(57)【要約】【課題】目的タンパク質を大量に得るために有効なバクミド変異体、またこのようなバクミド変異体を用いて目的タンパク質を長期間にわたって大量に得る。【解決手段】ｍｉｎｉＦレプリコン、システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部を共に欠損しているバキュロウイルスＤＮＡ、トランスポゾンの付着部位、を有するバクミド変異体と、このバクミド変異体と、目的タンパク質遺伝子配列と、トランスポゼースとにより、大腸菌中で、目的タンパク質発現バクミドを得ること、前記目的タンパク質発現バクミドをカイコ細胞又はカイコに感染させること、により、タンパク質を製造する。【選択図】図１
2008086239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉｎｉＦレプリコン
システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部を共に欠損しているバキュロウイルスＤＮＡ
トランスポゾンの付着部位
を有するバクミド変異体。
【請求項２】
前記バキュロウイルスＤＮＡが、配列番号１で示されるキチナーゼ遺伝子配列のうち１番目から６６番目の塩基を欠損しているものである請求項１記載のバクミド変異体。
【請求項３】
前記バキュロウイルスＤＮＡが、配列番号３で示されるシステインプロテアーゼ遺伝子配列のうち、１番目から３５３番目の塩基を欠損しているものである請求項１記載のバクミド変異体。
【請求項４】
前記バキュロウイルスＤＮＡが、配列番号１で示されるキチナーゼ遺伝子配列のうち１番目から６６番目の塩基を欠損しているものと共に、配列番号３で示されるシステインプロテアーゼ遺伝子配列のうち１番目から３５３番目の塩基を欠損しているものである請求項１記載のバクミド変異体。
【請求項５】
前記バキュロウイルスＤＮＡが、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＮＰＶであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のバクミド変異体。
【請求項６】
前記ＡｃＮＰＶが、１５２番目のアミノ酸がアスパラギンとなるＤＮＡヘリカーゼ遺伝子のHind III−SacＩフラグメントを含むものである請求項５記載のバクミド変異体。
【請求項７】
請求項１記載のバクミド変異体の製造方法であって、
ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドに、
ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置された挿入配列、
からなる挿入フラグメントを、
λバクテリオファージのリコンビナーゼＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍで構成されたλリコンビネーション系を用いて、相同組換えさせることを特徴とする製造方法。
【請求項８】
前記挿入配列が、目的タンパク質をコードする配列を有することを特徴とする請求項７基記載のバクミド変異体の製造方法。
【請求項９】
前記目的タンパク質遺伝子配列がドナープラスミド上にあり、更にトランスポゼースを使用することによって目的タンパク質発現バクミドを得ることを特徴とする請求項７記載のバクミド変異体の製造方法。
【請求項１０】
バクミド変異体を用いたタンパク質の製造方法であって、
大腸菌中で、請求項１〜６のいずれか１項記載のバクミド変異体と、目的タンパク質遺伝子配列と、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得ること、
前記目的タンパク質発現バクミドをカイコ細胞又はカイコに感染させること、
を含むことを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質発現バクミドが、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法によって得られたものである請求項１０記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１２】
バクミド変異体を用いたタンパク質製造のためのキットであって、
（１）ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドと、
（２）ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置され、発現目的タンパク質遺伝子を導入可能な挿入配列、で構成された挿入フラグメントと、
（３）λバクテリオファージのＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍを発現可能な発現ベクターと、
を少なくとも含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクミド変異体及びその製造方法、並びにこれを用いた目的タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えバキュロウイルスは、昆虫の培養細胞や幼虫個体において外来遺伝子を発現させるためのベクターとして広く利用されている。組換えバキュロウイルスを用いることによって、ポリへドリンプロモータの下流に置かれた外来遺伝子を、ウイルスの感染後期に大量に発現させることができる。ここで得られた組換えタンパク質には、ほとんどの場合、プロセシング、修飾、局在化などが本来のタンパク質と機能的に近い状態で行われるため、大腸菌のみを利用したタンパク質生成では得ることができない複雑な構造のタンパク質を得ることができる。外来遺伝子の発現を更に効率よく行うために、大腸菌内で増幅可能な、オートグラファ・カルフォルニカ多核体ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus：ＡｃＮＰＶ）をバックボーンとするバキュロウイルスのシャトルベクター（バクミド：ｂａｃｍｉｄ）も開発されている（非特許文献１）
さらに効率よく組換え遺伝子の発現を行うために、カイコ発現系に利用されるカイコ(Bombix mori）核多角体病ウイルス（Bombyx mori NPV：ＢｍＮＰＶ）をＢＡＣ（Bacterial Artificial Choromosome）クローン化できるＢｍＮＰＶシャトルベクターが開発され、大腸菌体内でのクローニングや組換えウイルスの構築を迅速に行うことができるようになった（特許文献１）。
【０００３】
