(57)【要約】      （修正有）【課題】非アミノ有機酸を効率よく発酵生産する細菌、及びそれを用いて非アミノ有機酸とそのポリマーを効率的に製造する方法を提供する。【解決手段】シトレートシンターゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、及びピルビン酸カルボキシラーゼの各酵素活性が増強するように改変された細菌、特にコリネ型、バチルス属、リゾビウム属細菌、または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で、有機原料に作用させて非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収することによって非アミノ有機酸を製造する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アミノ有機酸生産能を有し、シトレートシンターゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された細菌。
【請求項２】
さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて低減するように改変された請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株に比べて増強するように改変された請求項１または２に記載の細菌。
【請求項４】
さらに、アセテートキナーゼ、ホスフォトランスアセチラーゼ、ピルベートオキシダーゼおよびアセチルCoAハイドロラーゼからなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が非改変株に比べて低減するように改変された請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させて非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
【請求項７】
有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
有機原料がグルコースまたはシュークロースである請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
非アミノ有機酸がコハク酸である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の有機酸の製造方法。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び得られた非アミノ有機酸を重合させる工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な非アミノ有機酸生産菌およびそれを用いた非アミノ有機酸の製造に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum属、Actinobacillus属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１及び２、非特許文献１）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。
【０００３】
また、コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずに非アミノ有機酸を生産する方法も知られている（特許文献３及び４）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、非アミノ有機酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等、改善の余地があった。また、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増強させた細菌を用いた非アミノ有機酸の発酵生産などが報告されていたが（例えば、特許文献５参照）、シトレートシンターゼの活性を増強させた細菌を用いて非アミノ有機酸を製造することは、これまで報告されていなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８３４号公報
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号公報
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−１９６８８７号公報
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology (1999), 49,207-216
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、より生産効率の高い非アミノ有機酸の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、シトレートシンターゼの活性が増強するように改変された細菌あるいはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、有機原料の消費速度、コハク酸などの非アミノ有機酸の生成速度または収率が高まり、かつ、酢酸などの副生物が低下することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）非アミノ有機酸生産能を有し、シトレートシンターゼ活性が非改変株と比較して増強するように改変された細菌。
（２）さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が非改変株に比べて低減するように改変された（１）の細菌。
（３）さらに、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性が非改変株に比べて増強するように改変された（１）または（２）の細菌。
（４）さらに、アセテートキナーゼ、ホスフォトランスアセチラーゼ、ピルベートオキシダーゼおよびアセチルCoAハイドロラーゼからなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が非改変株に比べて低減するように改変された（１）〜（３）のいずれかの細菌。
（５）コリネ型細菌、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌からなる群より選ばれる、（１）〜（４）のいずれかの細菌。
（６）（１）〜（５）のいずれかの細菌または該細菌の処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する反応液中で有機原料に作用させて非アミノ有機酸を生成させ、該非アミノ有機酸を回収することを特徴とする非アミノ有機酸の製造方法。
（７）有機原料を嫌気的雰囲気下で作用させることを特徴する（６）の方法。
（８）有機原料がグルコースまたはシュークロースである（６）または（７）の方法。
（９）非アミノ有機酸がコハク酸である、（６）〜（８）のいずれかの有機酸の製造方法。
