(57)【要約】      （修正有）【課題】（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを工業的に利用できる量でかつ低コストで得るための手段を提供する。また、光学活性シアノヒドリンを工業的に製造するための手段を提供する。【解決手段】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ：（ａ）特定の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｂ）該塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；該ＤＮＡによってコードされる（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼおよびその製造方法；ならびに（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを用いて光学活性シアノヒドリンを製造する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされ、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養することを含む、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
【請求項５】
宿主細胞がピキア・パストリスである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
請求項２または３記載のタンパク質とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ、該酵素をコードするＤＮＡ、該酵素の製造方法、および該酵素を用いて光学活性シアノヒドリンを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体触媒を用いる合成プロセスは化学工業にとってきわめて重要になっている。また、生体触媒を使った化学反応の実施は、基質特異性の高い生体触媒の性質を利用する分野では、とりわけ興味深い。酵素が持つこの有利な性質を利用するには、その酵素を容易にかつ十分な量で入手できることが必須条件になる。
【０００３】
光学活性シアノヒドリンは特に興味深い光学活性化合物群であり、医薬活性物質、ビタミンまたはピレスロイド化合物などの生物活性物質の製造に使用されるα−ヒドロキシ酸、α−ヒドロキシケトン、β−アミノアルコールの合成等に重要である。シアノヒドリンは、カルボニル化合物のカルボニル基へのシアン化水素酸の付加によって製造される。例えば（Ｓ）−シアノヒドリンなどの光学活性化合物の工業的生産はパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）由来の酵素（Ｓ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを利用することによって可能になっている。
【０００４】
また、非特許文献１などには、サクラ属植物が（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのイソ酵素を含有しうることが開示されている。これらのイソ酵素は当該植物の様々な組織に異なるレベルで発現される。アメリカザクラには、現在までに５種類の異なるイソ酵素が同定され、それらの遺伝子が配列決定されている。その中でアメリカザクラ由来のｍｄｌ１遺伝子は非特許文献２に記されている。ここではこのタンパク質をＰｓＭＤＬ１と称する。アメリカザクラと近縁関係にあるアーモンド由来のイソ酵素は、今までのところ、非特許文献３にｍｄｌ５遺伝子が、特許文献１にｈｎｌ１、ｈｎｌ２、ｈｎｌ３、ｈｎｌ４、ｈｎｌ５遺伝子が記載されているが、ｃＤＮＡ配列はｍｄｌ５、ｈｎｌ１、ｈｎｌ５の３種で配列決定されているにすぎない。
【０００５】
特許文献２には、ウメ由来の光学活性シアノヒドリン合成酵素が開示されているが、ウメの種から酵素を精製したものであり、光学活性シアノヒドリン合成酵素のアミノ酸配列や遺伝子の塩基配列も特定されていない。従って、この光学活性シアノヒドリン合成酵素を十分な量かつ妥当な費用で入手することは困難であり、これを工業的に利用するには不適切である。
【０００６】
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の異種発現については、真核細胞である酵母を宿主として、アーモンド由来のヒドロキシニトリルリアーゼを遺伝子組換えにより製造した例が１例報告されているに過ぎない（特許文献１）。
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−３３０７９１号公報
【特許文献２】特開２００６−２３８７６３号公報
【非特許文献１】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ（１９９９）１１９：１５３５〜１５４６
【非特許文献２】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９３）３４：１１３９〜１１４３
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔａ（１９９８）２０６：３８８〜３９３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを工業的に利用できる量でかつ低コストで得るための手段を提供すること、ならびに光学活性シアノヒドリンを工業的に製造するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、アーモンドおよびウメから新規な（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼおよび該酵素をコードする新規遺伝子を見出し、そのアミノ酸配列および塩基配列を特定した。そして、この（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＲＨＮＬ）を遺伝子組換え法により製造することに成功した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなり、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（２）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列と９９％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡによってコードされ、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質。
（３）以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質。
（４）（１）記載のＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養することを含む、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法。
（５）宿主細胞がピキア・パストリスである、（４）記載の方法。
（６）（２）または（３）記載のタンパク質とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを工業的に利用できる量でかつ低コストで製造することができる。そして、該酵素を用いて光学活性シアノヒドリンを工業的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ）の葉からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲによって新規（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列を特定した（配列番号１）。また、該ＤＮＡを含むベクターで酵母を形質転換することにより、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを発現させることに成功した（配列番号１０）。
【００１３】
本発明者らはまた、ウメ（Ｐｒｕｎｕｓ ｍｕｍｅ）の仁から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をコードするｃＤＮＡを取得し、その塩基配列を特定するとともに（配列番号２〜９）、該ＤＮＡを含むベクターで酵母を形質転換することにより、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを発現させることに成功した（配列番号１１〜１５）。
【００１４】
本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡの塩基配列は、既知の配列または公表された配列とはいくつかの配列位置で異なり、それが重要な機能的相違をもたらしている。結果として、アメリカザクラから得られるｃＤＮＡの既知配列を利用したプライマーの組み合わせを使ったにもかかわらず、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの新規変異体が見出された。
【００１５】
すなわち、一実施形態において本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ：
（ａ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列番号１〜９のいずれかで表される塩基配列と９９％以上、好ましくは９９．５％以上、より好ましくは９９．８％以上の相同性を有する塩基配列からなり、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
に関する。以下、上記ＤＮＡを本発明のＤＮＡまたは本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡと称する場合がある。
【００１６】
本発明において、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性とは、当技術分野において通常用いられる意味を有し、シアノ基供与体の存在下、カルボニル化合物を基質としてシアノヒドリンを合成する反応を触媒する活性を意味する。シアノ基供与体、カルボニル化合物およびシアノヒドリンについては、後述する。
【００１７】
本発明はまた、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質
に関する。以下、上記タンパク質を本発明のタンパク質または本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼと称する場合がある。
【００１８】
ここで数個とは、２〜５個、好ましくは２〜３個を意味する。上記各配列番号で表されるアミノ酸配列における、１または数個のアミノ酸の欠失、付加、挿入または置換は、常用される技術、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０  ６４７８−６５００，１９８２）により、各配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡの配列を改変することにより実施することができる。上記におけるアミノ酸残基の置換は保存的置換であることが好ましい。アミノ酸残基間の保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）またはアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が知られている。
【００１９】
本発明のタンパク質には、配列番号１０〜１５のいずれかで表されるアミノ酸配列と９９％以上の同一性、好ましくは９９．５％以上の同一性、より好ましくは９９．８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有するタンパク質も包含される。
