(57)【要約】      （修正有）【課題】免疫システムを効率よく機能させるために免疫調節活性を持つサイトカインレセプターを提供する。【解決手段】ヒトＴＮＦ（腫瘍壊死因子）レセプタースーパーファミリーに属するＲＡＮＫ。単離されたレセプター、そのようなレセプターをコードするＤＮＡ、およびそれから作り出された医薬組成物。単離されたレセプターは、免疫応答を調節するために用いることができる。また、レセプターは、その阻害剤のスクリーニングにも有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号６に示したアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするＤＮＡであって、該タンパク質は、配列番号６のアミノ酸１とアミノ酸３３の間のアミノ酸（アミノ酸１および３３を含む）からなる群から選択されたアミノ末端、ならびにアミノ酸１９６とアミノ酸６１６の間のアミノ酸（１９６および６１６を含む）からなる群より選択されたカルボキシ末端を持つ、上記のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｂ）  配列番号１５に示したアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするＤＮＡであって、該タンパク質は、配列番号１５のアミノ酸１とアミノ酸３１の間のアミノ酸（アミノ酸１および３１を含む）からなる群より選択されたアミノ末端、ならびにアミノ酸１９７とアミノ酸６２５の間のアミノ酸（１９７および６２５を含む）からなる群より選択されたカルボキシ末端を持つ、上記のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）  ５０℃、５×ＳＳＣで一晩という条件を含む、ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のＤＮＡにハイブリダイゼーションする能力を持ち、生物学的に活性なＲＡＮＫをコードするＤＮＡ分子；および
（ｄ）  （ａ）、（ｂ）または（ｃ）のＤＮＡによってコードされたタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡ分子、ここにおいて、上記フラグメントは生物学的に活性である：
からなる群より選択される単離されたＤＮＡ。
【請求項２】
天然型ＲＡＮＫとアミノ酸配列に関して少なくとも約８０％の同一性を有するＲＡＮＫポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項３】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドをコードする、請求項１または２記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項４】
さらに、イムノグロブリンＦｃドメイン、イムノグロブリンＦｃムテイン、ＦＬＡＧＴＭタグ、少なくとも約６のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパーおよびそれらの組み合わせ、からなる群より選択されたポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、請求項３記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項５記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項７】
請求項６記載の宿主細胞を、発現を促進する条件下で培養し、そしてＲＡＮＫを回収することを含む、ＲＡＮＫタンパク質の調製方法。
【請求項８】
配列番号５のヌクレオチド残基３９−１８８６または配列番号１４のヌクレオチド残基１−１８７８のフラグメントである、少なくとも約１７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、および少なくとも約３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドからなる群より選択された、単離されたＤＮＡ。
【請求項９】
（ａ）  配列番号６のアミノ酸３３から１９６のアミノ酸配列を持つポリペプチド；
（ｂ）  配列番号１５のアミノ酸３１から１９７のアミノ酸配列を持つポリペプチド；
（ｃ）  ストリンジェント条件下で（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡとハイブリダイゼーションする能力を持つＤＮＡによってコードされる、生物学的に活性である、ＲＡＮＫポリペプチド；および、
（ｄ）  生物学的に活性である、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリペプチドのフラグメント；
からなる群より選択された、単離されたＲＡＮＫポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号６または配列番号１５と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を持つ、請求項９記載のタンパク質。
【請求項１１】
可溶性のＲＡＮＫである、請求項９または１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
さらに、イムノグロブリンＦｃドメイン、イムノグロブリンＦｃムテイン、ＦＬＡＧＴＭタグ、少なくとも約６のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されたペプチドを含む、可溶性ＲＡＮＫタンパク質。
【請求項１３】
請求項９記載のＲＡＮＫポリペプチドと免疫反応する抗体。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１３記載の抗体。
【請求項１５】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法であって、膜関連ＲＡＮＫを発現する細胞を可溶性ＲＡＮＫとｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させて、可溶性ＲＡＮＫをＲＡＮＫＬへ結合させ、そして上記細胞へのＲＡＮＫＬの結合を阻害することを含む、上記のＮＦ−κＢ活性化阻害方法。
【請求項１６】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法に使用するための、可溶性ＲＡＮＫを含む組成物であって、前記方法は、膜関連ＲＡＮＫを発現する細胞を前記組成物と接触させて、可溶性ＲＡＮＫをＲＡＮＫＬへ結合させ、そして上記細胞へのＲＡＮＫＬの結合を阻害することを含む、前記組成物。
【請求項１７】
免疫応答または炎症応答を調節する方法に使用するための、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドを含む組成物であって、前記方法は、前記組成物を免疫応答または炎症応答の危険性を有する個人に投与し、そして可溶性ＲＡＮＫをＲＡＮＫＬへ結合させて、ＲＡＮＫを発現する細胞へのＲＡＮＫＬの結合を阻害することを含む、前記組成物。
【請求項１８】
ＮＦ−κＢ活性化の阻害を介しての抗炎症反応の阻害剤を検出するための、あるいはＲＡＮＫポリペプチドに結合できる分子を検出するためのスクリーニング方法であって、請求項１−４のいずれか１項にコードされるＤＮＡによってコードされる精製ＲＡＮＫポリペプチドを用いることを含む、前記スクリーニング方法。
【請求項１９】
ＲＡＮＫ活性に拮抗または作動する分子の能力を決定するための方法であって、請求項１−４のいずれか１項にコードされるＤＮＡによってコードされる精製ＲＡＮＫポリペプチドを用いることを含む、前記方法。        
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、一般的には、サイトカインレセプター、より具体的には、免疫調節活性を持つサイトカインレセプター／リガンド対の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
免疫システムが効率良く機能するには、細胞の増殖と分化および細胞死の間の良好なバランスが必要であり、免疫システムが外来抗原と反応するが自己抗原とは反応しないことを確実にする。免疫応答および炎症応答を調節するプロセスには、様々な構成員からなる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター／神経増殖因子レセプターのスーパーファミリーが関与している（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１０１９、１９９０）。このファミリーのレセプターには、２つの異なるＴＮＦレセプター（Ｉ型およびII型、Ｓｍｉｔｈら、上記、およびＳｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ，６１，３６１、１９９０）、神経増殖因子レセプター（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，４７，５４５、１９８６）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，８，１４０３、１９８９）、ＣＤ２７（Ｃａｍｅｒｉｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，３１６５、１９９１）、ＣＤ３０（Ｄｕｒｋｏｐら、Ｃｅｌｌ，６８，４２１、１９９２）、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０（Ｍａｌｌｅｔｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，９，１０６３、１９９０）、ヒトＦａｓ抗原（Ｉｔｏｈら、Ｃｅｌ，６６，２３３、１９９１）、ネズミ４−１ＢＢレセプター（Ｋｗｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１９６３、１９８９）およびアポトーシス−誘導レセプター(Apoptosis-Inducing Receptor) （ＡＩＲ）（ＵＳＳＮ  ０８／７２０，８６４、１９９６年１０月４日出願）と名付けられたレセプターが含まれる。
【０００３】
ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、上皮細胞およびいくつかのカルシノーマ細胞系上に存在するレセプターであり、活性化Ｔ細胞上に認められるリガンドＣＤ４０Ｌ（ＵＳＳＮ０８／２４９，１８９、１９９４年５月２４日出願）と相互作用する。このリガンド／レセプター対の相互作用は、細胞性および体液性の免疫応答の両方で重要である。ＣＤ４０によるシグナル伝達は、この分子の細胞質ドメインとＴＮＦレセプター−関連因子(TNF receptor-associated factors) （ＴＲＡＦｓ；ＢａｋｅｒおよびＲｅｄｄｙ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１２，１、１９９６）の構成員との関連を通して仲介される。最近、ＴＲＡＦ３をコードする遺伝子内の標的化破壊によってＴＲＡＦ３発現が欠損しているマウスは、誕生時には正常に見えるが、進行性低血糖症および末梢白血球の減少が進み、日齢約１０日で死に至ることが分かった（Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５，４０７、１９９６）。ＴＲＡＦ３−／−  胎児肝細胞で再構築されたキメラマウスの免疫応答においては、ＴＲＡＦ３−／−  Ｂ細胞は機能的に正常に見えるものの、ＣＤ４０−欠損マウスの免疫応答に類似する。
【０００４】
シグナル伝達でのＴＲＡＦ３の重要な役割は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのその他の構成員の一員、例えばＴ細胞上に存在するＣＤ３０またはＣＤ２７、とＴＲＡＦ３の相互作用の点であろう。代わりに、ＴＲＡＦ３と相互作用し生後の発達ならびに適格な免疫システムの発達に重要な役割を演ずるこのレセプターのファミリーの未だ同定されていない構成員の様な、その他の構成員が存在するかも知れない。ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのさらなる構成員の同定は、免疫応答および炎症応答を調節するさらなる手段を提供し、ならびに哺乳動物での生後の発達のさらなる知識を提供する可能性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの一員であるＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢのレセプター活性化因子）（receptor activator of NF-κB）と呼ばれる新規のレセプターを提供する。ＲＡＮＫは、ＴＲＡＦ３と相互作用する６１６アミノ酸残基を持つＩ型のトランスメンブランタンパク質である。過剰発現、ＲＡＮＫおよび膜結合ＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）の同時発現、ならびに可溶性ＲＡＮＫＬまたはアゴニスト抗体のＲＡＮＫへの付加によってＲＡＮＫが誘発されると、その結果、免疫システム細胞に最も広範囲に利用されている普遍的な転写因子である転写因子ＮＦ−κＢがアップレギュレーションされる。
【０００６】
可溶型のレセプターを調製して使用すると、膜結合ＲＡＮＫを通してのシグナル伝達、従ってＮＦ−κＢのアップレギュレーションを阻害することができる；従って、可溶型の新規レセプターを含む医薬組成物もまた提供される。ＲＡＮＫアンタゴニストによるＮＦ−κＢの阻害は、ＲＡＮＫの引き金により生じる炎症性応答の不所望な影響の改善、例えば中毒性ショックまたは敗血症、移植片対宿主反応、または急性炎症性反応の治療、に有用であることができる。また、可溶型レセプターは、インビトロでのＲＡＮＫ活性のアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに有用であろう。
【０００７】
ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、シグナル伝達の阻害剤のアッセイの開発、例えば、ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ３とのＲＡＮＫの相互作用を阻害する分子のスクリーニング、に有用であろう。また、新規のレセプターを含む欠失型および融合タンパク質についても開示されている。
【０００８】
また、本発明では、ＲＡＮＫＬと呼ばれるＲＡＮＫの相手構造（counter structure）
またはリガンドを同定している。ＲＡＮＫＬは、約５０アミノ酸より少ない細胞内ドメイン、トランスメンブランドメインおよび約２４０から２５０アミノ酸の細胞外ドメインを持つ２型のトランスメンブランタンパク質である。それが属するＴＮＦファミリーのその他の構成員と同様に、ＲＡＮＫＬは、トランスメンブランドメインとレセプター結合ドメインとの間に、レセプターの結合には必要ではない、「スペーサー」領域を持つ。従って、可溶型ＲＡＮＫＬは、レセプター結合領域を含む細胞外ドメイン全体またはそのフラグメントを含むことができる。
【０００９】
本発明のこれらのおよびその他の態様は、本発明の以下の詳細な説明を参考に明らかになるであろう。
【００１０】
発明の詳細な説明
ヒト骨髄由来の樹状突起細胞（ＤＣ）から作り出されたｃＤＮＡの配列情報を含むデータベース中に、ＣＤ４０に対してある程度の類似性を持ち、予想されるオープンリーディングフレームを持つ新規の部分的ｃＤＮＡ挿入物を同定した。この挿入物を用いて、全長のｃＤＮＡを含むＤＣ  ｃＤＮＡライブラリーから生成されたコロニーブロットとハイブリダイズした。いくつかのコロニーハイブリダイゼーションを行い、そして２つのクローン（配列番号１および３）を単離した。配列番号５は、配列番号１および３のオーバーラップする配列のアライメントを基に予想した全長タンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。
【００１１】
ＲＡＮＫは、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの一員であり；細胞外領域ではＣＤ４０と非常に良く似ている。ＣＤ４０と同様に、ＲＡＮＫは、Ｒｏｔｈｅら、Ｃｅｌｌ，
８３，１２４３、１９９５に記載した方法に実質上従って、同時免疫沈降アッセイ（co-immunoprecipitation assays）によって決定した場合、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と関
連している。ＴＲＡＦは、免疫応答および炎症性応答の調節に極めて重要である。ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの様々な構成員とそれらが関連することによって、シグナルが細胞に伝達される。そのシグナルは、どのレセプター（類）が誘発されるか、そしてどのＴＲＡＦ（ｓ）がレセプター（類）と関連するかによって、細胞の増殖、分化またはアポトーシスを生ずる結果となる；つまり、様々なシグナル化イベントを連動させることによって、異なるシグナルを細胞に伝達することができる。このように、このファミリーの一員を通して伝達されたシグナルは、細胞に伝達されたその他のシグナルおよび／または細胞の分化の状態によって、増殖性、分化性またはアポトーシス性であることができる。この増殖性／アポトーシス性経路のそのような精巧な制御は、病原体に対する防御を発達させ維持するために必要であり；その不均衡は、自己免疫病を生ずる可能性がある。
【００１２】
