(57)【要約】【課題】  ＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドの提供を課題とする。【解決手段】  生体反応を制御するレセプターとリガンドの結合によるシグナルの伝達を阻害し、かつ当該分子の立体構造を認識するペプチドを進化工学的手段であるIn vitro virus法を用いてN末端側に一つのシステイン残基をもつ計35残基のランダムペプチドライブラリーから取得した。膨大なライブラリからより特異性、親和性が高い機能ペプチドを取得する試みを行いホモロジーのあるペプチドを見出した。特に、本発明では２つ以上のS-S結合を形成するシステイン残基とそのS-S架橋の方式によってペプチドの機能が大きく変化することを見出し本発明を完成させた。本発明のペプチドは、ＩＬ−６の受容体に結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害する機能を有するＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドである。【選択図】図２
2008193924.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）または（２）に記載のポリペプチド。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）および（ｂ）の架橋を有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
（ａ）Ｎ末端側１番目のシステイン残基とＣ末端側１番目のシステイン残基における架橋
（ｂ）Ｎ末端側２番目のシステイン残基とＣ末端側２番目のシステイン残基における架橋
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
【請求項５】
請求項３に記載のポリヌクレオチド、または請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１または２に記載のポリペプチドを有効成分とする、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤。
【請求項７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドの製造方法。
（ａ）請求項４に記載のベクターを細胞へ導入する工程、
（ｂ）前記細胞を培養する工程、
（ｃ）前記細胞培養物からＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドを回収する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン６（ＩＬ−６）の受容体に結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害し、ＩＬ−６の異常産生に伴う疾患の予防・治療に寄与し得る、ＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインは、細胞間の情報伝達を担う蛋白性の化学物質であり、標的細胞の表面上に特徴的なサイトカイン受容体が発現している。そして、サイトカインが持つ細胞増殖、分化などの生理活性はこの受容体分子とサイトカインが結合することによって発揮される。サイトカインの異常産生は、さまざまな病態に関与することが知られている。
ＩＬ−６は炎症性サイトカインの一つであり、その異常産生が病態の中心と考えられる疾患が多くみられる。そのような疾患の例として、慢性関節リウマチ、血管炎症候群、二次性アミロイドーシス、キャッスルマン病、間質性肺炎（ＬＩＰ）、増殖性糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、腎移植に伴う拒絶、骨粗鬆症、エイズ、ＩＬ−６産生腫瘍（多発性骨髄腫、腎癌、子宮頸癌、肺癌、心房粘液腫）あるいは悪液質などが挙げられる。
【０００３】
また、これまでにＩＬ−６の異常産生に伴う疾患に対して、ヒト型化抗ＩＬ−６受容体抗体（ＭＲＡ）によるＩＬ−６の機能阻害が、有効な治療法になることを示している。
しかし、ＭＲＡはヒト型化とはいえマウス異種蛋白を含むため、ＭＲＡに対する抗体の出現を否定することはできず、ＭＲＡの作用低下あるいはアナフィラキシー出現の危険性も完全に除外するわけにはいかない。また、ＭＲＡは抗体で高分子（１５０ｋｄ）であるため、経静脈注入を余儀なくされ、患者の利便性を著しく損なっている。さらに高額であるため経済的にも負担がかかる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明の目的は、以上の障害を改善し、より低分子で経口可能な安全性の高いＩＬ−６機能阻害剤を提供しようとするものである。即ち本発明は、ＩＬ−６受容体に結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害する機能を有するＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のペプチドは、生体反応を制御するレセプターとリガンドの結合によるシグナルの伝達を阻害し、かつ当該分子の立体構造を認識するペプチドを進化工学的手段であるIn vitro virus法（Nemoto N, et al., FEBS lett, 414,405-408, 1997)、またはcDNA display法(Nucleic Acids Research, 34, e140, 2006)を用いてN末端側に一つのシステイン残基をもつ計35残基のランダムペプチドライブラリーから取得した。すでにRafflerらはN末端側に一つのシステイン残基をもつ計１５残基のライブラリを用いてin vitro virus法の類似技術であるmRNA display法を用いてthrombinに対してスクリーニングし、１つのS-S結合を含む166〜520 nMの親和性をもつペプチドを取得している（Chemistry & Biology, 10, 69-79, 2003）。ここで取得されたペプチドはthrombinに対する阻害効果が認められた。同様に、今回行った実験ではより膨大なライブラリからより特異性、親和性が高い機能ペプチドを取得する試みを行いホモロジーのあるペプチドを見出した。特に、本発明では２つ以上のS-S結合を形成するシステイン残基とそのS-S架橋の方式によってペプチドの機能が大きく変化することを見出し本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は、ＩＬ−６受容体に結合してＩＬ−６とＩＬ−６受容体の結合を阻害する機能を有するＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドに関し、より具体的には、
〔１〕以下の（１）または（２）に記載のポリペプチド、
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド
〔２〕以下の（ａ）および（ｂ）の架橋を有することを特徴とする、〔１〕に記載のポリペプチド、
（ａ）Ｎ末端側１番目のシステイン残基とＣ末端側１番目のシステイン残基における架橋
（ｂ）Ｎ末端側２番目のシステイン残基とＣ末端側２番目のシステイン残基における架橋
〔３〕〔１〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
〔４〕〔３〕に記載のポリヌクレオチドを有するベクター、
〔５〕〔３〕に記載のポリヌクレオチド、または〔４〕に記載のベクターを含む宿主細胞、
〔６〕〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドを有効成分とする、ＩＬ−６シグナル伝達阻害剤、
〔７〕以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドの製造方法、
（ａ）〔４〕に記載のベクターを細胞へ導入する工程、
（ｂ）前記細胞を培養する工程、
（ｃ）前記細胞培養物からＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドを回収する工程
を、提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ＩＬ−６シグナル伝達拮抗ペプチドが提供された。本発明のポリペプチドの開発により、従来のＭＲＡの作用低下あるいはアナフィラキシー出現の危険性を排除することができる。また、本発明のポリペプチドはより低分子で経口可能な安全性の高いＩＬ−６機能阻害剤であり、非常に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＩＬ−６受容体のアンタゴニスト活性を有するポリペプチド（本明細書において単に「本発明のポリペプチド」と記載する場合あり）に関する。
本発明のポリペプチドの好ましい態様としては、例えば、以下の（１）または（２）に記載のポリペプチドが挙げられる。