【００２０】
本発明はまた、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの製造方法に関する。一旦そのアミノ酸配列が決定されたタンパク質については、その配列を元に当業者に公知の手法、例えば、アミノ酸１つ１つを化学的に重合してポリペプチドを合成する方法（ペプチド合成法）に従って調製することもできる。しかし、このような方法はコストの観点から工業的な利用には好適でないため、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを作製し、該ベクターを適切な宿主細胞中に導入して得られる形質転換体を培地に培養し、その培養物から採取する方法が好ましく用いられる。あるいは、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡを無細胞タンパク質合成系で発現させることにより、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを製造することもできる。以下、形質転換体を用いる方法について説明する。
【００２１】
まず、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼをコードするＤＮＡをベクター中に連結し、組換えベクターを製造する。上記ベクターには、宿主細胞で自律的に増殖し得るファージ、コスミド、人工染色体またはプラスミドが使用されるほかに、たとえば、プラスミドを発現カセットとして染色体に導入するような場合にはその発現カセットの構築に必要な宿主（たとえば大腸菌）での自律複製能は必要だが、その発現カセットを導入する宿主（たとえば酵母）での自律複製能は必ずしも必要でない。これらの組換えベクターはたとえば大腸菌と酵母の両方で使用可能なように設計したシャトルベクター等も使用可能である。プラスミドとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２１ａ（＋）、ｐＥＴ３２ａ（＋）、ｐＥＴ３９ｂ（＋）、ｐＥＴ４０ｂ（＋）、ｐＥＴ４３．１ａ（＋）、ｐＥＴ４４ａ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、また酵母でもピキア・パストリス用のプラスミド（例えばｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ６、ｐＧＡＰＺ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＦＬＤ）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。また、クローニング、シークエンス確認用にｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（登録商標）などの市販のクローニング用ベクターを用いてもよい。
【００２２】
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。例えば本発明のＤＮＡは、通常知られている方法により合成することができ、ベクターに組み込むため、適当な制限酵素の切断部位を両末端に含むように、プライマーを用いてＰＣＲ法により増幅してもよい。ＰＣＲ反応の条件は、当業者が適宜決定することができるが、例えば９４℃で３０秒→６０℃で３０秒→７４℃で１分を１サイクルとして３０サイクル反応させ、増幅されたＤＮＡを得ることができる。
【００２３】
その他、組換えベクターには、プロモーターおよび本発明のＤＮＡに加えて、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などが連結されていてもよい。選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールなどの薬剤耐性マーカー、ロイシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、ウラシルなどの栄養要求性マーカーが挙げられるがこれに限定されない。
【００２４】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、組換えベクターを作成する。好ましくは市販のライゲーションキット、例えばライゲーションｈｉｇｈ（東洋紡株式会社製）を用いて、規定の条件にてライゲーション反応を行うことにより組換えベクターを得ることができる。
【００２５】
また、これらのベクターを、必要であればボイル法、アルカリＳＤＳ法、磁性ビーズ法およびそれらの原理を使用した市販されているキット等により精製し、さらに例えばエタノール沈殿法、ポリエチレングリコール沈殿法などの濃縮手段により濃縮することができる。
【００２６】
形質転換に使用する宿主としては、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。本発明においては、細菌または真核微生物が好ましく、サッカロミセス・セレビシェまたはピキア・パストリスなどの酵母が特に好ましい。例えば、ピキア・パストリスＧＳ１１５株、ピキア・パストリスＫＭ７１株、ピキア・パストリスＫＭ７１Ｈ株、ピキア・パストリスＳＭＤ１１６８株、ピキア・パストリスＳＭＤ１１６８Ｈ株、ピキア・パストリスＭＳ１０５株等を使用できる。
【００２７】
宿主細胞への組換えベクターの導入方法は、特に限定されないが、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００２８】
本発明のＤＮＡを含む形質転換体は、その組換えベクターが有するマーカー遺伝子により、例えば、アンピシリン、カナマイシンなどの抗生物質を含むＬＢ培地寒天プレート上でコロニーを形成することにより選抜することができるが、クローニングされた宿主細胞が本発明の組換えベクターにより形質転換されたものかどうかを確認するため、一部を用いて、ＰＣＲ法によるインサートの増幅確認、またはシーケンサーを用いたダイデオキシ法による配列解析をしてもよい。また、上記の自律複製可能なプラスミドを導入する形式の他に、染色体の遺伝子と相同な領域をベクター内に配置し、相同組換えを起こさせて目的遺伝子を導入させる染色体組み込み型の導入方法を使用してもよい。
【００２９】
上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００３０】
炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコースなどの糖類、グリセリンなどのポリオール類、メタノールなどのアルコール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミンなどのアルキルアミン類、またはアンモニアもしくはその塩などを使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤なども必要に応じて使用してもよい。また、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドなどのタンパク質発現誘導剤を必要に応じて培地に添加してもよい。
【００３１】
培養は、通常、振盪培養または通気攪拌培養などの好気的条件下、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは１０〜３７℃、特に好ましくは１５〜３７℃で培養を行う。培養期間中、培地のｐＨは宿主の発育が可能で、生産された（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性が損なわれない範囲で適宜変更することができるが、好ましくはｐＨ４〜８程度の範囲である。ｐＨの調整は、無機または有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３２】
培養後、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが菌体内または細胞内に生産される場合には、通常知られている方法、例えば、菌体または細胞を機械的方法、リゾチームなどを用いた酵素的方法または界面活性剤などを用いた化学的処理によって破壊することにより当該酵素を抽出できる。また、当該酵素が菌体外または細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体または細胞を除去する。
【００３３】
（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが封入体として得られる場合には、好ましくはさらにリフォールディングを行うことにより、活性型でかつ可溶性の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを得ることができる。リフォールディングは、当技術分野で通常用いられる方法に従って実施することができ、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９９８）６４：１４０５−１４１１に記載された方法に従って、実施することができる。
【００３４】
具体的には、培養後、遠心分離等の方法により集菌した後、細胞を破砕し、封入体を変性剤を用いて可溶化することによって、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ類を抽出することができる。細胞の破砕は、常法で、たとえば超音波により実施できる。懸濁媒体としてはｐＨ５．０〜８．０のｐＨ値に調整した好適な緩衝液（例えばクエン酸緩衝液やリン酸緩衝液等）を用いることが好ましい。この際、細胞の破砕を促進させるためＥＤＴＡを添加してもよい。このようにして細胞を破砕した後に、不溶性成分（封入体）を任意の方法で、遠心分離するか、濾過することにより分取する。異種のタンパク質をできる限り除去するため、たとえば水、リン酸緩衝液を用いて洗浄することが好ましいが、場合により界面活性剤や４Ｍ程度の尿素で洗浄してもよい。得られた沈殿（ペレット）を変性剤を用いて可溶化するが、変性剤としては、公知の変性剤、特にグアニジンまたは尿素を使用することができる。この可溶化に当っての変性剤の濃度は、グアニジンでは４〜８モル／リットル、好ましくは約６モル／リットル、尿素では５〜９モル／リットル、好ましくは約８モル／リットルである。グアニジンは通常グアニジン塩酸塩等のグアニジンの酸付加塩として用いられる。
【００３５】
上記のようにして封入体の可溶化を行った後、遠心分離等で不純物を除去し、得られた上清を必要により精製工程に付した後、リフォールディング（活性化、再生化）を行うことができる。リフォールディングは、精製した（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ類にレドックスバッファーを添加するか、あるいは（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ類を含有する上澄液をレドックスバッファーで希釈することにより行われる。（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ類を含有する上澄液をレドックスバッファーで希釈する場合、変性剤の濃度を活性化に適した中性ｐＨにおいて不作用濃度まで希釈することが必要であり、グアジニンでは０〜２．０モル／リットル、好ましくは約１モル／リットル以下まで、尿素では０〜４．０モル／リットル、好ましくは約２モル／リットル以下まで希釈する。
【００３６】
レドックスバッファーとしては、酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）および還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、システインおよびシスチン、またはシステアミンおよびシスタミンを含有する緩衝液（例、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液）が好ましいものとして挙げられ、中でもＧＳＳＧおよびＧＳＨを含有するＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液が好ましい。ＧＳＳＧおよびＧＳＨを用いる場合、ＧＳＳＧの濃度は０．１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．１〜１．０ミリモル／リットル、ＧＳＨの濃度は０．１〜１０ミリモル／リットル、好ましくは０．１〜１．０ミリモル／リットルである。
