(57)【要約】      （修正有）【課題】β１インテグリン活性化作用を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルス、並びに、これらを有効成分として含有する、β１インテグリンを活性化する薬剤、β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する薬剤等の薬剤を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列からなり、β１インテグリンを活性化する作用を有するペプチド。該ペプチドやそれをコードするポリヌクレオチド等は、β１インテグリン活性化剤、細胞接着増強剤、傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、細胞死誘導剤、及び抗腫瘍剤等に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを除く。）。
【請求項２】
配列番号３〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３】
配列番号１０〜１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターが導入され、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを分泌する細胞。
【請求項７】
請求項５に記載の組換えベクターが導入され、細胞に感染することにより請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドを前記細胞に分泌させるウイルス。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有するβ１インテグリン活性化剤。
【請求項９】
β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する細胞接着増強剤であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する細胞接着増強剤。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する外傷修復剤。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する脂肪細胞分化抑制剤。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する肥満予防剤又は肥満抑制剤。
【請求項１３】
浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する細胞死誘導剤であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する細胞死誘導剤。
【請求項１４】
Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチドをさらに含有することを特徴とする請求項１３に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１５】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含有することを特徴とする請求項１３に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１６】
細胞外マトリックスをさらに含有することを特徴とする請求項１３に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１７】
フィブロネクチンまたは多量体フィブロネクチンをさらに含有することを特徴とする請求項１３に記載の細胞死誘導剤。
【請求項１８】
浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤であって、
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載の組換えベクター、請求項６に記載の細胞、及び請求項７に記載のウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【請求項１９】
Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチドをさらに含有することを特徴とする請求項１８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２０】
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをさらに含有することを特徴とする請求項１８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２１】
細胞外マトリックスをさらに含有することを特徴とする請求項１８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２２】
フィブロネクチンまたは多量体フィブロネクチンをさらに含有することを特徴とする請求項１８に記載の抗腫瘍剤。
【請求項２３】
浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する細胞死誘導剤であって、
多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する細胞死誘導剤。
【請求項２４】
浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤であって、
多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β１インテグリン活性化作用を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルス、並びに、これらを有効成分として含有する、β１インテグリンを活性化する薬剤、β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する薬剤、傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、細胞死誘導剤、及び抗腫瘍剤、並びに、多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
