(57)【要約】【課題】高い精度で簡便かつ迅速に核酸の定量を行うのに好適な標準核酸キットを提供する。【解決手段】複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、濃度が異なる複数の標準核酸溶液が密封されてなることを特徴とする標準核酸キット、および複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、質量が既知の複数の標準核酸が密封されてなることを特徴とする標準核酸キット。前記容器は、ウェルプレート状であることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、濃度が異なる複数の標準核酸溶液が密封されてなることを特徴とする標準核酸キット。
【請求項２】
前記複数の標準核酸溶液が系列希釈されたものであることを特徴とする請求項１に記載の標準核酸キット。
【請求項３】
複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、質量が既知の複数の標準核酸が密封されてなることを特徴とする標準核酸キット。
【請求項４】
前記容器がウェルプレート状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の標準核酸キット。
【請求項５】
他の容器への装着時に装着方向を決定する凸部が前記容器に設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の標準核酸キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の定量に好適な標準核酸キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の定量は、特に分子生物学の多くの領域で、また医療分野の分子診断において極めて重要である。具体的には、例えば、ゲノム内で増幅される遺伝子配列のコピー数をＤＮＡレベルで決定する際などに、核酸の定量が行われる。そして、この時実際には、ｍＲＮＡの定量が行われることが多い。なぜなら、通常ｍＲＮＡの量が各コード遺伝子の発現の尺度となるからである。
一般的に、定量に用いる試料中に十分な量の核酸が存在する場合には、ノーザンブロット解析やＲＮアーゼプロテクションアッセイなどの従来法によってｍＲＮＡを定量できる。しかし、これら従来法は、核酸の検出感度が低いため、用いる試料中に定量対象の核酸が微量しかない場合や、極めて弱く発現する遺伝子の定量を行う場合などには不適切である。そこで、このような条件下でも定量性が高い核酸定量方法として、例えば、比較対象として内部標準核酸溶液または外部標準核酸溶液を用いる方法が開示されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００１−３１４１９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、特許文献１に記載の方法は、標準核酸溶液の濃度や標準核酸の純度に誤差が生じると、核酸の定量を正確に行うことができない。特に、用いる試料中の定量対象の核酸が微量であるほど、また遺伝子の発現が弱くなるほど、誤差が生じた時の定量結果の精度低下は著しい。そして誤差は、定量に伴う操作が多くなるほど、そして煩雑になるほど生じ易い。
従来、定量時には、濃度既知の核酸溶液をＴｒｉｓ−ＥＤＴＡなどの緩衝液で希釈して標準核酸溶液を調製し、これを測定用セルやウェルプレートなどに分注する必要がある。この時、上記のように、定量対象の核酸が微量な場合や遺伝子の発現が弱い場合には、標準核酸溶液も極めて低濃度にすることが必要なので、特に希釈操作の回数も多くなる。そして、定量を行うたびにこのような希釈、分注等の操作が必要なので、標準核酸溶液の濃度誤差発生の原因となる操作ミスを起こす頻度も高くなる。さらにそれだけにとどまらず、操作が多いので大変手間を要し、一回の定量に３０分以上の所要時間が必要となることがほとんどであった。また、特にＲＮＡは、ＤＮＡよりも不安定なので、操作中のコンタミネーションにより分解し易く、操作が多いことでコンタミネーションの起こる頻度が高かった。
このように、従来の核酸定量方法は、操作が煩雑で時間を要し、測定誤差を生じる可能性が高いという問題点があった。
【０００４】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、高い精度で簡便かつ迅速に核酸の定量を行うのに好適な標準核酸キットを提供すること課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記課題を解決するため、
請求項１に記載の発明は、複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、濃度が異なる複数の標準核酸溶液が密封されてなることを特徴とする標準核酸キットである。
