(57)【要約】      （修正有）【課題】糖鎖の生体内での役割を解明するためのツールを提供する。【解決手段】癌抑制遺伝子ファミリーの一つ、ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつＥＸＴＬ２遺伝子が正常に機能しない、野生型に比較してヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸の合成量が増大し、癌転移能が亢進されている非ヒト動物。また、該動物に癌細胞を投与した後、癌転移抑制剤候補物質を投与して、該抑制剤をスクリーニングする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物。
【請求項２】
前記ＥＸＴＬ２遺伝子のエキソン３の一部およびエキソン４の全てを含む領域が、相同組換えにより他の塩基配列に置換されている、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
野生型と比べてヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸の合成量が増大されている、請求項１または２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
癌転移能が亢進されている、請求項１から３のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記非ヒト動物が、齧歯目動物である、請求項１から４のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記齧歯目動物が、マウスである、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
癌転移抑制剤をスクリーニングする方法であって、請求項１から６のいずれかに記載の非ヒト動物の組織に癌細胞を投与する工程、該非ヒト動物に癌転移抑制候補物質を投与する工程、および該癌細胞を含む組織から異なる組織への癌の転移を検出する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＸＴＬ２遺伝子が正常に機能しない、すなわち、ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損している、非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカンに結合した硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖は、細胞の増殖、移動、分化、組織の形態形成などに必須の役割を演じる。特に、ヘパラン硫酸（ＨＳ）は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Wingless、またはヘッジホッグ（Hedgehog）のシグナル伝達に関与し、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）は、神経回路網の形成への関与が示唆されている。したがって、あるタンパク質にＧＡＧ鎖が付与されるメカニズムおよびどのようなＧＡＧ鎖が付与されるかを決定するメカニズムは、ＧＡＧ鎖の機能発現の調節を理解する上で極めて重要であるが、詳細については依然として不明な点が多い。
【０００３】
グルコサミノグリカン（ヘパリン／ヘパラン硫酸）およびガラクトサミノグリカン（コンドロイチン／デルマタン硫酸）のタンパク質への結合領域は、共通の四糖構造（GlcA-Gal-Gal-Xyl）からなり、キシロース（Xyl）を介して、コアタンパク質のセリン（Ser）に結合している。
【０００４】
ＨＳの生合成と癌抑制（ＥＸＴ）遺伝子ファミリーとの関連がこれまでに研究されてきている。ＥＸＴ遺伝子ファミリーは、遺伝性多発性外骨腫（ＨＭＳ）の発生と関連して発見され、癌抑制遺伝子と考えられている。このファミリーは、ＥＸＴ１、ＥＸＴ２、ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２、およびＥＸＴＬ３遺伝子を含む。ＥＸＴ１およびＥＸＴ２はそれぞれ、α1,4-GlcNAc転移酵素（GlcNAcT-II）およびβ1,4-GlcA転移酵素（GlcAT-II）の両活性を有するポリメラーゼであり、ＨＳの合成に必須である酵素をコードしている（非特許文献１）。ＥＸＴＬ１、ＥＸＴＬ２、およびＥＸＴＬ３もまた、ＨＳ合成に関与していると思われるGlcNAc転移酵素をコードしていることが知られている（非特許文献２および３）。ＥＸＴＬ１は、GlcNAcT-II活性を有し、ＥＸＴＬ２は、GlcNAcT-I活性を有し、そしてＥＸＴＬ３は、GlcNAcT-II活性およびGlcNAcT-I活性の両方を有する酵素をコードしている。ＥＸＴＬ２は、GlcA残基にα位でGalNAcを転移する活性を有する（非特許文献２）。また、ＥＸＴＬ２は、ＧＡＧ鎖の合成に際し、グリコサミノグリカン−タンパク質四糖結合領域のGlcA残基にα位でGalNAcを転移することでＧＡＧ鎖の伸長を制御していると考えられている（非特許文献２）。
【０００５】
また、これまで癌細胞の転移とＧＡＧ鎖の関係については様々な報告がなされている。特に、生体内でＨＳ鎖を分解する酵素の１つであるエンド−β−グルクロニダーゼ（へパラナーゼ）が、癌の転移において重要な働きをしている点について、既に多くの研究がなされている（非特許文献４）。
【非特許文献１】Senay, C.ら, EMBO reports, 1巻, 282-286, 2000年
【非特許文献２】Kitagawa, H.ら, J. Biol. Chem., 274巻, 13933-13937, 1999年
【非特許文献３】Kim, B-Tら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98巻, 7176-7181, 2001年
【非特許文献４】Nakajima, M.ら, J. Cell. Biochem., 36巻, 157-167, 1988年
【非特許文献５】Nagy, A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90巻, 8424-8428, 1993年
【非特許文献６】Kitagawa, H.ら, Glycobiology, 7巻, 531-378, 1997年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
糖鎖の生体内での役割を解明するためのツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物を提供する。
【０００８】
１つの実施態様では、本発明の非ヒト動物は、上記ＥＸＴＬ２遺伝子のエキソン３の一部およびエキソン４の全てを含む領域が、相同組換えにより他の塩基配列に置換されている。
【０００９】
別の実施態様では、本発明の非ヒト動物は、野生型と比べてヘパリン硫酸またはコンドロイチン硫酸の合成量が増大されている。
【００１０】
別の実施態様では、本発明の非ヒト動物は、癌転移能が亢進されている。
【００１１】
別の実施態様では、本発明の非ヒト動物は、齧歯目動物である。
【００１２】
さらなる実施態様では、上記齧歯目動物は、マウスである。
【００１３】
