(57)【要約】      （修正有）【課題】同位体標識法を用いないで定量解析する場合、分析データの信頼性を評価する手法を提供する。【解決手段】分析成分と同時に検出される内部標準物質を液体クロマトグラフの移動相や溶出液に混合させ、定量分析阻害要因が発生しない条件下で、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを取得し、データ解析部に記録させる。次に、分析サンプルを混合して試料の分析データを取得し、データ解析部において分析実時間で内部標準物質由来イオンの強度をブランク試料のものと比較する。不一致が検出されると定量分析阻害要因が発生したと判断し、分析モードをタンデム質量分析の優先度が低い定量分析モードからタンデム質量分析を優先させる定性分析モードに変更させて、分析実時間で内部標準物質由来イオンの強度をブランク試料のものと一致すれば、再度定量分析モードに変更させる。一致する時間帯には分析データを収集して高効率・高精度に分析を行う。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた分析方法において、
標準物質を分析溶液に混合する工程と、
該分析溶液に分析サンプルを混合しない状態で該標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを取得する工程と、
該分析溶液に該分析サンプルを混合した状態で該標準物質に由来するイオンの第二のマスクロマトグラムを取得する工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムのレベル調整を行う工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出し、あらかじめ記憶している不一致度閾値と比較する工程と、
該不一致度が、該不一致度閾値よりも小さい状態である分析時間帯を検出する工程と、
該分析時間帯において取得した分析サンプルの分析データを収集する工程とを持つこと
を特徴とする分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記標準物質は親水性を持ち、
該標準物質を前記液体クロマトグラフの移動相または溶出液に一定の濃度で混合することを特徴とする分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の分析方法において、
前記標準物質は等電点が概略３以上８以下であることを特徴とする分析方法。
【請求項４】
請求項１に記載の分析方法において、
前記第一のマスクロマトグラムを取得するときには、前記移動相を構成する成分のいずれかをブランク試料として用いることを特徴とする分析方法。
【請求項５】
請求項１に記載の分析方法において、
前記第一のマスクロマトグラムを取得するときには、ブランク試料として純水を用いることを特徴とする分析方法。
【請求項６】
請求項１に記載の分析方法において、
前記分析サンプルの分析データまたは前記マスクロマトグラムのデータに応じて、定量分析優先モードと定性分析優先モードとを切替える切替え工程を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項７】
請求項６に記載の分析方法において、
前記定性分析はタンデム分析であることを特徴とする分析方法。
【請求項８】
請求項６に記載の分析方法において、
前記分析モードの切替え状態を表示する工程を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項９】
請求項１に記載の分析方法において、
あらかじめ分析モードを切替える手順と切替え基準を記憶する工程と、
前記分析サンプルの分析データを前記切替え手順に従い前記切替え基準と比較する工程と、
前記不一致度と前記不一致度閾値の大小関係、または前記分析データと前記切替え基準との比較結果に応じて、定量分析優先モードと定性分析優先モードとを切替える切替え工程を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の分析方法において、
前記不一致度が前記不一致度閾値よりも小さい状態である前記分析時間帯の長さを、あらかじめ記憶している基準時間と比較する工程を持ち、
該比較の結果に応じて前記分析溶液の調製条件を変化させて分析を行うことを特徴とする分析方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の分析方法において、
前記分析時間帯と前記基準時間の大小関係に応じて、前記分析溶液の調製条件の変化または分析を繰り返す工程と、
前記分析時間帯が前記基準時間より長くなるか、または前記不一致度が前記不一致度閾値より低くなるときに、前記分析溶液の調製条件の変化を停止する工程と
を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記標準物質の質量と電荷の比の理論値をあらかじめ記憶する工程と、
前記標準物質の質量と電荷の比を分析時間に対して実測する工程と、
該理論値と該実測値の関係を元に、分析サンプルの質量と電荷の比の実測値を補正する工程とを持つことを特徴とする分析方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の分析方法において、前記標準物質を前記液体クロマトグラフの分離カラムよりも下流から導入することを特徴とする分析方法。
【請求項１４】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた分析方法において、
等電点が異なる第一、第二の標準物質を分析溶液に混合する工程と、
該第一の標準物質由来イオンの第一のマスクロマトグラムと、該第二の標準物質由来イオンの第二のマスクロマトグラムとを取得する工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムのレベル調整を行う工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出し、あらかじめ記憶している不一致度閾値と比較する工程と、
該不一致度が、該不一致度閾値よりも小さい状態である分析時間帯を検出する工程と、
該分析時間帯において取得した分析サンプルの分析データを収集する工程と
を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の分析方法において、
前記第一、第二の標準物質は親水性を持ち、
該標準物質を前記液体クロマトグラフの移動相または溶出液に一定の濃度で混合することを特徴とする分析方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の分析方法において、
前記第一、第二の標準物質は、一方の標準物質の等電点が概略３以上８以下、他方の標準物質の等電点が概略８以上であることを特徴とする分析方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の分析方法において、
前記第一、第二の標準物質は、親水性であることを特徴とする分析方法。
【請求項１８】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた分析方法において、
第一の標準物質を分析溶液に混合する工程と、
複数の物質のマスクロマトグラムをモニタして第二の標準物質を探索する工程と、
該第一の標準物質由来イオンの第一のマスクロマトグラムと、該第二の標準物質由来イオンの第二のマスクロマトグラムとを取得する工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムのレベル調整を行う工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出し、あらかじめ記憶している不一致度閾値と比較する工程と、
該不一致度が、該不一致度閾値よりも小さい状態である分析時間帯を検出する工程と、
該分析時間帯において取得した分析サンプルの分析データを収集する工程とを持つことを特徴とする分析方法。
【請求項１９】
標準物質を混合して移動相を分析溶液へ導入する移動相導入部と、
試料を該分析溶液へ導入する試料導入部と、
液体クロマトグラフを用いて該分析溶液を分離する分離部と、
該分離した物質をイオン化・質量分析するイオン化・質量分析部と、
該分析して取得したデータを解析するデータ解析部と該分析の状況を表示する画面表示部とからなる液体クロマトグラフ/質量分析装置において、
該データ解析部は、
該分析溶液に分析サンプルを混合しない状態で該標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを取得して記憶する手段と、
該分析溶液に該分析サンプルを混合した状態で該標準物質に由来するイオンの第二のマスクロマトグラムを取得して該第一のマスクロマトグラムとレベル調整を行うレベル調整手段と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出し、あらかじめ記憶している不一致度閾値と比較する演算手段と、
該不一致度が、該不一致度閾値よりも小さい状態である分析時間帯を検出する手段と、
該分析時間帯において取得した分析サンプルの分析データを収集する手段と
を持つことを特徴とする分析装置。
【請求項２０】
請求項１９に記載の分析装置において、
前記分析サンプルの分析データまたは前記マスクロマトグラムのデータに応じて、定量分析優先モードと定性分析優先モードとを切替える切替え手段を持つことを特徴とする分析装置。
【請求項２１】
請求項２０に記載の分析装置において、
前記画像表示部は、前記切替え状態を表示することを特徴とする分析装置。
【請求項２２】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた分析方法において、
標準物質を分析溶液に混合する工程と、
該分析溶液に分析サンプルの混合を無視できる状態で該標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを取得する工程と、
該分析溶液に該分析サンプルを混合した状態で該標準物質に由来するイオンの第二のマスクロマトグラムを取得する工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムのレベル調整を行う工程と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出し、あらかじめ記憶している不一致度閾値と比較する工程と、
該不一致度を、分析サンプルの分析データにおけるピーク面積の誤差として反映させる工程と
を持つことを特徴とする分析方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の正イオン分析方法において、
前記標準物質は酸性アミノ酸を含むことを特徴とする分析方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の負イオン分析方法において、
前記標準物質は塩基性アミノ酸を含むことを特徴とする分析方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の分析方法において、分析サンプルのデータに基づき、イオンピークのデータを、該ピーク面積とその誤差、及び、保持時間、ピークのm/z（あるいはmまたはz）に関する情報として取得することを特徴とする分析方法。
【請求項２６】
