(57)【要約】【課題】培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で調製することができる多糖質微粒子であって、応用範囲が広く、生体適合性にも優れた新たな多糖質微粒子及びその製造方法を提供する。【解決手段】  多糖質高分子化合物が、フェノール性水酸基を介して架橋されてなる多糖質微粒子であって、平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍである多糖質微粒子を得る。その調製のために、官能基としてフェノール性水酸基を有するフェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、前記フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。また、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物と、前記ポリフェノール類化合物のフェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖質高分子化合物が、フェノール性水酸基を介して架橋されてなることを特徴とする多糖質微粒子であって、平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍであることを特徴とする多糖質微粒子。
【請求項２】
前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境に曝されることにより、前記多糖質高分子化合物が架橋されてなるものである請求項１に記載の多糖質微粒子。
【請求項３】
前記多糖質高分子化合物が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、脱アセチル化キチン又はキトサンである請求項１又は２に記載の多糖質微粒子。
【請求項４】
前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境が、前記多糖質高分子化合物に、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、及びラッカーゼから選ばれた少なくとも１種を作用させる反応系である請求項３に記載の多糖質微粒子。
【請求項５】
更に、培養細胞が生きた状態で封入された請求項１〜４のいずれか１つに記載の多糖質微粒子。
【請求項６】
官能基としてフェノール性水酸基を有するフェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、前記フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする多糖質微粒子の製造方法。
【請求項７】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物の該フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素が、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、及びラッカーゼから選ばれた少なくとも１種である請求項６に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項８】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってペルオキシダーゼ又はカタラーゼを添加したものと、過酸化水素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項６又は７に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項９】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってチロシナーゼを添加したものと、酸素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項６又は７に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってラッカーゼを添加したものと、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項６又は７に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１１】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物が、フェノール基含有カルボキシメチルセルロース、フェノール基含有アルギン酸、フェノール基含有ヒアルロン酸、フェノール基含ポリグルタミン酸、又はフェノール基含有キトサンである請求項６〜１０のいずれか１つに記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１２】
官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物と、前記ポリフェノール類化合物のフェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１３】
前記ポリフェノール類化合物の該フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素が、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、及びラッカーゼから選ばれた少なくとも１種である請求項１２に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１４】
前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってペルオキシダーゼ又はカタラーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、過酸化水素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項１２又は１３に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１５】
前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってチロシナーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、酸素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項１２又は１３に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１６】
