(57)【要約】      （修正有）【課題】瘢痕の減少をともなう創傷または線維性疾患の治癒の促進を目的とした医薬組成物の提供。【解決手段】フラクトース−１−ホスフェートを有効成分として、さらに医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤からなる医薬組成物は、瘢痕の減少をともなう創傷、特に皮膚創傷の治癒、腱損傷の回復、挫傷の治癒、角膜創傷などの眼創傷の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治癒、中枢神経系に瘢痕組織が形成される状態、打撃による瘢痕組織の形成、および損傷または外科手術の結果として起こる組織の癒着（これには、腱治癒および腹部狭窄および癒着などを含めてもよい）といった創傷、または肺線維症、糸球体腎炎、肝硬変および増殖性硝子体網膜症といった線維性疾患の治癒を促進することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2008239625.tif 000002
のフラクトース−１−ホスフェートを含有する、瘢痕の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物。
【請求項２】
慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いる請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いる請求項１またはに記載の医薬組成物。
【請求項４】
創傷生成／線維性疾患の発症の直前または直後のいずれかに投与するために製剤された請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
創傷生成／線維性疾患の発症後約１２０時間以内投与するために製剤された請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
瘢痕の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物の製造における式：
【化２】
2008239625.tif 000003
のフラクトース−１−ホスフェートの使用。
【請求項７】
フラクトース−１−ホスフェートが、創傷生成／線維性疾患の発症の直前または直後のいずれかに投与するために製剤された請求項６に記載の使用。
【請求項８】
フラクトース−１−ホスフェートが、創傷生成／線維性疾患の発症後約１２０時間以内投与するために製剤された請求項６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷または線維性疾患の治癒、特に瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
“創傷または線維性疾患”とは、結果的に瘢痕組織が形成されうる状態のいずれをも意味する。特に、皮膚創傷の治癒、腱損傷の回復、挫傷の治癒、角膜創傷などの眼創傷の治癒、中枢神経系（ＣＮＳ）損傷の治癒、中枢神経系に瘢痕組織が形成される状態、打撃による瘢痕組織の形成、および損傷または外科手術の結果として起こる組織の癒着（これには、腱治癒および腹部狭窄および癒着などを含めてもよい）が包含される。線維性疾患の例としては、肺線維症、糸球体腎炎、肝硬変および増殖性硝子体網膜症が挙げられる。
【０００３】
“瘢痕の形成の減少”とは、非処置の創傷または線維性疾患と比較した場合の瘢痕の減少のレベルを意味する。
【０００４】
特に、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための組成物が欠如している。瘢痕組織の形成は、治癒した創傷に機械的強度を与えるものではあるが、醜いものとなりえるものであり、かつ組織の機能を損なう可能性もある。
【０００５】
このことは、特にＣＮＳにおける瘢痕組織が形成される創傷が該当し、該瘢痕組織は損傷を受けるかまたは再成長した神経末端を阻害し、その機能に非常に重大な影響を及ぼす。
【０００６】
