(57)【要約】【課題】超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成することができることに加え、さらに生体内での中性な生理条件下における分散安定性および特定の生体組織を特異的に認識する機能をバランスよく両立することができる複合体粒子を提供する。【解決手段】超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成するＴｉＯ２粒子と、ＴｉＯ２粒子の表面の少なくとも一部を被覆するポリアクリル被膜と、ポリアクリル被膜被膜に結合しており、哺乳動物の肝組織を特異的に認識するＢ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列を含むポリペプチドと、を備え、分散粒径が５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下の範囲内である、複合体粒子。【選択図】図１０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成する基体粒子と、
前記基体粒子の表面の少なくとも一部を被覆する高分子被膜と、
前記高分子被膜に結合しており、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドと、
を備える複合体粒子。
【請求項２】
請求項１記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、哺乳動物の肝組織を特異的に認識する、複合体粒子。
【請求項３】
請求項１または２記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原由来のアミノ酸配列を含む、複合体粒子。
【請求項４】
請求項１乃至３いずれかに記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、
Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列と、
Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列に８０％以上の相同性を有する配列と、
Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列の１または数アミノ酸を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列と、
からなる群から選ばれる１種以上のアミノ酸配列を含む、複合体粒子。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、タグポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む、複合体粒子。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、蛍光タンパク質由来のアミノ酸配列を含む、複合体粒子。
【請求項７】
請求項１乃至６いずれかに記載の複合体粒子において、
前記基体粒子は、ＴｉＯ２を含む粒子である、複合体粒子。
【請求項８】
請求項１乃至７いずれかに記載の複合体粒子において、
前記複合体粒子の分散粒径は、５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、複合体粒子。
【請求項９】
請求項１乃至７いずれかに記載の複合体粒子において、
前記高分子被膜は、カルボキシル基を有する親水性高分子を含む被膜である、複合体粒子。
【請求項１０】
請求項９記載の複合体粒子において、
前記高分子被膜は、ポリアクリル酸を含む高分子皮膜である、複合体粒子。
【請求項１１】
請求項１乃至１０いずれかに記載の記載の複合体粒子において、
前記ポリペプチドは、前記高分子被膜とアミノカップリングにより結合している、複合体粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドラッグデリバリーシステムに用いる複合体粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＴｉＯ２を光触媒として用いたさまざまな分野での応用展開が注目されている。ＴｉＯ２に３８０ｎｍ以下の短波長の光を照射することで生成される活性酸素種の酸化力を利用するもので、環境ホルモンなどの有害化学物質の分解処理、有害微生物の殺菌・抗菌が報告されている。さらに、この光触媒反応を利用して、新規がん治療としての研究も進められている（非特許文献１〜４を参照）。
【０００３】
本発明者等の所属する研究室ではこのような光触媒として知られているＴｉＯ２に超音波を照射すると、高濃度のヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が生成されることを確認した（二酸化チタン／超音波触媒法（ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法））。ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法は、超音波を利用することによって光触媒反応と比較して水相中への超音波浸透距離が大きいなどの利点を有しており、さまざまな分野での応用が期待できる。これまでに、このＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法を用いて大腸菌や、レジオネラなどの効果的な殺菌効果が得られることが確認された。
【０００４】
また、超音波を利用したがん治療には、生体組織の超音波吸収による加熱作用を用いたものや、超音波振動による機械作用を用いたもの、超音波が引き起こすキャビテーション効果を利用して生体に投与した物質に化学反応を起こさせる音響化学療法などがあり、がん細胞に超音波を照射すると、アポトーシスを誘導してがん細胞の増殖を抑制するという報告がされている。
【０００５】
【非特許文献１】R,Cai, Y.Kubota, T.Shuin, et al. Induction of Cytotoxicity by Photoexcited TiO2 Particles. Cancer Res. 52 (1992) 2346-2348.
【非特許文献２】Photocatalytic killing effect of TiO2 nanoparticles on Ls-174-t human.colon carcinoma cells, World J Gastroenterol 10 (2004) 3191-3193.
【非特許文献３】Q.Liu, X.Wang, P.Wang, et al. Sonodynamic effrct of protoporphyrin IX disodium salt on isolated sarcoma 180 cells. Ultrasonics 2006;45:56-60.
【非特許文献４】H.Honda, Q.L.Zhao, T.Kondo. Effects Of Dissolved Gases And Echo Contrast Agent On Apotosis Induced By Ultrasound And Its Mechanism Via The Mitochondria-Caspaze Pathway. Ultrasound in Med. & Biol. 28 (2002) 673-682.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記文献記載の従来技術は、以下の点で改善の余地を有していた。
第一に、上記の二酸化チタン／超音波触媒法に用いられるＴｉＯ２粒子は、生体内での中性な生理条件下における分散安定性が不十分であるため、哺乳動物の血流中での流動性を確保することが困難であった。
【０００７】
第二に、上記の二酸化チタン／超音波触媒法に用いられるＴｉＯ２粒子は、特定の生体組織を特異的に認識することが困難であるため、生体外から超音波を照射することにより特定の生体組織に集中的に高濃度のヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を生成することが困難であった。
【０００８】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成することができることに加え、さらに生体内での中性な生理条件下における分散安定性および特定の生体組織を特異的に認識する機能をバランスよく両立することができる複合体粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成する基体粒子と、基体粒子の表面の少なくとも一部を被覆する高分子被膜と、高分子被膜に結合しており、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドと、を備える複合体粒子が提供される。
【００１０】
この複合体粒子では、基体粒子の表面の少なくとも一部を被覆する高分子被膜を有するため、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを基体粒子に結合することができる。その結果、この複合体粒子は、生体内において特定の生体組織に特異的に移送することができ、生体外からの超音波の照射によって特定の生体組織において高濃度のヒドロキシラジカルを生成することが可能となる。よって、この複合体粒子を用いれば、生体外からの超音波の照射によって特定の生体組織の細胞損傷を促進することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の複合体粒子によれば、生体外からの超音波の照射によって特定の生体組織の細胞損傷を促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１３】
＜概要＞
本実施形態に係る複合体粒子は、超音波の照射により水溶液中でヒドロキシラジカルを生成する基体粒子と、基体粒子の表面の少なくとも一部を被覆する高分子被膜と、高分子被膜に結合しており、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドと、を備える複合体粒子である。
【００１４】
このように、本実施形態に係る複合体粒子は、基体粒子の表面の少なくとも一部を被覆する高分子被膜を有するため、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを基体粒子に結合することができる。その結果、この複合体粒子は、生体内において特定の生体組織に特異的に移送することができ、生体外からの超音波の照射によって特定の生体組織において高濃度のヒドロキシラジカルを生成することが可能となる。よって、この複合体粒子を用いれば、生体外からの超音波の照射によって特定の生体組織の細胞損傷を促進することができる。
【００１５】
＜基体粒子＞
本実施形態における基体粒子は、超音波の照射により水溶液中で活性酸素、特にヒドロキシラジカル（・ＯＨ）を生成することができる粒子であれば、任意の粒子を好適に用いることができるが、たとえば、酸化物半導体触媒粒子を用いることができる。酸化物半導体触媒粒子としては、粒状のＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ３、ＮｉＯ、ＦｅＯ、ＣｒＯ、Ｃｒ２Ｏ３、ＭｏＯ３などを用いることができる。特に、ルチル型のＴｉＯ２触媒粒子またはアナターゼ型のＴｉＯ２触媒粒子がヒドロキシラジカル生成能に優れているために好ましい。
【００１６】
本実施形態における基体粒子の平均分散粒径は、生理的条件下において５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。基体粒子の平均分散粒径がこの範囲内であれば、後述の製造方法により得られる複合体粒子も同様の範囲内となる可能性が高いため、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを高分子被膜を介して結合させるには十分な大きさであり、さらに哺乳動物の血流中などの水溶液中で十分な分散安定性および流動性を確保することができるためである。
【００１７】
尚、ここでいう平均分散粒径とは、動的光散乱法によって測定を行い、キュムラント法解析から算出される平均値のことを示している。また、ここでいう生理的条件下とは２５℃、１気圧で（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）の組成であるリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）存在下のことを示す。
【００１８】
＜二酸化チタン／超音波照射法  ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法＞
光触媒
光触媒は多くの産業分野で注目され、実用化に向けた応用開発が盛んに行われている。
【００１９】
まず触媒とは、化学反応の際に自分自身は変化せず反応の速度をはやめる物質である。触媒を用いることにより活性化エネルギーを小さくして、少ないエネルギーで反応を進めることができる。また触媒自身は変化しないため、原理的には半永久的に使用することができる。
【００２０】
光触媒とは、光が照射されると働き始める触媒であり光のエネルギーによって働く触媒である。光触媒は光を吸収してエネルギーの高い状態となり、そのエネルギーを反応物質に与えて化学反応を起こし、以下の特徴を持つ（橋本和仁  藤島昭  監修：図解  光触媒のすべて（２００４）工業調査会を参照）。
・数万度という高温でなければ起こりにくい反応を室温で起こすことができる。
・普通の化学反応では反応が始まると反応物質がなくなるまで反応が進んでしまうのに対し、光の照射を止めれば反応を止めることができる。
・光がなければ働かず、反応物質が光触媒に接触してこないと反応を起こさない。
【００２１】
光触媒の定義
半導体の一種である光触媒は、自身は反応の前後で変化しないが紫外光を吸収することで、反応を促進させる物質と定義されている。光触媒による反応（光触媒反応）は１９７２年、本多・藤島らが水溶液中でＴｉＯ２に光を照射した場合、水が酸素と水素に分解することで発見され、ホンダ・フジシマ効果とよばれている。この光触媒反応をダイオキシンなどの環境汚染物質の分解や抗菌・殺菌効果さらに防臭などに利用する研究が現在注目されている。
