(57)【要約】【課題】神経栄養因子の生物学的活性の有効なインヒビターを提供すること。【解決手段】（ａ）天然の配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド（ｂ）天然の配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドと少なくとも９５％の アミノ酸配列の同一性を有し、天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド、および（ｃ）天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性である（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片 よりなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、単離したヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ヒトｔｒｋ受容体に関する。本発明はさらに、神経栄養因子インヒビターおよび神経栄養因子の生物学的活性の抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
神経栄養因子またはニューロトロフィンは、神経系の発達および維持に重要な役割を果たしている小さな塩基性タンパク質のファミリーである。このファミ リーの成員の中で最初に同定され、おそらく最もよく理解されているのは神経成長因子（ＮＧＦ）であり、これは末梢神経系の知覚ニューロンおよび交感ニューロンを発達させるうえで顕著な作用を有する（レビ−モンタルチーニ（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ，Ｒ．）およびアンジェレッティ （Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｕ．）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８、５３４〜５６９［１９６８］；テーネン（Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．）ら、Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０９、１４５〜１７８［１９８７］））。
【０００３】
ＮＧＦ、およびマウス顎下腺からのホモログ（成熟した活性形はしばしばβ−または２．５ＳＮＧＦと呼ばれる）を含む多数の動物ホモログは長い間知られていたが、類似の機能を有し連続的に関連するが区別されるポリペプチドが同定されたのは最近になってからであった。
【０００４】
一番目は脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）と呼ばれる（現在はニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）とも呼ばれる）因子であり、このものはレイブロック （Ｌｅｉｂｒｏｃｋ，Ｊ．）らによりクローニングされ配列決定されている（Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、１４９〜１５２［１９８９］）。この因子は最初ブタの脳から精製されたが（バード（Ｂａｒｄｅ，Ｔ．Ａ．）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１、５４９〜５５３［１９８２］）、ＮＧＦとの相同性が明らかになったのはその ｃＤＮＡがクローニングされ配列決定されてからであった。ＮＧＦとＢＤＮＦ（ＮＴ−２）との全アミノ酸配列の同一性は約５０％である。この知見からレイブロックらは、構造および機能的特性を共通して有する神経栄養因子のファミリーの成員がＢＤＮＦおよびＮＧＦに限られる理由はないと考えた。
【０００５】
実際、β−ＮＧＦおよびＢＤＮＦに密接に関連する別の神経栄養因子がその後発見されている。幾つかの研究グループは、最初ニューロン性因子 （ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒ）（ＮＦ）と呼ばれ、現在はニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）と呼ばれている神経栄養因子を同定した（アーンフォアズ（Ｅｒｎｆｏｒｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
【０００６】
【数１】
2008113664.tif 000002
３４４、３３９［１９９０］；メゾンピエール（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７、１４４６［１９９０］；ローゼンタール （Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ４、７６７［１９９０］；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）およびライヒャルト（Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、８０６０〜８０６４（１９９０）；カイショー（Ｋａｉｓｈｏ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２６６、１８７ ［１９９０］）。ＮＴ−３はβ−ＮＧＦおよびＢＤＮＦ（ＮＴ−２）とアミノ酸の約５０％が共通する。ニューロトロフィン−４およびニューロトロフィン−５（ＮＴ−４およびＮＴ−５）が該ファミリーに最近加えられた（１９９４年１１月１５日に発行された米国特許第５，３６４７６９号；ハルブック（Ｈａｌｌｂｏｏｋ，Ｆ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ６、８４５〜８５８［１９９１］；バークマイアー（Ｂｅｒｋｍｅｉｅｒ，Ｌ．Ｒ．）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ７、８５７〜８６６［１９９１］；イプ（Ｉｐ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ   ８９、３０６０〜３０６４［１９９２］）。上記バークマイアーらにより最初に記載された哺乳動物分子はその後ゼノプス（Ｚｅｎｏｐｕｓ）ＮＴ−４のホモログであることがわかり、通常、ＮＴ−４／５と呼ばれる。
【０００７】
ニューロトロフィンは、他のポリペプチド性の成長因子と同様、標的細胞の細胞表面上の受容体と相互作用することにより作用を及ぼす。現在の本発明者らの 知見によると、２種類の膜貫通糖タンパク質がニューロトロフィンの受容体として働いている。平衡結合研究によれば、ニューロトロフィン応答性のニューロンは、ＮＧＦ、ＢＤＮＦおよびＮＴ−３に２×１０−９ＭのＫＤにて結合する共通の低分子量（６５〜８０ｋＤａ）で低親和性の受容体（ＬＮＧＦＲ）（ｐ７５ＮＴＲまたはｐ７５とも呼ばれる）と、高分子量（１３０〜１５０ｋＤａ）で高親和性（ＫＤが１０−１１Ｍ）の受容体（受容体チロシンキナーゼのｔｒｋファミリーの成員である）とを有することが示された。
【０００８】
最初のｔｒｋ受容体ファミリーの成員であるｔｒｋＡは、トロポミオシン配列の触媒ドメインへの転座によって引き起こされた癌遺伝子の形質転換の結果とし て最初同定された。その後の研究により、ｔｒｋＡはＮＧＦのシグナル変換受容体（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として同定された。その後、２つの他の関連する受容体、すなわちマウスおよびラットのｔｒｋＢ（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、ＥＭＢＯ
Ｊ．８、３７０１〜３７０９［１９８９］；ミドルマス（Ｍｉｄｄｌｅｍａｓ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、１４３〜１５３［１９９１］； １９９１年１１月６日に公開されたＥＰ４５５，４６０号）およびブタ、マウスおよびラットのｔｒｋＣ（ランバレ（Ｌａｍｂａｌｌｅ）ら、Ｃｅｌｌ  ６６、９６７〜９７９［１９９１］；１９９３年１月１３日に公開されたＥＰ５２２，５３０号）がｔｒｋ受容体ファミリーの成員として同定された。これらｔｒｋ受 容体の構造は極めて類似しているが、交互のスプライシングにより該ファミリーの複雑さは増大し、２つの知られた形態のｔｒｋＡ、３つの知られた形態のｔｒｋＢ（２つは機能性のチロシンキナーゼドメインを有しない）および少なくとも４つの形態のｔｒｋＣ（幾つかは機能性のチロシンキナーゼドメインを有せ ず、２つはチロシンキナーゼドメインに小さな挿入を有する）が出現する。このことは図１にまとめて示してある。
【０００９】
ｐ７５受容体およびｔｒｋ受容体の役割は反対である。ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼは特定のニューロトロフィンに結合特異性を付与するうえで重要な役割 を果たすことが一般に受け入れられているが、ＮＴ−３にのみ結合する（しかしながら、他のニューロトロフィンには結合しない）と報告されているｔｒｋＣ発現細胞とは対照的に、ｔｒｋＡを発現する細胞株はＮＧＦのみならずＮＴ−３およびＮＴ−４／５にも結合し（しかしながら、ＢＤＮＦには結合しない）、 ｔｒｋＢを発現する細胞はＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、およびＮＴ−４／５に結合する（しかしながら、ＮＧＦには結合しない）。さらに、交互のスプライシング事象により生じる種々の形態のｔｒｋ受容体は異なる細胞内シグナル伝達経路を活性化することができ、それゆえ、おそらくインビボで異なる生理学的機 能を媒体することがモデル系で示されている。所定のｔｒｋ受容体を発現する細胞がｐ７５の不在下でニューロトロフィンに低または高親和性で結合するかどうかは明らかでない（ミーキン（Ｍｅａｋｉｎ）およびシューター（Ｓｈｏｏｔｅｒ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５、３２３〜３３１ ［１９９２］）。
【００１０】
種々の細胞株を用いた研究の刊行された結果は混乱しており、ｐ７５がニューロトロフィンの応答性に本質的であるかまたは重要でないかいずれかであることを示唆している。ｐ７５のみを発現する細胞株はＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、およびＮＴ−４に平衡時に同様の低親和性にて結合するが、結合速度定数は顕著に異なっている。その結果、ｐ７５結合はすべてのニューロトロフィンの共通する性質であるが、ｐ７５受容体はリガンド識別においても何らかの役割を果たしているかもしれないことが示唆されている（ロドリゲス−テバー（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｔｅｂａｒ）ら、 ＥＭＢＯ  Ｊ．１１、９１７〜９２２［１９９２］）。ｐ７５受容体単独でニューロトロフィンの生物学的活性を媒体しうるかどうかは明らかでない。ｔｒｋ受容体は従来より生物学的に有意の神経栄養因子受容体と考えられてきたが、ｔｒｋＡ発現を欠くメラノーマ細胞でＮＧＦがなおおそらくｐ７５により生物学的挙 動の顕著な変化をもたらしうることが最近示されている（ヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ４、１２０５〜１２１６［１９９３］）。最近、デービーズ（Ｄａｖｉｅｓ）らは（Ｎｅｕｒｏｎ  １１、５６５〜５７４［１９９３］）、ｐ７５遺伝子にヌル変異（ｎｕｌｌ   ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有するトランスジェニックマウスのモデルにおいてニューロトロフィンへの胚ニューロンの生存応答を媒体するうえでのｐ７５の役割を調べた研究の結果を報告している。彼らは、ｐ７５がＮＧＦ依存性の皮膚知覚ニューロンのＮＧＦへの感受性を高めることを見いだした。
【００１１】
ニューロトロフィンは、末梢および中枢ニューロンの、区別されるが重複するセットに作用を示す。これら作用は、発達しつつあるニューロンの生存を確実に するうえで決定的な役割を果たすものから（知覚ニューロンおよび交感ニューロンにおけるＮＧＦ）ニューロンの形態に対して比較的微妙な作用を及ぼすもの（プルキンエ細胞に対するＮＴ−３）まである。これら作用は、ある種の神経変性疾患の治療のためにニューロトロフィンを使用するに際して関心がもたれてき た。ニューロトロフィンはまた炎症性疼痛の媒体にも影響を及ぼし、ある種の悪性腫瘍において過剰発現される。従って、ニューロトロフィンの生物学的活性のインヒビターは、疼痛の薬物療法や癌治療における化学療法剤として治療学的可能性を有する。
【００１２】
種々のヒトの病理学的状態におけるｔｒｋおよびニューロトロフィン作用の役割をより一層理解するため、ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣタンパク質を同定およ び単離し、とりわけどの形態のｔｒｋＢおよびｔｒｋＣがヒトで発現されているかを決定することが有用であろう。科学的および治療学的な可能性とは別に、かかるヒトｔｒｋ受容体タンパク質はヒト神経栄養因子の精製、およびｔｒｋＢおよび／またはｔｒｋＣに結合しうるニューロトロフィンの上昇レベルまたは減少 レベルと関連する種々のヒトの病理学的状態の診断に有用であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
神経栄養因子の生物学的活性の有効なインヒビターを提供することがさらに望まれる。かかるインヒビターは、神経栄養因子に関連する病理学的状態の診断および治療に有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要約）
本発明によって、以下が提供される。
【００１５】
（項目１）  （ａ）天然の配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド
（ｂ）天然の配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド、および
（ｃ）天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性である（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片よりなる群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列を含む、単離したヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド。
【００１６】
（項目２）  チロシンキナーゼドメインを有する項目１のポリペプチド。
【００１７】
（項目３）  チロシンキナーゼドメインを欠如した項目１のポリペプチド。
【００１８】
（項目４）  機能的な膜貫通ドメインを有する項目１のポリペプチド。
【００１９】
（項目５）  機能的な膜貫通ドメインを欠如した項目１のポリペプチド。
【００２０】
（項目６）  天然の配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの免疫グロブリン様ドメインであるか、またはストリンジェント条件下で天然の配列の ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの免疫グロブリン様ドメインをコードするＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされる項目１のポリペプチド断片。
【００２１】
（項目７）  該免疫グロブリン様ドメインが、天然の配列のｔｒｋＢまたはｔｒｋＣの第二の免疫グロブリン様ドメインである、項目６のポリペプチド断片。
【００２２】
（項目８）  配列番号：２に提示するアミノ酸配列の１〜７９１までのアミノ酸を含む項目１のポリペプチド。
【００２３】
（項目９）  アミノ酸残基４３６〜７９１までを、アミノ酸配列ＦＶＬＦＨＫＩＰＬＤＧで置換した項目８のポリペプチド。
【００２４】
（項目１０）  配列番号：２に提示するアミノ酸配列のアミノ酸残基３９９〜４２３までを欠如しているか、または不活化している項目８または項目９のポリペプチド。
【００２５】
（項目１１）  グリコシル化していない項目８のポリペプチド。
【００２６】
（項目１２）  配列番号：６に提示するアミノ酸配列の１〜８０８までのアミノ酸を含む項目１のポリペプチド。
【００２７】
（項目１３）  アミノ酸残基４９８〜８０８までを配列番号：８）に示すアミノ酸配列で置換した項目１２のポリペプチド。
【００２８】
（項目１４）  配列番号：６に提示するアミノ酸配列の３７１〜３７９位までのアミノ酸残基ＥＳＴＤＮＦＩＬＦを欠如している項目１２または項目１３のポリペプチド。
【００２９】
（項目１５）  配列番号：６に提示するアミノ酸配列の６８１〜６９４位までのアミノ酸残基ＬＦＮＰＳＧＮＤＦＣＩＷＣＥを欠如している項目１２のポリペプチド。
【００３０】
（項目１６）  配列番号：６に提示するアミノ酸配列のアミノ酸残基３９９〜４２２までを欠如している項目１２〜１５のいずれか１のポリペプチド。
【００３１】
（項目１７）  グリコシル化していない項目１２のポリペプチド。
【００３２】
（項目１８）  ａ）配列番号：２に提示するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基約２７０〜アミノ酸残基約３３４まで、
ｂ）配列番号：６に提示するアミノ酸配列におけるアミノ酸残基約２８２〜アミノ酸残基約３４５まで、およびｃ）ａ）またはｂ）のポリペプチドをコードする核酸の相補鎖にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる核酸によりコードされる
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【００３３】
（項目１９）  免疫グロブリンアミノ酸配列に共有結合したｔｒｋＡの第二の免疫グロブリン様ドメインを含むポリペプチド。
【００３４】
（項目２０）  該免疫グロブリンアミノ酸配列が免疫グロブリン定常ドメインをコードする項目１９のポリペプチド。
【００３５】
（項目２１）  項目１のポリペプチドに特異的に結合することができる抗体。
【００３６】
（項目２２）  項目２１の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【００３７】
（項目２３）  項目１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離した核酸分子。
【００３８】
（項目２４）  項目１９のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子。
【００３９】
（項目２５）  形質転換した宿主細胞により認識される調節配列に作動可能に連結した項目２３の核酸分子を含む発現ベクター。
【００４０】
（項目２６）  形質転換した宿主細胞により認識される調節配列に作動可能に連結した項目２４の核酸分子を含む発現ベクター。
【００４１】
（項目２７）  項目２５のベクターで形質転換した宿主細胞。
【００４２】
（項目２８）  項目２６のベクターで形質転換した宿主細胞。
【００４３】
（項目２９）  項目１のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドをコードする核酸分子の使用方法であって、形質転換した宿主細胞によって認識される調節 配列に作動可能に連結した該核酸分子を含むベクターで形質転換した培養宿主細胞中で該核酸分子を発現させ、ついで該コードポリペプチドを宿主細胞から回収することを特徴とする方法。
【００４４】
（項目３０）  項目１のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドを産生する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞のＤＮＡ中に、転写に影響を及ぼすに十分な近接および方向にて転写制御要素を挿入することを特徴とする方法。
【００４５】
（項目３１）  ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの存在を決定する方法であって、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを試験試料核酸とハイブリダイズさせ、ついでヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドＤＮＡの存在を決定することを特徴とする方法。
【００４６】
（項目３２）  ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドをコードする核酸により核酸ポリメラーゼ反応をプライミングすることを特徴とする、核酸試験試料を増幅する方法。
【００４７】
（項目３３）  天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの抗体アンタゴニスト。
【００４８】
（項目３４）  ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの全部または一部を含むポリペプチドをコードする核酸配列または関連核酸配列の検出方法であって、該核酸配列の少なくとも一部に特異的に結合する検出可能なマーカーに該核酸配列を接触させ、ついでそのように結合したマーカーを検出することを特徴とする方法。
【００４９】
本発明は、ヒトからの天然にみられる形態のｔｒｋＢ受容体およびｔｒｋＣ受容体の同定、クローニングおよび配列決定、およびノーザンおよびインシトゥハ イブリダイゼーション分析による種々の組織中の発現パターンの決定となった成功した研究に基づいている。本発明はさらにヒトｔｒｋＣ受容体において行った構造−機能突然変異誘発研究に基づいており、この研究の結果、受容体結合および／または生物学的活性に必要な領域が同定された。本発明はさらに、ヒト ｔｒｋ受容体の細胞外ドメインの免疫グロブリンキメラ（イムノアドヒーシン（ｉｍｍｕｎｏ  ａｄｈｅｓｉｎ））としての発現が、対応する天然の受容体の結合特異性を保持しその同族ニューロトロフィンの生物学的活性を阻止しうる可溶性分子を導くという実験的知見に基づいている。
【００５０】
一つの側面において、本発明は、
（ａ）天然配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド、
（ｂ）天然配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有し、天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド、および
（ｃ）天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの生物学的特性を示し、かつヒトにおいて非免疫原性である（ａ）または（ｂ）のポリペプチドの断片よりなる群から選ばれた単離ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドに関する。
【００５１】
他の側面において、本発明は、上記ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドのいずれかに特異的に結合しうる抗体、およびかかる抗体を産生するハイブリドーマ細胞株に関する。
【００５２】
さらに他の側面において、本発明は、上記で定義するヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離核酸分子に関する。
【００５３】
別の側面において、本発明は、形質転換した宿主細胞により認識される調節配列に作動可能に連結された上記核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００５４】
さらに別の側面において、本発明は、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００５５】
異なる側面において、本発明は、上記で定義するヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドをコードする核酸分子の使用方法であって、形質転換した宿主細胞 により認識される調節配列に作動可能に連結された該核酸分子を含むベクターで形質転換された培養宿主細胞中で該核酸分子を発現させ、ついで該コードポリペプチドを宿主細胞から回収することを特徴とする方法に関する。
【００５６】
本発明はさらに、上記で定義するヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドを産生する方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞のＤＮＡ中に、転写に影響を及ぼすに充分な近接および方向にて転写制御要素を挿入することを特徴とする方法に関する。
【００５７】
本発明はまた、ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの存在を決定する方法であって、かかるポリペプチドをコードするＤＮＡを試験試料の核酸とハイブリダイズさせ、ついでヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドＤＮＡの存在を決定することを特徴とする方法をも提供する。
【００５８】
異なる側面において、本発明は、上記で定義するヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドをコードする核酸に核酸ポリメラーゼ反応をプライミングする（ｐｒｉｍｉｎｇ）ことを特徴とする、核酸試験試料の増幅方法に関する。
【００５９】
本発明はまた、上記で定義する天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドのアンタゴニストに関する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、（ａ）上記で定義するヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチド、（ｂ）天然のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドのア ンタゴニスト、または（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに特異的に結合する抗体を薬理学的に許容しうる担体とともに含む医薬組成物に関する。
【００６１】
さらに別の側面において、本発明は、免疫グロブリン配列に結合した、天然の神経栄養因子に結合しうるｔｒｋ受容体アミノ酸配列を含む、キメラポリペプチ ドに関する。特別の態様において、このキメラポリペプチドは、免疫グロブリン配列に結合した、天然の神経栄養因子に結合しうるｔｒｋ受容体アミノ酸配列の融合体を含む、イムノアドヒーシンである。ｔｒｋ受容体は好ましくはヒトの受容体であり、融合は免疫グロブリンの定常ドメイン配列、さらに好ましくは免疫 グロブリン重鎖の定常ドメイン配列との間で行われる。特定の態様において、２つのｔｒｋ受容体−免疫グロブリン重鎖融合体の会合（たとえば、ジスルフィド結合による共有結合により）の結果、ホモ二量体の免疫グロブリン様構造となる。免疫グロブリン軽鎖はさらに、ジスルフィド結合した該二量体のｔｒｋ受容体 −免疫グロブリンキメラの一方または両者と会合してホモ三量体またはホモ四量体構造を生成してよい。
【００６２】
別の側面において、本発明は、天然の神経栄養因子に結合しうるｔｒｋ受容体アミノ酸配列および異なる結合配列を有する２特異的な分子に関する。特別の態 様において、かかる２特異的な分子は、免疫グロブリン配列への異なる結合配列の融合体に共有結合した免疫グロブリン配列への、神経栄養因子に結合しうるｔｒｋ受容体アミノ酸配列の融合体からなるイムノアドヒーシンである。異なる晧合配列は、たとえば同じまたは異なる神経栄養因子に結合しうる異なるｔｒｋ 受容体アミノ酸配列であってよく、または第一のｔｒｋ受容体アミノ酸配列が結合する神経栄養因子を発現するタイプの細胞上の決定基を認識してよい。
【００６３】
好ましい態様において、各結合配列は免疫グロブリン重鎖の定常ドメイン配列に融合し、これら２つの融合体はジスルフィド結合してヘテロ二量体構造を提供 する。免疫グロブリン軽鎖が免疫グロブリン様分子の一方のアームまたは両方のアームにおける結合配列−免疫グロブリン定常ドメイン融合体と会合して、ジスルフィド結合したヘテロ三量体またはヘテロ四量体構造を提供してもよい。
【００６４】
本発明はさらに、上記モノ特異的または２特異的なイムノアドヒーシンまたは本発明の範囲内の他の２特異的なポリペプチドのキメラ鎖をコードする核酸、か かる分子をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、形質転換した宿主細胞、および形質転換宿主細胞を培養することによる該分子の製造方法に関する。
【００６５】
別の側面において、本発明は、精製しようとする神経栄養因子に結合しうるｔｒｋ受容体アミノ酸配列の免疫グロブリン配列への融合体からなるイムノアド ヒーシン上に吸着させることによる神経栄養因子の精製方法に関する。ｔｒｋ受容体配列は、精製しようとする神経栄養因子の採取源と同じ種のものであるのが好ましい。
【００６６】
さらに別の側面において、本発明は、ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣタンパク質のすべてまたは一部を含むポリペプチド分子をコードする核酸配列または関連核 酸配列の検出方法であって、該核酸配列の少なくとも一部に特異的に結合する検出可能なマーカーに該核酸配列を接触させ、ついでそのように結合したマーカーを検出することを特徴とする方法に関する。
【００６７】
神経栄養因子の過剰発現または過小発現を特徴とする病理学的状態の診断方法は、該神経栄養因子を含む生物学的試料を該神経栄養因子に結合しうる検出可能に標識したｔｒｋ受容体ポリペプチドと接触させ、ついでそのように結合したマーカーを検出することを特徴とする。
【００６８】
本発明はさらに、薬理学的に許容しうる担体とともに、上記モノ特異的または２特異的なキメラポリペプチドの治療学的または予防学的有効量を含む医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
（発明の詳細な記載）
（Ａ．定義）
「ニューロトロフィン」および「神経栄養因子」なる語およびそれらの文法的変形は互換的に用いられており、神経成長因子（ＮＧＦ）および連続的に関連す るホモログを含むポリペプチドのファミリーをいう。ＮＧＦ、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ、ＮＴ−２としても知られる）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、およびニューロトロフィン−４およびニューロトロフィン−５（ＮＴ−４／５）が現在までにこのファミリーの成員として同定されている。
【００７０】
「ニューロトロフィン」および「神経栄養因子」なる語には、天然の採取源から精製されたか、組換えＤＮＡ技術の方法、化学的合成、またはこれらまたは他 の方法との組み合わせにより合成されたかに拘わらず、いずれかの（ヒトまたは非ヒト）動物種の天然のニューロトロフィン、およびその機能性の誘導体が含まれる。「天然」または「天然配列」の神経栄養因子またはニューロトロフィンは、天然にみられる切断されたおよび変異体の形態および天然にみられる対立遺伝 子変異体を含む、ヒトまたは非ヒト動物種において天然に存在するニューロトロフィンのアミノ酸配列を有する。
【００７１】
「ｔｒｋ」、「ｔｒｋポリペプチド」、「ｔｒｋ受容体」およびそれらの文法的変形は互換的に用いられており、少なくとも一つの天然の神経栄養因子に結合 しうる、受容体チロシンキナーゼスーパーファミリーのポリペプチドをいう。このファミリーに現在のところ同定されている成員は、ｔｒｋＡ（ｐ１４０ｔｒｋＡ）、ｔｒｋＢ、およびｔｒｋＣであるが、この定義は、この受容体ファミリーの成員として将来同定されるかもしれないポリペプチドを本質的に含む。「ｔｒｋ」、 「ｔｒｋポリペプチド」および「ｔｒｋ受容体」なる語は、このファミリー内の特定の成員を示す接辞大文字（たとえば、Ａ、ＢまたはＣ）の有無に拘わらず、完全長の受容体、その切断された形態および変異体の形態（別の仕方のスプライシングおよび／または挿入により生じるものなど）、および天然にみられる対立 遺伝子変異体、並びにかかる受容体の機能性の誘導体を含む、いずれかの動物（たとえば、ヒト、マウス、ウサギ、ブタ、ウマなど）からの「天然」または「天然配列」の受容体（これら用語は互換的に用いられる）を含む。
【００７２】
それゆえ、「天然」または「天然配列」のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドは、完全長の天然ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ、完全長の天然ヒト ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの切断されたチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメインの欠失した（スプライスされた）形態、および完全長または切断された天然ヒトｔｒｋＣの挿入変異体（該挿入はＴＫドメイン内かまたは細胞外ドメイン内にある）、および将来同定されるかもしれない他の天然にみられるヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドを含む、ヒトにおいてみられるあらゆる形態のｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列を有する。動物種にみられるｔｒｋポリペプチドと比較したヒトｔｒｋポリペプチドの種々 の同定形態の図表を図４に示す。シグナル配列が先行した後、完全長の天然ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインは、種々の他のタンパク質において同定された相同なまたは他の仕方で類似の構造との関連で定められた５つの機能性ドメインを有する（図１１参照）。これらドメインは、成熟ｔｒｋ 受容体のアミノ酸配列のＮ末端から、１）ヒトｔｒｋＡの１位のアミノ酸から約３２位のアミノ酸、ヒトｔｒｋＢの１位のアミノ酸から約３６位のアミノ酸、およびヒトｔｒｋＣの１位のアミノ酸から約４８位のアミノ酸にわたる第一のシステインに富むドメイン；２）ｔｒｋＡ中の約３３位のアミノ酸から約１０４位の アミノ酸、ｔｒｋＢ中の約３７位のアミノ酸から約１０８位のアミノ酸、およびｔｒｋＣ中の約４９位のアミノ酸から約１２０位のアミノ酸にわたるロイシンに富むドメイン；３）ｔｒｋＡ中の約１０５位のアミノ酸から約１５７位のアミノ酸、ｔｒｋＢ中の約１０９位のアミノ酸から約１６４位のアミノ酸、および ｔｒｋＣ中の約１２１位のアミノ酸から約１７７位のアミノ酸にわたる第二のシステインに富むドメイン；４）ｔｒｋＡ中の約１７６位のアミノ酸から約２３４位のアミノ酸、ｔｒｋＢ中の約１８３位のアミノ酸から約２３９位のアミノ酸、およびｔｒｋＣ中の約１９６位のアミノ酸から約２５７位のアミノ酸にわたる第 一の免疫グロブリン様ドメイン；および５）ｔｒｋＡ中の約２６４位のアミノ酸から約３３０位のアミノ酸、ｔｒｋＢ中の約２７０位のアミノ酸から約３３４位のアミノ酸、およびｔｒｋＣ中の約２８８位のアミノ酸から約３５１位のアミノ酸にわたる第二の免疫グロブリン様ドメインとして示されている。「天然」また は「天然配列」のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣなる語は、これら受容体のいずれかの形態の天然にみられる対立遺伝子変異体を含む。ヒトｔｒｋＢの４３３位のアミノ酸はＭまたはＶとして種々に決定されていることが注目される。両配列とも本発明の範囲に本質的に包含される。
【００７３】
天然ポリペプチドの「機能性誘導体」とは、天然のポリペプチドと共通の定性的な生物学的特性を有する化合物をいう。神経栄養因子の機能性誘導体は、天然 の（ヒトまたは非ヒト）神経栄養因子と共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。同様に、ｔｒｋ受容体の機能性誘導体は、天然の（ヒトまたは非ヒト）ｔｒｋ受容体と共通の定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」には、対応する天然のポリペプチドと共通する生物学的活性を有する ことを条件として、いずれかの動物種（ヒトを含む）からの天然のポリペプチドの断片、および天然（ヒトおよび非ヒト）ポリペプチドおよびその断片の誘導体を含むが、これらに限られるものではない。
