(57)【要約】【課題】  フェルラ酸を４−ＶＧに転化する微生物を明らかにし、その微生物を用いて、従来よりも簡便な方法で香味豊かな穀類蒸留酒を製造する方法を提供すること。【解決手段】  植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、これを蒸留する蒸留酒の製造方法において、もろみにラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を作用させることを特徴とする蒸留酒の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、これを蒸留する蒸留酒の製造方法において、もろみにラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を作用させることを特徴とする蒸留酒の製造方法。
【請求項２】
植物由来の酒造原料が、穀類である請求項第１項記載の蒸留酒の製造方法。
【請求項３】
蒸留酒が、泡盛である請求項第１項記載の蒸留酒の製造方法。
【請求項４】
植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、このもろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させた後、これを蒸留することにより得られる蒸留酒。
【請求項５】
植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、これを蒸留する蒸留酒の製造方法において、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させることを特徴とする蒸留酒に香味を付与する方法。
【請求項６】
フェルラ酸にラクトコッカス・ラクチスを作用させることを特徴とする４−ビニルグアヤコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香味豊かな蒸留酒の製造方法に関し、更に詳細には、泡盛、焼酎等の蒸留酒の製造において、もろみ中に含まれるフェルラ酸の４−ビニルグアヤコール（４−ＶＧ）への転化を促進することによる、香味の豊かな蒸留酒の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、健康志向の高まりから、清酒等のいわゆる醸造酒よりも、泡盛、焼酎等の蒸留酒を愛好する人が多くなっている。この蒸留酒は、長期間の保存が可能であり、長期間保存（熟成）した後の蒸留酒は、製造直後のものよりも香味が高く、古酒として高い評価を得ている。
【０００３】
ところで、沖縄県には４７泡盛酒造所と１酒造組合があり、沖縄本島内のみならず周辺離島において、蒸留酒である泡盛が広く製造されている。その中でも、最近では特に「泡盛古酒」が注目されており、その芳醇な香りとまろやかな口あたりが人気を集めている。
【０００４】
この泡盛古酒の香り成分は１００種類以上あると言われ、それぞれの含有量やバランスが泡盛の個性を決定しているが、泡盛に含まれる重要な香味成分の一つにバニリンがある。バニリンはバニラに含まれる甘い芳香を持つ物質で、泡盛古酒が有する甘い香りの起因成分の一つとなっている。
【０００５】
泡盛製造過程において下記式１に示されるようにバニリンは原料米由来のフェルラ酸が遊離し、これがもろみの酸や蒸留過程の熱により４−ＶＧへと変化して泡盛中に移行する。さらに熟成により４−ＶＧがバニリンへと変化することで泡盛中のバニリンが生成すると考えられている（非特許文献１〜３）。
[式１]
2008000075.tif 000002
【０００６】
このような知見に基づき本出願人はもろみ中の４−ＶＧ量と蒸留後の泡盛の４−ＶＧ量との関係を調べたところ、もろみ中の４−ＶＧ量が高い場合には蒸留後の泡盛の４−ＶＧ量も高くなる傾向があることを知った。また、本出願人は通常もろみの発酵に用いられる酵母にはフェルラ酸を４−ＶＧに転化する能力がないので、もろみ中の４−ＶＧ生成に対してはもろみ中の酵母以外の何らかの微生物が関与していると判断した。
【０００７】
【非特許文献１】小関ら、醸協、８９、ｐ.４０９−４１１、１９９４
【非特許文献２】小関ら、醸協、９３、ｐ.５１０−５１７、１９９８
【非特許文献３】小関卓也、生物工学会誌、７８、ｐ.４６５−４６７、２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、もろみ中でフェルラ酸を４−ＶＧに転化する微生物を明らかにし、その微生物を用い、従来よりも簡便な方法で香味豊かな蒸留酒を製造する方法を提供することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、もろみの４−ＶＧ量と、この中に存在する微生物との関係を探索した結果、フェルラ酸を４−ＶＧに転化すると思われる微生物を見出した。そしてもろみにこの微生物を作用させると、もろみ中の４−ＶＧ量が高くなることおよびこのもろみを蒸留した後の蒸留酒中の４−ＶＧ量も高くなることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、これを蒸留する蒸留酒の製造方法において、もろみにラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）を作用させることを特徴とする蒸留酒の製造方法である。
