(57)【要約】【課題】  微生物を用いて３級アルコール誘導体の分解を行う方法において、３級アルコール誘導体を迅速に分解することができる方法を提供する。【解決手段】  ３級アルコール誘導体の分解方法であって、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を分解できる微生物を用い、分解促進剤の存在下で３級アルコール誘導体を分解することを特徴とする方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
３級アルコール誘導体の分解方法であって、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を分解できる微生物を用い、分解促進剤の存在下で３級アルコール誘導体を分解することを特徴とする方法。
【請求項２】
分解促進剤がメタノール、C２〜C８の１級アルコール、C３〜C８の２級アルコール、C１〜C８のジオール、C３〜C８のケトン、C１〜C８のヒドロキシカルボン酸、C１〜C８のモノカルボン酸、C２〜C８のジカルボン酸、またはC４〜C８の３級アルコールである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
３級アルコール誘導体がエチルターシャリーブチルエーテルである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
微生物が硫酸還元菌または硝酸還元菌である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、嫌気的条件下で微生物を用いて３級アルコール誘導体を分解する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガソリンのオクタン価向上剤として、含酸素化合物であるアルコール類やエーテル類が用いられている。中でも３級アルコール誘導体であるターシャリーブチルエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ターシャリーアミルメチルエーテルはエタノールと比較して吸水性が低く、ガソリンとの分離がおきにくい、金属腐食が少ないなどの利点が多い。そのため、ガソリン車の改造や運搬、輸送設備の改造等が少なくてよいという利点も多い。
【０００３】
しかしながら、３級アルコールあるいはその誘導体であるターシャリーブチルエチルエーテル、ターシャリーブチルメチルエーテル、ターシャリーアミルメチルエーテルは生分解を受けにくく、土壌や水中に漏洩した場合、環境汚染の発生が懸念されている。
【０００４】
また、ターシャリーブチルエチレングリコール類は消火剤の成分や界面活性剤、可塑剤として広く用いられている。さらに、熱に対する安定性の高いことから、潤滑油として用いられることもある。しかし、化学消火剤として使用された場合には、土壌中や水系に流出し、環境汚染を引き起こす原因にもなる。
【０００５】
難分解性物質を環境中から除去する方法としては、活性炭による吸着やRO膜による分離などの物理的方法がある。また、オゾンや過酸化水素と水中UVランプあるいは酸化チタンを組み合わせて行う光化学的分解がある。また、過マンガン酸塩による化学的酸化や２価の鉄塩と過酸化水素を組み合わせたフェントン反応によるラジカル分解も知られている。一方、３級アルコールあるいはその誘導体は難分解性ではあるが、生分解を全く受けないわけではない。特に好気的条件下での微生物分解が報告されている（非特許文献１，２を参照）。これらの３級アルコールを分解する好気性微生物は、３級アルコール誘導体を資化して増殖するタイプと、３級アルコール誘導体を資化できずに、他の栄養源を炭素源にして増殖し、その際共酸化により分解するタイプの二つのタイプに分けられる。
【０００６】
３級アルコール誘導体を資化するタイプの微生物は３級アルコール誘導体そのものの溶媒効果や毒性が微生物に作用し、高濃度の３級アルコール誘導体を分解しにくいため、低濃度条件下でのみ増殖するという傾向が強い。結果として、微生物の菌濃度が高まらず分解が遅いという問題がある。
【０００７】
一方、共酸化で分解するタイプの微生物はプロパン、ブタンをはじめとするアルカン、イソアルカン、シクロアルカン等の炭化水素を炭素源として増殖する微生物を用いている。しかし、これらのアルカンは微生物が共酸化のエネルギーを獲得するために炭化水素を酸化する必要があり、その際エネルギーを消費するために、結果的に増殖が悪い、あるいは共酸化する際、エネルギー不足で、共酸化能力があるにも関わらず３級アルコール誘導体を分解できないか分解速度が遅いといった問題があった。
【０００８】
嫌気的条件下で３級アルコールはゆっくりとした速度で分解されるという報告と分解されなかったという報告がある。土壌の深部や汚れて酸素の少ない水域の低泥中には酸素が極めて乏しいため、好気性菌による分解が期待しにくい地域もある。嫌気的に３級アルコール誘導体を分解するためには、共酸化という分解手段を使うことが考えられる。しかし
、共酸化できる微生物だけを加えても、それらの微生物の増殖を促したり、分解を加速したりするための手段を講じないと、分解、浄化までには至らない。
