(57)【要約】【課題】本発明は、ロドコッカス属微生物を宿主とする発現ベクターに用いられる複製開始領域のスクリーニング方法と、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクターを提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、バクテリオファージの複製開始領域を利用したロドコッカス属微生物用の発現ベクターの作製方法および発現ベクターを提供した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させる発現ベクターの複製開始領域の塩基配列を決定する方法であって、
ロドコッカス属微生物に感染できるバクテリオファージのゲノムＤＮＡを断片化し、得られたＤＮＡ断片をそれぞれベクターＤＮＡに挿入して発現ベクターライブラリを形成する第一の工程と、
前記発現ベクターライブラリに含まれる各発現ベクターをロドコッカス属微生物に導入し、ロドコッカス属微生物を形質転換し得る発現ベクターを選択する第二の工程と、
前記第二の工程で選択された発現ベクターに含まれる前記ＤＮＡ断片に含まれる複製開始領域の塩基配列を決定する第三の工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記第一の工程の後、第二の工程に先立って、前記発現ベクターライブラリに含まれる各発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を形質転換し得る発現ベクター群を選択する工程を含み、該選択された発現ベクター群を第二の工程に用いる発現ベクターライブラリとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ロドコッカス属微生物に感染できる微生物が、バクテリオファージＮＪＬである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二の工程で用いられるロドコッカス属微生物が、R. rhodochrous S-1株である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４の方法によって決定された塩基配列からなる複製開始領域を含む、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項６】
バクテリオファージＮＪＬ由来の複製開始領域を含む、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクター。
【請求項７】
配列番号：１に記載の塩基配列を含む、請求項６に記載の発現ベクター。
【請求項８】
請求項６または７に記載の発現ベクターであって、さらに大腸菌を宿主として目的タンパク質を発現させることが可能な発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させることが可能な発現ベクターと、当該発現ベクターに用いられる複製開始領域の塩基配列を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、プラスチックやポリマー原料等のコモディティケミカルをバイオプロセスにより生産する技術や、微生物や植物などを利用して汚染された環境を浄化、修復する技術であるバイオレメディエーションが注目されている。これらの技術を実現するためには、有機溶媒耐性能の高い微生物を宿主として組換えタンパク質を産生する発現系の構築が不可欠である。
【０００３】
有機溶媒に対して強い耐性を持つ微生物として、ロドコッカス（Rhodococcus）属の微生物が知られている。ロドコッカス属微生物は、石油系炭化水素、ＰＣＢをはじめとする数多くの難分解性化合物に対して分解および資化能力を有する種が存在すること、また、酵素やバイオサーファクタント、機能性細胞外多糖など有用な物質の生産菌であることなどから、産業的に有用な菌群であると位置づけられている。
【０００４】
これまでに、ロドコッカス属微生物を宿主とする発現ベクターとして、ニトリラーゼ遺伝子プロモータを活性化する作用をもつ調節因子をコードするＤＮＡ領域、該調節因子により活性化を受けるニトリラーゼ遺伝子プロモータ領域、およびロドコッカス属微生物において機能する薬剤耐性ＤＮＡ領域を含んでなる発現ベクターが提案されている（特許文献１を参照）。
【０００５】
しかしながら、より多くのロドコッカス属微生物に利用できる汎用的な宿主−ベクター系の構築が求められており、本発明者らのグループは、ロドコッカス属微生物の中でも比較的遺伝子操作の容易な菌株、および同株より派生した変異株を見出し、それらの菌株を利用した高効率の遺伝子導入系を構築した（非特許文献１または２を参照）。さらに、ベクターの機能向上のために必要な材料として、コスミドの構築に必要なバクテリオファージのｃｏｓ末端配列（非特許文献３を参照）や、セルフクローニング時に必要なクローニングマーカー、高発現のために必要なプロモータ配列などもすでに開発した。
【特許文献１】特開平１０−２４８５７８号公報
【非特許文献１】Sunairi, M. et al.; Letters in Applied Microbiology (1996) 22:66-69
