(57)【要約】【課題】L-アミノ酸を効率よく生産する。【解決手段】L-アミノ酸生産能を有し、tonB遺伝子、fepA遺伝子、fecA遺伝子から選ばれる1種類以上の遺伝子の発現を増強することなどによって鉄トランスポーターの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物を培養することによってL-アミノ酸を生産する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ鉄トランスポーターの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物であって、tonBシステムに関与するtonB遺伝子、fepA遺伝子、およびfecA遺伝子からなる群より選ばれる一種以上の遺伝子の発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする微生物。
【請求項２】
tonB遺伝子、fepA遺伝子、およびfecA遺伝子からなる群より選ばれる一種以上の遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、鉄のトランスポーター活性が増強された、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
tonB遺伝子が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
fepA遺伝子が、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項５】
fecA遺伝子が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１０において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項６】
前記tonB遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、請求項１または２に記載の微生物：
（ａ）配列番号1に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を制御する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記fepA遺伝子が、下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のＤＮＡである、請求項１または２に記載の微生物：
（ｃ）配列番号3に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記fecA遺伝子が、下記（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡである、請求項１または２に記載の微生物：
（ｅ）配列番号９に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である
請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌から選択される微生物である請求項１〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
【請求項１２】
前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、請求項１１に記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法、特にL−リジン、L-スレオニン、L-グルタミン酸等のL-アミノ酸の製造法に関する。Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、アミノ酸輸液等として、Ｌ−グルタミン酸は調味料として、産業上有用なＬ−アミノ酸である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属等に属する微生物を用いた発酵法により工業生産されている。例えば、Ｌ−リジンの製造法としては、例えば、特許文献１〜８に記載された方法を挙げることができる。一方、これらの製造法においては、自然界から分離された菌株または該菌株の人工変異株、さらには、組換えDNA技術によりＬ−アミノ酸生合成酵素の活性が増強するように改変された微生物などが用いられている。
【０００３】
Ｌ−アミノ酸の生産能を向上させる方法として、Ｌ−アミノ酸の取り込み系、又は排出系を改変する方法が知られている。Ｌ−アミノ酸の排出系を強化する方法としては、例えばL-リジン、Ｌ−アルギニン排出遺伝子(LysE)の発現を強化したコリネバクテリウム属微生物の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（例えば、特許文献９参照）又はＬ−アルギニンの製造法（例えば、特許文献１０参照）が知られている。また、Ｌ−アミノ酸の排出に関与することが示唆されている遺伝子である、ｒｈｔＡ，Ｂ，Ｃ遺伝子（例えば、特許文献１１参照）又はｙｆｉＫ、ｙａｈＮ遺伝子等（例えば、特許文献１２参照）、ybjE遺伝子（特許文献１３）、yhfK遺伝子（特許文献１４）の発現を強化した腸内細菌科に属する微生物を用いたＬ−アミノ酸の製造法も報告されている。
【０００４】
また、発酵の基質となる糖の取り込み遺伝子の発現を強化することによってアミノ酸生産能が向上することが知られている。例えば、ptsG遺伝子の発現を強化したエシェリヒア属細菌を用いたL-アミノ酸の製造法（特許文献１５）やptsH、ptsI、crr遺伝子の発現を強化したエシェリヒア属細菌を用いたL-アミノ酸の製造法（特許文献１６）が知られている。
【０００５】
fepA遺伝子、fecA遺伝子は、鉄のトランスポーターとして知られる膜タンパク質をコードする遺伝子であり、tonB遺伝子はこれらの鉄トランスポーターの活性を制御するタンパク質をコードする遺伝子である（非特許文献１−４参照）。しかしながら、これらの遺伝子産物の活性を増強させることがＬ−アミノ酸生産に効果があることは、全く知られていなかった。
【特許文献１】欧州特許0643135号公報
【特許文献２】欧州特許0733712号公報
【特許文献３】欧州特許出願公開1477565号公報
【特許文献４】欧州特許出願公開0796912号公報
【特許文献５】欧州特許出願公開0837134号公報
【特許文献６】国際公開01/53459号パンフレット
【特許文献７】欧州特許出願公開1170376号公報
【特許文献８】国際公開2005/010175号パンフレット)
【特許文献９】国際公開第９７／２３５９７号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開２００３−０１１３８９９号明細書
【特許文献１１】特開２０００−１８９１７７号公報
【特許文献１２】欧州特許出願公開１０１６７１０号明細書
【特許文献１３】国際公開2005/073390号パンフレット
【特許文献１４】国際公開2005/085419号パンフレット
【特許文献１５】国際公開０３／０４６７０号パンフレット
【特許文献１６】国際公開０３／０４６７４号明細書
【非特許文献１】J Bacteriol. 1990;172(5):2736-46
【非特許文献２】J.Bacteriol, 2003, vol.185, No. 6, p1870-1885
【非特許文献３】Mol Microbiol. 2005;58(5):1226-1237
【非特許文献４】J.Bacteriol 2001, vol.183, No. 20, p5885-5895
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を効率よく生産することのできる菌株を提供すること、及び該菌株を用いてＬ−アミノ酸を効率よく生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を行った。その結果、tonBシステムに関与する遺伝子をそれぞれＬ−アミノ酸生産菌において増幅することで、Ｌ−アミノ酸生産性が向上する事を見出した。さらに、tonBシステムに関与する遺伝子を用いて改変した微生物を用いることにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつ鉄トランスポーターの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物であって、tonBシステムに関与するtonB遺伝子、fepA遺伝子、およびfecA遺伝子からなる群より選ばれる一種以上の遺伝子の発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする微生物。
（２）tonB遺伝子、fepA遺伝子、およびfecA遺伝子からなる群より選ばれる一種以上の遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することにより、鉄のトランスポーター活性が増強された、（１）の微生物。
（３）tonB遺伝子が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号２において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）または（２）の微生物。
（４）fepA遺伝子が、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号４において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）または（２）の微生物。
（５）fecA遺伝子が、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、または配列番号１０において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、（１）または（２）の微生物。
（６）前記tonB遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである、（１）または（２）の微生物：
（ａ）配列番号1に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列番号1に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を制御する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）前記fepA遺伝子が、下記（ｃ）又は（ｄ）に記載のＤＮＡである、（１）または（２）の微生物：
（ｃ）配列番号3に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｄ）配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（８）前記fecA遺伝子が、下記（ｅ）又は（ｆ）に記載のＤＮＡである、（１）または（２）の微生物：
