(57)【要約】【課題】本発明は、封入体を介して原核生物においてプロテインキナーゼを組換え産生および精製するための改善された方法を提供することを課題とする。【解決手段】チロシンプロテインキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼからなる群より選択されるプロテインキナーゼをコードする核酸を微生物宿主細胞において発現させ、キナーゼを含む封入体を形成させ、キナーゼを単離、可溶化、再生、および精製することによって、プロテインキナーゼを組換え産生および精製するための方法であり、プロテインキナーゼの少なくとも70％が疎水性吸着剤に結合せず、疎水性吸着剤に結合しなかったプロテインキナーゼを回収する条件下で、疎水性吸着剤との疎水性相互作用によって精製を行うことを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンプロテインキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼからなる群より選択されるプロテインキナーゼをコードする核酸を微生物宿主細胞において発現させ、該キナーゼを含む封入体を形成させ、該キナーゼを単離、可溶化、再生、および精製することによって、プロテインキナーゼを組換え産生および精製するための方法であり、正しく折り畳まれたプロテインキナーゼの少なくとも70％が疎水性吸着剤に結合せず、疎水性吸着剤に結合しなかったプロテインキナーゼを回収する条件下で、疎水性吸着剤との疎水性相互作用によって該精製を行うことを特徴とする方法。
【請求項２】
キナーゼがsrc、pkb、c-met、lck、またはp38であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
吸着剤がフェニルセファロース、オクチルセファロース、またはブチルセファロースであることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
キナーゼを、少なくとも0.1MのKClまたはNaClを含む水溶液中でクロマトグラフィー材料に適用することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
水溶液が、少なくとも1Mのアルギニン、または一般式I
R2-CO-NRR1(I)
(式中、RおよびR1は、水素、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C4アルキル鎖であり、
R2は、水素、NHR1、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C3アルキル鎖である)
を有する化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項4記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、封入体を介して原核生物においてプロテインキナーゼを組換え産生および精製するための改善された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインキナーゼは、リン酸基をタンパク質に付加することによって、様々な多くの細胞増殖、分化、およびシグナル伝達プロセスを調節する(非特許文献1)。プロテインキナーゼは、通常、その基質、調節分子、または変異表現型の特徴の後に名付けられる。基質に関して、プロテインキナーゼは、2つのグループ;チロシン残基をリン酸化するもの(プロテインチロシンキナーゼ、PTK)と、セリン残基またはスレオニン残基をリン酸化するもの(セリン/スレオニンキナーゼ、STK)に分類することができる。ほとんど全てのキナーゼが、類似の250〜300アミノ酸触媒ドメインを含む。N末端ドメインはATP(またはGTP)供与体分子を結合および指向する。より大きなC末端部分はタンパク質基質に結合し、ATPのリン酸をセリン残基、スレオニン残基、またはチロシン残基のヒドロキシル基に転移させる。
【０００３】
キナーゼは、キナーゼドメインのいずれかの側に位置する、またはキナーゼドメインのループに挿入された異なるアミノ酸配列(一般的に、5〜100残基)によってファミリーに分類することができる。これらの付加されたアミノ酸配列は標的タンパク質を認識し、標的タンパク質と相互作用するので、各キナーゼの調節が可能となる。キナーゼドメインの一次構造は保存されており、11のサブドメインにさらに分割することができる。11のサブドメインのそれぞれが、そのサブドメインに特徴的で、高度に保存された特定の残基およびアミノ酸モチーフまたはアミノ酸パターンを含む(非特許文献2)。
