(57)【要約】【課題】生体内の特定部位に埋入された後、ベクターが当該部位に留まる遺伝子導入材を提供することを目的とする。【解決手段】分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸との複合体が、連通性のある多孔質三次元網状構造の合成樹脂よりなる多孔体に保持されてなる遺伝子導入材。分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターは、好ましくはベンゼン環に対し３，４又は６分岐鎖が結合したものである。このベクターが核酸と複合体とされ、ソフトセグメント化ポリウレタン製の細棒体に含浸されて遺伝子導入材とされる。核酸はＨＧＦ肝細胞増殖因子などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸との複合体が、連通性のある多孔質三次元網状構造の合成樹脂よりなる多孔体に保持されてなる遺伝子導入材。
【請求項２】
請求項１において、前記ベクターは、多官能性化合物を核とし、この核に該分岐鎖として複数の高分子鎖が結合していることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項３】
請求項２において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が２，３，４又は６であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項４】
請求項２又は３において、高分子鎖がカチオン性であることを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求項４において、分岐鎖を構成する高分子鎖はビニル系ポリマーであることを特徴とするベクター。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、ベクターの分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記多孔体は、平均孔径１０〜６５０μｍ、見掛け密度０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３の、連通性のある多孔性三次元網状構造の熱可塑性樹脂よりなることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項８】
請求項７において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、シリコン樹脂、アクリル樹脂及びメタクリル樹脂並びにこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項９】
請求項８において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項１０】
請求項９において、該ポリウレタン樹脂がセグメント化ポリウレタン樹脂であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項において、核酸がＨＧＦ肝細胞増殖因子であることを特徴とする遺伝子導入材。
【請求項１２】
請求項１ないし１１のいずれか１項において、細棒状に成形されていることを特徴とする遺伝子導入材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクターと核酸との複合体を有する遺伝子導入材に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。外来ＤＮＡの導入のためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス又はヘルペスウイルスを含む多くのウイルスが、治療用遺伝子を運搬するように改変されて、遺伝子治療のヒトの臨床試験に使用されている。しかし感染及び免疫反応の危険性は依然として残されている。
【０００３】
ＤＮＡを細胞中に運搬するための非ウイルス系ベクターとして、本出願人はＷＯ２００４／０９２３８８にて分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターを提案している。このベクターは、拡散凝集対と複合体を形成させて生体内へ投与される。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来のベクターは、生体内に投与された後、血液、リンパ液などの流れによって生体内に拡散し易く、生体の特定組織に継続して作用を与えることができない。
【０００５】
本発明は、生体内の特定部位に埋入された後、ベクターが当該部位に留まる遺伝子導入材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明（請求項１）の遺伝子導入材は、分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸との複合体が、連通性のある多孔質三次元網状構造の合成樹脂よりなる多孔体に保持されてなるものである。
【０００７】