請求項２に記載の発明は、前記複数の標準核酸溶液が系列希釈されたものであることを特徴とする請求項１に記載の標準核酸キットである。
請求項３に記載の発明は、複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、質量が既知の複数の標準核酸が密封されてなることを特徴とする標準核酸キットである。
請求項４に記載の発明は、前記容器がウェルプレート状であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の標準核酸キットである。
請求項５に記載の発明は、他の容器への装着時に装着方向を決定する凸部が前記容器に設けられていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の標準核酸キットである。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、核酸の定量を高い精度で簡便かつ迅速に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について詳しく説明する。
（第一の実施形態）
本発明の標準核酸キットの第一の実施形態は、複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、濃度が異なる複数の標準核酸溶液が密封されてなることを特徴とする。
【０００８】
図１は、本実施形態の標準核酸キットおよび該キットの使用方法を例示する図である。
図１（ａ）には、試料充填部である八つのチューブ状容器１１１、１１１、・・・が直列に連結されてなる容器（以下、連結容器と略記する）１１を図示している。連結容器１１は、本発明の標準核酸キットを構成するものである。
【０００９】
連結容器１１は、透明、半透明、着色されたものなどいずれでも良い。材質としては、好ましいものとして、ポリスチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレン、メチルペンテン樹脂（ＴＰＸ）、フッ素樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリウレタン、塩化ビニル樹脂等のプラスチック等が挙げられる。そして、必要であれば従来公知の方法で着色し、金型成型等の従来公知の方法によって製造すれば良い。
【００１０】
チューブ状容器１１１、１１１、・・・の容量は特に限定されないが、核酸定量時に用いる試料の一般的な量を考慮すると、１０〜１０００μｌであることが好ましい。
【００１１】
連結容器１１中、チューブ状容器１１１、１１１、・・・には、それぞれ互いに異なる濃度の標準核酸溶液１３（１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅ、１３ｆ、１３ｇおよび１３ｈ）が充填されている。ここで、標準核酸溶液１３は、標準核酸の種類はいずれも同じで濃度が異なる、所謂系列希釈されたものである。また、チューブ状容器１１１一つあたりの標準核酸溶液１３の充填量は、チューブ状容器１１１の容量よりも少なければ特に限定されず、核酸の定量に必要な液量以上であれば良く、必ずしもすべての標準核酸溶液１３で同じである必要性はない。すなわち、充填される標準核酸溶液１３は、濃度で管理される。
【００１２】
標準核酸溶液１３は、標準核酸に水または緩衝液を添加して、該標準核酸を溶解することで調製できる。
本発明で用いる標準核酸とは、目的の核酸を定量する際に比較対象として用いるものであり、その種類は特に限定されず、定量対象の核酸の種類に応じて適宜選定すれば良い。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡのいずれでも良いし、天然由来のものおよび人工合成品のいずれでも良い。ここで人工合成品とは、天然由来のものを化学的に修飾したものも含む。標準核酸は従来公知の方法で調製すれば良く、例えば、天然由来のものは、生体等から取り出したものを必要に応じて適宜抽出および／または精製して用いることができるし、人工合成品は、液相合成または固相合成等の化学合成によって調製できる。これら標準核酸は、定量対象の核酸と同一であることが好ましい。
【００１３】
標準核酸溶液の調製に用いる水は、蒸留水、イオン交換水等の精製水が好ましい。また、緩衝液は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０〜８．０）＋０．１〜１ｍＭ  ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０〜８．０））等の、核酸の定量に通常用いられるもので良い。
【００１４】
また、標準核酸溶液の濃度範囲は特に限定されず、試料中の定量対象の核酸濃度を考慮して適宜調整すれば良い。
【００１５】
本発明の標準核酸キットを用いた定量の対象となる核酸を含む試料としては、特に限定されるものではなく、例えば、血液由来の試料など、生体成分由来の試料をそのまま、あるいは必要に応じて核酸の抽出および／または精製操作等を加えたものを用いることができる。
