(57)【要約】【課題】  安価に大量の組換え抗体を生産することができる新規な手段を提供する。【解決手段】  抗体のH鎖およびL鎖のそれぞれの構造遺伝子が染色体に組み込まれたトランスジェニックカイコであって、H鎖２分子およびL鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子を繭に分泌するトランスジェニックカイコ。このカイコの繭から機能的な抗体分子を回収することを特徴とする抗体の製造方法。【選択図】図１
2008067612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のH鎖およびL鎖のそれぞれの構造遺伝子が染色体に組み込まれたトランスジェニックカイコであって、H鎖２分子およびL鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子を繭に分泌するトランスジェニックカイコ。
【請求項２】
抗体のH鎖およびL鎖を中部絹糸腺細胞で発現し、繭糸のセリシン層へ機能的な抗体分子を分泌する請求項１のトランスジェニックカイコ。
【請求項３】
抗体のH鎖およびL鎖を後部絹糸腺細胞で発現し、繭糸のフィブロイン層へ機能的な抗体分子を分泌する請求項１のトランスジェニックカイコ。
【請求項４】
請求項２のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターであって、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子の両方、および中部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項２のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターセットであって、
抗体のH鎖の構造遺伝子、および中部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクターと、
抗体のL鎖の構造遺伝子、および中部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター、
とからなるベクターセット。
【請求項６】
請求項３のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターであって、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子の両方、および後部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター。
【請求項７】
請求項３のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターセットであって、
抗体のH鎖の構造遺伝子、および後部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクターと、
抗体のL鎖の構造遺伝子、および後部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター、
とからなるベクターセット。
【請求項８】
請求項１のトランスジェニックカイコの繭から、機能的な抗体分子を回収することを特徴とする抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、機能的な抗体分子を生産するトランスジェニックカイコに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、機能的な抗体分子を繭に分泌するトランスジェニックカイコ、そのトランスジェニックカイコを作製するためのベクター、および、そのトランスジェニックカイコの繭から抗体を回収する抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬は、ヒトが本来もっている免疫システムを活用した医薬品であり、体内に侵入・発生した異物や微生物（抗原）から細胞を守る「抗体」を人工的に作製し、医薬品として加工するものである。抗体は、ヒト体内に存在するタンパク質そのものであり、低分子化合物と違って予期せぬ副作用が起きにくい。このような理由から、世界中で積極的に抗体医薬の開発が進められており、その市場は急速に拡大している。
【０００３】
現在、抗体医薬のほとんどはチャイニーズハムスター卵巣由来の培養細胞であるCH0細胞を用いて生産されている。抗体遺伝子を組み込んだCHO細胞を巨大な培養槽で培養し、培養液から抗体を精製する。この生産系では、１g/リットル前後の比較的高い生産性が実現されているが、それでも、多量の抗体を投与する必要がある抗体医薬療法では、投与あたりのコストが高くなってしまう。また、数千、数万リットルの培養槽を何基もそろえるには巨額な設備投資が必要である。このことは、製造設備不足を招く原因ともなっている。そこで、CHO細胞の生産系よりも低コストで抗体を生産でき、また、巨額な設備投資を必要としない抗体医薬生産系が、世界的に望まれている。
【０００４】