ＲＡＮＫは、上皮細胞、いくつかのＢ細胞系、および活性化Ｔ細胞上に発現する。しかしながら、活性化Ｔ細胞上でのその発現は遅く、活性化の約４日後である。発現のこの時間経過は、既知のアポトーシス因子であるＦａｓの発現と一致する。ＲＡＮＫは抗アポトーシスシグナルとして作用することができ、ＣＤ４０で知られているように、ＲＡＮＫを発現する細胞をアポトーシスから救済する。代わりに、ＲＡＮＫは、適当な環境下では、再びＣＤ４０と同様に、アポトーシス性シグナルをますます強めることもできる。ＲＡＮＫおよびそのリガンドは、免疫応答および炎症性応答の調節に不可欠の役割を演ずるらしい。
【００１３】
さらに、ＴＲＡＦ３遺伝子が標的崩壊されたマウスの生後死亡率は、この分子が免疫応答のみならず発生にも重要であることを証明している。ＴＲＡＦ３と関連するタンパク質としてのＲＡＮＫおよびそのリガンドを単離すると、このシグナル化経路がさらに明確になり、そして自己免疫病および／または炎症性疾病の領域での使用への診断適用および治療適用の開発が可能になるであろう。
【００１４】
ＤＮＡ、タンパク質および類似体
本発明は、単離されたＲＡＮＫポリペプチドおよび天然分子によって示される活性を持つその類似体（またはムテイン）（即ち、細胞上に発現したかあるいは表面上に固定化されたＲＡＮＫリガンド又はＲＡＮＫ特異的抗体に特異的に結合するＲＡＮＫムテイン；ＲＡＮＫを通してＲＡＮＫリガンドが誘導するシグナル伝達を阻害するその可溶型）を提供する。そのようなタンパク質は、実質上、内因性物質の混入がなく、所望により、関連する天然のパターンのグリコシル化を含まない。本発明の範囲内のＲＡＮＫ誘導体には、生物活性を保持している本来のタンパク質の様々な構造形もまた含まれる。イオン化されうるアミノ基およびカルボキシル基の存在により、例えば、ＲＡＮＫタンパク質は、酸性塩または塩基性塩の形で存在することができ、また中性の形で存在することもできる。また、個々のアミノ酸残基を、酸化または還元により修飾することもできる。本来のアミノ酸構造を、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基およびその類似物のようなその他の化学部分と共有結合または凝集結合を形成することによって、またはアミノ酸配列変異体を作り出すことによって、修飾することができる。共有結合誘導体は、アミノ酸側鎖またはＮ−あるいはＣ−末端に特定の官能基を連結することにより、調製される。
【００１５】
また、Ｍ−マレイミドベンゾイルスクシンイミドエステルおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドのような架橋剤をシステインおよびリジン残基に作用させることによって、ＲＡＮＫ誘導体を得ることもできる。また、本発明のタンパク質を、臭化シアン−活性化、ビスオキシラン−活性化、カルボニルジイミダゾール−活性化またはトシル−活性化されたアガロース構造のような様々な不溶性物質に活性側基を通して共有結合させ、または（グルタルアルデヒド架橋を伴うあるいは伴わずに）ポリオレフィン表面に吸着させることに
よって、結合させることもできる。ひとたび、物質と結合させたならば、そのタンパク質を用いて、上記タンパク質に対して、またはＲＡＮＫあるいはＲＡＮＫＬに類似したその他のタンパク質類、ならびにＲＡＮＫあるいはＲＡＮＫＬあるいはその同族体と結合するその他のタンパク質に対して作成した抗体と（アッセイまたは精製の目的で）選択的に結合させるために用いることができる。
【００１６】
ＲＡＮＫの可溶型もまた、本発明の範囲内にある。ＲＡＮＫのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を配列番号１から６に示す。コンピューターによる分析から、タンパク質は、Ｎ−末端にシグナルペプチドを持ち；予想される切断部位は残基２４の次であることが、示された。当業者らは、実際の切断位置がコンピューター分析によって予想されたそれとは異なることもあり得ることを認識しているであろう。従って、切断されたペプチドのＮ−末端アミノ酸は、残基２４に続く予想された、好ましい切断部位のいずれかの側の約５のアミノ酸残基内にあると、予想される。さらに、アミノ酸３３で始まる可溶型が調製され；この可溶型は、ＲＡＮＫＬと結合した。シグナルペプチドの後に、１８８アミノ酸からなる細胞外ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび３８３アミノ酸の細胞質尾部が続くと予想される。
【００１７】
可溶性ＲＡＮＫは、シグナルペプチドおよび細胞外ドメイン（配列番号６の残基１から２１３）またはそのフラグメントを含む。代わりに、天然のリーダー配列を、配列番号６の残基１で始まり、アミノ酸２４から３３（その両端のアミノ酸を含む）からなる群から選択された一残基に続く異なるシグナルペプチドと置換することもできる。さらに、細胞外ドメインのフラグメントも、ＲＡＮＫの可溶型を提供するであろう。フラグメントは、細胞外領域の所望の部分を単離するために既知の技術を用いて調製することができ、例えば、細胞外領域をＴＮＦＲのその他の構成員の細胞外領域と比較し、そしてその他のファミリー構成員について調製されたそれらと類似した型を選択することによって調製することもできる。代わりに、ユニークな制限部位またはこの技術分野で既知のＰＣＲ技術を用いて、数多くの先端切除型を調製し、発現させてその活性について分析することもできる。
【００１８】
フラグメントは、既知の技術を用いて細胞外領域の所望の部分を単離して調製することができ、例えば、細胞外領域をＴＮＦＲファミリー（ＲＡＮＫもその一員である）のその他の構成員の細胞外領域と比較して、その他のファミリー構成員について調製されたそれらと類似した形を選択することによって、調製することもできる。代わりに、ユニークな制限部位またはこの技術分野で既知のＰＣＲ技術を用いて、数多くの先端切除型を調製し、発現させてその活性を分析することもできる。
【００１９】
本発明の範囲内にあるＲＡＮＫタンパク質のその他の誘導体には、Ｎ−末端またはＣ−末端融合のような組換え培養での合成によるように、ＲＡＮＫタンパク質またはそれらのフラグメントとその他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合体または凝集結合体が含まれる。例えば、共有結合されるペプチドは、合成された部位から、それが機能する細胞膜あるいは細胞壁の内側または外側の部位へのタンパク質の移動を、翻訳と同時にまたは翻訳後に指示する、タンパク質のＮ−末端領域に存在するシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母のα−因子リーダー）であることができる。
【００２０】
タンパク質融合物は、ＲＡＮＫタンパク質およびその同族体の精製または同定を容易にするために加えられるペプチド（例えばポリ−Ｈｉｓ）を含むことができる。また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１２０４（１９８８）に記載されたような同定ペプチドと連結することもできる。そのような高抗原性ペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、迅速なアッセイを可能にし、発現した組み換えタンパク質の精製を容易にする。また、Ｈｏｐｐらの配列は、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に切断され、精製タンパク質からのペプチドの除去を可能にする。そのようなペプチドでキャップされた融合タンパク質はまた、大腸菌内の細胞内分解に耐性であることができる。
【００２１】
さらに、融合タンパク質は、イムノグロブリンＦｃ領域に連結したＲＡＮＫのアミノ酸配列を含む。例示的Ｆｃ領域は、配列番号８に示したアミノ酸配列のヌクレオチドを持つヒトＩｇＧ１である。また、Ｆｃ領域のフラグメントを、Ｆｃムテインとして、用いることもできる。例えば、Ｆｃ領域のヒンジ領域内のある残基は、ＦｃγＲ１への高アフィニティー結合に重要である。ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７３，１４８３、１９９１）は、Ｌｅｕ(234) およびＬｅｕ(235) がＵ９３７細胞上に存在するＦｃγＲ１へのＩｇＧ３の高アフィニティー結合に重要であると、報告した。同様の結果は、Ｌｕｎｄら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，２６５７、１９９１；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９，５３、１９９１）によっても得られた。そのような変異を、単独でまたは組み合わせて、ＩｇＧ１Ｆｃ領域内に作成し、ＦｃＲへのＩｇＧ１のアフィニティーを減少させることもできる。用いられたＦｃ領域の部分によっては、融合タンパク質を、鎖間ジスルフィド結合の形成を通して、ダイマーとして発現させることができる。融合タンパク質が抗体の重鎖および軽鎖の両方で作られているならば、４つまでのＲＡＮＫ領域を持つタンパク質オリゴマーを作成することができる。
【００２２】
もう一つの実施態様では、ＲＡＮＫタンパク質は、さらに、ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー化したペプチドを含む。ロイシンジッパーは、はじめは様々なＤＮＡ−結合タンパク質内で同定された（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１７５９、１９８８）。ロイシンジッパードメインは、これら（およびその他）のタンパク質内に存在する保存ペプチドドメインを指すために用いられた用語であり、タンパク質のダイマー化の原因となる。このロイシンジッパードメイン（ここでは、また、オリゴマー化ドメインまたはオリゴマー−形成ドメインとも呼ばれている）は、その他のアミノ酸に散在する４または５のロイシン残基を持つ、７個の反復性繰り返しを含む。ロイシンジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４に見出されたもの、およびラット肝臓内で見いだされた熱安定性ＤＮＡ−結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｅｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１６８１、１９８９）である。２つの核形質転換タンパク質、ｆｏｓおよびｊｕｎ、もまた、ネズミのプロト−オンコジーンの遺伝子生成物ｃ−ｍｙｃ（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１７５９、１９８８）がそうであるように、ロイシンジッパードメインを提示している。核オンコジーンｆｏｓおよびｊｕｎの生成物は、優先的にヘテロダイマーを形成するロイシンジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５，６４６、１９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１６８９、１９８９）。ロイシンジッパードメインは、これらタンパク質の生物学的活性（ＤＮＡ結合性）に必要である。
【００２３】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、および数多くのレトロウイルスを含む異なる様々なウイルスの融合形成タンパク質もまた、ロイシンジッパードメインを持っている（ＢｕｃｋｌａｎｄおよびＷｉｌｄ、Ｎａｔｕｒｅ，３３８，５４７、１９８９；Ｂｒｉｔｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３５３，３９４、１９９１；ＤｅｌｗａｒｔおよびＭｏｓｉａｌｏｓ、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ，６，７０３、１９９０）。これらの融合形成ウイルスタンパク質内のロイシンジッパードメインは、タンパク質のトランスメンブラン領域の近くにあり；ロイシンジッパードメインが融合形成タンパク質のオリゴマー構造に寄与しうることを示唆した。融合形成ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合ポア形成に関与する（Ｓｐｒｕｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，３５２３，１９９１）。また、ロイシンジッパードメインは、熱ショック転写因子のオリゴマー化に役割を演ずることが、最近報告された（Ｒａｂｉｎｄｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，２３０、１９９
３）。
【００２４】
ロイシンジッパードメインは、短いパラレルコイルドコイル（平行高次コイル）として巻かれている（Ｏ’Ｓｈｅａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，５３９、１９９１）。パラレルコイルドコイルの一般的組み立ては、良く特徴が調べられており、１９５３年にＣｒｉｃｋ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６，６８９）によって提案されたような「ノブと穴（knobs-into-holes）」パッキングを持つ（Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ，６，６８９）。ロイシンジッパードメインによって形成されたダイマーは、ＭｃＬａｃｈｌａｎおよびＳｔｅｗａｒｔ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．．９８．２９３、１９７５）の表記法に従って、（ａｂｃｄｅｆｇ）ｎ（式中、残基ａおよびｄはヘリックスの同じ面上に整列する概ね疎水性の残基であり、ｄはロイシンである）で表される７つの繰り返しによって安定化されている。一般に位置ｇおよびｅには、反対にチャージした残基が存在している。従って、２つのヘリカルロイシンジッパードメインから形成されたパラレルコイルドコイル内では、第一のヘリックスの疎水性側鎖によって形成される「ノブ」は、第二のヘリックスの側鎖の間に形成される「穴」の中に詰め込まれている。
【００２５】
位置ｄのロイシン残基は、大きな疎水性安定化エネルギーを提供し、ダイマー形成に重要である（Ｋｒｙｓｔｅｋら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，３８，２２９、１９９１）。Ｌｏｖｅｊｏｙらは、最近、ヘリックスがアップ−アップ−ダウンに走る三本鎖α−らせん束の合成について、報告している（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９，１２８８、１９９３）。これらの研究から疎水性安定化エネルギーは、らせんモノマーからコイルドコイルを形成するための主な駆動力を提供することが、確認された。また、これらの研究は、静電的相互作用がコイルドコイルの化学量論および幾何に寄与することを、示している。
【００２６】
保存的なアミノ酸により、個々のロイシン残基のそれぞれを、ダイマー化する能力の減少を最少に維持しつつ置換できるが；複数の変化は通常この能力を失う結果となることが、いくつかの研究から示された（Ｌａｎｄｓｈｕｌｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１６８１、１９８９；ＴｕｒｎｅｒおよびＴｊｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，１６８９、１９８９；Ｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１４００、１９９０）。ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅｒｅｎらは、ＧＣＮ４のロイシンジッパー内では異なる数多くのアミノ酸をロイシン残基の代わりに置換することができ、さらに２つのロイシン置換を含むいくつかのＧＣＮ４タンパク質は弱い活性を持つことが分かった、と報告した（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，３７２１、１９９２）。麻疹ウイルス融合タンパク質（the measles virus fusion protein）（ＭＶＦ）のロイシンジッパードメインの第一および第二の７つのロイシンの変異は、シンシチウムの形成（ウイルスが誘導する細胞融合の指標である）に影響を与えなかったが；４つのロイシン残基のすべてを変異すると、融合は完全に妨害された（Ｂｕｃｋｌａｎｄら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，１７０３、１９９２）。変異は、いずれもテトラマーを形成するＭＶＦの能力に影響を与えなかった。
【００２７】
ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインを表す合成ペプチドのａおよびｄ残基のアミノ酸を置換すると、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化特性が変化することが分かった（Ａｌｂｅｒ、Ｓｉｘｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。位置ａのすべての残基をイソロイシンに変えても、ロイシンジッパーは、依然としてパラレルダイマーを形成する。この変化に加えて、位置ｄのすべてのロイシン残基をイソロイシンに変えると、得られたペプチドは、溶液中でトリマー化したパラレルコイルドコイルを自発的に形成する。位置ｄのすべてのアミノ酸をイソロイシンに、そして位置ａの全アミノ酸をロイシンに置換すると、その結果、テトラマー化したペプチドが生じた。これらの置換を含むペプチドも、なお、ロイシンジッパードメインと呼ばれる。
【００２８】
また、本発明の範囲内には、ＲＡＮＫの細胞内ドメインのフラグメントまたは誘導体も含まれる。そのようなフラグメントは、ここに記載された任意の技術によって調製され、配列番号５に示したようなＲＡＮＫまたは配列番号１５に示したようなネズミのＲＡＮＫの細胞質ドメインと同一のペプチドおよびそれらの細胞質領域の一部分を含むペプチドを含む。また、可溶型の調製に用いられるすべての技術を、細胞質ドメインのフラグメントまたは類似体の調製に用いることができる（即ち、先端切除型を調製するためのＲＴ−ＰＣＲ技術または選択された制限酵素の使用）。細胞質内ドメインのすべてまたはフラグメントをコードするＤＮＡは、例えば本明細書中に記載された免疫沈降技術または酵母２−ハイブリッドシステムのようなその他の技術（Ｒｏｔｈｅら、上記）を用いると、ＲＡＮＫシグナル化と関連するその他のタンパク質を同定するために有用であろう。
