(57)【要約】【課題】  これまで量産が困難であったMEL-Cを効率良く生産できる微生物を提供すること、および該微生物を用いてMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを効率良く生産する方法を提供すること。【解決手段】  配列番号１に示す塩基配列と95％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有し、かつ、MEL-C高生産能を有するシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物、および該微生物を油脂類含有培地にて培養し、培養物中からMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示す塩基配列と95％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有し、かつ、下記式(I)で表されるMEL-C高生産能を有するシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物。
【化１】
2008079600.tif 000007
（式(I)中、Acはアセチル基、ｎは１〜１６の整数を表す。)
【請求項２】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物を油脂類含有培地にて培養し、培養物中から下記式(I)で表されるMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【化２】
2008079600.tif 000008
（式(I)中、Acはアセチル基、ｎは１〜１６の整数を表す。)
【請求項５】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、請求項１〜３のいずれかに記載の微生物である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株である、請求項４に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項４から７のいずれかに記載の方法により得られる、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド。
【請求項９】
請求項８に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを含有するリオトピック液晶性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオサーファクタントの一種であるマンノシルエリスリトールリピッドの中でも、特に量産が困難であったMEL-Cを効率よく生産できる微生物、およびその微生物を用いたMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質は、脂質に１〜数十個の単糖が結合した物質であり、生体内において細胞間の情報伝達に関与し、神経系及び免疫系の機能維持にも重要な役割を果たしていることなどが明らかにされつつある。また、糖脂質は、糖の性質に由来する親水性と脂質の性質に由来する親油性の二つの性質を合わせ持つ両親媒性物質であり、このような性質を有する両親媒性物質は界面活性物質と呼ばれている。石油化学工業が隆盛となるまでは、レシチン、サポニン等の生体成分由来の界面活性剤（バイオサーファクタント）が利用されていた。近年、石油化学工業の発展により合成界面活性剤が開発され、その生産量が飛躍的に増加し、日常生活には無くてはならない物質となっている。現在、一般に用いられている合成界面活性剤の種類は、細かな構造の違いまで考慮すると、数千種類にものぼる。親水基・疎水基の種類が異なるものから、それぞれのドメインの組成が同じでも分子量や立体構造の違いによって親水性疎水性バランス（HLB）の異なる同族体など、あらゆる化合物が開発されており、これらを単一種類で用いるだけでなく、混合して用いることで、幅広い産業分野において要求される性能に対応している。しかしながら、このような合成界面活性剤の使用量の拡大に伴って環境汚染が広がり、社会問題が生じている。従って、安全性が高く、環境に対する負荷を低減できる生分解性の高い界面活性剤の開発が望まれている。
【０００３】
微生物などが生産する界面活性物質であるバイオサーファクントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。このことから、食品、化粧品、医薬品、化学工業、環境分野等にこれらのバイオサーファクタントを幅広く応用することは、環境調和型の社会を実現し、高機能な製品を提供する上で極めて有意義である。微生物が生産する界面活性物質は、糖脂質系、アシルペプタイド系、リン脂質系、脂肪酸系及び高分子系の界面活性物質の５つに分類されている。なかでも、糖脂質系の界面活性物質については最もよく研究されており、酵母が生産する糖脂質系の界面活性物質としてカンジダ属酵母によるソホロースリピッド（特許文献１参照）やマンノシルエリスリトールリピッド（下記非特許文献１から６参照）などが知られている。
【０００４】
マンノシルエリスリトールリピッド（mannosyl erythritol lipid:MEL）は、界面活性能以外にも抗微生物活性、白血病細胞、神経系細胞などの細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など多様な機能が知られている。MELの生産はこれまで酵母を中心に多くの報告があり、生産量向上を目的として菌株の選択、培養条件、培地組成が検討されている。酵母によるMEL生産に関する報告としては、たとえば、Candida sp. B-7株を用いて５質量％の大豆油から５日間で３５ｇ/Ｌ（生産速度：０．３ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：７０質量%）のMELを生産した例（非特許文献１及び２参照）、Candia antarctica T-34株を用いて８質量％の大豆油から８日間で３８ｇ/Ｌ（生産速度：０．２ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：４８質量％）のMELを生産した例（非特許文献３及び４参照）、Candia antarctica T-34株を用いて６日間隔で計３回の逐次流加により２４日後に２５質量％のピーナッツ油から１１０ｇ/Ｌ（生産速度：０．２ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：４４質量％）のMELを生産した例（非特許文献５参照）、Candida sp. SY-16株を用いて１０質量％の植物油脂から回分培養法により２００時間で５０ｇ/Ｌ（生産速度：０．２５ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：５０質量％）のMELを生産し、また、２０質量％の植物油から流加培養法により２００時間で１２０ｇ/Ｌ（生産速度：０．６ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：５０質量％）のMELを生産した例（非特許文献６参照）、Pseudozyma aphidis株を用いて８０質量％の植物油脂から流加培養法により２４時間で１３．９ｇ/Ｌ（生産速度：０．５７ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：９２質量％）のMELを生産した例（非特許文献７参照）などがある。また、醤油醸造工程において副産物として生産されるしょうゆ油を原料としてCandia antarctica T-34株を用いて７日間で８質量％のしょうゆ油から17g/L（生産速度：０．１ｇ/Ｌ/ｈ、原料収率：２１質量％）のMELの生産が可能であることも報告されている（特許文献２参照）。
【０００５】
MELはマンノースにエリスリトールと２個の脂肪酸と２個のアセチル基が結合した糖脂質であり、アセチル基の結合位置と数によって、４種類のMEL（MEL-A、-B、-C、-D）が存在することが知られている。上記のように、MEL生産については多くの微生物菌株と培養技術が検討されているが、これまで量産可能なタイプは、MEL-A と MEL-B だけである。MEL-CとMEL-Dはより水溶性が高く、MEL-AやMEL-B とは異なる性質と用途を持つことが予想されているが、量産できないために、これまで全く実用化の見通しが立っていなかった。従って、MEL-C や MEL-D を量産できれば、マンノシルエリスリトールリピッドのバリエーションの拡充と実用化に大きく貢献できる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−４５１９５公報
【特許文献２】特開２００２−１０１８４７号公報
【非特許文献１】T. Nakahara，H. Kawasaki, T. Sugisawa, Y. Takamori and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 19 (1983）
【非特許文献２】H. Kawasaki, T. Nakahara, M. Oogaki and T. Tabuchi：J. Ferment. Technol., 61, 143（1983)
【非特許文献３】D. Kitamoto, S. Akiba, C. Hioki and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 31 (1990)
【非特許文献４】D. Kitamoto, K. Haneishi, T. Nakahara and T. Tabuchi：Agric. Biol. Chem., 54, 37 (1990）
【非特許文献５】D. Kitamoto, K. Fujishiro, H. Yanagishita, T. Nakane and T.Nakahara：Biotechnol. Lett., 14, 305 (1992)
【非特許文献６】金，伊炳大，桂樹徹，谷吉樹：平成１０年日本生物工学会大会要旨，p.195
【非特許文献７】Rau U, Nguyen LA, Roeper H, Koch H, Lang S.: Appl Microbiol Biotechnol., 68(5),607-13 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、マンノシルエリスリトールリピッドの中でも量産が困難であったMEL-Cを効率良く生産できる微生物を提供すること、および該微生物を用いてMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを効率良く生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、シュードザイマ属に属する微生物の中に、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを効率良く生産する能力を有する微生物を見出した。また、当該MEL-Cの液晶形成能を調べると、短時間で極めて容易にリオトロピック液晶、特にラメラ液晶の形成が可能であり、化粧品および医薬品素材として高い潜在能力を有することを見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（1)  配列番号１に示す塩基配列と95％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有し、かつ、下記式(I)で表されるMEL-C高生産能を有するシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物。
【００１０】
【化１】
2008079600.tif 000002
（式（I)中、Acはアセチル基、ｎは１〜１６の整数を表す。)
(2)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）である、(1)に記載の微生物。
(3)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)である、(1)または(2)に記載の微生物。