【００７４】
「断片」は、成熟した天然の神経栄養因子またはｔｒｋ受容体ポリペプチドの配列内の領域を含む。ｔｒｋ受容体の好ましい断片には、完全長の天然または変異体ｔｒｋ受容体の少なくとも第二の免疫グロブリン様ドメインが含まれる。
【００７５】
「誘導体」なる語は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列およびグリコシル化変異体、および共有結合修飾をいうものとして用いられ、一方、「変異体」なる語は、この定義内でアミノ酸配列およびグリコシル化変異体をいう。
【００７６】
「機能性誘導体」の定義との関連における「生物学的特性」は、１）天然のポリペプチド（たとえば、ニューロトロフィンまたはｔｒｋ受容体）の少なくとも 一つのエピトープとの免疫学的交差反応性か、または２）天然のポリペプチド（たとえば、ニューロトロフィンまたはｔｒｋ受容体）と定性的に共通する少なくとも一つの接着、制御またはエフェクター機能の所持として定義される。
【００７７】
好ましくは、機能性誘導体は、天然のポリペプチドと少なくとも約６５％のアミノ酸配列の同一性、さらに好ましくは約７５％のアミノ酸配列の同一性、さらに一層好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列の同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列の同一性を有するポリペプチドである。本発明との関連においては、天然配列のヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドの機能性誘 導体は、好ましくは、その同族ヒト受容体と少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を示し、ヒトにおいて免疫原性でないか、またはかかる天然受容体と少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を示し、ヒトにおいて免疫原性でない天然ヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体またはポリペプチドの断片である。天然の完 全長のｔｒｋ受容体の断片は、リガンド結合および／または生物学的活性に必要な細胞外ドメイン内のドメインを保持しているのが好ましい。上記で検討したように、タンパク質のｔｒｋファミリーの細胞外ドメインは５つのドメイン、すなわち第一のシステインに富むドメイン、ロイシンに富むドメイン、第二のシステ インに富むドメイン、および２つの免疫グロブリン様ドメインから構築されている。機能性誘導体には、天然のｔｒｋ受容体の少なくとも第二の免疫グロブリン様ドメイン、または天然のｔｒｋ受容体の第二の免疫グロブリン様ドメインと少なくとも約９５％の配列同一性を示す配列が含まれ、その際、ｔｒｋ受容体は好 ましくはｔｒｋＢまたはｔｒｋＣである。
【００７８】
アミノ酸配列の同一性またはホモロジーは、本明細書において、配列を整列させ必要ならギャップを導入して最大のホモロジーパーセントを達成するが保存的 な置換は配列同一性の一部とは考えないようにした後、対応する天然のポリペプチド配列の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。Ｎ末端またはＣ末端における伸長および挿入はいずれも同一性またはホモロジーを減少させるものとは考えられないであろう。
【００７９】
本明細書において使用する免疫学的に交差反応性であるとは、候補（ポリ）ペプチドが、知られた活性な分子に対して産生されたポリクローナル抗体または抗 血清との活性を有する対応する天然のポリペプチドの定性的な生物学的活性を競合的に抑制しうることを意味する。かかる抗体および抗血清は、ヤギやウサギなどの動物にたとえば完全フロイントアジュバント中の知られた天然の神経栄養因子またはｔｒｋ受容体を皮下注射し、ついで不完全フロイントアジュバント中に てブースター腹腔内または皮下注射する通常の方法により調製する。
【００８０】
本発明との関連における「単離」核酸またはポリペプチドは、核酸またはポリペプチドの動物またはヒト採取源中に存在する混入核酸またはポリペプチドから 同定および分離された核酸またはポリペプチドである。核酸またはポリペプチドは、以下の診断アッセイの検討のところで記載しさらに定義する標識を用い、診断またはプローブの目的のために標識することができる。
【００８１】
「単離ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣポリペプチド」なる語および文法的なその変形は、該ポリペプチドを単離したヒトその他の採取源中に存在する混入ポリペ プチドから分離されたヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣポリペプチド（上記定義による）、および少なくとも一つの天然の神経栄養因子に結合する定性的能力を保持しヒトにおいて免疫原性でない限りにおいて、かかる天然配列ポリペプチドの断片、アミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体および誘導体をいう。かかる単離 ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣポリペプチドは、天然の完全長のヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体、天然にみられる切断された形態および別の仕方のスプライシングおよび天然にみられる対立遺伝子により生じるアミノ酸（挿入）変異体を含む、天然配列のヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣを含む。天然配列のｔｒｋＢまたは ｔｒｋＣポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、その天然対応物と少なくとも約９５％のホモロジー、さらに好ましくは少なくとも約９８％のホモロジーを示し、ヒトに対して非免疫原性である。最も好ましくは、単離された天然のヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣポリペプチドの定義におけるアミノ酸配列変異体は、チロ シンキナーゼドメインの全天然配列および天然にみられるスプライスされたヒトｔｒｋＢまたはｔｒｋＣポリペプチドにおいて認められる挿入を保存している。この定義にはさらに、少なくとも一つの天然の神経栄養因子に結合する定性的な能力を保持している限りにおいて、上記天然ポリペプチドの断片およびそのアミノ酸配列変異体並びにそのグリコシル 化変異体および誘導体を含む。
【００８２】
一般に、「アミノ酸配列変異体」とは、参照（たとえば、天然配列）ポリペプチドと比較した場合にアミノ酸配列に若干の相違を有する分子をいう。アミノ酸の変化は、天然のアミノ酸配列の置換、挿入、欠失またはかかる変化の所望な組み合わせであってよい。
【００８３】
置換変異体は、天然配列中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されたものである。置換は単一であってよく、 その場合は分子中のただ一つのみのアミノ酸が置換され、または複数であってよく、その場合は２またはそれ以上のアミノ酸が同分子中で置換される。
【００８４】
挿入変異体は、天然のアミノ酸配列中の特定の位置にあるアミノ酸のすぐ隣に１またはそれ以上のアミノ酸が挿入されたものである。アミノ酸のすぐ隣とは、該アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合されることを意味する。
【００８５】
欠失変異体は、天然アミノ酸配列中の１またはそれ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は該分子の特定領域中で１または２以上のアミノ酸が欠失されるであろう。
【００８６】
「グリコシル化変異体」は、対応する天然のポリペプチドとは異なるグリコシル化プロフィルを有するポリペプチドをいうのに使用される。ポリペプチドのグ リコシル化は、一般にＮ−結合またはＯ−結合のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合の 認識配列である。Ｏ−結合グリコシル化とは、糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースの一つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまたＯ−結合グリコシル化に関与しうる。天然の対応物と比 較して変異体または断片中に存在する炭水化物部分の位置および／または性質におけるいかなる相違も本発明の範囲に包含される。
【００８７】
天然ポリペプチドのグリコシル化パターンの決定は、ＨＰＡＥクロマトグラフィー［ハーディー（Ｈａｒｄｙ，Ｍ．Ｒ．）ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７０、５４〜６２（１９８８）］、グリコシル結合組成を決定するメチル化分析［リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｂ．）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８、１７８〜１９５（１９７２）；ワエー（Ｗａｅｇｈｅ，Ｔ．Ｊ．）ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１２３、２８１〜３０４（１９８３）］、ＮＭＲス ペクトル、マススペクトルなどを含むよく知られた分析化学技術により行うことができる。
【００８８】
「共有結合誘導体」は、有機のタンパク質性または非タンパク質性の誘導体化剤による天然ポリペプチドまたはその断片の修飾、および翻訳後修飾を含む。共 有結合修飾は、一般に選択された側鎖または末端残基と反応しうる有機誘導体化剤と標的アミノ酸残基を反応させるか、または選択された組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の動力化メカニズム（ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）により導入される。ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対 する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基は、しばしば、翻訳後に脱アミド化されて対応グルタミン酸およびアスパラギン酸になる。別の場合には、これら残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらいずれの形態の残基も本発明のｔｒｋ受容体ポリペプチド中に存在していてよい。他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリン、チロシンまたはトレオニン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が挙げられる ［クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、フリーマン、サンフランシスコ、７９〜８６頁（１９８３）］。
【００８９】
「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡ」および「コードする核酸」なる語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序また は配列をいう。これらデオキシリボヌクレオチドの順序はポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。このようにＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００９０】
「複製可能な発現ベクター」および「発現ベクター」なる語は、その中に一片の外来ＤＮＡが挿入された通常二本鎖の一片のＤＮＡをいう。外来ＤＮＡは、宿 主細胞中に天然にはみられない異種ＤＮＡとして定義される。ベクターは適当な宿主細胞中に外来または異種ＤＮＡを移すのに用いる。いったん宿主細胞に入ったら、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立に複製することができ、ベクターおよびその挿入（外来）ＤＮＡの幾つかのコピーが生成する。加えて、ベクター は外来ＤＮＡをポリペプチドに翻訳するのを可能にするのに必要な要素を含有している。かくして外来ＤＮＡによりコードされるポリペプチドの多くの分子を速やかに合成することができる。
【００９１】
「調節配列」なる語は、特定の宿主生物中において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列をいう。原核生物に適した調節配列は、たとえ ば、プロモーター、任意にオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらく他の未だよく理解されていない配列を含む。真核生物細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られている。
【００９２】
核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関係に置かれた場合に「作動可能に連結した」といわれる。たとえば、プレ配列または分泌リーダーは、ポリペプチド の分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合に該ポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写をさせる場合に該コード配列に作動可能に連結している；またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にある場合にコード配 列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結されたＤＮＡ配列が近接しており（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）、分泌リーダーの場合には近接しておりかつ読み取り枠にある。しかしながら、エンハンサーは近接している必要はない。連結は都合のよい制限部位におけるライゲーションにより行 う。そのような部位が存在しない場合は、常法に従って合成のオリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【００９３】
本発明との関連における「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」なる表現は互換的に用いられ、これらはすべて子孫を含む。それゆえ、「形質転換体」およ び「形質転換された（宿主）細胞」なる語は、初代の対象細胞および継代の数とは無関係に該細胞に由来する培養を含む。すべての子孫は、ゆっくりとしたまたは偶然による突然変異のためにＤＮＡの内容が正確に同一ではないかもしれないことも理解される。最初に形質転換した細胞に対してスクリーニングして同じ機 能または生物学的活性を有する変異体子孫は包含される。異なる表示を意図する場合も文脈から明らかであろう。
【００９４】
「外因性」要素は、本明細書において、細胞にとって外来性の核酸、または細胞にとって同種ではあるが通常みられない宿主細胞核酸内の位置にある核酸を意味するものと定義される。
【００９５】
抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリン は抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子との両方を含む。後者のポリペプチドは、たとえば、リンパ系により低レベルで産生され、ミエローマにより増加レベルで産生される。
【００９６】
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タン パク質である。各軽鎖は重鎖に一つの共有ジスルフィド結合により連結されるが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンの異なるイソタイプの重鎖により変わる。各重鎖および軽鎖はまた、規則的な空間を隔てた鎖内のジスルフィド架橋を有する。各重鎖はその一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと並列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列する。特別 のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖の可変ドメイン間の界面を形成していると思われる［クロチア（Ｃｌｏｔｈｉａ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８６、６５１〜６６３（１９８５）；ノボトニー（Ｎｏｖｏｔｎｙ）およびヘイバー（Ｈａｂｅｒ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、 ４５９２〜４５９６（１９８５）］。
【００９７】
可変性は抗体の可変領域内に均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変領域の両方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域 とよばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインにおいて一層高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）とよばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大体においてβシート構造をとる４つのＦＲが、ある場合には該βシート構造の一部を形成しながら該βシート構造を連結するループ を形成する３つのＣＤＲにより連結されてなる。各鎖中のＣＤＲはＦＲ領域によって極めて近接して保持され、他方の鎖からのＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する［カバット（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．）ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ   Ｉｎｔｅｒｅｓｔナショナル・インスチテュート・オブ・ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ、メリーランド（１９８７）］。定常ドメインは抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの種々のエフェクター機能を示す。
【００９８】
抗体をパパイン消化すると、それぞれ単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントとよばれる２つの同一の抗原結合断片、および残りの「Ｆｃ」フラグメ ント（その名称は容易に結晶化する能力を反映している）が生成する。ペプシン処理をすると、２つの抗原結合部位を有し、なお抗原と架橋しうるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
【００９９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインとが緊密に非共有会合した二量体からなる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定めるのはこのような立体配置においてである。集合的に、６つのＣＤＲが該抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、 単一の可変ドメイン（すなわち抗原に特異的な３つのＣＤＲのみからなるＦｖの半分）であっても、完全な結合部位に比べると低い親和性においてではあるが抗原を認識および結合する能力を有する。
【０１００】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含む幾つかの残基が付加しているところがＦａｂフラグメントと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’をいう。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、相互間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして元々生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【０１０１】
脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパおよびラムダ（λ）とよばれる２つの明らかに区別されるタイプの一つが割り当てられうる。
【０１０２】
重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づき、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられうる。５つの主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、 ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうち幾つかはさらにサブクラス（イソタイプ）、たとえばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、デルタ、イプシロン、γ、およ びμとよばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２は、通常、二量体かまたは一層大きなポリマーの形態にあるＩｇＡの単量体サブクラスである。消化管中の免疫細胞は主としてポリマー性のＩｇＡ（二量体および一層大きなポリ マーを含むポリ−ＩｇＡともよばれる）を生成する。かかるポリ−ＩｇＡは、「ジョイニング」または「Ｊ」鎖とよばれるジスルフィド結合したポリペプチドを含み、５つのサブユニットからなるＪ含有ポリマー性ＩｇＭ（ポリ−ＩｇＭ）とともに腺上皮を輸送されうる。
【０１０３】
「抗体」なる語は最も広い意味で使用され、特に、単一の抗ｔｒｋモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を有する抗ｔｒｋ抗体組成物を包含する。
【０１０４】
本明細書において「モノクローナル抗体」なる語は、実質的に均質な抗体の集団、すなわち該集団を構成する個々の抗体が天然において最小量で存在するかも しれない可能な突然変異の他は同一であるものから得られた抗体をいう。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して向けられており、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を典型的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は 抗原上の単一の決定基に向けられている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の免疫グロブリンが混入することのないハイブリドーマ培養により合成される。
【０１０５】
本明細書においてモノクローナル抗体は、定常ドメインによる抗ｔｒｋ抗体の可変（超可変を含む）ドメインのスプライシング（たとえば、「ヒト化」抗 体）、または重鎖による軽鎖のスプライシング、または他の種からの鎖による一方の種からの鎖のスプライシング、または種の起源または免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスとは無関係に異種タンパク質との融合により生成されるハイブリッド抗体および組換え抗体、並びに所望の生物学的活性を示す限りにおいて 抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を含む［キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許第４，８１６，５６７号；メージ（Ｍａｇｅ）およびラモイ（Ｌａｍｏｙｉ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７９〜９７頁（マーセル・デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９８７）参照］。
【０１０６】
それゆえ、「モノクローナル」という修飾語が付されている場合は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特性を意味するものとし、特定の方法に よって抗体を産生させる必要があるものではない。たとえば、本発明に従って用いるモノクローナル抗体は、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュテイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって最初に記載されたハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５））により作製することができ、または組換えＤＮＡ法［キャビリーら、上掲］により作製することができる。
【０１０７】
「ヒト化」形態の非ヒト（たとえばマウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小で含む特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合性のサブ配列など）である。ヒト化抗体の殆どの部分はヒト免疫グロブリン（受容体の抗体）であり、そのうち受容体の相補性決定領域 （ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（供与体の抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されている。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は受 容体の抗体にも移入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも認められない配列を含んでいてよい。これら修飾は、抗体の性能をさらに洗練させ最適化するために行う。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、一般には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その際、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが 非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンの共通配列のＦＲ領域であろう。ヒト化抗体はまた、最適には、一般にはヒト免疫グロブリンからのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含むであろう。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションは「ストリンジェントな条件」下で行うのが好ましいが、これは（１）洗浄に低イオン強度および高温、たとえば５０℃にて０． ０１５塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを使用すること、または（２）ハイブリダイゼーションの間、ホルムアミドなどの変性剤、たとえば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを０．１％血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｎＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む）とともに４２℃で使用することを意味する。他の例は、４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６／８）、 ０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸の使用が挙げられ、洗浄は４２℃にて０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で行う。
【０１０９】
（Ｂ．ｔｅｒｍ受容体をコードするＤＮＡの単離）
本発明の目的のためには、ｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡは、ｔｒｋ受容体ｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製し たｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。たとえば、実施例に記載してあるようなヒト脳のｃＤＮＡライブラリーはｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体ｃＤＮＡの良好な採取源である。ｔｒｋ受容体遺伝子はまたヒトゲノムコスミドライブラリーなどのゲノムライブラリーから得ることもできる。
【０１１０】
ｔｒｋ受容体の同定は、既知の基準（その一つは、配列は偽陽性が最小となるように十分な長さを有し十分に明白でなければならないことである）に従って既 知のｔｒｋ配列（ヒトｔｒｋＡ配列、マウスｔｒｋＢ配列またはマウスまたはブタｔｒｋＣ配列）から選択した標識オリゴヌクレオチド配列によりヒトまたは他の哺乳動物のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをプローブすることにより最も都合よく行われる。典型的に、約３０〜５０塩基を有する３２Ｐ−標識オリゴヌクレオチドが、とりわけ該オリゴヌクレオチドがメチオニンまたはトリプトファンの１またはそれ以上のコドンを含む場合には十分である。単離核酸は、核酸の採取源からの他のポリペプチドをコードする混入核酸から同定および分離されたＤＮＡであろう。
【０１１１】
ｔｒｋ受容体をコードする遺伝子を単離するための別の手段は、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５号、サンブルック （Ｓａｍｂｒｏｏｋ）らのモレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、ニューヨーク、１９８９の１４章、またはカレント・プロトコルズ・イン・モレ キュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、グリーン・バプリッシング・アソシエーツ・アンド・ウイリー−イン ターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１に記載されているように、また実施例に説明するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いることである。
【０１１２】
他の別法は、エンジェルス（Ｅｎｇｅｌｓ）およびウールマン（Ｕｈｌｍａｎｎ）により記載された方法（Ａｇｎｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ２８、７１６（１９８９））の一つを用い、ｔｒｋ受容体をコードする遺伝子を化学的に合成することである。これら方法には、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホルアミダイト法およびＨ−ホスホネート法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー（ａｕｔｏｐｒｉｍｅｒ）法、固相支持体上のオリゴヌクレオチド合 成が挙げられる。
【０１１３】
（Ｃ．天然ｔｒｋ受容体または受容体断片のアミノ酸配列変異体）
天然ｔｒｋ受容体およびｔｒｋ受容体断片のアミノ酸配列変異体は、天然のまたは変異体のｔｒｋ受容体ＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することに より、または所望のポリペプチドのインビトロ合成によって、当該技術分野で知られた方法により調製される。アミノ酸配列変異体を構築するうえで２つの主要な変数が存在する：すなわち、変異部位の位置および変異の性質である。ｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡ配列の操作を必要としない天然にみられる対立遺伝子 を例外として、ｔｒｋ受容体のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡを変異させて天然にはみられない対立遺伝子かまたはアミノ酸配列の変異体となるようにすることにより構築するのが好ましい。一般に、変異は天然のｔｒｋ受容体の細胞外ドメイン内に生成されるであろう。神経栄養因子のシグナル変換にとって重要と思わ れる部位または領域が、ニューロトロフィンの生物学的活性のインビトロ研究のために選択されるであろう。ついで、かかる位置にある部位を、たとえば、（１）保存的な選択をまず置換し、ついで得られた結果に応じて一層劇的な選択を置換すること、（２）標的残基を欠失させること、または（３）該位置の部位 に隣接して同じまたは異なるクラスの残基を挿入すること、または選択肢（１）〜（３）の組み合わせにより、系列的に修飾されるであろう。
【０１１４】
一つの便利な方法は「アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）」とよばれるものである（カニンガム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ）およびウ エルズ（Ｗｅｌｌｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４、１０８１〜１０８５［１９８９］）。この方法では、残基または標的残基の群がアラニンまたはポリアラニンにより同定され置換される。ついで、このようなアラニン置換に対して機能的感受性を示したドメインを、アラニン置換の部位にてまたは該部位に対してさらな るまたは他の置換を導入することにより洗練する。
【０１１５】
所望の変異を同定した後、ｔｒｋ受容体変異体をコードする遺伝子を上記化学的合成法により得ることができる。
【０１１６】
さらに好ましくは、ｔｒｋ受容体アミノ酸配列変異体をコードするＤＮＡは、それ以前に調製した変異体またはｔｒｋ受容体の非変異体をコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発により調製する。部位特異的突然変異誘発は、所望の変異をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列並びに十分な数の隣接ヌクレオチドを使用して、横切る欠失ジャンクションの両側上に安定な二本鎖を形成するに十分なサイズおよび配列の複雑さのプライマー配列を提供することにより、ｔｒｋ受容体変異体を生成することを可能にする。典型的に、約２０〜２５ヌクレオチドの長さのプライマーが 好ましく、配列のジャンクションの両側上の約５〜１０残基が変えられる。一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は、エデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）らのＤＮＡ２、１８３（１９８３）などの刊行物により例示されるように、当該技術分野でよく知られている。認識されるであろうように、部位特異的突然変異誘発 法は一般に一本鎖および二本鎖の両形態で存在するファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターには、たとえばメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らにより開示されているように（サード・クリーブランド・シンポジウム・オン・マクロモレキュールズ・アンド・リコンビナントＤＮＡ （Ｔｈｉｒｄ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）、ウォルトン（Ａ．Ｗａｌｔｏｎ）編、エルセビエ、アムステルダム（１９８１））、Ｍ１３ファージなどのベクターが含まれる。このファージベクターおよび他のファージ ベクターは市販されており、その使用は当業者によく知られている。Ｍ１３由来のベクターを用いたＤＮＡ断片中のオリゴデオキシリボヌクレオチド指定の部位特異的突然変異誘発の構築のための用途範囲の広い効率的な手順が、ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．）により刊行されてい る（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、６４８７〜６５００［１９８２］）。また、一本鎖ファージの複製起点を有するプラスミドベクター（ベイラ（Ｖｅｉｒａ）ら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３、３［１９８７］）を用いて一本鎖ＤＮＡを得ることもできる。別法として、適当なＤＮＡ断片をインビ トロで合成し、これを当該技術分野で知られたＰＣＲ法により増幅することによりヌクレオチド置換を導入する。