（ｅ）配列番号９に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｆ）配列番号９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、鉄トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（９）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である（１）〜（８）のいずれかの微生物。
（１０）前記腸内細菌科に属する微生物が、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌から選択される微生物である（１）〜（９）のいずれかの微生物。（１１）（１）〜（１０）のいずれかの微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造法。
（１２）前記Ｌ−アミノ酸がＬ−リジン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-バリン、L-ロイシン、L-スレオニン、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-システイン、L-グルタミン酸から選択される一種または二種以上のＬ−アミノ酸である、（１１）の製造法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の微生物を用いることにより、効率よく、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリンなどの塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシンなどの脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリンなどのヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリンなどの環式アミノ酸、L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニンなどの含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能し、かつ鉄トランスポーターの活性が増強するように改変された腸内細菌科に属する微生物であって、tonBシステムに関与する遺伝子の発現量が上昇するように改変されたことを特徴とする微生物である。ここで、Ｌ−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にＬ−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。
【００１２】
L-アミノ酸の種類は特に制限されないが、L-リジン、L-オルニチン、L-アルギニン、L-ヒスチジン、L−シトルリン等の塩基性アミノ酸、L-イソロイシン、L-アラニン、L-バリン、L-ロイシン、L-グリシン等の脂肪族アミノ酸、L-スレオニン、L-セリン等のヒドロキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸、L-プロリン等の環式アミノ酸、L-フェニルアラ
ニン、L-チロシン、L-トリプトファン等の芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニン等の含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギン等の酸性アミノ酸が挙げられる。本発明の微生物は２種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
【００１３】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸生産能の付与
以下に、Ｌ−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明の微生物を得るために使用することのできるＬ−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、Ｌ−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。
本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物を用いることができる。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター（Enterobacter）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。
【００１４】
エシェリヒア属細菌としては、ナイトハルトらの著書（（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に挙げられるもの、例えばエシェリヒア・コリ等が利用できる。エシェリヒア・コリの野生株としては、例えばK12株又はその誘導体、エシェリヒア・コリ MG1655株（ATCC No.47076）、及びW3110株（ATCC No.27325）等が挙げられる。これらを入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所  P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United Statesof America ）。
【００１５】
また、エンテロバクター属細菌としては、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、エンテロバクター・アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)等、パントエア属細菌としてはパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）が挙げられる。尚、近年、エンテロバクター・アグロメランスは、１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列解析などにより、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）又はパントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）等に再分類されているものがある。本発明においては、腸内細菌科に分類されるものであれば、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれに属するものであってもよい。パントエア・アナナティスを遺伝子工学的手法を用いて育種する場合には、パントエア・アナナティスＡＪ１３３５５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１４）、ＡＪ１３３５６株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６６１５）、ＡＪ１３６０１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２０７）及びそれらの誘導体などを用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
【００１６】
以下、上述したような親株にＬ−アミノ酸生産能を付与する方法について述べる。
Ｌ−アミノ酸生産能を付与するには、栄養要求性変異株、アナログ耐性株又は代謝制御変異株の取得や、Ｌ−アミノ酸の生合成系酵素の発現が増強された組換え株の創製等、従来、エシェリヒア属細菌等の育種に採用されてきた方法を適用することができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年５月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。ここで、Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独でもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、発現が
増強されるＬ−アミノ酸生合成系酵素も、単独であっても、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。
【００１７】
Ｌ−アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸のアナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理、すなわちＸ線や紫外線の照射、またはＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）、エチルメタンスルフォネート（EMS）等の変異剤処理などによって処理し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、かつＬ−アミノ酸生産能を有するものを選択することによって得ることができる。
【００１８】
Ｌ−リジンアナログとしては、例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ノルロイシン等を使用することができる。また、Ｌ−アルギニンアナログとしては、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、カナバニン等を使用することができる。
【００１９】
Ｌ−リジン生産能を有するＬ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許第4346170号参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000−189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。WC196株は、エシェリヒア・コリK-12由来のW3110株にＡＥＣ(Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン)耐性を付与することによって育種されたものである。同株は、エシェリヒア・コリAJ13069株と命名され、平成６年１２月６日付で工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号FERM P-14690として寄託され、平成７年９月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている。
【００２０】
Ｌ−アミノ酸生産能の付与は、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素遺伝子の発現を増強するによっても行うことができる。
