(57)【要約】【課題】染色体内部にある遺伝子を含めて広い範囲にわたって高解像度で解析できる手段・方法を開発する。【解決手段】本発明によれば、受容体にて修飾した領域を表面に有する染色体結合用線維状基体、染色体が結合した該基体、該基体からの染色体の展開・伸長方法およびそのための装置、展開・伸長された染色体の分析・利用方法等が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体にて修飾した領域を表面に有する染色体結合用線維状基体。
【請求項２】
断面最大幅が１００マイクロメートル以下である請求項１記載の線維状基体。
【請求項３】
断面最大幅が２０マイクロメートル以下である請求項１記載の線維状基体。
【請求項４】
受容体にて修飾した領域が受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置されている請求項１〜３のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項５】
表面に幅１０マイクロメートル以下の受容体修飾領域が、１ミリメートル以下の間隔で配置されている請求項３記載の線維状基体。
【請求項６】
材料がガラス、合成樹脂、カーボン、セラミックス、シリコン、シリコン酸化物、シリコン窒化物、金属、金属酸化物、天然繊維、あるいはそれらの混合物または複合体である請求項１〜５のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項７】
受容体が抗体、レクチン、ビオチン特異的受容体、ビオチン、ストレプトタグ、金属錯体配位子、抗体結合タンパク質、グルタチオン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、アミロース、セルロース、ガラクトース、アミノ基、アミノ基に対する共有結合性を有する反応基、チオール基、チオール基に対する共有結合性を有する反応基、核酸結合性を有する基および核酸からなる群より選択されるものを含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項８】
受容体がビオチン、アビジン、ストレプトアビジンから選択されるものを含む請求項１〜６のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項９】
受容体が金属錯体配位子を含む請求項１〜６のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項１０】
受容体が核酸を含む請求項１〜６のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項１１】
染色体が分裂期染色体である請求項１〜請求項１０のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項１２】
染色体を結合させた請求項１〜１０のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項１３】
染色体が分裂期染色体である請求項１２の線維状基体。
【請求項１４】
染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸に導入されているリガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している請求項１２または１３記載の線維状基体。
【請求項１５】
染色体ＤＮＡが繰り返し塩基配列を有するものである請求項１４記載の線維状基体。
【請求項１６】
繰り返し塩基配列がテロメア領域の繰り返し塩基配列ある、あるいは、セントロメア領域の繰り返し塩基配列である請求項１５記載の線維状基体。
【請求項１７】
染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、該ハイブリダイゼーションした核酸をプライマーとし、リガンドによる修飾を受けた核酸塩基を合成基質とし、染色体ＤＮＡを鋳型として、染色体ＤＮＡにハイブリダイゼーションした状態で合成された核酸に結合している該リガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している請求項１２または請求項１３記載の線維状基体。
【請求項１８】
染色体ＤＮＡが末端一本鎖部分を有するものであって、該末端一本鎖部分に対して核酸をハイブリダイゼーションさせた請求項１７記載の線維状基体。
【請求項１９】
リガンドと受容体の結合が、抗原分子と該抗原分子に対する抗体分子の結合、抗体分子と抗体結合性タンパク質の結合、ビオチンあるいはストレプトタグとビオチン特異的受容体の結合、グルタチオンとグルタチオンＳトランスフェラーゼの結合、糖と該糖に結合性のあるレクチンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合、チオール基とチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合、核酸結合性を有する基を介する結合からなる群より選択されるものである、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項２０】
