(57)【要約】      （修正有）【課題】PAFの生合成において中心的に関与するLysoPAF-ATをコードする遺伝子を特定して、LysoPAF-ATのアミノ酸配列情報及び該遺伝子の塩基配列情報を利用可能にする。【解決手段】LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、該アミノ酸配列が下記のいずれかのアミノ酸配列：(1)出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の特定のアミノ酸配列；(2)上記アミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は(3)上記アミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列である遺伝子。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、該アミノ酸配列が下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
である遺伝子。
【請求項２】
下記の何れかの塩基配列：
(1)配列表の配列番号９に記載の塩基配列；
(2)配列表の配列番号９に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列；又は
(3)配列表の配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
である請求項１に記載の遺伝子。
【請求項３】
哺乳類動物において機能する請求項１又は２に記載の遺伝子。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組み換えベクター。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項又は請求項４に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質であって、下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし８いずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし８いずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含むタンパク質。
【請求項７】
請求項５に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物から請求項６に記載のタンパク質を採取する工程を含む、請求項６に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現調節作用を有する物質のスクリーニング方法であって、請求項５に記載の形質転換体を被検物質の存在下で培養し、発現した請求項６に記載のmRNA、又はタンパク質を定量し、該mRNA、又は該タンパク質の発現量に変動を与えた被検物質をLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現調節作用を有する物質として選択する工程を含む方法。
【請求項９】
血小板活性化因子生合成調節作用を有する物質のスクリーニング方法であって、請求項５に記載の形質転換体あるいは形質転換体抽出物を被検物質の存在下で培養、あるいは共存させ、生成する血小板活性化因子、又は請求項６に記載の酵素活性を定量し、該タンパク質の酵素活性に変動を与えた被検物質を血小板活性化因子生合成調節作用を有する物質として選択する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血小板活性化因子の合成機能を有する遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板活性化因子(PAF: platelet-activating factor、1-O-アルキル-2-アセチル-snグリセロ-3-ホスホコリン、以下、本明細書で「PAF」と略す場合がある)はエーテルリン脂質の一種であり（脂肪酸がエステル結合したアシル型又はビニルエーテル型として存在する場合もある）、好塩基球、肥満細胞、単球・マクロファージ、好中球、好酸球、血管内皮細胞、及び血小板などの広範な細胞が刺激に応じて産生する生体内物質である。PAFは血小板の形態変化や凝集作用の他に、血管透過性亢進作用、血管拡張作用、平滑筋収縮作用（気管支収縮、回腸収縮）、白血球浸潤作用、好酸球の遊走作用、血圧降下作用など、炎症やアレルギー反応におけるメディエーターとして多様な生理活性を有することが明らかにされており、最近になって骨粗鬆症に関与していることも明らかにされている(J. Clin. Invest., 114, pp.85-93, 2004)。PAFは主として哺乳類動物において研究が進められてきたが、出芽酵母や分裂酵母、下等動物においてもPAFが発見されており、生物の基本的生命維持にPAFが重要な役割を担っているものと考えられている。
【０００３】
細胞内でのPAFの生合成経路は２種類存在することが知られている。うち一つは前駆体であるLysoPAFとアセチルCoAを基質としてLysoPAF-AT（AT:アセチルトランスフェラーゼ）の反応によりPAFが生成する修復系経路である。この経路では、細胞膜の構成リン脂質である1-O-アルキル-2-アシル-GPC（GPC：glycerophosphocholine）がホスホリパーゼA2（PLA2）により加水分解されてアラキドン酸とLysoPAF（1-O-アルキル-GPC）が生成し、さらにLysoPAFにアセチルトランスフェラーゼが作用してPAFが生成する。もう一つの経路は1-O-アルキル-2-アセチル-グリセロールにCDP（シチジン三リン酸）-コリンが作用してPAFを生成する経路である。
【０００４】
