(57)【要約】【課題】被検化合物のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に対する結合性を簡便かつハイスループットに評価する技術を提供する。【解決手段】所望のＧＰＣＲのＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオジピリジンを添加してなる組成物が、被検物質のＧＰＣＲに対する結合性評価に好ましく用いられる。当該組成物においては、シャペロニンリングの脱リング化により、格納されていたＧＰＣＲが露出している。当該組成物に被検化合物を添加して前記融合タンパク質内のＧＰＣＲに被検物質を接触させる工程を含むＧＰＣＲに対する結合性評価方法も提供される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価するために用いられる組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオジピリジンを添加してなるＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物。
【請求項２】
前記基本溶液は、さらに界面活性剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記基本溶液は、さらに脂質二重膜を含む請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなる請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質共役型受容体のＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されている請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物に被検化合物を添加して前記融合タンパク質内のＧタンパク質共役型受容体に被検物質を接触させる工程を含むＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物および結合性評価方法に関し、さらに詳細には、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体と所望のＧタンパク質共役型受容体との融合蛋白質を含むＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物、および当該組成物を用いるＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞表面上の膜受容体タンパク質は、細胞外の情報を細胞内へ伝達する極めて重要な働きをしている。そのため、膜受容タンパク質に結合する物質はアゴニスト型医薬品やアンタゴニスト型医薬として候補物質となり、受容体タンパク質と被検化合物との結合性を解析することは、医薬品開発において極めて重要である。膜受容体タンパク質の中でも特にＧタンパク質共役型受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ。以下、「ＧＰＣＲ」と略記することがある。）は、現在市販されている低分子医薬品の約半数がこの受容体を標的としているため、医薬品開発において極めて注目を集めている。また、ＧＰＣＲの約半数が、生体内で機能しているナチュラルリガンドが同定されていないオーファンＧＰＣＲであり、ナチュラルリガンドやその類縁化合物が新規医薬品の候補物質として期待されていることから、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングが熾烈を極めている。
【０００３】
ＧＰＣＲは細胞膜を貫通して存在する受容体の１つであり、細胞膜を７回貫通し、そのＮ末端を細胞外に、Ｃ末端を細胞内に向けて存在している。ＧＰＣＲは細胞外からリガンドの刺激を受け取り、細胞内のＧタンパク質を活性化する機能を有する。Ｇタンパク質は、α、β、γの３種のサブユニットからなる３量体タンパク質であり、ＧＰＣＲからの刺激を受け取ると、αサブユニットに結合していたＧＤＰ（グアノシン５’二リン酸）がＧＴＰ（グアノシン５’三リン酸）に置換され（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）、さらにαサブユニットがβ、γサブユニットから遊離する。遊離したＧタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ結合体は、セカンドメッセンジャーを制御する細胞内の効果器を活性化すると共に、自分自身のＧＴＰａｓｅ活性によりＧＴＰを加水分解し、αサブユニット−ＧＤＰ結合体となり、再びβγサブユニットと会合し不活性型となる。
【０００４】
Ｇタンパク質αサブユニットは、そのＧタンパク質の標的分子の種類によってＧｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇ１２の４つのファミリーに分類されている。さらに、各ファミリーはメンバーに細分類されている。例えば、Ｇｉファミリーはαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZの各メンバーに、Ｇ１２ファミリーはα12、α13の各メンバーに細分類されている。
【０００５】
ＧＰＣＲをターゲットとするリガンドのスクリーニングは、リガンドの候補となる被検化合物と所望のＧＰＣＲとの結合性を評価し、特異的に結合したものを選抜することにより行なわれる。結合性の評価方法は、大きく分けて、生きた動物細胞を用いる方法と、細胞膜画分を用いるインビトロの方法の２種類がある。動物細胞を用いる方法は、ＣＨＯ細胞やＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞に目的とするＧＰＣＲ遺伝子を導入し、膜表面に発現させた細胞を用いてアッセイする方法である。すなわち、ＧＰＣＲにリガンドが結合した際に共役するＧタンパク質のシグナル伝達を介した細胞内カルシウム濃度変化やｃＡＭＰの濃度変化などのシグナル伝達を、蛍光プローブなどで検出する方法である。
【０００６】
細胞膜画分を用いるインビトロの方法は、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を検出する手段の違いによって、さらにいくつかに分類される。一つの例は、標識化したリガンド候補物質を用いる方法である。例えば、ＧＰＣＲを膜表面に発現させた昆虫細胞や動物細胞から調製した細胞膜画分を基板上に固定化させ、リガンドの結合を検出する方法が開発されている。具体例としては、アミノプロピルシランコートしたスライドガラス上にＧＰＣＲが発現した膜画分を固定化したＧＰＣＲチップが開発されている（非特許文献１）。これは、放射性標識したリガンド候補物質を用いてＧＰＣＲとリガンドの結合を検出するものである。
【０００７】
リガンド候補物質を標識化しない方法としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）を用いてＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合を検出する方法もある。
【０００８】
リガンド候補物質を標識化しない他の方法としては、ＧＰＣＲとリガンドとの結合を、Ｇタンパク質への活性化に基づいて検出する方法が提案されている。例えば、ＧＰＣＲのＣ末端にＧタンパク質αサブユニットを連結させた融合タンパク質を、昆虫細胞に発現させ、該昆虫細胞から細胞膜画分を調製する。次に、該細胞膜画分を試料とし、リガンド候補物質と細胞膜画分中のＧＰＣＲとの結合にともなうＧタンパク質αサブユニット上のＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応を、放射性標識したＧＴＰを用いることにより検出し、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰ連結体の形成を検出する方法が報告されている（非特許文献２）。
【０００９】
細胞膜画分を用いないインビトロの方法も提案されている。例えば、シャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を構築し、該ＧＰＣＲと被検化合物との結合性をＳＰＲ法で評価する方法が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−８５５４２号公報
【非特許文献１】ファング（Ｆａｎｇ）ら，ケムバイオケム（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ），２００２年，第３巻，ｐ．９８７−
【非特許文献２】武田ら，ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），２００４年，第１３５巻，ｐ．５９７−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、生きた動物細胞を用いる方法は、ＧＰＣＲの種類によっては動物細胞内で必要量が発現しないものが少なくなく、また、発現したとしても発現量を安定に制御することが困難という問題がある。また、ＧＰＣＲの種類によっては共役するＧタンパク質の種類が決まっているため、ＧＰＣＲ遺伝子だけでなく、対応するＧタンパク質の遺伝子を細胞内に導入し、細胞内でシグナル伝達系を再構築する必要がある。さらに、これらの細胞を培養し、目的のタンパク質群を発現させるためには、費用、時間などがかさみ、培養途中のコンタミネーションの防止など熟練した操作が要求される。
【００１１】
また、標識化したリガンド候補物質を用いる方法は、あらかじめリガンド候補の全てに対して、蛍光標識等をする必要があり、操作が煩雑である。また、ＧＰＣＲと非特異的に結合しているリガンド候補物質も検出してしまうため、リガンド候補物質に対して常に正しい評価ができるとは限らない。
