(57)【要約】【課題】酸化還元電位の変化を高感度にかつ時間分解的に検出することが可能な酸化還元感受性化合物を提供する。【解決手段】酸化還元反応により蛍光スペクトルが可逆的に変化する第１の蛍光発色団と、前記第１の蛍光物質と相互作用することにより蛍光スペクトルが変化する第２の蛍光発色団と、前記第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結する連結基とを有する化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元反応により蛍光スペクトルが可逆的に変化する第１の蛍光発色団と、
前記第１の蛍光発色団と相互作用することにより蛍光スペクトルが変化する第２の蛍光発色団と、
前記第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結する連結基と、
を有する酸化還元感受性化合物。
【請求項２】
前記相互作用が、光誘起電子移動及び蛍光共鳴エネルギー移動から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１に記載の酸化還元感受性化合物。
【請求項３】
前記第１の蛍光発色団が、イソアロキサジン誘導体残基であることを特徴とする請求項１又は２に記載の酸化還元感受性化合物。
【請求項４】
前記第１の蛍光発色団が、下記一般式（Ｉ）で表される化合物に由来する化合物残基であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【化１】
2008239615.tif 000024
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアリール基を表す。］
【請求項５】
前記第２の蛍光発色団が４００ｎｍ〜７００ｎｍに分光吸収を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【請求項６】
前記第２の蛍光発色団が、下記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【化２】
2008239615.tif 000025
［式中、Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１８は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基又は複素環基を表す。］
【請求項７】
前記連結基が、アミド結合、チオアミド結合、ウレイド結合およびチオウレイド結合から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【請求項８】
下記一般式（ＩＶ）で表されるイソアロキサジン誘導体。
【化３】
2008239615.tif 000026
［式中、Ｒ４１〜Ｒ４６は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｌは２価の連結基を表し、Ｄは蛍光発色団を表す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化還元感受性化合物及びイソアロキサジン誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内では様々な酸化還元反応が起きており、その中で最も重要なものの一つは、タンパク質システイン残基上のチオール基の酸化還元反応である。通常、細胞内は還元的な状態にあり、ジスルフィド結合はほとんど見られない。例えば、ＨｅＬａ細胞の細胞質の酸化還元電位（以下特記しない限り、標準水素電極（ｖｓ．ＳＨＥ）に対する、ｐＨ７．０、２５℃における値を意味する）は−０．２９Ｖである。細胞が酸化ストレスを受けると、タンパク質システイン残基上のチオール基はジスルフィド基へと酸化されてタンパク質の高次構造が大きく変化し、種々の酵素の活性は著しく低下する。このため、過度の酸化ストレスを受けた細胞は機能障害を起こして、細胞死につながる場合もある。また、このようなチオール基の酸化還元を含む局所的で微少な酸化還元状態の変化は、アポトーシス、細胞の増殖分化、抗酸化物質の誘導等に関与するなど、種々の細胞機能に関わるシグナル伝達の成立に重要な役割を果たしていることがわかっている。このように、近年細胞内の酸化還元状態の重要性についての認識が深まっており、細胞内の微妙な酸化還元状態変化、とりわけチオール基の可逆的な酸化還元反応を、非破壊的かつ時間分解的に観測するための有効な技術の開発が必要となっている。
【０００３】
これまで、細胞内の活性酸素種や活性窒素種による酸化ストレスを非破壊的かつ時間分解的に測定評価する方法として、蛍光性色素前駆体を細胞内に導入し、活性酸素種や活性窒素種によって非可逆的に生成される蛍光性色素を利用する方法が開発されている（例えば、特許文献１、非特許文献１〜２参照）。
また、活性酸素種や活性窒素種による化学発光を蛍光共鳴エネルギー移動によって長波長の蛍光として検出可能な化学発光試薬が知られている（例えば、特許文献２参照）
更に、チオール類の酸化還元を含む生体内での微妙な酸化還元状態の変化を非破壊的かつ時間分解的に測定する手法としては、分子内のチオール基の可逆的酸化還元反応により蛍光強度が変化する蛍光指示薬を用いる方法が知られている（例えば、特許文献３、非特許文献３〜４）。
【特許文献１】特開２００３−２７７３８５号公報
【特許文献２】特開２００６−１２６１５２号公報
【特許文献３】特表平１０−５０９８８１号公報
【非特許文献１】J. Immun. Methods, 2002, Vol.265, pp.49-72
【非特許文献２】J. Am. Chem. Soc., 2004, Vol.126, pp.15392-15393
【非特許文献３】J. Am. Chem. Soc., 2004, Vol.126, pp.13616-13617
【非特許文献４】Anal. Biochem., 2006, Vol.352, pp.265-273
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記の活性酸素種や活性窒素種の酸化還元電位は、過酸化水素の場合は１．７７Ｖ、一酸化窒素の場合は０．７１Ｖと、チオール類の酸化還元電位である−０．１〜−０．４Ｖと比べて非常に高い。このため、非特許文献１〜２に記載の蛍光性色素前駆体や特許文献１〜２に記載の化学発光試薬を用いて酸化還元電位の低いチオール類の可逆的な酸化還元反応を検出定量したり、チオール類の酸化還元にともなう酸化還元電位変化を時間分解的に検出定量したりすることは困難であった。
また、特許文献３又は非特許文献３に記載の蛍光指示薬では、酸化還元反応に伴う蛍光強度の変化が２〜４倍程度であり、十分な検出感度を有しているとは言い難かった。更に、分子内チオール基の酸化還元反応を利用しているため、検出可能な酸化還元電位の範囲に制限があり、より広範な酸化還元電位の変化を検出することは困難であった。
【０００５】
したがって、本発明は、酸化還元電位の変化を、高感度にかつ時間分解的に検出することが可能な酸化還元感受性化合物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
＜１＞  酸化還元反応により蛍光スペクトルが可逆的に変化する第１の蛍光発色団と、前記第１の蛍光発色団と相互作用することにより蛍光スペクトルが変化する第２の蛍光発色団と、前記第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結する連結基と、を有する酸化還元感受性化合物。
＜２＞  前記相互作用が、光誘起電子移動及び蛍光共鳴エネルギー移動から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記＜Ｉ＞に記載の酸化還元感受性化合物。
＜３＞  前記第１の蛍光発色団が、イソアロキサジン誘導体残基であることを特徴とする前記＜１＞又は＜２＞に記載の酸化還元感受性化合物。
＜４＞  前記第１の蛍光発色団が、下記一般式（１）で表される化合物に由来する化合物残基であることを特徴とする前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【０００７】
【化１】
2008239615.tif 000002
【０００８】
［式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアリール基を表す。］
＜５＞  前記第２の蛍光発色団が、４００ｎｍ〜７００ｎｍに分光吸収を有することを特徴とする前記＜１＞〜＜４＞のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
＜６＞  前記第２の蛍光発色団が、下記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基であることを特徴とする前記＜１＞〜＜５＞のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【０００９】
【化２】
2008239615.tif 000003
【００１０】
［式中、Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１８は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基又は複素環基を表す。］
＜７＞  前記連結基が、アミド結合、チオアミド結合、ウレイド結合およびチオウレイド結合から選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする前記＜１＞〜＜６＞のいずれか１項に記載の酸化還元感受性化合物。
【００１１】
＜８＞  下記一般式（ＩＶ）で表されるイソアロキサジン誘導体。
【００１２】
【化３】
2008239615.tif 000004
【００１３】
［式中、Ｒ４１〜Ｒ４６は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｌは２価の連結基を表し、Ｄは蛍光発色団を表す。］
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、酸化還元電位の変化を、高感度にかつ時間分解的に検出することが可能な酸化還元感受性化合物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の酸化還元感受性化合物は、酸化還元反応により蛍光スペクトルが可逆的に変化する第１の蛍光発色団と、前記第１の蛍光発色団と相互作用することにより蛍光スペクトルが変化する第２の蛍光発色団と、前記第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結する連結基と、を有することを特徴とする。かかる構成であることによって、酸化還元電位の変化を、高感度にかつ時間分解的に検出することが可能となる。
【００１６】
本発明において「第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とが相互作用する」とは、第１の蛍光発色団の蛍光スペクトルの発光波長及び／又は蛍光強度が変化することによって、第２の蛍光発色団の蛍光スペクトルの発光波長及び／又は蛍光強度が変化することを意味する。
本発明においては、検出感度の観点から、第１の蛍光発色団の蛍光強度が変化することによって、第２の蛍光発色団の蛍光強度が変化する相互作用であることが好ましい。
【００１７】
前記相互作用の具体例としては、例えば、光誘起電子移動（ＰＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、エキシマー形成等を挙げることができる。
