(57)【要約】【課題】微細構造体において基体と目的物質との結合に利用し得る、光架橋基と特異的に結合可能な抗光架橋基抗体、かかる抗体または一部を少なくとも含む複合タンパク質、及びこれらの標的物質の検出への利用のための技術を提供すること。【解決手段】光架橋基を認識する抗体の構造を少なくとも有するタンパク質を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式Ｉ（Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ2は、水素原子またはハロゲン原子、アルコキシ基、又はアルキレンオキシドにより置換されていてもよいアルキル基を表す。）で表される反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を少なくとも認識する抗体からなることを特徴とするタンパク質。
【化１】
2008113654.tif 000006
【請求項２】
前記光架橋基のみを認識する抗体からなることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２５またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２６として寄託されたハイブリドーマにより産生される請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記抗体が以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列の組み合わせからなる相補性決定領域の組み合わせ、またはこれと機能的に同等の相補性決定領域の組み合わせを有する請求項１乃至３のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号：１、２および３のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号：４、５および６のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号：７、８および９のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号：１０、１１および１２のアミノ酸配列の組み合わせ
【請求項５】
前記抗体がキメラ抗体、相補性決定領域移植抗体、一本鎖抗体、またはこれらの抗体断片からなる群より選択される請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項６】
標的物質と結合し得るタンパク質であって、
前記光架橋基を少なくとも認識する第１の領域の少なくとも一つと、
前記標的物質を認識する第２の領域の少なくとも１つと、
を有し、
前記第１の領域が、請求項１乃至５のいずれかに記載のタンパク質またはその一部からなり、
前記第２の領域が認識する標的物質が、前記光架橋基と異なることを特徴とするタンパク質。
【請求項７】
タンパク質の架橋基認識能と架橋反応を利用して該タンパク質を基体に固定する方法であって、
１）基体表面に架橋基として前記反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を設ける工程と、
２）請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質を、前記基体表面の架橋基に、該タンパク質の該架橋基認識能を利用して反応させて、該タンパク質を該基体に固定する工程と、
３）前記反応後、あるいは同時に光を照射し、前記光架橋基を利用した光架橋反応により、前記基体と前記タンパク質との間に架橋構造を形成する工程と、
を有することを特徴とするタンパク質の固定方法。
【請求項８】
基体とタンパク質を有する構造体であって、
前記基体が表面の少なくとも一部に架橋基として反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を有し、
前記タンパク質が請求項１から６のいずれかに記載されたタンパク質であることを特徴とする構造体。
【請求項９】
請求項８に記載の構造体を有するバイオセンサー。
【請求項１０】
請求項１乃至６のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
標的物質を検出するための検出用キットであって、請求項８に記載の構造体を形成するための基体とタンパク質と、を有することを特徴とする標的物質検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、該タンパク質を基体に固定させる方法、タンパク質と基体とを有する構造体、該構造体を有するバイオセンサー、前記タンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、前記基体とタンパク質とを有する標的物質検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸、タンパク質に代表される生体分子は、その機能を発揮する為に原子レベルで制御された精密な構造を構築することが知られており、そのような生体分子の特性を利用し、生体分子を種々の材料上に配することが検討されている。利用分野としては、主にバイオセンサーや生体分子の精製プロセスがあり、近年では、半導体プロセスでのナノスケール構造形成などへの生体分子利用などが更に挙げられる。例えば、特許文献１（特開２００５−３１２４４６号公報）は、金と目的物質（標的物質）との結合に利用し得る、金と特異的に結合可能な金結合性のタンパク質を開示している。当該特許文献に開示されたタンパク質は金に対して結合性を有する抗体の少なくとも一部を含んでいるタンパク質である。このタンパク質は抗体構造を足場とし、抗体の抗原認識能力を活かして直接的に金を認識するタンパク質である。特許文献１では、金基体を用いたバイオセンサーへの用途が想定されている。また、特許文献１におけるタンパク質の固定は、金認識能を利用した分子認識による固定であるので、固定されたタンパク質に配向性が付与され、タンパク質を同質的に固定することでバイオセンサーの性能向上が見込まれる。
【０００３】
しかし、特許文献１では、金基体へのタンパク質固定に、抗原−抗体反応に見られる分子認識を利用しているため、タンパク質は非共有結合的に固定されており、少なからず固定したタンパク質の解離が生じる恐れがある。その結果、バイオセンサーに用いる場合、速度論的な解析が必要となる。また、このタンパク質をバイオセンサーに用いる場合、金基体を用いたものに限られるために、金基体への非特異吸着防止技術の工夫が更に必要となる。
【０００４】
一方、タンパク質を基体へ固定する方法として、従来、タンパク質の物理的吸着や化学架橋を利用した固定方法が検討されている。また、種々の標的物質を検出するバイオセンサーを製造する場合、固定するタンパク質の数（分子の個数）は、通常検出したい標的物質数以上必要になるため、同一の固定方法で効率よく必要数のタンパク質を固定できる手法が求められている。しかし、本来、固定するタンパク質は化学的に種々雑多で、官能基の種類や量も異なる上に、官能基のタンパク質表面での存在位置も異なる。結果として、同一の固定方法で基体に複数のタンパク質を同質的に固定することは非常に困難な場合が多かった。
【０００５】
一方、非特許文献１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ  （２００２）  １８，  ２４６３−２４６７）では、光架橋基を介して共有結合的にタンパク質を基体へ固定する技術を開示している。ここでは光架橋基を有する非特異吸着防止ポリマーを利用しているのでタンパク質の種類による官能基の違いはほぼ無視することができ、従来の固定方法に比べて、より同質的に固定することができる。しかしながら非特許文献１で示唆されるのは、あくまでタンパク質の種類による固定量の変化を抑えられることに止まり、非特許文献１では、バイオセンサーに求められるタンパク質の同質的な配向性を有した固定には何ら言及されていない。
【０００６】
また、固定するタンパク質の末端や特定のサイトに特定の配列、例えばＨｉｓ  ＴａｇやＣｙｓｔｅｉｎｅ残基を導入し、タンパク質を修飾してより配向性を持たせて固定する方法も広く知られている。しかし、このようなタンパク質の修飾は、ある種のタンパク質で微生物などでの生産性に悪影響をもたらしたり、導入残基が低分子量のため基体表面からの影響によりタンパク質の標的物質捕捉活性が低下する恐れがある。
【特許文献１】特開２００５−３１２４４６号公報
【非特許文献１】Ｌａｎｇｍｕｉｒ  （２００２）  １８，  ２４６３−２４６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述の特許文献１のタンパク質は、金基体に分子認識反応により固定されるので、非常に均質的で配向性に優れた固定状態を得ることができる。しかしながら、分子認識反応のみを利用して固定するため、得られた構造体上では非共有結合的であり、ある確率でタンパク質が基体から解離する恐れがある。つまり、特許文献１は均質的ではあるが、共有結合によるタンパク質の固定方法を開示するものではない。また、特許文献１は金基体以外への分子認識反応を利用した固定法を開示するものでもない。
【０００８】
一方、非特許文献１は、光架橋基を介してタンパク質を共有結合的に固定することを開示している。非特許文献１の方法によれば、種々タンパク質の官能基などの違いを実質無視することができるため、タンパク質をある程度均質的に基体に固定できる。しかしながら、非特許文献１には、タンパク質に配向性を持たせる固定方法の開示はない。
【０００９】
一方、バイオセンサーや診断デバイスなど各種の機器の商業レベルでの製造プロセスやコスト、性能を考えると、捕捉タンパク質のより少量使用で目的とする感度等の機能が得られることが望まれる。更に、これらの機器の製造プロセス数の低減や製造時間の短縮が求められる。つまり、いかにより少量のタンパク質を用いて、基体上での標的物質との結合活性が高いタンパク質を、効率よく短時間に基材へ固定できるか、が重要である。また、このようなタンパク質の固定化技術を用いて、捕捉タンパク質をバイオセンサーや診断薬・診断デバイスに搭載し、医療機器として商品化を行う際には、再現性や精度の点から、より緻密にタンパク質を配向させて基体に固定化することが重要になる。更に、タンパク質の生産性はデバイスのコスト低減に寄与するため、捕捉タンパク質を微生物等で大量に生産できることが望まれる。
【００１０】
本発明の目的は、上記の捕捉タンパク質とタンパク質固定化技術の両方に対する要求を満たすための技術を提供する可能性を広げることにある。本発明の他の目的は、遺伝子工学を利用して微生物により安定的に製造可能であり、かつ基体へ配向性良く共有結合的に固定化が可能である、すなわち光照射により基体表面に架橋結合可能なタンパク質を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記一般式Ｉ（Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基を
表し、Ｒ2は、水素原子またはハロゲン原子、アルコキシ基、又はアルキレンオキシドにより置換されていてもよいアルキル基を表す。）で表される反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を少なくとも認識する抗体からなることを特徴とするタンパク質である。
【化１】
2008113654.tif 000002
本発明のタンパク質は、前記光架橋基のみを認識する抗体からなっていてもよいし、前記光架橋基とその他の部分とをあわせて認識する抗体からなっていてもよい。
前記抗体としては、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６２、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６３またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６４、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２５またはＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２６として寄託されたハイブリドーマにより産生されるものが挙げられる。
また、前記抗体としては、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列の組み合わせからなる相補性決定領域の組み合わせまたはこれと機能的に同等の相補性決定領域の組み合わせを有するものが挙げられる。
（ａ）配列番号：１、２および３のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号：４、５および６のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号：７、８および９のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号：１０、１１および１２のアミノ酸配列の組み合わせ
また、前記抗体としては、キメラ抗体、相補性決定領域移植抗体、一本鎖抗体、またはこれらの抗体断片からなる群より選択されるものが挙げられる。
【００１２】
また、本発明の標的物質と結合し得るタンパク質は、反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を認識する第１の領域の少なくとも一つと、標的物質を認識する第２の領域の少なくとも１つと、
を有し、前記第１の領域が、前述したタンパク質のいずれかまたはその一部からなり、前記第２の領域が認識する標的物質が、前述した反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基と異なることを特徴とするタンパク質である。
【００１３】
また、本発明は、タンパク質の架橋基認識能と架橋反応を利用して該タンパク質を基体に固定する方法であって、
１）基体表面に架橋基として反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を設ける工程と、
２）前述したタンパク質のいずれかを、前記基体表面の架橋基に、該タンパク質の該架橋基認識能を利用して反応させて、該タンパク質を該基体に固定する工程と、
３）前記反応後、あるいは同時に光を照射し、前記光架橋基を利用した光架橋反応により、前記基体と前記タンパク質との間に架橋構造を形成する工程と、
を有することを特徴とするタンパク質の固定方法である。
【００１４】
また、本発明は、基体とタンパク質を有する構造体であって、
前記基体が表面の少なくとも一部に架橋基として反応性フェニルジアジリン誘導体を有し、前記タンパク質が前述したタンパク質のいずれかであることを特徴とする構造体である。
【００１５】
また、本発明は、上記構造体を有するバイオセンサーである。
【００１６】
また、本発明は、前述したタンパク質のいずれかをコードする核酸である。
【００１７】
また、本発明は、上記核酸を含むベクターである。
【００１８】
本発明のキットは、標的物質を検出するための検出用キットであって、上記の構造体を形成するための基体と、タンパク質と、を有することを特徴とする標的物質検出用キットである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、所望の機能を有するタンパク質を基体に固定するための技術を提供することができる。また、本発明は、タンパク質を基体に固定した構造体のバイオセンサーや生体分子の精製プロセスなどの種々の分野への利用に寄与するものである。また、本発明にかかるタンパク質は、遺伝子工学を利用して微生物を用いることでも安定して製造可能である。また、本発明のタンパク質は、基体に配向性良く共有結合による固定化が可能である。また、本発明は、光照射により基体表面へ架橋結合可能なタンパク質を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のタンパク質は、少なくとも反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を認識する抗体からなる。本発明のタンパク質は、反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基のみを認識するタンパク質であってもよいし、光架橋基とその他の部分とをあわせて認識する抗体からなっていてもよい。後者の例としては、光架橋基とその近傍を認識するものを挙げることができる。前者は、「反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基のみを認識する抗体からなるタンパク質」、すなわち光架橋基そのものを認識する抗体からなるタンパク質である。後者は「反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を少なくとも認識する抗体からなるタンパク質」であって、光架橋基以外の部分もあわせて認識する抗体からなるタンパク質である。
【００２１】
この光架橋基を認識する抗体を、所望の機能を有するタンパク質の少なくとも一部として用い、この光架橋基を基体表面に設けておくことで、分子認識を利用したこのタンパク質の基体表面への良好な固定状態を得ることが可能となる。また、光照射により、タンパク質を良好な固定状態で共有結合的に固定することが可能となる。
【００２２】
この光架橋基を認識する抗体として、以下の独立行政法人産業技術総合研究所特許微生物センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央６）に、ブタペスト条約下で国際寄託されているハイブリドーマにより産生されるものが好適に利用可能である。
・Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １Ｅ２−２Ｈ６−１Ａ９
国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６２（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５５（受託日：平成１８年３月２９日）から平成１９年１月１９日に国際寄託へ移管）。
・Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６Ａ８−１Ｃ６−１Ｂ６
国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６３（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５６（受託日：平成１８年３月２９日）から平成１９年１月１９日に国際寄託へ移管）。
・Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６Ｃ９−Ａ５Ｂ１０
国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５７（受託日：平成１８年３月２９日）から平成１９年１月１９日に国際寄託へ移管）
・Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ４Ｇ２−１Ｅ１０−１Ｆ１０
国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２５（受託日：平成１９年５月１０日）
・Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ６Ｈ１１−Ｆ１１Ｆ４
国際寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２６（受託日：平成１９年５月１０日）
また、この抗体としては、以下の（ａ）から（ｄ）のいずれかのアミノ酸配列の組み合わせからなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する抗体を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１、２、および３のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｂ）配列番号：４、５、および６のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｃ）配列番号：７、８、および９のアミノ酸配列の組み合わせ
（ｄ）配列番号：１０、１１および１２のアミノ酸配列の組み合わせ
【００２３】
なお、上記の「機能的に同等の相補性決定領域」とは、アミノ酸の欠失、置換または挿入によりアミノ酸配列の変更がなされた場合においても、上記の光架橋基認識能を維持しているものをいう。例えば、光架橋基認識能が維持されている範囲内で、１〜数個のアミノ酸の欠失、置換または挿入による配列変更を上記のアミノ酸配列に行ったものを挙げることができる。
【００２４】
上記の抗体は、キメラ抗体、相補性決定領域移植抗体、一本鎖抗体、またはこれらの抗体断片からなる群より選択されるいずれかの形態を有することができる。
【００２５】
上記の抗体を利用して標的物質と結合し得るタンパク質を得ることができる。すなわち、かかるタンパク質は、以下の構成を有する。
（１）反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を認識する第１の領域の少なくとも一つ
（２）前記第１の領域と異なる物質を認識する第２の領域の少なくとも１つ
（３）前記第１の領域が、上記抗体からなるタンパク質またはその一部からなる
【００２６】
なお、上記の第２の領域において認識される標的物質は、上記の構造体の用途に応じたタンパク質における所望の機能に応じて標的となる物質であり、例えば、バイオセンサーにおいては検出対象としての物質であり、分離プロセスにおける分離対象物質である。また、上記の第２の領域を２以上設け、各領域で異なる標的物質の２以上を認識できるようにすることも可能である。
【００２７】
更に、上記の少なくとも光架橋基を認識する抗体からなるタンパク質または標的物質と結合し得るタンパク質の光架橋基認識能と、架橋反応と、を利用して、タンパク質を基体に固定する方法を提供することができる。かかる固定方法は、以下の工程を有する。
【００２８】
１）基体表面に架橋基として反応性フェニルジアジリン誘導体を設ける工程
２）反応性フェニルジアジリン誘導体からなる光架橋基を少なくとも認識する抗体からなるタンパク質を、前記基体表面の架橋基に、該タンパク質の該架橋基認識能を利用して反応させて、該タンパク質を該基体に固定する工程
３）前記反応後、あるいは同時に光を照射し、前記光架橋基を利用した光架橋反応により、前記基体と前記タンパク質との間に架橋構造を形成する工程
【００２９】
上記の少なくとも光架橋基を認識する抗体からなるタンパク質または標的物質と結合し得るタンパク質を基体に固定することで、バイオセンサーや生体分子の精製プロセスなど種々の分野においての利用が期待できる構造体を得ることができる。
【００３０】
また、この構造体を構成するタンパク質として、バイオセンサーとしての機能を有する酵素や検出対象捕捉用のタンパク質を用いることで、この構造体をバイオセンサーのセンサー部として利用可能となる。更に、この構造体を形成するためのタンパク質と基体とを少なくとも用いて検出対象としての標的物質を検出するためのキットを構成することができる。
【００３１】
一方、上記の少なくとも光架橋基を認識する抗体からなるタンパク質または標的物質と結合し得るタンパク質をコードする核酸をベクターに組み込んで、微生物などの宿主細胞で発現させることで、これらのタンパク質の安定生産が可能となる。
【００３２】
本発明にかかる光架橋基認識能を有するタンパク質は光架橋基結合部位と前記部位を形成する免疫グロブリンドメイン構造部を有する。その結果、この構造部に連鎖して結合する標的物質結合部位を基体表面に固定化する際に、標的物質結合部位にはその本来の機能に対する固定化の影響は及ばないか、極めて少なくなる。そして、標的物質結合部位と基体との距離が、構造部の存在により保たれているため標的物質結合部位がその機能に影響を及ぼすような基体からの相互作用を受けることもない。その結果、高い標的物質捕捉能を有することが可能になる。なお、この光架橋基認識能を有するタンパク質とは、前記光架橋基を認識する抗体からなるタンパク質と前記標的物質と結合し得るタンパク質とを含む概念で用いられる。
【００３３】
本発明にかかる光架橋基認識能を有するタンパク質をバイオセンサーに用いる場合、原理的には、検出方法は限定されない。どんな検出法でも利用可能である。つまり、前記構造体が光架橋基を利用した固定状態が維持可能な方法であれば特に限定されない。すなわち、本発明にかかる光架橋基認識能を有するタンパク質は、基体表面に光照射により架橋固定することができ、バイオセンサーに用いた場合、共有結合的に固定され、且つ、非常に安定に均質的に配向することができ、バイオセンサーの精度向上につながる。なお、光架橋基認識能を有するタンパク質は構造体上の光架橋基を認識するため、自動的に該タンパク質の光架橋基結合部位が光架橋基の方向を向くことになる。その結果、標的物質結合部位が構造体と反対方向に提示されることになり、配向性が担保されることとなる。
【００３４】
本発明にかかる構造体を適用し得るバイオセンサーの一例の構造を図１６に示す。このバイオセンサーの基体上には、まず、非特異吸着防止効果を有するタンパク質などからなる非特異防止層が設けられている。この非特異防止層の表面に配置された光架橋基を利用して標的物質を捕捉する機能を有する光架橋基認識複合体タンパク質が固定されている。この光架橋基認識複合体タンパク質への標的物質の捕捉の有無により、標的物質のセンシングを行う。
【００３５】
更に、本発明の光架橋基認識能を有するタンパク質の内の、標的物質認識能を更に有する、すなわち標的物質との特異的結合性を併せ持つタンパク質（以下、光架橋基認識複合タンパク質という）を用いることで少なくとも以下の（ｉ）乃至（ｉｉｉ）の要素からなる多層体を形成することができる。
（ｉ）表面の少なくとも一部に光架橋基を有する基板
（ｉｉ）本発明の光架橋基認識複合タンパク質
（ｉｉｉ）本発明の光架橋基認識複合タンパク質が結合できる標的物質
【００３６】
なお、光架橋基認識複合タンパク質として２以上の異なる標的物質を認識するものを用いることもできる。この際、光架橋基認識複合タンパク質は光架橋基認識部位として少なくとも立体的にも安定したβシート構造であるイムノグロブリン構造体を有することができ、その結果、基体と標的物質との結合部位の間に所定の距離をおいたこれらの空間位置を保つことが可能となる。すなわち、光架橋基認識複合タンパク質の標的物質結合部位が、光架橋基を含む基板から何らかの相互作用を受けることがなく、結合能を保持することができる。また、これにより極めて薄膜で緻密に配向した多層構造体を形成することが可能である。この光架橋基認識複合タンパク質によるこれらの特性を利用して、検出装置を構成することができる。例えば、金薄膜上に光架橋基を少なくとも有する分子層を設け、更に所望の１以上の標的物質と結合可能な光架橋基認識複合タンパク質を設けることで、所望とする標的物質のセンシング素子とすることができる。その場合、光架橋基認識複合タンパク質に捕捉された標的物質の検出方法としては、光学的な手段、例えば表面プラズモン共鳴などを利用した手段を利用することができる。
【００３７】
本発明にかかる光架橋基認識能を有するタンパク質を用いた基体への固定では、光照射量、照射タイミングなどを変更することで、短時間にその固定量を所望量に制御することができる。そのため、バイオセンサーの製造プロセスの短縮、タンパク質使用量の低減など商業レベルでのメリットが見込まれる。
【００３８】
以下、本発明にかかる光架橋基認識能を有するタンパク質、それを用いた構造体および標的物質の検出用途などについて更に詳細に説明する。
（１）光架橋基認識能を有するタンパク質
・光架橋基
本発明の光架橋基認識能を有するタンパク質は、少なくとも光架橋基を認識する抗光架橋基抗体からなるものである。なお、該抗光架橋基抗体は、前記光架橋基を認識する抗体からなるタンパク質に相当する。この抗体が認識する光架橋基は、反応性フェニルジアジリン誘導体をその機能を損なうことなく基板等の所定の部位に設けられたものである。反応性フェニルジアジリン誘導体は、下記一般式Ｉで表される。
【００３９】
【化２】
2008113654.tif 000003
【００４０】
（Ｒ1は、水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基を表し、Ｒ2は、水素原子またはハロゲン原子、アルコキシ基、又はアルキレンオキシドにより置換されていてもよいアルキル基を表す。）
Ｒ1は、水素原子、または置換基を有してもよいアルキル基である。Ｒ1のアルキル基の置換基としては、フッ素原子などの電子吸引基を挙げることができる。置換基を有してもよいアルキル基としてはトリフルオロメチル基が特に好ましい。
【００４１】
Ｒ2は、水素原子またはハロゲン原子、アルキル基、置換されていてもよい（ポリ）アルキレンオキシドアルキルエーテル基、アルコキシ基、又は、アルキレンオキシドにより置換されていてもよいアルキル基である。Ｒ2は、好ましくは水素原子又はアルコキシ基を表し、アルコキシ基の炭素数は１〜３が好ましい。アルキレンオキシドにより置換されていてもよいアルキル基は、好ましくは−（ＣmＨ2mＯ）n−（ＣＨ2）o−Ｒ4で表され、式中、ｍは２又は３、ｎは１〜６のいずれかの整数、ｏは１〜４のいずれかの整数を表し、Ｒ4は水素原子、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基、好ましくは水素原子を表す。アルキレンオキシドとして例えば、ポリエチレングリコール鎖などが固定するタンパク質の安定化という点で適用できる。また、Ｒ2は−ＣＮ2Ｒ1に対してメタ位にあることが好ましい。また、光架橋基認識タンパク質により認識されればジアジリン化合物中にＲ2は複数あってもよく、その際それぞれは同一であっても異なってもよい。Ｒ2が複数の場合も、少なくとも１つのＲ2が、−ＣＮ2Ｒ1に対してメタ位に存在することが好ましい。
【００４２】
反応性フェニルジアジリン誘導体からなる基を基板面に設ける場合の構造を以下の一般式Ｉ’に示す。
【００４３】
【化３】
2008113654.tif 000004
【００４４】
Ｒ3は、基体への光架橋基担持固定のための官能基を表し、基体表面に担持された官能基と反応できる基であればどんなものでも良い。例えば、カルボキシル基、ホルミル基、活性エステル基、水酸基、チオール、スルフィド、アミノ基、ハロゲン置換アルキル基、トリアルコキシシリル基、又はこれらの置換基を有する基等が挙げられる。Ｒ3は−ＣＮ2Ｒ1に対してパラ位にあることが好ましい。
【００４５】
また、標的物質の基体への非特異吸着を防止することを目的として、非特異吸着防止効果を有するタンパク質と光架橋基を供給する化合物とのコンジュゲートを形成し、光架橋基を有する分子とすることができる。例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ：牛血清アルブミン）、カゼインタンパク質とのコンジュゲートとすることができる。その場合、Ｒ3を介して、ＢＳＡやカゼインタンパク質などのタンパク質に光架橋基を連結することができる。これらのコンジュゲートを利用することで、例えばバイオセンサーでの基体表面の所定部位への非特異吸着防止処理を、捕捉タンパク質の基体への固定処理を行う際に同時に行うことが可能となる。また、抗光架橋基抗体を作出するための免疫工程に用いられるタンパク質であるキャリヤー蛋白質（Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）とのコンジュゲートでもよい。このキャリヤー蛋白質として、例えば、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ：卵白アルブミン）やＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）がある。本発明に係るタンパク質の特徴である光架橋基を認識する能力が発揮されればどんな光架橋基を有する分子でも良い。
【００４６】
また、光架橋は、３５０ｎｍ付近の紫外線照射により達成され、本発明の光架橋によるタンパク質の配向的固定はＴＯＦｍａｓｓなどの質量分析により確認できる。つまり、本発明によるタンパク質は分子認識により光架橋基を認識し、更に光照射により架橋されるので、本発明にかかる構造体を適当なタンパク質分解酵素で処理して質量分析をすることで、特定の領域が光架橋されていることが確認できる。
【００４７】
・分子認識
本発明に係るタンパク質は、分子認識能として、少なくとも光架橋基認識能を有する。分子認識には、生体分子反応である抗体・抗原反応が含まれ、好ましくはこれらの複合体の解離定数ＫD値が１０-4Ｍ以下である。ＫD値が１０-4Ｍ以下であれば、非特異吸着性のタンパク質の吸着挙動と分子認識を十分に区別することが可能である。例えばカロリメトリーやＳＰＲ、ＱＣＭなどの生体分子相互作用計測装置により区別することができる。タンパク質の固定操作時間の短縮という点から解離定数は１０-6Ｍ以下であることがより好ましい。
【００４８】
・抗体
本発明において用いられる抗光架橋基抗体は、抗光架橋基抗体全体を用いて、あるいは、架橋基認識部位を含む部分を用いて形成することができる。抗光架橋基抗体としては、光架橋基（またはその誘導体）または光架橋基（またはその誘導体）を少なくとも含む部位に特異的に結合する抗体を用いることができる。例えば、脊椎動物のリンパ系細胞で産出することができる。また、それらのアミノ酸配列におけるアミノ酸の１個または数個が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、その構造・機能が維持されている抗体（抗体変異体）を用いることができる。抗体は、その特性（免疫学的または物理学的な）の分類において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに分類されるが、本発明において用いられる抗体はその何れの分類に属するものであってもよい。更には、これらが多量体を形成していてもよい。例えば、ＩｇＡは２量体、ＩｇＭは５量体を形成するが、金に結合しうる形状であれば何ら問題はない。また、その使用用途がｉｎ  ｖｉｔｒｏである場合は哺乳類に限らず、ＩｇＷ、ＩｇＹであっても問題ない。
【００４９】
本発明における抗体には、特に、重鎖（Ｈ鎖）及び／または軽鎖（Ｌ鎖）の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体が含まれる。更に、本発明における抗体には、先に挙げた抗体変異体、並びに抗体の断片も含まれる。これらについては、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）に開示がある。
【００５０】
本発明において、「抗体変異体」とは、１またそれ以上のアミノ酸残基が改変された、抗体のアミノ酸配列変異体を指す。例えば、抗体の可変領域を、光架橋基結合能を改善するために改変することができる。このような改変は、部位特異的変異、ＰＣＲ変異、カセット変異等の方法により行うことができる。このような変異体は、抗体の重鎖若しくは軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも９０％、そして、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となった抗体のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。