（１）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド
【０００９】
本発明のポリペプチドは、以下の（ａ）および（ｂ）の架橋を有することが好ましい。
（ａ）Ｎ末端側１番目の（最初の）システイン残基とＣ末端側１番目の（最初の）システイン残基における架橋
（ｂ）Ｎ末端側２番目のシステイン残基とＣ末端側２番目のシステイン残基における架橋
【００１０】
本発明のポリペプチドの好ましい態様としては、例えば、以下の（ａ）および（ｂ）の架橋を有するポリペプチドを挙げることができる。
（ａ）配列番号：１に記載のポリペプチドにおいて、Ｎ末端側１番目のシステイン残基（Ｎ末端側から３番目のアミノ酸）とＣ末端側１番目のシステイン残基（Ｃ末端側から２番目のアミノ酸）における架橋
（ｂ）配列番号：１に記載のポリペプチドにおいて、Ｎ末端側２番目のシステイン残基（Ｎ末端側から１２番目のアミノ酸）とＣ末端側２番目のシステイン残基（Ｃ末端側から１０番目のアミノ酸）における架橋
【００１１】
本発明のポリペプチドは、天然のタンパク質のほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。組換えタンパク質は、本発明のポリペプチドをコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより調製することが可能である。
【００１２】
本発明のポリペプチドは、必ずしも具体的に示される上記のポリペプチド（配列番号：１）のみに限定されるものではない。本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチド（例えば、IL-6Rと実質的に結合する活性、もしくはIL-6Rに対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド）であれば、いかなる形態（構造）のポリペプチドであってもよい。例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、実質的にIL-6Rと結合する機能を有するポリペプチド、IL-6Rに対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチド、または、IL-6シグナル伝達阻害活性を有するポリペプチドは本発明のポリペプチドに含まれる。
【００１３】
具体的なアミノ酸配列（例えば、配列番号：１）が開示された場合においては、当業者であれば、これらアミノ酸配列を基に、適宜アミノ酸が改変された配列からなるポリペプチドを作製し、当該ポリペプチドについて、上述の機能を有するか否かを評価し、本発明のポリペプチドを適宜選択することが可能である。
【００１４】
例えば、所望のポリペプチドについてIL-6Rとの結合活性（相互作用活性）は、当業者においては、公知の技術、例えば、免疫沈降法及びプルダウンアッセイ等を利用して、適宜、評価（測定）することができる。
また、所望のポリペプチドについてIL-6シグナル伝達阻害活性を有するか否かは、例えば、後述の実施例に記載の細胞アッセイによって適宜評価することができる。
【００１５】
また、本発明のポリペプチドは、上記ポリペプチドにおいて、IL-6Rとの結合領域を有する部分断片ペプチドであってもよい。
また、本発明のポリペプチドは、配列番号：１に記載のポリペプチドの改変体であって、IL-6Rと実質的に結合する機能を有する、または、IL-6Rに対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドであってもよい。
これらのポリペプチドは、通常、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００１６】
本明細書において用いられる「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸からなる重合体を意味し、そのアミノ酸の長さは特に制限されない。従って、本発明のポリペプチドには、所謂「オリゴペプチド」および「タンパク質」も含まれる。ポリペプチドは、天然に存在する状態から修飾されていないもの、および修飾されているものの双方を含む。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、メチル化、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介付加、ユビキチン化等が含まれる。
【００１７】
本発明のポリペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することが可能であり、該方法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくはアミノ酸配列の情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次合成させて鎖を延長していくステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法を包含し、本発明のポリペプチドの合成は、いずれの方法を用いてもよい。
このようなペプチド合成法にて用いられる縮合法も、各種方法に従って行うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、ウッドワード法等を例示できる。
【００１８】
これら各種方法に利用できる溶媒もまた、一般的に使用されるものを適宜利用することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（THF）、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。なお、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸およびペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、P−メトキシベンジルエステル、P−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばTyrの水酸基は、アセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよいが、必ずしもかかる保護は必須ではない。また、例えば、Argのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、2−メトキシベンゼンスルホニル基、メチシレン−2−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。
【００１９】
上記のようにして得ることが可能な本発明のポリペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜、精製を行うことができる。
【００２０】
本発明のポリペプチドは、例えば、配列番号：１に記載のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするDNA核酸分子を合成し、次いで適当な発現ベクターへ導入した後、宿主細胞内において発現させる遺伝子工学的手法によっても取得することができる。
一例を示せば、まず配列番号：１に記載されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを合成する。該方法としては、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am.Chem. Soc.、89、4801 (1967)；同 91、3350 (1969)；Science、150、178 (1968)；Tetrahedron Lett.、22、1859 (1981)；同 24、245 (1983)〕及びそれらの組合せ方法などが例示できる。より具体的には、DNAの合成は、ホスホルアミダイト法またはトリエステル法による化学合成により行うこともでき、市販されている自動ポリヌクレオチド合成装置上で行うこともできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にDNAポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。
【００２１】
本発明のポリペプチドには、例えば、本発明者らによって配列番号：１からなるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドが含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるポリペプチドが、配列番号：１からなるポリペプチドと同様の（同等の）生物学的あるいは生化学的機能（活性）を有することを指す。このような機能としては、例えば該ポリペプチドが有する機能、即ち、IL-6Rと結合する機能、IL-6Rに対するアンタゴニスト活性等を挙げることができる。対象となるポリペプチドが、上記ポリペプチドと同等の生物学的あるいは生化学的な機能（活性）を有しているか否かは、例えばIL-6Rとの結合活性、または後述の細胞アッセイ等を実施することにより適宜評価することが可能である。