前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってラッカーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項１２又は１３に記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１７】
前記アミノ基含有多糖質高分子化合物が、脱アセチル化キチン又はキトサンである請求項１２〜１６のいずれか１つに記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１８】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液、又は前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液として、該フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物と該アミノ基含有多糖質高分子化合物とを溶解及び／又は分散した水性溶液を用いる請求項６〜１７のいずれか１つに記載の多糖質微粒子の製造方法。
【請求項１９】
前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物及び／又はアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液に生きた培養細胞を分散させ、培養細胞が生きた状態で封入された微粒子を得る請求項６〜１８のいずれか１つに記載の多糖質微粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧品、医薬、医療、農薬の分野で有用な多糖質微粒子及び多糖質微粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、多糖質微粒子の化粧品、医薬、医療、農薬の分野での利用が検討されている。
【０００３】
多糖質微粒子に関する技術については、例えば、下記特許文献１に、芯物質と、腸溶性のアニオン性セルロース誘導体と、カチオン性高分子架橋剤とを含んでなるマイクロカプセルであって、カチオン性高分子架橋剤がキトサンであるマイクロカプセルの発明が開示されている。そして、得られたマイクロカプセルは、薬品、食品として使用した際の毒性が無く、人工胃液（日本薬局方第１液）には溶解せず、人工腸液（日本薬局方第２液）に崩壊してｐＨ依存溶解性が見られ、マイクロカプセルの基剤によっては芯物質の放出時間も調整できることからコントロールリリース基剤としても有用であることが記載されている。
【０００４】
また、近年、医療分野では、ガンや糖尿病などの各種疾患に有効な成分を産生する細胞を包括する細胞包括カプセルを治療に利用することが試みられている。
【０００５】
そのような細胞包括カプセルに関する技術については、例えば、下記特許文献２には、約９００ダルトンから約３，０００ダルトンの間の分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングを有する複数のカプセル状構造物と、上記カプセル状構造物でカプセル化された複数の細胞とを含み、少なくとも約１００，０００ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度を有する細胞治療用組成物の発明が開示されている。そして、得られた細胞治療用組成物を患者に移植しても、患者（生体）の炎症・免疫防御機構による破壊からカプセルで包んだ細胞が保護され、長期間の抗炎症治療または免疫抑制治療を施す必要がないので、ヒトおよび動物の種々の異なる病気や不具合、例えば糖尿病の治療のために有用であることが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−７０８８１号公報
【特許文献２】特表２００６−５０３０８０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１に記載のカプセル化の技術は、ポリカチオンコロイド溶液とポリアニオンコロイド溶液との電気的相互作用を利用するカプセル化法、いわゆるコンプレックスコアセルベーション法によるものであるので、カプセル化材料がその方法に適するものに限られ他の材料への応用が制限されるという問題があった。
【０００７】
また、上記特許文献２に記載の細胞包括カプセル化の技術は、アクリル酸化したＰＥＧを、重合開始剤の存在下にアルゴンレーザーを照射して光重合するものであるので、誤照射などによってカプセル化しようとする細胞の損傷してしまう可能性があり、又は予期せぬストレス応答を誘引してしまう可能性もあった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で調製することができる多糖質微粒子であって、応用範囲が広く、生体適合性にも優れた新たな多糖質微粒子、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究した結果、多糖質高分子化合物を、フェノール性水酸基の存在下に、そのフェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と作用させることで、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な環境下に微粒子を作製することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明の多糖質微粒子は、多糖質高分子化合物が、フェノール性水酸基を介して架橋されてなることを特徴とする多糖質微粒子であって、平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍであることを特徴とする。
【００１１】
本発明の多糖質微粒子によれば、その構成の起源としてフェノール性水酸基が用いられるので、該フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて高分子ネットワーク構造が形成され、その内部に物質を包接できる。また、平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍである多糖質微粒子であるので、応用範囲が広く、生体適合性にも優れている。
【００１２】
本発明の多糖質微粒子においては、前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境に曝されることにより、前記多糖質高分子化合物が架橋されてなるものであることが好ましい。これよれば、前記多糖質高分子化合物が該化学的環境に曝されることにより、前記フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて高分子ネットワーク構造が形成される。例えば、ヒドロキシフェニル基同士の自己架橋形成やヒドロキシフェニル基とアミノ基の架橋形成による高分子ネットワーク構造が形成される。
【００１３】