本発明はまた、癌転移抑制剤をスクリーニングする方法を提供し、上記非ヒト動物の組織に癌細胞を投与する工程、この非ヒト動物に癌転移抑制候補物質を投与する工程、および癌細胞を含む組織から異なる組織への癌の転移を検出する工程を含む。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物が提供される。この非ヒト動物は、野生型に比較してヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸の合成量が増大している。この非ヒト動物はまた、癌転移能が亢進されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明において、ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部の染色体上での欠損とは、染色体上のＥＸＴＬ２遺伝子の一部もしくは全部が欠損していることをいう。また、ＥＸＴＬ２遺伝子が正常に機能しないとは、野生型において発現されるＥＸＴＬ２を発現する機能が失われていることをいう。「ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない」ことは、例えば、遺伝子破壊によってもたらされ得る。このような遺伝子破壊は、ＥＸＴＬ２遺伝子領域の配列が改変されて、ＥＸＴＬ２遺伝子の正常な発現が阻害されていること、その結果、ＥＸＴＬ２タンパク質の正常な発現が抑制され、生体（特に肝臓）においてＥＸＴＬ２が正常に機能しないことをいう。領域の配列の改変としては、他の塩基配列との置換、部分配列の欠失、他の塩基配列の挿入による該領域の分断などが挙げられる。「ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない」とは、ＥＸＴＬ２遺伝子が正常に発現されない、あるいは、ＥＸＴＬ２遺伝子が本来の機能を発揮できない状態でのみ発現されることをいい得る。
【００１６】
ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物には、上記のようなＥＸＴＬ２遺伝子の改変を天然または人為的に生じている任意の非ヒト動物が含まれる。代表的には、ＥＸＴＬ２ノックアウト非ヒト動物（例えば、マウス）であり得る。
【００１７】
本発明における「野生型」の非ヒト動物とは、上記ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物と同種の非ヒト動物であって、ＥＸＴＬ２遺伝子非欠損型（すなわち、上記の遺伝子改変が生じていない）の動物をいう。例えば、マウスの場合を例に取ると、メンデルの法則に従い出生してくるＦ２マウスのうち、ＥＸＴＬ２非欠損型の同種のマウスをいう。これらＦ２マウスにおける欠損型とその野生型、特に同腹の野生型を同時に実験に供することによって、個体レベルで正確な比較実験をすることができる。
【００１８】
ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつ該遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物は、遺伝子ターゲッティング法などの公知の方法を用いて作製され得る。
【００１９】
以下、遺伝子ターゲッティング法を用いたＥＸＴＬ２遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作製方法を簡単に説明する。
【００２０】
（ターゲッティングベクターの作製）
まず、ターゲッティングベクターの作製のため、対象となる動物のＥＸＴＬ２遺伝子の一部を単離する。例えば、ノックアウトマウスを作製する場合は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリーからＥＸＴＬ２遺伝子をスクリーニングすればよい。スクリーニングの条件および方法は特に限定されない。スクリーニングに用いるプローブは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡからＰＣＲ法などを用いて容易に調製され得る。
【００２１】
上記スクリーニングにより得られたゲノムＤＮＡクローンを用いて、相同組換えのためのターゲッティングベクターを構築する。ゲノムＤＮＡクローンは遺伝子全長である必要はなく、ＥＸＴＬ２遺伝子を破壊し、その発現を抑制するために必要な領域のみクローニングすればよい。例えば、後述の実施例（マウス）に記載のように、ＥＸＴＬ２ゲノムＤＮＡのエキソン３から５を含む領域をサブクローニングし、エキソン３の一部およびエキソン４の全てを含む領域（特に、図１に示されるエキソンIIIのＥｃｏＲＩ部位からエキソンIVの下流のＨｉｎｄＩＩＩまでの領域）を、相同組換えにより他の塩基配列に置換することによってノックアウトマウスが作製され得る。
【００２２】
ターゲッティングベクターは、公知の方法により作製され得る。市販のプラスミド（例えば、pBK-RSV phagemidベクター（ストラタジーン社））をバックボーンとして、上記ゲノムＤＮＡクローン、ポジティブセレクション用のマーカー（例えば、ＰＧＫｎｅｏカセット）、およびネガティブセレクション用のマーカー（例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ−Ａ）またはヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ｔｋ））のような各フラグメントを適切に連結することにより作製され得る。ターゲッティングベクターは、目的とする制限酵素切断部位が適切な位置に配されるように設計され得る。また、ターゲッティングの効率は相同領域の長さに依存するので、相同領域はできるだけ長いほうが好ましい。さらに、ターゲッティングベクターは、直鎖状化のための相同領域以外の部分に一カ所適当な制限酵素切断部位が設けられ得る。
【００２３】
（ＥＸＴＬ２ノックアウト動物の作製）
ターゲッティングベクターは、受精卵、初期胚、または胚性幹細胞（ＥＳ細胞）のような個体形成能（分化全能性）を有する細胞にエレクトロポレーション法などにより導入され、次いで目的とする相同組換えを生じている細胞が選別され得る。選別は、ポジティブ−ネガティブ選択法により薬剤を用いて効率よくスクリーニングされ得る。選別後、目的とする相同組換えを生じている細胞は、例えばサザンブロットまたはＰＣＲ法によって確認され得る。最終的に所望の相同組換えが確認された細胞を、妊娠中の輸卵管または子宮から採取された８細胞期胚または胚盤胞（ブラストシスト）に導入する。８細胞期胚または胚盤胞への細胞の導入は、マイクロインジェクション法などにより行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００２４】
キメラ動物の作製に好ましい方法として、アグリゲーション法が挙げられる。アグリゲーション法とは、２個の８細胞期胚の透明帯を除去することにより、凝集しやすい状態にし、２個の胚の間にＥＳ細胞の塊を挟むことにより両者を凝集させ、１個の胚盤胞に分化させる方法である。うまく凝集した場合には、宿主となる受精卵と相同組換えされたＥＳ細胞由来の２種類の細胞で構成されるキメラ動物が誕生する。したがって、アグリゲーション法によれば、マイクロインジェクション法などの高度な技術を必要としないので、キメラ動物の生成がより容易であり得る。本方法のより具体的な手順については、例えば、非特許文献５に記載される。
【００２５】
上記８細胞期胚または胚盤胞を常法に従い仮親に移植する。仮親から生まれた生殖系列キメラ動物（好ましくは雄）と、野生型ＥＸＴＬ２遺伝子をホモで有する野生型動物（好ましくは雌）とを交配させることにより、第１世代（Ｆ１）として、相同染色体上の一方のＥＸＴＬ２遺伝子が相同組換えにより破壊されたヘテロ接合体（ＥＸＴＬ２＋／−）が得られ得る。さらに、これらヘテロ接合体同士を交配させることにより、第２世代（Ｆ２）として、相同染色体上の双方のＥＸＴＬ２遺伝子が破壊されたホモ接合体（ＥＸＴＬ２−／−）、すなわち、ＥＸＴＬ２ノックアウト動物が得られ得る。ホモ接合体の同定は、体の一部（例えば尻尾）を切断してＤＮＡを抽出し、例えば、サザンブロットまたはＰＣＲ法によって遺伝子型を判定することによって行われ得る。また、第２世代（Ｆ２）として、ＥＸＴＬ２ノックアウト動物と同腹の野生型動物（野生型遺伝子をホモで持つ；ＥＸＴＬ２＋／＋）が得られ得、この野生型動物は対照実験に好適に用いられ得る。
【００２６】
ＥＸＴＬ２ノックアウト動物の対象となる動物は、特に限定されないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどの哺乳動物が例示される。これらのうち、実験動物として用いるには、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットが好ましく、なかでも齧歯目がさらに好ましい。近交系が多数作出されており、受精卵の培養、体外受精などの技術が整っているマウスおよびラットが、特に好ましい。