β１インテグリンを活性化する作用を有する物質として、従来、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1231〜1236番目のアミノ酸配列を有するペプチド、例えば、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1218〜1238番目のアミノ酸配列からなるペプチドが知られているが、このようなβ１インテグリンを活性化するペプチドは、β１インテグリンを介して細胞が細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に接着する細胞接着の増強、細胞伸展の促進、創傷の治癒、術後組織の修復、肥満の改善、がん治療、感染症治療、骨髄抑制等の免疫抑制状態の治療、エリスロジェネシスなどに有用であることが報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１など参照）。
【特許文献１】特開２００１−２１３８９８号公報
【非特許文献１】Biochemistry 2002, 41, 3270-3277
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、β１インテグリン活性化作用を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルス、並びに、これらを有効成分として含有する、β１インテグリンを活性化する薬剤、β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する薬剤、傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、細胞死誘導剤、及び抗腫瘍剤、並びに、多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、配列番号１０〜２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドのうち、配列番号１０〜１５に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、ヒト由来のテネシンＣ（GenBank Accession No. NP_002151）の1218〜1238番目のアミノ酸配列からなるペプチド（以下「TNIIIA2」と称する。配列番号２参照）のＣ末端にシステイン（Ｃ）を付加したペプチド（配列番号９参照）と同様にβ１インテグリンを活性化し、配列番号１６〜２０に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、β１インテグリンを活性化できないことを見出した。
【０００５】
また、本発明者は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドが、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する作用を有することを見出した。
【０００６】
さらに、本発明者は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを８分子櫛形に結合したＭＡＰ（以下、「(ＲＧＤ)８」と称する。）、あるいは、フィブロネクチン（特に、多量体フィブロネクチン）とともに浮遊性腫瘍細胞に作用させることにより細胞死を効率よく誘導できることを見出した。
【０００７】
また、本発明者は、多量体フィブロネクチンが、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する作用を有することを見出した。このようにして、本発明者は本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明に係るペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。但し、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを除く。なお、本発明に係るペプチドは、例えば、配列番号３〜８のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号１０〜１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド等である。
【０００９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
【００１０】
本発明に係る組換えベクターは、上記ポリヌクレオチドを有する。
【００１１】
本発明に係る細胞は、上記組換えベクターが導入されており、上記ペプチドを分泌する。
【００１２】
本発明に係るウイルスは、上記組換えベクターが導入されており、細胞に感染することにより上記ペプチドを前記細胞に分泌させる。
【００１３】
本発明に係るβ１インテグリン活性化剤は、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。
【００１４】
また、本発明に係る細胞接着増強剤は、β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する薬剤であって、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。
【００１５】
さらに、本発明に係る外傷修復剤は、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。
【００１６】
本発明に係る脂肪細胞分化抑制剤は、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。
【００１７】
また、本発明に係る肥満予防剤及び肥満抑制剤は、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。
【００１８】
