(57)【要約】【課題】放線菌以外の生物に由来する外来タンパク質を放線菌により発現可能な発現系を構築する。【解決手段】放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において発現するベクターであって、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、プロモーターの下流に発現可能に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、シグナル配列の下流に発現可能に連結されている、外来タンパク質をコードする外来塩基配列と、外来タンパク質の下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、を備えるベクター。【選択図】図１
2008193953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において発現するベクターであって、
ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、
前記プロモーターの下流に発現可能に連結されている、前記ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、
前記シグナル配列の下流に発現可能に連結されている、外来タンパク質をコードする外来塩基配列と、
前記外来タンパク質の下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、
を備えるベクター。
【請求項２】
請求項１のベクターにおいて、
前記プロモーター配列は、配列番号１に記載のプロモーター配列において１または数個の塩基が欠失・置換・付加されてなる塩基配列からなる、ベクター。
【請求項３】
請求項１または２記載のベクターにおいて、
前記ターミネーター配列は、配列番号２に記載のターミネーター配列において１または数個の塩基が欠失・置換・付加されてなる塩基配列からなる、ベクター。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載のベクターにおいて、
前記シグナル配列は、配列番号３に記載のシグナル配列のコードするシグナルペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基が欠失・置換・付加されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる、ベクター。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載のベクターにおいて、
前記外来塩基配列は、哺乳動物または枯草菌由来の外来タンパク質をコードする塩基配列である、ベクター。
【請求項６】
請求項５記載のベクターにおいて、
前記外来塩基配列は、ＧＦＰおよびｇｌｏｂｉｎ；Ａ２，Ｂ１，Ｂ２からなる群から選ばれる１種以上の外来タンパク質をコードする塩基配列である、ベクター。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載のベクターにおいて、
プラスミドである、ベクター。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載のベクターにおいて、
前記放線菌において前記ベクターの複製を可能にする複製起点配列をさらに備える、ベクター。
【請求項９】
請求項１乃至８いずれかに記載のベクターにおいて、
大腸菌において前記ベクターの複製を可能にする複製起点配列をさらに備える。ベクター。
【請求項１０】
請求項１乃至９いずれかに記載のベクターにおいて、
抗生物質耐性遺伝子をさらに備える、ベクター。
【請求項１１】
放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を組み込んで前記外来タンパク質を放線菌において発現するためのベクターであって、
ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、
前記プロモーターの下流に発現可能に連結されている、前記ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、
前記シグナル配列の下流に設けられている前記外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入するためのクローニングサイトと、
前記クローニングサイトの下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、
を備えるベクター。
【請求項１２】
放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を発現するための組換え放線菌であって、
請求項１乃至１０いずれかに記載のベクターが組み込まれている、組換え放線菌。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換え放線菌において、
ストレプトマイセス・リヴィダンスである、組換え放線菌。
【請求項１４】
放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において生産する方法であって、
請求項１２または１３記載の組換え放線菌を培地中で培養する工程と、
前記組換え放線菌の菌体または培地から前記外来タンパク質を取得する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放線菌を宿主とする新しいタンパク質発現系開発と応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
放線菌は好気的な土壌には必ず、しかも高密度で存在する、グラム陽性の土壌細菌である。放線菌は細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）の仲間だが、通常の細菌が球状や桿状といった単純な形態しか示さないのに対して、典型的な放線菌は生育のための環境条件が整うと、胞子が発芽し、菌糸を伸ばして分岐し、その後菌糸を伸長させ、気菌糸はやがて分断して胞子となるといった複雑な形態をとる。従って、形態的には細菌というよりも、真核生物である糸状菌に近いといえる。放線菌はまた、医薬品として市場に出回っている抗生物質の大部分が、放線菌によって生産されることから分かるように、抗生物質生産菌の代表であり、多様な抗生物質（二次代謝物）生産能を有している。そして、ゲノム解析の結果、ゲノムサイズとゲノム上にコードされている情報量（遺伝子の数）は、細菌の中では群を抜いて多いことが明らかになり、放線菌は細菌の中では最も進化した生物であると考えられている。
【０００３】
放線菌、特にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける分子生物学的研究が本格化したのは、１９８０年代からであるが、研究はそれ以前から行われていた。１９５０年代半ば、放線菌において遺伝的組み換えが起こることが判明し、それ以降、プラスミドを介した接合やプロトプラスト融合による、遺伝学的解析が地道に行われてきた。研究を行ったのは英国のＨｏｐｗｏｏｄらのグループであり、対象とした菌株はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒである。以後、同株は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓの遺伝学的、分子生物学的解析の標準菌となっている（非特許文献１、４参照）。
【０００４】
組み換えＤＮＡ技術の開発で、大腸菌を中心とした微生物の分子生物学が盛んになっていったが、放線菌は遺伝学的に大腸菌とは大きく異なっており、放線菌の遺伝子は大腸菌内では発現しないものが多い。このため、独自のクローニング系が必要であった。その後、ＨｏｐｗｏｏｄらによりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおいてクローニング系（宿主−ベクター系）が開発されたことが、研究に対する大きな刺激となった。ベクターは放線菌のプラスミドを改良したもので、選択マーカーとしてはチオストレプトン耐性遺伝子が適している。宿主としては、Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの近縁の、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓが標準的に用いられている。Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒとＳ．  ｌｉｖｉｄａｎｓは同種と言えるほど近縁であるが、制限がほとんどなく、形質転換効率が高い等、遺伝子組み換えの宿主としては後者の方が適している。こうして開発された宿主−ベクター系を用い、酵素生産や一次代謝、抗生物質の生合成、形態形成（分化）等に関与する遺伝子がクローニングされ、分子生物学的研究が盛んに行われてきている。（非特許文献１、３、４参照）
【０００５】
本発明者等の研究室では以前より放線菌−大腸菌シャトルベクターであるｐＵＣ７０２に放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来分泌性タンパク質Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ（ＰＬＤ）の遺伝子及び、その上流プロモーター領域と下流ターミネーター領域を導入したｐＵＣ７０２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＰＬＤを構築し、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）に組換えを施すことで、ＰＬＤの分泌生産が行えることを確認している。
【０００６】
より詳しく説明すると、このプロモーター領域を組み込むことで野生株に対し、約２０倍のＰＬＤ生産量を示し、比活性に関しても野生株Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ由来ＰＬＤとほぼ同じであった（非特許文献２参照）。
【０００７】
これらの研究成果に関しては、神戸大学の福田秀樹教授らが兵庫ＴＬＯを介して、出願している（特許文献１を参照）。これらよりＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ由来ＰＬＤ発現プロモーターは、放線菌組み換え体においてもＰＬＤ生産に効果的に、しかも強力に働いていることが明らかとなっている。
【０００８】
【特許文献１】特開平２００２−５１７８０号公報
【非特許文献１】服部勉，新・土の微生物（９）放線菌の機能と働き  博友社（２００３）
【非特許文献２】Ｃ．Ｏｇｉｎｏ，Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ；Ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ［Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４，８２３−８２８．２００４］
【非特許文献３】Ｃ．Ｏｇｉｎｏ，Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ；Ｐｈｏｓｏｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ：  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ［Ｊｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ２３，１０７−１１５．  ２００３］
【非特許文献４】安藤忠彦，物質生産のための遺伝子工学  朝倉書店（１９８５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、大腸菌をはじめとする放線菌以外の微生物では様々な異種由来の遺伝子組み換えタンパク質の発現または分泌生産を行う宿主ベクター系が提案されているにも関わらず、放線菌以外の生物に由来する外来タンパク質の放線菌による発現系または分泌生産系は殆ど報告が無い。そのため、哺乳動物由来の異種タンパク質をはじめとして、様々な有用な外来タンパク質の発現または分泌が放線菌にて期待されてきたが、未だ報告された成功事例はない。
【００１０】
また、本発明者等の所属する研究室では高いリン酸基転移反応を有するＰｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ（ＰＬＤ）を放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ（ＩＦＯ  １２８５２）から同定しその遺伝子配列を決定しており、放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６株を宿主とするＰＬＤの大量分泌発現系を構築したが（非特許文献３を参照）、未だ放線菌により放線菌以外の生物由来の外来タンパク質等を分泌可能な分泌発現系は構築できていない。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、放線菌以外の生物に由来する外来タンパク質を放線菌により発現可能な発現系を構築することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
放線菌は様々な二次代謝物の生産をおこなったり、多くのタンパク質遺伝子を有していたりすることから、様々なタンパク質の発現が可能であると予想され、物質生産の宿主としての利用が期待されている。本発明者等の所属する研究室の放線菌発現系では、クローニングしたＰＬＤ遺伝子の上流に位置するＰｒｏｍｏｔｅｒ領域の高い転写能のため、ＰＬＤの大量分泌発現が既に可能となっている。
【００１３】
そこで、本発明者等は、ＰＬＤ遺伝子を他のタンパク質の遺伝子に置き換えることで様々なタンパク質を発現できると考えられるとの着想に基づいて、工業的な有用タンパク質の分泌生産系を構築するために、まず、モデルタンパク質としていくつかの放線菌以外の生物由来の外来タンパク質の発現系を構築し、この放線菌の発現系が外来タンパク質を生産することができるか検討した。
【００１４】
その結果、本発明者等は、上記の発現系を様々な外来由来タンパク質の発現に適用する為に、汎用ベクターの開発を行うために試行錯誤をした結果、ついに特定の構成からなる汎用ベクターを用いることにより、放線菌の発現系で放線菌以外の生物由来の外来タンパク質の分泌発現を行うことができることを見出し、本発明を完成させた。
【００１５】
すなわち、本発明によれば、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において発現するベクターであって、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、プロモーターの下流に発現可能に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、シグナル配列の下流に発現可能に連結されている、外来タンパク質をコードする外来塩基配列と、外来タンパク質の下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、を備えるベクターが提供される。
【００１６】
このベクターによれば、放線菌の一種であるストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子（ＰＬＤ遺伝子）として、プロモーター領域とＰＬＤ遺伝子の培地中への分泌発現に関係するシグナル領域とＰＬＤ遺伝子（ＯＲＦ）下流に存在するターミネーター領域とを用いて、そのシグナル領域の下流にタンパク質としての発現可能な配列にて外来遺伝子を挿入しているため、ＰＬＤ遺伝子由来の分泌シグナルを用いて、発現された外来タンパク質を放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することが可能になる。
【００１７】
また、本発明によれば、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を組み込んで外来タンパク質を放線菌において発現するためのベクターであって、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、プロモーターの下流に発現可能に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、シグナル配列の下流に設けられている外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入するためのクローニングサイトと、クローニングサイトの下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、を備えるベクターが提供される。
【００１８】
このベクターによれば、放線菌の一種であるストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子（ＰＬＤ遺伝子）として、プロモーター領域とＰＬＤ遺伝子の培地中への分泌発現に関係するシグナル領域とＰＬＤ遺伝子（ＯＲＦ）下流に存在するターミネーター領域とを用いて、そのシグナル領域の下流にタンパク質としての発現可能な配列にて外来遺伝子を挿入するためのクローニングサイトが設けられているため、そのクローニングサイトに放線菌以外の生物由来の外来タンパク質をコードする外来塩基配列を発現可能な形で挿入することによって、ＰＬＤ遺伝子由来の分泌シグナルを用いて、発現された外来タンパク質を放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することが可能になる。
【００１９】
また、本発明によれば、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を発現するための組換え放線菌であって、外来塩基配列を既に挿入済みの上記ベクターが組み込まれている、組換え放線菌が提供される。
【００２０】
この組換え放線菌によれば、放線菌の一種であるストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子（ＰＬＤ遺伝子）として、プロモーター領域とＰＬＤ遺伝子の培地中への分泌発現に関係するシグナル領域とＰＬＤ遺伝子（ＯＲＦ）下流に存在するターミネーター領域とを用いて、そのシグナル領域の下流にタンパク質としての発現可能な配列にて外来遺伝子を挿入しているベクターが組み込まれているため、ＰＬＤ遺伝子由来の分泌シグナルを用いて、発現された外来タンパク質を放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することが可能になる。
【００２１】
また、本発明によれば、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において生産する方法であって、上記の組換え放線菌を培地中で培養する工程と、組換え放線菌の菌体または培地から外来タンパク質を取得する工程と、を含む、方法が提供される。
【００２２】
この方法によれば、放線菌の一種であるストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子（ＰＬＤ遺伝子）として、プロモーター領域とＰＬＤ遺伝子の培地中への分泌発現に関係するシグナル領域とＰＬＤ遺伝子（ＯＲＦ）下流に存在するターミネーター領域とを用いて、そのシグナル領域の下流にタンパク質としての発現可能な配列にて外来遺伝子を挿入しているベクターが組み込まれている放線菌を用いるため、発現された外来タンパク質を放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することが可能になる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、放線菌以外の生物に由来する外来タンパク質を放線菌により放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００２５】
