(57)【要約】【課題】皮膚バリア機能の向上に有効な物質を、高い確度で、かつ簡便に探索する方法を提供する。【解決手段】被験物質の角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価するための指標とする。具体的には、被験物質の角層細胞の重層度合いの増大作用が大きいほど、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用が大きく、被験物質の角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が大きいほど、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用が大きいと評価することができる。また、マイリオシンの角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いを基準として、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することを特徴とする、物質の皮膚バリア機能向上作用の評価法。
【請求項２】
前記角層細胞の重層度合いの増大作用が大きいほど、皮膚バリア機能向上作用が大きいと評価することを特徴とする、請求項１に記載の評価法。
【請求項３】
前記角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が大きいほど、皮膚バリア機能向上作用が大きいと評価することを特徴とする、請求項１に記載の評価法。
【請求項４】
被験物質の皮膚バリア機能向上作用は、一般式（Ｉ）で表される化合物の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を基準として評価されることを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の評価法。
【化１】
2008058293.tif 000018
（上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ2及びＲ3は、独立して水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ4は水素又は−ＣＨ2ＯＲ’であり、Ｒ’は水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立して水素、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基を表し、Ａは、置換基を有しても良い炭素数５〜２０炭化水素基を表す。）
【請求項５】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、一般式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする、請求項４に記載の評価法。
【化２】
2008058293.tif 000019
（但し、式中Ｘはヒドロキシメチレン基又はカルボニル基を表し、波線で表される結合はあってもなくても良い。）
【請求項６】
一般式（ＩＩ）で表される化合物が、マイリオシンであることを特徴とする、請求項５に記載の評価法。
【請求項７】
被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が、一般式（Ｉ）で表される化合物の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用より大きい
場合に、該被験物質は、皮膚バリア機能向上に有効であると鑑別することを特徴とする、請求項１〜６の何れか一項に記載の評価法。
【化３】
2008058293.tif 000020
（上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ2及びＲ3は、独立して水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ4は水素又は−ＣＨ2ＯＲ’であり、Ｒ’は水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立して水素、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基を表し、Ａは、置換基を有しても良い炭素数５〜２０炭化水素基を表す。）
【請求項８】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、一般式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする、請求項７に記載の評価法。
【化４】
2008058293.tif 000021
（上記一般式（ＩＩ）において、Ｘはヒドロキシメチレン基又はカルボニル基を表し、波線で表される結合はあってもなくても良い。）
【請求項９】
被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の評価法。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の評価法により、皮膚バリア機能向上に有効であると鑑別された物質を含有してなる、皮膚バリア機能向上のための皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の皮膚バリア機能向上作用を評価する方法に関する。詳しくは、皮膚外用剤に含有するための物質の皮膚バリア機能向上作用を評価する方法、皮膚バリア機能の向上に有効な物質を鑑別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚バリア機能は、皮膚の健全性を保つために重要な因子であり、皮膚バリア機能が低下すると、アトピー性皮膚炎や化学物質過敏症などの病的な症状が出現すると言われている。皮膚バリア機能は、経皮的散逸水分量（ＴＥＷＬ）によって測定される場合が多い。