本発明の多糖質微粒子においては、前記多糖質高分子化合物が、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、ヒアルロン酸、ポリグルタミン酸、脱アセチル化キチン又はキトサンであることが好ましい。これによれば、更に応用範囲が広く、生体適合性に優れた多糖質微粒子とすることができる。
【００１４】
また、前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境が、前記多糖質高分子化合物に、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、及びラッカーゼから選ばれた少なくとも１種を作用させる反応系であることが好ましい。これによれば、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で、前記フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて高分子ネットワーク構造が形成される。
【００１５】
本発明の多糖質微粒子の好ましい態様においては、前記多糖質微粒子は、培養細胞が生きた状態で封入されている。これによれば、ガンや糖尿病などの各種疾患に有効な成分を産生する細胞を包括する細胞包括カプセルとして用いることができる。また、医薬、医療分野の基礎的細胞研究のためにも有用である。
【００１６】
一方、本発明の多糖質微粒子の製造方法は、官能基としてフェノール性水酸基を有するフェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、前記フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする。また、本発明の多糖質微粒子の製造方法は、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物と、前記ポリフェノール類化合物のフェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする。
【００１７】
本発明の多糖質微粒子の製造方法によれば、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で、前記フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて高分子ネットワーク構造が形成され、前記平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍの多糖質微粒子を調製することができる。
【００１８】
本発明の多糖質微粒子の製造方法においては、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物の該フェノール性水酸基及び／又は前記ポリフェノール類化合物の該フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素が、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、チロシナーゼ、及びラッカーゼから選ばれた少なくとも１種であることが好ましい。これによれば、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で、前記フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて高分子ネットワーク構造が形成される。
【００１９】
本発明の多糖質微粒子の製造方法において、その好ましい態様においては、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってペルオキシダーゼ又はカタラーゼを添加したものと、過酸化水素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。また、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってチロシナーゼを添加したものと、酸素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる請求項６又は７に記載の多糖質微粒子の製造方法。更にまた、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってラッカーゼを添加したものと、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。
【００２０】
本発明の多糖質微粒子の製造方法において、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物は、フェノール基含有カルボキシメチルセルロース、フェノール基含有アルギン酸、フェノール基含有ヒアルロン酸、フェノール基含ポリグルタミン酸、又はフェノール基含有キトサンであることが好ましい。また、前記アミノ基含有多糖質高分子化合物は、脱アセチル化キチン又はキトサンであることが好ましい。
【００２１】
本発明の多糖質微粒子の製造方法において、その別の好ましい態様においては、前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってペルオキシダーゼ又はカタラーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、過酸化水素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。また、前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってチロシナーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、酸素を飽和させた流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。更にまた、前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液であってラッカーゼを添加したものと、前記ポリフェノール類化合物と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成させる。
【００２２】
本発明の多糖質微粒子の製造方法において、前記アミノ基含有多糖質高分子化合物は、脱アセチル化キチン又はキトサンであることが好ましい。
【００２３】
本発明の多糖質微粒子の製造方法においては、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液、又は前記アミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液として、該フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物と該アミノ基含有多糖質高分子化合物とを溶解及び／又は分散した水性溶液を用いることができる。これによれば、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物、及び前記アミノ基含有多糖質高分子化合物とを多糖質微粒子の構成材料として併用することができる。
