(57)【要約】      （修正有）【課題】良好な抗癌作用を有する新規な桂皮酸誘導体及びその製造方法並びにプロポリス発酵物を提供する。【解決手段】下記式に示す構造を有する化合物。2008000081.tif 000013【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体。
【化１】
2008000081.tif 000012
【請求項２】
請求項１に記載の新規な桂皮酸誘導体を製造する方法であって、担子菌類の菌糸体をプロポリスに接種し、前記菌糸体によりプロポリスを発酵処理した後、式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を分離することを特徴とする新規な桂皮酸誘導体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載の新規な桂皮酸誘導体を製造する方法であって、担子菌類の菌糸体をアルテピリンＣ（Ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎ Ｃ）に接種し、前記菌糸体によりアルテピリンＣを発酵処理した後、式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を分離することを特徴とする新規な桂皮酸誘導体の製造方法。
【請求項４】
担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理してなり、請求項１に記載の式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を含有することを特徴とするプロポリス発酵物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば担子菌類の菌糸体によりプロポリス又はアルテピリンＣ（Ａｒｔｅｐｉｌｌｉｎ Ｃ）を発酵処理した発酵物に含まれる新規な桂皮酸誘導体及びその製造方法並びにプロポリス発酵物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
プロポリスは、ミツバチにより集められた樹木の樹液、植物の新芽、浸出物等がミツロウ等と混ざり合ってできた膠状の物質であり、ミツバチはプロポリスで巣の補修等を行う。プロポリスは天然の抗菌成分、抗炎症剤、鎮痛剤等幅広い用途で外用や内服の形態で民間薬として長い間用いられてきた。近年、その様々な生理作用等を解明する研究が進み、また経口的摂取によっても様々な効果を発揮することがわかってきている。このため、例えば、抗菌、抗酸化、抗腫瘍、発癌抑制、免疫賦活等の効果、また生活習慣病やその他疾病の予防・改善・治療効果等を期待して、健康食品や機能性食品の原料として注目されており、その実用化も進みつつある。しかしながら、プロポリスは樹木の樹液や樹脂、起源植物となる種々の薬用植物、花粉、ミツロウ等様々な物質の混合物であると共に、プロポリスに含有される物質は十分解明されたとは言えず、むしろプロポリスに含まれる物質は解明又は同定されていないものの方が多いと考えられる。
【０００３】
一口にプロポリスと言っても産地により含有成分が様々である。近年、多くの研究者により産地別プロポリスの成分に関する研究が進められており、ブラジル産プロポリスには桂皮酸誘導体の一つであるアルテピリンＣが主成分として多く検出されると開示されている（例えば、非特許文献１を参照）。
【０００４】
これまでに、産地の異なるプロポリスをブレンドしたもので、アルテピリンＣを成分の一つとして含有するプロポリス組成物が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。例えば、ケルセチン、ｐ−クマール酸及びアルテピリンＣを含有し、さらにクリシン、ガランギン又はカフェイン酸フェネチルエステルを含有するプロポリス組成物が挙げられている。
【０００５】
プロポリス及びアガリクスの菌糸体にはいずれも抗癌作用及び抗菌作用があることが知られている。例えばこれまでに、アガリクス及びプロポリス並びにアマゾン酵素の三者を溶解する溶剤を用いて、それぞれのエキスを別々又は複合して抽出し、その一種類、二種類又は三種類を混合溶解化し、飲食料品に添加して保存を可能とする飲食料品が開示されている（例えば、特許文献２を参照）。
【特許文献１】特開２００４-１５９５６３号公報（第１、２頁）
【特許文献２】特開平１０−２１５８３８号公報（第１、２頁）
【非特許文献１】田澤茂実ら：生薬学雑誌、５４（６），１６４−１６８，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、野菜中心の栄養バランスのとれた食事から肉中心の食事となり、脂肪接種量が増えるなど食生活が欧米化し、癌患者が増加する中で、新たな抗癌剤の開発が望まれている。これまでに、プロポリス及びアガリクスのような担子菌類の菌糸体にそれぞれ抗癌作用があることは知られている。しかしながら、そのような抗癌作用のさらなる向上が求められ、そのような要求に応えるべく、プロポリスとアガリクスの組合せによる発酵食品が開発され、発酵による成分変化によって生じる新規な化合物の探索が続けられている。
【０００７】
