(57)【要約】【課題】マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物や、これらを用いたマイコプラズマ由来リポタンパクに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ＴＬＲ６等のマイコプラズマ由来リポタンパクを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したモデル非ヒト動物、例えばＴＬＲ６ノックアウトマウスを作製する。このマイコプラズマ由来リポタンパク不応答性モデル非ヒト動物あるいは該モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ等の免疫細胞と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパクとを用いて、前記モデル非ヒト動物あるいは免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパクに対する応答を測定・評価し、それに対する応答の抑制物質又は促進物質をスクリーニングする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質であるＴＬＲ６をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法。
【請求項２】
非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする請求項１記載の使用する方法。
【請求項３】
齧歯目動物がマウスであることを特徴とする請求項２記載の使用する方法。
【請求項４】
マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたＴＬＲ６遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ６遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＴＬＲ６ノックアウトマウスであることを特徴とする請求項３記載の使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するＴＬＲ６等のタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物や、またこれらモデル非ヒト動物を用いたマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
トール（Ｔｏｌｌ）遺伝子は、ショウジョウバエの胚発生中の背腹軸の決定（非特許文献１及び２参照）、また成体における抗真菌性免疫応答に必要であることが知られている（非特許文献３参照）。かかるＴｏｌｌは、細胞外領域にロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）を有するＩ型膜貫通受容体であり、この細胞質内領域は、哺乳類インターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）の細胞質内領域と相同性が高いことが明らかとなっている（非特許文献４、５、及び６参照）。
【０００３】
近年、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるＴｏｌｌの哺乳類のホモログが同定され、ＴＬＲ２やＴＬＲ４など現在までに６つのファミリーが報告されている（非特許文献７、８、９、及び１０参照）。このＴＬＲファミリーは、上記ＩＬ−１Ｒと同様にアダプタータンパク質であるＭｙＤ８８を介し、ＩＬ−１Ｒ結合キナーゼ（ＩＲＡＫ）をリクルートし、ＴＲＡＦ６を活性化し、下流のＮＦ−κＢを活性化することが知られている（非特許文献１１、１２、及び１３参照）。また、哺乳類におけるＴＬＲファミリーの役割は、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ：pattern recognition receptor）として、先天的な免疫認識に関わっているとも考えられている（非特許文献１４参照）。
【０００４】
上記ＰＲＲにより認識される病原体会合分子パターン（ＰＡＭＰ：pathogen-associated molecular pattern）の一つは、グラム陰性菌の外膜の主成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）であって（非特許文献１４参照）、かかるＬＰＳが宿主細胞を刺激して宿主細胞にＴＮＦα、ＩＬ−１及びＩＬ−６等の各種炎症性サイトカインを産生させること（非特許文献１５及び１６参照）や、ＬＰＳ結合タンパク質（ＬＢＰ：LPS-binding protein）により捕獲されたＬＰＳが細胞表面上のＣＤ１４に引き渡されることが知られている（非特許文献１６及び１７参照）。本発明者らは、ＴＬＲ４のノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ４ノックアウトウスが上記グラム陰性菌の外膜の主成分であるＬＰＳに不応答性であること（非特許文献１８参照）や、ＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製し、ＴＬＲ２ノックアウトマウスのマクロファージがグラム陽性菌細胞壁やその構成成分であるペプチドグリカンに対する反応性が低下すること（非特許文献１９参照）を報告している。
【０００５】
他方、マイコプラズマは自己増殖可能な最小の微生物で生物学的には細菌に分類されるが、他の細菌と異なり細胞壁を欠くため多形態性を示し、ペニシリン、セフェム等の細胞壁合成阻害剤には感受性を示さない。ヒトからよく分離されるマイコプラズマは７種あるが、このうち病原性が明らかなのはマイコプラズマ・ニューモニエ（M.pneumoniae）のみであり上気道炎、気管支炎、肺炎などの呼吸器感染症を起こすことが知られている。最近、本発明者らは、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドなどの細菌菌体成分が、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていることを明らかにしている（非特許文献２０参照）が、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質は知られておらず、そのためマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドが免疫細胞を活性化する分子メカニズムはよくわかっていなかった。
【０００６】
【非特許文献１】Cell 52, 269-279, 1988
【非特許文献２】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献３】Cell 86, 973-983, 1996
【非特許文献４】Nature 351, 355-356, 1991
【非特許文献５】Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 393-416, 1996
【非特許文献６】J. Leukoc. Biol. 63, 650-657, 1998
【非特許文献７】Nature 388, 394-397, 1997
【非特許文献８】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588-593, 1998