【００２４】
また、本発明の多糖質微粒子の製造方法において、更に別の好ましい態様においては、前記フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物及び／又はアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液に生きた培養細胞を分散させ、培養細胞が生きた状態で封入された微粒子を得ることができる。これによれば、医薬、医療の分野に応用される上記細胞包括カプセルを、簡便に、且つ効率よく製造することができる。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、培養細胞の生存に影響を与えないほど温和な条件で調製することができ、応用範囲が広く、生体適合性にも優れた新たな多糖質微粒子及びその製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明において「多糖質高分子化合物」とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース等のペントース、ヘキソース糖類等を構成糖とする多糖類を意味し、天然物から得られたものであってもよく、その化学的修飾物であってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、セルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、キチン、脱アセチル化キチン、キトサン、アガロース、アガロペクチン、デンプン、アミロース、アミロペクチン、イソリケナン、ラミナラン、リケナン、グルカン、プルラン、イヌリン、マンナン、キシラン、アラビナン、ペントザン、ペクチン酸、プロツベリン酸、キチン、コロミン酸、ポルフィラン、フコイダン、カラギナン、ペクチン、ローカストビーンガム、グアーガム、タマリンドガム、タラガム、アラビアガム、ジェランゴムなどを好ましく例示することができ、好ましくはセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、キチン、脱アセチル化キチン、キトサンであり、より好ましくは、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸、脱アセチル化キチン、キトサンである。
【００２７】
本発明において、「フェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物」とは、官能基としてフェノール性水酸基を有する上記多糖質高分子化合物であり、以下のようなものを好ましく例示することができる。
【００２８】
すなわち、本発明において、「フェノール基含有カルボキシメチルセルロース」とは、カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基に官能基としてフェノール性水酸基を有する化合物を導入してなる化合物である。
【００２９】
例えば、カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基とチラミンのアミノ基とを３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride ）を用いて縮合させることで得られる。具体的にその合成反応の一例を模式的に表すと、例えば下記の模式図のように表すことができる。
【００３０】
【化１】
2008174510.tif 000002
【００３１】
すなわち、カルボキシメチルセルロースとチラミンの混合溶液に、上記ＥＤＣ、N-ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加え、室温で２４時間反応させた後、４８時間精製水中で透析して未反応物を除く。その後、凍結乾燥を行い、フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを得ることができる。
【００３２】
本発明において、「フェノール基含有アルギン酸」とは、アルギン酸のカルボキシル基に官能基としてフェノール性水酸基を有する化合物を導入してなる化合物である。その合成については、上記フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを得る場合と同様に考えることができる。
【００３３】
すなわち、アルギン酸のカルボキシル基とチラミンのアミノ基とを３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride ）を用いて縮合させることで得られる。例えば、アルギン酸とチラミンの混合溶液に上記ＥＤＣ、N-ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加え、室温で２４時間反応させた後、４８時間精製水中で透析して未反応物を除く。その後、凍結乾燥を行い、フェノール基含有アルギン酸を得ることができる。
【００３４】
本発明において、「フェノール基含有ヒアルロン酸ナトリウム」とは、ヒアルロン酸のカルボキシル基に官能基としてフェノール性水酸基を有する化合物を導入してなる化合物である。その合成については、上記フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを得る場合と同様に考えることができる。
【００３５】
すなわち、ヒアルロン酸のカルボキシル基とチラミンのアミノ基とを３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride ）を用いて縮合させることで得られる。例えば、ヒアルロン酸とチラミンの混合溶液に上記ＥＤＣ、N-ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加え、室温で２４時間反応させた後、４８時間精製水中で透析して未反応物を除く。その後、凍結乾燥を行い、フェノール基含有アルギン酸を得ることができる。
【００３６】
本発明において、「フェノール基含有ポリグルタミン酸」とは、ポリグルタミン酸のカルボキシル基に官能基としてフェノール性水酸基を有する化合物を導入してなる化合物である。その合成については、上記フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを得る場合と同様に考えることができる。
【００３７】
すなわち、ポリグルタミン酸のカルボキシル基とチラミンのアミノ基とを３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride ）を用いて縮合させることで得られる。例えば、ポリグルタミン酸とチラミンの混合溶液に上記ＥＤＣ、N-ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）を加え、室温で２４時間反応させた後、４８時間精製水中で透析して未反応物を除く。その後、凍結乾燥を行い、フェノール基含有アルギン酸を得ることができる。