【００１２】
また、ＳＰＲ法を用いる方法は、リガンド候補物質を標識せずにすむ利点はあるものの、やはり、ＧＰＣＲとリガンド候補物質との結合が特異的なものかどうかを判断することは困難である。これはシャペロニンとＧＰＣＲとの融合タンパク質を用いる方法でも同じである。
【００１３】
また、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット−ＧＴＰの複合体の形成を検出する方法は、放射性物質を使用するので特別な施設が必要であり、簡便でハイスループットな評価方法とは言えない。また、放射性標識の代わりに蛍光標識されたＧＴＰを使用することも考えられるが、感度を上げるためには高価な細胞膜画分を大量に必要とするため、やはりハイスループット性に欠ける。
以上より、より簡便且つハイスループットなＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する技術が求められている。
【００１４】
このような状況を鑑み、本発明者らは、所望のＧＰＣＲのＮ末端側に折り畳み因子が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質に被検化合物を接触させる工程を含むＧＰＣＲに対する結合性評価方法を開発し、すでに特許出願を行っている（特願２００６−１３１８８２号）。この方法によれば、従来の技術に比べてより簡便且つハイスループットなＧＰＣＲに対する結合性を評価することができる。
【００１５】
そして本願発明は、当該の方法を基礎としながら、より正確かつ高感度にＧＰＣＲに対する結合性を評価する技術を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、ネイティブ型のシャペロニンにＳＨ基修飾物質の１つである４，４’−ジチオジピリジンを作用させることにより、シャペロニンの四次構造形成を阻害し、脱リング化させることができるとの報告（ボチカレーワ（Ｂｏｃｈｋａｒｅｖａ）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，１９９９年，第２７４巻，ｐ．２０７５６−）に着目し、ＧＰＣＲに対する結合性評価に応用することを試みた。その結果、シャペロニンと所望のＧＰＣＲとの融合タンパク質にジチオジピリジンを作用させることによって、より正確かつ高感度にＧＰＣＲに対する結合性を評価できることを見出した。さらに、この報告では脱リング化に必須とされているヌクレオチドが、ＧＰＣＲに対する結合性評価を行う際には任意であることが分かった。上記した課題を解決するための本発明の要旨は以下のとおりである。
【００１７】
請求項１に記載の発明は、被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価するために用いられる組成物であって、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオジピリジンを添加してなるＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物である。
【００１８】
シャペロニンは分子シャペロンの一種であり、分子量約６万のサブユニット（シャペロニンサブユニット）からなる複合タンパク質ある。代表的なシャペロニンは、シャペロニンサブユニット７〜９個からなるリング状構造体が２個重なった、総分子量８０万〜１００万程度のシリンダー状の巨大な複合タンパク質である。そして、シャペロニンはその内部に他のタンパク質を格納し、正しく折り畳むことができる。そして、本発明は被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価するために用いられる組成物にかかるものであり、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオピリジンを添加してなるものである。
【００１９】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物（以下、「本発明の組成物」と略記することがある。）においては、ジチオジピリジンの作用によりシャペロニンの「脱リング化」が起こっており、シャペロニンのリング状構造体内部に格納されていたＧタンパク質共役型受容体が外部に露出している。その結果、被検化合物を添加した場合に、被検化合物とＧタンパク質共役型受容体とが接触する際のシャペロニンのリング状構造体による立体障害が少ない。したがって、本発明の組成物を用いると、被検化合物とＧタンパク質共役型受容体との接触効率がよく、より正確かつ高感度に被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することができる。さらに、本発明の組成物を用いれば、不溶性の細胞膜画分を用いる必要がないので、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価における操作性がよくなる。さらに、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質を生産することができるので、ＧＰＣＲを多量に取得することができ、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価をさらに効率的に行える。
【００２０】
ここで「脱リング化」とは、シャペロニンのリング構造が緩み、内部に格納された目的タンパク質がより露出された状態をなることを意味する。「脱リング化」の場合には「変性」とは異なり、露出された目的タンパク質が変性することなく外部に露出する。本発明の組成物においても、シャペロニンのリング状構造体を壊す際に尿素や塩酸グアニジンのようなタンパク質変性剤が添加されないので、露出されたＧタンパク質共役型受容体は正しく折り畳まれた状態で保持され、融合タンパク質中のＧタンパク質共役型受容体が可溶性タンパク質として存在できる。
【００２１】
ここで、「シャペロニンサブユニット」という語は、単独の分子である場合（単独のシャペロニンサブユニット）の他に、融合タンパク質の一部である場合にも用いる。また、「シャペロニンサブユニット連結体」とは、２個以上のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された人工タンパク質をいう。さらに、Ｎ個のシャペロニンサブユニットからなるシャペロニンサブユニット連結体を、「シャペロニンサブユニットＮ回連結体」と呼ぶこととする。つまり、本発明における融合タンパク質には、１個のシャペロニンサブユニットのＣ末端側とＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側とが連結された融合タンパク質と、２個以上のシャペロニンサブユニットがタンデムに連結された人工タンパク質のＣ末端側とＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側とが連結された融合タンパク質の両方が含まれる。
【００２２】
なお、天然型のシャペロニンにおける脱リング化にはヌクレオチドの存在が必須とされているが、本発明の組成物においてはヌクレオチドの存在は任意である。すなわち、本発明の組成物を用いれば、ヌクレオチドの非存在下でもＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することができる。
【００２３】
請求項２に記載の発明は、前記基本溶液は、さらに界面活性剤を含む請求項１に記載の組成物である。
【００２４】
本発明の組成物では基本溶液がさらに界面活性剤を含むので、露出したＧタンパク質共役型受容体がより安定化される。本発明の組成物を用いることにより、より確実にＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行うことができる。
【００２５】
請求項３に記載の発明は、前記基本溶液は、さらに脂質二重膜を含む請求項１又は２に記載の組成物である。
【００２６】
Ｇタンパク質共役型受容体は生体内においては脂質二重膜からなる細胞膜を貫通する形で存在している。そして、本発明の組成物においては、基本溶液がさらに脂質二重膜を含む。かかる構成により、露出したＧタンパク質共役型受容体が生体内と同様に脂質二重膜により保護され、Ｇタンパク質共役型受容体がより安定化される。本発明の組成物を用いることにより、より確実にＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価を行うことができる。脂質二重膜の例としては、人工的に作成したリン脂質二重膜が挙げられる。また、本発明で用いられる脂質二重膜の形態としては平面構造を有する二重膜の他、ベシクル化したリポソームなどが挙げられる。脂質二重膜を作製する際の具体的な成分としては、各種リン脂質やコレステロールなどのステロール類が挙げられる。
【００２７】
請求項４に記載の発明は、前記シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体は、大腸菌由来のシャペロニンサブユニットからなる請求項１〜３のいずれかに記載の組成物である。
【００２８】
大腸菌由来のシャペロニンはＧｒｏＥＬと呼ばれ、その生化学的・物理化学的性質がよく研究されている。また、そのサブユニットの遺伝子も単離されている。したがって、融合タンパク質をコードする融合遺伝子を容易に構築することができ、融合タンパク質の調製が容易である。その結果、本発明の組成物は、調製が容易である。
【００２９】
請求項５に記載の発明は、前記Ｇタンパク質共役型受容体のＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されている請求項１〜４のいずれかに記載の組成物である。
