(57)【要約】【課題】異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物を用いて免疫グロブリンを得ること。【解決手段】下記工程を含むヒト配列免疫グロブリンポリペプチドを作る方法、（Ａ）トランスジェニックマウスを得ること（Ｂ）該トランスジェニックマウスを所定の抗原により免疫化すること、（Ｃ）再配列されたトランスジェンの可変領域の少なくとも一部をエンコードする核酸を単離しかつ配列決定し、そして該再配列されたトランスジェンの配列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列を決定すること、（Ｄ）第２の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工的遺伝子を作ること、（Ｅ）該人工的遺伝子を転写プロモーター配列に結合すること、そして（Ｆ）該人工的遺伝子を細胞内へ導入すること、これによりヒト配列免疫グロブリンポリペプチドが作られる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載される免疫グロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数６】
2008189691.tif 000002
【数７−１】
2008189691.tif 000003
【背景技術】
【０００２】
【数７−２】
2008189691.tif 000004
【数８】
2008189691.tif 000005
【数９】
2008189691.tif 000006
【数１０−１】
2008189691.tif 000007
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
【数１０−２】
2008189691.tif 000008
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によって、以下が提供される：
１．予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも２×１０９Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）を有する免疫グロブリンを含む組成物であって、ここで、該免疫グロブリンは、以下：
ヒト配列軽鎖であって、（１）ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、ならびに（２）ＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリぺプチド配列を有する軽鎖定常領域から構成される、ヒト配列軽鎖：ならびに
ヒト配列重鎖であって、（１）ヒトＶＨ遺伝子セグメントと、必要に応じて、Ｄ領域およびヒトＪＨセグメントとによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに（２）ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する定常領域から構成される、ヒト配列重鎖、
からなる、組成物。
２．項目１に記載の組成物であって、ここで前記ヒト配列重鎖および前記ヒト配列軽鎖は、ヒト重鎖トランスジーンおよびヒト軽鎖トランスジーンによってそれぞれ別々にコードされ、該ヒト重鎖トランスジーンおよび該ヒト軽鎖トランスジーンは、マウス細胞のゲノムに組込まれている、組成物。
３．項目１に記載の組成物であって、該組成物は、単一のイディオタイプのモノクローナル抗体を含む、組成物。
４．項目１に記載の組成物であって、前記予め決められたヒト抗原は、ヒトの体細胞の少なくとも１つの細胞型において表面蛋白質または膜通過蛋白質として天然に存在するヒト蛋白質である、組成物。
５．前記ヒト配列軽鎖がκ定常領域を有する、項目１に記載の組成物。
６．前記ヒト配列重鎖がγ定常領域を有する、項目１に記載の組成物。
７．項目１に記載の組成物であって、前記免疫グロブリンが、κ定常領域を有するヒト配列軽鎖と、γ定常領域を有するヒト配列重鎖とを含む、組成物。
８．項目４に記載の組成物であって、前記予め決められたヒト抗原が、ヒトＣＤ４蛋白質またはその抗原性フラグメントである、組成物。
９．項目７に記載の組成物であって、前記予め決められたヒト抗原が、ヒトＣＤ４蛋白質またはその抗原性フラグメントである、組成物。
１０．予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも１×１０１０Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）を有する免疫グロブリンであって、ここで、該免疫グロブリンは、以下：
ヒト配列軽鎖であって、（１）ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、ならびに（２）ヒトＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリぺプチド配列を有する軽鎖定常領域から構成される、ヒト配列軽鎖：ならびに
ヒト配列重鎖であって、（１）ヒトＶＨ遺伝子セグメントと、必要に応じて、Ｄ領域およびヒトＪＨセグメントとによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、ならびに（２）ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する定常領域から構成される、ヒト配列重鎖、
からなる、免疫グロブリン。
１１．項目１０に記載の免疫グロブリンであって、前記予め決められたヒト抗原は、ヒトの体細胞の少なくとも１つの細胞型において表面蛋白質または膜通過蛋白質として天然に存在するヒト蛋白質である、免疫グロブリン。
１２．項目１１に記載の免疫グロブリンであって、前記ヒト蛋白質が、ヒトＣＤ４蛋白質またはその抗原性フラグメントである、免疫グロブリン。
１３．項目１０に記載の免疫グロブリンであって、前記ヒト配列軽鎖がκ鎖であり、そして前記ヒト配列重鎖がγ鎖である、免疫グロブリン。
１４．ヒト重鎖トランスジーンとヒト軽鎖トランスジーンとを有するトランスジェニックマウスから得られるＢ細胞から構成されるハイブリドーマであって、該Ｂ細胞は、ハイブ
リドーマを作製するために適切な不死細胞に融合されており、ここで該ハイブリドーマは、検出可能な量の項目１０に記載の免疫グロブリンを培養上清中に産生する、ハイブリドーマ。
１５．前記免疫グロブリンが、ヒト配列κ鎖およびヒト配列γ鎖からなる、項目１４に記載のハイブリドーマ。
１６．前記免疫グロブリンが、少なくとも１．１×１０１０Ｍ−１の親和性でヒトＣＤ４に結合する、項目１４に記載のハイブリドーマ。
１７．前記免疫グロブリンが、少なくとも１．１×１０１０Ｍ−１の親和性でヒトＣＤ４に結合する、項目１５に記載のハイブリドーマ。
１８．トランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスは、以下：
機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、異種免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、および異種免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー
を含み、ここで該動物はヒト抗原での免疫化後に抗体応答を行い、ここで該抗体応答は、項目１０に記載の免疫グロブリンを含む、トランスジェニックマウス。
１９．項目１８に記載のトランスジェニックマウスであって、ここで前記項目１０に記載の免疫グロブリンは、ヒト配列κ鎖およびヒト配列γ鎖を含む、トランスジェニックマウス。
２０．項目１８に記載のトランスジェニックマウスであって、ここで前記免疫グロブリンは、ヒトの少なくとも１つの体細胞型において存在するヒト表面蛋白質またはヒト膜通過蛋白質に結合し、ここで該免疫グロブリンは、１．５×１０９Ｍ−１と１．８×１０１０Ｍ−１との間の親和性定数（Ｋａ）で該ヒト表面蛋白質または該ヒト膜通過蛋白質に結合する、トランスジェニックマウス。
２１．前記ヒト表面蛋白質または前記ヒト膜通過蛋白質がヒトＣＤ４である、項目２０に記載のトランスジェニックマウス。
２２．項目１４に記載のハイブリドーマであって、前記トランスジェニックマウスが、項目１８に記載のトランスジェニックマウスである、ハイブリドーマ。
２３．項目１８に記載のトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、トランスジーン内でのアイソタイプスイッチを受け得るヒト重鎖トランスジーンの生殖細胞系コピーを含むトランスジェニックマウスを、反対の性別の適切なトランスジェニックマウスと交配する工程を包含し、その結果、子孫が項目１８に記載のトランスジェニックマウスを含む、方法。