リガンドと受容体の結合が、ビオチンとストレプトアビジン、あるいは、ビオチンとアビジンの結合である、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項２１】
リガンドと受容体の結合が、金属錯体配位子を介した結合である、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項２２】
リガンドと受容体の結合が、核酸を介した結合である、請求項１４〜１８のいずれか１項記載の線維状基体。
【請求項２３】
請求項１２〜２２のいずれか１項記載の染色体を結合させた線維状基体を作製するための溶液槽であって、請求項１記載の線維状基体の一部あるいは全体を、可逆あるいは不可逆に、把持あるいは固着する要素を有する溶液槽。
【請求項２４】
下記工程：
請求項１２〜２２のいずれか１項記載の線維状基体を溶液に浸漬し、流動あるいは泳動しないように支持し、
溶液全体を流動し、あるいは溶液中の物質を泳動し、染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長する
を含む、染色体の展開方法あるいは伸長方法。
【請求項２５】
下記工程：
請求項１２〜２２のいずれか１項記載の線維状基体を溶液に浸漬し、流動あるいは泳動しないように支持し、
送液、電気浸透流、電気泳動のいずれか１つあるいは複数の方法を用いて染色体を展開あるいは伸長する
を含む、染色体の展開方法あるいは伸長方法。
【請求項２６】
請求項２４または２５記載の方法において染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長するための溶液槽であって、線維状基体の一部あるいは全体が、可逆あるいは不可逆に、把持あるいは固着されるものである溶液槽。
【請求項２７】
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡであって、展開／伸長槽内にある一部あるいは全部が平滑な表面へ固定された染色体ＤＮＡ。
【請求項２８】
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡであって、展開／伸長槽内にある網目状構造、繊維状構造、棒構造、あるいはこれらの混合構造に固定された染色体ＤＮＡ。
【請求項２９】
展開／伸長槽内にある正電荷に帯電した表面あるいは構造に固定された、あるいは、２価以上の金属イオン、金属錯体、ポリアミンからなる群より選択されるものを含む物質を介して展開／伸長槽内にある負電荷に帯電した表面あるいは構造に固定された請求項２７または２８記載の固定された染色体ＤＮＡ。
【請求項３０】
核酸結合性を有する基による結合を介して固定された請求項２７または２８記載の固定された染色体ＤＮＡ。
【請求項３１】
染色体ＤＮＡに核酸をハイブリダイゼーションさせ、その核酸に導入されているリガンドと、基体にあらかじめ修飾してある受容体との結合を介して固定された請求項２７または２８記載の固定をされた染色体ＤＮＡ。
【請求項３２】
繰り返し塩基配列を有する染色体ＤＮＡであって、その繰り返し塩基配列に核酸がハイブリダイゼーションするものである請求項３１記載の固定をされた染色体ＤＮＡ。
【請求項３３】
染色体ＤＮＡのニックを始点とし、リガンドの修飾を受けた核酸塩基を合成基質として用いて合成された核酸中のリガンドと、展開／伸長槽内にある表面あるいは構造にあらかじめ修飾してある受容体の結合を介して固定された請求項２７または２８記載の固定された染色体ＤＮＡ。
【請求項３４】
請求項３１〜請求項３３のいずれか１項記載のリガンドと受容体の結合が、ビオチンとストレプトアビジンの結合、ビオチンとアビジンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合、チオール基あるいはチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合からなる群より選択されるものを含む請求項２７あるいは請求項２８記載の染色体ＤＮＡ。（マル）
【請求項３５】
下記工程：
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、一種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡの複数個の該繰り返し塩基配列の組について染色体ＤＮＡ上での相互の距離を計測し、
計測された距離の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法。
【請求項３６】
下記工程：
