(57)【要約】【課題】  本発明は薬剤の標的蛋白質を、該薬剤と蛋白質の結合ではなく薬剤に応答した蛋白質の立体構造の変化を指標として、しかも前記薬剤の構造修飾を必要とすることなく、同定する方法の提供を課題とする。【解決手段】薬剤の作用による標的蛋白質の立体構造の変化を薬剤の側からではなく、薬剤に応答した標的蛋白質の側から捕捉及び検出する手法を開発することにより、従来の手法で不可避であった薬剤の化学構造の修飾を必要とせずに、該薬剤の標的蛋白質を同定することを可能にした。即ち、ユビキチンリガーゼ蛋白質が、標的蛋白質を探索したい薬剤による蛋白質の立体構造の変化を認識することを見出し、細胞内蛋白質とユビキチンリガーゼ蛋白質との結合の変化を指標に標的蛋白質を探索したい薬剤の標的蛋白質を検出し同定する方法を構築した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
［１］（１）試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）ユビキチンリガーゼ蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法。
【請求項２】
ユビキチンリガーゼ蛋白質が、配列番号２、配列番号４、及び／若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号４、及び／若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドからなる蛋白質である請求項１に記載の同定する方法。
【請求項３】
ユビキチンリガーゼ蛋白質が、配列番号２、配列番号４、及び／又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である請求項１に記載の同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質に結合する性質を有するユビキチンリガーゼ蛋白質を利用して、薬理作用を有する薬剤が標的蛋白質と結合することによる該標的蛋白質の立体構造の変化を検出することによる、薬理作用を有する薬剤の標的蛋白質の同定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤として使用されている化合物には、薬理作用が明確でありながらその作用機序が不明な分子が多数存在する。作用機序が不明な薬剤では、その標的となる蛋白質が同定されていない。標的となる蛋白質が明らかな薬剤は生体への作用機序が明確であり、また該蛋白質との結合の強度、あるいは該蛋白質が有する酵素活性の変化を指標として薬剤の化学構造を改変できる。このため吸収や分解を含む体内動態、さらには薬理活性の向上を目的とする改良研究が容易であり、薬剤を開発する上で非常に有利である。反対に標的蛋白質が不明な薬剤は、たとえ明確な薬理作用が見出されている場合でも、当該活性を向上させる目的でその化学構造の改良を図ることが容易ではない（非特許文献１参照）。
【０００３】
従来、薬剤が作用する標的蛋白質を同定する手段としては、該薬剤と直接結合する蛋白質を物理的及び／又は化学的な手段で検出し分離する方法が一般的であった。例えば、薬剤の化学構造の一部分を改変して高分子量のアフィニティービーズと結合させることにより、重力など物理的な力によって薬剤と結合した標的蛋白質を分離・精製する方法が知られている。また、薬剤の化学構造の一部分に標識となるタグをつけることで該薬剤と結合した標的蛋白質を化学的に検出することも行われている（非特許文献２参照）。近年では酵母ツーハイブリッド法（非特許文献３参照）やファージディスプレイ法（非特許文献４参照）などの分子生物学的な手法を応用して、目的の薬剤と結合する蛋白質をコードする遺伝子断片をｃＤＮＡライブラリー中からスクリーニングし、同定する試みも行われている。
しかしながら、上述した様々な手法による試みにもかかわらず、これまでに進められた研究から実際に薬剤の標的蛋白質が同定された例は多くはない。成功する確率が低い原因として、上述の方法においては、いずれの場合もプローブとする薬剤にビーズやタグを結合させるために、薬剤の一部構造を改変する必要があることから、本来の薬剤とは異なる人工的な構造体に対して、結合する蛋白質を探索せざるを得ない点が挙げられる（非特許文献１及び２参照）。
一方、薬剤の分子内の元素をラジオアイソトープに置換することにより標識した薬剤（構造は標識前と同じ）を用いて特定の蛋白質との結合を確認することは可能であったが、固定可能な修飾ではない為、多数の蛋白質の中から標的蛋白質を探索することは容易ではなかった。また、この方法では、標識により薬剤が不安定になったり、コストがかかるといった難点もあった。
従来法による薬剤標的探索の成功確率が低い別の原因として、上述の方法ではいずれも薬剤と蛋白質の直接の結合を指標として標的の検出・分離を行うために、薬剤と標的蛋白質の結合親和性が高くなければ標的発見が困難である点が挙げられる。実際に上述の方法で標的を見出した数少ない成功例は、いずれも薬剤と蛋白の結合親和性の高いものである（非特許文献４参照）。しかしながらこれまでの知見から薬剤の薬理活性の高さと標的蛋白質との結合親和性は必ずしも相関しない。むしろ不可逆な阻害を除いては薬理作用の惹起に薬剤が標的蛋白質と強固に結合する必要はないとも考えられている（非特許文献５参照）。以上の問題点から、従来の手法では見出すことができなかった薬剤の標的蛋白質を同定する方法が望まれていた。
【０００４】
ユビキチンリガーゼは細胞内で蛋白質の分解に働くユビキチン酵素カスケードの最後に位置する蛋白質であり、標的となる基質蛋白質を選別し、該基質蛋白質に結合してユビキチン分子を連結する役割を担う一群の蛋白質である（非特許文献６参照）。ユビキチン化された蛋白質がプロテアソームにより分解される系は、細胞内で不用な蛋白質を分解するという蛋白質の品質管理上重要であるばかりで無く、細胞内の様々な現象、例えば細胞周期の進行やシグナル伝達などに積極的に関わっている。このシステムにおいては不用になった蛋白質がユビキチンリガーゼによって特異的に認識され、ユビキチン化修飾を受けている。近年、ユビキチンリガーゼの同定が進み、今日までにユビキチンリガーゼ分子ファミリーに属する複数の分子が報告されている（非特許文献７参照）。それらのユビキチンリガーゼの分子構造は、ユビキチン結合酵素Ｅ２と結合する部分と標的の基質蛋白質と結合する部分の２つの機能部位からなり、Ｅ２結合部位の種類によって、ＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型及びＵ−ｂｏｘ型の３つに大別される（非特許文献８，９、１０参照）。それらの中でＵ−ｂｏｘ型ユビキチンリガーゼは、異常蛋白質や正しい立体構造が取れない蛋白質の分解、除去に関与することから、品質管理Ｅ３と呼ばれている（非特許文献１０参照）。ＲＩＮＧ型ユビキチンリガーゼであるＳＣＦ複合体が、小胞体で品質管理に機能すること（非特許文献１１）、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼであるＳｍｕｒｆ２が、Ｓｍａｄ２のリン酸化構造を認識して選択的に分解すること（非特許文献１２）が報告されている。
【０００５】
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オブ  アンティバイオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」Ｈ  Ｈａｔｏｒｉら，  ２００４年  第５７巻７号ｐ．４５６−４６１．
【非特許文献２】「ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（英国）２０００年、Ｎ  Ｓｈｉｍｉｚｕら、第１８巻、ｐ．８７７−８８１
【非特許文献３】「バイオケミカル  ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」２００２年、Ｄ  Ｈｅｎｔｈｏｒｎら  第６３巻９号ｐ．１６１９−１６２８
【非特許文献４】「ケミストリー  ＆  バイオロジー（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｓｃｈｅ  ＰＰら，１９９９年  第６巻１０号：ｐ．７０７−７１６．  ＰＭＩＤ：１０５０８６８５
【非特許文献５】「生化学（ＯＵＴＬＩＮＥＳ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ）」１９８７年、Ｅｒｉｃ  Ｅ．  ＣＯＮＮら
【非特許文献６】「セル（Ｃｅｌｌ）」Ｐｉｃｋａｒｔ，  ＣＭ  ２００４年  第１１６巻２号：ｐ．１８１−１９０．
【非特許文献７】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  」（日本）Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，  Ｓ  ＆  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｋ  Ｉ  ２００３年  第１３４巻  １号  ｐ．１−８．
【非特許文献８】「セル（Ｃｅｌｌ）」Ｍ  Ｓｃｈｅｆｆｅｒら  １９９３年  第７５巻：ｐ．４９５−５０５．
