(57)【要約】【課題】ビタミンＢ2生産性が向上した納豆菌を育種開発し、その納豆菌を用いて納豆を生産することにより、ビタミンＢ2含有量が向上した納豆を生産する方法、及び該納豆を提供すること。【解決手段】納豆菌にヒスチジンアナログ耐性、または、ヒスチジン要求性を付与した後、ビタミンＢ2の生産性が向上した納豆菌を選択することにより、ビタミンＢ2含有量の高い納豆を製造可能な納豆菌を取得することができ、さらに該納豆菌を用いて納豆を製造することによるビタミンＢ2含有量が向上した納豆を製造する方法、及び該製造方法によって製造された納豆を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジンアナログ耐性を有し、且つビタミンＢ2を高生産することを特徴とするバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
【請求項２】
ヒスチジンアナログが２−メチルヒスチジン、２−チアゾールアラニン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールから選ばれる少なくともひとつであることを特徴とする請求項１に記載の納豆菌。
【請求項３】
ヒスチジン要求性を有し、且つビタミンＢ2を高生産することを特徴とするバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
【請求項４】
ビタミンＢ2を高生産する納豆菌が５０ｇ納豆あたりビタミンＢ2を０．２ｍｇ以上、好ましくは０．２１〜１．０５ｍｇ、更に好ましくは０．４〜１．０５ｍｇ、そのうえ更に好ましくは０．６〜１．０５ｍｇ含有するビタミンＢ2高含有納豆を生産する納豆菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の納豆菌。
【請求項５】
納豆菌が、バチルス・サチリス  ＡＴ−７５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴ−７５）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７４）、あるいは、バチルス・サチリス  Ｈ−５０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｈ−５０）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７５）であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の納豆菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の納豆菌を用いることを特徴とするビタミンＢ2高含有納豆の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とするビタミンＢ2高含有納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌及び該納豆菌を用いて製造された新規納豆に関し、さらに詳細には、ヒスチジンアナログ耐性を有し、及び／又はヒスチジン要求性を有し、ビタミンＢ2を高生産する納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造されたビタミンＢ2高含有納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビタミンＢ2（リボフラビンと称する場合もある）は多種の微生物、植物で生合成される水溶性ビタミンの一種である。
【０００３】
ヒトをはじめとする脊椎動物はビタミンＢ2を生合成することが出来ない。そのため、ヒトにとってビタミンＢ2は必須栄養素の一つであり、ビタミンＢ2の欠乏は口腔粘膜の炎症、皮膚の炎症及びその他皮膚の損傷、結膜炎、視力減退、成長阻害などを引き起こすことが知られている。
【０００４】
なお、ビタミンＢ2の一日あたりの所要量としては、厚生労働省の「第六次改定日本人の栄養所要量」によれば、成人男性で１．１ｍｇとされている。
さらに、厚生労働省認可の栄養機能食品では、食品一日摂食量あたりのビタミンＢ2含有量が０．３３ｍｇ以上のものが認可されることになっている。
【０００５】
一方、日本人の食生活に深く根付き、近年の健康志向からその消費量が拡大している納豆は、比較的ビタミンＢ2を多く含む食品であり、ビタミンＢ2を摂取するのに適した食品として知られている。しかし、市販の納豆のビタミンＢ2含有量をみてみると、５０ｇあたり０．２ｍｇ前後に過ぎず、納豆は一日あたり１パック（４０〜５０ｇ入り）程度を摂食するのが一般的であることを考慮すると、従来の納豆から一日に摂取できるビタミンＢ2量は０．１６〜０．２ｍｇ程度に過ぎないことになる。
【０００６】
そこで、納豆のビタミンＢ2含有量を高めることが出来れば、納豆を更に容易にビタミンＢ2を摂取することができる健康食品とすることが期待出来る。
【０００７】
以上のことから、ビタミンＢ2の含有量を高めた納豆は産業上の価値は高く、納豆のビタミンＢ2含有量を高める方法が切望されている。
【０００８】
