(57)【要約】【課題】単離されたポリヌクレオチド分子は、組換えPIV ワクチンの生成のための組換え PIVゲノム又はアンチゲノムを提供する。【解決手段】その組換えゲノム又はアンチゲノムは、単離された感染性PIV 粒子を生成するために、ヌクレオチドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）及び大きな（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質と共に発現され得る。組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムは、所望する変化を生成するために、たとえば、生物学的に誘導されたPIV 変異体からの弱毒化突然変異を組込むために、又はキメラPIV クローンを創造するために、すなわちワクチン使用のための弱毒化された免疫原ウィルスを生成するために修飾され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用可能に連結された転写プロモーター、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、キメラPIV ゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１配列、HPIV２配列、HPIV３配列、BPIV配列又はMPIV配列から選択された異種PIV 配列の導入により修飾されていることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
ヒト PIV３の遺伝子又は遺伝子セグメントが、異種PIV からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記カウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントが、HPIV１又はHPIV２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第２項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
PIV１又は PIV２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子がHPIV３のカウンターパートHN又はＦ糖タンパク質遺伝子により置換される請求の範囲第２項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
前記ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列がBPIV遺伝子又は遺伝子セグメントを含む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
RSV からの異種配列を組込む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
RSV からの前記異種配列が、Ｇ又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第６項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
麻疹ウィルスからの異種配列を含む請求の範囲第１項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
麻疹ウィルスからの前記異種配列がHA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第８項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１０】
作用可能に連結された転写プロモーター、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、ここで前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、
ｉ）ｐ218 (131)(配列番号１）；
ii）ｐ３／７ (131)（配列番号14）；
iii ）ｐ３／７ (131)２Ｇ（配列番号15）；又は
iv）HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列もしくはMPIV配列
から選択された異種PIV 配列の導入により、又はPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）の単離されたポリヌクレオチド、から成る群から選択されることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１１】
作用可能に連結された転写プロモーター、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されることを特徴とする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換が、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が複数のts突然変異を組込む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が複数の非ts突然変異を組込む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１５】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列がJS cp45 の１又は複数の突然変異を含む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、ポリメラーゼＬタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第15項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
前記ポリメラーゼＬタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45 のTyr９４２, Leu９９２、又はThr１５５８  に対応する位置で生じる請求の範囲第16項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１８】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１９】
前記Ｎタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45 の残基Val５６  又はSer３８９に対応する位置で生じる請求の範囲第18項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｃタンパク質におけるアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２１】
前記Ｃタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45 のIle９６  に対応する位置で生じる請求の範囲第20項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２２】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｆタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２３】
前記Ｆタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45 のIle420又はAla450に対応する位置で生じる請求の範囲第22項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、HNタンパク質におけるアミノ酸置換をコードする請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２５】
前記HNタンパク質における前記アミノ酸置換が、JS cp45 の残基Val381に対応する位置で生じる請求の範囲第24項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が３’リーダー配列における少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２７】
前記３’リーダーにおける突然変異が、JS cp45 のヌクレオチド23，24，28又は45に対応する位置で生じる請求の範囲第26項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２８】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎ遺伝子開始配列における突然変異を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２９】
前記Ｎ遺伝子開始配列における突然変異がJS cp45 のヌクレオチド62に対応する位置で生じる請求の範囲第28項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N、又はrcp45 Ｆに存在する、多くの及び十分な数までの突然変異を含む請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３１】
rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N, rcp45 L, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN 又はrcp45 Ｃから選択されたアンチゲノムcDNAである請求の範囲第12項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３２】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、突然変異を特定するコドンにおける複数のヌクレオチド置換により安定化された突然変異を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPIV又はMPIVからの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３４】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３６】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３７】
前記JS cp45 の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIV タンパク質において、又は３’リーダー又はＮ−遺伝子開始配列から選択されたPIV 遺伝子外配列において生じる請求の範囲第36項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３８】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、又は宿主範囲制限から選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３９】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N、又はrcp45 Ｆに存在する、少なくとも１つの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４０】
PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパート PIV１又は PIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数の PIV３ HN 又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラPIV バックグラウンドに組込まれる請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４１】
前記異種配列が、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第33項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４２】
HPIV１，HPIV２，BPIV又はMPIVのシス−作用性調節配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４３】
RSV からの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４４】
前記RSV からの異種配列が、Ｇ又はＰ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第43項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４５】
麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４６】
前記麻疹ウィルスからの異種配列がHA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第45項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４７】
哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV 分子をコードするポリヌクレオチド配列を組込む請求の範囲第11項記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４８】
PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、及びPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを包含し、それにより、前記PIVゲノム又はアンチゲノム、及びＮ，Ｐ、及びＬタンパク質の発現が感染性PIV 粒子を生成する細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項４９】
前記感染性RIV 粒子がウィルスである請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項５０】
前記感染性PIV 粒子がサブウィルス粒子である請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項５１】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド、及びPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが、単一のベクター内に組込まれる請求の範囲第48項記載の細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項５２】
感染性PIV 粒子をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から前記PIV 粒子を生成するための方法であって、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、及びＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを、細胞又は細胞−フリーシステムにおいて同時発現し、それにより、感染性PIV 粒子を生成することを含んで成る方法。
【請求項５３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノム、及び前記Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質が同じ発現ベクターにより発現される請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｎ，Ｐ、及びＬタンパク質が、２又は３種の異なった発現ベクター上にコードされる請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質の少なくとも１つが、PIV による同時感染により供給される請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子がcDNAである請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５７】
前記感染性PIV 粒子がウィルスである請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５８】
前記感染性PIV 粒子がサブウィルス粒子である請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項５９】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、ヒト、ウシ、又はネズミPIV 配列である請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、野生型PIV 株の配列をコードする請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６１】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、HPIV３をコードする請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６２】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、生物学的に誘導されたPIV 株からの弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６５】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、JS cp45 の少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項６６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、JS cp45 の複数の突然変異を組込む請求の範囲第65項記載の方法。
【請求項６７】
前記JS cp45 の突然変異が、ポリメラーゼＬタンパク質における少なくとも１つのアミノ酸置換を特定する請求の範囲第65項記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリメラーゼＬにおける前記アミノ酸置換が、JS cp45のTyr９４２, Leu９９２、又はThr１５５６に対応する位置で生じる請求の範囲第67項記載の方法。
【請求項６９】
前記JS cp45 の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択されたPIV タンパク質、又は３’リーダー又はＮ遺伝子開始配列から選択されたPIV 遺伝子外配列における変化を特定する請求の範囲第65項記載の方法。
【請求項７０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、突然変異を特定するコドンにおける複数のヌクレオチド置換により安定化される突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項７１】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N又はrcp45 Ｆに存在する、多くの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項７２】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NF, rcp45 3'N, rcp45 L, rcp45 F, rcp45 M, rcp45 HN 又はrcp45 Ｃから選択されたアンチゲノムcDNAである請求の範囲第69項記載の方法。
【請求項７３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPIV又はMPIVからの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項７４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、HPIV３配列、及びHPIV１，HPIV２，BPIV又はMPIV配列のキメラである請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項７５】
HN又はＦ糖タンパク質の遺伝子又は遺伝子セグメントをコードする、HPIV１又はHPIV２からの異種配列が、HPIV３の対応する遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第74項記載の方法。
【請求項７６】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項７７】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項７８】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムがJS cp45 の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項７９】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ又は宿主範囲制限が選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項８０】
PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパート PIV１又は PIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数の PIV３ HN 又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラPIV バックグラウンドに組込まれる請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項８１】
JS cp45 の１又は複数の突然変異が、カウンターパート PIV１又は PIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された両 PIV３ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラバックグラウンドにおいて組込まれる請求の範囲第80項記載の方法。
【請求項８２】
前記JS cp45 の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIV タンパク質、又は３’リーダー又はＮ遺伝子開始配列から選択されたPIV 遺伝子外配列において生じる請求の範囲第81項記載の方法。
【請求項８３】
前記異種配列が、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する請求の範囲第73項記載の方法。
【請求項８４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、RSV からの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項８５】
前記RSV からの異種配列が、Ｇ又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第84項記載の方法。
【請求項８６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチドが麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項８７】
前記麻疹ウィルスからの異種配列が、HA又はＦ遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第86項記載の方法。
【請求項８８】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、
ｉ）ｐ218 (131)(配列番号１）；
ii）ｐ３／７ (131)（配列番号14）；
iii ）ｐ３／７ (131)２Ｇ（配列番号15）；又は
iv）HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列
から選択された異種PIV 配列の導入により、又はPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）のポリヌクレオチド分子から選択される請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項８９】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、
ｉ）ｐ218 (131)(配列番号１）；
ii）ｐ３／７ (131)（配列番号14）；
iii ）ｐ３／７ (131)２Ｇ（配列番号15）；又は
iv）HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列
から選択された異種PIV 配列の導入により、又はPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する前記異種PIV 配列の前記導入とは異なる、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）のポリヌクレオチド分子から選択される請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項９０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド分子が、哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV 分子をコードするよう修飾される請求の範囲第52項記載の方法。
【請求項９１】
組換えPIV ゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質を含んで成る単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９２】
サブウィルス粒子である請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９３】
ウィルスである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９４】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムがRSV 又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９５】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムがcDNAである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９６】
ヒトPIV である請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９７】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、HPIV１，HPIV２，HPIV３，BPIV、又はMPIV配列から選択された異種PIV 配列のキメラである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９８】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、
ｉ）ｐ218 (131)(配列番号１）；
ii）ｐ３／７ (131)（配列番号14）；
iii ）ｐ３／７ (131)２Ｇ（配列番号15）；又は
iv）HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列
から選択された異種PIV 配列の導入により、又はPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）のゲノム又はアンチゲノムから選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項９９】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、
ｉ）ｐ218 (131)(配列番号１）；
ii）ｐ３／７ (131)（配列番号14）；
iii ）ｐ３／７ (131)２Ｇ（配列番号15）；又は
iv）HPIV１配列、HPIV２配列、BPIV配列又はMPIV配列
から選択された異種PIV 配列の導入により、又はPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する前記異種PIV 配列の前記導入とは異なる、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）のゲノム又はアンチゲノムから選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１００】
前記カウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントが、HPIV１又はHPIV２のHN又はＦ糖タンパク質遺伝子の遺伝子又は遺伝子セグメントである請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０１】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムがRSV 又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０２】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更をコードする、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０３】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、複数のts突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０４】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０５】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の少なくとも１つの突然変異を組込む請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０６】
前記JS cp45 の突然変異が、前記ポリメラーゼ  Ｌタンパク質におけるアミノ酸置換を特定する請求の範囲第 105項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０７】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数のts突然変異を組込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０８】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を仕込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１０９】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の１又は複数の突然変異を組込む請求の範囲第97項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１０】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、又は宿主範囲制限から選択された表現型をそれぞれ特定する複数の突然変異を組込む請求の範囲第 109項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１１】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N、又はrcp45 Ｆに存在する、少なくとも１つの及び十分な数までの突然変異を組込む請求の範囲第 109項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１２】
PIV の弱毒化、感温性、低温適合体、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパート PIV１又は PIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数の PIV３ HN 又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラ PIVバックグラウンドに組込まれる請求の範囲第91項記載の単離された感染性 PIV粒子。
【請求項１１３】
JS cp45 の１又は複数の突然変異が、前記キメラバックグラウンドにおいて組込まれる請求の範囲第 112項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１４】
前記JS cp45 の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIV タンパク質において、又は３’リーダー又はＮ−遺伝子開始配列から選択されたPIV 遺伝子外配列において生じる請求の範囲第 113項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１５】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ；制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV 分子をコードするよう修飾される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１６】
哺乳類宿主において、RSV に対して保護免疫性を誘発するRSV 抗原又はエピトープをさらに含んで成る請求の範囲第91項記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項１１７】
ｒ942,ｒ992,ｒ1558, ｒ942 ／992,ｒ992 ／1558，ｒ942／1558、又はｒ942 ／992 ／1558，rcp45 3'N, rcp45 C, rcp45 M, rcp45 F, rcp45 HN, rcp45L, rcp45 3'NL, rcp45 3'NCMFHN、及びrcp45 から選択される請求の範囲第91項記載の単離された感染性PI  V 粒子。
【請求項１１８】
医薬的に許容できるキャリヤーに、組換え PIVゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を含んで成る感染性PIV 粒子の免疫原的有効量を含んで成る免疫原組成物。
【請求項１１９】
前記感染性PIV 粒子が、サブウィルス粒子である請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２０】
前記感染性PIV 粒子がウィルスである請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２１】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、RSV 又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２２】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、感染性キメラPIV 粒子を形成するために、HPIV１，HPIV２，HPIV３、BPIV、又はMPIV配列から選択された異種PIV 配列のキメラである請求の範囲第118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２３】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムがヒトPIV をコードし、ここで遺伝子又は遺伝子セグメントが異種PIV からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換される請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２４】
HPIV１の１又は両HN及びＦ糖タンパク質遺伝子が、前記感染性キメラPIV 粒子を形成するために、HPIV３のHN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換される請求の範囲第 123項記載の免疫原組成物。
【請求項１２５】
前記感染性キメラPIV 粒子の組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更をコードする、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾される請求の範囲第 123項記載の免疫原組成物。
【請求項１２６】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、弱毒化された感染性キメラPIV 粒子を形成するために、ts及び非−ts弱毒化突然変異から選択された複数の突然変異を組込む請求の範囲第 125項記載の免疫原組成物。
【請求項１２７】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の突然変異を組込む請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【請求項１２８】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の複数の突然変異を組込む請求の範囲第 118項記載の免疫原組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、弱毒化パラインフルエンザウィルスワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパラインフルエンザウィルス（HPIV）、すなわちHPIV１，HPIV２、及びHPIV３は、乳児及び幼児における細気管支炎、偽膜性喉顎炎及び肺炎の主要原因である（Karronなど., J. Infect. Dis. 172 : 1445-50 (1995); Collinsなど. “Parainfluenza Viruses ”, p. 1205-1243 ; B. N. Fields など., eds., Fields Virology,3rd ed, vol. 1. Lippincott-Raven Publ., Philadelphia (1996); Murphyなど., Virus Res. 11 : 1-15 (1988)）。それらのウィルスによる感染は、３才以下の年齢の幼児に実質的な病的状態をもたらし、そして呼吸気管感染のために乳児及び幼児間での約20％の入院の原因でもある。
【０００３】
HPIVに対する効果的なワクチン療法を開発するための相当な努力にもかかわらず、いづれかのHPIV株に対しても、又はHPIV関連疾病の回復のためにも、改良されたワクチン剤は、まだ達成されていない。今日まで、わずか２種の弱毒化された生PIV ワクチン候補が特に注目されている。それらの候補の１つは、HPIV３に対して抗原的に関連し、そしてHPIV３に対して動物を保護することが示されているウシPIV (BPIV)株である。BPIV３は、弱毒化され、遺伝的に安定しており、且つヒト乳児及び幼児において免疫原性である（Karronなど, J. Inf. Dis. 171 : 1107-14 (1995a) ; Karron など., J. Inf. Dis. 172 : 1445-1450 (1995b))。
【０００４】
第２の PIV３ワクチン候補、すなわちJS cp45 は、HPIV３のJS野生型（wt）の低温適合変異体である（Karronなど, (1995b),前記 ; Belshe など, J. Med. Virol. 10 : 235-42 (1982) ）。この弱毒化された低温−継代された（cp）生 PIV３ワクチン候補は、感温性（ts）低温−適合性（ca）、及びインビボでのウィルス複製の後、安定性である表現型を示す。cp45ウィルスは、実験動物においてヒト PIV３攻撃に対して保護性であり、そして弱毒化され、遺伝的に安定しており、そしてセロネガティブヒト乳児及び幼児において免疫原性である（Hallなど, Virus Res. 22 : 173-184 (1992) ; Karron など, (1995b),前記）。
【０００５】
HPIV３は、パラミクソウィルス(Paramyxovirus）科、モノネガビラレス(Mononegavirales）目のパラミクソウィルス属のメンバーである。そのゲノムは、長さ 15462個のヌクレオチド（nt）の一本鎖ネガティブ−センスRNA であり（Galinskiなど, Virology 165 : 499-510, (1988) ; Stokes など, Virus Res. 25 : 91-103 (1992)）、そして少なくとも８種のタンパク質をコードする(Collinsなど, 前記, (1996) ; Galinski,前記, (1991) ; Spriggs及びCollins, J. Gen. Virol. 67 : 2705-2719, (1986)) 。それらの３種のタンパク質は、ヌクレオキャプシド、すなわちヌクレオキャプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ及び大きなポリメラーゼサブユニットＬを形成するために、RNA ゲノムに関係している。
