(57)【要約】【課題】化学発光可能な分子を含む試料を高精度で観察できる顕微鏡を提供する。【解決手段】少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料７３を観察する顕微鏡であって、化学発光過程により第１量子状態にある分子を、発光が抑制された他のエネルギー準位に遷移させる光を出射する光源３１と、光源３１からの光を化学発光試料７３に集光する顕微鏡対物レンズ７２と、顕微鏡対物レンズ７２により空間的に選択される化学発光試料７３の領域の一部の発光を抑制するように、光源３１からの光を空間変調する空間変調素子３２と、顕微鏡対物レンズ７２により集光される光と化学発光試料７３とを相対的に移動させて化学発光試料７３を光により走査する走査手段５２，５３と、顕微鏡対物レンズ７２により空間的に選択された化学発光試料７３の領域からの発光を検出する検出手段５４，５５，５８と、を有する。【選択図】図６
2008057997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料を観察するにあたり、
上記化学発光試料に、化学発光過程により第１量子状態にある上記分子を他のエネルギー準位に遷移させる光を照射することにより、空間的に選択された領域の一部の発光を抑制して、上記化学発光試料を観察することを特徴とする化学発光試料の観察方法。
【請求項２】
少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料を観察する顕微鏡であって、
化学発光過程により第１量子状態にある上記分子を、発光が抑制された他のエネルギー準位に遷移させる光を出射する光源と、
該光源からの光を上記化学発光試料に集光する顕微鏡対物レンズと、
該顕微鏡対物レンズにより空間的に選択される上記化学発光試料の領域の一部の発光を抑制するように、上記光源からの光を空間変調する空間変調素子と、
上記顕微鏡対物レンズにより集光される上記光と上記化学発光試料とを相対的に移動させて上記化学発光試料を上記光により走査する走査手段と、
上記顕微鏡対物レンズにより空間的に選択された上記化学発光試料の領域からの発光を検出する検出手段と、
を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項３】
上記光源はレーザ光源からなり、上記空間変調素子は位相空間変調素子からなることを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
上記位相空間素子で位相空間変調された上記レーザ光源からの光が、ｍ次のベッセル光であることを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
【請求項５】
上記検出手段は、上記集光手段と共焦点のピンホールを有し、該ピンホールの開口径ａは、ｍをベッセル光の次数、Ｍを上記検出手段による検出側光学系の倍率、ＮＡを上記顕微鏡対物レンズの開口数、λを上記レーザ光源から出射される光の波長とするとき、下記の条件を満たすことを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
ｍＭ（λ／ＮＡ）≦ａ≦ｍＭ（２λ／ＮＡ）
【請求項６】
上記位相空間素子で位相空間変調された上記レーザ光源からの光は、上記ｍがｍ＝１となる１次のベッセル光であることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光可能な分子を含む化学発光試料の観察方法および顕微鏡、特に化学発光試料を超解像で観察する方法および顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、さらに高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観察するものである。この原理について、図７〜図１０を参照して説明する。図７は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図７に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図８に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図９に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１０に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図９の吸収過程や図１０の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図８のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図９のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図９の