(57)【要約】【課題】４つの天然塩基とより良好な塩基対形成が可能なユニバーサル塩基を含むプライマー及びプローブのような核酸結合化合物を提供することを目的とする。【解決手段】検出可能なリポーター基を含む核酸結合化合物であって、前記核酸結合化合物は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記核酸結合化合物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出可能なリポーター基を含む核酸結合化合物であって、前記核酸結合化合物は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記核酸結合化合物。
【請求項２】
以下のステップ：
−  核酸を含むことが推測されるサンプルを準備すること、
−  上記核酸の一部又は全体と本質的に相補的であり、検出可能なリポーター基を含む核酸結合化合物を準備すること、
−  上記核酸結合化合物が上記核酸に結合するための条件下、上記サンプルをその核酸結合化合物と接触させること、
−  上記核酸の存在の指標としてその核酸と上記核酸結合化合物から形成された結合産物を測定すること
を含む核酸の測定方法であって、ここで、上記核酸結合化合物が、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記測定方法。
【請求項３】
１を超えるリポーター基が、核酸結合化合物に付着する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１のレポーター基が蛍光エミッタであり、他方が蛍光クエンチャである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１〜４個のレポーター基が、核酸結合化合物にある、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
１又は２個のレポーター基が、核酸結合化合物にある、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１個のレポーター基が、核酸結合化合物にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
−  プライマー、つまり核酸の第１結合配列に本質的に相補的な第１プライマー及びこの核酸の相補鎖の結合配列に本質的に相補的な第２プライマー、並びに少なくとも２つの異なるリポーター基により異なるサブユニットで標識されている、上記プライマーの結合配列の間の核酸又はその相補鎖に相補的なプローブを準備すること、
−  上記プライマーの伸長に好ましい条件下、そのサンプルをそのプライマー及びプローブにさらし、そしてそのプローブの分解により互いから上記リポーター基を分離すること、そして
−  少なくとも１つの上記リポーター基を介してプローブの分解の程度を測定すること
を含むサンプル中の核酸の存在、不存在又は量の測定方法であって、少なくとも１つの上記プライマー又は／及びプローブがバックボーンを含む核酸結合化合物であり、上記バックボーンは、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着しており、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンが前記核酸結合化合物ないに含まれる前記測定方法。
【請求項９】
プライマーとしての核酸結合化合物の使用であって、前記核酸結合化合物は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記使用。
【請求項１０】
プライマー若しくはプローブとしての又は核酸を測定するための検出可能なリポーター基を含む核酸結合化合物の使用であって、前記核酸結合化合物は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記使用。
【請求項１１】
インビトロにおける突然変異誘発のための核酸結合化合物の使用であって、前記核酸結合化合物は、天然の核酸塩基と塩基対形成が可能なヘテロ環式基を付着したバックボーンを含み、少なくとも１つの該へテロ環式基は、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンである前記使用。
【請求項１２】
Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンが核酸結合化合物内に含まれる、多重ハイブリダイゼーション反応における該核酸結合化合物の使用であって、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンを上記核酸結合化合物内に導入し、その標的核酸にハイブリダイズしたさらなる核酸結合化合物により形成されたさらなるハイブリダイゼーション複合体の安定性と比較して、標的核酸にハイブリダイズした上記核酸結合化合物の複合体安定性を等しくした前記使用。
【請求項１３】
前記バックボーンが、糖及びリン酸部分を含む、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法、又は請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記糖の立体配置が、α−Ｄ−、β−Ｄ−、α−Ｌ−、及びβ−Ｌ−立体配置から成る群から選ばれる、請求項１３に記載の方法又は使用。
【請求項１５】
前記糖部分が２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル部分である、請求項１３に記載の方法又は使用。
【請求項１６】
前記核酸結合化合物が、以下の一般式（II）：
【化１】
2008113669.tif 000023
｛式中、
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｎ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｌは、オキシ、スルファンジイル、−ＣＨ2−、及び−ＮＲ22−から成る群から選ばれ、
Ｔは、オキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、
Ｕは、−ＯＨ、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−Ｓリポーター基、−ＳｅＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、又はここで−ＮＲ23Ｒ24はＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｖは、オキシ、スルファンジイル、−ＣＨ2−又は−ＮＲ22−から成る群から選ばれ、
Ｒ14は、−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−Ｏ−アリル、−Ｏ−アルキニル、及び−ＮＨ2から成る群から選ばれ、
Ｒ22は、−Ｈ及び−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ23及びＲ24は、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2）c］d−ＮＲ26Ｒ27、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は、−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、及び−ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキル、並びにリポーター基から成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、及び−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、並びにリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
ｃは、２〜６の整数であり、
ｄは、０〜６の整数であり、そして
Ｂは、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンであり、
ここで、いずれのアルキル、アルケニル、及びアルキニルも置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5Ｒ6、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5Ｒ6、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5Ｒ6、及び−［Ｏ−（ＣＨ2）r］s−ＮＲ5Ｒ6から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができ、
ｒ及びｓは、互いに独立して１〜１８の整数である｝及びそのいずれかの塩の１以上の部分を含む、請求項１に記載の化合物、請求項２〜８及び１３〜１５のいずれか１項に記載の方法、又は請求項９〜１２及び１３〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
前記バックボーンが、以下の一般式（III）：
【化２】
2008113669.tif 000024
［式中、
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、及びＮ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍは、オキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−Ｏ−から成る群から選ばれ、
Ｒ22は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、保護基、及びリポーター基から成る基から選ばれ、
Ｒ14は、−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相、及び−ＮＨ2から成る群から選ばれ、
Ｒ15は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、固相、及び以下の式（IV）：
【化３】
2008113669.tif 000025
｛式中、
Ｔは、オキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、そして
Ｕは、−ＯＨ、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、又はここでＮＲ23Ｒ24がＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ23及びＲ24は、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2）c］d−ＮＲ26Ｒ27から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は、−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、及び−ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、及び−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ29は、−ＯＲ30及び−ＳＲ30から成る群から選ばれ、
Ｒ30は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6〜Ｃ22）−アリール、保護基、固相、及びリポーター基から成る群から選ばれ、
ｃは、２〜６の整数であり、
ｄは、０〜６の整数である｝の基から成る群から選ばれ、そして
Ｂは、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンとの連結であり、
ここで、いずれのアルキル、アルケニル、及びアルキニルも置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5Ｒ6、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5Ｒ6、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5Ｒ6、及び−［Ｏ−（ＣＨ2）r］s−ＮＲ5Ｒ6から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができ、
ｒ及びｓは、互いに独立して１〜１８の整数である］
の部分を含む、請求項１に記載の化合物、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法、又は請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
前記バックボーンが、以下の一般式（Ｖ）：
【化４】
2008113669.tif 000026
［式中、
Ａは、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、及びＮ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍ′は、オキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−ＮＲ22−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−Ｏ−から成る群から選ばれ、
Ｒ22は、−Ｈ、保護基、リポーター基、及び−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキルの基から選ばれ、
Ｒ14は、−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相、及び−ＮＨ2から成る群から選ばれ、
Ｒ16は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、−（Ｃ2〜Ｃ18）−アルケニル、−（Ｃ2〜Ｃ18）−アルキニル、−（Ｃ2〜Ｃ18）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、保護基、又は以下の式（IV）：
【化５】
2008113669.tif 000027
｛式中、
Ｔは、オキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、
Ｕは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、ここでＮＲ23Ｒ24がＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ23及びＲ24は、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2）c］d−ＮＲ26Ｒ27から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は、−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2、及び−ＣＯＯ（Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、及び−（Ｃ1〜Ｃ4）−アルコキシ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ29は、−ＯＲ30及び−ＳＲ30から成る群から選ばれ、
Ｒ30は、−Ｈ、−（Ｃ1〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6〜Ｃ22）−アリール、保護基、固相、及びリポーター基から成る群から選ばれ、
ｃは、２〜６の整数であり、
ｄは、０〜６の整数である｝の化合物から成る群から選ばれ、そして
Ｂは、Ｎ８−グリコシル化８−アザ−７−デアザアデニンとの連結であり、
ここで、いずれのアルキル、アルケニル、及びアルキニルも置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル、−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5Ｒ6、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5Ｒ6、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5Ｒ6、及び−［Ｏ−（ＣＨ2）r］s−ＮＲ5Ｒ6から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができ、
ｒ及びｓは、互いに独立して１〜１８の整数である］又はそれらのいずれかの塩の部分を含む、請求項１に記載の化合物、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法、又は請求項９〜１２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
Ｍ′がＯであり、Ｒ16がＨであり、そしてＲ14が−Ｈ及び−ＯＨから成る群から選ばれる、請求項１８に記載の化合物、方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ8 −又はＣ8 −連結プリン塩基及び構造的に関連したヘテロ環を含む核酸結合化合物、上記化合物の製造に有用な化合物、この核酸結合化合物の核酸との結合産物、上記化合物を用いた核酸の測定方法、及び８−連結プリン塩基及び構造的に関連したヘテロ環のいくつかの使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
いくつかのＣ8 −グリコシル化プリン誘導体の合成はCzech. Chem. Comm. (Vol 34, p. 247), Heterocycl. Chem. (Vol 12, p. 111）、及びJournal of Medicinal Chemistry (Vol 33, p. 2750-2755）に記載されており、Ｎ8 −グリコシル化プリン誘導体はHelv. Chim. Acta (Vol. 72, p. 1527), Zh. Org. Khim. (Vol 12, p. 1131）、及びHelv. Chim. Acta (Vol 76, p. 2184-2193）に示されている。しかしならが、核酸内に組込まれた場合、４の天然塩基のそれぞれと塩基対形成が可能なユニバーサル塩基としてのこれらの非天然塩基の使用に対する開示は存在しない。
【０００３】
そのＮ8 位で糖部分を結合した８−アザ−７−デアザアデニンのいくつかの例が本技術分野で知られている。Helv. Chim. Acta (Vol 72, p. 868-881）において、８−アザ−７−デアザアデニンＮ8 −（β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシド）の合成が開示されている。Ｎ6 −メチル化−８−アザ−７−デアザアデニンＮ8 −（β−Ｄ−２′−デオキシリボフラノシド）の合成はHelv. Chim. Acta (Vol 71, p. 1813-1823）に示されている。しかしながら、ユニバーサル塩基として上述のヌクレオチドを使用する長所を示す開示は存在しない。
【０００４】
Biochemistry (Vol 15, p 1005-1015 ）において、８−アザ−７−デアザアデニンＮ8 −（β−Ｄ−リボフラノシル）（Ａ* ）の合成が開示されている。ポリヌクレオチド・ホスホリラーゼの存在下、ＡＤＰ及びＡ* ＤＰの酵素的重合をも示される。しかしながら、それら２塩基以外を含む定められた配列を有するオリゴヌクレオチドの合成に関する開示は存在しない。これらのポリマーのハイブリダイゼーション特性は記載されていない。これらの修飾塩基がハイブリダイゼーション法に使用されうることをほのめかしてもいない。
【０００５】
本発明は核酸ハイブリダイゼーション法、例えば特にヘルス・ケアの分野における分析論による核酸の測定に特に有用である。それはインビトロ突然変異誘発に使用されることもできる。それは医薬の分野、例えばアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして使用されるオリゴヌクレオチドに使用されることもできる。
【０００６】
核酸は、ヒト体液、食品又は環境中の遺伝子又は微生物の存在又は不存在の判定のための有用な検体であることが知られている。特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＵＳ−Ａ−４，６８３，２０２を参照のこと）のような核増幅技術の導入により、それらの十分な感度のため、核酸の判定は幅広く使用される。
【０００７】