ところで、カイコに外来遺伝子の発現を行った場合、ウイルス由来のプロテアーゼによって、発現されたタンパク質は分解されてしまい、得られる組換え遺伝子タンパク質の収率が低下することが知られている。システインプロテアーゼの活性を阻害させるには、プロテアーゼ阻害剤も有効であるが、大量生産で扱う生体レベル（カイコ）ではプロテアーゼ阻害剤を使用することが不可能であるため、ウイルス内のプロテアーゼ遺伝子を直接ノックアウトさせる必要がある。
【０００４】
このような方法として、ＢｍＮＰＶにおいてシステインプロテアーゼ遺伝子を同定し、このシステインプロテアーゼ遺伝子を欠損させたウイルスが開発されている（特許文献２及び非特許文献２）。この方法でのバキュロウイルスは、昆虫細胞で発現するキイロショウジョウバエｈｓｐプロモータ下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が組み込まれているため、宿主であるカイコへ感染させた場合に、常にβ−ガラクトシダーゼが発現されることになる。
更に、非特許文献３には、ＡｃＮＰＶのｖ−ｃａｔｈとｃｈｉＡの遺伝子を欠損させたベクター（BacVector 3000)が開示されており、このウイルスに感染したｓｆ９細胞のライセートでは、βグルクロニダーゼやＧＦＰの分解が大きく抑制されることが記載されている。
【特許文献１】特開２００４−１７３５０７号公報
【特許文献２】特開平７−３０３４８８号公報
【非特許文献１】J. Virol., (1993) 67, p.4566-4579
【非特許文献２】J. Gen. Virol., (1997) 78, p.3073-3080
【非特許文献３】Biosci. Biotechnol. Biochem., (2003) 67, p.2388-2395
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のようにカイコを用いてタンパク質の大量発現を行う場合、異種の遺伝子をそのまま導入しているため、異種遺伝子によって発現したタンパク質はバキュロウイルス由来のプロテアーゼによって分解現象が起こる。一方、カイコの骨格はキチン質で構成されているためバキュロウイルス由来のキチナーゼの発現によってカイコが溶解するという現象が起こる。このような生成タンパク質のプロテアーゼによる分解や、キチナーゼの発現によるカイコ自身の溶解は、効率的タンパク質生産の障害となっている。特に強力なプロモータを用いてタンパク質を発現したとしてもキチナーゼによってカイコ自身の溶解した場合，短時間当りの生成量が多くてもカイコを用いて発現させることができる期間が限られてしまうため、結果的に目的タンパク質の生成量の向上はできない。
【０００６】
従って、本発明の目的は、目的タンパク質を大量に得るために有効なバクミド変異体、またこのようなバクミド変異体を用いて目的タンパク質を長期間にわたって大量に得ることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のバクミド変異体は、ｍｉｎｉＦレプリコン、システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部を共に欠損しているバキュロウイルスＤＮＡ、トランスポゾンの付着部位を有するものである。
ここで、前記バキュロウイルスＤＮＡが、配列番号１で示されるキチナーゼ遺伝子配列のうち１番目から６６番目の塩基を欠損しているものであることが更に好ましい。
また、前記バキュロウイルスＤＮＡが、配列番号３で示されるシステインプロテアーゼ遺伝子配列のうち１番目から３５３番目の塩基を欠損しているものであることが更に好ましい。
【０００８】
本発明の上記バクミド変異体の製造方法は、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドに、ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置された挿入配列、からなる挿入フラグメントを、λバクテリオファージのリコンビナーゼＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍで構成されたλリコンビネーション系を用いて、相同組換えさせることを含むものである。
ここで、前記目的タンパク質遺伝子配列がドナープラスミド上にあり、更にトランスポゼースを使用することによって前記目的タンパク質発現バクミドを得ることが好ましい。
【０００９】
本発明のタンパク質の製造方法は、バクミド変異体を用いたタンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、上記のバクミド変異体と、目的タンパク質遺伝子配列と、トランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得ること、前記目的タンパク質発現バクミドをカイコ細胞又はカイコに感染させることを含むものである。
【００１０】
本発明のタンパク質製造のためのキットは、バクミド変異体を用いたタンパク質製造のためのキットであって、（１）ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドと、（２）ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置され、発現目的タンパク質遺伝子を導入可能な挿入配列、で構成された挿入フラグメントと、（３）λバクテリオファージのＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍを発現可能な発現ベクターと、を少なくとも含むものである。
【００１１】
本発明のバクミド変異体は、システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とを共に欠損したバキュロウイルスＤＮＡを有するものである。この結果、生成タンパク質やカイコを構成するタンパク質に作用するシステインプロテアーゼのみならず、カイコ自身を溶解可能なキチナーゼの発現を抑制することができる。
この結果、カイコ自身の溶解を効果的に抑制することができ、カイコによるタンパク質生成を長期間にわたって継続させることができる。
【００１２】
なお、本発明において「バクミド」とは、大腸菌のトランスポゾン（Ｔｎ）のターゲットサイトと大腸菌プラスミドＦ因子の複製系を有するバキュロウイルスＤＮＡとを少なくとも含むＢＡＣクローン化したバキュロウイルスシャトルベクターをいう。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、目的タンパク質を大量に得るために有効なバクミド変異体、またこのようなバクミド変異体を用いて目的タンパク質を長期間にわたって大量に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明のバクミド変異体に含まれるバキュロウイルスＤＮＡは、システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部を共に欠損しているものである。
