(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒストンデアセチラーゼ遺伝子および遺伝子産物を提供する。特に、既知の酵母ヒストンデアセチラーゼ１(hda1)クラスＩＩ ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)に高い相同性を有するタンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を認識する抗体、および、例えば、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性もしくは免疫性応答、または乾癬を含むＨＤＡＣの異常に関連する病状の診断方法を提供する。【解決手段】新規ＨＤＡＣ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド、及び、該ＨＤＡＣ９ポリペプチドの特定のアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。【選択図】図１
2008113660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ＤＮＡ。
【請求項４】
請求項３に記載の単離ＤＮＡの少なくとも１つのフラグメントを含むベクター分子。
【請求項５】
転写制御配列を含む請求項４に記載のベクター分子。
【請求項６】
請求項５に記載のベクター分子を含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項３に記載の単離ＤＮＡであって、
(１)請求項２において定義されたポリペプチドをコードする完全ｃＤＮＡ配列である、配列番号２、７または８で示されるヌクレオチド配列；
(２)請求項２において定義されたポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームである、配列番号３で示されたヌクレオチド配列；
(３)配列番号３で示されたヌクレオチド配列にハイストリンジェント条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列；および
(４)請求項２において定義されたポリペプチドをコードする内在性ヒトゲノムＤＮＡである、配列番号４で示されたヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載の単離ＤＮＡ分子の少なくとも１つフラグメントを含むベクター分子。
【請求項９】
転写制御配列を含む、請求項８に記載のベクター分子。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクター分子を含む宿主細胞。
【請求項１１】
インビトロで増殖可能であり、そして請求項１もしくは２に記載のポリペプチドを培養増殖で生成する能力のある宿主細胞であって、そこでは該細胞は請求項２に記載のポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子の転写制御配列でない少なくとも１つの転写制御配列を含み、そこでは該１もしくはそれ以上の転写制御配列は請求項１もしくは２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する、宿主細胞。
【請求項１２】
ヒトにおける異常細胞増殖、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症もしくは免疫応答、または乾癬を含む遺伝子発現制御の異常に関連する病状を診断する方法であって：
ヒトからの適切な組織もしくは細胞において請求項２で定義されたポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡの転写の異常を検出すること含み、そこでは転写の異常が該病状の診断となる、方法。
【請求項１３】
天然型内在性ヒト遺伝子が配列番号４、７または８において示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、適切な組織もしくは細胞の試料を、または該組織もしくは細胞に由来する単離ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を、請求項３において定義された単離ヌクレオチド配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズするところの少なくとも約１５〜２０ヌクレオチド長の単離ヌクレオチド配列と接触させることを含む、方法。
【請求項１５】
ヒトにおけるＨＤＡＣ９発現または活性の異常に関連した病状の診断方法であって：
該病状を患うヒトからの適当な組織または細胞中の、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドの量を測定することを含み、そこではＨＤＡＣ９発現または活性の異常に関連した該病状を患わないヒトからの対応する組織中の該ポリペプチドまたはそのフラグメントの量と比較した該ポリペプチドまたはそのフラグメントの異常の存在が病状を患うヒトの診断となる、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、検出工程が、適当な組織または細胞を、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させること、および該適当な組織または細胞においてポリペプチドとの該抗体の特異的結合を検出することを含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の検出が配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドの存在を示す、方法。
【請求項１７】
配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該ポリペプチドのフラグメントに特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項１８】
ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントである、請求項１７に記載の抗体フラグメント。
【請求項１９】
ポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２０】
モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１または２において定義されたポリペプチドの製造方法であって：
宿主細胞におけるポリペプチドの発現に十分な条件下で配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を培養し、それにより発現されるポリペプチドの産生を引き起こす、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、さらに、細胞が生成したポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項２３】
外来性ポリヌクレオチドが配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドをコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
外来性のポリヌクレオチドが配列番号２、７または８で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
外来性ポリヌクレオチドが配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
外来性ポリヌクレオチドが配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
外来性ポリヌクレオチドが配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒストンデアセチラーゼ遺伝子および遺伝子産物に関する。特に、本発明は、既知の酵母ヒストンデアセチラーゼ１(hda1)クラスＩＩ ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)に高い相同性を有するタンパク質、このようなタンパク質をコードする核酸分子、該タンパク質を認識する抗体、および、例えば、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性もしくは免疫性応答、または乾癬を含むＨＤＡＣの異常に関連する病状の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンのアセチル化は、ＤＮＡへの転写因子の接近可能性を改変することにより遺伝子発現を調節する主要な制御メカニズムである。ヒストンのアセチル化は、ヌクレオソームの集合の間およびＤＮＡ合成の間に起こるリジンの遊離Σ−アミノ基の可逆的修飾である。ヒストンのアセチル化レベルの変化は、また、転写活性化および不活性化(silencing)の間にも起こる。ヒストンのアセチル化は、一般に、転写の活性化に関連する。一方、脱アセチル化は転写抑制に関連する。ヒストンのアセチル化のレベルは、競合するヒストンアセチラーゼおよびデアセチラーゼの間の平衡に起因する(Emiliani, S., Fischle, W., Van Lindt, C., Al-Abed, Y., and Verdin, E., Proc Nat. Acad. Sci., U. S. A., 95, 2795-2800 (1998)。
【０００３】
ＨＤＡＣは、転写の制御において重要な役割を果たすことが示されている。ＨＤＡＣは、転写抑制に関与する複合体の構成要素として機能する。これはＨＤＡＣと複合タンパク質複合体との相互作用を仲介するものであり、そしてデアセチラーゼの活性化を要する。ＨＤＡＣ複合体は、コリプレッサーｍＳｉｎ３Ａ(Kasten, M.M., Dorland, S., Stillman, D.J. Mol. Cell. Biol. 17, 4852-4858 (1997))およびｍＳｉｎ３Ａ−関連タンパク質 (Zhang, Y., Iratni, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. Cell 89, 357-364 (1997)；Zhang, Y., Sun, Z.W., Iratni, R., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Hampsey, M., Reinberg, D. Mol. Cell. 1, 1021-1031(1998))、不活性化メディエーターＮｃｏＲ (Nagy, L., H.- Y. Kao, D. Chakravarti, R. J. Lin, C. A. Hassig, D. E. Ayer, S. L. Schreiber, and R. M. Evans (1997) Cell 89, 373-380およびＳＭＲＴ(Alland, L. et al., Nature 387:49-55 (1997)；Heinzel, T. et al., Nature 387:43-8 (1997)), 転写リプレッサーＲｂ(Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, T., Kobayashi, R., Edmondson, D. G., Roth, S.Y.,  and Allis, C. D. (1996) Cell 84, 843-851)、Ｒｂ様タンパク質ｐ１０７(Ferreira, R., Magnaghi-Jaulin, L., Robin, P., Harel-Bellan, A., Trouche, D. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10493-10498)およびｐ１３０(Stiegler, P., De Luca, A. Bagella, L., Giordano, A. (1998) Cancer Res. 389, 187-190)、Ｒｂ結合タンパク質(Nicolas, E., Morales, V., Magnaghi-Jaulin, L., Harel-Bellan, A., Richard-Foy, H., Trouche, D. (2000) J. Biol. Chem. 275, 9797-9804, Lai, A., Lee, J.M., Yang, W.M., DeCaprio, J.A., Kaelin, W.G. Jr., Seto, E., Branton, P.E. (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 6632-6641)、Ｍａｄ／Ｍａｘ(Laherty, C., W.- M. Yang, J.- M. Sun, J. R. Davie, E. Seto, and R. N. Eisenman. (1997) Cell 89, 349-456)、核ホルモン受容体(Nagy, L., H.- Y. Kao, D. Chakravarti, R. J. Lin, C. A. Hassig, D. E. Ayer, S. L. Schreiber, and R. M. Evans. (1997) Cell 89, 373-380)、ヌクレオソームリモデリング因子(Xue, Y., Wong, J., Moreno, G.T., Young, M.K., Cote, J., Wang, W. (1998) Mol. Cell. 2, 851-861)、メチル−結合タンパク質(Fuks, F., Burgers, W.A., Brehm, A., Hughes-Davies, L., Kouzarides, T. (2000) Nat. Genet. 24, 88-91, Nan, X., Ng, H.H., Johnson, C.A., Laherty C.D., Turner, B.M., Eisenman, R.N., Bird, A. (1998) Nature 393, 386-389, Ghosh, A.K., Steele, R., Ray, R.B. (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 260, 405-409, Ng, H. H., Zhang, Y., Hendrich, B., Johnson, C.A., Turner, B.M., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D., Bird, A. (1999) Nat. Genet. 23, 58-61)、およびＤＮＡ修復機構タンパク質(Yarden, R.I., Brody, L.C. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 4983-4988, Cai, R.L., Yan-Neale, Y., Cueto, M.A., Xu, H., Cohen, D. (2000) J. Biol. Chem. 275, 27909-27916)を含み得る。
【０００４】
さらに、ＨＤＡＣ１はＹＹ１(Yang, W.- M., Inouye, C., Zeng, Y., Bearss, D.,  and Seto, E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 122845-12850)およびＳｐ１(Doetzlhofer, A., Rotheneder, H., Lagger, G., Koranda, M., Kurtev, V., Brosch, G., Wintersberger, E., Seiser, C. (1999) Mol. Cell. Biol. 19, 5504-5511)に直接結合することが見出されており、そしてＨＤＡＣ４および５はＭＥＦ２(Grozinger, C. M., and Schreiber, S. L. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 7835-7840)に結合する。さらに、ＨＤＡＣは複合体中で一体となって見出されている(Eilers, A.L., Billin, A.N., Liu, J., Ayer, D.E. (1999) J Biol Chem 274, 32750-32756, Grozinger, C. M., and Schreiber, S. L. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 7835-7840)。
【０００５】
２つの明確なクラスの酵母ヒストンデアセチラーゼがサイズおよび配列に基づいて同定された。酵母クラスＩ ＨＤＡＣはＲｐｄ３、Ｈｏｓ１ｐ、およびＨｏｓ２ｐを含む。クラスＩＩは酵母ＨＤＡ１ｐを含む。さらに、これら２つのクラスのメンバーは、異なる複合体を形成することが見出されている。ヒトＨＤＡＣは、それらの酵母配列への類似性に基づいて分類される。クラスＩヒトＨＤＡＣはＨＤＡＣ１〜３および８を含む。クラスＩＩ ＨＤＡＣはＨＤＡＣ４〜７を含む。クラスＩ ＨＤＡＣのデアセチラーゼコアは、最初から３９０までのアミノ酸に存在する。Ｎ末端に第２の触媒ドメインを含むＨＤＡＣ４を除いて、クラスＩＩ ＨＤＡＣ触媒ドメインはこれらのペプチドのＣ末端に位置する(Grozinger, C. M., Hassig, C. A., and Schreiber, S. L. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 4868-4873)。
【０００６】
クロマチンのアセチル化の機能を研究するために使用されてきた重要なアプローチは、ヒストンデアセチラーゼの特異的インヒビターの使用である。いくつかのクラスの化合物は、ＨＤＡＣを阻害することが同定されている。ヒストンデアセチラーゼインヒビターは、Ｇ１／ＳおよびＧ２／Ｍ細胞周期アレスト、分化(Itazaki, H., K. Nagashima, K. Sugita, H. Yoshida, Y. Kawamura, Y. Yasuda, K. Matsumoto, K. Ishii, N. Uotani, H. Nakai, A. Terui, S. Yoshimatsu, Y. Ikenishi and Y. Nakagawa. (1990) J. Antibiot. 12, 1524-1532, Hoshikawa, Y., Kijima, M., Yoshida, M., and Beppu, T. (1991) Agric. Biol. Chem. 55, 1491-1497, Hoshikawa, Y., Kwon, H.- J., Yoshida, M., Horinouchi, S., and Beppu, T. (1994) Exp. Cell Res. 214, 189-197, Sugita, K., Koizumi, K., and Yoshida, H. (1992) Cancer Res. 52, 168-172, Yoshida, M., Y. Hoshikawa, K. Koseki, K. Mori and T. Beppu. (1990) J. of Antibiot. 43, 1101-106, Yoshida, M., Nomura, S., and Beppu, T. (1987) Cancer Res. 47, 3688-3691)、ならびに変形および正常細胞のアポトーシス(Medina, V., Edmonds, B., Young, G. P., James, R., Appleton, S., Zalewski, P. D. (1997) Cancer Res. 57, 3697-3707)および変形の反転(Kwon, H. J., Owa, T., Hassig, C. A., Shimada, J., and Schreiber, S. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 3356-3361, Kim, M.-S., Son, M.-W., Park, Y. I., and Moon, A. (2000) Cancer Lett. 157, 23-30)の誘導を含む抗増殖効果を有することが見出されている。
【０００７】
これらの効果は、非リガンド化レチノイン酸受容体ＰＭＬ−ＲＡＲαおよびＰＬＺＦ−ＲＡＲαの融合体との複合体中のＨＤＡＣの存在と共に、腫瘍発生能におけるＨＤＡＣに対する役割を示す(Grignani, F., De Matteis, S., Nervi, C., Tomassoni, L., Gelmetti, V., Cioce, M., Fanelli, M., Ruthardt, M., Ferrara, F. F., Zamir, I., Seiser, C., Grignani, F., Lazar, M. A., Minucci, S., Pelicci, P. G. (1998) Nature 391, 815-818, He, L. Z., Guidez, F., Tribioli, C., Peruzzi, D., Ruthardt, M., Zelent, A., Pandolfi, P. P. (1998) Nat. Genet., 18, 126-35, Lin, R.J., Nagy, L., Inoue, S., Shao, W., Miller, W. H. Jr and Evans, R. M. (1998) Nature 391, 811-814)。さらに、ヒストンデアセチラーゼインヒビター、フェニルブチレートおよびトリコスタチンＡは、前骨髄球性白血病の処置において有望であり、そしていくつかの他のＨＤＡＣインヒビターは研究中であり、臨床での使用に近づいている(Byrd, J.C., Shinn, C., Ravi, R., Willis, C.R., Waselenko, J.K., Flinn, I.W., Dawson, N.A., Grever, M.R. (1999) Blood 94, 1401-1408, Kim, Y.B., Lee, K.H., Sugita, K., Yoshida, M., Horinouchi, S. (1999) Oncogene 18, 2461-2470, Cohen, L.A., Amin, S., Marks, P.A., Rifkind, R.A., Desai, D., Richon, V.M. (1999) Anticancer Res. 19, 4999-5005)。
【０００８】
さらに、ＨＤＡＣインヒビターであるブチレートは、炎症誘発性サイトカインＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＩＬ−６、およびＩＬ１−βの発現の減少させることが見出された。これらの効果は、ＮＦｋＢの活性化の阻害(Segain JP, Raingeard de la Bletiere D, Bourreille, A., Leray V., Gervois, N., Rosales, C., Ferrier, L., Bonnet, C., Blottiere, H.M., Galmiche, J.P. (2000) Butyrate inhibits inflammatory responses through NFkappaB inhibition: implications for Crohn's disease. Gut 47, 397-403)およびヒストンデアセチラーゼを阻害する能力(Inan M.S., Rasoulpour, R.J., Yin, L., Hubbard, A.K., Rosenberg, D.W., Giardina, C. (2000) The luminal short-chain fatty acid butyrate modulates NF-kappaB activity in a human colonic epithelial cell line. Gastroenterology 118, 724-34)に起因するものと考えられている。
【０００９】
ＨＤＡＣインヒビターであるトラポキシンの発見により、トラポキシン様分子が結合したアフィニティーマトリックスカラムを用いて、最初のヒトヒストンデアセチラーゼであるＨＤＡＣ１を単離することが可能となった(Taunton, J., Collins, J. L., and Schreiber, S. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118, 10412-10422)。続いて、７つの他のヒトＨＤＡＣ酵素の異性体が報告された(Taunton, J., Hassig, C. A. and Schreiber, S.L. (1996). Science 272, 408-411, Yang, W. m., Inouye, C., Zeng, Y., Bearss, D., and Seto, D. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12845-12850, Yang, W. M., Yao, y. L., Sun, J. M., Davie, J. R., and Seto, E. (1997). J. Biol Chem. 272, 28001-28007, Emiliani, S., Fischle, W., Van Lint, C., Al-Abed, Y., and Verdin, E. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2795-27800)。これら８つのＨＤＡＣは、配列相同性に基づいてクラスＩ(酵母遺伝子Ｒｐｄ３に類似したＨＤＡＣ１〜３および８)とクラスＩＩ ＨＤＡＣ(酵母遺伝子ｈｄａ１に類似した４〜７(Grozinger, C. M., Hassig, C.A., and Schrieber, S. L. (1999). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4983-4988.)とに分けられる。今回、我々は可能性のある新規なＨＤＡＣ(以下、ＨＤＡＣ９という。)の単離および特徴化を報告する。これはｈｄａ１ クラスＩＩ ＨＤＡＣに対して配列類似性を示す。ＨＤＡＣ９は、ＨＤＡＣ クラスＩおよびクラスＩＩを橋渡しする特徴を有する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、ヒストンデアセチラーゼ、特に新規ヒストンデアセチラーゼＨＤＡＣ９に関する。