【００２２】
二酸化チタン（ＴｉＯ２）
ＴｉＯ２は常温常圧では酸、アルカリ、有機溶媒に溶解せず、フッ化水素、塩素、硫化水素などの反応性の強いガスとも反応しないきわめて安定な物質である。また耐久性、耐磨耗性、経済性、安全性、実用性などで多くの利点を持っていることから光触媒として主に使用され、研究が行われている。
【００２３】
ＴｉＯ２にはルチル型、アナターゼ型、ブルッカイト型の３種類の結晶構造がある（ルチル型、アナターゼ型の結晶構造を図２に示す）。このうちルチル型が最も安定した結晶形態であり、アナターゼ型とブルッカイト型は高温になるとルチル型に変化する。ＴｉＯ２は室温では完全な絶縁体であるが、光を照射したり加熱したりすると半導体となる。ルチル型のバンドギャップは３．０ｅＶ、アナターゼ型とブルッカイト型のバンドギャップは３．２ｅＶであり、そのエネルギーを光の波長に換算すると３９０ｎｍの近紫外光に相当する。光触媒としては活性の高いアナターゼ型が使用され活性の劣るルチル型は白色顔料、塗料として広く利用されている。もう１つのブルッカイト型は天然に産出される鉱石であり、最近工業的にも合成されるようになったが、これまでの研究例は少なくよく分かっていない。
【００２４】
＜光触媒反応＞
反応機構
ＴｉＯ２の光触媒メカニズムを図３に示す。
【００２５】
ＴｉＯ２に３９０  ｎｍ以下の近紫外線領域の光が照射されると価電子帯（Ｖａｌｅｎｃｅ  ｂａｎｄ）にある電子（ｅ−）が励起して伝導帯（Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂａｎｄ）に移動する。電子がもとあった場所には正孔（ｈ＋）が生じる。この電子と正孔は非常に強い還元力、酸化力を持っており、水と反応することによってヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）やスーパーオキサイドアニオン（Ｏ２−）などの活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を生じる。反応式を以下に示す。
【００２６】
【化１】
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【００２７】
【化２】
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【００２８】
【化３】
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【００２９】
【化４】
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【００３０】
この活性酸素種の中でもヒドロキシルラジカルは特に酸化力が大きく有機物質を構成する分子中のＣ−Ｃ結合（８３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｃ−Ｈ結合（９９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｃ−Ｎ結合（７３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｃ−Ｏ結合（８４ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｏ−Ｈ結合（１１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、Ｎ−Ｏ結合（９３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の結合エネルギーよりもヒドロキシルラジカルのエネルギー（１２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は非常に大きいため、これらの結合を簡単に切断してしまう。このように光を照射することでＴｉＯ２表面に生成した活性酸素種の強い酸化力によって、分解困難な有機化合物質や有害気相物質の分解・抗菌作用などが発揮されると考えられる。
【００３１】
活性酸素種（ＲＯＳ）
活性酸素は、大気中に含まれる酸素分子（３Ｏ２）が、電気的なエネルギーや紫外線などの光エネルギーを得て、より反応性の高い化合物に変化したものである（吉川敏一著：活性酸素・フリーラジカルのすべて（２０００）丸善および吉川  河野  野原  共著：フリーラジカルの科学（２００４）講談社を参照）。
【００３２】
これらの代表的なラジカルとしては、
・  一重項酸素（１Ｏ２）
・  スーパーオキシドアニオンラジカル（Ｏ２・−：通称スーパーオキシド）
・  過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）
・  ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）
の４つが挙げられる。
【００３３】
ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）
ヒドロキシルラジカルは塩素、オゾンなどによりはるかに強い酸化力を持っており、反応性が高くほとんどの化合物と拡散律速に近い速度で反応すると考えてよい。反応性が高いということは、それだけヒドロキシルラジカルは不安定であることを意味する。生体内では、ＤＮＡやタンパク質あるいは脂質などに障害を与えやすい。しかし水中の種々の有害な化学物質や空気中の化学物質の分解・無害化ができ、それを利用して水処理、脱臭、大気浄化、抗菌・抗カビなど環境分野での様々な応用が可能である。
【００３４】
ヒドロキシルラジカルはフェントン反応、紫外線照射法、超音波照射法などにより生成させることができる。
【００３５】
超音波
光触媒反応は光触媒体の表面でのみ反応が進行し、さらに紫外線が照射された部位のみで反応が進行するという特徴を持つ。しかしこれらの特徴は水の浄化などを考えた際は、そのすべての部位に光を照射することは困難であり必ずしも利点とはならない。またＴｉＯ２が利用できる光は紫外線に限られており、人工的に作り出した紫外線の光子のコストは想像以上に高価である。そこで後述する実施例における実験では、超音波を用いることにより有害物質の分解を検討する。超音波は回折能が高いため地下、生体内、高濃度の汚染水などの光の届かない場所にも利用できることが考えられる（図４）。以下では超音波の性質について述べる。
【００３６】
超音波の特性
人間に聞こえる周波数範囲（約２０Ｈｚ〜２０ｋＨｚ）の音を可聴音といい、２０Ｈｚより周波数の低い音を超低周波音、２０ｋＨｚを超える周波数の音を超音波と呼ぶ。超音波は高い指向性を持ち気体、液体、固体を問わず伝搬することができる。しかし極端に媒質同士の密度が異なる場合、その音波は反射する。これらの性質は海底測深や魚群探知機などの情報探査技術に用いられている。また音波は回折能が高いために進行方向に障害物があったとしても回り込むことによりその後ろにも音波を照射することが可能である。
【００３７】
超音波は強いエネルギーの音波を発生できるため、精密機械の洗浄や殺菌にも応用されている。
【００３８】
また電磁波や光は横波であるが、超音波には縦波と横波の２種類の波がある。縦波が液中に伝搬すると音圧の高低により液体中に密度の粗の部分と密な部分が生じる。これがキャビテーションの原因となる。
【００３９】
キャビテーション効果
超音波を照射すると縦波の影響で分子が縦方向に振動することにより、高密度と低密度の状態、即ち高圧域と低圧域ができる。低圧状態になった際に溶媒分子同士が引き離されると、溶媒中での圧力がその蒸気圧より十分低くなった部分でキャビティー（空洞）が形成され、その際にキャビティー内に溶媒や溶質の蒸気が取り込まれる。比較的小さなキャビティーは低圧から高圧域に移る際、再溶解するが大きなキャビティーは液体中の圧力変化に伴って気泡表面が膨張・収縮する際に溶媒が蒸気として内部に取り込まれる。十分に大きく膨張し自身を維持できなくなり臨界状態に達したキャビティーは、圧力の腹の部分に引き寄せられると急激に圧壊する。この様子を図５に示す。この圧壊によって局在的に発生する圧力と温度はきわめて大きく圧力では１０００数百気圧、温度では５０００〜数万度に達すると言われている。また、圧壊時には・ＯＨが生成することが報告されている。この反応を以下に示す。
【００４０】
【化５】
2008195653.tif 000007
【００４１】
キャビテーションの生じやすさ、即ちキャビテーションの発生する圧力は液体の粘度、蒸気圧、表面張力などの物理的性質と超音波照射条件に依存する。一般には周波数が低いほどキャビテーションは発生しやすい。
【００４２】
このキャビテーション効果を最も端的に反映したものとして「超音波洗浄」がある。水に超音波を照射した時に発生するキャビテーションによる高温反応場において水分子は分解し、・Ｈや・ＯＨが生成しこれによって汚れを落とすのである。
【００４３】
ソノケミストリー
キャビテーションによって生じる短寿命の高温・高圧場をホットスポットと呼び、この特異な環境は極限反応場として注目され、この反応場の影響下にある化学反応分野をソノケミストリーと呼ぶ。
【００４４】
ソノケミストリーは非接触で局所的に反応を起こすことができるため、医療分野や工業分野への応用の可能性が高い。ソノケミストリーにおける化学反応はラジカルの生成が第一段階である。このラジカルは超音波を溶液中に照射することによって溶液中の分子の化学結合が切断され生じる。反応を以下に示す。
【００４５】
【化６】
2008195653.tif 000008
【００４６】
【化７】
2008195653.tif 000009
【００４７】
【化８】
2008195653.tif 000010
【００４８】
【化９】
2008195653.tif 000011
【００４９】
本発明者等の所属する研究室ではＴｉＯ２に超音波を照射することで高濃度のヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が生成することを見出した。
【００５０】
人間に聞こえる周波数範囲は約２０Ｈｚ〜２０ｋＨｚであり、２０ｋＨｚよりも高い周波数の音を超音波と呼ぶ。超音波は高い指向性を持ち、気体、液体、固体を問わず伝播することができる。また音波は回折能が高いために進行方向に障害物があったとしても、回りこむことによりその背後にも音波を照射することが可能である。そのため、地下や高濃度の汚染水、生体内などの光の届かない場所にも利用できると考えられる。
【００５１】
＜特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチド＞
本実施形態において、複合体粒子に特定の生体組織の識別能を付与する、特異的な結合能を有するポリペプチドとしては、目的の組織に存在する分子と特異的に結合するポリペプチドであれば特に限定されるものではない。本実施形態によれば、ポリペプチドとして機能タンパク質、構造タンパク質、抗体、リガンド、レセプター、オリゴペプチドまで好適に固定化が可能である。また、単純タンパク質の二酸化チタン複合体への固定化にはアミノ基およびチオール基を、糖タンパク質の場合では糖のアルデヒド基を、固定化の際の標的官能基とすることが可能である。また、例えば、水溶性高分子により修飾した二酸化チタンのカルボキシル基にビオチン（または、アビジン）を導入しておき、タンパク質をアビジン（または、ビオチン）と架橋させることにより、ビオチン：アビジンの相互作用を利用して固定化することも可能である。
【００５２】
また、本実施形態において、特異的な結合能を有するポリペプチドは、蛍光タンパク質由来のアミノ酸配列を含んでもよい。こうすれば、複合体粒子がＤＤＳの目的とする特定の組織に確かに送達されているかどうか、免疫蛍光法などにより確認することが可能だからである。蛍光タンパク質由来のアミノ酸配列としては、たとえば、一般的なＧＦＰ（オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク）、ＤｓＲｅｄなど由来のアミノ酸配列などを好適に使用することができる。
【００５３】
また、本実施形態において、特異的な結合能を有するポリペプチドは、タグポリペプチド由来のアミノ酸配列を含んでもよい。こうすれば、特異的な結合能を有するポリペプチドを作製する際に、ポリペプチドの精製が容易になるためである。タグポリペプチド由来のアミノ酸配列としては、たとえば、一般的なタグポリペプチドであるＧＳＴタグ、Ｈｉｓタグ、ＴＦタグ、ＨＡタグ、ＭＢＰタグ、ｃ−Ｍｙｃタグなどのアミノ酸配列などを好適に使用することができる。
【００５４】
＜Ｂ型肝炎ウィルス＞
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）
Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＤＳ）とは、必要な量の薬物を、効率よく患部に送達するシステムのことである。ＤＤＳの利用により、治療効果を十分に発揮させると同時に、副作用を最小限に抑えることが可能である。薬剤の効能に伴う副作用から患者を解放して患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を向上させ、また治療効果が高いが強い副作用をもつ既存の医薬品を実用化させるために、近年ＤＤＳの研究開発が活性化されている。特に、薬物を適当な運搬体に包含させることで、体内での行く先をコントロールする標的化（ターゲッティング）が重要な研究課題となっている（非特許文献１参照）。
【００５５】
近年、新しい治療法として遺伝子治療が注目されている。遺伝子治療では、特定の臓器で欠損した遺伝子や機能しなくなった遺伝子を正常な遺伝子に置き換えるが、目的臓器以外に遺伝子が導入されると思わぬ副作用が生じる可能性がある。そのため遺伝子治療でも、ピンポイントな標的化が可能なＤＤＳが不可欠である。
【００５６】
現在、薬物や遺伝子の運搬体として、ウィルス由来のタンパク質を利用したタンパク質中空ナノ粒子の開発が行われている。中空ナノ粒子はウィルスと同様の高い遺伝子導入率を示すとともに、人工系であることからリポソームと同様に安全である。さらに高い標的化能力を持つことから、薬物運搬体としての利用が期待されている。
【００５７】
