(57)【要約】【課題】醸造用酵母の正確な判別、分離、同定を迅速、正確且つ容易に行う方法の開発。【解決手段】醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＦＬＯ５遺伝子及びＹＨＲ２１３Ｗ遺伝子又はＹＡＲ０６２Ｗ遺伝子を含むＤＮＡ配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し、又は制限酵素処理したのち電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いにより酵母を判別する。その結果、醸造用酵母の正確な分類・判別が、迅速且つ容易に可能となる。本判別方法は、再現性が高く、しかも極めて短期間に結果を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＦＬＯ５遺伝子及びＹＨＲ２１３Ｗ又はＹＡＲ０６２Ｗ遺伝子を含むＤＮＡ配列の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅させた遺伝子断片を電気泳動し又は制限酵素処理した後に電気泳動し、その電気泳動のパターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項２】
醸造用酵母がブドウ酒酵母、焼酎酵母、泡盛酵母、清酒酵母の少なくとも一つの酵母であって、判別が同一用途間及び／又は異なった用途間での判別であること、を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
電気泳動のパターンの違いが、増幅された遺伝子断片の有無又は該遺伝子断片の数の違い、又は、該遺伝子断片の大きさの違いであること、を特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
醸造用酵母のゲノムＤＮＡを
配列番号１（プライマーＡ）及び配列番号２（プライマーＢ）、
配列番号３（プライマーＣ）及び配列番号４（プライマーＤ）、
配列番号５（プライマーＥ）及び配列番号６（プライマーＦ）、
配列番号７（プライマーＧ）及び配列番号８（プライマーＨ）、
の少なくとも一つで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片をプライマーとして用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、増幅された遺伝子断片を直接電気泳動し、その泳動パターンの違いによって酵母を判別すること、を特徴とする醸造用酵母の判別方法。
【請求項５】
配列番号１〜８の塩基配列で、それぞれ示される、醸造用酵母判別プライマーＡ〜ＨのＤＮＡの少なくともひとつ。
【請求項６】
請求項５に記載のプライマーＤＮＡあるいは該プライマーを用いたＰＣＲ産物を含んでなること、を特徴とする醸造用酵母判別キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母の判別に関し、更に詳細には、醸造用酵母の分類・判別に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
醸造用酵母としては、ブドウ酒酵母、清酒酵母、焼酎酵母等いくつかの種類の酵母が使用されてきており、また更にこれらの各酵母の内、例えばブドウ酒酵母は、Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社販売の２２３６酵母やＥＣ１１１８酵母等が使用され、また清酒酵母としては協会７号（Ｋ−７）、９号（Ｋ−９）酵母等が使用され、焼酎酵母としては鹿児島酵母Ｋ２、宮崎酵母ＭＫ等が使用されている。
【０００３】
しかしながら、これらの醸造用酵母はいずれもサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に分類され、更に清酒酵母及び焼酎酵母等に関してはサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に分類される。このように醸造用酵母は同一属又は同一種に属するため、通常の菌学的性質は共通しており、これらの酵母を短時間にかつ正確に区別することは極めて困難である。したがって、現時点においては、酵母を小仕込試験するなどして、その醸造特性から判別するなどの方法で酵母の判別を行わざるを得ないのが実状である。しかしながら、これらの判別方法は、酵母を実際に培養し、仕込みを行って当該酵母の醸造特性を確認する必要があるため、判別に相当の時間を要しており、当業界においてその改善が求められている。
【０００４】
このように、実際の酒類製造の現場において、そしてまた試験研究機関において、短期間で正確且つ簡易な酵母の判別システムの確立は従来から重要な課題である。
