(57)【要約】      （修正有）【課題】各種生物系の実験系においても使用することができるような水溶液中におけるアニオンを定量的に測定することができるセンサー化合物を提供する。【解決手段】環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合において、該蛍光色素上の置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合において、該蛍光色素上の置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とする、前記化合物。
【請求項２】
環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合に関与する該蛍光色素上の電子供与性置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって該蛍光色素上の電子供与性が増大し、その結果、蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とする、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
金属錯体の金属イオンに対する配位力がより強いアニオンの存在によって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合に関与する該蛍光色素上の電子供与性置換基が金属イオンとの配位結合からはずれることを特徴とする、請求項１又は２記載の化合物。
【請求項４】
蛍光色素の吸収（励起）スペクトルが長波長側にシフトすることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
アニオンホスト及び蛍光色素がリンカーを介して結合していることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
環状ポリアミンを構成する窒素原子及び炭素原子の総数が１２であり、窒素原子数が４であることを特徴とする、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
環状ポリアミンが１，４，７，１０−テトラアザシクロデカンである、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
蛍光色素上の電子供与性置換基がアミノ基である、請求項２ないし７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
蛍光色素が７位置換クマリン誘導体である、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
蛍光色素が７−アミノ−トリフルオロメチルクマリンである、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
リンカーがアルキレン基である、請求項５ないし１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
リンカーがエチレン基である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
金属錯体を構成する金属がＣｄである、請求項１ないし１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物から成る蛍光センサー。
【請求項１５】
水溶液中のアニオンを検出することの出来る、請求項１４記載の蛍光センサー。
【請求項１６】
アニオンが、ピロリン酸イオン、リン酸イオン、クエン酸イオン、ハロゲンイオン、及びヌクレオチドから成る群から選択される一種又は複数種のアニオンである、請求項１５記載の蛍光センサー。
【請求項１７】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合いに基づき、アニオン濃度を測定する方法。
【請求項１８】
水溶液中におけるアニオン濃度を測定することを特徴とする、請求項１７に記載の測定方法。
【請求項１９】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合いに基づき、アニオン性残基の増減を測定する方法。
【請求項２０】
水溶液中におけるアニオン性残基の増減を測定することを特徴とする、請求項１９に記載の測定方法。