本発明における前記相互作用としては、検出感度の観点から、光誘起電子移動及び蛍光共鳴エネルギー移動から選ばれる少なくとも１種であることが好ましく、光誘起電子移動と蛍光共鳴エネルギー移動の両方の相互作用であることがより好ましい。
【００１８】
（光誘起電子移動）
本発明における光誘起電子移動では、励起された第２の蛍光発色団におけるエネルギーが、第１の蛍光発色団からの光誘起電子移動によって解消されて、第２の蛍光発色団の蛍光発色が抑制される態様であることが好ましい。すなわち、第２の蛍光発色団が励起された状態において、その近傍に電子密度が高い状態の第１の蛍光発色団が存在することにより、第１の蛍光発色団が電子供与体、第２の蛍光発色団が電子受容体となって光誘起電子移動が起きる。これにより、電子供与体と電子受容体とが電荷分離状態になる。次いで、この電荷分離状態から逆電子移動が起きることで、第２の蛍光発色団が蛍光発光することなく励起エネルギーが解消される態様であることが好ましい。
上記のように第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団との間で光誘起電子移動がおきるためには、２つの蛍光発色団が光誘起電子移動可能な範囲に存在すればよく、例えば、
１ｎｍ以下の距離にあることが好ましく、０．３〜１ｎｍの距離にあることがより好ましい。第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団との間の距離は、例えば、分子間の重なりを考慮した分子モデリングによって求めることができる。
【００１９】
（蛍光共鳴エネルギー移動）
本発明における蛍光共鳴エネルギー移動では、第１の蛍光発色団が励起され、その励起エネルギーが、他の相互作用としての蛍光共鳴エネルギー移動により第２の蛍光発色団の蛍光発色として解消される態様であることが好ましい。
【００２０】
蛍光共鳴エネルギー移動が起きる条件としては、励起された第１の蛍光発色団（ドナー）と、第２の蛍光発色団（アクセプター）とが特定の条件を満たすことが必要である。ここでいう特定の条件とは、ドナーとアクセプターとが互いの近傍に存在すること、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが重なりを有すること、ドナーとアクセプターとが適切な配向をとっていること、の３点である。
ドナーとアクセプターとが互いの近傍に存在するとは、例えば、０．３〜１０ｎｍ程度の距離に存在することを意味する。また、ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとが重なりが大きければそれだけ蛍光共鳴エネルギー移動の効率が向上する。また、ドナーとアクセプターが適切な配向をとっているとは、遷移状態における両者の双極子が少なくとも直交していないことを意味する。
ドナーの蛍光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとの重なりについてのドナーとアクセプターの適切な組合せは、例えば、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団それぞれ単独状態での蛍光スペクトル及び吸収スペクトルを測定し、それらを比較することで得ることができる。また、ドナーとアクセプターの距離及び配向については、例えば、分子間の重なりを考慮した分子モデリングによって得ることができる。
【００２１】
本発明において、第１の蛍光発色団と相互作用することにより第２の蛍光発色団の蛍光スペクトルが変化する態様としては、
（１）第1の蛍光発色団の発光波長が変化することにより、第２の蛍光発色団の蛍光強度が変化する態様、
（２）第１の蛍光発色団の蛍光強度が変化することにより、第２の蛍光発色団の蛍光強度が変化する態様、
を好ましい態様として挙げることができる。
中でも、検出感度の観点から、（２）第１の蛍光発色団の蛍光強度が変化することにより、第２の蛍光発色団の蛍光強度が変化する態様が好ましい。
【００２２】
本発明における上記（２）の態様のうち、
（２−１）酸化還元反応によって可逆的に第１の蛍光発色団の蛍光強度が低下し、また、第１の蛍光発色団から第２の蛍光発色団への光誘起電子移動が発生して第２の蛍光発色団の蛍光強度を低下させる態様、
（２−２）酸化還元反応によって可逆的に第１の蛍光発色団の蛍光強度が上昇することにより、第１の蛍光発色団から第２の蛍光発色団への蛍光共鳴エネルギー移動が発生して第２の蛍光発色団の蛍光強度を上昇させる、また、第１の蛍光発色団の酸化還元により、第１の蛍光発色団から第２の蛍光発色団への光誘起電子移動が解消されて第２の蛍光発色団の蛍光強度が、見かけ上上昇する態様、
の少なくとも一方の態様であることがより好ましく、両方の相互作用を生じさせうる態様であることが特に好ましい。これにより検出感度を更に向上させることができる。
【００２３】
＜第１の蛍光発色団＞
本発明の酸化還元感受性化合物においては、第１の蛍光発色団と測定対象物質との間の酸化還元反応によって可逆的に第１の蛍光発色団の蛍光スペクトルが変化する。測定対象物質の酸化還元電位が経時的に変化する場合、第１の蛍光発色団の蛍光スペクトルも経時的に変化することになる。すなわち測定対象物質の酸化還元電位を時間分解的に測定することが可能となる。
酸化還元反応によって可逆的に蛍光スペクトルが変化する蛍光発色団とは、酸化状態の構造と還元状態の構造とが相互に変換可能であり、酸化状態の構造における蛍光スペクトルと還元状態の構造における蛍光スペクトルとが、発光波長又は蛍光強度において互いに相違する蛍光発色団であることを意味する。
【００２４】
そのような蛍光発色団としては、酸化還元反応によって可逆的に蛍光スペクトルが変化する蛍光発色性化合物由来の化合物残基を挙げることができる。ここでいう化合物残基としては、前記蛍光発色性化合物から、例えば水素原子を１以上取り除いた化合物残基を挙げることができる。前記蛍光発色性化合物としては、例えば、（１）酸化状態においては蛍光性化合物であり、還元状態では非蛍光性化合物であるような化合物、（２）酸化状態においては非蛍光性化合物であり、還元状態では蛍光性化合物であるような化合物、（３）酸化状態における発光波長と還元状態における発光波長とが異なる化合物等を挙げることができる。
ここで非蛍光性化合物とは、蛍光発色を全く又はほとんど示さない化合物を意味する。
【００２５】
本発明においては、検出感度の観点から、（１）酸化状態においては蛍光性化合物であり、還元状態では非蛍光性化合物であるような化合物、又は（２）酸化状態においては非蛍光性化合物であり、還元状態では蛍光性化合物であるような化合物であることが好ましく、（１）酸化状態においては蛍光性化合物であり、還元状態では非蛍光性化合物であるような化合物であることがより好ましい。
【００２６】
本発明における第１の蛍光発色団としては、酸化還元反応によって可逆的に蛍光スペクトルが変化する蛍光発色団であれば、特に制限なく、用いることができるが、前記蛍光発色団の酸化還元電位が、−０．１〜−０．４Ｖの範囲内であることが好ましく、−０．２〜−０．３Ｖの範囲であることがより好ましい。これにより、例えば、細胞内の酸化還元電位の変化を検出することができる。
本発明における第１の発色団としては、具体的には、ルミフラビン及びリボフラビン並びにそれらの誘導体であるイソアロキサジン誘導体、ニコチンアミド誘導体、キノン誘導体、オキサジン誘導体等に由来する化合物残基を挙げることができる。
中でも、酸化還元電位及び蛍光強度変化の観点から、イソアロキサジン誘導体残基であることが好ましく、下記一般式（Ｉ）で表される化合物由来の化合物残基であることが更に好ましい。
【００２７】
【化４】
2008239615.tif 000005
【００２８】
式中、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ１〜Ｒ４で表される置換基としては、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アルキニル基、水酸基、アシル基、アシルオキシ基、アルコキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルバモイル基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、チオール基、チオアルキル基、シリル基、リン酸基、リン酸エステル基等を挙げることができる。
Ｒ１〜Ｒ４で表される置換基は、可能であれば更に置換基を有していてもよい。
Ｒ１〜Ｒ４で表される置換基としては、酸化還元電位及び蛍光強度の観点から、水素原子、ハロゲン原子、カルボキシ基、シアノ基、又は総炭素数１〜１２の置換もしくは無置換のアルキル基であることが好ましく、水素原子又は総炭素数が１〜６の置換基を有していてもよいアルキル基であることがより好ましい。
【００２９】
Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアリール基を表し、該アルキル基、アルケニル基又はアリール基は置換基を更に有していてもよい。該置換基としてはＲ１〜Ｒ４で表される置換基と同様のものを挙げることができる。
Ｒ５及びＲ６で表されるアルキル基の総炭素数としては、１〜１０であることが好ましく、１〜６であることがより好ましい。また、Ｒ５及びＲ６で表されるアルケニル基の総炭素数としては、２〜１０であることが好ましく、２〜６であることがより好ましい。また、Ｒ５及びＲ６で表されるアリール基の総炭素数としては、６〜１０であることが好ましく、６〜８であることがより好ましい。
中でもＲ５及びＲ６としては、生細胞への導入効率と発光強度の点から、炭素数１〜６の無置換のアルキル基又は置換基を有するアルキル基が好ましく、炭素数１〜４の無置換のアルキル基、または置換基としてヒドロキシ基及びアシルオキシ基から選ばれる少なくとも１種を有する炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜４の無置換のアルキル基、または炭素数３〜６の糖アルコールに由来する基もしくはそのアシル誘導体であることが更に好ましい。
ここで糖アルコールに由来する基とは、糖アルコールから水酸基を一つ取り除いて形成される置換基を意味する。
【００３０】
本発明においては、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団との相互作用維持の観点から、Ｒ５及びＲ６がアルキル基、アルケニル基及びアリール基である場合には、Ｒ５及びＲ６の少なくとも１つが、カルボキシ基又はアミノ基を有していることが好ましく、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、アミノメチル基、アミノエチル基、カルボキシエテニル基、カルボキシメチルフェニル基から選ばれるアルキル基、アルケニル基又はアリール基であることがより好ましい。
また、本発明においては、細胞との相互作用の観点から、Ｒ５が炭素数３〜６の糖アルコールに由来する基またはそのアシル誘導体であることもまた好ましい。
【００３１】
本発明においては、Ｒ１〜Ｒ６を適宜変更することにより、一般式（Ｉ）で表される化合物の酸化還元電位を所望の値にすることができる。例えば、Ｒ１〜Ｒ４の少なくとも１つをエチニル基とすることで酸化還元電位をより貴に（高く）することができる。
【００３２】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、例えば、Tetrahedron Lett., 2000, Vol.41, pp.1515-1518、Tetrahedron, 2001, Vol.57, pp.4507-4522、Tetrahedron Lett, 2005, Vol.46, pp.5053-5056等に記載の方法で合成することができる。