【０１１７】
一般に、部位特異的突然変異誘発を行うには、まずその配列内に関連タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む一本鎖ベクターを得る。所望の変異配列を含む オリゴヌクレオチドプライマーを、たとえばクレア（Ｃｒｅａ）らの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５、５７６５（１９７８））により一般に化学的に調製する。ついで、このプライマーを上記一本鎖のタンパク質配列含有ベクターにアニールさせ、大腸菌ポリメラーゼＩのクレノウ断片など のＤＮＡ重合酵素に供して変異含有鎖の合成を完成させる。かくして、一方の鎖が元々の非変異配列をコードし、第二の鎖が所望の変異を有するヘテロ二本鎖が生成する。ついで、このヘテロ二本鎖ベクターを用いてＪＰ１０１細胞などの適当な宿主細胞を形質転換し、変異配列の組み合わせを有する組換えベクターを含 むクローンを選択する。その後、変異領域を除去し、タンパク質産生のための適当な発現ベクター中に入れる。
【０１１８】
ＰＣＲ法はまた、ｔｒｋ受容体のアミノ酸配列変異体を生成させるために用いることもできる。少量の鋳型ＤＮＡをＰＣＲの出発物質として用いる場合は、鋳 型ＤＮＡ中の対応領域とはわずかに異なる配列を有するプライマーを用い、該プライマーが該鋳型と異なる部位のみ鋳型と異なる比較的大量の特定ＤＮＡ断片を得ることができる。プラスミドＤＮＡ中に変異を導入するため、プライマーの一方を該変異の位置に重複するように、および該変異を含有するように設計する； 他のプライマーの配列はプラスミドの反対鎖の配列と同一でなければならないが、この配列は該プラスミドＤＮＡに沿っていずれの場所に位置してもよい。しかしながら、最終的にこれらプライマーによって境界を定められたＤＮＡの全増幅領域を容易に配列決定することができるように、第二のプライマーの配列は第一 のプライマーの配列から２００ヌクレオチド内に位置しているのが好ましい。上記のようなプライマーのペアを用いたＰＣＲ増幅の結果、該プライマーにより特定された変異部位、および鋳型コピーが若干誤りを犯すのでおそらく他の位置にて異なるＤＮＡ断片の集団が得られる。
【０１１９】
生成物に対する鋳型の比率が極めて低いならば、生成物のＤＮＡ断片の大部分は所望の変異を導入している。この生成物を用い、ＰＣＲの鋳型として働いたプラスミド中の対応領域を標準ＤＮＡ法を用いて置換する。変異体の第二のプライマーを用いるか、または異なる変異体プライマーを用いて第二のＰＣＲを行い、 得られた２つのＰＣＲ断片をベクター断片に３（またはそれ以上）部分ライゲーションにて同時にライゲートすることにより、別々の位置に変異を同時に導入することができる。
【０１２０】
ＰＣＲ突然変異誘発の特別の例において、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）中の増幅しようとする領域の外側に唯一の制限部位を有する制限エンドヌクレアー ゼで消化することにより該プラスミドを線状にする。この物質のうち１０ｎｇを、ＰＣＲ緩衝液（４つのデオキシヌクレオチド三リン酸を含有しジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標））キット（パーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ）、ノーウォーク、コネチカットおよびエメ リビル、カリフォルニアから入手した）中に入れてある）、および各２５ピコモルのオリゴヌクレオチドプライマーを５０μｌの最終容量で含有するＰＣＲ混合物に加える。この反応混合物に３５μｌの鉱油を重層する。反応液を１００℃にて５分間変性させ、氷上にしばらく置き、ついで１μｌのテルムス・アクアチク ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／１）（パーキン−エルマー・シータス、ノーウォーク、コネチカットおよびエメリビル、カリフォルニアから購入）を鉱油層の下に加える。ついで、反応混合物を下記の通りプログラムされたＤＮＡサーマルサイクラー（パーキン−エ ルマー・シータスから購入）中に挿入する。
【０１２１】
５５℃で２分
７２℃で３０秒、ついで以下のサイクルを１９サイクル：
９４℃で３０秒
５５℃で３０秒および
７２℃で３０秒。
【０１２２】
上記プログラムの終了時に反応バイアルをサーマルサイクラーから除き、水性相を新たなバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容量）で抽 出し、エタノール沈殿し、ＤＮＡを標準手順により回収する。この物質をその後、ベクター中に挿入するための適当な処理に供する。
【０１２３】
変異体の調製のための他の方法であるカセット突然変異誘発は、ウエルズ（Ｗｅｌｌｓ）らにより記載された技術［Ｇｅｎｅ  ３４、３１５（１９８５）］に 基づく。出発物質は変異させようとするｔｒｋ受容体ＤＮＡを含むプラスミド（またはベクター）である。変異させようとするｔｒｋ受容体内のコドンを同定する。同定した変異部位の両側には唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在していなければならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上記オリゴヌ クレオチド媒体突然変異誘発法を用いて該制限部位をｔｒｋ受容体内の適当な位置に導入することによって生成させる。制限部位がプラスミド中に導入された後、これら部位にてプラスミドを切断して線状にする。該制限部位間に該ＤＮＡの配列をコードするが所望の変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを標準法を用 いて合成する。２つの鎖が別々に合成され、ついでこれらを標準法を用いて一緒にハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットとよばれる。このカセットは、プラスミドに直接ライゲートすることができるように、３’末端および５’末端が線状化したプラスミドの末端と整合すべく設計してある。こ のプラスミドは、いまや変異したｔｒｋ受容体ＤＮＡ配列を含む。
【０１２４】
加えて、天然または変異体のｔｒｋ受容体またはその断片のアミノ酸配列を作製するうえでいわゆるファージミド提示法も有用であるかもしれない。この方法は、（ａ）変異させようとする受容体をコードする第一の遺伝子、天然または野生型のファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする第二の遺伝子（該第一の遺伝子および該第二の遺伝子は異種である）、該第一の遺伝子および該第二の遺伝子に作動可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な発現ベクターを構築し、それに よって融合タンパク質をコードする遺伝子融合を生成させ、（ｂ）該第一の遺伝子内の１またはそれ以上の選択された部位で該ベクターを突然変異させ、それによって関連するプラスミドのファミリーを生成させ、（ｃ）これらプラスミドで適当な宿主細胞を形質転換し、（ｄ）これら形質転換した宿主細胞をファージ コートタンパク質をコードする遺伝子を有するヘルパーファージで感染させ、（ｅ）これら形質転換し感染した宿主細胞を、該プラスミドの少なくとも一部を含み宿主を形質転換しうる組換えファージミド粒子を生成するのに適当な条件下で培養し、その際、該条件は再少量以上のファージミド粒子が該粒子の表面上に１ を越えるコピーの該融合タンパク質を提示するように調節されており、（ｆ）これらファージミド粒子を適当な抗原と接触させてファージミド粒子の少なくとも一部が該抗原に結合するようにさせ、ついで（ｇ）結合したファージミド粒子を結合しなかったファージミド粒子から分離する、ことを含む。工程（ｄ）から （ｇ）は１回からそれ以上繰り返すことができる。この方法において好ましくは、プラスミドを転写調節要素の厳重な制御下におき、培養条件を、ファージミド粒子の表面上に１を越えるコピーの融合タンパク質を提示するファージミド粒子の量または数が約１％未満となるように調節する。また、１を越えるコピーの融 合タンパク質を提示するファージミド粒子の量が単一コピーの融合タンパク質を提示するファージミド粒子の量の１０％未満であるのが好ましい。該量は２０％未満であるのが最も好ましい。この方法においては一般に、該発現ベクターはさらに該ポリペプチドの各サブユニットをコードするＤＮＡに融合した分泌シグナ ル配列をさらに含み、転写調節要素はプロモーター系であろう。好ましいプロモーター系は、ｌａｃＺ、λＰＬ、ｔａｃ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファン、およびアルカリホスファターゼプロモーターおよびこれらの組み合わせから選ばれる。また、この方法は、通常、 Ｍ１３Ｋ０７、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳ、およびＰｈｉＸ１７４から選ばれるヘルパーファージを用いるであろう。好ましいヘルパーファージはＭ１３Ｋ０７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌であり、大腸菌のプロテアーゼ 欠失株である。
【０１２５】
上記および類似の突然変異誘発技術の詳細は、たとえば、サンブルックらの上掲文献、およびカレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー、オースベルら編などの一般的な教科書に記載されている。
【０１２６】
アミノ酸置換変異体は、天然の受容体分子中の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。置換突然変異誘発 において大いに興味がもたれる部位は、シグナル変換および／またはリガンド結合に重要であると同定された部位、および種々の種からの天然のｔｒｋ受容体にみられるアミノ酸が、側鎖のかさばり、電荷および／または疎水性に関して実質的に異なっている部位を含む。実施例からも明らかであろうように、ヒト ｔｒｋＣ受容体の第二の免疫グロブリン様ドメインはニューロトロフィン結合に主として関わるものとして同定されている。この領域内での置換は（他のアミノ酸変化のように）、ｔｒｋ受容体のニューロトロフィン結合能に有意の影響を及ぼすと思われる。個々のｔｒｋ受容体の結合特異性および該受容体によって媒体 される多様な生物学的活性に主として関わるアミノ酸は、上記突然変異誘発法の組み合わせにより同定することができる。種々のｔｒｋ受容体を互いに区別するアミノ酸の少なくとも一部は、その細胞外領域の第二の免疫グロブリン様ドメイン内に存在すると思われる。一方のｔｒｋ受容体においてリガンド特異性に関わ ると同定された領域を他方のｔｒｋ受容体のリガンド結合ドメインで置換することによってｔｒｋ受容体変異体を生成することが可能である。
【０１２７】
興味のもたれる他の部位は、種々の種からの天然のｔｒｋ受容体の特定の残基が同一であるものである。これら位置はｔｒｋ受容体の生物学的機能にとって重要であるかもしれない。突然変異誘発にとってさらに重要な部位は、ｔｒｋ受容体ファミリーの種々の成員間で共通するモチーフを含む。
【０１２８】
天然に存在するアミノ酸は共通する側鎖の特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）中性、疎水性：システイン、セリン、トレオニン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；
（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：グリシン、プロリン；および
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【０１２９】
保存的な置換は一つのグループ内の成員を同じグループ内の他の成員と交換することを含み、一方、非保存的な置換はこれらクラスの一つの成員を他のクラス の成員と交換することを含むであろう。天然のｔｒｋ受容体またはその断片の神経栄養因子結合領域内における非保存的な置換によって得られる変異体は、得られる変異体の生物学的特性が有意に変化することが期待され、その結果、その同族の神経栄養因子の生物学的特性を阻止する、すなわち対応する天然の神経栄養 因子の生物学的作用のアンタゴニストとなるか、または対応する天然のｔｒｋ受容体を上回るシグナル伝達能となるかもしれない。種々の種および／またはｔｒｋ受容体ファミリーの種々の受容体において保存されているアミノ酸位置は、もしも目的が生物学的活性を保持することであるなら、一般に相対的に保存的 な仕方で置換される。
【０１３０】
アミノ酸欠失は一般に、約１〜３０残基、より好ましくは約１〜１０残基の範囲であり、典型的には隣接するものである。欠失はシグナル変換および／または リガンド結合に直接には関与しない領域中に導入することにより、ｔｒｋ受容体の生物学的活性を修飾してよい。シグナル変換および／またはリガンド結合に直接関与する領域からの欠失は一層有意に変異ｔｒｋ受容体の生物学的活性の修飾をもたらすであろうし、ｔｒｋ受容体アンタゴニストを生成するかもしれない。 連続的な欠失の数は、影響を受けるドメインにおいてｔｒｋ受容体の三次元構造を保持すべく選択されるであろう。
【０１３１】
１を越える神経栄養因子に対する結合ドメインを組み合わせ、従って１を越える神経栄養因子の生物学的活性をシグナル伝達する能力を有するｔｒｋ受容体変 異体を構築することが可能である。かかる変異体は、ｔｒｋ受容体の配列中に他のｔｒｋ受容体のニューロトロフィン結合ドメインを挿入することによって作製することができる。たとえば、天然のｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体は、ｔｒｋＡ受容体の天然のリガンドであるＮＧＦには認めうる程度で結合しない。 ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体中にｔｒｋＡ受容体のＮＧＦ結合配列を挿入すると、（それぞれ、天然のｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体の天然のリガンドに加えて）ＮＧＦに結合するｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体変異体が得られる。同様に、天然にみられるｔｒｋＢ受容体はＢＤＮＦおよびＮＴ４／５には結合するが ＮＧＦまたはＮＴ−３には認めうるほどには結合しない。それゆえ、ｔｒｋＢ受容体中にｔｒｋＣのＮＴ−３結合配列を挿入すると、ＢＤＮＦ、ＮＴ４／５およびＮＴ−３に結合しうる変異体受容体が得られる。得られた受容体変異体は一層広範囲の生物学的活性のスペクトルを媒体することができ、その応用および治療 学に新生面を開くであろう。
【０１３２】
アミノ酸挿入はまた、長さが１残基から数百またはそれ以上の残基を含むポリペプチドにいたるアミノ−および／またはカルボキシル−末端での融合、並びに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（すなわち、ｔｒｋ受容体アミノ酸配列内の挿入）は、一般に約１〜１０残基、より好ましくは１〜５残基、さらに好ましくは１〜３残基の範囲であってよい。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有するｔｒｋ受容体、細菌組換え宿主細胞培養中での直接発現の人工産物、および組換え宿主細胞からの成熟ｔｒｋ受容体の分泌を容易にするための ｔｒｋ受容体分子のＮ末端への異種Ｎ末端シグナル配列の融合が挙げられる。かかるシグナル配列は、一般に意図する宿主細胞種から得られ、それゆえ同種であろう。適当な配列としては、大腸菌に対するＳＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母に対するアルファ因子、および哺乳動物細胞に対するヘルペスｇＤなどのウイルスシグ ナルが挙げられる。
【０１３３】
天然ｔｒｋ受容体分子の他の挿入変異体としては、該受容体のＮ−またはＣ−末端への免疫原性ポリペプチド、たとえばβ−ラクタマーゼや大腸菌のｔｒｐ遺 伝子座によりコードされる酵素などの細菌性ポリペプチド、または酵母タンパク質の融合、および免疫グロブリン領域（好ましくは免疫グロブリンの定常領域）、アルブミン、またはフェリチンなどのような長い半減期を有するタンパク質のＣ−末端融合が挙げられる（１９８９年４月６日に公開された ＷＯ８９／０２９２２に記載されているように）。
【０１３４】
変異体ｔｒｋ受容体の特性を前以て予測することはしばしば困難であるので、最適の変異体を選択するためのある種のスクリーニングが必要であろうことが理解されるであろう。
【０１３５】
（Ｄ．クローニングビヒクル中へのＤＮＡの挿入）
天然または変異体のｔｒｋ受容体をコードする核酸が得られたら、これを一般にさらにクローニング（ＤＮＡの増幅）するため、または発現のために複製可能な発現ベクター中にライゲートする。
【０１３６】
発現ベクターおよびクローニングベクターは当該技術分野でよく知られており、１またはそれ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配 列を含んでいる。適当なベクターの選択は、１）ＤＮＡ増幅かまたはＤＮＡ発現のいずれに用いるのか、２）ベクター中に挿入すべきＤＮＡのサイズ、および３）ベクターで形質転換すべき宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅かまたはＤＮＡの発現か）およびそれが適合する宿主細胞 に応じて種々の成分を含む。これらベクター成分としては、一般に下記のうちの１またはそれ以上が挙げられるが、これらに限られるものではない：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
【０１３７】
（ｉ）シグナル配列成分
一般に、シグナル配列はベクターの成分であってよく、またはベクター中に挿入されるｔｒｋ受容体の一部であってよい。天然のｔｒｋ受容体は、ポリペプチ ドの翻訳後プロセシングにより開裂されて成熟ｔｒｋ受容体を生成したときの該ポリペプチドのアミノ末端（該ＤＮＡの５’末端）にシグナル配列を含む。しかしながら、天然のｔｒｋ受容体は細胞外ドメインと細胞質ドメインとの間に膜接着ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）を含むた め、宿主細胞から分泌されない。それゆえ、分泌形態のｔｒｋ受容体を生成するには、膜接着ドメイン（膜貫通ドメインともよばれる）を通常欠失させるかまたは他の仕方で不活化させる（たとえば、点変異によって）。一般に、細胞質ドメインもまた膜接着ドメインとともに欠失させる。切断された（または膜貫通ドメ インが不活化された）ｔｒｋ受容体変異体は、該切断された変異体をコードするＤＮＡがアミノ末端のシグナル配列を保持している限りにおいて該細胞から分泌されうる。
【０１３８】
本発明の範囲には、天然のシグナル配列が欠失され、異種のシグナル配列で置換されたｔｒｋ受容体が含まれる。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂される）ものでなければならない。
【０１３９】
天然のｔｒｋ受容体シグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞に対しては、該シグナル配列を、たとえばアルカリホスファターゼリーダー、 ペニシリナーゼリーダー、ｌｐｐリーダー、または熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーよりなる群から選ばれた原核細胞のシグナル配列で置換する。酵母での分泌には、天然のｔｒｋ受容体シグナル配列を酵母のインベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー、または酸性ホスファターゼリーダーで置換する。哺乳 動物細胞での発現においては、天然のシグナル配列でよいが、他の哺乳動物シグナル配列が適当なこともある。
【０１４０】
（ｉｉ）複製起点成分
発現ベクターおよびクローニングベクターの両者とも、１またはそれ以上の選択された宿主細胞中での複製を可能とする核酸配列を含む。一般に、クローニン グベクターでは、この配列は宿主染色体と独立に複製することを可能とする配列であり、複製起点および自律複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。よく知られたｐＢＲ３２２からの複製起点が大抵のグラム陰性細菌に適しており、２μプラスミド起点が酵母に適し ており、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。複製起点は哺乳動物発現ベクターには必要でない（ＳＶ４０起点は、それが初期プロモーターを含むことのみの理由によって一般に用いられる）。大抵の発現ベク ターは「シャトル」ベクターである、すなわち少なくとも一つのクラスの生物において複製することができるが、発現のために他の生物中にトランスフェクションすることができる。たとえば、ベクターを大腸菌中にクローニングし、ついで、宿主細胞染色体とは独立に複製することができないときでも同ベクターを酵母 または哺乳動物細胞中に発現のためにトランスフェクションする。
【０１４１】
ＤＮＡはまた、宿主ゲノム中に挿入することによりクローニングされる。このことは、たとえばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種を宿主として用い、バシラス のゲノムＤＮＡにみられる配列と相補的なＤＮＡ配列をベクター中に含めることにより容易に行うことができる。バシラスをこのベクターでトランスフェクションすると、該ゲノムと所望の異種ポリペプチドをコードするＤＮＡの挿入配列との相同的組換えとなる。しかしながら、ゲノムＤＮＡの回収は外来的に複製した ベクターよりも複雑なものとなる。なぜなら、コードされたポリペプチド分子を切り出すのに制限酵素消化が必要であるからである。
【０１４２】
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは、選択遺伝子（選択マーカーともよばれる）を含んでいなければならない。これは、ベクターにより形質転換され た宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である。この遺伝子の存在により、該ベクターを欠失した宿主細胞が形質転換した宿主に対して増殖または生殖に関して有利でないことが確実になる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質や他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトト レキセートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求欠乏を補足するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用できない不可欠な栄養素を供給するタンパク質をコードし、たとえば桿菌のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０１４３】
選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬剤を利用するものである。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は薬剤耐性を付与するタンパク質を 発現し、それゆえ選択レジメンを生き残る。かかる主要な選択の例では、薬剤のネオマイシン［サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、３２７（１９８２）］、マイコフェノール酸［マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９、１４２２（１９８０）］、またはハイグロマイシン［サジェン（Ｓｕｄｇｅｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５、４１０〜４１３（１９８５）］を利用する。上記３つの例では、それぞれ適当な薬剤であるＧ４１８ま たはネオマイシン（ジェネチシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を付与すべく真核細胞制御下に細菌遺伝子を用いる。
【０１４４】
哺乳動物細胞に適した選択マーカーの他の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。かかるマーカーは、所望の核酸を取 り込むのにコンピテントな細胞の同定を可能にする。哺乳動物細胞の形質転換体を、マーカーの取り込みにより形質転換体のみが生存可能なように適合した選択圧下におく。選択圧の負荷は、形質転換体を培地中の選択剤の濃度が連続的に変化する条件下で培養し、それによって選択遺伝子および所望のポリペプチドを コードするＤＮＡの両方の増幅へ導くことにより行う。増幅は、増殖に不可欠のタンパク質の産生のために一層要求される遺伝子が組換え細胞の継続的な世代の染色体内に直列に反復されるプロセスである。増幅したＤＮＡからは増加量の所望のポリペプチド（ｔｒｋ含有キメラポリペプチドかまたはそのセグメント）が 合成される。
【０１４５】
たとえば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は、ヒポキサンチン、グリシン、およびチミジンを欠く培地中ですべての形質転換体を培養することによ り最初に同定される。この場合に適した宿主細胞は、ウアラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）により記載されたようにして（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、４２１６（１９８０））調製および増殖したＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で ある。とりわけ有用なＤＨＦＲは、ＭＴＸに高度に耐性の変異体ＤＨＦＲである（ＥＰ１１７，０６０号）。この選択剤は、内生のＤＨＦＲの存在の如何にかかわらず、他の面では適当ないかなる宿主、たとえばＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ６１  ＣＨＯ−Ｋ１に用いることができる。ついで、それぞれＤＨＦＲおよび所望の ポリペプチドをコードするＤＮＡが該ＤＨＦＲを不活化する剤（メトトレキセート、すなわちＭＴＸ）に暴露することにより増幅される。その後のラウンドの一層高濃度のＭＴＸ中で増殖しうる細胞のみを選択することにより、細胞が一層ＤＨＦＲを必要とする（従って、すべての外来ＤＮＡを増幅させる）ことが確実に なる。別法として、所望のポリペプチドをコードする遺伝子、野生型ＤＨＦＲをコードする遺伝子、およびｎｅｏ遺伝子などの他の選択マーカーを同時に形質転換した宿主は、Ｇ４１８などの選択マーカーのための選択剤を用いて同定することができ、ついで内生のＤＨＦＲを有する野生型宿主中てメトトレキセートを用 いて選択および増殖することができる（米国特許第４，９６５，１９９号をも参照）。
【０１４６】
酵母中で使用するのに適した適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（スティンチコーム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ） ら、１９７９、Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；キングスマン（Ｋｉｎｇｓｍａｎ）ら、１９７９、Ｇｅｎｅ７：１４１；またはチェンパー（Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ）ら、１９８０、Ｇｅｎｅ  １０：１５７）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の変異体株、たとえば ＡＴＣＣＮｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）、１９７７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：１２）に選択マーカーを提供する。ついで、酵母宿主細胞中のｔｒｐ１領域の存在は、トリプトファンの不在中で増殖させることにより形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、ｌｅｕ２ 欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補足される。
【０１４７】
（ｉｖ）プロモーター成分
クローニングベクターと違って発現ベクターは、宿主生物によって認識され所望のポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含んでいなければならない。プロモーターは構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流に位置する非翻訳配列であり、その制御下に核酸の転 写および翻訳を制御する。プロモーターは典型的に誘導性および構成的の２つのクラスに分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、たとえば栄養素の存在または不在または温度の変化に応答して、その制御下にＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始するプロモーターである。現時点では種々の可能な宿主 細胞により認識される多数のプロモーターがよく知られている。これらプロモーターは、その由来する遺伝子から制限酵素消化により除去し、ついで発現すべきポリペプチドの開始コドンの５’側に挿入することにより、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。このことは、ｔｒｋ受容体のゲノ ムプロモーターを使用できないということではない。しかしながら、一般に異種プロモーターは天然のｔｒｋ受容体プロモーターに比べて発現されるｔｒｋ受容体の一層大きな転写および一層高い収量が得られるであろう。
【０１４８】
原核細胞宿主に使用するのに適したプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系（チャング（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ   ２７５：６１５（１９７８）；およびゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゴッデルら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、８：４０５７（１９８０）およびＥＰＯ出願公開第３６，７７６号）およ びｔａｃプロモーター（ドゥ・ベール（Ｈ．ｄｅＢｏｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１〜２５（１９８３））などのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の知られた細菌プロモーターも適している。それらのヌクレオチド配列は刊行されており、それにより 当業者は必要な制限部位を供給するためにリンカーまたはアダプターを用い、これらプロモーターをｔｒｋをコードするＤＮＡ（ジーベンリスト（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ）ら、Ｃｅｌｌ  ２０：２６９（１９８０））に作動可能に連結することができる。細菌系に用いるプロモーターはまた、ｔｒｋをコー ドするＤＮＡに作動可能に連結したシャインーダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列をも含むであろう。
【０１４９】
酵母宿主に用いるのに適したプロモーター配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸 イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼなどの他の解糖酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｑ．７：１４９（１９７８）；およびホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８））が挙げられる。
【０１５０】
増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー ムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関わる酵素のプロモーター領域である。酵母発現に使用するのに適したベクターおよびプロモーターはヒッツェマンらのＥＰ７３，６５７Ａ にさらに記載されている。酵母のエンハンサーもまた酵母プロモーターとともに有利に使用できる。
【０１５１】
プロモーター配列は真核細胞について知られている。本質的にすべての真核細胞の遺伝子は、翻訳が開始される部位の約２５〜３０塩基上流の位置にＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始部位から７０〜８０塩基上流にみられる他の配列はＣＸＣＡＡＴ（Ｘはいずれかのヌクレオチドである）領域である。大抵の真核細胞遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これはコード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のシグナルであるかもしれない。これら配列はすべて哺 乳動物の発現ベクター中に適当に挿入される。
【０１５２】
哺乳動物宿主細胞中でのベクターからのｔｒｋ受容体の転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合しうることを条件として、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイル ス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモー ター、異種哺乳動物プロモーター、たとえばアクチンプロモーターや免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、およびｔｒｋ受容体配列に通常付随するプロモーターにより制御されうる。