２４．項目２３に記載の方法であって、前記反対の性別の適切なトランスジェニックマウスが、ヒト軽鎖トランスジーンの生殖細胞系コピーと、機能的に破壊されたマウス重鎖対立遺伝子および機能的に破壊された軽鎖対立遺伝子の生殖細胞系コピーを含むノックアウトバックグラウンドを含む、方法。
２５．項目１８に記載のトランスジェニックマウスであって、該マウスのＢ細胞は、機能的なマウス配列重鎖または機能的なマウス配列軽鎖の発現の非存在下において、Ｂ細胞成熟、ヒト配列免疫グロブリンの発現、クラススイッチ、および体細胞変異を起こす、トランスジェニックマウス。
２６．ヒト可変領域遺伝子セグメントの拡張されたレパートリーを有するトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、ヒト免疫グロブリントランスジーンと、該ヒト免疫グロブリントランスジーンには存在しないヒトＶ遺伝子セグメントを含有するヒトＶ遺伝子ポリヌクレオチドとを、マウスのゲノム中に共導入する工程を包含する、方法。
２７．前記Ｖ遺伝子ポリヌクレオチドが、ヒトκ免疫グロブリン遺伝子座の一部を含む酵母人工染色体である、項目２６に記載の方法。
２８．項目２６に記載の方法によって作製されるトランスジェニックマウスであって、該マウスは、前記Ｖ領域ポリヌクレオチドに存在するＶ領域遺伝子セグメントによってコー
ドされる可変領域配列を含む免疫グロブリン鎖を発現する、トランスジェニックマウス。２９．少なくとも５つの異なるＶκ遺伝子を含む、トランスジェニックマウス。
３０．ヒト配列免疫グロブリンを発現する形質を遺伝させる方法であって、該方法は、項目２８に記載のトランスジェニックマウスを交配する工程を包含する、方法。
３１．項目２９に記載のトランスジェニックマウスによって産生される、項目１０に記載の免疫グロブリン。
３２．ヒト配列免疫グロブリンポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、以下の工程：
（Ａ）トランスジェニックマウスを得る工程であって、ここで該トランスジェニックマウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、およびヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピーを含む、工程；
（Ｂ）該トランスジェニックマウスを予め決められた抗原により免疫化する工程であって、ここで免疫応答が誘発され、そしてそれにより該マウスのトランスジーンがＶ−Ｄ−Ｊ再配列を受け、それにより再配列されたトランスジーンが作製される、工程；
（Ｃ）再配列された該トランスジーンの可変領域の少なくとも一部をコードする核酸を単離しかつ配列決定し、そして該再配列されたトランスジーンの配列決定された部分によりコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列を決定する工程；
（Ｄ）第２の免疫グロブリンポリペプチドをコードする人工的遺伝子を作製する工程であって、ここで該第２の免疫グロブリンポリペプチドは、再配列された該トランスジーンの配列決定された部分によりコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に類似したアミノ酸配列を含む、工程；
（Ｅ）該人工的遺伝子を転写プロモーター配列に結合する工程；ならびに
（Ｆ）該人工的遺伝子を細胞内へ導入する工程、
を包含し、これによりヒト配列免疫グロブリンポリペプチドが作製される、
方法。
３３．前記第２の免疫グロブリンポリペプチドが、再配列された前記トランスジーンの配列決定された部分によりコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む、項目３２に記載の方法。
３４．工程（Ｃ）の前記核酸が、ヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマから単離される、項目３２に記載の方法。
３５．再配列された前記トランスジーンがヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンである、項目３２に記載の方法。
３６．前記人工的遺伝子がガンマイソタイプ定常領域をコードする、項目３５に記載の方法。
３７．工程（Ｆ）の前記細胞中に第２の人工的遺伝子を導入する工程を更に含み、ここで該第２の人工的遺伝子は、再配列された前記トランスジーンがヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンであることを除いては項目４に記載の工程（Ａ）〜（Ｅ）に従って作製され、かつここで該細胞は免疫グロブリンを産生する、項目３５に記載の方法。
３８．ヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーン及びヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンが、トランスジェニックマウス由来の単一のＢ細胞を１つの不死細胞へ融合させることにより作製されたハイブリドーマ内で発現される、項目３７に記載の方法。
３９．前記細胞が、少なくとも約１０８Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）で予め決められた抗原に結合する免疫グロブリンを産生する、項目３７に記載の方法。
４０．項目３２に記載の方法により作製された、免疫グロブリン。
４１．免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部をコードする少なくとも１つの人工的遺伝子を含む細胞であって、該細胞は予め決められたヒト抗原を結合する免疫グロブリンの検出可能量を産生し、該免疫グロブリンポリペプチドは、トランスジェニックマウスから得られたハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンポリペプチドと実質的に同
じ配列を有し、該マウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも一つのコピーを含む、細胞。
４２．項目４１に記載の真核細胞。
４３．前記免疫グロブリンが、ヒトＣＤ４またはその抗原性フラグメントに結合する、項目４２に記載の細胞。
４４．ヒトＣＤ４に特異的に結合する免疫グロブリンであって、該免疫グロブリンが、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．３、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．４、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．５、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６、配列Ｉ．
Ｄ．Ｎｏ．７、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．８、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．９、または配列Ｉ．
Ｄ．Ｎｏ．１０によりコードされるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を含むヒト配列軽鎖可変領域を含む、免疫グロブリン。
４５．前記免疫グロブリンが配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６１又は配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６２の配列を含む、項目４４に記載の免疫グロブリン。
４６．予め選択された抗原に特異的に結合するヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを選択する方法であって、該方法は以下の工程：
（ａ）トランスジェニックマウスからＢ細胞を得る工程であって、ここで該トランスジェニックマウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１つのコピー、ならびにμセグメントおよび非μセグメントをコードする配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも一つのコピーを含み、かつここで該マウスは予め決定された抗原により免疫化されている、工程；
（ｂ）該Ｂ細胞を不死細胞に融合させる工程であって、ここでハイブリドーマが産生される、工程；
（ｃ）非μ、非δイソタイプ免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマの第１群を同定する工程；
（ｄ）ハイブリドーマの第２群を同定する工程であって、ここで該第２群は、ハイブリドーマの第１群のサブセットであり、該第２群のハイブリドーマは予め決定された抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを分泌する、工程；