第１の観点において、本発明は配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドを提供する。配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列はＨＤＡＣのファミリーの既知のメンバーとかなりの程度の相同性を示す。簡便のため、配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ヒストンデアセチラーゼ９またはＨＤＡＣ９と称する。このようなポリペプチド、またはそのフラグメントは、種々の正常組織中において発現し、例えば、ＨＤＡＣ９は約３ｋｂの転写物として正常な精巣、胃、脾臓、小腸、胎盤、肝臓、腎臓、結腸、肺、心臓および脳に存在する。ＨＤＡＣ９は筋肉においては検出されないが、このレーンは、また、ＧＡＰＤＨにもハイブリダイズしなかった(図７)。
【００１１】
配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドのフラグメントは、約５〜１４８アミノ酸、好ましくは約１０〜約１４３アミノ酸、さらに好ましくは約２０〜約１００アミノ酸、および最も好ましくは約２０〜約５０アミノ酸を含むポリペプチドを含む。このようなフラグメントは、また、本発明の一部を形成する。好ましくは、フラグメントは触媒ドメインを包含し、これはアミノ酸番号１〜３９０の間に存在すると予想されている。本発明のこの観点にしたがって、ヒト由来の新規ポリペプチド、ならびに生物学的、診断的または治療的に有用なそのフラグメント、変異体および誘導体、フラグメントの変異体および誘導体、および前記のアナログを提供する。
【００１２】
第２の観点において、本発明は上記のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡを提供する。特に、本発明は、
(１)配列番号２、配列番号７または配列番号８で示されるヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ；
(２)配列番号３で示されるヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ；
(３)配列番号３で示されるヌクレオチド配列にハイストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができる単離ＤＮＡ；および
(４)配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含む単離ＤＮＡ；
を提供する。また、少なくとも約１５塩基、好ましくは少なくとも約２０塩基を含む核酸配列、さらに好ましくは配列番号２、配列番号７または配列番号８あるいは配列番号３の約３０連続塩基を含む核酸配列も提供される。
【００１３】
また、配列番号２、配列番号７または配列番号８あるいは配列番号３で示される核酸配列の核酸に実質的に類似した核酸も、本発明の範囲内である。好ましい実施態様において、単離ＤＮＡは、本発明のＤＮＡの少なくとも１つのフラグメントを含む、特に配列番号２、配列番号７または配列番号８あるいは配列番号３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡを含む、ベクター分子の形態をとる。
【００１４】
本発明の第３の観点は、ヒトにおける細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、または乾癬に関連した病状を含む（ただし、これらに限定されるわけではない。）遺伝子発現制御の異常に関連した病状の診断方法を含み、該方法はヒトからの適当な組織または細胞中の配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる新規ポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの転写の異常を検出することを含み、ここで、該転写の異常はこのような病状のヒトの苦痛の診断となる。特に、配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなる新規ポリペプチドをコードする該天然型内在性ヒト遺伝子は、配列番号４で示されるゲノム性ヌクレオチド配列を含む。本発明の１つの実施態様において、該診断方法は、適当な組織または細胞の試料を、あるいは組織または細胞由来の単離ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列を有する新規ポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズする少なくとも約１５〜２０ヌクレオチド長の単離ヌクレオチド配列と、接触させることを含む。
【００１５】
本発明のアッセイの観点の別の実施態様は、ヒトにおけるＨＤＡＣ９活性の異常に関連した病状の診断方法であって、そのような病状を患うヒトからの一定の組織または細胞におけるデアセチラーゼ活性のレベルを測定することを含み、ここで、ＨＤＡＣ活性の異常に関連した病状に罹患していないヒトのそれぞれの組織または細胞におけるそのレベルと比較したデアセチラーゼ活性のレベルの異常が該病状を患うヒトの診断となる、方法を提供する。
【００１６】
本発明のこの観点の１つの実施態様にしたがって、新規ＨＤＡＣ９をコードする遺伝子の転写を制御できるアンチセンスポリヌクレオチドが提供され；別の実施態様において、新規ＨＤＡＣ９をコードする遺伝子の転写を制御できる二本鎖ＲＮＡが提供される。
【００１７】
本発明の別の観点により、前記のポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、変異体および誘導体、変異体および誘導体のフラグメント、ならびにこれらのアナログの製造方法が提供される。本発明のこの観点の好ましい実施態様において、宿主細胞においてポリペプチドの発現に十分な条件下で、該ポリペプチドをコードする外来性ヌクレオチド配列を含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を培養すること、これによってポリペプチドの発現を引き起こすこと、および所望により、発現したポリペプチドを回収することを含む、前記ＨＤＡＣ９の製造方法が提供される。本発明のこの観点の好ましい実施態様において、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドの製造方法であって、宿主細胞においてポリペプチドの発現に十分な条件下で、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を培養すること、これにより発現ポリペプチドの生成を引き起こすこと、そして所望により発現したポリペプチドを回収することを含む方法が提供される。
【００１８】
好ましくは、このような方法のいずれかにおいて、外来性ポリヌクレオチドは、配列番号２、７または８で示されるヌクレオチド配列、配列番号３で示されるヌクレオチド配列、あるいは配列番号４で示されるヌクレオチド配列を含むあるいはからなる。本発明の別の観点にしたがって、とりわけ、研究、生物学的、臨床的および治療目的のための、生成物、組成物、製造方法、ならびに前記のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用が提供される。
【００１９】
本発明のこの観点の一定のさらなる好適な実施態様において、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、すなわちすべてのＨＤＡＣ９変異体に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。この点に関して一定の特に好ましい実施態様において、該抗体は、ヒトＨＤＡＣ９ ポリペプチドまたはヒトＨＤＡＣ９ポリペプチドの部分に極めて選択的である。
【００２０】
さらなる観点において、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列のフラグメントまたは部分に結合する抗体またはそのフラグメントが提供される。
【００２１】
別の観点において、病状が対象中のＨＤＡＣ９ポリペプチドの存在下で、ＨＤＡＣ９の遺伝子発現の異常、増加または減少、あるいはＨＤＡＣ９ポリペプチドの活性の増加または減少に関連した、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列、あるいはそのフラグメントまたは部分を有するポリペプチドに結合した抗体の有効量を投与することによる、該対象における該病状の処置方法が提供される。また、対象中のＨＤＡＣ９の存在下で、ＨＤＡＣ９遺伝子の発現の異常または増加または減少、あるいはＨＤＡＣ９ポリペプチドの活性の増加または減少に関連した疾患または病状の診断方法であって、例えば、前に記載したＨ４ヒストンアッセイ(Inokoshi, J., Katagiri, M., Arima, S., Tanaka, H., Hayashi, M., Kim, Y.-B., Furumai, R., Yoshida, M., Horinouchi, S., Omura, S. (1999) Biochem. Biophys. Res. Com. 256, 372-376.)を含む、通常の方法の使用を含む方法も提供される。
【００２２】
さらに別の観点において、本発明は、インビトロで増殖可能な宿主細胞、好ましくは、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドを培養増殖で生成することができる脊椎動物細胞、特に哺乳動物細胞もしくは細菌細胞を提供し、そこでは細胞は転写制御性ＤＮＡ配列を含有し、そこでは転写制御配列は、配列番号１、５もしくは６にしたがうアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードするＲＮＡの転写を制御する。これは、プラスミドにおけるＨＤＡＣ９の増殖、および内在性ＨＤＡＣ９プロモーターまたは他の任意の転写制御配列を用いる、ヒトまたは昆虫細胞または細菌におけるＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質の生成を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
本発明のさらに別の観点において、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの正常を超えた発現を、患者から得られる体組織試料中に検出するために必要な成分を含むアッセイ方法およびキットが提供され、そのようなキットは例えば、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに、もしくはそのフラグメントに、結合する抗体を、または本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを、含む。好ましい実施態様では、そのようなキットは、また、キットの構成成分が使用されるべき手順の詳細を記した説明書を含む。
【００２４】
別の観点において、本発明は、ＨＤＡＣ活性または遺伝子発現の異常に関連した疾患を処置するための医薬の製造における、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント、または配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含む該ポリペプチドもしくはそのフラグメントに結合する抗体の使用を目的とする。
【００２５】
別の観点は、ＨＤＡＣ活性または遺伝子発現の異常に関連した疾患の処置のために、適当な医薬担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒に、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むかまたはからなるポリペプチドもしくはそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはそのフラグメント、またはそのようなポリペプチドもしくはそのフラグメントに結合する抗体を含む医薬組成物を目的とする。
【００２６】
別の観点において、本発明は、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合できる、および／または配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を調節できる分子、あるいは配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写または翻訳を調節する核酸配列に結合できる分子の同定方法を目的とする。このような方法は、例えば、米国特許５,５４１,０７０；５,５６７,３１７；５,５９３,８５３；５,６７０,３２６；５,６７９,５８２；５,８５６,０８３；５,８５８,６５７；５,８６６,３４１；５,８７６,９４６；５,９８９,８１４；６,０１０,８６１；６,０２０,１４１；６,０３０,７７９；および６,０４３０２４に記載され、これらすべての文献のすべての内容を引用により本明細書に包含させる。このような方法で同定された分子は、また、本発明の範囲内である。
【００２７】
関連する観点において、ＨＤＡＣに生物学的に関連する複合体中の、結合タンパク質を同定するための新規ＨＤＡＣ９の使用を目的とする。これまで、ＨＤＡＣ９に結合するタンパク質は知られていない。しかしながら、これらは、ＨＤＡＣ９が他のＨＤＡＣと相互作用することが前から知られているタンパク質と結合するかどうかを測定することにより特徴付けられ得る(序論を参照。)。例えば、ＨＤＡＣ９複合体の構成成分は、共免疫沈降を含む、通常の方法を用いて測定され得る（実施例９を参照。）。
【００２８】
さらに別の観点において、本発明は、処置を必要とする対象の１もしくはそれ以上の組織中に本発明の核酸を導入する方法であって、その方法の結果、該核酸によりコードされた１もしくはそれ以上のタンパク質が発現し、そして／または組織内で細胞により分泌される、方法を目的とする。
【００２９】
本発明の他の目的、特徴、利点、および観点は、以下の記載から当業者に明らかであろう。しかしながら、以下の記載および具体的実施例は、本発明の好ましい実施態様を示したものであるが、例示のためだけに与えられたことを理解すべきである。開示される発明の精神および範囲内での多様な変更および修飾は、下記の説明を読むことからおよび本開示の他の部分を読むことから当業者には容易に明らかになるであろう。
【００３０】
図面の簡単な説明
図１は、ＧＥＮＦＡＭ(プロプラエタリ・ソフトウエア)を用いて同定され、そして完全ＨＤＡＣ９ ｃＤＮＡ配列に関してデータベースを検索するために使用される１１５６ｂｐオープンリーディングフレームを示す。それぞれのＯＲＦ(配列番号３)はヌクレオチド位置番号１で開始し、そしてヌクレオチド位置番号１１５６で終了する。
【００３１】
図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ＨＤＡＣ９の完全長ｃＤＮＡ配列(配列番号２)およびそのアミノ酸配列(配列番号１)を示す。完全長ｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド位置番号１で開始し、そしてヌクレオチド位置番号２０２２で終了する。
【００３２】
図３は、クローン１９８９２９／ＨＤＡＣ９の配列とアラインした、インシリコ(in silico)のゲノム性ＤＮＡ配列(ＡＬ０２２３２８) (配列番号４)を示す。該アラインメントは、プロプリエタリ・ソフトウエア(Novartis Pharmaceuticals, Summit, NJ)を用いて製造された。
【００３３】
図４は、ＨＤＡＣ９予想ペプチドおよび S. pombe Hda1ペプチドのアラインメントを示す。クエリー(query)はＨＤＡＣ９ペプチドであり、そして対象(subject)はS. pombe Hda1ペプチドである。アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【００３４】
図５は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントならびに推定される触媒ドメインのアミノ酸およびＲｂ結合ドメインの位置を示す。触媒ドメインのアミノ酸は実線で囲まれ、そして推定されるＲｂドメインのアミノ酸は点線の囲み中に含まれる。 アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【００３５】
図６は、ＨＤＡＣ １〜９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【００３６】
図７は、ＨＤＡＣ９のノーザン分析を示す。(Ａ)正常ヒト組織におけるＨＤＡＣ９の分布のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡローディングのための対照と同一のブロットとハイブリダイズした。(Ｂ)腫瘍および正常組織の比較におけるＨＤＡＣ９のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡローディングのための対照と同一のブロットとハイブリダイズさせた。
【００３７】
図８は、１８ＳリボソームＲＮＡと比較した正常ヒト組織および細胞株中のＨＤＡＣ９の分布のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ヒト肺カルシノーマ細胞株であるＡ５４９からのＲＮＡを、内部標準として使用した。
【００３８】
図９は、クラスＩＩ ＨＤＡＣ(ＨＤＡＣ４、５、６、７)とのＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。触媒ドメインのアミノ酸が実線で囲まれている。
【００３９】
図１０は、クラスＩ ＨＤＡＣ(ＨＤＡＣ１、２、３、８)とのＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。触媒ドメインのアミノ酸が実線で囲まれている。
【００４０】
図１１は、３つのＨＤＡＣ９配列変異体(ＨＤＡＣ９ｖ１、ＨＤＡＣ９ｖ２、およびＨＤＡＣ９ｖ３)を示す。ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡ９ｖ２は、ヒトＥＳＴデータベースを検索することにより見出され、そしてＨＤＡＣ９ｖ３はＣｅｌｅｒａ配列データベース中の予想される転写物として見出された。(Ａ)は、該３つのＨＤＡＣ９変異体ペプチド配列のアラインメントを示す。(Ｂ)は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣペプチド配列の略図を示す。触媒ドメインは黒塗りのボックスであり、そして推定されるＬＸＣＸＥモチーフは白抜きのボックスである。(Ｃ)は、ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡＣ９ｖ２のゲノム構造の略図である。エキソンを黒塗りのボックスで示し、そしてイントロンを黒塗りのボックスの間の線で示す。ボックスおよび線の長さは、エキソンおよびイントロンの長さを示す。
【００４１】
図１２は、ＨＤＡＣ９が酵素的に活性なヒストンデアセチラーゼであることを示す。(Ａ) ＨＤＡＣ９の触媒活性は、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ４の活性に匹敵する。(Ｂ)は、ＨＤＡＣ１が本アッセイにおけるヒストン基質の脱アセチル化に関して、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、およびＨＤＡＣ９よりも効果的であったことを示す。
【００４２】
図１３は、ＨＤＡＣ９が核タンパク質であることおよびＨＤＡＣ９−フラッグがインビトロで翻訳されることを示す。
図１４は、 ＨＤＡＣ９ｖ３およびＨＤＡＣ９ｖ２のＤＮＡおよびペプチド配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
本明細書で引用した全ての特許出願、特許および参考文献は、その全体を本明細書に包含させる。
【００４４】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの通常の技術が使用される。これらの技術は周知であり、そして、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.); Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins); Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.); Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.); Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press); Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory)；およびMethods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)において説明されている。
【００４５】
本開示を通して使用される下記の略語を以下に列挙する：
ヒストンデアセチラーゼ(ＨＤＡＣ)、ヒストンデアセチラーゼ様タンパク質(ＨＤＬＰ)。
【００４６】
最も広い意味において、ヌクレオチド配列に関して本明細書において使用される場合の“実質的に類似”なる語は、参照ヌクレオチド配列に対応するヌクレオチド配列を意味し、ここで、対応する配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドと実質的に同一の構造および機能を有するポリペプチド（例えば、該ポリペプチドの機能に影響しない程度のアミノ酸における変化のみが起こる）をコードする。望ましくは、実質的類似ヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドをコードする。実質的類似ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列との間の同一性の百分率は、望ましくは、少なくとも８０％、さらに望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、いっそうさらに好ましくは少なくとも９９％である。配列の比較を、Clustalw(例えば、Higgins, D.G. et al. Methods Enzymol. 266:383-402 (1996)参照。)を用いて実施する。Clustalwアラインメントは、デフォルトのパラメーターを用いて実施された。
【００４７】
参照ヌクレオチド配列に“実質的に類似する”ヌクレオチド配列は、５０℃にて２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄しながら５０℃にて７％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、さらに望ましくは、５０℃にて１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄しながら５０℃にて７％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、さらにいっそう望ましくは、５０℃にて０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄しながら５０℃にて７％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、好ましくは、５０℃にて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄しながら５０℃にて７％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、さらに好ましくは、６５℃にて０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ中で洗浄しながら５０℃にて７％硫酸ドデシルナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡにおいて、参照ヌクレオチドとハイブリダイズし、さらに、機能的に等価な遺伝子産物をコードしている。
【００４８】
“ｍＲＮＡの上昇した転写”は、 ＨＤＡＣ９活性の異常に罹患していない対象よりも、このような疾患または病状を患う個体の適当な組織または細胞中に存在する本発明の新規ポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの量が多いことを意味する；特に、このような病状に罹患していないヒトにおける対応する組織において見出される量の、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、さらに好ましくは少なくとも約１０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍の量のｍＲＮＡ。このような上昇したレベルのｍＲＮＡは、結果的に、健康な個体と比較した細胞増殖の異常に関連した病状を患う個体におけるこのようなｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質のレベルの上昇をもたらし得る。また、“ｍＲＮＡの上昇した転写”は、発現が単独または他の分子と組み合わせたＨＤＡＣ９により調節される遺伝子から転写されたメッセンジャーＲＮＡの量がより多いことを意味し得ることも理解される。