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、複数種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている、繰り返し塩基配列の該種類について特異的に識別できるあるいは識別できない標識物を用いることにより、複数個からなり複数種類の繰り返し塩基配列を含む繰り返し塩基配列の組について相互の距離を計測し、
計測された距離、また、識別できる場合においてはその識別内容の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法。
【請求項３７】
繰り返し塩基配列にハイブリダイゼーションする核酸として、アニーリング温度の相違が５℃の範囲に収まる１００種類以下のオリゴ核酸を用いる請求項３５または３６記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
【請求項３８】
繰り返し塩基配列がヒトＡｌｕ配列を含む請求項３５〜３７のいずれか１項記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
【請求項３９】
配列番号：１１にあるコンセンサスＡｌｕ配列の第１３３〜第１５７残基の塩基配列、第２３１〜第２４５残基の塩基配列、第２６０〜第２８２残基の塩基配列、ならびに、これらの相補鎖配列からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を染色体ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションする核酸として用いる請求項３８記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
【請求項４０】
繰り返し塩基配列がヒトＬＩＮＥ−１配列を含む請求項３５〜３７のいずれか１項記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
【請求項４１】
下記工程：
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、メチル化シトシンに結合活性があるタンパク質を加え結合させ、
該タンパク質に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡのメチル化シトシンの位置を同定する
を含む、染色体ＤＮＡ上のメチル化シトシン位置マッピング方法。
【請求項４２】
下記工程：
生体試料から抽出した複数種類の核酸からなる核酸の混合物、それらを断片化した核酸の混合物、それらを鋳型として複製した核酸の混合物、それらの断片化と複製の両方を行った核酸の混合物から選択されるいずれか１つの混合物を用意し、
請求項２４または２５記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡをハイブリダイゼーションを受ける核酸とし、前記用意した核酸の混合物をハイブリダイゼーションする核酸とし、ハイブリダイゼーションをおこない、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、前記用意した核酸の混合物に含まれていた核酸の種類の判別、相対含有量の計測を行う
を含む、試料に含まれる核酸混合物の組成分析方法。
【請求項４３】
標識物が蛍光を発する物質を含む請求項３５〜４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
請求項３５〜４１または４３のいずれか１項記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法に使用される染色体ＤＮＡマッピング装置システムであって、繰り返し塩基配列についてその標識物を可視化する観察装置、観察像の撮影装置、および、撮影画像から繰り返し塩基配列の位置を抽出し、その組について相互の距離を計測し、ゲノム塩基配列データベース情報あるいは該情報から抽出した情報と照合する計算装置の三装置を必須の要素として含む、染色体ＤＮＡマッピング装置システム。
【請求項４５】
下記条件を満たす線維状基体と液滴保持器具を組み合わせてなる複合体
・請求項１２〜２２のいずれか１項記載の染色体を結合している線維状基体
・一枚あるいは複数枚から成る板状構造を有する液滴保持器具であって、該板状構造の表面にて液滴を保持し、該液滴にて前記の線維状基体の一部あるいは全部を浸漬する液滴保持器具。
【請求項４６】
請求項１２〜２２のいずれか１項記載の染色体を結合した線維状基体を浸漬した溶液槽と、該線維状基体を浸漬していない溶液槽との二つの溶液槽からなる組であって、溶液に浸漬した状態のままで該染色体を結合した線維状基体が一方の溶液槽から他方の溶液槽に転載されるものであり、かつ、溶液の一体化と分離が行われる二つの溶液槽の組。
【請求項４７】
一方あるいは両方の溶液槽が、疎水領域に囲まれた親水領域からなる表面を有する請求項４６記載の二つの溶液槽の組。
【請求項４８】