これら２つの遺伝子を欠如することによって、システインプロテアーゼ及びキチナーゼがいずれも機能的に有効な酵素として発現されることがない。この結果、カイコの細胞のみならず、カイコ本体やサナギ自体を溶解させることがなく、カイコの細胞や本体、サナギの寿命をのばすことができる。これにより本バクミド変異体を用いて所定の目的タンパク質の発現を行う際には、機能的なタンパク質をより長期間にわたって生成させることができる。また、カイコの細胞や本体が溶解しないので、目的タンパク質にカイコ細胞や本体由来のタンパク質等が含まれることがない。これにより、得られるタンパク質量を増加することができる。
【００１５】
キチナーゼ遺伝子は、バキュロウイルスＤＮＡ上に存在すると共にカイコ個体を構成するキチンを溶解する原因キチナーゼをコードする遺伝子をいう。
本発明において欠損の対象となるキチナーゼ遺伝子には、好ましくはＢｍＮＰＶキチナーゼ、更に好ましくは配列番号１で示されるものが該当する。
欠損するキチナーゼ遺伝子は、機能的に有効な酵素としてのキチナーゼを生成しないように欠損されているものであればよく、全長を欠損しているものであってもよいが、バクミド変異体の製造効率や部分欠損キチナーゼの酵素活性等の観点から、配列番号１で示される塩基配列のうち１番目から６６番目の塩基を欠損しているものが好ましい。この結果、配列番号２で示されるキチナーゼのアミノ酸配列のうち１番目から２２番目のアミノ酸が欠損し、生成されるキチナーゼの活性を効果的に抑制することができる。
【００１６】
また、システインプロテアーゼ遺伝子は、バキュロウイルスＤＮＡ上に存在すると共に生成タンパク質の分解及び組織等の液化を生じさせる原因システインプロテアーゼをコードする遺伝子をいう。
このようなシステインプロテアーゼ遺伝子としては、ＡｃＮＰＶのカテプシンＬに類似した特徴を有するプロテアーゼの遺伝子（v-cath）及びこの類似遺伝子を挙げることができる。v-cathは、ＡｃＮＰＶ ＤＮＡにおいてエンベロープ表面の糖タンパク質ｇｐ６７をコードする遺伝子の下流に存在し、３２ｋＤａとＮ−グリコシル化された３５．５ｋＤａの２つの前駆体を持ち、糖鎖とシグナルペプチドの切断によって２７０５ｋＤａの活性体に変換される。至適ｐＨは５．０であり、システインプロテアーゼ阻害剤のＥ６４とロイペプチンによって阻害され、カテプシンＬと同様に尿素によって活性が増加する。
本発明において欠損の対象となるシステインプロテアーゼ遺伝子には、v-cathと、v-cathと相同性のある遺伝子、好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子、更に好ましくは９６．３％の相当性を有する遺伝子（配列番号３）が該当する。
【００１７】
欠損するシステインプロテアーゼ遺伝子は、機能的に有効な酵素としてのシステインプロテアーゼを生成しないように欠損されているものであればよく、全長を欠損しているものであってもよい。本バクミド変異体の製造効率や部分欠損システインプロテアーゼの酵素活性の観点から、好ましくは配列番号３で示されるシステインプロテアーゼ遺伝子配列のうち１番目から３５３番目の塩基を欠損しているものである。この結果、配列番号４で示されるシステインプロテアーゼのアミノ酸配列のうち１番目から１１８番目のアミノ酸が欠損し、生成されるシステインプロテアーゼの活性を効果的に抑制することができる。
【００１８】
また、システインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子とはバキュロウイルスＤＮＡ上で互いに隣接し且つ逆方向に配置されているので、１又は２の酵素によって一度の処理で両遺伝子の欠損を行うことが、処理効率の観点から好ましい。特に、前述したようにキチナーゼ遺伝子及びシステインプロテアーゼ遺伝子のそれぞれの特定部位を一度に欠損させることができる制限酵素の組み合わせが好ましく、このような制限酵素としては、ＰｓｈＡＩ（システインプロテアーゼ遺伝子側）とＳｇｒＡＩ（キチナーゼ遺伝子側）との組み合わせを挙げることができる。ＰｓｈＡＩとＳｇｒＡＩとを用いることによって、前述の１番目から２２番目までのアミノ酸を欠損したキチナーゼと１番目から１１８番目までのアミノ酸を欠損したシステインプロテアーゼを同時に得ることができる。
【００１９】
本発明のバクミド変異体に含まれるｍｉｎｉＦレプリコンは、大腸菌ＤＨ５αＦ’ＩＱより分離したプラスミド由来の配列であって複製に必要な領域を意味する。本発明のバクミドでは、ｃｃｄＡ、ｃｃｄＢ、ｒｅｓＤおよびｒｅｐＥの各遺伝子ならびに４ヶ所のリピートユニットを含有するｍｉｎｉＦレプリコンが用いられる。このｍｉｎｉＦレプリコンは、例えばＦ’レプリコンから得ることができる。このｍｉｎｉＦレプリコンの構造は、例えば特開２００４−１７３５０７号公報に開示されている。
【００２０】
バキュロウイルスＤＮＡとしては、ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ又はＡｃＮＰＶ ＤＮＡを挙げることができる。ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを用いるかＡｃＮＰＶ ＤＮＡを用いるかは、本バクミドの使用目的によって適宜変更可能である。
ＢｍＮＰＶは、蚕の幼虫、蚕の蛹および蚕の培養細胞に感染して、感染細胞の核内に多角体をつくるカイコガ核多角体病ウイルス（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus）を意味し、「ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ」は、ＢｍＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
ＡｃＮＰＶは、オートグラファ・カルフォルニカ多角体病ウイルス（autographa Californica nuclear polyhedrosis virus）を意味し、「ＡｃＮＰＶ ＤＮＡ」は、ＡｃＮＰＶのＤＮＡ配列を意味する。
【００２１】
ＡｃＮＰＶの場合には、１５２位アミノ酸がアスパラギンであるＤＮＡヘリカーゼ遺伝子のHind III−SacＩフラグメントを含むものであることが特に好ましい。このようなフラグメント中のＤＮＡヘリカーゼ遺伝子は、ＢｍＮＰＶのＤＮＡヘリカーゼ遺伝子に見出されるものである。このようにＤＮＡヘリカーゼ遺伝子がＢｍＮＰＶ型（配列番号５、アミノ酸配列：配列番号６）に変更されているので、昆虫細胞とカイコ（カイコ細胞）との双方に感染可能となって、宿主を拡大することができる。好ましくは更に他のアミノ酸が天然型ＡｃＮＰＶと異なっていてもよい。この２以上の部位において天然型と異なっている宿主拡張配列としては、１５２位のアスパラギンに加えて、１９３位がチロシン、１４４位がロイシン、１６５位がロイシンからなる群より選択された少なくとも１つを有するものである。ＢｍＮＰＶのＤＮＡヘリカーゼ遺伝子全体を、ＡｃＮＰＶのＤＮＡヘリカーゼ遺伝子全体に対する相同組換えによって導入してもよい。