物質の皮膚バリア機能向上作用を評価する方法としては、例えば角層細胞の形状や分布を指標として、ＴＥＷＬを推定する方法が知られている（例えば特許文献１を参照）。しかしながら、正常な形状の角層細胞を有している場合でも、皮膚バリア機能の低い様な例外も存することが知られており、皮膚バリア機能に影響を与える他の因子が存することが推定されている。
このような他の因子としては、セラミドなどの細胞間脂質の量と組成が知られている。即ち、セラミドなどの細胞間脂質の量が多ければ多いほど、皮膚バリア機能は高いと言われている（例えば、非特許文献１を参照）。また、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ（Serine palmitoyl transferase、SPT）はセラミドのde novo合成律速酵素であり、その欠損は角層バリア機能を低下させ致死的な結果をもたらすことも知られており（例えば、特許文献２、非特許文献２を参照）、セラミドに加えてこの合成酵素も皮膚バリア機能の発現においては重要な役割を果たしていることが推察される。しかしながら、この様な因子を加えても、皮膚バリア機能の説明には、時として不十分な場合も存することは否めない。即ち、皮膚バリア機能に寄与する新規因子の発見が望まれていたと言える。
【０００３】
一方、角層細胞の重層度合いや角層におけるデスモソーム構造の出現度合いが、皮膚バリア機能と関連していることは知られていなかったし、角層細胞の重層度合いを増大させる物質や角層におけるデスモソーム構造の出現度合いを増大させる物質も知られていなかった。そして、被験物質の角層細胞の重層度合いの増大作用や角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、前記被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することについては、全く検討されていなかった。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１８９０１１号公報
【特許文献２】特表２００５−５３１２８５号公報
【非特許文献１】Grubauer G et al: Lipid content and lipid type as determinants of the epidermal permeability barrier. J. Lipid Res 30 : 89-96, 1989
【非特許文献２】Sano S et al: Disappearance of lamellar bodies and enrichment of aberrant lipids in the epidermis of the ceramide knockout mice. The 27st Annual Meeting of the Japanese Society for Investigative Dermatology Program :poster No.p-134,2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、この様な状況下為されたものであり、皮膚バリア機能に寄与する新規因子を見いだし、皮膚バリア機能の向上に有効な物質を、高い確度で、かつ簡便に探索する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この様な状況に鑑みて、本発明者らは、皮膚バリア機能に寄与する新規因子を求めて、鋭意研究努力を重ねた結果、マイリオシンを経皮投与することにより、角層細胞の重層化とデスモソームの出現が促進され、以て、経皮的散逸水分量（ＴＥＷＬ）が低下することを見いだし、皮膚バリア機能の向上の新規なメカニズムを見いだした。この知見を基に、本発明者らは、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価するための指標となることを見いだし、発明を完成させるに至った。即ち、本発明は以下に示す通りである。
【０００７】
（１）被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することを特徴とする、物質の皮膚バリア機能向上作用の評価法。
（２）前記角層細胞の重層度合いの増大作用が大きいほど、皮膚バリア機能向上作用が大きいと評価することを特徴とする、（１）に記載の評価法。
（３）前記角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が大きいほど、皮膚バリア機能向上作用が大きいと評価することを特徴とする、（１）に記載の評価法。
（４）被験物質の皮膚バリア機能向上作用は、一般式（Ｉ）で表される化合物の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を基準として評価されることを特徴とする、（１）〜（３）の何れか一に記載の評価法。
【化１】
2008058293.tif 000002