請求項２の遺伝子導入材は、請求項１において、前記ベクターは、多官能性化合物を核とし、この核に該分岐鎖として複数の高分子鎖が結合していることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３の遺伝子導入材は、請求項２において、核はベンゼン環であり、高分子鎖の数が２，３，４又は６であることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項４の遺伝子導入材は、請求項２又は３において、高分子鎖がカチオン性であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項５の遺伝子導入材は、請求項４において、分岐鎖を構成する高分子鎖はビニル系ポリマーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項６の遺伝子導入材は、請求項１ないし５のいずれか１項において、ベクターの分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項７の遺伝子導入材は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記多孔体は、平均孔径１０〜６５０μｍ、見掛け密度０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３の、連通性のある多孔性三次元網状構造の熱可塑性樹脂よりなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項８の遺伝子導入材は、請求項７において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、シリコン樹脂、アクリル樹脂及びメタクリル樹脂並びにこれらの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項９の遺伝子導入材は、請求項８において、該熱可塑性樹脂がポリウレタン樹脂であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項１０の遺伝子導入材は、請求項９において、該ポリウレタン樹脂がセグメント化ポリウレタン樹脂であることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項１１の遺伝子導入材は、請求項１ないし１０のいずれか１項において、核酸がＨＧＦ肝細胞増殖因子であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項１２の遺伝子導入材は、請求項１ないし１１のいずれか１項において、細棒状に成形されていることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の遺伝子導入材は、生体組織に埋入されるようにして使用される。この遺伝子導入材が埋入された生体組織の細胞が、遺伝子導入材の合成樹脂よりなる多孔体部分に浸潤し、遺伝子導入材が生体組織と一体化する。この浸潤し易い細胞は、貪食系細胞、細網管上皮細胞などである。これらの貪食系細胞や細網管上皮細胞は遺伝子導入材のＤＮＡを異物として取り込み（エンドサイトーシス）し易い。
【００１９】
核酸がＨＧＦ肝細胞増殖因子である場合、貪食系細胞や細網管上皮細胞にエンドサイトーシスされた後、そのままｍＲＮＡに転写され、ＨＧＦが合成される。このため、遺伝子導入材周囲の生体組織に対し遺伝子導入材から長期にわたって継続してＨＧＦが供給される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【００２１】
本発明の遺伝子導入材は、分岐鎖を有するカチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸との複合体が、連通性のある多孔質三次元網状構造の合成樹脂よりなる多孔体に保持されてなるものである。
【００２２】
[カチオン性ポリマー]
本発明で用いるカチオン性ポリマーは分岐鎖を有する。
【００２３】
好ましくは、分岐鎖が多官能性化合物好ましくはベンゼン環、ナフタレン、アントラセン又はピレンに複数個結合している。ベンゼン環の場合、この結合数は２〜６、特に２，３，４又は６であり、結合数が多い程効果的である。ナフタレンの場合、結合数は８まで可能であり、アントラセン、ピレンは１０まで可能である。
【００２４】
分岐鎖を結合させる核となるのはベンゼン環が好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２５】
分岐鎖としては、ビニル系モノマーの単独あるいは共重合体が好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２の重合体が好ましい。
【００２６】
この３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと上記の各ベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−を介して上記ビニル系モノマーの重合体が結合したカチオン性ポリマーが生成する。このベクターの分子量は５千〜５０万、特に５千〜５万とりわけ１万〜２万程度が好ましい。
【００２７】
このようにして生成したカチオン性ポリマーよりなるベクターが核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００２８】
分岐鎖はランダム共重合体又はブロック共重合体であってもよい。
【００２９】