【００２２】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、例えばポリペプチド中のアミノ酸配列に変異を導入する方法が挙げられる。具体的には当業者であれば部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh、T. et al. (1995) Gene 152、271-275、Zoller、MJ、and Smith、M.(1983) Methods Enzymol. 100、468-500、Kramer、W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12、9441-9456、Kramer W、and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154、350-367、Kunkel、TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82、488-492、Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85、2763-2766）などを用いて、配列番号：１に記載のアミノ酸配列に適宜変異を導入することにより、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、ポリペプチド中のアミノ酸の変異は自然に生じることもある。このように、人工的か自然に生じたものかを問わず、本発明者らにより同定されたポリペプチド（配列番号：１）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸配列が変異したアミノ酸配列を有し、該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、本発明のポリペプチドに含まれる。
【００２３】
上記変異体における、変異するアミノ酸数は、本発明のポリペプチドの有する機能が保持される限り制限はないが、通常10アミノ酸以内であり、好ましくは5アミノ酸以内であり、より好ましくは3アミノ酸以内であり、さらに好ましくは1もしくは2アミノ酸である。なお、本発明のポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端へ、さらにポリペプチドが付加される場合には、本発明のポリペプチドの機能が保持される限りにおいてその付加されるポリペプチドの長さは制限されないが、通常、100アミノ酸以内であり、好ましくは50アミノ酸以内であり、より好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内であり、最も好ましくは1〜４アミノ酸である。
【００２４】
変異するアミノ酸残基としては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（R、K、H）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字表記を表す）。好ましくは、配列番号：１で示されるポリペプチドにおいて、システイン残基は保存されていることが好ましい。具体的には、配列番号：１に記載のポリペプチドにおいて、N末端側およびC末端側から最初のシステイン残基と、2番目のシステイン残基は保存されていることが好ましい。
【００２５】
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的機能（活性）を維持し得ることはすでに知られている（Mark、 D. F. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81、5662-5666、Zoller、M. J. & Smith、M. Nucleic Acids Research (1982) 10、6487-6500、Wang、A. et al.、Science 224、1431-1433、Dalbadie-McFarland、 G. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79、6409-6413）。
【００２６】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加されたポリペプチドには、これらポリペプチドを含む融合ポリペプチドが含まれる。融合ポリペプチドは、これらポリペプチドと他のペプチド又はポリペプチドとが融合したものである。融合ポリペプチドを作製する方法は、本発明のポリペプチド（配列番号：１）をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のポリペプチドとの融合に付される他のペプチド又はポリペプチドは、特に制限されない。
【００２７】
本発明のポリペプチドとの融合に付される他のペプチドとしては、例えばFLAG（Hopp、 T. P. et al.、 BioTechnology (1988) 6、 1204-1210）、6個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His、10×His、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のポリペプチドとの融合に付される他のタンパク質としては、例えば、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。
【００２８】
またあるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook、J et al.、Molecular Cloning 2nd ed.、9.47-9.58、Cold Spring Harbor Lab. press、1989）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号：１）をコードするポリヌクレオチドもしくはその一部をもとに、同種または異種生物由来のポリヌクレオチド試料から、これと相同性の高いポリヌクレオチドを単離して、該ポリヌクレオチドから本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを単離することも通常行いうることである。
【００２９】
本発明には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドが含まれる。
【００３０】
本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者であれば適宜選択することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、低ストリンジェントな条件が挙げられる。低ストリンジェントな条件とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄において、例えば42℃、0.1×SSC、0.1％SDSの条件であり、好ましくは50℃、0.1×SSC、0.1％SDSの条件である。より好ましいハイブリダイゼーションの条件としては、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば65℃、5×SSC及び0.1％SDSの条件である。これらの条件において、温度を上げる程に高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本発明のポリペプチドは「成熟」ポリペプチドの形であっても、融合ポリペプチドのような、より大きいポリペプチドの一部であってもよい。本発明のポリペプチドには、リーダー配列、プロ配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列などが含まれていてもよい。
【００３１】
これらハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術により単離されるポリヌクレオチドがコードする、本発明のポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドは、通常、該ポリペプチド（配列番号：１）とアミノ酸配列において高い相同性を有する。本発明のポリペプチドには、配列番号：１に記載のポリペプチドと機能的に同等であり、かつ該ポリペプチドのアミノ酸配列と高い相同性を有するポリペプチドも含まれる。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも50％以上の同一性、好ましくは75％以上の同一性、さらに好ましくは85％以上の同一性、さらに好ましくは95％以上（例えば、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上）の同一性を指す。ポリペプチドの相同性を決定するには、文献（Wilbur、W. J. and Lipman、 D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80、726-730）に記載のアルゴリズムに従えばよい。