増幅された核酸は、特定の目的に依存するさまざまに異なる技術を用いて測定される。大部分のアッセイは固定化されたか又は固定化されうるか、あるいは１以上のリポーター基の付着により標識されたプローブの使用を必要とする。リポーター基はそれ自身が測定されることを可能にする特徴を有するか又は上記リポーター基を介してプローブを測定可能にする試薬と反応させうる。よって、例えば、プローブと測定されるべき核酸を含むハイブリッドが存在する時、リポーター基により標識されたプローブが測定されうる。
【０００８】
さらなる増幅ステップ、並びにプローブ・ハイブリダイゼーション・ステップに関して、プライマー及びプローブとして使用されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性は非常に重要である。特定の目的に依存して、ハイブリダイゼーション法を改良するために前述のオリゴヌクレオチド内に天然核酸塩基の代わりに修飾又は非天然ヘテロ環式基を含むための多くの案がある。
【０００９】
前述の非天然基の例は、ｄＧＴＰに置き換えて核酸内に導入された時にシークエンシング・ゲル内のバンド圧縮を軽減する７−デアザ−ｄＧＴＰである（ＥＰ−Ｂ−０  ２８６  ０２８）。
【００１０】
核酸測定は、天然の基準塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴが４の天然塩基の１つだけと唯一塩基対形成が可能であることに基づくところが大きい。しかしながら、ハイブリッドのメルティング・ポイントがプローブ・オリゴヌクレオチドの長さだけでなくそのＧＣ含量にも依存するため、Ｃと塩基対形成したＧに比べＴと塩基対形成したＡの異なる安定性が、問題となりうる。
【００１１】
核酸のスクリーニング方法において、付随的なタンパク質のアミノ酸配列だけが利用できる場合には他に問題はない。その場合、そのアミノ酸配列から核酸配列が推論される。しかしながら、遺伝子コードの重複性は多数の異なる配列を導く。この重複性を考慮するオリゴヌクレオチドの混合物を合成し、そして可能性のあるＤＮＡ又はＲＮＡ候補のスクリーニングのために使用しなくてはならない。
【００１２】
代替の方法は識別力を失った塩基アナログを使用する。この塩基は、対応のヌクレオシドがユニバーサル又は多義性ヌクレオシドと呼ばれる、普遍的又は多義性塩基を意味する。ユニバーサル塩基は主要な識別なしに天然塩基のいくつか又は全てと塩基対を形成する塩基である。４の天然塩基全てと水素結合を形成しうるので、用語ユニバーサル塩基がそのために作り出されたヒポキサンチンはユニバーサル塩基として広く使用されている（Y. Takahashi, K. Kato, Y. Hayashizaki, T. Wakabayashi, E. Ohtsuka, S. Matsuki, M. Ilehara, K. Matsubara, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985, 1931-1935 ）。ヒポキサンチンによるヌクレオシド、２′−デオキシイノシン（図１、１参照のこと）が４の天然ヌクレオシドのそれぞれと向かい合った１２ｍｅｒの二本鎖内に組み込まれる時、それらは１５℃のＴｍ値の差により表される広い範囲にわたる熱安定性を示す（F. Seela, K. Mittelbach, Nucleosides, Nucleotides 1999, 18, 425-441）。これはヒポキサンチンが他の塩基と一様に塩基対を形成しないことを示す。さらに、ＰＣＲプライマーに使用されるヒポキサンチンはグアニンのように振る舞う。他のユニバーサル・ヌクレオシドは化合物Ｐ（図１、２を参照のこと）及びＫ（図１、３を参照のこと）である（P. Kong Thoo Lin, D.M. Brown, Nucleic Acids Res. 17, 10373-10383 ; D.M. Brown, P. Kong Thoo Lin, Carbohydrate Res., 216, 129-139）。それらの塩基のそれらのアミノ−イミノ互変異性型として選ばれたそれらは天然の塩基よりも高い結合性がある。ヌクレオシドＰはプリン・ヌクレオシドｄＡ及びｄＧとワトソン−クリック型塩基対を形成しうる一方で、ヌクレオシドＫはｄＴ及びｄＣと塩基対を形成する。
【００１３】
水素結合を形成するヌクレオシドを除いて、水素結合の能力を持たない多くのユニバーサル残基が存在する。前述のヘテロ環の電子電荷分布は基準部位をスタッキングした塩基の良好な候補であり（図１、４を参照）（T.A. Milican, G.A. Mock, M.A. Chaunncy, T.P. Patel, M.A.W. Eaton, J. Gunning, S.D. Cutbush, S. Neidle, J. Mann, Nucleic Acids Res. 1984, 12, 7435-7453）、そして５−ニトロインドール（図１、５を参照）（D. Lokes, D.M. Brown, Nucleic Acids Res. 1994, 22, 4039-4043）、３−ニトロピロール（図１、６を参照）による天然塩基の置き換え（D.E. Bergstrom, P. Zhang, W. Travis Johnson, Nucleic Acids Res. 1997, 25, 1935-1942 ）が前述の操作に使用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
これまでに知られる全ての案はいくつかの不都合を有する。故に、４の天然塩基とより良好な塩基対形成が可能なユニバーサル塩基を含むプライマー及びプローブのような核酸結合化合物を提供する必要性がなおも存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の説明
本発明の対象は、少なくとも１の、そのヘテロ環が以下の一般式（Ｉ）：
【００１６】
【化１】
2008113669.tif 000002
【００１７】
｛式中、
Ｘ1 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ1 の群から選ばれ、そしてＸ2 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ1 はＣＲ1 であり、
Ｘ2 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ2 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ2 はＣＲ2 であり、
Ｘ3 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ3 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ2 のそれぞれがＮである場合、Ｘ3 はＣＲ3 であり、
Ｘ4 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35、及びＣＲ4 の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮＲ35である場合、Ｘ4 はＣＲ4 又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮである場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＣＲ34である場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ4 はＮ又はＣＲ4 であり、
Ｘ5 はＸ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣの群から選ばれ、
Ｘ6 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35及びＣＲ34の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮＲ35である場合、Ｘ6 はＣＲ34又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮである場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＣＲ4 である場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ6 はＮ又はＣＲ34であり、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、及びＲ34は−Ｈ、−ハロゲン、−ＯＲ13、−ＳＲ19、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−ＮＯ2 、−ＮＲ5 Ｒ6 、−シアノ、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ11から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ11は−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールオキシ、及びＮＨＲ12から成る群から選ばれ、
Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ19、及びＲ35は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、
Ｄは前記核酸結合化合物のこの基以外の部分へのこの基の付着位置であり、
上記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換される。｝の基であることを特徴とし、天然核酸塩基と塩基対形成が可能な前記ヘテロ塩基を付着したバックボーンを含む核酸結合化合物であり、
ただし、
一般式（Ｉ）のヘテロ環基が、２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル部分に付着する８−アザ−７−デアザアデニン（Ａ* ）である場合、上記核酸結合化合物の配列は、（Ａ* Ｔ）6 、ＣＴＧＧＡ* ＴＣＣＡＧ又はＣＴＧＧＡＴＣＣＡ* Ｇから成る群からは選ばれず、
一般式（Ｉ）のヘテロ環基が２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロペントフラノシル部分に付着するＮ6 −メチル化−８−アザ−７−デアザアデニン（Ａ*m）である場合、上記核酸結合化合物の配列は、（Ａ*mＴ）6 、ＣＴＧＧＡ*mＴＣＣＡＧ又はＣＴＧＧＡＴＣＣＡ*mＧから成る群からは選ばれず、
一般式（Ｉ）のヘテロ環基がβ−Ｄ−リボフラノシル部分に付着する８−アザ−７−デアザアデニンである場合、上記化合物の配列はアデニン以外の、及び８−アザ−７デアザアデニン以外の少なくとも１のさらなるヘテロ環を含み、そして
一般式（Ｉ）のヘテロ環基が２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル部分とＮ8 −付着する８−アザ−９デアザ−９−メチル−グアニンである場合、上記化合物の配列は、チミジン以外の及び８−アザ−９−デアザ−９−メチル−グアニン以外の少なくとも１のさらなるヘテロ環を含む、上記化合物である。
【００１８】
式（Ｉ）のヘテロ環式基は以下の性質により主に特徴づけられる：
・前記塩基は８位（プリン・ナンバリング）を介してバックボーンに、好ましくは糖部位に連結される。
【００１９】
・前記塩基は他の核酸構成要素とスタッキング相互作用の形成が可能な芳香族又はキノイドπ電子系を含む。
【００２０】
・前記塩基は４の天然ヌクレオシドＡ、Ｃ、Ｇ、及びＴへの水素結合のための１以上の供与及び／又は受容部位を含む。
【００２１】
式（Ｉ）のヘテロ環式基はその８位で核酸結合化合物のバックボーンに連結する。他の核酸とハイブリダイズした場合、それらは普遍の９−連結プリンに比べ二本鎖複合体において異なった配置をされる。天然の９−連結グアニン又はアデニンはその相補塩基、例えばそれぞれシトシン及びチミンとだけ塩基対を形成する。それに対して、驚くべきことに核酸結合化合物中に含まれる本発明による８−連結ヘテロ環式基は低い特異性を示し、そして二本鎖複合体の状態に前記核酸結合化合物がハイブリダイズした時、核酸の向かい合わせの位置に含まれる４の天然の塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）とのＨ−結合を介して塩基対形成をもたらす。例として、二本鎖における８−アザ−７−デアザアデニンと４の天然塩基の全てとの可能性のある構造を図５に示す。
【００２２】
特に好ましいものは、そのヌクレオシドの４の天然塩基全てとの塩基対形成をもたらすだけでなく、４の天然塩基全てとのほぼ同じ安定性を持つ塩基形成をもたらす６位（プリン・ナンバリング）で連結したＨ供与体（例えばアミノ基）を持つ式（Ｉ）のヘテロ環式基である。これらの化合物において、Ｘ3 はＣＲ3 であり、好ましくはＣ−Ｒ3 はＣ−ＮＲ5 Ｒ6 であり、そして最も好ましくはＣ−ＮＨ2 である。特定の位置にこれらの核酸塩基を含む核酸結合化合物は、イノシン含有核酸結合化合物と比べて、向かい合った位置にＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを持つ異なるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合、同じか又はごくわずかなＴｍの差を示す（実施例６を参照のこと）。好ましいものは、これらのヘテロ環式基のＮ8 −グリコシル化をもたらすＸ5 がＮである、式（Ｉ）のヘテロ環式基でもある。
【００２３】
故に、式（Ｉ）のヘテロ環式基を向上した性質を有する核酸結合化合物において天然核酸塩基に対する代替物として使用されうる。オリゴヌクレオチドである前述の核酸結合化合物は、例えば、標的核酸配列の配列が、可能性のあるさまざまな標的核酸配列を導くタンパク質のアミノ酸配列から推論される場合のハイブリダイゼーション法において使用されうる。それが縮退される標的核酸の位置とハイブリダイズするための位置で天然核酸塩基を本発明による核酸塩基により置き換えることは、多型ハイブリダイゼーション・プローブの必要性なしにこれらの標的核酸の測定をもたらす。有利な使用に関する他の例は特定の位置に異なる配列を含む対立遺伝子の配列を測定しなくてはならない場合の核酸の測定である。天然ヌクレオシドの代わりに８−アザ−７−デアザアデニンをいつもと違って連結したような本発明によるユニバーサル塩基の使用によりたった１つのプローブだけでハイブリダイゼーションには十分である。さらに、８−アザ−７−デアザアデニンのようなヌクレオシドは、核酸にハイブリダイズした時の得られるハイブリダイゼーション複合体のＴｍを変えるためにオリゴヌクレオチド内に含まれる４の天然塩基それぞれの代替物として使用される。元のプローブ−核酸複合体のＴｍと比較したＴｍのこの変化は、溶液及び／又は表層で実施されるＰＣＲ、多重ＰＣＲ、多重プローブ・ハイブリダイゼーション法又は他のハイブリダイゼーション技術のような多重ハイブリダイゼーション法を行う場合のいくつかのハイブリダイゼーション複合体のＴｍを等しくするために使用される。ユニバーサル塩基を含むこれらの化合物はインビトロ突然変異誘発法に、そして医薬品として使用されることもできる。これらの例は可能性のある使用を説明することを意図し、本発明の範囲を制限するものではない。
【００２４】
環系について、本発明による式（Ｉ）のヘテロ環式基を図７に示す（ヘテロ環を図式的に示し、置換基をさらに記載しないが、式（Ｉ）から選ばれることを意図する）。式（Ｉ）のヘテロ環式基の互変異性型及び塩も本発明の中に含まれる。
【００２５】
式（Ｉ）によるヘテロ環式基に含まれる二重結合の配置は環系内のＣ及びＮ原子の位置に依存する。そのため、Ｘ1 〜Ｘ6 の選択により二重結合はそれぞれに位置して平面的な芳香族の又はキノイドのπ電子系をもたらす。二重結合の位置をごく一般的な方法で式（Ｉ）中に示したが、それらを具体的なヘテロ環として示すことは当業者に明白である（図７も参照のこと）。
【００２６】
ハロゲンはフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード基を意味する。最も好ましいハロゲン基は−Ｃｌ及び−Ｂｒである。
【００２７】
アルキル基は線状、分枝又は環状のいずれかに配置された１〜１０の炭素原子を含むアルキル基から好ましくは選ばれる。アルキル基の実際の長さはそのアルキル基が配置された個々の位置での立体構造の状況に依存する。立体的制約がある場合、アルキル基は一般的に小さく、メチル及びエチル基が最も好ましい。全てのアルキル、アルケニル、及びアルキニル基は置換されないか又は置換されるかのいずれかである。先に概説したヘテロ原子による置換は水性溶液中への可溶性を高める助けとなる。
【００２８】
アルケニル基は２〜１０の炭素原子を含むアルケニル基から好ましくは選ばれる。選択に関して、アルキル基に関するものと同様の検討材料を適用する。それらは線状、分枝、及び環状でもありうる。最も好ましいアルケニル基はエチレン基である。
【００２９】
アルキニル基は２〜１０の炭素原子を好ましくは有する。同様に、それらの炭素原子は線状、分枝、及び環状の様式で配置される。さらに、アルキニル基内に２以上の三重結合が存在する。最も好ましいアルキニル基は３−プロパルギル基である。
【００３０】
アルコキシ基は１〜６の炭素原子を好ましくは含み、そして酸素原子を介して他の部分に付着する。アルコキシ基内に含まれるアルキル基に関して、アルキル基に関するものの中のいくつかの検討材料を適用する。最も好ましいアルコキシ基はメトキシ基である。
【００３１】
アリールオキシ基は６〜２０の炭素原子を好ましくは含む。それらの炭素原子は１以上の芳香族環内、及びさらにはその芳香族部分に付着した側鎖（例えばアルキル鎖）内に含まれる。好ましいアリールオキシ基はフェノキシ及びベンズオキシ基である。
【００３２】
好ましいＯ−保護基はアロイル基、ジフェニルカルバモイル基、アシル基、及びシリル基である。これらの中で最も好ましいものはベンゾイル基である。
【００３３】
好ましいシリル基はトリメチルシリル、トリエチルシリル、及び第３ブチル−ジメチル−シリルのようなトリアルキルシリル基である。他の好ましいシリル基はトリメチルシリル−オキシ−メチル基（ＴＯＭ）（スイス特許出願第０１９３１／９７号）である。
【００３４】
本明細書中に示される式中の定義においていずれの原子も特定の同位体に制限されない。よって、リン原子（Ｐ）は通常の31Ｐ又は放射性の32Ｐあるいはそれらの混合物のいずれをも意味する。水素（Ｈ／Ｄ／Ｔ）、炭素（Ｃ）、ヨウ素（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、及び窒素（Ｎ）についても同様に適用する。
【００３５】
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ34、及びＲ35の定義の中の好ましい基−ＮＲ5 Ｒ6 は−ＮＨ2 基である。この場合、式（Ｉ）の前述の基を含む化合物の化学合成の間、このアミノ基の水素原子の１つが好適なアミノ保護基により保護されることは明らかである。そのような保護基は当業者に広く知られている。
【００３６】
化学合成の間、−ＯＨ、−ＳＨ、及び−ＮＨ2 （リポーター基内のそれらの基を含む）の全ての基は好適な保護基により保護されるべきである。さらに、化学合成の間、前記化合物を便宜上、固相に付着させる。これらの場合において、先に与えられた置換基の定義を適宜選択する。
【００３７】
保護基は、望まれない様式による反応から官能基を守るために官能基に付着させる（例えば、ヒドロキシル基の酸素又はアミノ基の窒素と水素を置き換える）化学基である。保護基は、それが形成される分子の生理活性、ここでは核酸結合化合物の核酸への結合を破壊することなしに除去される事実によりさらに定義される。好適な保護基は当業者に知られている。例えば、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの５′末端のヒドロキシル基のための特に好ましい保護基はトリチル基、例えばジメトキシトリチルから選ばれる。
【００３８】
式（Ｉ）内の環外アミノ基での好ましい保護基はアシル基、最も好ましくはベンゾイル基（Ｂｚ）、フェノキシアセチル又はアセチル又はホルミル、及びＮ，Ｎ−ジアルキルホルムアミド基、優先的に、ジメチル−、ジイソブチル−、及びジ−ｎ−ブチルホルムアミド基である。
【００３９】
特定のヌクレオシドの合成に関する簡略化したプロトコールを図８及び実施例８に記載する。一般的に、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン含有６−アミノ基の合成のための最初のステップにおいて６−メトキシ・ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンを合成する。次のステップにおいて、例えば、オリゴヌクレオチド合成のためにピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン・ホスホルアミド酸を使用する場合、アミノ官能基を保護するための保護基を結合させたアミノ基によりメトキシ基を交換する。驚いたことに、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１ａ及び２ａ（図８）は、オリゴヌクレオチド合成の最終ステップにおいて通常使用される脱保護の条件下でアミノ官能基へ変換される。さらに、６−メトキシ基の安定性は、オリゴヌクレオチド合成、例えばホスホルアミド酸モノマーに使用されうるヌクレオシド・モノマーの合成に必要なさらなる合成ステップをもたらす。そのため、ヌクレオシドの合成の間に保護されたアミノ官能基の導入は必要でなく、オリゴヌクレオチドを合成し、そしてオリゴヌクレオチドを脱保護する時のアミノ基によりメトキシ基を交換する場合、６−メトキシ・ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン・モノマーの使用が必要である。この工程を６−アミノ基を持つ関連のヌクレオシドの合成に使用することもできる。