【００３０】
本発明の組成物においては、融合タンパク質中のＧタンパク質共役型受容体のＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されている。かかる構成により、被検化合物と融合タンパク質中のＧＰＣＲとの結合性を、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無をもって検出することができる。
【００３１】
請求項６に記載の発明は、被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価する方法であって、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物に被検化合物を添加して前記融合タンパク質内のＧタンパク質共役型受容体に被検物質を接触させる工程を含むＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法である。
【００３２】
本発明はＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法にかかり、本発明の組成物を使用する。すなわち、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法（以下、「本発明の評価方法」と略記することがある。）は、被検化合物を本発明の組成物に添加して融合タンパク質内のＧタンパク質共役型受容体に被検物質を接触させる工程を含む。本発明の評価方法においては、所望のＧタンパク質共役型受容体が、シャペロニンの脱リング化により露出し且つ正しく折り畳まれた状態で保持されているので、より正確かつ高感度に行うことができる。さらに、不溶性の細胞膜画分を使用する従来の方法に比べて操作性がよい。さらに、組換えＤＮＡ技術によって当該融合タンパク質を生産することができるので、ＧＰＣＲを多量に取得することができ、さらに効率的である。なお、本発明の評価方法においては、本発明の組成物を準備する段階を前処理段階と捉えることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物によれば、被検物質を添加するだけで、より正確かつ高感度に被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することができる。
【００３４】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法についても同様であり、より正確かつ高感度に被検化合物のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性を評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物（本発明の組成物）は、所望のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオジピリジンを添加してなるものである。
【００３６】
本発明の組成物の基本溶液に含まれる融合タンパク質は、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体（以下、「シャペロニンサブユニット連結体等」と略記することがある。）が連結されたものである。これは、換言すれば、「シャペロニンサブユニット−所望のＧＰＣＲ」或いは「シャペロニンサブユニット連結体−所望のＧＰＣＲ」の順で連結された融合タンパク質で、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体（シャペロニンサブユニット連結体等）側がＮ末端、ＧＰＣＲ側がＣ末端となるものである。ＧＰＣＲは疎水性が高いので単独では不溶性となるが、この融合タンパク質中のＧＰＣＲは、隣接するシャペロニンサブユニット連結体等の作用によって可溶性となる。より詳しくは、この融合タンパク質中のＧＰＣＲは、シャペロニンリング構造のキャビティー内に発現されることにより可溶性となる。この際、必要に応じて単独のシャペロニンサブユニットが補充されてリング構造が形成される。その結果、本発明の組成物を用いれば従来のように不溶性の細胞膜画分を使用することなく、可溶生蛋白質としてＧＰＣＲに対する結合性評価を行なうことができる。ＧＰＣＲの発現において、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体と融合発現させることにより、動物細胞や昆虫細胞を用いて単独発現させる場合と比べて大量発現させることが可能となる。
【００３７】
一般に、シャペロニンはグループ１型とグループ２型とに大別される。バクテリアや真核生物のオルガネラに存在するシャペロニンはグループ１型に分類され、いずれも分子量６０ｋＤａからなるシャペロニンサブユニット７つが環状に連なるリング構造を形成し、さらに２つのリングが２層構造を形成する、１４量体のホモオリゴマーを形成する。これらはコシャペロニンと称される分子量約１０ｋＤａのタンパク質の環状７量体を補因子とする。一方、グループ２型シャペロニンは、真核生物の細胞質や古細菌にみられ、通常８，９個のシャペロニンサブユニットからなるリングが２層に連なった１６〜１８量体のホモ、またはヘテロオリゴマーを形成している。本発明の組成物の基本溶液に含まれる融合タンパク質においては、シャペロニンサブユニット連結体等の由来となるシャペロニンはグループ１型及びグループ２型のいずれでもよい。ここで、１型シャペロニンの例として、大腸菌由来のシャペロニンであるＧｒｏＥＬのサブユニット（ＧｒｏＥＬサブユニット）の遺伝子の塩基配列と対応するアミノ酸配列を配列番号１に、対応するアミノ酸配列のみを配列番号２に示す。
【００３８】
バクテリア、古細菌由来のシャペロニンは、組換えＤＮＡ技術により、大腸菌の細胞質可溶性画分に大量生産させることがすでに可能である。さらに、そのようにして発現させた様々のシャペロニンサブユニットであっても、自己集合し、１４〜１８量体からなる２層リング構造のシャペロニン複合体を形成できることが、電子顕微鏡による観察でわかっている。
【００３９】
前記したシャペロニンサブユニットの数、すなわち、グループ１型シャペロニンの場合の７個、グループ２型シャペロニンの場合の８，９個は、リング状構造体を形成する際の最適数である。そして、シャペロニンサブユニット連結体においても、単独のシャペロニンサブユニットが補充されて最適数となり、天然型シャペロニンと同様にリング構造を構成することがわかっている。そして、シャペロニンサブユニット連結体のＣ末端側に目的タンパク質を連結させた融合タンパク質において、その目的タンパク質がシャペロニンのキャビティー内に格納された状態で発現できることがわかっている（古谷ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００５，１４，３４１）。本発明の組成物の基本溶液に含まれる融合タンパク質においても、ＧＰＣＲがシャペロニンのキャビティー内部に格納される。また、シャペロニンサブユニットＮ回連結体の連結数（Ｎ）は、前記の最適数であれば、単独のシャペロニンサブユニットの補充なしでリング状構造体を形成できる。しかし、組成物に被検物質を添加してＧＰＣＲに接触させる際に、脱リング化後の立体障害をより少なくする観点からは、Ｎの値はより小さい方がよいと考えられる。
【００４０】
上記のように、一般的なシャペロニンはリング状構造体が２個重なったダブルリング構造を有しているが、リング状構造体１つからなる「シングルリング」のシャペロニンも知られている。すなわち、近年、遺伝子工学的にアミノ酸変異を導入することにより、上述のような２層のリング構造を形成せず、シングルリングを形成するようなシャペロニンも得られるようになってきた。これらのシングルリングを形成するシャペロニンも、大腸菌の可溶性画分に大量発現することができ、ゲル濾過や電子顕微鏡及び画像解析等によって発現産物の大部分がシングルリングを構成していることが確認されている。そして、かかるシングルリングのシャペロニンでも他のタンパク質を収容できるキャビティーが充分に形成されることが確認されており、他のタンパク質の折り畳みを行うことができる（特開２００４−４３４４７号公報）。本発明の組成物においては、シングルリングを形成するシャペロニンも採用できる。この場合には、組成物に添加された被検化合物がＧＰＣＲに結合する際の立体的な障害がより少ない可能性がある。なお、真核生物のミトコンドリア由来のシャペロニン６０は、通常、シングルリングとして精製されるため、特別の遺伝子操作なしで得ることができる（Ｖｉｉｔａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，６９５−６９８）。
【００４１】
また、人為的にシングルリングを形成させる手段としては様々な方法があり、いずれの手段を用いてもかまわない。最も一般的に用いられている方法は、リング間の疎水的相互作用や塩橋に寄与するアミノ酸に変異を導入することによって、リング間相互作用を抑制する方法である。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬ（配列番号２）の場合、結晶構造解析より赤道ドメインの４つの荷電アミノ酸（Ｒ４５２、Ｅ４６１、Ｓ４６３、Ｖ４６４）がリング間の結合に強く寄与していていることが分かっている。そこで、４５２番目のアミノ酸残基（アルギニン）をグルタミン酸に、４６１（グルタミン酸）、４６３（セリン）、４６４番目（バリン）のアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、リング間相互作用が軽減し、シングルリングを構成することが分かっている（Ｗｅｉｓｓｍａｎｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｅｌｌ，８３，５７７−５８７）。