Ｂ型肝炎ウィルスエンベロープ
Ｂ型肝炎ウィルスは、ウィルスゲノムがタンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）と脂質からできたナノカプセルで包まれた構造をとっている（図１ａ）。このウィルスゲノムがなく、タンパク質と脂質から成る中空ナノ粒子のことをＢ型肝炎ウィルスエンベロープという（図１ｂ）。
【００５８】
Ｂ型肝炎ウィルスエンベロープの生産法は次に示す通りである。
１）  Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の遺伝子を酵母細胞で発現させる。
２）  酵母細胞を破砕し、細胞の破砕物等を遠心分離する。
３）  セシウム密度勾配遠心分離を行う。
４）  スクロース密度勾配遠心分離を行う。
【００５９】
こうして高純度の粒子を精製出来る。収量としては、酵母の培養液１ｌ当たり約２０ｍｇの粒子が得られる。このように酵母で生産されたＢ型肝炎ウィルスエンベロープ粒子は、人体に危険性のないことが明らかになっている。
【００６０】
Ｂ型肝炎ウィルスエンベロープを形成するタンパク質は、ｐｒｅ−Ｓ１（１０８または１１９アミノ酸残基）、ｐｒｅ−Ｓ２（５５アミノ酸残基）、Ｓタンパク質（２２６アミノ酸残基）の３つの部位から成る。Ｂ型肝炎ウィルスエンベロープ粒子の大きさは不揃いで、５０〜５００ｎｍ程度の粒子径をもつ。また平均的粒子は、粒子径８０ｎｍであり、約１１０個のＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質から構成されていることが明らかとなっている。
【００６１】
Ｂ型肝炎ウィルスエンベロープは、ウィルスが本来持つ肝臓への高い感染力を保持した中空ナノ粒子であり、遺伝子や薬剤を包含させれば肝臓に特異的に導入することができる。またＢ型肝炎ウィルスエンベロープの分子認識部位を、他の臓器を特異的に認識する分子に置き換えることで、任意の臓器に遺伝子や薬剤を送達することが可能となる（リターゲッティング）。現在、リターゲッティングの技術開発が進んでおり、任意の臓器へのピンポイントな遺伝子・薬剤の導入が自在にできるようになると期待されている。
【００６２】
＜高分子被膜＞
本実施形態では、基体粒子の表面の少なくとも一部が高分子被膜により被覆されている。このため、通常であればポリペプチドを直接結合させることが困難である基体粒子の表面に、高分子被膜を介して特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを結合させることが可能になる。
【００６３】
本実施形態に用いる高分子被膜は、親水性のカチオンポリマーであることが好ましい。このように、親水性のカチオンポリマーが基体粒子の表面に強固に結合することにより、中性付近で正電荷を有することになる。そのため、中性付近はもとより幅広いｐＨの水系溶媒中においても極めて良好な分散安定性を示すことになる。この場合、基体粒子がＴｉＯ２粒子の場合には、水または塩を含む各種ｐＨ緩衝液中において、生理的条件下、分散剤等の他物質の添加なしに、分散性が極めて良好となり、２４時間以上にわたって安定な分散が実現する。
【００６４】
本実施形態で用いる高分子被膜の材料としては、カルボキシル基を有する水溶性高分子が望ましい。水溶性高分子としては、重量平均分子量が１０００から１０００００の範囲にあるアミンであればいずれも使用可能である。また、カルボキシル基を有する高分子であればいずれも適用可能であるが、例えばカルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリカルボン酸類、およびカルボキシル基単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸等のポリカルボン酸類、およびアクリル酸／マレイン酸やアクリル酸／スルフォン酸系モノマーの共重合体（コポリマー）がより好適に使用される。
【００６５】
これらのカルボキシル基を有する親水性高分子により二酸化チタンを修飾することにより、親水性高分子のカルボキシル残基に所望の特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを固定化することが可能となる。さらに、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドの固定化後においても、残余のカルボキシル基間の電気的斥力により、複合体粒子は中性付近を含む広範囲のｐＨ領域で均一に分散した状態を維持できる。
【００６６】
本実施形態で用いる高分子被膜の材料としては、アミンである水溶性高分子も望ましい。水溶性高分子としては、重量平均分子量が１０００から１０００００の範囲にあるアミンであればいずれも使用可能であるが、例えばポリアミノ酸、ポリペプチド、ポリアミン類、およびアミン単位を有する共重合体（コポリマー）などが挙げられる。具体的には、水溶性高分子の加水分解性および溶解度の観点から、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミン類がより好適に使用される。
【００６７】
この場合も、本実施形態の分散液は、水系溶媒への分散性が向上する。これは、水系の分散媒体中では、例えば光触媒性二酸化チタン微粒子表面上に存在するアミンにより、粒子間に電気的斥力が働くために凝集することなく、長期間にわたって安定に存在することによる。しかも、基本的にｐＨの変動や無機塩類の添加に対しても極めて安定である。さらに、本発明の光触媒性二酸化チタン微粒子の等電点は、該親水性高分子のアミンの等電点を反映しており、ｐＨ９以下の水系分散媒中ではｐＨが減少するにつれて粒子間に働く電気的斥力が増大するため、ｐＨが３〜９の水系分散媒中で極めて良好な分散性を示すものである。
【００６８】
このように、カルボキシル基を有する親水性高分子またはアミンである親水性高分子を含む被膜複合体粒子の分散粒径は、生理的条件下において５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下で安定化するため、後述するように哺乳動物の血流中において優れた分散安定性および流動性を示し、一種のＤＤＳシステムとして有効に機能する。そして、ＤＤＳシステムにより目的とする肝組織などの特定の組織に送達された複合粒子に、生体外から超音波を照射することにより、特定の組織における細胞破壊を促進することができる。
【００６９】
本実施形態において、例えば二酸化チタン微粒子にカルボキシル基を複数有する親水性高分子の被膜を形成するには、二酸化チタン微粒子と、カルボキシル基を複数有する親水性高分子をジメチルホルムアミドに分散させて９０〜１８０℃で１〜１２時間水熱反応を行って両者をエステル結合で結合させればよい。ここで、二酸化チタンと親水性高分子とがエステル結合するのは、粒子表面の酸化チタンが反応系中の水に水和されてその表面に水酸基が生成し、その水酸基と親水性高分子のカルボキシル基とが反応してエステル結合を形成することによるものである。エステル結合の確認方法としては種々の分析方法が適用できるが、例えば赤外分光法によりエステル結合の吸収帯である１７００〜１８００ｃｍ−１付近の赤外吸収の有無で確認することが可能である。
【００７０】
本実施形態において、例えば二酸化チタン微粒子にアミンを含む親水性高分子の被膜を形成するには、二酸化チタン微粒子およびアミンを含む親水性高分子をジメチルホルムアミドに分散させた混合液を加熱して結合反応を行えばよく、この際二酸化チタンと親水性高分子との比率を適宜選択すれば加圧しなくとも反応は進行する。しかしながら、加圧すると反応がより促進されるため、加圧下で反応を進行させる方が望ましい。この際、親水性高分子としてポリエチレンイミン（平均分子量：１００００）を用いた場合では、分散性をより好適にするためポリエチレンイミンの終濃度を１０ｍｇ／ｍｌ以上とするのが好ましい。この製造方法では、前記加熱温度が８０〜２２０℃であることが好ましい。
【００７１】
このように、本実施形態では、基体粒子の表面に高分子被膜が形成されているため、高分子被膜に含まれる親水性高分子のカルボキシル残基またはアミノ基に目的分子に対して特異的な結合能を有する分子を固定化することができる。例えば、特異的な結合能を有する分子の基体粒子表面の高分子被膜への固定化には、主にこの分子が有するアミノ基またはカルボキシル基を用いてアミノカップリング法が行われる。
【００７２】
例えば、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチド中のアミノ基と高分子被膜のカルボシキル基とを、脱水縮合反応で共有結合させて、基体粒子表面の高分子被膜に特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを結合させることができる。あるいは、高分子被膜のアミノ基と特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチド中のカルボキシル基とを、脱水縮合反応で共有結合させて、基体粒子表面の高分子被膜に特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを結合させることもできる。
【００７３】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００７４】
例えば、上記実施の形態では、特定の生体組織を特異的に認識するポリペプチドを哺乳動物の肝組織を特異的に認識するポリペプチドとしたが、他の組織をターゲットとしてもよい。例えば、哺乳動物の上皮組織、支持組織、筋組織、神経組織、血管組織、肝臓以外の各種臓器の組織などをターゲットとしてもよい。このようにすれば、肝組織以外の各種組織についても、同様にそれらの組織を特異的に認識するポリペプチドを用いれば、同様に優れたＤＤＳが構築可能である。
【００７５】
また、上記実施の形態では、Ｂ型肝炎ウィルスの表面抗原由来のアミノ酸配列としてｐｒｅＳ１／Ｓ２配列を用いたが、他の配列を用いてもよい。例えば、Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列に８０％以上の相同性を有する配列や、Ｂ型肝炎ウィルスのｐｒｅＳ１／Ｓ２配列の１または数アミノ酸を欠失・置換・付加してなるアミノ酸配列を用いても、ｐｒｅＳ１／Ｓ２配列とほぼ同等の肝組織認識能力を有するため、同様に優れた肝組織へのＤＤＳが構築可能である。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７７】
本研究の目的には、Ｂ型肝炎ウィルス由来のタンパク質を固定化したＴｉＯ２ナノ粒子を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養がん細胞への取込み及びＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によるがん細胞障害メカニズムを検討することが含まれる。
【００７８】
そこで本研究では以下のように検討を行った。
実施例１：本研究で用いた実験試薬・装置について説明する。
実施例２：肝細胞認識タンパク質ｐｒｅＳ１／Ｓ２の精製について示す。
実施例３：ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質のＴｉＯ２上への固定化について結果を示す。
実施例４：ＳＰＲセンサーを用いたｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の機能評価について結果を示す。
実施例５：免疫染色法を用いたｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質固定化ＴｉＯ２の肝細胞へのターゲッティング能について結果を示す。
実施例６：ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によるラジカルの精製について蛍光プローブ試薬を用いて評価を行った。
実施例７：ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を用いたＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法による細胞損傷効果の結果を示す。
【００７９】
＜実施例１：実験試薬と装置＞
［腫瘍細胞］
正常な細胞では、増えすぎないように調節機構が働いている。しかし、細胞ががん化すると、この調節機構がうまく働かずに無限に分裂を続ける。
【００８０】
がんは、それが由来した組織や細胞の種類によって分類される。上皮細胞から生じるがんをがん腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、結合組織や筋細胞からのものを肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）とよび、この２つのどちらにも該当しないがんに、造血細胞由来の白血病（ｌｅｕｋｅｍｉａ）や、神経系の細胞に由来するがんがある。
【００８１】
ＨｅｐＧ２
本研究では、ヒト肝臓癌由来の癌細胞（ＨｅｐＧ２）を用いた。本実験では全て対数増殖期にあたる細胞を用いた。この細胞は、大阪大学産業科学研究所黒田俊一助教授から供与していただいた。
【００８２】
培養方法
培地はＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ＋６０ｍｇ／ｍｌ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ＋１００ｍｇ／ｍｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎとし、３７℃、５％  ＣＯ２を含むインキュベーター内で培養する。細胞の経代方法は、以下の手順で行い、１０回（約１ヶ月）経代培養を行った時点でその細胞は破棄し、凍結保存された新たな細胞を使用した。
（１）  培地を除去し、ＰＢＳ（−）にて洗浄
（２）  ２．５ｇ／Ｌ  Ｔｒｙｐｓｉｎ＋１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａを添加し、インキュベーター（３７℃、５％  ＣＯ２）にて２〜３ｍｉｎインキュベートする。
（３）  ＤＭＥＭを加えてＴｒｙｐｓｉｎを中和し、ピペッティングによって全ての細胞を剥がす。