【０００５】
そこで本発明者らは、このような技術の現状に鑑み、例えば協会ブドウ酒酵母１号、３号、４号といった同一用途の酵母間においても、それを短期間で正確且つ簡易に判別できるシステムの開発という極めて困難な技術的課題をあえて新規に設定し、鋭意研究を行ってきた。そして、遺伝子を利用した酵母の判別法を開発するのに成功し、その成果について、既に特許出願をしたところである（特許文献１、２、３参照）。
【特許文献１】特開２００３−２４５０７７号公報
【特許文献２】特開２００４−３２９０８６号公報
【特許文献３】特開２００６−３４０６７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
先願に係る発明は、いずれも、すぐれたものであるが、本発明者らは、これらの成果に満足することなく、先願に係る発明を発展させ、改良することとした。
【０００７】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものである。
まず、先願の発明（特許文献１及び特許文献２）は、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部を増幅させ、その増幅される断片の長さ、数の違いにより、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【０００８】
先願発明においては、醸造用酵母のゲノムＤＮＡをＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部を増幅させるプライマーを用いて、ＰＣＲ法にて増幅させ、それら増幅した遺伝子断片を電気泳動又は制限酵素処理した後、電気泳動することで、その泳動パターンを観察すればよいので作業が容易かつシンプルである。また、特定の遺伝子（この場合はＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子、ＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子、ＭＵＣ１遺伝子の一部又は全部）を増幅させるプライマーを用いることで、ＰＣＲ法での増幅で得られるＤＮＡ断片の種類も安定している点など、優れた点が多い。
【０００９】
また先願では、初めにＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子及びＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子に着目し、それらの遺伝子が酵母の増殖に必須遺伝子でないこと、当該遺伝子にコードされているタンパク質は分子内に繰り返される短いアミノ酸配列を有することなど共通した特徴を有することに着目し、ＹＩＬ１６９Ｃ遺伝子及びＹＯＬ１５５Ｃ遺伝子と相同性を有しない遺伝子の中から、これらの特徴を有する遺伝子を検索した結果、ＭＵＣ１遺伝子を見出し、更にこれが醸造用酵母の判別法に利用可能であることを確認した。
【００１０】
そして、本発明者らは、上記した先願の発明について更に検討を加えた結果、ＦＬＯ遺伝子でも判別が可能であることを見出した。ＦＬＯ遺伝子自体は、既知であるが（インターネット（ｈｔｔｐ：ｗｗｗ．  Ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．  ｏｒｇ）にて公開されており入手に格別の困難性はない。）、先願出願前においてＦＬＯ遺伝子に着目した酵母の判別は行われておらず、ましてや、ＦＬＯ遺伝子の特定の一部をプライマーとして増幅させ、増幅させた遺伝子断片を利用して酵母を判別する点については、全く報告されておらず、先願に係る発明が最先である（特許文献３参照）。
【００１１】
また、リボソーム遺伝子は従来より酵母の判別に利用されているが、詳細に遺伝子配列を検討した結果、ＩＧＳ領域に醸造用酵母間で６ｂｐを単位として繰り返し回数の異なる部位があることを新しく見出した。当該配列に着目したプライマーを設計し、ＰＣＲ反応を行うことで増幅するＤＮＡ断片が醸造用酵母間で異なり、醸造用酵母の判別に利用可能であることを見出し、この点についても既に特許出願をしたところである（特許文献３参照）。
【００１２】
これらの方法により、同一用途の酵母間において、それを短期間で正確且つ簡易に判別できた。しかし、これらの特許文献記載による手法でブドウ酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と清酒酵母といった異なった用途の酵母間の判別も可能であるものの、電気泳動によるＤＮＡ断片の長さの差が小さいため正確に算出する必要があった。
【００１３】