＜概要＞
本実施形態に係るベクターは、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において発現するベクターであって、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列と、プロモーターの下流に発現可能に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列と、シグナル配列の下流に発現可能に連結されている、外来タンパク質をコードする外来塩基配列と、外来タンパク質の下流に連結されている、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列と、を備える。
【００２６】
このベクターによれば、放線菌の一種であるストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ）由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子（ＰＬＤ遺伝子）として、プロモーター領域とＰＬＤ遺伝子の培地中への分泌発現に関係するシグナル領域とＰＬＤ遺伝子（ＯＲＦ）下流に存在するターミネーター領域とを用いて、そのシグナル領域の下流にタンパク質としての発現可能な配列にて外来遺伝子を挿入しているため、ＰＬＤ遺伝子由来の分泌シグナルを用いて、発現された外来タンパク質を放線菌の菌体外の培地中に分泌生産することが可能になる。
【００２７】
＜プロモーター＞
本実施形態で用いるプロモーターは、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（ＩＦＯ１２８５２）（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  、以下、Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ（ＩＦＯ１２８５２）と略記する）由来のホスフォリパーゼＤ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ、以下、ＰＬＤともいう）遺伝子のプロモーターである。
【００２８】
放線菌群の中でも、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム（ＩＦＯ１２８５２）（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  、以下、Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ（ＩＦＯ１２８５２）と略記する）は、現時点において、分泌ＰＬＤ活性の最も高い菌株であることが判っている（Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，Ｖｏｌ．４４，１１９３−１１９８（１９９４））。なお、ストレプトバーティシリウムについては、分類上、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に分類されることがある。
【００２９】
ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列、構造遺伝子配列、ターミネーター配列を含むクローンの塩基配列を配列番号：４に示す。この配列番号４の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７ま
での塩基配列が、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のプロモーター配列（配列番号：１）である。
【００３０】
また、本実施形態で用いるプロモーターは、この配列番号４の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７までの塩基配列（配列番号：１）において、１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であってもよい。この場合にも、両配列のホモロジーの高さから同様に放線菌での発現効率に優れると考えられるからである。
【００３１】
また、本実施形態で用いるプロモーターは、この配列番号４の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７までの塩基配列（配列番号：１）と、相同性が８０％以上、９０％以上、または９５％以上の塩基配列であってもよい。この場合にも、両配列のホモロジーの高さから同様に放線菌での発現効率に優れると考えられるからである。なお、本明細書で定義する相同性については、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で計算したホモロジーの数値に従うものとする。
【００３２】
＜外来塩基配列＞
本実施形態で用いる外来塩基配列は、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質をコードする塩基配列であればよく、任意の塩基配列を用いることができるが、例えば、哺乳動物または枯草菌由来の外来タンパク質をコードする塩基配列を好適に用いることができる。哺乳動物または枯草菌由来の外来タンパク質としては、例えば、後述の実施例２で実証しているように、ＧＦＰおよびｇｌｏｂｉｎ；Ａ２，Ｂ１，Ｂ２からなる群から選ばれる１種以上の外来タンパク質などを好適に発現することができる。なお、哺乳動物には、当然にヒトが含まれるものとする。
【００３３】
もっとも、外来塩基配列は、これらの塩基配列に限定されるものではなく、例えば、ＮＯ合成酵素、クロロペルオキシダーゼ、ＣｏｏＡなどのヘム結合領域を有する複雑な立体構造タンパク質についても、ｇｌｏｂｉｎ；Ａ２，Ｂ１，Ｂ２と同様に、本実施形態のベクターで放線菌において好適に発現可能であると考えられる。
【００３４】
＜ターミネーター＞
本実施形態に係るベクターは、外来塩基配列の下流に連結されているストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのゲノム由来のターミネーター配列を備える。このことにより、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質の生産能を向上させることができる。
【００３５】
本実施形態で用いるターミネーターは、発現効率の高さからストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのゲノム由来のターミネーター配列を用いる。なお、配列番号：４の配列表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３までの塩基配列（配列番号：２）が、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のターミネーター配列である。
【００３６】
また、本実施形態で用いるターミネーターは、この配列番号：４の配列表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３までの塩基配列（配列番号：２）において、１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列であってもよい。この場合にも、両配列のホモロジーの高さから同様に放線菌での発現効率に優れると考えられるからである。
【００３７】
また、本実施形態で用いるターミネーターは、この配列番号：４の配列表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３までの塩基配列（配列番号：２）と、相同性が８０％以上、９０％以上、または９５％以上の塩基配列であってもよい。この場合にも、両配列のホモロジーの高さから同様に放線菌での発現効率に優れると考えられるからである。
【００３８】
＜シグナル配列＞
本実施形態のベクターは、プロモーターの下流かつ外来塩基配列の上流に、外来タンパク質を放線菌の細胞外に分泌するためのシグナルペプチドをコードするシグナル配列として、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列を備える。この場合、シグナルペプチドを有することにより、外来タンパク質を放線菌の細胞外に分泌することが可能になる。その結果、外来タンパク質の生産効率が向上し、菌体外に分泌された外来タンパク質を精製することも容易になる。
【００３９】
なお、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列は、配列番号：４の配列表における、塩基番号１４０８から塩基番号１５０９までの塩基配列（配列番号：３）である。もっとも、シグナル配列は、この配列に限定されるものではなく、放線菌において菌体外への分泌を可能にするのであれば、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム由来のホスフォリパーゼＤ遺伝子のシグナル配列を一部改変したものであっても利用可能である。
【００４０】
＜複製起点配列＞
本実施形態のベクターは、放線菌においてベクターの複製を可能にする複製起点配列をさらに備えてもよい。この場合には、放線菌の菌体内でベクターの複製が可能になり、放線菌の増殖によってベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。また、放線菌の菌体内でのベクターのコピー数を増加させることができるため、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質の生産能を向上させることができる。図１および図５におけるｒｅｐ遺伝子がこの放線菌においてベクターの複製を可能にする複製起点配列に対応する。
【００４１】
本実施形態のベクターは、大腸菌において前記ベクターの複製を可能にする複製起点配列をさらに備えてもよい。この場合には、ベクターの遺伝子組換え等を大腸菌内で行って大腸菌内で保存することが可能になり、ベクターの修飾・改変・保存等が容易になる。図１および図５におけるｏｒｉ遺伝子がこの大腸菌においてベクターの複製を可能にする複製起点配列に対応する。
【００４２】
＜マーカー＞
本実施形態のベクターは、抗生物質耐性遺伝子をさらに備えてもよい。この場合には、対応する抗生物質を含む培地で放線菌を培養することにより、放線菌の菌体内からベクターが落ちてしまうことを抑制することができる。また、このベクターで放線菌を形質転換した場合には、実際に形質転換されたか否かを対応する抗生物質を含む培地で放線菌を培養することにより確認することができる。図１および図５におけるＡｍｐｒ遺伝子がこの抗生物質耐性遺伝子に対応する。もっとも、Ａｍｐｒ遺伝子以外にも、放線菌で一般的に用いられている任意の抗生物質耐性遺伝子を利用可能である。また、抗生物質耐性遺伝子以外のマーカー遺伝子を利用してもよい。
【００４３】
＜クローニングサイト＞
本実施形態に係るベクターは、外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入する前の状態では、プロモーターの下流に設けられている外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入するためのクローニングサイトを有している。このクローニングサイトは、特定の種類の制限酵素（またはその組合せ）によって、ユニークに切断されるサイトであるために、その特定の種類の制限酵素（またはその組合せ）で切断した箇所に、目的の外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入することができる。
【００４４】
図５では、この外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入する前の状態のベクターは、ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍに相当し、クローニングサイトは、ＮｈｅＩ  １８７１、ＢａｍＨＩ  １８７７、ＢｇｌＩＩ  １８８３を含むサイトである。もっとも、クローニングサイトはこの配列に限定されるわけではなく、ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍのようなこの外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入する前の状態のベクターのクローニングサイト以外の配列を切断しない制限酵素サイトの組合せを含む配列であれば好適に用いることができる。
【００４５】
また、この外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入する前の状態のベクターの構成も、ｐＵＣ１８を基にして構成されたｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍの構成に限定されるわけではなく、他の放線菌で利用可能なベクターを同様に改変して作製したものであっても好適に利用可能である。なお、蛇足ではあるが、特開２００２−５１７８０に記載のベクターは、そのままでは適当なクローニングサイトがないので、外来タンパク質をコードする外来塩基配列を挿入することが困難である。
【００４６】
＜組換え放線菌＞
本実施形態の組換え放線菌は、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を発現するための組換え放線菌であって、上記のベクターが組み込まれている、組換え放線菌である。この放線菌としては、どのような種類の放線菌を用いてもよいが、例えば、タンパク質の生産能に優れるストレプトマイセス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６株、以下、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓとも略記する）を好適に用いうる。
【００４７】
このようにして組み換えた放線菌を培地中で培養し、組換え放線菌の菌体または培地から外来タンパク質を取得することにより、放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を放線菌において生産することができる。このときの培養方法としては、特に限定されず任意の一般的な放線菌の培養方法を用いることができ、任意の一般的な放線菌用の培地を用いることができる。例えば、ＬＢ培地を用いて好気性の振とう培養を行ってもよい。そして、菌体または培地から外来タンパク質を取得して、一般的なタンパク質の精製方法により精製すれば、純度の高い活性な放線菌以外の生物由来の外来タンパク質を生産することができる。
【００４８】
＜放線菌ベクターについて＞
ベクターに使われている放線菌のプラスミド
多くのプラスミドが放線菌から分離されているがその中で選択マーカーが付与され情報発現可能なクローニングサイトが決定されているベクターは、ＳＣＰ２、ＳＬＰ１、およびｐＩＪ１０１の３種類のプラスミド由来のもののみである（非特許文献３参照）。表１はそれらのプラスミドの起源、機能、分子量、コピー数、宿主域および構築された代表的なベクターを示したものである。いずれもＨｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．グループおよびＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．グループによって開発されたものである。それらのうちでｐＩＪ１０１の機能マップは欠失変異と外来ＤＮＡの挿入実験によって詳細に検討され、プラスミドの接合伝達（ｔｒａｎｓｆｅｒ）、ポック形成（ｓｐｒｅａｄ）、コピー数の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が決定されている（図９）。
【００４９】
【表１】
2008193953.tif 000003
【００５０】
ベクターに使われている選択マーカー
放線菌プラスミドに組み込まれている放線菌由来の選択マーカーは現在９種類ある（非特許文献３参照）。
Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ
菌株由来                            選択マーカー
Ｓ．  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）       メチレノマイシン耐性（ｍｍｙ）
Ｓ．  ｆｒａｄｉａｅ                ネオマイシン耐性（ａｐｈ）
Ｓ．  ｆｒａｄｉａｅ                ネオマイシン耐性（ｅａａｃ）
Ｓ．  ａｚｕｒｅｕｓ                チオストレプトン耐性（ｔｓｒ）
Ｓ．  ｖｉｎａｃｅｓ                バイオマイシン耐性（ｖｐｈ）
Ｓ．  ｅｒｙｔｈｒｅｕｓ            ＭＬＳ耐性（ｍｌｓ）
Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓ              Ｂ−ガラクトシダーゼ（Ｂ−ｇａｌ）
Ｓ．  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ          メラニン生成（ｍｅｌ）
Ｓ．  ｇｒｉｓｅｕｓ                ｐ−アミノ安息香酸合成酵素（ｐａｂ）
【００５１】
既往の研究で構築されたベクター
ｐＩＪ７０２
前述のｐＩＪ１０１由来のベクターは数多く作られており、そのうちで２種類の選択マーカー（ｔｓｒ，ｍｅｌ）を有するものがｐＩＪ７０２である。ｐＩＪ７０２の宿主域はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の多くの種にまたがり、コピー数は４０〜３００、接合伝達能は消失している。ｍｅｌ遺伝子の発現は誘導的である（非特許文献３参照）。
【００５２】
ｐＵＣ７０２
放線菌ベクターｐＩＪ７０２と大腸菌ベクターｐＵＣ１９から制限酵素ＳｅｃＩとＫｐｎＩにより合成した放線菌と大腸菌のシャトルベクターｐＵＣ７０２が構築されている（Ｔｏｂｉａｓ  Ｋｉｅｓｅｒ，Ｍｅｒｖｙｎ  Ｊ．Ｂｉｂｂ，Ｍａｒｋ  Ｊ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，Ｋｅｉｔｈ  Ｆ．Ｃｈａｔｅｒ，Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｈｏｏｗｏｏｄ；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ［Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｐｒｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｒｏｗｓ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  Ｅｎｇｌａｎｄ．  ２０００］を参照）（図１）。
【００５３】
ｐＵＣ７０２−ｐｒｏ−ＰＬＤ
Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍのゲノムから得られたＰＬＤ遺伝子及び周辺のプロモーター領域、シグナル領域、ターミネーター領域をｐＵＣ７０２へ導入することで、ＰＬＤを大量分泌発現するプラスミドが構築されている（非特許文献２を参照）（図１）。
【００５４】
Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ  ＰＬＤ由来プロモーターの特徴