（ｅ）ハイブリドーマの第２群から、予め選択された抗原に特異的に結合するヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを選択する工程
を包含する、方法。
４７．ハイブリドーマの前記第１群がＩｇＧ免疫グロブリンを分泌する、項目４６に記載の方法。
４８．工程（ｅ）の前記ヒト配列免疫グロブリンが、少なくとも約１０９Ｍ−１の親和性定数（Ｋａ）で予め決定された抗原に結合する、項目４６に記載の方法。
４９．ヒト由来のＣＤ４に特異的に結合し、かつ少なくとも１つの非ヒト霊長類由来のＣＤ４に特異的に結合する、ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリン。
５０．前記非ヒト霊長類がアカゲザル、カニクイザル、又はチンパンジーである項目４９に記載の免疫グロブリン。
５１．前記ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、アカゲザル及びカニクイザルの両方に由来するＣＤ４に特異的に結合する項目５０に記載の免疫グロブリン。
５２．前記ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、アカゲザル、カニクイザル及びチンパンジー由来のＣＤ４に特異的に結合する項目５０に記載の免疫グロブリン。
５３．ＶＨ４−３４セグメント、ＤＸＰ’１セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。
５４．ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ２セグメント、及び配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６４）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配
列免疫グロブリン。
５５．ＶＨ４−３４セグメント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６５）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。
５６．ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。
５７．ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。５８．ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹＰＱＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。
５９．ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン。
６０．ＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、ヒト配列免疫グロブリン。
６１．免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマであって、該免疫グロブリンが、ＶＨ４−３４セグメント、ＤＸＰ’１セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ２セグメント、及び配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６４）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ４−３４セグメント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６５）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ５−５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳＰＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹＰＱＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン：ならびにＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン
から成る群から選択される、ハイブリドーマ。
【数１０−３】
2008189691.tif 000009
【数１１】
2008189691.tif 000010
【数１２】
2008189691.tif 000011
【数１３】
2008189691.tif 000012
【数１４】
2008189691.tif 000013
【数１５】
2008189691.tif 000014
【数１６】
2008189691.tif 000015
【数１７】
2008189691.tif 000016
【数１８】
2008189691.tif 000017
【数１９】
2008189691.tif 000018
【数２０】
2008189691.tif 000019
【数２１】
2008189691.tif 000020
【数２２】
2008189691.tif 000021
【数２３】
2008189691.tif 000022
【数２４】
2008189691.tif 000023
【数２５】
2008189691.tif 000024
【数２６】
2008189691.tif 000025
【数２７】
2008189691.tif 000026
【数２８】
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【数２９】
2008189691.tif 000028
【数３０】
2008189691.tif 000029
【数３１】
2008189691.tif 000030
【数３２】
2008189691.tif 000031
【数３３】
2008189691.tif 000032
【数３４】
2008189691.tif 000033
【数３５】
2008189691.tif 000034
【数３６】
2008189691.tif 000035
【数３７】
2008189691.tif 000036
【数３８】
2008189691.tif 000037
【数３９】
2008189691.tif 000038
【数４０】
2008189691.tif 000039
【数４１】
2008189691.tif 000040
【数４２】
2008189691.tif 000041
【数４３】
2008189691.tif 000042
【数４４】
2008189691.tif 000043
【数４５】
2008189691.tif 000044
【数４６】
2008189691.tif 000045
【数４７】
2008189691.tif 000046
【数４８】
2008189691.tif 000047
【数４９】
2008189691.tif 000048
【数５０】
2008189691.tif 000049
【数５１】
2008189691.tif 000050
【数５２】
2008189691.tif 000051
【数５３】
2008189691.tif 000052
【数５４】
2008189691.tif 000053
【数５５】
2008189691.tif 000054
【数５６】
2008189691.tif 000055
【数５７】
2008189691.tif 000056
【数５８】
2008189691.tif 000057
【数５９】
2008189691.tif 000058
【数６０】
2008189691.tif 000059
【数６１】
2008189691.tif 000060
【数６２】
2008189691.tif 000061
【数６３】
2008189691.tif 000062
【数６４】
2008189691.tif 000063
【数６５】
2008189691.tif 000064
【数６６】
2008189691.tif 000065
【数６７】
2008189691.tif 000066
【数６８】
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【数６９】
2008189691.tif 000068
【数７０】
2008189691.tif 000069
【数７１】
2008189691.tif 000070
【数７２】
2008189691.tif 000071
【数７３】
2008189691.tif 000072
【数７４】
2008189691.tif 000073
【数７５】
2008189691.tif 000074
【数７６】
2008189691.tif 000075