【００５１】
また、本発明にかかる抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と機能的に同等の相補性決定領域とは、本発明の抗体のＣＤＲのアミノ酸配列と類似したアミノ酸配列を有し、光架橋基を少なくとも分子認識して結合することを言う。ＣＤＲとは抗体の可変領域に存在する抗原への結合の特異性を決定している領域であり、Ｈ鎖とＬ鎖にそれぞれ３箇所ずつ存在し、それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と命名されている。各ＣＤＲを挟むようにフレームワークと呼ばれるアミノ酸配列の保存性の高い４つの領域が介在する。ＣＤＲは他の抗体に移植することが可能であり、所望の抗体のフレームワークと組み合わせることにより組み換え抗体を作製することができる。また抗原に対する結合性を維持しながら１または数個のＣＤＲのアミノ酸を改変することが可能である。例えば、ＣＤＲ中の１または数個のアミノ酸を、置換、欠失、および／または付加することができる。
【００５２】
アミノ酸残基の置換により変異を行う場合においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質は、以下のように分類することができる。
（１）疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）
（２）親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）
（３）脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）
（４）水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）
（５）硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）
（６）カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）
（７）塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）
（８）芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）
【００５３】
これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている。この点についてはＭａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６に開示がある。変異するアミノ酸数は特に制限されないが、通常、各ＣＤＲのアミノ酸の４０％以内であり、好ましくは３５％以内であり、さらに好ましくは３０％以内である。アミノ酸配列の同一性は本明細書に記載したようにして決定すればよい。
【００５４】
具体的には、塩基配列およびアミノ酸配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている。この点についてはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０に開示がある。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。この点についてはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）のウェブサイトで参照可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。
【００５５】
・キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植抗体、抗体断片
本発明では、種々の抗体分子の提示を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体などが挙げられ、例えばマウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域をヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域に導入した抗体が挙げられる。このような抗体は、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。
【００５６】
ヒト化抗体は、例えば所望の目的に利用するマウス抗体などの非ヒト抗体の重鎖または軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト抗体の相補性決定領域に置き換えたものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６））。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることによってヒト化抗体を得ることができる。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体に導入させたＣＤＲまたはフレームワーク配列のどちらにも含まれないアミノ酸残基を含んでいてもよい。通常、このようなアミノ酸残基の導入は、抗体の抗原認識・結合能力をより正確に至適化するために行われる。例えば必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
【００５７】
また本発明にかかる抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の断片又はその修飾物であってもよい。「抗体断片」とは、全長抗体の一部を指し、一般に、抗原結合領域または可変領域を含む断片のことである。本発明で述べる抗体断片とは、モノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ（ｖａ
ｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ  Ｆｖ）あるいは可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単ドメインｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）等が挙げられる。
【００５８】
・抗光架橋基抗体の取得
本発明にかかる光架橋基認識能を有する抗体（抗光架橋基抗体）の取得は、従来行われてきた抗血清調製技術、および細胞融合によるモノクローン抗体作製技術を適宜選択して行うことができる。例えば、結合対象となる光架橋基は低分子化合物であるため、光架橋基を有するハプテンを作製し、キャリアタンパク質ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ：スカシ貝ヘモシアニン）と結合した免疫原を調製して適当な免疫動物に免疫する。抗体価の上昇を確認したところで血清中から抗体を回収することができる。前記免疫は、免疫原となる光架橋基キャリアタンパク質コンジュゲートを適当な溶媒、例えば生理食塩水などで適当な濃度に希釈し、この溶液を静脈内や腹腔内に投与することにより行うことができる。更に、必要に応じてフロイント完全アジュバントを併用投与してもよい。動物に１〜２週間間隔で３〜４回程度投与する方法が一般的である。このようにして免疫された動物を最終免疫後３日目に解剖し、摘出した脾臓から得られた脾臓細胞を免疫細胞として使用する。また、本発明の光架橋基は紫外線（３５０ｎｍ）で失活するので、免疫するまでは暗室などで行うことが望ましい。
【００５９】
得られる抗体はポリクローナルでも良いが、モノクローナルとすることによってより光架橋基に対する特異性に優れたクローンを選択することが可能となる。モノクローナルな抗体は、それを産生する細胞をクローニングすることによって得ることができる。一般的には、免疫動物から回収した脾臓等のイムノグルブリン産生細胞を癌化細胞と融合させることによってハイブリドーマを形成することができる（Ｇｕｌｆｒｅ  Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２６６．５５０−５５２，１９７７）。例えば、癌化細胞としてはマウス由来ミエローマＰ３／Ｘ６３−ＡＧ８．６５３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．  ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ，Ｓｐ２）、ＮＳ０、ＰＡＩ、Ｆ０あるいはＢＷ５１４７、ラット由来ミエローマ２１０ＲＣＹ３−Ａｇ．２．３．、ヒト由来ミエローマＵ−２６６ＡＲ１、ＧＭ１５００−６ＴＧ−Ａ１−２、ＵＣ７２９−６、ＣＥＭ−ＡＧＲ、Ｄ１Ｒ１１あるいはＣＥＭ−Ｔ１５等のミエローマ細胞をあげることができる。
【００６０】
モノクローナルの抗体を産生する細胞のスクリーニングは、前記細胞をタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前記光架橋基に対する反応性を測定することにより行うことができる。この測定には、例えばＲＩＡ（ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）やＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｓｓａｙ）等の酵素免疫測定法、免疫沈降等を利用できる。または、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）装置を利用した光架橋基に対する結合性を定量的に測定することも可能である。ＳＰＲ装置により評価する場合は、センサー金表面に直接、アジュバントタンパク質を物理吸着または化学架橋固定して測定することができる。
【００６１】
・抗体断片
本発明で述べる抗体断片とは、モノクローナル抗体の一部分の領域を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ  Ｆｖ）あるいは可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）からなる単ドメインｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）等が挙げられる。
【００６２】
ここで、「Ｆ（ａｂ’）２」及び「Ｆａｂ’」とは、抗体のヒンジ領域で２本の重鎖（
Ｈ鎖）間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。この抗体フラグメントは、タンパク分解酵素であるペプシンあるいはパパイン等で抗体を処理することにより得ることができる。例えば、ＩｇＧをパパインで処理すると、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断される。その結果、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる軽鎖（Ｌ鎖）、及び重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とからなる重鎖（Ｈ鎖）フラグメントがＣ末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な２つのフラグメントが得られる。これら２つの相同な抗体フラグメントを各々Ｆａｂ’という。またＩｇＧをペプシンで処理する
と、ヒンジ領域中の２本のＨ鎖間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前記２つのＦａｂ’がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメントを製造する
ことができる。この抗体フラグメントをＦ（ａｂ’）２という。
【００６３】
このように、本発明にかかる光架橋基認識抗体は、上記Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２であ
ってもよい。また、ＶＨと前記ＣＨ１を結合したＦｄ断片であっても構わない。
【００６４】
さらには、抗体の可変領域部（Ｆｖ）またはその一部であってもよく、例えばＦｖを構成する重鎖可変領域（ＶＨ）や軽鎖可変領域（ＶＬ）またはその一部であってもよい。一方、前記ＶＨまたはＶＬからなる複合体において、一方のカルボキシ末端と他方のアミノ末端数個のアミノ酸からなるペプチドを介して連結した一本鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ｓｃＦｖ）を利用することもできる。上記ｓｃＦｖを形成するＶＨ／ＶＬ間（順不同）に一以上のアミノ酸からなるリンカーを設けることが望ましい。アミノ酸リンカーの残基長については、ＶＨまたはＶＬと抗原との結合に必要な構造形成を妨げるような拘束力を持たないように設計することが重要である。具体的な例としては、アミノ酸リンカー長は、５乃至１８残基が一般的で１５残基が最も多く用いられ検討されている。これら断片は遺伝工学的な手法により得ることが可能である。
【００６５】
更には、ＶＨ、ＶＬが何れか単ドメインｄＡｂであっても構わないが、前記単ドメイン構造は一般的に不安定であることが多いのでＰＥＧ修飾等の化学修飾による安定化を施しても良い。また、重鎖抗体としてｉｎ  ｖｉｖｏにおいても存在し、機能することができることが知られているラクダ重鎖抗体の可変領域ＶＨＨ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３１１：ｐ１２３、２００１）、Ｎｕｒｓｅ  ｓｈａｒｋのイムノグロブリン様分子の可変領域ＩｇＮＡＲであっても構わない。更には、ヒト又はマウス由来に代表される重鎖・軽鎖から構成される抗体分子のＶＨ、ＶＬを、図１乃至図４のようにドメイン単体で使用する際に、ＶＨ／ＶＬ界面等に重鎖抗体の相当部分を参考にして変異導入することによって安定性を向上させても良い。
【００６６】
光架橋基認識部位は、（１）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、その変異体及びこれらの一部、並びに（２）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、その変異体及びこれらの一部、から選択された少なくとも１種を含んでなるものとすることができる。抗体重鎖可変領域（ＶＨ）の相補性決定領域のセットとしては、配列番号：１〜３のアミノ酸配列の組み合わせまたは４〜６のアミノ配列の組み合わせから選ばれるタンパク質を好ましいものとして挙げることができる。抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域のセットとしては、配列番号：７〜９のアミノ酸配列の組み合わせまたは１０〜１２のアミノ配列の組み合わせから選ばれるタンパク質を好ましいものとして挙げることができる。これらの配列を以下に示す。
ＰＭ１−ＶＨ  ＣＤＲ
配列番号１：（Ｈ鎖ＣＤＲ１）
Ｓ  Ｈ  Ｎ  Ｍ  Ｌ
配列番号：２（Ｈ鎖ＣＤＲ２）
Ｇ  Ｉ  Ｙ  Ｐ  Ｇ  Ｄ  Ｇ  Ｄ  Ｔ  Ｓ  Ｙ  Ｎ  Ｑ  Ｎ  Ｆ  Ｋ  Ｇ
配列番号：３（Ｈ鎖ＣＤＲ３）
Ｗ  Ｄ  Ｌ  Ｌ  Ｃ  Ｆ  Ｄ  Ｙ
ＰＭ２−ＶＨ  ＣＤＲ
配列番号：４（Ｈ鎖ＣＤＲ１）
Ｓ  Ｙ  Ｗ  Ｍ  Ｈ
配列番号：５（Ｈ鎖ＣＤＲ２）
Ｙ  Ｉ  Ｎ  Ｐ  Ｓ  Ｔ  Ｇ  Ｙ  Ｔ  Ｅ  Ｙ  Ｎ  Ｑ  Ｋ  Ｆ
配列番号：６（Ｈ鎖ＣＤＲ３）
Ｎ  Ｇ  Ｎ  Ｇ  Ｙ
ＰＭ１−ＶＬ  ＣＤＲ
配列番号：７（Ｌ鎖ＣＤＲ１）
Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｍ  Ｈ
配列番号：８（Ｌ鎖ＣＤＲ２）
Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｓ
配列番号：９（Ｌ鎖ＣＤＲ３）
Ｑ  Ｑ  Ｗ  Ｓ  Ｎ  Ｓ  Ｐ  Ｐ  Ｙ  Ｔ
ＰＭ２−ＶＬ  ＣＤＲ
配列番号：１０（Ｌ鎖ＣＤＲ１）
Ｔ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｖ  Ｖ
配列番号：１１（Ｌ鎖ＣＤＲ２）
Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｎ  Ｌ  Ａ  Ｓ
配列番号：１２（Ｌ鎖ＣＤＲ３）
Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｙ  Ｓ  Ｐ  Ｌ  Ｔ
これらの配列番号：１〜１２のアミノ配列のそれぞれの一個もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を一つ以上含み、光架橋基結合性を有している抗体断片も機能的に同等であれば同様に利用できる。
【００６７】
上記のアミノ酸配列からなるＣＤＲ領域を、ＦＲに挿入することで目的とするＶ鎖やＬ鎖などを得ることができる。配列番号１３〜１６にＦＲ中にＣＤＲ領域が配置された状態の一例が示されている。配列番号１３のアミノ酸配列の第３１番〜第３５番が配列番号１のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ１である。以下、配列番号１３のアミノ酸配列には、配列番号２のアミノ酸配列からなるＨ鎖ＣＤＲ２及び配列番号３のアミノ酸配列からならるＨ鎖ＣＤＲ３が含まれている。更に、配列番号１４、１５及び１６のアミノ酸配列には、それぞれ上記配列番号４〜６、７〜９及び１０〜１２のアミノ酸配列の組み合わせからなるＣＤＲが含まれている。フレームとしては、目的とする抗体としての機能が得られるものであれば特に制限されず、公知の種々のフレームから目的に応じて選択してＣＤＲ領域と組み合わせることができる。