【００４２】
さらに、様々な組み合わせのキメラシャペロニンを作製することによって、シャペロニンとしての機能を保持した状態のシングルリングシャペロニンを得ることもできる。例えば、大腸菌由来のシャペロニンＧｒｏＥＬと根粒菌由来のシャペロニンとを用いてキメラシャペロニンを作製することによって、シングルリングシャペロニンを作製することができる（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８２，７８９−８００）。
【００４３】
上記の融合タンパク質を製造する方法としては、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体の遺伝子とＧＰＣＲ遺伝子とを連結した融合遺伝子を作製し、該融合遺伝子を転写・翻訳させる方法が代表的である。各ＧＰＣＲの遺伝子は米国Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＧＣ）などの遺伝資源保存機関で入手可能である。例えば、該融合遺伝子を発現ベクターに組み込み、該組換えベクターを適宜の宿主に導入して形質転換体を作製し、該形質転換体内で発現させる。このときに用いる宿主としては特に限定はなく、例えば、バクテリア、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等の細胞の他、動物個体、植物個体又は昆虫個体等も用いることができる。この中でも、培養コストが安価であり、培養日数が短く、培養操作が簡便な点から、バクテリア又は酵母が好ましく、特に、大腸菌が取り扱いの容易さの面でより好ましい。また、宿主として大腸菌を使用すると、シャペロニンとして大腸菌由来ＧｒｏＥＬを採用し、Ｎが最適数（ＧｒｏＥＬの場合は一般的に「７」）に満たないシャペロニンサブユニットＮ回連結体を発現させる場合でも、宿主由来のシャペロニンサブユニット（ＧｒｏＥＬサブユニット）が補充されてリング状構造体を形成することができる。
【００４４】
ただし、一般的に、大腸菌では１０ｋｂ以上の発現ベクター（プラスミド）を保有すると、プラスミドのコピー数が減少し、結果的に組換えタンパク質の生産量が低下することがある。シャペロニンサブユニットが８個連結したシャペロニンサブユニット８回連結体の場合、その遺伝子をプラスミドに組み込むと、プラスミドのサイズは１５ｋｂｐ以上になる。しかし、このサイズのプラスミドは、大腸菌内で安定に保持されない可能性がある。したがって、大腸菌を宿主として用いる場合は、プラスミドに導入する融合遺伝子の大きさ、すなわち、シャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体をコードする遺伝子の大きさ（連結数）やＧＰＣＲ遺伝子の大きさを考慮し、大腸菌内で安定に保持されるようサイズを選択すべきである。
【００４５】
また、大腸菌などの宿主で発現される融合タンパク質が巨大な場合は、転写されたｍＲＮＡの特定のリボヌクレアーゼによる分解、翻訳された融合タンパク質のプロテアーゼによる分解と、２段階の切断を受ける可能性がある。かかる場合には、例えば、ｍＲＮＡの分解に関与するリボヌクレアーゼをコードするＲＮａｓｅＥ遺伝子を欠損させた宿主を用いることでｍＲＮＡの分解を抑制することが可能である。また、翻訳後のプロテーゼによる分解を抑制するために、宿主細胞を１５〜２５℃の低温で培養したり、ｌｏｎ、ｏｍｐＴ等のプロテアーゼの構造遺伝子を欠損させた大腸菌を宿主として用いることができる。
【００４６】
また、シャペロニンサブユニット連結体の遺伝子には、シャペロニンサブユニット遺伝子が繰り返し含まれるため、それを含むプラスミドが不安定となり、特に宿主とシャペロニンの由来生物が同じであるときには、プラスミドＤＮＡとゲノムＤＮＡの相同組換えが起こる可能性がある。宿主として大腸菌を用いる場合は、遺伝子の相同組換えに関する遺伝子であるｒｅｃＡを欠損させた宿主を用いることで、プラスミドの安定性を向上させ、相同組換えを抑制することができる。
【００４７】
形質転換体内で融合タンパク質を発現させる方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、薬剤耐性遺伝子を有する発現ベクターを用いる場合は、対応の薬剤を含有する培地を用いて、形質転換体を培養することができる。このようにして、形質転換体内で融合タンパク質を発現させた後、該形質転換体を回収する。さらに回収した形質転換体を破砕して菌体抽出液を調製し、該菌体抽出液から融合タンパク質を精製する。
【００４８】
精製の手順としては、例えば、硫安塩析によって菌体抽出液中の融合タンパク質を沈殿させ、沈殿を回収した後、適当な緩衝液に溶解し、疎水クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィーによって融合タンパク質の存在するフラクションを回収する。これらを限外ろ過によって濃縮した後、濃縮液を５〜５０ｍＭ程度の塩化マグネシウム及び５０〜３００ｍＭ程度の塩化ナトリウム又は塩化カリウムが含有された緩衝液を展開液としてゲルろ過を行い、排除限界直後のピークを回収することによって融合タンパク質を精製することができる。
【００４９】
さらに高度な精製が必要な場合は、融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ異なる２種類のタグをペプチド結合を介して付加しておくことが好ましい。例えば、融合タンパク質のＮ末端に６〜１０個のヒスチジンが並んだヒスチジンタグを連結し、さらに、Ｃ末端に配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＦＬＡＧタグを連結する。この場合、精製のファーストステップとしてニッケル等の金属キレートカラムを用いれば、Ｎ末端にヒスチジンタグの付加されていないタンパク質は除去され、さらにセカンドステップとして抗ＦＬＡＧ抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィーによってＣ末端側にＦＬＡＧタッグの付加されていないタンパク質は除去される。したがって、Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれヒスチジンタグ及びＦＬＡＧタグが付加された融合タンパク質のみが精製されることになる。Ｎ末端及びＣ末端に付加されるタグとしてはヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ以外でもよく、他のタグとしては、例えば、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ等が挙げられる。
【００５０】
また、宿主を用いない方法として、バクテリア、真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（例えば、Ｓｐｉｒｉｎ，  Ａ．Ｓ．，  １９９１，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１，  ２６５６−２６６４：  Ｆａｌｃｏｎｅ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ２６５６−２６６４）でも、融合タンパク質を可溶性タンパク質として発現させることが可能である。
【００５１】
また、前記融合タンパク質においては、シャペロニンと所望のＧＰＣＲとが、リンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは２〜５０アミノ酸程度が好ましい。
【００５２】
本発明の組成物における基本溶液は上記の融合タンパク質を含むものである。当該基本溶液としては、例えば、生化学分野で一般的に用いられている緩衝液に上記の融合タンパク質溶解させたものが採用できる。本発明の組成物における融合タンパク質の濃度としては、例えば終濃度０．０２μＭ〜４μＭ程度であればよい。
【００５３】
本発明の組成物は、前記の基本溶液、すなわち所望のＧＰＣＲのＮ末端側にシャペロニンサブユニット又はシャペロニンサブユニット連結体が連結された融合タンパク質を含む基本溶液に、ジチオジピリジンを添加してなるものである。本発明の組成物においては、ジチオジピリジンの作用によってシャペロニンリングが「脱リング化」し、内部に格納されていたＧＰＣＲが外部に露出している。さらに、当該ＧＰＣＲは正しい立体構造を保った状態で露出しており、変性していない。本発明の組成物におけるジチオジピリジンの濃度としては、例えば終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭ程度であればよい。
【００５４】