【０００８】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ2及びＲ3は、独立して水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ4は水素又は−ＣＨ2ＯＲ’であり、Ｒ’は水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立して水素、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基を表し、Ａは、置換基を有しても良い炭素数５〜２０炭化水素基を表す。
（５）一般式（Ｉ）で表される化合物が、一般式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする、（４）に記載の評価法。
【０００９】
【化２】
2008058293.tif 000003
【００１０】
上記一般式（ＩＩ）において、Ｘはヒドロキシメチレン基又はカルボニル基を表し、波線で表される結合はあってもなくても良い。
（６）一般式（ＩＩ）で表される化合物が、マイリオシンであることを特徴とする、（５）に記載の評価法。
（７）被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が、一般式（Ｉ）で表される化合物の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用より大きい場合に、該被験物質は、皮膚バリア機能向上に有効であると鑑別することを特徴とする、（１）〜（６）の何れか一に記載の評価法。
（８）一般式（Ｉ）で表される化合物が、一般式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする、（７）に記載の評価法。
（９）被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、該被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することを特徴とする、（１）〜（８）の何れか一に記載の評価法。
（１０）（７）又は（８）に記載の評価法により、皮膚バリア機能向上に有効であると鑑別された物質を含有してなる、皮膚バリア機能向上のための皮膚外用剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明を用いれば、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を高い確度で評価することができる。また、皮膚バリア機能の向上に有効な物質を、高い確度で簡易に見出すことができ、皮膚外用剤の製造等に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、被験物質の、角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を指標として、前記被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することを特徴とする。
このような評価は、評価対象となる被験物質を動物の皮膚組織にin vivo又はin vitroで投与した後、投与部位の角層を観察することにより行うことができる。具体的な方法を以下に示す。
in vivoでの被験物質の投与は、一般的な経皮投与試験方法に準じて行えば良く、使用動物、及び投与する皮膚の部位も適宜選択される。試験動物としては、毛が試験時に存しない、ヘアレスマウスが特に好適に例示できる。
また、in vitroでの被験物質の投与は、３次元培養系への一般的な薬剤投与方法に準じて行えばよい。
また、被験物質の投与期間及び投与回数は、被験物質の安全性、毒性、許容される使用量などに応じて適宜選択することができる。通常、角層の変化を観察するためには、被験物質を複数回投与することが好ましく、３〜２４回投与することが好ましく例示できる。
次に、被験物質の投与を行った動物の角層を観察する。角層の観察は、通常用いられる方法により行うことができる。例えば、in vivoでの投与の場合は、動物より皮膚標本を採取し、in vitroでの投与の場合は、３次元培養系からサンプルを採取し、これらに一般的な組織染色法を角層に施した後、アルカリ、例えばNaOH等を用いて角層を膨潤させて、光学顕微鏡を用いて観察したり、電子顕微鏡（走査型電子顕微鏡（SEM）、透過型電子顕微鏡（TEM））を用いて観察したりする方法が挙げられる。
角層細胞の重層度合いの観察は、以下の方法により行うことができる。光学顕微鏡を用いて観察する場合は、上述のようにアルカリにより角層を膨潤させ、この像をCCDカメラ等で記録し、この画像の中において特定長さ（単位長さ）を設定して、その幅の組織断面中に角層が何枚堆積しているかを数える方法が挙げられる。また、電子顕微鏡を用いて観察する場合は、TEMで５０００倍程度の拡大率で、皮膚の角層領域を撮影し、光学顕微鏡の場合と同様に、特定長さ当たりの組織断面中に角層が何枚堆積しているかを数える方法が挙げられる。他に、角層を例えばEDTAのような溶液を用いて皮膚より単離し、凍結乾燥を施したのち、皮膚単位面積当たりの角層の乾燥重量を秤量しこの重さから角層の量、すなわち重層度合いを見積もる方法も挙げられる。
