(57)【要約】 【課題】初期リリースを減らし、長期間に渡ってシスプラチン（ＣＤＤＰ）のリリースを維持して、がん細胞への抗がん効果を高めるとともに、副作用を軽減し、患者の延命効果を高めることの可能なマイクロ微粒子製剤およびこのマイクロ微粒子製剤を含んだ医薬組成物を提供すること。【解決手段】マイクロ微粒子製剤は、二重らせんＤＮＡにインターカレートしているシスプラチンを含有する。このマイクロ微粒子製剤は、シスプラチンを安定して保持し、徐放性にすぐれているため、毒性の強いシスプラチンを用いても、副作用を抑えながら長期間に渡って優れた抗がん作用を発揮できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重らせんＤＮＡを含有するマイクロ微粒子製剤であって、
前記二重らせんＤＮＡに医薬品がインターカレートしていることを特徴とするマイクロ微粒子製剤。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロ微粒子製剤において、
前記医薬品が抗がん剤であることを特徴とするマイクロ微粒子製剤。
【請求項３】
請求項２に記載のマイクロ微粒子製剤において、
前記抗がん剤がシスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキザリプラチンおよびロバプラチンからなる群より選ばれる少なくとも一つの白金化合物であることを特徴とするマイクロ微粒子製剤。
【請求項４】
請求項１〜請求項３のいずれかに記載のマイクロ微粒子製剤と、
薬学的に許容される担体とを含む、腫瘍を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品を封入したマイクロ微粒子製剤およびこのマイクロ微粒子製剤を含んだ医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、シスプラチン（Cisplatin、cis-dichlorodiammineplatinum(II)、ＣＤＤＰ）は、精巣腫瘍、膀胱がん、卵巣がん、子宮頸がん、および腎盂尿管腫瘍などの悪性腫瘍の治療に広く使用されてきた。一方で、シスプラチンは、抗がん剤としての効果はあるものの、神経毒性や腎毒性などの副作用も強いため、シスプラチンの投与には制限があった。抗がん効果を保ちつつ副作用を減らすためには、腫瘍部位にだけ薬物を選択的に到達させ、高濃度を保持させることが重要であり、静脈内投与、腹腔内投与、腫瘍内投与などが実施されている。
しかし、溶液中のシスプラチンは急速に大循環内へ吸収されターゲット部位にて高濃度を保持することができなかった。
そこで、リポソームや高分子ミセル、あるいはマイクロ微粒子などのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用してターゲット部位に高濃度のシスプラチンを保持させる試みがなされており、生分解性高分子を用いたシスプラチンのカプセル化についての研究が多く行われている（例えば、特許文献１、２参照）。
【０００３】
【特許文献１】特許公開２００６−３１２０１５
【特許文献２】特許公開２００６−２４８９７８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１に記載のポリマーコート組成物技術や、特許文献２に記載のリポソーム製剤では、初期リリースが多いため、一定濃度で持続的にリリースされないこという問題があった。
そこで、本発明の目的は、初期リリースを減らし、長期間に渡って医薬品のリリースを維持して、患部への治療効果を高めることができるマイクロ微粒子製剤およびこのマイクロ微粒子製剤を含んだ医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のマイクロ微粒子製剤は、二重らせんＤＮＡを含有するマイクロ微粒子製剤であって、前記二重らせんＤＮＡに医薬品がインターカレートしていることを特徴とする。
ここで、二重らせんＤＮＡの構造は、一般に、右巻きらせん型を有する２本のポリヌクレオチド鎖からなっている。また、２本のポリヌクレオチド鎖の糖−リン酸骨格は、構造的相補性を有する平面的な塩基同士がらせんの軸に対して垂直にらせんの中央部に向かって突出し合い水素結合で結合している。該ＤＮＡの２本鎖の塩基対と塩基対の間には、Ｂ型構造の場合、幅約１．１ｎｍ、高さ約０．３４ｎｍの隙間があり、平面構造を有する小分子はこの隙間に入り込むことが可能であって、これをインターカレーション（インターカレート）と呼ぶ。この現象は小分子の電荷や疎水性により促進される場合がある。
また、本発明における二重らせんＤＮＡの原料としては、例えば、魚類の白子を好適に用いることができる。魚類の白子の核はＤＮＡを多く含み、また従来は廃棄されていた物質であることから、二重らせんＤＮＡを安価に大量生産するための原料として適している。該魚類としては例えば鮭（サケ）、鰊、鱒、鱈等を挙げることができ、これらの白子から皮、筋、血管等を除去した後、油分を除き精製することによって本発明の二重らせんＤＮＡを得ることができる。
【０００６】