基本溶液には、さらに界面活性剤が含まれていてもよい。界面活性剤の作用により、露出したＧタンパク質共役型受容体がより安定化される。界面活性剤の例としては、ＧＰＣＲやシャペロニンを不活性化させない程度の親水性部分／疎水性部分のバランスを有するものが好ましく、ＨＬＢ値が１２〜１６程度のものが好ましい。当該界面活性剤の例としては、Ｎ−ラウリルサルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤；塩化セチルピリジニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤；３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−〔（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、スルフォベタイン系界面活性剤（商品名：ＳＢ８、ＳＢ１０、ＳＢ１２、ＳＢ１４、ＳＢ１６など）等の両性界面活性剤；ポリオキシエチレンドデシルエーテル（商品名：Ｂｒｉｊ３５など）、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０など）、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン（商品名：Ｔｗｅｅｎ ２０など）、ポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン（商品名：Ｔｗｅｅｎ ８０など）、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体（商品名：Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８など）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（商品名：ＭＥＧＡ−８など）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（商品名：ＭＥＧＡ−９など）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（オクチルグルコシド）、６−Ｏ−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）メチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（商品名：ＨＥＣＡＭＥＧなど）、スクロースモノラウレート、ジギトニン等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。これらの界面活性剤については、１種のみを用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の組成物における界面活性剤の濃度としては、個々の界面活性剤の臨界ミセル濃度等にも依存するが、例えば終濃度０．０１％〜７％程度であればよい。
【００５５】
基本溶液には、さらに脂質二重膜が含まれていてもよい。当該脂質二重膜は、組換えＤＮＡ技術により発現させたシャペロニンサブユニット連結体等とＧＰＣＲとの融合タンパク質を、脱リング化と併せて脂質膜に埋め込まれる必要があるので、人工的に作成したリン脂質二重膜であることが好ましい。脂質二重膜の形態としては、平面構造を有する二重膜やベシクル化したリポソームが挙げられる。平面構造を有する脂質二重膜の一例としてＢｌａｃｋ  ｌｉｐｉｄ  ｆｉｌｍがある。Ｂｌａｃｋ  ｌｉｐｉｄ  ｆｉｌｍの一般的な作製方法としては、まず水槽をテフロン（登録商標）板などで２つの槽に仕切り、その側面に０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の小穴を開けておく。この小穴にデカンなどの有機溶媒に溶かしたリン脂質を塗りつけ、水溶液中に放置すると自然に薄くなり、最終的にリン脂質の２分子の厚さに相当する脂質二重膜が形成される。一方、リポソームの作製方法としては、例えばリン脂質成分とコレステロールを適宜有機溶剤に溶解させ、乾燥後、水に分散させる。その後、超音波処理により均一な粒径を持つリポソームを得ることができる。
【００５６】
脂質二重膜を作製する際の具体的な成分としては、各種リン脂質やコレステロールなどのステロール類が挙げられる。リン脂質の例としては、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dilauroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine、DLPC）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine、DMPC）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine、DPPC）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine、DSPC）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine、DOPC）などが挙げられる。
【００５７】
リン脂質の例としては、さらに、１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（1- Palmitoyl-2-Oleoyl-Phosphatydylethanolamine）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine、DMPE）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine、DPPE）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine、DOPE）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphate (Monosodium Salt)、DMPA）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphate (Monosodium Salt)、DPPA）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（１ナトリウム塩）（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphate (Monosodium Salt)、DOPA）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (Sodium Salt)、DMPG）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (Sodium Salt)、DPPG）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ナトリウム塩）（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1-glycerol)] (Sodium Salt)、DOPG）、などが挙げられる。
【００５８】
リン脂質の例としては、さらに、ホスファチジルセリン（Phosphatydyl-Serine）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] (Sodium Salt)、DMPS）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] (Sodium Salt)、DPPS）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（ナトリウム塩）（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-L-Serine] (Sodium Salt)、DOPS）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（グルタリル）（ナトリウム塩）（1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-(glutaryl) (Sodium Salt)）、１，１’，２，２’−テトラミリストイルカルディオリピン（アンモニウム塩）（1,1',2,2'-Tetramyristoyl Cardiolipin (Ammonium Salt)）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-2000] (Ammonium Salt)）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−５０００］（アンモニウム塩）（1,2-Dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy(Polyethylene glycol)-5000] (Ammonium Salt)）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（塩化物塩）（1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propane (Chloride Salt)、DOTAP）、などが挙げられる。これらのリン脂質については、１種のみを用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一方、ステロール類としてはコレステロールの他、コレステリル−ヘミサクシネートなどが好適に用いられる。本発明の組成物における脂質二重膜の濃度としては、例えば終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ程度であればよい。
【００５９】
基本溶液には、さらに他の成分が含まれていてもよい。例えば、ヌクレオチドは本発明の組成物に必須ではないが、ヌクレオチドを含めると、より速くシャペロニンの脱リング化が進む。ヌクレオチドの例としては、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ−ＰＮＰ、ＡＴＰγＳ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ等が挙げられる。これらのヌクレオチドについては、１種のみを用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。本発明の組成物におけるヌクレオチドの濃度としては、例えば終濃度０．１ｍＭ〜５ｍＭ程度であればよい。
【００６０】
