(57)【要約】【課題】未熟児網膜症（ＲＯＰ）は失明の可能性のある疾患で、未熟な出生後の網膜の血管の成長の欠如に始まる。ＲＯＰ発症の最大のリスク因子は低体重および在胎週数である。新生児が未熟で生まれる場合、網膜は血管形成が完了していない。ＲＯＰを発症する新生児では、無血管であるにもかかわらず出生時に成熟を取り残したまま、血管の成長が遅いかまたは止まってしまうため、末梢の網膜が低酸素になる。しかしながら、未熟児合併症の理解が深められているにもかかわらず、未熟による罹患および死亡が非常に広く認められるように、現在、利用可能な有効な治療またはこれらの生命を脅かす症状を発症するリスクを決定する方法はない。【解決手段】有効量のＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体を含む、早産による合併症である未熟児網膜症の予防または治療用医薬組成物が提供される。【選択図】  図１
2008163043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体を含む、早産による合併症である未熟児網膜症の予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】
ＩＧＦ−Ｉおよび/またはＩＧＦ結合タンパク質の血清レベルが子宮内の基準値未満である患児に投与して、同患児のＩＧＦ−Ｉレベルを子宮内ベースラインレベルまで上昇させることにより、早産による合併症の患者を予防または治療するための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
子宮内ベースラインレベルが１０μｇ/Ｌから１５０μｇ/Ｌである、請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体を、ＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせて投与するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＩＧＦ結合タンパク質がＩＧＦＢＰ−３である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
皮下投与するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
静脈内投与するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
経口投与するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
筋肉内投与するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
包装材および同包装材に内包された医薬剤を含む製造品であって、前記包装材が、早産に伴う合併症である未熟児網膜症を治療および/または予防するために、前記医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含み、前記医薬剤がＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体を医薬的に受容可能な担体と共に含む、当該製造品。
【請求項１１】
医薬剤がＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体をＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせて含む、請求項１０の製造品。
【請求項１２】
ＩＧＦ結合タンパク質がＩＧＦＢＰ−３である、請求項１１の製造品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願に対する相互参照
本出願は２００１年３月３日に出願された仮特許出願第６０/２７４，２５２号および２０００年１１月２８日に出願されたスウェーデン特許出願第０００４４０５−７号に基づき、その内容を利用し全体を通して参照として援用し、Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９章に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は全体として早産および低体重による合併症を発症するリスクの決定、そして特にＩＧＦ−Ｉに関連する合併症に関する。本発明はさらにこのような症状を治療する方法に関する。
【０００３】
発明の背景
毎年アメリカにおける推定４２０万例の出産のうち、およそ３８３，０００例（約９％）が未熟児である。早産およびその合併症は現代先進国社会において、周産期の重要な社会的健康問題である。低体重の新生児または未熟で生まれた新生児は、子宮内での成長の非常に重要な期間の主要部分が欠落している。これら新生児は新生児全体の死亡の１/２および長期間罹患の３/４を占める。新生児期および生存者の生涯にわたりどちらも特別なケアに要する高いコストのため、国家経済に重い負担をかけることになる。生存者の多くはまた、未熟児に直接起因する身体的障害によりクオリティーオブライフの低下を課せられてきた。
【０００４】
正常な妊娠または在胎期間は受精日から４０週（２８０日）であると考えられている。在胎３７週前に生まれた新生児は未熟であると考えられ、合併症のリスクが懸念される。医学技術の進歩により、在胎週数２３週（１７週未熟）程度の早期に生まれた新生児の生存も可能となった。未熟で生まれた新生児は、その低体重および体のシステムが成熟していないことによる、死亡または重篤な合併症の危険性がより高い。２，５００ｇ以下の区切りで定義される低体重は、出生前のリスク因子、分娩時合併症および新生児疾患に相関することより、リスクの高い新生児の１つの指標とみなされており、早期出生の多くを構成する。超低体重に関する研究では、超未熟に関連する重篤な呼吸器合併症および神経学的合併症を高比率で伴う、最もリスクの高い新生児と同定する１，５００ｇ未満、または１，０００ｇ未満で区切って定義している。（Hack, M., Klein, N. K., & Taylor, H. G.、低体重新生児の長期間の発達の結果、The Future of Children, 5, 176-196(1995)）。
【０００５】
未熟児では肺、消化系および神経系（脳を含む）が十分に発達しておらず、特に合併症の傷害を受けやすい。早産の新生児に起こる最も一般的な医学的障害は、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺の形成不全、壊死性腸炎、および脳室内出血である。
【０００６】
未熟児網膜症（ＲＯＰ）は失明の可能性のある疾患で、未熟な出生後の網膜の血管の成長の欠如に始まる。ＲＯＰ発症の最大のリスク因子は低体重および在胎週数である。ＲＯＰは２段階で起こる。 (Simons, B. D. & Flynn, J. T. (1999) International Ophthalmology Clinics 39, 29-48)。新生児が未熟で生まれる場合、網膜は血管形成が完了していない。ＲＯＰを発症する新生児では、無血管であるにもかかわらず出生時に成熟を取り残したまま、血管の成長が遅いかまたは止まってしまうため、末梢の網膜が低酸素になる。(Ashton, N. (1966) Am J Ophthalmol 62, 412-35; Flynn, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthlmol 95, 217-23)。これがＲＯＰの第１段階である。
【０００７】
ＲＯＰの最初の段階での網膜の非潅流の程度が、続いて起こる新生血管形成の程度、すなわち網膜剥離および全盲という付随リスクを伴うＲＯＰの後半の破壊的段階を決定するようである。(Penn, J. S., Tolman, B. L. & Henry, M. M. (1994) Invest Ophthalmol Vis Sci 35, 3429-35)。すべての未熟児に子宮内で成長するように正常に血管を成長させることができれば、ＲＯＰの障害に至る第２段階の新生血管形成は起こらないだろう。ＲＯＰが１９４２年に最初に報告された当時、病因は分からなかった。しかし未熟児に高濃度酸素の補給を過分に使用することが、直ちにこの疾患に結びつき、高酸素が網膜の血管形成の完了していない新生仔動物におけるＲＯＰ様の網膜症を誘導することが示された。このことは酸素によって制御される因子が関与することを示唆した。血管内皮成長因子（ＶＧＥＦ）の発現は正常な血管の発達に必要であるが、酸素により制御されており、ＲＯＰの双方の段階に重要であることが発見された。(Aiello, L. P., Pierce, E. A., Foley, E. D., Takagi, H., Chen, H., Riddle, L., Ferrara, N., King, G. L. & Smith, L. E. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 10457-61; Robinson, G. S., Pierce, E.A., Rook, S. L., Foley, E., Webb, R. & Smith, L. E. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 4851-6; Pierce, E. A., Foley, E. D. & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28; Stone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47; Alon, T., Hemo, I., Itin, A., Pe'er, J., Stone, J. & Keshet, E. (1995) Nature Medisine 1, 1024-8; Ozaki, H., Seo, M. S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J. M. & Campochiaro, P. A. (2000) American Journal of Pathology 156, 697-707)。高濃度酸素の補給はＶＥＧＦの発現抑制を通してＲＯＰ動物モデルの血管成長の第１段階に影響を与える。しかし今日、現在の中程度の濃度の酸素補給の注意深い使用をもってすれば、患児の酸素レベルはＲＯＰの有意なリスク因子ではないのであるが、なおこの疾患は存続しており、他の因子も関与することを示唆する。(Kinsey,V.E., Arnold,H.J., Kalina,R.E., Stern,L., Stahlman,M., Odell,G., Driscoll,J.M., Jr., Elliott,J.H., Payne,J. & Patz,A. (1977) Pediatrics 60, 655-68; Lucey, J.F. & Dangman,B. (1984) Pediatrics 73, 82-96)。
【０００８】
未熟児は脳の発達が完了していない。脳内の呼吸中枢が未熟であろうことから、多くの未熟児は脳内の出血または脳内酸素供給が不十分なことに起因する神経学的障害を受けやすい。神経学的障害（例えば脳室内または脳室周囲の出血、周産期低酸素障害）および早産による様々な早期感染が、発達遅滞、すなわち発達の評価指標を達成する進歩が遅いというリスクをもたらす。早期に発達遅滞のある小児は精神遅滞の“リスクがある”と考えられる。精神遅滞は、その他の生活技術の全般的欠落と合わせて、１８歳前に発達していなければならない一般的な知的機能の障害をいう。超未熟で生まれた小児は、健常の満期産の小児より精神遅滞をはるかに発症しやすい。神経学的障害は、例えば脳波（ＥＥＧ）により検出することができる。ＥＥＧは新生児の脳の機能を反映する有用な情報を提供する。ＥＥＧを脳の成熟、病巣または一般的異常を決定する一助とすることができる。ＥＥＧは脳神経細胞からの電流を測定することにより脳の外層における脳の活動を検査する。頭の様々な部分に電極を固定し、電気的活動からグラフを作成する。脳波をその振動数（１秒当たりの波の数）およびその波形（１つの波の形、または一群の波の形）により、解釈することができる。
【０００９】