ここで、納豆のビタミンＢ2含有量を高めるための手段としては、ビタミンＢ2を納豆に添加する方法と、納豆菌のビタミンＢ2生産性を高める方法が考えられる。ビタミンＢ2を納豆へ添加する場合は、当然、添加する分のビタミンＢ2のコストが発生し、且つ、添加物を使用している点で消費者の嗜好に適合しないものとなるので、望ましいのは納豆菌のビタミンＢ2生産性を高める方法である。
【０００９】
一方、納豆菌のビタミンＢ2の生産性を高める方法についてみてみると、過去に納豆菌のビタミンＢ2の生産性を高めた事例はなく、近縁のバチルス属細菌において、ビタミンＢ2の生産性を高めた事例があるのみであった。
【００１０】
すなわち、バチルス属細菌においては、例えばプリン要求性且つプリンアナログ耐性を付与する方法（例えば、特許文献１参照）、バチルス・サチリスにリボフラビンアナログ耐性を付与する方法（例えば、非特許文献１参照）、バチルス・サチリスにスレオニンアナログ耐性を付与する方法（例えば、特許文献２参照）、バチルス・サチリスにプロリン類似体に耐性を付与する方法（例えば、特許文献３参照）など多くの事例がある。
【００１１】
しかし、バチルス属細菌においては、これまでにビタミンＢ2生合成とヒスチジン生合成との経路上の関連性については具体的には知られておらず、さらに納豆菌においては、近縁のバチルス・サチリスとは異なって、ヒスチジンの利用性がないことが知られていること（例えば、非特許文献２参照）などから、特に、ビタミンＢ2生産性とヒスチジンとの関連性を想定するのが困難な状況であった。
【非特許文献１】Ｇｅｎｅｔｉｋａ、１８号、ｐ．３１９〜３２１、１９８２年
【非特許文献２】医学と生物学、第１０５巻、第２号、ｐ．１１９〜１２２、１９８２年
【特許文献１】特開昭４９−６６８９４号公報
【特許文献２】特開２００４−１８０６７１号公報
【特許文献３】特開２００４−１８０６７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ビタミンＢ2高含有納豆の製造において、消費者のニーズにしたがって、ビタミンＢ2を納豆に添加（強化）するのではなく、ビタミンＢ2を高生産する納豆菌を新たに育種することとし、納豆に含まれるビタミンＢ2含有量を増加させるためのビタミンＢ2高生産納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造されたビタミンＢ2高含有納豆を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、納豆菌のビタミンＢ2生産性を向上させるため鋭意検討を重ねた結果、納豆菌にヒスチジンアナログ耐性を付与すること、及び／又は、ヒスチジン要求性を付与することで納豆菌のビタミンＢ2生産性が向上し、納豆のビタミンＢ2含有量を向上させることができることを見出して、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下の各項に関する。
【００１５】
（１）ヒスチジンアナログ耐性を有し、且つビタミンＢ2を高生産することを特徴とするバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
【００１６】
（２）ヒスチジンアナログが２−メチルヒスチジン、２−チアゾールアラニン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールから選ばれる少なくともひとつであることを特徴とする上記（１）に記載の納豆菌。
【００１７】
（３）ヒスチジン要求性を有し、且つビタミンＢ2を高生産することを特徴とするバチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
【００１８】
（４）ビタミンＢ2を高生産する納豆菌が５０ｇ納豆あたりビタミンＢ2を０．２ｍｇ以上、好ましくは１．１〜１．２以下、更に好ましくは０．２１〜１．０５ｍｇ、そして更に好ましくは０．４〜１．０５ｍｇ、そのうえ更に好ましくは０．６〜１．０５ｍｇ含有し、場合によっては１．１〜１．２ｍｇ含有するビタミンＢ2高含有納豆を生産する納豆菌であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の納豆菌。
【００１９】
（５）納豆菌が、バチルス・サチリス  ＡＴ−７５（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴ−７５）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７４）、あるいはバチルス・サチリス  Ｈ−５０（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｈ−５０）株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７５）であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１項に記載の納豆菌。
【００２０】
（６）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の納豆菌を用いることを特徴とするビタミンＢ2高含有納豆の製造方法。