【００２７】
（ＥＸＴＬ２遺伝子の機能が正常に機能しない非ヒト動物の有用性）
本発明の非ヒト動物は、野生型に比較して生体内でのヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸の合成量が増大されている。したがって、これらの糖鎖の生体内での役割を解明するために、重要なツールとなる。
【００２８】
本発明の非ヒト動物はまた、癌転移能が亢進されている。したがって、癌転移の解明のため、または癌転移の新しい治療方法の発見のためのツールとしても有用である。本ＥＸＴＬ２ノックアウト動物を用いることにより、例えば、癌の転移におけるヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸の役割に関する新たな発見、およびヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸、あるいはその生合成に関与する酵素を標的とした癌転移の新しい治療方法の開発が期待できる。
【００２９】
さらに、本発明によって、癌転移抑制剤をスクリーニングする方法が提供される。本方法は、上記非ヒト動物の組織に癌細胞を投与した後に、この非ヒト動物に癌転移抑制候補物質を投与し、そして癌細胞を含む組織から異なる組織への癌の転移を検出することによって行われ得る。癌細胞は、動物において通常用いられる癌細胞であればいずれでもよい。癌細胞を投与する組織は、便宜上、脾臓細胞が用いられ得る。癌転移の検出は、顕微鏡による観察、および癌細胞の計数によって行われ得る。
【実施例】
【００３０】
（材料）
以下の実施例中で特に入手先を明記していない材料の入手先は、次の通りである：KOD-Plus-DNA ポリメラーゼ、KOD  Dash（登録商標）DNA ポリメラーゼは、東洋紡績株式会社より購入した。QIAGEN plasmid midi prep kit は、QIAGEN社より購入した。ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢａｍＨＩは、New England Biolabs社より購入した。プロテナーゼＫは、和光純薬工業より購入した。Hybond N+ メンブレン、rediprimeTM II DNA Labeling System、Quick Prep Total RNA Extraction Kit、PD-10（登録商標）カラム、およびSuperdex TM 200 HR 10/30カラムは、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社より購入した。GENECLEAN（登録商標）III Kitは、フナコシ株式会社より購入した。Bio-Spin 30は、Bio-Rad株式会社より購入した。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、Sigma社より購入した。牛胎仔血清（ＦＢＳ）は、Thermo Trace社より購入した。M-MLV逆転写酵素およびオリゴdTプライマーは、Promega社より購入した。TaKaRa ExTM Taq DNAポリメラーゼは、タカラバイオ株式会社より購入した。M-PERTM Mammalian Protein Extraction Reagent、BCA Protein Assay Kitは、PIERCE社より購入した。[α-32P] dCTP 、UDP-[3H]GalNAc、およびDowex 1 x 8は、室町化学工業株式会社より購入した。Ｎ−アセチルコンドロシン（GlcAβ1-3GalNAc）は、生化学工業株式会社より購入したコンドロシン（GlcAβ1-3GalNH2）をＮ−アセチル化して用いた。AccellTM Plus QMA Cartridgeは、Waters社より購入した。Flavobacterium heparinum由来へパリチナーゼ（HSase）およびヘパリナーゼ（Hepase）、Proteus vulgaris由来コンドロイチナーゼABC（CSase ABC）は、生化学工業株式会社より購入した。コスモスピンフィルターＨは、ナカライテスクより購入した。ポリアミン結合シリカカラムYMC-Pack PA-03（4.6×250mm）は、MC株式会社より購入した。Ｂ１６／Ｆ１０メラノーマ細胞は、理化学研究所より寄与された。ネンブタール（登録商標）注射液は、大日本住友製薬株式会社より購入した。注射針（27G×3×4）、注射用１mLシリンジは、テルモ株式会社より購入した。縫合糸（ネスコスーチャー；GAD4SW、4-0、白、滅菌済み）は、アルフレッサファーマ株式会社より購入した。MILLEX（登録商標GP（0.22μm）は、MILLIPORE社より購入した。グルコースCII-テストワコーは、和光純薬工業より購入した。その他の試薬類は、ナカライテスクおよび和光純薬工業より特級試薬を購入した。
【００３１】
（実施例１：相同組換え体の単離）
図１は、本実施例のｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する模式図である。図中、上から順に、正常のｍＥＸＴＬ２遺伝子（EXTL2 wild type allele）、ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター（EXTL2 targeting vector）、相同組換え体（EXTL2 targeted allele）の構造をそれぞれ模式的に示す。相同組換え体は、ターゲッティングベクターの５’末端のＥｃｏＲＩとジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ−Ａ）の５’末端に隣接するＸｈｏＩとの間の配列がＥＳ細胞に内在する正常のｍＥＸＴＬ２遺伝子と相同組換えされたものである。図中の丸数字１〜３の矢印は、マウスの遺伝子型を判定するために用いたプライマーの位置を示している。１，m.EXTR-S1；２，m.EXTR-A3；３，pGK-NEO-S2。
【００３２】
まず、ターゲッティングベクターをQIAGEN plasmid midi prep kitのプロトコールに従い大量調製した。より詳細には、マウスＥＸＴＬ２（ｍＥＸＴＬ２）ｃＤＮＡを、マウス脳由来ｃＤＮＡ（クローンテック社より購入）を鋳型にmEXTL2-cDNA ５’（配列番号１；ｍＥＸＴＬ２遺伝子の開始コドンＡＴＧの上流−６１より−４０の領域にＸｂａＩ部位（配列中の１〜８位）を付加）およびmEXTL2-cDNA ３’（配列番号２；ｍＥＸＴＬ２遺伝子の開始コドンＡＴＧの下流１０３２〜１０５３の領域にＢａｍＨＩ部位（配列中の１〜８位）を付加）をプライマーとするＰＣＲによって調製した。マウスのゲノムＤＮＡライブラリー（クローンテック社より購入）より、このｍＥＸＴＬ２ｃＤＮＡをプローブとして用いるプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、ｍＥＸＴＬ２ゲノムＤＮＡを単離し、制限酵素マッピングおよびＤＮＡシーケンシングにより特定した。ターゲッティングベクターのバックボーンとしてプラスミドpBK-RSV phagemidベクター（ストラタジーン社）を用いた。得られたクローンの制限酵素マッピングおよびＤＮＡシーケンシング情報に基づいて、エキソン３のＥｃｏＲＩ部位とその上流のファージベクター由来のＮｏｔＩ部位との間の１．２ｋｂｐフラグメントと、エキソン４の下流のＨｉｎｄＩＩＩ部位とエキソン５の下流のＸｈｏＩ部位との間の６．１ｋｂｐフラグメントとをアームとして、このバックボーンプラスミドのＮｅｏ耐性遺伝子の両側に挿入し、ターゲッティングベクターを作製した（図１では、エキソンIII、IV、Ｖと表示）。なお、ターゲッティングベクターは、非相同領域にジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ−Ａ）を配置している。得られたターゲティングプラスミドをGENECLEAN（登録商標）III Kitにより精製した。
【００３３】