（１０）（６）〜（９）のいずれかの方法により非アミノ有機酸を製造する工程、及び得られた非アミノ有機酸を重合させる工程を含む、非アミノ有機酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、迅速かつ高効率でコハク酸などの非アミノ有機酸を製造することができる。得られた非アミノ有機酸は食品添加物や医薬品、化粧品等に用いることができる。また、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の細菌は、非アミノ有機酸生産能を有し、シトレートシンターゼの活性が増強するように改変された細菌である。以下、シトレートシンターゼをCSと表記することがある。
ここで、「非アミノ有機酸生産能を有する」とは、該細菌を培地中で培養したときに該培地中に非アミノ有機酸を生成蓄積することができることをいう。非アミノ有機酸はアミノ酸以外の有機酸を意味するが、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、クエン酸、イソクエン酸、２−オキソグルタル酸、シス−アコニット酸およびピルビン酸が好ましく、コハク酸が特に好ましい。
「CSの活性が増強した」とは、野生株などの非改変株と比較してCSの活性が増強したことを意味する。CSの活性は、非改変株と比較して、単位菌体重量当たり1.5倍以上増強されていることが好ましく、2倍以上増強されていることがより好ましい。
なお、CSはオキザロ酢酸をクエン酸に変換する反応を触媒する酵素であり、CS活性はMethods Enzymol. 13,3-11(1969)に記載された方法によって測定することができる。
【０００９】
本発明の細菌は、本来的に非アミノ有機酸生産能を有する細菌又は育種により非アミノ有機酸生産能を付与された細菌において、CS活性を増強させる改変を行ったものでもよいし、CS活性を増強させる改変を行うことにより非アミノ有機酸生産能を有するようになったものでもよい。育種により非アミノ有機酸生産能を付与する手段としては、変異処理、遺伝子組換え処理などが挙げられ、例えば、コハク酸生産能を付与する場合は、後述するようなラクテートデヒドロゲナーゼ活性を低減するような改変やピルビン酸カルボキシラーゼ活性を増強するような改変などが挙げられる。
【００１０】
本発明に用いる細菌は、以下に示すような細菌を親株として用い、該親株を改変するこ
とによって得ることができる。親株の種類は特に限定されないが、コリネ型細菌（coryneform bacterium）、バチルス属細菌、又はリゾビウム属細菌が好ましく、コリネ型細菌がより好ましい。
バチルス属細菌としては、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）等が挙げられ、リゾビウム属細菌としては、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）などが挙げられる。
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム属に属する細菌、ブレビバクテリウム属に属する細菌又はアースロバクター属に属する細菌が挙げられ、このうち好ましくは、コリネバクテリウム属又はブレビバクテリウム属に属するものが挙げられ、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）又はブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）に属する細菌が挙げられる。
【００１１】
上記細菌の親株の特に好ましい具体例としては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233（FERM BP-1497）、同MJ-233  AB-41（FERM BP-1498）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ATCC6872、コリネバクテリウム・グルタミカム  ATCC31831、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあることから（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、本発明においては、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株、及びその変異株MJ-233 AB-41株はそれぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムMJ-233株及びMJ-233 AB-41株と同一の株であるものとする。
ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233は、1975年4月28日に通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-3068として寄託され、1981年5月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-1497の受託番号で寄託されている。
【００１２】
本発明の方法において親株として用いられる上記細菌は、野生株だけでなく、ＵＶ照射やＮＴＧ処理等の通常の変異処理により得られる変異株、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。尚、上記遺伝子組み換え株の宿主としては、形質転換可能な微生物であれば、導入遺伝子と同じ属種であっても良いし、属種の異なるものであっても良いが、上述のような好気性細菌を宿主とするのが好ましい。
【００１３】
CSの活性の増強は、遺伝子組換え法、例えば、CSをコードする遺伝子のコピー数を高めること、またはこの遺伝子のプロモーターを置換することによって行うことができる。
cs遺伝子を用いてCS活性が増強するように改変する場合、用いることのできる遺伝子は、CS活性を有するタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、配列番号１５の塩基配列を有するブレビバクテリウム・フラバムMJ-233株由来の遺伝子（Cgl0829：BA000036の877838..879151）を挙げることができる。また、cs遺伝子は、CS活性を有するタンパク質をコードするものである限り、上記塩基配列の相補配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または上記塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAのようなホモログであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。
また、cs遺伝子は、配列番号１６のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０%以上、より好ましくは９５%以上、特に好ましくは９９%以上の相同性を有し、CS活性を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。