角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの観察は、以下の方法により行うことができる。具体的には、TEMで３０００倍〜１万倍程度の拡大率で写真をとり、特定長さ当たりの組織断面中（角層断面中に）において角層間にある、デスモソーム構造数を数え見積もる方法が挙げられる。他に、角層を例えばEDTAのような溶液を用いて皮膚より単離し、この角層からタンパク質を抽出しウエスタンブロット法などでデスモソーム構成タンパク質をブロッドし定量することにより、角層中のデスモソーム構造量を推定する方法が挙げられる。
また、角層の中層より下の層（下層）について、角層におけるデスモソーム構造の出現度合いを観察することが好ましい。
角層細胞の重層度合い、及び角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの観察においては、例えば、「Ya-Xian Z et al： Number of cell layers of the stratum corneum in normal skin -relationship to the anatomical location on the body, age, sex and
physical parameters. Arch Dermatol Res. 1999 Oct;291(10):555-9」、「Sato J et al： Dry condition affects desquamation of stratum corneum in vivo. J Dermatol Sci. 1998 Dec;18(3):163-9」などを参照することができる。
【００１３】
上記観察結果を基に、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価する。評価の方法としては、例えば、被験物質を投与した後の角層の観察結果を、特定の物質を投与した後の観察結果を基準として評価する方法が挙げられる。具体的には、被験物質を投与しない陰性コントロールの観察結果や皮膚バリア機能向上作用を有することが知られている標準陽性物質を投与した陽性コントロールの観察結果と比較することにより、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することができる。
陽性コントロールとしては、マイリオシン（化合物１、ＩＳＰ−１）や特開平１１−３１０５２３号公報、特開平０７−２４７２５２号公報、ＷＯ２００４／０１３０８４に示されるようなマイリオシンと類似の骨格を有する化合物を用いることが好ましく例示できる。マイリオシンと類似の骨格を有する化合物として、一般式（Ｉ）で表される化合物を用いることができる。
【００１４】
【化３】
2008058293.tif 000004
【００１５】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ1は水素又は炭素数１〜４のアルキル基を表し、好ましくは、水素である。また、Ｒ2及びＲ3は、独立して水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、好ましくは、Ｒ2及びＲ3共に水素である。Ｒ4は水素又は−ＣＨ2ＯＲ’である。−ＣＨ2ＯＲ’におけるＲ’は水素、炭素数１〜４のアルキル基又は炭素数１〜４のアシル基を表し、好ましくは、水素である。Ｒ5、Ｒ6及びＲ7は、独立して水素、水酸基、炭素数１〜４のアルコキシ基又は炭素数１〜４のアルキルカルボニルオキシ基を表す。Ｒ5及びＲ6は、好ましくは、水素又は水酸基であり、Ｒ7は、好ましくは、水素である。Ａは、置換基を有しても良い炭素数５〜２０炭化水素基を表す。
さらに、一般式（Ｉ）で表される化合物の中でも、一般式（ＩＩ）で表される化合物を好ましく用いることができる。
【００１６】
【化４】
2008058293.tif 000005
【００１７】
一般式（ＩＩ）において、Ｘはヒドロキシメチレン基又はカルボニル基を表し、波線で表される結合はあってもなくても良い。
【００１８】
一般式（ＩＩ）で表される化合物として、具体的には以下に示す化合物１〜９が挙げられる。
この中でも、マイリオシン（化合物１）の角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を基準として、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することが特に好ましい。
なお、マイリオシンには、しわ改善作用があることが知られており（特開平１１−３１０５２３号公報）、その製造方法も既に知られている（例えば、特開平０７−２４７２５２号公報）。
【００１９】
【化５】
2008058293.tif 000006
【００２０】
【化６】
2008058293.tif 000007
【００２１】
【化７】
2008058293.tif 000008
【００２２】
【化８】
2008058293.tif 000009
【００２３】
【化９】
2008058293.tif 000010
【００２４】
【化１０】
2008058293.tif 000011
【００２５】
【化１１】
2008058293.tif 000012
【００２６】
【化１２】
2008058293.tif 000013
【００２７】
【化１３】
2008058293.tif 000014
【００２８】
なお、一般式（Ｉ）で表される化合物として、化合物１０も好ましく用いられる。
【００２９】
【化１４】
2008058293.tif 000015
