(57)【要約】【課題】極微量物質を検出する際に、当該極微量物質の増幅を行わなくても高感度に検出すること。【解決手段】共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質Ｆと、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質Ｑと、該クエンチャー物質Ｑと前記蛍光物質Ｆの間に位置しており、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位Ｘを有する核酸鎖部分Ｎと、を少なくとも有する検出用核酸鎖Ｐや該検出用核酸鎖Ｐを用いた検出技術を提供する。【選択図】図１
2008067694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質と、
前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質と、
前記クエンチャー物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位が形成された核酸鎖部分と、
を少なくとも有する検出用核酸鎖。
【請求項２】
前記酵素切断部位は、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼにより切断される塩基欠落部位（ＡＰ部位）であることを特徴とする請求項１記載の検出用核酸鎖。
【請求項３】
前記核酸鎖部分は、オリゴヌクレオチド鎖であることを特徴とする請求項１記載の検出用核酸鎖。
【請求項４】
前記核酸鎖部分には、所定のタンパク質と結合する応答塩基配列領域が存在することを特徴とする請求項１記載の検出用核酸鎖。
【請求項５】
前記タンパク質は、転写因子であることを特徴とする請求項４記載の検出用核酸。
【請求項６】
共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質と、
前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質と、
前記クエンチャー物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位を有する核酸鎖部分を少なくとも有する検出用核酸鎖が係わる相補鎖形成反応を進行させる手順と、
前記相補鎖形成反応によって得られた二本鎖に特異的な前記エンドヌクレアーゼを作用させることによって、前記酵素切断部位でプローブ核酸鎖を切断して断片化し、かつ、一本鎖へ解離させることによって、前記蛍光物質の蛍光を増幅する手順と、
を少なくとも行う核酸鎖利用方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法を利用する方法であって、
前記エンドヌクレアーゼ添加前の蛍光強度と添加後の蛍光強度とを測定し、蛍光増幅の有無又は増幅量に基づいて、次の（１）から（５）のいずれかを検出することを特徴とする方法。
（１）前記検出用核酸鎖に相補的な標的核酸鎖。
（２）核酸以外の生体物質。
（３）生体物質の化学的変化。
（４）生体物質の構造変化。
（５）薬剤候補物質。
【請求項８】
前記エンドヌクレアーゼ切断前の前記検出用核酸鎖が前記相補鎖形成反応を進行できる上限温度以下であり、かつ、前記エンドヌクレアーゼ切断後の検出用核酸鎖断片が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度以上の温度条件下で行うことを特徴とする請求項７記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の検出等に有用な核酸鎖とその関連技術に関する。より詳細には、蛍光物質とクエンチャー物質の間の塩基配列部分に酵素切断部位が存在する核酸鎖、並びに該核酸鎖を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
物質から発せられる蛍光を検出することにより、物質の存在や反応等を検出する技術が知られており、種々のセンサー技術などに広く利用されている。
【０００３】
例えば、反応場に存在している物質の存在を、当該物質と特異的に相互作用し得るプローブ物質を前記反応場に導入し、該プローブ物質に予め標識された蛍光が該反応場から検出できるか否かによって確認する技術が知られている。例えば、基板（チップ）表面に固定された核酸鎖に向けて、蛍光標識された核酸鎖を導入して、両核酸鎖間のハイブリダイゼーションの有無を蛍光検出により行う手法はＤＮＡチップの慣用技術である。
【０００４】
また、反応場に存在している一本鎖核酸同士がハイブリダイゼーションしたときに、その相補結合部分に特異的に結合して蛍光を発する物質、いわゆる「インターカレーター」も知られている。このインターカレーターは、核酸鎖に蛍光物質を予め標識しておく手間が省けるなどの利点がある。
【０００５】
「ＦＲＥＴ（Fluorescence Resonance Energy Transfer）」は、励起された蛍光物質（Donor）から放出された共鳴励起エネルギーを受け取った蛍光物質（Acceptor）が励起状態となって蛍光が発せられる現象又は原理を言う。この「ＦＲＥＴ」が起こるためには、ドナーとアクセプターの蛍光スペクトルが重なり合うこと、両物質が一定程度の範囲や適切な位置関係にあることが必要である。この「ＦＲＥＴ」を利用して、ドナーとなる蛍光物質がラベルされた物質とアクセプターとなる蛍光物質がラベルされた物質との相互作用の有無を検出する技術が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００６】
次に、「生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）」は、タンパク質間相互作用を直接的に検出できる生物物理学的な方法である。この「ＢＲＥＴ」は、もともとクラゲAequorea victoriaやウミシイタケRenilla reniformisなどの海洋生物に認められるプロセスであり、ドナータンパク質とアクセプタータンパク質が接近したきに発生する、ドナータンパク質の励起エネルギー移動に伴うアクセプタータンパク質のエネルギー放出を、蛍光検出することができる。したがって、ＢＲＥＴは、タンパク質間の相互作用を検出する有用な技術となり得る。
【特許文献１】特開２００４−０６５２６２号公報。
【特許文献２】特開２００５−２０７８２３号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
反応場や試料溶液中に存在する極微量物質を検出しようとする場合に、一般的に行われる手法は、前記極微量物質を増幅させることによって検出感度を向上させることである。
例えば、検出対象となる極微量の核酸鎖を、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によって増幅する技術は広く行われている。
【０００８】
しかし、極微量物質の増幅には、慎重な作業が要求され、手間もかかり、また、特別の高価な装置も必要となる場合が多い。さらに、作業に慎重を期しても、目的対象外の物質が増幅過程で副次的に発生してしまう可能性があり、この場合は検出ノイズの原因となってしまうという技術的課題があった。加えて、タンパク質や脂質などの生体物質は核酸鎖に比べて増幅することが難しいという技術的課題もある。
【０００９】
そこで、本発明は、極微量物質を検出する際に、当該極微量物質の増幅を行わなくても高感度に検出することができる技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、まず、共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質と、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質と、該クエンチャー物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位が形成された核酸鎖部分と、を少なくとも有する検出用核酸鎖を提供する。