精製後のターゲッティングベクターを、ＮｏｔＩで消化し、直鎖状化した。ＮｏｔＩ消化後の溶液をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1, v/v/v）で処理し、クロロホルムで処理し、そしてエタノールで沈殿させ、タンパク質を除去した。次いで、この沈殿物をオートクレーブ済みの５mM Tris-HCl（ＴＥ）緩衝液（pH8.0）50μLに溶解した。この濃度は1.05mg/mLであり、260nm/280nm吸光度比は1.8であった。濃度はエチジウムブロミドの染色と吸光度測定との両方で確認した。
【００３４】
２０μｇのターゲッティングベクターを1.0×107個のＥＳ細胞と混和し、エレクトロポレーション法により遺伝子を導入した。ＥＳ細胞は、129マウス株由来のE14-1株を用いた。エレクトロポレーションは、Gene PulserTM（Bio-Rad社）を用い、250Ｖ、500μFの条件で１回パルスした。この際、ＤＮＡを加えないネガティブコントロールも同時に行った。エレクトロポレーションの２４時間後、選別試薬であるＧ４１８（250μg(active form)／mL）を含むＥＳ培地（最終濃度として0.1mM 非必須アミノ酸（ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液10mM（100×）；GIBCO:Cat.no.11140-050）、１mM ピルビン酸ナトリウム（ＭＥＭピルビン酸ナトリウム溶液100mM（100×）；GIBCO:11360-070）、0.1mM ２−メルカプトエタノール（1,000×）；GIBCO:21985-023）、50U/mL ペニシリン（Meiji：注射用ペニシリンＧカリウム２０万単位）、50μg/mL ストレプトマイシン（硫酸ストレプトマイシン明治・１ｇ(力価)）、15％ウシ胎仔血清、1,000U/mL LIF（CHEMICON；ESGRO 10e7/ml）、Ｄ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium（高グルコース・(-)ピルビン酸ナトリウム；GIBCO:12100-046）、炭酸水素ナトリウムでpH7.3に調整）に交換し、スクリーニングを開始した。以降、毎日培地交換し、肉眼でコロニーが確認できるようになり、さらにネガティブコントロールの細胞が完全に死滅した後、コロニーのピックアップを開始した。実体顕微鏡下で形態的に分化してないコロニーを１個ずつ拾い上げ、３７℃にて５分間、０．０５％（w/v）トリプシンで処理した。細胞塊は分化を誘導するために、トリプシン処理後の溶液をピペッティングにより十分に分散させ、２４穴フィーダープレートに移し、クローン化した。ピックアップ後の細胞を実体顕微鏡で観察し、７０〜８０％コンフルエントにまで増殖したクローンを３７℃にて５分間、０．０５％（w/v）トリプシンで処理し、続いてその溶液にＥＳ培地を加えることによりトリプシンの反応を止めた。溶液中のクローンをピペッティングでシングル細胞とし、次いでゼラチンコート済みの２４穴プレートに全量を移した。一部は２４穴フィーダープレートに移し、マスタープレートとした。残りのＥＳ細胞についてはそのまま２４穴プレートで培養し、シングルクローンの同定に用いた。その際、２４穴ゼラチンプレートのクローンとマスタープレートのクローンとを対応させた。
【００３５】
（実施例２：相同組換え体の同定）
（２−１．シングルクローンからのゲノムＤＮＡの抽出）
上記実施例１で得られたシングルクローン中の組換え体の有無を確認するため、クローンからゲノムＤＮＡを抽出および精製した。より詳細には、同定用に培養していた２４穴プレートの各クローンから液体培地を除去し、190μLのＳＥＴ緩衝液（50mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM EDTA-NaOH(pH8.0)、０．５％（w/v）ＳＤＳ）、および10μLのプロテナーゼＫ（10mg/mL）を加え、５５℃にて一晩インキュベートした。次いで、エタノール394μLおよび5M NaCl 6μLを加えて、沈殿させた。一時間放置後、２４穴プレートを傾けて上清を捨て、沈殿物を７０％（v/v）エタノールで３回洗浄した。これを５mM Tris-HCl（ＴＥ）緩衝液（pH8.0）に溶解し、ゲノムＤＮＡを得た。
【００３６】
（２−２．ＰＣＲによる相同組換え体の同定）
上記２−１にて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、以下に示す条件に従ってＰＣＲを行った。酵素としてKOD-Plus-DNAポリメラーゼを用い、９６℃で２０秒、７３℃で１６０秒、７３℃で２４０秒を１サイクルとして３５サイクル行った。また、使用するプライマーは、センスプライマーとしてm.L2-I2-S1（配列番号３）、アンチセンスプライマーとしてm.pGK-Neo Ps-2（配列番号４）を用いた。ＰＣＲ後の溶液を、エチジウムブロミドを含む１．０％アガロースゲルを用いて電気泳動した。その結果、以下の表１に示される１０個のクローンが相同組換え体として同定された。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
（２−３．サザンブロッティングによる相同組換え体の同定）
上記２−２で得た１０個のクローンの核型判定を以下のようにして行った。ＥＳ細胞をコルセミド処理してその有糸分裂を停止させ、ＥＳ細胞を低張液（0.56％（w/v）KCl）で処理し、次いでカルノア液（メタノール：酢酸＝３：１、v/v）で固定した。固定したＥＳ細胞液をスライドグラスに滴下して、染色体を展開させた。ギムザ液で染色体を染色して、展開された染色体の数を顕微鏡下でカウントした。マウスの正常な染色体数は、性染色体を含めて40本である。上記核型判定の結果、最も正常な染色体数に近かった（結果は示していない）２種のクローン（１２Ｃ５および５Ａ３）について、さらにサザンブロッティングにより相同組換え体であるかについて同定した。
【００３９】
５’末端側の相同組換えを確認するための５’検出用プローブおよび３’末端側の相同組換えを確認するための３’検出用プローブをＰＣＲ法により作製した。５’検出用プローブの作製には、センスプライマーとしてmEXTL2-KO ５’Southern（イントロン３）（配列番号５）、アンチセンスプライマーとしてmEXTL2-KO ３’Southern（エキソン３）（配列番号６）を用い、ターゲティングベクターを鋳型に、９６℃で２０秒、６８℃で６０秒、６８℃で１８０秒を１サイクルとして３５サイクル行った。酵素としては、KOD-plus-DNAポリメラーゼを用いた。３’検出用プローブの作製には、センスプライマーとしてmEXTR-S7（エキソン５）（配列番号７）、アンチセンスプライマーとしてmEXTR-A10（エキソン５）（配列番号８）を用いた。ＰＣＲ反応のために、鋳型としてｍＥＸＴＬ２のエキソン３からエキソン５までの配列を含むように調製したファージ１７を用い、酵素としてはKOD  Dash（登録商標）DNAポリメラーゼを用いた。反応条件としては、９８℃で１０秒、５１℃で３０秒、７２℃で６０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。ＰＣＲ後のＤＮＡを、GENECLEAN（登録商標）III Kitで精製した。それぞれ精製した約15ngのプローブを、rediprimeTM II DNA labeling Systemを用いて[α-32P]dCTPと３７℃にて６０分間インキュベートし、標識した。次いで、Bio-Spin 30に添付されたプロトコールに従って、未反応の[α-32P]dCTPを除いて、プローブを精製した。このようにして得られた５’検出用プローブおよび３’検出用プローブのサイズおよびｍＥＸＴＬ２ゲノムＤＮＡとハイブリダイズ可能な位置を図２に示す。５’検出用プローブは４９２ｂｐの長さを有し、エキソン３の配列とハイブリダイズ可能であり、そして、３’検出用プローブは１．０ｋｂの長さを有し、エキソン５の配列とハイブリダイズ可能である。図２には、ｍＥＸＴＬ２ゲノムＤＮＡ上の制限酵素の部位も併せて示す。
【００４０】