【非特許文献９】「米国科学アカデミー紀要  （Ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」Ｓｃｈｅ  ＰＰら，１９９９年  第９６巻２０号：ｐ．１１３６４−１１３６９．
【非特許文献１０】「バイオケミカル  ＆  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ）」（英国）Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，  Ｓ  ＆  Ｎａｋａｙａｍａ  Ｋ  Ｉ，２００３年  第３０２巻：ｐ．６３５−６４５．
【非特許文献１１】「エンボ  レポート（ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ）」（独国）Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙら,２００５年  第６巻  ３号  ｐ．２３９−２４４．
【非特許文献１２】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー  （Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  」（米国）Ｌｉｎ  Ｘら,  ２０００年  第２７５巻  ４７号  ｐ．３６８１８−３６８２２．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は標的蛋白質を探索したい薬剤の標的蛋白質を、該薬剤と蛋白質の結合ではなく薬剤に応答した蛋白質の立体構造の変化を指標として、しかも前記薬剤の構造修飾を必要とすることなく、同定する方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
薬剤が作用して標的となる蛋白質の機能に影響を与える場合、該蛋白質の立体構造が薬剤との相互作用により変化を受けると考えた。従って薬剤がもたらす薬理作用に必要なのは、薬剤と標的間の単純な結合ではなく、薬剤の作用による標的蛋白質の立体構造の変化であると考えた。そこで、本発明者らは、該変化を指標として蛋白質を探索することが可能であれば、薬剤と蛋白質の結合を指標とした従来の薬剤標的探索手法より高い確率で、薬剤の薬理作用を担う真の標的蛋白質を検索できると考えた。薬剤に応答した標的蛋白質の側から捕捉及び検出する手法を開発することにより、従来の手法で不可避であった薬剤の化学構造の修飾を必要とせずに、該薬剤の標的蛋白質を同定することを可能にした。
即ち、本発明者らは、細胞内での異常蛋白質の選別に関与する分子として知られているユビキチンリガーゼ蛋白質が、標的蛋白質を探索したい薬剤による標的蛋白質の立体構造の変化を認識することを見出し、細胞内蛋白質とユビキチンリガーゼ蛋白質との結合の変化を指標に、標的蛋白質を探索したい薬剤の標的蛋白質を検出し同定する方法を構築し、更に、本発明の方法で、薬理作用を有する薬剤であるであるＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質として知られているＦＫＢＰ１２またはＦＫＢＰ５２が同定できること（実施例２）、１７β−エストラジオールの標的蛋白質として知られているエストロゲン受容体が同定できること（実施例３）、デキサメタゾンの標的蛋白質として知られているグルココルチコイド受容体が同定できること（実施例３）、加えてアルドステロンの標的蛋白質として知られているミネラルコルチコイド受容体が同定できること（実施例４）を確認した。
【０００８】
すなわち、本発明は、
＜１＞［１］（１）試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）上記（１）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）ユビキチンリガーゼ蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）上記（３）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法、
＜２＞ユビキチンリガーゼ蛋白質が、配列番号２、配列番号４、及び／若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、あるいは、配列番号２、配列番号４、及び／若しくは配列番号６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドからなる蛋白質である＜１＞に記載の同定する方法、
また、
＜３＞ユビキチンリガーゼ蛋白質が、配列番号２、配列番号４、及び／又は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質である＜１＞に記載の同定する方法
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
薬剤の構造修飾を必要とせず、かつ、該薬剤と標的蛋白質との結合の強度を指標とせずに、標的蛋白質の立体構造の変化を指標として薬剤に応答する標的蛋白質を同定する本発明の方法は、既存の薬剤の改良研究に有用な標的蛋白質の同定方法として有用であり、従来の薬剤標的蛋白質の探索法にあった種々の課題を一掃する新規の手法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明について詳細に説明する。本明細書における遺伝子操作技術は特に断りのない限り「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等の公知技術に従って実施可能であり、蛋白質操作技術は特に断りのない限り「タンパク実験プロトコール」（秀潤社、１９９７年）等の公知技術に従って実施可能である。
【００１１】
標的蛋白質を探索したい薬剤を、本明細書では、「試験薬剤」と称する。また、本明細書において、試料細胞内蛋白質とは、探索したい標的蛋白質を含むと考えられる細胞（以下、試料細胞と称する）に含まれる（発現している）蛋白質群を意味する。
本発明の一つは、生体内で蛋白質の立体構造の変化を認識する機能を有する蛋白質分子であるユビキチンリガーゼ蛋白質を利用して、試験薬剤の添加及び未添加時におけるユビキチンリガーゼと内在性の標的蛋白質との結合の変化の差を網羅的に調べ、試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質を選択することにより、試験薬剤に応答して立体構造が変化した標的蛋白質を同定する方法である。
【００１２】
本発明の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）上記（１）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）ユビキチンリガーゼ蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）上記（３）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。本発明の同定方法は、更に、試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質を標的蛋白質として選択する工程を含むことが好ましい。
本発明の同定方法においては、試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質、及び試料細胞内蛋白質とが、接触する限り、接触の順序、ユビキチンリガーゼ蛋白質の状態（単離されているか、細胞に発現しているか、又は細胞の抽出液に含まれているか）、及び試料細胞内蛋白質の状態（生細胞内に発現しているか、細胞の抽出液に含まれているか）によって限定されない。即ち、本発明の同定方法には、単離精製したユビキチンリガーゼ蛋白質及び試料細胞の抽出液に含まれている試料細胞内蛋白質を用いる方法（第一の同定方法）、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドの一部若しくは全長域を含むベクターで形質転換した試料細胞に発現しているユビキチンリガーゼ蛋白質及び前記形質転換した試料細胞（生細胞）に発現している試料細胞内蛋白質を用いる方法（第二の同定方法）、前記形質転換した細胞の抽出液に含まれた状態のユビキチンリガーゼ蛋白質及び同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質を用いる方法（第三の同定方法）が含まれる。
本発明の第一の同定方法では、ユビキチンリガーゼ蛋白質を単離する。例えばユビキチンリガーゼ蛋白質の一部若しくは全長域、又はＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させたユビキチンリガーゼ蛋白質の一部若しくは全長域を、大腸菌などのバクテリア、酵母、又は昆虫細胞等に発現させる、あるいは化学的な合成法によって大量に産生させた後、ユビキチンリガーゼ蛋白質の抗体又はユビキチンリガーゼ蛋白質に融合させた各種タグの抗体あるいはタグと親和性の高いアフィニティービーズ又はアフィニティーカラムを用いて精製することができる。あるいは試験管内でユビキチンリガーゼ遺伝子のＤＮＡ断片を転写、翻訳させることによりユビキチンリガーゼ蛋白質を産生し、精製することも可能である。本発明の第一の同定方法では、試料細胞から抽出した蛋白質混合液（即ち、試料細胞内蛋白質を含む液）に、精製したユビキチンリガーゼ蛋白質を試験薬剤添加又は未添加の状態で試験管内で混合し接触させた後、ユビキチンリガーゼ蛋白質とそこに結合する蛋白質を上述と同様の方法に従って濃縮する。好ましくは、実施例２（２）、３又は４に記載の方法により、試験薬剤の未添加時に比較して試験薬剤の添加時にユビキチンリガーゼ蛋白質への結合量が増加する試料細胞由来の蛋白質又は試験薬剤の未添加時に比較して試験薬剤の添加時にユビキチンリガーゼ蛋白質への結合量が減少する試料細胞由来の蛋白質を検出することができる。