標準物質を分析溶液へ導入する標準物質導入部と、
試料を該分析溶液へ導入する試料導入部と、
液体クロマトグラフを用いて該分析溶液を分離する分離部と、
該分離した物質をイオン化・質量分析するイオン化・質量分析部と、
該分析して取得したデータを解析するデータ解析部と該分析の状況を表示する画面表示部と、
からなる液体クロマトグラフ/質量分析装置において、
該データ解析部は、
該分析溶液に分析サンプルの混合を無視できる状態で該標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを取得して記憶する手段と、
該分析溶液に該分析サンプルを混合した状態で該標準物質に由来するイオンの第二のマスクロマトグラムを取得して該第一のマスクロマトグラムとレベル調整を行うレベル調整手段と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出する演算手段と、
該不一致度を分析サンプルの分析データに付加する手段と
を持つことを特徴とする分析装置。
【請求項２７】
該分析溶液に分析サンプルの混合を無視できる状態で取得される該標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを記憶する手段と、
該分析溶液に該分析サンプルを混合した状態で取得される該標準物質に由来するイオンの第二のマスクロマトグラムを該第一のマスクロマトグラムとレベル調整を行うレベル調整手段と、
該第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度を算出する演算手段と、
該不一致度を分析サンプルの分析データに付加する手段と
を持つことを特徴とするデータ解析装置。
【請求項２８】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた正イオン分析において、
定量分析阻害要因を検知するために使用される内部標準物質であり、
該内部標準物質が親水性かつ酸性であることを特徴とする内部標準物質。
【請求項２９】
請求項２８に記載の内部標準物質において、
該内部標準物質が親水性かつ等電点が３以上８以下であることを特徴とする内部標準物質。
【請求項３０】
液体クロマトグラフ/質量分析装置を用いた負イオン分析において、
定量分析阻害要因を検知するために使用される内部標準物質であり、
該内部標準物質が親水性かつ塩基性であることを特徴とする内部標準物質。
【請求項３１】
請求項３０に記載の内部標準物質において、
該内部標準物質が親水性かつ等電点が８以上であることを特徴とする内部標準物質。
【請求項３２】
請求項３０に記載の内部標準物質を用いた分析方法。
【請求項３３】
請求項３０に記載の内部標準物質を用いた分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生体関連物質や有機物質の質量分析システムなどに関し、特に創薬における薬物動態あるいは代謝物解析、タンパク質解析、疾患マーカー探索における定量質量分析方法や質量分析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾患診断に向けたマーカー探索などにおいては、疾患患者由来の試料と健常者由来の試料の分析結果を比較し、検出される成分の中から差分が顕著な変動成分を抽出することが重要である。さらに、その変動成分を同定することも必要である。このような分析では、液体クロマトグラフ/質量分析装置（LＣ/MS）がしばしば用いられる。LＣ/MSは、多成分が含まれる試料をLCで分離し、分離成分をＭＳで質量分析することができるオンライン分離分析システムであり、マーカー探索以外の分野でも広く用いられている分析装置である。そして、質量分析装置（ＭＳ）部分には、ダイナミックレンジが３桁以上確保できる、MS/MS分析などのタンデム質量分析ができる質量分解能が高い質量分析装置がよく用いられる。これにより、定量解析による変動成分の抽出、および変動成分における多数の未知の成分に対する同定（定性分析）と定量分析による含有量の測定という一連の解析が精度よく可能となる。
【０００３】
タンデム質量分析はよく知られているように、質量分析した結果からある成分のイオンを選んでガス分子と衝突させるなどして分解し、分解されてできたイオンをさらに質量分析する技術であり、物質の同定（定性分析）のために実施されるのが一般的である。一方、定量分析においては、タンデム質量分析を用いない質量スペクトル(マススペクトル)を取得することが多い。ある物質のイオンに注目してタンデム質量分析による定性分析を行うと、その間の時間にはタンデムを用いない質量分析のデータを取得できず、実質的に定量分析の精度が低減するという関係がある。そこで、定量分析を行うときにはタンデム分析を行わないという制御が必要になる。そのため、従来は、先ず、同定のためにタンデム質量分析を実施する定性分析を行い、次に質量スペクトルを取得する定量分析を実施している。
【０００４】
従来の定量分析の手順によると、先ず、幾つかの濃度で標準物質を分析する。そして、その標準物質由来のイオンのｍ/ｚ（質量/電荷比）に対し、イオン強度の時間変化（マスクロマトグラム）を取得し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。この面積と試料物質濃度との関係より、検量線を作成する。次に、濃度が不明の同一物質を分析し、マスクロマトグラムのピーク面積を求める。そして、作成された検量線に基づき、マスクロマトグラムのピーク面積に対応する物質濃度を決定する。この方法は、標準物質を予め入手し、検量線を作成することが前提となるので、マーカー探索の対象となる未知成分には適用困難である。
【０００５】
特許文献１では、検量線を作成することができない未知成分に対し、相対的な定量解析を行い、マーカーを探索する方法が記載されている。この方法によると、先ず様々な成分を含む標準的な試料で分析データを取得し、次に同一の成分が含まれると期待される別の試料で分析データを取得し、各成分毎にイオン強度比（あるいは面積比）を算出する。そして、標準的なイオン強度比を求め、その値を用いて各成分のイオン強度比を規格化する。以上により、各成分の相対的なイオン強度比を決定することができ、イオン強度の変動が顕著な成分（マーカー候補）を特定することができる。マーカー候補の同定には、別途タンデム質量分析を優先的に行う分析が必要である。
【０００６】
また、検量線を作成することができない未知成分に対し、同位体標識法を用いることにより、相対定量解析を行うことができる。即ち、様々な成分を含む試料と同位体標識を施した標準的な試料を混入させることにより、相対的な定量分析が可能である（非特許文献１）。同位体標識された成分は、未標識成分と同時に検出されるが、検出イオンのｍ/ｚが所定の値だけ異なるので、そのイオンペアについてマスクロマトグラムのイオン強度（あるいはピーク面積）を比較することにより、各成分の濃度比を決定することができる。この手法を採用すれば、問題なく定量解析を行うことができる。しかし、この手法は、適用可能な試料の種類に制限があるうえ、手間やコストが掛かる。そのため、マーカー探索においては、同位体標識法が採用されないことが多い。
【０００７】
さて、LC/MSのインターフェースには、エレクトロスプレーイオン化法（ESI）や大気圧化学イオン化法（APCI）、大気圧光イオン化法（APPI）などが使用される。そして、特にESIを用いたインターフェースにおいて、マトリックス効果やイオンサプレッションと呼ばれる定量分析阻害要因が発生することが知られる。定量分析阻害要因は、以下のような成分間の電荷の奪い合いが原因でイオン強度が変動してしまう現象であり、特許文献１に記載のような相対的な定量分析を行う場合においても、イオンサプレッションが発生すれば、分析データの解析結果は信頼性を損なう可能性がある。ちなみに、マトリックス効果はサンプルにイオン性の成分が多量に含まれる場合にイオン強度が低減する現象であり、サンプル調製において脱塩を充分に実施すれば回避することが可能である。
【０００８】
イオンサプレッションは、インターフェース（イオン化部）で発生可能なイオン量の最大値と比較して、イオン化の対象成分が同等以上の量である場合に発生する。この現象が発生すると、様々な成分の間で電荷の奪い合いが起こり、各成分の化学的な性質や量によりイオン化効率が変動する。その結果、検出されるイオン強度と成分濃度との関係に直線性が失われる（非特許文献２）という結果に至る。発生可能なイオン量の最大値Iは、液体流量Q、液体の電気伝導度κ、表面張力γを用いると、以下のような関係がある。
【０００９】
I  ＝  β（ε）  （Ｑκγ／ε）1/2                            （１）
ここで、βは定数、εは液体の誘電率である。イオンサプレッションの発生を未然に防止するためには、液体の電気伝導度κを高くすることが有効であることが（１）式より示される。ただ、電気伝導度κが高すぎるとイオン生成効率が低減する。そのため、酸などの移動相への添加量時には効率よくイオン生成ができる範囲でκを設定することが望ましい。換言すると、電気伝導度κは２つの相反する必要性を満たす必要があるため、実際にはイオンサプレッションを低減させるのに十分な高い値にすることができない。したがって、イオンサプレッション現象を条件によらず有効に防止することは困難である。
【００１０】
上記のような問題は、ESIだけでなく、大気圧化学イオン化法（APCI）などのLC/MSにおける他のインターフェースやGC/MSのイオン化部でも発生する可能性がある。インターフェース（イオン化部）で発生し得る最大のイオン量には上限があるためである。
【００１１】
イオンサプレッションのような定量分析阻害要因の発生を検知する方法としては、内部標準物質を用いたイオン強度のモニタが挙げられる。たとえば、非特許文献３には、移動相成分が一定のイソクラティックLC（流量0.25mＬ/分）を用い、内部標準物質を分離カラムの下流側からインフュージョン（流量5マイクロＬ/分）で導入することによる試料調製の評価方法が記載されている。試料が充分に精製されていない場合、試料の導入直後は試料に含まれる塩などの影響により定量分析阻害要因が発生し、内部標準物質由来イオンの強度が低減する。このイオン強度をモニタすることで、定量分析阻害要因を検知することができる。しかし、この方法は、LC分離後に比較的長い経路を通過させてからイオン化するため、LC流量が少ない場合に分離精度が低下しやすく、LC流量の高いセミミクロLCや汎用LCなどに有効であるが、LC流量が低いマイクロLCやナノLC（キャピラリーLC）などの分離手段には適用が困難である。さらに、内部標準物質の最適化がなされていない。
【００１２】
定量分析阻害要因の発生が検出された場合には、試料調製を見直して試料の純度を上げ、試料中の定量分析阻害要因となる不純物等を排除するか、あるいはLCでの分離条件を見直して時間をかけて分離するなどして分離成分に含まれる各種成分の種類を減らすなどして、再度定量分析を実施することになる。
【００１３】
【特許文献１】USP6835927
【非特許文献１】Y. Ishihara, T. Sato, T. Tabata, N. Miyamoto, K. Sagane, T. Nagasu, Y. Oda, Quantitative mouse brain proteomics using culture-derived isotope tags as internal standard, Nature Biotechnology 23 (2005) 617-621.