【００４９】
本明細書において使用される“宿主細胞”とは、例えば、エレクトロポレーション、燐酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などの任意の方法により細胞中に導入された異種のＤＮＡを含む原核もしくは真核細胞を意味する。
【００５０】
本明細書において使用される“異種の”とは、“異なる天然由来の”を意味するか、もしくは非天然の状態を表す。例えば、もし宿主細胞が他の生物から、特に他の生物種から、得られるＤＮＡもしくは遺伝子で形質転換されるならば、その遺伝子はその宿主細胞に関して、そしてまたその遺伝子を保有する宿主細胞の子孫に関して、異種である。同様に、“異種の”とは、同じ天然の元の細胞タイプから得られかつその中に挿入されるが、非天然の状態、例えば異なるコピー数、もしくは異なる調節エレメントによる制御下で存在する、ヌクレオチド配列を意味する。
【００５１】
“ベクター”分子は、その中に異種核酸を挿入することができて、次いで適切な宿主細胞中に導入され得る、核酸分子である。ベクターは好ましくは、１つもしくはそれ以上の複製起点、および組換えＤＮＡが挿入され得る１つもしくはそれ以上の部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞をそうでないものから選別できる簡便な手段を有しており、例えばそれらは薬剤耐性遺伝子をコードする。一般的なベクターとしては、プラスミド、ウイルスゲノム、および(主として酵母および細菌中の)“人工染色体”が挙げられる。
【００５２】
“プラスミド”は、先行する小文字のｐおよび／もしくはそれに続く大文字ならびに／または数字により、当業者によく知られた標準的命名規約にしたがって本明細書において示される。本明細書において開示される出発材料のプラスミドは市販で入手可能であるか、無制限に公開で入手可能であるか、または入手可能なプラスミドから周知の公表された手順の日常的な適用により構築され得るかのいずれかである。本発明にしたがって使用され得る多くのプラスミドならびに他のクローニングベクターおよび発現ベクターは周知であり、かつ当業者には容易に入手可能である。さらに、当業者は本発明における使用に適した任意の数の他のプラスミドを容易に構築し得る。本発明におけるこのようなプラスミドならびに他のベクターの性質、構築および使用は、本開示より当業者には容易に明らかであろう。
【００５３】
“単離（された）”なる用語は、材料がその本来の環境(例えば、それが天然に由来するならば、天然の環境)から除去されることを意味する。例えば、生きている動物中に存在している天然由来のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは単離されていないが、天然の系中に共存する物質の一部もしくは全てから分離された該ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、たとえその後で天然の系中に再導入されたとしても、単離されている。このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、そして／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、そしてなおこのようなベクターもしくは組成物がその天然環境の一部でない点において、単離されている。
【００５４】
本明細書において使用される“転写制御配列”なる用語は、それらが機能し得るように結合された、タンパク質をコードする核酸配列の転写を誘導し、抑制し、もしくはさもなければ制御する、開始配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のような、ＤＮＡ配列を意味する。
【００５５】
本明細書において使用される“ヒト転写制御配列”は、本発明の新規ＨＤＡＣ９ポリペプチドをコードするヒト遺伝子と関連して、それがそれぞれのヒト染色体中に見出されるように、通常見出されるそれらの転写制御配列のいずれかである。該用語は、また、単独または他の分子と組み合されたＨＤＡＣ９により調節されるヒト遺伝子発現に関連して通常見出される転写制御配列を意味し得ることも理解される。
【００５６】
本明細書において使用される“非ヒト転写制御配列”は、ヒトゲノムに見出されない任意の転写制御配列である。
“ポリペプチド”なる用語は、本明細書において、“ポリペプチド類”および“タンパク質(類)”なる用語と互換的に用いられる。
【００５７】
本明細書において使用されるように、本発明のポリペプチドの“化学的誘導体”は、通常その分子の一部ではないさらなる化学的部分を含有する本発明のポリペプチドである。そのような部分は分子の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善し得る。これに代えて、これらの部分は分子の毒性を軽減し、分子の任意の望ましくない副作用などを消失もしくは減弱させ得る。このような効果を仲介する能力のある部分は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,16th ed., Mack Publishing Co., Eatson, Pa. (1980)に開示されている。
【００５８】
本明細書において使用されるように、“ＨＤＡＣ９”は、天然、合成、半合成または組換えのどれかの任意の供給源からの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマおよび好ましくはヒトを含む哺乳動物から得られた実質的に精製されたＨＤＡＣ９のアミノ酸配列を意味する。
【００５９】
本明細書において使用されるように、“ＨＤＡＣ９活性”を含む“ＨＤＡＣ活性”は、３Ｈ−標識Ｈ４ヒストンペプチドを含むヒストンタンパク質を脱アセチル化するＨＤＡＣポリペプチドの能力を意味する。このような活性は、常法にしたがって、例えば Inokoshi, J., Katagiri, M., Arima, S., Tanaka, H., Hayashi, M., Kim, Y.-B., Furumai, R., Yoshida, M., Horinouchi, S., and Omura, S. (1999) Biochem. Biophys. Res. Com. 256, 372-376 に記載されたように測定され得る。生物学的に“活性な”タンパク質は、天然の分子の構造的、制御的または生化学的機能を有するタンパク質を意味する。
【００６０】
本明細書において使用される“アゴニスト”なる語は、ＨＤＡＣ９と結合した場合に、ＨＤＡＣ９において変化を引き起こしてＨＤＡＣ９の活性を調節する分子を意味する。アゴニストは、ＨＤＡＣ９と結合するタンパク質、核酸、炭水化物、または他の任意の分子を含み得る。
【００６１】
本明細書において使用される“アンタゴニスト”または“インヒビター”なる語は、ＨＤＡＣ９と結合した場合に、ＨＤＡＣ９の生物学的活性をブロックまたは調節する分子を意味する。アンタゴニストおよびインヒビターには、ＨＤＡＣ９に結合する、天然または合成の、タンパク質、核酸、炭水化物、または他の任意の分子が含まれ得る。
【００６２】
ＨＤＡＣ９は、Celera Human Genome Database、Incyte LIFESEQ(登録商標)データベースおよび公共のHigh Throughput Genomicデータベースにおけるヒストンデアセチラーゼに関連する新規ヒト配列を検索するための、ＧＥＮＦＡＭと呼ばれるプロプリエタリー・コンピューター・ソフトウエアを用いて同定された。１１５６ｂｐのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を同定および使用して、全組織および後根神経節ｃＤＮＡライブラリーからの配列決定されたクローンのデータベースを検索した。各ライブラリーから２つずつ、計４つのクローンが、該ＯＲＦ(Ｍ６、Ｋ１０、Ｐ３、Ｆ２３)を含むことが見出された。これらのクローンのうち、全組織ライブラリーからのＭ６は、配列解析およびインビトロ翻訳の結果として最も完全なｃＤＮＡであることが決定された。
【００６３】
ＢＬＡＳＴ(Altshul S.F. et al Nucleic Acid Res 25:3389-402 (1997))を、ｃＤＮＡクローンＭ６を用いてＧｅｎＢａｎｋデータベースを検索するために使用した。ゲノム配列ＡＬ０２２３２８は、Ｍ６ ｃＤＮＡと同一の配列であるエキソンを含むことが見出された。ゲノム配列ＡＬ０２２３２８との、ＨＤＡＣ９(２０２２〜８)のアンチセンス配列のＣｌｕｓｔａｌｗアラインメントを図３に示す。ＨＤＡＣ９と予想されるｃＤＮＡの最初の７塩基は、おそらくそれらが次のイントロンへと続きそしてこの配列がおそらくソフトウエアにとって短すぎてアラインメントを測定することができないために、アラインメントしない。ｃＤＮＡクローンＭ６の配列は、自動ＤＮＡ配列決定法(ACGT, Inc., Northbrook, IL)により確認された。ゲノム配列ＡＬ０２２３２８から予想されたｃＤＮＡ配列に基づいて、４４塩基がＭ６のＮ末端から消失していた。続いて、この配列をＰＣＲにより加えた。
【００６４】
ＨＤＡＣ９の完全長ｃＤＮＡから、６７３アミノ酸のタンパク質が予想される。ＨＤＡＣ９のｃＤＮＡ配列は２０２２塩基対の長さである。他の既知のＨＤＡＣとのＨＤＡＣ９の類似性の割合を測定するために、Ｃｌｕｓｔａｌｗ複数配列アラインメントを、ＨＤＡＣ１〜９の完全ペプチド配列を用いて行った。ＨＤＡＣ９は、ヒトＨＤＡＣ６に対するペプチド配列類似性が３７％と最も高い。クラスＩＩ ＨＤＡＣとのＨＤＡＣ９のＣｌｕｓｔａｌｗアラインメントを、図９に示す。ＨＤＡＣ９は、また、Ｓ. ｐｏｍｂｅからの酵母クラスＩＩ配列ｈｄａ１に対して４０％の類似性であった。ヒトＨＤＡＣ９およびＳ. ｐｏｍｂｅのＣｌｕｓｔａｌｗアラインメントを図４に示す。ＨＤＡＣ９はクラスＩ ＨＤＡＣに対して比較的類似性が低い(＜１８％)。クラスＩ ＨＤＡＣに対するＨＤＡＣ９のＣｌｕｓｔａｌｗアラインメントを図１０に示す。
【００６５】
ＨＤＡＣ９は、他の既知のすべてのＨＤＡＣの推定触媒ドメインとのＨＤＡＣ９のアラインメントに基づいて、約３１７ａａ(約６から３２３)を包含する触媒ドメインを有する。ＨＤＡＣ９の触媒ドメインを同定するために、Ｃｌｕｓｔａｌｗアラインメントを、クラスＩ ＨＤＡＣ(１〜３および８)またはクラスＩＩ ＨＤＡＣ(４〜７)からのＨＤＡＣ９完全ペプチドおよび触媒ドメイン配列を用いて個別に行う。従来から、１アミノ酸変異による不活性化ならびにＨＤＡＣ様タンパク質(ＨＤＬＰ)、Ｚｎ２＋およびＨＤＡＣインヒビターの複合体により形成される三次元構造に基づいて、１３アミノ酸がデアセチラーゼ活性に寄与することが示されていた(Finnin, M. S., Doniglan, J. R., Cohen, A., Richon, V. M., Rifkind, R. a., Marks, P. A., Breslow, R., and Pavletich, N. P. (1999) Structures of a histone deacetylase homologue bound to TSA and SAHA inhibitors. Nature 401, 188-193)。
【００６６】
これらの１３アミノ酸は、Ｐｒｏ ２２、Ｈｉｓ １３１、Ｈｉｓ １３２、Ｇｌｙ １４０、Ｐｈｅ １４１、Ａｓｐ １６６、Ａｓｐ １６８、Ｈｉｓ １７０、Ａｓｐ １７３、Ｐｈｅ １９８、Ａｓｐ ２５８、Ｌｅｕ ２６５、およびＴｙｒ ２９７を含む。これらの１３アミノ酸のうちの１２は、ＨＤＡＣ９において保存されている。保存されていないアミノ酸は、Ｌｅｕ ２６５である。この疎水性残基はＴＳ結合ポケットの一部を形成し、そしてＨＤＡＣ９において２７２位のアミノ酸がＧｌｕに置換されている。Ｌｅｕ ２６５は、ＨＤＡＣ８においてはＭｅｔに置換され、そしてＨＤＡＣ６ドメイン１においてはＬｙｓに置換されている。これにより、該残基は高度に保存されているわけではなく、他のＨＤＡＣと同一である必要がないことが示唆される。ＨＤＬＰ、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ２と異なる第２の残基であるＡｓｐ １７３は、ＨＤＡＣ９の１７７位においてＧｌｎで置換されており、この相違はＨＤＡＣ６の触媒ドメイン１においても存在する。さらに、Ａｓｐ １７３は、ＨＤＡＣ４、５、６(ドメイン２)、および７において、Ａｓｎで置換されている。この証拠により、これらのＡｓｐ １７３の置換はＨＤＡＣ活性に影響しないことが示唆される。
【００６７】
従来から、アミノ酸配列モチーフはＨＤＡＣ１および２の網膜芽腫タンパク質(Ｒｂ)に対する結合に重要であることが見出されている。ＨＤＡＣ１および２とＲｂの複合体が、Ｅ２Ｆ応答プロモーターの抑制を誘導する(Brehm, A., Miska, E. A., McCance, D. J., Reid, J. L., Bannister, A. J., and Kouzarides, T. (1998) Nature 391, 597-601)。Ｒｂ結合モチーフは、配列モデルＬＸＣＸＥ（式中、“Ｘ”は任意のアミノ酸である。）と適合する。該ＬＸＣＸＥドメインは、Ｒｂの増殖抑制機能に関して必須でないことが見出されているが、ＨＤＡＣ結合には必要である(Chen, T.-T. and Wang, J. Y. J. (2000) Mol. Cell Biol. 20, 5571-5580)。以前にＨＤＡＣ１において決定されたＲｂ結合ドメインは、アミノ酸４１４からアミノ酸４１９に位置し、そして配列ＩＡＣＥＥである。これまで、他のＨＤＡＣがＲｂに対して結合できるかどうか決定されていなかった。しかしながら、ＨＤＡＣ９は推定Ｒｂ結合モチーフＬＳＣＩＬを含み、これはＨＤＡＣ１ ＩＡＣＥＥとアラインし、そしてアミノ酸５６０〜５６４の間に位置する。ＲｂとのＨＤＡＣ９の共免疫沈降は、ＨＤＡＣ９におけるこのモチーフの機能を確認するために使用され得る１つのストラテジーである。
【００６８】
ＨＤＡＣファミリーのメンバーのように、ＨＤＡＣ９はタンパク質と生物学的に等価な複合体を形成し、そして他のＨＤＡＣに関して記載された機能を示し得る。例えば、それは、複合タンパク質複合体とのＨＤＡＣの相互作用を介する転写抑制に関係する複合体の構成成分として転写制御に関係し得、そしてこれはデアセチラーゼ活性を必要とする。したがって、ＨＤＡＣ９の活性または発現の増加は、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性または免疫性応答、あるいは乾癬を含む(しかし、これらに限定されるわけではない)数多くの病理学的状態に関連し得る。
【００６９】
したがって、ＤＮＡ／アミノ酸配列およびＨＤＡＣ９の予想された構造は、ＨＤＡＣ活性の異常に関連する病状を改善するのに有用な薬剤(例えば、アンタゴニストまたはインヒビター)を設計するのに有用である。これらには、例えば、それに対して指向された小分子またはタンパク質(例えば、抗体)の使用を介する抗増殖性または抗炎症性薬剤、あるいはＨＤＡＣ転写リプレッサー複合体中の関連タンパク質を含まれ得る。さらに、ＨＤＡＣ９配列に由来するタンパク質は、また、宿主細胞増殖性または炎症性応答を緩和する治療薬としても使用され得る。
【００７０】
新規ポリペプチドの発現パターンを測定するために、種々のヒト組織からのｍＲＮＡパネルをノーザン分析にかける。データにより、ＨＤＡＣ９がヒト組織中で発現しており、脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、胎盤、小腸、脾臓、胃および精巣において検出可能であることが示唆される。したがって、ＨＤＡＣ９は転写された遺伝子を表す。
【００７１】
したがって、１つの観点において、本発明は新規ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）に関する。上で概説したように、ＨＤＡＣ９はｈｄａ１ クラスＩＩ ＨＤＡＣ中の他のＨＤＡＣタンパク質に対して極めて類似しているので、ＨＤＡＣ９は明らかにＨＤＡＣファミリーのメンバーである。それは、また、ＨＤＡＣファミリーと多くの類似性を共有する。
【００７２】
本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドに関連する。例えば、このようなポリペプチドは、新規ＨＤＡＣ９のアミノ酸配列を含む融合タンパク質であり得る。別の観点において、本発明は、特に新規ＨＤＡＣ９である、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドに関する。
【００７３】
本発明は、核酸またはヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡ分子、特に新規ＨＤＡＣ９をコードするものを含む。好ましくは、本発明の単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子は、配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。同様に、配列番号１、配列番号５または配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子が同様に好ましい。このような核酸またはヌクレオチド、特にこのようなＤＮＡ分子は、好ましくは、
(１)それぞれ配列番号１、５および６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする完全ｃＤＮＡ配列である、配列番号２、７または８で示されるヌクレオチド配列；
(２)配列番号２で示されるｃＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームに対応する配列番号３で示されるヌクレオチド配列；
(３)配列番号３で示されるヌクレオチド配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズできるヌクレオチド配列；および
(４)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする内在性ヒトゲノムＤＮＡに対応する配列番号４で示されるヌクレオチド配列：
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。このようなハイブリダイズの条件は、上記のように、ハイストリンジェントであるか、または比較的ハイストリンジェントでなくてもよい。核酸がデオキシオリゴヌクレオチド(“オリゴ”)である場合において、ハイストリンジェント条件とは、例えば、３７℃(１４−塩基オリゴのために)、４８℃(１７−塩基オリゴのために)、５５℃(２０−塩基オリゴのために)、および６０℃(２３−塩基オリゴのために)にて、６×ＳＳＣ／０.０５％ピロ燐酸ナトリウム中で洗浄することを意味し得る。さまざまな組成物の核酸のためのこのようなストリンジェント条件の適当な範囲は、Krause and Aaronson (1991), Methods in Enzymology, 200:546-556、ならびに前出のManiatis et al.において記載されている。
【００７４】
これらの核酸分子は、例えば、標的遺伝子の制御において有用な標的遺伝子アンチセンス分子として、および／または標的遺伝子核酸配列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして、機能し得る。さらに、このような配列は、標的遺伝子の制御に有用な、リボザイムおよび／またはトリプルへリックス配列の部分として使用され得る。さらになお、このような分子は診断方法の構成要素として使用され得、その結果、ＨＤＡＣ９発現または活性の異常を伴う疾患、例えば、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性または免疫性応答、あるいは乾癬を引き起こす対立遺伝子の存在が検出され得る。
【００７５】
本発明は、また、
(a)任意の前記のヌクレオチド配列および／またはそれらに相補的なもの(すなわち、アンチセンス)の少なくとも１つのフラグメントを含むベクター；
(b)コードしている配列の発現を指示する制御エレメントと機能的に結合した任意の前記のコード配列を含む、ベクター分子、好ましくは転写制御配列を含むベクター分子、特に発現ベクター；および
(c)本明細書において記載したベクター分子または宿主細胞においてコード配列の発現を指示する制御エレメントと機能的に結合した任意の前記のヌクレオチド配列の少なくとも１つのフラグメントを含む遺伝子操作された宿主細胞
を含む。本明細書において使用されるように、制御エレメントには、誘導可能なおよび誘導不可能なプロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび発現を駆動および制御する当業者に既知の他のエレメントが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は脊椎動物の宿主細胞、好ましくは哺乳動物の宿主細胞、例えばヒト細胞またはネズミ細胞、例えばＣＨＯまたはＢＨＫ細胞であり得る。同じく好ましくは、宿主細胞は細菌性宿主細胞、特にE.coli細胞であり得る。
【００７６】
特に好ましいのは、インビトロで増殖させることができて、そして培養増殖によりＨＤＡＣ９ポリペプチド、特に配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むかからなるポリペプチドを生成する能力のあるところの、とくに上述のタイプの宿主細胞であり、そこでは該細胞は、該ポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子の転写制御配列ではない１もしくはそれ以上の転写制御配列により制御された構成体中にＨＤＡＣ９コード配列のあるフラグメントまたは完全配列を含み、そこでは該１もしくはそれ以上の転写制御配列が該ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する。可能性のある転写制御配列には、細菌性またはウイルス性配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明は、該遺伝子の完全配列ならびに本明細書において開示された任意の核酸配列のフラグメントを含む。新規ＨＤＡＣ９ポリペプチドをコードする核酸配列のフラグメントは、ＨＤＡＣ９遺伝子に対する高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するためのｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイズ用プローブとして使用され得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも約３０塩基を有し、そして、例えば、約３０〜約５０塩基、約５０〜約１００塩基、約１００〜約２００塩基、または２００塩基以上を含み得る。該プローブは、また、完全長転写物ならびにゲノム性クローンまたは制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全ＨＤＡＣ９遺伝子を含むクローンに対応するｃＤＮＡクローンを同定するために使用され得る。スクリーニングの１つの例は、既知のＤＮＡ配列を用いることによりＨＤＡＣ９遺伝子のコード領域を単離して、オリゴヌクレオチドプローブを合成することを含む。本発明の遺伝子と相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングして、プローブがハイブリダイズするライブラリーのメンバーを決定するために使用され得る。
【００７８】
上記の遺伝子配列に加えて、例えば他の生物種に存在するであろうような配列のホモログを、当分野において周知の分子生物学的技法により、必要以上の実験(undue experimentation)を行わずに、同定しかつ容易に単離し得る。さらに、そのような遺伝子産物の１またはそれ以上のドメインに対して相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、ゲノム内の他の遺伝子座に存在してもよい。これらの遺伝子は、また、同様の技法で同定され得る。例えば、新規ＨＤＡＣ９ ポリペプチドをコードする本発明の単離ヌクレオチド配列を標識し、興味のある生物から得られたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーが、標識配列が得られた生物のタイプと異なる生物から得られる場合には、ハイブリダイゼーションはより低いストリンジェント条件下で行われるであろう。これに代えて、標識フラグメントを用いて、興味のある生物から得られるゲノムライブラリーを、ここでも適切にストリンジェント条件を用いてスクリーニングし得る。そのような低いストリンジェント条件は当業者に周知であろうし、そしてライブラリーおよび標識配列が得られる特定の生物に依存して予想の通りに変動するであろう。そのような条件の指針として例えば上で引用されたSambrook et al.を参照されたい。
【００７９】
さらに、興味のある遺伝子内のアミノ酸配列に基づいてデザインした二つの縮重したオリゴヌクレオチドプライマープールを用いてＰＣＲを実施することにより、以前に知られていなかった、差次的発現遺伝子型(differentially expressed gene-type)の配列を単離し得る。反応用のテンプレートは、差次的発現対立遺伝子を発現すると知られているか推測されるヒトのもしくは非ヒトの細胞株または組織から調製したｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡであってもよい。ＰＣＲ産物をサブクローン化して配列決定し、増幅された配列が差次的発現遺伝子様核酸配列の配列を表わすことを確認し得る。次いで、ＰＣＲフラグメントを用いて、種々の方法により完全ｃＤＮＡクローンを単離し得る。例えば、増幅されたフラグメントを標識し、バクテリオファージのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングに用い得る。これに代えて、標識フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングし得る。