本発明に係る細胞死誘導剤は、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する薬剤であって、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。本発明に係る細胞死誘導剤は、Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチド（例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド等）、細胞外マトリックス（例えば、フィブロネクチン等）などをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る細胞死誘導剤は、多量体フィブロネクチンをさらに含んでいてもよい。
【００１９】
本発明に係る抗腫瘍剤は、浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する薬剤であって、上記ペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルスからなるグループから選ばれる物質を１又は２以上有効成分として含有する。本発明に係る抗腫瘍剤は、Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチド（例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド等）、細胞外マトリックス（例えば、フィブロネクチン等）などをさらに含んでいてもよい。また、本発明に係る抗腫瘍剤は、多量体フィブロネクチンをさらに含んでいてもよい。
【００２０】
本発明に係る細胞死誘導剤は、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する薬剤であって、多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する。
【００２１】
また、本発明に係る抗腫瘍剤は、浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する薬剤であって、多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する。
【００２２】
なお、本願明細書において「腫瘍細胞に作用させる」とは、上述のペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、ウイルスなどを、添加又は投与することにより腫瘍細胞に細胞死を誘導させる作用を発揮させることをいい、対象となる腫瘍細胞は、培養細胞であっても、個体内の細胞であってもよい。なお、前記個体としては、例えば、ヒトであってもよいし、ヒト以外のマウス、ラット、ブタなどの脊椎動物であってもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、β１インテグリン活性化作用を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞、及びウイルス、並びに、これらを有効成分として含有する、β１インテグリンを活性化する薬剤、β１インテグリンを活性化することにより、細胞外マトリックスに対する細胞接着を増強する薬剤、傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、細胞死誘導剤、及び抗腫瘍剤、並びに、多量体フィブロネクチンを有効成分として含有する細胞死誘導剤及び抗腫瘍剤等を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００２５】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２６】
＝＝本発明に係るペプチドの薬理作用＝＝
上述のTNIIIA2の作用を増強させるため、２つのペプチド鎖がジスルフィド結合で結合できるように、TNIIIA2のＣ末端にシステイン（Ｃ）を付加して作製したペプチド（配列番号９）において、１４番目のチロシン（Ｙ）をアラニン（Ａ）に、１５番目のスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に、１７番目のスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に、１９番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に、２０番目のグリシン（Ｇ）からアラニン（Ａ）に、９番目のリジン（Ｋ）及び１９番目のアルギニン（Ｒ）をアルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）に、それぞれ置換したペプチド（配列番号１０〜１５参照）は、システインを付加したTNIIIA2と同様にβ１インテグリンを活性化する作用を有するが、１６番目のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）に、１８番目のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）に、２１番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に、１９番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に、９番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、それぞれ置換したペプチド（配列番号１６〜２０参照）は、β１インテグリンを活性化する作用を有していない。
【００２７】
以上のことから、TNIIIA2のアミノ酸配列において、少なくとも９、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１番目のアミノ酸がそれぞれ、塩基性アミノ酸、チロシン又はアラニン、スレオニン又はアラニン、イソロイシン、スレオニン又はアラニン、イソロイシン、塩基性アミノ酸又はアラニン、グリシン又はアラニン、バリンであることが、β１インテグリンの活性化に重要であることが示された。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを細胞に作用させることにより、細胞膜におけるβ１インテグリンを活性化し、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する細胞接着を増強することができる。なお、作用させる細胞は、培養細胞であっても、個体内の細胞であってもよい。前記個体は、例えば、ヒトであってもよいし、ヒト以外のマウス、ラット、ブタなどの脊椎動物であってもよい。
