(57)【要約】【課題】血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性が優れた腫瘍撮像用MRI造影剤が求められていた。【解決手段】分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を含む、腫瘍撮像用MRI造影剤。好ましくは、分岐型非荷電性ポリマーが２本鎖ポリエチレングリコールである。さらに好ましくは、腫瘍が膵臓癌である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を含む、腫瘍撮像用MRI造影剤。
【請求項２】
分岐型非荷電性ポリマーが分岐型ポリエチレングリコール、分岐型ポリビニルアルコール、分岐型アクリルアミド、分岐型ポリアクリル酸エステルおよび分岐型ポリオキサゾリンからなる群から選ばれる少なくとも1つである、請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
分岐型ポリエチレングリコールが２本鎖ポリエチレングリコールである、請求項２に記載の造影剤。
【請求項４】
ポリアニオンがカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、およびポリアクリル酸からなる群から選ばれる少なくとも1つである、請求項１から３のいずれか１項に記載の造影剤。
【請求項５】
カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸が、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である、請求項４に記載の造影剤。
【請求項６】
ブロック共重合体が下記一般式（１）で示されるものである、請求項５に記載の造影剤。
【化１】
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（式中、mは５〜２００００の整数を表し、nは２〜５０００の整数を表す。）
【請求項７】
腫瘍が膵臓癌、大腸癌および肝臓癌からなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１から６のいずれか１項に記載の造影剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍撮像用MRI(Magnetic Resonance Imaging)造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌患者のQOL（Quality of Life）の向上が叫ばれているが、癌患者のQOL向上のためには癌の早期診断が大切である。例えば、図２の膵臓癌の患者の５年生存率のグラフによると、膵臓癌の患者の２年後の生存率は、初期（Ｉ期）に発見された膵臓癌患者ではほぼ１００％であるに対して、末期（IV期）の膵臓癌患者では２０％を切っている。このことから現在の癌治療においては癌の早期診断が非常に重要であり、また、癌患者のQOLの向上のためには癌の早期診断が非常に重要であることがわかる。
【０００３】
しかしながら、特に膵臓癌の場合、初期癌の発見が極めて難しく、膵臓癌は多くの場合III／IV期というかなり進行した状態で発見されるのが現状である。しかも、現在、膵臓癌に効く抗癌剤の数も少ない。これらのことから、膵臓癌は他の病変に比べて死亡率が高い傾向がここ２０年続いている。初期癌は患者に自覚症状がない場合が多いので、膵臓癌の早期発見のためには、一見全く健康な人に対しても癌診断を行う必要がある。そのため、非侵襲的かつ安全な癌の診断方法の開発が求められている。
【０００４】
以前の癌の診断方法は、レントゲン、外科手術、または病理標本による検査方法によるものが多かったが、最近の癌の診断方法は、X線CT(X-ray Computed Tomography)、MRI(Magnetic Resonance Imaging)またはPET(Positron Emission Tomography)といった画像診断法を用いるものが多くなってきている。
【０００５】
中でも、MRIは、磁場やラジオ波を用いていることから放射線被爆の心配がなく非侵襲的かつ安全であること、また、癌の診断に必要な解像度(10μm-100μm)が得られること、さらに、腫瘍などの軟部組織のコントラストが良いことから、癌の診断方法に用いるものとして大いに期待されている。
【０００６】
しかしながら、初期の癌は周囲の組織とのコントラストが非常に小さい。このため、従来のMRIを用いた方法では初期の癌を発見することができない場合もあった。これに対して、MRIを用いた方法でも、適切な造影剤を用いることで初期の癌をより発見し易くすることができると考えられている。
【０００７】
従来のMRI造影剤には、Gd錯体を用いる造影剤(Magnevist(登録商標)やDotarem(登録商標)など)と酸化鉄微粒子を用いる造影剤(Feridex(登録商標)やResovist(登録商標)など)がある（例えば、非特許文献１および２参照。）。これらの造影剤は、造影する部位や造影メカニズムに違いがある。
【０００８】
しかし、これらの従来のMRI造影剤は、血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性の点で改良の余地があった。
【０００９】
【非特許文献１】N. Kato et al., Invest. Radiol. 34, pp.551 (1999)
【非特許文献２】R. C. Brasch, Radiology 147, pp.781 (1983)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