【００８０】
ＰＣＲ技法は、また、完全長ｃＤＮＡ配列を単離するのに利用され得る。例えば、適切な細胞もしくは組織の供給源から、標準的な手順にしたがって、ＲＮＡを単離し得る。第１鎖の合成のプライミングために増幅フラグメントの５’最末端に特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いて、ＲＮＡについて逆転写反応を実行し得る。次いで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに、標準的な末端トランスフェラーゼ反応を用いてグアニンで“テール”をつけ、該ハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化し、次いで第２鎖の合成をポリＣプライマーでプライムし得る。かくして、増幅フラグメント上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離し得る。使用し得るクローン化ストラテジーの総説については、例えば、上述のSambrook et al., 1989を参照されたい。
【００８１】
同定された遺伝子が正常の、即ち野生型の、遺伝子である場合には、この遺伝子を使用して、遺伝子の変異型対立遺伝子を単離し得る。そのような単離は、遺伝的基盤を有すると知られているか疑われているプロセスまたは障害において好ましい。変異型対立遺伝子は、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性もしくは免疫性応答、または乾癬のような病状を含む（しかしこれらに限定されない）ＨＤＡＣ活性の異常に関連する疾患症状に寄与する遺伝子型を有すると知られているか疑われている個人から単離され得る。次いで、変異型対立遺伝子および変異型対立遺伝子産物を下記の診断アッセイシステムにおいて利用し得る。
【００８２】
変異遺伝子のｃＤＮＡは、例えば、当業者に周知である技術のＰＣＲを用いて単離され得る。この場合には、第１のｃＤＮＡ鎖を、変異型対立遺伝子を保有すると考えられる個人において発現していることが知られているか疑われている組織から単離されたｍＲＮＡにオリゴｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることにより、そして新しい鎖を逆転写酵素で伸張することにより、合成し得る。次いで、ｃＤＮＡの第２鎖は、正常遺伝子の５’末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いて合成される。これら２つのプライマーを用いて、産物を次いでＰＣＲで増幅し、適当なベクター中にクローン化し、そして当業者に周知である方法によりＤＮＡ配列分析に供する。変異型遺伝子のＤＮＡ配列を正常遺伝子のそれと比較することにより、変異型遺伝子産物の機能の消失もしくは変化の原因となる変異を確認することができる。
【００８３】
これに代えて、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーを、変異型対立遺伝子を保有すると知られているか疑われている個人において、目的の遺伝子を発現していると知られているか疑われている組織からのＤＮＡまたはＲＮＡをそれぞれ用いて構築し、そしてスクリーニングすることができる。次いで、正常な遺伝子もしくはその任意の適当なフラグメントを標識し、プローブとして用いて、ライブラリー中の対応する変異型対立遺伝子を同定し得る。次いで、この遺伝子を含有するクローンを当分野において日常的に実施される方法により精製し、上述のように配列分析に供し得る。
【００８４】
これに加えて、変異型対立遺伝子を保有すると疑われているか知られている個人において、目的の遺伝子を発現していることが知られているか疑われている組織から単離されたＤＮＡまたは同組織から合成されたｃＤＮＡを利用して、発現ライブラリーを構築することができる。この方法で、推定的変異組織から作成される遺伝子産物を発現し、以下に説明するように、正常な遺伝子産物に対する抗体と一緒に標準的な抗体スクリーニング技法を用いてスクリーニングし得る(スクリーニング技法については、例えば、Harlow, E. and Lane, eds., 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harborを参照のこと)。変異により、変化した機能を有する発現遺伝子産物がもたらされる場合には(例えば、ミスセンス変異の結果として)、抗体のポリクローナルセットは変異遺伝子産物と交叉反応すると思われる。そのような標識抗体との反応により検出されるライブラリークローンを精製し、上述のように配列分析に供することができる。
【００８５】
本発明は、配列番号２、３、４、７または８のいずれかで示されるヌクレオチド配列によりコードされたタンパク質、特に、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列であるかもしくはこれらを含むポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００８６】
さらに、本発明は機能的に同等な遺伝子産物を表すタンパク質を含む。そのような同等な差次的発現遺伝子産物は、上述の差次的発現遺伝子によりコードされるアミノ酸配列内に、アミノ酸残基の欠失、付加もしくは置換を含んでもよいが、それはサイレントな変化をもたらし、かくして機能的に同等な差次的発現遺伝子産物を生成する。アミノ酸の置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／もしくは両親媒性における類似性に基づいてなされてもよい。
【００８７】
例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書において使用される“機能的に同等な”とは、上述の差次的発現遺伝子配列によりコードされた内在性の差次的発現遺伝子産物と実質的に類似したインビボおよびインビトロ活性を発揮する能力のあるタンパク質もしくはポリペプチドを意味し得る。
【００８８】
“機能的に同等な”は、また、内在性の差次的発現遺伝子産物の対応する部分がするであろう方式と実質的に類似した様式で他の細胞内もしくは細胞外分子と相互作用する能力のあるタンパク質もしくはポリペプチドを意味し得る。例えば、“機能的に同等な”ペプチドは、イムノアッセイにおいて、内在性タンパク質の対応するペプチド(すなわち、そのアミノ酸配列を修飾して“機能的に同等な”ペプチドを達成したペプチド)への、もしくは内在性タンパク質自身への、抗体の結合を減少させることができるであろうが、そこでは該抗体は内在性タンパク質の対応するペプチドに対するものである。等モル濃度の機能的に同等なペプチドは、対応するペプチドの前記結合を少なくとも約５％、好ましくは約５％〜１０％、さらに好ましくは約１０％〜２５％、なおさらに好ましくは約２５％〜５０％、そして最も好ましくは約４０％〜５０％だけ減少させるであろう。
【００８９】
本発明のポリペプチドは、当分野において周知である技法を用いる組換えＤＮＡ技術により製造され得る。したがって、本発明のポリペプチドを製造する方法が提供され、該方法は、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする外来性ポリヌクレオチドを含有する発現ベクターがその中に組み込まれた宿主細胞を、その宿主細胞中でポリペプチドを発現させるに十分な条件下で培養することを含み、それによって発現ポリペプチドの生成を引き起こす。所望により、該方法はさらに該細胞により生成されたポリペプチドを回収することを含む。そのような方法の好ましい実施態様において、該外来性ポリヌクレオチドは、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。好ましくは、該外来性ポリヌクレオチドは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７もしくは配列番号８のいずれかで示されるヌクレオチド配列を含む。配列番号３で示されるヌクレオチド配列、すなわちオープンリーディングフレームを使用する場合には、その配列は、ベクターに挿入されるとき、１つもしくはそれ以上の適切な翻訳停止コドンが、好ましくはｃＤＮＡ配列中のヌクレオチド２０２１で始まる天然型内在性停止コドンＴＧＡが、後ろに続いてもよい。
【００９０】
かくして、それぞれのヌクレオチド配列をコードする核酸を発現させることにより、本発明のポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が、本明細書において記載される。当業者に周知である方法を用いて、タンパク質コード配列および適当な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技法、合成技法およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば、上記Sambrook et al., 1989および上記Ausubel et al., 1989に記載されている技法を参照されたい。これに代えて、タンパク質配列の差次的発現遺伝子をコードする能力のあるＲＮＡを、例えば合成機(synthesizers)を用いて化学的に合成してもよい。例えば、"Oligonucleotide Synthesis", 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford(出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)に記載されている技法を参照されたい。
【００９１】
種々の宿主−発現ベクターシステムを利用して、本発明のＨＤＡＣ９遺伝子コード配列を発現させ得る。そのような宿主−発現システムは、目的のコード配列を生成し次いで精製し得るビヒクルを表すが、また、適切なヌクレオチドコード配列を形質転換もしくは形質移入したときに、インサイツ(in situ)で本発明のＨＤＡＣ９遺伝子タンパク質を発現し得る細胞を表す。これらとしては、差次的発現遺伝子タンパク質コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、E.coli、B.subtilis)のような微生物；差次的発現遺伝子タンパク質コード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母(例えば、Saccharomyces、Pichia)；差次的発現遺伝子タンパク質コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染もしくは形質移入させた昆虫細胞システム；組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)で感染させた、もしくは、タンパク質コード配列を含有する、プラスミド(例えば、Ｔｉプラスミド)を含む組換えベクターで形質転換させた、植物細胞システム；または哺乳動物細胞のゲノムから得られるプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスから得られるプロモーター(例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７.５ＫプロモーターもしくはＣＭＶプロモーター)を含有する組換え発現構築体を収容する哺乳動物細胞システム(例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９２】
また、その細胞に本来存在するＨＤＡＣ９コード遺伝子から細胞により本発明のＨＤＡＣ９の発現を実施することができる。そのような発現の方法は、例えば、米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７(これらは全て出典明示により、これらの全体を本明細書の一部とする。)に詳述されている。米国特許５,６４１,６７０；５,７３３,７６１；５,９６８,５０２；および５,９９４,１２７のいずれかの方法によりＨＤＡＣ９を発現するように誘導されている細胞を、生きている動物中で望ましい組織中に植え込んで、該組織内のＨＤＡＣ９の局所的濃度を増加させることができる。
【００９３】
細菌のシステムにおいて、発現されるタンパク質の使用目的に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択し得る。例えば、抗体の作成のためにもしくはペプチドライブラリーをスクリーニングするために、大量のそのようなタンパク質を生成したい場合には、例えば、容易に精製できる融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが望ましいであろう。この点において、ヘキサヒスチジンタグ、例えばｐＣＤＮＡ３.１／Ｈｉｓ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含むEpiTag vectosを含む融合タンパク質が使用され得る。他のベクターとして、E.coli発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791)[該タンパク質コード配列は、融合タンパク質が生成され得るように、ｌａｃＺコード領域とフレーム中のベクター中で個別に結合され得る]；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
ｐＧＥＸベクターは、また、外来ポリペプチドをグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)と共に融合タンパク質として発現させるために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、そして溶解した細胞からグルタチオン−アガローズビーズへの吸着とこれに続く遊離グルタチオン存在下での溶出により容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された目的遺伝子タンパク質をＧＳＴ部分から放出できるように、トロンビンもしくは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含有するようデザインされている。Ｆｌａｇタグ、例えば３Ｘ Ｆｌａｇ(Sigma, St. Louis, MO)またはｍｙｃタグ、例えばｐＣＤＮＡ３.１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む融合タンパク質が使用され得る。これらの融合物は、抗体が入手できないタンパク質の共免疫沈降およびウエスタン検出を可能にする。
【００９５】
プロモーター領域は、候補プロモーターフラグメント；即ちプロモーターを含有し得るフラグメント、を導入するための１つ以上の制限部位の下流で、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“ＣＡＴ”)のようなプロモーター領域を欠くレポーター転写ユニット、またはルシフェラーゼ転写ユニットを含有するベクターを用いて任意の望ましい遺伝子から選択され得る。例えば、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位におけるプロモーター含有フラグメントのベクター中への導入は、標準的なＣＡＴアッセイにより検出することができるＣＡＴ活性の生成を惹き起こす。この目的に適したベクターは周知であり、そして容易に入手可能である。二つのそのようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。かくして、本発明のポリヌクレオチドの発現用のプロモーターには、周知かつ容易入手可能なプロモーターのみならず、レポーター遺伝子を用いて前述の技法により容易に得られ得るプロモーターも含まれる。
【００９６】
本発明にしたがうポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した公知の細菌プロモーターの中には、大腸菌のｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、Ｔ５ ｔａｃ プロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターならびにｔｒｐプロモーターがある。この点に関して適当な公知の真核細胞のプロモーターの中には、ＣＭＶの直接前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス(“ＲＳＶ”)のそれらのようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターがある。例えば、プラスミド構築体は、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質またはルシフェラーゼのコード領域をコードするレポーター転写ユニットと融合したＨＤＡＣ９転写制御配列を含有し得る。
【００９７】
この構築体は、ＨＤＡＣ９の転写を調節する小分子をスクリーニングするために使用され得る。このような小分子は、潜在的な治療薬である。さらに、ＨＤＡＣ９レポーター遺伝子は、蛍光リポーターおよびイメージング技術、例えば蛍光顕微鏡またはBiophotonicインビボイメージング、リアルタイムで視覚的および定量的測定を提供する技術(Xenogen, Palo Alto, CA)を用いて哺乳動物細胞または異種移植片におけるＨＤＡＣ９治療の効果を試験するために使用され得る。正常、罹患した、または薬物処置した組織または細胞中のこれらのレポーターにおける変化は、ＨＤＡＣ９発現または活性における変化のインジケーターであり得る。
【００９８】
昆虫のシステムにおいて、Autographa californicaの核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)は、外来遺伝子発現ベクターとして使用され得る幾つかの昆虫システムの１つである。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞中で増殖する。コード配列をウイルスの非必須領域(例えば多角体遺伝子)の中に個別にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えば多角体プロモーター)の制御下に置き得る。コード配列の成功的挿入は、ポリへドリン遺伝子の失活および閉じ込められていない組換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によってコードされるタンパク質性の外被を欠いているウイルス)の生成をもたらす。次いで、これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子を発現するSpodoptera frugiperda細胞に感染させる(例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, 米国特許第４,２１５,０５１号を参照のこと)。
【００９９】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現システムを利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、興味のあるコード配列をアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三連リーダー配列に結合させ得る。次いで、このキメラ遺伝子をインビトロもしくはインビボ組換えによりアデノウイルスのゲノム中に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、Ｅ１もしくはＥ３領域)への挿入は、感染宿主中で生存可能かつ望ましいタンパク質を発現する能力のある、組換えウイルスをもたらすであろう(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659を参照のこと)。また、挿入された遺伝子コード配列の効率的翻訳のために特定の開始シグナルが必要とされ得る。
【０１００】
これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接の配列が挙げられる。それ自身の開始コドンおよび隣接の配列を含有する遺伝子全体を適切な発現ベクター中に挿入する場合には、さらに別の翻訳制御シグナルは必要でないであろう。しかしながら、配列をコードする遺伝子の一部のみが挿入される場合には、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、挿入物全体の翻訳を確保するためには、開始コドンは望ましいコード配列のリーディングフレームと合っていなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然のおよび合成の両方の、種々の起源のものでよい。
【０１０１】
発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含めることにより増大され得る(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 516-544を参照のこと)。他の一般的なシステムは、ＳＶ４０、レトロウイルスもしくはアデノ随伴ウイルスに基づくものである。宿主細胞内での発現用の適切なベクターおよびプロモーターの選択は周知の手順であり、そして発現ベクターの構築、宿主内へのベクターの導入、および宿主自身内での発現に不可欠な技法は当分野において日常的技術である。一般的に、組換え体発現ベクターは、複製起点、下流の構造配列の転写を指令するための高度に発現される遺伝子から得られるプロモーター、およびベクターへの曝露後にベクター含有細胞の単離を可能にする選択マーカーを含むであろう。
【０１０２】
加えて、挿入配列の発現を調整するか、もしくは遺伝子産物を特定の望ましい方法で修飾およびプロセシングする、宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のそのような修飾(例えばグリコシル化)およびプロセシング(例えば切断)は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特性的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株もしくは宿主系を選んで、発現された外来性タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のために、一次転写物の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化および燐酸化のための細胞の仕組み(cellular machinery)を有する真核生物の宿主細胞を用い得る。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
組換えタンパク質の長期間、高収率な生成のためには、安定的な発現が好ましい。例えば、差次的発現遺伝子タンパク質を安定的に発現する細胞株を工学操作し得る。ウイルス性の複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりもむしろ、適切な発現制御エレメント(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、等)で制御されるＤＮＡおよび選択マーカーにより、宿主細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入に続いて、工学操作された細胞は強化培地で１〜２日間増殖させてもよく、次いで選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択マーカーが選択抵抗性を与え、そして細胞がプラスミドをその染色体中に安定的に組み込み、かつ増殖巣を形成するために増殖することを可能にし、これを今度は細胞株中にクローン化し伸張させることができる。この方法は、差次的発現遺伝子タンパク質を発現する細胞株を工学操作するのに有利に用いられる。そのような工学操作された細胞株は、発現されたタンパク質の内在的活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であろう。
【０１０４】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−もしくはａｐｒｔ−細胞内で使用され得る単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817)の遺伝子を含むが、これらに限定されない、多数の選択システムが使用され得る。また、メトトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527)；ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072)；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびヒグロマイシン抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ(Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147)の遺伝子に対する選択の基盤として、代謝拮抗剤抵抗性を用いることができる。
【０１０５】