【００１１】
また本発明は、植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、このもろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させた後、これを蒸留することにより得られる蒸留酒である。
【００１２】
更に本発明は、植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させてもろみとし、これを蒸留する蒸留酒の製造方法において、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させることを特徴とする蒸留酒に香味を付与する方法である。
【００１３】
また更に本発明は、フェルラ酸にラクトコッカス・ラクチスを作用させることを特徴とする４−ＶＧの製造方法である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の蒸留酒の製造方法によれば、もろみの原料に含まれるフェルラ酸の４−ＶＧへの転化が、ラクトコッカス・ラクチスの作用により促進されるため、もろみ中の４−ＶＧ量を高めることができる。その結果、もろみを蒸留後の蒸留酒中においても蒸留酒の香味の一つであるバニリンの前駆体である４−ＶＧ量を有意に高めることができる。
【００１５】
従って、この製造方法により得られる蒸留酒は、通常の製法で得られる蒸留酒と同期間熟成させた場合であっても、甘い芳香と香味の増強された蒸留酒となる。
【００１６】
また、本発明の蒸留酒に香味を付与する方法によれば、簡便な方法で蒸留酒に香味を付与することができる。
【００１７】
更に、本発明の４−ＶＧの製造方法によれば、フェルラ酸からバニリンの前駆体となる４−ＶＧを効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の蒸留酒の製造方法（以下、「本発明製法」という）は、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させる以外は、発酵したもろみを蒸留する公知の蒸留酒の製造方法により実施することができる。
【００１９】
本発明製法に用いられるラクトコッカス・ラクチスは、自然界に広く分布するホモ発酵型乳酸菌の１種で、古くからゴーダーチーズ、チェダーチーズ等の半硬質タイプのチーズ、バター、発酵乳等の発酵食品の製造に用いられており、極めて安全な菌株である。このラクトコッカス・ラクチスの生理、生化学性状等は例えば、「乳酸菌の科学と技術」（乳酸菌研究談会編、学会出版センター、１９９６年）等に記載されている。また、ラクトコッカス・ラクチスの１６Ｓ ｒＤＮＡは細胞基準株データベース（http://www.nbrc.nite.go.jp）に登録されている。本発明製法においてはこれら生理、生化学性状および１６Ｓ ｒＤＮＡから、ラクトコッカス・ラクチスに分類される菌株であれば特に制限無く、例えば、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス等の何れの亜種も使用することができる。なお、ラクトコッカス・ラクチスにフェルラ酸を４−ＶＧに転化する能力があることはこれまで知られていない。
【００２０】
本発明製法に用いることのできるラクトコッカス・ラクチスの一例としては、独立行政法人製品評価技術基盤機構（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）等から購入可能な以下のものが挙げられる。
・ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス  ＮＢＲＣ１２００７
・ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス  ＮＢＲＣ１００９３３
・ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス  ＮＢＲＣ１００６７６
【００２１】