【００４０】
本発明による核酸結合化合物は好ましくは１００サブユニット未満、より好ましくは１０〜３０サブユニットの長さを持つ。核酸結合化合物として活性であるために、前記置換基は、結合される核酸のヘテロ環式基に対する水素結合を好ましくは塩基対形成、例えばワトソン−クリック型又はブーグスティーン型塩基対形成により可能にするように選ばれるべきである。その置換基が前述の好ましい水素結合の不可能な化合物は核酸結合化合物の製造のための中間物質として有用である。本発明の好ましい核酸結合化合物は化学合成されるものである。
【００４１】
前記核酸結合化合物を核酸の測定のためのプローブとして使用するかあるいは化合物又は核酸のいずれか他の同定を意図する場合、その置換基のいずれかが例えばリポーター基を含むために選ばれる。付着されうるできるだけ多くのリポーター基は核酸結合化合物を十分に標識するために有用である一方で、そのプローブがハイブリダイゼーション・アッセイに有用でなくなるような、核酸の認識、核酸に対する親和性、及び可溶性への影響を受けないように１のサブユニットに対して限られた数のリポーター基だけが付着することが好ましい。非常に好ましい場合、各核酸結合化合物中に１〜４、最も好ましくは１又は２、あるいは最も好ましくはただ１つのリポーター基が存在する。プローブに付着された１以上のリポーター基を必要とする核酸測定のための形式がある。前述の形式に関する例はＷＯ９２／０２６３８に記載されている。この場合、１のリポーター基は蛍光エミッタであるのに対して、もう一方は蛍光クエンチャである。
【００４２】
リポーター基は一般的にその核酸結合化合物、並びにそこに結合されるあらゆる核酸を残り物の液体、すなわちサンプルから区別できるようにする基である（リポーター基を付着させた核酸結合化合物は、標識核酸結合化合物、標識プローブ又はただプローブとも呼ばれる）。この違いは、そのリポーター基が、直接的又は間接的に検出されうる基の群からか、あるいは固定化された基又は固定化されうる基の群から選ばれるかによりもたらされる。直接検出されうる基は、例えばフルオレセイン、並びにヘキサクロロフルオレセイン及びヘキサフルオロフルオレセインのようなその誘導体、ローダミン、ソラレン、スクアライン（squaraines）、ポルフィリン、蛍光粒子のような蛍光性化合物、アクリジニウム・エステル及びルミノールのような生物発光性化合物、又はＣｙ−５のようなシアニン色素である。前述の化合物の例はＥＰ  ０  ６８０  ９６９に記載されている。さらに、ＴＥＭＰＯのようなスピン標識、電子化学的に検出可能な基、フェロセン、ビオロゲン、ルテニウム、ビスピリジル複合体、及びナフトキノンのような重金属キレート及び電子化学発光標識、並びにダブシル（dabcyl）のようなクエンチャ色素、そして例えばＦｅ及びＣｕの核酸複合体が有用な検出可能な基である。前述の化合物の他の例はユーロピウム化合物である。間接的に検出されうる基は、直接的又は間接的に標識される他の部分により認識されうる基である。前述の間接的に検出しうる基の例はジゴキシゲニン又はビオチンのようなハプテンである。例えばジゴキシゲニンはジゴキシゲニンに対する抗体により認識される。それらの抗体は直接標識されるか又は（抗ジゴキシゲニン）抗体に対する標識抗体により認識されるかのいずれかである。ジゴキシゲニンの認識に基づく形式がＥＰ−Ｂ−０  ３２４  ４７４に開示されている。ビオチンはアビジン、及びストレプトアビジンのような類似化合物、そして他のビオチン結合化合物により認識される。同様にそれらの化合物も直接的又は間接的に標識される。
【００４３】
リポーター基はさらにサンプル中の他の核酸配列に干渉しないヌクレオチド配列でありうる。従って、前記配列は特に相補配列を含むヌクレオチドにより認識されうる。このヌクレオチド配列は直接的又は間接的に標識されるか、あるいは固定化されうるか又は固定化されている。
【００４４】
リポーター基はさらに固相でありうる。核酸結合化合物の固相への付着は、検出可能な基についての先の指摘のとおり直接的又は間接的である。前述の固相の例はラテックス・ビーズ又は金粒子である。
【００４５】
直接標識は固相上の官能基への、すなわち、好ましくはリンカーを介した核酸結合化合物の共有結合によりもたらされる。間接標識は、検出可能な基について先に開示されたのと同様に作製される。好ましくは、間接的付着は生物固有の相互作用、例えば、ハプテン抗体、ビタミン受容体、及び核酸に相補的な核酸の群から選ばれるものにより非共有的である。この場合も同様に、それらの相互作用及び核酸アッセイにおけるそれらの使用は当業者に知られている。
【００４６】
本発明によるプローブの固定に有用な固相は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ガラス、及びＴｉＯ2 の群から好ましくは選ばれる。前述の固相の形態は計測の必要性及びアッセイの形態により選ばれる。例えば、固相はビーズ又は容器の形をとる。
【００４７】
用語、リポーター基、そして特定の態様は、使用が意図される部分（固相そのもの又はフルオロリン部分）をリポーター基の付着部分につなぐために使用されるリンカーを好ましくは含む。リンカーは、その核酸結合化合物が固相による障害なしに測定すべき核酸配列を結合できるような自由度を与える。特に疎水性でないもの、例えばＤＥ  ３９４３５２２に記載のとおり、例えば連続的なエチレンオキシ単位に基づくリンカーが当業者に知られている。
【００４８】
以上の説明から、本発明は、プローブのバックボーンが厳密な意味でのオリゴヌクレオチドでない場合でさえ、なおも作用するであろうことが明らかになる。オリゴヌクレオチドのような類似の性質を有するが、しかしそれらのバックボーンが異なる核酸結合化合物が昨年示された。バックボーンは、同質又は異質のサブユニットに結合した塩基を担う、主に線形の様式の核酸結合化合物の一部であると一般的にみなされる。最もよく知られているバックボーンは（リボヌクレオシド・サブユニット（ＲＮＡ）、デオキシリボヌクレオシド・サブユニット（ＤＮＡ）又はペプチド核酸サブユニット（ＰＮＡ）のいずれかを含む）核酸の天然糖リン酸バックボーンである。従って、好ましい態様において、バックボーンは糖及びリン酸部分を含む。より好ましい態様において、糖の立体配置はα−Ｄ−、β−Ｄ−、α−Ｌ−、及びβ−Ｌ−立体配置から成る群から選ばれ、最も好ましくは、前記化合物は少なくとも１の２′−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル部分又は１のβ−Ｄ−リボフラノシル部分を含む。
【００４９】
好ましいアリール基は、置換されないか、又は１以上のアミノ、−アミノアルキル、−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、スルホニル、スルフェニル、スルフィニル、ニトロ、及びニトロソにより置換されるフェニル又はナフチル部分である。最も好ましいアリール基はフェニル基である。好ましいアリールアルキル基はベンジル基である。好ましいアルキルアミノ基はエチルアミノ基である。好ましい−ＣＯＯ（Ｃ1 〜Ｃ4 ）アルキル基はアルキル部分に１又は２の炭素を含む（メチル又はエチル・エステル）。
【００５０】
好ましくは、Ｄは本発明による化合物の糖部分であるグリコシドＣ−１である。
【００５１】
核酸結合化合物は、測定するべき核酸に十分に相補的である核酸塩基配列、又は塩基対形成によりそこに結合することが意図されている核酸を含むように構築される。そのような場合、核酸は天然核酸塩基Ａｄｅ、Ｃｙｔ、Ｇｕａ、及びＴｈｙ又はＵｒａのいずれかを少なくとも１度含み、本発明の核酸結合化合物もそれらの４の塩基のいずれかを含む。しかしながら、本発明により、少なくとも１のヘテロ環式基が式（Ｉ）のヘテロ環式基により置き換えられる。
【００５２】
本発明による核酸結合化合物は、好ましくは逆平行の状態で核酸に結合する。しかしながら、核酸及び／又は核酸結合化合物の核酸塩基を注意深く選ぶことにより、プローブとしてのその機能における結合は平行の状態にさせもする。イソ−Ｃ及びイソ−Ｇを含む核酸の平行ハイブリダイゼーションは、例えばＥＰ  ０  ６２４  １６１に開示されている。
【００５３】
好ましい核酸結合化合物はそのバックボーンが以下の一般式（II）：
【００５４】
【化２】
2008113669.tif 000003
【００５５】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、Ｎ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｌはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ2 −、及び−ＮＲ22−から成る群から選ばれ、
Ｔはオキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、
Ｕは−ＯＨ、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−Ｓリポーター基、−ＳｅＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、又はここで−ＮＲ23Ｒ24はＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｖはオキシ、スルファンジイル、−ＣＨ2 −又は−ＮＲ22−から成る群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−Ｏ−アリル、−Ｏ−アルキニル、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ23及びＲ24は−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2 ）c ］d −ＮＲ26Ｒ27、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1 〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2 、及び−ＣＯＯ（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルキル、並びにリポーター基から成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、及び−（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルコキシ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、並びにリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数であり、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）部分であり、
ここで、いずれのアルキル、アルケニル、及びアルキニルも置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができ、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数である。｝及びそのいずれかの塩の１以上の部分を含むものである。
【００５６】
別段の指示がない場合、式（Ｉ）の下で定められた基の好ましい定義は式（II）及び以下の式に適用される。
【００５７】
好ましくは、式（II）の化合物において、Ｒ14は水素である。Ｌの好ましい定義はオキシである。Ｕの好ましい定義は−ＯＨ及び−Ｏ−リポーター基である。Ｖの好ましい定義はオキシである。ｃの好ましい定義は２〜４の整数であり、そしてｄの好ましい定義は０〜２の整数である。
【００５８】
式（II）の化合物は、核酸結合化合物の（好ましくは終端の１つでなく）統合部分として本発明のヘテロ環部分を含むのに特に好適である。
【００５９】
基ＮＲ23Ｒ24は好ましくはジアルキルアミノ基から成る群から選ばれる。この基が５又は６員ヘテロ環式環の形成と一緒の場合、好ましくはモルホリニル、ピロリジニル又はピペリジニルの定義を前提とする。
【００６０】
従って、本発明の好ましい対象は先に概説した核酸結合化合物であり、ここでそのバックボーンは以下の一般式（III ）：
【００６１】
【化３】
2008113669.tif 000004
【００６２】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、保護基、及びリポーター基から成る群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ15は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、固相、及び以下の式（IV）：
【００６３】
【化４】
2008113669.tif 000005
【００６４】
｛式中、
Ｔはオキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、そして
Ｕは−ＯＨ、−Ｏ−リポーター基、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、又はここでＮＲ23Ｒ24がＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ23及びＲ24は−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2 ）c ］d −ＮＲ26Ｒ27から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1 〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2 、及び−ＣＯＯ（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、及び−（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルコキシ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ29は−ＯＲ30及び−ＳＲ30から成る群から選ばれ、
Ｒ30は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、固相、及びリポーター基から成る群から選ばれ、
ｃは２〜６の整数であり、
ｄは０〜６の整数である。｝の基から成る群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）部分との連結である。｝及びそのいずれかの塩の１以上の部分を含む。
【００６５】
定義及び選択について、詳細は、特に式（III ）について別段の指定がない限り、式（Ｉ）及び（II）の下で置換基について概説されたとおり適用される。
【００６６】
核酸結合化合物において、その化合物の３′末端でサブユニット、例えばヌクレオチドに付着する式（Ｉ）の基は、大型化合物の合成のための開始化合物として又は／及び末端標識プローブとして有用である。プローブの末端の位置は一般的に化学部分の付着の観点で最も寛容であるため、化合物のこの基は特に好ましい。
【００６７】
本発明のより好ましい対象は以下の式（Ｖ）：
【００６８】
【化５】
2008113669.tif 000006
【００６９】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ、保護基、リポーター基、及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルの基から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ16は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ8 ）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルキニル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ8 ）−アルキル、保護基、又は以下の式（IV）：
【００７０】
【化６】
2008113669.tif 000007
【００７１】
｛式中、
Ｔはオキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、
Ｕは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、ここでＮＲ23Ｒ24がＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ23及びＲ24は−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2 ）c ］d −ＮＲ26Ｒ27から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1 〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2 、及び−ＣＯＯ（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、及び−（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルコキシ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ29は−ＯＲ30及び−ＳＲ30から成る群から選ばれ、
Ｒ30は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、固相、及びリポーター基から成る群から選ばれる。｝の化合物から成る群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）部分との連結である、
ここで、全てのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換される。｝又はそのいずれかの塩のバックボーン部分を含む先に概説した核酸結合化合物である。
【００７２】
非常に好ましい化合物は、式（Ｖ）の化合物であり、ここでＭ′はＯであり、Ｒ16はＨであり、そしてＲ14は水素及びヒドロキシルから成る群から選ばれる。
【００７３】
これらの化合物は例えば５′末端標識プローブとして使用される。置換基の定義に関して、別段の指示がない限り先に与えられた定義を適用する。
【００７４】
核酸結合化合物のバックボーンは、その化合物が相補配列を有する核酸に結合しうるような塩基対形成ヘテロ環を担持するための機能を有する。好ましくは、天然塩基における相補性の程度は、結合すべき核酸の領域内の同じ長さの一帯に比べ、結合に影響する領域内の塩基の一帯の中の７０％〜１００％の範囲内であろう。従って、各配列内のサブユニットの欠失及び挿入は、この計算により、次の適合塩基までギャップとしてカウントされ、その結果ギャップ含有と同数の塩基分ずつ相補性が低下する。
【００７５】
好ましいバックボーンは糖−リン酸部分を含む。これらの中で、デオキシ糖含有バックボーンがより好ましい。
【００７６】
本発明の部分を含む、相補的配列の核酸と塩基対形成が可能な部分を担持するバックボーンの各部分はサブユニットと呼ばれる。化合物は異なる種類のサブユニットと混じり合ったバックボーンを持つことが知られている。最近、新種の非天然核酸結合化合物が示された。それらは、少なくとも１の、サブユニット間のペプチド結合を含むのでペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる（ＷＯ９２／２０７０２）。本発明の核酸結合化合物はあらゆる長さを持ちうる。しかしながら、化学合成の便宜のために、１００未満、より好ましくは１０〜３０サブユニットの長さの化合物、例えばヌクレオシドが好ましい。
【００７７】
本発明の核酸結合化合物は、自動合成デバイスの適当に使用した溶液中又は好ましくは固相上で製造される。オリゴマーはそれぞれの場合によりヌクレオチド塩基が適当な誘導体化支持体上、又はオリゴマー鎖の伸長の先に取り付く連続的なモノヌクレオチドの縮合により段階的に組み立てられうる。あるいは、核酸結合化合物はジヌクレオチド又はトリヌクレオチドを同時に連結することにより組み立てられうる（S. Beaucage et al., Tetrahedron, 48 (12), 2223-2311, (1992) ；及びTetrahedron, 48 (28), 6123-6194, (1993））。これは、修飾されたリン酸架橋を持つオリゴヌクレオチドを合成する時に特に有利である。