これに代わる融合タンパク質システムは、ヒト細胞株で発現される非変性融合タンパク質の迅速な精製を可能にする(Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8972-8976)。このシステムでは、目的の遺伝子は、該遺伝子のオープンリーディングフレームが６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端タグに翻訳的に融合されるように、ワクシニアの組換えプラスミドの中にサブクローン化される。組換えワクシニアウイルスを感染させた細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムに装てんし、そしてヒスチジンタグをつけたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出する。
【０１０６】
以下に説明するようなアッセイシステムにおける成分として用いるときには、本発明のタンパク質を直接的もしくは間接的に標識して、タンパク質と試験物質との間で形成された複合体の検出を容易にし得る。１２５Ｉのような放射性同位元素；基質に曝露すると検出可能な比色シグナルもしくは光を発生する酵素標識システム；および蛍光標識を含むが、これらに限定されない、種々の適当な標識システムのいずれかを使用し得る。
【０１０７】
組換えＤＮＡ技術を用いて、このようなアッセイシステム用に本発明のタンパク質を生成する場合には、標識、固相化、検出および／もしくは単離を容易にすることができる、融合タンパク質を工学操作するのが有利であり得る。
間接標識は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する標識抗体のような、タンパク質の使用を伴う。そのような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生成されるフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
別の実施態様において、ＨＤＡＣ９タンパク質をコードする配列を含む核酸もしくはその機能的誘導体を投与して、遺伝子治療により、正常な生物学的機能、例えば正常な転写制御を促進する。遺伝子治療とは、対象への核酸の投与により実施される治療をいう。本発明のこの実施態様において、核酸は、正常な転写制御を促進することにより治療効果を仲介する、そのコードされたタンパク質を生成する。
【０１０９】
当分野において使用可能な遺伝子治療のいずれかを、本発明にしたがって使用することができる。例示的な方法は以下に説明されている。
【０１１０】
好ましい観点において、治療薬は、適当な宿主中でＨＤＡＣ９タンパク質またはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質を発現する、発現ベクターの一部であるところのＨＤＡＣ９核酸を含む。特に、そのような核酸はＨＤＡＣ９コード領域に機能し得るように結合したプロモーターを有しており、該プロモーターは誘導性もしくは構成的、そして所望により組織特異的である。別の特定の実施態様において、その中でＨＤＡＣ９コード領域配列および任意の他の望ましい配列がゲノム中の望ましい部位で相同的組換えを促進する領域で隣接している核酸分子が用いられ、かくしてＨＤＡＣ９核酸の染色体内発現が提供される(Koller and Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438)。
【０１１１】
患者への核酸の送達は、直接的（この場合には、患者は核酸もしくは核酸を保有するベクターに直接曝露される。）または間接的（この場合には、細胞は先ずインビトロで核酸により形質転換され、次いで患者に移植される。）のいずれかであり得る。これら二つのアプローチは、それぞれインビボもしくはエキスビボ(ex vivo)遺伝子治療として知られている。
【０１１２】
特異的な実施態様において、核酸はインビボで直接投与され、そこでは発現してコードされた産物を生成する。これは当分野において公知の多数の方法のいずれかにより達成されることができるが、それは、例えば、それを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そして、例えば、欠失もしくは弱毒レトロウイルスまたは他のウイルスベクター(例えば、米国特許第４,９８０,２８６号および上述の他のものを参照のこと)を用いる感染により、もしくは裸のＤＮＡの直接的注入により、もしくは微粒子衝撃(例えば、遺伝子銃; Biolistic, Dupont)の使用により、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤、リポゾーム内への封入、微粒子もしくはマイクロカプセルによるコーティングにより、それが細胞内となるように、投与することによるか、または核に入ることが知られているペプチドに結合した形でそれを投与することによるか、受容体−仲介エンドサイトーシスを受けるリガンドに結合した形でそれを投与することによる(例えば、米国特許５,１６６,３２０；５,７２８,３９９；５,８７４,２９７；および６,０３０,９５４（これらのすべてを出典明示によりそれらの全体を本明細書の一部とする）を参照のこと)(これは受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするために用いることができる)、等である。
【０１１３】
別の実施態様において、核酸−リガンド複合体を形成することができて、その中で、リガンドはエンドゾームを破壊する融合誘導性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソームによる分解を避けることを可能にする。さらに別の実施態様において、核酸は、特異的受容体を標的とすることにより、細胞特異的な取り込みと発現をインビボで標的とされることができる(例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ９２／０６１８０；ＷＯ  ９２／２２６３５；ＷＯ  ９２／２０３１６；ＷＯ  ９３／１４１８８；およびＷＯ  ９３／２０２２１を参照のこと)。これに代えて、核酸を細胞内に導入し、相同的組換えにより宿主細胞のＤＮＡ内に組み込んで発現させることができる(例えば、米国特許５,４１３,９２３；５,４１６,２６０；および５,５７４,２０５；ならびにZijlstra et al., 1989, Nature 342:435-438を参照のこと)。
【０１１４】
特定の実施態様において、ＨＤＡＣ９核酸を含有するウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる(例えば、米国特許５,２１９,７４０；５,６０４,０９０；および５,８３４,１８２を参照のこと)。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムをパッケージして宿主細胞のＤＮＡに組み込むために必要でない、レトロウイルス配列を取り除くように修飾されている。遺伝子治療に用いられるＨＤＡＣ９核酸はベクター内にクローン化され、これは患者への遺伝子の送達を促進する。
【０１１５】
アデノウイルスは遺伝子治療に用いることのできる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは気道上皮に遺伝子を送達するためのとりわけ魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは天然では気道上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達システムの他の目標は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは非分裂細胞に感染する能力があるという利点を有している。アデノウイルスに基づく遺伝子治療を実施する方法は、例えば、米国特許５,８２４,５４４；５,８６８,０４０；５,８７１,７２２；５,８８０,１０２；５,８８２,８７７；５,８８５,８０８；５,９３２,２１０；５,９８１,２２５；５,９９４,１０６；５,９９４,１３２；５,９９４,１３４；６,００１,５５７；および６,０３３,８８４３(これらの全てを、出典明示によりそれらの全体を本明細書の一部とする)に記載されている。
【０１１６】
アデノ随伴ウイルス(ＡＡＶ)は、また、遺伝子治療への使用が提案されている。ＡＡＶの生成し、利用する方法は、例えば、米国特許５,１７３,４１４；５,２５２,４７９；５,５５２,３１１；５,６５８,７８５；５,７６３,４１６；５,７７３,２８９；５,８４３,７４２；５,８６９,０４０；５,９４２,４９６；および５,９４８,６７５(これらの全てを、出典明示によりそれらの全体を本明細書の一部とする)に記載されている。
【０１１７】
遺伝子治療へのもう１つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、燐酸カルシウム仲介形質移入もしくはウイルス感染のような方法により、遺伝子を組織培養の細胞に移入することを伴う。通常、移入の方法は選択マーカーの細胞への移入を含む。次いで、該細胞を、移入された遺伝子を取り込みそして発現しているそれらの細胞を単離するための選択下に置く。次いで、それらの細胞を患者に送達する。
【０１１８】
この実施態様では、核酸を先ず細胞に導入した後に、得られた組換え細胞をインビボで投与する。そのような導入は当分野において公知である任意の方法によって行なうことができ、その方法としては、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含有するウイルスもしくはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体仲介性遺伝子導入、マイクロセル仲介性遺伝子導入、スフェロプラスト融合、等が挙げられるが、これらに限定されない。外来性遺伝子を細胞に導入するための多数の技法は、当分野において公知であり、そしてレシピエント細胞の必要な発生上および生理的機能が損なわれない限り、本発明にしたがって用いられ得る。その技法は、核酸が細胞により発現可能であり、そして好ましくは、細胞の子孫によって遺伝性でありかつ発現可能であるように、核酸の細胞への安定な移入を提供すべきである。
【０１１９】
ここで得られる組換え細胞を、当分野において公知である種々の方法により患者に送達することができる。好ましい実施態様では、上皮細胞を例えば皮下に注射する。もう１つの実施態様では、組換え皮膚細胞を皮膚移植片として患者に適用し得る。好ましくは、組換え血液細胞(例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞)が静脈内投与される。使用を想定する細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者により決定されることができる。
【０１２０】
遺伝子治療の目的で核酸を導入できる細胞は、任意の望ましい、入手可能な細胞型をも包含し、そして上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血液細胞；種々の幹細胞もしくは前駆細胞、特に、例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝などから得られるような造血幹細胞および前駆細胞、が挙げられるが、これらに限定されない。
好ましい実施態様では、遺伝子治療に用いられる細胞は患者にとって自己由来のものである。
【０１２１】
組換え細胞が遺伝子治療に用いられる実施態様では、ＨＤＡＣ９核酸はそれが細胞およびその子孫により発現可能であるように細胞中に導入され、次いで、組換え細胞が治療効果のためにインビボで投与される。特定の態様では、幹細胞もしくは前駆細胞が用いられる。単離されそしてインビトロで維持されることができる任意の幹−および／もしくは前駆細胞は、本発明のこの実施態様にしたがって潜在的に使用されることができる。そのような幹細胞としては、造血幹細胞(ＨＳＣ)、皮膚および腸管の内層のような上皮組織の幹細胞、胚性心筋細胞、肝臓幹細胞(例えばＷＯ  ９４／０８５９８参照)、ならびに神経幹細胞(Stemple and Anderson, 1992, Cell 71:973-985)が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
上皮幹細胞(ＥＳＣ)もしくはケラチン生成細胞は、皮膚および腸管の内層のような組織から公知の手順(Rheiwald, 1980, Meth. Cell Bio. 21A:229)により得られ得る。皮膚のような重層上皮組織では、再生が基底板に最も近い層である基底層内の幹細胞の分裂によって起こる。腸管の内層内の幹細胞は、この組織の迅速な再生速度を提供する。患者もしくはドナーの皮膚もしくは腸管の内層から得られるＥＳＣもしくはケラチン生成細胞を、組織培養で増殖させることができる(Pittelkow and Scott, 1986, Mayo Clinic Proc. 61:771)。もしＥＳＣがドナーにより提供されるならば、宿主対移植片反応性を抑制する方法(例えば、放射線照射、中等度の免疫抑制を促進する薬剤もしくは抗体の投与)をまた用いることができる。
【０１２３】
造血幹細胞(ＨＳＣ)に関しては、インビトロでＨＳＣの単離、増殖および維持を提供する任意の技法を本発明のこの実施態様において用いることができる。これを達成し得る技法としては、(ａ)将来の宿主もしくはドナーから単離された骨髄細胞からのＨＳＣ培養液の単離および確立、または(ｂ)同種異系もしくは異種であり得る、先に確立された長期ＨＳＣ培養の使用、が挙げられる。非自家性ＨＳＣは、好ましくは将来の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法と一緒に用いられる。本発明の特別な実施態様では、ヒト骨髄細胞を後部腸骨稜(posterior iliac crest)から針穿刺吸引により得ることができる(例えば、Kodo et al., 1984, J. Clin. Invest. 73:1377-1384を参照のこと)。本発明の好ましい実施態様では、ＨＳＣは高度に富化した、もしくは実質的に純粋な形で作成することができる。この富化は長期培養の前、期間中、もしくは後で達成されることができ、そして、当分野において公知である任意の技法によって行われることができる。骨髄細胞の長期培養は、例えば、修飾Dexterの細胞培養技法(Dexter et al., 1977, J. Cell Physiol. 91:335)もしくはWitlock-Witteの培養技法(Witlock and Witte, 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3608-3612)を用いて確立され、そして維持され得る。
【０１２４】
特定の実施態様において、遺伝子治療の目的で導入される核酸は、核酸の発現が適切な転写インデューサーの存在もしくは不存在を制御することにより制御可能であるように、コード領域に機能し得るように結合された誘導性プロモーターを含む。
【０１２５】
本発明のさらなる実施態様は、配列番号１、５もしくは６で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または該ポリペプチドのフラグメントに特異的に結合する精製抗体またはそのフラグメントに関するものである。好ましい実施態様はそのような抗体のフラグメントに関するものであり、該フラグメントはＦａｂもしくはＦ(ａｂ')２である。特に、抗体はポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体であり得る。
【０１２６】
１つもしくはそれ以上の差次的発現遺伝子エピトープを特異的に認識できる抗体を作成する方法が本明細書において記載される。そのような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)、ヒト化もしくはキメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーで生成したフラグメント、抗イディオタイプ(ａｎｔｉ−Ｉｄ)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを挙げることができるが、これらに限定されない。そのような抗体は、例えば、フィンガープリント、標的、生物学的試料中の遺伝子の検出に、もしくはこれに代えて異常な標的遺伝子活性を阻害する方法として使用され得る。かくして、そのような抗体を心臓血管疾患の処置方法の一部として利用し得、そして／または患者のＨＤＡＣ９ポリペプチドの異常なレベルをもしくは異常な型のＨＤＡＣ９ポリペプチドの存在を試験し得るところの診断技法の一部として使用し得る。
【０１２７】
ＨＤＡＣ９ポリペプチドに対する抗体の生成のために、ＨＤＡＣ９ポリペプチドもしくはその一部の注射により、種々の宿主動物を免疫し得る。そのような宿主動物としては、２、３の例を挙げると、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。免疫応答を増強するために、宿主動物種に応じて種々のアジュバントを用いることができるが、これらとしては、フロインドの(完全および不完全)アジュバント、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、スカシガイのヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ(bacille Calmette-Guerin)およびCorynebacterium parvumのような潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物もしくはその抗原的に機能を有する誘導体のような抗原により免疫した動物の血清から得られる、抗体分子の不均一な集団である。ポリクローナル抗体の生成には、上述のような宿主動物を、また上述のようにアジュバントを補充したＨＤＡＣ９ポリペプチドもしくはその一部による注射により免疫し得る。
【０１２９】
特定抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、持続性細胞株の培養により抗体分子の生成を提供する、任意の技法によって得られ得る。これらとしては、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ技法(1975, Nature 256:495-497；および米国特許第４,３７６,１１０号)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96)が挙げられるが、これらに限定されない。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびその任意のサブクラスを含む、任意のイムノグロブリンクラスのものでもよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマはインビトロもしくはインビボで培養され得る。インビトロでの高力価のｍＡｂの生成に関して、これが現在のところ好ましい生成方法とされている。
【０１３０】
加えて、適切な抗原特異性を持つマウス抗体分子からの遺伝子を適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより、“キメラ抗体”を生成するために開発された技法(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)を用いることができる。キメラ抗体は、マウスｍＡｂから得られる可変領域もしくは超可変領域およびヒトイムノグロブリンの定常領域を有するそれらのような、種々の部分が種々の動物種から得られる分子である。
【０１３１】
これに代えて、単鎖抗体の生成のために記述された技法(米国特許第４,９４６,７７８号；Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-546)を適応して、差次的に発現する遺伝子−単鎖抗体を生成することができる。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを結合させることにより形成されて、単鎖ポリペプチドをもたらす。
【０１３２】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の生成に有用な技法を適応して、本明細書において開示されたポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的同等物に対する抗体を生成させることができる。そのような技法は、米国特許第５,９３２,４４８号；第５,６９３,７６２号；第５,６９３,７６１号；第５,５８５,０８９号；第５,５３０,１０１号；第５,９１０,７７１号；第５,５６９,８２５号；第５,６２５,１２６号；第５,６３３,４２５号；第５,７８９,６５０号；第５,５４５,５８０号；第５,６６１,０１６号；および第５,７７０,４２９号(これらは全体的な出典明示によりその全体を本明細書の一部とする)に開示されている。
【０１３３】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技法により作成され得る。例えば、そのようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシン消化により生成されることのできるＦ(ａｂ')２フラグメント、およびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作成されるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。これに代えて、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築して(Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にし得る。
【０１３４】
好ましくは、本発明の抗体は、ヒトにおけるＨＤＡＣ９発現または活性の異常、例えば細胞増殖の異常、癌、アテローム動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性もしくは免疫性応答、または乾癬に関連する病状を診断する方法において使用され得、該方法は、ＨＤＡＣ９活性の異常に関連した病状を患うヒトからの適切な組織または細胞中で、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドの量を測定することを含み、そこでは、ＨＤＡＣ９活性の異常に関連した病状を患っていないヒトからのそれぞれの組織中の該ポリペプチドもしくはそのフラグメントの量に比べて上昇した量の該ポリペプチドもしくはそのフラグメントの存在は、そのような病状に該ヒトが罹患していることの診断となる。
【０１３５】
そのような方法は本発明のさらなる実施態様を形成する。好ましくは、該検出ステップは該適切な組織もしくは細胞を、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含むポリペプチドに特異的に結合するところの抗体と接触させること、および該抗体と該適切な組織もしくは細胞中のポリペプチドとの特異的結合を検出することを含み、そこではポリペプチドへの特異的結合の検出は配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドの存在を示す。
【０１３６】
検出の容易のためにはサンドイッチアッセイが特に好ましく、それには多数の変法が存在するが、その全てが本発明に包括されるものとする。
【０１３７】
例えば、典型的なフォワードアッセイでは、非標識抗体を固体の基盤に固定し、結合した分子と被検試料を接触させる。適当な期間のインキュベーションの後、抗体−抗原の二元複合体の形成を起こさせるのに十分な期間。この時点で、検出可能なシグナルを誘発する能力のあるレセプター分子で標識された第２抗体を次いで添加してインキュベートし、抗体−抗原−標識抗体の三元複合体の形成に十分な時間を与える。いかなる未反応物質も洗浄して除き、そして抗原の存在をシグナルの観察で測定するか、もしくは既知量の抗原を含有する対照試料と比較して定量し得る。
【０１３８】
フォワードアッセイの変法としては、結合した抗体に試料および抗体を同時に添加する同時アッセイ、もしくは標識抗体と被検試料とを先ず一緒にしてインキュベートし、表面に結合した非標識抗体に添加する逆アッセイが挙げられる。これらの技法は当業者に周知であり、そして小さな変法の可能性は容易に明らかであろう。本明細書において使用されるように、“サンドイッチアッセイ”は、基本的な二−サイト技法に基づく全ての変法を包含することとする。本発明のイムノアッセイについて、唯一の制限因子は、標識抗体がＨＤＡＣ９ポリペプチドもしくはそのフラグメントに特異的である抗体でなければならないということである。
【０１３９】
このタイプのアッセイにおいて最も汎用されるレセプター分子は、酵素、蛍光物質もしくは放射性核種を含有する分子のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合には、酵素を、通常グルタルアルデヒドもしくは過ヨウ素酸(periodate)を用いて第２抗体に結合させる。容易に認識されるように、しかしながら、多様な異なる連結反応技法が存在し、これらは当業者に周知である。汎用される酵素としては、なかんずく西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特定の酵素と共に用いられる基質は、対応する酵素による加水分解によって検出可能な色調変化を生成するように一般に選ばれる。
【０１４０】
例えば、ｐ−ニトロフェニルホスフェートはアルカリホスファターゼ複合体と共に使用するのに適しており；ペルオキシダーゼ複合体には１,２−フェニレンジアミンもしくはトルイジンが汎用される。また、蛍光基質を使用することも可能であり、これは上述の発色性基質の代わりに蛍光産物を与える。次いで、適切な基質を含有する溶液を三元複合体に添加する。第２抗体と結合した酵素と基質が反応して定性的な視覚的シグナルを与え、これを通常分光測定法的にさらに定量して、血清試料中に存在するＨＤＡＣ９の量の判定を得ることができる。
【０１４１】