【０００６】
３種の追加のタンパク質、すなわちウィルス結合及び開放を仲介することが示されているユトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、及び融合タンパク質Ｆは、エンベロープに関係している。２種の他のタンパク質、すなわちMN及びＦは、PIV の中和及び保護抗原を表わす(Collinsなど, Filds Virology, 3rd ed., 1 : 1205-43 (1996))。異なったPIV 間でのそれらの２種の保護抗原における有意な配列の相違が、それらの病原体に対する保護免疫性の型特異性のための基礎である。
【０００７】
PIV のもう１つのタンパク質、すなわちＣタンパク質は、Ｐタンパク質mRNAのオーバーラップ読取り枠(ORF）によりコードされ（Spriggs and Collins, 1986)、そしてＤタンパク質はＰシストロンのRNA 修正により生成される（Galinskiなど, Virology 186 : 543-50 (1992)) 。Ｐ mRNA はまた、Ｖと呼ばれるシステインに富んでいるドメインをコードする能力を有する内部ORF を含む。Ｖ ORFはまた、他のパラミクソウィルスにも見出されており、そして典型的には、RNA 修正により入手されるが、しかしこれはPIV に関する場合ではない。現在、PIV V ORF が発現されるかどうかは知られていない。
【０００８】
PIV のウィルスゲノムはまた、ウィルスの複製及び転写のために必要とされるプロモーターを有する、遺伝子外リーダー及びトレイラー領域も含む。従って、PIV 遺伝子地図は、３’リーダーN-P/C/D-M-F-HN-L-トレイラーとして表わされる。転写は３’末端で開始し、そして遺伝子境界で見出される短い保存されたモチーフにより案内される連続的停止−開始機構により進行する。個々の遺伝子の上流端は、そのそれぞれのmRNAの開始を方向づける遺伝子−開始（GS）シグナルを含む。個々の遺伝子の下流端は、ポリアデニル化及び終結を方向づける遺伝子−末端（GE）モチーフを含む。
【０００９】
cp45及び他の PIV３ワクチン候補における弱毒化突然変異の同定が種々の理由のために興味あるものである。特に、それらの及び他のパラミクソウィルス、特に、追加の７％の小児科入院の原因であるHPIV１及びHPIV２に対して使用するための臨床的に許容できるワクチンを提供するために、弱毒化の遺伝子基礎を理解し、そして弱毒化されたHPIV３株の分子ウィルス学及び病因論を特徴づけることが有用であろう。それらの及び関連する目的を達成するためには、cDNAからのwt表現型を有するウィルスを生成するための方法が、cp45ウィルスにおける突然変異がts, ca及びatt 表現型を規定し、そしてBPIV３の遺伝子が弱毒化表現型を規定することを決定するために必要とされる。
【００１０】
原型 PIV３株、並びにJS wt HPIV３及びcp45株の完全なヌクレオチド配列は決定されている（Stokesなど, 前記, (1992); Stokesなど., Virus Res. 30 : 43-52 (1993))。それらの研究から、cp45株は、親JS wt HPIV３株に比較して、少なくとも17個のヌクレオチド置換（その８個の置換は、ウィルスタンパク質に対する変化と相互関係する）を有することが示されている。しかしながら、それらの同定された突然変異のどれが、所望の、たとえばts, ca、及びatt表現型を規定するかどうかは、これまで示されたことはない。最近、非許容温度でのcp45の増殖が、47885wt PIV３株のＬ遺伝子のcDNAクローンの同時発現により補足されることが報告されており(Rayなど., J. Virol. 70 : 580-584 (1996)）、これは、Ｌ遺伝子が、cp45の表現型に寄与する１又は複数の突然変異を含むことができることを示唆している。
【００１１】
しかしながら、この研究の結果は、47885 株がcp45のJS親と同遺伝子型ではない（たとえば、前記２種のウィルスはヌクレオチドレベルで４％の差異があり、そしてＬタンパク質が41のアミノ酸位置で異なる）事実によりわかりにくい（Stokesなど, 前記, (1992); 公開された誤りがVirus Res. 27 : 96 (1993)にあり；Virus Res. 25 : 91-103）。また、この補完法は、cp45の全体のts表現型へのＬ遺伝子突然変異の相対的寄与の明白な測定を提供していない。
【００１２】
PIV３及び他のRNA ウィルスにおける弱毒化突然変異の獲得及び分析は、注目の特定のウィルスについてのcDNAを操作する効果的方法を必要とする。PIV のためのcDNAを同定するこれまでの進歩にもかかわらず、この及び他のネガティブ−センスRNA ウィルスのゲノムRNA の操作は、困難であることがわかっている。これに関しての１つの主要障害は、それらのウィルスの裸のゲノムRNA が非感染性であることである。
【００１３】
セグメント化されていないネガティブ鎖RNA ウィルスの直接的な遺伝子操作のための好都合な方法がつい最近、開発され始めている（総説のためには、Conzelmann, J. Gen. Virol. 77 : 381-89 (1996) ; Raleseなど, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 : 11354-58,(1996)を参照のこと）。機能的ヌクレオカプシドは、Ｔ７ RNAポリメラーゼプロモーターを担持し、そしてゲノム又はアンチゲノムRNA 、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする、別々にトランスフェクトされたプラスミドの細胞内同時発現から都合良く、生成されて来た。その細胞内cDNA発現は、ワクシニア組換えウィルスにより同時感染せしめることによって生成されるＴ７ RNAポリメラーゼにより駆動される。このアプローチは最初に、cDNAによりコードされたミニレプリコンの転写及び複製必要条件を決定するために使用された。
【００１４】
いくつかの成功が、ヌクレオカプシドＮ、リンタンパク質Ｐ及び大きなポリメラーゼサブユニットＬの存在下で、cDNAコードされたアンチゲノムRNA から感染性狂犬病ウィルス、水疱性口内炎ウィルス(VSv）、麻疹ウィルス及びSendaiウィルスを獲得するためにそれらの一般的な方法の適用により達成されて来た（Garcinなど, EMBO J. 14 : 6087-6094 (1995); Lawson など, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 4477-81 (1995) ; Radeckeなど, EMBO J. 14 : 5773-5784 (1995) ; Schnell など, EMBO J. 13 : 4195-203 (1994) ; Whelan など, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 8388-92 (1995)) 。呼吸シンシチウムウィルス(RSV）がまた、cDNAコードのアンチゲノムから回収されているが、しかしこれはM2 ORF 1転写延長因子をコードする追加のプラスミドの転写を必要とした(Collinsなど., 1995)。
【００１５】
感染性PIV ウィルス及び他のモノネガビラレス(Mononegavirales) メンバーの獲得は、それらのセグメント化されていないネガティブ−鎖RNA ゲノムのために複雑である。セグメント化されたゲノムウィルス、たとえばインフルエンザのゲノムリボヌクレオプロテイン複合体(RNP）は一般的に、サイズが小さく、そしてゆるく(loosely) 構成されており、そしてRNA 及び必要とされるウィルスタンパクシ質からインビトロで、アセンブルされ得る。しかしながら、PIV 及び他のモノネガビラレスメンバーは、より大きく、且つよりきつく(tightly) 構成されたRNP であり、これらはインビトロで、機能的会合しにくい。さらに、HPIV３ P mRNA のコード能力は、同時転写“RNA 編集”により複雑化される（Galinskiなど, Virology 186 : 543-50 (1992)) 。
【００１６】
読取り枠におけるその得られるシフトは、ＰのＮ−末端部分に融合されるキメラとして発現される内部ORF に近づく。さらに、HPIV３は、上記に示されたように、キメラＶタンパク質を発現するほとんどの他のパラミクソウィルスとは異なっているように見える。HPIV３編集からのその対応するタンパク質組はまだ同定されておらず、そしてHPIV３の内部Ｖ ORFは多くの翻訳停止コドンにより編集部位から分離される。（Galinskiなど. (1992), 前記）。さらにもう１つの複雑化する要因は、BPIV３及びHPIV３による編集が、Ｐの上流半分が第２内部ORF によりコードされるドメインに融合されている新規のキメラタンパク質Ｄを生成することである(Peletなど, EMBO J. 10 : 443-448 (1991); Galinski など, 前記, (1992)）。そのＤタンパク質は、他のパラミクソウィルスにおいて、カウンターパートを有さない。
【００１７】
前述の観点から、PIV に帰因する重大な健康問題、特にHPIV３に帰因する、乳児及び幼児間で疾病を緩和するための安全且つ効果的なワクチンを生成するための手段及び方法の早急な必要性が、当業界において存在する。非常に驚くべきことには、本発明は、それらの及び他の関連する必要性を満たすものである。
【発明の開示】
【００１８】
発明の要約
本発明は、感染性PIV 中に、定義された予定の構造及び表現型変化を導入するための新規手段及び方法を提供する。本発明の１つの態様においては、作用可能に連結された転写プロモーター、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子が提供される。
【００１９】
PIV ゲノム又はアンチゲノムは、ヒトもしくは非ヒトPIV 配列、又は組換え的に修飾されたそのバージョンであり得る。１つの態様において、ポリヌクレオチド配列は、非ヒトPIV 配列、たとえばウシPIV (BPIV)からの遺伝子又は遺伝子セグメントにより組換え的に連結されたヒトPIV 配列を含んで成るキメラゲノム又はアンチゲノムをコードする。さらなる例においては、ポリヌクレオチドは、非ヒトPIV からの配列及びヒト又は非ヒト起源の少なくとも１つの他のPIV のキメラをコードする。
【００２０】
他の態様においては、本発明は、組換えPIV (rPIV)ゲノム又はアンチゲノムを含んで成る、単離された感染性PIV 粒子を提供する。その単離された感染性PIV 粒子は、ウィルス又はサブウィルス粒子であり得る。本明細書において使用される場合、サブウィルス粒子とは、完全なウィルス（たとえば、完全なゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオカプシド及びエンベロープを包含するアセンブルされたビリオン）に存在する、構造要素、たとえば遺伝子セグメント、遺伝子タンパク質、又はタンパク質機能ドメインを欠いているいづれかの感染性PIV 粒子を意味する。従って、本発明のサブウィルス粒子の１つの例は、ゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬ遺伝子の生成物を含む感染性ヌクレオカプシドである。他のサブウィルス粒子は、他の非必須構造要素の中で、非必須遺伝子及び／又はそれらの生成物（たとえば、F. HN,Ｍ又はＣ）の部分的又は完全な欠失又は置換により生成される。
【００２１】
単離された感染性PIV 粒子は好ましくは、ヒトPIV 、より好ましくはヒト PIV３（HPIV３）である。本発明はまた、ウシ又はネズミPIV(BPIV又はMPIV）からの単離された感染性粒子、及び複数の異なったPIV ゲノムからのキメラ配列を含んで成る粒子、たとえばHPIV３及びHPIV１からの、HPIV３及びHPIV２配列からの、又はHPIV３及びBPIV配列から成るポリヌクレオチド配列を組込んでいる粒子を提供する。
【００２２】
本発明の関連する観点においては、異種PIV 、たとえばHPIV１，HPIV２，BPIV又はMPIVからの少なくとも１つの配列に連結されたHPIV３からのヌクレオチド配列を組込んでいる、単離された感染性PIV 粒子が提供される。たとえば、HPIV３の全遺伝子は、PIV の他の形からのカウンターパート遺伝子、たとえば PIV１又は PIV２のHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。
【００２３】
あるいは、選択された遺伝子セグメント、たとえばHPIV１又はHPIV２のHN又はＦの細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン (ectodomain) は、キメラタンパク質、たとえば PIV１又は PIV２のエクトドメインに融合された、 PIV３の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有する融合タンパク質をコードする構造体を生成するために、カウンターパートのHPIV３遺伝子における対応する遺伝子セグメントにより置換され得る。他の方法として、１つの PIVからの遺伝子又は遺伝子セグメントは、得られるクローン内に新規の免疫原性質を創造するために、異種PIV バックグラウンド内に付加され得る（すなわち、置換を伴わないで）。
【００２４】
他の修飾は、所望の表現型変更、たとえばPIP の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、改良されたインビトロ増殖、又は免疫原性エピトープの変化をもたらす変更をコードするよう選択された、ヌクレオチド挿入、転位、欠失、又は置換をPIV ゲノム又はアンチゲノム中に導入することによって生成され得る。本発明の１つの観点においては、生物学的に誘導された、弱毒化された PIVに存在する突然変異は、同定され、そして十分な長さのPIV クローン中に個々に、又は組合して導入される。典型的には、それらの突然変異は、野生型 PIV対する、生物学的に誘導された変異体ウィルスにより示される単一のアミノ酸変化、たとえばts, ca、又はatt 表現型を有するPIV 変異体により示される変化である。
【００２５】
生物学的に誘導された変異体PIV からのそれらの変化は、得られるウィルスにおける所望の特徴を規定するために組換えPIVクローン中に組込まれる。典型的な突然変異は、HPIV３株JS cp45における弱毒化された表現型を規定するアミノ酸変化を包含する。それらの中で、典型的な突然変異は、ts, ca又はatt 表現型を規定するPIV ポリメラーゼ遺伝子Ｌ内に存在する突然変異、たとえばJS野生型PIV 株のTyr 942, Leu 992, 及び／又はThr 1558 で存在するアミノ酸置換である。より詳細な観点においては、Tyr９４２がHis により置換され、Leu 992がPhe により置換され、そして／又はThr 1558 がIle により置換されている弱毒化されたPIV 組換え体が記載される。
【００２６】
所望の特性、たとえば弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等を生成するために感染性クローンのゲノム又はアンチゲノム中に選択された組換えで導入された複数の表現型−特異的突然変異を有する組換えPIV がまた、本発明内に提供される。たとえば、生物学的に誘導されたPIV 変異体から採用された少なくとも２種の異なった突然変異、たとえばHPIV３ JS cp45からの２種のts突然変異を組込むPIV クローンが提供される。従って、多様に弱毒化されたウィルスが、同定された損傷の“メニュー”から突然変異を選択し、そしてそれらの突然変異を、ワクチンウィルスを、弱毒化、免疫原性及び安定性の選択されたレベルに対応せしめるために種々の組合せで導入することによって得られる。
【００２７】
さらなる態様においては、本発明は、生物学的に誘導されたPIVから採用された１又は複数の突然変異の、同じか又は異なった遺伝子を包含する追加のタイプの突然変異による補足を提供する。これに関しての突然変異のための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ，赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。好ましい観点においては、生物学的に誘導されたPIV から採用された弱毒化突然変異が、キメラPIV 組換え体、たとえばHPIV３及びHPIV１の両者、又はHPIV及びBPIV両ウィルスからのヌクレオチド配列を有するPIV 組換え体内に導入される。
【００２８】
他の態様においては、本発明は、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子から、感染性PIV 粒子、たとえばウィルス又はサブウィルス粒子を生成するための方法を提供する（また、1997年５月23日に出願された係属中のアメリカ合衆国特許出願第60／047575号を参照のこと；それは引用により本明細書中に組込まれる）。それらの方法に従って、感染性PIV 粒子を生成するためには、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターが、PIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターと共に、細胞又は細胞−フリーシステムにおいて同時発現され、それにより、感染性PIV 粒子が生成される。
【００２９】
PIV ゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質は、単一の発現ベクター、又は別々の発現ベクターにより同時発現され得る。他の態様においては、Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質は、別々の発現ベクターに基づいて、個々にコードされる。
【００３０】
前記方法内においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、ヒト、ウシ又はネズミPIV のゲノム又はアンチゲノム配列に対応することができる。あるいは、PIV コードのポリヌクレオチドは、ヒトPIV ゲノム又はアンチゲノム配列及び少なくとも１つの非ヒトPIV ゲノム又はアンチゲノム配列のキメラであり得る。感染性PIV を生成するための追加の方法においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチドは、複数のヒトPIV ゲノムのキメラ、たとえば１又は複数の関連する形のヒトPIV 、たとえばヒト PIV１又はヒト PIV２からの配列に連結される、HPIV３からの配列を含むポリヌクレオチドである。
【００３１】
ヒト PIV３の個々の遺伝子は、キメラPIV をコードする修飾されたゲノム又はアンチゲノムを生成するために、異種PIV からのカウンターパート遺伝子、たとえば PIV１又は PIV２のHN及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。あるいは、選択された異種遺伝子セグメント、たとえばHPIV１又はHPIV２のHN又はＦの細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメインは、キメラタンパク質、たとえば PIV１又は PIV２のエクトドメインに融合された PIV３の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有する融合タンパク質をコードする構造体を生成するために、異なったPIV 型又は異なった遺伝子、たとえばHPIV３のHN又はＦにおけるカウンターパートの遺伝子セグメントにより置換され得る。
【００３２】
感染性PIV を生成するためのさらにもう１つの方法においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムは、ヒトPIV ゲノム又はアンチゲノム配列、及び少なくとも１つの非ヒトPIV 配列のキメラ、たとえばヒト及びウシの両PIV からの配列を含むポリヌクレオチドを生成するために修飾される。
【００３３】
感染性PIV を生成するための他の方法においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムが、所望の表現型の変更、たとえばPIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化をもたらす変更をコードするよう選択された、ヌクレオチドの挿入、転位、欠失又は置換により修飾される。あるいは、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子は、意図された宿主において保護免疫応答を誘発することができる非−PIV 分子、たとえばサイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、又は異なった微生物病原体（たとえば、ウィルス、細菌又は菌類）のタンパク質をコードするよう修飾され得る。１つの態様においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムは、ヒトRSV 、又は麻疹ウィルスからのタンパク質をコードするよう修飾される。
【００３４】
本発明の他の態様においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、並びにPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクターを組込む、細胞又は細胞−フリー発現システム（たとえば、細胞−フリー溶解物）が提供される。発現に基づいて、ゲノム又はアンチゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質が、感染性PIV 粒子、たとえばウィルス又はサブウィルス粒子を生成するために結合する。PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、並びにPIV のＮ，Ｐ、及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子は、単一のベクターにより発現され得、又は１もしくは複数のＮ，Ｐ及びＬタンパク質は、複数の別々のベクター中に組込まれ得る。
【００３５】
図面の簡単な説明
図１は、HPIV３ゲノムRNA の完全なコピーをコードするプラスミドｐ218 (131) の構成を示す。ｐ218 (A A'CC'D E)のダイアグラム（上部左）は、HPIVゲノムのヌクレオチド１に隣接するδリボザイム及びＴ７ターミネーターの位置を示す。p(E FF'GHIJKL）の上部右のダイアグラムは、７個の配列決定マーカー（星印)(下記図２を参照のこと）、及びHPIV３のヌクレオチド15462 に隣接するＴ７プロモーターの位置を示す。十分な長さのゲノムcDNAを構成するために使用される15のオーバーラップするクローンが、２種のプラスミドの外部上に文字により示される。ユニーク制限部位 NgoMI及び XhoＩが、底部に示されるHPIV３の完全なネガティブ−センスのゲノムRNA をコードするｐ218 (131) をクローン化するために使用された。JSと組換えJSとを区別するｐ218 (131) における個々の配列決定マーカーの位置は星印により示される。
【００３６】
図２は、HPIV３のHN（１）及びＬ（２）遺伝子のcDNAによりコードされたゲノムRNA における配列マーカーを示す。配列はネガティブセンスであり、突然変異はボックスで囲まれている。
１）7903での非コードnt置換は、JS wt から HgaＩ部位を除く。7913及び7915でのJS cDNA におけるヌクレオチド置換は、 ScaＩ部位を創造し、そしてアミノ酸370 をプロリンからトレオニンに変え、mAb170／７及び423 ／６により認識される抗体エピトープを除去する。また、HN遺伝子は、これまで認識されたことがないnt7593での追加の点突然変異を含むことが見出された。これは、HNタンパク質におけるアミノ酸位置263 でのトレオニンのイソロイシンへの変化をもたらす。
２）プラスミド構成又はアセンブリーの間に生じた、JS cDNA のＬ遺伝子における３種の偶発的な非コード突然変異。
【００３７】
図３は、 PIV３−CAT cDNA（上部；環状プラスミドとして描かれている）、及びコードされたミニゲノムRNA （低部；一本鎖のネガティブ−センスRNA （３’→５’）として描かれている）の図を包含する。
プラスミド：Ｔ７プロモーターは、転写の方向を示す黒の矢印として示される。位置は、δリボザイム、Ｔ７転写ターミネーター、挿入されたワクシニアウィルス転写ターミネーター（T７CT及びT５AT）、制限酵素部位、及びコードされたミニゲノムの種々のドメインのためのコード配列に関して示される。
【００３８】
ミニゲノム RNA：ミニゲノムの５’（右側）端は、２種の非ウィルスＧ残基の延長に寄与する、T7 RNAポリメラーゼのためのプロモーターにより定義される。それらは、長さの計算には包含されない。３’端は、リボザイムにより定義され、そしていずれの異種ヌクレオチドも有さない。 PIV３−特異的領域は、空白のボックスとして示される。CAT ORF は、影がつけられており、そして翻訳開示(UAC）及び終結(AUU）コドンのネガティブ−センス相補体が示される。ヌクレオチド位置は、最とも短い898 −ヌクレオチドのミニゲノムに従って示される。特定領域のヌクレオチドの長さは、括弧内に示される。位置90〜124 （３’→５’、ネガティブ−センス）の配列が底部に示され； PIV３−特異的配列には下線が引かれており、ワクシニアウィルス転写ターミネーターの相補体には上線が引かれており、 XbaＩ部位の相補体はイタリック体で示されており、そしてCAT ORF のための翻訳開始コドンの相補体は太字で示されている。 PIV３−CAT ０〜＋６をもたらす、０〜６個のＧ残基が挿入された部位が、示される。略語：GS, 転写遺伝子−開始モチーフ；GE, 転写遺伝子−末端終結／ポリアデニル化モチーフ；NT, 非翻訳遺伝子配列。
【００３９】
図４は、ミニゲノム PIV3-CAT ０〜＋６によるCAT 酵素の発現を示す。細胞は、示される PIV3-CAT ミニゲノム、並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクトされ、そしてT7 RNA ポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換えvTF7−３により同時に感染された。溶解物が感染の48時間後に調製され、そして3000個の細胞を示すサンプルがCAT 活性について分析された。活性は、６の倍数である＋２ミニゲノムに対して、100 として示される。Ｌプラスミドが除去されているサンプルは、それらの条件下で検出できるCAT 活性を有さなかった。
【００４０】
図５Ａ及び５Ｂは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６によるミニ−アンチゲノムRNA の合成を示す。細胞が図４に記載されるようにしてトランスフェクトされ、そして感染された。但し、Ｎプラスミド（レーン１）又はＬプラスミド（レーン２）が削除された対照を除く。個々の場合において、トランスフェクトされた PIV３−CATミニゲノムプラスミドが示される。細胞溶解物がトランスフェクションの48時間後に調製され：１つのアリコートはミクロコッカスヌクレアーゼにより処理され（処理された）、そして第２のアリコートは擬似 (mock) 処理され（処理されていない）、続いてRNA 精製のために処理された。RNA は、ネガティブ−センスCAT リボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析された。ヌクレアーゼ処理のマーカー及び対照として、 RSV−CAT Ｃ２ミニゲノム（Grosfeldなど., J. Virol. 69 : 5677-5686 (1995)、引用により本明細書中に組込まれる）がRSV Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質により補完され、そして同時に処理された（レーン10）。ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムが、図５Ａに示される。図５Ｂは、＋２ミニゲノムに対するハイブリダイゼーションの量が、処理された及び処理されていないサンプルに関して別々に計算されているホスホルイメージャー（phosphorimager）分析を示す。
【００４１】
図６Ａ及び６Ｂは、 PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６による、ポリアデニル化されたmRNAの分析を示す。図５Ａ及び５Ｂに示されるのと同じ実験からの細胞のアリコートを用いて、全細胞内RNA を、感染の48時間後に収穫し、そしてネガティブ−センスCAT リボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析される、結合された及び結合されていない画分に、オリゴ（dT）クロマトグラフィーにより分別した。図６Ａは、ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムを示す。図６Ｂは、ハイブリダイゼーションの量が＋２ミニゲノムの結合されたRNA 画分に対して標準化されているホスホルイメージャー分析を示し、２ｄは、結合された画分及び結合されていない画分に関して、別々に計算された。
【００４２】
図７Ａ及び７Ｂは、 PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６をコードするプラスミドに応答しての細胞内ミニゲノムの蓄積を示す。これは、図５Ａ及び５Ｂに示される実験の継続である。従って、ミニゲノム並びにＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドによりトランスフェクトされ、そして vTF７−３により感染された細胞を、トランスフェクションの48時間後に収穫し、そして細胞溶解物を調製した。溶解物の１つのアリコートを、ミクロコッカスヌクレアーゼにより処理し（処理された）、そして他を、擬似 (mock) 処理し（処理されていない）、続いて、RNA 精製のために処理した。RNAを、ポジティブ−センスCAT リボプローブとのノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析し、他方図５Ａにおいては、リボプローブは、ネガティブ−センスであった。図７Ａは、ハイブリダイズされたブロットのオートラジオグラムを示す。図７Ｂは、＋２ミニゲノムに対してのハイブリダイゼーションの量が、処理された及び処理されていないサンプルに関して、別々に計算されているホスホルイメージャー分析を示す。
【００４３】
図８〜図10は、ｐ３／７(131）２Ｇの構成を示す。ｐ３／７(131）２Ｇは、完全なポジティブ−センスHPIV３アンチゲノムをコードし、そしてアンチゲノムのＴ７プロモーターとヌクレオチド１との間に２つのＧ残基を含む。その構成は、ネガティブ−センスゲノムをコードするcDNA218 (131）の左及び右半分の別々の修飾に関与した。同じ手段を用いて、２つのＧ残基が除去されていることを除いて、ｐ３／７(131）２Ｇに対して同一である第２のcDNA、すなわちｐ３／７(131）を構成した。
【００４４】
図８は、ｐ218 (A A'CC'D E)のリボザイム及びＴ７転写ターミネーターを、２つのＧ残基を含むＴ７プロモーターにより置換することによって実施される、ｐ（Left＋２Ｇ）の構成を示す。ｐ218 (A A'CC'D E)は、Ｔ７プロモーターを導入された左側PCR プライマーを用いて、HPIV３ゲノムの左側の1224個のヌクレオチド（右側の長方形のラベルされた“ PIV３seq.”）を増幅するPCR において鋳型として使用された。このPCR フラグメントを、ｐ218 (A A'CC'D E)の MluＩ− PmlＩウインドウ中にクローン化し、ｐ（Left−２Ｇ）をもたらした。
【００４５】
図９は、ポジティブ−センス（アンチゲノム）鎖において PIV３ヌクレオチド15642 に隣接して配置されるリボザイム及びT7ターミネーターによりｐ(E FF'GHIHKL )のT7プロモーターを置換することによって実施されるp(Right＋）の構成を示す。ｐ(E FF'GHIHKL )が、δリボザイムの一部（天然に存在する RsrII部位を含む）を付加した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いて、右側の 649個のヌクレオチドのHPIV３ゲノム（左側の長方形のラベルされた“ PIV３seq.”）を増幅するPCR において鋳型として使用された。このPCR 生成物を、p3/7の RsrII−BssHIIウインドウ中にクローン化し、pPIV3-3/7を生成し、従って、T7ターミネーターを端に有する完全なリボザイムを再構成した。pPIV3-3/7の SwaＩ−NgoMI フラグメントを、p (E FF'GHIHKL )の SwaＩ−NgoMI ウインドウ中にクローン化し、p(Right＋）をもたらした。７個の配列マーカーの位置は、星印により示される。
【００４６】
図10は、p3/7(131)2Gの構成を示す。ｐ(Right＋）の NgoMI− XhoＩフラグメントを、ｐ (Left＋2G）の NgoMI− XhoＩ窓中にクローン化し、ｐ３／７(131）２Ｇをもたらした。HPIV３遺伝子の位置は示されている。配列マーカーの位置は星印により示される。
図11は、ネガティブ−センスの組換え PIV３の配列確認を示す。7903，7913及び7915での突然変異を包含する1379bpのフラグメント（ヌクレオチド7334−8713）を、感染された細胞からのRNA のRT−PCR により生成し、そしてサイクル−配列決定により分析した。JSから組換えPIV を分化する突然変異は、矢印により示される。nt7897〜7922の完全な配列が、太字で示される３種のヌクレオチド差異と共に、個々のゲルの次の端に示される。
【００４７】
図12は、Ｌタンパク質配列における位置942, 992及び1558でのアミノ酸置換を有する PIV３ L cDNA を含む、プラスミドpTM(Ｌ)942／992 ／1558の地図を提供する。個々のコード変化の相対的位置が、マーカーとして故意に除去された天然に存在する制限部位及びaa差異と共に示される。クローニングのために使用される制限部位(SphＩ, PinAI, BamHI及び NheＩ）が示される。矢印は、Ｌタンパク質コード配列の方向を示し、そしてアミノ酸位置に従って番号づけされている。
【００４８】
図13は、本発明内の代表的な突然変異を担持する組換え PIV３ウィルスの図示である。
図14は、 PIV３ HN 及びＦ ORFが PIV１のそれらにより置換されているキメラ PIV3- PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成を示す。最初に（底部左から開始して）、 PIV3 F及びHN遺伝子を、十分な長さの PIV３ cDNA クローンp3/7(131)2G（パネルＡ）からサブクローン化し（BspEII−XhoＩ及び EcoRI−SpeＩフラグメントとして）、それぞれpLit. PIV3. F3a 及びpLit. PIV3. NH4(パネルＢ）を生成した。PCR 突然変異誘発（パネルＣ）を実施し、 PIV3 F及びHN遺伝子の完全なコード領域を欠失し、そして新しい制限部位（ボックスにより囲まれる）を導入した。 PIV１ F及びHN cDNA を、RT-PCR により感染された−細胞RNA から調製し、そしてpLITMUS28 中にクローン化した（パネルＤ）。
【００４９】
それらのクローン、すなわちpLit．１Fwt 及びpLit.1HNwtを、 PIV３欠失において導入された制限部位と適合する新規制限部位を導入するためにそれらの開始及び停止コドンでの PIV１ F及びHN遺伝子の修飾のための鋳型として使用した（パネルＥ）。キメラＦ及びNH遺伝子が、pLit. PIV3-1.Fhc 及びpLit. PIV3-１．HNhcを生成するために、 PIV３欠失中に PIV１コード領域を導入することによって構成された（パネルＦ）。キメラＦ及びHNを一緒にアセンブルし、pSE. PIV３−１．hcを生成した（パネルＧ）。Ｆ及びHNキメラセグメントを、十分な長さの PIV３クローンp3/7(131)2G中に、その BspEI− SphＩフラグメントを置換することによって導入し、pFLC. ２Ｇ−.hを生成した（パネルＨ）。遺伝子間の小さなボックスは、遺伝子末端、遺伝子間、及び遺伝子開始領域を示し、そして線は非コード領域を示す。濃い色の部分は PIV１からであり、空白のボックスは PIV３からである。黒色の矢印はＴ７プロモーターを示し、そして黒色のボックスは肝炎δウィルス(HDV）のリボザイムを示す。
【００５０】
図15Ａは、キメラrPIV３−１のキメラHN及びＦ遺伝子（中間）と共に、rPIV３／JS (上部；他方では、本明細書において、rJS 及びJS wt rPIV３として言及される）及び PIV１／Wash64（底部）のHN及びＦ遺伝子の図である。 PIV３から PIV１への配列移行を含む４種の連結領域がボックスで囲まれており、そしてＩからIVまで番号づけされている。遺伝子間の個々の小さなボックスは、遺伝子末端、遺伝子間及び遺伝子開始領域を示し、そしラインは非コード領域を示す。図14Ｂにおいて使用される、 PIV３  Ｍ及びＬ遺伝子に対して特異的な（上部でのプライマー対Ａ）、又は PIV１  Ｍ及びHN遺伝子に対して特異的な（底部でのプライマー対Ｂ）RT−PCR プライマーが、矢印により示される。
【００５１】
図15Ｂは、鋳型としてビリオンRNA (vRNA)、及び図14Ａに記載される PIV３−又は PIV１−特異的プライマー対を用いて生成されたRT−PCR 生成物の評価を示す。逆転写段階は、PCR 生成物がRNA に由来することを確かめるために、示されるように、個々の鋳型の重複体においては削除された。rPIV３−１に関しては、 PIV３−特異的プライマー対Ａが予測される 4.6kbの生成物を生ぜしめ、そしてrPIV3-1に存在しない PIV-1配列に対して特異的なプライマー対Ｂは生成物を生成しなかった。rPIV３／JS (rPIV３としてラベルされる）又は PIV１／Wosh64(PIV１としてラベルされる）vRNAを用いての陽性対照が同時に示されている。
【００５２】
図16は、決定された、図14Ｂに示されるrPIV３−１のRT−PCR 生成物における PIV３− PIV１連結の配列を示す。4 種の連結領域（領域Ｉ−IV）の個々のための配列が示されており、そしてrPIV３／JS (上部ライン）及び PIV１／Wash64 (下部ライン）のその対応する領域（RT−PCR 生成物から同時に配列決定された）と共に一列配列されている。垂直の棒は配列同一性を示し、そしてボックスで囲まれた領域は導入された突然変異及び制限部位を示す。キメラＦ遺伝子におけるGln のGlu コドンへの変化が濃いボックスにより示される。開始及び停止コドンは下線が引かれている。
【００５３】
図17は、rPIV３（左）又は PIV１（右）に比較しての、rPIV３−１のRT−PCR 生成物の領域III （左）及びIV（右）についての配列決定ゲルを示す。開始及び停止コドンはボックスにより示され、制限部位は矢印により示される。
図18は、組織培養物における親及びキメラPIV の多サイクル増殖を示す。 LLC−MK２細胞単層培養物を、0.01のMOI でウィルスにより接種し、そしてウィルス感染された細胞を、トリプシンの存在下で32℃でインキュベートした。組織培養物上清液を24時間の間隔で収穫し、そしてウィルス−感染された培養物を同定するために、赤血球吸着を用いての同じTCID５０アッセイにおいて分析した。個々の点は、示されるS. E. と共に、３種の別々の培養物の平均力価を表わす。水平の点線は、ウィルス検出の下限を示す。
【００５４】
図19は、pFLC. ２Ｇ＋. hc、すなわちキメラウィルスrPIV３−１のアンチゲノムcDNAクローン中への３種のＬ遺伝子突然変異の導入を示す。pTM(Ｌ)942／992 ／1558（Ａ）は、cp45に見出される３種の突然変異を担持するＬ遺伝子のプラスミドクローンである。 PIV３  Ｌタンパク質におけるアミノ酸位置942 での突然変異は、tyr(wt)→his (cp45)の置換であり、そして近くの EaeＩ部位はこの部位を示すために削除された。同様に、992 突然変異はleu →phe 変化であり、そして BsrＩ部は削除され、そして1558突然変異はthr→ile 変化であり、そして AvaII部位は削除された。
【００５５】
pTM(Ｌ)942／992 ／1558に存在する 2.9kbの SphＩ− NheＩフラグメントを、pFLC. ２Ｇ＋hc（Ｂ）、すなわちrPIV３−１の十分な長さのcDNAクローンを担持するプラスミド中に導入し、pFLC＋hc. cp45Ｌ（Ｃ）を得た。（Ｂ）及び（Ｃ）における構造体に関しては、黒色のボックスはＤ型肝炎ウィルスのリボザイム及びＴ７ターミネーターの位置を示し、そして濃い領域は PIV１ HN 及びＦ ORFであり、そして空白のボックスは PIV３に由来する配列を示す。pFLC. ２Ｇ＋hc. cp45Ｌをトランスフェクションに使用し、rPIV３−１．cp45Ｌと命名された、弱毒化されたキメラ組換えウィルスを生成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
本発明は、単離されたポリヌクレオチド分子、好ましいcDNAから感染性PIV を生成し、そして修飾するための組成物及び方法を提供する。感染性PIV 粒子は、感染性PIV 中への定義された変化の導入を可能にする組換え同時発現系により生成される。それらの修飾は、広範囲の種類の用途、たとえば予定された、定義された弱毒化突然変異を担持する弱毒化された生存ワクチン株の開発において有用である。
【００５７】