【請求項２１】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物をセンサーとして使用し、蛍光強度の変化に基づき、アニオン性残基の増減を伴う反応に関与する酵素の活性を測定する方法。
【請求項２２】
酵素がホスホジエステラーゼである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
酵素が環状モノヌクレオチド特異的ホスホジエステラーゼである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に水溶液中のアニオンを検出することの出来るセンサー化合物、及び該化合物を使用する各種測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光センサーは、生体系における生体分子の役割を分析し、解明するのに有用であり、例えば、蛍光CaＩＩ指示薬を用いて、細胞内CaＩＩのいくつかの機能が解明されてきた１。さらにその他に多数の金属センサー及びpHセンサーが開発されている２。
【０００３】
多数の有機アニオン及び無機アニオンが生きている生物において重要な役割を担っているために、今やアニオン認識３及びアニオンセンサー検出４に関心が高まっている。アニオンセンサーの開発によって分子内にアニオン基を持つ生体有機分子を検出することができる新規のセンサーの開発にも繋がる。しかしながら、従来知られているほとんどのセンサーは有機媒質の中でしか機能せず、それらを生化学的又は生理学的な実験に使用するのは困難である。
一般にアニオンは、金属イオンのような陽イオンよりも大型なので、陽イオンよりも溶媒化の制約を受け易い。有機溶媒では、溶媒化エネルギーが比較的小さく、静電気の相互作用が効果的に働くので、アニオンを捕捉し、検出するのはさほど難しくはない。しかしながら、生体応用に適している水性溶媒では、強い水和のためにアニオンを認識するのは極めて困難である。今のところ、有機環境では多数が知られているけれども、水溶液中で作動する蛍光アニオンセンサーはほとんど開発されていない。
【０００４】
水溶液中で使用するための蛍光アニオンセンサーは、２つの必要条件を満たさなければならない。１つは、水中でのアニオンに対する十分に強い親和性であり、もう１1つは、アニオンの認識を蛍光シグナルに変換する能力である。既知のアニオンセンサーはほとんど、後者の必要条件は満たすけれども、水中でのアニオンに対して十分な親和性を持っていない。アニオンホストの中には、水性溶媒中でアニオンを捕捉することができるものもあるが、それらは単にホスト分子であって、センサー分子ではない。双方の必要条件を同時に満たすのは困難である。
【０００５】
Crazuik et alは、水溶液中で作動する蛍光アニオンセンサーの開発に成功した５。このようなセンサーの検出メカニズムは、蛍光団に隣接したアミノ基のpKａをアニオンが結合することによって変化させることに基づいている。しかしながら、このセンサーではある特定のｐＨ領域でしか測定できず、ｐＨ変化に敏感である。従って、このセンサー検出のメカニズムを生物実験に応用するのは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、各種生物系の実験系においても使用することができるような水溶液中におけるアニオンを定量的に測定することができるセンサー化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、アニオンを検出するための新規の手段を開発し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合において、該蛍光色素上の置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とする、前記化合物に係る。
より、具体的には、本発明は環状ポリアミンの金属錯体から成るアニオンホスト及び蛍光色素を有する化合物であって、該金属錯体の金属イオンとの配位結合に関与する該蛍光色素上の電子供与性置換基とアニオンとの間の配位子交換機能によって該蛍光色素上の電子供与性が増大し、その結果、蛍光色素のスペクトルに変化が生じることを特徴とするものである。
この蛍光色素上の電子供与性置換基とアニオンとの間の配位子交換機能とは、アニオンホスト（金属錯体）に対して配位力の強いアニオン種が存在しない水溶液系では、蛍光色素上の電子供与性置換基が金属イオンに配位しているが、配位力の強いアニオン種がその系に添加されることによって電子供与性置換基が金属イオンとの配位結合から外れ、その結果電子供与性置換基に生じる電子状態の変化が蛍光色素に伝わりその蛍光スペクトルに変化を及ぼす、より具体的には、蛍光色素の吸収（励起）スペクトルが長波長側にシフトするというものである。