このような本発明のマイクロ微粒子製剤によれば、二重らせんＤＮＡにインターカレートしている医薬品を含有しているので、徐放効果に優れており、例えば、毒性の強い医薬品をゆっくりと患部に送り込むことが可能となる。
特に、二重らせんＤＮＡが標的細胞指向性のリガンドで誘導化されていると、特定の患部を選択的に治癒できるのでより好ましい。
【０００７】
本発明のマイクロ微粒子製剤は、医薬品として抗がん剤に適用することが好ましく、具体的には、シスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキザリプラチンおよびロバプラチンからなる群より選ばれる少なくとも一つの白金化合物に好ましく適用することができる。特に抗がん剤として毒性が極めて強いシスプラチン（以下、「ＣＤＤＰ」ともいう）に適用すると、副作用を最小限に抑えつつ、長期間に渡ってがん細胞を攻撃できるため特に好ましい。
このような二重らせんＤＮＡとしては、生分解性で毒性のない天然高分子であるサケＤＮＡを用いることが好ましい。
本発明のマイクロ微粒子製剤は、容易に注射可能な製剤とでき、医療の現場に提供することより抗がん剤投与による副作用を軽減できることことに伴って、がんの末期患者の苦痛を和らげることができ、また医療費の抑制にも貢献できる。
また、本発明のマイクロ微粒子製剤は、薬学的に許容される担体に担持されることで、腫瘍を治療するための医薬組成物としても好適に使用できる。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例の内容に何ら限定されるものではない。
〔製造例〕
（１）抽出、精製による二重らせんＤＮＡの調製方法
魚（サケ）の白子を水洗し苛性ソーダで処理後、プロテアーゼ処理し、エタノールで固液分離して、二重らせんＤＮＡを得た。
（２）ＣＤＤＰを含有するマイクロ微粒子の製造方法
ＣＤＤＰを含有するマイクロ微粒子は、O/Oエマルジョンを用いた液中乾燥法により製造した。具体的には、以下のようにして行った。
二重らせんＤＮＡ(分子量１００万以上)５００ｍｇを蒸留水５０ｍｌに溶かし、N,N-ジメチルホルムアミド(和光純薬製)を溶媒にした１質量％ＣＤＤＰ溶液５ｍｌに加えて攪拌した。次に、このＣＤＤＰ-ＤＮＡ混合溶液を２８℃のソルビタンモノオレエート（span80）含有流動パラフィンに加え、攪拌しながら１０分間隔で２℃ずつ４０℃度まで温度を上げ４８時間反応させた。このパラフィン溶液を１０００rpmにて１０分間遠心分離し、マイクロ微粒子を採取した。マイクロ微粒子は、ｎ-ヘキサンで５回、最後に２-プロピルアルコールで1回洗浄し、凍結乾燥した。
【０００９】
前記した（１）により調製された二重らせんＤＮＡは、白くて水溶性である物質であったが、ＣＤＤＰを含有させることにより、液中乾燥法で得られたマイクロ微粒子は黄色くて不溶性の物質となった（以後、このマイクロ微粒子を、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳと表記することがある。）。これはＤＮＡの二重らせん構造にＣＤＤＰがインターカレートされることにより化学結合し、架橋が起こったことを示唆する。従って、ＣＤＤＰはマイクロ微粒子の中に安定的に取り込まれたと考えられる。図１に走査型電子顕微鏡によるマイクロ微粒子の形態構造を示した。ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳは、凹凸のない滑らかな表面を持つ球であり、その平均直径は１５〜２５μｍであった。また、このようなマイクロ微粒子の調製方法で得られた生成物はさらさらとした粉末であった。
【００１０】
（３）ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ中のＣＤＤＰ含有量の測定
得られたマイクロ微粒子中のＣＤＤＰの含有量を調べるため、ＤＮＡ分解酵素を含んだnuclease−tris-HClバッファ溶液(３unit/ｍｌ、シグマ)１０ｍｌに１０ｍｇのマイクロ微粒子を入れ、攪拌しながら完全に溶かした。また、ＣＤＤＰ１０ｍｇをtris-HClバッファ溶液１０ｍｌに溶かし、０．５〜２μｇ/ｍｌの濃度の溶液を標準液とした。ＣＤＤＰ含有量は原子吸光分析装置（Hitachi Model Z-8000）を用いて１個のサンプルにつき３回ずつ測定した。 原子吸光分析は次のような条件で行った。
Pt lamp: l=265.9ｎｍ
Ｓlit width: 1.9A
carrier gas:argon(１ l/min)
measurement mode: BGC
amount of infusion: １０μl
その結果、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ中のＣＤＤＰ含有量は４質量％（理論値：９質量％）であり、取り込み効率は４５％であった。
【００１１】
〔実施例１：In vitro リリース試験〕
ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ（１０ｍｇ）を０．０１質量％のTween 80が含まれているtris-HClバッファ溶液 (ｐＨ ７．４)１０ｍｌに入れ振蕩しながら３７℃にて２時間、１日間、３日間、５日間、７日間インキュベーションした。各時点でバッファ溶液５ｍｌを取り出し、原子吸光分析装置を用いて265.95ｎｍにおける吸光度を測定し溶液中のPt量を測った。測定は独立に３回行った