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図７に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１１は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、さらに波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１１はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１１に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１２は、図１１と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１２において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１２の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の中空状の光照射により蛍光領域を抑制すれば、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。以下、波長λ１の光をポンプ光、波長λ２の光をイレース光とも呼ぶ。したがって、この原理を利用することで、回折限界を超える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば超解像蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
ここで、波長λ２のイレース光を中空状に整形する方法としては、位相空間変調法が有名である。この位相空間変調法は、光軸対称位置で通過したイレース光の位相が反転し、光軸周りでイレース光の位相差が、例えば２πで周回するように形成された空間変調素子を用い、この空間変調素子を通過したイレース光を集光することにより、光軸上で電場を相殺して中空状のイレース光を生成するものである。このような位相空間変調法に用いられる空間変調素子としては、例えば図１３に示すように、イレース光波長に対してπ／２ずつ位相が異なる４領域をガラス基板にエッチングにより形成した位相板９１や、図１４に示すように、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なる８領域をガラス基板にエッチングにより形成した位相板９２を用いることができる。なお、図１４には、各領域のエッチング深さｄも示している。
【００１８】
一方、近年では、蛍光顕微鏡のような励起光源を有しないタイプの生物顕微鏡も出現している。このタイプの顕微鏡は、励起光源からの光照射を受けることなく試料自体が発光する蛍光を捕らえるもので、特に、化学発光する発光生物の細胞レベルで発現する遺伝子機能の解析に応用が開始されている。
【００１９】
化学発光とは、ルシフェリンに代表される発光基質の酸化を発光酵素が触媒する酵素反応である。この化学発光を用いると、化学反応により物質すなわち分子が励起状態で生成され、これが励起状態に蛍光過程で脱励起する。発光酵素としてはルシフェラーゼが有名であり、９０％に近い極めて高い蛍光収率で蛍光発光をする。したがって、一般の蛍光色素とは異なり、レーザ等で光照射して励起状態を生成する必要がない。
【００２０】
最近では、蛍や鉄道虫といった発光生物における化学発光を観察することにより、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク、へと発展する転写機構の流れを遺伝子レベルで解明する試みが始まっている。化学発光は、生物が自ら起す発光過程であり、従来の光照射による蛍光観察法と比較して、試料自体へのダメージが極めて少ない。したがって、生きた細胞の生命活動を極めて自然なままで観察できる特長があり、蛍や鉄道虫に留まらず、遺伝子導入法を用いることで他の生物にも応用が広まっている。
【００２１】
【特許文献１】特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】特開２００１−１００１０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
しかしながら、化学発光を分析する従来の蛍光顕微鏡は、他方式の顕微鏡と比較すると空間分析の観点では分析能力が劣る。例えば、レーザ走査型蛍光顕微鏡では、顕微鏡対物レンズで選択した特定の試料部位のみにレーザ光を集光照射するので、レーザ光が照射されない空間部分からの光応答信号は検出器に混入せず、レーザ光が照射された試料部位のみからの蛍光信号を検出して分析することができる。しかも、レーザ走査型蛍光顕微鏡では、蛍光相関法と組み合すことで、レーザ光が集光照射された試料部位を出入りする蛍光分子を１分子レベルで高感度で解析できる。
【００２３】
これに対して、化学発光を分析する従来の蛍光顕微鏡では、酵素反応が起こると場所を問わずに発光が起こるため、外界の影響を切り離して特定部位だけを精度良く観察することができない。