このような状況の下、血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性が優れた腫瘍撮像用MRI造影剤が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、腫瘍撮像用MRI造影剤の血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性を改良すべく鋭意研究を行った。その結果、本発明者は、分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を含む腫瘍撮像用MRI造影剤が、血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性が優れていること、などを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は以下のものである。
（１）分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を含む、腫瘍撮像用MRI造影剤。
（２）分岐型非荷電性ポリマーが分岐型ポリエチレングリコール、分岐型ポリビニルアルコール、分岐型アクリルアミド、分岐型ポリアクリル酸エステルおよび分岐型ポリオキサゾリンからなる群から選ばれる少なくとも1つである、上記（１）に記載の造影剤。
（３）分岐型ポリエチレングリコールが２本鎖ポリエチレングリコールである、上記（２）に記載の造影剤。
（４）ポリアニオンがカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、およびポリアクリル酸からなる群から選ばれる少なくとも1つである、上記（１）から（３）のいずれか１つに記載の造影剤。
（５）カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸が、ポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸である、上記（４）に記載の造影剤。
（６）ブロック共重合体が下記一般式（１）で示されるものである、上記（５）に記載の造影剤。
【化２】
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（式中、mは５〜２００００の整数を表し、nは２〜５０００の整数を表す。）
（７）腫瘍が膵臓癌、大腸癌および肝臓癌からなる群から選ばれる少なくとも１種である、上記（１）から（６）のいずれか１つに記載の造影剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、腫瘍撮像用MRI造影剤を提供する。本発明の好ましい態様によれば、血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性の高いMRI造影剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下に、本発明を詳細に説明する。
＜本発明の概要＞
本発明者は、MRIを用いた方法で初期の癌を容易に発見することができるようにするため、例えば造影剤を血中などへ投与したとき腫瘍組織で高い造影効果が得られるような腫瘍集積性の高いMRI造影剤を作製することを考えた。このような造影剤を作製することができれば、その造影剤はMRIを用いた方法での癌の診断、特に癌の早期診断に役立つことが期待される。
そのような腫瘍撮像用MRI造影剤として、本発明者は、ポリエチレングリコールとポリアミノ酸とのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を含む造影剤を用いることを考えた。しかし、この１本鎖ポリエチレングリコールとポリアミノ酸とのブロック共重合体を用いた造影剤は、腫瘍集積性が低く、造影が困難であった。
【００１５】
そこで本発明者はさらに検討を重ねた結果、分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子、例えば、２本鎖ポリエチレングリコールとカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸とのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子を腫瘍撮像用MRI造影剤として用いると、腫瘍撮像用MRI造影剤の血中安定性、血中滞留性および腫瘍集積性が高いことを見出し、本発明を完成させた。
【００１６】
本発明の好ましい態様として、２本鎖ポリエチレングリコールとカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸とのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子の模式図を図１に示す。図１に示すように、内殻は磁化率が高く、高い造影効果が期待できるマグネタイト粒子である。そして、外殻は、生態適合性の高いポリエチレングリコール（PEG）とポリアミノ酸とのブロック共重合体であり、この外殻のPEGとして２本鎖PEGを用いる。このように２本鎖PEGを用いることにより、造影剤の血中滞留性が高まり、さらには造影剤の腫瘍集積性を高めることができる。
【００１７】
＜ブロック共重合体＞
本発明の好ましい態様で用いるブロック共重合体は、分岐型非荷電性ポリマー部分とポリアニオン部分とを含む。「分岐型非荷電性ポリマー」は、枝分れした非荷電性ポリマーのことであり、例えば、２本鎖非荷電性ポリマーおよび３本鎖非荷電性ポリマー等を挙げることができる。「分岐型非荷電性ポリマー」は、好ましくは、２本鎖非荷電性ポリマーである。「非荷電性ポリマー」は、正電荷および負電荷を帯びないポリマーであり、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、アクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、およびポリオキサゾリン等を挙げることができる。「分岐型非荷電性ポリマー」は、より好ましくは、２本鎖ポリエチレングリコールである。