上記ラクトコッカス・ラクチスをもろみに作用させるには、植物由来の酒造原料を、麹菌および／または酵母で発酵させるもろみ調製工程の何れかの段階において、ラクトコッカス・ラクチスを接種するだけでよい。具体的にラクトコッカス・ラクチスを焼酎のもろみに作用させる場合には、一次もろみと二次もろみの二段のもろみ調製工程の何れかまたは両方のもろみ仕込み時あるいはもろみ発酵過程中にラクトコッカス・ラクチスを接種すればよい。また、ラクトコッカス・ラクチスを泡盛のもろみに作用させる場合には、一次もろみのみの一段のもろみ調製工程のもろみ仕込み時あるいはもろみ発酵過程中にラクトコッカス・ラクチスを接種すればよい。また、焼酎または泡盛のもろみを調製する何れの場合であっても、製麹開始時または製麹中の麹にラクトコッカス・ラクチスを接種して付着させ、この麹を用いてもろみを調製することにより、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させてもよい。本発明製法において、ラクトコッカス・ラクチスのもろみへの接種量は、もろみ１Ｌあたり１×１０３〜１×１０１８ｃｆｕ程度、好ましくは１×１０８〜１×１０１３ｃｆｕ程度である。
【００２２】
本発明製法に用いられるもろみとは、米、麦（麦芽）、トウモロコシ、そば、ひえ、あわ等の穀類、じゃがいも、さつまいも等の芋類、くり、ごま等の植物、黒糖、白ぬか、清酒粕等の植物由来の酒造原料を、アスペルギルス・オリゼー等の黄麹菌、アスペルギルス・カワチ等の白麹菌、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・サイトウイ等の黒麹菌等の麹菌および／またはサッカロマイセス・セレビシエ等の焼酎酵母、サッカロマイセス・パストリアヌス等のビール酵母等の酵母で発酵させたものをいう。なお、本発明製法においては、上記酒造原料のデンプン質を酵素等により糖化したものを上記酵母で発酵させたものももろみに含まれる。本発明製法においては、これらもろみの中でも穀類を麹菌および酵母で発酵させたものが好ましく、特に穀類を黒麹菌および焼酎酵母で発酵させたものが好ましい。前記穀類を原料とするもろみはフェルラ酸を多く含有するので本発明製法による効果が特に認められる。
【００２３】
上記のようにしてラクトコッカス・ラクチスを作用させたもろみは、次に、公知の条件で蒸留することにより焼酎、泡盛等の蒸留酒が得られる。本発明においてはこれら蒸留酒の中でも泡盛が好ましい。
【００２４】
本発明製法によれば、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させることにより、もろみ中のフェルラ酸から４−ＶＧへの転化が促進され、もろみ中の４−ＶＧ量が高くなる。そして、このもろみを蒸留して蒸留酒とすれば、もろみ中の４−ＶＧが蒸留酒中に移行し、蒸留酒中の４−ＶＧ量が高くなる。具体的には、蒸留酒中の４−ＶＧ量は１〜５０μｇ／ｍｌ程度になり、ラクトコッカス・ラクチスを作用させていないもろみを蒸留して得られる蒸留酒と比べて５.０質量％（以下、単に「％」という）以上、好ましくは１０.０〜５０．０％程度高くなる。更に、蒸留酒中に含まれる４−ＶＧは蒸留工程での熱や、その後の熟成等により蒸留酒の香味成分の１つであるバニリンとなるので、本発明製法で得られる蒸留酒は香味豊かなものとなる。
【００２５】
本発明製法の好ましい一態様として、泡盛の製造方法を示せば次の通りである。
まず、タイ米を洗米後、水に数十分間から一晩漬浸したものを蒸煮して蒸米とする。この蒸米を放冷後、市販黒麹菌を蒸米１ｋｇ当たり１×１０６〜１×１０１０ｃｆｕ程度接種し、これを３０〜４５℃程度で、３８〜４５時間程度、適宜手入れを行いながら製麹する。この麹に、汲み水歩合１５０〜１８０％程度の水を加え、泡盛１０１号等の酵母をもろみ１Ｌ当たり１×１０８〜１×１０１３ｃｆｕ程度およびフェルラ酸を４−ＶＧに変換するラクトコッカス・ラクチスをもろみ１Ｌあたり１×１０６〜１×１０１８ｃｆｕ程度接種してもろみを仕込み、１５〜３０℃程度で仕込みタンク中で発酵する。もろみの発酵時間は７日〜２８日程度でよい。発酵の終了した熟成もろみを従来の方法に従い、蒸留機等を用いて８５〜１００℃程度で蒸留し、蒸留液として泡盛を得る。
【００２６】
また、ラクトコッカス・ラクチスは上記した蒸留酒の製造以外にも、フェルラ酸を原料とした４−ＶＧの製造に用いることもできる。具体的には、市販のフェルラ酸を含有させたＭＲＳ等の培地にラクトコッカス・ラクチスを培地１Ｌあたり１×１０６〜１×１０２０ｃｆｕ程度接種し、２０〜４５℃程度の条件で数時間〜数日程度培養することにより培地中に４−ＶＧが生成される。この培地中に生成された４−ＶＧは、高速液体クロマトグラフィー等の公知の方法により精製することもできる。また、上記のようにして得られる４−ＶＧは熱や熟成、文献（特開２００３−１３５０５１号公報）に記載のオゾンへの接触等によりバニリンにすることもできる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら制限されるものではない。