分岐鎖を構成する高分子鎖は基端側に第４級アミンを有し、先端側に第３級アミンを有するものであってもよい。分岐鎖を結合させる核の近傍を４級アミンにし、その周囲を３級アミンにすれば、細胞傷害性の低減と遺伝子導入の高効率化が期待できる。４級アミンはベクターとして必須の要素であるカチオンではあるが、殺菌剤や抗菌コートなどにも使用されているように細胞傷害性があるので、周囲を３級とすることは細胞傷害性の点で有利である。
【００３０】
[核酸]
核酸の好ましい例としては、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。また、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００３１】
[核酸とベクターとの複合体]
カチオン性ポリマーよりなるベクターと核酸とを複合させるには、このベクターの濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対してカチオン性ポリマーを過剰量添加し、カチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００３２】
この複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、核酸含有複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００３３】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００３４】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００３５】
[多孔体]
本発明で用いる多孔体は、好ましくは、平均孔径１０〜６５０μｍで、見掛け密度が０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３の、連通性の、即ち、連続気孔性の多孔性三次元網状構造の合成樹脂、特に好ましくは熱可塑性樹脂よりなる。
【００３６】
この熱可塑性樹脂からなる多孔性三次元網状構造の平均孔径は１０〜６５０μｍで、見掛け密度は０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３であるが、好ましい平均孔径は１０〜４００μｍ、より好ましくは１０〜３００μｍである。見掛け密度としては０．０１〜０．５ｇ／ｃｍ３範囲内であれば、細胞生着性が良好で、優れた物理的強度を維持し、生体に近似した弾性特性が得られるが、好ましくは０．０１〜０．３ｇ／ｃｍ３、より好ましくは０．０１〜０．２ｇ／ｃｍ３である。
【００３７】
また、平均孔径の概念において、孔径の分布は単分散の方が好ましく、細胞の侵入に重要な孔径サイズである孔径１０〜２００μｍの孔の寄与率が高いことが望ましい。孔径１０〜２００μｍの孔の寄与率が１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、更に好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上あると、細胞が侵入し易く、また、侵入した細胞が接着、成長しやすいため、人工血管や人工食道など脈管代替物としての用途に有効である。
【００３８】
このような平均孔径、見掛け密度及び孔径分布の多孔性三次元網状構造であれば、細胞が容易に空孔部分へ浸透し、多孔性構造層へ細胞が接着、成長しやすい。
【００３９】
この熱可塑性樹脂としては、ポリウレタン樹脂、ポリアミド樹脂、ポリ乳酸樹脂、ポリオレフィン樹脂、ポリエステル樹脂、フッ素樹脂、シリコン樹脂、アクリル樹脂、メタクリル樹脂並びにそれらの誘導体を例示することができ、これらは１種を単独で使用しても良く、２種以上を併用しても良いが、好ましくは、ポリウレタン樹脂であり、中でもセグメント化ポリウレタン樹脂が抗血栓性や物理特性などの点でも優れた人工血管を得ることができ、好ましい。
【００４０】
セグメント化ポリウレタン樹脂は、ポリオール、ジイソシアネート及び鎖延長剤の３成分から合成され、いわゆるハードセグメント部分とソフトセグメント部分を分子内に有するブロックポリマー構造によるエラストマー特性を有するため、このようなセグメント化ポリウレタン樹脂を使用した場合に得られる人工血管は、弾性力学的に生体血管に近似なＳ−Ｓ曲線（低血圧領域では高いコンプライアンスで低弾性であり、高血圧領域では低血圧領域よりも低いコンプライアンスの高弾性である特性）を示す管状構造体に成形することも可能であり、抗血栓性や物理特性にも優れている。
【００４１】
また、熱可塑性樹脂が加水分解性又は生分解性を有するものであれば、生体移植後に徐々に分解、吸収され、最終的には生着した細胞を残したまま樹脂製の骨格基材自体を生体から排除することも可能である。
【００４２】
このような熱可塑性樹脂で構成される多孔性三次元網状構造部には、アルガトロパン、ピリジン，ニコチン，ニコチン酸，ニコチン酸エステル，ニコチン酸アミド，コラーゲンタイプI，コラーゲンタイプII，コラーゲンタイプIII，コラーゲンタイプIV，アテロ型コラーゲン，フィブロネクチン，ゼラチン，ヒアルロン酸，ヘパリン，ケラタン酸，コンドロイチン，コンドロイチン硫酸，コンドロイチン硫酸Ｂ，ヒドロキシエチルメタクリレートとジメチルアミノエチルメタクリレートの共重合体，ヒドロキシエチルメタクリレートとメタクリル酸の共重合体，アルギン酸，ポリアクリルアミド，ポリジメチルアクリルアミド及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される１種又は２種以上が保持又は単に含浸されていてもよい。
【００４３】