【００２９】
また、本発明は、関連する天然型グリコシル化を持つまたは持たないＲＡＮＫを含む。酵母または哺乳動物発現システム、例えばＣＯＳ−７細胞、で発現させたタンパク質は、発現システムによって、天然分子よりも分子量およびグリコシル化型が類似しているかまたはわずかに異なるであろう。大腸菌のような細菌内での本発明のタンパク質をコードするＤＮＡｓの発現は、グリコシル化されていない分子を提供する。不活性化されたＮ−グリコシル化部位を持つＲＡＮＫタンパク質の機能的変異類似体は、オリゴヌクレオチドの合成および連結によって、または部位特異的変異技術によって、作り出すことができる。これらの類似体タンパク質は、酵母発現システムを用いて、良い収率で、均一で少なく炭水化物化された型として作り出すことができる。真核生物タンパク質内のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ａ１−Ｚ（式中、Ａ1はＰｒｏを除く任意のア
ミノ酸であり、そしてＺはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。この配列では、アスパラギンが炭水化物に共有結合付加する側鎖アミノ基を提供する。そのような部位は、Ａｓｎまたは残基Ｚをその他のアミノ酸で置換する、ＡｓｎまたはＺを欠失させる、またはＡ１およびＺの間にＺでないアミノ酸を、あるいはＡｓｎおよびＡ１の間にＡｓｎ以外のアミノ酸を挿入することによって、消去することができる。
【００３０】
また、未変性のＲＡＮＫまたはそのサブユニットを変異させることによって、ＲＡＮＫタンパク質誘導体を得ることもできる。ここに示されるように、ＲＡＮＫ変異タンパク質は、それぞれ、未変性のＲＡＮＫタンパク質に相同なポリペプチドであるが、一つのあるいは複数の欠失、挿入または置換故に、未変性のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を持っている。変異ペプチドをコードするＤＮＡで作り出された任意の変異の影響は、変異ペプチドが特異的様式でその相手構造と結合する能力を分析することによって、容易に測定することができる。さらに、ＲＡＮＫ類似体、ムテインまたは誘導体の活性は、本明細書中に記載された任意のアッセイ（例えば、転写を活性化するＲＡＮＫの能力の阻害）によって測定することができる。
【００３１】
本発明のタンパク質の類似体は、例えば、残基あるいは配列の様々な置換を作り出す、または末端あるいは内部残基あるいは生物学的活性に必要でない配列を欠失させる、ことによって構築することができる。例えば、システイン残基を欠失させるかまたはその他のタンパク質で置き換えると、復元時の不適切な細胞内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。突然変異誘発へのその他のアプローチには、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母システムでの発現を強化する隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾が含まれる。
【００３２】
欠失または挿入ストラテジーを採用する場合、生物学的活性への欠失または挿入の潜在的影響を考慮しなければならない。本発明のタンパク質のサブユニットは、末端あるいは内部の残基または配列を欠失することによって、構築することができる。ＲＡＮＫの可溶型は、容易に調製され、ＲＡＮＫ誘導ＮＦ−κＢ活性化を阻害するそれらの能力について試験することができる。細胞質領域に相当するポリペプチドおよびそのフラグメント［例
えばデスドメイン（death domein）］を類似の技術によって調製することができる。作り出すことのできる変異の型に関してのさらなるガイダンスは、ＲＡＮＫ配列を類似の構造を持つタンパク質と比較することによって、ならびに本発明のＲＡＮＫタンパク質の構造的分析を行うことによって、提供される。
【００３３】
一般的に、置換は、保守的に行われるべきである；即ち、最も好ましい置換アミノ酸は、ＲＡＮＫの生物学的活性に影響を与えないそれらである（即ち実質上等価な様式で相当する天然のタンパク質に対する抗体と結合する本発明のタンパク質の能力、実質上同様の様式で未変性タンパク質のような相手構造を結合する能力、ＲＡＮＫシグナルを伝達する能力、または例として一過性トランスフェクションシステム内で過剰発現時にＮＦ−κＢ活性を誘導する能力）。保守的置換の例としては、結合ドメイン（細胞外ドメインのリガンド／レセプターあるいは抗体のいずれかの結合領域、またはその他と相互作用する領域、細胞質ドメインの細胞内タンパク質）の外側のアミノ酸置換、ならびに、天然タンパク質の二次および／または三次構造を変化させないアミノ酸の置換、が含まれる。さらなる例としては、一つの脂肪族残基をＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａのようなその他の残基と、互いに置換すること、またはＬｙｓおよびＡｒｇ；ＧｌｕおよびＡｓｐ；またはＧｌｎおよびＡｓｎ間のように、一つの極性残基ともう一つの極性残基との置換、が含まれる。その他のそのような保守的置換、例えば類似の疎水性特性を持つ領域全体の置換、もまた良く知られている。
【００３４】
類似体タンパク質またはそのフラグメントの発現のために構築されるヌクレオチド配列の変異は、もちろん、コード配列のリーディングフレーム相を保存しなければならず、好ましくは、ハイブリダイズしてｍＲＮＡの翻訳に逆影響を与えるループまたはヘアピンのようなｍＲＮＡの二次構造を作り出す可能性がある相補領域を含まないであろう。
【００３５】
ＲＡＮＫタンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列の変異のすべてが最終生成物に現れるとは限らない、例えば、発現を強めるように、主に転写されたｍＲＮＡの二次構造ループを防ぐように（ＥＰＡ７５，４４４Ａ、ここに参照として採用する、を参照のこと）、または選択された宿主によってより容易に翻訳されるコドン、例えば大腸菌で発現させるための周知の大腸菌優先コドン、を提供するように、ヌクレオチド置換を作り出すことができる。
【００３６】
変異部位を前もって決めることができるが、変異の種類それ自体を前もって決める必要はない。例えば、最適な特性を持つ変異体を選択するためには、ランダム変異誘発を行い、そして発現した変異タンパク質を好ましい活性についてスクリーニングすることができる。天然配列のフラグメントとの連結を可能にする制限部位に隣接させて、変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の座に変異を導入することができる。連結の後、得られた再構築配列は、好ましいアミノ酸の挿入、置換または欠失を含む類似体をコードする。
【００３７】
代わりに、オリゴヌクレオチドへの部位特異的変異誘発法を用いて、要求される置換、欠失または挿入に従って変化した特定のコドンを持つ変化した遺伝子を提供することもできる。上記の変化を作り出す例示的方法は、Ｗａｌｄｅｒら（Ｇｅｎｅ，４２，１３３、１９８６）；Ｂａｕｅｒら（Ｇｅｎｅ，３７，７３、１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２−１９、１９８５年１月）；Ｓｍｉｔｈら（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｅｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓｓ、１９８１）；ならびに合衆国特許第４，５１８，５８４号および第４，７３７，４６２号に開示されており、ここに参照として採用される。
【００３８】
本発明のタンパク質のその他の実施態様には、中程度のストリンジェント条件下（５ｘ
ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の前洗浄溶液、５０℃、５ｘＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション条件）で配列番号６のＤＮＡに、ＲＡＮＫをコードするＤＮＡ配列に、またはより好ましくはストリンジェント条件下（例えば６ｘＳＳＣ、６３℃で一晩ハイブリダイゼーション、３ｘＳＳＣ、５５℃で洗浄）でハイブリダイズする能力を持つＤＮＡによってコードされるＲＡＮＫポリペプチド、およびそれらのＲＡＮＫをコードするその他の縮重配列を含む。一つの実施態様では、ＲＡＮＫポリペプチドは、配列番号５に示した天然型ＲＡＮＫタンパク質のアミノ酸配列に、アミノ酸配列で少なくとも約７０％同一である。好ましい実施態様では、ＲＡＮＫポリペプチドは、ＲＡＮＫの天然型とアミノ酸配列で少なくとも約８０％同一であり；最も好ましいポリペプチドは、天然型ＲＡＮＫと少なくとも約９０％同一であるそれらである。
【００３９】
同一性の割合を、コンピュータープログラム、例えばＤｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ，Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７、１９８４）に記載されておりウイスコンシン大学の遺伝子コンピューターグループ（the University of Wisconsin Genetics Computer Group）（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、を用いて決定することができる。ＲＡＮＫタンパク質から誘導されたフラグメントでは、フラグメント内に存在するＲＡＮＫタンパク質該当部分をもとにして同一性を計算する。
【００４０】
ＲＡＮＫ類似体またはムテインの生物学的活性は、転写の活性化を阻害する類似体またはムテインの能力を、例えば本明細書中の実施例に記載した方法に従って、試験することによって、測定することができる。代わりの方法として、天然型ＲＡＮＫと結合する抗体または可溶型ＲＡＮＫＬを用いた適当なアッセイ、例えば酵素イムノアッセイまたはドットブロットを用いると、ＲＡＮＫ類似体またはムテインの活性を評価することができ、さらには、ＲＡＮＫＬを発現する細胞を用いてアッセイをしてもよい。また、適当なアッセイには、例えば、シグナル伝達アッセイが含まれ、シグナル伝達に関与するその他の細胞内タンパク質（即ちＴＲＡＦ２および３）と関連するＲＡＮＫの細胞質領域の能力を評価する方法もまた、ＲＡＮＫ類似体またはムテインの活性の評価に有用であろう。そのような方法は、この技術分野では周知である。
【００４１】
ＲＡＮＫヌクレオチド配列のフラグメントもまた有用である。一つの実施態様では、そのようなフラグメントは、本明細書中に開示された少なくとも約１７の連続的ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約２５のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３０の連続ヌクレオチドのＲＡＮＫ  ＤＮＡを含む。そのようなフラグメントのＤＮＡおよびＲＮＡ相補体を、配列番号５の一本鎖型および二本鎖型の両方のＲＡＮＫ  ＤＮＡ、および前述のポリペプチドをコードするそれらと共に、ここに提供する。一般的には、ＲＡＮＫ  ＤＮＡのフラグメントは、少なくとも約１７ヌクレオチド、好ましくは約１７から約３０のヌクレオチドを含む。そのような核酸フラグメント（例えばＲＡＮＫの細胞外ドメインに相当するプローブ）が、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）中でプローブとしてまたはプライマーとして用いられる。
【００４２】
また、プローブは、インビトロアッセイでのＲＡＮＫ核酸の存在の検出に、およびノーザンおよびサザンブロットのような方法に、用いられることが分かる。ＲＡＮＫを発現する細胞型もまた、同定することができる。そのような方法は周知であり、当業者らは、特別に計画された適用によって、適当な長さのプローブを選ぶことができる。ＰＣＲでは、所望のＲＡＮＫ  ＤＮＡ配列の末端に相当する５’および３’プライマーが、慣用の技術を用いて、その配列を増幅するために用いられる。
【００４３】
ＲＡＮＫ核酸のその他の有用なフラグメントは、標的ＲＡＮＫ  ｍＲＮＡ（センス）またはＲＡＮＫ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合する能力を持つ一本鎖の核酸配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドであ
る。与えられたタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを作り出す技術は、例えば、ＳｔｅｉｎおよびＣｏｈｅｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４８，２６５９、１９８８およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６，９５８、１９８８に記載されている。
【００４４】
ＤＮＡ、タンパク質および類似体の用途
本明細書中に記載のＲＡＮＫ  ＤＮＡｓ、タンパク質および類似体は、医薬組成物の製造を含む、数多くの用途を持つであろう。例えば、可溶型ＲＡＮＫは、ＲＡＮＫ仲介ＮＦ−κＢ活性化のアンタゴニストとして、ならびにＲＡＮＫを通してのシグナルの伝達を阻害するために、有用であろう。ＲＡＮＫ組成物（タンパク質およびＤＮＡの両方）もまた、ＲＡＮＫへのアゴニストおよびアンタゴニストの両方の抗体の開発に有用であろう。本発明のＤＮＡｓは、組換えタンパク質の発現に、そしてＲＡＮＫ転写物の存在あるいは分布の（量的または質的のいずれかの）分析のためのプローブとして、有用である。
【００４５】
また、本発明のタンパク質は、例えば患者検体内で、可溶性ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬを検出する、またはＲＡＮＫ関連活性をモニターするために用いられるキットの調製に有用であろう。また、ＲＡＮＫタンパク質には、この活性のアンタゴニストまたは擬態（mimetic）をスクリーニングする場合に必要であるような、その他のサンプルまたは組成物（例えば相互作用をそれぞれに阻害または擬態するペプチドまたは小分子）のＲＡＮＫ関連活性をモニターする用途も、見出されるであろう。様々なアッセイフォーマットは、（限定するわけではないが）ＥＬＩＳＡ、ドットブロット、（バイオセンサーを用いるそれらのような）固相結合アッセイ、ラピッドフォーマットアッセイ、およびバイオアッセイを含む、そのようなキットに有用である。
【００４６】
本発明に従って精製されたＲＡＮＫは、ＲＡＮＫ阻害剤、従って（ＮＦ−κＢ活性化の阻害を通しての）炎症性応答の阻害剤の発見を容易にするであろう。潜在的阻害剤のスクリーニングに精製ＲＡＮＫポリペプチドを用いることは重要であり、混入物により反応が妨害される可能性を事実上排除することができる。そのようなスクリーニングアッセイには、ＲＡＮＫの細胞外ドメイン、細胞内ドメインまたはこれらポリペプチドのいずれかのフラグメントのいずれかを用いることができる。典型的には、分子の阻害活性の検出には、ＲＡＮＫを結合し、そして例えばアゴニスト抗体あるいはＲＡＮＫＬの結合を阻害する能力を持つ分子を検出するためのスクリーニングアッセイには細胞外ドメインから誘導された可溶型ＲＡＮＫを用いること、またはＲＡＮＫとその他のシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質との相互作用の阻害を検出するためのアッセイには細胞内ドメインから誘導されたポリペプチドを用いること、が含まれるであろう。
【００４７】
さらに、インビトロでのシステムは、ＲＡＮＫ活性に拮抗または作動する分子の能力を確認するために用いることもできる。その様な方法に含まれるのは、ＲＡＮＫキメラ、例えば既知のリガンドを持つタンパク質から誘導されたＲＡＮＫ細胞内ドメインおよび細胞外ドメインのキメラ、の使用である。様々な分子のシグナル伝達への影響を、シグナルを伝達する既知のリガンドを用いることによって、モニターすることができる。
【００４８】
さらに、ＲＡＮＫポリペプチドはまた、ＲＡＮＫ阻害剤の構造を基本とする設計に用いることができる。そのような構造を基本とする設計もまた、「合理的薬剤設計」として知られている。ＲＡＮＫポリペプチドを、例えばＸ線結晶学、核磁気共鳴または相同性モデル化（そのすべては周知の方法である）によって三次元的に分析することができる。阻害剤設計を助ける分子モデル化ソフトウェアシステムでのＲＡＮＫ構造情報の使用もまた、本発明の内にある。そのようなコンピューターを用いたモデル化および薬剤設計は、化学的配座分析、分子のエレクトロスタティックポテンシャル、タンパク質の折り畳みのような情報を用いることができる。本発明の特別な方法は、基質の有望な結合部位についての
ＲＡＮＫの三次元構造の分析、予想される反応部位を持つ新規分子の合成、および上記のような新規分子のアッセイを含む。
【００４９】
組換えＲＡＮＫの発現
本発明のタンパク質は、ＲＡＮＫタンパク質およびその類似体をコードするＤＮＡ配列を組み換え発現ベクター内に挿入し、そして発現を促進する条件下、組換え体発現システムでＤＮＡ配列を発現することによる、組換え型ＤＮＡ法によって作成するのが好ましい。本発明によって提供されるタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ｃＤＮＡフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから組み立てると、組換え発現ベクター内に挿入され組換え転写ユニット内で発現する能力を持つ合成遺伝子を提供することができる。
【００５０】