【００６８】
・光架橋基認識抗体断片の取得
・酵素処理による取得
また、上記抗体をある種の酵素処理することで、前記抗体の抗原結合部位及び抗原結合能をある程度有した抗体断片を得ることもできる。例えば、前記得られた抗体をパパイン処理することによりＦａｂ断片またはその類似体を得るができ、ペプシン処理によってＦ（ａｂ’）２断片またはその類似体が得られる。前記抗体断片は、前記酵素的手法の他に
化学的分解して作製する方法もある。これら抗体断片も光架橋基に対して結合能を有するものであれば、何ら問題なく使用することができる。
【００６９】
本発明に係わる上記Ｆａｂ’、Ｆｖ、ＶＨまたはＶＬのｄＡｂを得る方法としては、遺
伝工学的な手法を用いた取得も可能である。例えば、前記ＶＨまたはＶＬ遺伝子ライブラリーを作製し、それらをタンパク質として網羅的に発現させて、その遺伝子と対応させながら、光架橋基または標的物質に対する結合性により選択する方法がある。前記遺伝子ライブラリーは、たとえば、臍帯血、扁桃、骨髄、あるいは末梢血細胞や脾細胞等から得ることができる。例えば、ヒト末梢血細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、ヒトＶＨ、ＶＬをコードする配列をプローブとして、ヒトＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡライブラリーを作製する。例えば、ヒトＶＨファミリー（ＶＨ１乃至７）をファミリー毎に幅広く増幅することができるプライマーやヒトＶＬを増幅できるプライマーは公知である。これらＶＨ、ＶＬ毎にプライマーを組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＶＨ、ＶＬをコードした遺伝子を取得する。また、ファージディスプレー法を用いることも可能である。ファージディスプレー法では、ＶＨ、ＶＬまたはそれら含む複合体（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）をコードした遺伝子ライブラリーを、ファージ外殻タンパクをコードした遺伝子と結合し、ファージミドライブラリーを作製する。それらを大腸菌に形質転換し、種々のＶＨまたはＶＬを外殻タンパクの一部として有するファージとして発現させる。それらのファージを用いて、上記同様にして光架橋基また標的物質に対する結合性により選択することができる。ファージに融合タンパクとして提示されたＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子は、ファージ内にファージミドにコードされているのでＤＮＡシークエンス解析をすることにより、特定することができる。
【００７０】
・ライブラリーの選択に用いる光架橋基を有する被結合対象物
パニングにより抗光架橋基抗体断片を選択する際に用いる被結合対象物としては、少なくともその表面の一部に光架橋基を有する物質から種々選択して用いることができる。パニングにより選択する場合は、光架橋基以外の物質に対して吸着するタンパク質の混入を除くために被結合対象物表面は光架橋基のみであることがより望ましい。表面以外の内部コア基材となる材料は、既知の種々の材料から選択して用いることができる。光架橋基を含む分子を直接、または間接的に固定できる被結合対象物表面であればどんなものでも良い。また、被結合対象物に、非特異吸着を抑制する処理を施すことができる。また、パニング選択中は、本発明の光架橋基が失活するのを防ぐため、極力暗室または紫外線をカットするイエローカーテン内で行うことが望ましい。
【００７１】
本発明は、上記光架橋基認識抗体をコードする核酸をも含む。更に、本発明は、宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、マウス、ヒト等由来の従来既知のタンパク発現用細胞）を形質転換して、上記光架橋基認識抗体を発現させるための遺伝子ベクターとなる核酸と、上記光架橋基認識抗体をコードする核酸とを有する構成物をも含む。一つの構造物（発現ベクター）により発現できる本発明の光架橋基認識抗体は、抗体全分子、またはその抗体断片であるＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ＶＨ、ＶＬ、またはこれら複合体
から選択して、設計することが可能である。ひとつの発現用ベクターに複数の前記断片をコードする場合、それぞれの抗体断片が独立した個々のポリペプチド鎖として発現させることができる。また、ドメイン間を連続して結合またはアミノ酸を介して結合させた一つのポリペプチド鎖として発現ベクターの構成とすることも可能である。
【００７２】
本発明の光架橋基認識抗体発現用の発現ベクターの構成は、選択する宿主細胞に応じて既知のプロモーター等の導入遺伝子を発現させるために必要な構成等に組み込むことより、設計及び構築することができる。発現ベクターは、選択する宿主細胞に応じて既知のプロモーター等の構成等を参照し、構築することができる。また、大腸菌等を宿主細胞として用いる場合、外来遺伝子産物である本発明に係る光架橋基認識抗体またその構成物を速やかに細胞質外に除外することで、プロテアーゼによる分解を少なくすることが可能である。また、この外来遺伝子産物が菌体にとって毒性である場合でも、菌体外へ分泌することによりその影響を小さくすることができることが知られている。通常、既知の細胞質膜あるいは内膜を通過して分泌されるタンパク質の多くがその前駆体のＮ末端にシグナルペプチドを有し、分泌過程においてシグナルペプチダーゼにより切断され、成熟タンパク質となる。多くのシグナルペプチドはそのＮ末に塩基性のアミノ酸、疎水性アミノ酸、シグナルペプチダーゼによる切断部位と配置されている。
【００７３】
本発明にかかる光架橋基認識抗体をコードする核酸の５’側にシグナルペプチドである
ｐｅｌＢに代表される従来既知のシグナルペプチドをコードする核酸を配することにより、光架橋基認識抗体を分泌発現させることができる。
【００７４】
また、ひとつのベクター中に本発明にかかる光架橋基認識抗体（複数の抗体断片含む）から構成されるポリペプチド鎖をそれぞれ独立して複数挿入することも可能である。この場合、各ドメインまたはポリペプチド鎖をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢをコードす
る核酸を配置し、分泌を促すことができる。更に、または一以上のドメインからなるポリペプチド鎖として発現させる場合、前記ポリペプチド鎖の５’末端に同様にしてｐｅｌＢ
をコードする核酸を配置することにより分泌を促すことができる。このようにシグナルペプチドをＮ末端に融合した本発明の光架橋基認識抗体は、ペリプラズマ画分及び培地上清から精製することができる。
【００７５】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
【００７６】
完全抗体として光架橋基認識抗体を取得精製する場合、アフィニティー精製カラムとしてプロテインＡカラム、プロテインＧカラムの使用が挙げられる。
【００７７】
また、抗体断片を発現させ精製する作業の簡便さを考慮して、種々の抗体断片を形成するポリペプチド鎖のＮまたはＣ末端にアフィニティー精製用のタグを遺伝子工学的に配置することが可能である。精製用タグとしては、ヒスチジンが６残基連続したヒスチジンタグ（以下、Ｈｉｓ×６）やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合部位などが挙げられる。タグの導入方法としては、発現ベクターにおける光架橋基認識抗体をコードする核酸の５’または３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市
販の精製タグ導入用ベクターを使用するなどが挙げられる。
【００７８】
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【００７９】
以下に、上記発現ベクターを用いた本発明の光架橋基認識抗体の製造方法について述べる。本発明にかかる光架橋基認識抗体、またはその構成要素となるポリペプチド鎖は、従来既知のタンパク発現用の宿主細胞を、宿主細胞に応じて設計した上記光架橋基認識抗体発現ベクターで形質転換することにより製造可能である。すなわち、かかる光架橋基認識抗体、またはその構成要素となるポリペプチド鎖は、宿主細胞内のタンパク合成システムを用いて、宿主細胞内に合成される。その後、宿主細胞内外に蓄積または分泌された目的タンパク質を細胞内部または細胞培養上清から精製することにより、目的とする用途に利用可能となる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合、本発明にかかる光架橋基認識抗体をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢに代表される従来既知のシグナルペプチドを
コードする核酸を配することにより細胞質外に分泌発現しやすい構成にすることができる。
【００８０】
ひとつの発現用ベクターで本発明にかかる光架橋基認識抗体を構成する複数のポリペプチド鎖を発現させる場合、各ポリペプチド鎖をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢをコー
ドする核酸を配置することで、発現時に細胞質外への分泌を促すことができる。このようにシグナルペプチドをＮ末端に融合した光架橋基認識抗体は、ペリプラズマ画分及び培地上清から精製することができる。精製方法としては、精製タグがＨｉｓタグの場合、ニッケルキレートカラムやＧＳＴの場合、グルタチオン固定化カラムを使用することで精製することができる。
【００８１】
また、菌体内に発現した光架橋基認識抗体が不溶性顆粒で得ることも可能である。この場合、培養液から得られた菌体をフレンチプレスや超音波により破砕した細胞破砕液から不溶性顆粒を遠心分離することができる。得られた不溶性顆粒画分を尿素、塩酸グアニジン塩を含む従来既知の変性剤を含んだ緩衝溶液で可溶化した後に、変性条件下で前記と同様なカラム精製することができる。得られたカラム溶出画分は、リフォールディング作業により、変性剤除去と活性構造再構築を行うことができる。リフォールディング方法としては、従来既知の方法から適宜用いることも可能である。具体的には、段階透析法や希釈法などを目的のタンパクに応じて用いることが可能である。
【００８２】
本発明にかかる光架橋基認識抗体の各ドメインまたは各ポリペプチド鎖は、同一宿主細胞内で発現させることも可能であるし、別の宿主細胞を使用して発現した後に共存させて、複合体化させることも可能である。
【００８３】
更に、本発明の光架橋基認識抗体をコードするベクターを用いて、細胞抽出液を用いて生体外でのタンパク質発現をすることも可能である。好適に用いられる細胞抽出液としては、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等が挙げられる。しかしながら、上記無細胞抽出液によるタンパク合成は一般的には還元条件下で行われる。その為に、抗体中のジスルフィド結合を形成させるために何らかの処理を行う方がより好ましい。
【００８４】
・抗体断片タンパク発現
光架橋基認識抗体をコードするＤＮＡを、所望の制限酵素、例えば上記の例ではＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにより切断して光架橋基認識抗体断片コードＤＮＡを得る。これを宿主細胞に応じた従来公知のタンパク発現用プラスミドに導入することで抗体断片を得ることができる。例えば、大腸菌の場合、菌体外発現またはペリプラズム画分から目的の抗体断片を回収したい場合、前記抗体断片コード遺伝子の上流に従来既知のシグナルペプチドを導入することができる。シグナルペプチドとしては、ｐｅｌＢ等が挙げられる。また、発現後、培養上清または菌体画分から目的タンパクを精製を容易にするために、従来既知の精製用タグを融合してもよい。具体的には、ヒスチジン６残基（Ｈｉｓ×６）やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合部を導入し、融合タンパクとすることができる。これらは、Ｈｉｓタグの場合、ニッケル等の金属キレートカラムなどにより精製することが容易にできる。ＧＳＴタグの場合は、グルタチオンをセファロース等に担体に固定化したカラムにより精製することが可能である。
【００８５】
また、菌体内に発現した目的タンパクが不溶性顆粒で得ることができない場合、これらを尿素、塩酸グアニジン塩を含む従来既知の緩衝溶液で可溶化した後に、リフォールディングを行うことも可能である。リフォールディング方法としては、従来既知の方法から適宜用いることも可能である。具体的には、段階透析法や希釈法などを目的のタンパクに応じて用いることが可能である。
【００８６】
これらで得られた抗体、及びそれらの断片、例えばＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、Ｆｄ、Ｖ
ＨまたはＶＬまたは前記それらの複合体等のアミノ酸配列において、一もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列であっても光架橋基結合性を示すものであれば本発明の範囲から超えるものではない。
【００８７】
・基体及び構造体
抗光架橋基抗体と、表面の少なくとも一部が光架橋基から形成されている基体とから各種の用途に使用し得る構造体を得ることができる。この基体は、その表面の少なくとも一部に光架橋基が配置されたものであり、本発明の構造体を形成しうるものであればいかなる材質、形状のものも利用可能である。光架橋基の基体上への形成に関しては、公知の反応が利用できる。反応の例として、ガラス表面とシランカップリング剤との反応、プラスティップ表面の官能基と活性ハロゲン化物との反応、セルロース系樹脂とイソシアネート類との反応、物理吸着などが挙げられる。予め基体表面に導入された基との反応例としては、求核性基（アミノ基、ヒドロキシル基など）と電子受容基（カルボキシル基、エステル基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、共役ケトン、アクリル酸エステル、ビニルスルホン、酸無水物、アシルハライド、スルホニルハライドなど）との組み合わせ、生体反応を利用した組み合わせ（ビオチン−アビジン、基質―酵素）、金−チオールの組合せなど、基体の種類により適宜選択することができる。また、上記反応を行うための材料を基体の一部分に配置することが可能である。この配置は、例えば、スタンパーの利用やパターニングにより達成できる。基体の材質は、本発明の構造体を形成しうるものであればいかなる材質でもよく、金属、金属酸化物、無機半導体、有機半導体、ガラス類、セラミクス、天然高分子、合成高分子、プラスチックから選ばれる何れか１以上或いはその複合体を含んでなる材質である。本発明に用いる基体の形状は、本発明の構造体を形成しうるものであればいかなる形状でもよく、板状、粒子状、多孔体状、突起状、繊維状、筒状、網目状から選ばれる何れか１以上の形状を含んでなる形状である。
【００８８】
本発明に用いることのできる基体材料とその基体の例示は、特開２００５−３１２４４６号公報に開示されているものが使用できるが、これらに限定されるものではない。また、本発明の基体の大きさは使用用途に応じて種々選択することが可能である。
【００８９】
・標的物質検出用のキット
本発明にかかる抗光架橋基抗体に標的物質との結合性を付加した構成を用いて、標的物質検出用のキットを得ることができる。例えば、上記の構造体を形成するための基体及び抗光架橋基抗体と、該構造体への標的物質の結合を検出するための検出手段と、を有する標的物質検出用キットを構成することができる。抗光架橋基抗体を基体へ光照射により架橋固定化する方法は後述する。本キットにおける抗光架橋基抗体は、例えば種々の抗体に結合する糖鎖提示体として用いることができる。つまり、標的物質が抗体の糖鎖結合物質であることができる。標的物質と抗体との結合の形成を物理的あるいは化学的な手法で検出することによって標的物質の検出を行うことができる。更に、例えば、光学的な変化、電気的な変化、あるいは熱的な変化などにおける物理量の変化によって標的物質と抗光架橋基抗体との結合を検出することができる。
【００９０】
なお、かかる標的物質（特に抗原）との結合性を付加した構成としては、後述する光架橋基認識複合タンパク質として利用する場合を好ましいものとして挙げることができる。
【００９１】
・表面プラズモン共鳴装置および水晶発振子マイクロバランス装置
なお、光架橋基認識能を有するタンパク質への標的物質の結合は、例えば、従来既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定装置や水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）などで定量的に測定することができる。表面プラズモン共鳴は、一般にガラス基板上に設けた金薄膜上の屈折率変化を全反射角以下でガラス側から入射させた光によりガラス／金界面で生じるエバネセント波と金薄膜上の自由電子の共鳴（表面プラズモン共鳴）によって生じる共鳴角変化から測定する方法である。測定された屈折率変化を、標的物質の結合量として換算し、評価できる。光架橋基を化学的或は物理的に金薄膜上に形成したチップを作製し評価することができる。ＱＣＭは一般的に水晶発振子上の金電極面で行われる生体分子相互作用を水晶の周波数変化を指標に定量評価が可能である。その結果、周波数変化を被対象タンパク質の金への結合量として評価できる。ＳＰＲ同様光架橋基を化学的或は物理的に金薄膜上に形成したチップを作製し評価することができる。