脳室内出血（ＩＶＨ）は現在、未熟な新生児の中枢神経系罹患の最も知られている原因である。ほぼすべての重症のＩＶＨは在胎週数２８−３０週またはそれ未満で起こる。重篤なＩＶＨの９０％は、リスクの高い新生児の約１５−４０％の生後数日から1週以内に起こる。ＩＶＨは未熟で壊れやすい脳内の血管が破裂し、通常は髄液が保持されている空洞な部分（脳室）内およびその周辺組織内に出血する症状である。ＩＶＨの重症度はＩ−ＩＶのスケールにより、Ｉは破裂した血管周囲の小さな領域に限定された出血、ＩＶは脳室だけでなく脳組織自身にまで血液の貯留が拡大する、という様に段階づけられている。グレードＩおよびＩＩはよく見られ、通常病的な影響を与えることなく乳児の体が血液を再吸収する。しかしより重篤なＩＶＨは、脳室に過剰の体液が貯留され脳圧の増加をきたし、乳児の頭を異常に膨満させる原因となる致死の可能性のある症状である水頭症になり得る。体液を抜いて脳圧を減圧するため医師は、髄腔に針を挿入して液体を抜く腰椎穿刺；脳室から、逃避の下または上の人工的な空間に体液を抜くチューブである、貯留場所の設置；または脳室から腹部に体液を抜き、体で再吸収させるチューブである、脳室シャントの設置、のいずれかを行う。ＩＶＨのリスクの高い新生児には、通常生後1週以内に脳の超音波検査を行い、出血が検出された場合はさらに他の検査を行う。現在ＩＶＨを予防することはできない；しかしきめ細かくモニターすることは、障害の可能性を最小にするために脳内の体液を減ずる手段を直ちに行うことを確実にする。
【００１０】
すべての新生児の約１％は、肺が成熟していないことを反映する呼吸窮迫症候群を発症する。新生児集中治療室（ＩＣＵ）で呼吸窮迫症候群を治療した新生児のうち約２０から３０％が、慢性新生児肺疾患の最も一般的な形である気管支肺形成不全（ＢＰＤ）を発症する。(Northway WH. 気管支肺形成不全：２５年後、Pediatrics 1992; 89: 969-973)。毎年約７，０００例のＢＰＤの新たな症例が診断されている。(Davis JM, Rosenfeld WN. Chronic lung disease. ：Avery GB, Fletcher MA, MacDonald MG編、 Neonatology: pathophysiology and management of the newborn. Philadelphia, PA: JB Lippincott, 1994; 453-477)。ＢＰＤの新生児では、主に心肺不全による高頻度の再入院（６０％まで）およびその後の死亡（２０％まで）が認められている。(Southall DP, Samuels MP、気管支肺形成不全：管理の新しい見解、 Arch Dis Child 1990; 65:1089-1095)。生存は改善されているが、治療の進歩によってもＢＰＤ発症の有意な低下には至っていない。(Frank L.、抗酸化剤、栄養摂取および気管支肺形成不全、Clin Perinatol 1992; 19: 541-562; Rush MG, Hazinski TA. 、気管支肺形成不全の現在の治療、Clin Perinatol 1992; 19: 563-590)。未熟、気圧障害および酸素毒性がＢＰＤの病因に寄与しているが、新生児の肺が、構造および機能のこのような重篤な崩壊をきたす正確な機序は完全には解明されていない。
【００１１】
インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は生後の成長および代謝の公知の制御物質である。Baker J, Liu JP, Robertson EJ. Efstratiadis A. Role of insulin-like growth factors in embryonic and postnatal growth.（胎児期および生後の成長におけるインスリン様成長因子の役割） Cell 1993; 75: 73-82 を参照のこと。この物質は約７．５キロダルトン（Ｋｄ）の分子量を有する。ＩＧＦ−Ｉは、様々な他の成長因子による組織の治療がＩＧＦ−Ｉ産生増加をもたらすことから、このような成長因子の作用に関連づけられてきた。しかし出生前の成長および発達におけるその役割は最近になって理解されたに過ぎない。Guluckman PD, Harding JE. 、子宮内の成長遅滞の生理学および病理生理学、Hormon Research 1997; 48: 11-6を参照のこと。ＩＧＦ−Ｉ-/-マウスで得られた実験データは、ＩＧＦ−Ｉが胎仔期の成長の第３三半期およびいくつかの組織の発達に重要な役割を担うことを示唆する。Baker J, Liu JP, Robertson EJ. Efstratiadis A.、胎児期および生後の成長におけるインスリン様成長因子の役割、Cell 1993; 75: 73-82 を参照のこと。マウスのＩＧＦ−Ｉ-/-のデータを支持するものとして、ＩＧＦ−Ｉ系を遺伝的に欠損する２名の患児が、中枢神経系の出生前の成長障害および発達障害を呈することが示された。１名の女児はＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子の１つの対立遺伝子の欠損があり、１名の男児はＩＧＦ−Ｉ受容体遺伝子の部分的欠損があった。Woods KA. Camacho-Hubner C, Savage MO, Clark AJ.インスリン成長因子Ｉ遺伝子の欠損に伴う子宮内での成長遅滞および生後の成長不全。New England Journal of Medicine 1996; 335: 1363-7;およびde Lacerda L, Carvalho JA, Stannard B, et al., 1999 環状クロモゾーム１５およびタイプ１ＩＧＦ受容体遺伝子の１つの対立遺伝子欠損を伴う重篤な成長遅滞の女児における短期の組み換えヒトインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）に対するin vitroおよびin vivoにおける反応、Clin. Endocrinol. 51(5): 541-50 を参照のこと。
【００１２】
ＩＧＦ−Ｉはインスリン様の活性を有し、神経組織、筋肉組織、生殖組織、骨組織およびその他の組織の細胞に対して分裂促進的（細胞分裂を刺激する）および/または栄養性（再生/生存を促進する）である。ほとんどの成長因子とは異なり、ＩＧＦは循環系に相当量存在するが、循環系または他の体液中においてこのＩＧＦの非常に少量部分のみが遊離型である。ほとんどの循環しているＩＧＦはＩＧＦ結合タンパク質、さらに特にＩＧＦＢＰ−３と結合している。ＩＧＦ−Ｉを血清中で測定し、異常な成長に関する症状、例えば脳下垂体性巨人症、末端肥大症、小人症、様々な成長ホルモン欠損症等、を診断することができる。ＩＧＦ−Ｉは多くの組織で産生されるが、ほとんどの循環しているＩＧＦ−Ｉは肝臓で合成されると考えられている。
【００１３】
ほとんどすべてのＩＧＦはＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦＢＰ−３およびacid labile subunit(ＡＬＳ)と呼ばれるより大きなタンパク質サブユニットから成る、非共有結合的に会合する三元複合体で血中に存在する。ＩＧＦ−Ｉ/ＩＧＦＢＰ−３/ＡＬＳ三元複合体は三成分それぞれの等モル量で構成される。ＡＬＳは直接ＩＧＦに結合する活性はなく、ＩＧＦ−Ｉ/ＩＧＦＢＰ−３の二元複合体とのみ結合するようである。ＩＧＦ−Ｉ/ＩＧＦＢＰ−３/ＡＬＳ三元複合体は分子量約１５０Ｋｄである。この三元複合体は “遊離型ＩＧＦの濃度の急速な変化を防ぐためのＩＧＦ−Ｉの貯蔵場所およびバッファーとして”血中で機能すると考えられている。(Blum et al., pp.381-393, Modern Concepts In Insulin-Like Growth Factors(E.M.Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991) )。
【００１４】
ＩＧＦＢＰ−３は循環系に最も多量に存在するＩＧＦ結合タンパク質であるが、少なくとも５種の他の別個のＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）が様々な組織および体液中で同定されている。これらのタンパク質はＩＧＦと結合するが、これらは各々別の遺伝子を起源とし、独自のアミノ酸配列を有する。したがって当該結合タンパク質は単なる共通の前駆体の類似体または誘導体ではない。
【００１５】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質、例えばＩＧＦＢＰ−３は天然の素材から精製するか、または組み換え手段により生成することができる。例えばヒト血清からのＩＧＦ−Ｉの精製は当該技術分野で公知である(Rinderknecht et al.(1976)Proc. Natl.Acad.Sci. USA 73: 2365-2369)。組み換え法によるＩＧＦ−Ｉの生成は１９８４年１２月に発行されたＥＰ ０ １２８ ７３３に示されている。ＩＧＦＢＰ−３は天然の原料から、例えばBaxterらにより示された方法(1986, Biochem.Biophys.Res.Comm. 139: 1256-1261 )を用いて精製することができる。あるいはＩＧＦＢＰ−３はSommerらによりModern Concepts Of Insulin -Like Growth Factors, pp.715-728(E. M. Spencer, ed., Elsevier, New York, 1991)に述べられたように、組み換えにより合成することができる。組み換えＩＧＦＢＰ−３は１：１のモル比でＩＧＦ−Ｉと結合する。
【００１６】
未熟児合併症の理解が深められているにもかかわらず、未熟による罹患および死亡が非常に広く認められるように、現在、利用可能な有効な治療またはこれらの生命を脅かす症状を発症するリスクを決定する方法はない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
本発明のひとつの側面において、在胎４０週前または患児の在胎週数の平均体重より１０％以上少ない体重で生まれた患児における、早産による合併症の発症リスクを決定する方法を提供する。当方法は、ＩＧＦ−Ｉおよび/またはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質の血清レベルを同患児の出生後に測定して、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質のレベルを得ること；および前記ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質レベルを、同じ在胎週数の子宮内での平均レベルに基づくＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質の子宮内ベースラインレベルと相関させることを含み、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質のレベルが子宮内在胎週数平均レベル以下の場合は、同患児の早産による合併症を発症するリスクの増加を示すものとする。早産による合併症は未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、および脳室内出血を含む。
【００１８】
本発明のもう１つの側面において、早産による合併症の患児を治療する方法、または患児が早産による合併症を発症することを予防する方法を提供する。当方法は、子宮内の基準以下の血清レベルのＩＧＦ−Ｉの患児に、有効量のＩＧＦ−Ｉ、その類似体、またはそのアゴニストを投与し、同患児のＩＧＦ−Ｉレベルを子宮内ベースラインレベルまで増加させることを含む。子宮内ベースラインレベルとして好ましくは１０μｇ/Ｌから１５０μｇ/Ｌまでの濃度まで増加させる。本発明の１つの態様においてＩＧＦ−Ｉまたはその類似体を、ＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせて投与する。好ましい態様において、ＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質はＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）である。ＩＧＦ−Ｉまたはその類似体（ＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質と共にまたは伴わずに）またはそのアゴニストは、皮下、静脈内、筋肉内、または経口投与する。経口投与が好ましい。