損傷または線維性疾患の治癒を促進するための組成物は、静脈潰瘍、糖尿病性潰瘍および床ずれ（褥瘡性潰瘍）（特に高齢かつ車椅子使用患者におけるもの）といったような慢性創傷の治療用組成物とともに用いることもできる。このような組成物は、創傷の治癒が遅いかまたは創傷の治癒過程がまだ開始していない患者において極めて有用である。このような組成物を用いて、創傷の治癒を“キックスタート”させ、次いで本発明組成物と組み合わせて用いることができる。したがって、慢性創傷が治癒されるのみならず、瘢痕の形成も減少して治癒されうることになる。
【０００７】
ＬＴＧＦ−β（Latent Transforming Growth Factor-β：潜伏性トランスフォーミング成長因子β）を活性化してＴＧＦ−βにすることが、治癒過程における臨界的段階である。ＬＴＧＦ−β（ＬＴＢＰ（ＬＴＧＦ−β結合タンパク質）に交互に結合しうる、ＬＡＰ（Latency Associated Peptide：潜伏期関連ペプチド）に結合しているＴＧＦ−βからなる）は、ＬＡＰにおいて、Ｍ６Ｐ包含糖質を介して細胞表面のＭ６Ｐ（マンノース−６−ホスフェート）レセプターに結合する［パーチョ,M.F.ら、1988、J.Biol.Chem.,263:14211-14215；デニス,P.A.およびリフキン,D.B.、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:580-584；シャー,M.ら、1992、Lancet,339:213-214；シャー,M.ら、1994、J.Cell.Sci.,107:1137-1157］。この結合が、トランスグルタミナーゼおよびプラスミノーゲン／プラスミンも関与して、ＬＴＧＦ−βを活性化させる。
【０００８】
ＬＴＧＦ−βがＭ６Ｐレセプターに結合するために、ＬＡＰにおいて、Ｍ６Ｐレセプター結合サイトに対して、Ｍ６ＰがＭ６Ｐ包含糖質と競合することによって、Ｍ６Ｐそれ自身が治癒過程において重要な役割を演じる。ある部位（ここで“部位”とは、創傷または線維性疾患の部位を意味する）におけるＭ６Ｐの量が増加することにより、ＬＴＧＦ−βがＭ６Ｐレセプターへ結合するのを阻害し（あるいは少なくとも減少させ）、線維性および非線維性ＴＧＦ−βのレベルに影響を及ぼすことができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｍ６Ｐは極めて有用であるが、ただちに代謝されるので、創傷部位においてＭ６Ｐのレベルを増加するためにこれまでに行われた試みは、遅延性／持続性／生体適合性非炎症性デリバリーシステムの使用によって、創傷部位へＭ６Ｐの一定の供給が行われるようにすることに集中している。非炎症性／生体適合性ビヒクルにおいて遅延性放出を達成するのが難しいので、このような遅延性／持続性デリバリーシステムは、コストが高く、かつ簡便性にも劣り、生産するのが極めて困難である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、Ｍ６Ｐの類縁体を用いることにより、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進しうることを見いだした。該類縁体は、Ｍ６Ｐと構造および機能的に類似しているが異なるものであり、Ｍ６Ｐの分解を阻害するものである。
【００１１】
本発明にしたがって、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するのに用いるＭ６Ｐ類縁体が提供される。
【００１２】
該類縁体は、Ｍ６Ｐのホスホネート類縁体またはその塩である。このような類縁体は、たとえば、図１（ａ）〜（ｆ）に示す分子のいずれかまたはその塩である。驚くべきことに、Ｍ６Ｐのホスホネート類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼ結合サイトに結合しうることが見出された。この事実によって、これらの類縁体は、Ｍ６Ｐが結合サイトに結合するのを競合的に阻害してＭ６Ｐが分解する（すなわち、Ｍ６Ｐの代謝）のを競合的に阻害することになり、それゆえに、Ｍ６Ｐの半減期が延長される。さらに驚くべきことに、これらのＭ６Ｐのホスホネート類縁体は、その分子がＭ６Ｐと類似しており、Ｍ６Ｐイソメラーゼ結合サイトに結合する能力があるにもかかわらず、Ｍ６Ｐよりも有意に半減期が長い（すなわち、Ｍ６Ｐよりも有意に遅い速度で分解される）。
【００１３】