【非特許文献２】K. Tang, J. S. Page, R. D. Smith, Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry, Journal of American Society for Mass Spectrometry 15 (2004) 1416-1423.
【非特許文献３】R. Bonfiglio, R. C. King, T. V. Olah, K. Merkle, The effects of sample preparation methods on variability of the electrospray ionization response for model drug compounds, Rapid Communications in Mass Spectrometry 13 (1999) 1175-11885.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
以上説明してきたように、マーカー探索においては、疾病患者と健常者由来の試料を比較して変動成分を抽出し、変動成分を構成する多数の種類からなる未知の成分物質を精度よく同定して、イオンサプレッション現象等の定量分析阻害要因の影響を受けずに、高感度・高精度に成分物質の定量分析を行うことが求められる。しかも、この一連の解析をできるだけ短時間に行うこと、すなわち、高スループットが求められている。また、一連の解析をできるだけ低コストで行うことも必要とされている。
【００１５】
この要求に対し、従来の定量分析手法である検量線を用いた分析は、あらかじめ標準物質から検量線データを取得しておく必要があり、未知の物質を含む定量分析には適用できない。非特許文献1に記載されたような同位体標識法を用いた分析も、試料の種類が限定され、しかも手間がかかり、コストも高い。また、特許文献1に記載された相対的な定量解析手法はイオンサプレッション現象によるイオン強度の変動の影響を避けられないため、分析結果の精度が低下する問題がある。
【００１６】
そこで、同位体標識法を用いず、しかもイオンサプレッション等の定量分析阻害要因の影響を受けない分析を行うことがマーカー探索に向けた課題となる。しかし、同位体標識法を用いずに定量解析する場合、定量分析阻害要因が発生すると、分析をやり直す必要が生じる。そのため、定性分析の回数と定量分析の回数を極力低くすることが、コストやスピードの面で重要である。
【００１７】
高スループット化については、次のような問題がある。マーカー探索では、タンデム質量分析をしないで質量スペクトルを取得する定量分析と、同定のためにタンデム質量分析を実施する定性分析が必要である。しかも、非常に多くの成分からなる試料を分析することが多いが、その場合、一回の分析で検出される全成分に対し定性分析を実施することは困難なことが多い（特許文献２）。タンデム質量分析のスループットが有限だからである。したがって、多数回のタンデム質量分析が必要になり、一連のマーカー探索のスループットを上げることができない。
【００１８】
また、定量分析阻害要因の検出手法としては、非特許文献3に記載された手法では、液体流量の低いLCやグラジエントモードＬＣを用いた定量分析には精度が確保できず、そのため液体流量の低いLCによる高感度分析、微量な試料の分析ができないという問題がある。 ＬＣ流量が低い場合には、内部標準物質を分離カラムの上流から導入する必要が発生するが、そのためには内部標準物質が分離カラムに吸着されない必要がある。このことは、ＬＣ移動相における有機溶媒の混合比率が一定のイソクラティックモードのみならず、比率が時間的に変化するグラジエントモードにおいて非常に重要な問題である。そのため、内部標準物質の化学的性質を充分に考慮する必要がある。
【００１９】
本発明の課題は、以上の問題を解決し、同位体標識法を用いずに、定量分析阻害要因の影響を受けず、高感度に高スループットに定性、及び、定量解析を行うことである。同位体標識法を用いず、定性、定量分析を最低限の分析回数で信頼できるデータを取得するための分析方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる課題は、定量分析阻害要因の発生を検知する内部標準物質を提供することである。
【００２１】
【特許文献２】特開2005-091344
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上記課題を解決するために、以下の分析手法が提供される。即ち、先ず、分析成分と同時に検出される内部標準物質を液体クロマトグラフの移動相や溶出液に混合させ、定量分析阻害要因が発生しない条件下で、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを取得し、データ解析部に記録させる。典型的には、分析サンプルを含まないブランク試料を分析する。次に、分析サンプルを混合して試料の分析データを取得するが、その際、データ解析部において分析実時間で内部標準物質由来イオンの強度をブランク試料分析時のものと比較する。このとき、イオン強度に不一致が検出されると、分析サンプル混合時に定量分析阻害要因が発生したと判断し、この場合には定量分析阻害要因により定性分析結果の精度が低下することから、分析モードをタンデム質量分析の優先度が低い定量分析モードからタンデム質量分析を優先させる定性分析モードに変更させる。そして、分析サンプルの混合量を低減するなどして分析実時間で内部標準物質由来イオンの強度がブランク試料のものと一致すれば、再度定量分析モードに変更させる。また、マスクロマトグラムにおいて内部標準物質由来イオンの強度が一致する時間帯がある場合には、この一致する時間帯における試料の分析データを有効な分析データとして取得する。この分析手法において、内部標準物質としては分析実時間の間安定して検出される性質を持つ物質を用いる。
【００２３】
また、正イオン分析の場合に、内部標準物質に、イオンサプレッションなどの定量分析阻害要因に敏感に反応する物質として、等電点が移動相のｐＨ（水素イオン濃度）よりも顕著に低くなく、疎水性が低い物質を提供する。一方、負イオン分析の場合には、塩基性が高く、疎水性が低い物質を提供する。
【００２４】
また、さらなる効率向上のために、分析阻害要因に対する感度が大きく異なる2種類の内部標準物質を導入し、分析サンプルを混合して分析し両方の内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを比較することにより、一回の分析で分析阻害要因の発生を検出する手法も提供される。分析阻害要因に対する感度が大きく異なる2種類の内部標準物質として、等電点が異なる2種類の内部標準物質を選定する。
【００２５】
また、１種類の内部標準物質を導入し、その他に分析溶液内に存在して第二の内部標準物質になりうる物質を探索して第二の内部標準物質とし、両者のマスクロマトグラムを比較することで、一回の分析で分析阻害要因の発生を検出する手法も提供する。
【００２６】
さらにまた、上記課題を解決するための分析装置として、内部標準物質を混合して移動相を導入する移動相導入部と、試料導入部と分離部とイオン化・質量分析部とデータ解析部と画像表示部を持ち、分析サンプルを混合しない状態で内部標準物質に由来するイオンの第一のマスクロマトグラムを取得して記憶する手段と、分析サンプルを混合した状態で内部標準物質由来イオンの第二のマスクロマトグラムを取得して比較する手段と、第一と第二のマスクロマトグラムの不一致度が一定以下の場合に分析データを収集する手段を持つ分析装置を提供する。
【００２７】
また、第一、第二の内部標準物質が移動相に混合した状態で、両者のマスクロマトグラムを取得して比較し、比較結果に応じて分析データを収集する手段を持つ装置も提供する。さらに、第一の内部標準物質が移動相に混合した状態で、その他に分析溶液内に第二の内部標準物質になりうる物質を探索するための分析データモニタ手段を持ち、探索して得られた第二の内部標準物質と第一の内部標準物質のマスクロマトグラムを取得して比較し、比較結果に応じて分析データを収集する装置についても開示する。
【発明の効果】
【００２８】
内部標準物質をLCの移動相や溶出液に混合させ、まず分析阻害要因が発生しない条件でブランク試料を分析する。次に、分析サンプルを分析するが、その際分析実時間で内部標準物質由来イオンの強度を測定して分析実時間でブランク試料の分析結果と比較することで、分析サンプルが混合したときに分析阻害要因が発生したか否かを精度よく検出することができる。さらに、上記不一致度に基づき、定量データの誤差を評価することができる。
【００２９】
ブランク試料と分析サンプル混合時の内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを比較して一致する時間帯のデータは、分析阻害要因の影響を受けていないと判断して、イオン強度が一致する時間帯における分析サンプルの分析データを有効な分析データとして取得することで、分析時間の無駄を省き、分析の効率向上を図ることができる。
【００３０】
また、内部標準物質を2種類導入して一回の分析でマスクロマトグラムを取得して比較することで、一回の分析実時間内に分析阻害要因の発生を検知することができ、分析時間のさらなる短縮を図ることができる。
【００３１】
また、内部標準物質を予めLCの移動相に混入させることにより、液体流量の低いマイクロLCやナノLC（キャピラリーLC）を定量質量分析に使用することができる。このことは、高感度分析に有利であり、微量試料の分析が可能となる。
【００３２】
定量分析阻害要因が発生する場合、非常に多くの成分が同時に検出されることが多いので、定性分析を優先的に実施することにより、トータルの分析回数を低減させることが可能となり、高スループット化が可能になる。
