(57)【要約】  【課題】インターフェロンα/β受容体誘導剤を提供する。  【解決手段】亜鉛、好ましくは亜鉛錯体をインターフェロンα/β受容体誘導剤の有効成分とする。  【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜鉛を有効成分として含むインターフェロンα/β受容体誘導剤。
【請求項２】
亜鉛錯体を含む、請求項１に記載のインターフェロンα/β受容体誘導剤。
【請求項３】
亜鉛錯体が亜鉛とＬ−カルノシンの錯体である、請求項２に記載のインターフェロンα/β受容体誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜鉛を有効成分として含むインターフェロンα/β受容体誘導剤、好ましくは亜鉛錯体を含むインターフェロンα/β受容体誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
亜鉛製剤としては、Ｌ−カルノシン亜鉛錯体が胃潰瘍治療剤として市販されており、臨床の場で汎用されている。また、Ｌ−カルノシン亜鉛錯体が口内炎の治療および予防に有効であることが知られている（特許文献１）。
一方、亜鉛が感冒症候群の罹患期間を短縮するとの報告(非特許文献１)や、ＨＩＶ感染者の臨床症状を軽減する（非特許文献２）との報告がなされているが、亜鉛がインターフェロンの薬効やインターフェロン受容体に与える効果などは知られていない。
【特許文献１】特開平10-017490
【非特許文献１】McElroyBH, 他、Am J Ther 2003   10(5):324-9
【非特許文献２】Bobat R, 他、Lancet 2005   366(9500):1862-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、インターフェロンα/β受容体の発現を誘導することができ、それにより、内因性または外因性インターフェロンの効果を高めて感冒症候群やウイルス性疾患などの予防や治療に用いることのできる薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、亜鉛や亜鉛錯体がインターフェロンα／β受容体のｍＲＮＡだけでなくインターフェロンα／β受容体のタンパク質レベルを増加させるを見出し、感冒薬やインターフェロン療法の補助剤として使用できることを見出した。以上により、本発明を完成させた。
【０００５】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）亜鉛を有効成分として含むインターフェロンα/β受容体誘導剤。
（２）亜鉛錯体を含む、（１）のインターフェロンα/β受容体誘導剤。
（３）亜鉛錯体が亜鉛とＬ−カルノシンの錯体である、（２）のインターフェロンα/β受容体誘導剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明のインターフェロンα/β受容体誘導剤は新たなる感冒症候群の症状改善薬になり得る。また、インターフェロンαは骨髄抑制、インフルエンザ様症状など、副反応も多く、投与量の増大は臨床的に制約が多いことから、インターフェロンα／β受容体を誘導する亜鉛または亜鉛錯体の併用はＣ型慢性肝炎に対するインターフェロン治療効果を安全で確実に向上すると考えられる。さらに、インターフェロンαが治療に用いられてきた慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、肝細胞癌などに対する新たなる治療を提供しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳しく説明する。
【０００８】
本発明のインターフェロンα/β受容体誘導剤は亜鉛を有効成分として含む。インターフェロンα/β受容体誘導剤とは、インターフェロンα/β受容体のｍＲＮＡだけでなく、タンパク質レベルで発現を誘導することを意味する。本発明のインターフェロンα/β受
容体誘導剤は、少なくとも、ヒト細胞において、ヒトインターフェロンα/β受容体の発現を誘導するものであることが好ましく、ヒトインターフェロンα/β受容体としては、GenBank Accession No. AAB46413で登録されたアミノ酸配列を有するヒトインターフェロンα/β受容体が例示される。