【００１６】
本発明の標準核酸キットを用いる場合には、標準核酸の検出値と濃度との関係から検量線を作成しておき、この検量線を用いて定量対象の核酸の検出値からその濃度を算出すると良い。
また、標準核酸と定量対象の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略記する）法等、従来公知の核酸増幅法により増幅を行ってから、あるいは増幅反応中に、定量に供しても良い。この場合は、標準核酸と定量対象の核酸をいずれも同一条件下で増幅することが必要である。
標準核酸と定量対象の核酸の検出には、従来公知の核酸検出方法を適用すれば良い。例えば、これら核酸のＵＶ吸収や、これら核酸に結合している蛍光試薬の蛍光シグナルの測定により行うことができる。
【００１７】
標準核酸溶液１３はすべて、後記するように蓋１２を装着する前に、標準核酸濃度を測定して、品質に異常がないことを確認おくことが好ましい。さらに、標準核酸濃度の測定は、複数の方法で行うことが好ましい。そして、品質異常の有無は、例えば、標準核酸濃度の測定値と濃度設定値との誤差が、濃度設定値に対して±５％以内であるか否かを目安にすると良い。このようにすることで、標準核酸キット１を一層高品質なものとすることができる。
【００１８】
そして、図１（ｂ）に示すように、このような状態の連結容器１１に蓋１２を装着して、チューブ状容器１１１、１１１、・・・をそれぞれ個別に密閉することで標準核酸キット１が構成されている。蓋１２は、透明、半透明、着色したものなどいずれでも良く、材質も連結容器１１と同様のもので良いし、連結容器１１と同様の方法で製造できる。蓋１２の連結容器１１への固定のさせ方は、特に限定されない。
【００１９】
標準核酸キット１においては、蓋１２が装着されていることで、標準核酸溶液１３は、個別にチューブ状容器１１１、１１１、・・・内に密封されている。したがって、標準核酸キット１を取り扱う際は、すべての標準核酸溶液１３はチューブ状容器１１１、１１１、・・・から漏れることがない。そして、標準核酸キット１の保存中に、すべての標準核酸溶液１３に異物が混入することもない。
【００２０】
標準核酸キット１は、チューブ状容器１１１、１１１、・・・内の雰囲気を窒素ガスや、ヘリウムまたはアルゴン等の不活性ガスで置換しておく方が好ましい。これにより、酸化反応等による標準核酸溶液１３の劣化を一層効果的に抑制できるので、標準核酸キット１の一層長期の保存が可能である。このようなガスの置換は、連結容器１１に蓋１２を装着する際に、チューブ状容器１１１、１１１、・・・内に、前記ガスを通じておくことで行える。
【００２１】
また、連結容器１１および蓋１２は、いずれも着色されたものとし、チューブ状容器１１１、１１１、・・・内に光が透過し難くしておくことが好ましい。これにより、光吸収による標準核酸溶液１３の劣化を一層効果的に抑制できるので、標準核酸キット１の一層長期の保存が可能である。
【００２２】
核酸の定量を行う時は、例えば、標準核酸キット１から蓋１２を外し、充填されている標準核酸溶液１３を、定量を行う別の容器に添加すれば良い。図１（ｂ）および（ｃ）では、標準核酸溶液１３ｄ、１３ｅ、１３ｆ、１３ｇおよび１３ｈを、９６ウェルプレート７の一系列のウェル内に、濃度ごとに添加する場合を例示している。なお、図１（ｃ）においては、９６ウェルプレート７について、その一部の図示を省略している。
【００２３】
そして、定量対象の核酸を含む試料を、前記ウェルプレート７の、標準核酸溶液１３ｄ〜１３ｈが添加されていないウェル内に添加して、これら標準核酸溶液中および試料中の核酸を検出すれば良い。標準核酸溶液中の標準核酸検出値から検量線を作製し、該検量線を用いて、試料中の核酸検出値から、核酸濃度を定量できる。なお、ここでは、標準核酸溶液として標準核酸キット１から五種類の濃度のものを選択して用いる例を示したが、いずれの濃度の標準核酸を用いるかは、適宜状況に応じて選択すれば良い。
【００２４】
なお蓋１２を、連結容器１１へ繰返し着脱可能なものとしておけば、標準核酸キット１は、標準核酸溶液１３がなくならない限り何度でも繰返し使用できる。繰返し使用する際は、使用前に上記方法で標準核酸溶液１３の品質に異常がないことを確認しておくことが好ましい。
【００２５】
本発明の標準核酸キットを用いれば、核酸の定量操作を大幅に簡略化できる。例えば、従来法では、定量時に所定濃度の核酸溶液を希釈して、複数の異なる濃度の標準核酸溶液を調製し、これを核酸の定量を行う別の容器に添加する必要がある。特に定量対象の核酸が微量である場合には、標準核酸溶液の濃度も極めて低くする必要があり、核酸溶液の希釈操作を繰り返す必要がある。定量を行うたびにこのような煩雑な操作が必要となるので、核酸の定量に長時間を要する。