【００１８】
また、「ポリアニオン」としては、例えば、酸化鉄との親和性が高いカルボン酸を側鎖にもつポリマーを挙げることができる。「カルボン酸を側鎖にもつポリマー」としては、カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸、ポリリンゴ酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸等を挙げることができる。ここで、「カルボン酸を側鎖にもつ」とは、ポリマーを構成する繰り返し単位が、カルボキシル基をその側鎖に有することを言う。
【００１９】
本発明のさらに好ましい態様においては、ブロック共重合体は、２本鎖ポリエチレングリコール部分とカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸部分とを含む。この時、２本鎖ポリエチレングリコール部分は、分岐型非荷電性ポリマー部分であり、一方、ポリアミノ酸部分はポリアニオン部分である。ここで、「２本鎖ポリエチレングリコール（２本鎖PEG）」とは、枝分れした２本のPEG鎖のことを意味する（以下、「PEGasus」という。）。
【００２０】
上記のようにポリアミノ酸がカルボン酸を側鎖にもつものであれば、ブロック共重合体中のポリアミノ酸部分が、マグネタイトと比較的強い多点結合を形成することができ、造影剤の血中安定性をより一層高めることができる。そして、造影剤の血中安定性を高めることにより、造影剤の腫瘍集積性をさらに高めることができる。ここで、「カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸」とは、ポリアミノ酸のアミノ酸残基が、カルボキシル基をその側鎖に有するポリアミノ酸のことを言う。
【００２１】
カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸としては、例えば、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、およびグルタミン酸残基とアスパラギン酸残基の両方を含むポリマーを挙げることができる。中でも、本発明では、ポリアミノ酸はポリアスパラギン酸であることが好ましい。
【００２２】
さらに、本発明では、ブロック共重合体として、下記一般式（１）で示されるものを例示することができる。
【００２３】
【化３】
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（式中、mは５〜２００００の整数を表し、nは２〜５０００の整数を表す。）
【００２４】
本発明では、上記式中、mは５〜２００００の整数であり、２０〜５０００であることが好ましく、１００〜５００であることがより好ましい。nは2〜５０００の整数であり、５〜２００であることが好ましく、１０〜３０であることがより好ましい。
【００２５】
＜ブロック共重合体の合成方法＞
本発明の造影剤に用いるブロック共重合体の合成方法は、特に限定されないが、例えば、分岐型非荷電性ポリマー部分を予め合成しておき、合成した分岐型非荷電性ポリマー部分の末端に、ポリアニオンを構成するモノマー、例えば、カルボン酸を側鎖にもつアミノ酸残基を順に重合していく方法、あるいは、分岐型非荷電性ポリマー部分とポリアニオンの部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。分岐型非荷電性ポリマーおよびポリアニオンを合成する方法は、特に限定されず、常法に従って合成することができる。
【００２６】
分岐型非荷電性ポリマーであるPEGasusの合成方法を例に挙げると、アルゴン雰囲気下の反応容器中に、反応溶媒としてTHF(Tetrahydrofuran)、反応開始物質としてOH基１個だけに保護基をつけたグリセリンを加え、反応物質の２倍モル量のカリウムナフタレン溶液を加えて開始剤をメチル化し、開始剤を合成する。続けてエチレンオキサイド(EO)を液体窒素で冷却したシリンジを用いて加え、室温下で２日間撹拌し重合を行う。重合終了後、保護基を外す。
尚、分岐型非荷電性ポリマーは、市販のものを購入するようにしても良い。分岐型非荷電性ポリマーは、例えば、日本油脂株式会社等から入手することができる。
【００２７】
カルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸部分を合成する方法としては、カルボン酸を含むアスパラギン酸やグルタミン酸などのアミノ酸残基を用いてポリアミノ酸部分を合成する方法、あるいは、ポリアミノ酸部分を合成した後、必要に応じて側鎖がカルボン酸を含むように置換又は変換する方法を挙げることができる。
【００２８】
ブロック共重合体の合成方法における各種反応の方法及び条件は、常法を考慮し適宜選択又は設定することができる。
以下にPEGasusとポリアスパラギン酸(P[Asp])とのブロック共重合体の合成方法の一例を示す。
【００２９】
【化４】
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【００３０】
上記式中、mおよびnは前記と同様である。
【００３１】