上記の第一の経路（修復系経路）は高等動物から酵母に至るまで広く存在するものと考えられている。しかしながら、この経路で中心的役割を果たすLysoPAF-ATはこれまでいずれの生物種においても単離・精製されておらず、そのアミノ酸配列も未知のままである。上記のようにPAFは様々な疾患に関与していることから、PAFの生合成経路を解明してPAFの生合成を調節する薬剤を提供することができれば、炎症性疾患をはじめ、気管支喘息、アナフィラキシーショックなどに対して有効な予防及び／又は治療剤として利用できることが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、PAFの生合成経路を解明し、PAFの生合成に関与する遺伝子を同定することにある。より具体的には、本発明の課題はPAFの生合成において中心的に関与するLysoPAF-ATをコードする遺伝子を特定して、LysoPAF-ATのアミノ酸配列情報及び該遺伝子の塩基配列情報を利用可能にすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)からLysoPAF-ATをコードする遺伝子を特定することに成功した。より具体的には、出芽酵母の4741個の各遺伝子を破壊したクローンのセットYeast Deletion Clones (Homozygous Diploid Complete Set)（Invitrogen社製）を用いて各遺伝子破壊株におけるLysoPAF-AT活性の測定を行い、本酵素活性を検出できない株を１株見出した。本株は、出芽酵母ゲノムプロジェクトにより機能未知で小胞体に局在するタンパク質をコードするYOR175cとORF番号を付された遺伝子の破壊株であった。当該遺伝子のプロモーターを含むと思われる領域を野生株ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅後、出芽酵母用多コピープラスミドベクターにクローニングした。LysoPAF-AT活性を消失した遺伝子破壊株を本プラスミドで形質転換した株では、LysoPAF-AT活性が検出されるようになったことから、本遺伝子がLysoPAF-ATをコードするものと確認した、そして、このホモログ遺伝子をヒト、チンパンジー、マウス、ラットなどの哺乳類動物において特定することに成功した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
【０００７】
すなわち、本発明により、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質（以下、本明細書においてこのタンパク質を「LysoPAFアセチルトランスフェラーゼ」と呼ぶ場合がある）のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、該アミノ酸配列が下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
である遺伝子
が提供される。
【０００８】
好ましくは、本発明の遺伝子は哺乳類動物において機能する遺伝子であり、より具体的には、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、該アミノ酸配列が下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
である遺伝子が好ましい。
【０００９】
また、非哺乳類動物において機能する遺伝子も好ましく、より具体的には、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子であって、該アミノ酸配列が下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
である遺伝子も好ましい。
【００１０】
本発明の遺伝子は、さらに好ましくは、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列であって、下記の何れかの塩基配列：
(1)配列表の配列番号９に記載の塩基配列；
(2)配列表の配列番号９に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列；又は
(3)配列表の配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含む遺伝子である。
好ましくは、上記の遺伝子は哺乳類動物において機能する遺伝子であり、さらに好ましくはヒトにおいて機能する遺伝子であり、特に好ましくはヒト由来の天然型遺伝子である。
【００１１】
別の観点からは、本発明により、上記遺伝子を含む組み換えベクター、及び上記遺伝子又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
また、本発明により、上記の形質転換体を培養し、得られた培養物から上記LysoPAFアセチルトランスフェラーゼを採取する工程を含む、上記LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの製造方法が提供される。
【００１２】
さらに別の観点からは、本発明により、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質であって、下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし８いずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし８いずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含むタンパク質が提供される。本発明のタンパク質は上記の(1)ないし(3)のいずれかのアミノ酸配列を全長のアミノ酸配列の一部として含むものであってもよい。また、本発明により、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成させるための酵素製剤であって上記タンパク質を含む酵素製剤も提供される。
【００１３】
好ましくは、本発明のタンパク質は哺乳類動物においてLysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質であり、より具体的には、下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号５ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含むタンパク質であることが好ましい。
【００１４】
また、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するタンパク質であって、下記のいずれかのアミノ酸配列：
(1)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列；
(2)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
(3)配列表の配列番号１ないし４のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含むタンパク質も好ましい。
【００１５】