しかし、本発明の標準核酸キットを用いれば、系列希釈された標準核酸溶液が既に調製されているので、蓋を外して標準核酸溶液を、定量を行う別の容器に添加するだけである。標準核酸キットは、冷凍または冷蔵保存することが好ましいが、例えば、冷凍保存中のものを解凍して、上記のように標準核酸溶液を別の容器に添加するまでに要する時間は、３分程度である。すなわち、核酸の定量時間を従来よりも大幅に短縮できる。
また、従来法では、必要な操作が多いので、標準核酸溶液の濃度誤差発生の原因となる操作ミスを起こす可能性が高く、さらに、操作の過程で標準核酸溶液にコンタミネーションが生じる可能性も高いので、定量結果の精度が低くなる可能性が高い。
しかし、本発明の標準核酸キットを用いれば、操作が大幅に簡略化できるので、操作ミスおよびコンタミネーションのいずれもが抑制でき、高精度な定量結果が得られる。
【００２６】
なお、ここでは、蓋１２を連結容器１１へ装着することで、同時にチューブ状容器１１１がすべて密閉される構成のものを示したが、例えば、蓋１２を装着する代わりに、連結容器１１の、チューブ状容器１１１、１１１、・・・の開口部側表面に、蓋としてプラスチックフィルム（図示略）を貼着して、チューブ状容器１１１、１１１、・・・を密閉しても良い。この場合、プラスチックフィルムの貼着面のうち、貼着時に前記開口部と重なる部位には、粘着剤が存在しないことが好ましい。プラスチックフィルムとしては、従来公知のものを用いれば良い。さらに、チューブ状容器１１１、１１１、・・・は、ここに示したように、すべて一括して一つの蓋で密閉されていなくても良く、複数の蓋で個別に密閉されていても良い。ただし、定量操作の容易さの観点から、すべて一括して一つの蓋で密閉されていることが好ましい。
【００２７】
また、ここでは、連結容器としてチューブ状容器１１１が八つ連結されてなるものを例示しているが、本発明はこれに限定されるものではない。例えば、チューブ状容器１１１の数は、複数であれば八つ以外のいくつでも良い。そして、試料充填部の形状も試料が充填できるものであれば、チューブ状以外のいずれでも良く、必ずしもすべて同一の形状である必要性もない。ただし、試料の充填および採取、並びに連結容器の作製の容易さの観点から、すべて同一の形状である方が好ましい。そして、連結容器の形状も、試料充填部が一列で直列に連結されたもの以外でも良く、例えば、複数列で直列に連結されたものでも良いし、必ずしも直列に連結されている必要性もない。ただし、試料の充填および採取の容易さの観点から、直列に連結されていることが好ましい。すなわちここでは、複数の試料充填部が設けられた容器として、上記「連結容器」を採り上げて説明しているが、密閉可能な試料充填部が複数設けられているものであればいずれでも良く、上記「連結容器」以外で好ましいものとしては、複数のウェルが設けられたウェルプレート状のものを例示できる。
さらに、標準核酸溶液１３の数も、複数であれば八つ以外のいくつでも良いし、必ずしもすべての濃度が異なっていなくても良く、定量対象の核酸を含む試料の種類に応じて適宜選定すれば良い。
【００２８】
例えば、ここでは、標準核酸キットとして、連結容器１１のチューブ状容器１１１すべてに標準核酸溶液１３を充填した構成のものを示したが、標準核酸溶液が充填されている試料充填部以外に、空の試料充填部を有する容器を用いても良い。このようなものとして、具体的には、ウェルプレート状の容器の一系列のウェルのみに複数の標準核酸溶液を充填したものが例示できる。そして、該容器のすべてのウェルを蓋で密封して標準核酸キットとすれば良い。図２は、このような標準核酸キットの蓋を取り外し、ウェルプレート状容器２１の空の試料充填部に定量対象の核酸を含む試料を充填した状態を示す図である。
このような前記容器２１を用いれば、該容器２１を直ちに核酸の定量に供することが可能で、標準核酸溶液を核酸定量用の他の容器へ添加する操作が省略できる。
【００２９】
さらに本発明においては、連結容器等の複数の試料充填部を有する容器を、他の容器へ装着可能としても良い。この場合、連結容器等には、他の容器への装着時に装着方向を決定する凸部を設けると良い。このようなものの一例を図３に示す。図３は、他の容器へ装着可能な連結容器と、該連結容器の他の容器への装着方法を説明する図である。符号３は、八つのチューブ状容器が直列に連結され、該チューブ状容器に異なる濃度の八つの標準核酸溶液が別々に充填された連結容器３１に、各チューブ状容器を個別に密閉可能な蓋３２が装着された標準核酸キットである。連結容器３１の両端部のチューブ状容器には、チューブ状容器の配列方向に対して略垂直かつ同一の方向に二つの凸部３３、３３が設けられている。一方、符号８は、前記標準核酸キット３の装着部位８１が設けられたウェルプレートである。装着部位８１は、ウェルプレート８の一辺に沿って設けられており、標準核酸キット３の外形形状にあわせて形成された嵌合部である。これにより、標準核酸キット３は、ウェルプレート８に着脱可能となっている。そして核酸の定量時には、ウェルプレート８に装着された標準核酸キット３から、蓋３２を取り外せば良い。蓋３２を取り外しても、連結容器３１はそのままウェルプレート８に装着されたままである。そしてウェルプレート８の各ウェルに定量対象の核酸を含む試料が充填されていれば、この状態のまま核酸の定量に供することができる。
