(57)【要約】【課題】抗原の分離の際のゴミ詰まりの問題を解消し、かつ必要に応じた流体体処理量を確保可能な抗原の分離装置を提供し、これを用いて分離された抗原の画像計測を行ない、抗原の計測時間の短縮と高精度な計測を可能とする。【解決手段】抗原を含む試料流体の導入口１と、試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体ビーズを配設し、抗原・抗体反応により抗原を分離する反応部３と、導入口と反応部とを連通する試料流体の導入路４と、試料流体の排出路５とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、空気の導入口１１を備え、前記試料流体と空気とを同一水平面内で同時に導入するものとし、前記底面と垂直方向の空気層と試料流体層との層分離により、抗原濃縮機能を備える構成とする。反応部上方には、画像計測装置を備える。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌や生体内蛋白質等の抗原を含む試料流体の導入口と、前記試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体担持体を配設し、抗原・抗体反応により前記抗原を分離する反応部と、前記試料流体の導入口と反応部とを連通する前記マイクロチャンネル状の試料流体の導入路と、前記反応部から試料流体を排出する排出路とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、前記試料流体と空気又は水等の流体とを同一水平面内で同時に導入するものとし、前記底面と垂直方向の空気，水等の流体層と試料流体層との層分離により、前記試料流体中の抗原の分散濃度を局所的に高くする抗原濃縮機能を備える構成とすることを特徴とする抗原の分離装置。
【請求項２】
請求項１に記載の分離装置において、前記反応部は、抗原を、前記抗体担持体が配設された底面側に、電気的吸引力により吸引するための電場発生手段を備えることを特徴とする抗原の分離装置。
【請求項３】
請求項１または２に記載の分離装置において、前記導入路は、前記導入口と反応部との間に、前記試料流体に蛍光染色試薬を注入するための注入口を備えることを特徴とする抗原の分離装置。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の分離装置において、分離装置本体は、前記試料流体の導入口，導入路，反応部および排出路等の流路を含む部材と、光透過性の蓋部材とを貼り合せた構成とすることを特徴とする抗原の分離装置。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の分離装置において、前記反応部を複数備え、各反応部はそれぞれ多種類の抗体を固定した抗体担持体もしくは各反応部毎に異なる抗体を固定した抗体担持体を有し、前記導入路は、前記各反応部を直列もしくは並列に試料流体が流れるように構成して、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する構成とすることを特徴とする抗原の分離装置。
【請求項６】
請求項３に記載の抗原の分離装置を用いる抗原の計測装置であって、前記分離装置は、分離された抗原の蛍光画像情報に基づき画像計測を行なう画像計測装置を備えることを特徴とする抗原の計測装置。
【請求項７】
請求項６に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、合焦用マーカーを有し、計測対象の抗原に対してオートフォーカスする合焦手段を備えることを特徴とする抗原の計測装置。
【請求項８】
請求項７に記載の抗原の計測装置において、前記合焦用マーカーは、前記反応部の底面に配設した複数個の抗体担持体とすることを特徴とする抗原の計測装置。
【請求項９】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、前記抗原の蛍光標識後の画像情報と蛍光標識前の画像情報との差に基づき画像計測を行ない、夾雑物の蛍光誤差を除去する演算機能を備えるものとすることを特徴とする抗原の計測装置。
【請求項１０】
請求項６ないし８のいずれか１項に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、下記の工程を含むことを特徴とする抗原の計測方法。