【００７８】
オリゴヌクレオチドは、当業者に知られた方法、例えばトリエステル法、Ｈ−ホスホン酸法又はホスホアミダイト法を用いて組み立てられうる（E. Sonvea ux, (1986), Bioorganic Chemistry, 14, 274-325 ; S.L. Beaucage et al., (1992), Tetrahedron, 48, 2223-2311）。
【００７９】
従って、本発明のさらなる対象は、少なくとも１の、式（Ｉ）の基を含むサブユニットであるところの活性化サブユニットを用いた本発明の核酸結合化合物の化学合成方法である。最も好ましい化学合成の方法はホスホアミダイト法を用いる。特に好ましい方法は１以上の、一般式（VII ）の化合物上の活性化サブユニットを用いる。この方法は非常に便利で、そして必要な試薬、例えば式（Ｉ）の基を含むホスホアミダイトは容易に包含されうる。
【００８０】
従って、本発明のさらなる対象は、以下の一般式（VII ）：
【００８１】
【化７】
2008113669.tif 000008
【００８２】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍ及びＭ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルの基から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＲ31、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジドＮＨＲ31、−ＳＲ31、Ｏ−リポーター基、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ31は保護基又はリポーター基であり、
Ｒ32及びＲ17は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールから成る群から独立して選ばれ、又はここでＮＲ32Ｒ17は５〜６員ヘテロ環式環として存在するＮと一緒に形成されることができ、
Ｒ18は−（Ｃ2 〜Ｃ6 ）−アルケニルオキシ、置換された又は置換されない−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、置換されない−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、又は−ハロゲンｐ−ニトロアリールオキシ及び−シアノから成る群から選ばれる基により１回以上置換された−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシから成る群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）の基であり、
上記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができ、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数である。｝の化合物であって、
ただし、
上記化合物は、２−［２′−デオキシ−５′−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−４−（メチルアミノ）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン３′−［メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］、４−（ベンゾイルアミノ）−２−［２′−デオキシ−５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］−ピリミジン３′−［メチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］又はＮ−［２−［５−Ｏ−［ビス（４−メトキシフェニル）フェニルメチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル］−３−メチル−７−オキソ−２Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］ピリミジン−５−イル］−２−メチル−プロパンアミド−３′−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］ではない。
【００８３】
式（VII ）の好ましいヌクレオチドモノマーの構造的要素はＸ5 がＮのものであり、好ましいものはＸ3 がＣＲ3 である、より好ましくはＣ−ＮＲ5 Ｒ6 である、最も好ましくはＣ−ＮＨ2 である化合物でもある。
【００８４】
式（VII ）の化合物は対応の８−グリコシル化ヌクレオシドからの処理によりオリゴヌクレオチド固相合成のための構造的要素として製造される。例えば、ハロゲン又はメチルにより７又は９位で置換される８−グリコシル化誘導体の調製はSeela et al. (Helv. Chim. Acta, (1994), 77, 897-903 ）により記載されるとおり７−デアザプリン誘導体の場合に実施される。式（VII ）のアルケニル又はアルキニル置換された８−グリコシル化ヌクレオシド誘導体を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｏ）の存在下、交差結合により６〜５員環系の７又は８位へのアルケニル又はアルキニル基の結合により製造する。求電子置換基（例えばハロゲン）が５〜６員基の７又は９位に導入される。これらのハロゲン化基は８−グリコシル化及び９−又は７−グリコシル化誘導体を得るためにＫＯＨ及びＴＤＡ−１の存在下、α−ハロゲノースによりアセトニトリル中グリコシル化される。前記ハロゲン化ヌクレオシドは次に前記パラジウム触媒交差結合反応による他の置換基、例えばアルキル、アルケニル又はアルキニル基の挿入のための開始化合物として使用される。アルコキシ誘導体又は置換されたアミン誘導体は求核置換により導入され、そして窒素基は求電子置換により導入される。
【００８５】
６位のアミノ基及び糖部分遊離の５′−ヒドロキシル基のための好適な保護基を導入した後、前記モノマーを対応のホスホン酸又はホスホアミダイトに転化させる。例えばアシル保護基（例えば、イソブチリル、アセチル又はフェノキシアセチル）の形態における好適なアミノ保護基は周知の方法を用いて挿入される（J.C. Schulhof, D. Molko, R. Teoule, (1987), Nucleic Acids Res., 15, 397-416 ）。糖の遊離５′−ＯＨ基に対する好適な保護基の例は、その挿入が既知の方法（C.B. Reese (1978), Tetrahedron, 34, 3143 ; D. Flockerzi et al., (1981), Liebigs Ann. Chem., 1568）を用いて同様にもたらされる４，４′−ジメトキシトリチル残基である。この方法により保護されたモノマーを、Froehler et al. (B.C. Froehler et al., (1986), Nucleic Acids Res., 14, 5399 ）によるプロトコールに従って対応のホスホン酸に転化させる。シアノエチル−ホスホアミダイト誘導体は、例えば前記モノマーを無水ジクロロメタン中でクロロ−β−シアノエトキシ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスファンと反応させることにより製造される（N.D. Sinha et al., (1984), Nucleic Acids Res., 12, 4539 ）。
【００８６】
本発明のさらなる対象は以下の一般式（IX）：
【００８７】
【化８】
2008113669.tif 000009
【００８８】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍ及びＭ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ、及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルの群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＲ31、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジドＮＨＲ31、−ＳＲ31、Ｏ−リポーター基、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ31は保護基又はリポーター基であり、
Ｒ32及びＲ17は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールから成る群から独立して選ばれるか又はここでＮＲ32Ｒ17はＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ18は−（Ｃ2 〜Ｃ6 ）−アルケニルオキシ、置換された又は置換されない−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、置換されない−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、あるいは−ハロゲン、ｐ−ニトロアリールオキシ、及び−シアノから成る群から選ばれる基により１回以上置換された−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシから成る群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）の基である。｝の化合物である。
【００８９】
それら化合物は化学合成において式（VII ）の化合物のように使用される。
【００９０】
本発明のさらなる対象は以下の一般式（Ｘ）：
【００９１】
【化９】
2008113669.tif 000010
【００９２】
｛式中、
Ｍ及びＭ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルの群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＲ31、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジドＮＨＲ31、−ＳＲ31、Ｏ−リポーター、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ31は保護基又はリポーター基であり、
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）の基である。｝の化合物である。
【００９３】
これらの化合物は先に触れた核酸結合化合物及びその前駆物質の化学合成に有用である。
【００９４】
長いオリゴマー及び天然バックボーンに基づくものにより好適な他の選択肢において、そのオリゴマーは酵素的に製造される。この場合、開始オリゴマーを、モノホスフェート又は修飾モノホスフェートをオリゴマーの末端に付着させるようにポリメラーゼ及びトリホスフェート又は修飾トリホスフェートと反応させ、それによりそのオリゴマーを伸長する。この方法についても、当業者はニック・トランスレーション法又は単純なプライマー伸長のようないくつかの利用可能な形式を知っているであろう（J. Sambrook. E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 ）。
【００９５】
従って、本発明のさらなる対象は、プライマー伸長のため鋳型として核酸を使用してトリホスフェートサブユニットをプライマーと反応させることを含む本発明による核酸結合化合物の酵素的合成方法であり、ここで上記トリホスフェート・サブユニットは式（Ｉ）のヘテロ環式基を含む。好ましくは前記トリホスフェート・サブユニットは以下の式（VI）：
【００９６】
【化１０】
2008113669.tif 000011
【００９７】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ−保護基、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ15及びＲ16は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ8 ）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルキニル、−（Ｃ2 〜Ｃ18）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ8 ）−アルキル、保護基、及び以下の式（IV）：
【００９８】
【化１１】
2008113669.tif 000012
【００９９】
｛式中、
Ｔはオキソ、チオキソ、及びセレノキソから成る群から選ばれ、そして
Ｕは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳｅＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−ＮＲ23Ｒ24、及び−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｒ25から成る群から選ばれ、又はここでＮＲ23Ｒ24がＮと共に５〜６員ヘテロ環式環であることができ、
Ｒ23及びＲ24は−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ20）−アリール、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−［ＮＨ（ＣＨ2 ）c ］d −ＮＲ26Ｒ27から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ25は−Ｈ、−ＯＨ、−ハロゲン、−アミノ、−（Ｃ1 〜Ｃ18）−アルキルアミノ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2 、及び−ＣＯＯ（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｒ26及びＲ27は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、及び−（Ｃ1 〜Ｃ4 ）−アルコキシ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から独立して選ばれ、
Ｒ29は−ＯＲ30及び−ＳＲ30から成る群から選ばれ、
Ｒ30は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、ホスフェート、ジホスフェート、及びリポーター基から成る群から選ばれる。｝の化合物から成る群から独立して選ばれ、
ただし、Ｒ15又はＲ16が式（IV）の化合物であり、そして
Ｍ及びＭ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ及び−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルの群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）の部分であり、
ここでいずれのアルキル、アルケニル、及びアルキニルも置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換されることができる。｝の化合物であって、
ただし、
上記化合物は８−アザ−７−デアザ−７−Ｈ−アデニン−Ｎ8 −β−Ｄ−リボフラノシル−５′−一リン酸又は８−アザ−７−デアザ−７−Ｈ−アデニン−Ｎ8 −β−Ｄ−リボフラノシル−５′−二リン酸ではない。
【０１００】
これらの化合物において最も好ましい−Ｍ′Ｒ16はトリホスフェート基であり、そして−ＭＲ15はＯＨである。最も好ましい化合物はＲ14が−Ｈであるものである。
【０１０１】
本発明による核酸結合化合物の酵素的合成に関して最も好ましい化合物は以下の式（VIII）：
【０１０２】
【化１２】
2008113669.tif 000013
【０１０３】
｛式中、
ＰＰＰはトリホスフェート基であり、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、及びＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ36は−Ｈ及び−ＯＨの群から選ばれ、そして
Ｂは（先に定めた）式（Ｉ）の基である。｝の化合物であって、
ただし、
上記化合物は、８−アザ−グアノシン−Ｎ8 −β−Ｄ−２′−３′−ジデスオキシ−グリセロペントフラノシルではない。
【０１０４】
他の好ましい態様において、式（VIII）の化合物における式（Ｉ）の基は、Ｘ5 がＮである式（Ｉ）の基から成る群から選ばれる。また、好ましくはＸ3 がＮＨ2 のようなＨ供与基に連結したＣである化合物である。
【０１０５】
例えば、式（VIII）による３′デオキシ−及び２′−３′−ジデスオキシ・トリホスフェートサブユニットは配列決定法における末端ヌクレオチドとして使用される。
【０１０６】
より好ましくは、酵素的合成に関する前述の方法はトリホスフェート・サブユニットとして先に定めた式（VIII）の化合物を使用する。
【０１０７】
先の方法により、ある核酸結合化合物中に、本発明の部分を含む１のモノマーだけでなく、場合によっては１より多く導入することが理論上可能である。これは核酸結合化合物の合成のための化学的方法を用いて特に可能である。
【０１０８】
前述のトリホスフェート・サブユニットの合成に関して、いくつかの方法が本技術分野で知られている（K. Burgess, D. Cook, Chem Rev. (2000), Vol 100, p.2047-2059 ）。当業者は、例えばLudwig, J., Acta Biochimica Biochim et Biophysica Acad. Sci. Hung., Vol.16, page 131-133に記載の方法を使用する。また、ポラメラーゼによるＤＮＡ内への類似のピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンの基質依存性の組み込みの成功が証明されている。
【０１０９】
これらの核酸化合物はハイブリダイゼーション法に有効に利用される。従って、本発明のさらなる対象は以下のステップ：
−  その核酸を含むことが推測されるサンプルを準備し、
−  上記核酸の一部又は全体と本質的に相補的な請求項１に記載の核酸結合化合物を準      備し、
−  上記核酸結合化合物が上記核酸に結合するための条件下、上記サンプルをその核酸      結合化合物と接触させ、
−  上記核酸の存在の指標としてその核酸と上記核酸結合化合物から形成された結合産      物を測定する、
を含む核酸の測定方法である。
【０１１０】
ハイブリダイゼーションによる核酸の測定方法は、例えばSambrook et al.（前掲）によって一般的に知られている。それらは本発明のプローブの使用を容易に取り込まれうる。
【０１１１】
好ましくは、式（Ｉ）のヘテロ環式基は、４の天然核酸塩基のそれぞれと塩基対形成が可能なユニバーサル塩基として使用される。これらのヘテロ環式基を含む核酸結合化合物は、例えばプローブ及びプライマーとして使用される。他の核酸結合化合物と同様に、それらはストリンジェントな条件下、それらの相補配列を持つ核酸とだけハイブリダイズする。しかし本発明によるユニバーサル塩基を含む位置では、核酸結合化合物はその配列に関係のない核酸とハイブリダイズする。従って、非特異的なハイブリダイゼーションが可能である。これは測定すべき核酸（標的核酸）の特定の位置で明確な天然塩基が知られていない場合に有用である。通常、当業者は、標的核酸が必ず測定されるように標的核酸の不明確な位置との塩基対形成の位置で可能性のある全ての相補ヌクレオチドを含むいくつかのプローブを製造する。本発明による核酸結合化合物を用いたその位置にユニバーサル塩基を含むたった１つのプローブで標的核酸とのハイブリダイゼーションをもたらすのに足りる。特に標的核酸のヌクレオチド配列がいくつかの位置で知られていない場合、２以上のユニバーサル塩基を含むプローブの使用は、全ての可能性のあるいくつかのプローブの使用よりも好ましい。従って、本発明によるプローブの使用は、遺伝子コードの重複が多数の可能性のある核酸配列をもたらすので、その配列がタンパク質配列から推測される場合に核酸の測定のための大きな助けとなりうる。
【０１１２】
本発明のプローブは、対立遺伝子又は配列が特定の位置で異なる配列を含むサブタイプに属することが知られている場合における核酸の測定をももたらす。１の例は細菌又はウイルス、例えばＨＣＶ、ＨＢＶ、及びＨＩＶのような病原体の測定である。しばしば、それらの病原体のサブタイプは、１種類だけのプローブを用いた１の属に属する全てのサブタイプの測定を妨げる、それらのゲノム内の特定の位置で異なる核酸配列を持つ。本発明によるユニバーサル塩基を含むプローブの使用はこの問題を解決する。
【０１１３】