【００３０】
連結容器３１に設けられた凸部３３、３３により、標準核酸キット３は、装着方向を誤ることなくウェルプレート８に装着される。したがって、連結容器３１に充填されている標準核酸溶液を取り違えるなどの誤操作が防止される。
また、このような標準核酸キットを用いることにより、例えば、本来であれば標準核酸溶液を連結容器から核酸定量用の他の容器へ添加する必要がある場合に、標準核酸溶液の添加操作を省略することができる。
【００３１】
なお、凸部３３の形状、数および連結容器に設ける位置は、ここに示すものに限定されず、連結容器３１のウェルプレート８への装着方向が一つに決まれば、いずれでも良い。
また、ここでは、ウェルプレート８に標準核酸キット３がそのまま装着される例を示したが、少なくとも、連結容器３１がウェルプレート８に装着可能であれば良い。そして、連結容器を装着する他の容器は、ウェルプレートに限定されるものではなく、複数の試料充填部が設けられた容器も連結容器３１に限定されるものではなく、それぞれ先に述べたように種々のものを用いることができる。
【００３２】
（第二の実施形態）
本発明の標準核酸キットの第二の実施形態は、複数の試料充填部が設けられた容器の該試料充填部に、質量が既知の複数の標準核酸が密封されてなることを特徴とする。
【００３３】
本実施形態は、試料充填部に濃度既知の標準核酸溶液に代わり、質量既知の標準核酸が充填されている点を除けば、前記第一の実施形態と同様である。
換言すると、本実施形態の標準核酸キットでは、充填されている前記標準核酸が、質量で管理される。
【００３４】
各試料充填部には、異なる質量の標準核酸が充填されていると、検量線の作成等に好適である。また、充填されている標準核酸の質量の範囲は特に限定されず、試料中の定量対象の核酸濃度を考慮して適宜調整すれば良い。
【００３５】
標準核酸の充填量は極めて微量となることがほとんどであり、この場合、試料充填部に粉体または固体の標準核酸を直接測りとることは困難である。そこで本実施形態においては、例えば、以下のような方法で標準核酸を充填することが好ましい。すなわち、前記第一の実施形態と同様に、所定の濃度の複数の標準核酸溶液を調製する。これら標準核酸溶液は、第一の実施形態同様、好ましくは複数の方法で標準核酸濃度を測定して、品質に異常がないことを確認おくことが好ましい。そしてこれら標準核酸溶液を、所定量ずつ別々に試料充填部に充填する。次いで、各試料充填部から溶媒を除去すれば良い。溶媒として水を使用することがほとんどなので、溶媒除去は凍結乾燥で行うことが好ましい。
【００３６】
各試料充填部に充填する標準核酸の質量は、前記標準核酸溶液の濃度および充填量で調整できる。具体的には以下の通りである。例えば、複数の異なる質量の標準核酸を充填する場合には、（ｉ）同一濃度の標準核酸溶液を異なる液量だけ充填して溶媒を除去する、（ｉｉ）異なる濃度の標準核酸溶液を同一液量だけ充填して溶媒を除去する、（ｉｉｉ）異なる濃度の標準核酸溶液を異なる液量だけ充填して溶媒を除去する（ただし、「［濃度］×［液量］」の値が互いに異なるようにする）、という方法が例示できる。これらのうち、操作が簡便である点では（ｉ）および（ｉｉ）の方法が好ましく、充填する標準核酸の質量範囲を大きくしたい場合には（ｉｉｉ）の方法が好ましい。
【００３７】
本実施形態では、核酸を定量する際に蓋を外してから、標準核酸が充填されている各試料充填部に、所望の濃度となるように水または緩衝液を添加して複数の標準核酸溶液を調製することが必要である。この時用いる水または緩衝液は、第一の実施形態と同様である。
【００３８】
水または緩衝液を添加後の前記標準核酸溶液は、必ずしもすべて異なる濃度である必要性はない。そして、水または緩衝液添加後の標準核酸溶液の濃度は、充填されている標準核酸の質量および該標準核酸に添加する水または緩衝液の液量で調整できる。具体的には以下の通りである。例えば、該標準核酸溶液の濃度を異なるものとする場合には、（Ａ）同一質量の標準核酸に異なる液量の水または緩衝液を添加する、（Ｂ）異なる質量の標準核酸に同一液量の水または緩衝液を添加する、（Ｃ）異なる質量の標準核酸に異なる液量の水または緩衝液を添加する（ただし、「［標準核酸の質量］×［水または緩衝液の液量］」の値が互いに異なるようにする）、という方法が例示できる。これらのうち、標準核酸溶液の濃度範囲を大きくしたい場合には、（Ｃ）の方法が好ましい。
【００３９】
本実施形態では、このように、核酸を定量する際に、再度標準核酸溶液を調製する必要があるが、第一の実施形態とは異なり、標準核酸キット中で標準核酸は粉体または固体として存在するので、一層安定した状態で保存できる。
また、例えば、複数の試料充填部が設けられた容器としてウェルプレート状の容器を用い、一部のウェルに標準核酸を密封して標準核酸キットとして冷凍保存したものを用いる場合は、これを解凍して標準核酸に水または緩衝液を添加しても、標準核酸キットの解凍から標準核酸溶液の調製までに要する時間は、３分程度である。すなわち、核酸の定量時間を従来よりも大幅に短縮できる。
