(57)【要約】【課題】カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を、着色の少ない状態で安定に保存する。【解決手段】カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液のｐＨを６．４以下又は７．５以上に調整して保存する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を保存する方法であって、
該溶液のｐＨを６．４以下又は７．５以上に調整する
ことを特徴とする、保存方法。
【請求項２】
前記のカダベリン及び／又はカダベリン塩が、リジン及び／又はリジン塩にリジン脱炭酸酵素を作用させて得られたものである
ことを特徴とする、請求項１記載の保存方法。
【請求項３】
前記カダベリン塩がカダベリン・カルボン酸塩である
ことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の保存方法。
【請求項４】
前記溶液を７日間保存した場合に、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化が０．１３以下である
ことを特徴とする、請求項１〜３の何れか一項に記載の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カダベリン及び／又はカダベリン塩（以下「カダベリン類」と略称する場合がある。）の溶液を保存する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カダベリン類は、ナイロン等のポリアミドの原料等として期待され、需要が高まりつつある。
【０００３】
従来、カダベリン類の製造技術として、触媒を用いる方法（非特許文献１，２、特許文献１）や酵素を用いる方法（特許文献２〜５）等が検討され、開発されつつある。これらの方法においては、カダベリン類は溶液として得られることになる。
【０００４】
しかしながら、実際に工業レベルでカダベリン類を製造した後、それを用いた重合反応を行ない、ポリアミドを製造する場合、カダベリン類の製造後に精製及び重合反応を短時間で行なうことは不可能である。よって、製造されたカダベリン類の溶液をより安定な状態で保存することが重要である。
【０００５】
これまでに、カダベリン類の溶液中に存在する不純物がその後の重合反応に影響を与えるという観点に基づき、その製法を改善する手法が提案されている。例としては、カダベリンをカルボン酸塩として製造する方法（特許文献６，７）や、精製工程においてｐＨを制御し、極性有機溶剤で抽出する工程を含む製造方法（特許文献８）等が挙げられる。
【０００６】
【非特許文献１】薬学雑誌、ｖｏｌ．８５（６）５３１（１９６５）
【非特許文献２】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ、８９８（１９８６）
【特許文献１】特公平４−１０４５２号公報
【特許文献２】特開２００２−２２３７７０号公報
【特許文献３】特開２００４−２２３７７１号公報
【特許文献４】特開２００４−１１４号公報
【特許文献５】特開２００４−２９８０３４号公報
【特許文献６】特開２００５−６６５０号公報
【特許文献７】特開２００４−２０８６４６号公報
【特許文献８】特開２００４−２２２５６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上述の各文献等の従来の技術によれば、比較的純度の高いカダベリン類の溶液を製造した場合でも、そのまま数日放置しておくと不純物が生成したり、着色を生じたりする場合があった。このため、不純物を取り除いて脱色するために、複雑な精製工程が必要となり、手順が煩雑となるとともに、収量が低下する等の課題が生じている。
【０００８】
以上の背景から、カダベリン類の溶液を着色の少ない状態で安定に保存する方法であって、生産効率に優れ、経済的にも有効な方法が望まれている。
【０００９】
本発明は上述の課題に鑑みてなされたもので、その目的は、カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を、着色の少ない状態で安定に保存する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を保存する際に、溶液のｐＨを６．４以下又は７．５以上に調整して保存することで、溶液の着色が防止され、安定な保存が可能となることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明の要旨は、カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を保存する方法であって、該溶液のｐＨを６．４以下又は７．５以上に調整することを特徴とする、保存方法に存する（請求項１）。
【００１２】
ここで、前記のカダベリン及び／又はカダベリン塩が、リジン及び／又はリジン塩にリジン脱炭酸酵素を作用させて得られたものであることが好ましい（請求項２）。
【００１３】
また、前記カダベリン塩が、カダベリン・カルボン酸塩であることが好ましい（請求項３）。
【００１４】
また、前記溶液を７日間保存した場合に、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化が０．１３以下であることが好ましい（請求項４）。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液を、着色の少ない状態で安定に保存することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について実施の形態を挙げて詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではなく、その要旨を超えない範囲において種々に変更して実施することができる。
【００１７】
以下の記載では、まず、本発明において保存の対象となるカダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液（以下「本発明に係るカダベリン類溶液」という。）について説明し、続いて、その製造方法について説明した上で、本発明に係るカダベリン類溶液の保存方法（本発明の保存方法）について説明する。