【非特許文献２】Iwabuchi, N. et al.; Actinomycetologica (1997) 11:59-63
【非特許文献３】Sunairi, M. et al.; Applied and Environmental Microbiology (1993) 59:97-100
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これまでに、広くロドコッカス属微生物において機能できる複製開始領域が開発されていないため、ロドコッカス属微生物において汎用性の高い発現ベクターが構築されていない。
【０００７】
そこで、本発明は、ロドコッカス属微生物において汎用性の高い発現ベクターに用いられる複製開始領域の塩基配列を決定する方法、また、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクターを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、R. rhodochrousに感染することのできるバクテリオファージＮＪＬのゲノムＤＮＡを断片化し、各断片をベクターＤＮＡに挿入して発現ベクターライブラリを作製したところ、このライブラリの中にロドコッカス属の微生物を形質転換し得る発現ベクターが存在することを見出した。そして、その発現ベクターに含まれる上記断片を、ロドコッカス属を宿主とする発現ベクターに利用可能な複製開始領域として用いられること、また当該断片を含む発現ベクターは、ロドコッカス属の別の種も形質転換させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
即ち、本発明は、
〔１〕ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させる発現ベクターの複製開始領域の塩基配列を決定する方法であって、ロドコッカス属微生物に感染できるバクテリオファージのゲノムＤＮＡを断片化し、得られたＤＮＡ断片をそれぞれベクターＤＮＡに挿入して発現ベクターライブラリを形成する第一の工程と、前記発現ベクターライブラリに含まれる各発現ベクターをロドコッカス属微生物に導入し、ロドコッカス属微生物を形質転換し得る発現ベクターを選択する第二の工程と、前記第二の工程で選択された発現ベクターに含まれる前記ＤＮＡ断片に含まれる複製開始領域の塩基配列を決定する第三の工程と、を含む方法；
〔２〕前記第一の工程の後、第二の工程に先立って、前記発現ベクターライブラリに含まれる各発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を形質転換し得る発現ベクター群を選択する工程を含み、該選択された発現ベクター群を第二の工程に用いる発現ベクターライブラリとする、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記ロドコッカス属微生物に感染できる微生物が、バクテリオファージＮＪＬである、上記〔１〕または〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記第二の工程で用いられるロドコッカス属微生物が、R. rhodochrous S-1株である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の方法；
〔５〕上記〔１〕から〔４〕の方法によって決定された塩基配列からなる複製開始領域を含む、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクター；
〔６〕バクテリオファージＮＪＬ由来の複製開始領域を含む、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクター；
〔７〕配列番号：１に記載の塩基配列を含む、上記〔６〕に記載の発現ベクター；及び、
〔８〕上記〔６〕または〔７〕に記載の発現ベクターであって、さらに大腸菌を宿主として目的タンパク質を発現させることが可能な発現ベクター、に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る方法によれば、ロドコッカス属を宿主とする発現ベクターに用いられる複製開始領域を効率よく探すことができる。かかる複製開始領域を用いれば、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させる発現ベクターを作製することが可能であり、バイオレメディエーションやコモディティケミカルの産生に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本明細書に用いられる用語等の意義を明らかにし、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
本発明に係る、ロドコッカス属微生物を宿主とする発現ベクターに用いられる複製開始領域を決定する方法は、その第一の工程において、ロドコッカス属に感染できるバクテリオファージのゲノムＤＮＡを断片化し、得られたＤＮＡ断片をそれぞれベクターＤＮＡに挿入して発現ベクターライブラリを形成する。
【００１３】