該類縁体は、Ｍ６Ｐよりも有意に長い半減期を有することができる。該類縁体は、Ｍ６Ｐの少なくとも約１０倍という長い半減期を有することができる。たとえば、Ｍ６Ｐの少なくとも約１００または１０００倍という長い半減期を有することができる。該類縁体は、Ｍ６Ｐよりも有意に遅い速度でＭ６Ｐイソメラーゼによって代謝される。該類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼレセプター結合サイトに結合することができる。該類縁体は、細胞表面のＭ６Ｐレセプター結合サイトに結合することができる。
【００１４】
該類縁体は、Ｍ６Ｐレセプターに対して、Ｍ６Ｐよりも大きい結合親和性を有する。該類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼレセプター結合サイトに対して、Ｍ６Ｐよりも大きい結合親和性を有することができる。該類縁体は、Ｍ６Ｐレセプターに対して、Ｍ６Ｐの約２または３倍の結合親和性を有することができる。
【００１５】
図１（ｂ）のＭ６Ｐホスホネート類縁体またはその塩は、Ｍ６Ｐの約１０００倍の半減期を有し、Ｍ６Ｐイソメラーゼ結合サイトに対して、Ｍ６Ｐの約３倍の結合親和性を有する。
【００１６】
該類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼが存在する環境においてＭ６Ｐの半減期を延長することができる。該類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼが存在する環境においてＭ６Ｐの半減期を延長するのに用いることができる。
【００１７】
該類縁体は、ヒトまたは動物の体内において用いることができる。
【００１８】
該類縁体は、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するのに用いることができる。
【００１９】
該類縁体は、Ｍ６Ｐの分解のインヒビターになりうる。該類縁体は、Ｍ６Ｐの代謝のインヒビターになりうる。該類縁体は、Ｍ６Ｐイソメラーゼのインヒビターになりうる。
【００２０】
該類縁体は、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進するための組成物とともに用いることができる。このような組成物は、Ｍ６Ｐを含むことができる。たとえば、本発明にしたがって、ある類縁体は、Ｍ６Ｐそれ自体とともにＭ６Ｐのホスホネート類縁体を含むことを特徴とする。
【００２１】
該類縁体は、慢性の創傷の治癒を促進するための組成物とともに用いることができる。
【００２２】
該類縁体は、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とともに用いることができる。
【００２３】
このことは、ホスホネート類縁体を創傷部位に一回投与するだけで、長期間持続する効果を与えることができ、大きな臨床上および治療上の利点が提供されることを意味する。また、このことは、現在行われている創傷部位への持続的なＭ６Ｐの投与の代わりに、Ｍ６Ｐのホスホネート類縁体を一回または数回投与すればよいことを意味する。
【００２４】
創傷部位へのＭ６Ｐの投与を減らすことにより、創傷部位の周囲の組織における浸透の影響を、Ｍ６Ｐの持続的投与を行う場合の浸透の影響に比べて、有意に減少することができる。
【００２５】
したがって、該類縁体は、Ｍ６Ｐと機能的に等価であり、さらになお、Ｍ６Ｐよりも有意に半減期が長くおよび／またはレセプター結合親和性が大きい。該類縁体は、Ｍ６Ｐとして機能するばかりでなく、たとえばＭ６ＰイソメラーゼなどによるＭ６Ｐの代謝を阻害することにより、外来性または内在性のＭ６Ｐのいずれの半減期および効能をも増すように作用しうる。
【００２６】
さらに本発明にしたがって、前述のいずれかひとつのＭ６Ｐの類縁体の使用を特徴とする瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進する方法を提供する。
【００２７】
該方法は、創傷または線維症の部位にＭ６Ｐの類縁体を投与することを特徴とする。
【００２８】
該方法は、創傷生成／発症の直前または直後にＭ６Ｐの類縁体を使用することを特徴とする。該方法は、創傷生成／発症の約１２０時間以内にＭ６Ｐの類縁体を使用することを特徴とするが、創傷生成／発症後、より短い時間、たとえば、１２０，９６，７２，４８，２４または１２時間以内に適用するのが好ましい。“発症”とは、線維性疾患の発症を意味する。