これに代えて、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光性化合物を、抗体の結合能を変えることなく抗体に化学的に結合させ得る。特定波長の光による照射で活性化された場合、蛍光色素で標識された抗体は光エネルギーを吸収して分子中に励起状態が誘起され、次いで特徴的なより長波長の光が放射される。発光は、光学顕微鏡により目視で検出可能な特徴的な色調として現れる。免疫蛍光およびＥＩＡ技法は両方とも当分野において非常に良く確立されていて、本発明の方法にとって特に好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化学発光もしくは生物発光分子のようなレポーター分子も、また、使用され得る。要求される使用に合わせるための手順の変更の仕方は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１４２】
本発明はまた、診断用試薬としての本発明のポリヌクレオチドの使用に関する。特に、本発明はヒトにおけるＨＤＡＣ９発現または活性の異常、例えば、細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性もしくは免疫性応答、または乾癬に関連した病状を診断する方法に関し、これは、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする天然型内在性ヒト遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡの上昇した転写を、ヒトからの適切な組織もしくは細胞内で検出することを含み、そこでは上昇した転写は、該ヒトがＨＤＡＣ９発現または活性の異常に関連した病状に罹患していることの診断となる。
【０１４３】
特に、該天然型内在性ヒト遺伝子は配列番号４、７または８で示されるヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様では、そのような方法は、該適切な組織もしくは細胞の試料を、またはその組織もしくは細胞から得られる単離ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を、配列番号１、５または６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離ヌクレオチド配列とハイストリンジェント条件下でハイブリダイズする、少なくとも約２０ヌクレオチド長の単離ヌクレオチド配列と接触させることを含む。
【０１４４】
機能障害と関連する、配列番号４、７または８のポリヌクレオチドを特徴とする遺伝子の変異型の検出は、この遺伝子の過少発現、過大発現、または変化した位置的もしくは時間的発現によりもたらされるところの疾患、もしくは疾患に罹りやすさの診断に追加し、または、該診断を規定することができる、診断の手段を提供する。この遺伝子の変異を保有する個人は種々の技法によりＤＮＡレベルで検出され得る。
【０１４５】
診断用の核酸、特にｍＲＮＡは、血液、尿、唾液、組織生検もしくは剖検材料からのような対象の細胞から入手し得る。ゲノムＤＮＡは検出のために直接使用され得るか、または、分析前にＰＣＲもしくはその他の増幅技法を用いることにより酵素的に増幅され得る。ＲＮＡもしくはｃＤＮＡはまた、同様に用いられ得る。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較して増幅産物のサイズの変化により検出され得る。本発明のＨＤＡＣ９ポリペプチドをコードする標識ヌクレオチド配列に増幅ＤＮＡをハイブリダイズさせることにより、点突然変異を同定することができる。
【０１４６】
完全にマッチした配列は、ＲＮアーゼ消化もしくは融解温度の違いによりミスマッチの二重鎖から区別されることができる。ＤＮＡ配列の差はまた、変性剤の有無で、ゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動の移動度の変化により、もしくは直接的なＤＮＡ配列決定により検出され得る(例えば、Myers et al., Science (1985) 230:1242)。特定の位置での配列変化は、また、ＲＮアーゼおよびＳ１保護のようなヌクレアーゼ保護アッセイ、もしくは化学的切断法(Cotton et al., Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85:4397-4401を参照のこと)によって明らかにされ得る。もう１つの実施態様では、本発明のＨＤＡＣ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列もしくはそのようなヌクレオチド配列のフラグメントを含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築して、例えば遺伝的変異の効率よいスクリーニングを実施することができる。アレイ技法の方法は周知で汎用性を有し、そして、遺伝子発現、遺伝連鎖および遺伝的変異性を含む分子遺伝学における様々な問題に対処するために使用され得る(例えば：M. Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996)を参照のこと)。
【０１４７】
診断用アッセイは、記載の方法によるＨＤＡＣ９遺伝子中の変異の検出を通して、疾患の罹りやすさを診断もしくは決定する方法を提供する。加えて、そのような疾患は、対象から得られる試料からポリペプチドもしくはｍＲＮＡの異常に減少したもしくは増加したレベルを測定することを含む方法により診断され得る。減少したもしくは増加した発現は、例えば核酸増幅、例を挙げればＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼ保護、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法のようなポリヌクレオチド定量用に当分野において周知である任意の方法を用いてＲＮＡのレベルで測定されることができる。宿主から得られる試料中における、本発明のポリペプチドのような、タンパク質のレベルを測定するために使用できるアッセイ技法は当業者に周知である。そのようなアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、拮抗的結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。
【０１４８】
かくして、別の態様において、本発明は：
(ａ)本発明のポリヌクレオチド、好ましくは配列番号２、３、４、７もしくは８のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント；
(ｂ)(ａ)のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列；
(ｃ)本発明のポリペプチド、好ましくは配列番号１、５もしくは６のポリペプチド、またはそのフラグメント；あるいは
(ｄ)本発明のポリペプチドに対する、好ましくは配列番号１、５もしくは６のポリペプチドに対する、抗体
を含む、診断用キットに関する。
【０１４９】
そのような任意のキットにおいて、(ａ)、(ｂ)、(ｃ)もしくは(ｄ)は実質的な成分を含み得ることは認識されるであろう。そのようなキットは、疾患、特にＨＤＡＣ９発現または活性の異常に関連した疾患または病状、例えば細胞増殖の異常、癌、アテローム性動脈硬化症、炎症性腸疾患、宿主炎症性または免疫性応答、または乾癬の診断、あるいは該疾患への罹りやすさの診断に有用であろう。
【０１５０】
本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体上の位置決定にも有用である。該配列を個別のヒト染色体上の特定の部位に特異的に標的化し、これとハイブリダイズさせることができる。本発明にしたがって関連配列を染色体にマッピングすることは、これらの配列を疾患関連遺伝子と相関させる重要な最初のステップである。一旦配列が正確な染色体の部位にマッピングされれば、染色体上の配列の物理的な位置を遺伝子マップデータと相関させることができる。そのようなデータは、例えば、V. McKusick, Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通してオンラインで入手可能)に見出される。同じ染色体領域にマップされている遺伝子と疾患との関係は、次いで、連鎖分析(物理的に隣接する遺伝子の共遺伝)により同定される。
【０１５１】
また、罹患した個体と罹患していない個体の間のｃＤＮＡもしくはゲノム配列の差を決定することが可能である。もし変異が罹患している個体の全てもしくは一部で観察されるが正常人のいずれにも観察されないならば、該変異は疾患の原因因子と思われる。
【０１５２】
本発明のさらなる実施態様は、上で議論したいずれかの治療効果のための、薬学的に許容される担体、賦形剤もしくは希釈剤と一緒での、医薬組成物の投与に関する。そのような医薬組成物は、ＨＤＡＣ９、そのポリペプチドに対する抗体、ＨＤＡＣ９機能の模倣物、アゴニスト、アンタゴニストまたはインヒビターからなっていてもよい。組成物は単独で、もしくは安定剤のような少なくとも１つの他の剤と組み合わせて投与され得、それらは生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水を含む（ただし、これらに限定されない）任意の無菌で生体適合性の医薬担体中で投与され得る。組成物は、単独、もしくは他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、患者に投与され得る。
【０１５３】
さらに、上記の治療用タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、アンチセンス配列またはベクターは、他の適当な治療剤と組み合せて投与され得る。併用治療において使用するための適当な剤の選択は、通常の医薬的原則にしたがって、当業者によりなされ得る。組合せ治療剤は、共同的に作用して、上記のさまざまな障害の処置または予防に効果を及ぼし得る。このアプローチを用いて、それぞれ、より少ない投与量の剤で治療効果を達成することができ、したがって、不都合な副作用の可能性を減少させることができる。ＨＤＡＣ９のアンタゴニストおよびアゴニストは、当分野において一般的に知られた方法を用いて製造され得る。
【０１５４】
本発明に包含される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下もしくは直腸の手段を含む（ただし、これらに限定されない）任意の数の経路により投与され得る。
【０１５５】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は活性化合物を薬学的に使用され得る製剤に加工するのを容易にする賦形剤および補助剤を含む適当な薬学的に許容される担体を含有してもよい。処方および投与の技法に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, Pa)の最新版に見出され得る。
【０１５６】
経口投与用の医薬組成物を、当分野において周知である薬学的に許容される担体を用いて、経口投与に適する剤型に製剤化することができる。そのような担体は、医薬組成物を患者の摂取用に、錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤等への製剤化を可能にする。
【０１５７】
経口用医薬製剤は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、所望により得られた混合物を粉砕し、そして適当な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工し、所望により錠剤もしくは糖剤の核を得ることを通して得られ得る。適当な賦形剤は、炭水化物またはタンパク質のような増量剤、例えば、乳糖、蔗糖、マンニトールもしくはソルビトールを含む糖類；コーン、コムギ、コメ、ジャガイモもしくは他の植物から得られる澱粉；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含むゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムのような崩壊剤もしくは可溶化剤を添加してもよい。
【０１５８】
糖剤の核は、濃縮糖液のような適切なコーティング剤と一緒に用いてもよく、これはまた、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル(carbopol gel)、ポリエチレングリコール、ならびに／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶剤もしくは溶剤混合物を含有してもよい。製品の識別のために、もしくは活性化合物の量すなわち投与量を特色づけるために染料もしくは色素を錠剤もしくは糖剤に添加してもよい。
【０１５９】
経口で使用できる医薬製剤としては、ゼラチンで作成した押込嵌めカプセル(push-fit capsule)、ならびにゼラチンおよびグリセリンもしくはソルビトールのようなコーティング剤で作成した密封軟カプセルが挙げられる。押込嵌めカプセルは、乳糖もしくは澱粉のような増量剤もしくは結合剤、タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および、所望により安定剤、と混合された活性成分を含有することができる。軟カプセルにおいて、活性化合物を、安定剤が入ったまたは入っていない、脂肪油、液体または液状ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁させてもよい。
【０１６０】
非経腸投与に適した医薬製剤は、水溶液中で、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液もしくは生理緩衝食塩水のような、生理的に適合する緩衝液中で、製剤化され得る。水溶性注射懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールもしくはデキストランのような、懸濁液の粘性を増加させる物質を含有してもよい。加えて、活性化合物の懸濁液は適切な油性の注射懸濁液として調製してもよい。適当な親油性溶剤もしくはビヒクルとしては、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポゾームが挙げられる。非脂質性、ポリカチオン性アミノポリマーをまた、送達用のために使用し得る。所望により、懸濁液はまた、適当な安定剤、または高濃度溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増加させる薬剤、を含有してもよい。
【０１６１】
局所もしくは鼻腔内投与には、浸透させるべき特定の障壁に対して適当な浸透剤が製剤化において用いられる。そのような浸透剤は当分野において一般的に公知である。
本発明の医薬組成物は、当分野において公知の様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣がけ、湿式粉砕、乳化、カプセル充てん、封入もしくは凍結乾燥により製造され得る。
【０１６２】
医薬組成物は塩として供給されてもよく、そして塩を、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む（ただし、これらに限定されない）多くの酸により形成することができる。塩は、対応する遊離塩基型であるよりも水性もしくは他のプロトン性溶媒中に溶けやすい傾向がある。他の場合には、好ましい製剤は以下のもの：すなわち１〜５０ｍＭヒスチジン、０.１％〜２％蔗糖、および２〜７％マンニトール、のいずれかもしくは全てをｐＨ４.５〜５.５の範囲で含有し得る凍結乾燥粉末でもよく、該製剤を使用前に緩衝液と混合する。
【０１６３】
医薬組成物を調製した後、それらを適切な容器の中に入れ、適用される病状の処置のための表示をする。ＨＤＡＣ９の投与については、そのような表示は投与の用量、頻度および方法を含むであろう。
本発明における使用に適した医薬組成物としては、意図する目的を達成するための有効量で活性成分が含有されている、組成物が挙げられる。有効用量の決定は、十分に、当業者の能力の範囲内である。
【０１６４】
任意の化合物について、治療上の有効用量を、例えば、腫瘍細胞の細胞培養アッセイで、または通常マウス、ウサギ、イヌもしくはブタの動物モデルで、のどちらかで初めに推定することができる。動物モデルは、また、投与の適切な濃度範囲および経路を決定するために使用され得る。次いで、そのような情報を用いて、ヒトにおける投与のための有用な用量および経路を決定することができる。
【０１６５】
治療的有効用量とは、症状もしくは病状を軽減する、活性成分、例えばＨＤＡＣ９もしくはそのフラグメント、ＨＤＡＣ９に対する抗体、ＨＤＡＣ９のアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビター、の量をいう。治療的有効性および毒性は、細胞培養もしくは実験動物での標準的な薬学的手順、例えばＥＤ５０(集団の５０％で治療効果を示す用量)およびＬＤ５０(集団の５０％で致死的な用量)、により決定され得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療係数(therapeutic index)であり、これはＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。大きな治療係数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータは、ヒトでの使用のための一定の範囲の投与量の製剤化において用いられる。そのような組成物に含有される投与量は、好ましくは、毒性が殆どまたは全く無しに、ＥＤ５０を含む血液濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤型、患者の感受性および投与経路に依存してこの範囲内で変動する。
【０１６６】
正確な投与量は、処置を要する対象に関連した諸要因に照らし合わせて、医師により決定されるであろう。投与量と投与法は、十分なレベルの活性成分を供給するように、あるいは望ましい効果を維持するように調整される。考慮に入れられる要因としては、疾病状態の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時刻および頻度、併用薬、反応感受性、ならびに治療に対する認容性／応答が挙げられる。持続性医薬組成物は特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日毎、週１回、もしくは隔週毎に投与されてもよい。
【０１６７】
通常の投与量は、投与経路に応じて０.１〜１００,０００マイクログラム、約１ｇの総用量まで変動してもよい。特定の投与量および送達方法に関する指針は文献中に提供されており、当分野における医師は一般に入手できる。当業者は、タンパク質もしくはその阻害剤に対するのとは異なる処方をヌクレオチドに対して使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの送達は、特定の細胞、病状、部位等に特異的であろう。タンパク質の経口投与に適した医薬製剤は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
【０１６８】
以下の実施例は本発明を例示するものであって、いかなる点からもその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１６９】
実施例
実施例１：バイオインフォマティクスを用いる新規ＨＤＡＣ関連ヒトＤＮＡ配列の同定
最初に非重複アミノ酸データベース、続いてCelera Human Genome Database (CHGD)、公開High Throughput Genomic (HTG) データベースおよびIncyte LIFESEQ（商標）データベースのようなあまり大きくないデータベースを検索することによって、既知のＨＤＡＣファミリーのメンバー中から最大の進化的関連を見つけるためのストラテジーに基づく遺伝子ファミリーの新しいメンバーの同定のためのコンピューターソフトウエアを用いてＨＤＡＣ９を同定した。Smith-Waterman モデル(Pearson W. R. Comparison of methods for searching protein sequence databases. Protein Sci (1995) 4, 1145-60) および Hidden Markov モデル(すべての位置でアミノ酸の多様性に由来する推定モデル (Eddy S. R. Hidden Markov models. Curr Opin Struct Biol (1996) 6, 361-5)を実施した。１１５６ｂｐのオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を同定および使用して、全組織および後根神経節ｃＤＮＡライブラリーから配列決定されたクローンのデータベースを検索した。
【実施例２】
【０１７０】
実施例２：全組織および後根神経節ｃＤＮＡライブラリーの構築
全組織および後根神経節ｃＤＮＡライブラリーを、ポリＡ＋ＲＮＡから構築する。総ＲＮＡを３１のヒト組織または後根神経節のプールしたサンプルから抽出し、そして製造者(Life Technologies, Rockville, MD)の使用説明書にしたがってＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて単離した。ｍＲＮＡを、製造者(Promega, Madison, WI)の使用説明書にしたがってPolytract mRNA Isolation System IIIを用いて単離する。総ＲＮＡを、ビオチン化オリゴ(ｄｔ)プローブとハイブリダイズする。該オリゴ(ｄｔ)−ｍＲＮＡハイブリッドを、ストレプトアビジン・マグネスフェアー・パーティクル(streptavidin magnesphere particles)上で捕捉し、そしてＲｎａｓｅの入っていないＨ２Ｏ中で溶出する。３μｌのビオチン化オリゴ(ｄｔ)プローブ(５０ｐｍｏｌ／μｌ)および１３μｌの２０×ＳＳＣを、ＲＮａｓｅの入っていない水中で６５℃に加熱した６０〜１５０μｇのＲＮＡに加える。完全に冷却されるまで、この混合物を室温でインキュベートする。ストレプトアビジン・マグネスフェアー・パーティクル(ビーズ)を再懸濁し、そして０.５×ＳＳＣ中で３回洗浄し、次いで０.５×ＳＳＣ中で再懸濁する。前のステップからのＲＮＡ−オリゴ(ｄｔ)ハイブリッドを、これらのビーズに加える。
【０１７１】
ビーズからポリ−Ａ ＲＮＡを分離するために、該ビーズを、Ｒｎａｓｅの入っていない水中で再懸濁し、そして磁気的に捕捉し、そして次いでビーズからの溶出液をエタノール沈澱する。第１および第２ストランドのｃＤＮＡ合成を、Life Technologiesからの修正手順(D'Alessio, J. M., Gruber, C.E., Cain, C. R., and Noon, M. C. (1990) Focus 12, 47)を用いて行う。第１ストランド合成を、１×第１ストランド用緩衝液(Life Technologies)／６ｍＭ ＤＴＴ／６００ｎＭ ｄＮＴＰｓ／２単位の抗−Ｒｎａｓｅ中で６０℃に加熱した１〜５μｇのＲＮＡをインキュベートすることにより行う。この混合液を４０℃にて２分間インキュベートし、次いで、Superscript II 逆転写酵素(ＲＴ)および１μｌのDisplay Thermo RT ターミネーター・ミックスを加え、そして混合液を４０℃で１時間、続いて６０℃で１０分間インキュベートする。第２ストランド合成を、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏ／６６ｎＭ／１μｌ Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡ リガーゼ／４μｌ Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ／１μｌ Ｅ.ｃｏｌｉ Ｒｎａｓｅ Ｈ中の、１×第２ストランド用緩衝液(Life Technologies)中で行う。この混合液を１０℃で１０分間、そして次いで１６℃で２時間インキュベートする。
【０１７２】
この混合液に、２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加え、そして１６℃で５分間インキュベーションを継続する。反応を１０μｌの０.５Ｍ ＥＤＴＡで停止させ、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、そしてエタノール沈澱を行う。Ｓａｌ ＩおよびＮｏｔ Ｉアダプターを、通常の方法を用いて指向性クローニングのためのライゲーションによりｃＤＮＡの５'末端に加える。次いで、該ｃＤＮＡをサイズ分別カラムにかけ、製造者(Life Technologies, Rockville, MD)の使用説明書にしたがって、＞５００ｂｐの長さのｃＤＮＡを回収する。ｃＤＮＡを、通常の方法を用いて、Ｓａｌ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ消化Ｇａｔｅｗａｙ適合性ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ６ベクター(Life Technologies, Rockville, MD)にライゲートする。コンピテントＤＨ１０Ｂ細胞(Life Technologies, Rockville, MD)を、通常の方法を用いて、得られたライブラリーで形質転換する。ライブラリーの半固体増幅を、製造者(Life Technologies, Rockville, MD)の使用説明書にしたがって行う。
【実施例３】
【０１７３】
実施例３：配列番号１、５もしくは６からなる新規ＨＤＡＣ９をコードする完全長ｃＤＮＡの調製：
１１５６塩基対のＯＲＦを使用して、ＢＬＡＳＴを用いる全組織および後根神経節ｃＤＮＡライブラリーからの配列決定されたデータベースを検索した。それぞれのライブラリーから２つ、計４つのクローンがＯＲＦ(Ｍ６、Ｋ１０、Ｐ３、Ｆ２３)を含有することが見出された。これらのクローンのうち、全組織のライブラリーからのＭ６は最も完全であるがＮ末端からの約４４塩基対を欠失していることが判明した。完全なｃＤＮＡに対して予想されるのよりも少し小さいタンパク質が、インビトロでの翻訳により観察された。