【００１９】
本発明のなおもう１つの側面において、早産による合併症の治療用薬剤の製造におけるＩＧＦ−Ｉ、その類似体、またはそのアゴニストの使用を提供する。
最後に包装材および同包装材に内包される医薬剤を含む製造品もまた提供する。包装材は、早産に伴う合併症の治療および/または予防するため、同医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含む。同医薬剤はＩＧＦ−Ｉまたはその類似体、またはそのアゴニストを、医薬的に受容可能な担体と共に含む。
【００２０】
本発明をその好ましい限定された態様と関連させて述べてきたが、先の記述ならびに以下の実施例は本発明を説明するためであり、その範囲を限定する意図はないことは理解されるであろう。本発明の範囲に含まれるその他の側面、利点および修飾は、本発明に関連する当該技術分野の技術者には明らかであろう。
【００２１】
詳細な説明
マウスモデルでインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）が正常な網膜血管の発達に必要であることを示した。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞内のＶＥＧＦの生存シグナルを抑制する：臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。また以下の実施例＃２を参照のこと。未熟児網膜症（ＲＯＰ）は、網膜の血管の成長が子宮内での発達から遅れる、異常な網膜の発達に関連する。未熟児の血清ＩＧＦ−Ｉレベルを、出生（最終月経後週数２４から３２週）から退院まで毎週測定するプロスペクティブ時系列研究を行った。新生児はＲＯＰおよびその他の未熟による罹患：気管支肺形成不全（ＢＰＤ）、脳室内出血（ＩＶＨ）および壊死性腸炎（ＮＥＣ）について評価した。早産後の持続的に低い血清ＩＧＦ−Ｉレベルが未熟児合併症、例えばＲＯＰに関与することを発見した。これより早産に伴うリスクを決定する方法および合併症を治療する方法を発明した。
【００２２】
妊娠第３期に胎児のＩＧＦ−Ｉは子宮内で急速に増加し、この増加が胎児の組織の発達に関与する。Gluckman PD, Harding JE、子宮内成長遅滞の生理学および病理生理学、Hormon Research 1997; 48: 11-6 を参照のこと。早産後のＩＧＦ−Ｉレベルは、最終月経後週数、特に第３期に相当する最終月経後週数の等しい胎児の子宮内レベルより低い。Lineham JD, Smith RM, Dahlenburg GW, et al.、未熟な新生児および満期産新生児における循環インスリン様成長因子Ｉレベルの時系列的追跡、Early Hum Dev 1986; 13: 37-46 を参照のこと。ＩＧＦ−Ｉ-/-マウスでは、ＩＧＦ−Ｉの非存在が正常な網膜の血管の成長を阻害する。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞内でのＶＥＧＦの生存シグナルを抑制する：臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。ＲＯＰを発症する未熟な新生児では、正常な網膜の血管の成長の休止が増殖性の網膜症を引き起こす。未熟な乳児においてＲＯＰおよび他の生後罹患は、一部の未熟児が子宮内で正常に認められる血清ＩＧＦ−Ｉレベルに匹敵するレベルを獲得することのできないことによる、異常な組織の成熟の結果である可能性があるとの仮説を立てた。
【００２３】
ＩＧＦ−Ｉが最終月経後週数３３週で３０μｇ/Ｌ以下の場合、ＲＯＰおよびその他の罹患の相対的リスクは５．７倍（９５％信頼区間２．２−１４．６）に増加した。最終月経後週数調整後、最終月経後週数３１−３５週中の平均ＩＧＦ−Ｉを各々５μｇ/Ｌ増加するとＲＯＰのリスクは５９％までに低下した。在胎３１−３５週でのＩＧＦ−Ｉレベルの中央値は、生後罹患を伴わない群（ｎ＝２９）の３８μｇ/Ｌ（範囲２０−５９）に比較して、ＲＯＰおよび他の罹患を伴う新生児（ｎ＝１９）では２６μｇ/Ｌ（範囲１７−４９）であった、ｐ＜０．０００１。
【００２４】
ＲＯＰおよび他の生後罹患（ＢＰＤ、ＩＶＨおよびＮＥＣ）を発症する未熟児は、ＲＯＰおよび他の合併症を伴わない新生児と比較して生後のＩＧＦ−Ｉ血清レベルが低い。ＲＯＰの新生児のＩＧＦ−Ｉ血清レベルは、在胎３１−３６週中の緩やかな比較的直線的な上昇を示した。反対にＲＯＰまたは他の生後罹患を伴わない新生児では、ＩＧＦ−Ｉの血清レベルは異なるパターンを有する傾向があり、より急速に増加し、在胎３１−３５週に相当する週数でＩＧＦ−Ｉの最大値となる、子宮内で観察された値に近いレベルに達していた（図２）。したがって血清ＩＧＦ−Ｉレベルから早産による合併症、例えばＲＯＰを予測することができる。未熟児それ自体（在胎週数または最終月経後週数および出生体重）が歴史的には明らかに最も強いＲＯＰのリスク因子であった。Simons BD, Flynn JT、未熟児網膜症および関連因子、International Ophthalmology Clinics 1999; 39: 29-48を参照のこと。しかし最終月経後３１−３５週でのＩＧＦ−Ｉレベルの平均が、ＲＯＰおよび他の未熟児合併症の予測因子として未熟児それ自体の程度（出生時の最終月経後週数）と同じ位重要であることを発見した。
【００２５】
罹患を伴わない未熟児で観察されたＩＧＦ−Ｉレベルのピークは、目、肺、腎臓および脳の重要な成熟が正常に起こる、子宮内での極めて重要な発達期間中に表れる。O'Rahilly R, Muller F. Human Embryology and Teratology New York: Wiley-Liss, 1996 を参照のこと。網膜の血管の成長を制御する上で、ＩＧＦ−Ｉが血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の作用に重要であることが最近実験的に示された。網膜の血管内皮細胞において、内皮細胞の生存および増殖に重要であるＭＡＰＫおよびＡｋｔ経路のＶＥＧＦによる最大の活性化に、最低レベルのＩＧＦ−Ｉが必要である。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞内でのＶＥＧＦの生存シグナルを抑制する：臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8、およびSmith LE, Shen W, Perruzzi C, et al.、インスリン様成長因子−１受容体による血管内皮成長因子依存性網膜新生血管形成の制御、Nature Medisine 1999; 5: 1390-5を参照のこと。Ａｋｔ経路のＶＥＧＦによる最大の活性化に必要なＩＧＦ−Ｉレベルは、ＲＯＰを発症しなかった未熟児で認められたレベルと等しい。網膜の血管の発達におけるＩＧＦ−Ｉ系の重要な役割は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ受容体の遺伝的欠損のある患児が網膜の血管分岐点の数が少ないことが発見された臨床研究(Hellstrom、個人的な観察)で支持された。このようにこれらの新生児で観察されたＩＧＦ−Ｉの血清レベルの低減は、未熟に伴う罹患の一部の原因となり得る。
【００２６】
羊水からの摂取も胎児にＩＧＦ−Ｉを提供できるが、胎児のＩＧＦ−Ｉは主に胎盤から得る。Bauer MK, Harding JE, Bassett NS, et al.、胎児の成長および胎盤機能、Molecular & Cellular Endocrinology 1998; 140: 115-20 を参照のこと。いくつかの研究は、子宮内において臍帯のＩＧＦ−Ｉレベルが、同じ最終月経後週数の未熟児の生後の血清レベルより高いことを示した。Lineham JD, Smith RM, Dahlenburg GW, et al.、未熟児および満期産新生児における循環インスリン様成長因子Ｉレベルの時系列的追跡、Early Hum Dev 1986; 13: 37-46 を参照のこと。未熟児において胃小腸の発達は出生時に十分に完了されておらず、したがって経腸的な栄養摂取には耐えられない可能性がある。ＩＧＦ−Ｉは栄養摂取依存性因子であるため、一部の未熟児で見出される低い血清レベルは一般的な栄養摂取の不足で説明することができる。Smith WJ, Underwood LE, Keyes L, Clemmons DR、未熟児の栄養摂取をモニターするためのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）およびＩＧＦ−結合タンパク質の測定の使用、J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 3982-8 を参照のこと。しかしヒツジ胎仔において、経腸的ＩＧＦ−Ｉ投与が胃小腸の発達を高めることが示されたため、外因的ＩＧＦ−Ｉおよび適当な一般的な栄養摂取の併用が、早産後の最適な発達を得るために必要となり得る。Kimble RM, Breier BH, Gluckman PD, Harding JE、食道結さつしたヒツジの胎仔において経腸的なＩＧＦ−Ｉが胎子の成長および胃小腸の発達を高める、Journal of Endocrinology 1999; 162: 227-35を参照のこと。
【００２７】
定義
“早産の(preterm)”または“早産(preterm birth)”または“未熟児(prematurity)”は在胎４０週前または患児の在胎週数の平均体重より１０％以上少ない体重の患児の出生をいう。
【００２８】
“ＩＧＦ−Ｉ”はウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびヒト、好ましくはヒトを含むあらゆる種から、そして外因的投与を指す場合には天然、合成、または組み換えにかかわらずあらゆる原料から得られるインスリン様成長因子をいうが、ただしＩＧＦ−ＩはＩＧＦ結合タンパク質に適当な部位で結合するものとする。ＩＧＦ−Ｉは組み換えにより、例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ９５/０４０７６に記載されているように製造することができる。
【００２９】
“ＩＧＦＢＰ”または“ＩＧＦ結合タンパク質”はインスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーに含まれ、循環系に存在するかどうかにかかわりなく（すなわち血清中または組織中で）ＩＧＦ−Ｉと会合または結合または複合体化する、タンパク質またはポリペプチドをいう。前記結合タンパク質は受容体を含まない。本定義にはＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ−４、ＩＧＦＢＰ−５、ＩＧＦＢＰ−６、Ｍａｃ２５（ＩＧＦＢＰ−７）、およびプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）または内皮細胞に特異的な分子(endothelial cell-specific molecule)（ＥＳＭ−１）、ならびにＩＧＦＢＰ群と高い相同性のあるその他のタンパク質を含む。Ｍａｃ２５は例えばSwisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995)およびOh et al., J. Bio. Chem., 271: 30322-30325 (1996)に記載されている。ＰＳＦはYamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994)に記載されている。ＥＳＭ−１はLassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996)に記載されている。同定されているその他のＩＧＦＢＰについては、例えば１９９０年６月２７日に公開されたＥＰ３７５，４３８；１９９０年５月２３日に公開されたＥＰ３６９，９４３；１９８９年１０月５日に公開されたＷＯ８９/０９３６８；Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); １９８８年１２月７日に公開されたＥＰ２９４，０２１；Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); １９８９年９月２１日に公開されたＷＯ８９/０８６６７；１９８９年１０月１９日に公開されたＷＯ８９/０９７９２；およびBinkert et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989)を参照のこと。