また、本発明により、被検物質がLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現調節作用を有するか否かを判定する方法であって、上記形質転換体を被検物質の存在下で培養し、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼのmRNA量またはタンパク質量を定量する工程を含む方法、及びLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現調節作用を有する物質のスクリーニング方法であって、上記形質転換体を被検物質の存在下で培養し、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼのmRNA量またはタンパク質量を定量し、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現量に変動を与えた被検物質をLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現調節作用を有する物質として選択する工程を含む方法が提供される。また、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされ、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼ発現調節作用を有する化合物も本発明により提供される。
【００１６】
さらに、本発明により、被検物質が血小板活性化因子の生合成調節作用を有するか否かを判定する方法であって、上記形質転換体を被検物質の存在下で培養し、産生する血小板活性化因子を定量する工程を含む方法、及び血小板活性化因子の生合成調節作用を有する物質のスクリーニング方法であって、上記形質転換体を被検物質の存在下で培養し、産生する血小板活性化因子を定量し、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの酵素活性に変動を与えた被検物質を血小板活性化因子の生合成調節作用を有する物質として選択する工程を含む方法が提供される。また、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされ、血小板活性化因子の生合成調節作用を有する化合物も本発明により提供される。
【００１７】
また、本発明により、被検物質が血小板活性化因子の生合成調節作用を有するか否かを判定する方法であって、上記形質転換体を被検物質の存在下で培養、または培養後に形質転換体または形質転換体抽出物と被検物質を共存させ、発現したLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を定量する工程を含む方法、及び血小板活性化因子の生合成調節作用を有する物質のスクリーニング法であって、上記形質転換体を培養し、発現したLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの酵素活性を定量し、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの酵素活性に変動を与えた被検物質を血小板活性化因子の生合成調節作用を有する物質として選択する工程を含む方法が提供される。また、上記スクリーニング方法によりスクリーニングされ、血小板活性化因子の生合成調節作用を有する化合物も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によりPAFの生合成において中心的に関与するLysoPAF-ATをコードする遺伝子が利用可能になり、該遺伝子を用いてLysoPAF-ATを遺伝子工学的手法により製造することができる。また、本発明により提供される遺伝子を用いて、LysoPAF-ATの発現調節作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。さらに、本発明により提供される遺伝子産物を用いて、LysoPAF-ATの酵素活性調節作用を有する化合物をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
「LysoPAFアセチルトランスフェラーゼ」（又は「LysoPAF-AT」と略す場合もある）は、1-O-アルキル-2-アシル-GPC（GPC：glycerophosphocholine）がPLA2により分解されて生成するLysoPAF（1-O-アルキル-GPC）とアセチルCoAとを基質としてPAFを生成する機能を有する酵素である。LysoPAFアセチルトランスフェラーゼは任意の哺乳類動物において発現されており、その他の真核生物（動物、原生生物、植物、又は菌類）においても発現されている。本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼは、任意の真核生物由来の天然型LysoPAFアセチルトランスフェラーゼ、あるいは任意の真核生物由来の天然型LysoPAFアセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有する非天然型のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼを包含する。哺乳類動物において機能するLysoPAFアセチルトランスフェラーゼが好ましいが、非哺乳類動物由来のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼも好ましい。
【００２０】
より具体的には、真核生物由来の天然型LysoPAFアセチルトランスフェラーゼとして、配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するLysoPAFアセチルトランスフェラーゼを挙げることができるが、本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼはこれらに限定されることはない。また、好ましい非天然型のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼとしては、例えば、配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するLysoPAFアセチルトランスフェラーゼ；又は配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するLysoPAFアセチルトランスフェラーゼなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。上記のアミノ酸配列を全長の一部分の配列として含むLysoPAFアセチルトランスフェラーゼも好ましく、このようなLysoPAFアセチルトランスフェラーゼも本発明の範囲に包含される。