【００２４】
したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、化学発光可能な分子を含む試料を高精度で観察できる化学発光試料の観察方法およびこの観察方法を実施する顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
上記目的を達成する請求項１に係る化学発光試料の観察方法の発明は、少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料を観察するにあたり、
上記化学発光試料に、化学発光過程により第１量子状態にある上記分子を他のエネルギー準位に遷移させる光を照射することにより、空間的に選択された領域の一部の発光を抑制して、上記化学発光試料を観察することを特徴とするものである。
【００２６】
さらに、上記目的を達成する請求項２に係る顕微鏡の発明は、少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料を観察する顕微鏡であって、
化学発光過程により第１量子状態にある上記分子を、発光が抑制された他のエネルギー準位に遷移させる光を出射する光源と、
該光源からの光を上記化学発光試料に集光する顕微鏡対物レンズと、
該顕微鏡対物レンズにより空間的に選択される上記化学発光試料の領域の一部の発光を抑制するように、上記光源からの光を空間変調する空間変調素子と、
上記顕微鏡対物レンズにより集光される上記光と上記化学発光試料とを相対的に移動させて上記化学発光試料を上記光により走査する走査手段と、
上記顕微鏡対物レンズにより空間的に選択された上記化学発光試料の領域からの発光を検出する検出手段と、
を有することを特徴とするものである。
【００２７】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の顕微鏡において、
上記光源はレーザ光源からなり、上記空間変調素子は位相空間変調素子からなることを特徴とするものである。
【００２８】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の顕微鏡において、
上記位相空間素子で位相空間変調された上記レーザ光源からの光が、ｍ次のベッセル光であることを特徴とするものである。
【００２９】
請求項５に係る発明は、請求項４に記載の顕微鏡において、
上記検出手段は、上記集光手段と共焦点のピンホールを有し、該ピンホールの開口径ａは、ｍをベッセル光の次数、Ｍを上記検出手段による検出側光学系の倍率、ＮＡを上記顕微鏡対物レンズの開口数、λを上記レーザ光源から出射される光の波長とするとき、下記の条件を満たすことを特徴とするものである。
ｍＭ（λ／ＮＡ）≦ａ≦ｍＭ（２λ／ＮＡ）
【００３０】
請求項６に係る発明は、請求項５に記載の顕微鏡において、
上記位相空間素子で位相空間変調された上記レーザ光源からの光は、上記ｍがｍ＝１となる１次のベッセル光であることを特徴とするものである。
【００３１】
先ず、本発明の概要について説明する。前述したように、化学発光は、励起状態の分子が、光励起によらず化学反応によって生成される。この状態は、蛍光発光可能なＳ１状態に対応する。このＳ１状態にある分子に、共鳴する波長による光すなわちイレース光を照射して、分子をＳ１状態からＳ２状態に励起すれば、二重共鳴吸収過程の場合と全く同様に、分子が蛍光発光する前に、高い量子状態への熱緩和によって蛍光を抑制できる。加えて、ルシフェリンのような化学発光物質は、蛍光収率が極めて高いので、蛍光波長帯域のイレース光を用いれば、誘導放出過程によっても蛍光抑制が可能となる。
【００３２】
化学発光試料の顕微鏡観察における特異性は、光源が不要なことである。したがって、超解像技術を応用する場合には、従来の超解像顕微鏡では不可欠あったポンプ光が不要になり、最低限イレース光光源があれば良いことになる。
【００３３】
すなわち、図１に示すように、化学発光を行っている化学発光試料１に、顕微鏡対物レンズ２を介してイレース光３を集光照射して輪帯状スポット３ａを形成することにより、輪帯状スポット３ａの蛍光発光過程を抑制して、その部位からの蛍光情報が得られないようにし、輪帯状スポット３ａの中央部であるイレース光強度がない領域と、輪帯状スポット３ａの外側領域が化学発光より蛍光を発するようにする。
【００３４】
本発明に係る顕微鏡においては、図２に原理的構成を示すように、空間変調されたイレース光１０を、ハーフプリズム１１で反射させた後、顕微鏡対物レンズ１２により集光して、化学発光試料１３に図１に示したように輪帯状に照射し、その輪帯状照射部位の中央部の蛍光信号を、顕微鏡対物レンズ１２を経てハーフプリズム１１を透過させた後、検出手段である投影レンズ１４、顕微鏡対物レンズ１２と共焦点に位置するピンホール１５を経て光電子増倍管１６で受光する。
【００３５】