【００９２】
・解離定数（ＫD）
「解離定数（ＫD）」とは、「解離速度（ｋｄ）」値を「結合速度（ｋａ）」値で除して求められる値である。これらの定数は、モノクローナル抗体またはそれらの断片が光架橋基に対する親和性を表す指標として用いることができる。この定数は、種々の方法に従って解析することができるが、本発明においては、測定機器であるＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用い、この装置に添付された解析ソフトに従って、得られた結合曲線から解析して得た。
【００９３】
・光架橋基認識複合タンパク質
本発明にかかる光架橋基認識複合タンパク質は、２以上のドメインから構成され、１以上のドメインが上記の構成の抗光架橋基抗体を有するものとして提供することができる。但し、全ドメインが抗光架橋基抗体を有することはなく、少なくとも１つのドメインが標的物質認識能を有する標的物質結合部位を成すドメインとして提供される。本複合タンパク質において、標的物質結合部位を成すドメインは標的物質を特異的に認識結合できればどんな構造の分子でも良い。タンパク質、糖鎖、核酸、脂質及びこれらの複合体などを用いることができる。タンパク質の場合、例えば抗体を超える親和性や抗体が認識できない分子認識などが期待される非抗体構造を有し且つ遺伝子工学的改変を施し標的物質に特異的に結合することが可能である分子、それらの断片、または誘導体も利用でき、少なくとも抗体の一部を有しているものが好ましい。かかる分子としては、アンキリン構造分子（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ２２，  Ｎｏ．５，  ５７５−５８２（２００４））、アフィリン分子（Ｓｃｉ  Ｐｒｏｔｅｉｎ社）、アフィボディー分子（Ｐｅｒ−Ａｋｅ  Ｎｙｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４８，  ４５４−４６２（２００２）））、フィブロネクチンＴｙｐｅＩＩＩ  １０ｔｈ、リポカリン、ＧＦＰ、レクチン、チオレドキシン、Ｏｍｐ（アウターメンブレンタンパク質）分子などを挙げることができる。また、それらの断片、または誘導体があり、少なくとも抗体の一部を有しているものも挙げることができる。
複合タンパク質には以下の構成のものが例示できる。
（ａ）上記構成の抗光架橋基抗体を含む第一のドメインと、標的物質に対する結合部位を有するタンパク質を含む第二のドメインと、を有する複合タンパク質
（ｂ）上記の第一のドメインと第二のドメインに加えて、第一のドメインと複合体を形成する第三のドメイン及び前記第二のドメインと複合体を形成する第四のドメインの少なくとも一方を更に有する複合タンパク質
【００９４】
なお、第一〜第四のドメインの被結合物質への結合性は各ドメインで独立して設定することができ、これらのドメインにおいて同じ結合性を有するドメインが２以上存在してもよく、異なる結合性のドメインからこれらのドメインを構成してもよい。更に、前記第一〜第四のドメインから選択された少なくとも２種が同一ポリペプチド鎖中に含まれているものであってもよい。このような構成としては、以下の構成を含む場合を挙げることができる。
（１）第一のドメインと第二のドメインが一本のポリペプチド鎖を形成している構成
（２）第一のドメインと第二のドメインが一以上のアミノ酸を介して結合されている構成
（３）第三のドメインと第四のドメインが一本のポリペプチド鎖を形成する構成
（４）第三のドメインと第四のドメインが一以上のアミノ酸を介して結合されている構成
（５）第一のドメインと第二のドメインを含んでなる第一のポリペプチド鎖と、第三のドメインと第四のドメインを含んでなる第二のポリペプチド鎖とからなる構成
（６）第一のドメインと第二のドメインを含んでなる第一のポリペプチド鎖と、第三のドメインと第二のドメインを含んでなる第三のポリペプチド鎖とからなる構成
（７）第一のドメインと第二のドメインを含んでなる第一のポリペプチド鎖と、第一のドメインと第四のドメインを含んでなる第四のポリペプチド鎖と、からなる構成
（８）少なくとも第一のドメインと第二のドメイン、及び第三のドメインを含んでなる一つのポリペプチド鎖からなる構成
（９）少なくとも第一のドメインと第二のドメイン、第四のドメインを含んでなる一つのポリペプチド鎖からなる構成
（１０）第一〜第四のドメインを含んでなる一つのポリペプチド鎖からなる構成
【００９５】
光架橋基認識複合タンパク質の構成要素としてのタンパク質は、少なくとも二以上のアミノ酸が結合して形成されるポリペプチド鎖を少なくとも一以上含んでなり、それらポリペプチド鎖が特定の立体構造を形成するように折り畳まれている構造を有する分子をいう。このタンパク質は、この構造により、固有の機能（変換、分子認識等）を発揮できるものとなっている。また、本発明の光架橋基認識複合タンパク質は、上述のとおり、少なくとも光架橋基に対する結合部位を一以上有し、更に標的物質との結合部位を少なくとも一以上有する、多価または多重特異性の結合性を示す複合タンパク質である。好ましい構成では、光架橋基に対する結合部位を有する第一のドメインは、少なくとも抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または重鎖可変領域（ＶＨ）の一部を含み、標的物質に対する結合部位を有する第二のドメインは、少なくともＶＨまたはＶＬの一部を含む。以下、光架橋基に結合するＶＨ、ＶＬをＶＨ（Ｐ）、ＶＬ（Ｐ）、標的物質に結合するＶＨ、ＶＬをＶＨ（Ｔ）、ＶＬ（Ｔ）とする。
抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、前述したように抗体重鎖及び抗体軽鎖が有する可変領域である。抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）は、一般的には各々アミノ酸約１１０個からなり、筒状の構造をとり、逆平行の向きに配置されたβシート群による層状構造が形成されている。この層状構造をひとつのＳＳ結合により結合し、非常に安定した構造体を形成している。また、可変領域（ＶＨまたはＶＬ）は、抗体の多様な抗原への結合を決定する相補的決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）と呼ばれる部分を有することが知られている。ＣＤＲは、ＶＨまたはＶＬにそれぞれ３つあり、比較的に多様性の少ないアミノ酸配列であるフレームワーク領域により分離されて配置され、対象となる認識部位の官能基の空間配置を認識することにより、より高度な特異的な分子認識を可能としている。
【００９６】
以下に、本発明の光架橋基認識複合タンパク質の一例について述べる。本発明の光架橋基認識複合タンパク質の最小単位は、上記第一のドメインと上記第二のドメインから構成され、図１にその模式的な図を示す。その組み合わせ例としては、ＶＨ（Ｐ）−ＶＨ（Ｔ）、ＶＨ（Ｐ）−ＶＬ（Ｔ）、ＶＬ（Ｐ）−ＶＨ（Ｔ）、ＶＬ（Ｐ）−ＶＬ（Ｔ）といった組み合わせが挙げられる。（Ｐ）で示されるタンパク質が、抗光架橋基抗体タンパク質である。この例では、光架橋基認識複合タンパク質は、第一のドメインと第二のドメインは相補的な結合部位を形成することなく、第一のドメインが光架橋基、第二のドメインが標的物質へと独立して結合するものである。第一のドメインと第二ドメインは、独立したポリペプチド鎖であっても、ドメインが連続的に結合されたポリペプチド鎖であってもよい。但し、ポリペプチド鎖が連続して結合されたポリペプチド鎖を形成することが、製造工程の簡略化及びその機能発現においてより好ましい形態である。第一のドメインと第二のドメインが連続して結合されたポリペプチド鎖の場合、第一のドメインと第二のドメインを直接連鎖してもよいし、一個以上のアミノ酸からなるリンカーを介して連鎖してもよい。アミノ酸からなるリンカーは１乃至１０個のアミノ酸からなるものであることが好ましい。より好ましくは１乃至５個のアミノ酸からなるものである。リンカーのアミノ酸長が１１乃至１５である場合、第一のドメインと第二のドメインは配置による制限が少なく、前記ドメイン間で相補的な結合形成（ｓｃＦｖ化）してしまう場合がある。このＶＨ／ＶＬ間の相補的な複合体形成を抑制するために、リンカー長を短くし、ドメイン間に構造的な制約を負荷することが有効であることが知られている。一方で、標的物質との結合性において立体障害を受けないようにするためにあえてリンカー長を１１以上に長く設けることも可能である。その場合、例えば重鎖抗体の抗原認識部位ＶＨＨやＶＨ／ＶＬ界面を遺伝子工学的に改変したＶＨまたはＶＬを用いることが望ましい。第一もしくは第二のドメインのそれぞれが光架橋基もしくは標的物質に結合した場合にもたらされる構造変化の影響が互いの所望する光架橋基と標的物質に対する結合能に影響がないことが望ましい。このために、リンカーにα−ヘリックス等の二次構造を持たせたり、本来所望の結合特性に無関係なポリペプチドのドメンインを挿入することも所望の特性や生産性に著しい影響を与えない範囲において可能である。
【００９７】
更に、先に述べたように、本発明の光架橋基認識複合タンパク質は、第一のドメインと複合体を形成する第三のドメイン、または／及び第二のドメインと複合体を形成する第四のドメインを含んでなる構成であっても良い。なお、これらの第三のドメイン及び第四のドメインのそれぞれは、ＶＨまたはＶＬの一部を少なくとも含む構成とすることができる。第三のドメインは、第一のドメインと複合体を形成することにより、第一のドメインと相補的な光架橋基結合部位を形成していることがより望ましい。例えば、図２（ａ）の模式図で示すように第一のドメインがＶＨ（Ｐ）である場合、第三のドメインは第一のドメインとＦｖを形成し得るＶＬであることが好ましい。より好ましくは第一のドメインと第三のドメインが光架橋基結合部位を連合して形成する構成である。このように第一のドメインが第三のドメインとＦｖを形成することにより、構造的により安定化し、構造変化による機能低下を抑制することが期待できる。さらに、第三のドメインが第一のドメインと連合して光架橋基結合部位を形成することにより、更に結合能（例えば、結合速度の向上、解離速度の抑制等）を向上することも期待される。
【００９８】
更には、図２（ｂ）に示すように第一のドメインと第三のドメインは、それぞれ独立したポリペプチド鎖として設けても、連鎖してなるポリペプチド鎖であってもよい（例えば、図２（ｂ）の模式図に示すように第三のドメイン−第一のドメイン−第二のドメインを連結してもよい。各ドメインは光架橋基及び標的物質に対して結合能が発揮されるように適宜その構成及び各ドメイン間の結合の組み合わせを決定することができる。）。また、別の例として、図３の模式図に示すような構成も可能である。つまり、前記第一のドメインと前記第二のドメインからなるポリペプチド鎖と第三のドメインと前記第二のドメインからなるポリペプチド鎖からなる複合体である。この場合、第一のドメインと第三のドメインから形成されるＦｖまたはＦｖ様複合体により光架橋基と結合し、上記第二のドメインにより標的物質に対して結合するアンカーとして第一のドメインが機能するものである。
【００９９】
また、本発明の光架橋基認識複合タンパク質は、第二のドメインと複合体を形成する、少なくともＶＨまたはＶＬの一部からなる第四のドメインを含んだ構成であっても良い。第四のドメインは、前記第二のドメインとともに標的物質に対する結合部位を相補的に形成することが望ましい。例えば、図４（ａ）の模式図に示すように、第二のドメインがＶＬである場合、第四のドメインは第二のドメインとＦｖを形成し得るＶＨであることが好ましい。より好ましくは第二のドメインと第四のドメインが前記標的物質に対する結合部位を連合して形成する構成である。また、図４（ｂ）の模式図に示すように、第一のドメイン、第二のドメイン、及び第四のドメインが連鎖したポリペプチド鎖を形成してもよい。図４（ｂ）の構成では、第一のドメインにて少なくとも表面の一部に光架橋基を有する基体と結合し、第二及び第四のドメインにて標的物質と結合するように各ドメインを選択することができる。この構成においては、特に、第一のドメインが基体との結合した際において不可逆的な構造変化をした場合においてもリンカー等を好適に設計することにより第二及び第四のドメインの標的物質との結合能への影響を最小限に抑えるようにすることが可能である。
【０１００】
更に、図５の模式図に示すような構成も可能である。つまり、前記第一のドメインと前記第二のドメインからなるポリペプチド鎖と第一のドメインと前記第四のドメインからなるポリペプチド鎖からなる複合体である。この場合、第二のドメインと第四のドメインから形成されるＦｖまたはＦｖ様複合体により標的物質を結合し、上記両ポリペプチド鎖を光架橋基に対して結合するアンカーとして第一のドメインが機能するものである。
【０１０１】
また、本光架橋基認識複合タンパク質は第三及び第四のドメインをともに構成材料とすることが可能である。図６の模式図に示すように第三のドメインと第四のドメインがそれぞれ独立したポリペプチド鎖であっても、図７の模式図に示すように連鎖されてなるポリペプチド鎖であってもよい。連鎖したポリペプチド鎖の場合、第三のドメインと第四のドメインを直接連鎖してもよいし、図７のように一以上のアミノ酸からなるリンカーを介して連鎖してもよい。また、図８の模式図に示すように前記第一乃至第四のドメインが一つのポリペプチド鎖内に連鎖されたものであってもよい。この場合、第一のドメインと第三のドメインが複合体を形成し光架橋基と結合し、第二のドメインと第四のドメインが複合体を形成し標的物質に結合できるように配置できるように構成されるものである。その為に、前記リンカーをドメイン間に設けることが好ましい。例えば、第一及び第二のドメイン間、第三及び第四のドメイン間は１乃至５アミノ酸であり、第二及び第三のアミノ酸のドメイン間は１５乃至２５アミノ酸である。同じような構成において、第一のドメインと第二のドメイン、第三のドメインと第四のドメインをそれぞれ／双方とも入れ替えること可能である。
【０１０２】
これら一本鎖ポリペプチド内における各ドメインの配列は、光架橋基及び標的物質に対する結合性、及び本光架橋基認識複合タンパク質の長期安定性等、所望の特性に応じて適宜選択して決定することが可能である。
【０１０３】
第一のドメインとしては、例えば、配列番号：１乃至配列番号：３のセット、配列番号：４及至配列番号：６のセットのアミノ酸からなる各セットの３つのＣＤＲｓまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲｓを有する第一のドメインが挙げられる。それぞれのアミノ酸配列は抗体のＨ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。機能的に同等のＣＤＲとは、一個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のものであって光架橋基に対する結合性を保持できれば何ら問題はない。各ＣＤＲｓは適宜各セット間で組み合わせても光架橋基に対する結合性を保持していれば何ら問題は無い。なお、上記配列を第三のドメインとして用いてもかまわない。
【０１０４】
第三のドメインとしては、例えば、配列番号：７及至配列番号：９のセット、配列番号：１０及至配列番号：１２のセットのアミノ酸からなる各セットの３つのＣＤＲまたはこれらと機能的に同等のＣＤＲを有する第三のドメインが挙げられる。それぞれのアミノ酸配列は抗体のＬ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３に対応する。機能的に同等のＣＤＲとは、一個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列のものであって光架橋基に対する結合性を保持できれば何ら問題はない。各ＣＤＲは適宜各セット間で交換して組み合わせても光架橋基に対する結合性を保持していれば何ら問題は無い。なお、上記配列を第一のドメインとして用いてもかまわない。
【０１０５】
上記第一のドメインと第三のドメインのＣＤＲセットまたはドメイン間で適宜交換して組み合わせて用いることができる。光架橋基に対する結合性を保持していれば何ら問題は無い。好ましくは、第一と第三のドメインの組み合わせはＨ鎖とＬ鎖由来のＣＤＲセットの組み合わせが好ましい。
【０１０６】
本発明は、上記光架橋基認識複合タンパク質をコードする核酸をも含む。更に、宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、マウス、ヒト等由来の従来既知のタンパク発現用細胞）を形質転換に用い、上記光架橋基認識複合タンパクを発現させるための遺伝子ベクターと、上記光架橋基認識複合タンパク質をコードする核酸を有する構成物をも含む。
【０１０７】
一つの構造物（発現ベクター）により発現できる本発明に係る光架橋基認識複合タンパク質の各ドメインは、１乃至４のいずれかから選択して、設計することが可能である。ひとつの発現ベクターに本発明の光架橋基認識複合タンパク質の複数のドメインをコードする場合、それぞれのドメインが独立した個々のポリペプチド鎖として発現させることができる。また、ドメイン間を連続して結合またはアミノ酸を介して結合させた一つのポリペプチド鎖として発現する発現ベクターの構成とすることも可能である。本発明の光架橋基認識複合タンパク質発現ベクターは、選択する宿主細胞に応じて既知のプロモーター等の導入遺伝子を発現させるために必要な構成等に組み込むことより、設計及び構築することができる。発現ベクターは、選択する宿主細胞に応じて既知のプロモーター等の構成等を参照し、構築することができる。また、大腸菌等を宿主細胞として用いる場合、外来遺伝子産物である光架橋基認識複合タンパク質を速やかに細胞質外に除外することで、プロテアーゼによる分解を少なくすることが可能である。また、この外来遺伝子産物が菌体にとって毒性である場合でも、菌体外へ分泌することによりその影響を小さくすることができることが知られている。通常、既知の細胞質膜あるいは内膜を通過して分泌されるタンパク質の多くがその前駆体のＮ末端にシグナルペプチドを有し、分泌過程においてシグナルペプチダーゼにより切断され、成熟タンパク質となる。多くのシグナルペプチドはそのＮ末に塩基性のアミノ酸、疎水性アミノ酸、シグナルペプチダーゼによる切断部位と配置されている。