【００２１】
（７）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の納豆菌を用いて製造されたことを特徴とするビタミンＢ2高含有納豆。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ヒトの必須栄養素であるビタミンＢ2の生産性が向上した納豆菌を育種する方法が提供され、その方法により開発されたビタミンＢ2高生産菌を用いて納豆を生産することによりビタミンＢ2含有量が非常に高い納豆の製造が可能となる。
【００２３】
本発明によれば、本発明に係るビタミンＢ2高生産納豆菌を使用すれば、ほかは常法にしたがって納豆を製造することにより、ビタミンＢ2高含有納豆を容易に製造することができる。すなわち、本発明によれば、天然のビタミンＢ2を通常の食品から多量に摂取することができるのである。したがって、ビタミンＢ2を別途納豆に添加してビタミンＢ2強化納豆、いわば人工食品ないし半天然食品ともいうべき食品を製造する場合とは明らかに相違し、コスト面、操作、工程の面においても本発明は卓越している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明で育種改良に用いる元の納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、およびさらに改良を重ねた優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００２６】
納豆菌は、枯草菌バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、大豆などの豆類を発酵して、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バチルス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてバチルス・サチリス・バリアント・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏ）あるいはバチルス・サチリス（ナットウ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  （ｎａｔｔｏ））などと、枯草菌と区別して分類する場合もある。
【００２７】
納豆菌としては、バチルス・ナットウＩＦＯ３００９株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ  ＩＦＯ３００９）、バチルス・サチリスＩＦＯ３３３５株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３３５）、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがあるほか、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００２８】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株のビタミンＫ2高生産性変異株であるＯＵＶ２３４８１株（独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）（旧名称：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所、旧住所：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号）に１９９９年２月２２日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６５９として寄託されている。）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ3株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００２９】
また、本発明において、変異納豆菌を得るための変異方法としてはいかなる変異方法を用いてもよい。納豆菌は特別に人工的な変異処理を施さなくてもある程度の確率で自然に変異を起こすので、このような自然変異によって目的のビタミンＢ2の生産性が向上した変異納豆菌を取得することが可能である。
【００３０】
また、人工的な手段による突然変異を起こさせて取得する方法もある。突然変異には物理的方法と化学的方法が用いられる。突然変異の物理的方法としては、紫外線照射、放射線照射などがあり、化学的方法としては、例えばエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異剤の溶液に菌体を懸濁させる方法などがあり、これらの方法を単独または組み合わせて適宜実施することができる。
【００３１】
本発明では、納豆菌にヒスチジンのアナログ耐性及び／又はヒスチジンの要求性を付与することを特徴とする。
【００３２】