このため、異なった用途の酵母間で顕著な差が増幅ＤＮＡ断片に認められれば判別が一層容易になると考えられる。具体的には、用途の異なる酵母間で増幅ＤＮＡ断片の有無に差が認められる、増幅ＤＮＡ断片の長さが３０％程度異なる、用途の異なる酵母間では長さが異なるものの用途の同じ酵母間では同じである等の結果を得ることができれば判断が容易となる。
【００１４】
本発明は、これらの点を解決することを新規技術課題として新たに設定したものである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、この技術課題を解決する目的でなされたものである。換言すれば、本発明は、本発明者らの開発に係る遺伝子を利用した酵母の判定法を大幅に改良して、実効性を高める目的でなされたものである。
【００１６】
本発明者らは、上記目的達成のため、各方面から検討の結果、再度、ＦＬＯ遺伝子に着目した。そして、本発明者らは、改めてＦＬＯ遺伝子について更に研究を続けたところ、ＦＬＯ５遺伝子をＰＣＲ法により増幅させることで、清酒酵母と焼酎酵母が、そして更に、ＦＬＯ５遺伝子、ＹＨＲ２１３Ｗ遺伝子又はＹＡＲ０６２Ｗ遺伝子の一部を増幅させることで、清酒酵母と焼酎酵母とブドウ酒酵母の大半が用途別に特徴的な増幅ＤＮＡ断片を示し、用途に酵母を容易且つ正確に判別できることをはじめて見出した。
【００１７】
本発明は、上記有用新知見に基づき更に研究の結果完成されたものであって、上記遺伝子由来のＤＮＡ断片をプライマーとして用い、醸造用酵母ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行って、増幅された遺伝子断片の有無、長さや数の違い等により、その醸造用酵母の判別を行う点を基本的技術思想とするものである。
【００１８】
本発明を実施するにあたり、先ず、プライマーの開発が必要となる。そこで本発明者らは、鋭意研究の結果、プライマーＡ〜Ｈ（それらの塩基配列を配列表の配列番号１〜８及び下記表１に示す）を初めて開発するのに成功した。
【００１９】
プライマーＡ〜Ｈの塩基配列を下記表１に示す。
【００２０】
【表１】
2008193904.tif 000002
【００２１】
本発明の実施にあたり、プライマーとして、上記したように今回本発明者らが初めて開発するのに成功したプライマーＡ〜Ｈ（配列番号１〜８：表１）を選択、使用し、酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを行うのであるが、プライマーとしては当該遺伝子から切り出してもよいし、また、上記したプライマーを合成して用いてもよい。プライマーとしては、判別しようとする酵母に応じたものを適宜選択して使用すればよく、酵母によっては、Ａ〜Ｈ以外のプライマーをＦＬＯ５遺伝子から若しくはＹＨＲ２１３Ｗ又はＹＡＲ０６２Ｗ遺伝子を含むＤＮＡ断片が増幅するように設計して用いてもよい。ＰＣＲは常法に従って行えばよく、その結果、目的としたＤＮＡ断片を得ることが出来る。なお、本発明においては、プライマーは、配列番号１〜８の少なくともひとつで示される塩基配列からなるＤＮＡ断片のほか、該塩基配列を含むＤＮＡ断片を包含するものである。
【００２２】
このように増幅して得た遺伝子断片は、これをアガロースゲル電気泳動等の電気泳動して、その泳動パターンを観察することにより、酵母の判別をすることができる。プライマーの種類、組み合わせを選択することにより、酵母に特有な明確な泳動パターンが得られる。また所望するのであれば、ＰＣＲにて増幅された遺伝子断片を制限酵素で切断し、これを電気泳動してその電気泳動パターンを観察することができる。
【００２３】
したがって、本発明によれば、プライマー、鋳型に用いるゲノムＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ断片、その制限酵素消化物の少なくともひとつについて、その種類を変えることによって、各種の醸造用酵母の判別、同定が可能となり、あるいは、逆に特定の醸造用酵母の用途等を判別、同定するためには、プライマー等を選別すればよい。
【００２４】
このようにして本発明によれば、醸造用酵母の用途別分類が可能となるので、上記したプライマー等の少なくともひとつを用いて酵母の判別、同定、分類用キットを組むことができる。したがって、例えばプライマーＡ及びＢを用いて、協会焼酎酵母の判別、同定、分類キットを組むことができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する等従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００２６】