【００３２】
アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877、 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215: 403-410、1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えば、score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、当業者に公知の方法により、組み換えポリペプチドとして調製することが可能である。例えば、本発明のポリペプチド（例えば、配列番号：１）をコードするポリヌクレオチドを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリペプチドに対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
【００３４】
また、本発明のポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼタンパク質との融合ポリペプチドとして、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリペプチドはグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、目的のポリペプチド以外の領域を、トロンビンまたはファクターXaなどにより切断し、除去することも可能である。
また、本発明のポリペプチドは例えば、IL-6R結合領域を認識する抗体の作製、および、IL-6Rとの結合を変化させる化合物のスクリーニング等に利用することが可能である。
【００３５】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードし得るものであればいかなる形態でもよい。即ち、mRNAから合成されたcDNAであるか、ゲノムDNAであるか、化学合成DNAであるかなどを問わない。また、本発明のポリペプチドをコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。
また、本発明のポリヌクレオチドの作成においては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Grantham、 R. et al.、 Nucelic Acids Research (1981) 9、r43-74）。また、本発明のポリヌクレオチドは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なDNAフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ATG）及び／又は終止コドン（TAA、TGA、又はTAG）の挿入等が挙げられる。
【００３６】
また本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および該ポリヌクレオチドを有するベクターを提供する。さらに、本発明のポリヌクレオチド、または、上記ベクターを含む宿主細胞に関する。
また本発明は、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを有効成分とする、IL-6R阻害薬（本明細書においては単に「本発明の薬剤」と記載する場合あり）を提供する。さらに本発明は、本発明のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを有効成分とするIL-6シグナル伝達阻害剤を提供する。
【００３７】
上記ベクターとしては、通常、本発明のポリペプチドをコードするDNAを担持するプラスミドもしくはウイルスベクターが一般的である。当業者においては、所望のDNAを有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することができる。
本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のポリヌクレオチドを保持したり、本発明のポリペプチドを発現させるためにも有用である。
【００３８】
本発明におけるポリヌクレオチドは、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的としてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などを例示することができる。ベクターへの本発明の核酸の挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる。
【００３９】
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
【００４０】
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
【００４１】
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
本発明は、上述の方法によってポリペプチドを回収する工程を含む、ＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドの製造方法もまた本発明に含まれる。
【００４２】
本発明の製造方法の好ましい態様としては、例えば、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法が挙げられる。
（ａ）本発明のベクターを細胞へ導入する工程、
（ｂ）前記細胞を培養する工程、
（ｃ）前記細胞培養物からＩＬ−６受容体に対してアンタゴニスト活性を有するポリペプチドを回収する工程
本発明の製造方法は、好ましくは、ポリペプチド中のシステイン残基間において、上述のような架橋を形成する工程を含む。
【００４３】
また、動物の生体内で本発明のポリヌクレオチド(DNA)を発現させる方法としては、本発明のDNAを適当なベクターに組み込み、例えば、レトロウィルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウィルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、癌治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のDNAの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Molecular Cloning 、5.61-5.63）。生体内への投与は、ex vivo法であっても、in vivo法であってもよい。
【００４４】
本発明の薬剤は、IL-6の異常生産（IL-6増加等）に伴う疾患に対して予防・もしくは治療効果を有する。従って、本発明は、本発明の上記薬剤を有効成分とする、IL-6の異常生産に伴う疾患の治療剤を提供する。該疾患の例として、例えば、慢性関節リウマチ、血管炎症候群、二次性アミロイドーシス、キャッスルマン病、間質性肺炎（ＬＩＰ）、増殖性糸球体腎炎、炎症性腸疾患（クローン病）、腎移植に伴う拒絶、骨粗鬆症、エイズ、ＩＬ−６産生腫瘍（多発性骨髄腫、腎癌、子宮頸癌、肺癌、心房粘液腫）あるいは悪液質などが挙げられる。
また、本発明の薬剤は、「治療剤」、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
なお、本発明における「治療」には、疾患の発症を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００４５】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００４６】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００４７】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００４８】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００４９】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。例えば、本発明のポリペプチドもしくはベクターを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。癌組織等に局所的に投与することもできる。