この多孔性三次元網状構造層を構築する熱可塑性樹脂からなる骨格基材自体にも微細な孔を設けてもよい。このような微細孔は、骨格表面を平滑な表面でなく複雑な凹凸のある表面とし、コラーゲンや細胞増殖因子などの保持にも有効であり、結果として細胞の生着性を上げることが可能である。ただし、この場合の微細孔は、本発明でいう多孔性三次元網状構造部の平均孔径の計算の概念に導入されるものではない。
【００４４】
[多孔体への核酸／ベクター複合体の保持]
上記多孔体に核酸／ベクター複合体を保持させるには、核酸／ベクター複合体の分散液を多孔体に含浸させるのが好ましい。分散液の濃度は１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ程度が好ましいが、これに限定されない。
【００４５】
分散液の液媒としては生食（生理食塩水）が好適である。
【００４６】
多孔体に保持させる核酸／ベクター複合体の保持量は、多孔体１．０ｍｍ3当たりに１μｇ〜１ｍｇ程度が好ましいが、これに限定されない。
【００４７】
[遺伝子導入材の形態]
本発明の遺伝子導入材は、生体の好ましくは筋に対し刺入または筋に設けた穴や切開部に挿入されるようにして埋入される。そのため、遺伝子導入材は直径０．１〜５．０ｍｍ特に０．５〜２．０ｍｍ、長さ１〜５０ｍｍ特に２〜２０ｍｍ程度の細棒ないしは針状とされるのが好ましい。この細棒ないし針は、長さ方向の全体において等径であってもよく、テーパ形など非等径であってもよい。
【００４８】
細棒ないし針の長手方向と直交方向の断面は、通常は円形とされるが、楕円形、角形、星型などであってもよい。また、扁平形状であってもよい。
【００４９】
[投与部位]
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい生体投与部位は、当該核酸の機能発現が求められるものであり、例えば心筋、平滑筋、繊維芽、骨格筋などである。
【００５０】
[投与方法]
本発明のベクターを用いた遺伝子導入材を生体の筋などに投与するには、筋などに遺伝子導入材を挿入するか筋などに微小な穴や切開部を設けておき、この穴や切開部に遺伝子導入材を挿入するのが好ましい。
【００５１】
[埋入後の遺伝子導入材の挙動]
生体の例えば筋に遺伝子導入材が埋入された場合、周囲の細胞が浸潤してきて遺伝子導入材と生体組織が一体化する。この浸潤し易い細胞は、貪食系細胞又は細網管上皮細胞である。この貪食系細胞又は細網管上皮細胞は、遺伝子導入材の核酸をエンドサイトーシスし易い。この細胞内にエンドサイトーシスされた核酸のＤＮＡがコードする蛋白が当該細胞から放出され続ける。
【００５２】
このＤＮＡがＨＧＦ肝細胞増殖因子などである場合、放出された蛋白によって血管新生作用が奏される。この蛋白は、投与された遺伝子導入材から継続して周囲組織に投与されるので、当該周囲組織を局所的に効率よく治療することができる。
【００５３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５４】
本発明の遺伝子導入材が適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
＜ベクターの合成＞
合成例１［３分岐型ベクターの合成］
まず、下記反応式（化１）に従って、ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを合成した。
【００５６】
【化１】
2008195680.tif 000002
【００５７】
即ち、ナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（10.3g,  46mmol,  Mw.225.31）を含むエタノール溶液50ml中に塩化ベンジル（4.8g,  38mmol,  Mw.126.58）を含むエタノール溶液10mlを窒素雰囲気下0℃で滴下した。反応溶液を室温で23時間撹拌した後、150mlの水を加え、ジエチルエーテルで抽出した（200ml×3回）。有機層を水洗いし（100ml×3回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。エバポレータを用いて減圧下で溶媒を留去し、ベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを得た（無色液体）。収量は17.6ｇ（収率93％）であり、1H-NMR：δ7.407〜7.271ppm(m,  5H,  Ar-H)δ4.540ppm(s,  2H,  Ar-CH2S)、δ4.082〜4.012ppm(ｑ,  2H,  -N-CH2-)、δ3.763ppm〜3.692ppm(ｑ,  2H,  -N-CH2-)、δ1.311〜1.252ppm(m,  6H,  -CH2-CH3)である。
【００５８】
次に、このベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートを用い、下記反応式（化２）に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させた。
【００５９】
【化２】
2008195680.tif 000003
【００６０】