他のユニバーサル塩基、例えばイノシンのような、本発明による塩基は全ての天然核酸塩基と対をなす。しかしながら、全ての天然塩基と対をなす本発明による前述の塩基の結合安定性は非常に類似している。従って、本発明によるユニバーサル塩基を含む核酸結合化合物が、ユニバーサル塩基（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）と対をなす位置を除いてそれぞれが同じ配列を持つ核酸とハイブリダイズする時、そのＴｍは非常に近い。本発明によるユニバーサル塩基を含む核酸結合化合物にハイブリダイズする定義された１２−ｍｅｒ（実施例６を参照のこと）を用いた時、そのΔＴｍは３℃であった。従って、これらのハイブリダイゼーション複合体の結合安定性は、既知の人為的な塩基、例えばイノシンに比べ天然塩基と本発明によるユニバーサル塩基の対に対して依存が少ない。
【０１１４】
プローブ又はプライマーに含まれる本発明によるユニバーサル塩基は対立遺伝子性の違い又は特定の位置に知られていない配列を有する核酸の検出のために使用される。ハイブリダイゼーション複合体のＴｍが、天然塩基と本発明によるユニバーサル塩基の対に対して依存が少ないので、本発明による核酸結合化合物は、部分的に未知の又は対立遺伝子の配列を含む核酸を測定するための多数のプローブ又はプライマーの必要を回避するだけでなく、それらはアッセイの信頼度を向上させ、そして使用する必要がある適当なハイブリダイゼーション条件の発見を容易にもする。
【０１１５】
本発明による核酸結合化合物は、測定すべき核酸が増幅されている場合の核酸測定法に適用されもする。Ｑｂ−増幅、ＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＴＭＡのようないくつかの方法が本技術分野で知られている。実施した方法はＰＣＲである。
【０１１６】
本発明による核酸結合化合物はプライマー及びプローブとして使用される。この場合、核酸結合化合物はプローブとして使用されるべきであり、好ましくは、検出可能なリポーター基を含む。その時、核酸結合化合物と核酸から形成されるあらゆるハイブリッドはその検出可能なリポーター基により測定される。アッセイのこの群はさらに２つの群、１つは均一性アッセイの群であり、そしてもう１つは不均一性アッセイに分けられる。不均一性アッセイにおいて、好ましくはハイブリッド（結合産物）は固相に結合した時に測定される。この態様は、あらゆる過剰なプローブ及び他の成分をそのハイブリッドから容易に除去できるため、測定を容易にする利点を有する。形成されたハイブリッドは共有的又は非共有的に、特異的又は非特異的に固相に捕捉される。当業者に知られているいくつかの態様が存在する。
【０１１７】
いわゆる均一性アッセイにおいて、形成されたハイブリッドは固相に結合しないが溶液中で直接的又は間接的のいずれかで測定される。このようなアッセイの好ましい例はＰＣＴ／ＵＳ９１／０５５７１に開示され、それを本明細書中に援用する。
【０１１８】
従って、本発明のさらなる対象は以下のステップ：
−  プライマー、つまりその核酸の第１結合配列に本質的に相補的な第１プライマー及      びこの核酸の相補鎖の結合配列に本質的に相補的な第２プライマー、並びに少なく      とも２の異なるリポーター基により異なるサブユニットで標識されている、上記プ      ライマーの結合配列の間の核酸又はその相補鎖に相補的なプローブを準備し、
−  上記プライマーの伸長に好ましい条件下、そのサンプルをそのプライマー及びプロ      ーブにさらし、そしてそのプローブの分解により互いに上記リポーター基を分離し      、そして
−  少なくとも１の上記リポーター基を介してプローブの分解の程度を測定する、
を含む、サンプル中の核酸の存在、不存在又はその量の測定方法であり、少なくとも１の上記プライマー又は／及びプローブが少なくとも１の式（Ｉ）のヘテロ環式基を含む核酸結合化合物であることを特徴とする。
【０１１９】
特に、いくつかの核酸結合化合物を用いる場合、例えばＰＣＲ法、多重ＰＣＲ法又は多重ハイブリダイゼーション法を実施する場合、低い安定性をも意味する低いＴｍによりもたらされるいくつかの特異的なハイブリダイゼーション複合体の遊離なしに良好な特異性を確保する適当なハイブリダイゼーション条件を見つけ出すことは多くの場合、困難である。診断方法の場合、これは回避すべき誤った陰性の結果を導きうる。さらなる困難は生物サンプル、例えば血液又は痰の複雑さにある。このようなサンプルは多くの場合、例えば誤った陽性の結果を導く測定法を妨げうるバックグラウンド核酸を持つ。従って、非常に特異的なアッセイの確立が必要であり、そしてこれらのアッセイにより形成される全てのハイブリダイゼーション複合体の近いＴｍが高く評価される。
【０１２０】
従って、式（Ｉ）のヘテロ環式基はアッセイにより形成される１以上のハイブリダイゼーション複合体のＴｍを変えるために多重ハイブリダイゼーション法にも使用される。そのアッセイに使用される核酸結合化合物に含まれる天然塩基の代わりに式（Ｉ）のヘテロ環式基を導入することにより、その標的核酸と形成されるハイブリダイゼーション複合体のＴｍを変化させる。前述のＴｍの変化は異なる温度でのその標的核酸と核酸化合物の特異的ハイブリダイゼーションをさらにもたらす。この方法は、サンプル中に存在する標的核酸に関するアッセイにより生じうるハイブリダイゼーション複合体のＴｍを等しくするために使用される。式（Ｉ）のヘテロ環式基の使用は、未知の又は対立遺伝子の配列を含む標的核酸と塩基対形成する核酸結合化合物の位置に制限されず、他の位置にも適用されうる。従って、これらのヘテロ環式基はユニバーサル塩基としてだけでなく、多重ハイブリダイゼーション法におけるＴｍ均等化塩基としても使用される。好ましい応用分野は、多くの場合、１００〜数千のハイブリダイゼーション・プローブを用いたチップによる多重ハイブリダイゼーション法である。
【０１２１】
本発明によるこれらのユニバーサル塩基は、例えばＰＣＲのような増幅法を用いたインビトロにおける突然変異誘発のためにも使用される。
【０１２２】
さらに、本発明は生理的に許容される賦形剤、そして適切な場合には好適な添加剤及び／又は慣用の補助物質と一緒に、少なくとも１の式（Ｉ）のヘテロ環式基を含む１以上の核酸結合化合物を含む医薬組成物に関する。ごく一般的な様式において、本発明は治療として有効な組成物への前述の核酸結合化合物の使用に及ぶ。このような組成物は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを形成する三本らせん、アプタマー又はリボザイム、特にアンチセンス・オリゴヌクレオチドとして本発明による核酸結合化合物を含むことを意味することが理解される。
【０１２３】
記載の核酸結合化合物の化学合成のための中間物質及び前駆物質をも本発明に含む。好ましい中間物質及び前駆物質を以下に記載する。
【０１２４】
好ましいものは、以下の一般式（VI）：
【０１２５】
【化１３】
2008113669.tif 000014
【０１２６】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍ及びＭ′はオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、保護基、及びリポーター基の群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＲ31、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、Ｏ−保護基、Ｓ−保護基、ＮＨ2 保護基、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルメルカプト、−ＮＨ2 、及びＯ−固相から成る群から選ばれ、
Ｒ15及びＲ16は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、保護基、及び固相から成る群から独立して選ばれ、
Ｂは以下の式（Ｉ）：
【０１２７】
【化１４】
2008113669.tif 000015
【０１２８】
｛式中、
Ｘ1 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ1 の群から選ばれ、そしてＸ2 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ1 はＣＲ1 であり、
Ｘ2 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ2 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ2 はＣＲ2 であり、
Ｘ3 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ3 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ2 のそれぞれがＮである場合、Ｘ3 はＣＲ3 であり、
Ｘ4 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35、及びＣＲ4 の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮＲ35である場合、Ｘ4 はＣＲ4 又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮである場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＣＲ34である場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ4 はＮ又はＣＲ4 であり、
Ｘ5 はＸ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣの群から選ばれ、
Ｘ6 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35及びＣＲ34の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮＲ35である場合、Ｘ6 はＣＲ34又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮである場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＣＲ4 である場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ6 はＮ又はＣＲ34であり、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、及びＲ34は−Ｈ、−ハロゲン、−ＯＲ13、−ＳＲ19、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−ＮＯ2 、−ＮＲ5 Ｒ6 、−シアノ、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ11から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ11は−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールオキシ、及びＮＨＲ12から成る群から選ばれ、
Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ19、及びＲ35は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
Ｄはこの基の前記バックボーンへの付着位置である。｝の部分と連結し、
上記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換され、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、
ここでＲ14、Ｒ15又はＲ16のいずれか１が固相である。｝の部分を含むバックボーンを含む核酸結合化合物の合成のための固相に結合した前駆物質である。
【０１２９】
前述の式（VI）の化合物は前駆物質として本発明による核酸結合化合物の化学合成に使用される。この場合、前記化合物は固相に凍結され、好ましくはＲ14がＯ−固相であるか又はＲ15若しくはＲ16が固相であり、最も好ましくはＲ15が固相である。反応基が保護基により保護されることも好ましい。
【０１３０】
そのバックボーンが以下の一般式（III ）：
【０１３１】
【化１５】
2008113669.tif 000016
【０１３２】
｛式中、
ＡはＯ、Ｓ、ＣＨ2 、及びＮ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキルから成る群から選ばれ、
Ｍはオキシ、スルファンジイル、−ＮＲ22−、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−又は−Ｏ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、及び−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル−Ｏ−、並びに−ＮＲ22−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル−Ｏ−から成る群から選ばれ、
Ｒ22は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、保護基、及びリポーター基の群から選ばれ、
Ｒ14は−Ｈ、−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルコキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニルオキシ、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニルオキシ、−ハロゲン、−アジド、−ＳＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキルメルカプト、Ｏ−リポーター基、Ｏ−固相、及び−ＮＨ2 から成る群から選ばれ、
Ｒ15は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルケニル−カルボニル、−（Ｃ3 〜Ｃ19）−アルキニル−カルボニル、−（Ｃ6 〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、固相から成る群から選ばれ、
Ｂは以下の式（Ｉ）：
【０１３３】
【化１６】
2008113669.tif 000017
【０１３４】
｛式中、
Ｘ1 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ1 の群から選ばれ、そしてＸ2 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ1 はＣＲ1 であり、
Ｘ2 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ2 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ2 はＣＲ2 であり、
Ｘ3 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ3 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ2 のそれぞれがＮである場合、Ｘ3 はＣＲ3 であり、
Ｘ4 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35、及びＣＲ4 の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮＲ35である場合、Ｘ4 はＣＲ4 又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮである場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＣＲ34である場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ4 はＮ又はＣＲ4 であり、
Ｘ5 はＸ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣの群から選ばれ、
Ｘ6 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35及びＣＲ34の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮＲ35である場合、Ｘ6 はＣＲ34又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮである場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＣＲ4 である場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ6 はＮ又はＣＲ34であり、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、及びＲ34は−Ｈ、−ハロゲン、−ＯＲ13、−ＳＲ19、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−ＮＯ2 、−ＮＲ5 Ｒ6 、−シアノ、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ11から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ11は−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールオキシ、及びＮＨＲ12から成る群から選ばれ、
Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ19、及びＲ35は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
Ｄはこの基の前記バックボーンへの付着位置である。｝の部分と連結し、
ここで全てのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換され、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、
ここで、Ｒ14がＯ−固相であるか又はＲ15が固相である。｝の部分を含む、核酸結合化合物の前駆物質又は中間物質も本発明中に含まれる。
【０１３５】
本発明による核酸結合化合物の化学合成のための固相は、増えた核酸結合化合物を固定するためのリンカーをも好ましくは含む。このようなリンカーが本技術分野で知られている。好ましくは前述のリンカーは合成後遊離の前述の核酸結合化合物に付着し、そして例えばその核酸結合化合物内に遊離の３′−ヒドロキシ基を生じるために使用されもする。前述のリンカーは本技術分野で知られる、例えばエステル及びアミド結合を介して結合したコハク酸である。好ましいＲ15は固相であるが、式（III ）による核酸結合化合物の化学合成のための前駆物質では、あるいはＲ14が固相でもありうる。前記化合物の反応基は好ましくは保護基により保護される。
【０１３６】
本発明による好ましい前駆物質及び中間物質のさらなる一般式は、少なくとも１の前述のヘテロ環式基が以下の一般式（Ｉ）：
【０１３７】
【化１７】
2008113669.tif 000018
【０１３８】
｛式中、
Ｘ1 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ1 の群から選ばれ、そしてＸ2 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ1 はＣＲ1 であり、
Ｘ2 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ2 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ3 のそれぞれがＮである場合、Ｘ2 はＣＲ2 であり、
Ｘ3 はＸ4 、Ｘ5 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣＲ3 の群から選ばれ、そしてＸ1 及びＸ2 のそれぞれがＮである場合、Ｘ3 はＣＲ3 であり、
Ｘ4 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35、及びＣＲ4 の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮＲ35である場合、Ｘ4 はＣＲ4 又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＮである場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ6 がＣＲ34である場合、Ｘ4 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ4 はＮ又はＣＲ4 であり、