一方の溶液槽が、請求項１２〜２２のいずれか１項記載の染色体を結合させた線維状基体を作製するための溶液槽であって、請求項１記載の線維状基体の一部あるいは全体を取り外し可能な状態で把持あるいは固着する要素を有する溶液槽であり、他方の溶液槽が、請求項２４または２５記載の方法において染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長するための溶液槽であって、取り付け可能な状態で線維状基体の一部あるいは全体が把持あるいは固着されるものである溶液槽である、請求項４６または４７記載の二つの溶液槽の組。
【請求項４９】
下記工程：
線維状基体を平滑な表面を有する樹脂層の表面近傍に包埋し、
該樹脂表面に沿って線維状基体に交差する方向に複数本の切削を行い、線維状基体の複数個所で基体面を露出し、
切削によって露出していない基体面を樹脂層により受容体修飾から保護し、切削によって露出した基体面に受容体の修飾をおこない、
線維状基体を樹脂層から解放する、
を含む、請求項４あるいは請求項５記載の線維状基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体の展開・伸長に用いる線維状基体、それを用いる染色体の展開・伸長方法、ならびに染色体の展開・伸長のための装置、展開・伸長された染色体の分析・利用方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、変異遺伝子と疾病との関連性について盛んに研究が行われており、異常遺伝子を検出することにより、あるいは染色体構造の異常を検出することにより、疾病を診断することが可能になっている。これをより効率的に行うには、長鎖染色体ＤＮＡからゲノムや染色体修飾についての連続した一続きの大域的情報を得ることが望ましい。長鎖染色体ＤＮＡから一続きのゲノム情報を得るために用いられている方法としては、クローン化された染色体ＤＮＡライブラリのコンティグ決定（非特許文献１等参照）、ＤＮＡチップを用いたComparative Genome Hybridization（非特許文献２等参照）、ならびに染色体蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および染色体ファイバーＦＩＳＨ法（非特許文献３〜８等参照）が例示される。
【０００３】
コンティグが決定されているライブラリスクリーニングによる方法は、断片化された長鎖の染色体ＤＮＡを、純化・増幅が可能なベクター配列に組み込み、ライブラリＤＮＡに調製する方法である。ライブラリＤＮＡから純化・増幅したクローンと呼ばれる単一のＤＮＡ種の集団を用いると、単一断片を用いた場合では弱い検出感度しか得られない検出方法であっても、十分な検出感度が得られるという利点がある。しかし、クローン化には断片のベクターへの挿入・純化・増幅という複数の工程が必要であり、また、均質な断片のコンティグを再現性よく形成する方法がない。このため多検体で同じ断片コンティグを調製してゲノム情報を比較分析することは難しい。
【０００４】
ＤＮＡチップを用いたComparative Genome Hybridization法は、染色体上等間隔の位置にある塩基配列を配置したＤＮＡチップを用いる方法である。ＤＮＡチップに断片化した試料染色体ＤＮＡ（あるいはその増幅物）をハイブリダイゼーションし、各位置に結合した染色体断片の量を計測することで配列の大域的な増幅・欠失を判定することが出来る。ただし、繰り返し塩基配列の増幅・欠失や転座の判定には不向きである。またＤＮＡチップ自体が高価である。
【０００５】
染色体蛍光in situハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および染色体ファイバーＦＩＳＨ法は、核内で、あるいは、分裂期染色体として凝集状態にある染色体ＤＮＡについて、断片化せず解析を行う方法である。この凝集体には多重にゲノム情報が存在し、これらから発せられる輻輳した信号を、顕微観察など空間分解能を有する方法で解像する必要がある。しかし、実質的に塩基配列上１Ｍｂ以下のゲノム配列上の位置を検出することは困難である。この問題を解決するため、除タンパクを行い、染色体ＤＮＡ全長を展開・伸長したファイバー化染色体ＤＮＡを観察する方法についての潜在的需要はある。しかし、全長にわたって伸長に成功した例はない。これは展開・伸長後の染色体ＤＮＡは極めて脆弱な一本の二重ラセンから成り、適切に配置しないと互いに絡み合い、分断されるからである。そこで穏やかな除タンパクによる部分展開を行い絡み合いや分断を回避するファイバー化の例はある。この場合、目的の部分の展開・伸長が制御出来ず再現性の問題を残している。
【０００６】
いずれにせよ、染色体内部に埋もれた遺伝子を含めて広い範囲にわたって高解像度で解析することが必要とさる。そのためには損傷を抑えつつ染色体を十分に展開・伸長してから解析することが望ましい。
【非特許文献１】Olson M.V., et al., Proc Natl Acad Sci USA 83:7826-7830(1989), Green E.D. and Olson M.V. Proc Natl Acac Sci USA 87:1213-1217(1990)