【００５０】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウィルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【００５１】
また本発明のポリペプチドを体液中に導入することによって、IL-6とIL-6Rとの結合を阻害することができる。従って、本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分として含む、IL-6とIL-6Rとの結合阻害剤を提供する。また、本発明のポリペプチドを体液中に導入することを特徴とする、IL-6とIL-6Rとの結合を阻害する方法を提供する。
【００５２】
本方法において「ポリペプチドを細胞内へ導入する」とは、該ポリペプチド直接体液中に導入することに加えて、例えば、該ポリペプチドを発現し得るベクターを細胞内へ導入することも含まれる。
細胞内への導入は、例えば本発明のポリペプチドを脂溶性の高い物質、例えばリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を導入することによって実施することができる。あるいは別の態様として、該ポリペプチドを細胞内へ移行する活性を有する分子（薬物）と結合（修飾）させることによっても行うことができる。該分子としては、ペプチドあるいは核酸の移行の際に利用可能な、種々の公知の物質、例えば、担体、運搬体、ベクター、デリバリー分子、キャリア分子等を利用することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
In vitro virus法またはこの発展形であるcDNA disiplay法によって以下のようにIL-6Rに対して結合するペプチドのスクリーニングを行った。（図１）
１．スペーサーＢｉｏＬｏｏｐ−Ｐｕｒｏ（以下"ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ"と略す）の合成
Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓ［配列；５′−（Ｓ）−ＴＣ（Ｆ）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−（Ｓｐｅｃ１８）−ＣＣ−（Ｐｕｒｏ）− ３′、ＢＥＸ社より購入］１０ｎｍｏｌを、１００μｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶かし、１００ｍＭ ＴＣＥＰを１μｌ加え（ｆｉｎａｌ １ｍＭ）、室温で６時間放置し、Ｐｕｒｏ−Ｆ−ＳのＴｈｉｏｌを還元した。架橋反応を行う直前に５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化した ＮＡＰ５（アマシャム、１７−０８５３−０２）を用いてＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を除いた。なお、Ｐｕｒｏ−Ｆ−Ｓの配列中、（Ｓ）は５′−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ ＣＰＧ、Ｓｐａｃｅｒ１８はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｅａｒｃｈ社製のスペーサー（１８−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ，１−［（２−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ）− （Ｎ，Ｎ−ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌ）］−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）で次の化学構造を有する。
【００５４】
【化１】
2008193924.tif 000003
【００５５】
０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１００μｌに、５００ｐｍｏｌ／μｌ Ｂｉｏｔｉｎ−ｌｏｏｐ［（５６ｍｅｒ）配列； ５′−ＣＣＣＧＧ ＴＧＣＡＧ ＣＴＧＴＴ ＴＣＡＴＣ（Ｔ−Ｂ）ＣＧＧＡ ＡＡＣＡＧ ＣＴＧＣＡ ＣＣＣＣＣ ＣＧＣＣＧ ＣＣＣＣＣ ＣＧ（Ｔ）ＣＣＴ−３′（配列番号：２、ＢＥＸ社より購入）、（Ｔ）：Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ６ ｄＴ、（Ｔ−Ｂ）：Ｂｉｏｔｉｎ−ｄＴ（アンダーラインは制限酵素ＰｖｕＩＩのサイトを示す）］２０μｌ、１００ｍＭ架橋剤ＥＭＣＳ（３４４− ０５０５１；６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）２０μｌ、を加え、良く攪拌した後、３７℃で３０分放置した後に、未反応のＥＭＣＳを取り除いた。沈殿を減圧下で乾燥 させた後、０．２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１０μｌに溶かし、上記の還元したＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓ（〜１０ｎｍｏｌ）を加えて４℃で一晩放置した。サンプルに最終で４ｍＭになるようにＴＣＥＰを加え室温で１５分放置した後、未反応のＰｕｒｏ−Ｆ−Ｓをエタノール沈殿で取り除き、未反応のＢｉｏｔｉｎ− ｌｏｏｐを取り除くために以下の条件でＨＰＬＣ精製を行った。
カラム；ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ ＣＳＯＭＯＳＩＬ ３７９１８−３１ １０ ｘ ２５０ｍｍ Ｃ１８−ＡＲ−３００（Ｗａｔｅｒｓ）
ＢｕｆｆｅｒＡ；０．１Ｍ ＴＥＡＡ、ＢｕｆｆｅｒＢ；８０％アセトニトリル（超純水で希釈したもの）
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ（Ｂ％：１５−３５％ ３３ｍｉｎ）
【００５６】
ＨＰＬＣの分画は１８％アクリルアミドゲル（８Ｍ尿素、６２℃）で解析し、目的の分画を減圧下で乾燥させた後、ＤＥＰＣ処理水で溶かして、１０ｐｍｏｌ／μｌにした。
【００５７】
２．Ｉｎ ｖｉｔｒｏウィルスの合成のためのライブラリー作成
５７ｂｐのランダムな領域を含むＤＮＡライブラリーは、（株）ファスマックに依託合成した３本の一本鎖ＤＮＡフラグメント（配列番号：３−５）をつなぎ合わせて完全長を作成した。配列番号：３−５で示すようにｆｒａｇｍｅｎｔ１と２、２と３が互いに２０〜３０ｍｅｒの相補な配列を持つ。これら３本の一本鎖ＤＮＡフラグメントを、最初にｆｒａｇｍｅｎｔ２と３、次に、ｆｒａｇｍｅｎｔ１の順で逐一伸長反応を行うことでつなぎ合わせて、全長のＤＮＡライブラリーを得た（配列番号：６）。伸長反応はＥｘ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）を用いて、熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング６９℃１５秒、伸長反応７２℃４５秒のサイクルを１８回繰り返すことで行った。完全長のＤＮＡは５′末端にＴ７プロモーター、Ｃａｐ、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列、３′末端にヒスチジンタグ、転写したときにＰＭ付き スペーサーＤＮＡの一部と相補なタグ配列を含む。配列番号：６で"ｘｙｚ"の３５回の繰り返しで示した１２４ｂｐ−２２８ｂｐのランダムな領域は、翻訳時に終止コドンの出現が少なくなるように、ｘはＴ１３％，Ｃ２０％，Ａ３５％，Ｇ３２％，ｙはＴ２４％，Ｃ２２％，Ａ３０％，Ｇ２４％、ｚはＴ３７％，Ｃ３７％，Ａ０％，Ｇ２６％ （Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９３ Ａｕｇ；２（８）：１２４９−５４）、になるように特殊ミックスした塩基を表す。配列表においては、"ｘｙｚ"は"ｎｎｎ"の繰り返しで示される。完全長 のＤＮＡは変性アクリルアミドゲルから切り出し精製した後、定量しそのまま転写反応に使用した。
【００５８】
配列番号：３／ｆｒａｇｍｅｎｔ １（１１７ ｍｅｒ）;  ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧ
配列番号：４／ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２（１４５ ｍｅｒ）;  ＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣａｔｇＧＧＡＴＧＴｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙzｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｇｇｇｇｇａｇｇｃａｇｃＣＡＴＣ