組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫の遺伝子から誘導された適当な転写または翻訳調節エレメントに機能できるように連結された、ＲＡＮＫ、または相同体、ムテインまたはその生物学的に等価な類似体、をコードする合成またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡフラグメントを含む。そのような調節エレメントは、転写プロモーター、転写を調節するための所望のオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終止を調節する配列が含まれ、以下にその詳細を記載する。さらに通常複製開始点によって提供される宿主内で複製する能力および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子を、取り入れることができる。
【００５１】
ＤＮＡ領域が互いに機能的に関係する場合、それらは機能するように連結される。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）用ＤＮＡが、もしポリペプチドの分泌に関係する前駆体として発現される場合は、それは、ポリペプチド用ＤＮＡと機能するように連結されていることを意味する；もしプロモーターが配列の転写を調節するならば、それはコード配列に機能する様に連結されている；またはもしリボソーム結合部位を適当な位置に置くことによって翻訳が可能になるならば、リボソーム結合部位はコード配列と機能するように連結されている。一般的に、「機能するように連結する」とは、連続的であることを、そして分泌リーダーの場合には連続的で且つリーディングフレーム内であることを意味する。微生物内で発現されるべきＲＡＮＫ、または相同体またはその類似体をコードするＤＮＡ配列は、好ましくは、ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写を未熟なままに終結させるおそれがあるイントロンを含まないであろう。
【００５２】
細菌での使用に有用な発現ベクターは、市販されている周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子エレメントを含むプラスミドから誘導された、選択可能マーカーおよび細菌の複製開始点を含むことができる。そのような市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。これらのｐＢＲ３２２「骨格」部分を、適当なプロモーターおよび構造配列と結合して、発現させる。典型的には、大腸菌種から誘導されたプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を用いて、大腸菌を形質転換する（Ｂｏｌｉｖａｒら、Ｇｅｎｅ，２，９５、１９７７）。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、このことによって、形質転換された細胞を同定するための単純な手段が提供される。
【００５３】
微生物の組換え発現ベクターに共通して用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーターシステム（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、２７５，６１５、１９７８；およびＧｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１，５４４、１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８，４０５７、１９８０；およびＥＰＡ３６，７７６）ならびにｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、４１２頁、１９８２）が含まれる。特に有用な細菌の発現システムは、ファージλＰＬプロモーターおよびｃ１８５７ｔｓ熱感受性レプレッサーを用いる。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手できるλＰL プロモーターの誘導体を採用したプラスミドベクターは、大腸菌ＪＭＢ９株（ＡＴＣＣ３７０９２）に常在するプラスミドｐＨＵＢ２、および大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）に常在するｐＰＬｃ２８を含む。
【００５４】
酵母ベクターに適当なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５，２０７３、１９８０）またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような、その他の解糖系酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７，１４９、１９６８；およびＨｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７，４９００、１９７８）のプロモーターが含まれる。さらに、酵母での発現に用いるに適当なベクターおよびプロモーターは、Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎら、ＥＰＡ７３，６５７に記載されている。
【００５５】
好ましい酵母ベクターは、大腸菌での分泌および複製用のｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（ａｍｐｒ遺伝子および複製開始点）、ならびにグルコース−抑制ＡＤＨ２プロモーターおよびα−因子分泌リーダーを含む酵母のＤＮＡ配列を用いて、組み立てることができる。ＡＤＨ２プロモーターは、Ｒｕｓｓｅｌｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８，２６７４、１９８２）およびＢｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ，３００，７２４、１９８２）に記載されている。酵母α−因子リーダーは、外来タンパク質の分泌に関係し、プロモーターと発現される構造遺伝子との間に挿入することができる。Ｋｕｒｊａｎら、Ｃｅｌｌ，３０，９３３、１９８２；およびＢｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５３３０、１９８４を参照のこと。リーダー配列を修飾して、その３’末端付近に、一つまたはそれより多くの有用な制限部位を含ませて、リーダー配列の外来遺伝子への融合を促進することもできる。
【００５６】
脊椎動物細胞の形質転換に用いられる発現ベクター内の転写および翻訳調節配列を、ウイルス起源で提供することもできる。例えば、共通に用いられるプロモーターおよびエンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サルウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒトのサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０開始点、早期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位、から誘導したＤＮＡ配列を用いて、外来ＤＮＡ配列の発現に必要なその他の遺伝子エレメントを提供することもできる。早期および後期プロモーターは、その両方がＳＶ４０ウイルス複製開始点をも含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるため、特に有用である（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，２７３，１１３，１９７８）。ウイルス複製開始点内に位置するＨｉｎｄIII 部位からＢｇｌＩ部位に向かって伸びるおおよそ２５０ｂｐの配列が含まれる限りにおいて、より小さいまたはより大きいＳＶ４０フラグメントもまた、用いることができる。さらに、そのようなコントロール配列が選択された宿主細胞に適合する限りにおいて、ウイルスゲノムプロモーター、コントロールおよび／またはシグナル配列を用いることもできる。例として、ベクターは、ＯｋａｙａｍａおよびＢｅｒｇ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３，２８０，１９８３）に開示の方法に従って、構築することもできる。
【００５７】
Ｃ１２７ネズミ乳房上皮細胞内での哺乳動物のレセプターｃＤＮＡｓの安定な高レベル発現の有用なシステムは、実質上、Ｃｏｓｍａｎら、（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，９３５、１９８６）に記載の方法に従って、構築することができる。ＲＡＮＫ  ＤＮＡを発現するための好ましい真核生物ベクターは、ｐＤＣ４０６と呼ばれ（ＭｃＭａｈａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０，２８２１、１９９１）、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびエプステイン−バールウイルス(Epstein-Barr virus)（ＥＢＶ）から誘導された調節配列を含む。その他の好ましいベクターには、ｐＤＣ４０６から誘導された、ｐＤＣ４０９およびｐＤＣ４１０が含まれる。ｐＤＣ４１０は、ＥＢＶ複製開始点をＳＶ４０ラージＴ抗原をコードする配列で置換することによってｐＤＣ４０６から誘導された。ｐＤＣ４０９は、マルチプルクローニング部位の外側のＢｇｌII制限部位を欠失させて、マルチプルクローニング部位内に唯一のＢｇｌII部位を作成した点でｐＤＣ４０６とは異なる。
【００５８】
ｐＤＣ４０６およびｐＤＣ４０９のような、ＥＢＶ複製開始点を含む、発現ベクターのエピソームでの複製を可能にする有用な細胞系は、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４７８）である。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプスタイン−バーウイルスの核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードする遺伝子をＣＶ−１細胞系にトランスフェクションすることによって誘導され、ヒトＣＭＶ即時−早期エンハンサー／プロモーターから誘導されたＥＢＮＡ−１を構成的に発現する。
【００５９】
宿主細胞
形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術用いて構築し、本発明のタンパク質をコードする配列を含む、発現ベクターで形質転換されるかまたはトランスフェクトされた細胞である。形質転換された宿主細胞は、所望のタンパク質（ＲＡＮＫまたはその相同体あるいは類似体）を発現することができるが、本発明のＤＮＡをクローニングするかまたは増幅する目的で形質転換された宿主細胞は、タンパク質を発現する必要がない。発現したタンパク質は、好ましくは、選択されたＤＮＡによって、培養上清内に分泌されるであろうが、細胞膜内に留め置くことも可能であろう。
【００６０】
タンパク質の発現に適当な宿主細胞には、適当なプロモーター調節下の、原核生物、酵母またはより高等の真核生物が含まれる。原核生物には、グラム（−）またはグラム（＋）の生物体、例えば大腸菌またはバシラス属、が含まれる。より高等な真核細胞には、以下に記載したような哺乳動物起源の確立された細胞系が含まれる。また、無細胞翻訳システムを用いて、本明細書中に開示されたＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡを用いて、タンパク質を生成することもできる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用に適当なクローニングおよび発現ベクターは、Ｐｏｕｗｅｌｓら（Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５）に記載されており、その関連開示はここに参照として採用される。
【００６１】
原核生物発現宿主を用いて、広範囲のタンパク質分解およびジスルフィドプロセシングを必要としない、ＲＡＮＫまたはその同族体あるいは類似体の発現させることができる。原核生物発現ベクターは、一般的には、一つまたはそれより多くの表現型選択可能マーカー、例えば抗生物質耐性を授与するかまたは独立栄養要求性を与えるタンパク質をコードする遺伝子、および宿主内での増幅を確立するための宿主によって認識される複製開始点、が含まれる。形質転換に適当な原核生物宿主には、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびスタフィロコッカスの属内の様々な種が含まれるが、その他もまた、選択次第で用いることができる。
【００６２】
組換えＲＡＮＫはまた、酵母宿主内で、好ましくは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様なサッカロミセス種から、発現させることができる。ＰｉｃｈｉａまたはＫｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓのような酵母のその他の属もまた、用いることができる。一般的には、酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製開始点または自己複製配列（autonomously replicating sequence）（ＡＲＳ）、プロモーター、タンパク質をコードするＤＮＡ、ポリアデニル化および転写終結のための配列、選択可能遺伝子を含むであろう。好ましくは、酵母ベクターは、複製開始点および酵母および大腸菌の両方の形質転換を可能にする選択可能マーカー（例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびトリプトファン内で増殖する能力の欠如した酵母の変異株に選択マーカーを提供する、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔｒｐ１遺伝子）ならびに下流の構造配列の転写を誘導するために高発現酵母遺伝子から誘導されたプロモーター、を含むであろう。次いで、酵母宿主細胞ゲノム内にｔｒｐ１障害を存在させておいて、トリプトファンの不在下での増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【００６３】
適当な酵母形質転換プロトコールは、当業者らに既知であり；例示的技術は、Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９、１９７８に記載されおり、０，６７％の酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌのアデニンおよび２０μｇ／ｍｌのウラシルからなる選択培地内でｔｒｐ＋形質転換株について選択される。ＡＤＨ２プロモーターを含むベクターによって形質転換された宿主株を、８０μｇ／ｍｌのアデニンおよび８０μｇ／ｍｌのウラシルを補足した１％酵母エキス、２％ペプトンおよび１％グルコースからなる豊富培地内での発現用に増殖させることができる。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、培地グルコースの涸渇時に起こる。酵母の粗上清をろ過によって集め、さらに精製する迄、４℃に保つ。
【００６４】
様々な哺乳動物または昆虫細胞培養システムを用いて、組換えタンパク質を発現することができる。昆虫細胞内で外来タンパク質を生成するためのバキュロウイルスシステムは、ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）によって論評されている。適当な哺乳動物宿主細胞系の例としては、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３，１７５，１９８１に記載されているサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系、例えば、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１０４７８）、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を含む適当なベクターを発現する能力を持つその他の細胞系が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、複製開始点、発現される遺伝子に連結された適当なプロモーターおよびエンハンサーならびにその他の５’または３’フランキング非転写配列のような非転写エレメント、ならびに、必須のリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位および転写終止配列のような、５’または３’非翻訳配列を含むことができる。
【００６５】
組換えＲＡＮＫの精製
本発明のＤＮＡの組換え翻訳生成物を発現する適当な宿主／ベクターシステムを培養し、次いで培養液または細胞抽出物を精製することにより、精製ＲＡＮＫおよびその同族体あるいは類似体を調製する。例えば、最初に、培養液中に組み換えタンパク質を分泌するシステムからの上清を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎの限外ろ過ユニット、を用いて濃縮することができる。
【００６６】
濃縮段階に次いで、濃縮物を適当な精製マトリックスにかけることができる。例えば、適当なアフィニティーマトリックスは、適当な支持体に結合した相手構造のタンパク質またはレシチンあるいは抗体分子を含むことができる。代わりに、アニオン変換樹脂、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）付属基を持つマトリックスまたは基質を、用いることもできる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製に通常用いられるその他の型であることができる。代わりに、カチオン交換工程を用いることもできる。適当なカチオン交換体には、スルホプロピルまた