そこで、本発明の目的とするところは、良好な抗癌作用を発揮させることができる新規な桂皮酸誘導体及びその製造方法並びにプロポリス発酵物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アガリクスのような担子菌類の菌糸体を利用してプロポリス又はアルテピリンＣを発酵処理した後、分離することによって良好な抗癌作用を有する新規な桂皮酸誘導体が得られることを見出した。
【０００９】
上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明の新規な桂皮酸誘導体は、下記式（１）の構造を有する化合物であることを要旨とする。
【００１０】
【化１】
2008000081.tif 000002
請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の新規な桂皮酸誘導体を製造する方法であって、担子菌類の菌糸体をプロポリスに接種し、前記菌糸体によりプロポリスを発酵処理した後、式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を分離することを特徴とするものである。
【００１１】
請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の新規な桂皮酸誘導体を製造する方法であって、担子菌類の菌糸体をアルテピリンＣに接種し、前記菌糸体によりアルテピリンＣを発酵処理した後、式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を分離することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項４に記載の発明のプロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理してなり、請求項１に記載の式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を含有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、次のような効果を発揮することができる。
請求項１に記載の発明の新規な桂皮酸誘導体によれば、式（１）の化合物が桂皮酸誘導体の基本骨格を有しており、良好な抗癌作用を発揮させることができる。
【００１４】
請求項２及び請求項３に記載の発明の新規な桂皮酸誘導体を製造する方法によれば、担子菌類の菌糸体を利用してプロポリス又はアルテピリンＣを発酵処理する。その後、新規な桂皮酸誘導体を分離するという簡単な操作により、容易に式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を提供することができる。
【００１５】
請求項４に記載の発明のプロポリス発酵物によれば、プロポリス及び担子菌類の菌糸体が元来有している抗癌作用のある成分の他に、良好な抗癌作用のある新規な桂皮酸誘導体を含有している。従って、それらが相乗的に働くことで、プロポリス、担子菌類の菌糸体又は両者の混合物に比べて、飛躍的な抗癌作用を発揮させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の最良と思われる実施形態について詳細に説明する。
本実施形態の新規な桂皮酸誘導体は、下記式（１）で示される構造を有する化合物である。
【００１７】
【化２】
2008000081.tif 000003
式（１）の化合物は、ＩＵＰＡＣ命名法では３−[３−ヒドロキシ−２−（１−メチルエチル）−７−（３−メチル−２−ブテニル）−２，３−ジヒドロベンゾフラン−５−イル]アクリル酸と命名でき、抗癌作用のある桂皮酸誘導体の基本骨格を有する構造的特徴がある。
【００１８】
この新規な桂皮酸誘導体は、例えばプロポリス又はアルテピリンＣを担子菌類の菌糸体により発酵処理した発酵物から分離して得られる化合物で、抗癌作用を有する。従って、前記新規な桂皮酸誘導体は、抗癌効果を目的として健康食品、機能性食品、及び医薬品等に利用できる。
【００１９】
新規な桂皮酸誘導体の製造方法は特に制限されず、公知の化学的合成法によるものであってもよいし、発酵法によるものであってもよい。それらの方法のうち、担子菌類の菌糸体を利用してプロポリス又はアルテピリンＣを発酵処理した後、新規な桂皮酸誘導体を分離する簡単な操作により、容易に得られることから、発酵法が好ましい。
【００２０】
まず、担子菌類の菌糸体を利用したプロポリスからの新規な桂皮酸誘導体の製造方法について説明する。該製造方法は担子菌類の菌糸体をプロポリスに接種し、該菌糸体によりプロポリスを発酵処理した後、新規な桂皮酸誘導体を分離するものである。
【００２１】
本実施形態の製造方法で用いられる担子菌類としては、ラッカーゼ活性を有するアガリクス、冬虫夏草、カバノアナタケ、霊芝などあらゆる種類のものが使用可能である。それらの中でも高いラッカーゼ活性により、最も効率的に新規な桂皮酸誘導体を得ることができることから、アガリクスを使用することが好ましい。なお、菌糸体は、担子菌類の子実体から採取して利用してもよいし、寄託機関等から入手して利用してもよい。
【００２２】