【００２２】
トランスポゾン（Ｔｎ）の付着部位とは、ドナーベクター内のトランスポゼース認識配列に挟まれた外来遺伝子（発現目的遺伝子）を、転位酵素トランスポゼースによりシャトルベクター内の標的部位に挿入させるための配列である。トランスポゾンの付着部位としては、Ｔｎ７の付着部位ｍｉｎｉ−ａｔｔＴｎ７、Ｔｎ３の付着部位およびＴｎ４の付着部位などが挙げられる。このＴｎは、例えば、ｌａｃＺ遺伝子（例えば、ｌａｃＺα遺伝子）に含まれている。
【００２３】
この他、ベクターの構造の確認及び選別のために、種々のマーカー配列及び選択用配列等の補助配列を含んでもよい。外来遺伝子がシャトルベクター上に挿入されたことを確認するために利用されるマーカー配列としては、例えば、ＬａｃＺ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、薬剤耐性遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を挙げることができる。目的とする構造のベクターを選択するための選択用配列としては、薬剤耐性遺伝子、例えば、カナマイシン耐性遺伝子やアンピシリン耐性遺伝子などを挙げることができる。これらの補助配列は、当業者により適宜選択することができる。
【００２４】
本発明のシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損のバクミド変異体は、ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドに、ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置された挿入配列、からなる挿入フラグメントを、λバクテリオファージのリコンビナーゼＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍで構成されたλリコンビネーション系を用いて、相同組換えさせることによって作製することができる。
特定の配列を欠損させるためには種々の方法が知られているが、本発明のバクミド変異体では、適合性や確率の観点から、λリコンビネーション系を用いることによって、本発明のバクミド変異体を効率よく得ることができる。
【００２５】
ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位から構成されたバクミドの基本骨格は、公知の方法で作成することができ、例えば前述の例えば特開２００４−１７３５０７号公報や、Biochemical and Biophysica Research Communications 326 (2005) 564-9569などの記載されている。
本製造方法では、このようなバクミドに対して、欠損標的部位に対応した所定の挿入フラグメントをλリコンビネーション系による相同組換えに供する。
【００２６】
挿入フラグメントに含まれる一対の相同配列は、上記システインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部及びキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域と相同組換えを起こさせるために、この標的領域の両端側のそれぞれ所定の領域の配列と相同性を有する配列である。相同配列は、標的領域の両側に配置されて相同組換え可能な程度の長さがあればよく、例えば３０〜２００ｂｐの範囲で変更することができる。組換え精度の観点からは、１００〜２００ｂｐが好ましく、経済的な観点からは３０〜５０ｂｐが好ましいので、これら双方の観点を考慮すれば、好ましくは５０〜７５ｂｐ、さらに好ましくは３６〜５０ｂｐの長さにすることができる。
【００２７】
標的領域との相同組換えが可能であれば、一対の相同配列の位置は特に限定されず、相同配列の長さに応じて適宜設定することができる。例えば、標的領域の上流側及び下流側３５〜５０ｂｐの位置からそれぞれ開始する配列とすることができ、確実に相同組換えを起こさせるために４０〜５０ｂｐの位置からの配列とすることができる。
なお相同配列における「相同」とは、本明細書では、対象となる配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する配列をいう。
【００２８】
本発明において利用されるλリコンビネーション系とは、Murphyの文献（J. Bacteriology, (1998) p.2063-2071）に記載されているものである。
このλリコンビネーション系とは、λバクテリオファージで機能するリコンビネーション系であり、大腸菌内で作用することが知られている。これは、ｇａｍ、ｂｅｔ、ｅｘｏで構成されており、Ｇａｍは、宿主のＲｅｃＢＣＤとエクソヌクレアーゼＶを阻害し、Ｂｅｔ及びＥｘｏがＤＮＡ末端に接近することができ、これら両者が相互作用することによって効率的な相同組換えが促進される。
Ｇａｍ、Ｂｅｔ、Ｅｘｏを発現させるために発現ベクターを用いてもよい。ここで使用される発現ベクターは、大腸菌において機能可能な発現系を有するものであればよく、例えば、アラビノースオペロン制御下で発現するようにクローン化されたプラスミドが用いられる。このようなプラスミドとしては、一般に使用されているものであればよく、例えばｐＵＣ１８等を挙げることができる。
【００２９】
挿入配列は、相同組換えにより、対象となるバキュロウイルスＤＮＡ中のシステインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子に代ってバクミドに組み込まれる。挿入配列としては、ポジティブ選択用のマーカー配列、例えば薬剤耐性遺伝子としてもよく、或いは、目的とするタンパク質をコードする配列であってもよい。特に目的とするタンパク質のコード領域を挿入配列とすることは、マーカー遺伝子のような目的外のタンパク質を生成することがなく、効率よくタンパク質の生成を行うことができるため、特に好ましい。
挿入フラグメントは、この目的のために使用可能ないずれの方法を用いて作製してもよいが、ＰＣＲを利用した遺伝子欠損用ＰＣＲフラグメントであることが好ましい。このとき、ＤｐｎＩ処理を行って、メチル化していないＰＣＲフラグメントからメチル化されているテンプレートプラスミドを完全に除去することが好ましい。
挿入配列は、挿入可能な長さのものであればよく、例えば１１００〜１３００ｂｐ、好ましくは１１００〜１２００ｂｐとすることができ、これらの範囲から、適宜選択可能である。
【００３０】