はカルボキシメシル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲルろ過クロマトグラフィーもまた、本発明のタンパク質の精製手段として提供される。
【００６７】
アフィニティークロマトグラフィーは、ＲＡＮＫおよびその同族体の精製に特に好ましい方法である。例えば、イムノグロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質として発現するＲＡＮＫを、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。さらに、オリゴマー化ジッパードメインを含むＲＡＮＫタンパク質を、オリゴマー化ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製することができる。ＲＡＮＫタンパク質に対するモノクローナル抗体もまた、この技術分野で周知の方法を用いることによって、アフィニティークロマトグラフィー精製に有用であろう。リガンドもまた、ＲＡＮＫのアフィニティー精製のアフィニティーマトリックスの調製に用いることができる。
【００６８】
最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えばメチルまたはその他の脂肪族の付属基を持つシリカゲル、を用いる一つまたはそれより多くの逆相−高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）段階を、ＲＡＮＫ組成物のさらなる精製に用いることができる。また、前述の精製段階のいくつかまたはすべてを、様々に組み合わせて用いて、均一な組換えタンパク質を提供することができる。
【００６９】
通常、細胞培養物内に生成した組換えタンパク質は、最初に細胞ペレットから抽出し、次いで一回またはそれより多くの濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー段階によって、単離される。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製段階として用いることができる。組換えタンパク質発現に用いられる微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、または細胞溶解剤の使用を含む、任意の慣用の方法で崩壊させることができる。
【００７０】
分泌タンパク質として本発明のタンパク質を発現する酵母の発酵は、精製が非常に単純である。大規模発酵から得られた分泌組換えタンパク質を、Ｕｒｄａｌら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６，１７１、１９８４）によって開示されたそれらに類似の方法によって精製することができる。この文献は、調製用ＨＰＬＣカラムでヒト組換えＧＭ−ＣＳＦを精製するために逆相ＨＰＬＣを二度連続して行う段階について、記載している。
【００７１】
組換え培養物内で合成されたタンパク質に関して、タンパク質を含めて混在する細胞成分の量および性質について調べるが、それは培養物からの本発明のタンパク質の回収に用いられた精製段階に依存する。これらの成分は、通常は、酵母、原核生物または非ヒト高等真核生物の起源のものであり、好ましくは、約１重量％より少ないオーダーの無害の量の混入物として存在する。さらに、組換え細胞培養物は、もとの動物種に天然に見出される、通常は該タンパク質と関連するその他のタンパク質を含まない本発明のタンパク質の生成を可能にする。
【００７２】
ＲＡＮＫ組成物の用途および投与
本発明は、有効量のタンパク質および適当な希釈剤およびキャリヤーを含む治療組成物を用いる方法、ならびに免疫応答または炎症応答を調節する方法を提供する。可溶性サイトカインレセプターあるいはサイトカインまたはその他の免疫調節分子と一緒にＲＡＮＫを用いることもまた、計画されている。
【００７３】
治療的使用では、適応症に適当な様式で治療するために、精製タンパク質を患者、好ましくはヒト、に投与する。従って、例えば、免疫機能を調節するために投与されるＲＡＮＫタンパク質組成物は、ボーラス注射、連続注入、インプラントからの持続的放出、また
はその他の適当な技術によって、与えることができる。典型的には、治療薬剤は、生理的に許容しうるキャリヤー、補助剤または希釈剤と一緒に、精製されたＲＡＮＫを含む組成物の形で、投与されるであろう。そのようなキャリヤーは、用いられる投与量および濃度では、宿主に無害であろう。
【００７４】
通常、そのようなタンパク質組成物の調製は、バッファー、アスコルビン酸のような抗酸化剤、（約１０残基より少ない）低分子量ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、グルコース、スクロースまたはデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオンおよびその他の安定剤ならびに補助剤と、本発明のタンパク質を合わせることを必要とする。中性バッファー塩類溶液または同種の血清アルブミンと混合した塩類溶液は、適当な例示的希釈剤である。好ましくは、生成物は適当な補助溶液（例えばスクロース）を希釈剤として用いた、凍結乾燥物として調合される。適当な投与量は、試行後に決めることができる。投与の量および頻度は、もちろん、治療する症状の性質および程度、期待される応答、患者の状態などのようなそのような因子に依存するであろう。
【００７５】
可溶型のＲＡＮＫおよびアンタゴニスト的なモノクローナル抗体のようなその他のＲＡＮＫアンタゴニストをＲＡＮＫの誘導するＮＦ−κＢ活性の誘導を阻害する目的で投与することができる。ＮＦ−κＢは、細胞の免疫システムに広範囲に用いられている転写因子であり、炎症応答に役割を演ずる。このように、ＲＡＮＫによるシグナル伝達の阻害は、ＲＡＮＫによるシグナル伝達が好ましくない結果、例えば毒性あるいは敗血症性ショックまたは移植片−対−宿主反応、をもたらす様な状態の治療に有用であろう。また、それらは、細胞形質転換でのＮＦ−κＢの役割の妨害に有用であろう。そのようなＮＦ−κＢがブロックされる場合、腫瘍細胞は照射に対してより敏感であり、従って、可溶性ＲＡＮＫ（またはＲＡＮＫシグナル伝達のその他のアンタゴニスト）は、ＲＡＮＫを発現する新形成細胞を特徴とする疾病の補助療法として有用であろう。
【００７６】
以下の実施例は、説明のため提供されており、本発明の制限を意図して提供されているものではない。当業者らは、実施例に記載された本発明からの変法を、特に本明細書中に引用された様々な参考文献の教え、参考文献によって採用された開示にかんがみて、作り出すことができる。
【実施例】
【００７７】
実施例１
本実施例は、ＴＮＦレセプタースーパーファミリーの新たな一員をコードするＤＮＡの同定および単離について説明している。ＣＤ４０（Ｂ細胞の増殖および分化に重要な役割を演ずることが示されたヒトの正常および新形成の両Ｂ細胞の表面上に存在する細胞表面抗原；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，８，１４０３、１９８９）とある種の類似性を持ち、予想されるオープンリーディングフレームを持つ部分的ｃＤＮＡ挿入物を、ヒト骨髄誘導樹状突起細胞（ＤＣ）から生成したｃＤＮＡからの配列情報を含むデータベースで同定した。挿入物を、制限エンドヌクレアーゼ消化によりベクターから切り出し、ゲル精製し、３２Ｐで標識化し、そして高いストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションおよび洗浄技術（５ｘＳＳＣ、５０％ホルムアミド中、４２℃で一晩、ハイブリダイゼーション；６３℃、０．５ｘＳＳＣ中で洗浄）を用いて、より大きいｃＤＮＡ挿入物を含むＤＣ  ｃＤＮＡライブラリーから作成したコロニーブロットとのハイブリダイズに使用した；その他の適当な高ストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；１９８９）、９．５２−９．５５に開示されている。最初の実験では、９Ｄ−８Ａ（配列番号１）と名付けられたクローンが得られ；続いて行われた分析では、このクローンが５’末端の一番端を除いて新規ｃＤＮＡの全体を含むことが示され、５’末端には予想されるイントロン配列（配列番号１のヌクレオチド１−９２）を有していた。さらなるコロニーハイブリダイゼーションを行い、第二のクローンを単離した。９Ｄ−１５Ｃ（配列番号３）と名付けられた第二のクローンは、イントロン介在のない５’末端を含むが３’末端全体は含まなかった。配列番号５は、配列番号１および３のオーバーラッピング配列のアライメントに基づいた予想される全長のタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示している。
【００７８】
コードされているタンパク質は、ＮＦ−κＢのレセプター活性化物質であるため、ＲＡＮＫと名付けられた。ｃＤＮＡは、予想される２４のアミノ酸シグナル配列（コンピューター予想の切断部位はＬｅｕ２４の後である）、１８８アミノ酸の細胞外ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメイン、および３８３アミノ酸の細胞質尾部を持つ、６１６アミノ酸残基を持つ予想されるＩ型トランスメンブランタンパク質をコードする。ＲＡＮＫの細胞外領域は、ＣＤ４０と有意のアミノ酸相同性（３８．５％の同一性、５２．３％の類似性）を示した。ヒトのＲＡＮＫ配列を含むクローニングベクター（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：ｈｕＲＡＮＫ（大腸菌ＤＨ１０Ｂ内）と名付けられ、ブダペスト条約の条件下でＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ（ＡＴＣＣ）に１９９６年１２月２０日に寄託された（寄託番号９８２８５）。
【００７９】
実施例２
本実施例は、ＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＲＡＮＫ  ＤＮＡ構築物の構築について説明している。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合した可溶型ＲＡＮＫを、哺乳動物発現ベクターｐＤＣ４０９（ＵＳＳＮ０８／５７１，５７９）内に構築した。この発現ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）オープンリーディングフレームＲ２７０８０（配列番号９）のリーダー配列、次にＲＡＮＫのアミノ酸３３−２１３、次にＦｃレセプターに対してアフィニティーの減少を示すヒトＩｇＧ１の定常ドメインの変異型（配列番号８；融合タンパク質として、構築物のＦｃ部分は、Ａｒｇ３からＬｙｓ２３２からなる）をコードする。また、ＲＡＮＫのアミノ酸１−２１３（天然のリーダー配列を用いる）次いでＩｇＧ１ムテインを含む、代わりの発現ベクターを、調製した。両発現ベクターは、形質転換細胞内でＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質の高レベル発現を誘導することが分かった。
【００８０】
ＲＡＮＫ／Ｆｃタンパク質を得るために、ＲＡＮＫ／Ｆｃ発現プラスミドをＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトし、上清を約一週間集めた。ＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質を、Ｆｃ融合タンパク質を精製するためのこの技術分野で周知の手段、例えば製造者（即ち、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）らの指示書に従ってプロテインＡセファロースカラムクロマトグラフィーによって、精製する。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析から、精製されたＲＡＮＫ／Ｆｃタンパク質は、還元剤存在下では〜５５ｋＤａの分子量、に、そして還元剤不在下では〜１１０ｋＤａの分子量で移動した。
【００８１】
ＣＭＶ  Ｒ２７０８０リーダーを用いて作成された精製タンパク質のＮ−末端アミノ酸のシークエンシングは、Ａｌａ２０の後ろで６０％の切断、Ｐｒｏ２２の後ろで２０％の切断、Ａｒｇ２８の後ろで２０％の切断（これらはフューリン（Furin）切断部位であり
、アミノ酸残基は配列番号９に相当する）を示し；天然リーダーを伴って発現した融合タンパク質のＮ−末端アミノ酸分析は、Ｇｌｎ２５の後に顕著な切断を示した（Ｇｌｕ２５の後ろでは８０％、Ａｒｇ２３の後ろでは、２０％、アミノ酸残基は、全長のＲＡＮＫである配列番号６に相当する）。両方の融合タンパク質は、特異的様式でＲＡＮＫのリガンドを結合することができ（即ち、それらはネズミ胸腺腫細胞系であるＥＬ４のような様々な細胞系の表面に結合した）、ＲＡＮＫのＮ−末端へのさらなるアミノ酸の存在がＲＡＮ
ＫＬと結合するその能力を妨害しないことが示された。さらに、ＣＭＶリーダーを含む構築物は、アミノ酸３３で始まるＲＡＮＫをコードし、Ａｒｇ２３およびＰｒｏ３３を含めてその間のアミノ酸をＮ−末端として持つＲＡＮＫペプチドは、特異的様式でＲＡＮＫのリガンドを結合する能力があると期待される。
【００８２】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのその他の構成員は、トランスメンブランドメインおよびリガンド結合ドメインの間に「スペーサー」領域と呼ばれるアミノ酸領域を持つが、それはリガンドの結合に必須ではない。ＲＡＮＫでは、１９６と２１３の間のアミノ酸は、そのようなスペーサー領域を形成すると予想される。従って、この領域内のアミノ酸で終止する可溶型ＲＡＮＫは、特異的様式でＲＡＮＫのリガンドと結合する能力を残していると期待される。可溶性ＲＡＮＫペプチドの好ましいＣ−末端アミノ酸は、配列番号６のアミノ酸２１３および１９６からなる群から選択されるが、スペーサー領域内のその他のアミノ酸をｃ−末端として用いることもできる。
【００８３】
実施例３
本実施例は、ＲＡＮＫに対するモノクローナル抗体の調製について説明している。例えば、精製された組換えＲＡＮＫの調製物、または高レベルのＲＡＮＫを発現するトランスフェクトされた細胞を用いて、合衆国特許第４，４１１，９９３号に開示された技術のような慣用の技術を用いて、ＲＡＮＫに対するモノクローナル抗体を作り出す。また、ＲＡＮＫをコードするＤＮＡを、免疫原として、例えば、ＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３，１６５、１９９５に論評されている方法に従って、用いることができる。そのような抗体は、ＲＡＮＫによって誘導されるシグナルの妨害に（アンタゴニストまたはブロッキング抗体）、またはＲＡＮＫあるいはＲＡＮＫ活性についての診断アッセイまたは研究アッセイの成分としての、架橋ＲＡＮＫ（アンタゴニスト抗体）によるシグナルの誘導に、またはＲＡＮＫのアフィニティー精製に、有用であると考えられる。
【００８４】
齧歯類を免疫化するために、ＲＡＮＫ免疫原を、［完全または不完全なフロイントアジュバント、ミョウバン、または、ＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）のようなそれ以外のアジュバントのような］アジュバント内に乳化し、１０−１００μｇの範囲の量を選択された齧歯類、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスあるいはＬｅｗｉｓラット内に、皮下注射する。ＤＮＡを、皮内（Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９５１９、１９９４）または筋肉内（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４１５６、１９９３）に投与することができ；食塩水は、ＤＮＡを基本とした抗原の適当な希釈剤であることが分かった。１０日から３週間後、免疫化された動物をさらなる免疫原で追加免疫化し、そしてその後も毎週、隔週、または３週間毎の免疫化スケジュールで、その後も定期的に追加免疫化する。
【００８５】
血清サンプルを、ドット−ブロットアッセイ（抗体サンドイッチ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）、免疫沈降、またはＦＡＣＳ分析を含むその他の適当なアッセイによる試験のために、眼窩後部採血または尾先端切除により定期的に採取する。適当な抗体力価を検出した後、陽性動物に食塩水中の抗原を静脈内注射する。３−４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を収集し、そしてネズミのミエローマ細胞系［例えば、ＮＳ１または好ましくはＡｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）］と融合させる。この方法によって作り出されたハイブリドーマ細胞系を選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンまたはＨＡＴを含む培地）を含む複数のミクロタイタープレート内に播いて、非融合細胞、ミエローマ−ミエローマハイブリッドおよび脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を止める。
【００８６】