従って、このような原理に基づき蛍光色素のスペクトルに変化が生じる化合物である限り、本発明化合物の各構成部分である環状ポリアミン、金属イオン、及び蛍光色素の構造及び種類は特に制限はない。
又、このような蛍光スペクトルの変化を効率よく起こさせる為には、アニオンホスト及び蛍光色素がリンカーを介して結合していることが好ましい。
【０００８】
更に本発明は、このような化合物から成る蛍光センサー、特に、水溶液中のアニオンを検出することの出来る蛍光センサーに係る。
本発明のセンサーにより定量的に測定することが可能なアニオンの例としては、ピロリン酸イオン、リン酸イオン、及びハロゲンイオン等の無機アニオン、クエン酸イオン等の有機アニオン、並びに各種ヌクレオチドから成る群から選択される一種又は複数種のアニオンを挙げることが出来る。
【０００９】
更に本発明は、本発明化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合いに基づき、例えば、水溶液中のアニオン濃度を測定する方法に係る。
更に本発明は、本発明化合物をセンサーとして使用し、その蛍光色素の吸収（励起）スペクトルの長波長側へのシフトの度合いに基づき、例えば、水溶液中のアニオン性残基の増減を測定する方法に係る。
更に本発明は、本発明化合物をセンサーとして使用し、蛍光強度の変化に基づき、アニオン性残基の増減を伴う反応に関与する酵素の活性を測定する方法に係る。このような酵素の例として、環状モノヌクレオチド特異的ホスホジエステラーゼ（ホスホジエステラーゼ3',5'-環状モノヌクレオチド）等のホスホジエステラーゼを挙げることが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明化合物において、環状ポリアミンを構成する窒素原子及び炭素原子の各個数及びそれらの総数に特に制限はないが、好ましくは）〜１２、より好ましくは１２であり、窒素原子数は好ましくは３又は４、より好ましくは４である。
具体的には好適な環状ポリアミンとして、１，４，７，１０−テトラアザシクロデカン（サイクレン）を挙げることが出来る。
又、本発明化合物の蛍光色素上の電子供与性置換基にも特に制限はないが、蛍光色素、環状ポリアミン及び金属イオンの種類等に応じて当業者が適宜選択することができるが、好適例としてアミノ基を挙げ蛍光色素ることが出来る。
蛍光色素もその他の構成成分に応じて当業者が適宜選択することができるが、好適例としてが７位置換クマリン誘導体、例えば、７−アミノ−トリフルオロメチルクマリンを挙げることが出来る。
リンカーとしては、例えば、エチレン基及びメチレン基等のアルキレン基を使用することが出来る。
金属錯体を構成する金属の好適例として、ＣｄII等の遷移金属を挙げることが出来る。
【００１１】
本発明の化合物は、例えば、以下の実施例に具体的に示すような合成方法によって、当業者であれば容易に調製することが出来る。更に、各物質の入手方法、各化合物の合成方法、及び、合成された化合物（PDF)に関する性状分析データ等については、インターネットhttp://pubs.acs.orgを介して無償で入手可能である。
【実施例】
【００１２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００１３】
実施例１
化合物の調製
以下の化学反応式に示した４工程で、7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンを出発物質として、サイクレン共役のクマリン（１）を合成し、ＮＨ−シリカゲル（フジ・シリシア・ケミカル株式会社）カラムクロマトグラフィによって精製した。こうして合成された本発明に属する化合物である、化合物（１）のＣｄII錯体、即ち、錯体１−ＣｄIIは過塩素酸塩として得られ、2-プロパノール/H２Oから再結晶した。
【００１４】
【化１】
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【００１５】
上に示したサイクレン共役のクマリン（１）及び錯体１−ＣｄIIの合成経路において使用する反応試薬は次のとおりである。（a)TsCl  ピリジン、
(b)  BrCH２CH２Br、Cs２CO３、（c)  濃H２SO４、90℃（d)  サイクレン、
(e)  Cd(ClO４)２  60℃。
尚、本発明に属するその他の化合物も、当業者であれば、上記合成経路に準じて適宜合成することが出来る。