放線菌遺伝子の転写は、その高いＧＣ含有量に起因するプロモーター配列の特異性のために、大腸菌等ではほとんど起こらない。種々の放線菌プロモーターの構造が明らかになっているが、大腸菌のタンパク質発現システム因子であるσ因子との対応がついているのは２〜３例しかない（非特許文献１および服部勉，新・土の微生物（３）遺伝子と土壌微生物  博友社（１９９８）を参照）。しかしながら、Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ（ｒｂｓ）に相当する領域ＴＴＴＡＡＧＧＡＴＧは確認されている。
【００５５】
本発明者達の所属する研究室では、これまでに大腸菌と放線菌のシャトルベクターｐＵＣ７０２プラスミドへＳｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ由来ＰＬＤ遺伝子とその上流のプロモーター遺伝子領域を導入したｐＵＣ７０２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＰＬＤを構築し、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）に組み込み、その発現について解析を行ってきた（図２）。その結果、放線菌によるタンパク質の大量発現において、プロモーター領域の作用が非常に大きく関与していることが明らかとなっている。なお、図２で示す塩基配列は配列番号：４の塩基配列の塩基番号１４１０から塩基番号１６２０に相当する。また、図２で示すアミノ酸配列を配列番号：５で示す。
【００５６】
タンパク質の分泌について
細胞の外側の構造を形成するタンパク質を含め細胞外に放出される全てのタンパク質は、細胞膜を通過することから分泌型タンパク質と呼ばれる。生物の進化の過程でタンパク質の分泌機構は分化し、高度に発達してきた。そのため、分泌型タンパク質が原核細胞の細胞膜を通過する機構及び、真核生物での小胞体膜を透過する機構は類似している。タンパク質のような高分子を分泌することは、外の高分子を取り込むのと同様に細胞膜が極力阻止しているため、タンパク質の分泌機構は共通して巧妙なからくりが用いられている（松澤洋，タンパク質工学の基礎  東京化学同人（２００４）を参照）。
【００５７】
分泌型タンパク質は、細胞内のリボソーム上で合成されるとき、Ｎ末端側に余分なアミノ酸配列がかなり付加された状態で合成される。その配列はシグナルペプチドと呼ばれ、Ｎ領域、Ｈ領域、Ｃ領域の３部分から構成されている（図２におけるＰＬＤのシグナル領域）。Ｎ領域は正電荷に荷電しており、膜との融合に関係している。中央に位置するＨ領域はαへリックス構造を形成し、細胞膜とよくなじんで潜り込み、本来のタンパク質を形作ることとなる後続のアミノ酸配列をスムーズに通過させる役目を果たす。最後のＣ領域は、Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａという領域を有しており、シグナルペプチダーゼ（ＳＰａｓｅ）が認識し切断すると言われている（松澤洋，タンパク質工学の基礎  東京化学同人（２００４）を参照）。
【００５８】
タンパク質の分泌機構については様々な報告があり、放線菌などの原核生物では少なくとも４種の分泌機構が存在すると報告されている。その中で、主な機構はＳｅｃｒｅｔｏｒｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ（Ｓｅｃ−ｐａｔｈｗａｙ），Ｓｉｇｎａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｐａｔｈｗａｙ（ＳＲＰ−ｐａｔｈｗａｙ），Ｔｗｉｎ  Ａｒｇｉｎｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＴＡＴ  ｓｙｓｔｅｍ）の３種類であり、シグナルによって分泌機構が決定されると言われている。
【００５９】
多くの分泌型タンパク質はＳｅｃ−ｐａｔｈｗａｙ（図３）によって分泌されると言われる。１８−２６アミノ酸のシグナルを持つタンパク質はこの分泌機構が適応される。この分泌機構では未フォールディングのタンパク質しか膜を通過できないため、通過後にフォールディングされる。この分泌機構はまず、細胞内のシャペロンＳｅｃＢｐが翻訳されたタンパク質を巻きつけ、未フォールディングの状態を保たせる。タンパク質を巻きつけたＳｅｃＢｐが膜タンパク質ＳｅｃＹＥＧｐに結合しているＳｅｃＡｐと結合することでタンパク質は膜まで輸送される。そして、膜タンパク質ＳｅｃＹＥＧｐを通過させ、フォールディングされる。その後、細胞膜の外側に位置するＳＰａｓｅの働きでシグナルとタンパク質は分離される（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａ．Ａｇｒｒａｂｅｒｅｓ，Ｊ．Ｆｒｅｄ  Ｄｉｃｅ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５１３，１−２４．２００１］を参照）。
【００６０】
報告は少ないが、ＳＲＰ−ｐａｔｈｗａｙ（図３）という分泌機構も存在する。これは疎水性の強いシグナルの場合に適応される。この分泌機構でも同様に膜タンパク質ＳｅｃＹＥＧｐを通過させるために、未フォールディング状態でタンパク質は通過することになる。この分泌機構ではシグナル領域が翻訳されると直ちにＳＲＰが結合する。ＳＲＰが細胞膜上のＦｔｓＹに結合することで細胞膜上にリボソーム、ｍＲＮＡが輸送される。ＳｅｃＹＥＧｐ近傍でタンパク質の翻訳が行われるため、タンパク質の合成と分泌が同時進行で行われることとなる。合成及び、分泌が終了した後ＳＰａｓｅの働きでシグナルとタンパク質は分離される（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａ．Ａｇｒｒａｂｅｒｅｓ，Ｊ．Ｆｒｅｄ  Ｄｉｃｅ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５１３，１−２４．２００１］を参照）。
【００６１】
ＳｅｃＹＥＧｐを利用せず、ＴａｔＡ−Ｄと呼ばれる膜タンパク質を通過する分泌機構をＴＡＴ  ｓｙｓｔｅｍと言う。これは、４８アミノ酸以上のシグナルに適応される。シグナルは共通して（ＳＲＲＸＦＬＫ（配列番号：６））という配列を持っており、ｔｗｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｏｔｉｆがＳｅｃ−ｐａｔｈｗａｙの働きを妨げていると言われている。この分泌機構ではリボソームで翻訳されたタンパク質はフォールディングされ、フォールディングされた状態で分泌される。また、シャペロンなどの働きを必要とせず、シグナルの働きのみで細胞膜まで輸送され、膜タンパク質ＴａｔＡ−Ｄを通過して分泌され、ＳＰａｓｅの働きでシグナルとタンパク質は分離される（Ｆｅｒｎａｎｄｏ  Ａ．Ａｇｒｒａｂｅｒｅｓ，Ｊ．Ｆｒｅｄ  Ｄｉｃｅ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｃｒｏｓｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５１３，１−２４．２００１］を参照）。
【００６２】
放線菌分泌発現系の利点
遺伝子操作で外来遺伝子を発現させ、タンパク質を生産させるときにもこの分泌機構は利用できる。細胞の中だけで異種タンパク質を生産させると、微量しか作られない場合は細胞内プロテアーゼで分解されてなくなってしまう恐れが多く、逆に大量に作られる場合でも、分解によるロスや、細胞内の合成の場の状態により活性ある成熟タンパク質にならなかったり、生産が頭打ちになったりする。実際、遺伝子操作により、大腸菌の細胞内で異種タンパク質を生産すると、細胞内のタンパク質の約２０％までできるが、不溶性の塊になることが多い。これを正常化するにはグルタチオンなどの酸化還元剤を用い、「巻き戻し」という厄介な操作を必要とする。また、分泌といっても、大腸菌などのグラム陰性菌は細胞膜が二重になっているため、二層の膜の空間（ペリプラズム）に目的タンパク質は蓄積されため、抽出作業を必要とする。放線菌などのようなグラム陽性菌は一層の細胞膜しか持たないため、タンパク質は完全に細胞の外へ出て培地中に蓄積するため、大量生産が期待され、かつ、細胞からの抽出作業を簡略化することができる（松澤洋，タンパク質工学の基礎  東京化学同人（２００４）を参照）。
【００６３】
＜現状での遺伝子組み換え発現系＞
タンパク質の遺伝子組み換え発現には、遺伝子やｃＤＮＡの同定や確認の為の一過的な小スケールの発現から、タンパク質を物質として単離するための工場レベルでの大規模な発現まで、様々なスケールがある。また、タンパク質の発現の宿主として使われているものにも様々なものがある。簡便さや歴史的な背景から大腸菌の使用が最も多いが、枯草菌、放線菌などの細菌、酵母、哺乳動物の培養細胞、昆虫及びその培養細胞、植物細胞、カビ  等が報告されている。これらの発現系には各々の特徴があり、各発現系の特徴を十分理解した上で目的に合う最適な系を選択する必要がある。
【００６４】
大腸菌での発現系は伝統的な知見が豊富で、これまでに蓄積された発現技術などが応用できる上、培養が簡単でコストが安く、大量発現の宿主として最初に考えられる系である。大腸菌の菌体内で発現したタンパク質は普通、封入体(正しい立体構造を取っていない不溶性タンパク質)として蓄積されることが多い。これは大腸菌体内において、発現タンパク質が非常に多量となる為に、正しく折りたたまれないことが原因である場合が多く、タンパク質機能研究の大きな障害となっている。封入体から活性を持つタンパク質に調整するには、不溶物を尿素(ウレア)や塩酸グアニジン等の変性剤で可溶化したのち、変性から再生させる操作が必要である。他の方法として、タンパク質の折りたたみに共同して働いていることが知られている複数の分子シャペロンが、それぞれひとつのプラスミド上にコードされたベクターを使用してクローニングを行うこともできる。また、大腸菌の発現系の大きな問題点の一つは糖鎖の付加を含む種々の修飾が出来ないことである。
【００６５】
酵母は大腸菌と同様に培養が簡単なので多用されている。菌体内に発現させる場合とシグナルペプチドを付けて菌体外に分泌発現させる場合がある。糖鎖の付加も可能だが、動物細胞でみられる複合型糖鎖の付加はできない。また、大腸菌と同じく、アシル化、アミド化などの修飾も出来ないという欠点も有している。
【００６６】
動物細胞は、タンパク質に翻訳後に修飾を必要とする発現に使われるが、培養には高価な血清が必要で、培養時間も長く、タンパク質の生産量も多くない。このように動物細胞は大量生産には適さない面が多く、医薬品の生産を目的としたり、実験室レベルの小スケールの発現など、大腸菌に比べると使用が限られている。昆虫細胞の培養は血清を必要とするが、密閉系で培養できるので、培養装置が簡便になり、生産性も比較的高い。動物・昆虫細胞や酵母などの真核細胞系での組み換え発現では、発現したタンパク質は可溶性の場合が多く、その場合可溶化や変性回復の操作はいらない（表２、非特許文献４および太田次郎，微生物−バイオテクノロジー入門  朝倉書店（１９９２）を参照）。
【００６７】
【表２】
2008193953.tif 000004
【００６８】
＜ＧＦＰについて＞
ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ（オワンクラゲ）において、化学発光タンパク質、Ａｅｑｕｏｒｉｎ（エオクリン）の青色の光（極大４７０ｎｍ）を緑色の光（極大５０８ｎｍ）にシフトするタンパク質として、１９６２年、下村脩博士らによって発見され、１９９２年ＰｒａｓｃｈｅｒらによってそのｃＤＮＡはクローニングされた。ＧＦＰの一次構造（アミノ酸配列）は、２３８個のアミノ酸から成るタンパク質であり、６５〜６７番目のアミノ酸セリン、チロシン、グリシンから発色団ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｙｌｉｄｅｎｅｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅが形成される。ＧＦＰの蛍光タンパク質の発光メカニズムの研究が進むに従いＨｅｉｍ，Ｄｅｌａｇｒａｖｅ，Ｃｒａｍｅｒｉ，ＣｏｒｍａｃｈらによってＧＦＰタンパク質の変異体が作製され、これらの蛍光タンパク質の有用性が報告されるようになった。中でも６５番目のセリンをスレオニンに置換したＳ６５Ｔ変異体は励起極大波長が４９０ｎｍと長波長側にシフトしｗｔＧＦＰよりも数倍強い蛍光を発することや、アミノ酸置換によっては、タンパク質の高次構造の形成を促進したり、タンパク質の溶解度を高めたりする特性を付与しうることが報告された。現在、市販品として様々な変異体ＧＦＰが入手可能である。ＣＬＯＮＴＥＣ社のＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）は、発色団のアミノ酸置換（Ｐ６４Ｌ，Ｓ６５Ｔなど）に加え、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化がなされており、塩基配列としては１９０箇所以上の変異が導入されている。更に同社より蛍光色の変異体ＥＢＰＦ（Ｂｌｕｅ）（Ｙ６６Ｈのアミノ酸置換など）、ＥＣＦＰ（Ｃｙａｎ）（Ｙ６６Ｗのアミノ酸置換など）、ＥＹＦＰ（Ｙｅｌｌｏｗ）（Ｔ２０３Ｙのアミノ酸置換など）が、ヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列最適化のうえ、ＥＧＦＰとは異なる発光色で観察可能な変異体として入手可能である。また同社からは不安定化した変異体や、励起波長をシフトしたり、溶解性を高めたり細胞への毒性を抑えた変異体が作製されている（宮脇敦史，ＧＦＰとバイオイメージング  羊土社（２００２）を参照）。
【００６９】
ＧＦＰを利用する際の発現様式として３つに大別できる。ＧＦＰの単独発現、ＧＦＰに局在化シグナルを付加、ＧＦＰと機能タンパク質との融合の３つである。
【００７０】
＜シトクロムＰ４５０について＞
シトクロムＰ４５０（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０、以下Ｐ４５０）は微生物から植物、動物まで生物界に広く分布する一群のヘムタンパク質で、還元型で一酸化炭素結合して４５０ｎｍに極大をもつ特徴的吸収スペクトルを示す。モノオキシゲナーゼ様式の酸素添加酵素活性をもち、触媒する反応の基質特異性が異なる極めて多数の分子種の存在が知られているが、タンパク質の一次構造と高次構造の比較から、Ｐ４５０は一つの共通祖先遺伝子から生物進化の過程で分化し多様化した遺伝子ファミリーであると結論されている。
【００７１】
Ｐ４５０の特徴である一酸化炭素結合物の４５０ｎｍの吸収スペクトルはプロトヘムの第五配位座にＰ４５０タンパク質のシステイン残基の−ＳＨ基がイオン化したチオレートアニオン（−Ｓ−）が配位していることによる。このシステイン残基の前後のアミノ酸配列はすべてのＰ４５０についてよく保存されており“ヘム結合領域”とよばれている。ヘモグロビンなど一酸化炭素結合物の吸収スペクトルの極大が４２０ｎｍにあるプロトヘムタンパク質では第五配位子はヒスチジン残基のイミダゾールである。Ｐ４５０の変性物であるＰ４２０ではタンパク質分子の構造変化によって第五配位子はイミダゾールに置き換わっており、その一酸化炭素結合物の吸収スペクトルはヘモグロビンとほとんど同じである。
【００７２】
Ｐ４５０の基本的な分子構造はＸ線結晶解析で明らかにされた。Ｐ４５０分子は一辺が約６０Å、厚さ約３０Åのプリズム型であり、分子全体を貫く長いＩへリックスが特徴的である。分子内部には疎水性の基質分子を収容し固定できる空間があり、酸素分子を活性化するヘムがその底部に位置しているのでヘムポケットとよばれる。
【００７３】
ほとんどのＰ４５０はモノオキシゲナーゼとして機能するが、この反応には分子状酸素の存在とともにヘム鉄を還元しＰ４５０に結合した酸素分子を活性化するための還元力の供給が必要である。このＰ４５０還元系には下記の４種類の形式がある。
（１）ＮＡＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（Ｐ４５０還元酵素）
（２）シトクロムｂ５−ＮＡＤＨ−シトクロムｂ５還元酵素系（ｂ５系）
（３）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−鉄−硫黄タンパク質系（ＩＳＰ系）
（４）Ｐ４５０と還元系の融合タンパク質（融合タンパク質系）
（１）と（２）は真核細胞の小胞体に、（３）はミトコンドリアや細菌に見いだされる。（４）は細菌やカビに見いだされるが、まだその記載例が少ない。なお、Ｐ４５０をその還元系で分類することがある。ＩＳＰ系から電子をもらうものをクラスＩ、Ｐ４５０還元酵素によるものをクラスＩＩ、Ｐ４５０還元酵素と同様な組成をもつ還元系とＰ４５０が融合してできているものをクラスＩＩＩとよんでいる。
【００７４】
Ｐ４５０の研究は医学や薬学、農学分野において研究の重要性が認めらており、特異性の高い酸素添加反応を触媒するＰ４５０を有機化合物の工業生産へ応用する試みもなされている。Ｐ４５０分子の基質結合部位を改変して任意の基質特異性をもつＰ４５０を創出することは可能と思われ、工業生産へのＰ４５０の利用は新しい発展方向のひとつであると期待されている（大村恒雄，Ｐ４５０の分子生物学  講談社（２００４）を参照）。
【００７５】
＜ＣＹＰ１０２Ａ３＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに発見されたＰ４５０ＢＭ３（ＣＹＰ１０２Ａ１）は、Ｐ４５０とＰ４５０還元酵素が融合して１本のポリペプチド鎖として存在するユニークな構造をもつ。触媒する反応脂肪酸亜末端（ω−１〜ω−３）水酸化反応である。また不飽和脂肪酸のエポキシ化も行う。ゲノム解析の結果、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）にも２種類のホモログ（ＣＹＰ１０２Ａ２，ＣＹＰ１０２Ａ３）の存在が明らかになっている。したがってこの種のＰ４５０はＢａｃｉｌｌｕｓ属の細菌に普遍的に存在する可能性がある。脂肪酸は枯草菌に毒性を示すため、本Ｐ４５０は枯草菌にとって解毒酵素として意義があると思われる（大村恒雄，Ｐ４５０の分子生物学  講談社（２００４），Ａｎｄｒｅｗ  Ｗ．Ｍｕｎｒｏ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｌｉｎｄｓａｙ；Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ−４５０［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（６），１１１５−１１２５．１９９６］およびＡｎｄｒｅｗ  Ｗ．Ｍｕｎｒｏ，Ｋｉｒｓｔｙ  Ｊ．ＭｃＬｅａｎ；Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０−ｒｅｄｏｘ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ２００６］を参照）。
【００７６】
＜ＣＹＰ１０６Ａ３＞
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＡＴＣＣ  １３３６８から発見されたＣＹＰ１０６Ａ２はステロイド骨格の基質を触媒する。ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅや１１−ｄｅｏｘｙｃｏｒｔｉｓｏｌなど重要なステロイドを水酸化する反応を行うため、バイオテクノロジーの分野で利用されている（Ｃ．Ｖｉｒｕｓ，Ｒ．Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ；Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  １５β−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  ＣＹＰ１０６Ａ２［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．３４（６），１２１５−１２１８．２００６］を参照）。