即ち、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（3.9g,  24.96mmol,  Mw.156.23）とベンジルＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート（23.94mg,  0.1mmol,  Mw.239.41）の混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量1mW/cm2）を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去し、高分子を水に溶解し、凍結乾燥させた。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であり、1H-NMR：δ7.8〜7.4ppm(br,  1H,  -NH)、δ3.43〜3.0ppm(br,  2H,  -NH-CH2-CH2-)、δ2.4〜2.2ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,  6H,  -N-CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-CH2-)であった。
【００６１】
次に、下記反応式（化３）に従ってナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートと２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとを反応させ、２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンを合成した。
【００６２】
【化３】
2008195680.tif 000004
【００６３】
即ち、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレン（2g,  4.02mmol,  Mw.398.98）にエタノール（100ml）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（5.43g,  24.12mmol,  Mw.225.31）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始24時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンを得た（白色固体）。収量は3.03ｇ（収率98.4％）であり、1H-NMR：δ4.447ppm(s,  6H,  Ar-CH2S)、δ4.086〜4.015ppm(ｑ,  6H,  -N-CH2-)、δ3.746〜3.676ppm(ｑ,  6H,  -N-CH2-)、δ2.421ppm(s,  9H,  Ar-CH3)、δ1.324〜1.222ppm(m,  18H,  -CH2-CH3)であった。
【００６４】
この２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンに対し、下記反応式（化４）に従ってジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて３分岐型ベクターを合成した。
【００６５】
【化４】
2008195680.tif 000005
【００６６】
即ち、２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレン（20.14mg,  1.67mmol,  Mw.604.08）をクロロホルム（300μl）に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（1.6224g,  10.38mmol,  Mw.156.23）に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量1mW/cm2）を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H-NMR：δ7.7〜7.4ppm(br,  1H,  -NH)、δ3.4〜3.0ppm(br,  2H,  -NH-CH2-CH2-)、δ2.4〜2.3ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-NR2)、δ2.3〜2.1ppm(br,  6H,  -N-CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-CH2-)であった。
【００６７】
合成例２［４分岐型ベクターの合成]
まず、下記反応式（化５）に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。
【００６８】
【化５】
2008195680.tif 000006
【００６９】
即ち、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼン（1g,  2.22mmol,  Mw.449.83）にエタノール（100ml）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（4g,  17.76mmol,  Mw.225.31）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始48時間後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケータにて真空乾燥させて１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量1.48ｇ（収率91.4％）。1H-NMR測定をした結果、δ7.487ppm(s,  2H,  Ar-H)、δ4.573ppm(s,  8H,  Ar-CH2S)、δ4.065〜3.994ppm(q,  8H,  -N-CH2-)、δ3.765〜3.687ppm(q,  8H,  -N-CH2-)、δ1.304〜1.256ppm(t,  24H,  -CH2-CH3)であった。