この出願の発明者らは、カイコが有する絹タンパク質の合成能力に着目し、絹タンパク質と共に大量の組換えタンパク質を繭中に分泌する形質転換カイコの開発を行ってきた。カイコは、一頭あたり0.3〜0.5gの繭を作るが、このほとんどは、後部絹糸腺で合成されるフィブロインや、中部絹糸腺で合成されるセリシンなどの絹タンパク質である。このように、カイコは優れたタンパク質合成能力を有した生物であり、この能力を利用すれば、抗体医薬などの組換えタンパク質を大量に、かつ、安価に生産することができる。この出願の発明者らは、絹タンパク質遺伝子プロモーターの下流に連結したヒト・コラーゲンcDNAをカイコに組み込み、組換えヒト・コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコを開発し（非特許文献１）、特許出願している（特許文献１−３）。また、後部絹糸腺で、フィブロインと生理活性タンパク質の融合タンパク質遺伝子を発現させることにより、絹糸の中心に存在するフィブロイン層に、フィブロインと生理活性タンパク質の融合タンパク質を発現させ、カイコが産生する絹タンパク質と前記融合タンパク質を主成分とする生理活性バイオマテリアルを開発し（非特許文献２）、特許出願している（特許文献４）。さらに、この出願の発明者らは、フィブロインの周りに存在し、比較的水に溶けやすいセリシン層に、組換えタンパク質を局在させるために、中部絹糸腺で効率良くの組換えタンパク質を発現させるためのポリヌクレオチドも開発し（非特許文献３）、特許出願を行っている（特許文献５）。この特許出願５の発明を利用すると、繭に含まれる組換えタンパク質を、その立体構造を変性させることなく容易に抽出することが可能となる。
【０００５】
このように、この出願の発明者らは、カイコを宿主として用いて、有用な組換えタンパク質を生産する技術開発を行ってきた。しかしながら、カイコを用いた抗体の生産が可能であるかどうかについては不明であった。一方、昆虫の培養細胞を宿主として用いる発現系おいて抗体を発現した報告は存在する（非特許文献４）。バキュロウイルスベクターをSf9細胞に感染させ、IgGを発現させることが試みられている。しかし、発現したIgGのほとんどは細胞内で不溶化し、IgGを効率良く回収することはできていない。また、ヒト化したIgGのH鎖およびL鎖を安定的に発現するショウジョウバエ培養細胞を作製し、IgGの発現を試みた報告もある（非特許文献５）。この報告では、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体が形成され、培地中に分泌されている。このヘテロ２量体は、抗原との結合活性も有していた。しかしながら、H鎖だけを単独で発現させたショウジョウバエ細胞において、ヘテロ２量体の場合と同様な効率で、H鎖のみからなる２量体が形成され培地中に分泌されている。従って、H鎖およびL鎖の発現量が等しくなく、例えば、H鎖が過剰に発現した場合は、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体に加えて、H鎖のみからなる２量体も分泌されてしまうことになり、その結果、培地中からヘテロ２量体のみを選別する操作が必要となる。一般的に、複数のサブユニットからなる組換えタンパク質を発現する場合、サブユニット間の発現量を等しくすることは難しい。哺乳動物細胞においては、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体を効率良く細胞外へ分泌させ、H鎖２量体やL鎖単量体を細胞内へ留める機構が存在するため（非特許文献６）、ショウジョウバエ細胞のように、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体とH鎖のみからなる２量体が混在して分泌されるようなことはない。抗体を効率良く生産・回収するためには、宿主細胞に、哺乳動物細胞で見られるような分泌制御機構が存在することが望ましい。
【特許文献１】特開2001-161214号公報
【特許文献２】特開2002-315580号公報
【特許文献３】特開2004-016144号公報
【特許文献４】特開2006-016323号公報
【特許文献５】特開2006-109772号公報
【非特許文献１】Tomita, M. et al., Nature Biotechnology. 21, 52-56, 2003
【非特許文献２】第27回 日本分子生物学会年回 プログラム・講演要旨集、2004年11月25日、3PB-531
【非特許文献３】第27回 日本分子生物学会年回 プログラム・講演要旨集、2004年11月25日、3PB-533
【非特許文献４】Hsu, T.A. et al., Protein Expr. Purif. 5, 595-603, 1994
【非特許文献５】Kirkpatrick, R.B. et al., J. Biol. Chem. 270, 19800-19805, 1995
【非特許文献６】Morrison, S.L. et al., J. Immunol. 114, 655-659, 1975
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記したように、低コストで大量の組換え抗体を生産するために、CHO細胞の発現系に代わる新しい生産系が望まれている。そして、この新しい生産系には、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体を効率良く細胞外へ分泌させ、H鎖２量体などを細胞内へ留める機能を有している必要がある。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、安価に大量の組換え抗体を生産することができる新規な手段を提供することを課題としている。また、さらに、H鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体を選択的に細胞外へ分泌させ、これを容易に回収することができる手段を提供することも課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この出願は、前記の課題を解決する発明として、以下の(1)〜(7)の発明を提供する。