上記方法の場合、まず、g-benzyl-L- aspartate (BLA)からFuchs- Farthing法（ホスゲン法）によりg-benzyl- L-aspartate N-carboxy-anhydride (BLA-NCA)を合成する。次に、片末端がアミノ基のPEGasus-NH2 (Mw=20000)を開始剤として、DMF（N,N-dimethylformamide）溶媒、あるいはジクロロメタン(CH2Cl2)との混合溶媒中でBLA-NCAの開環重合を行うことによりPEGasus-b-PBLAを合成する。このPEGasus-b-PBLAの側鎖のベンジル基をアルカリ加水分解することで脱保護し、目的とするPEGasus-b-P[Asp]ブロック共重合体を合成する。
【００３２】
＜マグネタイト粒子＞
本発明の造影剤に用いるマグネタイト粒子は、化学式Fe3O4で示される磁性酸化鉄の粒子である。マグネタイト粒子は磁化率が高いため、マグネタイト粒子をMRI造影剤に用いることで、高い造影効果が期待できる。
【００３３】
マグネタイト粒子の粒径は、１〜２００nmの範囲であり、２〜５０nmであることが好ましく、より好ましくは５〜１０nmである。
【００３４】
マグネタイト粒子は、常法に従って製造することができる。具体的には、塩化第１鉄(II
)(FeCl2)と塩化第２鉄(III)（FeCl3）を１：２の比率で混ぜた混合水溶液中に、アンモニア水あるいは水酸化ナトリウム溶液を静かにゆっくりと滴下することで、マグネタイト粒子を作製することができる。
【００３５】
本発明の好ましい態様では、マグネタイト粒子は、前述のブロック共重合体で表面修飾される。「表面修飾」とは、マグネタイト粒子の表面がブロック共重合体で覆われることを意味する。また、本発明の好ましい態様においては、ブロック共重合体とマグネタイト粒子とは、１つのマグネタイト粒子の周りを複数のブロック共重合体が覆うことでミセル状構造体を形成する。ミセル状構造体は、図１に示すように内殻部分がマグネタイト粒子であり、外殻部分がブロック共重合体である。さらに、マグネタイト粒子は、ブロック共重合体の負電荷を帯びたポリアミノ酸部分と多点結合を形成しており、一方、ブロック共重合体の電荷を帯びない２本鎖PEG部分は、マグネタイト粒子とは反対側、すなわち外側に向かって広がっている。
ブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子は、例えば、適量のブロック共重合体を適当なbufferに溶解させ、これに適量のマグネタイト粒子水溶液を加えることにより作製することができる。必要に応じて、マグネタイト粒子水溶液を加えた後に、これらの混合液に超音波をかけ、余分なマグネタイト微粒子を凝集させて沈殿させることもできる。さらに、超音波をかけた後に、上澄みを回収し、限外ろ過を行うことによりミセルを形成していないブロック共重合体を除去することができる。
【００３６】
＜腫瘍撮像用MRI造影剤＞
腫瘍撮像用MRI造影剤は、MRIでの撮像時に、腫瘍の検出および腫瘍の進展範囲の明確化などを可能にし、腫瘍の診断能の向上に寄与する医薬組成物である。
腫瘍には、非新生生物性の膨張と、真性腫瘍とが含まれる。さらに、真性腫瘍には、良性腫瘍と悪性腫瘍とが含まれる。悪性腫瘍としては、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型T細胞白血病、悪性リンパ腫）、等またはこれらの組合せがあげられる。上記癌は、原発巣であっても、転移したものであってもよい。本発明の好ましい態様によれば、造影剤は、肝臓癌、大腸癌および膵臓癌から選ばれる少なくとも１つの診断に利用することができ、特に膵臓癌の診断のために有用である。
【００３７】
本発明の造影剤は、MRIを用いた方法により腫瘍の診断をすることが求められている哺乳動物に投与することができる。投与の対象となる哺乳動物としては、例えばヒトのほか、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
【００３８】
本発明の造影剤の投与形態は、経口および非経口投与のいずれでも可能である。経口投与の場合は、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤もしくはシロップ剤等による投与が可能である。非経口投与の場合は、注射剤、座剤もしくは点眼剤等、経肺剤型(例えばネフライザーなどを用いたもの)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型(例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。注射剤型の場合は、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与することができる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの医薬上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。
【００３９】
賦形剤としては、例えば、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。
滑沢剤（コーティング剤）としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のフェエノール類が挙げられ、さらに、チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート80、ステアリン酸ポリオキシル40、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。
【００４０】
上記添加物等は、本発明の造影剤の剤形に応じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。
【００４１】