【００２１】
本明細書において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列に言及する場合、「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から20個、好ましくは１から10個、より好ましくは１から7個、さらに好ましくは１から5個、特に好ましくは１から3個程度である。また、本明細書において特定のアミノ酸配列に対して70%以上の相同性を有するアミノ酸配列に言及する場合、相同性は70%以上であれば特に限定されないが、さらに好ましくは80%以上、さらに好ましくは85％以上、さらに好ましくは90%、特に好ましくは95%以上である。
【００２２】
本発明の遺伝子は上記のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。本発明の遺伝子は、例えば、下記の方法により確認することができる。出芽酵母の4741個の各遺伝子を破壊したクローンのセットが市販されているので（Yeast Deletion Clones、Homozygous Diploid Complete Set、Invitrogen社製）、このセットを用いて各遺伝子破壊株におけるLysoPAF-AT活性の測定を行い、本酵素活性を検出できない株を選抜して破壊されている遺伝子を特定する。この遺伝子は、出芽酵母ゲノムプロジェクトにより機能未知で小胞体に局在するタンパク質をコードするYOR175cとORF番号を付された遺伝子である。該遺伝子のプロモーターを含むと思われる領域を野生株ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅後、出芽酵母用多コピープラスミドベクターにクローニングし、LysoPAF-AT活性を消失した遺伝子破壊株を本プラスミドで形質転換して、得られた形質転換体においてLysoPAF-AT活性を検出することにより本遺伝子がLysoPAF-ATをコードするものと確認できる。この出芽酵母由来の遺伝子を本明細書において「LPT1」と呼ぶ場合がある。
【００２３】
また、出芽酵母において確認されたLPT1の核酸配列情報から得られたアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を基にして、相同遺伝子の検索をデータベースにおいて行うことにより、他の生物種における遺伝子を特定することができる。
この手法により、分裂酵母Schizosaccharomyces pombeの相同遺伝子としては、ゲノムプロジェクトによりSPBC16A3.10とORF番号を付けられた遺伝子が見出された（配列表の配列番号２）。出芽酵母Lpt1と分裂酵母の相同遺伝子産物とは、比較した511アミノ酸残基において39.3％の相同性を示した。
線虫Caenorhabditis elegansの相同遺伝子としては、ゲノムプロジェクトによりC54G7.2及びC08F8.4とORF番号を付された２つの相同遺伝子が見出された（配列表の配列番号３及び配列番号４）。出芽酵母Lpt1と線虫由来の相同遺伝子C54G7.2及びC08F8.4は、それぞれ比較した487及び510アミノ酸残基において25.3％及び25.1％の相同性を示した。
【００２４】
哺乳類動物における相同遺伝子も同様にして特定することができる。例えば、マウスMus musculusの相同遺伝子としてOact1及びOact2と命名された２つの遺伝子が見出された（配列表の配列番号５及び配列番号６）。出芽酵母Lpt1とマウス由来の相同遺伝子Oact1及びOact2は、それぞれ比較した404および459アミノ酸残基において29.7％及び28.1％の相同性を示した。
【００２５】
ヒトHomo sapiensの相同遺伝子としてはOACT1およびOACT2と命名された２つの遺伝子が見出された（配列表の配列番号７及び配列番号８）。出芽酵母Lpt1とヒト由来の相同遺伝子OACT1及びOACT2は、それぞれ比較した460及び458アミノ酸残基において27.4％及び28.2％の相同性を示した。また、マウス由来の相同遺伝子Oact1とヒト由来の相同遺伝子OACT1はアミノ酸残基において83.2％の相同性を示した。
【００２６】
哺乳類動物由来の上記遺伝子の機能は、これらの遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)を含むcDNAをクローニングして哺乳類動物細胞で発現させ、発現物がLysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有することを確認することにより証明することができる。哺乳類動物由来の各遺伝子は、それぞれ高い相同性を示し、好ましくは70%以上、さらに好ましくは80%以上の相同性を有する。
【００２７】
本発明の遺伝子は、好ましくは、LysoPAFアセチルトランスフェラーゼをコードする塩基配列であって、
(1)配列表の配列番号９に記載の塩基配列；
(2)配列表の配列番号９に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換、及び／又は付加を有する塩基配列；又は
(3)配列表の配列番号９に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
を含む。好ましくは、本発明の遺伝子は哺乳類動物に由来する遺伝子であり、さらに好ましくはヒト由来の遺伝子である。
なお、配列表の配列番号９に示された塩基配列は発現遺伝子情報を基に発明者がクローニングしたヒトOACT1のORFであり、配列番号１０に示された塩基配列はゲノムプロジェクトにより推定されたヒトOACT1のORFであり、配列番号１１に示された塩基配列はゲノムプロジェクトにより推定されたヒトOACT2のORFである。
【００２８】
本明細書において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列に言及する場合、１から数個の範囲は特には限定されないが、例えば、１から40個、好ましくは１から30個、より好ましくは１から20個、より好ましくは１から10個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度である。
【００２９】