（４）  遠心（１０００ｒｐｍ、５ｍｉｎ）し、上清を除去して新しい培地を加える。
（５）  目的の細胞濃度になるように調整し、新しいｄｉｓｈに播種する。
【００８３】
［二酸化チタン］
ポリアクリル酸修飾チタン（ＰＡ−ＴｉＯ２）
ＴｉＯ２の等電点はｐＨ６．２付近であり、生体内の環境及び培地（ｐＨ７．４）中に懸濁すると凝集してしまう。そこで、本研究ではＴｉＯ２の分散性を高めるために、ＴｉＯ２表面にポリアクリル酸を修飾した二酸化チタン（ＰＡ−ＴｉＯ２）を用いた。ＰＡ−ＴｉＯ２は中性付近では表面がマイナスの電荷に帯電しており、静電気的な反発力によって分散する。ＨＰＰＳによって測定した平均粒経は約９０ｎｍである（後述するＦｉｇ．７−１）。
【００８４】
ＰＡ−ＴｉＯ２作製方法
（１）  ポリアクリル酸（ＰＡＡ）にＤＭＦを加えて混合し、１００ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡ溶液とする。
（２）  ＴｉＯ２懸濁液１０ｍｌおよび（１）の１００ｍｇ／ｍｌ  ＰＡＡ溶液を５０ｍｌコーニングにいれ、超音波発生装置で３０分間超音波照射。
（３）  ＤＭＦ  ３７．５ｍｌ→ＰＡＡ溶液２ｍｌ→ＴｉＯ２懸濁液０．５ｍｌの順に５０ｍｌコーニングを用いて混合する。
（４）  （３）の混合物を沈殿がなくなるまで超音波処理を行う。
（５）  テフロン製の密閉容器にいれて１５０℃、５時間反応（夕方反応を開始して翌日まで放置）。
（６）  反応液を１０ｍｌずつ５０ｍｌコーニングにわける。
（７）  （６）にアセトンを２倍量（２０ｍｌ）加えて攪拌した後、室温で１時間静置。
（８）  遠心分離機にて４０００ｒｐｍ、１５℃、２０ｍｉｎ遠心分離を行う。
（９）  分離した上澄み液を沈殿物がはがれないようにデカンテーションで捨てる。
（１０）  ９９％  Ｅｔｈａｎｏｌを２倍量（２０ｍｌ）加えて穏やかに攪拌する。
（１１）  遠心分離機にて４０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心分離を行う。
（１２）  分離した上澄み液を、沈殿物がはがれないようにデカンテーションで捨てた後、Ｄ．Ｗ．で必要な濃度に懸濁。
【００８５】
［試薬］
細胞培養
・  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）  （ナカライテスク）
・  Ｆｏｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  （ＦＢＳ）  （ＧＩＢＣＯ）
・  ＰＢＳ（−）  （日水製薬株式会社）
・  Ｔｙｐｓｉｎ  （Ｓｉｇｍａ）
・  ＥＤＴＡ−２Ｎａ  （Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−２Ｎａ−２Ｈ２Ｏ）  （ナカライテスク）
【００８６】
ＡＴＰ  ａｓｓａｙ
・  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （Ｇ７５７０）  （Ｐｒｏｍｅｇａ）
【００８７】
ＬＤＨ  ａｓｓａｙ
・  ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  （Ｇ７８９０）  （Ｐｒｏｍｅｇａ）
【００８８】
Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ染色法
・  Ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）
【００８９】
ラジカル測定
・  Ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  （ＡＰＦ）  （第一化学薬品）
【００９０】
抗体
・  Ａｎｔｉ−ｐｒｅＳ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ・  Ａｎｔｉ−ｐｒｅＳ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （特殊免疫研究所）
・  Ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ナカライテスク）
・  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５５５  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００９１】
試薬
・  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ
・  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ
・  ＮａＣｌ
・  ａｇａｒｏｓｅ
・  Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
・  ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  （ＩＰＴＧ）
・  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
・  尿素
・  Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  （ＤＴＴ）
・  ２−ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ
・  Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｏｒｍａｍｉｄｅ  （ＤＭＦ）
・  Ｂｏｖｉｎ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ  （ＢＳＡ）  （ナカライテスク）
・  ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ  （ＰＭＳＦ）
・  ４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  （ＤＡＰＩ）  （ＳＩＧＭＡ）
・  １−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  （ＥＤＣ）
・  Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  （ＮＨＳ）
・  Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  （ＰＡＡ）
・  ｐａｒａｈｏｌｍａｌｄｅｈｙｄｅ  （ＰＦＡ）  （和光純薬工業）
【００９２】
二酸化チタン
・  ＭＴＴ−４２２  （石原産業）
【００９３】
ゲルろ過クロマトグラフィー担体
・  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０
・  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００  ＨＲ
・  ＰＤ−１０  カラム  （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）
【００９４】
透析膜
・  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｓｉｚｅ  ２０  （和光純薬工業）
【００９５】
菌株
・  ＢＬ２１  （ＤＥ３）  （Ｆ−ｏｍｐＴ  ｈｓｄＳＢ  （ｒＢ−ｍＢ−）  ｇａｌ  ｄｃｍ  （ＤＥ３）  （Ｎｏｖａｇｅｎ）
【００９６】
プラスミド
・  ｐＧＥＸ−ＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２  （図６）
・  ｐＧＥＸ−ＧＦＰ  （大阪大学産業科学研究所）
【００９７】
本研究では上記のＧＳＴ、ＧＦＰ、ｐｒｅＳ１／Ｓ２の遺伝子が組み込まれたプラスミドを用いてタンパク質の発現を行った。ＧＳＴはアフィニティ精製用のタグであるキャリアータンパク質、ＧＦＰは緑色蛍光を発色する蛍光タンパク質である。そしてｐｒｅＳ１／Ｓ２が肝細胞を認識する分子認識タンパク質である。
【００９８】
［緩衝液および培地］
本研究で使用した緩衝液および培地は以下のように調整した。
【００９９】
ＬＢ培地
Ｔｒｉｐｔｏｎ：１．０ｇ
Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ：０．５ｇ
ＮａＣｌ：０．５ｇ
これらを蒸留水１００ｍｌに溶解させた後、オートクレーブする。冷めてから、アンピシリン１００ｍｌを添加する。
【０１００】
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ  ７．４）
ＨＥＰＥＳ：２３８．９ｇ
これを超純水に溶解させた後、４ＮのＮａＯＨにてｐＨ  ７．４に調整する。その後、１Ｌにメスアップし密栓してオートクレーブする。また、ｐＨ  ８．０のＨｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒを作成する時も同様の操作にて作成した。
【０１０１】
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ
ＦＢＳ：１ｍｌ
ＢＳＡ：１．５ｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００：１５ｍｌ
これらをＰＢＡ（−）にて溶解し、５０ｍｌに調整する。分注し冷凍保存する。
【０１０２】
封入体洗浄液
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ  （ｐＨ８．０）：４ｍｌ
１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００：１０ｍｌ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ：０．４ｍｌ
超純水に溶解させた後、２００ｍｌにメスアップする。
【０１０３】
８Ｍ尿素溶液
尿素：９６ｇ
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）：４ｍｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ：０．２ｍｌ
０．５Ｍ  ＥＤＴＡ：０．４ｍｌ
超純水に溶解させた後、２００ｍｌにメスアップする。
【０１０４】
４Ｍ  尿素溶液
尿素：２４０ｇ
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）：２０ｍｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ：１ｍｌ
０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ：２ｍｌ
超純水に溶解させた後、１Ｌにメスアップする。
【０１０５】
２Ｍ  尿素溶液
尿素：１２０ｇ
１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）：２０ｍｌ
１ｍＭ  ＤＴＴ：１ｍｌ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ：２ｍｌ
超純水に溶解させた後、１Ｌにメスアップする。
【０１０６】
Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１２．５％）
Ｄ．Ｗ．：２．０ｍｌ
Ｓｏｌ．Ａ（１．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８））：１．５ｍｌ
Ｓｏｌ．Ｃ（３０％  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、０．８％  Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）：２．５ｍｌ
１０％  ＳＤＳ：６０ｍｌ
１０％  過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）：８０ｍｌ
ＴＥＭＥＤ：１０ｍｌ
上記の組成で混合する。ＡＰＳは最後に加える。
【０１０７】
Ｓｔａｃｋｉｎｇ  Ｇｅｌ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（３．５％）
Ｄ．Ｗ．：２．７５ｍｌ
Ｓｏｌ．Ｂ（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））：０．７５ｍｌ
Ｓｏｌ．Ｃ（３０％  Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ、０．８％  Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）：０．７ｍｌ
１０％  ＳＤＳ：５０ｍｌ
１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）：５０ｍｌ
ＴＥＭＥＤ：５ｍｌ
上記の組成で混合する。ＡＰＳは最後に加える。
【０１０８】
×１０  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動バッファー
Ｔｒｉｓ：３０．３ｇ
Ｇｌｙｃｉｎｅ：１４３．１ｇ
ＳＤＳ：１０ｇ
Ｄ．Ｗ．に溶解させた後、１ｌにメスアップする。
【０１０９】
×２  ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）：２５ｍｌ
１０％  ＳＤＳ：４０ｍｌ
Ｇｌｙｃｅｒｏｌ：２０ｍｌ
Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ（ＢＰＢ）：１０ｍｇ
上記の組成で調整する。
【０１１０】
［装置］
ＣＯ２インキュベーター
・  ＡＰＣ−３０Ｄ  （ＡＳＴＥＣ）
【０１１１】
安全キャビネット
・  ＬＡＤ−１３００ＸＡ  クラスＩＩ  （オリエンタル技研工業）
【０１１２】
超音波照射装置
・  ＳＯＮＩＣ  ＭＡＳＴＥＲ  ＥＳ−２  （ＯＧ  ＧＩＫＥＮ）
【０１１３】
遠心分離機
・  ＫＵＢＯＴＡ  ６９３０  （ＫＵＢＯＴＡ）