本発明の造影剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なる。投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択する。有効投与量は、一回につき体重1kgあたり０．１〜５００mg、好ましくは１〜２０mgである。但し、本発明の造影剤の投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。
【００４２】
造影剤を投与することにより、MRIでの撮像時に腫瘍部は黒く造影される。本発明においては、造影剤の投与に際してTGFβ阻害剤などの因子を併用することも可能である。併用時期は、造影剤の投与の前後を問わず、また造影剤の投与中であってもよい。
【００４３】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、前述の分岐型非荷電性ポリマーとポリアニオンとのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子、例えば、２本鎖ポリエチレングリコールとカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸とのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子は、上記腫瘍撮像用MRI造影剤の製造のために使用される。
【実施例】
【００４４】
１．  PEGasus-P[Asp]ブロック共重合体の合成
１．１  PEGasus-NH2の精製
購入したPEGasus-NH2(15.0g)（日本油脂）には5%程度のPEGasus-OHが含まれているため、これを分離する必要があった。そこで、以下のようにしてPEGasus-NH2の精製を行った。
イオン交換ゲル（CM-Sephadex C-50）を充填したカラムを用いて、イオン交換クロマトグラフィーにより購入品から、PEGasus-OHとPEGasus-NH2とを分離した。その後、分離したPEGasus-NH2溶液を減圧留去、凍結乾燥してPEGasus-NH2を回収した。精製の確認は、HPLC（High performance liquid chromatography）測定により行った。
その結果、精製後のPEGasus-NH2は、PEGasus-NH2の割合がほぼ100%であることがわかった。
【００４５】
１．２  BLA-NCAの合成
高分子量のポリアミノ酸（poly(a-amino acid)）を合成する方法として、本実施例では、アミノ酸（a-amino acid）からN-carboxy anhydride (NCA)を合成し、このNCAの開環重合によりpoly(a-amino acid)を合成する方法を用いた。この方法は比較的簡便に行うことができる。そこで、まずBLA（g-benzyl-L-aspartate）からBLA-NCA（g-benzyl- L-aspartate N-carboxy-anhydride）の合成を行うことにした。
BLA-NCAの合成方法として、比較的簡便に高純度のNCAを合成できるFuchs-Farthing法(ホスゲン法)を用いることにした。ホスゲン法によるBLA-NCAの合成方法の反応式を下記に示す。
【００４６】
【化５】
2008280277.tif 000006
【００４７】
この反応では、BLAのアミノ基に対して、ホスゲン（phosgene）のC＝Oによる求電子攻撃が行われ、さらに、反応が進むことによって、BLA-NCAが合成される。
【００４８】
上記反応式に示したように、この合成反応では、HClが生じるが、生じたHClがBLAのアミノ基と反応するとBLAが塩酸塩となってしまい、BLA-NCAの合成が阻害される場合がある。このため、BLA-NCAへの合成反応を速やかに進めるために、通常はエーテル、リン酸エステル及びニトリル等を反応系へ添加することでO原子あるいはN原子の不対電子にH+を引き付けさせ、平衡を塩酸塩からアミノ基側へ移動させることが行われている。このため、本実施例でも反応溶媒としてtetrahydrofuran(THF)を用いることにした。また、反応溶媒を加熱還流することでHClを系外に追い出すこともBLA-NCA合成を速やかに進めるのに効果的であるため、合わせて加熱還流を行った。
【００４９】
ここで、phosgeneは毒性を持っており取り扱いには十分な注意が必要である。そのため、本実施例では、トリホスゲン（triphosgene）を用いた。triphosgeneは固体(融点：80oC)で揮発性が低く、また分量も量りやすいために比較的取り扱いやすい。triphosgene自体は熱で分解し、三倍量のphosgeneとなる（上記反応式参照）。
【００５０】
得られたBLA-NCAは非常に反応性に富んでおり、熱や湿気によって容易にCO2を放出して開環し、他のBLA-NCAと反応して重合を開始してしまうため、本実施例ではBLA-NCAの合成中の雰囲気をArとした。
【００５１】
以下により具体的な反応操作を記す。
まず、BLA(2.50g)を一晩減圧乾燥した後、乾燥したBLAをAr雰囲気下で200mlのTHFに懸濁させた。一方、BLAに対して1.3倍当量のphosgeneに相当するtriphosgene(1.35g)を1時間減圧乾燥した後、Ar雰囲気下で50mlのTHFに溶解させた。次に、BLA懸濁液にtriphosgene溶液を加え、この混合溶液に対し50oCに保たれたオイルバス中で加熱還流を行いながら両者を反応させた。溶液が白濁から透明に変わってから更に一時間還流を続けた後、反応溶液をBLA-NCAの貧溶媒であるn-hexane 750ml中に滴下し、-20oCで一晩静置することで再結晶化を行った。