λリコンビネーションは、λリコンビネーション系が作用可能な大腸菌（コンピテントセル）内において行われる。このような大腸菌としては、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５αなどを挙げることができる。これらのコンピテントセルには、予めトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドが組み込まれているので、λリコンビネーション系とバクミド生成系とを同時に行うことができる。
【００３１】
コンピテントセルへの各種核酸の導入には、通常用いられる手段をそのまま適用することができ、例えばエレクトロポレーションなどの電気的手法や、塩化カルシウム法などの薬剤を用いた化学的手法を挙げることができる。このうち、導入効率の観点から電気的手法であることが好ましい。
相同組換えは、バクミド及び挿入フラグメントを含む細胞を、λリコンビナーゼが作用可能な条件下に供することによって容易に実行することができる。このような条件は、通常の酵素活性化条件でよく、例えば３７℃の温度で、１時間程度で行うことができる。
【００３２】
本発明のバクミド変異体は、生成し、増殖させるために、大腸菌（コンピテントセル）へ導入される。このような大腸菌としては、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ５αなどを挙げることができる。これらのコンピテントセルには、予めトランスポゼースを発現するヘルパープラスミドが組み込まれているので、後述するドナープラスミドを共存させることによって、バクミドへ目的タンパク質配列が相同組換えによって挿入される。
【００３３】
コンピテントセルへの各種核酸の導入には、通常用いられる手段をそのまま適用することができ、例えばエレクトロポレーションなどの電気的手法や、塩化カルシウム法などの薬剤を用いた化学的手法を挙げることができる。このうち、導入効率の観点から電気的手法であることが好ましい。
【００３４】
目的タンパク質の配列は、トランスポゾンＴｎの両末端の配列を有するドナープラスミドに組み込んで、本発明のバクミド及びヘルパープラスミドと同一のコンピテントセルに共存させればよい。この結果、ヘルパープラスミドの作用によって目的タンパク質配列がバクミドに組み込まれ、目的タンパク質発現バクミドを得ることができる。
【００３５】
上述に従って得られたバクミド変異体を用いて、所望のタンパク質を大量に効率よく生成することができる。
即ち、本発明のタンパク質の製造方法は、バクミド変異体を用いた目的タンパク質の製造方法であって、大腸菌中で、本発明のバクミド変異体と目的タンパク質遺伝子配列とトランスポゼースとにより、目的タンパク質発現バクミドを得ること、前記目的タンパク質発現バクミドをカイコ細胞に感染させることを含むことを特徴としている。
【００３６】
目的タンパク質発現バクミドは、バクミド系を用いてタンパク質生成を行うために、トランスポゼースを有するヘルパープラスミドを用いる通常の方法によって、容易に得ることができる。
ここで使用されるヘルパープラスミドは、当業界では既知であり、主としてトランスポゼース遺伝子配列と選択マーカー配列とを有するものである。目的タンパク質発現バクミド作成のために使用されるトランスポゼースは、使用されるトランスポゾンの種類に応じて適宜選択可能である。このようなヘルパープラスミドは、例えばインビトロジェン社から購入することができる。
【００３７】
目的タンパク質発現バクミドを導入（感染）するカイコの細胞としては、天然のカイコの個体から得られた細胞の他、確立した細胞株であってもよい。このような細胞株としては、例えば、Ｂｍ５、ＢｍＮ４等を挙げることができ、細胞の増殖の観点からＢｍ５であることが好ましい。カイコ細胞への導入には、ウイルス溶液をカイコに直接接種してもよく、餌などに混ぜて摂取させてもよいが、感染効率の観点からカイコへの直接接種することが好ましい。
なお、導入をカイコ蛹（さなぎ）に対して行ってもよい。さなぎの組織がほとんど脂肪体で構成されており、カイコ幼虫に比べて感染力や目的タンパク質の発現効率が高く、また長期保存が可能であるため、好ましい。その上、カイコ由来のプロテアーゼやキチナーゼの発現が抑制された状態とすることができるので、より一層、効率よく目的タンパク質を得ることができる。この場合には、特に、非分泌タンパク質を目的タンパク質とした場合に有効である。
【００３８】
更に、生成されたタンパク質の回収工程を設けてもよい。
このような回収工程としては、通常、カイコ個体を用いた生成タンパク質の回収に用いられる手段であればいずれも用いることができ、例えば、Ｈｉｓタグ及びＦｌａｇタグのようなタグや、発現タンパク質に対する抗体などを用いる方法や、イオン交換カラム及びアフィニティカラムなどによる精製方法など、公知の手段を用いることができる。
【００３９】
また、生成タンパク質の回収としては、カイコ細胞、カイコ個体の体液や組織からの回収を挙げることができるが、実施が容易であることからカイコ個体の体液からの回収が好ましい。体液からの回収を効率よく行うために、細胞外へ分泌させるために適当なシグナルペプチドを目的タンパク質に連結させることが好ましい。このようなシグナルペプチドとしては、カイコ脳神経ペプチドホルモン由来のシグナルペプチドｂｘ（例えば、配列番号７）、フェノール酸化酵素前駆体活性化酵素由来シグナルペプチドｐｐａｅ（例えば、配列番号８）等を挙げることができる。これらのシグナルペプチドと目的タンパク質との融合タンパク質の製造については、目的タンパク質の遺伝子に連結させることにより容易に行うことができ、当業界で既知の手法をそのまま用いることができる。
【００４０】
また本発明には、上記のような目的タンパク質の製造方法を容易に実行させるためのキットも含まれる。
即ち、本発明のタンパク質製造キットは、バクミド変異体を用いたタンパク質製造のためのキットであって、（１）ｍｉｎｉＦレプリコン、バキュロウイルスＤＮＡ及びトランスポゾンの付着部位を含むバクミドと、（２）ａ）該バキュロウイルスＤＮＡ上に存在するシステインプロテアーゼ遺伝子の少なくとも一部とキチナーゼ遺伝子の少なくとも一部とで構成された標的領域の上流及び下流と相同性を有する一対の相同配列、ｂ）該相同配列間に配置され、発現目的タンパク質遺伝子を導入可能な挿入配列、で構成された挿入フラグメントと、（３）λバクテリオファージのＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍを発現可能な発現ベクターと、を少なくとも含むものである。
ここでの相同配列など、前記したものについては前述の記載をそのまま適用可能である。
このようなキットを用いることによって、目的とするタンパク質を容易に大量に製造することができる。
【００４１】
また、挿入フラグメント中の挿入配列には、発現目的タンパク質遺伝子が導入可能となっている。発現目的タンパク質遺伝子の導入を可能にするには、例えば複数の制限酵素の切断部位で構成されたマルチクローニングサイトなど、当業界で既知の手段を適用すればよい。