１）前記抗原の分離装置の前記反応部へ、抗原を含む試料流体を、所定流量速度で通流する工程。
２）前記反応部において、電場を印加もしくは印加せずに抗原濃縮し、抗原・抗体反応により抗原を抗体担持体に吸着する工程。
３）前記試料流体に蛍光試薬を注入して抗原を蛍光標識する工程。
４）洗浄液を通流して、前記蛍光試薬を洗浄する工程。
５）蛍光画像装置により抗原の画像計測を行なう工程。
【請求項１１】
請求項９に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、前記請求項１０に記載の工程に加えて、請求項１０に記載の３）の工程に係る蛍光標識する工程の前段においても画像計測を行い、請求項１０に記載の５）の工程に係る画像計測による画像情報と、前記蛍光標識前段の画像情報との差に基づき、抗原の画像計測を行なうことを特徴とする抗原の計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、試料中の細菌や生体内蛋白質等の抗原の分離装置並びにこれを利用した抗原の計測方法及び装置に関する。分離・計測対象としては、抗原抗体反応を利用して計測可能なすべての物が含まれ、細菌や放線菌などの原核生物、酵母やカビなどの真核生物、下等藻類、ウイルスなどの微生物や、動植物由来の培養細胞及びスギやヒノキなどの花粉などの細胞が含まれる。また、免疫分析，内分泌撹乱性物質（環境ホルモン）の検出，アトピー性皮膚炎の原因物質特性なども対象となる。対象試料としては、気体試料に比べて液体試料の場合の方が多いが、例えば気中に浮遊する細菌やカビなどの気体試料の抗原の計測も含まれる。本発明の利用分野としては、医療，食品製造，上下水道，環境分析などがある。
【背景技術】
【０００２】
例えば、試料中の微生物や動植物等の組織細胞などの検出は、滅菌状態の確認や、細胞の生存状態の異常等を検出する上で、産業上極めて重要な技術である。
【０００３】
従来、被験面上に存在する肉眼では観察することのできない細菌等の微生物を観察および計数するには、培養法、すなわち寒天などで賦形した固形の平板培地を被験面に押し当てることにより、被験面上の微生物を寒天平板培地上に転写し、該微生物をそのまま平板培地上で適当な環境のもとで培養することにより出現するコロニーを肉眼または実体顕微鏡等で見定めながら計測する方法が一般的に利用されている。
【０００４】
前記培養法は、計測所要時間が諸準備を含めて４８〜７２時間もかかる欠点があるので、近年では、抗原抗体反応を利用し、抗原を蛍光試薬により標識して画像計測する方法が開発されている。例えば、フィルタ上に捕集した微生物を適当な染色液と接触させて、発色した菌体数を顕微鏡等で計数することにより、培養を行わずに微生物を検出する。
【０００５】
前記画像計測方法によれば、２〜３時間で計測が可能となる。計測所要時間の内訳は、例えば、抗原抗体反応および抗体磁気ビーズと試料液中のゴミとの磁気的分離に約７０分，蛍光染色に約３０分，顕微鏡観察に約３０分で、合計２〜３となる。
【０００６】
ところで、前記計測方法における画像解析方法としては、一般に、手動合焦の顕微鏡や撮像装置等を用いた画像解析が行なわれており、高倍率の使用条件下では被写界深度が狭いので合焦に手間取ることも多く、自動合焦や自動解析が望まれている。この観点から、自動合焦を行なって蛍光画像計測を行なう方法に関して、本件出願人によって発明された蛍光画像計測方法が、特願２００２−３０６４８号（国際公開第０３／０６７２３０号パンフレット）により出願されている。
【０００７】
図６は、前記特願２００２−３０６４８号に記載された方法を実施する装置の一例を示す。図６に示す装置によれば、標本８１に対して励起光を励起用光源８０から照射する前に、蛍光画像計測波長帯域で発光するオートフォーカス（ＡＦ）用光を、図示のように励起光照射側と同じ側から光源８２により照射し、これにより得た画像情報から合焦度を判断し、その度合いに応じて標本８１と受光系の少なくとも一方を駆動して合焦点位置を探索し、合焦点位置に達したらＡＦ用光の照射を停止し、その後に光源８０から標本８１に励起光を照射して蛍光画像計測を行なうことができる。本装置によれば、透過光を利用しないので、メンブレンフィルタ表面に補足した標本の計測も可能となる。
【０００８】
