(57)【要約】      （修正有）【課題】単独で紫外線障害緩和作用を発揮する、天然の紫外線障害緩和作用物質を配合した皮膚外用剤の提供。【解決手段】マンノプロテインは単独で優れた紫外線障害緩和効果があり、マンノプロテインを配合してなることを特徴とする皮膚外用剤。マンノプロテインは、α−マンナンを主体とするマンナンとタンパク質から構成される糖タンパク質であり、マンノプロテイン放出酵母株を、遠心分離、濾過、エタノール沈殿等の手法により回収し、凍結乾燥糖することにより得られる水溶性の白色無臭の糖タンパク質である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノプロテインを配合してなることを特徴とする皮膚外用剤。
【請求項２】
マンノプロテインが酵母由来である請求項１記載の皮膚外用剤。
【請求項３】
マンノプロテインの含有量が０．００１〜３０％ｗ／ｗである請求項１または２記載の皮膚外用剤。
【請求項４】
マンノプロテインの含有量が０．１〜１０％ｗ／ｗである請求項１または２記載の皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤、さらに詳しくは、紫外線障害緩和用の皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
化粧品素材の中で、単独で紫外線障害緩和作用を有する物質は、従来から、酸化チタン、亜鉛、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ポリフェノール類など多くの物質が知られている。
しかし、化学物質は肌へのダメージを生じる場合もあり、また、ポリフェノールやビタミン類は変色する場合や、かえってラジカルを発生させる場合がある。そこで、肌への影響や社会の天然物志向を鑑みて、天然の紫外線障害緩和作用物質が望まれている。
特許文献１には、コンニャク等の天然物由来のマンナンを配合してなる外用皮膚化粧料が、紫外線焼け等のあとの手入剤として有用であることが開示されている。また、酵母や酵母抽出物を化粧品素材として利用することが種々提案されており、特許文献２には、酵母抽出物や酵母培養上清より選ばれる１種以上の成分を配合した紫外線障害を緩和する皮膚外用剤が開示されているが、これは、チオレドキシンおよび紫外線遮断剤との併用を必要としている。
一方、酵母の細胞壁中には、マンノプロテインを主体とする水溶性多糖類が存在し、それらが、制癌作用、抗腫瘍作用、抗感染作用等、種々の生理活性を有することが知られており、本出願人の特許文献３には、酵母の細胞壁に天然に存在する状態に近いマンノプロテイン製造法が開示されている。
【特許文献１】特開昭５３−１２４２８号公報
【特許文献２】特開２００４−２４８４号公報
【特許文献３】国際公開第２００６／０２５２９５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、単独で紫外線障害緩和作用を発揮する、天然の紫外線障害緩和作用物質を配合した皮膚外用剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意研究を重ねた。その結果、上記特許文献３の製造法で得られるマンノプロテインが単独で優れた紫外線障害緩和作用を発揮することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）マンノプロテインを配合してなることを特徴とする皮膚外用剤、
（２）マンノプロテインが酵母由来である上記（１）記載の皮膚外用剤、
（３）マンノプロテインの含有量が０．００１〜３０％ｗ／ｗである上記（１）または（２）記載の皮膚外用剤、および
（４）マンノプロテインの含有量が０．１〜１０％ｗ／ｗである上記（１）または（２）記載の皮膚外用剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００６】
酵母の細胞壁由来のマンノプロテインは、天然物質であり、物性は、白色、無臭、水溶性である。
このマンノプロテインは、ヒト表皮細胞において細胞賦活活性があり、紫外線（ＵＶＢ）を照射した時の表皮の細胞死を抑制する。このメカニズムは、細胞の抗酸化酵素の発現を有意に誘導すると考えられ、マンノプロテインを含有する皮膚外用剤は、紫外線を直接防御する日焼け止めとは異なり、常日頃から使用することで、細胞を活性化して、紫外線耐性肌を造ることができる。さらに紫外線照射によって生じるしみ、しわ、そばかす等が少ない美肌を維持することができ、抗老化外用剤としても有用である。また、細胞毒性が低いことから、肌へのダメージがほとんどなく、白色無臭であることから、高濃度で添加することも可能であるため、肌触り等の物性的にも好ましく、より高い効果が期待できる皮膚外用剤とすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明の皮膚外用剤において、紫外線障害緩和作用物質として用いるマンノプロテインは、α−マンナンを主体とするマンナンとタンパク質から構成される糖タンパク質であり、特に限定するものではないが、その代表的例として、上記特許文献３に記載される製造法で得られるマンノプロテインが挙げられる。すなわち、マンノプロテイン放出酵母株を、適宜の培地で培養し、培地に放出されたマンノプロテインを、遠心分離、濾過、エタノール沈殿等の手段により回収し、凍結乾燥等することにより得られる。得られるマンノプロテインは、水溶性の白色無臭の糖タンパク質で、例えば、約１０％程度のタンパク質を含有する。