本発明の感染性PIV は、転写、複製ヌクレオカプシドを生成するために必要なウィルスタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチドと一緒に、PIV ゲノム又はアンチゲノムRNA をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子の細胞内又は細胞−フリーの同時発現により生成される。感染性PIV を生成するための同時発現のために有用なウィルスタンパク質の中には、次のものが存在する：主要ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｐ）、大きな（Ｌ）ポリメラーゼタンパク質、融合タンパク質（Ｆ）、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ糖タンパク質（NH）、及びマトリックス（Ｍ）タンパク質。PIV のＣ，Ｄ及びＶ ORFの生成物もまた、本発明において有用である。
【００５８】
PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、感染性PIV を形成するために、必要なウィルスタンパク質による細胞内又はインビトロ同時発現のために構成される。“PIV アンチゲノム”とは、子孫PIV ゲノムの合成のための鋳型として作用する単離されたポジティブ−センスのポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくは、転写し、複製するヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補的配列のポジティブ−センスの転写体によるハイブリダイズの可能性を最少にするために、複製性中間体RNA に対応するPIV ゲノム、又はアンチゲノムのポジティブ−センスバージョンであるcDNAが構成される。
【００５９】
本発明のいくつかの態様においては、組換えPIV(rPIV）のゲノム又はアンチゲノムは、それによりコードされるウィルス又はサブウィルス粒子を感染性にするのに必要なそれらの遺伝子又はそれらの一部を単に含む必要がある。さらに、前記遺伝子又はそれらの一部は、１よりも多くのポリヌクレオチド分子により供給され得、すなわち１つの遺伝子は別々のヌクレオチド分子からの相補性又は同様のものにより供給され得る。他の態様においては、PIV ゲノム又はアンチゲノムは、プラスミド又はヘルパー細胞系により提供されるヘルパーウィルス又はウィルス機能の関係を伴わないで、ウィルス増殖、複製及び感染のために必要なすべての機能をコードする。
【００６０】
“組換えPIV ”とは、組換え発現系に直接的に又は間接的に由来するか又はそれらから生成されるウィルス又はサブウィルス粒子から増殖された、PIV 又はPIV 株ウィルス又はサブウィルス粒子を意味する。組換え発現系は、PIV 遺伝子発現において調節的な役割を有する少なくとも１つの遺伝子要素又は複数の遺伝子要素、たとえばプロモーター、PIV RNA 中に転写される構造又はコード配列、及び適切な転写開始及び終結配列のアセンブリーを含んで成る組換え発現ベクターを用いるであろう。
【００６１】
cDNA−発現されたPIV ゲノム又はアンチゲノムから感染性PIV を生成するためには、ゲノム又はアンチゲノムが、（ｉ）RNA 複製できるヌクレオカプシドを生成し、そして（ii）子孫ヌクレオカプシドを、RNA 複製及び転写の両者のために有能にするのに必要なそれらのPIV Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質と共に同時発される。ゲノムヌクレオカプシドによる転写は、他のPIV タンパク質を提供し、そして生産性感染を開始せしめる。他方では、生産性感染のために必要とされる追加のPIV タンパク質は、同時発現により供給され得る。
【００６２】
上記ウィルスタンパク質と共にPIV アンチゲノム又はゲノムの合成はまた、たとえば組合された転写−翻訳反応、続く細胞のトランスフェクションを用いて、インビトロ（細胞−フリー）で達成され得る。他方では、アンチゲノム又はゲノムRNA は、インビトロで合成され、そしてPIV タンパク質を発現する細胞中にトランスフェクトされ得る。
【００６３】
本発明の一定の態様においては、転写し、複製するPIV ヌクレオカプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補的配列が、１又は複数のヘルパーウィルスにより供給される。そのようなヘルパーウィルスは、野生型でも又は変異体でもあり得る。好ましくは、ヘルパーウィルスは、PIV cDNAによりコードされるウィルスとは、表現型的に区別され得る。たとえば、ヘルパーウィルスとは免疫学的に反応するが、しかしPIV cDNAによりコードされるウィルスとは反応しないモノクローナル抗体を供給することが所望される。そのような抗体は、中和抗体であり得る。いくつかの態様において、前記抗体は、組換えウィルスからヘルパーウィルスを分離するためにアフィニティークロマトグラフィーにおいて使用され得る。そのような抗体の獲得を助けるためには、突然変異が、たとえばHN又はＦ糖タンパク質遺伝子に、ヘルパーウィルスからの抗原多様性を付与するためにPIV cDNA中に導入され得る。
【００６４】
本発明の他の態様においては、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望のPIV タンパク質は、ゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターと同じか又は異なる１又は複数の非ウィルス性発現ベクターによりコードされる。追加のタンパク質が、所望により含まれ得、その個々のタンパク質はそれ自体のベクターにより、又は１もしくは複数のＮ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIV タンパク質、又は完全なゲノムもしくはアンチゲノムをコードするベクターによりコードされる。
【００６５】
トランスフェクトされたプラスミドからのゲノム又はアンチゲノム、及びタンパク質の発現は、たとえばT7 RNA ポリメラーゼのための発現系、たとえばＴ７RNA ポリメラーゼを発現するワクシニアウィルスMVA 株組換え体による感染、トランスフェクション又はトランスダクションにより供給される、T7 RNA ポリメラーゼのためのプロモーターの制御下にある個々のcDNAにより達成され得る(Wyattなど., Virology, 210 : 202-205 (1995) ; 引用により本明細書に組込まれる）。ウィルスタンパク質、及び／又はＴ７RNA ポリメラーゼはまた、形質転換された哺乳類細胞により、又は予備形成されたmRNAもしくはタンパク質のトランスフェクションにより供給され得る。
【００６６】
PIV アンチゲノムは、PIV mRNA又はゲノムRNA の逆転写されたコピーのポリメラーゼ鎖反応又は同様のもの(PCR；たとえば、アメリカ特許第 4,683,195号及び第 4,683,202号、及びPCR Protocols :A Gudide to Methods and Applications, Innis など., eds., Academic Press, San Diego (1990) ; 個々は引用により本明細書中に組込まれる）により、完全なアンチゲノムを凝集体において表わすクローン化されたcDNAセグメントをアセンブルすることによって、本発明への使用のために構成され得る。
【００６７】
たとえば、適切なプロモーター（たとえば、Ｔ７RNA ポリメラーゼプロモーター）から、アンチゲノムの左側端までを含むcDNAを含んで成る第１構造体が生成され、そして適切な発現ベクター、たとえばプラスミド、コスミド、ファージ、又はDNA ウィルスベクターにおいてアセンブルされる。ベクターは、突然変異誘発、及び／又はアセンブリーを促進するよう企画されたユニーク制限部位を含む合成ポリリンカーの挿入により修飾され得る。容易な調製のためには、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIV タンパク質は、１又は複数の別々のベクターにおいてアセンブルされ得る。
【００６８】
アンチゲノムプラスミドの右側端は、所望により、追加の配列、たとえばフランキングリボザイム及びタンデムＴ７転写ターミネーターを含むことができる。リボザイムは、単一の非ウィルス性ヌクレオチドを含む３’末端を生成するハンマーヘッド型（たとえば、Grosfeldなど, (1995), 前記）であり得、又は他の適切なリボザイム、たとえば非−PIV ヌクレオチドを有さない３’末端を生成する肝炎デルタウィルス（Perrottaなど, Nature 350 : 434-436 (1991) ; 引用により本明細書に組込まれる）のリボザイムのいづれかであり得る。次に、左側及び右側端が、共通する制限部位を通して連結される。
【００６９】
種々のヌクレオチド挿入、欠失及び転位が、cDNAの構成の間、又はその後で、PIV ゲノム又はアンチゲノムにおいて行なわれ得る。たとえば、特定の所望のヌクレオチド配列が、合成され、そして常用の制限酵素部位を用いて、cDNAにおける適切な領域で挿入され得る。他方では、そのような技法、たとえば部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャンニング、PCR 突然変異誘発、又は当業界において良く知られている他のそのような技法が、cDNA中に突然変異を導入するために使用され得る。
【００７０】
ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAを構成するためのもう１つの手段は、サブユニットcDNA成分の数を、１又は２つなどの少ない断片に減じるために、改良されたPCR 条件（たとえば、Chengなど, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 5695-5699 (1994)に記載のような；これは引用により本明細書中に組込まれる）を用いての逆転写−PCR を包含する。他の態様においては、異なったプロモーター（たとえば、T3，SP6）、又は異なったリボザイム（たとえば、肝炎デルタウィルスのリボザイム）が使用され得る。異なったDNA ベクター（たとえば、コスミド）が、大きなサイズのゲノム又はアンチゲノムを良好に提供するための増殖のために使用され得る。
【００７１】
ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド（たとえば、cDNA）は、生産性PIV 感染を支持することができる細胞、たとえば HEp−２，FRhL− DBS２,LLC−MK２,MRC−５及びVero細胞中にトランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、トランスダクション又は同様の手段により挿入され得る。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、たとえばリン酸カルシウム−介在性トランスフェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725 (1978) ; Corsumo and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 : 603 (1981) ; Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456 (1973))、エレクトロポレーション(Neumannなど, EMBO J. 1 : 841-845 (1982)), DEAE −デキストラン介在性トランスフェクション(Ausubelなど, (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY (1987)) 、カチオン性脂質介在性トランスフェクション (Hawley−Nelsonなど, Focus 15 : 73-79 (1993))、又は市販のトランスフェクション試薬、たとえばLipofect ACEＲ（Life Technologies, Gaithersburg, MD)又は同様の手段により、培養された細胞中に導入され得る（前記個々の引例は、引用により本明細書中に組込まれる）。
【００７２】
上記で示されたように、本発明のいくつかの態様においては、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIV タンパク質は、ゲノム又はアンチゲノムをコードするウィルスとは、表現型的に区別できる１又は複数のヘルパーウィルスによりコードされる。Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望のPIV タンパク質はまた、ゲノム又はアンチゲノム、及びその種々の組合せをコードするベクターと同じか又は異なる１もしくは複数の発現ベクターによってもコードされ得る。それ自体のベクターにより、又は１又は複数のＮ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIV タンパク質、又は完全なゲノム又はアンチゲノムをコードするベクターによりコードされる追加のタンパク質が、所望により含まれ得る。
【００７３】
本発明の組成物及び方法は、選択されたPIV タンパク質の機能又は発現を変更するために、たとえば、定義された突然変異を用いて、PIV 分子生物学及び病原性機構の分析及び操作を可能にする。それらの方法及び組成物を用いれば、偶発的なサイレント突然変異と所望の表現型変化を担当する突然変異とを容易に区別し、そしてワクチン生成のために組換えPIV ゲノム又はアンチゲノム中への組込みのための表現型−特異的突然変異を容易に選択することができる。
【００７４】
本発明内に提供されるPIV の修飾は、たとえばウィルス弱毒化及びワクチン免疫原性を増強するために、不所望の免疫病理学に関係するエピトープを削除するために、抗原ドリフトを提供するために、改良されたワクチンウィルスの生成に向けられる。それらの及び他の目的を達成するためには、本発明の組成物及び方法は、感染性組換えPIV 中への組込みのためのPIV ゲノム又はアンチゲノム中への広範囲の種類の修飾の導入を可能にする。たとえば、保護抗原又はエピトープをコードする外来性遺伝子又は遺伝子セグメントが、保護抗原が由来するPIV 及びもう１つのウィルス又は剤の両者に対する免疫性を誘発することができるPIV ウィルス株を生成するためにPIV クローン内に付加され得る。あるいは、ワクチンウィルスの免疫原性を増強するために、免疫系のモジュレーター、たとえばサイトカインをコードする外来性遺伝子が、全部又は一部、挿入され得る。
【００７５】
本発明のPIV クローン内に包含され得る他の突然変異は、たとえば、異種遺伝子又は遺伝子セグメント（たとえば、糖タンパク質遺伝子の細胞質末端をコードする遺伝子セグメント）の、カウンターパートの遺伝子又は遺伝子セグメントによるPIV クローンにおける置換を包含する。他方では、PIV クローン内の遺伝子の相対的順序を変えることができ、PIV ゲノムプロモーターはそのアンチゲノムカウンターパートにより置換され得、又は選択された遺伝子は非機能的にされ得る（たとえば、遺伝子の発現を阻止するために停止コドンの導入を包含する機能的削除による）。PIV クローンにおける他の修飾は、操作、たとえば種々の非コード又はコード領域又は他の場所におけるユニーク制限部位の挿入を促進するために行なわれ得る。さらに、翻訳されていない遺伝子配列が、外来性配列を挿入するための能力を高めるために除去され得る。
【００７６】
従って、PIV の感染性クローンを提供することによって、本発明は、PIV ゲノム（又はアンチゲノム）内で組換え的に生成される広範囲の変更を可能にし、所望の表現型変化を規定する、定義された突然変異を生成する。“感染性クローン”とは、感染性ウィルス又はサブウィルス粒子のゲノムを生成するために鋳型として作用することができるゲノム又はアンチゲノムRNA 中に転写され得る感染性ビリオン中に直接的に組込まれ得る、cDNA又はその生成物、合成物又は他方では、RNA を意味する。上記で示されたように、定義された突然変異は、種々の従来の技法（たとえば、特定部位の突然変異誘発）により、ゲノム又はアンチゲノムのcDNAコピー中に導入され得る。
【００７７】
本明細書において記載されたような完全なゲノム又はアンチゲノムcDNAをアセンブルするためへのゲノム又はアンチゲノムcDNAサブフラグメントの使用は、個々の領域が別々に操作され得、ここで小さなcDNA対象が大きなcDNA対象よりも、より容易な操作を提供し、そして次に、完全なcDNAに容易にアセンブルされ得る利点を有する。従って、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNA、又は選択されたそのサブフラグメントが、特定オレゴヌクレオチドの突然変異誘発のための鋳型として使用され得る。
【００７８】
これは、たとえば、 Bio−Rad Laboratories (Richmond, CA) のMUTA−geneＲキット、又は鋳型として二本鎖プラスミドを直接的に用いる方法、たとえばStratagene (La Jolla, CA）のChameleon Ｒ突然変異誘発キットを用いて、又は興味ある突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマー又は鋳型のいづれかを用いるポリメラーゼ鎖反応により、一本鎖ファージミド (phagemid) 形の中間体を仕上げることができる。次に、突然変異誘発されたサブフラグメントが、完全なアンチゲノム又はゲノムcDNAにアセンブルされ得る。種々の他の突然変異誘発技法が知られており、そして本発明のPIV アンチゲノム又はゲノムcDNAにおける興味ある突然変異を生成することへの使用のために通常、適合され得る。
【００７９】
従って、１つの例示的な機能においては、突然変異は、 Bio−Rad Laboratoriesから入手できるMUTA−geneＲファゲミドインビトロ突然変異誘発キットを用いることによって導入される。手短に言及すれば、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするcDNAが、プラスミドpTZ18U中にクローン化され、そしてCJ236 細胞(Life Technologies）を形質転換するために使用される。ファージミド調製物は、製造業者により推薦されるようにして調製される。オリゴヌクレオチドが、ゲノム又はアンチゲノムの所望の位置での変更されたヌクレオチドの導入による突然変異誘発のために企画される。次に、遺伝子的に変更されたゲノム又はアンチゲノムを含むプラスミドが、増幅される。
【００８０】
突然変異は、単一のヌクレオチドの変更から、１又は複数の遺伝子又は遺伝子セグメントを含む大きなcDNAセグメントの導入、欠失又は置換まで変化することができる。ゲノムセグメントは、構造及び／又は機能ドメイン、たとえばタンパク質の細胞質、トランスメンブラン又はエクトドメイン、活性部位、たとえば異なったタンパク質との結合又は他の生化学的相互作用を仲介する部位、エピトープ部位、たとえば抗体結合、及び／又は体液又は細胞介在性免疫応答を刺激する部位、等に対応することができる。これに関する有用なゲノムセグメントは、タンパク質の小さな機能的ドメイン、たとえばエピトープ部位をコードするゲノムセグメントの場合の約13〜35個のヌクレオチドから約50，75，100, 200〜500 及び 500〜1,500 又はそれ以上のヌクレオチドまでの範囲である。
【００８１】
定義された突然変異を感染性PIV 中に導入する能力は、PIV 病原及び免疫原機構の操作を包含する多くの用途を有する。たとえば、Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬタンパク質、並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する、PIV タンパク質の機能は、タンパク質発現のレベルを削減するかもしくは低め、又は変異体タンパク質を生成する突然変異を導入することによって操作され得る。１つのそのような典型的な修飾においては、Ｆタンパク質の分解部位での配列が修飾され得、そして得られるPIV の組織培養における増殖、及びそのPIVの感染及び病因に対するこの修飾の効果は、通常、実験動物において決定され得る。
【００８２】
種々のゲノムRNA 構造特徴、たとえばプロモーター、遺伝子間領域及び転写シグナルはまた、本発明の方法及び組成物内で通常、操作され得る。トランス−作用性タンパク質及びシス−作用性RNA 配列の効果は、たとえば、PIV ミニゲノムを用いる平行したアッセイにおいて、完全なアンチゲノムcDNAを用いて、容易に決定され得（Dimock, など, J. Virol. 67 : 2772-8 (1993) ;これは引用により本明細書に組込まれる）、この救援−依存性状態は複製−無関係感染ウィルスにおいて回収されるほど阻害性であり得るそれらの変異体の特徴化において有用である。
【００８３】
本発明はさらに、疑わしい突然変異を、感染性野生型（すなわち、１又は複数の表現型特性、たとえば感温性、選択された宿主における複製、等のために）PIV のゲノム又はアンチゲノム中に、別々に、及び種々の組合せで導入することによって、偶発的なサイレント突然変異と表現型差異を担当する突然変異との間を容易に区別する手段及び方法を提供する。この方法は、所望のワクチン表現型、たとえば弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等を担当する突然変異の同定を可能にする。次に、それらの方法により同定された突然変異は、ワクチンウィルスを適切な弱毒化レベルに修飾するために、所望により、種々の組合せで導入され得る。さらに、本発明は、異なったウィルス株から単一のワクチン株に突然変異を組合す能力を提供する。
【００８４】
上記で示されたように、組換え的に変更されたPIV クローン内に組込まれる突然変異は、所望の表現型変化を生成するか、又は種々の他の目的のための、選択されたPIV タンパク質の発現及び／又は機能を変更するそれらの能力に基づいて選択され得る。所望の表現型変化は、たとえば培養物におけるウィルス増殖、感温性、プラークサイズ、弱毒化及び免疫原性の変化を包含する。たとえば、ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列は、弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、遺伝子発現の変更、又は免疫原エピトープの変化を特定するためにヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾され得る。
【００８５】
本発明の１つの観点においては、生物学的に誘導され、弱毒化されたPIV に存在する突然変異が、同定され、そして十分な長さのPIV クローン中に、個々に又は組合して導入され、そしてその導入された突然変異を含む獲得された組換えウィルスの表現型が決定される。典型的な態様においては、野生型PIV に対する生物学的に誘導された変異体ウィルスにより示されるアミノ酸変化、たとえばts,ca又はatt 表現型を有するPIV 変異体により示される変化が、組換えPIV クローン内に導入される。生物学的に誘導された変異体PIVからのそれらの変化は、得られるクローンにおける所望の特徴、たとえばHPIV３変異体JS cp45 から採用された突然変異により特定される弱毒化表現型を特定する。それらの変化は好ましくは、遺伝的復帰に対して突然変異を安定化する効率を有する、対応する野生型又は生物学的に誘導された変異体配列に比較して、２又は３個のヌクレオチド変化を用いて組換えウィルス中に導入される。
【００８６】
本発明はまた、感染性クローンのゲノム又はアンチゲノム中に選択された組合せで導入される、複数の表現型−特異的突然変異を有する組換えPIV を提供する。表現型の評価と対をなすこの方法は、弱毒化、感温性、低温適合化、小さなプラークサイズ、宿主範囲の制限、等のような所望する特性を有する変異体組換えPIV を供給する。従って、１又は複数の、そして好ましくは少なくとも２種の弱毒化突然変異、たとえば生物学的に誘導されたPIV 変異体、たとえばJS cp45 から採用されたts, ca又はatt 突然変異を組込む典型的なPIV クローンが開示される。
【００８７】
本明細書に関して、組換えPIV において生物学的に誘導された突然変異を採用するための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−イノラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、及びＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。遺伝子外配列、たとえばPIV ゲノムの３’側リーダー又はトレイラー領域における、及びシス−作用性要素、たとえば遺伝子開始及び遺伝子終結配列、たとえばＮ遺伝子開始シグナルにおける配列がまた、標的化される。本明細書において組換えPIV に組込まれる典型的な突然変異は、たとえばTyr 942, Leu 992及び／又はThr 1558 で、ポリメラーゼＬ遺伝子におけるアミノ酸変化を特定する１又は複数のヌクレオチド置換を包含する。
【００８８】
たとえば、Tyr 992がHis により置換され、Leu 992がPhe により置換され、そして／又はThr 1558 がIle により置換されているPIV 組換え体が開示される。それらの突然変異は、下記例に記載されるｒ942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942 ／992,ｒ992 ／1558, ｒ942 ／1558、又はｒ942 ／992 ／1558組換え体を包含する、本明細書における種々の典型的なPIV 組換え体に連続的に組込まれて来た。生物学的に誘導されたPIV 変異体から採用される他の典型的な突然変異は、JS cp45 の残基Val 96 又はSer 389に対応する位置での特定の突然変異を包含する、Ｎタンパク質における１又は複数の突然変異を包含する。より詳細な観点においては、それらの突然変異は、Val 96 →Ala 又はSer 389→Ala として表わされる。
【００８９】
Ｃタンパク質におけるアミノ酸置換、たとえば、好ましくはIle 96 →Thr の置により表わされる、JS cp45 のIle 96 に対応する位置での突然変異をコードする組換えPIV が、下記例に記載される。生物学的に誘導されたPIV 変異体から採用された、さらなる典型的な突然変異は、好ましくはアミノ酸置換Ile 420→Val 又はAla 450→Thr により表わされる、JS cp45 の残基Ile 420又はAla 450に対応する位置でJS cp45 から採用される突然変異を包含する、Ｆタンパク質における１又は複数の突然変異を包含する。本発明内の他のPIV 組換え体は、好ましくは置換Val３８４→Ala により表わされる、JS cp45 の残基Val 384に対応する位置での突然変異を採用する組換え体PIV により例示されるように、HNタンパク質における１又は複数のアミノ酸置換を採用する。
【００９０】
本発明のこの観点内のように追加例は、遺伝子外配列、たとえば組換えPIVゲノム又はアンチゲノムの３’側リーダー配列における１又は複数の突然変異を組込む組換えPIV を包含する。これに関しての典型的な突然変異は、JS cp45 のヌクレオチド23でのＴ→Ｃ変化、ヌクレオチド24でのＣ→Ｔ変化、又はヌクレオチド28でのＧ→Ｔ変化を包含する、それらのヌクレオチド23，24及び／又は28に対応する１又は複数の位置での３’側リーダー配列における突然変異を包含する。さらなる追加の遺伝子外突然変異は、好ましくは、Ａ→Ｔ変化により表わされる、JS cp45 のヌクレオチド62に対応する位置でのＮ遺伝子開始配列における突然変異により例示されるように、Ｎ遺伝子開始配列における１又は複数の突然変異を包含する。
【００９１】
生物学的に誘導された変異体PIV から採用される上記の典型的な突然変異は、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N及びrcp45 F として本明細書において命名された組換え体により例示されるように、新規の弱毒化された候補体ワクチン株を、個々に及び／又は組合してもたらすよう、下記例において評価され、そして組換えPIV 中に組合される。本発明内の他のPIV 組換え体は、１又はそれよりも多くのそれらの典型的な組換え体に存在する突然変異の多くの及び十分なまでの相補体、及び本明細書における教授に従って組換えPIVにおいて同定され、そして採用された、他の生物学的に誘導された変異体PIV 株に同定される突然変異を組込むであろう。
【００９２】
本明細書に開示される方法に従って同定される突然変異は、“メニュー”中に編集され、そしてワクチンウィルスを弱毒化、免疫原性及び安定性の選択されたレベルに対応されるために種々の組合せで導入される。好ましい態様においては、本発明は、生物学的に誘導されたPIV から採用される１又は複数の突然変異、たとえばts,ca又はatt 突然変異、及び同じか又は異なった遺伝子を包含する追加のタイプの突然変異の補充を提供する。これに関しての突然変異のための標的遺伝子はまた、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、及びＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。
【００９３】
１つの観点においては、少なくとも１つの弱毒化突然変異がPIV ポリメラーゼ遺伝子Ｌにおいて存在し、そして生物学的に誘導された変異体PIV 株、たとえばJS cp45 から採用されるts又はatt 表現型を特定するヌクレオチド置換を包含する組換えPIV が供給される。本明細書に開示される典型的なHPIV３組換え体は、下記例に記載される、ｒ942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942 ／992,ｒ992 ／1558，ｒ942 ／1558、又はｒ942 ／992 ／1558組換え体を包含する。それらの典型的なPIV クローンは、Tyr 942, Leu 992、及び／又はThr 1558 で、ポリメラーゼ遺伝子においてアミノ酸変化をもたらす１又は複数のヌクレオチド置換を組込む。たとえば、Tyr 942がHis により置換され、Leu 992がPhe により置換され、そして／又はThr 1558 がIle により置換されているPIV 組換え体が開示される。好ましくは、２又は３個の突然変異が、表現型復帰に対する高められた安定性を付与する弱毒化突然変異を特定するコドンに組込まれる。
【００９４】
さらなる観点においては、種々の他の遺伝子変更が、感染性組換えPIV 中への組込みのために組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムにおいて、単独で、又は生物学的に誘導された変異体PIV から採用される１又は複数の弱毒化突然変異と一緒に、生成され得る。異種遺伝子（たとえば、異なったPIV 株又は非−PIV 源、たとえば他のウィルス、たとえばRSV 又は麻疹ウィルスからの）が、全体的に又は一部、挿入され、又は置換され、遺伝子の順序が変えられ、遺伝子オーバーラップが除去され、PIV ゲノムプロモーターがそのアンチゲノムカウンターパートにより置換され、そしてさらに、非必須遺伝子が欠失され得る。
【００９５】
１つの観点においては、選択されたPIV 遺伝子、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFが、新規の表現型特徴、たとえば増強されたインビトロ増殖及び／又はインビボ弱毒化を有する組換えPIV を生成するために、機能的に欠失される。本発明の感染性PIVクローンはまた、その免疫原性を増強し、そして天然の感染により生成される保護よりも強いレベルの保護を誘発するか、又は所望しない免疫病理学的反応に関連するエピトープを削除するよう構築され得る。本発明により生成されるワクチンの増強された免疫原性は、PIV を制御することに対する１つの最大の障害、すなわち天然の感染により誘発される免疫性の不完全な性質を取り組む。
【００９６】
この場合、追加の遺伝子又は遺伝子セグメントが、共通する又は独立した転写シグナル組の制御下で配置され得るPIV ゲノム又はアンチゲノム中に又はその近くに挿入され得る。興味ある遺伝子は、サイトカイン（たとえばIL−２〜IL−15、特にIL−２，IL−６及びIL−12、等）、及びＴヘルパー細胞エピトープに富んでいるタンパク質をコードするそれらの遺伝子を包含する。追加のタンパク質は、別々のタンパク質として、又はPIV タンパク質の１つの第２のコピー、たとえばHNから構築されたキメラとして発現され得る。これは、PIV に対する免疫応答を、定量的及び定性的に修飾し、そして改良する能力を提供する。
【００９７】
本発明内の有用な他の突然変異は、ゲノムの３’末端の、RNA 複製及び転写の変化に関連する、アンチゲノムからのそのカウンターパートによる置換を包含する。さらに、遺伝子間領域は、配列含有において、短くされたり又は長くされたりされ得、又は変更され得る。さらに追加の観点においては、ワクチン配合において有用なPIV は便利には、循環ウィルスにおける抗原流動性を順応せしめるために修飾され得る。典型的には、その修飾は、HN及び１又はＦタンパク質に存在するであろう。たとえば、完全なHN又はＦ遺伝子、又は特定の免疫原性領域をコードするセグメントの選択された抗原形が、PIV ゲノム又はアンチゲノムcDNA中に、感染性クローンにおけるカウンターパート領域の置換により、又はいくつかの抗原形がその得られるクローンにおいて表わされるよう遺伝子の１又は複数のコピーを付加することによって、組込まれ得る。次に、修飾されたPIV cDNAから生成された子孫ウィルスが、出現する株に対して予防接種プロトコールに使用される。
【００９８】
本発明の感染性PIV への使用のための他の突然変異は、PIV ミニゲノムの突然変異分析の間に同定されるシス−作用性シグナルにおける突然変異を包含する。たとえば、リーダー、トレイラー及びフランキング配列の挿入及び欠失分析は、ウィルスプロモーター及び転写シグナルを同定し、そしてRNA 複製又は転写の種々の程度の低下に関連する一連の突然変異を提供する。それらのシス−作用性シグナルの飽和突然変異誘発（それにより、個々の位置が個々の選択されるヌクレオチドに、順に修飾される）はまた、RNA 複製又は転写を低め又は高める突然変異を同定する。それらの突然変異のいずれかが、本明細書に記載のようにして、完全なアンチゲノム又はゲノム中に挿入され得る。
【００９９】
PIV クローンにおける追加の修飾が、操作、たとえば種々の遺伝子間領域又は他の場所におけるユニーク制限部位の挿入を促進せしめるために行なわれ得る。翻訳されていない遺伝子配列がまた、外来性配列を挿入するための能力を高めるために除去され得る。
【０１００】
本発明の組換えPIV 内の遺伝子又は遺伝子セグメントの一定の置換、挿入、欠失又は転位（たとえば、選択されたタンパク質又はタンパク質領域、たとえば細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位を含む領域、等をコードする遺伝子セグメントの置換）が、同じか又は異なったPIV 又は他の源からの存在する“カウンターパート”遺伝子又は遺伝子セグメントに対して構造的又は機能的関係で行なわれる。そのような修飾は、野生型又は親PIV 又は他のウィルス株に比較して、所望する表現型変化を有する新規の組換え体を生成する。たとえば、このタイプの組換え体は、もう１つのPIV のエクトドメインに融合される１つのPIV の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現することができる。このタイプの他の典型的な組換え体は、重複タンパク質領域、たとえば重複免疫原性領域を発現する。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、“カウンターパート”遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質、又はタンパク質領域は典型的には、異種源（たとえば、異なったPIV 遺伝子からの、又は異なったPIV 型又は株において同じ（すなわち、相同又は対立遺伝子）遺伝子又は遺伝子セグメントを表わす）からである。これに関して、選択される典型的なカウンターパートは、全体的な構造特徴を共有し、たとえば個々のカウンターパートは、比較できるタンパク質又はタンパク質構造ドメイン、たとえば細胞質ドメイン、トランスメンブランドメイン、エクトドメイン、結合部位又は領域、エピトープ部位又は領域、等をコードすることができる。カウンターパートドメイン及びそれらのコード遺伝子セグメントは、ドメイン又は遺伝子セグメント変異体間で共通する生物学的活性により定義される広範囲のサイズ及び配列の流動性を有する種の集団を包含する。
【０１０２】
たとえば、本発明内のカウンターパート遺伝子セグメントによりコードされる２種の選択されたタンパク質ドメインは、たとえば膜延長機能、特定の結合活性、免疫学的認識部位、等を提供する、実質的に同じ性質的な活性を共有する。より典型的には、カウンターパート間で、たとえば選択されたタンパク質セグメント又はタンパク質間で共有される特定の生物学的活性は、定量的に実質的に類似し、すなわち、それらはそれぞれの定量活性レベルにおいて、30％以上、好ましくは20％以上、より好ましくは５〜10％以上、変化しないであろう。
【０１０３】
本発明の組換えPIV を生成するために本明細書に開示される、カウンターパート遺伝子及び遺伝子セグメント、及び他のポリヌクレオチドは、好ましくは、選択されたポリヌクレオチド“対照配列”と、たとえばもう１つの選択されたカウンターパート配列と実質的な配列同一性を共有する。本明細書において使用される場合、“対照配列” (reference sequence) とは、配列比較のための基礎として使用される定義された配列、たとえば十分な長さのcDNA又は遺伝子のセグメント、又は完全なcDNA又は遺伝子配列である。一般的に、対照配列は、少なくとも20個の長さのヌクレオチド、時おり、少なくとも25個の長さのヌクレオチド、及びしばしば少なくとも50個の長さのヌクレオチドのものである。
【０１０４】
２種のポリヌクレオチドはそれぞれ、（１）それらの２種のポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含んで成り、そして（２）さらに、それらの２種のポリヌクレオチド間で互いに異なる配列を含んで成るので、２種（又はそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局部領域を同定し、そして比較するために“比較窓”に対してそれらの２種のポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。
【０１０５】
“比較窓”（reference window) とは、本明細書において使用される場合、少なくとも20個の連続したヌクレオチド位置の概念的セグメントを意味し、ここでポリヌクレオチド配列は少なくとも20個の連続したヌクレオチドの対照配列に比較され得、そして比較窓におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２種の配列の最適な一列配列のための対照配列（付加又は欠失を包含しない）に比較される場合、20％又はそれ以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。
【０１０６】
比較窓を一列配列するための配列の最適な一列配列は、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2 : 482 (1981) の局部相同アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48 : 443 (1970) の相同一列配列アルゴリズムにより、Pearson & Lipmon, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 05 : 2444 (1988) の類似性調査方法により、それらのアルゴリズムのコンピューター処理された実施により（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Conputer Grop, 575 Science Dr., Madison, WI におけるGAP, BESTFIT, FASTA 及びTFASTA）、又は検査により行なわれ得、そして種々の方法により生成される最良の一列配列（すなわち、比較窓に対して配列類似性の最高％をもたらす）が選択される。
【０１０７】
用語“配列同一性”とは、２種のポリヌクレオチド配列が、比較窓に対して同一である（すなわち、ヌクレオチド×ヌクレオチドに基づいて）ことを意味する。用語“配列同一性の百分率”は、比較窓に対して２種の最適に一列配列された配列を比較し、同一の核酸塩基（たとえば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ、又はＩ）が、適合された位置の数を得るために、両配列において存在する位置の数を決定し、前記適合された位置の数を、比較窓における位置の合計数（すなわち、窓サイズ）により割り算し、そして配列同一性の％を得るために、前記結果に100 を掛け算することによって計算される。
【０１０８】
用語“実質的な同一性”とは、本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ここで前記ポリヌクレオチドは、少なくとも20個のヌクレオチド位置の比較窓に対して、時おり、少なくとも25〜50個のヌクレオチドの窓に対し、対照配列に比較される場合、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性、より通常には、少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含んで成り、ここで配列同一性の％は、比較窓に対して対照配列の合計20％又はそれ以下の配列において欠失又は付加を包含することができるポリヌクレオチド配列に対して対照配列を比較することによって計算される。対照配列は、より長い配列のサブセットであり得る。
【０１０９】
それらのポリヌクレオチド配列の関係の他に、本発明の組換えPIV によりコードされるタンパク質及びタンパク質領域はまた、典型的には、保存的関係を有するように、すなわち選択された対照ポリペプチドに対して、実質的な配列同一性又は配列類似性を有するように選択される。ポリペプチドに適用される場合、用語“配列同一性”とは、ペプチドが対応する位置で同一のアミノ酸を共有することを意味する。用語“配列類似性”とは、ペプチドが対応する位置で、同一の又は類似するアミノ酸（すなわち保存性置換）を有することを意味する。
【０１１０】