【００３７】
また、レドックスバッファーには、通常、グリセリン等の添加剤を添加してもよい。添加量としてグリセリンは１〜５０％、好ましくは５〜２０％の濃度で添加するのがよい。また、当該酵素は補酵素としてＦＡＤが必要なので、これを添加してもよい。添加量としては１〜１０００μＭ、好ましくは１０〜１００μＭの濃度で添加するのがよい。
【００３８】
該リフォールディングに当っての温度は０〜３０℃、好ましくは０〜１５℃、ｐＨは７〜９、好ましくはｐＨ７．５〜８．５である。リフォールディングに要する時間は通常１時間〜１０週間、好ましくは３日〜１週間である。
【００３９】
その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫安分画法、有機溶媒沈殿法、イオン交換体などによる吸着処理法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法、限外ろ過膜を使用しての濃縮・脱塩・バッファー交換等を単独でまたは適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを単離精製することができる。（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００４０】
本発明はまた、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（本発明のタンパク質）とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法に関する。
【００４１】
このような光学活性シアノヒドリンの製造方法としては、上記のように製造した本発明のＤＮＡを含む組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させ、反応液から光学活性シアノヒドリンを回収することを含む方法が挙げられる。あるいは、無細胞タンパク質合成系を用いる方法が挙げられる。無細胞タンパク質合成系は、細胞抽出液を用いて試験管内でタンパク質を合成する系である。「無細胞タンパク質合成系」は、ｍＲＮＡの情報を読み取ってリボソーム上でタンパク質を合成する無細胞翻訳系とＤＮＡを鋳型としてＲＮＡを合成する無細胞転写系との両者を含む。無細胞タンパク質合成系は、系を容易に改変することができるため、目的のタンパク質に適した発現系を構築しやすいという利点がある。なお、無細胞タンパク質合成系の詳細については、特開２０００−１７５６９５号などに記載されている。
【００４２】
従って、本発明の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させることには、精製された（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼとカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させることだけでなく、本発明のＤＮＡを含む形質転換体を培養した培養物とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させること、ならびに無細胞タンパク質合成系から得られる反応液とカルボニル化合物およびシアノ基供与体とを反応させることも含まれる。
【００４３】
ここで「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、細胞または菌体の破砕物、およびこれらから精製された（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ自体のいずれをも意味するものである。本発明においては、好ましくは精製（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを用いる。
【００４４】
シアノヒドリンを合成する酵素反応の形態については制限されず、水・有機溶媒混合系、有機溶媒系、有機溶媒水二相系、固定化酵素を使う反応系などのいずれの反応系においても効果的に実施することができる。
【００４５】
光学活性シアノヒドリンとは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体より多く含まれているシアノヒドリン、または、いずれか一方の鏡像異性体のみからなるシアノヒドリンをいう。（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼを用いることにより、用いた基質に応じて（Ｒ）−シアノヒドリンおよび（Ｓ）−シアノヒドリンの双方を製造することができる。
【００４６】
ここでカルボニル化合物とは、アルデヒドまたはケトンをいい、具体的には、次式（Ｉ）：
Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２    （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、互いに同一でも異なっていてもよく、それぞれ水素原子または炭素数２２以下の１価の炭化水素基を表し、前記炭化水素基中、−ＣＨ２−ならびに−ＣＨ３のＣＨ２はカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−またはＳ−で置き換えられていてもよく、＝ＣＨ２は＝Ｏまたは＝Ｓで置き換えられていてもよく、また−ＣＨ２−のＣ−Ｈ、−ＣＨ３のＣ−Ｈ、＞ＣＨ−のＣ−Ｈ、＝ＣＨ−のＣ−Ｈならびに＝ＣＨ２のＣ−Ｈは、ＮまたはＣ−ハロゲンで置き換えられていてもよく、また、Ｒ１およびＲ２は、共同して２価の基を表してもよい。）で示される。
【００４７】
前記式（Ｉ）において、炭素数２２以下の１価の炭化水素基とは、直鎖状または分岐状の鎖状炭化水素基、側鎖のないまたは側鎖のある単環式炭化水素基、側鎖のないまたは側鎖のある多環式炭化水素基、側鎖のないまたは側鎖のあるスピロ炭化水素基、側鎖のないまたは側鎖のある環集合構造の炭化水素基、あるいは、前記の環式炭化水素基が置換した鎖状炭化水素基のいずれをも含む。また、飽和な炭化水素基ならびに不飽和な炭化水素基のいずれをも含むが、不飽和な炭化水素基において、Ｃ＝Ｃ＝Ｃのアレン構造を含む基は除く。
【００４８】
なお、以下においては、側鎖のない芳香族基、側鎖のある芳香族基、ならびに、フェニルフェニル基または側鎖のあるフェニルフェニル基などを併せて、アリール基といい、このアリール基で置換された直鎖状または分岐状のアルキル基をアラルキル基という。他の環式炭化水素基に関しても、特に明記しない場合、環上に側鎖のないものとあるものを併せて指す場合には、単にシクロアルキル基等の名称を用いる。鎖状炭化水素基についても、直鎖状のものと分岐状のものを併せて指す場合には、単にアルキル基等の名称を用いる。
【００４９】
前記炭化水素基中、−ＣＨ２−がカルボニル基、スルホニル基、−Ｏ−またはＳ−で置き換えられると、それぞれケトン、スルホン、エーテルまたはチオエーテルの構造が導入され、−ＣＨ３の−ＣＨ２−がカルボニル基、−Ｏ−またはＳ−で置き換わると、それぞれホルミル基（アルデヒド）、水酸基またはメルカプト基に変わり、あるいは、末端の＝ＣＨ２が＝Ｏまたは＝Ｓに置き換わると、ケトン、チオケトンの構造が導入されることを意味し、また、−ＣＨ２−のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ−となり、＞ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＞Ｎ−となり、＝ＣＨ−のＣ−ＨがＮに変わると、＝Ｎ−となり、末端の−ＣＨ３のＣ−ＨがＮに変わると、−ＮＨ２が導入され、＝ＣＨ２のＣ−ＨがＮに変わると、＝ＮＨとなる。また、−ＣＨ３、−ＣＨ２−、＝ＣＨ−、≡ＣＨまたは＞ＣＨ−のＣ−ＨがＣ−ハロゲンで置き換えられると、当該炭素上へハロゲン原子を置換することになる。なお、炭素鎖中における−Ｏ−、−Ｓ−、Ｎへの置き換えは、当該炭化水素基に対する、それぞれオキサ置換、チア置換、アザ置換に当たり、例えば、炭化水素環の環の骨格炭素で起こると、炭化水素環のそれぞれ含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環への変換となる。該炭化水素基中、ＣＨ２ならびにＣ−Ｈにおける置き換えは、それぞれ独立に行われてよく、加えて、前記の置き換えを行った後、なお当該炭素上にＣＨ２またはＣ−Ｈが残存する際には、更に置き換えがなされてもよい。更には、前記の置き換えにより、−ＣＨ２−ＣＨ３の−ＣＯ−Ｏ−Ｈ；カルボン酸構造への変換などもなされる。
【００５０】
本明細書において、ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を指すが、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が好ましい。
【００５１】
従って、前記炭化水素基としては、鎖状炭化水素基ならびに環式炭化水素基など環構造を有する炭化水素基のいずれをも選択でき、例えば、飽和鎖状炭化水素基である直鎖状または分岐状のアルキル基、不飽和鎖状炭化水素基である直鎖状または分岐状のアルケニル基、直鎖状または分岐状のアルキニル基、直鎖状または分岐状のアルカジエニル基など、飽和な環式炭化水素基であるシクロアルキル基、不飽和な環式炭化水素基であるシクロアルケニル基、シクロアルキニル基、シクロアルカジエニル基など、芳香族炭化水素基であるアリール基、アラルキル基、アリールアルケニル基などが挙げられる。
【００５２】
更に詳しくいえば、直鎖状または分岐状のアルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、１−メチルプロピル基、ペンチル基、１−メチルブチル基、ヘキシル基、１−メチルペンチル基、ヘプチル基、１−メチルヘキシル基、１−エチルペンチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、２−メチルプロピル基、２−メチルブチル基、３−メチルブチル基、２−メチルペンチル基、３−メチルペンチル基、４−メチルペンチル基、メチルヘキシル基、メチルヘプチル基、メチルオクチル基、メチルノニル基、１，１−ジメチルエチル基、１，１−ジメチルプロピル基、２，６−ジメチルヘプチル基、３，７−ジメチルオクチル基、２−エチルヘキシル基など、シクロアルキルアルキル基としては、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基など、シクロアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、メチルシクロペンチル基、シクロヘキシル基、メチルシクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基など、ビシクロアルキル基としては、ノルボルニル基、ビシクロ［２．２．２］オクチル基、アダマンチル基などが挙げられる。直鎖状または分岐状のアルケニル基としては、例えばビニル基、アリル基、クロチル基（２−ブテニル基）、イソプロペニル基（１−メチルビニル基）など、シクロアルケニル基またはシクロアルカジエニル基としては、シクロペンテニル基、シクロペンタジエニル基、シクロヘキセニル基、シクロヘキサンジエニル基などが挙げられる。直鎖状または分岐状のアルキニル基としては、例えばエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。アリール基としては、例えばフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、２−フェニルフェニル基、３−フェニルフェニル基、４−フェニルフェニル基、９−アントリル基、メチルフェニル基、ジメチルフェニル基、トリメチルフェニル基、エチルフェニル基、メチルエチルフェニル基、ジエチルフェニル基、プロピルフェニル基、ブチルフェニル基などが挙げられる。アラルキル基としては、例えばベンジル基、１−ナフチルメチル基、２−ナフチルメチル基、フェネチル基（２−フェニルエチル基）、１−フェニルエチル基、フェニルプロピル基、フェニルブチル基、フェニルペンチル基、フェニルヘキシル基、メチルベンジル基、メチルフェネチル基、ジメチルベンジル基、ジメチルフェネチル基、トリメチルベンジル基、エチルベンジル基、ジエチルベンジル基などが挙げられる。アリールアルケニル基としては、例えばスチリル基、メチルスチリル基、エチルスチリル基、ジメチルスチリル基、３−フェニル−２−プロペニル基などが挙げられる。