【数７７】
2008189691.tif 000076
【数７８】
2008189691.tif 000077
【数７９】
2008189691.tif 000078
【数８０】
2008189691.tif 000079
【数８１】
2008189691.tif 000080
【数８２】
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【数８３】
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【数８４】
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【数８５】
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【数８６】
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【数８７】
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【数８８】
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【数９０】
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【数１００】
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【数１０１】
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【数１２７】
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【数１２９】
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【数２０４】
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【数２１０】
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【数２１１】
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【数２１３】
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【数２１４】
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【数２１５】
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【数２１８】
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【数２１９】
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【数２２０】
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【数２２１】
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【数２２２】
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【数２２４】
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【数２２７】
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【数２２８】
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【数２２９】
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【数２３０】
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【数２３１】
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【数２３２】
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【数２３３】
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【数２３４】
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【数２３５】
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【数２３６】
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【数２３７】
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【数２３８】
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【数２３９】
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【数２４０】
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【数２４１】
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【数２４２】
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【数２４３】
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【数２４４】
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【数２４５】
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【数２４６】
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【数２４７】
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【数２４８】
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【数２４９】
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【数２５０】
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【数２５１】
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【数２５２】
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【数２５３】
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【数２５５】
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【数２５６】
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【数２５７】
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【数２５９】
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【数２６０】
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【数２６１】
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【数２６２】
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【数２６４】
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【数２６９】
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【数２７０】
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【数２７１】
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【数２７２】
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【数２７３】
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【数２７４】