【００３３】
さらに、検出成分の同定には、質量分析装置の質量精度を高く保つ必要がある。しかし、LCを用いたデータ取得では、分析中にｍ/ｚ値の変動が検出されることがある。そこで、常に検出される内部標準物質（既知物質）由来のイオンのｍ/ｚ値をモニタすることにより、検出イオンに対して正しいｍ/ｚ値に補正することができる。このことにより、極めて高い質量精度の分析データを得ることができる。
【００３４】
また、内部標準物質由来イオンの強度に基づき、検出イオンの強度（マスクロマトグラム面積）を規格化すると、データ間の比較を高い精度で行うことができる。分析ごとにイオン強度が多少は変動することがあるためである。
【実施例１】
【００３５】
本発明の質量分析システムにおける一実施例の構成図を図1に示す。装置は、移動相導入部１０１、試料導入部１０２、分離部１０３、イオン化・質量分析部１０４、データ解析部１０５、画面表示部１０６、分析モード制御部１０７からなる。なお、データ解析部１０５、画面表示部１０６、分析モード制御部１０７をまとめて、制御系１０８とする。また、移動相導入部１０１、試料導入部１０２、分離部１０３、イオン化・質量分析部１０４、制御系１０８の各部は装置全体を統括するシステム制御部で総合的に制御され、装置各部間で双方向に制御状態の情報をやり取りしながら所望の動作を実現させている。移動相導入部１０１より移動相が導入され、様々な成分からなる試料２０５が試料導入部１０２で導入され、液体クロマトグラフ（LC）などの分離装置からなる分離部１０３において分離される。移動相導入部１０１には、移動相A（２０１）、B（２０２）のみならずC（２０３）が用意される。移動相A、Bは通常の逆相クロマトグラフで使用されるもので、典型的な移動相A（２０１）は２％アセトニトリル水（蟻酸０．１％）、移動相B（２０２）は９８％アセトニトリル水（蟻酸０．１％）である。
【００３６】
また、移動相C（２０３）は内部標準物質２０４を一定量だけ移動相Aに添加したものである  最初から、移動相A、Bに内部標準物質が添加される場合には、移動相Cは不要である。重要な点は、内部標準物質２０４が常に一定濃度で分離部１０３に導入されることである。試料導入部１０２に導入される試料（ブランク試料、分析サンプル等）２０５は、分離部１０３で分離され、分離成分として、逐次イオン化・質量分析部１０４に導入され、イオン化、及び、質量分析される。質量分析部の出力はデータ解析部１０５に導入され、分析データとして保存、及び、データ処理される。図１に示すデータ解析部１０５には画面表示部１０６が設けられており、分析実時間における「定量分析優先モード」か「定性分析優先モード」かなど、タンデム質量分析における優先度を示す情報が表示される。その他、全イオン強度の時間依存性（全イオンクロマトグラム）、及び、最新の質量スペクトルまたはタンデム質量分析スペクトル等の分析状況が表示される。質量分析部１０４の制御は、データ解析部１０５で行われても、破線で示すように別の情報処理設備（分析モード制御部１０７）で行われても構わない。あるいは、後述するように画面表示部１０６に分析モード切替えボタンがあって、オペレータが切替え可能な構成であってもよい。
【００３７】
分析手順の概略は以下の通りである。まず、前述のような移動相A、B、Cを用意し、内部標準物質が含まれる移動相Ｃの比率を3％など一定に保ちつつ、移動相Aと移動相Bの混合比率をある初期値に設定し、時間を追って混合比率を変化させていく。典型的には、例えばスタート時に移動相AとBの混合比率を92％と5％とし（Cは3％固定）、６０分後の終了時に比率を47％、５０％となるように直線的に混合比率を変える。この混合比率の初期値と終了時の数値、混合時間等は一例であり、適宜、変えることが可能である。なお、この移動相A、Bの混合比を時間的に変えていくグラジエントモードはLC分離においてよく用いられる手法である。
【００３８】
内部標準物質は、後述の条件により所望の物質を選定し用意しておく。内部標準物質は分析成分と同時に検出されるLC保持時間範囲で常に検出されるよう選定されており、これを移動相や移動相成分などに混合させ、また、試料導入部１０２からブランク試料を導入して、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを取得し、データ解析部１０５に記録させる。データ解析部１０５には、データ記憶媒体等で構成したデータ記憶手段113が配置されている。このとき、定量分析阻害要因が発生しない条件下でデータ取得を行うことが必要である。そのため、試料導入部１０２で導入するブランク試料として移動相Aと同一の物質、あるいは純水を導入するなどして移動相にあらかじめ存在する物質以外のものを混入しない。また、ブランク試料には不純物が含まれないように注意が必要である。そして、内部標準物質はそれ自体がイオンサプレッションを生じないために、イオン検出に必要な最小限の量だけが含まれていることが必要である。次に、ブランク試料の代わりに試料導入部１０２で分析サンプルを導入し、内部標準物質を同量混合させた試料の分析データを取得し、データ解析部に記録させる。
【００３９】
典型的な内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを図２に示す。横軸はLCの保持時間、縦軸はイオン強度である。このデータは、液体クロマトグラフ/質量分析装置（LC/MS）を用いて取得したものである。通常、LC/MSにおけるLCでは、分離カラムに逆相カラムが使用されるため、この内部標準物質は逆相カラムを素通りできる程度の高い親水性を有することが望ましい。親水性が非常に高いと、移動相に含まれる内部標準物質由来のイオンが、分離の保持時間において常に安定して検出されるため、定量分析阻害要因の発生を常にモニタすることができる。図２の例では、内部標準物質にアミノ酸配列がSSSSSSKである合成ペプチドを用いた。そして、ブランク試料には純水を用いた。本実施例では、保持時間０のタイミングでブランク試料の純水を導入したところ１２．６分後に純水が溶出した。そのため、図２の内部標準物質由来イオンのイオン強度１２０１は保持時間１２．６分において落ち込んでおり、内部標準物質由来のイオンが検出されなくなっている。この時間範囲においては、試料に含まれる分離されない成分が溶出しており、定量解析の対象外と考えれば、定量分析阻害要因の発生をモニタできなくても問題はない。一方、他の時間範囲では、イオン強度の保持時間依存性が非常に低く、滑らかにしか変化しない。このことは、この内部標準物質のイオン化効率が、移動相成分の変化により、顕著に変化しないと説明される。
【００４０】
定量分析阻害要因であるイオンサプレッションの原理について、以下に簡単に述べる。エレクトロスプレーイオン化法などの噴霧イオン化法では、先ず、液体の噴霧によりミクロン程度のサイズの帯電液滴が生成される。この帯電液滴においては、液相のイオンは静電反発力により液滴表面に分布する。次に、帯電液滴から溶媒分子が蒸発することにより、帯電液滴からイオン蒸発過程あるいは電荷残留過程により気体状イオンが生成される。そのため、質量分析計で検出される気体状イオンの主要な起源は、帯電液滴の表面に存在する液相のイオンである。帯電液滴は溶媒分子が蒸発することによりサイズが減少し、表面の電荷密度は増加する。このことにより、液滴表面近傍の電荷を帯びていない分析対象物質もイオン化（プロトン付加など）が進行する。そして、液滴表面の電荷に対して、分析対象物質の量が充分に少ない場合には、分析対象物質のイオン化効率は一定となる。この条件が成立している場合には、検出イオンの強度とサンプル量との関係は一定となる。ところが、分析対象物質の量が液滴表面の電荷と同等以上の場合には、分析対象物質への電荷の供給が一部不足し、液滴表面で分析対象物質間の電荷の奪い合いが発生する。この結果、帯電液滴から気体状イオンが生成される効率が変動（低減）する。即ち、イオンサプレッションの発生である。そして、イオン化効率の低減率は分析対象物質の物理化学的性質に依存する。上記イオン生成過程によると、イオンサプレッションの影響を受け易い分析対象物質を特徴付ける主な要素は、１）液相での電離度の低さと、２）液滴表面への接近のし易さ（表面活性の低さ）と、の２点であると考察される。一方、液相で完全に電離する成分は、イオンとして帯電液滴表面に存在することができ、イオンサプレッションの影響は受け難いと考えられる。
【００４１】
そこで、定量分析阻害要因の発生をモニタするための内部標準物質の選定において、発明者らは、内部標準物質の等電点（あるいは酸性／塩基性）と疎水性（あるいは親水性）とが指標に使えることを初めて見出した。等電点とは、化合物全体の電荷平均が0となるときのｐHである。等電点が７より低い内部標準物質は酸性であり、正イオン分析において定量分析阻害要因に敏感に反応して定量分析阻害要因の検知に有利であることを確認した。しかし、等電点が移動相のｐＨより充分に低くなると正イオンの生成効率は非常に低くなる。通常、逆相LC/MSで使用される移動相には、LC分離性とイオン化の兼ね合いから、蟻酸などの酸が添加され、ｐHが３程度に調製されている。一方、疎水性（あるいは親水性）については、平均的な疎水性（あるいは親水性）を有するアミノ酸であるGかAに比較し、疎水性が低い（あるいは親水性が高い）ことが必要条件となる。
【００４２】
