(57)【要約】【課題】少ない心筋細胞を用いて、in vitroで、短期間に確実に心筋細胞の再生効果を評価する。【解決手段】単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルを用意するステップＳ１と、用意されたサンプルに評価対象物質を添加するステップＳ２と、該評価対象物質が添加されたサンプルを培養するステップＳ３と、培養後のサンプルの拍動の有無および／または拍動の強さを評価するステップＳ５とを含む心筋再生評価方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルを用意するステップと、
用意されたサンプルに評価対象物質を添加するステップと、
該評価対象物質が添加されたサンプルを培養するステップと、
培養後のサンプルの拍動の有無および／または拍動の強さを評価するステップとを含む心筋再生評価方法。
【請求項２】
前記評価対象物質が、幹細胞である請求項１に記載の心筋再生評価方法。
【請求項３】
前記評価対象物質が、薬剤である請求項１に記載の心筋再生評価方法。
【請求項４】
前記薬剤がサイトカインである請求項３に記載の心筋再生評価方法。
【請求項５】
前記サンプルを用意するステップが、複数のサンプルを用意し、
前記評価対象物質を添加するステップが、密度の異なる幹細胞をそれぞれサンプルに添加する請求項１に記載の心筋再生評価方法。
【請求項６】
前記評価するステップが拍動によりサンプルに生ずる電位を検出し評価する請求項１に記載の心筋再生評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、評価対象物質による心筋の治療効果をin vitroで評価する心筋再生評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、幹細胞による心筋の治療効果を評価するには、例えば、生きたラット等の実験小動物の心臓に虚血部分を人為的に作り、その虚血部分に幹細胞を注入して１ヶ月以上経過後に、幹細胞注入部分の収縮率や心臓の血液排出量等を観察することが行われている（例えば、非特許文献１参照。）。
また、幹細胞が心筋細胞に分化したか否かをin vitroで評価する方法として、幹細胞を長期培養して心筋細胞に分化したか否かを示すマーカにより評価する方法も考えられる。
【非特許文献１】Mark F. et. al., "Mesenchymal stem cellinjection after myocardial improves myocardial compliance", American Journal ofPhysiology Heart and Circulatory Physiology, Jun. 2006, 290, H2196-H2203
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、非特許文献１に開示された方法では、生体内において心筋治療の効果を評価しなければならず、ヒトに適用することは困難であるという問題がある。また、評価するための多量（例えば、１×１０８個程度）の心筋細胞が必要であるという問題もある。
一方、幹細胞の心筋細胞への分化をマーカにより評価する方法では、実際に拍動を行う心筋細胞に分化したか否かの評価を行うことができないという不都合がある。
また、上記いずれの方法においても、最終的な評価を行うことができるまでに１ヶ月以上の期間を要してしまうという不都合がある。
【０００４】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、少ない心筋細胞を用いて、in vitroで、短期間に確実に心筋細胞の再生効果を評価することができる心筋細胞評価方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルを用意するステップと、用意されたサンプルに評価対象物質を添加するステップと、該評価対象物質が添加されたサンプルを培養するステップと、培養後のサンプルの拍動の有無および／または拍動の強さを評価するステップとを含む心筋再生評価方法を提供する。
【０００６】
本発明によれば、単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルに、評価対象物質を添加して培養することにより、心筋細胞が拍動することを観察することによって、評価対象物質が心筋細胞に対して有効であるか否かの効果を評価することができる。すなわち、単独で拍動を行わない密度の心筋細胞を用意すれば足りるので、サンプルとして採取する心筋細胞量が少なくて済み、in vitroで、簡易に評価することができる。
【０００７】
また、本発明によれば、心筋組織の再生を評価するために、マーカによって間接的に評価するのではなく、心筋による拍動という心筋本来の機能によって直接的に評価するので、より確実に評価することができる。また、この場合に、評価に要する時間を大幅に短縮することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記評価対象物質が、幹細胞であることとしてもよい。
幹細胞は様々な細胞に分化することができるので、心筋細胞に特異な反応を示すマーカにより心筋細胞への分化を判断するのが一般的であるが、マーカによる評価には、多数の心筋細胞を要し、また、評価に要する期間も長いという不都合がある。