【００５３】
前記炭化水素基中のＣＨ２がカルボニル基、スルホニル基、ＯまたはＳで、またはＣ−ＨがＮまたはＣ−ハロゲンで置き換えられた基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、スルホン、エーテル、チオエーテル、アミン、アルコール、チオール、ハロゲン、複素環（例えば、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環）などの構造を一つ以上含む基が挙げられる。なお、含酸素複素環、含硫黄複素環、含窒素複素環とは、環式炭化水素基の環骨格の炭素がそれぞれ酸素、硫黄、窒素で置き換わるものを意味し、更には、これらヘテロ原子置換が二種以上ある複素環であってもよい。前記の置換を有する炭化水素基としては、例えば、ケトン構造のアセチルメチル基、アセチルフェニル基；スルホン構造のメタンスルホニルメチル基；エーテル構造のメトキシメチル基、メトキシエチル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、ブトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、メトキシフェニル基、ジメトキシフェニル基、フェノキシメチル基；チオエーテル構造のメチルチオメチル基、メチルチオフェニル基；アミン構造のアミノメチル基、２−アミノエチル基、２−アミノプロピル基、３−アミノプロピル基、２，３−ジアミノプロピル基、２−アミノブチル基、３−アミノブチル基、４−アミノブチル基、２，３−ジアミノブチル基、２，４−ジアミノブチル基、３，４−ジアミノブチル基、２，３，４−トリアミノブチル基、メチルアミノメチル基、ジメチルアミノメチル基、メチルアミノエチル基、プロピルアミノメチル基、シクロペンチルアミノメチル基、アミノフェニル基、ジアミノフェニル基、アミノメチルフェニル基；含酸素複素環のテトラヒドロフラニル基、テトラヒドロピラニル基、モルホリルエチル基；含酸素複素芳香環のフリル基、フルフリル基、ベンゾフリル基、ベンゾフルフリル基；含硫黄複素芳香環のチエニル基；含窒素複素芳香環のピロリル基、イミダゾリル基、オキサゾリル基、チアジアゾリル基、ピリジル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基、ピラジニル基、テトラジニル基、キノリル基、イソキノリル基、ピリジルメチル基；アルコール構造の２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、３−ヒドロキシプロピル基、２，３−ジヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、３−ヒドロキシブチル基、４−ヒドロキシブチル基、２，３−ジヒドロキシブチル基、２，４−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジヒドロキシブチル基、２，３，４−トリヒドロキシブチル基、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、ヒドロキシメチルフェニル基、ヒドロキシエチルフェニル基；チオール構造の２−メルカプトエチル基、２−メルカプトプロピル基、３−メルカプトプロピル基、２，３−ジメルカプトプロピル基、２−メルカプトブチル基、３−メルカプトブチル基、４−メルカプトブチル基、メルカプトフェニル基；ハロゲン化炭化水素基である２−クロロエチル基、２−クロロプロピル基、３−クロロプロピル基、２−クロロブチル基、３−クロロブチル基、４−クロロブチル基、フルオロフェニル基、クロロフェニル基、ブロモフェニル基、ジフルオロフェニル基、ジクロロフェニル基、ジブロモフェニル基、クロロフルオロフェニル基、トリフルオロフェニル基、トリクロロフェニル基、フルオロメチルフェニル基、トリフルオロメチルフェニル基；アミン構造とアルコール構造を有する２−アミノ−３−ヒドロキシプロピル基、３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基、２−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−３−ヒドロキシブチル基、２，４−ジアミノ−３−ヒドロキシブチル基、３−アミノ−２，４−ジヒドロキシブチル基、２，３−ジアミノ−４−ヒドロキシブチル基、４−アミノ−２，３−ジヒドロキシブチル基、３，４−ジアミノ−２−ヒドロキシブチル基、２−アミノ−３，４−ジヒドロキシブチル基、アミノヒドロキシフェニル基；ハロゲンと水酸基で置換された炭化水素基であるフルオロヒドロキシフェニル基、クロロヒドロキシフェニル基；カルボン構造のカルボキシフェニル基などが挙げられる。
【００５４】
Ｒ１およびＲ２で表される非対称の２価の基としては、特に制限はなく、例えば、ノルボルナン−２−イリデン、２−ノルボルネン−５−イリデンが挙げられる。
【００５５】
前記式（Ｉ）で示されるカルボニル化合物としては、例えば、ベンズアルデヒド、ｍ−フェノキシベンズアルデヒド、ｐ−メチルベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−クロロベンズアルデヒド、ｐ−クロロベンズアルデヒド、ｍ−ニトロベンズアルデヒド、３，４−メチレンジオキシベンズアルデヒド、２，３−メチレンジオキシベンズアルデヒド、フェニルアセトアルデヒド、フルフラール等の芳香族アルデヒド；アセトアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアルデヒド、シクロヘキサンアルデヒド等の脂肪族アルデヒド；エチルメチルケトン、ブチルメチルケトン、メチルプロピルケトン、イソプロピルメチルケトン、メチルペンチルケトン、メチル（２−メチルプロピル）ケトン、メチル（３−メチルブチル）ケトン等の飽和脂肪族ケトン；メチル（２−プロペニル）ケトン、（３−ブテニル）メチルケトン等の不飽和脂肪族ケトン；（３−クロロプロピル）メチルケトン等のアルキル（ハロアルキル）ケトン；２−（アルコキシカルボニルアミノ）−３−シクロヘキシルプロピオンアルデヒド等の２−（保護アミノ）アルデヒド；３−メチルチオプロピオンアルデヒド等のアルキルチオ脂肪族アルデヒドが挙げられる。
【００５６】
本発明において、基質としてのカルボニル化合物をシアノヒドリンに変換するためには、シアノ基供与体の存在下で酵素反応を実施する。本明細書中、シアノ基供与体とは、反応系へ添加することによって、シアニド、すなわちシアン化物イオン（ＣＮ−）を生じる物質を意味し、例えば、シアン化水素、青酸（シアン化水素酸）、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素の塩、または、アセトンシアノヒドリン等のシアノヒドリン類が挙げられる。特に回収リサイクルが容易な青酸（シアン化水素酸）を用いるのが好ましい。シアノ基供与体の供給方法としては常法により液体として供給する方法、または常法により気体として供給する方法のいずれをも採用することができる。
【００５７】
本発明において酵素反応は、有機溶媒系、水系、二相系またはエマルジョン系いずれでも実施できるが、反応原料の濃度を高め、生産性を高めるために、反応溶媒として、水と実質的に混和しない有機溶媒を用いることが好ましい。ここで水系は本発明のＨＮＬを含有する水溶液または緩衝液でクエン酸Ｎａ緩衝液やリン酸緩衝液がその例である。また、ここで、「水と実質的に混和しない有機溶媒」とは、水に任意の割合で溶解する溶媒を除く有機溶媒を意味する。有機溶媒としては、水と実質的に混和せず、基質および生成物を充分に溶解し、酵素反応に悪影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができる。このような有機溶媒は、原料のアルデヒドまたはケトンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。
【００５８】
水と実質的に混和しない有機溶媒としては、具体的には、ハロゲン化されていてもよい炭化水素系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状または環状の飽和または不飽和脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素）、例えば、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン、塩化メチレン、クロロホルムなど；ハロゲン化されていてもよいアルコール系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状または環状の飽和または不飽和脂肪族アルコール、アラルキルアルコール）、例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ−アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよいエーテル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状または環状の飽和または不飽和脂肪族エーテル、芳香族エーテル）、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど；ハロゲン化されていてもよいエステル系溶媒（例えば、直鎖状、分岐状または環状の飽和または不飽和脂肪族エステル、芳香族エステル）、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル等が挙げられ、これらを単独で用いてもまた２種以上を混合して用いてもよい。特に、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチルを用いるのが好ましい。
【００５９】
前記有機溶媒は、水または水性緩衝液で飽和されているのが好ましい。ここで水性緩衝液としては、特に制限はないが、酵素活性の最適ｐＨ（ｐＨ４〜７）の付近において緩衝能を発揮する緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ−フタル酸、コハク酸などの塩等によって構成される緩衝液等が好ましく用いられる。
【００６０】
本発明において、酵素、基質およびシアノ基供与体の使用量、反応温度は、用いる基質に応じて適宜決定される。通常、酵素の使用量は基質であるカルボニル化合物５０ｍｍｏｌに対して２５０〜１００，０００単位、好ましくは５００〜５０，０００単位である。
【００６１】
本明細書において、当該酵素（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの活性１単位は、（Ｒ）−マンデロニトリル（アルドリッチ製）を基質として１分間に１μｍｏｌのベンズアルデヒドを遊離する酵素量を１Ｕと定義した。測定方法は２０℃に保温した０．２Ｍクエン酸−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ５．５）７ｍｌに０．９３１μｌのＲ−マンデロニトリルを添加混合し、３ｍｌずつ測定セルと対照セルに分注し、分光光度計の２０℃に保温したセルホルダーの測定側と対照側にセット後、濃縮酵素液を１０μｌ添加して３０秒間の２４９．６ｎｍの吸光度変化からベンズアルデヒドの２４９．６ｎｍでのモル吸光係数１２３５０（Ｍ−１・ｃｍ−１）を用いて容量活性（Ｕ／ｍｌ）を算出した。カルボニル化合物の濃度は通常０．０１〜１０ｍｏｌ／Ｌの範囲に設定し、シアノ基供与体は用いるカルボニル化合物に対して１〜１０倍モル、好ましくは１〜５倍モル、より好ましくは１〜３倍モルの濃度で添加する。本反応は基質濃度によって酵素活性および反応速度が変化するので、用いるカルボニル化合物の種類に応じて基質濃度を適宜決定する。反応時間は、基質であるカルボニル化合物の転換率が８０％以上、好ましくは９０％以上に達するまでの時間が適当であるが、これに限定されない。反応温度は酵素の活性が十分発揮される温度であればよく、通常０〜４０℃、好ましくは４〜３０℃である。