上記のプロポリスとしては、プロポリス原塊を公知の抽出方法によって抽出したプロポリス抽出物が好適に使用される。プロポリス原塊は、ミツバチが樹木の特定部位、主として新芽や樹皮から採取したガム質、樹液、植物色素系の物質及び香油等の集合体に、ミツバチ自身の分泌物や蜂ロウ等を混合して作製した暗緑色や褐色から暗褐色を呈した粘着性のある樹脂状の固形天然物質である。プロポリス抽出物を得るために用いられるプロポリス原塊としては、ブラジルを含む南アメリカ諸国、中国や日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、オセアニア諸国等のあらゆる産地のものが使用可能である。それらの中でも桂皮酸誘導体であるアルテピリンＣが２〜６質量％と豊富に含有されているブラジル産の原塊を使用することが好ましい。
【００２３】
プロポリス抽出物としては、プロポリスの水抽出物、アルコール抽出物、含水アルコール抽出物、有機溶媒抽出物、超臨界抽出物、ミセル化抽出物等が挙げられる。これらの中でも高い抗癌作用を有する成分を容易、且つ多量に抽出可能であることから、プロポリスのアルコール抽出物を使用することが好ましい。なお、アルコール抽出物を調製するために用いられるアルコールは、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコールであることが好ましい。また、有機溶媒抽出物を調製するために用いられる有機溶媒としては、アセトンやヘキサン等の公知の有機溶媒が使用可能である。
【００２４】
本実施形態のプロポリスの発酵処理では、プロポリスの発酵処理の前に、担子菌類の菌糸体を前培養することにより、該担子菌類の菌糸体をあらかじめ活性化させておくことが好ましい。例えば、発酵処理の前に、担子菌類の胞子を前培養することにより、活性化された菌糸体を調製することができる。
【００２５】
また、プロポリスの発酵処理では、担子菌類の菌糸体の培養に適した培地、培養温度、培養期間等の処理条件を適宜選択すればよい。発酵処理及び前培養では、担子菌類の菌糸体をより早く増殖させることが可能な培地を選択することが好ましい。このような培地には、通常、糖分、酵母エキス、ペプトン、塩類等が含有されている。なお、培地にはプロポリス抽出物を調製する際に用いられたアルコールや有機溶媒等が、菌糸体の培養を阻害しない程度の低濃度で含有されていても差し支えない。
【００２６】
発酵処理を実施する時間、すなわち発酵時間は特に限定されないが、好ましくは０．５〜３００時間、より好ましくは０．５〜１５０時間、さらに好ましくは３．５〜７２時間である。発酵時間が０．５時間未満の場合、十分な量の新規な桂皮酸誘導体が得られないので好ましくない。逆に発酵時間が３００時間を超える場合、発酵時間のわりに十分な量の新規な桂皮酸誘導体が得られず、効率が悪く、結果として製造コストも上昇するため好ましくない。
【００２７】
発酵処理を実施する温度、すなわち発酵処理温度は特に限定されないが、好ましくは２５〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃、さらに好ましくは３５〜４５℃である。発酵処理温度が２５℃未満の場合、酵素活性が低く反応が遅くなり、逆に６０℃を超える場合、酵素が失活し反応が効率的でないため好ましくない。
【００２８】
例えば、発酵処理時のプロポリスとして、プロポリス固形分２０質量％のアルコール抽出液を使用する場合、発酵処理液中のプロポリス固形分の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０５〜３質量％、より好ましくは０．０５〜１．５質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。プロポリス固形分の濃度が０．０５質量％未満の場合、菌糸体の栄養源としてプロポリス中の成分が全て利用されてしまう可能性があり、またこの発酵物を製品とする場合、製品中におけるプロポリス含量が低くなってしまうため好ましくない。逆に３質量％を超える場合、プロポリスの溶解性が悪くなると共に、アルコール濃度が濃くなることから、菌糸体の成長が悪く、ラッカーゼ活性も低下するため好ましくない。
【００２９】
分離方法としては特に限定されず、例えば酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出した後、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種カラムクロマトグラフィーを適宜組合せることにより行われ、その場合常法に従って実施される。
【００３０】
次に、担子菌類の菌糸体を利用したアルテピリンＣからの新規な桂皮酸誘導体の製造方法について説明する。該製造方法は担子菌類の菌糸体をアルテピリンＣに接種し、該菌糸体によりプロポリスを発酵処理した後、新規な桂皮酸誘導体を分離するものである。
【００３１】
本実施形態の製造方法で用いられるアルテピリンＣとしては特に限定されず、例えば、プロポリス由来であってもよく、プロポリスの起源植物であるキク科植物由来であってもよく、又は化学合成法によるものであってもよい。なお、前記キク科植物としては、ヨモギ属（例えば、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｃａｐｉｌｌａｒｉｓ）或いはバッカリス属（例えば、Ｂａｃｃｈａｒｉｓ  ｃｏｎｆｅｒｉｆｏｌｉａ）等が挙げられる。
【００３２】
また、前記プロポリスとしては、上記同様、プロポリス抽出物が好適に使用され、プロポリス原塊の産地及び抽出法は特に限定されない。桂皮酸誘導体含量が多く、効率的に抽出可能であることから、ブラジル産の原塊をアルコール抽出したプロポリス抽出物が特に好ましい。さらに、担子菌類としては、上記同様、ラッカーゼ活性を有するアガリクス、冬虫夏草、カバノアナタケ、霊芝などあらゆる種類のものが使用可能である。