【非特許文献２】Kallioniemi A., et al., Science 258:818-821(1992), Pinkel D. et al., Nat Genet 20:207-211(1998)
【非特許文献３】Wiegant J., et al., Hum Mol Genet 1:587-591(1992)
【非特許文献４】Heng H.H.Q., et al., Proc Natl Acac Sci USA 89:909-9513(1992)
【非特許文献５】Senger G., et al., Cytogenet Cell Genet 64:49-53(1993)
【非特許文献６】Parra I. and Windle B. Nat Genet 5:17-21(1993)
【非特許文献７】Haaf T. and Ward D.C., Hum Mol Genet 3:697-709(1994)
【非特許文献８】Bensimon A., et al., Science 265:2096-2098(1994)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
損傷を抑えつつ染色体を展開・伸長し、染色体内部にある遺伝子を含めて広い範囲にわたって高解像度で解析できる手段・方法を開発することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記事情に鑑み、受容体にて修飾した領域を表面に有する線維状基体を作成し、これに染色体を結合させ、流動あるいは泳動を用いて染色体を展開・伸長すると、上記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、極めて長くまた損傷を受けやすい直鎖超高分子である染色体ＤＮＡを分析に適した形態に展開・伸長し配置した上で、その染色体ＤＮＡ自体を分析する、あるいは、他の試料の分析に利用するというものである。これまで、染色体ＤＮＡの極めて長くまた損傷を受けやすい性質が、分析に適した形態に展開・伸長し配置することを困難にしてきた。これを解決するための手段を与える。
【００１０】
上記を実現する工程を概括すると以下の通りとなる。
（１）染色体を線維状基体に結合させる
（２）線維状基体から染色体を展開・伸長し、これを別の基体上に固定する
（３）展開・伸長され固定された染色体ＤＮＡのゲノム情報を取得し、あるいは、展開・伸長され固定された染色体ＤＮＡを比較対象・参照対象として試料ＤＮＡの組成についての情報を取得する
というものである。
【００１１】
詳細には、本発明は上記課題を解決するために下記のものを提供する。
（１）受容体にて修飾した領域を表面に有する染色体結合用線維状基体。
（２）断面最大幅が１００マイクロメートル以下である（１）記載の線維状基体。
（３）断面最大幅が２０マイクロメートル以下である（１）記載の線維状基体。
（４）受容体にて修飾した領域が受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置されている（１）〜（３）のいずれかに記載の線維状基体。
（５）表面に幅１０マイクロメートル以下の受容体修飾領域が、１ミリメートル以下の間隔で配置されている（３）記載の線維状基体。
（６）材料がガラス、合成樹脂、カーボン、セラミックス、シリコン、シリコン酸化物、シリコン窒化物、金属、金属酸化物、天然繊維、あるいはそれらの混合物または複合体である（１）〜（５）のいずれかに記載の線維状基体。
（７）受容体が抗体、レクチン、ビオチン特異的受容体、ビオチン、ストレプトタグ、金属錯体配位子、抗体結合タンパク質、グルタチオン、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、アミロース、セルロース、ガラクトース、アミノ基、アミノ基に対する共有結合性を有する反応基、チオール基、チオール基に対する共有結合性を有する反応基、核酸結合性を有する基および核酸からなる群より選択されるものを含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の線維状基体。
（８）受容体がビオチン、アビジン、ストレプトアビジンから選択されるものを含む（１）〜（６）のいずれかに記載の線維状基体。
（９）受容体が金属錯体配位子を含む、（１）〜（６）のいずれかに記載の線維状基体。
（１０）受容体が核酸を含む（１）〜（６）のいずれかに記載の線維状基体。
（１１）染色体が分裂期染色体である（１）〜（１０）のいずれかに記載の線維状基体。
（１２）染色体を結合させた（１）〜（１０）のいずれかに記載の線維状基体。
（１３）染色体が分裂期染色体である（１２）記載の線維状基体。
（１４）染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸に導入されているリガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している（１２）または（１３）記載の線維状基体。
（１５）染色体ＤＮＡが繰り返し塩基配列を有するものである（１４）記載の線維状基体。