本発明においては、マンノプロテインを紫外線障害緩和作用物質として、皮膚外用剤全量に対して、通常、０．００１〜３０％ｗ／ｗ、好ましくは０．１〜１０％ｗ／ｗの割合で配合する。
【０００８】
他の配合成分は、本発明の目的に反しない限り、特に限定するものではなく、各種の賦形剤を配合でき、また、他の生理活性成分を配合してもよい。
【０００９】
本発明の皮膚外用剤は、自体公知の方法により、所望の成分を処方することにより製造でき、ローション、乳液、ゲル、クリーム、軟膏、顆粒、粉末等の剤形の化粧料や医薬品とすることができる。
【００１０】
本発明の皮膚外用剤は、紫外線照射時の皮膚表皮の細胞死を抑制するだけにとどまらず、細胞を活性化し皮膚の紫外線耐性を高めることができるので、常用することにより、細胞を活性化して、紫外線耐性肌を造ることができる。さらに紫外線照射によって生じるしみ、しわ、そばかす等が少ない美肌を維持することができ、抗老化外用剤としても使用できる。
以下に、参考例、試験例、実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
参考例１
【００１１】
マンノプロテイン放出酵母株（Saccharomyces cerevisiae AB9：国際寄託番号BP-10390）を合成培地（Difco社、Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid 0.67%、Glucose 2%、アミノ酸0.13%）中で３０℃、ｐＨ５．５において、攪拌下、通気しながら７２時間培養した。培養液を遠心分離し、上清を濾過して菌体を除去し、６０％以上の濃度エタノールを用いてエタノール沈殿させ、沈殿物に適当量の水を加えてマンノプロテイン水溶液を得た。これを凍結乾燥して白色粉末状のマンノプロテインを得た。これは、ゲル濾過による平均分子量が約４００ｋＤａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる平均分子量が２５０ｋＤａ以上の糖タンパク質であり、全体の約８５％が主としてマンノースを構成糖とする糖類で、残りがほぼタンパク質であった。
試験例１
【００１２】
細胞賦活活性
ヒト表皮細胞を播種した後、参考例１のマンノプロテインを含むＫＢ２培地（ＫＧ２から成長因子を除いた基本培地（倉敷紡績（株）））にて４８時間培養した。培養後、０．４ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（3-(4,5-Dimethyl-2-thiazoll)2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を含有するＫＢ２培地に交換し、２時間培養した。培地を除去したのち、２−プロパノールを添加して溶解した細胞溶解液の吸光度（O.D.=550nm）を測定することによりＭＴＴ還元量を求め、賦活作用の指標（Index）とした。MTT還元量は試料を無添加培養細胞(コントロール)の吸光度を100とした百分率、Index (%)で表した。統計処理はStudent t検定をもちいた有意差検定を行った。
結果を表１および図１に示す。
【表１】
2008222655.tif 000002
1):  ポジティブ  コントロール  KG2培地（倉敷紡績（株））
2):  マンノプロテイン未処理細胞に対する有意差
表１および図１の結果、０．０３１〜０．４８８μｇ／ｍＬの低濃度のマンノプロテイン処理範囲でも有意な細胞賦活作用が認められた。
試験例２
【００１３】
紫外線（ＵＶＢ）障害緩和作用
（１）マンノプロテイン共存下におけるＵＶＢ曝露
ヒト表皮細胞をＫＧ２培地にて２４時間培養後、マンノプロテインを添加したハンクス緩衝液に交換し、２０ｍＪ／ｃｍ２にてＵＶＢ照射を行った。照射後、再度ＫＧ２培地に交換した。さらに２４時間培養後、細胞の生存率をニュートラルレッド法にて測定した。
ＵＶＢ照射したマンノプロテイン未添加に対して危険率１％未満の有意差がつくほどのＵＶＢ障害緩和作用が認められた。
結果を表２および図２に示す。
【表２】
2008222655.tif 000003
1):ＵＶＢ未照射・マンノプロテイン未処理細胞。
2):２０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射・マンノプロテイン未処理細胞。
3):２０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射・マンノプロテイン未処理細胞に対する各生存率の有意差 ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
表２および図２から、０．６２５〜１０．０００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で、いずれも有意なＵＶＢ障害緩和作用が容量依存的に認められた。特にマンノプロテイン１０ｍｇ／ｍＬでは、０ｍｇ／ｍＬより３０％以上も生存率が増加し、高い活性を有することが確認された。