・  Ｃｅｂｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５  Ｒ  （ｅｐｐｅｎｄｏｌｆ）
【０１１４】
ルミノメーター
・  Ｖｅｒｉｔａｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）
【０１１５】
オートクレーブ
・  Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｓｔｅａｍ  Ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｒ  ＢＳ−３０５  （ＴＯＭＹ）
・  ＫＴ−２３４６  （ＡＬＰ）
【０１１６】
オーブン
・  ＳＴ０−８２  （ＩＷＡＫＩ）
【０１１７】
蛍光マイクロプレートリーダー
・  ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ  Ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４０００  （Ｐｅｒ  Ｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
【０１１８】
分光光度計
・  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  Ｕ−３０１０  （ＨＩＴＡＣＨＩ）
【０１１９】
フローサイトメトリー
・  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ  ＡＤＣ  （ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）
【０１２０】
ＳＰＲセンサー
・  ＢＩＡＣＯＲＥ２０００  （ＢＩＡＣＯＲＥ）
【０１２１】
顕微鏡
・  万能倒立顕微鏡  ダイアフォト  ＴＭＤ３００
・  顕微鏡  ＶＳＴＢ−２  （Ｎｉｋｏｎ）
・  蛍光顕微鏡  Ｂｉｏ  ｚｅｒｏ  （ＢＺ−８０００）  （Ｋｅｙｅｎｃｅ）
【０１２２】
ＦＰＬＣ
・  ＡＫＴＡ  （ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）
【０１２３】
ＨＰＰＳ
・  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ  （ＭＡＬＶＥＲＮ）
ＨＰＰＳの原理としては、ほとんどの動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ＝ＤＬＳ）システムメーカは粒子にレーザー光を照射し、９０度の位置で散乱光の強度の変動を解析することで、粒子のブラウン運動と粒子のサイズとを関係付ける方法を用いている。今回用いたシステムでは１８０度に近い（１７３度）いわゆる後方散乱光を測定する。ブラウン運動とは粒子の周囲の液体の分子がランダムに衝突することによって起きる粒子の不規則な運動のことで、小さい粒子では早く動き、大きい粒子では遅く動くという特徴をもつ。このように粒子が動きまわる結果、レーザー光の光強度が変動し、この変動速度を測定することで粒子サイズを計算する。なお、上記のＰＡ−ＴｉＯ２粒子の粒度分布を測定した結果を図７に示す。
【０１２４】
［器具］
・  細胞培養ｄｉｓｈ  （３０００−０３５）
・  細胞培養ｄｉｓｈ  （４０００−０１０）  
・  細胞培養ｄｉｓｈ  （４０２０−０１０）  （ＩＷＡＫＩ）
・  １０ｍｌピペット  （  ３５６５５１）  （ＦＡＬＣＯＮ）
・  ２４穴プレート  （３５２６）
・  ９６穴プレート  （３６０３）  （Ｃｏｓｔａｒ）
・  ０．２２ｍｍ  フィルター  （ＳＬＧＶ  Ｊ１３ＳＬ）  （Ｍｉｌｌｅｘ）
【０１２５】
＜実施例２：ｐｒｅＳ１／Ｓ２及びＧＦＰタンパク質の精製＞
［はじめに］
肝細胞ターゲッティングＴｉＯ２を作成するにあたり、はじめに肝細胞特異性を持つＢ型肝炎ウィルス由来ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の精製について検討した。今回用いたｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質は蛍光タンパク質ＧＳＴ−ＧＦＰとの融合タンパク質として大腸菌を用いて以下の手順によって発現させた。
【０１２６】
［実験方法］
以下の実験方法は、大野茂男、西村善文：タンパク実験  プロトコール１  機能解析編（１９９７）秀潤社を参照して行った。
【０１２７】
タンパク質の発現
（１）  ｐＧＥＸ−ｈＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２及びｐＧＥＸ−ｈＧＦＰプラスミド１ｍｌを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）１００ｍｌに添加する。
（２）  氷上で３０分静置後、４２℃で６０秒間  Ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋを加える。
（３）  氷上で５分間冷やした後、ＬＢプレート（＋Ａｍｐ）に蒔き３７℃で一晩培養する。
（４）  プレート上のコロニーを爪楊枝でＬＢ培地（＋Ａｍｐ）３ｍｌに植菌し、３７℃で８時間培養する。
（５）  三角フラスコにＬＢ培地（＋Ａｍｐ）２００ｍｌと培養した大腸菌１ｍｌを加え、３７℃で培養する。
（６）  培養液がＯ．Ｄ．６００＝０．８〜１．０になった時点で、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ  ２００ｍｌを添加し、１７℃で１２時間培養する。
【０１２８】
タンパク質の回収
（１）  培養液２００ｍｌを遠心管に移し、４℃で１００００  ｒｐｍ、１０分間遠心して、集菌する。
（２）  上清を除去し、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を３０ｍｌ加え、菌体を懸濁する。
（３）  溶液をコーニングに移し、１０ｍｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ  ３００ｍｌを添加する。
（４）  超音波を照射し（ＯＵＴＰＵＴ  ５、ＤＵＴＹ  ４０、５分）、大腸菌を破砕する。
（５）  ４℃で１００００ｒｐｍ、１０分間遠心して、上清を回収する。
【０１２９】
不溶性画分からのタンパク質の精製
（１）  不溶性画分（沈殿）に封入体洗浄液１０ｍｌを加え、懸濁する。
（２）  ４℃で１００００ｒｐｍ、１０分間遠心する。
（３）  （１）〜（２）の操作をもう１回繰り返す。
（４）  沈殿に８Ｍ尿素溶液１０ｍｌを加えてよく懸濁し、室温で１時間静置する。
（５）  ４℃で１００００ｒｐｍ、１０分間遠心する。
（６）  上清を透析チューブに移し、５００ｍｌの４Ｍ尿素溶液に対して４℃で２．５時間透析する。
（７）  透析外液を５００ｍｌの２Ｍ尿素溶液に交換し、４℃で２．５時間透析する。
（８）  透析外液を２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に交換し、４℃で一晩透析する。
（９）  透析チューブから溶液を取り出し、４℃で１００００ｒｐｍ、１０分間遠心して、上清を回収する。
【０１３０】
［タンパク質の評価］
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によるタンパク質の定量
廃液中のタンパク濃度測定法としてＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法とは色素溶液中のクマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）が試料中のタンパク質と結合すると最大吸収波長が４６５ｎｍから  ５９５ｎｍに移動することを利用し、この波長を吸光度計で測定することによりタンパク質濃度測定を行う方法である。
【０１３１】
以下の手順にて測定した。
（１）  測定可能範囲になるように希釈したサンプル溶液をエッペンドルフチューブに８００  ｍｌ採る。また検量線用の基準ＢＳＡ溶液として０、１、５、１０、２０ｍｇ／ｍｌに調整する。
（２）  色素溶液のＣＢＢ溶液を２００μｌ加え、よく攪拌する。
（３）  分光光度計（波長：５９５ｎｍ）にて１時間以内に測定する。
（４）  検量線を引き、タンパク質濃度を算出する。
【０１３２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料の調整
以下の方法で試料の調整を行った。
（１）  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌと２×ＳＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒを１：９で混ぜる（１サンプルあたり１５ｍｌ使用）。
（２）  ｓａｍｐｌｅタンパク質溶液とステップ１で作ったものを１：１で混ぜる（１サンプル１５ｍｌ：１５ｍｌで混合）。
（３）  ９５℃、３分間熱処理する。
（４）  氷上で５分以上静置する。
（５）  Ｓａｍｐｌｅを２０ｍｌずつゲルのスポットに注入する。
【０１３３】
ＣＢＢ染色によるタンパク質の検出
（１）  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後ゲルを取り出し、不用な部分を切り捨てた後、容器に移し、ゲル体積の５〜１０倍量程度の染色液を入れ、１時間ゆっくり振る。
（２）  染色液を除き、ゲル体積の５〜１０倍量程度の脱色液を注ぎ、ゲルの脱色が完了してタンパク質のバンドがはっきりと認められるようになるまでゆっくり振る。
（３）  ゲルを取り出す。
【０１３４】
タンパク質の定量
ゲルをスキャナで取り込み、解析ソフト（Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ）で解析する。スキャナで取り込んだ画像より、バンドの濃さを数値化し（Ｍｅａｓｕｒｅ）、濃度が決定している標準ＢＳＡ溶液（２５、５０、１００ｍｇ／ｍｌ）と比較して、ゲルに流したタンパク質溶液の濃度を推定する。
【０１３５】
［結果と考察］
ＧＳＴ−ＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２およびＧＳＴ−ＧＦＰタンパク質の精製を行い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の定量を行った（図８、表１）。
【０１３６】
【表１】
2008195653.tif 000012
【０１３７】
タンパク質の精製は可溶性画分（Ｕ．Ｓ．破砕後の上精）から行うことが望ましいが、今回の可溶性画分から得られた溶液を観察すると両タンパク質ともＧＦＰの蛍光がほとんどあまり見られなかった。そこで、不溶性画分の封入体からタンパク質を抽出する方法を用いた。この方法によって得られたタンパク質は濃い緑色蛍光を示しており、高濃度のＧＳＴ−ＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２あるいはＧＳＴ−ＧＦＰタンパク質が精製できたのではないかと考えられる。これらのタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって求めるとｐｒｅＳ１／Ｓ２は２．９８ｍｇ／ｍｌの濃度で得られた。しかし、これらのタンパク質溶液にはｐｒｅＳ１／Ｓ２以外の不純タンパク質も多く含まれていることが考えられるためＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって精製したタンパク質の分子量の確認および解析ソフトによる濃度測定も行った。
【０１３８】
この結果より、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２の分子量は約７２ｋＤａ、ＧＳＴ−ＧＦＰの分子量は約５４ｋＤａであると分かっている。図８より、それぞれの分子量の位置にバンドが現れていることから、ＧＳＴ−ＧＦＰ−ｐｒｅＳ１／Ｓ２及びＧＳＴ−ＧＦＰタンパク質が精製されたことが確認された。
【０１３９】
また、上清溶液からはｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質は０．０４８ｍｇ／ｍｌの濃度しかなく、違う分子量の位置に多くのバンドがあった。しかし、封入体からの精製においては１．７９ｍｇ／ｍｌと高濃度のタンパク質が得られ、上清のときのＳＤＳゲルと比べると他の分子量の位置にバンドが見られず純度も良いものを得ることが出来た。ＧＳＴ−ＧＦＰタンパク質においても同様の結果が見られた。よって、今後この手法でタンパク質の発現を行い、封入体から精製したタンパク質を使用する。
【０１４０】
＜実施例３：ｐｒｅＳ１／Ｓ２及びＧＦＰタンパク質のナノ粒子表面への固定化＞
［はじめに］
実施例２にてｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質は精製出来た。本実施例ではアミノカップリング法を用いたＰＡ−ＴｉＯ２表面へのタンパク質の固定化について検討し、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化粒子の分離精製も行う。
【０１４１】
［ゲルろ過クロマトグラフィーの原理］
タンパク質を分離する方法としては、
l  ゲルろ過クロマトグラフィー
l  イオン交換クロマトグラフィー
l  （抗体）アフィニティークロマトグラフィー
などが用いられるが、本研究においてはゲルろ過クロマトグラフィー法を用いた。
【０１４２】
その原理としては、質量の違うタンパク質は、ポリアクリルアミドゲルやデキストラン（細菌由来の多糖類）あるいはアガロース（海草由来の多糖類）などの多孔性ビーズを用いたゲルろ過クロマトグラフィーで分離できる。タンパク質溶液をビーズの詰まったカラムに流すと、ビーズのまわりを流れながらタンパク質はある時間ビーズの孔の中にとどまる。その結果、カラム内でのこのタンパク質の移動は遅くなる。小さなタンパク質ほど簡単にビーズの孔にしみ込むので、カラムの中を大きなタンパク質よりゆっくり流れることになる（図９）。
【０１４３】
［実験方法］