ヒスチジンのアナログ耐性株は、選択培地にヒスチジンのアナログを添加しても生育する菌株を選択することで取得可能であり、使用するヒスチジンのアナログは任意のものが使用でき、具体的には、２−メチルヒスチジン、２−チアゾールアラニン、３−アミノ−１，２，４−トリアゾールなどが例示されるが、特に３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを用いるのが望ましい。
【００３３】
なお、ヒスチジンのアナログの添加は、納豆菌のヒスチジンアナログに対する耐性度を勘案して実施する必要があるが、０．１〜１００ｍｇ、好ましくは０．２〜２０ｍｇ／ｍｌ程度の濃度で選択培地に添加しておくとよい。
【００３４】
また、ヒスチジンの要求性株はヒスチジンを含まない培地で生育が悪い、または、生育せず、ヒスチジンを含む培地のみに生育する菌株を選択することで取得可能である。例えば、ヒスチジンを含まない合成培地と含む合成培地でのコロニー形成の有無を判定指標として用いて、選択することができる。
【００３５】
なお、ビタミンＢ2の生産性が向上した納豆菌株は、ヒスチジンアナログ耐性株及び／又はヒスチジン要求性株の中から、ビタミンＢ2の生産性が向上した株を選抜することによって取得可能である。
【００３６】
納豆菌のビタミンＢ2の生産性が向上した株の選抜方法としては、ヒスチジンアナログ耐性及び／又はヒスチジン要求性となった納豆菌を培養して後、元の親株よりもビタミンＢ2の生産性が向上した株を選択し、分離することによって可能である。
【００３７】
すなわち、例えば以下に開示のような方法に従って納豆を製造した後、納豆中に含有されるビタミンＢ2の濃度を測定することによって行うことができる。
【００３８】
納豆の製造は、得られたヒスチジンアナログ耐性株及び／又はヒスチジン要求性株の胞子液と通常納豆菌の胞子液を用いて、常法通り納豆を発酵する。例えば、浸漬した大豆を水切りし、１．８Ｋｇ／ｃｍ2で１８分間加圧蒸煮して得た蒸煮大豆１ｇあたり１，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で発酵を行う。発酵終了後、熟成させて、納豆を製造する。
【００３９】
また、納豆中のビタミンＢ2の測定は、例えば、以下の方法によって実施することができる。すなわち適当量の納豆をよく磨り潰し、磨り潰した納豆３ｇを褐色瓶に取り、０．１Ｎ塩酸を５０ｍｌ加えて、沸騰水浴中で１５分間、酸分解する。冷却後、４Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ４．５に調整し、２．５％タカジアスターゼＢ溶液５ｍｌを加え、３７℃、約１６時間酵素分解を行なって酵素分解液を得る。次に該酵素分解液を８０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で１００ｍｌに定容したのち、等量のメタノールを加え、析出物をフィルターろ過し、ビタミンＢ2含有量を高速液体クロマトグラフィーにて蛍光検出器（励起波長４４５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）で検出することが出来る。尚、納豆あたりのビタミンＢ2含有量はリボフラビンを用いた標準曲線から算出することが出来る。
【００４０】
また、高速液体クロマトグラフィーのカラムにはＯＤＳカラムを用い、移動相にはメタノール：１０ｍｍｏｌ／リッター濃度のＮａＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ５．５）＝３５：６５の溶媒を用い、流速は０．８ｍｌ／分とした。
【００４１】
以上の方法によって、ヒスチジンアナログ耐性及び／又はヒスチジン要求性の納豆菌の中から、ビタミンＢ2の高生産性の納豆菌を選抜することによって本発明の納豆菌を取得することができるが、ここで得られる納豆菌のビタミンＢ2の生産性としては、元株よりも高く、例えば０．２ｍｇ以上／５０ｇ納豆が好ましく、より好ましくは０．６ｍｇ／５０ｇ納豆、さらに好ましくは１ｍｇ／５０ｇ納豆であるのが望ましい。
【００４２】
本発明に係るビタミンＢ2高生産納豆菌は、５０ｇ納豆あたりビタミンＢ2を０．２ｍｇ以上生産することができ、０．２１０〜１．０５ｍｇの生産が実証されている。更に具体的には、０．２ｍｇ以上、０．３ｍｇ以上、０．４ｍｇ以上、０．５ｍｇ以上、０．６ｍｇ以上、０．７ｍｇ以上、０．８ｍｇ以上、０．９ｍｇ以上生産することができる。上限についても、１ｍｇ以上、１．０５ｍｇが実際に行われているが、１．１〜１．２ｍｇも充分に期待することができ、１．５ｍｇ以上も期待できる。
【００４３】
本発明によれば、ビタミンＢ2を高生産する納豆菌が５０ｇ納豆あたりビタミンＢ2を０．２１〜１．０５ｍｇ、好ましくは０．４〜１．０５ｍｇ、更に好ましくは０．６〜１．０５ｍｇ含有するビタミンＢ2高含有納豆を生産する納豆菌を得ることができるが、ビタミンＢ2含有量は、これらの範囲のほか、前段落に記載した各数値で規定される各種の範囲、例えば０．３〜０．５ｍｇ、０．４〜０．７ｍｇ、０．２〜１ｍｇの数値範囲のビタミンＢ2高含有納豆も適宜生産することが可能である。
【００４４】
このようにして開発されたビタミンＢ2を高生産する納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、何ら制限がない。
【００４５】