【００３０】
“ＩＧＦＢＰ−３”はインスリン様成長因子結合タンパク質３である。ＩＧＦＢＰ−３はインスリン様成長因子結合タンパク質ファミリーのメンバーである。ＩＧＦＢＰ−３はウシ、ヒツジ、ブタおよびヒトを含むあらゆる種から、天然の配列または変異体の形（自然に発生する対立遺伝子の変異体を含むがこれに限定されない）で得ることができる。ＩＧＦＢＰ−３は、天然、合成または組み換えであるかどうかにかかわらず、あらゆる原料から得られるが、ただし適当な部位でＩＧＦ−Ｉと結合するものとする。ＩＧＦＢＰ−３は組み換えにより、例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ９５/０４０７６に記載されているように製造することができる。
【００３１】
当明細書で使用される場合“治療組成物”は、ＩＧＦ−Ｉ、その類似体、またはその結合タンパク質、ＩＧＦＢＰ−３と組み合わせてのＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ/ＩＧＦＢＰ−３複合体）を含むものと定義する。治療組成物はまた他の物質、例えば水、ミネラル、担体例えばタンパク質、および当該技術分野の技術者に公知のその他の添加物も含むことができる。
【００３２】
ＩＧＦ−Ｉの“類似体”は、ヒトまたは動物においてＩＧＦ−Ｉと同じ治療効果を有する化合物である。これらは自然に発生するＩＧＦ−Ｉ類似体（例えばtruncated（切断された）ＩＧＦ−Ｉ）またはＩＧＦ−Ｉのあらゆる公知の合成類似体も存在し得る。例えばＩＧＦ−Ｉ類似体化合物に関しては米国特許第５，４７３，０５４号を参照のこと。
【００３３】
ＩＧＦ−Ｉの“アゴニスト”は、哺乳類および特にヒトのＩＧＦ、特にＩＧＦ−Ｉの血清レベルおよび組織レベルを増加させることのできる、ペプチドを含む化合物である。例えばＩＧＦアゴニスト分子に関しては米国特許第６，２５１，８６５号を参照のこと。
【００３４】
当明細書で使用される場合“発達遅滞”は、発達の評価指標を達成する精神的な進歩が遅くなる可能性がある、異常な神経発生を意味するものとする。発達遅滞は症例によっては脳波で決定することができる。
【００３５】
本発明は１つの側面において、在胎４０週前または患児の在胎週数の平均体重より１０％以上少ない体重で生まれた同患児における、早産による合併症の発症リスクを決定する方法を提供する。当方法は、血清ＩＧＦ−Ｉおよび/またはＩＧＦ結合タンパク質レベルを同患児の出生後に測定して、ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質のレベルを得ること；および前記ＩＧＦ−Ｉ、またはＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質のレベルを、子宮内での同じ在胎週数の平均レベルに基づくＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質の子宮内ベースラインレベルと相関させることを含み、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質のレベルが、子宮内在胎週数平均レベル以下の場合は、同患児は早産による合併症を発症するリスクが増加していることを示すものとする。本発明の方法に適する早産による合併症は、未熟児網膜症、発達遅滞、精神遅滞、気管支肺形成不全、壊死性腸炎および脳室内出血を含む。
【００３６】
ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質のレベルはまた、抗体を用いる方法、いわゆるリガンド仲介免疫機能法(ligand-mediated immunofunctional method)（ＬＩＦＡ）により測定することもできる。この方法は米国特許第５，５９３，８４４号に開示されており、同アッセイに使用できる抗体および他の物質および条件に関する同特許の開示を参照として援用する。
【００３７】
適切な市販の入手可能なＩＧＦ抗体は、Biogenesis Ltd., Poole, Dorset, UKのNo.5345-0329および5345-0209; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USAのGF006; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USAのSC-7144およびSC-1422;およびHarlan Sera-Lab Ltd., Loughborough, Leicestershire, UKのMAS974p を含む。
【００３８】
本発明のもう１つの側面において、早産による合併症の患児を治療する方法、または早産による合併症を患児が発症することを予防する方法を提供する。当該方法は、子宮内の基準以下の血清ＩＧＦ−Ｉレベルの患児に、有効量のＩＧＦ−Ｉまたはその類似体、またはそのアゴニストを投与して、患児のＩＧＦ−Ｉレベルを子宮内ベースラインレベルまで上昇させることを含む。子宮内ベースラインレベルとして好ましくは１０μｇ/Ｌから１５０μｇ/Ｌの濃度まで上昇させるものとする。本発明の１つの態様において、ＩＧＦ−Ｉまたはその類似体はＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせて投与する。好ましい態様において、ＩＧＦ−Ｉと結合することのできるＩＧＦ結合タンパク質はＩＧＦ−Ｉ結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）である。ＩＧＦ−Ｉまたはその類似体またはそのアゴニストは、皮下、筋肉内、静脈内、または経口投与することができる。経口投与が好ましい。
【００３９】
本発明の方法は、未熟児合併症を有効に予防し正常な血管の発達を促進するため、生後直ちに開始することが好ましい。これはＲＯＰの治療に極めて重要である、というのは同疾患の過程におけるＩＧＦ−Ｉの増加の遅れが血管新生の遅れ、ＲＯＰの破壊的な段階を促進し得るからである。O'Rahilly R, Muller F. Human Embryology and Teratology. New York: Wiley-Liss, 1996およびSmith LE, Kopchick JJ, Chen W, et al.、虚血誘導性の網膜新生血管形成における成長ホルモンの本質的な役割、Science 1997; 276: 1706-9を参照のこと。血管新生されない網膜が低酸素をきたした後まで治療が遅れると、網膜の異常な新生血管形成を引き起こすことになる。
【００４０】
ＩＧＦ−Ｉもしくはその類似体もしくはそのアゴニスト、またはＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせてのＩＧＦ−Ｉもしくはその類似体の投与は、ＩＧＦ−Ｉの循環レベルを増加させることができる。したがってＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ結合タンパク質と組み合わせてのＩＧＦ−Ｉの投与は、低レベルの循環ＩＧＦ−Ｉに伴う症候、障害、および症状の治療または予防に有用である。
【００４１】
当該明細書で開示した本発明の方法は、ＩＧＦ−Ｉ、その類似体もしくはそのアゴニスト、またはＩＧＦ結合タンパク質と組み合せたＩＧＦ−Ｉもしくはその類似体の複合体の、このような治療を必要とする新生児への非経口および経口投与を提供する。非経口投与は、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻腔内、および吸気ルートを含むが、これに限定されない。本発明の方法においてＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニストまたはその類似体は、好ましくは経口投与する。ＩＶ、ＩＭ、ＳＣおよびＩＰ投与はボーラスでまたは注射により行うことができ、除放性埋め込み式の装置（ポンプ、除放性製剤、および機械的な装置を含むがこれに限定されない）により投与することもできる。製剤、ルートおよび投与法、および投与量は、治療する障害および患児の既往に依存することになる。一般には皮下注投与の用量は、静注または筋注投与する治療的に等価の用量より多くなる。好ましくは投与するＩＧＦ−Ｉまたはその類似体の用量は、体重あたり約２５μｇ/ｋｇから約２ｍｇ/ｋｇである。より好ましくはＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体の用量は約５０μｇ/ｋｇから約１ｍｇ/ｋｇである。
【００４２】
等モル量のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ結合タンパク質を含む組成物を使用することができる。好ましくはＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ結合タンパク質は投与前に複合体化させる。好ましくはこの複合体は、生理学的に適合する担体、例えば通常の生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水に溶かした、ほぼ等モル量のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ結合タンパク質を混合することにより形成させる。より好ましくは組み換えヒトＩＧＦ−Ｉ濃縮液および組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質濃縮液を十分に時間をかけて混合し、当モル比の複合体を形成させる。最も好ましくは国際特許出願第ＷＯ９６/４０７３６号に記載されているように、組み換えヒトＩＧＦ−Ｉおよび組み換えヒトＩＧＦ結合タンパク質を結合させて精製中に複合体を形成させる。
【００４３】
非経口または経口投与用には複合体の組成物は半固体または液体の製剤、例えば液体、懸濁液等とすることができる。生理学的に適合する担体は、使用する投与量および濃度でレシピエントに毒性のない、そして製剤中の他の成分と適合するものである。例えば製剤は好ましくは、ポリペプチドに有毒であることが知られている酸化剤および他の化合物を含まない。したがって生理学的に適合する担体は、通常の生理食塩水、血清アルブミン、５％デキストロース、血漿製剤、および他のタンパク質含有溶液を含むがこれに限定されない。任意に同担体はまた界面活性剤または表面活性物質を含んでもよい。
【００４４】
本発明のなおもうひとつの側面において 早産による合併症を治療するための治療組成物の製造における、ＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニスト、またはその類似体の使用を提供する。
最後に包装材および同包装材に内包される医薬剤を含む製造品もまた提供する。包装材には、早産に伴う合併症を治療および/または予防するため、医薬剤を十分な期間有効な用量で投与できることを示すラベルを含む。同医薬剤はＩＧＦ−Ｉ、そのアゴニストまたはその類似体を、医薬的に受容可能な担体と共に含む。
【００４５】
治療への適用としてＩＧＦ−Ｉまたはその類似体を単独で、または１つまたはそれ以上の受容可能なその担体および任意に他の治療成分と共にＩＧＦ−Ｉまたはその類似体を含む医薬組成物の一部として、患児に適切に投与することができる。担体は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに有害ではないという意味で“受容可能”でなければならない。
【００４６】
本発明の医薬組成物は経口、経鼻、局所（頬からおよび舌下を含む）、または非経口（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与に適するものを含む。製剤は簡便なようにユニット投与の形、例えば錠剤および持続的に放出するカプセル、およびリポソーム中にて提供することができ、薬学分野で公知のあらゆる方法で製造することができる。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA (17th ed. 1985)を参照のこと。