例えば、以下のようにして、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ遺伝子の発現を増強することによってＬ−リジン生産能を付与することができる。すなわち、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、Ｌ−リジンの製造に用いる宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これで宿主を形質転換する。形質転換により宿主細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
【００２１】
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子としては、宿主微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる遺伝子であれば、特に限定されないが、例えば、エシェリヒア・コリ、メチロフィラス・メチロトロファス、コリネバクテリウム・グルタミカムなどの遺伝子が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297(1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、エシェリヒア・コリ K-12等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳
型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。以下、エシェリヒア・コリ由来のdapA及びlysCを例として説明するが、DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子は、これらに限定されるものではない。
【００２２】
エシェリヒア・コリ由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA及びlysCを用いる場合、これらの遺伝子は、コードするDDPS及びAKがＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。なお、コリネバクテリウム属微生物由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないこともあり、本発明に用いるDDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。
【００２３】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型DDPSをコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するDDPSをコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型AKIIIをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
上記のようなL-リジン生合成遺伝子の発現増強は、後述のtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子と同様に、プラスミドなどを用いた形質転換や相同組換えなどの方法によって達成することができる。
【００２４】
なお、変異型DDPSをコードする変異型dapA及び変異型AKIIIをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００２５】
Ｌ−リジン生産能の付与は、DDPS、AK以外の、Ｌ−リジン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより行ってもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（dapB：以下カッコ内は遺伝子名）(国際公開01/53459号パンフレット)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ddh）（以上、国際公開96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(pepC)（特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素(asd)（国際公開00/61723号パンフレット）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺伝子（dapD）、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ（dapE）等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。なお、括弧内に、各酵素の遺伝子発現が増強されたＬ−リジン生産株に関する文献を示した。これらの酵素の遺伝子発現増強は、DDPS、AK遺伝子発現増強と組み合わせてもよい。
【００２６】
また、本発明では、Ｌ−リジン固有の生合成系酵素をコードするする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、TCAサイクル、ペントースリン酸サイクル、補充経路の各
酵素、エネルギー代謝に関与する遺伝子を目的遺伝子として発現増強させてもよい。また、各アミノ酸に対する耐性を付与する遺伝子やアミノ酸排出遺伝子を目的遺伝子として増強させてもよいし、各副生物の取り込み遺伝子を目的遺伝子として増強させてもよい。これらの遺伝子の増強は、L-アミノ酸全般に有効である。
【００２７】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュークロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュークロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）、PTSグルコース取り込み遺伝子（ptsG、ptsH,ptsI,crr; 国際公開第03/04670号、第03/04674号パンフレット、欧州特許出願公開第1254957号）、ガラクトース プロトン シンポーター遺伝子（galP；米国出願公開2004-214294号）、D-キシロースパーミアーゼ遺伝子（xylE；国際公開第2006/043730号パンフレット）、マルトース輸送に関与する遺伝子（malK）が挙げられる。
【００２８】
TCAサイクルの酵素としては、クエン酸シンターゼ遺伝子（gltA;国際公開第03/008607号パンフレット）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（icd; 国際公開第03/008607号パンフレット）、２−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（sucAB; 国際公開第03/008614号パンフレット）、スクシネートデヒドロゲナーゼ遺伝子（sdh; 国際公開第01/02544号パンフレット）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（gdh；国際公開第00/53726号パンフレット）が挙げられる。
【００２９】
ペントースリン酸サイクルの酵素としては、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（zwf; 国際公開第03/008607号パンフレット）、リボース５リン酸イソメラーゼ遺伝子（rpiB；国際公開第03/008607号パンフレット）が挙げられる。
【００３０】
補充経路とは、anaplerotic pathwaysとよばれる経路で、補充経路の酵素としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC;米国特許5,876,983号明細書）、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc;欧州出願公開1092776号明細書）、マレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（mdh;国際公開第01/02546号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA;WO04/090125）などが挙げられる。
【００３１】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochromoe bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。また、各種アミノ酸への耐性を付与する遺伝子として、rhtB遺伝子（米国特許6,887,691号明細書）、rhtC遺伝子(欧州特許出願公開1013765号明細書)、yedA遺伝子(欧州特許出願公開EP1449917号明細書)、yddG遺伝子(欧州特許出願公開1449918号明細書)、ygaZH遺伝子（欧州特許出願公開1239041号明細書）、yahN,yfiK,yeaS遺伝子（欧州特許出願公開1016710号明細書）、rhtA遺伝子（Res Microbiol. 2003 Mar;154(2):123-35.）、ybjE遺伝子(国際公開2005/073390号パンフレット)が挙げられる。
【００３２】
さらに、本発明の微生物は、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損していてもよい。このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ、マリックエン
ザイムがあり、該酵素の活性が低下又は欠損した株は国際公開95/23864号、国際公開96/17930号、国際公開2006/038695、国際公開2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、例えば、後述の実施例２に記載の方法に従って行うことができる。
cadA遺伝子としては、配列番号１７の塩基配列を有するDNA（エシェリヒア・コリ由来のcadA遺伝子）、または配列番号１７の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
ldcC遺伝子遺伝子としては、配列番号１１の塩基配列を有するDNA（エシェリヒア・コリ由来のldcC遺伝子）、または配列番号１１の塩基配列の相補配列もしくはこの相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつリジンデカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNAが挙げられる。
なお、「ストリンジェントな条件」については後述するとおりである。