【非特許文献９】Blood 91, 4020-4027, 1998
【非特許文献１０】Gene 231, 59-65, 1999
【非特許文献１１】J. Exp. Med. 187, 2097-2101, 1998
【非特許文献１２】Mol. Cell 2, 253-258, 1998
【非特許文献１３】Immunity 11, 115-122, 1999
【非特許文献１４】Cell 91, 295-298, 1997
【非特許文献１５】Adv. Immunol. 28, 293-450, 1979
【非特許文献１６】Annu. Rev. Immunol. 13, 437-457, 1995
【非特許文献１７】Science 249, 1431-1433, 1990
【非特許文献１８】J. Immunol. 162, 3749-3752, 1999
【非特許文献１９】Immunity 11, 443-451, 1999
【非特許文献２０】J. Immunol. 164, 554-557, 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
インビボにおける菌体成分に対する応答は、細胞表面上の各ＴＬＲの発現レベルの差異により変化することが予測されるものの、未だインビボにおける菌体成分刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリーの各メンバーの関わりは明らかにされていない。また、生体膜などに存在する水不溶性のリポタンパク／リポペプチドが免疫細胞を活性化することは知られていた。しかし、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質は知られていなかった。本発明の課題は、インビボにおけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド刺激によるシグナル伝達に対するＴＬＲファミリー各メンバーの関わり、特にＴＬＲ６のインビボにおける役割を明らかにする上で有用な、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物、特にＴＬＲ６遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物や、これらを用いたマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記のように、細菌の共通構造を認識するパターン認識受容体として、先天的な免疫認識に関わっている哺乳類におけるＴＬＲファミリーは、現在までに６つのメンバー（ＴＬＲ１−６）が公表されている（Nature 388, 394-397, 1997、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 588-593, 1998、Gene 231, 59-65, 1999）が、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識する受容体は知られていなかった。本発明者らは、既に同定されているＴＬＲ６のｃＤＮＡを、マウス遺伝子ライブラリーから単離し、このＴＬＲ６遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位を、ネオマイシン耐性遺伝子に置き換え、またそれぞれのＣ末端側にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を導入させて、Ｇ４１８とガンシクロビアに対して２重に抵抗力のあるＥＳ細胞クローンをスクリーニングし、このＥＳ細胞クローンをＣ５７ＢＬ／６のマウスの胚盤胞（blastocysts）の中に注入し、その生殖系列をとおして、メンデルの法則に従い出生してくるＴＬＲ６遺伝子子機能が染色体上で欠損したＴＬＲ６ノックアウトマウスを作製し、このＴＬＲ６ノックアウトマウスと野生型マウスとＴＬＲ２ノックアウトマウスとを比較・解析することにより、ＴＬＲ６がマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識する受容体タンパク質であることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質であるＴＬＲ６をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル動物として使用する方法や、（２）非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする上記（１）記載の使用する方法や、（３）齧歯目動物がマウスであることを特徴とする上記（２）記載の使用する方法や、（４）マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたＴＬＲ６遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ６遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＴＬＲ６ノックアウトマウスであることを特徴とする上記（３）記載の使用する方法や、（５）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質であるＴＬＲ６をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド特異的不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、前記免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価することを特徴とするマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（６）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質であるＴＬＲ６をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損したマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド特異的不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、前記非ヒト動物におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価することを特徴とするマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（７）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価するに際し、対照としての野生型非ヒト動物との比較・評価を行うことを特徴とする上記（５）又は（６）記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（８）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質が、マイコプラズマ感染症に対する抑制物質又は促進物質であることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれか記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（９）マイコプラズマ感染症が、ヒトマイコプラズマ肺炎、ウシ肺疫、ヒツジ・ヤギ乳房炎又はニワトリ呼吸器疾患であることを特徴とする上記（８）記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（１０）マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質が、ＴＬＲ６に対するアゴニスト又はアンタゴニストであることを特徴とする上記（５）〜（７）のいずれか記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（１１）非ヒト動物が齧歯目動物であることを特徴とする上記（５）〜（１０）のいずれか記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（１２）齧歯目動物がマウスであることを特徴とする上記（１１）記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法や、（１３）マウスが、マウス遺伝子ライブラリーからマウスＥＳＴクローン由来のプローブを用いてスクリーニングすることにより得られたＴＬＲ６遺伝子の細胞内領域及び膜貫通領域を含む遺伝子部位の全部又は一部の遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルとマーカー遺伝子をもつプラスミドに置換してターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを線状化した後胚幹細胞に導入し、ＴＬＲ６遺伝子機能を欠損した標的胚幹細胞を、マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、このキメラマウスと野生型マウスとを交配させてヘテロ接合体マウスを作製し、かかるヘテロ接合体マウスをインタークロスすることによって得られるＴＬＲ６ノックアウトマウスであることを特徴とする上記（１２）記載のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウス等のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物は、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対してのみ不応答性であるため、このモデル非ヒト動物を用いることによって、マイコプラズマ肺炎等のマイコプラズマ感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ６に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答性の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニングが可能となり、ひいては、マイコプラズマ属をはじめとする細菌による感染成立の分子機構の解明における新たな有用情報を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質としては、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識することができるタンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、ＴＬＲ６の一部又は全部を具体的に挙げることができる。かかるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質は、そのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができる。また、本発明においてマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとは、マイコプラズマに由来するリポタンパク／リポペプチドの他、マイコプラズマ菌体自体又はその処理物、ＭＡＬＰ−２等の合成マイコプラズマ由来リポペプチド等を意味する。
【００１３】
本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物とは、野生型非ヒト動物に比べてマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドによる刺激に対する生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が特異的に低下しているか、あるいは失われている非ヒト動物、すなわち、スピロヘーターやグラム陰性菌等のリポプロテイン／リポペプチドによる刺激に対しては正常に生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官において反応性を有するが、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにおいては、生体又は生体を構成する細胞、組織若しくは器官の反応性が低下しているか、あるいは失われているマウス、ラット、ウサギ等のヒト以外の動物をいい、具体的には、ＴＬＲ６ノックアウトマウス等のＴＬＲ６遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物を具体的に挙げることができる。また、上記マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドによる刺激としては、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを生体に投与するインビボでの刺激や、生体から分離された細胞にマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを接触させるインビトロでの刺激等を挙げることができる。
【００１４】
次に、本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物の作製方法を、ＴＬＲ６ノックアウトマウスを例にとって説明する。マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＴＬＲ６をコードする遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＴＬＲ６をコードする遺伝子をウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このＴＬＲ６をコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３′末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲットベクターを作製する。
【００１５】
この作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス：＋／−）を得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウスを作製することができる。また、ＴＬＲ６ノックアウトマウスにおいてＴＬＲ６が生起しているかどうかを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べたり、またこのマウスにおけるＴＬＲ６の発現をウエスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００１６】