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。
【００４６】
丸大豆納豆の製造方法は、一般に原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（１．５〜２Ｋｇ／ｃｍ2・１２８〜１３３℃）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入して比較的高温度（４０〜５５℃程度）で所定時間（１２〜４８時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。
【００４７】
また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００４８】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって育種改良したビタミンＢ2高産性納豆菌に代えて使用することによって製造される。
【００４９】
このようにして、従来納豆と品質的に差異はなく風味豊かで、かつビタミンＢ2を高濃度で含有する納豆が生産可能となる。
【実施例】
【００５０】
以下に、実施例等を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００５１】
（実施例１）
（１）使用菌株等
納豆菌はＯＵＶ２３４８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６５９）を元株として用いた。
該納豆菌を培養する際に用いる培地は、表１に示すＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）及び表２に示したＳＰ培地（改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ培地）を用いた。なお、固体培地には寒天１．５重量／容量％を添加した。
【００５２】
【表１】
2008113633.tif 000002
【００５３】
【表２】
2008113633.tif 000003
【００５４】
（２）変異処理方法
納豆菌をＮＢ培地に白金耳で植菌し、一晩３７℃で振とう培養した後、遠心分離して５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄した。
【００５５】
約１０7ｃｆｕ／ｍｌの濃度の洗浄菌体に、終濃度１６０μｇ／ｍｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを添加し、６０分間振とうして、変異処理を行った。この時の生存率は２％前後であった。
【００５６】
（３）ヒスチジン要求性ビタミンＢ2高含有納豆菌のスクリーニング方法
変異処理した菌体をＮＢ培地で培養して形質を発現させ、その後に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、固体ＮＢ培地に塗抹培養した。
【００５７】
出現したコロニーを固体ＳＰ培地、及び終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでヒスチジンを含む固体ＳＰ培地に移植し、３７℃で２〜３日培養した後、固体ＳＰ培地で生育せず、ヒスチジンを含む固体ＳＰ培地で生育するコロニーをヒスチジン要求性株であると判定し、合計６８株取得した。
【００５８】
得られた６８株のヒスチジン要求性株の胞子液と、元株であるＯＵＶ２３４８１株の胞子液を調製し、該胞子液を用いて、常法通り納豆を作製した。
【００５９】
すなわち、浸漬した大豆を水切りし、１．８Ｋｇ／ｃｍ2で１８分間加圧蒸煮した。蒸煮大豆１ｇあたり１，０００〜４，０００個の胞子を植菌し、５０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温４０〜４５℃で高湿度下で発酵を行った。発酵終了後、熟成させ、その後に納豆としての品質を評価した。
【００６０】
用いたヒスチジン要求性株６８株のうち、納豆としての品質を満たした４６株の納豆についてビタミンＢ2の含有量を測定した。尚、ビタミンＢ2の含有量は以下の方法で定量した。
【００６１】
すなわち適当量の納豆をよく磨り潰し、磨り潰した納豆３ｇを褐色瓶に取り、０．１Ｎ塩酸５０ｍｌを加え、沸騰水浴中で１５分間、酸分解した。冷却後、４Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ４．５に調整し、２．５％タカジアスターゼＢ溶液５ｍｌを加え、３７℃で約１６時間酵素分解を行なった。次に酵素分解液を８０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で１００ｍｌに定容したのち、等量のメタノールを加え、析出物をフィルターろ過し、ビタミンＢ2含有量を高速液体クロマトグラフィーにて蛍光検出器（励起波長４４５ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）で検出した。尚、納豆あたりのビタミンＢ2含有量はリボフラビンを用いた標準曲線から算出した。
【００６２】
