(57)【要約】【課題】目的生体分子のみを効率よく検出し、そのほかの分子による阻害吸着を抑え、被検出分子の高感度な測定が安定に繰り返し行うことができる表面に混合薄膜を設けた基板、及び該基板を使用するたんぱく質の検出方法を提供する。  【解決手段】末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）、及びたんぱく質の基板への結合を抑制する部位を有する化合物（Ｂ）、からなる混合薄膜を化学的に結合した基板において、化合物（Ａ）の末端糖類を混合薄膜の表面に突出した状態に形成することにより表面に混合薄膜を設けた基板を得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）、及びたんぱく質の基板への結合を抑制する部位を有する化合物（Ｂ）、からなる混合薄膜を化学的に結合した基板において、化合物（Ａ）の末端糖類を混合薄膜の表面に突出した状態に形成したこと特徴とする表面に混合薄膜を設けた基板。
【請求項２】
前記化合物（Ａ）の末端糖類が単糖類又は二糖類であることを特徴とする請求項１に記載の基板。
【請求項３】
前記化合物（Ｂ）のたんぱく質の基板への結合を抑制する部位が、メチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものであることを特徴とする請求項１又は２に記載の基板。
【請求項４】
前記混合薄膜を構成する化合物（Ａ）と化合物（Ｂ）の混合比が、重量比で１：１〜１：１０００であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の基板。
【請求項５】
前記化合物（Ａ）が、式（１）で表される化合物であり、前記化合物（Ｂ）が式（２）で表される化合物であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の基板：
Ｇ−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ        （１）
Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ        （２）
（式中、Ｇは単糖類又は二糖類であり；Ｘはメチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものであり；ｍ及びｎは１〜２０の整数で、かつｍ≧ｎである。）
【請求項６】
前記化合物（Ａ）の末端糖類が、前記混合薄膜の表面に点在した状態で存在することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の基板。
【請求項７】
前記混合薄膜が単分子膜であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の基板。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載された基板を使用して、たんぱく質を検出することを特徴とするたんぱく質の検出方法。
【請求項９】
前記たんぱく質がレクチンであることを特徴とする請求項８に記載のたんぱく質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たんぱく質、ペプチドなどの生体分子やウイルス、細胞等を選択的に認識することのできる表面に混合薄膜を設けた基板、及び該基板を使用するたんぱく質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、たんぱく質・ウィルス・細胞などをリアルタイムに感度よく検出する手法の開発が望まれている。ウィルスの検出、がん細胞からのマーカー分子の検出、抗原抗体反応を用いる特定抗原の検出などに於いては、蛍光で標識した色素や蛍光標識たんぱく質、蛍光標識抗原を用いる手法が中心に行われている。蛍光標識を用いる手法では、目的分子との間の結合が起こると起こらずとに関わらず、蛍光を発するため検出の精度に問題が残る。
【０００３】
また、目的分子のみを効率よく検出するために、表面にカルボキシメチルセルロースやポリフェニレンジアミンなど親水性の高分子を塗布し、阻害物質の吸着を抑制することも既に行われている（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。
【特許文献１】特開平3-202764
【非特許文献１】J. Wangら”Enhanced Selectivity and Sensitivity of First-Generation enzyme Electrodes Based on the Coupling of Rhodinized Carbon Paste Transducers and Permselective Poly(o-phenylenediamine) Coatings”  Electroanalysis, 8巻、1996年ｐ1127-1130
【０００４】
また、被検出分子が基質となる機能性基より大きい場合、機能性部位をまばらに吸着させ、分子認識能を高める実験も行われている（非特許文献２参照）。
【非特許文献２】E. A. Smithら”Surface Plasmon Resonance Imaging Studies of Protein-Carbohydrate Interactions”, Journal of the American Chemical Society, 125巻 、2003年、6140-6148
【０００５】
さらに、一本鎖DNAの検出においても、相補的なDNA鎖のほうを固体基板にまばらに付けることにより、二本鎖を構成するに十分な自由空間を確保することにより、初めて相補塩基対鎖を作ることができるとの報告もある（例えば、非特許文献３参照）
【非特許文献３】M.Nakayamaら”DNA sensors using a ferrocene-oligonucleotide conjugate”, Talanta, 56巻、2002年、857-866.