用語“実質的な配列同一性”とは、２種のペプチド配列が、たとえば欠如ギャップ重量(default gap weights）を用いてのプログラムGAP 又はBESTFIT により、最適に一列配列される場合、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％の配列同一性又はそれ以上（たとえば99％）の配列同一性を共有することを意味する。用語“実質的な類似性”とは、２種のペプチド配列が対応する％の配列類似性を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【０１１１】
保存性アミノ酸置換とは、類似する側鎖を有する残基の互換性を言及する。たとえば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸グループはセリン及びトレオニンであり；アミド−含有側鎖を有するアミノ酸グループはアスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸グループはフェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸グループはリシン、アルギニン及びヒスチジンであり；そして硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸グループはシステイン及びメチオニンである。
【０１１２】
好ましい保存性アミノ酸置グループは次のものである：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミン。本明細書において使用される20種の天然に存在するアミノ酸についての略語は、従来の使用法に従がう（Immunology-A Synthesis (2nd ed., E. S. Golub & D. R. Gren, eds., S-inauer Associates, Sunderland, MA, 1991 ;それらは引用により本明細書に組込まれる）。20種の従来のアミノ酸、非天然のアミノ酸、たとえばα，α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の異例なアミノ酸の立体異性体（たとえば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。
【０１１３】
異例なアミノ酸の例としては、次のものを挙げることができる：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−N,N,N−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、Ｓ−ヒドロキシリジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシプロリン）。さらに、アミノ酸は、グリコシル化、リン酸化及び同様のものにより修飾され得る。
【０１１４】
cDNA−発現されたゲノム又はアンチゲノムから生成された感染性PIV は、たとえばヒト、ウシ、ネズミ、等からのPIV 又は PIV−様株のいづれかであり得る。保護免疫応答を生ぜしめるためには、PIV 株は、免疫化される対象に対して内因性であるものであり、たとえばヒトPIV がヒトを免疫化するために使用される。しかしながら、ゲノム又はアンチゲノムは、異種PIV 遺伝子又は遺伝子セグメント、又は他の異種源、たとえばRSV 、又は麻疹ウィルスからの遺伝子又は遺伝子セグメントを発現するために修飾され得る。従って、ヒトへの投与のために意図された感染性PIV は、たとえば弱毒化のために、ウシ又はネズミPIV 型からの遺伝子又は遺伝子セグメントを含むよう修飾されたヒトPIV であり得る。
【０１１５】
BPIV３は、アカゲザル及びヒトにおいてその複製を制限する宿主域変異を有する（Karronなど.,前記, 1995a ; ran Wyke Coelingh など, 1988；それらは引用により本明細書中に組込まれる）。所望する表現型、たとえば宿主域制限を特定するBPIV３の遺伝子、突然変異及びシス−作用性調節配列は、本発明のrPIVにおける対応する配列によるそれらの置換により同定され、そしてさらに有用なワクチン剤を開発するために、さらに修飾されたrPIV内に組込まれるであろう。
【０１１６】
同様に、アカゲザルのための非−ts宿主域弱毒化突然変異を付与することが知られているJS cp45 の突然変異（Hallなど, 前記, (1992)）は、同様に同定され、そして本発明の修飾されたrPIVワクチン剤中に組込まれる。他方では、ウシPIV は、たとえばヒトPIV 感染に対する保護を誘発するタンパク質、又は免疫原エピトープをコードする遺伝子を含むよう修飾され得る。たとえば、ヒトPIV 糖タンパク質遺伝子は、ウシPIV がヒトPIV 株に対して、ヒトにおいて保護免疫応答を誘発するよう、カウンターパートのウシ糖タンパク質遺伝子により置換され得る。
【０１１７】
典型的な態様においては、１つのPIV の個々の遺伝子、遺伝子セグメント、又は単一の又は複数のヌクレオチドが、異種PIV 又は他の源からのカウンターパート配列により置換される。たとえば、１つのPIV からの選択されたタンパク質の異種遺伝子セグメント、たとえば細胞質末端、トランスメンブランドメイン又はエクトドメイン、エピトープ部位又は領域、結合部位又は領域、活性部位又は活性部位を含む領域、等をコードする遺伝子は、新規組換え体、たとえばもう１つのPIV のエクトドメインに融合される１つのPIV の細胞質末端及び／又はトランスメンブランドメインを有するキメラタンパク質を発現する組換え体を生成するために、もう１つのPIV におけるカウンターパート遺伝子セグメントにより置換される。これに関しての好ましいゲノムセグメントは、タンパク質の小さな機能的ドメイン、たとえばエピトープ部位をコードする遺伝子セグメントの場合、約15〜35のヌクレオチドから、大きなドメイン又はタンパク質領域をコードする遺伝子セグメントの場合、約50，75，100, 200〜500 又は 500〜1,500 又はそれ以上のヌクレオチドまでの範囲である。
【０１１８】
本発明の１つの観点においては、１つのPIV 株のHN及び／又はＦタンパク質の選択されたドメインが、免疫化された宿主において両PIV 株に対する交差−保護免疫応答を刺激することができる組換えウィルスを生成するために、異種PIV クローン中に置換される。他の態様においては、ヒトPIV ゲノム又はアンチゲノム配列、及び少なくとも１つの非ヒトPIV 配列のキメラ、たとえばヒト及びウシの両PIV からの配列を含むポリヌクレオチドを含んで成る修飾されたPIV クローンが提供される。ヒトPIV コード配列又は非コード配列（たとえば、プロモーター、遺伝子−終結、遺伝子−開始、遺伝子間又は他のシス−作用性要素）のカウンターパートウシ又はネズミPIV 配列による置換は、種々の可能な弱毒化効果を有する組換え体を生成する。
【０１１９】
たとえば、宿主域効果は、他の有用な弱毒化効果の中で、ヒト細胞において効果的に機能しない異種PIV 遺伝子から、すなわち生物学的に相互作用するヒトPIV 配列又はタンパク質と異種配列又はタンパク質（たとえば、ウィルス転写、翻訳、アセンブリー、等のために置換された配列又はタンパク質と通常、協力する配列又はタンパク質）との不適合性からしばしば発生するであろう。本発明のさらにもう１つの観点においては、外来性遺伝子又は遺伝子セグメント、及びいくつかの場合、非コードヌクレオチド配列のPIV ゲノム中への挿入は、さらに追加の所望の表現型効果を引き起こす、ゲノムの長さの所望の上昇をもたらす。
【０１２０】
高められたゲノムの長さは、挿入体の長さに一部、依存して、得られるPIV クローンの弱毒化をもたらすことが予測される。さらに、組換えPIV 中に挿入された遺伝子からの一定のタンパク質の発現は、そのタンパク質の作用のために、ウィルスの弱毒化をもたらすであろう。これは、ワクシニアウィルスにおいて発現されるIL−２について記載されており（たとえば、Flexner など, Nature 33 : 259-62 (1987) を参照のこと）、そしてまた、γインターフェロンのために予測されるであろう。
【０１２１】
本発明の組換えPIV における完全なウィルス遺伝子又は遺伝子セグメントの変化を包含する欠失、挿入、置換及び他の突然変異は、免疫抑制された個人の場合に特に有用である、非常に安定したワクチン候補体を生成する。それらの突然変異の多くは、得られるワクチン株の弱毒化をもたらし、そして他は、異なったタイプの所望する表現型変化を特定するであろう。たとえば、宿主免疫性を特異的に妨害するタンパク質をコードする一定のウィルス遺伝子は知られている（たとえば、Katoなど., EMBO. J. 16 : 578-87 (1997)を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる）。ワクチンウィルスにおけるそのような遺伝子の削除は、毒性及び病因を低め、そして／又は免疫原性を改良することが予測される。
【０１２２】
本発明の好ましい観点においては、修飾されたPIV クローンは、複数のヒトPIV ゲノムのキメラ、たとえば１又は複数の異種ヒトPIV 、たとえばHPIV１及びHPIV２からの配列に連結されるHPIV３からのポリヌクレオチド配列を含むクローンを表わす。従って、ヒト PIV３の個々の遺伝子又は遺伝子セグメントは、HPIV１又はHPIV２からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換され又は複製され得、又は逆も真である。下記に記載される１つの例においては、本発明は、PIV クローン、すなわちHPIV１のHN及びＦ糖タンパク質の両者がHPIV３バックグラウンドにおけるそれらのカウンターパート遺伝子を置換し、両親の株を表わす免疫学的特徴を有するキメラウィルスを生成するrPIV３−１を提供する。
【０１２３】
本発明の追加の観点においては、上記のような、遺伝子又は遺伝子セグメントの他の変更を有するキメラPIV 又はPIV クローンが、弱毒化された、又はさらに弱毒化されたキメラ変異誘導体を達成するために、生物学的に誘導された変異体PIV 、たとえばHPIV３ JScp45から採用される１又は複数の弱毒化突然変異を導入することによってさらに修飾される。たとえば、１又は複数のヒトPIV コード又は非コードポリヌクレオチドが上記のようにして、異種ヒトPIV、ウシPIV 又はネズミPIV からのカウンターパート配列により置換され得、そしてこの変更が、弱毒化された又はさらに弱毒化された（すなわち、キメラクローン又は生物学的に誘導された親ウィルスのいづれかと比較して）ワクチンウィルスを得るために、生物学的に誘導された、弱毒化されたPIV 変異体から採用されるts, ca又はatt 表現型を特定する１又は複数の突然変異により組合され得る。
【０１２４】
他方では、非必須遺伝子又は遺伝子セグメント、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFの機能的欠失が、弱毒化されたワクチン株を生成するために、生物学的に誘導されたPIV 変異体からのts, ca又はatt 表現型を特定する１又は複数の突然変異と共に組換えPIV において組合され得る。それらの組合せ修飾は、所望の表現型特徴、たとえば高められたウィルス収率、高められた弱毒化、弱毒化された表現型からの復帰に対する遺伝子耐性を、異なった選択された突然変異の組合された効果のために有する組換えPIV を生成する。
【０１２５】
１つの組合せ突然変異企画においては、ヒトPIV ゲノム又はアンチゲノム配列及び少なくとも１つの非ヒトPIV 配列のキメラ、たとえばヒト及びウシの両PIV からの配列を含むポリヌクレオチドを含んで成り、そしてまた、生物学的に誘導されたPIV から採用された１又は複数の突然変異、たとえば１又は複数の天然に存在するts,ca又はatt 突然変異を組込んでいる修飾されたPIV が提供される。他方では、修飾されたPIV は、複数のヒトPIV ゲノムのキメラ、たとえば１又は複数の異種ヒトPIV 、たとえばHPIV１及びHPIV２からの配列に連結されるHPIV３からの配列を含むポリヌクレオチドであり得、そして後者はさらに、１又は複数のts, ca, att 、又は生物学的に誘導されたPIV からの他の選択された突然変異（たとえば生物学的に誘導された変異体PIV 株、たとえばJS cp45 から採用されたts, ca又はatt 表現型を特定するヌクレオチド置換）を組込む。
【０１２６】
より詳細な観点においては、ヒト PIV３の個々の遺伝子又は遺伝子セグメントは、たとえば弱毒化されているか又は大きなポリメラーゼＬ遺伝子におけるts突然変異を付与するアミノ酸置換をコードするヌクレオチド変更により、さらに弱毒化されているクローンにおいて、HPIV１又はHPIV２からのカウンターパート遺伝子又は遺伝子セグメントにより置換され又は補完され、又は逆も真である。たとえば、本発明は、HPIV３バックグラウンドにおいてそれらのカウンターパート遺伝子により置換されたHPIV１のHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するPIV クローンを提供し、ここで得られるキメラクローンの表現型は、１又は複数のＮ，Ｐ，Ｌ，Ｍ, HN，Ｆ，Ｃ，Ｄ及びＶ遺伝子内にコードされるts, ca又はatt 突然変異によりさらに修飾される。
【０１２７】
本明細書に開示される可能な突然変異のメニューからの種々の組合せが、ワクチンウィルスを、選択された弱毒化、免疫原性及び安定性レベルに対応せしめるために、たとえば複数のPIV 株を表わす免疫学的特徴を有する、十分に弱毒化された免疫原性キメラウィルスを得るために実施され得る。１つの観点においては、少なくとも１つの弱毒化突然変異が、キメラPIV バックグラウンドにおいて組込まれるPIV ポリメラーゼ遺伝子Ｌにおいて存在する（下記例に記載される組換え体ｒ942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942 ／992,ｒ942 ／1558，ｒ992 ／1558又はｒ942 ／992 ／1558により例示されるような）組換えPIV が提供される。
【０１２８】
たとえば、本発明のこの観点内の有用なキメラPIV 組換え体は、異種バックグラウンドにおいて、たとえばHPIV３クローンにおいてそれらのカウンターパート遺伝子により置換されたHPIV１からのHN及び／又はＦ糖タンパク質遺伝子の１又は複製の遺伝子又は遺伝子セグメントを有し、そして１又は複数の弱毒化突然変異、たとえば生物学的に誘導されたPIV 変異体からのポリメラーゼ遺伝子におけるアミノ酸変化（たとえば、位置942 でのTyr からHis への変化、位置992 でのLeu からPhe への変化、及び／又は位置1558でのThr からIle への変化）をもたらすヌクレオチド置換をさらに組込むであろう。下記に例示される、１つのそのような弱毒化されたキメラ組換え体は、rPIV３−１．cp45Ｌ、すなわちJS cp45 からの、上記に特定されたすべての３種のＬ遺伝子突然変異を組込むrPIV３−１の誘導体である。
【０１２９】
ワクチン株を開発するためにキメラPIV バックグラウンドに組込まれ得るさらに追加の突然変異は、他の遺伝子における生物学的に誘導された突然変異から選択され、又は標準的部位特定突然変異誘発又は他の純粋な組換え突然変異誘発方法により組換えゲノムに新たに創造されるであろう。これに関して、組換えPIV における、生物学的に誘導された突然変異を採用し、又は新規の突然変異を創造するための標的遺伝子は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、大きなポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックスタンパク質Ｍ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質HN、融合タンパク質Ｆ、並びにＣ，Ｄ及びＶ ORF生成物を包含する。遺伝子外配列、たとえばPIV ゲノムの３’リーダー又はトレイラー領域における配列がまた、標的化される。
【０１３０】
従って、上記の非キメラ性組換えPIV において同定され、そしてそれに組込まれる典型的な突然変異は、たとえばrPIV3-1により例示されるように、キメラPIV バックグラウンド内に容易に組込まれるであろう。それらの典型的な突然変異は、Ｎタンパク質における１又は複数の突然変異、たとえばJS cp45 の残基Val 96 又はSer 389に対応する位置での特異的突然変異を包含する。より詳細な観点においては、それらの突然変異は、Val 96 →Ala 又はSer 389→Ala として表わされる。Ｃタンパク質における突然変異、たとえば、好ましくは、上記のようにして、Ile 96 のThr への置換により表わされる、JS cp45 のIle 96 に対応する位置での突然変異が、キメラPIV 組換え体における組込みのために所望される。
【０１３１】
キメラPIV バックグラウンドにおける組込みのためのさらなる典型的な突然変異は、残基Ile 420又はAla 450に対応する位置でのJS cp45 から採用された、Ｆタンパク質における１又は複数の置換、たとえば置換Ile 420→Val 又はAla 450→Thr を包含する。本発明内のさらなる追加のキメラPIV 組換え体は、HNタンパク質における１又は複数のアミノ酸置換、たとえばJS cp45 の残基Val 384に対応する位置での突然変異、たとえばVal 384→Ala を採用するであろう。さらに追加のキメラ組換え体は、遺伝子外配列、たとえば組換えゲノム又はアンチゲノムの３’側リーダー配列に１又は複数の突然変異を組込むであろう。これに関しての典型的な突然変異は、JS cp45 のヌクレオチド23，24，28及び／又は45に対応する１又は複数の位置で生じる３’側リーダーにおける突然変異、たとえばヌクレオチド23でのＴ→Ｃ変化、ヌクレオチド24でのＣ→Ｔ変化、ヌクレオチド28でのＧ→Ｔ変化、又はヌクレオチド45でのＴ→Ａ変化を包含する。
【０１３２】
キメラPIV バックグラウンド内への組込みのためのさらに追加の遺伝子外突然変異は、JS cp45 のヌクレオチド62に対応する位置でのＮ遺伝子開始配列における突然変異、たとえばＡ→Ｔ変化により本明細書において例示されるように、Ｎ遺伝子開始配列における１又は複数の突然変異を包含する。下記例において組換えPIV を評価し、そしてそこに組合されるそれらの典型的な突然変異は、本明細書に提供される方法及び手段を用いてキメラPIV 組換え体内に容易に組込まれ、そして本発明のさらに追加の弱毒化されたキメラワクチン株を生成するために所望する表現型変化を、個々に及び／又は組合して特定するであろう。
【０１３３】
さらなる組合せ突然変異企画においては、生物学的に誘導されたPIV から採用され、又は本発明のPIV クローンにおいて組換え的に生成された、１又は複数の前述のts, ca又はatt 突然変異を、本明細書に開示されるもう１つの明確な突然変異（たとえば、PIV のＮ，Ｐ，Ｌ，Ｍ，HN，Ｆ，Ｃ，Ｄ又はＶ遺伝子又は遺伝子セグメント、又は他の源、たとえばRSV 又は麻疹ウィルスからの遺伝子又は遺伝子セグメントの欠失、付加、又は転位）と組合して組込んでいる修飾されたPIV が提供される。また、この場合、本明細書に開示される突然変異のメニューからの種々の組合せが、ワクチンウィルスを、選択された弱毒化、免疫原性及び安定性レベルに対応せしめるために行なわれ得る。
【０１３４】
従って、生物学的に誘導されたPIV 変異体からの少なくとも１つの弱毒化突然変異、たとえばJS cp45 に見出されるようなPIV ポリメラーゼ遺伝子Ｌにおける突然変異、又は組換え的に生成された突然変異を示し、そしてさらに、たとえば非−PIV 源（たとえば免疫原性RSV 又は麻疹ウィルス遺伝子又はエピトープ、又はサイトカインをコードする遺伝子）からの異種遺伝子又は遺伝子セグメントの置換又は導入、発現レベルを変更するためにウィルス遺伝子の順序の変化、遺伝子オーバーラップの除去、PIV ゲノムプロモーターのそのアンチゲノムカウンターパートによる置換、外来性領域を挿入するための能力を高めるための遺伝子間領域の短縮、延長又は除去、RNA 複製又は転写を低めたり又は高めたりするためにシス−作用性シグナルにおける突然変異、ユニーク制限部位の挿入、又は完全な非−必須遺伝子の欠失から選択された１又は複数の追加の変更を組込んでいる組換えPIV が提供される。
【０１３５】
ワクチン使用のためには、本発明に従って生成されたウィルスは、ワクチン配合物に直接的に使用され、又は当業者に良く知られている凍結乾燥プロトコールを用いて、所望により、凍結乾燥され得る。凍結乾燥されたウィルスは典型的には、約４℃で維持される。使用される場合、その凍結乾燥されたウィルスは、下記にさらに記載されるように、安定化溶液、たとえば塩溶液、又はSPG, Mg2+ 及びHEPES を含んで成る溶液（アジュバントを含んでも又は含まなくても良い）において再構成される。
【０１３６】
本発明のPIV ワクチンは、活性成分として、本明細書に記載のようにして生成された、免疫学的有効量のPIV を含む。修飾されたウィルスは、生理学的に許容できるキャリヤー及び／又はアジュバントと共に宿主中に導入され得る。有用なキャリヤーは当業界において良く知られており、そしてたとえば、水、緩衝水、 0.4％塩溶液、 0.3％グリシン、ヒアルロン酸及び同様のものを包含する。得られる溶液は使用のためにパッケージされ、又は凍結乾燥され、その凍結乾燥された調製物が、上記で言及されたように、投与の前、無菌溶液と組合される。
【０１３７】
生成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされるような、医薬的に許容できる補助物質、たとえばpH調節及び緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤及び同様のもの、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、及び同様のものを含むことができる。許容できるアジュバントは、当業界において良く知られている多くの他の適切なアジュバントの中で、不完全フロイントアジュバント、 MPLＴＭ（３−０−デアシル化されたモノホスホリル脂質Ａ；RIBI Immuno Chem Research, Inc., Hamilton, MT)及びIL−12（Genetics Institute, Cambridge, MA)を包含する。
【０１３８】
エアゾール、液滴、経口、局所又は他の経路を通して、本明細書に記載されるようなPIV 組成物により免疫化した後、宿主の免疫系は、PIV ウィルスタンパク質、たとえばＦ及びHN糖タンパク質に対して特異的な抗体を生成することによってそのワクチンに応答する。本明細書に記載されるようにして生成された、免疫原的有効量のPIV による予防接種の結果として、宿主は、PIV 感染に対して少なくとも部分的に又は完全に免疫性になり、又は特に、低部呼吸器官の中位の又は重度のPIV 感染に対して耐性になる。
【０１３９】
ワクチンが投与される宿主は、PIV 又は密接に関連するウィルスによる感染に対して敏感であり、そして予防接種株の抗原に対して保護免疫応答を生成することができるいずれの哺乳類でもあり得る。従って、本発明は、種々のヒト及び獣医使用のためのワクチンを創造するための方法を提供する。
【０１４０】
本発明のPIV を含むワクチン組成物は、宿主自体の免疫応答能力を増強するために、PIV 感染に対して敏感な又はPIV 感染の危険性のある宿主に投与される。そのような量は、“免疫原的有効用量”であると定義される。この使用においては、有効用量内で投与されるPIV の正確な量は、宿主の健康状態及び体重、投与の態様、配合物の性質、等に依存するが、しかし一般的には、約103 〜約106 のプラーク形成単位(PFU）又はそれ以上のウィルス／宿主、より通常には、約104 〜105 PFU のウィルス／宿主の範囲である。いずれにせよ、ワクチン配合物は、重度の又は生命−脅威のPIV 感染に対して宿主患者を効果的に保護するのに十分な量の修飾されたPIV を提供すべきである。
【０１４１】
本発明に従って生成されるPIV は、複数のPIV 血清型又は株に対する保護を達成するために他のPIV 血清型又は株のウィルスと共に組合され得る。他方では、複数のPIV 血清型又は株に対する保護は、本明細書に記載のように、１つのウィルス中に構築された複数の血清型又は株の保護エピトープを組合すことによって達成され得る。典型的には、異なったウィルスが投与される場合、それらは混合して存在し、そして同時に投与されるが、しかしそれらはまた、別々でも投与され得る。１つの株による免疫化は、同じか又は異なった血清型の異なった株に対して保護することができる。
【０１４２】
多くの場合、本発明のPIV ワクチンを、他の剤、特に他の小児期ウィルスに対する保護応答を誘発するワクチンと共に組合すことが所望される。本発明のもう１つの観点においては、PIV は、他の病原体、たとえば呼吸シンシチウムウィルス(RSV）又は麻疹ウィルスの保護抗原のためのベクターとして、それらの保護抗原をコードする配列を、本明細書に記載のようにして、感染性PIV を生成するために使用されるPIV ゲノム又はアンチゲノム中に組込むことによって、使用され得る。RSV cRNAのクローニング及び本発明に関する他の開示は、アメリカ合衆国同時係属特許出願番号第08／534,768 号、第60／021,773 号、第08／720,132 号、第60／046,141 号、第60／047,634 号及び第08／892,403 号、及びPCT 特許出願 PCT／US97／12269 号（それらは、引用により本明細書中に組込まれる）に記載されている。
【０１４３】
本発明のワクチン組成物の１回の又は複数回の投与が実施され得る。新生児及び幼児においては、複数回の投与が十分なレベルの免疫性を誘発するのに必要とされる。投与は生後、１カ月以内に開始し、そして小児期を通して、生来（野生型）のPIV 及び／又は他の対象のウィルス感染に対する十分なレベルの保護性を維持するために必要により、２カ月、６カ月、１年及び２年間隔で行なわれるべきである。同様に、反復しての又は重度のPIV 感染に対して特に敏感である成人、たとえばヘルスケアーワーカー、デイケアーワーカー、子供、年配の人、及び無防備状態の心肺機能を有する個人は、保護免疫応答を確立し、そして／又は維持するために複数回の免疫化を必要とする。
【０１４４】
本発明のワクチンにより提供される、誘発された免疫性のレベルは、中和性分泌及び血清抗体の量を測定することによってモニターされ得る。それらの測定値に基づいて、ワクチン投与量が調整され、又はワクチン投与が、所望する保護レベルを維持するために、所望により反復され得る。さらに、異なったワクチンウィルスが、異なった受容体グループのためには好都合であり得る。たとえば、Ｔ細胞エピトープに富む追加のタンパク質を発現する、構築されたPIV 株が特に、幼児よりもむしろ成人のために好都合である。
【０１４５】
本発明のさらにもう１つの観点においては、PIV は呼吸器官の一時的な遺伝子療法のためのベクターとして使用される。この態様によれば、組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、興味ある遺伝子生成物をコードすることができる配列を組込む。その興味ある遺伝子生成物は、PIV 発現を制御する同じか又は異なったプロモーターの制御下にある。組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムを、Ｎ，Ｐ，Ｌ及び他の所望するPIV タンパク質と共に同時発現し、そして興味ある遺伝子生成物をコードする配列を含むことによって生成された感染性PIV が患者に投与される。投与は典型的には、エアロゾル、ネブライザー又は他の局部適用により、処理される患者の呼吸器官に行なわれる。
【０１４６】
組換えPIV は、治療又は予防レベルの所望する遺伝子生成物の発現をもたらすのに十分な量で投与される。本発明内で投与され得る代表的な遺伝子生成物、たとえばインターロイキン−２、インターロイキン−４、γ−インターフェロン、GM−CSF,Ｇ−CSF 、エクトロポイエチン及び他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ノウ胞性繊維症トランスメンブランコンダクタンスレギュレーター（CFTR）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒素、腫瘍抑制遺伝子、アンチセンスRNA 及びワクチン抗原が、好ましくは、一時的な発現のために適切である。
【実施例】
【０１４７】
次の例は例示的であって、本発明を制限するものではない。
例Ｉ
陰性センスPIV ゲノムRNA をコードするプラスミドｐ218 (131) の構成
ｐ218 (131)(図１：配列番号１)(American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA にブタベスト条約に基づいて寄託され、そして寄託番号第 97991号が得られた）と命名された十分なcDNAクローンを、HPIV３ JS 株の完全な15461nt のゲノム配列をコードするよう構成した。
【０１４８】
肝炎ウィルスδリボザイムを、自己−切断がHPIV３の３’末端を生成するよう、ゲノム配列の３’末端に隣接して配置した（Perrotta and Been, Nature 350 : 434-436, (1991) ; 引用により本明細書中に組込まれる）。T7転写ターミネーターを、δリボザイムに続いて配置した。Ｔ７プロモーターを、HPIV３ゲノムの５’末端ヌクレオチドが合成される最初のヌクレオチドであるよう、そのゲノム配列の５’末端に隣接して配置した。この配置においては、cDNAは、いづれの追加の異種ヌクレオチドも伴わないで、正しいゲノム末端を含む PIV３ゲノムRNA の完全なネガティブ−センスコピーをコードする。
【０１４９】
HPIV３ cDNA を、スクロースグラジエント遠心分離（Stokesなど.,前記, 1992; Stokesなど, 前記, 1993; それらは引用により本明細書に組込まれる）により精製されたビリオンから単離されたRNAの逆転写（RT）及びポリメラーゼ鎖反応(PCR）により構成された、14のオーバラップするサブクローン（A −Ｌと称する；括弧内の文字は個々のプラスミドを示し、そして特定のウィルス遺伝子を言及しない）からアセンブルした。サブクローンは、ゲノムRNA の次のヌクレオチドに及んだ（位置１として命名された３’末端から番号づけされた）：１−2058（A ), 1874-3111 (A'), 3086-5140 (C),4348-5276 (C' ), 5072-6695 (D ), 5904-8532 (E), 7806-9898 (F), 9632-10740 (F' ), 9760-10955 (G), 10862-11925 (H), 11835-12868 (I), 12426-13677 (J), 13630-14496 (K),及び14467-15462(L) 。個々のフラグメントを、従来のクローニング技法を用いて、pBluescript KSII (Strategene, La Julla, CA) 中にクローン化し、そして完全に配列決定した。
【０１５０】
次に、プラスミドp(L）を、MUTA−GENE方法（BioRad, Hercules, CA）に従って一本鎖DNA 中間体を通してＴ７プロモーターを導入するために特定部位の突然変異誘発にゆだねた。Ｔ７プロモーターを位置決定し、その結果、転写がネガティブ−センスの突然変異誘発プライマー：5'-AATACGACTCACTATA ACCAAACAAGAGAAG-3'（配列番号２；Ｔ７配列はイタリック型で書かれており、HPIV３−特異的配列は下線が引かれており、そして５’−末端HPIV３ヌクレオチド（ゲノム位置15462)は星印により示される）を用いて、HPIV３ゲノムの正確な５’末端で開始する。この修飾されたｐ（Ｌ）を、ｐ（Ｌ )と命名した。プラスミドｐ（Ｅ）を、３種のヌクレオチド置換（下線）をHPIV３位置7903，7913，7915（図１）でHN遺伝子中に挿入するためにネガティブ−センスの突然変異誘発オリゴヌクレオチド5'-CCAAGTACTATGAGATGCTTGATT-3'（配列番号３）を用いて、同じ方法により修飾し、ｐ（Ｅ )を生成した。
【０１５１】
それらの置換は、 HgaＩ部位を除去し、 ScaＩ部位を挿入し、そしてモノクローナル抗体(mAb)423/6及び 170/7により認識されるエピトープが削除されるよう、コードされたHNタンパク質のアミノ酸370 を修飾した(van Wyke Coelinghなど, J. Virol. 61 : 1473-1477 (1987);引用により本明細書中に組込まれる）p(E)〜p(K）サブクローンを、p(L)プラスミド中に、段階的態様でアセンブルし、p(E FF'GHIJKL)(図1A）を得た。このプラスミドは、ゲノムの５’末端でヌクレオチド15462 に隣接するＴ７プロモーターと共にHPIV３ヌクレオチド5904−15462 を含む。サブクローンp(A)〜p(E）を、HPIV３ヌクレオチド１−8532を含む第２のオーバーラッピングサブクローンp(A A'CC'D E) 中にアセンブルした。
【０１５２】
両サブクローンｐ（E FF'GHIJKEL )及びｐ（A A'CC'D E) を、完全に配列決定した。上記の導入された点突然変異の他に、cDNAは、Ｎ遺伝子内に存在し、そしてコードされたタンパク質におけるアミノ酸506 での置換を引き起こした位置1615での単一のヌクレオチド置換により、真正の JS HPIV３配列（Stokesなど, 前記, 1992) とは異なった。３種の他のヌクレオチド置換が、コードされたタンパク質を変更しなかったＬ遺伝子において位置10355, 11333及び15248 で見出された（図２）。それらの３種の非コード変更を、cDNAに由来する組換えウィルス（rPIVと命名される）を同定するための追加の配列マーカーとして保持し、そしてＮ遺伝子における突然変異を、後で記載のようにして補正した。
【０１５３】
次に、サブクローンp(A A'CC'D E) を修飾し、HPIV３位置１に隣接して、肝炎δウィルスリボザイム及びＴ７ターミネーターを挿入した。HPIV３ゲノム(GGT↓GGG)の３’末端（下線が引かれている）がフランキング肝炎δウィルスアンチゲノムリボザイム（太文字で部分的に示される）の自己−切断を通して生成されたHPIV３ミニゲノムを、前記のようにして構成した（Dimock及びCollins, J. Virol. 67 : 2772-2778, (1993) ; Perrotta and Been,前記, (1991); それぞれ引用により、本明細書中に組込まれる）。リボザイムの後に、Ｔ７転写ターミネーターが続いた。このミニゲノムcDNAを、リボザイム切断部位に隣接する配列を、 SmaＩ部位(CCC↓GGG)に修飾し、そしてＴ７ターミネーターの下流部位上に ApaＩ部位(GGGCC↓C)を配置するPCR 反応において鋳型として使用した。PCR 生成物を、BssHIIにより消化され、そしてフィルインによりブラント末端化された pKSII中にクローン化し、ｐ218 を生成した。
【０１５４】
ｐ218 を、いづれかの配列が開環された SmaＩ部位中にブラント−末端連結により導入され、そしてそのRNA 転写体がδリボザイム切断部位(NNN↓GGG)で切断されるよう企画した。p(A A'CC'D E)サブクローンを HgaＩ及び SalＩ（8533）により消化し、HPIV３ cDNA を開放し、そしてdNTP及びT4 DNAポリメラーゼによりフィルインし、ブラント末端を得た。
【０１５５】
HgaＩ部位は、HPIV３位置１の10ヌクレオチド上流に存在し、そして消化され、そしてフィルインされる場合、HPIV３位置１で開始するブラント末端を付与する。修飾された HgaＩ− SalＩフラグメントを、ゲル精製し、そしてｐ218 の SmaＩ部位中にクローン化した。Ｎ遺伝子における突然変異（nt1615でのＴ）を、Kunkel突然変異誘発（Kunkelなど., Methods Enzymol. 154 : 367-382, (1987) ; 引用により本明細書中に組込まれる）を用いて、JS wt 配列（nt1615でのＡ) (GenBank受託番号Z11575を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる）に対して補正した。このプラスミドをｐ218 (A A'CC'D E)（図１）と命名した。
【０１５６】
ヌクレオチド7438−15462 からのT7プロモーター及びHPIV３ cDNA をを含む、ｐ（E FF'GHIJKL ) の XhoＩ−NgoMI フラグメントを、ｐ218 (A A'CC'D E)の XhoＩ−NgoMI 窓中にクローン化した（図１）。これは、HPIV３ヌクレオチド7438でHPIV３ cDNA の２つのフラグメントを連結せしめ、HN遺伝子における上記３種の所望する突然変異及びＬ遺伝子における３種の偶発的突然変異と共に、ネガティブ−センスのゲノムRNA をコードする十分な長さのHPIV３ cDNA を含むプラスミドを生成した。次に、ｐ218 (131)(図１；配列番号１）として命名された最終構造体を、Taq DYE Deoxy Terminatorサイクル配列決定キット（ABI, Foster City, CA）を用いて、NCIFrederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD)で、自動配列決定によりその全体を配列決定した。これは、HN遺伝子における追加の変化、すなわち、図２にまた示される、トレオニンからイソロイシンにHNアミノ酸263 を変えた位置7593でのHN遺伝子におけるＣからＴへの変化を同定した。
【０１５７】
例II
HPIV３のための転写及びRNA 複製系
この例は、ヒトパラインフルエンザウィルスタイプ３（HPIV３）のための再構成された転写及びRNA 複製系を生成するための組成物及び方法を記載する。この典型的なシステムを、ワクシニアウィルス組換え体により供給されるT7 RNAポリメラーゼにより駆動される、トランスフェクトされたプラスミドから細胞内発現される成分を用いて開発した。この系は、ウィルス遺伝子が欠失され、そして細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）をコードするポリヌクレオチドにより置換されているHPIV３ゲノムRNAのネガティブ−センス類似体に基づかれている。Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質を、効果的な転写及びRNA 複製を方向づけるために、同時トランスフェクトされたプラスミドから発現せしめる。この例に従っての転写は、たとえばoligo (dT)クロマトグラフィーにより容易に単離され得る、ポリアデニル化されたサブゲノムmRNAを生成する。この例に従ってのRNA 複製は、ミクロコッカスヌクレアーゼによる消化に対する耐性に基づいてカプシド封入されることが示されている、ミニ−アンチゲノム及び子孫のミニゲノムを生成する。
【０１５８】
Ａ）ウィルス及び細胞
バクテリオファージＴ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体、すなわち vTF7-3を、Fuerstなど. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83 : 8122-8126, 1986 ; これは引用により本明細書に組込まれる）により記載のようにして調製した。 HEp−２単層培養物を、２％ウシ胎児血清(FBS）、50μg/mlのゲンタマイシンスルフェート及び２mMのグルタミンにより補充されたOptiMEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD）により、５％CO2 の下で37℃で維持した。
【０１５９】
Ｂ）cDNA
HPIV３のJS株（GenBank #Z11575 ; Stokesなど., 1992)のＮ，Ｐ及びＬ遺伝子のORF に対応するcDNAは、T7 RNAポリメラーゼ、及び外来性ORF の前の内部リボソーム侵入部位による翻訳により仲介される(Elroy-Steinなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 6126-6130 (1989); 引用により本明細書に組込まれる）。個々の遺伝子をまず、ポリメラーゼ鎖反応(PCR）により修飾し、下流の末端上の翻訳開始部位及びSa'lＩ部位で NcoＩ又は NcoＩ−適合性部位を配置した。
【０１６０】
肝炎δウィルスリボザイムを欠いていることを除いて、ｐ218 (131) に類似するプラスミドp(131)を、個々のPCR のための鋳型として使用した。Ｎ ORFを増幅するために使用されるプライマーは、CCCTATAATTTCAACATGTTGAGCCTATTTG（配列番号４；ポジティブ−センスに対して前方向プライマー）、及びGATTAAAATGTTGGTCGACTTAGTTGCTTCC（配列番号５；イタリック型が制限酵素部位を表わし、そして翻訳開始部位が太字で示される）であった。PCR 生成物、すなわち AflIII 及び SalＩ部位を端に有する1578bpのフラグメントを、 pTM-1の NcoＩ-SalＩ窓中にクローン化し、pTM(Ｎ）を生成した。
【０１６１】
PIV３リンタンパク質（Ｐ）を増幅するために使用されるプライマーは、5-'CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGATGCTAAAAACTATC-3'(配列番号６；前方向プライマー、及び5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3'（配列番号７；逆方向プライマー）であった。ゲノムRNA(ｐ131)のJS株の十分な長さのcDNAを、PCR のための鋳型として使用した。得られるPCR 生成物は、 NcoＩ及び SalＩ制限部位（イタリック型）を端に有する1851bpのフラグメントであった。次に、PCR 生成物を、 pTM-1の NcoＩ-SalＩ窓中にクローン化し、pTM(ｐ）を生成した。
【０１６２】