【００３３】
この発酵処理では、上記同様、担子菌類の菌糸体の培養に適した培地、培養温度、培養期間等の処理条件を適宜選択すればよく、担子菌類の菌糸体をより早く増殖させることが可能な培地を選択することが好ましい。
【００３４】
発酵処理を実施する時間、すなわち発酵時間は特に限定されないが、好ましくは０．１〜３００時間、より好ましくは０．１〜１５０時間、さらに好ましくは６〜４８時間である。発酵時間が０．１時間未満の場合、十分な量の新規な桂皮酸誘導体が得られないので好ましくない。逆に発酵時間が３００時間を超える場合、発酵時間のわりに十分な量の新規な桂皮酸誘導体が得られず、効率が悪く、結果として製造コストも上昇するため好ましくない。
【００３５】
発酵処理を実施する温度、すなわち発酵処理温度は特に限定されないが、好ましくは２５〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃、さらに好ましくは３５〜４５℃である。発酵処理温度が２５℃未満の場合、酵素活性が低く反応が遅くなり、逆に６０℃を超える場合、酵素が失活し反応が効率的でないため好ましくない。
【００３６】
例えば、発酵処理時のアルテピリンＣとして、アルテピリンＣ固形分２０質量％のアルコール溶液を使用する場合、発酵処理液中のアルテピリンＣ固形分の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜５質量％、より好ましくは０．０５〜３質量％、さらに好ましくは０．１〜１質量％である。アルテピリンＣ固形分の濃度が０．０１質量％未満の場合、菌糸体の栄養源としてアルテピリンＣが全て利用されてしまう可能性があり、またこの発酵物を製品とする場合、製品中におけるアルテピリンＣ含量が低くなってしまうため好ましくない。逆に５質量％を超える場合、アルテピリンＣの溶解性が悪くなると共に、アルコール濃度が濃くなることから、菌糸体の成長が悪く、ラッカーゼ活性も低下するため好ましくない。
【００３７】
分離方法としては、上記同様特に限定されず、例えば酢酸エチルなどの有機溶媒により抽出した後、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種カラムクロマトグラフィーを適宜組合せることにより行われる。
【００３８】
次に、プロポリス発酵物について説明する。
本実施形態のプロポリス発酵物は、担子菌類の菌糸体によりプロポリスを発酵処理してなり、上記新規な桂皮酸誘導体を含有している。プロポリス発酵物の形態は特に限定されず、発酵処理したままの液の形態であってもよいし、噴霧乾燥（スプレードライ）や凍結乾燥等の公知の乾燥処理を行った形態であってもよい。
【００３９】
プロポリス発酵物は、プロポリス単独、担子菌類の菌糸体単独又はその両方でそれぞれ発揮される抗癌作用よりも、飛躍的に高い抗癌作用を発揮する。プロポリス発酵物によって発揮される抗癌作用は、癌細胞及び癌化しつつある異常細胞のいずれに対しても有効である。このため、プロポリス発酵物は、抗癌剤として、或いは癌予防剤として健康食品、機能性食品、医薬品等に利用できる。
【００４０】
さて、本実施形態における作用について説明すると、新規な桂皮酸誘導体は、プロポリス又はアルテピリンＣに担子菌類の菌糸体を接種して発酵処理した後、分離することにより得られる。得られた新規な桂皮酸誘導体は、抗癌作用のある桂皮酸誘導体の基本骨格を有すると共に、２つの水酸基と１つのカルボキシル基とを有している。このような構造的な特徴を有することにより、良好な抗癌作用を発揮させることができるものと推測される。
【００４１】
また、プロポリスを担子菌類の菌糸体により発酵処理することで、プロポリス発酵物が得られる。該プロポリス発酵物は、プロポリス及び担子菌類の菌糸体が元来有している抗癌作用のある成分の他に、良好な抗癌作用のある新規な桂皮酸誘導体を含有している。それらの含有成分が相乗的に働くことで、飛躍的な抗癌作用を発揮させることができるものと考えられる。
【００４２】
前記実施形態によって発揮される効果について、以下にまとめて記載する。
・  本実施形態の新規な桂皮酸誘導体は、特に桂皮酸誘導体の基本骨格を有しており、良好な抗癌作用を発揮させることができる。
【００４３】
・  本実施形態の新規な桂皮酸誘導体の製造方法によれば、プロポリスがブラジル産のプロポリス原塊をアルコール抽出したものであり、桂皮酸誘導体を豊富に含有しているので、効率的に多量の新規な桂皮酸誘導体を提供することができる。また、本実施形態の製造方法によれば、担子菌類がアガリクスであり、高いラッカーゼ活性を有しているので、短時間で効率的に新規な桂皮酸誘導体を提供することができる。
【００４４】
・  本実施形態のプロポリス発酵物は、強い抗癌作用のあるアガリクスの菌糸体により抗癌作用のある桂皮酸誘導体が豊富なブラジル産プロポリスを発酵処理したものである。従って、強い抗癌作用のある成分が多量に含まれているので、他の担子菌類及びプロポリスを使用したものより、さらに飛躍的な抗癌作用を発揮させることができる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜プロポリスのエタノール抽出物の製造＞