【０００９】
そこで、嫌気的条件下で微生物を用いて３級アルコール誘導体汚染を浄化するための新たな方法が望まれていた。
【００１０】
【非特許文献１】Foyolle，et al.，（2001）Appl.Microbio.Biotechnol.，56，339-349
【非特許文献２】Kharoune，et al.，（2002）Environ.Toxcol.Chem.21，2052-2058
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記観点からなされたものであり、嫌気的条件下で微生物を用いて３級アルコール誘導体を効率的に分解する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、嫌気的条件下で、３級アルコール誘導体の分解を促進するための方法を提供する。すなわち、本発明は、３級アルコール誘導体の分解を行う能力のある嫌気性微生物を用いて３級アルコール誘導体を分解するときに、メタノール、C２〜C８の１級アルコール、C３〜C８の２級アルコール、C１〜C８のジオール、C３〜C８のケトン、C１〜C８のヒドロキシカルボン酸、C１〜C８のモノカルボン酸、C２〜C８のジカルボン酸、またはC４〜C８の３級アルコールなどの分解促進剤を添加すると、３級アルコール誘導体の分解が促進されるという知見に基づく、３級アルコール誘導体を分解する方法を提供するものである。
【００１３】
すなわち、本発明の要旨は、以下の通りである。
（１）３級アルコール誘導体の分解方法であって、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を分解できる微生物を用い、分解促進剤の存在下で３級アルコール誘導体を分解することを特徴とする方法。
（２）分解促進剤がメタノール、C２〜C８の１級アルコール、C３〜C８の２級アルコール、C１〜C８のジオール、C３〜C８のケトン、C１〜C８のヒドロキシカルボン酸、C１〜C８のモノカルボン酸、C２〜C８のジカルボン酸、またはC４〜C８の３級アルコールであるである、（１）記載の方法。
（３）３級アルコール誘導体がエチルターシャリーブチルエーテルである（１）または（２）記載の方法。
（４）微生物が硫酸還元菌または硝酸還元菌である（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
３級アルコール誘導体を資化または共酸化で分解する微生物が存在する環境下に、エネルギー源などの分解促進剤を添加することで、分解時間を短縮できるほか、より高い濃度の汚染に対処できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の３級アルコール誘導体の分解方法は、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を分解できる微生物を用い、分解促進剤の存在下で３級アルコール誘導体を分解することを特徴とする方法である。
【００１６】
例えば、３級アルコール誘導体を含む試料に、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を分解できる微生物と分解促進剤を加えて反応させる３級アルコール誘導体の分解を行うこ
とができる。ここで、試料とは、３級アルコール誘導体が含まれている土壌および／または水などが挙げられ、３級アルコール誘導体を含むものであれば全て対象となり得る。
【００１７】
また、本発明で分解の対象とする３級アルコール誘導体としては、特に制限されないが、３級アルコールエーテルを挙げることができる。例えば、３級アルコールエーテルとしては、ターシャリーブチルエーテル、ターシャリーアミルエーテルを挙げることができ、さらに具体的には、メチルターシャリーブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、エチルターシャリーブチルエーテル（ＥＴＢＥ）、ジエチレングリコールターシャリーブチルエーテル、ターシャリーアミルメチルエーテル、ターシャリーアミルエチルエーテルを挙げることができる。この中では、エチルターシャリーブチルエーテルがより好ましい。
【００１８】
本発明の３級アルコール誘導体の分解方法に用いられる微生物としては、３級アルコール誘導体を資化することにより３級アルコール誘導体を分解する能力を有する微生物、或いは共酸化により３級アルコール誘導体を分解する能力を有する微生物を挙げることができる。これらの微生物としては、硫酸還元菌、硝酸還元菌、およびメタン細菌などが挙げられ、この中では、硫酸還元菌および硝酸還元菌が好ましい。硫酸還元菌としては、具体的には、Desulfovibrio属（例えば、Desulfovibrio alaskensis、Desulfovibrio desulfuricansおよびDesulfovibrio grigas）、Desulfobacter属、Desulfotomaculum属に属する菌が挙げられる。硝酸還元菌は、脱窒細菌とも呼ばれ、硝酸還元菌しては、Propionibacterium属、Paracoccus属（例えば、Paracoccus denitrificans）、Micrococcus属（例えば、Micrococcus denitrificans）に属する菌が挙げられる。メタン細菌としては、Methanobacterium属（例えば、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium omelianskii、Methanobacterium propionicum、Methanobacterium sohngenii、およびMethanobacterium