【００４２】
また、これらの発現系に加えて、バクミドの増殖に必要な昆虫細胞、更には、目的タンパク質の大量生成に使用可能なカイコ個体又はカイコ細胞、及び目的タンパク質遺伝子を挿入可能なドナープラスミドの少なくとも一方を更に含むものであってもよい。
更には、バクミドと、λバクテリオファージのＢｅｔ、Ｅｘｏ及びＧａｍを発現可能な発現ベクターとは、これら両者を有する大腸菌の形態として存在してもよい。また、このとき、上述したヘルパープラスミドを更に含むものであってもよい。
このようなキットを用いることによって、目的とするタンパク質を容易に大量に製造することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【００４４】
［実施例１］
［１］システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損用フラグメントの作製
ＢｍＮＰＶ ＤＮＡに対して、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号９）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物を精製し、pT7Blue Vector（Novagen）に導入し、ｐＢｍＣＫＩを得た。ＢｍＮＰＶ ＤＮＡでは、システインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子とは逆向きの方向で隣接していることがわかっている。ＰＣＲ条件は１０×ＫＯＤバッファー、１００μＭ ｄＮＴＰ、１．２ｍＭ Ｍｇ２＋、１ｕｎｉｔ ＫＯＤｐｏｌ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、野生型ＢｍＮＰＶ ＤＮＡ（フナコシ社）をテンプレートとして４０μｌ系で調製し、９４℃３０ｓｅｃ、６０℃３０ｓｅｃ、７４℃４５ｓｅｃを２５サイクル行った。増幅させた５７２ｂｐのＰＣＲフラグメントを１．５％アガロースゲル電気泳動した後、ゲルから切り出し、精製を行った。精製された５７２ｂｐＰＣＲフラグメントとｐＵＣ１８をSacＩ/Hind IIIで３７℃、２時間消化した後同様にアガロース電気泳動を行い、それぞれゲルから切り出して精製した。
【００４５】
システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子を含むＰＣＲ産物をクローニングしたベクタープラスミドｐＢｍＣＰＫＩを得た（図１）。このｐＢｍＣＰＫＩのＳｇｒＡＩ−ＰｓｈＡＩ断片には、システインプロテアーゼ配列のアミノ酸１番目から１１８番目までと、キチナーゼ配列のアミノ酸１番目から２２番目までの配列に対応する塩基配列が含まれている。
【００４６】
次に、ｐＫＤ３（エール大学（米）のMary K. B. Berlyn博士から供与）とプライマーセットＣａｔ０５１２３０（配列番号１１）−Ｃａｔ０５１２３１（配列番号１２）を用いて前記と同様にＰＣＲを行い、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセット（ＣＡＴ）を精製した（図１）。
ｐＢｍＣＰＫＩプラスミドをＳｇｒＡＩ−ＰｓｈＡＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（例えば宝酒造のBlunting kit）で平滑末端化した後、この平滑化したｐＢｍＣＰＫＩプラスミドに、クロラムフェニコール耐性遺伝子カセットを挿入して連結し、プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴを得た（図２）。
【００４７】
［２］システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子欠損用カセットの作製
プラスミドｐＢｍＣＰＫＩ−ＣＡＴから、プライマーセットＡｃ０５１２３２（配列番号９）−Ａｃ０５１２２９（配列番号１０）を用いてＰＣＲを行い、システインプロテアーゼ遺伝子のうちアミノ酸１番目から１１８番目と、キチナーゼ遺伝子のうち１番目から２２番目とがクロラムフェニコール耐性遺伝子に置き換わったシステインプロテアーゼ遺伝子およびキチナーゼ遺伝子欠損用カセットを得た（図３)。
【００４８】
［２］プラスミドのサブクローニング
温度感受性レプリコンをもつと共にリコンビナーゼを発現するｐＫＤ４６（図４参照：エール大学（米）のMary K.B. Berlyn 博士から供与）を、アンピシリンＬＢ培地中で３０℃一晩培養して、サクローニングした。またテンプレートプラスミドであるｐＫＤ３（図２及び図４参照：エール大学（米）のMary K.B. Berlyn 博士から供与）を、アンピシリンＬＢ培地中で３７℃一晩培養し、サブクローニングした。
【００４９】
［３］ｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶのシステインプロテアーゼ及びキチナーゼ欠損変異体の構築（図３参照）
ｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶ ＤＮＡを含むＤＨ１０Ｂコンピテントセル（インビトロジェン社）にRed recombinase plasmid ｐＫＤ４６をトランスフォーメーションし、Ｋａｎ／Ａｍｐ ＬＢプレート（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）上で３０℃一晩培養した。生育したコロニーのうちｂａｃｍｉｄ−ＢｍＮＰＶとｐＫＤ４６が含まれているものを選択し、０．２％−アラビノース存在下のＳＯＢ培地（カナマイシン、アンピシリン：各５０μg/ml）で再度３０℃一晩培養した培養液（Ｄ６１０の値が０．５〜０．６）に氷冷１０％グリセロールを加えて、エレクトロポレーション用のコンピテントセルを作製した。
作製したコンピテントセル５０μｌに５００ｎｇの精製ＣＰＫＩ−ＣＡＴフラグメントを常法に従ってヒートショックによってトランスフォーメーションし、５００μｌのＳＯＣを添加後に３７℃１時間培養した。この際、ＤＨ１０ＢａｃコンピテントセルはλｒｅｄリコンビナーゼをコードするｐＫＤ４６を含んでいるので、アラビノースによって３種類のλリコンビナーゼ、ｇａｍ，ｂｅｔ，ｅｘｏが誘導される。Ｇａｍは相同組換えを阻害する宿主大腸菌Ｋ１２のｒｅｃＢＣＤ遺伝子産物であるエクソヌクレアーゼＶを阻害するが、ＢｅｔとＥｘｏはＤＮＡ末端に接近して相同組換えを促進する。培養液をＣｍ／Ｋａｎ ＬＢプレート一枚に付き２５０μｌでプレーティング後、３７℃一晩培養した。ｐＫＤ４６プラスミドは温度感受性レプリコンをコードしているため、このときに自動的に除去される。形成されたコロニーを拾い、システインプロテアーゼ及びキチナーゼ欠損変異体＝ＢｍＮＰＶ Ｂａｃｍｉｄ Ｐ−Ｃ−を単離した（図３）。