【０００４】
セカンドメッセンジャー依存性プロテインキナーゼは、主として、環状AMP(cAMP)、環状GMP、イノシトール三リン酸、ホスファチジルイノシトール、3,4,5-三リン酸、環状ADPリボース、アラキドン酸、およびジアシルグリセロールなどのセカンドメッセンジャーの作用を媒介する。例えば、環状AMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAP)はSTKファミリーのメンバーである。環状AMPは、研究された全ての原核細胞および動物細胞におけるホルモン作用の細胞内介在物質である。このようなホルモン誘導性細胞反応として、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾール分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨吸収、ならびに心拍および心筋収縮力の調節が挙げられる。PKAは全ての動物細胞において見出され、これらの細胞の大部分における環状AMPの作用を説明すると考えられる。PKA発現の変化は、癌、甲状腺障害、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および心血管疾患を含む様々な障害および疾患に関与している。
【０００５】
p38のようなMAPキナーゼも細胞内シグナル伝達経路を調節する。MAPキナーゼは細胞表面からのシグナル伝達をリン酸化カスケードを介して核に伝える。いくつかのサブグループが同定されており、それぞれが異なる基質特異性を示し、別々の細胞外刺激に反応する(非特許文献3)。
【０００６】
プロテインキナーゼB(PKB/Akt)は、成長因子および生存因子(survival factor)の作用を発揮するように機能し、インシュリンおよび炎症シグナルに対する反応を仲介する根本的に重要な細胞内シグナル伝達経路の一成分である(非特許文献4;非特許文献5)。フェニルTSK疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いた、pkBの組換え産生および精製が特許文献1に記載されている。pkBは、カラムに吸着させ、直線勾配を用いて洗浄した後に溶出された。
【０００７】
SRCキナーゼは、癌、免疫系機能不全、および骨再形成疾患に関与している。概説については、非特許文献6を参照のこと。Srcファミリーのメンバーは、例えば、Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、およびBlkである。これらは、分子量が52〜62kDの非受容体型プロテインキナーゼである。メンバーは全て、6つの異なる機能ドメイン:Src相同ドメイン4(SH4)、ユニークドメイン、SH3ドメイン、SH2ドメイン、触媒ドメイン(SH1)、およびC末端15調節領域からなる共通の構造構成によって特徴付けられる。
【０００８】
翻訳とも呼ばれるが、タンパク質合成は、原核生物においては細胞質内のリボソームで行われる。大腸菌などの原核宿主生物において組換えDNAを発現させると、結果として得られる組換え遺伝子産物/タンパク質は、不溶性の封入体の形で細胞質内に沈殿することが多い。細胞の発酵および溶解が完了した後、封入体を単離かつ選択的には精製し、尿素または塩酸グアニジニウム(guanidinium hydrochloride)などの変性剤を添加して封入体に含まれる組換えタンパク質を可溶化し、変性条件を減らしてタンパク質の再生を行う。このような方法は周知であり、組換えタンパク質の産業的製造にも首尾よく長い間用いられてきた(例えば、非特許文献7;非特許文献8;非特許文献9;非特許文献10;非特許文献11;および非特許文献12を参照のこと)。
【０００９】
大腸菌などの微生物宿主細胞における哺乳動物タンパク質の発現は、溶解度が低く、折り畳みが不適切であり、安定性に欠け、かつ他の問題点があり、困難な作業となることが多い。本発明者らの試みは、活性のあるごく少量の可溶性キナーゼと、多量の望ましくない非活性な二量体およびより大きな凝集体とが通常生じる微生物宿主細胞における組換え発現を用いて、プロテインキナーゼを産生することである。
【００１０】
【特許文献１】国際公開公報第2003/016516号