さらに、cs遺伝子は、配列番号１６のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、ＣＳ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、１または数個とは、好ましくは、１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個を意味する。
【００１４】
また、ブレビバクテリウム・フラバムMJ-233以外のコリネ型細菌、または他の微生物又は動植物由来のcs遺伝子を使用することもできる。微生物または動植物由来のcs遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、またはホモロジー等に基いてCS活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものなどを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。これらはハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法によりそのプロモーターおよびＯＲＦ部分を含む領域を増幅することによって、取得することができる。
【００１５】
CSの活性を高めるためには、例えば、上記のようなDNAを宿主微生物で機能しうるプラスミドに発現可能に組込み、宿主微生物に導入すればよい。
cs遺伝子を組み込むことができるプラスミドベクターとしては、宿主細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。コリネ型細菌に遺伝子を導入するために使用できるプラスミドの具体例としては、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。
【００１６】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００１７】
cs遺伝子を、上記したようなコリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)MJ-233株（FERM BP-1497）を形質転換することにより、cs遺伝子の発現が増加したコリネ型細菌が得られる。
形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）
等によって行うことができる。
また、CSの活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でcs遺伝子を多コピー化させることによって行うこともできる。
また、CSの活性の増強は、宿主染色体上でcs遺伝子のプロモーターを置換または改変することによっても行うことができる。プロモーター置換の方法としては、例えば、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69-73）が挙げられる。
【００１８】
上記組み換えプラスミドによる導入または染色体上への相同組換えにおいて、cs遺伝子を発現させるためのプロモーター、または染色体上のcs遺伝子のプロモーターを置換するために使用するプロモーターは、宿主細菌で機能しうるものであれば特に制限されないが、嫌気的条件下で転写活性が抑制されないプロモーターが好ましく、例えば、大腸菌で用いられるtacプロモーターや、trcプロモーターなどが挙げられる。
このように、プロモーターを適宜選択することによって、cs遺伝子の発現量の調節が可能である。
以上、コリネ型細菌を用いる例を述べたが、他の細菌を用いる場合も同様の方法によって、CSの活性増強を達成することができる。
【００１９】
本発明の細菌は、CSの活性増強に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDHともよぶ）活性が低減するように改変された細菌であってもよい。ここで、「LDH活性が低減された」とは、非改変株と比較してLDH活性が低下していることをいう。LDH活性は、非改変株と比較して、単位菌体重量当たり１０％以下に低減化されていることが好ましい。また、LDH活性は完全に欠損していてもよい。LDH活性が低下したことは、公知の方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりLDH活性を測定することによって確認することができる。コリネ型細菌のLDH活性の低減した株の具体的な作製方法としては、特開平１１−２０６３８５号公報に記載されている染色体への相同組換えによる方法、あるいは、sacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）等が挙げられる。LDH活性が低減されcs遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌は、例えば、LDH遺伝子が破壊された細菌を作製し、該細菌をcs遺伝子を含む組換えベクターで形質転換することにより得ることができる。ただし、LDH活性低減のための改変操作とCSの活性増強のため改変操作はどちらを先に行ってもよい。
【００２０】
また、本発明に用いる細菌は、CSの活性増強に加えて、ピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、PCとも呼ぶ）の活性が増強するように改変された細菌であってもよい。「PC活性が増強される」とは、PC活性が野生株又は親株等の非改変株に対して、単位菌体重量あたり好ましくは1.5倍以上、より好ましくは3倍以上増加していることをいう。PC活性が増強されたことは、公知の方法（Magasanikの方法[J.Bacteriol., 158, 55-62, (1984)]）によりPC活性を測定することによって確認することができる。このような細菌は、例えば、cs遺伝子の発現増強されたコリネ型細菌に、pc遺伝子を導入することにより得ることができる。なお、PC活性の増強とCS活性増強のための改変操作はいずれの操作を先に行ってもよい。
【００２１】
pc遺伝子の導入は、上記cs遺伝子の導入と同様にして行うことができる。具体的には、例えば、特開平11-196888号公報に記載の方法と同様にして、pc遺伝子をコリネ型細菌中で高発現させることにより行うことができる。具体的なpc遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のpc遺伝子（Peters-Wendisch, P.G. et al. Microbiology, vol.144 (1998) ｐ915-927）（配列番号１７）などを用いることができる。また、pc遺伝子は、配列番号１７の塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA、または配列番号１７の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するDNAであって、PC活性を有するタンパク質をコードするDNAも好適に用いることができる。
さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム以外のコリネ型細菌、または他の微生物又は動植物由来のpc遺伝子を使用することもできる。特に、以下に示す微生物または動植物由来のpc遺伝子は、その配列が既知（以下に文献を示す）であり、上記と同様にしてハイブリダイゼーションにより、あるいはＰＣＲ法によりそのＯＲＦ部分を増幅することによって、取得することができる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］