本発明によれば、単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルと幹細胞とを混合培養することにより、心筋細胞の拍動が認められれば、幹細胞が心筋細胞の機能に用影響を与えたことを明白に確認できる。また、拍動の強さを確認することにより、心筋組織を再生するための適正な幹細胞の投与量を決定することが可能となる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記評価対象物質が、薬剤であることとしてもよい。また、前記薬剤がサイトカインであることとしてもよい。
このようにすることで、単独で拍動を行わない密度の心筋細胞からなるサンプルに薬剤を混合して培養することにより、薬剤による心筋組織の再生効果を簡易に、少ない心筋細胞量で、短期に評価することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記サンプルを用意するステップが、複数のサンプルを用意し、前記評価対象物質を添加するステップが、密度の異なる幹細胞をそれぞれサンプルに添加することとしてもよい。
このようにすることで、密度の異なる幹細胞を、複数サンプルと混合培養することにより、さらに短期に、幹細胞の適正な密度を決定することが可能となる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記評価するステップが拍動によりサンプルに生ずる電位を検出し評価することとしてもよい。
このようにすることで、心筋細胞の拍動の有無とその強度をより客観的に検出して評価することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、少ない心筋細胞を用いて、in vitroで、短期間に確実に心筋細胞の再生効果を評価することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一実施形態に係る心筋再生評価方法について、図１を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る心筋再生評価方法、図１に示されるように、新生ラットから心筋細胞を採取してサンプルを用意する第１のステップＳ１と、用意されたサンプルに脂肪由来幹細胞を混合する第２のステップＳ２と、混合された心筋細胞と脂肪由来幹細胞とを培養する第３のステップＳ３と、心筋細胞の拍動を検出する第４のステップＳ４と、検出された拍動に基づいて心筋細胞の再生状態を評価する第５のステップＳ５とを備えている。心筋細胞は、新生ラット由来のものや、ＥＳ細胞から分化誘導してきたヒト細胞でよい。
【００１４】
前記第１のステップは、例えば、複数のシャーレ内に、それぞれ単独では拍動を生じない異なる密度で心筋細胞を収容する。
前記第2のステップＳ２は、心筋細胞に対して種々の濃度で脂肪由来幹細胞を混合する。
【００１５】
前記第３のステップＳ３は、このように混合された心筋細胞と脂肪由来幹細胞とを所定の培地内に貯留して、所定の培養条件下において培養する。
前記第４のステップＳ４は、シャーレ内の心筋細胞を、例えば、目視で観察し、その拍動の有無および拍動の強さを検出する。
【００１６】
そして、第５のステップＳ５は、ステップＳ４において検出された拍動の有無と強さとに基づいて、脂肪由来幹細胞が心筋再生に効果があるか否かおよびその効果の度合いが良好であるか否かを評価する。
【００１７】
表１に示されるように、心筋細胞は、１×１０４／ｃｍ２以下の細胞密度では、単独で拍動を生じない。表１は、新生ラットの心筋細胞の拍動の様子を培養日数との関係で示したものである。表１においては、心筋細胞密度５×１０４／ｃｍ２で拍動が発生することが示されている。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
発明者らは、脂肪由来幹細胞が心筋細胞に分化することで、心筋細胞密度が増大すれば、拍動が生ずることを利用し、本実施形態に係る心筋再生評価方法を考案した。
すなわち、本実施形態に係る心筋再生評価方法によれば、脂肪由来幹細胞の心筋再生の効果を、マーカにより間接的に評価するのではなく、心筋細胞の拍動により直接的に評価することができる。
【００２０】
元々拍動している高い密度の心筋細胞に脂肪由来幹細胞を加えてもその分化の有無を簡易に検出することは困難であるが、単独では拍動を生じない低い密度の心筋細胞に脂肪由来幹細胞を加えて、その拍動を生じさせることにより、脂肪由来幹細胞の心筋再生の効果をより容易に、かつ、明確に検出することができる。
【００２１】
この場合において、サンプルとしては単独で拍動を生じない程度の低い密度の心筋細胞を用いるので、評価対象となる細胞（例えば、ヒト脂肪由来幹細胞）を患者から採取する必要がなく、より簡易にin vitroで心筋細胞の再生の評価を行うことができる。例えば、in vivoによる評価では１×１０８／ｃｍ２程度の心筋細胞密度が要求されるが、この方法によれば、１×１０3／ｃｍ２程度の細胞密度で足りる。
【００２２】
また、in vivoによる心筋の再生の評価、あるいは、in vitroでマーカによる心筋の再生の評価では、心筋細胞の培養を1ヶ月程度実施しなければならないが、本実施形態に係る評価方法によれば、より短い培養期間で足りる。
その結果、本実施形態に係る心筋再生評価方法によれば、少ない細胞数の心筋細胞サンプルを用いて、短時間で、直接的かつ明確に、脂肪由来幹細胞の心筋再生の効果、すなわち、心筋組織の再生を、in vitroで評価することができるという利点がある。
【００２３】
また、本実施形態に係る心筋再生評価方法によれば、サンプルとして非常に少ない心筋細胞を用意すればよいので、サンプルを多数用意し、異なる密度の脂肪由来幹細胞をそれぞれ混合して心筋細胞再生の効果を評価することとしてもよい。このようにすることで、心筋細胞の再生に有効な脂肪由来幹細胞の投与量を測定することができる。また、異なる密度の脂肪由来幹細胞を混合した複数のシャーレを同時に培養して対比観察することで、心筋細胞の再生に適した脂肪由来幹細胞の密度を目視にて容易に評価することができる。