【０１７４】
タンパク質が不完全ｃＤＮＡのインビトロでの翻訳により観察されるという結果により、ＨＤＡＣ９内の別の翻訳開始部位の可能性が示唆される。特に、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６中のＨＤＡＣ９の配列決定を、自動ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ(ACGT, Northbrook, IL)を用いて行った。ＰＣＲを、ABI Prism BigDye(商標)Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kitマニュアル中に挙げられた条件を用いて行った、そして下記の通りである：変性、９６℃で３０秒間、アニーリング、５０℃で１５秒間、伸張、６０℃で４分間、計２５サイクル。それぞれのシーケンシングにより、２００〜６００ｂｐの配列が提供される。
【０１７５】
第１のシーケンシングのためのＰＣＲプライマーは、５'−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ−３'(Ｓｐ６、センス鎖)および５'−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３'(Ｔ７、アンチセンス鎖)であった。Ｓｐ６プライマーを用いるシーケンシングの結果は次の通りである。太字の配列は、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ６ベクター配列である。
【表１】
2008113660.tif 000003
【０１７６】
Ｔ７プライマーを用いるシーケンシングの結果は、
【表２】
2008113660.tif 000004
であった。
【０１７７】
第２および第３シーケンシング・プライマーは、前の段階のシーケンシングから得られた配列のプライマーとなるように設計されている。第２プライマーは、５'−ＧＴＣＡＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＣＧＴＧ−３'(ＨＵＦ７３９２、アンチセンス鎖)および５'−ＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧ−３'(ＤＦ−２、センス鎖)である。ＤＦ−２プライマーを用いるシーケンシングの結果は、
【表３】
2008113660.tif 000005
であった。
【０１７８】
ＨＵＦ７３９２プライマーに関するシーケンシング結果は、
【表４】
2008113660.tif 000006
であった。
【０１７９】
第３シーケンシングプライマーは、５'−ＡＡＣＡＧＣＧＧＴＧ Ｃ ＧＧＡＣＡＧＡ −３'(ＨＵＦ２Ａ、アンチセンス鎖)および５'−ＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＴＧＧＣＧＧＡＧ −３'(ＤＦ３Ａ、センス鎖)であった。ＤＦ３Ａプライマーを用いるシーケンシングの結果は、
【表５】
2008113660.tif 000007
であった。
【０１８０】
ＨＵＦ２Ａプライマーを用いるシーケンシングの結果は、
【表６】
2008113660.tif 000008
であった。センス鎖およびアンチセンス鎖のシーケンシングの組合せから得られたオーバーラップしている配列を再構築して、ＨＤＡＣ９の完全なｃＤＮＡ配列を得た。図２Ａを参照。
【０１８１】
ＢＬＡＳＴを、Ｍ６ ｃＤＮＡ配列を含むゲノム配列を同定するためのクエリー(query)としてｃＤＮＡクローンＭ６を用いるＧｅｎｂａｎｋデータベースを検索するために使用する。この検索結果により、Ｍ６ ｃＤＮＡと同一の配列のエキソンを含むことが見出されているゲノム配列ＡＬ０２２３２８が同定された。ｃＤＮＡクローンＭ６の配列を、自動ＤＮＡシーケンシング(ACGT, Inc. Northbrook, IL)により確認した。図２Ａ参照。
【０１８２】
Ｎ末端配列の残りの４４ｂｐを、ネステッド(nested)センス鎖プライマー  ５'−ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＴＴＧＴＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣ ＡＴＧ−３'および５'−ＧＴＧＴＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＣ ＣＣＧＡＧＴＧＣ−３'ならびに３'プライマー  ５'−ＧＡＡＣＣＡＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＣＧＧＣＧＴＴＧ−３'を用いるＰＣＲにより加えた。該５'プライマーをクローニングのためにｋｏｚａｋ配列およびＳａｌ １部位に加え、そして該３'プライマー配列は、ＨＤＡＣ９中のＥｃｏＲＶ部位とオーバーラップする。ＰＣＲを、９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間、および７２℃で１分間の１サイクル、続いて９４℃で３０秒間および７２℃で１分間の２０サイクルを用いる増幅のためのステップサイクルファイル(step-cycle file)を用いて行った。
【実施例４】
【０１８３】
実施例４  ＨＤＡＣ９配列の変異体  ＨＤＡＣ９配列の３つの変異体、すなわち、ＨＤＡＣ９ｖ１、ＨＤＡＣ９ｖ２、およびＨＤＡＣ９ｖ３が見出された。ＨＤＡＣ９ｖ１は、発見されたオリジナルの配列であり、そして上に記載されている。ＨＤＡＣ９ｖ２はヒト後根神経節ｃＤＮＡライブラリーにおいておよびＡＬ０２２３２８ゲノム配列において見出された。ＨＤＡＣ９ｖ３は、Ｃｅｌｅｒａヒトゲノムデータベースにおいて見出された停止コドンを欠く予想された転写物である。ＨＤＡＣ９ｖ１は２０エキソンを有し、そしてＨＤＡＣ９ｖ２は２０エキソンを有する。ＨＤＡＣ９変異体のペプチド配列の比較により、ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡＣ９ｖ２はエキソン１７まで同一であるが、このエキソン以降は異なることが示された。ＨＤＡＣ９ｖ２は、エキソン１７と１８の間に延長されたイントロン、およびＨＤＡＣ９ｖ１のエキソン１９を含む延長されたエキソン１８を有するが、４４６位のヌクレオチドにおける単一ヌクレオチド挿入の結果としてエキソン２０を欠く。この挿入は該配列をフレームシフトさせ、そして該ペプチドを１１アミノ酸だけ短くする(図１１Ａ)。ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡＣ９ｖ２と比較すると、ＨＤＡＣ９ｖ３は２１９〜２４０位のアミノ酸の内部欠失を有し、そして４８６位のアミノ酸で始まるＣ末端において異なる。ＨＤＡＣ９は、配列変異体が報告された最初のＨＤＡＣ酵素である。ＨＤＡＣ９ｖ１は、特記しない限り、特徴付けされた該配列変異体である。
【実施例５】
【０１８４】
実施例５：ＨＤＡＣ関連配列モチーフの同定
Ｍ６クローンを、ＨＤＡＣ触媒ドメインならびにＲｂおよびＲｂ−様タンパク質の結合部位を示すモチーフの存在に関して分析した。ＨＤＡＣは、保存されたアミノ酸を有する触媒ドメインの存在により特徴付けられる。今までに同定された大抵のＨＤＡＣは１つの触媒ドメインを有するが、例外的にＨＤＡＣ６は２つのドメインを有する。Ｎ末端触媒ドメインはクラスＩ ＨＤＡＣと結合する。一方、Ｃ末端触媒ドメインはクラスＩＩ ＨＤＡＣと結合する。Ｎ末端触媒ドメインは、ＰＦＡＭ予想および他のＨＤＡＣの触媒ドメインとのアラインメントに基づいて、ＨＤＡＣ９において見出された。
【０１８５】
一組の保存されたアミノ酸は、ＨＤＡＣ活性のために極めて重要であり、そしてＨＤＡＣ１における１アミノ酸変異、ならびにＨＤＡＣ−様タンパク質(ＨＤＬＰ)、Ｚn２＋およびＨＤＡＣインヒビターＴＳＡの複合体により形成される三次元構造に基づいて、ＨＤＡＣインヒビターＴＳＡに関する極めて重要な接触を提供することが前に示された(Hassig CA, Tong JK, Fleischer TC, Owa T, Grable PG, Ayer DE, Schreiber SL. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3519-3524; Finnin, M. S., Doniglan, J. R., Cohen, A., Richon, V. M., Rifkind, R. a., Marks, P. A., Breslow, R., and Pavletich, N. P. (1999) Structures of a histone deacetylase homologue bound to TSA and SAHA inhibitors. Nature 401, 188-193)。ヒトＨＤＡＣに対して配列および酵素活性類似性を有する細菌性タンパク質であり、かつ、構造が解明された唯一のクラスＩ ＨＤＡＣ−様構造である、ＨＤＬＰが、ＨＤＡＣのテンプレートとして使用された。
【０１８６】
いくつかの例外を有する多くのこれらの保存されたアミノ酸が、ＨＤＡＣ９において見出された[表４(Table 4)]。ＨＤＡＣペプチド配列のアラインメントにより、ＨＤＬＰにおいて結合ポケットの一部を形成する疎水性残基Ｌｅｕ ２６５はＨＤＡＣ９の２７２位のアミノ酸においてＧｌｕで置換されていることが示された。同様に、Ｌｅｕ ２６５は、また、ＨＤＡＣ８においてＭｅｔで、およびＨＤＡＣ６ドメイン１においてＬｙｓで、置換されている。さらに、ＨＤＬＰ中のＡｓｐ １７３はＨＤＡＣ９の１７７位においてＧｌｎで置換されており、当該相違はＨＤＡＣ６触媒ドメイン１においても見出された。該Ａｓｐは、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６ドメイン２、およびＨＤＡＣ７においてＡｓｎに置換されている。これらのタンパク質におけるアミノ酸置換物は全く酵素的意義を有さないので、ＨＤＡＣ１〜８は触媒活性を有する。
【０１８７】
ＨＤＡＣ９は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣと配列類似性を有する。ＨＤＡＣは、酵母ＨＤＡＣ Ｒｐｄ３、Ｈｄａ１およびＳｉｒ２との配列類似性、ならびに触媒ドメインの位置により分類されている。ＨＤＡＣ９、酵母ＨＤＡＣ Ｒｐｄ３、Ｈｄａ１、分裂酵母からのＨｄａ１サブファミリーのメンバー、cryptic loci regulator 3 (Ｃｌｒ３)、およびＳｉｒ２のペプチド配列のアラインメントにより、ＨＤＡＣ９はＣｌｒ３と最も高い配列類似性を有することが決定された(表１)。しかしながら、当該配列類似性は、ＨＤＡＣ９に分類するほどは高くない。
【０１８８】
ヒトＨＤＡＣ １〜９およびＳｉｒ １〜７ペプチド配列のアラインメントにより、ＨＤＡＣ９がクラスＩＩ ヒトＨＤＡＣ６と極めて類似性が高いことが示された(表２)。クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣ触媒ドメインとＨＤＡＣ９触媒ドメインとのアラインメントにより、ＨＤＡＣ６触媒ドメイン１がＨＤＡＣ９と最も高い配列類似性を有することが示された(表３)。
【０１８９】
ＨＤＡＣ中の触媒ドメインの位置を比較するために、ＨＤＡＣペプチドの触媒ドメインのＰＦＡＭ予測を行った(図１１Ｂ)。ＨＤＡＣ９触媒ドメインの位置は、クラスＩ ＨＤＡＣと同様にＮ末端であり、そしてアミノ酸４〜３２３のアミノ酸配列に及ぶと推定されている。さらに、クラスＩ ＨＤＡＣの平均的な長さは４４３アミノ酸である。一方、クラスＩＩ ＨＤＡＣの平均的な長さは１０６９アミノ酸である。６７３アミノ酸のＨＤＡＣ９ペプチドが、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣの間の平均的サイズである(図１１Ｂ)。
【表７】
2008113660.tif 000009
【０１９０】
【表８】
2008113660.tif 000010
【０１９１】
【表９】
2008113660.tif 000011
【０１９２】
網膜芽腫タンパク質(Ｒｂ)遺伝子のタンパク質産物は、ＤＮＡ合成、細胞サイクル、分化およびアポトーシスを制御する転写レギュレーターであり、そして通常の成長において組織特異的な役割を果たす。Ｒｂは転写因子Ｅ２Ｆと複合体を形成し、該相互作用はリン酸化により制御される。Ｒｂにおける変異は、網膜の癌、網膜芽腫の遺伝的な形態をもたらす。変異は、また、数多くの間葉性および上皮性癌において見出されている。サイクリンＤ１、ｃｄｋ４、およびｐ１６を含むＲｂのリン酸化のレギュレーターに影響する変異が、多くの癌において見出されている。したがって、Ｒｂの機能は腫瘍形成において極めて重要な役割を果たすと考えられている(Sellers, W.R., Kaelin, W.G. Jr. (1997) J. Clin. Oncol. 15, 3301-3312, DiCiommo, D., Gallie, B.L., Bremner, R.(2000) Semin. Cancer Biol. 10, 255-269)。Ｒｂ−結合モチーフは、アミノ酸配列ＬＸＣＸＥ〔式中、“Ｘ”は任意のアミノ酸であり得る。〕として前に定義された(Chen, T.-T. and Wang, J. Y. J. (2000) Mol. Cell Biol. 20, 5571-5580)。ＨＤＡＣ１中の該ＬＸＣＸＥドメインは、Ｒｂの成長抑制機能にとって重要ではないが、ＲｂへのＨＤＡＣの結合に必要であることが見出された。２つの推定的Ｒｂ−結合モチーフがＨＤＡＣ９において見出された(図１１Ａ、緑色のボックス)。ＬＬＣＶＡはアミノ酸５１０および５１５の間に位置し、そしてＬＳＣＩＬはアミノ酸５６０および５６４の間に位置する。これらはともにＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡＣ９ｖ２中に存在する。
【０１９３】
【表１０】
2008113660.tif 000012
【実施例６】
【０１９４】
実施例６:正常組織におけるＨＤＡＣ９のｍＲＮＡの分布
正常組織におけるＨＤＡＣ９のｍＲＮＡの分布を、ノーザン分析を用いて調べる。プローブを、製造者(Amersham, Piscataway, NJ)の使用説明書にしたがってＲｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅランダムヌクレオチド標識キットを用いて、７５０ｂｐのＥｃｏｒＶ／Ｎｏｔ１ ＨＤＡＣ９フラグメントを３２Ｐ−標識することにより製造する。１２の正常組織からのポリＡ＋ＲＮＡ(Origene Technologies, Rockville, MD)を含むノーザンブロット、ならびに適合化した腫瘍と正常ｃＤＮＡのアレイ(Clontech, Palo Alto, Ca)を、[３２Ｐ]で標識した７５０ｂｐのＥｃｏｒＶ／Ｎｏｔ１ ＨＤＡＣ９フラグメントでプローブ化し、そしてハイストリンジェント条件下(６８℃)で洗浄する。ハイブリダイズしたブロットを、６８℃にて２×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で１５分間２回洗浄し、続いて６８℃にて０.１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中で３０分間２回洗浄する。該ブロットを、増感スクリーンとともにフィルムに１８時間曝露する。これにより、約３.０ＫｂのＨＤＡＣ９ ｍＲＮＡが脳、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、胎盤、小腸、脾臓、胃および精巣において検出されることが示される。ＨＤＡＣ９メッセージは筋肉において検出されないが、ＧＡＰＤＨもまた検出されなかった。図７参照。
【０１９５】
ＢＬＡＳＴを用いる同様のコンピューター技術(Altshul, S.F. 1993, 1990参照)を用いて、GenBankまたはLIFESEQ(商標)データベースのようなヌクレオチドデータベース中の同一または関連する分子を検索する。該検索の基本は、
【数１】
2008113660.tif 000013
として定義されるプロダクト・スコア(product score)である。
【０１９６】
該プロダクト・スコアは、２つの配列間の同一性の度合いおよび適合配列の長さの両方を考慮している。例えば、４０のプロダクト・スコアでは、該適合は誤差１〜２％以内で正確であり；そして７０では、該適合は正確であろう。ホモログ分子は、通常、１５〜４０の間のプロダクト・スコアを示すものを選択することにより同定されるが、もっと低いスコアであっても関連分子を同定し得る。
【０１９７】
ノーザン分析の結果は、ＨＤＡＣ９をコードしている転写物が存在するライブラリーのリストとして報告されている。存在量(abundance)および存在率も報告されている。存在量は、直接的に、特定の転写物がｃＤＮＡライブラリー中に現れる回数を反映し、そして存在率は、ｃＤＮＡライブラリーにおいて試験された配列の総数で除した存在量である。
【０１９８】
この場合において、LIFESEQ(商標)データベース(Incyte Pharmaceuticals, Inc. Palo Alto, Calif)の電子的ノーザン分析により、表５において見られるＨＤＡＣ９配列の組織分布が示される。これらの結果は、ＨＤＡＣ９をコードする転写物が存在するｃＤＮＡライブラリーのリストとして報告されている。さまざまな組織特異的かつ混合組織源からの２０ライブラリー中のＨＤＡＣ９の存在により、他のＨＤＡＣファミリーのメンバーのようにＨＤＡＣ９は広範な組織において発現している遺伝子として見出され得ることが示される。この結果は、１２の正常組織からのｍＲＮＡに対するＨＤＡＣ９プローブのノーザンハイブリダイゼーションにより支持される(図７参照)。
【０１９９】
【表１１】
2008113660.tif 000014
【実施例７】
【０２００】
実施例７：ヒト正常組織および細胞株におけるＨＤＡＣ９分布のリアルタイムＰＣＲ測定
リアルタイムＰＣＲ。培養細胞株からの総ＲＮＡを、製造者(Qiagen, Valencia CA)のプロトコルにしたがってＲｎｅａｓｙ ９６キットを用いて単離した。ヒト組織からのＲＮＡを購入し(Clontech Inc, Palo Alto, Ca)、そして組織源を下記の表６に示す。
【表１２】
2008113660.tif 000015
【０２０１】
ヒト細胞株、Ｈ１２９９ ヒト肺カルシノーマ、Ｔ２４ 膀胱カルシノーマ、ＳＪＲＨ３０ 筋性横紋筋肉腫、ＳＪＳＡ−１ 骨肉腫、ヒト繊維芽細胞、およびＡ５４９ ヒト肺カルシノーマを、American Type Tissue Culture Collectionから入手した。総ＲＮＡを、製造者(Qiagen, Valencia, CA)の使用説明書にしたがって、ＲＮＡイージー・キット(easy kit)を用いてヒト細胞株から単離した。ＲＮＡを、ABI Prism Sequence Detection System上でＲＴ−ＰＣＲを用いて定量した。ＨＤＡＣ９の検出のために使用されたプライマーは、フォワードプライマー５'−ＧＧＡＴＣＣＡＧＴＡＴＣＴＣＴＴ ＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣ−３'、リバースプライマー５'−ＡＧＡＡＧＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＣＡＴＡ−３'、およびＴａｑｍａｎプローブ５'−ＡＧＣＧＴＣＣＴＴＴＡＣＴ ＴＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧ−３'であった。
【０２０２】
該Taqman Reaction System (Eurogentec, Belgium)を、製造者により指示された比率であるが０.２５Ｕ／μｌ逆転写酵素(MultiScribe ABI, Perkin Elmer, Branchburg NJ)および０.０８Ｕ／μl RNaseOUT RNAseインヒビター(Life Technologies, Gaithersburg, MD)を補った、２５μｌ反応液中の１０ｎｇの総ＲＮＡとともに使用した。該逆反応を、ｍＲＮＡの逆転写反応のための４８℃での５分間のインキュベーションで開始し、続いて、９５℃で１０分間インキュベーションして逆転写酵素を不活性化し、そして同時に‘hot-start’熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを活性化する。この後、９５℃で１５秒および６０℃で６０秒に変更した２ステップＰＣＲ反応を５０サイクルした。
【０２０３】
評価を、ＡＢＩ配列検出ソフトウエア(バージョン１.６.３)を用いて行った。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、製造者のプロトコルにしたがってＭａｘｉｓｃｒｉｐｔキット(AMBION Inc., Austin, TX)を用いて、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応でインビトロにて転写されたｃＲＮＡで標準化した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、Ａ５４９肺腫瘍細胞から単離された総ＲＮＡの希釈シリーズで標準化した。ＲＴ−ＰＣＲと並行して、各反応におけるＲＮＡの総量を、製造者の使用説明書にしたがって、基準としてキットに備えられた哺乳類リボソームＲＮＡを用いて、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎキット(Molecular Probes Inc., address)を用いる蛍光測定アッセイ中で定量した。
【０２０４】
リアルタイムＰＣＲを、また、１８ＳリボソームＲＮＡのレベルと比較した組織および腫瘍細胞株におけるＨＤＡＣ９の分布およびレベルを調べるために使用した。ヒトＡ５４９肺カルシノーマ細胞株からのＲＮＡを、サンプル中の総ＲＮＡのレベルのための内部標準として任意に選択した。Ａ５４９細胞内のＨＤＡＣ９および１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルを１００％に設定し、そして他の組織および細胞株におけるＨＤＡＣ９および１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルをＡ５４９ ＲＮＡ中のこれらの遺伝子のレベルのパーセントとして測定した。
【０２０５】
１８ＳリボソームＲＮＡのレベルは、すべてのＲＮＡサンプルのＡ５４９内部標準の８２％〜１２６％の範囲であり、このことは分析された組織サンプル中に同じくらいの量のＲＮＡが存在することを示唆している。ＨＤＡＣ９は広範な組織においてリアルタイムＰＣＲによりさまざまなレベルで検出され(図８)、これはノーザンブロット分析の確認となる(図７)。正常組織において、ＨＤＡＣ９は、胎児脳(８９４％)、小脳(５３８％)、および胸腺(５８９％)において最も高いレベルで検出された。腫瘍細胞株において、ＨＤＡＣ９は、ＳＪＲＨ３０細胞(８５０％)において最も高いレベルで検出された(図８)。これらの結果は、ＨＤＡＣ９がいくつかの組織においてＲＮＡレベルに関して差次的に発現していることを示唆している。
【実施例８】
【０２０６】
実施例８：ＨＤＡＣ酵素アッセイ
ＨＤＡＣ９−フラッグの調製。フラッグエピトープタグ配列を、ＰＣＲによりＨＤＡＣ９ｖ１の３'末端に付加した。ＰＣＲプライマーは、５'−ＡＣＧＣＣＧＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＴＧＧＴ ＴＣＴＧＣ−３'および５'−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＣＣ ＧＴＣＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡ−３'であった。フラッグ−タグ化ＨＤＡＣ９ｖ１を、第１プライマーのＥｃｏＲＶ部位を用いて再構築し、そしてヒト発現ベクターｐＣＤＮＡ３.１(−)のＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位中にサブクローン化した(Invitrogen, Carlsbad, CA)。
【０２０７】
ＨＤＡＣ活性アッセイ。ＨＤＡＣ活性アッセイを前に記載されたように行う(Emiliani, S., Fischle, W., Van Lint, C., Al-Abed, Y., and Verdin, E. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2795-2800)。１００ｍｍ皿中の５０％コンフルエントまで増殖させた５×１０６個の２９３細胞を、製造者の使用説明書にしたがってＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒトランスフェクションキットを用いて３０μｇのＣ末端フラッグ−タグ化ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、またはＨＤＡＣ９とともにトランスフェクトする。
【０２０８】