ＡＦ用光源８２としては、発光ダイオードや半導体レーザが好適である。ＡＦ用光照射時の標本の画像は、対物レンズ８５，ダイクロイックミラー８３，蛍光受光側フィルタ８４および結像レンズ８6を介して、撮像素子８７で捉える。撮像素子としてはＣＣＤカメラ用素子やＣＭＯＳカメラ用素子が好適である。撮像素子８７で得た画像は演算部８８に送り、ここでコントラストの評価を行なう。コントラストの評価は、例えば隣り合う画素間の輝度差として算出し、コントラストが最大になる位置を合焦点位置とする、一般的なＡＦ手法により行なう。
【０００９】
なお、図６において、８９はステージ移動機構、９１は励起光の集光レンズ、９２はフィルタ、９３は蛍光フィルタブロックを示す。また、前記コントラストの評価を行なうための合焦用マーカーとしては、図６には図示しないが、標本を保持するスライドガラスの表面に模様（マーク）をつけるか、もしくは標本のろ過捕捉用のメンブレンフィルタの表面に模様（マーク）をつける方法を採用している（詳細は、前記特願２００２−３０６４８号参照）。上記方法によれば、要素数の少ないシンプルな構成で、励起光の照射によって標本が消光し検知不能とすることなく、かつ、メンブレンフィルタ表面に補足した標本やコントラストが不鮮明な標本についてもオートフォーカス（ＡＦ）が可能となる。
【００１０】
また、前記蛍光画像計測方法においては、試料の性状に関わらず蛍光性夾雑物の影響を排除し、測定精度の向上を図ることが望ましく、この観点から、本件出願人によって発明された生細胞の計数方法および装置が、特願２００２−１４８８８４号（国際公開第０３／１０００８６号パンフレット）により出願されている。
【００１１】
前記特願２００２−１４８８８４号に記載された画像計測装置は、生細胞の蛍光標識後の画像情報と蛍光標識前の画像情報との差に基づき画像計測を行ない、夾雑物の蛍光誤差を除去する機能を備えるものであって、前記出願においては三種類の方法を開示している。
【００１２】
即ち、第一の方法は、試料中の微生物や細胞組織などの生細胞を蛍光試薬により標識することにより、前記生細胞の数を測定する生細胞の計数方法および装置において、生細胞を蛍光標識する前に、試料の蛍光画像（第一画像）を取得し、前記生細胞を蛍光標識した後に、試料の蛍光画像（第二画像）を取得し、前記第一画像中と第二画像中の輝点数の差（Ｂ−Ａ）を求めることとする。さらに前記とは異なる方法としては、前記第一画像と第二画像との差分画像を求め、この差分画像中の輝点数を求める第二の方法か、もしくは、前記第二画像中の輝点の内、その位置が、前記第一画像中の各輝点に付随する不感領域に含まれない輝点数を求める第三の方法である（詳細は、前記特願２００２−１４８８８４号参照）。
【００１３】
図７は、一例として、第一画像と第二画像との間で差分画像を求めることを利用する前記第二の方法に係る細菌数の計測方法を示す図である。
【００１４】
手順としては、例えば、試料液に含まれる細菌を、ろ過によってメンブレンフィルタ上に捕捉する。次に、細菌を捕捉したメンブレンフィルタの蛍光標識前の蛍光画像（図７の中央部に示す第一画像９６）を取得する。続いて、メンブレンフィルタ上に蛍光標識試薬を添加し、細菌を蛍光標識する。その後、再びメンブレンフィルタの蛍光画像（図７の左側に示す第二画像９７）を取得する。そして、前記第二画像９７と第一画像９６とにより、図７の右側に示す差分画像９８を求める。
【００１５】
差分画像９８中に存在する輝点が蛍光標識によって現れた輝点であり、これを細菌数として計数することにより、夾雑物の蛍光誤差を除去することができる。
【００１６】
ところで、上記のように改良された蛍光画像計測方法に対しても、さらに簡便に短時間で、高精度の計測ができるような改良が求められている。また、計測対象によっては、微量の試料で計測を可能とすることが望まれる。このような観点から、微量試料をマイクロチップ内で抗原抗体反応をさせて計測する免疫分析装置と方法が、特許文献１により知られている。
【００１７】
図８は、特許文献１に記載された免疫分析装置の斜視図を示す。図８に示す免疫分析装置は、特許文献１の記載によれば、反応固相としての直径１ｍｍ以下の固体微粒子１０２とともに、この固体微粒子１０２の径よりも大きい断面積を有するマイクロチャンネル反応槽部１０３と、前記固体微粒子１０２の径よりも小さい断面積を有するマイクロチャンネル分離部１０４とを備え、抗原および標識抗体を別々に前記反応槽部１０３へと導く導入部もしくはマイクロチャンネル流入部１０５，１０６を有している免疫分析マイクロチップを構成し、これを用いて分析する。
【００１８】