【００２２】
さらに、本発明の細菌は、CS活性の増強に加えて、アセテートキナーゼ（以下、ACKとも呼ぶ）、ホスフォトランスアセチラーゼ（以下、PTAとも呼ぶ）、ピルベートオキシダーゼ（以下、POXBとも呼ぶ）およびアセチルCoAハイドロラーゼ（以下、ACHとも呼ぶ）からなる群より選ばれる１種類以上の酵素の活性が低減するように改変された細菌であってもよい。
【００２３】
PTAとACKはいずれか一方を活性低下させてもよいが、酢酸の副生を効率よく低減させるためには、両方の活性を低下させることがより好ましい。
「PTA活性」とは、アセチルCoAにリン酸を転移してアセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「PTA活性が低減するように改変された」とは、PTA活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。PTA活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、単位菌体重量当たり10％以下に低下していることがより好ましい。また、PTA活性は完全に消失していてもよい。PTA活性が低下したことは、Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969)）により、PTA活性を測定することによって確認することができる。
【００２４】
「ACK活性」は、アセチルリン酸とADPから酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACK活性が低減するように改変された」とは、ACK活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ACK活性は非改変株と比較して、菌体当たり30％以下に低下していることが好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることがより好ましい。また、ACK活性は完全に消失していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACK活性を測定することによって確認することができる。
【００２５】
なお、コリネバクテリウム・グルタミカム（ブレビバクテリウム・フラバムに分類されるものも含む）においては、Microbiology. 1999 Feb;145 (Pt 2):503-13に記載されているように、両酵素はｐｔａ−ａｃｋオペロン（GenBank Accession No. X89084）にコードされているため、pta遺伝子を破壊した場合は、PTA及びACKの両酵素の活性を低下させることができる。
【００２６】
PTAおよびACKの活性低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってこれらの遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、特開2006-000091号公報や後
述の実施例に開示された方法に従って行うことができる。pta遺伝子およびack遺伝子としては、上記GenBank Accession No. X89084の塩基配列を有する遺伝子のほか、宿主染色体上のpta遺伝子およびack遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有する遺伝子を用いることもできる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡであれば、相同組換えは起こり得る。
【００２７】
「POXB活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「POXB活性が低減するように改変された」とは、POXB活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。POXB活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。POXB活性が低下したことは、Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E. JR, J.Bacteriol.151,1279-1289(1982)）により、POXB活性を測定することによって確認することができる。
【００２８】
POXB活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってpoxB遺伝子を破壊することにより行うことができる。具体的には、WO2005/113745や後述の実施例に開示された方法に従って行うことができる。poxB遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2610（GenBank Accession No． BA000036の2776766-2778505番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のpoxB遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡであれば、相同組換えは起こり得る。
【００２９】
「ACH活性」は、アセチルCoAと水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ACH活性が低減するように改変された」とは、ACH活性が、非改変株、例えば野生株よりも低くなったことをいう。ACH活性は非改変株と比較して、単位菌体重量当たり30％以下に低下していることが好ましく、10％以下に低下していることがより好ましい。尚、「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。ACH活性は、Gergely,J.,らの方法（Gergely,J., Hele,P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334）により測定することが出来る。
【００３０】
ACH活性の低下は、公知の方法、例えば、相同組換えを利用する方法やsacB遺伝子を用いる方法（Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73）に従ってach遺伝子を破壊することによって行うことができる。具体的には、WO2005/113744や後述の実施例に開示された方法に従って行うことができる。ach遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No．Cgl2569（GenBank Accession No．BA000036の2729376..2730917番目の相補鎖）の塩基配列を有する遺伝子が挙げられるが、宿主細菌の染色体ＤＮＡ上のach遺伝子と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、該配列の相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡであれば、相同組換えは起こり得る。