【００１８】
［Ｉ．カダベリン類溶液］
本発明に係るカダベリン類溶液は、カダベリン及び／又はカダベリン塩と、溶媒とを備えてなる。
【００１９】
本発明において「カダベリン」とは、１，５−ペンタンジアミン（Ｈ2Ｎ（ＣＨ2）5ＮＨ2）をいう。カダベリンは、ポリマー原料や医薬中間体の合成原料として有用な化合物である。
【００２０】
また、本発明において「カダベリン塩」とは、カダベリン及び酸から形成される塩のことを言う。
【００２１】
カダベリンとともに塩を形成する酸の種類に制限はない。無機酸でも有機酸でもよく、また、一価の酸でも二価以上の酸でもよい。酸の例としては、塩酸、硫酸、硝酸、炭酸、カルボン酸、リン酸、スルホン酸等が挙げられる。カルボン酸の具体例としては、ギ酸、酢酸、アジピン酸、グルタル酸、コハク酸、セバシン酸等が挙げられる。中でも、ナイロン等のポリアミドの製造用途に使用する観点からは、カルボン酸が好ましく、特にアジピン酸が好ましい。これらの酸は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００２２】
カダベリン塩１分子を構成するカダベリン及び酸の分子数も任意に選択し得る。カダベリン塩１分子あたり、カダベリン及び酸が共に１分子であってもよく、カダベリン及び酸の一方又は双方が２分子以上であってもよい。例えば、二価の塩基であるカダベリンと二価の酸とから構成される塩の場合、一般的にはカダベリン１分子と二価の酸（例えばアジピン酸）１分子とからカダベリン塩１分子が構成されるが、他の形態を排除するものではなく、２分子以上のカダベリン及び／又は２分子以上の二価の酸から構成されたカダベリン塩が含まれていてもよい。
【００２３】
本発明に係るカダベリン類溶液は、カダベリンのみを含有していてもよく、カダベリン塩のみを含有していてもよく、カダベリン及びカダベリン塩の双方を含有していてもよい。但し、本発明に係るカダベリン類溶液がカダベリン塩を含有する場合、カダベリン塩の一部は通常、カダベリン（又はカダベリンのイオン）と酸（又は酸のイオン）とに解離した状態で溶液中に存在する。本発明において「カダベリン類溶液」即ち「カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液」とは、このような状態の溶液をも含む概念である。
【００２４】
また、本発明に係るカダベリン類溶液がカダベリン塩を含有する場合、カダベリン塩の種類は一種のみでもよく、二種以上であってもよい。
【００２５】
溶媒としては、上述のカダベリン及び／又はカダベリン塩を溶解させることが可能であれば、その種類は任意である。具体的な溶媒の種類は、本発明に係るカダベリン類溶液の調製の手法や用途等に応じて選択される。また、何れか一種の溶媒を単独で用いてもよく、二種以上の溶媒を任意の組み合わせ及び比率で混合して用いてもよい。
【００２６】
特に、カダベリン及び／又はカダベリン塩の製造反応時に使用した溶媒をそのまま使用する場合、その溶媒の種類は反応の種類によって、以下のように分けられる。
【００２７】
例えば、触媒を用いた化学反応によりカダベリン及び／又はカダベリン塩を製造する場合、溶媒としては通常、水及び／又は有機溶媒が使用される。有機溶媒の種類は制限されるものではなく、使用する触媒等の条件に応じて選択すればよい。一般的な有機溶媒の例としては、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２，３−トリクロロプロパン、テトラクロルエチレン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化脂肪族炭化水素類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、オクタノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類；酢酸エチル、プロピオン酸メチル、エナント酸メチル、リノール酸メチル、ステアリン酸メチル等のエステル類；シクロヘキサン、ヘキサン、オクタン等の脂肪族炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、ジフェニルメタン、モノクロロベンゼン、ジクロロベンゼン、ニトロベンゼン、スクアラン等の芳香族炭化水素類；ジメチルスルホキシド、スルホラン等のスルホキシド類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル尿素、１，３−ジメチルイミダゾリジノン等のアミド類；テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメトキシエタン、ジエチレングリコールジメチルエーテル、トリエチレングリコールジメチルエーテル、テトラエチレングリコールジメチルエーテル等のエーテル類；等が挙げられる。これらの溶媒は、何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で混合して用いてもよい。
【００２８】
また、後述のように酵素を用いた反応によりカダベリン及び／又はカダベリン塩を製造する場合、溶媒としては通常、水又は水を主成分とする混合溶媒が用いられる。ここで「主成分」とは、混合溶媒の通常５０重量％以上、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上を占める成分をいう。
【００２９】
また、上述の触媒を用いた化学反応や酵素を用いた反応により生成したカダベリン及び／又はカダベリン塩に対して、精製等の後処理やポリアミドへの変換を行なう際にも、水及び／又は有機溶媒が使用される場合がある。この場合、反応時に使用した溶媒をそのまま使用してもよく、異なる溶媒を使用してもよい。
【００３０】