【非特許文献１】Hunter, T.、Cell、1987年、第50号、823〜829頁
【非特許文献２】Hardie, G.およびHanks, S.、「The Protein Kinase Facts Books I」、1995年、Academic Press、カリフォルニア州サンディエゴ、7-20頁
【非特許文献３】Egan, S. E.およびWeinberg, R. A.、Nature、1993年、第365号、781〜783頁
【非特許文献４】Datta, S. R.ら、Genes Dev.、1999年、第13号、2905〜2927頁
【非特許文献５】Brazil, D. P.およびHemmings, B. A.、Trends Biochem. Sci.、2001年、第11号、657〜664頁
【非特許文献６】Thomas, S. M.およびBrugge, J. S.、Annu. Rev. Cell Dev. Biol.、1997年、第13号、513〜609頁
【非特許文献７】Lee, S. Y.、Trends Biotechnol.、1996年、第14号、98〜105頁
【非特許文献８】Panda, A. K.ら、J. Biotechnol.、1999年、第75号、161〜172頁
【非特許文献９】Mattes, R.、Semin. Thromb. Hemost. 2001年、第27号、325〜336頁
【非特許文献１０】Clark, E. D.、Curr. Opin. Biotechnol.、2001年、第12号、202〜207頁
【非特許文献１１】Misawa, S.およびKumagai, I.、Biopolymers、1999年、第51号、297-307頁
【非特許文献１２】Lilie, H.、Current Opinion Biotechnol.、1998年、第9号、497〜501頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、封入体を介して原核生物においてプロテインキナーゼを組換え産生および精製するための改善された方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の方法を用いることにより、微生物宿主細胞での組換え産生後に、正しく折り畳まれた形でキナーゼを多量に回収できるということを驚くべきことに発見した。
【００１３】
本発明は、チロシンプロテインキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼからなる群より選択されるプロテインキナーゼをコードする核酸を微生物宿主細胞において発現させ、プロテインキナーゼを含む封入体を形成させ、プロテインキナーゼを単離、可溶化、再生、および精製することによって、プロテインキナーゼを組換え産生および精製するための方法であり、正しく折り畳まれたプロテインキナーゼの少なくとも70％が疎水性吸着剤に結合せず、疎水性吸着剤に結合しなかったプロテインキナーゼを回収する条件下で、疎水性吸着剤との疎水性相互作用によって精製を行うことを特徴とする方法を目的としている。折り畳まれていないタンパク質は吸着剤に結合する。
【００１４】
本発明に係る方法においては、（１）チロシンプロテインキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼからなる群より選択されるプロテインキナーゼをコードする核酸を微生物宿主細胞において発現させ、該キナーゼを含む封入体を形成させ、該キナーゼを単離、可溶化、再生、および精製することによって、プロテインキナーゼを組換え産生および精製するための方法であり、正しく折り畳まれたプロテインキナーゼの少なくとも70％が疎水性吸着剤に結合せず、疎水性吸着剤に結合しなかったプロテインキナーゼを回収する条件下、疎水性吸着剤との疎水性相互作用によって該精製を行う方法であることを特徴とする。
【００１５】
本発明に係る方法においては、（２）キナーゼがsrc、pkb、c-met、lck、またはp38である上記(1)記載の方法であることを特徴とする。
【００１６】
本発明に係る方法においては、（３）吸着剤がフェニルセファロース、オクチルセファロース、またはブチルセファロースである上記(1)または(2)記載の方法であることを特徴とする。
【００１７】
本発明に係る方法においては、（４）キナーゼを、少なくとも0.1MのKClまたはNaClを含む水溶液中でクロマトグラフィー材料に適用する上記(1)〜(3)のいずれか1つに記載の方法であることを特徴とする。
【００１８】