(1)  抗体のH鎖およびL鎖のそれぞれの構造遺伝子が染色体に組み込まれたトランスジェニックカイコであって、H鎖２分子およびL鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子を繭に分泌するトランスジェニックカイコ。
(2)  抗体のH鎖およびL鎖を中部絹糸腺細胞で発現し、繭糸のセリシン層へ機能的な抗体分子を分泌する前記発明(1)のトランスジェニックカイコ。
(3)  抗体のH鎖およびL鎖を後部絹糸腺細胞で発現し、繭糸のフィブロイン層へ機能的な抗体分子を分泌する前記発明(1)のトランスジェニックカイコ。
(4)  前記発明(2)のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターであって、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子の両方、および中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター。
(5)  前記発明(2)のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターセットであって、
抗体のH鎖の構造遺伝子、および中部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクターと、
抗体のL鎖の構造遺伝子、および中部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター、
とからなるベクターセット。
(6)  前記発明(3)のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターであって、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子の両方、および後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター。
(7)  前記発明(3)のトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターセットであって、
抗体のH鎖の構造遺伝子、および後部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクターと、
抗体のL鎖の構造遺伝子、および後部絹糸腺細胞で当該遺伝子の発現を引き起こすプロモーターを有する発現ベクター、
とからなるベクターセット。
(8)  前記発明(1)のトランスジェニックカイコの繭から、機能的な抗体分子を回収することを特徴とする抗体の製造方法。
【０００９】
すなわち前記の各発明は、カイコが有する高い絹タンパク質合成能力に着目して、絹糸腺において抗体のH鎖およびL鎖を発現するトランスジェニックカイコを作製し、このトランスジェニックカイコが、H鎖２量体などの不完全な分子より、H鎖およびL鎖からなる完全な抗体分子（ヘテロ２量体）を選択的に繭に分泌することを確認したことによって完成されたものである。
【００１０】
なお、この発明において、抗体とは、IgG、IgA、IgGなどを意味し、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト型抗体などが含まれる。また、「抗体のH鎖の構造遺伝子」または、「抗体のL鎖の構造遺伝子」とは、抗体のH鎖またはL鎖をコードする領域（open reading flame: ORF）を含むポリヌクレオチドであり、例えば組換えタンパク質遺伝子のcDNAである。「プロモーター」とは、タンパク質をコードする遺伝子領域の転写開始点から上流域に存在する転写を開始させるために必須な配列を含む領域であって、一般に「プロモーター」および「エンハンサー」と言われる領域を言う。
【００１１】
この発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学および分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等に記載されている。
【発明の効果】
【００１２】
この出願の発明によれば、H鎖２分子およびL鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子（ヘテロ２量体）を繭に分泌するトランスジェニックカイコが得られ、このカイコの繭から、安価にかつ大量の抗体分子を回収することが可能となる。
【００１３】
以下、各発明について、実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明(1)は、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子が染色体に組み込まれており、H鎖２分子およびL鎖２分子がジスルフィド結合で連結され、かつ、抗原に対する結合活性を有する機能的な抗体分子（ヘテロ２量体）を繭に分泌するトランスジェニックカイコである。このカイコは、完全な抗体分子であるヘテロ２量体を優先的に繭に分泌し、他の昆虫細胞で見られるようなH鎖２量体などの不完全な分子が無制御に分泌されることはない。その結果、繭にはH鎖２量体などの不完全な分子は含まれず、そのため、繭からヘテロ２量体を容易に回収することができる。