配列番号：５／ｆｒａｇｍｅｎｔ  ３（６１ ｍｅｒ）;  ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣｇＣＣＣＣｃｃＧＴＣＣＴｇｃｔｔｃｃｇｃｃＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧｇｃｔｇｃｃｔｃｃｃｃｃ
配列番号：６（２８９ ｍｅｒ）;  ＧＡＴＣＣＣＧＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣａｔｇＧＧＡＴＧＴｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｘｙｚｇｇｇｇｇａｇｇｃａｇｃＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣｇｇｃｇｇａａｇｃＡＧＧＡＣｇｇＧＧＧＧｃＧＧＣＧＧＧＧＡＡＡ
【００５９】
転写は、プロメガ社のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１３００）に付属するプロトコルに従いＤＮＡ ２μｇ、４０μｌスケールで行った。合成の際、ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｐ１７１１）を加えた。３７℃で１時間放置した後、キット付属のＤＮａｓｅ（ＲＱ１ ＤＮａｓｅ）を２ｕｎｉｔ加え、さらに３７℃で１５分放置することでテンプレートのＤＮＡを分解した。フェノール・クロロフォルム処理を行った後、ＤＳ Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｅｍｏｖｅｒ（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で精製した。
【００６０】
３．ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの結合
転写した結果できたｍＲＮＡ ４５０ｐｍｏｌに、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡを４５０ｐｍｏｌ、１０ ｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）１２μｌを加え、１１２μｌになるようＤＥＰＣ処理水を加えた。８５℃から２５℃へ１０〜１５分かけてアニーリングし、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を２４ｕｎｉｔ、Ｔ４ ＲＮＡ Ｌｉｇａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を８０ｕｎｉｔ加え、２５℃４０分反応させた。後に、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、７４１０４）で精製した。
【００６１】
４．翻訳（ｉｎ ｖｉｔｒｏウィルスの合成）
ＰＭ付きスペーサーＤＮＡとｍＲＮＡの複合体４００ｐｍｏｌを、無細胞翻訳系（Ｒｅｔｉｃ Ｌｙｓａｔｅ ＩＶＴ Ｋｉｔ，Ａｍｂｉｏｎ社，１２００）２．５ｍｌスケールで翻訳した。翻訳は３０℃１０分間行った。その後、ＭｇＣｌ２、 ＫＣｌをそれぞれ最終で６３ｍＭ、７５０ｍＭになるように加えて３７℃で２時間放置することで、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ・翻訳されたペプチド の三者複合体を得た。翻訳のスケールは、セレクションの最初のラウンドのために上記のように４００ｐｍｏｌ、２ｎｄラウンドのために５０ｐｍｏｌ、以降の ラウンドのためには２０ｐｍｏｌへスケールダウンして行った。
【００６２】
５．逆転写
翻訳した産物４００ｐｍｏｌ分を、付属のＢｉｎｄｉｎｇバッファーであらかじめ洗浄した４００μｌのアビジンビーズ（ＴａＫａＲａ、９０８８、 ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ）に結合させ、付属のバッファーで洗浄した後、直ちに４００ｐｍｏｌに対して、逆転写用のバッファー４００μｌ（逆転写酵素Ｍ− ＭＬＶ（ＴａＫａＲａ、２６４０Ａ）を４０００ｕｎｉｔ、ｄＮＴＰ ０．５ｍＭ．ＲＮａｓｅインヒビター（Ａｍｂｉｏｎ、２６９４、ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ）４００ｕｎｉｔを含む）に置換して、ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ （配列番号：２）の３′末端にある塩基"ＣＣＴ"からｍＲＮＡの５′末端へ逆転写反応を行った（１０分間、４２℃）。
【００６３】
６．ビーズからＤＮＡ−タンパク質を回収
アビジンビーズから、翻訳した産物４００ｐｍｏｌ分（ＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体、および翻訳に使用さ れなかったＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ）を回収するため、２２５ｕｎｉｔの制限酵素ＰｖｕＩＩ（ＴａＫａＲａ）、０．０１％ＢＳＡを含む 付属のバッファー３００μｌに置換し、１時間３７℃で放置した。
【００６４】
７．Ｈｉｓタグ精製
アビジンビーズを沈殿させた上清を回収し、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ、３６１１１、Ｎｉ−ＮＴＡ ＭａｇｎｅｔｉｃＡｇａｒｏｓｅＢｅａｄｓ）１００μｌを使って、付属のプロトコルどおりに、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製を行い、翻訳に使用されなかったＰＭ付き スペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ・複合体を取り除いた。Ｈｉｓ−ｔａｇ精製した産物は、６Ｍ尿素を含んだ６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、バンドを Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｍａｇｅｒ ＦＸ（Ｂｉｏ ＲＡＤ ｃｏ．）でＦＩＴＣの蛍光を可視化することで純度の確認および定量を行い、以下のセレクションに使用した。
【００６５】
８．ＩＬ−６Ｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズの作成
Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＩＬ−６Ｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、２００−０６Ｒ）８０μｇ をＨＣＬで活性化させたＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、１７−０９０６−０１）０．４ｍｌへ、２０ｍＭ リン酸バッファー ｐＨ７．８、４℃で６時間、攪拌させて結合させた。結合が終了したビーズに対して１M  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐH ７．６ を ２０μｌ加えて４℃にて２時間攪拌することにより結合反応を終了させた。反応後のビーズをＰＢＳバッファーで３回洗浄を行いＩＬ−６Ｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズとした。
【００６６】
９．選択過程