イオン化効率が低い場合、内部標準物質を高濃度で移動相に混入する必要があり、内部標準物質として好ましくない。定量分析阻害要因の発生は、イオン化される物質の量に依存するため、内部標準物質の添加自体が定量分析阻害を引き起こす可能性があるからである。以上の観点から、正イオンを分析する場合には、親水性が高く、等電点が３以上で８以下である合成ペプチド（DSSSSSやSSSSSSなどの酸性ペプチド、等電点はそれぞれ3.8、5.2）などは内部標準物質に最も好適である。一方、等電点が８以上の塩基性ペプチド（SSSSSKやSSKSSK、等電点はそれぞれ8.5、10.0）なども同様に内部標準物質として使用できる。ただ、塩基性ペプチドでは、酸性ペプチドより定量分析阻害要因による影響が少なく検知に不利であることに加え、一価のプロトン化分子のみならず多価のプロトン化分子も生成されやすい傾向がある。多価のプロトン化分子（多価イオン）は気相イオン分子反応による脱プロトン化を受けて、一価イオンになることがありえる。このことは、イオン強度が低減することに対応し、定量分析阻害要因の検知と区別することが困難となり得ることを意味する。
【００４３】
したがって、多価イオンが生成されやすい等電点が8以上の塩基性物質は定量分析阻害要因の検知には不適当である。以上をまとめると、正イオンを分析する場合には、疎水性が低い（親水性が高い）うえ、酸性で等電点が3以上で低い値を有し、また一価のプロトン付加分子だけが検出される物質、すなわち等電点が３以上（あるいは移動相のｐＨより低くない等電点）で８以下の物質が、内部標準物質に最も好適である。ペプチドを例にとれば、等電点が３以下のアミノ酸がD（等電点2.8）のみなので、大抵の成分は等電点が３以上である。そのため、等電点が３程度の性質を有する内部標準物質を用いれば、この内部標準物質由来イオンはイオンサプレッションなどの定量分析阻害要因に最も強く影響を受けると考えることができる。このような内部標準物質に利用可能なペプチドには、典型的な酸性アミノ酸であるDやE、及び、親水性が高く電離し難いSやQ、Nなどをアミノ酸配列に含むものを選択すればよい。（DやE は親水性が高いうえ、pKR（側鎖）は４程度である。）一方、負イオンを分析する場合には、親水性が高い（疎水性が低い）うえ、塩基性で等電点が高い物質が内部標準物質に最も好適である。このような内部標準物質に利用可能なペプチドとしては、典型的な塩基性アミノ酸であるRやK、及び親水性の高いSやQ、Nなどをアミノ酸配列に含むものを選択すればよい。RやKも親水性が高いうえ、等電点は９以上であり、pKR（側鎖）では１０以上である。一方、SやQ、Nは親水性が高いだけでなく、液相で電離し難い性質を有する。このようなペプチド例としては、KNNNNNとRNNNNNが挙げられ、等電点はそれぞれ8.75と9.75と8以上である。勿論、内部標準物質はペプチドでなければならない理由はなく、上記性質を有した化合物であれば同様に使用できる。
【００４４】
最後に、内部標準物質の分子量について、検討が必要である。質量分析装置の質量分解能で識別ができない程度に、内部標準物由来イオンのｍ/ｚが他の検出イオンのｍ/ｚと重なると、内部標準物由来イオンの強度が増加したと誤認識する可能性が発生する。この場合、後述のように、イオンサプレッションの検出が困難となる。そのため、例えばペプチドの分析では、内部標準物由来イオンのｍ/ｚが６００以上あるいは３５０以下であると他の検出イオンのｍ/ｚと重なる可能性が非常に低いと経験的に期待される。また、低分子化合物を分析する場合にはｍ/ｚが５００以上のものは稀であり、内部標準物由来イオンのｍ/ｚが４００以上であれば、問題ないと考えられる。一般的に、内部標準物質は分子量が大きくなると疎水性が高くなる傾向があるので、分子量は１０００以下が望ましい。
【００４５】
このような内部標準物質を用いる分析では、定量分析阻害要因の発生により、内部標準物質由来イオンの強度が低減する。それと同時に、他イオンも強度が低減する可能性があるが、その強度低減率の最大値は内部標準物質由来イオンの強度低減率となる。この性質を利用すれば、内部標準物質由来イオンのイオン強度低減率を、他成分の強度測定値における最大の低減率として誤差に含めることができ、様々なデータの統計的な処理に反映することが可能である。実際には分析データには必ず測定誤差が含まれるため、その誤差に基づく閾値を設定し、それよりも内部標準物質由来イオンのイオン強度低減率の方が低い場合には誤差として閾値を採用し、逆の場合には誤差に内部標準物質由来イオンのイオン強度低減率を採用すればよい。なお、ここで説明した等電点の数値はすべて概略の目安であり、経験的には１０％程度の誤差があってもかまわない。
【００４６】
また、これまではESIを用いた分析を前提としたが、APCIを用いる場合には、気相イオン分子反応を支配するプロトン親和力が、等電点の代わって重要な物理量となる。即ち、内部標準物質のプロトン親和力を低く設定することにより、定量分析阻害要因を最も受け易くすることができる。例えば、アミノ酸などのプロトン親和力は200kcal/mol以上なので、それよりもプロトン親和力が低く親水性の高い成分が内部標準物質の候補である。LC移動相溶媒に含まれる水（約165kcal/mol）やメタノール（約180kcal/mol）、アセトニトリル（約187kcal/mol）などの利用が便利である。定量分析阻害要因発生によるイオン強度の低減率は、ESIの場合と同様に扱うことができる。最後に、内部標準物質の第三の要求条件としては、イオンのｍ/ｚが分析対象成分のそれと異なることである。
【００４７】
図１２に、血漿サンプルの分析例を示す。インジェクション量が０．５μｇから０．００５μｇまで二桁変化させた場合の、全イオンクロマトグラムを(a)に重ねて示す。また、内部標準物質（DSSSSS）由来イオンのマスクロマトグラムを (b)に重ねて示す。この結果より、インジェクション量が０．００５μｇの場合には、内部標準物質（DSSSSS）由来イオンの強度に低減が観測されない。そのため、ブランクサンプルの分析結果と同等であると考えられ、この分析データは定量解析を実施しても問題ないことが示される。ところが、インジェクション量が０．０５μｇの場合には、内部標準物質由来イオンの強度が保持時間50分以降で20から40％程度低減している。そのため、保持時間50分以降では、他のイオン強度も可能性としては同程度まで低減すると考えられる。そして、インジェクション量が０．５μｇの場合には、分離成分が検出される殆ど全ての保持時間領域において、内部標準物質由来イオンの強度が顕著に低減している。
【００４８】
図１２において、(1)および(2)で示される保持時間において取得された質量スペクトルの比較を図１３および図１４に示す。インジェクション量が最大の場合(c)に取得された質量スペクトルのパターンは、インジェクション量が低い場合（(a)や(b)）の結果と異なることが示される。この差異は、イオンサプレッションの発生によると説明される。図１３および図１４において検出されるイオン（それぞれm/z＝637.97、588.96）に着目し、これらのイオンピークの面積（質量スペクトルにおけるピーク面積を保持時間方向に積算したもの）とインジェクション量との関係を図１５に示す。
【００４９】
この図は両対数プロットであるため、傾きが1の直線にフィッティングできる場合には定量解析が可能である。図１５に示されるように、上記２種類のイオンについては、インジェクション量が０．００５と０．０５μｇの場合は殆ど傾き1の直線上にデータポイントがプロットできるが、インジェクション量が０．５μｇの場合には傾き1の直線からデータポイントが明確に外れている。これらのイオンは、０．５μｇの場合に、顕著なイオンサプレッションを受けたと説明される。そして、直線からのズレは、内部標準物質由来イオンの強度の低減よりも少ないことが示される。このことは、イオン強度の低減率が内部標準物質由来イオンのそれ以下となるという説明と一致する。
【００５０】
定量解析を行う場合、検出イオンは、そのイオンの保持時間やm/z（またはmとz）、ピーク面積、及び、ピーク面積の誤差を纏めてデータセットとして処理される。このピーク面積の誤差に、サンプル調製における誤差や質量分析装置における測定誤差だけでなく、イオンサプレッションの効果も含めることにより、データ解析結果の精度向上に重要と考えられる。
【００５１】
図３には、データ解析部の画面表示部における表示データの例を示す。また、本実施例における分析工程の流れを図9に示し、以下図3と図9を用い、分析工程を詳細に説明する。なお、図9には疾病患者、あるいは健常者のいずれかの検体を分析する素工程を示しており、図9の分析に入る前に両者の顕著な差分を持つ変動成分を抽出してあって図9では変動成分のみを分析するのでもよいし、変動成分をまだ特定せずにすべての構成要素を分析する目的で各検体を図9の工程で分析してもよい。
【００５２】
図３は、BSA（ウシ血清アルブミン）のトリプシン酵素消化産物を分析サンプルとして分析した際の内部標準物質由来イオンのイオン強度1201b（データb、黒の実線）とブランク試料を分析した際の内部標準物質由来イオンのイオン強度120１a（データa、グレーの実線）の例である。内部標準物質としては、図2と同様にアミノ酸配列がSSSSSSKである合成ペプチドを用いた。図９に示すように、分析開始１００１後、まず移動相A、B、および内部標準物質を含有する移動相Cを所定の混合比率（初期値）で混合して移動相導入部から導入し、ブランク試料をほぼ同時に試料導入部から導入する（１００２）。このブランク試料導入のタイミングを時間０として分析を開始する。次に、移動相Cの混合比を一定に保ったまま、移動相A、Bの混合比を所定の変化量で時間変化させながら移動相を導入し（１００３）、内部標準物質の濃度は常に一定になるように制御し、逐次、LCによる分離（１００４）、イオン化部によるイオン化（１００５）、質量分析部による質量分析、内部標準物質由来イオンのイオン強度、すなわちマスクロマトグラムのデータ（データa）取得を行う（１００６）。所定の時間をかけて移動相の混合比を終了時の混合比まで変化させて分析データを取得したら、終了（１００７）してデータをデータaとしてデータ記憶部に記憶する（１００８）。以上のステップで、ブランク試料を用いて取得した参照用の内部標準物質のマスクロマトグラム（データa）を取得した（１０５０）。