【０１５３】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を含むＳＶ４０制限断片として都合よく得られる［ファイヤーズ （Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３（１９７８）、マリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）およびバーグ（Ｂｅｒｇ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９、１４２２〜１４２７（１９８０）；パブラキス（Ｐａｖｌａｋｉｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：７３９８〜７４０２ （１９８１）］。ヒトサイトメガロウイルスの即時（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ）初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として都合よく得られる［グリーナウエイ（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ）ら、Ｇｅｎｅ１８、３５５〜３６０（１９８２）］。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いた哺乳動物宿主中でのＤＮＡの 発現系が米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の変法は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。ヒト免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡのサル細胞中での発現に関してはグレイ（Ｇｒａｙ）らのＮａｔｕｒｅ  ２９５、５０３〜５０８（１９８２）をも参照；単純ヘルペスウイ ルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞中でのヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関してはレイズ（Ｒｅｙｅｓ）らのＮａｔｕｒｅ  ２９７、５９８〜６０１（１９８２）を参照；培養マウスおよびウサギ細胞中でのヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現に関してはカナーニ （Ｃａｎａａｎｉ）およびバーグ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９、５１６６〜５１７０（１９８２）を参照；およびラウス肉腫ウイルスの長末端リピート（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）を用いたＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細 胞、ヒーラ細胞、およびマウスＨＩＮ−３Ｔ３細胞中での細菌ＣＡＴ配列の発現に関してはゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９、６７７７〜６７８１（１９８２）を参照。
【０１５４】
マウスｔｒｋ受容体をクローニングする際に使用する実際のプラスミドはマウスの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ遺伝子のプロ モーター［ゴーチエ（Ｇａｕｔｉｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７、８３８９（１９８９）］を含んでおり、一方、発現クローニングに際して使用したリポータープラスミド［ｐＵＭＳ（ＧＴ）８−Ｔａｃ］は人工的な多量体化したｔｒｋの受容体誘導性（ｒｅｃｅｐｔｏ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）プ ロモーター要素［マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら、Ｃｅｌｌ  ６０、７６７〜７７９（１９９０）］を含んでいた。
【０１５５】
（ｖ）エンハンサー要素成分
高等真核細胞による本発明のｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによりしばしば増加する。エンハンサーはプロモーター上に作用してその転写を増加させる、通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは転写ユニットの５’側［ライミンズ（Ｌａｉｍｉｎｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８、９９３（１９８１）］および３’側［ラスキー（Ｌａｓｋｙ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３、１１０８（１９８３）］、イントロン内［バネルジ （Ｂａｎｅｒｊｉ）ら、Ｃｅｌｌ  ３３、７２９（１９８３）］並びにコード配列自身の内部［オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４、１２９３（１９８４）］に認められ、方向および位置に関して比較的独立である。現在、多くのエンハンサー遺伝子が哺乳動物遺伝子（グロビ ン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から知られている。しかしながら、一般に、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用されるであろう。例としては、複製起点の後期側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハン サー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核細胞プロモーターの活性化のためのエンハンサー要素に関しては、ヤニブ（Ｙａｎｉｖ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７、１７〜１８（１９８２）をも参照。エンハンサーはｔｒｋ受容体ＤＮＡの５’側または３’側 の位置にてベクター中にスプライスされるが、プロモーターの５’側の部位に位置するのが好ましい。
【０１５６】
（ｖｉ）転写終結要素
真核細胞宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）で使用する発現ベクターはまた、転写の終結および ｍＲＮＡの安定化に必要な配列をも含むであろう。かかる配列は、真核細胞またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’側、場合によっては３’側の非翻訳領域から普通に利用できる。これら領域は、ｔｒｋ受容体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを 含む。３’非翻訳領域はまた転写終結部位を含む。
【０１５７】
上記１またはそれ以上の要素、所望のコード配列および調節配列を含む適当なベクターの構築には、標準的なライゲーション法を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を開裂し、テーリングし、必要なプラスミドを生成するのに望ましい形態に再ライゲートする。
【０１５８】
構築したプラスミド中で配列が正しいことを確認するための分析のため、ライゲーション混合物を用いて大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）を形 質転換し、首尾よくいった形質転換体を必要に応じてアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性により選択する。これら形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、および／またはメッシングらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９、３０９（１９８１））かまたはマ クサムらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５、４９９（１９８０））により配列決定する。
【０１５９】
本発明を実施するに際して特に有用なものは、ｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞中での一過性発現を提供する発現ベクターである。一般に、一 過性の発現ベクターは、宿主細胞が多くのコピーの発現ベクターを蓄積し、そのことが今度は該発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成すべく、宿主細胞中で効率的に複製しうる発現ベクターの使用を含む。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性の系は、クローンＤＮＡにより コードされるポリペプチドの便利で明確な同定、並びに所望の生物学的または生理学的特性についての該ポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。それゆえ、一過性の発現系は、ｔｒｋ受容体の類似体および変異体を同定する目的のために本発明において特に有用である。
【０１６０】
組換え脊椎動物細胞培養中でｔｒｋ受容体の合成に適合させるのに適した他の方法、ベクターおよび宿主細胞は、ゲッチング（Ｇｅｔｔｉｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９３、６２０〜６２５（１９８１）；マンテル（Ｍａｎｔｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２８１、４０〜４６（１９７９）；レビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）ら、ＥＰ１１７，０６０およびＥＰ１１７，０５８に記載されている。ｔｒｋ受容体の哺乳動物細胞培養発現に特に有用なプラスミドはｐＲＫ５（ＥＰ３０７， ２４７）である。
【０１６１】
（Ｅ．宿主細胞の選択および形質転換）
本発明においてベクターをクローニングおよび発現するのに適した宿主細胞は、上記原核細胞、酵母または高等真核細胞である。適当な原核細胞としては、グ ラム陰性またはグラム陽性生物、たとえば、大腸菌または桿菌が挙げられる。好ましいクローニング宿主は大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）、シュードモナス種、またはセラチア・マルセサンス （Ｓｅｒｒａｔｉａ  Ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などの他のグラム陰性またはグラム陽性原核細胞も適している。
【０１６２】
原核細胞に加えて、繊維状真菌または酵母などの真核微生物も本発明のベクターの適当な宿主である。サッカロミセス・セレビシエ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）やその他の普通のバン酵母は、低級の真核宿主微生物の中でも最も普通に用いられている。しかしながら、サッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）［ビーチ（Ｂｅａｃｈ）およびナース（Ｎｕｒｓｅ）、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０、１４０（１９８１）］、クルイ ベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）［ルーベンコート（Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７３７（１９８３）］；ヤロウイア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ１８３， ０７０）、トリコデルマ・レーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）［ケース（Ｃａｓｅ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６、５２５９〜５２６３（１９７９）］；およびアスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、たとえば、アスペルギルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）［バランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２、２８４〜２８９（１９８３）；チルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）ら、Ｇｅｎｅ２６、２０５〜２２１ （１９８３）；イェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、１４７０〜１４７４（１９８４）］およびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）［ケリー（Ｋｅｌｌｙ）およびハインズ（Ｈｙｎｅｓ）、ＥＭＢＯ  Ｊ．４、４７５〜４７９（１９８５）］などの他の多くの 属、種および株は普通に入手でき、本発明に使用できる。
【０１６３】
適当な宿主細胞はまた多細胞生物に由来してもよい。かかる宿主細胞は、プロセシング活性およびグリコシル化活性を複合しうる。原則として、脊椎動物培養 か無脊椎動物培養かにかかわらず、いかなる高等真核細胞培養も利用できるが、ヒトなどの哺乳動物からの細胞が好ましい。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモムシ）、エデス・エジプティ （Ａｅｄｅｓａ  ｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、エデス・アルボピクツス（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジョウバエ）、およびボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）宿主細胞などの宿主から数 多くのバクロウイルス株および変異体および対応する許容しうる昆虫宿主細胞が同定されている。ルッコウ（Ｌｕｃｋｏｗ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６、４７〜５５（１９８８）；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ジェネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ   Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、セットロウ（Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．）ら編、Ｖｏｌ．８（プレナム・パブリシング、１９８６）、２７７〜２７９頁；およびマエダ（Ｍａｅｄａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５、５９２〜５９４（１９８５）参照。かかるウイルス株は、種々、公的に利用可能であり（たとえば、アウトグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶのＬ−１変異体）、かかるウイルスはとりわけスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために本発明によるウイルスとして使用できる。
【０１６４】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養を宿主として利用することができる。一般に、ｔｒｋ受容体 ＤＮＡを含むように前以て操作しておいた細菌アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のある株とともにインキュベートすることにより植物細胞をトランスフェクションする。植物細胞培養をアグロバクテリウム・チュメファシエンスとともにインキュベート する間に、ｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡは該植物細胞宿主に移され、トランスフェクションされて適当な条件下でｔｒｋ受容体ＤＮＡを発現するようになる。加えて、ノパリンシンターゼプロモーターやポリアデニル化シグナル配列などの植物細胞と適合しうる調節配列およびシグナル配列も利用できる。デピッ カー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１、５６１（１９８２）。加えて、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流から単離したＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含有する植物組織での植物発現可能な遺伝子の転写レベルを活性化または増加させうる。１９８９年６月２１日に公開されたＥＰ３２１， １９６を参照。
【０１６５】
しかしながら、脊椎動物細胞での関心が最も高く、培養（組織培養）中での脊椎動物細胞の増殖は、それ自体よく知られている。ティッシュー・カルチャー （Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、アカデミック・プレス、クルーズ（Ｋｒｕｓｅ）およびパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）編（１９７３）参照。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓細胞株［２９３または浮遊培 養での増殖用にサブクローニングした２９３細胞、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６、５９（１９７７）］；ベビーハムスター腎臓細胞９ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ［ＣＨＯ、ウアラウプおよびチェイシン、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、４１２６（１９８０）］；マウスセルトリ細胞［ＴＭ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ）、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３、２４３〜２５１（１９８０）］；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ− １５７８）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳腫瘍 （ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞［マザーら、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３、４４０６８（１９８２）］；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）である。好ましい宿主細胞はヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞であ る。
【０１６６】
本発明の目的のために特に好ましい宿主細胞は、ｔｒｋ受容体を産生する脊椎動物細胞である。
【０１６７】
宿主細胞を上記発現またはクローニングベクターでトランスフェクションおよび好ましくは形質転換し、プロモーターを誘導すべくまたは増幅遺伝子を含む形質転換体を選択すべく適当に改変した通常の栄養培地中で培養する。
【０１６８】
（Ｆ．宿主細胞の培養）
本発明のｔｒｋ受容体ポリペプチドを産生するのに用いた原核生物細胞を、サンブルックらの上掲文献に一般に記載されているようにして適当な培地中で培養する。
【０１６９】
哺乳動物細胞は種々の培地中で培養することができる。ハムＦ１０（Ｈａｍ’ｓＦ１０）（シグマ）、最小必須培地（ＭＥＭ、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０ （シグマ）、およびダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）などの市販の培地が宿主細胞を培養するのに適している。加えて、ハム（Ｈａｍ）およびウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５８、４４（１９７９）；バーンズ（Ｂａｒｎｅｓ）およびサトー（Ｓａｔｏ）、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２、２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；４，６５７，８６６；４，９２７，７６２；または４，５６０，６５５；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５またはＵＳ  Ｐａｔ．Ｒｅ．３０，９８５号に記載されたいずれの培地も宿主細胞の培地として使用できる。これ ら培地には、必要に応じ、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（登録 商標）薬剤など）、微量元素（マイクロモルの範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を添加することができる。他の必要な添加物もまた、当業者に知られた適当な濃度で含まれていてよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、クローニングまたは発現のた めに選択された宿主細胞とともに用いたものが適しており、当業者には明らかであろう。
【０１７０】
本開示において言及する宿主細胞は、インビトロ細胞培養における細胞並びに宿主動物または植物中の細胞を包含する。
【０１７１】
本発明のｔｒｋ受容体は、相同的組換えにより、またはｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡをすでに含む細胞中に導入した調節要素を利用した組換え製造法により製造しうる。
【０１７２】
（Ｇ．遺伝子増幅／発現の検出）
遺伝子増幅および／または発現は、試料中で直接、たとえば、本明細書に提供する配列に基づき、適当に標識したプローブを用いて、ｍＲＮＡの転写を定量す る通常のサザーンブロッティング、ノーザンブロッティング［トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７、５２０１〜５２０５（１９８０）］、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、またはインシトゥハイブリダイゼーションにより測定することができる。種々の標 識を用いることができるが、最も普通には放射性同位元素、とりわけ３２Ｐを用いる。しかしながら、ポリヌクレオチド中に導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いるなどの他の技術も用いることができる。該ビオチンは、ついでアビジンまたは抗体への結合部位として働き、該アビジンまたは抗体は放射性核 種、蛍光、酵素などの広範囲の種々の標識で標識されていてよい。別法として、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡ混成二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識しうる抗体を用いることができる。これら抗体は今度は標識することができ、表面上で二本鎖が生成したときに該二 本鎖に結合した抗体の存在を検出することができるように、該二本鎖が結合する該表面上でアッセイを行うことができる。
【０１７３】
遺伝子発現はまた、別のやり方として、遺伝子産物の発現を直接定量するための組織切片の免疫組織化学的染色および細胞培養液または体液のアッセイなどの 免疫学的方法によっても測定することができる。免疫組織化学的染色法では、細胞試料を一般に脱水および固定によって調製し、ついで遺伝子産物に特異的な標識抗体と反応させる。その際、該標識は、酵素標識、蛍光標識、ルミネセンス標識などの、通常、視覚的に検出しうるものである。本発明に用いるのに適した特 に感度の高い染色法は、フセ（Ｈｓｅ）らのＡｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．７５、７３４〜７３８（１９８０）に記載されている。
【０１７４】
免疫組織化学的染色および／または試料液のアッセイに有用な抗体はモノクローナルまたはポリクローナルのいずれであってもよく、いずれの動物においても調製しうる。都合のよいことには、抗体は天然のｔｒｋ受容体ポリペプチドに対して、または以下にさらに詳細に記載するように本明細書により提供される ＤＮＡ配列に基づいた合成ペプチドに対して産生させることができる。
【０１７５】
（Ｈ．ｔｒｋ受容体の精製）
ｔｒｋ受容体は細胞培養の培地から分泌ポリペプチドとして回収するのが好ましいが、分泌シグナルとともにまたは分泌シグナルなしで膜接着ドメインを含む形態で直接発現される場合には宿主細胞溶解液から回収することもできる。
【０１７６】
ｔｒｋ受容体がヒト由来のもの以外の組換え細胞中で発現される場合には、ｔｒｋ受容体はヒト由来のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しか しながら、ｔｒｋ受容体に関して実質的に均質な調製物を得るため、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからｔｒｋ受容体を精製することが必要である。第一の工程として、培地または溶解液を遠心分離にかけて微細な細胞破砕物を除去する。ついで、膜および可溶性タンパク質のフラクションを分離する。つい で、ｔｒｋ受容体が膜に結合しているか否かにより、ｔｒｋ受容体を可溶性タンパク質フラクションから、または培養溶解液の膜フラクションから精製することができる。下記手順は適当な精製手順の例である：イムノアフィニティーカラムまたはイオン交換カラム上での分画化；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；たとえば、セファデックスＧ−７５を用いたゲル濾過；およびＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム。
【０１７７】
残基が欠失、挿入および／または置換されたｔｒｋ受容体の機能性の誘導体も、かかる変更により引き起こされた特性の実質的な変化を考慮に入れたうえで天 然の受容体鎖と同じ仕方で回収する。たとえば、他のタンパク質またはポリペプチド、たとえば細菌やウイルス抗原とのｔｒｋ受容体の融合は精製を容易にする；該抗原に対する抗体を含むイムノアフィニティーカラムを用いて該融合体を吸着させることができる。ウサギポリクローナル抗ｔｒｋ受容体抗体カラムなど のイムノアフィニティーカラムを用い、少なくとも一つの残留する免疫エピトープに結合させることによりｔｒｋ受容体変異体を吸着させることができる。フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）などのプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク質加水分解を抑制するのに有用であり、外来混入物 の増殖を防ぐために抗生物質を含有させることもできる。当業者であれば、天然のｔｒｋ受容体に適した精製法が、組換え細胞培養中で発現されたｔｒｋ受容体またはその変異体の特性の変化を補償するための修飾を必要とすることを理解するであろう。
【０１７８】
（Ｉ．ｔｒｋ受容体の共有結合修飾）
ｔｒｋ受容体の共有結合修飾は本発明の範囲に包含される。かかる修飾は、伝統的に、ｔｒｋ受容体の標的アミノ酸残基を選択した部位または末端残基と反応 しうる有機誘導体化剤と反応させるか、または選択した組換え宿主細胞中で機能する翻訳後修飾の動力化メカニズムにより導入される。得られる共有結合誘導体は、生物学的活性に重要な残基の同定、ｔｒｋ受容体のイムノアッセイ、または組換え体のイムノアフィニティー精製のための抗ｔｒｋ受容体抗体の調製に向け られたプログラムに有用である。たとえば、ニンヒドリンとの反応後のタンパク質の生物学的活性の完全な不活化は、その活性に少なくとも一つのアルギニンまたはリシン残基が必須であることを示唆しており、その後、修飾アミノ酸残基を含むペプチド断片を単離することにより、選択された条件下で修飾された個々の 残基を同定する。かかる修飾は当業者の行いうる範囲内であり、不当な実験なしで行うことができる。
【０１７９】
システイン残基は、最も普通にクロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応してカルボキシメチルまたはカル ボキシアミドメチル誘導体を与える。システイン残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、 ２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。
【０１８０】
ヒスチジン残基はジエチルピロカーボネートとのｐＨ５．５〜７．０での反応により誘導体化される。というのは、この試薬はヒスチジンの側鎖に比較的に特 異的であるからである。パラ−ブロモフェナシルブロマイドもまた有用である；この反応は好ましくは０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中、ｐＨ６．０で行う。
【０１８１】
リシンおよびアミノ末端残基は、無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させる。これら試薬による誘導体化は、リシン残基の電荷を逆転する効果を有 する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬としては、メチルピコリンイミデートなどのイミドエステル；ピリドキサールリン酸；ピリドキサール；クロロボロハイドライド（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン； およびグリオキシル酸とのトランスアミナーゼにより触媒された反応が挙げられる。
【０１８２】
アルギニン残基は１または幾つかの通常の試薬との反応により修飾されるが、それら試薬にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シク ロヘキサンジオン、およびニンヒドリンが含まれる。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａのためにアルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これら試薬は、アルギニンのイプシロン−アミノ基と同様にリシンの基とも反応するかもしれない。
【０１８３】
チロシン残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることによりチロシン残基中に分光学的標識を導入することに 大いなる興味をもって行うことができる。最も普通には、Ｎ−アセチルイミドゾールおよびテトラニトロメタンを用い、それぞれＯ−アセチルチロシン分子種および３−ニトロ誘導体を生成させる。チロシン残基は１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化してラジオイムノアッセイに使用するための標識タンパク質を調製する。
【０１８４】
カルボキシル側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドや１−エチル− ３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）と反応させることにより選択的に修飾する。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基はアンモニウムイオンと反応させることによりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。
【０１８５】
グルタミンおよびアスパラギン残基は対応グルタミン酸およびアスパラギン酸残基にしばしば脱アミド化される。別法として、これら残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【０１８６】
他の修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、プロテインズ：ストラクチュラル・アンド・モレキュラー・プロパティーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、フリーマン、サンフランシスコ、７９〜８６頁［１９８３］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびＣ−末端カルボキシル基のアミ ド化が含まれる。これら分子はさらに、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ８９／０２９２２または米国特許第４，６４０，８３５号；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９，３３７に記載された方法により、非タンパク質性のポリマー、たとえばポリエチレングリ コール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに共有結合により連結することができる。
【０１８７】
ポリペプチドとのｔｒｋ受容体の分子内凝集体の調製並びにアッセイまたはアフィニティー精製に使用するための水不溶性支持体マトリックスまたは表面への ｔｒｋ受容体の架橋には、２官能性試薬を用いた誘導体化が有用である。加えて、鎖間架橋の研究は立体配置構造に関する直接的な情報を提供するであろう。普通に用いられる架橋剤としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ ２官能性イミドエステル、および２官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を生成しうる光活性化中間体を生成する。別法として、臭化シアンで活性化した炭水化物などの反応性の水不溶性マトリックスおよびシステム 反応性基体（米国特許第３，９５９，６４２；３，９６９，２８７；３，６９１，０１６；４，１９５，１２８；４，２４７，６４２；４，２２９，５３７；４，０５５，６３５；および４，３３０，４４０に記載）をタンパク質の固定化および架橋に用いる。
【０１８８】
ある種の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミンおよびアスパラギン残基は、しばしば翻訳後に対応 するグルタミン酸およびアスパラギン酸残基に脱アミド化される。別のやり方として、これら残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
【０１８９】
他の翻訳後修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリン、トレオニンまたはチロシンのヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、 およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロパティーズ、フリーマン、サンフランシスコ、７９〜８６頁（１９８３）］が挙げられる。
【０１９０】
他の誘導体には、非タンパク質性のポリマーに共有結合した本発明の新規ペプチドが含まれる。かかる非タンパク質性ポリマーは、通常、親水性の合成ポリ マー、すなわち天然には他の仕方ではみられないポリマーである。しかしながら、天然から単離されたポリマーが有用であるように、天然に存在し組換えまたはインビトロ法により製造されるポリマーも有用である。親水性のポリビニルポリマー、たとえばポリビニルアルコールおよびポリビニルビロリドンは本発明の範 囲に包含される。特に有用なのはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどのポリビニルアルキレンエーテルである。
【０１９１】
ｔｒｋ受容体は、米国特許第４，６４０，８３５；４，４９６，６８９；４，３０１，１４４；４，６７０，４１７；４，７９１，１９２または４，１７９， ３３７に記載された方法により、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの種々の非タンパク質性ポリマーに結合させることができる。
【０１９２】