このようにして作り出されたハイブリドーマクローンは、例えば、Ｅｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．，８，８７１、１９７１および合衆国特許第４，７０３，００４号に開示された技術を適用することによって、ＲＡＮＫとの反応性をＥＬＩＳＡによって、スクリーニングすることができる。好ましいスクリーング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４２１２、１９９０に記載された抗体捕獲技術である。次いで、陽性のクローンを同系の齧歯類の腹膜腔内に注射すると、高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗−ＲＡＮＫモノクローナル抗体を含む腹水が生成される。得られたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。代わりに、ＲＡＮＫタンパク質への結合を基本にしたアフィニティークロマトグラフィーを用いることができ、同様に、プロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合を基本としたアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。
【００８７】
免疫原としてＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質を用いて、モノクローナル抗体を生成させた。ＲＡＮＫタンパク質に対する反応性を確認するために、これらの試薬をスクリーニングした。ｍＡｂｓの活性をモニターするために本明細書中に記載の方法を用いて、ブロッキング（即ちＲＡＮＫと結合しＲＡＮＫへのリガンドの結合を阻害する抗体）およびノンブロッキング（即ちＲＡＮＫと結合してリガンド結合を阻害しない抗体）の両方を単離した。
【００８８】
実施例４
本実施例は、２９３／ＥＢＮＡ細胞［細胞系はヒトＣＭＶ即時−早期エンハンサー／プロモーターから誘導されるエプスタイン−バーウイルスの核抗原−１（Epstein Barr Virus nuclear antigen-1）（ＥＢＮＡ−１）を構成的に発現するＥＢＮＡ−１をコードする遺伝子を持つ２９３細胞系のトランスフェクションによって誘導された］内のＲＡＮＫによるＮＦ−κＢ活性の誘導について説明している。Ｙａｏら（ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３，８１１、１９９５）に記載の方法に実質上従って、ＮＦ−κＢ活性の活性化を２９３／ＥＢＮＡ細胞内で測定した。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢ結合部位を含む２５塩基対のオリゴヌクレオチドを用いて、ゲル遅延アッセイによってＮＦ−κＢ活性について分析した。２００万の細胞を、ＤＮＡトランスフェクションの２日前に１０ｃｍの皿内に種付けし、２．５％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ−Ｆ１２培地内で培養した。ＤＮＡトランスフェクションは、本明細書に記載の方法に従って、ＩＬ−８プロモーター／レポーターアッセイのために行った。
【００８９】
単離された核を４００ｍＭ  ＮａＣｌで可溶化することによって、核抽出物を調製した（Ｙａｏら、上記）。ＮＦ−κＢ結合部位を含むオリゴヌクレオチドをアニールし、Ｔ４
ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼを用いて３２Ｐで末端標識した。移動度シフト反応は、１０μｇの核抽出物、４μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）および１５，０００ｃｐｍの標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、そして室温で２０分間インキュベートした。得られたタンパク質−ＤＮＡ複合体を、０．２５ｘトリス−ホウ酸−ＥＤＴＡバッファー中の６％の未変性ポリアクリルアミドゲル上で解析した。
【００９０】
ＲＡＮＫの過剰発現は、ゲル上の放射能プローブの移動度のおおよそのシフトにより示されたように、結果としてＮＦ−κＢ活性の誘導した。ＲＡＮＫを結合し、そしてレセプターを発現する細胞にシグナルを伝達する（即ち、ヒトＲＡＮＫおよびネズミＲＡＮＫＬ
ＤＮＡで細胞を同時トランスフェクトすることによって；以下の実施例７を参照のこと）リガンドによって、ＲＡＮＫを誘発させた場合にも類似の結果が認められ、このことから誘発がアゴニスト抗体で行われる場合にも起こると期待される。
【００９１】
実施例５
本実施例は、インビボでの遺伝子転写の活性化を分析するために用いられたヒトのイン
ターロイキン−８（ＩＬ−８）プロモーターを基にした遺伝子プロモーター／レポーターシステムについて説明している。サイトカインであるインターロイキン−１（ＩＬ−１）または腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）によるヒトＩＬ−８遺伝子転写物の誘導は、インタクトなＮＦ−κＢおよびＮＦ−ＩＬ−６転写因子結合部位に依存するものであることが知られている。ネズミＩＬ−４レセプター（ｍＩＬ−４Ｒ）をコードするｃＤＮＡとサイトカイン応答性ＩＬ−８プロモーターを融合させると、トランスフェクトされた細胞の細胞表面上の異種レポータータンパク質（ｍＩＬ−４Ｒ）を検出することにより、プロモーター活性化の測定が可能になる。
【００９２】
ヒト腎臓上皮細胞（２９３／ＥＢＮＡ）を、１）レポーター／プロモーター構築物（ｐＩＬ−８ｒｅｐと名付けた）および２）興味あるｃＤＮＡ：をコードするプラスミドで（ＤＥＡＥ／ＤＥＸＴＲＡＮ法を通して）トランスフェクトした。ＤＮＡ濃度は、常に、空のベクターＤＮＡを加えることによって一定に保たれている。２９３／ＥＢＮＡ細胞を６穴プレートに２．５ｘ１０４細胞／ｍｌ（３ｍｌ／穴）の密度で播き、トランスフェクションする前に２日間インキュベートする。トランスフェクションの２日後、ｍＩＬ−４レセプターを、以下に記載のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって検出する。
【００９３】
一つのそのような実験では、２９３／ＥＢＮＡ細胞を、ＲＡＮＫをコードするＤＮＡおよびＲＡＮＫＬをコードするＤＮＡで同時トランスフェクションした（以下の実施例７を参照のこと）。細胞によるこのレセプターとその相手構造の同時発現は、結果として、ＲＡＮＫのシグナル化プロセスを活性化する。そのような同時トランスフェクション研究では、ＤＥＡＥトランスフェクションのためのＤＮＡ濃度／穴は、以下の通りである：４０ｎｇのｐＩＬ−８ｒｅｐ［ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）］；０．４ｎｇのＣＤ４０（ＣＤ４０をコードするＤＮＡ、コントロールレセプター；ｐＣＤＭ８ベクター）；０．４ｎｇのＲＡＮＫ（ＲＡＮＫをコードするＤＮＡ；ｐＤＣ４０９ベクター）、および１−５０ｎｇのＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０のリガンドをコードするＤＮＡ、ＣＤ４０と同時トランスフェクトした場合には正のコントロールとして働き、ＲＡＮＫと同時トランスフェクトした場合には負のコントロールとして働く、ｐＤＣ３０４内）またはＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫのリガンドをコードするＤＮＡ、ｐＤＣ４０６内）のいずれか。類似の実験を、可溶性ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫに対するアゴニスト抗体を用いて行い、ＲＡＮＫでトランスフェクトされた細胞を誘発することができる。
【００９４】
ｍＩＬ−４Ｒ特異的ＲＩＡでは、ｍＩＬ−４Ｒと反応するモノクローナル抗体を、クロラミンＴ結合法を用いて１２５Ｉで標識する：得られた比活性は、典型的には、１．５ｘ１０１６ｃｐｍ／ｎｍｏｌである。４８時間後、トランスフェクトされた細胞を培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；５％ＦＢＳ）で一度洗浄する。非特異的結合部位は、前もって暖めておいた５％脱脂乾燥ミルクを含む結合培地を加え、そして３７℃／５％ＣＯ２、組織培養インキュベーター中で１時間インキュベートすることによって、ブロックする。ブロッキング培地をデカントし、１２５Ｉ抗−ｍＩＬ−４Ｒ（クローンＭ１；ラットＩｇＧ１）を含むブロックバッファーを細胞に加え、そして室温で１時間揺らしながらインキュベートする。放射能標識した抗体と細胞とをインキュベーションした後、細胞を結合バッファー（２ｘ）で十分に、そしてリン酸塩バッファー溶液（ＰＢＳ）で二度洗浄する。細胞を１ｍｌの０．５Ｍ  ＮａＯＨで溶解し、そして全放射能をガンマカウンターで測定する。
【００９５】
このアッセイを用いると、ＲＡＮＫをコードするＤＮＡで同時トランスフェクトされた２９３／ＥＢＮＡは、細胞表面上のｍｕＩＬ−４Ｒを検出することによって示されるような、転写活性を持つことが証明された。ＲＡＮＫの過剰発現は、結果としてＲＡＮＫＬによるＲＡＮＫの誘発のような、ｍｕＩＬ−４Ｒの転写を生ずる。ＲＡＮＫをアゴニスト抗体で誘発する場合にも、同様の結果が認められる。
【００９６】
実施例６
本実施例は、ＴＲＡＦタンパク質とＲＡＮＫの関係について説明している。細胞質ＴＲＡＦタンパク質とＲＡＮＫの相互作用を、実質上Ｈｓｕら、（Ｃｅｌｌ，８４，２９９、１９９６）に記載された方法に従って、同時免疫沈降法によって証明した。簡単に言えば、２９３／ＥＢＮＡ細胞を、ＲＡＮＫおよびエピトープ−タグ（ＦＬＡＧＲ；配列番号７）ＴＲＡＦ２またはＴＲＡＦ３の合成を指示するプラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの２日後、表面タンパク質を、ビオチン−エステルで標識し、０．５％ＮＰ−４０を含むバッファー中で細胞を溶解した。このレセプターに関連するＲＡＮＫおよびタンパク質を抗ＲＡＮＫで免疫沈降し、十分に洗浄し、６−１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動分離によって解析し、そしてウエスタンブロッティングを行うためにニトロセルロース膜に電気的にトランスファーした。ＲＡＮＫとＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３タンパク質との関連を、ＦＬＡＧＲエピトープを特異的に認識する抗体で膜をプローブ化することによって、可視化した。ＴＲＡＦ２および３は、ＲＡＮＫ発現がない場合には、抗−ＲＡＮＫで免疫沈降しなかった。
【００９７】
実施例７
本実施例は、ＲＡＮＫＬと名付けられたＲＡＮＫリガンドの直接発現クローニングによる単離について、説明している。リガンドを、ＣＤ４０Ｌに関するＵＳＳＮ０８／２４９，１８９、１９９４年５月２４日出願（ここに参照として採用される適切な開示）に記載の方法に実質上従って、クローン化した。簡単に言えば、ＦＡＣＳ（fluorescence activated cell sorter）（蛍光活性化細胞選別器）内でビオチニル化されたＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質で５回選別することによって誘導された、ＥＬ−４０．５と名付けられたマウスの胸腺腫細胞系ＥＬ−４（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ３９）のクローンから、ライブラリーを調製した。ｃＤＮＡライブラリーを標準方法論を用いて作成し；プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＥＡＥ−デキストラン法を用いてサブコンフルエント状態の融合ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内にトランスフェクトした。実施例２で調製したＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質との二段階結合法を用いたＲＡＮＫＬ発現についてのスライドオートラジオグラフィーによって、次いで放射性ヨウ素標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体を使用することによって、トランスフェクタントをスクリーニングした。
【００９８】
ＲＡＮＫを特異的に結合するタンパク質をコードするクローンを単離し、そして配列決定した；このクローンを１１Ｈと名付けた。ｐＤＣ４０６：ｍｕＲＡＮＫ−Ｌ（大腸菌ＤＨ１０Ｂ内）と名付けられたネズミＲＡＮＫＬ配列を含む発現ベクターは、ブダペスト条約の条件に従って、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ（ＡＴＣＣ）に１９９６年１２月２０日に寄託された（寄託番号９８２８４）。このクローンのヌクレオチド配列および予想されるアミノ酸配列を、配列番号１０に図示している。このクローンは、開始コドンであるメチオニンを含んでいなかった；さらなる全長クローンを（実質上、合衆国特許第５，５９９，９０５号、１９９７年２月４日発行、に記載の方法に従って調製された）７Ｂ９ライブラリーより得た；５’領域は、残基９のＴｈｒのＧｌｙへの置換を除いて、配列番号１２のアミノ酸１から２２に示したヒトＲＡＮＫＬのそれと同一あることが分かった。
【００９９】
このリガンドは、数多くの異なるアッセイによってＲＡＮＫＬと結合するＲＡＮＫの能力を評価するために有用である。例えば、ＲＡＮＫＬを発現するトランスフェクトされた細胞は、ＦＡＣＳアッセイ（または類似のアッセイ）に用いると、ＲＡＮＫＬと結合する可溶性ＲＡＮＫの能力を評価することができる。さらに、ＲＡＮＫＬの可溶型を調製し、この技術分野で既知のアッセイ（即ち、実質上、ＵＳＳＮ０８／２４９，１８９、１９９４年５月２４日出願、に記載したようなＥＬＩＳＡまたはＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）に用いることができる。また、ＲＡＮＫＬは、ＲＡＮＫのアフィニティー精製に、そしてサンプル中のＲＡＮＫレベルを測定する方法での試薬として、有用である。また、可溶性ＲＡＮＫＬは、ＮＦ−κＢ活性化の誘導、また、それ故ＲＡＮＫを発現する細胞のアポトーシスからの防御に有用である。
【０１００】
実施例８
本実施例は、ＰＣＲに基づく技術を用いたヒトＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）の単離について説明している。ネズミＲＡＮＫリガンド−特異的オリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型としてヒト細胞系−誘導第一鎖ｃＤＮＡを用いてＰＣＲ反応に用いた。これらのプライマーは、ネズミＲＡＮＫリガンド（配列番号１０）のヌクレオチド４７８−４９７、およびヌクレオチド８５８−８７８の相補体に相当する。ヒト上皮細胞系ＫＢ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７）を用いた一つの反応から増幅されたおおよそ４００ｂｐ長のバンドをゲル精製し、そのヌクレオチド配列を決定した；配列は、ネズミＲＡＮＫリガンドの相当する領域と８５％の同一性を示し、フラグメントがヒトＲＡＮＫＬからのものであることが確認された。
【０１０１】
全長のヒトＲＡＮＫＬ  ｃＤＮＡを得るために、ＫＢ  ＰＣＲ生成ヌクレオチド配列から誘導された２つのヒトＲＡＮＫＬ−特異的オリゴヌクレオチドを放射標識し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、実質上、合衆国特許第５，５９９，９０５号（１９９７年２月４日発行）に記載の方法に従って、λｇｔ１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内に調製されたヒトＰＢＬ  ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。いくつかの正のハイブリダイズプラークを同定し、そして精製し、それらの挿入物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）内にサブクローン化し、それらのヌクレオチド配列を決定した。一つの単離株ＰＢＬ３は、予想されるヒトＲＡＮＫＬの大部分をコードすることが分かったが、５’コード領域のおおよそ２００ｂｐを失っているらしかった。第二の単離株ＰＢＬ５は、全５’末端および５’非翻訳配列のさらなる２００ｂｐを含む、予想されるヒトＲＡＮＫＬの多くの部分をコードすることが分かった。
【０１０２】
ＰＢＬ５の５’末端およびＰＢＬ３の３’末端を連結して、ヒトＲＡＮＫＬをコードする全長のｃＤＮＡを形成させた。全長のヒトＲＡＮＫリガンドのヌクレオチドおよび予想されるアミノ酸配列を、配列番号１２に示す。ヒトＲＡＮＫリガンドは、ネズミのＲＡＮＫリガンドと８３％のヌクレオチド同一性および８４％のアミノ酸同一性を持つ。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：ｈｕＲＡＮＫ−Ｌ（大腸菌ＤＨ１０Ｂ中）と名付けられたヒトＲＡＮＫＬ配列を含むプラスミドベクターは、ブダペスト条約の条件下、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ（ＡＴＣＣ）に１９９７年３月１１日に寄託された（寄託番号９８３５４）。
【０１０３】
ネズミおよびヒトのＲＡＮＫＬは、２型のトランスメンブランタンパク質である。ネズミＲＡＮＫＬは、予想される４８アミノ酸からなる細胞内ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび２４７の細胞外ドメインを含む。ヒトＲＡＮＫＬは、予想される４７アミノ酸からなる細胞内ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび２４９アミノ酸の細胞外ドメインを含む。
【０１０４】
実施例９