バクテリオファージは細菌に寄生するウイルスであり、発現ベクターを構築するための一般的な材料である。本発明に用いられるバクテリオファージは、ロドコッカス属に感染できる限り、特に限定されない。ロドコッカス属に感染できるバクテリオファージとしては、例えば、バクテリオファージＮＪＬ（M. Sunairi et al. Characterization of genome of the Rhodococcus rhodochrous bacteriophage NJL. (1993), Applied and Environmental Microbiology. 59.97-100.; 中嶋、室岡：発酵工学会誌, 61 (1), 1-9 (1983)等参照；寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２３５）が挙げられる。バクテリオファージＮＪＬのゲノムＤＮＡは、４９ｋｂの二本鎖ＤＮＡであるが、１８塩基長のｃｏｓ末端を有し、感染すると環状ＤＮＡを形成することが知られている。
【００１４】
バクテリオファージＮＪＬのゲノムＤＮＡは常法に従って抽出され、公知の方法またはそれに準ずる方法に従って断片化される。断片化方法としては、例えば、制限酵素を用いる方法や、ＤＮＡ断片化装置を用いて物理的に断片化する方法などが挙げられる。得られたＤＮＡ断片は、例えば、５’末端をアルカリホスファターゼによって脱リン酸化するなどの処理を行うことによって、自己連結を防ぐことができる。また必要に応じて末端を平滑化してもよい。
【００１５】
ＤＮＡの断片化は液相で行われるので、これを、例えば電気泳動により分子量に従って分離し、目的の大きさの断片を精製して、ベクターＤＮＡへの挿入に用いることができる。
【００１６】
こうして得られたＤＮＡ断片を一つずつ適当なベクターＤＮＡに挿入し、発現ベクターライブラリを構築する。各発現ベクターは、例えば、ベクターＤＮＡを制限酵素で切断し、切断された部位にＤＮＡリガーゼを用いて各ＤＮＡ断片を連結することによって作製することができる。ここで、ベクターＤＮＡとしては、各種プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ファージミドのいずれを用いてもよく、断片の大きさ等に応じて適宜選択することができるが、大腸菌で汎用されているpBR322の誘導体系ベクター、pHSG299、pHSG398等が特に好ましい。
【００１７】
本発明に係るロドコッカス属微生物を宿主とする発現ベクターに用いられる複製開始領域を決定する方法では、第二の工程として、発現ベクターライブラリの各発現ベクターから、ロドコッカス属を形質転換し得る発現ベクターを選択する。
【００１８】
発現ベクターにおいて、複製開始領域は、宿主中で自己増殖するために必須の要素である。本工程により、ロドコッカス属で目的タンパク質を発現させるために必要な複製開始領域を有する発現ベクターを選択することができる。形質転換することの確認は、抗生物質耐性や栄養要求性を有する選択マーカーをベクターＤＮＡに挿入しておくことによって行うことができる。例えば、ＤＮＡ断片の挿入により挿入失活する抗生物質耐性遺伝子を選択マーカーとしてベクターＤＮＡに挿入しておけば、その抗生物質を含む培地で成育できる宿主は形質転換されておらず、生育できない宿主は形質転換されていることが確認できる。
【００１９】
なお、第二の工程で用いるロドコッカス属としては、ロドコッカス属ロドキュラス種、中でもR. rhodochrous S-1株（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２３４）が好ましい。この株は、ロドコッカス属微生物の中でも比較的遺伝子操作の容易な変異株であり、発現ベクターに形質転換能があるかどうかの確認に適している。
【００２０】
なお、第一の工程の後、第二の工程に先立って、発現ベクターライブラリに含まれる各発現ベクターを大腸菌に導入し、大腸菌を形質転換し得る発現ベクター群を選択する工程を含み、選択された発現ベクター群を第二の工程に用いる発現ベクターライブラリとしてもよい。
【００２１】
第一の工程で得られた発現ベクターには、制限酵素でランダムに切断して得られたＤＮＡ断片が挿入されており、発現しない偽遺伝子が含まれるベクターも存在すると考えられる。そこで、各発現ベクターを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体のインサートチェックを行い、インサート配列の確認されたクローンを発現ベクターライブラリとして用いることができる。大腸菌を用いることにより、組換え体の中間産物によってインサートチェックを行うことができる。
【００２２】
本発明に係るロドコッカス属微生物を宿主とする発現ベクターに用いられる複製開始領域を決定する方法では、第三の工程として、第二の工程で選択された発現ベクターに含まれるＤＮＡ断片に含まれる複製開始領域の塩基配列を決定する。
【００２３】
第二の工程で、ロドコッカス属微生物中で機能する発現ベクターを得ていることから、この発現ベクターに含まれる複製開始領域はロドコッカス属微生物中で機能していることになる。塩基配列の決定は、当業者であれば公知の方法またはそれに準ずる方法で行われる。
【００２４】