ｔｒｋ受容体は、たとえばコアセルベーション法または界面重合法により調製したマイクロカプセル中、コロイド状のドラッグデリバリーシステム（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子（ｎａｎｏ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）およびナノカプセル（ｎａｎｏｃａｐｓｕｌｅｓ））中、またはマクロエマルジョン中に包括することができる。かかる技術はレミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンスィズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ   Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１６版、オソル（Ｏｓｏｌ，Ａ．）編（１９８０）に開示されている。
【０１９３】
（Ｊ．ｔｒｋ受容体のグリコシル化変異体）
天然のｔｒｋ受容体は糖タンパク質である。本発明の分子中に存在するかもしれない天然のアミノ酸配列とは異なるグリコシル化パターンを有する変異体は本 発明の範囲に包含される。簡便のため、天然のポリペプチドのグリコシル化パターンにおける変化は、通常、本質的にアミノ酸変異体に関する上記技術を用い、ＤＮＡレベルで行う。
【０１９４】
本発明の分子のｔｒｋ受容体へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングもまた、炭水化物置換基の数またはプロフィルを修飾または増加させるために 用いることができる。これら手順は、Ｏ−結合（またはＮ−結合）グリコシル化しうるポリペプチドを製造する必要がないという点で有利である。使用したカップリング態様に応じて、糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離のカルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離のヒドロキシル基、（ｄ） セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンのものなどの遊離のスルフヒドリル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのものなどの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法はＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日に公開）、およびア プリン（Ａｐｌｌｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）のＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁に記載されている。
【０１９５】
ポリペプチド上に存在する炭水化物部分はまた化学的または酵素的に除去することができる。化学的な脱グリコシル化は、トリフルオロメタンスルホン酸また は等価な化合物に暴露することを要する。この処理の結果、連結糖を除く殆どまたはすべての糖が開裂し、一方でポリペプチドは完全な形で残す。化学的な脱グリコシル化はハキムジン（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ）らのＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９、５２（１９８７）およびエッジ（Ｅｄｇｅ）らの Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、１３１（１９８１）に記載されている。炭水化物部分は、トタクラ（Ｔｈｏｔａｋｕｒａ）らのＭｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８、３５０（１９８７）に記載されているように、種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼにより除去することができ る。グリコシル化は、ダスキン（Ｄｕｓｋｉｎ）らのＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、３１０５（１９８２）に記載されているように、ツニカマイシンにより抑制される。ツニカマイシンはタンパク質−Ｎ−グリコシダーゼ結合の生成を阻止する。
【０１９６】
グリコシル化変異体はまた、組換え製造の適当な宿主細胞を選択することによっても調製できる。たとえば、酵母は哺乳動物系とは有意に異なるグリコシル化 を導入する。同様に、天然のｔｒｋ受容体とは異なる種（たとえば、ハムスター、マウス、昆虫、ブタ、ウシまたはヒツジ）または組織（たとえば、肺、肝臓、リンパ節、間充織または表皮）由来の哺乳動物細胞は変異体グリコシル化を導入する能力により日常的にスクリーニングされる。
【０１９７】
（Ｋ．ｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラ（イムノアドヒーシン））
イムノアドヒーシンは、結合タンパク質（通常、受容体、細胞接着分子またはリガンド）の機能性ドメインを免疫グロブリン配列と組み合わせたキメラ抗体様分子である。免疫グロブリン配列は好ましくは（必ずしもそうでなくてよいが）免疫グロブリン定常ドメインである。
【０１９８】
免疫グロブリン（Ｉｇ）およびある種の変異体は知られており、その多くは組換え細胞培養において調製されている。たとえば、米国特許第４，７４５，０５５；ＥＰ２５６，６５４；フォークナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６（１９８２）；ＥＰ１２０，６９４；ＥＰ１２５， ０２３，モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）、Ｊ．
【０１９９】
【数２】
2008113664.tif 000003
Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１９７（１９８０）；ラソ（Ｒａｓｏ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４１；２０７３（１９８１）；モリソンら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９（１９８４）；モリソン、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；モリソンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１（１９８４）；ＥＰ２５５，６９４；ＥＰ２６６，６６３；およびＷＯ８８／０３５５９を参照。再会合した免疫グロブリン鎖 もまた知られている。たとえば、米国特許第４，４４４，８７８；ＷＯ８８／０３５６５；およびＥＰ６８，７６３およびその引用文献を参照。本発明のキメラ中の免疫グロブリン部分はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから得られてよいが、好ま しくはＩｇＧ−１またはＩｇＧ−３である。
【０２００】
適当な免疫グロブリン定常ドメイン配列に結合した受容体配列から構築したキメラ（イムノアドヒーシン）は当該技術分野で知られている。文献に報告された イムノアドヒーシンは、Ｔ細胞受容体★［ガスコイン（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、２９３６〜２９４０（１９８７）］；ＣＤ４★［カポン（Ｃａｐｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５〜５３１（１９８９）；トラウネッカー（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ）ら、 Ｎａｔｕｒｅ  ３３９、６８〜７０（１９８９）；ゼットマイスル（Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ）ら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ  ９、３４７〜３５３（１９９０）；バーン（Ｂｙｒｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４、６６７〜６７０（１９９０）］；Ｌ−セレクチン（ホーミングレセプター）［ワトソン （Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０、２２２１〜２２２９（１９９０）；ワトソンら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４９、１６４〜１６７（１９９１）］；ＣＤ４４★［アルフォ（Ａｒｕｆｆｏ）ら、Ｃｅｌｌ  ６１、１３０３〜１３１３（１９９０）］；ＣＤ２８★およびＢ７★［リンスレイ （Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３、７２１〜７３０（１９９１）］；ＣＴＬＡ−４★［リンスレイら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４、５６１〜５６９（１９９１）］；ＣＤ２２★［スタメンコビッチ（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）ら、Ｃｅ１ｌ６６、１１３３〜１１４４（１９９１）］；ＴＮＦ受 容体［アシュケナージ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、１０５３５〜１０５３９（１９９１）；レスラウアー（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７、２８８３〜２８８６（１９９１）；ペッペル（Ｐｅｐｐｅｌ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７４、１４８３〜１４８９（１９９１）］；ＮＰ受容体［ベネット（Ｂｅｎｎｅｔｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、２３０６０〜２３０６７（１９９１）］；ＩｇＥ受容体α★［リッジウエイ（Ｒｉｄｇｗａｙ）およびゴーマン（Ｇｏｒｍａｎ）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５、要約、１４４８ （１９９１）］；ＨＧＦ受容体［マーク（Ｍａｒｋ，Ｍ．Ｒ．）ら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．提出］（星印（★）は該受容体が免疫グロブリンスーパーファミリーの成員であることを示す）の融合体を含む。
【０２０１】
最も簡単で直截的なイムノアドヒーシンの設計は、「アドヒーシン」タンパク質の結合領域を免疫グロブリン重鎖のヒンジ領域およびＦｃ領域と組み合わせる ものである。通常、本発明のｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラを調製するには、所望のｔｒｋ受容体の細胞外ドメインまたはその断片をコードする核酸のＣ末端を免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合も可能である。
【０２０２】
一般に、かかる融合において、コードされたキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ド メインを保持しているであろう。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、または重鎖のＣＨ１の直ぐＮ末端または軽鎖の対応領域にて行うこともできる。
【０２０３】
融合を行う正確な位置は重要ではない；特定の部位はよく知られており、ｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラの生物学的活性、分泌または結合特性を最適にするために選択することができる。
【０２０４】
幾つかの態様において、ｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラは、本質的にＷＯ９１／０８２９８に説明されているように、単量体、ヘテロ多量体またはホモ多量体、とりわけ二量体または四量体として組み立てられる。
【０２０５】
好ましい態様において、ｔｒｋ受容体細胞外ドメイン配列（好ましくは第二の免疫グロブリン様ドメインを含む）を、免疫グロブリン、たとえば、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ−１）のエフェクター機能を含む抗体のＣ末端部分（とりわけ、Ｆｃドメイン）のＮ末端側に融合させる。重鎖定常領域全体をｔｒｋ受容体の細胞外ドメイン配 列に融合することも可能である。しかしながら、一層好ましくは、パパイン開裂部位（ＩｇＧＦｃを化学的に定める；重鎖定常領域の最初の残基を１１４として［コベットら、上記文献］残基２１６、または他の免疫グロブリンの類似の部位）の直ぐ上流のヒンジ領域から開始する配列を融合に用いる。特に好ましい態様 において、ｔｒｋ受容体アミノ酸配列を、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、またはＩｇＧ−３重鎖のヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させる。融合を行う正確な部位は重要ではなく、最適部位は日常的な実験により決定することができる。
【０２０６】
幾つかの態様において、ｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラは、多量体、とりわけホモ二量体またはホモ四量体として組み立てられる。一般に、これら組み 立てられた免疫グロブリンは、知られたユニット構造を有するであろう。基本的な４鎖構造ユニットが、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する形態である。４ユニットは高分子免疫グロブリンでは繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合により一緒にされた基本的な４ユニットの五量体として存在する。 ＩｇＡグロブリン、および場合によりＩｇＧグロブリンはまた血清中で多量体形態で存在する。多量体の場合、各４ユニットは同じであっても異なってもよい。
【０２０７】
本発明の範囲に包含される種々の組み立てられたｔｒｋ受容体−免疫グロブリンキメラの例を以下に図式的に示す：
（ａ）ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＨ−［ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ］；
（ｃ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−［ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ−ＡＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ］；
（ｄ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−［ＡＣＨ、またはＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ］；
（ｅ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−［ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ］；および
（ｆ）［Ａ−Ｙ］ｎ−［ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ］２
（式中、各Ａは同一または異なるｔｒｋ受容体のアミノ酸配列を示す；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインである；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖の可変ドメインである；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖の定常ドメインである；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインである；
ｎは１を越える整数である；
Ｙは共有架橋剤の残基を示す）。
【０２０８】
簡潔な表示のため、上記構造は基本的な特性のみを示す；上記構造は免疫グロブリンのジョイニング（Ｊ）ドメインまたは他のドメインを示していないし、ジ スルフィド結合も示していない。しかしながら、かかるドメインが結合活性のために必要な場合には、これらドメインは免疫グロブリン分子中に占める通常の位置にて存在するように構築されるであろう。
【０２０９】
別法として、キメラ重鎖を含む免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖配列と軽鎖配列との間にｔｒｋ受容体の細胞外ドメイン配列を挿入する ことができる。この態様において、ヒンジとＣＨ２ドメインとの間かまたはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間にて、免疫グロブリンの各アームにおいて免疫グロブリン重鎖の３’末端にｔｒｋ受容体配列を融合させる。同様の構築物がフーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．）らのＭｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、１０２７〜２０３７（１９９１）により報告されている。
【０２１０】
本発明のイムノアドヒーシンには免疫グロブリン軽鎖の存在は必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖はｔｒｋ受容体−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに 共有結合により会合するか、またはｔｒｋ受容体細胞外ドメインに直接融合して存在していてよい。前者の場合、一般に免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをｔｒｋ受容体−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと共発現させる。分泌されると、混成の重鎖および軽鎖が共有結合により会合して、２ つのジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造体が提供される。かかる構造体の調製に適した方法は、たとえば、１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０２１１】
好ましい態様において、本発明のイムノアドヒーシンの構築に使用する免疫グロブリン配列は、ＩｇＧ免疫グロブリン重鎖の定常ドメインからのものである。 ヒトイムノアドヒーシンの場合、ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列を使用するのが好ましい。ＩｇＧ１を使用する主要な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヒーシンが固定化プロテインＡ上で効率的に精製しうることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製にはプロテインＧが必要であるが、これは有意に利用範囲の 狭い手段である。しかしながら、特定のイムノアドヒーシンの構築のためのＩｇ融合相手の選択に際しては、免疫グロブリンの他の構造的および機能的特性をも考慮すべきである。たとえば、ＩｇＧ３のヒンジは一層長くて一層可撓性に富むため、ＩｇＧ１に融合した場合には折り畳まれずまたは適切に機能しない一層大 きな「アドヒーシン」ドメインを収容することが可能である。他の考慮すべき点は結合価である；ＩｇＧイムノアドヒーシンは２価のホモ二量体であるのに対し、ＩｇＡやＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、それぞれ基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体構造または五量体構造を生じる。インビボ適用のために設計 したｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンのためには、薬物動態学的特性およびＦｃ領域により特定されるエフェクター機能もまた重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はすべて２１日のインビボ半減期を有するが、補体系を活性化する相対的な効力は異なっている。ＩｇＧ４は補体を活性化せず、ＩｇＧ２は ＩｇＧ１に比べて補体活性化が有意に弱い。さらに、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は単核細胞または好中球上のＦｃ受容体には結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化が最適であるが、インビボでの半減期は他のＩｇＧイソタイプの約１／３である。イムノアドヒーシンをヒト治療剤として用いるべく設計するに際して考慮 すべき他の重要な点は、特定のイソタイプのアロタイプ変異体である。一般に、血清学的に定められたアロタイプの少ないＩｇＧイソタイプが好ましい。たとえば、ＩｇＧ１はわずかに４つのみの血清学に定められたアロタイプ部位を有し、そのうち２つ（Ｇ１ｍおよび２）はＦｃ領域に位置している；これら部位のうちの一つであるＧ１ｍ１は非免疫原性である。対照的に、ＩｇＧ３には１２の血清学的に定められたアロタイプが存在し、そのすべてがＦｃ領域中に存在する；これら部位のうちの３つ（Ｇ３ｍ５、１１ および２１）だけが非免疫原性の一つのアロタイプを有する。それゆえ、γ３イムノアドヒーシンの潜在的な免疫原性はγ１イムノアドヒーシンの免疫原性よりも大きい。
【０２１２】
本発明のｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンを設計するに際して、ニューロトロフィン結合および／または生物学的活性に必要でないドメインは欠失させてよ い。かかる構造において、折り畳みの間違いを回避するために融合接続（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）をドメイン間に位置する残基に置くのが重要である。親の免疫グロブリンに関して、有用な接続点は２つの重鎖の間でジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインの直ぐ上流である。しばしば用いられる設計において、該分 子の「アドヒーシン」（ｔｒｋ）部分のＣ末端残基のコドンをＩｇＧ１ヒンジ領域の配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰのコドンの直ぐ上流に位置させる。
【０２１３】
イムノアドヒーシンの構築および発現に適した一般法は、上記で（天然または変異体の）ｔｒｋ受容体に関して開示したものと同じである。ｔｒｋ−Ｉｇイム ノアドヒーシンは、最も都合よくはｔｒｋ部分をコードするｃＤＮＡ配列をＩｇｃＤＮＡ配列にインフレームで融合することにより構築される。しかしながら、ゲノムＩｇ断片への融合を用いることもできる［たとえば、ガスコイン（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、 ２９３６〜２９４０（１９８７）；アルフォら、Ｃｅｌｌ  ６１、１３０３〜１３１３（１９９０）；スタメンコビッチら、Ｃｅｌｌ  ６６、１１３３〜１１４４（１９９１）参照］。後者のタイプの融合には発現のためのＩｇ調節配列の存在が必要である。ＩｇＧ重鎖の定常領域をコードするｃＤＮＡ の単離は、脾臓または末梢血リンパ球に由来するｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づき、ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行うことができる。「アドヒーシン」をコードするｃＤＮＡおよびイムノアドヒーシンのＩｇ部分をコードするｃＤＮＡを、選択された宿主 細胞中での効率的な発現を指令するプラスミドベクター中に直列に挿入する。哺乳動物細胞中に発現するには、ｐＲＫ５ベースのベクター［シャル（Ｓｃｈａｌｌ）ら、Ｃｅｌｌ  ６１、３６１〜３７０（１９９０）］およびＣＤＭ８ベースのベクター［シード（Ｓｅｅｄ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９、８４０ （１９８９）］を用いる。正確な接続は、オリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異誘発を用い、設計した接続コドンの間の余分な配列を除去することにより創製することができる［ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０、６４８７（１９８２）；カポンら、 Ｎａｔｕｒｅ  ３３７、５２５〜５３１（１９８９）］。各半分が所望の接続の各部位に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いることができる；理想的には、これらオリゴヌクレオチドは３６〜４７量体である。別法として、ＰＣＲ法を用いて該分子の２つの部分を適当なベクターにインフレームで接続することができ る。
【０２１４】
ｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンの発現のための宿主細胞株の選択は、主として発現ベクターに依存する。他の考慮すべき点は、必要とするタンパク質の量である。ミリグラムの量が一過性のトランスフェクションによってしばしば産生されうる。たとえば、アデノウイルスＥＩＡで形質転換された２９３ヒト胚腎臓細 胞株をリン酸カルシウム法の変法によりｐＲＫ５ベースのベクターでトランスフェクションして充分なイムノアドヒーシン発現を行うことができる。ＣＤＭ８ベースのベクターを用いてＤＥＡＥ−デキストラン法によりＣＯＳ細胞をトランスフェクションすることができる［アルフォら、Ｃｅｌｌ  ６１、 １３０３〜１３１３（１９９０）；ゼットマイスルら、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（ＵＳ）９、３４７〜３５３（１９９０）］。一層多量のタンパク質の産生を望む場合は、宿主細胞株の安定なトランスフェクションの後にイムノアドヒーシンを発現させることができる。たとえば、ｐＲＫ５ベースのベクターを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードしＧ４１８に対する耐性を付与する別のプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入することがで きる。Ｇ４１８に対して耐性のクローンを培養中で選択することができる；これらクローンを増加レベルのＤＨＦＲインヒビターのメトトレキセートの存在下で増殖させる；ＤＨＦＲおよびイムノアドヒーシン配列をコードする遺伝子コピーの数が同時に増幅されたクローンを選択する。イムノアドヒーシンがそのＮ末端 に疎水性のリーダー配列を含む場合には、トランスフェクションした細胞によってプロセシングおよび分泌されやすい。一層複雑な構造のイムノアドヒーシンの発現には、独特に適した宿主細胞を必要とする；たとえば、軽鎖またはＪ鎖などの成分は、ある種のミエローマまたはハイブリドーマ細胞宿主によって提供され てよい［ガスコインら、１９８７、上記文献；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７、３５６１〜３５６８（１９９３）］。
【０２１５】
イムノアドヒーシンはアフィニティークロマトグラフィーにより都合よく精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、 キメラに用いた免疫グロブリンのＦｃドメインの種およびイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づくイムノアドヒーシンを精製するのに用いることができる［リンドマーク（Ｌｉｎｄｍａｒｋ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２、１〜１３（１９８３）］。プロテインＧ はすべてのマウスイソタイプおよびヒトγ３に推奨される［グス（Ｇｕｓｓ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５、１５６７１５７５（１９８６）］。アフィニティーリガンドを結合させるマトリックスは最もしばしばアガロースであるが、他のマトリックスを利用することもできる。制御多孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ   ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）やポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは一層速い流速を可能とし、一層短い処理時間がアガロースで達成できる。イムノアドヒーシンをプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティーカラムに結合させる条件は、完全にＦｃドメインの特性、すなわちその種お よびイソタイプによる。一般に、適切なリガンドを選択すると、非適正化培養液から効率的な結合が直接生じる。イムノアドヒーシンの一つの顕著な特徴は、ヒトγ１分子の場合、プロテインＡに対する結合能が同じＦｃタイプの抗体に比べて若干減少していることである。結合したイムノアドヒーシンは、酸性ｐＨ （３．０またはそれ以上）かまたは穏やかなカオトロープ塩を含む中性ｐＨの緩衝液中で効率的に溶出することができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程の結果、＞９５％の純度のイムノアドヒーシン調製物を得ることができる。
【０２１６】
プロテインＡまたはプロテインＧ上のアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、またはプロテインＡまたはプロテインＧ上のアフィニティークロマトグ ラフィーに加えて、当該技術分野で知られた他の方法を用いてイムノアドヒーシンを精製することができる。イムノアドヒーシンは、親チオ性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［ハッチェンズ（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ）およびポラト（Ｐｏｒａｔｈ）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９、 ２１７〜２２６（１９８６）］および固定化金属キレートクロマトグラフィー［アルーマシキ（Ａｌ−Ｍａｓｈｉｋｈｉ）およびマカイ（Ｍａｋａｉ）、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７１、１７５６〜１７６３（１９８８）］において抗体と同様に振る舞う。しかしながら、抗体とは対照的に、イオン交換カラム上の振る 舞いは等電点によるのみならず、そのキメラ特性のために分子中に存在するかもしれない荷電双極子にもよる。
【０２１７】
所望なら、イムノアドヒーシンは２特異的にできる、すなわち２つの異なるリガンドに向けられるようにすることができる。それゆえ、本発明のイムノアド ヒーシンは２つの異なるニューロトロフィンに対する結合特異性を有していてよく、またはニューロトロフィンと、該イムノアドヒーシン構造のｔｒｋ部分が結合する該ニューロトロフィンを発現する細胞上に特異的に発現された他の決定基とに特異的に結合してよい。２特異的な分子には、抗体様構造体の一方のアームのキメラ抗体重鎖と、他方のアームのキメラ抗体重鎖−軽鎖対とからなる三量体分子が精製の容易さのために有利である。２特異的なイムノアドヒーシンを産生するために伝統的に使用される抗体産 生クアドローマ（１０の四量体の混合物を産生する）とは対照的に、三量体イムノアドヒーシン構造体の３つの鎖をコードする核酸によりトランスフェクションされた細胞はわずかに３つの分子の混合物を産生し、この混合物からの所望の生成物の精製は一層容易である。
【０２１８】
（Ｌ．ｔｒｋ受容体抗体調製物）
（ｉ）ポリクローナル抗体
ｔｒｋ受容体に対するポリクローナル抗体は、一般に、ｔｒｋ受容体およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により動物において 産生される。ｔｒｋ受容体または標的アミノ酸配列を含むその断片を、２官能性または誘導体化試薬、たとえば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による結合）、グリタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用い、免疫をしようとする種において免疫原性であるタンパク質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターにコンジュゲートするのが有用である。
【０２１９】
１ｍｇまたは１μｇの免疫原性コンジュゲート（それぞれ、ウサギまたはマウスに対して）を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、該溶液を 複数部位にて皮内に注射することにより動物を該免疫原性コンジュゲートまたは誘導体に対して免疫する。１カ月後、動物にフロイントの完全アジュバント中の最初の量の１／５〜１／１０の量のコンジュゲートを複数部位にて皮下注射することによりブースター投与する。７〜１４日後、動物から採血し、血清を、抗 ｔｒｋ受容体抗体力価についてアッセイする。力価がプラトーに達するまで動物をブースター投与する。好ましくは、動物を同じｔｒｋ受容体のコンジュゲートだが異なるタンパク質にコンジュゲートした、および／または異なる交差試薬によりコンジュゲートしたものでブースター投与する。コンジュゲートはまた、組 換え細胞培養中でタンパク質融合体として製造することもできる。また、免疫応答を促進するためにアルミニウムなどの凝集剤を用いる。
【０２２０】
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、天然において最小量で存在する可能性のある変異以外は集団を構成する抗体が同一であるもの から得られる。それゆえ、「モノクローナル」なる修飾語は、区別される抗体の混合物でないものとしての抗体の特性を示す。
【０２２１】
たとえば、本発明の抗ｔｒｋ受容体モノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュテインによって最初に記載されたハイブリドーマ法（Ｎａｔｕｒｅ   ２５６：４９５（１９７５））を用いて作製することができ、または組換えＤＮＡ法［キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、米国特許第４，８１６，５６７号］によって作製することができる。
【０２２２】
ハイブリドーマ法では、マウスや他の適当な宿主動物、たとえばハムスターを上記のようにして免疫して、免疫に用いたタンパク質に特異的に結合するであろ う抗体を産生するまたは産生しうるリンパ球を生成させる。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することができる。ついで、ポリエチレングリコールなどの適当な融合剤を用いてリンパ球をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成する［ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、モノクローナル・アンティボ ディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）、５９〜１０３頁（アカデミックプレス、１９８６）］。
【０２２３】
かくして産生されたハイブリドーマ細胞を、未融合の親ミエローマ細胞の増殖または生存を抑制する１またはそれ以上の物質を好ましくは含む適当な培地中に 接種し、増殖させる。たとえば、親のミエローマ細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合には、ハイブリドーマの培地は一般にヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（これら物質はＨＧＰＲＴを欠く細胞の増殖を妨害する）を含むで あろう（ＨＡＴ培地）。