以下に、一般式（Ｉ）で表される化合物の具体例を例示するが、本発明はこれらに限定されない。
【００３３】
【化５】
2008239615.tif 000006
【００３４】
【化６】
2008239615.tif 000007
【００３５】
【化７】
2008239615.tif 000008
【００３６】
上記一般式（Ｉ）で表される化合物由来の化合物残基は、上記一般式（Ｉ）で表される化合物から少なくとも１つの水素原子が取り除かれた化合物残基であることが好ましい。水素原子取り除かれる位置については、特に制限はないが、一般式（Ｉ）においてＲ５又はＲ６が水素原子の場合はその水素原子、Ｒ５又はＲ６がアルキル基、アルケニル基又はアリール基の場合はそのいずれかの水素原子が取り除かれることが好ましい。また、Ｒ５又はＲ６がアミノ基を有するアルキル基、アルケニル基又はアリール基の場合にはアミノ基上の水素原子が取り除かれることもまた好ましい。
また上記一般式（Ｉ）で表される化合物が水酸基に相当する基を有している場合には、その水酸基が取り除かれた化合物残基であることもまた好ましい。例えば、Ｒ５又はＲ６がカルボキシ基を有するアルキル基、アルケニル基又はアリール基の場合にはカルボキシ基から水酸基が取り除かれることが好ましい。
【００３７】
一般式（Ｉ）で表される化合物は、酸化還元電位が、−０．１０〜−０．４０Ｖの範囲において、酸化状態と還元状態との間で可逆的に相互変換可能であり、酸化状態においては強い蛍光発光を示すが、還元状態においては蛍光発光が著しく弱くなる。
【００３８】
一般式（Ｉ）で表される化合物の１例として、酸化状態が下記化学式（Ｉｏｘ）で、還元状態が下記化学式（Ｉｒｅｄ）で表される化合物（以下、ＣＭＩＡということがある）を挙げることができる。図１に、この化合物の酸化状態（実線で示す）および還元状態（破線で示す）における吸収スペクトルを示し、図２に、励起波長４４６ｎｍにおける蛍光スペクトルを示す。
図１及び図２に示すように、化学式（Ｉｏｘ）で表される酸化型（実線、Oxidized form）においては、４４６ｎｍに分光吸収を有し、５１０ｎｍに強い蛍光発光を示すが、化学式（Ｉｒｅｄ）で表される還元型（破線、Reduced form）においては、蛍光発光が著しく弱くなる。化学式（Ｉｏｘ）で表される酸化型と、化学式（Ｉｒｅｄ）で表される還元型とにおける酸化還元電位は−０．２５Ｖであり、例えば、細胞内における酸化還元電位を測定するのに適切な値である。また、酸化状態と還元状態とは可逆的に相互変換可能である。
【００３９】
【化８】
2008239615.tif 000009
【００４０】
本発明の酸化還元感受性化合物においては、第１の蛍光発色団を１種単独、また２種以上を有していてもよい。
【００４１】
＜第２の蛍光発色団＞
本発明における第２の蛍光発色団としては、第１の蛍光発色団と相互作用してその蛍光スペクトルが変化する蛍光発色団であれば、特に制限なく使用することができる。中でも、第１の蛍光発色団との相互作用の観点から、第２の蛍光発色団が４００ｎｍ〜７００ｎｍに分光吸収を有することが好ましく、４５０ｎｍ〜６５０ｎｍに分光吸収を有することがより好ましい。これにより、より高感度に酸化還元電位変化を検出することができる。
【００４２】
本発明における第２の蛍光発色団として具体的には、インダセン誘導体、ローダミン誘導体、フルオレセイン誘導体、ポルフィリン誘導体、ランタノイド錯体、オキサジン誘導体、シアニン誘導体等に由来する化合物残基を挙げることができる。中でも、酸化還元電位、分光吸収特性、蛍光強度の観点から、インダセン誘導体残基、ローダミン誘導体残基およびフルオレセイン誘導体残基が好ましく、下記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基であることがより好ましい。
【００４３】
【化９】
2008239615.tif 000010
【００４４】
式中、Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１８は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基又は複素環基を表し、アルキル基、アリール基及び複素環基は置換基を有していてもよい。前記置換基としては、前記第１の蛍光発色団の項で説明した置換基と同じものを好ましく挙げることができる。
Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１８としては、水素原子、炭素数１〜１２のアルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数５〜１０の複素環基が好ましく、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数６〜８のアリール基、炭素数５〜８の複素環基がより好ましい。
本発明においては、蛍光強度の観点から、第２の発色団が下記一般式（ＩＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基であることがさらに好ましい。
【００４５】
【化１０】
2008239615.tif 000011
【００４６】
式中、Ｒ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７は、それぞれ独立に水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ２９は水素原子または置換基を表す。
本発明においては、Ｒ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７が、水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であることが好ましい。また、Ｒ２９としては、水素原子、アルキル基、アミノ基、アルコキシ基、カルボキシ基が好ましい。
【００４７】
上記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体は、例えば、J. Am. Chem. Soc., 2001, Vol.123, pp.100-110、Photochem. Photobiol., 2006, Vol.82, pp.746-749等に記載の方法で合成することができる。また、インビトロジェン社等から市販されている化合物を使用することもできる。
一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体の具体例としては、以下に示す化合物を挙げることができるが、本発明はこれらに限定されない。
【００４８】
【化１１】
2008239615.tif 000012
【００４９】
上記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基としては、一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体から、１以上の水素原子が取り除かれた化合物残基であることが好ましい。一般式（ＩＩ）で表される水素原子が取り除かれる位置については、特に制限はないが、上記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体が置換基としてアミノ基を有する場合にはアミノ基上の水素原子が取り除かれることが好ましい。
また上記一般式（ＩＩ）で表されるインダセン誘導体が、置換基としてカルボキシ基を有する場合にはカルボキシ基から水酸基が取り除かれた化合物残基であることもまた好ましい。
また、上記一般式（ＩＩＩ）で表されるインダセン誘導体に由来する化合物残基としては、一般式（ＩＩＩ）で表されるインダセン誘導体から、１以上の水素原子が取り除かれた化合物残基であることが好ましい。水素原子が取り除かれる位置については、特に制限はないが、一般式（ＩＩＩ）で表されるインダセン誘導体の８位フェニル基上のいずれかの位置、又は、Ｒ２９から水素原子が取り除かれることがより好ましい。
【００５０】
また、本発明における第２の蛍光発色団として、下記一般式（ＶＩＩ）で表わされるローダミン誘導体または下記一般式（ＶＩＩＩ）で表わされるフルオレセイン誘導体に由来する化合物残基であることもまた好ましい。
【００５１】
【化１２】
2008239615.tif 000013
【００５２】
一般式（ＶＩＩ）中、Ｒ７１〜Ｒ７７はそれぞれ独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ７８は水素原子または置換基を表す。また、一般式（ＶＩＩＩ）中、Ｒ８１〜Ｒ８３はそれぞれ独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ８４は水素原子または置換基を表す。
本発明においては、Ｒ７１が水素原子であって、Ｒ７２〜Ｒ７７がそれぞれ独立に水素原子または炭素数１〜４のアルキル基であることが好ましく、Ｒ７１、Ｒ７６、Ｒ７７が水素原子であって、Ｒ７２〜Ｒ７５が炭素数１〜４のアルキル基であることがより好ましい。また、Ｒ７８は水素原子、アルキル基、アミノ基、アルコキシ基、またはカルボキシ基が好ましい。
また、Ｒ８１〜Ｒ８３は水素原子であって、Ｒ８４は水素原子、アルキル基、アミノ基、アルコキシ基、またはカルボキシ基であることが好ましい。
【００５３】
以下に、一般式（ＶＩＩ）で表わされるローダミン誘導体または一般式（ＶＩＩＩ）で表わされるフルオレセイン誘導体の具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されない。
【００５４】
【化１３】
2008239615.tif 000014
【００５５】
本発明の酸化還元感受性化合物においては、第２の蛍光発色団を、１種を単独、または２種以上を有していてもよい。
【００５６】
＜連結基＞
前記連結基としては、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とが相互作用しうる立体関係を保持できる連結基であれば、特に制限なく用いることができる。
前記連結基としては、分子内にアルキレン基、アリーレン基、エーテル結合、チオエーテル結合、アミノ基、カルボニル基、スルホニル基、スルホニルアミド結合、エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、チオアミド結合、ウレイド結合、チオウレイド結合、カルバメート結合及びこれらの組合せを含む連結基を好ましく用いることができる。
前記連結基がアルキレン基、アリーレン基を含む場合には、該アルキレン基部分及びアリーレン基部分は更に置換基を有していてもよい。
【００５７】
前記連結基は、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結するものであることから、少なくとも２価の連結基である。前記連結基が前記蛍光発色団のいずれかと連結する態様としては、共有結合である限り特に制限はなく、炭素−炭素間結合、炭素−ヘテロ原子間結合のいずれであってもよい。
【００５８】
本発明においては、溶解性と前記蛍光発色団間の相互作用維持の観点から、前記連結基がアミノ酸誘導体、ジカルボン酸誘導体及びジアミン誘導体から選ばれる少なくとも１種を含むことが好ましい。前記アミノ酸誘導体はカルボキシ基とアミノ基を有する広義のアミノ酸由来の誘導体を意味するが、α−アミノ酸由来の誘導体であることが好ましい。
【００５９】
また本発明における前記連結基は、環状の連結基を有していることが好ましい。これにより、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団との相互作用をより強いものとすることができる。前記環状の連結基としては、環状脂肪族基、芳香族基、複素環基、飽和複素環基を挙げることができる。また、環を形成する原子数としては３〜７であることが好ましく、５〜６であることがより好ましい。前記環状連結基は更に置換基を有していてもよい。