【００３１】
なお、本発明において使用する細菌は、CS活性を増強する改変に加え、上記改変のうちの2種類以上の改変を組み合わせて得られる細菌であってもよい。複数の改変を行う場合、その順番は問わない。
【００３２】
コハク酸などの非アミノ有機酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによっても製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、先ず菌体を通常の好気的な条件で培養した後用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体は、遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。
【００３３】
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。
【００３４】
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールおよびシュークロースが好ましく、特にグルコースおよびシュークロースが好ましい。
【００３５】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、非アミノ有機酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。
【００３６】
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、例えば、細菌を培養するための培地であってもよいし、リン酸緩衝液等の緩衝液であってもよい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む水溶液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化して非アミノ有機酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。
【００３７】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。
【００３８】
本発明で用いる反応液としては、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ま
しい。培地には、例えば上記した有機原料と炭酸イオン、重炭酸イオン又は二酸化炭素ガスを含有させ、嫌気的条件で反応させることができる。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは二酸化炭素ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、１~５００ｍＭ、好ましくは２~３００ｍＭ、さらに好ましくは３〜２００ｍＭの濃度で添加する。二酸化炭素ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの二酸化炭素ガスを含有させる。
【００３９】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。
【００４０】
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、非アミノ有機酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的雰囲気下で行ってもよい。ここで言う嫌気的雰囲気下は、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、二酸化炭素ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法によって得ることができる。
【００４１】
反応液（培養液）中に蓄積した非アミノ有機酸は、常法に従って、反応液より回収（分離・精製）することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーにより非アミノ有機酸を分離・精製することができる。
【００４２】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸などの非アミノ有機酸を製造した後に、得られた非アミノ有機酸を原料として重合反応を行うことにより非アミノ有機酸含有ポリマーを製造することができる。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、特に、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。また、本発明の製造法により得られる非アミノ有機酸または該非アミノ有機酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。
【００４３】
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
＜ＰｏｘＢ欠損、ＡＣＨ欠損、ＰＴＡ欠損、ＡＣＫ欠損、ＰＣ増強株の作製＞
（Ａ）ＭＪ２３３株ゲノムＤＮＡの抽出
Ａ培地［尿素 ２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４−５Ｈ2Ｏ６ｍｇ、ビオチン ２００μｇ、チアミン １００μｇ、イーストエキストラクト １
ｇ、カザミノ酸 １ｇ、グルコース ２０ｇ、蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株を対数増殖期後期まで培養し、遠心分離（１００００ｇ、５分）により菌体を集めた。得られた菌体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度にリゾチームを含む１０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液０．１５ｍＬに懸濁した。次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロフォルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５，０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００４５】