【００１５】
繭を構成する絹糸は、中心に存在するフィブロイン層の周りにセリシン層が存在する構造をしている。絹タンパク質を合成している絹糸腺は、機能的および形態的に、後部絹糸腺、中部絹糸腺、および前部絹糸腺に区別されるが、セリシン層を構成するセリシンは中部絹糸腺で合成され、フィブロイン層を構成するフィブロインは後部絹糸腺で合成される。抗体を発現する組織が中部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のセリシン層へ分泌される（発明(2)）。一方、抗体を発現する組織が後部絹糸腺であった場合、抗体は絹糸のフィブロイン層へ分泌される（発明(3)）。
【００１６】
発明(4)は、発明(2)のセリシン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターである。この発現ベクターには、中部絹糸腺で抗体のH鎖およびL鎖を発現させるために、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子に加えて、それぞれの構造遺伝子の上流に、中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターを組み込まれている。中部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、セリシン１遺伝子またはセリシン２遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【００１７】
発明(4)の発現ベクターを用いると、一回の遺伝子導入操作で、発明(2)のトランスジェニックカイコを作製することができる。一方、発明(2)のトランスジェニックカイコは複数回の遺伝子導入操作によって作製することもできる。例えば、発明(５)の発現ベクターセットを用いて、抗体のH鎖を中部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のL鎖を中部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代のカイコから抗体のH鎖およびL鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜して発明(2)のトランスジェニックカイコを作製しても良い。また、抗体のH鎖を発現するカイコに抗体のL鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のL鎖を発現するカイコに抗体のH鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、発明(2)のトランスジェニックカイコを作製しても良い。
【００１８】
発明(6)は、発明(3)のフィブロイン層に抗体を分泌するトランスジェニックカイコを作製するための発現ベクターである。このベクターには、後部絹糸腺で抗体のH鎖およびL鎖を発現させるために、抗体のH鎖およびL鎖の構造遺伝子に加えて、それぞれの構造遺伝子の上流に、後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターが組み込まれている。後部絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーターとしては、例えば、フィブロインL鎖、フィブロインH鎖、またはフィブロヘキサメリンなどの遺伝子のプロモーターをあげることができる。
【００１９】
発明(2)のトランスジェニックカイコを作製する場合と同様に、発明(3)のトランスジェニックカイコを作製する場合においても、発明(７)の発現ベクターセットを用いて、複数回の遺伝子導入操作によりトランスジェニックカイコを作製しても良い。抗体のH鎖を後部絹糸腺で発現するカイコと、抗体のL鎖を後部絹糸腺で発現するカイコとを、それぞれ別々に作製し、これらを交配して、次世代カイコから抗体のH鎖およびL鎖の両方の遺伝子を有するカイコを選抜して発明(3)のトランスジェニックカイコを作製しても良い。また、抗体のH鎖を発現するカイコに抗体のL鎖を発現させるための発現ベクターを導入する、あるいは、抗体のL鎖を発現するカイコに抗体のH鎖を発現させるための発現ベクターを導入することによって、発明(3)のトランスジェニックカイコを作製することもできる。
【００２０】
これらの発現ベクターは、カイコ染色体へ遺伝子を導入するための機能を有している。例えば、昆虫由来のDNA型トランスポゾンの部分配列が組み込まれていれば、遺伝子をカイコ染色体に導入することが可能である。具体的には、DNA型トランスポゾンの末端に存在する一対の逆向き反復配列を有したプラスミドベクターであり、一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、染色体に挿入される遺伝子配列、すなわち、抗体の遺伝子とプロモーターが組み込まれている発現ベクターである。昆虫由来DNA型トランスポゾンとしては、piggyBac、mariner（Insect Mol. Biol. 9, 145-155, 2000）、およびMinos（Insect Mol. Biol. 9, 277-281, 2000）などが知られているが、この中でもpiggyBac由来の配列は、最も頻繁に利用されている。