【００３８】
本発明において、「フェノール基含有キトサン」とは、脱アセチル化キチン類又はキトサン類のグルコサミン単位の２位のアミノ基の少なくとも一部に、官能基としてフェノール性水酸基を導入してなるものである。
【００３９】
上記脱アセチル化キチン類又はキトサン類は、キチン（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−１，４結合した多糖）類のグルコサミン単位の２位のアセトアミド基が脱アセチル化されている多糖類であり、主にエビやカニなどの甲殻類の甲羅に含まれるキチン質から公知の手段で得ることができる。
【００４０】
上記脱アセチル化キチン類又はキトサン類の起源等については、特に制限はなく、常法によって調製されたもの、もしくは市販されているものを用いることができるが、脱アセチル化度が５０％以下であると、キチンの特性を有し溶解性の面で取り扱いづらく汎用性に欠けるので好ましくない。
【００４１】
上記脱アセチル化キチン類又はキトサン類へのフェノール性水酸基の導入手段には特に制限はないが、−ＮＨ２基対−ＣＯＯＨ基を架橋するための架橋剤、又は−ＮＨ２基対−ＳＨ基を架橋するための架橋剤等を用いることによって効率よく導入することができる。すなわち、官能基としてフェノール性水酸基を有する化合物であって、更に−ＣＯＯＨ基又は−ＳＨ基を有する化合物を、架橋剤とともに上記−ＮＨ２基を有する脱アセチル化キチン類又はキトサン類に反応させる。その反応の一例を模式的に表すと、例えば下記の模式図のように表すことができる。
【００４２】
【化２】
2008174510.tif 000003
【００４３】
具体的には、前記フェノール性水酸基を有する化合物としては、チロシン、４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、２‐アミノ‐３‐ヒドロキシフェニルプロピオン酸、及びホモゲンチジン酸等が挙げられる。また、前記架橋剤としては、−ＮＨ２基対−ＣＯＯＨ基を架橋するための架橋剤として、１，１−カルボニルジイミダゾール、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩等、−ＮＨ２基対−ＳＨ基を架橋するための架橋剤として、N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate （ＳＰＤＰ）、N-(8-Maleimidocapryloxy)sulfosuccinimide、N-(6-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide等が挙げられる。
【００４４】
以下、フェノール基含有キトサンについての、上記架橋反応の好ましい態様を挙げる。
【００４５】
まず所望の脱アセチル化度のキトサンを、ギ酸または酢酸のような希有機酸溶液に溶解する。これにこれに３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を添加し、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩を加えて、４〜３０℃で、１〜４８時間程度攪拌する。次いで、蒸留水を用いて透析し、未反応の架橋剤などを除去した後、凍結真空乾燥してフェノール基導入キトサンを得る。
【００４６】
フェノール基含有キトサンの上記フェノール性水酸基の導入率が、上記グルコサミン単位数１００に対して、該フェノール性水酸基数０．０１〜２０の割合であることが好ましい。その割合が、０．０１以下であると架橋形成能が低く、２０以上であると溶解性が低くなるので、いずれも好ましくない。
【００４７】
なお、上記「フェノール性水酸基の導入率」とは、フェノール性水酸基に起因する吸収波長（例えば２７５ｎｍ）における吸光度を測定することで算出される、上記グルコサミン単位数１００に対するフェノール性水酸基数の相対値を意味する。
【００４８】
上記フェノール性水酸基の導入率は、上記架橋反応の反応時間、反応温度、各反応成分の濃度を変えることによって制御することができる。例えば、反応時間を短くし、又は反応温度を下げ、又は各反応成分の濃度を低くすることで導入率を低く抑えることができる。一方、反応時間を長くし、又は反応温度を上げ、又は各反応成分の濃度を高くすることで、高い効率で導入することができる。また、前述の架橋剤の至適ｐH条件下で反応を行わせることで、導入率を向上させることができる。
【００４９】
本発明の多糖質微粒子は、上記多糖質高分子化合物が、フェノール性水酸基を介して架橋されてなるものであって、平均粒子径が０．０１〜５，０００μｍであることを特徴とする。また、そのより好ましい平均粒子径は、１０〜５００μｍである。
【００５０】
本発明の多糖質微粒子は、上記多糖質高分子化合物を、フェノール性水酸基の存在下に、そのフェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境に曝すことにより得ることができる。その際、上記のフェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物のように、多糖質高分子化合物にフェノール性水酸基が導入されていていることにより該化学的環境にフェノール性水酸基が存在していてもよく、ポリフェノール類化合物のようなフェノール性水酸基を有する化合物を別に添加することにより該化学的環境にフェノール性水酸基が存在していてもよく、その両方であってもよい。
【００５１】
上記ポリフェノール類化合物としては、カテキン類化合物、アントシアニン類化合物、ルチン、並びに、赤キャベツ色素（シアニジンアシルグリコシド類化合物）、ベニバナ黄色素（カーサマスイエロー：サフロミンA、サフロミンB）、カーサマスレッド（カーサミン）、シソ色素（Perilla colour：シソニン、マロニルシソニン）、アカダイコン色素（Red radish colour：ペラルゴニジンアシルグリコシド類化合物）、ムラサキイモ色素（Purple sweet potato colour：シアニジンアシルグルコシド類化合物、ペオニジンアシルグルコシド類化合物）、エルダーベリー色素（Elderberry colour：シアニジングリコシド類化合物）等の天然色素を好ましく例示することができる。
【００５２】
また、ゼラチン等のポリペプチド類化合物は、その分子内にチロシン残基等のフェノール基を複数個含有してなるものが多く、本願発明においては、これらの化合物を上記ポリフェノール類化合物として用いることもできる。
【００５３】
本発明において、「フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境」とは、フェノール性水酸基が有する架橋形成能が発揮されて化学的結合が形成されるのに必要かつ十分な化学的環境を意味する。その結合の態様としては、水酸基が活性化されてキノンが生成し、これが他のキノンやその他の官能基と結合したものが挙げられ、以下の構造式に表すようなものが例示できる。