【００３３】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法によって、染色体上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。例えば、遺伝子組換えによって、染色体上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、染色体上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分を欠失させることによっても達成出来る（Journal of biological Chemistry 272:8611-8617（1997）。また、コード領域が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子で染色体上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００３４】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する微生物に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）と組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖上ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（Datsenko, K.A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000); 米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００３５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。
【００３６】
以下、L-リジン以外のL-アミノ酸生産能が付与されたL-アミノ酸生産菌について例示する。
【００３７】
Ｌ−スレオニン生産菌
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００３９】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、L-スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)に、受託番号VKPM B-5318で寄託されている。
【００４０】
好ましくは、本発明に用いる細菌は、さらに、下記の遺伝子の１種以上の発現が増大するように改変されたものである。
−スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子
−スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子
−推定トランスメンブランタンパク質をコードするrhtA遺伝子
−アスパルテート−β−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするasd遺伝子
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子
【００４１】
Escherichia coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913
.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００４２】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されている。
【００４３】
rhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651,
GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th
International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology,
San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００４４】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００４５】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００４６】
Ｌ−システイン生産菌
Ｌ−システイン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、フィードバック阻害耐性のセリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysEアレルで形質転換されたE. coli JM15(米国特許第6,218,168号、ロシア特許出願第2003121601号)、細胞に毒性の物質を排出するのに適したタンパク質をコードする過剰発現遺伝子を有するE. coli W3110 (米国特許第5,972,663号)、システインデスルフォヒドラーゼ活性が低下したE. coli株 (JP11155571A2)、cysB遺伝子によりコードされる正のシステインレギュロンの転写制御因子の活性が上昇したE. coli W3110 (WO0127307A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
Ｌ−ロイシン生産菌
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明に用いる細菌は、L-ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大さ
れることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはL-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００４９】
Ｌ−ヒスチジン生産菌
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
L-ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォリボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾールカルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００５１】
hisG及びhisBHAFIにコードされるL-ヒスチジン生合成系酵素はL-ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、L-ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
L-ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、L-ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE.coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli
80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００５２】
Ｌ−グルタミン酸生産菌
Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC遺伝子及びilvA遺伝子に変異を有するL-イソロイシン及びL-スレオニン要求性株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型アレルは、野生型E. coli K12株 (VKPM B-7)の細胞で増殖したバクテリオファージP1を用いる一般的形質導入法により導入された。この結果、L-イソロイシン要求性のL-グルタミン酸生産菌VL334thrC+ (VKPM B-8961) が得られた。
【００５３】
L-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L-グルタミン酸生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株が挙げられるが、これらに限定されない。かかる遺伝子の例としては、グルタメートデヒドロゲナーゼ（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタメートシンテターゼ(gltAB)、イソシトレートデヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、シトレートシンターゼ(g
ltA)、フォスフォエノールピルベートカルボシラーゼ(ppc)、ピルベートデヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ピルベートキナーゼ(pykA, pykF)、フォスフォエノールピルベートシンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、フォスフォグリセロムターゼ(pgmA, pgmI)、フォスフォグリセレートキナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド-3-フォスフェートデヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースフォスフェートイソメラーゼ(tpiA)、フルクトースビスフォスフェートアルドラーゼ(fbp)、フォスフォフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースフォスフェートイソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。
【００５４】
シトレートシンテターゼ遺伝子、フォスフォエノールピルベートカルボキシラーゼ遺伝子、及び／またはグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株の例としては、EP1078989A、EP955368A及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。
【００５５】
L-グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性が低下または欠損している株も挙げられる。このような酵素の例としては、イソシトレートリアーゼ(aceA)、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ(sucA)、フォスフォトランスアセチラーゼ(pta)、アセテートキナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセトラクテートシンターゼ(ilvI)、フォルメートアセチルトランスフェラーゼ(pfl)、ラクテートデヒドロゲナーゼ(ldh)、グルタメートデカルボキシラーゼ(gadAB)などが挙げられる。α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したエシェリヒア属に属する細菌、及び、それらの取得方法は米国特許第5,378,616 号及び第5,573,945号に記載されている。