【実施例】
【００２４】
次に、本実施形態に係る心筋再生評価方法の一実施例を説明する。
本実施例においては、まず、複数のシャーレ内に、それぞれ単独では拍動を生じない異なる密度で心筋細胞を収容した。各シャーレ内の心筋細胞の密度は、それぞれ１×１０３／ｃｍ２および１×１０４／ｃｍ２である。また、参考のため心筋細胞密度１×１０５／ｃｍ２のシャーレを用意した。
【００２５】
次に、心筋細胞に対して種々の濃度で脂肪由来幹細胞を混合した。
例えば、表２に示す例では、心筋細胞密度１×１０３／ｃｍ２のシャーレには、脂肪由来幹細胞：心筋細胞密度が１：１および１０：１の割合となるように脂肪由来幹細胞を混合した。また、心筋細胞密度１×１０４／ｃｍ２のシャーレには、脂肪由来幹細胞：心筋細胞密度が１：１および５：１の割合となるように脂肪由来幹細胞を混合した。また、参考として、心筋細胞密度１×１０５／ｃｍ２のシャーレには、脂肪由来幹細胞：心筋細胞密度が１：１および２：１の割合となるように脂肪由来幹細胞を混合した。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
また、前記第３のステップＳ３は、このように混合された心筋細胞と脂肪由来幹細胞とを所定の培地内に貯留して、所定の培養条件下において培養する。所定の培地は、例えば、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）である。また、所定の培養条件は、例えば、温度３６℃、ＣＯ２濃度５％であり、定期的に培地交換を行う。培養期間としては、７〜３４日間とし、培養期間中の適時に心筋細胞の拍動を検出して評価を実施した。
【００２８】
その結果、表２に示されるように、心筋細胞密度１×１０３／ｃｍ２（密度比１：１）のシャーレにおいても、培養１１日〜１５日において心筋細胞の拍動が検出された。また、心筋細胞密度１×１０３／ｃｍ２（密度比１０：１）のシャーレにおいても、培養７日〜３４日において心筋細胞の拍動が検出され、特に、培養８日〜２７日において強い拍動が検出された。
【００２９】
また、心筋細胞密度１×１０４／ｃｍ２（密度比１：１）のシャーレにおいても、培養７日〜２０日において心筋細胞の拍動が検出された。また、心筋細胞密度１×１０４／ｃｍ２（密度比５：１）のシャーレにおいても、培養８日〜２８日において心筋細胞の拍動が検出され、特に、培養８日〜１４日において強い拍動が検出された。
【００３０】
参考として、心筋細胞密度１×１０５／ｃｍ２（密度比１：１）のシャーレにおいて、培養７日〜１４日、心筋細胞密度１×１０５／ｃｍ２（密度比２：１）のシャーレにおいても、培養８日〜１４日において心筋細胞の拍動が検出されたが、強い拍動は検出されず、単独で拍動可能な密度の心筋細胞による拍動であるか、脂肪由来幹細胞の心筋再生による拍動であるのかを判別することは困難であることがわかる。
【００３１】
なお、本実施形態に係る心筋再生評価方法においては、心筋細胞の拍動の有無および強さを目視により観察して評価することとしたが、これに代えて、拍動により心筋細胞に発生する電位を検出することで評価してもよい。このようにすることで、拍動の有無および強さをより客観的に把握して、心筋細胞の再生の評価を容易に、かつ、正確に行うことができるという利点がある。
【００３２】
また、本実施形態においては、脂肪由来幹細胞を評価対象物質として選択したが、これに代えて、骨髄由来間葉系幹細胞を選択してもよい。
表３は、骨髄由来間葉系幹細胞を細胞密度１×１０４／ｃｍ２の心筋細胞に５：１の比率で混合して培養した場合の拍動の有無について示している。また、参考として、骨髄由来間葉系幹細胞を細胞密度５×１０４／ｃｍ２の心筋細胞に４：１の比率で混合して培養した場合の拍動の有無についても示している。
【００３３】
これによれば、単独では拍動を生じない細胞密度１×１０４／ｃｍ２の心筋細胞が、８日〜１４日において拍動を生じていることがわかる。これにより、骨髄由来間葉系幹細胞によっても心筋細胞の再生効果があるという評価を得ることができる。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
また、評価対象物質としては幹細胞に限定されるものではなく、例えば、サイトカイン等の薬剤を心筋細胞に混合し、心筋細胞の増殖効果により心筋細胞の再生について評価することが可能となる。すなわち、単独では拍動を生じない密度の心筋細胞に薬剤を混合して培養することで、心筋細胞が増殖し拍動を生ずる密度となれば、拍動が発生し、その強さを観察することで、心筋細胞の再生に対する薬剤の有効性について評価することができる。また、薬剤の濃度を変化させて同様の観察を行うことにより、心筋細胞の再生に適した薬剤の濃度を決定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】本発明の一実施形態に係る心筋再生評価方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００３７】
Ｓ１  第１のステップ（サンプルを用意するステップ）
Ｓ２  第２のステップ（評価対象物質を添加するステップ）
Ｓ３  第３のステップ（サンプルを培養するステップ）
Ｓ５  第５のステップ（評価するステップ）
【図１】
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