【００４７】
このような製造法には投与される成分である分子、例えば１つまたはそれ以上の補助的成分からなる担体と会合させるステップを含む。一般に組成物は活性成分を液体の担体、リポソーム、もしくは微細に粉砕された固体の担体またはその双方と均一および密接に会合させることにより製造し、その後必要なであれば生成物を成形する。
【００４８】
経口投与に適する本発明の組成物は、個別のユニット、例えば予め決定された量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、カシェ剤もしくは錠剤として；粉末もしくは顆粒として；水溶性の液体もしくは非水溶性の液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油滴型エマルジョンもしくは油中水滴型エマルジョンとして、もしくはリポソーム中に封入およびボーラスとして、等で提供することができる。
【００４９】
錠剤は、所望により１つまたはそれ以上の補助的成分と共に圧縮または成型して、製造することができる。圧縮錠剤は浮遊する形の活性成分、例えば粉末または顆粒を、所望により結合剤、滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合して、適切な機械で圧縮することにより製造することができる。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末状の化合物の混合物を適切な機械で成型することにより製造することができる。錠剤は所望により被覆したり刻み目をつけてもよく、また錠剤中の活性成分を徐放性または制御放出性であるように製剤化することもできる。
【００５０】
局所投与に適する組成物は、香味性のベース、通常スクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に成分を含むロゼンジ(lozenge)；および不活性なベース、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアラビアゴム中に活性成分を含むトローチを含む。
【００５１】
非経口投与に適する組成物は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶媒を含むことのできる、水性および非水性の殺菌注射溶液；および懸濁剤および増粘剤を含むことのできる水性および非水性の殺菌懸濁液を含む。製剤は、ユニット用量または複数ユニット用量を含む容器、例えば封入アンプルおよびバイアルにて提供することができ、使用直前に殺菌した液体の担体、例えば注射用の水を添加するだけでよい凍結乾燥の状態で保存することができる。殺菌された粉末、顆粒および錠剤から即席の注射溶液および懸濁液を調製することができる。
【００５２】
本発明を例示することを目的とする以下の実施例により、本発明の特徴をさらに明らかにする。
【実施例】
【００５３】
実施例１
試験の被験者
対象となり得るすべての患児は、出生時の最終月経後週数を基準としてＲＯＰおよび他の罹患を発症するリスクが高いものとした。GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalにて１９９９年１２月から２００１年５月までの間に最終月経後週数３２週未満で生まれたすべての新生児を、本試験の対象となり得るものとした。除外基準は、生後の臨床的な追跡を最終月経後４０週に相当する週数まで完了することができないこと、およびあらゆる顕著な先天的奇形とした。
【００５４】
GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalで１９９９年１２月から２００１年５月までの間に９９例の対象となり得る乳児が生まれた。４８例の新生児は研究開始時までに調査者が両親に連絡を取ることができなかったため除外された（図１）。除外された小児の出生時の最終月経後週数の平均は３０週だった；この群には出生時最終月経後週数２７週未満の小児は含まれていなかった。５１例の新生児が本試験に参加可能であると同定された。これら５１例の患児すべての両親からその小児の本研究への参加の承認を得た。データ集積完了後、１例の新生児の両親によりデータ公表の承認が撤回され、結果的に除外された。生後最初の２０日間に２例の新生児が死亡した。
【００５５】
出生時最終月経後週数の中央値２７．０週（範囲２４．０−３１．８週）の６組の双生児を含む総計４８例の乳児が含まれた。すべての小児は新生児集中治療室に入院した。出生時在胎週数は、最終月経後１６週に行った胎児の超音波に基づいた。２７例の小児は先に報告された横断的ＩＧＦ−Ｉ値およびＲＯＰに関する研究に含まれていた。Hellstrom A, Perruzzi C, Ju M, et al.、低レベルのＩＧＦ−Ｉは網膜内皮細胞内のＶＥＧＦ生存シグナルを抑制する：臨床の未熟児網膜症との直接の相関、Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 5804-8を参照のこと。
【００５６】
栄養摂取
すべての新生児は新生児科の未熟児に関するルーチーンにしたがって栄養摂取を行った。ヒト/母乳を増量しながら経口授乳を生後１日または２日の間に導入した。生後３日目に、予定された２４時間の必要量の少なくとも半量の経口授乳に小児が耐えられなかった場合には、非経口栄養摂取を導入した。出生体重１５００グラム以下の小児に与える母乳には、生後１０日から新生児の体重が２０００グラムになるまで、１００ｍｌ母乳あたり０．８ｇプロテインを強化した（１週間かけて漸次導入した）。
【００５７】
ＩＧＦ−Ｉの分析
ＲＯＰの状態を知らせずに、誕生から新生児の退院まで毎週静脈血サンプル（０．５ｍｌ）を採血し、−２０から−８０℃で保存した。各乳児の血液サンプルはすべて同時に分析した。血清を１：５０に希釈し、ＩＧＦＢＰを遮断したＲＩＡにより、抽出を行わずに〜２５０倍の過剰ＩＧＦ−ＩＩ(Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany)の存在下で、ＩＧＦ−Ｉの測定を二つ組で行った。Blum WF, Breier BH、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰのためのラジオイムノアッセイ、Growth Regulation 1994; 4:11-9を参照のこと。１０．２μｇ/Ｌおよび３４．５μｇ/Ｌのアッセイ内変動係数（ＣＶ）は各々１５．７％および９．６％であった。１０．２μｇ/Ｌおよび３４．５μｇ/Ｌのアッセイ間ＣＶは各々２３．９％および１２．１％であった。
【００５８】
ＩＧＦＢＰ−３の分析
血清ＩＧＦＢＰ−３の本来の濃度を１：３００に希釈し、二つ組で測定し、ＲＩＡを用いて決定した。Blum WF, Breier BH、ＩＧＦおよびＩＧＦＢＰのためのラジオイムノアッセイ、Growth Regulation 1994; 4:11-9を参照のこと。１７７３ｎｇ/ｍｌのアッセイ内およびアッセイ間ＣＶは、各々６．１％および１０．６％であった。
【００５９】
罹患の評価
ＲＯＰはthe International Classification(著者不明、An International classification of retinopathy of prematurity（未熟児網膜症の国際的分類）an international committee（国際委員会）作成、British Journal of Ophthalmology 1984; 68: 690-7) にしたがって分類し、ステージ１（境界線）、ステージ２（隆線）、ステージ３（網膜外線維性血管の増殖を伴う隆線）、ステージ４（大半の網膜剥離）、およびステージ５（全網膜剥離）にさらに分割した。後部網膜の血管が拡張しているときは疾患“プラス”とした。本研究の目的に関しては、ＲＯＰをこの疾患のステージ１より高いあらゆるステージの存在と定義した。ＲＯＰの重症度はその最も進行したステージで分類した。ＲＯＰを発症していない、またはステージ１のＲＯＰの場合は、暦年齢５から６週から眼球が十分に血管新生されるまで、散瞳しての眼底検査を含むルーチーンのプロトコルにしたがって新生児の検査を行った。ＲＯＰステージ２またはそれ以上と診断された場合は、治療の有無にかかわらず症状が安定したと考えられるまで、疾患の重症度により週に１回または２回検査を行った。新生児の目は１％シクロジル(cyclogyl)で散瞳した後、間接的な検眼鏡検査により検査した。検査中は疼痛およびストレスを最小にするようにケアを行った。
【００６０】
他の罹患の評価
気管支肺形成不全（ＢＰＤ）の診断は、一連の胸部Ｘ線によるＢＰＤの典型的な所見、および在胎３６週での酸素補給の必要性に基づいた。Shenman AT, Dumn MS, Ohlsson A, Lennox K, Hoskins EM、未熟児における異常な肺の結果：新生児期の酸素の必要性からの予測、Pediatrics 1988; 82: 527-32を参照のこと。脳室内出血（ＩＶＨ）（グレード２−４；周産期の脳の超音波による診断(Burstein J, Papile LA, Burstein R、未熟児における脳室内出血および水頭症：ＣＴによるプロスペクティブな試験、AJR. American Journal of Roentgenology 1979; 132: 631-5)）および手術にいたる腸穿孔を伴う壊死性腸炎（ＮＥＣ）については各小児のカルテもまとめた。
【００６１】
統計分析
ＲＯＰステージ０−１の小児とＲＯＰステージ２−３の小児との比較において、ＩＧＦ−Ｉ＞３０μｇ/Ｌに達するまでにかかる生後からの時間、および最終月経後３１−３５週でのＩＧＦ−Ｉの測定の平均レベルを、Wilcoxon-Mann-WhitneyのＵ検定により分析した。重ロジスチック回帰分析をＲＯＰ8について行った。モデルの可能な説明変数は、最終月経後周数または在胎週数（ＧＡ）、出生時体重（ＢＷ）および最終月経後３１−３５週中の各小児のＩＧＦ−Ｉ平均レベルとした。使用したモデルはロジット（ＲＯＰステージ＞１＝１、その他ＲＯＰ＝０）＝α＋β1×ＧＡ（週）＋β2×３１−３５週の平均ＩＧＦ−Ｉ（μｇ/Ｌ）とした。各小児の時系列的血清ＩＧＦ−ＩレベルはＩＧＦ−Ｉパターンの評価で使用した。
【００６２】
生後罹患は、罹患していない（ＲＯＰステージ０−１、ＢＰＤなし、ＩＶＨステージ０−１、およびＮＥＣなし）または生後罹患（ＲＯＰステージ２−４、ＢＰＤ、ＩＶＨステージ２−４、またはＮＥＣ）に二分した。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
【００６３】
参加した新生児のデモグラフィックス
ＲＯＰを発症しない新生児（ｎ＝３１）と比較したＲＯＰの新生児（ｎ＝１７）のベースラインの特徴は、ＲＯＰの小児は在胎週数がより早く出生時体重がより低いことを示した（表１）。
【００６４】
ＩＧＦ−ＩおよびＲＯＰおよびその他の周産期罹患
４８例の新生児の１９例が早産に伴う生後罹患（ＲＯＰ、ＩＶＨ、ＢＰＤまたはＮＥＣ）があった。罹患した新生児１９例のうち１７例はＲＯＰを発症し、ＲＯＰの１７例のうち１３例はさらに他に罹患していた。総計１１例がＢＰＤ、４例が手術にいたるＮＥＣ、そして４例がＩＶＨであった。２例の小児だけがＲＯＰをさらに伴わない生後罹患（ＩＶＨ）であった（表２）。ＲＯＰを発症しないまたは最小のＲＯＰの未熟児では、ＲＯＰ群と比較して異なる時系列的ＩＧＦ−Ｉパターンが見出された（図２。ＲＯＰステージ０−１の未熟児（ｎ＝３１）は、在胎週数３１−３５週にＩＧＦ−Ｉレベルのピークが認められたが、一方ＲＯＰステージ２−３の未熟児（ｎ＝１７）は、ピークは認められずＩＧＦ−Ｉレベルは緩やかに上昇した（図２）。生後からＩＧＦ−Ｉが３０μｇ/Ｌに達するまでの期間の中央値は、ＲＯＰステージ２−３を発症した新生児（ｎ＝１７）の５９日（範囲１−１００日）に比較して、ＲＯＰステージ０−１（ｎ＝３１）の新生児では１６日（範囲０−５３日）であった、（Ｐ＜０．０００１）、図２。在胎３１−３５週でのＩＧＦ−Ｉレベルの中央値は、生後罹患のない群（ｎ＝２９）における３８μｇ/Ｌ（範囲２０−５９μｇ/Ｌ）に比較して、ＲＯＰまたは他の罹患を伴う新生児（ｎ＝１９）では２６μｇ/Ｌ（範囲１７−４９μｇ/Ｌ）であった、Ｐ＜０．０００１。在胎週数３３週で、ＲＯＰまたは他の罹患を伴う小児１９例のうち４例はＩＧＦ−Ｉ値が３０μｇ/Ｌ以上であり、一方１５例の小児はＩＧＦ−Ｉ値は３０μｇ/Ｌ以下であった。生後罹患のない２９例の小児のうち２５例の小児はＩＧＦ−Ｉ値が３０μｇ/Ｌ以上であり、一方４例の小児が３０μｇ/Ｌ以下であった、図３。したがって在胎３３週でＩＧＦ−Ｉが３０μｇ/Ｌ以下の未熟児は、ＲＯＰまたは他の生後罹患を発症する相対リスクが５．７（９５％信頼区間２．２−１４．６）であった。本試験の６組の双生児のうち、より重症の罹患を伴う１組は、最も低いＩＧＦ−Ｉ値を有していた（データは示さない）。