精製されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体の分子内に存在しているシステイン残基のジスルフィド結合形成を促進させるために、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＤＩ）（ＴａＫａＲａ、７３１８）を作用させた。反応条件は付属プロトコルに従った。ＩＬ−６Ｒと相互作用を示すＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体の選択過程として、最初に２０μｌのダミーカラム（ＩＬ６−Ｒが結合していないＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ）にセレクションバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）を１６０μｌ加え、そして精製されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体を２０μｌ加えて混合し、室温にてローテーターで３０分間攪拌を行った。この混合物を１０００ｒｐｍで遠心分離した後に、上清を新しいチューブに移し、ＩＬ−６Ｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズを２０μｌ加えた。この混合物を再び室温にてローテーターで３０分間攪拌を行った後に、１０００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を廃棄した後に５００μｌのセレクションバッファーで３回洗浄を行った。最後に、１００μＭのＤＴＴを含んだセレクションバッファー２００μｌをビーズに加えて室温にて３０分間ローテーターで攪拌し、ＩＬ−６Ｒに結合しているＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体の分子内に存在しているジスルフィド結合を壊すことにより溶出を行った。溶出されたＰＭ付きスペーサーＤＮＡ・ｍＲＮＡ／ＤＮＡ・翻訳されたペプチドの三者複合体は脱塩・濃縮の後、ＰＣＲで増幅し（プライマー；配列番号：７／５′−ＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣ−３′、配列番号：８／５′− ＴＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＧＡＴ−３′、熱変性９５℃２分の後、熱変性９５℃３０秒、アニーリング ６９℃１５秒、伸長反応７２℃４５秒のサイクルを３０回繰返し）、精製したＰＣＲ産物にｆｒａｇｍｅｎｔ１（配列番号：３）をライゲーションすることで、再び全長のＤＮＡを得た。後に、転写、ＰＭ付きスペーサーとのライゲーション、翻訳、精製を行い、次のラウンドのセレクションに使用した。
【００６７】
１０．エラープローンＰＣＲ法による突然変異導入処理
上記のようなセレクションの作業を３ラウンド連続して行った後、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲランダム突然変異誘発キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３０７０３）を用いて突然変異を導入しながらセレクションする作業を行った。変異導入比率は１０００ｂｐのＤＮＡに対して、ラウンド４が３．２、ラウンド６が７．３、ラウンド７が６．５、ラウンド８が３．２個の塩基について変異が導入されるよう反応条件の調整を行った。その後、１０ラウンドまで継続してセレクションを行った。
【００６８】
１１．クローニング
上記のようなセレクションを１０回連続して行った後のＤＮＡを、ベクターｐＤｒｉｖｅ（ＱＩＡＧＥＮ、２３１２２２、ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ）へライゲーション、ＱＩＡＧＥＮ ＥＺ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌへトランスフォーメーション、ＬＢプレートで培養を行い、２５個のコロニーをランダムに選びＤＮＡのシーケンス解析を行った。シーケンス解析は （株）日立ハイテクノロジーズへ依頼した。この解析結果全てについて、１１５ｂｐ〜２２８ｂｐをアミノ酸の一文字表記に変換して配列番号：９−３３へ示した。
【００６９】
配列番号：９； ＭＲＣＨＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＥＧＹＰＴＬＣＹＤＴＦＶＤＲＣＡＳＶＥＥＥＤ
配列番号：１０； ＭＧＣＨＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＥＹＰＴＬＣＹＹＡＦＶＤＲＣＡＳＴＥＥＧＧ
配列番号：１１； ＭＧＣＲＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＥＹＰＴＬＣＦＤＴＦＶＤＲＣＡＳＴＫＧＧＮ
配列番号：１２； ＭＧＣＲＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＰＧＥＹＰＴＬＣＹＹＡＦＶＤＲＣＡＳＴＥＧＧＮ
配列番号：１３； ＭＥＣＨＳＡＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＥＹＰＴＬＣＹＹＴＦＶＤＲＣＡＳＴＫＥＥＮ
配列番号：１４； ＭＧＣＨＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＥＨＰＴＬＣＹＹＴＦＶＤＲＣＡＧＡＫＥＥＮ
配列番号：１５； ＭＧＣＨＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＳＧＥＹＰＴＬＣＹＹＡＦＶＤＲＣＡＳＴＫＥＧＮ
配列番号：１６； ＭＧＣＲＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＧＹＰＴＬＣＹＤＴＦＶＤＲＣＡＳＴＫＥＥＮ
配列番号：１７； ＭＧＣＨＳＴＬＶＧＡＬＣＦＡＡＬＧＥＹＰＴＬＣＦＹＡＦＶＤＲＣＡＳＴＥＥＧＮ
配列番号：１８； ＭＧＣＨＳＴＦＶＧＴＬＣＦＶＡＬＧＲＹＰＴＬＣＹＨＡＦＶＤＲＣＡＳＴＫＥＥＡ
配列番号：１９； ＭＧＣＨＳＴＬＶＧＴＬＣＦＶＡＰＧＧＨＰＴＬＣＹＹＴＦＶＤＲＣＡＳＡＥＥＧＮ
配列番号：２０； ＭＧＣＹＰＬＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＮＤＴＳＶＳＴＬＦＩＧＴＹ
配列番号：２１； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＬＳＰＧＨＳＬＲＨＰＶＳＹＣＩＮＴＳＧＳＴＬＦＩＧＴＹ
配列番号：２２； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＳＤＴＳＧＰＴＬＦＩＧＩＹ
配列番号：２３； ＭＥＣＹＰＬＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＲＹＣＳＤＡＳＶＳＴＬＦＩＧＡＹ
配列番号：２４； ＭＧＣＹＰＬＶＩＡＩＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＮＤＴＳＧＳＴＬＦＩＧＴＨ
配列番号：２５； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＡＳＹＣＳＧＴＳＶＳＴＬＦＩＧＴＹ
配列番号：２６； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＡＳＹＣＳＤＴＳＡＳＴＬＦＩＧＡＹ
配列番号：２７； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＦＣＮＤＴＳＡＳＴＬＦＩＧＡＹ
配列番号：２８； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＬＳＰＧＨＳＬＲＹＰＡＳＹＣＳＧＴＳＶＳＴＬＦＩＧＴＹ
配列番号：２９； ＭＧＣＹＰＦＡＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＳＤＴＳＧＳＴＬＦＩＧＴＹ
配列番号：３０； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＦＰＳＧＲＳＬＲＹＰＶＳＹＣＮＤＡＳＶＳＴＬＹＩＧＴＹ
配列番号：３１； ＭＧＣＹＰＦＶＩＥＶＨＦＰＳＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＮＤＡＳＶＳＡＬＨＩＧＴＹ
配列番号：３２； ＭＡＣＹＰＬＶＩＡＶＨＦＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＮＤＡＳＶＳＴＬＩＩＧＴＹ
配列番号：３３； ＭＧＣＹＰＦＶＩＡＶＨＬＳＰＧＨＳＬＲＹＰＶＳＹＣＳＤＴＳＶＳＡＬＦＩＧＴＹ
【００７０】
２５個クローンの内４４％（配列番号：９−１９、１１／２５）の配列が分子内にシステインを４つ含んだ配列であり、５６％（配列番号：２０−２７、１４／２５）が分子内にシステインを２含んだ配列であった。これらの配列の内、配列番号：９の配列についてＣｙｓ４−２と命名し、後の試験に用いた。
【００７１】
ペプチドデザイン及び合成
取得されたクローンは38残基であるが、架橋部分に限定して以下のような32残基のペプチド配列をデザインした。N末端側はアッセイ用にビオチン化し、C末端側はアミノ基で保護した。
Biotin-MR(C1)HSTFVGTL(C2)FVALEGYPTL(C3)YDTFVDR(C4)A-NH2  （「MRCHSTFVGTLCFVALEGYPTLCYDTFVDRCA（配列番号：１）」のN末端にビオチンが付加）
（ここで、C1,C2,C3,C4はシステイン残基で番号はN末端側からの順番）
架橋パターンの異なる2種類のペプチドとして、（C1-C4,C2-C3）で架橋したものをsCys4-2A, （C1-C3,C2-C4）で架橋したものをsCys4-2Bとし、これらをペプチド研究所で化学合成した。
【００７２】