（Ｂ）ｐｏｘＢ  破壊用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｏｘＢ遺伝子の内部配列を欠失したＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４）を用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。ｐｏｘＢ遺伝子の５’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号１と配列番号２、３’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号３と配列番号４の合成ＤＮＡをそれぞれプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。次に得られた二つの増幅産物を鋳型として配列番号１および配列番号４の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。得られたｐｏｘＢ遺伝子の内部配列が欠失したＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製後、制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａ
ｃＩで切断した。これによって生じた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（sacB遺伝子を含むプラスミド：特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲー
ションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａｃＩで切断することにより約１．０ｋｂの挿入断片が
認められ、これをｐＯＸＢ１１と命名した（図１）。
【００４６】
（Ｃ）ａｃｈ  破壊用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ａｃｈ遺伝子の内部配列を欠失したＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８）を用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。ａｃｈ遺伝子の５’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号５と配列番号６、３’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号７と配列番号８の合成ＤＮＡをそれぞれプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。次に得られた二つの増幅産物を鋳型として配列番号５および配列番号８の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。得られたａｃｈ遺伝子の内部配列が欠失したＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製後、制限酵素ＳａｌＩおよびＳａｃＩで
切断した。これによって生じた約１．０ｋｂのＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＳａ
ｃＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｌｕＩおよびＳａｃＩで切断することにより約１．１ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＡＣＨ２２と命名した（図２）。
【００４７】
（Ｄ）ｐｔａ−ａｃｋ  破壊用プラスミドの構築
ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子の内部配列を欠失したＤＮＡ断片の取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子周辺の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＢＡ００００３６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２）を用いたクロスオーバーＰＣＲによって行った。ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子の５’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号９と配列番号１０、３’末端側領域のＤＮＡ断片は配列番号１１と配列番号１２の合成ＤＮＡをそれぞれプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．
２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で４５秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。次に得られた二つの増幅産物を鋳型として配列番号９および配列番号１２の合成ＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲを行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製） ０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ ＭｇＳＯ4、 ０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で１分２０秒からなるサイクルを３０回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は３分とした。得られたｐｔａ−ａｃｋ遺伝子の内部配列が欠失したＤＮＡ断片はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて精製後、制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断した。これによって生じた約１．１ｋｂの
ＤＮＡ断片は０．８％アガロース（ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することで検出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いてゲルから回収した。このＤＮＡ断片を、ｐＫＭＢ１（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡと混合し、ライ
ゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＳａｃＩおよびＳｐｈＩで切断することにより約１．１ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＴＡＣＫ１と命名した（図３）。
【実施例２】
【００４８】
＜ＰｏｘＢ／ＡＣＨ／ＰＴＡ／ＡＣＫ欠損株の作製＞
（Ａ）ＰｏｘＢ欠損株の作製