【００１１】
なお、「クエンチャー物質」は、蛍光を低減又は消光する機能を有する物質を広く意味し狭く限定されない。「核酸鎖」は、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ等を広く含む。
【００１２】
「エンドヌクレアーゼ」は、核酸鎖の内部を切断する核酸分解酵素の総称であり、本発明では本酵素を単独で用いたり、あるいは他の協働的作用を発揮する酵素と併用したりする。「検出用核酸鎖」は、所定の物質、反応（化学的結合、相互作用等を含む）、構造等を検出する目的で用いられる核酸鎖であり、場合によってはプローブ核酸鎖と称されるような概念と一致する。
【００１３】
本発明に係る検出用核酸鎖を構成する核酸鎖部分に存在する前記酵素切断部位としては、例えば、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼによって切断され得る塩基欠落部位（ＡＰ部位）を挙げることができる。
【００１４】
なお、「ＡＰ部位（Apurinic/Apyrimidinic site）」は、核酸鎖において塩基が欠落（脱落）している部位を意味し、「ＡＰ-エンドヌクレアーゼ（AP-endonuclease又はApurinic/Apyrimidinic endonuclease）」は、核酸鎖においてＡＰ部位にニック（nick、切れ目）を入れるＡＰリアーゼ活性を有する酵素である。その例を幾つか挙げると、Endonuclease VI・Endonuclease IV（ＡＰ部位の５′側を切断）、Endonuclease III(ＡＰ部位の３′側を切断)、Endonuclease S1, Endonuclease VIII、Formamidopyrimidine-DNA-glycosylase（Fpg）、ＯＧＧ１などである。本発明において、特に有用なＡＰ-エンドヌクレアーゼは、二本鎖を特異的に認識し、かつ、塩基欠落部位を有する側の一方の核酸鎖を当該塩基欠落部位において切断する酵素である。
【００１５】
本発明に係る核酸鎖の塩基数（核酸分子数）は、特に限定されないが、例えば、オリゴヌクレオチド鎖であって、同核酸鎖の用途についても特に限定はされないが、一例を挙げれば、標的物質（検出目的の物質）を検出するためのプローブとして用いることができる。なお、オリゴヌクレオチド鎖とは、数十塩基程度、例えば、１５〜３０塩基程度のヌクレオチドポリマーを意味する。核酸鎖部分は、例えば、所定のタンパク質と結合する応答塩基配列領域が存在するものでもよく、該タンパク質は、核酸鎖に結合する機能を有するタンパク質であって、その一例は、転写因子である。
【００１６】
次に、本発明は、（１）共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質と、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質と、該クエンチャー物質と前記蛍光物質の間に位置しており、エンドヌクレアーゼにより切断される酵素切断部位を有する核酸鎖部分を少なくとも有する検出用核酸鎖が係わる相補鎖形成反応を進行させる手順、（２）前記相補鎖形成反応によって得られた二本鎖に特異的なエンドヌクレアーゼを作用させることによってエンドヌクレアーゼ切断部位でプローブ核酸鎖を切断して断片化し、かつ、一本鎖へ解離させることによって、前記蛍光物質の蛍光を増幅する手順、以上（１）、（２）の手順を少なくとも行う核酸鎖利用方法を提供する。
【００１７】
なお、「相補鎖形成反応」は、核酸（ヌクレオチド鎖）間のいわゆるハイブリダイゼーションであって、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＲＮＡ間の相補結合などを広く含む。
【００１８】
本発明に係る方法は、クエンチャー物質の作用により蛍光低減又は消光状態にある検出用核酸鎖が、自らと相補的な核酸鎖と二本鎖を形成したことが想定されるときに、二本鎖特異的なエンドヌクレアーゼの作用により、検出用核酸鎖をエンドヌクレアーゼ切断部位にて切断するとともに、一本鎖へと解離させる。
【００１９】
この一本鎖解離の段階では、検出用核酸鎖は、蛍光物質側の核酸鎖とクエンチャー物質側の核酸鎖に断片化されて遊離することから、蛍光物質はクエンチャー物質と距離を置いて存在するようになるので、（クエンチャー物質の影響が無くなって）蛍光が増幅するようになる。
【００２０】
本方法は、例えば、エンドヌクレアーゼ切断前の前記検出用核酸鎖が前記相補鎖形成反応を進行できる上限温度以下であり、かつ、エンドヌクレアーゼ切断後の検出用核酸鎖断片が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度以上の温度条件下で行うことができる。
【００２１】
この蛍光増幅の有無、あるいは増幅量（増幅の程度）を測定することによって、本発明では、検出用核酸鎖が二本鎖（相補鎖）を形成したこと、即ち、前記プローブ核酸鎖に相補的な標的核酸鎖が存在すること、さらには、核酸以外の生体物質が存在すること、生体物質に化学的変化や構造変化が起こっていること、薬剤候補物質が存在すること、などを知ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明に核酸鎖を用いることによって、極微量物質を検出する際に、当該極微量物質の増幅を行わなくても高感度に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施形態例ついて、添付図面を参照にしながら説明する。なお、本発明の概念は、以下に説明する実施形態例に基づいて狭く解釈されることはない。
【００２４】
まず、図１から図４は、本発明に係る検出用核酸鎖の概念及び実施形態例を説明するための図である。
【００２５】
図１から図４中に示されている符号Ｐは、本発明に係る検出用核酸鎖の一実施形態例を示している。この検出用核酸鎖Ｐは、共鳴励起エネルギー（fluorescence Resonance Energy）のドナーとなり得る蛍光物質Ｆと、前記共鳴励起エネルギーを受け取ることが可能な位置に存在するクエンチャー物質Ｑと、該クエンチャー物質と前記蛍光物質の間に位置する核酸鎖部分Ｎと、該核酸鎖部分Ｎに存在する酵素切断部位（例えば、ＡＰ部位：図面中、符号Ｘで示す。）と、を少なくとも有している。
【００２６】
例えば、所定の分子長からなる核酸鎖の３′末端又は５′末端に蛍光物質Ｆを結合（標識）し、該蛍光物質Ｆとは逆側の末端部にクエンチャー物質Ｑを結合（標識）した場合では、前記核酸鎖の全部が蛍光物質Ｆとクエンチャー物質Ｑの間に位置しているので、その全核酸鎖部分が本発明で言うところの核酸鎖部分Ｎに相当するものとなる（図１参照）。
【００２７】
また、所定の分子長からなる核酸鎖の末端以外の位置に、蛍光物質Ｆとクエンチャー物質Ｑの両方又はいずれか一方を結合した構成では、両物質Ｆ、Ｑの間に存在している核酸鎖領域が本発明で言う核酸鎖部分Ｎとなる（図２〜図４参照）。
【００２８】
具体的には、図２は、蛍光物質Ｆとクエンチャー物質Ｑの両方を核酸鎖の途中部位に結合した実施形態例、図３は、蛍光物質Ｆを末端部位、一方のクエンチャー物質Ｑを途中部位に結合した他の実施形態例、図４は、蛍光物質Ｆを途中部位、一方のクエンチャー物質Ｑを末端部位に結合したさらに別の実施形態例をそれぞれ示している。
【００２９】