【００４０】
上記の点を除き、本実施形態の標準核酸キットは、前記第一の実施形態と同様である。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１）第一の実施形態による核酸の定量
標準核酸としてλＤＮＡ、希釈液としてＴＥ（ＰＨ＝７．５）緩衝液をそれぞれ用いて、八種類の濃度の標準核酸溶液（１）、すなわち、標準核酸溶液（１）−１（標準核酸濃度；０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−２（標準核酸濃度；１ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−３（標準核酸濃度；３ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−４（標準核酸濃度；１０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−５（標準核酸濃度；３０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−６（標準核酸濃度；１００ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（１）−７（標準核酸濃度；３００ｎｇ／μｌ）および標準核酸溶液（１）−８（標準核酸濃度；１０００ｎｇ／μｌ）を調製した。これら標準核酸溶液（１）は、濃度誤差が±５％以内であることを複数の定量法（リアルタイム定量的ＰＣＲ法；吸光度（２６０ｎｍ）、蛍光インターカレーター、 例えば、ピコグリーンの場合５３０ｎｍ）によって確認した。そして、これら標準核酸溶液（１）をその濃度ごとに、図１に示すものと同様の連結容器の各チューブ状容器内に１００μｌずつ分注した。次いで、各標準核酸溶液（１）を個別に密封可能な蓋を連結容器に装着し、各標準核酸溶液（１）の濃度を記載して、標準核酸キット１とした。該標準核酸キット１は、−２０℃で２４時間冷凍保存した。
次いで、これを５０℃で１分間解凍した後、２０００ｒｐｍで１０秒間遠心し、標準核酸溶液（１）−１〜（１）−８を各チューブ状容器内で撹拌し、さらに２０００ｒｐｍで１０秒間遠心した。
そして、８連ピペットを用いて、前記標準核酸溶液（１）のうち、（１）−１〜（１）−５、すなわち濃度が０ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、３ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌおよび３０ｎｇ／μｌの標準核酸溶液（１）を５０μｌずつ採取し、９６ウェルプレートの各ウェル内に濃度ごとに分注した。この間、解凍から分注までに要した時間は、わずか３分程度であった。
【００４３】
次いで、ヒト血液由来の１０種類の被検ＤＮＡサンプル（検体１〜１０）各５０μｌを、別々に前記ウェルプレートの空いたウェル内に添加した後、ＵＶ測定用プレートリーダーを用いて２６０ｎｍ／２８０ｎｍの波長で、前記ウェルプレートの各ウェル内の核酸濃度を測定した。標準核酸の測定結果を表１に示す。そしてこの測定結果より検量線を作成したところ、図４に示すように、Ｒ２＝０．９９９９となり良好な直線性が得られ、標準核酸溶液（１）は、信頼性の高いものであることが確認された。この検量線を用いて、被検ＤＮＡサンプルのＵＶ測定値から、各ＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を算出した。算出結果を表２に示す。表２に示すように、微量のＤＮＡを定量することができた。
このように本発明により、従来法よりも大幅な定量の時間短縮および簡略化が可能になり、微量のＤＮＡの定量を、高い精度で簡便且つ迅速に行うことができた。
【００４４】
（比較例１）従来法
標準核酸としてλＤＮＡ、希釈液としてＴＥ（ＰＨ＝７．５）緩衝液をそれぞれ用いて、１０００ｎｇ／μｌの濃度に調製した５００μｌの標準核酸溶液（２）を、チューブ状容器内に充填して蓋を装着して密封し、−２０℃で２４時間冷凍保存した。
次いで、これを５０℃で５分間解凍した後、解凍後の標準核酸溶液（２）をチューブ状容器内で撹拌し、さらに２０００ｒｐｍで１０秒間遠心した。そして、標準核酸溶液（２）を、別のチューブ状容器内でＴＥ（ＰＨ＝７．５）緩衝液を用いて希釈し、五種類の濃度の標準核酸溶液、すなわち、標準核酸溶液（２）−１（標準核酸濃度；０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（２）−２（標準核酸濃度；１ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（２）−３（標準核酸濃度；３ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（２）−４（標準核酸濃度；１０ｎｇ／μｌ）および標準核酸溶液（２）−５（標準核酸濃度；３０ｎｇ／μｌ）を濃度の高い順に１つずつ調製し、これらを実施例１と同様に９６ウェルプレートに分注した。この間、解凍から分注までに要した時間は、約３０分であり、解凍、撹拌および遠心に加え、標準核酸溶液（２）を新たなチューブ状容器内で５種類の濃度に希釈しなければならず、長時間を要した。
