(57)【要約】【課題】ポリアミド樹脂や医薬中間体の原料となるジアミンであるカダベリンを経済的にかつ環境負荷を低減した製造方法を提供する。【解決手段】リジン炭酸塩を基質として、酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに維持されるように二酸化炭素を加えながら、リジンの酵素的脱炭酸反応を行い、カダベリン炭酸塩を生成する。この溶液を濃縮処理することにより、二酸化炭素を系外に放出させてカダベリンを製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン炭酸塩の水溶液に、同溶液のpHがリジンの酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに維持されるように二酸化炭素を加えながら、リジンの酵素的脱炭酸反応を行ってカダベリン炭酸塩を生成させ、得られたカダベリン炭酸塩の水溶液を濃縮してカダベリンを得ることを特徴とするカダベリンの製造法。
【請求項２】
前記酵素的脱炭酸反応に適したpHがpH9.0以下である請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記二酸化炭素を気体として加える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リジン炭酸塩の水溶液がリジン炭酸塩発酵液である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酵素的脱炭酸反応を、リジン脱炭酸酵素、またはリジン脱炭酸酵素を産生する細胞もしくは同細胞の処理物を用いて行う請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、リジン脱炭酸酵素活性が上昇するように改変された細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、リジン脱炭酸酵素活性が上昇した組換え細胞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がエシェリヒア・コリ細胞であり、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が下記の（a）又は(b)に記載の遺伝子である請求項７に記載の方法；
（a）配列番号１１に記載の塩基配列を有する遺伝子、
（b）配列番号１１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はポリアミド樹脂や医薬中間体の原料などとして有用なカダベリンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
所謂プラスティックの生産の原料としてナフサ等の石油系原料が多く用いられている。プラスティックを再生利用する場合はともかく、燃焼等によるプラスティックの廃棄は炭酸ガスの放出を招くことから近年社会問題となりつつある。そこで、地球温暖化防止及び循環型社会の形成に向けてプラスティック原料を非石油系原料に置き換えることが嘱望されている。
非石油系原料から製造されるプラスティックは、ポリ乳酸を始めとする様々な種類のものが検討されている。これらのプラスティックはその原料により耐熱性などの物性が異なる。このうち特に耐熱性の高い非石油系原料由来のプラスティックの開発は、ポリ乳酸が高温条件での使用に向かない点から特に注目されている。
耐熱性の高いプラスティックとしてはポリアミド樹脂があげられ、このうち使用量が多いのは炭素数６のジアミンであるヘキサメチレンジアミンと炭素数６のジカルボン酸であるアジピン酸とのモル比1:1の重合体であるナイロン６６である。しかしヘキサメチレンジアミンはナフサから得られるベンゼン、プロピレンまたはブタンジエンを原料に製造されており、非石油系原料からの製造方法は知られていない。
一方、炭素数５のペンタメチレンジアミンは別名カダベリンと呼ばれ、アミノ酸の1つであるリジンからリジン脱炭素酵素（LDC）によって生成することが知られている（非特許文献１）。したがって、炭素数６のヘキサメチレンジアミンの代わりに炭素数５のペンタメチレンジアミンを原料に用いてポリアミド樹脂を製造することにより、非石油系原料を用いた高温条件下で使用可能なプラスティック素材の供給が可能となる。
また、カダベリンはポリアミド樹脂以外にも医薬中間体などで需要が見込まれるが、その価格が高価であり、更なる普及の為には安価な製造方法の開発が必須である。