図５は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐの機能とその代表的な使用例を示す図である。なお、この図５に示す例では、同検出用核酸鎖Ｐを用いて、その核酸鎖部分Ｎに相補的な塩基配列を有する核酸鎖Ｔの存在やその存在量を検出する例が示されており、本例においては、図１に示す検出用核酸鎖Ｐを代表例として説明している（図２〜４の検出用核酸Ｐでもよい）。
【００３０】
検出用核酸鎖Ｐは、所定の酵素処理（後述）が施される前では、蛍光物質Ｆから発せられるはずの蛍光がクエンチャー物質Ｑの作用によって低減又は消光されている。この状態にある検出用核酸鎖Ｐが存在する反応場Ｒにサンプル溶液を導入したときに、該サンプル溶液中に検出用核酸鎖Ｐの核酸鎖部分Ｎに相補的な塩基配列を有する核酸鎖Ｔが存在すると、前記核酸鎖部分Ｎと核酸鎖Ｔは二本鎖（相補鎖）を形成する（相補鎖形成手順）。なお、図５中の符号Ｗは、前記相補鎖形成手順によって生成した二本鎖（相補鎖）部分を示している（以下、同様）。
【００３１】
次に、上記相補鎖形成手順を行った後、あるいはこの手順と同時に、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入すると（図６参照）、該ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥが相補鎖Ｗを形成している（検出用核酸鎖Ｐの）核酸鎖部分Ｎに存在しているＡＰ部位Ｘを認識し、該ＡＰ部位Ｘ部分に対して切れ目（Ｎｉｃｋ）を入れ、検出用核酸鎖Ｐを蛍光物質Ｆ側とクエンチャー物質Ｑ側に分断する。即ち、二本鎖（相補鎖）部分Ｗは、蛍光物質Ｆ側の二本鎖Ｗ１とクエンチャー物質Ｑ側の二本鎖Ｗ２に短鎖化される。なお、図６は、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによってＡＰ部位Ｘに対して切れ目が形成される様子を模式的に示す図である。
【００３２】
ここで、二本鎖（相補鎖）部分Ｗ（図５参照）と、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって短鎖化された二本鎖Ｗ１及び二本鎖Ｗ２（図６参照）とでは、鎖長が異なるため、Ｔｍ（メルト温度）が相違する。即ち、Ｔｍは、Ｗ＞Ｗ１、Ｗ＞Ｗ２となる。
【００３３】
そこで、反応場Ｒのバッファー溶液温度条件を、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによる切断前の検出用核酸鎖Ｐが前記相補鎖形成反応を進行又は維持することができる温度Ｔａ以下であって、かつ、前記ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによる切断後の検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２（図６参照）が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度Ｔｂ以上の適正温度（Ｔ）条件、即ち、温度Ｔｂ≦Ｔ≦Ｔａとする。
【００３４】
図７は、前記適正温度条件Ｔ下で、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって切断された検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２（図６参照）が核酸鎖Ｔから解離し、一本鎖として反応場Ｒに遊離している状態を模式的に示している。
【００３５】
また、図９は、反応場Ｒの温度条件の変化によって、（切断されていない）検出用核酸鎖Ｐと、（ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって切断された）検出用核酸断片Ｐ１、Ｐ２の二本鎖形成又は解離の様子を示す参考図である。
【００３６】
図９について具体的に説明すると、温度Ｔｂ未満の温度条件Ｔ１では、検出用核酸鎖Ｐと検出用核酸断片Ｐ１、Ｐ２のすべてが二本鎖形成を進行させることが可能であり、また、二本鎖を維持することもできる。
【００３７】
次に、適正温度Ｔ２（Ｔｂ≦Ｔ２≦Ｔａ）の条件下では、検出用核酸鎖Ｐが前記相補鎖形成反応を進行可能であって、形成された相補鎖は維持することができる。一方、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって短鎖化された検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２は、核酸鎖Ｔから解離してそれぞれ一本鎖になっており、この一本鎖解離によって、蛍光物質Ｆはクエンチャー物質Ｑと距離を置いて存在するようになるため、（クエンチャー物質Ｑの影響が無くなって）蛍光が増幅するようになる（図９参照）。
【００３８】
さらに、温度Ｔ３の条件下では、検出用核酸鎖Ｐも一本鎖に解離しており、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって短鎖化された検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２も、核酸鎖Ｔから解離してそれぞれ一本鎖になっている（図９参照）。
【００３９】
ここで、本発明は、反応場Ｒに対して、核酸鎖Ｔに比して過剰量の検出用核酸Ｐを導入することによって、「核酸鎖Ｔと検出用核酸鎖Ｐとの間の相補鎖形成（図５参照）」→「ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによる検出用核酸鎖Ｐの短鎖化（図６参照）」→「短鎖化された検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２の核酸鎖Ｔからの解離とそれに伴う蛍光増幅（図７参照）」、という一連の反応が、反応場Ｒに存在する検出用核酸鎖Ｐによって何度も繰り返されることで（以下、便宜上「サイクル反応」という。）、反応場Ｒに存在する極微量の核酸鎖Ｔからも増幅された強い蛍光シグナルを得ることができるという利点がある。
なお、図８は、このサイクル反応の基本的なフローを示す図である。
【００４０】
即ち、反応場Ｒに存在する核酸鎖Ｔの量をわざわざ増幅しなくても、極微量のままの状態から、同核酸鎖Ｔの存在を示すことになる（クエンチャー物質Ｑによって消光されなくなった）蛍光物質Ｆ由来の強い蛍光シグナルを反応場Ｒから得られることになるので、核酸鎖Ｔを高感度で検出することができる。
【００４１】
したがって、本発明において、反応場Ｒの温度条件の設定は、核酸鎖Ｔと検出用核酸鎖Ｐとの間の相補鎖形成が進行させることができることが重要であるので、図９に示すようなＴａを超える温度Ｔ３の条件は、好ましくない。
【００４２】
したがって、本発明において好適な温度条件は、既述したとおり、ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによる切断前の検出用核酸鎖Ｐが前記相補鎖形成反応を進行又は維持することができる温度Ｔａ以下であって、かつ、前記ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによる切断後の検出用核酸鎖断片Ｐ１、Ｐ２（図６参照）が相補鎖形成反応を維持又は進行できなくなる温度Ｔｂ以上の温度（即ち、温度Ｔｂ≦Ｔ≦Ｔａ）である（図９再参照）。
【００４３】
なお、検出用核酸鎖断片Ｐ１とＰ２（図６参照）の鎖長が異なることによって、これらのＴｍが異なる場合が想定されるが、その場合は、より高い方のＴｍを、設定温度条件の下限温度Ｔｂとして扱うことによって、検出用核酸鎖断片Ｐ１とＰ２の両方を核酸鎖Ｔから解離させることができる。これにより、上記繰り返し反応を行うことが可能となる。
【００４４】
以下、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用した応用方法例について、幾つか説明する。なお、以下に説明する応用方法例は、あくまで例示であって、これらにより、本発明が狭く限定されることはない。