本実施例は、ＰＣＲに基づくマッピングストラテジーを用いたヒトＲＡＮＫの染色体マッピングについて説明している。最初のヒト染色体アサインメントは、ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬ−特異的ＰＣＲプライマーならびにＢＩＯＳ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）からのＢＩＯＳ体細胞ハイブリッドＰＣＲ可能ＤＮＡキット（BIOS Somatic Cell Hybrid PCRable DNA kit）を、製造者らの指示書に従って、用いて作成した。ＲＡＮＫはヒト染色体１８にマッピングされ；ＲＡＮＫリガンドはヒト染色体１３にマッピングされた。さらなる詳細なマッピングを、放射線ハイブリッドマッピングパネル、Ｇｅｎｅｂｒｉｄｇｅ  ４  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐａｎｅｌ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ；Ｗａｌｔｅｒ，ＭＡら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，２２−２８、１９９４に記載されている）を用いて、行った。次に、この分析からのデータを、ＭＩＴ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｍａｐｐｅｒ（ＵＲＬ；http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl）に、それらの内に含まれる指示に従って、電子提出した。この分析から、特定の遺伝子マーカー名が得られ、それをＮＣＢＩ  Ｅｎｔｒｅｚ  ｂｒｏｗｓｅｒ（ＵＲＬ：http://www3.ncbi,nlm.nih.gov/htbin-post/Entrez/query?db=c&form=0）に電子提出して、具体的な地図上の位置が決定された。ＲＡＮＫは、染色体１８ｑ２２．１にマッピングされ、そしてＲＡＮＫＬは染色体１３ｑ１４にマッピングされた。
【０１０５】
実施例１０
本実施例は、ＲＡＮＫＬに対するモノクローナル抗体の調製について説明している。例えば、精製された組換えＲＡＮＫＬの調製、またはＲＡＮＫＬを高レベル発現する穿刺細胞（transfixed cell）、を用い、合衆国特許第４，４１１，９９３号に開示された技術
のような慣用の技術を用いてＲＡＮＫＬに対するモノクローナル抗体を作成する。また、ＲＡＮＫＬをコードするＤＮＡを、例えばＰａｒｄｏｌｌおよびＢｅｃｋｅｒｌｅｇ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：１６５，１９９５に論評されている方法に従って、免疫原として用いることもできる。そのような抗体は、ＲＡＮＫＬシグナル化の妨害（アンタゴニスト抗体またはブロッキング抗体）のため、ＲＡＮＫＬまたはＲＡＮＫＬ活性についての診断用または研究アッセイの成分として、またはＲＡＮＫＬのアフィニティー精製に有用である。
【０１０６】
齧歯類を免疫化するために、ＲＡＮＫＬ免疫原を、［完全または不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、またはＲｉｂｉアジュバントＲ７００（Ｒｉｂｉ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）のようなそれ以外のアジュバンドのような］アジュバントで乳化し、そして選択された齧歯類、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスまたはＬｅｗｉｓラットに、１０−１００μｇの範囲の量を、皮下注射する。ＤＮＡを皮内（Ｒａｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１．９５１９、１９９４）または筋肉内（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４１５６、１９９３）に投与することもでき；食塩水は、ＤＮＡを基本とした抗原の適当な希釈剤であることが分かった。１０日から３週間後、免疫化された動物をさらなる免疫原で追加免役し、その後、毎週、隔週または３週毎の免疫化スケジュールで周期的に追加免役する。
【０１０７】
血清サンプルを、ドット−ブロットアッセイ（抗体サンドイッチ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）、免疫沈降、またはＦＡＣＳ分析を含むその他の適当なアッセイによる試験のために、眼窩後部採血または尾先端切除により定期的に採取する。適当な抗体力価を検出した後、陽性動物に食塩水中の抗原を静脈内注射で投与する。３ー４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を収集し、そしてネズミのミエローマ細胞系［例えば、ＮＳ１または好ましくはＡｇ８．６５３（ＡＣＣ  ＣＲＬ１５８０）］と融合させる。この方法によって作り出されたハイブリドーマ細胞系を選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地、またはＨＡＴ）を含む複数のミクロタイタープレート内に塗布して、非融合細胞、ミエローマ−ミエローマハイブリッドおよび脾臓細胞−脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１０８】
このようにして作り出されたハイブリドーマクローンを、ＲＡＮＫとの反応性に関してＥＬＩＳＡによって、例えばＥｎｇｖａｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．，８，８７１、１９７１および合衆国特許第４，７０３，００４号に開示された技術を適用することによって、スクリーニングすることができる。好ましいスクリーング技術は、Ｂｅｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４，４２１２（１９９０）に記載された抗体捕獲技術である。次いで、陽性のクローンを同系の齧歯類の腹膜腔内に注射すると、高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗−ＲＡＮＫモノクローナル抗体を含む腹水が生成される。得られたモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、次いでゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。代わりに、ＲＡＮＫＬタンパク質への結合を基本にしたアフィニティークロマトグラフィーを用い、あるいはプロテインＡまたはプロテインＧへの抗体の結合を基本としたアフィニティークロマトグラフィーを用いることもできる。ｍＡＢｓの活性をモニターするためにここの記載された方法を用いて、ブロッキング（即ちＲＡＮＫＬと結合してＲＡＮＫへの結合を阻害する抗体）および非ブロッキング（即ちＲＡＮＫＬと結合するがＲＡＮＫとの結合を阻害しない抗体）の両抗体を単離する。
【０１０９】
実施例１１
本実施例は、ＲＡＮＫ発現をアップレギュレートすることができることについて説明している。ヒトの末梢血液Ｔ細胞は、フローサイトメトリーソーティングによって、または抗体コートビーズを用いた負の選択によって精製することができ、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）およびその他の市販されているサイトカイン（ＩＬ１−α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α）を含む、様々なサイトカインの存在下または不在下で、抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３、Ｄａｋｏ）コートプレートまたはフィトヘマグルチニンで活性化した。以下の表に示すように、ＲＡＮＫの発現を、マウスのモノクローナル抗体ｍＡｂ１４４（実施例３に記載の方法によって調製された）を用いて、２−８日間の時間経過実験でＦＡＣＳによって評価した。結果を抗−ＲＡＮＫでの染色強度の相対的増加に応じて、＋から＋＋＋＋で表した。また、抗−ＲＡＮＫ及び抗−ＣＤ８または抗−ＣＤ４抗体の両方を用いた二重標識実験も行った。
【０１１０】
【表１】
2008113656.tif 000002
【０１１１】
試験されたサイトカインの内、ＩＬ−４およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８＋細胞毒性およびＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方で４から８日間ＲＡＮＫ発現のレベルを上昇させた。ＩＬ
−４とＴＧＦ−βの組み合わせは、相乗的に作用し、活性化されたＴ細胞上のこのレセプターの発現をアップレギュレートした。サイトカインのこの特定の組み合わせは、サプレッサーＴ細胞によって分泌されるので、寛容の生成に重要であると考えられ（ＭｉｔｃｈｉｓｏｎおよびＳｉｅｐｅｒ、Ｚ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，５４，１４１、１９９５に論評されている）、寛容または活性免疫応答誘導のいずれかに対する免疫応答の調節にＲＡＮＫが相互作用していることを示している。
【０１１２】
実施例１２
本実施例は、活性化されたＴ細胞の増殖へのＲＡＮＫ．ＦｃおよびｈＲＡＮＫＬの影響について説明している。抗−ＣＤ３活性化ヒト末梢血液Ｔリンパ球にＴＧＦβを加えると、増殖停止、そして結果的に培養のはじめ数日以内に大部分のリンパ球の死を誘導する。我々は、ＲＡＮＫ．Ｆｃまたは可溶性ヒトＲＡＮＫＬをＴ細胞培養に加えることによって、ＴＧＦβ−処理Ｔ細胞へのＲＡＮＫ：ＲＡＮＫＬ相互作用の影響について試験した。
【０１１３】
ヒト末梢血液Ｔ細胞（７ｘ１０５ＰＢＴ）を、抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３、５μｇ／ｍｌ）および抗−Ｆｌａｇ（Ｍ１、５μｇ／ｍｌ）でコートした２４穴プレート上、ＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）存在下、組換えＦＬＡＧ−タグ付け可溶性ｈＲＡＮＫＬ（１μｇ／ｍｌ）またはＲＡＮＫ．Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ）を加えて、または加えずに、６日間培養した。トリパンブルー染色を３回行うことによって、生存可能なＴ細胞回収率を測定した。
【０１１４】
ＲＡＮＫ．Ｆｃを添加すると、６日後に回収された生存可能なＴ細胞の数が有意に減少したが、これに対して可溶性ＲＡＮＫＬは、生存可能なＴ細胞の回収を著しく増加させた（図１）。このように、内因性または外因性のＲＡＮＫＬは、ＴＧＦβの存在下で生成された生存可能なＴ細胞数を増加する。ＴＧＦβは、ＩＬ−４と共に、ＴＨ３／調節Ｔ細胞サブセットによって分泌された場合、免疫応答調節にかかわる。これらのＴ細胞は、エフェクターＴ細胞のバイスタンダー（bystander）抑制を仲介すると考えられる。従って、ＲＡＮＫおよびそのリガンドは、自己／パラ分泌様式で作用し、Ｔ細胞寛容に影響を与えることができる。さらに、ＴＧＦβは、ある病原性または日和見感染生物によって影響を受ける免疫システムの回避に役割を演ずることが知られている。寛容の発達に役割を果たすことに加えて、ＲＡＮＫは、また、病原体による免疫システムの回避にも役割を果たす可能性がある。
【０１１５】
実施例１３
本実施例は、ＣＤ１ａ＋樹状突起細胞（ＤＣ）上でのＲＡＮＫの相互作用の影響について説明している。機能的に成熟した樹状突起細胞（ＤＣ）を、ＣＤ３４＋骨髄（ＢＭ）始原細胞からインビトロで生成した。簡単に言えば、正常な健康なボランティアからのヒトＢＭ細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ培地を用いて濃度分画し、ＣＤ３４＋ＢＭ細胞を抗−ＣＤ３４マトリックスカラム（Ｃｅｐｒａｔｅ，ＣｅｌｌＰｒｏ）を用いてイムノアフィニティーで単離した。次いで、ＣＤ３４＋ＢＭ細胞を、１０％のウシ胎児血清を補充したＳｕｐｅｒ  ＭｃＣｏｙの培地中のヒトＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍｌ）、ヒトＣＨＯ−誘導Ｆｌｔ３Ｌ（ＦＬ：１００ｎｇ／ｍｌ）中で、充分に湿気を与えた３７℃のインキュベーター中（５％ＣＯ２）で１４日間、培養した。次いで、ＣＤ１ａ+、ＨＬＡ−ＤＲ+ＤＣを、ＦＡＣＳｔａｒ  ＰｌｕｓＴＭを用いて選別し、そしてＲＡＮＫの生物学的評価に用いた。
【０１１６】
ＣＤ３４＋骨髄細胞から誘導されたヒトのＣＤ１ａ＋ ＤＣ上では、フローサイトメト
リー分析による評価では、ＣＤ１ａ＋ＤＣのサブセット（２０−３０％）のみが細胞表面にＲＡＮＫを発現した。しかしながら、ＤＣ培地へのＣＤ４０Ｌの付加は、結果として大部分のＣＤ１ａ＋  ＤＣ上でＲＡＮＫを表面に発現した。ＤＣ４０Ｌは、インビトロでの
クラスター形成を強化し、ＤＣの形態変化を誘導し、そしてＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートすることによってＤＣを活性化することが分かった。
【０１１７】
ＤＣ培地にＲＡＮＫＬを加えると、ＤＣ４０Ｌで認められた影響（図２）と同様に、対照培地以上にＤＣ凝集およびクラスター形成の程度が有意に増加した。選別されたヒトＣＤ１ａ＋  ＤＣを、サイトカイン混液（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αおよびＦＬ）（左上方パネル）中、混液＋ＣＤ４０Ｌ（１μｇ／ｍｌ）（右上方）中、混液＋ＲＡＮＫＬ（１μｇ／ｍｌ）（左下方）中、または混液＋熱不活性化（ΔＨ）ＲＡＮＫＬ（１μｇ／ｍｌ）（右下方）中、１ｍｌ培養液を含む２４穴の平底培養プレート中で、４８−７２時間培養し、次いで、反転顕微鏡を用いて写真撮影した。熱不活性化ＲＡＮＫＬを用いた場合、対照培地以上のＤＣ凝集およびクラスター形成の増加は、明らかではなく、この影響は、生物学的に活性なタンパク質に依存することが示された。しかしながら、粘着分子発現の最初の表現型分析は、ＲＡＮＫＬ−誘導クラスター化が、ＣＤ２、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５４またはＣＤ５８のレベルの増加によるものではないことを、示した。
【０１１８】
ＲＡＮＫＬをＣＤ１ａ＋  ＤＣに加えると、ＣＤ４０Ｌ−培養ＤＣと比較して、混合リンパ球反応物中（mixed lymphocyte reaction）（ＭＬＲ）では少なくとも３−１０倍に
、それらの同種刺激能力を強化した（図３）。０．２ｍｌの培養液を含む９６穴の丸底培養プレート中で、図２で上に示したように培養した様々な数の照射（２０００ｒａｄ）ＤＣと共に、４日間、同種異系のＴ細胞（１ｘ１０５  ）をインキュベートした。培養物を、８時間、０．５ｍＣｉ［３  Ｈ］−チミジンでパルス標識し、そして、気相βカウンターで計測するために、細胞をグラス繊維シート上に集めた。単独で培養されたＴ細胞またはＤＣのいずれかのみのバックグラウンド計数は、＜１００ｃｐｍであった。値は、３回の培養の平均値±ＳＤで表している。熱不活性化ＲＡＮＫＬは効果がなかった。ＤＣ同種刺激活性は、ＲＡＮＫＬおよびＣＤ４０Ｌを組み合わせて使用しても、それ以上は強化されず、これはおそらく、ＤＣの作用能力がいずれかのサイトカイン単独で最高レベルに到達したためであろう。ＲＡＮＫＬのみならずＣＤ４０Ｌも、３日の培養期間に、インビトロでのＤＣの増殖を強化しなかった。ＣＤ４０Ｌとは異なり、ＲＡＮＫＬは、ＨＬＡ−ＤＲの発現レベルも、またＣＤ８０あるいはＣＤ８６の発現のレベルも、有意には増加しなかった。
【０１１９】
ＲＡＮＫＬは、細胞粘着性（ＣＤ１８、ＣＤ５４）、抗原提示（ＨＬＡ−ＤＲ）または共刺激（ＣＤ８６）に含まれる既知の分子を修飾することなくＤＣクラスター形成および作用能力を強化することができるが、それらの分子のすべては、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌシグナル化によって制御される。これらの分子の発現への影響の欠如は、ＲＡＮＫＬがＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌとは別の代わりの経路を通して、ＤＣ機能を制御するらしいことを示唆している。ＣＤ４０Ｌがインビトロで生成されたＤＣ上のＲＡＮＫ表面発現を調節し、そしてＤＣ−Ｔ細胞が相互作用している間、ＣＤ４０Ｌが活性化Ｔ細胞上でアップレギュレートされることから、ＲＡＮＫおよびそのリガンドは、ＤＣの仲介によってＴ細胞が膨張する間に誘導される活性化カスケードの重要な部分を形成すると考えられる。さらに、ＲＡＮＫＬ中でＤＣを培養すると、その結果、ＣＤ１ｂ／ｃ発現レベルが減少し、ＣＤ８３レベルが上昇する。これらの分子は両方とも、ＤＣが成熟する間、ＣＤ４０Ｌによって同じ様に修飾され（Ｃａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，１２６３、１９９４）、ＲＡＮＫＬがＤＣの成熟を誘導することが示唆される。
【０１２０】
樹状突起細胞は、「専門的」抗原提示細胞と呼ばれ、ＭＨＣ制限Ｔ細胞の感作に高い能力を持つ。腫瘍または感染症ワクチンアジュバントとしてエキソビボで樹状突起細胞を用いることに興味が増している（例えば、Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０，８３、１９９４を参照のこと）。それ故、ＤＣの成熟を誘導し、免疫応答を刺激する樹状突起細胞の能力を強化するＲＡＮＫＬのような抗原は、様々な疾病の免疫療法に有用であろう。
【０１２１】
実施例１４
本実施例は、ｍｕＲＡＮＫと名付けられた、ネズミＲＡＮＫの同族体の単離について説明している。ｍｕＲＡＮＫを、交差種ＰＣＲおよびコロニーハイブリダイゼーションの組み合わせによって単離した。ＴＮＦＲスーパーファミリー構成タンパク質の細胞外ドメインのＣｙｓに富むシュードリピート内でのＣｙｓ残基の保存を利用して、ヒトＲＡＮＫに基づくＰＣＲプライマーを設計して、様々な種からのネズミの第一鎖ｃＤＮＡに対して用いた。センス上流プライマーおよびアンチセンス下流プライマーは両方とも、Ｃｙｓ残基内にそれらの３’末端終止を持つように設計された。
【０１２２】