【００５６】
具体例としては下記のものが挙げられる。
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００５７】
E. coli W3110sucA::Kmr は、E. coli W3110のα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、「sucA遺伝子」ともいう）を破壊することにより得られた株である。この株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを完全に欠損している。
【００５８】
L-グルタミン酸生産菌の他の例としては、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性を有するものが挙げられる。これらの株は、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼを欠損していてもよく、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5.908,768号)、さらにL-グルタミン酸分解能が低下したFFRM P-12379(米国特許第5,393,671号); AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)などが挙げられる。
【００５９】
L-グルタミン酸生産菌の例としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損した、または、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が低下したパントエア属に属する細菌が挙げられ、上記のようにして得ることができる。このような株としては、Pantoea ananatis AJ13356(米国特許第6,331,419号)がある。Pantoea ananatis AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破壊によりα-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ活性が欠損している。この株は、単離された時には、Enterobacter agglomera
nsと同定され、Enterobacter agglomerans AJ13356として寄託された。しかし、16S rRNAの塩基配列などに基づき、Pantoea ananatisに再分類された。AJ13356は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書では、Pantoea ananatisとして記載する。
【００６０】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E.coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)、変異型pheA34遺伝子を保持するE.coli HW1089
(ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E.coli MWEC101-b (KR8903681)、E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、親株として、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６１】
Ｌ−トリプトファン生産菌
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するL-トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６２】
L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選ばれる酵素の活性の一種以上が増大した株も挙げられる。アントラニレートシンターゼ及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除されたフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げられる。
【００６３】
L-トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝子の発現を増大させることによりL-トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニット
からなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を増大させることによりL-トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６４】
Ｌ−プロリン生産菌
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvA遺伝子が欠損し、L-プロリンを生産できるE. coli 702ilvA (VKPM B-8012) (EP 1172433)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
本発明に用いる細菌は、L-プロリン生合成に関与する遺伝子の一種以上の発現を増大することにより改良してもよい。L-プロリン生産菌に好ましい遺伝子の例としては、L-プロリンによるフィードバック阻害が解除されたグルタメートキナーゼをコードするproB遺伝子(ドイツ特許第3127361号)が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からL-アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の一種以上の発現が増大することにより改良してもよい。このような遺伝子としては、b2682 遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が挙げられる。
【００６６】
L-プロリン生産能を有するエシェリヒア属に属する細菌の例としては、NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (英国特許第2075056号)、VKPM B-8012 (ロシア特許出願2000124295)、ドイツ特許第3127361号に記載のプラスミド変異体、Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34)に記載のプラスミド変異体などのE. coli 株が挙げられる。
【００６７】
Ｌ−アルギニン生産菌
Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 237株 (VKPM B-7925) (米国特許出願公開2002/058315 A1)、及び、変異N-アセチルグルタメートシンターゼを保持するその誘導株(ロシア特許出願第2001112869号)、E. coli 382株 (VKPM B-7926) (EP1170358A1)、N-アセチルグルタメートシンテターゼをコードするargA遺伝子が導入されたアルギニン生産株(EP1170361A1)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
L-アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、L-アルギニン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、N-アセチルグルタミルフォスフェートレダクターゼ遺伝子(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(argJ)、N-アセチルグルタメートキナーゼ遺伝子(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ遺伝子(argD)、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子(argF)、アルギノコハク酸シンテターゼ遺伝子(argG)、アルギノコハク酸リアーゼ遺伝子(argH)、カルバモイルフォスフェートシンテターゼ遺伝子(carAB)が挙げられる。
【００６９】
Ｌ−バリン生産菌
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるL-バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
L-バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow
117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００７０】
Ｌ−イソロイシン生産菌
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【００７１】
＜１−２＞鉄トランスポーター活性の増強
本発明の微生物は、上述したようなＬ−アミノ酸の生産能を有する微生物を、 鉄トランスポーター活性を増強するように改変することによって得ることができる。ただし、鉄トランスポーター活性を増強するように改変を行った後に、Ｌ−アミノ酸の生産能を付与してもよい。なお、鉄トランスポーター活性の増強は、後述するように、tonBシステムに関与する遺伝子の発現量が上昇するように改変することによって達成でき、これらの発現量の増強はプロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性遺伝子の発現増強であってもよいし、遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
【００７２】
ここで、鉄トランスポーターとは、鉄を細胞内に取りこむ機能を有する膜タンパク質を意味し、「鉄トランスポーターの活性が上昇するように改変された」とは、野生株、または非改変株に対して細胞あたりの鉄トランスポーターの分子の数が増大した場合や、鉄トランスポーターの分子当たりの活性が向上した場合が該当する。鉄トランスポーターの活性は野生株又は非改変株と比較して、菌体当たり150%以上、好ましくは200％以上、さらに望ましくは菌体当たり300％以上に向上するように改変されていることが好ましい。ここで、対照となる野生株の腸内細菌科に属する微生物としては、エシェリヒア・コリMG1655株（ATCCNo.47076）、及びW3110株（ATCCNo.27325）、パントエア・アナナティスAJ13335株（FERM BP-6615）などが挙げられる。鉄を細胞内に取り込む活性は、ラベル化されたFe3+の取り込みを測定することにより測定できる。（J.Bacteriol,May.2003 p1870-1885）
【００７３】