【００４５】
以下に例示する応用方法例のいずれにも共通する本発明の特徴は、反応場に導入された過剰量の検出用核酸鎖Ｐが係わる上記「サイクル反応」によって、極微量の物質、量的に少ない反応や相互作用、物質構造の変化を高感度に検出できるという点である。この点については、重複するので都度の詳しい説明については割愛する。
【００４６】
＜第１応用方法例＞
図１０は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第１応用方法例の概念を示す模式図である。この第１応用方法例では、核酸鎖Ｙの塩基配列中に、目的の塩基配列領域が存在するか否かを検証する場合などに有用である。一例を挙げれば、遺伝子上流に位置するプロモーター領域中に、特定の転写因子に対する特異的な応答塩基配列部分が存在するか否かを確認することができる。
【００４７】
＜第２応用方法例＞
図１１は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第２応用方法例の概念を示す模式図である。この第２応用方法例によれば、固相（例えば、基板、ビーズ、担体等）の表面Ｓに検出標的となる物質（例えば、タンパク質）が存在しているか否かを検出することができる。
【００４８】
より具体的には、表面Ｓが臨む反応場Ｒへサンプル溶液を導入し、これに続いて、検出目的である物質Ｍと特異的に結合する塩基配列を有する核酸鎖Ｚ１を導入した後、あるいはそれと同時に、前記塩基配列と相補的な核酸鎖部分Ｎを有する検出用核酸鎖Ｐを導入し、その後、反応場Ｒを溶液洗浄する。そして、さらに検出核酸鎖Ｐと二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入する。
【００４９】
仮に、前記サンプル溶液中に前記物質Ｍが存在していた場合は、相補鎖を形成した核酸鎖Ｚ１と検出用核酸鎖Ｐが物質Ｍに結合した状態となるので、該相補鎖に対してＡＰ-エンドヌクレアーゼＥが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分ＮのＡＰ部位Ｘ）に切れ目を入れて一本鎖化する。このため、当該物質Ｍの含有量が極微量であっても、検出用核酸鎖Ｐを構成していた蛍光物質Ｆからの強い蛍光シグナルが得られる。これにより、前記物質Ｍの高感度検出を行うことができる。
【００５０】
＜第３応用方法例＞
図１２は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第３応用方法例の概念を示す模式図である。この第３応用方法例によれば、固相（例えば、基板、ビーズ等）の表面Ｓに固定されている物質Ｋに対する物質Ｌの反応や相互作用を検出することができる。
【００５１】
より具体的には、物質Ｋが予め固定された表面Ｓが臨む反応場Ｒに対して、前記物質Ｋとの反応や相互作用の有無を検証する物質Ｌを含有するサンプル溶液を導入し、その後、反応場Ｒを溶液洗浄する。なお、物質Ｌには所定塩基配列の核酸鎖Ｚ２を予め標識しておくようにする。
【００５２】
溶液洗浄に続いて、前記核酸鎖Ｚ２の塩基配列と相補的な核酸鎖部分Ｎを有する検出用核酸鎖Ｐを導入し、続いて、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入する。
【００５３】
仮に、物質Ｋと物質Ｌが反応して結合する場合又は相互作用する場合は、反応場Ｒにおいて物質Ｌに標識されている核酸鎖Ｚ２と検出用核酸鎖Ｐ（の核酸鎖部分Ｎ）が相補鎖を形成するので、該相補鎖に対して二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分ＮのＡＰ部位Ｘ）に切れ目を入れて一本鎖化する。このため、物質Ｋと物質Ｌの反応や相互作用の量が極わずかであっても、検出用核酸鎖Ｐを構成していた蛍光物質Ｆからの強い蛍光シグナルが得られる。
【００５４】
これにより、物質Ｋと物質Ｌの反応（例えば、抗原抗体反応）や相互作用（例えば、タンパク質間の相互作用、脂質と結合分子の反応等）の高感度検出を行うことができる。
【００５５】
＜第４応用方法例＞
図１３は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第４応用方法例の概念を示す模式図である。この第４応用方法例によれば、薬剤候補となり得るような低分子化合物、例えば、レセプターに結合して、アゴニストやアンタゴニストとなり得る化合物を高感度に検出又はスクリーニングすることができる。
【００５６】
より具体的には、基板等の固相表面Ｓに存在する物質Ｕに向けて、前記物質Ｕと結合又は相互作用し得る候補物質Ｖを含有するサンプル溶液を導入し、その後、反応場Ｒを溶液洗浄する。なお、物質Ｕには所定塩基配列の核酸鎖Ｚ２を予め標識しておくようにする。
【００５７】
この溶液洗浄に続いて、前記核酸鎖Ｚ２の塩基配列と相補的な核酸鎖部分Ｎを有する検出用核酸鎖Ｐを導入し、続いて、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入する。
【００５８】
仮に、物質Ｕと低分子化合物Ｖが結合する場合は、反応場Ｒにおいて物質Ｖに標識されている核酸鎖Ｚ２と検出用核酸鎖Ｐ（の核酸鎖部分Ｎ）が相補鎖を形成するので、該相補鎖に対して二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分ＮのＡＰ部位Ｘ）に切れ目を入れて一本鎖化する。このため、物質Ｕと低分子化合物Ｌの結合量が極わずかであっても、検出用核酸鎖Ｐを構成していた蛍光物質Ｆからの強い蛍光シグナルが得られる。
【００５９】
これにより、物質Ｕと低分子化合物Ｖの結合の高感度検出を行うことができる。この検出技術を利用して、薬剤候補物質のスクリーニングを実施することができる。
【００６０】
＜第５応用方法例＞
図１４は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第５応用方法例の概念を示す模式図である。この第５応用方法例によれば、例えば、環境ホルモン（内分泌撹乱物質）の検出やスクリーニングを行うことができる。
【００６１】
まず、ある種の転写因子Ｊ（ＤＮＡ結合性タンパク質）は、ホルモンＨが結合すると構造が変化し、これにより、遺伝子上流域に存在する応答塩基配列領域に結合して、遺伝子の転写を促進するという機能を有している。一般に、環境ホルモンと称される内分泌撹乱物質は、生体内のホルモンＨと同様の振る舞いをする物質である。
【００６２】
本発明では、基板やビーズ等の固相表面Ｓに対して予め転写因子（核内レセプター）Ｊを存在（例えば、固定）させておくとともに、前記応答塩基配列領域に相当する核酸鎖Ｚ３と核酸鎖Ｚ３の塩基配列と相補的な核酸鎖部分Ｎを有する検出用核酸鎖Ｐを少なくとも存在させておくようにする。このような物質環境の反応場Ｒに対して、内分泌撹乱物質となるか否かを検証するためのホルモン様物質ｈを導入する。
【００６３】
具体的に説明すると、仮に、当該ホルモン様物質ｈが、本当にホルモンＨと同様の機能を有するならば、ホルモン様物質ｈの作用によって転写因子Ｊの構造が変化する。この構造変化を受けた転写因子Ｊが存在する反応場Ｒに対して、上記応答塩基配列領域に相当する核酸鎖Ｚ３と該核酸鎖Ｚ３と二本鎖を形成する核酸鎖部分Ｎを備える検出用核酸鎖Ｐを同時に導入する。これに続いて、反応場Ｒの溶液洗浄を行うことによって、反応場Ｒ中に遊離状態で存在している余剰の核酸鎖Ｚ３を反応場Ｒから除去し、続いて、さらに検出用核酸鎖Ｐを導入するとともに、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入する。
【００６４】