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【数２７５】
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【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロプリン重鎖遣伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ４を表す。
【図２】図２はヒトλ鎖鎮遺伝子座を表す。
【図３】図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。
【図４】図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。
【図５】図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５ｋｂ断片に次いでラット鎖３’エンハンザ−配列を含む７００ｂｐ断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。
【図６】図６は、生体内相同キ目同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。
【図７】図７はｐＧＰ１の作製を示す。
【図８】図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカ−の構成を示す。
【図９】図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。
【図１０】図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。
【図１１】図１１は、ｏＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。
【図１２】図１２はｐＨＩＧ３’およびｐＣＯＮの作製を示す。
【図１３】図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。
【図１４】図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。
【図１５】図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包含する断片を示す。
【図１６】図１６はｐＥμの構造を示す。
【図１７】図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。
【図１８】図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図１９】図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２０】図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２１】図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２２】図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２３】図２３は、マウスの内因性免役グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図２４】図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２５】図２５はκ軽鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２６】図２６はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２７】図２７はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。
【図２８】図２８はべクターｐＧＰｅの地図を示す。
【図２９】図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。
【図３０】図３０はベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。
【図３１】図３１はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す
【図３２】図３２はｐγｅ２の構造を示す。
【図３３】図３３はｐＶＧＥ１の構造を示す。
【図３４】図３４はｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。
【図３５】図３５はｐＪＣＫ１の構造を示す。
【図３６】図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。
【図３７】図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。
【図３８】図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１．ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。
【図３９】図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。
【図４０】図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
【図４１】図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図４２】図４２はプラスミドｐＢＣＥ１の略図である。
【図４３】図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（４３Ａ）．ＫＬＨ（４３Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（４３Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。
【図４４】図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４５】図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４６】図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１．ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４７】図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定了ミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文宇で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４８】図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４９】図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細抱トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５０】図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５１】図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定了ミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５２】図５２は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．３と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５３】図５３はＶκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えングナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５４】図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５５】図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５６】図５６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換ええによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。ｓ