前記環状の連結基環としては、例えば、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、アザシクロブタン、ピロリジン、ピペラジン、ホモピペラジン、ピロリン、ピペラジン、ベンゼン等に由来する２価の連結基を挙げることができる。
以下に、本発明における連結基の具体例を例示するが、本発明はこれらに限定されない。尚、下記具体例の化学式中の「＊」は連結位置を表す。
【００６０】
【化１４】
2008239615.tif 000015
【００６１】
【化１５】
2008239615.tif 000016
【００６２】
本発明の酸化還元感受性化合物としては、第１の蛍光発色団が下記一般式（Ｉ）で表される化合物であり、第２の蛍光発色団が下記一般式（ＩＩ）で表される化合物であり、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団とを連結する連結基がアミノ酸誘導体、ジカルボン酸誘導体及びジアミン誘導体から選ばれる少なくとも１種含む連結基であることが好ましい。
【００６３】
【化１６】
2008239615.tif 000017
【００６４】
式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｒ１１〜Ｒ１３、Ｒ１５〜Ｒ１８の好ましい態様については、既述のとおりである。
また、本発明の酸化還元感受性化合物としては、下記一般式（Ｖ）で表される化合物であることがより好ましい。
【００６５】
【化１７】
2008239615.tif 000018
【００６６】
一般式（Ｖ）中、Ｒ１〜Ｒ５は一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ５と同義である。また、Ｒ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７は一般式（III）におけるＲ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７と同義である。
また、Ｌ３０はアルキレン基、アリーレン基、アミノ基、エーテル結合、スルホニル基、カルボニル基、アミド結合、ウレイド結合、イミド結合及びスルホニルアミド結合から選ばれる少なくとも１種を含む２価の連結基を表す。本発明においてはＬ３０が、アルキレン基、アミド結合、ウレイド結合及びスルホニルアミド結合から選ばれる少なくとも１種を含む２価の連結基であることが好ましく、アミド結合を少なくとも１つ含む２価の連結基であることがより好ましい。
本発明においてＲ５としては、生細胞への導入効率と発光強度の点から、炭素数１〜６の無置換のアルキル基又は置換基を有するアルキル基が好ましい。前記置換基としては、ヒドロキシ基及び／又はアシルオキシ基を好ましく挙げることができる。
【００６７】
本発明の酸化還元感受性化合物としては、下記一般式（ＶＩ）で表される化合物であることがより好ましい。
【００６８】
【化１８】
2008239615.tif 000019
【００６９】
式中、Ｒ１〜Ｒ５については、一般式（Ｉ）におけるＲ１〜Ｒ５と同義である。Ｌ３１及びＬ３２はそれぞれ独立にアルキレン基を表し、Ｒ３１及びＲ３２は、それぞれ独立に水素原子またはアルキル基を表す。Ｌ３１とＲ３１、Ｌ３２とＲ３１、Ｌ３２とＲ３２はそれぞれ環を形成してもよい。
また、Ｒ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７は一般式（III）におけるＲ２１〜Ｒ２３、Ｒ２５〜Ｒ２７と同義である。
【００７０】
本発明においては、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ２１、Ｒ２３、Ｒ２５及びＲ２７がそれぞれ独立に炭素数１〜６のアルキル基であって、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ２２及びＲ２６が水素原子であって、Ｌ３１及びＬ３２がそれぞれ独立に炭素数１〜６のアルキレン基であって、Ｒ３１及びＲ３２がそれぞれ独立に水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であって、Ｒ３１とＬ３２が５員または６員環を形成していることがより好ましい。このような態様であることにより、第１の蛍光発色団と第２の蛍光発色団の相互作用がより強い状態になり、より高感度に酸化還元電位を検出することが可能となる。
本発明においてＲ５としては、生細胞への導入効率と発光強度の点から、炭素数１〜６の無置換のアルキル基又は置換基を有するアルキル基が好ましい。前記置換基としては、ヒドロキシ基及び／又はアシルオキシ基を好ましく挙げることができる。
【００７１】
上記一般式（ＶI）で表される化合物は、例えば、以下のようにして合成することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物のうちＲ６がカルボキシアルキル基であるような化合物のカルボキシ基に、常法により連結基を構成するアミノ酸を結合させる。ついで、該アミノ酸のカルボキシ基と、一般式（ＩＩ）で表される化合物のうちＲ１８がアミノフェニル基であるような化合物のアミノ基とを常法により結合させる。これにより一般式（ＶI）で表される化合物を合成することができる。
以下に、本発明の酸化還元感受性化合物の具体例として、例示化合物１〜２０を示すが、本発明はこれらに限定されない。
【００７２】
【化１９】
2008239615.tif 000020
【００７３】
【化２０】
2008239615.tif 000021
【００７４】
【化２１】
2008239615.tif 000022
【００７５】
本発明の酸化還元感受性化合物は、検出感度と生細胞との相互作用の観点から、第１の蛍光発色団が一般式（Ｉ）で表わされる化合物であって、第２の蛍光発色団が一般式（ＩＩ）、一般式（ＶＩＩ）または一般式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物であって、連結基がアミド結合、チオアミド結合、ウレイド結合およびチオウレイド結合の少なくとも１種と環状連結基とを含む２価の連結基であることが好ましく、第１の蛍光発色団が一般式（Ｉ）で表わされ、一般式（Ｉ）におけるＲ５が炭素数１〜４のアルキル基または炭素数３〜６の糖アルコールに由来する基もしくはそのアシル誘導体である化合物であって、第２の蛍光発色団が一般式（ＩＩＩ）、一般式（ＶＩＩ）または一般式（ＶＩＩＩ）で表わされる化合物であって、連結基がアミド結合、チオアミド結合、ウレイド結合およびチオウレイド結合の少なくとも１種と環状連結基とを含む２価の連結基であることが好ましい。
【００７６】
本発明の酸化還元感受性化合物は、第１の蛍光発色団が示す酸化還元電位において、第２の蛍光発色団の蛍光発光が、可逆的に大きく変動する。したがって、本発明の酸化還元感受性化合物と検出対象物質とを接触させることによって、第１の蛍光発色団の酸化還元電位を基準として、検出対象物質の酸化還元電位の変化を蛍光発光の変化として時間分解的に検出することができる。
また、本発明の酸化還元感受性化合物は、その酸化還元電位を、例えば、タンパク質システイン残基上のチオール基の酸化還元状態を検出可能な−０．１〜−０．４Ｖとすることができる。また、本発明の酸化還元感受性化合物は、可逆的な酸化還元反応によってその蛍光発光が高感度に変化するものである。したがって、本発明の酸化還元感受性化合物を生細胞に導入することによって、生細胞内における酸化還元電位の変化を時間分解的に高感度に検出することができる。
【００７７】
本発明のイソアロキサジン誘導体は、下記一般式（ＩＶ）で表されることを特徴とする。本発明のイソアロキサジン誘導体は、酸化還元反応によって蛍光スペクトルが可逆的に変化するイソアロキサジン構造部分を有している。また、イソアロキサジン構造部分と連結基Ｌで連結された蛍光発色団Ｄを有している。したがって、イソアロキサジン構造部分と蛍光発色団Ｄが相互作用することにより、本発明の酸化還元感受性化合物と同様の作用を有することができる。即ち、本発明のイソアロキサジン誘導体は、本発明の酸化還元感受性化合物と同様の作用及び用途を有することができる。
【００７８】
【化２２】
2008239615.tif 000023
【００７９】
式中、Ｒ４１〜Ｒ４６は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表し、Ｌは２価の連結基を表し、Ｄは蛍光発色団を表す。
本発明において、Ｒ４１〜Ｒ４６はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を表すが、上記酸化還元感受性化合物における一般式（Ｉ）で説明した事項をそのまま適用することができる。
【００８０】
また、Ｌは２価の連結基を表すが、上記酸化還元感受性化合物における「連結基」の説明において既述した事項をそのまま適用することができる。中でも、Ｌとしては、イソアロキサジン環部分と蛍光発色団Ｄの相互作用の観点から、少なくとも１つのアミド結合を有することが好ましく、アミノ酸誘導体、ジカルボン酸誘導体、ジアミン誘導体から選ばれる少なくとも１種を含む２価の連結基であることがより好ましく、アミノ酸誘導体であることがより好ましく、環状構造を有するアミノ酸誘導体であることがさらに好ましい。
【００８１】
更に、Ｄは蛍光発色団を表すが、上記酸化還元感受性化合物における「第２の蛍光発色団」の説明において既述した事項をそのまま適用することができる。中でもＤとしては、蛍光強度の観点から、上記一般式（ＩＩ）で表される化合物であることが好ましく、上記一般式（ＩＩＩ）で表される化合物であることがより好ましい。
【００８２】
本発明のイソアロキサジン誘導体は、上記一般式（Ｖ）で表される化合物と同様にして合成することができる。
本発明のイソアロキサジン誘導体は、イソアロキサジン環部分と蛍光発色団Ｄとが相互作用することにより、蛍光発色団Ｄの蛍光強度を変化させることができる。すなわち、イソアロキサジン環部分が可逆的に還元されることにより、蛍光発色団Ｄの蛍光強度を弱めることができ、また、イソアロキサジン環構造に可逆的に酸化されることにより、蛍光発色団Ｄの蛍光強度を見かけ上増強することができる。
したがって本発明のイソアロキサジン誘導体は、例えば、酸化還元電位の測定に用いることができる。イソアロキサジン環の酸化還元電位は、一般に−０．１〜−０．４Ｖとすることができ、タンパク質システイン残基上のチオール基がジスルフィド結合を形成する酸化還元電位を検出することに好適である。
【実施例】
【００８３】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８４】
（実施例１）
［例示化合物１の合成］
Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルボニル）プロリン１１０ｍｇとベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  １６５ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．１ｍｌ、および８−（４-アミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン  ８１ｍｇに、ジメチルホルムアミド５ｍｌを加え、室温で２０時間攪拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去した後、残渣をクロロホルム１００ｍｌに溶かして、水１００ｍｌで４回、次いで飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣にピペリジン：ジメチルホルムアミド＝１：１溶液を４ｍｌ加えて、室温で４時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して、赤色オイルを得た。この赤色オイルをクロロホルム：メタノール＝９：１を展開溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製することで、８−（４-（ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン５３ｍｇ（収率５０％）の赤橙色アモルファス状固体を得た。