本発明に係るカダベリン類溶液におけるカダベリン及び／又はカダベリン塩の濃度は、カダベリン及び／又はカダベリン塩が溶媒に溶解可能な範囲内であれば任意であるが、通常はカダベリン類溶液の製法や用途に応じて選択される。例えば、後述のようにリジン及び／又はリジン塩の溶液を原料として、触媒や酵素の作用により製造されたカダベリン類溶液の場合、工業的な観点から、カダベリン濃度（カタベリン塩の場合はカダベリン換算濃度）が、通常１０ｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ以上、また、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下の範囲であることが望ましい。
【００３１】
なお、カダベリン類溶液におけるカダベリンの濃度（カダベリン塩の場合はカダベリン換算濃度）は、種々の分析機器で測定することが可能である。分析手法は限定されないが、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を用いて測定するのが一般的である。これらのクロマトグラフィーによって測定を行なう場合、測定対象となるカダベリン類溶液をそのまま、或いは必要に応じて所定の濃度範囲となるように希釈して測定に供する。また、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーの場合は、カダベリン類溶液中の成分が有する特定の官能基（主にカダベリンのアミノ基）を誘導体化してから測定に供することが好ましい。
【００３２】
また、本発明に係るカダベリン類溶液は、上述の溶媒並びにカダベリン及び／又はカダベリン塩に加えて、その他の一種又は二種以上の成分を含有していてもよい。その他の成分の種類や含有量は任意であり、通常はカダベリン類溶液の製法や用途に応じて選択される。
【００３３】
［II．カダベリン類溶液の製法］
本発明に係るカダベリン類溶液の製法は任意である。例としては、カダベリン及び／又はカダベリン塩を溶媒に溶解させて調製する方法や、リジンの脱炭酸反応により製造する方法等が挙げられるが、何れであってもよい。但し、工業的な観点から考えると、リジン及び／又はリジン塩の溶液（以下「リジン類溶液」という場合がある。）を原料として、触媒や酵素を用いた脱炭酸反応により製造する方法が好ましい。後者の方法の場合、使用可能な触媒や酵素としては、前述した非特許文献１，２及び特許文献１〜５に記載された触媒や酵素が挙げられる。中でも、リジン脱炭酸酵素（Lysine decarboxylase：ＬＤＣ）を用いることが好ましい。以下、ＬＤＣを用いたリジン脱炭酸反応によりカダベリン類溶液を製造する方法について、詳細に説明する。
【００３４】
原料としては、リジン及び／又はリジン塩を用いる。また、通常はこれらに加えて、更に酸を原料として用いる。
【００３５】
リジンは、酵素的脱炭酸反応によりペンタメチレンジアミンを生成するものであれば、Ｌ−リジン、Ｄ−リジンの何れであってもよく、これらが任意の比率で混合されたものであってもよいが、通常はＬ−リジンが好ましい。
【００３６】
リジン塩は、リジン及び酸から構成される塩である。リジン塩を構成する酸の種類やその好ましい例は、上述のカダベリン塩を構成する酸として挙げたものと同様である。リジン塩は一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００３７】
また、原料として酸を用いる場合、その種類や好ましい例も、上述のカダベリン塩を構成する酸として挙げたものと同様である。酸は一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００３８】
なお、原料となるリジン、リジン塩、酸の組み合わせや比率等の詳細は、目的とするカダベリン及び／又はカダベリン塩の詳細を考慮して、適宜選択することが好ましい。
【００３９】
反応は通常、溶媒の存在下で行なう。溶媒としては通常、上述のように、水又は水を主成分とする混合溶媒が用いられる。水と混合される溶媒は制限されないが、通常は水と混和性を有する親水性有機溶媒が用いられる。親水性有機溶媒の例としては、アルコール類、カルボン酸、エステル類等が挙げられる。アルコール類の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブタノール、ペンタノール、イソペンタノール、ヘキサノール、エチレングリコール、１，２-プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセリン等が挙げられる。カルボン酸の例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸、イソ吉草酸、ヘキサン酸等が挙げられる。エステル類の例としては、酢酸メチル、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル等が挙げられる。親水性有機溶媒は一種を単独で使用してもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００４０】
なお、通常は酸によって反応液のｐＨを調整するため、他のｐＨ調整剤や緩衝剤を併用する必要はないが、溶媒として緩衝液を用いてもよい。緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液等が挙げられる。但し、カダベリンと酸との塩を形成させるという点からは、緩衝剤等は用いないか、用いる場合であっても低濃度に抑えることが好ましい。
但し、溶媒の詳細についても、目的とするカダベリン類溶液の詳細を考慮して、適宜選択することが好ましい。
【００４１】
上述のリジン及び／又はリジン塩、並びに必要に応じて用いられる酸を、上述の溶媒に溶解させることにより、反応液を調製する。
【００４２】
ここで、原料となるリジン、リジン塩、酸は反応開始前又は反応開始時に反応液に全量加えてもよく、ＬＤＣ反応の進行に応じて分割して加えてもよいが、反応開始時におけるリジン及び／又はリジン塩と酸との比率を調整することにより、反応液のｐＨが酵素的脱炭酸反応に適したｐＨとなるように調整することが好ましい。具体的には、反応液のｐＨを、通常４．０以上、好ましくは５．０以上、より好ましくは５．５以上、また、通常８．０以下、好ましくは７．５以下、より好ましくは７．０以下の範囲とすることが望ましい。反応液のｐＨが低過ぎても高過ぎても、充分な反応速度が得られない場合がある。なお、以下の記載では、このように反応液のｐＨを酵素的脱炭酸反応に適したｐＨに調整することを、「中和」と称する場合がある。