本発明は、上述の方法で得られた複製開始領域を含む、ロドコッカス属微生物を宿主として目的タンパク質を発現させるための発現ベクターも提供する。
【００２５】
かかる発現ベクターには、上記複製開始領域に加えて、選択マーカー遺伝子、プロモータ、ポリリンカーまたはマルチクローニング部位などと呼ばれる制限酵素認識部位が集中した領域、レポーター遺伝子ユニットなどを挿入しておくことができる。この発現ベクターに、例えば有用なコモディティケミカルをコードする遺伝子や、石油系炭化水素やＰＣＢの分解能に関連する遺伝子を挿入し、ロドコッカス属微生物を形質転換すれば、有機溶媒を含む環境においてもこれらの遺伝子を発現させることが可能となる。
【００２６】
このような発現ベクターの一つとして、配列番号：１に記載のバクテリオファージＮＪＬ由来の塩基配列を含むベクターが挙げられる。
【００２７】
以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、実施例は例示的なものにすぎず、本発明は如何なる場合も以下の具体例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
＜バクテリオファージNJLが機能できる宿主の検討＞
バクテリオファージNJLの複製関連領域が機能できる宿主を検討するため、各種ロドコッカス属微生物にバクテリオファージNJLのDNAを導入し、R. rhodochrous S-1株を指示菌としてプラークが形成されるか否かを検討した。合計41菌株について形質導入を行った結果、7種7菌株でプラークの形成が確認された。プラークが形成された菌株を表１に示す。
【００２９】
【表１】
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【００３０】
得られたプラークから再度バクテリオファージNJLを抽出し、S-1株への感染性を確認したところ、感染能を有することが確認された。バクテリオファージNJLの複製関連領域は、多くのロドコッカス属微生物内で機能することが示唆された。
＜バクテリオファージNJLの増幅とDNAの抽出＞
バクテリオファージNJL（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２３５）をR. rhodochrous S-1株（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−２３４）にmoi=1になるように接種し、室温で30分間放置した。その後、28℃で一晩培養した。得られた培養液を遠心し、必要に応じて上清をDNase、RNaseの酵素で処理した。このようにして得られた溶液をファージライゼートとして以降の工程に用いた。
【００３１】
続いて、プレートライゼート法により、100-300個ぐらいのプラークが形成されたプレートから滅菌したそれぞれのプラークを寒天ごと採取し、SM bufferに懸濁し、一晩、4℃で放置した。サンプル溶液を遠心し、寒天片を取り除いた後、ファージライゼートとして以降の工程に用いた。
【００３２】
ファージライゼートを濃縮し、最終的に109〜1010 pfu/mlとなるようにした。濃縮されたファージライゼートをDNaseおよびRNaseで処理した後、常法によりDNAを抽出、精製した。
＜発現ベクターライブラリの作製＞
全量で40μgのDNAをhydroshear（Genomic Solution社製）により物理的に断片化した。続いて、BAL31 Nuclease（タカラバイオ社製）およびT4 DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用いて説明書に従って処理し、末端の平滑化を行った。
【００３３】
得られたDNA断片を電気泳動で分離し、目的の大きさのDNA断片が含まれるスポットをゲルから切り出した。切り出したサンプルは、Montage DNA Extraction Device（Millipore社製）を用いて説明書に従って処理し、精製した。
【００３４】
ベクターDNAとしては、Hinc II（タカラバイオ社製）で処理したプラスミドpHSG299（タカラバイオ社製）をBAP処理（東洋紡社製）したものを用いた。このベクターDNAと上述のDNA断片をT4 ligaseやDNA ligation kit（タカラバイオ社製）を用いて説明書通りにライゲーション反応を行い、E. coli DH5α（タカラバイオ社製）に導入した。この操作もまた説明書通りに行った。得られた形質転換体をアルカリ-SDS法などの方法でインサートチェックを行い、インサート断片の確認できたクローンをライブラリとして保存した。
【００３５】
クローンは合計で531個得られ、平均インサート長は約2.5kbであった。
＜発現ベクターライブラリを用いたロドコッカス属微生物で機能する複製開始領域のスクリーニング＞
発現ベクターライブラリを直接R. rhodochrous S-1株に導入した結果、2種のプラスミドがS-1株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを回収し、他のRhodococcus属に導入したところ、前述した2種のプラスミドのうち1つが、別のロドコッカス属R. coprophilus ATCC 29080も形質転換することが確認され、これをpNJL7と名付けた。