トランスジェニックカイコを作製するためには、このプラスミドを、piggyBacのトランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、piggyBacの逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的にはpiggyBacのトランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。ヘルパープラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモーターは、内在性のトランスポゼースプロモーターをそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ・アクチンプロモーターやショウジョウバエHSP70プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、挿入するポリヌクレオチドを組み込んだベクター内に同時にマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。
【００２１】
ベクターを微量注入したカイコ卵から孵化した幼虫（F0世代）を飼育する。得られた全F0世代のカイコを野生型カイコと、あるいはF0カイコ同士で交配し、次世代（F1世代）のカイコからトランスジェニックカイコを選抜する。トランスジェニックカイコの選抜は、例えばPCR法やサザンブロット法を用いて行う。また、マーカー遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子としてGFP等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、F1世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。以上のような方法によりトランスジェニックカイコを作出することができる。
【００２２】
発明(8)は、発明(1)のトランスジェニックカイコの繭から、機能的な抗体分子を回収する抗体の製造方法である。抗体がセリシン層に局在する場合はセリシン層から、フィブロイン層に含まれている場合はフィブロイン層から回収する。セリシン層からの抗体の回収は、特に容易に実施することができる。セリシン層を構成するセリシンは親水性であるため、この層に局在する組換えタンパク質は、タンパク質を変性させてしまう溶液を用いることなく抽出することが可能である。セリシン層から抗体を抽出するための抽出液は、抗体の抽出が可能であるものならば特段の制限はない。例えば、中性の塩類溶液であっても良いし、界面活性剤や、その他、抽出を効率的に行うための試薬などが含まれる溶液であっても良い。これらの抽出液を使って繭から抗体を抽出するには、例えば、断片化した繭を抽出液に浸し攪拌するなどの方法を用いることができる。また、抽出の前に、繭を微粉末化する処理を行っても良いし、抽出の際に超音波処理を行うなどの機械的処理を併用しても良い。
【００２３】
以下、実施例によりこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
抗体H鎖および抗体L鎖のcDNAのクローニング
ヒトIgGを抗原とするIgG抗体を産生するハイブリドーマからmRNAを抽出し、逆転写酵素とoligo(dT)プライマーを用いてcDNAを合成した。抗体H鎖および抗体L鎖それぞれのORFをコードするcDNAを、合成したcDNAをテンプレートとしたPCRによって取得した。抗体H鎖のcDNAを増幅するために用いたプライマーの配列は、5'-gatatccaccatggcttgggtgtggac-3'（SEQ ID NO:1）および5'-gatatcttatcatttaccaggagagtggga-3'（SEQ ID NO:2）であり、抗体L鎖のcDNAを増幅するための用いたプライマーの配列は、5'-gatatccaccatggtgtccacttctcagctc-3'（SEQ ID NO:3）および5'-gatatcttactaacactcattcctgttgaagct-3'（SEQ ID NO:4）である。それぞれのプライマーの5'-側両端にはEcoRV制限酵素サイト認識配列が付加されている。得られたPCR産物をクローニングベクターpCR4blunt-TOPO（Invitrogen）にクローニングした。DNAシークエンサーにより塩基配列を解析し、該PCR産物が抗体H鎖および抗体L鎖をコードするcDNAであることを確認した。抗体H鎖および抗体L鎖cDNAを含有するベクターを、以下、それぞれIgG(H)/pCR4、IgG(L)/pCR4と表記する。
【実施例２】
【００２５】
トランスジェニックカイコ作製用ベクターの構築
5’末端がリン酸化されたオリゴヌクレオチド5’-aattccttaagctcgagtcgcga-3’（SEQ ID NO:5）と5’-aatttcgcgactcgagcttaagg-3’（SEQ ID NO:6）をアニーリングさせた２本鎖オリゴヌクレオチドを作製した。この２本鎖オリゴヌクレオチドは、AflII、XhoI、NruIの制限酵素認識配列を有し、両末端はEcoRIサイトに連結可能な構造をしている。マーカー遺伝子として眼や神経系で発現する赤色蛍光タンパク質（DsRed）遺伝子を有するpiggyBacベクターであるpBac[3xP3-DsRed/pA]（Nat. Biotechnol. 21, 52-56 (2003)）のEcoRIサイトに、この２本鎖オリゴヌクレオチドを挿入し、pBac[3xP3-DsRed/pA]ベクターにAflII、XhoI、NruIの制限酵素認識配列を挿入した。
【００２６】