第２のPCR を実施し、Ｃ ORFを有さない PIV３リンタンパク質Ｐ ORFを増幅した。ｐ131 を再び、鋳型cDNAとして使用した。次の異なった前方向プライマー及び同じ逆方向プライマーを用いて、Ｃを有さない PIV３ P ORFを増幅した：5'-CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3'(配列番号74；前方向プライマー）及び5'-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3(配列番号７；逆方向プライマー）、その得られるPCR 生成物は、 NcoＩ及び SalＩ制限部位（イタリック型で示される）を端に有する1851bpのフラグメントであった。前方向プライマーにおける下線のヌクレオチドは、Ｐ ORFにおいてはサイレントであるが、しかしＣ ORFの開始コドンをトレオニンに変えるヌクレオチド置換を表わす。Ｃ ORFのための次の開始コドンは、400 以上下流のヌクレオチドである。従って、Ｐタンパク質のみが生成される。次に、PCR 生成物を、 pTM-1の NcoＩ-SalＩ窓中にクローン化し、第２のプラスミド、すなわちpTM(Ｐ，Ｃナシ）を生成した。
【０１６３】
HPIV３のＬ ORFを、３個の部分で pTM−１中にクローン化した：末端はPCR 生成物に由来し、そして主要本体はｐ218 (131) からの制限フラグメントであった。Ｌ ORFの上流末端を、次のプライマーを用いて増幅した：GCAAAGCGTGCCCGGCCATGGACACTGAATCTAACAATGGC(配列番号８）及びGAAATTCCTTAATCGATTCTCTAGATTC(配列番号９）。これは、十分な長さのゲノムの位置8625−9645が、上流末端上に SmaＩ及び NcoＩ部を、及び下流末端上に ClaＩ部位を有する（すべての３種の部位はイタリック型で示される）、 1,020−bpのPCR生成物Ｌ１を生成した。Ｌ ORFの下流末端を次のプライマーを用いて増幅した；CCCATCAACTGTAACATACGTAGAAAGAC(配列番号10）及びGGTTAGGATATGTCGACATTGTATTTATG（配列番号11）。これは、十分な長さのゲノムの位置13,645−15,378が、SnaBI 及び SalＩ部位（イタリック型で示される）を有する 1,733−bpのPCR 生成物L2を生成した。
【０１６４】
プラスミドｐ(131）を ClaＩ及び PstＩにより消化し、十分な長さのゲノムの位置 9,630−14,120を含む 4,487−bpのフラグメントＬ中間を生成した。Ｌ１及びＬ中間を共通する ClaＩ部位で連結し、そしてpBluescript の SmaＩ−PstＩ窓中にクローン化し、p(L1-L中間）を生成した。次に、L2フラグメントを、p(L1+L中間）の PstＩ−SalＩ窓中にクローン化し、 NcoＩ及び SalＩを端に有する完全なＬ ORFを生成した。次に、これを、 pTM−１の NcoＩ− SalＩ窓中にクローン化し、pTM(Ｌ）を生成した。pTM(Ｎ)(配列番号20）、pTM(Ｐ)(配列番号21）及びpTM(Ｌ)(配列番号22）の PCR−生成された領域の配列を、ジデオキシヌクレオチド配列決定方法により確かめた。
【０１６５】
T7転写の効率を高めるために、一定の修飾を、 PIV３−CAT(−）と呼ばれるネガティブ−センスのPIV ミニゲノムをコードするcDNA構造体に対して行なった（Dimock及びCollins, J. Virol. 67 :2772-2778 (1993) ;これは引用により本明細書に組込まれる）。 PIV３−CAT(−）は、CAT ORF のネガティブ−センスコピーに融合されるHPIV３ゲノムの３’−末端の 111個のヌクレオチド及び５’−末端の 115個のヌクレオチドを含む。このcDNAを、 HgaＩによる線状化及びT7 RNAポリメラーゼによる転写に基づいて、HPIV３ゲノムの正確な末端を含むミニゲノムを生成するよう企画した。cDNA末端への連続的な延長を付加する突然変異誘発オリゴヌクレオチドを用いての２回の連続したPCR を用いて、自己−切断が正しい3'HPIV3 ゲノム末端を生成するよう、肝炎ウィルスδリボザイムにより HgaＩ部位を置換した(Perotta及びBeen, Nature 350 : 434-436 (1991) ; これは引用により本明細書中に組込まれる）。T7転写終結シグナルを、リボザイムの直後に挿入し（図３）、 PIV３−CAT −δを生成した。
【０１６６】
PIV3-CAT-δ cDNA を、PCR 突然変異誘発により修飾し、トレイラー及びＴ７プロモーターを端に有する制限部位を用いて、T7プロモーターとミニゲノムの５’末端との間に１，２又は３個のＧ残基を挿入した。この修飾はＴ７転写の高められた効率を生成した。予備実験においては、 PIV3-CAT-GGと呼ばれる、Ｇ残基を含むミニゲノムが、下記に記載される再構成された転写及び複製システムにおいてのCAT の発現において最とも活性的であり、そしてすべての続く誘導体化のために使用された。
【０１６７】
PIV3-CAT-GG cDNA をさらに、オーバーラッピングPCR 突然変異誘発により修飾し、次の通りに、２つの部位で同時に修飾を導入した。第１に、ワクシニアウィルス初期段階RNA ポリメラーゼ(T５NT) (Yuen及びMoss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 : 6417-6421 (1987); 引用により本明細書中に組込まれる）のためのタンデム転写終結モチーフを含む配列T７CTを、δリボザイムとＴ７転写ターミネーターとの間のポジティブ−センス鎖のcDNA鎖中に挿入した（図１）。このモチーフ、及び下記に記載される第２モチーフを付加し、ワクシニアウィルス初期RNA ポリメラーゼによりCAT 遺伝子の無差別な転写を防止した。第２に、ミニゲノムcDNA挿入体を、（ｉ）第２ワクシニアウィルス終結モチーフ（T５AT）の、コードされたミニゲノムに対して位置 103〜109 でのポジティブ−センスのcDNA鎖中への挿入、及び（ii）ミニゲノム位置112 での０〜６個のＧ残基（ネガティブ−センス）の挿入を含むよう、Ｎ−非翻訳領域とCAT 遺伝子との間の連結部で修飾した（図３）。
【０１６８】
オーバーラッピングPCR 突然変異誘発は、次の通りに実施される３組の反応(PCR１，２及び３）を包含した。 PCR１は、鋳型として PIV３−CAT −GG cDNA を及びプライマーとして次の２種の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いる７回の平行した反応組〔PCR １（０）〜（＋６）〕であった：前方向プライマー：+111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG-52（配列番号12）、及び逆方向プライマー： 124CTC'CAT'TCTAGA(N)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90(配列番号13）。第１のオリゴヌクレオチドにおける太字の配列は上流のタンデムワクシニアターミネーターであり、そして第２のオリゴヌクレオチドにおける太字の配列は第２ターミネーターである。この反応は、リボザイム及び隣接するリーダー領域を増幅し、そして上記の突然変異を挿入した。
【０１６９】
PCR２は、鋳型として PIV3-CAT-GG cDNA 、及びユニークNgoMI 部位の上流のプラスミド配列においてハイブリダイズした前方向プライマー（図３）、及び反応１の前方向プライマーに対して相補的な逆方向プライマーを用いる単一反応であった。従って、 PCR１及び２の生成物は、この後者の配列でオーバーラップした。 PCR１（０）〜（＋６）、及び PCR２の生成物をゲル精製した。PCR１（０）〜（＋６）の生成物を、 PCR２の生成物のアリコートとそれぞれ別々に混合し、そしてまた、 PCR２の前方向プライマー及び PCR１の逆方向プライマーを含む第３反応(PCR３（０）〜（＋６))において増幅した。
【０１７０】
PCR３（０）〜（＋６）の生成物を、プラスミド特異的配列において切断するNgoMI 、及びCAT 遺伝子の上流端で切断する XbaＩにより消化し（図３）、そして PIV３−CAT −GGの NgoMI− XbaＩ窓中にクローン化した。これは、挿入されたＧ残基の数に従って命名されたミニゲノムコードのcDNAのパネルをもたらした： PIV３−CAT ０〜 PIV３−CAT ＋６．PCR に由来するすべてのDNA 領域の構造を、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。
【０１７１】
Ｃ）トランスフェクション
HEp−２細胞を、６ウェルプレートにおいて、90％集密性に増殖した。６ウェルプレートの個々のウェル(1.5×106 個の細胞）を、0.4μgのpTM(Ｐ), 0.4μｇのpTM(Ｎ) , 0.05μgのpTM(L）、及び 0.4μｇのミニゲノムプラスミドによりトランスフェクトした。前記プラスミドを、 0.1mlのOpti MEM(Life Technologies）に添加し、そして12μｌのLipofect ACE (Life Technologies)を含むOpti MEM 0.1mlと共に混合した。室温で約15分間のインキュベーションの後、２％ウシ血清及び 1.5×107pfuの vTF７−３を含むOpti MEM1(0.8 ml）を、個々のウェルに添加した。プレートを37℃で12時間インキュベートし、その後、培地を、２％ウシ胎児血清を含む新鮮なOpti MEMにより変換した。次に、細胞を37℃で合計48時間インキュベートし、そしてRNA 分析及びCAT アッセイのために収穫した。個々のミニゲノムを、三重反復して表わし（３個のウェル）、これを培地に削り取り、そしてプールした。
【０１７２】
Ｄ）CAT アッセイ
上記収穫された細胞の個々のプールされたサンプルの3.33％(1.5×105 個の細胞）を表わすアリコートを、CAT アッセイのために取り出した。そのアリコートを1,000rpmで５分間、遠心分離し、そして上清液を捨てた。細胞懸濁液を、40mMのトリス（pH7.5)、１mMのEDTA、150mM のNaClの溶液１mlにより洗浄し、そして0.25Ｍのトリス（pH7.5)溶液50mlに再懸濁した。溶解物を、３回の凍結及び融解により調製し、そして8,000rpmでの５分間の遠心分離により透明にした。溶解物１μｌを、従来のアッセイを用いて、Ｄ−トレオー〔ジクロロアセチル１−１４Ｃ〕クロラムフェニコール（Amersham）をアセチル化する能力についてアッセイした（Gormonなど., Mol. Cell. Biol. 2 : 1044-1051 (1982); これは引用により本明細書に組込まれる。アセチル化を、薄層クロマトグラフィーにより可視化し、そしてホスホイメージャー分析（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)により定量化した。
【０１７３】
Ｅ）RNA 分析
個々のプールされたサンプルの残る細胞収穫物を、カプシド化されたRNA 、合計RNA 及びmRNAの単離のために３つの等しい部分に分けた。それらの３つのアリコートを、1,000rpmで５分間、遠心分離し、そして上清液を捨てた。細胞懸濁液の２つのアリコートを、１％Triton X-100, 0.5％DOC を含むRSB(10mMのNaCl, 10mMのトリス、pH7.5, 1.5mMのMgCl2)50μｌに再懸濁した。次に10mMのトリス（pH7.5), １mMのCaCl2 及び20μｇ（１mg／mlのストック）のミクロコッカスヌクレアーゼの溶液50μｌを１つのアリコートに添加し、そして他はミクロコッカスヌクレアーゼを有さない同じ混合物を受けた（Baker & Moyer, J. Virol. 62 : 834-838 (1988) ; 311ｐにより本明細書に組込まれる）。ミクロコッカスヌクレアーゼの目的は、カプシド化されなかったRNA を破壊することであり、そして使用される条件は、予備実験において最適化された。
【０１７４】
混合物を30℃で30分間インキュベートし、そしてRNA を供給者の方法に従ってTrizol (Life Tcehnologies)により単離した。細胞懸濁液の第３のアリコートをTrizolによるRNA 精製のために処理し、そして精製されたRNA を、oligo (dT)セルロースクロマトグラフィーによりポリアデニル化された画分及びポリアデニル化されていない画分に分離した（Grosfeldなど., J. Virol. 69 : 5677-5686 (1995); 引用により本明細書中に組込まれる）。RNA サンプルを、0.44Ｍのホルムアルデヒドを含む 1.5％アガロースゲル上で試験し、ニトロセルロースに移し（Chomczynski, Anal. Biochem. 201 : 134-139 (1992);引用により本明細書中に組込まれる）、鎖特異的リボプローブによりハイブリダイズせしめ、そしてホスホイメージャー分析により定量化した。
【０１７５】
例III 
修飾された PIV３ミニゲノムの構成及び発現
この例においては、cDNAのパネルが、単一のヌクレオチドインクレメントにより長さが異なる PIV３ミニゲノムをコードするよう構成された。この再構成されたシステムにおける転写及びRNA 複製は、その長さがちょうど６の倍数であるミニゲノムに関して最とも効果的であった。これに関して、パラミキソウィルス及びモルビリビラス(Morbillivirus）属のメンバーは、典型的には、“６の規則”により守られ、すなわちゲノム（又はミニゲノム）は、それらのヌクレオチドの長さが６の倍数である場合のみ、効果的に複製する（NPタンパク質のカプシド化に対してのヌクレオチド残基の正確な間隔開けのための必要条件であると思われる）。しかしながら、この発見は、長さが６のちょうど倍数よりも１つのヌクレオチド大きいか又は少さいミニゲノムが驚くべきことには、特にRNA 複製においてのみ活性的であることを示す。
【０１７６】
７種のcDNAのパネルが、単一のヌクレオチドインクレメント、長さが異なる、 PIV３−CAT ０〜＋６と呼ばれる７種の PIV３−CATミニゲノムをコードするよう構成された（図３）。個々のミニゲノムは、ウィルス遺伝子が欠失され、そしてCAT ORF のネガティブ−センスコピーにより置換されているHPIV３ゲノムRNA の短いネガティブ−センス類似体である。CAT ORF は、Ｎ及びＬ遺伝子非翻訳セグメント、Ｎ GS 及びＬ GE 転写モチーフ、及びゲノムRNA の３’リーダー及び5'トレイラー遺伝子外末端を端に有する。個々の PIV３−CAT ミニゲノムの5'末端は、T7 RNAポリメラーゼのための隣接するプロモーターにより定義される。
【０１７７】
このプロモーターは、上記のように、２つの非ウィルスＧ残基の延長が、コードされたミニゲノムの５’末端に寄与されるよう構成された。Ｔ７プロモーターの非転写コアーに隣接する追加のＧ残基の存在は、その転写の効率を改良し、そして予備研究は、２つのＧ残基の存在が下記再構成されたシステムにおいて最高レベルの活性を提供したことを示した。それらの２つのＧ残基は、ミニゲノムの長さの計算には包含されていない。３’ミニゲノム末端を、正しい３'−末端ヌクレオチドを生成する、隣接する肝炎δウィルスリボザイムによる自己−切断により創造する。
【０１７８】
７種の PIV３−CAT ミニゲノムは、Ｎ非翻訳領域とCAT 遺伝子との間の連結部での０〜６のＧ残基の挿入のために長さの延長、及び 898〜904 のヌクレオチドの長さの範囲で、単一のヌクレオチドで異なる。 PIV３−CAT ＋２ミニゲノムは、６のちょうど倍数である唯一のミニゲノムである（個々のミニゲノムは、２つの追加の非ウィルス性Ｇ残基を、Ｔ７プロモーターにより寄与される５’末端で含むが、しかしそれらは細胞内HPIV３−介在性RNA複製の間、失われると思われることが注目されるべきである）。
【０１７９】
個々の PIV３−CAT cDNAを、 vTF７−３、すなわちＴ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体により感染された HEp−２細胞中にトランスフェクトした。Ｔ７プロモーターの制御下でＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドを同時にトランスフェクトした。Ｐ cDNA は、Ｃ ORFの翻訳開始部位を排除するために特定部位の突然変異誘発により修飾されていた。細胞を感染後48時間で収穫した。細胞懸濁液のアリコートを、CAT 酵素アッセイのために処理した（図４）。残る細胞を、３つの等しいアリコートに分け、そして下記のようにして、RNA 分析のために処理した。
【０１８０】
ミニゲノムcDNAをさらに、 PIV３−CAT 挿入体の上流のポジティブ−センスプラスミド鎖に２つのタンデムワクシニアウィルス初期−遺伝子転写終結モチーフ（T7NT）を、及びCAT ORF のすぐ上流の同じ鎖に第３の前記モチーフ（T5AT）を含むよう、修飾した（図３）。それらを、ワクシニアウィルスポリメラーゼによるCAT ORF の無差別な転写を最少にするよう企画した（Grosfeldなど. (1995),前記）。CAT 発現は、 PIV３−CAT ミニゲノムの個々がＮ，Ｐ及びＬプラスミドにより補充される場合、再生的に検出され、（図４）、そしてCAT の検出は、すべてのそれらの PIV３タンパク質に依存した。しかしながら、発現率は、６のちょうど倍数であるヌクレオチドの長さを有する PIV３−CAT ＋２に関してより高かった。ミニゲノム及び支持プラスミドの好ましい割合及び量を、CAT 酵素発現に基づいて決定した。
【０１８１】
例IV
PIV ミニゲノムによるポジティブ−センスRNA の合成
PIV ミニゲノムの転写及び複製を、両方法のRNA 生成物の検出により確かめた。前記例に記載されるように、細胞懸濁液の３つの等しいアリコートを、RNA 分析のために採取した。１つのアリコートを、上記のように、oligo (dT)分析のために使用した。他の２つのアリコートを、界面活性剤により溶解し、そしてミクロコッカスヌクレアーゼと共にインキュベートするか又は擬似−処理した。次に、RNA を、単離し、ホルムアルデヒドアガロースゲル上での電気泳動により分離し、ニトロセルロースに移し、そしてネガティブ−センスCAT リボプローブによるハイブリダイゼーションにより分析した。ミクロコッカス−処理された及び擬似−処理された溶解物からのRNA が、それぞれ、図5Aの上部及び下部パネルに示される。
【０１８２】
擬似 (mock) −処理された溶解物からのRNA の分析は、Ｎ，Ｐ及びＬプラスミドによる個々のミニゲノムの補充が、 931−ヌクレオチド RSV−CAT Ｃ２ミニゲノムにより発現されるRNA から成るマーカーにサイズ上、ひじょうに類似するRNA バンドの合成をもたらしたことを示した（Grosfeldなど, (1995), 前記）。ホスホルイメージャー分析が、図８Ｂに示される。Ｎ又はＬプラスミドが削除される場合、RNA はほとんど、又はまったく検出されず、このことは、それらのRNA が再構成された PIV３ポリメラーゼの生成物であることを確かめた。
【０１８３】
個々の PIV３−CAT ミニゲノムは、２種のポジティブ−センスRNA 、すなわちミニ−アンチゲノム及びサブゲノムCAT mRNAをコードすることが予測される。個々のミニ−アンチゲノムは、 898〜904の長さのヌクレオチドである、そのミニゲノムの正確な補体であることが予測される。予測されるサブゲノムmRNAは、GS及びGEシグナルにより定義され、そして 804個のヌクレオチドの長さであり、そして 100〜200 個のヌクレオチドのポリＡ末端を含むことが予測される。
【０１８４】
図5Aにおけるポジティブ−センスRNA の単一ゲルバンドの検出（下部パネル）は、アンチゲノム及びmRNAがゲル電気泳動により分解されなかったことを示した。従って、ミクロコッカスヌクレアーゼによる処理は、アンチゲノム（及びゲノム)(但し、mRNAではない）がカプシド化され、そして消化に対して耐性であるので、アンチゲノムRNA を同定するために使用された。この目的のためへのミクロコッカスヌクレアーゼの使用は十分に確立されており（Baker &Moyer (1988), 前記）、そして選択される条件はRSV ミニレプリコンにより確証されており、そして HEp−２細胞溶解物に含まれるmRNAを完全に分解することが示されている。
【０１８５】
残留RNA を精製し、そしてネガティブ−センスリボプローブによるノザンブロット分析により分析し（図5A、上方パネル）、そしてホスホルイメージャーにより定量化した（図5B；この分析においては、ミクロコッカス−処理された及び処理されていないRNA 量が別々に標準化されたことを注目すること）。それらの調査は、ポジティブ−センスのカプシド化されたミニ−アンチゲノムに対応する保護されたRNA 集団の存在を示した。いくつかの実験の中で、この保護されたRNA は、約３〜15％のポジティブ−センスRNA であった。
【０１８６】
全RNA 及びミクロコッカス−耐性RNA の両者に関して、蓄積は、 900個の長さのヌクレオチドであり、そして従って６の倍数である＋２ミニゲノムの場合に最大であった。しかしながら、RNA の実質的な量がまた、６の倍数のヌクレオチドに対応する長さを示さないミニゲノム１、特に＋２ミニゲノムよりも１つ長いか又は短いヌクレオチドであるミニゲノム＋１及び＋３の場合に蓄積した。実際、＋１及び＋３ミニゲノムにより生成されるカプシド化されたアンチゲノムの量は、＋２ミニゲノムの85％及び72％であった（図5B）。さらに最少の効率のミニゲノム、すなわち＋５ミニゲノムは、蓄積されたカプシド化されたRNA の測定により決定される場合、＋２ミニゲノムの20％ほどの活性であった。合計のポジティブ−センスRNA を検出するための測定の場合、＋１及び＋３ミニゲノムは、＋２ミニゲノムの合計RNA の52％及び45％を生成した。
【０１８７】
サブゲノムmRNAの存在を確かめるために、収穫された細胞懸濁液の最終アリコートを、RNA 精製のために処理した。次に、RNA をoligo (dT)クロマトグラフィーにゆだねた。結合しなかったRNA 、及び結合し、そして低い塩緩衝液で溶出されたRNA を、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより（図6A）及びホスホリイメージャー（図6B；この場合、結合された及び結合されなかったRNA は、＋２ミニゲノムの結合されたRNA に対して一緒に標準化されたことを注目すること）により分析した。それらのアッセイは、約64％のポジティブ−センスRNA が、サブゲノムmRNAに関して予測されるように、ポリアデニル化されたことを示した。mRNAの蓄積は、＋２ミニゲノムに関しては最大であった。しかしながら、mRNAの実質的な量がまた、他のミニゲノムに関して観察された。＋１及び＋３ミニゲノムにより合成されたmRNAの量は、＋２ミニゲノムにより合成されるその量に比較して、それぞれ30％及び20％であり、そして最少の活性ミニゲノムに関して、約13％であった。
【０１８８】
例Ｖ
PIV ミニゲノムによるネガティブセンスのRNA の合成
前記例に記載される種々の PIV３−CAT ミニゲノムを、mRNA及びポジティブ−センスのカプシド化されたミニ−アンチゲノムの合成に向け、後者は、RNA 複製における第１段階を表わす。RNA 複製における第２段階は、ミニ−アンチゲノム生成物からのカプシド化された子孫ミニゲノムの合成を包含する。この後者の工程を評価するために、前記例に記載される擬似（mock）−処理された及びヌクレアーゼ−処理された溶解物を、ポジティブ−センスCAT リボプローブによるノザンブロットハイブリダイゼーションにより分析し（図7A）、そしてホスホルイメージャーにより定量化した（図7B）。
【０１８９】
擬似−処理された溶解物からのRNA の分析（図7A、下方パネル）は、相当量のミニゲノムが、Ｎ又はＬ支持プラスミドが削除されている負の対照を包含するすべてのサンプルにおいて、細胞内蓄積していることを示した。図5A〜5B及び6A〜6Bに記載される分析は、ポジティブ−センスRNA の合成がそれらの条件下でほんのわずかであったことを示した。従って、Ｎ又はＬの不在下で観察されるミニゲノムは、再構成されたHPIV３ポリメラーゼにより介在されるRNA 複製の生成物ではなく、そして代わりに、トランスフェクトされたプラスミドのT7転写の生成物であるはずである。
【０１９０】
再構成されたHPIV３ポリメラーゼにより生成されたミニゲノムは、カプシド化されていることが予測されるが、T7 RNAポリメラーゼにより生成される多くのミニゲノムは、カプシド化されていないことが予測される。従って、図5A〜5Bに記載される、同じミクロコッカスヌクレアーゼで処理されたサンプルからのRNA を、ポジティブ−センスのCAT リボプローブによりハイブリダイズされる第２ブロットを調製するために使用した（図7A、上方パネル）。これは、Ｎタンパク質の不在下で蓄積したすべてのミニゲノムRNA が、予測通りに分解されたことを示した（図7A、上方パネル、レーン１）。Ｌの不在下で蓄積した実質的にすべてのミニゲノムはまた、分解に対して敏感であって（図7A、上方パネル、レーン２）。Ｌの不在下で、そしてＮ及びＰのみの不在下で合成されたプラスミド−由来のミニゲノムは、効果的に生じるようには思えなかった。
【０１９１】
３種の支持プラスミドの完全な組が存在する場合、有意な量のミクロコッカスヌクレアーゼ−耐性ミニゲノムRNA が、個々のミニゲノムに関して蓄積した（図７Ａ、上方パネル）。ポジティブ−センスのRNA の場合、よくあることだが、最大量の子孫ミニゲノムが＋２ミニゲノムと共に観察された。次に、＋１及び＋３ミニゲノムが豊富になり、そしてゲノムRNA のレベルは、＋２ミニゲノムのレベルの67％及び42％であった。
【０１９２】
前記例は、HPIV３  Ｎ，Ｐ及びＬタンパク質が効果的な転写及びRNA 複製のために必要且つ十分であることを示す。再構成された PIV３ポリメラーゼにより介在される転写及びRNA 複製の非常に強い性質が、コードされたタンパク質の機能性を確認した。発現系内への追加のウィルスタンパク質の包含がそれらの過程を増強し、又は修飾するであろうことがさらに予測される。本発明の組成物及び方法内でのPIV Ｃ，Ｄ、及び滞在的にはＶの同時発現が、たとえばRNA 複製を増大し、そして／又は修飾するために有用であろう。このためには、プラスミドが、PIV 転写及びRNA 複製、並びに適切な感染モデルにおけるPIV 表現型に対するそれらの効果を決定するために、１又は複数のそれらの要素の同時発現を達成するための前記方法に従って、構成され、そしてアッセイされるであろう。
【０１９３】
例VI
cDNAからの感染性組換えRNA の構成
次の例は、４種のプラスミド担持のcDNAの細胞内同時発現による感染性組換えPIV (rPIV)の生成を記載する。それらのcDNAは、完全なHPIV３ゲノム及びHPIV３ヌクレオカプシドタンパク質Ｎ、リンタンパク質Ｐ、及びポリメラーゼタンパク質Ｌを別々にコードする。
【０１９４】
Ａ）ウィルス及び細胞
修飾されたワクシニア株Ankara (MVA)、すなわちバクテリオファージＴ７ RNAポリメラーゼを発現するワクシニアウィルス組換え体を、Wyatt など., Virol. 210 : 202-205, 1995(引用により本明細書に組込まれる）に従って調製した。 HEp−２単層培養物を、２％FBS,50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェート及び２mMのグルタミンにより補充されたOpti MEM1 (Life Technologies）により、５％CO2 下で37℃で維持した。HPIV３のJS wt 株及びその弱毒化されたts誘導体、すなわちJS cp45 を、Hallなど., Virus Res. 22 : 173-184, (1992)（引用により本明細書に組込まれる）により記載のようにして、 LLC−MK２細胞において増殖した。
【０１９５】
Ｂ）cDNA
HPIV３の完全なゲノム配列をコードする、ｐ218 (131)(図１、配列番号１）と称する十分なcDNAクローンを、上記のようにして構成した。p3/7 (131)（配列番号14)(ATCCにブタペスト条約の下で寄託され、そして寄託番号第 97990号を付与されている）と称する第２のcDNAクローンを、HPIV３の完全なアンチゲノム配列をコードするよう構成した。ｐ３／７ (131)は、ｐ218 (131）と、HPIV３ cDNA 挿入体に対してのＴ７プロモーター及びリボザイム/T7ターミネーターの位置が相互変更されていることにおいて異なる。従って、p3/7 (131)において合成される第１のヌクレオチドは、アンチゲノムの5'末端、すなわちゲノム位置１のポジティブ−センス相補体であり、そしてリボザイム分解により定義される３’アンチゲノム末端はゲノム位置15462 の相補体である。
【０１９６】
p3/7 (131)2G（配列番号15)(ATCCにブタペスト条約下で寄託され、そして寄託番号第 97989号を付与されている）と称する第３のクローンもまた構成し、これはp3/7 (131)と同一であるが、但し２つのＧ残基がアンチゲノムの5'末端とT7プロモーターとの間に挿入されている点で異る。p3/7 (131)2G及びp3/7 (131)の構成のために、２種のプラスミドｐ（A A'CC'D E) 及びp(E FF'GHIJKL) を修飾し、そしてHPIV３の完全なポジティブ−センスのアンチゲノムをコードするよう連結した。第１に、p(A A'CC'D E) におけるHPIV３の3'末端に隣接するＴ７ターミネーター及びδリボザイムを、PCR を用いて、Ｔ７プロモーターにより置換した（図８を参照のこと）。
【０１９７】
ポジティブ−センスプライマー：5'-GGCCCGTCGACGCG TAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAG-3'（配列番号18）により、HPIV３（HPIV３配列は下線を引かれている）の３’リーダーに隣接してＴ７プロモーター（太字）が配置され、転写を改良するためにそれらの２種の要素間に２個のＧ残基が挿入される。ユニーク MluＩ部位（イタリック型）を、クローニング目的のためにＴ７プロモーターの上流に配置した（図８）。ネガティブ−センスプライマー：5'-1224CGGCAT GACGTG CTAC1209-3'（配列番号19）は、HPIV３  Ｎ遺伝子のnt1209−1224にわたり、そして天然のHPIV３配列に存在するユニーク PmlＩ部位（イタリック型）を包含した。
【０１９８】
PCR 生成物及び親の鋳型ｐ218 (A A'CC'D E)の両者を、 MluＩ及び PmlＩにより消化し、そして次に、PCR 生成物を MluＩ− PmlＩウインドウ中にクローン化した。第２のPCR 反応を、同じネガティブ−センスプライマー及びポジティブ−センスプライマー（但し、HPIV３のＴ７プロモーターと３’末端との間に２Ｇ残基が挿入されていない）を用いて行なった。それらのプラスミドを、ｐ（Left＋２Ｇ）及びｐ（Left＋）と命名した。ｐ（Left＋２Ｇ）の構成は図８に示され、ｐ（Left＋）の構成は同じ手段に従った。
【０１９９】
プラスミドｐ (E FF'GHIJKL ) をPCR により修飾し、HPIV３の５’末端に隣接してδリボザイム及びＴ７ターミネーターを配置した（図９）。ポジティブ−センスプライマー：5'-GGATTT GCGCCC14813 AATTTAAAT CATCTGG24820-3'(配列番号16）は、HPIV３（HPIV３特異的配列は下線が引かれている）のＬ遺伝子におけるユニーク SwaＩ部位（イタリック型、下線が引かれている）のすぐ上流にBssHII部位（イタリック型）を導入した。ネガティブ−センスプライマー：5'-CCCAGGT GGCACC GCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC15462ACCAAAACAAGAGAAGAACTCTGTTTGG15435−3'（配列番号17）は、HPIV３ゲノム（ネガティブ−センスは下線が引かれている）の５’末端に隣接する天然に存在するユニーク RsrII部位（イタリック型）を含む、δリボザイムの一部（太字）を配置した。
【０２００】
このPCR 生成物をHssHII及び BsrIIにより消化し、そしてプラスミドp3/7のBssHII− RsrIIウインドウ中にクローン化した（図９）。プラスミドｐ３／７はｐ218 と同一であるが、但し、δリボザイム及びＴ７ターミネーターは逆方向配向で存在する。上記挿入を含むp3/7プラスミドを、pPIV3-3/7として命名し、そしてHPIV３の5'末端の 651個のヌクレオチドに隣接する完全なδリボザイム及びT7ターミネーターを含んだ。プラスミドの PIV3-3/7の SwaＩ及びMgoMI フラグメントを単離し、そしてp(E FF'GHIKL )の SwaＩ−NgoMI ウインドウ中にクローン化した。
【０２０１】
p(Right ＋）と命名されたその得られるプラスミドは、HPIV３の５’末端に隣接する完全なδリボザイム及びＴ７ターミネーターを配置した（図９を参照のこと）。ｐ(Right＋）の XhoＩ−NgoMI フラグメントを、p(Left＋）及びp(Left＋2G）の XhoＩ−NgoMI ウインドウ中にクローン化し、それぞれ、プラスミドp3/7 (131)（配列番号14）及びp3/7 (131 2G)(配列番号15）をもたらした（図10）。それらの個々は、HPIV３アンチゲノムRNA の完全なポジティブ−センス類似体をコードし、そして後者のcDNAは改良された転写効率のためにＴ７プロモーターに隣接して２つのＧ残基を含む。
【０２０２】
Ｃ）トランスフェクション
HEp−２細胞を、６ウェルプレートにおいて90％集密性 (confluence) まで増殖せしめた。６−ウェルプレートの個々のウェル(1.5×106 個の細胞）を、３種の前記支持プラスミド、すなわち 0.4μｇのpTM(Ｐ), 0.4μｇのpTM(Ｎ）, 0.05μｇのpTM(Ｌ）、及び５μｇの十分な長さのゲノム又はアンチゲノムHPIV３ cDNA によりトランスフェクトした。プラスミドを、12μｌのLipofect ACE (Life Technologies)を含むOpti MEM1 (Life Technology)0.2mlに添加した。室温で約15分間のインキュベーションの後、２％ウシ胎児血清及び 1.5×10７pfuの MVA−Ｔ７を含む 0.8mlのOpti MEMを個々のウェルに添加した。その培養物を32℃で12時間インキュベートし、その後、培地を、２％ウシ胎児血清を含む新鮮なOpti MEM1 により交換した。
【０２０３】
その培養物を32℃でさらに３日間インキュベートし、次に収穫し、そして新鮮な HEp−２単層上に継代した（継代１と言及する）。それらの継代１培養物を32℃で５日間インキュベートし、そして培養物に存在するウィルスを収穫し、 LLC−MK２培養物において１度、継代し、そしてvan Wyke Coelingh など., Virol. 143 : 569-582, (1985)(引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにして赤血球凝集阻止(HAI）により特徴づけ、それがcDNAから回収されたウィルスを表わすモノクローナル抗体耐性突然変異（MARM）を有するかどうかを決定した。
【０２０４】
Ｄ）組換えウィルスの配列決定
組換えPIV のHN及びＬ遺伝子におけるヌクレオチド配列マーカーの存在を、回収されたビリオンから単離されたRNA のRT−PCR により決定した。1 mlのpPIV（１×10５pfu／ml、継代レベル２）を、氷上での１時間のインキュベーションにより、25％ポリエチレングリコール 200μｌにより沈殿せしめ、そして12,000ｇで15分間、遠心分離した。RNA を、TRIzol試薬(Life Technologies) により、製造業者の推薦方法に従って精製した。RT−PCR を、Superscript キット(Life Technologies) により、製造業者の推薦方法に従って実施した。対照反応は同一であったが、但しPCR 生成物がウィルスRNAからのみ由来し、そして可能性ある汚染性cDNAプラスミドからではないことを確認するために逆転写酵素を反応から削除した。４種のプライマー対を用いて、nt7334-8715, 9364-10854, 10939-15392及び13623-15392 からPCR 生成物を生成した。次に、それらの得られるPCR 生成物を、サイクルジデオキシヌクレオチド配列分析（NewEngland Biolabs, Beverly, MA）を用いて配列決定した。
【０２０５】
例VII 
ネガティブ−センスのゲノムRNA をコードするcDNAからの組換えウィルスの回収
プラスミドｐ218 (131) 、並びに３種の支持プラスミドpTM(Ｎ），pTM(Ｐ）及びpTM(Ｌ）を、Ｔ７ RNAポリメラーゼを発現するMVAと共に、 HEp−２細胞中にトランスフェクトした。pTM(Ｎ）, pTM(Ｐ），pTM(Ｌ）及びMVA から成る対照グループを、 HEp−２細胞中に、ｐ218 (131) を伴わないで同時トランスフェクトした。４日目、トランスフェクタントを収穫し、新鮮な HEp−２細胞単層上に５日間、継代し、そして再び LLC−MK２培養物において５日間、継代した（継代２）。
【０２０６】
継代２の収穫物に存在するウィルスをさらに、HAI により特徴づけた。十分な長さのゲノムクローンｐ218 (131) を伴わないで、３種の支持プラスミドのみを受けたトランスフェクショングループからの培養物は、HPIV３を生成しなかった。ウィルスから回収されたrPIVは、それがHAI アッセイにおいて、HPIV３に対して特異的である mAb77／５,101／１及び 454／11と反応するので、HPIV３であることが確認された。それは、mAb170／７及び 423／６と反応しないので、仮定に基づけば、cDNA−由来のものとして同定され、それはcDNA中に導入されたMARM突然変異と一致した。
【０２０７】
【表１】
2008307055.tif 000002
【０２０８】
rPIVが実際にcDNAから回収されたかを確かめるために、それを、野生型JS株HPIV３と平行して、７個の挿入されたマーカー突然変異挟む４種のプライマー対を用いてRT−PCR により分析した。得られた個々のPCR 生成物はRTの包含に依存し、このことは、各々がRNAに由来し、そして汚染性cDNAに由来しないことを示す。４種のPCR生成物のサイクル−配列決定は、rPIVの配列が７種のマーカーの各々を含むことを確かめ、３種のマーカーを示す配列決定データが図11に示される。nt7903, 7913及び7915を包含する、HN遺伝子におけるrPIVとJS wt との間の配列差異は明白である。類似する配列分析を、nt位置7593, 10355, 11333及び15248 での他の４種のマーカー、並びに個々の突然変異を有したrPIVについて行なった。
【０２０９】
それらの結果は、ネガティブ−センスのゲノムRNA をコードするcDNAからの感染性rPIVの好都合な回収を示す。これは、ウィルス回収のために使用されたcDNAがポジティブ−センスのアンチゲノムRNA をコードするように企画されている、セグメント化されていないネガティブ鎖RNA ウィルスの回収についてのほとんどの公開された報告とは異なる（Baron and Barrett,前記, 1997 ; Collinsなど,前記, 1995 ; Conzelmann,前記, 1996; Garcinなど, 前記, 1995;Lawsonなど, 前記, 1995 ; Radeckeなど.,前記, 1995; Whelanなど, 前記, 1995）。ゲノムRNA をコードするcDNAからの感染性ウィルスの回収は、これまで、Sendaiウィルスの場合においてのみ報告されており、そして回収の効率はアンチゲノムRNA をコードするcDNAに関してよりも低かった（Katoなど., 1996)。
【０２１０】
ほとんどの他の研究においては、ウィルスの回収は、アンチゲノムcDNAにより達成されているが、しかしゲノムcDNAによっては達成されていない（Lawsonなど., 1995 ; Whelanなど., 1995)。不活性ハイブリッドをもたらす、支持プラスミドにより生成されるmRNAとcDNA−コードのゲノムRNA との可能なアニーリングを包含する、それらの御しがたい結果を説明することができる多くの可能性ある問題が示されて来た（Conztlmann, 前記, 1996; Lawsonなど.,前記, 1995）。たぶん、GEシグナルのオリゴＵ形跡がＴ７ RNAポリメラーゼによる転写終結のための天然のシグナルに類似するので、T7 RNAポリメラーゼは、ゲノムRNA の遺伝子連結部で選択的に終結するように思われることがまた示されている（Whelanなど.,前記, 1995）。
【０２１１】
例VII 
ポジティブ−センスのアンチゲノムRNA をコードするcDNAからの組換えウィルスの回収
上記でより詳細に記載されたように、p3/7 (131)及びp3/7 (131)2Gを、組換えPIV を生ぜしめるポジティブ−センスのアンチゲノムをコードするよう構成した。プラスミドp3/7 (131)2Gは、p3/7 (131)と同一であるが、但しT7プロモーターとアンチゲノムの第１ヌクレオチドとの間の２つのＧ残基が付加されている。T7プロモーターと第１HPIV３ヌクレオチドp3/7 (131)2Gとの間への２つのＧ残基の付加は、２つのＧ残基の存在（０，１又は３個の付加される残基に反して）はミニレプリコン複製の実質的に高められたレベルを生成することを示す前記例に基づかれている。
【０２１２】
２種のアンチゲノムcDNA〔p3/7 (131)及びp3/7 (131)2G〕を、Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと共に、細胞中に別々にトランスフェクトし、そしてｐ218 (131) について記載されるのと同じ方法を用いて、 MVA−Ｔ７組換えウィルスにより同時に感染せしめた。個々のアンチゲノムcDNAからの感染性ウィルスを回収し、そしてmAb423／６及び 170／７と反応できないその能力によりcDNA−誘導されるものとして推定的に同定した。
【０２１３】
ウィルス回収の効率を、ゲノムcDNA p218 (131) に対する個々のアンチゲノムcDNAについて評価した。ネガティブ−センスのゲノムcDNA ｐ218 (131)(配列番号１）を用いての12のトランスフェクション反応を、２種のcDNAからのウィルス回収の効率を比較するために、ポジティブ−センスのアンチゲノムcDNA p3/7 (131)2G（配列番号15）を用いての12のトランスフェクションと同時に実施した。個々のウェルからのトランスフェクション収穫物１mlを LLC−MK２細胞に対してタイトレーションし、そして残る２mlを新鮮な LLC−MK２細胞ヒト継代した（継代１）。
【０２１４】