【００５４】
【化３】
2008174510.tif 000004
【００５５】
また、上記化学的環境において、遊離のアミノ基が存在する場合には、その結合の態様としては、例えば、以下の模式図に表すようなものが挙げられる。
【００５６】
【化４】
2008174510.tif 000005
【００５７】
フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境としては、その一例として、上記官能基としてフェノール性水酸基を有する多糖質高分子化合物に、ペルオキシダーゼ又はカタラーゼ、及び過酸化水素を作用させる反応系が挙げられる。その場合、ペルオキシダーゼの起源については特に限定されないが、西洋ワサビ由来のもの等を好ましく用いることができる。また、カタラーゼは、ヒト由来のもの等を好ましく用いることができる。
【００５８】
また、前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境の他の一例として、前記機能性キトサン誘導体にチロシナーゼ及び酸素を作用させる反応系が挙げられる。その場合、チロシナーゼは、マッシュルーム由来のもの等を好ましく用いることができる。
【００５９】
また、前記フェノール性水酸基が酸化されるのに有効な化学的環境の更に他の一例として、前記機能性キトサン誘導体にラッカーゼを作用させる反応系が挙げられる。その場合、ラッカーゼは、ウルシ由来のもの等を好ましく用いることができる。
【００６０】
一方、本発明の多糖質微粒子の製造方法は、官能基としてフェノール性水酸基を有するフェノール性水酸基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、前記フェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする。また、本発明の多糖質微粒子の製造方法は、官能基としてアミノ基を有するアミノ基含有多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液と、ポリフェノール類化合物と、前記ポリフェノール類化合物のフェノール性水酸基を酸化する能力のある酵素と、流動パラフィンとを混合しエマルジョンを形成することを特徴とする。
【００６１】
上記エマルションを形成する手段に特に制限はないが、攪拌によるほか、膜乳化装置、同心円管をもちいるエマルション作製装置等の装置を用いることができる。なお、エマルション形成の安定化のためには、溶液に大豆由来レシチン等の界面活性剤を添加して用いることが好ましい。
【００６２】
本発明の好ましい態様においては、上記多糖質高分子化合物を溶解及び／又は分散した水性溶液に生きた培養細胞を分散させておくことで、培養細胞が生きた状態で封入された微粒子を得ることができる。
【００６３】
上記培養細胞は、通常の実験、研究、工業的目的に使用される環境で培養できる細胞であればよく、特に制限されない。
【００６４】
本発明の多糖質微粒子は、ドラッグデリバリー用の薬剤封入材料等として有用である。また、本発明の多糖質微粒子を用いて、培養細胞が封入された微粒子は、例えば、抗体などの有用タンパク質を生産する細胞を生きた状態で封入して、その有用タンパク質を生体外で生産させる技術などに有用である。更に、インスリン分泌細胞を封入した後、生体に移植して糖尿病の治療を行う技術や、抗ガンプロドラック代謝酵素発現細胞を封入した後、腫瘍近傍に移植してのガン治療を行う技術などにも有用である。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００６６】
<製造例１>  
フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを以下のようにして調製した。
【００６７】
平均分子量６０，０００のカルボキシメチルセルロースナトリウム（関東化学株式会社製）を、１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で、５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し、その溶液に０．７（ｗ／ｖ）でチラミン塩酸塩（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）を溶解させた。その後、０．４ ％（ｗ／ｖ）の濃度で３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ペプチド研究所）と０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度でヒドロキシこはく酸イミド（和光純薬工業株式会社製）また０．３％（ｗ／ｖ）で１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物を添加し、２５℃で２４時間反応させた。その後、蒸留水で透析することにより未反応の架橋剤等を除去し、フェノール基含有カルボキシメチルセルロースを得た。
【００６８】
得られたフェノール基含有カルボキシメチルセルロースを、紫外・可視分光法で分析したところ、カルボキシメチルセルロースの構成単位糖１００個当りに２４個のフェノール基が導入されていた。なお、チラミン塩酸塩、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩、ヒドロキシこはく酸イミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物の添加量の操作や反応時間を操作することによって、フェノール基の導入量を制御可能であった。
【００６９】
<製造例２>  
フェノール基含有アルギン酸を以下のようにして調製した。
【００７０】
平均分子量７０，０００のアルギン酸（Kimica I-1G、Kimica）を、１．０ ％（ｗ／ｖ）の濃度で、０．１M MES緩衝液（ｐH６．０）に溶解し、その溶液に１．０ ％（ｗ／ｖ）の濃度で３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ペプチド研究所）と０．８６％（ｗ／ｖ）の濃度でヒドロキシこはく酸イミド（和光純薬工業株式会社製）を添加した。そして、２５℃で、１時間反応させた。その後、チラミン塩酸塩（シグマアルドリッチ ジャパン株式会社製）を１１．３％（ｗ／ｖ）となるように添加し、さらに２５℃で２０時間反応させた。その後、蒸留水で透析することにより未反応の架橋剤等を除去し、フェノール基含有アルギン酸を得た。
【００７１】
得られたフェノール基含有アルギン酸を、紫外・可視分光法で分析したところ、アルギン酸の構成単位糖１００個当りに２．５個のフェノール基が導入されていた。なお、      チラミン塩酸塩、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩ペプチド研究所製）、ヒドロキシこはく酸イミド（和光純薬工業株式会社製）の添加量を操作することによって、フェノール基の導入量を制御可能であった。