リジンにLDCを作用させてカダベリンを生成する場合、リジンの脱炭酸により二酸化炭素が発生し、１価のカチオンであるリジンから2価のカチオンであるカダベリンが生成する為、反応中pHが上昇する。したがって、ｐH上昇を防ぎ酵素反応を最適pHに維持する為には高濃度の緩衝液中で反応させるか、又は塩酸、硫酸等の酸を逐次反応系に添加する必要がある（特許文献1）。
しかしながら、上記方法では、生成されたカダベリン塩からカダベリンを生成するに際し、酵素反応のpH調整剤として添加した酸由来の塩が副生し、多大な環境負荷を与える。これを改善する為に、リジン発酵微生物を培養する際にアジピン酸等のジカルボン酸を添加し、得られたリジン・ジカルボン酸溶液にリジン脱炭酸酵素を作用させて中和することなしにカダベリン・ジカルボン酸を生成する方法がある（特許文献２）。
この方法を用いると精製工程における副生塩の削減は可能であるが、精製工程において有機溶媒晶析工程が必要になり、有機溶媒による環境負荷が生じ、有機溶媒を回収する場合は設備が必要となる。
【特許文献１】特開2002-22370号公報
【特許文献２】特開2004-208646号公報
【非特許文献１】酵素ハンドブック  初版  636ページ  朝倉書店
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の解決しようとする課題は、カダベリン製造工程において中和剤による副生塩の生成を削減し、かつ製造工程から発生する有機溶媒による環境負荷を低減することにある
。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記課題を解決する為、本発明者らは二酸化炭素を加えながらリジンの酵素的脱炭酸反応を行って、リジン炭酸塩からカダベリン炭酸塩を生成させ、さらに、カダベリンの精製工程において加熱処理工程を加え、カダベリンの対イオンである炭酸イオンあるいは炭酸水素イオンを二酸化炭素として系外に放出させてカダベリンを得ることにより、従来必要であったイオン交換樹脂、又は有機溶媒晶析などの操作を不要とし、これらの操作に由来する副生塩及び有機溶媒の環境に対する負荷を低減することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）リジン炭酸塩の水溶液に、同溶液のpHがリジンの酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに維持されるように二酸化炭素を加えながら、リジンの酵素的脱炭酸反応を行ってカダベリン炭酸塩を生成させ、得られたカダベリン炭酸塩の水溶液を濃縮してカダベリンを得ることを特徴とするカダベリンの製造法。
（２）前記酵素的脱炭酸反応に適したpHがpH9.0以下である（１）の方法。
（３）前記二酸化炭素を気体として加える（１）の方法。
（４）前記リジン炭酸塩の水溶液がリジン炭酸塩発酵液である（１）の方法。
（５）前記酵素的脱炭酸反応を、リジン脱炭酸酵素、またはリジン脱炭酸酵素を産生する細胞もしくは同細胞の処理物を用いて行う（１）の方法。
（６）前記細胞が、リジン脱炭酸酵素活性が上昇するように改変された細胞である（５）の方法。
（７）前記細胞が、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することにより、リジン脱炭酸酵素活性が上昇した組換え細胞である（６）の方法。
（８）前記細胞がエシェリヒア・コリ細胞であり、リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が下記の（a）又は(b)に記載の遺伝子である（７）の方法；
（a）配列番号１１に記載の塩基配列を有する遺伝子、
（b）配列番号１１に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リジン脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、カダベリンの製造において副生物の塩の生成を極小化し、安価なカダベリンの供給が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の詳細を説明する。
本発明の製造法は、リジン炭酸塩の水溶液に、同溶液のpHがリジンの酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに維持されるように二酸化炭素を加えながら、リジンの酵素的脱炭酸反応を行ってカダベリン炭酸塩を生成させ、得られたカダベリン炭酸塩の水溶液を濃縮してカダベリンを得ることを特徴とするカダベリンの製造法である。
ここで、リジンは酵素的脱炭酸反応でカダベリンを生成するものであればL-リジンでもD-リジンでも構わないが、通常はL-リジンが良い。