【００８５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.97 (s, 1H), 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.97 (s, 2H), 3.94 (m, 1H), 3.14 (m, 1H), 3.03 (s, 1H), 2.55 (s, 6H), 2.26 (m, 1H), 1.87−1.75 (m, 2H), 1.44 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 167.2, 155.4, 143.1, 141.5, 130.2, 128.7, 121.2, 121.2, 119.5, 61.1, 47.4, 30.7, 26.4, 14.7, 14.6
【００８６】
得られた８−（４−（ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの赤橙色固体５１ｍｇを、３−カルボキシメチル−７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン（ＣＭＩＡ）  ４５ｍｇ、ベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ６８ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．０６ｍｌ、およびジメチルホルムアミド３ｍｌの混合溶液に加えた。反応溶液を室温で１２時間攪拌した後、減圧下でジメチルホルムアミドを留去した。得られた赤色オイルをクロロホルムクロロホルム１００ｍｌに溶かして、水１００ｍｌで４回、次いで飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣をクロロホルム：メタノール＝１０：１を展開溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製した後、クロロホルムを展開溶媒としたリサイクル分取ＨＰＬＣ（日本分析工業製  LC9201、使用カラム：JAIGEL-2H  (20mmφ×600mm)）により精製することで、８−（４−（（Ｎ−（７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物１、ＦＰ−ＢＯＤＩＰＹ）５６ｍｇ（収率６３％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【００８７】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.32 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.76 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.95 (s, 2H), 5.07 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.85 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.84 (m, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.88 (m, 1H), 3.70 (m, 1H), 2.64 (m, 1H), 2.56 (s, 3H), 2.52 (s, 6H), 2.45 (s, 3H), 2.17−2.14 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.41 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 168.8, 167.9, 159.9, 155.3, 155.1, 149.3, 148.4, 143.3, 141.7, 139.0, 137.2, 135.3, 134.9, 132.6, 131.8, 131.6, 130.0, 128.4, 121.0, 120.4, 115.4, 61.4, 47.1, 43.4, 32.2, 27.1, 24.9, 21.5, 19.5, 14.7, 14.5
【００８８】
（実施例２）
［例示化合物２の合成］
Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルボニル）−Ｌ−ピペリジン−２−カルボン酸４２ｍｇとベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ６９ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．１ｍｌ、および８−（４−アミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン  ２６ｍｇに、ジメチルホルムアミド２ｍｌを加え、室温で２２時間攪拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去した後、残渣をクロロホルム５０ｍｌに溶かして、水５０ｍｌで５回、次いで飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣にピペリジン：ジメチルホルムアミド＝１：１溶液を２ｍｌ加えて、室温で１．５時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して、赤色オイルを得た。この赤色オイルをクロロホルム：メタノール＝９：１を展開溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製することで、８−（４−（ピペリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン２８ｍｇ（収率５２％）の赤橙色アモルファス状固体を得た。
【００８９】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.59 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.96 (s, 2H), 3.68 (m, 1H), 3.39−2.98 (m, 3H), 2.94−2.82 (m, 1H), 2.54 (s, 6H), 2.17-2.10 (m, 1H), 1.91-1.81 (m, 1H), 1.76−1.65 (m, 1H), 1.61-1.49 (m, 1H), 1.37 (s, 6H), 1.29−1.19 (m, 1H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 171.1, 155.4, 143.0, 141.3, 138.7, 131.6, 130.5, 128.7, 121.1, 119.9, 59.9, 45.1, 29.0, 25.0, 23.2, 14.6, 14.6
【００９０】
得られた８−（４-（ピペリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの赤橙色固体２８ｍｇを、３−カルボキシメチル−７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン（ＣＭＩＡ）  ２４ｍｇ、ベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ４１ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．０３ｍｌ、およびジメチルホルムアミド１ｍｌの混合溶液に加えた。反応溶液を室温で１８時間攪拌した後、減圧下でジメチルホルムアミドを留去した。得られた赤色オイルをクロロホルムクロロホルム５０ｍｌに溶かして、水５０ｍｌで３回、次いで飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣をクロロホルム：メタノール＝１０：１を展開溶媒としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製した後、クロロホルムを展開溶媒としたリサイクル分取ＨＰＬＣ（日本分析工業製  LC9201、使用カラム：JAIGEL-2H  (20mmφ×600mm)）により精製することで、８−（４−（（Ｎ−（７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）−ピペリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物２）１３ｍｇ（収率３０％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【００９１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.39 (s, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.93 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.47 (s, 1H), 7.24 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.97 (s, 2H), 5.44 (m, 1H), 5.26 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 4.87 (d, J = 15.1 Hz, 1H), 4.76−4.67 (m, 1H), 4.04−3.94 (m, 1H), 3.40−3.29 (m, 1H), 2.62−2.49 (m, 1H), 2.57 (s,, 3H), 2.55 (s, 6H), 2.47 (s, 3H), 1.89−1.75 (m, 2H), 1.75−1.55 (m, 2H), 1.414 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 168.7, 167.3, 160.0, 155.6, 155.2, 148.5, 143.3, 139.1, 137.2, 135.5, 135.0, 132.7, 131.7, 130.2, 128.5, 121.1, 120.3, 115.4, 100.6, 53.4, 43.8, 42.5, 32.3, 25.4, 24.5, 21.6, 21.6, 19.5, 14.7, 14.5
【００９２】
（実施例３）
［例示化合物３の合成］
Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルボニル）−ピペリジン−４−カルボン酸８３ｍｇとベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  １３７ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．１８ｍｌ、および８−（４-アミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン  ５３ｍｇに、ジメチルホルムアミド２ｍｌを加え、室温で２４時間攪拌した。ジメチルホルムアミドを減圧留去した後、残渣をクロロホルム１００ｍｌに溶かして、水１００ｍｌで３回、次いで飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色のオイルを得た。この赤色オイルをクロロホルム：メタノール＝９：１を展開溶媒として、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製することで、８−（４−（Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルボニル）-ピペリジン−４−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン８２ｍｇ（収率４４％）の赤色アモルファス状固体を得た。
【００９３】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.89 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.57 (dd, J = 7.6, 1.2 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.31 (td, J = 7.6, 1.2 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.98 (s, 2H), 4.46 (m, 2H), 4.24 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 4.21−3.95 (m, 2H), 3.02−2.89 (m, 2H), 2.74−2.67 (m, 1H), 2.55 (s, 6H), 2.04-1.92 (m, 2H), 1.79−1.63 (m, 2H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ:173.6, 155.5, 155.0, 147.2, 145.7, 143.9, 143.0, 141.3, 141.0, 131.6, 130.3, 128.9, 127.7, 127.0, 124.9, 121.2, 120.0, 116.5, 67.3, 57.1, 47.3, 43.0, 39.6, 27.6, 14.6
【００９４】
８−（４−（Ｎ−（９−フルオレニルメチルカルボニル）-ピペリジン−４−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン８２ｍｇにピペリジン：ジメチルホルムアミド＝１：１溶液を２ｍｌ加えて、室温で２時間攪拌した後、溶媒を減圧留去して、赤色固体３２ｍｇを得た。この赤色固体３２ｍｇを、３−カルボキシメチル−７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン（ＣＭＩＡ）  ３６ｍｇ、ベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ５８ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．０７ｍｌ、およびジメチルホルムアミド２ｍｌの混合溶液に加えた。反応溶液を室温で３１時間攪拌した後、減圧下でジメチルホルムアミドを留去した。得られた赤色オイルをクロロホルムクロロホルム１００ｍｌに溶かして、水５０ｍｌで４回、次いで飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣を、クロロホルムを展開溶媒としたリサイクル分取ＨＰＬＣ（日本分析工業製  LC9201、使用カラム：JAIGEL-2H  (20mmφ×600mm)）により精製することで、８−（４−（（Ｎ−（７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）ピペリジン−４−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物３）２８ｍｇ（収率５１％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【００９５】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.71 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.86 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 7.43 (s, 1H), 7.18 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 5.95 (s, 2H), 5.11 (d, J = 21.0 Hz, 1H), 4.93 (d, J = 21.0 Hz, 1H), 4.56 (m, 1H), 4.08 (m, 3H), 4.06 (s, 1H), 3.28 (m, 1H), 2.82 (m, 1H), 2.66 (m, 1H), 2.55 (s, 3H), 2.54 (s, 3H), 2.54 (s, 6H), 2.42 (s, 3H), 2.10−1.96 (m, 3H), 1.82 (m, 1H), 1.39 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 164.8, 160.8, 159.9, 155.5, 154.7, 149.4, 143.1, 135.6, 134.9, 132.6, 132.6, 131.8, 131.6, 129.1, 121.2, 120.0, 119.0, 115.3, 100.6, 44.3, 42.7, 41.9, 32.1, 21.6, 19.5, 14.7, 14.6
【００９６】
（実施例４）
［例示化合物４の合成］
８−（４−アミノフェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの赤橙色固体２１ｍｇを、３−カルボキシメチル−７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン（ＣＭＩＡ）  ３１ｍｇ、ベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ５９ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．０７ｍｌ、およびジメチルホルムアミド１ｍｌの混合溶液に加えた。反応溶液を室温で２１時間攪拌した後、減圧下でジメチルホルムアミドを留去した。得られた赤色オイルをクロロホルムクロロホルム７０ｍｌに溶かして、水１００ｍｌで２回、次いで飽和食塩水１００ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。クロロホルムを展開溶媒としたリサイクル分取ＨＰＬＣ（日本分析工業製  LC9201、使用カラム：JAIGEL-2H  (20mmφ×600mm)）により精製することで、８−（４−（（７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン−３−イル）−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物４）３０ｍｇ（収率７５％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【００９７】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.94 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.44 (s, 1H), 7.16 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.92 (s, 2H), 5.06(s, 1H), 4.12 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.50 (s, 6H), 2.42 (s, 3H), 1.37 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 165.4, 159.8, 155.7, 155.2, 149.2, 148.6, 143.2, 141.4, 138.9, 137.2, 135.3, 134.9, 132.5, 131.7, 131.5, 130.2, 128.5, 121.1, 120.1, 115.5, 45.4, 32.3, 21.6, 19.5, 14.6, 14.5
【００９８】
（実施例５）
［例示化合物５の合成］
８−（４−（ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンの赤橙色固体４７ｍｇを、３−カルボキシメチル−７，８−ジメチル−１０−（２，３，４，５−テトラアセトキシ−ペンチル）イソアロキサジン７４ｍｇ、ベンゼントリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスフェート  ６８ｍｇ、ジイソプロピルエチルアミン  ０．０８ｍｌ、およびジメチルホルムアミド１ｍｌの混合溶液に加えた。反応溶液を室温で６１時間攪拌した後、減圧下でジメチルホルムアミドを留去した。得られた赤色オイルをクロロホルムクロロホルム５０ｍｌに溶かして、水５０ｍｌで５回、次いで飽和食塩水５０ｍｌで１回洗浄した。クロロホルム層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、クロロホルムを減圧留去して、赤色の残渣を得た。この残渣をクロロホルムを展開溶媒としたリサイクル分取ＨＰＬＣ（日本分析工業製  LC9201、使用カラム：JAIGEL-2H  (20mmφ×600mm)）により精製することで、８−（４−（（Ｎ−（７，８，−ジメチル−１０−（２，３，４，５−テトラアセトキシ−ペンチル）−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物５）７２ｍｇ（収率６５％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【００９９】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 9.37 (s, 1H), 8.02 (s, 1H), 7.72 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.60 (s, 1H), 7.18 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 5.96 (s, 2H), 5.68 (m, 1H), 5.48-5.39 (m, 2H), 5.39-5.10 (m, 1H), 4.99 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 4.96-4.80 (m, 2H), 4.87 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 4.43 (m, 1H), 4.25 (dd, J = 12.5, 5.4 Hz, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.68 (dd, J = 16.9, 9.3 Hz, 1H), 2.70-2.59 (m, 1H), 2.58-2.53 (m, 1H), 2.57 (s, 3H), 2.53 (s, 6H), 2.44 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.26-2.07 (m, 1H), 2.06 (s, 3H), 2.06-1.89 (m, 1H), 1.75 (s, 3H), 1.41 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 170.6, 170.2, 169.8, 169.8, 168.8, 167.8, 159.7, 155.2, 154.7, 149.5, 143.3, 141.7, 139.1, 137.0, 135.4, 134.8, 132.9, 131.7, 131.6, 131.2, 130.1, 128.4, 121.0, 120.4, 115.5, 110.5, 70.4, 69.5, 69.0, 61.9, 61.4, 47.0, 44.8, 43.4, 26.8, 25.0, 21.4, 21.0, 20.7, 20.6, 20.3, 19.4, 14.7, 14.5