タンパク質の固定化法（図１０）
（１）  ０．４Ｍ  ＥＤＣ溶液０．２５ｍｌに０．１Ｍ  ＮＨＳ溶液０．２５ｍｌを加える。
（２）  １．５％  ＰＡ−ＴｉＯ２溶液２．５ｍｌに（１）の混合液を０．５ｍｌ加え室温にて１時間緩やかに撹拌させながら反応させる。
（３）  ゲルろ過カラムＰＤ−１０にてＰＡ−ＴｉＯ２と未反応のＥＤＣ／ＮＨＳを分離させる。
（４）  カラムから出てきたＰＡ−ＴｉＯ２溶液３．５ｍｌにタンパク質溶液２．５ｍｌを加え、４℃にて４時間〜１晩緩やかに撹拌させながら反応させる。
（５）  ０．１Ｍモノエタノールアミンを１ｍｌ加え４℃にて３０分緩やかに撹拌させながら反応させる。
【０１４４】
ゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ）
（１）  付属のＰＣの電源を入れプログラムを起動する。
（２）  事前に２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４、ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（０．２２ｍｍ））にてカラムを平衡化させておく。
（３）  Ｓａｍｐｌｅ溶液を２ｍｌサンプルループに注入し、プログラムを流速０．５ｍｌ  ／ｍｉｎ、Ｓａｍｐｌｅを４ｍｌずつ分画するように設定し開始する。
【０１４５】
［結果と考察］
ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画精製
ゲルろ過クロマトグラフィーの結果を図１１、１２に示した。図１１では各分画の蛍光を測定することでｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の存在する分画を調べた。また、図１２ではＢｒａｄｆｏｒｄ法によって各分画のタンパク質量を調べた。同時に比較対象としてｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質のみをゲルろ過した場合、そしてＰＡ−ＴｉＯ２のみをゲルろ過した場合のクロマトグラムも同時に得た。
【０１４６】
これらを比較すると、ＴｉＯ２の分画はＵＶデテクターの値より、分画７〜１１になることが分かった。そして、ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質は分画１１〜１８に分画されたことが分かった。これらのことから、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の分画は７〜１０になっているのではないかと考えられる。また粒子上に存在するタンパク質量は６４ｍｇ／Ｌであった。
【０１４７】
固定化量を増加させるには、
・  アミノカップリング法（ＥＤＣ／ＮＨＳ）の条件検討（Ｎ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｙ．Ｉｋａｄａ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ａｍｉｄｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｍｅｄｉａ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６（１９９５）１２３−１３０．を参照）
・  他のＬｉｎｋｅｒ試薬を用いた検討
・  タンパク質の純度を上げる（アフィニティークロマトグラフィーなどによるpreS1/S2のさらなる精製）
などを行うことによって、より多くのタンパク質を修飾した粒子を作成することが可能となるのではと考えられる。
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による固定化の確認
ゲルろ過クロマトグラフィーによって分画された各サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ熱変性によって粒子上から剥がれた、あるいは粒子に付着していた、そして未反応のタンパク質を検出した（図１３）。この結果、分画８〜１６にかけてｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の分子量の位置にバンドが見られた。これは先の図１１および図１２におけるデータと相関を持ち、さらにＴｉＯ２が検出される分画８、９で濃いバンドが得られていることから図１１〜１３を総合的に見て今後の研究には分画８を用いるのが良いと考えられる。
【０１４９】
粒子の安定性
精製したＴｉＯ２粒子を１０％  ＦＢＳ入りＤＭＥＭ中に入れ、生体内と同じ環境下での粒子径の変化を調べた（図１４）。通常、表面電荷が中性付近であるＴｉＯ２は生体内の環境においては凝集しやすいことが知られている。ＰＡ−ＴｉＯ２はポリアクリル酸が修飾されているため、表面にあるカルボキシル基によって分散性が向上していた。今回のｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化後もＴｉＯ２粒子は粒径５０〜２００ｎｍで良好な分散性を持ち、若干の凝集は見られるが２４、７２時間後もその分散性を保持することが分かった。これらの結果よりｉｎ  ｖｉｖｏの実験系においては、ターゲッティング機能に加えて、がん組織でのＥＰＲ効果によるｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２粒子の集積が期待出来るのではないかと考えられる。
【０１５０】
［まとめ］
今回のアミノカップリング法によるタンパク質固定化によってＴｉＯ２粒子上にｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質が結合したことが分かった。そのタンパク質量は６４ｍｇ／Ｌであり、その粒子径は平均１００ｎｍくらいであることも分かった。これは粒子１個あたりにｐｒｅＳ１／Ｓ２分子が平均３個結合していることになる。
【０１５１】
また今回作成した粒子は１０％  ＦＢＳ中においてもほとんど凝集することがなく、安定した粒径を持つことも分かった。実施例４以降では本粒子の機能評価を行った。
【０１５２】
＜実施例４：ＳＰＲセンサーによるｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２特異性評価＞
［はじめに］
実施例３までにｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を作成し、ゲルろ過クロマトグラフィー法により分画精製した。本実施例では完成したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２に対してＳＰＲセンサーを用いてｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の抗ｐｒｅＳ１抗体に対する特異性評価実験を行う。
【０１５３】
［ＳＰＲセンサー（ＢＩＡＣＯＲＥ）の検出原理］
ＢＩＡＣＯＲＥの検出系では、表面プラズモン（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ）が金属／液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ＝ＳＰＲ）の光学現象を採用している。光源に発光ダイオードを用い、波長７６０ｎｍの偏光をプリズムに照射し、プリズムにくさび型の光に集光し、全反射の条件下でセンサーチップに照射する。この光は全反射する際に、金膜表面に特殊な波を生じさせる。その波動を生むために入射光の一部の波長エネルギーが消費されるために、反射光をモニタリングすると特定の角度にエネルギーの消失が見られ、反射光の全波長域に対する強度を測定すると、特定の角度に強度の減少した光の谷間が確認できる。この減少をＳＰＲという。反射光の消失角度（ＳＰＲ角度）は金膜表面近傍での媒質の屈折率に依存して変動する。この減少を利用して、２分子間の結合・解離を測定する。金薄膜上に試料（リガンド）を固定し、それに特異性をもつ物質（アナライト）を注入することで、２分子は結合するために、金薄膜の質量が増加し、その結果としてセンサーチップ表面の屈折率が増加する。この屈折率の変化により光の谷が移動する（図１５）。この移動度の経時変化をセンサーグラムというグラフに表示することで、分子間の相互作用をリアルタイムにモニタリングすることができる。
【０１５４】
光の谷の移動度を表す単位として、ＳＰＲ角度の０．１°の変化を１０００レゾナンスユニット（ＲＵ）と定義する。１０００ＲＵはセンサーチップ表面に約１ｎｇ／ｍｍ２の質量変化が生じたことになる。
【０１５５】
［センサーチップへの抗ｐｒｅＳ１抗体の固定］
ＢＩＡＣＯＲＥではセンサーチップは測定中、常に流体に接している状態であり、得られるセンサーグラムは直接にはセンサーチップ表面の溶媒の屈折率変化を反映している。そのため、ＲＵ値の変化は、センサーチップ上に固定化したリガンドと溶媒中のアナライトとの結合に伴うセンサーグラムと溶媒そのものの屈折率がもたらすセンサーグラムの総和であり、このときの溶媒の影響をバルク効果と呼ぶ。
【０１５６】
ＢＩＡＣＯＲＥでの典型的なセンサーグラムを図１６に示す。リガンドを固定化したセンサーチップ表面にアナライトを注入添加すると、特異的結合反応に伴いレゾナンズセンサーグラムが増加する。設定時間後アナライトの注入が終わり、ランニングバッファーが流れ始める。ここでは、いったんリガンドに結合したアナライトの解離反応が観察される。強固に結合した分子を引き離すために、界面活性剤等の変性剤を添加することで、アナライトとリガンドを完全に解離させ、センサーチップを再生させる。このサイクルを繰り返すことで、多サンプルを連続的に処理することが可能である。また、ＢＩＡＣＯＲＥで使用する溶液、試料等は、マイクロ流路に流すので、微粒子の混入を避けるために、フィルトレーション処理をし、十分に脱気をしておく必要がある。
【０１５７】
本研究ではセンサーチップの金薄膜上にｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質をアミノカップリング反応により固定化する。センサーチップにはアミノカップリング用チップＣＭを使用した。ＣＭ５の金薄膜表面には親水性のデキストラン層があり、このデキストランはカルボキシル基が修飾されている。このカルボキシル基と抗ｐｒｅＳ１抗体のアミノ基を利用してカップリングにより固定化した。
【０１５８】
これにより、抗ｐｒｅＳ１抗体をリガンドとし、実施例３までに作成したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２をアナライトとして使用した。ランニングバッファーには５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４、ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（０．２２  ｍｍ））を使用した。
【０１５９】
［ＢＩＡＣＯＲＥによるｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の特異性評価］
ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質による濃度依存性評価
センサーチップ（ＣＭ５）上に抗ｐｒｅＳ１抗体をプログラムを用いて固定化させ、そこへ１、７、１４ｍＭのｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質を２０ｍｌ流し、今回の抗体における濃度依存性を評価した。その後、１０ｍＭ  ＮａＯＨ＋１０％  ＳＤＳにおいて最終的に解離させセンサーチップを再生させた。
【０１６０】
ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２による特異性評価
センサーチップ（ＣＭ５）上に固定化した抗ｐｒｅＳ１抗体上にｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を２０ｍｌ流し、抗ｐｒｅＳ１抗体への特異性を評価した。その後、１０ｍＭ  ＮａＯＨ＋１０％  ＳＤＳにおいて最終的に解離させセンサーチップを再生させた。
【０１６１】
［結果と考察］
抗ｐｒｅＳ１抗体によるｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の濃度依存性およびｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の特異性を評価した（図１７、図１８）。１、７、１４ｍＭのｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質を流した結果、１４ｍＭの時は３７０ＲＵを得られ７ｍＭの時は２４０ＲＵとタンパク質濃度を下げるに従って、きれいな濃度依存的センサーグラムを得ることが出来た。しかし、１ｍＭのｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質では２０ＲＵくらいと、抗体との特異的な反応をほとんど得られなかった（図１７）。また、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を流した時、ＢＳＡ固定化ＴｉＯ２およびＴｉＯ２においては抗体との反応がほとんど見られなかった。一方、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は溶液中のタンパク質が０．３ｍＭと先程の図１７より１ｍＭ以下のタンパク質量にもかかわらず約８０ＲＵと大きな特異性を示した（図１８）。これは、ＲＵは反応した物質の質量変化によって値が上昇するので、多くのタンパク質が反応したということではなく、ＴｉＯ２の質量がタンパク質に比べてかなり大きく、そのため０．３ｍＭのタンパク質ながら８０ＲＵという値を得られたのだと考えられる。よって、本研究のｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２はｐｒｅＳ１／Ｓ２の特異性を持ち、またＢＩＡＣＯＲＥのデータからＴｉＯ２表面にｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質が固定化されていることを改めて示すことが出来た。