本明細書において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、DNAをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、又はサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるDNAの塩基配列を意味しており、例えば、コロニー又はプラーク由来のDNA又は該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2×SSC溶液（1×SSC溶液は、150 mM塩化ナトリウム、15 mMクエン酸ナトリウム）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNA等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションはMolecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、「モレキュラークローニング第２版」と略す場合がある）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００３０】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げられ、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。
【００３１】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載したアミノ酸配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて真核生物のcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。cDNAライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００３２】
PCR法により本発明の遺伝子を取得することもできる。真核生物由来の染色体DNAライブラリー又はcDNAライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１ないし８のいずれか１つに記載したアミノ酸配列をコードする塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてPCRを行うことができる。PCRの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜1分間（アニーリング）、72℃で2分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で7分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたDNA断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００３３】
上記のプローブ又はプライマーの調製、cDNAライブラリーの構築、cDNAライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの手法は当業者に周知かつ慣用であり、例えば、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」と略す場合がある）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３４】
配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、LysoPAF及びアセチルCoAを基質として血小板活性化因子を生成する酵素活性を有するLysoPAFアセチルトランスフェラーゼをコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を「変異遺伝子」と呼ぶ場合がある）は、配列番号１ないし８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法、又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００３５】
例えば、配列表の配列番号１ないし８のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、又は遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であるが、この手法はモレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００３６】
本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの取得方法は特に制限されないが、典型的には、上記(1)に記載したLysoPAFアセチルトランスフェラーゼをコードする塩基配列であるDNAを取得して、このDNAを適当な発現系に導入することにより本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼを産生することができる。
【００３７】
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えばプロモーター等）が機能的に連結されていることが望ましい。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すDNA配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００３８】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)若しくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、又はファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp、若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００３９】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、SV40プロモータ、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、P10プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス39K遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、TPI1プロモータ、ADH2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ADH3プロモータまたはtpiAプロモータなどがある。