仮に、転写因子Ｊに核酸鎖Ｚ３を介して結合した検出用核酸鎖Ｐが反応場Ｒに存在すると、該核酸鎖Ｚ３と検出用核酸鎖Ｐ（の核酸鎖部分Ｎ）の相補鎖に対して二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥが作用し、該相補鎖（を構成する核酸鎖部分ＮのＡＰ部位Ｘ）に切れ目を入れて一本鎖化する。
【００６５】
このため、サンプル溶液中のホルモン様物質ｈの量が極微量であっても、検出用核酸鎖Ｐを構成していた蛍光物質Ｆからの強い蛍光シグナルが得られる。これにより、ホルモン様物質ｈの高感度検出を行うことができる。この検出技術を利用して、内分泌撹乱物質のスクリーニングも実施することができる。
【００６６】
＜第６応用方法例＞
図１５は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第６応用方法例の概念を示す模式図である。この第６応用方法例によれば、例えば、タンパク質の翻訳後修飾反応の検出などを行うことができる。
【００６７】
まず、タンパク質は翻訳後に、酵素反応等を介して修飾を受ける場合がある。例えば、リン酸化はその代表的なものである。本発明では、基板等の固相表面Ｓに対して、予め検出目的のタンパク質Ｄを存在（例えば、固定）させておくとともに、当該タンパク質Ｄの修飾（例えば、リン酸化）されていない部分に特異的に結合する抗体Ｂ１と修飾（例えば、リン酸化）された部分に特異的に結合する抗体Ｂ２も存在させておくようにする。なお、抗体Ｂ１と抗体Ｂ２には、予めそれぞれに特有の塩基配列からなる核酸鎖Ｚａ、核酸鎖Ｚｂをそれぞれ標識しておくようにする（図１５参照）。
【００６８】
このような物質環境の反応場Ｒに対して、核酸鎖Ｚａに相補的な核酸鎖部分Ｎａを有する検出用核酸鎖Ｐａと、核酸鎖Ｚｂに相補的な核酸鎖部分Ｎｂを有する検出用核酸鎖Ｐｂと、を一緒に導入する。なお、検出用核酸鎖Ｐａには、所定波長の蛍光を発し得る蛍光物質Ｆ１を標識しておき、検出用核酸鎖Ｐｂには、前記蛍光物質Ｆ２とは異なる波長の蛍光を発し得る蛍光物質Ｆ２を標識しておくようにする。
【００６９】
そして、反応場Ｒの溶液洗浄に続いて、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを反応場Ｒへ導入し、二本鎖を形成している検出用核酸鎖Ｐａの核酸鎖部分Ｎａと二本鎖を形成している検出用核酸鎖Ｐｂの核酸鎖部分Ｎｂに切れ目をいれて短鎖化して、これにより一本鎖へ解離させ、蛍光増幅を行う。
【００７０】
反応場Ｒに存在するすべてのタンパク質Ｄには、原理的に、検出用核酸鎖Ｐａが相補鎖を介して結合するので、該検出用核酸鎖Ｐａを構成していた蛍光物質Ｆ１由来の（増幅された）蛍光シグナルを測定することによって、反応場Ｒに存在するすべてのタンパク質Ｄの分子数を予測することができる。
【００７１】
また、反応場Ｒに存在するすべてのタンパク質Ｄのうち修飾（例えば、リン酸化）されているタンパク質Ｄには、検出用核酸鎖Ｐｂが相補鎖を介して結合するので、該検出用核酸鎖Ｐｂを構成していた蛍光物質Ｆ２由来の（増幅された）蛍光シグナルを測定することによって、修飾されたタンパク質Ｄの分子数を予測することができる。
【００７２】
このような手法によって、反応場Ｒに存在するすべてのタンパク質Ｄの分子数と、修飾されたタンパク質Ｄの分子数から、当該タンパク質Ｄの修飾されている割合を予測することができる。
【００７３】
＜第７応用方法例＞
図１６、図１７は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第７応用方法例の概念を示す模式図である。図１６は、構造変化前の物質（例えば、タンパク質）を検出している場合の模式図、図１７は、構造変化後の物質（例えば、タンパク質）を検出している場合の模式図である。この第７応用方法例によれば、物質の構造変化の検出や同構造変化の数的割合などを検出することができる。
【００７４】
例えば、タンパク質は、他の因子が作用することで、その高次構造が変化して、特有の機能を発揮する場合がある。したがって、このような物質の構造変化を検出することによって、当該物質の機能や活性を知ることができる。以下、図１６、図１７に基づいて、具体的に説明する。
【００７５】
図１６に示す符号Ｄｘは、構造変化前のタンパク質を示しており、一方の図１７に示す符号Ｄｙは、構造変化後のタンパク質を示している。まず、図１６を参照すると、表面Ｓに固定等されたタンパク質Ｄｘが存在する反応場Ｒへ、タンパク質Ｄｘの構造部位ｄ１に特異的に結合する抗体Ｂ１（核酸鎖Ｚａが標識されている）と、同タンパク質Ｄｘの構造部位ｄ２に特異的に結合する抗体Ｂ２（核酸鎖Ｚｂが標識されている）と、蛍光波長の異なる二種類の検出用核酸鎖Ｐａ,Ｐｂを導入する。
【００７６】
検出用核酸鎖Ｐａを構成する核酸鎖部分Ｎａは、抗体Ｂ１に標識されていう核酸鎖Ｚａに相補的であるので二本鎖を形成し、一方の検出用核酸鎖Ｐｂを構成する核酸鎖部分Ｎｂは、抗体Ｂ２に標識されていう核酸鎖Ｚｂに相補的であるので二本鎖を形成する（図１６参照）。
【００７７】
このような反応場Ｒへ二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを導入すると、核酸鎖部分Ｎａ,Ｎｂに切れ目が入り、それぞれ一本鎖へ解離する。その結果、蛍光物質Ｆ１、Ｆ２からそれぞれの波長の蛍光シグナルが発せられる。これにより、表面Ｓに存在するタンパク質Ｄｘは、構造変化を起きていないものであることがわかる。
【００７８】
一方、図１７を参照すると、表面Ｓに固定等されたタンパク質Ｄｙ（構造変化が生じたタンパク質）が存在する反応場Ｒへ、タンパク質Ｄｘ（図１６参照）の構造部位ｄ１に特異的に結合する抗体Ｂ１（核酸鎖Ｚａが標識されている）と、タンパク質Ｄｙの構造部位ｄ２（この場合、タンパク質Ｄｘの構造部位ｄ２と同じ）に特異的に結合する抗体Ｂ２（核酸鎖Ｚｂが標識されている）と、蛍光波長の異なる二種類の検出用核酸鎖Ｐａ,Ｐｂを導入する。
【００７９】
抗体Ｂ１、Ｂ２のうち、構造変化が生じたことによって構造部位ｄ１が消失したタンパク質Ｄｙに結合するのは、抗体Ｂ２のみである。従って、検出用核酸鎖Ｐｂを構成する核酸鎖部分Ｎｂだけが、該抗体Ｂ２に標識されている核酸鎖Ｚｂと相補結合し二本鎖を形成する。
【００８０】
この状況の反応場Ｒに、二本鎖特異的なＡＰ-エンドヌクレアーゼＥを導入すると、核酸鎖部分Ｎｂだけに切れ目が入って、一本鎖へ解離し、その結果、蛍光物質Ｆ２からの蛍光シグナルだけが発せられることになる（図１７参照）。
【００８１】
これにより、表面Ｓに存在するタンパク質Ｄｙは、構造変化を生じる修飾を受けたものであり、構造変化が生じていないタンパク質Ｄｘではないことがわかる。なお、本方法によれば、蛍光シグナルを解析することによって、タンパク質ＤｘとＤｙの両方を同時に検出することもできる。一例を挙げると、βアミロイド構造変化の微量検出、ひいてはアルツハイマー病の診断に応用できる。
【００８２】
＜第８応用例＞
図１８は、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用する第７応用例の概念を示す模式図である。この第７応用例は、前記検出用核酸鎖ＰをＤＮＡチップのプローブとして利用する例である。なお、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐは、ＤＮＡチップ以外の他のセンサー技術にも応用可能である。
【００８３】
図１８では、符号Ｃで示す基板表面に本発明に係る検出用核酸鎖Ｐ（Ｐ１１,Ｐ１２,Ｐ１３,Ｐ１４）が固定された状態が示されている。そして、この図１８の（Ａ）〜（Ｃ）では、基板表面Ｃ上での経時的な反応の進行状況を模式的に示している。
【００８４】