Ｘ5 はＸ1 、Ｘ2 、Ｘ3 、Ｘ4 、及びＸ6 から独立してＮ及びＣの群から選ばれ、
Ｘ6 はＸ1 、Ｘ2 、及びＸ3 から独立してＮ、ＮＲ35及びＣＲ34の群から選ばれ、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮＲ35である場合、Ｘ6 はＣＲ34又はＮであり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＮである場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、
Ｘ5 がＣであり、そしてＸ4 がＣＲ4 である場合、Ｘ6 はＮＲ35であり、そして
Ｘ5 がＮである場合、Ｘ6 はＮ又はＣＲ34であり、
Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、及びＲ34は−Ｈ、−ハロゲン、−ＯＲ13、−ＳＲ19、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−ＮＯ2 、−ＮＲ5 Ｒ6 、−シアノ、及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ11から成る群から独立して選ばれ、
Ｒ11は−ＯＨ、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリールオキシ、及びＮＨＲ12から成る群から選ばれ、
Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ19、及びＲ35は−Ｈ、−（Ｃ1 〜Ｃ10）−アルキル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルケニル、−（Ｃ2 〜Ｃ10）−アルキニル、−（Ｃ6 〜Ｃ22）−アリール、保護基、固相、及びリポーター基から成る群から独立して選ばれ、
ｒ及びｓは互いに独立して１〜１８の整数であり、
Ｄはこの基の前記バックボーンへの付着位置であり、
上記アルキル、アルケニル、及びアルキニルは置換されないか、又は−ハロゲン、−ＳＨ、−Ｓ−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルキル、−（Ｃ1 〜Ｃ6 ）−アルコキシ、−ＯＨ、−ＮＲ5 Ｒ6 、−ＣＯＲ11、−ＮＨ−ＣＯＮＲ5 Ｒ6 、−ＮＨ−ＣＳＮＲ5 Ｒ6 、及び−［Ｏ−（ＣＨ2 ）r ］s −ＮＲ5 Ｒ6 から成る群から選ばれる１以上の部分により置換され、
ここで、上記バックボーンが固相に結合されているか又はＲ5 、Ｒ6 、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ19、及びＲ35の少なくとも１が固相である。｝の基であることを特徴とする付着したヘテロ環式基を有するバックボーンを含む化合物である。
【０１３９】
前記前駆化合物又は中間物質をバックボーンで固相に結合させる可能性に加え、それを上記化合物中に含まれる式（Ｉ）のヘテロ環式基で、例えば付着部位として−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＨ2 基を用いて連結することもできる。好ましくは、前述の化合物の他の反応基は保護基により保護される。
【実施例】
【０１４０】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する：
実施例
実施例１
合成に使用される物質は合成番号を用いて記載される。ユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドの合成を市販のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置により標準的なプロトコールを用いて行った。一般的に、オリゴヌクレオチドの合成はリン塩基を持つ中間物質を通して進む。有用な中間物質のいくつかの例を、Beaucage及びCaruthers (1981）によるホスホルアミド、並びにFroehler及びMatteucci (1986) によるＨ−ホスホン酸を含め図３に示す。
【０１４１】
４−（アミノ）−２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（１）を相転位グリコシル化を用いて最初に合成した（F. Seela, H. Steker Helv. Chim. Acta 1985, 68, 563）。メチル基、例えばチオフェノールの脱保護のための特別なステップを必要とするメチル保護ホスホルアミダイトを製造した（F. Seela, K. Kaiser Helv. Chim. Acta 1988, 71, 1813)。この構築物の６−アミノ官能基を、脱保護のより長い半減期を示すベンゾイル基により保護した（ＮＨ3 の２５％水溶液中、４０℃で２９０分）。この構築物はＰ（III ）オリゴヌクレオチド合成又は素早い脱保護手順の一般的なプロトコールに対応しない。
【０１４２】
現行のシアノエチル・ホスホルアミダイト・プロトコール及び素早い脱保護に完全に対応する新しい構築物の合成について、図４に見ることができる。イソブチリル基の脱保護の半減期は２２分であり、そしてアセチル基のそれは８分である（ともにアンモニアの２５％水溶液中、２０℃）。
【０１４３】
実施例２
４−（アセチルアミノ）−２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ｂ、図４）。ヌクレオシド１（図４を参照のこと）（１５０mg，０．６mol ）を無水ピリジンとの沸留去（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）により留去し、次にピリジン（４ml）中に溶解した。Ｍｅ3 ＳｉＣｌ（０．４ml，３．１mmol）の溶液を１５分間撹拌し、無水酢酸（０．２８ml，３．０mmol）で処理し、そして３時間室温に維持した。前記混合物を冷却し（氷浴）、そしてＨ2 Ｏ（１ml）により希釈した。１５分後、得られた物を水冷ＮＨ3 １０％水溶液により処理し、そしてさらに１５分間撹拌した。次にその溶液を留去し乾固させ、そして残渣をトルエン（２×１０ml）と共沸留去した。その残渣をＦＣ（カラム３×１０cm、溶媒（ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１））に適用した。表題の化合物３ｂを白色粉末として分離した（１１０mg，６２％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１）０．２；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２３９（ε／dm3 mol-1cm-1 ８４００），２７３（９３００），３０２（６７００）；（実測：Ｃ，４８．９９；Ｈ，５．２５；Ｎ，２３．６８．Ｃ12Ｈ15Ｎ5 Ｏ4 要求Ｃ，４９．１４；Ｈ，５．１６；Ｎ，２３．８８％）；δH ［２５０MHz ；（ＣＤ3 ）2 ＳＯ］２．２４（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ），２．４１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．６５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），３．５５（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．９４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．４３（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），４．９１（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．３，５′−ＯＨ），５．３７（１Ｈ，ｄ，Ｊ４．４，３′−ＯＨ），６．４６（１Ｈ，‘ｔ’，Ｊ６．１，１′−Ｈ），８．６０（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），８．９５（１Ｈ，ｓ，３−Ｈ）、及び１１．２２（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１４４】
実施例３
２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−４−（イソブチリルアミノ）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３ａ、図４）。化合物１（図４を参照のこと）（１．０ｇ，４．０mmol）をピリジン（２×２５ml）との共沸留去により乾燥させた。その残渣をピリジン（２５ml）中に懸濁し、そして室温でＭｅ3 ＳｉＣｌ（２．５ml，１９．７mmol）を加えた。１５分撹拌の後、その溶液を無水イソ酪酸（３．２６ml，１９．９mmol）により処理し、そして３時間室温に維持した。それを氷浴中で冷却し、Ｈ2 Ｏ（５ml）、そして続けて（５分後）ＮＨ3 の２５％水溶液（５ml）を加え、そして撹拌を１５分間続けた。その溶液を留去し乾固させ、Ｈ2 Ｏ（２５ml）中に溶解し、そしてジエチルエーテル（２×１５ml）により洗浄した。その水相を再び留去し乾固させ、最初にトルエン（２×２０ml）と、次にＭｅＯＨ（２×２０ml）と共蒸発させた。その残渣をＦＣ（カラム１２×２cm、溶媒（ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１））に適用して表題の化合物３ａを無色フォーム（ｃｏｌｏｕｒｌｅｓｓ  ｆｏａｍ）として得た（１．０５ｇ，８２％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１）０．２５；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２３９（ε／dm3 mol-1cm-1 ８１００），２７３（８９００），３０４（６５００）；（実測：Ｃ，５２．４８；Ｈ，６．０５；Ｎ，２１．７０．Ｃ14Ｈ19Ｎ5 Ｏ4 要求Ｃ，５２．３３；Ｈ，５．９６；Ｎ，２１．８０％）；δH ［２５０MHz ；（ＣＤ3 ）2 ＳＯ］１．１５（６Ｈ，ｓ，Ｍｅ2 ），２．４０（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．６７（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），２．９１（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．７，ＣＨ），３．６０（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．９３（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．４６（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），４．９０（１Ｈ，ｔ，Ｊ４．３，５′−ＯＨ），５．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ３．１，３′−ＯＨ），６．４８（１Ｈ，‘ｔ’，Ｊ５．５，１′−Ｈ），８．６１（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），９．００（１Ｈ，ｓ，３−Ｈ）、及び１１．２０（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１４５】
実施例４
２−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−４−（イソブチリルアミノ）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（４、図４を参照のこと）。イソブチリル保護ヌクレオシド３（図４を参照のこと）（１．０ｇ，３．１mmol）を無水ピリジン（２×２０ml）との共沸留去の繰り返しにより乾燥させ、そして無水ピリジン（２５ml）中に溶解した。次に４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル・クロライド（１．２２ｇ，３．６mmol）を加え、そしてその溶液を室温でアルゴン雰囲気下３時間撹拌した。その混合物を室温まで冷却し、ＭｅＯＨ（５ml）を加え、そしてその混合物をさらに３０分間撹拌した。次にその溶液を半分の容量まで減らし、ＣＨ2 Ｃｌ2 （１００ml）中に溶解し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（５０ml）、続けて飽和ＮａＣｌ溶液（５０ml）により２度抽出した。その有機層を脱水し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過し、留去し、そしてトルエン（３０ml）と２度共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、溶媒（ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン８：２））により精製して表題の化合物４を無色フォームとして得た（１．４６ｇ，７５％）。（実測：Ｃ，６７．３６；Ｈ，５．９８；Ｎ，１１．３０．Ｃ35Ｈ37Ｎ5 Ｏ6 要求Ｃ，６７．４０；Ｈ，５．９８；Ｎ，１１．２３％）；Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン８：２）０．３；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２３６（ε／dm3 mol-1cm-1 ２８５００），２７３（１１４００），３０５（６７００）；δH ［２５０MHz ；（ＣＤ3 ）2 ＳＯ］１．１１（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．９，Ｊ１０．４，（ＣＨ3 ）2 ），２．４３（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．８１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），２．９０（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．８，ＣＨ），３．１４（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．６６及び３．６９（６Ｈ，２ｓ，ＯＭｅ），４．０４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），５．４２（１Ｈ，ｄ，Ｊ５．０，３′−ＯＨ），６．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．４，Ｊ２．７，１′−Ｈ），６．７４（４Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．１１−７．２９（９Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），８．６２（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），９．０５（１Ｈ，ｓ，３−Ｈ）、及び１１．２２（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１４６】
実施例５
２−（２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−４−（イソブチリルアミノ）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３′−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］（２、図４を参照のこと）。無水ＣＨ2 Ｃｌ2 （４０ml）中、化合物４（図４を参照のこと）（８００mg，１．２８mmol）の溶液を空気によりプレ・フラッシュした。次にアルゴン雰囲気下で（ｉ−Ｐｒ）ＥｔＮ（０．４２ml，２．４８mmol）及び２−シアノエチル・ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４２ml，１．８８mmol）を加えた。反応をＴＬＣにより観察した。２０分間の撹拌の後、その反応混合物をＣＨ2 Ｃｌ2 （４０ml）により希釈し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（２×２０ml）、続いて飽和食塩水（２０ml）により洗浄した。その有機層を脱水し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、留去し、そしてＣＨ2 Ｃｌ2 （２×２０ml）と共沸留去した。そのジアステレオマー残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、溶媒（ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１））により精製して表題のホスホルアミダイト５（図４）を無色フォームとして得た（８４０mg，７８％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１）０．５及び０．６；δP ［１０１MHz ；ＣＤＣｌ3 ］１４９．５及び１４９．７。
【０１４７】
実施例６
表１に示されるオリゴヌクレオチドをホスホルアミダイト化学の一般的なプロトコールに従い、オリゴヌクレオチドの固相合成により合成した。そのオリゴマーをＨＰＬＣにより精製し、そしてそのヌクレオシド組成を逆相ＨＰＬＣ、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ、続いてアルカリホスファターゼによる酵素的加水分解により決定した。前記オリゴヌクレオチドは１又は２のユニバーサル・ヌクレオシド１残基を含む（図４を参照のこと）。それらをハイブリダイズさせ、そして熱変性特性を測定した。５′−ｄ（Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ）（Ｒ１）及び３′−ｄ（Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ）（Ｒ２）は修飾ヌクレオシドのハイブリダイゼーション特性を詳細に詰めるためにこれらの研究に一般的に使用される標準オリゴヌクレオチドである（F. Seela, I. Muenster, U. Loechner, H. Rosemeyer, Helv. Chim. Acta (1998), Vol 81, p 1139-1155）。前記配列はヘアピン又は三本鎖のような他の構造を排除できるように設計されている。４の天然ヌクレオシドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴのそれぞれに向かい合った１又は２の８−アザ−７−デアザ−Ｎ8 −２′−デオキシアデノシン（Ａ* ）残基を含むオリゴヌクレオチドについてのＴｍ値を（F. Seela, C. Wei, Helv. Chim. Acta (1999), Vol 82, p.726-745）の記載に従って計測した。その結果を表１に示す。
【０１４８】
【表１】
2008113669.tif 000019
【０１４９】
【表２】
2008113669.tif 000020
【０１５０】
表１によれば、４の天然ヌクレオシドｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴのそれぞれに向かい合う、オリゴマーＲ１及びＲ２の中心部分への１のユニバーサル・ヌクレオシドの挿入（図４を参照のこと）は、Ｔｍ値のごくわずかな変化しか示さなかった。４の非修飾ヌクレオシドのそれぞれに対する第１の修飾オリゴヌクレオチド（８９）の間のメルティング・ポイントの違いは０℃〜３℃である。同様の特徴が、２のユニバーサルヌクレオシド残基を４の通常ＤＮＡの構築物と向かい合わせて組み込んだ時に観察される。このような結果は全く考えられもしなかった。可能性のある二本鎖構造（図５）の最近の研究は、ｄＧ−ｄＣ対のように３箇所ではなく、ｄＡ−ｄＴ対の２箇所であるところの２箇所の水素結合を全てが含む塩基対が形成されるであろうことを示した。糖付着部位の間隔は、ピリミジン塩基（ｄＣ又はｄＴ）が通常のグリコシル化部位を提示し、そして「プリン・ベースの」塩基のグリコシリル化部位が８位である場合、ほぼ同一である。
【０１５１】
実施例７
７−デアザ−グアノシン−Ｃ8 −２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシドのホスホルアミダイトの合成を以下に説明する（図６も参照のこと）。
【０１５２】