【００１３】
本発明の第二の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞に発現しているユビキチンリガーゼ蛋白質、及び前記形質転換された試料細胞に発現している試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）上記（１）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞に発現しているユビキチンリガーゼ蛋白質と前記形質転換された試料細胞に発現している試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）上記（３）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。
本発明の第三の同定方法は、
［１］（１）試験薬剤、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞の細胞抽出液に含まれた状態のユビキチンリガーゼ蛋白質及び前記抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（２）上記（１）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、
［２］（３）ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換された試料細胞の細胞抽出液に含まれた状態のユビキチンリガーゼ蛋白質と前記抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させる工程、及び
（４）上記（３）で接触させた結果ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程、並びに
［３］（２）により検出された蛋白質と（４）により検出された蛋白質とを比較する工程
を含む試験薬剤の標的蛋白質を同定する方法
である。
【００１４】
本発明の第二の同定方法及び第三の同定方法には、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドの一部若しくは全長域を含むベクターで、探索したい標的蛋白質を含むと考えられる細胞を形質転換し、ユビキチンリガーゼ蛋白質であるポリペプチドの一部若しくは全長域、又はＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた該ポリペプチドの一部若しくは全長域を、該細胞に発現させる工程が含まれる。第二の同定方法では、前記形質転換された生きている状態の細胞に、試験薬剤を添加（接触）する又は添加しない（未添加）。これにより、前記形質転換された試料細胞に発現しているユビキチンリガーゼ蛋白質、試料細胞内蛋白質及び試験薬剤とを、あるいは前記形質転換された試料細胞に発現しているユビキチンリガーゼ蛋白質と試料細胞内蛋白質とを接触させることができる。第三の同定方法では、前記形質転換された細胞から抽出した蛋白質混合液（即ち、ユビキチンリガーゼ蛋白質及び試料細胞内蛋白質を含む試料細胞抽出液）に試験薬剤を添加（接触）する又は添加しない（未添加）。これにより、前記形質転換された試料細胞の抽出液に含まれた状態のユビキチンリガーゼ蛋白質、同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質及び試験薬剤とを、あるいは前記形質転換された試料細胞の抽出液に含まれた状態のユビキチンリガーゼ蛋白質と同抽出液に含まれた状態の試料細胞内蛋白質とを接触させることができる。
本発明の第二の同定方法及び第三の同定方法では、ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を第一の同定方法と同様の方法に従って濃縮する。
【００１５】
＜ユビキチンリガーゼ蛋白質＞
本発明の同定方法で用いることのできるユビキチンリガーゼ蛋白質としては、公知の、ユビキチンリガーゼ蛋白質を用いることが出来る。具体的にはＨＥＣＴ型、ＲＩＮＧ型及びＵ−ｂｏｘ型の各ファミリーに属する代表的なユビキチンリガーゼ蛋白質群が挙げられる（前述非特許文献８〜１０参照）。
【００１６】
本発明の同定方法において用いることができるユビキチンリガーゼ蛋白質としては、公知のユビキチンリガーゼ又は公知のユビキチンリガーゼ蛋白質を表すアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）が含まれる。また、上記に挙げたユビキチンリガーゼ蛋白質を表すアミノ酸配列との同一性が９０％以上（好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）が含まれる。
また、本発明の機能的等価改変体及び相同ポリペプチドの起源は特定の生物種に限定されない。更には、機能的等価改変体及び相同ポリペプチドのいずれかに該当する限り、天然ポリペプチドに限定されず、公知のユビキチンリガーゼ蛋白質を表すアミノ酸配列を元にして遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドも含まれる。
なお、本明細書における「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；  ４８：  ４４３−４５３）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  １０
Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ  ＝  ０．５
Ｍａｔｒｉｘ  ＝  ＥＤＮＡＦＵＬＬ
【００１７】
本発明の同定方法で用いるユビキチンリガーゼ蛋白質としては、配列番号２，４，及び／又は６に示す蛋白質（ヒトＵＢＥ３Ａ、ヒトＮＥＤＤ４、ヒトＣＨＩＰ）、及び配列番号２，４，及び／又は６で表されるアミノ酸配列において１〜１０個（好ましくは１〜７個、より好ましくは１〜５個、更に好ましくは１〜３個）のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチド、又は、配列番号２，４，及び／又は６で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上（好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上）であるアミノ酸配列を含み、かつ蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合するポリペプチドが好ましい。
「蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合する」とは、試験薬剤と結合することによる蛋白質の立体構造の変化に応答して、ユビキチンリガーゼ蛋白質が該蛋白質に結合する、あるいは、未変化の状態の蛋白質に結合していたユビキチンリガーゼ蛋白質が、試験薬剤と結合することによる蛋白質の立体構造の変化に応答して、乖離することを意味する。ユビキチンリガーゼ蛋白質が蛋白質の立体構造の変化に応答して「結合する」か否かは、本発明の同定方法の「ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する」方法と同様にして確認することができる。特に、配列番号２，４，及び／又は６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能的等価改変体及び相同ポリペプチドについて「蛋白質の立体構造の変化を認識して該蛋白質と結合する」ことは、ＦＫ１７０６（試験薬剤）と結合することによるＦＫＢＰ１２蛋白質の立体構造の変化に応答して、未変化の状態のＦＫＢＰ１２蛋白質では弱く結合していたユビキチンリガーゼ蛋白質が、ＦＫ１７０６と結合することによるＦＫＢＰ１２蛋白質の立体構造の変化に応答してより強く結合することで確認する。この確認は、実施例２の条件下で、実施例２において用いたユビキチンリガーゼ蛋白質の代わりに検討対象の機能的等価改変体及び相同ポリペプチドを用いることによって実施する。
【００１８】
本発明の同定方法においては、ユビキチンリガーゼ蛋白質のうち、配列番号２，４，及び／又は６に示す蛋白質の利用が特に好ましい。配列番号２及び４で表される蛋白質は前述のユビキチンリガーゼのＨＥＣＴ型ファミリーに、配列番号６で表される蛋白質はＵ−ｂｏｘ型ファミリーにそれぞれ属している。
【００１９】
＜ユビキチンリガーゼ蛋白質の製造方法＞
本発明の同定方法において、ユビキチンリガーゼ蛋白質は、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて一般的な遺伝子工学的及び／又は生化学的手法により容易に製造し取得することが出来る。該ポリヌクレオチドは本明細書に開示された配列情報又は公知の遺伝子配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造及び取得することが出来る。例えば次のように得ることができるが、この方法に限らず公知の操作でも得ることができる。