【００１４】
（２）マンノプロテイン前処理後におけるＵＶＢ曝露
ヒト表皮細胞をＫＧ２培地にて２４時間培養後、マンノプロテインを添加したＫＧ２培地に交換した。２４時間後、ハンクス緩衝液に交換し、１５ｍＪ／ｃｍ２にてＵＶＢ照射を行った。照射後、再度ＫＧ２培地にて、さらに２４時間培養後、細胞の生存率をニュートラルレッド法にて測定した。  結果を表３および図３に示す。
【表３】
2008222655.tif 000004
1):ＵＶＢ未照射・マンノプロテイン未処理細胞。
2):１５ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射・マンノプロテイン未処理細胞。
3):１５ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢ照射・マンノプロテイン未処理細胞に対する各生存率の有意差  ＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
表３および図３から、５．０００および１０．０００ｍｇ／ｍＬの濃度において、ＵＶＢ照射したマンノプロテイン未添加に対して有意差がつくほどの高いＵＶＢ障害緩和作用があることが認められた。ＵＶＢ照射時にマンノプロテインが共存していなくても生存率を有意に増加したことは、マンノプロテインが細胞に対して、ＵＶＢによる酸化ストレス耐性を付加するためと考えられる。
さらに、ＵＶＢ照射時のマンノプロテイン共存下あるいは非共存下におけるＵＶＢ障害緩和作用を比較すると、共存下の方がその作用は強いことが確認された。従ってマンノプロテインには、酸化ストレス耐性付加作用だけでなく、多糖類としての糖結合により、ＵＶＢ照射により生じたラジカルを消去する作用、あるいはＵＶＢ吸収などのサンスクリーン効果を保持する可能性も考えられる。
試験例３
【００１５】
ヒト表皮細胞における抗酸化酵素群発現（Catalase、CuZn SOD、γGCS）に対する作用評価
ヒト表皮細胞をマンノプロテインを添加したＫＧ２培地にて２４時間処理した。培養後、各細胞より調製したtotal ＲＮＡに対して逆転写酵素による反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより、各抗酸化群遺伝子の発現量比較を行った。遺伝子発現量はインターナルコントロールであるＧＡＰＤＨの発現量にて除することにより補正した。
結果を表４、５および６、図４，５および６に示す。
【表４】
2008222655.tif 000005
1):  マンノプロテイン未処理細胞に対する有意差。
濃度２．５０００〜１０．０００ｍｇ／ｍＬの範囲でいずれも有意に増加した。
【表５】
2008222655.tif 000006
【表６】
2008222655.tif 000007
1):  マンノプロテイン未処理細胞に対する有意差。
濃度２．５００〜１０．０００ｍｇ／ｍLの範囲でいずれも有意差が認められた。
【００１６】
表４〜６および図４〜６にから、マンノプロテイン処理により、CatalaseおよびγＧＣＳ、mＲＮＡの有意な発現増加が認められた（表４および表６）。一方、ＣｕＺｎ ＳＯＤに関しても、有意差は得られなかったが、発現増加傾向が観察された（表５）。よってマンノプロテインは、抗酸化酵素群に対する高い発現促進作用を有していることが示唆された。
実施例１
【００１７】
グリセリン２．５ｍL、キサンタンガム０．５ｇ、マンノプロテイン０．２５ｇを混合し、これに精製水５０ｍｌを添加し、ゲル化させて、無色透明なゲル状の皮膚外用剤を得た。
実施例２
【００１８】
マンノプロテインを２．５ｇ使用する以外は、実施例１と同様にして、無色透明なゲル状の皮膚外用剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００１９】
以上記載したごとく、本発明によれば、紫外線照射時の皮膚表皮の細胞死を抑制するだけにとどまらず、細胞を活性化し皮膚の紫外線耐性を高めることができる天然の紫外線障害緩和作用物質を配合した、化粧料や医薬品として有用な皮膚外用剤が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】表１のデータに基づく低濃度試験試料の表皮細胞に対する賦活作用を示すグラフである。
【図２】表２のデータに基づく試料共存下におけるＵＶＢ障害に対する緩和作用を示すグラフである。
【図３】表３のデータに基づく試料前処理におけるＵＶＢ障害に対する緩和作用を示すグラフである。
【図４】表４のデータに基づくCatalase mRNA発現に対する各試料の作用を示すグラフである。
【図５】表５のデータに基づくCuZn mRNA発現に対する各試料の作用を示すグラフである。
【図６】表６のデータに基づくγGCS mRNA発現に対する各試料の作用を示すグラフである。
【図１】
2008222655.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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