(4)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物を油脂類含有培地にて培養し、培養物中から下記式(I)で表されるMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを採取することを特徴とする、マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法。
【００１１】
【化２】
2008079600.tif 000003
（式(I)中、Acはアセチル基、ｎは１〜１６の整数を表す。)
【００１２】
(5)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、(1)〜(3)のいずれかに記載の微生物である、(4)に記載の製造方法。
(6)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）である、(4)に記載の製造方法。
(7)  シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物が、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株である、(4)に記載の製造方法。
(8)  (4)から(7)のいずれかに記載の方法により得られる、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド。
(9)  (8)に記載のマンノシルエリスリトールリピッドを含有するリオトピック液晶性組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを効率良く生産する能力を有する微生物が提供される。従って、この微生物を植物油脂等の油脂類含有培地で培養することにより、これまで量産が困難であったMEL-Cを効率よく生産することができる。MEL-CはMEL-AやMEL-Bより水溶性が高く、より応用範囲が広いことが予想されており、マンノシルエリスリトールリピッドの新たな用途開拓ならびに構造・機能的バリエーションの拡充に貢献できる。本発明により得られたMEL-C は、水性媒体に容易に水和し、ラメラ液晶などの各種のリオトロピック液晶を形成できる。また、得られた液晶は糖骨格に起因する水素結合のネットワークにより、極めて安定性も良く、温度変化に対して強固であるから、化粧品や医薬品の安定化剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．MEL-C高生産能を有する微生物
本発明の微生物は、配列番号１に示す塩基配列と95％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有し、かつ、MEL-C高生産能を有するシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物である。
【００１５】
このような微生物の例としては、本発明者らが、沖縄で採取した植物（葉）サンプルから分離したKM-59株を挙げることができる。本菌株は、ＹＭ寒天培地上にて２５℃２日間培養で、直径が２〜３ｍｍ程度のコロニーを形成する（形：円形、隆起状態：半レンズ状、周縁：波状、表面の形状：スムーズ、透明度：半透明、粘ちょう度：粘ちょう性）。また、子嚢胞子の形成は認められない。
【００１６】
KM-59株は、リボソームRNA遺伝子の塩基配列（rDNA配列）を決定し、DNAデータベース(DDBJ)にアクセスし、FASTAプログラム (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域から5.8S 領域までの塩基配列と100％一致した。また、DNAデータベース上より入手したシュードザイマ（Pseudozyma）属および代表的な酵母種のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域から5.8S 領域までの塩基配列を多重整列後、NJ法により分子系統解析を行った結果、本菌株の分子系統樹の位置はシュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）と一致した（図１）。KM-59株は、マンノシルエリスリトールリピッド生産菌ではあるが、MEL-Cを量産できる点においてシュードザイマ属に属する既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産菌とは異なる新菌株と判断されたため、本菌株をシュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株と命名した。本菌株は、平成18（2006）年8月11日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-20987として寄託されている。
【００１７】
本発明の微生物には、上記のKM-59株のほか、その類縁微生物も含まれる。KM-59株の類縁微生物としては、例えば、配列番号１の塩基配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有し、かつ、MEL-C高生産能を有する微生物をいう。ここで、MEL-Cは、下記式(I)で表される構造を有するマンノシルエリスリトールリピッドである。
【００１８】
【化３】
2008079600.tif 000004
（式（I)中、Acはアセチル基、ｎは１〜１６の整数を表す。)
【００１９】
また、「MEL-C高生産能」とは、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを効率良く生産する能力をいい、「主成分とする」とは、生産されるマンノシルエリスリトールリピッド全量に対してMEL-Cの占める割合がMEL-A、MEL-Bなどの他のマンノシルエリスリトールリピッドに比べて有意に高いことをいう。
【００２０】