例えば、（１）ＰＣＲを用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわちｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株から所望のポリペプチドを含む形質転換株を選択する方法）を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げることができる。各製造方法については、ＷＯ０１／３４７８５に記載されているのと同様に実施できる。
【００２０】
ＰＣＲを用いた方法では、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」１）蛋白質遺伝子の製造方法ａ）第１製造法に記載された手順により、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することができる。例えば、ヒトの肝臓、脳、乳腺といった組織からｍＲＮＡを抽出する。次いで、このｍＲＮＡをランダムプライマー又はオリゴｄＴプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行い、第一鎖ｃＤＮＡを合成することが出来る。得られた第一鎖ｃＤＮＡを用い、目的遺伝子の一部の領域をはさんだ２種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供し、ユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチド又はその一部を得ることができる。より具体的には、例えば実施例１に記載の方法によりユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを製造することが出来る。
【００２１】
配列の変異は、例えば天然において突然変異によって生じることもあるが、人為的に改変して作製することも出来る。本発明は、該変異の原因及び手段を問わない。上記の変異体作製にいたる人為的手段としては、例えば上記のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基特異的置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９８７）１５４、３５０，３６７−３８２）等の遺伝子工学的手法の他、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイド法などの化学合成手段（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１５０，１７８、１９６８）を挙げることができる。それらの組み合わせによって所望の塩基置換を伴うポリヌクレオチドを得ることが可能である。あるいはＰＣＲ法の繰り返し作業や、その反応液中にマンガンイオンなどを存在させることによりポリヌクレオチド分子中の非特定塩基に置換を生じさせることが可能である。
【００２２】
上述のように得られたユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドは、適当なプロモーターの下流に連結することでユビキチンリガーゼ蛋白質を試験管内、あるいは試験細胞内で発現させることができる。
具体的には上述のように得られたポリヌクレオチドの開始コドン上流に特定のプロモーター配列を含むポリヌクレオチドを付加することにより、これを鋳型として用いた無細胞系での遺伝子の転写、翻訳によるユビキチンリガーゼ蛋白質の発現が可能である。
あるいはユビキチンリガーゼ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを適当なベクタープラスミドに組み込み、プラスミドの形で宿主細胞に導入すれば細胞内で該ポリペプチドの発現が可能になる。あるいは、このような構成が染色体ＤＮＡに組み込まれた細胞を取得してこれを用いてもよい。より具体的には、単離されたポリヌクレオチドを含む断片は、適当なベクタープラスミドに再び組込むことにより、真核生物及び原核生物の宿主細胞を形質転換させることができる。さらに、これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を導入することにより、それぞれの宿主細胞においてユビキチンリガーゼ蛋白質を発現させることが可能である。宿主細胞は、特に限定されるわけではなく、本発明の方法に利用する目的に十分量のユビキチンリガーゼ蛋白質の発現が実現できるものであればよい。
【００２３】
宿主細胞を形質転換し遺伝子を発現させる方法は、例えば、前記特許文献の「発明の実施の形態」２）の組換え蛋白の製造方法に記載された方法により実施できる。ユビキチンリガーゼ発現細胞の製造に用いる発現ベクター（ユビキチンリガーゼ発現用発現ベクター）は、所望のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではない。例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、所望のポリヌクレオチドを挿入することにより得られる発現ベクターを挙げることができる。ユビキチンリガーゼ蛋白質は、例えば、前記発現ベクターにより所望の宿主細胞を形質転換し、該細胞中で上記ポリペプチドを発現させることにより得ることができる。また所定のプロモーター下流に結合した上記ポリヌクレオチドを用いて、公知の手法により試験管内で所望のユビキチンリガーゼ蛋白質を生産することができる。
【００２４】
前述の細胞を培養することにより細胞中で産生したユビキチンリガーゼ蛋白質を精製することが出来る。該蛋白質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース−バインディングプロテイン（ＭＢＰ）など適当なタグ蛋白質との融合蛋白質として発現させることにより、これらタグ蛋白質を利用して前記蛋白質を精製することが出来る。より具体的には、タグ蛋白質としてＧＳＴを用いた場合には、公知のＧＳＴ−プルダウン（ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ）法（実験工学、Ｖｏｌ１３、Ｎｏ．６、１９９４年５２８頁  松七五三ら）に従って、破砕した細胞の抽出液よりＧＳＴタグと融合したユビキチンリガーゼ蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ；アマシャムファルマシア社）に結合させて遠心分離により単離することができる。
【００２５】
＜試験薬剤＞
試験薬剤としては、医薬品又はその候補であり、薬理作用を示す薬剤であって、標的蛋白質を探索したい薬剤である限り、特に限定されるものではないが、例えば、市販の化合物（ペプチドを含む）、ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術（Ｎ．Ｔｅｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ，  ４（１）：４１，１９９９  ）によって得られた化合物群、微生物の培養上清、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物（ポリヌクレオチド、ポリペプチドを含む）、あるいは、それらを化学的又は生物学的に修飾した化合物で、明確な薬理作用を有するものを挙げることができる。該薬理作用には医療における望ましい作用のみでなく、生体に有害な作用も含まれる。特に本発明の方法の利用が、既存の方法に比較してより有用であると考えられる試験薬剤として、（１）化学構造上、修飾を加えることが困難な薬剤、（２）修飾によって上述の薬理作用が失われる、あるいは失われると予測される薬剤、（３）分解あるいは代謝産物、その他の共雑物の混合により、薬理活性をもたらす化学構造が未定の薬剤、（４）合成や精製、あるいは原材料の入手が困難で利用可能な量が限られる薬剤（天然物を含む）、等を挙げることができる。試験薬剤としては、低分子化合物が特に好ましい。
【００２６】
＜細胞抽出液＞
本発明の方法で用いる細胞抽出液は、試験薬剤が有する薬理活性を惹起するための一次標的組織、あるいは該組織の性質の多くを維持する培養細胞から蛋白質を抽出した液を使用することができる。細胞からの蛋白質の抽出方法は、目的に応じた調製方法を用いることが好ましい。具体的には、公知の蛋白質抽出法に従い、ＳＤＳ，トリトンＸ−１００、あるいはＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯなどの各種界面活性剤から目的に適合するものを選択し、それらを目的に適した濃度で含む緩衝液を用いて上述の細胞を破砕し、遠心分離後上澄を分離及び回収した後に、本発明の方法における細胞抽出液として用いる。より具体的には、破砕のために用いる緩衝液中には生体由来の各種蛋白質分解酵素の阻害剤、例えばＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＥＧＴＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｂｉｓ（β−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  Ａｃｉｄ）等を含むことが好ましく、本発明の方法に適用するまでは凍結され蛋白質が安定に維持される−８０℃以下の状態で保存されることが好ましい。