図２にＣＤＤＰ -ＤＮＡ ＭＳからリリースされたＣＤＤＰ量を示した。ＣＤＤＰリリース試験はＤＮＡ分解酵素なしの環境下で行い、7日間ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳからリリースされたＣＤＤＰ含有量を測定した結果、リリースされたＣＤＤＰは取り込まれた量の８%であったことを確認した。また、多量の初期リリースが見られないことから、ＣＤＤＰの徐放性が確認された。これは酵素なしの環境下ではＤＮＡの分解が遅くなり、ＤＮＡとＣＤＤＰの複合体からＣＤＤＰのリリースが抑えられたためと考えられる。マイクロ微粒子からの多量の初期リリースとは、該微粒子表面の周りにある薬物が拡散により放出されることであり、本発明のマイクロ微粒子には多量の初期リリースがないことからＣＤＤＰがＤＮＡとの安定的な結合をしていることが理解できる。
【００１２】
〔実施例２：In vitro  細胞毒性試験〕
マウス由来結腸がん細胞（colon-26）を用いてマイクロ微粒子のがん細胞に対する毒性を調べた。具体的には、以下のようにして行った。
colon-26細胞を96well-plateに1´104の濃度に播種し２４時間培養後、ＣＤＤＰ単体(Free CDDP：１μｇ/ｍｌ、５μｇ/ｍｌ、１０μｇ/ｍｌ）、ＤＮＡ単体(５ｍｇ/ｍｌ)およびＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ（CDDP-MS：１ｍｇ/ｍｌ、１０ｍｇ/ｍｌ）を処理し４８時間培養した。細胞毒性は細胞内の酵素により、テトラゾリウムのホルマザン置換量を測るCCK-8 キット(Dojindo、日本熊本県)を用いて450ｎｍの吸光度を測定した。
図３に、処理４８時間後Colon-26結腸がん細胞に対するＣＤＤＰ単体とＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳの細胞増殖抑制効果を示した。
Colon-26結腸がん細胞に対しては、単独ＤＮＡ処理においても若干細胞増殖が抑えられたが、繊維芽細胞L-929に対する毒性試験では細胞増殖に影響はなかったことで毒性による影響ではないと考えられる。
１０μｇ/ｍｌのＣＤＤＰ単体処理群では約５０％の細胞増殖抑制効果があることが示された。ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳはそれぞれ１ｍｇ/ｍｌと１０ｍｇ/ｍｌの濃度で処理され、コントロール（基準サンプル）に比較して有意に細胞増殖を抑えたが、処理濃度による差は有意ではなかった。ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳからリリースされたＣＤＤＰは細胞増殖抑制に対する活性を保つことが明確になった。
【００１３】
〔実施例３：In vivo毒性試験〕
実験動物として、６週齢のBALB/c雄性マウス（体重25ｇ、日本清水実験材料）を恒温恒湿環境下（温度：24±2℃、湿度55±10%）で飼育し、５匹ずつコントロール群とＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ群およびＣＤＤＰ単体群に群分けを行った。期間中、水および餌は自由に摂取させた。ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ、ＣＤＤＰ単体およびＤＮＡ単体を０．０１質量％のTween80の生理食塩水に浮遊しそれぞれの溶液を調整した。
コントロールは生理食塩水とした。ＣＤＤＰ単体群は５ｍｇ/ｋｇ、１０ｍｇ/ｋｇ、２０ｍｇ/ｋｇの濃度で、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ群は含有されているＣＤＤＰの濃度が２０ｍｇ/ｋｇ、４０ｍｇ/ｋｇになるようにして一回の腹腔内投与を行った。その後、状態観察及び生死の確認を行うとともに、体重を測定した。また投与３０日後マウスを犠牲死させ、心臓から採血し血液学的検査、血液生化学検査を行った。さらに、解剖後、臓器を肉眼観察した。
【００１４】
図４にＣＤＤＰ単体とＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳの腹腔内投与後、２０日間時間経過によるマウスの体重変化を示した。全てのＣＤＤＰ単体処理群では投与翌日から体重減少が見られ、４日目または５日目に最大体重減少が観察され、２０ｍｇ/ｋｇのＣＤＤＰ単体処理群では２０％の体重減少があった。最低体重が見られた投与後５日目以降から次第に体重が増加し、１５日目にはコントロールに近づいていった。一方、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群では、急激な体重変化が見られずコントロールの体重変化パターンと類似であった。