【００４５】
次いで、実施例１と同様に、標準核酸溶液（２）−１〜（２）−５の標準核酸濃度を測定した。測定結果を表３に示す。そしてこの測定結果より検量線を作成したところ、図５に示すように、Ｒ２＝０．９７０１となり、検量線としての使用可否判断の目安であるＲ２＝０．９８よりも直線性が低く、標準核酸溶液（２）−１〜（２）−５は、核酸の定量に使用できるものではなかった。これは、標準核酸溶液（２）の希釈操作により、標準核酸溶液（２）−１〜（２）−５の濃度が±５０％以内でばらついた上、これら濃度のばらつきを定量前に確認していなかったからであった。
このように従来法は、操作が煩雑なため、核酸の定量で誤差が生じ易く、定量に時間も要し、微量のＤＮＡの定量には適さないことが確認された。
【００４６】
【表１】
2008141965.tif 000002
【００４７】
【表２】
2008141965.tif 000003
【００４８】
【表３】
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【００４９】
（実施例２）第二の実施形態による核酸の定量
図２に示すものと同様の９６ウェルプレートに対して、０ｎｇ／μｌ、１．２５ｎｇ／μｌ、２．５ｎｇ／μｌ、５ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、２０ｎｇ／μｌ、４０ｎｇ／μｌおよび８０ｎｇ／μｌと八種類の濃度のλＤＮＡ水溶液を一濃度につき１００μｌずつ、一系列の一ウェル内に添加し、これを凍結乾燥に供した。この時、各ウェル内のλＤＮＡ溶液の濃度を各ウェル近傍に記載した。凍結乾燥後、各ウェルが個別に密閉できるよう、ウェルプレートのウェル開口部側の表面にプラスチックフィルムを貼着し、標準核酸として八種類の質量のλＤＮＡが充填された標準核酸キットとした。そして、該標準核酸キットを、−２０℃で半年間冷凍保存した。
次いで、これを遠心機で２０００ｒｐｍで１０秒間遠心した後、プラスチックフィルムを前記９６ウェルプレートから剥離させ、標準核酸が充填されている各ウェル内に超純水（ミリポア社製超純水製造装置で精製したもの）を１０μｌずつ添加して、プラスチックフィルムで蓋をして、各ウェル内で溶液を撹拌した。その後、２０００ｒｐｍで１０秒間遠心して、液体をウェルの底に集めた。このようにして、八種類の濃度の標準核酸溶液（３）、すなわち、標準核酸溶液（３）−１〜（３）−８を調製した。この間、解凍から標準核酸溶液（３）−１〜（３）−８の調製までに要した時間は、３分程度であった。
【００５０】
次いで、実施例１で用いたものと同様のヒト血液由来の１０種類の被検ＤＮＡサンプル（検体１１〜２０）各１０μｌを、別々に前記９６ウェルプレートの空いたウェル内に充填した。
次いで、標準核酸溶液（３）および被検ＤＮＡサンプルが充填されている各ウェル内に、ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑ（商品名、Ｔａｋａｒａ社製）１２．５μｌ、１０μＭの配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマー０．５μｌ、１０μＭの配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマー０．５μｌおよび超純水（ミリポア社製超純水製造装置で精製したもの）１．５μｌを添加した。ＳＹＢＲ  ｐｒｅｍｉｘ  ＥＸ  Ｔａｑは二本鎖ＤＮＡに選択的に結合する蛍光試薬が含まれており、ＰＣＲによって増幅された二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発するものである。
次いで、各ウェル内の蛍光強度を測定しながら「９５℃／３０秒→６０℃／３０秒→７２℃／1分」のＰＣＲサイクルを３０サイクル行い、ＰＣＲ増幅を行った（リアルタイムＰＣＲ法）。この際、リアルタイムＰＣＲ装置「７９００ＨＴ」（商品名、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて５２０ｎｍの波長で前記９６ウェルプレートの各ウェル内の蛍光強度を測定しながらＰＣＲ増幅を行った。そして、この測定結果より検量線を作成したところ、図６に示すように、Ｒ２＝０．９９８６となり良好な直線性が得られ、標準核酸溶液（３）−１〜（３）−８は、信頼性の高いものであることが確認された。なお、図６において、縦軸の「Ｃｔ値」はＰＣＲ時のサイクル数を表す。このサイクル数がＤＮＡ濃度と比例するため、濃度既知の標準ＤＮＡと被検ＤＮＡサンプルのＣｔ値を比較することで濃度を計算できる。この検量線を用いて、被検ＤＮＡサンプルの蛍光強度測定値から、各ＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を算出した。算出結果を表４に示す。表４に示すように、微量のＤＮＡを定量することができた。