【０００６】
当該技術分野においては、目的生体分子のみを効率よく検出し、そのほかの分子による阻害吸着を抑え、被検出分子の高感度な測定が安定に繰り返し行える手段の開発が極めて重要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、目的生体分子のみを効率よく検出し、そのほかの分子による阻害吸着を抑え、被検出分子の高感度な測定が安定に繰り返し行うことができる表面に混合薄膜を設けた基板、及び該基板を使用するたんぱく質の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、上記課題を解決するために下記の構成１〜９を採用する。
１．末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）、及びたんぱく質の基板への結合を抑制する部位を有する化合物（Ｂ）、からなる混合薄膜を化学的に結合した基板において、化合物（Ａ）の末端糖類を混合薄膜の表面に突出した状態に形成したこと特徴とする表面に混合薄膜を設けた基板。
２．前記化合物（Ａ）の末端糖類が単糖類又は二糖類であることを特徴とする１に記載の基板。
３．前記化合物（Ｂ）のたんぱく質の基板への結合を抑制する部位が、メチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものであることを特徴とする１又は２に記載の基板。
４．前記混合薄膜を構成する化合物（Ａ）と化合物（Ｂ）の混合比が、重量比で１：１〜１：１０００であることを特徴とする１〜３のいずれかに記載の基板。
５．前記化合物（Ａ）が、式（１）で表される化合物であり、前記化合物（Ｂ）が式（２）で表される化合物であることを特徴とする１〜４のいずれかに記載の基板：
Ｇ−（ＣＨ２）ｍ−ＳＨ        （１）
Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ        （２）
（式中、Ｇは単糖類又は二糖類であり；Ｘはメチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものであり；ｍ及びｎは１〜２０の整数で、かつｍ≧ｎである。）
６．前記化合物（Ａ）の末端糖類が、前記混合薄膜の表面に点在した状態で存在することを特徴とする１〜５のいずれかに記載の基板。
７．前記混合薄膜が単分子膜であることを特徴とする１〜６のいずれかに記載の基板。
８．１〜７のいずれかに記載された基板を使用して、たんぱく質を検出することを特徴とするたんぱく質の検出方法。
９．前記たんぱく質がレクチンであることを特徴とする８に記載のたんぱく質の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、対象とするたんぱく質と、混合薄膜中の該たんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）との間で特異的な相互作用があった場合にのみ、表面での質量変化や光学的定数の変化が生じ、該たんぱく質の有無を容易にかつ瞬時に鋭敏に検出可能である。また、定性的な評価だけでなく高感度な定量を行うことも可能である。
本発明では、目的たんぱく質以外のたんぱく質の基板への結合を抑制する部位を有する化合物（Ｂ）を、化合物（Ａ）よりも表面垂直方向に於いて低いところに配置することにより、化合物（Ａ）のみで薄膜を形成した場合に比較して飛躍的に高感度の検出を行うことが可能となる。また、一回の認識反応後、検出した分子をはずした後の基板を何度でも再使用することが可能である。
本発明によれば、目的たんぱく質のみを高感度に検出することが可能となるので、プロティンチップや細胞チップなどの各種チップの作製にも有用な技術である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明では、末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）、及びたんぱく質の基板への結合を抑制する部位を有する化合物（以下、「非特異吸着抑制分子」という）（Ｂ）、からなる混合薄膜を基板の表面に化学的に結合して、化合物（Ａ）の末端糖類を混合薄膜の表面に突出した状態に形成する。
本発明において利用される基板としては、金、白金、銀、銅等の金属電極、シリコン等の半導体電極基板、酸化インジウムスズ(ITO) 等の透明導電性電極が好都合に利用される。これら金属や半導体等は、例えば硫黄を含む有機化合物と自己組織的に金属-Sの結合により、またはSi-Oのシロキサン結合等を介して安定に修飾膜を形成することが知られているものである。また、ガラス基板や樹脂基板なども、Si-Oのシロキサン結合を作ることで分子層が構築できることから好都合に利用できる。また膜透過物質を取り扱うことを考え、多孔質基板（孔径0.05-20マイクロメートル）を使用することも好ましい。