また、「炭酸塩」とは特に断わらない限り、炭酸塩と炭酸水素塩の両者を含むものとする。
【０００８】
本発明の製造法においては、リジン炭酸塩の水溶液を用いる。この水溶液に含まれるリジンの塩は100%遊離リジン炭酸塩である必要はなく、部分的に他のリジン塩、例えばリジン塩酸塩、リジン硫酸塩などが含まれていても良い。
リジン炭酸塩の水溶液は、例えば、リジン炭酸塩を水に溶解することによって得ることができる。また、リジン炭酸塩発酵液（特開2002-65287号）をリジン炭酸塩水溶液として使用することもできる。リジン炭酸塩の水溶液は二酸化炭素を添加して、リジンの酵素的脱炭酸反応に適したpHに調整する。この場合の二酸化炭素は気体、液体及び固体（ドライアイス）であっても構わないが、好ましくは気体が良い。二酸化炭素は他のガスを含む混合ガスであっても構わないが、好ましくは純度100%の二酸化炭素が良い。
また、遊離リジン塩基（リジンベース）を水に溶解し、この水溶液に二酸化炭素（CO2）を添加してリジン炭酸塩水溶液としてもよい。この場合の二酸化炭素の添加方法は特に制限されないが、例えば、気体として添加することができる。二酸化炭素を気体として添加してリジン炭酸塩水溶液を得る場合、二酸化炭素を好ましくは12時間以上リジン水溶液に通気する。遊離リジン塩基は原料の由来は精製リジン塩基であってもよいし、飼料用液体リジン（特開2000-256290号）であっても良い。好ましくはリジン以外の化合物の含有が少なく、対となる炭酸イオン以外のアニオンが少ない、精製度の高い原料がよい。より好ましくは単離精製された遊離リジン塩基がよい。
【０００９】
上記のようにして調製したリジン炭酸塩の溶液を用いて脱炭酸反応を行う。
リジン脱炭酸反応はリジン炭酸塩溶液にリジン脱炭酸酵素（LDC）を添加することにより行う。前記LDCとしては、リジンに作用してカダベリンを生成させるものであれば特に制限はない。LDCとしては、精製酵素を用いてもよいし、LDCを産生する微生物、植物細胞又は動物細胞などの細胞を用いてもよい。ＬＤＣ又はそれを産生する細胞は、１種でもよく、２種以上であってもよい。リジン脱炭酸酵素としては、例えば、配列番号１２のアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつリジンを脱炭酸させる活性を有するタンパク質が挙げられる。ここで、数個とは２〜５０個、好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個を意味するものとする。
また、細胞をそのまま用いてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物を用いてもよい。細胞処理物としては、細胞破砕液、及びその分画物が挙げられる。微生物、植物細胞又は動物細胞等の細胞を用いて酵素反応を行う場合、有機溶媒や界面活性剤等で処理した細胞を用いると基質の透過性が良くなり、反応性が向上する場合があることが一般的に知られている。リジンの酵素的脱炭酸反応においても、ＬＤＣを産生する細胞を有機溶媒や界面活性剤等で処理することにより、反応性を高めることができる。処理する界面活性剤としてはTriton X-100、Tween 20、コール酸ナトリウム、CHAPS、有機溶媒としてはアセトン、キシレン、トルエンなどが使用可能である。さらに具体的にはTriton X-100を用いる場合、０．０１％〜１．０％（ｗ／ｖ）濃度を添加し、０℃〜３７℃で、２分〜１時間の処理が適当である。
【００１０】
前記微生物としてはE.coli等のエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）等のセラチア属細菌等の細菌、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cervisiae）等の真核細胞が挙げられる。これらの中では細菌、特にE.coliが好ましい。
前記微生物はLDCを産生する限り、野生株でもよく、変異株であってもよい。またLDC活性が上昇するように改変された組換え体であっても良い（特開2002-223770号）。植物細胞又は動物細胞もLDC活性が上昇するように改変された組換え細胞などを用いることができる。
【００１１】
LDC活性が上昇するように改変された組換え細胞としては、例えば、LDCをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現が増強されるように同遺伝子の発現調節配列を改変することによりLDC活性が上昇するように改変された組換え細胞が挙げられる。
