(57)【要約】【課題】神経変性疾患の治療又は予防に有効な新たな化合物、薬剤及び食品を提供することである。【解決手段】下記式（Ｉ）で示されるクロマン誘導体と、本クロマン誘導体を有効成分として含む神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物並びに食品。2008222680.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表されるクロマン誘導体。
【化１】
2008222680.tif 000006
【請求項２】
請求項１記載のクロマン誘導体を有効成分として含む神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物。
【請求項３】
請求項１記載のクロマン誘導体を含有する神経変性疾患治療又は予防用食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマン誘導体並びに神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物及び食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アルツハイマー病やパーキンソン病に代表される神経変性疾患の患者数が増えていることを受けて、治療又は予防効果の高い治療方法や治療剤の開発が世界的な規模で進められている。
アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン病などの経変性疾患は、神経細胞が脱落することにより引き起こされる疾患であり、その神経細胞死の引き金となるのは小胞体ストレスであると考えられている。
小胞体ストレスの抑制をすると思われる薬剤としては、特許文献１にはジリノレオレイルホスファチジルエタノールアミンが開示されている。また、特許文献２には、小胞体ストレス誘導性アポトーシス抑制作用を有するユビキチンＥ３結合酵素（ＫＦ−１）をコードする遺伝子に基づいたポリペプチドが開示されている。その他、キノコの一種である桑黄由来の脂溶性抽出成分を有効成分とした小胞体ストレス抑制剤も提案されている（特許文献３）。
【０００３】
一方、キノコには人体に有効な薬理活性を持つ物質や成分を含むものが数多く存在することが知られている。例えば、カワラタケからはクレスチン、シイタケからはレンチナン、スエヒロタケからはシゾフィランという多糖体が単離され、抗ガン剤として利用されている。
また、ヤマブシタケからは、神経成長因子を誘導産生するヘリセノンやエリナシン、神経成長因子酸性誘導活性や抗菌活性を有するシアタン誘導体（特許文献４、５）、耐メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）活性を有する化合物（特許文献６）などが単離されている。
【特許文献１】特開２００５−２４７７２８号公報
【特許文献２】特開２００５−０８２５５７号公報
【特許文献３】特開２００６−３４２０７７号公報
【特許文献４】特開平７−７０１６８号公報
【特許文献５】特開２００１−２５９６８６号公報
【特許文献６】特開２００５−２７３２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述したような神経変性疾患の予防ないしは治療効果は、投与対象によって大きく異なることがあるため、治療又は予防用に使用可能な候補化合物を数多く開発することは重要である。また種々の生理活性物質が単離されているキノコ類からは、神経変性疾患の発症メカニズムに作用すると思われる化合物は未だに単離されていない。
従って、本発明の目的は、神経変性疾患の治療又は予防に有効な新たな化合物、医薬組成物及び食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のクロマン誘導体は、下記式（Ｉ）で表されるものである。
【０００６】
【化１】
2008222680.tif 000002
【０００７】
本発明の神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物は、上記式（Ｉ）で示されるクロマン誘導体を有効成分とするものである。
また本発明の神経変性疾患治療又は予防用食品は、上記式（Ｉ）で示されるクロマン誘導体を含むものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、神経変性疾患の治療又は予防に有効な新たな化合物、これを含む医薬組成物及び食品を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明のクロマン誘導体は、上記式（Ｉ）で示される化合物である。本化合物は、小胞体ストレスによる細胞死を抑制する作用を有する。この結果、本化合物を用いることによって、小胞体ストレスに基づいた神経変性疾患を治療又は予防することができる。
【００１０】
本発明において「神経変性疾患」とは、神経細胞がアポトーシス（神経細胞死）を起こし、正常な神経伝達機能が脱落した疾患をいう。「神経変性疾患」としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病、ハンチントン舞踏病、ピック病、進行性核上性麻痺、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、及びその他の各種痴呆疾患（例えば、ビンスバンガー病、脳血管性痴呆、正常圧水頭症、脳外傷後痴呆、慢性硬膜下血腫、脳腫瘍）が挙げられるが、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルトヤコブ病及びハンチントン舞踏病である。
【００１１】