本発明に係る方法においては、（５）水溶液が、少なくとも1Mのアルギニン、または一般式I
R2-CO-NRR1(I)
(式中、RおよびR1は、水素、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C4アルキル鎖であり、
R2は、水素、NHR1、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C3アルキル鎖である)
を有する化合物をさらに含む上記(4)記載の方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、封入体を介して原核生物においてプロテインキナーゼを組換え産生および精製するための改善された方法が提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好ましくは、プロテインキナーゼはsrc、pkb、c-met、lck、aurora、またはp38である。
【００２１】
本発明の吸着剤は、好ましくは、フェニル残基、ブチル残基、またはオクチル残基などの疎水性残基で修飾されたセルロース、架橋デキストラン、架橋アガロースなどからなる固形材料またはゲル材料(HIC吸着剤、疎水性相互作用クロマトグラフィー吸着剤)である。
【００２２】
好ましくは、キナーゼは、少なくとも0.1MのKClまたはNaCl、より好ましくは0.1〜1MのKClまたはNaClを含む水溶液中で疎水性吸着剤で処理される。プロテインキナーゼタンパク質物質の全量の70％を超える多量の望ましくないプロテインキナーゼが結合しない限り、より高いKCl濃度またはNaCl濃度が可能である。塩濃度をさらに高くするとプロテインキナーゼが不安定化する可能性がある。
【００２３】
さらに、疎水性相互作用処理は、好ましくは、少なくとも1Mのアルギニン、または一般式I
R2-CO-NRR1 (I)
(式中、RおよびR1は、水素、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C4アルキル鎖であり、
R2は、水素、NHR1、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C3アルキル鎖である)
を有する化合物の存在下で行われる。
【００２４】
本発明に従って産生および精製することができるプロテインキナーゼは前記で定義されている。好ましくは、本発明の方法は、SRCキナーゼおよび環状AMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)の産生および精製に有用である。Srcファミリーのメンバーは、例えば、Src、Fyn、Yes、Fgr、Lyn、Hck、Lck、およびBlkである。これらは、分子量が52〜62kDの非受容体型プロテインキナーゼである。メンバーは全て、6つの異なる機能ドメイン:Src相同ドメイン4(SH4)、ユニークドメイン、SH3ドメイン、SH2ドメイン、触媒ドメイン(SH1)、およびC末端15調節領域からなる共通の構造構成によって特徴付けられる。環状AMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)はSTKファミリーのメンバーである。環状AMPは、研究された全ての原核細胞および動物細胞におけるホルモン作用の細胞内介在物質である。このようなホルモン誘導性細胞反応として、甲状腺ホルモン分泌、コルチゾール分泌、プロゲステロン分泌、グリコーゲン分解、骨吸収、ならびに心拍および心筋収縮力の調節が挙げられる。PKAは全ての動物細胞において見出され、これらの細胞の大部分における環状AMPの作用について説明がつくと考えられる。
【００２５】
本発明に従って産生することができる前記のプロテインキナーゼは全て生化学プロセスにおいて重要な役割を果たしている。代謝の相関関係をさらに解明するために、天然のプロテインキナーゼが関心対象となるだけでなく、これらの天然に生じるプロテインキナーゼの変異体も関心対象である。
【００２６】
本発明に有用な吸着剤(HIC吸着剤)は、好ましくは、疎水性リガンドで置換されたゲルマトリックスからなる。置換の程度は、通常、10〜50μmol/mlゲルの範囲である。好ましいリガンドは、例えば、C2〜C8アルキル残基または単純なアリール残基(フェニルなど)である。通常、疎水性相互作用は塩添加によって高まる。クロマトグラフィーにHIC吸着剤が用いられる場合、正しく折り畳まれた形のキナーゼの大部分は結合せず、従って、フロースルーに回収される。