また、作出されたＴＬＲ６ノックアウトマウスがマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対して不応答性であることは、例えば、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドをＴＬＲ６ノックアウトマウスのマクロファージ、単核細胞、樹状細胞などの免疫細胞にインビトロ又はインビボで接触せしめ、かかる細胞におけるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等の産生量や、脾臓Ｂ細胞の増殖応答や、脾臓Ｂ細胞表面でのＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原の発現量や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ６のシグナル伝達経路における分子の活性化を測定することにより確認することができる。そして、本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウスは、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの作用機序の解明や、肺炎などの感染症を引き起こすマイコプラズマ感染に対する治療戦略を考案する上で有用なモデルとすることができる。
【００１７】
ところで、メンデルの法則に従い出生してくるホモ接合体非ヒト動物には、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質欠損型とその同腹の野生型とが含まれ、これらホモ接合体非ヒト動物における欠損型とその同腹の野生型を同時に用いることによって個体レベルで正確な比較実験をすることができることから、野生型の非ヒト動物、好ましくはマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドを特異的に認識するタンパク質をコードする遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物と同種の野生型非ヒト動物、さらには同腹の動物を、例えば以下に記載する本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニングに際して併用することが好ましい。
【００１８】
本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物や該モデル非ヒト動物由来のマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞は、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの作用機序の解明の他、マイコプラズマ肺炎等のマイコプラズマ感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ６に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング等に用いることができる。かかる肺炎等のマイコプラズマ感染症に対する抑制物質若しくは促進物質又はＴＬＲ６に対するアゴニスト若しくはアンタゴニストなどのマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質若しくは促進物質のスクリーニング方法を、以下に例を挙げて説明する。
【００１９】
本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の抑制物質又は促進物質のスクリーニング方法としては、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物に由来するマクロファージ、脾臓細胞、樹状細胞等の免疫細胞と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、かかる免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、かかるモデル非ヒト動物におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法等を挙げることができる。
【００２０】
上記マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物に由来する免疫細胞を用いたスクリーニング方法としては、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞と被検物質とをあらかじめインビトロで接触せしめた後、かかる免疫細胞をマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物から得られる免疫細胞とマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとをあらかじめインビトロで接触せしめた後、該免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２１】
また、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞をマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該非ヒト動物をマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにより感染させ、該非ヒト動物から得られる免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２２】
また、本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにより感染させた後、該非ヒト動物から得られる免疫細胞を被検物質の存在下で培養し、該免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにより感染させた後、該非ヒト動物に被検物質を投与し、該非ヒト動物から得られる免疫細胞におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２３】
他方、本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物と、被検物質と、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドとを用いて、かかるモデル非ヒト動物におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法としては、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物にあらかじめ被検物質を投与した後、該モデル非ヒト動物をマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにより感染させ、該モデル非ヒト動物におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法や、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチド不応答性モデル非ヒト動物をあらかじめマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドにより感染させた後、該モデル非ヒト動物に被検物質を投与し、該モデル非ヒト動物におけるマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価する方法を挙げることができる。