【００２９】
瘢痕の形成の減少をともなう治癒の促進における該処置の効能は、ＬＡＰに結合したＴＧＦ−β１が脱顆粒化している血小板から放出されるときに、創傷生成後すぐに創傷部位におけるＭ６Ｐのレベルを増加することによって有意に強化される。ＬＡＰに結合したＴＧＦ−β１は、組織液中で遊離であるか、フィブリンクロッツ／血小板複合体に結合しているか、またはＭ６Ｐレセプターによって周囲の細胞（線維芽細胞、単球およびマクロファージなど）にエンドサイトーシスされている。創傷の初期に起こる、この線維性ＴＧＦ−β１の脱顆粒化および放出は、続いて起こる創傷の治癒に影響を及ぼす多くの効果を有している。特に、ＴＧＦ−β１は、単球およびマクロファージを該部位に誘因し、次いで、さらにＴＧＦ−β１を放出させる。この初期のＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１が優勢である）の活性化を阻害することにより、非線維性成長因子にとって有利となるように、部位における線維性：非線維性成長因子の比率が変更され、瘢痕の形成の減少をともなった治癒が強化される。
【００３０】
該方法は、瘢痕の形成の減少をともなって創傷または線維性疾患の治癒を促進する方法とともに用いることができる。
【００３１】
該方法は、慢性の創傷の治癒を促進する方法とともに用いることができる。
【００３２】
非ホスホリル化マンノースおよびグルコースを用いる創傷治療の実験を行うと、コントロールに比べて治癒が遅くなった。ガラクトース−６−ホスフェートおよびグリセロール−６−ホスフェートは、創傷の治癒あるいは瘢痕の形成のいずれにおいても効果はない。
【００３３】
本発明を後記実施例によりさらに具体的に説明するが、該実施例は、例示に過ぎず、Ｍ６Ｐよりも代謝速度が遅く、Ｍ６Ｐレセプター結合親和性が大きいＭ６Ｐの類縁体のひとつを用いて、Ｍ６Ｐ代謝を阻害することができる。
【実施例】
【００３４】
実験例
同配体マンノースホスホネート（図１（ｂ））および非同配体マンノースホスホネート（図３（ａ））、フラクトース−１−ホスフェート（図３（ｂ））およびマルトース−１−ホスフェート（図３（ｃ））の創傷治癒および抗瘢痕形成特性を下記のとおり試験した。さらに、図１（ｂ）のＭ６Ｐホスホネート類縁体を製造し、Ｍ６Ｐイソメラーゼを用いてレセプター結合アッセイを行い、Ｍ６Ｐレセプターに対する結合親和性を分析し、さらにその半減期も分析した。標準的方法を用いてデータを得た。
【００３５】
方法：
成体の雄性スプラーグドーリーラット（２００〜２５０ｇ）に等量部のハロタン、酸化窒素および酸素で麻酔を施した。４カ所の全厚直線切開（長さ１ｃｍで皮筋層の深さのもの）を、背面の皮膚上に、正中線から１ｃｍの部分および頭蓋底から５ｃｍおよび８ｃｍの部分で行った。創傷は、次の過程で治癒するために、縫合せずにおいた。皮内注入により、創傷の縁に実験処置物を投与した（各創傷縁あたり５０μｌ）。選択した時点で、クロロホルムの過剰投与により、実験動物を屠殺した。周囲の組織から創傷を切り取り、２等分した。創傷の半分は、凍結薄切および免疫細胞化学用にＯＣＴ内で急速に凍結し、半分は、ワックス包埋および組織学用にホルムアルデヒド中で固定した。ワックス切片を慣例の方法により、ヘマトキシリンおよびエオシン、ピクロシリウスレッド、ならびにマッソンズ・リル・トリクロムで染色して、コラーゲン線維の厚み、密度および方向性を呈示させて、瘢痕形成の質を評価できるようにした。フラクトース−１−ホスフェート（Ｆ１Ｐ）およびマルトース−１−ホスフェート（Ｍalt１Ｐ）は、シグマ・ケミカル・カンパニーから購入した。各糖質の投与量を変えて（１０ｍＭ，２０ｍＭおよび４０ｍＭ）、コントロールとしてＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を用いて実験を行った。創傷生成時およびその後７日間毎日処置物を投与した。各化合物に対して、各投与ごとに３つの時点（創傷生成後７日、４０日および８０日の時点）で２匹の動物を用いて調べた。総ｎ＝１２。
【００３６】