特許文献（特開2006-109772号公報）の実施例１に記載されている「hr3とセリシン1プロモーターの下流にホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するベクター」をテンプレートとしたPCRによって、hr3とセリシン1プロモーターからなり、かつ両末端にXhoIサイトを有したDNA断片を増幅した。用いたプライマーは、5’-ctcgaggatatcgaattcctgcagcc-3'（SEQ ID NO:7）および5’-ctcgagcccgatgataagacgactatg-3'（SEQ ID NO:8）である。増幅したDNA断片をXhoIで消化した後、前記のAflII、XhoI、NruIの制限酵素認識配列を挿入したpBac[3xP3-DsRed/pA]ベクターのXhoIサイトに挿入した。これをpMSG1.1Rと表記する。このベクターのマーカー遺伝子であるDsRed遺伝子を、緑色蛍光タンパクMonster GreenGFP（hMGFP）の遺伝子に置き換えたものも作製した。これをpMSG1.1MGと表記する。
【００２７】
実施例1で得られたIgG(H)/pCR4、および、IgG(L)/pCR4ベクターから、抗体H鎖、およびL鎖のcDNA断片をEcoRVで切り出し、上記のpMSG1.1R、およびpMSG1.1MGにそれぞれ挿入し、抗体H鎖、および抗体L鎖をそれぞれ発現するベクターIgG(H)/pMSG1.1R、およびIgG(L)/pMSG1.1MGを構築した（図１）。
【実施例３】
【００２８】
抗体H鎖、抗体L鎖をセリシン層に分泌するトランスジェニックカイコの作出
IgG(H)/pMSG1.1Rを塩化セシウム超遠心法で精製した後、それぞれをヘルパープラスミドであるpHA3PIG（Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000)）とプラスミド量が1:1になるように混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、IgG(H)/pMSG1.1RとpHA3PIGの濃度がそれぞれ200μg/mlなるようにインジェクションバッファー（0.5 mMリン酸バッファー pH 7.0, 5 mM KCl）に溶解した。このIgG(H)/pMSG1.1Rを含むDNA溶液を、産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約15〜20 nlの液量で微量注入した。合計2854個の卵に微量注入した。上記の操作を、IgG(L)/pMSG1.1MGについても同様の操作を行い、合計3154個の卵に微量注入した。
【００２９】
ベクターDNA（IgG(H)/pMSG1.1R、およびIgG(L)/pMSG1.1MG）を微量注入した卵を25℃でインキュベートしたところ、それぞれ516、および678個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、得られた生殖可能な成虫を交配し、それぞれ138、および、132グループのF1卵塊を得た。産卵日から5〜6日目のF1卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察することにより、眼や神経系から赤色、または緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵をスクリーニングした。その結果、トランスジェニックカイコの卵を含む卵塊を、それぞれ11、および15グループ得ることができた。得られた卵塊を孵化させ飼育したところ、それぞれ9、および8グループの卵塊に由来するトランスジェニックカイコは、正常に繭を作り蛹となり、さらに羽化して生殖能力を有した成虫になった。そこで、野生型のカイコと交配して、トランスジェニック系統を樹立した。
【実施例４】
【００３０】
抗体H鎖およびL鎖を共発現するトランスジェニックカイコの作出
実施例３で得られた抗体H鎖と抗体L鎖のcDNAをゲノム中に持ったトランスジェニックカイコ成虫を交配し、H鎖とL鎖を共に発現するカイコを作製した。実施例３で得られた2種のカイコのうち任意の一系統ずつを交配し、産卵された卵を飼育した。4齢期に至った段階で、目で発現するマーカー遺伝子の蛍光色（H鎖-DsRedの赤色蛍光、L鎖-hMGFPの緑色蛍光）を観察し、H鎖およびL鎖両方を発現するカイコ（赤色と緑色蛍光が合わさって黄色の蛍光を発する）、H鎖のみを発現するカイコ（赤色蛍光を発する）、および、L鎖のみを発現するカイコ（緑色蛍光を発する）を選別した。これらのカイコを25℃で飼育し、繭を作らせた。
【実施例５】
【００３１】
トランスジェニックカイコの繭からの抗体分子の検出
実施例４で得られた抗体H鎖とL鎖を共発現するカイコ、抗体H鎖のみを発現するカイコ、および抗体L鎖のみを発現するカイコの、それぞれの繭糸をハサミで断片化した後、8 M尿素溶液中（8 M Urea、50 mMトリス塩緩衝液pH 8.0）で、80℃、5分間加温してセリシン層を全溶解させ、セリシン層に含まれる抗体H鎖、抗体L鎖を抽出した。野生型カイコの繭糸の断片も、同様の処理をした。遠心して繭糸断片を取り除き、それぞれの抽出液を電気泳動してウエスタンブロット解析を行った。抽出液を2-メルカプトエタノールを含むSDSサンプルバッファーと混合し、5分間95℃で加熱した。この試料をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（Nature 227, 680-685, 1970）に供した。