【図５７】抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクロ−ナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５８】ヒトＶＤＪ及びフウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図５９】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。
【図６０】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウスμについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６１】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウスκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６２】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。
【図６３】４つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒトκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６４】免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。
【図６５】さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。
【図６６】００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。
【図６７】ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗休力価を示す。
【図６８Ａ】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６８Ｂ】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６９】Ｓｔｏｒｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。
【図７０】相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。
【図７１】「免疫グロブリン遺伝子」、Ｈｏｎｊｏ，Ｔ，ＡＩｔ，ＦＷ，及びＲａｂｂｉｔｓ  ＴＨ（ｅｄｓ）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）ｐ１２９  から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。
【図７２】マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図７３】マウス重鎖遺伝子座Ｊ４遺伝子内に２つのｂｐフレームソフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。
【図７４】高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。
【図７５】クラススイッチ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃ１／Ｓｆｉ１消化されたＤＮＡのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ−５Ｈ１−５、ヒトγ１＋／μ−；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１＋／μ−；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１−．μ＋。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３’半部分にまたがる２．３ｋｂのＢｇＩＩＩ／ＳｆｉＩ［ＤＮＡフラグメントから誘導されたブローブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つのγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１ｋｂ及び５．３ｋｂのＰａｃＩ／ＳｆｉＩ［フラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。
【図７６】図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを決失するべく組換えできる４００ｂｐの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４ｋｂι１１，；ｂのＰａｃ１／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えによるクラススイッテは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４ｋｂと７ｋｂの間のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッテ領域の間で組換えを受けていると思われる。
【図７７】トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ筋のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。
【図７８−１】図７８および図７９再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８ｂｐ）。
【図７８−２】図７８および図７９再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８ｂｐ）。
【図７９−１】図７８および図７９再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８ｂｐ）。
【図７９−２】図７８および図７９再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５２／３．１９８ｂｐ）。
【図８０】図８０および図８１広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６ｂｐのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４ｂｐ）である。図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８ｂｐ）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８ｂｐである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８１−１】図８０および図８１広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６ｂｐのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４ｂｐ）である。図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８ｂｐ）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８ｂｐである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８１−２】図８０および図８１広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６ｂｐのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４ｂｐ）である。図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ−ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８ｂｐ）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８ｂｐである）。記号の説明については、図７８及び７９の凡例を参照のこと。