【０２２４】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択した抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に感受性であるもので ある。これらのうち、好ましいミエローマ細胞株は、ソーク・インスティチュート・セル・ディストリビューション・センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）（サンジエゴ、カリフォルニア、米国）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍 からのものや、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ロックビル、メリーランド、米国）から入手可能なＳＰ−２などのマウスミエローマ株である。
【０２２５】
ハイブリドーマ細胞を増殖させた培地を、ｔｒｋ受容体に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細 胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を免疫沈降により、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより決定する。
【０２２６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、たとえば、マンソン（Ｍｕｎｓｏｎ）およびポラード（Ｐｏｌｌａｒｄ）のスキャッチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０））により決定することができる。
【０２２７】
所望の特異性、親和性、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、これらクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標 準法により増殖させる。ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）、モノクローナル・アンティボディーズ：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、５９〜１０４頁（アカデミックプレス、１９８６）。この目的に適した培地としては、たとえば、ダルベッコの変性イーグル培地やＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。加えて、 ハイブリドーマ細胞はまた腹水腫瘍として動物中でインビボで増殖させることができる。
【０２２８】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、たとえば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳 動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順により、培地、腹水、または血清から適当に分離する。
【０２２９】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合しうるオリゴヌクレオ チドプローブを用いることにより）を用い、容易に単離および配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい採取源である。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついで該発現ベクターをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパ ク質を産生しないミエローマ細胞などの宿主細胞中にトランスフェクションして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成する。ＤＮＡ配列はまた、たとえば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列で置換することにより（モリソンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンのコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全体または部分を共有結合により連結することにより、修飾することができる。このようにして、本発明の抗ｔｒｋモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッ ド」抗体が調製される。
【０２３０】
典型的に、かかる非免疫グロブリンポリペプチドは本発明の抗体の定常ドメインと置換されるか、または本発明の抗体の一方の抗原結合部位の可変ドメインと 置換されて、ｔｒｋ受容体に対する特異性を有する一方の抗原結合部位と、異なる抗原に対する特異性を有する他方の抗原結合部位とを含む２価のキメラ抗体を創製する。
【０２３１】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、架橋剤を使用するものを含む合成タンパク質化学において知られた方法を用い、インビトロで調製することもでき る。たとえば、ジスルフィド交換反応を用い、またはチオエーテル結合を生成することにより、イムノトキシンを構築することができる。この目的に適した試薬としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０２３２】
診断に応用するには、本発明の抗体は典型的に検出可能な部分で標識されるであろう。検出可能な部分とは、検出可能なシグナルを直接または間接に生成しうるものであればいずれであってもよい。たとえば、検出可能な部分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、または１２５Ｉなどの放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、またはルシフェリンなどの蛍光または化学ルミネセンス化合物；ビオチン；放射性同位元素標識、たとえば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、または３Ｈ、またはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素であってよい。
【０２３３】
抗体を検出可能な部分に別々に連結させるため、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５（１９６２）；デービッド（Ｄａｖｉｄ）ら、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４（１９７４）；ペイン（Ｐａｉｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．４０：２１９（１９８１）；およびニグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．３０：４０７（１９８２）に記載された方法を含む、当該技術分野で知られたいか なる方法も用いることができる。
【０２３４】
本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイなどの公知アッセイ法のいずれにおいても使用できる。 ゾラ、モノクローナル・アンティボディーズ：ア・マニュアル・オブ・テクニークス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１４７〜１５８頁（ＣＲＣプレス、１９８７）。
【０２３５】
競合結合アッセイは、限られた量の抗体への結合に対して標識標準（ｔｒｋ受容体かまたはその免疫学的に反応性の部分であってよい）が試験試料分析対象物 （ｔｒｋ受容体）と競合する能力に基づく。試験試料中のｔｒｋ受容体の量は、該抗体に結合した標準の量に反比例する。結合した標準の量の決定を容易にするため、該抗体に結合した標準および分析対象物を結合しないで残った標準および分析対象物から都合よく分離できるように、該抗体を一般に競合の前または後に 不溶化する。
【０２３６】
サンドイッチアッセイは、それぞれ、検出すべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに結合しうる２つの抗体を使用することを含む。サンド イッチアッセイにおいては、試験試料の分析対象物が固相支持体上に固定化した第一の抗体に結合され、その後、第二の抗体が分析対象物に結合し、かくして不溶性の３部分複合体を生成する。デービッドおよびグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）、米国特許第４，３７６，１１０号。第二の抗体は、それ自体が検出可能な部分で標識されていてもよいし（直接サンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識した抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接サンドイッチアッセイ）。たとえば、一つのタイプのサンドイッチアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合は検出可能な部分は酵素で ある。
【０２３７】
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトの採取源から導入された１またはそれ以上のアミノ酸残基を その中に有する。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、典型的に「インポート」可変ドメインから取られたものである。ヒト化は本質的にウインター（Ｗｉｎｔｅｒ）および共同研究者の方法［ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２〜５２５ （１９８６）；リーチマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３〜３２７（１９８８）；ベルヘイェン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、１５３４〜１５３６（１９８８）］に従い、ネズミＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより行うことがで きる。従って、かかる「ヒト化」抗体は、実質的に完全なヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応配列により置換されたキメラ抗体である（キャビリー、上掲）。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、幾つかのＣＤＲ残基およびおそらく幾つかのＦＲ残基がネズミ抗体中の類似部位からの残基により置換されたヒト抗 体である。
【０２３８】
抗体のヒト化は、抗原に対する高親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながら行うことが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法に従 い、ヒト化抗体は親およびヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは当業者には普通に利用でき、よく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列のありうる三次元立体構造を明らかにし表示するコンピュータプログラ ムを利用できる。これら表示を調べると、候補免疫グロブリン配列の機能におけるこれら残基の果たしうる役割の分析、すなわち該候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このように、標的抗原への増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基を共 通配列およびインポート配列から選択し組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲが直接かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与している。詳細はＰＣＴ特許公報第ＷＯ９４／０４６７９号参照。
【０２３９】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作製できる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ 細胞株が、たとえば、コズボー（Ｋｏｚｂｏｒ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３、３００１（１９８４）、およびブロダー（Ｂｒｏｄｅｕｒ）ら、モノクローナル・アンティボディー・プロダクション・テクニークス・アンド・アプリケーションズ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ   Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、５１〜６３頁（マーセル・デッカー（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９８７）に記載されている。
【０２４０】
免疫後に内生の免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを産生しうるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）を作製することが今や可能である。たとえば、キメラおよび生殖細胞変異体マウスにおける抗体重鎖ジョイニング領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は内生抗体産生の完全な抑制という結果になることが記載されている。ヒト生殖細胞免疫グロブリン遺伝子アレイをかかる生殖細胞変異 体マウス中に移すと、抗原攻撃によりヒト抗体が産生される結果となる。たとえば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０、２５５１〜２５５（１９９３）；ジャコボビッツら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２、２５５〜２５８（１９９３）参照。
【０２４１】
別法として、ファージ提示（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）法（マッカファーティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５５２〜５５３ ［１９９０］）を用い、免疫していない供与体からの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体断片を作製することができる。この技術によれば、抗体のＶドメイン遺伝子がＭ１３やｆｄなどの繊維状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝 子のいずれかの中にインフレームでクローニングされ、該ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示される。繊維状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、該特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択という結果となる。それゆえ、ファージはＢ細胞 の幾つかの特性を真似たものとなる。ファージ表示は種々の態様で行うことができる；その概論には、たとえば、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ケビン（ＫｅｖｉｎＳ．）およびチズウエル（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ）、デービッド（ＤａｖｉｄＪ．）、カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）３、５６４〜５７１（１９９３）を参照。幾つかの入手源のＶ−遺伝子セグメントをファージ提示に使用できる。クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）らは、免疫したマウスの脾臓からのＶ遺伝子の小さなランダム組み合わせライブラリー （ｓｍａｌｌ  ｒａｎｄｏｍ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ）から抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを単離した（Ｎａｔｕｒｅ  ３５２、６２４〜６２８（１９９１））。免疫していないヒトからのＶ遺伝子のレパートリーの構築および抗原の種々のアレイ（自己抗原を含む）に対する抗体の単離 は、本質的にマークス（Ｍａｒｋｓ）ら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１〜５９７（１９９１））またはグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ）ら（ＥＭＢＯ  Ｊ．１２、７２５〜７３４（１９９３））によって記載された技術に従って行うことができる。天然の免疫応答においては、抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄 積する（体細胞超突然変異（ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ））。導入された変化の幾つかは一層高い親和性を付与し、高親和性の表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞はその後の抗原攻撃の間に優先的に複製し分化する。この天然のプロセスは、「鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）」 として知られる技術により真似ることができる（マークスら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０、７７９〜７８３［１９９２］）。この方法では、ファージ提示により得られた「一次（ｐｒｉｍａｒｙ）」ヒト抗体の親和性は、免疫していない供与体から得られたＶドメイン遺伝子の天然にみられる変異体のレパートリーで 重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置換していくことにより改善することができる。この技術はｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の作製を可能とする。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「マザー−オブ−オールライブラリー（ｔｈｅ  ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても 知られる）を作���するための戦略がウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）らによって記載されており（Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１、２２６５〜２２６６（１９９３））、かかる大きなファージライブラリーからの高親和性のヒト抗体の直接の単離はグリフィスらにより報告されている （ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９４）、印刷中）。遺伝子シャフリング（ｇｅｎｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）はまた、ネズミ抗体からヒト抗体を由来するのに用いることができ、その際、該ヒト抗体は出発のネズミ抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング（ｅｐｉｔｏｐｅ   ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージ提示法により得られたネズミ抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換してネズミ−ヒトキメラが創製される。抗原の選択は、機能的な抗原結合部位、すなわち相手の選択を支配（刷り込む）するエピトープ を再分類しうるヒト可変の単離という結果となる。このプロセスを残りのネズミＶドメインを置換するために繰り返すと、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ特許出願第ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ移植によるネズミ抗体の伝統的なヒト化と異なり、この方法は、ネズミ由来のフレームワークもＣＤＲ残基もともに有しない完全にヒトの抗体を提供する。
【０２４２】
（ｖ）２特異的抗体
２特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナルな、好ましくはヒトまたはヒト化された抗体である。本発明の場合 には、これら結合特異性のうちの一つはｔｒｋ受容体に対するものであり、他の特異性は他の抗原、好ましくは他の受容体または受容体サブユニットに対するものである。たとえば、ｔｒｋ受容体および神経栄養因子、または２つの異なるｔｒｋ受容体に特異的に結合する２特異的抗体は本発明の範囲に包含される。
【０２４３】
２特異的抗体の製造法は当該技術分野で知られている。伝統的に、２特異的抗体の組換え製造は２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づいており、 その際、２つの重鎖は異なる特異性を有する（ミルシュテインおよびクエロ（Ｃｕｅｌｌｏ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の取り合わせがランダムなため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、そのうち 一つのみが正しい２特異的な構造を有する。正しい分子の精製は通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われるが、かなり面倒であり、生成物の収率は低い。同様の手順がＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびトラウネッカー（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ）らのＥＭＢＯ
Ｊ．１０、３６５５〜３６５９（１９９１）に開示されている。
【０２４４】
異なる一層好ましいアプローチによれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合す る。融合は、少なくとも一部のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと行うのが好ましい。軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が融合物の少なくとも一つに存在するのが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体および所望なら免疫グロブリン軽鎖をコードする ＤＮＡを別々の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物中にコトランスフェクションする。このことは、構築において３つのポリペプチド鎖の均等でない比率を使用することが最適の収率を与える態様において、これら３つのポリペプチド断片の相互の比率を調節するうえでの大きな柔軟性を付与する。しかしながら、 少なくとも２つのポリペプチド鎖の等比率での発現が高収率の結果となるかまたは比率が特に重要でない場合には、３つのポリペプチドのうちの２つまたはすべてをコードする配列を一つの発現ベクター中に挿入することが可能である。このアプローチの好ましい態様において、２特異的抗体は、一方のアームにおける第 一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を付与する）とからなる。このような非対称な構造は、免疫グロブリン軽鎖が２特異的分子の半分の一方にのみ存在することは分離を容易にするので、望まない免疫グロブリ ン鎖の組み合わせから所望の２特異的化合物を分離するのを容易にすることがわかった。このアプローチは、１９９４年３月３日に公開されたＰＣＴ出願公開第ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。
【０２４５】
２特異的抗体の作製に関するさらなる詳細は、たとえば、スレシュ（Ｓｕｒｅｓｈ）らのＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１、２１０（１９８６）を参照。
【０２４６】
（ｖ）ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合により結合された２つの抗体からなる。かかる抗体は、 たとえば、免疫系細胞を所望されていない細胞にターゲティングしたり（米国特許第４，６７６，９８０）、ＨＩＶ感染の治療（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）に提唱されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、都合のよい架橋法を用いて作製することができる。適当な架橋剤は当該技術分野でよく知られており、多数の架橋法とともに米国特許第４，６７６，９８０に開示されている。
【０２４７】
（Ｍ．ｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンの使用）
（ｉ）リガンド結合
抗体におけるように、イムノアドヒーシンのＦｃ領域は精製のみならず捕捉および検出のための便利な取っ手を提供する。このことは、２つの異なる抗Ｆｃ抗 体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを用いてイムノアドヒーシンを定量する（たとえば、トランスフェクションした細胞の上澄み液中で）のに有用である。加えて、Ｆｃ取っ手は、ｔｒｋ部分と対応ニューロトロフィンとの相互作用を調べるのを容易にする。たとえば、マイクロタイタープレート結合アッセイ態様を使用 でき、その場合、抗Ｆｃ抗体を前以てコーティングしたウエル上にイムノアドヒーシンを固定化する。このことは、イムノアドヒーシンを同族ニューロトロフィンリガンドによる結合にｔｒｋ部分が接近できるような方向に配置することになる。ついで、リガンドを加え、固定化イムノアドヒーシンとともにインキュベー トする。未結合のリガンドを洗浄して除いた後、ニューロトロフィンリガンドが放射性標識してある場合には放射能をカウントすることにより、または抗ニューロトロフィン抗体により結合を定量する。非特異的な結合は、イムノアドヒーシンを省くことにより、または関係のない「アドヒーシン」部分を有するイソタイ プマッチしたイムノアドヒーシンを含めることにより決定することができる。このアッセイ態様は、ある種のニューロトロフィンの過小または過剰発現を特徴とする病理学的状態の診断に使用でき、また、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ受容体への種々の神経栄養因子の結合の比較、およびｔｒｋ受容体に対する新た なリガンドの発見に向けられた努力、たとえば、合成または天然の有機化合物のライブラリーのスクリーニングにも有用である。
【０２４８】
（ｉｉ）リガンドの同定／単離
ｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンを使用できる他の領域は、ヒトまたは種々の動物種におけるさらなるニューロトロフィンの探索、およびかかるリガンドの精 製である。このアプローチによって現在までに同定されたリガンドとしては、２つのＬ−セレクチンリガンド、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＣＤ３４が挙げられ、これらはＬ−セレクチン−ＩｇＧアフィニティーカラムを用いて同定および単離された（イマイ（Ｉｍａｉ）ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１３、 １２１３〜１２２１（１９９１）；ワトソンら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０、２２２１〜２２２９（１９９０）；ワトソンら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３４９、１６４〜１６７（１９９１）］。
【０２４９】
（ｉｉｉ）大量の精製可溶性ｔｒｋ受容体の製造
イムノアドヒーシンと抗体との構造的類似は、パパインなどのタンパク質加水分解酵素によりイムノアドヒーシンを開裂して「アドヒーシン」部分を含むＦｄ 様の断片を生成することが可能であることを示唆した。イムノアドヒーシンの開裂のための一層包括的なアプローチを得るためには、標的配列に高度に特異的なプロテアーゼを用いるべきである。この目的に適したプロテアーゼは、ズブチリシンＢＰＮの遺伝子操作変異体であり、このものは配列ＡＡＨＹＴＬを認識し開 裂する。この標的配列をｔｒｋ−ＩｇＧ１イムノアドヒーシンの支持体ヒンジ領域中に導入すると、Ｆｃドメインとｔｒｋドメインとの間での高度に特異的な開裂が容易となる。イムノアドヒーシンはプロテインＡクロマトグラフィーにより精製し、固定化された該酵素により開裂される。開裂の結果、２つの生成物、 Ｆｃ領域およびｔｒｋ領域が得られる。これら断片は、プロテインＡカラムに２回目通過させてＦｃを保持し溶出フラクション中に精製ｔｒｋ断片を得ることにより容易に分離することができる。同様のアプローチは、開裂可能な配列を一層下方のヒンジ部に配置することにより二量体ｔｒｋ部分を得るのに使用できる。
【０２５０】
（Ｎ．ｔｒｋ受容体の使用）
（ｉ）キナーゼ受容体活性化アッセイ
ｔｒｋ受容体は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９４／０３１９８に記載されたキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイに使用できる。このＥＬＩＳＡタイプの アッセイは、受容体プロテインチロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ、たとえば、ｔｒｋ受容体）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによるキナーゼ活性化の定性的または定量的測定、並びに選択されたｒＰＴＫの潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストの同定および特徴付けに適している。このアッセイの第一 段階は、キナーゼ受容体、たとえばｔｒｋ受容体のキナーゼドメインのリン酸化を含み、その際、該受容体は真核細胞の細胞膜中に存在する。受容体は内生の受容体であってよく、または受容体または受容体構築物をコードする核酸を細胞中に形質転換してよい。典型的に、第一の固相（たとえば、第一のアッセイプレー トのウエル）にかかる細胞（通常、哺乳動物細胞株）が接着するように該細胞の実質的に均一な集団で該固相をコーティングする。しばしば、細胞は接着性であり、それによって第一の固相に自然に接着する。「受容体構築物」を使用する場合には、それは通常、キナーゼ受容体とフラグ（ｆｌａｇ）ポリペプチドとの融 合からなる。フラグポリペプチドは該アッセイのＥＬＩＳＡ部分において捕捉試薬、しばしば捕捉抗体により認識される。ついで、チロシンキナーゼ受容体（たとえば、ｔｒｋ受容体）が分析対象物に暴露されるように（または分析対象物と接触するように）、細胞が接着したウエルに分析対象物を加える。このアッセイ は、興味のもたれるチロシンキナーゼ受容体（たとえば、ｔｒｋＡ、ｔｒｋＢまたはｔｒｋＣ）に対するアゴニストおよびアンタゴニストリガンドの同定を可能にする。受容体にアゴニストが結合するのを阻止するアンタゴニストリガンドの存在を検出するためには、受容体結合および活性化の競合的抑制を測定できるよ うに、まず、接着している細胞をアンタゴニストリガンドであると思われるものに暴露し、ついでアゴニストリガンドに暴露する。また、このアッセイは、アゴニストリガンドに結合することによって該アゴニストリガンドがｒＰＴＫに結合し活性化する能力を減少または除去するアンタゴニストを同定することができ る。かかるアンタゴニストを検出するには、ｒＰＴＫに対するアンタゴニストと思われるものおよびアゴニストを一緒にインキュベートし、ついで、このリガンド混合物に接着細胞を暴露する。分析対象物への暴露の後、接着細胞を溶解緩衝液（可溶化界面活性剤を含有する）および穏やかな撹拌により可溶化し、それに よって細胞溶解液を放出させ、これを濃縮または清澄化する必要なく直接、アッセイのＥＬＩＳＡ部分に供することができる。ついで、かくして調製した細胞溶解液はアッセイのＥＬＩＳＡ段階に容易に供することができる。ＥＬＩＳＡ段階の第一の工程として、第二の固相（通常、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート のウエル）を、チロシンキナーゼ受容体または受容体構築物の場合はフラグポリペプチドに特異的に結合する捕捉試薬（しばしば捕捉抗体）でコーティングする。第二の固相のコーティングは、捕捉試薬が第二の固相に接着するようにして行う。捕捉試薬は一般にモノクローナル抗体であるが、実施例にも記載するよう にポリクローナル抗体を用いることもできる。ついで、受容体または受容体構築物が第二の固相に接着する（または捕捉される）ように、得られた細胞溶解液を接着捕捉試薬に暴露または接触させる。ついで、未結合の細胞溶解液を除去するために洗浄工程を行い、捕捉された受容体または受容体構築物を残す。ついで、 接着したまたは捕捉された受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に暴露または接触させる。好ましい態様において、抗ホスホチロシン抗体は、非放射性の発色試薬の色変化を触媒する酵素に（直接または間接に）コンジュゲートされてい る。従って、受容体のリン酸化は、その後の試薬の色変化により測定することができる。該酵素は抗ホスホチロシン抗体に直接結合させることができるし、またはコンジュゲート分子（たとえば、ビオチン）を抗ホスホチロシン抗体にコンジュゲートし、その後、該酵素をコンジュゲート分子を介して抗ホスホチロシン抗 体に結合させることができる。最後に、捕捉された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を、たとえば発色試薬の色変化により測定する。
【０２５１】
（ｉｉ）治療学的使用
本発明のｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体ポリペプチド並びにこれら受容体に特異的に結合する抗体（モノ特異的であるか２特異的であるかまたはヘテロコン ジュゲート態様である）は、これら受容体の少なくとも一つに結合しうるニューロトロフィンの生物学的活性をシグナル伝達（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、促進または阻止するうえで有用である。本発明のｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンは、ｔｒｋ受容体とその神経栄養因子リガンドとの相互作用を阻止し、それによって ニューロトロフィンの生物学的活性を抑制することがわかった。このアンタゴニスト活性は、内生ニューロトロフィン産生を伴う病理学的状態、たとえば、炎症性の疼痛（ｔｒｋＡ−イムノアドヒーシン；実施例５参照）、膵炎（ｔｒｋＢ−イムノアドヒーシン）、腎臓疾患、肺疾患、心血管疾患（ｔｒｋＣ−イムノアド ヒーシン）、種々のタイプの腫瘍（ｔｒｋＡ−、ｔｒｋＢ−およびｔｒｋＣ−イムノアドヒーシン）、癲癇における異常な出現（ａｂｅｒｒａｎｔ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）、精神病（ｔｒｋＢ−およびｔｒｋＣ−イムノアドヒーシン）などの治療に有用である。ヒトイムノアドヒーシンは、ヒト免疫系によって 「外来のもの」と認識される唯一の新規な配列が接続部分のみであるように、該分子のｔｒｋ部分およびＩｇ部分の両方ともがヒト配列であることに基づくことができる。それゆえ、ヒトイムノアドヒーシンはキメラ（ヒト化）抗体とは対照的にヒトにおける免疫原性が最小である。このような減少した免疫原性は、とり わけ複数の投与を必要とする適応症にとって重要な利点である。