また、スタンダードとして、抗human surfactant protein DモノクローナルIgG抗体（ヤマサ醤油）も泳動した。泳動後、ゲル中のタンパク質をCBB-R250で染色した。また、Matsudairaらの方法（J. Biol. Chem. 262, 10035-10038, 1987）に準じて、泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜BA85（S&S）に転写した。このニトロセルロース膜をブロッキング液（5 ％ Skim milk/ 50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.5、150 mM NaCl）で室温において1時間処理した後に、ブロッキング液で2000倍に希釈した抗IgG(H+L)ポリクローナル抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories）と室温で2時間反応させた。次に、Tween20を含むTBS（50 mMトリス塩酸緩衝液 pH 7.5、150 mM NaCl）で2000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（Cell Signaling Technology）と室温で約1時間反応させた。最後に、抗体が反応したタンパク質をECL Western Blotting Detection Reagents（Amersham Biosciences）を用いて検出した。その結果、抗体H鎖と抗体L鎖の両方を発現するカイコの繭からは抗体H鎖と抗体L鎖の両方のバンドが、抗体H鎖のみを発現するカイコの繭からは抗体H鎖のバンドが、また、抗体L鎖のみを発現するカイコの繭からは抗体L鎖のバンドが検出された（図２）。抗体H鎖とL鎖の両方を発現するカイコの繭に含まれる抗体H鎖の量は、抗体H鎖のみを発現するカイコの繭に含まれる抗体H鎖の量よりも、明らかに多いことが分かった。
【００３２】
CBBで染色したゲル（図２A）をスキャナーで取込み画像化し、定量ソフトImageGage（Fujifilm）を用いて解析し、抗体H鎖と抗体L鎖の両方を発現するカイコの繭に含まれる抗体H鎖の量と、抗体H鎖のみを発現するカイコの繭に含まれる抗体H鎖の量を定量的に測定した。その結果、抗体H鎖と抗体L鎖の両方を発現するカイコの繭には、抗体H鎖のみを発現するカイコの繭と比べて、約３倍の量のH鎖を含んでいることが明らかになった。
【００３３】
以上の結果から、抗体のH鎖とL鎖を、繭のセリシン層へ分泌するカイコを作出できたことが確認された。さらに、抗体のH鎖とL鎖を共発現させると、H鎖を単独で発現させた時に比べ、繭中のH鎖の量が大幅に増加することが示された。
【実施例６】
【００３４】
抗体H鎖とL鎖を共発現するカイコが繭に産生した抗体分子の抽出および立体構造の解析
実施例５で得られた抗体H鎖とL鎖を共発現するカイコの繭片を、タンパク質変性剤を含まない中性緩衝液に浸し抗体分子の抽出を試みた。繭糸をハサミで断片化した後、PBSに懸濁し、4℃において12時間インキュベートした。同様にして、野生型カイコの繭糸の断片も、PBS中でインキュベートした。遠心して繭糸断片を取り除いて得られた抽出液を、還元剤である2-メルカプトエタノールを含まないSDSサンプルバッファー、および2-メルカプトエタノールを含むSDSサンプルバッファーと混合し、非還元条件および還元条件にてSDS-PAGEを行った。泳動後、ゲルをCBBで染色すると共に、実施例４と同じ方法でウエスタンブロットを行った。（図３）。その結果、還元条件では、抗体H鎖とL鎖の２本のバンドが検出でき（図３A）、非還元条件では、高分子量の１本のバンドが検出できた（図３B）。還元条件で泳動された高分子量のバンドの移動度は、同時に泳動したスタンダードの抗human surfactant protein DモノクローナルIgG抗体のバンドの移動度と一致していた。従って、繭の抽出液から検出された高分子量のバンドは、抗体のH鎖およびL鎖からなるヘテロ２量体であることが明らかとなった。抗体H鎖の単量体や２量体、抗体L鎖の単量体は検出されなかった。また、繭に含まれる抗体のヘテロ２量体は、中性緩衝液で抽出されることも示された。
【実施例７】
【００３５】
抗体の活性測定
実施例６で得られた繭抽出液に含まれる抗体分子（H鎖とL鎖のヘテロ２量体）の抗体力価と抗原特異性を、ELISA法を用いて調べた。実施例1で、抗体のcDNAを調製したハイブリドーマは、抗ヒトIgG抗体を産生する細胞である。そこで、繭から得られた抗体分子とハイブリドーマが産生した抗体分子のヒトIgGへの結合量を調べ、抗体力価を測定した。また、抗原特異性を調べるため、同様の操作をヒトIgA、およびヒトIgMに対しても行った。
【００３６】