（１６）繰り返し塩基配列がテロメア領域の繰り返し塩基配列ある、あるいは、セントロメア領域の繰り返し塩基配列である（１５）記載の線維状基体。
（１７）染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸をプライマーとし、リガンドによる修飾を受けた核酸塩基を合成基質とし、染色体ＤＮＡを鋳型として、染色体ＤＮＡにハイブリダイゼーションした状態で合成された核酸に結合している該リガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している（１２）または（１３）記載の線維状基体。
（１８）染色体ＤＮＡが末端一本鎖部分を有するものである（１７）記載の線維状基体。
（１９）リガンドと受容体の結合が、抗原分子と該抗原分子に対する抗体分子の結合、抗体分子と抗体結合性タンパク質の結合、ビオチンあるいはストレプトタグとビオチン特異的受容体の結合、グルタチオンとグルタチオンＳトランスフェラーゼの結合、糖と該糖に結合性のあるレクチンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合、チオール基とチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合、核酸結合性を有する基を介する結合からなる群より選択されるものである、（１４）〜（１８）のいずれかに記載の線維状基体。
（２０）リガンドと受容体の結合が、ビオチンとストレプトアビジン、あるいは、ビオチンとアビジンの結合である、（１４）〜（１８）のいずれかに記載の線維状基体。
（２１）リガンドと受容体の結合が、金属錯体配位子を介した結合である、（１４）〜（１８）のいずれかに記載の線維状基体。
（２２）リガンドと受容体の結合が、核酸を介した結合である、（１４）〜（１８）のいずれかに記載の線維状基体。
（２３）（１２）〜（２２）のいずれかに記載の染色体を結合させた線維状基体を作製するための溶液槽であって、（１）記載の線維状基体の一部あるいは全体を、可逆あるいは不可逆に、把持あるいは固着する要素を有する溶液槽。
（２４）下記工程：
（１２）〜（２２）のいずれかに記載の線維状基体を溶液に浸漬し、流動あるいは泳動しないように支持し、
溶液全体を流動し、あるいは溶液中の物質を泳動し、染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長する
を含む、染色体の展開方法あるいは伸長方法。
（２５）下記工程：
（１２）〜（２２）のいずれかに記載の線維状基体を溶液に浸漬し、流動あるいは泳動しないように支持し、
送液、電気浸透流、電気泳動のいずれか１つあるいは複数の方法を用いて染色体を展開あるいは伸長する
を含む、染色体の展開方法あるいは伸長方法。
（２６）（２４）または（２５）記載の方法において染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長するための溶液槽であって、線維状基体の一部あるいは全体が、可逆あるいは不可逆に、把持あるいは固着されるものである溶液槽。
（２７）（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡであって、展開／伸長槽内にある一部あるいは全部が平滑な表面へ固定された染色体ＤＮＡ。
（２８）（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡであって、展開／伸長槽内網目状構造、繊維状構造、棒構造、あるいはこれらの混合構造に固定された染色体ＤＮＡ。
（２９）展開／伸長槽内にある正電荷に帯電した表面あるいは構造に固定された、あるいは、二価金属イオン、金属錯体、ポリアミンからなる群より選択されるものを含む物質を介して展開／伸長槽内にある負電荷に帯電した表面あるいは構造に固定された（２７）または（２８）記載の固定された染色体ＤＮＡ。
（３０）核酸結合性を有する基による結合を介して固定された（２７）または（２８）記載の固定された染色体ＤＮＡ。
（３１）染色体ＤＮＡに核酸をハイブリダイゼーションさせ、その核酸に導入されているリガンドと、基体にあらかじめ修飾してある受容体との結合を介して固定された（２７）または（２８）記載の固定をされた染色体ＤＮＡ。
（３２）繰り返し塩基配列を有する染色体ＤＮＡであって、その繰り返し塩基配列に核酸がハイブリダイゼーションするものである（３１）記載の固定をされた染色体ＤＮＡ。
（３３）染色体ＤＮＡのニックを始点とし、リガンドの修飾を受けた核酸塩基を合成基質として用いて合成された核酸中のリガンドと、展開／伸長槽内にある表面あるいは構造にあらかじめ修飾してある受容体の結合を介して固定された（２７）または（２８）記載の固定された染色体ＤＮＡ。
（３４）（３１）〜（３３）のいずれか１項記載のリガンドと受容体の結合が、ビオチンとストレプトアビジンの結合、ビオチンとアビジンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合、チオール基あるいはチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合からなる群より選択されるものを含む（２７）あるいは（２８）記載の染色体ＤＮＡ。