【００２７】
フェニル基、ブチル基、またはオクチル基で置換された架橋アガロースを使用することが特に好ましい。このような吸着剤は、例えば、フェニルセファロース、ブチルセファロース、またはオクチルセファロース(例えば、架橋アガロース、4％球形(spherical)、平均粒径90μm、粒径範囲45〜165μm、置換の程度約50μmolブチル基/mlゲル)である。
【００２８】
疎水性吸着剤処理は通常のやり方で行うことができる(例えば、キナーゼを含む溶液を、吸着剤の懸濁液で、またはクロマトグラフィー(HIC)として処理する)。
【００２９】
「プロテインキナーゼの少なくとも70％が結合しない」という表現は、組換え産生および再生の後に回収されたタンパク質(正しく折り畳まれた形のプロテインキナーゼ、正しく折り畳まれていない形のプロテインキナーゼ(例えば、多量体など)、およびキナーゼを含む水溶液中での再生後に存在する宿主細胞に由来する他のタンパク質不純物が含まれる)から、正しく折り畳まれた形の少なくとも70％が吸着剤に結合せず、キナーゼ溶液の吸着剤処理後の上清に見出されるか、または吸着剤がクロマトグラフィーHIC精製に用いられる場合、フロースルーに見出されることを意味する。
【００３０】
「正しく折り畳まれた」という表現は、再生後のタンパク質が天然の3次元構造をとっていることを意味する。これは、触媒活性とは関係がなく、触媒活性のない変異体も含む。好ましくは、活性のあるプロテインキナーゼが本発明によって産生される。
【００３１】
キナーゼと吸着剤との結合の割合は、再生後のキナーゼの水溶液を、少なくとも0.1MのKClまたはNaCl、より好ましくは0.1〜1MのKClまたはNaClで処理することによって30％未満とすることができる。プロテインキナーゼタンパク質物質の全量の70％を超える多量の望ましくないプロテインキナーゼが結合しない限り、より高いKCl濃度またはNaCl濃度が可能である。塩濃度をさらに高くするとプロテインキナーゼが不安定化する可能性がある。
【００３２】
一般式Iを有する化合物として、好ましくは、ホルムアミド、アセトアミド、尿素、または尿素誘導体(例えば、エチル尿素もしくはメチル尿素)が用いられる。アルギニンを、例えば、塩酸塩としてまたは塩基性アルギニンの別の滴定された形として使用することができる。しかしながら、好ましくは、L-アルギニン、より好ましくは、L-アルギニンの塩酸塩形態が用いられる。
【００３３】
微生物宿主細胞でのポリペプチドの組換え発現中に、不溶性の封入体が形成される。封入体は、コード遺伝子の過剰発現の際に生じる、プロテアーゼに耐性のある、誤って折り畳まれた所望のタンパク質からなる屈折性凝集体(refractile aggregate)である(Misawa, S.およびKumagai, I., Biopolymers 51 (1999) 297-307)。
【００３４】
組換え遺伝子発現に適した原核宿主細胞は、例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物(例えば、大腸菌および枯草菌)である。適切な大腸菌株は、例えば、UT5600、AB101、XL1、K12、X1776、およびW3110などの大腸菌株である。しかしながら、他の腸内細菌ならびに他の微生物(例えば、クレブシエラ属(Klebsiella)、サルモネラ属(Salmonella)または枯草菌、シュードモナス属(Pseudomonas)またはストレプトミセス属(Streptomyces))も宿主細胞として適している。例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、およびシゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)などの酵母株も宿主細胞として適している。
【００３５】
ポリペプチドをコードする核酸は、通常、発現ベクターに挿入される。適切なベクターは当業者に周知であり、例えば、プラスミドまたはファージである。
【００３６】
宿主細胞の発酵も当業者に周知の方法に従って行われる。細胞が所定の数に達した後(細菌数は発酵ブロス/細胞懸濁液の光学密度によって測定される)、組換えポリペプチドの発現が誘導され、(バッチ培養の場合は)定常期に達するまで培養が行われる。細胞増殖が完了した後、細胞は採取され、封入体が単離され、既知の方法に従って可溶化および再生により処理される。
【００３７】