KM-59株の類縁微生物は、上記MEL-C高生産能と配列番号１に記載の塩基配列を指標として単離することができる。自然界から採取したサンプル（例えば、土壌、河川・湖沼の水、樹液、花、葉、果実など）を、油脂類含有培地にて２６〜３０℃にて３〜７日間培養し、培養液をGC/MS分析してMEL-C生産が認められたサンプルを選抜する（一次スクリーニング）。次に、選抜したサンプルの培養液をプレート上で培養し、コロニーを形成させて微生物を単離し、さらに単離した微生物を油脂類含有培地にて培養で培養し、GC/MS分析してMEL-C生産が認められた微生物を選択し（二次スクリーニング）、この微生物菌株のリボソームRNA遺伝子の塩基配列について、DDBJ のFASTAプログラム (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）の塩基配列データベースに対して相同性検索を行う。
【００２１】
上記のスクリーニングに用いる培地としては、例えば、８０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地が挙げられる。
【００２２】
２．マンノシルエリスリトールリピッドの製造方法
本発明のマンノシルエリスリトールリピッドの製造方法には、シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物を用いることができる。シュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物としては、MEL-C高生産能を有するものであれば特に制限はないが、例えば、配列番号１に示す塩基配列と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上相同な塩基配列を含むリボソームRNA遺伝子を有するシュードザイマ（Pseudozyma）属に属する微生物；シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）；シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）などが挙げられる。特に、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株（FERM P-20987)、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株が好ましい。
【００２３】
上記のような微生物を油脂類含有培地にて培養することにより培養物中に前記式(I)で表されるMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを製造することができる。
【００２４】
また、製造されるマンノシルエリスリトールリピッドは、下式（II)で表される。
【００２５】
【化４】
2008079600.tif 000005
【００２６】
上記式（II）において、Ｒ１〜Ｒ５は、互いに同一であっても異なっていてもよく、水素原子、アセチル基、又は炭素原子数１〜１８、好ましくは３〜１２の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
【００２７】
上記式（II）で表されるマンノシルエリスリトールリピッドには、主成分であるMEL-Cのほか、例えば、MEL-A（式（II)中、Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ３とＲ4がアセチル基、Ｒ５が水素原子である化合物）、MEL-B（式（II）中、Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ4がアセチル基、Ｒ３とＲ５が水素原子である化合物）、MEL-D（式（II）中、Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ３とＲ4とＲ５が水素原子である化合物）、トリアシル型MEL（式（II）中、Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ３とＲ4が水素原子またはアセチル基、Ｒ５が炭素原子数１〜１８の脂肪酸残基である化合物）、モノアシル型MEL（式（II）中、Ｒ１とＲ２のいずれか一方が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基で、いずれか一方が水素原子、Ｒ３とＲ4とＲ５が水素原子またはアセチル基である化合物）などが含まれる。
【００２８】
上記培養に用いる培地には、油脂類を添加する以外については特に制限はなく、酵母に対して一般に用いられる培地、たとえば、ＹＰＤ培地（イーストエキストラクト１０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、及びグルコース２０ｇ）を使用することができる。培地中の油脂類の含有量としては、４〜１０質量％が好ましい。油脂類は培養開始時にその全量を添加しても、培養中に連続的または間欠的に添加してもよい。
【００２９】
油脂類としては、植物油脂又は動物油脂等のいずれでもよく、目的に応じて適宜選定することができる。植物油脂としては、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ごま油、オリーブ油、バーム油等が挙げられ、これらの中でも、大豆油が好ましい。動物油脂としては、牛脂、豚脂、魚脂等が挙げられる。これらは、１種を単独で又は２種以上を適宜混合して用いてもよい。
【００３０】
培地に添加する油脂類以外の他の成分としては、当該技術分野で通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要な栄養源等が用いられる。炭素源としては、該微生物が資化し得るものであればよく、炭水化物（グルコース、マンノース、グリセロール、マンニトール等の単糖、ショ糖、麦芽糖、乳糖等のオリゴ糖、デンプン等）、有機酸（酢酸、プロピオン酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸等）、アルコール類（エタノール、プロパノール等）が用いられる。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、又はペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、コーンスチープリカー等の含窒素化合物が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