【００５３】
次に、分析サンプルを導入して同様に内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムデータを取得する。まず、データa取得時と同様に、移動相A、B、Cの混合比を初期値に設定して移動相へ導入し、ほぼ同時に分析サンプルを導入する（１００９）。次に、移動相Cの混合比を一定に保ったまま、移動相A、Bの混合比をデータa取得時と同様に時間変化させ（１０１０）、ステップ１００４〜１００６と同様に逐次分離（１０１１）、イオン化（１０１２）し検出イオンの質量分析、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムのデータ（データb）取得を行う（１０１３）。このとき、分析時には後述するようにリアルタイム分析制御（１０５１）を行いながらデータ解析・分析（１０２１）を行う。以上のステップで、分析サンプルを導入して内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラム取得とサンプルの分析を同時に行う（１００９〜１０２３）。
【００５４】
LC/MSのインターフェースにおいてはエレクトロスプレーイオン化法（ESI）を用いているが、分析毎のイオン強度が必ずしも一致するとは限らない。そこで、試料に含まれる分離されない成分が溶出する直前の保持時間帯（図３中の時間帯I）において、イオン強度を規格化、すなわちレベル調整をしている。図中の時間帯IIIにおいて、内部標準物質由来のイオンの強度がほぼ一致しており、広い範囲で定量分析阻害要因が発生していないことが示される。一方、図３中時間帯IVで示した時間帯では、イオン強度が一致していない。この不一致の発生が、データb取得時（すなわち分析サンプル混合時）にはイオンサプレッション等の定量分析阻害要因が発生し、内部標準物質由来イオンの強度が変動していることを現していると解釈できる。データの規格化および比較は、高周波なノイズ成分の影響を受けずに各保持時間における平均レベルをもとに規格化および比較を行うようにデータを処理する。たとえばデータの高周波数成分を除去するなどして低周波数成分を抽出し、同じ保持時間におけるデータ同士を比較演算する。たとえば、規格化処理においては、データaの大きさを100％としてデータｂが１００％±５％になるように表示を調整する。この±５％は一例であり、あらかじめ規格化（レベル調整）許容範囲として制御系８において記憶するか、オペレータが入力できるようにしておく。また、比較処理においても、ほぼ同様にデータaを100％とし、データbがaに対し何％であるかを計算する。たとえばデータbがaに対し97％であるとき、3%の違いがあると判断する。このようにして求めた数値（ここでは3%）を、以下、差分比率と称し、データa、bの不一致度を示す指標とする。
【００５５】
なお、データを詳細に見ると、時間帯IIIにおいても、データaとデータbは数％程度以内の誤差があることがわかる。この数％の誤差は、通常のLC/MSによるマスクロマトグラムの測定ばらつきとしてよく知られたものである。このようなマスクロマトグラムにおけるイオン強度の誤差があるため、データaとbの差分が装置の測定誤差から来る数％以内の微小なずれであれば測定ばらつきとして許容し、データaとbの差がある閾値を超えたときには、定量分析阻害要因による差分が発生したと判定する必要がある。そこで、この判断基準となる差分比率（不一致度）閾値をあらかじめ決めておき、データを取得してリアルタイムに差分比率（不一致度）を算出し不一致度閾値と比較する。この不一致度閾値は、上記の規格化許容範囲と同様に、あらかじめ制御系８に記憶させておくか、あるいはオペレータが入力できるようにしておく。本実施例では、装置の誤差が標準的なレベルとして5〜１０％程度の測定誤差を持つことから、差分比率（不一致度）閾値を１５％と設定した。すなわち、データaとbの差分比率dが１５％を超えたときに、定量分析阻害要因として判定することにした。このような誤差は質量分析装置に依存すると考えられ、装置に応じた誤差がデータ解析部１０５に入力できるように構成している。なお、図１のデータ解析部１０５には、以上説明したデータa、b間のレベル調整を行う演算や画像表示制御を行うレベル調整手段114と、データ間の不一致度を計算してあらかじめ記憶させた不一致度閾値と比較する演算手段115が内蔵されている。
【００５６】
さて、検出された図３中時間帯IVの上記不一致は、イオンサプレッションのような定量分析阻害要因が発生したことを示し、時間帯IVでは試料の分析データの精度が低下し定量解析が困難である。一方、時間帯IIIでのデータは十分な精度があり定量解析が可能である。そこで、時間帯IIIにおける分析サンプルのデータだけを抽出することにより、この時間帯における分析サンプルの定量分析を行う。この時間帯IIIで分析サンプルの定量分析が十分行えれば、そのまま信頼性の高い定量解析を行うことが可能となる。これにより、分析中に定量分析阻害要因が発生する場合にも、阻害要因の影響を受けない時間帯のデータを有効に活用でき、分析の無駄を省くことができる。また、時間帯IVにおいては、定量評価阻害要因が発生して定量評価結果の精度が低下してデータを使用できないため、後述するように、時間帯IVにおいては分析実時間で定性評価を優先して行うように分析モードを切替えてもよい。また、一回の分析でデータが取り切れない場合には、以上の分析を繰り返してもよい。
【００５７】
また、このようなイオンサプレッションのような定量分析阻害要因の発生を検知した場合、試料の濃度低減や精製、分離などを施すことにより、定量分析阻害要因を発生させない試料を調製することが可能である。この場合も、データ解析部の画面表示部において、試料の調製にフィードバックをかけて再調製した結果内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムに不一致が観測されなければ、定量分析阻害要因が発生しなくなったことを確認することができる。試料の調製条件の変化を繰り返し行い、定量分析阻害要因が発生しないか、あるいは発生するが影響を受けずに定量分析できる時間帯が一定の時間以上に確保されるときには、試料の調製条件の変更を停止させるように制御してもよい。
【００５８】
図４に、顕著に定量分析阻害要因が発生する例を示す。この例では、図中時間帯IIIで示す非常に広い範囲で内部標準物質由来イオンのイオン強度に不一致が発生して定量分析阻害要因が発生することが示され、このデータは定量解析に不適であることが示される。この場合は、１）分析サンプルの量を1/10程度に低減させる、２）試料調製において予め分離・分画を実施する、３）試料調製において脱塩などによるイオン性の不純物を除去する、などの対策を施してから、再分析を実施することが必要である。このように、イオン強度の不一致の度合いによっては、試料に対策を施さないと有効な定量分析データが取得できない場合がある。これも、あらかじめイオン強度の不一致領域と一致領域の時間に基準値を設け、基準時間よりもイオン強度の一致領域の時間が短い場合、試料の調製を順次やり直すように制御するよう制御系を構成した。この基準時間も、あらかじめ制御部８に記憶させるか、オペレータが入力してもよい。
【００５９】
なお、図４中に破線の楕円で示す保持時間帯には、サンプル分析データにおける内部標準物質由来イオンの強度（データb）が増加し、ブランク試料のそれ（データa）と同等になっている。しかし、この場合の質量スペクトルを調べると、内部標準物質由来イオンとは別だがｍ/ｚが同等のイオンが検出されていた。したがって、この保持時間帯においても、定量分析阻害要因が発生しなかった訳ではない。このように、非常に複雑な試料を分析する場合は、内部標準物質由来イオンとｍ/ｚが殆ど一致するイオンが観測されることがあり、このことが定量分析阻害要因の検知に悪影響を与える可能性がある。そこで、分析の実時間で内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較を実施し、不一致が発生した場合にはMS/MSなどのタンデム質量分析を実施すると便利である。予め内部標準物質由来イオンのイオン強度とタンデム質量分析スペクトルで検出される解離イオンの強度との関係を調べておくことにより、実時間でのタンデム質量分析スペクトル取得により、内部標準物質由来イオンの本来のイオン強度が求められるためである。
【００６０】
さて、プロテオーム解析やメタボローム解析、マーカー探索においては、試料に含まれる成分が必ずしも既知でないため、定性（同定）解析と定量（変動）解析の両方が必要である。しかし、定性（同定）解析では通常の質量スペクトルだけでなくMS/MSなどのタンデム質量分析スペクトルを高スループットで取得することが必要であるのに対し、定量（変動）解析では極力タンデム質量分析を実施しないで通常の質量スペクトルを高スループットで取得することが必要である。即ち、目的に応じて、質量分析装置で取得されるデータの優先順位が異なる。
【００６１】
従来は、たとえば定性分析を先に行い、全ての成分を同定した後に定量分析を行うという手法が一般的であった。具体的には、分析装置の制御部８には分析手順を指示するファイルが格納され、定性分析を行う際に制御部８はこの分析手順指示ファイルを参照して、例えば一度通常の質量分析を行った後、スペクトルのピークを上位１０種類まで抽出してタンデム分析し、再度通常の質量分析を行って成分を確認し再度スペクトルから次の上位１０種類抽出してタンデム分析するという繰り返しを行って全成分の定性分析を行っていた。このとき、定性分析しようとする成分の種類が少なく、例えば１５種類程度の成分しかない場合には、２回目のタンデム分析で全成分を定性分析して終了したらその後は通常の質量分析による定量分析を行うという制御をすることもあった。これを定性分析優先モードと称することもあった。