【０１６２】
＜実施例５：免疫染色法＞
［はじめに］
実施例４にてＳＰＲセンサーを用いることで抗体との特異性を示し、また同時にＴｉＯ２表面にｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質が固定化されていることが確認出来た。本実施例では、実際にヒト肝臓癌由来ＨｅｐＧ２培養細胞を用いて、免疫染色法による肝細胞特異性を評価した。
【０１６３】
［原理］
以下の免疫染色法は、許南浩  黒木登志夫  編集：実験医学別冊  培養細胞実験ハンドブック（２００４）羊土社、およびＭ．Ｒｉｃｃｉ，Ｍ．Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ，Ｃ．Ａｎｚｉｖｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．１７ｂ−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ＨｅｐＧ２  ａｎｄ  ＷＲＬ−６８  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．  Ｊ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２１（２００６）８９４−９０１を参照して行った。
【０１６４】
まず、培養及び染色後の観察に適切な機材の上に細胞を培養する。適切な固定処理後に細胞膜の透過処理を行い、抗体分子が細胞内に入り込めるようにする。その後、研究対象となる分子に対する抗体（一次抗体）を反応させる。一次抗体との反応後、未反応の抗体を除く。蛍光物質あるいは酵素が結合している二次抗体を反応させた後にバッファーで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察する（図１９）。また、染色後、必要に応じて核染色も行う。ここでいう酵素とはＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）やＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＰ）のことである。今回は、蛍光色素であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５５５を結合した抗体を用いた。
【０１６５】
［抗ｐｒｅＳ１・抗ＧＦＰ抗体による免疫染色］
実験方法
免疫染色法について簡潔に示す（図２０）。
（１）  ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように３．５ｃｍ  ｄｉｓｈに２ｍｌずつ細胞懸濁液を入れる。
（２）  ３７℃、５％  ＣＯ２にて２４時間インキュベート。
（３）  ０．１％のｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を２００ｍｌずつ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２にてさらに６時間インキュベートする。
（４）  培地を捨ててＰＢＳ（−）にて３回洗浄する。
（５）  ４％  ＰＦＡを５００ｍｌ添加し、１５分間静置する。
（６）  ＰＦＡを除去し０．２５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りのＰＢＳ（−）を５００ｍｌ加え１５分間撹拌する。
（７）  １ｍｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ｐｒｅＳ１  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙあるいは４．４ｍｇ／ｍｌ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙを５００ｍｌ添加にて一晩静置する。
（８）  ０．０３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りＰＢＳ（−）にて３回洗浄する。
（９）  ４ｍｇ／ｍｌ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５５５  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙを５００ｍｌ添加後遮光し室温で１時間静置する。
（１０）  ０．０３％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００入りＰＢＳ（−）にて３回洗浄する（遮光）。
（１１）  乾燥防止にＰＢＳ（−）を５００ｍｌ入れ、蛍光顕微鏡にて観察する。
【０１６６】
結果と考察
抗ｐｒｅＳ１抗体および抗ＧＦＰ抗体を使った免疫染色法によってｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２のターゲット能を調べた（図２１、図２２）。ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を添加した細胞はどちらの抗体を用いた場合も肝細胞特異的に用いた免疫染色法によって強い赤色蛍光を示した。また、ポジティブコントロールとして添加したｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質においても、どちらの抗体の場合も赤色蛍光を示し肝細胞に特異的に取り込まれていることが分かった。ここで図２２Ａ、図２２Ｂを比較するとその蛍光に違いが見られた。ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の方は主に細胞膜の周辺で蛍光が観察された。一方、ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質においては点状の蛍光が見られ、これは細胞質内に取り込まれているように思われる。よって、６時間の取り込み時間ではｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、特異的に肝細胞をターゲッティングしてはいるが、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれてはいないようであった。
【０１６７】
＜実施例６：ラジカル測定＞
［はじめに］
これまでに、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２のターゲッティング能を示してきた。ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法による癌細胞死滅効果は、ＴｉＯ２に超音波を照射することで発生したラジカルによる酸化が原因と考えられる。そこで、この章では、ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によって生成された活性酸素種をＡｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＡＰＦ）を用いて定量した。今回は、石原産業製の二酸化チタン（ＭＰＴ−４２２）を用いてラジカル生成を確認した。
【０１６８】
［原理］
ＡＰＦは中性水溶液中でほとんど蛍光を持たないが、これらのプローブが強い活性を持つ活性酸素種（特に・ＯＨ、・Ｏ２−）と反応すると、強蛍光性化合物であるフルオレセインが生成し、蛍光強度に増大が観察される（図２３）。
【０１６９】
［超音波照射時間によるラジカル量の変化］
実験方法
（１）  ＰＢＳ（−）を用いて、ＡＰＦを１ｍＭに希釈する。
（２）  （１）を２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ３．５ｃｍ  ｄｉｓｈに添加する。
（３）  ０．１％  ＰＡ−ＴｉＯ２を２００ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加する。
（４）  超音波（１ＭＨｚ、３０秒、５０％パルス）を０〜０．８Ｗ／ｃｍ２の出力にて照射する。照射方法としては超音波照射器のプローブ部分にジェルを塗りその上にｄｉｓｈを水平になるように置く。超音波の照射装置を簡単に示す（図２４）。
（５）  生成されたラジカル量を蛍光として測定（Ｅｘ＝４９０ｎｍ、Ｅｍ＝５１５ｎｍ）。
【０１７０】
［結果と考察］
ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によって生成されるラジカル量のＴｉＯ２濃度による影響を調べた（図２５）。ＴｉＯ２が０％のときでも今回の条件ではラジカルの生成は確認されたが、ＴｉＯ２を添加したとき、そしてさらにＴｉＯ２濃度が濃くなるにしたがって生成されるラジカル量は増加した。このことから、ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によって生成されるラジカル量は、ＴｉＯ２濃度に依存性をもって増加する傾向にあることが考えられる。しかし、０．１％ＰＡ−ＴｉＯ２の時は、０．０５％と比較すると顕著な差は認められなかった。これはＴｉＯ２濃度があまりにも濃いと超音波を遮ってしまい全体として効果があまり得られないのではないかと考えられる。
【０１７１】
［まとめ］
ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によって今回使用したＴｉＯ２粒子においてもラジカルが生成されることが分かった。しかし、今回の条件においてはＵ．Ｓ．のみの場合でもラジカルが発生していることが分かり、さらにＴｉＯ２有無の差は見られるが大きな差ではなく、今後、照射条件の再検討が必要となるかもしれない。
【０１７２】
＜実施例７：ＴｉＯ２／ＵＳ法による細胞障害検討＞
［はじめに］
実施例６までにｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の抗体および肝がん細胞への特異性が示された。本章ではＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によるがん細胞の死滅・損傷効果を検討した。その評価系には、損傷によって細胞内より漏出する乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）量を測定する方法を用いた。
【０１７３】
［ＬＤＨの原理］
ほとんどすべてのネクローシスや多くのアポトーシス（とくに後期）においては、細胞死に伴う細胞膜の破綻により細胞質内の分子が細胞外に漏出される。そこで、このような分子を定量測定することにより、細胞膜の破綻、生存活性を失った細胞の定量が可能になる。この乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）は細胞質に豊富に存在し、比較的安定な酵素であるため、このような目的で測定されることが多い。
【０１７４】
ＬＤＨは分子量約１５０ｋＤａの解糖系酵素であり、乳酸からピルビン酸への酸化を補酵素ＮＡＤ＋の触媒により行う酵素であり、これが細胞膜にダメージを受けた細胞から漏出されると、レサズリン／ジアホラーゼ共役系を介して生成するレゾルフィンの蛍光として定量することができる（図２６）。
【０１７５】
測定方法としては以下のように行う。
（１）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＭｉｘとＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを２２℃に安定させる。
（２）  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＭｉｘにＡｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒを１１ｍｌ加え、ゆっくりと転倒混和する。
（３）  サンプルとなる細胞上清を９６穴プレートに１００ｍｌ／ｗｅｌｌずつ播種。
（４）  （２）を（３）に１００ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加。
（５）  ３０秒間プレートを攪拌。
（６）  ２２℃で遮光しながら１０分間インキュベート。
（７）  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを５０ｍｌ／ｗｅｌｌ加える。
（８）  １０秒間プレートを攪拌。
（９）  蛍光測定（Ｅｘ＝５６０ｎｍ，Ｅｍ＝５９０  ｎｍ）。
【０１７６】
［超音波出力による影響］
実験方法
（１）  ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように３．５ｃｍ  ｄｉｓｈに２ｍｌずつ細胞懸濁液を入れる。
（２）  ３７℃、５％  ＣＯ２にて２４時間インキュベート。
（３）  培地を捨てて新しい培地を２ｍｌ入れる。
（４）  超音波の条件は１ＭＨｚ、５０％  Ｄｕｔｙ比、３０秒間照射し、その後ＬＤＨ活性を測定した。
【０１７７】
［結果と考察］
超音波強度変化による細胞への影響について結果を示す（図２７）。出力が０．２Ｗ／ｃｍ２あたりから徐々にＬＤＨ値が上昇し、０．８Ｗ／ｃｍ２以上になるとその上昇の仕方も緩やかになっている。この結果と、実施例６でのラジカル捕捉蛍光プローブ試薬のデータから、今回の条件においてＵ．Ｓ．によるキャビテーションの閾値は０．３あるいは０．４Ｗ／ｃｍ２前後にあるのではないかと考えられる。よって次の検討項目として、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を肝細胞に取り込ませ、その後、出力０．２、０．４、０．６Ｗ／ｃｍ２の超音波を当てることで優位な細胞損傷効果を検討してみる。
【０１７８】
［ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の効果］
実験方法
（１）  ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように３．５ｃｍ  ｄｉｓｈに２ｍｌずつ細胞懸濁液を入れる。
（２）  ３７℃、５％  ＣＯ２にて２４時間インキュベート。