このように本発明により、従来法よりも大幅な定量の時間短縮および簡略化が可能になり、微量のＤＮＡの定量を、高い精度で簡便且つ迅速に行うことができた。
【００５１】
【表４】
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【００５２】
（実施例３）他の容器に装着可能な連結容器を用いた場合の第一の実施形態による核酸の定量
標準核酸としてλＤＮＡ、希釈液としてＴＥ（ＰＨ＝７．５）緩衝液をそれぞれ用いて、六種類の濃度の標準核酸溶液（４）、すなわち、標準核酸溶液（４）−１（標準核酸濃度；０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（４）−２（標準核酸濃度；０．１ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（４）−３（標準核酸濃度；１ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（４）−４（標準核酸濃度；１０ｎｇ／μｌ）、標準核酸溶液（４）−５（標準核酸濃度；１００ｎｇ／μｌ）および標準核酸溶液（４）−６（標準核酸濃度；１０００ｎｇ／μｌ）を調製した。該標準核酸溶液（４）−１〜（４）−６を、図３に示すものと同様の連結容器の八つのチューブ状容器のうち六つに、濃度ごとに５０μｌずつ分注した。該連結容器には、後記するウェルプレートへの装着時に装着方向を決定する凸部が設けられている。次いで、各チューブ状容器を個別に密閉可能な蓋を連結容器に装着し、各チューブ状容器内の標準核酸溶液（４）の濃度を記載して、標準核酸キット３とした。該標準核酸キット３は、−２０℃で1ヶ月冷凍保存した。
次いで、これを７０℃で３０秒間解凍した後、解凍後の標準核酸溶液（４）−１〜（４）−６を各チューブ状容器内で撹拌し、遠心してチューブ状容器の底に液体を集めた。そして、チューブ状容器の蓋をはずし、標準核酸キット３を、蓋が装着されていないこと以外は図３と同様に、ウェルプレートに所定方向に装着した。この間、解凍からウェルプレートへの装着までに要した時間は、２分程度であった。
【００５３】
そして、実施例１で用いたものと同様のヒト血液由来の１０種類の被検ＤＮＡサンプル（検体２１〜３０）各５０μｌを、別々に前記ウェルプレートの各ウェル内に添加した。次いで、標準核酸溶液（４）および被検ＤＮＡサンプルに、さらにインターカレーターとなる蛍光色素ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を５０μｌずつ添加した。添加後、各チューブ状容器内および各ウェル内で溶液を撹拌し、さらに１０００ｒｐｍで1分間遠心してから、蛍光プレートリーダーを用いて５３０ｎｍの波長で各チューブ状容器内および各ウェル内の蛍光強度を測定した。標準核酸についての測定結果より検量線を作成したところ、図７に示すようにＲ２＝１となり、良好な直線性が得られ、標準核酸溶液（４）−１〜（４）−６は、信頼性の高いものであることが確認された。この検量線を用いて、被検ＤＮＡサンプルの蛍光強度測定値から、各ＤＮＡサンプルのＤＮＡ濃度を算出し、微量のＤＮＡを定量することができた。
このように本発明により、従来法よりも大幅な定量の時間短縮および簡略化が可能になり、微量のＤＮＡの定量を、高い精度で簡便且つ迅速に行うことができた。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、分子生物学の研究や、医療分野の分子診断等に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】本発明の第一の実施形態の一例およびその使用方法を説明する図である。
【図２】本発明の第一の実施形態の他の例を説明する図である。
【図３】本発明の第一の実施形態のさらに他の例を説明する図である。
【図４】実施例１で作成した標準核酸の検量線を示すグラフである。
【図５】比較例１で作成した標準核酸の検量線を示すグラフである。
【図６】実施例２で作成した標準核酸の検量線を示すグラフである。
【図７】実施例３で作成した標準核酸の検量線を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５６】
１，３・・・標準核酸キット、１１，３１・・・連結容器、１２，３２・・・蓋、１３・・・標準核酸溶液、３３・・・凸部、１１１・・・チューブ状容器
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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