鉄トランスポーター活性の増強は、tonBシステムに関与する遺伝子の発現を増強させるように改変することによって達成できる。tonBシステムに関与する遺伝子の発現が親株、例えば野生株や非改変株と比べて向上していることの確認は、mRNAの量を野生型、あるいは非改変株と比較することによって確認出来る。発現量の確認方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCRが挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。発現量については、野生株あるいは非改変株と比較して、上昇していればいずれでもよいが、例えば野生株、非改変株と比べて１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上上昇していることが望ましい。また、tonBシステムに関与する遺伝子の発現量の増強は、目的とするタンパク質量が非改変株、野生株と比較して上昇していることによっても確認することができ、例えば抗体を用いてウェスタンブロットによって検出することが出来る。（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press,Cold spring Harbor(USA),2001））。
【００７４】
tonBシステムに関与する遺伝子としては、例えば、tonB遺伝子、fepA遺伝子、fecA遺伝子、あるいはそのホモログが挙げられる。tonBシステムとは、膜タンパク質TonBの介在により鉄を取り込むシステムで、TonBは、鉄のトランスポーターであるFepA,FecAに電子を伝達することによってこれらのトランスポーターの活性を制御する。（J.Bacteriol Oct 2001 vol.183, No. 20, p5885-5895）ここで、エシェリヒア・コリの遺伝子としては、例えば、配列番号１のtonB遺伝子(GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号1309113..1309832)、配列番号3のfepA遺伝子(GenBank Accession No.NC_000913の塩基番号609477..611717の相補鎖)、配列番号９のfecA遺伝子（GenBank Accession No.NC_000913.2: 4512376..4514700の相補鎖）が挙げられる。
【００７５】
さらに、上記遺伝子のホモログは、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、エシェリヒア属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものであってもよく、例えばtonB遺伝子の場合、配列番号５、６、fepA遺伝子の場合、配列番号７、８に示される合成オリゴヌクレオチドを用いて増幅出来るものであってもよい。
【００７６】
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin および AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やPearsonによるFASTA(MethodsEnzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００７７】
tonBシステムに関与する遺伝子のホモログとは、他の微生物由来または天然もしくは人工の変異型遺伝子で、エシェリヒア・コリのtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子からなる群より選択される遺伝子と構造が高い類似性を示し、宿主に導入あるいは増幅した際に鉄トランスポーター活性を向上させる機能を有する遺伝子を意味する。tonBシステムに関与する遺伝子（tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子）のホモログは、それぞれ配列番号２，４, または１０のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有し、かつ、鉄トランスポーター活性制御因子（tonB）または鉄トランスポーター（fepA,fecA）としての機能を有するタンパク質をコードするものを意味する。なお、鉄トランスポーター活性制御因子または鉄トランスポーターとしての機能を有することは、これらの遺伝子を宿主細胞で発現させ、膜を介した鉄の輸送を調べることによって確認することができる（例えば、上記非特許文献１〜４参照）。また、ホモログであることは対応する野生型遺伝子の破壊株を作製し、破壊株に導入したときに野生型遺伝子の機能を相補しうるか、例えば、遺伝子破壊により低下した鉄の取り込みが回復するかどうかを調べることによって確かめることができる。
【００７８】
また、本発明に用いるtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子は、野生型遺伝子には限られず、コードされるTonBタンパク質, FepAタンパク質、FecAタンパク質の機能、すなわち鉄トランスポーター活性制御因子（TonB）または鉄トランスポーター（FepA,FecA）としての機能が損なわれない限り、配列番号２、４、または１０のアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１または数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記置換は保存的置換が好ましく、保存的変異とは、置換部位が芳香族ア
ミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換としては、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７９】
またtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子は、それぞれ配列番号１、３、または９の塩基配列に相補的な塩基配列又は該配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、鉄トランスポーター活性制御因子（tonB）または鉄トランスポーター（fepA,fecA）としての機能を有するタンパク質をコードするDNAであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳさらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００８０】
上記tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子の発現を増強するための改変は、例えば、遺伝子組換え技術を利用して、細胞中のこれらの遺伝子のコピー数を高めることによって行うことができる。例えば、これらの遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組換えDNAを作製し、これを微生物に導入して形質転換すればよい。
【００８１】
tonB遺伝子,fepA遺伝子としてエシェリヒア・コリのtonB遺伝子,fepA遺伝子を用いる場合、それぞれ配列番号１，３の塩基配列に基づいて作製したプライマー、例えば、配列番号５，６、または７，８に示すプライマーを用いて、エシェリヒア・コリの染色体DNAを鋳型とするPCR法（PCR：polymerase chain reaction； White,T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)参照）によって、tonB遺伝子,fepA遺伝子を取得することができる。他の微生物のtonB遺伝子,fepA遺伝子も、それぞれその微生物において公知のtonB遺伝子,fepA遺伝子もしくは他種の微生物のtonB遺伝子,fepA遺伝子又はTonB, FepAタンパク質の配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ法、又は、前記配列情報に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼーション法によって、微生物の染色体ＤＮＡ又は染色体ＤＮＡライブラリーから、取得することができる。なお、染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である微生物から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製するこ
とができる。
fecA遺伝子も同様にして取得することができる。
【００８２】
次に、PCR法により増幅されたtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子を、宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターDNAに接続して組換えDNAを調製する。宿主微生物の細胞内において機能することのできるベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを挙げることができる。
【００８３】
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,（pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可）, RSF1010（Gene vol.75 (2), p271-288, 1989）, pBR322, pMW219、pMW119（pMWはニッポンジーン社より入手可）、pSTV28、pSTV29（宝バイオ社製）等が挙げられる。他にもファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００８４】
これらの遺伝子を上記ベクターに連結して組み換えＤＮＡを調製するには、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子を含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition",
Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００８５】
上記のように調製した組換えDNAを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。また、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M.and Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Young,F.E., Gene, 1, 153 (1977)）を使用することもできる。
【００８６】