相同組換えが成功したことを確認するために、図２に示されるように５’末端側のためにＸｂａＩを、そして３’末端側のためにＡｆｌＩＩまたはＢａｍＨＩ＋ＡｆｌＩＩを用いて、得られる断片を検出した。図２に示されるように、５’末端側の確認においては、５’検出用プローブとのハイブリダイゼーションにより、組換え体であれば３．０ｋｂのバンドが出現し、非組換え体であれば５．５ｋｂのバンドが出現する。３’末端側の確認においては、３’検出用プローブとのハイブリダイゼーションにより、組換え体であればＡｆｌＩＩ処理で１９ｋｂのバンドおよびＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩ処理で１１ｋｂのバンドが出現し、非組換え体であれば両処理とも８．０ｋｂのバンドが出現する。上記実施例２−１にて抽出したゲノムＤＮＡ約10μgに対して上記の各制限酵素とともに一晩消化を行った。消化後の試料について、５’末端側の確認のために、１．０％アガロースゲルを用いて５０Ｖで６時間電気泳動した。他方、３’末端側の確認のために、０．７％アガロースゲルを用いて２５Ｖで２０時間電気泳動した。泳動後、１０×ＳＳＣ緩衝液の存在下でゲノムＤＮＡをHybond N+メンブレンに一晩かけて転写し、続いて、８０℃にて２時間インキュベートしてゲノムＤＮＡを乾燥固定した。次いで、上記の５’検出用プローブまたは３’検出用プローブを、固定したメンブレンとともに４２℃で一晩インキュベートすることによりハイブリダイズさせた。０．１％（w/v）ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣでメンブレンを洗浄し、BIOMAXTM MA（Kodak社）に２日間露光し、ＤＮＡのバンドを検出した。
【００４１】
図３は、１２Ｃ５クローン、５Ａ３クローン、および非相同組換え体ＥＳ細胞から抽出したゲノムＤＮＡについてサザンブロッティングを行った結果を示す電気泳動写真である。Ａは、ＸｂａＩ消化し３２Ｐ標識した５’検出用プローブを用いた検出、Ｂは、ＢａｍＨＩ／ＡｆｌＩＩ消化し３２Ｐ標識した３’検出用プローブを用いた検出、そしてＣは、ＡｆｌＩＩ消化し３２Ｐ標識した３’検出用プローブを用いた検出の結果を示す。検出されたバンドの大きさを示す指標として、同時に泳動したスタンダードの位置をそれぞれの写真の右側に示した。図中１、２、および３の番号はそれぞれ、１２Ｃ５クローン、５Ａ３クローン、非相同組換え体ＥＳ細胞を表す。
【００４２】
その結果、５’検出用プローブを用いた同定では、１２Ｃ５クローンおよび５Ａ３クローンともに、組換え体であることを示す３．０ｋｂのバンドが検出された（図３Ａ）。また、３’検出用プローブを用いた同定では、１２Ｃ５クローンにおいて、組換え体を示す１１ｋｂおよび１９ｋｂのバンドが検出された（図３Ｂ、Ｃ）。一方、５Ａ３クローンでは、１１ｋｂも１９ｋｂのバンドも検出されなかった。また、コントロールとして用いた非相同組換え体（野生型）ＥＳ細胞について、検出されたバンドの発色が他のＥＳクローンと比較して強かった理由としては、今回使用した野生型ＥＳ細胞由来のゲノムＤＮＡは実験の約半年前に寄与されたものであり、保存の間にゲノムＤＮＡ溶液が濃縮され、今回の検出に際して用いたＤＮＡ量が計算値よりも多くなってしまったためではないかと考えられた。
【００４３】
以上のように、１２Ｃ５クローンについては、ＰＣＲ法およびサザンブロッティング法の両方により相同組換えが確認され、さらに核型判定の結果より最も正常に近い染色体数を有していた（示していない）ことから、キメラマウスの作製に適したクローンであると考えられた。
【００４４】
（実施例３：キメラマウスの作製）
上記実施例２にて相同組換えが確認された１２Ｃ５クローンを用いて、非特許文献５に記載の方法に従って、アグリゲーション法によりキメラマウスの作製を行った。２個の８細胞期胚の透明帯を除去して凝集しやすい状態にし、これらの２個の胚の間にＥＳ細胞の塊を挟んで両者を凝集させ、１個の胚盤胞に分化させた。この胚盤胞を偽妊娠させた雌マウスの子宮に移植し、キメラマウスを出産させた。これにより、宿主となる受精卵と相同組換えされたＥＳ細胞由来細胞との２種類の細胞で構成されるキメラマウスを得た。
【００４５】
（実施例４：ｍＥＸＴＬ２欠損マウスの作製および出生したマウスの遺伝子判定）
誕生したキメラマウスのうち１０匹の雄のキメラマウスを野生型のC57BL/6J雌マウス１０匹とそれぞれ交配させ、Ｆ１へテロマウスを作製した。その結果、用いた雌マウス１０匹中８匹のマウスにおいて妊娠が確認され、誕生したＦ１へテロマウスについて遺伝子型を判定した。その結果、雄のキメラマウス８匹中５匹が、生殖細胞に相同組換え体をもつマウスであることを確認した。
【００４６】
さらに、Ｆ１へテロマウス（ｍＥＸＴＬ２＋／−）同士を交配させることにより自家繁殖させた。出生後のマウスについてそれぞれの遺伝子型を判定した。
【００４７】
マウスの遺伝子判定は、以下に示すように、ＰＣＲ法によって決定した。マウスの尾を先端より約１cm切断し、70μLのＨＭＷ緩衝液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、150mM NaCl、10mM EDTA-NaOH（pH8.0）、0.1％（w/v）SDS）および35μLのプロテナーゼＫ（10mg/mL）を含む溶液中で転倒混和しながら、５５℃にて１２時間インキュベートした。尾が溶解した後、700μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1, v/v/v）を加え、室温で１時間転倒混和し、5,000rpmで５分間遠心分離し、水層（上層）を新しいエッペンドルフチューブに回収した。この操作を二回繰り返し、最終的に200μLの水溶液に溶解したマウスゲノムＤＮＡを調製した。ゲノムＤＮＡを含む水溶液に、20μLの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび500μLの１００％（v/v）エタノールを加えてゲノムＤＮＡを沈殿させ、15,000rpmで１０分間遠心分離した。得られたＤＮＡを７０％（v/v）エタノール１mLで洗浄し、５mM Tris-HCl（ＴＥ）緩衝液（pH8.0）50μLに溶解した。尾より抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、野生型、組換え型の各アレルに特異的な配列からなるプライマーを用いることで、３種の遺伝子型（野生型、ｍＥＸＴＬ２＋／−、ｍＥＸＴＬ２−／−）を判定した。判定には１度のＰＣＲ反応により３種の遺伝子型が判別できるpolymerase chain reaction with confronting two-pair primers（ＰＣＲ−ＣＴＰＰ）法を用いた。（１）m.EXTR-S1（配列番号９）、（２）m.EXTR-A3（配列番号１０）、および（３）pGK-NEO-S2（配列番号１１）の３種の異なるプライマーをＰＣＲ反応溶液中で混合することにより、野生型では１．２ｋｂ、ヘテロ接合体（ｍＥＸＴＬ２＋／−）では１．２ｋｂおよび５５０ｂｐの２本、ホモ接合体（ｍＥＸＴＬ２−／−）では５５０ｂｐのバンドが検出されることより判定を行った（図１）。酵素は、KOD-Plus-DNAポリメラーゼを用いた。ＰＣＲ条件は、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で９０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。
【００４８】
その結果、１匹のヘテロマウスより平均８匹のマウスが誕生し、メンデルの法則に従う１：２：１の割合で野生型、ヘテロ接合体（ｍＥＸＴＬ２＋／−）、およびホモ接合体（ｍＥＸＴＬ２−／−）が得られた。
【００４９】
（実施例５：ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来ＭＥＦ細胞におけるｍＥＸＴＬ２の発現レベルの確認）
ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス（ホモ接合体）のｍＥＸＴＬ２の発現の確認を行うことを目的として、野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウト（ＫＯ）マウスより各々単離したマウス胎仔繊維芽細胞（ＭＥＦ細胞）において、ＲＴ（reverse transcription）−ＰＣＲ法を用いてｍＥＸＴＬ２の発現レベルを調べた。
【００５０】
野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス（ｍＥＸＴＬ２−／−）のそれぞれより、ＭＥＦ細胞を得た。ＭＥＦ細胞を１０ｃｍディッシュ上で１０％（w/v）ＦＢＳを含むＤＭＥＭで５％ＣＯ２存在下、３７℃にて、７０％〜８０％コンフルエントにまで培養した。次いで、細胞をセルスクレーパーにより単離した。回収した細胞をＰＢＳで洗浄し、Quick Prep Total RNA Extraction Kitに添付されたプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。調製したトータルＲＮＡの１μgを鋳型にオリゴｄＴプライマーおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写反応（３７℃にて６０分）を行い、ｃＤＮＡを調製した。
【００５１】
調製されたｃＤＮＡを鋳型にTaKaRa ExTM Taq DNAポリメラーゼおよびセンスプライマーとしてmEXTL2-RT-S1（配列番号１２）、アンチセンスプライマーとしてmEXTL2-RT-A1（配列番号１３）を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応条件としては、９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１０秒を１サイクルとして３０サイクル行った。また、ＲＴ−ＰＣＲ反応のポジティブコントロールとして、ハウスキーピング遺伝子の１つであるマウスグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ｍＧ３ＰＤＨ）の増幅を確認した。増幅したｍＥＸＴＬ２断片はアガロースゲル電気泳動法を用いて検出を行った。泳動はエチジウムブロミドを含む１％アガロースゲルを用いて、100Ｖで２０分間行った。
【００５２】
図４は、ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（wild）マウスのそれぞれより単離したＭＥＦ細胞についてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す電気泳動写真である。左から順に、ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（wild）マウスの結果を示す。上段は、ハウスキーピング遺伝子の１つであるマウスグリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素遺伝子（ｍＧ３ＰＤＨ）の発現を、下段は、ｍＥＸＴＬ２の発現について確認した結果を示した。また、写真の左外には、同時に泳動したスタンダードの位置を示した。どちらの細胞においても、コントロールとして用いたｍＧ３ＰＤＨ（２０５ｂｐ）に関しては同程度の発現が確認されたが、ｍＥＸＴＬ２（１５０ｂｐ）については、野生型の細胞からのみバンドが検出された。図４に示されるように、どちらの細胞においても同程度のｍＧ３ＰＤＨの発現が確認されたにもかかわらず、ｍＥＸＴＬ２については、野生型マウス由来ＭＥＦ細胞からのみ、ｍＥＸＴＬ２に相当する１５０ｂｐのバンドが確認された。このことからもｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスにおいて、ｍＥＸＴＬ２遺伝子が欠損していることが確認された。
【００５３】
（実施例６：ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来肝組織中のα-GalNAc転移酵素活性の測定）
ＥＸＴＬ２が有している活性の１つとして、GlcA残基にα位でGalNAcを転移する活性が知られている（非特許文献２）。したがって、ｍＥＸＴＬ２をノックアウトすることによって、検出されるα-GalNAc転移酵素活性にも変化が見られるのではないかと予想し、作製されたｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスを用いて、組織中のα-GalNAc転移酵素活性を測定した。
【００５４】
（６−１．糖転移酵素活性測定：反応条件）
約２０週齢のマウスより約100mgの肝臓組織を摘出し、哺乳動物細胞タンパク質抽出試薬であるM-PERTM 哺乳動物タンパク質抽出試薬を用いて溶解し、酵素源とした。最終濃度として、50mM MES-NaOH（pH6.5）、10mM MnCl2、25mM ATP-2Na、8.57μMの放射標識された糖供与体UDP-[3H]GalNAc（8.8kBq）を加えた条件下で、5nmolのＮ−アセチルコンドロシン（GlcAβ1-3GalNAc）を基質として酵素源と混合し、酵素反応溶液35μLを調製した。その後、37℃で１時間酵素反応を行い、酵素活性を測定した。
【００５５】
（６−２．糖転移反応生成物の測定：チップカラムアッセイ）
Ｎ−アセチルコンドロシンを糖受容体として用いた際の酵素反応生成物の単離には、非特許文献６の記載に従ってチップカラムアッセイを用いた。
【００５６】
上記６−１に示した条件で、酵素源を加えずに調製したコントロールおよび酵素源を加えて調製したサンプルについて各々２本ずつ反応を行った。反応終了後、５mMリン酸緩衝液（pH6.8）を各々１mLずつ加えて酵素反応液を希釈し、反応を停止させた。希釈液をブルーチップに充填した陰イオン交換樹脂（Dowex 1 x 8、PO42- form）１mLに添加し、さらに１mLの５mMリン酸緩衝液（pH6.8）で洗浄した。素通りした画分について全量の放射活性を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定した。糖転移活性は、（酵素源を加えて反応させたサンプル２本の平均）−（酵素源を加えていないコントロール２本の平均）＝（糖転移反応生成物）の計算式により算出した。また、同時に酵素源中に含まれているタンパク質量を、BCA Protein Assay Kitを用いて定量し、タンパク質１mgあたりの比活性を算出した。
【００５７】
以下の表２は、野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来肝組織中のα-GalNAc転移酵素活性を示す。Ｎ−アセチルコンドロシン（GlcAβ1-3GalNAc）を基質として、野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中のα-GalNAc転移酵素活性を比較した。
【００５８】
【表２】
2008193985.tif 000003
【００５９】
表２に示されるように、ノックアウトマウス由来肝組織において、野生型と比較してα-GalNAc転移活性が約半分にまで減少していた。
【００６０】
（実施例７：ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来肝組織中のＧＡＧ鎖の二糖組成分析）
ＥＸＴＬ２は、ＧＡＧ鎖の合成に際し、四糖結合領域のGlcA残基にα位でGalNAcを転移することでＧＡＧ鎖の伸長を制御していると考えられている（非特許文献２）。そこで、ＥＸＴＬ２のＧＡＧ鎖合成に関する生体内での機能を明らかにするため、野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスより抽出した肝臓組織中のヘパリン／ヘパラン硫酸（ＨＳ）鎖およびコンドロイチン硫酸（ＣＳ）鎖について、二糖組成分析を行った。
【００６１】