（３５）下記工程：
（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、一種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡの複数個の該繰り返し塩基配列の組について染色体ＤＮＡ上での相互の距離を計測し、
計測された距離の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法。
（３６）下記工程：
（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、複数種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている、繰り返し塩基配列の該種類について特異的に識別できるあるいは識別できない標識物を用いることにより、複数個からなり複数種類の繰り返し塩基配列を含む繰り返し塩基配列の組について相互の距離を計測し、
計測された距離、また、識別できる場合においてはその識別内容の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法。
（３７）繰り返し塩基配列にハイブリダイゼーションする核酸として、アニーリング温度の相違が５℃の範囲に収まる１００種類以下のオリゴ核酸を用いる（３５）または（３６）記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
（３８）繰り返し塩基配列がヒトＡｌｕ配列を含む（３５）〜（３７）のいずれかに記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
（３９）配列番号：１１にあるコンセンサスＡｌｕ配列の第１３３〜第１５７残基の塩基配列、第２３１〜第２４５残基の塩基配列、第２６０〜第２８２残基の塩基配列、ならびに、これらの相補鎖配列からなる群より選択される少なくとも１種の塩基配列を有する核酸を染色体ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションする核酸として用いる（３８）記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
（４０）繰り返し塩基配列がヒトＬＩＮＥ−１配列を含む（３５）〜（３７）のいずれかに記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法。
（４１）下記工程：
（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、メチル化シトシンに結合活性があるタンパク質を加え結合させ、
該タンパク質に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡのメチル化シトシンの位置を同定する
を含む、染色体ＤＮＡ上のメチル化シトシン位置マッピング方法。
（４２）下記工程：
生体試料から抽出した複数種類の核酸からなる核酸の混合物、それらを断片化した核酸の混合物、それらを鋳型として複製した核酸の混合物、それらの断片化と複製の両方を行った核酸の混合物から選択されるいずれか１つの混合物を用意し、
（２４）または（２５）記載の方法により展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡをハイブリダイゼーションを受ける核酸とし、前記用意した核酸の混合物をハイブリダイゼーションする核酸とし、ハイブリダイゼーションをおこない、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、前記用意した核酸の混合物に含まれていた核酸の種類の判別、相対含有量の計測を行う
を含む、試料に含まれる核酸混合物の組成分析方法。
（４３）標識物が蛍光を発する物質を含む（３５）〜（４２）のいずれかに記載の方法。
（４４）（３５）〜（４１）または（４３）のいずれかに記載の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法に使用される染色体ＤＮＡマッピング装置システムであって、繰り返し塩基配列についてその標識物を可視化する観察装置、観察像の撮影装置、および、撮影画像から繰り返し塩基配列の位置を抽出し、その組について相互の距離を計測し、ゲノム塩基配列データベース情報あるいは該情報から抽出した情報と照合する計算装置の三装置を必須の要素として含む、染色体ＤＮＡマッピング装置システム。
（４５）下記条件を満たす線維状基体と液滴保持器具を組み合わせてなる複合体
・（１２）〜（２２）のいずれかに記載の染色体を結合している線維状基体
・一枚あるいは複数枚から成る板状構造を有する液滴保持器具であって、該板状構造の表面にて液滴を保持し、該液滴にて前記の線維状基体の一部あるいは全部を浸漬する液滴保持器具。