基板表面Ｃ上では、ターゲットとなる核酸鎖Ｔが反応場Ｒへ導入されると、この核酸鎖Ｔが、時間の経過とともに、基板表面Ｃ上に固定されている検出用核酸Ｐ１１,Ｐ１２,Ｐ１３,Ｐ１４のそれぞれの核酸鎖部分Ｎとの間で相補鎖を次々に形成していく。そして、二本鎖特異的なＡＰ−エンドヌクレアーゼ（図１８では図示せず。）による核酸鎖部分Ｎの分断（短鎖化）が行われると、短鎖化された検出用核酸鎖断片の核酸鎖Ｔからの解離が起こり、それに伴う蛍光増幅がもたらされるという一連の反応（サイクル反応）が連鎖的に起こる。
【００８５】
この図１８に示す反応例からもわかるように、本発明に係る検出用核酸鎖ＰをＤＮＡチップのプローブとして利用すれば、ターゲットとなる一分子の核酸鎖Ｔが複数のプローブ（図１８の例ではＰ１１,Ｐ１２,Ｐ１３,Ｐ１４）により利用されるため、高感度な検出が可能となる。また、ＤＮＡチップへのハイブリダイゼーションとプローブ切断を、蛍光色素増幅により時間経過を追って観察すれば、反応速度からターゲットの濃度を測定することが可能となる。
【００８６】
従来のＤＮＡチップでは、ターゲット核酸鎖Ｔを蛍光色素で標識する必要があったが、その手間を省略することができる。さらに、従来のＤＮＡチップではハイブリダイゼーションしたターゲット核酸鎖Ｔがプローブに固定された状態となるため、ハイブリダイゼーションの反応場付近でのターゲット核酸鎖Ｔの見かけ上の濃度が低下し、ハイブリダイゼーションの効率が低下するという問題があったが、本発明に係る検出用核酸鎖Ｐを利用すると、ターゲット核酸鎖Ｔを固定された状態としないために、ハイブリダイゼーション反応場付近のターゲット核酸鎖Ｔの見かけ濃度が低下せず、ハイブリダイゼーションの効率
も改善することが期待できる。
【実施例】
【００８７】
本発明に係る検出用核酸鎖の機能及び同検出用核酸鎖を用いた検出技術の有効性を確認するため、以下の実験例１〜４を行った。
【００８８】
（実験例１）
まず、極微量な標的核酸鎖（配列番号１）が反応場に存在するときに、該反応場に導入された過剰量の検出用核酸鎖（核酸鎖部分：配列番号２、その構成は図１等を再参照）が係わるサイクル反応（図８再参照）が起きて、ＡＰ-エンドヌクレアーゼ（配列番号３）の作用によって多量の検出用核酸鎖断片が生じることを検証した。なお、配列番号２中の記号「ｎ」は、塩基が欠落しているＡＰ部位を意味する。
【００８９】
なお、本実験で使用したＡＰ-エンドヌクレアーゼは、human AP-endonuclease(APE1)であり、検出用核酸鎖に使用した蛍光物質は蛍光色素ＦＡＭ（５′末端に結合）であり、クエンチャー物質は、ＴＡＭＲＡ（３′末端に結合）である。
【００９０】
１００ｆｍｏｌの標的核酸鎖と８ｐｍｏｌの（ＡＰ部位を有する）検出用核酸鎖が存在する反応場にＡＰ-エンドヌクレアーゼ添加して反応させた。ＡＰ−エンドヌクレアーゼ存在下において、適正温度内の３７,４２,４７℃で反応を行い、それら反応液をＡＰ−エンドヌヌクレアーゼを加えていない反応液と合わせて、アガロース電気泳動を行い検出用核酸鎖のサイズによる分離を行い、結合している蛍光色素により検出した。
【００９１】
アガロース電気泳動による核酸鎖のサイズによる分離では、サイズの小さな核酸鎖が早く泳動される(バンドが下方に移動する)。ＡＰ−エンドヌクレアーゼを加えた反応液(レーン2-4)では、加えていない反応液(レーン1,5)に比べて、バンドが下方に移動している（図１９参照）。このことから、本実験で使用した検出用核酸鎖がＡＰ−エンドヌクレアーゼによって切断されている（cleaved)ことが明らかである。
【００９２】
この実験例１の結果から明らかなように、標的核酸鎖に対して８０倍量の検出用核酸鎖が完全に切断されたことがわかった。即ち、「標的核酸鎖と検出用核酸鎖との間の相補鎖形成」→「ＡＰ-エンドヌクレアーゼによる検出用核酸鎖の短鎖化（断片化）」→「短鎖化された検出用核酸鎖断片の標的核酸鎖からの解離」という一連の反応が、反応場に存在する多量の検出用核酸鎖によって何度も繰り返されるサイクル反応が起こることが明らかになった（図８再参照）。
【００９３】
（実験例２）
この実験例２では、濃度違いの標的核酸鎖（配列番号１）に対して、８ｐｍｏｌの（ＡＰ部位を持つ）検出用核酸鎖（蛍光物質：ＦＡＭ（５′末端に結合）、クエンチャー物質：ＴＡＭＲＡ（３′末端に結合）、核酸鎖部分の塩基配列：配列番号２）を導入し、さらにＡＰ-エンドヌクレアーゼを反応させ、蛍光シグナルの増幅を経時的に検出した。図２１に示す図は、その結果を示すグラフである（縦軸：蛍光強度、横軸：時間（分））。なお、標的核酸鎖の濃度は、３２ａｍｏｌ、１６０ａｍｏｌ、０．８ｆｍｏｌ、４ｆｍｏｌ、２０ｆｍｏｌである。図２０に示す結果から明らかなように、標的核酸鎖量に依存した反応速度で、時間経過に伴って蛍光シグナルの増大することが実証された。
【００９４】
更に、各標的核酸鎖の濃度と初期反応速度を「Lineweaver Burk Plot」を用いてプロットすると、３５ａｍｏｌから１００ｆｍｏｌまでの範囲でほぼ直線となる。即ち、標的核酸鎖をＡＰ-エンドヌクレアーゼの基質とすると、その鋳型核酸鎖濃度[Ｔ]０と初期反応速度Ｖは一次式で表すことができる。したがって、同濃度範囲において標的核酸鎖を定量できることが示された(図２１参照)。
【００９５】
（実験例３）
本実験例は、本発明に係わる応用方法例の一例を実際に実施して成功したことを示す。具体的には、本実験例は、ヒト口腔内粘膜上皮細胞から転写因子活性を有する体内時計遺伝子産物（時計タンパク質）であるBMAL1-CLOCK複合体の検出、さらには、日内変動リズムの検出に成功したことを示す実験例である。
【００９６】
以下に、ヒト口腔内粘膜上皮細胞からの時計タンパク質BMAL1-CLOCK複合体を検出した手順例を示す。
【００９７】
まず、本実験例で使用した「検出用核酸鎖」は、５′末端側に蛍光色素（ＦＩＴＣ）、３′末端側にクエンチャー物質（ＢＨＱ）が結合された以下の塩基配列構成を備えるオリゴＤＮＡ(５′末端側から６番目の塩基（グアニンが欠落：ＡＰ部位）であり（表１参照）、この検出用核酸鎖と二本鎖を形成する核酸鎖は、「表２」に示す塩基配列構成を備えるオリゴＤＮＡであり、抗体は、anti-BMAL1 antibody (Santa Cruz Biotechnology社)を使用した。     
【００９８】
【表１】
2008067694.tif 000003
【００９９】
【表２】
2008067694.tif 000004
【０１００】
次ぎに、以下の手順で、抗体磁気ビーズを作製した。磁気ビーズ(micromer-M[PEG-COOH], mcromod Partikeltechnologie社)にPolyLink-Protein Coupling Kit for COOH Microparticles(Polyscience社)を用いて、上述の抗体を固定した。
【０１０１】
（１）ヒトから採取した口腔内細胞を、protease inhibitor cocktail(ロシュ社)を含んだ20mM Tris-Cl (pH7.5), 150mM NaCl, 1% Sucrose Monolaurate,に懸濁し、ボルテックスにより細胞を破砕した。（２）16,000g 10minの遠心分離を行い、不溶成分を沈殿させた。（３）（２）で得られたサンプルの上清について２８０ｎｍの吸光度測定を行って、各サンプルの総タンパク質量の指標とし、全てのサンプルのタンパク質を揃えた。（４）前手順でタンパク質量を揃えたサンプルを、９倍量のprotease inhibitor cocktailを含んだPBS(pH7.5), 0.05% Tween20 (PBS-T)で希釈した。（５）各２μＬの抗体磁気ビーズ(anti-BMAL1)を加えて、４℃で一昼夜インキュベートした。（６）抗体磁気ビーズを５００μＬのPBS-Tで洗浄し、非特異的に結合した分子の洗浄を行った。（７）次に、抗体磁気ビーズを10mM Tris-Cl(pH7.5), 50mM KCl, 2.5% glycerol, 10mM EDTA, 0.05% NP-40, 0.05mg/mL salmon sperm DNA, 各0.2μM 検出用核酸プローブ(プローブ核酸1,2からなる2本鎖DNA)に懸濁し、３７℃ １hrのインキュベーションを行った。（８）抗体磁気ビーズを500μLのPBS-Tで3回洗浄し、非特異的に結合した分子およびプローブ核酸の洗浄を行った。（９）抗体磁気ビーズを水に懸濁し、８０℃の条件で、インキュベーションし、特異的に結合した検出用核酸鎖の抽出を行った。（１０）前手順で抽出した検出用核酸鎖を２０ｍＭTris-Acetat, １０ｍＭMg-Acetat, ５０ｍＭKCl, １ｍＭDTT(pH7.9) (いずれも最終濃度)に懸濁し、最終濃度各０．２μＭの検出用核酸鎖（配列番号４）とＡＰエンドヌクレアーゼを加えて３７℃でインキュベーションし、蛍光色素（FITC）の蛍光の増加を経時的に測定した。（１１）単位時間当たりの蛍光の増加率を、各時刻においてプロットした（図２２の図面代用グラフ参照）。また、また、感度を調べるため、Hela細胞の細胞数を振って、上記と同様の方法でBMAL1-CLOCK複合体の検出を行い成功した。なお、その結果をグラフ化して示した(図２３の図面代用グラフ参照)。