この場合、ピンホール１５上には、投影レンズ１４により、図３に示すような強度分布で、イレース光集光点近傍の投影蛍光像が結像される。このピンホール１５上に結像される投影蛍光像は、化学発光試料１３の試料面の蛍光像が、顕微鏡対物レンズ１２と投影レンズ１４とにより決まる倍率で拡大投影されたものほかならない。すなわち、ピンホール１５の開口１５ａの中心部に、イレース光中央部で蛍光抑制を受けない蛍光成分１７ａが存在し、その外側に蛍光抑制されて蛍光強度が存在しない輪帯パターン１７ｂが存在し、更にその外側に試料面のイレース光の外輪において全く蛍光抑制を受けずに化学発光している蛍光成分１７ｃが存在する蛍光像にほかならない。
【００３６】
ここで、例えば、顕微鏡対物レンズ１２によりベッセル１次ビームを集光すると、イレース光１０の輪帯状スポットにおける内輪の直径ｒは、
ｒ＝λ／ＮＡ        （１）
となる。ここで、λはイレース光１０の波長であり、ＮＡは顕微鏡対物レンズ１２の開口数である。この直径ｒが、イレース光輪帯状スポットの中空部の直径となるので、イレース光輪帯状スポットの外輪の直径は、その倍となる。したがって、ほぼ径ｒのサイズの蛍光抑制部が形成され、その蛍光強度の存在しない輪帯像が、顕微鏡対物レンズ１２と投影レンズ１４とを含む光学系の総合倍率（Ｍ）でピンホール１５上に拡大投影される。
【００３７】
また、拡大投影される蛍光像とピンホール１５との位置関係を調べてみると、中央部の蛍光強度ピークが、ピンホール１５の開口１５ａの中央部に結像するので、この蛍光強度ピークを有する蛍光成分１７ａは開口１５ａを通過することになる。これに対し、輪帯パターン１７ｂの外側に存在する蛍光成分１７ｃは、開口１５ａを通り抜けることができずに遮光される。したがって、光電子増倍管１６で受光される蛍光信号は、イレース光集光スポットの中央部で蛍光が抑制されなかった蛍光成分（超解像信号成分）１７ａとなる。
【００３８】
このことは、ポンプ光を集光して試料を励起し、その中央以外の領域を中空状にイレース光を集光して蛍光を抑制して計測する従来の超解像顕微鏡と同等である。したがって、蛍光を計測すべき試料空間のサイズは、従来の超解像顕微鏡と全く変わらないので、得られる空間分解も同じになる。すなわち、分解能は、超解像信号成分の空間強度分布の半値幅（Γ）であるので、集光したイレース光の最大フォトンフラックスをＰe、蛍光分子の寿命をτ、蛍光抑制断面積をσdipとすると、分解能は下記の（２）式で与えられる。
【００３９】
【数１】
2008057997.tif 000003
【００４０】
ここで、蛍光抑制断面積σdipとは、文献：Y. Iketaki, T. Watanabe, M, Sakai, S Ishiuchi, M. Fujii and T. Watanabe, "Theoretical investigation of the point-spread function given by super-resolving fluorescence microscopy using two-color fluorescence dip spectroscopy," Opt. Eng.44, 033602(2005)で定義されている光学定数で、
σdip＝σf＋ασup
で表される。なお、σf は誘導放出断面積であり、σupはＳ１状態から他のＳｎ状態（ｎは２以上の正の整数）へ遷移するときの２重共鳴吸収断面積である。また、αはＳｎ状態からの非輻射で緩和する確率である。
【００４１】
このように、図２に示した構成の顕微鏡によると、従来の超解像顕微鏡と同等の分解能を得ることができる。ここで、図２に示した顕微鏡では、集光されたイレース光の輪帯状スポット外輪より外側の領域で化学発光した蛍光成分１７ｃは、ピンホール１５により確実に遮光して光電子増倍管１６に到達しないようにする必要があると同時に、輪帯状スポットの中央部の観察領域の蛍光成分１７ａは、ピンホール１５で遮光することなく光電子増倍管１６に到達させる必要がある。
【００４２】
すなわち、顕微鏡対物レンズ１２で集光されるイレース光輪帯状スポットの外輪の直径（Ｒout）は、上述したように内輪の直径ｒの２倍で、
Ｒout＝２λ／ＮＡ        （３）
であるから、Ｒoutより外側で化学発光する蛍光成分は観察対象外とし、内輪直径ｒの内側の中空領域で化学発光する蛍光成分を観察対象の超解像信号成分とする。
【００４３】
このためには、顕微鏡対物レンズ１２と投影レンズ１４とを含む検出側光学系の総合倍率Ｍを勘案すると、ピンホール１５の開口１５ａの径ａは、少なくとも下記の条件式（４）を満たすことが望ましく、この（４）式を満たすことにより、観察領域とは無関係な蛍光成分を遮光して、観察対象となる領域のみからの蛍光信号を検出することができる。
Ｍｒ≦ａ≦ＭＲout        （４）
【００４４】
また、上記のような共焦点光学系を有するレーザ走査型顕微鏡において、空間変調素子として図１３または図１４に示したような位相板を用いてイレース光を空間位相変調して、顕微鏡対物レンズによりイレース光を中空状に整形して集光するとともに、化学発光試料と集光イレース光とを相対的に空間走査するようにすれば、全領域で発光する化学発光試料であっても、選択した部位のみの独立した空間情報を計測でき、回折限界を超える空間分解能で蛍光２次元画像を形成することができる。