【００４０】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは、ポリアデニレーションシグナル(例えばSV40またはアデノウイルス5E1b領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばSV40エンハンサ）などの要素を有していてもよい。本発明の組み換えベクターは、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするDNA配列を有していてもよい。その一例としては、宿主細胞が哺乳類細胞のときのSV40複製起点が挙げられる。
【００４１】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)若しくはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、又は例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、並びに所望によりターミネータ及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
【００４２】
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の遺伝子又は組み換えベクターを導入するための宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できる限り特にその種類は限定されない。例えば、細菌、酵母、真菌、及び高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルス又はストレプトマイセス等のグラム陽性菌、あるいは大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これらの細菌の形質転換は、プロトプラスト法又は公知の方法などによりコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
【００４３】
哺乳類細胞の例としては、HEK293細胞、HeLa細胞、COS細胞、BHK細胞、CHL細胞、又はCHO細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたDNA配列から該DNAによりコードされるタンパク質を発現させる方法も公知である。組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、又はリポフェクション法等を用いることができる。
【００４４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセス又はシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)又はサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００４５】
他の真菌細胞の例として、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、又はトリコデルマに属する細胞などを挙げることができる。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、DNA構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。DNA構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換え又は異種組換えにより行うことができる。
【００４６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組み換えベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等）。
【００４７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHiFive(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクター及び上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００４８】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することができる。形質転換体の培養物から本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼを単離・精製する手段は特に限定されず、通常のタンパク質又は膜結合タンパク質の単離、精製法を用いることができる。
【００４９】
例えば、本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼが細胞膜画分に発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕を行うか、又は酵素的に細胞壁を溶解してスフェロプラストを調製し、浸透圧ショックによりこれを破砕して粗酵素標品を得ることができる。該粗酵素標品を遠心分離を行うことにより得られた上清をさらに超遠心分離することにより膜画分を得ることができる。該膜画分をCHAPS等の界面活性剤を含む水系緩衝液に懸濁後、さらに超遠心分離を行うことで可溶化した酵素標品を得ることができる。また、本発明のLysoPAFアセチルトランスフェラーゼが細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得ることができる。該膜画分より可溶化した酵素標品又は該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製されたLysoPAFアセチルトランスフェラーゼを得ることができる。
【００５０】
本発明により提供される上記の形質転換体、又は形質転換体抽出物を用いて、被検物質がLysoPAFアセチルトランスフェラーゼ発現調節作用、血小板活性化因子生合成調節作用、又はLysoPAFアセチルトランスフェラーゼの活性調節作用を有するか否かを判定することができ、この判定方法により、上記の作用を有する物質をスクリーニングすることができる。上記判定又はスクリーニングに際しては、上記形質転換体、又は形質転換体抽出物を被検物質の存在下で培養、もしくは共存させればよく、発現したLysoPAFアセチルトランスフェラーゼのmRNA、タンパク質、又は酵素活性を適宜の手段で定量すればよい。LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの発現量、あるいは酵素活性に変動を与えた被検物質は上記のいずれかの作用を有する物質である。被検物質又は本発明の方法によりスクリーニング可能な物質の種類は特に限定されず、低分子有機化合物、高分子化合物、オリゴペプチド類、タンパク質類、糖類、脂質類、核酸類（RNAiなどに用いる小分子RNAや非天然型塩基を含む核酸などを含む）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１