【０１０２】
考察。
いわゆる時計タンパク質は、転写因子であり、生体リズムのうち最も重要な概日リズム（サーカディアンリズム）を動かす自律的な振動子である。転写因子である時計タンパク質は、他の時計タンパク質の発現を誘導し、そして、誘導された時計タンパク質は、転写因子としても機能し、他の（元の）時計タンパク質の転写を抑制するといったようなネガティブフィードループにより、サーカディアンリズムの振動子として機能していると現在考えられている。つまり、転写因子である時計タンパク質は、体内時計のコアであるので、この時計タンパク質を測定することこそが、生物の生体リズムを測定するに最も適していると考えられる。
【０１０３】
近年、体内時計に係わる生体分子の機能、遺伝子の欠陥や多様性が、癌をはじめとして、糖尿病、血管系の疾患、神経変性疾患などの生活習慣病の要因となることが徐々に明らかとなってきている。特に、双極性障害や鬱病のような精神疾患に関しては、体内時計の変調が原因であると疑われており、実際に体内時計をリセットする効果のある光照射により治療効果が現れる。
【０１０４】
また、人間の睡眠覚醒サイクルは、体内時計による自律的な制御だけでなく、社会生活により制約を受けるため、睡眠覚醒サイクルによるリズムと体内時計による自律リズムの間にズレが生じ、これが時差ぼけに代表されるような体調の不良、さらには上記のような健康状態の不良の原因となる可能性がある。さらに、体内で薬を代謝する酵素量がサーカディアンリズムを持つこと、また薬のターゲットとなる分子の量もサーカディアンリズム持つものが多いことから、薬に対する感受性についてもサーカディアンリズムが存在することが知られており、投薬時間を定めて行う時間医療という考え方も広がってきている。もっと身近なところでは、心身の活動度や運動能力にもサーカディアンリズムがあることが知られており、自分の能力を最大限に引き出せるリズムや、学習やトレーニングに良いリズム、太りやすい食事リズムなどが考えられている。
【０１０５】
以上のように、本発明に係る検出用核酸鎖や方法を応用すれば、転写因子の一例である時計タンパク質を測定することが実際に可能となる。このことは、体内時計による自律的な生体リズム、または、その睡眠覚醒サイクルや外的時刻とのズレを知ることは、精神疾患や生活習慣病の予防、時差ぼけなどの体調不良の改善、時間医療、自己能力の発揮、学習やトレーニング、ダイエットなどに非常に有益な技術となると予想される。さらに、本発明の応用例として、次の実験例４を示す。
【０１０６】
（実験例４）
現在、培養細胞を50% Horse Serumを含んだ培養液で刺激することで、時計遺伝子の発現が各細胞で同調し各時計遺伝子のmRNA量の変動として、リズムが観察されることが知られている。しかしながら、これまで時計タンパク質を検出することが困難であったために、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体の「発現変動」について詳しく観察されたことは無かった。
【０１０７】
そこで、本発明を応用して、Hela細胞からBMAL1-CLOCKタンパク質複合体の発現変動の観察が可能であることを実証するための所定の実験を行った。更に、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体が結合するE-box配列をプロモーター領域に持ち、その転写がBMAL1-CLOCKタンパク質複合体によって活性化される遺伝子、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２のｍＲＮＡの変動パターンを観察し、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体の発現変動と比較した。
【０１０８】
具体的には、Hela細胞を50% Horse Serumを含んだ培養液(DMEM培地)で２時間刺激した。刺激スタート時から１５時間、１７．５時間、２０時間、２２．５時間後に細胞を回収し、口腔粘膜上皮細胞と同様の手順で、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体を検出した（図２４の図面代用グラフ参照）。
【０１０９】
また、刺激スタート時から１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間後にそれぞれ細胞を回収した。回収した各細胞からtotalＲＮＡを抽出し（メーカー名Agilent Technologies：型番5185-6000）、定法に従ってＰＴ-ＰＣＲを行って、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２のｍＲＮＡ量を定量した。なお、ＲＴ-ＰＣＲで使用したプライマーの配列は、次の「表３」の通りである。
【０１１０】
【表３】
2008067694.tif 000005
【０１１１】
なお、図２５は、Ｐｅｒ１のｍＲＮＡ量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）であり、図２６は、Ｐｅｒ２のｍＲＮＡ量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）である。なお、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２のｍＲＮＡ量は、内在性コントロールとしてのＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）の量に対する相対値として計算した。
【０１１２】
考察。
BMAL1-CLOCKタンパク質複合体量の変動パターンと、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体によって転写が活性化されるＰｅｒ１、Ｐｅｒ２のｍＲＮＡの変動パターンが似通っていることから（図２４と図２５及び図２６を比較参照）、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体量が、BMAL1-CLOCKタンパク質複合の転写活性を反映していることが示された。この結果から、本発明を応用することによって、時計タンパク質を検出することが可能であり、なおかつ、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体の「発現変動」について詳しく観察することが可能であることが実証された。
【０１１３】
