカライテクス製）                              ０．７５μＬ
１００ｍＭ  ジチオトレイトール（和光純薬工業製）            １．２５μＬ
２％  Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（Ｓｉｇｍａ製）                      ２．５０μＬ
１０Ｕ／μＬ  ＡＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ製）          ０．１４μＬ
８Ｕ／μＬ  ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ製）
２．２７μＬ
ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）          ０．６３μＬ
プライマ
８０ｐｍｏｌ／μＬ  ＦＩＰ                                １．００μＬ
８０ｐｍｏｌ／μＬ  ＲＩＰ                                １．００μＬ
５ｐｍｏｌ／μＬ  Ｆ３プライマ                            １．００μＬ
５ｐｍｏｌ／μＬ  Ｒ３プライマ                            １．００μＬ
６０ｐｍｏｌ／μＬ  ループプライマＦ                      １．００μＬ
６０ｐｍｏｌ／μＬ  ループプライマＲ                      １．００μＬ
計２３．００μＬ
【００５７】
iv）ＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅及び増幅産物の測定
上記六種のプライマを含むＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、前述したＲＮＡ試料２μＬを添加し、６５℃で１時間加温して核酸増幅を行った。核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。核酸増幅及び測定にはテラメックス社製ＬＡ−２００を用いた。
プライマセット１〜６を用いた場合の、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によるＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域の増幅において、濁度が０．１に達した時間を測定した。核酸増幅及び増幅産物の濁度測定は四回行い、その平均値も算出した。
【００５８】
v）結果
測定結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2008000002.tif 000003
【００６０】
表２より、ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域のｍＲＮＡが３７００００００コピー存在するＲＮＡ試料をテンプレートとした場合の増幅立ち上がり時間は８．７〜１１．４分であった。また、ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域のｍＲＮＡが３７００００コピー存在するＲＮＡ試料をテンプレートとした場合の増幅立ち上がり時間は、１０．３〜１３．３分であった。ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域のｍＲＮＡが３７００コピー存在するＲＮＡ試料をテンプレートとした場合の増幅立ち上がり時間は、１１．５〜１６．３分であった。
【００６１】
以上より、ＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域は何れの場合においても１７分以内に増幅することが分かった。即ち、表１に示す各プライマセットを用いるとＲＢＣＳ−１Ａ増幅領域を迅速に増幅でき、ＲＢＣＳ−１Ａを検出できるということが確認された。
【００６２】
（実験例２）
実験例２においては、配列番号２７のＲ３プライマの一部に変異を加えたＲ３プライマ（配列番号４５）を用いてＲＴ−ＬＡＭＰを行い、変異を持つプライマを用いてもＲＢＣＳ−１Ａが増幅するかどうかを確認した。
【００６３】
i）ＲＮＡ試料の調製
ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡのコピー数が１１００００００００、１１００００００、及び１１００００となるように５０ｎｇ／ｍＬ  ｙｅａｓｔ  ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製すること以外は、実験例１と同様にしてＲＮＡ試料を調製した。
【００６４】
ii）プライマセット
表１におけるプライマセット５と、プライマセット５のＲ３プライマを配列番号４５のプライマとしたプライマセット（以下、プライマセット７とする）とを用いた。
配列番号４５のＲ３プライマは、配列番号２７のＲ３プライマの７番目の塩基であるアデニンをグアニンに置換したものである。即ち、配列番号４５のＲ３プライマの７番目の塩基配列はＲＢＣＳ−１ＡのＲ３領域の７番目の塩基配列と同一ではない。
【００６５】
iii）ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液組成
実験例１におけるＲＴ−ＬＡＭＰ反応液と同様のものを使用した。
【００６６】
iv）ＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅及び増幅産物の測定
測定を二回行うこと以外は、実験例１と同様にして核酸増幅及び増幅産物の測定を行った。
【００６７】
v）結果
測定結果を表３に示す。
【００６８】
【表３】
2008000002.tif 000004
【００６９】
表３より、塩基配列に一塩基置換を有するＲ３プライマを含むプライマセット７でＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅を行うと、変異のないＲ３プライマを含むプライマセット５で核酸増幅を行った場合よりも、濁度が０．１に達する時間が同じか僅かに遅かったのみで、配列番号１に示すＲＢＣＳ−１Ａの核酸を増幅できることが確認された。
【００７０】
（実験例３）
実験例３においては、癌マーカーであるヒトサイトケラチン１９（以下、ＣＫ１９とする）のｍＲＮＡと、ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡとを鋳型として、阻害物質の存在下及び非存在下においてＲＴ−ＬＡＭＰ法によりそれぞれｃＤＮＡを増幅させ、阻害物質がそれぞれの核酸増幅にどのように影響を与えるかを分析した。