【００２７】
＜ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する工程＞
ユビキチンリガーゼ蛋白質は、いずれも各分子あたり多数の基質蛋白質に応答すると考えられている。しかしその種類により、基質特異性は異なると考えられている。従って様々な構造を有する薬剤の標的を真に網羅的に探索するためには、多種類の異なるファミリーに属するユビキチンリガーゼ蛋白質を揃えてプローブとして同時に利用することが好ましい。より好ましくは、本発明の実施例２（２）、３及び４に示すとおり、異なるユビキチンリガーゼファミリー由来の複数のユビキチンリガーゼ蛋白質を揃えて、同時に利用することが望まれる。
また生化学的な実験系においては、プローブとする蛋白質（本発明においてはユビキチンリガーゼ蛋白質）が基質となる蛋白質に比較して大過剰に存在する場合、プローブの基質特異性は薄れ、本来の基質以外の蛋白質であっても該基質に類似の分子であればプローブに認識されることが期待できる。従って本発明の実施例２，３及び４に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウン法のように、基質となる細胞由来蛋白質に比較して大量のプローブ蛋白質を反応させうる系の利用が、試験薬剤の網羅的な標的探索を可能にする上ではより好ましい。
また、ユビキチンリガーゼ蛋白質の多くは生体内で多量体を形成して作用することが報告されている。従って本発明の方法を実施するにあたっては、実施例２，３及び４に示されるような、ユビキチンリガーゼ蛋白質（プローブ）と複合体を形成しうる内在性の蛋白質群が混在する生体試料由来の細胞抽出液、及び蛋白質の分離条件を用いることがより好ましい。より具体的には、本発明の実施例２，３及び４に示すｉｎ  ｖｉｔｒｏプルダウン法のように、内在性の蛋白質群を含む細胞由来の細胞抽出液に対してユビキチンリガーゼ蛋白質（プローブ蛋白質）を反応させる系の利用が好ましい。
【００２８】
「ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する」ためには以下の操作を行う。試験薬剤を添加した又は未添加の細胞から抽出した試料細胞抽出液あるいは試験薬剤を添加した又は未添加の試料細胞抽出液のそれぞれから、ユビキチンリガーゼ蛋白質の抗体、又はユビキチンリガーゼ蛋白質に融合させたタグの抗体を用いた公知の免疫沈降法により、ユビキチンリガーゼ蛋白質とユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を濃縮することができる。あるいは上述のタグに親和性を有するアフィニティービーズやアフィニティーカラムを用いた公知の方法によっても同様にユビキチンリガーゼ蛋白質とユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質の濃縮が可能である。具体的な方法としては、ＧＳＴなどのタグをつけて精製した該ペプチドを用いたＧＳＴ−プルダウン法を挙げることができる。
上記で得られたユビキチンリガーゼ蛋白質及びその結合蛋白質の濃縮液を、公知の蛋白質分離法により分離し、ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を検出する。例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、銀染色法、クーマジーブリリアントブルー染色法、又はネガティブゲル染色法（和光純薬）等の既存の蛋白質染色法など公知の蛋白質を検出する種々の方法（「遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析」  平野久  東京化学同人  １９９３年  ｐ３７−ｐ４０）により、ユビキチンリガーゼ蛋白質及びユビキチンリガーゼ蛋白質に結合した試料細胞に由来する蛋白質を検出することができる。ここで本発明の工程に用いる方法は、蛋白質を検出することが可能であれば、上記の方法に限られない。
上記により検出した蛋白質について、試験薬剤添加の場合と未添加の場合でのユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を比較する。両者を比較することにより、試験薬剤添加又は未添加時にユビキチンリガーゼ蛋白質への結合が変化した試料細胞由来の蛋白質（即ち、試験薬剤の標的蛋白質）を同定することができる。試験薬剤添加又は未添加時で得られる試料細胞由来の蛋白質群を検出して比較する方法として、公知のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法が挙げられる。その場合に二次元電気泳動法で展開することにより、より正確な比較が可能である。電気泳動法で展開された、試験薬剤添加時の結果及び試験薬剤未添加の場合の結果について、バンドを比較し（即ち、試験薬剤の添加時のみバンド量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみバンド量が減少するものがあるか、比較し）試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質を選択することができる。試験薬剤の添加時のみ結合量が増加する、又は試験薬剤の添加時のみ結合量が減少する蛋白質としては、試験薬剤の添加時のみ結合する、又は試験薬剤の添加時のみ結合しない蛋白質を選択することが好ましい。
続いて、上記方法により検出し選択された蛋白質を同定する。公知の蛋白質精製法及び蛋白質同定法（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）により、その分子内に存在するアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列情報をもとに、試験薬剤の添加又は未添加時にユビキチンリガーゼ蛋白質との結合が変化する蛋白質（即ち試験薬剤の標的蛋白質）を同定することができる。具体的には、試験薬剤の標的蛋白質は、ゲルから回収して精製した後、マススペクトル法、公知の手法によりそのアミノ酸配列を決定し、蛋白質を同定することができる。より具体的には、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルにより分離された目的の蛋白質を、トリプシン等を用いて断片化し、生じたペプチド混合物をゲルより回収し、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行うことができる（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）。あるいは、ゲルから電気溶出法等により目的蛋白質を溶出させた後、もしくはゲル上の目的蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド）等の膜にブロッティングした後、必要ならば酵素消化、化学的分解により断片化し、さらに必要ならば得られた断片化ペプチドを液体クロマトグラフ法、キャピラリー電気泳動法等により分離した後、マススペクトル解析、もしくはＮ末端又はＣ末端アミノ酸配列解析により、蛋白質の同定を行うことができる（平野  久  プロテオーム解析ー理論と方法ー  東京化学同人、２００１年）。ここで本発明の方法に用いる同定方法は、精製した該標的蛋白質群の同定が可能である限り、上記の方法に限られない。
より具体的には、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動ゲルにより分離された標的蛋白質は、トリプシン等を用いてタンパク質を断片化し、生じたペプチド混合物をゲルより回収し、マススペクトル解析により蛋白質の同定を行うことができる。
【００２９】
本発明の方法で同定された標的蛋白質は、公知の遺伝子機能解析技術により、試験薬剤の薬理作用をもたらす真の標的蛋白質であることを確認することが可能である。まず、具体的には、以下に示す方法により、試験薬剤と得られた標的蛋白質分子の直接的な結合の有無を調べることができる。