インターフェロンα/β受容体誘導効果は、インターフェロンα/β受容体を発現する細胞において本発明のインターフェロンα/β受容体誘導剤を添加し、ウエスタンブロットやFACS(fluorescence activated cell sorting)などの方法でインターフェロンα/β受容体タンパク質の発現量を調べ、非添加時の発現量と比較することによって確かめることができる。インターフェロンα/β受容体を発現する細胞としては、例えば、Ｕ９３７細胞（ヒト白血病由来細胞株）が挙げられる。
【０００９】
亜鉛は塩化亜鉛や酢酸亜鉛など亜鉛の塩として含まれてもよいし、亜鉛の錯体として含まれてもよい。錯体の種類としては、亜鉛と、アミノ酸、ペプチド、または有機酸との錯体が例示され、具体的には、亜鉛と、ヒスチジン、タウリン、Ｌ−カルノシン（β−アラニル−Ｌ-ヒスチジン）、グルタチオン、カルニチン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、ピコリン酸、グリセリン酸、アセキサム酸もしくはイブプロフェンとの錯体が例示される。
【００１０】
その中では、亜鉛とＬ−カルノシンとの錯体が好ましい。亜鉛とＬ−カルノシンとの錯体としては、例えば、ゼリア新薬株式会社より販売されているポラプレジンク（Polapre zinc)はゼリア新薬（株）から入手可能である。
Ｌ−カルノシン亜鉛錯体は、不定形及び結晶性の２つのタイプが存在することが知られており（特公平３−５３６７号、特公平７−１１６１６０号）、結晶性のＬ−カルノシン亜鉛塩は特公平７−１１６１６０号公報に、不定形のＬ−カルノシン亜鉛塩は特公平３−５３６７号公報に記載されている方法により製造することができる。本発明においてはいずれを使用することも可能である。
【００１１】
本発明のインターフェロンα/β受容体誘導剤の剤型は特に制限されないが、液剤、懸濁剤、シロップ剤、乳剤、錠剤、散剤、顆粒剤などが例示される。投与形態も特に制限されず、適宜選択されるが、経口投与、静脈注射などが挙げられる。また、感冒症候群に対する予防または治療に使用する場合、鼻腔内投与のほか、含嗽用としてもよい。
【００１２】
これらの製剤は、適当な添加剤、例えば注射用蒸留水、精製水、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、乳糖、ソルビット、マンニット、白糖、トウモロコシデンプン、結晶セルロース、ラクチトール、セルロース誘導体、アラビアゴム、トラガントゴム、ゼラチン、ポリソルベート８０、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、エタノール、白色ワセリン、グリセリン、脂肪、脂肪油、グリコール類、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類、プラスチベース、パラフィン、ミツロウ、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、サッカリン、パインシロップ等を適宜選択、組合わせて使用することができる。
【００１３】
投与量はインターフェロンα/β受容体を誘導できる量であればよく、年齢、体重、病態症状、治療効果、投与方法、投与時期、投与回数、投与期間に応じて適宜設定されるが、亜鉛の量として、１回１〜１５０ｍｇを１日１〜１０回、好ましくは５〜３０ｍｇを１日２〜６回投与することが好ましい。
【００１４】
本発明のインターフェロンα/β受容体誘導剤は、Ｃ型肝炎などウイルス性疾患や慢性骨髄性白血病、もしくは腎細胞癌、肝細胞癌などの癌に対するインターフェロン療法の補助剤として使用することができる。また、本発明において亜鉛が単独でインターフェロンα/β受容体を誘導することが明らかになったので、本発明のインターフェロンα/β受容
体誘導剤は体内の免疫力を高めて感冒症候群に対して予防または治療するための薬剤としても使用することができる。
【００１５】
［実施例］
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１６】
１−１．塩化亜鉛によるインターフェロンα/β受容体誘導
「細胞と試薬」