同配体マンノースホスフェートは、マンチェスター大学、薬学部のドクター・サリー・フリーマンが合成したものを入手した。投与量を変えて（１０ｍＭ，２０ｍＭおよび１０ｍＭ＋１０ｍＭのＭ６Ｐ）、ネガティブコントロールとしてＰＢＳを、ポジティブコントロールとして１０ｍＭのＭ６Ｐおよび２０ｍＭのＭ６Ｐを用いて実験を行った。創傷生成時およびその後２日間毎日処置物を投与した。各投与ごとに２つの時点（創傷生成後７日および８０日の時点）で１匹の動物を用いて調べた。総ｎ＝４。
【００３７】
非同配体マンノースホスフェートは、マンチェスター大学、薬学部のドクター・サリー・フリーマンが合成したものを入手した。単一の投与量（２０ｍＭ）で、コントロールとしてＰＢＳを用いて実験を行った。先の実験に準じて投与回数を変化させた。実験動物を３つのグループに分け、第０日のみ、第０，２および４日間、または第０日から第７日にそれぞれ処置を行った。処置毎にそれぞれ３つの時点（３，７および８０日後）で２匹の動物を用いて調べた。総ｎ＝１８。
【００３８】
動物実験に加えて、生成Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ ＩＩ（インスリン様成長因子ＩＩ）レセプターを用いるＥＬＩＳＡアッセイを行い、これらのＭ６Ｐの類縁体がＭ６Ｐ／ＩＧＦ ＩＩレセプターに結合するかどうかを審査した。
【００３９】
結果：
フラクトース−１−ホスフェートおよびマルトース−１−ホスフェート
創傷生成後第７日目には、組織学的分析では、Ｆ１ＰおよびＭalt１Ｐのいずれにも、ＰＢＳコントロールと比較して、どのような創傷治癒効果もみられないことが示された。免疫細胞化学分析でもまた、治療された創傷がコントロールと同程度であることが示された。フィブロネクチンに対する染色は、単球／マクロファージプロフィールと同様に、処置物およびコントロールの間で一致した。創傷生成後第４０日目には、組織学的分析では、明瞭な傾向もなく、一貫性はなかった。創傷生成後第８０日目には、Ｍalt１Ｐは皮膚構造をごくわずかに改善するのみであるが、一方、Ｆ１Ｐは、特に高濃度（４０ｍＭ）の投与において、より優位に瘢痕の形成を減少していることが見られた。
【００４０】
同配体マンノースホスホネート
創傷生成後第７日目には、組織学的分析では、処置された創傷のいずれもがＰＢＳコントロールと変わらないことが示された。創傷生成後第８０日目には、同配体類縁体が、コントロールと比較して、皮膚の構造を改善していることがみられ、Ｍ６Ｐ処置と類似した瘢痕形成における改善がみられた。
【００４１】
非同配体マンノースホスホネート
２０ｍＭの非同配体類縁体で第０日から第７日まで処置した創傷の初期の組織学的分析では、抗瘢痕形成効果があることが示される。特に２０ｍＭで第０日から第７日まで処置した場合。
【００４２】
これまでに得られた結果から、試験されたマンノース−６−ホスフェート類縁体（Ｆ１Ｐ、Ｍalt１Ｐおよび同配体ならびに非同配体マンノースホスフェート類縁体）の類似性にもかかわらず、マンノースホスフェートがより大きな効能を有するのは、他の分子との相互作用に関する、それらの果す別の役割または特別の特性によるものであることがわかる。
【００４３】
レセプター結合アッセイ
レセプター結合アッセイの初期の結果から、Ｆ１Ｐは、Ｍ６Ｐと類似した親和性においてＭ６Ｐ／ＩＧＦ ＩＩレセプターに結合するが、一方、Ｍalt１Ｐは、このレセプターに結合しないことが示された。該結果から、図１（ｂ）の類縁体が、Ｍ６Ｐレセプター結合サイトに対してＭ６Ｐの約３倍の結合親和性を有することも示された。驚くべきことに、該結果から、この有意に増加した結合親和性およびそのＭ６Ｐに対する構造的類似性にもかかわらず、該類縁体の半減期が、Ｍ６Ｐの約１０００倍であることも示された。
【００４４】
この現象は、Ｍ６Ｐの他の類縁体、特にＭ６Ｐの他のホスホネート類縁体が、同様の特性を有することが可能であり、したがって、瘢痕の形成のインヒビターとして非常に強力でありうることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】種々のＭ６Ｐのホスホネート類縁体を示す。符号（ａ）〜（ｆ）は図面左から右、上から下に付されている。
【図２】該類縁体の合成方法を示す。
【図３】（ａ）非同配体のマンノースホスホネート；（ｂ）フラクトース−１−ホスフェート；および（ｃ）マルトース−１−ホスフェートを示す。
【図１】
2008239625.tif 000004
【図２】
2008239625.tif 000005
【図３】
2008239625.tif 000006