【００２８】
また、上述のような作用を有することから、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、β１インテグリンの活性化、及び、β１インテグリンを介した、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する細胞接着の増強に有用である他、TNIIIA2と同様に、細胞伸展の促進、外傷の修復（例えば、創傷の治癒、術後組織の修復など）、脂肪細胞の分化抑制、肥満の予防・抑制、がん治療、感染症治療、骨髄抑制等の免疫抑制状態の治療、エリスロジェネシス（赤血球生成）などにも有用である。
【００２９】
さらに、TNIIIA2は、実施例２及び３に示すように、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する作用を有すること、及び、インテグリン結合配列（Arg-Gly-Asp：ＲＧＤ）を有する(ＲＧＤ)８又はフィブロネクチン（特に多量体フィブロネクチン）などと一緒に浮遊性腫瘍細胞に対して作用させることにより、浮遊性腫瘍細胞に細胞死を効率よく誘導できることが明らかになった。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドも、TNIIIA2と同様に、浮遊性腫瘍細胞に細胞死を誘導する作用を有し、Arg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチドと一緒に浮遊性腫瘍細胞に作用させることにより、浮遊性腫瘍細胞に細胞死を効率よく誘導することができる。
【００３０】
そこで、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドは、浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導剤、浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤等として有用である。
【００３１】
なお、本明細書において、通常状態で浮遊している悪性の細胞群をいい、分化の程度を異にするすべての白血病細胞、リンパ腫細胞等を挙げることができる。また生体内及び初期培養細胞に限らず、各種の細胞株であってもよく、このような細胞株としては、Ｕ９３７、ＨＬ６０、Ｎａｌｍ−６、Ｒａｍｏｓ、ＬＹ５１７８Ｙ−ＭＬ２５及びＫ５６２などの白血病細胞株を挙げることができる。
【００３２】
ここで、上述の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドとしては、β１インテグリンを活性化する作用を有するものであれば特に制限されるものではなく、例えば、配列番号３〜８に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、タグ（例えば、Hisタグ、GSTタグなど）が結合した、配列番号３〜８に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、これらのペプチドの作用を増強させるために、２つのペプチド鎖がジスルフィド結合で結合できるようにペプチドのＣ末端にシステイン（Ｃ）を付加したペプチド（例えば、配列番号１０〜１５に示されるアミノ酸配列からなるペプチド）、上述のアミノ酸配列を繰り返し有するペプチド等であってもよい。
【００３３】
＝＝本発明に係るペプチドの製造方法＝＝
本発明に係るペプチドは、その配列情報に基づいて有機化学的に合成することができる。また、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入した組換えベクターを用いてもよい。組換えベクターがプラスミドの場合、この組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の菌や、イースト、動物細胞などに導入し、発現させ、生成したペプチドを、常法を用いて精製することができる。また、この組換えベクターをin vitroで転写させて得られたmRNAを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させて、合成されたペプチドを精製してもよい。組換えベクターがファージＤＮＡやウイルスＤＮＡの場合、適切な宿主細胞に感染させ、合成されたペプチドを精製してもよい。
【００３４】
ここで、発現ベクターを作製する際、Hisタグ、GSTタグなどのタグをコードするポリヌクレオチドと、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチドとを融合した融合ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、融合タンパク質として発現させるのがより好ましい。タグを利用して、目的のペプチドを容易に精製することが可能になるからである。なお、タグは、最終段階で除去し、HPLC（high-performance(-speed) liquid chromatography）などで本発明に係るペプチドだけを精製することもできる。
【００３５】
なお、本発明に係るペプチドを細胞外に分泌させるため、シグナルペプチドを付加してもよく、そのような融合ペプチドを発現することのできる組換えベクターは、上述のように、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、シグナルペプチドを有する融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入することで作製することができる。
【００３６】
また、前記組換えベクターを含有する細胞（組換え細胞）は、例えば、動物細胞に、前記組換えベクターをエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等によって導入することにより作製できる。