＜ゲノムシークエンス解析＞
シークエンス反応は、上述の発現ベクターライブラリ作製し、これを鋳型として、-21M13プライマーとM13RevプライマーでBigDye Terminator ver. 3.1（Applied Biosystems社製）を用いたサイクルシークエンスで行った。なお、発現ベクターの平均インサート長は2.5kbであり、約49kbと予想されたバクテリオファージNJLの染色体を十分に網羅していると考えられた。
【００３６】
シークエンスの結果、1061個の有効シークエンスを得た。得られた反応物は、ABI3700 Genetic Analyzer （Applied Biosystems社製）で電気泳動を行い、得られた配列はPhredPhrapによりアセンブルした。コンティグの形成にはPhredPhrapが20以上の値のデータを用いたところ、0.9kbと43.8kbの2つのコンティグが得られた。
【００３７】
この段階でトータルシークエンスの長さが約400kbに達したが（図１）、2つのコンティグ間のギャップを埋めるため、新たにプライマーを作製し、プライマーウォーキング法によりシークエンスを行った。得られた52シークエンスの配列を加えて再度アセンブルした結果、約46kbの１つのコンティグが形成された。
【００３８】
シークエンスの結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
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【００４０】
得られたドラフトシークエンスは46619bpであり、GC含量66.6%、現在までのアノテーションの結果、推定ORF数は、70前後と予想された。
＜プラスミドpNJL9Nkmの作製、およびその宿主域の検討＞
次に、上述の方法により得られたpNJL7をもとに、改良型のプラスミドであるpNJL9Nkmを構築した。
【００４１】
尚、(1)エレクトロポレーション、(2)DNA抽出および組換えDNS実験、および(3)ベンジルアルコールの変換反応は以下の手順に従った。
【００４２】
(1)エレクトロポレーション
基本的に、非特許文献１〜３に示されるSunairiら、Iwabuchiらの方法に従って行った。対数増殖期の菌体を回収し、数回洗浄した後に10 mM sucrose bufferに懸濁した。これらの菌体をエレクトロポレーション用のキュベットに移し、12.5 kv/cm、10 msecの条件でエレクトロポレーションした。形質転換体の選択は予め各菌株のカナマイシン耐性濃度を調査しておき、それぞれの株の条件に応じた濃度で行った。
【００４３】
(2)DNA抽出および組換えDNA実験
プラスミド抽出とtotal DNA抽出、大腸菌での形質転換などは基本的に定法に従い、適宜材料に合わせて実験条件を調整して行った。制限酵素、DNA修飾酵素、PCR関連試薬、DNA精製試薬などはタカラバイオ、プロメガ、Millipore、TOYOBOなどの製品を使用し、基本的に説明書通りに行った。
【００４４】
(3)ベンジルアルコールの変換反応
各種菌株を定常期まで培養した培養液をO.D.660が1.0になるように調整し、これらの菌懸濁液100μlをYG培地(1％グルコース、1％イーストエキストラクト、水道水、pH 7.2)に摂取し、30℃で培養した。培養開始から2時間後ベンジルアルコールを終濃度10 mg/mlになるように添加し、さらに48時間培養した。培養後、各培養液を100μl採取し、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)-アセトニトリル溶液を400μl加え、良く懸濁した。サンプルを口径0.22μmの遠心フィルターでろ過した後、10μlを採取し、HPLCで安息香酸を検出した。
【００４５】
pNJL7をもとにさらにNJLファージの複製関連領域に検討を加えた結果、NJLファージ由来のORF25、26をpHSG299のHinCIIサイトに導入することにより、さらに汎用性の高いE. coli-Rhodococcusシャトルベクターを構築できることがわかり、これをpNJL9Nkmと名付けた(図２)。配列番号：１に、pHSG299のHinCIIサイトに導入されたDNAの塩基配列を示す。このプラスミドの宿主域を検討するため、各種Rhodococcus属細菌へ導入した結果、8種のRhodococcus属細菌に適応できた。各種の代表的な菌株はR. coprophilus JCM3200、R. erythropolis PR-4、R. globerulus ATCC15076、R. opacus JCM9703、R. percolatus JCM10087、R. rhodochrous S-1、R. rubber IFO15591、R. zopfiiATCC51349株であり、ここからpNJL9Nkmは多くのRhodococcus属細菌に利用できるものと考えられた。
＜プラスミドpNJL9Nkmの物質変換への応用＞
続いて、本研究で構築したプラスミドpNJL9Nkmが実際の物質変換に応用できるか否かを検討するため、Rhodococcus opacus DSM43205株由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(AdhA)をマーカー遺伝子として用い、ベンジルアルコールから安息香酸への変換能を検討した。
