(57)【要約】【課題】第１反応体−被験物−第２反応体を実質的に不可逆的に結合させることを利用したサンドイッチ法による高感度の被験物の測定方法を提供すること。【解決手段】（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物であって第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位とが結合している結合物を得る工程；（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する工程を含む、被験物の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物であって第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位とが結合している結合物を得る工程；（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する工程を含む、被験物の測定方法。
【請求項２】
第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合が、直接または間接的な実質的に不可逆的な結合である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合が、共有結合である、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合が、炭素−炭素間の結合、炭素−窒素間の結合、炭素−酸素間の結合、窒素−窒素間の結合、酸素−酸素間の結合、又は窒素−酸素間の結合、あるいはその組み合わせの結合である請求項１から３の何れかに記載の測定方法。
【請求項５】
第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合が、ラジカル反応、光反応、付加反応、縮合反応、またはその組み合わせにより形成される結合である、請求項１から４の何れかに記載の測定方法。
【請求項６】
工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を開始または加速させる物質を添加する、請求項１から５の何れかに記載の測定方法。
【請求項７】
工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を形成する物質を添加する、請求項１から６の何れかに記載の測定方法。
【請求項８】
第１反応体及び／又は第２反応体が、各々の標識部位以外に、検出可能な検出部位を有する、請求項１から７の何れかに記載の測定方法。
【請求項９】
検出部位が光学的に検出可能な部位、または酵素である、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１０】
工程（２）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合により生成した部位を検出することによって、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する、請求項１〜９の何れかに記載の測定方法。
【請求項１１】
第１反応体及び第２反応体の反応部位が、抗原、抗体、抗体フラグメント、受容体、DNA、RNA、及びアプタマーからなる群より選択される１種類またはその組み合わせである、請求項１から１０の何れかに記載の測定方法。
【請求項１２】
第１反応体及び第２反応体の反応部位が、抗体である、請求項１から１１の何れかに記載の測定方法。
【請求項１３】
被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、及び該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体を含む、請求項１から１２のいずれかに記載の測定方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、互いに結合することができる２つの標識物質を用いた被験物の測定方法に関する。本発明は、サンドイッチアッセイにおいて互いに結合することができる２つの標識物質を用いた被験物の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、抗原抗体反応を利用した免疫測定法では、被験物濃度を、いわゆる「サンドイッチ法」が用いられることが多い。サンドイッチ法は、被験物と特異的に結合する２種類の抗体（反応体）が、被験物の異なる部位に結合することにより、「第１反応体−被験物−第２反応体」を形成し、被験物濃度を「第１反応体−被験物−第２反応体」の濃度として算出される。
【０００３】
この「第１反応体−被験物−第２反応体」は第１反応体／被験物／第２反応体との平衡状態で存在し、極微量の被験物を検出する場合、「第１反応体−被験物−第２反応体」量は被験物量を越える事は原理的になく、精度の高い高感度検出における大きな問題点となっている。この事は、特に極微量のサンプル（血液など）を対象とする場合に大きな問題となる。例えば、10nL（10-8nL）のサンプル量中の0.01pM（10-14M）の被験物を検出する場合、サンプル中に存在する被験物は、僅か60分子（6x1023 ｘ 10-8nL ｘ 10-14nL）となり、この分子数を検出するには、１分子蛍光検出法などの特殊な検出法が必要となる。
【０００４】
また「サンドイッチ法」における被験物量の検出には、被験物に対して過剰量のレポーター分子や酵素で標識された第１反応体または第２反応体を洗浄操作などにより系外に除去する操作（B／F分離）必要がある。このB／F分離は測定操作を煩雑にし、測定時間が長くなる事に加え、B／F分離やそれに続く洗浄操作により、第１反応体または第２反応体に結合した被験物が除去されてしまい、検出感度の低下をもたらす欠点を有している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、第１反応体−被験物−第２反応体を実質的に不可逆的に結合させることを利用したサンドイッチ法による高感度の被験物の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、互いに結合することができる２つの標識物質をサンドイッチ法において用いることによって、B／F分離操作を必要とすることなく、簡便、短時間かつ高感度に被験物の測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明によれば、（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物であって第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位とが結合している結合物を得る工程；（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する工程を含む、被験物の測定方法が提供される。
【０００８】
好ましくは、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合は、直接または間接的な実質的に不可逆的な結合である。