【００３１】
培養温度は、２０〜３０℃、好ましくは２６〜３０℃である。培養日数としては、MEL-C生産量に応じて適宜設定すればよいが、３〜２０日間が好ましい。培養方法としては、振盪培養、通気撹拌培養等の公知の一般的な微生物の培養方法を適用することができる。良好な微生物の生育及びマンノシルマンニトールリピッドの生産のためには、培養液に酸素を供給することが好ましく、そのためには、ジャーファメンターを用いる場合では、空気を通気しながら撹拌するか、振とう培養を行えばよい。
【００３２】
本発明において、前記シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株またはシュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株を用いてMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドを生産する場合、増殖能の高い菌株を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりのマンノシルエリスリトールリピッド生産量が高くなるため、まず前培養によって菌体を活性化させ、これを本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。例えば、種培養、本培養及びマンノシルエリスリトールリピッド生産培養の順にスケールアップしていくことが好ましい。これらの培養における、具体的な培地組成、培養条件を例示すると以下のとおりである。
【００３３】
グルコース５〜２０ｇ／Ｌ，酵母エキス０．１〜２ｇ／Ｌ，硝酸ナトリウム０．１〜５ｇ／Ｌ，リン酸２水素カリウム０．１〜２ｇ／Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に、保存菌株を１白金耳接種し、２６〜３０℃で１〜３日振とう培養を行う（種培養）。次に、２０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは４０〜１００ｇ／Ｌの植物油脂等の油脂類を加えた上記と同じ組成の液体培地５０〜１００ｍＬの入った坂口フラスコに上記の種培養を行った培養液を接種して、２６〜３０℃で１〜７日間振とう培養を行う(本培養）。さらに、上記の本培養と同じ組成の液体培地１〜２Ｌが入ったジャーファメンターに上記の本培養を行った培養液を接種して、２６〜３０℃で１〜２Ｌ／分の通気速度と６００〜１０００ｒｐｍの撹拌速度で培養する(マンノシルエリスリトールリピッド生産培養)。このときの培養温度は２６〜３０℃、培養時間は、３〜２０日間である。この培養においては、培養途中から油脂類を培養容器中に流下させて、培地中の油脂類濃度を５０〜２００ｇ／Ｌに保持することが好ましい。
【００３４】
微生物菌株の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地１Ｌあたり、１０〜２００ｍl、好ましくは５０〜１００ｍlの種培養液あるいは本培養液中に含まれる量であればよい。
【００３５】
本発明における培養は、培養液中の所望のMEL-C生成量が最高に達した時点で終了させることができるように、培養液中のMEL-Cをガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の周知の方法により測定しながら行うことが好ましい。
【００３６】
培養液中に蓄積されたマンノシルエリスリトールリピッドは、培養終了後、培養液を抽出することによって取得できる。抽出は、酢酸エチル等の有機溶媒を用いて行う。抽出は当該分野において通常行われる方法に従って行えばよく、例えば、培養液１Ｌあたり０．５〜１．５Ｌ程度の有機溶媒を用いて１〜数回抽出操作を行い、酢酸エチル層を合わせて溶媒を留去する。
【００３７】
酢酸エタノール抽出物に含まれるマンノシルエリスリトールリピッドから、MEL-Cを分画するには、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによる分離精製を行う。酢酸エタノール抽出物をシリカゲルカラムに供し、クロロホルムとアセトンを溶出液として用い、当該抽出物中の成分を分離精製する。クロロホルムのみを流した後、クロロホルムとアセトンの混合液で当該抽出物中の成分を溶出する。この時、クロロホルムとアセトンの混合液中におけるアセトンの割合は、段階的に上げていく。例えば、９：１から始め、次に、８：２あるいは７：３としていく。各溶出液は収集し、TLCにて精製度を確認する。
【００３８】
上記培養において、微生物の形態は、特に限定されず、微生物の菌体、菌体処理物（例えば、菌体破砕物）などをいう。
【００３９】
微生物の菌体または菌体処理物は固定化して用いることもできる。固定化法としては、従来公知の担体結合法、架橋化法、包括法などの方法が挙げられる。担体結合法では、担体に菌体を固定化させるが、固定化は物理的吸着、イオン結合、共有結合のいずれであってもよい。担体としては多糖（アセチルセルロース、アガロース）、無機物質（多孔質ガラス、金属酸化物）、合成高分子（ポリアクリルアミド、ポリスチレン）等が用いられる。架橋化法では、グルタルアルデヒド等の二官能性試薬を用いて菌体同士を架橋、結合させることによって固定化する。また、包括法では、多糖（アルギン酸、カラギーナン）、ポリアクリルアミド、コラーゲン、ポリウレタン等の高分子ゲルの格子や半透膜カプセルに菌体を包み込むことによって固定化する。
【００４０】
３．MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドの用途