結合するか否かの検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域、またはＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグを融合させた検討対象ポリペプチドの一部若しくは全長域を細胞に発現させる。該細胞からＧＳＴやＦｌａｇ、Ｈｉｓなどのタグとの親和性を利用したアフィニティ精製法、あるいは該タグに応答する抗体を利用した免疫沈降法等により、発現させた検討対象のポリペプチドを単離・精製する。続いて精製した該ポリペプチドと試験薬剤を混合し、該試験薬剤とポリペプチドが結合して形成された複合体を単離する。次に該複合体を酸、熱その他の刺激により変性させて試験薬剤を再度分離させて蛋白質のみを除去した後、マススペクトロメトリーを用いた質量分析法による解析を行って同試料中に該試験薬剤が含まれるかどうかを調べることによって、検討対象のペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。また別の手法として、試験薬剤の分子構造の一部を標識することにより作成した標識試験薬剤をプローブとして、公知のＥＬＩＳＡ法、ファーウエスタン法、バインディングアッセイ法等の方法により検討対象のポリペプチドと該試験薬剤が結合するか否かを確認することができる。試験薬剤の標識は、標的蛋白質との結合に影響を与えないラジオアイソトープを用いるのが好ましい。具体的には、例えば、試験薬剤の分子内の元素をラジオアイソトープに置換することにより標識した試験薬剤を作製することができる。該標識試験薬剤をプローブとして利用することにより、上述の方法により精製した検討対象のポリペプチドを固定したＥＬＩＳＡ法により、該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。あるいは、検討対象のポリペプチドを公知のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、ニトロセルロース膜上に転写した後、上述標識試験薬剤をプローブとして利用したファーウエスタン法により、やはり該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。また、あるいは標識させた試験薬剤と上述の方法により精製した検討対象のポリペプチドを混合し、フィルター上にトラップして洗浄した後に、標識プローブ由来の放射線量を測定することにより形成された試験薬剤とペプチドの複合体の総量を検出する、いわゆるバインディングアッセイによって該ポリペプチドと該試験薬剤の結合を確認することができる。
また公知の予測手法（Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００４  Ｄｅｃ  ３０；４７  （２７）：６８０４−１１）により、本発明の方法で同定された標的蛋白質に該試験薬剤が結合しうる鍵穴となる構造が存在するかどうかを調べることができる。さらに公知のＲＮＡ干渉技術（Ｔｕｓｃｈｌ  Ｔ．  ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２，  ２０（５）：ｐ４４６−４４８．）を用いた細胞レベルでの遺伝子ノックダウン実験、同じく細胞レベルでの公知の遺伝子過剰発現実験、さらには遺伝子ノックアウト動物の作製、又は遺伝子過剰発現動物の作製、等の各種生化学的及び／又は遺伝子工学的実験手法により、上記標的蛋白質の発現量を増大、あるいは減少させることができるが、これらの条件下で試験薬剤の主作用又は副作用を試験した場合において、主作用又は副作用が亢進、あるいは抑制される効果が見出されることにより、発現を変動させた遺伝子がコードする標的蛋白質は真の標的蛋白質であると確認できる。
本発明の同定方法では、試験薬剤の薬理作用をもたらす試験薬剤の標的蛋白質を同定することができるが、本発明の同定方法は、試験薬剤の薬理作用の内、望ましい薬理作用（主作用）をもたらす標的蛋白質を同定する方法として、より適している。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年、等）に従って実施可能である。また、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
【００３１】
＜実施例１＞ユビキチンリガーゼ蛋白質の構築
（１）ＧＳＴ融合発現ベクターの作製
ユビキチンリガーゼのｃＤＮＡの３’側にＧＳＴタグをインフレームで融合するため、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャムバイオサイエンス社）、ｐＥＴ−１７ｂ（ノバジェン社）及びｐＥＴ−２８ａ（ノバジェン社）を用いてＧＳＴ融合発現ベクターを作製した。具体的には、配列番号１３及び配列番号１４で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、宝酒造社）を用いて、９５℃３分間の熱変性反応の後、９８℃１０秒間、６０℃３０秒間、７４℃１分３０秒からなるサイクルを３５回、さらに７４℃７分間の条件でＰＣＲを行って、ＧＳＴタグをコードするｃＤＮＡの５’側にＡｓｅＩ、ＢａｍＨＩ、及びＮｏｔＩの各制限酵素の認識サイトが、３’側に停止コドンとＸｈｏＩの制限酵素認識サイトが付加したＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＡｓｅＩ及びＸｈｏＩで処理し、ｐＥＴ−１７ｂのＮｄｅＩ，ＸｈｏＩサイトに制限酵素及びＤＮＡライゲースを用いて挿入した（ＮｄｅＩで切断された部位とＡｓｅＩで切断された部位は結合することができる）。このベクターを、制限酵素ＸｂａＩ（ｐＥＴ−１７ｂ上にはＸｂａＩ認識サイトが存在する）及びＸｈｏＩで処理して挿入したＧＳＴ配列を完全に含むＤＮＡ断片を切り出し、これをｐＥＴ−２８ａベクターのマルチクローニングサイト上にあるＸｂａＩとＸｈｏＩサイトの間に制限酵素及びＤＮＡライゲースを用いて挿入した。これによりｌａｃプロモーターの支配下でＧＳＴ融合蛋白質の発現を誘導できるようにした。完成したＧＳＴ融合発現ベクターを、以下ｐＥＴ−２８ａＧＳＴ−Ｃと略記する。
【００３２】
（２）ユビキチンリガーゼ遺伝子のクローニング及びＧＳＴ融合ユビキチンリガーゼ蛋白質発現プラスミドの作製
配列番号２，４，又は６のアミノ酸配列で表される３種類のユビキチンリガーゼ蛋白質（ヒトヒトＵＢＥ３Ａ、ヒトＮＥＤＤ４、ヒトＣＨＩＰ）の全長領域をコードするｃＤＮＡ配列を配列番号７−１２（奇数番号５’側、偶数番号３’側）で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーとし（例えばヒトＵＢＥ３Ａに対するプライマーセットは、配列番号７及び配列番号８。以下同様）、ＵＢＥ３Ａは市販のｃＤＮＡクローン（インビトロジェン社）、ＮＥＤＤ４及びＣＨＩＰは平滑筋由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）をそれぞれ鋳型として、上述と同じ条件のＰＣＲを行って取得した。これにより生成した約２．６ｋｂｐ（ＵＢＥ３Ａ）３．７ｋｂｐ（ＮＥＤＤ４）、０．９ｋｂｐ（ＣＨＩＰ）のＤＮＡ断片を取得した。これらｃＤＮＡは、いずれも両末端に、プライマーに含まれた配列により以下の制限酵素サイトが付加される様設計した。具体的にはＵＢＥ３ＡのｃＤＮＡの場合には、ＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイトが、ＮＥＤＤ４のｃＤＮＡの場合にはＢｇｌＩＩサイトとＮｏｔＩサイトが、ＣＨＩＰのｃＤＮＡの場合にはＢａｍＨＩサイトとＮｏｔＩサイトが付加された。またタグの付いた融合蛋白質を作製するために、これらのｃＤＮＡは３’側のストップコドンを除いてある。これらのｃＤＮＡをＧＳＴ融合発現ベクターへ上述の各制限酵素を利用して挿入した。具体的には、上述のＰＣＲ反応で得られた各ユビキチンリガーゼのｃＤＮＡ断片を、それぞれに付加した制限酵素サイトで、それぞれ切断した。この各ユビキチンリガーゼのｃＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで処理したｐＥＴ−２８ａＧＳＴ−Ｃベクターと混合し、更にＤＮＡ  ライゲース液（ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ；宝酒造社）と混合して１６℃で３時間処理し、ｐＥＴ−２８ａＧＳＴ−Ｃ上に各ユビキチンリガーゼｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを作製した。配列番号１５に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとして、シーケンシングキット（アプライドバイオシステム社）及びシーケンサー（ＡＢＩ  ３７００  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  アプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列の決定を行った結果、いずれも期待されたユビキチンリガーゼの各塩基配列（配列番号１，３，５）が確認された。各ユビキチンリガーゼのｃＤＮＡのコード領域とｐＥＴ−２８ａＧＳＴ−ＣベクターのＧＳＴタグの翻訳フレームが一致して挿入されているものをそれぞれ選択した。
【００３３】
（３）ＧＳＴ融合ユビキチンリガーゼ蛋白質の精製
上述の（１）で得られた、３種類のユビキチンリガーゼをクローニングしたＧＳＴ融合発現プラスミド群を、ヒートショック（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ）法による形質転換でそれぞれ大腸菌ＢＬ２１（タカラバイオ株式会社）に導入した。２．４ｍＬの培養液で一晩振盪培養した後、その全量を４００ｍＬ培養液に移し変え、３７℃で３時間振盪培養した後、最終濃度が２．５ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（シグマ社）を添加し、更に３時間振盪培養してそれぞれのＧＳＴ融合ユビキチンリガーゼ蛋白質（以下、各々ＵＢＥ３Ａ−ＧＳＴ（約１３６ｋＤａ）、ＮＥＤＤ４−ＧＳＴ（約１６６ｋＤａ）、ＣＨＩＰ−ＧＳＴ（約６０ｋＤａ））と略記する）（カッコ内は各々の期待される分子量）の発現を誘導した。菌体を回収し、公知のＧＳＴ−プルダウン法に従ってＧＳＴ融合ユビキチンリガーゼ蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ上に精製した。公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分離及びクーマジーブリリアントブルー染色を行い、各々期待される分子量の蛋白質が精製されていることを確認した。