約８週齢のノックアウトマウスおよび同腹子の野生型マウスより肝臓組織を摘出した。摘出した各々の肝組織の重量を測定し、組織重量の５倍量のアセトンを加えてホモジナイズし、2,000rpmにて２分間遠心分離を行い、上清のアセトンを取り除いて脱脂した。さらに同様の操作を３回繰り返し、沈殿物を回収した。この回収した沈殿物を五酸化二リン存在下で数時間放置することにより風乾し、パウダー状にした。パウダー状にした各々の組織を蒸留水で可溶化し、全量１mL、最終濃度として10mM CaCl2、100μMホウ酸緩衝液（pH8.0）となるように調製し、あらかじめ活性化しておいたアクチナーゼＥを加え、60℃で一晩消化した。アクチナーゼＥの活性化は、試料重量（乾燥後）の1/50量のアクチナーゼＥを、10mM CaCl2を含む100μMホウ酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、次いで55℃で30分間反応させることにより行った。その後、最終濃度として５％（w/v）となるようにトリクロロ酢酸を加え、タンパク質を変性・沈殿させた。遠心分離により上清を回収し、この上清に試料と等量のエーテルを加え、エーテル層を除くことによりトリクロロ酢酸を除去した。この操作を３回繰り返し、１M Na2CO3で水層を中和した後、回収した水層に空気を吹きつけ、残ったエーテルを完全に除去した。続いて、５％（w/v）の濃度となるように酢酸ナトリウムを、さらに酢酸を加えてpH5.0とし、７０％（v/v）となるようにエタノールを加え、４℃で30分以上放置し、ＧＡＧ鎖を沈殿させた。3,500rpmで10分間遠心分離し、沈殿したＧＡＧ鎖を回収した。
【００６２】
得られたＧＡＧ画分に50mMのピリジン酢酸緩衝液（pH5.0）を１mL加えて溶解し、10,000rpmで５分間遠心分離後、上清を回収した。回収した上清を、同様の緩衝液およびPD-10（登録商標）カラムを用いたゲル濾過に供して、脱塩した。次いで、素通り画分を回収し、乾固し、0.15M NaClを含む300mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）を１mL加えて溶解し、AccellTM Plus QMAカートリッジを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、ＧＡＧ鎖を精製した。この際、溶離液として2.0M NaClを含む300mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）を用いた。溶出した画分を乾固し、次いで50mMピリジン・酢酸緩衝液（pH5.0）を１mL加えて溶解し、同様の緩衝液を用いてPD-10（登録商標）カラムを用いて脱塩した。次いで、素通り画分を回収し、乾固した。
【００６３】
乾固した試料に蒸留水100μLを加えて溶解し、そのうち10μLを採取し、蒸留水を加えて60μLとした。氷上で25mM四ホウ酸ナトリウム/硫酸溶液300μLを加えて攪拌し、100℃にて10分間反応させ、次いで氷冷した。さらに氷上で7.57mMカルバゾール／エタノール溶液を加えて攪拌し、100℃にて15分間反応させ、次いで氷冷した。反応物について、530nmでの吸収を測定した。また、グルクロン酸標準品を蒸留水に溶解して60μLとしたものについても同様の反応を行い、吸光度測定により検量線の作成を行った。これにより、試料中のウロン酸量を求め、その値からＧＡＧ二糖単位の総量を算出した。
【００６４】
算出したウロン酸量をもとに、ＧＡＧ鎖を二糖単位にして１nmol相当の試料を用いて、ＨＳ鎖の二糖組成を解析するためにヘパリチナーゼ／ヘパリナーゼ消化、またはＣＳ鎖の二糖組成分析のためにコンドロイチナーゼＡＢＣ消化を行った。ヘパリチナーゼ／ヘパリナーゼ消化については、試料を、最終濃度として２mM酢酸カルシウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）、ならびに各々0.5mIUのヘパリチナーゼおよびヘパリナーゼと混合して全量を20μLとして、37℃で２時間反応させた。コンドロイチナーゼＡＢＣ消化については、試料を、最終濃度として60mM酢酸ナトリウムを含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）および５mIUのコンドロイチナーゼＡＢＣと混合して全量を20μLとし、３７℃で１時間反応させた。消化後、それぞれの反応液を100℃で１分間加熱して、反応を停止させた。消化後のサンプルを凍結乾燥し、次いで350mM ２−アミノベンズアミド（2-AB）と１M NaCNBH3を含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）：氷酢酸＝７：３（v/v）混合液５μLを添加し、６５℃で２時間反応させて、消化により得られる二糖を蛍光標識した。さらに、試料を500μLの蒸留水に溶解し、同量のクロロホルムを加えて攪拌し、3,000rpmで１分間遠心分離し、下層のクロロホルム層を除去して未反応の2-ABを除いた。この操作を10回繰り返し、次いで凍結乾燥した。乾固後の試料を16mM NaH2PO4に溶解し、コスモスピンフィルターＨを用いて濾過し、ポリアミン結合シリカカラムYMC-Pack PA-03（4.6×250mm）を用いる陰イオン交換ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ条件としては、常温下、流速１mL／分、NaH2PO4濃度を60分間で16mMから530mMまでにする直線勾配をかけて溶出し、励起波長320nm、蛍光波長420nmでの2-ABの蛍光を、蛍光検出器（島津製作所、RF-10AXL）を用いて検出した。また、検出されたピークの同定および定量は、同じく2-AB化されたＨＳまたはＣＳ二糖の標準品の溶出位置と比較することにより行った。
【００６５】
ＨＳ鎖およびＣＳ鎖についての分析結果を、それぞれ以下の表３および表４に示す。
【００６６】
【表３】
2008193985.tif 000004
【００６７】
【表４】
2008193985.tif 000005
【００６８】
表３は、野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中の種々のＨＳ鎖の量を示し、そして表４は、種々のＣＳ鎖の量を示す。野生型と比較してｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中のＧＡＧ鎖の各二糖当たりの組成には大きな変化は見られなかった。しかし、合成されたＧＡＧ鎖の全二糖量について比較したところ、野生型のマウスと比較してｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスでは、ＨＳ鎖およびＣＳ鎖ともに増加していた。
【００６９】
（実施例８：ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来肝組織中のＧＡＧ鎖の鎖長解析）
上記実施例７で見られた全二糖総量の増加が、ＧＡＧ鎖の本数の増加または鎖長の増加のどちらによるものかを調べるため、ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来肝組織について、合成されたＧＡＧ鎖の鎖長を解析した。
【００７０】
約１２週齢の野生型およびノックアウトマウスの肝組織を用いたこと以外は、上記実施例７と同様にして、ＧＡＧ鎖を抽出および精製した。
【００７１】
精製したＧＡＧ鎖を蒸留水に溶解し、SuperdexTM 200 HR 10/30カラムを用いてＧＡＧ鎖を分子サイズ別に分離および回収した。ゲル濾過クロマトグラフィーの条件は、溶離液として0.2M NH4HCO3を用い、流速0.3ml／分で80分間流すことにより、各フラクション１mLずつ、３０フラクション分を回収した。回収した各フラクションを凍結乾燥し、次いで１mLの蒸留水を加え溶解した。この操作を３回繰り返すことにより、ゲル濾過に用いた緩衝液由来の塩を除去した。
【００７２】