架橋の違いによる結合能の比較
合成した2種類のビオチン化ペプチドであるsCys4-2AとsCys4-2Bをそれぞれ1μMの濃度でPBS-T (Tween 20 0.1%, BSA 0.1%)バッファー中で200nMの濃度でIL-6Rを固定化したアガロースビーズに加えて30分インキュベートした。次にこのビーズをPBS-T (Tween 20, 0.1%)バッファーで３回洗浄した。その後、2000倍に希釈したStreptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（ＧＥヘルスケア、RPN1231）溶液を加え30分インキュベートした。そしてそのビーズをPBS-T バッファーで数回洗浄した後、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TBN) Liquid Substrate (Sigma, T8665)を加えた。充分に発色するまで反応させた後、0.5MのH2SO4によって反応を停止し、450nm の波長において吸光マイクロプレートリーダーを用いてシグナル強度を測定した。この結果、sCys4-2AはsCys4-2Bに比べ2倍以上のOD値を示すことがわかった（図２）。つまり、分子内システイン分子がC1-C4,C2-C3の位置で架橋した sCys4-2A の方が、IL-6R に対する親和性が高く、Cys4-2分子として正しい架橋構造であることが示唆された。
【００７３】
間接結合アッセイ（Kdの決定）
sCys4-2A の IL-6R に対する乖離定数（Ｋｄ）は，Ｆｒｉｇｕｅｔら（Friguet, B., Chaffotte, A. F., Djavadi-Ohaniance, L. and Goldberg M. E. (1985), J. Immunol. Methods., 77, 305-319) に記載の方法を改変をして行った。sCys4-2A（10 nM）に対して様々な濃度の IL-6R (１nM〜1μM) を加え１×PBSバッファー中で1時間インキュベートした。これらの混合物に対し200nMに相当するアガロースビーズ固定化IL-６Rを加え、さらに30分インキュベートした。次にこのビーズをＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ０．１％）バッファーで３回洗浄し，2000倍に希釈したStreptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（ＧＥヘルスケア、RPN1231）を加え30分インキュベートした。そしてこのビーズを再び ＰＢＳ−Ｔバッファーを用いて３回洗浄した後、3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine (TBN) Liquid Substrate (Sigma)を加えた。発色するまで反応させた後、0.5MのH2SO4によって反応を停止した。この溶液の吸光度を450nmにてマイクロプレートリーダーを用いて測定した。解析したデータはＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いてシグナル強度（Ｙ−軸）をIL-6R濃度（Ｘ−軸）に対してプロットし，非線形回帰曲線への当てはめにより解離定数を計算した。この結果、sCys4-2Aの解離定数は269nM程度であることがわかった。（図３）
【００７４】
阻害アッセイ
ペプチドｓCys4-2AがＩＬ−６Ｒに対してビオチン化IL-6と競合するかどうかを競合阻害実験により検討した。ビオチン化ＩＬ−６の濃度は，予め間接結合法により決定したＩＬ−６Ｒの解離定数（２０ｎＭ）の約２倍高い４５ｎＭと設定した。一定量のビオチン化ＩＬ−６（４５ｎＭ）および種々の量のペプチド（１ｎＭ−２μＭ）を一定量の固定化ＩＬ−６Ｒ（３５０ｎＭ）とともにインキュベーションして，ＩＬ−６Ｒに対して競合させた。ビーズに結合したビオチン化IL-6をSDS化した後に回収しSDS-PAGEに供し、ブロッターを用いてPVDF膜にトランスファーを行った。このPVDF膜に対して、Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate（ＧＥヘルスケア、RPN1231）を作用させて洗浄を行った。このPVDF膜について、ECL Advance Western Blotting Detection Kit (GE ヘルスケア、RPN213)で検出を行った（図４上）。この検出を行ったバンドを画像解析ソフトを用いて定量化し、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＵＳＡ）を用いてシグナル強度（Ｙ−軸）をIL-6R濃度（Ｘ−軸）に対してプロットし，非線形回帰曲線への当てはめによりIC50を計算した。この結果、IC50は２３３nMであることがわかった。（図４下）
【００７５】
Cys4-2細胞アッセイ
アメリカATCC（The American Type Culture Collection）よりDS-1細胞を購入し以下のようにIL-6依存増殖アッセイを行った。
細胞培養条件は、
・培地：RPMI1640,10%FBS,10mMHEPES,ペニシリン,カナマイシン
・継代用培地としては上記にIL-6 を10U/ml となるよう添加した。
・培養は37℃,５％CO2 にて行った。
2.0×104 cells/well にて24well プレートにDS-1 細胞をまき、24 時間培養した後、（37℃,５％CO2 ）以下のようにIL-6 を添加し刺激を行った。
IL-6 (U/ml) 0 , 0.312 , 0.625 , 1.25 , 2.5 , 5 , 10
【００７６】
それぞれの濃度に対して３つのwell を用いて培養し、42 時間後に細胞数を計数した。そして、細胞数が最大の濃度になったところで以下のアッセイを行った。ポシティブコントロールとしてAnti-IL-6Rモノクローナル抗体（Anti-IL-6 receptor, Human, Goat-poly; R&D systems: 型番AF-227-NA）を用いた。
【００７７】
Anti-IL-6Rモノクローナル抗体、アンタゴニスト候補「sCys4-2A」、「sCys4-2B」を2.2×104 cells/well にて24well プレートにDS-1 細胞をまき、24 時間インキュベート（37℃,５％CO2 ）後、IL-6 ( 10U/ml ) とAnti-IL-6Rモノクローナル抗体、「sCys4-2A」、「sCys4-2B」を以下の容量で同時に添加し阻害効果を調べた。
Anti-IL-6Rモノクローナル抗体 (U/ml) 0, 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2
sCys4-2A, sCys4-2B (M) 0 , 10-11 , 10-10 , 10-9 , 10-8 , 10-7 , 10-6, 10-5
【００７８】
それぞれの濃度に対して３つのwell を用いて培養し、刺激後36 時間後および42 時間後に細胞数をカウントした。
カウントした細胞数（3well の平均）を縦軸に、Anti-IL-6Rモノクローナル抗体、sCys4-2A, sCys4-2B の濃度を横軸に取り、グラフを作成した(平均±標準誤差)。42 時間培養の結果を示す。（図５、６）
この実験から、sCys4-2AはIL-6 (10U/ml)存在下でAnti-IL-6Rモノクローナル抗体と同様にDS-1 細胞の増殖を抑えることが確認できたが、一方sCys4-2Bにおいては同様の効果が確認できなかった。つまり、sCys4-2AとsCys4-2Bは架橋構造の違いに起因してアンタゴニスト効果が異なることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１は、本発明のペプチドのスクリーニングに用いたIn vitro virus法の概略を示す図である。
【図２】図２は、架橋の違いによる結合能を比較した結果を示す図である。実験に使用したポリペプチドの一次構造を上部に示す。
【図３】図３は、間接結合アッセイによってKd値を決定した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明のポリペプチドを用いた阻害アッセイの結果を示す図および写真である。
【図５】図５は、DS-1細胞増殖における、抗IL-6抗体処理の影響を示す図である。
【図６】図６は、DS-1細胞増殖における、sCys4-2AおよびsCys4-2B処理の影響を示す図である。
【図１】
2008193924.tif 000004
【図２】
2008193924.tif 000005
【図３】
2008193924.tif 000006
【図５】
2008193924.tif 000007
【図６】
2008193924.tif 000008
【図４】
2008193924.tif 000009
【配列表】
2008193924000001.app