【００７７】
＜ヘモグロビンについて＞
ヘモグロビン（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）とは、血液中に存在する赤血球の中にある蛋白質である。酸素分子と結合する性質を持ち、肺から全身へと酸素を運搬する役割を担っている。鉄イオンがあるため、赤色を帯びている。各サブユニットはグロビンと呼ばれるポリペプチド部分と１つのヘム部分が結合したもので、本件の実施例では後述するように４種類のグロビンからなるヘモグロビンを用いた。
【００７８】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００７９】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００８０】
＜概要＞
本実施例では、大腸菌の発現系において取得された高活性変異体ＰＬＤ（Ｃ．Ｏｇｉｎｏ，Ｈ．Ｆｕｋｕｄａ；Ｐｈｏｓｏｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｄ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  （Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ２３，１０７−１１５．２００３））を放線菌で大量に分泌できる発現系を構築し、解析を行った。また、放線菌を宿主とした有用タンパク質の分泌生産系への応用のために、まず、モデルタンパク質としていくつかの外来タンパク質の発現系を構築し、この放線菌の発現系が外来タンパク質生産に有効であるかを検討した。
【００８１】
そのために、本発明者等は、本組換え発現系の多様なタンパク質発現系への適用可能性を検討することを目的として、構築プラスミド（ｐＵＣ７０２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＰＬＤ）のＰＬＤ遺伝子領域に様々なタンパク質遺伝子を組み込み、外来由来タンパク質の分泌発現を可能にする宿主ベクター系の開発を行った。そして、真核生物由来のヘム含有タンパク質と枯草菌由来のヘム含有タンパク質の発現に成功した。
【００８２】
このスキームを示す図１に沿って説明すると、目的遺伝子の５’側にＮｈｅＩサイトを有するように、そして３’側にＢａｍＨＩかＢｇｌＩＩ配列を有するようにＰＣＲ用プライマーを設計して目的遺伝子を増幅することで、本ベクター（ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍ）に、遺伝子を挿入することが可能であった。本スキームではモデル系として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入するスキームを示した。
【００８３】
挿入したプラスミド（ｐＵＣ１８−ｐｒｏ−ｇｆｐ）は、それ自身は放線菌に挿入（形質転換）することが困難なベクターであるので、更に放線菌と大腸菌の両方にて形質転換が可能となるシャトルベクターへの遺伝子の挿入を行った。プラスミド（ｐＵＣ１８−ｐｒｏ−ｇｆｐ）に挿入されたＰｒｏｍｏｔｅｒ領域からＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ領域の終わりまでは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩにて取り出すことが可能であった。この切り出した配列を、放線菌・大腸菌のシャトルベクターｐＵＣ７０２に挿入することで、放線菌で大量に分泌生産可能なベクターの構築が完了した。本ベクターシステムを用いて、真核生物由来ヘム含有タンパク質と枯草菌由来ヘム含有タンパク質の発現を確認することが出来た。
【００８４】
本実施例の結果をより詳しく説明すると、放線菌でも変異体ＰＬＤをＷ．Ｔ．−ＰＬＤと同様に大量分泌発現できることが分かった。さらに、変異体ＰＬＤの立体構造解析を行うことによって、Ｗ．Ｔ．−ＰＬＤと比較して活性部位付近に存在する蓋様構造（以下Ｌｉｄ領域）のみが変化していることが推測された。それにより、比活性や基質親和性や触媒能が変化することが示された。また、大腸菌の発現系とは関連性が見られないことが分かり、大腸菌発現系での活性の低い変異体が放線菌の発現系では活性が高くなる可能性があることが示された。さらに、本発現系を様々な外来由来タンパク質の発現に適用する為に、汎用ベクターの開発を行い、放線菌の発現系で外来タンパク質の分泌発現が確認された。
【００８５】
＜実験材料および装置＞
［使用試薬］
ＤＮＡ関連
・ＮａＣｌ                                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｔｒｉｐｔｏｎ                           ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ａｇａｒ  Ｐｏｗｄｅｒ  （寒天末）         ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・アガロースＬＥ（低電気浸透）クラシックタイプ  ［電気泳動用］
ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＳＤＳ                                   ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＫＯＡｃ                                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・酢酸                                          ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・クロロホルム                             ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・２−プロパノール（イソプロピルアルコール） ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・酢酸ナトリウム                           関東化学株式会社
・エタノール                                    ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・メタノール                                    ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・エチジウムブロマイド                     ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｔｒｉｓ                                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＨＣｌ                                   Ｗａｋｏ
・ＥＤＴＡ                                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｇｌｙｃｅｒｏｌ                         ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ  （ＢＰＢ）
ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ  （ＤＭＳＯ）
Ｗａｋｏ（０４６−２１９８１
Ｌｏｔ．ＴＣＱ２６２０）
・６×Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ                 ＴＯＹＯＢＯ
・分子量マーカー（λ／ＥｃｏＲＩ・ＨｉｎｄＩＩＩ）
ＴＯＹＯＢＯ，Ｗａｋｏ
・Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ                 ＴＯＹＯＢＯ
・ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ，  Ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ
ＴＯＹＯＢＯ  ＮＰＫ−６０１
・Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ       
Ａｌｗ４４Ｉ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，
ＫｐｎＩ，ＮｈｅＩ，ＰｓｔＩ，ＳｐｈＩ，ＸｂａＩ
ＴＯＹＯＢＯ
・ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ，  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＴＭ  ＨＳ
ＴａＫａＲａ
ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ                     ＴＯＹＯＢＯ
・ＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ１．１，  ＢｉｇＤｙｅ  ｖｅｒ３．１，  Ｈｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ，  ＰＯＰ−６  Ｐｏｌｙｍｅｒ，  Ｂｕｆｆｅｒ  １０×ｗｉｔｈ  ＥＤＴＡ
Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｙｅｍｓ
【００８６】
タンパク質関連
・ＡＰＳ                                   ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ         ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）
ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・銀染色ＩＩキット                         Ｗａｋｏ（２９１−５０３０１）
・Ｎａ２ＨＰＯ４                             ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＮａＨ２ＰＯ４                             ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｔｗｅｅｎ  ２０  （Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｓｏｒｂｉｔａｎ  Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ                                ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
３５６−２４
・スキムミルク                             ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒａｂｂｉｔ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ）
Ａｆｆｉｎｉｔｙ
ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ
（ＰＡ１−９８０Ａ）
・Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ（ＦＣ），  ＡＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ
Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓ３７３１）
・ＢＣＩＰ／ＮＢＴ  Ｃｏｌｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｓ３７７１）
【００８７】
放線菌培養関連
・Ｋ２ＳＯ４                                 ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＫＨ２ＰＯ４                                    Ｗａｋｏ
・ＭｇＣｌ２                               Ｗａｋｏ
・ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                       ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｇｌｕｃｏｓｅ                           ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｓｕｃｒｏｓｅ                           ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｇｌｙｃｉｎｅ                           ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・ＴＥＳ（Ｎ−Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ−２−ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ）
ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ
・Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）＜以下に３０ｇ／ｌあたりの組成を示す＞                                     ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ
Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ｃａｓｅｉｎ（１７．０ｇ／ｌ）
Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｍｅａｌ
（３．０  ｇ／ｌ）
Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（２．５ｇ／ｌ）
Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（５．０ｇ／ｌ）
Ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（２．５ｇ／ｌ）
・ＢＡＣＴＯＴＭ  Ｐｅｐｔｏｎｅ             ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ
・Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ                 ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ
・ＣＡＳＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ               ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ
・ＭＡＬＴ  ＥＸＴＲＡＣＴ                   ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ
・Ｌｙｓｏｚｙｍｅ，ｆｒｏｍ  Ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ
Ｗａｋｏ（１２６−０２６７１）
・Ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｚｕｒｅｕｓ，                                            ＳＩＧＭＡ（Ｔ８９０２−１Ｇ）
・Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（ＰＥＧ）１，０００
Ｆｌｕｋａ（８１１８８）
・５−Ａｍｉｎｏｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
コスモバイオ（ＡＬ−００−２）
【００８８】
［使用装置］
・ディープフリーザー（−８５℃）
ＵＬＴＲＡ  ＬＯＷ  ＭＤＦ−１９２  （ＳＡＮＹＯ）
・オートクレーブ
ＨＩＧＨ−ＰＲＥＳＳＵＲＥ  ＳＴＥＡＭ  ＳＴＥＲＩＬＩＺＥＲ  ＢＳ−３０５（ＴＯＭＹ）
ＫＴ−２３４６（ＡＬＰ）
・バイオシェーカー
ＢＩＯ  ＳＨＡＫＥＲ  ＢＲ−４０ＬＦ（ＴＡＩＴＥＣ）
Ｂｉｏ  Ｓｈａｋｅｒ  ＢＲ−４１ＦＬ（ＴＡＩＴＥＣ）
・ＰＥＲＳＯＮＡＬ−１１  ＳＤセット（ＴＡＩＴＥＣ）
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  ＩＱ８０２（ｙａｍａｔｏ）
ＥＹＥＬＡＴＲＯＮ  ＦＬＩ−３０１Ｎ（ＥＹＥＬＡ）
・インキュベーター
ＳＯＦＴ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＳＬＩ−４５０Ｎ（ＥＹＥＬＡ）
ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＭＩＲ−１５３（ＳＡＮＹＯ）
ＣＯＯＬ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＰＣＩ−３０１（ＡＳＯＮＥ）
・クリーンベンチ
ＢＩＯ−ＬＡＢＯ  ＣＬＥＡＮＢＥＮＣＨ  ＮＳ−８Ａ（十慈フィールド）
バイオクリーンベンチ  ＶＣＢ−１６００Ｓ（Ｏｒｉｅｎｔａｌ）
・遠心分離機
インバータ・コンパクト高速冷却遠心機  ６９３０（ＫＵＢＯＴＡ）
Ｍｉｃｒｏｔｅｃ  １５２４Ｒ（ＡＳＴＥＣ）
Ｈ−１０３ｎ（ＫＯＫＵＳＡＮ）
ｈｉｍａｃ  ＣＴ１３（ＨＩＴＡＣＨＩ）
Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５  Ｒ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ＭＲ−１５０（ＴＯＭＹ）
ＣＡＰＳＵＬＥＦＵＧＥ  ＰＭＣ−０６０（ＴＯＭＹ）（卓上遠心機）
・分光光度計
Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｕ−３０１０（ＨＩＴＡＣＨＩ）
・アガロース電気泳動装置
Ｍｕｐｉｄ−２ｐｌｕｓ（ＡＤＶＡＮＣＥ）
・ＰＡＧＥ電気泳動装置
ＰＯＷＥＲ  ＳＴＡＴＩＯＮ  １０００ＶＣ  ＡＥ−８２７０（ＡＴＴＯ）
ＰＯＷＥＲ  ＳＴＡＴＩＯＮ  １０００ＶＣ  ＡＥ−８４５０（ＡＴＴＯ）
・ＵＶサンプル撮影装置
ＦＡＳ−ＩＩＩ（ＴＯＹＯＢＯ）
ＤＩＧＩＴＡＬ  ＩＭＡＧＥ  ＳＴＯＣＫＥＲ  ＤＳ−３０（ＴＯＹＯＢＯ）
・ブロックインキュベーター
ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５１５（ＡＳＴＥＣ）