【００６２】
反応系において、回分式で反応を行う場合には、撹拌などにより、酵素が反応系内に分散するようにする。カラムなどに固定化酵素を充填して反応を行う場合には、基質を含む溶液を適当な流速でカラムに流入させ、流出液を採取することで実施できる。回分反応の場合には、反応が完結した時点で混合を止め、生産物が溶解している有機相を常法により取り出すことで生産物を回収できる。これらの酵素は初回と同じ方法で調製した基質を含む溶液と混合することによって再使用することができる。
【００６３】
酵素反応終了後のシアノヒドリンを含む反応液からの反応溶媒および未反応のシアノ基供与体の回収は、蒸留等の操作をすることにより行うことができる。蒸留は、シアノヒドリンが高温では不安定であるため、常圧高温下で実施するよりも、比較的低い温度で減圧下で実施することが好ましい。また、この蒸留操作においては、公知のシアノヒドリンの安定化剤を添加することもできる。安定化剤としては蒸留ボトムを酸性に維持できるものであればよく、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸などの有機酸、硫酸などの無機酸などをシアノヒドリンに対して１／２００〜１／１０モル添加することで実施できる。
【００６４】
以下、本発明を実施例を参照することにより詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例の範囲に限定されない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：アーモンド（アーモンドの葉）からのゲノムＤＮＡの単離
アーモンドの木（日本、奈良県で採取）を採取後、−２０℃で冷凍した。凍結破砕器具ＳＫミル  ＳＫ−２００（有限会社  トッケン製）を使用して凍結破砕処理を行った。方法は添付マニュアルに従った。まず、アーモンドの葉（以下試料と略す）の部分のみを４０ｍｇ量りとり、１．５ｍｌサンプルチューブに入れた。次にサンプルチューブをチューブホルダーにセットし、液体窒素中に入れて凍結処理をした。続いてチューブホルダーをアウターケースに入れて手で３０秒間上下に振り試料を破砕した。約４０ｍｇの微粉末試料が得られた。
【００６６】
得られた微粉末全量から、「Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。方法はマニュアルに従って以下のように処理した。まず、微粉末試料４０ｍｇを６００μｌのＮｕｃｌｅｉ  Ｌｙｓｉｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎに懸濁した。１〜３秒間激しく攪拌し、６５℃で１５分間インキュベートした。ＲＮａｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを３μｌ加え、ゆっくり攪拌し、３７℃で１５分間インキュベートした。反応液を室温まで戻し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μｌ加え、２０秒間激しく攪拌した。１５，０００ｇ、室温で３分間遠心分離し、上清を回収した。イソプロパノールを６００μｌ加え、攪拌し、１５，０００ｇ、室温で１分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物に７０％エタノールを６００μｌ加え、１５，０００ｇ、室温で１分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿を真空乾燥機で乾燥させ、ＤＮＡ  Ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ加え、６５℃で１時間インキュベーションし、ゲノムＤＮＡを溶解した。得られたゲノムＤＮＡ溶液は冷蔵庫にて保管した。この結果、アーモンドの葉４０ｍｇから約１８μｇのゲノムＤＮＡが得られた。
【００６７】
実施例２：既知アメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子に相同なアーモンドＤＮＡのゲノムＤＮＡ区分の増幅とクローニング
サクラ属植物には互いに高度に相同な配列を持つ多数のヒドロキシニトリルリアーゼイソ酵素を見出しうることが知られているので（非特許文献１、前掲）、アメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子の配列相同性に基づく以下の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを作成した。プライマー１には制限酵素ＥｃｏＲＩサイト、プライマー２にはＮｏｔＩサイトを付加してある。
プライマー１（配列番号１６）
５’−ＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＡＴＡＣ−３’
プライマー２（配列番号１７）
５’−ＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’。
【００６８】
増幅は、「Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ」（タカラバイオ製）を使用した。マニュアルに従ってＰｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ溶液１０μｌに、テンプレートとして１７８ｎｇのアーモンドゲノムＤＮＡ、９７ｎｇのプライマー１および９０ｎｇのプライマー２を加え、滅菌水で２０μｌにした混合溶液を作成した。９８℃で３０秒間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９８℃で３０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１分）を行い、完全な産物を得るために７２℃で１０分の最終インキュベーションを行った。このＰＣＲにより、約２．１ｋｂの大きさ（アガロースゲル電気泳動を使った分析によって決定）のＤＮＡ断片が生成した。
【００６９】
得られたＰＣＲ反応液を使用して「ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でｐＣＲ４−ＴＯＰＯへ組み込み、ケミカルコンピテントセル「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α」（東洋紡績製）へ形質転換した。方法はマニュアルに従い、以下のように行った。まず、ＰＣＲ反応液１．５μｌに滅菌水を２．５μｌ、Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１μｌ、ＴＯＰＯベクターを１μｌ加え（トータル６μｌ）、室温で５分間インキュベートし、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯとのライゲーションを行った。インキュベーション後の反応液は氷上にて保管した。続いて、１００μｌのケミカルコンピテントセル、Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを氷上にて融解し、氷上で保管しておいた反応液４μｌを混合した。氷上にて３０分間インキュベーション後、４２℃で３０秒、氷上２分間のヒートショックを行い、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を添加した。３７℃で１時間振とう培養を行い、適量をＬＢ−Ａｍｐ（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）プレート（上記培地に１５％のアガロースを添加し作成する）にまいた。３７℃で一晩インキュベーションした。
【００７０】
得られたコロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌにて一晩培養し、プラスミド抽出した。プラスミド抽出は、「Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いた。得られたプラスミドを用いてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してＰＣＲに使用した２つのプライマーから出発するプライマーウォーキング法で配列決定した。得られた全長２１２２塩基対のクローニングされた配列を図１に示した（配列番号１８）。また、ここで得られた配列を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターをｐＴＯＰＯＰａＲＨＮＬ１Ｇｅｎとした。
【００７１】
実施例３：プライマー１および２を使ったＰＣＲ増幅によって得られるアーモンドゲノムＤＮＡ断片の配列解析
ＰＣＲ増幅し配列決定したＤＮＡは、核酸配列でアメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子前駆体（ここではイントロン込みの配列；Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｕ７８８１４、Ｈｕ，Ｚ．  ａｎｄ  Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９６））と相同性９７％と判明した。この配列との比較によりイントロン領域を決定した。
【００７２】
読み枠は＋１２位のＡＴＧコドンで始まり、＋２１０９位の停止コドンで終わる。コード領域は、１２〜１１３位（エキソンＩ）、２５１〜９０６位（エキソンＩＩ）、１０４８〜１８９６位（エキソンＩＩＩ）および２０２５〜２１０９位（エキソンＩＶ）である。これらを一つに繋いだ配列を図２（配列番号１）に示した。
【００７３】
組み立てられた図２のＤＮＡ配列は５６３アミノ酸のタンパク質をコードし、分子量計算値は６１．１ｋＤａ、またはＮ末端加工型の場合は５８．０ｋＤａである。ペプチド質量は遺伝子情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）を使って計算した。このタンパク質をＰａＲＨＮＬ１と名づけた。オープンリーディングフレーム（イントロン無し）について推定されるタンパク質のアミノ酸配列を図３（配列番号１０）に示した。
【００７４】
アメリカザクラ由来のＭｄｌ１（ＰｓＭＤＬ１と略する）（非特許文献２、前掲）との相同性は９６％であった。この相同性を使ってＳ２７とＬ２８の間に切断部位を持つ切断可能なシグナル配列を同定した。今回取得できたアーモンド由来の新規ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）遺伝子をｒｈｎｌ１とした。
【００７５】
実施例４：ＰＣＲによるイントロンを含まないアーモンド由来ｒｈｎｌ１遺伝子の取得
オーバーラップしたプライマーを用いるＰＣＲ法を使って、エキソン断片を作成する４回のＰＣＲ反応とエキソン断片を連結する２段階のＰＣＲ反応により、コード領域を互いに連結した（図４参照）。
【００７６】
１段目のエキソン断片を作成するＰＣＲでは、それぞれプライマー対をプライマー１／プライマー３（エキソンＩ）、プライマー４／プライマー５（エキソンＩＩ）、プライマー６／プライマー７（エキソンＩＩＩ）、プライマー８／プライマー２（エキソンＩＶ）、としてエキソン部分の４断片を増幅した。
プライマー：
プライマー３（配列番号１９）
５’−ＣＧＴＡＴＧＣＡＡＡＧＧＴＣＡＧＧＴＡＧＣＴＡＡＡＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＧＣＡＡＧＣＧ−３’
プライマー４（配列番号２０）
５’−ＣＴＣＧＣＴＴＧＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＧ−３’
プライマー５（配列番号２１）
５’−ＧＡＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＣＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＴＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’
プライマー６（配列番号２２）
５’−ＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＴＣＡＴＡＴＡＣＡＧ−３’
プライマー７（配列番号２３）
５’−ＧＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＣＡＧＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＡＣＡＴＡＣＣＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴＣＡＧＡＴＡＧＡＡＧＣ−３’
プライマー８（配列番号２４）
５’−ＣＴＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＡＧＧＧＡＧＧＴＡＴＧＴＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＧ−３’
【００７７】
増幅には、「ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（東洋紡績製）を使用した。マニュアルに従って２７９μｌの滅菌水に、４０μｌの１０×ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ＃１、４０μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス、１６μｌの２５ｍＭ塩化マグネシウム溶液、各１６０ｐｍｏｌの適当なプライマー、テンプレートとして１μｌの２００ｎｇ／μｌの濃度のプラスミドｐＴＯＰＯＰａＲＨＮＬ１Ｇｅｎを添加混合後、８μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加（全量４００μｌ）し、混合溶液を作成した。９４℃で３０秒間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分）を行った。このＰＣＲにより、それぞれエキソンＩ（約１４０ｂｐ）、エキソンＩＩ（約７１０ｂｐ）、エキソンＩＩＩ（約９００ｂｐ）、エキソンＩＶ（約１２０ｂｐ）断片を作成した。
【００７８】
このＰＣＲで得られた４断片はそれぞれ１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行い、目的サイズの断片を切り出し、「Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）でゲルから抽出精製し、２段目のＰＣＲのテンプレートとして用いた。
【００７９】
２段目のエキソン断片を連結するＰＣＲでは、プライマー対をプライマー１／プライマー２としてエキソン部分の４断片を連結増幅した。
【００８０】
増幅は、「ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（東洋紡績製）を使用した。マニュアルに従って２７６μｌの滅菌水に、４０μｌの１０×ＫＯＤ  ｂｕｆｆｅｒ  ＃１、４０μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス、１６μｌの２５ｍＭ塩化マグネシウム溶液、各１６０ｐｍｏｌのプライマー、テンプレートとしてそれぞれ１μｌの５０ｎｇ／μｌの濃度のエキソン断片４種を添加混合後、８μｌのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加（全量４００μｌ）し、混合溶液を作成した。９４℃で３０秒間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７４℃で１分）を行った。このＰＣＲにより、それぞれエキソンＩ（約１４０ｂｐ）、エキソンＩＩ（約７１０ｂｐ）、エキソンＩＩＩ（約９００ｂｐ）、エキソンＩＶ（約１２０ｂｐ）断片を連結増幅して図２の配列を含むＤＮＡ断片を作成した。
【００８１】
このＰＣＲで得られた断片は１％のアガロースゲルを用いた電気泳動を行い、目的サイズの約１７００ｂｐであることを確認した。この断片を切り出し、「Ｗｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）でゲルから抽出精製した。
【００８２】
次にｐＣＲ４−ＴＯＰＯにクローニングするためにＰＣＲ産物精製物にＡ末端を付加させた（ＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで増幅したのでＡ付着末端がない）。方法は以下に従った。１０μｌの２０ｎｇ／μｌの濃度のＰＣＲ産物精製物に「Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ」（タカラバイオ製）の１０μｌのＰｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ溶液を混合し７２℃、２０ｍｉｎインキュベートした。
【００８３】
実施例２と同様に得られた反応液を使用して「ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でｐＣＲ４−ＴＯＰＯへ組み込み、ケミカルコンピテントセル「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α」（東洋紡績製）へ形質転換した。得られたコロニーをＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌにて一晩培養し、プラスミド抽出し、得られたプラスミドのシークエンスが図２と１００％同じである配列を含むことを確認した。このクローンをｐＴＯＰＯＰａＲＨＮＬ１ＯＲＦとした。
【００８４】
実施例５：ピキア・パストリスにおけるｒｈｎｌ１遺伝子の異種発現用の発現カセットの構築
Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いてピキア・パストリスにおいてアーモンド由来ｒｈｎｌ１遺伝子を異種発現させるための発現カセットを作成した。発現カセットにはメタノールでの誘導発現で酵素を分泌させるためのシグナル配列にα−ファクターのシグナル配列を採用しているｐＰＩＣ９Ｋベクターを用いた。方法は以下に従った。まず、ｐＰＩＣ９Ｋにアーモンド由来ｒｈｎｌ１遺伝子をアーモンド由来のシグナル配列を除いた形で制限酵素サイトＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを介してクローニングするためにｐＴＯＰＯＰａＲＨＮＬ１ＯＲＦをテンプレートとしてプライマー９とプライマー１０を用いてＰＣＲ反応を行った。増幅には正確性の高い、「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（東洋紡績製）を使用した。マニュアルに従って２７９μｌの滅菌水に、４０μｌの１０×ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ、４０μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス、１６μｌの２５ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、各１６０ｐｍｏｌのプライマー、テンプレートとして１μｌの５０ｎｇ／μｌの濃度のｐＴＯＰＯＰａＲＨＮＬ１ＯＲＦを添加混合後、８μｌのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加（全量４００μｌ）し、混合溶液を作成した。９４℃で２分間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分）を行った。ＰＣＲ反応で増幅した当該断片はプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ切断部位を介してクローニングした。ベクター部分から組み込まれたｒｈｎｌ１断片の移行が正しいことを、配列決定によって確認した。形成されたピキア・パストリスにおける発現用のプラスミドを、ｐＰＩＣ９ＫＰａＲＨＮＬ１ａと名づけた。
プライマー９（配列番号２５）
５’−ＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＣＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＡＴＧ−３’
プライマー１０（配列番号２６）
５’−ＧＧＧＧＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣ−３’
【００８５】
実施例６：ピキア・パストリスにおけるアーモンド由来ｒｈｎｌ１遺伝子の発現試験
プラスミドｐＰＩＣ９ＫＰａＲＨＮＬ１αのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで切断し、ピキア・パストリスＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に形質転換した。形質転換はＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のプロトコールに従って行った。
【００８６】
ヒスチジン栄養要求性クローンをＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のプロトコールに従って液体培地ＢＭＧ２０ｍｌで振盪培養し、培地をＢＭＭに変更し、メタノールで１２０時間誘導した。細胞を遠心分離によって取り除き、培養上清を限外ろ過し、濃縮酵素液とした。
【００８７】
これらの振とうフラスコ実験で培養上清中に最も高い活性を示したクローン（ピキア・パストリスＰａＨＮＬａ６−４、メタノール資化性は良好（Ｍｕｔ＋））では濃縮液の容量活性は３７．６Ｕ／ｍｌであった。これによってＰｓＭＤＬ１型のＲＨＮＬ活性を有するアーモンド由来タンパク質の発現に初めて成功した。
【００８８】
実施例７：ウメ（ウメの仁）からのＴｏｔａｌＲＮＡの抽出
ウメ（日本、茨城県つくば市で採取）の木から実を採取後、直ちに液体窒素にて凍結させた。完全に凍結させた後、破砕し、種の仁の部分を回収した。回収した仁は、液体窒素を使って、乳鉢の中ですり潰した。得られた微粉末を用い、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。
【００８９】
方法はマニュアルに従い以下のように行った。凍結乾燥させた組織を１００ｍｇ量りとり、融解させないように注意しながら、直ちにＴＲＩｚｏｌを１ｍｌ添加した。ｖｏｒｔｅｘにて激しく攪拌し、十分に懸濁させた。１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清にクロロホルムを２００μｌ添加し、十分に攪拌した。１２，０００ｇで１５分間遠心分離し、水層部分を回収した。イソプロパノールを５００μｌ加え、攪拌し、室温にて１０分間インキュベーションした。１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿物に７０％エタノールを１ｍｌ加え、洗浄した。１２，０００ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿物を乾燥させ、ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅの滅菌水４０μｌで溶解させた。保存は−３０℃で行った。約７５μｇのｔｏｔａｌＲＮＡを取得できた。
【００９０】
実施例８：ウメ（ウメの仁）のＴｏｔａｌＲＮＡからのｍＲＮＡの単離
得られたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ４０μｇから「ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  III」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いてｍＲＮＡを単離した。単離の方法は以下に従った。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液を６５℃で１０分間インキュベーションした。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ−Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｐｒｏｂｅ  ３μｌと、２０×ＳＳＣ  １３μｌを添加し、穏やかに混合した。室温で１０分程度放置し、溶液の温度を室温に戻した。室温に戻す間に、ＳＡ−ＰＭＰｓの洗浄を行った。チューブ内のＳＡ−ＰＭＰｓを再溶解させ、磁石のスタンドを用い、溶液のみ除去した。０．５×ＳＳＣ  （２０×ＳＳＣ  ３０μｌ  ＋  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  １．１７０μｌ）の溶液３００μｌで同様に３回洗浄を行い、最後に０．５×ＳＳＣの溶液１００μｌに溶解させておいた。室温まで戻した溶液をＳＡ−ＰＭＰｓ溶液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベート中は１〜２分ごとに転倒混和し、穏やかに混合した。ＳＡ−ＰＭＰｓ磁石のスタンドに置き、上清のみを除去した。ＳＡ−ＰＭＰｓに０．１×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ  ７μｌ  ＋  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  １．３９３μｌ）を３００μｌ添加し、洗浄した。洗浄は４回行い、毎回磁石のスタンドを用いて洗浄液を除去した。ここで、最後の洗浄時には出来るだけ洗浄液が残らないようにした。ＳＡ−ＰＭＰｓにＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ  １００μｌ添加し、再溶解（ｍＲＮＡの溶出）をさせ、磁石のスタンドに置いた。溶液を回収し、さらにＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅ  １５０μｌ添加し、同様に溶液を回収した。
【００９１】
得られたｍＲＮＡは濃度が薄かったため、「ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ製）を使用して溶液の濃縮を行った。濃縮の方法は以下に従った。ｍＲＮＡ溶液２００μｌにＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴを７００μｌ添加し、十分に混和した。５００μｌのエタノールを添加し、ピペッティングにより完全に混和した。２ｍｌコレクションチューブにセットしたＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにサンプル７００μｌをアプライし、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離した。カラムを通過した溶液を捨て、残り２００μｌも同様に遠心分離し、溶液を除去した。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎに５００μｌの８０％エタノールを添加し、１０，０００ｇで２分間遠心分離した。通過した溶液を除去し、ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しいコレクションチューブにセットした。この状態でさらに１０，０００ｇで５分間遠心分離を行い、カラムを乾燥させた。このとき、カラムのフタは完全に開けておいた。ＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを１．５ｍｌのコレクションチューブにセットし、１４μｌのＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒをアプライした。チューブのフタを閉め、１５，０００ｇで１分間遠心分離し、ｍＲＮＡを溶出させた。
【００９２】
実施例９：ウメ（ウメの仁）のｍＲＮＡからのｃＤＮＡの合成
実施例８で濃縮したｍＲＮＡ溶液を使用し、逆転写反応によって一本鎖ｃＤＮＡを合成した。逆転写反応には、「Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  III」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を使用した。方法はキットプロトコールに従って以下のように行った。プライマーは添付の５０ｍＭ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０を使用した。ｍＲＮＡ溶液５μｌに１μｌの５０μＭ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ、３μｌのＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒ（トータル１０μｌ）を混合し、６５℃で５分、氷上１分間のヒートショックを行った。当該溶液に２μｌの１０×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ、４μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２μｌの０．１Ｍ  ＤＴＴ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  III（２００Ｕ／μｌ）をさらに添加し、混合した。５０℃で５０分間インキュベーションを行った。反応を停止するために、８５℃で５分、氷上に静置した。ＲＮＡの分解のため、ＲＮａｓｅＨを１μｌ添加し、３７℃で２０分間インキュベーションした。−３０℃で保存した。
【００９３】
実施例１０：既知アメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子に相同なウメｃＤＮＡ区分の増幅とクローニング
ウメもサクラ属植物であるので、実施例２と同様にプライマー１、プライマー２を用いてＰＣＲで既知アメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子に相同性の高い新規ウメ（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＲＨＮＬ）の取得を検討した。増幅には、「Ｐｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ」（タカラバイオ製）を使用した。マニュアルに従ってＰｒｅｍｉｘ  Ｔａｑ溶液１０μｌに、テンプレートとして実施例９で作成した１μｌのｃＤＮＡ溶液、それぞれ２０ｐｍｏｌのプライマーを加え、滅菌水で２０μｌにした混合溶液を作成した。９４℃で２分間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分）を行った。このＰＣＲにより、約１．７ｋｂの大きさ（アガロースゲル電気泳動を使った分析によって決定）のＤＮＡ断片が生成した。
【００９４】
得られたＰＣＲ反応液を使用して「ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でｐＣＲ４−ＴＯＰＯへ組み込み、ケミカルコンピテントセル「Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α」（東洋紡績製）へ形質転換した。方法はマニュアルに従い、以下のように行った。まず、ＰＣＲ反応液１．５μｌに滅菌水を２．５μｌ、Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１μｌ、ＴＯＰＯベクターを１μｌ加え（トータル６μｌ）、室温で５分間インキュベートし、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯとのライゲーションを行った。インキュベーション後の反応液は氷上にて保管した。続いて、１００μｌのケミカルコンピテントセル  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｈｉｇｈ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを氷上にて融解し、氷上で保管しておいた反応液４μｌを混合した。氷上にて３０分間インキュベーション後、４２℃で３０秒、氷上２分間のヒートショックを行い、９００μｌのＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、１０ｍＭ塩化ナトリウム、２．５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸マグネシウム、１０ｍＭ塩化マグネシウム、２０ｍＭグルコース）を添加した。３７℃で１時間振とう培養を行い、適量をＬＢ−Ａｍｐ（１％トリプトン、０．５％イーストエクストラクト、１％塩化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）プレート（上記培地に１５％のアガロースを添加し作成する）にまいた。３７℃で一晩インキュベーションした。
【００９５】
得られたコロニー２０株をＬＢ−Ａｍｐ培地５ｍｌにて一晩培養し、プラスミド抽出した。プラスミド抽出は、「Ｗｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いた。得られたプラスミドを用いてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用してＰＣＲに使用した２つのプライマーから出発するプライマーウォーキング法で配列決定した。結果として８種類の全長１７１３塩基対の配列が得られ、配列番号２〜９として、それぞれ図５〜１２に示した。得られたウメ由来の新規ｒｈｎｌ遺伝子をウメ由来ｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２、ｒｈｎｌ３、ｒｈｎｌ４、ｒｈｎｌ５、ｒｈｎｌ６、ｒｈｎｌ７、ｒｈｎｌ８とした。また、ここで得られた配列を含むｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターをｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ１、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ２、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ３、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ４、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ５、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ６、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ７、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ８とした。
【００９６】
実施例１１：プライマー１および２を使ったＰＣＲ増幅によって得られるウメｃＤＮＡ断片の配列解析