好ましくは、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合は、共有結合である。
【０００９】
好ましくは、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合は、炭素−炭素間の結合、炭素−窒素間の結合、炭素−酸素間の結合、窒素−窒素間の結合、酸素−酸素間の結合、又は窒素−酸素間の結合、あるいはその組み合わせの結合である。
好ましくは、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合は、ラジカル反応、光反応、付加反応、縮合反応、またはその組み合わせにより形成される結合である。
【００１０】
好ましくは、工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を開始または加速させる物質を添加する。
好ましくは、工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を形成する物質を添加する。
【００１１】
好ましくは、第１反応体及び／又は第２反応体は、各々の標識部位以外に、検出可能な検出部位を有する。
好ましくは、検出部位は光学的に検出可能な部位、または酵素である。
【００１２】
好ましくは、工程（２）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合により生成した部位を検出することによって、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する。
【００１３】
好ましくは、第１反応体及び第２反応体の反応部位は、抗原、抗体、抗体フラグメント、受容体、DNA、RNA、及びアプタマーからなる群より選択される１種類またはその組み合わせである。
好ましくは、第１反応体及び第２反応体の反応部位は、抗体である。
【００１４】
本発明の別の側面によれば、被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、及び該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体を含む、本発明の測定方法に用いるためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の被験物の測定方法においては、B／F分離操作が不要であり、簡便かつ短時間での測定が可能である。また、また、本発明の被験物の測定方法においては、第１反応体−被験物−第２反応体の結合物が解離しないため、平衡状態での存在量より「第１反応体−被験物−第２反応体」の量を多くすることができ、高感度検出が可能である。また、本発明の被験物の測定方法においては、酵素反応により検出シグナルを増幅することができることにより高感度の測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の被験物の測定方法においては、先ず、（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物であって第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位とが結合している結合物を得る工程を行い、その後に、上記工程で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出する。本発明の方法の概要を図１に示す。
【００１７】
被験物と第１反応体と第２反応体とを反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を生成する工程においては、好ましくは、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位とが直接または間接的に反応し、実質的に不可逆的な結合（特に好ましくは、共有結合）が形成される。上記した実質的に不可逆的な結合の具体例としては、炭素−炭素間の結合、炭素−窒素間の結合、炭素−酸素間の結合、窒素−窒素間の結合、酸素−酸素間の結合、又は窒素−酸素間の結合、あるいはその組み合わせの結合を挙げることができる。また、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合は、好ましくはラジカル反応、光反応、付加反応、縮合反応、またはその組み合わせにより形成される結合である。
【００１８】
本発明で用いることができる被験物の種類は特に限定されないが、例えば、医薬品、抗原、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン、糖質、脂質、ビタミン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、細胞、細菌、又はウィルスなどが挙げられる。また、環境ホルモンなど自然界に存在する物質であってもよい。被験物としては、上記した被験物を含有する血液、尿、唾液、骨髄液、脳脊髄液などの体液；河川水、又は廃液などを用いてもよい。
【００１９】
本発明で用いる第１反応体は、該被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有するものである。また、本発明で用いる第２反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有するものである。
【００２０】
第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位は、例えば、抗原、抗体、抗体フラグメント、種々の受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、これらを結合した血球などの細胞性物質を挙げることができる。反応部位は、上記の中でも、抗体又は抗体フラグメントであることが好ましい。
【００２１】
本発明による被験物の測定方法は、サンドイッチ法の原理を採用している。従って、第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位はそれぞれ、被験物の異なる部位に特異的に結合するものであることが必要である。
【００２２】
第１反応体及び第２反応体における標識物質は、互いに結合できる物質であれば、その種類は特に限定されないが、好ましくは、上記の通り、互いに直接または間接的に反応し、実質的に不可逆的な結合（特に好ましくは、共有結合）が形成される物質である。具体的には、結合定数（Ｋａ値）として１０13以上である事が好ましく、１０15以上である事がより好ましい。標識物質の具体例としては、チミン、５−フルオロウラシル、ジメチルマレインイミド、アクリレートまたはメタクリレート化合物、アルキン化合物とアジド化合物との組み合わせ、Diels-Alder反応を起させるアルケン化合物類の組み合わせなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の測定方法においては、工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を開始または加速させる物質を添加してもよい。あるいはまた、工程（１）において、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を形成する物質を添加してもよい。第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を開始または加速させる物質の具体例としては、光２量化を加速させるメチレンブルーなどの３重項増感剤、アルキン化合物とアジド化合物との反応によりとトリアゾール環形成を触媒する１価の銅イオン、アクリレートまたはメタクリレート化合物のラジカル重合を開始させるベンゾイルパーオキサイドなどの重合開始剤などが挙げられる。また、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合を形成する物質の具体例としては、アクリレートまたはメタクリレート化合物などが挙げられる。