細胞培養培地を、トランスフェクションの５時間後に交換する。トランスフェクションの４８時間後、細胞を冷ＰＢＳ中で洗浄し、そして１ｍｌのＩＰ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７.５、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ ＮＰ−４０)中にこすり落とし、ロッカー(a rocker)上で２０分間インキュベートする。細胞片を、１４Ｋで２０分間の遠心でペレット化させる。上清を、事前にＩＰ緩衝液中のプロテインＧビーズ(Pharmacia Biotech)で１時間透明化させる。免疫沈降は、事前に透明化した上清を、α−ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースアフィニティーゲル(Sigma)で４℃にて２時間または抗−ＨＤＡＣ２(Santa Cruz)で１時間のどちらかでインキュベートし、続いてプロテインＧビーズで４℃にて１時間のインキュベーションすることにより行われた。次いで、ビーズをＩＰ緩衝液中で５分間３回洗浄し、そして次いで、高塩濃度のＩＰ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７.５、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、０.５ｍＭ ＥＤＴＡ、０.５％ＮＰ−４０)中で４℃にて３回洗浄する。次いで、ＩＰＳを１ｍｌのＨＤ−緩衝液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８.０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリン)中で２分間２回洗浄する。
【０２０９】
トラポキシン阻害を測定する場合、ＩｐｓをＨＤ−緩衝液中の０.３、３、３０および３００ｎＭ ＴＰＸとともに２０分間インキュベートする。上清を、３０μｌのＨＤ−緩衝液またはＨＤ−緩衝液中のＴＰＸ中の１０００００ｃｐｍの基質([３Ｈ]−Ａｃ(Ｈ４１−２４) ＳＧＲＧＫＧＧＫＧＬＧＫＧＧＡＫＲＨＲＫＶＬＲＤ、インビトロ／ＢＯＰ化学を用いて化学的アセチル化されている)とともにインキュベートし、チューブを軽くたたくことによりセファロースを再懸濁させ、そしてＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４３６ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中で、最高速度で３７℃にて２時間振盪する。１７０μｌのＨＤ−緩衝液および５０μｌの停止−混合液(１Ｍ ＨＣｌ、０.１６Ｍ ＨＡｃ)を加え、１５分間ボルテックスし、次いで６００μｌの酢酸エチルを加え、そして４５分間ボルテックスし、次いで１４０００ｇにて７分間遠心分離する。次いで、５４０μｌの有機(上)相を、通常の方法を用いて５ｍｌのシンチレーション液中で計測する。
【０２１０】
ＨＤＡＣ９は触媒活性を有する。ＨＤＡＣ９が触媒活性を有するかどうかを調べるため、ならびにＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ４の既知の触媒活性とＨＤＡＣ９の活性を比較するために、基質として免疫沈降ＨＤＡＣ９および３Ｈ−アセチル化ヒストンＨ４ペプチドを用いるインビトロのヒストンデアセチラーゼアッセイを行った。触媒活性を欠くＨＤＡＣ−関連タンパク質、ＨＤＲＰ／ＭＩＴＲ／ＨＤＡＣＣを、ネガティブコントロールとして使用した(Zhou, X., Richon, V.M., Rifkind, R.A., Marks, P.A. (2000) Identification of a transcriptional repressor related to the noncatalytic domain of histone deacetylases 4 and 5. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 1056-61)。これらの結果により、ＨＤＡＣ９はＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ４と同等のレベルでヒストンペプチド基質を脱アセチル化することができるが(図１２Ａ)、ＨＤＡＣ１は本アッセイにおいてさらに効果的である(図１２Ｂ)ことが示された。
【実施例９】
【０２１１】
実施例９  ＨＤＡＣ９発現および細胞局在化
製造者(Promega, Madison, WI)の使用説明書にしたがって、１μｇのＭ６クローン、２μｌの３５Ｓ−メチオニンおよびSp6 TNT Quick Coupled Transcription/Translation Systemを用いて、ＨＤＡＣ９をインビトロで発現させる。タンパク質を通常の方法にしたがってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、そしてStorm phosphorimagerにより視覚化する。完全ＨＤＡＣ９配列の分子量は、VectorNTI Suiteソフトウエア(Informax, North Bethesda, MD)を用いてインシリコ(in silico)で７２ｋｄａと推定される。二重線が１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察された。ＨＤＡＣ１がインビトロで翻訳された場合にも二重線が観察される。これらの二重線により、第２の翻訳開始部位の存在の可能性が示唆される。さらに、これらの結果により、ＨＤＡＣ９が発現遺伝子であることが示唆される。図１３を参照。
【０２１２】
１×１０５個のＣｏｓ７細胞を、チャンバースライド上で培養する。細胞を該スライド上にて、製造者の使用説明書にしたがって血清なしの培地中のＧｅｎｅｐｏｒｔｅｒ２を用いて、２μｇのフラッグエピトープ−タグ化ＨＤＡＣ９または細胞質発現タンパク質(Ena-flag)でトランスフェクトする。細胞培養培地を、トランスフェクションの２４時間後に交換する。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、５％ホルムアルデヒド中で１５分間固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして０.５％ Triton-X-100含有ＰＢＳ中の１０％ウシ胎児血清(Sigma)中で室温にて３０分間ブロックして、該細胞を浸透可能にする。細胞をＰＢＳ中でさらに２回洗浄し、そして次いで、２５ｍｇ／ｍｌの抗−フラッグ−ＦＩＴＣコンジュゲートで１時間インキュベートする。染色細胞をＰＢＳで洗浄し、そして蛍光顕微鏡を用いて写真を撮る。
【０２１３】
ＨＤＡＣ９は核タンパク質である。翻訳されたＨＤＡＣ９ペプチド配列は、７２Ｋｄａのタンパク質と予想され、そしてこれをインビトロでの翻訳により確認した(図１３Ａ)。ＨＤＡＣ９の細胞局在を調べるために、フラッグエピトープ−タグ化ＨＤＡＣ９、Ｅｎａｂｌｅｄ(Ｅｎａ)またはｐＣＭＶ４フラッグをＣｏｓ７および２９３細胞中にトランスフェクトするか、または細胞をプラスミドなしで擬トランスフェクトした。フラッグエピトープを、トランスフェクションの４８時間後に蛍光免疫化学により検出した(図１３Ｂ)。Ｅｎａは、軸索誘導中にRoundabout受容体の軸索反発機能を形質導入するＡｂｌチロシンキナーゼの細胞骨格関連細胞質タンパク質基質である(Gertler FB, Comer AR, Juang JL, Ahern SM, Clark MJ, Liebl EC, Hoffmann FM. (1995) enabled, a dosage-sensitive suppressor of mutations in the Drosophila Abl tyrosine kinase, encodes an Abl substrate with SH3 domain-binding properties. Genes Dev. 9, 521-533. Bashaw GJ, Kidd T, Murray D, Pawson T, Goodman CS. (2000) Repulsive axon guidance: Abelson and Enabled play opposing roles downstream of the roundabout receptor. Cell.101, 703-715)。予想通り、Ｅｎａは細胞質において検出されたが、ＨＤＡＣ９はこれらの細胞の核内で検出された。Ｃｏｓ７および２９３細胞の両方の核におけるＨＤＡＣ９の検出により、ＨＤＡＣ９は優勢的に核タンパク質であることが示唆される。
【実施例１０】
【０２１４】
実施例１０：ＨＤＡＣ複合体における関連タンパク質の同定
トランスフェクション。１×１０７個のＣｏｓ７細胞を、０.３Ｋｖ／５００μＦにセットされたＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ装置(Biorad, Hercules CA)を用いたエレクトロポレーションにより、トランスフェクション対照として、ｐＣＤＮＡ３.１発現ベクターまたはＦｌａｇベクターまたは緩衝液(Mock)中の１０μｇのＣ末端フラッグエピトープ−タグ化ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７またはＨＤＡＣ９でトランスフェクトする。
【０２１５】
免疫沈降。免疫沈降を記載されたように行う(Grozinger, C. M., Hassig, C. A., and Schreiber, S. L. 1999. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873)。全細胞抽出物を、完全プロテアーゼインヒビターカクテル(Boehringer-Mannheim)を含むＪＬＢ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセリン、０.５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００)中に細胞をこすり落とすことにより、トランスフェクションの４８時間後に調製する。溶解を４℃で１０分間継続し、そして次いで、細胞片を１４Ｋで５分間の遠心分離によりペレット化する。上清を、Sepharose A/G＋アガロースビーズ(Santa Cruz)で事前に透明にする。組換えタンパク質を、４℃にて２時間のα−ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースアフィニティーゲル(Sigma)または４℃にて１時間の抗−ＨＤＡＣ１(Santa Cruz, Santa Cruz, CA)でのインキュベーションにより、続いてSepharose A/Gビーズとのインキュベーションにより、事前に透明化した上清から免疫沈降する。ウエスタンブロット分析のために、ビーズをＭＳＷＢ緩衝液(５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣl、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１％ＮＰ−４０)で洗浄し、そしてタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥにより分離する。ウエスタンブロットを、抗−フラッグＭ２(Sigma)、ＨＤＡＣ１(Santa Cruz)、抗−ＨＤＡＣ２(Santa Cruz)、抗−ＨＤＡＣ６(Santa Cruz)、抗−Ｒｂ(Pharmingen)、または抗−ｍＳｉｎ３Ａ(Transduction Labs, Lexington, KY)を用いてプローブ化する。
【０２１６】
ｍＳｉｎ３Ａ複合体中のタンパク質と結合したＨＤＡＣ９。クラスＩのＨＤＡＣ(ただし、クラスＩＩのＨＤＡＣではない。)は、前から、ｍＳｉｎ３Ａ複合体と結合することが知られていた。コアＨＤＡＣ１複合体は、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＲｂＡｐ４６、ＲｂＡｐ４８からなる。このコア複合体は、ＲｂおよびＥ２Ｆ複合体を介する転写抑制に関与するｍＳｉｎ３Ａと結合することが見出されている(Luo RX, Postigo AA, Dean DC.(1998) Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription. Cell. 92, 463-473; Magnaghi-Jaulin L, Groisman R, Naguibneva I, Robin P, Lorain S, Le Villain JP, Troalen F, Trouche D, Harel-Bellan A. (1998) Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase. Nature. 391, 601-605; Brehm A, Miska EA, McCance DJ, Reid JL, Bannister AJ, Kouzarides T. (1998) Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription. Nature. 391, 597-601)。
【０２１７】
ＨＤＡＣ９がこの複合体の一部であるかどうかを調べるために、内在性ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、Ｒｂ、およびｍＳｉｎ３タンパク質を、フラッグ−エピトープタグ化ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７またはＨＤＡＣ９でトランスフェクトした細胞から共免疫沈降した。トランスフェクトされたフラッグエピトープ−タグ化ＨＤＡＣが細胞中に検出されることを確かめるために、ＨＤＡＣ発現のレベルを、フラッグエピトープに対する抗血清とともに免疫沈降およびウエスタンブロットすることにより検出した。Ｓｉｎ３複合体の構成成分と結合したＨＤＡＣを測定するために、Ｓｉｎ３複合体中の内在性タンパク質を免疫沈降し、そして結合ＨＤＡＣをウエスタンブロッティングフラッグエピトープ−特異的抗体により検出すると、ＨＤＡＣ９がＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＲｂおよびｍＳｉｎ３Ａに結合していることが見出され、これによりＨＤＡＣ９がｍＳｉｎ３Ａ複合体の構成成分であることが示唆される。
【０２１８】
ＳＭＲＴおよびＮＣｏＲと結合したＨＤＡＣ９。コリプレッサーＳＭＲＴおよびＮＣｏＲはｍＳｉｎ３コア複合体と結合するので、ＨＤＡＣをＮＣｏＲおよびＳＭＲＴと共免疫沈降させる実験を行った(図１５)。ＨＤＡＣ９はこれらのタンパク質の両方と共免疫沈降し、これによりＨＤＡＣ９はＳＭＲＴおよびＮＣｏＲと結合することが示唆される。抗−ＮＣｏＲでのフラッグ検出ブロットのウエスタン分析により、ＮＣｏＲが免疫沈降することが示される。従来から報告されていたように、ＳＭＲＴはＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ６と共免疫沈降し、そしてＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ７はＳｉｎ３Ａ複合体と結合しなかった。
【０２１９】
１４−３−３およびＥｒｋタンパク質と結合したＨＤＡＣ９。ＨＤＡＣ４は、従来から、１４−３−３−β、１４−３−３−ε、ＣａｍＫ、Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２タンパク質と結合することが見出されており、これらは細胞質中のＨＤＡＣ４を隔離し、そしてリン酸化されたＨＤＡＣ４およびＨＤＡＣ５が核内に入ってＭＥＦ２活性化転写を抑制することを防ぐ。ＨＤＡＣ９がこれらのタンパク質と結合するかどうかを調べるために、ＨＤＡＣを１４−３−３およびＥｒｋタンパク質と共免疫沈降させる実験を行った。試験されたすべてのＨＤＡＣは、１４−３−３およびＥｒｋと結合した。これらの結果により、ＨＤＡＣの１４−３−３およびＥｒｋとの結合は細胞質においてＨＤＡＣの隔離の一般的なメカニズムであり得る。
【０２２０】
ＨＤＡＣ９の分類。ＨＤＡＣは、酵母ＨＤＡＣとの配列類似性、配列の長さ、触媒ドメインの位置、細胞の局在性、結合しているタンパク質、およびＨＤＡＣインヒビターに対する感受性により分類される。この研究のデータにより、ＨＤＡＣ９はクラスＩおよびクラスＩＩのＨＤＡＣの両方の特徴を有することが示唆される。ＨＤＡＣ９は、クラスＩＩ酵母ｈｄａ１サブファミリーメンバーＣｌｒ３およびＨＤＡＣ６触媒ドメイン１と配列類似性を有する。さらに、３ＫｂのＨＤＡＣ９転写物は腎臓および精巣においてのみ検出され、これによりクラスＩＩ ＨＤＡＣのように組織分布が限定されていることが示唆される。ＨＤＡＣ９はクラスＩとクラスＩＩ ＨＤＡＣの間の長さである。クラスＩ ＨＤＡＣは平均４４３ｂｐの長さであるが、クラスＩＩ ＨＤＡＣは平均１０６９ｂｐの長さである。しかしながら、ＨＤＡＣ９は、クラスＩＩ ＨＤＡＣにおいて見出されているＣ末端触媒ドメインとは反対に、Ｎ末端触媒ドメインを有することが見出された。
【０２２１】
Ｎ末端およびＣ末端触媒ドメインの両方を有するＨＤＡＣ６は例外である。さらに、クラスＩ ＨＤＡＣは核タンパク質であるが、クラスＩＩ ＨＤＡＣは核−細胞質性である。免疫細胞化学により、ＨＤＡＣ９は、優勢的に核性であり、そして細胞質で発現するＥｎａタンパク質と比較して、さまざまな亜細胞性区画において検出されることが示された。差次的に発現し得る３ＫｂのＨＤＡＣ９転写物とは対照的に、ノーザン分析により同定される３.５ＫｂのＨＤＡＣ９転写物は、クラスＩ ＨＤＡＣと同様に、正常組織、腫瘍組織および細胞株においていたるところで発現していた。さらに、ＨＤＡＣ９は、前に、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ｍＳｉｎ３ＡおよびＲｂを含むクラスＩ ＨＤＡＣ複合体とのみ結合したタンパク質と共免疫沈降することが見出された。また、ＨＤＡＣ９は、これまではＨＤＡＣ１においてのみ見出されていた推定的Ｃ末端ＬＸＣＸＥモチーフを有する。ＨＤＡＣ９は、また、ＮＣｏＲおよびＳＭＲＴと結合することも見出された。この事実により、ＨＤＡＣ９はクラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣの特徴の橋渡しをする特徴を有することが示唆される。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、ＧＥＮＦＡＭ(プロプラエタリ・ソフトウエア)を用いて同定され、そして完全ＨＤＡＣ９ ｃＤＮＡ配列に関してデータベースを検索するために使用される１１５６ｂｐオープンリーディングフレームを示す。それぞれのＯＲＦ(配列番号３)はヌクレオチド位置番号１で開始し、そしてヌクレオチド位置番号１１５６で終了する。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、ＨＤＡＣ９の完全長ｃＤＮＡ配列(配列番号２)およびそのアミノ酸配列(配列番号１)を示す。完全長ｃＤＮＡ配列は、ヌクレオチド位置番号１で開始し、そしてヌクレオチド位置番号２０２２で終了する。
【図３】図３は、クローン１９８９２９／ＨＤＡＣ９の配列とアラインした、インシリコ(in silico)のゲノム性ＤＮＡ配列(ＡＬ０２２３２８) (配列番号４)を示す。該アラインメントは、プロプリエタリ・ソフトウエア(Novartis Pharmaceuticals, Summit, NJ)を用いて製造された。
【図４】図４は、ＨＤＡＣ９予想ペプチドおよび S. pombe Hda1ペプチドのアラインメントを示す。クエリー(query)はＨＤＡＣ９ペプチドであり、そして対象(subject)はS. pombe Hda1ペプチドである。アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【図５】図５は、ＨＤＡＣ１およびＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントならびに推定される触媒ドメインのアミノ酸およびＲｂ結合ドメインの位置を示す。触媒ドメインのアミノ酸は実線で囲まれ、そして推定されるＲｂドメインのアミノ酸は点線の囲み中に含まれる。 アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【図６】図６は、ＨＤＡＣ １〜９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。
【図７】図７は、ＨＤＡＣ９のノーザン分析を示す。(Ａ)正常ヒト組織におけるＨＤＡＣ９の分布のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡローディングのための対照と同一のブロットとハイブリダイズした。(Ｂ)腫瘍および正常組織の比較におけるＨＤＡＣ９のノーザンブロット分析。ＧＡＰＤＨを、ＲＮＡローディングのための対照と同一のブロットとハイブリダイズさせた。
【図８】図８は、１８ＳリボソームＲＮＡと比較した正常ヒト組織および細胞株中のＨＤＡＣ９の分布のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ヒト肺カルシノーマ細胞株であるＡ５４９からのＲＮＡを、内部標準として使用した。
【図９】図９は、クラスＩＩ ＨＤＡＣ(ＨＤＡＣ４、５、６、７)とのＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。触媒ドメインのアミノ酸が実線で囲まれている。
【図１０】図１０は、クラスＩ ＨＤＡＣ(ＨＤＡＣ１、２、３、８)とのＨＤＡＣ９ｖ１のアラインメントを示す。該アラインメントは、Clustalwアルゴリズム(Higgins, D.G., Thompson, J.D., Gibson, T.J. (1996) 複数の配列アラインメントのためのCLUSTALの使用。Methods Enzymol 266, 383-402)を用いて製造された。触媒ドメインのアミノ酸が実線で囲まれている。
【図１１】図１１は、３つのＨＤＡＣ９配列変異体(ＨＤＡＣ９ｖ１、ＨＤＡＣ９ｖ２、およびＨＤＡＣ９ｖ３)を示す。ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡ９ｖ２は、ヒトＥＳＴデータベースを検索することにより見出され、そしてＨＤＡＣ９ｖ３はＣｅｌｅｒａ配列データベース中の予想される転写物として見出された。(Ａ)は、該３つのＨＤＡＣ９変異体ペプチド配列のアラインメントを示す。(Ｂ)は、クラスＩおよびクラスＩＩ ＨＤＡＣペプチド配列の略図を示す。触媒ドメインは黒塗りのボックスであり、そして推定されるＬＸＣＸＥモチーフは白抜きのボックスである。(Ｃ)は、ＨＤＡＣ９ｖ１およびＨＤＡＣ９ｖ２のゲノム構造の略図である。エキソンを黒塗りのボックスで示し、そしてイントロンを黒塗りのボックスの間の線で示す。ボックスおよび線の長さは、エキソンおよびイントロンの長さを示す。
【図１２】図１２は、ＨＤＡＣ９が酵素的に活性なヒストンデアセチラーゼであることを示す。(Ａ) ＨＤＡＣ９の触媒活性は、ＨＤＡＣ３およびＨＤＡＣ４の活性に匹敵する。(Ｂ)は、ＨＤＡＣ１が本アッセイにおけるヒストン基質の脱アセチル化に関して、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、およびＨＤＡＣ９よりも効果的であったことを示す。
【図１３】図１３は、ＨＤＡＣ９が核タンパク質であることおよびＨＤＡＣ９−フラッグがインビトロで翻訳されることを示す。
【図１４】図１４は、 ＨＤＡＣ９ｖ３およびＨＤＡＣ９ｖ２のＤＮＡおよびペプチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図３．４】
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【図４】
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【図５】
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【図６．１】
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【図６．２】
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【図６．３】
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【図６．４】
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【図６．５】
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【図６．６】
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【図７】
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【図８】
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【図９．１】
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【図９．２】
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【図９．３】
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【図１０．１】
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【図１０．２】
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【図１０．３】
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【図１１．１】
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【図１１．２】
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【図１１．３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４．１】
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【図１４．２】
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【配列表】
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