上流センスプライマーは、配列番号５のヌクレオチド２７２−２９５（アミノ酸７９−８６をコードする領域）をコードし；下流アンチセンスプライマーは、ヌクレオチド４０９−４２７（アミノ酸１２４−１３０をコードする領域）の相補体をコードする。これらのプライマーおよび様々なネズミの細胞系あるいは組織原からの第一鎖ｃＤＮＡを用いて、標準ＰＣＲ反応を計画し実施した。９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、そして７２℃で２０秒の３０回の反応を行った。ＰＣＲ生成物を電気泳動によって分析し、特異的バンドがいくつかのサンプルで認められた。一つのサンプルからのバンドをゲル精製し、ＤＮＡシークエンシングにより、プライマー間の配列は相当するヒトＲＡＮＫヌクレオチド配列とおおよそ８５％同一であることが分かった。
【０１２３】
ネズミ胎児肝臓上皮細胞系ＦＬＥ１８（上のＰＣＲスクリーニングで陽性と同定された細胞系の一つ）から調製されたプラスミドに基づくｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ生成物のシークエンシングから決定されたネズミのＲＡＮＫ配列から誘導されたネズミＲＡＮＫ−特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて、全長のＲＡＮＫ  ｃＤＮＡをスクリーニングした。一つは（全長のヒトＲＡＮＫとの配列比較に基づいて）全長のネズミＲＡＮＫの５’末端をコードし、もう一つは３’末端をコードする、２つのｃＤＮＡを再結合して全長のネズミＲＡＮＫ  ｃＤＮＡを作り出した。ｍｕＲＡＮＫのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号１４および１５に示す。
【０１２４】
このｃＤＮＡは、予想される３０アミノ酸からなるシグナル配列、１８４のアミノ酸細胞外ドメイン、２１アミノ酸のトランスメンブランドメインおよび３９０アミノ酸の細胞質尾部を持つ、１型トランスメンブランタンパク質と予想される６２５アミノ酸残基をコードする。ｍｕＲＡＮＫの細胞外領域は、ｈｕＲＡＮＫと有意のアミノ酸相同性（６９．７％の同一性、８０．８％の類似性）を示す。当業者らは、正確な切断部位がコンピューターで予想されたそれとは異る可能性があり、従って、ＲＡＮＫのＮ−末端はアミノ酸２５からアミノ酸３５の間にあることを認識するであろう。
【０１２５】
ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのその他の構成員は、トランスメンブランドメインとリガンド結合ドメインとの間に、「スペーサー」領域と呼ばれるリガンド結合に必要ではないアミノ酸領域を持つ。ｍｕＲＡＮＫでは、１９７と２１４の間のアミノ酸がそのようなスペーサー領域を形成すると予想される。従って、この領域のアミノ酸で終結している可溶型ＲＡＮＫは、特異的様式でＲＡＮＫのリガンドと結合する能力を残していると予想される。可溶型ＲＡＮＫペプチドの好ましいＣ−末端アミノ酸は、配列番号１４のアミノ酸２１４および１９７からなる群より選択されるが、しかしスペーサー領域のその他のアミノ酸もＣ−末端として利用することができる。
【０１２６】
実施例１５
本実施例は、様々な異なる可溶型ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬの調製について説明してい
る。制限酵素による切断および連結の標準技術を、慣用の制限部位の存在しないフラグメントのＰＣＲに基づく単離と組み合わせて、用いた。ＰＣＲを用いた場合、ＰＣＲ生成物を配列決定して、任意の変異が導入されていないかについて確認したが；そのような変異は、全く認められなかった。
【０１２７】
実施例２に記載したｈｕＲＡＮＫ／Ｆｃに加えて、もう一つのＲＡＮＫ／Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号６のアミノ酸１−２１３をコードするＤＮＡを、前述のＦｃムテイン（配列番号８）のアミノ酸３−２３２をコードするＤＮＡに連結することによって、調製された。全長のネズミＲＡＮＫ（配列番号１５）のアミノ酸１−２１３をコードするＤＮＡを、Ｆｃムテイン（配列番号８）のアミノ酸３−２３２をコードするＤＮＡに連結して、ネズミＲＡＮＫについても類似の構築物を調製した。
【０１２８】
ｈｕＲＡＮＫＬの可溶型タグ付ポリーＨｉｓ体（version）は、イムノグロブリンκ鎖
（配列番号１６）からのリーダーペプチドをコードするＤＮＡを、ＦＬＡＧＴＭタグ（配列番号１７）の短い変形をコードするＤＮＡに、次にＧｌｙＳｅｒをコードするコドン、その後ポリ−Ｈｉｓタグ（配列番号１８）、次いでＧｌｙＴｈｒＳｅｒをコードするコドン、そして配列番号１３のアミノ酸１３８−３１７をコードするＤＮＡに連結することによって、調製された。ネズミＲＡＮＫＬの可溶性ポリ−Ｈｉｓタグ変形は、ＣＭＶリーダー（配列番号９）をコードするＤＮＡを、ＡｒｇＴｈｒＳｅｒをコードするコドンに、次いでポリ−Ｈｉｓ（配列番号１８）をコードするＤＮＡ、次いで配列番号１１のアミノ酸１１９−２９４をコードするＤＮＡに連結することによって、調製された。
【０１２９】
可溶性オリゴマー型のｈｕＲＡＮＫＬは、ＣＭＶリーダー（配列番号９）をコードするＤＮＡを、Ａｓｐをコードするコドンに、次いでトリマー型「ロイシン」ジッパー（配列番号１９）をコードするＤＮＡ、その後ＴｈｒＡｒｇＳｅｒをコードするコドン、次いで配列番号１３のアミノ酸１３８−３１７に連結することによって、調製された。
【０１３０】
これらおよびその他の構築物は日常の実験で調製される。次いで、これらの様々なＤＮＡを適当な発現ベクター内に挿入し、発現させる。特に好ましい発現ベクターは、哺乳動物細胞に用いることのできるそれらである。例えば、ここに記載されたｐＤＣ４０９およびｐＤＣ３０４は、一過性の発現に有用である。安定なトランスフェクションのためには、ＣＨＯ細胞の使用が好ましいく；いくつかの有用なベクターは、ＵＳＳＮ０８／７８５，１５０に記載されており、そこで検討された２Ａ５−３λ−誘導発現ベクターの一つを例示することができる。
【０１３１】
実施例１６
本実施例は、ＲＡＮＫＬ発現をネズミのＴ細胞上でアップレギュレートできることを示している。細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの腸間膜リンパ節から得、そして、実質上ここに記載されているように、抗−ＣＤ３コートプレート、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）またはホルボールミリステートアセテートを、イオノマイシン（抗−ＣＤ３：５００Ａ２、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ；ＣｏｎＡ，ＰＭＡ，イオノマイシン、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と組み合わせて活性化し、そして約２−５日間培養した。ＲＡＮＫＬの発現を、ここに記載された方法に従って調製された、Ｔ細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ４５ＲＢ、ならびにＲＡＮＫ／Ｆｃに対する抗体を用いて、ＦＡＣＳによる三色分析で評価した。
【０１３２】
ＲＡＮＫＬは、刺激されていないマウスのＴ細胞上では、発現されなかった。抗−ＣＤ３、ＣｏｎＡまたはＰＭＡ／イオノマイシンのいずれかで刺激されたＲ細胞は、ＲＡＮＫＬを差別的に発現した：ＣＤ４＋  ／ＣＤ４５ＲＢＬｏおよびＣＤ４＋  ／ＣＤ４５ＲＢＨｉ細胞は、ＲＡＮＫＬ陽性であるが、ＣＤ８＋細胞はそうではなかった。ＲＡＮＫＬは
、ヒト細胞で認められた結果と同様に、Ｂ細胞上では認められなかった。
【０１３３】
実施例１７
本実施例は、細胞増殖および活性化へのネズミのＲＡＮＫＬの影響について説明している。免疫応答に役割を果たす細胞を代表する様々な細胞または細胞系（ネズミ脾臓、胸腺およびリンパ節）を、ＲＡＮＫＬの存在または非存在下で、それらの生命力を促進する条件下でそれらを培養することによって、評価した。ＲＡＮＫＬは、試験したいずれの細胞の増殖も刺激しなかった。一つの細胞系である、ＲＡＷ２６４．７と呼ばれるマクロファージ細胞系（ＡＴＣＣ寄託番号ＴＩＢ７１）は、活性化のいくらかのサインを示した。
【０１３４】
ＲＡＷ細胞は、少量のＴＮＦ−αを本質的に生成する。ヒトまたはネズミのいずれかのＲＡＮＫＬを含むインキュベーションは、投与量依存様式で、これらの細胞によるＴＮＦ−αの生成を強化した。ＲＡＮＫＬを１０分間煮沸すると、ＴＮＦ−αは生成されなくなるが、これに対して精製されたエンドトキシン（ＬＰＳ）を同様に処理しても、ＬＰＳのＴＮＦ−αの生成刺激能力は影響されなかったことから、この結果は、ＲＡＮＫＬ調製物へのエンドトキシンの混入によるものではなかった。ＲＡＮＫＬがＴＮＦ−αの生成に関するマクロファージ細胞系ＲＡＷ  Ｔ６４．７を活性化するという事実にもかかわらず、ヒトＲＡＮＫＬも、またネズミＲＡＮＫＬも、これら細胞による硝酸酸化物の生成を刺激しなかった。
【０１３５】
実施例１８
本実施例は、胎児マウス内の胸腺の成長および発達へのネズミＲＡＮＫＬの影響について説明している。妊娠マウスに、１ｍｇのＲＡＮＫ／Ｆｃまたはベヒクル対照タンパク質（ネズミ血清アルブミン；ＭＳＡ）を、妊娠１３日、１６日および１９日に注射した。誕生後、新生児に、ＲＡＮＫ／Ｆｃを、毎日投与量１μｇから始めて、４日毎に投与量を倍増しながら、最終的に４μｇの投与量を腹腔内投与し続けた。新生児は生後１日、８日および１５日で捕らえ、それらの胸腺および脾臓を収集し、その大きさ、細胞充実性および表現型組成について試験した。
【０１３６】
ＲＡＮＫ／Ｆｃを注射した雌に産まれた新生児では、１日で胸腺サイズにわずかな減少が認められた；同様のサイズの減少は、対照の新生児では認められなかった。８日では、胸腺サイズおよび細胞充実性は、ＭＳＡ処理マウスと比較して、ＲＡＮＫ／Ｆｃ処理動物では約５０％減少した。表現型分析では、胸腺内の異なるＴ細胞集団の相対割合が対照マウスとＲＡＮＫ／Ｆｃマウスでは同じであることが証明され、このことから、細胞充実性の減少は、特定の集団での減少ではなく、胸腺のＴ細胞数の全体的な抑制によることを示唆している。ＲＡＮＫ／Ｆｃで処理した生後１５日の新生児は、胸腺細胞のサイズ、細胞充実性、表現型のいずれに関しても、対照新生児と有意な差はなかった。評価したいずれの時点でも、脾臓の大きさ、細胞充実性または組成に、有意な差異は認められなかった。生後１５日ではなく８日で細胞充実性に差異が認められたことは、ＲＡＮＫ／Ｆｃが胸腺発達の早期にその影響を示しうることが、示唆される。
【０１３７】
実施例１９
本実施例は、ＲＡＮＫの細胞質ドメインのＣ−末端領域が異なる様々なＴＲＡＦタンパク質の結合に重要であることを示している。ＲＡＮＫは、ＴＲＡＦドッキング部位と考えられる少なくとも２つの認識可能なＰＸＱＸ（Ｘ）Ｔモチーフを含んでいる。従って、ＴＲＡＦ結合に関するＲＡＮＫの細胞質ドメインの様々な領域の重要性を評価した。ＲＡＮＫ／ＧＳＴ融合タンパク質を、実質上、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ、Ｇｅｎｅ，６７，３１、１９８８に記載の方法に従って調製し、以下に記載した、様々な先端切除型の調製に用いた。
【０１３８】
ネズミおよびヒトのＲＡＮＫのヌクレオチド配列の比較から、ＴＲＡＦ結合に重要でありうるいくつかの保存領域があることが示された。従って、ＰＣＲに基づく技術を発展させて、保存領域を残しているであろう様々なＣ−末端先端切除型の調製を行った。終止コドンおよび制限酵素部位を選択された場所に導入するように、ＰＣＲプライマーを設計して、以下の表１に記載した先端切除型を得た。シークエンシングにより、非所望の変異が構築物内に導入されていないことを、確認した。
【０１３９】
放射能標識した（３５Ｓ−Ｍｅｔ、Ｃｙｓ）ＴＲＡＦタンパク質を、市販の網状赤血球溶解キットを製造者ら（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示に従って用いて、インビトロでの翻訳により調製した。先端切除型ＧＳＴ融合タンパク質を、実質上、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（上記）に記載の方法に従って精製した。簡単に言えば、大腸菌を融合タンパク質をコードする発現ベクターでトランスフェクトし、タンパク質の発現を誘導した。細菌を溶解し、不溶物質を除去し、そして融合タンパク質をグルタチオン−コートビーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、Ｐｈａｒｍａｓｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ  Ｓｗｅｄｅｎ）で沈殿させることにより、単離した。
【０１４０】
ビーズを洗浄し、様々な放射能標識したＴＲＡＦタンパク質と共にインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄段階の後、融合タンパク質／ＴＲＡＦ複合体を、０．１％ＳＤＳ＋β−メルカプトエタノール中で煮沸することにより、ビーズから除去し、そして１２％ＳＤＳゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に負荷した。ゲルをオートラジオグラフィーにかけ、放射能標識した物質の存在または不在を記録した。結果を以下の表２に示す。
【０１４１】
【表２】
2008113656.tif 000003
【０１４２】
これらの結果は、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５およびＴＲＡＦ６が、ＲＡＮＫ細胞質ドメインの最も遠位の部分（アミノ酸Ｇ５４４およびＡ６１６）と結合することを示している。また、ＴＲＡＦ６は、Ｓ３３９とＹ４２１の間にも結合部位を持つ。この実験では、ＴＲＡＦ５もまた、ＲＡＮＫの細胞質ドメインと結合した。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】図１は、活性化Ｔ細胞の増殖へのＲＡＮＫ-ＦｃおよびｈＲＡＮＫＬの影響について示している。ヒト末梢血液Ｔ細胞を実施例１２に記載の方法に従って培養し；生きたＴ細胞の回収率をトリパンブルー計数を３回行うことによって測定した。
【図２】図２は、ヒトのＤＣクラスター形成を誘導するＲＡＮＫＬの能力について、示している。機能的に成熟した樹状突起細胞（dendritic cells）（ＤＣ）をインビトロでＣＤ３４＋ 骨髄（ＢＭ）始原細胞から生成させ、実施例１３記載の方法に従って培養した。ＣＤ１ａ＋ＤＣを、サイトカイン混液単独（図２Ａ）中、混液＋ＣＤ４０Ｌ（図２Ｂ）、ＲＡＮＫＬ（図２Ｃ）または加熱不活性化（ΔＨ）ＲＡＮＫＬ（図２Ｄ）中で培養し、次いで、反転顕微鏡を用いて写真撮影した。
【図３】図３は、ＲＡＮＫＬがＤＣの同種刺激能力（allo-stimulatory capacity）を強化することについて、示している。同種（allogenic）Ｔ細胞を、実施例１３記載の方法に従って培養された様々な数の照射ＤＣと共にインキュベートした。培地は、［３Ｈ］−チミジンでパルス標識し、細胞を計数用ガラス繊維シート上に集めた。値は、３回の培養の平均±標準偏差（ＳＤ）を表している。
【図４】図４は、ヒトＲＡＮＫとその他のＴＮＦＲファミリー構成員の、構造的に保存された細胞外のシステインに富むシュードリピート領域内のアライメントを、示している。予想されるジスルフィド結合（ＤＳ１−ＤＳ３）を示す。ＲＡＮＫおよびＣＤ４０は、第二のシュードリピート中のＤＳ２をなくすような同一のアミノ酸置換（Ｃ＾Ｈ、Ｃ＾Ｇ）を含む。
【図５−１】図５は、ヒトのＲＡＮＫＬとその他のＴＮＦファミリー構成員とのアライメントを示している。
【図５−２】図５は、ヒトのＲＡＮＫＬとその他のＴＮＦファミリー構成員とのアライメントを示している。
【図１】
2008113656.tif 000004
【図２】
2008113656.tif 000005
【図３】
2008113656.tif 000006
【図４】
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【図５−１】
2008113656.tif 000008
【図５−２】
2008113656.tif 000009
【配列表】
2008113656000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月25日(2007.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）  配列番号６のアミノ酸配列の一部を含んでなるタンパク質であって、配列番号６のアミノ酸１ないし３３のいずれか１つから選択されるアミノ末端、およびアミノ酸１９６ないし２１３のいずれか１つから選択されるカルボキシ末端を有する、タンパク質；
（ｂ）  （ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の欠失、挿入または置換を含むアミノ酸配列を含んでなるタンパク質であって、該タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸６９−３１７または配列番号１１のアミノ酸４８−２９４からなるＲＡＮＫＬポリペプチドに結合可能である、前記タンパク質；および、
（ｃ）  ５０℃、５×ＳＳＣの条件下で配列番号５に示されるヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡにハイブリダイズ可能なＤＮＡによってコードされるタンパク質であって、該タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸６９−３１７または配列番号１１のアミノ酸４８−２９４からなるＲＡＮＫＬポリペプチドに結合可能である、前記タンパク質；
からなる群より選択される可溶性ＲＡＮＫポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項２】
ＮＦ−κＢの活性化を阻害する方法に使用するための、請求項１に記載の医薬組成物であって、ここで、該方法は当該医薬組成物を配列番号６のアミノ酸３３−６１６を含んでなるＲＡＮＫタンパク質を発現する細胞と接触させることを含む、前記医薬組成物。
【請求項３】
免疫応答を調節するための、請求項１に記載の医薬組成物。