【００７０】
次に、下記反応式（化６）に従い、この１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて４分岐型ベクターを合成した。
【００７１】
【化６】
2008195680.tif 000007
【００７２】
即ち、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（18.08mg,  1.25mmol,  Mw.723.30）をクロロホルム（300μl）に溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（1.326g,  8.49mmol,  Mw.156.23）に加えた。この混合物をメタノールで希釈し、全量20mlの溶液を調製した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量1mW/cm2）を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H-NMR：δ7.8〜7.4ppm(br,  1H,  -NH)、δ3.4〜3.0ppm(br,  2H,  -NH-CH2-CH2-)、δ2.4〜2.2ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,  6H,  -N-CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-CH2-)であった。
【００７３】
合成例３［６分岐型ベクターの合成］
まず、下記反応式（化７）に従って、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。
【００７４】
【化７】
2008195680.tif 000008
【００７５】
即ち、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼン（1g,  1.57mmol,  Mw.635.68）にエタノール（200ml）とナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートトリハイドレート（6.36g,  28.23mmol,  Mw.225.31）を加えて、室温で撹拌した。撹拌開始4日後、ろ過して沈殿を回収した。回収した沈殿をクロロホルムに溶解し、水で分液洗浄した。クロロホルム層をエバポレータにて濃縮し、デシケーターにて真空乾燥させてヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを得た（白色固体）。収量は1.48ｇ（収率90.2％）であり、1H-NMR：δ4.565ppm(s,  12H,  Ar-CH2S)、δ4.012〜3.988ppm(q,  12H,  -N-CH2-)、δ3.731〜3.708ppm(q,  12H,  -N-CH2-)、δ1.307〜1.261ppm(m,  36H,  -CH2-CH3)であった。
【００７６】
次に、下記反応式（化８）に従い、このヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンにジメチルアミノプロピルアクリルアミドを重合させて６分岐型ベクターを合成した。
【００７７】
【化８】
2008195680.tif 000009
【００７８】
即ち、ヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン（17.43mg,  0.83mmol,  Mw.1045）を少量のクロロホルムに溶解し、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（3.9g,  24.96mol,  Mw.156.23）に加えた。この混合物をクロロホルムで希釈し、全量20mlの溶液を調整した。この溶液に窒素ガスを吹き込みながら撹拌し、紫外光（光量1mW/cm2）を照射した。紫外光照射30分後、重合溶液をエバポレータにて濃縮し、大量のジエチルエーテルに滴下することで高分子を析出させた。デカンテーションにより上澄み液を除去した後、高分子を水に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、GPCにて得られた高分子の分子量を測定したところ、約18,000であった。また、1H-NMR：δ7.8〜7.4ppm(br,  1H,  -NH)、δ3.43〜3.0ppm(br,  2H,  -NH-CH2-CH2-)、δ2.4〜2.2ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-NR2)、δ2.2〜2.1ppm(br,  6H,  -N-CH3)、δ1.8〜1.5ppm(br,  2H,  -CH2-CH2-CH2-)であった。
【００７９】
＜核酸／ベクター複合体の形成＞