【００３７】
＝＝多量体フィブロネクチンの薬理作用＝＝
多量体フィブロネクチンは、実施例２に示すように、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導する作用を有する。このことから、多量体フィブロネクチンは、浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導剤、浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤等として有用である。
【００３８】
なお、多量体フィブロネクチンは、例えば、ジチオスレイトールで還元したフィブロネクチン同士をジスルフィド結合で結合することにより作製してもよいし、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）やＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）等に複数のフィブロネクチンをコンジュゲートすることにより作製してもよいし、ＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）法により多量体フィブロネクチンを作製してもよい。
【００３９】
＝＝本発明に係る薬剤について＝＝
本発明に係るペプチドは、上述のように、β１インテグリンの活性化、及び、β１インテグリンを介した、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する細胞接着の増強、外傷の修復、脂肪細胞の分化抑制、肥満の予防・抑制等に有用であることから、β１インテグリン活性化剤、細胞接着増強剤、外傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導剤、及び浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤等の薬剤として用いることができる。
【００４０】
また、本発明に係るペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド、並びに、これらのポリヌクレオチドを有する組換えベクター、並びに、この組換えベクターが導入され、本発明に係るペプチドを分泌する細胞、及び、細胞に感染することにより本発明に係るペプチドを該細胞に分泌させるウイルス等も、β１インテグリンの活性化、及び、β１インテグリンを介した、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対する細胞接着の増強、外傷の修復、脂肪細胞の分化抑制、肥満の予防・抑制等に有用であり、上述の薬剤として用いてもよい。なお、ウイルスを薬剤として用いる場合には、毒性や副作用が生じないようにするために、ウイルスを遺伝子操作等の公知の方法により、増殖しないように変異させておくことが好ましい。例えば、感染はするが、複製しないように改変されたレトロウイルスやアデノウイルスに、本発明に係るペプチドを発現することができる組換えベクターを組み込んだものを用いればよい。
【００４１】
また、本発明に係るペプチド、又は、それをコードするポリヌクレオチド、若しくはその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを封入したリポソームも上述の薬剤として有用である。この場合、Trans IT In Vivo Gene Delivery System（TaKaRaの商品名）などを用いることにより、生体内標的部位にこれらのペプチドやポリヌクレオチドを導入することができる。
【００４２】
さらに、上記ペプチドやポリヌクレオチドなどを内包した高分子ミセルも、薬物キャリアとして優れた特性を有し、上述の薬剤として有用である。
【００４３】
また、本発明に係るペプチドを細胞に発現させるためのプラスミドと、高分子キャリアとの複合体も、標的組織にプラスミドを運び、そこでペプチドを発現させることが可能であることから、上述の薬剤として有用である。なお、高分子キャリアとしては、前記プラスミドを細胞内に導入することが可能な物質であればどのようなものを用いてもよく、例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポロタミン、キトサン、合成ペプチド、又はデンドリマーなどを用いることができる。
【００４４】
さらに、本発明に係るペプチドとタンパク質キャリアとの複合体、及び本発明に係るペプチドを含むＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）等も上述の薬剤として有用である。なお、タンパク質キャリアとしては、例えば、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）、ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）、ＯＶＡ（Ovalbumin）、ＨＳＡ（Human Serum Albumin）などを用いることができる。
【００４５】
なお、本発明に係る、β１インテグリン活性化剤、細胞接着増強剤、外傷修復剤、脂肪細胞分化抑制剤、肥満予防剤、肥満抑制剤、浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導剤、及び浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤等の薬剤は、上述の本発明に係るペプチドを２種以上含んでいても構わないし、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド（例えば、TNIIIA2、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するペプチドなど）を含んでいても構わない。
【００４６】
また、本発明に係る浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導剤、及び浮遊性腫瘍細胞に起因する腫瘍に対する抗腫瘍剤等の薬剤においては、その効能を高めるために、例えば、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド、このアミノ酸配列を繰り返し有するペプチド、(ＲＧＤ)８等のArg-Gly-Asp（ＲＧＤ）配列を有するペプチド（但し、細胞接着活性を示すものに限る。）、細胞外マトリックスなどを併用してもよいし、上述の薬剤にさらに含めて使用してもよい。なお、併用する場合には、腫瘍細胞に対して一緒に作用させてもよいし、別々に作用させてもよい。