【０１００】
（実施例６）
［例示化合物６の合成］
８−（４−（（Ｎ−（７，８−ジメチル−１０−（２，３，４，５−テトラアセトキシ−ペンチル）−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物５）の赤橙色固体５８ｍｇを蒸留したメタノール  ９ｍｌに溶解し、ジエチルアミン  ０．４ｍｌを加えた。反応溶液を室温で４３時間攪拌した後、生じた沈殿を濾取し、冷メタノール  ３ｍｌで３回洗浄した。この沈殿を減圧乾燥して、８−（４−（（Ｎ−（７，８−ジメチル−１０−（２，３，４，５−テトラヒドロキシ−ペンチル）−イソアロキサジン−３−イル）メチルカルボニル）ピロリジン−２−カルボニルアミノ）フェニル）−４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン（例示化合物６）２８ｍｇ（収率５９％）を、赤橙色のアモルファス状固体として得た。
【０１０１】
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.73 (s, 1H), 8.51 (s, 2H), 8.32 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.69 (s, 2H), 5.68-5.64 (m, 1H), 5.59-5.47 (m, 1H), 5.44-5.32 (m, 3H), 5.29-5.15 (m, 2H), 5.06-4.94 (m, 2H), 4.39-4.22 (m, 3H), 4.20-4.11 (m, 3H), 4.08-3.96 (m, 1H), 3.04 (s, 3H), 2.97 (s, 6H), 2.95 (s, 3H), 2.89-2.49 (m, 4H), 1.91 (s, 6H)
13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 208.9, 186.3, 170.6, 165.3, 165.1, 165.0, 159.3, 154.7, 154.4, 149.5, 146.6, 142.7, 141.9, 139.8, 136.1, 135.5, 134.5, 130.9, 128.3, 121.3, 119.4, 84.8, 73.6, 72.7, 63.3, 60.5, 40.4, 35.6, 29.3, 24.6, 28.8, 20.3, 18.8, 14.3, 14.2
【０１０２】
（実施例７）
［例示化合物１３の合成］
リボフラビンを酢酸、塩化ベンゼンスルホニル、ピリジンの存在下にテトラアセチル化し、ブロモ酢酸ｔ−ブチルを用いて常法により、リボフラビンの９位にカルボニルメチル基を導入した化合物０．２ｇをアセトニトリル４ｍｌに溶解し、ＰｙＢＯＰ０．１８ｇ、ジイソプロピルエチルアミン０．４ｍｌ、１−Ｂｏｃ−１，２−シクロヘキサンジアミン０．０７ｇを加えて、室温で昼夜攪拌した。溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、黄色粉末を０．１４ｇ得た。
得られた黄色粉末をＴＦＡにて処理した後、その６０ｍｇをアセトニトリル１．５ｍｌに溶解し、ＤＢＵ１滴を加え、次いでローダミンＢイソチオシアネート２２ｍｇを加えて室温で２０時間攪拌した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し、例示化合物１３を赤色粉末として５．４ｍｇ得た。
【０１０３】
1H NMR (300 MHz, CDCl3 / TMS) δ 7.95-7.73 (m, 2H), 7.52 (s, 1H), 7.43-7.36 (m, 2H), 6.98-6.94 (m, 2H), 6.85 (br, 1H), 6.50 (s, 1H), 6.29-6.15 (m, 2H), 6.10-6.03 (m, 1H), 5.70-5.35 (m, 2H), 5.33-5.12 (m, 1H), 4.71-4.58 (m, 2H), 4.45-4.19 (m, 1H), 4.29-4.03 (m, 2H), 3.63 (br, 8H), 2.61 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.18 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.76-1.59 (m, 12H), 1.48-1.46 (m, 2H), 1.13-1.04 (m, 6H)
13C NMR (75 MHz, CD3OD / TMS)  172.20, 171.74, 171.25, 169.55, 163.23, 159.33, 159.30, 158.83, 158.64, 156.93, 156.92, 156.43, 155.85, 150.45, 135.86, 133.52, 132.79, 130.83, 114.93, 105.69, 104.39, 102.27, 100.72, 96.93, 96.88, 96.42, 79.49, 70.52, 62.78, 49.00, 46.80, 46.74, 46.68, 45.64, 21.49, 21.33, 20.80, 20.61, 20.40, 19.46, 19.35, 13.58, 13.03, 12.96, 12.88, 12.83, 12.72
IR (neat) 2971, 2931, 2360, 1747, 1666, 1589, 1549, 1464, 1410, 1338, 1273, 1221, 1181, 1133, 1074, 926, 822, 754, 684 cm-1
【０１０４】
（実施例８）
［例示化合物１４の合成］
実施例７において、１−Ｂｏｃ−１，２−シクロヘキサンジアミンの代わりに、１−Ｂｏｃ−１，４−シクロヘキサンジアミンを用いた以外は実施例７と同様にして、例示化合物１４を赤色粉末として得た。
【０１０５】
1H NMR (300 MHz, CDCl3 / TMS) δ: 7.99 (br, 4H), 7.72-7.69 (m, 1H), 7.56 (s, 1H), 7.55-7.51 (m, 2H), 5.64 (s, 1H), 5.45 (s, 1H), 5.40 (s, 1H), 4.64 (s, 2H), 4.41 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.23-4.20 (m, 2H), 3.73-3.72 (m, 1H), 3.54 (br, 8H), 3.48 (s, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.25-1.90 (m, 21H), 1.76 (s, 3H)
13C NMR (75 MHz, CD3OD / TMS) δ: 172.30, 171.77, 171.46, 169.26, 169.05, 167.87, 161.72, 161.25, 161.10, 159.29, 157.03, 151.01, 149.56, 138.66, 136.11, 133.54, 132.69, 132.3, 129.86, 117.70, 115.25, 115.04, 97.14, 71.61, 70.77, 69.09, 67.26, 66.96, 62.99, 49.28, 40.15, 37.73, 37.66, 35.63, 34.28, 30.41, 30.12, 27.46, 24.94, 24.04, 21.40, 21.04, 20.73, 20.39, 19.53
IR (neat)  2927, 1735, 1648, 1589, 1544, 1466, 1412, 1338, 1274, 1247, 1180, 1132, 1074 cm-1
融点  190-195 ℃(dec)
【０１０６】
（実施例９）
［例示化合物１５の合成］
実施例７において、ローダミンＢイソチオシアネートの代わりに、フルオレセインイソチオシアネートを用いた以外は実施例７と同様にして、例示化合物１５を赤色粉末として得た。
【０１０７】
1H NMR (300 MHz, CD3OD / TMS) δ: 8.13 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.78-7.69 (m, 2H), 7.66-7.58 (m, 1H), 7.14 (s, 1H), 7.12 (s, 1H), 6.67-6.54 (m, 2H), 6.54-6.50 (m, 1H), 5.72-5.65 (m, 1H), 5.57-5.51 (m, 1H), 5.47-5.38 (m, 1H), 4.69-4.68 (m,2H), 4.5 (dd, J = 2.2, 11.9 Hz, 1H), 4.31, 4.16 (m, 2H), 3.90-3.82 (s, 1H), 2.62 (s, 3H), 2.48 (s, 3H), 2.21 (s, 3H), 2.22 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.93 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.45-1.39 (m, 2H), 1.00-0.87 (m, 6H)
13C NMR (75 MHz, CD3OD / TMS) δ: 172.34, 171.82, 171.48, 169.13, 161.82, 156.97, 154.02, 138.62, 136.13, 132.68, 130.30, 130.19, 117.71, 113.54, 111.72, 111.32, 103.48, 70.79, 62.96, 49.24, 45.77, 45.02, 43.35, 40.20, 33.07, 30.75, 30.60,23.70, 21.41, 21.06, 20.72, 20.61, 20.37, 19.36, 14.42, 14.43, 12.99
IR (neat) 3583, 2284, 742, 1656, 1584, 1545, 1449, 1371, 1233, 1112, 1047 cm-1
融点  191-197 ℃ (dec)
【０１０８】
［酸化還元特性］
例示化合物１（ＦＰ−ＢＯＤＩＰＹ）の酸化還元特性を、以下のようにして測定した。
１００μＭの例示化合物１を３０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）に溶かした溶液を用いて、ＢＡＳ社製電気化学アナライザーＭｏｄｅｌ  ８１４によりサイクリックボルタモグラム測定を行った。測定は室温で行い、作用電極にはグラッシーカーボン電極、対極には白金電極、参照電極にはＢＡＳ社製ＲＥ-１Ｂ水系参照電極（Ａｇ/Ａｇ+）を用いた。