【０１０８】
本発明の光架橋基認識複合タンパク質をコードする核酸の５’側にシグナルペプチドで
あるｐｅｌＢに代表される従来既知のシグナルペプチドをコードする核酸を配することにより、これを分泌発現させることができる。また、ひとつのベクター中に光架橋基認識複合タンパク質を構成する各ドメインまたは複数のドメインから構成されるポリペプチド鎖をそれぞれ独立して複数挿入することも可能である。この場合、各ドメインまたはポリペプチド鎖をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢをコードする核酸を配置し、これらの分泌
を促すことができる。更に、または一以上のドメインからなるポリペプチド鎖として発現させる場合、前記ポリペプチド鎖の５’末端に同様にしてｐｅｌＢをコードする核酸を配
置することにより、その分泌を促すことができる。このようにシグナルペプチドをＮ末端に融合した光架橋基認識複合タンパク質、あるいはその構成用途してのドメインは、ペリプラズマ画分及び培地上清から精製することができる。また、発現させたタンパク精製時の作業の簡便さを考慮して、独立した各ドメインもしくは複数のドメインが結合して形成されたポリペプチド鎖のＮまたはＣ末端に精製用のタグを遺伝子工学的に配置することが可能である。精製用タグとしては、ヒスチジンが６残基連続したヒスチジンタグ（以下、Ｈｉｓ×６）やグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのグルタチオン結合部位などが挙げられる。タグの導入方法としては、発現ベクターにおける光架橋基認識複合タンパク質をコードする核酸の５’または３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市
販の精製タグ導入用ベクターを使用するなどが挙げられる。
【０１０９】
以下に、上記発現ベクターを用いた本発明の光架橋基認識複合タンパク質の製造方法について述べる。
【０１１０】
本発明の光架橋基認識複合タンパク質、またはその構成要素となるポリペプチド鎖は、従来既知のタンパク発現用の宿主細胞を、宿主細胞に応じて設計した上記光架橋基認識複合タンパク質発現用ベクターで形質転換することにより生産することができる。この場合、これらは、宿主細胞内のタンパク合成システムを用いて、宿主細胞内に合成される。その後、宿主細胞内外に蓄積または分泌された目的生産物を細胞内部または細胞培養上清から精製することにより得ることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合、光架橋基認識複合タンパク質をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢに代表される従来既知
のシグナルペプチドをコードする核酸を配することにより細胞質外に分泌発現しやすい構成にすることができる。ひとつの発現ベクターで光架橋基認識複合タンパク質を構成する各ドメインを得るための複数のポリペプチド鎖を発現させる場合、各ポリペプチド鎖をコードする核酸の５’側にｐｅｌＢをコードする核酸を配置し、発現時に細胞質外への分泌
を促すことができる。このようにシグナルペプチドをＮ末端に融合した光架橋基認識複合タンパク質は、ペリプラズマ画分及び培地上清から精製することができる。精製方法としては、精製タグがＨｉｓタグの場合、ニッケルキレートカラムやＧＳＴの場合、グルタチオン固定化カラムを使用することで精製することができる。タンパク質の発現誘導以降の操作は可能な限り暗室またはイエローカーテン内で行うことが望ましい。
【０１１１】
また、菌体内に発現した本発明の光架橋基認識複合タンパクを不溶性顆粒で得ることも可能である。この場合、培養液から得られた菌体をフレンチプレスや超音波により破砕した細胞破砕液から前記不溶性顆粒を遠心分離することができる。得られた不溶性顆粒画分を尿素、塩酸グアニジン塩を含む従来既知の変性剤を含んだ緩衝溶液で可溶化した後に、変性条件下で前記と同様なカラム精製することができる。得られたカラム溶出画分は、リフォールディング作業により、変性剤除去と活性構造再構築を行うことができる。リフォールディング方法としては、従来既知の方法から適宜用いることも可能である。具体的には、段階透析法や希釈法などを目的のタンパクに応じて用いることが可能である。
【０１１２】
本発明の光架橋基認識複合タンパク質の各ドメインまたは各ポリペプチド鎖は、各々を同一宿主細胞内で発現させてから複合化させることも可能であるし、別の宿主細胞を使用して発現した後に共存させて、複合体化させることも可能である。
【０１１３】
更に、本発明の光架橋基認識複合タンパク質をコードするベクターを用いて、細胞抽出液を用いて生体外でのタンパク質発現をすることも可能である。好適に用いられる細胞抽出液としては、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球等が挙げられる。しかしながら、上記無細胞抽出液によるタンパク合成は一般的には還元条件下で行われる。その為に、抗体断片中のジスルフィド結合を形成させるために何らかの処理を行う方がより好ましい。
【０１１４】
本発明の光架橋基認識複合タンパク質の光架橋基に対する好ましい解離定数（ＫD）は、先に述べたとおり、１０-4Ｍ以下であり、より好ましくは１０-6Ｍ以下である。
【０１１５】
本発明の標的物質に対して結合能を有するこのような抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、または抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を取得する方法のひとつとして以下の方法を挙げることができる。
【０１１６】
まず、ＶＨまたはＶＬ遺伝子ライブラリーを作製し、それらをタンパク質として網羅的に発現させる。次に、その遺伝子と対応させながら、標的物質に対する結合性により選択する。
【０１１７】
前記遺伝子ライブラリーは、たとえば、臍帯血、扁桃、骨髄、あるいは末梢血細胞や脾細胞等から得ることができる。例えば、ヒト末梢血細胞からｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。次に、ヒトＶＨ、ＶＬをコードする配列をプローブとして、ヒトＶＨまたはＶＬのｃＤＮＡライブラリーを作製する。例えば、ヒトＶＨファミリー（ＶＨ１乃至７）をファミリー毎に幅広く増幅することができるプライマーやヒトＶＬを増幅できるプライマーは公知である。これらＶＨ、ＶＬ毎にプライマーを組み合わせてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＶＨ、ＶＬをコードした遺伝子を取得する。
【０１１８】
また、ファージディスプレー法を用いることも可能である。ファージディスプレー法では、まず、ＶＨ、ＶＬまたはそれら含む複合体（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）をコードした遺伝子ライブラリーを、ファージ外殻タンパクをコードした遺伝子と結合し、ファージミドライブラリーを作製する。次に、それらを大腸菌に形質転換し、種々のＶＨまたはＶＬを外殻タンパクの一部として有するファージとして発現させる。それらのファージを用いて、上記同様にして標的物質に対する結合性により所望のＶＨ、ＶＬまたはそれら含む複合体を選択する。ファージに融合タンパクとして提示されたＶＨまたはＶＬをコードする遺伝子は、ファージ内にファージミドにコードされているのでＤＮＡシークエンス解析をすることにより、特定することができる。もちろん、ファージディスプレー法と同等の選択方法も適用できる。
【０１１９】
さらに、本発明の標的物質に対して結合能を有する非抗体構造の標的物質捕捉タンパク質、例えばアンキリン、アフィリンなども上記選択方法を用いて選択することができる。更には、標的物質にて免疫した動物から目的の抗体を産出する細胞を採取し、上記と同じプライマーを使用し、ＶＨまたはＶＬの塩基配列及びアミノ酸配列を特定することができる。
【０１２０】
また、本発明の第二のドメイン、第四のドメインは標的物質に対して既知の抗体及び抗体断片の可変領域のアミノ配列を元に設計することができる。また、標的物質に対する抗体または抗体断片が未取得の場合、これに対する抗体を取得した後にアミノ酸配列を解析することにより、前記と同様にして設計することも可能である。前記第三のドメインと前記第四のドメインが供に本発明の金結合性タンパク質を構成するドメインであってもよい。このようにして、得られたＶＨまたはＶＬの塩基配列を用いて、本発明の光架橋基認識複合タンパクを作製することが可能である。
【０１２１】
・光架橋基を有する被結合対象物
免疫やパニング等により光架橋基認識複合タンパク質を選択する際に用いる被結合対象物としては、先に抗光架橋基抗体の場合に例示したものが利用できる。
【０１２２】
・基体及び構造体
本発明に係る光架橋基認識複合タンパク質は、基体との組み合わせることで種々の用途に利用できる構造体を得ることができる。この用途に利用できる基体としては、先に抗光架橋基抗体の場合に例示したものが利用できる。
【０１２３】
・標的物質
本発明にかかる光架橋基認識複合タンパク質を、光架橋基と結合性を有するドメインと、標的物質に対して結合性を有するドメインとが含まれるように構成することで、標的物質検出用の複合タンパク質として利用することが可能となる。この検出対象としての標的物質としては、抗原抗体反応を用いた各手法によって抗原となり得る物質であれば如何なる分子も用いることが可能である。例えば、標的物質は、非生体物質と生体物質に大別される。
【０１２４】
本発明に用いることのできる標的物質としての非生体物質、生体物質または具体的なタンパク質の例示は、特開２００５−３１２４４６号公報の段落０１０８〜０１１１に開示されているものが使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
・標的物質検出用キット
本発明にかかる光架橋基認識複合タンパク質を用いて標的物質検出用のキットを構成することができる。例えば、第二ドメイン及び必要に応じて用いられる第四ドメインに標的物質に対して特異的に結合する抗体又はその変異体を用いた光架橋基認識複合タンパク質を用いる。この光架橋基認識複合タンパク質と、光架橋基を含む表面を有する基体と、必要に応じて、基体上に光架橋基認識複合タンパク質を介して固定された標的物質を検出するための検出手段と、を含む標的物質検出用のキットを構成することができる。光架橋基を含む基体上に光架橋基認識複合タンパク質を介して固定された標的物質の検出には、例えば、前記基体が金基板であり、その基板表面に光架橋基を設けていれば、前述の表面プラズモン共鳴測定装置を用いて測定することが可能である。
【実施例】
【０１２６】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。下記に示す実施例において本発明タンパク質を光照射により光架橋する工程以外は、基本的に暗室またはイエローカーテン内で操作を行うことができる。
【０１２７】
実施例１（免疫原のマウスへの免疫）
本発明における抗光架橋基抗体を取得するため、免疫原として４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ−ＫＨＬ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  （株式会社矢内原研究所製）を用いてマウスに６回免疫した。免疫する前の免疫原溶液の取扱いはイエローカーテン内で行った。
【０１２８】
一回目の免疫は次の手順で行った。まず、２ｍｇ／ｍｌ免疫原溶液０．７ｍｌ（免疫原１．４ｍｇ）にフロイント完全アジュバント（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．３４４２８９）０．７ｍｌを加えて、ジョイントで連結させた注射筒内で約１０分間混合しエマルジョンを作製した。次に、このエマルジョン０．２ｍｌ（０．２ｍｇ）をマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、♀、７週齢）１匹の腹腔内に免疫した。合計５匹のマウスに免疫を行った。
【０１２９】
２〜６回目の免疫は次の手順で行った。まず、１ｍｇ／ｍｌ免疫原溶液０．７ｍｌ（免疫原０．７ｍｇ）にフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．２６３９１０）０．７ｍｌを加えて、ジョイントで連結させた注射筒内で約１０分間混合しエマルジョンを作製した。次に、このエマルジョン０．２ｍｌ（０．１ｍｇ）をマウス１匹の腹腔内に免疫した。４回免疫後１２日目及び５回免疫後７日目に部分採血して抗血清を取得し、抗体価測定に用いた。
【０１３０】
実施例２（抗血清の抗体価測定）
下記（１）、（２）の異なる方法により、実施例１で部分採血したサンプルの抗体価を従来既知のＥＬＩＳＡ法により測定した。また、下記に示す操作のすべては可能な限り暗所にて行った。
（１）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体固定による測定法
抗原サンプルとして、４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＮＨ−ｂｉｏｔｉｎ（株式会社矢内原研究所製）を用いた。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を固相化した９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、以下の各成分を添加した。
（１）０．０１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌに希釈した抗原サンプル溶液５０μｌ
（２）２０００〜１６００倍希釈した抗血清（４回及び５回免疫後部分採血抗血清）５０
μｌ
その状態で、室温で３時間反応させた。次に、９６ウェルタイタープレートを洗浄後、３０００倍に希釈したＳＡ−ＨＲＰ溶液（ＯＮＣＯＧＥＮＥ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＯＲ０３Ｌ）１００μｌを分注し室温で２時間反応させた。更にプレートを洗浄して基質溶液（ＯＰＤ；ＳＩＧＭＡ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＵＫ−Ｂ２５）１００μｌを分注し室温で２０分間反応させた。最後に２Ｎ硫酸溶液１００μｌを加えて反応を停止し、ＯＤ４９２ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１３１】
マウス（ｍｏｕｓｅ）Ｎｏ．１〜５の４回免疫後部分採血した抗血清のビオチン標識体を用いた抗体価測定結果を図９中の（１−１）、（２−１）及び（３−１）、並びに図１０中の（１−１）及び（２−１）に示した。また、マウスＮｏ．１〜５の５回免疫後部分採血した抗血清のビオチン標識体を用いた抗体価測定結果を図９中の（１−２）、（２−２）及び（３−２）、並びに図１０の（１−２）及び（２−２）に示した。また、４回及び５回免疫後部分採血抗血清を比較して、いずれのマウスの抗体価もほぼ同じであった。マウスＮｏ．３が最も高い抗体価を示し、以下Ｎｏ．２、Ｎｏ．４、Ｎｏ．１、Ｎｏ．５の順で高かった。これらの図９及び図１０中、−●−は×２０００の場合を、−■−は×４０００の場合を、−▲−は×８０００の場合を、−○−は×１６０００の場合を示す。
【０１３２】
（２）抗原固定による測定法
抗原サンプルとして、４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ−ＢＳＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  （株式会社矢内原研究所製）を用いた。まず、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3溶液を用いて１μｇ／ｍｌの抗原サンプル溶液を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに０．１ｍｌずつ添加し、４℃で一晩静置した。溶液を捨てブロックエース（４倍希釈液）０．３ｍｌを分注し、４℃更に一晩静置し、プレート内の溶液を除きデシケーター内で２日間乾燥させ抗原サンプルを固相化した９６ウェルマイクロタイタープレートを作製した。使用まで４℃で保存した。上記プレートのウェルに３０００〜３７５０００倍希釈した抗血清（４回及び５回免疫後部分採血抗血清）１００μｌを添加し、室温で３時間反応させた。次に、９６ウェルタイタープレートを洗浄後、１００００倍に希釈したヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）溶液（ＩＣＮ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６７４２８１）１００μｌを分注し室温で２時間反応させた。更にプレートを洗浄して基質溶液（ＯＰＤ；ＳＩＧＭＡ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＵＫ−Ｂ２５）１００μｌを分注し室温で２０分間反応させた。最後に２Ｎ硫酸溶液１００μｌを加えて反応を停止し、ＯＤ４９２ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１３３】