【００４６】
まず、pNJL9Nkmのカナマイシン耐性遺伝子の下流にadhAを同方向に挿入したプラスミドpNJL9Nkm+adhA (図３)を作製し、エレクトロポレーションで各種Rhodococcus属細菌に導入した。その結果、R. coprophilus JCM3200、R. erythropolis PR-4、R. globerulus ATCC 15076、R. percolatus JCM 10087、R. zopfii ATCC 51349株から形質転換体を得た。
【００４７】
続いて、これらの形質転換体のベンジルアルコールから安息香酸への変換能を検討した。結果は表３に示した。その結果、供試した5菌株中、R. percolatus JCM 10087とR. zopfii ATCC 51349株を除く3菌株でpNJL9Nkm+AdhAの導入により安息香酸の生産量が増加した。中でも、R. coprophilus JCM3200株では、pNJL9Nkm+AdhAの導入により安息香酸の生産量が約32倍にも増加した。一方で、R. percolatus JCM 10087とR. zopfii ATCC 51349株ではpNJL9Nkm+AdhAの導入による安息香酸の生産量の増加は確認できなかった。以上の結果、pNJL9Nkmは物質変換においても複数の株で機能できることが明らかとなった。
【００４８】
【表３】
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【００４９】
＜誘導型プロモータの導入＞
上述の方法で作製したpNJL9Nkmをさらに機能強化するため、誘導型プロモータの導入を行った。将来的な微生物による物質生産の培養は、原料となる有機溶媒と培地の二層培養系を基本として考えられていることから、培地中に物質を加えずに遺伝子発現を制御できるプロモータを利用することが出来れば、その後の物質生産プロセスに新たな選択肢を供給できることから、本研究では培地中に物質を加えずに遺伝子発現の制御を可能とするプロモータの探索と導入を試みた。
【００５０】
Takanoらは、Streptomyces coelicolor A3(2)株のカロテノイド生合成オペロンが光誘導型の制御系によってコントロールされていることを報告しており（Takano H, et al.: (2005), Journal of Bacteriology. 187(5):1825-32.）、本研究では、このオペロンの発現を調節しているプロモータに注目して検討を行った。
【００５１】
まず、S. coelicolor A3(2)株からPCRによりlitRおよびlitSを含む断片をクローンし、さらに、この遺伝子断片のlitSの下流にcrtEのプロモータ領域をつなげた遺伝子断片を用意した。この遺伝子断片をpNJL9Nkmに導入したプラスミドpNJL9Nkmlitを構築した(図４)。プラスミドpNJL9NkmlitはlitRおよびLitSのプロモータが逆方向に向いており、さらに、それぞれの遺伝子の下流にクローニングサイトとしてKpnI、EcoRIの制限酵素サイトを有するプラスミドである。次にlitR側の下流に位置するKpnIサイトにadhAをlitRと同方向になるように挿入したプラスミドpNJL9Nkmlit+adhAを作製した(図５)。このプラスミドを各種Rhodococcus属細菌に導入した結果、これまでにR. globerulus ATCC15076とR. rhodochrous S-1株から形質転換体を得た。
【００５２】
続いて、これら形質転換体のベンジルアルコールから安息香酸への変換能を明条件および暗条件で検討した。その結果(表４)、供試した2菌株で光の照射に伴い安息香酸の生産量の増加が確認された。このことから、S. coelicolor由来のlitRプロモータがRhodococcus属細菌でも利用できる汎用的なプロモータであることが示唆された。
【００５３】
【表４】
2008193976.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】バクテリオファージNJLのショットガンシークエンス法によるゲノムDNA解析における総シークエンス数とコンティグの長さとの関係を示す。
【図２】プラスミドpNJL9NkmとNJLファージのGCプロットの結果を示す。
【図３】プラスミドpNJL9Nkmのカナマイシン耐性遺伝子の下流にadhAを同方向に挿入したプラスミドpNJL9Nkm+adhAを示す。
【図４】litSの下流にcrtEのプロモータ領域をつなげた遺伝子断片をpNJL9Nkmに導入して構築したプラスミドpNJL9Nkmlitを示す。
【図５】litR側の下流に位置するKpnIサイトにadhAをlitRと同方向になるように挿入して作製したプラスミドpNJL9Nkmlit+adhAを示す。
【図１】
2008193976.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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