【０２５２】
本発明の治療用調合物は、所望の程度の純度を有する活性成分を任意の生理学的に許容しうる担体、賦形剤または安定化剤（レミングトンズファーマシュー ティカルサイエンスィズ、第１６版、オソル編（１９８０））と混合することにより、凍結乾燥調合物または水溶液の形態にて貯蔵のために調製される。許容しうる担体、賦形剤または安定化剤は、使用した投与量または濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を 含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキスト リンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールやソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；およびツイーン、プルロニックまたはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０２５３】
活性成分はまた、たとえばコアセルベーション法によりまたは界面重合法により調製したマイクロカプセル（たとえば、それぞれヒドロキシメチルセルロース またはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロエマルジョン中に包括することができる。かかる技術は上記 レミングトンズファーマシューティカルサイエンスィズに開示されている。
【０２５４】
インビボ投与に使用する調合物は滅菌する必要がある。このことは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜にて濾過することにより容易に行うことができる。
【０２５５】
本発明の治療用組成物は、一般に滅菌アクセスポートを有する容器、たとえば静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により破砕しうるストッパーを有するバイアル中に入れる。
【０２５６】
投与経路は公知の方法に従い、たとえば、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内または病変内経路による注射または注入、局所投与、または除放系にて行う。
【０２５７】
除放調製物の適当な例としては、たとえばフィルムやマイクロカプセルなどの形状製品の形態の半透明ポリマーマトリックスが挙げられる。除放マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγＬ−グルタミン酸エチルとのコポリマー（シドマン（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎ）ら、１９８３、 「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」２２（１）：５４７〜５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（ランガー（Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ）ら、１９８１、「Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．」１５：１６７〜２７７およびランガー、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５）、エチレンビニ ルアセテート（ランガーら、上掲）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８Ａ）を含む。除放組成物はまたリポソームを含む。本発明の範囲内の分子を含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製される：ＤＥ３，２１８，１２１Ａ；エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）ら、１９８５、 「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８２：３６８８〜３６９２；ファング（Ｈｗａｎｇ）ら、１９８０、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」７７．４０３０〜４０３４；ＥＰ５２３２２Ａ；ＥＰ３６６７６Ａ；ＥＰ８８０４６Ａ；ＥＰ１４３９４９Ａ；ＥＰ１４２６４１Ａ；日本特許 出願第８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５および４，５４４，５４５；およびＥＰ１０２，３２４Ａ。通常、リポソームは脂質含量が約３０モル％コレステロールを越える小さな（約２００〜８００オングストローム）単ラメラタイプのものであり、選択された比率は最適なＮＴ−４療法に適合されてい る。
【０２５８】
治療に用いる本発明の分子の有効量は、たとえば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存するであろう。従って、治療者は最適の治療効果を得るため の必要に応じて投与量を滴定し投与経路を変える必要があるであろう。典型的な１日当たりの投与量は、上記因子に依存して約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上までの範囲である。一般に、臨床医は必要とされる生物学的効果を奏する投与量に達するまで本発明の分子を投与するであろ う。この治療の進行は通常のアッセイにより容易にモニターされる。
【０２５９】
本発明は下記の限定されない実施例によりさらに詳細に説明されるであろう。実施例に記載した実験については、ヒト脳ｃＤＮＡ、ポリα＋ＲＮＡ、ゲノムお よびｃＤＮＡライブラリーはクローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（パロアルト、カリフォルニア）から入手した。ｐＧＥＭはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マジソン、ウイスコンシン）から、制限酵素はニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（ビバリー、マサチューセッ ツ）から入手した。Ｔａｑポリメラーゼはパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）（ノーウォーク、コネチカット）から入手したが、他のすべての酵素、凍結したコンピテントな大腸菌および組織培養培地はギブコ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（ライセルスブルク、メリーランド）から購入した。
【実施例】
【０２６０】
（実施例１）
（ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体のクローニング）
（Ａ．ヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣプローブの生成）
ヒト脳ｃＤＮＡ、ポリＡ＋ＲＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーをクローンテック（パロアルト）から入手した。
【０２６１】
ｃＤＮＡライブラリーのプローブに使用するヒトｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ配列の断片を増幅するため、ラットｔｒｋＢまたはブタｔｒｋＣの公知配列に基づく 縮重プライマー（表１参照）を用いたＰＣＲを採用した。ＰＣＲ反応緩衝液は、１０ｍＭトリス（室温にてｐＨ８．４）、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＫＣｌからなっていた。すべての反応に「ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒｔ）」手順を用い、酵素を含まない試料を９８℃にて１０分間イン キュベートし、６５℃に平衡化し、酵素を加えた。ついで、９４℃にて４５秒；６０℃にて４５秒；および７２℃にて６０秒のサイクルを３５サイクル行い、最終伸長を７２℃で１０分間行った。
【０２６２】
この手順により増幅された断片をｐＧＥＭベクター（プロメガ、マジソン、ウイスコンシン）中にサブクローニングし、配列決定した。ついで、公知の ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ配列と類似の配列を有するクローンから挿入物を切り出し、ゲル精製し、３２Ｐ  ｄＣＴＰを用いたランダムプライミングにより標識した。これらを用いて１５ｃｍ皿当たり５×１０４プラークにてプレーティングした１０６ｃＤＮＡ クローンをプローブし、ニトロセルロース（シュライヒャー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）、キーン、ニューハンプシャー）に２つずつ移し、アルカリ変性し、中和し、８０℃で２時間焼結した。フィルターを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、 ２０ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ７．４、０．１％ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、４２℃にて少なくとも４時間プレハイブリダイズし、デンハルト溶液を１×に下げた同じ条件下で一夜ハイブリダイズした。ついで、フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４回、および０．１ ×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて２回、および０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃にて２回、洗浄した。両セットのフィルターで陽性であったクローンをプラーク精製し、挿入物をヘルパー媒体した切り出し（ラムダＤＲ２ライブラリー）かまたは標準的なサブクローニングによりｐＧＥＭ中にサブクローニン グした。オリゴヌクレオチドプローブをポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識するか、またはＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いた「充填（ｆｉｌｌ−ｉｎ）」反応により標識し、ホルムアミドを３５％に減少させた同じ条件下でフィルターにハイブリダイズさせた。ｔｒｋＢの５’プローブにハイ ブリダイズするゲノムクローンをＳａｕ３ａで消化し、得られた断片をＢａｍＨＩ切断したＭ１３ｍｐ１８中にサブクローニングした。これらクローンをラムダライブラリーと同様に再スクリーングし（変性工程なし）、陽性のクローンをプラーク精製し、配列決定した。ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの完全なコード領域を コードするＤＮＡを標準法を用いて再構築した。
【０２６３】
（Ｂ．ヒトｔｒｋＢクローンの特徴付け）
ヒトｔｒｋＢのプローブを用いて６つのクローンが得られた。これらを、最初のプローブで得られた配列から設計したＰＣＲおよびプライマーを用いてマッピ ングし、最大の３’および５’伸長を有するクローンを配列決定した。配列分析は、これらクローンがネズミｔｒｋＢと高度に相同なタンパク質をコードしており、全チロシンキナーゼドメインを含み３’ポリＡ＋テールは完全であるが５’末端は明らかに不完全であることを明らかにした。ラットｔｒｋＢ配列の５’末 端から設計したオリゴヌクレオチドプローブを用い、最初のライブラリー、および引き続き、陽性のクローンが認められなかった４つの他のｄＴプライミングしたヒト脳ライブラリーを再スクリーニングした。このプローブを用いてランダムプライミングヒト脳ライブラリーをスクリーニングしたところ、４つの陽性ク ローンが得られた。これらクローンの配列分析は、これらクローンが前記ヒトクローンと重複しているが、ラットと比較すると５’末端のコード領域の１７の塩基が依然として失われていた。ついで、ヒトゲノムライブラリーを５’オリゴヌクレオチドプローブでプローブし、ゲノムクローンを単離した。ついで、これら クローンのＳａｕ３ａ断片をＭ１３中にサブクローニングし、再スクリーニングし、陽性サブクローンの配列を決定して最終のコード配列を得た。これらｃＤＮＡクローンの重複領域から得られたヒトｔｒｋＢの最終的なヌクレオチド配列およびそれから導かれたアミノ酸配列を図１に示す。
【０２６４】
（Ｃ．ヒトｔｒｋＣクローンの特徴付け）
同様の戦略をヒトｔｒｋＣの細胞外ドメインに特異的なプローブを作製するために用い、２つの最初のクローンを得た。これらクローンの両者とも、ブタおよ びラットにおいて記載されたｔｒｋＣの切断形態に対応する配列を含むことがわかった（ランバレら、［１９９２］上掲；ツォウルファス、［１９９３］上掲；バレンズエラら、［１９９３］、上掲）。なぜなら、該配列は、ｔｒｋＣの完全な細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＫ様配列を含まない短い細胞質ドメインをコードしていたからである。ｔｒｋＣのチロシンキナーゼドメインをコードするクローンを単離するため、ブタｔｒｋＣのＣ末端テールおよびヒトｔｒｋＣの細胞間ドメインの膜近傍領域に対応するオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーを２回再プローブした。二重陽 性クローンが分析され、切断されたｔｒｋＣクローンと重複する配列を含み、チロシンキナーゼコード配列をも含むことがわかった。これらクローンの重複領域から得られたヌクレオチド配列およびそれから導かれたアミノ酸を図２に示す。
【０２６５】
（Ｄ．ヒトｔｒｋＡのクローニング）
加えて、正確にマッチするプライマーおよび鋳型としてのヒト脳ｃＤＮＡを用いることによりＰＣＲでヒト脳からｔｒｋＡを再クローニングした。得られたク ローンを配列決定したところ、以前に刊行された配列との５つの不一致がみられた。これら各領域をそれぞれ幾つかの異なる増幅反応での直接配列決定により調べ、配列決定したクローン中の真の間違いを部位特異的突然変異誘発により修正した。以前に決定された配列とは一つだけ差異が残ったが、これは導かれたアミ ノ酸配列中の残基３００においてセリンからシステインへの変換となるＣＧのＧＣへの転位であった。複数の反応で配列決定したこと、およびラットｔｒｋＡ（ミーキンら、［１９９２］、上掲）および他のすべての知られたｔｒｋ（下記参照）において該システインが保存されていることから、オリジナルの配列が誤 りであると思われる。
【０２６６】
（Ｅ．結果）
ヒトクローンから得られた配列の吟味およびラットおよびマウスｔｒｋＢおよびラットおよびブタｔｒｋＣの知られた構造との比較は、配列全体にわたってこ れら哺乳動物種間で非常に高度の類似性が存在することを示している。シュナイダーおよびシュバイガー（１９９１、上掲）によって同定された全構造モチーフは維持されている、すなわち、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの両者について残基３１で切り取られると予測された（後にＮ末端配列分析により確認された；ｔｒｋイ ムノアドヒーシンの発現を参照）シグナル配列、ロイシンに富むドメインの両側のシステインに富む２つのドメイン、Ｃ２タイプの２つのＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、および他の公知のチロシンキナーゼとの高い類似性を示すチロシンキナーゼドメイン。ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの細胞外ドメインには、それぞれ １１および１３の潜在的なＮ結合グリコシル化部位が存在する。種内および種間での知られたｔｒｋの異なる領域の類似性を図３に示す。
【０２６７】
ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣについて得られた異なるクローンの幾つかの配列分析において、おそらく別の仕方のスプライシングにより生じたと思われる複数の形 態が認められた。変異体の形態は、ｔｒｋＣの細胞外ドメイン中への可能な挿入、切断された非ＴＫ形態のｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ、およびｔｒｋＣのＴＫドメイン内の可能な挿入として観察された。ついで、特異的なオリゴヌクレオチドプローブでのライブラリースクリーニングおよびＰＣＲを用い、異なるヒトｔｒｋ 中のこれら部位での他の潜在的な変異を探索するために一層系統的な探索を行った。異なるヒトｔｒｋ中でみられた異なる形態および他の公知のｔｒｋでみられたものとの比較の図式を図４に示す。
【０２６８】
ヒトｔｒｋＣの細胞外ドメイン中には、ラットおよびヒトｔｒｋＡにおいて細胞外挿入が記載された部位の近接部位に、ラットおよびブタｔｒｋＣと比べて９ つのアミノ酸の可能な欠失が存在した（バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１５１０〜１５１５７［１９９３］；図２）。ヒトｔｒｋＣ中の該領域のＰＣＲ分析は、挿入含有および挿入欠失の両形態に期待される長さに対応する２つのバンドしか示さなかった。ヒトｔｒｋＢ中の該領域の ＰＣＲ分析は検出可能な断片長多型を示さなかったが、ｔｒｋＡ特異的なプライマーを用いた増幅では２つの区別されるバンドが示され、これらをクローニングし配列決定した。潜在的なヌクレオチド挿入は、ラットおよびヒトｔｒｋＡにおいて以前に記載されたもの（バーカーら、上掲）と同一のペプチド挿入をコードする１２９７位でのＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＴＧＧであった。
【０２６９】
ヒト脳ライブラリーからは、ＴＫドメインをコードしないがその代わりに切断された細胞内ドメインを示すｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの両クローンが得られた。 ｔｒｋＢでは、これはラットでｔ１として（ミドルマスら、［１９９１］、上掲）マウスでは切断形態として（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８、３７０１〜３７０９［１９８９］）以前に同定されたものと同一の４３５位の後に付加された１１の新たなアミノ酸からなっていた。オリゴヌクレオチドでプ ローブするｃＤＮＡライブラリーを使用したまたはＰＣＲを使用したあらゆる試みも、ラットにおいてｔ２として同定されたもの（ミドルマスら、［１９９１］、上掲）と類似のヒトからの配列を得ることができなかった。マウスまたはラットのいずれかの脳ｃＤＮＡを鋳型として用いた場合にはＰＣＲに よってｔ２と類似の配列が容易に得られたが、このことはｔ２がラットに特有のものではないこと、および使用した技術は少なくともネズミからｔ２様配列を検出しうることを示していた（データは示していない）。
【０２７０】
ｔｒｋＣの切断形態はｔｒｋＢのものよりも長く、ブタｔｒｋＣにおいて（ランバレら、［１９９１］、上掲）およびラットにおいて（ツォウルファスら、 ［１９９３］、上掲）またはラットｔｒｋＣのｉｃ１５８形態として（バレンズエラら、［１９９３］、上掲）以前に記載されたものと類似していた。この形態は４９８位から開始する８３の付加的アミノ酸からなり、これらアミノ酸は種間で高度に保存されていた。この範囲において、ただ２つの相違、アスパラギン酸 のグルタミン酸への置換およびセリンのプロリンへの置換のみが３つのすべての種において存在した。
【０２７１】
ｃＤＮＡクローンにおいて得られたｔｒｋＣのＴＫドメインは、サブドメインＶＩＩとＶＩＩＩとの間に１４のアミノ酸のみかけの挿入を有していた（ハンク ス（Ｈａｎｋｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：４２〜５２［１９８８］およびハンクスら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００：３８〜６２［１９９１］）。この配列はラットｔｒｋＣＴＫドメインでみられた観察された潜在的な挿入と同じ部位に挿入されており、そこでみられた１４のアミノ酸挿入 と配列が同じである（ハンクスら、［１９８８］、上掲；バレンズエラら、［１９９３］、上掲）。ラットｔｒｋＣでみられた１４のアミノ酸挿入に加え、２５（ツォウルファスら、［１９９３］、上掲）または３９（バレンズエラら、［１９９３］、上掲）のアミノ酸の一層長い挿入が認められている。これら一層長い 挿入がヒトでも発現されているかどうかを決定するため、この領域にわたって脳ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。これら実験は一貫して、２つのすでに観察されたスプライス型、すなわち１４のアミノ酸挿入を有するものと有しないものとに対応する長さの２つのバンドを示した。これら２つのバンドのクロー ニングおよび配列決定により、これらバンドが以前にみられた１４のアミノ酸挿入を有する形態と有しない形態との２つの形態に対応することが確かめられた。興味深いことに、挿入不含の形態に対応するバンドは高レベルのｔｒｋＣを発現する非神経組織、すなわち精巣からのｃＤＮＡを用いた増幅においてのみ認めら れたので（データは示していない）、このスプライスは組織特異的であった。ｔｒｋＢＴＫドメインの同領域に特異的なオリゴヌクレオチドを用いたヒト脳ｃＤＮＡのＰＣＲは、この領域における断片長多型の証拠を示さなかった。
【０２７２】
（Ｆ．検討）
単一の種内での異なるｔｒｋの間および異なる種の同じｔｒｋの間での類似性の程度を調べることにより、ある種の一般化が引き出されるかもしれない。３つ のヒトｔｒｋ相互間およびこれらとラットからの等価なｔｒｋとの比較を、上記シュナイダーおよびシュバイガー（１９９１）によって定められた異なるドメインについて図３に示す。各ｔｒｋはヒトとラットとで極めてよく保存されており、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣはこれら２つの哺乳動物種間で殆ど同一である。ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの個々のドメインはラットとヒトとの間で少なくとも８５％類似である。他方、ｔｒｋＡはヒトとラットとの間の全体的な類似性は極めて高いものの、有意の配列相違の領域を示す。とりわけ、細胞外ドメインにおいては、少なくとも８５％類似であるのはロイシン に富む領域と第二のＩｇ様ドメインのみである。このことは、ｔｒｋのニューロトロフィン結合ドメインの局在化を意味しているのかもしれない。ｔｒｋＡの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインは、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣと同様にラットおよびヒト間で高度に保存されている。ヒトにおいて異なるｔｒｋ間で類似性を 比較すると、ＴＫドメインが異なるｔｒｋ間で最も高度に保存されていることが明らかである。細胞外ドメインのうちでは、この場合も異なるヒトｔｒｋ間で最も類似しているのは第二のシステインに富むドメインとともに第二のＩｇ様ドメインである。
【０２７３】
配列の保存とは対照的に、異なってプロセスされた転写物の形態においてヒトｔｒｋと以前に知られているｔｒｋとの間に相違が観察された。ネズミにおいて はｔｒｋＢは少なくとも２つの異なる切断された形態を含み、ｔｒｋＢに対してプローブしたノーザンブロットは多くの転写物サイズの複雑なパターンを示した。本発明者らは、かなり努力したにもかかわらずヒトにおいてｔ２形態の存在を示す証拠を見いだすことはできず、ｔｒｋＢについてはるかに単純な転写物パ ターンを観察した。本発明者らはヒトにおける該形態のホモログの存在を除外することはできないが、ｔ２の等価物がネズミと同じくらい豊富に発現されることはありそうにないと思われる。
【０２７４】
ｔｒｋの切断形態に対して提唱されている役割の一つは、発現細胞においてニューロトロフィンによるシグナル変換に対し優勢な負の作用（ｄｏｍｉｎａｎｔ   ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ）を及ぼすことである（ジング（Ｊｉｎｇ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ９、１０６７〜１０７９［１９９２］）。このことは、ニューロトロフィンで刺激したときに成人脳からの組織でみられるニューロトロフィンシグナル伝達の効率の相対的な欠如と一致する（クヌセル （Ｋｎｕｓｅｌ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．［１９９４］）。なぜなら、切断されない形態に対する切断された形態の比は成人において極めて高いからである。これが切断されたｔｒｋの主要な役割であるなら、ヒトにおいてｔ２が見かけ上欠如しているのはますます一層興味深い。というのは、ネズミではｔ２は ニューロンにおいて主として発現されるがｔｒｋＢの他の切断形態であるｔ１は主として非ニューロン性細胞で発現されることが示されているからである。このような局在化がヒトにも当てはまるなら、ｔ２の存在しないヒトニューロンはｔｒｋＢの切断形態をネズミに比べてはるかに低レベルで発現する。それゆえ、提 唱されている優勢な負の作用はヒトニューロンではネズミほど重要ではないかもしれない。
【０２７５】
ヒトｔｒｋＣと以前に記載されたｔｒｋＣの転写物との間にもまた相違が存在する。細胞外ドメインにおいて、９のアミノ酸の挿入を有する形態と有しない形 態という２つの形態を生じる明らかな別の仕方のスプライシングが存在する。この明らかな挿入部位は、ラットｔｒｋＡで以前に特徴付けられた挿入部位と整列する。挿入が６アミノ酸であるラットｔｒｋＡの２つのスプライス形態では、今のところ結合またはシグナル変換における機能的な相違は検出されていないが （バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１５１０〜１５１５７［１９９３］）、おそらく、９のアミノ酸挿入を有するヒトｔｒｋＣ形態では一層大きな相違が存在するであろう。異なってスプライスされた形態の生物学的役割が何であれ、これら形態は極めて種特異的である。なぜなら、本研 究においてはヒトｔｒｋＢで該位置に挿入の証拠はみられず、これまでの研究ではヒト以外でｔｒｋＣ中の挿入は検出されていないからである（バレンズエラら、［１９９３］、上掲；ツォウルファス、［１９９３］、上掲；ランバレら、［１９９１］、上掲）。
【０２７６】
本発明者らはまた、ヒトｔｒｋＣ分子の細胞内部分中におそらく別の仕方のスプライシングによるものと思われる種々の形態の例を見いだした。本発明者らは、共通のチロシンキナーゼドメインを全く含有しないｔｒｋＣの切断形態の存在を観察した。切断形態が非常に短い細胞質テールを有するｔｒｋＢと異なり、切断されたヒトｔｒｋＣの細胞質部分は８３残基の長さである。加えて、この領域は種間で 非常に高程度に保存されており、重要な機能を有するかもしれないこと（おそらく細胞下局在を特定するシグナルとして働く）が示唆されている。
【０２７７】
ラットｔｒｋＣで記載されているように、ＴＫドメイン中に挿入を含むヒトｔｒｋＣの形態が存在する。１４および２５または３９アミノ酸の挿入が可能な ラットと異なり、ヒトの該部位には１４アミノ酸の挿入のみが可能であると思われる。これら挿入はリガンドのｔｒｋＣへの結合によって誘発されたシグナル伝達カスケードを変調するうえで重要な役割を果たしているように思われる。シグナル変換のアッセイ系として種々の形態のｔｒｋＣを発現するＰＣ１２細胞を用 い、ＴＫドメイン中に挿入を有しないｔｒｋＣの発現が発現細胞に対して神経突起の過剰生育を伴うＮＴ３に対する応答能力を付与し、ＮＴ３により誘発された自己リン酸化を引き起こすことが示された。ＴＫ挿入を含むｔｒｋＣを発現する細胞はリガンドにより誘発された自己リン酸化を起こしうるが、神経突起の過剰 生育を伴うＮＴ３への応答は起こさない。この点に関してはこれまでのところ種々の挿入の間で何ら相違が記載されていないが、ニューロトロフィン結合に対して多くの下流後遺症（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｓｅｑｕｅｌａｅ）が存在し、今日までほとんど全く調べられていない。このプロセシングは、１４残基挿入を有 する形態を示す証拠がヒト精巣では観察されていないので組織特異的である。
【０２７８】
（実施例２）
（ヒト組織におけるｔｒｋ受容体の発現パターン）
（Ａ．ノーザン分析）
ノーザン分析に用いるプローブは、ＰＣＲおよび表１に示すプライマーを用いて適当なクローニング鋳型ＤＮＡ上にて標識した。ＰＣＲ反応は、非標識 ｄＣＴＰの代わりにガンマ３２ＰｄＣＴＰを８ｍＣｉ／ｍｌ（３，０００Ｃｉ／ミリモル）の濃度で用い、反応を２０サイクルしか行わなかった他は最初のクローニングと同様にして行った。プローブを導入されなかったヌクレオチドから分離し、５分間沸騰させた後、５×ＳＳＰＥ、１０×デンハルト、 １００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、および２％ＳＤＳ中でプレハイブリダイズさせておいたレーン当たり２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むニトラン（Ｎｙｔｒａｎ）ブロット（クローンテック、パロアルト、カリフォルニア）に加えた。ハイブリダイゼーションを５０℃にて同溶液中で行い、ついでブ ロットをライブラリーフィルターと同様にして洗浄したが最終の洗浄は５０℃にて行った。造影プレートを１０〜２０時間暴露した後、フジ（Ｆｕｊｉ）ＢＡＳ２０００イメージアナライザーを用いてオートラジオグラムを得た。
【０２７９】
（結果）
ヒト組織でのｔｒｋの発現パターンおよび転写物サイズをノーザン分析により調べた。ｔｒｋＢのプローブでのハイブリダイゼーションでは、細胞外特異的プ ローブとＴＫ特異的プローブとの両者にハイブリダイズする６．９ｋｂの転写物、およびＴＫ特異的プローブのみにハイブリダイズする８．１ｋｂの転写物という、明らかに簡単なパターンが得られた。この簡単な結果に基づき、８．１ｋｂの転写物はおそらく完全長（ＴＫ含有メッセージ）に対応し、一方、６．９ｋｂ の転写物はヒトでみられた単一の切断形態をコードするメッセージに対応する。ｔｒｋＣをクローニングする間に検出された多数の潜在的スプライス変異体から期待されるように、この分子のノーザンプローブは一層複雑なハイブリダイゼーションパターンに導いた。ＴＫドメインに特異的なプローブを用いると１１． ７、７．９および４．９ｋｂの転写物が検出され、一方、細胞外ドメインプローブを用いると４．４ｋｂの別の転写物が検出された。
【０２８０】
調べたヒト組織のうち、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣはともに脳において最も豊富に発現された。しかしながら、成人および胎児組織の両方において神経系以外の 種々の部位で発現が認められた。ＴＫドメインを含む８．１ｋｂ転写物は、腎臓、骨格筋および膵臓において発現されたが、心臓、脾臓および卵巣では切断形態のみの発現が検出された。胎児組織では、ＴＫ含有ｔｒｋＢは脳のみならず腎臓および肺でも認められ、一方、切断されたｔｒｋＢは脳、腎臓、肺および心臓で 認められた。切断されたｔｒｋＢ転写物に対するＴＫ含有ｔｒｋＢ転写物の比は、成人脳よりも胎児脳ではるかに高いことが明らかであった。
【０２８１】
ｔｒｋＣの最も高い発現レベルは脳においてであったが、神経系以外でも広くｔｒｋＣの発現が認められた。成人ではＴＫ含有ｔｒｋＣは腎臓、骨格筋、肺、 心臓、小腸、卵巣、精巣、および前立腺で発現され、胎児では最も高い発現は脳、腎臓、肺および心臓においてであった。ｔｒｋＣの切断形態に対応する４．４ｋｂ転写物は、末梢血白血球を除く調べたすべての組織で検出された。ｔｒｋＢの場合と同様に、切断されたｔｒｋＣに対するＴＫ含有ｔｒｋＣの比は、成人 脳に比べて胎児脳の方が高かった。
【０２８２】
（検討）
ｔｒｋＢの転写物のノーザンブロットを用いた分析は、ネズミでみられたものに比べて比較的簡単なパターンを示した。このことは、ヒトではｔｒｋＢの単一 の主要な切断形態のみが存在するという考えと一致する。ｔｒｋＣの分析は、クローンの配列分析で検出された多数の形態と一致して転写物のサイズにおいて一層完全なパターンを示した。ラットｔｒｋＣにおいて記載されたような［バレンズエラら、［１９９３］、上掲］キナーゼプローブとはハイブリダイズするが細 胞外プローブとはハイブリダイズしない転写物についての証拠はみられなかった。異なる組織の分析において、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ発現の主要な部位は神経系であり、とりわけＣＮＳの領域であった。予期しなかったのは、神経系以外の組織にも広くｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの低レベルの発現がみられることであっ た。その発現レベルは脳の種々の領域でみられるものに比べると極めて低いが、それでもバックグラウンドを越えて明確に検出しえた。ある種の組織でみられる発現の幾つかは、該組織にまばらに分散した神経系の要素上での発現によるのかもしれない。たとえば、小腸でのｔｒｋＣの発現は、その全部または一部が腸神 経系のニューロンによる発現によるものであるかもしれない。このことの最終的な解明は、神経系以外の組織の詳細なインシトゥハイブリダイゼーション分析を待たなければならないであろう。
【０２８３】
（Ｂ．インシトゥハイブリダイゼーション）
以前に刊行された手順（フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０、２９０〜２９４［１９９０］）の変法によりインシトゥハイブリダ イゼーションを行った。ハイブリダイゼーションのための組織は種々の技術により調製した。すべての組織について自己消化の時間は２４時間以下であった。全体の非固定胎児をＯＣＴ中に埋設し、液体窒素上のペトリ皿中に塊を浮遊させることにより凍結し、クリオスタットの助けをかりて切片にした。切片をスライド （スーパーフロストプラス（ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ）、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ））上に解凍−積載し（ｔｈａｗ−ｍｏｕｎｔｅｄ）、空気乾燥し、５５℃にて１０秒間焼結し、使用時まで除湿剤を入れた密封箱中に−７０℃にて貯蔵した。成人後根神経節を４％ホルムアルデヒド中に浸漬し、パラフィン 切片化かまたは凍結切片化（ｃｒｙｓｏｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇ）のいずれかのために処理した。脳標本は、４％ホルムアルデヒド中に２４時間浸漬することにより固定し、ショ糖緩衝液中で２４時間凍結保護し（ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）、ドライアイス上で凍結し、フリージングスライディングマイクロトーム （ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｓｌｉｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）上で切断した。切片をリン酸緩衝食塩水中で４℃にて貯蔵し（４８時間未満）、ゼラチン−埋設（ｇｅｌａｔｉｎ−ｓｕｂｂｅｄ）スライド上に積載し、空気乾燥し、４℃で貯蔵した。組織貯蔵の間のすべての組織切片上での水分の凝結を回避すべく注意を払った。
【０２８４】