以下の実施例、図面、および参考文献は本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の趣旨から逸脱することなく、示された手順に変更を加えることができることが理解される。
【実施例】
【００３８】
実施例1
srcの組換え産生
a)クローニング
Srcキナーゼドメインは、N末端トロンビン切断部位をPCRによって導入したpQE32(キアゲン(QIAGEN)GmbH)のBamHI/HindIIIに挿入してクローニングした。
【００３９】
b)発酵
接種材料を調製するために、組換えキナーゼタンパク質を産生する発現プラスミドを有する適切な大腸菌株のグリセロールストック1mlをLB培地100mlに添加し、回転式振盪器で37℃で8〜10時間インキュベートする。この前培養物を、LB培地およびグルコースをさらに含む滅菌した発酵槽に移す。キナーゼタンパク質を封入体へ不溶性発現させることが望ましい場合は、主培養の温度を37℃に維持する。発酵中は、攪拌速度を上げることで培地の溶解酸素濃度を20％飽和以上に保つ。高pH値でのグルコース添加および酵母-トリプトン溶液の連続添加(2ml/分)により、培養物にさらに養分を供給する。光学密度の増加が測定できなくなったら、フェドバッチ発酵を終了する。培養ブロスを遠心分離によって採取する。
【００４０】
c)IB調製
バイオマスを、TrisおよびMgSO4を含む緩衝液に懸濁する。必要に応じて、リゾチームおよびDNアーゼ(例えば、ベンゾナーゼ(Benzonase)(メルク(Merck))を添加する。封入体を内部から放出させるために、細菌細胞をホモジナイゼーションによって破壊する。DNアーゼを追加し、さらなる操作に必須の懸濁液として保つ。一定期間室温でインキュベートした後に、NaCl、EDTAおよびBrij溶液を含む第2の緩衝液を懸濁液に添加する。室温でさらに一定期間インキュベートした後に、被覆された封入体を遠心分離によって上清から分離する。次いで、IBを洗浄するために(エンドトキシン放出)、ペレットをTrisおよびEDTAを含む第3の緩衝液で懸濁し、室温で攪拌しながらインキュベートし、遠心分離する。
【００４１】
d)srcの再生
封入体1.3gを、0.1M TRIS pH 8.0、8M塩酸グアニジン、10mM EDTA、10mM DTT(100ml)に室温で懸濁した。このsrcの可溶化物(solubilisate)を、攪拌しながら、1M TRIS pH7.0、0.5Mアルギニン、10mM DTT、コンプリート(Complete)10錠を含む再折り畳み緩衝液(refolding buffer)10Lに滴下する。再折り畳みプロセスは攪拌せずに8℃で3〜5日間続ける。
【００４２】
この段階での異なる緩衝液(様々な添加物を含む、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、MES、TRIS(pH5〜9))に対する透析は、折り畳まれていない非活性srcが高度に凝集し、活性画分が免疫共沈降するために、うまくいかなかった。再生緩衝液に可溶化した折り畳まれていない非活性srcは、透析の前に、疎水性クロマトグラフィーによって、除去することが必要であった。
【００４３】
e)疎水性バッチクロマトグラフィー
再折り畳みタンパク質(refolded protein)溶液のKCl濃度を1Mにした。その後に、ブチルセファロース4ファストフロー(Fast Flow)(アマシャム(Amersham))40gを添加し、8℃で1時間結合させた。濾過によってブチルセファロースを除去した後、上清は、正しく折り畳まれた活性srcタンパク質を含む。これらの条件下では、折り畳まれていない非活性タンパク質はブチルセファロースに結合する。この方法によって、活性srcと非活性srcの分離が可能になる(図1および2)。必要に応じて、さらなるクロマトグラフィー段階(すなわち、Ni-キレートクロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー)によって、さらに精製を行うことができる。
【００４４】
図3から分かるように、KCl(0.2M、0.5M、および1.0M)の添加は、硫酸アンモニウムと比較して優れていることが判明した。同程度の濃度の硫酸アンモニウムを用いると、活性srcは沈殿する。活性srcが疎水性物質に結合する条件は、カラム上で活性がかなり消失するため、使用に適さなかった。溶出液は、極めて少ないsrcタンパク質および活性回収率を示す。
【００４５】
f)srcアッセイ