LDCをコードする遺伝子としては、配列番号１１の塩基配列を有するE.coliの遺伝子を用いることができる。また、LDC活性を有する限りにおいて、配列番号１１の塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子を用いることもできる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
LDCをコードする遺伝子のコピー数を高めることは、例えば、LDCをコードする遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換したり、相同組換えによりLDCをコードする遺伝子を宿主細胞の染色体上に組み込んだりすることにより行うことができる。LDCをコードする遺伝子を導入するためのプラスミドとしては、宿主細胞内で複製能を有するものであれば特に制限されないが、例えば、エシェリヒア・コリの場合には、例えばpSTV29（宝バイオ社製）,RSF1010 （Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）,pUC19,pBR322,pMW119等が挙げられ、他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。またコリネ型細菌で機能するベクターとしては、pAM330(特開昭58-067699号公報)、pHM1519(特開昭58-77895号公報)、pSFK6 （特開2000-262288号公報）などが挙げられる。
プラスミドを用いた形質転換や相同組換えは通常の方法に従って行うことができる。
プラスミドを用いた形質転換や相同組換えを行う場合、導入するLDC遺伝子の発現調節領域を改変してもよい。発現調節領域としては、例えば、プロモーターが挙げられ、強力なプロモーターとしては、たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が挙げられる。
また、LDC活性が高められた変異株を脱炭酸反応に用いてもよい。このような変異株は、例えば、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、LDC活性が高められた株を選択することによって得ることができる。
【００１２】
LDCの製造に用いる微生物又は細胞を得るための培養は、用いる微生物又は細胞に応じ、LDC産生に適した方法によって行えばよい。例えば、培養に用いられる培地は炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機成分を含有する通常の培地でよい。炭素源としては、シュクロース、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマル酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニウムガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、ビタミンB1等のビタミン類、アデニンやRNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
培養は、例えばE.coliの場合は、好気的条件下で16-72時間程度実施するのがよく、培養温度は20-45℃、培養pHは5.0-8.0に制御する。なお、ｐH調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にはアンモニアガス等を使用することができる。
尚、LDC遺伝子が誘導可能なプロモーターによって発現が調整されている場合には誘導剤を培地に添加する。
培養後、細胞は遠心分離機や分離膜などにより、培養液から回収することができる。細胞はそのまま用いてもよいが、LDCを含むそれらの処理物を用いる場合は、細胞を超音波、フレンチプレスまたは酵素的処理により破砕し、酵素を抽出させ、無細胞抽出液として用いることができる。
さらにそこからLDCを精製する場合には、常法に従い、硫安塩析、各種クロマトグラフィーを使用することによって精製することができる。精製したLDCは、担体を用いて固定化したり、膜等を通じて反応液と接触できる状態にして用いることもできる。
【００１３】
上記のようにして得られるＬＤＣ又はＬＤＣを発現する細胞もしくはその処理物を用いて脱炭酸反応を行う。脱炭酸反応を行う際は、基質であるリジン炭酸塩は反応の進行に応じてさらに追加してもよい。また、LDC及びLDCを含む細胞、細胞処理液は反応開始時に反応液中に全量、直接添加してもよいし、反応の進行に応じて分割して添加してもよい。