更に本発明は、酵母としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する酵母であればすべての酵母に対して適用可能であり、例えば、清酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と焼酎酵母、ブドウ酒酵母と清酒酵母等異なった醸造用酵母間の判別はもとより、非常に困難でデリケートな同一の醸造用酵母間の判別、例えば、ブドウ酒酵母間や、焼酎酵母間や、清酒酵母間の判別も可能である。したがって、本発明は、酒類製造学、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・同定・判定を可能にするものである。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１：醸造用酵母の判別法）
酵母として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に属する清酒酵母、焼酎酵母、ブドウ酒酵母及び実験室酵母を用いた。
【００２９】
具体的には、清酒酵母として、Ｋ−６、Ｋ−７、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１１、Ｋ−１３、Ｋ−１４、Ｋ−１５０１、Ｋ−１６０１、Ｋ−１７０１、Ｋ−６０１、Ｋ−７０１、Ｋ−９０１、Ｋ−１００１及び  Ｋ−１４０１（日本醸造協会）を、焼酎酵母として、ＫＦ１、ＫＦ３及びＣＡＮ１（球磨焼酎酒造組合）、ＭＫ０２１、Ｉ−３３及びＣ１４（宮崎県食品開発センター）、Ｃ４、Ｈ５及びＫ２（鹿児島県工業技術センター）、Ａｗ１０１（沖縄国税事務所）、Ｓ−２及びＳ−３（日本醸造協会）を、ブドウ酒酵母として、ブドウ酒酵母１号（ＫｙｏｋａｉＮｏ１）、３号（ＫｙｏｋａｉＮｏ３）及び４号（ＫｙｏｋａｉＮｏ４）（日本醸造協会）、Ｌ２３２３、ＢＭ４５、７１Ｂ、Ｋ１Ｖ１１１６、ＣＳ２、ＣＥＧ、ＳＩＨＡ７、Ｌ２７、ＥＣ１１１８、ＳＩＨＡ４、Ｔ７３、４３、ＢＣ、ＳＩＨＡ４、ＢＤＸ（以上Ｌａｌｌｅｍａｎｄ社）及びＷ−３（当所保存菌株）を、実験室酵母としてＳ２８８Ｃ（インビトロジェン社）を、それぞれ、用いた。
【００３０】
宝酒造（株）の「じぇんとる君」を用いて、精製したゲノムＤＮＡを、プライマーＡ〜Ｈ（配列番号１〜８）の各々の組み合わせでＰＣＲ法（ＰＣＲ反応条件は、９５℃で３分を１サイクル、９５℃で１分、６１℃で１分、７２℃で１分を２５サイクル、７２℃で３分を１サイクルの条件で、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）で行った。）にて増幅したのち、アガロースゲル電気泳動を行った。
【００３１】
＜結果１＞
焼酎酵母（Ａ）及び清酒酵母（Ｂ）のプライマーＡ（配列番号１）とプライマーＢ（配列番号２）による増幅ＤＮＡ断片の電気泳動結果を図１に示す。
【００３２】
図中、（Ａ）レーン１は、分子量マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ：  長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１３は順にＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１、ＭＫ０２１、Ｉ−３３、Ｃ１４、Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２、Ａｗ１０１、Ｓ−２、Ｓ−３、以上、焼酎酵母。（Ｂ）レーン１及び１３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１２は順にＫ−６、Ｋ−７、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１１、Ｋ−１３、Ｋ−１４、Ｋ−１５０１、Ｋ−１６０１、Ｋ−１７０１、以上、清酒酵母。レーン１２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１４〜１８はＫ−６０１、Ｋ−７０１、Ｋ−９０１、Ｋ１００１、Ｋ−１４０１、以上、清酒酵母。レーン１９はＳ２８８Ｃで実験室酵母。
【００３３】
清酒酵母やＳ２８８Ｃでは３．２ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が認められるものの、Ｈ５を除く焼酎酵母に増幅ＤＮＡ断片は認められない。またＨ５の増幅ＤＮＡ断片は清酒酵母やＳ２８８Ｃのものに比べて２倍程度の長さ（６．２ｋｂｐ）を有している。
【００３４】
＜結果２＞
ブドウ酒酵母（Ａ）、焼酎酵母（Ｂ）及び清酒酵母（Ｃ）のプライマーＣ（配列番号３）とプライマーＤ（配列番号４）による増幅ＤＮＡ断片の電気泳動結果を図２に示す。
【００３５】