【００４３】
なお、反応液中におけるリジンの濃度（リジン塩の場合はリジン換算濃度）は制限されないが、通常１０ｇ／Ｌ以上、好ましくは２０ｇ／Ｌ以上、また、通常７００ｇ／Ｌ以下、好ましくは５００ｇ／Ｌ以下の範囲とすることが望ましい。なお、反応液中にリジン塩が存在する場合も、リジン換算の濃度で測定する。
【００４４】
リジン濃度は、種々の分析機器で測定することが可能である。分析手法は限定されないが、リジンセンサー、イオンクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を用いて測定するのが一般的である。これらのリジンセンサーやクロマトグラフィーによって測定を行なう場合、測定対象となる反応液をそのまま、或いは必要に応じて所定の濃度範囲となるように希釈して測定に供する。また、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーの場合は、反応液中の成分が有する特定の官能基（主にリジンのアミノ基）を誘導体化してから測定に供することが好ましい。
【００４５】
なお、生産速度および反応収率向上のため、反応液に補酵素としてビタミンＢ６を加えることが好ましい。ビタミンＢ６の例としては、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサル、ピリドキサルリン酸等が挙げられる。これらは一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。中でも、ピリドキサルリン酸が好ましい。
【００４６】
ビタミンＢ６の使用量は特に制限されないが、通常、反応液に対して０．０１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以下の範囲が好ましい。ビタミンＢ６の使用量が少な過ぎると反応速度が遅くなる場合があり、多過ぎると反応液の色が黄色くなる場合がある。
ビタミンＢ６を反応液に含有させる時機や手法に制限はない。反応前に含有させてもよく、反応中に含有させてもよい。また、一度に反応液に含有させてもよく、二度以上に分割して、異なる時機に反応液に含有させてもよい。
【００４７】
上述の中和された反応液とリジン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）とを混合し、リジンの脱炭酸反応を行なう。ＬＤＣとしては、リジンに作用してカダベリンを生成させるものであれば、その種類に制限はない。具体的に、ＬＤＣとしては、精製された酵素を用いてもよいし、ＬＤＣを産生する細胞を用いてもよい。ＬＤＣ及びそれを産生する細胞は、何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で混合して用いてもよい。
【００４８】
ＬＤＣを産生する細胞の例としては、微生物、植物細胞、動物細胞等が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、細菌、真核細胞等が挙げられる。細菌としては、Escherichia coliなどのエシェリヒア属細菌、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）等のコリネ型細菌、バチルス・サブチリス（Bacillus subtills）等のバチルス属細菌、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）等のセラチア属細菌等が挙げられる。真核細胞としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等が挙げられる。中でも、微生物としては細菌が好ましく、エシェリヒア属細菌がより好ましく、Escherichia coliが特に好ましい。微生物は、ＬＤＣを産生する限り、野生株でもよく、変位株であってもよい。また、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え株であってもよい。植物細胞又は動物細胞も、ＬＤＣ活性が上昇するように改変された組換え細胞を用いることができる。
【００４９】
ＬＤＣを産生する細胞を用いる場合は、細胞をそのまま反応液に含有させてもよく、ＬＤＣを含む細胞処理物としてから反応液に含有させてもよい。細胞処理物としては、細胞の破砕液及びその分画物が挙げられる。
【００５０】
リジン溶液とＬＤＣとを混合して反応を開始した後は、反応の進行に伴い、リジンから遊離される炭酸ガスが反応液から放出され、ｐＨが上昇する。従って、反応液のｐＨが前記範囲となるように、反応液に酸を加えてｐＨを調整する。酸は反応液に連続的に加えてもよく、ｐＨが前記範囲に維持される限り、分割して加えてもよい。
【００５１】
反応時の条件は、ＬＤＣがリジンに作用してカダベリンを生成させる条件であれば特に制限はないが、一般的には以下の通りである。
【００５２】
反応方式は、連続式でもバッチ式でもよい。反応中における反応系への酸の添加を容易に行なう観点からは、バッチ式で反応を行なうことが好ましい。また、ＬＤＣ並びにＬＤＣを産生する細胞及びその処理物のうち一種又は二種以上を固定化した担体を用いた移動床カラムクロマトグラフィーによって反応を行なうこともできる。その場合は、反応系のｐＨが所定の範囲に維持されたまま反応が進行するように、リジン及び／又は酸をカラムの適当な部位に注入すればよい。
【００５３】
反応液の温度は、通常２０℃以上、好ましくは３０℃以上、また、通常６０℃以下、好ましくは４０℃以下の範囲とすることが望ましい。反応液の温度が低過ぎると反応が進行しない場合があり、高過ぎると酵素が失活する場合がある。
反応時の雰囲気は任意であるが、通常は空気、炭酸ガス又は窒素ガス雰囲気下が好ましい。
反応時の圧力も任意であるが、通常は常圧或いはそれに近い圧力下で行なう。
また、反応液に攪拌を加えてもよい。
【００５４】