【００６５】
最終月経後週数および出生時体重と比較した平均ＩＧＦ−Ｉ
ＩＧＦ−Ｉおよび最終月経後ＧＡを含めた重回帰分析の結果は、ロジット（ＲＯＰステージ２−３）＝２３−０．１８（３１−３５週の平均ＩＧＦ−Ｉμｇ/Ｌ）−０．６５（ＧＡ/週）であった。最終月経後３１−３５週中の平均ＩＧＦ−Ｉの５μｇ/Ｌ増加に伴うＲＯＰの相対リスクは、最終月経後週数を調製するとｅ-0.9＝０．４１であった。したがって最終月経後３１−３５週中の平均ＩＧＦ−Ｉの５μｇ/Ｌ増加により、ＲＯＰステージ２−３のリスクは５９％まで低減されたが、在胎週数を１週増加するとリスクは４８％までの減少にとどまった（図４）。ＩＧＦ−ＩおよびＢＷを含めた重回帰分析の結果は、ロジット（ＲＯＰステージ２−３）＝１０−０．１６（３１−３５週の平均ＩＧＦ−Ｉμｇ/Ｌ）−０．６２（ＢＷ/１００グラム）であった。
【００６６】
実施例２
ＩＧＦ−１ノックアウトマウスにおける血管の成長の測定
これらの研究はARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Researchに准ずる。ＩＧＦ−Ｉ null（欠損）マウス（ＩＧＦ−Ｉ-/-）は、mixed Ｃ５７/１２９ｓｖバックグラウンド上にヘテロのＩＧＦ−Ｉ−ｆｌｏｘ+/-（Ｌ/−）を持つマウスを同系交配させて作製した。Liu, J. L. & LeRoith, D. (1999) Endocrinology 140, 5178-84を参照のこと。この種は重篤な発達不全を伴う小型として生まれ、生まれた数頭のうち４０％しか生後生存することはできない。これらの同腹子、Ｌ/ＬまたはＬ/−は実質的に同一で正常である。尻尾のＤＮＡサンプルのＰＣＲによる遺伝子の増幅およびサザンブロット分析は、既に報告されている方法で行った。Liu, J. L., Grinberg, A., Westphal, H., Sauer, B., Accili, D., Karas, M., & LeRoith, D. (1998) Mol Endocrinol 12, 1452-62を参照のこと。生後５日で５頭のＩＧＦ１-/-および６頭のＩＧＦ１+/+同腹マウスをと殺し、眼球を摘出し、そのままＯＣＴ中で冷凍し、連続切片（８μｍ）を作製した。蛍光Griffonia Bandereiraea Simplicifolia Isolectin B4(Vector Laboratories, Burlingame, California) で染色した瞳孔、視神経および血管より３０切片を作製した。血管新生された網膜の長さは、視神経から神経節層表面に沿って血管の先端末までを測定し、視神経から鋸状縁までの網膜の全長さのパーセントで表わした。
【００６７】
網膜の平面状の標本 (Flat Mount)
５頭のＩＧＦ−１-/-および５頭のＩＧＦ−１+/+同腹コントロールマウスを、４％パラホルムアルデヒド中のフルオレセイン−デキストランで心臓内灌流の後、生後５日で眼球を摘出した。D'Amato,R., Wesolowski,E. & Smith,L.E. (1993) Microvasc Res 46, 135-42を参照のこと。網膜を単離し、グリセロール−ゼラチンで平面状の標本を作製し、蛍光顕微鏡で撮影した。ＶＥＧＦｍＲＮＡは標準的なプロトコルにより視覚化した。Pierce,E.A., Foley,E.D. & Smith,L.E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28を参照のこと。
【００６８】
レーザー捕獲マイクロダイセクション(Laser Capture Microdissection)
５頭のＩＧＦ−１-/-マウスおよび６頭のＩＧＦ−１+/+同腹コントロールマウス のＯＣＴ固定した眼球をクリオスタット内で８μｍ切片とし、コートしてないスライドグラスにのせた後、直ちに−８０℃に保存した。凍結切片をのせたスライドグラスを直ちに７０％エタノールで３０秒間固定し、ヘマトキシリン(Meyers)およびエオシン(H/E)で染色し、その後７０％、９５％および１００％エタノールで段階的に５秒間ずつ脱水し、最後にキシレンで１０分間脱水した。一度空気乾燥した後、網膜切片の前方の無血管の１/３を、ＲＰＥに汚染されないようにPixCell II LCMシステム(Arcturus Engineering, Mountain View, California)でマイクロダイセクションを行った。各母集団は、捉えた細胞を顕微鏡により視覚化して決定したところ、９５％以上“均一”であると推定された。４頭より多くのマウスからの４０切片の素材を合わせて、ＲＮＡを単離し、記載のようにｃＤＮＡに変換し、特異的なｃＤＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲにより定量した。
【００６９】
ＲＮＡ/ｃＤＮＡの単離
ＩＧＦ−１-/-およびコントロールのＩＧＦ−１+/+マウスのマイクロダイセクションした網膜をプールしたものから全ＲＮＡを単離した。Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J. & Rutter, W. J. (1979) Biochemistry 18, 5294-9を参照のこと。すべてのｃＤＮＡサンプルを一定分量取って−８０℃で保存した。cyclophillinと比較したＶＥＧＦ ｍＲＮＡをＩＧＦ−１-/-およびコントロールのＩＧＦ−１+/+の網膜について測定した。
【００７０】
ＶＥＧＦ発現の分析
ＶＥＧＦおよび２つの変化していないコントロール遺伝子（cyclophillinおよび１８ｓ）を標的とするＰＣＲプライマーを、Primer Express ソフトウェア(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut)を用いて設計し、合成した(Oligo Therapeutics, Wiosonville, Oregon)。ＰＣＲ反応中に生成された増副産物はゲルにより精製し、配列決定して所望の配列が選択されていることを確認した。遺伝子発現の定量分析はABI Prism 7700 Sequence Detection System(登録商標TaqMan)およびSYBR Green master mix kit(Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut) を用いて行った。ＶＥＧＦ：フォワードプライマー ５’−ＧＧＡＧＡＴＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＣＡＣＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、リバースプライマー ５’−ＧＧＣＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＡＴＡＡＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）；Cyclophillin：フォワードプライマー ５’−ＣＡＧＡＣＧＣＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴＴＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、リバースプライマー ５’−ＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＧＣＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）；１８ＳリボソームＲＮＡ：フォワードプライマー５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、リバースプライマー ５’−ＧＣＴＧＧＡＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）。
【００７１】
臨床試験
ＩＲＢの承認を得たプロトコルにおいて、GoteborgのThe Queen Silvia Children's Hospitalにて１９９９年１２月１５日および２０００年３月１５日の間に生まれた、明らかな異常のない出生時在胎週数３２週未満のすべての小児に、本試験への参加を求めた。書面で同意を得て、生後から退院まで毎週０．５ｍｌの血液を採血した。血清ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦＢＰを遮断したＲＩＡにより、抽出を行わずに〜２５０倍の過剰ＩＧＦ−ＩＩ（Blum, W. F., Breier, B. H. (1994) Growth Regulation 4, 11-9）(Mediagnost GmbH, Tubingen, Germany)の存在下で測定を二つ組で行った。濃度５５、２１９および４７９μｇ/Ｌでのアッセイ内ＣＶは各々８．１、４．４および４．５％また濃度５５，２１９および４７９μｇ/Ｌでのアッセイ間ＣＶは各々１０．４、７．７、５．３％だった。
【００７２】
ＲＯＰ検査
間接的な検眼鏡を用いての散瞳による網膜検査を、年齢５から６週から網膜が十分に血管新生されるまで、または症状が安定したと考えられるまで、毎週または隔週で行った。プラス病（plus disease）および／またはステージ３ ＲＯＰの小児は寄り頻繁に検査を行った。ＲＯＰの変化はＲＯＰの国際分類にしたがって分類した。
【００７３】
網膜内皮細胞およびＡＫＴリン酸化の分析
ウシ網膜内皮細胞 (VEC Technologies, Rensselaer, New York) を用いた実験を４回行い、類似する結果が得られた。さらに先に記載されたように単離した別のウシ網膜内皮細胞の母集団でも類似した結果が得られた。Smith,L.E., Shen,W., Perruzzi,C., Soker,S., Kinose,F., Xu,X., Robinson,G., Driver,S., Bischoff,J., Zhang,B., Schaeffer,J.M. & Senger,D.R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。ＡＫＴリン酸化の分析のため、細胞を完全培養培地(MCDB-131 Complete)(VEC Technologies, Rensselaer, New York)中で、ウシコラーゲンタイプ１（５０μｇ／ｍｌ Vitrogen,(Cohesion Co., Palo Alto, California)）でコートした２４穴プレート上で集密になるまで培養した。集密状態において、細胞を２％ウシ胎児血清を含む内皮の基礎培地(EBM)(Clonetics, San Diego, California)に数日間移して、ＡＫＴのリン酸化のベースラインを低下させた。アッセイ当日無血清ＥＢＭに細胞を４時間移し、ベースラインをさらに低下させた後、記載のようにＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、またはその双方(R & D Systems, Minneapolis, Minnesota)により刺激した。細胞を電気泳動サンプルバッファーで溶解し、１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、記載されているように（同著書）電気ブロッティングを行った。ブロットはまた記載されているように（同著書）ホスホＡＫＴ抗体(Ser-473, Pharmingen, San Diego, California)、二次抗体、および化学発光基質で染色した。すべてのＡＫＴを視覚化するため、追試のブロッティングを行い、リン酸化ＡＫＴおよび非リン酸化ＡＫＴ双方と結合する抗体(H-136,Santa Cruz Biotechnology, San Diego, California)で染色した。
【００７４】
ＩＧＦ−１は正常な網膜の血管の成長に極めて重要である