東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより提供されたヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｕ９３７細胞)を実験に使用した。インターフェロンα/β受容体に対する一次抗体は大塚製薬（株）から提供されたポリクロナールインターフェロンα/β受容体抗体（S Tochizawa, et al. J Pharmacol Toxicol Methods 50, 59-66, 2004）を500倍に希釈して使用した。2次抗体としてFluorescen isothiocyanate (FITC)-conjugated F(ab')2 fragment goat anti-rabbit IgG (H+L)(Sigma, USA)を使用した。
【００１７】
「方法」
U937細胞はDulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）(ニッスイ、東京)に10％仔ウシ血清（JRHBioscience,Lenexa,KS）と100U/mLのペニシリン、3％グルタミンを加えた培養液を使用して、37℃で5％CO2に維持されたインキュベーター内で培養した。
Ｕ９３７細胞1×104  をＤＭＥＭ 1mlに入れ、12well culture  plateに各1ml播き、5％CO2、３７℃で24時間培養した。その後、塩化亜鉛（０、５０、１００、２００ μＭ）入りメデイウム１ｍｌと交換し、さらに２４時間培養した。ＦＢＳで洗浄後トリプシン、EDTAで細胞を剥がし遠心（200ｇ、5分間,４℃）し、上清を除去後、さらに、FCS buffer（PBS＋2％FBS＋0.01% Sodium Azide）1mlを入れ遠心し、上清を除去した。この操作を3回繰り返した。
Ｕ９３７細胞に一次抗体（抗IFNα/β受容体抗体）300μlを添加し、氷中で1時間反応させた。遠心後、上清を除きFACS bufferで3回洗浄した。つぎに、Ｕ９３７細胞を、2次抗体ＦＩＴＣ（１％）を含むFACS buffer 100μlと氷中で1時間反応させた。遠心後（200ｇ、5分間,４℃）、FACS buffer 1ml で3回洗浄し、FACS lysing solution で細胞を20分間暗所で固定した。再び遠心（200ｇ、5分間,４℃）し、FACS lysing solution を除去後、新たにFACS buffer 1mlに細胞を懸濁し、セルストレーナキャップ付ポリスチレン（5ml）チューブに入れ測定した。
測定にはBECTON DICKINSON  FACSCalibur 4S（装置）を使用し、データの読み込み解析にはBECTON DICKINSON CELL Quest(ソフト)を使用した。
FSC,SSC、FL1検出器電圧を調節（機器微調整）し、（測定対象とする細胞集団がプロット内の適切な位置に来るようにするため）細胞集団にゲートを設定し（プロット内には細胞以外のものや、変性した細胞がありそれらを除外するため）、ゲート内細胞5000中のFSC（前方散乱光、細胞の大きさ、大きいほど細胞も大きい）、SSC（側方散乱光、細胞の内部構造、大きいほど内部構造複雑）、FL1（蛍光強度、FITCはFL1検出器で検出）を測定した。その後、BECTON DICKINSON CELL Quest(ソフト)を使用しFL1（蛍光強度）のヒストグラムを作成した。
【００１８】
「成績」
Ｕ９３７細胞に塩化亜鉛（５０〜２００μＭ）を添加して２４時間後のインターフェロンα/β受容体蛋白質の発現をコントロール(亜鉛無添加)と比較すると、軽度の増加を認めた（図１）。
【００１９】
１−２．塩化亜鉛によるインターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ誘導
「方法」
Ｕ９３７細胞1×１０4  をＤＭＥＭ(１０％ＦＢＳ添加) 1mlに入れ、12well culture  plateに各1ml播き、5％ＣＯ2，３７℃で24時間培養した。その後、塩化亜鉛（０、５０，１００，２００μＭ）入りメデイウム１ｍｌと交換し、さらに２４時間培養した。ＦＢＳで洗浄後トリプシン、EDTAで細胞を剥がし遠心（1000rpm、5分間）し、上清を除去しRLT buffer+β-MEを350μl加え細胞を溶解した。トータルＲＮＡをRNeasy Mini Kit (キアゲン社）を用いてＵ９３７細胞から抽出し、そのうち2mgをランダムプライマー（インビトロジェン）を用いて、マニュアルに沿って、逆転写反応を行いcDNAを作成した。２μｌのｃＤＮＡを用い、１８μｌのQuantiTect SYBR Green PCR Master MIX(キアゲン社)中で増幅反応を行った。次に、ＰＣＲを95℃15分１サイクル、続いて９４℃２０秒、６０℃１５秒、７２℃１５秒、５０サイクル行い、各サイクル後の７２℃で蛍光の検出を行った。