ＰＣＲ増幅し配列決定した８種のＤＮＡ配列は、＋４６２位、＋７２３位、＋８１５位、＋９３５位、＋９７７位、＋１５７１位、＋１５７４位の７箇所の配列だけが異なり、それぞれ箇所は２種類の違う配列であった。その組み合わせで８種類の配列が得られた。このうち＋４６２位、＋７２３位、＋８１５位以外の４箇所はアミノ酸配列としては、どちらでも同じ残基になる。すなわち、アミノ酸配列としてはＰｍＲＨＮＬ１のオープンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列（図１３；配列番号１１）、ＰｍＲＨＮＬ２のオープンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列（図１４；配列番号１２）、ＰｍＲＨＮＬ３のオープンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列（図１５；配列番号１３）、ＰｍＲＨＮＬ４のオープンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列（図１６；配列番号１４）、ＰｍＲＨＮＬ５のオープンリーディングフレームに対応するアミノ酸配列（図１７；配列番号１５）の５配列になる（ウメ由来ｒｈｎｌ６遺伝子がコードするタンパク質はＰｍＲＨＮＬ２と同等であり、ウメ由来ｒｈｎｌ７遺伝子およびｒｈｎｌ８遺伝子がコードするタンパク質はＰｍＲＨＮＬ１と同等であった）。分かりやすく以下の表にまとめた。
【００９７】
【表１】
2008113601.tif 000002
【００９８】
５種類のアミノ酸配列とアメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子前駆体（ここではイントロン込みの配列；Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｕ７８８１４、Ｈｕ，Ｚ．ａｎｄ  Ｐｏｕｌｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．（１９９６））と相同性は９６％と判明した。この相同性を使ってＳ２７とＬ２８の間に切断部位を持つ切断可能なシグナル配列を同定した。
【００９９】
図５〜９のＤＮＡ配列は５６２アミノ酸のタンパク質をコードし、分子量計算値は６１．０ｋＤａ、またはＮ末端加工型の場合は５７．９ｋＤａである。ペプチド質量は遺伝子情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ  Ｖｅｒ．７（ゼネティックス製）を使って計算した。
【０１００】
実施例１２：ピキア・パストリスにおけるウメ由来ｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２遺伝子の異種発現用の発現カセットの構築
５種類の遺伝子のうち特徴的なｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２の２種に関して実施例５と同様にＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて異種発現させるための発現カセットを作成した。発現カセットにはメタノールでの誘導発現で酵素を分泌させるためのシグナル配列にα−ファクターのシグナル配列を採用しているｐＰＩＣ９Ｋベクターを用いた。方法は以下に従った。まず、ｐＰＩＣ９Ｋにそれぞれウメ由来ｒｈｎｌ１遺伝子、ｒｈｎｌ２遺伝子をウメ由来のシグナル配列を除いて制限酵素サイトＥｃｏＲＩとＮｏｔＩを介してクローニングするためにそれぞれｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ１、ｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ２をテンプレートとしてプライマー９とプライマー１０を用いてＰＣＲ反応を行った。増幅には正確性の高い、「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」（東洋紡績製）を使用した。マニュアルに従って２７９μｌの滅菌水に、４０μｌの１０×ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ、４０μｌのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）ミックス、１６μｌの２５ｍＭ硫酸マグネシウム溶液、各１６０ｐｍｏｌのプライマー、テンプレートとして１μｌの５０ｎｇ／μｌの濃度のｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ１またはｐＴＯＰＯＰｍＲＨＮＬ２を添加混合後、８μｌのＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加（全量４００μｌ）し、混合溶液を作成した。９４℃で２分間の変性工程から出発して、３０サイクルの増幅（９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分）を行った。ＰＣＲ反応で増幅した当該断片はプラスミドｐＰＩＣ９Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩ切断部位を介してクローニングした。ベクター部分から組み込まれたＨＮＬ断片への移行が正しいことを、配列決定によって確認した。形成されたピキア・パストリスにおける発現用のプラスミドをそれぞれｐＰＩＣ９ＫＰｍＲＨＮＬ１ａ、ｐＰＩＣ９ＫＰｍＲＨＮＬ２ａと名づけた。
【０１０１】
実施例１３：ピキア・パストリスにおけるウメ由来ｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２遺伝子の発現試験
プラスミドｐＰＩＣ９ＫＰｍＲＨＮＬ１ａ、ｐＰＩＣ９ＫＰｍＲＨＮＬ２ａのＤＮＡをそれぞれ制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで切断し、ピキア・パストリスＧＳ１１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に形質転換した。形質転換はＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のプロトコールに従って行った。
【０１０２】
ヒスチジン栄養要求性クローンをＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のプロトコールに従って液体培地ＢＭＧ２０ｍｌで振盪培養し、培地をＢＭＭに変更し、メタノールで１２０時間誘導した。細胞を遠心分離によって取り除き、培養上清を限外ろ過し、濃縮酵素液とした。
【０１０３】
これらの振とうフラスコ実験で培養上清中に最も高い活性を示したクローンとしてＰｍＲＨＮＬ１では、ピキア・パストリスＰｍＲＨＮＬａ１−３株（メタノール資化性は良好でＭｕｔ＋）では濃縮液の容量活性は１６．８Ｕ／ｍｌであった。これに対し、ＰｍＲＨＮＬ２ではピキア・パストリスＰｍＲＨＮＬａ２−４株（メタノール資化性は良好でＭｕｔ＋）では濃縮液の容量活性は３４．４Ｕ／ｍｌであった。これによってウメ由来のＰｓＭＤＬ１型のＲＨＮＬ活性を有する組換えタンパク質の発現に初めて成功した。
【０１０４】
実施例１４：ウメ由来ｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２遺伝子の３’末端のアミノ酸配列の解析
ウメのｍＲＮＡから取得したＰｓＭＤＬ１型配列のｒｈｎｌ１、ｒｈｎｌ２は、配列を取得する際に、ＰｓＭＤＬ１の末端配列をＰＣＲのプライマーとして使用したため、両末端の配列はアメリカザクラ由来ｍｄｌ１遺伝子のものとなっている。正確なウメの末端配列を調べるために、３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、３’末端配列の増幅を行った。配列決定に必要となるウメに特異的に結合するプライマーは、既知の内部配列から作成した。プライマー１１はプライマー１２より５’側の配列である。
プライマー１１（配列番号２７）
５’−ＣＧＡＴＧＧＴＴＣＴＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＣＡＴＣＣ−３’
プライマー１２（配列番号２８）
５’−ＣＧＡＧＣＧＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＴＧＧＴＧ−３’
【０１０５】
方法はキット付属のマニュアルに従って行い、ｍＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡを作成、その後、まず、プライマー１１とキット付属のプライマーＡＵＡＰでＰＣＲを行って遺伝子を増幅、さらに増幅された遺伝子をプライマー１２とキット付属のプライマーＡＵＡＰでＰＣＲを行い、３’末端付近を含む断片を増幅した。この断片を常法にしたがい、プラスミドにクローニングし、遺伝子配列を確認した。結果としてｒｈｎｌ１，ｒｈｎｌ２いずれの遺伝子も図１３、１４の５６０番目のロイシンがフェニルアラニン、５６２番目のロイシンがフェニルアラニンであることが判明した。３’末端は酵素の性質や発現にはそれほど必要とは考えられないので実施例１３の発現試験では図１３、図１４の配列のまま発現試験を行った。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】アーモンドの葉から得られた全長２１２２塩基対のゲノム（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】図１に示される塩基配列のコード領域を一つに繋いだ配列を示す。
【図３】図２に示される塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】オーバーラップしたプライマーを用いるＰＣＲ法を使って、エキソン断片を作成する４回のＰＣＲ反応とエキソン断片を連結する２段階のＰＣＲ反応により、コード領域を互いに連結する方法の概要を示す。
【図５】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ１）。
【図６】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ２）。
【図７】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ３）。
【図８】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ４）。
【図９】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ５）。
【図１０】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ６）。
【図１１】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ７）。
【図１２】ウメの仁から得られた全長１７１３塩基対の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の塩基配列を示す（ウメ由来ｒｈｎｌ８）。
【図１３】ウメ由来（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰｍＲＨＮＬ１）のアミノ酸配列を示す。
【図１４】ウメ由来（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰｍＲＨＮＬ２）のアミノ酸配列を示す。
【図１５】ウメ由来（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰｍＲＨＮＬ３）のアミノ酸配列を示す。
【図１６】ウメ由来（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰｍＲＨＮＬ４）のアミノ酸配列を示す。
【図１７】ウメ由来（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＰｍＲＨＮＬ５）のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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