【００１１】
これら固体基板表面を末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）と、非特異吸着抑制分子（Ｂ）とで混合修飾する。混合薄膜として単分子膜を形成した場合には、目的とする化合物（Ａ）の末端糖類を混合薄膜の表面に突出した状態に容易に形成することができるので好ましい。
単分子膜を形成する方法としては、例えば非特許文献４に記載された、自己組織化を利用した単分子膜形成法を使用することができる。
【非特許文献４】K. Uosaki, Y. Sato, H. Kita, “Electrochemical Characteristics of a Gold Electrode Modified with a Self-Assembled Monolayer of Ferrocenylalkanethiols”, Langmuir, 1991, 7, 1510-1514
【００１２】
末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）としては、他方の末端に固体基板表面と強固な化学結合を造り得る基（例えば、金等に対してはチオール、ジスルフィド、スルフィドなどの含硫黄官能基、シリコンやガラスなどの固体基板にはSiO(CH３)３やSiＸ３（Ｘはハロゲン）などのSi-Oのシロキサン結合を作り得るもの）を有するものを使用することができる。化合物（Ａ）中には、基板吸着後に分子間相互作用により強固な分子層を作るためのアルキル鎖が存在することが好ましい。分子間相互作用を持たせるためにはアルキル鎖の他、ビニル基含有アルキル、または芳香族を有するものも好都合である。
【００１３】
特に好ましい化合物（Ａ）としては、たんぱく質に結合する糖類として単糖類又は二糖類を有する次式（１）で表される化合物が挙げられる。
Ｇ-（ＣＨ２）ｍ-ＳＨ        （１）
（式中、Ｇは単糖類又は二糖類であり、ｍは１〜２０の整数である。）
このような化合物（Ａ）の具体例としては、12-メルカプトドデシルα-グルコシド（単糖チオール）、12-メルカプトドデシルβ-マルトシド（二糖チオール）、8-メルカプトオクチルα-D-グルコシド（単糖チオール）、8-メルカプトオクチルβ-D-マルトシド（二糖チオール）等が挙げられる。
【００１４】
非特異吸着抑制分子（Ｂ）としては、たんぱく質の基板への結合を抑制する部位として、メチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものを有する化合物を使用することが好ましい。
特に好ましい非特異吸着抑制分子（Ｂ）としては、次式（２）で表される化合物が挙げられる。
Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ        （２）
（式中、Ｘはメチル基、水酸基、フルオロカーボン、繰り返し単位が１〜１０のポリエチレングリコール、から選択されたものであり；ｎは１〜２０の整数である。）
【００１５】
式（２）で表される化合物は、上記式（１）で表される化合物（Ａ）と組み合わせて使用することが好ましく、この場合には上記式（１）及び（２）におけるｍ及びｎについて、ｍ≧ｎとなるように選択することが好ましい。
混合薄膜を構成する化合物（Ａ）と化合物（Ｂ）の混合比は、重量比で１：１〜１：１０００、特に１：５〜１：２０とすることが好ましい。
【００１６】
次に、たんぱく質としてレクチンを対象とする場合を例にして、本発明を詳細に説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。。
レクチンと結合する化合物（Ａ）として、上記式（１）で表される、糖鎖を有する有機硫黄化合物を設計・合成し、このものが金基板表面に吸着し、溶液内のレクチンを高感度に認識することを確認した（レクチンが糖鎖部分に吸着することで、光学的性質が変化することを利用）。
これまで、未修飾の金表面には、検出したいレクチンの他にも様々なたんぱく質等が容易に吸着してしまい、検出感度を下げてしまうことが問題であった。したがって、目的レクチンのみを検出し、他のたんぱく質等の吸着を抑えることを同時に検討する必要がある。
【００１７】