こうして合成された本発明化合物がアニオンを検出する蛍光センサーとして機能し、アニオンを検出する機構を図１に示した。ここで、Mｎ＋はサイクレンによって安定的にキレートされうる金属イオンである。
【００１６】
実施例２
本発明化合物の吸収スペクトルと励起スペクトル
どの金属が我々の設計概念に最も良く合致するかを見い出すために、我々は化合物（１）のＺｎII、ＣｄII、及びＣｕIIとの錯体、及び金属なしでの化合物（１）の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。化合物（１）の濃度は5mM、 金属はすべて化合物（１）を基にして1.2当量加えた。溶液は100mMのHEPES（ｐH  7.4）で緩衝した。尚、測定は、UV-1600  UV可視分光計（日本、京都、島津）を用いて、25℃にて5mMの濃度で実施した。更に、蛍光分光計はF-4500（日本、東京、日立）を使用した。
得られた吸収スペクトル及び励起スペクトルを図２に示す。これらの金属はサイクレンによって強く配位されることが良く知られている。図１に示すようにアニオンのセンサー検出には7-アミノ基の金属への配位が求められ、金属の配位における窒素の単独電子対の関与がそのような波長のシフトを誘導するので、望ましいスペクトルの変化は、吸収スペクトル及び励起スペクトルの青色シフトであった。
ＺｎII、ＣｄII、及びＣｕIIととの錯体の形成が極めて緩慢なために、十分な平衡化（３時間を超える）の後スペクトルを測定した。化合物（１）の吸収スペクトルのピークは382nmであり、錯体１−ＺｎII、錯体１−ＣｄII及び錯体１−ＣｕIIのそれは、それぞれ388nm、342nm及び342nmであった。即ち、ＣｄII、及びＣｕIIを化合物（１）の溶液に加えた場合、それぞれの吸収スペクトルにおける青色シフトが認められた。このことは、7-アミノ基がＣｄII及びＣｕIIに配位するという考えを支持している。錯体１−ＺｎIIの吸収スペクトルはわずかに赤色シフトした。この赤色シフトは、ＺｎIIと7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリンとの間に何らかの相互作用があることを示しているが、上述の理由によって7-アミノ基は多分ＺｎIIには配位していないものと思われる。
化合物（１）、錯体１−ＺｎII、及び錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルは、錯体１−ＺｎIIの蛍光強度がやや増加したが、それらの吸収スペクトルに類似していた。一方、これらに対して、ＣｕIIの性質（ＣｕIIイオンは種々の蛍光化合物の蛍光を失活させることは一般に知られている）のために錯体１−ＣｕIIの蛍光は顕著に低下した。
図１に示すアニオンのセンサー検出の原理から、中心金属イオンは、7-アミノ基を含む5つの窒素原子によって配位されることが必要である。従って、100ｍMのHEPESを含む中性水溶液中にて化合物（１）の7-アミノ基によってＺｎIIが配位されなければ、錯体１−ＺｎIIは、アニオンセンサーとして作用することはできない。さらに、錯体１−ＣｕIIの蛍光は強く失活させられるので、これも蛍光センサーとしては適当ではない。
従って、吸収スペクトル及び励起スペクトルに基づいて、我々は、錯体１−ＣｄIIが、図１に示すような我々の設計概念に基づく最も良好な蛍光アニオンセンサーであるという結論に達した。
【００１７】
実施例３
電位差ｐH滴定
次に、参考文献１２に詳細に記載されている手順に従って、1：1の金属-化合物（１）（0.17ｍMと0.5mM）錯体システム（化合物（１）・4HCO４、化合物（１）・4HClO４+Zn(ClO４)２及び化合物（１）・4HClO４+Cd(ClO４)２）について、イオン強度I=0.1M（Et４NClO４)、25℃にて電位差ｐH滴定実験を行った。配位子のプロトン化定数、金属錯体形成定数及び分布ダイヤグラムは、コンピュータ・プログラム、SUPERQUAD１３及びMINIQUAD１４を用いて算出した。