上記の方法により得られたMEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッド、及びMEL-Cは、温度範囲が室温から７０℃まで、濃度範囲が0.0001%から90%までの幅広い条件下でリオトロピック液晶を形成することが可能である。リオトロピック液晶は、高濃度の水溶性成分と油溶性成分の双方を内包安定化できるという性質を有している。従って、当該マンノシルエリスリトールリピッドは、医薬品、化粧品、食品等の種々の組成物に含有させることにより、その界面活性作用により主成分の分散性、製品の酸化安定性向上をはかることができる。化粧品の形態は特に限定はされないが、たとえばクリームやクレンジングジェル及び乳液等が挙げられる。また、医薬品の形態も特に限定はされないが、クリーム状の外用剤や分散安定化した注射剤などが挙げられる。
【００４１】
また前記のとおり、マンノシルエリスリトールリピッドは界面活性能以外にも抗微生物活性、細胞分化誘導活性、糖タンパク質結合活性、抗炎症・抗アレルギー活性、アポトーシス誘導活性、癌細胞増殖抑制活性など種々の生理活性作用を有する。従って、MEL-Cを主成分とするマンノシルエリスリトールリピッドは、公知の種々の方法にて各種製剤形態に調製し、それ自体を有効成分とする医薬（例えば、抗癌剤など）として用いることができる。各種製剤は、製剤上通常用いられる賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等などを適宜選択し、常法により製造することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）KM-59株の単離と同定
沖縄で採取した植物（葉）サンプルから分離したKM-59株のリボソームRNA遺伝子の塩基配列（rDNA配列）による相同性検索を以下のようにして行った。ゲノムの抽出には、GenTLE (TaKaRa社製)を使用し、操作はTaKaRa社のプロトコールに従った。抽出したゲノムDNAを鋳型とし、リボゾームRNA遺伝子 (rDNA)に特異的なプライマーＡ（5’-gcatcgatgaagaacgcagc-3’:配列番号２）及びプライマーＢ（5’-tcctccgcttattgatatgc-3’:配列番号３）を用いて、PCRによりITS-1領域から5.8S 領域までの塩基配列を増幅した。その後、増幅された前記領域の塩基配列を決定した。決定した塩基配列を配列番号１に示す。得られたrDNA配列について、DNAデータベース(DDBJ)にアクセスし、FASTAプログラム (http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/fasta-j.html）を用いて相同性検索を行ったところ、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）の対応する前記領域のrDNA配列と100％一致した。また、DNAデータベース上より入手したシュードザイマ（Pseudozyma）属および代表的な酵母種のリボソームRNA遺伝子のITS-1領域から5.8S 領域までの塩基配列を多重整列後、NJ法により分子系統解析を行った結果、本菌株の分子系統樹の位置はシュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）と一致した（図１）。従って、KM-59株は、は、シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）に分類された。KM-59株は、平成18（2006）年8月11日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IPOD）（茨城県つくば市東１−１−３）に受託番号FERM P-20987として寄託されている。
【００４３】
（実施例２）本発明微生物菌株によるマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）の生産
(1) シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株の培養
(a) 種培養
保存培地（麦芽エキス３ｇ/Ｌ、酵母エキス３ｇ/Ｌ、ペプトン５ｇ/Ｌ、グルコース１０ｇ/Ｌ、寒天３０ｇ/Ｌ）に保存しておいた上記のシュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株(以下、「KM-59株」という）を、グルコース２０ｇ/Ｌ、酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地４ｍＬが入った試験管に１白金耳接種し２６℃で振とう培養を１日間行った。
(b) 本培養
(a)で得られた菌体培養液を、８０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地２０ｍＬが入った坂口フラスコに接種し、振とう培養を２６℃にて７日間行った。
【００４４】
(2) KM-59株のマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）生産能の確認
上記(1)の培養終了後の培養液を採取し、これを用いてKM-59株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィー（TLC)で確認した（図２、レーンＡ）。マンノシルエリスリトールリピッドの標準として、Pseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた（図２、レーンＳ）。なお、薄層クロマトグラフィーは、Silica gel 60F（Wako社製）を用い、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：７N アンモニア＝６５:１５:２とした。検出は、展開後のプレートにアンスロン試薬を吹き付け、１１０℃で５分間加熱した。
【００４５】
なお、図２のマンノシルエリスリトールリピッド標準において、MEL-Aは前記式（II)中、Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ３とＲ4がアセチル基、Ｒ５が水素原子である化合物、MEL-Bは同式中Ｒ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ4がアセチル基、Ｒ３とＲ５が水素原子である化合物、MEL-CはＲ１とＲ２が炭素原子数１〜１６の脂肪酸残基、Ｒ３がアセチル基、Ｒ4とＲ５が水素原子である化合物である。
【００４６】