【００２８】
実 施 例   １
フェルラ酸を４−ＶＧに転化する微生物のスクリーニング：
（１）４−ＶＧを多く含む酒造所の泡盛のもろみ中から分離した多数の菌株をそれぞれＭＲＳ培地にて１０−１〜１０−５まで段階希釈した。次に、それぞれ希釈したものを０.５％の炭酸カルシウムを含有するＭＲＳ寒天培地（１５ｍｌ）に混釈し、それをシャーレに注いだ。更に、シャーレを嫌気条件下、３０℃で２４時間以上維持した後、ハローを形成したコロニーを釣菌した。
【００２９】
試験管に滅菌したＭＲＳ培地を２〜１０ｍｌ分注し、フェルラ酸を１００μｇ／ｍｌになるよう添加した。その後、上記で釣菌された菌株をＭＲＳ培地で前培養し、その１０〜１００μｌを上記ＭＲＳ培地中に播種し、３０℃で４８時間培養を行った。培養終了後、遠心分離した上清を０.４５μｍのフィルターに通し、培地中のフェルラ酸量および４−ＶＧ量をＨＰＬＣにより測定した。ＨＰＬＣ分析により培地中のフェルラ酸量が減少し、４−ＶＧ量が上昇した菌株としてＳ１株を得た。
【００３０】
（２）上記（１）で得たＳ１株について、培地中のフェルラ酸量と４−ＶＧ量の経時変化と菌体量の増加を以下の方法により測定した。まず、５０ｍｌ容量のスクリューキャップ付遠心沈殿管にフェルラ酸を１００μｇ／ｍｌに調整したＭＲＳ培地を３０ｍｌ分注し、別途前培養を行ったＳ１株を０.１ｍｌ（１.０×１０８ｃｆｕ）添加して、３０℃で３０時間培養を行った。この培養中は２時間ごとに１ｍｌのサンプリングを行い、これを０.４５μｍのフィルターに通し、各培養時間におけるフェルラ酸量および４−ＶＧ量をＨＰＬＣにより測定した。また、各培養時間における濁度をバイオフォトメーター（ADVANTEC製）で吸光度６００ｎｍの吸収を測定することにより求めた。これらの結果を図１に示した。
【００３１】
（３）上記（１）のようにして得られたＳ１株の１６Ｓ ｒＤＮＡについて、ＢＬＡＳＴを用いた相同性検索を行ったところ、Ｓ１株の１６Ｓ ｒＤＮＡはラクトコッカス・ラクチスの３亜種の１６Ｓ ｒＤＮＡと高い相同性を示した。その中でもラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスとは１００％の相同性を示した。また、Ｓ１株の分子系統解析の結果、Ｓ１株はラクトコッカス・ラクチスの３亜種の１６Ｓ ｒＤＮＡが形成するクラスター内に含まれることが判った（図２）。更に、Ｓ１株の生理、生化学性状試験を行ったところ、Ｓ１株はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスの性状と一致した。以上の結果からＳ１株はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスに帰属する菌株と同定された。なお、Ｓ１株については寄託機関に寄託をしていないが、本株は特許法施行規則第２７条の３の条件を満足する分譲の請求があった場合は、出願人において、同条の条件に従って分譲することを保証する。
【００３２】
実 施 例   ２
寄託菌株のフェルラ酸−４−ＶＧ転化活性についての検討：
（１）ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１００９３３およびラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリスＮＢＲＣ１００６７６（いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入）を、実施例１（２）と同様にフェルラ酸を添加した培地中で培養し、培養１８時間後におけるフェルラ酸量および４−ＶＧ量をＨＰＬＣにより測定し、フェルラ酸を４−ＶＧに転化する活性（フェルラ酸−４−ＶＧ転化活性）の有無を調べた。なお活性の有無は以下の評価基準で評価した。
【００３３】
＜フェルラ酸−４−ＶＧ転化活性評価基準＞
（評価）  （内容）
＋＋  ：培養１８時間でフェルラ酸の９０％以上を４−ＶＧに転化
＋    ：培養１８時間でフェルラ酸の３％以上〜９０％未満を４−ＶＧに転化
−    ：培養１８時間でフェルラ酸の３％未満を４−ＶＧに転化
【００３４】
【表１】
2008000075.tif 000003
【００３５】
フェルラ酸を４−ＶＧに転化する能力はラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスおよびサブスピーシーズ・クレモリスにも認められた。以上の結果より、フェルラ酸を４−ＶＧに転化する能力は前記Ｓ１株だけでなく、ラクトコッカス・ラクチス全般に認められることが判った。
【００３６】
実 施 例   ３
ラクトコッカス・ラクチスを用いたもろみの調製（１）：