基本溶液に含まれる融合タンパク質においては、Ｇタンパク質共役型受容体のＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されていてもよい。すなわち、融合タンパク質として、所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット連結体等が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結されたものを採用することができる。当該融合タンパク質は、換言すれば、「シャペロニンサブユニット連結体等−所望のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質αサブユニット」の順で連結された融合タンパク質で、シャペロニンサブユニット連結体等側がＮ末端、Ｇタンパク質αサブユニット側がＣ末端となるものである。この際、所望のＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとがリンカーとなるオリゴペプチドを介して連結されていてもよい。該オリゴペプチドの長さは１〜２５アミノ酸程度が好ましい。
【００６１】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法（本発明の評価方法）は、本発明の組成物に被検化合物を添加して前記融合タンパク質内のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に被検物質を接触させる工程を含むものである。本発明の評価方法では、被検物質を添加すべき本発明の組成物内においてシャペロニンリングの脱リング化により所望のＧＰＣＲが正しい立体構造を保った状態で露出している。その結果、被検物質と当該ＧＰＣＲとの結合性評価をより正確かつ高感度に行うことができる。
【００６２】
本発明の評価方法は、融合タンパク質内のＧＰＣＲに被検物質を接触させる工程を含む。その後、被検物質とＧＰＣＲとの結合性、具体的には被検物質と当該ＧＰＣＲとの結合の有無や結合の度合い等を適宜の方法で検出すればよい。被検物質とＧＰＣＲとの結合性の検出については、例えば、ＧＰＣＲにおけるＧＴＰ−ＧＤＰ交換反応を利用して行うことができる。この例につき、以下に具体的な手順を挙げる。この方法は、特願２００６−１３１８８２号明細書に記載の方法を基本とするものである。
【００６３】
まず前段階として、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物を調製する。具体的には、「所望のＧタンパク質共役型受容体のＮ末端側にシャペロニンサブユニット連結体等が連結され且つＣ末端側にＧタンパク質αサブユニットが連結された融合タンパク質」を適宜の緩衝液等に溶解し、さらにＧＴＰ又はＧＴＰアナログ並びにＧＤＰを加えて基本溶液を調製する。この基本溶液にジチオジピリジンを添加し、Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物を調製する。このとき、当該組成物中では、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとは結合せず、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログが遊離状態で存在する。一方ＧＤＰは、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合している。
【００６４】
次に、調製した組成物に被検化合物を添加し、上記融合タンパク質内のＧＰＣＲに被検物質を接触させる。このとき、被検化合物が目的のリガンドであれば、該被検化合物が融合タンパク質中のＧＰＣＲに結合し、該ＧＰＣＲに構造変化が起こる。その結果、融合タンパク質中のＧタンパク質αサブユニットに結合していたＧＤＰが、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログと置き換わる（ＧＤＰ−ＧＴＰ交換反応）。一方、被検化合物が目的のリガンドでない場合はＧＰＣＲに結合しないので、ＧＴＰ又はＧＴＰアナログはＧＰＣＲに結合しない。
【００６５】
続いて、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログの量を測定し、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。換言すれば、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログと、遊離状態のＧＴＰ又はＧＴＰアナログとを区別し、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する。そして、この測定結果をもってＧタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合の有無を検出する。この際、Ｇタンパク質αサブユニットに結合したＧＴＰ又はＧＴＰアナログのみを選択的に測定する方法として、後述する様々の方法が採用可能である。
【００６６】
最後に、前記Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合が検出された場合に、上記被検化合物は上記Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性を有すると評価する。このようにしてＧタンパク質共役型受容体に結合すると評価された被検化合物は、特定のＧＰＣＲに対するリガンドである可能性が高く、医薬品開発等に有用と考えられる。なお、Ｇタンパク質αサブユニットとＧＴＰ又はＧＴＰアナログとの結合を検出する方法としては、例えば、蛍光標識されたＧＴＰ又はＧＴＰアナログを用いて、反応前後における蛍光強度の変化を捉えることにより行うことができる。蛍光標識の代わりに放射性標識を採用してもよい。
【００６７】
ＧＴＰ又はＧＴＰアナログとして加水分解が制限されたＧＴＰアナログを用いてもよい。すなわち、そのようなＧＴＰアナログは、Ｇタンパク質αサブユニットが有するＧＴＰａｓｅ活性により加水分解されにくい。該ＧＴＰアナログの例としては、ＧＴＰγＳとＧＭＰ−ＰＮＰ（ＧｐｐＮＨｐ）が挙げられる。ＧＴＰγＳは、ＧＴＰのγ位のＰがＳに置換されたＧＴＰアナログである。またＧＭＰ−ＰＮＰは、ＧＴＰのγ位のリン酸結合に２級アミンが導入されたＧＴＰアナログである。その他、ＧＴＰアナログとしては、トリニトロ基を有するＧＴＰアナログなども用いることができる。
【００６８】
なお、上記の例において、融合タンパク質からＧタンパク質αサブユニットが遊離されていてもよい。すなわち、前段階で用いる本発明の組成物において、基本溶液として「所望のＧＰＣＲとシャペロニンサブユニット連結体等との融合タンパク質」と遊離のＧタンパク質αサブユニットを含むものを使用することができる。
【００６９】
被検化合物とＧＰＣＲとの結合を検出する手段の他の例としては、上記の例のようにＧタンパク質を介さず、直接ＧＰＣＲと被検化合物の結合を検出する方法が挙げられる。例えば、本発明の組成物をセンサーチップ上に固定化しておき、被検化合物との相互作用を表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）により検出することも可能である。また、アンタゴニスト候補物質のスクリーニング方法として、本発明の組成物をシンチレーションビーズ等に固定化しておき、放射性同位元素によりラベル化した既知のナチュラルリガンドと被検化合物との拮抗作用をシンチレーターで検出する（ＳＰＡ法）などの手段により被検化合物とＧＰＣＲとの結合を検出することができる。
【００７０】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、全てのＧＰＣＲに適用可能である。例えば、クラスＡに分類されるロドプシン型のＧＰＣＲ、クラスＢに分類されるセクレチンレセプター型のＧＰＣＲ、クラスＣに分類される代謝共役型ＧＰＣＲまたはホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＤの真菌ホルモンレセプター型ＧＰＣＲ、クラスＥのｃＡＭＰレセプター型ＧＰＣＲなどに適用できる。また、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、リガンドや、分類が未同定のオーファンレセプターにも適用できる。
【００７１】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法で用いる融合タンパク質に含まれるＧタンパク質αサブユニットとしては、Ｇｓファミリー、Ｇｉファミリー、Ｇｑファミリー、及び、Ｇ１２ファミリーに属する全てのαサブユニットが適用可能である。すなわち、Ｇｓファミリーに属するαs-1〜4、αolf；Ｇｉファミリーに属するαi-1〜4、αo-1〜2、αt-1〜2、αgust、αZ；Ｇｑファミリーに属するαq、α11、α14、α15、α16；Ｇ１２ファミリーに属するα12、α13のいずれもが、本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法に適用可能である。ただし、ＧＰＣＲとＧタンパク質αサブユニットとの組み合わせは、リガンドの結合によるＧＰＣＲの構造変化に伴い、活性化することのできる（ＧＤＰ及びＧＴＰの親和性が変化するなど）Ｇタンパク質αサブユニットとの組み合わせであることが好ましい。その点において、Ｇｑファミリーに属するα15及びα16は幅広く様々なＧＰＣＲと共役するためより好ましい。
【００７２】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法は、種々の用途に使用することができる。一つの用途は、オーファンＧＰＣＲに対するリガンドのスクリーニングである。例えば、アゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。一方、アンタゴニスト型リガンドをスクリーニングする場合は、既知のアゴニスト型リガンドと被検化合物とを反応系に共存させて競合的に結合させ、被検化合物とＧＰＣＲとの結合の有無を検出し、結合した候補化合物を所望のリガンドと判定することができる。本発明の評価方法を用いたリガンドのスクリーニングによれば、より効率的に薬物候補となるリガンドをスクリーニングすることができる。