【００４５】
なお、位相板は、図１３や図１４に示したように、光軸の周りをイレース光の位相差が２πで周回するように構成したものに限らず、エッチングの深さを変えて２πの整数倍（ｍ）で周回するように構成したものを用いることもできる。この場合は、ｍ次のベッセル光と呼ばれ、集光スポットにおける中空径は、１次のベッセル光におけるサイズｒのｍ倍となる。
【００４６】
さらに、図４に示すように、輪帯状に位相分布が異なる位相板２１によりイレース光を位相空間変調して、顕微鏡対物レンズ２２により集光することにより、集光点近傍で干渉により３次元的にイレース光が当たらない領域（ダークホール）２３を形成して、３次元的に蛍光を抑制することもできる。図４においては、ダークホール２３の部分と外側の輪帯部とでは、位相のとびがπとなっている。
【００４７】
なお、空間変調素子は、エッチングを施して形成した位相板の他にも、蒸着膜を形成して構成した位相板や、液晶型の空間変調器や、鏡面形状を制御可能なデフォーマラブルミラーを用いることも可能である。
【発明の効果】
【００４８】
本発明によれば、少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料に、化学発光過程により第１量子状態にある分子を他のエネルギー準位に遷移させる光を照射することにより、空間的に選択された領域の一部の発光を抑制して化学発光試料を観察するので、回折限界を上回る空間分解で化学発光試料を高精度で観察することが可能となる。その結果として、細胞内のオルガネラレベルの空間サイズで起きる遺伝子発現現象を空間解析することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
以下、本発明の実施の形態について、赤色に発光する鉄道虫を観察する場合を例にとって説明する。
【００５０】
図５は、鉄道虫の化学発光スペクトルを示すものである。この鉄道虫は、波長６４０ｎｍに蛍光発光ピークをもち、波長７００ｎｍの領域までテールを引いている。鉄道虫をはじめとする化学発光分子ルシフェリンの蛍光収率は、９０％と極めて高く、ナノ秒オーダーの蛍光発光寿命を持ち、蛍光発光断面積も１０−１６ｃｍ２以上の値を持っている。
【００５１】
例えば、化学発光過程により生成されたＳ１状態のルシフェリンに、波長７００ｎｍの光を照射すると、Ｓ１状態からＳ０状態へ強制的に誘導放出が起こる。加えて、Ｓ１状態以上のより高いエネルギー準位Ｓ２に励起遷移が起こるため、強い蛍光抑制が発現する。
【００５２】
このことは、波長７００ｎｍをイレース光として用いれば、鉄道虫の微小組織を超解像で観察できることを意味する。このような波長の光を放射する光源としては、例えばＴｉサファイアレーザが使用可能である。このＴｉサファイアレーザは、波長６７５ｎｍより長波領域で１Ｗ以上の強いレーザ光を波長可変で発振できる。
【００５３】
図６は、本実施の形態による顕微鏡の光学系の要部構成図である。この顕微鏡は、通常のレーザ走査型蛍光顕微鏡を前提としたもので、主に３つの独立したユニット、すなわち、光源ユニット３０、スキャンユニット５０および顕微鏡ユニット７０からなっている。
【００５４】
光源ユニット３０は、イレース光用光源３１と、イレース光を空間変調する空間変調素子３２とを有している。イレース光用光源３１は、ＣＷ／Ｎｄ：ＹＡＧ固体レーザで励起されるＴｉサファイアレーザからなり、波長７００ｎｍ、強度４００ｍＷのイレース光を出射するようになっている。また、空間変調素子３２は、例えば図１４に示したように、イレース光波長に対して１／８ずつ位相が異なる８領域を、ガラス基板にエッチングや光学薄膜の蒸着により形成した位相板を用いる。この空間変調素子３２を通過した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺され中空状のイレース光が生成される。
【００５５】
スキャンユニット５０は、光源ユニット３０から出射されるイレース光を、ハーフプリズム５１を通過させた後、走査手段を構成する２枚のガルバノミラー５２および５３により２次元方向に揺動走査して、後述の顕微鏡ユニット７０に出射するようになっているとともに、顕微鏡ユニット７０で検出された蛍光を、往路とは逆の経路を辿ってハーフプリズム５１で分岐し、その分岐された蛍光を、検出手段を構成する投影レンズ５４、ピンホール５５、ノッチフィルタ５６および５７を経て光電子増倍管５８で受光するようになっている。図２では、図面を簡略化するため、ガルバノミラー５２，５３を同一平面内で揺動可能に示している。なお、ノッチフィルタ５６および５７は、蛍光に混入したイレース光を除去するものである。また、ピンホール５５は、顕微鏡対物レンズ７２の共焦点光学系を成す重要な光学素子で、観察試料内の特定の断層面で発光した蛍光のみを通過させるものである。
【００５６】