ＢＬＯＣＫ  ＩＮＣＵＢＡＴＯＲ  ＢＩ−５１６Ｃ（ＡＳＴＥＣ）
Ｄ−ＴＨＥＲＭＯ  ５０１（ＡＰＥＬ）
ＨＥＡＴＩＮＧ  ＢＬＯＣＫ  ＨＦ−４１（ＹＡＭＡＴＯ）
・減圧乾燥装置
ＶＣ−３６Ｎ（ＴＡＩＴＥＣ）
ＶＣ−１２Ｓ（ＴＡＩＴＥＣ）
・Ｖｏｒｔｅｘ  ｍｉｘｅｒ
ＴＵＢＥ  ＭＩＸＥＲ  ＴＭ−２０００（ＩＷＡＫＩ）
ＶＯＲＴＥＸ−ＧＥＮＩＥ２  Ｇ−５６０（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）
・ＰＣＲ装置
ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ２７２０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
・電子天秤
ＢＪ  ６１０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
ＡＸ  ２００（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）
・蒸留水装置
ＳＴＩＬＬ  ＡＣＥ  ＳＡ−２０００Ｅ（ＥＹＥＬＡ）
・ＤＮＡ  シーケンサー
ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・エレクトロポレーション装置
Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＸｃｅｌｌＴＭ エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ−ＲＡＤ）
・顕微鏡
ＥＣＬＩＰＳＥ  ５０ｉ（Ｎｉｋｏｎ）
ビルケルチュルク血球計算板（エルマ販売株式会社）
・イオン交換クロマト装置
ＧＲＡＤＩＥＮＴ  ＰＮＭＰ
ＥＣＯＮＯ  ＵＶ  ＭＯＮＩＴＯＲ
ＭＯＤＥＬ  ２１１０  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＯＲ
【００８９】
［菌体］
・大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ：  Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｎｏｖａｂｌｕｅ  （Ｎｏｖａｇｅｎｅ）
ＤＨ５−α  （ＴａＫａＲａＢｉｏ）
【００９０】
・放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６株
培養温度；２８℃、培地；ＴＳＢ。
本実験を福本らが開始した際に使用した放線菌である。出処は、農林水産省管轄の食品総合研究所（通称：食総研）より、静岡大学農学部農芸化学科の徳山真治先生を介して、分与いただいた菌株である。
【００９１】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ（別名Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）（ＮＢＲＣ  １３３８５）
培養温度；  ２８  ｏＣ、培地；  ＴＳＢ。
平成１７年度に、発酵研究所（ＩＦＯ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ）より移管された独立行政法人製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）より購入した菌株である。遺伝的性質は、上記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６株と同等であり、ｐＩＪ７０２系のプラスミドの形質転換に適用可能である。
【００９２】
Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ（別名Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｓ）（ＩＦＯ１２８５２、現在はＮＢＲＣ１２８５２）
培養温度；２８℃、培地；ＴＳＢ。
神戸大学の福田秀樹らによって、高いリン酸機基転移反応活性を有するＰＬＤを培地中に大量に分泌生産する生産株として、スクリーニングされた菌株である。荻野らによって、この株由来のＰＬＤ遺伝子配列が決定され、ｐＩＪ７０２系プラスミドでの遺伝子組み換え系にて使用される遺伝子材料となった。また本菌株のＰＬＤ遺伝子上流には、分泌生産に非常に強力に作用する発現プロモーターが存在していることも明らかとなっている。以上の意味で、本研究のオリジナルとなる菌株である。
【００９３】
［試料の組成］
【００９４】
【表３】
2008193953.tif 000005
【００９５】
【表４】
2008193953.tif 000006
2008193953.tif 000007
【００９６】
【表５】
2008193953.tif 000008
【００９７】
【表６】
2008193953.tif 000009
【００９８】
【表７】
2008193953.tif 000010
2008193953.tif 000011
【００９９】
【表８】
2008193953.tif 000012
【０１００】
【表９】
2008193953.tif 000013
【０１０１】
【表１０】
2008193953.tif 000014
【０１０２】
【表１１】
2008193953.tif 000015
【０１０３】
【表１２】
2008193953.tif 000016
【０１０４】
【表１３】
2008193953.tif 000017
【０１０５】
［使用プライマー］
ＤＮＡ断片増幅用
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域増幅用
Ｓ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号：７）
5'-CCCAAGCTTACGTCATGGCGGGTCTCTCTCGTC-3'
Ａｓ−ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ−ｓｉｇｎａｌ（配列番号：８）
5'-CCCGGATCCGCTAGCGAAGGCCGGAGCCGCGGGCAG-3'
【０１０６】
ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ領域増幅用
Ｓ−ＢａｍＨＩＩＩ−ＢａｌＩＩ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（配列番号：９）
5'-CCGGATCCAGATCTTGAGACGACTGAGCGCCCGGA-3'
Ａｓ−ＥｃｏＲＩ−ｋｐｎＩ−Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（配列番号：１０）
5'-CCGAATTCGGTACCATTTCCTCGCTGGTCGGTTCG-3'
【０１０７】
ＧＦＰ，ＢＦＰ遺伝子増幅用
ＮｈｅＩ−ＧＦＰ（配列番号：１１）
5'-CCGCTAGCATGGCCAGTAAAGGAGAAGAACTCTTCACTGGA-3'
Ａｓ−ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ−ＧＦＰ（配列番号：１２）
5'-CCAGATCTGGATCCTCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCATG-3'
【０１０８】
Ａ１遺伝子増幅用
ＸｂａＩ−Ａ１（配列番号：１３）
５'-CCCTCTAGAGTATGTAACCGACTTGAGCAG-3'
Ａｓ−ＢａｍＨＩ−Ａ１（配列番号：１４）
5'-CCCGGATCCTTAGCCGGAAATACCGCTAGC-3'
【０１０９】
Ａ２遺伝子増幅用
ＮｈｅＩ−Ａ２（配列番号：１５）
5'-CCCGCTAGCGATTGCACTTCCCTCAATCGC-3'
Ａｓ−ＢａｍＨＩ−Ａ２（配列番号：１６）
5'-CCCGGATCCTTAACCAGAAATGCCGCTGAC-3'
Ｓ−ｒｅｐａｉｒ−Ａ２（配列番号：１７）
5'-GTTGGAGCTCGTAGCTTCGACAAC-3'
Ａｓ−ｒｅｐａｉｒ−Ａ２（配列番号：１８）
5'-GTTGTCGAAGCTACGAGCTCCAAC-3'
【０１１０】
Ｂ１遺伝子増幅用
ＮｈｅＩ−Ｂ１（配列番号：１９）
5'-CCCGCTAGCGAATGCTGCAGTAGAGGTGAT-3'
Ａｓ−ＢｇｌＩＩ−Ｂ１（配列番号：２０）
5'-CCCAGATCTTTACAAGCCTGCACCAATACC-3'
【０１１１】
Ｂ２遺伝子増幅用
ＮｈｅＩ−Ｂ２（配列番号：２１）
5'-CCCGCTAGCTCGAGCTGTTGTTCCTCCGAG-3'
Ａｓ−ＢａｍＨＩ−Ｂ２（配列番号：２２）
5'-CCCGGATCCTTACAAGCCTGCTGAGATGCC-3'
【０１１２】
ＣＹＰ１０６Ａ２遺伝子増幅用
Ｓ−ＸｂａＩ−ＣＹＰ１０６  （配列番号：２３）
5'-CCCTCTAGAATGAAAGAAGTTATTGCAGTA-3'
Ａｓ−ＢｇｌＩＩ−ＣＹＰ１０６（配列番号：２４）
5'-CCCAGATCTTTACATGCGGCTTGCCTTAAG-3'
Ｓ−ｒｅｐａｉｒ−ＣＹＰ１０６（配列番号：２５）
5'-GATGATATCATCTCTGATCTATTGA-3'
Ａｓ−ｒｅｐａｉｒ−ＣＹＰ１０６（配列番号：２６）
5'-GACTTCAATAGATCAGAGATGATAT-3'
【０１１３】
ＣＹＰ１０２Ａ３遺伝子増幅用
Ｓ−ＮｈｅＩ−ＣＹＰ１０２（配列番号：２７）
5'-CCCGCTAGCATGAAACAGGCAAGCGCAATA-3'
Ａｓ−ＢｇｌＩＩ−ＣＹＰ１０２（配列番号：２８）
5'-CCCAGATCTCTACATTCCTGTCCAAACGTCTTT-3'
【０１１４】
シーケンス用
ｐＵＣ１８への組み込みの際、プロモーター領域確認用
Ｓ−Ｍ１３Ｆｗ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：２９）
5'-GGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAG-3'
【０１１５】
ｐＵＣ１８ではターミネーターを、ｐＵＣ７０２ではプロモーター領域確認用
ＡＳ−Ｍ１３Ｒｖ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：３０）
5'-GGATAACAATTTCACACAGG-3'
【０１１６】
ｐＵＣ７０２への組み込みの際、ターミネーター領域確認用
Ｒｖ−ｐＵＣ７０２（配列番号：３１）
5'-CCCGGGAGTAATCCTGGGATTAC-3'
【０１１７】
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ領域，Ｓｉｇｎａｌ領域確認用
ｐｒｏｍｏｔｅｒ−１（配列番号：３２）
5'-GCGCGGCGCCCCGCGGCTCGT-3'
Ａｓ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−２（配列番号：３３）
5'-ACCCTCGCCCGGCAGCGCGGT-3'
ｐｒｏｍｏｔｅｒ−３（配列番号：３４）
5'-TAGCCGCGGGCCACGACGTCC-3'
Ｆｗ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号：３５）
5'-CGTGCGCCGACTCCACGTCCGTGCC-3'
Ｆｗ−ｒｂｓ（配列番号：３６）
5'-CCCTCTCGGAGGCGGCCTGCCGTACC-3'
【０１１８】
ＧＦＰ遺伝子確認用
ｇｆｐ−１（配列番号：３７）
5'-CCATACGGAAAACTTACCCTGAA-3'
【０１１９】
ＣＹＰ１０６Ａ２遺伝子確認用
Ｐ４５０−１０６Ａ２（Ｓｅｑ１）（配列番号：３８）
5'-GGTGGATACCTTATTTCTTC-3'
【０１２０】
ＣＹＰ１０２Ａ３遺伝子確認用
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ３００）（配列番号：３９）
5'-GCCCACCGCATTTTGCTGCC-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ６００）（配列番号：４０）
5'-GAAAACGAAGCTGCAGTTCC-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ９００）（配列番号：４１）
5'-GTTAACGGATGACACGCCTG-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ１２００）（配列番号：４２）
5'-GCGCTTGTATTGGCATGCAG-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ１５００）（配列番号：４３）
5'-GGTGAACTGGCTGCTCAAGG-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ１８００）（配列番号：４４）
5'-CAGCGATTGGGGAAGGTGAC-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ２１００）（配列番号：４５）
5'-CATATCGGAATCCTGCCAAAG-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ２４００）（配列番号：４６）
5'-CAAAACGTCTTACCATGCTTG-3'
Ｐ４５０−１０２Ａ３（Ｓｅｑ２７００）（配列番号：４７）
5'-CGCCTATGAT
【０１２１】
＜実験方法＞
［遺伝子における基本操作］
現在、目的とするＤＮＡの増幅にはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が一般的に用いられている。ＰＣＲ法は、極微量のＤＮＡを鋳型とし、わずか数時間で目的とする配列のみを特異的に１００万倍以上にも増幅することができる画期的な方法である。現在では、操作の簡便さから、基礎研究、臨床検査、犯罪捜査にいたるまで多彩な分野で応用されている。
【０１２２】
ＤＮＡの増幅（ＰＣＲ）
ＰＣＲ法は試験管内で目的のＤＮＡ断片を指数関数的に増幅する方法であり、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いることで初めて可能になった技術である。ＰＣＲ反応は３つのステップを１サイクルとして、これを繰り返すことでＤＮＡを増幅する。この反応に必要なものは、鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）となるＤＮＡ、増幅したい遺伝子部分の５’末端にあたる主鎖、副鎖それぞれの短いＤＮＡ断片（Ｐｒｉｍｅｒ）、デオキシリボヌクレオチド類、塩と耐熱性のＤＮＡポリメラーゼである。
【０１２３】
最初のステップで９５℃前後の熱をかけることで２本鎖になっている鋳型ＤＮＡを１本鎖状態（Ｄｅｎａｔｕｒｅ）にし、プライマーが鋳型ＤＮＡ中の設定している配列部分に結合できる状態にする。次に温度を下げることで、鋳型の相補的配列部分にプライマーが結合し、部分的に２本鎖状態を形成する（アニ−ル（ａｎｎｅａｌｉｎｇ））。最後に鋳型に結合したプライマーを始点にして耐熱性ポリメラーゼがＤＮＡを５’→３’方向に合成し、ＤＮＡを伸張（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）させる。
【０１２４】
以上のような単純なサイクルを繰り返すことで、目的のＤＮＡ断片を増幅させることが可能になるが、それぞれの条件は一義的に決定されているものではなく、目的に応じて最適な条件を決定する必要がある。
【０１２５】
ＰＣＲ法の検討項目
ＰＣＲにおけるサイクルは基本的には先にもふれたように、熱変性・アニーリング・伸長反応の３段階からなっており、そのうち独自に設定する必要があるのはアニーリング温度、及び各ステップにかける時間、サイクル数である。
【０１２６】
アニーリング温度は通常各プライマーのＴｍを参考にして決定する。２つのプライマーのＴｍが大きく異なる場合は、低い方のＴｍ付近に設定する。ステップにかける時間・サイクルはまず、ポリメラーゼの説明書に従う。また、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅは増幅断片１ｍｉｎ／１ｋｂｐで行う。
【０１２７】
Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
２本鎖ＤＮＡの場合、塩基の荷電は相補鎖間の水素結合で互いに打ち消しあっているため、分子全体としてはリン酸基のマイナスチャージのみが主となる。また、このリン酸基の個数（荷電）はヌクレオチド数（ＤＮＡの分子量）に比例するため、全てのＤＮＡ分子は質量あたり一定の力で陽極に引かれることになる。さらに、二重らせん構造を取っているＤＮＡは塩基配列にかかわらず同じ線状分子の形をしており、立体構造の泳動度にほとんど影響を与えない。すなわち、唯一泳動度に影響を与えるのが分子の大きさ（長さ）ということになる。分子量が大きい長い分子ほど泳動移動度が遅くなる。ＤＮＡ鎖の長さのみに依存した原理を用いて、ＤＮＡを分離する。
【０１２８】
１）アガロースを秤量して三角フラスコに入れ、１×ＴＡＥを加えて電子レンジにかけ、アガロースを溶かす。
２）アガロースが溶けて均一になった溶液が５０℃前後ぐらいまで冷えたらエチジウムブロマイド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）をゲル１００ｍｌあたり５μｌの割合で加えよく混合する。
３）ゲル成型トレイにゲルを流し込み、コームを刺す。
４）ゲルを室温で３０ｍｉｎほど放置し、十分に冷えて固まったら、コームを抜いてゲルを電気泳動槽にセットする。
５）ゲルの上面くらいまで電気泳動バッファー（１×ＴＡＥ）を満たす。
６）サンプルＤＮＡに対して、１／５ｖｏｌｕｍｅの６×ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｙｅを加える。
７）ゲルの穴にサンプルを静かに入れる。
８）ゲルの穴にＭａｒｋｅｒ２を入れる。
Ｍａｒｋｅｒ２とは、λ（ｄ８５７Ｓａｍ７）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩでｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
したもので、高〜中分子領域のＤＮＡ分子量マーカーとして使われる。
９）ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）がゲルの１／２か２／３くらい流れたところ（約２０ｍｉｎ）で電気泳動を止める。
１０）トランスイルミネーターにより、ＵＶを照射する（波長３０２ｎｍ）。
【０１２９】
Ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＰＣＲやＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎなどの後、目的のサイズのＤＮＡ断片のみを回収する方法である。
【０１３０】
１）アガロース電気泳動、エチジウムブロマイド染色。
２）ＵＶ照射下（Ｌｏｎｇ  ｗａｖｅ）で目的のバンドをなるべく小さくなるようにメスで切り出す。
３）切り出したゲルを細かくスライスし、１．５ｍｌのチューブに移す。
４）４００μｌ吸着液を加え、ゲルが完全に溶解するまで時々撹拌しながら放置。※溶けにくい場合、５５℃で放置する。
５）３０μｌの磁性ビーズを加え時々ｖｏｒｔｅｘしながら２ｍｉｎ静置。
６）Ｂ／Ｆ分離し、６００μｌの洗浄液を加え１０ｓｅｃ，ｖｏｒｔｅｘする。
７）Ｂ／Ｆ分離し、１ｍｌ  ７５％  ｅｔｈａｎｏｌを加え、１０ｓｅｃ，ｖｏｒｔｅｘする。
８）Ｂ／Ｆ分離し、スピンダウン、完全に上清を除去する。
※チューブの蓋をあけ、５５℃，５ｍｉｎ静置する。
９）２５〜１００μｌのＴ．Ｅ．を加え１０ｓｅｃ，ｖｏｒｔｅｘする。