上で得られたＧＡＧ鎖をフラクションごとに同量ずつ２本に分け、各々ヘパリチナーゼ／ヘパリナーゼまたはコンドロイチナーゼＡＢＣで消化して、二糖にまで分解した。反応条件として、ヘパリチナーゼ／ヘパリナーゼ消化については、試料を、最終濃度として２mM酢酸カルシウムを含む20mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）ならびに各々１mIUのヘパリチナーゼおよびヘパリナーゼと混合して全量20μLとして、３７℃で２時間反応させた。コンドロイチナーゼＡＢＣ消化については、試料を、最終濃度として60mM酢酸ナトリウムを含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH8.0）ならびに10mIUのコンドロイチナーゼＡＢＣと混合して全量を20μLとし、３７℃で２時間反応させた。消化後の二糖の蛍光標識およびＨＰＬＣによる検出は、上記実施例７と同様にして行った。
【００７３】
野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中のＨＳ鎖およびＣＳ鎖の鎖長解析の結果を、それぞれ図５Ａおよび図５Ｂに示す。図５ＡおよびＢとも、縦軸は、それぞれの二糖の量（pmol）を示し、横軸はサイズ別のフラクション番号を表す。図５ＡおよびＢに示されるように、ｍＥＸＴＬ２ノックアウト（ＫＯ）マウスは、同腹子の野生型（Ｗｔ）と比較して、ＨＳ鎖とＣＳ鎖ともに、合成されたＧＡＧ鎖の長さに違いは見られなかった。
【００７４】
（実施例９：Ｂ１６メラノーマ細胞を用いた癌細胞転移実験）
（９−１．Ｂ１６メラノーマ細胞の培養）
マウス皮膚由来転移性黒色腫であるＢ１６メラノーマ細胞を、１０％（w/v）ＦＢＳを含むＤＭＥＭで５％ＣＯ２存在下、１０ｃｍディッシュ上で約９０％コンフルエントにまで培養した。次いで細胞を０．１％（w/v）トリプシン／１mM ＥＤＴＡ処理によりデッシュ上より剥離し、無血清ＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞混濁液の濃度は、ＤＭＥＭ100μL中の細胞数が2.2×105個になるように調整した。
【００７５】
（９−２．Ｂ１６メラノーマ細胞のマウス脾臓への投与）
約２０週齢の野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス各々について、滅菌済ＰＢＳで５mg/mLに希釈したネンブタール（登録商標）注射液を１匹につき250〜300μLずつ腹腔内に投与することにより、麻酔を行った。数分後、麻酔がかかったことを確認し、マウスの左肋骨下を１センチほど開腹し、他の臓器を傷つけないように注意深く脾臓を取り出し、上記９−１で調製したＢ１６メラノーマ細胞を１匹につき100μLずつ投与した。次いで、脾臓を元の位置に戻し、腹腔膜と皮膚とを別々に縫合した。覚醒するまでしばらく様子を見た後、１４日間、通常の餌（F-2）を用いて飼育、観察を行った。１４日後、頸椎脱臼法によりマウスを安楽死させた後に肝臓を摘出し、実体顕微鏡下で転移したＢ１６メラノーマ細胞のコロニーの数を計測した。用いる器具、試薬などについては、全てオートクレーブにより滅菌処理した。
【００７６】
図６は、投与後１４日目の野生型およびノックアウトマウスの肝組織を示す顕微鏡写真であり、そして図７は、計測したコロニー数を表すグラフ（野生型（wild）、ｎ＝７；ノックアウト（ＫＯ）、ｎ＝９）である。野生型の肝組織では平均して約80個のメラノーマ細胞のコロニーが確認されたが、ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスの肝組織においては、野生型の約２倍の１５０個程度のＢ１６メラノーマ細胞の転移が確認された（図６および図７）。
【００７７】
（実施例１０：ｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス由来血漿中グルコース濃度の測定）
16時間絶食（水のみ摂取）させた約４週齢の野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスを用いた。糖負荷を行うために、100mg/mLに調製したグルコース溶液を用いて、マウス体重１ｇあたり２mgのグルコースを腹腔内投与した。用いたグルコース溶液は、粉末のグルコースを再蒸留水に溶解し、MILLEX（登録商標）GP（0.22μm）を用いて濾過滅菌した。（１）グルコース溶液投与前の空腹時、（２）グルコース溶液投与30分後、（３）投与60分後、（４）投与90分後、および（５）投与120分後の血中グルコース濃度を、以下のようにして測定した。
【００７８】
マウスの尻尾の先端から５mmほどをはさみで切断し、尻尾の根から先端にかけてマッサージするように血液を押し出し、血液約３〜４滴を滅菌済み500μLエッペンドルフチューブに回収した。回収後の血液をできるだけ速やかに４℃にて14,000rpmで30秒間遠心分離し、上清（血漿成分）約４μLを新しい滅菌済み500μLエッペンドルフチューブに移し、氷上で保存した。次いで、調製した血漿成分１μLとグルコースCII-テストワコーキットに添付されている反応試薬150μLとを混合し、室温で15分間インキュベートし、そして490nmでの吸光度を測定した。また、同時に同じくキットに添付されている標準グルコース溶液を用いて検量線を作成し、試料中のグルコース濃度を定量した。
【００７９】
図８は、グルコース溶液投与に関するＥＸＴＬ２ノックアウトマウスおよび野生型マウスの血漿中グルコース濃度の経時変化を示す。縦軸は、血漿中グルコース濃度（mg/dL）を示し、横軸は、投与後の時間（分）を表す。野生型（wild）は黒三角にて、およびノックアウトマウス（ＫＯ）は黒四角にて表し、グルコース溶液投与前の空腹時、投与後30分、60分、90分、および120分の各マウスの血漿中クルコース濃度を示している。測定には、野生型およびノックアウトマウス共に５匹ずつを用いた（ｎ＝５）。ノックアウトマウス血漿中グルコース濃度は、野生型と同等の値を示した（図８、０分時の値）。また、グルコース投与120分後の値も野生型とノックアウトマウスとの間でほぼ変わらず、いずれも血漿中グルコース濃度は正常値（空腹時）近くにまで回復していた。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
ＥＸＴＬ２遺伝子の少なくとも一部が染色体上で欠損し、かつＥＸＴＬ２遺伝子が正常に機能しない非ヒト動物は、野生型に比較してヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸の合成量が増大しており、糖鎖の生体内での役割を解明するためのツールとして有用である。この非ヒト動物はまた、癌転移能が亢進されており、癌転移の解明のため、または癌転移の新しい治療方法の発見のためのツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】ＥＸＴＬ２ノックアウトマウスの作製に使用した遺伝子ターゲッティング法を説明する模式図である。
【図２】野生型およびＥＸＴＬ２ノックアウトマウスの制限酵素部位ならびに相同組換え体検出用プローブの位置およびそれらのサイズを示す模式図である。
【図３】１２Ｃ５クローン、５Ａ３クローン、および非相同組換え体ＥＳ細胞から抽出したゲノムＤＮＡについてサザンブロッティングを行った結果を示す電気泳動写真である。
【図４】ノックアウト（ＫＯ）マウスおよび野生型（wild）マウスそれぞれより単離したＭＥＦ細胞についてＲＴ−ＰＣＲを行った結果を示す電気泳動写真である。
【図５Ａ】野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中のＨＳ鎖の鎖長解析の結果を示すグラフである。
【図５Ｂ】野生型およびｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウス肝組織中のＣＳ鎖の鎖長解析の結果を示すグラフである。
【図６】投与後１４日目の野生型およびノックアウトマウスの肝組織の顕微鏡写真である。
【図７】投与後１４日目の野生型およびノックアウトマウスの肝組織で計測したコロニー数を表すグラフである。
【図８】グルコース溶液投与後のｍＥＸＴＬ２ノックアウトマウスおよび野生型マウスの血漿中グルコース濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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