本発明において「細胞死誘導」とは、細胞外部からの物理的、化学的刺激により細胞内部に情報が伝わり細胞死が誘導されることをいう。
本発明において「小胞体ストレス」とは、細胞表面又は細胞外タンパク質の翻訳の場である粗面小胞体における機能異常により、異常構造を持ったタンパク質などが蓄積することにより起こるストレスをいう。
なお、本発明において「治療」及び「予防」は、発症前での適用では「予防」との表現が適切であることが一般的であるが、本適用の疾患の性質上、厳格に区別されるものではない。特に発症後においては、症状の改善のみならず症状の悪化の抑制も、本発明における「治療又は予防」の概念に包含される。
【００１２】
本発明の化合物は、化学合成等によって得てもよいが、ハリタケ科（Hydnaceae）サンゴハリタケ属（Hericium）のキノコであるヤマブシタケ（Hericium erinaceum）から抽出されたものであることが好ましい。
本化合物を取得するための抽出溶媒の一例として、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルム、フェノール、ベンゼン、ヘキサン、ブタノール、イソプロパノール、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、トルエン、ジクロロメタン、トリクロロエチレン等の有機溶媒、及びこれらの有機溶媒と水の混合物が挙げられる。これらの溶媒は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を任意に組み合わせて使用してもよい。上記抽出溶媒の中で、好ましくは、酢酸エチル、エタノール及びこれらと水の混合物であり、更に好ましくは酢酸エチル及びこれと水の混合物、特に好ましくは酢酸エチルである。上記有機溶媒と水の混合物を抽出溶媒として使用する場合、該混合物における有機溶媒と水の混合比率としては、例えば、該混合物中に水が１〜９９重量％、好ましくは５〜５０重量％、更に好ましくは５〜３０重量％となる割合が例示される。
【００１３】
本化合物を得るには、まず、ヤマブシタケの子実体をそのまま、或いは必要に応じて乾燥、細切、破砕、圧搾又は煮沸処理したものを、上記抽出溶媒で抽出処理する。当該抽出処理は、抽出溶媒１００ｍｌに対して、ヤマブシタケの子実体が乾燥重量で通常５〜３０ｇ、好ましくは１５〜２５ｇ程度を加えて行うことができる。抽出処理は、通常室温で行われるが、３０〜９０℃に加熱して行ってもよい。また、抽出処理は、抽出溶媒中でヤマブシタケの子実体を攪拌又は静置させることにより行うことができるが、必要に応じて還流を行ってもよい。抽出時間は、通常２〜２４時間、好ましくは１０〜１５時間である。
【００１４】
上記抽出処理に先立って、ヤマブシタケの子実体をクロロホルムに浸漬（以下、単にクロロホルム処理という）して、クロロホルム可溶化画分を除去した後、得られた固形分を上記抽出処理に供してもよい。このように、前処理として、クロロホルム処理を行うことによって、より高い純度で本化合物を抽出溶媒に抽出させることが可能になる。当該クロロホルム処理における、クロロホルムに対するヤマブシタケの子実体の添加量、処理温度、処理時間、その他の条件等は、前記抽出処理の条件と同様である。
【００１５】
また、生の状態のヤマブシタケの子実体を用いて抽出処理する場合、その抽出処理は、例えば、以下に示す態様の抽出方法によって行うこともできる：メタノール、エタノール、アセトン、又はこれらと水の混合物（例えば８０〜８５％エタノール水溶液、８０〜８５％メタノール水溶液、８５％アセトン水溶液等）を用いて、ヤマブシタケの子実体を室温〜９０℃で１〜７２時間抽出処理し、次いで固形分を除去して更に酢酸エチルを混合し、酢酸エチル中に抽出された成分を回収する。
【００１６】
上記抽出処理後に、抽出溶媒から固形分（不溶化成分）を除去し、次いで減圧下で加熱して溶媒を蒸発させることにより、ヤマブシタケ溶媒抽出物を得ることができる。斯くして得られるヤマブシタケの溶媒抽出物には、上記クロマン誘導体が含まれている。当該ヤマブシタケの溶媒抽出物を、必要に応じて、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種クロマト分画処理に供することによって、本クロマン誘導体を単離することができる。
また、本クロマン誘導体は、上記抽出処理後に、抽出溶媒をそのまま上記のクロマト分画処理に供することによっても得ることができる。
【００１７】
前述したように、本発明の上記式（Ｉ）で示されるクロマン誘導体は、小胞体ストレスによる細胞死を抑制する作用を有するので、例えば、食品や医薬品の分野に有用である。
即ち、本発明の神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物は、本発明のクロマン誘導体を有効成分として含むものである。本治療又は予防用医薬組成物は、本クロマン誘導体を薬学的に許容される基材や担体と共に製剤化したものである。本治療又は予防用医薬組成物には、必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤化剤、緩衝剤、保存剤、香料等の薬学的に許容される添加剤を任意に配合してもよい。本治療又は予防用医薬組成物の形態としては、特に制限されるものではないが、一例として、フィルム剤、トローチ、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤等を挙げることができる。
【００１８】
本発明のクロマン誘導体を有効成分として含む神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物の投与量は、投与形態、投与目的、投与対象者の年齢や体重等によって異なるが、成人１日当たりの投与量として、本発明のクロマン誘導体が、例えば０．０１ｍｇ〜５００ｍｇに相当する量を挙げることができる。また、本発明の神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物の一日当たりの投与回数は、投与対象者の年齢や体重、症状、本治療又は予防用医薬組成物の１回当たりの投与量等に応じて適宜設定できる。