各ベクター（2.36mg,  M.w.18,000）をそれぞれトリス−ＨＣｌ−バッファー（2ml）に溶解した。この溶液を50μl採取し、トリス−ＨＣｌ−バッファーを加えて希釈し、全量500μlのベクター溶液とした。別に、ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミ（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）の0.2μg/μl溶液90μlに２×バッファー溶液（450μl）を加え、全量540μlのDNA溶液を調製した。DNA溶液（100μl）にベクター溶液（67μl）を加え（カチオン性高分子の正電荷量とDNAの負電荷量の比は１：１）、37℃で24時間静置させ、核酸含有複合体を形成させた。
【００８０】
動的光散乱測定によりポリイオンコンプレックスの粒径測定を行なった結果、各カチオン性高分子はDNAと混合直後にポリイオンコンプレックスを形成した。キュムラント解析による粒径では約250nmのナノ粒子を生成しており、24時間後も安定であるとわかった。
【００８１】
＜多孔体の製造＞
熱可塑性ポリウレタン樹脂（日本ミラクトラン社製，ミラクトランＥ９８０ＰＮＡＴ）をＮ−メチル−２−ピロリジノン（関東化学社製，ペプチド合成用試薬，ＮＭＰ）にディゾルバー（約２，０００ｒｐｍ）を使用して室温下で溶解して５．０％溶液（重量／重量）を得た。このＮＭＰ溶液約１．０ｋｇをプラネタリーミキサー（井上製作所製，２．０Ｌ仕込み，ＰＬＭ−２型）に秤量して入れ、ポリウレタン樹脂と同重量相当のメチルセルロース（関東化学社製，試薬，２５ｃｐグレード）を４０℃で２０分間混合し、その後攪拌を継続したまま１０分間、２０ｍｍＨｇ（２．７ｋＰａ）まで減圧して脱泡し、ポリマードープを得た。
【００８２】
化学実験用濾紙（東洋濾紙社製，定性分析用，２番）で作成した内径４ｍｍφ，外径６ｍｍφ，長さ６０ｍｍの筒状の紙管と、ＳＵＳ４４０製の直径２ｍｍφの芯棒と、この芯棒を紙管の中心部分に固定できる医用ポリプロピレン樹脂製の円柱状密栓から構成させるチューブ成形治具中に、上記ポリマードープを２３ゲージの針を使用して射出注入し、その後密栓した後、還流状態にあるメタノール中へ投入して７２時間還流を継続して、紙管面から内部のＮＭＰ溶媒を抽出除去することによりポリウレタン樹脂を凝固させた。この際、メタノールは還流状態を維持したまま、随時新液と交換した。７２時間後、チューブ成形治具を還流状態のメタノールから乾燥させることなく室温下のメタノール浴中に移し、浴内でチューブ成形治具から内容物を取り出し、日本薬局方精製水中で７２時間洗浄することによりメチルセルロース、メタノール及び残留するＮＭＰを抽出除去した。洗浄用の水は随時新液を供給した。これを室温下で２４時間減圧（２０ｍｍＨｇ（２．７ｋＰａ））乾燥させて、管状の多孔性三次元網状構造体を製造した。これを切断して直径１ｍｍ、長さ１０ｍｍの細棒上の軟質ポリウレタン多孔体（以下、ＳＰＵスポンジということがある。）とした。
【００８３】
得られたＳＰＵスポンジについて、下記方法により平均孔径及び見掛け密度の測定を行った。なお、平均孔径と見掛け密度の測定において、試料の切断は両刃カミソリ（フェザー社製，ハイステンレス）を使用して室温下で行った。
【００８４】
（１）平均孔径の測定
両刃カミソリで切断した試料の平面（切断面）を実体顕微鏡（キーエンス社製，ＶＨ−６３００）にて撮影した写真を使用して、同一平面上の個々の孔を三次元網状構造の骨格から包囲された図形として画像処理（画像処理装置はニレコ社のＬＵＺＥＸ  ＡＰを使用し、画像取り込みＣＣＤカメラはＳＯＮＹのＬＥ  Ｎ５０を使用した。）し、個々の図形の面積を測定した。これを真円面積とし、対応する円の直径を求め孔径とした。多孔体の骨格部分に穿孔した微細孔を無視して同一平面上の連通孔のみを測定した結果、平均孔径は１６９±５５μｍと計測された。同時に、孔径分布における孔径１５０〜３００μｍの寄与率は７１．２％と計測され、細胞接着に有効なサイズの孔を主体とする多孔体であることが確認された。
【００８５】
（２）見掛け密度の測定
約１０ｍｍ長さに両刃カミソリで切断した試料を投影機（Ｎｉｋｏｎ，Ｖ−１２）にて測定して得た寸法より体積を求め、その重量を体積で除した値から求めた結果、０．０７７±０．００２ｇ／ｃｍ３と計算された。
【００８６】
＜核酸／ベクター複合体のＳＰＵスポンジへの含浸＞
上記の各核酸／ベクター複合体の分散液を上記ＳＰＵスポンジへ含浸させた。含浸量は０．８ｍｇ／ｍｍ3である。
【００８７】
＜ＳＰＵスポンジの生体への埋入及び摘出＞
通常手技によって局所麻酔、剃毛されたウサギ背部の表皮をイソジン消毒後に速やかに約３０ｍｍ切開し、上記の細棒状のＳＰＵスポンジ（核酸／ベクター複合体は含浸させてない）を骨髄穿刺用針内に挿入した。生理食塩水で針内部を濡らしてＳＰＵスポンジの摺動性を確保しながら盲栓用のピンで押し出すことによってウサギ皮下組織に埋入した。縫合部位はイソジンにて１日２回の消毒を行い、水は自由給水とし、飼料としてオリエンタル酵母社製ＯＲＣ４を体重に応じて適量給仕した。
【００８８】
埋入期間中、穿刺部及び埋入皮下組織において感染や炎症の所見は認められず、抗生物質は一切使用する必要がなかった。埋入から６週間経過後に摘出した。ＳＰＵスポンジは周辺組織と境界がはっきりしているレベルで癒着し、血管が入り込んでいたが、簡単に剥離することができた。外周部の全面を被覆するように厚みのある組織体が形成されており、ＳＰＵスポンジの内部も組織が浸潤して器質化されていた。病理所見では繊維芽細胞など貪食系の細胞が選択的に優先して入り込んでいることが分かった。