１０）２ｍｉｎ放置し、Ｂ／Ｆ分離し上清回収する。
【０１３１】
Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
核酸を精製、濃縮するために用いる最も簡単な方法で、高分子コロイドであるＤＮＡをアルコールと塩で凝縮させて沈殿を得る。使用するアルコールの種類により、エタノール沈殿、イソプロピルアルコール沈殿などがある。余分な塩類や低分子成分は沈殿しないため、ＤＮＡの濃縮やバッファーの置換を容易に行うことが可能である。また、エタノール沈殿の場合にはＲＮＡも共沈するが、高分子アルコールのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてＤＮＡを沈殿させた場合（ＰＥＧ沈）、ＲＮＡの共沈はほとんど起こらないので、シークエンス用のプラスミドのようにＲＮＡを取り除く必要がある場合には、ＰＥＧ沈が用いられることが多い。
【０１３２】
Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
アルコール沈殿の中で最も一般的な方法である。冷却時間に比例してＤＮＡの収率が高くなる。
【０１３３】
１）Ｓａｍｐｌｅに約１／１０倍量の３Ｍ  ＮａＯＡｃ（Ａｌｋａｌｉ  Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ後のようにＳａｍｐｌｅに塩が含まれている場合は加えなくてよい）と２〜２．５倍量の低温１００％  Ｅｔｈａｎｏｌを加え、Ｖｏｌｔｅｘする。
２）−２０℃で１ｈまたは、−８５℃で２０ｍｉｎ以上冷却し、４℃，１３０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心して、ＤＮＡを沈殿させる。
３）上清を慎重に取り除き、７０％  Ｅｔｈａｎｏｌを加えてＶｏｌｔｅｘし、４℃，１３０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心して洗浄する。（チューブ壁面に７０％  Ｅｔｈａｎｏｌを流し入れることを２回ほど行うだけの洗浄方法もある。）
４）減圧乾燥機で完全に乾燥させる。
５）ＴＥもしくはＤＷを適量加え、溶解させる。
【０１３４】
Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
アルコールを加える量が少量でよいので、サンプル量が多い場合に適している。１ｈ以上の冷却でも収率は変わらないので、エタノール沈殿に比べて短時間の処理で済む。
【０１３５】
１）Ｓａｍｐｌｅに約１／１０倍量の３Ｍ  ＮａＯＡｃ（アルコール沈殿同様、Ｓａｍｐｌｅに塩が含まれている場合は加えなくてよい）と等量の１００％  Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌを加え、Ｖｏｌｔｅｘする。
２）以下、エタノール沈殿と同様。
【０１３６】
ＰＥＧ  Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ
高分子アルコールであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＤＮＡの水和水を奪うことで凝集を促進しＤＮＡ分子を沈殿させる。※ＲＮＡの除去に行う。
【０１３７】
１）Ｓａｍｐｌｅに等量のＰＥＧ６０００  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、Ｖｏｌｔｅｘする。
２）４℃で１ｈ冷却する。
３）４℃，１３０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心操作し、ＤＮＡを沈殿させる。
４）以下、エタノール沈殿と同様。
【０１３８】
Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
制限酵素やエンドヌクレアーゼの一種であり、ＤＮＡの特定の配列を認識してその部位を切断する酵素である。この性質を利用することによって、任意のＤＮＡの配列の中から目的とする配列のみを切り出したり、別のＤＮＡに組み込んだりすることが可能となる。さらに、目的とするＤＮＡ配列が正確な位置に組み込まれているかどうか確かめるためにも用いられる。
【０１３９】
１）Ｓａｍｐｌｅがプラスミド状の場合、９８℃，３ｍｉｎ熱を加え、氷上にて冷却する。
２）Ｓａｍｐｌｅに制限酵素（全反応液体積の５％以内）、１０×Ｂｕｆｆｅｒ、任意のＤ．Ｗ．を加える。
３）３７℃で３〜６ｈ反応させる。
【０１４０】
Ｌｉｇａｔｉｏｎ
制限酵素処理して線状化したＶｅｃｔｏｒとＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔをリン酸ジエステル結合させる方法である。
【０１４１】
１）組み込みたいＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔとＶｅｃｔｏｒをＤＮＡ濃度に応じ、（３：１〜５０：１）で混合し、Ｓａｍｐｌｅを作成する。
２）ＳａｍｐｌｅにＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ）を半量〜等量混合する。
３）１６℃で６ｈ〜一晩反応させる。
【０１４２】
Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌ
大腸菌を宿主として遺伝子の形質転換を行う際、大腸菌が目的のｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを取り込みやすいようにするために、細胞壁をコンピテント化する。コンピテント細胞は生育性を保存するためにグリセロールとともに−８０℃で凍らせることができ、数年間に渡って保存することが可能である。この方法はＤＨ−１株に最適化されているが、ほとんどの大腸菌に適用できる。この方法により大腸菌Ｎｏｖａ  Ｂｌｕｅ，ＤＨ−５α株のコンピテントも作成する。
【０１４３】
作業はすべてクリーンベンチ内で行い、コンタミネーションに注意する。
１）７０％  Ｅｔｈａｎｏｌで滅菌したスプレッダーを用いて、コンピテント化したい大腸菌５０μｌをＬＢプレート（抗生物質なし）に均一に塗り広げる。
２）３７℃で一晩培養する。
３）ＬＢ培地（抗生物質なし）もしくはＴｆ培地５０ｍｌに大腸菌１ｌｏｏｐを植菌し、３７℃でさらに一晩培養する（Ｍｉｎｉ  ｃｕｌｔｕｒｅ）。
４）ＬＢ培地（抗生物質なし）４００ｍｌに培養液２０ｍｌを加え、ＯＤ６００＝０．５のなるまで約３ｈ、３７℃にて培養する（Ｌａｒｇｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）。
５）氷上で５ｍｉｎ冷却する。
６）４℃，４０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心し、上清を取り除く。
７）集菌した菌体に、氷冷したＴｆｂ−１を８０ｍｌを加え、ピペッティングにて懸濁する。
８）５〜７と同様、５ｍｉｎ冷却、遠心し、上清を除いた後にＴｆｂ−２を１６ｍｌを加えてピペッティングにて懸濁する。
９）氷上で１５ｍｉｎ冷却した後、手早く２００μｌずつに分注する。
１０）ディープフリーザー（−８５℃）で保存する。
【０１４４】
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）とは、ｐｌａｓｍｉｄなどの適当なｖｅｃｔｏｒを用いて大腸菌や培養細胞に新たな遺伝情報を導入する方法である。現在までに、より応用範囲の広いｐｌａｓｍｉｄを用いた形質転換の系が研究されており、現在では大腸菌系での形質転換はもっとも広く用いられている方法である。本研究では遺伝子クローニング用に大腸菌ＤＨ５−α株を使用した。
【０１４５】
１）Ｐｌａｓｍｉｄ  ２．０μｌ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ後は５μｌ）にｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  １００μｌを加え、３０ｍｉｎ氷冷する。
２）４２℃で４５ｓｅｃ熱処理（Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）をし、５ｍｉｎ以上氷冷する。
３）ＬＢ溶液（Ａｍｐなし）を１ｍｌ加え、３７℃で１ｈインキュベートする。
４）３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心し、上清を取り除く。
５）集菌した菌体をピペッティングにて懸濁させ、７０％  Ｅｔｈａｎｏｌで滅菌したスプレッダーを用いて、ＬＢプレート（Ａｍｐ入り）に大腸菌の形質転換体を均一に塗り広げる。
６）３７℃で一晩静置培養する。
【０１４６】
Ａｌｋａｌｉ−ＳＤＳ
プラスミド増幅のための宿主となる大腸菌には、プラスミド以外のＤＮＡとしてゲノムＤＮＡや種々のＲＮＡ、さらに菌体の構成成分としてのタンパク質や脂質などが含まれている。アルカリ法は、これらの混合物からプラスミドＤＮＡを精製する方法である。
【０１４７】
操作方法
１）オートクレーブ済みの爪楊枝でシングルコロニーをすくい上げ、ＬＢ培地（Ａｍｐ入り）３ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養する。
２）爪楊枝をピンセットで取り除き、３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心して菌を沈殿させ、上清を捨てる。
３）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを１００μｌ加えてＶｏｒｔｅｘし、菌を懸濁する。
４）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩを２００μｌ（４Ｎ水酸化ナトリウム１００μｌ、１％  ＳＤＳ  １００μｌ）を加え、軽く攪拌する。
５）Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩを２００μｌ加えて軽く攪拌し、チューブに移す。
６）クロロホルム５０μｌを加えて、Ｖｏｒｔｅｘした後に、４℃，１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心する。
７）沈殿が入らないように注意しながら、上層（水相）を回収する（境界に存在する白い沈殿物はタンパク質の変性したものであるので極力混入を防ぐ）。
【０１４８】
ＲＮａｓｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
プラスミド抽出の際に細胞からＤＮＡを抽出すると、細胞中に多量に存在するＲＮＡが混入してしまう。そこでＳｅｑｕｅｎｃｅ反応のようにＲＮＡの混入が悪影響を及ぼす場合には、ＲＮＡを除去する必要があるため、ＲＮａｓｅ処理を施し、ＲＮＡを分解する。
【０１４９】
１）ＳａｍｐｌｅにＲ１０を１／５００倍量程度加える。
２）３７℃で３０ｍｉｎ〜６ｈ静置する。
【０１５０】
Ａｌｋａｌｉ  Ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ
アルカリにより、２本鎖ＤＮＡを１本鎖に変性させる方法である。この方法により、ＤＮＡにニックが入りやすくなり、ニックが入ったＤＮＡ鎖はアルカリ変性によって直鎖状ＤＮＡになり、ニックの入らなかったＤＮＡ鎖はそのまま環状ＤＮＡになる。ここで、アニーリングを行うと、ほとんどの直鎖状ＤＮＡは直鎖同士または環上１本鎖ＤＮＡと再会合するが、直鎖同士の再会合があるおかげで、一部の環状１本鎖ＤＮＡは再会合せずに残る。残った環状１本鎖ＤＮＡは再会合せずに残る。残った環状１本鎖ＤＮＡには確率的に＋鎖と−鎖が等モルずつ含まれ再会合しようとするが、立体障害のため完全に２本鎖に戻ることはできない。こうして残った環状１本鎖ＤＮＡが鋳型となり、シークエンス反応が進みやすくなる。
【０１５１】
１）マイクロチューブに
ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ                ５μｌ
２Ｎ  ＮａＯＨ                        ２μｌ
２ｍＭ  ＥＤＴＡ                      ２μｌ
Ｄ．Ｗ．                              １１μｌ
Ｔｏｔａｌ                            ２０μｌを調製する。
２）よく混ぜ合わせて、３７℃で５ｍｉｎインキュベートする。
３）エタノール沈殿を行い、乾燥させる。
【０１５２】
ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
目的のＤＮＡ断片の両側に位置する配列に対するｐｒｉｍｅｒからＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて相補鎖を合成することにより、塩基配列を調べる方法。合成の際にその原料としてヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ；ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）を反応液中に入れるが、そのときにそれぞれのアナログである蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ；ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ，ｄｄＴＴＰ）を混合しておく。ＤＮＡ合成の際に、このジデオキシヌクレオチドがある確率で取り込まれると、そこで合成がストップし、様々な長さの合成産物ができる。それらの断片を１塩基分の長さの違いも区別できる変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、これらを、キャピラリー電気泳動を行うことで異なる分子量を会席することが可能となる。なお本研究では、蛍光自動シーケンサーにＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０を用いた。
【０１５３】
１）シーケンサー用のＰＣＲの反応液を混合し、以下の条件でＰＣＲを行う。プライマーは解析箇所にあわせて、以下の表のように変更する。
【０１５４】
反応組成
Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ              ０．４μｌ
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ        ３．０μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ                          ４．０μｌ
ＤＭＳＯ                              １．０μｌ
Ｄ．Ｗ．                              ９．６μｌ
Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（Ｖｅｒ１．１ｏｒ３．１）（５ｐｍｏｌ／μｌ）                ２．０μｌ
Ｔｏｔａｌ                            ２０μｌ
【０１５５】
ＰＣＲ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ            ９８℃・５ｍｉｎ
↓
Ｄｅｎａｔｕｒｅ                      ９８℃・３０ｓｅｃ
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ                    ５０℃・１５ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ                    ６０℃・４ｍｉｎ                      ＊２５ｃｙｃｌｅ繰り返す
↓
４℃
【０１５６】
２）３Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ  ２μｌ，１００％  Ｅｔｈａｎｏｌ  ５０μｌを加え、室温で１５ｍｉｎ放置する。なお、これ以降の操作は全て遮光して行う。
３）１５０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ以上遠心する。
４）ピペットで上清を除去し、７０％  Ｅｔｈａｎｏｌ  ２００μｌを加える。
５）１５０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ遠心する。
６）ピペットで上清を除去し、減圧乾燥する。
７）Ｈｉ−Ｄｉホルミアミドを２０μｌ加える。
８）９５℃で２ｍｉｎ加熱した後、氷上で５ｍｉｎ静置する。
９）シーケンサー専用のチューブに移し、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０にて遺伝子配列解析を行う。
【０１５７】
［放線菌の形質転換とタンパク質の発現］
放線菌のプロトプラスト調整
あらかじめ用意する物
・コットンを詰めてオートクレーブ、乾熱滅菌（１５０℃，２ｈ）したシリンジ（２０ｍｌ）
・２５０ｍｌ遠心管を培養本数分、１０ｍｉｎ  ＵＶ殺菌しておく
・１０．３％スクロース溶液１００ｍｌ×培養本数
・Ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液１５ｍｌ×培養本数
・Ｐ−ｂｕｆｆｅｒ約２０ｍｌ以上×培養本数
【０１５８】
基本的に遠心操作、培養機以外での操作はクリーンベンチ内で行う。
１）ＹＥＭＥ培地１００ｍｌ＋ステンレスコイルを坂口フラスコへ入れ、オートクレーブ。
２）放線菌をＴＳＢ培地３ｍｌを入れオートクレーブにかけた試験管にて２８℃，２００ｒｐｍで２〜３日振盪培養（前培養）。
３）前培養した菌をＹＥＭＥ培地へ植菌し、２８℃，２００ｒｐｍで３０ｈ振盪培養。
４）遠心管へ移し、８℃，３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨てる。
５）１０．３％スクロース溶液５０ｍｌ加え懸濁し、８℃，３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ  遠心分離し、上澄みを捨てる（これを２回行う）。
６）Ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液を１５ｍｌ加え、懸濁し、３０℃，６０ｍｉｎ以上頻繁に懸濁させながら静置。
７）Ｐ−ｂｕｆｆｅｒ  １５ｍｌを加えてよく懸濁。
８）コットンを詰めてあらかじめオートクレーブにかけておいたシリンジを使い、濾過。
９）８℃，３０００ｒｐｍ，７ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、Ｐ−ｂｕｆｆｅｒをおよそ１５００μｌ加える。（濾過後の見た目の菌体量によってある程度調整）
１０）５０μｌずつ分注する。
１１）ディープフリーザー（−８５℃）で冷凍保存。
【０１５９】
放線菌の形質転換（ＰＥＧ法）及び、抗生物質による選択
あらかじめ用意する物
・１５ｍｌコーニングを培養本数分ＵＶ殺菌しておく
・Ｔ−ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌ×培養本数
・Ｐ−ｂｕｆｆｅｒ  ５．５ｍｌ×培養本数
・Ｒ２ＹＥプレートを作り、２〜４ｈクリーンベンチ内で乾燥させ、水分３０％ほど減らしておく
【０１６０】
基本的に遠心操作、インキュベーター以外での操作はクリーンベンチ内で行う
１）プロトプラストの保存試料を氷上で解凍。
２）プラスミド溶液１０μｌとＴ−ｂｕｆｆｅｒ２００μｌ加え、懸濁。
３）Ｒ２ＹＥプレートに１００μｌずつ蒔いて、３０℃で１〜２日培養。
４）０．７％ソフトアガロース（電気泳動アガロースＬＥクラッシクタイプをＤ．Ｗ．に加えてオートクレーブしたもの）に終濃度５００μｇ／ｍｌとなるようにチオストレプトンを添加し、３ｍｌをプレートに上層し、３０℃で５日インキュベート。