【００７３】
本発明のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価方法の他の用途としては、ターゲットバリデーションが挙げられる。これは、既知又は未知の複数のＧＰＣＲに対して、ある目的のリガンドを用いて本方法を適用し、リガンドが結合したＧＰＣＲを選抜するものである。本方法を用いたターゲットバリデーションによれば、リガンドの作用機序の解明を効率的に行なうことができる。
【００７４】
以下に実施例を掲げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
１．シングルリングＧｒｏＥＬ２回連結−ＥＴＡＲ融合タンパク質の発現
大腸菌Ｋ１２株ゲノムを鋳型とし、配列番号４に示されるプライマーＧｒｏ−Ｆ１と配列番号５に示されるプライマーＧｒｏ−Ｒ１をプライマー対としてＰＣＲを行い、大腸菌シャペロニンＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。さらに、該増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター（ノバジェン社）に導入した。次に、ＧｒｏＥＬ遺伝子中のＤｒａＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部分（１３２８〜１４８７番）を同制限酵素で切り出した後、配列番号６で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを代わりに組み込み、ＧｒｏＥＬの４５２番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に、４６１番目のグルタミン酸（Ｅ）をアラニン（Ａ）に、４６３番目のセリン（Ｓ）をアラニン（Ａ）に、及び４６４番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換する変異を導入した。これにより、シングルリングを形成する変異型ＧｒｏＥＬのサブユニットをコードする遺伝子ＳＲＩＩをｐＴ７ｂｌｕｅＴベクター中にクローニングできた。
【００７６】
ｐＴｒｃ９９Ａ発現ベクター（アマシャムファルマシア社）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに配列番号７で表される塩基配列からなる２本鎖ＤＮＡを挿入し、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターを構築した。これにより、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ（Ｅｋ）翻訳サイト）、その下流に、転写翻訳されてＦＬＡＧタグとなる塩基配列（ＦＬＡＧサイト）及び終始コドン、さらにその下流にＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。すなわち、ｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターによれば、ＮｃｏＩサイトのＡＴＧが開始コドンとなった場合、各制限酵素サイトにＯＲＦを導入したときに、正しい読み枠となる。
【００７７】
上記で得られたＳＲＩＩ遺伝子をＳｐｅＩ／ＸｂａＩで処理し、あらかじめＸｂａＩ処理しておいたｐＴｒｃ９９ＡＬＴＣＦベクターに、ＳＲＩＩ遺伝子が正しい方向に翻訳されるように導入した。さらに、得られたベクターをＸｂａＩ処理し、同様にＳｐｅＩ／ＸｂａＩ処理して得られたＳＲＩＩ遺伝子を正しく翻訳されるように導入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子が２回連結された発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦを構築した。発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦの構成を図１に示す。図中、「ｇｒｏＥＬ」はＳＲＩＩ遺伝子、「ＰＳ」はペプチドリンカーサイト、「ＣＳ」はクローニングサイト、「ＦＬＡＧ」はＦＬＡＧペプチドサイトを表す。すなわち、発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦはｔｒｃプロモーターの下流に、順に、２個のＳＲＩＩ遺伝子（（ＳＲＩＩ）2）、ペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）、ＢｇｌＩＩサイト、スペーサー配列、ＸｈｏＩサイト、ペプチドリンカーサイト（Ｅｋ翻訳サイト）、ＦＬＡＧペプチドサイト、終始コドン、及びターミネーターを有する。そして、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩサイトに目的タンパク質の遺伝子を挿入することにより、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。なお、２つのペプチドリンカーサイトはいずれもプロテアーゼ（トロンビンとエンテロキナーゼ）の認識アミノ酸配列をコードするものであるが、本実施例では単なるペプチドリンカーをコードする塩基配列として機能する。
【００７８】
２．融合タンパク質の発現
ヒトエンドセリンＡ受容体（ヒトＥＴＡＲ）をモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
【００７９】
ヒトＥＴＡＲ遺伝子のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した（アクセッションナンバー NM_001957、配列番号８）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号９で表されるプライマーと配列番号１０で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＥＴＡＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＢｇｌＩＩサイト（５’末端）とＸｈｏＩサイト（３’末端）が導入された。この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＦベクターを作製した。
【００８０】
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＦベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む２×Ｙ．Ｔ．培地（１６ｇ／Ｌ バクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ 酵母エキス、５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）で２５℃、１１０ｒｐｍで２４時間回転培養した。培養後、菌体を回収し、超音波処理により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離して上清を回収した。この上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。結果を図２（ａ）に示す。その結果、「変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体−ヒトＥＴＡＲ」の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ）の分子量に相当する１６０ｋＤａ付近の位置にバンドが検出された。これにより、目的の融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ）が大腸菌可溶性画分に発現されることが確認された。
【００８１】
３．融合タンパク質の精製
上記２の上清に対して、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズ（シグマ社製）を用いて免疫沈降反応を行った。ビーズ洗浄後ＦＬＡＧペプチドで溶出される画分を１０％ 硫酸アンモニウム／１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラム ５ｍＬ（アマシャムファルマシア社）に供した。次に、１０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液で溶出し、融合タンパク質を含む画分を回収した。この画分を、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液であらかじめ平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いたゲル濾過に供し、目的の融合タンパク質を精製した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びに供し、クマシーブリリアントブルーにてゲルを染色した。結果を図２（ｂ）に示す。その結果、ＳＲＩＩの２回連結体とＥＴＡＲとの融合タンパク質（ＳＲ−ＥＴＡＲ）と共に、シャペロニンモノマー（単独のシャペロニンサブユニット）が確認できた。
【００８２】
得られた画分についてＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図３（ａ）に示す。その結果、ＳＲ−ＥＴＡＲがシングルリングとして存在していることが確認できた。このことは、得られたＳＲ−ＥＴＡＲが、宿主大腸菌由来のシャペロニンモノマーと共に、シャペロニンリング構造を形成していることを示していた。