【００１４】
反応液にCO2を供給することにより、脱炭酸反応時のpHをLDCが作用できる範囲になるように維持する。このpHは添加CO2ガスの純度、流量及び酵素反応系の圧力を調整することによって調整する。通常はpH9.0以下とし、好ましくはpH5.0-9.0、より好ましくはpH7.0-9.0とする。
リジンの脱炭酸反応によりカダベリンが生成する。この時1価のカチオンであるリジンから脱炭酸により2価のカチオンであるカダベリンとなるが、水溶液中に存在する炭酸が対イオンとなり、反応液中にカダベリン炭酸塩を蓄積する。
反応pHは前記pH範囲内で維持できれば脱炭酸反応中は厳密なpH調整は必要としない。しかし、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、pHが上昇する。したがって、反応液のpHが前記範囲となるように、二酸化炭素を反応液に添加して調整する。添加する二酸化炭素は気体、液体、固体（ドライアイス）であってもよい。二酸化炭素の添加は連続的又は間欠的であってもよい。
【００１５】
脱炭酸酵素反応の反応温度は酵素反応が最大となり、かつCO2の溶液からの放出を最小限に抑え、反応pHを前記pHの範囲に抑えられる範囲であればよく、好ましくは20-50℃であり、より好ましくは25-45℃である。
【００１６】
酵素的脱炭酸反応は補酵素であるビタミンB6を添加することにより加速することができる。ビタミンB6の種類に制限はないが、好ましくはピリドキシン、ピリドキサミン及びピリドキサルリン酸のうちの１種類でよい。より好ましくはピリドキサルリン酸（PLP）である。添加濃度も特に制限はないが、好ましくは0.1mM以上の濃度である。
【００１７】
次いで、リジンの脱炭酸反応によって得られたカダベリン炭酸塩の水溶液を濃縮することによりカダベリンを分離して回収する。例えば、以下の方法により、簡易にカダベリンとして分離回収することができる。まず、遠心分離等により除菌した後、好ましくはPLP及び不純物を除くために活性炭処理により脱色を行う。次に濃縮を行うことにより、炭酸イオン、炭酸水素イオンは大気中に二酸化炭素として放出され、水分蒸発後、カダベリンを取得することができる。濃縮は、減圧下で行うことが好ましく、また、加熱することにより効率よく濃縮することができる。加熱する場合の温度は40〜100℃が好ましい。
この方法は、公知のイオン交換樹脂法、及び有機溶媒晶析法と比較して、精製工程で大量の水を使用しない、樹脂再生の過程で副生塩を発生しない、有機溶媒を使用しないなどの点で優れておりかつ、簡便な方法である。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
[実施例1；二酸化炭素添加によるリジン炭酸塩溶液のpH調整]
100g/L L-リジン溶液200mLに対して100%二酸化炭素ガスを5, 10, 20, 50mL/minで溶液中に通気し、100rpm相当の攪拌を行いながら、L-リジン炭酸塩の生成を行った。この際、反応中のpHの測定を行った。結果は表１に示した。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
L-リジン溶液のpHは、反応初期はCO2流量に依存し、添加流量が大きい程、ｐH低下速度は速く、反応18時間後に、それぞれのCO2添加流速に依存したpHで平衡状態に達し、pHは一定の値を示した。その後、CO2添加を中断するとpHはアルカリ方向に上昇し、溶液中にはL-リジンを中和するのに十分以上なCO2が溶解していることが確認された。
この結果より、L-リジン溶液にCO2を添加してL-リジン炭酸塩を生成する際に、CO2添加量を高めることより、より多くのCO2を溶液中に溶解させ、反応液のpHを更に低下させることが可能であることが確認された。
反応基質のL-リジン炭酸塩溶液のpHが酵素の反応至適pHと異なる場合は、記載の方法により酵素の反応至適ｐHに反応液のｐHを調整することが可能であることが確認された。
【００２１】
[実施例２；Escherichia coli cadA220株の構築]
（Escherichia coli由来LDC発現プラスミドの構築）
E.coli由来LDC遺伝子（cadA）の塩基配列（N. Watson et al., Journal of bacteriology, (1992) vol. 174, 530-540; S. Y. Neng and GN Bennet, Journal of bacteriology (1992) vol. 174, 2659-2669）を基に、5'-gtcgacactgcacacggctggcgg-3'（ 配列番号1）及び5'-gttagcggcacgtacacctgcctgg-3'（配列番号2）に示す塩基配列を有するPCRプライマーを設計し、E.coli W3110 (ATCC39936)の染色体を鋳型として、PCR法によりcadAを含むDNA断片を増幅した。