図８において、第二抗体としての標識抗体の反応槽部１０３への導入のためのマイクロチャンネル流入部１０６とともに、第一抗体の導入のためのマイクロチャンネル流入部１０７、並びにバッファー液や洗浄液の導入のためのマイクロチャンネル流入部１０８を備えており、各々のマイクロチャンネル流入部１０５，１０６，１０７，１０８の端部には、抗原、標識抗体（第二抗体）、第一抗体、そして洗浄液の注入穴部１０５Ａ，１０６Ａ，１０７Ａ，１０８Ａが設けられてもいる。また、図８の例では、マイクロチャンネル分離部１０４の端部には、廃液部１０４Ａが設けられている。
【００１９】
固体微粒子１０２は、免疫抗原−抗体反応のための反応固相としての役割を果たすものであって、たとえばガラスビーズ、あるいはポリスチレン等の高分子ビーズ等が用いられる。この固体微粒子１０２は、直径が１ｍｍ以下、たとえば１５〜８５μｍのもの用いられる。
【００２０】
上記免疫分析マイクロチップによって、微量の試料等の使用によって、簡便に短い反応時間で免疫分析が可能となる。免疫分析の方法としては、反応固相としての固体微粒子１０２をマイクロチャンネル反応槽部１０３に導入し、導入部もしくはマイクロチャンネル流入部１０５，１０６より導入した抗原および標識抗体、さらに必要によりマイクロチャンネル流入部１０７より導入した抗体の固体微粒子１０２上での反応を行い、未反応物をマイクロチャンネル分離部１０４で分離し、光熱変換分析や蛍光分析等により分析することを可能としている。
【特許文献１】特開２００１−４６２８号公報（第３−４頁、図１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
ところで、上記特許文献１に記載された発明においても、主に測定対象物の分離装置に関わり、下記のような問題点がある。
【００２２】
特許文献１の装置の場合、具体的には、上記特許文献１に記載されたように、「マイクロチャンネル反応槽部１０３の大きさは、半球状の穴部とした場合には、たとえばその半径が１００μｍ以上、より好ましくは１５０μｍ以上とし、また、マイクロチャンネル分離部１０４は、たとえば、深さが１０μｍ以下、幅１０μｍ以下とされる。このようにすることによって、反応固相としての固体微粒子１０２は、マイクロチャンネル分離部１０４に流入することはなく、せき止められることになる。そして未反応物だけが、マイクロチャンネル分離部１０４に流入して分離される。また、必要に応じて、固体微粒子１０２から脱着された反応生成物のみが分離される。」
上記特許文献１に記載のように、特許文献１の分離装置は、「せき止め方式」であるため、試料液中に「ゴミ」がある場合、前記１０μｍ以下に絞られた部分に、ゴミが詰まりやすく、測定不能となる問題がある。
【００２３】
また、測定対象試料が比較的均質な場合には、極微量の試料により、高精度の検出が可能であるが、測定対象試料として、例えば、単位体積当りに含まれる細菌の数が少ない試料液であって、その液中の分布が均等でないような場合には、測定する液体の処理量は、ある程度の量必要であり、処理量が少なすぎると、測定精度の低下をもたらすか、もしくは測定が実質的に不可能となる。
【００２４】
この発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、この発明の課題は、試料流体中の抗原の分離の際に、マイクロチャンネル内に液中のゴミが詰まることがなく、かつ、分離が簡便にして短時間ででき、流体の処理量も必要に応じて確保可能な抗原の分離装置を提供し、さらにこの分離装置を用いて、簡便にして短時間かつ高精度な計測が可能な抗原の計測方法及び装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
前述の課題を解決するために、この発明は、細菌や生体内蛋白質等の抗原を含む試料流体の導入口と、前記試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体担持体を配設し、抗原・抗体反応により前記抗原を分離する反応部と、前記試料流体の導入口と反応部とを連通する前記マイクロチャンネル状の試料流体の導入路と、前記反応部から試料流体を排出する排出路とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、前記試料流体と空気又は水等の流体とを同一水平面内で同時に導入するものとし、前記底面と垂直方向の空気，水等の流体層と試料流体層との層分離により、前記試料流体中の抗原の分散濃度を局所的に高くする抗原濃縮機能を備える構成とする（請求項１の発明）。
【００２６】