【００１９】
本発明の神経変性疾患治療又は予防用食品は、本発明のクロマン誘導体を食品素材として各種食品に配合されたものである。本発明が適用可能な食品は、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、特に抗認知症用の食品等を挙げることができる。
本発明の食品における本発明のクロマン誘導体の配合量は、該食品の種類、対象者の年齢、性別、期待される効果等に応じて、適宜設定することができる。一例として、上記食品の総重量に対して、本発明のクロマン誘導体が０．０１質量％〜５重量％となる割合が挙げられる。
本発明の食品の１日当たりの摂取量や摂取回数は、投与対象者の年齢や体重、症状、本発明のクロマン誘導体の１回当たりの投与量等に応じて適宜設定できる。
【実施例】
【００２０】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００２１】
［実施例１］
クロマン誘導体の単離
ヤマブシタケの乾燥子実体３．８ｋｇをクロロホルム２０Ｌに加えて、ホモジナイズ処理し２５℃で１２時間、静置した。次いで、固形分を回収し、該固形分（乾燥重量）３．７ｋｇを酢酸エチル２０Ｌに加えて、２５℃で１２時間、静置した。
【００２２】
得られたクロロホルム層４０ｇをシリカゲルカラム（silica gel 60N、関東化学社製）を用いたカラムクロマトグラフィーに供した。この際、展開溶媒として、順次極性が大きくなるように、クロロホルム／メタノール＝９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、０：１０をそれぞれ１Ｌ用いて、４０ｍＬの画分を合計１５０画分得た。この内、クロロホルム／メタノール＝８：２溶出画分を、更に展開溶媒としてクロロホルム／メタノール＝８：２、６：４、０：１０を各１Ｌ用いて、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行い、４０ｍＬの画分を合計７５画分得た。次いで、得られた第２１〜２８画分について、クロロホルム／メタノール＝８：２を展開溶媒として用いて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行い、スポットが検出された画分をかき取った。更に、回収した画分をＨＰＬＣ（カラム；CAPCEL PAK AQ φ４．６×２５０ｍｍ、流速；５ｍＬ／ｍｉｎ、溶媒９５％メタノール水溶液）に供し、油状物質を１．２ｍｇ得た。これをＹＡＴ−１と名付けた。
【００２３】
［実施例２］
ＹＡＴ−１の特性
次に、実施例１で得られたＹＡＴ−１の物理化学的性質及び構造解析を行った。
得られた化合物は、下記の物理化学的性質及び構造解析結果を示す。
（１）分子量：５８６．７９９１（Ｃ３５Ｈ５４Ｏ７）
（２）性状：油状
（３）溶媒に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチルに可溶、水にやや可溶
（４）塩基性、中性、酸性の別：中性
（５）１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ(in ＣＤＣｌ３）：表１のとおり。
また本化合物は、ＩＲにおいて３４４６ｃｍ−１に水酸基の吸収が認められた。なお旋光度を測定したが、光学活性は見られなかった。
これらの結果から、ＹＡＴ−１は、式Ｉで示されるとおり、分子式Ｃ３５Ｈ５４Ｏ７、８−ホルミル−３−ヒドロキシ−５−メトキシ−２−メチル−３−（４’−メチル−２’−オキソ−３’−ペンテニル）−７−クロマニルメチルパルミテート（8-formyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-methyl-3-(4’-methyl-2’-oxo-3’-pentenyl)-7-chromanylmethyl palmitate）であった。
【００２４】
【表１】
2008222680.tif 000003
【００２５】
［実施例３］
ＹＡＴ−１の小胞体ストレス誘導神経細胞死抑制効果
実施例２で構造が確認されたクロマン誘導体ＹＡＴ−１の広範な神経変性疾患予防効果を確認するために、神経変性疾患における小胞体ストレス誘導細胞死のモデルとして汎用されているツニカマイシン（ＴＭ：糖鎖生合成阻害）及びタプシガルギン（ＴＧ：小胞体内カルシウム枯渇）の神経系細胞（Ｎｅｕｒｏ２ａ）に対する細胞毒性を、ＹＡＴ−１が抑制するか否かについて検討を行った。ツニカマイシン及びタプシガルギンは、神経変性疾患に関わる細胞内情報伝達系モデルである。ＹＡＴ−１は、少量のエタノールに溶解し、水（細胞培養用培地）を加えた懸濁液を調製して、以下の試験に供した。
【００２６】
マウス神経芽細胞腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２ａ（ＩＦＯ５００８１）を、９６ウェルプレート中、５，０００細胞／ウェルの密度で２４時間培養を行う。培養は、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質としてペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を使用し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件で行った。