図中、（Ａ）レーン１及び１４は、分子量マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ：長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１２は順に協会ブドウ酒酵母１号、協会ブドウ酒酵母３号、協会ブドウ酒酵母４号、Ｌ２３２３、ＢＭ４５、７１Ｂ、Ｋ１Ｖ１１１６、ＣＳ２、ＣＥＧ、ＳＩＨＡ７、Ｗ−３、以上、ブドウ酒酵母。レーン１３はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１５〜２１は順にＬ２７、ＥＣ１１１８、Ｔ７３、４３、ＢＣ、ＳＩＨＡ４、ＢＤＸ、以上、ブドウ酒酵母。レーン  ２２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。（Ｂ）レーン１はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１３は順にＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１、ＭＫ０２１、Ｉ−３３、Ｃ１４、Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２、Ａｗ１０１、Ｓ−２、Ｓ−３、以上、焼酎酵母。
（Ｃ）レーン１及び１３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１２は順にＫ−６、Ｋ−７、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１１、Ｋ−１３、Ｋ−１４、Ｋ−１５０１、Ｋ−１６０１、Ｋ−１７０１、以上、清酒酵母。レーン１２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１４〜１８はＫ−６０１、Ｋ−７０１、Ｋ−９０１、Ｋ１００１、Ｋ−１４０１、以上、清酒酵母。レーン１９はＳ２８８Ｃで実験室酵母。
【００３６】
約４００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片がブドウ酒酵母で認められるものの、他の酵母では焼酎酵母のＫＦ１及び実験室酵母Ｓ２８８Ｃでのみ認められる。
【００３７】
＜結果３＞
ブドウ酒酵母（Ａ）、焼酎酵母（Ｂ）及び清酒酵母（Ｃ）のプライマーＥ（配列番号５）とプライマーＦ（配列番号６）による増幅ＤＮＡ断片の電気泳動結果を図３に示す。
【００３８】
図中、（Ａ）レーン１及び１４は、分子量マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ：  長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１３は順に協会ブドウ酒酵母１号、協会ブドウ酒酵母３号、協会ブドウ酒酵母４号、Ｌ２３２３、ＢＭ４５、７１Ｂ、Ｋ１Ｖ１１１６、ＣＳ２、ＣＥＧ、ＳＩＨＡ７、Ｗ−３、以上、ブドウ酒酵母。レーン１３はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１５〜２１は順にＬ２７、ＥＣ１１１８、Ｔ７３、４３、ＢＣ、ＳＩＨＡ４、ＢＤＸ、以上、ブドウ酒酵母。レーン２２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。（Ｂ）レーン１はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）、レーン２〜１３は順にＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１、ＭＫ０２１、Ｉ−３３、Ｃ１４、Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２、Ａｗ１０１、Ｓ−２、Ｓ−３、以上、焼酎酵母。（Ｃ）レーン１及び１３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１１は順にＫ−６、Ｋ−７、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１１、Ｋ−１３、Ｋ−１４、Ｋ−１５０１、Ｋ−１６０１、Ｋ−１７０１、以上、清酒酵母。レーン１２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１４〜１８はＫ−６０１、Ｋ−７０１、Ｋ−９０１、Ｋ１００１、Ｋ−１４０１、以上、清酒酵母。レーン１９はＳ２８８Ｃで実験室酵母。
【００３９】