suboxydans）、Methanococcus属（例えば、Methanococcus mazeiおよびMethanococcus vanielii）、Methanosarcina属（例えば、Methanosaricina methanicaおよびMethanosaricina barkerii）に属する菌が挙げられる。
【００１９】
本発明の方法において用いられる微生物は、好ましくは、Desulfovibrio属およびParacoccus属の微生物であり、最も好ましくは、Desulfovibrio alaskensis (NCIMB 13491) およびParacoccus denitrificans (DSM 1406) である。これらの微生物は、NCIMB (The National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria: Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen A B21 9YA, Scotland)またはDSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: Inhoffenstraβe 7B 38124 Braunschweig GERMANY)より入手可能である。本発明の方法において反応系に存在させる微生物の濃度としては、好ましくは１０3〜１０12ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは１０4〜１０11ＣＦＵ／ｍｌ、さらに好ましくは１０5〜１０10ＣＦＵ／ｍｌである。
【００２０】
本発明においては、上記の菌の他、その自然もしくは人工的手段によって変異させて得られる変異株であっても、前記した能力を有するものはすべて本発明に使用できる。
【００２１】
分解促進剤としては、例えば、メタノール、C２〜C８の１級アルコール、C３〜C８の２級アルコール、C１〜C８のジオール、C３〜C８のケトン、C１〜C８のヒドロキシカルボン酸、C１〜C８のモノカルボン酸、C２〜C８のジカルボン酸、またはC４〜C８の３級アルコールから選ばれる炭素源を挙げることができる。より詳しくは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ギ酸、酢酸、吉草酸、２−プロパノール、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、アセトン、メチルエチルケトン、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。本発明の分解促進剤は、反応系に、好ましくは５ｍｇ〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ／Ｌの濃度で添加される。
【００２２】
また、本発明の分解方法においては、反応系にさらに分解促進剤として、窒素源、リン源、または金属塩等からなる無機栄養源を加えてもよい。窒素源としては、硝酸塩、アンモニウム塩等の無機態窒素、尿素、アミノ酸等の有機態窒素が挙げられる。リン源としては、リン酸カリウム等のリン酸塩が挙げられる。金属塩としては、カリウム、マグネシウム、コバルト、銅、ニッケル等の金属の塩が挙げられる。このような上記無機栄養源は、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは１０ｍｇ〜１ｇ／Ｌの濃度で添加される。
【００２３】
本発明の３級アルコール誘導体の分解方法は、３級アルコール誘導体により汚染された土壌および／または水などの試料に対し、分解促進剤を注入し、嫌気的条件下で上記したような微生物を存在させることで行う。ここで、存在させるとは、微生物と３級アルコール誘導体と分解促進剤とを注入、混合或いは混練等により、これらを一つの反応系に共存させることをいい、共存には、微生物と３級アルコール誘導体と分解促進剤とを接触させる態様を含む。微生物と３級アルコール誘導体と分解促進剤との共存は、具体的には、例えば、分解対象物である３級アルコール誘導体を含む土壌や水中に、分解促進剤を加え、微生物を該微生物の培養条件下に維持しておくというのがよい。尚、微生物が、例えば、３級アルコール誘導体の分解に関与する酵素を菌体外に分泌するような場合には、３級アルコール誘導体が直接菌体に接触することがなくとも３級アルコール誘導体の分解が行われるが、本発明はこのような態様も含むものである。
【００２４】