２４時間培養後、ＦＢＳを含まない上記培地に０．５μｇ／ｍｌのツニカマイシン（和光純薬工業製）又は１０ｎＭタプシガルギン（和光純薬工業製）と、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌのＹＡＴ−１を加えた培地で更に２４時間培養を行った。
培養後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブトミド（ＭＴＴ）法による生細胞数の定量解析を行った。具体的には、培地を２５０μｇ／ｍｌのＭＴＴを含む無血清の上記培地に交換し、さらに２時間培養を行い、反応停止液（２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド水溶液）を培地と同量添加して反応を停止する。細胞と生成物の可溶化後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍの吸光度測定を行うことで生細胞数の定量評価を行った。
結果を表２及び図１に示す。
【００２７】
【表２】
2008222680.tif 000004
【００２８】
結果に示されるように、ツニカマイシンを投与したＮｅｕｒｏ２ａ細胞の生存率は無添加コントロールの４８．９１±２．１５％であったが、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌのＹＡＴ−１を添加した細胞の生存率は、それぞれ５２．８０±１．６１％、５６．１３±５．１７％、６５．１７±２．４６％であった。ｔ−ｔｅｓｔによる解析の結果０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ添加群ではｐ＜０．０５の、１０μｇ／ｍｌ添加群ではｐ＜０．０１の有意差が認められた。
一方、タプシガルギン投与系においては、タプシガルギン投与のみでは生存率は５１．３７±３．６６％であったが、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌのＹＡＴ−１を添加した細胞の生存率は、それぞれ５１．９９±２．６８％、５６．９０±３．６９％、５７．３５±３．０８％であった。ｔ−ｔｅｓｔによる解析の結果１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ添加群でｐ＜０．０５の有意差が認められた。
以上の結果から、ＹＡＴ−１には、広範な小胞体ストレス誘導神経細胞死に対する抑制効果があると考えられ、ＹＡＴ−１を摂取することによって神経変性疾患の症状の抑制又は緩和が期待できる。
【００２９】
［実施例４］
ＹＡＴ−１のアルツハイマー病モデルに対する効果
ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ−１２（ＪＣＲＢ０７３３）を、９６ウェルプレート中、１０，０００細胞／ウェルの密度で２４時間培養を行う。培養は、１０％馬血清（ＨＳ）５％牛胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質としてペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを添加したダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）を使用し、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件で行った。
２４時間培養後、ＦＢＳを含まない上記培地に１０μＭのアミロイドβ１−４０−ペプチド（配列番号１：４３０７−ｖ、ペプチド研究所製）と、０．１μｇ／ｍｌのＹＡＴ−１を加えた培地で更に４８時間培養を行った。
【００３０】
培養後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウムブトミド（ＭＴＴ）法による生細胞数の定量解析を行った。具体的には、培地を２５０μｇ／ｍｌのＭＴＴを含む無血清の上記培地に交換し、さらに２時間培養を行い、反応停止液（２０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｖ／ｖ）ジメチルホルムアミド水溶液）を培地と同量添加して反応を停止する。細胞と生成物の可溶化後、マイクロプレートリーダーにより５７０ｎｍの吸光度測定を行うことで生細胞数の定量評価を行った。
結果を表３及び図２に示す。
【００３１】
【表３】
2008222680.tif 000005
【００３２】
ツニカマイシンを投与したＰＣ−１２細胞の生存率は無添加コントロールの７６．２９±７．９９％であったが、０．１μｇ／ｍｌのＹＡＴ−１を添加した細胞の生存率は、９０．４３±５．６２％であった。ｔ−ｔｅｓｔによる解析の結果０．１μｇ／ｍｌ添加群でｐ＜０．０５の有意差が認められた。
以上の結果から、ＹＡＴ−１には、アルツハイマー病の原因と考えられているアミロイド−β−ペプチドによる神経細胞死に対する抑制効果があると考えられ、ＹＡＴ−１を摂取することによってアルツハイマー病の症状の抑制又は緩和が期待できる。
【００３３】
このように本発明によれば、神経変性疾患の治療又は予防効果を有するクロマン誘導体が提供でき、このクロマン誘導体を適用分野に応じた担体等と配合することによって、神経変性疾患治療又は予防用医薬組成物並びに食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施例にかかる小胞体ストレス誘導神経細胞死抑制試験の結果を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例にかかるアミロイドβ１−４０−ペプチドによる神経細胞死抑制試験の結果を示すグラフである。
【図１】
2008222680.tif 000008
【図２】
2008222680.tif 000009
【配列表】
2008222680000001.app