（３）  ０．１％のｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を２００ｍｌずつ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２にてさらに６時間インキュベートする。
（４）  培地を捨ててＤＭＥＭにて３回洗浄後、新しい培地を２ｍｌ入れる。
（５）  超音波の条件は１ＭＨｚ、５０％  Ｄｕｔｙ比、３０秒間照射し、その後ＬＤＨ活性を測定した。
【０１７９】
［結果と考察］
ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２とＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法による細胞損傷効果の結果を示した（図２８）。０．２Ｗ／ｃｍ２から出力を強くするごとにどの条件においても出力依存的なデータを得られた。その中でも０．４Ｗ／ｃｍ２の時は、Ｕ．Ｓ．とＰＡ−ＴｉＯ２、ＰＡ−ＴｉＯ２とｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を比較すると優位な差はなかった。しかし、Ｕ．Ｓ．のみとｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を比較するとｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の方が細胞損傷効果において優れていた。一方、０．２Ｗ／ｃｍ２では図２７からも言えるように多くのラジカルは発生しておらず、また０．６Ｗ／ｃｍ２においては逆に出力が強いためどちらの場合も優位な差を得ることが出来なかった。
【０１８０】
［超音波照射時間による影響］
実験方法
（１）  ２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように３．５ｃｍ  ｄｉｓｈに２ｍｌずつ細胞懸濁液を入れる。
（２）  ３７℃、５％  ＣＯ２にて２４時間インキュベート。
（３）  ０．１％のｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を２００ｍｌずつ添加し、３７℃、５％  ＣＯ２にてさらに６時間インキュベートする。
（４）  培地を捨ててＤＭＥＭにて３回洗浄後、新しい培地を２ｍｌ入れる。
（５）  超音波の条件は１ＭＨｚ、５０％Ｄｕｔｙ比、０．４Ｗ／ｃｍ２で０〜６０秒間照射し、その後ＬＤＨ活性を測定した。
【０１８１】
［結果と考察］
照射時間による細胞への影響について検討した（図２９）。この結果、１０秒間照射ではほとんど差を得られず、６０秒間では反対に照射時間が長すぎるのかどの条件でも大きなＬＤＨ値を検出した。一方、３０秒間の照射では、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の方が細胞損傷効果において優れていた。よって、０．４Ｗ／ｃｍ２で３０秒間の照射が最も効果的な照射条件になるのではないかと考えられる。
【０１８２】
［まとめ］
今回の照射条件では、０．４Ｗ／ｃｍ２で３０秒間の照射でｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２が優れた細胞損傷効果を示すというデータを得ることが出来た。しかし、実施例６において、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は肝細胞に特異的なターゲッティング能を示した。また、図２８および図２９においては、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は０．４Ｗ／ｃｍ２の強度で３０秒間の照射を行った場合には、Ｕ．Ｓ．のみおよびＴｉＯ２の場合と比較して優位な細胞損傷効果が見られた。
【０１８３】
上記の実施例１〜７では、ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法を用いたがん治療を目指し、ターゲッティング能を有するナノ粒子の創生および機能評価を行った。その結果、以下の結論が得られた。
・  アミノカップリング法によって肝細胞認識タンパク質ｐｒｅＳ１／Ｓ２を固定化することに成功した。また、この粒子は生体内と同じ環境下でも著しい凝集を見せることなく、安定した粒径を保った。
・  ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、ＳＰＲセンサーによる評価、および肝癌細胞ＨｅｐＧ２を用いた免疫染色法による評価のどちらにおいても優位な特異性を持つことを確認した。
・  ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２存在下における超音波照射の細胞障害効果については、０．４Ｗ／ｃｍ２で３０秒間の照射でＵ．Ｓ．のみおよびＴｉＯ２の場合と比較して優位な細胞損傷効果が見られた。
【０１８４】
すなわち、本発明者らの初めて作製したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、上記の実施例１〜７のように、ポリアクリル酸によってコーティングされたＴｉＯ２上に、Ｂ型肝炎ウィルス由来の分子認識タンパク質ｐｒｅＳ１／Ｓ２をアミノカップリング法によって固定化して得られ、粒径５０〜２００ｎｍで良好な分散性を持ち、若干の凝集は見られるが２４、７２時間後もその分散性を保持することができる。
【０１８５】
また、本発明者らの初めて作製したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、上記の実施例１〜７に示したように、ＳＰＲセンサーによる評価、および肝癌細胞ＨｅｐＧ２を用いた免疫染色法による評価のどちらにおいても、確認肝細胞への特異性を有することが明らかである。
【０１８６】
さらに、本発明者らの初めて作製したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を指標とした検討結果により、０．４Ｗ／ｃｍ２で３０秒間の照射条件で、超音波照射による優れた細胞障害効果を示すことが明らかである。
【０１８７】
したがって、本発明者らの初めて作製したｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、光励起された二酸化チタン（ＴｉＯ２）表面の高い反応性を医療分野に応用することができる。本研究室では、以前にＴｉＯ２に超音波を照射する際に生成するヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が、がん細胞を有意に死滅させることを報告している（二酸化チタン／超音波触媒法（ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法）。その結果とあわせて考えれば、このｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２は、超音波を用いることにより、光の届かない生体内でもがん細胞を死滅させる効果が得られる可能性があると期待される。
【０１８８】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１８９】
たとえば、上記実施例では、ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２に０．４Ｗ／ｃｍ２で３０秒間の照射条件で超音波を照射した場合に超音波照射による優れた細胞障害効果を示したが、他の条件により超音波を照射してもよい。この場合、超音波の振動数（周波数）、照射強度、照射時間を、治療対照、治療目的等に応じて適宜調整することにより、同様に優れた細胞障害効果を示しうるものと想定される。特に、腫瘍細胞に対して優れた細胞障害効果があるため、ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法の改良技術として、新規がん治療として用いることができる可能性があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】Ｂ型肝炎ウィルス（図１ａ）およびＢ型肝炎ウィルスエンベロープ（図１ｂ）の構造を示した模式図である。
【図２】ＴｉＯ２のルチル型、アナターゼ型の結晶構造を示す模式図である。
【図３】ＴｉＯ２の光触媒メカニズムを示す模式図である。
【図４】超音波の性質について説明するための模式図である。
【図５】十分に大きく膨張し自身を維持できなくなり臨界状態に達したキャビティーは、圧力の腹の部分に引き寄せられると急激に圧壊することを説明するための模式図である。
【図６】プラスミドの構築について説明するための模式図である。
【図７】ＰＡ−ＴｉＯ２粒子の粒子径の分布を測定した結果を示すグラフである。
【図８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の定量を行った結果を示す写真および模式図である。
【図９】ゲルろ過クロマトグラフィーの原理について説明するための模式図である。
【図１０】アミノカップリング法によるＴｉＯ２粒子へのタンパク質の固定化法について説明するための模式図である。
【図１１】ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示したグラフである（Ａ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＰｒｅＳ１／Ｓ２，Ｂ：ＰｒｅＳ１／Ｓ２  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃ：  ＰＡ−ＴｉＯ２）。
【図１２】ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質のゲルろ過クロマトグラフィーの結果を示した別のグラフである（Ａ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＰｒｅＳ１／Ｓ２，Ｂ：ＰｒｅＳ１／Ｓ２  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃ：  ＰＡ−ＴｉＯ２）。
【図１３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によるｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質のＰＡ−ＴｉＯ２粒子への固定化の確認について説明するための写真である。
【図１４】ｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質が固定化されたＰＡ−ＴｉＯ２粒子の生体内と同じ環境下での粒子径の変化を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】ＳＰＲセンサー（ＢＩＡＣＯＲＥ）の検出原理を説明するための模式図である。
【図１６】ＢＩＡＣＯＲＥのセンサーグラムの典型を示した模式図である。
【図１７】抗ｐｒｅＳ１抗体によるｐｒｅＳ１／Ｓ２タンパク質の濃度依存性をＢＩＡＣＯＲＥで評価した結果を示すセンサーグラムである。
【図１８】抗ｐｒｅＳ１抗体によるｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２の特異性をＢＩＡＣＯＲＥで評価した結果を示す別のセンサーグラムである。
【図１９】免疫染色法の原理について説明するための模式図である。
【図２０】免疫染色法の手順について簡潔に示した模式図である。
【図２１】抗ＰｒｅＳ１抗体による免疫染色法の結果を示した写真である（Ａ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｒｅＳ１／Ｓ２−ＧＦＰ−ＧＳＴ，Ｂ：ＰｒｅＳ１／Ｓ２  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＧＦＰ−ＧＳＴ（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝５０ｍｍ））。
【図２２】抗ＧＦＰ抗体による免疫染色法の結果を示した写真である（Ａ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｐｒｅＳ１／Ｓ２−ＧＦＰ−ＧＳＴ，Ｂ：ＰｒｅＳ１／Ｓ２  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｃ：ＴｉＯ２  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＧＦＰ−ＧＳＴ（ｓｃａｌｅ  ｂａｒ＝５０  ｍｍ）。
【図２３】ＡＰＦを用いてラジカルを定量する方法の原理を説明するための模式図である。
【図２４】超音波の照射装置を簡単に示す模式図である。
【図２５】ＴｉＯ２／Ｕ．Ｓ．法によって生成されるラジカル量のＴｉＯ２濃度による影響をＡＰＦを用いて調べた結果を示したグラフである。
【図２６】ＬＤＨが細胞膜にダメージを受けた細胞から漏出されると、レサズリン／ジアホラーゼ共役系を介して生成するレゾルフィンの蛍光として定量することができることを説明するための模式図である。
【図２７】ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２を用いて超音波強度変化による細胞への影響についてＬＤＨ測定の結果を示したグラフである。
【図２８】ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２およびＴｉＯ２を用いて超音波強度変化による細胞損傷効果の結果を示したグラフである。
【図２９】ｐｒｅＳ１／Ｓ２固定化ＴｉＯ２およびＴｉＯ２を用いて超音波照射時間による細胞への影響についてＬＤＨ測定の結果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2008195653.tif 000029
【図１８】
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【図１９】
2008195653.tif 000031
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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