これらにより、ＣＤＤＰ単体の1回投与による毒性は投与初期に体重減少で現れたが、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理による毒性はなかったと考えられる。さらに、薬物投与２０日目にマウスを犠牲死させ、血液学的検査、血液生化学検査を行った結果を図５〜図８に示した。白血球の数（図５）はＣＤＤＰ単体処理群では減少する傾向が見られたが、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群ではコントロールとの差がなかった。ヘモグロビン値（図６）ではＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群とＣＤＤＰ単体処理群との有意な差がなかった。血小板の数（図７）にもＣＤＤＰ単体処理群ではコントロールと比較し有意な減少が見られたが、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群は大きな変化がなかった。血液学的検査により、ＣＤＤＰ単体による毒性は投与３０日後においても現れていることがわかる。図８には、ＣＤＤＰの代表的な副作用である腎臓毒性を調べるため、血液尿素窒素を測定した結果を示した。ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群では若干増加しているが、全て処理群には有意な差がなかった。
以上の結果より、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ投与はＣＤＤＰ単体投与より、毒性が極めて少ないことが理解できる。
【００１５】
〔実施例４：In vivo  抗がん治療試験〕
実験動物として、６週齢のBALB/c雄性マウス（体重25ｇ、日本清水実験材料）を選び、がん移植当日の体重をもとに層別連続無作為化法により７匹ずつコントロール群とＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ群及びＣＤＤＰ単体を投与する治療群に群分けを行った。この試験では毒性試験と同様の薬物処理を行った。具体的には以下の通りである。
マウス由来結腸がん(Colon-26adenocarcinoma）細胞(1´106)をマウスの腹腔内に移植し、担がんマウスを作成した。がん移植６日後、薬物（ＣＤＤＰ単体とＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ）を腹腔内投与し、その日から体重の変化と生存可否を調べた。結果を図９にマウスの生存曲線として示した。
【００１６】
薬物投与後、ＣＤＤＰ単体処理群ではＣＤＤＰの毒性による体重減少と外見変化が起きた。２０ｍｇ/ｋｇのＣＤＤＰ単体処理群では投与５日目に最低体重が見られつつ、処理群の半分が死亡した。これはＣＤＤＰの毒性による死と考えられる。
一方、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群では体重減少と外見的変化が見られなかった。ＣＤＤＰ単体処理群ではＣＤＤＰ投与後、毛のつやがなくなるという変化があった。がん形成による外観的変化は接種３０日後から見られ、ＣＤＤＰ単体処理群では４０日以降からがんにより死亡するマウスが発生した。ＣＤＤＰ単体５ｍｇ/ｋｇ、１０ｍｇ/ｋｇ処理群では濃度による抗がん効果の差は有意でなかった。一方、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ処理群では外見的にも腫瘍形成が明らかに抑えられており、延命にもコントロールとＣＤＤＰ単体処理群に比べ有意な差が出た。
これらの結果より、ＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳ投与による抗がん効果が優れていることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明のマイクロ微粒子製剤は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）等の抗がん剤を含んだ徐放性医薬組成物として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明のマイクロ微粒子の形態構造を示す走査型電子顕微鏡写真。
【図２】本発明の実施例１にかかるＣＤＤＰリリース量を示すグラフ。
【図３】本発明の実施例２にかかるＣＤＤＰ-ＤＮＡ ＭＳの細胞増殖抑制効果を示すグラフ。
【図４】本発明の実施例３にかかるマウスの体重変化を示すグラフ。
【図５】本発明の実施例３にかかるマウスの白血球数を示すグラフ。
【図６】本発明の実施例３にかかるマウスのヘモグロビン値を示すグラフ。
【図７】本発明の実施例３にかかるマウスの血小板の数を示すグラフ。
【図８】本発明の実施例３にかかるマウスの血液尿素窒素の量を示すグラフ。
【図９】本発明の実施例４にかかるマウスの生存率を示すグラフ。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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