本発明における「矩形状断面」とは、底辺と対向する一辺が平行をなす多角形状断面のことであり、台形あるいは６角形などの断面形状を含むものとする。
【００２７】
抗原・抗体反応により抗原を分離するためには、抗体担持体（例えば、抗体ビーズ）付近に抗原を濃縮する必要がある。抗体ビーズから例えば、２０〜３０μｍ程度、好ましくは、従来装置のように１０μｍ程度に濃縮する必要がある。上記分離装置によれば、従来のように試料液の流路をせき止めもしくは絞ることなく、液中の固形物を濃縮し、反応部において特定の抗原のみを抗体ビーズにより捕獲分離して、残りのゴミを反応部から排出できるので、ゴミ詰まりの問題が解消でき、かつ簡便にして短時間に抗原が分離できる。また、例えば１０分で１０ｍＬ程度の処理量も確保できるので、種々のニーズに対応できる。詳細は後述する。
【００２８】
前記請求項１の発明によれば、試料流体と空気又は水等の流体とを同一水平面内で同時に導入するものとしたが、この場合、処理流体の流速が充分小さいので、速度，粘度，密度，有効直径で決まるレイノルズ数は、前記層分離が可能な条件となり、簡単な構成で濃縮できる。詳細は後述する。
【００２９】
また、前記請求項１の発明の抗原濃縮機能は、下記請求項２の発明のようにすると、濃縮機能はさらに向上する。即ち、請求項１に記載の分離装置において、前記反応部は、抗原を、前記抗体担持体が配設された底面側に、電気的吸引力により吸引するための電場発生手段を備えるものとする。
【００３０】
抗原は、自然状態において、負に帯電しているので、前記抗体担持体が配設された底面側を正極とし、対向面を負極とした電場を発生することにより、抗原は抗体担持体の側に吸引されて濃縮される。なお、前記電場は、交番電界によって形成することもできる。
【００３１】
また、前記請求項１または２に記載の分離装置において、前記導入路は、前記導入口と反応部との間に、前記試料流体に蛍光染色試薬を注入するための注入口を備えるものとする（請求項３の発明）。これにより、後述するように、蛍光画像観察により、抗原を計測することができるようになる。
【００３２】
さらにまた、前記請求項１ないし３のいずれか１項に記載の分離装置において、分離装置本体は、前記試料流体の導入口，導入路，反応部および排出路等の流路を含む部材と、光透過性の蓋部材とを貼り合せた構成とする（請求項４の発明）。分離装置は、試料液や蛍光染色試薬等を導入するための配管，シール装置，制御弁などの種々の周辺機器を含むが、分離装置本体を、上記請求項４の発明のように構成することにより、分離装置本体をチップ化でき、量産性の向上とコストの低減化が図れる。上記チップは、使い捨てとすることができるので、装置の機動性およびメンテナンス性も向上する。
【００３３】
また、試料液が多種類の抗原を含み、これらを同時に分離するためには、下記請求項５の発明が好ましい。即ち、前記請求項１ないし４のいずれか１項に記載の分離装置において、前記反応部を複数備え、各反応部はそれぞれ多種類の抗体を固定した抗体担持体もしくは各反応部毎に異なる抗体を固定した抗体担持体を有し、前記導入路は、前記各反応部を直列もしくは並列に試料流体が流れるように構成して、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する構成とする。上記のように、反応部を複数設けたマルチチップとすることにより、多様性が高くかつ低コストの計測が可能となる。詳細は後述する。
【００３４】
次に、前記分離装置を利用した抗原の計測装置としては、下記請求項６ないし９の発明が好ましい。即ち、請求項３に記載の抗原の分離装置を用いる抗原の計測装置であって、前記分離装置は、分離された抗原の蛍光画像情報に基づき画像計測を行なう画像計測装置を備えるものとする（請求項６の発明）。これにより、従来２〜３時間かかった計測時間は、磁気的分離操作がないこともあり、大幅に短縮され、２５〜３０分となる。
【００３５】
また、請求項６の発明の実施態様としては、下記請求項７〜９の発明が好ましい。即ち、請求項６に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、合焦用マーカーを有し、計測対象の抗原に対してオートフォーカスする合焦手段を備えるものとする（請求項７の発明）。この作用効果は、前述のとおりである。
【００３６】
さらに、請求項７に記載の抗原の計測装置において、前記合焦用マーカーは、前記反応部の底面に配設した複数個の抗体担持体とする（請求項８の発明）。抗体担持体として、例えば、ポリスチレンビーズを用いた場合、前記底面に配列したビーズは、合焦用マーカーとして機能させることができるので、あらためて、マーカーを設ける必要がない。