以上の実験例は、本発明の応用例の一部を示すものである。転写制御が転写因子の量や翻訳後修飾の度合い、他の分子との複合体形成により制御されている場合は、実施例に示したように細胞破砕液を使うことができる。転写制御が前記制御機構に依存せず、転写因子の核内移行によって制御されている場合は、核抽出液を用いることで転写因子の活性度を測定することができる。また、NotchやSREBPのように膜結合型タンパク質として生成され、タンパク質切断酵素により切断され核内へ移行するような転写因子に関しては、膜画分を含まないような細胞抽出液を用いることで転写因子の活性度を測定することが出来る。
【０１１４】
なお、転写因子の中には、ステロイドホルモンと結合してはじめて転写活性を有する核内レセプターが多く存在する。本発明を応用して、これら核内レセプターのリガンド（ステロイドホルモン等）を検索、定量することも可能である。また、核内レセプターに対するアゴニストやアンタゴニストとして働く薬剤の検索、定量、評価を行うことも可能である。コレステロールによって活性化されるSREBPを測定すれば、メタボリックシンドロームやアルツハイマーなどの予防が可能となることも考えられ、ビタミンやホルモンの核内受容体となる転写因子を測定することで、栄養状態をはじめとする生理状態を知ることができる。精製した核内受容体を用いれば、リガンドとなるビタミンやホルモンの定量や核内受容体との親和性の測定が可能であり、また、核内受容体をターゲットしたアゴニストやアンタゴニストのスクリーニングや評価に本発明を応用することも可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、反応場に存在する極微量の物質を高感度に蛍光検出する技術として利用することができる。例えば、（１）検出用核酸鎖に相補的な標的核酸鎖の検出、（２）核酸以外の生体物質の検出、（３）生体物質の化学的変化（化学的修飾）の検出、（４）タンパク質その他の生体物質の構造変化の検出、（５）薬剤候補物質の検出又はスクリーニング、（６）環境ホルモン（内分泌撹乱物質の検出、（７）疾病診断、（８）ＤＮＡチップなどのセンサーチップ分野において特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明に係る検出用核酸鎖の概念及び実施形態例を説明するための図である。
【図２】同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質（Ｆ）とクエンチャー物質（Ｑ）の両方を核酸鎖の途中部位に結合した実施形態例を示す図である。
【図３】同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質（Ｆ）を末端部位、一方のクエンチャー物質（Ｑ）を途中部位に結合した他の実施形態例を示す図である。
【図４】同検出用核酸鎖のうち、蛍光物質（Ｆ）を途中部位、一方のクエンチャー物質（Ｑ）を末端部位に結合したさらに別の実施形態例を示す図である。
【図５】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）の機能とその代表的な使用例を示す図である。
【図６】ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによってＡＰ部位Ｘに対して切れ目が形成される様子を模式的に示す図である。
【図７】適正温度条件（Ｔ）下で、ＡＰ-エンドヌクレアーゼ（Ｅ）によって切断された検出用核酸鎖断片（Ｐ１、Ｐ２）が核酸鎖（Ｔ）から解離し、一本鎖として反応場（Ｒ）に遊離している状態を模式的に示す図である。
【図８】本発明に係る検出用核酸鎖Ｐによる「サイクル反応」の基本的なフローを示す図である。
【図９】反応場（Ｒ）の温度条件の変化によって、（切断されていない）検出用核酸鎖（Ｐ）と、（ＡＰ-エンドヌクレアーゼＥによって切断された）検出用核酸断片（Ｐ１、Ｐ２）の二本鎖形成又は解離の様子を示す参考図である。
【図１０】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第１応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１１】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第２応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１２】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第３応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１３】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第４応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１４】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第５応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１５】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第６応用方法例の概念を示す模式図である。
【図１６】本発明に係る検出用核酸鎖（Ｐ）を利用する第７応用方法例の概念を示す図であって、構造変化前の物質（例えば、タンパク質Ｄｘ）を検出している場合の模式図である。
【図１７】同第７応用方法例の概念を示す図であって、構造変化後の物質（例えば、タンパク質Ｄｙ）を検出している場合の模式図である。
【図１８】同第８応用例の概念を示す図であって、検出用核酸ＰをＤＮＡチップのプローブとして用いた例を示す模式図である。
【図１９】実験例１：１００ｆｍｏｌの標的核酸鎖と８ｐｍｏｌの（ＡＰ部位を有する）検出用核酸鎖をＡＰ−エンドヌクレアーゼと反応させ、検出核酸鎖の切断を検出した結果を示す図（アガロース電気泳動の結果を示す写真）である。
【図２０】実験例２：蛍光シグナルの増幅を経時的に検出したときの結果を示す図（縦軸：蛍光強度、横軸：時間（分））である。
【図２１】実験例２：各標的核酸鎖の濃度と初期反応速度を「Lineweaver Burk Plot」を用いてプロットしたときの図（グラフ）である。
【図２２】実験例３：蛍光色素（FITC）の蛍光の増加を経時的に測定した結果であり、単位時間当たりの蛍光の増加率を、各時刻においてプロットした図（図面代用グラフ）である。
【図２３】実験例３：。Hela細胞の細胞数（横軸）を振って、BMAL1-CLOCK複合体の検出を行った結果を示す図(図面代用グラフ)である。
【図２４】実験例４：Hela細胞を50% Horse Serumを含んだ培養液(DMEM培地)で２時間刺激し、刺激スタート時から１５時間、１７．５時間、２０時間、２２．５時間後に細胞を回収し、BMAL1-CLOCKタンパク質複合体を検出した結果を示す図（図面代用グラフ）である。
【図２５】実験例４：Ｐｅｒ１のｍＲＮＡ量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）である。
【図２６】実験例４：Ｐｅｒ２のｍＲＮＡ量を定量した結果を示す図（図面代用グラフ）である。
【符号の説明】
【０１１７】
Ｅ  エンドヌクレアーゼ（例.ＡＰ−エンドヌクレアーゼ）
Ｆ  蛍光物質
Ｐ  検出用核酸鎖
Ｎ  核酸鎖部分
Ｑ  クエンチャー物質
Ｘ  酵素切断部位（例.ＡＰ部位）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１９】
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【配列表】
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