ｐｏｘＢ遺伝子欠損株作製の供試菌株は、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＬＤＨ（ＬＤＨ遺伝子が破壊された株：特開２００５−９５１６９）とし、形質転換用プラスミドＤＮＡは、上記実施例１の（Ｂ）で構築したｐＯＸＢ１１を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。ブレビバクテリウムの形質転換は、電気パルス法（Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、Vol.144, p.181-185, 1993）によって行い、得られた形質転換体をカナマイシン ５０μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地に塗抹した。この培地上に生育した株は、ｐＯＸＢ１１がブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株菌体内で複製不可能なプラスミドであるため、該プラスミドのｐｏｘＢ遺伝子とブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノム上に該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子が挿入されているはずである。次に、上記相同組み換え株をカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ培地にて液体培養した。この培養液の菌体数約１００万相当分を１０％ショ糖含有ＬＢＧ培地に塗抹にした結果、２回目の相同組み換えによりｓａｃＢ遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株を数十個得た。この様にして得られた２回目の相同組み換え株の中には、そのｐｏｘＢ遺伝子がｐＯＸＢ１１に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ｐｏｘＢ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ｐｏｘＢ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号１および配列番号４）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１５１８ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では９８１ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記
方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨと命名した。
【００４９】
（Ｂ）ＡＣＨ欠損株の作製
ａｃｈ遺伝子欠損株作製の供試菌株は、上記（Ａ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨとし、形質転換用プラスミドＤＮＡは、上記実施例１の（Ｃ）で構築したｐＡＣＨ２２を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。ブレビバクテリウムの形質転換および2回相同組換え体の選抜は、上記（Ａ）示した方法で行い、数十個のショ糖非感受性コロニーを得た。これらのうちａｃｈ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ａｃｈ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号５および配列番号８）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１２２８ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１００３ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨと命名した。
【００５０】
（Ｃ）ＰＴＡ−ＡＣＫ欠損株の作製
ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子欠損株作製の供試菌株は、上記（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨとし、形質転換用プラスミドＤＮＡは、上記実施例１の（Ｄ）で構築したｐＴＡＣＫ１を用いて塩化カルシウム法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９，１９７０）により形質転換した大腸菌ＪＭ１１０株から調製した。ブレビバクテリウムの形質転換および2回相同組換え体の選抜は、上記（Ａ）示した方法で行い、数十個のショ糖非感受性コロニーを得た。これらのうちｐｔａ−ａｃｋ遺伝子が変異型であるか野生型であるかの判定は、ｐｔａ−ａｃｋ遺伝子をＰＣＲ増幅するためのプライマー（配列番号９および配列番号１２）を用いて分析することによって行うことができ、野生型では１６４５ｂｐ、欠失領域を持つ変異型では１０８６ｂｐのＤＮＡ断片を生成する。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株をブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨと命名した。
【００５１】
（Ｄ）ＰＣ増強株の作製
上記（Ｃ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨにｐＭＪＰＣ１（ＰＣ増強用プラスミド：特開２００５−９５１６９）を導入し、ＰＣ増強を施した。
形質転換は大腸菌ＤＨ５α株から調製したｐＭＪＰＣ１プラスミドＤＮＡを、上記（Ａ）に記載した電気パルス法により導入することによって行った。得られた形質転換体をカナマイシン25μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地に塗抹し、この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＭＪＰＣ１を保持していることを確認し、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨと命名した。
【実施例３】
【００５２】
＜ＣＳ増強株の作製＞
（Ａ）ＣＳ増強用プラスミドの構築
プロモーター領域を含むブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３株由来シトレートシ
ンターゼ遺伝子の取得は上記実施例１の（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されているコリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ１３０３２株の該遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＰ００５２７６）を基に設計した合成ＤＮＡ（配列番号１３および配列番号１４）を用いたＰＣＲによって行った。反応液組成：鋳型ＤＮＡ１μＬ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．５μＬ、１倍濃度添付バッファー、０．４μＭ各々プライマー、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、０．２μＭｄＮＴＰｓを混合し、全量を５０μＬとした。反応温度条件：ＤＮＡサーマルサイクラー  ＰＴＣ−２００（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製）を用い、９４℃で１０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は２分、最終サイクルの６８℃での保温は１０分とした。