【００３０】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物を陽性コントロールとして用いる場合の経皮投与量は、０．０２％  （Ｗ／Ｖ  ｉｎ  ８０％  ＥｔＯＨ）を１０〜５００μｌ／ｄａｙが好ましく例示できる。被験物質の角層細胞の重層度合いの増大作用又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が、陽性コントロールのこれら作用と同等であるかこれより大きい場合には、前記被験物質は、皮膚バリア機能の向上に有効であると鑑別することができる。
また、被験物質の投与後の角層細胞の層数が、被験物質の投与前の角層細胞の層数の１．３倍以上、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上であれば、該被験物質は、
皮膚バリア機能の向上に有効であると鑑別することもできる。
また、被験物質の投与後のデスモソーム構造の数が、被験物質の投与前のデスモソーム構造の数の１．４倍以上、好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上であれば、該被験物質は、皮膚バリア機能の向上に有効であると鑑別することもできる。
また、種々の被験物質を投与した場合の観察結果どうしを比較することにより、複数の被験物質の皮膚バリア機能向上作用を比較することもできる。本発明においては、角層細胞の重層度合いの増大作用が大きければ大きいほど、皮膚バリア機能向上作用も大きいと評価することができる。同様に、本発明においては、角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用が大きければ大きいほど皮膚バリア機能向上作用も大きいと評価することができる。
【００３１】
本発明においては、角層細胞の重層度合いの増大作用及び角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用の何れか一方を指標として、被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することもできるが、両方を指標として被験物質の皮膚バリア機能向上作用を評価することが好ましい。
【００３２】
また、本発明においては、上記必須の指標に加えて、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を計測し、補助的な指標とすることも、皮膚機能の微変化を捉えることが出来るので好ましい。経皮的散逸水分量の計測は、常法に従って行うことができる。
また、さらに皮膚バリア機能の評価の指標として従来から知られているセラミドの産生量を補助的な指標とすることもできる。また、セラミドの定量は、既に知られている常法に従えば良く、具体的に以下のような方法で行うことができる。
例えば、in vitroの検討では、ＣＨＯ細胞などを用いることができる。このような細胞を放射化などでラベルされたセリンの存在下培養し、培養後、細胞より産生されたセラミド（骨格にセリンを含有する）を有機溶剤などで抽出し、薄層クロマトグラフィーにてセラミドを分離し、写真などに感光させて、セラミドに取り込まれた標識セリンによる感光強度を測定することにより、セラミド量を知ることが出来る（例えば、  Hanada K.  et al. , Specificity of Inhibitors of Serine Palmitoyltransferase(SPT), a Key Enzyme in Sphingolipid Biosynthesis, in Intact Cells.  Biochem Pharmacol, 59, 1211-1216, 2000を参照）。
又、in vivoの検討であれば、被験物質を動物に経皮投与した後に、皮膚を採取し、皮膚より表皮を分離し、これをトリプシン処理して角層と表皮細胞とに分けて、表皮細胞から有機溶剤によりセラミドを含む画分を抽出し、これを薄層クロマトグラフィーで展開することによりセラミドを単離し、角層におけるセラミドを定量すればよい。セラミドの定量は、セラミドを硫酸などを用いた炭化焼付で発色させ、かかる発色をデンシトメータなどで定量することにより行うことができる。上記方法で被験物質の投与前後のセラミドを定量し、その差を求めることによりセラミド産生量を知ることができる。
このセラミド産生量を、被験物質の投与前後のＴＥＷＬの変化量等と対比することにより、被験物質投与による皮膚バリア機能の向上のメカニズムなどについて分析を行うことができる。
例えば、皮膚のセラミド産生を抑制している状態で被験物質を投与した場合やセラミド産生を抑制する作用を有する被験物質を投与した場合に、皮膚バリア機能が向上（例えば、ＴＥＷＬが低下）すれば、被験物質は、セラミド産生の促進以外のメカニズムで、皮膚のバリア機能を向上させると推測することができる。
【００３３】
以下に、実施例を挙げて、本発明について、更に詳細に説明を加えるが、本発明がかかる実施例にのみ限定されないことは言うまでもない。
【実施例】
【００３４】
以下に示す手順に従って、ヘアレスマウスの背部をマイリオシンで処理し、これによる
角層の性状の変化を計測した。
ヘアレスマウス（Ｈｒ−ｋｕｄ）背部皮膚にマイリオシン（ＩＳＰ−１）（０．０２％