【００３７】
さらにまた、前記請求項６ないし８のいずれか１項に記載の抗原の計測装置において、前記画像計測装置は、前記抗原の蛍光標識後の画像情報と蛍光標識前の画像情報との差に基づき画像計測を行ない、夾雑物の蛍光誤差を除去する演算機能を備えるものとする（請求項９の発明）。この作用効果は、前述のとおりである。
【００３８】
次に、抗原の計測方法としては、下記請求項１０または１１の発明が好ましい。即ち、請求項６ないし８のいずれか１項に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、下記の工程を含むこととする（請求項１０の発明）。
１）前記抗原の分離装置の前記反応部へ、抗原を含む試料流体を、所定流量速度で通流する工程。
２）前記反応部において、電場を印加もしくは印加せずに抗原を濃縮し、抗原・抗体反応により抗原を抗体担持体に吸着する工程。
３）前記試料流体に蛍光試薬を注入して抗原を蛍光標識する工程。
４）洗浄液を通流して、前記蛍光試薬を洗浄する工程。
５）蛍光画像装置により抗原の画像計測を行なう工程。
【００３９】
なお、上記３）の工程において、試料流体が気体の場合には、前記蛍光染色試薬は、ミスト状にして注入することが望ましい。
【００４０】
また、前記請求項９に記載の抗原の計測装置を用いた抗原の計測方法であって、前記請求項１０に記載の工程に加えて、請求項１０に記載の３）の工程に係る蛍光標識する工程の前段においても画像計測を行い、請求項１０に記載の５）の工程に係る画像計測による画像情報と、前記蛍光標識前段の画像情報との差に基づき、抗原の画像計測を行なう（請求項１２の発明）。
【発明の効果】
【００４１】
上記のとおり、この発明によれば、細菌や生体内蛋白質等の抗原を含む試料流体の導入口と、前記試料流体が流れる矩形状断面を有するマイクロチャンネル内の底面に複数個の抗体担持体を配設し、抗原・抗体反応により前記抗原を分離する反応部と、前記試料流体の導入口と反応部とを連通する前記マイクロチャンネル状の試料流体の導入路と、前記反応部から試料流体を排出する排出路とを備える抗原の分離装置において、前記導入路は、前記試料流体と空気又は水等の流体とを同一水平面内で同時に導入するものとし、前記底面と垂直方向の空気，水等の流体層と試料流体層との層分離により、前記抗原濃縮機能を備える構成とするものとしたので、
抗原の分離の際のゴミ詰まりの問題を解消し、分離が簡便にして短時間ででき、さらに流体の処理量も必要に応じて確保可能な抗原の分離装置が提供できる。
【００４２】
また、上記分離装置により分離された抗原の蛍光画像情報に基づき画像計測を行なうことにより、従来２〜３時間かかった抗原の計測時間は、２５〜３０分に短縮され、簡便にして短時間かつ高精度な計測が可能となる。
【００４３】
さらに、前述のように、分離装置を成型樹脂で１チップ化し、また反応部を複数設けてマルチチップ化することにより、多様性が高くかつ低コストの計測が実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本発明の実施例に関し、液体試料中の菌の計測例について、図１〜５に基づいて以下に述べる。
【００４５】
まず、図４について述べる。図４は請求項１の発明に関わり、空気層と試料液層との層分離により、前記抗原濃縮する場合の概念的説明図である。（ａ）図は平面模式図、（ｂ）図は層分離状態の説明図である。図４において、１は試料液の導入口、１１は空気の導入口を示し、試料液と空気とを同一水平面内で同時に導入して、導入路４を経て反応部３に通流する。これにより、（ｂ）図に示すように、空気層４０ａと試料液層４０ｂとに層分離し、この状態で反応部３に通流することにより、結果的に抗原の濃縮が実現した状態で抗原抗体反応が行われることとなる。なお、図４において、５は排出口、６は蛍光染色試薬の注入口を示す。
【００４６】
前述のような層分離の最適状態は、試料液の通流状態が層流を維持する臨界レイノルズ数以下の条件を満足することを要件として、空気と試料液の流量比によって定まる。この最適条件は、予備実験により、最適な濃縮状態を得る観点から決められる。
【００４７】
次に、図１および２について述べる。図１は、請求項２の発明に関わる抗原の分離装置本体の概念的模式図である。また、図２は抗原の計測装置の模式的構成図であり、分離装置本体の具体的構成の斜視断面図を合わせて示す。図２（ａ）には本体下部の部材と蓋部材とを分解した斜視断面図を示し、図２（ｂ）には組み立てた状態の斜視断面図を示す。