沈殿物の生成を確認後、上澄み液を除去し、白色の沈殿を減圧乾燥した。次に、70mlのTHFを加えることでこれを溶解させ、透明な溶液を得た。この溶液をNCAの良溶媒であるTHFと貧溶媒であるn-hexaneを用いて再結晶を繰り返すことで、BLA-NCAを回収した。各BLA-NCAは示差走査熱量計(DSC)を用いて融点測定を行うことで、純度及び精製の確認を行った。
その結果、最終的に得られたBLA-NCAの純度は、１００％であった。
【００５２】
１．３  PEGasus-b-P[Asp] ブロック共重合体の合成
１．３．１  PEGasus-b-PBLAの合成
BLA-NCAは、第1〜3級アミン等のプロトン性求核試剤を開始剤として加えて、室温〜50oCで反応させるとCO2を放出して容易に重合することが知られている。第1級アミンを開始剤として用いた場合には、重合が進み主鎖が長くなるに連れて末端アミノ基の塩基性が低下し、それにより徐々に重合反応が進みにくくなってしまう場合がある。このため、第1級アミンは、重合度が10〜100程度のpoly(a-amino acid)の合成を行う場合の開始剤としてよく用いられている。
ここで、PEGasus-b-PBLAの合成法の一例を示す。
【００５３】
【化６】
2008280277.tif 000007
【００５４】
この反応では、PEGasus-NH2のアミノ基が、BLA-NCAの5-CO基に親核付加することで重合反応が始まり、次いで熱によりCO2を放出して末端に新たなアミノ基を生じる。この末端アミノ基が更に他のBLA-NCAと反応することでリビング的に重合反応が進行する。
尚、重合溶媒としてポリアミノ酸のランダム溶媒であるN,N-dimethylformamide(DMF)を用いた場合、分子量分布は狭いポリマーは得られるが、高分子量のポリマーが得られにくくなる場合がある。しかし、高分子量のポリマーが得られにくくなるといっても、重合度80程度であればほとんど問題とはならない。また、DMFには、ポリマーの回収を簡便に行えるという利点もある。
【００５５】
以下により具体的な反応操作を示す。
まず、所定の組成のPEGasus-b-PBLAが得られるように、１ｇのPEGasus-NH2及び２５０mgのBLA-NCAを量り取った。PEGasus-NH2をベンゼン凍結乾燥した後に、またBLA-NCAを減圧乾燥した後に、PEGasus-NH2とBLA-NCAをいずれもAr雰囲気下においた。さらに、PEGasus-NH2を0.1g/mlとなるようにDMFに加えてDMFに溶解させ、またBLA-NCAを溶解させるのに必要最小限のDMFを加えてDMFに溶解させた。次に、両者を混合し40oCの恒温槽中で攪拌しながら２日間反応させた。その後、エーテル再沈、吸引ろ過およびベンゼン凍結乾燥を経て、PEGasus-b-PBLAを回収した。得られたPEGasus-b-PBLAの構造解析は、1H-NMR及びGPC測定により行った。
【００５６】
１．３．２  PEGasus-b-PBLAの脱保護
得られたPEGasus-b-PBLAに、過剰量の1M NaOHを加え1時間攪拌することで、保護基であるベンジル基のアルカリ加水分解を行った。その後、蒸留水中で透析(MWCO:3000)を２日間で計４回行い、凍結乾燥してPEGasus-b-P[Asp] ブロック共重合体を回収した。脱保護の確認は、1H-NMR測定と水系GPCにより行った。分析の例として、図３にPEGasus- PAsp (20-19)をGPCにより分析した結果を示す。尚、下記式は、得られたPEGasus-b-P[Asp]ブロック共重合体の構造式であり、ここではPEGasus-b-P[Asp]ブロック共重合体はナトリウム塩を形成している。
【００５７】
【化７】
2008280277.tif 000008
【００５８】
このようにして、重合度の異なる２種類のPEGasus-b-P[Asp] ブロック共重合体を合成した。すなわち、合成したブロック共重合体は、２本鎖PEG部分の分子量が10000でP[Asp]部分の重合度が30のものと（PEGasus-PAsp(10-30)）、２本鎖PEG部分の分子量が20000でP[Asp]部分の重合度が19のもの(PEGasus-PAsp(20-19))である。
【００５９】
２．  ブロック共重合体修飾マグネタイト粒子の作製
先ず、次のようにしてマグネタイト粒子を作製した。塩化第１鉄(II)(FeCl2)と塩化第２鉄(III)（FeCl3）を１：２の比率で混ぜた混合水溶液中にアンモニア水あるいは水酸化ナトリウム溶液を静かにゆっくりと滴下し、マグネタイト粒子を作製した。
次に、ブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子（以下、ブロック共重合体修飾マグネタイト粒子と称する）は、前記のPEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)の水溶液をそれぞれ作製し、その水溶液中にマグネタイトを加えることで作製した。
具体的には、次のようにしてブロック共重合体修飾マグネタイト粒子を作製した。ブロック共重合体を適量のtris buffer(10mM,pH7.4)に溶解させた。([-COOH]/[Fe])が0.2になるようにマグネタイト微粒子水溶液を加えた。その後、混合溶液を超音波に5分かけることで、余分なマグネタイト微粒子を凝集させ沈殿させた。上澄みを回収し、限外ろ過(MWCO:30000,2000rpm,20分)を5回行うことによりミセルを形成していないポリマーを除去した。
【００６０】
３．  ブロック共重合体修飾マグネタイト粒子の物性評価
３．１  生理条件化における安定性評価
動的光散乱(DLS: Dynamic Light Scattering)光度計を用いて、前記ブロック共重合体修飾マグネタイト粒子（PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子）の粒径を測定した。
PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子との比較のために、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）についてもDLS光度計を用いて粒径の測定を行った。
PEG-PAsp(12-8)は、分子量12000の１本鎖PEGと重合度8のPAspとのブロック共重合体であり、PEG-PAsp(12-38)は、分子量12000の１本鎖PEGと重合度38のPAspとのブロック共重合体である。そして、PEG-PAsp (12-8)修飾マグネタイト粒子とは、PEG-PAsp (12-8)で表面修飾したマグネタイト粒子のことであり、PEG-PAsp (12-38)修飾マグネタイト粒子とは、PEG-PAsp (12-38)で表面修飾したマグネタイト粒子のことである。PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子は、常法に従い調製した（M. Kumagai, et al., Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 56 (2007) 174？181）。
Resovist（登録商標）およびFeridex（登録商標）は、いずれも、デキストラン(Dextran)で覆われた磁性酸化鉄微粒子を含む造影剤であり、それぞれ、日本シェーリング株式会社および栄研科学株式会社から市販されている。
【００６１】
PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径の測定結果を下記表１に示す。
【００６２】
【表１】
2008280277.tif 000009
【００６３】
次に、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径の生理条件下での安定性評価を行った。安定性評価で用いた、Fe濃度、測定時間、生理条件および散乱強度は、次の通りである。
Fe濃度：2mM Fe
測定時間：24時間
生理条件：10mM Tris-HCl(pH 7.4), 150mM NaCl, 10% FBS at 37℃
散乱強度：10%FBSのみのときの5-10倍
【００６４】
図４は、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径の安定性評価の結果を示すグラフである。
図４から分かるように、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子とPEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子はいずれも粒径が24時間ほぼ一定に保たれ粒径が安定していた。このことから、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子は、生理条件での安定性が非常に高いことが分かる。また、PEGasus-PAsp修飾マグネタイト粒子は、Asp鎖長が長いほうが粒径は少し小さく、粒径の時間変化もより小さいという特徴があった。
【００６５】
一方、Negative controlであるResovist（登録商標）とFeridex（登録商標）では、Resovist（登録商標）はある時間を越えると急激に粒径が大きくなることが分かった。これは、Resovist（登録商標）は図５に示すようにDextranがOH基を介して酸化鉄微粒子と多点結合しているが、生理条件ではNaClが入ったために徐々に結合が置き換わり、最終的にDextranが酸化鉄微粒子から離れ、酸化鉄微粒子が凝集したものと考えられる。Feridex（登録商標）もResovist（登録商標）ほど粒径に変化は見えなかったものの、24時間後には沈殿物が観察された。
【００６６】
３．２  Na塩に対する安定性評価
次に、過剰なNa塩に対してもPEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子が粒径をほとんど変化させることなく粒径の安定性が高いかどうかを調べることにした。過剰なNa塩に対しても粒径の安定性が高いことが分かれば、PEG-PAspがマグネタイト粒子と選択的に結合している証左にもなり得ると考えた。
そこで、0.25-3M NaClの濃度範囲とし、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）を24時間、37℃でインキュベートした後、それぞれの粒径を測定した。粒径の測定結果を図６−１および図６−２に示す。
【００６７】
図６−１および図６−２を見て分かるように、基本的に、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、ならびにPEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子は、Asp鎖長やPEG分子量に関係なく粒径変化がほとんどなかった。このことから、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子は、Na塩に対して粒径の安定性が高いことが分かる。
【００６８】
これとは対照的に、Resovist（登録商標）やFeridex（登録商標）はNa塩に対して粒径の安定性が低く、凝集傾向にあることが分かった。つまり、カルボン酸を持たないDextranのようなものでマグネタイト粒子を表面修飾した場合、図５に示すようにDextranがOH基を介してマグネタイト粒子と多点結合しているが、OH基とFeの結合力が弱くマグネタイト粒子表面からdextranなどが外れやすくなっている可能性が高い。