マウスＮｏ．１〜５の４回免疫後部分採血した抗血清のＢＳＡコンジュゲート固相化プレートを用いた抗体価測定結果を図１１中の（１）に、５回免疫後部分採血した抗血清のビオチン標識体を用いた抗体価測定結果を図１１中の（２）に示した。いずれのマウス抗血清もＢＳＡコントロール（ＢＳＡ  ｃｏｎｔｒｏｌ）プレートにはほとんど反応しなかった。また、４回及び５回免疫後部分採血抗血清を比較して、いずれのマウスの抗体価もほぼ同じであった。マウスＮｏ．５が最も高い抗体価を示し、以下Ｎｏ．４、Ｎｏ．３、Ｎｏ．２、Ｎｏ．１の順で高かった。
【０１３４】
実施例３（ハイブリドーマの作製（細胞融合））
実施例２の部分採血抗体価測定の結果より、マウスＮｏ．３及びＮｏ．５をハイブリドーマ作製のサンプルとした。まず、５ｃｍシャーレに培養液（ＲＰＭＩ  １６４０：  ＩＣＮ社製）５ｍｌを加え、火炎滅菌したスチールメッシュを入れた。マウスより摘出した脾臓をメッシュ上で磨り潰し、単離脾細胞を得た。脾細胞を５０ｍｌ遠心チュ−ブに移し、２０ｍｌの培養液で２回洗浄した。あらかじめ培養してあるＰ３Ｕ１ミエローマ細胞を２０ｍｌの培養液で２回洗浄した。それぞれの細胞数をカウントし、脾細胞とミエローマ細胞を１０：１の割合で混合し、遠心した。細胞沈査にＰＥＧ溶液ＨＹＢＲＩ−ＭＡＸ（ＳＩＧＭＡ社製）２ｍｌを３０秒間かけて加えた後、３０秒間ゆっくりと混合した。培養液５ｍｌを２分間かけて加え、さらに培養液５ｍｌを加えた。そして、３７℃で３分間インキュベートした。その後、８００ｒｐｍで５分間遠心した。細胞沈査にＨＡＴ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をゆっくりと加え、脾臓細胞数で２〜３×１０５／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌに調整した。その後更に、９６ウェル培養用プレートの各ウェルに０．２ｍｌずつ分注した。その後、ＣＯ2インキュベーター内で１０日間培養して、細胞融合を完了した。
【０１３５】
実施例４（スクリーニング＆抗体価測定）
実施例２の（２）に記載の抗体価測定法と同様に実施例３で得たハイブリドーマに関して測定を行い、抗体価の上昇確認することでハイブリドーマのスクリーニングを完了した。２次スクリーニングまで行い抗体価の高いハイブリドーマ細胞を得た。その結果、マウスＮｏ．３より４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ−ＢＳＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを固相化したプレートに反応する抗体を産生するハイブリドーマ２株、マウスＮｏ．５より４株の計６株を得た。得られたハイブリドーマ株６種類の名を６Ｈ１１−Ｆ１１Ｆ４、６Ｃ９−Ａ５Ｂ１０、６Ａ８−１Ｃ６−１Ｂ６、１Ｅ２−２Ｈ６−１Ａ９、４Ｇ２−１Ｅ１０−１Ｆ１０、３Ｅ１２−１Ｂ６−１Ａ５と定めた。
【０１３６】
実施例５（クローニング（二回）及び腹水の作製）
マウスの胸腺を摘出し、胸腺細胞を調製した。胸腺細胞を培養液で５×１０6細胞／ｍｌに調整し、その１００μｌを９６ウェル培養プレートの各ウェルへ入れた。実施例４の２次スクリーニングで選択したハイブリドーマ細胞をそれぞれ培養液で１０細胞／ｍｌに希釈し、その細胞希釈液１００μｌを上記調製した培養プレートの各ウェルへ入れた。１０日間培養後各ウェルのコロニーを観察し、１コロニーのみのウェルを確認した。次に培養上清を回収し、抗体価の測定方法により陽性ウェルをＯ．Ｄ．値の高いものより順次選択した。クローン細胞約５×１０6個をあらかじめプリスタン０．５ｍｌを腹腔内に投与したヌードマウス２匹ずつに投与し、約１０日後より腹水を採取した。
【０１３７】
実施例６（モノクローナル抗体の精製）
実施例５で得た腹水に脱脂処理を行い、等量の硫酸アンモニウムを徐々に滴下した後、４℃で１時間放置した。懸濁液を３５００ｒｐｍで３０分遠心し、上清を除いた後沈査を元の腹水量のダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社）に溶解した。生理食塩水（５Ｌ×２）で透析し、−３０℃で凍結保存した。実施例５で各種ハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体名もハイブリドーマ株と同様の名前とし、各々の採取腹水量と抗体精製量について表１に示した。
【０１３８】
【表１】
2008113654.tif 000005
【０１３９】
実施例７（モノクローナル抗体のアイソタイプ決定）
精製したモノクローナル抗体のアイソタイプをＭｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（大日本製薬株式会社：Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＭＴ１）を用いて決定した。培養液１５０μｌをキット添付のチューブへ入れ、３０秒間静置した後、攪拌した。キット添付のスティックをチューブに入れ反応した。各抗体のアイソタイプを表１にまとめた。取得したすべてのモノクローナル抗体はＩｇＭであり、詳細として、３Ｅ１２−１Ｂ６−１Ａ５は、ＩｇＭ（λ）であり、その他抗体６Ｈ１１−Ｆ１１Ｆ４、６Ｃ９−Ａ５Ｂ１０，６Ａ８−１Ｃ６−１Ｂ６、１Ｅ２−２Ｈ６−１Ａ９、４Ｇ２−１Ｅ１０−１Ｆ１０はＩｇＭ（κ）であった。
【０１４０】
実施例８（精製モノクローナル抗体の反応性）
実施例２の（２）に記載の抗体価測定法と同様に行い抗体の反応性を評価した。実施例２における抗血清の代わりに実施例６で得た精製モノクローナル抗体６種類について濃度希釈系列を作製し、測定をした。その結果、図１２〜１４に示すとおり、６種類すべてのモノクローナル抗体において、ＢＳＡコントロールプレートではほとんど反応せず（○）、抗原提示ＢＳＡプレートにおいて濃度に依存して有意に反応する（●）ことが解った。
【０１４１】
実施例９（抗体可変部位遺伝子配列解析）
（１）Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの調製
実施例４で得たハイブリドーマ細胞６種の内、３種類（１Ｅ２−２Ｈ６−１Ａ９、６Ａ８−１Ｃ６−１Ｂ６、６Ｃ９−Ａ５Ｂ１０）のモノクローナル抗体について遺伝子解析を行った。以下の実施例において、上記３種の産生するモノクローナル抗体を改めてＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３と命名した（同順）。ＰＭ１及びＰＭ２を産生する２種のハイブリドーマ細胞を１種毎に回収し処理した後、それぞれについてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）中において、ホモジナイズにより破砕した。以降の操作は、Ｔｒｉｚｏｌ試薬のプロトコールに準じた条件で作業を行い、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出・精製を行った。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（タカラバイオ）で処理し、残存するＤＮＡを分解した後、精製した。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ反応
（１）で調製したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型にして、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ反応には、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用して、ＰＣＲにはＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ）を使用した。ＲＴ反応に用いた各Ｈ鎖、Ｌ鎖増幅用ｐｒｉｍｅｒは、Ｍｏｕｓｅ  ｓｃＦｖ  Ｍｏｄｕｌｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス）添付のＰｒｉｍｅｒセット（Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（アマシャム  ２７−１５８３−０１）、Ｈｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（アマシャム  ２７−１５８６−０１））を用いた。以下に反応組成と反応条件を示す。
＜ＲＴ反応液組成＞
２×Ｂｃａ  １ｓｔ  Ｂｕｆｆｅｒ                    １０．０μｌ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ4                                  ４．０μｌ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｕｒｅ                                １．０μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ                        ０．５μｌ
Ｂｃａ  ＰＬＵＳ  ＲＴａｓｅ                          １．０μｌ
Ｏｌｉｇｏ  ｄＴ−Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＦＢ  １．０μｌ
ＲＮＡ                                                １．０μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ            Ｕｐ  ｔｏ  ２０．０μｌ
＜ＲＴ反応条件＞
６５℃                          １ｍｉｎ．
３０℃                          １ｍｉｎ．
３０→６５℃                  １５ｍｉｎ．（３０℃→６５℃を１５分かけて行った）
６５℃                          ３０ｍｉｎ．
９８℃                          ５ｍｉｎ．
５℃                            ５ｍｉｎ．
＜  ＰＣＲ反応液組成＞
１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ      ２．０μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                １．６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（注）
ＲＴ  Ｐｒｏｄｕｃｔ                  １．０μｌ
Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）            ０．１μｌ
ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｈ2Ｏ      Ｕｐ  ｔｏ  ２０．０μｌ
（注）Ｌ鎖を増幅する場合、Ｌｉｇｈｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｍｉｘ（アマシャムバイオサイエンス）を０．８μｌ、
Ｈ鎖を増幅する場合、Ｈｅａｖｙ  Ｐｒｉｍｅｒ１，２（アマシャムバイオサイエンス）を各０．４μｌ添加した。
【０１４２】
＜ＰＣＲ反応条件＞
９６℃                          ５ｍｉｎ．
９４℃  ３０ｓｅｃ．→５５℃  ３０ｓｅｃ．→７２℃  １ｍｉｎ．  ３０サイクル
７２℃                          ５ｍｉｎ．
４℃
ＲＴ―ＰＣＲ反応液を１％アガロース電気泳動によりｃＤＮＡ由来の増幅をすべて確認した。
【０１４３】
（３）ＴＡクローニング
ＲＴ−ＰＣＲ反応により得られた各増幅産物をゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いてプライマーを除去して精製した。精製物を、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２．１（タカラバイオ）を用いて、ｐＴ７  Ｂｌｕｅ−Ｔ  ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ）とライゲーション反応を行った。その後、ライゲーション産物を用いて大腸菌ＤＨ５α（タカラバイオ）を形質転換した。得られた白コロニーについて、ベクター上のプライマー（Ｍ１３−４７、ＲＶ−Ｍ（タカラバイオ））を用いてころにーＰＣＲを行い、推定分子量の増幅産物が確認されたそれぞれ８クローンをシークエンス解析に使用した。
【０１４４】
（４）シークエンス解析
選択したクローンについてプラスミドＤＮＡを調製し、Ｍ１３−４７およびＲＶ−Ｍプライマーを使用してシークエンス解析を行った。シークエンス反応には、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、Ｋｉｔ添付のプロトコールに準じた条件で反応を行った。シークエンス反応物は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０  Ｆｉｎｅを用いてゲルろ過精製した。精製物を用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００を用いて電気泳動を行い解析し、ハイブリドーマ２種が産生するモノクローナル抗体（ＰＭ１、ＰＭ２）の各抗体可変領域（ＶＨ、ＶＬ）の塩基配列を決定した。（ＰＭ１−ＶＨ  配列番号：１３、ＰＭ１−ＶＬ  配列番号：１４、ＰＭ２−ＶＨ  配列番号：１５、ＰＭ２−ＶＬ  配列番号：１６）
実施例１０（細胞寄託）
前記ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関して、特許生物寄託センターに寄託を行い、各々受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６２）、ＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５６（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６３）およびＦＥＲＭ  Ｐ−２０８５７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７６４）を得た。また、４Ｇ２−１Ｅ１０−１Ｆ１０、６Ｈ１１−Ｆ１１Ｆ４を産生するハイブリドーマに関して、特許生物寄託センターに寄託して、各々受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２５及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０８２６を得た。
【０１４５】
実施例１１（精製抗体の光架橋効果評価）
実施例６で精製したモノクローナル抗体（ＰＭ１、ＰＭ２、ＰＭ３）を実施例２の（２）に記載の抗体価測定法と同様にして作製した抗原サンプルを固相化したプレートに分注する。なお、抗原サンプルは、４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ−ＢＳＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅである。分注後、室温で３時間反応させる。次に、９６ウェルタイタープレートを洗浄後、ＵＶクロスリンカー  ＣＬ−１０００Ｌ（フナコシ）で上記プレートに３６５ｎｍ波長の光を２０ｍＷ／ｃｍ2程度照射する。その後、洗浄と光照射を４回繰り返し行う。更に、各工程のプレートに、それぞれ１００００倍に希釈したヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰコンジュゲート溶液（ＩＣＮ社製  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．６７４２８１）１００μｌを分注する。分注後、室温で２時間反応させる。更にプレートを洗浄して基質溶液（ＯＰＤ；ＳＩＧＭＡ社製  Ｃａｔ  Ｎｏ．ＵＫ−Ｂ２５）１００μｌを分注し、室温で２０分間反応させる。最後に２Ｎ硫酸溶液１００μｌを加えて反応を停止し、ＯＤ４９２ｎｍの吸収をマイクロプレートリーダーで測定する。対照実験として光照射をせず同数洗浄したプレートを用意する。結果として、ＭＰ１〜３のすべてのモノクローナル抗体において、光照射したプレートはほぼ１００％抗体が保持されているのに対して光照射しない対照プレートでは洗浄により脱落していく様子が見える（図１５）。
【０１４６】
実施例１２（光架橋基およびＨＥＬ認識複合タンパク質の取得）
（１）抗光架橋基抗体可変領域ＶＨコード核酸断片の調製
抗光架橋基抗体可変領域ＶＨ（ＰＭ２−ＶＨ  配列番号：１５）の５末端側に制限酵素ＮｃｏＩ切断部位、３’末端側に制限酵素ＮｈｅＩを配置したベクター導入用の抗光架橋
基抗体可変領域ＶＨ（以下、ＶＨｐ）を作製する。そのために、プライマーとして、以下のものを用意する。
ＰＭ２−ＶＨ−Ｆ（配列番号：１７）：
５’−ＮＮＮＮＮＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧ−３’
ＰＭ２−ＶＨ−Ｂ（配列番号：１８）：
５’−ＮＮＮＮＮＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧ−３’
【０１４７】