ブラジル産のプロポリス原塊１．２ｋｇに９５質量％エタノール溶液４Ｌを加え、常温で１２時間エタノール抽出した後、珪藻土ろ過後に脱ロウすることにより、プロポリスのエタノール抽出物を得た。このエタノール抽出物を濃縮後、乳化剤（キラヤニンＳ−１００丸善化成（株）製、キラヤ抽出物２５質量％含有）を１０質量％添加し、プロポリス固形分２０質量％のエタノール抽出物を作製した。
【００４６】
＜プロポリス発酵物の製造＞
（実施例１、アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造１）
２．４ｇ／Ｌの濃度のポリデキストロースブロス（ＰＤＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養したアガリクス菌糸体（（有）ニューピアーズより子実体入手）を集菌し、乾燥させた。次に、乾燥菌糸体を１ｍｌあたり０．００３５ｇの濃度となるように０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁することにより、アガリクス培養液を調製した。続いて、ミニシェーカー（ＩＷＡＫＩ社製）を用いて、アガリクス培養液を２５℃、１００ｒｐｍで６日間振とうすることにより前培養した。次いで、上記プロポリス固形分２０質量％のエタノール抽出物を、酵素処理液におけるプロポリス固形分の濃度が０．５質量％となるように添加し、４０℃で３．５時間攪拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス懸濁液を凍結乾燥することによりプロポリス発酵物とした。
【００４７】
（実施例２、アガリクス菌糸体によるプロポリス発酵物の製造２）
ポテトデキストロースアガー（ＰＤＡ）（日水製薬（株）製）よりなる寒天培地を用いて、アガリクス菌糸体を２５℃、暗所で２〜３時間培養した。その後、寒天培地上で増殖したアガリクス菌糸体を掻き取り、２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地５０ｍｌを入れたフラスコに添加し、５〜１０日間静置することにより前培養した。次に、このフラスコ（乾燥菌糸体質量１１３ｍｇに相当）内の培地をＰＹＳ培地（０．３質量％ポリペプトン、０．３質量％酵母エキス、１質量％ショ糖；いずれもナカライテクス（株）製）５Ｌに添加し、ミニジャーファーメンター(高崎科学機器（株）製)にて、通気量０．５Ｌ／分、攪拌速度１００ｒｐｍの培養条件で１０〜１５日間通気培養（前培養）した。通気培養後の菌糸体を集菌後、０．２４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地に懸濁してアガリクス懸濁液を調製した。さらに、該アガリクス懸濁液に上記プロポリス固形分２０質量％のエタノール抽出物を、酵素処理液におけるプロポリス固形分の濃度が０．５質量％となるように添加し、４０℃で７２時間攪拌することにより、発酵処理を行った。発酵処理後のアガリクス懸濁液を凍結乾燥することによりプロポリス発酵物とした。
【００４８】
＜新規な桂皮酸誘導体の製造＞
（実施例３、プロポリスのエタノール抽出物から新規な桂皮酸誘導体の製造）
上記実施例２の方法により、プロポリスのエタノール抽出物からプロポリス発酵物を製造した。該プロポリス発酵物を酢酸エチルにて抽出した後、濃縮し、抽出物５．６ｇを得た。その抽出物をまず、下記条件（ａ）でＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより精製し、５０容量％メタノール溶出画分を回収した後、濃縮することにより溶出物８００ｍｇを得た。次いで、その溶出物を下記条件（ｂ）で分取高速液体クロマトグラフィー（略称分取ＨＰＬＣ）により精製し、リテンションタイム２０分付近のピークを分画した後、濃縮することにより溶出物１５３ｍｇを得た。最後にその溶出物を下記条件（ｃ）で分取ＨＰＬＣにより精製し、リテンションタイム３５分付近のピークを分画した後、濃縮することにより新規な桂皮酸誘導体５．２ｍｇを得た。該新規な桂皮酸誘導体の構造決定は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、異種核２次元ＮＭＲであるＣ−Ｈ  ＣＯＳＹ、同種核２次元ＮＭＲであるＨ−Ｈ  ＣＯＳＹ、遠隔Ｃ−Ｈ相関２次元ＮＭＲであるＨＭＢＣ、メチル、メチレン、メチン、４級炭素の区別を測定するＤＥＰＴ、ＭＳスペクトルを測定することによって行った。
【００４９】
それらの測定条件を以下に示し、測定結果を表１、表２、化３、及び図１に示す。なお、表１にプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体の１Ｈ−ＮＭＲのケミカルシフトの結果を、表２にプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体の１３Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフトの結果を示す。さらに、〔化３〕に式（２）で示される新規な桂皮酸誘導体の構造式と１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの帰属番号との関係を、図１にプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＭＳスペクトルの結果を示す。
【００５０】