【００２４】
本発明においてマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答の測定・評価とは、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドと特異的に反応し、細胞内にシグナルを伝達する機能の測定・評価をいい、かかるシグナル伝達機能としては、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ等のサイトカインを産生する機能や、亜硝酸イオンを産生する機能や、細胞を増殖する機能や、細胞表面においてＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスII等の抗原を発現する機能や、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ＩＲＡＫ等のＴＬＲ９のシグナル伝達経路における分子を活性化させる機能などを具体的に例示することができるが、これらに限定されるものではない。また前記したように、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する応答を測定・評価するに際し、対照として野生型非ヒト動物、特に同腹の野生型非ヒト動物の測定値と比較・評価することが個体差によるバラツキをなくすることができるので好ましい。
【００２５】
本発明のマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドに対する反応性を特異的に欠如したモデル非ヒト動物により、ＴＬＲ６がマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの認識に特異的に関与していることが明らかとなったことから、これらのモデル非ヒト動物は、M.pneumoniaeによる原発性非定型肺炎であるヒトマイコプラズマ肺炎、M.mycoidesによるウシ肺疫、M.agalacliaeによるヒツジ・ヤギ乳房炎又はM.gallisepticumによるニワトリ呼吸器疾患等のマイコプラズマ感染症に対する治療戦略を考案する上で、非常に有用なモデル動物となることが考えられる。またＴＬＲ６のアゴニストやアンタゴニストは、上記各種マイコプラズマ感染症に対する抑制物質又は促進物質や、ＴＬＲ６活性の欠失又は異常に起因する疾病等の診断・治療に有用な物質である可能性がある。
【実施例】
【００２６】
以下に、実施例・参考例を挙げてこの発明を更に具体的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれら実施例等により限定されるものではない。
参考例（ＴＬＲ２ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）から、ヒトＴＬＲ２遺伝子と類似したマウスＥＳＴクローン（登録番号Ｄ７７６７７）由来のプローブを用いて、ＴＬＲ２遺伝子をスクリーニングし、pBluescriptベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、ＴＬＲ２遺伝子の細胞内領域を含むエクソン部位１．３ｋｂの遺伝子フラグメントを、ポリＡシグナルをもつpMC1-neo（ストラタジーン社製）に置換することにより構築した。かかるターゲッティングベクターは、４．８ｋｂの５′遺伝子フラグメントと１．０ｋｂの３′遺伝子フラグメントとをフランキング配列として有し、ＨＳＶ−ｔｋカセットを５′末端に含んでいる。このターゲッティングベクターをＳａｌＩにより線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションした。上記エレクトロポレーションしたＥＳ細胞から、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示し、かつ突然変異ＴＬＲ２対立遺伝子を含有していたものをスクリーニングし、かかるＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製し、この雄のキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６雌マウスとを交配させることによってＴＬＲ２ノックアウトマウスを作製した（Immunity 11, 443-451, 1999）。
【００２７】
実施例１（ＴＬＲ６ノックアウトマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス遺伝子ライブラリー（ストラタジーン社製）から、マウスＴＬＲ６遺伝子（登録番号ＡＢ０２０８０８）由来のプローブを用いて、ＴＬＲ６遺伝子をスクリーニングし、pBluescript II SK(+)ベクター（ストラタジーン社製）中でサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡ配列決定により特定した。ターゲッティングベクターは、マウスＴＬＲ６の細胞内領域及び膜貫通領域をコードする遺伝子部位（およそ６ｋｂ）を、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（pMC1-neo；ストラタジーン社製）に置換し、負の選択マーカーとして単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を挿入することにより構築した（図１）。このターゲッティングベクターを線状化し、胎生１４．１日目の胚幹細胞（ＥＳ細胞）にエレクトポレーションし、Ｇ４１８及びガンシクロビアに抵抗性を示す１２６個のクローンを選択し、ＰＣＲ法及びサザンブロット法により３個のクローンをスクリーニングした。
【００２８】
突然変異ＴＬＲ６対立遺伝子を含有していた３個の標的ＥＳクローンを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションしキメラマウスを作製した。この雄のキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６雌マウスと交配させ、ヘテロ接合体Ｆ１マウスを作製し、かかるヘテロ接合体Ｆ１マウスをインタークロスすることによってホモ接合体マウス（ＴＬＲ６ノックアウトマウス：TLR6-/-）を得た。なお、ホモ接合体マウスの確認は、マウスの尾から抽出した各ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩでダイジェストし、図１に示すプローブを用いるサザンブロット法により行った（図２）。本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウス（TLR6-/-）はメンデルの法則に従い作製することができ、２５週目までは顕著な異常を示
さなかった。
【００２９】
実施例２（腹腔マクロファージの調製）
野生型マウス（wild-type）、ＴＬＲ６ノックアウトマウス（TLR6-/-）及びＴＬＲ２ノックアウトマウス（TLR2-/-）のそれぞれの腹腔内に４％のチオグリコール酸培地（ＤＩＦＣＯ社製）を２ｍｌずつ注入し、３日後に各マウスの腹腔内から腹腔滲出細胞を単離し、これらの細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ社製）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ社製）中で３７℃にて２時間培養し、氷温のハンクス緩衝液（Hank's buffered salt solution：ＨＢＳＳ；ＧＩＢＣＯ社製）で洗浄することにより非付着細胞を取り除き、付着細胞を腹腔マクロファージとして以下の実験に使用した。