【０１６１】
形質転換体の培養
１）上層したゲルを突き破ったコロニーを白金耳で取り、チオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）を加えた３  ｍｌのＴＳＢ培地（１．７％  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ，０．３％  ｏｆ  ｐａｐａｉｃ  ｄｉｇｅｓｔ  ｏｆ  ｓｏｙｂｅａｎ  ｍｅａｌ，０．２５％  ｏｆ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ，０．５％  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，０．２５％ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）にて２８℃、２００ｒｐｍで培養を２〜３日行う。
２）種培養液３ｍｌを１００ｍｌのチオストレプトン（５μｇ／ｍｌ）を加えたＴＳＢ培地（坂口フラスコ）へ加え、２８℃、２００ｒｐｍで培養する。
※培養液は２４ｈおきにサンプリングする。サンプルは菌体と培養液を分けておき、培養液にはプロテアーゼインヒビターを１／１００ｖｏｌ加え４℃にて保管する。
【０１６２】
［タンパク質の操作及び、評価］
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）は、目的のタンパク質の発現を確認する最も簡単な方法である。ＳＤＳを用いて、タンパク質を変性させると同時にして負電荷を帯びさせ、ポリアクリルアミドゲル中で泳動すると、タンパク質は陰極から陽極に移動する。分子量が小さいものほど移動距離は長くなり、大きいものほど移動距離は短くなるので、分子量マーカーと比較することでおよその分子量が推定できる。また、ゲル中のアクリルアミドが高濃度の場合は、広い範囲の分子量をカバーできるが、高分子領域の分解能は低下する。低濃度の場合は、低分子量にタンパク質を分離できないが、高分子領域の分解能は向上する。
【０１６３】
操作方法
分析するタンパク質ｓａｍｐｌｅの調整
１）２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（２−ＭＥ）と２×ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを１：９（＝１００μｌ：９００μｌ）で混合する。
２）分析するｓａｍｐｌｅタンパク質溶液と１）で作ったものを１：１（＝１５μｌ：１５μｌ）で混ぜる。
３）９５℃，３ｍｉｎ熱変性後、５ｍｉｎ以上氷冷する。
【０１６４】
ゲルの作製
１）電気泳動用平板型ガラス、コーム、パッキンを７０％Ｅｔｈａｎｏｌで念入りに拭き組み立てる。
２）分離ゲル（Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｇｅｌ）を以下の組成で調整する。ただし、１０％  ＡＰＳとＴＥＭＥＤを混合することで重合が開始するので、１０％  ＡＰＳは重合開始直前に加える。
【０１６５】
【表１４】
2008193953.tif 000018
【０１６６】
３）すばやくかき混ぜた後、分離ゲルをゲル成型板に半分程度まで流し込み、その上に滅菌用の７０％  Ｅｔｈａｎｏｌを吹きかける。
４）次に、濃縮ゲル（Ｓｔａｃｋｉｎｇ  Ｇｅｌ）を以下の組成で調整する。Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｇｅｌと同様、１０％  ＡＰＳは重合開始直前に加える。
【０１６７】
【表１５】
2008193953.tif 000019
【０１６８】
５）分離ゲルが固まったら、エタノールを取り除いた後、濃縮ゲルを流し込み、その上に気泡が入らないようにコームを差し込む。
【０１６９】
泳動
１）１×ＳＤＳ−Ｂｕｆｆｅｒを泳動槽に２ｃｍほど注入し、ゲル板の底に空気が入らないように注意しながら、泳動槽にゲル板をセットする。
２）ゲル板の内側を１×ＳＤＳ−Ｂｕｆｆｅｒで満たし、ゲル穴を壊さないようにコームを静かに抜く。
３）マイクロシリンジを用いて、Ｓａｍｐｌｅを２０μｌずつゲル穴にａｐｐｌｙする。
４）ＳＤＳ−Ｍａｒｋｅｒ（低分子量マーカー）を５μｌ  ａｐｐｌｙする。
５）電源装置を１０００Ｖ、２０ｍＡ／ｐｌａｔｅにセットし、定電流泳動を行う。
６）２．５ｈ程度行い、青色のラインがＧｅｌの下端近くまで達したら泳動を終了する。
【０１７０】
ＣＢＢ染色によるタンパク質の検出
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後ゲルを取り出し、不要な部分を切り捨てた後、容器に移し、ゲルが完全に浸るくらいＣＢＢ色素溶液を入れ、３０ｍｉｎほど染色する。
２）ＣＢＢ色素溶液を保管容器に戻し、脱染液をゲルが浸るくらいに入れ、適度な染色像が得られるまで脱染する。
【０１７１】
銀染色によるタンパク質の検出
１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後ゲルを取り出し、不要な部分を切り捨てた後、容器に移し、ゲルが完全に浸るくらい固定液Ｉを入れ、１０ｍｉｎ以上（１ｈ程度が好ましい）浸す。
※固定液Ｉ組成
Ｍｅｔｈａｎｏｌ                      ２００ｍｌ
酢酸                                  ４０ｍｌ
Ｄ．Ｗ．                              １６０ｍｌ
【０１７２】
２）固定液Ｉを捨て、固定液ＩＩにて１０ｍｉｎ以上ゲルを浸す。
※固定液ＩＩ組成
固定液Ｉ                              ４７．５ｍｌ
固定原液                              ２．５ｍｌ
【０１７３】
３）固定液ＩＩを捨て、増感液にて１０ｍｉｎ以上ゲルを浸す。
※増感液組成
増感原液                              ２．５ｍｌ
Ｍｅｔｈａｎｏｌ                      ２３．７５ｍｌ
Ｄ．Ｗ．                              ２３．７５ｍｌ
【０１７４】
４）増感液を捨て、多めの蒸留水にて１０ｍｉｎ以上ゲルを浸す。
５）洗浄中に次の染色液を作成する。
染色液Ａ                              ２．５ｍｌ
染色液Ｂ                              ２．５ｍｌ
蒸留水                                ４５ｍｌ
【０１７５】
６）蒸留水を捨て、染色液にて正確に１５ｍｉｎゲルを浸す。
７）染色液を専用の廃液入れに捨てる。一度は蒸留水ですすぐ。
８）蒸留水にて洗浄する。（５ｍｉｎを３回繰り返す）。
９）現像液にてゲルを浸す。これにより染色が始まる。
※現像液組成
現像原液                              ５ｍｌ
Ｄ．Ｗ．                              ４７．５ｍｌ
【０１７６】
１０）停止液を準備し、現像の程度に合わせて、容器に２．５ｍｌ加える。これにより染色は停止する。そのまま１０ｍｉｎ程度ゲルを浸す。
１１）容器内の溶液を捨て、蒸留水にて洗浄する。
【０１７７】
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、タンパク質をメンブレンに転写し、抗体を用いて特定のタンパク質を検出する方法である。目的のタンパク質に対する抗体が入手できれば、この方法で検出することができる。
【０１７８】
抗体にはポリクローナル抗体とモノクローナル抗体があり、ポリクローナル抗体を作製するには、ウサギなどに抗原を注射して免疫し、抗体のできたところを見計らって採血して血清（抗血清）をとる。Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇにはこれをそのまま希釈して用いる場合もあるし、また抗原カラムなどを用いて特異的抗体を精製してから用いる場合もある。
【０１７９】
タンパク質のメンブレンへの転写
準備するもの
セミドライブロッティング装置
電源
プラスチックケース
振とう機
濾紙６枚
ＰＶＤＦ膜
ＴＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒ
１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒ
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ
【０１８０】
１）７×１０ｃｍ程の大きさの濾紙を８枚（×ゲルの枚数分）５ｍｉｎ程度１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒに浸す。
２）７×１０ｃｍ程のＰＶＤＦメンブレンをメタノールに５ｍｉｎ浸した後、濾紙の入っている容器に移し、５ｍｉｎ程度１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒに浸す。ニトロセルロースメンブレンの場合は、メタノールに浸けないでそのまま１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒに浸す。※メンブレンには素手で触らないようにする。
３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを濾紙とメンブレンの入っている容器に移し、１ｍｉｎ程度１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒに浸す。
４）予め１×Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｂｕｆｆｅｒで濡らした装置に気泡が入らないように注意しながら陽極側から濾紙４枚、メンブレン、ゲル、濾紙４枚を重ねていく。
５）電源装置を１５０Ｖ、７０ｍＡ／ゲル１枚当たり（定電流）にセットし、４５ｍｉｎ転写する。
６）メンブレンをＢｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒに３０ｍｉｎ以上振とうする。ＳＤＳ−Ｇｅｌは染色を行う。
７）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを捨て、ＴＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒをメンブレンが完全に浸るくらいに入れて、５ｍｉｎ振とうして、３回程度洗浄する。
【０１８１】
抗体との反応
準備するもの
器具類
プラスチックケース
振とう機
【０１８２】
【表１６】
2008193953.tif 000020
【０１８３】
１）ＴＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒを捨て、メンブレンをナイロンバックに入れ、３辺をポリシーラーで閉じる。
２）バックに冷却しておいた一次抗体を入れ、残り１辺を閉じる。
３）軽く撹拌した後、４℃で１ｈｒ以上反応させる。（通常一晩反応させる）
４）一次抗体を捨て、ＴＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒをメンブレンが完全に浸るくらいに入れて、５ｍｉｎ振とうして、３回程度洗浄する。
５）再び、メンブレンをナイロンバックに入れ、３辺をポリシーラーで閉じる。
６）バックに冷却しておいた二次抗体を入れ、残り１辺を閉じる。
７）軽く撹拌した後、４℃で１ｈｒ以上反応させる。
８）二次抗体を捨て、ＴＢＳ−Ｔ  Ｂｕｆｆｅｒをメンブレンが完全に浸るくらいに入れて、５ｍｉｎ振とうして、３回程度洗浄する。
【０１８４】
アルカリホスファターゼ反応による抗原の検出
準備するもの
Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒ
ＮＢＴ
ＢＣＩＰ
【０１８５】
１）発色液を作製する（メンブレン１枚に対して５ｍｌ）。
２）メンブレンを容器に入れ、発色液を加える。
３）バンドが見えてきたら、適当なところで発色液を捨て、Ｈ２Ｏで洗う。
４）ドライヤーで乾燥させる。
【０１８６】
［タンパク質の精製］
透析
試料中のバッファーを交換したり、脱塩したりする最も一般的な方法が透析とゲルろ過である。透析は非常に薄い（２０〜１００μｍ）再生セルロース製多孔性膜を用いて自然拡散によって外液と内液の間で低分子の交換を行う。短時間の透析には、できるだけ細長い（表面積が大きい）ものを選ぶ。
【０１８７】
透析膜
Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｉｚｅ２０
Ｗａｋｏ社製５４６−０００５１（小ボリューム）
Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｔｕｂｉｎｇ
三光純薬製  ＵＣ３６−３２−１００（大ボリューム）
【０１８８】
Ｂｕｆｆｅｒ
２０  ｍＭ  Ａｃｅｔａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）
２０  ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
【０１８９】
１）市販の透析膜には保存剤としてグリセロールが含まれているので、ビーカーに蒸留水と透析膜を入れ、約１０ｍｉｎ煮沸して除き、蒸留水で洗浄する。
２）透析膜の底を縛り、水を入れ、孔が開いていないかを確認し、水を捨てる。
３）上端よりピペットを用いて試料を入れる（＊５ｍｌ  ｏｒ  ５０ｍｌ）。
４）上端の方を数ｃｍ残して縛り、ビーカーの壁面にぶら下げる。
５）４  ℃のバッファー１Ｌを加え、４℃、スターラーの上で撹拌する。
６）４  ｈ以上後、一度外液のバッファーを交換して、４ｈ以上撹拌を続ける。
※５０ｍｌで行う場合数回バッファーを交換する。
７）透析が終わったら、上端よりコーニングに試料を移す。
【０１９０】
＊ＰＬＤの透析には培養上清５ｍｌを用い、２０ｍＭ  ＡｃｅｔａｔｅＢｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．６）に置換する。
＊ｇｌｏｂｉｎ，Ｐ４５０の透析には培養上清５０ｍｌを用い、２０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）に置換する。
【０１９１】
イオン交換クロマトグラフィー
原理
イオン交換クロマトグラフィーは、一般的な精製方法のひとつで、可溶性タンパク質のほとんどすべてに対応することができる。タンパク質の総電荷は等電点より高いｐＨでは負となり、等電点より低いｐＨでは正となる。一方、イオン交換クロマトグラフィーに用いる担体（ゲル）には、正に荷電した陰イオン交換体と負に荷電した陽イオン交換体がある。負の総電荷をもつタンパク質は陰イオン交換体に、正の総電荷をもつタンパク質は陽イオン交換体に結合することができる。結合したタンパク質の溶出には、溶出バッファーのイオン強度（塩濃度）を増大させる方法が一般的に用いられている。イオン強度（塩濃度）の増大はイオン交換体に結合する対イオンを増加させる。対イオンがタンパク質に代わってイオン交換体に結合し、結合の弱いタンパク質から順番に遊離し溶出される。このように、イオン交換クロマトグラフィーはタンパク質のもつ総電荷と解離基との静電的な結合（イオン結合）を利用して行うクロマトグラフィーである。
【０１９２】
装置
ＧＲＡＤＩＥＮＴ  ＰＵＭＰ                                                  ＢＩＯ−ＲＡＤ
ＥＣＯＮＯ  ＵＶ  ＭＯＮＩＴＯＲ                                            ＢＩＯ−ＲＡＤ
ＭＯＤＥＬ  ２１１０  ＦＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＯＬＬＥＣＴＯＲ                  ＢＩＯ−ＲＡＤ
【０１９３】
ｇｌｏｂｉｎ，Ｐ４５０の精製
Ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＴｒａｐＴＭＱ  ＨＰ（１ｍｌ）１７−１１５３−０１  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ
開始緩衝液Ａ：２０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
溶出緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）＋１．０Ｍ  ＮａＣｌ
【０１９４】
【表１７】
2008193953.tif 000021
【０１９５】
操作方法
１）ＵＶレコーダーの波長を２８０ｎｍにセットする。
２）開始緩衝液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで流す。充填層体積の５倍量（１５ｍｉｎ）の開始緩衝液を流してカラムを平衡化する。
３）透析によって塩が取り除かれ、開始バッファーのｐＨに合わせられた試料（５〜８）を流速１ｍｌ／ｍｉｎで２回流し、カラムに結合させる。
４）開始緩衝液を流速１ｍｌ／ｍｉｎで１０分流し、カラムを洗浄する。
５）コントローラーでＮａＣｌ濃度勾配をつくるように設定する（図４）。
６）溶出の開始と同時に、フラクションコレクターをスタートさせる。
７）溶液を２ｍｌチューブで分画し、各フラクションについて活性測定、純度測定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行う。
【０１９６】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ
Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄは、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｇ−２５０という色素がタンパク質の塩基性および芳香族アミノ酸の側鎖と結合し、その結果吸収のピークが４６５  ｎｍから５９５  ｎｍへとシフトすることを利用した方法である。他のタンパク質定量法と比較して、簡単、迅速、高感度（０．０２〜０．１ｍｇ／ｍｌ）で、還元剤やＥＤＴＡの影響をほとんど受けない。スタンダード、バッファー（ｂｌａｎｋ）、目的のタンパク質溶液を測定し、検量線からタンパク質濃度を算出する。スタンダードとして、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を用いる。
【０１９７】
１）サンプル５０μｌにＤ．Ｗ．７５０μｌを加える。
２）ｋｉｄ２００μｌを加え、よくｖｏｒｔｅｘし、３７℃で１５ｍｉｎ放置する。
３）波長５９５ｎｍでの吸光度を測定し、検量線からタンパク質濃度を定量する。
【０１９８】
＜実施例１：放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６で外来タンパク質分泌発現ベクターの構築＞
［ベクター構築で用いる遺伝子組み換え手順の概略］
１）ＰＣＲ及び、２ｎｄＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅
２）ＰＣＲ産物の全量をアガロース電気泳動し、Ｇｅｌ精製キットを用いてＤＮＡインサートを単離する。もしくはエタノール沈殿を行い、Ｂｕｆｆｅｒなどを除去する。
３）ＤＮＡインサートはｐｒｉｍｅｒに挿入した任意の制限酵素サイトを持つので、それに対応する制限酵素でベクターも処理する。
４）Ｇｅｌ精製キットを用いてＤＮＡ断片を単離する。もしくは、エタノール沈殿にてＢｕｆｆｅｒ、制限酵素を除去する。
※Ｂｕｆｆｅｒの異なる制限酵素を用いる場合、３）４）を繰り返し、Ｂｕｆｆｅｒを交換して行う。
５）Ｌｉｇａｔｉｏｎを行う。
６）Ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を遺伝子クローニング用大腸菌Ｎｏｖａ−ＢｌｕｅもしくはＤＨ５−ａに形質転換する。