【００４７】
前記細胞外マトリックス（Extracellular Matrix：ECM）としては、インテグリン結合部位（ＲＧＤ配列）を有し、細胞接着活性を示すものであれば特に制限されるものではなく、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、フォンビィルブランド因子、エンタクチン、Ｉ型コラーゲン、ネトリン、粘菌のディスコイディンＩ、大腸菌のλ受容体タンパク質など、あるいは、これらのタンパク質を２以上組み合わせたもの、あるいは、これらのタンパク質を、例えば、ジスルフィド結合で結合したり、ＫＬＨやＢＳＡ等にコンジュゲートしたり、ＭＡＰ（Multiple Antigenic Peptide）法を行ったりして多量体化したものを用いることができる。
【００４８】
なお、上述の薬剤は、使用する部位又は目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤や基剤などの、従来使用されている製剤添加物をさらに含有することとしてもよい。
【００４９】
また、本発明に係る薬剤を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に対して投与する場合には、例えば、患部、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内等の注射による投与、経口投与、塗布や貼付等による非経口投与などの方法を用いることができる。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これに限定されるものではない。また、実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００５１】
［実施例１］
TNIIIA2は、β１インテグリンを活性化する作用、脂肪細胞の分化を抑制する作用等を有する。そこで、TNIIIA2のどのアミノ酸がこれらの作用に必須か、あるいは、必須でないかを調べるため、様々な変異がTNIIIA2の活性を失わせるかどうか、β１インテグリンの活性化を指標にして調べた。
【００５２】
1mLの血清を含まないDMEM培地に懸濁したWI38VA13細胞（1〜5×105cells/mL）を表１に示す各種ペプチドを終濃度で50μg/mLとなるように混合し、活性型β１インテグリン特異的エピトープを認識するAG89抗体（MBL社製；終濃度で1〜5μg/mL）を添加して室温で30分間インキュベートした。なお、コントロールとしてペプチドを添加しないで同様にインキュベートしたものを用いた。
【００５３】
その後、FITC標識抗マウスIgG（Jackson Immuno Laboratries；終濃度で1μg/mL）を添加して室温で30分間インキュベートした後、細胞をPBS(-)溶液で洗浄し、フローサイトメトリー分析（FACS Calibur及びFACS Aria：Becton Dickinson；Cytoron：Ortho Diagnostics）により蛍光強度（MFI：mean fluorescence intensity）を測定し、細胞におけるβ１インテグリンの活性化（TNIIIA2活性）を評価した。
【００５４】
その結果を表１及び図１に示す。
【表１】
2008067616.tif 000002
【００５５】
表１及び図１に示すように、Ｃ末端にシステインを付加したTNIIIA2のアミノ酸配列において、１４番目のチロシン（Ｙ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（Y14A）、１５番目のスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（T15A）、１７番目のスレオニン（Ｔ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（T17A）、１９番目のアルギニン（Ｒ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（R19A）、２０番目のグリシン（Ｇ）からアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（G20A）、９番目のリジン（Ｋ）及び１９番目のアルギニン（Ｒ）をアルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）に置換した変異ペプチド（K9R19K）は、それぞれＣ末端にシステインを付加したTNIIIA2と同様にβ１インテグリンを活性化する作用を有することが明らかになった。特に、T15AとG20Aの変異ペプチドは、TNIIIA2に比べてβ１インテグリンを活性化する作用が強いことがわかった。
【００５６】
一方、Ｃ末端にシステインを付加したTNIIIA2のアミノ酸配列において、１６番目のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（I16A）、１８番目のイソロイシン（Ｉ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（I18A）、２１番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に置換した変異ペプチド（V21A）、１９番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異ペプチド（R19E）、９番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に置換した変異ペプチド（K9E）は、β１インテグリンを活性化できないことがわかった。
【００５７】
従って、TNIIIA2の９番目のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）への変異、１９番目のアミノ酸のリジン（Ｋ）への変異、並びに、１４、１５、１７、１９、及び２０番目のアミノ酸のアラニン（Ａ）への変異は、TNIIIA2の活性を失わせないことがわかった。