ＰＣＲ反応終了後、Ｔａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（宝バイオ製）を０．１μＬ加え、さらに７２℃で３０分保温した。増幅産物の確認は、０．７５％アガロース（ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧ ａｇａｒｏｓｅ：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離後、臭化エチジウム染色により可視化することにより行い、約２．１ｋｂの断片を検出した。ゲルからの目的ＤＮＡ断片の回収は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて行った。回収したＤＮＡ断片を、ＰＣＲ産物クローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）と混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌（ＤＨ５α株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＫｐｎIで切断すること
により、約２．１ｋｂの挿入断片が認められ、これをｐＣＳ３．０と命名した。
次に、ｐＣＳ３．０を制限酵素ＰｓｔＩおよびＫｐｎIで切切断して生じた約約４．４
ｋｂのＤＮＡ断片を０．７５％アガロースゲル電気泳動により分離、回収し、プラスミドｐＣ３．１４（特開２００５−９５１６９）を制限酵素ＰｓｔＩおよびＫｐｎIで切断す
ることによって調製したＤＮＡと混合し、ライゲーションキットｖｅｒ．２（宝バイオ製）を用いて連結した。このようにして得られたプラスミドＤＮＡで大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンおよび５０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。この培地上で生育した白色コロニーを常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩおよびＫｐｎIで切断することにより、約２．１ｋｂの挿入断片が認められたものを選抜し、これをｐＣＳ３．１と命名した（図４）。
【００５３】
（Ｂ）ＣＳ増強株の作製
上記実施例２の（Ｄ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨに、上記（Ａ）で構築したｐＣＳ３．１を導入し、ＣＳ増強を施した。
形質転換はｐＣＳ３．１プラスミドＤＮＡを、上記実施例２の（Ａ）に記載した電気パルス法により導入することによって行った。得られた形質転換体をストレプトマイシン10μｇ／ｍＬおよびカナマイシン25μｇ／ｍＬを含むＬＢＧ寒天培地に塗抹し、この培地上に生育した株から、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出、制限酵素切断による解析を行った結果、同株がｐＣＳ３．１を保持していることを確認し、これをブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＣＳ／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨと命名した。
【実施例４】
【００５４】
＜ＣＳ増強株の評価＞
１００ｍＬの種培養培地（尿素：４ｇ、硫酸アンモニウム：１４ｇ、リン酸１カリウム
：０．５ｇ、リン酸２カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物：０．５ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：２０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：２０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：２００μｇ、塩酸チアミン：２００μｇ、酵母エキス：１ｇ、カザミノ酸：１ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬの培地１００ｍＬ）を５００ｍＬの三角フラスコにいれ、１２０℃、２０分加熱滅菌した。これを室温まで冷やし、あらかじめ滅菌した５０％グルコース水溶液を４ｍＬ、無菌濾過した５％カナマイシン水溶液を５０μＬ、２％ストレプトマイシン水溶液を５０μＬ添加し、実施例３（Ｂ）で作製したブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＣＳ／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨ株を接種して２４時間３０℃にて種培養した。但し、実施例２（Ｄ）で作製した対象株ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨ株を培養する場合は、ストレプトマイシン添加は除いた。
得られた全培養液を１００００ｇ、５分の遠心分離により集菌し、菌体懸濁培地（硫酸マグネシウム・７水和物：１ｇ、硫酸第一鉄・７水和物：４０ｍｇ、硫酸マンガン・水和物：４０ｍｇ、Ｄ−ビオチン：４００μｇ、塩酸チアミン：４００μｇ、リン酸一アンモニウム：０．８ｇ、リン酸二アンモニウム：０．８ｇ、塩化カリウム：０．３ｇ、硫酸アンモニウム６６ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）にＯＤ６６０の吸光度が８０になるように懸濁した。４ｍｌ反応器に前記の菌体懸濁液０．５ｍｌに、基質溶液（グルコース：２００ｇ、炭酸マグネシウム：１９４ｇ、及び蒸留水：１０００ｍＬ）０．５ｍＬを加えて、５〜６％炭酸ガス雰囲気下、３５℃で２２時間反応させた。
反応後、上述の条件で遠心分離し、上清の有機酸濃度を分析した結果、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＣＳ／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨ株は、対照株であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ２３３／ＰＣ／ΔＰＴＡ／ΔＡＣＫ／ΔＡＣＨ／ΔＰｏｘＢ／ΔＬＤＨ株と比較して、ジカルボン酸（コハク酸、リンゴ酸、フマル酸の総量）収率が９．３％増加し、同ジカルボン酸当たりの酢酸の副生量が５８％減少していた。ＣＳの増強によって明らかなジカルボン酸収率の向上および副生酢酸の低減効果が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】プラスミドｐＯＸＢ１１の構築手順を示す図。
【図２】プラスミドｐＡＣＨ２２の構築手順を示す図。
【図３】プラスミドｐＴＡＣＫ１の構築手順を示す図。
【図４】プラスミドｐＣＳ３．１の構築手順を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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