７）形成したコロニーをＬＢ培地（＋Ａｍｐ）３ｍｌに植菌し、一晩培養する（Ｍｉｎｉ  ｃｕｌｔｕｒｅ）。
８）アルカリＩ−ＩＩ−ＩＩＩ、イソプロピルアルコール沈殿を用いて、ベクターを精製する。
９）ＳａｍｐｌｅをＲＮａｓｅ処理する。
１０）アガロース電気泳動を行いインサートが組み込まれたと思われるベクターを選ぶ。
１１）制限酵素処理やＰＣＲ  Ｃｈｅｃｋなどで目的のインサートが組み込まれたかを確認。
１２）インサートが確認されたＳａｍｐｌｅをポリエチレングリコール沈殿する。
１３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅを行い、塩基配列の確認を行う。Ｓａｍｐｌｅの保存は−２０℃で行う。
【０１９９】
［全体の構築手順］（図１および図５）
ｉ）任意の制限酵素サイトを付けたプライマーを設計し、放線菌Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ染色体由来ＰＬＤ遺伝子の下流にある翻訳停止領域（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ領域）をＰＣＲ法で増幅させマルチクローニングサイトを有するｐＵＣ１８に組み込む。（ｐＵＣ１８＋ｔｅｒｍ）
【０２００】
ｉｉ）シグナル領域の末端のＡｌａ，Ｓｅｒをコードする配列をＮｈｅＩサイトに変え、任意の制限酵素サイトを付けたプライマーを設計し、放線菌Ｓｔｖ．  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ染色体由来ＰＬＤ遺伝子の上流にあるプロモーター領域、シグナル領域を、ＰＣＲ法で増幅させｐＵＣ１８＋ｔｅｒｍに組み込む。（ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）
【０２０１】
ｉｉｉ）目的とするタンパク質の遺伝子を有するプラスミド及び、ＰＣＲ断片をＴｅｍｐｌａｔｅにして遺伝子のＮ末端にＮｈｅ■サイト、Ｃ末端に任意の制限酵素サイトを付けたプライマーを設計し、ＰＣＲにて増幅させｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒに組み込みｐｌｄ遺伝子を他の外来タンパク質の遺伝子に置き換える。
【０２０２】
ｖｉ）プロモーター領域、シグナル領域、外来タンパク質遺伝子、ターミネーター領域の全長をベクターより切り出し、大腸菌・放線菌シャトルベクターであるｐＵＣ７０２ベクターへ組み込む。（ｐＵＣ７０２−ｐｒｏ−ＸＸＸ）
【０２０３】
増幅するＤＮＡ断片の作製の方法を以下に示す。
Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、Ｓｉｇｎａｌ領域の作製
以下の条件のＰＣＲにてＰｒｏｍｏｔｅｒ、Ｓｉｇｎａｌ領域を増幅させる。
・使用Ｔｅｍｐｌａｔｅ   ｐＵＣ１８−ｐｒｏ−ＰＬＤ
・Ｐｒｉｍｅｒ
Ｓ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ｐｒｏｍｏｔｅｒ（配列番号：７）
5’- CCCAAGCTTACGTCATGGCGGGTCTCTCTCGTC-3’
Ａｓ−ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ−ｓｉｇｎａｌ（配列番号：８）
5’ - CCCGGATCCGCTAGCGAAGGCCGGAGCCGCGGGCAG -3’
【０２０４】
・反応組成
Ｔｅｍｐｌａｔｅ                          ０．２５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）        各０．７５μｌ
ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）            ２．０μｌ
×５  Ｂｕｆｆｅｒ                        ５．０μｌ
Ｄ．Ｗ．                                  １６．０μｌ
Ｐｏｌｙ（Ｔａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ）
０．２５μｌ
Ｔｏｔａｌ                                ２５．０μｌ
【０２０５】
・Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）
９８℃            １ｍｉｎ
↓    ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加える
９８℃            １ｍｉｎ
↓
Ｄｅｎａｔｕｒｅ   ９８℃・３０ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃・２ｍｉｎ         ＊２５ｃｙｃｌｅ繰り返す
↓
７２℃            ３ｍｉｎ
↓
４℃
【０２０６】
以下の条件のＰＣＲにて各種タンパク質遺伝子を増幅させる。
使用Ｔｅｍｐｌａｔｅ・Ｐｒｉｍｅｒ、ＰＣＲのＥｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｔｉｍｅ、制限酵素はたんぱく質遺伝子によって異なるため表１８に示す。※残りの条件は同じである。
【０２０７】
・反応組成  Ｔｅｍｐｌａｔｅ    ０．２５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）   各０．７５μｌ
ｄＮＴＰ  （２．５  ｍＭ  ｅａｃｈ）   ２．０μｌ
×５Ｂｕｆｆｅｒ                     ５．０μｌ
Ｄ．Ｗ．                             １６．０μｌ
Ｐｏｌｙ  （Ｔａｋａｒａ  Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ）
０．２５μｌ
Ｔｏｔａｌ                           ２５．０μｌ
【０２０８】
・Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ）
９８℃            １ｍｉｎ
↓    ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加える
９８℃            １ｍｉｎ
↓
Ｄｅｎａｔｕｒｅ   ９８℃・３０ｓｅｃ
Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ７２℃・Ｘｍｉｎ         ＊２５ｃｙｃｌｅ繰り返す
↓
７２℃・Ｘ＋０．５ｍｉｎ
↓
４℃
【０２０９】
【表１８】
2008193953.tif 000022
【０２１０】
※ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒのベクターはシグナル領域のＣ末端のＡｌａ，Ｓｅｒをコードする配列のアミノ酸を変えずに、制限酵素サイトＮｈｅＩに置き換えて作製した。遺伝子がタンパク質に翻訳され、分泌される際、このＳｅｒの後ろでアミノ酸が切られる。そのため、発現させたいタンパク質遺伝子のＮ末端にＮｈｅＩサイトを付けてＤＮＡ断片を増幅し、挿入することで目的のタンパク質のみを分泌発現することが可能である（図６）。図６において、上段の塩基配列を配列番号：４８とし、上段のアミノ酸配列を配列番号：４９とし、中断の左側の配列を配列番号：５０とし、中断の右側の配列を配列番号：５１とし、下段の塩基配列の省略箇所の左側を配列番号：５２とし、下段の塩基配列の省略箇所の右側を配列番号：５３とし、下段のアミノ酸配列の省略箇所の左側を配列番号：５４とし、下段のアミノ酸配列の省略箇所の右側を配列番号：５５とする。
【０２１１】
＜実施例２：外来タンパク質の発現＞
ＰＬＤを大量に分泌発現できる放線菌の発現系で、外来タンパク質を発現させるため、ｐＵＣ７０２−ｐｒｏ−ｐｌｄのＰＬＤ遺伝子を外来タンパク質遺伝子に置き換えたベクターを構築し（図５）、放線菌Ｓ．  ｌｉｖｉｄａｎｓに形質転換を施し、放線菌で外来タンパク質の発現を試みた。
【０２１２】
［ＧＦＰ，ＢＦＰについて］
ＰＬＤを発現させた場合と同様に、上記のタンパク質遺伝子に置き換えたベクターの形質転換体もＴＳＢ培地にて２８℃で７２ｈ培養し、培養上清及び、菌体内のタンパク質を解析した。
【０２１３】
結果及び、考察
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、タンパク質の発現の確認を行った。しかし、目的タンパク質の大きさに優位的なバンドは見られず、ＰＬＤの発現の場合のように大量分泌発現（５０−１００ｍｇ／ｌ）はされないことが分かった。
【０２１４】
そこで、ＧＦＰ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った（図７）。ＢＦＰは菌内外において検出されなかった。ＧＦＰは菌体内外において検出された。しかしながら、菌体内外でＧＦＰのサイズと同様のバンドと非常に低いバンドが検出された。低いサイズのバンドはＧＦＰが分解されたものと考えられる。菌体内の低いバンド、菌体内のＧＦＰのバンド、菌体外のＧＦＰのバンド、菌体外の低いバンドという順でバンドの濃さが薄くなっていることが分かる。
【０２１５】
これらから、ＧＦＰは発現するものの、そのほとんどが、菌体内にて分解され、微少量しか分泌されないと考えられる。データからの考察は以上であるが、ＧＦＰは様々な変異体が作られ、様々な生物に組み換えが検討されており多くの知見がある（宮脇敦史，ＧＦＰとバイオイメージング  羊土社（２００２）を参照）。その知見を参考にすると、発現しないことに関して、菌体内で不溶性画分になることが挙げられる。
【０２１６】
微生物でＧＦＰの発現を行った場合、タンパク質の合成速度が速すぎると、ＧＦＰはフォールディングされずに、菌体内にインクルージョンボディとして蓄積されると言われている。我々の用いた放線菌発現系は当てはまる。また、生物種によってＧＦＰの向き不向きがあり、微生物ではｗｔＧＦＰ，ＧＦＰｕｖ，ＧＦＰｍｕｔ３．１などの変異体が適しており、動植物細胞ではヒトのコドン使用頻度に合わせた塩基配列の最適化がされた変異体ＥＧＦＰが適している。今回用いたＧＦＰは全てＥＧＦＰであるためにこれも要因のひとつであると考えられる。
【０２１７】
［ｇｌｏｂｉｎ；Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｐ４５０；ＣＹＰ１０２Ａ３，ＣＹＰ１０６Ａ２について］
ＰＬＤを発現させた場合と同様に、上記のタンパク質遺伝子に置き換えたベクターの形質転換体もＴＳＢ培地にて２８℃で７２ｈ培養し、培養上清及び、菌体内のタンパク質を解析した。
【０２１８】
結果及び、考察
まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、タンパク質の発現の確認を行った。しかし、目的タンパク質の大きさに優位的なバンドは見られず、ＰＬＤの発現の場合のように大量分泌発現（５０−１００ｍｇ／ｌ）はされないことが分かった。
【０２１９】
そこで、ｇｌｏｂｉｎ抗体を用いてＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った（図８）。※Ｐ４５０の抗体はないため、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇはできない。Ａ１については検出されなかった。Ａ２，Ｂ１，Ｂ２については目的のバンドに検出された。よって、ヘム結合領域を有し、組み換えによる可溶タンパク質の発現の報告がほとんどなされていない（Ｔｏｎｇ−Ｆｉａｎ  Ｓｈｅｎ，Ｃｈｉｅｎ  Ｈｏ；Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９０，８１０８−８１１２．１９９３］を参照）ｇｌｏｂｉｎというタンパク質の一種を放線菌の発現系にて発現できた。この結果より、ＮＯ合成酵素、クロロペルオキシダーゼ、ＣｏｏＡなどのヘム結合領域を有する複雑な立体構造タンパク質（大村恒雄，Ｐ４５０の分子生物学  講談社（２００４））の発現の可能性を示すことができた。
【０２２０】
培養条件の検討
ＴＳＢ培地にてｇｌｏｂｉｎの発現を行った際、発現は確認されたものの発現量は微少量であったことから、ｇｌｏｂｉｎが立体構造を形成するために必要なヘミンが放線菌体内で十分に合成されていないと考えられる。大腸菌の発現系において、同じようなヘム結合領域を有するタンパク質Ｐ４５０についてヘミン（非特許文献２）や５−ａｍｉｎｏ  ｌｅｖｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（５−ＡＬＡ）（Ｉｎｇｅｌａ  Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｂ．Ｓｃｈｅｎｋｍａｎ；Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＹＰ１Ｂ１  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ［Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １４４，２１１−２１９．２０００］）を添加することで発現が誘導されたという報告があるために培養条件の検討を行った。ヘミン添加については制約が多いため、まず、５−ＡＬＡ添加を試みた。本培養の際、ＴＳＢ培地に２．５ｍＭになるように５−ＡＬＡを添加して同様に２８℃で７２ｈ培養し、培養上清及び、菌体内のタンパク質を解析した。
【０２２１】
結果及び考察
７２ｈ培養を行った後、遠心にて培養上清と菌に分けた際、全てのｇｌｏｂｉｎ，Ｐ４５０の培養上清が赤くなった。そこで、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥとＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによる解析を行った結果、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは発現は確認されなかった。しかし、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによってＡ２，Ｂ１，Ｂ２が検出された（※５−ＡＬＡ無添加とほとんど変わらないため不図示）。培地が赤いことから、発現していると仮定し、発現したｇｌｏｂｉｎ，Ｐ４５０の濃縮やＣＤ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ、吸光度計で解析を行うために、精製を行った。
【０２２２】
ｇｌｏｂｉｎの精製
培養上清５０ｍｌを透析にてＢｕｆｆｅｒ交換と脱塩を行い、陰イオン交換クロマトグラフィーにて精製を行った。各フラクションの液の色から、赤い色のフラクションを見つけ出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって精製されているかを確認した。
【０２２３】
結果及び考察
精製を行ったところ、６種類とも２１〜２５の分画にピンク色の液が精製された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで２１〜２５のフラクションのタンパク質を解析した。６種類ともｇｌｏｂｉｎでもＰ４５０でもないバンドの高さにタンパク質が確認された（不図示）。そこで確認のため、形質転換を施していないＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓを５−ＡＬＡを添加した同様の培地で培養を行ったところ、培地は赤くなった。つまり、５−ＡＬＡを培地に添加することでＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓが染色体ＤＮＡ上にある分泌型のヘム結合タンパク質の誘導が起こったと考えられる。よって、５−ＡＬＡを培地に添加しても、ｇｌｏｂｉｎ，Ｐ４５０の発現は変化が見られないことが示された。
【０２２４】
＜結論＞
上記の実施例の結果から、本件発明において初めて構築されたｐＵＣ７０２−ｐｒｏ−ｐｌｄのＰＬＤ遺伝子を外来タンパク質遺伝子に置き換えたベクターを用いた放線菌の発現系において、外来タンパク質発現の検討を行ったところ、ＧＦＰ，ｇｌｏｂｉｎ；Ａ２，Ｂ１，Ｂ２の分泌発現が可能であることが明らかとなった。
【０２２５】
これらのＧＦＰ，ｇｌｏｂｉｎ；Ａ２，Ｂ１，Ｂ２は、いずれも放線菌以外の生物由来の外来タンパク質であるため、本件発明において初めて構築されたｐＵＣ７０２−ｐｒｏ−ｐｌｄのＰＬＤ遺伝子を外来タンパク質遺伝子に置き換えたベクターは、哺乳動物、枯草菌をはじめとする放線菌以外の生物由来の外来タンパク質であっても、放線菌で好適に発現・分泌を可能にするベクターであると考えられる。
【０２２６】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０２２７】
たとえば、上記実施例では、配線材料として銅を用いたが、銅および銀を含む合金としてもよい。この場合、・・・
また、低誘電率膜として、・・・・
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】実施例で用いたベクター（ｐＵＣ１８＋ｐｒｏｍｏｔｅｒ＋ｔｅｒｍ）に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を挿入するスキームを示した模式図である。
【図２】ｐＵＣ７０２−ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＰＬＤを用いた放線菌でのＰＬＤの分泌におけるプロモーター領域の作用を説明するための図である。
【図３】放線菌におけるＳｅｃ−ｐａｔｈｗａｙおよびＳＲＰ−ｐａｔｈｗａｙによるタンパク質の分泌機構について説明するための図である。
【図４】イオン交換クロマトグラフィーにおける溶出バッファーの塩濃度勾配について説明するための模式図である。
【図５】実施例で用いた放線菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  １３２６で外来タンパク質を分泌する発現ベクターの構築を説明するためのスキームを示した模式図である。
【図６】図５で説明したベクターで発現させたいタンパク質遺伝子のＮ末端にＮｈｅＩサイトを付けてＤＮＡ断片を増幅し、挿入することで目的のタンパク質のみを分泌発現することを可能にする方法を説明するための配列を示す模式図である。
【図７】図５で説明したベクターを用いてＧＦＰ，ＢＦＰ，ＧＳＴ−ＧＦＰを放線菌で発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した写真である。
【図８】図５で説明したベクターを用いてｇｌｏｂｉｎ；Ａ１，Ａ２，Ｂ１，Ｂ２，Ｐ４５０；ＣＹＰ１０２Ａ３，ＣＹＰ１０６Ａ２を放線菌で発現させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した写真である。
【図９】Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．グループおよびＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．グループによって開発されたｐＩＪ１０１の制限酵素地図である。
【０２２９】
【図４】
2008193953.tif 000023
【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
2008193953.tif 000029
【図７】
2008193953.tif 000030
【図８】
2008193953.tif 000031
【配列表】
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