【００２４】
第１反応体における反応部位と標識部位との結合は、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。また、同様に、第２反応体における反応部位と標識部位との結合も、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。
【００２５】
本発明においては、被験物と、第１反応体と、第２反応体とを反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体結合物を得る。反応の順番は特に限定されない。即ち、被験物と第１反応体と第２反応体とを同時に混合して反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、被験物と第１反応体を反応させて第１反応体−被験物の結合物を得た後に第２反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、あるいは被験物と第２反応体を反応させて被験物−第２反応体の結合物を得た後に第１反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよい。
【００２６】
本発明においては、被験物と第１反応体と第２反応体とを反応させることによって生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出することによって、被験物の測定を行う。第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出することを目的として、第１反応体及び／又は第２反応体としては、各々の標識部位以外に、検出可能な検出部位を有するものを用いてもよい。検出可能な検出部位としては、光学的に検出可能な部位、または酵素などを挙げることができる。光学的に検出可能な部位としては、蛍光物質（例えば、ＦＩＴＣ、フルオロセイン、ローダミン、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒなど）、発光物質（例えば、ルシフェリン、シンプレクチン、エクオリンなど）を挙げることができる。また、酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ若しくはアセチルコリンエステラーゼ等を挙げることができる。
【００２７】
あるいは、本発明の好ましい態様においては、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合により生成した部位を検出することによって、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を検出することもできる。例えば、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合により生成した部位に特異的な抗体を用いることによって、第１反応体の標識部位と第２反応体の標識部位との結合により生成した部位を検出することができる。
【００２８】
本発明においては、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物の量を指標として、被験物の量を測定することができる。本発明においては、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物の量を、吸光度、蛍光強度、発光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴、又は近接場光のいずれかにより算出することができる。近接場光としては、例えば、エバネッセント光を用いることができる。エバネッセント光とは、光が全反射したときに第２媒質中にわずかに滲み出した光で、伝搬せず、第２媒質との境界面から１００ｎｍ程度の領域にだけ発生する。試料収容部と接触させた光導波路又はプリズムに臨界角度以上で光を入射することにより、試料収容部との境界面でエバネッセント波を生じさせることができる。
【００２９】
本発明によれば、被験物と特異的に結合する反応部位及び標識部位を有する第１反応体、及び該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記第１反応体の標識部位と結合する標識部位を有する第２反応体を含む、本発明による被験物の測定方法に用いるためのキットが提供される。第１反応体及び第２反応体は、溶液状態、乾燥状態、凍結状態、凍結乾燥状態等で提供することができる。保存安定性の点から、凍結乾燥状態であることが好ましいが、液状で安定な物質である場合、液状試薬として提供することが好ましい。また、本発明のキットには、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を測定するための試薬（即ち、各種酵素の基質、発色（光）基質、安定化剤など）を含めることもできる。
【００３０】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
２種類の抗CRP（C反応性タンパク）抗体（Fitzgerald社製）（製品番号；M7111422、M701289）のそれぞれに、チミン−１−酢酸（シグマ社製）を縮合剤EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（同仁化学研究所製））により結合させ、これらの反応生成物「チミン化抗CRP１次抗体」、「チミン化２次抗体」を得る。「チミン化抗CRP１次抗体」、「チミン化２次抗体」各１μg/mLのPBS水溶液各40μLと、被験物であるCRP  10fMのPBS水溶液40μLを混合し、紫外線照射下で30分間振とうする。反応混合物に西洋ワサビペルオキシダーゼ（同仁化学研究所製）により標識した抗チミンダイマー抗体（Sigma社製）１μg/mLのPBS水溶液40μLを加え20分間振とう後、テトラメチルベンジジン（Piece社製）を用いた発色反応を行い生成した色素を450nmで検出する。その結果、CRPが検出可能である。一方、被験物であるCRPを含まない場合には、発色反応による色素は検出されない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、本発明の方法の概要を示す図である。
【図１】
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