その結果を表１に示す。化合物（１）のプロトン化平衡定数は、9.67（logK１=logb０１１)  及び8.39（logK２  = logb０１２- logb０１１)であった。他のさらに低いpKａは算出できなかった。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１においてlogb１１０として示されるＺｎII及びＣｄIIに対する化合物（１）の安定定数を算出し、logK(錯体１−ＺｎII)及びlogK(錯体１−ＣｄII)はそれぞれ10.80及び11.38であった。報告されているlogK(サイクレンＺｎII)及びlogK(サイクレンＣｄII)はそれぞれ16.2及び14.3である。化合物（１）-金属の配位形成が、サイクレンのそれと同じであるならば、logK(錯体１−ＺｎII)はlogK(１−ＣｄII)よりも大きいことが期待されるが、そうはならず、すなわち、化合物（１）-金属錯体の相対的安定性の順序は、サイクレン金属錯体に比べて逆であった。この結果は、錯体１−ＣｄIIの配位形成は、錯体１−ＺｎIIのそれとは異なることを示唆している。我々は、ＺｎIIに強く結合するアニオンが存在していなくても芳香族アミノ基がＺｎIIに配位するのを水分子が妨げる可能性があり、ＺｎIIは芳香族アミノ基によって配位されないとみなしている。一方、その結果は、ＣｄIIが5つの窒素原子、すなわち、サイクレンの4つのアミノ基と芳香族アミノ基によってキレートされるという考えに一致している。従って、ｐH滴定の結果もまた、錯体１−ＣｄIIが図１における設計原理を満たしていることを示唆している。
【００２０】
実施例４
1-CdＩＩを用いたアニオンの蛍光検出
次に、種々のアニオンが励起スペクトルにどのような影響を持つのかを調べるために、合成した錯体１−ＣｄII溶液（5mM）に種々のアニオンを加えた。スペクトルはすべて100mMのHEPES緩衝液（ｐH7.4）の存在下、25℃にて測定した。
錯体１−ＣｄII溶液にピロリン酸ナトリウム（PPi)溶液を加えた場合、励起スペクトルは、  用量依存性に長い波長の方にシフトした。図３に示すように、10mMのPPiを加えた後、λｍａｘは、342nmから383nmにシフトした。錯体１−ＣｄII溶液+10mMのPPiの励起スペクトルは、遊離の塩基（図２）のそれに類似していた（例えば、両者のピーク波長はおよそ380nmだった）。設計概念の項目で記載したように、7-アミノクマリンの場合、励起スペクトルの深色シフトは、7-アミノ基の電子密度が上昇したことを示す７。このような結果は、我々が期待したように、不安定な5番目の配位子（芳香族アミノ基）が用量依存性にPPiアニオンに置き換わったことを示している（図１）。要するに、中性の水溶液において、アミノ基が分子内にあったとしても、芳香族アミノ基よりもPPiの方がＣｄII-サイクレンに対して大きな親和性を持っていることが示された。
【００２１】
更に、同様な方法を用いてその他のアニオンの効果を調べ、励起スペクトルのピークにおける蛍光測定値をアニオンの濃度に対してプロットし、以下の式に従って、各アニオンに対する錯体１−ＣｄIIから成るセンサーの見かけの解離定数（Kｄ)を算出した。
式：F=(F０ + Fｍａｘ[A]/Kｄ) / (1 + [A]/Kｄ)
上式において、F０はアニオンなしの最初のFの値、FｍａｘはFの最大値、及び[A]は溶液に加えたアニオンの最終濃度を示す。尚、アニオンはすべてナトリウム塩又はカリウム塩として加えた。Kｄはすべて、100mMのHEPES緩衝液（ｐH7.4）の条件下で算出した。
その結果を以下の表２に示す。＊Kｄは大きすぎて計算できなかった。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
表２の結果から明らかなように、クエン酸塩が強い親和性を示した。リン酸塩は、おそらくプロトン化形態のためにPPiよりも極めて低い親和性を持ち、HPO４２−およびH２PO４−は、ｐH7.4の水溶液では優勢な種であり、それらはPPiよりも負の荷電数が少ない。過塩素酸塩は100mMでもいかなる変化も起こさなかった。オキソ酸に関しては、多価のアニオンは一価又は二価のアニオンよりも強く錯体１−ＣｄIIに結合した。このようなデータは、アニオンが、複数点での認識を介して、おそらく金属とサイクレン環のNHプロトンの双方によって錯体１−ＣｄIIと相互作用していることを示唆している。
ハロゲンイオンについては、スペクトル変化は、I−＞Br−＞Cl−＞＞F−の順で生じ、ソフト塩基度の程度を反映していた。このことは、CdＩＩがソフト酸であり、ソフト塩基に対して高い親和性を持つという事実に一致する。
【００２４】
さて、一部のヌクレオチドが生物における重要な役割を持つ負に荷電した有機化合物であり、特に、cAMPやcGMPのような環状ヌクレオチドは細胞内セカンドメッセンジャーとして作用するので、種々のヌクレオチドのセンサー検出は極めて重要である。そこで、次にこれらのヌクレオチドについて検討した。
第１に、４種のヌクレオシド一リン酸、AMP、GMP、CMP及びUMPを5mMの錯体１−ＣｄII溶液に加えた。興味深いことに、GMPだけが蛍光を失活させ、ほかの3種のヌクレオチドは無機アニオンのように励起スペクトルの赤色シフトを誘発した（図４[a]）。又、見かけの解離定数を表２に示す。このような結果は、励起スペクトルの形状及び解離定数がヌクレオチドの塩基に依存することを示唆している。考えられる説明の１つは、クマリンが直接、ヌクレオチドの塩基と相互作用しているということである。