以上の手順により、リジンの酵素的脱炭酸反応によってカダベリンが生成し、それに伴って反応液のｐＨが上昇する。よって、反応液を酸を用いて逐次中和することにより、酵素反応が良好に進行する。反応によって生成するカダベリンは、通常はカダベリン塩として反応液中に蓄積する。
【００５５】
以上の反応により得られた反応液は、そのままの状態で、或いは処理を加えることにより、本発明に係るカダベリン類溶液として用いることが可能である。処理の内容は任意であるが、例としては、反応液の滅菌・濾過や、溶媒の除去・追加によるカダベリン及び／カダベリン塩の濃度調整等の処理が挙げられる。
【００５６】
また、以上の反応により得られた反応液から、カダベリン及び／カダベリン塩を精製・単離することも可能である。精製・単離の手法は任意であり、公知の手法を適宜選択して用いればよい。例としては、晶析、蒸留等が挙げられる。精製・単離されたカダベリン及び／カダベリン塩を任意の溶媒に溶解させることにより、本発明に係るカダベリン類溶液を調製することも可能である。
【００５７】
［III．カダベリン類溶液の保存方法］
本発明の保存方法は、上述した本発明に係るカダベリン類溶液のｐＨを、酸性或いは塩基性に調整して保存する。
【００５８】
具体的に、カダベリン類溶液のｐＨを酸性に調整する場合、そのｐＨは、通常６．４以下、好ましくは６．０以下、更に好ましくは５．５以下である。
一方、カダベリン類溶液のｐＨをアルカリ性に調整する場合、そのｐＨは、通常７．５以上、好ましくは８．０以上、更に好ましくは８．５以上である。
上述のように、カダベリン類溶液のｐＨを酸性或いは塩基性に調整して保存することにより、カダベリン類溶液を着色の少ない状態で安定に保存することができる。
【００５９】
カダベリン類溶液のｐＨを上記範囲内となるように調整する手法は制限されないが、例としては、以下に挙げる二種の手法が挙げられる。
【００６０】
まず、第一の手法として、カダベリン類溶液の製造時にその条件を調整することにより、得られるカダベリン類溶液のｐＨを上記範囲内にするという手法が挙げられる。具体例として、上述のＬＤＣを用いたリジンの酵素的脱炭酸反応によってカダベリン類溶液を製造する場合、反応時に反応液に加える酸の量を調整したり、或いはカダベリンやカダベリン塩を加えることにより、反応終了時における反応液、即ちカダベリン類溶液のｐＨが上記範囲内となるように調整することができる。
【００６１】
また、第二の手法として、カダベリン類溶液を製造した後に、ｐＨ調整剤を用いてそのｐＨを上記範囲内に調整するという手法が挙げられる。
ｐＨ調整剤の種類は制限されない。保存するカダベリン類溶液の成分や用途等に応じて適宜選択することができる。
【００６２】
ｐＨ調整剤は主に、酸と塩基とに分けられる。
酸の種類は任意であるが、例としては、上述のカダベリン塩を構成する酸として例示したものが挙げられる。
塩基としては、無機塩基でも有機塩基でもよく、また、一価の塩基でも二価以上の塩基でもよい。塩基の例としては、カダベリン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、アンモニア等が挙げられる。中でも、カダベリン、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが好ましい。これらの塩基は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００６３】
なお、ｐＨ調整剤とともに、緩衝剤を用いてもよい。緩衝剤の種類は任意であるが、例としては、酢酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝剤は何れか一種を単独で用いてもよく、二種以上を任意の組み合わせ及び比率で併用してもよい。
【００６４】
本発明に係るカダベリン類溶液の保存時におけるその他の条件は任意であるが、通常は以下の通りである。
保存時の温度は特に制限されないが、通常は常温以下とすることが望ましい。具体的には、通常３０℃以下、好ましくは２５℃以下が望ましい。また、例えば通常１０℃以下、好ましくは５℃以下の低温に冷却して保存を行なってもよい。保存時の温度が高過ぎると、変色が進んだり、不純物が発生したりする場合がある。
保存時の雰囲気は任意であるが、通常は空気又は窒素ガス等の不活性ガス雰囲気下が好ましい。
保存時の圧力も任意であるが、通常は常圧或いはそれに近い圧力とする。
保存時のカダベリン類溶液の状態も制限されないが、通常は静置状態で保存する。
【００６５】
本発明の保存方法によれば、本発明に係るカダベリン類溶液を、着色の少ない状態で安定に保存することができる。具体的には、本発明の保存方法によりカダベリン類溶液を７日間保存した場合、下記式［１］により規定される、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化が、通常０．１３以下、好ましくは０．１２５以下、更に好ましくは０．１２以下である。この値が低いほど、可視光領域における吸光度の変化が少なく、ひいては着色が少ないといえる。
【００６６】
（波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化）
＝  （保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
／（カダベリン類溶液中のカダベリンのモル濃度）                ［１］
【００６７】
上記式［１］中、「保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化」は、下記式［２］により求められる値である。
【００６８】
（保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
＝  （保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）
−  （保存０日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）    ［２］
【００６９】