【００３０】
実施例３（ＴＬＲ６ノックアウトマウス由来マクロファージのＬＰＳ、スピロヘータ由来リポプロテイン、黄色ブドウ球菌由来ペプチドグリカンに対する応答性）
本発明者らは、ＴＬＲ２が細菌由来のリポプロテインやペプチドグリカンの認識に必須であり、ＴＬＲ４がＬＰＳやリポタイコ酸の認識に必須であることを、ＴＬＲ２ノックアウトマウスやＴＬＲ４ノックアウトマウスを作製することにより既に明らかにしている。そこで、ＴＬＲ６ノックアウトマウスのこれらＬＰＳ、スピロヘータ由来リポプロテイン、黄色ブドウ球菌由来ペプチドグリカンに対する応答性を調べてみた。実施例２により調製した野生型マウス及びＴＬＲ６ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ（５×１０４cells）を、１０μＭのB.burgdorferi由来リポプロテインＯｓｐＡ若しくはＯｓｐＣ、１０μＭのT. pallidum由来リポプロテイン１７−ｋＤａ（１７）若しくは４７−ｋＤａ（４７）、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、又は図３に示された各種濃度のペプチドグリカン（ＰＧＮ）といっしょに２４時間培養した。培養後、培養上清中のＴＮＦαの各濃度をＥＬＳＩＡにより測定した。この結果を図３に示す。これらの結果から、ＴＬＲ６ノックアウトマウス（TLR6-/-）由来のマクロファージは、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、１７、４７、ＬＰＳ、ＰＧＮに対して野生型マウス由来のマクロファージとほぼ同程度のＴＮＦαを産生することがわかった。
【００３１】
実施例４（ＴＬＲ６ノックアウトマウス由来マクロファージのリポペプチドに対する応答性）
野生型マウス又はＴＬＲ６ノックアウトマウス由来腹腔マクロファージのリポペプチドに対する応答性を、合成グラム陰性菌由来リポペプチドＪＢＴ３００２及び合成マイコプラズマ由来リポペプチドＭＡＬＰ−２を用いて調べた。実施例２により調製した野生型マウス及びＴＬＲ６ノックアウトマウスの腹腔マクロファージ（５×１０４cells）を、図４に示された各種濃度のＪＢＴ３００２（Dr.Z. Dongより提供された）又はＭＡＬＰ−２（Dr. P. F. Muhlradtより提供された）といっしょに２４時間培養し刺激した。培養後、培養上清中のＴＮＦ−α（ＴＮＦα）及びＮＯ２−（ＮＯ）の産生量を測定した（図４）。なお、ＮＯ２−はＮＯ２／ＮＯ３アッセイキット（同仁科学研究所社製）を使用し、Ｇｒｅｉｓｓ法により測定した。
【００３２】
上記の結果から、野生型マウス由来腹腔マクロファージ（wild-type）は、グラム陰性菌由来リポペプチドＪＢＴ３００２やマイコプラズマ由来リポペプチドＭＡＬＰ−２の投与量に応じてＴＮＦ−α（ＴＮＦα）及びＮＯ２−（ＮＯ）の産生量を増加しているのに対して、ＴＬＲ６ノックアウトマウス由来腹腔マクロファージ（TLR6-/-）は、グラム陰性菌由来リポペプチドＪＢＴ３００２の投与量に応じてＴＮＦ−αやＮＯ２−の産生を、野生型マウス由来腹腔マクロファージのものと同様に増加していたが、マイコプラズマ由来リポペプチドＭＡＬＰ−２においてはいかなる濃度においてもＴＮＦ−αやＮＯ２−を産生していなかった（図４）。以上のことから、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドがＴＬＲ６を介してマクロファージを活性化することがわかった。
【００３３】
実施例５（ＴＬＲ６を介した細胞内シグナル伝達経路の活性化）
ＴＬＲのシグナルは、アダプター分子であるＭｙＤ８８を介してセリン／トレオニンキナーゼであるＩＲＡＫを活性化し、次いでＭＡＰキナーゼ及びＮＦ−κＢを活性化することが知られている（Immunity 11, 115-122, 1999）。また、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドが、ＴＬＲ２及びＭｙＤ８８シグナル伝達経路を介して生体反応を引き起こしていることも知られている（J. Immunol. 164, 554-557, 2000）。そこで野生型マウス、ＴＬＲ６ノックアウトマウス及びＴＬＲ２ノックアウトマウスを用いて細菌由来のリポタンパク／リポペプチドが細胞内シグナル伝達分子を活性化するかどうかを調べてみた。実施例２により調製した野生型マウス（wild-type）、ＴＬＲ６ノックアウトマウス（TLR6-/-）及びＴＬＲ２ノックアウトマウス（TLR2-/-）の腹腔マクロファージ（１×１０６cells）を、０．１ｎｇ／ｍｌのＪＢＴ３００２又は０．３ｎｇ／ｍｌのＭＡＬＰ−２で２０分間又は４０分間刺激し、各マウスのマクロファージから核蛋白質を抽出し、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合部位を含む特異的プローブといっしょにインキュベートし、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーにより視覚化した（図５）。
【００３４】
この結果から、野生型マウス由来マクロファージではＭＡＬＰ−２やＪＢＴ３００２の刺激に対してＮＦ−κＢの活性化が認められた。ＴＬＲ６ノックアウトマウス由来マクロファージではＭＡＬＰ−２に対する活性化は認められなかったが、ＪＢＴ３００２に対する活性化は認められた。また、ＴＬＲ２ノックアウトマウス由来マクロファージではＭＡＬＰ−２及びＪＢＴ３００２に対する活性化は認められなかった。これらのことから、ＴＬＲ６はマイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの認識に特異的に関与していることが明らかになった。また、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドの認識にはＴＬＲ２及びＴＬＲ６の両方が必要であり、これら２つの分子がヘテロダイマーを形成し、マイコプラズマ由来リポタンパク／リポペプチドシグナルを伝えていると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウスと野生型マウスの遺伝子地図を示す図である。
【図２】本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウスのサザンブロット分析の結果を示す図である。
【図３】本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるリポプロテイン、ＬＰＳ又はＰＧＮ刺激によるＴＮＦα産生の結果を示す図である。
【図４】本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるリポペプチド刺激によるＴＮＦ−α又はＮＯ２−の産生を示す図である。
【図５】本発明のＴＬＲ６ノックアウトマウス及び野生型マウスにおけるリポペプチド刺激によるＮＦ−κＢの活性化の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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