【００６２】
このような定性分析が終了して定量分析を行う際には、別の分析手順指示ファイルがあらかじめ制御部８に格納されていてこれを制御部８が参照し、通常の質量分析を実施して高精度な定量分析を行っていた。すなわち、定性、定量分析にはそれぞれ定性、定量分析用の分析手順指示ファイル（第一、第二の分析手順指示ファイル）が格納されてこれらによる制御が行われ、定性分析→定量分析の順に分析が実行されるのが一般的であった。しかし、予め、定性（同定）解析を目的とするデータ取得を実施し、その後に定量（変動）解析を目的とするデータ取得を実施するので、状況にあわせた高スループットな分析ができなかった。これに対し、分析モードを実時間で変更する機能があれば、多成分が含まれる試料を分析する場合に高スループット化の観点で有利である。
【００６３】
そこで、図１、図６に示すように、本発明では、分析の実時間で、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較を実施し、不一致が発生した場合には定性（同定）分析優先モードに切替えるなど分析モードを変更するように制御系を構成した。すなわち、定性/定量分析を行う順序を、取得するデータに応じてリアルタイムに制御する。本実施例では、例えば、まず定量分析を優先して分析を行う（定量分析優先モード）。そして、前述した手法で定量分析阻害要因の有無を判定し、阻害要因の影響を受けていない時間帯には定量分析を続行して分析データを制御部８に格納する。阻害要因が発生して影響が顕在化していることを検出した際には、定量分析の精度は低下すると考えられるので定性分析を優先するように切替える（定性分析優先モード）。これにより、定量分析阻害要因の影響を受ける時間帯にも、効率よく定性分析を行うことが可能になった。
【００６４】
上記定量分析優先モードについてさらに詳細に説明する。従来は、定量分析モードであればタンデムによる定性分析を行わない制御を行うのが一般的であった。これに対し、本実施例では、新たに、定量分析中にも、スペクトルの特徴によっては定性分析を行えるように制御を行った。これを称して定量分析優先モードと呼ぶ。例えば、定量分析阻害要因が検出されない時間帯にも、あらかじめ分析サンプル中に存在すると予想される成分を制御部８に記憶しておき、定量分析によって予想しなかった成分のスペクトルが得られた場合には、定量分析中に定性分析を実行してもよい。この機能を利用し、例えば、健常者の検体から、分析サンプルの成分分析結果を取得して制御部８に記憶しておき、疾病患者の検体を分析する際にこれを参照し、健常者から検出されなかった成分についてだけ定性分析に切替えて同定することも可能になった。このように分析手順を制御することで、マーカー探索等において精度、効率（すなわちスループット）とも飛躍的に向上させることができた。
【００６５】
この場合、内部標準物質は１種類でも、後述するように２種類でも構わない。そして、図に示すように、分析の状態を、データ解析部の画面、あるいは、質量分析装置の制御部の画面に実時間で「定量解析（優先）モード」や「定性解析（優先）モード」などと表示するようにし、オペレータが、装置が正常に動作していることを目視で確認できるようにした。なお、このモード切替えは、第三の分析手順指示ファイルのようなものを制御部８に格納しておいて、逐次取得したデータをもとに定性解析優先モード」と「定量解析優先モード」を切替えて制御してもよいし、図６に示すように、画面表示部に定性・定量分析のモード選択ボタン１０９があって、オペレータが分析結果を逐次モニタしながら、必要に応じてポインティングデバイス１１２等によるポインタ１１０でモードを切替える構成であってもよい。切替えを判断する判断基準も、制御部８に記憶しておいてもよいしオペレータが入力してもよい。
【００６６】
以上述べたように、図９にリアルタイム分析制御（１０５１）と表示した制御として、（1）分析初期段階におけるデータaとデータbのリアルタイムにおける規格化・レベル調整（１０１4、１０１５）、（2）リアルタイムの定量分析阻害要因の有無（内部標準物質由来イオンの強度データa、bの不一致度）判定（１０１６）と、判定の結果による定量分析阻害要因の生じていない有効時間帯のデータ抽出（１０１７）、（3）定量分析阻害要因の影響度（データaとbの一致する時間の長さ等）に応じ、影響度が大（一致時間の長さが基準値以下）である場合に試料分離調製条件等の見直し（１０１８、１０１９）、（4）定量分析阻害要因の影響を受けている時間帯の定量/定性（タンデム）分析の優先モード切替え選択（１０２０）を行うように制御系を構成し、取得データの解析による定量、定性分析を行う（１０２１）ように制御した。さらに、例えば定量分析優先モードにおいても、スペクトルに顕著な特徴、例えばあらかじめ記憶させた分析サンプルの予想成分と比較して予想しない成分ピークを検出した場合には定性分析を行うように、リアルタイムに分析モードを制御した。そして、分析が終了して分析データを取り切れていない場合は、分析を繰り返して必要なデータを全て取得する。
【００６７】
なお、データ解析部１０５には、データaとｂの不一致度が不一致度閾値より小さいかあるいは大きい時間帯を検出する手段116と、不一致度が小さい、すなわち一致度が高い時間帯（一致時間帯）における分析データを収集する手段117とが内蔵されている。また、上記の分析手順指示ファイルの記憶部やファイル読み取り制御部を持つ構成となっている。
【実施例２】
【００６８】
次に、第２の実施例として、内部標準物質を２種類用いる分析手法について図５、図１０を用いて説明する。図１０に示すように、内部標準物質を２種類用いると、第１の実施例のように２回分析を行って評価するのではなく、一回の分析において、定量分析阻害要因の発生の有無を評価することができる。それにより、分析時間の更なる短縮を図ることができる。２つの内部標準物質としては、常にイオンとして検出される物質、すなわち親水性物質であり、さらに、一方が酸性、他方が塩基性であり前者が定量分析阻害要因に対し敏感に変化し、後者がほとんど変化しない物質を選定する。
【００６９】
すなわち、内部標準物質の一方は等電点が概略3以上8以下、他方は概略8以上である物質を選定する。ここでは、親水性と酸性が高い物質を第1の内部標準物質、親水性と塩基性が高い物質を第２の内部標準物質とする。図５上図に、本実施例で取得した第1の内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラム（１２０２a、黒の実線）と第２の内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラム（１２０２b、グレーの破線）とを示す。本実施例では、図５の時間帯Iにおいて、リアルタイムで第１、第２の内部標準物質由来イオンの強度のレベル調整が行われて強度の規格化がなされ、重ねてデータ解析部の画面表示部で表示される。なお、LC/MSでの分析時には、装置に起因するイオン量の予期できない微妙な変動が起こる可能性があるが、実施例１のように２回にわたって分析を行う場合、その都度ランダムな変動が起こりうるので、この予期できないランダムなイオン量の変動の影響を避けることができない。しかし、本実施例では同時に２つのデータを取得して比較できるので、装置に起因した予期できないイオン量の変動が起きたときにも両者のデータにおいて同様のイオン変動が起こり、両者の差分においてはイオン変動の影響を受けずにすむ。その結果、本実施例では、不一致度の評価を実施例１よりも高い精度で正確に行うことができるという利点がある。
【００７０】
図５下図は全イオンクロマトグラムであり、定量分析阻害要因が発生している保持時間（時間帯IV）とは異なる保持時間領域（時間帯III）の分析データは定量解析が可能である。そこで、上記保持時間領域（時間帯III）の分析データのみを抽出し、別名でデータ解析部などに保存する。このようにして、定量解析が可能な分析データのみを解析することができる。本実施例は、以上説明したように、内部標準物質を２種類用いて1回の分析で定量分析阻害要因の発生有無を判定しながら、目的とする分析サンプルの分析を行う点が第1実施例と異なり、その他の部分は第1実施例と同様である。すなわち、２つの内部標準物質のマスクロマトグラムから、第１実施例と同様に両者の不一致度を算出し、あらかじめ定めた不一致度閾値と比較し、不一致度が閾値よりも小さいときの分析時間帯を検出し、この分析時間帯における分析データを収集する。２つの内部標準物質は一定の濃度で移動相に導入し、分析時間全体にわたり安定して検出されるようにする。
【００７１】
そして、第１実施例と同様に、２つのマスクロマトグラムの不一致度が大きい場合には定量・定性分析優先モードを切替えて定性分析（タンデム分析）を優先させたり、切替え状態を表示させたり、不一致度が十分に小さくなる時間帯の長さがあらかじめ定めた基準時間より短い場合には、試料の調製状態を見直して不一致度が小さくなるまで繰り返すような制御を行って高効率・高精度な分析を実現した。第二の実施例で使った装置の構成は、データ解析部１０５や制御系８における演算手段の演算内容の細部が一部異なる以外は図１に示す第１の実施例で使った装置の構成とほぼ同様である。
【実施例３】
【００７２】