また、高速液体クロマトグラフィーのカラムにはＯＤＳカラムを用い、移動相にはメタノール：１０ｍｍｏｌ／リッター濃度のＮａＨ2ＰＯ4溶液（ｐＨ５．５）＝３５：６５の溶媒を用い、流速は０．８ｍｌ／分とした。
【００６３】
以上の方法によって、ヒスチジン要求性の納豆菌株６８株から、納豆としての品質を満たす納豆を製造可能な４６株についてビタミンＢ2含有量を調べた結果、以下の表３に示すＨ−６株、Ｈ−５０株及びＨ−６４株の合計３株のビタミンＢ2高生産性の納豆菌株を取得することができた。なお、表３中の固体ＳＰ培地での増殖は、○：増殖あり、×：増殖なし、を示し、ヒスチジンありの固体ＳＰ培地では増殖するが、ヒスチジンなしの固体ＳＰ培地では増殖しない株がヒスチジン要求性であることを意味している。
【００６４】
【表３】
2008113633.tif 000004
【００６５】
このようにして取得したビタミンＢ2の生産性が向上したヒスチジン要求性の３株（Ｈ−６株、Ｈ−５０株、Ｈ−６４株）を得た。このうち、最もビタミンＢ2の生産性の高かったＨ−５０株は、バチルス・サチリスＨ−５０株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｈ−５０）と命名され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７５として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００６６】
（実施例２）
（１）使用菌株等
納豆菌は、実施例１と同様に、ＯＵＶ２３４８１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６５９）を元株として用いた。
【００６７】
該納豆菌を培養する際に用いる培地も実施例１と同様に、表１に示すＮＢ培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ）及び表２に示したＳＰ培地（改変Ｓｐｉｚｉｚｅｎ培地）を用いた。なお、固体培地には寒天１．５重量／容量％を添加した。
【００６８】
（２）変異処理方法
実施例１と同様の方法で納豆菌の変異処理を行なった。尚、ＯＵＶ２３４８１株からヒスチジンアナログ耐性株を取得する際の変異処理では、終濃度８０μｇ／ｍｌのＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを用い、生存率は４％前後であった。
【００６９】
（３）ヒスチジンアナログ耐性ビタミンＢ2高含有納豆菌、及びヒスチジン要求性ビタミンＢ2高含有納豆菌のスクリーニング方法
【００７０】
変異処理した菌体をＮＢ培地で培養して形質を発現させ、その後に５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で洗浄し、終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでアデニンを含むＳＰ培地に１１ｍｇ／ｍｌとなるように３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを添加した固体培地に塗沫した。
【００７１】
３７℃で２〜３日間培養した後、得られたコロニーを、固体ＮＢ培地で単コロニー分離し、さらに終濃度０．１ｍｇ／ｍｌでアデニンを含むＳＰ培地に１１ｍｇ／ｍｌとなるように３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを添加した固体培地にてアナログ耐性を再確認し、７９株のアナログ耐性株を得た。
【００７２】
このようにして得られたアナログ耐性株を用いて実施例１に記した方法で納豆を試作し、納豆としての品質、及び納豆中のビタミンＢ2の含量を評価した。
【００７３】
アナログ耐性株７９株の内、納豆としての品質を満たしたものを製造できた５４株についてビタミンＢ2の含有量を測定した結果、ビタミンＢ2の含有量が向上した納豆を製造できた８株を得た。この内の生産性が向上した３株についての生産性及びアナログ耐性を調べた結果を表４に示した。
【００７４】
以上の結果の内、このなかで最もビタミンＢ2の含有量が高い納豆を製造できたＡＴ−６６株、ＡＴ−７５株、ＡＴ−８９株について、ビタミンＢ2の生産性、ヒスチジンアナログ耐性に関して調べた結果を表４に示した。なお、表４中のヒスチジンアナログ耐性については、上記のＳＰ培地に１１ｍｇ／ｍｌとなるように３−アミノ−１，２，４−トリアゾールを添加した固体培地にて増殖できた場合は○、増殖できなかった場合は×で表し、増殖できた場合にヒスチジンアナログ耐性を有することを意味する。
【００７５】
このようにして得られたヒスチジンアナログ耐性でビタミンＢ2の生産性が向上したＡＴ−７５株は、バチルス・サチリスＡＴ−７５株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴ−７５）と命名され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６７４として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている。
【００７６】
【表４】
2008113633.tif 000005