【００７２】
<製造例３>  
フェノール基含有キトサンを以下のようにして調製した。
【００７３】
脱アセチル化度８０％以上、粘度１０ｃｐｓ以上、８０メッシュパスのキトサン（脱アセチル化キチン）（商品名「キトサンＬＬ」、焼津水産化学工業株式会社製）を、３‐（ｐ‐ヒドロキシフェニル）プロピオン酸を０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解する蒸留水に１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いてｐＨを６．０に調整した後、３−（３−ジメチルアミノプロピル）−１−エチルカルボジイミド・塩酸塩（ペプチド研究所製）、ヒドロキシこはく酸イミド（和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ、０．４３％（ｗ／ｖ）および０．３６％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解し、２５℃、ｐＨ６．０で２４時間反応させて、キトサンのグルコサミン単位の２位のアミノ基にフェノール基を導入した。なお、水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）および３−（ｐ‐ヒドロキシフェニル）プロピオン酸の添加量を操作することによって、フェノール基の導入量を制御可能であった。
【００７４】
<実施例１>  
フェノール基含有カルボキシメチルセルロースが架橋されてなる多糖質微粒子を以下のようにして調製した。
【００７５】
大豆由来レシチン（３ｗｔ％、和光純薬製）を添加した１Ｌの流動パラフィンに５ｍｌの３０％過酸化水素水を添加し、4時間攪拌した。遠心分離によって、油層と水層を分離し、その油層を、以下に過酸化水素飽和−流動パラフィンとして使用した。
【００７６】
製造例１で得られたフェノール基含有カルボキシメチルセルロースを、最終濃度４．０質量％となるようにKrebs Ringer Hepes 緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。その溶液に、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase、HRP）（和光純薬工業株式会社製）を最終濃度５（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるように添加した。これを、以下にペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有カルボキシメチルセルロース溶液として使用した。
【００７７】
同心円二重管の外筒から上記過酸化水素飽和−流動パラフィンを送液し、その同一方向に内筒から上記ペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有カルボキシメチルセルロース溶液を送液し、直径約１５０‐２００マイクロメートルの液滴が分散したエマルション液を作製した。
【００７８】
１０分間放置後、得られたエマルション液３５ｍｌとKrebs Ringer Hepes緩衝液５ｍｌと混合し、遠心分離器にかけた結果、水層に直径約１５０‐２００マイクロメートルの微粒子が形成していることが確認された。
【００７９】
<試験例１>  
上記実施例１の微粒子の調製工程において、そのペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有カルボキシメチルセルロース溶液に、ネコ腎由来細胞（ＣＲＦＫ細胞）を、１．５×１０７ｃeｌｌｓ／ｍｌの細胞数濃度で懸濁して用いたところ、１つの微粒子当りに約１〜１０細胞個の割合で微粒子中に細胞が封入された（図１の顕微鏡写真参照）。また、セルラーゼを用いてカプセルを分解した後、トリパンブルー法により生きている細胞の割合を測定したところ、得られた微粒子中の細胞は８０％以上が生存していた。
【００８０】
<比較例１>  
フェノール基を有しないカルボキシメチルセルロースを用いた以外は、実施例１と同様にして、微粒子の調製を試みた。しかしながら微粒子は形成しなかった。
【００８１】
<実施例２>
フェノール基含有アルギン酸が架橋されてなる多糖質微粒子を以下のようにして調製した。
【００８２】
大豆由来レシチン（３ｗｔ％、和光純薬製）を添加した１Ｌの流動パラフィンに５ｍｌの３０％過酸化水素水を添加し、4時間攪拌した。遠心分離によって、油層と水層を分離し、その油層を、以下に過酸化水素飽和−流動パラフィンとして使用した。
【００８３】
製造例２で得られたフェノール基含有アルギン酸を、最終濃度１．５質量％となるように二価の金属イオンを含まないKrebs Ringer Hepes 緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。その溶液に、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を最終濃度１．６（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるように添加した。これを、以下にペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有アルギン酸溶液として使用した。
【００８４】
同心円二重管の外筒から上記過酸化水素飽和−流動パラフィンを送液し、その同一方向に内筒から上記ペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有アルギン酸溶液を送液し、直径約１５０‐２００マイクロメートルの液滴が分散したエマルション液を作製した。
【００８５】
１０分間放置後、得られたエマルション液３５ｍｌとKrebs Ringer Hepes緩衝液５ｍｌと混合し、遠心分離器にかけた結果、水層に直径約１５０‐２００マイクロメートルの微粒子が形成していることが確認された。
【００８６】
<試験例２>  
上記実施例２の微粒子の調製工程において、そのペルオキシダーゼ添加―フェノール基含有アルギン酸溶液に、ネコ腎由来細胞（ＣＲＦＫ細胞）を、１．５×１０７ｃeｌｌｓ／ｍｌの細胞数濃度で懸濁して用いたところ、１つの微粒子当りに約１〜１０細胞個の割合で微粒子中に細胞が封入された（図２の顕微鏡写真参照）。また、アルギン酸リアーゼを用いてカプセルを分解した後、トリパンブルー法により生きている細胞の割合を測定したところ、得られた微粒子中の細胞の９０％以上が生存していた。
【００８７】
更に、その微粒子を１０ｖｏｌ％の牛胎児血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ培養液中で液体培養したところ、１ヶ月以上にわたり微粒子は破壊されることなく、微粒子内に封入された細胞は生存していた。
【００８８】