一方、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子のコピー数を高めることは、これらの遺伝子を微生物の染色体DNA上に多コピー存在させることによっても達成できる。微生物の染色体DNA上にこれらの遺伝子を多コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペティティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーテッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。染色体上にこれらの遺伝子が転移したことの確認は、これらの遺伝子の一部をプローブとして、サザンハイブリダイゼーションを行うことによって確認出来る。
【００８７】
さらに、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子の発現の増強は、上記した遺伝子コピー数の増幅以外に、国際公開00/18935号パンフレットに記載されたようにして、染色体DNA上またはプラスミド上のこれらの遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することや、これらの遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅、これらの遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成される。例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、trcプロモーター、tacプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター
等が強力なプロモーターとして知られている（国際公開98/004715号パンフレット）。
また、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である（EP1033407号明細書）。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128）等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がｍＲＮＡの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。これらのプロモーター置換または改変によりtonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子の発現が強化される。
【００８８】
さらに、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強するために、鉄輸送系の活性が上昇するような変異をこれらの遺伝子に導入してもよい。鉄輸送系の活性が上昇するような変異としては、tonB遺伝子,fepA遺伝子,fecA遺伝子の転写量が増大するようなプロモーター配列の変異、及び、TonBタンパク質, FepAタンパク質、FecAタンパク質の比活性が高くなるようなこれらの遺伝子のコード領域内の変異が挙げられる。また、これらの遺伝子の発現を正に制御する活性を高めるような変異を導入してもよい。
【００８９】
＜２＞Ｌ−アミノ酸の製造法
本発明のＬ−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、Ｌ−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ−アミノ酸を回収することを特徴とする製造法である。
【００９０】
使用する培地は、微生物を用いたＬ−アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００９１】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【００９２】
また、塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５〜９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２〜９．０となるように制御し、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御する、あるいは又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給して、培地中の重炭酸イオン及び／または炭酸イオンが少なくとも２ｇ／Ｌ以上存在する培養
期があるようにし、前期重炭酸イオン及び／または炭酸イオンを塩基性アミノ酸を主とするカチオンのカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい。（特開2002-065287号公報、国際公開2006/038695号パンフレット参照）
【００９３】
［実施例］
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHまたはHClで調整した。
【００９４】
(L培地)
バクト・トリプトン（ディフコ社製）10g/L
酵母エキス（ディフコ社製）         5g/L
塩化ナトリウム                    10g/L
pH7.0
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
【００９５】
［L寒天培地］
L培地
バクトアガー 15g/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
【００９６】
［エシェリヒア属細菌  L-リジン生産培地］
グルコース                      40g/L
硫酸アンモニウム                24g/L 
リン酸２水素カリウム            1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩        1.0g/L
硫酸鉄・７水塩                  0.01g/L
硫酸マンガン・７水塩            0.01g/L
酵母エキス                      2.0g/L
局方炭酸カルシウム              50g/L（別殺菌）
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分間上記滅菌を行った。
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
局方炭酸カルシウムは別に180℃で感熱滅菌した。
抗生物質として、クロラムフェニコール25 mg/Lまたはアンピシリン100mg/Lを添加した。
【００９７】
［エシェリヒア属細菌  L-Thr生産培地］
グルコース                      40g/L
硫酸アンモニウム                16g/L 
リン酸２水素カリウム            1.0g/L
硫酸マグネシウム・７水塩        1.0g/L
硫酸鉄４・７水塩                0.01g/L
硫酸マンガン４・７水塩          0.01g/L
局方炭酸カルシウム              30g/L（別殺菌）
水酸化カリウムでpH7.5に調整し、115℃で10分間上記滅菌を行った。
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
局方炭酸カルシウムは別に１８０℃で乾熱滅菌した。
抗生物質として、ストレプトマイシン100 mg/Lとアンピシリン100 mg/Lを添加した。
【実施例１】
【００９８】
＜１＞  tonB遺伝子、fepA遺伝子増幅用プラスミドの構築
tonB遺伝子、fepA遺伝子の単独でのL-リジン生産に寄与する増幅効果を確認する為に、各遺伝子を単独で増幅するためのベクターを構築した。エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)の染色体の全塩基配列は既に明らかにされており（Science, 277, 1453-1474 (1997)）、この文献に報告されているtonB遺伝子(GenBank Accession No. NC_000913の塩基番号1309113〜1309832：配列番号２)、fepA遺伝子の塩基配列(NCBI Accession No.NC_000913の塩基番号609477〜611717の相補鎖：配列番号４)に基づき、各遺伝子を増幅するプライマーを設計した。配列番号５〜８（tonB：配列番号5,6；fepA：配列番号7,8）に各遺伝子を増幅するプライマーを示す。これらのプライマーを用いてエシェリヒア・コリ MG1655株の染色体ＤＮＡを鋳型としてPCRを行った。染色体DNAはBacterial Genomic DNA purifiation kit（Edge Bio Systems）を用いて取得した。PCRにはpyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）を用い、96℃ 20秒、65℃ 20秒、72℃ 2分の反応を25サイクル行った。
精製したtonB遺伝子とfepA遺伝子をそれぞれ、SmaIで消化したベクターpSTV28（タカラバイオ社製）とpMW119(日本ジーン社製)に連結して、tonB増幅用プラスミドpStonB、fepA増幅用プラスミドpSfepAを構築した。
【実施例２】
【００９９】
＜２＞エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのtonB、fepA増幅の効果
＜２−１＞リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA,ldcC遺伝子破壊株の構築リジンデカルボキシラーゼ非産生株の構築を行った。リジンデカルボキシラーゼは、cadA遺伝子（Genbank Accession No. NP_418555. 配列番号17）、ldcC遺伝子（Genbank Accession No. NP_414728. 配列番号11）によってコードされている（国際公開WO96/17930号パンフレット参照）。ここで親株は、WC196株を用いた。
【０１００】
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA、ldcC遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH， Gumport RI， Gardner JF.）によって行った。「Red-driven integration」方法によれば、目的とする遺伝子の一部を合成オリゴヌクレオチドの5'側に、抗生物質耐性遺伝子の一部を３'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することができる。さらにλファージ由来の切り出しシステムを組合わせることにより、遺伝子破壊株に組み込んだ抗生物質耐性遺伝子を除去することが出来る（特開2005-058227）。
【０１０１】
（１）cadA遺伝子の破壊
PCRの鋳型としてPCRの鋳型として、プラスミドpMW118-attＬ−Cm-attR（特開2005-058827）を使用した。pMW118-attＬ−Cm-attRは、pMW118(宝バイオ社製)にλファージのアタッチメントサイトであるattL及びattR遺伝子と抗生物質耐性遺伝子であるcat遺伝子を挿入したプラスミドであり、attＬ−cat-attRの順で挿入されている