第３の実施例として、内部標準物質を一種類導入して第１の内部標準物質とし、第２の内部標準物質を積極的には導入せず、意図しないで混入していた不純物等のような成分物質から第２の内部標準物質になりうる成分を探索し、両者のマスクロマトグラムを同時に比較する手法について説明する。この実施例の分析工程は、図１１に示すように、図１０の第２実施例と比較して第２内部標準物質として使用可能な物質を探索・選定する工程が追加される。この場合、第１の内部標準物質は第２の実施例における第１の内部標準物質と同様、親水性、かつ酸性の物質であり、定量分析阻害要因に敏感に反応する物質を選定しておく。
【００７３】
そして、第２内部標準物質探索モニタを設け、分析装置内に存在して広い保持時間領域で安定してイオンとして検出され、しかも定量分析阻害要因に対してほとんど影響を受けない物質を、移動相やサンプルを変えながら検出する。たとえば、シロキサンのような一種の不純物も、広い保持時間領域に安定してイオン観測され、しかもイオンサプレッションのような定量分析阻害要因に対してほとんどイオン強度が変動しなかった。このような物質を第２の内部標準物質として選定し、第２の実施例と同様に第１、第２の内部標準物質のマスクロマトグラムを同時に取得して比較し、定量分析阻害要因を検出する。その他の部分は、第１、第２の実施例と同様である。本実施例の装置は、第一の実施例の装置構成と比較して、第二の内部標準物質となりうる物質を探索するために複数の物質の分析データをモニタするモニタ手段と、探索して見つけた物質を第二の内部標準物質に選んで入力するための入力部、すなわち、ポインティングデバイスやキーボード等による入力デバイスと、選択メニューや選択ボタン、数値入力欄等の画像表示メニュー等をさらに併せ持つ装置構成である。
【実施例４】
【００７４】
次に、第４の実施例として、内部標準物質を１種類導入し、ブランク試料の分析を行わず、分析サンプルを導入した分析結果のみで定量分析阻害要因を検出する手法について説明する。図２に示すように、内部標準物質のマスクロマトグラムは、時間に対して急激な変動はしない傾向を示す。そのため、ブランク試料の分析結果を用いなくても、定量阻害要因の発生を検知することは原理的に可能である。そこで、分析サンプルを導入した状態のみで、内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムを取得し、時間に対して急激な変化があるか否かを調べることで、定量分析阻害要因を検出する。この分析手法では、分析阻害要因による内部標準物質由来イオンの強度低減が急激でない場合、分析阻害要因の発生を検知することが困難になる点に注意が必要である。
【実施例５】
【００７５】
図７に示す本発明の質量分析システムにおける他の一実施例の構成図では、図１の実施例と異なり、分離部１０３の下流で内部標準物質２０４がシリンジポンプ１１１から導入される。このことにより、液体クロマトグラフの溶出液に内部標準物質２０４が一定の比率で混入される。勿論、内部標準物質２０４は分析液体に混合できればよく、混合場所はインターフェース（イオン源）より上流側にあれば何処でも良い。液体クロマトグラフの流量が１マイクロリットル/分より高い汎用液体クロマトグラフやセミミクロ液体クロマトグラフ、マイクロ液体クロマトグラフを使用する場合には、このような構成の方が図１に示す構成よりも有利である。内部標準物質を含む溶液の交換が容易であるためである。本実施例は、第１から第４の実施例と組合せて実施することが可能である。
【実施例６】
【００７６】
図８に、本発明の質量分析システムにおける他の一実施例における内部標準物質由来イオンの検出を利用した質量シフトの保持時間依存性を示す。液体クロマトグラフを用いた分析が数分以上になると、温度変化などにより、ｐｐｍレベルの質量精度が低減することがある。そこで、理論質量（図8の1401）が既知の内部標準物質由来イオンのｍ/ｚの測定値（図8の1402）を保持時間に対して調べることにより、各保持時間に検出されるイオンのｍ/ｚの測定値（図8の1404）を比例配分により補正することができる（図8の1403）。このことにより、特に定性分析におけるデータベース検索において、物質の同定を非常に高精度で行うことが可能となる。本実施例は、第１から第５の実施例と組合せて実施することが可能である。
【００７７】
これまでは、主に疾患診断に向けたマーカー探索分野に向けた定量分析阻害要因の検出手段やそれを利用する質量分析システムについて述べた。一方、マルチプル・リアクション・モニタリング（Multiple reaction Monitoring：MRM）と呼ばれるタンデム質量分析法が用いられる薬物動態などの分野では、物質の定性分析だけでなく、定量分析においてもタンデム質量分析が用いられる。このような場合、予め内部標準物質由来イオンのタンデム質量分析を実施し、主要なフラグメントイオン１種類か複数種類のｍ/ｚを質量分析装置に登録することが必要となる。これにより、内部標準物質由来イオンの主要なフラグメントのマスマスクロマトグラムを取得することができる。そして、フラグメントイオンのマスクロマトグラムにおいて、強度の変動（低減）により定量分析阻害要因の発生を検知することができる。具体的な検知方法などは、これまで述べたものと同様である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の質量分析システムにおける一実施例の構成図。
【図２】典型的なブランク試料分析データにおける内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラム。
【図３】本発明の質量分析システムにおける一実施例における、ブランク試料と分析サンプルの分析データにおける内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較と、定量分析阻害要因の発生検知の検知例。
【図４】ブランク試料と分析サンプルの分析データにおける内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較と、定量分析阻害要因の発生が大規模な例。
【図５】本発明の質量分析システムにおける一実施例において、二種類の内部標準物質を使用し、分析サンプルの分析データにおける内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較と、定量分析阻害要因の発生検知例。
【図６】本発明の質量分析システムにおける一実施例におけるデータ解析部の画面、あるいは、質量分析装置の制御部の画面。
【図７】本発明の別の質量分析システムにおける一実施例の構成図。
【図８】本発明の質量分析システムにおける内部標準物質由来イオンの実測ｍ/ｚの時間依存性の例。
【図９】本発明の第１の実施例における分析工程を説明する図。
【図１０】本発明の第２の実施例における分析工程を説明する図。
【図１１】本発明の第３の実施例における分析工程を説明する図。
【図１２】本発明の質量分析システムを用いて取得した(a)全イオンクロマトグラム、及び、(b)内部標準物質由来イオンのマスクロマトグラムの比較。
【図１３】本発明の質量分析システムを用いて保持時間(1)に取得した質量スペクトルの比較。
【図１４】本発明の質量分析システムを用いて保持時間(2)に取得した質量スペクトルの比較。
【図１５】保持時間(1)及び(2)に検出されたイオンに対する、ピーク面積とインジェクション量との関係。
【符号の説明】
【００７９】
101：移動相導入部、102：試料導入部、103：分離部、104：イオン化・質量分析部、105：データ解析部、106：画面表示部、107：分析モード制御部、108：制御系、109：分析モード選択ボタン、110：ポインタ、111：シリンジポンプ、112：ポインティングデバイス、113：データ記憶手段、114：レベル調整手段、115：不一致度算出・比較手段、116：一致時間帯検出手段、117：分析データ収集手段、201：移動相A、202：移動相B、203：移動相C、204：内部標準物質、205：ブランク試料または分析サンプル、1001：分析開始ステップ、1002：移動相、ブランク試料の導入ステップ、1003：移動相の導入継続ステップ、1004：分離ステップ、1005：イオン化ステップ、1006：質量分析、マスクロマトグラムデータ（データa）取得ステップ、1007：終了判定ステップ、 1008：データa記憶ステップ、1009：移動相、分析サンプルの導入ステップ、1010：移動相の導入継続ステップ、1011：分離ステップ、1012：イオン化ステップ、1013：質量分析、マスクロマトグラムデータ取得ステップ、1014：分析初期段階判定ステップ、1015：データのレベル調製（規格化）ステップ、1016：データの不一致度判定ステップ、1017：定量分析データ取得ステップ、1018：データの一致時間の判定ステップ、1019：試料調製条件見直しステップ、1020：定量・定性分析モードの切替えステップ、1021：データ解析・分析ステップ、1022：終了判定ステップ、1023：終了ステップ、1024：第2の内部標準物質探索・選定ステップ、1050：ブランク試料の分析ステップ、1051：リアルタイム分析制御ステップ、1201：内部標準物質由来イオンのイオン強度、1201a：ブランク試料分析時の内部標準物質由来イオンのイオン強度(データa)、1201b：分析サンプル分析時の内部標準物質由来イオンのイオン強度(データb)、1202a：第１の内部標準物質由来イオンのイオン強度、1202b：第２の内部標準物質由来イオンのイオン強度、1401：内部標準物質のm/z理論値、1402：内部標準物質のm/zの測定値、1403：分析サンプルのm/z補正値、1404：分析サンプルのm/z測定値。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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