【００３４】
＜実施例２＞ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質であるＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２の検出
（１）ＦＫＢＰ１２遺伝子及びＦＫＢＰ５２遺伝子のクローニング、及びＦｌａｇタグ融合ＦＫＢＰ１２発現プラスミド及びＦｌａｇタグ融合ＦＫＢＰ５２発現プラスミドの作製
ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２はＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質の一つであることが知られている（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９３  Ｎｏｖ  ５；２６８（３１）：２２９９２−２２９９９、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００５  Ｆｅｂ  １０；５０９（１）：１１−１９）。
【００３５】
（ａ）ＦＬＡＧタグ融合タンパク質発現ベクターの作製
両末端に制限酵素ＡｇｅＩとＮｏｔＩの接着配列をもつＦＬＡＧタグをコードするオリゴヌクレオチド配列を化学合成し（配列番号１６及び配列番号１７）、アニーリングさせ２本鎖ＤＮＡとした。ＧＦＰ蛋白質発現ベクターであるｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（クロンテック社）から制限酵素ＡｇｅＩとＮｏｔＩで処理してＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を除き、代わりに上述したＦＬＡＧタグ配列をコードするＤＮＡを挿入し、ＦＬＡＧタグ融合タンパク質の発現ベクターを作製した。以下、この発現ベクターをｐＦＬＡＧと略記する。
【００３６】
（ｂ）ＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧタグ融合タンパク質発現ベクター及びＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧタグ融合タンパク質発現ベクターの作製
ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２の全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡを、ＤＮＡプライマー（配列番号１８及び配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１）を用いてそれぞれクローニングした。配列番号１９と配列番号２１に示すプライマーは、ストップコドン配列を除き、クローニング後３’側にＦＬＡＧ配列がＦＫＢＰ１２遺伝子及びＦＫＢＰ５２遺伝子のトリプレットと同じフレームで続くように設計した。具体的には、配列番号１８及び配列番号１９、並びに配列番号２０及び配列番号２１のプライマーセットをそれぞれ用いて、脳由来ｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２の全長域をコードする３２６ｂｐと約１．３８ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ反応はＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用い、９８℃（１分）の後、９８℃（５秒）、５５℃（３０秒）、７２℃（５分）のサイクルを３５回繰り返した。得られた同ＤＮＡ断片は、両末端にＮｈｅＩ及びＡｇｅＩの配列を付与しているため、制限酵素ＮｈｅＩとＡｇｅＩで切断処理をした後、制限酵素ＮｈｅＩとＡｇｅＩで切断処理をした上述のｐＦＬＡＧベクターに挿入した。得られたプラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０５４０１４及びＮＭ＿００２０１４に示されるヒトＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２をコードするｃＤＮＡが前述のｐＦＬＡＧベクターに挿入されていることを確認した。以下この発現プラスミドをｐＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ及びｐＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧとそれぞれ略記する。
【００３７】
（２）ヒトＦＫＢＰ１２発現細胞及びヒトＦＫＢＰ５２発現細胞の作製、並びに本発明の同定方法によるＦＫ５０６及びＦＫ１７０６標的蛋白質の検出
１０ｃｍシャーレ上で７０％コンフルエント状態に培養したＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）に、リポフェクトアミン２０００試薬（インビトロジェン社）を用いて、上記ｐＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ及びｐＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧを、それぞれ一過性に導入した。３０時間培養した後、培地を除去し、氷冷したＰＢＳで細胞を洗浄した後に、１．０ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１０％グリセロール、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５％  ＮＰ−４０）を加えて溶解した。この細胞抽出液を１５０００ｒｐｍで５分遠心して沈殿物を除き、上澄みの可溶画分（以下、ＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液及びＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液）を集めた。それぞれの細胞抽出液の可溶画分中には、ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００５  Ｆｅｂ  １０；５０９（１）：１１−１９）ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２が含まれている。ＦＫ５０６又はＦＫ１７０６の各存在下で、標的蛋白質であるＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２を、ユビキチンリガーゼ蛋白質であるＵＢＥ３Ａ、ＮＥＤＤ４及びＣＨＩＰ蛋白質を用いた本発明の同定方法で実際に検出できるかどうか調べた。即ち、次の組み合わせで以下の実験を行った。ａ）ユビキチンリガーゼ及びＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液（試験薬剤を未添加；コントロール）、ｂ）ユビキチンリガーゼ、ＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液及びＦＫ５０６、ｃ）ユビキチンリガーゼ、ＦＫＢＰ１２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液及びＦＫ１７０６、ｄ）ユビキチンリガーゼ及びＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液（試験薬剤を未添加；コントロール）、ｅ）ユビキチンリガーゼ、ＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液及びＦＫ５０６、ｆ）ユビキチンリガーゼ、ＦＫＢＰ５２−ＦＬＡＧ発現細胞抽出液及びＦＫ１７０６。ユビキチンリガーゼとしては、グルタチオンセファロースビーズ上に精製したＵＢＥ３Ａ−ＧＳＴ、ＮＥＤＤ４−ＧＳＴ及びＣＨＩＰ−ＧＳＴ蛋白質（上述実施例１（３）で作製）を混合したもの（以下、ユビキチンリガーゼ蛋白質混合物）１μｇを用いた。ＦＫ５０６（特公平０３−０３８２７６号）及びＦＫ１７０６（欧州特許第３４６４２７号）は合成した化合物を使用した。公知のＧＳＴ−プルダウン法に従って、上記ａ）からｆ）の各組み合わせをそれぞれ混合し、４℃で１時間振盪した。ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６は１００μＭとなるように添加した。その後遠心分離によりユビキチンリガーゼ蛋白質混合物に結合する蛋白質を共沈殿させた。これをバッファーＡ’（上述のバッファーＡのＮａＣｌ濃度を１００ｍＭに置換した緩衝液）０．５ｍｌでけん濁し、再度遠心分離により共沈殿させた。