＜方法＞
(a)LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの活性測定
LysoPAF-AT活性は、14C標識されたPAFの合成量を検出することで測定した。酵素反応は14C標識Acetyl-CoAとLyso-PAF(C-16)又はLyso-PAF(C-18)を基質として0〜37℃で10〜30分行った。反応液よりBligh & Dyer法を用いて脂質画分を抽出し、濃縮後TLCにスポットして展開した。展開後のTLCは、イメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーの後、バイオイメージングアナライザーBAS2500を用いて生成物の検出及び定量を行った。また、生成物の確認は標準の3H-PAF(C-16)を同じTLCにスポットして展開後、EN3HANCE SprayとX線フィルムを用いたフルオログラフィーにより行なった。
【００５２】
(b)酵素標品の調製
(i)出芽酵母
対数増殖期初期から中期まで増殖させた細胞を集菌し、菌体量の２倍から５倍の緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 5 mM 2-メルカプトエタノール, 2 mM フェニルメチルスルホニルフロオリド)に懸濁後、ガラスビーズとともに激しく振とうさせて細胞を破砕し、粗酵素標品を得た。粗酵素標品を遠心分離した上層を超遠心分離することにより得られた膜画分（沈殿画分）を上記緩衝液に懸濁したものを部分精製酵素標品として用いた。
【００５３】
(c)酵母の培養法
(i)出芽酵母
出芽酵母の培養は、YPD培地（2% グルコース, 2% ペプトン, 1% イーストエクストラクト）を用いて30℃で行った。プラスミドで形質転換した株はSD培地(2% グルコース, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製））又はSC培地(2% グルコース, 0.67% Yeast Nitrogen Base w/o amino acids (Difco社製), 0.062% DO supplement（BD Bioscience社製））に必要なアミノ酸を加えた培地を用いた。
【００５４】
(d)酵母形質転換法
(i)出芽酵母
出芽酵母の形質転換は酢酸リチウム法を用いて行った。対数増殖期初期の細胞を形質転換用緩衝液（10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA, 0.1M 酢酸リチウム）に懸濁後0.1 mlを取りプラスミドDNAを加え、さらに0.7 mlのポリエチレングリコール溶液(40% ポリエチレングリコール 4000, 10 mM Tris-HCl, pH7.5, 1 mM EDTA, 0.1M 酢酸リチウム）を加えて懸濁後、30℃で30分インキュベートし、0.094 ml のジメチルスルホキシドを加えて攪拌後、42℃で15分間インキュベートし、その一部を選択寒天培地に塗布した。DNAを取り込んだ形質転換体はプラスミドにコードされた栄養要求性のマーカーで選択した。
【００５５】
＜結果＞
出芽酵母の4741個の各遺伝子を破壊したクローンのセット（Yeast Deletion Clones、Homozygous Diploid Complete Set、Invitrogen社製）を用いて各遺伝子破壊株におけるLysoPAF-AT活性の測定を行い、本酵素活性を検出できない１株を選抜した。破壊されている遺伝子は出芽酵母ゲノムプロジェクトにより機能未知で小胞体に局在するタンパク質をコードするYOR175cとORF番号を付された遺伝子であった。該遺伝子のプロモーターを含むと思われる領域を野生株ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより増幅後、出芽酵母用多コピープラスミドベクターにクローニングし、LysoPAF-AT活性を消失した遺伝子破壊株を本プラスミドで形質転換した。得られた形質転換体においてLysoPAF-AT活性を検出することにより本遺伝子がLysoPAF-ATをコードするものと確認し、この出芽酵母由来の遺伝子を「LPT1」と命名した。
【００５６】
出芽酵母において確認されたLPT1の核酸配列情報から得られたアミノ酸配列（配列表の配列番号１）を基にして、相同遺伝子の検索をデータベースにおいて行うことにより、マウスにおいて２つの相同遺伝子Oact1及びOact2を見出し、ヒトにおいて２つの相同遺伝子OACT1及びOACT2を見出した。また、線虫において２つの相同遺伝子C54G7.2及びC08F8.4を見出し、それらをRT-PCR法によりクローニングした。その際、OACT1はマウスOact1の配列との比較により相同性を持たないN末端領域317アミノ酸を除いたORF（318番目のメチオニン以降のORF）をクローニングし、OACT2はORF全長をクローニングした。線虫の２つの遺伝子をGAL1プロモーターを有する発現ベクターに導入した。これらプラスミドを酵母細胞に導入してガラクトースによる誘導後、LysoPAF-AT活性の測定を行ったところ、線虫由来の２つの相同遺伝子のうちC54G7.2ではLysoPAF-AT活性が認められた（図１）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】酵母細胞において発現した線虫由来LysoPAFアセチルトランスフェラーゼの活性を示した図である。１：野生株酵母+vector、２：lpt1遺伝子破壊株+C54G7.2、３：lpt1遺伝子破壊株+C08F8.4、４：lpt1遺伝子破壊株+vector、５：野生株酵母+vector、６：lpt1遺伝子破壊株+C54G7.2７： lpt1遺伝子破壊株+C08F8.4、８：lpt1遺伝子破壊株+vector。１〜４は、ガラクトースにて遺伝子発現を誘導したものであり、５〜８は、ガラクトースによる誘導を行わなかったものを示す。
【図１】
2008193913.tif 000002
【配列表】
2008193913000001.app