２−イソブチリルアミノ−６−（β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（５、図６）。化合物２ａ（２−アミノ−６−β−Ｄ−リボフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン、Girgis et al., J. Med. Chem., Vol.33, p.2750-2755, 1990)（５２０mg，１．８４mmol）をピリジン（２×１０ml）との共沸留去により乾燥させた。その残渣をピリジン（５ml）中に溶解し、そして室温でＭｅ3 ＳｉＣｌ（３．０ml，２３．６mmol）を加えた。１５分間の撹拌の後、その溶液を無水イソ酪酸（０．４ml，３．８２mmol）により処理し、そして６時間室温に維持した。その溶液を氷浴中で冷却し、Ｈ2 Ｏ（３ml）、そして続けて（５分後に）ＮＨ3 の２５％水溶液（３ml）を加え、その間１５分間撹拌を続けた。その溶液を留去し乾固させ、Ｈ2 Ｏ（２０ml）中に溶解し、そしてエーテル（２×１０ml）により洗浄した。その水層を再び留去し乾固させ、そして最初にトルエン（２×１０ml）と、次にＭｅＯＨ（２×１０ml）と共沸留去した。その残渣をＦＣ（カラム１０×２cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ８：２，ｖ／ｖ）に適用して表題の化合物５（図６）を黄白色粉末として得た（４７０mg，７２％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ８：２，ｖ／ｖ）０．３；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７５（ε／dm3 mol-1cm-1 １６６００），２９４（１５０００sh）；（実測：Ｃ，５１．２３；Ｈ，５．８２；Ｎ，１５．９５．Ｃ15Ｈ20Ｎ4 Ｏ6 要求Ｃ，５１．１３；Ｈ，５．７２；Ｎ，１５．９０％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．８，Ｍｅ2 ），２．７６（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．８，ＣＨ），３．５１（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ），３．５７（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ），３．７８（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），３．９７（２Ｈ，ｍ，２′−Ｈ，３′−Ｈ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ６．３，１′−Ｈ），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ４．６，３′−ＯＨ），４．９２（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．８，５′−ＯＨ），５．０６（１Ｈ，ｄ，Ｊ５．８，２′−ＯＨ），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ１．４，５−Ｈ），１１．３４（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），１１．６０（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）、及び１１．７８（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１５３】
２−イソブチリルアミノ−［３，５−（１，１，３，３−テトライソプロピル−１，３−ジシロキサン−１，３−イル）−６−β−Ｄ−リボフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（６）。無水ピリジン（６ml）中、化合物２（５００mg，１．４２mmol）の溶液に、アルゴン雰囲気下、１，３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（０．５５ml，１．７１mmol）を加えた。この反応混合物を室温で一晩撹拌し、そしてＮａＨＣＯ3 ５％水溶液（２５ml）、続いて飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ml）により２度抽出した。その有機層を脱水（Ｎａ2 ＳＯ4 ）し、ろ過し、留去し、そしてトルエン（２０ml）と２度共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９５：５，ｖ／ｖ）により精製して表題の化合物６（図６）を無色のフォームとして得た（４８５mg，５８％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９５：５）０．５；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７５（ε／dm3 mol-1cm-1 １７２００），２９３（１５７００sh）；（実測：Ｃ，５４．５１；Ｈ，７．８８；Ｎ，９．５１．Ｃ27Ｈ46Ｎ4 Ｏ7 Ｓｉ2 要求Ｃ，５４．５２；Ｈ，７．７９；Ｎ，９．４２％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］０．８９−１．０４（２８Ｈ，ｍ，（ＣＨＭｅ2 ）4 ），１．１２（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．７，Ｍｅ2 ），２．７７（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．７，ＣＨ），３．８７（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ），３．９１（１Ｈ，ｍ，５′−Ｈ），３．９４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．１５（１Ｈ，ｄ‘ｔ’，Ｊ５．０，Ｊ３．５，２′−Ｈ），４．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．０，Ｊ６．７，３′−Ｈ），４．７１（１Ｈ，ｄ，Ｊ３．０，１′−Ｈ），５．０３（１Ｈ，ｄ，Ｊ５．３，２′−ＯＨ），６．３５（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），１１．３４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），１１．６７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）、及び１１．７４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）。
【０１５４】
２−イソブチリルアミノ−［２−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−３，５−（１，１，３，３−テトライソプロピル−１，３−ジシロキサン−１，３−イル）−６−β−Ｄ−リボフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７ａ）。無水アセトニトリル（６５ml）中、化合物６（図６）（１．７１ｇ，２．８８mmol）及び４−ジメチルアミノピリジン（２．１ｇ；１７．２mmol）の懸濁液にアルゴン雰囲気下、フェニルクロロチオンホルメイト（０．４８ml，３．４８mmol）を加えた。その反応混合物を室温で一晩撹拌した後、それを留去し乾固させ、そしてＣＨ2 Ｃｌ2 （５０ml）により溶解した。その有機相を１Ｎ冷塩酸（２０ml）、水（２０ml）、及びＮａＨＣＯ3 の飽和水溶液（２０ml）により２度洗浄した。その有機層を脱水し（ＮａＳＯ4 ）、そして溶媒を留去し乾固させた。２つの主な成分の混合物であるその残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン  ９：１，ｖ／ｖ）により精製した。移動の遅い主要産物を無色フォームとして得、そして表題の化合物７ａ（図６）と特徴づけた（１．０ｇ，４８％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１）０．６；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７４（ε／dm3 mol-1cm-1 １８０００），２９４（１６２００sh）；（実測：Ｃ，５６．００；Ｈ，６．８２；Ｎ，７．６０．Ｃ34Ｈ50Ｎ4 Ｏ8 ＳＳｉ2 要求Ｃ，５５．８６；Ｈ，６．８９；Ｎ，７．６６％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］０．９５−１．０３（２８Ｈ，ｍ，（ＣＨＭｅ2 ）4 ），１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．９，Ｍｅ2 ），２．７７（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．９，ＣＨ），３．９０（１Ｈ，ｍ，５″−Ｈ），４．００（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ，４′−Ｈ），４．６６（１Ｈ，ｄ‘ｔ’，Ｊ６．４，３′−Ｈ），５．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ２．８，１′−Ｈ），５．９０（１Ｈ，‘ｔ’，Ｊ４．２，１′−Ｈ），７．１２（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．９，ａｒｏｍ．Ｈ），７．３３（１Ｈ，ｔ，Ｊ７．２，ａｒｏｍ．Ｈ），７．４８（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．５，ａｒｏｍ．Ｈ），１１．３６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ），１１．８１（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）、及び１１．８７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１５５】
２−イソブチリルアミノ−７−フェノキシチオカルボニル［２−Ｏ−フェノキシチオカルボニル−３，５−（１，１，３，３−テトライソプロピル−１，３−ジシロキサン−１，３−イル）−６−β−Ｄ−リボフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（７ｂ、図６）。前記合成手順の速く移動する副産物を黄色粉末として得（２５０mg，１０％）、そして化合物７ｂと特徴づけした。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１）０．８；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７２（ε／dm3 mol-1cm-1 ２０９００），２９５（１５６００sh）；（実測：Ｃ，５６．８９；Ｈ，６．１６；Ｎ，６．４１．Ｃ41Ｈ54Ｎ4 Ｏ9 Ｓ2 Ｓｉ2 要求Ｃ，５６．７９；Ｈ，６．２８；Ｎ，６．４６％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］０．９７−１．０８（２８Ｈ，ｍ，（ＣＨＭｅ2 ）4 ），１．１３（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．４，Ｍｅ2 ），２．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ６．８，ＣＨ），３．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．９，４′−Ｈ），４．０１（１Ｈ，ｄ，Ｊ１２．１，５′−Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｄ，Ｊ１２．７，５″−Ｈ），４．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ８．９，Ｊ４．５，３′−Ｈ），５．７８（１Ｈ，ｓ，１′−Ｈ），６．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ４．５，２′−Ｈ），６．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．６，ａｒｏｍ．Ｈ），６．８８（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），７．２９（１Ｈ，ｔ，Ｊ７．３，ａｒｏｍ．Ｈ），７．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ８．３，ａｒｏｍ．Ｈ），７．４１（２Ｈ，ｔ，Ｊ８．０，ａｒｏｍ．Ｈ），７．４５（１Ｈ，ｔ，Ｊ８．３，ａｒｏｍ．Ｈ），７．５７（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．６，ａｒｏｍ．Ｈ），１１．４４（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）、及び１２．１８（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）。
【０１５６】
２−イソブチリルアミノ−［３，５−（１，１，３，３−テトライソプロピル−１，３−ジシロキサン−１，３−イル）−６−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（８）。無水トルエン（６０ml）中、化合物７ａ（１．０６ｇ，１．４５mmol）の溶液にアルゴン雰囲気下、２，２′−アゾビス（２−メチルプロピオニトリル）（ＡＩＢＮ，１２０mg，０．７３mmol）及び水素化トリ−ｎ−ブチルチン（ｔｒｉ−ｎ−ｂｕｔｙｌｔｉｎ  ｈｙｄｒｉｄｅ）（３．８ml，１４．１mmol）を加えた。前記反応フラスコを予熱した油浴（７０℃）中に置いた。２時間後、その混合物を室温まで冷却し、そして溶媒を留去した。油性残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９５：５，ｖ／ｖ）に適用して表題の化合物８（図６）を無色フォームとして得た（７５５mg，９０％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ）０．４；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７４（ε／dm3 mol-1cm-1 １７２００），２９３（１５５００）；（実測：Ｃ，５６．２１；Ｈ，８．１５；Ｎ，９．６３．Ｃ27Ｈ46Ｎ4 Ｏ6 Ｓｉ2 要求Ｃ，５６．０２；Ｈ，８．０１；Ｎ，９．６３％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］０．９９−１．０２（２８Ｈ，ｍ，（ＣＨＭｅ2 ）4 ），１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．６，Ｍｅ2 ），２．１８（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．４１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），２．７６（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．５，ＣＨ），３．７５（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．９５（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．５１（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），５．０２（１Ｈ，ｔ，Ｊ７．２，１′−Ｈ），６．３７（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），１１．３６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），１１．７０（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）、及び１１．７７（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１５７】
２−イソブチリルアミノ−６−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（９、図６）。ＴＨＦ（１０ml）中、化合物８（８６５ｇ，１．５０mmol）の溶液にＴＨＦ中、フッ化テトラブチルアンモニウムの１Ｎ溶液（８ml，８mmol）を加えた。その混合物を室温で３時間撹拌し、そして溶媒を留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１，ｖ／ｖ）に適用して表題の化合物９を無色の粉末として得た（４１０mg，８２％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１）０．２５；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７２（ε／dm3 mol-1cm-1 １５９００），２９１（１４２００）；（実測：Ｃ，５３．５４；Ｈ，５．９４；Ｎ，１６．６３．Ｃ15Ｈ20Ｎ4 Ｏ5 要求Ｃ，５３．５７；Ｈ，５．９９；Ｎ，１６．６６％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．９，Ｍｅ2 ），２．０１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．１１（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），２．７６（１Ｈ，ｈ，Ｊ７．０，ＣＨ），３．４５（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．７４（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．２０（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），４．７９（１Ｈ，ｔ，Ｊ４．２，５′−ＯＨ），５．０２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ１０．１，Ｊ５．７，１′−Ｈ），５．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ３．５，３′−ＯＨ），６．３５（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），１１．３３（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），１１．６３（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）、及び１１．７６（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１５８】