srcキナーゼによって標識されるsrc基質ペプチドYA133のリン酸化は、ホスホチロシン抗体Eu標識(PT66 Lance Eu-W1024(ワラック(Wallac)))および時間分解蛍光シグナル検出を用いて測定する。
【００４６】
実施例2
auroraの組換え産生
a)クローニング
ヒト完全長野生型Aurora Aキナーゼの細菌発現用のベクター構築物ならびにキナーゼアッセイ(例えば、Elisa、HTRF、FP)用および生物構造研究用の誘導体を設計し、以下の手順に従ってクローニングした。
【００４７】
ヒト完全長Aurora Aキナーゼ(残基1〜403)をコードするORFを、ヒトHeLa cDNAライブラリー(クロンテック(Clontech))から、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびPwo DNAポリメラーゼ(ロシュダイアグノスティックス(Roche Diagnostics)GmbH)を用いた標準的なPCRによって増幅し、その後に、細菌発現ベクターにサブクローニングした。これらのベクターは、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたPCRによってAurora Aの切断型を作成するための鋳型として、および部位特異的変異誘発によってAurora Aムテインを作成するための鋳型として用いられた。最終的な発現構築物のために、野生型および変異型Aurora Aキナーゼドメイン(残基114〜403)を、対応するAurora A基本ベクターから、遺伝子特異的プライマーおよびPwo DNAポリメラーゼを用いたPCRによって増幅した。N末端RGS-(His)6タグを含む、およびN末端RGS-(His)6タグを含まない、T5プロモーター制御下の改良pQE40発現ベクターに、NdeIおよびXhoI制限部位を介して、PCR産物をサブクローニングした。全てのベクターインサート配列はシークエンシングによって確認した。その後に、大規模発酵においてタンパク質を封入体として発現させるために、ベクターで大腸菌BL21株およびUT5600株を形質転換した。大腸菌BL21株およびUT5600株は、アンピシリン(100μg/ml)およびカナマイシン(50μg/ml)を添加したLB培地において37℃で吸光度0.5〜0.8まで増殖させ、その後、1mMイソプロピル-D-チオガラクトピラノシドと共に37℃で一晩誘導し、タンパク質を発現させた。誘導後、細胞を遠心分離によって採取し、再懸濁し、示された手順に従って封入体を調製した。
【００４８】
b)発酵
接種材料を調製するために、組換えキナーゼタンパク質を産生する発現プラスミドを有する適切な大腸菌株のグリセロールストック1mlをLB培地100mlに添加し、回転式振盪器で37℃で8〜10時間インキュベートする。この前培養物を、LB培地およびグルコースをさらに含む滅菌した発酵槽に移す。主培養の温度は37℃に維持する。高pH値でのグルコース添加および酵母-トリプトン溶液の連続添加(2ml/分)により、培養物にさらに養分を供給する。光学密度の増加が測定できなくなったら、フェドバッチ発酵を終了する。培養ブロスを遠心分離によって採取する。
【００４９】
c)IB調製
バイオマスを、TrisおよびMgSO4を含む緩衝液に懸濁する。必要に応じて、リゾチームおよびDNアーゼ(例えば、ベンゾナーゼ、メルク)を添加する。封入体を内部から放出させるために、細菌細胞をホモジナイゼーションによって破壊する。一定期間室温でインキュベートした後に、NaCl、EDTAおよびBrij溶液を含む第2の緩衝液を懸濁液に添加する。室温でさらに一定期間インキュベートした後に、被覆された封入体を遠心分離によって上清から分離する。次いで、IBを洗浄するために、ペレットをTrisおよびEDTAを含む第3の緩衝液で懸濁し、室温で攪拌しながらインキュベートし、遠心分離する。
【００５０】
d)auroraの再生
封入体160mgを、0.1M TRIS pH8.0、8M塩酸グアニジン、10mM EDTA、10mM DTT(10ml)に室温で懸濁した。このauroraの可溶化物を、1M TRIS pH7.0、0.5Mアルギニン、10mM DTTを含む再折り畳み緩衝液1Lに攪拌しながら滴下する。再折り畳みプロセスは攪拌せずに8℃で1日続ける。
【００５１】
e)疎水性バッチクロマトグラフィー