【００４８】
なお、前記図１に示す装置は、図４に示す反応部３の前段に、さらに前記抗原濃縮機能を高めるために、導入路４に流路段差４ａ（詳細は後述）を設けた実施例を示すが、前記流路段差は、かならずしも設ける必要はない。
【００４９】
図１および図２において、１は試料液の導入口、２は例えばポリスチレン製の抗体ビーズ、３は反応部、４は試料液の導入路、５は試料液の排出路、６は蛍光染色試薬の注入口、７は前記導入口，導入路，反応部および排出路等を含む試料液の流路を示す。また、図１において３０は電場発生手段であり、図２において８は成型部材、９は蓋部材、１０は蛍光染色試薬、２０は画像計測装置を示す。
【００５０】
図１に基づき、抗原の分離動作について説明する。導入口１から導入路４に導入された試料液は、抗原としての例えば菌１ａとゴミ１ｂとを含むものとする。この試料液が反応部３に導入される過程で、導入路４の流路段差４ａの部分で、矢印Ｖで示すような垂直方向の流れのベクトルを受けて、試料液中の菌１ａは、ゴミ１ｂと共に反応部３の下方に濃縮される。反応部３のチャンネルの深さは、例えば、１００μｍとし、長さは３０００μｍである。また、濃縮される部分の深さ（図示ｈ）は、例えば２０μｍである。
【００５１】
上記濃縮により、抗体ビーズ２に菌１ａに、抗原抗体反応によって容易に捕獲され、ゴミ１ｂのみが排出路５から排出されて、抗原としての菌１ａが、試料液およびゴミから容易に分離される。また、濃縮される部分以外の流路は、試料液が円滑に流れることができるので、前記処理量を必要に応じて確保できる。
【００５２】
なお、前記流路段差４ａは、導入路４が直角に曲がる段差を図示しているが、デッドスペースをなくして滑らかな曲線で導入路４と反応部３とを接続してもよく、垂直方向の流れのベクトルを受けるような実質的な段差を備える流路構成であれば、種々の形状をとり得る。また、図１においては、排出路５にも段差を設けた例を示すが、この段差も省略することができる。
【００５３】
また、前述のように、上記流路段差４ａの他に、前記抗体ビーズが配設された底面側を正極とし、対向面を負極とした電場を、電場発生手段３０により発生することにより、自然状態で負に帯電した抗原としての菌１ａを、抗体ビーズ２の側に吸引し濃縮できる。なお、電場発生用の電源電圧は、例えば１０数Ｖである。
【００５４】
次に、図２に基づき、抗原の分離装置本体の構成および蛍光画像計測との関連について述べる。先に、分離装置本体の構成について、図３をも参照して述べる。図３は分離装置本体のみに着目した断面斜視分解図（ａ図），断面斜視図（ｂ図）および断面図（ｃ図）である。
【００５５】
分離装置本体は、前述のように、前記試料液の導入口１，導入路４，反応部３および排出路５等の流路７を含む樹脂一体成型部材８と、ガラスもしくは光透過性樹脂製の蓋部材９とを接着した構成とする。なお、図２においては、導入路４に、蛍光染色試薬１０の注入口６を設けた例を示す。また、蓋部材９には、排出路５の段差部の一部を塞ぐ突出部９ａを設けた例を示すが、排出路５の段差を省略した場合には、前記突出部９ａは不要である。
【００５６】
次に、図２に基づき、抗原の計測手順について説明する。図２において、画像計測装置２０は、前記図６に示したものと同様の装置であって、抗体ビーズ２に捕獲された抗原としての菌１ａが、例えばガラス製の蓋部材９を介して観察できるように配設される。計測手順の具体例に関しては後述するとして、電場を印加する例に関して、まず基本的な手順について述べる。
【００５７】
まず、反応部３へ、抗原としての菌１ａを含む試料液を所定流量速度で導入した後、電場を印加して抗原を濃縮し、抗原・抗体反応により菌１ａを抗体ビーズ２に吸着する。続いて、蛍光染色試薬１０を注入して抗原を蛍光標識する。その後、洗浄液を通流して、前記蛍光染色試薬を洗浄した後、画像計測装置２０により、画像計測を行ない、菌の計数が可能となる。画像計測の際、反応部に空気を導入して試料液を排出してもよいが、液を満たした状態で計測することができる。また蛍光出力は、菌の体積濃度の増大とともに比例的に増大するので、予め標準濃度で検量したデータに基づき、菌の体積濃度の計数も可能である。
【００５８】
なお、ゴミなどの夾雑物の蛍光出力誤差を防止するためには、前述のように、蛍光標識する工程の前段においても画像計測を行い、蛍光標識前後の画像情報の差に基づき、抗原の画像計測を行なうことが望ましい。また、測定に当っては抗原へオートフォーカスすることが望ましいが、この具体的な方法に関しては後述する。