【００２０】
インタ−フェロンα/β受容体ｍＲＮＡの定量はLight  Cycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, ＵＳＡ)を用いて、マニュアルに沿って行った。検量線作成のため、既知量の目的遺伝子のＰＣＲ産物を鋳型ＤＮＡとして用い、18SリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）転写物の量を内部標準とした。そしてインタ−フェロンα/β受容体ｍＲＮＡ発現量はコントロール（18SリボゾームＲＮＡ）に対する比で表した。
インターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ測定に使用したプライマーはHs IFNAR11 SG QuantiTect Primer Assay (200) (NM_000629) QT00094017（キアゲン社）である。一方、18rRNAプライマーは以下のとおりである。
18rRNAプライマー；forward,5’-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3’（配列番号１）, 
reverse,5’-GCT GGA ATT ACC GCG GCT GC-3’ （配列番号２）
【００２１】
「成績」
インターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ発現は、塩化亜鉛（５０，１００，２００μＭ）投与２４時間後において増強していた。そして塩化亜鉛１００μＭ投与ではコントロールと比べ約３０％の発現増加を認めた（図２）。
【実施例２】
【００２２】
ポラプレジンク(商標：亜鉛とＬ−カルノシンの錯体）によるインターフェロンα/β受容体誘導
ポラプレジンクはゼリア新薬工業（株）から提供された製剤を使用した。ポラプレジンクは水には溶けないため、以下のように塩酸に溶解し0.1M ポラプレジンク 1.0mLに調製して実験に使用した。
【００２３】
0.1M ポラプレジンク 1.0mLの調製法
（１）ポラプレジンク 28.96mgを秤量する。
（２）2N HCl 0.1mLを加える。
（３）H2O 0.8mLを加えて溶解し、完全に溶解していない場合は溶解するまで、わずかに2N HClを追加する。
（４）全量1.0mLになるようにH2Oを加えてメスアップする。
【００２４】
「方法」
Ｕ９３７細胞1×104  をＤＭＥＭ(１０％ＦＢＳ添加) 1mlに入れ、12well culture  plateに各1ml播き、５％ＣＯ2，３７℃で２４時間培養した。ポラプレジンク(亜鉛投与量 ０、５０、１００、１５０、２００μＭ)入りメデイウム１ｍｌと交換し、さらに２４時間培養した。
以降、前述の操作を行い、インターフェロンα/β受容体タンパク質発現をFACSで測定した。
同様に、ポラプレジンク(亜鉛投与量 ０、５０、１００、１５０、２００μＭ)投与１
２、２４時間後のインターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ発現をreal time PCR法にて測定した。
【００２５】
「成績」
Ｕ９３７細胞にポラプレジンク（亜鉛投与量５０〜２００μＭ）を投与すると、２４時間後にインターフェロンα/β受容体タンパク質およびｍＲＮＡ発現の増強を認めた（図３，４）。
投与２４時間後のインターフェロンα/β受容体ｍＲＮＡ発現を比べると、ポラプレジンクでは塩化亜鉛に比べ増強していた。
一方、Ｌ−カルノシン単独はインターフェロンα/β受容体発現に影響を及ぼさなかった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】インターフェロンα／β受容体タンパク質の誘導：亜鉛負荷２４時間後。
【図２】インターフェロンα／β受容体ｍＲＮＡの誘導：亜鉛負荷２４時間後。
【図３】インターフェロンα／β受容体タンパク質の誘導：ポラプレジンク負荷２４時間後。
【図４】インターフェロンα／β受容体ｍＲＮＡの誘導：ポラプレジンク負荷２４時間後。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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