５日目、継代１を収穫し、そして上記のようにしてタイトレーションした。組換えウィルスを、ｐ218 (131) によりトランスフェクトされた12のウェル当たりわずか４のウェルからではなく、p3/7 (131)2Gによりトランスフェクトされた12のウェル当たり12のウェルから回収した。ポジティブ−センスのアンチゲノムからの継代されたウィルスの培養物に存在するウィルスの平均力価（10５．０)は、10４．１  であるネガティブ−センスゲノムからの力価よりも10倍近く高かった。しかしながら、１つの追加増幅により、力価は同等になった。
【０２１５】
【表２】
2008307055.tif 000003
【０２１６】
（ｉ）ゲノム又はアンチゲノムcDNAが組換えウィルスの生成でより効果的であるかどうかを決定するために、及び（ii）組換えウィルスの収率に対する２つの特別な５’末端Ｇ残基の効果を決定するために、ゲノム又はアンチゲノムHPIV３RNA をコードする３種の十分な長さのプラスミドからの組換えウィルスの回収効率を研究した（表２）。不運なことには、残留 MVA−T7が LLC−MK２単層培養物上でのrJS のプラーク形成を妨害するので、プラークタイトレーションによりトランスフェクション収穫物を直接的にタイトレーションすることは不可能であった。
【０２１７】
従って、本発明者は、まず、複数の独立したトランスフェクションからのrJS の回収の効率を比較し、そして他の実験に見られるように、rJS がｐ218 (131) によりトランスフェクトされた培養物からよりもp3/7 (131)2Gによりトランスフェクトされた培養物からより頻繁に回収されたことを見出した。ｐ218 (131) によるトランスフェクション収穫物を包含する、個々のトランスフェクション収穫物は他の実験においてrJS を生成したので、組換えウィルスを生成する相対的な効率を比較するためにこの分析方法を用いることは不可能であった。従って、本発明者は、トランスフェクション収穫物の１回の継代に続いてウィルスの量を定量化することによって、トランスフェクション収穫物に存在するウィルスの相対的量を推定した（表２）。
【０２１８】
個々のプラスミドは同一のウィルス(rJS）を生成するよう企画されているので、継代されたウィルスの力価における差異は、トランスフェクション収穫物に存在するウィルスの力価の差異の表示として見なされた。上記実験においては、5'末端Ｇ残基を有する構造体はrJS の生成において最とも効果的であった。これは、２つの付加された残基が実際、回収の効率を増強したことを示したが、しかし効率におけるこの小さなインクレメントについての機構は定義されていない。それらの発見は、HPIV３ cDNA 中に突然変異を導入するよう企画される将来の実験のための基質としてp3/7 (131)2Gを用いることの小さいが、しかし記載できる利点を示す。p3/7 (131)2Gからの組換えウィルスの回収における小さな利点は、インビトロで複製を制限する弱毒化突然変異を有するウィルスを回収するために特に必要とされる。
【０２１９】
VSV は、5'−末端で３個のＧ残基を含むアンチゲノムcDNAから回収されて来たが、この構造体からのウィルスの回収効率は、その特別な残基を欠失する同じ構造体からの回収率と比較されていない（Whelanなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 8388-8392 (1995) ; 引用により本明細書に組込まれる）。Sendaiウィルス及び麻疹ウィルスによる実験に比較して、アンチゲノムの５’−末端でのウィルス外Ｇ残基が、組換えウィルスの回収に対して有害でなく、そして好都合であると思われることが明白である（Garcinなど.,前記, 1995 ; Radeckeなど.,前記, 1995; Katoなど, 1996) 。２つの5'−末端グアニン残基を有さないゲノム及びアンチゲノムプラスミドは、組換えウィルスの生成において同様に効果的であるように思われる。これは、組換えウィルスの生成においてアンチゲノムcDNAよりも効果が低いゲノムcDNAを見出しているこれまでの報告とは異なる（Whelan, 1995; Katoなど, 1996) 。
【０２２０】
p3/7 (131)（配列番号14）からのウィルスの回収の効率を、上記に類似する実験で、p3/7 (131)2G（配列番号15）及びｐ218 (131)(配列番号１）のその効率と比較した。p3/7 (131)からの回収率は、ｐ217 (131) の回収率に相当した。回収率は、余分のＧを含む両アンチゲノムcDNAに関して、より一致し且つ効果的であった（表２）。
【０２２１】
例VII 
許容できる温度及び制限的温度でのrPIVのプラーク形成の効率
ｐ218 (131) 及びp3/7 (131)2Gの両者に由来するrPIV及び対照ウィルスのインビトロ複製の温度感受性レベルを、次の変性を伴って、Hallなど., Virus Res. 22 : 173-184 (1992)(引用により本明細書中に組込まれる）により前に記載されたようにして LLC−MK２単層培養物において、32℃、37℃、39℃及び40℃で決定した。ウィルスを、室温で１時間、吸着せしめられた連続した10倍希釈溶液を含む24−ウェルプレート上の LLC−MK２単層上に接種した。
【０２２２】
次に、培養物を、２mMのグルタミン及び 0.8％のメチルセルロースにより補充された１mlのＬ−15により被覆し、そして次に、プレートを上記で示された温度で５日間インキュベートした。メチルセルロース膜を除去し、そして単層を80％メタノールにより４℃で１時間、固定した。単層に存在するウィルスプラークを、Murphyなど., Vaccine 8 : 497-502 (1990)(引用により本明細書に組込まれる）により記載のようにしてネズミ抗体に対して特異的なイムノペルオキシダーゼ染色方法を用いて、１：500 の希釈度で使用される腹水として２種のHPIV３−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び66／４の混合物を用いて計数した。
【０２２３】
ポジティブ又はネガティブ−センスのcDNAのいずれかに由来する組換えウィルスを、それらがJS wt ウィルスに表現型的に類似するかどうかを決定するために、32℃、37℃、39℃及び40℃でプラークアッセイにより特徴づけた。ポジティブ及びネガティブ−センスのrPIVの両者は、39℃及び40℃の高温で、それらの複製レベルにおいて、JS wt ウィルスに匹適した（表３）。これを、37℃で力価の30倍の低下を示し、そして39℃又は40℃でプラークを生成し得ないts変異体JS cp45 と対比した。
【０２２４】
【表３】
2008307055.tif 000004
【０２２５】
JS cp45の配列は十分に決定されており（Stokesなど.,前記, 1993) 、そして突然変異はリーダー、Ｎ，Ｐ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬ遺伝子において同定されている。しかしながら、突然変異がca, att 又はts表現型を担当するかは未知である。本発明の典型的なrPIVはJS wt 親のようなts＋  表現型を示すので、既知の又はPIV のために発見されるべき他の突然変異間のcp45突然変異が、たとえば高温で注目の突然変異を組込む組換えウィルスの複製を評価することによって、個々の突然変異又はその組合せの効果を指摘するために十分な長さのcDNA中に、単独で、又は組合せて導入され得る。このように同定された突然変異は、下記例に記載のようにして、効果的な弱毒化されたワクチン剤中に組込まれ得る。組換えPIV 中に組込まれたそれらの及び他の突然変異はさらに、生物学的に誘導された変異体株よりも組換えウィルスを遺伝子的により安定性にするために、コドン当たり複数のヌクレオチド置換を創造する突然変異誘発により最適化され得る。
【０２２６】
例VIII
ハムスターにおけるrPIVの複製
36匹の生後16週のgolden Syrian ハムスターを、４つのグループ（それぞれ９匹のハムスター）に分け、そして105.5pfuの、ネガティブ−センスcDNAから回収されたrPIV、ポジティブ−センスcDNAから回収されたrPIV, JS cp45 、又はJS wt ウィルスを含む 0.1ml溶液を鼻腔内接種した。４日目、ハムスターを殺し、そして肺及び鼻甲介を収穫した。肺を、 2.5μｇ／mlのアンホテリシンＢ（Guality Biologicals, Gaithersburg, MD)、 200μｇ／mlのピペリシリン（Lederle Laboratories, Pearl River, NY)及び50μｇ／mlのゲンタマイシン（Quality Biologicals)を含む20％（ｗ／ｖ）Ｌ−15懸濁液において均質化した。鼻甲介を同様に、10％（ｗ／ｖ）Ｌ−15懸濁液において均質化した。均質化の後、サンプルをアリコートし、そしてドライアイス−エタノール槽において急速に凍結せしめた。サンプルに存在するウィルスを、後日、32℃で LLC−MK２細胞の96ウェルプレートにおいて滴定し、接種の後、５及び７日目でCPEを計測した。平均 log10TCID50/gを、９匹のハムスターの個々のグループについて計算した。
【０２２７】
表４は、ネガティブ−センスのcDNAから回収されたrPIV及びポジティブ−センスのcDNAから回収されたrPIVが、ハムスターの上部及び下部呼吸器官におけるJS wt と実質的に同じレベルに複製することを示す。これを、個々の部位で弱毒化されるJS cp45 ウィルスと対比した。
【０２２８】
【表４】
2008307055.tif 000005
【０２２９】
従って、本発明の典型的なrPIVは、生物学的に誘導されたJS wt親株により示される、ハムスターにおける複製能力を保持することができ、それにより、突然変異、たとえばハムスター及び他の宿主、たとえば非ヒト霊長類及びヒトにおいて複製を制限する、JS cp45 候補ワクチンに存在する突然変異が、下記例に記載のようにして、同定され、そして本発明の修飾されたrPIV株内に組込まれ得る。
【０２３０】
例IX
弱毒化された表現型を特定するHPIV３中のアミノ酸置換の同定、 及び感染性の弱毒化されたPIV クローン中への弱毒化突然変異の組込み
cDNAから感染性PIV を生成する能力は、弱毒化された生パラインフルエンザウィルスワクチンの開発を促進する。より詳しくは、本明細書に開示される方法及び手段を用いることによって、PIV 候補ワクチンの弱毒化の遺伝的基礎が容易に決定され、そしてcDNAから生成される感染性PIV ワクチンが、精細に調節されたレベルの弱毒化及び免疫原性を達成するよう企画され得る。
【０２３１】
さらに、本発明の手段及び方法は、ヒト疾病において最とも重要であるすべての３種のヒトパラインフルエンザウィルスHPIV１，HPIV２及びHPIV３のためのワクチン開発を提供する。たとえば、本発明内の効果的なHPIV３ワクチン剤を生成し、そして選択するためには、生物学的に誘導するHPIV３候補体ワクチン又は弱毒化されたBPIV３ウィルスの所望する表現型に関連する突然変異、たとえば弱毒化突然変異が、同定され、そしてrPIV中に組込まれ得る。この方法を適用して、候補突然変異の大メニューからの弱毒化突然変異が、弱毒化と免疫原性との間の所望するバランスを有し、そしてヒトにおける複製に続いて、弱毒化表現型を保持するrPIVを生成するために選択され、そして組合される。
【０２３２】
この例においては、 PIV３ JS cp45弱毒化された生ウィルスの感温性（ts）及びインビボ弱毒化(att）表現型の遺伝的基礎が記載されている。７種の典型的な組換え PIV３ウィルス（３種の単一、３種の二重、及び１種の三重−障害ウィルス）が、十分な長さのアンチゲノムcDNAから回収され、そしてそれらのts及びatt 表現型について分析された。それらの組換え体は、JS wt 親のcDNAクローン内に採用された、JS cp45 （他方では、cp45として本明細書において言及される）のＬ遺伝子に存在する１又は複数のアミノ酸置換突然変異を担持する。それらの３種の典型的な、生物学的に誘導された突然変異は、12301 Parklaw Drive, Rockville, Muryland 20852,USA のAmerican Type Culture Collection (ATCC) に、ブダペスト条約の下で、1997年８月21日に寄託され、そして寄託番号VR2588を付与された、JS cp45 Veroと称する、Vero細胞において増殖されたJS cp45 の代表的株にすべて存在する。
【０２３３】
下記に示される典型的なPIV 組換え体の分析は、Ｌにおける３種の個々の典型的な突然変異（Tyr942→His, Leu992→Phe 、及びThr1558→Ile)が、cp45のts及びatt 表現型に寄与し、そして組換えワクチンウィルスの生成のために有用である。
【０２３４】
ウィルス及び細胞
PIV３ JS wt及びcp45ウィルスを、前記のようにして、 LLC−MK２細胞において増殖した（Hallなど, Virus Res. 22 : 173-184 (1992) ;引用により本明細書中に組込まれる）。 vTF７−３組換えワクシニアウィルスは、Fuerstなど, Virology 225 : 419-422 (1996) に記載されており、そしてＴ７ポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアウィルスAnkara (MVA)は、Wyatt など, Virology 210：202-205 (1995)に記載される（個々の引例は、引用により本明細書中に組込まれる）。 HEp−２（ATCC CCL23）及び LLC−MK２（ATCC CCL7.1)細胞は、２％FBS 、及びゲンタマイシンスルフェート（50μｇ／ml）により補充されたOpti MEM (Life Technologies)において維持された。
【０２３５】
PIV３のＬ遺伝子における点突然変異の構成
部位特定突然変異誘発により点突然変異をＬ遺伝子中に導入するために、 pUC19を JS wt PIV３  Ｌ遺伝子のフラグメントを受容するよう修飾した。第１に、ユニーク NheＩ制限部位を、pUC19(Ｎ）を創造するために pUC19のMindIII 部位中に、 NheＩ制限部位を含む１対の相補的オリゴヌクレオチド（5' GATCGATGCTAGCCC 3'(配列番号23）及び5' GATCGGGCTAGCATC 3'(配列番号24))を連結することによって、 pUC19中に導入した。
【０２３６】
cp45における３種のコード変化が生じる位置を包含し、そして十分な長さの PIV３ cDNA 中に直接的に導入され得る（下記参照のこと）、pTM(Ｌ）の SphＩ(PIV３ nt11317）〜 NheＩ(PIV3 nt14087)フラグメントを、pUC19(Ｎ）の SphＩ及び NheＩ部位中にクローン化し、pUCL（Ｎ−Ｓ）を創造した。点突然変異を、（ｉ）Ｌタンパク質位置942, 992、及び1558で、個々に及び組合して、典型的なアミノ酸置換を創造するために、及び（ii）マーカーとして個々のコドン置換に近位の１つの特定の天然に存在する制限酵素部位を削除するために、Transformer 突然変異誘発キット（Clontech, Polo Alto, CA)と共に突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いて、pUCL（Ｎ−Ｓ）中に導入した〔表５を参照のこと〕。
【０２３７】
【表５】
2008307055.tif 000006
【０２３８】
pUCL(N-S）誘導体に導入された突然変異を、プラスミドDNAのジデオキシヌクレオチド配列決定により確かめた。cp45の個々のＬ遺伝子突然変異を含むpUCL(N-S）の SphＩ〜BamHI(nt13733)フラグメントを、pTM(L）の SphＩ〜BamHI 部位中にサブクローン化し、pTM(Ｌ）−942,−992,−942 ／992 、及び−1558を付与し；他の二重及び三重突然変異はPinAI 及び NheＩ部位を用いてアセンブルされた（図12）。変異体pTM(Ｌ）プラスミドを、プラスミド−コードのミニゲノムRNA 、及びＮ，Ｐ及びＬタンパク質を含んで成るミニレプリコンシステムにおいてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼマーカー遺伝子の発現を方向づける能力について、許容できる温度（32℃）で個々に試験した（Durbinなど., Virology 234 : 74-78 (1997); 引用により本明細書に組込まれる）。
【０２３９】
種々の変異体Ｌプラスミドは、マーカー遺伝子発現を、wt  Ｌのレベルの75〜106 ％までを支持し、このことは、個々の構築されたcDNAが有意な卓越した突然変異を有さないことを示唆する（示されていない）。次に、変異体pTM(Ｌ）プラスミドの個々の SphＩ〜 NheＩフラグメントを、十分な長さの PIV３ JS アンチゲノムcDNA  ｐ３／７ (131)２Ｇの SphＩ〜 NheＩ窓中にサブクローン化し、３種の置換のあらゆる可能な組合せを表わす７種の十分な長さの PIV３ cDNA クローンを創造した。
【０２４０】
１，２又は３個のcp45  Ｌタンパク質置換を担持する組換え体 PIV３（rPIV３）の回収
３種の支持プラスミドpTM(Ｎ），pTM(Ｐ）及びpTM(Ｌ）と共に、１又は複数のcp45  Ｌ遺伝子突然変異を担持する個々の十分な長さのアンチゲノムcDNAを、上記のようにして、Lipofect ACE (Life Technologies)及び MVA−Ｔ７を用いて、６−ウェルプレート（Costar, Cambridgo, MA)上の HEp−２細胞中にトランスフェクトした。32℃で４日間のインキュベーションの後、トランスフェクション収穫物を、６−ウェルプレート上の HEp−２細胞上に継代し、これを32℃で４日間インキュベートした。個々の継代１の上清液を収穫し、そして LLC−MK２細胞のＴ−25フラスコ上に通し、これを32℃で５〜６日間インキュベートした。
【０２４１】
継代２の上清液を収穫し、そして組換えウィルスの存在をまず、生物学的に誘導されたJS PIV３及び組換えJS PIV３の両者に結合する抗−HNモノクローナル抗体(Mab）、及びそのエピトープがマーカーとして作用するために削除されているために、cDNA−由来のウィルスに結合しないMab423／６による、ウィルスプラークのイムノペルオキシダーゼ染色（Murphyなど., Vaccine 8 : 497-502 (1990) ; 引用により本明細書に組込まれる）により確かめた。継代１に存在するウィルスを、前記のようにして、 LLC−MK２細胞に基づいて、２又は３回のプラーク精製にゆだねた。個の生物学的にクローン化された組換えウィルスを、さらなる特徴化のためのウィルスを生成するために、32℃で LLC−MK２細胞において２度、増幅した。ウィルスを、ポリエチレングリコール沈殿法により透明な培地から濃縮し、そしてウィルスRNA (vRNA)を、トリゾール試薬（Life Technologies)により抽出した。
【０２４２】
逆転写を、ランダムヘキサマーのプライマーと共にSuperscript IIキット（Life Technologies)を用いて、vRNAに対して実施した。AdvantagecDNA PCRキット（Clontech, Polo Alto, CA)、及び PIV３  Ｌ遺伝子に対して特異的な、センス（5' nt 11190-GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG 3' nt-11219) （配列番号31）及びアンチセンス（5' nt 14140-CCTGAATTATAATAATTAACTGCAGGTCCT 3' nt-14111)(配列番号32）プライマーを、 SphＩ〜 NheＩフラグメントの領域を増幅するために使用した。PCR フラグメントを、認識部位がＬにおける３種のcp45突然変異の挿入の間、削除されている、個々の制限酵素による消化により分析した（表５を参照のこと）。
【０２４３】
１，２又は３個のcp45  Ｌタンパク質アミノ酸置換を担持するrPIV３の許容でき且つ制限的な温度でのプラーク形成効率(EOP）
対照及び組換えウィルスのインビトロプラーク形成の感温性のレベルを、 LLC−MK２単層培養物において、32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃で決定し、そしてプラークを、メチルセルロース被膜の除去に続いて、テンジクネズミの赤血球細胞による血球吸着により数えた。他方では、その単層に存在するウィルスプラークを、１：500 に希釈された、２種の PIV３−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び 454／11の混合物によるイムノペルオキシダーゼ染色により同定した（Murphyなど, 前記 (1990))。
【０２４４】
ハムスター研究
６匹のグループにおける生後４〜16週間のgolden Syrian ハムスターに、10５．５pfuのrPIV３ JS wt,PIV３ cp35 ウィルス、又は１もしくは複数のcp45  Ｌタンパク質置換を含むrPIV３を含むOpti MEM1(動物当たり１ml）を、鼻腔内接種した。感染の４日後、ハムスターを殺し、肺及び鼻甲介骨を収穫し、そしてウィルスを上記のようにして定量化した。平均 log10TCID50／ｇを、６匹のハムスターの個々のグループについて計算した。
【０２４５】
結果
wt JS rPIV３中への PIV３ cp45 Ｌタンパク質アミノ酸置換の導入
上記のようにして、cp45のＬタンパク質に存在する３種のアミノ酸置換（表５）を、そのwt親、すなわち PIV３ JS 株をコードするアンチゲノムcDNA中に個々に又は選択された組合せで導入した。個々の導入された突然変異を、回収されたrPIV３における突然変異のモニターを促進するために、近位の天然に存在する制限酵素部位を削除したサイレント突然変異により識別されるよう構築した（表５、図12）。アミノ酸1558でのコード変化が、インビトロ、又はインビボ複製の間、この部位での復帰の機会を低めるために、cp45における１つのnt置換と比較して、ｒ1558における２つのヌクレオチド変化を含むよう企画された。
【０２４６】
cp45からの１，２又はすべての３個のアミノ酸置換を担持する７個のrPIV３を、pTM(Ｎ），pTM(Ｐ）及びpTM(Ｌ）支持プラスミドによる個々のアンチゲノムcDNAのトランスフェクション、及びワクシニアウィルス MVA／Ｔ７ pol組換え体による同時感染により組織培養物から回収した(Wyattなど, 前記, (1995)）。個々のrPIV３は、アンチゲノムcDNAを構築することによってHN遺伝子中に意図して導入されたMab 耐性マーカーを有した。rPIV３を、個々のウィルス調製物が遺伝的に均質であることを確かめるように、２又は３サイクルのプラーク対プラーク継代により生物学的にクローン化した。ワクシニアウィルスがアンチゲノムcDNAと支持プラスミドとの間での組換えを仲介する可能性があるので、上記のごとく用心した。
【０２４７】
７種のrPIV３の各々がＬ遺伝子に構築された突然変異を含むことを確認するために、RNA を沈殿したビリオンから精製し、そしてcDNA中にコピーし、そしてRT−PCR により増幅した。対照反応は、RT段階がRT−PCR 生成物の生成のために必要とされたことを示し、このことは、汚染性cDNAよりもむしろRNA 鋳型がRT−PCR 生成物の生成のために必要とされたことを示唆する。RT−PCR 生成物を、認識配列が挿入されたコード変化のためのマーカーとして削除されている、３種の制限酵素による消化にゆだねた。予測されるように、JS wt rPIV３のRT−PCR 生成物を、３種の酵素の個々により適切な回数、切断し、ところがｒ942 ／992 ／1558は、個々のcp45コード変化の創造の間に削除された個々の３つの部位を欠いていた。他のrPIV３の個々は、適切な制限部位を欠いており、このことは、導入された突然変異の存在を示す。
【０２４８】
cp45  Ｌ突然変異を担持するrPIV３の32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃でのプラーク形成の効率
cp45  Ｌタンパク質アミノ酸置換の種々の組合せを担持する７種のrPIV３を、32℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃で、 LLC−MK２単層上でのプラークを形成するそれらの能力についてアッセイした。表６に示されるように、cp45 aa 置換を担持する個々のrPIV３はtsであり、そしてJS wt rPIV３親は試験されたいづれの温度でも、プラーク形成において制限されなかった。
【０２４９】
ｒ942,ｒ992 及びｒ1558のプラーク形成の遮断温度は40℃であった。ｒ942 は40℃でプラーク形成の 700倍の低下を現わし、このことは、その複製がこの制限的温度でわずかに低められたことを示唆する。しかしながら、ｒ942 のプラークサイズはまた、40℃で非常に減じられ、このことはまた、その複製が、JS wt に比較して、この温度で制限されたことを示す。ｒ942 は、41℃で複製を完全に制限された（データは示されていない）。ｒ992 及びｒ1558は40℃でプラーク形成を非常に減じられた(1,000,000倍以上の低下）。それらの結果は、３種のcp45  Ｌ遺伝子突然変異の各々が、ts表現型を個々に特定し、但しｒ942 突然変異の表現型は幾分、限的的であったことを示す。
【０２５０】
二重変異体ウィルスｒ942 ／1558及び三重変異体ｒ942 ／992 ／1558は、39℃の遮断(cut-off）温度を有したが、ところがｒ942 ／992 の遮断温度は38℃であった。二重変異体ｒ992 ／1558は、ｒ992 の単一変異体よりも低いtsであった。ｒ942 のようにｒ992 ／1558は、41℃でのプラーク形成において、完全に制限された。二重又は三重変異体により示される感温性のレベルは、単一変異体により示される感温性のレベルから予測され得ない３種の突然変異の微妙なrPIV相互作用に起因する。また、ｒ942 ／992 ／1558はcp45よりもわずかに低いtsであるので、Ｌ遺伝子外の他の突然変異はまた、たぶん、cp45のts表現型に寄与し、従って、本発明内の注目の追加の突然変異を表わす。
【０２５１】
【表６】
2008307055.tif 000007
【０２５２】
ハムスターにおける増殖
６匹のGolden Syrrianハムスターのグループを、JS wt rPIV３、生物学的に誘導されたcp45、又は１もしくは複数のcp45  Ｌタンパク質アミノ酸置換を含むrPIVにより鼻腔内接種し、そして肺及び鼻甲介骨におけるウィルス複製を決定した。この実験〔表７〕においては、単一のアミノ酸置換を担持するrPIV３の各々を、上部及び下部呼吸器官における複製において制限した〔表７〕。しかしながら、ｒ942 、すなわち最小のtsウィルスが、第２の実験において上部及び下部呼吸器官における複製においてわずかに抑制されたに過ぎなかった。それらのデータは、３種のアミノ酸置換のうち２種の置換が、単一の損傷された組換えウィルスとして存在する場合、att表現型に寄与することを示す。
【０２５３】
しかしながら、942 突然変異は、実際、弱毒化に寄与する（たとえば、ｒ942 ／992 は、ｒ992 のみよりも、より弱毒化される）。従って、Ｌにおける個々のアミノ酸置換は、単独で作用するか又はもう１つのＬアミノ酸置換と共に作用するatt 表現型に寄与する。二重変異体の個々が弱毒化され、このことは、インビボでの複製に続いて、３種のＬ遺伝子置換のいづれかの欠失が弱毒化されたウィルスをまだ残していることを示す。これは、インビボでの複製に続いて、cp45のts表現型のこれまで観察された高レベルの安定性についての部分的な説明である。三重変異体ｒ942 ／992 ／1558は、上部及び下部呼吸器官における複製のためにcp45と同じくらい制限され、このことは、Ｌタンパク質における３種のアミノ酸置換がcp45のatt 表現型に対する主要要因であることを示す。
【０２５４】
【表７】
2008307055.tif 000008
【０２５５】
上記結果を要約すると、Ｌタンパク質アミノ酸位置992 及び1558での置換がそれぞれ、40℃で細胞培養物においてプラーク形成の 1,000,000倍の低下を特定し、そして位置942 での置換が 700倍の低下を特定した。従って、３種の突然変異の各々は、それぞれ、ts表現型に寄与する。すべての３種のＬ突然変異を有する三重組換え体は、cp45よりもわずかに少ないtsであり、このことは、また、そのts表現型に寄与する、cp45におけるＬ遺伝子の外部に突然変異が存在することを示唆する。Ｌにおける３種の個々の突然変異のうち２種の突然変異はそれぞれ、ハムスターの上部又は下部呼吸器官における制限された複製に寄与し、これは、インビボでの複製の間、cp45のts及びatt 表現型の観察される安定性を説明する。
【０２５６】
重要なことには、インビトロでの組換えワクチン株の感温性のレベルは、インビボでの弱毒化の密接な前兆となった。すべての３種の突然変異を有する組換えウィルスは、ハムスターの上部及び下部呼吸器官において、cp45変異体と同じほど、複製において制限され、このことは、cp45ウィルスのＬ遺伝子がこの候補体ワクチン株の主要な弱毒化成分であることを示す。個々の突然変異は、それ自体で、ts表現型を特定するが、一緒に配置される場合、それらは単純には、付加的ではないが、しかし代わりに、幾分、お互いに影響を及ぼす。三重変異体における３種の突然変異の一緒での効果は、評価される２種の二重変異体に観察される感温性のレベルを増強するよりもむしろ改良するように見えた。
【０２５７】
興味あることには、992 又は1558置換のいずれかの復帰による損失は、感温性のレベルを低めるよりもむしろ高めるので、これは、cp45  Ｌ突然変異の少なくともいくつかを維持するために予期しない選択的圧力を提供する。ひとまとめにして考えると、それらの発見は、cp45ウィルスのts及びatt 表現型の安定性の高レベルが、att 表現型へのＬにおける複数のts突然変異の寄与に起因することを示す。cp45の主要弱毒化突然変異としてのそれらの３種の突然変異の同定は、すべての製造段階の間、及びヒトにおける複製に続いて、ウィルスをモニターするための基礎を提供する。
【０２５８】
位置942 でのチロシンのヒスチジンへの突然変異、論じることには、３種の突然変異の最とも保存的な置換は、最小感温性であることが、さらなる興味の対象である。 PIV３のＬポリメラーゼは、2233個の長さのaaの大きなポリペプチドであり、そしてＰタンパク質、RNA 結合、RNA ポリアデニル化、RNA 転写及びRNA 複製による複合体形成のために必要とされるそれらのドメインを包含する、複数のドメインをコードする多機能タンパク質であると思われる(Collinsなど.,前記, (1996)）。
【０２５９】
位置942 及び992 でのＬにおけるアミノ酸置換は、パラミクソウィルス科の他のメンバー間に十分に保存される領域近くに位置する（Blumbergなど., Virology 164 : 487-497 (1982); Galinskiなど., Virology 165 : 499-510 (1988)）。位置1558での突然変異は、他のＬポリメラーゼと低い配列同一性を共有するように見えるポリメラーゼの領域に存在する。ts表現型がＬにおける三重アミノ酸置換により付与される機構は知られていないが、たぶん、複数のＬタンパク質ドメイン及び活性が影響され、又はＬの種々の活性を包含する通常の機構が影響される。
【０２６０】
例Ｘ
感温性、低温適合化及び弱毒化表現型を特定する、生物学的に誘導された、生存−弱毒化されたHPIVタイプ３ウィルス（cp45）における突然変異の直接的な同定、及び組換えワクチンウィルス中への再構成
上記例は、cp45のＬポリメラーゼタンパク質における３種のアミノ酸置換の各々が感温性（ts）及び弱毒化(att) 表現型を付与するが、しかし低温−適合性（ca）表現型を提供しないことを示す（また、Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 (3) : 1762-8, 1998 を参照のこと）。cp45は、他のタンパク質（Ｎ，Ｃ，Ｍ，Ｆ及びHN）又は可能性あるシス−作用性配列（Ｎ遺伝子のリーダー領域及び転写遺伝子開始｛GS｝シグナル）において12の追加の突然変異を含み、そしてそれらの表現型に対するそれらの寄与は前記のように下線が引かれている。
【０２６１】
この例はさらに、ヒト又は非ヒト霊長類におけるcp45の複製に続いてのそれらの表現型の観察される高レベルの安定性のための基礎に関するさらなる追加の情報を提供するために、cp45のts, ca及びatt 表現型についての遺伝的基礎を特徴づける。この研究の１つの観点においては、すべての15のcp45−特異的突然変異を含む組換えcp45(rcp45）ウィルスが、復帰遺伝学系を用いて構成され、そしてハムスターの上部及び下部呼吸器官におけるプラークサイズ、感温性のレベル、低温適合性及び複製のレベルに基づいて、生物学的に誘導されたウィルスと実質的に区別できないことが見出された。さらに、（１）Ｃ，Ｍ，Ｆ又はHNタンパク質におけるcp45−特異的変化、（２）組合されたリーダー及びＮ遺伝子突然変異、又は（３）cp45突然変異のいくつかの組合せを含む組換えウィルスを構成した。
【０２６２】
それらの組換えウィルスの分析は、ゲノムじゅうに分配される複数のcp45突然変異が、ts, ca及びatt 表現型に寄与することを示した。Ｃ及びＦにおける突然変異は、40℃でtsではないが、しかしそれにもかかわらず、att 表現型を付与し、そして従って、それらは非−ts att突然変異である。HN突然変異は、ca, ts又はatt 表現型を提供しなかった。３’リーダー及びＮ突然変異を有するウィルスはtsであるが、しかしハムスターの低部呼吸器官においては、わずかな弱毒化のみを示した。
【０２６３】
いくつかの突然変異の組合せを有する組換え体はcp45よりも高いレベルの感温性を示したが、しかしその高められた感温性レベルは、インビボでの弱毒化の増強において影響されなかった。それらの後者の発見は、cp45に同定される複数の突然変異は、インビトロでの複製を影響するために相互作用する。cp45における複数ts及び非−ts弱毒化突然変異はたぶん、その高レベルの弱毒化及び表現型安定性に寄与する。本明細書に提供されるcp45の種々の突然変異に関連する表現型の知識は、本発明内の有用なワクチン組換え体の大きな集合体を得るために、生物学的に誘導されたPIV ウィルスの正確なモニターリング、及び組換えウィルスの容易な操作を可能にする。
【０２６４】
ウィルス及び細胞
この例に記載されるrPIV３,PIV３ JS wt及びcp45ウィルスを、上記のようにして、サル LLC−MK２細胞(ATCC CCL7.1) において増殖した（また、Durbinなど, Virology 235 : 323-332, 1997a; Hallなど, Virus Res. 22 (3) : 173-184, 1992; Skiadopoulos など., J. Virol. 72 (3) : 1762-8, 1998を参照のこと）。修飾されたワクシニアウィルスAnkaraを上記のようにして調製した。HEp−２(ATCC CCL 23）及び LLC−MK２細胞を、２％FBS 及びゲンタマイシンスルフェート（50μｇ／ml）により補充されたOpti MEM1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD）、又は10％FBS 、ゲンタマイシンスルフェート（50μｇ／ml）及び２mMのグルタミンにより補充されたEMEMにおいて維持した。Ｌ−132 細胞 (ATCC CCL 5) を、10％FBS,２mMのグルタミン、20mMのHepes,１mMの非必須アミノ酸、及び 100単位のストレプトマイシン−ネオマイシン／mlにより補充されたEarl's MEM (Life Technologies)において増殖せしめた。
【０２６５】
PIV３における点突然変異の構成
3/7(131)2Gｐ、すなわち感染性ウィルスを回収するために上記で使用された PIV３ JS wtのアン3/7 (131)2GチゲノムcDNAクローンのサブゲノムフラグメント（また、Durbinなど., Virology 235 : 323-332, 1997a; Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 (3) : 1762-8, 1988を参照のこと）を、標準的分子クローニング技法を用いて、それらのフラグメントを受容するよう修飾されたpUC19 ベクター中にクローン化した。cp45に同定される突然変異に対応する点突然変異、及びサイレント制限酵素認識配列を創造し又は削除する突然変異（表８）を、前記のようにして、Transformer 突然変異誘発キット（Clontech, Palo Alto, CA)を用いて導入した。
【０２６６】
【表８】
2008307055.tif 000009
【０２６７】
ａ：示される PIV３配列における最初のヌクレオチドの位置。
ｂ：野生型配列が変異体配列上に示される。ヌクレオチド変化は下線が引かれている。コドン置換は太字で示される。
ｃ：各々の相当する制限エンドヌクレアーゼ認識配列がイタリック型で示される；（＋）は、新規の制限エンドヌクレアーゼ認識配列の付加を示し；（−）は天然に存在する制限エンドヌクレアーゼ認識配列の削除を示す。
ｄ：突然変異がwtの３文字アミノ酸割り当てとして、続いてアミノ酸位置、続いてcp45割り当てにより示される。
ｅ：それらの突然変異はJoanne Tatem（公開されていない観察）により同定されており、他はStokesなど, Virus Res. 30 (1) : 45-52, 1993 からであった。
ｆ：野生型配列への復帰を低めるために、示されるコドンにおいて２つのヌクレオチドが変更されている。
【０２６８】
突然変異誘発の後、制限エンドヌクレアーゼフラグメントを完全に配列決定し、そして十分な長さのクローン、p3/7(131)2G中にクローン化した。3'リーダー及びＮ突然変異を、 PIV３ cp45 ビリオンRNA から直接的に、逆転写（RT）−PCR により増幅し、そしてpLeft ＋2G（上記参照のこと）又はさらなる操作のために修飾されたpUC19 ベクター中にクローン化した。突然変異の組合せを、標準の分子クローニング技法を用いて構成した。pFLCcp45と称する、cp45突然変異を含む十分な長さのプラスミドクローンを、外来性突然変異がクローニング工程の間に導入されたかどうかを決定するために完全に配列決定したが、しかし見出されていない。
【０２６９】
組換え PIV３（rPIV３）の回収
３種の支持プラスミドpTM(Ｎ），pTM(Ｐ，Ｃなし）及びpTM(Ｌ）と共に、cp45突然変異を担持する個々の十分な長さのアンチゲノムcDNAを、上記のようにして、Lipofect ACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD)及び MVA−Ｔ７を用いて、６−ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA)上で HEp−２細胞中にトランスフェクトした。32℃で４日間のインキュベーションの後、トランスフェクション収穫物を、Ｔ−25フラスコにおける LLC−MK２細胞上に継代し、それを32℃で４〜８日間インキュベートした。この収穫されたウィルスを継代１と呼び、そして上記のようにして、 LLC−MK２細胞上での３回のプラーク精製にゆだねた。
【０２７０】
個々の生物学的にクローン化された組換えウィルスを、さらなる特徴化のためのウィルスを生成するために32℃で LLC−MK２細胞において２度、増幅した。ウィルスを、ポリエチレングリコール沈殿により透明化された培地から濃縮し（Mbiguino and Menezes, J. Virol. Methods 31 : 2-3, 1991を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）、そしてウィルスRNA (rRNA)を、トリゾール試薬（Life Technologies)により抽出した。逆転写を、ランダムヘキソマープライマーと共に、Superscript II Preamplification System (Life Technologies)を用いて、vRNAに対して行なった。Advantage cDNA PCRキット (Clontech）、及び PIV３ゲノムの種々の部分に対して特異的なセンス及びアンチセンスプライマーを用いて、制限エンドヌクレアーゼ分析のためのフラグメントを増幅した。PCR フラグメントを、認識部位が突然変異の構成の間、創造されているか又は削除されている個々の制限酵素による消化により分析した（表８）。
【０２７１】
許容できる温度及び制限的な温度での、cp45突然変異を担持するrPIV３のプラーク形成の効率(EOP）
対照及び組換えウィルスのインビトロででのプラーク形成の感温性のレベルを、上記のようにして、 LLC−MK２単層培養物において、32℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃及び41℃で決定した（また、Hallなど, Virus Res. 22 (3) : 173-184, 1992 を参照のこと；これは、引用により本明細書中に組込まれる) 。プラークを、メチルセルロースオーバレイの除去に続いて、テンジクネズミの赤血球細胞による血球吸着により数え、又は他方では、単層に存在するウィルスプラークを、１：250 に希釈された、２種の PIV３−特異的抗−HNネズミmAb101／１及び 454／11の混合物によるイムノペルオキシダーゼ染色により同定した(Murphなど., Vaccine 8 (5) : 497-502, 1990 ; van Wyke Coelinghなど., Virology 143 (2): 569-582, 1985 を参照のこと）。
【０２７２】
低温−適合表現型についてのrPIV３変異体のウィルスの評価
変異体及び wt rPIV３ウィルスの増殖を、24−ウェル組織培養プレートにおいて調製された集密的Ｌ−132 細胞単層上で、32℃及び20℃で決定した。２つのプレートの個々のウェルを、 0.2mlの個々の変異体又は wt rPIV３ウィルスにより、0.01の感染の多重度で二重反復して接種した。室温での１時間の吸着の後、接種物を吸引し、そして単層を、ウェル当たり１mlのPBS により洗浄した。
【０２７３】