条件（ａ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー
カラム：Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ−ＤＭ１０２０Ｔ、内径６０ｍｍ、長さ３００ｍｍ（富士シリシア化学（株）製）
溶出溶媒：水→水：メタノール（ｖ／ｖ）＝７０：３０→５０：５０→２０：８０→メタノール
溶出方法：ステップワイズにて各溶媒５００ｍｌずつ溶出
条件（ｂ）分取ＨＰＬＣ
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＡＣＲ、内径１０ｍｍ、長さ
２５０ｍｍ（資生堂（株）製）
溶出溶媒：水：メタノール：酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）＝２４：７５：１
流速：６ｍｌ／ｍiｎ
検出：３３０ｎｍ
条件（ｃ）分取ＨＰＬＣ
カラム：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ  ＡＣＲ、内径４．６ｍｍ、長
さ２５０ｍｍ（（株）資生堂製）
溶出溶媒：水：メタノール：酢酸（ｖ／ｖ／ｖ）＝４４：５５：１
流速：１ｍｌ／ｍiｎ
検出：３３０ｎｍ
各種ＮＭＲスペクトル条件
装置：ＭＥＲＣＵＲＹ  ３００  ＶＸ  ３００ＭＨｚ（ＶＡＲＩＡＮ社製）
溶媒：Ｍｅｔｈａｎｏｌ−ｄ４
ＭＳスペクトル条件
装置：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＰＩ３６５システム（アプライドバイオシステムズジャパン（株）製）
イオン化法：ターボイオンスプレーポジティブ
【００５１】
【表１】
2008000081.tif 000004
【００５２】
【表２】
2008000081.tif 000005
【００５３】
【化３】
2008000081.tif 000006
次に、プロポリス中の主成分の一つであるアルテピリンＣのみを発酵させたところ、実施例３に示したのと同様の新規な桂皮酸誘導体を得た。以下にその製造方法を示す。
【００５４】
＜プロポリスからアルテピリンＣの分離＞
固形分２０質量％のブラジル産プロポリスエタノール抽出物５１．５ｇを、下記条件（ｄ）でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、フラクション５〜１０を回収した後、濃縮することにより溶出物１３．４ｇを得た。次に、溶出物を下記条件（ｅ）でＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより精製し、フラクション２０〜２６を回収した後、濃縮することによりアルテピリンＣ濃縮物５．６６ｇを得た。最後に、純度を向上させるために、アルテピリンＣ濃縮物を下記条件（ｆ）で再度シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、フラクション１〜４を回収した後、濃縮してアルテピリンＣ３．８ｇを得た。
【００５５】
条件（ｄ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー
カラム：ＰＳＱ６０Ｂ、内径６０ｍｍ、長さ１００ｃｍ（富士シリシア（株）製）
溶出溶媒：クロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ）＝９５：５
溶出：１フラクションあたり２００ｍｌの溶出
溶出確認：薄層クロマトグラフィープレート（略称ＴＬＣプレート）（Ｍｅｒｃｋ社製）
条件（ｅ）ＯＤＳカラムクロマトグラフィー
カラム：Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ−ＤＭ１０２０Ｔ、内径４０ｍｍ、長さ５００ｍｍ（富士シリシア化学（株）製）
溶出溶媒：水：メタノール（ｖ／ｖ）＝２０：８０
溶出：１フラクションあたり１００ｍｌの溶出
溶出確認：薄層クロマトグラフィープレート（略称ＴＬＣプレート）（Ｍｅｒｃｋ社製）
条件（ｆ）シリカゲルカラムクロマトグラフィー
カラム：ＰＳＱ６０Ｂ（富士シリシア（株）製）
溶出溶媒：クロロホルム→クロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ）＝９９：１→９８：２→９５：５
溶出：１フラクションあたり１００ｍｌの溶出
溶出確認：薄層クロマトグラフィープレート（略称ＴＬＣプレート）（Ｍｅｒｃｋ社製）
（実施例４、アルテピリンＣから新規な桂皮酸誘導体の製造）
＜アガリクス菌糸体によるアルテピリンＣ発酵物の製造＞
ポテトデキストロースアガー（ＰＤＡ）（日水製薬（株）製）よりなる寒天培地を用いて、アガリクス菌糸体を２５℃、暗所で２〜３週間培養した。その後、寒天培地上で増殖したアガリクス菌糸体を掻き取り、２．４ｇ／Ｌの濃度のＰＤＢ培地５０ｍＬを入れたフラスコに添加し、２５日間静置培養した。ラッカーゼ活性が２００Ｕ／ｍｌ（基質としてのシリンガルダジンを含む反応溶液３ｍＬ（ｐＨ６．５、３０℃）中で、５３０ｎｍにおける吸光度を１分間に０．００１増加させる酵素活性の量を１Ｕ（ユニット）とする。）となるように調製した。その後、上記アルテピリンＣをエタノールに溶解した固形分２０質量％のアルテピリンＣエタノール溶液を、酵素処理反応系におけるアルテピリンＣ固形分の濃度が０．０７５質量％となるように添加し、４０℃で４８時間攪拌することにより発酵処理を行い、アルテピリンＣ発酵物を得た。なお、発酵処理の進行具合は、スタート時、６時間後、２４時間後、４８時間後の４点にてサンプリングして、そのサンプルのＨＰＬＣクロマトグラムを測定し、そのピーク面積の変化により確認した。その結果を表３に示す。