上記結果から明らかなように、ブドウ酒酵母は６４０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が、清酒酵母では１２００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が共通して認められ、焼酎酵母ではＫＦ１、Ｉ−３３、Ｃ１４を除いて９３０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が共通して認められる。焼酎酵母で認められる９３０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片はブドウ酒酵母では認められず、清酒酵母１２００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片はブドウ酒酵母の中ではＬ２７でのみ認められる。増幅ＤＮＡ断片のパターンは、焼酎酵母ＫＦ１がブドウ酒酵母１号に代表されるブドウ酒酵母と同じであり、焼酎酵母Ｉ−３３がブドウ酒酵母ＳＩＨＡ７と、焼酎酵母Ｃ１４がブドウ酒酵母Ｋ１Ｖ１１１６及びＥＣ１１１８と同じであるが、清酒酵母とブドウ酒酵母とは一致するものが見出せない。
【００４０】
＜結果４＞
ブドウ酒酵母（Ａ）、焼酎酵母（Ｂ）及び清酒酵母（Ｃ）のプライマーＧ（配列番号７）とプライマーＨ（配列番号８）による増幅ＤＮＡ断片の電気泳動結果を図４に示す。
【００４１】
図中、（Ａ）レーン１及び１４は、分子量マーカー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ：  長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１２は順に協会ブドウ酒酵母１号、協会ブドウ酒酵母３号、協会ブドウ酒酵母４号、Ｌ２３２３、ＢＭ４５、７１Ｂ、Ｋ１Ｖ１１１６、ＣＳ２、ＣＥＧ、ＳＩＨＡ７、Ｗ−３、以上、ブドウ酒酵母。レーン１３はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１５〜２１は順にＬ２７、ＥＣ１１１８、Ｔ７３、４３、ＢＣ、ＳＩＨＡ４、ＢＤＸ、以上、ブドウ酒酵母。レーン２２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。（Ｂ）レーン１はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に  ７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１３は順にＫＦ１、ＫＦ３、ＣＡＮ１、ＭＫ０２１、Ｉ−３３、Ｃ１４、Ｃ４、Ｈ５、Ｋ２、Ａｗ１０１、Ｓ−２、Ｓ−３、以上、焼酎酵母。（Ｃ）レーン１及び１３はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｒｋｅｒ（長さは上から順に７ｋｂｐ、５ｋｂｐ、３ｋｂｐ、２ｋｂｐ、１．５ｋｂｐ）。レーン２〜１１は順にＫ−６、Ｋ−７、Ｋ−９、Ｋ−１０、Ｋ−１１、Ｋ−１３、Ｋ−１４、Ｋ−１５０１、Ｋ−１６０１、Ｋ−１７０１、以上、清酒酵母。レーン１２はＳ２８８Ｃで実験室酵母。レーン１４〜１８はＫ−６０１、Ｋ−７０１、Ｋ−９０１、Ｋ１００１、Ｋ−１４０１、以上、清酒酵母。レーン１９はＳ２８８Ｃで実験室酵母。
【００４２】
ブドウ酒酵母で４３０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が共通して認められ、焼酎酵母の中ではＫＦ１及びＨ５でのみ４３０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が認められる。清酒酵母では増幅ＤＮＡ断片は認められない。
【００４３】
上記から明らかなように、プライマーの組み合わせを各種選択し、増幅されるＤＮＡ断片の有無、及び／又は増幅されるＤＮＡの長さを各種検討することによって、各酵母を分類・判別することができる。
【００４４】
本発明によれば、小仕込試験、薬剤や培養条件を変えて判別する従来の方法に比して、短時間に判別できるという著効が奏され、しかも明確に判別することができ、安定的な結果が得られ、再現性を有するものであり、操作も簡単という著効が奏される。
【００４５】
更に本発明によれば、用途の異なる醸造酵母間の判別はもとより、醸造酵母以外の野生酵母の混入などの判別も可能であって、本発明は、酒類製造業、試験研究機関等において、短期間に簡易にして正確な酵母の分類・判別を可能とするものであり、野生酵母ともろみ中の酵母の明確な判別も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】電気泳動のパターンを示す図面代用写真である（結果１）。
【図２】電気泳動のパターンを示す図面代用写真である（結果２）。
【図３】電気泳動のパターンを示す図面代用写真である（結果３）。
【図４】電気泳動のパターンを示す図面代用写真である（結果４）。
【図１】
2008193904.tif 000003
【図２】
2008193904.tif 000004
【図３】
2008193904.tif 000005
【図４】
2008193904.tif 000006
【配列表】
2008193904000001.app