同様にして、例示化合物１から、第２の蛍光発色団と連結基を除いた化合物である３−カルボキシメチル−７，８，１０−トリメチル−イソアロキサジン（ＣＭＩＡ）について、１００μＭの濃度でのサイクリックボルタモグラム測定を行った。
結果を図３及び図４に示す。
【０１０９】
図３は例示化合物１についての酸化還元特性を示し、図４は例示化合物１において第１の蛍光発色団に相当するＣＭＩＡの酸化還元特性を示す。図３及び図４から、例示化合物１とＣＭＩＡにおける酸化還元反応は可逆的であることがわかる。また、例示化合物１とＣＭＩＡとは、ほぼ同一の酸化還元特性を示し、ほぼ同一の酸化還元電位を示すことがわかる。
図３及び図４においては、３０％ＤＭＳＯ含有水溶液中での酸化還元電位（Ａｇ/Ａｇ+）を示したが、ＣＭＩＡのｐＨ７．０の水溶液中での酸化還元電位（対標準水素電極）は−０．２５Ｖであることから、例示化合物１の水溶液中での酸化還元電位（対標準水素電極）も約−０．２５Ｖであって細胞内の酸化還元電位を測定するのに好適であると容易に予測できる。
【０１１０】
［吸収スペクトル及び蛍光スペクトル］
例示化合物１の酸化型と還元型とにおける吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを以下のようにして測定した。結果を図５及び図６に示す。尚、図５及び図６において実線は酸化型のスペクトルを表し、破線は還元型のスペクトルを表す。
【０１１１】
１０μＭの例示化合物１を、３０％のＤＭＳＯを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）に溶解して、アルゴンバブリングにより脱酸素した。この溶液について、酸化型のＪＡＣＳＯ  Ｖ−５５０  ＵＶ-Ｖｉｓスペクトロフォトメータを用いてＵＶ-Ｖｉｓスペクトル（吸収スペクトル）を、ＪＡＣＳＯ  ＦＰ−６５００  スペクトロフルオロメータを用いて蛍光スペクトル（励起波長４５０ｎｍ）をそれぞれ測定した。
次いでこの溶液に、還元剤である亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）（酸化還元電位  −１．１２Ｖ）１００μＭを加えて１分間静置した。この還元剤を加えた溶液を用いて還元型の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを上記と同様にして測定した。
【０１１２】
図５は吸収スペクトルを示し、図６は蛍光スペクトル（励起波長４５０ｎｍ）を示す。例示化合物１の酸化型（実線）においては４５０ｎｍの励起光により、５１２ｎｍに強い蛍光発光を示すことが分かる。一方、還元型（破線）においては酸化型（実線）に比べて約１／１０の蛍光強度しか示さないことが分かる。
【０１１３】
また、同様にして例示化合物１の励起スペクトルをＪＡＣＳＯ  ＦＰ−６５００  スペクトロフルオロメータを用いて測定した。結果を図７及び図８に示す。
図７は例示化合物１における酸化型（実線）と還元型（破線）のそれぞれの励起スペクトルを示す。また、図８は例示化合物１における酸化型と還元型の励起スペクトルの発光強度比を示す。図８から、例示化合物１においては、酸化型と還元型との間で４３０−４５０ｎｍにおける５１２ｎｍの蛍光強度の比が約１０倍に達していることがわかる。
【０１１４】
次に、上記と同様にして、例示化合物１３、１４、１５について、酸化型と還元型の蛍光スペクトルを測定した。結果を図１２〜図１４に示す。尚、例示化合物１３、１４については励起波長を４５０ｎｍとし、例示化合物１５については励起波長を４１４ｎｍとした。尚、図１２〜図１４において実線は酸化型のスペクトルを表し、破線は還元型のスペクトルを表す。
いずれの化合物においても、酸化型（実線）の蛍光強度と還元型（破線）の蛍光強度には、大きな差があることが分かる。
【０１１５】
［酸化還元電位と吸収スペクトル及び蛍光スペクトル］
ジチオスレイトールとトランス−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジチアンの混合溶液を用いて、種々の酸化還元電位を有する溶液中での、例示化合物１の吸収スペクトル及び発光スペクトルを以下のようにして測定した。結果を図９及び図１０に示す。
【０１１６】
アルゴン雰囲気下のグローブボックス内において、アルゴンバブリングにより脱酸素した溶媒を用いて、ジチオスレイトールとトランス−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジチアンを一定の比で含み（ジチオスレイトールとトランス−４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジチアンの濃度の合計は５０ｍＭとした）、かつ１０μＭの例示化合物１と３０％ＤＭＳＯを含む１００ｍＭのバッファー溶液（ｐＨ８．６ではＴＡＰＳを使用、ｐＨ８．０、７．４ではＨＥＰＥＳを使用）を作成した。その後、溶液のＵＶ-ＶｉｓスペクトルをＪＡＣＳＯ  Ｖ−５５０  ＵＶ-Ｖｉｓスペクトロフォトメータを用いて、蛍光スペクトルをＪＡＣＳＯ  ＦＰ−６５００  スペクトロフルオロメータを用いて測定した。溶液の酸化還元電位は、ジチオスレイトールの酸化還元電位（−０．３１Ｖ  ｖｓ．ＳＨＥ、ｐＨ７．０）を用いて、ネルンストの式により算出した。
【０１１７】
図９及び図１０において、横軸は、対標準水素電極の酸化還元電位を示す。図９は４５０ｎｍにおけるＵＶ−ＶＩＳスペクトル（吸収スペクトル）の変化を示し、図１０は４５０ｎｍ励起時における５１２ｎｍの蛍光強度の変化を示す。
図９及び図１０から、例示化合物１は３０％ＤＭＳＯ中では、−０．４１〜−０．３６Ｖ（ｖｓ．ＳＨＥ、ｐＨ７．０）付近において、酸化還元による状態変化を示すことが分かる。この酸化還元電位よりも低い酸化還元電位においては、例示化合物１は還元型の構造をしており、蛍光発光がほとんど消失することがわかる。一方、この酸化還元電位よりも高い酸化還元電位においては、酸化型の構造をしており、強い蛍光発光を示すことが分かる。すなわち、例示化合物１は３０％ＤＭＳＯ水溶液中における−０．４１〜−０．３６Ｖ（ｖｓ．ＳＨＥ、ｐＨ７．０）の酸化還元電位の変化を高感度に検出可能であることが分かる。
【０１１８】
以上の結果をまとめると、［酸化還元特性］の結果から、本発明にかかる例示化合物１は酸化還元反応によって可逆的な構造変化を起こし、酸化還元電位の変化を時間分解的に検出可能であることがわかる。
また、［吸収スペクトル及び蛍光スペクトル］の結果から、例示化合物１は、酸化状態と還元状態における蛍光強度が大きく異なり、高感度に酸化還元状態を検出することが可能であることが分かる。
更に、［酸化還元電位と吸収スペクトル及び蛍光スペクトル］の結果から、例示化合物１は、３０％DMSO水溶液中における−０．４１〜−０．３６Ｖの酸化還元電位の変化を高感度に検出可能であることが分かる。
【０１１９】
［生細胞中での蛍光発光］
ＨｅＬａ細胞を、３７℃、Ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ５％ＣＯ２／ａｉｒ下で、接着培養した。３５ｍｍ培養皿（住友ベークライト社製）を用い、培地として、５６℃、４０分の熱処理で非動化した牛胎児血清１０%（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製、フェノールレッド不含）培地（１０%ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２）を用いた。上清を除き、接着培養したＨｅＬａ細胞に、１μＭの例示化合物１（ＦＰ−ＢＯＤＩＰＹ、酸化型）および１％ＤＭＳＯを含む１０%ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。上清を除き、細胞をＰＢＳ１ｍｌで1回洗浄した後、再度、３７℃に保温した１０%ＦＢＳ−ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を１ｍｌ加え、ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて、生細胞の蛍光顕微鏡測定をおこなった。シフトコントロールフィルタにはＯＰ−７９３０１  ＳＢフィルタＧＦＰ−ＢＰを用いて、４７２ｎｍの励起波長に対する５２０ｎｍの蛍光を露光時間０．６７秒で観察した。図１１に蛍光顕微鏡像を示す。
【０１２０】
図１１より、例示化合物１は生細胞内において酸化型状態で存在しており、強い蛍光発光を示すことが分かる。また、例示化合物１は主に細胞質に分布していることが分かる。
生細胞に酸化型の例示化合物１を導入した後、経時的に蛍光発光を観測したところ、徐々に蛍光強度が減少した。これは、生細胞内の酸化還元電位に応じて、生細胞内に導入した例示化合物１が還元され蛍光強度が大きく減少したためと考えられる。さらに、酸化剤として過酸化水素１０ｍＭを添加したところ、蛍光強度の回復が見られた。このように、例示化合物１は細胞内に効率よく導入でき、生細胞内酸化還元状態の可逆的変化をモニターすることが可能であることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】イソアロキサジン誘導体ＣＭＩＡの酸化型と還元型とにおける吸収スペクトルを表すチャートである。
【図２】イソアロキサジン誘導体ＣＭＩＡの酸化型と還元型とにおける蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図３】例示化合物１の酸化還元特性を表すチャートである。
【図４】ＣＭＩＡの酸化還元特性を表すチャートである。
【図５】例示化合物１の酸化型と還元型とにおける吸収スペクトルを表すチャートである。
【図６】例示化合物１の酸化型と還元型とにおける蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図７】例示化合物１の酸化型と還元型とにおける励起スペクトルを表すチャートである。
【図８】例示化合物１の還元型に対する酸化型の発光強度の比を表すチャートである。
【図９】横軸に酸化還元電位をとった例示化合物１の吸収スペクトルを表すチャートである。
【図１０】横軸に酸化還元電位をとった例示化合物１の蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図１１】例示化合物１の生細胞中での蛍光発光を示す蛍光顕微鏡像である。
【図１２】例示化合物１３の酸化型と還元型とにおける蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図１３】例示化合物１４の酸化型と還元型とにおける蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図１４】例示化合物１５の酸化型と還元型とにおける蛍光スペクトルを表すチャートである。
【図１】
2008239615.tif 000027
【図２】
2008239615.tif 000028
【図３】
2008239615.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008239615.tif 000033
【図９】
2008239615.tif 000034
【図１０】
2008239615.tif 000035
【図８】
2008239615.tif 000036
【図１１】
2008239615.tif 000037
【図１２】
2008239615.tif 000038
【図１３】
2008239615.tif 000039
【図１４】
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