図２に示すように、両株ともマンノシルエリスリトールリピッドを生産したが、マンノシルエリスリトールリピッドの標準（図２、レーンＳ）と対比して、KM-59株が主に生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドの中でもMEL-Cであることが確認できた（図２、レーンＡ）。
【００４７】
（実施例３）本発明微生物菌株によるトリアシル型およびモノアシル型マンノシルエリスリトールリピッドの生産
実施例２と同様にして種培養を行ったKM-59株の培養液を、Yeast Nitrogen base ６．７ｇ/Ｌ、大豆油８０ｇ/Ｌの組成の液体培地（培地Ａ）、または８０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌ（培地Ｂ）を用い、実施例２と同様にして本培養を行った。
【００４８】
培養終了後の培養液を採取し、これを用いてKM-59株のバイオサーファクタントの生産性を薄層クロマトグラフィー(TLC)で確認した[図３、レーンＡ（培地Ａによる培養液）、レーンＢ（培地Ｂによる培養液）]。マンノシルエリスリトールリピッドの標準として、Pseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品（図３、レーンＳ）、トリアシル型およびモノアシル型マンノシルエリスリトールリピッドの精製標品（図３、レーンＳ１およびＳ２）を用いた。図３に示すように、培地Ａで培養した場合に、KM-59株はモノアシル型マンノシルエリスリトールリピッドを生産しており、培地Ｂで培養した場合、KM-59株はトリアシル型マンノシルエリスリトールリピッドを生産していることが確認できた。
【００４９】
（実施例４）本発明微生物菌株により生産されるマンノシルエリスリトールリピッドの構造解析
(1) 精製標品の高速液体クロマトグラフィーによる分析
実施例２と同様にしてKM-59株の培養を行い、培養終了後の培養液を採取し、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル可溶分中のMELを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で検出した（図４、右のパネル）。また、比較例として既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産酵母であるPseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィー（HPLC)で検出した（図４、左のパネル）。高速液体クロマトグラフィー（HPLC)は、DP-8020（TOSOH社製）を用いた。カラムは、Inertsil SIL 100A 5μm, 4.6×250 mm（GL science 社製）を用い、クロロホルムとメタノールを 100:0 から 0:100 のグラジエントをかけて１ｍＬ/ｍｉｎの流速で流した。
【００５０】
図４に示すように、KM-59株のMEL生産パターンは、JCM 10317株のMEL生産パターンとは異なり、KM-59株のMEL生産パターンのメインピークは、JCM 10317株のMEL-Cと一致した。KM-59株は、高いMEL-C生産能を有し、一週間で約１３ｇ/ＬのMEL-Cを生産した。
【００５１】
(2) 精製標品のNMRによる構造解析
上記の培養液の酢酸エチル可溶分から、主成分であるMEL-Cをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製分離した後、１H と 13C NMRによる構造解析を行った。結果を下記表１に示す。また、典型的なMELの構造解析結果の例としてPseudozyma antarctica JCM 10317株が生産するMELの分析結果も表１に示す。表１によれば、KM-59株が生産する物質は典型的なMEL-Cの構造を有することが確認できた。
【００５２】
【表１】
2008079600.tif 000006
【００５３】
（実施例５）マンノシルエリスリトールリピッドの大量生産（ジャー培養）
実施例２と同様にしてKM-59株の培養を行った後、得られた菌体培養液を、８０ｇ/Ｌの大豆油と酵母エキス１ｇ/Ｌ、硝酸ナトリウム１ｇ/Ｌ、リン酸２水素カリウム０．５ｇ/Ｌ、及び硫酸マグネシウム０．５ｇ/Ｌの組成の液体培地１．４Ｌが入ったジャーファメンターに接種して、２６℃で８００rpmの撹拌速度でさらに培養を７日間行った。この培養においては、培養途中から大豆油を培養容器中に流下させて、培地中の大豆油濃度を５０〜２００ｇ/Ｌに保持した。
【００５４】
培養終了後、培養液を採取し、培養液中のMELを酢酸エチルで抽出し、その重量を測定した結果、MELの生産量は１４ｇ（１０ｇ/Ｌに相当する）であった。さらにMEL-C を精製分離した後、得られたMEL-Cの重量は２．８ｇであった。
【００５５】
（実施例６）マンノシルエリスリトールリピッドの液晶形成能
（1）MEL-C精製標品の液晶形成能
実施例４にて精製分離したMEL-Cのリオトロピック液晶形成能を進入法にて観察した。まず、スライドガラス上に上記MEL-Cを塗布してカバーガラスでシールし、カバーガラス中に水を進入させ、偏光顕微鏡（ニコン社製のECLIPSE E600）観察した（図５）。図５より明らかなように、非常に幅広い濃度領域において光学的異方相、すなわちリオトロピック液晶が観察された。
【００５６】
（2）MEL混合物の液晶形成能
未精製のMEL-A, -B, -C 混合物（MEL 混合物）のリオトロピック液晶形成能を上記と同様にして観察した（図６）。図６より明らかなように、MEL-Cを主成分とするMEL混合物は、MEL-Bを主成分とするMEL混合物に比べ、非常に幅広い濃度領域において光学的異方相、すなわちリオトロピック液晶が観察された。KM-59株が生産するMEL-A, -B, -C 混合物の主成分は図２に示されるようにMEL-Cであるが、その優れたリオトロピック液晶形成能は未精製の状態でも十分発揮できることがわかった。
【００５７】
（実施例７）シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）によるマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）の生産