なお、カダベリン類溶液の波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化は、２５℃の室内環境下でカダベリン類溶液を７日間保存するとともに、その前後における吸光スペクトルを分光光度計（例えば日立製作所製Ｕ−３５００）で測定し、得られた吸光スペクトルから求めることが可能である。
【００７０】
本発明の保存方法による保存後のカダベリン類溶液は、任意の用途に使用することが可能であるが、例としては、５６ナイロン等のポリアミドの製造原料としての用途が挙げられる。
【実施例】
【００７１】
以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に限定されるものではではない。
【００７２】
［カダベリン・アジピン酸水溶液の調製］
なお、後述の実施例及び比較例で使用したカダベリン・アジピン酸水溶液（カダベリン類溶液）は、リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株を用い、リジン・アジピン酸塩を原料として調製した。リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増幅株の作製手順と、それを用いたカダベリン・アジピン酸水溶液の調製手順について、以下に説明する。
【００７３】
（１）リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）増強株の作製：
図１は、リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）を組み込んだプラスミドｐＣＡＤ１の構築手順の概要を示す図である。具体的には、以下に説明する手順により行なった。
【００７４】
（Ａ）大腸菌ＤＮＡ抽出：
ＬＢ培地［組成：トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）５ｇを蒸留水１Ｌに溶解］１０ｍＬに、大腸菌（Eschericia coli）ＪＭ１０９株を対数増殖期後期まで培養し、得られた菌体を、１０ｍｇ／ｍＬのリゾチームを含む１０ｍＭＮａＣｌ／２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）／１ｍＭエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（ＥＤＴＡ・２Ｎａ）水溶液０．１５ｍＬに懸濁した。
【００７５】
次に、上記懸濁液にプロテナーゼＫを、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で１時間保温した。更にドデシル硫酸ナトリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５０００×ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるように添加した後、２倍量のエタノールを加え混合した。遠心分離（１５０００×ｇ、２分）により回収した沈殿物を７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに、１０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍＬを加え、４℃で一晩静置し、以後のＰＣＲの鋳型ＤＮＡに使用した。
【００７６】
（Ｂ）ｃａｄＡのクローニング：
大腸菌ｃａｄＡの取得は、上記（Ａ）で調製したＤＮＡを鋳型とし、全ゲノム配列が報告されている大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株の該遺伝子の配列（GenBank Database Accession No.U00096）を基に設計した合成ＤＮＡ（下記の配列番号１及び配列番号２で表わされる配列からなるＤＮＡ）をプライマーとして用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行なった。
【００７７】
・配列番号１：
ＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＴＧ
・配列番号２：
ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＡＴＧＡＧＴＡＡＧ
【００７８】
なお、反応液は、鋳型ＤＮＡ１μＬ及びＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）０．２μＬに、各プライマーが０．３μＭ、ＭｇＳＯ4が１ｍＭ、デオキシヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰｓ）が０．２５μＭとなるように、１倍濃度Ｐｆｘ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（インビトロジェン社製）を加えて全量を２０μＬとすることにより調製した。
【００７９】
また、反応温度条件としては、ＤＮＡサーマルサイクラー（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ社製ＰＴＣ−２００）を用い、９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で２．５分からなるサイクルを３５回繰り返した。但し、１サイクル目の９４℃での保温は１分２０秒、最終サイクルの７２℃での保温は１０分とした。
【００８０】
ＰＣＲの終了後、増幅産物をエタノール沈殿により精製し、制限酵素ＫｐｎＩ及び制限
酵素ＳｐｈＩで切断した。得られたＤＮＡ標品を、０．７５％アガロース（SeaKem GTG a
garose：ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ製）ゲル電気泳動により分離した後、臭化エチジウム染色を用いて可視化することにより、ｃａｄＡを含む約２．６ｋｂの断片を検出し、ＱＩＡ Quick Gel Extraction Kit（ＱＩＡＧＥＮ製）を用いて目的ＤＮＡ断片の回収を行なった。
【００８１】
回収したＤＮＡ断片を、大腸菌プラスミドベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素ＳｐｈＩで切断して調製したＤＮＡ断片と混合し、ライゲ
ーションキットｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結後、得られたプラスミドＤＮＡを用いて大腸菌（ＪＭ１０９株）を形質転換した。この様にして得られた組換え大腸菌を５０μｇ／ｍＬアンピシリン、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）及び５０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に塗抹した。
【００８２】
この培地上で白色のコロニーを形成したクローンを、常法により液体培養した後、プラスミドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩ及び制限酵素Ｓ
ｐｈＩで切断することにより、約２．５ｋｂの挿入断片が認められることを確認した。こ
のプラスミドをｐＣＡＤ１と命名し、ｐＣＡＤ１を含む大腸菌株をＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１と命名した。
【００８３】
（２）ｃａｄＡ増幅株の培養：
大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１をＬＢ培地で前培養した後、１０００ｍＬの培養液を９９Ｌの培地（ミーストＰ１Ｇ １０ｇ／Ｌ、ポリペプトンＮ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、アンピシリンＮａ ５０ｍｇ／Ｌ）が入った２００Ｌ容ジャーファーメンターに接種し、通気量２５０ｍｌ／分、３５℃、７００ｒｐｍで通気攪拌培養を行なった。１５時間培養後、培養液全量を３ｍ3の培地（ミーストＰ１Ｇ １０ｇ／Ｌ、ポリペプトンＮ ２０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ、アンピシリンＮａ ５０ｍｇ／Ｌ）が入った５ｍ3容タンクに接種して更に培養を行なった。５ｍ3ジャーでの培養条件は、通気量０．５ｖｖｍ、３５℃、Ａｇｉｔ：１００ｒｐｍであった。培養４時間目に、３００ｇのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を５Ｌの水に溶解した後、フィルターを通して加えた。その後２１時間培養を続けた。
【００８４】
（３）菌体の分離：
６４００ｒｐｍ、フィード速度７５０Ｌ／ｈｒの条件下で、アルファラバル分離機により培養液からの菌体回収を行った。回収された菌体の湿重量は３６．９Ｋｇであった。この湿菌体を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液１６０Ｌに懸濁したのち、１５０００ｒｐｍ、フィード速度１．０Ｌ／ｍｉｎの条件下でシャープレス遠心機により再度菌体回収を行ない、１８．７ｋｇの湿菌体を取得した。
【００８５】
（４）カダベリン・アジピン酸塩の製造：
５０重量体積％のリジン水溶液にｐＨが６．５となるようにアジピン酸を加え、リジン・アジピン酸塩溶液を調製し、基質溶液とした。ピリドキサルリン酸を０．１ｍＭとなるように加えて反応液を調製し、これに大腸菌株ＪＭ１０９／ｐＣＡＤ１の菌体液（仕込み湿菌体濃度０．２８ｇ／Ｌ）を添加し、反応を開始した。反応は、５ｍ3ジャーファーメンターに３ｍ3の反応液を仕込んで行なった。また、反応中に適宜、アジピン酸スラリーを反応液に添加することにより、反応液のｐＨを６．５となるように制御した。反応開始から６時間後に、リジンのほぼ全量がカダベリンに転化していた（リジンセンサーで検出限界以下）。更に反応を続け、トータルで２２時間反応させることにより、リジンのほぼ１００％がカダベリンに変換された（総消費リジン量３７０．８ｋｇ）。その後、反応液を限外濾過（ＵＦ）膜を通して濾過することにより、カダベリン・アジピン酸塩の粗溶液を得た。
【００８６】
（５）カダベリン・アジピン酸塩の精製：
上記手順により得られたカダベリン・アジピン酸塩の粗溶液を、以下の手順で精製した。まず、粗溶液に対し２０重量％の活性炭を導入し、２０℃で１時間攪拌後、珪藻土による濾過、ＵＦ膜処理を行ない、温度５５〜６０℃、圧力１１０〜１５０ｍｍＨｇで、４〜５倍の濃度となるように濃縮した。その後、４℃／ｈの降温速度で１０℃まで冷却することにより、晶析させた。得られた結晶を遠心濾過し、乾燥させた後、脱塩水を加えて溶解させ、カダベリン・アジピン酸塩水溶液を得た。この溶液のカダベリン・アジピン酸塩の濃度は１００ｇ／Ｌ、カダベリン換算濃度は４０．３ｇ／Ｌであった。
【００８７】
［実施例１］
上記手順により得られた１００ｇ／Ｌ濃度のカダベリン・アジピン酸塩水溶液（カダベリン類溶液）１０ｍＬを５０ｍｌコニカルチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）に入れ、攪拌しながら１Ｎ塩酸を加え、ｐＨを４．９３に調整した。次いで容器を２５℃の室内環境下で保存した。
【００８８】
上記カダベリン・アジピン酸塩水溶液（カダベリン類溶液）について、保存０日目（保存開始日）及び保存７日目に、分光光度計（日立製作所製Ｕ−３５００）を用いて吸光スペクトルを測定した。
【００８９】
また、得られた吸光スペクトルから、下記式［１］により、波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化を求めた。
（波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化）
＝  （保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
／（カダベリン類溶液中のカダベリンのモル濃度）                ［１］
【００９０】
なお、上記式［１］中、「保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化」は、下記式［２］により求められる値である。
（保存前後の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度の変化）