ハイブリダイゼーションを行う日に、切片の調製に用いた固定および切片化プロトコールに従って組織切片を種々前処理した。固定化していない組織切片を ４％ホルムアルデヒド、１％グルタルアルデヒド（０．１Ｍリン酸ナトリウム中）中で４℃にて３０秒間浸漬することにより固定し、０．５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣは３Ｍ  ＮａＣｌおよび０．３Ｍクエン酸ナトリウムである）中で濯ぎ、プレハイブリダイゼーション溶液中に直接入れた。浸漬−固定化組織の凍結切片 を０．１Ｍリン酸ナトリウム中の４％ホルムアルデヒド中で５分間固定化し、０．５×ＳＳＣで濯ぎ、プロテイナーゼＫ（ベーリンガー−マンハイム；０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中に２５μｇ／ｍｌ）を用いて室温にて３０分間消化し、濯ぎ、４％ホルムアルデヒド中で再度１０分間固定化 し、一連のアルコール（０．３％酢酸アンモニウムを含有する５０％エタノール；酢酸アンモニウムを含有する７０％エタノール；１００％エタノール；インキュベーション当たり２分間）中で脱水し、同じ一連のエタノールで再度脱水し、プレハイブリダイゼーションの前に０．５×ＳＳＣ中で再度濯いだ。パラフィ ン埋設組織については、キシレン中で２回濯ぐ（各２秒間）ことによって脱パラフィンを行い、その後、組織を一連のアルコール溶液（１００％エタノールで２回、９５％エタノール、７０％エタノール；各２秒間）で再度脱水した。ついで組織切片を４％ホルムアルデヒド中で１０秒間固定化し、プロテイナーゼＫ （２５または５０μｇ／ｍｌ；室温または３７℃）で３０秒間消化し、濯ぎ、１０秒間再度固定化し、プレハイブリダイゼーションの前に０．５×ＳＳＣ中で再度濯いだ。
【０２８５】
プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびハイブリダイゼーション後のＲＮＡアーゼ処理およびストリンジェンシー洗浄は、すべての組織において以前に記載されたものと同じであった（フィリップスら、１９９０）。
【０２８６】
ヒトｔｒｋＡ、およびｔｒｋＢのＴＫ含有形態、およびｔｒｋＣに対するプローブを用いたインシトゥハイブリダイゼーションを、種々のプロトコールにより 調製した限られた系列の胎児および成人ヒト組織に対して行った。妊娠６週および８週の２つの胎児（新たに凍結）においては、ｔｒｋＡの発現は後根神経節および三叉神経節を含む脳知覚神経節に限られていた。対照的に、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣは、知覚神経節で発現されたのみならず発生中の脳および脊髄内でも顕 著な発現が認められた。加えて、ｔｒｋＣの発現は発生中の脈管系で観察された。
【０２８７】
（結果）
発生中の後根神経節内では、６週および８週の胎児からの神経節の両方でｔｒｋＣが強く発現された。奇妙なことに、両方の胎児において、ｔｒｋＣを発現す る細胞が該神経節の腹側に局在する顕著な傾向がみられた。対照的に、ｔｒｋＡ陽性細胞は該神経節の主として脊側に限られていた。成人後根神経節（パラフィン埋設または凍結切片固定化した組織）では、ＤＲＧニューロンの亜集団を３つの各ｔｒｋプローブで標識した。これら３つの各ｔｒｋに対するプローブで標識 した細胞は、神経節でランダムに分布しているように思われた。これらプローブのいずれを用いても非ニューロン性細胞の標識は観察されなかった。
【０２８８】
成人ヒトの前脳（固定化し凍結切片化した組織）では、ｔｒｋＡ発現に対して強く標識された細胞がマネー（Ｍｅｙｎｅｒｔ）の基底核中で観察され、尾状核 の頭部に分散していた。標識された細胞は大きな直径であり、コリン作動性細胞の予測された外観と同じであった。ｔｒｋＣは、海馬および新皮質中での顕著な発現を含むヒト前脳を通じて広く発現され、標識された細胞はもっぱらニューロン様の形態を有していた。
【０２８９】
（検討）
ヒト神経系でのｔｒｋファミリーの成員の発現のインシトゥハイブリダイゼーション分析から、全体的な発現パターンが他の哺乳動物でみられる発現パターンと同様であることが確認された。このことは、正常および病理学的組織のある種の領域中でのヒトｔｒｋの、異なってスプライスされた形態の発現を詳細に調べ る研究の基礎を提供するに違いない。この点で、ヒト組織を入手することが困難であるとしても、死後に種々の仕方で取り扱われる組織においてインシトゥハイブリダイゼーションを行ったことは励みになる。切片を切断して固定化せず、固定化して凍結し、および固定化してパラフィン埋設したが、これらすべての方法 は有用な結果を与えた。一つの予期しない知見は、該神経節の明らかな極性であり、ｔｒｋＡ細胞が発生中のヒトＤＲＧ神経節の背側において優勢であり、ｔｒｋＣを発現する細胞が腹側において優勢であった。このようなｔｒｋ発現の極性は、成人ヒトＤＲＧからの切片またはラットｔｒｋＡおよびｔｒｋＣプロー ブとハイブリダイズしたラット胚では明らかではなかった（データは示していない）。
【０２９０】
（実施例３）
（ｔｒｋイムノアドヒーシンの発現）
（Ａ．ｔｒｋ−Ｉｇイムノアドヒーシンの構築）
タンパク質工学技術を用い、ヒトｔｒｋをｔｒｋ細胞外ドメインとヒトＩｇＧ重鎖のＦｃドメインとのキメラとして発現させた。ｔｒｋ細胞外ドメインと ＩｇＧ−１ＦｃドメインとのキメラをコードするＤＮＡ構築物を、ヒトＩｇＧ−１のＦｃ領域クローンを用いて作製した（アシュケナージーら、Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎｓ  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０、２１９〜２２７［１９９３］）。さらに詳しくは、ＩｇＧ−１コード配列の採 取源は、アスパラギン酸２１６（重鎖定常領域の第一の残基をアミノ酸１１４とする（カバットら、シークエンスィズ・オブ・プロテインズ・オブ・イミュノロジカル・インタレスト、第４版［１９８７］））（該アミノ酸は重鎖−軽鎖結合に関与するシステイン残基の後のＩｇＧ−１ヒンジの第一の残基である）から始 まり残基４４１で終わってＩｇＧ−１のＣＨ２およびＣＨ３Ｆｃドメインを含むヒトＩｇＧ−１配列に融合した成熟ヒトＣＤ４タンパク質の残基１〜１８０からなるハイブリッドポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を含むＣＤ４−ＩｇＧ−１発現プラスミドｐＲＫＣＤ４２Ｆｃ１（カポンら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４、 ５２５［１９８９］；バーンら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４、６６７［１９９０］）であった。
【０２９１】
ＣＤ４コード配列を発現プラスミドｐＲＫＣＤ４２Ｆｃ１か ら除去し、ＩｇＧ−１のアスパラギン酸２１６とｔｒｋＡのバリン４０２、ｔｒｋＢのトレオニン４２２、またはｔｒｋＣのトレオニン４１３とのスプライシングにより、該ベクターをｔｒｋ受容体をコードするＤＮＡに融合した。受容体全体またはＩｇＧキメラをコードするＤＮＡを、リン酸カルシウムを用いた２９３ 細胞での一過性発現のためにｐＲＫ中にサブクローニングした（スバ（Ｓｕｖａ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７、８９３〜８９６［１９８７］）。ｔｒｋ−ＩｇＧキメラの精製のため、細胞をトランスフェクションの１日後に血清不含培地に移し、さらに２〜３日後に培地を回収した。培地を濾過し、プロテインＡカ ラム（ハイトラップ（Ｈｉ−Ｔｒａｐ）Ａ、ファルマシア）に結合させ、カラムをＰＢＳで洗浄し、結合したタンパク質を０．１Ｍグリシン（ｐＨ３．０）で溶出し、トリス緩衝液で直ちに中和した。１．５の吸光係数を用いた２８０ｎｍでの吸光度により濃度を評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、得られたタンパク質 が単一の検出バンドであることを示した。
【０２９２】
これらＤＮＡ構築物で一過性にトランスフェクションした細胞は、プロテインＡに結合し、還元ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で約１２５ｋＤの分子量に て移動したタンパク質を分泌した。精製ｔｒｋ−ＩｇＧキメラは、プロテインＡカラム上の１回のアフィニティークロマトグラフィーにおいてならし培地から容易に単離することができた。これら精製タンパク質の配列分析から、予測されたシグナル配列開裂部位およびそれから得られるＮ末端が確認された（データは示 していない）。
【０２９３】
（Ｂ．結合アッセイ）
これらキメラタンパク質がｔｒｋ細胞外ドメインに期待される結合特異性を細胞環境で保持しているか否かを試験するため、ヨウ素化ニューロトロフィンを用 いて競合置換アッセイを行った。図５に示す結果から明らかなように、ｔｒｋ−ＩｇＧキメラは期待されたニューロトロフィンへの特異的結合を示した。ｔｒｋＡ細胞外ドメインを含むキメラはＮＧＦによく結合し、ＮＴ３およびＮＴ５には遥かに低い親和性にて結合した。ｔｒｋＢを含むキメラは、ＢＤＮＦおよ びＮＴ５によく結合したがＮＴ３よりもわずかに良好に結合し、ＮＧＦに対しては検出しうる結合は殆ど示さなかった。ｔｒｋＣを含むキメラは他のニューロトロフィンに比べてＮＴ３に高度に特異的であった。これら競合置換アッセイで決定されたこれらキメラの好ましいリガンドに対する明らかな親和性は、種々の ｔｒｋタンパク質でトランスフェクションし該タンパク質を発現する細胞上の結合部位の大部分で決定されたものの範囲内である。一つの実験において、ｔｒｋＡについて得られたＩＣ５０はＮＧＦに対しては６２ｐＭでＴ３に対しては２０ｎＭ、ｔｒｋＢについて得られたＩＣ５０はＢＤＮＦに対しては ８１ｐＭ、ＮＴ４／５に対しては２００ｐＭおよびＮＴ３に対しては１８ｎＭ、ｔｒｋＣについて得られたＩＣ５０はＮＴ３に対して９５ｐＭであった。これら試薬を用いて行ったアッセイにおいて、非特異的結合に対する特異的結合の比は極めて高く、通常、少なくとも１０／１であった（図５参照）。
【０２９４】
ｔｒｋ−ＩｇＧキメラがその同族リガンドの生物学的活性を阻止しうるか否かを調べるため、ニューロトロフィンにより誘発された末梢ニューロンの生存を適 当なｔｒｋ−ＩｇＧキメラの存在下でアッセイした。図６から明らかなように、ｔｒｋＡ−ＩｇＧはＮＧＦの、ｔｒｋＢ−ＩｇＧはＢＤＮＦの、ｔｒｋＣ−ＩｇＧはＮＴ３の、それぞれ生物学的活性の強力なインヒビターである。すべての場合において、過剰のニューロトロフィンを添加するとこの阻止を排除するこ とができ、ｔｒｋ−ＩｇＧキメラが一般にニューロンにとって毒性でないことを示していた。
【０２９５】
ここで示された結合データは、ｔｒｋ−ＩｇＧ融合体が細胞中での全受容体の発現によってみられるのと同様の選択性および親和性でニューロトロフィンに結 合することを示している。ここで報告した結合アッセイは多数で行うには非常に簡単であり、再現性に優れ、バックグラウンドが低く、天然のｔｒｋの特異性を保持している。これら特質は、変異体ニューロトロフィンの結合特性を分析するうえで極めて価値が高いことがわかった（ララミー（Ｌａｒａｍｅｅ）ら、突然 変異誘発によるＮＧＦ−ｔｒｋＡおよびｐ７５受容体相互作用の高解像マッピング（Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ
ＮＧＦ−ｔｒｋＡ  ａｎｄ  ｐ７５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ））。
【０２９６】
ニューロトロフィンの結合を分析するうえでの有用性に加え、ｔｒｋ−ＩｇＧキメラはその同族ニューロトロフィンの生物学的活性の有用なインヒビターであ る。ここでの実験はすべてインビトロ系で行ったが、予備的な実験はｔｒｋＡ−ＩｇＧがインビボでもＮＧＦ活性を抑制しうることを示している（データは示していない）。ＢＤＮＦ、ＮＴ３およびＮＴ４／５に対する良好な阻止抗血清を産生することは困難であったので、このことはｔｒｋＢキメラおよびｔｒｋＣキメ ラの必要性を満たすであろう。
【０２９７】
ヒトに存在するｔｒｋの形態に関する情報が手に入ったので、正常な状態および疾患状態におけるこれら形態の発現の探査を開始することが可能である。異な る形態のｔｒｋはニューロトロフィンへの応答において異なるおよびしばしば相反するシグナル変換を示しうるので、各ｔｒｋの形態の全スペクトルの発現レベルに関する知見は必須であろう。加えて、可溶性の形態のヒトｔｒｋを利用できることは、内生の生物学的活性の阻止を可能とすることによって、インビボでの ニューロトロフィンの生物学の研究を加速させるに違いない。
【０２９８】
（実施例４）
（ヒトｔｒｋＣの突然変異誘発）
ｔｒｋＣタンパク質の細胞外ドメインのどのアミノ酸がニューロトロフィンＮＴ−３に対する親和性および特異性を決定するのかを決定するため、突然変異誘 発研究を行った。ｔｒｋＣの三次元構造は知られていないが、推定のドメイン組成が提唱された。このモデルによると、タンパク質のｔｒｋファミリーの細胞外ドメインは５つのドメインから構築されている。シグナル配列が先行した後、これらドメインは、第一のシステインに富むドメイン、ロイシンに富むドメイン、 第二のシステインに富むドメイン、および２つの免疫グロブリン様ドメインである。
【０２９９】
これらｔｒｋＣ受容体ドメインの機能を調べるため、５つのドメインをそれぞれ一つずつ欠失した５つのｔｒｋ変異体（Δ１〜Δ５）および第二の免疫グロブ リン様ドメイン以外はすべてのドメインを欠失した一つの変異体（Δ６）を構築した。これらの構造は図７に示してある。これら変異体に加えて、ＮＴ−３に対する残留親和性を決定しＢＤＮＦ結合の補充を試験するため、５つのすべてのドメインをそれぞれ対応するｔｒｋＢ配列と個々に交換した（ｓ１〜ｓ５）。 ｔｒｋＣキメラおよびｔｒｋＢキメラを含むすべてのｔｒｋＣ変異体をイムノアドヒーシンの形態で調べた。イムノアドヒーシンは実施例３に記載したプロセスと同様にして構築し、ｐＲＫ５（ＥＰ３０７，２４７）またはｐＲＫ７ベクターを用いてヒト胎児腎臓細胞株２９３で発現させた。ｐＲＫ７は、ＣｌａＩと ＨｉｎｄＩＩＩとの間のポリリンカー領域中のエンドヌクレアーゼ制限部位の順序が逆になっている他はｐＲＫ５と同じである（１９９２年４月２８日発行の米国特許第５，１０８，９０１参照）。これらタンパク質は血清不含培地中に分泌され、２０×に濃縮し、抗Ｆｃ  ＥＬＩＳＡアッセイにより定量した。典型的な 発現の結果を図８に示す。特定の興味ある変異体、ｔｒｋＣ、Δ６、Δ５、ｓ５およびｔｒｋＢを標準プロトコールを用いてプロテインＡ上で均質に精製した。これら変異体のＮ末端配列を決定したが、予測したものと同じであった。
【０３００】
標識ＮＴ−３に結合する能力について、すべての受容体変異体を標準イムノアドヒーシン技術を用いた競合置換アッセイにおいて試験した。Δ５を除き、すべ ての融合体およびスワップは依然としてｔｒｋＣと同様の親和性でＮＴ−３に結合することができた。幾つかの変異体（すなわち、Δ１、Δ４、ｓ２）については全体の結合した標識ＮＴ−３は低かったが、ＩＣ５０値はすべてｔｒｋＣの値に近いものであった（図９Ａおよび９Ｂ）。最も重要なことに、第二の免疫グロ ブリン様ドメイン以外はすべてのドメインを欠失した変異体Δ６は、ｔｒｋＣの完全長受容体の結合能のほとんどを保持していた。加えて、Δ５において該ドメインを欠失させると、ＮＴ−３に全く結合することのできない分子となる（図９Ｃ）。
【０３０１】
ＮＴ−３結合と同じタイプのアッセイを用いた競合置換アッセイにおいて、すべての受容体変異体が標識ＢＤＮＦに結合する能力について試験した。ｔｒｋＣ はＢＤＮＦに結合できないことに注意しなければならない。一つの変異体以外のすべての変異体がＢＤＮＦに結合できなかった（図１０Ａ〜Ｃ）。ＢＤＮＦに結合した唯一の変異体は、ｔｒｋＣの第二の免疫グロブリン様ドメインがｔｒｋＢのものと交換されたスワップ５であった（図１０Ｃ）。この変異体は、ｔｒｋＢ 完全長受容体と同様にＢＤＮＦに結合した。
【０３０２】
上記結果から、ｔｒｋＣおよびｔｒｋＢの機能における第二の免疫グロブリン様ドメインの最重要性が明らかである。このドメイン以外のすべてのドメインを 欠失してもｔｒｋＣの完全な結合能は本質的に保持された。このドメインを欠失するとＮＴ−３に対するｔｒｋＣの結合能は除去された。このドメインを交換すると、ｔｒｋＢと同様の親和性でＢＤＮＦに結合しうるｔｒｋＣ変異体が創製された。
【０３０３】
（実施例５）
（炎症性疼痛の治療におけるｔｒｋＡ−ＩｇＧイムノアドヒーシンの使用）
（Ａ．カラギーナンにより誘発されたラットにおける痛覚過敏の阻止）
カラギーナン（シグマ、ロット＃２１Ｈ０３２２）単独の２％水溶液または実施例３で調製した１５μｇのｔｒｋＡ−ＩｇＧキメラと組み合わせた水溶液 （５０μｌ）を４匹の成体雄ウイスターラットの一方の後足に時間０にて注射した。不快な熱刺激に対する引っ込めの潜伏期間（ｌａｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）を、その後２時間毎に３回ずつ各後足で測定した。カラギーナン単独を注射した足は２時間以内に明瞭な炎症および痛覚過敏（反対側の コントロールの足と比べて減少した引っ込め潜伏期間）を示した。カラギーナンとともにｔｒｋＡ−ＩｇＧを注射したラットは明瞭な炎症を示したが、反対側のコントロールの足に比べて痛覚過敏の形跡は示さなかった。４時間、６時間および８時間の時点におけるカラギーナン単独とカラギーナンおよびｔｒｋＡ− ＩｇＧとからプールしたデータは、ｐ＞０．０２で有意に異なっていた（図１２参照）。
【０３０４】
（Ｂ．ｔｒｋＡ−ＩｇＧイムノアドヒーシンは鈍磨に導く）
ｔｒｋＡ−ＩｇＧイムノアドヒーシンを０．５μｇ／時の速度で４匹の成体雄ウイスターラットの一方の後足の背表面の皮膚下に連続注入した。その後、コン トロールの足および注入した足の引っ込めの潜伏期間を種々の時点で３回ずつ決定した。注入から５日後、コントロール側と比較したときに注入側の足は顕著な鈍磨を示した。５日後およびその後のすべての時点の引っ込め時間差異は、プールした前注入の時間差異とｐ＞０．０５にて有意に異なっていた（図１３参 照）。
【０３０５】
（実施例６）
（ｔｒｋＣおよびｔｒｋＡの突然変異誘発）
特異的なニューロトロフィン結合にとっての第二の免疫グロブリン様ドメインの重要性をさらに確認するため、さらに幾つかのｔｒｋ受容体変異体を構築し た。これらのさらなる変異体は、実施例４と同様にイムノアドヒーシンの形態で調べた。変異体に関する以下の記載において各ｔｒｋ受容体のアミノ酸残基は、図１１に示すシグナル配列の第一のアミノ酸残基から順次番号付けて示してある。
【０３０６】
ｔｒｋＣのＶａｌ２９７からＴｈｒ４２０のアミノ酸配列（第二の免疫グロブリン様ドメインを含む）をｔｒｋＡのＳｅｒ２７７からＶａｌ４０２のアミノ酸配列（第二の免疫グロブリン様ドメインを含む）で置換した成熟ｔｒｋ変異体（ｓ５ａ）を構築した。競合置換アッセイにおいて、ｔｒｋＣではなく ｔｒｋＡがＮＧＦに高親和性で結合し、ｓ５ＡキメラはｔｒｋＡの親和性（ＩＣ５０７３．９±８．１ｐＭ）に匹敵する親和性（ＩＣ５０３９．３±１．７ｐＭ）でＮＧＦに結合する。１２５Ｉ−ＮＧＦを用いた飽和結合実験は、ｔｒｋＡおよびｓ５Ａに対してそれぞれ４７．１±１２．４および３８．６±８．６ｐＭのＫｄ値となった（抑制定数（ＩＣ５０）と結合定数（Ｋｄ）との間の一般的な関係は、チェング（Ｃｈｅｎｇ）およびプルソフ（Ｐｒｕｓｏｆｆ）によって以前に記載されている；Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２：３０９９（１９７３））。これら結果は、ｔｒｋＡのＮＧＦ結合特異性にとってｔｒｋＡの第二の免疫グロブリンドメイン様ドメインが重要であることを示している。
【０３０７】
つぎに、４つの成熟ｔｒｋＡ変異体を構築した：ｔｒｋＡのＶａｌ１９３からＶａｌ２８２のアミノ酸配列を欠失した一つの変異体（Δ４Ａ）、ｔｒｋＡのＰｒｏ２８５からＶａｌ４０２を欠失した他の変異体（Δ５Ａ）、ｔｒｋＡのＰｒｏ３５からＳｅｒ２８３を欠失した他の変異体（Δ６Ａ）、およびｔｒｋＡのＰｒｏ３５からＶａｌ１９３を欠失した他の変異体（Δ７Ａ）である。実施例４に記載したｔｒｋＣ受容体変異体に関して得られた結果と同様、変異体Δ５ＡにおけるｔｒｋＡの第二の免疫グロブリン様ドメインの欠失はＮＧＦ結合が検出されないという結果になったが、このドメイン単独（変異体Δ６Ａ）では天然のｔｒｋＡに匹敵するＮＧＦに対する結合親和性が示された。加えて、ｔｒｋＡの第一の免疫グロブリン様ドメインの欠失 （Δ４Ａ）は天然のｔｒｋＡに比べて約２倍だけＮＧＦに対する親和性を減少させたが、最初の３つのドメインを欠失させても（Δ７Ａ）ＮＧＦに対する親和性に何ら影響を及ぼさなかった。ｔｒｋＡおよびΔ６ＡのＮＧＦ結合親和性を飽和実験において決定したところ、Ｋｄ値は４７．１±１２．４および１５５．３± ３３ｐＭ（約３．３倍の差異）であり、ｔｒｋＡ受容体においてＮＧＦとの結合相互作用のほとんどが第二の免疫グロブリン様ドメインによるものであることが確認された。しかしながら、飽和結合実験において、Δ５Ａ変異体は＞３５００ｐＭと推定されるＫｄ値にて検出しうる特異的結合を示し、ＮＧＦとの相互作用 に影響を及ぼすｔｒｋＡドメイン１〜４中の別の要素の存在の可能性が示されたが、Δ６Ａ変異体とｔｒｋＡとのＫｄ値が類似していることから明らかなように、これら要素の結合への貢献は小さなものであると思われる。
【０３０８】
【数３】
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【図面の簡単な説明】
【０３０９】
【図１−１】図１は、ヒトｔｒｋＢ受容体のヌクレオチド配列（配列番号：１）およびそれから導かれたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。Ａ）チロシ ンキナーゼドメイン含有ｔｒｋＢの配列を示してあり、可能なＮ結合グリコシル化部位は囲んであり、予測される膜貫通ドメインは下線を引いてあり、チロシンキナーゼドメインは矢印で挟んである。切断形を生じさせるスプライス部位は、単一の垂線で示してある。Ｂ）別の仕方でスプライスした切断された細胞内ドメ インの配列を示す。ヒトｔｒｋＢ受容体の切断形のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４および３として添付してある。
【図１−２】図１は、ヒトｔｒｋＢ受容体のヌクレオチド配列（配列番号：１）およびそれから導かれたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。Ａ）チロシンキナーゼドメイン含有ｔｒｋＢの配列を示してあり、可能なＮ結合グリコシル化部位は囲んであり、予測される膜貫通ドメインは下線を引いてあり、チロシンキナーゼドメインは矢印で挟んである。切断形を生じさせるスプライス部位は、単一の垂線で示してある。Ｂ）別の仕方でスプライスした切断された細胞内ドメインの配列を示す。ヒトｔｒｋＢ受容体の切断形のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列 番号４および３として添付してある。
【図２−１】図２は、ヒトｔｒｋＣ受容体のヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。Ａ）チロシンキナーゼ含有 ｔｒｋＣの配列を示してあり、可能なＮ結合グリコシル化部位は囲んであり、予測される膜貫通ドメインは下線を引いてあり、チロシンキナーゼドメインは矢印で挟んである。切断形を生じさせるスプライス部位は、単一の垂線で示してある。細胞外ドメインおよびチロシンキナーゼドメイン中の可能な挿入の配列は括弧 で挟んである。Ｂ）別の仕方でスプライスした切断された細胞内ドメインの配列を示す。切断されたヒトｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８および７として添付してある。
【図２−２】図２は、ヒトｔｒｋＣ受容体のヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。Ａ）チロシンキナーゼ含有 ｔｒｋＣの配列を示してあり、可能なＮ結合グリコシル化部位は囲んであり、予測される膜貫通ドメインは下線を引いてあり、チロシンキナーゼドメインは矢印で挟んである。切断形を生じさせるスプライス部位は、単一の垂線で示してある。細胞外ドメインおよびチロシンキナーゼドメイン中の可能な挿入の配列は括弧 で挟んである。Ｂ）別の仕方でスプライスした切断された細胞内ドメインの配列を示す。切断されたヒトｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号８および７として添付してある。
【図３】ラットおよびヒトからのｔｒｋファミリー成員の種々のドメインの類似性。ＰＡＭ２５０マトリックス（デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）ら、 １９８３）に基づく類似性パーセントを、シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）およびシュバイガー（Ｓｃｈｗｅｉｇｅｒ）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ６、１８０７〜１８１１（１９９１）により定められているように、異なるｔｒｋドメインについて決定した。ヒトｔｒｋＡとヒトｔｒｋＢ（Ｈ  Ａ−Ｂ）、ヒト ｔｒｋＡとヒトｔｒｋＣ（Ｈ  Ａ−Ｃ）、ヒトｔｒｋＢとヒトｔｒｋＣ（Ｈ  Ｂ−Ｃ）、ヒトｔｒｋＡとラットｔｒｋＡ（Ｈ−Ｒ  Ａ）、ヒトｔｒｋＢとラットｔｒｋＢ（Ｈ−Ｒ  Ｂ）、およびヒトｔｒｋＣとラットｔｒｋＣ（Ｈ−Ｒ  Ｃ）との間で一対毎に比較を行った。
【図４】ヒトおよび他の哺乳動物ｔｒｋにみられるスプライス形の要約。別の仕方のスプライシングから生じる種々のｔｒｋの形態の模式図を示す。ドメイ ンは上記シュナイダーおよびシュバイガーによる。ラットｔｒｋＡ（ミーキンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９、２３７４〜２３７８［１９９２］、バーカー（Ｂａｒｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１５１５０〜１５１５７［１９９３］）、ラットおよびマウスｔｒｋＢ（クラ イン（Ｋｌｅｉｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．８、３７０１〜３７０９［１９８９］；クラインら、Ｃｅｌｌ  ６１、６４７〜６５６［１９９０］、ミドルマスら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１、１４３〜１５３［１９９１］）およびラットおよびブタｔｒｋＣ（ランバレら、Ｃｅｌｌ  ６６、９６７〜９７９ ［１９９１］；バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  １０、９６３〜９７４［１９９３］；ツォウルファス（Ｔｓｏｕｌｆａｓ）ら、Ｎｅｕｒｏｎ  １０、９７５〜９９０［１９９３］）のデータは文献から再引用してある。上記バレンズエラらにより記載された切断されたラットｔｒｋＣの別 の形態は明瞭にするため省いてある。
【図５】ｔｒｋ−ＩｇＧに結合したニューロトロフィンの競合置換。放射性標識したニューロトロフィン（２５〜３５ｐＭ）を、増加濃度の種々の非標識 ニューロトロフィンの存在下でｔｒｋ−ＩｇＧに結合させた。Ａ）ｔｒｋＡ−ＩｇＧへの標識ＮＧＦの結合。Ｂ）ｔｒｋＢ−ＩｇＧへの標識ＢＤＮＦの結合。Ｃ）ｔｒｋＣ−ＩｇＧへの標識ＮＴ３の結合。置換は、冷ＮＧＦ（黒丸）、冷ＢＤＮＦ（白丸）、冷ＮＴ３（黒四角）、または冷ＮＴ５（白四角）で行った。
【図６】ニューロトロフィンの生物活性をｔｒｋイムノアドヒーシンにより阻止する。ニューロトロフィン生物活性を、ｔｒｋイムノアドヒーシンの不在下または存在下でニワトリ後根（ＡおよびＢ）または交感（Ｃ）神経節ニューロンの生存を測定することにより評価した。図中の記号は図５と同じ。
【図７】ｔｒｋＣ欠失およびｔｒｋＢとのスワップ（ｓｗａｐ）の構造。それぞれ、ｔｒｋＣおよびｔｒｋＢの構造ドメインを黒色および灰色で示す。
【図８】ｔｒｋＣ欠失およびｔｒｋＢとのスワップの発現。一つの特定の代表的実験を示す。濃度は抗ＦｃＥＬＩＳＡを用いて決定した。ｔｒｋＣ変異体の値はｔｒｋＣ野生型発現のパーセントとして表してある。
【図９−１】ｔｒｋＣ変異体に結合したＮＴ−３の競合置換。増加量の非標識ＮＴ−３の存在下で放射性標識したＮＴ−３（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体に 結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＣのＩｇ−ドメイン２の変異体。
【図９−２】ｔｒｋＣ変異体に結合したＮＴ−３の競合置換。増加量の非標識ＮＴ−３の存在下で放射性標識したＮＴ−３（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体に 結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＣのＩｇ−ドメイン２の変異体。
【図９−３】ｔｒｋＣ変異体に結合したＮＴ−３の競合置換。増加量の非標識ＮＴ−３の存在下で放射性標識したＮＴ−３（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体に 結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＣのＩｇ−ドメイン２の変異体。
【図１０−１】ｔｒｋＣ変異体に結合したＢＤＮＦの競合置換。増加量の非標識ＢＤＮＦの存在下で放射性標識したＢＤＮＦ（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体 に結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＢからの配列を有するＩｇ−ドメイン２のスワップ。
【図１０−２】ｔｒｋＣ変異体に結合したＢＤＮＦの競合置換。増加量の非標識ＢＤＮＦの存在下で放射性標識したＢＤＮＦ（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体 に結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＢからの配列を有するＩｇ−ドメイン２のスワップ。
【図１０−３】ｔｒｋＣ変異体に結合したＢＤＮＦの競合置換。増加量の非標識ＢＤＮＦの存在下で放射性標識したＢＤＮＦ（５０ｐＭ）をｔｒｋＣ変異体 に結合させた。（Ａ）ｔｒｋＣの欠失。（Ｂ）ｔｒｋＢからの対応配列を有するｔｒｋＣのドメインスワップ。（Ｃ）ｔｒｋＢからの配列を有するＩｇ−ドメイン２のスワップ。
【図１１−１】完全長のヒトｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列の比較。コンセンサス配列は囲んである；種々のドメインの境界は垂線で印を付してある（配列番号：９、２および６参照）。
【図１１−２】完全長のヒトｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列の比較。コンセンサス配列は囲んである；種々のドメインの境界は垂線で印を付してある（配列番号：９、２および６参照）。
【図１１−３】完全長のヒトｔｒｋＡ、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣ受容体のアミノ酸配列の比較。コンセンサス配列は囲んである；種々のドメインの境界は垂線で印を付してある（配列番号：９、２および６参照）。
【図１２】ラットにおいてカラギーナンにより誘発された痛覚過敏症に対するｔｒｋＡ−ＩｇＧイムノアドヒーシンの効果。
【図１３】ｔｒｋＡ−ＩｇＧの注入はラットにおいて鈍磨を引き起こす。
【０３１０】
（配列表）
【数４】
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【数５】
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【数６】
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【数７−１】
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【数７−２】
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【数７−３】
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【数７−４】
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【数７−５】
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【数７−６】
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【数７−７】
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【数７−８】
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【数７−９】
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【数７−１０】
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【数８】
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【数９】
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【数１０】
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【数１１−１】
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【数１１−２】
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【数１１−３】
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【数１１−４】
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【数１１−５】
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【数１１−６】
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【数１１−７】
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【数１１−８】
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【数１１−９】
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【数１１−１０】
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【数１１−１１】
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【数１１−１２】
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【数１１−１３】
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【数１２】
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【数１３】
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【数１４】
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【数１５】
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【数１６】
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【数１７】
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【数１８】
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【数１９】
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【数２０】
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【数２１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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