このようにして、微生物を、そのまま或いは水溶液に懸濁又は溶解して、３級アルコール誘導体により汚染された土壌及び／又は水に存在させると、３級アルコール誘導体は分解され、汚染された土壌及び／又は水を浄化することができる。
【００２５】
本発明の３級アルコール誘導体の分解方法において、共酸化により３級アルコール誘導体が分解される場合には、微生物と３級アルコール誘導体との共存箇所に、上記の分解促進剤とともに、その他の炭素源などのエネルギー源を存在させてもよい。また、３級アルコール誘導体を資化し増殖するタイプの微生物を用いて３級アルコール誘導体を分解する場合においても、炭素源をエネルギー源として存在させてもよい。また、共酸化による場合であっても、３級アルコール誘導体を資化する場合であっても、３級アルコール誘導体が含まれている土壌及び／又は水などの試料に対し、通常微生物の培養の際に培地に含ませることができる窒素源、リン源、又は金属塩等からなる無機栄養源をエネルギー源として存在させてもよい。
【００２６】
なお、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を資化または共酸化で分解する微生物は、土壌や水などの試料中にはごく少量ではあるが存在している場合が多く、単に分解促進剤を加えるだけでも分解反応を行うことができる。
【００２７】
本発明の微生物が存在していない場合には、人為的に分離し、培養した微生物を添加して、すでに３級アルコール誘導体で汚染されている土壌や水、あるいは活性汚泥処理設備の汚泥などの試料を加えることにより、分解反応を行うことができる。
【００２８】
本発明の３級アルコール誘導体の分解方法において、３級アルコール誘導体の分解を促進するために、さらに、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、又はそれらの誘導体を用いることができる。具体的には、３級アルコール誘導体により汚染された土壌および／または水に対し、微生物の他にポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、又はそれらの誘導体を存在させる。すると、３級アルコール誘導体の分解を早めることができる。
【００２９】
上記のような分解を促進するために用いられるポリエチレングリコールの誘導体としては、具体的には、ポリプロピレンオキシドやポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステ
ルが挙げられ、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、より具体的には、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等が挙げられる。
【００３０】
本発明において、３級アルコール誘導体の分解は、用いる微生物の培養条件にもよるが、一般には温度１０〜５０℃、ｐＨ４〜９の範囲内で行われる。
【００３１】
本発明において、嫌気的条件とは、土壌内、汚泥などの酸素濃度を低く抑えられた条件、酸素のない条件を意味する。具体的には、酸素濃度が、反応系において、好ましくは０〜２ｐｐｍ、より好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍであることをいう。地下水や土壌中では好気性微生物の働き、化学的酸化等により、特に酸素を注入しない限り、嫌気条件下になりやすい。
【００３２】
（実施例）
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【実施例１】
【００３３】
エチルターシャリーブチルエーテル（ＥＴＢＥ）を分解できるDesulfovibrio   alaskensis (NCIMB 13491) をブイヨン培地を用いて３０℃、７２時間、窒素雰囲気下で培養した。培養後、培養液１Ｌを８０００Gで１５分間遠心分離を行い、次いで、表１に示す培地２５０ｍｌに菌体を懸濁した。この懸濁液にエチルターシャリーブチルエーテル１００μｌを添加し、２５℃、窒素雰囲気下で１２時間振とうした。この懸濁液を遠心分離し、表１の培地１Lに懸濁し遠心分離を行い、洗浄した。菌体を再度同じ培地２５０ｍｌに懸濁し、懸濁液のODを測定しながら、菌濃度を２×１０7ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈した。一方、種々のエネルギー源を表１の培地に溶かし、酸性物質の場合にはｐHを７に水酸化ナトリウムで調整した液を作製し、試験管に１ｍｌずつ分注した。上記菌体の懸濁液にエチルターシャリーブチルエーテルを２．４ｍｇ／Lになるように添加し、得られた３級アルコール誘導体と菌体を含む液を、上記エネルギー源を溶かした培地が１ｍｌずつ分注された試験管に４９ｍｌずつ入れ、すみやかに水浴中、窒素雰囲気下で１６時間振とうした。１６時間後、順次氷水中に入れて分解を停止し、ガスクロマトグラフィーにて液中の濃度を定量した。
また、比較例として、エネルギー源を加えなかったこと以外は同様の操作を行った。
【００３４】
エネルギー源の種類          濃度（ｇ／Ｌ）          残留ＥＴＢＥ量（ｍｇ／Ｌ）