この操作を４回繰り返した後、沈殿物中の蛋白質を公知の方法に従ってＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離し、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｆ３１６５；シグマ社）を用いたウエスタンブロット法により、ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質であるＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２を検出し、コントロールと、ＦＫ５０６又はＦＫ１７０６添加時の検出量を比較した。即ち、上記組み合わせａ）とｂ）における検出蛋白質を比較した。同様に、ａ）とｃ）における検出蛋白質、ｄ）とｅ）における検出蛋白質、ｄ）とｆ）における検出蛋白質を比較した。なお、ウエスタンブロット法により得られたバンドのシグナルの強度は、ＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎ  ｐｒｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｉｓｉｎ社）を用いて画像を取り込み、単位面積あたりの密度の測定値として数値化した。数値化したデータを表１に示す。ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２の検出量は、ＦＫ５０６を添加した条件下で、試験薬剤の未添加時に比べて増加していた）。また、ＦＫ１７０６を添加した条件下で、ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２の検出量は、試験薬剤の未添加群に比べて増加していた。即ち、ＦＫＢＰ１２及びＦＫＢＰ５２が、ＦＫ５０６及びＦＫ１７０６の標的蛋白質として選択、同定された。これらの結果から、実際にユビキチンリガーゼ蛋白質を用いて、ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、試験薬剤を修飾する必要なしに、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが証明された。
【００３８】
＜実施例３＞本発明の同定方法による標的蛋白質の検出
ヒトのステロイドホルモン受容体の一種であるエストロゲン受容体α（以下、ＥＲα）は、１７−βエストラジオール（以下、Ｅ２と略記する）の薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｇｒｅｅｎ  Ｓ．  ＆  Ｃｈａｍｂｏｎ  Ｐ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １９８８  Ｎｏｖ；４（１１）：ｐ３０９−３１４．）。
ヒトのステロイドホルモン受容体の一種であるグルココルチコイド受容体（以下、ＧＲ）は、デキサメタゾンの薬効を示す標的蛋白質であることが知られている（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９９５  Ｊｕｎ；９５（６）：２４３５−２４４１）。
【００３９】
以下の各細胞抽出液可溶画分を調製し、該細胞抽出液可溶画分中に存在する各薬剤の標的蛋白質が、ユビキチンリガーゼを用いた本発明の方法で検出できるかどうか調べた。
以下の（Ａ）及び（Ｂ）の、細胞抽出液可溶画分及び試験薬剤の組み合わせで、実施例２（２）と同様の本発明の同定方法で、標的蛋白質が検出できるかどうか調べた。ユビキチンリガーゼ蛋白質としては、実施例２と同じユビキチンリガーゼ蛋白質混合物を用いた。なお、共沈殿とけん濁の４回の繰り返し操作は、１００μＭの試験薬剤の添加あるいは未添加の各条件で行った。ＥＲα及びＧＲのバンドは抗Ｖ５抗体（Ｒ９６０−２５；インビトロジェン社）を用いたウエスタンブロットでそれぞれ検出した。
（Ａ）Ｖ５エピトープ（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ  ＳＶ５のＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ由来、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｊ  Ａ，  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２，  １５５１−１５５７，１９９１）を融合させたＥＲαの全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡ（ＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００１２５）を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）の細胞抽出液可溶画分／Ｅ２（試験薬剤）。
（Ｂ）Ｖ５エピトープを融合させたＧＲの全長域をコードする遺伝子ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１０２４０９４）を過剰発現させたＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）の細胞抽出液可溶画分／デキサメタゾン（シグマ社）（試験薬剤）。
その結果（表１）、（Ａ）の場合、Ｅ２を添加した条件下ではＥＲαの検出量がＥ２未添加群と比較して増加している事が示された。即ち、ＥＲαがＥ２の標的蛋白質として選択、同定された。（Ｂ）の場合、約９５ｋＤａのＧＲのバンドがデキサメタゾンの未添加条件で検出され、一方、デキサメタゾンを添加した条件下ではＧＲのバンドはデキサメタゾンの未添加条件に比較し減少していた。即ち、ＧＲがデキサメタゾンの標的蛋白質として選択、同定された。これらの結果から、上述の実施例２と同様、本発明の同定方法が有用であることが確認された。即ち、ユビキチンリガーゼ蛋白質を用いて、ユビキチンリガーゼ蛋白質に結合する蛋白質を、試験薬剤の添加又は未添加時で比較することにより、試験薬剤を修飾する必要なしに、該試験薬剤の標的蛋白質の検出が可能であることが証明された。
＜実施例４＞アルドステロンの標的蛋白質であるミネラルコルチコイド受容体の検出
（１）細胞抽出液の調製、及び本発明の方法によるアルドステロン標的蛋白質の検出
１０ｃｍシャーレ上で８０％コンフルエント状態に培養したＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ）の培地を除去して氷冷したＰＢＳで細胞を洗浄した後、細胞分画キット（ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔ；メルク社）を用いて添付のプロトコールに従い細胞核蛋白質を抽出した（以下、ＨＵＶＥＣ可溶画分という）。ユビキチンリガーゼ蛋白質混合物１μｇ、上記のＨＵＶＥＣ可溶画分、最終濃度１００μＭのＤ−アルドステロン（シグマ社）（試験薬剤）の添加又は未添加状態で、実施例２（２）と同様に実験を行った。共沈殿及び再けん濁の操作は、バッファー中に最終濃度１００μＭのＤ−アルドステロンを添加あるいは未添加の各条件で行った。、抗ＭＲ抗体（Ｃ−１９：サンタクルーズ社）を用いたウエスタンブロット法により、アルドステロンの標的蛋白質であることが知られている（Ｓｃｉｅｎｃｅ. １９８７ Ｊｕｌ １７;２３７(４８１２):２６８−２７５）内在性のＭＲを検出して、試験薬剤の添加及び未添加時における検出量を比較した。ウエスタンブロット法により得られたバンドのシグナルの強度は、実施例２（２）と同様に数値化した。その結果（表１）、検出された約１１０ｋＤａのＭＲのバンドの濃さはアルドステロンの添加条件と未添加条件で明らかに異なり、アルドステロンの未添加条件下でより明確に検出された。この結果から、上述の実施例と同様に、本発明の同定方法が試験薬剤の標的蛋白質を見出す目的に有効であることが確認された。
または、上記ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離した後、公知の銀染色法を用いて蛋白質を検出する。アルドステロン添加時の結果及びアルドステロン未添加の場合の結果について、バンドを比較し（即ち、アルドステロンの添加時のみバンド量が増加する、又はアルドステロンの添加時のみバンド量が減少するものがあるか、比較し）アルドステロンの添加時のみ結合量が増加する、又はアルドステロンの添加時のみ結合量が減少する蛋白質を選択する。選択した蛋白質は、アルドステロンにより立体構造に変化をもたらされる、アルドステロンの標的蛋白質の一つであると考えられる。選択した蛋白質のバンドを切り出し、トリプシンを用いてタンパク質を断片化した後、生じたペプチド混合物をゲルより回収して公知の方法（Ｓｃｈｅｖｃｈｅｎｋｏら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第６８巻、第８５０−８５８頁、１９９６年）に従い、マススペクトル解析により蛋白質を同定する。その結果、該バンド中の蛋白質はＭＲであることが明らかになる。
【００４０】
【表１】
2008193954.tif 000002
【配列表フリーテキスト】
【００４１】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞は、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番号７〜２１の配列で表される各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列である。
【配列表】
2008193954000001.app