顕微鏡ユニット７０は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、スキャンユニット５０から入射するイレース光をハーフプリズム７１で反射させて、顕微鏡対物レンズ７２により化学発光可能な分子を含む化学発光試料である鉄道虫７３上に集光させるとともに、鉄道虫７３で発光した蛍光を、再び顕微鏡対物レンズ７２でコリメートしてハーフプリズム７１で反射させることにより、再び、スキャンユニット５０に戻すと同時に、ハーフプリズム７１を通過する蛍光の一部を接眼レンズ７４に導いて、蛍光像として目視観察できるようになっている。
【００５７】
本実施の形態において、顕微鏡対物レンズ７２のＮＡを０．９として、波長７００ｎｍ、強度４００ｍＷのイレース光を集光すると、７×１０２５フォトン／ｃｍ２／ｓｅｃのフォトンフラックスが得られる。また、鉄道虫７３における蛍光抑制過程が誘導放出断面積のみであると過程すると、蛍光抑制断面積は蛍光発光断面積である１０−１６ｃｍ２以上となる。したがって、蛍光分子の寿命τを１ｎｓｅｃ、蛍光抑制断面積σdipを１０−１６ｃｍ２とすると、上記（２）式から、１５０ｎｍの空間分解能が得られる。これは、回折限界の倍の分解能に相当する。この際、Ｓ１状態からＳ２状態への遷移は全く考慮していないので、実際には更に空間分解能は向上する。
【００５８】
また、ピンホール５５の開口の径ａは、上記（４）式から、例えば共焦点光学系の倍率（Ｍ）が１００倍の場合には、８０μｍから１６０μｍの間とする。これにより、観察領域以外から放射される化学発光光を遮光することができ、良好なＳ／Ｎで鉄道虫７３を空間計測することができる。
【００５９】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、鉄道虫を例にとって説明したが、本発明は鉄道虫に限らず、少なくとも２以上の安定な量子状態を有する化学発光可能な分子を含む化学発光試料の観察に広く適用することができ、観察試料の化学発光特性に応じてイレース光を適宜設定すればよい。また、走査手段は、２枚のガルバノミラー５２，５３を用いてイレース光を偏向して観察試料を二次元走査する構成に限らず、顕微鏡対物レンズ７２および／または観察試料を載置する試料ステージを移動させて、イレース光により観察試料を二次元走査したり、１枚のガルバノミラーによるイレース光の一次元移動（主走査）と、その一次元移動と直交する方向への顕微鏡対物レンズ７２あるいは試料ステージの一次元移動（副走査）との組み合わせて、観察試料を二次元走査したりすることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明の概要を説明するための図である。
【図２】本発明に係る顕微鏡の原理的構成を示す図である。
【図３】図２に示すピンホール上に結像される投影蛍光像の強度分布を示す図である。
【図４】輪帯状に位相分布が異なる位相板によりイレース光を位相空間変調した場合の集光状態を示す図である。
【図５】鉄道虫の化学発光スペクトルを示す図である。
【図６】本発明の一実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成図である。
【図７】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図８】図１３の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図９】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１０】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１１】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１２】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１３】空間変調素子の一例を示す図である。
【図１４】同じく、空間変調素子の他の例を示す図である。
【符号の説明】
【００６１】
１  化学発光試料
２  顕微鏡対物レンズ
３  イレース光
３ａ  輪帯状スポット
１０  イレース光
１１  ハーフプリズム
１２  顕微鏡対物レンズ
１３  化学発光試料
１４  投影レンズ
１５  ピンホール
１５ａ  開口
１６  光電子増倍管
２１  位相板
２２  顕微鏡対物レンズ
２３  ダークホール
３０  光源ユニット
３１  イレース光用光源
３２  空間変調素子
５０  スキャンユニット
５１  ハーフプリズム
５２，５３  ガルバノミラー
５４  投影レンズ
５５  ピンホール
５６，５７  ノッチフィルタ
５８  光電子増倍管
７０  顕微鏡ユニット
７１  ハーフプリズム
７２  顕微鏡対物レンズ
７３  鉄道虫
７４  接眼レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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