アフィニティー精製されたヒトIgG、ヒトIgA、ヒトIgM（いずれもCappel）をそれぞれ濃度3 mg/mlとなるように、抗原固相化溶液（150 mM NaCl、0.1% NaN3）で調整し、96ウェルELISAプレート（Greiner bio one）に各50 ml/ウェルとなるように入れて、一晩室温中で静置し、固相化させた。次に、プレート中の溶液を捨て、ウェルを洗浄液（150 mM NaCl、0.05% Tween20）で5回洗浄した。次に、70mlのブロッキング液（2% FBS、1x TBS）でウェルを1時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を捨てた後、繭からPBSで抽出した抗体分子、またはハイブリドーマから得た抗体分子を、濃度がそれぞれ、1000、320、100、32、10、3.2、1、0.3 ng/mlとなるように希釈溶液（10% FBS、0.1%NaN3 1x TBS）で調整したものを、30 ml/ウェルとなるよう入れ、1時間反応させた。反応後、ウェルを洗浄液（150 mM NaCl、0.05% Tween20）で5回洗浄した。次に、HRP標識抗マウスIgG(H+L)-ウサギポリクローナル抗体（Jackson lab. code 315-035-003）を希釈液（25% FBS、1x TBS）で0.8 mg/mlに調整したものを、50 ml/ウェルとなるように入れ、1時間反応させた。ウェルを洗浄液（150 mM NaCl、0.05% Tween20）で5回洗浄した。最後に、呈色させるため、発色液（H2O2-OPD）を100 ml/ウェルとなるように入れ、18分反応させた後、停止液（4N-H2SO4）を50 ml/ウェルとなるように入れて反応を停止させた。その後、波長492 nmの吸光度を測定し、抗原に結合した抗体の結合量を定量した。
【００３７】
以上の手順で、固相化したヒトIgG への結合を解析したところ、繭から抽出した抗体分子と、ハイブリドーマから精製した抗体分子が、同一の抗体力価を有していることが確認できた。また、繭由来、およびハイブリドーマ由来の抗体分子の、ヒトIgAおよびヒトIgMへの結合は、1000 ng/mlを固相化させた場合にもほとんど見られず、抗原特異性も同一であることが示された。
【００３８】
以上、実施例で示したとおり、抗体のH鎖とL鎖の両方を中部絹糸腺で発現するカイコは、H鎖とL鎖からなり、抗原との結合活性を有するヘテロ２量体を産生し、繭糸のセリシン層へ分泌する。抗体のヘテロ２量体は、H鎖の２量体などの不完全な分子よりも、効率良く細胞から分泌されるため、繭からは抗体のヘテロ２量体のみが検出される。さらに、セリシン層に含まれるヘテロ２量体は、中性の緩衝液にて容易に抽出できるため、抽出過程で変性してしまうことがない。このように、トランスジェニックカイコにより、活性を有する抗体のヘテロ２量体が効率良く生産できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、機能的な抗体分子を生産するトランスジェニックカイコが提供される。さらに、このカイコを作製するためのベクター、並びに、トランスジェニックカイコの繭から抗体を回収する抗体の製造方法が提供される。この発明を利用すれば、機能的な抗体を、安価にかつ大量に生産することができ、様々な治療に用いられている抗体医薬を、安価に大量生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】IgG(H)/pMSG1.1RおよびIgG(L)/pMSG1.1MGベクターの構造。中部絹糸腺において、抗体H鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（IgG(H)/pMSG1.1R）の構造を上段に、抗体L鎖を発現するトランスジェニックカイコを作出するためのベクター（IgG(L)/pMSG1.1MG）の構造を下段に示した。piggyBacR：piggyBac 3’末端側配列、3xP3-TATA：眼や神経系で発現を引き起こすプロモーター、DsRed：赤色蛍光タンパク質遺伝子、hMGFP：緑色蛍光タンパク質（Monster GreenGFP）の遺伝子、SV40 polyA：SV40由来ポリA付加シグナル、Pser1：カイコセリシン1遺伝子プロモーター、HR3：BmNP hr3、IgG(H)：マウスIgG抗体H鎖遺伝子、IgG(L)：マウスIgG抗体L鎖遺伝子、FibL polyA；カイコフィブロインL鎖ポリA付加シグナル、piggyBacL：piggyBac 5’末端側配列、Amp：抗生物質アンピシリン耐性遺伝子。
【図２】繭に含まれる抗体の電気泳動およびウエスタンブロット解析。繭セリシン層を8 M尿素溶液により可溶化し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて展開した。AはCBB染色像、Bは抗マウスIgG抗体を用いたウェスタンブロット像である。HL：抗体H鎖およびL鎖を共発現するカイコの繭、H：抗体H鎖のみ発現するカイコの繭、L：抗体L鎖のみのみ発現するカイコの繭、W：野生型カイコの繭、S：スタンダードとして用いた抗human surfactant protein D-マウスIgG抗体。矢尻で示されるHとLは、抗体H鎖および抗体L鎖を示す。写真左の数字は、分子量（kDa）を示す。
【図３】繭抽出液中の抗体の還元および非還元PAGEによる解析。繭からPBSで抽出した抗体を、還元状態（A）、または、非還元状態（B）で、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて展開した。CBB染色象を左側に、抗マウスIgG抗体を用いたウェスタンブロット象を右側に示した。HL：抗体H鎖およびL鎖を共発現するカイコの繭、H：抗体H鎖のみを発現するカイコの繭、L：抗体L鎖のみを発現するカイコの繭、W：野生型カイコの繭、S：スタンダードとして用いた抗human surfactant protein D-マウスIgG抗体。矢尻で示されるHとLは、抗体H鎖および抗体L鎖を、H2L2は抗体ヘテロ２量体示す。写真左の数字は、分子量（kDa）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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