本発明者等は、未修飾金に比べて、メチル末端のアルカンチオールや水酸基末端のアルキルチオール化合物で修飾した表面の方がレクチンの吸着が起こりにくいことを確認した。そして、糖類有機硫黄化合物（Ａ）100％で表面を修飾した基板よりも、たんぱく質等の吸着が起こりにくい水酸基末端等の有機硫黄化合物（Ｂ）で同時に分子層を構築した混合単分子層で基板を修飾した場合、レクチンの吸着効果が飛躍的に高まることを見いだした。また、目的とするレクチン分子の高効率な認識のために、レクチン認識部位となる糖類を有する有機硫黄化合物と、レクチン認識部位を持たない非特異吸着の起こりにくい有機硫黄化合物とを好適な範囲で混合し、基板を表面修飾した場合に、最高の表面認識が達成できることを確認した。
【００１８】
基板表面に形成する混合薄膜の構造について更に検討を重ねたところ、（１）水酸基末端のアルキルチオール化合物と糖鎖を有する有機硫黄化合物がプローブ顕微鏡観察により、一辺が20 nm以下の集合体を作って点状に相分離していること、（２）水酸基末端のアルキルチオール化合物の長さが、糖鎖を有する有機硫黄化合物よりも短く、分子認識部位である糖類が膜表面に露出しやすい構造において、レクチンとの強い相互作用が得られることを見いだした。
そして、このような混合薄膜を形成した基板を使用することにより、目的とするレクチン分子との反応を分光学的手法、水晶振動子マイクロバランス法のような微量天秤法、電気化学的手法など各種方法にて検出することができる。
【００１９】
本発明で対象とするたんぱく質はレクチンに限定されるものではなく、酵素、糖ペプチド、糖たんぱく質、血液凝集活性たんぱく質、細胞膜糖タンパク、リンパ球細胞膜、赤血球等の細胞表面膜、がん細胞等の各種細胞組織を含むたんぱく質を対象とすることができる。
そして、化合物（Ａ）及び非特異吸着抑制分子（Ｂ）とで混合修飾層構築した基板上に、基板に固定された化合物（Ａ）に特異的な結合をするたんぱく質がある場合にのみ金属または半導体の光学的性質、修飾界面での質量、電気化学的性質が変化することにより、当該たんぱく質の有無の検出、および濃度を測定することで、特定たんぱく質・糖脂質認識たんぱく質を検出することができる。
【００２０】
本発明で基板上に混合薄膜を形成する際には、非特異吸着抑制分子（Ｂ）の鎖長を、末端にたんぱく質に結合する糖類を有する化合物（Ａ）の鎖長よりも短く設定し、修飾膜の膜厚方向（垂直方向）に於いて低いところに非特異吸着部位が位置するように分子設計する。
ついで、固体基板表面に上記化合物（Ａ）と非特異吸着抑制分子（Ｂ）とによる混合修飾単分子層を構築する。予め化合物（Ａ）と非特異吸着抑制分子（Ｂ）を混合し、溶液に分散させ、ここに基板を浸す。分子層は自発的に自己組織化的に基板表面に配列する。基板表面にはたんぱく質を特異的に認識する糖鎖が固定してあるので、糖鎖を認識するたんぱく質・これを有する細胞のみが特異的に結合する。その際、検出対象分子と分子認識部位との立体的な障害をさけるために、非特異吸着抑制分子（Ｂ）の分子長が、少なくとも認識部位を有する化合物（Ａ）より短いことが好ましい。
【００２１】
図１は、このように分子設計した混合薄膜を有する基板の１例を示す模式図である。
図１において、符号１は固体基板、２は化合物（Ａ）、３は非特異吸着抑制分子（Ｂ）、そして４はレクチン等の検出するたんぱく質を表す。この基板１においては、非特異吸着抑制分子（Ｂ）の鎖長を、化合物（Ａ）の鎖長よりも短く設定することにより、たんぱく質に結合する化合物（Ａ）の末端糖鎖が基板上に形成した混合薄膜の表面に点在した状態で突出し、非特異吸着抑制分子（Ｂ）よりも高い位置にくるように構成した。このように構成することにより、検出対象とするたんぱく質を基板に効率良く吸着し検出することが可能となる。また、検出対象としたたんぱく質分子をはずすことによって、基板を繰り返し使用することができる。
【００２２】
相互作用による結合（吸着）反応が起きた場合、表面プラズモン共鳴センサー（ＳＰＲセンサー）にて表面の屈折率の変化を追跡する方法や、水晶振動子マイクロバランス法による表面での質量変化を追跡することでも目的物質の有無を検出可能である。吸着の有無は、反応前後のIR スペクトルを測定する手法でも検出可能である。また、酵素など生体触媒をラベルし、分子認識後、酵素の基質を加え生成した分子を吸光、蛍光、電気化学的な手法などにより検出することも可能である。
【実施例】
【００２３】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。
〔参考例１：各修飾表面におけるレクチンの吸着量の違い〕
基板としてビアコア（社）が販売する未修飾金チップ（商品名Sensor Chip Au）を使用し、末端にＳＨ基を有する次の修飾分子をＡｕ-Ｓの共有結合を介して結合させることにより基板表面を修飾し、各修飾表面におけるレクチンの吸着量を表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定した。