ＩＧＦ−１は正常な網膜の血管の成長に極めて重要であり、そのためＲＯＰの発症に極めて重要である(Flyme, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthalmol 95, 217-23；およびPenn, J. S., Tolman, B. L. & Henry, M. M.(1994) Invest Ophthlmmol Vis Sci 35, 3429-35)かどうかを検査するため、ＩＧＦ−１-/-マウス（循環および局所双方のＩＧＦ−１を欠失している）およびその正常な同腹のコントロール（ＩＧＦ−１+/+）の網膜の血管を調べた。ＩＧＦ−Ｉの全身レベル（局所産生に対して）が網膜症に最も有意に寄与する。Spranger, J., Buhnen, J., Jansen, V., Krieg, M., Meyer-Schwickerath, R., Blum, W. F., Schatz, H. & Pfeiffer, A. F. H. (2000) Hormon & Metabolic Research 32, 196-200を参照のこと。
【００７５】
マウスを生後５日（Ｐ５）にＦＩＴＣデキストランで灌流し、眼球を摘出し、網膜を平面状の標本として横断的に調べた。正常なＩＧＦ−１レベルのＩＧＦ−１+/+コントロール（図１Ｂ）に比してＩＧＦ−１-/-マウス（図１Ａ）の眼球には、有意な血管の成長遅滞が認められた。生後５日の視神経から末梢までの血管の長さの割合は、ＩＧＦ−１-/-網膜では５８±４．８％に対してＩＧＦ−１+/+コントロールでは７０．３±５．８％で（Ｐ＜０．００１）、ＩＧＦ−１が正常な血管の発達に極めて重要であり、新生仔期の低レベルのＩＧＦ−１が血管の成長遅滞の原因となり得ることを示した。
【００７６】
ＶＥＧＦは正常な血管の発達における重要な因子であり、成長する血管の先端の前方に見出される。Pierce, E. A., Foley, E. D., & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28; Stone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47;および Alon, T., Hemo, I., Itin, A., Pe'er, J., Stone, J. & Keshet, E. (1995) Nature Medisine 1, 1024-8を参照のこと。血管は、ＶＥＧＦが血管新生されていない網膜が前方（生理学的には低酸素）に成熟していく時に誘発され、その後血管が酸素を供給するようになると後方で抑制されるというＶＥＧＦの同行に関連して成長する（図２Ａ）。ＶＥＧＦの阻害は血管の成長遅滞の原因となり得る。Aiello, L. P., Pierce, E. A., Foley, E. D., Takagi, H., Chen, H., Riddle, L., Ferrara, N., King, G. L. & Smith, L. E. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92, 10457-61; Robinson, G. S., Pierce, E. A., Rook, S. L., Foley, E., Webb, R. & Smith, L. E. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 4851-6; およびOzaki, H., Seo, M. S., Ozaki, K., Yamada, H., Yamada, E., Okamoto, N., Hofmann, F., Wood, J. M. & Campochiaro, P. A. (2000) American Journal of Pathology 156, 697-707を参照のこと。低レベルＩＧＦ−１の血管の成長阻害への効果がＶＥＧＦ不在によるのかどうかを検査するため、生後５日のＩＧＦ−１-/-およびコントロールＩＧＦ−１+/+網膜の血管前方の領域のレーザーマイクロダイセクションを横断的に行い、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＶＥＧＦｍＲＮＡを調べた（図２Ｂ）。ｑＲＴ−ＰＣＲによる測定では、ＩＧＦ−１-/-およびＩＧＦ−１+/+コントロールの網膜双方の血管の前方に、cyclophillinのコントロールに匹敵する量でＶＥＧＦｍＲＮＡが存在していた。したがって低レベルのＩＧＦ−１はＶＥＧＦの抑制を通して血管の成長を阻害してはいない。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang ,B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp,J ., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。ＩＧＦ−１による調節はＶＥＧＦの下流にあるか、または血管の発達におけるＶＥＧＦの作用を許容しているかのいずれかである。このデータはまた、ＩＧＦ−１不在下のＶＥＧＦは正常な網膜の血管の発達を刺激できないという仮説を支持する。
【００７７】
低レベルＩＧＦ−１の長期化は血管の成長の抑制および増殖性ＲＯＰの双方に関与する
生後長期間低レベルのＩＧＦ−１は、未熟児における血管の成長の消失とそれに続くＲＯＰに関与するとの仮説を調べるため、ＲＯＰのリスクの高い在胎週数２６から３０週で生まれたすべての未熟児（ｎ＝３１）に対して、生後毎週ＩＧＦ−１血漿レベルをプロスペクティブに測定し、対応して網膜の検査を行った。ＲＯＰステージ０−４は国際分類 (Flynn,J.T. (1985) Ophthalmology 92, 987-94)にしたがって定義し、本研究ではＲＯＰ２−５をＲＯＰ、ＲＯＰステージ０−１をＲＯＰ発症していないものと定義した。
【００７８】
我々は血管の成長の消失が増殖性ＲＯＰに関与することを初めて立証した。Flynn, J. T., O'Grady, G. E., Herrera, J., Kushner, B. J., Cantolino, S. & Milam, W. (1977) Arch Ophthalmol 95, 217-23を参照のこと。正常な未成熟な網膜は、半透明の血管新生されている網膜からグレーの血管新生されていない網膜へと、両者間に明確な境界を持たずに漸次移行する。ＲＯＰでは、血管新生されている網膜と血管新生されていない網膜との間に、線または隆線(ridge)から成るはっきり観察される固定された境界が認められるようになる。ＲＯＰのすべての患児（ｎ＝１０）に血管の見えない前方に区分線があった。ＲＯＰを発症しないすべての新生児（ｎ＝１９）には隆線または区分線がなく、血管先端のより正常な成長を示していた（データは示さない）。
【００７９】
出生からＩＧＦ−１が３０ｎｇ/ｍｌに達するまでの平均期間は、ＲＯＰを発症した新生児（ｎ＝１０）の５８日（範囲２９−１２０日）と比較して、ＲＯＰを発症しない新生児（ｎ＝１９）では１９日（範囲１−７９日）であり（Ｐは０．０００１以下）、低レベルＩＧＦ−１の長期化がＲＯＰに関与するとの仮説を立証した。ＩＧＦ−１は、より若い胎児では子宮内でより低レベルであり、そのため単純には在胎週数に関連するのであろう。しかし等しい在胎週数での平均ＩＧＦ−１レベルは、３４週における非ＲＯＰの４３ｎｇ/ｍｌ（範囲１１−５８）に対してＲＯＰの２５ｎｇ/ｍｌ（範囲２１−３５）の差で（Ｐ≦０．００２）、ＲＯＰを発症しなかった新生児よりＲＯＰを発症した新生児の方が一貫して低レベルであった。在胎週数３０−３５週中のＩＧＦ−Ｉ最大値は、ＲＯＰの小児（３８ｎｇ/ｍｌ（範囲２８−５４ｎｇ/ｍｌ））はＲＯＰのない小児（５２ｎｇ/ｍｌ（範囲２９−９０ｎｇ/ｍｌ））より有意に低かった、Ｐ＜０．０４。ＲＯＰを発症したすべての小児において、ＲＯＰの増殖段階の開始はＩＧＦ−１レベルが＞３０ｎｇ/ｍｌまでに増加する以前には起こらなかった。まとめるとＲＯＰの発症は長期間の低レベルＩＧＦ−１（＜３０ｎｇ/ｍｌ）に続いて、〜３４−３５在胎週に本研究のコホートにおける増殖性ＲＯＰ開始の平均である、“閾値”（＞３０ｎｇ/ｍｌ）まで上昇することに強く関連していた。早期により高いＩＧＦ−１レベルの新生児はより正常な血管の発達を遂げ、ＲＯＰを発症しなかった（図３）。
【００８０】
ＩＧＦ−１は網膜内皮細胞におけるＡＫＴの生存経路のＶＥＧＦ活性化を支援する
ＲＯＰの後半の段階は、初めの血管の成長の休止に続く、在胎〜３４週（新生児の生活週数にかかわりなく）での新生血管形成の突然の増殖を特徴とする。ＶＥＧＦによる網膜血管の内皮細胞の生存および増殖の制御をＩＧＦ−１が支援する効果があるため、ＩＧＦ−１が低レベルであることがＶＥＧＦに誘発される最大の内皮細胞機能を抑制すると仮定した。我々は先に、ＶＥＧＦによるＭＡＰＫ経路の最大の刺激にＩＧＦ−１が必要であり、細胞増殖に重要であることを示した。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。
【００８１】
細胞の生存はＲＯＰの双方の段階にもまた極めて重要であるが、十分な濃度のＶＥＧＦ(Cameliet, P., Lampugnani, M. G., Moons, L., Breviario, F., Compernolle, V., Bono, F., Balconi, G., Spagnuolo, R., Oostuyse, B., Dewerchin, M., Zanetti, A., Angellilo, A., Mattot, V., Nuyens, D., Lutgens, E., Clotman, F., de Ruiter, M. C., Gittenberger-de Groot, A., Poelmann, R., Lupu, F., Herbert, J. M., Collen, D. & Dejana, E. (1999) Cell 98, 147-57; Fujio, Y., & Walsh, K. (1999) Journal of Biological Chemistry 274, 16349-54; およびGerber, H. P., McMurtrey, A., Kowalski, J., Yan, M., Keyt, B. A., Dixit, V. & Ferrara, N. (1998) Journal of Biological Chemistry 273, 30336-43)またはＩＧＦ−１(Michell, B. J., Griffiths, J. E., Mitchelhill, K. I., Rodriguez-Crespo, I., Tiganis, T., Bozinovski, S., de Montellano, P. R., Kemp, B. E. & Pearson, R. B. (1999) Current Biology 9, 845-8)の刺激により内皮細胞内で達成することのできるＡＫＴ経路の活性化に関連している。しかしこれら２つのサイトカインがＡＫＴ活性化に相補的効果を及ぼす可能性については調べられていなかった。したがって網膜内皮細胞でのＶＥＧＦによるＡＫＴ活性化におけるＩＧＦ−１の効果を調べた。ＶＥＧＦ（１０ｎｇ/ｍｌ）およびＩＧＦ−１（５０ｎｇ/ｍｌ）は個々にＡＫＴリン酸化の中程度の増加（２．５倍）を刺激するが、双方を合わせて５倍の増加を刺激することを発見した（図４）。しかしＡＫＴリン酸化の刺激に対するＶＥＧＦおよびＩＧＦ−１の相補的作用は、ＩＧＦ−１が１０ｎｇ/ｍｌに減少すると観察されなかった。したがってこれらのデータは、新生児のより正常な生理学的血中濃度にほぼ等しい５０ｎｇ/ｍｌのＩＧＦ−１が、ＶＥＧＦと共に作用してＡＫＴを活性化し（セリン４７３のリン酸化により示された）、それにより網膜の内皮細胞の生存を支援することを示す。反対にＩＧＦ−１が、ＲＯＰを発症するような未熟児に認められる血清レベルに匹敵する１０ｎｇ/ｍｌに減少すると、このようなＶＥＧＦとの相補性は観察されない。結論としてこのような患児において、ＶＥＧＦが一定レベルで存在しているにもかかわらず、正常レベル以下のＩＧＦ−１がＡＫＴ活性化の低下および内皮細胞生存の低下をもたらすものと思われる。
【００８２】
考察