２つの環状ヌクレオチド、cAMPとcGMPは、それぞれその加水分解産物であるAMPとGMPよりも錯体１−ＣｄIIに対して低い親和性を示した。cAMPとAMPのスペクトルデータを図４[b]に示す。10mMのcAMPを加えても錯体１−ＣｄIIに1の励起スペクトルの変化は小さかった。このスペクトルは、100mMのAMPを加えた時のスペクトルに類似していた。1mM未満のcAMPの添加では錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルはほとんど変化しなかった。この結果を考慮すると、AMPとcAMPの結合強度の差異はおそらくアニオン部位の数に基づくものであった。
【００２５】
実施例５
アニオンのセンサー検出の可逆性
次に、アニオンのセンサー検出の可逆性について調べた。センサー検出システムが可逆的であれば、ＣｄIIに配位するアニオンの減少が励起スペクトルの青色シフトを生じ、それが元のスペクトルに回復するはずである。PPiを結合し、PPiがＣｄIIに配位するのを妨げるために、PPiを含む溶液に過剰量のＭｇIIを加えた。1mMのPPiを含む錯体１−ＣｄII（5mM）の溶液に10mgのMg(ClO４)２を加えた場合、励起スペクトルは実際に青色にシフトしてλmax  345nmであった（図５[a])。このスペクトルはPPiを含んでいない錯体１−ＣｄIIのスペクトルにほぼ正確に一致した。
更に、ピロリン酸の加水分解の影響を調べた。無機ピロホスファターゼは、1つのピロリン酸塩を２つのリン酸イオンに変換することが知られている９。リン酸塩はPPiよりも弱く錯体１−ＣｄIIに配位するので、PPiの切断は、大量のＭｇIIイオンで見られたのと同じようなスペクトル変化を誘発するはずである。ｐH7.4にて1mMのピロリン酸塩を含む錯体１−ＣｄII溶液に0.33U/mlの無機ピロホスファターゼと0.5mMのMg(ClO４)２を加えると、励起スペクトルのピークは短い波長の方に迅速にシフトした（図５[b])。これらの結果も、センサー検出メカニズムが可逆的であることを示している。
【００２６】
実施例６
ホスホジエステラーゼの測定
生化学的応用へのこのシステムの可能性を調べるために、我々は、ホスホジエステラーゼ（PDE)の活性をモニターすることを試みた。我々は、環状ヌクレオチドのホスホジエステルの開裂によって環状ヌクレオチドのヌクレオシド一リン酸への変換、例えば、cAMPのAMPへの変換（化２）を触媒するホスホジエステラーゼ3',5'-環状モノヌクレオチド１０を用いた。そのような酵素は細胞内シグナル伝達に関与するので、その活性１１を感度良く検出するシステムを開発することは極めて重要である。
【００２７】
【化２】
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【００２８】
実施例５で示されたように、錯体１−ＣｄIIから成る本発明の蛍光センサーは、cAMPよりもはるかに強くAMPを認識した。従って次に、AMPの上昇をモニターすることによってPDE活性をリアルタイムで検出することを試みた。
即ち、ｐH7.4にて、100mMのHEPES、10mMのcAMP、10mMのCaCl２及び0.02U/mlのPDEアクチベータを含む5mMの錯体１−ＣｄIIに2U/ml（最終濃度）のPDEを加えた後、数回、励起スペクトル（放射波長は500nm)を測定した。その結果、図６[a]及び[b]に示すように、蛍光強度（励起波長：380nm/  放射波長：500nm)は徐々に増加した。このスペクトル変化は、cAMPからAMPへの変換を示している。このような結果から、ホスホジエステラーゼ3',5'-環状ヌクレオチド活性のリアルタイム蛍光測定に本発明化合物である錯体１−ＣｄIIが有用であることが明らかにされた。又、このアプローチは、他の酵素活性の測定に応用可能であると期待される。
【００２９】
本発明者は、スペクトル及びｐH電位差のデータに基づいて、ＣｄIIが７位置換クマリン誘導体の7-アミノ基によって弱く配位されるので、アニオンの一部がそれを置き換えることができ、その場所でＣｄIIイオンに配位することができ、下が手、このような化合物から成るアニオン検出用の蛍光センサーが可逆的であることを確認した。更に、本発明者は、本発明化合物である錯体１−ＣｄIIを用いて、環状ヌクレオチドのホスホジエステル結合を加水分解するホスホジエステラーゼ活性を水溶液中でモニターできることを証明した。このような特徴を持ったセンサーはこれまでに知られておらず、本発明化合物である錯体１−ＣｄIIは多数の生物学的及び分析的応用で好ましいアニオンセンサーになり得る。