【図８２Ａ】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４ｂｐ）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６ｂｐ）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８２Ｂ】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントでの体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４ｂｐ）である。単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６ｂｐ）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照のこと。
【図８３】分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ÷／−，ＪＣκ÷／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍ  ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０÷，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒトμ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細抱のヒストグラム（対数螢光：Ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基づくｅ−パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０÷細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの百分率として与えられている。
【図８４】２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４  ２重トランスＡジェニックマウスからのマウスγ及びλ及びヒトμ．γ及びκ。マウス：（÷）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（〇）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピ）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統  ４４３７。
【図８５】図８５および図８６ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告されている。図８６：インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／ｍｌの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣｏ４系統  ４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８６】図８５および図８６ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告されている。図８６：インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／ｍｌの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣｏ４系統  ４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８７】ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。
【図８８】トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４ＩｇＭ  ａｎｆ  ＩｇＧを示す。
【図８９】トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。
【図９０】培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。
【図９１】遺伝子、例えば重鎖定常領域遺伝子を欠失するための相同組換えターゲティングトランスジーンの構造を概略的に示す。
【図９２】図９２は、ＨＣｏ７トランスジーンを構成するプラスミド挿入部（ｉｎｓｅｒｔｓ）の重複する組を示す。
【図９３Ａ】図９３Ａは、ｐＧＰ２ｂプラスミドベクターのヌクレオチド配列および制限酵素地図を示す。
【図９３Ｂ】図９３Ｂは、ｐＧＰ２ｂプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。
【図９４】図９４（部分ＡおよびＢ）は、大きいトランスジーンを組み立てるためのクローニング法を示す。
【図９５】図９５は、大きな挿入部が、高複写（ｈｉｇｈ−ｃｏｐｙ）ｐＵＣ誘導プラスミドにおいて不安定であることを示す。
【図９６】図９６は、ファージＰ１クローンＰ１−５７０を示す。挿入部は、スウイッチ要素と共に、γ３およびγ１をカバーするヒト重鎖定常領域の部分に及ぶ。Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｓ、ＳａｌＩ、Ｘ、ＸｈｏＩ。
【図９７】図９７は、ＨＣｏ７トランスジェニック創立動物におけるヒトμおよびγ１の血清発現を示す。
【図９８】図９８は、ＨＣｏ７／ＫＣｏ４二重トランスジェニック／二重欠失マウスにおけるヒト免疫グロブリンの血清発現を示す。
【図９９】図９９は、ＨＣｏ７トランスジェニックマウス脾臓ＲＮＡにおけるヒトγ１およびγ３転写のＲＴ  ＰＣＲ欠失を示す。
【図１００】図１００は、インビトロでのＬＰＳおよびＩＬ−４によるヒトＩｑＧ１およびＩｇＧ３の誘導を示す。
【図１０１】図１０１、ＹＡＣ  ＤＮＡの濃縮のためのアガロースゲル電気泳動装置。
【図１０２】図１０２、ＨＣ２／ＫＣｏ５／ＪＨＤ／ＪＫＤおよびＨＣ２／ＫＣｏ４／ＪＨＤ／ＪＫＤマウスからの骨髄細胞の二色ＦＡＣＳ分析。Ｂ２２０＋／ＣＤ４３−、Ｂ２２０＋／ＣＤ４３＋およびＢ２２０＋／ＩｇＭ＋ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０３】図１０３、ＨＣ２／ＫＣｏ５／ＪＨＤ／ＪＫＤおよびＨＣ２／ＫＣｏ４／ＪＨＤ／ＪＫＤマウスからの脾臓細胞の二色ＦＡＣＳ分析。Ｂ２２０明るい／ＩｇＭ＋およびＢ２２０曇っている／ＩｇＭ＋ゲートのそれぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。
【図１０４】図１０４、ＩｇＧｋ抗−ｎＣＤ４モノクローナル抗体のＣＤ４＋  ＳｕｐＴ１細胞への結合。
【図１０５】図１０５、フローサイトメトリーによるＩｇＧ抗−ｎＣＤ４モノクローナル抗体のエピトープ測定。ＳｕｐＴ１細胞は、緩衝液（左のカラム）、２．５ｍｇ／ｍｌ  ＲＰＡ−Ｔ４（真中のカラム）または２．５ｍｇ／ｍｌ  Ｌｅｕ３ａ（右のカラム）で、次いで１０のヒトＩｇＧモノクローナル抗体（１：２に希釈した上清中）の１つまたはキメラＬｅｕ３ａで、プレインキュベートされた。３つの典型的ヒトＩｇＧモノクローナル抗体についての結果をこの図に示す。
【図１０６】図１０６、ヒトＩｇＧｋ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体によるＭＬＲの阻害。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイフリドーマを作製する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８−１】
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【図７８−２】
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【図７９−１】
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【図７９−２】
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【図８０】
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【図８１−１】
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【図８１−２】
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【図８２Ａ】
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【図８２Ｂ】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３Ａ】
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【図９３Ｂ】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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