接種された培養物を、10％FBS,２mMのグルタミン、20mMのHepes,１mMの非必須アミノ酸、及び 100単位のストレプトマイシン−ネオマイシン／mlにより補充されたイーグル MEM 0.5mlによりオーバーレイした。１つのプレートを、耐水性パウム(Kapak）に密封し、そして20℃の槽において13日間、浸した。二重反復プレートをCO２  インキュベーターに、32℃で３日間、配置した。インキュベーション期間の最後で、ウィルスを凍結／融解により収穫した。個々のウェルから回収されたウィルスの力価を、プラークを可視化するために、テンジクネズミ赤血球細胞による血球吸着を用いて、32℃で LLC−MK２細胞におけるプラークアッセイにより決定した。２つのwt及び２つのcp45対照ストックを、対照として使用した。
【０２７４】
ハムスター研究
５つのグループにおける生後５週目のGolden Syrian ハムスターを、10６．０pfuのJS wt rPIV３,PIV３ cp45 ウィルス、又は変異体rPIV３の１つを含むOpti MEM 1 0.1ml／動物により鼻腔内接種した。感染の４日後、ハムスターを殺し、肺及び鼻甲介を収穫し、そしてウィルスを上記のようにして定量化した。32℃での平均 log１０TCID５０／ｇを、個々のグループのハムスターについて計算した。
【０２７５】
結果
JS wt rPIV３中への PIV３ cp45 突然変異の導入
cp45の３’リーダー、Ｎ GS シグナル、並びにＮ，Ｃ，Ｍ，Ｆ，HN及びＬタンパク質における15の突然変異（表８）を、所望の突然変異を担持するcp45 cDNA のセグメントの部位特定突然変異誘発により又は直接的なPCR 増幅により、完全な PIV３アンチゲノムcDNA中に導入した。次のアンチゲノムcDNAを製造した（図13を参照のこと）：（ｉ）リーダー領域の４つの点突然変異、Ｎ GS シグナルにおける点突然変異、及びＮタンパク質における２つのアミノ酸変化を含むrcp45 3'N ; （ii）Ｃタンパク質における単一のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｃ；（iii ）Ｍにおける単一のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｍ；（iv）Ｆにおける２つのアミノ酸変化を有するrcp45 Ｆ；（ｖ）HNにおける単一のアミノ酸変化を含むrcp45 HN ;（vi）上記のように、Ｌにおける３個のアミノ酸変化を含むrcp45 Ｌ；（vii ）上記（ｉ）及び（vi）からの突然変異を含むrcp45 3'XIL ; （viii）Ｌにおける３個の突然変異を除くすべての突然変異を含むrcp45 3'NCMFHN; 及び（ix）表８に列挙されるすべての15個のcp45突然変異を含むrcp45 。
【０２７６】
ほとんどの場合、個々のcp45変化は、制限酵素認識部位を導入するか又は除去する１又は複数の近くのサイレント変化により付随されるよう構築された（表８）。それらは、cDNA及び回収されたウィルスにおける突然変異の存在を確かめるためのマーカーとして作用した。また、２つのアミノ酸コード変化（表８における突然変異番号10及び15）を、wtへの同じ部位復帰の可能性を低めるために、cp45に見出される単一の変化よりもむしろ２つのヌクレオチド変化を用いて行なった。表８におけるすべての15個のcp45変化を含むcp45 cDNA を、他のアンチゲノムcDNA中へのcp45変化を導入するために使用されるのと同じ突然変異誘発されたcDNAサブクローンからアセンブルし；それを全体的に配列決定し、そして意図された突然変異のみを含むことを確かめた。
【０２７７】
これは、突然変異誘発又はPCR にゆだねられ、そしてクローニングにより操作された領域のすべてが、所望する配列を有し、そして他の所望しない突然変異を欠いていることを示した。１又は複数のcp45突然変異を担持する個々の十分な長さのプラスミドを、上記のように、組換え PIV３を生成するために、支持プラスミド及び MVA−Ｔ７と共に HEp−２細胞中にトランスフェクトした。図13に示される種々の組換えウィルスのビリオンRNA から増幅された、表８に示される突然変異を包含するRT−PCR フラグメントの分析は、導入された突然変異の存在を確かめ、そして他の意図されない突然変異は見出されなかった。
【０２７８】
プラーク形態
いくつかの組換えウィルスは、 LLC−MK２細胞に対して試験される場合、特徴的なプラーク形態、すなわち平均サイズ１mmのJS wtrPIV３プラークを示し、そして生物学的に誘導された JS wt PIV３からはサイズ的に区別でなかった。cp45及びrcp45 ウィルスのプラークは、wtよりも大きく、wtよりも直径にして、平均２〜３倍大きく、そしてお互いとは区別できなかった。これは、この表現型に関しての生物学的に誘導された及び組換え体のcp45ウィルスの適合性を示した。
【０２７９】
許容できる温度及び制限的な温度での、 LLC−MK２細胞にcp45突然変異を担持するrPIV３のプラーク形成効率
rPIV３を、32℃〜41℃の範囲の許容できる温度及び制限的温度でプラークを形成するそれらの能力についてアッセイした（表９）。
cp45の個々の成分を担持するウィルスのts表現型の分析は、rcp453'N 及びrcp45 Ｍウィルスが40℃の遮断温度を有し、そしてrcp45Ｃ変異体が41℃の遮断温度を有したことを示した。rcp45 Ｆ及びrcp45 HN変異体の遮断温度は、41℃以上であった。rcp45 Ｌウィルスが39℃の遮断温度を有したことは、上記結果と一致した。40℃での複製のその低下（すなわち32℃での力価−40℃での力価）が40℃でのwtウィルスの力価の約 100倍以上である場合、ウィルスはts表現型を有すると思われる。この定義の適用により、この結果は、cp45の少なくとも２つの領域（３’Ｎ、及びＬ）がts表現型に寄与することを示した。
【０２８０】
【表９】
2008307055.tif 000010
【０２８１】
表９に示されるように、すべてのcp45突然変異を含むrcp45 は、生物学的に誘導されたcp45の遮断温度と同一である38℃の遮断温度を有した。それらの結果は、cp45のts表現型がrcp45 において都合良く再生されたことを示す。さらに、それらの結果は、cp45の配列分析、及び組換えウィルス中への突然変異の続く再構成を確認する。
【０２８２】
３種のＬ突然変異を欠いていることを除いて、rcp45 と同一であるrcp45 3'NCMFHNウィルスは、36℃の遮断温度を示した。Ｌ突然変異は感温性を個々に又は組合して付与することが知られているので、rcp45 3'NCMFHNがcp45よりもtsであることは幾分、逆説的である。これは、cp45内に突然変異の相互作用が存在し、それにより、突然変異が個々の成分の合計よりも低い感温性レベルを付与するためにお互い補足しあうことを意味する。
Ｌ突然変異がリーダー及び／又はＮ突然変異と相互作用するかどうかを調べるために、ウィルスrcp45 3'NLを構成した。なぜならば、それらのすべての要素は、RNA 合成の間、相互作用すると思われるからである。このウィルスは、それぞれ、rcp45 3'N 及びrcp45Ｌに関して40℃及び39℃であるの比較して、36℃の遮断温度を有した。それらの結果は、感温性の増大をもたらす、３’ＮとＬ突然変異との間に相互作用が存在することを示唆する。それらの結果はまた、cp45突然変異のサブセットが全組の突然変異を含むrcp45 に関して観察される感温性よりも高レベルの感温性を特定するもう１つの例を提供する。
【０２８３】
cp45突然変異を担持するrPIV３のca表現型
cp45の遺伝子要素がca表現型を特定したことを測定するために、rPIV３を分析した（表10）。rcp45 Ｌはts及びatt であるが、しかしcaではないことが上記に示されている。これは、ca表現型の大きな部分を特定する遺伝子要素がＬの外部に位置することを示し、そしてこれは、本発明の研究において確かめられた。３’リーダー及びＮ突然変異を有するrPIVの各々は、中間表現型を示したrcp45 3'NCMFHNを除いて、caであった。これは、ca表現型が３’Ｎ領域内にほとんど特定されることを示す。
【０２８４】
３’Ｎセグメントを含むウィルスのcaレベルがcp45又はrcp45 のcaレベルよりも低いという発見は、cp45の他の領域が、たとえこの領域がそれぞれ、他の領域の分析から明白でなくても、ca表現型に寄与することを示す。rcp45 3'NLウィルスは、rcp45 3'N ウィルスよりも、よりcaであり、このことは、Ｌ突然変異が適度な寄与を行なうことを示している。生物学的に誘導されたcp45及びrcp45 ウィルスは、caの比較できるレベルを示しており、このことは、プラークサイズ及びts表現型のような、この表現型が、本明細書に提供される組換えcp45ウィルスにおいて都合よく再生されることを示す。従って、ts表現型のような、このca表現型は、全体の表現型への個々の寄与、及び相互作用する遺伝子要素からの寄与に影響を及ぼす複合表現型である。
【０２８５】
【表１０】
2008307055.tif 000011
【０２８６】
ハムスターにおけるrcp45 変異体ウィルスの増殖
５匹のGolden Syrian ハムスターのグループを、10６TCID５０の組換え体又は生物学的に誘導されたウィルスにより鼻腔内接種し、そして肺及び鼻甲介骨におけるウィルス複製のレベルを、４日後に決定した（表11）。接種の14日目、wt及びcp45ウィルスの両者に関して、ハムスターにおいてウィルス複製のピークが存在することがこれまでに示されている（Crookshanks and Belshe, J. Med. Virol.13 (3) : 243-9, 1984 を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）。rcp45 ウィルスは、鼻甲介における複製が約40倍、及び肺における複製が1000倍低められ、そして従って、生物学的に誘導されたcp45ウィルスほどに弱毒化された。それらの結果は、cp45の弱毒化表現型が、その組換え体バージョンにおいて都合良く再生されたことを示す。cp45の個々の表現型は十分にrcp45 において再生されたので、この例に包含されないcp45における追加の５つの突然変異はたぶん、cp45の性質にほとんど寄与しなかった。
【０２８７】
【表１１】
2008307055.tif 000012
【０２８８】
上記に示されるように、cp45のＬ遺伝子における突然変異は、このウィルスの弱毒化表現型の大部分を特定する。この例においては、グループとしてのＬの外部のcp45突然変異の寄与が試験された。rcp45 3'NCMFHN変異体は、鼻甲介における複製においてわずかに低下したが、しかし肺における複製においては 100倍以上低下し、このことは、追加の弱毒化突然変異がＬタンパク質の外部に存在したことを示す。重要なことには、rcp45 のＬ遺伝子における３種の突然変異の各々が野生型配列に復帰する場合、その得られるウィルス、すなわちrcp45 3'NCMFHNはまだ、その弱毒化表現型を保持している。rcp45 Ｍ及びrcp45 HN変異体ウィルスはハムスターの呼吸器官における複製を欠いておらず、そしてrcp45 3'N ウィルスは、下部呼吸器官における複製において単にわずかな低下を示した。
【０２８９】
これは、３’リーダー、Ｎ遺伝子開始部位、並びにＮ，Ｍ及びHNタンパク質に存在する突然変異がそれら自体で及び単独で弱毒化しないことを示す。しかしながら、それらの突然変異は、他のcp45突然変異に関して、cp45の全体的な弱毒化に寄与する。また、３’Ｎ領域内の個々の突然変異は、突然変異の組が一緒に分析される場合、明らかでない効果を有し、これは、本発明の開示に従って、容易に決定され得る。
【０２９０】
rcp45 Ｃ及びrcp45 Ｆ変異体ウィルスの複製は、鼻甲介及び肺の両者において約 100倍低下し、このことは、cp45のＣ及びＦタンパク質に存在する突然変異が、弱毒化のレベルはcp45  Ｌ突然変異により付与されるレベルほど高くはないが、ハムスターにおいて弱毒化表現型を付与することを示す。上記で記載されたように、rcp45Ｆ及びrcp45 Ｃ変異体ウィルスはts表現型を有さず、そして従って、Ｃ及びＦタンパク質に存在する突然変異は非−ts弱毒化突然変異であると思われる。
【０２９１】
例ＸＩ
赤血球凝集素及び融合糖タンパク質が PIV１からの対応する糖タンパク質により置換されている組換え、キメラ PIV３の回収
この例においては、異なったrPIVバックグラウンド中に、１つのPIV からの１もしくは複数の異種遺伝子又は大きなポリヌクレオチド配列を組込んでいるキメラrPIVウィルスが生成され、そして選択される。本発明のこの観点においては、１つのPIV の個々の遺伝子又は遺伝子セグメントが、異種PIV 又は他の源からのカウンターパート配列により置換される。この例に記載される１つの態様においては、弱毒化された生ワクチンを開発するために適切なキメラ組換え体を生成するために、組換えHPIPV 中にHPIV１又はHPIV２のHN及び／又はＦ保護抗原を置換するための手段及び方法が提供される。
【０２９２】
ウィルス及び細胞
この研究に使用される PIV１株、 PIV１／Washington／20993 ／1964(PIV１／Wash64）が、1964年、Washington DC において単離され、そして成人ヒトボランティアにおける臨床研究においてビルレント野生型ウィルスであることが確認された（Murphyなど, Infect. Immun. 12 : 62-8 (1975);引用により本明細書に組込まれる）。それを、50μｇ／mlのゲンタマイシンサルフェート、２mMのグルタミン及び0.75μｇ／mlのトリプシンを含むOpti-MEM 1 (Life Technologies)中の LLC−MK２細胞(ATCC CCL7.1) において増殖せしめた（カタログNo. 3941, Warthington Biochemical Corp., Freehold, NJ)。
【０２９３】
血球凝集−阻害アッセイ(HAI）に使用されるヒト PIV２のGreer 株（カタログNo. Ｖ−322 −001 −020, NIAID Repository, Rockville, MD）を、同じ手段において増殖させた。ヒト PIV３ウィルスからのJS株、及び野生型表現型を有する、cDNAからのその組換え誘導体（rPIV３／JS）を、上記のようにして増殖せしめた。バクテリオファージT7 RNA ポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアAnkara (MVA)組換え体は、Wyatt など, Virology 210 : 202-205 (1995) （引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【０２９４】
HEp−２細胞を、ATCC (ATCC CCL 23)から得、そして２％ウシ胎児血清(FBS），50μｇ／mlのゲンタマイシンサルフェート及び２mMのグルタミンを含むOpti-MEM 1 (Life Technologies)中に維持した。
【０２９５】
完全なキメラ PIV３− PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成
PIV３ HN 及びＦ ORFがそれらの PIV１カウンターパートにより置換されている十分な長さの PIV３アンチゲノムRNA をコードするcDNAを、図14に示されるようにして構成した。 PIV１／Wash64のHN及びＦ遺伝子のcDNAクローンを、 PIV１／Wash64野生型ウィルスにより感染された LLC−MK２細胞から抽出されたRNA から調製した。cDNAを、ランダムヘキサマープライマー(Life Technologies) を用いて、SuperScript Preamplification System により生成した。 PIV１ Ｆ及びHN cDNA を、GenBank に存在するコンセンサス配列に基づいて、遺伝子特異的プライマー対を用いて、Vent DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）により増幅した。
【０２９６】
下記に記載されるすべてのプライマーに注釈をつけ、その結果、PIV 特異的配列に下線を引き、制限部位をイタリック型で書き、野生型配列から変更されたntを小文字で書き、そして開始及び停止コドンを太字で書く。開始コドンの上流のnt69−97にハイブリダイズするポジティブ−センスの PIV１ Fプライマーは、5'-GGGAAAGAAtCCAGAGACAAGAACGG-3'（配列番号33）であった。Ｆ停止コドンの下流のnt36-61 にハイブリダイズするネガティブ−センスの PIV１  Ｆプライマーは、5'-GGTGAAGTTGTGGATccATTTGATTG-3'（配列番号34）であった。それは、BamHI 部位を担持する。 PIV１ HN のためのポジティブ−センスのプライマーは、5'-CAACCTGTAAGGtAcCAGCATCCG-3'（配列番号35）であった。それはHN開始コドンの上流のnt13-36 にハイブリダイズし、そして KpnＩ部位を担持する。ネガティブ−センスの PIV１ HN プライマーは、5'-GATATGGTGTTaGGcCTTGATCTGTTC-3'(配列番号36）であった。それは停止コドンの最後の２つのnt、及びさらに下流の25ntにハイブリダイズし、そして StuＩ部位を担持する。
【０２９７】
PIV1 F cDNAを、BamHI 及びブラント−末端フラグメントとして、 BamHI−EcoRV 消化されたpLITMOS28 (New England Biolabs）中にクローン化し、そして PIV１ HN cDNAを、 KpnＩ− StuＩフラグメントとして、前記と同じベクター中にクローン化した。pLit. 1HNwt 及びpLit. 1Fwt GenBank受託番号：AFO16280, AFO16279）として命名されたそれらの得られるプラスミドのnt配列を、Circumvent Sequencing Kit (New England Biolals）を用いて決定した。それらの２つのクローンを、突然変異誘発性PCR プライマーを用いて修飾し（図14）、それらの非コード領域を欠失し、そして PIV３−１キメラHN及びＦ遺伝子を構成するためにそれらの開始及び停止コドンを端に有する新規制限部を導入した。
【０２９８】
ポジティブ−センス及びネガティブ−センスの PIV１  Ｆ突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-Cg333435AAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3'(配列番号37）及び5'-CtggatcctAATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3'(配列番号38）であり、導入された制限部位は NcoＩ及びBamHI である。ポジティブ−センス及びネガティブ−センスの PIV１ HN 突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-AACcATGGCTGAAAAAGGGAAAA-3'(配列番号39）、及び5'-GGTGAaGCTtAAGATGTGATTTTACATATTTTA-3'(配列番号40）であり、そして導入された制限部位は NcoＩ及びHindIII である。
【０２９９】
第２段階は、上記で生成された領域をコードする PIV１の受容体として作用するよう PIV３ HN 及びＦ遺伝子の修飾を包含した。pLit. PIV3. HN. 4 及びpLit. PIV3. F. 3a を生成するために、 PIV３／JS，p3/7(131)2Gの十分な長さのクローンからの PIV３  Ｆ及びHN遺伝子も、いくつかの段階でサブクローン化した（図14）。 PIV3 F又はHNコード領域を、PCR 突然変異誘発により欠失せしめ、そして上記 PIV１ HN 及びＦ cDNA を受容するのに適切な制限部位により置換した。 PIV3 Fポジティブ−センス及びネガティブ−センスの突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-AAATAggatccCTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3'(配列番号41）、及び5'-CgcCATgGTGTTCAGTGCTTGTTG-3'（配列番号42）であり、導入された制限部位は、BamHI 及び NcoＩであった。 PIV３ HN ポジティブ−センス及びネガティブ−センスの突然変異誘発性プライマーの配列は、それぞれ、5'-CCACAAgCtTAATTAACCATAATATGCATCA-3'(配列番号43）、及び5'-TTCCATggATTTGGATTTGTCTATTGGGT-3'(配列番号44）であり、導入された制限部位はHindIII 及び NcoＩであった。
【０３００】
キメラHNのための停止コドンを、突然変異誘発された PIV１ HN カセットとの連結に基づいて再生した。上記 PIV１ HN 及びＦ cDNA を、pLit.PIV３−１．HNhc及びpLit.PIV３−１．Fhc を生成する、HNのための NcoＩ−HindIII フラグメントとして、又はＦのための NcoＩ−BamHI フラグメントとして導入した。次に、それらの２つのcDNAを、続いてその全体を配列決定されるpSE. PIV３−１．hc中に連結した。次に、BspE.Ｉ−SphＩフラグメントを、p3/7(131)2G中に挿入し、pFLC. ２Ｇ＋．hcを生成した（図14）。
【０３０１】
キメラＦ及びHN遺伝子を含むこのBspEＩ− SphＩフラグメントのヌクレオチド配列は、GenBank(受託番号AFO16281）に存在する。重要なことには、cDNA構築は、最終rPIV３−１アンチゲノムが６の規則に従うよう企画された（Purbinなど., Virology 234 : 74-78 (1997); 引用により本明細書に組込まれる）。rPIV３−１キメラをコードするプラスミドpFLC．２Ｇ＋．hcを、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USAにあるAmerican Type Culture Collection (ATCC）に、ブダペスト条約下で1997年９月17日に寄託した。
【０３０２】
トランスフェクション
HEp−２細胞単層を、６−ウェルプレート（Costar Corp. Cambridge, MA）において集密性まで増殖し、そしてトランスフェクションを上記のようにして実施した。細胞単層を、50μｇ／mlのゲンタマイシン及び２mMのグルタミンを含む無血清Opti-MEM 1(0.8ml）における MVA−Ｔ７により、その感染の多重度で感染せしめ、そして次に、３種の支持プラスミド、すなわち 0.4μｇのpTM(Ｎ), 0.4μｇのpTM(Ｐ）及び0.05μｇのpTM(Ｌ）、並びに PIV３−１アンチゲノムcDNA５μｇによりトランスフェクトした。プラスミドを、12μｌのLipofect ACE (Life Technologies)を含むOpti-MEM 1(0.2ml)において混合し、そして個々のウェルに添加した。
【０３０３】
野生型 PIV３／JSアンチゲノムRNA をコードする PIV３／JS cDNA プラスミド、すなわちp3/7(131)2Gを、ポジティブ対照として平行してトランスフェクトした。32℃で12時間のインキュベーションの後、トランスフェクション培地を、50μｇ／mlのゲンタマイシンにより補充された新鮮なOpti-MEM 1(1.5ml）により交換し、そして培養物を32℃で、さらに２日間インキュベートした。トリプシンを、トランスフェクションの３日後に添加し、0.75μｇ／mlの最終濃度にした。細胞培養物上清液を４日目に収穫し、そして新鮮な LLC−MK２細胞単層上で継代した（継代１として言及される）。一晩の吸着の後、培地を、0.75μｇ／mlのトリプシンを含む新鮮なOpti-MEM 1により交換した。
【０３０４】
継代１培養物を32℃で４日間インキュベートし、そして増幅されたウィルスを収穫し、そして0.75μｇ／mlのトリプシンの存在下で32℃でさらに４日間、 LLC−MK２細胞上で継代した（継代２として言及される）。回収されたウィルスを、ウサギ PIV１抗血清、テンジクネズミ PIV２抗血清、及び２種の PIV３ HN モノクローナル抗体との反応により、上記のような血球凝集−阻害(HAI）アッセイ(van Wyke Coelinghなど.,前記, (1985)) において特徴づけ、但し、上記アッセイにおいては、鶏赤血球細胞（RBCS）が PIV１ HN 糖タンパク質を有するウィルスのために使用され、そしてテンジクネズミが PIV３のために使用された。HAI を、rPIV３がcDNAから回収されたウィルスを特徴づけるモノクローナル抗体耐性突然変異（MARM）を有するかどうかを、又はrPIV３−１が PIV１ HN を有するかどうかを決定するために実施した。
【０３０５】
ヌクレオチド配列分析
キメラcDNA構造体pSE. PIV３−１．hcを、Circumuent Sequencing Kit (New England Biolabs）により配列決定し、その後、最終的に、十分な長さのクローンpFLC．２Ｇ＋．hc中にアセンブルした。RNA の分析のために、適切なPIV を、 LLC−MK２細胞のＴ75フラスコにおいて増幅した。ウィルスを感染の５日目に収穫し、そしてポリエチレングリコール沈殿法（Mbiguinoなど., J. Virol. Methods 31 : 161-70 (1991))により濃縮した。ウィルスRNA を、ウィルスペレットから抽出し、そしてSuperscript Preamplification System (Life Technologies) による逆転写（RT）に使用した。RT−PCRを、Advantage cDNA合成キット（Clontech）、及び PIV１又は PIV３特異的プライマー対を用いて行なった。RT−PCR 生成物を、電気泳動、及びNA45 DEAE ニトロセルロース膜（Schleicher & Schnuell, Keene, NH）のストリップからの溶出により精製し、そして配列決定した。
【０３０６】
LLC−MK２細胞におけるPIV の複製
LLC−MK２単層上のプラークの計数を、前記のようにして行  なったが、但し、トリプシンが、 PIV１及びrPIV３−１ウィルスの場合に添加された（Hallなど. Virus Res. 22 : 173-84 (1992))。手短に言及すれば、連続的に希釈されたウィルスを、６−ウェルプレートにおける LLC−MK２単層上に接種し；ウィルスを32℃で１時間吸着せしめ；培養物を、 0.8％のアガロースを含むＬ−15培地（Life Technologies)（添加されたトリプシンを有する又は有さない）によりオーバーレイし、そして32℃で６日間インキュベートし；そしてプラークを、アガロースオーバーレイの除去に続いて、テンジクネズミ赤血球細胞による血球吸着(HAD）により同定した。
【０３０７】
組織培養におけるPIV ウィルスの増殖を、0.01のMOI でウィルスにより、12−ウェルプレート上の集密的 LLC−MK２単層を感染せしめることによって評価した。32℃で１時間の吸着の後、接種物を、ゲンタマイシン（50μｇ／ml）及びトリプシン（0.75μｇ／ml）により補充された 1.5ml（ウェル当たり）のOpti-MEM 1により交換し、そしてさらに、32℃で６日間インキュベートした。24時間の間隔で、 0.3mlの培地を個々のウェルから除去し、そしてトリプシンを含む新鮮な培地 0.3mlを添加した。ウィルスの力価を、前記のようにして、流体オーバーレイを用いて LLC−MK２細胞単層上での血球吸着アッセイにより32℃で決定し（Hallなど, Virus Res. 22 : 173-84 (1992) ）、そしてその力価を log10TCID50／mlとして表わした。
【０３０８】
ハムスターの呼吸器官におけるPIV の複製
12匹のグループにおけるGolden Syrian ハムスターにそれぞれ、10５pfuのrPIV３／JS, rPIV３−１又は PIV１／Wash64を含むＬ−15培地 0.1mlを鼻腔内接種した。接種の４及び５日後、個々のグループからの６匹のハムスターを殺し、そしてそれらの肺及び鼻甲介を収穫し、そして均質化し、そして LLC−MK２細胞単層からのサンプルに存在するウィルスを32℃でタイトレーションした。力価は、６匹のハムスターの個々のグループに関して、平均 log10TCID50／ｇとして表わされた。
【０３０９】
結果
十分な長さのキメラ PIV３−１アンチゲノムRNA をコードするcDNAクローンの構成がキメラウィルスrPIV３−１の回復をもたらした
上記に示されるようにして、JS野生型 PIV３ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子のORF が PIV１／Wash64コード配列のORF により置換されている（図14）、 PIV３及び PIV１キメラcDNAの最終構造体は、６の規則に従う、15,516ntの PIV３−１キメラアンチゲノムRNA をコードする（Durbinなど., Virology 234 : 74-78 (1997)）。キメラ PIV３−１アンチゲノムをコードするpFLC．２Ｇ＋．hc cDNA を、Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと一緒に、 HEp−２細胞上にトランスフェクトした。 JS wt PIV３アンチゲノムをコードするｐ３／７ (131)２Ｇ cDNA を、rPIV３対照親ウィルスを生成するために、同時にトランスフェクトした。ウィルスを、 LLC−MK２細胞上での第２の増幅に続いて、個々のトランスフェクションから回収し、そして個々の組換えウィルスがcDNAに由来することを確かめるために、研究を開始した。
【０３１０】
組換えウィルスrPIV３−１及びrPIV３をまず、血清型−特異的抗−HNモノクローナル又はポリクローナル抗体によるHAI アッセイにより、 PIV１又は PIV３ HN 糖タンパク質の存在について特徴づけた。表12に示されるように、rPIV３は、予測通り、２種のmAb の中の１つのみと反応するが、その生物学的誘導された親 PIV３／JSは両者と反応した。これは、rPIV３が、cDNAに由来する場合、このウィルスを特徴づける導入されたMARM突然変異を含んだことを確かめた。rPIV３−１ウィルスは、 PIV１ HN 糖タンパク質に対して特異的な抗体と反応するが、しかし PIV３又は PIV２のHNに対して特異的な抗体とは反応せず、このことは、そのウィルスが予測されるように PIV１ HN 遺伝子を含んだことを示す。
【０３１１】
【表１２】
2008307055.tif 000013
【０３１２】
次に、rPIV３−１ウィルスが構築されたキメラ PIV３−１ HN 及びＦ遺伝子を含むことが確かめられた。予定されるように、rPIV３−１の遺伝子構造は、その親、すなわち PIV１／Wash64又はrPIV３／JSのいずれかと比較される場合、４つの連結領域においてユニークであった（図15Ａのボックス部分）。それらの領域は、配列が PIV３非コード領域から PIV１コード領域に変化し、そして次に、 PIV１コード領域から PIV３非コード領域に戻る遷移点である。 PIV3 Ｍ及びＬ遺伝子に対して特異的なプライマー対Ａ、又は PIV１  Ｍ、及び異３’−末端のHN遺伝子に対して特異的なプライマー対Ｂを用いて、RT−PCR 生成物を、rPIV３−１，rPIV３／JS、及び PIV１／Wash64からのビリオン−由来のRNA のために生成した。
【０３１３】
対照反応は、RT段階がRT−PCR 生成物の生成のために必要とされることを示し、このことは、汚染性DNA よりもむしろRNA 鋳型が、RT−PCR 生成物を生成するために必要とされたことを示す。rPIV３−１が実際、キメラウィルスであった初期表示は、 PIV３−特異的プライマー対Ａのみが、Ｆ及びHN遺伝子まで及ぶ予測される 4.6kbのcDNA生成物を生成した発見に起因した（図15Ｂ）。従って、rPIV３−１ウィルスはHPIV１−特異的HN糖タンパク質のみを含むが（表12を参照のこと）、その非コード領域は PIV３に対して特異的である。一般的に、 PIV１特異的プライマー対Ｂは、 PIV１対照からの適切にサイズ分類された生成物を増幅するが、しかしrPIV−１からの生成物は増幅しなかった。制限消化分析はまた、rPIV−１  RT−PCR 生成物が、rPIV３／JS及び PIV１／Wash64の制限パターンとは異なり、そしてその予測される配列のために適切なユニーク制限パターンを有することを示した。
【０３１４】
rPIV３−１の 4.6kbのRT−PCR 生成物のnt配列をその４つの領域において決定し（図15Ａ）、そしてrPIV３／JS及び PIV１／Wash64のnt配列と比較した（図16）。rPIV３−１配列は、それが由来するcDNAと完全に一致した。３つのRT−PCR 生成物のための領域Ｉ−IVの配列の一列配列の試験は、rPIV３−１が、変更された開始及び停止コドンと共に、及び PIV３の５’及び３’非コード領域を端に有する、 PIV１  Ｆ及びHN糖タンパク質ORF を含むことを示す。rPIV３／JB又は PIV１／Wash64と同時に比較しての、rPIV３−１の領域III 及びIVに及ぶ配列決定ラダー（ladder）の例を評価し、そしてこの分析は、rPIV３−１が、その構造がそれが生成されるcDNAと完全に一致する組換えキメラウィルスであることを確かめた。
【０３１５】
インビトロでのrPIV３−１のトリプシン−依存性及び細胞障害性。
Sendaiウィルスのようであるが、しかし PIV３とは異なる PIV１は、組織培養細胞の連続した系上で多サイクル複製を受けるために、そのＦ糖タンパク質の切断のためにトリプシンを必要とする(Frankなど, J. Clin. Microbiol. 10 : 32-6 (1979)) 。さらに、 FIV１は非細胞障害性ウィルスであり、そして FIV３は広範なCPE を容易に生成する(Collinsなど, Fields Virology, 3rd ed., 1 : 1205-43 (1996)) 。rPIV３−１，rPIV３及び PIV１／Wash64を、それらの性質に基づいて比較した。 PIV１／Wash64のようにrPIV３−１は、テンジクネズミよりもむしろニワトリRBC を用いて高いHA力価を有し、その PIV１／Wash64親のように、rPIV３−１は流体オーバーレイを伴っての培養において効果的な複製のために及び効果的なプラーク形成のためにトリプシンを必要とした。
【０３１６】
rPIV３−１は、類似する効率を伴って、32℃、37℃又は40℃でプラークを生成した。従って、rPIV３−１が PIV１親ウィルスのＦ糖タンパク質を有し、そしてそれが感温性でないことが明らかである。他方では、rPIV３−１は、ウィルス感染された単層における細胞球状化及び分離により示されるように、その PIV３親とほとんど同じ程度、CPE を生成し、このことは、この生物学的性質が、HN及びＦコード領域外に存在するその PIV３遺伝子の機能であることを示す。従って、rPIV３−１は、それがキメラウィルスであることを示す上記発現と一致する両親からの生物学的性質を有する。本発明内のこの典型的な組換えキメラウィルスは、12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland20852, USAのAmerican Type Culture Collection (ATCC) にブダペスト条約下で、1998年５月21日に寄託された。
【０３１７】
【表１３】
2008307055.tif 000014
【０３１８】
LLC−MK２細胞及びハムスターにおけるrPIV３−１及びその親ウィルスの複製のレベルの比較
rPIV３，rPIV３−１及び PIV１ Wash ／64の多サイクル複製を、0.01のMOI での LLC−MK２組織培養細胞の接種に続いて評価した（図18）。３種のウィルスの複製の速度動態及び程度は非常に類似することが見出され得る。これは、 PIV１のHN及びＦ遺伝子の、 PIV３のそれらによる置換が、インビトロでの複製のためにウィルスを弱毒化しなかったことを示す。rPIV３−１がハムスターの上部及び下部呼吸器官における複製のために特にインビボで弱毒化されるかどうかが次に決定された（表14）。rPIV３−１の複製の観察されるレベルは、ハムスターの上部及び下部呼吸器官において、いづれかの親に類似し、そうでなければ、親よりもわずか高かった。
【０３１９】
【表１４】
2008307055.tif 000015
【０３２０】
要約すると、この例は、 PIV１ HN 及びＦ糖タンパク質のORF がrRIV３のORF により置換されているrPIV３−１キメラウィルスの好都合な回収を示す。このキメラウィルスは、インビトロ及びインビボで、その野生型 PIV１及び PIV３親ウィルスのように複製し、このことは、糖タンパク質ORF の置換がrPIV３−１の弱毒化をもたらさないことを示す。 PIV１のHN及びＦ糖タンパク質を担持する組換え PIV３のこの好都合な回収率は、異なった血清型を表わす２種のウィルスは密接には関連していないので、驚くべきことである。
【０３２１】
特に、キメラ組換え体が２種の親と同様、増殖することは、注目すべきである。特に、糖タンパク質遺伝子に置換を有するキメラ組換えウィルスがまた、水疱性口内炎ウィルス(VSV）に関して回収されている（Lawsonなど, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92 : 4477-81 (1995) ）。特に、Indiana 血清型のVSV Ｇ糖タンパク質遺伝子が、わずか50％のアミノ酸配列同一性を共有するNew Jersey血清型により置換された。rPIV３−１と比較すると、キメラ組換えVSV1/NJ は、組換え体VSV１又は生物学的に誘導されたVSV のレベルのわずか10％を複製する。
【０３２２】
この例においては、HN及びＦ糖タンパク質は、 PIV１と PIV３との間で、それぞれ43及び47％の配列同一性を有する。もちろん、２種の糖タンパク質の一緒のトランスファーは、糖タンパク質−対−糖タンパク質の不適合性を回避する（Tanabayashi, K. and Compans, R. W. J. Virol. 70 : 6112-18 (1996)）。他方では、糖タンパク質はそれらの細胞質（CT）又はトランスメングラン（TM）ドメインを通してＭタンパク質(PIV１と PIV３との間で63％の同一性がある）と相互作用し、そしてこの相互作用がビリオンの形態発生及び構造において重要であると一般的に思われている。これに関して、TM及びCTドメインにおける２種の血清型のHNタンパク質とＦタンパク質との間の配列同一性の程度は低く、実際、TMドメインに関しては、それぞれ30％及び22％であり、そしてCTドメインに関しては、それぞれ９及び11％であった。
【０３２３】
この低レベルの配列関連性を考慮して、本発明者は、また、個々の糖タンパク質の PIV１エクトドメインが PIV３ TM 及びCTドメインに融合されているキメラ糖タンパク質を構成する同目的の方策を追求している。Ｍタンパク質又は他の内部タンパク質との可能な相互作用に関して、保存された構造、たとえば変更されたアミノ酸の配列群が、保存された配列よりもむしろ重要である。他方では、内部タンパク質と、糖タンパク質のTM及びCTドメインとの相互作用は、これまで考えられて来たほど決定的ではない。それらの要因を、本明細書に提供される方法及び手段を用いて、より密接に試験することは可能であろう。たとえば、それらの要因は、さらに、 PIV２のHN及びＦを担持する PIV３を構成するために上記方法を用いての進行中の研究により解明されるであろう。
【０３２４】
rPIV３−１は、これが PIV１ F糖タンパク質により付与される性質であり、そしてこれが良く見出されるので、組織培養物における効果的な複製のためにトリプシンを必要とすることが予測された。しかしながら、rPIV３−１が PIV３親ウィルスのCPE に非常に密接に類似するCPE を引き起こすことを観察することは興味あることであり、ここで前記観察は、HN又はＦ以外の PIV３遺伝子がこの表現型を特定していることを示す。それらの役割はまた、非細胞障害性 PIV１と細胞障害性 PIV３との間の追加の遺伝子を交換するために、本明細書に提供される方法及び手段を用いて、さらに解明されるであろう。
【０３２５】
例ＸII
PIV タイプ３の内部タンパク質及びPIV タイプ１の表面糖タンパク質をコードする生存−弱毒化されたキメラ組換えPIV の回収
この例においては、rPIV３−１. cp45Ｌと称する、生存−弱毒化cp45 PIV３候補体ワクチンウィルスのＬ遺伝子に見出される変化をコードする３種の感温性及び弱毒化アミノ酸を担持するrPIV３−１の誘導体は、同じ３種の突然変異を有する組換えrPIV３ cp45 Ｌの表現型に類似する、38℃の遮断温度を有する感温性表現型を表わすことが示されている。rPIV３−１．cp45Ｌは、rPIV３ cp45 Ｌと同じ程度に、ハムスターの呼吸器官において弱毒化される。rPIV３−１．cp45Ｌによるハムスターの感染は、wt PIV１に対して中位のレベルの血球凝集−阻害抗体を生成し、そして野生型 PIV１による攻撃に対して完全な耐性を誘発する。
【０３２６】
これは、本発明の弱毒化されたキメラPIV が PIV１に対してひじょうに効果的な免疫応答を誘発することができることを示す。この開示はまた、パラインフルエンザウィルスの表面糖タンパク質が同種ウィルス攻撃に対して高レベルの耐性を誘発するのに十分であることを示す上記データを確認する。意外なことには、 PIV１の表面糖タンパク質遺伝子及び PIV３の内部遺伝子をそれぞれ担持する、組換えキメラウィルスrPIV３−１．cp45Ｌ又はrPIV３−１による感染は、また、 PIV３攻撃ウィルスの複製に対して中位のレベルの耐性を誘発する。これは、 PIV３の内部遺伝子がゲッ歯動物において PIV３に対して保護免疫性を独立して誘発できることを示す。従って、本明細書に開示されるような PIV３に関する逆向き遺伝学システムは、許容されたモデル対象において弱毒化され、そして保護性である生存−弱毒化された PIV１ワクチン候補体を都合良く生成する。
【０３２７】
ウィルス及び細胞