【００３０】
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(4) (a) De Santis, G.; Fabbrizzi, L.; Licchelli, M.; Poggi, A.; Taglietti, A. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.1996, 35, 202. (b) Fabbrizzi, L.; Faravelli, I.; Francese, G.; Licchelli, M.; Perotti, A.; Taglietti, A.Chem. Commun. 1998, 971. (c) Watanabe, S.; Onogawa, 0.; Komatsu, Y.; Yoshida, K. J. Am. Chem.Soc. 1998, 120, 229. (d) Niikura, K.; Metzger, A.; Anslyn, E. V. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120,8533. (e)Nishizawa, S.;Kato, Y.; Teramae, N. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9463. (f) Miyaji, H.;Anzenbacher Jr, P.; Sessler, J. L.; Bleasdale, E.R.; Gale, P. A. Chem. Commun. 1999, 1723.
(5) Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res. 1994, 27, 302.
(6) (a) Koike, T.; Kajitani, S.; Nakamura, I.; Kimura, E.; Shiro, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,1210. (b) Kimura, E.; Aoki, S.; Koike, T; Shiro, M. J. Am. Chem. Soc. 1997, 119, 3068.
(7) Wheelock, C. E. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 1348.
(8) Kodama, M.; Kimura, E. J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1977, 2269.
(9) (a) Moe, 0. A.; Butler, L. G. J. Biol. Chem. 1972, 247, 7308. (b) Cooperman, B. S.; Chiu, N.Y.; Bruckmann, R. H.; Bunick, G. J.; McKenna, G. P. Biochemistry, 1973, 12, 1665.
(10) Ho, H. C.; Teo, T. S.; Desai, R.; Wang, J. H. Biochim. Biophys. Acta, 1976, 429, 461.
(11) (a) Rutten, W. J.; Schoot, B. M.; De Pont, J. J. H. H. M. Biochim. Biophys. Acta, 1973, 315,378. (b) Thompson, W. J.; Appleman, M. M. Biochemistry, 1971, 10, 311. (c) Hiratsuka, T. J. Biol Chem., 1982, 257, 13354.
(12) Odani, A. Physical Methods in Supramolecular Chemistry (Comprehensive Supramolecular Chemistry, Vol.8), Davies J. E. D. and Ripmeester J. A., Eds., Pergamon, 1996, 8, 445.
(13) Gans, P.; Sabatini, A.; Vacca, A. J. Chem. Soc., Dalton Trans., 1985, 1195.