【００５９】
次に、蛍光標識を行なって画像計測を行なう方法の具体例について述べる。具体的な蛍光試薬としては、例えば、微生物一般を対象とする場合は、蛍光性核酸塩基類似体、核酸を染色する蛍光染色剤、タンパク質を染色する染色液、タンパク質などの構造解析に用いられる環境性蛍光プローブ、細胞膜や膜電位の解析に用いられる染色液、蛍光抗体の標識に用いられる染色液などが、また好気性細菌を対象とする場合は細胞の呼吸によって発色する染色液などが、さらに真核微生物を対象とする場合はミトコンドリアを染色する染色液、ゴルジ体を染色する染色液、小胞体を染色する染色液、細胞内エステラーゼと反応する染色液及びその修飾化合物などが、また高等動物細胞を対象とする場合は骨組織の観察に用いられる染色液、神経細胞トレーサである染色液などが適用できる。これらにより染色することにより、蛍光顕微鏡で蛍光画像が観察できる。
【００６０】
次に、前述のような方法で蛍光染色した微生物および細胞等の抗原の蛍光観察像を得る実施例について以下に述べる。即ち、分離した微生物および細胞等の抗原にエステラーゼ活性によって蛍光化する試薬、例えばカルボキシフルオレセインジアセテート（以下ＣＦＤＡと略す）を反応させる。ＣＦＤＡで蛍光染色された抗原の蛍光画像を取得する際は、まずマーカーとしての抗体ビーズ上にＣＦＤＡの蛍光波長光（例えば５００〜５５０ｎｍ）を発するオートフォーカス用光を照射する。
【００６１】
顕微鏡の焦点深度は、例えば約１０μｍ程度であり、抗体ビーズおよびビーズに捕獲された抗原は、それぞれ、例えば約１μｍ程度であるので、マーカーとしての抗体ビーズに合焦させれば、実質的に抗原にも合焦させたこととなる。従って、抗体ビーズに合焦させ後、フォーカスされた抗原計測面にＣＦＤＡを励起できる波長（例えば４５０〜５００ｎｍ）の光を照射して抗原の蛍光画像を取得する。得られた蛍光画像から、微生物および細胞等の抗原を認識、検出することができる。
【００６２】
次に、図５について述べる。図５は、請求項５の発明に関わり、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する場合の構成の概念的説明図である。（ａ）図は４個の反応部を直列に構成する場合の模式図、（ｂ）図は並列に構成する場合の模式図である。図５において、１は試料流体の導入口、４は試料流体の導入路、５は試料流体の排出口、６は蛍光染色試薬の注入口を示す。４個の反応部は、それぞれ、３ａ〜３ｄで示す。
【００６３】
前記各反応部３ａ〜３ｄは、それぞれ多種類の抗体を固定したビーズもしくは各反応部毎に異なる抗体を固定したビーズを備える。上記構成により、直列構成および並列構成のいずれの場合においても、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離することができる。但し、試料流体の各反応部への分配の均等性を考慮すると、直列構成の方が計測精度上好ましく、また構造もシンプルである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明の請求項２に関わる抗原の分離装置本体の実施例の概念的模式図
【図２】本発明の抗原の計測装置の実施例の模式的構成図
【図３】本発明の抗原の分離装置本体の断面斜視分解図，断面斜視図および断面図
【図４】本発明の請求項１に関わり、空気層と試料液層との層分離により抗原濃縮する実施例の概念的説明図
【図５】本発明に関わり、多種類の抗原を含む試料流体内の各抗原を個別に分離する場合の構成の概念的説明図
【図６】特願２００２−３０６４８号に記載されたオートフォーカスを行なう蛍光画像計測装置の構成の一例を示す図
【図７】差分画像による細菌数の計測方法を示す図
【図８】特許文献１に記載された免疫分析装置の斜視図
【符号の説明】
【００６５】
１：導入口、１ａ：菌、１ｂ：ゴミ、２：抗体ビーズ、３，３ａ〜３ｄ：反応部、４：導入路、４ａ：段差部、５：排出路、６：蛍光染色試薬の注入口、７：流路、８：成型部材、９：蓋部材、１０：蛍光染色試薬、１１：空気の導入口、２０：画像計測装置、３０：電場発生手段。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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