再折り畳みタンパク質溶液のKCl濃度を1Mにした。30分後に、ブチルセファロース4ファストフロー(アマシャム)5gを添加し、8℃で1時間結合させた。濾過によってブチルセファロースを除去した後、上清は、主に、正しく折り畳まれた活性auroraタンパク質を含む。これらの条件下では、折り畳まれていないタンパク質はブチルセファロースに結合する。必要に応じて、さらなるクロマトグラフィー段階(すなわち、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー)によって、さらに精製を行うことができる。
【００５２】
f)再折り畳みタンパク質の分析
再折り畳み後、ブチルセファロースバッチの上清は、SDS-Pageおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって示されるように単量体auroraキナーゼを90％を超えて含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】記載の通りに再生および疎水性クロマトグラフィーを行った後のSrc活性を示す図である。活性は上清(SN)に見られる(EL=溶出液)。
【図２】再生画分およびブチルクロマトグラフィー画分のSDS page(クマシーブルー染色)を示す図である。ブチル上清(SN)では活性が保たれるのに対して、多量の非活性srcタンパク質がカットオフ(cut off)される。1:分子量タンパク質標準、2:再生、3:再生+KCl、4:ブチルSN、5:限外濾過/濃縮。
【図３】再生およびKClまたは硫酸アンモニウム添加後のsrc活性を示す図である。疎水性クロマトグラフィーでよく見られる硫酸アンモニウムの添加は、上清中の活性srcの消失を招く。1MまでのKClは溶液中のsrcを活性に保ち、ブチルセファロースにおいて不活性srcを分離できる。
【図４】SDS page(クマシーブルー染色)を示す図である。レーン1:標準タンパク質、レーン2:再折り畳みおよびブチルセファロース後のauroraキナーゼ調製物。矢印:Auroraキナーゼ。
【図５】再折り畳みおよびブチルセファロースバッチ後のauroraキナーゼのサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す図である。スーパーデックス(Superdex)75(ファルマシア(Pharmacia))10/30。緩衝液:50mM TRIS pH7.5、500mM NaCl、10％グリセロール、3mM Chaps。流速:0.5ml/分。
【図１】
2008119014.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月14日(2008.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンプロテインキナーゼおよびセリン/スレオニンキナーゼからなる群より選択されるプロテインキナーゼをコードする核酸を微生物宿主細胞において発現させ、該キナーゼを含む封入体を形成させ、該キナーゼを単離、可溶化、再生、および精製することによって、プロテインキナーゼを組換え産生および精製するための方法であり、正しく折り畳まれたプロテインキナーゼの少なくとも70％が、疎水性残基で修飾された、セルロース、架橋デキストラン、または架橋アガロースからなる固形材料またはゲル材料に結合せず、該固形材料またはゲル材料に結合しなかったプロテインキナーゼを回収する条件下で、固形材料またはゲル材料との疎水性相互作用によって該精製を行い、ここで該プロテインキナーゼが、少なくとも0.1MのKClまたはNaClを含む水溶液中でクロマトグラフィー材料に適用され、さらに、該水溶液が、少なくとも1Mのアルギニン、または一般式I
R2-CO-NRR1(I)
(式中、RおよびR1は、水素、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C4アルキル鎖であり、
R2は、水素、NHR1、または飽和もしくは不飽和の、分枝もしくは非分枝のC1-C3アルキル鎖である)
を有する化合物をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
キナーゼがsrc、pkb、c-met、lck、またはp38であることを特徴とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記固形材料またはゲル材料がフェニルセファロース、オクチルセファロース、またはブチルセファロースであることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。