【００６９】
４．  MRI撮像
４．１  マウスモデル
BALB/c ヌードマウス (雌, 6週齢)にBxPc3（ヒト膵臓癌） (1 x 107 cells) を皮下移植し、3-4週間経過した後、そのマウスをMRI撮像のために使用した。MRI撮像中は、レシピレーターを使って定常的にイソフルランでマウスに麻酔をかけた。
【００７０】
４．２  造影剤投与およびMRI撮像プロトコル
ある群のマウスに0.1mg/kgの用量でTGF-(阻害剤を腹腔内投与した。その後、24時間後に5.5mg Fe/kgの造影剤を投与した。一方、別の群のマウスには、TGF-(阻害剤を投与せずに5.5mg Fe/kgの造影剤を投与した。投与した造影剤は、PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、ならびにResovist（登録商標）のいずれかである。
そして、造影剤を投与したマウスを用いて、次のプロトコルでT2強調画像の撮像を行った。用いたMRI装置は、Varian社の4.7Tである。
Spin-echo method
TR: 3000ms TE: 60ms
Slice Thickness: 2mm
FOV: 40mm ( 40mm
Matrix: 128  ( 128
【００７１】
図７に、MRI画像の例を示す。図７はTGF-β阻害剤とともに造影剤としてPEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子を投与したマウスの腫瘍の画像である。図７から、PEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子を投与することで、高いコントラストで腫瘍を撮像することができることが示された。
【００７２】
４．３  病理標本
次に、マウスに造影剤を投与してから４時間後にマウスを犠牲死させ、マウスから腫瘍や肝臓などの臓器を取り出し、ホルマリンで固定した。その後、取り出した腫瘍および臓器をホルマリンで樹脂固定してからミクロトームで切り出し、さらに鉄染色を施した。
図８−１および図８−２に、作成した病理標本の例を示す。図８−１は、鉄染色した腫瘍の病理標本であり、図８−２は、鉄染色した肝臓の病理標本である。
【００７３】
図８−１を見ると、造影剤としてPEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子を投与したマウスでは、腫瘍に鉄が多く集積していることが分かる。このことから、PEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子は、腫瘍集積性が高いことが示された。
【００７４】
さらに、図８−２を見ると、PEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子は、肝実質細胞への取り込みがほとんど確認されず、Kupffer細胞へ取り込まれていることが分かる（図８−２（a）および(b)）。一方、PEG-PAsp(12-38) 修飾マグネタイト粒子は、Kupffer細胞だけでなく類洞にも吸着している様子が伺える（図８−２（ｃ））。このようにPEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子は肝臓への取り込みが少ないことから、PEGasus-PAsp (20-19)修飾マグネタイト粒子はPEG-PAsp(12-38) 修飾マグネタイト粒子と比較して血中滞留性が高いと言うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の好ましい態様の造影剤に用いる、２本鎖ポリエチレングリコールとカルボン酸を側鎖にもつポリアミノ酸とのブロック共重合体で表面修飾したマグネタイト粒子の模式図である。
【図２】国立がんセンター中央病院における膵臓癌患者の病期別５年生存率のグラフである(1990年-2002年)。
【図３】製造したPEGasus-Asp(20-19)ブロック共重合体をGPCにより測定した結果である。UV（220nm）では、Aspのカルボンキシル基を検出している。
【図４】PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径の安定性評価の結果を示すグラフである。
【図５】Feridex（登録商標）におけるマグネタイト微粒子表面とDextran(重量平均分子量:9400, 95% linear, 鎖長:22nm)の相互作用を示す模式図である。Dextran層: 3.3nm、1 crystalあたり10Dextran。（C.W.Jung, Magnetic Resonance Imaging, 13(5), pp.675-691 (1995)）
【図６−１】PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径のNa塩に対する安定性評価の結果を示すグラフである。
【図６−２】PEGasus-PAsp(10-30)および(20-19)修飾マグネタイト粒子、PEG-PAsp (12-8)および(12-38)修飾マグネタイト粒子、Resovist（登録商標）ならびにFeridex（登録商標）の粒径のNa塩に対する安定性評価の結果を示すグラフである。
【図７】腫瘍を撮像したMRI画像の例である。
【図８−１】鉄染色した腫瘍の病理標本の例である。
【図８−２】鉄染色した肝臓の病理標本の例である。
【図１】
2008280277.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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