Ｗ／Ｖ  ｉｎ  ８０％  ＥｔＯＨ）を１００μｌ／ｄａｙ  ７日間連続塗布した。陰性コントロール（Vehicle Control）は８０  ％ＥｔＯＨとした。各群５匹設定した。投与終了後、２４時間に経皮的散逸水分量（ＴＥＷＬ）を、Tewameter（Courage +Khazaka社製）を用いて測定した。また、角層裏面のSEM観察 (Mishima T et al:  Subcellular changes in keratin and granular cell of keratin-stripped and psoriatic epidermis revealed by scanning and transmission electron microscopy. Acta Derm Venerol 100:83-100, 1973を参照)、角層のアルカリ膨潤測定（光学顕微鏡観察） (Tagami H et al: Number of cell layers of the stratum corneum in normal skin - relationship to the anatomical location on the body, age, sex and physical parameters. Arch Dermatol
Res 291:555-559, 1999を参照)、角層の乾燥重量測定、角層の投影面積測定 (Watanabe M et al: Functional analyses of the superficial stratum corneum in atopic xerosis. Arch Dermatol 127:1689-1692, 1991を参照)、およびhalf Karnovsky-1%四酸化オスミウム固定によるTEM観察を行った。
角層の乾燥重量測定は、以下のようにして求めた。EDTAおよび、ディスパーゼを用いて角層を皮膚より単離し、あらかじめ秤量しておいた（風袋重量）スピッツ管等に単離した角層を入れ、凍結乾燥装置にて乾燥を行った後、乾燥角層入りスピッツ管の秤量を行い、風袋の重量を差し引いた。
【００３５】
角層細胞の層数の測定は具体的に以下のように行った。
被験物質（およびvehicle control）を塗布した皮膚を採取し、スライドガラス上に10μm程度の凍結切片を作成し、１％サフラニンを切片に滴下し乾燥後、1NのNaOHを組織に滴下し、角層細胞を膨潤させた。カバーガラスを乗せてCCDを付属した光学顕微鏡にて拡大像を採取し、画像上の単位長さ当たりの組織像において角層が幾層あるかを計測した。
デスモソーム構造の数の測定は具体的に以下のように行った。
TEM5000倍〜10000倍程度の画像より、角層−顆粒層境界にそって単位長さを設定し、この単位長さ中にある角層領域の角層間にあるデスモソーム様高電子密度領域の数をカウントした。
【００３６】
ＴＥＷＬの変化の結果を表１に示す。これより、マイリオシンの投与により、ＴＥＷＬ値が減少していることが判る。また、角層細胞の投影面積の測定結果を図１に示す。図１に示すように、コントロール群とマイリオシン（ＩＳＰ−Ｉ）塗布群とでは、角層細胞の投影面積に有意差が見られなかった。すなわち、マイリオシンは角層細胞自体の成熟には作用しないことがわかった。
【００３７】
角層のアルカリ膨潤測定の結果を図２に、角層の重層総数を表２に、ＴＥＭ観察の結果を図３に、デスモソーム構造の数の測定結果を図４に示す。図２及び表２より、マイリオシンの投与により角層の重層層数が増大していることがわかる。また、図３及び図４より、マイオリシン投与により、デスモソーム構造が増大していることがわかる。さらに図３より、コントロール群では、角層中層領域（３層目あたり）にデスモソーム構造がないのに対し、マイリオシン投与群では、角層中層領域（３〜５層目あたり）にデスモソーム構造がより多く出現していることが判る。
また角層裏面のSEM観察の結果を図５にしめす。図５より、コントロール群、マイリオシン投与群の何れにおいても、角層裏面は平で起伏（凹凸）がほとんどみられなかったことから、マイリオシンを投与しても、正常な角層状態を示すことが分かった。
これらの結果から、マイリオシンの投与による、皮膚バリア機能の向上は、角層細胞の重層度合いの増大、及び角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大に起因している可能性が示唆された。すなわち、物質の角層細胞の重層度合いの増大作用及び／又は角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大作用を知ることにより、その物質に皮膚
バリア機能向上作用があるか否かを知ることができることが推察された。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
【表２】
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【００４０】
＜セラミド合成阻害作用の検討（in vitro）＞
また、マイリオシンのセラミド合成阻害作用を以下の方法で試験した。
１．使用培地、使用細胞など
・10%NCS/F12培地：
Ham’s F12培地に10%のnewborn calf serum(ＮＣＳ) とペニシリンG(100unit/ml)・硫酸ストレプトマイシン(100μg/ml)を添加したもの
・Nutridoma medium：
1% Nutridoma-SP (Boehringer Mannheim)とgentamaicin(10μg/ml)を添加したＨam’s F12培地
・CHO-K1細胞： 大日本製薬より購入
・Ｌ-〔U-14C〕serine： 5.99 GBq/mmol、1.85MBq/ml
・TLC展開溶媒１： アセトン：１−プロパノール：クロロホルム：メタノール：0.25% KCl＝25：25：25：10：9 (v/v)