【００５０】
［４］Ｐro- Ｃhi- ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄの単離と確認
λリコンビネーション系によって構築されたシステインプロテアーゼ及びキチナーゼ欠損変異体ｂａｃｍｉｄ−ＢｍＣＰＤを含むコロニーを単離後にＤＮＡを抽出し、システインプロテアーゼ遺伝子及びキチナーゼ遺伝子のさらに外側で設計したプライマーセットＢｍ９８６１４Ｆ−Ｂｍ９９９９３Ｒ（各１８mer、それぞれ配列番号１３及び１４）とＴａｑポリメラーゼを用いて２０μｌ系のＰＣＲ溶液を調製し、９４℃２０秒、５８℃２０秒、７２℃１分３０秒の合計３０サイクルのＰＣＲを行い、アガロース電気泳動によるＰＣＲ産物のサイズによって、システインプロテアーゼ遺伝子の欠損領域にＣＡＴ遺伝子が置換していることを確認した。
【００５１】
［５］酵素活性測定
（１）システインプロテアーゼ活性測定
カチオン性脂質セルフェクチン（インビトロジェン社製）を用いて精製したPro− Chi− ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、カイコの培養細胞Ｂｍ５細胞（韓国ソウル大学、B. K. Kim教授より分与）にトランスフェクションし、２７℃で９６時間培養後のウイルス液を１０倍希釈後に再度Ｂｍ５細胞へ感染し、２７℃で７２時間培養後のウイルス感染液を、システインプロテアーゼ活性測定に利用した。なお、Pro−Chi−ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄは、１×１０６ｐｆｕ／ｍｌとなるように希釈し、それぞれの実験系に供した。
in vitroの場合では、Ｂｍ５細胞へ感染させ、７２時間後の培養液を３００μｌ採取し、３５００ｒｐｍで１５分間遠心後に上清を除去し、界面活性剤１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を３００μｌ細胞沈殿物に加えて懸濁、氷上で１５分間静置した。これを細胞レベルにおけるシステインプロテアーゼ酵素液とした。
In vivoの場合では、カイコへPro−Chi−ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ（カイコ一匹あたり１×１０6ｐｆｕ／ｍｌを２０μｌ）を感染させ、組織・器官の液化現象が確認される９６時間後のカイコ体液を１００μｌ採取し、界面活性剤１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１００μｌ採取した体液に加えて懸濁、氷上で１５分間静置した。これを生体レベルにおけるシステインプロテアーゼ酵素液とした。
【００５２】
プロテアーゼ活性測定はＨｏｍらの方法（文献：Viology, 277巻178-183, 2000年）に従って行った。簡単に説明すれば、５８３μｌの０．２％アゾカゼイを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）に８３μｌの酵素液を加え、３７℃で４時間反応させた。２７μｌの１００％トリクロロ酢酸を加え、反応を停止させた。反応停止液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清に３３３μｌの９Ｍ尿素を添加した。これを４１０ｎｍで吸光度を測定し、活性を算出した。システインプロテアーゼ活性は、反応時間１時間の間、波長４１０ｎｍの吸光度を１変化させる酵素量を１Ｕとして評価した。
結果を表１に示す。
【００５３】
（２）キチナーゼ活性測定
カイコへ Pro−Chi−ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄを感染させ、組織、器官の液化現象が確認される９６時間後のカイコの体液を１００μｌ採取し、界面活性剤１％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を１００μｌ採取した体液に加えて懸濁、氷上で１５分間静置する。これをキチナーゼ酵素液とする。基質溶液は、グリコールキチンを０．０５％になるように０．０５％リン酸緩衝液、ｐＨ８．０に溶解して得る。発色試薬は、フェリシアン化カリウム［Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６］０．２５ｇを、０．５Ｍの炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）水溶液（２６．５ｇ／５００ｍｌ）５００ｍｌに溶かして、褐色ビンに保存したものを使用する。
【００５４】
反応溶液は、氷水中で基質溶液１．０ｍｌに酵素液０．１ｍｌを加えよく混和し、４０℃のウォーターバス中で１５分間反応させる。反応溶液は、反応終了後直ちに氷水で冷却してから、発色試薬２．０ｍｌを加え、１５分間煮沸する。煮沸後、氷水で冷却して、４２０ｎｍで吸光度を測定する。ブランク（対照）は、酵素溶液０．１ｍｌを５分間煮沸し、氷水で冷却後、基質溶液１．０ｍｌ、発色試薬２．０ｍｌを加え１０分間煮沸した後、氷水で冷却後、４２０ｎｍで吸光度を測定する（ブランクと試料との差  △４２０ｎｍ）。キチナーゼ活性は、時間反応１時間の間、波長４２０ｎｍの吸光度を１変化させる酵素量を１Ｕとして評価した。
結果を表１に示す。
【００５５】
［比較例］
比較例としては、システインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子を共に欠損していない野生型のＢｍバクミド（ＢｍＢａｃｍｉｄ）と、実施例１と同様にしてシステインプロテアーゼ遺伝子（全長）のみ欠損したバクミド（Ｐｒｏ−ＢｍＢａｃｍｉｄ）を用いた。
【００５６】
［実施例２］
［１］β３ＧｎＴ２導入バクミドの構築
実施例１で得られたシステインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子とを欠損したバクミド変異体と、比較例のバクミド変異体を用いて、タンパク質の発現を検討した。
発現用タンパク質としては、ヒト由来糖転移酵素：β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ(以下、β３ＧｎＴ）及びＧＦＰを用いた。
【００５７】
Pro− Chi− ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄへのβ３ＧｎＴの導入