ギ酸                          ３                        １．６１
酢酸                          ３                        １．７８
乳酸                          ３                        １．５９
ピルビン酸                    ３                        １．９８
１，２−プロパンジオール      ３                        １．７０
アセトン                      ２                        １．９２
リンゴ酸                      ３                        １．７１
無添加（比較例）                                        ２．２７
【００３５】
表１．硫酸還元菌培地
ペプトン                                      ５ｇ
ビーフエキス                                  ３ｇ
酵母エキス                                ０．２ｇ
ブドウ糖                                      ５ｇ
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ                        １．５ｇ
Ｎａ2ＳＯ4                                １．５ｇ
Ｆｅ2（ＳＯ4）・（ＮＨ4）2ＳＯ4・２４Ｈ2Ｏ  ０．１ｇ
蒸留水                                        １Ｌ
ｐＨ７
【実施例２】
【００３６】
メチルターシャリーブチルエーテル（ＭＴＢＥ）を分解できるParacoccus denitrificans (DSM 1406) をブイヨン培地を用いて３０℃、７２時間培養した。培養後、培養液１Ｌを８０００Gで１５分間遠心分離を行い、次いで、表２に示す培地２５０ｍｌに菌体を懸濁した。この懸濁液にメチルターシャリーブチルエーテル１００μｌを添加し、２５℃で１２時間振とうした。この懸濁液を遠心分離し、表２の培地１Lに懸濁し遠心分離を行い、洗浄した。菌体を再度同じ培地２５０ｍｌに懸濁し、懸濁液のODを測定しながら、菌濃度を２×１０7ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈した。一方、種々のエネルギー源を表２の培地に溶かし、酸性物質の場合にはｐHを７に水酸化ナトリウムで調整した液を作製し、試験管に１ｍｌずつ分注した。上記菌体の懸濁液にエチルターシャリーブチルエーテルを２．４ｍｇ／Lになるように添加し、得られた３級アルコール誘導体と菌体を含む液を、上記エネルギー源を溶かした培地が１ｍｌずつ分注された試験管に４９ｍｌずつ入れ、すみやかに水浴中で１６時間振とうした。１６時間後、順次氷水中に入れて分解を停止し、ガスクロマトグラフィーにて液中の濃度を定量した。
また、比較例として、エネルギー源を加えなかったこと以外は同様の操作を行った。
【００３７】
エネルギー源の種類                濃度        残留ＭＴＢＥ量（ｍｇ／Ｌ）
メタノール                    ４ｍｌ／Ｌ          ０．３
ギ酸                          ２ｇ／Ｌ            １．１
酢酸                          ３ｇ／Ｌ            ０．８
１，２−プロパンジオール      ３ｇ／Ｌ            １．７
ピルビン酸                    ３ｇ／Ｌ            １．９
リンゴ酸                      ３ｇ／Ｌ            １．３
無添加（比較例）                                  ２．３
【００３８】
表２．脱窒細菌培地
ペプトン              １０ｇ
酵母エキス              ５ｇ
ジャガイモ抽出物      ２５ｇ
ブドウ糖                ３ｇ
グリセリン            １５ｇ
ＮａＣｌ                ３ｇ
硝酸ナトリウム          ５ｇ
蒸留水                  １L
ｐH７．０
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明により、嫌気的条件下で３級アルコール誘導体を迅速に分解することができる。従って、本発明は、３級アルコール誘導体で汚染された土壌や水を浄化することができ、各種石油（化学）産業に関連する分野、工場等からの排水処理に関連する分野、ガソリンスタンド等石油取り扱い施設に関連する分野、或いは消火剤廃液や切削油廃液の処理に関連する分野などに適用することができる。