(1) シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株の培養
シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株を、前記実施例２と同様にして種培養、本培養を行った。
【００５８】
(2) CBS 10092株のマンノシルエリスリトールリピッド（MEL）生産能の確認
上記(1)の培養終了後の培養液を採取し、これを用いてCBS 10092株のバイオサーファクタントの生産性を、薄層クロマトグラフィー（TLC)で確認した（図７、レーンＡ）。マンノシルエリスリトールリピッドの標準として、Pseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、原料油脂等の不純物を取り除いた精製標品を用いた（図７、レーンＳ）。なお、薄層クロマトグラフィー（TLC)は、実施例２の記載に従って実施した。
【００５９】
図７に示すように、両株ともマンノシルエリスリトールリピッドを生産したが、マンノシルエリスリトールリピッドの標準（図７、レーンＳ）と対比して、CBS 10092株が主に生産しているバイオサーファクタントはマンノシルエリスリトールリピッドの中でもMEL-Cであることが確認できた（図７、レーンＡ）。
【００６０】
（実施例８）シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）により生産されるマンノシルエリスリトールリピッドの構造解析
(1) 精製標品の高速液体クロマトグラフィーによる分析
実施例２と同様にしてシュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）
CBS 10092株の培養を行い、培養終了後の培養液を採取し、酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル可溶分中のMELを、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で検出した（図８、右のパネル）。また、比較例として既知のマンノシルエリスリトールリピッド生産酵母であるPseudozyma antarctica JCM 10317株を上記と同じ条件で培養し、同様にして高速液体クロマトグラフィー（HPLC)で検出した（図８、左のパネル）。なお、高速液体クロマトグラフィー（HPLC)は、実施例４の記載に従って実施した。
【００６１】
図８に示すように、CBS 10092株のMEL生産パターンは、JCM 10317株のMEL生産パターンとは異なり、CBS 10092株のMEL生産パターンのメインピークは、JCM 10317株のMEL-Cと一致した。CBS 10092株は、高いMEL-C生産能を有し、一週間で約13g/LのMEL-Cを生産した。
【００６２】
(2) 精製標品のNMRによる構造解析
上記の培養液の酢酸エチル可溶分から、主成分であるMEL-Cをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製分離した後、１H と 13C NMRによる構造解析を行った。その分析結果は、前記表１と同じであり、シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株もまた、生産する物質は典型的なMEL-Cの構造を有することが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】Pseudozyma 属酵母の分子系統樹を示す。
【図２】シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株の培養液の薄層クロマトグラフィーによる分析結果を示す（レーンＳ：JCM 10317株培養液、レーンＡ：KM-59株培養液）。
【図３】シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株の培養液の薄層クロマトグラフィーによる分析結果を示す(レーンＳ：JCM 10317株培養液、レーンＳ１：トリアシル型マンノシルエリスリトールリピッド精製標品、レーンＳ２：モノアシル型マンノシルエリスリトールリピッド精製標品、レーンＡ：培地ＡによるKM-59株培養液、レーンＢ：培地ＢによるKM-59株培養液)。
【図４】シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株の培養液の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示す。
【図５】シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株により生産されるMEL-Cのリオトロピック液晶形成を示す偏光顕微鏡写真である。
【図６】シュードザイマ・ヒュベイエンシス（Pseudozyma hubeiensis）KM-59株により生産されるマンノシルエリスリトールリピッド混合物（MEL-A, -B,-Cの混合物）のリオトロピック液晶形成を示す偏光顕微鏡写真である（上のパネル：MEL混合物（MEL-Cが主成分）、下のパネル：MEL混合物（MEL-Bが主成分））。
【図７】シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株の培養液の薄層クロマトグラフィーによる分析結果を示す（レーンＳ：JCM 10317株培養液、レーンＡ：シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株培養液）。
【図８】シュードザイマ・グラミニコーラ（Pseudozyma graminicola）CBS 10092株の培養液の高速液体クロマトグラフィーによる分析結果を示す。
【図１】
2008079600.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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