（修飾分子）
・１２-メルカプトドデシルβ-マルトシド（末端糖鎖含有アルカンチオール：発明者等が合成、精製したものを使用）
・メルカプトドデカノール（末端OH基含有アルカンチオール：市販品）
・ドデカンチオール（末端CH3基含有アルカンチオール：市販品）
・トリエチレングリコール末端チオール（ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２）３−Ｃ１１Ｈ２２ＳＨ：市販品）      
【００２４】
（修飾方法）
各修飾分子の1 mM溶液（20％エタノール混合水溶液に溶解）を調製し、  ビアコア社製のＳＰＲ測定装置BIACore 2000に未修飾金チップを固定した後、10μl/minの流速で金基板流路表面に30分間、修飾分子溶液を流しながら金表面の修飾を行う。この後、修飾分子を含まない20％エタノール混合水溶液及びpH7程度のリン酸緩衝液（10 mM）を用いて、順次流路表面を20−100μl/minの流速で、10分程度溶液を流すことにより洗浄する。
【００２５】
（レクチンとの反応）
レクチンとして1mMコンカナバリンA (Con A)溶液（前記リン酸緩衝液に溶解）を調製し、各修飾分子で修飾した基板（流路）と流速10-20μl/minで30分反応させる。SPRを利用した本系ではレクチンの吸着量に応じて光学定数（共鳴角度）が変化するので、角度変化をレゾナンスユニット(RU)で表記した結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１によれば、糖鎖チオール修飾表面にはCon Aが吸着し、68RUという変化が起こっている。1RU=1pg/mm２の質量変化に相当する、と計算されているので、これより、吸着分子数（吸着Con A数）が4.1  ｘ10６分子/cm２と求められる。他のチオール類、水酸基末端チオール、メチル末端チオール（ドデカンチオール）、トリエチレングリコール末端チオールでは糖鎖チオールのような吸着量は得られなかった。未修飾金表面にも、タンパク質（レクチン）は吸着し、今回は56RUと比較的大きな値を示した。したがって、メチル末端チオールなどでは、タンパク質の非特異的な吸着を抑えている効果があることを示している。
【００２８】
（実施例１：糖チオールとメルカプトブタノール混合膜での表面分離構造の確認）
レクチン認識分子である12-メルカプトドデシルβ-マルトシドと非特異的な吸着を抑制するメルカプトブタノール（水酸基末端チオール）を用いて、下記の手順で混合膜を構築し、走査型トンネル顕微鏡(STM)で観察した。
12-メルカプトドデシルβ-マルトシドとメルカプトブタノールを、1：1で混合した1mMエタノール溶液に、金単結晶表面Au(111)を有する金基板を浸し、30分修飾した。修飾の後、基板をエタノール、ついで水で洗浄した。0.05Ｍ過塩素酸溶液中で、75nm x 75nmの範囲で観察した結果を図２ａに示す。また、混合膜の断面図の高低差を図２ｂに示す。STM観察は、基板電位0.85 V vs RHE  （可逆水素電極）、探針電位 0.25V、トンネル電流は0.45nA で、タングステンチップを使用した。
混合膜を観察すると、白く明るいところ（高いところ）と暗く見える低いところがある。黒くみえるところは金表面そのものが一層下がっていることによるものであり、中間色と一番明るいところがそれぞれ、OH末端、糖末端チオールである。混合溶液に金を浸けるだけで、このような相分離膜構造が得られる。糖鎖とOH基の高さの差は、図２ｂで示した断面図より、約0.25nm となる。図２ａ及び２ｂの観察では、20ｘ20nm四方の広いドメイン（おそらく水酸基末端チオール）があり、さらに5-10nm 四方の糖鎖由来のドメインが点在するのが観察される。この状態は、修飾条件、観察条件により変化する。
【００２９】
（実施例２：二糖チオールとメルカプトブタノール混合膜におけるレクチンの検出）
基板として参考例１と同じ、ビアコア（社）の金チップ使用し、実施例１と同様の手順で12-メルカプトドデシルβ-マルトシドとメルカプトブタノールの各種混合比の溶液を用いて修飾基板を作製した。その際に、混合チオールがトータルで10μMの溶液となるように20％エタノール水溶液を使用して溶液を調製し、流速1μl/min で1時間、金基板（流路）に流し、修飾した。修飾後は、基板を20％エタノール水溶液とリン酸緩衝液で参考例１と同様にして洗浄した。
得られた基板に、1μMCon A（参考例１と同じ）を混合膜修飾基板上に、2分間、流速10-20μl/minで反応させ、Con Aの吸着量を測定した結果を図３に示す。図３は、横軸に二糖チオールの混合割合、縦軸にCon Aの吸着量をプロットしたものである。