<比較例２>  
フェノール基を有しないアルギン酸を用いた以外は、実施例２と同様にして、微粒子の調製を試みた。しかしながら微粒子は生成しなかった。
【００８９】
<実施例３>  
キトサンと赤キャベツ色素とが架橋されてなる多糖質微粒子を以下のようにして調製した。
【００９０】
大豆由来レシチン（３ｗｔ％、和光純薬製）を添加した１Ｌの流動パラフィンに５ｍｌの３０％過酸化水素水を添加し、4時間攪拌した。遠心分離によって、油層と水層を分離し、その油層を、以下に過酸化水素飽和−流動パラフィンとして使用した。
【００９１】
１vol％−酢酸水溶液に、脱アセチル化度９０％以上、粘度１０ｃｐｓ以上、１００メッシュパスのキトサン（脱アセチル化キチン）（商品名「キトサンＰＬ−９０」、焼津水産化学工業株式会社製）を、最終濃度４．０質量％となるように溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐH５．８に調整した。その溶液に西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を、最終濃度５（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるように添加した。これを、以下にペルオキシダーゼ添加−キトサン溶液として使用した。
【００９２】
上記ペルオキシダーゼ添加−キトサン溶液に、１０質量％となるように精製水に溶解した赤キャベツ色素溶液を、体積比１（色素）：９（キトサン）で混合した。その混合液１ｍｌを上記過酸化水素飽和−流動パラフィン２０ｍｌに添加し、マグネティックスターラーで攪拌してエマルション液を得た。そのエマルション液２０ｍｌに、１０mlのヘキサンを混合し、遠心分離器にかけ微粒子を沈殿させた結果、直径約１０‐３００マイクロメートルの微粒子が形成していることが確認された（図３の顕微鏡写真参照）
<実施例４>  
キトサンとゼラチンとが架橋されてなる多糖質微粒子を以下のようにして調製した。
【００９３】
大豆由来レシチン（３ｗｔ％、和光純薬工業株式会社製）を添加した１Ｌの流動パラフィンに５ｍｌの３０％過酸化水素水を添加し、4時間攪拌した。遠心分離によって、油層と水層を分離し、その油層を、以下に過酸化水素飽和−流動パラフィンとして使用した。
【００９４】
１vol％−酢酸水溶液に、脱アセチル化度９０％以上、粘度１０ｃｐｓ以上、１００メッシュパスのキトサン（脱アセチル化キチン）（商品名「キトサンＰＬ−９０」、焼津水産化学工業株式会社製）を、最終濃度２．０質量％となるように溶解し、水酸化ナトリウムを用いてｐH５．８に調整した。その溶液に、１０質量％となるように精製水に溶解したゼラチン溶液を、体積比１（キトサン）：１（ゼラチン）で混合し、更に、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（和光純薬工業株式会社製）を、最終濃度５（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるように添加した。これを、以下にペルオキシダーゼ添加−ゼラチン添加―フェノール基含有キトサン溶液として使用した。
【００９５】
上記過酸化水素飽和−流動パラフィン２０ｍｌに、上記ペルオキシダーゼ添加−ゼラチン添加―フェノール基含有キトサン溶液を約１ml添加し、マグネティックスターラーで攪拌してエマルション液を得た。そのエマルション液２０ｍｌに、１０mlのヘキサンを混合し、遠心分離器にかけて微粒子を沈殿させた結果、直径約１０‐３００マイクロメートルの微粒子が形成していることが確認された（図４の顕微鏡写真参照）。
【００９６】
この微粒子は、ゼラチンを用いることによって、ゼラチンの構造中に含まれるヒドロキシフェニル基がキトサンの遊離アミノ基との間に架橋を形成し、この両者が化学的に結合した高分子ネットワーク構造が形成されたものであることが考えられた。
【００９７】
<実施例５>  
キトサンと赤キャベツ色素とが架橋されてなる多糖質微粒子を以下のようにして調製した。
【００９８】
１vol％−酢酸水溶液に、脱アセチル化度９０％以上、粘度１０ｃｐｓ以上、１００メッシュパスのキトサン（脱アセチル化キチン）（商品名「キトサンＰＬ−９０」、焼津水産化学工業株式会社製）を、最終濃度３．０質量％となるように溶解し、１Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐH５．８に調整した。その溶液に赤キャベツ色素を際終濃度が1 質量％となるように溶解させ、更に西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（商品名、及び購入元をおねがいします。）を、最終濃度１５（ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）となるように添加した。
【００９９】
上記のようにして得られた溶液を、膜乳化装置(細孔径19.9 mm、押し出し速度0.3 ml/min)（製品名等があればおねがいします）を用いて、大豆由来レシチンを３．０％溶解させた流動パラフィン中に分散させた。そして、得られたＷ／Ｏエマルション液に、過酸化水素を溶解させた、大豆由来レシチン（３ｗｔ％、和光純薬製）を含む流動パラフィン(過酸化水素：流動パラフィン＝１：１０、室温で１晩攪拌)を１：１の割合で混合し２０分間静置した。これを減圧下(常圧より０．１Ｍｐａ以下)に、４８時間攪拌して乾燥させた。これに、ヘキサンを加え洗浄、微粒子を回収後、液体窒素で凍結させ凍結真空乾燥した。
【０１００】
図５には、得られた微粒子の走査顕微鏡SEM（Scanning Electron Microscope）を用いて撮影した写真を示す。
【０１０１】
この微粒子は、赤キャベツ色素を用いることによって、赤キャベツ色素のシアニジンアシルグリコシド類化合物の構造中に含まれるヒドロキシフェニル基がキトサンの遊離アミノ基との間に架橋を形成し、この両者が化学的に結合した高分子ネットワーク構造が形成されたものであることが考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】ネコ腎由来細胞を封入したカルボキシメチルセルロース含有−多糖質微粒子の顕微鏡写真である。
【図２】ネコ腎由来細胞を封入したアルギン酸含有−多糖質微粒子の顕微鏡写真である。
【図３】キトサン含有−多糖質微粒子の顕微鏡写真である。
【図４】キトサンとゼラチンとが架橋されてなる多糖質微粒子の顕微鏡写真である。
【図５】キトサンと赤キャベツ色素とが架橋されてなる多糖質微粒子の電子顕微鏡写真である。
【図１】
2008174510.tif 000006
【図２】
2008174510.tif 000007
【図３】
2008174510.tif 000008
【図４】
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【図５】
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