５０μｇのｐＤＥＳＴ８−ｍｅ−ＧＦＰｕｖ−３ＧｎＴ２  ＤＮＡ（ＧＦＰｕｖ−３ＧｎＴ２融合遺伝子（ＷＯ２００４／０４８５６２参照）にメリチンシグナルＤＮＡを連結した融合遺伝子）を１００μｇのＤＨ１０Ｂａｃ／Pro− Chi− ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ／ｐＨｅｐｌｅｒコンピテントセルに形質転換した。形質転換した細胞に５００μｌのＳＣＯ培地を添加し，３７℃で１時間培養した後，ゼンタマイシン，カナマイシン，ＩＰＴＧ，およびＸ−Ｇａｌを添加したＬＢ培地を入れ，３７℃で一晩培養を行った。白のコロニーを拾い，ゼンタマイシン，カナマイシン，およびテトラサイクリンを添加したＬＢ培地で攪拌速度１５０ｒｐｍ，３７℃で更に一晩培養し，Pro−Chi− ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ／ｍｅ−ＧＦＰｕｖ−３ＧｎＴ２  ＤＮＡを単離した。単離したバクミドを、ＧＦＰ融合タンパク質遺伝子の配列から設計したプライマー（meβ3GnT2F、配列番号１５）とｂａｃｍｉｄ内の配列から設計したプライマー（Ｍ１３Ｒ、配列番号１６）を利用してｂａｃｍｉｄ内にＧＦＰ融合タンパク質遺伝子が転移し、組み込まれているかの確認を行った。
【００５８】
構築された組換えバクミドＰro- Ｃhi- ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ／me-ＧＦＰuv-３ＧｎＴ２ＤＮＡ１〜１０倍希釈して、カイコに注射して発現を確認した。４５μｌのバクミドＰro- Ｃhi- ＢｍＮＰＶ  Ｂａｃｍｉｄ／me-ＧＦＰuv-３ＧｎＴ２ＤＮＡと５μｌのＤＭＲＩ−Ｃ（1,2-dimyristyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxy ethyl ammonium bromide）を混合し常温で４５分間放置した後，４０μｌ／匹（カイコ）の割合でカイコにツベルクリン用注射器を用いて感染させた。感染３日後にＵＶライトでＧＦＰ融合タンパク質の発現を確認した。
【００５９】
［４］β３ＧｎＴ活性の測定
実施例及び比較例の各バクミド変異体を注射後５日目、６日目及び７日目に、カイコの足或いは尾部を切断し、氷上で体液を採集した。採集した体液に５ｍＭの１−フェニル−２−チオウレアを少量添加して、４℃で２５０００×ｇで遠心分離して上澄みを酵素液の試料とした。
β３ＧｎＴ反応は、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ塩化満願、１９ｍＭのＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、２２ｍＭのＧａｌβ１−４ＧｌｕｃＮＡｃβ−ｐＮＰ、試料５μｌを含有する全量２５μｌの試料液を調製した後、３７℃２４時間インキュベートすることによって行った。
β３ＧｎＴ反応終了後、５μｌの反応液を分取し、１９５μｌの蒸留水を添加した。更に５分間煮沸し、０．４５μｍニトロセルロースフィルターでろ過して、生成物をＨＰＬＣによって検出した。ＨＰＬＣは、Mightysil RP-18（Ｈ）ＧＰ１５０−４．６（関東化学（株）社製）を用い、流速１．０ｍｌ／分、カラム温度４０℃で行った。生成物は、１０％メタノールを用いて、吸光度３００ｎｍで検出した。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＧｌｃＮＡｃを転移させる酵素量と定義した。
結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2008086239.tif 000003
【００６１】
［５］結果
表１に示されるように、システインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子とを欠損させた本実施例のバクミド変異体では、プロテアーゼ及びキチナーゼの両酵素活性が共に、野生型及びシステインプロテアーゼ遺伝子のみを欠損させた比較例のバクミド変異体よりも低く、システインプロテアーゼとキチナーゼの両酵素の活性を効果的に抑制していることがわかる。このことは、システインプロテアーゼ遺伝子欠損バクミド変異体と同様に、カイコ幼虫に注射後７日を経過してもカイコ幼虫は生存しており、幼虫の黒変化及び液状化が見られないことからも明らかであった（図５参照）。
【００６２】
また、システインプロテアーゼ遺伝子のみを欠損させたバクミド変異体（図６（Ａ））と比較して、システインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子とを欠損させた本実施例のバクミド変異体を用いた方が、ＧＦＰの発現量が多いことは明らかであった（図６（Ｂ））。
このように本実施例のバクミド変異体によるβ３ＧｎＴは、表１に示されるように、５日目から検出可能となり、７日目においても活性が認められた。これに対してシステインプロテアーゼ遺伝子のみを欠損させたバクミド変異体の場合には、５日目に検出されたβ３ＧｎＴが７日目には認められなくなった。このことは、本実施例のバクミド変異体では、キチナーゼ遺伝子の欠損によってカイコ組織が温存されてタンパク質合成が継続されたことを示しており、システインプロテアーゼ遺伝子のみを欠損させた比較例のバクミド変異体を用いるよりも、はるかに大量のβ３ＧｎＴを生成できることが示された（表１参照）。
従って、本実施例のバクミド変異体では、目的とするタンパク質を大量に得るために優れていることは明らかであった。
【００６３】
これらのことから、本発明のバクミド変異体は、簡便に作製することができると共に大量の目的タンパク質を得ることができるので、特定のタンパク質を得るためのツールとして有用なものである。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】本発明に実施例にかかるシステインプロテアーゼ遺伝子とキチナーゼ遺伝子両欠損バクミド変異体を作成するために使用した挿入カセットの構造である。
【図２】本発明の実施例で使用されたＲｅｄリコンビナーゼプラスミドｐＫＤ４６（Ａ）と、テンプレートプラスミドｐＫＤ３（Ｂ）のベクターマップである。
【図３】本発明の実施例にかかるシステインプロテアーゼ及びキチナーゼ欠損型バクミド変異体を作製するための工程を示した図である。
【図４】本発明の実施例で用いたｐＫＤ４６の構造を示した図である。
【図５】本発明の実施例（Ｐ−Ｃｈ−Ｂｍ）と比較例（Ｍｏｃｋ、Ｂｍ、Ｐ−Ｂｍ）とにかかるバクミド変異体を注射後５日目、６日目、７日目のカイコ幼虫又は繭の様子を示す写真である。
【図６】（Ａ）は、比較例にかかるバクミド変異体を注射したカイコ幼虫のＵＶ照射像、（Ｂ）は、本発明の実施例にかかるバクミド変異体を注射したカイコ幼虫のＵＶ照射像を、それぞれ示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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