【００４１】
２．取り込み実験手順
（１）1×106のCHO−K1細胞を5mlの10% NCS/F−12培地を入れた60-mm dishに播き、37℃において16-24時間培養する。
（２）細胞のmonolayerを1mlの無血清F-12培地で２度リンスする。その後1.5mlのNutridoma培地をdishに添加する
（３）15μｌのＬ−〔U−14C〕serine（5.99 GBq/mmol、1.85MBq/mlをdishに添加する。37℃で2時間培養する。
（４）培地を除去し、氷温PBS 1mlで細胞monolayerを2度リンスする。
−以下の操作は室温で行う−
（５）細胞の溶解の為に0.1%のSDSを1000μｌ入れる。そして、細胞の溶解物をピペッティングで懸濁する。
（６）3mlのクロ：メタ=1：2(v/v)の入ったパイレックス（登録商標）ガラス管に800μlの懸濁液を入れ、良く混ぜる
（７）1mlのクロロホルムと1mlのPBSを管に入れ、よく混ぜる。
（８）遠心(1000gで2分)を行い、上層を除去する
（９）低層の組織混濁溶媒層をガラス管にパスツール管を用いて注意深く移す。窒素ガスを吹き付け乾燥させる
（１０）50μｌ 以下のクロ：メタ=19：1(v/v)で溶解させる。キャピラリーガラスでTCL
プレート上にスポットを打つ。
（１１）TLC展開溶媒１で展開させた後、空気で乾燥させる。
（１２）TLCプレートをイメージングプレート（フジ写真製）に２日間暴露する。
（１３）BSA2000イメージアナライザー（フジフィルム製）を使って放射活性のあるイメージを解析する。タンパク量に基づいてラベル脂質量をノーマライズする。
【００４２】
３．結果
結果を図６に示す。これらの図より、ＩＳＰ−１（マイリオシン）はセリンパルミトイルトランスフェラーゼを阻害し、セラミド合成を阻害していることがわかる。
【００４３】
＜セラミド合成阻害作用の検討（in vivo）＞
上記試験において、ＴＥＷＬ計測後、ヘアレスマウスの皮膚より、ディスパーゼ（合同酒精株式会社製）を用いて表皮を単離した。即ち、３ｃｍφのシャーレに１０００ユニットのディスパーゼを加え、ＰＢＳを加えて２．５ｍｌとした。採取皮膚をこれに真皮側を下にして浸し、５℃で１晩保存した。しかる後に、皮膚から表皮をピンセットで剥離させ、蒸留水を充填したシャーレに浮かべ、良くすすいだ後、水切りをした。この表皮を０．１％トリプシンＰＢＳ溶液１０ｍｌを充填した６ｃｍφのシャーレに基底層側を下にして浮かべ、室温で２時間保存した。しかる後に蒸留水をシャーレ一杯に満たし、スパチュラで表皮の下側をこそげ、消化された層を除去した。残った角層は凍結後真空乾燥し、質量を計量した。別途皮膚より２ｍｌのクロロホルム・メタノール混液（２：１）で細胞間脂質を抽出し、一定量の抽出物を５０μｌのクロロホルム・メタノール混液（２：１）に溶解させ、シリカゲル薄層クロマトグラフィーにスポッティングし、クロロホルム：メタノール：酢酸＝１９０：９：１で展開した。溶媒を風乾後、５０％硫酸水溶液を噴霧し、５００℃で炭化させた後、デンシトメータで炭化部分の黒度を測定した。結果を図７及び８に示す。これより、マイリオシンの投与により、セラミドの合成が阻害されていることがわかる。
【００４４】
以上のデータをまとめると、マイリオシンの投与においては、セリンプロテアーゼ阻害に起因して、セラミド合成が阻害されているにもかかわらず、ＴＥＷＬの著しい抑制が発現され、皮膚バリア機能が向上することができることが判る。一方で、マイリオシンは角層細胞の重層化度合いと、角層におけるデスモソーム構造の出現度合いを増大させていることから、マイリオシンの投与による皮膚バリア機能の向上は、角層の重層化と表皮組織の緻密化によるものであると推察される。すなわち、以上のデータは、皮膚バリア機能を考える上で、角層細胞の重層度合いと角層におけるデスモソーム構造の出現度合いが重要であることを裏付けるものである。
また、物質の角層細胞の重層度合いの増大、角層におけるデスモソーム構造の出現度合いの増大と、セラミドを代表とする細胞間脂質による細胞の保護とは独立の機能であることもわかる。
従って、皮膚バリア機能に関連するこれらの独立の因子を組み合わせることにより、より正確な皮膚バリア機能の理解が出来ることが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、化粧料の素材探索に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】マイリオシン投与による、角層細胞の投影面積の変化を示す図である。
【図２】角層のアルカリ膨潤測定の結果を示す図である（図面代用写真）。
【図３】角層のTEM観察結果を示す図である（図面代用写真）。
【図４】マイリオシン投与による、デスモソーム様構造の数の変化を示す図である。
【図５】角層裏面のSEM観察結果を示す図である（図面代用写真）（TS: tape stripping）。
【図６】in vitroでのマイリオシン投与によるセラミド合成阻害作用の検討結果を示す図である（図面代用写真）。
【図７】in vivoでのマイリオシン投与によるセラミド合成阻害作用の検討結果を示す図である（図面代用写真）。
【図８】in vivoでのマイリオシン投与による、セラミド量の変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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