【００５６】
【表３】
2008000081.tif 000007
その結果、アルテピリンＣ発酵処理開始後、数時間で急激に減り（発酵処理開始後６時間でアルテピリンＣ残り１９質量％）、それに対応して新規桂皮酸誘導体が増えることがわかった。
【００５７】
＜アルテピリンＣ発酵物から新規な桂皮酸誘導体の分離＞
前記アルテピリンＣ発酵物を実施例３と同様な条件及び方法により精製し、新規な桂皮酸誘導体３．２ｍｇを得た。実施例３と同一の化合物であることは、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＰＬＣのリテンションタイム及びＵＶスペクトルの分析結果が一致したことにより判断した。表４にアルテピリンＣ発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体の１Ｈ−ＮＭＲのケミカルシフトの結果を、表５にアルテピリンＣ発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体の１３Ｃ−ＮＭＲのケミカルシフトの結果を示す。さらに、図２（ａ）にプロポリス発酵物のＨＰＬＣのクロマトグラムのチャートを、（ｂ）にアルテピリンＣ発酵物のＨＰＬＣのクロマトグラムのチャートを、図３（ａ）にプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＵＶスペクトルを、（ｂ）にアルテピリンＣ発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＵＶスペクトルを示す。なお、図２のピーク１は新規な桂皮酸誘導体のピークを表す。
【００５８】
【表４】
2008000081.tif 000008
【００５９】
【表５】
2008000081.tif 000009
次に、新規な桂皮酸誘導体の効果を調べるために、癌細胞増殖抑制試験を行った。以下にその試験方法とその結果を示す。
【００６０】
（実施例５、新規な桂皮酸誘導体の癌細胞増殖抑制作用）
白血病細胞株（ＨＬ６０細胞）（Ｓｉｇｍａ社製）を１０％ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍの略）含有ＲＰＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ社製）にて５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養を行った。１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌにて培養後、１２〜２４時間以内に５０μｇ／ｍｌの濃度となるように各試料を添加した。そしてさらに２４時間培養した後、トリパンブルー染色（Ｓｈｉｇｍａ社製）により生細胞数をカウントした。試料を入れない細胞の生存率を１００％とした時の各試料での生存率を評価した。なお、試料については１０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯに溶解後、水にて使用濃度まで希釈した。また、測定は、新規な桂皮酸誘導体を始め、比較例として公知の桂皮酸誘導体であるアルテピリンＣ、ドゥルパニン及びバッカリンの３種を含め、計４種に関して行った。その結果を表６に示す。
【００６１】
【表６】
2008000081.tif 000010
その結果、新規な桂皮酸誘導体は、公知の桂皮酸誘導体であるアルテピリンＣ、ドゥルパニン及びバッカリンと同程度の癌細胞増殖抑制作用を示した。また、その作用は、アルテピリンＣに次いで強いものであった。
【００６２】
さらに次に、新規な桂皮酸誘導体を含有するプロポリス発酵物の抗癌作用について調べた。以下にその試験方法とその結果を示す。
（実施例６、プロポリス発酵物の抗癌作用）
ｄｄＹ系マウスに継代されているＳａｒｃｏｍａ１８０細胞をマウス腹水より採取し、生理食塩水で目的の細胞濃度となるように調整した。次に、中部科学資材（株）より購入したｄｄＹ系雄性マウス（６週齢）の背部に、Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を１×１０７細胞／マウスの移植量となるように皮下移植した。Ｓａｒｃｏｍａ１８０細胞を移植したマウスを下記の５つの群に分けてそれぞれ投与した（一群が１０匹ずつ）。
【００６３】
第一群：生理食塩水
第二群：実施例１で集菌したアガリクス菌糸体の乾燥菌糸体を生理食塩水に懸濁したもの
第三群：プロポリスのエタノール抽出物を生理食塩水に懸濁したもの
第四群：前記乾燥菌糸体及びエタノール抽出物の混合物を生理食塩水に懸濁したもの
第五群：実施例１で得られたプロポリス発酵物を生理食塩水に懸濁したもの
投与は、表７に示したような投与量で、２８日間連続腹腔内投与した。移植後２８日目に各群のマウスから腫瘍を摘出し、その質量をそれぞれ測定した。その結果を表７に示す。なお、表７の#はｐ＜０．１、*はｐ＜０．０５、**はｐ＜０．０１を表している。ここで、ｐはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔという統計手法により、統計学的に意味がある差を数字で表している。通常、ｐ＜０．０５で有意差有りと言え、数字が小さいほうが有意差の度合いが大きいことを意味する。ここでの有意差の対象は生理食塩水投与群である。