【０１０２】
このattLとattRの両端に対応する配列をプライマーの3'末端に、目的遺伝子であるcadA遺伝子の一部に対応するプライマーの5'末端に有する配列番号13及び14に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてＰＣＲを行った。
【０１０３】
増幅したPCR産物をアガロースゲルで精製し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むエシェリヒア・コリWC196株にエレクトロポレーションにより導入した。プラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2000， vol. 97， No. 12， p6640-6645）
は、アラビノース誘導性ParaBプロモーターに制御されるλRed相同組換えシステムのRed レコンビナーゼをコードする遺伝子（γ、β、exo遺伝子）を含むλファージの合計2154塩基のDNAフラグメント（GenBank/EMBL アクセッション番号 J02459、 第31088番目〜33241番目）を含む。プラスミドpKD46はPCR産物をWC196株の染色体に組み込むために必要である。
【０１０４】
エレクトロポレーション用のコンピテントセルは次のようにして調製した。すなわち、100mg／Lのアンピシリンを含んだLB培地中で３０℃、一晩培養したエシェリヒア・コリWC196株を、アンピシリン（20mg/L）とＬ−アラビノース（1mM）を含んだ5mLのSOB培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））で100倍希釈した。得られた希釈物を３０℃で通気しながらＯＤ600が約０．６になるまで生育させた後、100倍に濃縮し、10%グリセロールで３回洗浄することによってエレクトロポレーションに使用できるようにした。エレクトロポレーションは７０μＬのコンピテントセルと約１００ｎｇのＰＣＲ産物を用いて行った。エレクトロポレーション後のセルは１ｍＬのＳＯＣ培地（モレキュラークローニング：実験室マニュアル第２版、Sambrook， J.ら，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989年））を加えて３７℃で２．５時間培養した後、３７℃でＣｍ（クロラムフェニコール）(25mg/L)を含むＬ−寒天培地上で平板培養し、Ｃｍ耐性組換え体を選択した。次に、pKD46プラスミドを除去するために、Ｃｍを含むＬ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性を試験し、pKD46が脱落しているアンピシリン感受性株を取得した。
【０１０５】
クロラムフェニコール耐性遺伝子によって識別できた変異体のcadA遺伝子の欠失を、PCRによって確認した。得られたcadA欠損株をWC196ΔcadA::att-cat株と名づけた。
【０１０６】
次に、cadA遺伝子内に導入されたatt-cat遺伝子を除去するために、ヘルパープラスミド上述のpMW-intxis-ts（特開2005-058827）を使用した。pMW-intxis-tsは、λファージのインテグラーゼ（Int）をコードする遺伝子、エクシジョナーゼ(Xis)をコードする遺伝子を搭載し、温度感受性の複製能を有するプラスミドである。
【０１０７】
上記で得られたWC196ΔcadA::att-cat株のコンピテントセルを常法に従って作製し、ヘルパープラスミドpMW-intxis-tsにて形質転換し、３０℃で50 mg/Lのアンピシリンを含むＬ−寒天培地上にて平板培養し、アンピシリン耐性株を選択した。
次に、pMW-intxis-tsプラスミドを除去するために、Ｌ−寒天培地上、４２℃で２回継代し、得られたコロニーのアンピシリン耐性、及びクロラムフェニコール耐性を試験し、att-cat、及びpMW-intxis-tsが脱落しているcadA破壊株であるクロラムフェニコール、アンピシリン感受性株を取得した。この株をWC196ΔcadAと名づけた。
【０１０８】
（2）WC196ΔcadA 株のldcC遺伝子の欠失
WC196ΔcadA 株におけるldcC遺伝子の欠失は、上記手法に則って、ldcC破壊用プライマーとして、配列番号15、16のプライマーを使用して行った。これによって、cadA ldcC破壊株であるWC196ΔcadAΔldcCを得た。
【０１０９】
＜２＞ WC196ΔcadAΔldcC株のlys生産用プラスミド導入
WC196ΔcadAΔldcC株をdapA、dapB及びLysC遺伝子を搭載したLys生産用プラスミドpCABD2（国際公開第WO01/53459号パンフレット）で常法に従い形質転換し、WC196ΔcadAΔldcC /pCABD2株（WC196LC/pCABD2）を得た。
【０１１０】
＜２−２＞エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのtonB増幅の効果
WC196LC/pCABD2株を、実施例１で用いたtonB増幅用プラスミドpStonB、及び比較対照用
プラスミドpSTV28（宝バイオ社製）で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、pStonB導入株をWC196LC/pCABD2/pStonB株、pSTV28導入株をWC196LC/pCABD2/pSTV28株と名づけた。
WC196LC/pCABD2/pStonB株、WC196LC/pCABD2/pSTV28株を50 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
これらの株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、25 mg/Lのクロラムフェニコールと20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。プレートに生育する菌体を発酵培地2〜3mLに懸濁し、OD620≒13.5OD 1mLを、500mL坂口フラスコの、25 mg/Lのクロラムフェニコールと20mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地（エシェリヒア属細菌  L-リジン生産培地）の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において48時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。
24時間目のＬ−リジン蓄積と収率を表１に示す。表１から分かるように、WC196LC/pCABD2/pStonB株は、遺伝子を導入しないWC196LC/pCABD2/pSTV28株と比較して、24時間目のＬ−リジン蓄積が高く、Ｌ−リジン生産性が向上する事が判明した。
【０１１１】
【表１】
2008086305.tif 000002
【０１１２】
＜２−３＞エシェリヒア属細菌L-リジン生産株でのfepA増幅の効果WC196LC/pCABD2株を、実施例１で用いたfepA増幅用プラスミドpSfepAで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。fepA増幅用プラスミドpSfepA所定のプラスミドが導入されていることを確認し、pSfepA導入株をWC196LC/pCABD2/pSfepA株と名づけた。
＜２−２＞と同様にWC196LC/pCABD2/pSfepA株と、比較対照のWC196LC/pCABD2株のグリセロールストックを作製した。但し、50mg/Lのクロラムフェニコールの代わりに100mg/Lのアンピシリンを用いた。
これら株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、100 mg/Lのアンピシリンと20mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。プレートに生育する菌体を＜２−２＞と同様に発酵培地に接種し、48時間培養して培地中に蓄積したＬ−リジンの量をバイオテックアナライザーAS210（サクラ精機）を用いて測定した。但し、50mg/Lのクロラムフェニコールの代わりに100mg/Lのアンピシリンを用いた。
24時間目のＬ−リジン蓄積と収率を表２に示す。表２から分かるように、WC196LC/pCABD2/pSfepA株、遺伝子を導入しないWC196LC/pCABD2株と比較して、24時間目のＬ−リジン蓄積が高く、Ｌ−リジン生産性が向上する事が判明した。
【０１１３】
【表２】
2008086305.tif 000003
【実施例３】
【０１１４】
エシェリヒア属細菌L-スレオニン生産株でのfepA増幅の効果
Ｌ−スレオニン生産菌として、B-5318株を用いた。B-5318株は、1990年5月3日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ）に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。Ｌ−スレオニン生産菌からのfepA増幅株の構築は、実施例１に記載のプラスミドを用いて行った。
【０１１５】
B5318株を、実施例１で用いたfepA増幅用プラスミドpSfepAで形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、pSfepA導入株をB5318/pSfepA株と名づけた。
B5318/pSfepA株と、比較対照用にコントロールプラスミドを導入したB5318/pMW株を100
mg/Lのアンピシリンと100mg/Lのストレプトマイシンを含むL培地にて終OD600≒0.6となるように37℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注しグリセロールストックにして、-80℃に保存した。これをグリセロールストックと呼ぶ。
これらの株のグリセロールストックを融解し、100mg/Lのアンピシリンと100mg/Lのストレプトマイシンを含むLプレートに、各100μlずつを均一に塗布し、37℃にて24時間培養した。プレートに生育する菌体を生理食塩水6mLに懸濁し、OD620=3.0の菌液0.5mLを、500mL坂口フラスコの、100mg/Lのアンピシリンと100mg/Lのストレプトマイシンを含む発酵培地（エシェリヒア属細菌  L-スレオニン生産培地）の20 mLに接種し、往復振とう培養装置で37℃において24時間培養した。培養後、培地中に蓄積したＬ−スレオニン量を高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。
24時間目のＬ−スレオニン蓄積を表3に示す。表3から分かるように、B5318/pSfepA株は、B5318/pMW株と比較して、Ｌ−スレオニン蓄積が高く、Ｌ−スレオニン生産性が向上する事が判明した。
【０１１６】
【表３】
2008086305.tif 000004
【配列表】
2008086305000001.app