＝  （保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）
−  （保存０日目の波長４００〜５００ｎｍにおける平均吸光度）    ［２］
【００９１】
実施例１におけるカダベリン類溶液の波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化を後述の表１に示す。また、実施例１におけるカダベリン類溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを図２に示す。
【００９２】
［実施例２〜１１、比較例１〜７］
以下に示す点を除いては、実施例１と同様の手順により、カダベリン類溶液の調製及び保存を行なった。
【００９３】
比較例６、実施例１０では、カダベリン類溶液として、実施例１と同様の手順（上記［カダベリン・アジピン酸水溶液の調製］欄の「（５）カダベリン・アジピン酸塩の精製」までの手順）で調製されたカダベリン・アジピン酸塩水溶液を用いた。この溶液中におけるカダベリン・アジピン酸の濃度は１００ｇ／Ｌ、カダベリン換算濃度は４０．３ｇ／Ｌ（０．４０３ｍｏｌ／Ｌ）であった。
【００９４】
比較例４及び実施例１１では、カダベリン類溶液として、カダベリン（東京化成社製）を水に溶解させて調製した、濃度５０ｇ／Ｌ（０．４８９ｍｏｌ／Ｌ）のカダベリン水溶液を用いた。
【００９５】
実施例２〜９、比較例１〜３、比較例５では、カダベリン類溶液として、上記［カダベリン・アジピン酸水溶液の調製］欄の「（４）カダベリン・アジピン酸塩の製造」までの手順で調製されたカダベリン・アジピン酸塩水溶液（粗溶液）を用いた。この溶液中におけるカダベリン・アジピン酸の濃度は１５０ｇ／Ｌ、カダベリン換算濃度は６０．５ｇ／Ｌ（０．６０５ｍｏｌ／Ｌ）であった。
【００９６】
また、各実施例及び各比較例において、カダベリン類溶液のｐＨを、後述の表１に示す値に調整した。ｐＨ調整には基本的に１Ｎ塩酸を用いたが、比較例６については１Ｎ塩酸の代わりにカダベリンを用いてｐＨ調整を行なった。比較例１についてはｐＨ調整を行なわず、カダベリン類溶液をそのまま用いた。
【００９７】
実施例２〜１１、比較例１〜７におけるカダベリン類溶液の波長４００〜５００ｎｍにおける平均モル吸光度の変化を、後述の表１に示す。
【００９８】
また、実施例２、実施例３、比較例１、比較例２、比較例４、比較例６、実施例７、実施例１０及び実施例１１におけるカダベリン類溶液の保存０日目及び保存７日目の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを、それぞれ図３〜１１に示す。
【００９９】
［結果］
【表１】
2008174476.tif 000002
【０１００】
表１及び図２〜１１の結果から、カダベリン類溶液のｐＨを６．４以下又は７．５以上に調整して保存した実施例１〜実施例１１では、カダベリン類溶液のｐＨを６．４よりも大きく、７．５未満の範囲として保存した比較例１〜比較例７と比べ、カダベリン類溶液の着色が少なく、安定に保存できていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明を利用可能な分野は制限されず、カダベリン及び／又はカダベリン塩の溶液が用いられる任意の分野に利用することが可能であるが、特にナイロン等のポリアミドの製造分野において好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）を組み込んだプラスミドｐＣＡＤ１の構築手順の概要を示す図である。
【図２】実施例１におけるカダベリン類溶液（ｐＨ４．９３）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図３】実施例２におけるカダベリン類溶液（ｐＨ５．４３）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図４】実施例３におけるカダベリン類溶液（ｐＨ６．３５）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図５】比較例１におけるカダベリン類溶液（ｐＨ６．５０）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図６】比較例２におけるカダベリン類溶液（ｐＨ６．５５）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図７】比較例４におけるカダベリン類溶液（ｐＨ６．９７）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図８】比較例６におけるカダベリン類溶液（ｐＨ７．２０）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図９】実施例７におけるカダベリン類溶液（ｐＨ８．０８）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図１０】実施例１０におけるカダベリン類溶液（ｐＨ１０．３５）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図１１】実施例１１におけるカダベリン類溶液（ｐＨ１２．４２）の波長４００〜５００ｎｍにおける吸光スペクトルを示す図である。実線は保存０日目の吸光スペクトルを、破線は保存７日目の吸光スペクトルをそれぞれ示している。
【図１】
2008174476.tif 000003
【図２】
2008174476.tif 000004
【図３】
2008174476.tif 000005
【図４】
2008174476.tif 000006
【図５】
2008174476.tif 000007
【図６】
2008174476.tif 000008
【図７】
2008174476.tif 000009
【図８】
2008174476.tif 000010
【図９】
2008174476.tif 000011
【図１０】
2008174476.tif 000012
【図１１】
2008174476.tif 000013