これらの研究はＩＧＦ−１が血管の成長に必要であることを示し、早産後の網膜の血管の成長の休止に始まるＲＯＰ疾患の過程を説明する。子宮内と生後との血管の成長の重大な相違は、未熟児では生後ＩＧＦ−１が低下することである。Lineham, J. D., Smith, R. M., Dahlenburg, G.W., King, R., Haslam, R. R., Stuart, M.C. & Faull, L. (1986) Early Hum Dev 13, 37-46 を参照のこと。
本発明の発見は、未熟児において生後直ちにＩＧＦ−１が増加すれば、正常に血管を発達させ、ＲＯＰは起こらないことを示唆する。
【００８３】
ＶＥＧＦは血管の発達に有意な役割を担うことが示されたが、低レベルのＩＧＦ−１の存在下では十分に血管を成長させることはできない。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D.R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5;およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp, J., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。発達に伴い代謝の要求が高まると、ますます低酸素化の無血管の網膜内でＶＥＧＦが産生され、硝子体中のＶＥＧＦレベルが上昇する。Aiello, L. P., Avery, R. L., Arrigg, P. G., Keyt, B. A. Jampel, H. D., Shah, S. T., Pasquale, L. R., Thieme, H., Iwamoto, M. A., Park, J. E. & et al. (1994) N Engl J Med 331, 1480-7;およびMiller, J. W., Adamis, A. P. & Aiello, L. P. (1997) Diabetes Metab Rev 13, 37-50を参照のこと。ＲＯＰを発症しない新生児で起こるように、生後より急速にＩＧＦ−１が上昇すれば、成熟していく網膜に酸素を提供し、ＶＥＧＦ産生を調整する血管の成長が進行するため、ＶＥＧＦは蓄積しない。Pierce, E. A., Foley, E. D., & Smith, L. E. (1996) Arch Ophthalmol 114, 1219-28;およびStone, J., Itin, A., Alon, T., Pe'er, J., Gnessin, H., Chan-Ling, T. & Keshet, E. (1995) J Neurosci 15, 4738-47を参照のこと。ＩＧＦ−１が長期間低レベルであると、血管の成長が止まり、成熟していく無血管の網膜は低酸素になりＶＥＧＦが硝子体に蓄積される。高レベルのＶＥＧＦが存在する状態でＩＧＦ−１が閾値まで上昇すると、新しい血管（網膜の新生血管形成）の急速な成長が引き起こされる（図５）。ＩＧＦ−１およびＶＥＧＦは、ＭＡＲＫおよびＡＫＴシグナル伝達経路を通して内皮細胞の機能に相補的に作用するため、この急速な血管の成長は血管内皮細胞の生存および増殖の亢進に基づくものと思われる。特に今回のデータは、ＶＥＧＦの最大の機能を促進するため、ＩＧＦ−１（およびおそらくその他のサイトカイン）が最低レベルで必要であることを示す。
【００８４】
本研究は、ＲＯＰの診断および治療への直接的な臨床的示唆を与えた。これらの発見は、どの乳児がＲＯＰを発症するかの予測に、ＩＧＦ−１レベルを使用することができることを示唆する。ＲＯＰを発症する患児と発症しない患児間のＩＧＦ−１レベルのパターンの相違は、生後早期の血清ＩＧＦ−１の増加がこの疾患を予防し得ることを示唆する。早産後、高レベルのＩＧＦ−１を含む羊水の摂取を含むＩＧＦ−１の可能な源泉が失われる。カロリー摂取の増加（１７）、羊水の摂取を模倣したＩＧＦ−１の経口摂取（３４）、またはＩＧＦ−１をより正常なレベルに上昇させるための静脈内への供給により、ＲＯＰを発症しない新生児に認められたレベルにまでＩＧＦ−１を増加させることができる。ＲＯＰは他の発達の問題にも相関するため、ＲＯＰを発症しない新生児のレベルにＩＧＦ−１レベルを増加させることはまた、神経学的発達 (Johnston, B. M., Mallard, E. C., Williams, C. E. & Gluckman, P. D. (1996) J Clin Invest 97, 300-8) および身体の成長(Kimble, R. M., Breier, B.H., Gluckman, P. D,. Harding, J. E. (1999)Journal of Endocrinology 162: 227-35)を改善することにもなる。
【００８５】
ＩＧＦ−１およびＶＥＧＦの双方はまた、ＲＯＰの第２段階または新生血管の段階でも重要である。著者不明、未熟児網膜症の国際的分類、国際委員会作成、British Journal of Ophthalmology 1984; 68: 690-7； Shennan AT, Dunn MS, Ohlsson A, Lennox K, Hoskins EM、未熟児における異常な肺の結果：新生児期の酸素の必要性からの予測、Pediatrics 1988; 82: 527-32; Burstein J, Papile LA, Burstein R、未熟児における脳室内出血および水頭症：ＣＴ.によるプロスペクティブな試験、AJR. American Journal of Roentgenology 1979; 132: 631-5; Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5;およびSmith, L. E., Kopchick, J. J., Chen, W., Knapp, J., Kinose, F., Daley, D., Foley, E., Smith, R. G. & Schaeffer, J. M. (1997) Science 276, 1706-9を参照のこと。ＩＧＦ−１は網膜の新生血管形成に極めて重要である。Smith, L. E., Shen, W., Perruzzi, C., Soker, S., Kinose, F., Xu, X., Robinson, G., Driver, S., Bischoff, J., Zhang, B., Schaeffer, J. M. & Senger, D. R. (1999) Nature Medicine 5, 1390-5を参照のこと。したがってＩＧＦ−１を増加させるための早期の介入が正常な血管を成長させ、ＲＯＰの第２の破壊的な段階の可能性への発展を予防すると予測したが、ＶＥＧＦ蓄積後での遅い介入は網膜の新生血管形成を引き起こし、または増悪させることになり得る。
【００８６】
本発明の精神および範疇から離れることなく、本発明を様々に修飾し多様化できることは、当該技術分野の技術者には明らかであろう。したがって本発明の修飾および多様化が、付記された請求項およびその均等範囲の範疇にある限り、本発明はそれらを包含するものとする。
【００８７】
当該出願を通して引用した参考文献を参照して援用する。
【００８８】
【表１】
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【００８９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００９０】
本明細書に援用しその一部を構成する添付の図は、図中の記述と共に本発明の態様を説明し、本発明の目的、利点、および原理を説明するものである。
【図１】図１は本発明の対象となる被件者を表わす。スキームは成長因子および生後罹患に関する試験に適した超未熟児９９例を示す。在胎週数＜２７週の小児はすべてこの群に含まれた。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、未熟児網膜症（ＲＯＰ）のない未熟児（図２Ａ）（ｎ＝３１）およびＲＯＰの未熟児（図２Ｂ）（ｎ＝１７）における、各患児のＩＧＦ−Ｉレベルの時系列的パターンを示す。グレーの領域は、臍帯穿刺（cordo centesis）の技術および本研究で使用したのと類似するＩＧＦ−Ｉアッセイ18によるＩＧＦ−Ｉ値の９０％信頼区間を示す。破線は１組の双生児の個々の時系列的ＩＧＦ−Ｉ値を示す。
【図３】図３は、周産期罹患のない小児２９例および周産期罹患の小児１９例における、在胎３３週の血清ＩＧＦ−Ｉレベルを示す。水平の線はＩＧＦ−Ｉ濃度３０μｇ/Ｌを示す。生後罹患のない２９例の小児のうち２５例が、しかし生後罹患の小児１９例では４例のみが３０μｇ/Ｌ以上の値であった。
【図４】図４は重ロジスティック回帰分析により推定される未熟児網膜症のリスクにおける、ＩＧＦ−Ｉ血清レベルおよび最終月経後ＧＡの相対的な影響を示す。出生時の最終月経後週数（２４−３２週）をグラフ内に示した。回帰分析は、出生時に最終月経後週数が２４週の場合は、３１−３５週でのＩＧＦ−Ｉ平均レベル４０μｇ/ＬでＲＯＰ発症のリスクが５０％（破線）になることを示す。しかし出生時に最終月経後周数が３２週の場合には、ＩＧＦ−Ｉレベル１２μｇ/ＬでＲＯＰ発症リスクが５０％になる。
【図５】図５ＡおよびＢは血管の成長におけるＩＧＦ−Ｉの阻害効果を示す。平面状にした全網膜の標本は、ＩＧＦ−Ｉ+/+同腹子コントロール（図５Ｂ）と比較してＩＧＦ−Ｉ-/-マウス（図５Ａ）は、血管の発達（明るい領域）の進行が遅いことを示す。
【図６】図６ＡおよびＢは、成長している血管の前方の網膜のレーザーマイクロダイセクションを示す。図６Ａでは、平面状にした網膜の標本で、成長している血管の前方にＶＥＧＦｍＲＮＡが視覚化されている。図６Ｂは、ＩＧＦ−Ｉ-/-マウスおよびコントロールＩＧＦ−Ｉ+/+の双方の網膜の断面について、ＶＥＧＦを含む領域（囲い部分）をレーザーマイクロダイセクションにより採取し、ｑＲＴ−ＰＣＲによりシクロフィリンをコントロールとしてＶＥＧＦｍＲＮＡ分析を行った結果を示す。
【図７】図７はＲＯＰの新生児およびＲＯＰを発症しない新生児における、等しい在胎週数での平均血清ＩＧＦ−Ｉを示す。ＲＯＰの新生児（白丸）およびＲＯＰを発症しない新生児（黒丸）の平均ＩＧＦ−Ｉレベルを、在胎週数に対して示す。エラーバーは平均の標準誤差を示す。
【図８】図８は全細胞溶解産物から調製し、ホスホＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体、またはリン酸化の状態にかかわりなくＡＫＴを認識する（全ＡＫＴ）抗体のいずれかで染色した複製ブロットを示す。血清を除去して、ＡＫＴリン酸化ベースラインを低下させた後、細胞をＶＥＧＦおよびＩＧＦ−Ｉまたはその双方で示した時間で刺激した。
【図９】図９Ａ−Ｄは、ＲＯＰにおけるＩＧＦ−Ｉ/ＶＥＧＦによる血管の発達の制御のスキーム表示である。図９Ａは、子宮内においてＶＥＧＦが血管の成長先端に認められることを示す。血管を成長させる十分量のＩＧＦ−１が存在している。図９Ｂは早産によりＩＧＦ−１が子宮内レベルを維持しておらず、血管の成長先端にＶＥＧＦが存在しているにもかかわらず、血管の成長が止まっていることを示す。内皮細胞生存経路（ＡＫＴ）および増殖経路（ＭＡＰＫ）の双方とも抑えられている。低レベルＩＧＦ−１および血管の成長の休止により、血管先端に境界線が形成されている。（動物モデルおよび一部の未熟児で起こるように）高濃度酸素の暴露もＶＥＧＦを抑制し、血管の成長の阻害にさらに寄与し得る。図９Ｃは未熟児の成熟に伴い、発達したが血管新生されていない網膜が低酸素になることを示す。ＶＥＧＦが網膜および硝子体で増加する。成熟に伴いＩＧＦ−１レベルが徐々に増加する。図９ＤはＩＧＦ−１レベルが在胎〜３４週で閾値に達すると、硝子体中の高レベルＶＥＧＦに伴い、ＶＥＧＦによる内皮細胞の生存および増殖が促進される。境界線で新生血管形成が次々に起こり、硝子体で成長する。ＶＥＧＦ硝子体レベルが低下すれば、正常な網膜の血管の成長を促進することができる。正常な血管の成長および血流により、酸素がＶＥＧＦの発現を抑制し、その結果過剰に血管が成長することはなくなる。低酸素（およびＶＥＧＦレベルの上昇）が持続すると、さらなる新生血管形成および線維増多による網膜剥離が起こり得る。
【図１０】図１０は未熟児網膜症における血清ＩＧＢＦ−３およびＩＧＦの濃度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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