【００５８】
［実施例２］
次に、浮遊性腫瘍細胞におけるβ１インテグリンを活性化させ、細胞外マトリックスに接着させることにより、浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導できるかどうかを調べた。なお、活性化したβ１インテグリンの接着性を高めるために、多量体フィブロネクチン（多量体ＦＮ）を準備した。多量体フィブロネクチンは、ヒト由来血漿性フィブロネクチンのＩ型及びII型リピート内にある分子内ジスルフィド結合を、ジチオスレイトールで還元して、分子間ジスルフィド結合を形成させることにより作製した。多量体ＦＮが得られたかどうかの確認は、通常２量体で存在するフィブロネクチンの分子量より大きいかどうかを電気泳動法により調べることにより行った。
【００５９】
まず、細胞培養用96穴マイクロプレート（旭テクノグラス社製）の各ウェルに、無血清培地に懸濁したヒト悪性Ｂリンパ腫細胞Ramos（1×105細胞／200μl／ウェル）を添加し、さらに、最終濃度で100μg/mlになるようにヒト由来血漿性フィブロネクチン（ＦＮ）または多量体ＦＮを、最終濃度で25, 50, 又は75μg/mlになるようにTNIIIA2を加えた後、試料中のタンパク質濃度が全て最終300μg/mlになるようにBSAを添加して補正し、37℃、5% CO2インキュベータにて2日間培養した。なお、TNIIIA2及びBSAを添加しないでＦＮまたは多量体ＦＮを添加して培養したものを準備した。
【００６０】
培養後、Cell Counting Kit（和光純薬工業社製）を用いて生存細胞数を測定した。なお、細胞生存率は、BSAでコートしたウェルに、TNIIIA2を添加していない無血清培地を添加して培養した場合の生存細胞数を100％として算出した。その結果を図２Ａに示す。
【００６１】
また、上述と同様に、最終濃度で25, 50, 75, 若しくは100μg/mlになるように多量体ＦＮを、最終濃度で50μg/mlになるようにTNIIIA2を各ウェルにそれぞれ添加して赤白血病細胞株ＴＳＡ−８を培養し、多量体ＦＮを添加しないでTNIIIA2を添加して培養した場合の生存細胞数を100％として細胞生存率を算出した。なお、コントロールとして、最終濃度で25, 50, 75, 又は100μg/mlとなるように多量体ＦＮを各ウェルにそれぞれ添加して赤白血病細胞株ＴＳＡ−８を培養したものを準備し、多量体ＦＮ及びTNIIIA2を添加しないで培養した場合の生存細胞数を100％として細胞生存率を算出した。その結果を図２Ｂに示す。
【００６２】
図２Ａ及び図２Ｂに示すように、TNIIIA2をフィブロネクチンと一緒に浮遊性腫瘍細胞に作用させると細胞死を誘導できることがわかった。また、TNIIIA2の濃度に依存して細胞死の誘導が促進されることがわかった。さらに、多量体ＦＮを単独で浮遊性腫瘍細胞に作用させても細胞死を誘導できるが、TNIIIA2と併用することにより効率よく細胞死を誘導できることがわかった。
【００６３】
［実施例３］
次に、フィブロネクチンのインテグリン結合部位であるＲＧＤ配列を有するペプチドを、TNIIIA2と一緒に浮遊性腫瘍細胞に作用させることにより細胞死を誘導できるかどうか調べた。
【００６４】
まず、ＲＧＤペプチド（GRGDSP：配列番号２１参照）を８分子櫛形に結合したＭＡＰ（ (ＲＧＤ)８）を、Ｆｍｏｃ合成法に準じてペプチドシンセサイザーにより調製した。また、ネガティブコントロールとして、ＲＧＥペプチド（GRGESP：配列番号２２参照）を８分子櫛形に結合したＭＡＰ（ (ＲＧＤ)８）を同様に調製した。
【００６５】
次に、実施例２に記載の方法と同様に、接着基質をコートした96穴マイクロプレートの各ウェルに、上述の無血清培地に懸濁した急性骨髄性（単球系）白血病細胞株Ｕ９３７（1×104〜5細胞／200μl／ウェル）を添加し、さらに、(ＲＧＤ)８（最終濃度で50μg/ml）、(ＲＧＥ)８（最終濃度で50μg/ml）、TNIIIA2（最終濃度で25又は50μg/ml）、又は、TNIIIA2（最終濃度で25μg/ml）及び(ＲＧＤ)８（最終濃度で50μg/ml）若しくは(ＲＧＥ)８（最終濃度で50μg/ml）を添加して37℃、5% CO2インキュベータにて2日間培養した。また、コントロールとして、(ＲＧＤ)８、(ＲＧＥ)８、及びTNIIIA2を添加しないで培養したものを準備した。
【００６６】
培養後、Cell Counting Kitを用いて生存細胞数を測定し、コントロールでの生存細胞数を100％として細胞生存率を算出した。その結果を図３に示す。
【００６７】
図３に示すように、TNIIIA2だけでも浮遊性腫瘍細胞に対して細胞死を誘導でき、TNIIIA2と(ＲＧＤ)８とを併用することにより、より効率よく細胞死を誘導できることが明らかになった。このことから、インテグリン結合部位であるＲＧＤ配列を有するペプチドをTNIIIA2と一緒に浮遊性腫瘍細胞に作用させることによりより効率よく細胞死を誘導できることが示された。
【００６８】
以上のことから、浮遊性腫瘍細胞は、TNIIIA2単独により、あるいは、TNIIIA2と、インテグリン結合部位であるＲＧＤ配列を有するペプチドや細胞外マトリックス（例えば、フィブロネクチン（ＦＮ）など）、又はこれらを多量体化したものとの併用により、細胞死が誘導されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の一実施例において、各種ペプチドがβ１インテグリンを活性化するかどうかを調べた結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、TNIIIA2とＦＮあるいは多量体ＦＮとを用いた場合に細胞死が誘導されるかどうかを調べた結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、TNIIIA2、(RGE)8、(RGD)8、又は、TNIIIA2及び(RGE)8若しくは(RGD)8の浮遊性腫瘍細胞に対する細胞死誘導作用を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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