増幅されたDNA断片を、KpnIとSphIで切断し、得られた断片（2,468bp）をpUC18（タカラバイオ）のKpnIとSphI切断部位に挿入してプラスミドpcadAを作製した。
【００２２】
（Enterobacter属酸性フォスファターゼ遺伝子発現プラスミドの構築）
Journal of Bioscience and Bioengineering (2001) Vol. 92, No.1, 50-54記載の通り（もしくは特開平10-201481号公報、実施例24など）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes） IFO 12010菌株由来の染色体DNAより、酸性フォスファターゼ遺伝子領域を含む、制限酵素SalIと制限酵素KpnIで切り出される1.6kbpのDNA断片を単離し、pUC118に連結したプラスミドpEAM330を作製した。
【００２３】
（LDC高発現型プラスミドの構築）
鋳型として上記プラスミドpcadA、プライマーとして5'-ggggtacctgtgagggtgttttcatg tgttctc-3'（配列番号3）及び5'-tattgcaataacgttcatcgcgaaagcgttaacgg-3'（配列番号4）オリゴヌクレオチド各0.4mM並びにKOD plus用緩衝液（TOYOBO社製）、dATP, dCTP, dGTP,
dTTP各0.2mM、MgSO4 1mM及びKOD plusポリメラーゼ（TOYOBO社製）1ユニットを含む50μLの反応液を94℃、30秒の熱処理後、94℃を15秒、55℃を30秒、68℃を2分30秒のサイクルで25回繰り返すPCRを行い、cadA遺伝子部分を増幅した。
また、鋳型として上記プラスミドpEAM330、プライマーとして5'-gctctagaattttttcaatg
tgattt-3'（配列番号5）及び5'-gtgattcaatattgcaataacgttcatctacatttccttacggtgtta-3'（配列番号6）オリゴヌクレオチドを用い同条件にてPCRを行い、酸性フォスファターゼのプロモーター配列部分を増幅した。反応液はアガロースゲル電気泳動に供し、増幅された各DNA断片をMicrospin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収した。
次いで該増幅断片混合物を鋳型とし、プライマーとして配列番号3及び配列番号5オリゴヌクレオチドを用い、同様の組成の反応液で94℃を15秒、55℃を30秒、68℃を2分30秒のサイクルを25回繰り返すPCRを行い、キメラ型酵素遺伝子を構築した。増幅された各DNA断片を Microspin column（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）を用いて回収し、これをXbaIとPstIで消化した。これをプラスミドpUC119のXbaI-PstIサイトに連結した。かくしてCadA発現プラスミドを構築し、pcadA202と命名した。
次にQuickChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用い、CadA発現量を上昇させる為にpcadA202の発現制御領域に、以下に示す手順に従って変異導入を行った。
始めにプラスミドpcadA202を鋳型として、プライマーとして5'-ggacatataacaccgtaa ggaggaatgtagatgaacgttattgc-3'（配列番号7）及び5'-gcaataacgttcatctacattcctccttacggtgttatatgtcc-3'（配列番号8）オリゴヌクレオチドを用いて説明書の方法に従いPCRを行い、プラスミドpcadA210を構築した。
次いでプラスミドpcadA210を鋳型として、プライマーとして5'-gaattttttcaatgtgattttgacatttacttccagatgac-3'（配列番号9）及び5'-gtcatctggaagtaaatgtcaaaatcacattgaaaaaattc-3'（配列番号10）オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、プラスミドを構築した。このCadA高発現型プラスミドをpcadA220と命名した。pcadA220は、Enterobacter属の酸性フォスファターゼ遺伝子の構成発現型プロモーター及びリボソーム結合部位に改変が加えられ、LDCをより高発現するように設計されている。