２−イソブチリルアミノ−６−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン（１０、図６）。化合物９（３５０mg，１．０４mmol）を無水ピリジン（２×１０ml）との繰り返しの共沸留去により乾燥し、そして無水ピリジン（１５ml）中に溶解した。次に４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル・クロライド（４０７mg，１．２mmol）を加え、そしてその溶液を室温でアルゴン雰囲気下、３時間撹拌した。その混合物を室温まで冷却し、ＭｅＯＨ（３ml）を加え、そしてその混合物をさらに３０分間撹拌した。次にその溶液を半分の容量まで減少させ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （５０ml）により抽出し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（２５ml，２回）により、続けて飽和ＮａＣｌ溶液（２５ml）により洗浄した。その有機層を乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過し、留去し、そしてトルエン（２０ml）と共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９：１，ｖ／ｖ）により精製して表題の化合物１０を無色フォームとして得た（４８０mg，７４％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −ＭｅＯＨ  ９５：５，ｖ／ｖ）０．２；λmax （ＭｅＯＨ）／nm  ２７２（ε／dm3 mol-1cm-1 １５７００），２９４（１３２００）；（実測：Ｃ，６７．７０；Ｈ，６．０４；Ｎ，８．７２．Ｃ36Ｈ28Ｎ4 Ｏ7 要求Ｃ，６７．７０；Ｈ，６．００；Ｎ，８．７７％）；δH ［２５０MHz ；ｄ6 −ＤＭＳＯ］１．１１（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．６，Ｍｅ2 ），２．１０（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．１８（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），２．７６（１Ｈ，ｈ，Ｊ６．６，ＣＨ），３．０２（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．７２（６Ｈ，ｓ，Ｍｅ2 ），３．９１（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），４．１６（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），５．１０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ９．０，Ｊ６．４，１′−Ｈ），５．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ３．５，３′−ＯＨ），６．３６（１Ｈ，ｓ，５−Ｈ），６．８２−６．８７（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍ．Ｈ），７．１７−７．３９（９Ｈ，ｍ，ａｒｏｍ．Ｈ），１１．３８（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），１１．７７（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ）、及び１１．７９（１Ｈ，ｓ，ＮＨ）。
【０１５９】
２−イソブチリルアミノ−６−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４（３Ｈ）−オン３′−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト（４）。無水ＣＨ2 Ｃｌ2 （３０ml）中、化合物１０（５３０mg，０．８３mmol）の溶液をアルゴンによりプレ・フラッシュした。次に（ｉ−Ｐｒ）2 ＥｔＮ（０．２７ml，１．５９mmol）及び２−シアノエチル・ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．２７ml，１．２１mmol）をアルゴン下で加えた。その反応をＴＬＣにより観察した。２０分間の撹拌の後、その反応混合物をＣＨ2 Ｃｌ2 （３０ml）により希釈し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（２×１５ml）、続いて飽和食塩水（１５ml）により洗浄した。その有機層を乾燥し（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、留去し、そしてＣＨ2 Ｃｌ2 （２×２０ml）と共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、４×１０cm、ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン８：２，ｖ／ｖ）により精製して表題の化合物４を無色フォームとして得た（５４０mg，７８％）。Ｒf （ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１，ｖ／ｖ）０．７，０．７５；δH ［１０１MHz ；ＣＤＣｌ3 ］１４８．８及び１５０．９。
【０１６０】
【表３】
2008113669.tif 000021
【０１６１】
実施例８
アミノ官能基の前駆物質としてメトキシ基を伴うホスホルアミダイト（４、図１０）の合成。
【０１６２】
結果
ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン１ａ及び２ａ（図８)（F. Seela, H. Steker, Helv. Chim. Acta 1985, 68, 563-570）のメトキシ基はオリゴヌクレオチドのレベルでアミノ官能基に容易に変換される。よって、メトキシ・ホスホルアミダイト４（図１０）は固相オリゴヌクレオチド合成によりＤＮＡ内に１ｂ又は２ａ（図８）を組み込むための前駆物質として使用される。メトキシ基の変換はアンモニアによるオリゴヌクレオチドの脱保護の間に起こる。メトキシ−アミノ変換の半減期値を、４０℃でアンモニアの２５％水溶液によりＵＶ分光光度法で測定した。その半減期値については表３及び図９を参照のこと。次に４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル基を５′−ＯＨの位置に導入し、そして化合物３（図１０）を標準的なプロトコールを用いてβ−シアノエチル・ホスホルアミダイト４（図１０）に変換した（図１０）。ホスホルアミダイト４（図１０）のカップリング産生は少なくとも９９％になるまで見られた。
【０１６３】
【表４】
2008113669.tif 000022
【０１６４】
試作品
２−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−４−メトキシ−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン（３、図１０）。化合物１ａ（図１０，４１０mg，１．５４mmol）を無水ピリジン（２×１０ml）との共沸留去の繰り返しにより乾燥させ、そして無水ピリジン（１０ml）中に溶解した。次に４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル・クロライド（６２０mg，１．８３mmol）を加え、そしてその溶液をアルゴン下、室温で３時間撹拌した。次に、ＭｅＯＨ（２ml）を加え、そしてその混合物をさらに３０分間撹拌した。次に、その溶液を半分の容量まで減少させ、ＣＨ2 Ｃｌ2 （５０ml）中に溶解し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（２０ml）、続いて飽和食塩水（２０ml）により２度抽出した。その有機層を乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、ろ過し、留去し、そしてトルエン（２０ml）と２度共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、３×１０cm、溶媒ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン８：２）により精製した。化合物３を無色フォームとして得た（６８０mg，７８％）。ＴＬＣ（ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン８：２，ｖ／ｖ）：０．５；ＵＶ（ＭｅＯＨ）：２３５（２７８００），２７３（１２１００），３０４（７３００）； 1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 −ＤＭＳＯ）：２．４４（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈα），２．７５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），３．１６（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．６９（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ），３．７０（３Ｈ，ｓ，Ｍｅ），４．０５（４Ｈ，ｍ，Ｍｅ，４′−Ｈ），４．５２（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），５．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，３′−ＯＨ），６．４２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１′−Ｈ），６．７４−６．８１（４Ｈ，ｍ，ａｒｏｍ．Ｈ），７．１７−７．３２（９Ｈ，ｍ，ａｒｏｍ．Ｈ），８．５６（１Ｈ，ｓ，３−Ｈ），８．７９（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ）．Ｃ32Ｈ32Ｎ4 Ｏ6 （５６８．６２）に関する分析計算：Ｃ，６７．５９；Ｈ，５．６７；Ｎ，９．８５．実測：Ｃ，６７．３９；Ｈ，５．５８；Ｎ，９．７６。
【０１６５】
２−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−４−メトキシ−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３′−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］（４、図１０）。無水ＣＨ2 Ｃｌ2 （３０ml）中、化合物３（図１０、５１０mg，０．９０mmol）の撹拌溶液をアルゴンによりプレ・フラッシュした。次に、（ｉ−Ｐｒ）2 ＥｔＮ（０．３０ml，１．７２mmol）及び２−シアノエチル・ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．３０ml，１．３４mmol）をアルゴン下で加えた。その反応をＴＬＣにより観察した。２０分間の撹拌の後、その反応混合物をＣＨ2 Ｃｌ2 （３０ml）により希釈し、そしてＮａＨＣＯ3 の５％水溶液（２×２０ml）、続いて飽和食塩水（２０ml）により洗浄した。その有機層を乾燥させ（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、留去し、そしてＣＨ2 Ｃｌ2 （２×２０ml）と共沸留去した。その残渣をＦＣ（シリカゲル、３×１０cm、溶媒ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１）により精製して表題の化合物４を無色フォームとして得た（６００mg，８７％）。ＴＬＣ（ＣＨ2 Ｃｌ2 −アセトン９：１，ｖ／ｖ）：０．６，０．７；31Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ）：１５０．２，１５０．５．Ｃ41Ｈ49Ｎ6 Ｏ7 Ｐ（７６８．８４）に関する分析計算：Ｃ，６４．０５；Ｈ，６．４２；Ｎ，１０．９３．実測：Ｃ，６４．１９；Ｈ，６．４２；
実施例９
４−（アミノ）−２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン５′一リン酸の合成
４０mg（０．１６mmol）の４−（アミノ）−２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンを４mlのリン酸トリエチル中に溶解し、そして８７μｌのジイソプロピル・エチル・アミンを加えた。そのフラスコを氷浴中で０〜４℃まで冷却し、１２μｌのホスホルオキシクロライドを加えた。０〜４℃で１０分間撹拌の後、トリエチルアミン／酢酸バッファー０．１Ｍ，pH８．５を加えた。溶媒をロータリー・エバポレーターを用いて４０℃、０．１mbarで留去した。その残渣を２０mlの水の中に溶解し、そしてイオン交換体ＤＥＡＥセファデックスＡ２５Ｃｌ- を充填したカラム（ｄ＝１６mm，ｌ＝１５０mm）に適用した。バッファーＡは水、バッファーＢは０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、６０分で１００％Ｂまでのグラジエント、２７０nmでＵＶ／ＶＩＳ検出器により観察。前記産物を４０％のＢで溶出した。対応の画分を採集し、そして減圧下で１〜３mlの容量まで留去した。産物溶液を８０mlのアセトン／エタノールの２：１混合物に加えた。その懸濁液を遠心分離し、得られたペレットをアセトンにより３回洗浄してＬｉＣｌを除去し、次に高真空中で乾燥させた。収量：３０mg。31Ｐ  ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ３００、溶媒Ｄ2 Ｏ）（ppm ）：５．０４３（ｓ）。
【０１６６】
実施例１０
４−（アミノ）−２−（２−デオキシ−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン５′三リン酸の合成
３０mg（０．１１mmol）の一リン酸リチウム塩をＤｏｗｅｘ  ＷＸ８カラムを用いたイオン交換によりトリＮ−ブチルアンモニウム塩に変換した。そのトリＮ−ブチルアンモニウム塩を３mlの無水ＤＭＦ中に溶解した。８９mg（０．５５mmol）カルボニルジイミダゾールを加えた混合物を室温で２時間撹拌した。０．５mlのメタノールを加え、そしてその混合物を室温で２０分間撹拌した。メタノールを減圧下の留去により除去した。次にＤＭＦ（０．５５mmol）中、ピロリン酸ビストリブチルアンモニウムの０．８Ｍ溶液０．７mlを加えた。その混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒をロータリー・エバポレーターを用いることにより４０℃、０．１mbarで留去した。脱塩のために、その混合物を酢酸を用いてpH３まで酸性化し、Ｃａｒｂｏｒａｆｆｉｎ−Ｐを充填したカラム（ｄ＝１４mm，ｌ＝１３０mm）に適用した。それを２００mlの水により、次に２００ml希釈アンモニア（１０００mlの水＋６mlのｋｏｎｚアンモニア）により溶出した。前記三リン酸塩を含むアンモニア溶液を減圧下で留去した。
【０１６７】
さらに精製するために、未処理の産物を１０．０ml中に溶解し、そしてイオン交換体ＱＡＥセファデックスＡ２５Ｃｌ- を充填したカラム（ｄ＝１６mm，ｌ＝１５０mm）に適用した。バッファーＡは水、バッファーＢは０．５Ｍ  ＬｉＣｌ、２０分間０％Ｂ、次に６０分で１００％Ｂまでのグラジエント、２６０nmでＵＶ／ＶＩＳ検出器により観察。産物を４９％Ｂで溶出した。対応の画分を採集し、そして２mlの容量まで減圧下で留去した。産物溶液を８０mlのアセトン／エタノールの２：１混合物に加えた。その懸濁液を遠心分離し、得られたペレットをアセトンにより３回洗浄してＬｉＣｌを除去し、次に高真空中で乾燥した。収量：１０mg。31Ｐ  ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ３００、溶媒Ｄ2 Ｏ［ppm ］：−３．９１（ｄ）；−９．４７（ｄ）；−１９．２７（ｔ）。
【０１６８】
実施例１１
２−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−４−（イソブチリルアミノ）−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン３′−（３−カルボキシプロパノアート）（２、図１１）の合成及び固相結合
無水１，２−ジクロロエタン（１．５ml）中、化合物１（図１１）（３５０mg，０．５６mmol）の溶液に４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（３５mg，０．２８mmol）、無水コハク酸（４０mg，０．５３mmol）、及びＥｔ3 Ｎ（７８μｌ，０．５６mmol）を加えた。その混合物を５０℃で３０分間撹拌した。次にその溶液を１，２−ジクロロエタン（２０ml）により希釈し、そして氷冷クエン酸溶液（３×１０ml）及びＨ2 Ｏ（３×１０ml）により洗浄した。有機層をＮａ2 ＳＯ4 により乾燥し、ろ過し、留去し、そしてその残渣をＦＣ（シリカゲル、１５×３cm、アセトニトリル−Ｈ2 Ｏ  ９：１）に供した。その主要な帯域を化合物２の無色粉末として得た（３５２mg，０．４８mmol，８５％）。ＴＬＣ（アセトニトリル−Ｈ2 Ｏ  ９：１）：０．８；ＵＶ（ＭｅＯＨ）：２３７（２８５００），２７３（１１５００），３０５（６６００）； 1Ｈ−ＮＭＲ（ｄ6 −ＤＭＳＯ）：１．１２（６Ｈ，‘ｔ’，Ｊ＝７．４，（ＣＨ3 ）2 ），２．８８（１Ｈ，ｍ，ＣＨ），２．９５（１Ｈ，ｍ，２′−Ｈβ），３．２１（２Ｈ，ｍ，５′−Ｈ2 ），３．６８（６Ｈ，ｓ，ＣＨ3 ），４．２５（１Ｈ，ｍ，４′−Ｈ），５．４０（１Ｈ，ｍ，３′−Ｈ），６．６１（１Ｈ，‘ｔ’，Ｊ＝５．４，１′−Ｈ），６．７３（４Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．１３−７．２８（９Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），８．６２（１Ｈ，ｓ，６−Ｈ），９．０７（１Ｈ，ｓ，３−Ｈ），１１．２６（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＮＨ），１２．３２（１Ｈ，ｂｒ．ｓ，ＣＯ2 Ｈ）．Ｃ39Ｈ41Ｎ5 Ｏ9 （７２３．７７）に関する分析計算：Ｃ，６４．７２；Ｈ，５．７１；Ｎ，９．６８．実測：Ｃ，６４．６９；Ｈ，５．７６；Ｎ，９．６２。
【０１６９】
前記化合物２をF. Seela, H. Debelak, N. Usman, A. Burgin, L. Beigelman, Nucleic Acids Res. 1998, Vol.26, page 1010-1018に記載のプロトコールを用いて固相に結合させうる。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】従来技術においてユニバーサル塩基として提案されたさまざまな化合物を示す。
【図２】２′−デオキシリボフラノシル・クロライドを伴うピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンのＮ9 及びＮ8 グリコシル化を示す。
【図３】オリゴヌクレオチドの化学合成に使用されうるさまざまな構築物を示す。
【図４】８−アザ−７−デアザアデニン−Ｎ8 −２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシドのホスホルアミダイトの合成を示す。
【図５】ｄＡ* が天然核酸塩基と対を成すことにより形成される可能性のある二本鎖を示す。
【図６】７−デアザ−グアニン−Ｃ8 −２′−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシドのホスホルアミダイトの合成を示す。
【図７】本発明による一般式（Ｉ）の可能性のあるヘテロ環式基の環系を示す（式（Ｉ）に定められる置換基を図中に明記しないが、直線により示す）。
【図８】ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジンのａ）メトキシ基、ｂ）アミノ基を示す。
【図９】化合物２のメトキシ−アミノ変換の半減期値のＵＶ−分光光度的な割り当てを示す（図８、ＮＨ3 の２５％水溶液、４０℃）。
【図１０】アミノ官能基に対する前駆物質としてメトキシ基を伴うホスホルアミダイト、２−［２−デオキシ−５−Ｏ−（４，４′−ジメトキシトリフェニルメチル）−β−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ペントフラノシル］−４−メトキシ−２Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３′−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−ホスホルアミダイト］の合成を示す：ｉ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ピリジン、３ｈ、室温、ii）（ｉ−Ｐｒ）2 ＮＰ（Ｃｌ）Ｏ（ＣＨ2 ）2 ＣＮ、ＣＨ2 Ｃｌ2 、２０分間、室温。
【図１１】３′−サクシニルエステル２の合成を示す：ｉ）無水コハク酸、４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン、Ｅｔ3 Ｎ、１，２−ジクロロエタン、３０分間、５０℃。この化合物は固相に結合されうる。
【図１】
2008113669.tif 000028
【図２】
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【図３】
2008113669.tif 000030
【図４】
2008113669.tif 000031
【図５】
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【図６】
2008113669.tif 000033
【図７】
2008113669.tif 000034
【図８】
2008113669.tif 000035
【図９】
2008113669.tif 000036
【図１０】
2008113669.tif 000037
【図１１】
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【配列表】
2008113669000001.app