この研究に使用されるwt PIV１株は、 PIV１／Washington／20993 ／1964(PIV１／Wash64)(たとえば、Murphyなど, Infect. Immun. 62 : 1975を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）、及び PIV3 F及びHN ORFが、上記のようにして及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998(引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにして、 FIV１／Wash64のORF により置換されているキメラ PIV３ cDNA から回収されたキメラrPIV３−１である。それらのウィルスは、50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェート、及び0.75μｇ／mlのトリプシン（カタログNO. 3741, Washington Biochemical Corp., Freehold, NJ) により補充されたOpti-MEM 1 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)における LLC−MK２細胞において増殖された。
【０３２８】
トリプシンは、 PIV３の糖タンパク質ではなく、 PIV１のＦ糖タンパク質がそれらの条件下で細胞培養物において増殖される場合、切断のために外因性トリプシンに依存するので、包含される。ヒト PIV３ウィルスのwt JS 株、及びcDNAからのその組換え誘導体（rPIV３／JS）は、上記のようにして及びDurbinなど, Virology 235 : 323, 1997 (引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにして、増殖された。cp45、すなわちwt PIV３／JSの弱毒化された誘導体（上記、及びKarronなど, J. Infect. Dis. 171 : 1107,1995（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと）、及びrPIV３ cp45 Ｌ、すなわちcp45のＬ遺伝子に見出される３種のts突然変異を担持する組換え PIV３は、上記のようにして、及びSkiadopoulosなど, J. Virol. 72 : 1762, 1998(引用により本明細書に組込まれる）に記載のようにして、増殖された。バクテリオファージＴ７  RNA ポリメラーゼを発現する修飾されたワクシニアAnkara (MVA)組換え体は、Virology 210 : 202, 1995 (引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【０３２９】
トランスフェクションに使用される HEp−２細胞は、ATCC (ATCC CCL23）から得られ、そして２％ウシ胎児血清(FBS）、50μｇ／mlのゲンタマイシンスルフェートにより補充されたOpti-MEM 1に維持された。
【０３３０】
rPIV３−１アンチゲノムcDNA中へのＬ突然変異の導入
上記（また、Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 : 1762, 1998 も参照のこと）、pTM(Ｌ）942 ／992 ／1558プラスミドに存在するcp45の３種のＬ突然変異が、 PIV1 F及びHN ORF、及び３種のcp45 L遺伝子突然変異を担持する十分な長さのpFLC. ２Ｇ＋．hc．cp45Ｌを生成するために、 2.8kbの SphＩ− NheＩフラグメント(PIV３アンチゲノムcDNAにおいてnt11313 〜14092)として、キメラcDNA pFLC.２Ｇ＋．hc（上記に記載される；また、Tao など, J. Virol. 72 : 2955, 1988 も参照のこと）中に導入された（図19）。pTM(Ｌ）942／992／1558に存在する特定の突然変異は、図19に示される。
【０３３１】
トランスフェクション
６−ウェルプレートにおける HEp−２細胞単層を、集密的に増殖し、そしてトランスフェクションを、上記のようにして（また、Tao など, J. Virol. 72 : 2955, 1988 も参照のこと）実施した。４日目、収穫の前、トリプシンを、トランスフェクションの３日後、添加し、0.75μｇ／mlの最終濃度にした。細胞培養物上清液を澄まし、そして新鮮な LLC−MK２細胞単層上に継代した（継代１として言及される）。一晩の吸着の後、培地を、0.75μｇ／mlのトリプシンを有する新鮮なOpti-MEM 1により交換した。継代１培養物を32℃で４日間インキュベートし、そして上清液に存在するウィルスを収穫し、そして再び、同じ条件下で継代した（継代２として言及される）。継代２収穫物に存在するウィルスを、上記のようにして血球凝集−阻害(HAI）アッセイにより PIV１ HN タンパク質の存在について試験した（また、Tao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 も参照のこと）。
【０３３２】
種々の温度での LLC−MK２におけるPIV の複製
LLC−MK２単層上のプラークの数え上を、 PIV１，rPIV３−１及びrPIV３−１．cp45Ｌの場合、アガロースオーバーレイに添加される0.75μｇ／mlのトリプシンを伴って、上記のようにして実施した（また、Tao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 を参照のこと）。種の温度での６日間のインキュベーションの後、アガロースオーバーレイを除去し、そしてプラークを、テンジクネズミ赤血球(RBC）による血球吸着(HAD）により同定した。
【０３３３】
ハムスターの呼吸器官におけるPIV の複製
５匹のハムスターのグループを、106 プラーク形成単位(PFU）のrPIV３／JS, rPIV３ cp45 Ｌ，cp45， PIV１／Wash64, rPIV３−１又はrPIV３−１．cp45Ｌを含むＬ15培地 0.1mlにより鼻腔内接種した。ハムスターを、感染の４日後、殺し、そしてそれらの肺及び鼻甲介を収穫し、そして均質化した。組織サンプルに存在するウィルスを、上記のようにして、及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 に記載のようにして、32℃で LLC−MK２細胞単層上で滴定した。力価は、個々のグループに関して、逆数平均 log10TCID50／ｇ組織として表わされる。
ハムスターにおける免疫化及び攻撃の研究
10匹のハムスターのグループを、上記のようにして、動物当たり106 のPFU により鼻腔内免疫化した。血清を、HAI アッセイのために、感染の前、及び33日目に採取した。10匹のハムスターの個々のグループの血清に存在するHAI 抗体のレベルを、抗原として PIV１／Wash64及び PIV３／JSを用いて決定し、そして決定されたHAI 力価を、平均log２として表わす（また、Tao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 を参照のこと）。
【０３３４】
免疫化の35日後、個々のグループからの５匹のハムスターを、106 PFU の PIV１／Wash64又はrPIV３／JSにより鼻腔内攻撃した。それらの攻撃されたハムスターの鼻甲介及び肺を、攻撃の４日後に収穫した。組織サンプルにおけるウィルス力価を、上記のようにして及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 に記載のようにして、 LLC−MK２単層上で決定し、そして力価を平均 log10TCID50／ｇ組織として表わす。
【０３３５】
結果
組換えキメラウィルスrPIV３−１．cp45Ｌの回収及び特徴化
上記に示されるように、cDNAクローンpFLC．２Ｇ＋．hc、すなわちＦ及びHN糖タンパク質をコードするORF が PIV１のORF により置換されている PIV３の十分な長さのアンチゲノムcDNAを、cp45のＬ遺伝子に同定され、そして独立したts及び弱毒化突然変異であることが示されている３種のアミノ酸コード変化（Ｌタンパク質におけるアミノ酸位置に従って、942, 992及び1558と称する）の導入により修飾した（図19；また、Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 : 1762, 1998 も参照のこと）。
【０３３６】
個々のコード変化を、天然に存在する制限部位を除去する連続した、翻訳的にサイレントなnt置の同時導入により示した（図19；表８）。最終の十分な長さのプラスミド構造体、すなわちpFLC．２Ｇ＋．hc. cp45Ｌ（図19）は、長さ 15516ntの PIV３−１キメラアンチゲノムRNA をコードし、そして６の規則に従う（Durbinなど, Virology 234 : 74, 1997 を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる) 。pFLC．２Ｇ＋．hc. cp45Ｌの真正性は、適切な制限酵素による消化により確かめられた。
【０３３７】
pFLC．２Ｇ＋．hc. cp45Ｌ cDNA を、 PIV３  Ｎ，Ｐ及びＬ支持プラスミドと一緒に、 HEp−２細胞中にトランスフェクトし、そして上記のようにして及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 に記載のようにして、 MVA−Ｔ７により感染せしめた。rPIV３−１．cp45Ｌと称する、 LLC−MK２細胞上での２回の継代の後に回収されたウィルスを、プラーク〜プラーク〜プラーク継代により生物学的にクローン化し、そして増幅されたウィルスを、それがＬに PIV１糖タンパク質及び３種の導入された突然変異を有することを確かめるために分析した。
【０３３８】
最初に、rPIV３−１．cp45Ｌにおける PIV１ HN タンパク質の存在を、上記のようにして及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 に記載のようにして、HAI アッセイにおいて PIV１特異的抗体との反応性により確かめた。rPIV３−１．cp45ＬゲノムRNA におけるキメラ PIV３−１ HN 及びＦ遺伝子、並びに導入されたＬ遺伝子突然変異の存在を、上記のようにして及びTao など, J. Virol. 72 : 2955, 1998 に記載のようにして、ビリオンRNAから生成されたRT−PCR 生成物の制限酵素消化又はヌクレオチド配列分析により確かめた。それらのデータは、rPIV３−１．cp45Ｌがcp45のＬ遺伝子の３種のコドン置換を担持する組換えキメラウィルスであることを確認した。
【０３３９】
rPIV３−１．cp45Ｌは感温性である
cp45の３種のＬ遺伝子突然変異は、wt PIV３中に導入される場合、ts表現型を付与することが上記に示された（また、Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 : 1762, 1998)。キメラウィルスにおけるそれらの存在が同じ効果を有するかどうかを評価するために、rPIV３−１．cp45Ｌのプラーク形成効率を種々の温度で決定した。表15に示されるように、３種のＬ突然変異は実際、キメラウィルスに表現型を付与した。組換えウィルスrPIV３ cp45 Ｌ及びrPIV３−１．cp45Ｌにおけるcp45  Ｌ突然変異により特定される感温性のレベルは等しく（表15）、このことは、突然変異の効果が、 PIV３又は PIV１ HN 及びＦ糖タンパク質と無関係であることを示す。rPIV３ cp45Ｌ及びrPIV３−１．cp45Ｌの感温性のレベルは、後者のウィルスがＬの外部の突然変異を有する事実にかかわりなく、生物学的に誘導されたcp45ウィルスのレベルに匹敵した（Stokesなど, Virus Res. 30 : 43, 1993を参照のこと；引用により本明細書に組込まれる）。
【０３４０】
【表１５】
2008307055.tif 000016
【０３４１】
ハムスターにおけるrPIV３−１．cp45Ｌの複製のレベル
cp45の３種のＬ遺伝子突然変異は、wt PIV３中に導入される場合、ハムスターの上部及び下部呼吸器官においてウィルス複製の弱毒化を付与することが上記で示された（また、Skiadopoulosなど, J. Virol. 72 : 1762, 1998 を参照のこと）。キメラウィルスに対するそれらの効果を、表16に示されるように、ハムスターの鼻腔内感染により評価した。それらの発見は、rPIV３−１．cp45Ｌが実際、両部位で弱毒化され、そしてさらに、弱毒化のそのレベルがrPIV３ cp45 Ｌのレベルに匹敵したことを示す。従って、感温性のように、弱毒化を付与するcp45  Ｌ突然変異の能力は、表面糖タンパク質の抗原特異性に無関係である。
【０３４２】
【表１６】
2008307055.tif 000017
【０３４３】
PIV３の内部タンパク質及び PIV１の糖タンパク質を含むrPIV３−１又はrPIV３−１．cp45Ｌによる感染は、ハムスターにおいてPIV１攻撃に対する耐性を付与する
キメラrPIV３−１ウィルス及びその弱毒化されたrPIV３−１．cp45Ｌ誘導体を、ハムスターにおいて免疫原性及び保護効率について評価した。表17に示されるように、いづれかのウィルスによる感染は、 PIV３に対してではなく、 PIV１に対してHAI 抗体を誘発し、このことは、それらのキメラウィルスが PIV１ HN 糖タンパク質を有し、そして高い免疫原性であることを確認する。rPIV３−１．cp45Ｌにより誘発されるHAI 抗体のレベルはrPIV３−１によるレベルよりも２倍近く、このことは、その弱毒化が免疫原性において中位の低下をもたらしたことを示す。同様に、rPIV３及びrPIV３ cp45Ｌは PIV１に対してではなく、 PIV３に対してHAI 抗体を誘発し、そしてその弱毒化されたウィルスにより誘発されるレベルは約２倍、低かった。cp45  Ｌ突然変異を担持する組換えウィルスのハムスターにおける制限された複製にもかかわらず、rPIV３ cp45 Ｌ又はrPIV３−１．cp45Ｌのいづれかによる感染は、相同糖タンパク質を担持する攻撃ウィルスの複製に対して完全な耐性を誘発した。
【０３４４】
【表１７】
2008307055.tif 000018
【０３４５】
rPIV３−１．cp45Ｌによる感染はまた、 PIV３に対する耐性を付与する
耐性におけるPIV 中の非HN又はＦ糖タンパク質（すなわち、内部タンパク質）の役割に対する情報は制限されている。本明細書におけるrPIV３−１及びrPIV３−１．cp45Ｌの開示及び使用は、免疫化及び攻撃ウィルスにより共有される遺伝子のみが内部タンパク質遺伝子であるので、内部タンパク質が PIV３による攻撃に対する耐性において演じる役割を試験する機会を提供する。 PIV３攻撃ウィルスの複製は、rPIV３−１又はrPIV３−１．cp45Ｌによるハムスターの先の感染により上部及び下部呼吸器官において有意に制限される（表17）。従って、それらのデータは、HN及びＦタンパク質のように、 PIV３の内部タンパク質が攻撃 PIV３の複製に対して部分的な耐性を誘発できることを示す。
【０３４６】
上記免疫原性及び効率により示される発見の中で、特に予測できない発見は、wt又は弱毒化されたrPIV３による感染が肺における PIV１攻撃ウィルスの複製の 100倍の低下を誘発したことであった。従って、PIV の１つの血清型による感染は、異種血清型に対して有意な保護を提供した。これは、これまでの研究が、ヒトPIV の１つのタイプによる動物の感染が、ヒトPIV 感染に対する免疫性が大部分、タイプ−特異的である一般的な考えに従って、異なったヒト血清型に属するPIV に対して有意な異種保護性を誘発しなかったことを示しているので、一部、予測できないことであった（たとえば、Cookなど, Amer. Jour. Hyg. 77 : 150, 1963 ; Ray など, J. Infect. Dis. 162 : 746, 1990 ; それぞれ引用により本明細書に組込まれる）。
【０３４７】
この例は、 PIV１のための弱毒化された生存候補体ワクチンの急速、合理的な開発をさらに提供するために、 PIV３ワクチンを生成するために開発された新規方法及び試薬の好都合な開発を示す。感染性 PIV３をコードするcDNAを、 PIV１ HN 及びＦ保護抗原をコードするORF のそれらの PIV３カウンターパートによる置換により修飾した。続いて、cp45 PIV３のＬ遺伝子に存在する３種の弱毒化突然変異により例示される弱毒化突然変異を、この修飾された PIV３− PIV１ cDNA 内に組込んだ。このcDNAから、 PIV１のHN及びＦ遺伝子、 PIV３の内部タンパク質及び PIV３ cp45 Ｌ遺伝子突然変異を担持する組換えウィルスを回収した。
【０３４８】
この組換え体rPIV３−１．cp45Ｌは、感温性であり、ハムスターにおいて高く弱毒化され、そしてハムスターにおいて PIV１攻撃に対してひじょうに有効であった。rPIV３−１．cp45Ｌにより示される、感温性、弱毒化及び免疫原性のレベルは、cp45 PIV３のレベルに相当し、このことは、cp45  Ｌ遺伝子突然変異組により特定される表現型がHN及びＦ表面糖タンパク質に無関係であることを示す。逆向き遺伝学により生成される第１の生存、弱毒化された PIV１ワクチン候補体を表わすそれらの発見は、 PIV１に対するワクチンを開発するための一般的に好都合なスキームを提供する。
【０３４９】
パラインフルエンザウィルスの内部タンパク質が相同ウィルスによる再感染に対する耐性において演じる役割に関しての情報は、ほとんど知られていない。Ｎ，Ｎ以内のエピトープ又はＭを発現するワクシニア組換え体による感染は攻撃ウィルスの複製に対する耐性を誘発すると言われているが、しかし報告される耐性の大きさは、HN又はＦ糖タンパク質を担持するワクシニア組換え体により誘発される大きさよりも小さい（たとえば、Kastなど, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 : 2283, 1991 ; Sakaguchiなど, J. Gen. Virol. 74 : 479, 1993; Thomsonなど, J. Immunol. 157 : 822, 1996 を参照のこと；それらは引用により本明細書に組込まれる）。
【０３５０】
それらの研究は、内部タンパク質が再感染に対する耐性に対して単にわずかな寄与を行なっていることを示唆した。従って、この開示は、rPIV３−１．cp45Ｌ又はrPIV３−１によるハムスターの事前の感染が鼻甲介及び肺の両者において PIV３の複製の約 250〜4000倍の低下を誘発したことを示すことによって、予測できない結果を表わしている。それらの２種のキメラ組換えウィルスは、それらが PIV３よりもむしろ PIV１のHN及びＦ糖タンパク質を有するが、しかしそれらが攻撃ウィルスとすべての他の遺伝子を共有していることにおいて、 PIV３攻撃ウィルスとは異なる。 PIV１のHN及びＦ糖タンパク質は、それぞれ、 PIV３のそれらの糖タンパク質と47％及び43％の配列同一性を共有する。
【０３５１】
たぶん、共有される内部タンパク質は観察された耐性を仲介すると思われるが、 PIV１及び PIV３  Ｆ及びHN糖タンパク質間の共有されるタンパク質配列が観察される免疫性に寄与しているとも思われる。たとえば、 PIV１と PIV３との間に共有され、そして保護CTL エピトープとして作用する能力を有する少なくとも９個の長さのアミノ酸残基を延長する、HNにおける５つの延長部及びＦにおける２つの延長部が存在する。共有される内部タンパク質は、交差−免疫性のこのレベルはこれまでの研究には見出されていないので、wt PIV３攻撃ウィルスの複製の制限に寄与していると考えることが道理的である（たとえば、Cookなど, Amer. Jour. Hyg. 77 : 150, 1963; Rayなど, J. Infect. Dis. 162 : 746, 1990 を参照のこと；これは引用により本明細書中に組込まれる）。
【０３５２】
rPIV３−１及びrPIV３−１．cp45Ｌの内部 PIV３タンパク質が PIV３攻撃に対する耐性を付与する発見は、 PIV３の弱毒化された誘導体が PIV１及び PIV２保護抗原のためのベクターとして使用され得ることを示す。本発明の教授に従って、１つの PIV３に基づく生存−弱毒化されたワクチンウィルスによる免疫化が、続いて投与される他の PIV３に基づくワクチンウィルスの複製を制限することができ、それにより、第２ウィルスの免疫原性を低める。RSV のように PIV３は初期乳児において有意な疾病を誘発するので、ひじょうに若い、生後２〜４週目の乳児への使用のための組合された RSV−PIV３ワクチンが本発明の重要な観点である（たとえば、Collinsなど, Fields Virology 3rd ed. Philadelphia : Lippincott-Raven Publishers, 1205 (1), 1996; Reedなど, J. Infect. Dis. 175: 807, 1997 を参照のこと；それぞれ引用により本明細書中に組込まれる）。
【０３５３】
本発明のこの観点によれば、 PIV１− PIV２ワクチンによる免疫化は、ほとんどの PIV１及び PIV２疾病が６カ月の年齢の後に生じるので、好ましくは、約６カ月の年齢で開始されるであろう。rPIV３ cp45 による免疫化が、それが内部タンパク質遺伝子を共有するキメラ組換え PIV３−１ワクチンウィルスの複製を有意に阻害する可能な状況下では、組換え PIV３−１ワクチンによる好都合な免疫化が制限されるであろう。最終的には、三価の PIVワクチンが、連続的によりもむしろ同時に投与され、それにより、上記に示された阻害性を妨げるであろう。
【０３５４】
ワクチン又はwt PIV３による感染が異種wt PIV１の肺ウィルス複製の 100倍の低下を誘発する本明細書における開示は、一部、ヒトPIV ウィルスは中和アッセイにより血清学的に異なっており、そしてハムスターにおけるこれまでの研究は、１つのタイプのPIV による事前の感染が高い用量の異なったPIV 型による攻撃に対する耐性を誘発できなかったことを見出しているので、明らかに予測できるものではない（たとえば、Cookなど, Amer. Jour. Hyg. 77 : 150, 1963; Rayなど, J. Infect. Dis. 162 : 746, 1990 ; Cookなど,Amer. Jour. Hyg. 69 : 250, 1959 を参照のこと）。さらに、１つのPIV による事前の感染が異種型PIV による続く感染を有意に修飾することを詳細に示す疫学的データはほとんど存在しない。
【０３５５】
要約すると、本発明の例は、rPIV３が、Ｆ及びHN糖タンパク質をコードするORF を置換し、そしてその PIV３内部遺伝子中に既知の弱毒化突然変異を導入することによって、 PIV１のためのワクチンに都合良く転換されることを示す。従って、本明細書に提供される広範な方法及び試薬は、rPIV３−１キメラウィルスの PIV３バックボーンを直接的且つ予測的に弱毒化するために、並びに生存−弱毒化された PIV２ワクチンウィルスを生成するために適用され得る。
【０３５６】
前述の開示は、PIV 及び関連するワクチンの広い集合体を開発するために本明細書に提供される試薬及び方法の開発を可能にする。これに関して、 PIV３と PIV２との間の生存性免疫原性キメラの再生は、ワクチンへの使用のための広範囲の組換えPIV ウィルスを開発するための強力な新規手段を例示する。この研究に関して、天然に存在するPIV 変異体、たとえばcp45及びBPIV３ワクチン候補体の本発明の開示の教授に従っての弱毒化のための遺伝的基礎の同定及び特徴化はまた、組換えワクチンウィルス及びサブウィルス粒子の大きな宿主における開発を可能にする。
【０３５７】
特に、生物学的に誘導された変異体ウィルスに存在する所望する突然変異は、上記例に示されるように、野生型、特に弱毒化される、又はキメラ性のPIV バックグラウンド中に単独での及び組合してのそれらの導入により容易に同定され、そして選択されるであろう。それらの発見は、ワクチン組換え体における弱毒化及び免疫原性のレベルを調節するためにPIV クローン中に導入され得る、本発明内の典型的な弱毒化突然変異のメニューを拡張するであろう。生物学的に誘導された突然変異はまた、種々のタイプの突然変異、たとえば遺伝子又は遺伝子セグメントの変更、欠失又は置換を有するPIV クローン内に導入され得る。本発明のこの観点においては、選択された遺伝子欠失、付加又は置換を有する組換えPIV 、たとえばＣ，Ｄ又はＶ ORFの欠失を有するrPIVが提供される。
【０３５８】
そのような二者択一的に突然変異誘発されたクローンはさらに、PIV 組換え体ｒ942,ｒ992,ｒ1558，ｒ942 ／992,ｒ992 ／1558又はｒ942 ／1558及びｒ942 ／992 ／1558により例示されるように、生物学的に誘導された変異体PIV から採用されたts, ca又はatt 表現型を特定する１又は複数の突然変異を導入することによって、本発明の開示に従って修飾され得る。本発明のさらなる観点においては、生物学的に誘導された突然変異が、たとえばＣ，Ｄ、及び／又はＶ ORFの弱毒化遺伝子欠失により例示されるように、天然において見出されない新たな弱毒化突然変異と組合されるであろう。
【０３５９】
所望する表現型特徴を付与する、本明細書に開示される他のタイプの突然変異がまた、1997年７月15日に出願されたアメリカ特許出願第08／892,403 号（引用により本明細書に組込まれる）における組換えRSV ワクチン株について開示される組合せ突然変異の範囲に類似する、生物学的に誘導された弱毒化突然変異と組合されるであろう。比較できる突然変異が、キメラワクチン株において所望するレベルの弱毒化及び免疫原性を達成するために、たとえばキメラウィルス中に容易に導入され得る。この態様においては、他の所望する表現型特徴と共に、所望するバランスの弱毒化及び免疫原性を有する生存弱毒化されたrPIVワクチンの広範囲の集合体を構築するために有用である大多数の突然変異が本発明において提供される。
【０３６０】
前述の発明はより明確に理解するために、いくらか詳細に例示的且つ例的に記載されて来たが、一定の変更及び修飾を本発明の範囲内で行なえることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０３６１】
【図１】図１は、HPIV３ゲノムRNA の完全なコピーをコードするプラスミドｐ218 (131) の構成を示す。
【図２】図２は、HPIV３のHN（１）及びＬ（２）遺伝子のcDNAによりコードされたゲノムRNA における配列マーカーを示す。
【図３】図３は、 PIV３−CAT cDNA（上部；環状プラスミドとして描かれている）、及びコードされたミニゲノムRNA （低部；一本鎖のネガティブ−センスRNA （３’→５’）として描かれている）の図を包含する。
【０３６２】
【図４】図４は、ミニゲノム PIV３−CAT ０〜＋６によるCAT 酵素の発現を示す。
【図５Ａ】図5Aは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６によるミニ−アンチゲノムRNA の合成を示す。
【図５Ｂ】図5Bは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６によるミニ−アンチゲノムRNA の合成を示す。
【図６Ａ】図6Aは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６による、ポリアデニル化されたmRNAの分析を示す。
【図６Ｂ】図6Bは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６による、ポリアデニル化されたmRNAの分析を示す。
【０３６３】
【図７Ａ】図7Aは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６をコードするプラスミドに応答しての細胞内ミニゲノムの蓄積を示す。
【図７Ｂ】図7Bは、PIV3-CAT ミニゲノム０〜＋６をコードするプラスミドに応答しての細胞内ミニゲノムの蓄積を示す。
【図８】図８は、ｐ3/7(131)2Gの構成を示す。p3/7(131)2Gは、完全なポジティブ−センスHPIV3アンチゲノムをコードし、そしてアンチゲノムのT7プロモーターとヌクレオチド１との間に２つのＧ残基を含む。
【０３６４】
【図９】図９は、ｐ3/7(131)2Gの構成を示す。p3/7(131)2Gは、完全なポジティブ−センスHPIV3アンチゲノムをコードし、そしてアンチゲノムのT7プロモーターとヌクレオチド１との間に２つのＧ残基を含む。
【図１０】図10は、ｐ3/7(131)2Gの構成を示す。p3/7(131)2Gは、完全なポジティブ−センスHPIV3アンチゲノムをコードし、そしてアンチゲノムのT7プロモーターとヌクレオチド１との間に２つのＧ残基を含む。
【０３６５】
【図１１】図11は、ネガティブ−センスの組換え PIV３の配列確認を示す。
【図１２】図12は、Ｌタンパク質配列における位置942, 992及び1558でのアミノ酸置換を有する PIV３ L cDNA を含む、プラスミドpTM(Ｌ)942／992 ／1558の地図を提供する。
【図１３】図13は、本発明内の代表的な突然変異を担持する組換え PIV３ウィルスの図示である。
【図１４Ａ】図14Aは、PIV3 HN 及びＦ ORFが PIV１のそれらにより置換されているキメラ PIV３− PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成を示す。
【図１４Ｂ】図14Bは、PIV3 HN 及びＦ ORFが PIV１のそれらにより置換されているキメラ PIV３− PIV１アンチゲノムをコードするcDNAの構成を示す。
【０３６６】
【図１５Ａ】図15Ａは、キメラrPIV３−１のキメラHN及びＦ遺伝子（中間）と共に、rPIV３／JS (上部；他方では、本明細書において、rJS 及びJS wt rPIV３として言及される）及び PIV１／Wash64（底部）のHN及びＦ遺伝子の図である。
【図１５Ｂ】図15Ｂは、鋳型としてビリオンRNA (vRNA)、及び図14Ａに記載される PIV３−又は PIV１−特異的プライマー対を用いて生成されたRT−PCR 生成物の評価を示す。
【図１６】図16は、決定された、図14Ｂに示されるrPIV３−１のRT−PCR 生成物における PIV３− PIV１連結の配列を示す。
【０３６７】
【図１７Ａ】図17Aは、rPIV３に比較しての、rPIV３−１のRT−PCR 生成物の領域IIIについての配列決定ゲルを示す。開始及び停止コドンはボックスにより示され、制限部位は矢印により示される。
【図１７Ｂ】図17Bは、PIV１に比較しての、rPIV３−１のRT−PCR 生成物の領域IVについての配列決定ゲルを示す。開始及び停止コドンはボックスにより示され、制限部位は矢印により示される。
【図１８】図18は、組織培養物における親及びキメラPIV の多サイクル増殖を示す。
【図１９】図19は、pFLC. ２Ｇ＋. hc、すなわちキメラウィルスrPIV３−１のアンチゲノムcDNAクローン中への３種のＬ遺伝子突然変異の導入を示す。
【図１】
2008307055.tif 000019
【図２】
2008307055.tif 000020
【図３】
2008307055.tif 000021
【図４】
2008307055.tif 000022
【図５Ａ】
2008307055.tif 000023
【図５Ｂ】
2008307055.tif 000024
【図６Ａ】
2008307055.tif 000025
【図６Ｂ】
2008307055.tif 000026
【図７Ａ】
2008307055.tif 000027
【図７Ｂ】
2008307055.tif 000028
【図８】
2008307055.tif 000029
【図９】
2008307055.tif 000030
【図１０】
2008307055.tif 000031
【図１１】
2008307055.tif 000032
【図１２】
2008307055.tif 000033
【図１３】
2008307055.tif 000034
【図１４Ａ】
2008307055.tif 000035
【図１４Ｂ】
2008307055.tif 000036
【図１５Ａ】
2008307055.tif 000037
【図１５Ｂ】
2008307055.tif 000038
【図１６】
2008307055.tif 000039
【図１７Ａ】
2008307055.tif 000040
【図１７Ｂ】
2008307055.tif 000041
【図１８】
2008307055.tif 000042
【図１９】
2008307055.tif 000043
【配列表】
2008307055000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月20日(2008.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用可能に連結された転写プロモーター、PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列、及び転写ターミネーターを含んで成る単離されたポリヌクレオチド分子であって、前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、JS cp45のTyr942、Leu992及び／又はThr1558に対応するアミノ酸をコードする位置においてヌクレオチド置換により修飾されることを特徴とするポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎタンパク質におけるJS cp45のアミノ酸Val96又はSer389に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｃタンパク質におけるJS bcp45のアミノ酸Ile96に対応する位置のアミノ酸置換をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項４】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｆタンパク質におけるJS cp45のアミノ酸Ile420又はAla450に対応する位置の少なくとも１つのアミノ酸置換をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項５】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、HNタンパク質におけるJS cp45のアミノ酸Val384に対応する位置のアミノ酸置換をコードする請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が３’リーダー配列におけるJS cp45のヌクレオチド23、24、28又は45に対応する位置の少なくとも１つの突然変異を組込む請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、Ｎ遺伝子開始配列におけるJScp45のヌクレオチド62に対応する位置の変異を組込む請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする前記ポリヌクレオチド配列が、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N、又はrcp45 Ｆに存在する、多くの及び十分な数までの突然変異を含む請求項１に記載のポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る発現ベクター、及びPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数の単離されたポリヌクレオチド分子を含んで成る少なくとも１の発現ベクターを包含し、それにより、前記PIVゲノム又はアンチゲノム、及びＮ，Ｐ、及びＬタンパク質の発現が感染性PIV 粒子を生成する細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項１０】
前記PIV ゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド、及びPIV のＮ，Ｐ及びＬタンパク質をコードする１又は複数のポリヌクレオチドが、少なくとも２の発現ベクター内に組込まれる請求項９に記載の細胞又は細胞−フリー組成物。
【請求項１１】
組換えPIV ゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、及びＬタンパク質を含んで成る感染性PIV 粒子。
【請求項１２】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、
ｉ）p218(131)（配列番号１）；
ii）p3/7(131)（配列番号14）；
iii ）p3/7(131)2G（配列番号15）；又は
iv）PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープの変化から選択された表現型変更を特定する、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾されている、ｉ）、ii）又はiii ）のゲノム又はアンチゲノムから選択される請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１３】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムがRSV 又は麻疹ウィルスからの異種配列を組込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１４】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、PIV の弱毒化、感温性、低温適合性、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限、又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更をコードする、ヌクレオチド挿入、転位、欠失又は置換により修飾される請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１５】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、複数のts突然変異を組込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１６】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、複数の非−ts弱毒化突然変異を組込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１７】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、JS cp45 の少なくとも１つの突然変異を組込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１８】
前記JS cp45 の突然変異が、前記ポリメラーゼ  Ｌタンパク質におけるアミノ酸置換を特定する請求項17に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項１９】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数のts突然変異を組込む請求項11に記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項２０】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、１又は複数の非−ts弱毒化突然変異を仕込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項２１】
前記キメラゲノム又はアンチゲノムが、rcp45, rcp45 3'NCMFHN, rcp45 3'NL, rcp45 3'N、又はrcp45 Ｆに存在する、少なくとも１つの及び十分な数までの突然変異を組込む請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項２２】
PIV の弱毒化、感温性、低温適合体、小さなプラークサイズ、宿主範囲制限又は免疫原性エピトープにおける変化から選択された表現型変更を特定する突然変異が、１又は複数のカウンターパート PIV１又は PIV２ HN 及びＦ糖タンパク質遺伝子により置換された、１又は複数の PIV３ HN 又はＦ糖タンパク質遺伝子を有するゲノム又はアンチゲノムを含んで成るキメラ PIVバックグラウンドに組込まれる請求項11に記載の感染性 PIV粒子。
【請求項２３】
JS cp45 の１又は複数の突然変異が、前記キメラバックグラウンドにおいて組込まれる請求項22に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項２４】
前記JS cp45 の１又は複数の突然変異が、Ｌ，Ｍ，Ｎ，Ｃ，Ｆ、又はHNから選択された１又は複数のPIV タンパク質において、又は３’リーダー又はＮ−遺伝子開始配列から選択されたPIV 遺伝子外配列において生じる請求項23に記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項２５】
前記組換えPIV ゲノム又はアンチゲノムが、哺乳類宿主において保護免疫応答を誘発することができる、サイトカイン、Ｔ−ヘルパーエピトープ；制限部位マーカー、又は微生物病原体のタンパク質から選択された非−PIV 分子をコードするよう修飾される請求項11に記載の単離された感染性PIV 粒子。
【請求項２６】
哺乳類宿主において、RSV に対して保護免疫性を誘発するRSV 抗原又はエピトープをさらに含んで成る請求項11に記載の感染性PIV 粒子。
【請求項２７】
ｒ942,ｒ992,ｒ1558, ｒ942 ／992,ｒ992 ／1558，ｒ942／1558、又はｒ942 ／992 ／1558，rcp45 3'N, rcp45 C, rcp45 M, rcp45 F, rcp45 HN, rcp45L, rcp45 3'NL, rcp45 3'NCMFHN、及びrcp45 から選択される請求項11に記載の感染性PI  V 粒子。
【請求項２８】
医薬的に許容できるキャリヤーに、組換え PIVゲノム又はアンチゲノム、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質及びＬタンパク質を含んで成る請求項11〜27のいずれか１項に記載の感染性PIV 粒子の免疫原的有効量を含んで成る免疫原組成物。
【外国語明細書】
2008307055000001.pdf