タイ米を洗米し、水に浸漬した後水切りを行い、５０ｇずつフラスコに分取した。次いで、この洗浄米を１２１℃のオートクレーブで１０分間の蒸煮をして蒸米を得た。麹菌は事前にＰＤＡ培地で培養を行い、胞子懸濁液を調製し、これをフラスコ内の蒸米１ｇに対し４×１０５ｃｆｕ／ｇになるように接種した。培養は、温度３８℃、相対湿度９５％の恒温恒湿機（ＣＲＨ−２１０、タバイエスペック製）で４２時間培養を行った。培養開始から１８時間と２４時間にフラスコ内の米を攪拌して麹を得た。得られた麹５０ｇに水８０ｍｌを添加し、これに前培養した酵母を１.０×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように加え、更に、前培養を行ったＳ１株（実施例１で得られたもの）を１.０×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように添加し、２５℃で１４日間発酵させてもろみを得た。発酵開始直後、３日後、６日後、１０日後および１４日後のフェルラ酸量および４−ＶＧ量を実施例１と同様にＨＰＬＣにより測定した。なお、Ｓ１株を添加しない以外は上記と同様にして調製されたもろみを対照とした。これらの結果を図３および図４に示した。
【００３７】
もろみ中のフェルラ酸量は、Ｓ１株を添加したもろみとＳ１株を添加していないもろみとで、ほとんど変化がなかった。しかし、Ｓ１株を添加したもろみ中の４−ＶＧ量は、Ｓ１株を添加していないもろみよりも約２０％増加していた。
【００３８】
実 施 例   ４
蒸留酒の製造（１）：
実施例３で得られたＳ１株を添加したもろみ（発酵１４日）について８５〜１００℃程度で蒸留を行い、蒸留酒（泡盛）を製造した。蒸留酒中のフェルラ酸量および４−ＶＧ量を実施例１と同様にＨＰＬＣにより測定した。また、Ｓ１株を添加していないもろみについても同様に蒸留を行い、蒸留酒を製造し、同様の測定をした。
【００３９】
フェルラ酸は、もろみの蒸留により蒸留酒中に移行しないため、Ｓ１株を添加したもろみから蒸留された蒸留酒およびＳ１株を添加していないもろみから蒸留された蒸留酒のいずれにも検出されなかった。しかし、４−ＶＧ量は、Ｓ１株を添加したもろみから蒸留された蒸留酒の方が、Ｓ１株を添加していないもろみから蒸留された蒸留酒よりも約３０％も増加していた。
【００４０】
実 施 例   ５
蒸留酒の製造（２）：
実施例３の方法に従い作製した麹５０ｇに水８０ｍｌを添加し、これに前培養した酵母を１.０×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように加え、更に、前培養を行ったラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７を１.０×１０７ｃｆｕ／ｍｌとなるように添加し、２５℃で７日間発酵させてもろみを得た。
【００４１】
上記で得られたもろみ（発酵７日間）について８５〜１００℃程度で蒸留を行い、蒸留酒（泡盛）を製造した。蒸留酒中の４−ＶＧ量を実施例１と同様にＨＰＬＣにより測定したところ、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株を添加したもろみから蒸留された蒸留酒の方が、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチスＮＢＲＣ１２００７株を添加していないもろみから蒸留された蒸留酒よりも４−ＶＧ量が約３０％も増加していた。
【００４２】
以上の結果より、もろみにラクトコッカス・ラクチスを作用させることにより、もろみを蒸留した蒸留酒中に、蒸留酒の香味の一つであるバニリンの前駆体である４−ＶＧ量を有意に増加できることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の蒸留酒の製造方法によれば、ラクトコッカス・ラクチスの作用により、蒸留酒中の４−ＶＧを増加させることができる。この様にして製造される蒸留酒は、通常の製法で得られる蒸留酒と同期間熟成させた場合であっても、甘い芳香と香味の増強された蒸留酒となり、商品価値が高いものとなる。
【００４４】
また、ラクトコッカス・ラクチスはフェルラ酸からバニリンの前駆体となる４−ＶＧを製造するのにも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ＭＲＳ培地中のフェルラ酸量、４−ＶＧ量および濁度とＳ１株の培養時間との関係を示す図面である。
【図２】図２は、Ｓ１株の分子系統解析の結果を示す図面である。
【図３】図３は、Ｓ１株を添加したもろみ中のフェルラ酸量と培養日数との関係を示す図面である。
【図４】図４は、Ｓ１株を添加したもろみ中の４−ＶＧ量と培養日数との関係を示す図面である。
【図１】
2008000075.tif 000004
【図２】
2008000075.tif 000005
【図３】
2008000075.tif 000006
【図４】
2008000075.tif 000007