【００７１】
i）可溶化試薬の調製
以下に示す成分を含む可溶化液を調製した。
２００ｍＭ（ｐＨ３．０）  Ｇｌｙｃｉｎ−ＨＣｌ
（Ｇｌｙｃｉｎ、ＨＣｌ共に和光純薬工業製）
５％  Ｂｒｉｊ３５  （Ｓｉｇｍａ製）
０．０５％  ＫＳ−５３８  （信越化学工業製）
【００７２】
ii）ライセートの調製
先ず、癌転移のないヒトリンパ節に可溶化試薬４ｍＬを添加し、電動ホモジナイザによって２５０００ｒｐｍでホモジナイズした。得られたホモジネートを１５０００ｒｐｍで遠心し、その上清を本実験例におけるライセートとした。このライセートにはＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅を阻害する物質（以下、阻害物質とする）が含まれている。
【００７３】
iii）測定用試料ａ〜ｈの調製
以下に示す組成で測定用試料ａ〜ｈを調製した。
測定用試料ａ：実験例１で調製したＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＣＫ１９のｍＲＮＡを１３０００００コピー含む可溶化試薬２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｂ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＣＫ１９のｍＲＮＡを１３０００コピー含む可溶化試薬２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｃ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡを１１０００００コピー含む可溶化試薬２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｄ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡを１１０００コピー含む可溶化試薬２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｅ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＣＫ１９のｍＲＮＡを１３０００００コピー含む、ライセート２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｆ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＣＫ１９のｍＲＮＡを１３０００コピー含む、ライセート２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｇ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡを１１０００００コピー含む、ライセート２μＬを添加して調製した。
測定用試料ｈ：ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μＬに、ＲＢＣＳ−１ＡのｍＲＮＡを１１０００コピー含む、ライセート２μＬを添加して調製した。
即ち、測定用試料ａ〜ｄはライセートを含んでいないため、阻害物質が含まれておらず、測定用試料ｅ〜ｈはライセートを添加しているので、阻害物質が含まれている。
なお、測定用試料ａ〜ｈの組成の概略は図１に示す。
【００７４】
iv）ＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅及び増幅産物の測定
テラメックス社製ＬＡ−２００を用い、核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各測定用試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間を測定した。測定はそれぞれの測定用試料につき２回ずつ行い、その平均値も算出した。
【００７５】
v）結果
測定結果を表４に示す。
【００７６】
【表４】
2008000002.tif 000005
【００７７】
表４をグラフにしたものを図２に示す。
図２において、●は、阻害物質の非存在下でＣＫ１９の核酸を増幅したときの濁度が０．１に到達した時間（以下、濁度０．１到達時間とする）を示す。
○は、阻害物質の非存在下でＲＢＣＳ−１Ａの核酸を増幅したときの濁度０．１到達時間を示す。
■は、阻害物質の存在下でＣＫ１９の核酸を増幅したときの濁度０．１到達時間を示す。
□は、阻害物質の存在下でＲＢＣＳ−１Ａの核酸を増幅したときの濁度０．１到達時間を示す。
●と■とを比較すると、阻害物質によってＣＫ１９の核酸増幅において濁度０．１到達時間がどのくらい遅れたかが分かる。
また、○と□とを比較すると、阻害物質によってＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅において濁度０．１到達時間がどのくらい遅れたかが分かる。
表４及び図２より、ＣＫ１９の核酸増幅に対する阻害物質の影響と、ＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅に対する阻害物質の影響とが同程度であることが確認された。
【００７８】
従来は、阻害物質の存在が疑われる試料に含まれる濃度未知のＣＫ１９の核酸を測定したときに、ＣＫ１９の核酸が阻害物質の影響を受けているかどうか判別することが困難であった。また、阻害物質の影響を受けていたときにどの程度阻害を受けているのかが分からなかった。
実験例３の結果より濃度既知のＲＢＣＳ−１Ａの核酸を内部標準として用いることによって、ＣＫ１９の核酸増幅及びＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅に阻害物質が影響を与えているかどうかを確認でき、さらに阻害物質が核酸増幅に影響を与えていた場合、ＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅の影響の程度に基づき、ＣＫ１９の核酸の増幅立ち上がり時間を補正することができる。即ち、阻害物質がＣＫ１９の核酸増幅に影響を与えていた場合でも、補正された増幅立ち上がり時間に基づいて核酸増幅反応前の測定用試料に含まれていたＣＫ１９の核酸のコピー数を正確に算出することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】測定用試料ａ〜ｈの組成の概略。
【図２】ＣＫ１９及びＲＢＣＳ−１Ａの核酸増幅に対する阻害物質の影響。
【図１】
2008000002.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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