全ての構築したプラスミドは、その都度DNA Sequencing Kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (PERKIN ELMER社製)を用いたDye Terminator法により、310 Genetic analyzer (ABI)にて塩基配列を決定し、目的の変異が導入されていることを確認した。
また、プラスミドpcadA220でE.coli JM109株を形質転換し、得られた形質転換体をEscherichia coli cadA220と命名した。
【００２４】
[実施例３；カダベリン炭酸塩の生成]
（Escherichia coli cadA220株の培養）
Escherichia coli cadA220株をLB培地プレートに1エーゼ植菌し、26℃、一晩培養を行い、ここから培養菌体を1エーゼ掻き取り、50mLの液体LB培地を含む1.0L坂口フラスコに植菌を行い、28℃、150rpmの条件で振とう培養を8時間行い、前々培養液を得た。
得られた前々培養液を以下に示す前培養培地に10mL植菌を行い、全容量300mLとして28℃、700rpm、pH7.0、通気量300mL/minの条件で前培養を行った。培養pHの調整にはアンモニアを使用した。前培養培地中の糖消費が終了した時点で培養を終了し、前培養液を得た。
前培養培地組成
グルコース25g/L, MgSO4 7aq 1.0g/L, KH2PO4 1.4g/L, (NH4)2SO4 5.0g/L, 大豆塩酸分解物  無機窒素換算0.45g/L, FeSO4 7aq 20mg/L, MnSO4 5aq 20mg/L, Thiamine HCl 1.0mg/L, 消泡剤0.1mL/L
培地は混合後、KOH水溶液でpH5.0に調整を行った。
得られた前培養液15mLを前培養培地と同じ組成の本培養培地に添加して全容量300mLと
して30℃、700rpm、pH7.0、通気量300mL/minの条件で本培養を行った。培養pHの調整はアンモニアで行い、本培養培地中の糖消費が終了した時点で培養を終了し、Escherichia coli cadA220菌体を得た。
【００２５】
（Escherichia coli cadA220株の反応前処理）
得られたEscherichia coli cadA220株は酵素反応前に以下に示す反応前処理を実施した。菌体培養液を6,000rpm、10分、4℃の条件で遠心分離を行い、沈殿菌体を得た。
この沈殿菌体に遠心分離に使用した培養液の1/5量の0.1%Triton X-100, 0.2M Tris-HCl
(pH7.4)溶液を添加して沈殿菌体を均一に懸濁した。懸濁後、溶液は10分間氷冷を行い、これを酵素溶液とした。
【００２６】
（リジン炭酸塩溶液の調整）
L-リジン（医薬用グレード）溶液200g/L 200mLに60mL/minの流量で炭酸ガスの添加を行った。攪拌150rpm、25℃の条件で一晩調整を行い、所定のpHで平衡になった溶液をL-リジン炭酸塩水溶液として以下の反応に用いた。
【００２７】
（カダベリン炭酸塩の生成反応）
得られたL-リジン炭酸塩200g/L（L-リジン換算）200mLに、酵素溶液5mL及びピリドキサール-5-リン酸（PLP）を0.1mM相当になるように添加を行い、酵素反応を開始した。反応は攪拌150rpm、25℃、炭酸ガス60mL/min添加の条件で行い、反応途中には他の中和剤の添加は行わなかった。
酵素反応は一晩行い、その結果反応溶液中の残リジン炭酸塩濃度0.2g/Lのカダベリン炭酸塩溶液が取得された。その後の分析により128g/L（カダベリン換算）のカダベリン炭酸塩の生成が確認された。
【００２８】
[実施例４；カダベリンの精製]
得られたカダベリン炭酸塩溶液を初めに12,000rpm、10分、4℃の条件で遠心分離を行った。反応液中の菌体及び菌体残渣の除去を行い、上清画分を取得した。
得られた上清各分に対し活性炭を10% 乾燥重量（対カダベリン）添加し、50℃、30分間反応を行った。その後、ろ過により活性炭を除去し、カダベリン炭酸塩溶液を取得した。この操作により反応溶液中のPLP及び不純物の分離が行われた。
得られたカダベリン炭酸塩溶液300mLを、エバポレーターを使用して40℃で減圧濃縮することによりカダベリンの精製を行った。この操作により溶液中の二酸化炭素及び水分が除去され、最終的に28.7gのカダベリンが取得された。
【配列表】
2008193898000001.app