(14) Sabatini, A.; Vacca, A.; Gans P. Talanta 1974, 21, 53.
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明化合物がアニオンを検出する蛍光センサーとして機能し、アニオンを検出する機構を示す。
【図２】図２は、（a)種々の金属と化合物（１）の(a)吸収スペクトル及び（b)励起スペクトル（放射波長は500nm）を示す。ここで、縦軸：(a)蛍光強度、(b)吸収度、横軸：波長である。
【図３】図３は、100mMのHEPES緩衝液（ｐH7.4)中で25℃にてピロリン酸ナトリウム（0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、3、10ｍM)を加えた場合の5mMの錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルを示す。放射波長は500nmであり、縦軸は「蛍光強度」、横軸は「波長」である。
【図４】図４は、（a)AMP、GMP、CMP及びUMP、並びに（ｂ）AMP及びcAMPを加えた際の5mMの錯体１−ＣｄIIにおける励起スペクトルの比較を示す。各ヌクレオチドの濃度は10mMである。
【図５】図５は、（a)1mMのNa４P２O７（記号なし)及び1mMのNa４P２O７+10ｍMのMg２(ClO４)２（白抜きのマル）を伴った錯体１−ＣｄIIの励起スペクトル、及び、（b)無機ピロリン酸塩を添加する前（記号なし）及び添加後20分（白抜きのマル）の1mMのNa２P４O７を伴った錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルを示す。放射波長は500nmである。
【図６】図６は、ホスホジエステラーゼ活性の測定における、（a)錯体１−ＣｄIIの励起スペクトルの変化（放射波長は500nm）、及び(b)蛍光強度-時間のプロット（励起／放射波長は380nm／500nm）を示す。
【図１】
2008058319.tif 000007
【図２】
2008058319.tif 000008
【図３】
2008058319.tif 000009
【図４】
2008058319.tif 000010
【図５】
2008058319.tif 000011
【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月1日(2007.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式１で示される化合物の蛍光色素の励起スペクトルのシフトを測定することからなる、ピロリン酸又はピロリン酸の分解を用量依存的に蛍光検出する方法。
式１
2008058319.tif 000013
【請求項２】
化合物の蛍光色素の励起スペクトルの長波長側へのシフトを検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
遷移金属がカドミウムである、請求項１又は２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
水溶液中で使用するための蛍光アニオンセンサーは、２つの必要条件を満たさなければならない。１つは、水中でのアニオンに対する十分に強い親和性であり、もう１つは、アニオンの認識を蛍光シグナルに変換する能力である。既知のアニオンセンサーはほとんど、後者の必要条件は満たすけれども、水中でのアニオンに対して十分な親和性を持っていない。アニオンホストの中には、水性溶媒中でアニオンを捕捉することができるものもあるが、それらは単にホスト分子であって、センサー分子ではない。双方の必要条件を同時に満たすのは困難である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明化合物において、環状ポリアミンを構成する窒素原子及び炭素原子の各個数及びそれらの総数に特に制限はないが、好ましくは）〜１２、より好ましくは１２であり、窒素原子数は好ましくは３又は４、より好ましくは４である。
具体的には好適な環状ポリアミンとして、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（サイクレン）を挙げることが出来る。
又、本発明化合物の蛍光色素上の電子供与性置換基にも特に制限はないが、蛍光色素、環状ポリアミン及び金属イオンの種類等に応じて当業者が適宜選択することができるが、好適例としてアミノ基を挙げることが出来る。
蛍光色素もその他の構成成分に応じて当業者が適宜選択することができるが、好適例として７位置換クマリン誘導体、例えば、７−アミノ−トリフルオロメチルクマリンを挙げることが出来る。
リンカーとしては、例えば、エチレン基及びメチレン基等のアルキレン基を使用することが出来る。
金属錯体を構成する金属の好適例として、ＣｄII等の遷移金属を挙げることが出来る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2008058319.tif 000014