上記のプライマーセットを用いて市販のＰＣＲキットを当業者の推奨する調合にてＰＣＲを行い、約３５０ｂｐの塩基対を得る。上記ＶＨＢ−Ｆを使用し、市販のシークエンス反応キットと反応液組成によりＢｉｇＤｙｅ−ＰＣＲ反応を行った。温度サイクルは９６℃×３ｍｉｎ→（９４℃×１ｍｉｎ→５０℃×１ｍｉｎ→６８℃×４ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅ→４℃とする目的のＶＨをコードする塩基配列を有する断片が得られたことを確認する。
（２）抗光架橋基抗体可変領域ＶＬコード核酸断片の調製
抗光架橋基抗体可変領域ＶＬ（ＰＭ２−ＶＬ  配列番号：１６）の５末端側に制限酵素ＮｈｅＩ部位及びリンカー（ＧＧＧＧＳ）をコードする核酸、３’末端側にＨｉｓ×６の
上流に制限酵素ＳａｃＩＩを配置したベクター挿入用の抗光架橋基抗体可変領域ＶＬ（以下、ＶＬｐ）を作製する。そのために、プライマーとして以下のものを用意する。
ＰＭ２−ＶＬ−Ｆ（配列番号：１９）：
５’−ＮＮＮＮＮＧＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ−３’
ＰＭ２−ＶＬ−Ｂ（配列番号：２０）：
５’−ＮＮＮＮＮＣＣＧＣＧＧＡＴＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣ−３’
【０１４８】
これらのプライマーを使用する以外は、（１）と同様にして核酸断片を得て、目的のＶＬの塩基配列を有することを確認できる。
【０１４９】
実施例１３（発現ベクター作製）
上記２種の核酸断片用いてを２つの発現ベクターを以下の構成で構築する。
（１）ＶＨｐ−ＶＬｈ発現用ベクター（ｐＰＨＥＬ）の作製
（ｉ）ＶＨｐの挿入
特開２００５−３１２４４６号公報に開示されているベクターｐＧＨＥＬ（金結合性ＶＨ−ＨｙＨＥＬ１０認識ＶＬ）を、制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で切断する。得られた断片混合物を、スピンカラム４００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス）で処理する。次に、同様に実施例１２で増幅したＰＣＲ産物（ＶＨｐ）を制限酵素ＮｃｏＩ／ＮｈｅＩにて切断する。得られた切断断片を、市販のゲル精製キット（ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して精製する。上記二つの断片を、市販のＴ４リガーゼキット（Ｒｏｃｈｅ社）を業者推奨の方法にて調合しライゲーションを行う。ライゲーション溶液をＪＭ１０９コンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）４０μＬにヒートショック法により形質転換する。その後、ＬＢ／アンピシリン（ａｍｐ．）プレートに撒き、３７℃にて一晩静置する。次に、プレート中から任意のコロニーをＬＢ／ａｍｐ．  ３ｍＬ液体培地に植え継ぎ、３７℃にて一晩振盪培養を行う。その後、市販のＭｉｎｉＰｒｅｐｓキット（Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、プラスミドを回収する。得られたプラスミドを、ＭＰ１−ＶＨ−Ｆと−Ｂを使用して前記シークエンス方法にて塩基配列を確認したところ、目的の断片が挿入されていることを確認することができ、結果として抗光架橋基抗体可変領域ＶＨ−ＨｙＨＥＬ１０認識ＶＬコンストラクトが得られる。
【０１５０】
（２）ＶＨｈ−ＶＬｐ  発現用ベクター（ｐＨＰＨＯＴＯ）の作製
（ｉｉ）ＶＬｐの挿入
特開２００５−３１２４４６号公報に開示されているベクターｐＨＧＯＬＤ（ＨｙＨＥＬ１０認識性ＶＨ−金結合ＶＬ）を、制限酵素ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩ（ともにＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で切断する。得られた断片混合物を、スピンカラム４００ＨＲ（アマシャムバイオサイエンス）で処理する。次に、同様に実施例１２で増幅したＰＣＲ産物（ＶＬｐ）を制限酵素ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩにて切断する。得られた切断断片を市販のゲル精製キット（ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ：  Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して精製する。上記二つの断片を、市販のＴ４リガーゼキット（Ｒｏｃｈｅ社）を業者推奨の方法にて調合しライゲーションを行う。ライゲーション後、前記のように形質転換を行う。得られたプラスミドが目的のＶＨｈ−ＶＬｐ発現用ベクターｐＨＰＨＯＴＯであることを（１）と同様にして確認する。（確認用プライマーは、ＭＰ１−ＶＬ−Ｆ、−Ｂ）
実施例１４（タンパク発現及び精製）
上記実施例１３の（ｉ）で得られたＶＨｐ−ＶＬｈ、及び実施例１３の（ｉｉ）で得られたＶＨｈ−ＶＬｐのポリペプチドを発現する発現ベクターを用いて、個別の系において以下に記すタンパク発現及び精製工程を行う。そうして、それぞれポリペプチド鎖ＶＨｐ−ＶＬｈ及びＶＨｈ−ＶＬｐとして取得する。下記に示すリフォールディング完了以降は暗所またはイエローカーテン内で操作を行う。
１）形質転換
上記２つの発現ベクターを用いて、それぞれ異なる大腸菌ＢＬ２１株を形質転換する（ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル溶液４０μＬ）。形質転換は、ヒートショック（氷中→４２℃×９０ｓｅｃ→氷中）でおこなう。ヒートショックにより形質転換した上記ＢＬ２１溶液にＬＢ培地７５０μＬを加え、一時間３７℃にて振盪培養を行った。その後、６０００ｒｐｍ×５分間遠心を行い、培養上清６５０μＬを廃棄し、残った培養上清と沈殿となった細胞画分を攪拌し、ＬＢ／ａｍｐ．プレートに撒き、一晩３７℃にて静置する。
２）予備培養
プレート上のコロニーを無作為に選択し、３．０ｍＬ  ＬＢ／ａｍｐ．培地にて２８℃にて一晩振盪培養を行う。
３）本培養
上記予備培養溶液を２×ＹＴ培地  ７５０ＭＬに植え継ぎ、更に培養を２８℃にて継続した。ＯＤ６００が０．８を越えた時点で、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを加え、更に２８℃にて終夜培養を行う。
４）精製
目的のポリペプチド鎖を不溶性顆粒画分から以下の工程により精製する。
（ｉ）不溶性顆粒の回収
上記３）で得られた培養液を６０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎにて遠心し、沈殿を菌体画分として得る。得られた菌体をトリス溶液（２０ｍＭ  トリス／５００ｍＭ  ＮａＣｌ）１５ｍｌに氷中にて懸濁する。得られた懸濁液をフレンチプレスにて破砕し、菌破砕液を得る。次に、菌破砕液を１２，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎで遠心を行い、上清を除き、沈殿を不溶性顆粒画分として得る。
（ｉｉ）不溶性顆粒画分の可溶化
上記（ｉ）で得られた不溶性画分を６Ｍ  塩酸グアニジン／トリス溶液１０ｍＬを加えて、一晩浸漬する。次に、１２，０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎで遠心し、上清を可溶化溶液として得る。
（ｉｉｉ）金属キレートカラム
金属キレートカラム担体として、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いる。カラム調製やサンプル負荷、及び洗浄工程は、前記業者の推奨方法に準拠し、室温（２０℃）にて行う。目的であるＨｉｓタグ融合のポリペプチドの溶出は６０ｍＭイミダゾール／Ｔｒｉｓ溶液にて行う。溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（アクリルアミド１５％）の結果、単一バンドであり、精製されていることを確認する。
（ｉｖ）透析
上記溶出液に対して、外液を６Ｍ塩酸グアニンジン／Ｔｒｉｓ溶液として４℃にて透析を行い、溶出液中のイミダゾールの除去を行い、上記それぞれのポリペプチド鎖溶液を得る。
（ｖ）リフォールディング
上記と同様にして、ＶＨｐ−ＶＬｈ及びＶＨｈ−ＶＬｐのそれぞれのポリペプチド鎖溶液を以下の工程により別個に、脱塩酸グアニンジンを透析（４℃）にて行いながらタンパク質のリフォールディングを行う。
（ａ）６Ｍ塩酸グアニジン／Ｔｒｉｓ溶液を用い、それぞれのポリペプチド鎖のモル吸光係数とΔＯ．Ｄ．（２８０ｎｍ−３２０ｎｍ）値から濃度７．５μＭのサンプル（希釈後体積１０ｍｌ）を調製する。次にβ−メルカプトエタノール（還元剤）を終濃度３７５μＭ（タンパク濃度５０倍）になるよう添加、室温、暗所で４時間還元を行う。このサンプル溶液を透析バック（ＭＷＣＯ：１４，０００）に入れ、透析用サンプルとする。
（ｂ）透析外液を６Ｍ塩酸グアニンジン／トリス溶液として、透析サンプルを浸漬し、緩やかに攪拌しながら６時間透析する。
（ｃ）外液の塩酸グアニジン濃度を３Ｍ、２Ｍと段階的に下げる。それぞれの外液濃度において、６時間透析する。
（ｄ）酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を終濃度３７５μＭ、Ｌ−Ａｒｇを終濃度０．４Ｍ）となるようにトリス溶液に加え、上記（ｃ）の２Ｍの透析外液を加え、塩酸グアニジン濃度が１Ｍとし、ｐＨをＮａＯＨで、ｐＨ８．０（４℃）に調製した溶液にて、１２時間緩やかに攪拌しながら透析する。
（ｅ）上記（ｄ）と同様の作業にて塩酸グアニジン濃度０．５Ｍの含Ｌ−Ａｒｇトリス溶液を整し、更に１２時間透析する。
（ｆ）最後にトリス溶液にて１２時間透析する。
（ｇ）透析終了後、１００００ｒｐｍで約２０分遠心分離し凝集体と上清を分離する。
（ｖｉ）２量化画分の精製
上記（ｖ）で得られた個々の５μＭポリペプチド（ＶＨｐ−ＶＬｈ、ＶＨｈ−ＶＬｐ）溶液を混合し、４℃にて一晩する。次に、セファデックス７５カラム（カラム：バッファー  ２０ｍＭ  トリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、流速  １ｍｌ／ｍｉｎ）にて二量体化した６０ｋＤａ相当（インジェクションから約１８分）のフラクションを得る。これを相互作用測定用サンプルとする。
【０１５１】
実施例１５（ＱＣＭ金基板への光架橋基およびＨＥＬ認識複合タンパク質の光架橋固定）
水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）により、本複合タンパク質の固定能と標的物質としてのＨＥＬの結合能を評価できる。ＱＣＭ装置として、ＡＦＦＩＮＩＸＱ（イニシアム社製）を用いる。
ｉ）基板の前処理
まず、ＱＣＭ発振子（イニシアム社製）の金電極上をピランハ溶液（過酸化水素水：濃硫酸＝１：３）で５分間×２回洗浄し、蒸留水で再度洗浄し、１ｍＭジチオジプロピオン酸エタノール溶液に発振子を浸す。蒸留水で洗浄後、１００ｍｇ／ｍｌＥＤＣ（１−３−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）水溶液および１００ｍｇ／ｍｌＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）水溶液を等量混合する。発振子表面に得られた混合液の１００μｌをキャストし２０分放置する。そして、１ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．５）で発振子を洗浄後、０．１５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジン水溶液を発振子表面にキャストし、１時間以上放置する。更にバッファーで洗浄後、１Ｍエタノールアミン水溶液１００μｌを発振子表面にキャストし２０分放置し、最終的に結合評価に使用するバッファーＰＢＳ（ｐＨ７．４）に置換する。
【０１５２】
ｉｉ）光架橋基およびＨＥＬ認識複合タンパク質の固定
上記前処理をした発振子表面に４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｙｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨＮＨ−ｂｉｏｔｉｎ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌをキャストし１時間以上放置する。バッファーで洗浄後、実施例１４で作製した光架橋基およびＨＥＬ認識複合タンパク質を１００μｌキャストし、ＵＶクロスリンカー  ＣＬ−１０００Ｌ（フナコシ）で３６５ｎｍ波長の光を２０ｍＷ／ｃｍ2程度照射する。ＡＦＦＩＮＩＸＱに上記発振子を接続し、ＰＢＳバッファーが入っているガラスセルに浸し、振動数を安定化させる。光照射により複合タンパク質は架橋固定するので振動数の変化がほとんどないことが確認できる。
【０１５３】
また、もう一つの固定方法として、上記ｉ）のＥＤＣ／ＮＨＳ処理した発振子に４−（１−Ａｚｉ−２，２，２−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ  ＢＳＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌをキャストし１時間以上放置する。バッファーで洗浄後、実施例１４で作製した光架橋基およびＨＥＬ認識複合タンパク質を１００μｌキャストし、ＵＶクロスリンカー  ＣＬ−１０００Ｌ（フナコシ）で３６５ｎｍ波長の光を２０ｍＷ／ｃｍ2程度照射する。ＡＦＦＩＮＩＸＱに上記発振子を接続し、ＰＢＳバッファーが入っているガラスセルに浸し、振動数を安定化させる。光照射により複合タンパク質は架橋固定するので振動数の変化がほとんどないことが確認できる。
【０１５４】
実施例１６（ＱＣＭによるＨＥＬ結合評価）
前記ガラスセルに最終濃度が５０ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭになるようにＨＥＬ溶液を添加し、１０分後の各々周波数の変化を測定し、回帰線から反応速度定数を算出する。その結果、両固定法ともＨＥＬの結合力が十分に保持されていることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明によれば、光架橋基に対する結合部位を一以上有し、且つ標的物質に対する結合部位を有する光架橋基認識複合タンパク質、及び前記光架橋基認識複合タンパク質を固定化した基体を含む構造体を提供することができる。本発明にかかる光架橋基認識複合タンパク質を基体に固定化した構造体では、基体表面に設けた光架橋基を特異的に認識する結合部位で結合し、更に光照射により共有結合的に固定化されている。その為、前記タンパク質が有する標的物質結合部位が基体に固定化されることもなく、また一度固定化されたタンパク質は基体から解離することもない。更に光架橋基認識部位の構造部により基体から間隔を確保して均質的に再現良く配向される。それにより、標的物質結合部位が基板からの結合能に対する影響を最小限に抑え、効率的かつ高配向に基板表面上に固定されたものとなる。つまり、本発明は、生体物質などの有機物を基体表面に固定化して、該有機物の有する種々の生理的機能を利用する、バイオセンサーやバイオリアクターを初めとする、各種の生体物質の機能を応用する製品の高性能化に利用可能であることが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図２】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図３】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図４】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図５】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図６】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図７】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図８】本発明にかかる複合タンパク質の一例における、構造体の構成を模式的に示す図である。
【図９】実施例２で得られた結果を示す図である。
【図１０】実施例２で得られた結果を示す図である。
【図１１】実施例２で得られた結果を示す図である。
【図１２】実施例８で得られた結果を示す図である。
【図１３】実施例８で得られた結果を示す図である。
【図１４】実施例８で得られた結果を示す図である。
【図１５】実施例１１で得られた結果を示す図である。
【図１６】本発明にかかる構造体を適用し得るバイオセンサーの一例の構造を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【０１５７】
１    第一のドメイン
２    第二のドメイン
３    第三のドメイン
４    第四のドメイン
５    リンカー
６    リンカー
【図１】
2008113654.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008113654.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2008113654.tif 000019
【図１４】
2008113654.tif 000020
【図１５】
2008113654.tif 000021
【図１６】
2008113654.tif 000022
【配列表】
2008113654000001.app