【００８３】
４．Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物の調製
上記３で得られたＳＲ−ＥＴＡＲ溶液に０．３％濃度となるようにＣＨＡＰＳを添加して、基本溶液を調製した。この基本溶液に終濃度が１ｍＭとなるように４，４’−ジメチルジピリジンを添加し、室温で３０分間インキュベートした（Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物）。得られた組成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、図２（ｂ）と同様のバンドが検出された。さらに、得られた組成物をＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分析した。結果を図３（ｂ）に示す。その結果、シャペロニンモノマーとＳＲ−ＥＴＡＲの双方が検出され、シャペロニンが脱リング化されることが確認された。
【実施例２】
【００８４】
１．シングルリングＧｒｏＥＬ２回連結−ＥＴＡＲ−Ｇ蛋白質α融合タンパク質の発現
ヒトＥＴＡＲをモデルＧＰＣＲとし、ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体が連結され、且つＣ末端側にＧタンパク質α１５サブユニット（Ｇタンパク質αサブユニット）が連結された融合タンパク質を、以下の手順で調製した。
ヒトＧタンパク質α１５サブユニット（以下、単に「ヒトＧタンパク質α１５」、「α１５」等と略記する。）のｃＤＮＡクローンを、ＯｒｉＧｅｎｅ社より入手した（アクセッションナンバー NM_002068、配列番号１１）。このｃＤＮＡクローンを鋳型とし、配列番号１２で表されるプライマーと配列番号１３で表されるプライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片の両端にはプライマーに由来するＸｈｏＩサイトが導入された。
【００８５】
この増幅ＤＮＡ断片を、あらかじめＸｈｏＩで消化した実施例１のｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＦベクターに導入し、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを作製した。本ベクターに含まれる融合遺伝子の構成の概略を図４に、対応する融合タンパク質の構成の概略を図５に示す。図４で、「ｇｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット遺伝子、「ｅｔａｒ」はヒトＥＴＡＲ遺伝子、「ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５遺伝子を表す。また、図５で、「ＧｒｏＥＬ」は変異型ＧｒｏＥＬサブユニット、「ＥＴＡＲ」はヒトＥＴＡＲ，「Ｇ１５」はヒトＧタンパク質α１５を表す。すなわち、ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターは、変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体遺伝子（ＳＲＩＩ）2の下流に、ヒトＥＴＡＲ遺伝子、さらに下流にヒトＧタンパク質α１５遺伝子が連結された融合遺伝子を有する。そして、該融合遺伝子が発現することにより、「ヒトＥＴＡＲのＮ末端側に変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体が連結され且つＣ末端側にヒトＧタンパク質α１５が連結された融合タンパク質」（以下、「ＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５」と略記することがある。）が生産される。なお、該融合遺伝子においては、（ＳＲＩＩ）2とヒトＥＴＡＲ遺伝子との間にペプチドリンカーサイト（トロンビン翻訳サイト）があり、さらに、ヒトＧタンパク質α１５遺伝子の下流にペプチドリンカーサイト（エンテロキナーゼ翻訳サイト）及びＦＬＡＧペプチドサイトが連結されている。
【００８６】
ｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＧ１５Ｆベクターを大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。この形質転換体を実施例１と同様にして培養し、菌体破砕後、上清を回収した。
【００８７】
２．融合タンパク質の精製
実施例１と同様の方法で、抗ＦＬＡＧ抗体固定化ビーズでの免疫沈降、ＨｉＴｒａｐ Ｂｕｔｙｌ ＦＦカラムを用いる疎水クロマトグラフィー、及び、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ４０００ＳＷＸＬを用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより、目的の融合タンパク質を精製した。
【００８８】
３．Ｇタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物の調製
上記２で精製した１００μＭのＳＲ−ＥＴＡＲ−Ｇ１５（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液）に０．１％ジギトニン（界面活性剤）を加え、０．６ｍｇ／ｍＬの１−パルミトイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（リン脂質）、０．４ｍＭのホスファチジルセリン（リン脂質）、０．０３ｍｇ／ｍＬのコレステリル−ヘミサクシネート（ステロール類）、及び０．７％ＣＨＡＰＳ（界面活性剤）を含む脂質液を混合した（基本溶液）。この基本溶液に終濃度が１ｍＭとなるように４，４’−ジメチルピリジンを加え、室温、３時間撹拌することにより、脂質二重膜を含むＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物を調製した。
【実施例３】
【００８９】
１．融合タンパク質を用いたリガンドの結合性評価とスクリーニング
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１μＭ ＲＩ標識−ＧＴＰγＳ（パーキンエルマー社）、及び１００μＭ ＧＤＰを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液１６５μＬに、実施例２で調製した脂質二重膜を含むＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物（変異型ＧｒｏＥＬサブユニット２回連結体−ヒトＥＴＡＲ−ヒトＧタンパク質α１５融合タンパク質含む脂質膜画分）を終濃度が２００ｎＭとなるように添加した。この組成物に、エンドセリンＡ（被検化合物）を終濃度０（対照）又は１０００ｎＭとなるように添加し、３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で脂質膜を洗浄後、膜画分に残存するＲＩ標識−ＧＴＰγＳの量をシンチレーション法にて定量した。その結果、エンドセリンＡを添加しなかった対照の実験区（終濃度０）に対し、１０００ｎＭのエンドセリンＡを添加した実験区では優位にＲＩ標識−ＧＴＰγＳが結合していることが検出された。これにより、エンドセリンＡがヒトＥＴＡＲに対する結合性を有すると評価した。
以上より、実施例２のＧタンパク質共役型受容体に対する結合性評価用組成物を用いて、ヒトＥＴＡＲに対するリガンドがスクリーニングできることが示された。
【００９０】
なお、前述のジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，１９９９年，第２７４巻，ｐ．２０７５６−では、ネイティブ型のシャペロニンに対し、ジチオピリジンを作用させることにより、シャペロニンの四次構造形成を阻害し、脱リング化させることができると報告されている。しかしながら本報告では、３０分間程度の短時間内の脱リング化においてはＡＴＰなどのヌクレオチドが必須であることされている。一方、融合タンパク質を用いた本実施例では、ＡＴＰなどのヌクレオチドが無くとも３０分といった短時間の中で脱リング化することが可能であった。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】発現ベクターｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＴＣＦの主要部の構成を表す模式図である。
【図２】（ａ）は菌体破砕液上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｂ）は精製画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図３】（ａ）は精製画分のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を表す写真、（ｂ）は４，４’−ジメチルジピリジンを添加した後のＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥの結果を表す写真である。
【図４】実施例２で構築したｐＴｒｃ（ＳＲＩＩ）2ＥＴＡＲＧ１５Ｆべクターに含まれる融合遺伝子の構造の概略を表す模式図である。
【図５】図４の融合遺伝子に対応する融合タンパク質の構造の概略を表す模式図である。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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