この結果によれば、糖鎖が仕込み比で10％のときの膜を使ったとき、ConAの吸着量が最大になった（1.7  ｘ108分子/cm2）。二糖チオール100％で膜を構成した場合と比較すると、二糖チオール10%のとき、約45倍の吸着量を示し、混合膜とした効果が顕著に現れている。
【００３０】
（実施例３：二糖チオールとメルカプトドデカノール混合膜におけるレクチンの検出）
実施例２と同様の手順で12-メルカプトドデシルβ-マルトシドとメルカプトドデカノール（非特異吸着抑制分子）の各種混合比の溶液を用いて修飾基板を作製した。この例では、非特異吸着抑制分子のアルキレン基を糖のアルキレン基と同じ長さにした場合である。Con Aの吸着量を、参考例１と同様にして測定した結果を図４に示す。
得られた結果は、基本的には実施例２と同様であるが、水酸基末端チオール（非特異吸着抑制分子）の鎖長が長い場合、糖の混合割合が50％のときが最大結合量を示した（7.4 x 10７分子/cm２）。
短鎖のOH末端チオールを使用した場合に比較すると、混合膜の使用によるタンパク質の認識効果アップは小さいが、二糖チオールの割合が50％となる前後が結合量が最も多くなっている。この結果より、認識部位と抑制部位では、膜の垂直方向の高さの差を設けた方が効果的にレクチン認識することが判明した。
【００３１】
（実施例４：単糖チオールとメルカプトブタノール混合膜におけるレクチンの検出）
実施例２において、二糖チオールである12-メルカプトドデシルβ-マルトシドに代えて12-メルカプトドデシルα-グルコシド（単糖チオール）を使用した以外は、実施例２と同様にして混合膜修飾基板を作製した。得られた基板を使用して、Con Aの吸着量を、実施例２と同様にして測定した結果を図５に示す。
得られた結果は、基本的には実施例２と同様であるが、単糖チオールの割合が20％のとき最大結合量を示した（1.6 x 10８分子/cm２）。二糖チオールの時ほどはっきりしたピークは存在しないが、単糖100％のときよりも、単糖チオールの割合が5-20％のときにConAの結合量が多いことが確認できた。
【００３２】
（実施例５：各混合膜におけるレクチン相互作用能の違い）
実施例２と同様にして、金基板表面を、12-メルカプトドデシルβ-マルトシドに対して、これよりも鎖長の短いメルカプトブタノールまたは同等の鎖長のメルカプトドデカノールをそれぞれ10％の混合比で混合した溶液（トータル濃度10μM, 20％エタノール混合水溶液、糖チオール：水酸基末端チオール＝9：1の割合）にて、流速10μl/min で1時間修飾した。ついで、修飾分子の含まれない20％エタノール混合水溶液、リン酸緩衝液で順次洗浄した後に、レクチン（1mMConA）を120秒  20μl/minの流速で流し、レクチン相互作用を確認した結果を図６に示す。
この相互作用曲線（図６）より、解離定数ＫＤをビアコアの装置で計算させた結果、短鎖水酸基末端チオールであるメルカプトブタノールとの混合膜の場合、KD値が5.2  x 10-7(M)となった。一方、長鎖水酸基末端チオールであるメルカプトドデカノールとの混合膜の場合は、KD値が1.4  x 10-6(M)となった。溶液内にフリーに存在させた糖（マンノース）とCon Aの相互作用は2.0 x 10-4 (M)と報告されており、表面に膜構築することで相互作用が高まったことが判明した。また、糖部分より非特異吸着抑制分子である水酸基末端チオールを低い位置に設計した膜の場合、さらに相互作用が2.7倍ほど高まることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明の混合薄膜を設けた基板の１例を示す模式図である。
【図２ａ】実施例１で得られた混合膜を走査型トンネル顕微鏡(STM)で観察した結果を示す図である。
【図２ｂ】実施例１で得られた混合膜を走査型トンネル顕微鏡(STM)で観察した結果を示す図である。
【図３】実施例２で得られた基板を使用して、Con Aの吸着量を測定した結果を示す図である。
【図４】実施例３で得られた基板を使用して、Con Aの吸着量を測定した結果を示す図である。
【図５】実施例４で得られた基板を使用して、Con Aの吸着量を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例５によりレクチン相互作用を確認した結果を示す図である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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