【００６４】
【表７】
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その結果、アガリクス菌糸体投与群及びプロポリス発酵投与群では生理食塩水投与群と比較して、それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０１で有意に腫瘍質量が低下した。また、エタノール抽出物投与群及び混合物投与群では、生理食塩水投与群と比較して、いずれも腫瘍質量が低下する傾向が認められた（ｐ＜０．１）。これらの結果より、プロポリス発酵物は、エタノール抽出物、アガリクス菌糸体、及び両者の混合物よりも飛躍的に高い抗癌作用を有していることが確認された。
【００６５】
なお、本実施形態は、次のように変更して実施することも可能である。
・  プロポリス原塊に担子菌類の菌糸体を直接接種することにより、発酵処理を実施することも可能である。
【００６６】
・  新規な桂皮酸誘導体を含有するプロポリス発酵物は、抗癌作用以外の抗菌、抗酸化、免疫賦活、また生活習慣病やその他疾病の予防・改善・治療効果等の生理作用も発揮し得るため、抗癌剤及び癌予防剤以外の効果を有する健康食品や医薬品に利用することが可能である。
【００６７】
・  式（１）の化合物のカルボキシル基又はヒドロキシル基は、反応性が高い。従って、式（１）中のカルボキシル基又はヒドロキシル基の水素が、例えばナトリウム、カリウムといったアルカリ金属、又はマグネシウム、カルシウムといったアルカリ土類金属などに置換された式（１）の化合物の誘導体として利用することができる。
【００６８】
・  プロポリス発酵物とアルテピリンＣ発酵物とを混合して使用することもできる。
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・  前記担子菌類はアガリクスであることを特徴とする請求項２又は請求項３に記載の新規な桂皮酸誘導体の製造方法。このように構成した場合、アガリクスの高いラッカーゼ活性により、他の担子菌類の場合よりも、短時間で効率的に新規な桂皮酸誘導体を得ることができる。
【００６９】
・  前記プロポリスはアルテピリンＣが２〜６質量％含有されているブラジル産のプロポリス原塊をアルコール抽出した物であることを特徴とする請求項２に記載の新規な桂皮酸誘導体の製造方法。このように構成した場合、桂皮酸含量が高く、且つ効率良く抽出可能であることから、他の産地のプロポリス原塊、別の抽出法によるときよりも、効率的に多量の新規な桂皮酸誘導体を得ることができる。
【００７０】
・  前記発酵処理において、発酵時間が３．５〜７２時間、発酵処理温度が３５〜４５℃であることを特徴とする請求項２に記載の新規な桂皮酸誘導体の製造方法。このように構成した場合、容易に新規な桂皮酸誘導体が得られることに加え、発酵処理条件が適当であるので、効率的に新規な桂皮酸誘導体を得ることができる。
【００７１】
・  前記発酵処理において、発酵時間が６〜４８時間、発酵処理温度が３５〜４５℃であることを特徴とする請求項３に記載の新規な桂皮酸誘導体の製造方法。このように構成した場合、発酵処理条件が適当であるので、効率的に新規な桂皮酸誘導体を得ることができる。
【００７２】
・  前記担子菌類はアガリクスで、前記プロポリスはアルテピリンＣが２〜６質量％含有されているブラジル産のプロポリス原塊をアルコール抽出した物であることを特徴とする請求項４に記載のプロポリス発酵物。このように構成した場合、強い抗癌作用のある成分が多量に含まれているので、他の担子菌類及びプロポリスを使用したものより、さらに飛躍的な抗癌作用を発揮させることができる。
【００７３】
・  担子菌類の菌糸体によりアルテピリンＣを発酵処理してなり、請求項１に記載の式（１）で示される新規な桂皮酸誘導体を含有することを特徴とするアルテピリンＣ発酵物。このように構成した場合、アルテピリンＣ及び担子菌類の菌糸体が元来有している抗癌作用のある成分の他に、良好な抗癌作用のある新規な桂皮酸誘導体を含有している。従って、それらが相乗的に働くことで、プロポリス、担子菌類の菌糸体又は両者の混合物に比べて、飛躍的な抗癌作用を発揮させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】実施例３のプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＭＳスペクトルを示すチャート。
【図２】（ａ）は実施例２のプロポリス発酵物のＨＰＬＣクロマトグラムを示すチャート、（ｂ）は実施例４のアルテピリンＣ発酵物のＨＰＬＣクロマトグラムを示すチャート。
【図３】（ａ）は実施例３のプロポリス発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＵＶスペクトルを示すチャート、（ｂ）は実施例４のアルテピリンＣ発酵物から得られた新規な桂皮酸誘導体のＵＶスペクトルを示すチャート。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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