（４６）（１２）〜（２２）のいずれかに記載の染色体を結合した線維状基体を浸漬した溶液槽と、該線維状基体を浸漬していない溶液槽との二つの溶液槽からなる組であって、溶液に浸漬した状態のままで該染色体を結合した線維状基体が一方の溶液槽から他方の溶液槽に転載されるものであり、かつ、溶液の一体化と分離が行われる二つの溶液槽の組。
（４７）一方あるいは両方の溶液槽が、疎水領域に囲まれた親水領域からなる表面を有する（４６）記載の二つの溶液槽の組。
（４８）一方の溶液槽が、（１２）〜（２２）のいずれかに記載の染色体を結合させた線維状基体を作製するための溶液槽であって、（１）記載の線維状基体の一部あるいは全体を取り外し可能な状態で把持あるいは固着する要素を有する溶液槽であり、他方の溶液槽が、（２４）または（２５）記載の方法において染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長するための溶液槽であって、取り付け可能な状態で線維状基体の一部あるいは全体が把持あるいは固着されるものである溶液槽である、（４６）または（４７）記載の二つの溶液槽の組。
（４９）下記工程：
線維状基体を平滑な表面を有する樹脂層の表面近傍に包埋し、
該樹脂表面に沿って線維状基体に交差する方向に複数本の切削を行い、線維状基体の複数個所で基体面を露出し、
切削によって露出していない基体面を樹脂層により受容体修飾から保護し、切削によって露出した基体面に受容体の修飾をおこない、
線維状基体を樹脂層から解放する、
を含む、（４）あるいは（５）記載の線維状基体の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、染色体を傷つけることなく展開・伸長し、染色体の高次構造によって内部に埋もれた遺伝子を含めて広い範囲にわたって高解像度で染色体を解析することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、上述のごとく、受容体にて修飾した領域を表面に有する、染色体結合用線維状基体を提供するものである。基体が線維状であることによって、以下の利点が生じる。
（１）染色体固定環境と染色体ＤＮＡ伸長環境とを分離することが出来、これにより伸長環境における不適当な染色体混入を防ぐことが出来る。
（２）基体の表面積が少なく染色体固定量を少なくすることが出来る。
（３）線維状であるため染色体固定領域を外部から支持することが出来る。
（４）染色体ＤＮＡ伸長の出発点を伸長方向に関して一致させることが出来る。
（５）染色体ＤＮＡを間隔を置いて固定した場合、展開・伸長方向に関して平行な展開・伸長が出来る。
【００１４】
本明細書において、染色体ＤＮＡの「展開・伸長」、「展開／伸長」あるいは「展開あるいは伸長」とは、好ましい理想的な状態としては、切断がなく、他の物質が結合しておらず、ＤＮＡ自体が直線状であるか、必要に応じて制御された屈曲を有する形態をとるものであるが、いずれの場合もその全体において外部から接近を許す状態にあるものを言う。これに準じる状態として、数百マイクロメートル以上の切断のない連続した染色体ＤＮＡであって、５０％以上好ましくは８０％以上のＤＮＡ領域で他の物質の結合がなく、また直線状ないし制御された屈曲を有する形態をとる場合で、その領域において外部から接近を許す状態にあるものも含むものとする。
【００１５】
本発明で線維状とあるのは、直線状である、あるいは、折り曲げることは可能であっても、染色体展開・伸長操作においては直線状で成形きる状態を満たすものである。また、染色体展開・伸長操作において一本一本が操作対象として独立させることが出来る状態を満たすものである。折り曲げられた状態であって再び直線状に戻すのが困難である状態、あるいは、多数本を有する状態であって、より分けて操作・処理対象として独立させることが困難である状態を非線維状と呼ぶとすると、非線維状の基体をもってしては、特段の開示がない場合においては本発明を容易に実施することが出来るものではないと言える。線維状基体の縦と横の比率は好ましくは１０：１以上、さらに好ましくは１０００：１以上である。
【００１６】
線維状基体の線維方向の形状は様々なものであってよく、例えば、直線状であってもよく、折れ曲がっていてもよい。好ましくは、染色体の性状・特性、染色体を展開・伸長する条件、そのための装置の形状などの条件に適宜合わせた形状とする。線維状基体の断面の形状は円形、楕円形、三角形、四角形、多角形、Ｕ字型、Ｖ字型、前記の内一の形状であって多孔質の、あるいは、窪みを有する形状、前記形状の内一あるいは複数の形状を束ねた形状等であってよいが、これらの形状に限定されない。好ましくは、染色体の性状・特性、染色体を展開・伸長する条件、そのための装置の形状などの条件に適宜合わせた形状とする。基体の断面最大幅は１００マイクロメートル以下、好ましくは２０マイクロメートル以下である。その理由は、染色体の大きさは、分裂期染色体を対象とする場合、長辺方向２０マイクロメートル以下、短辺方向１０マイクロメートル以下のを、また、間期染色体を対象とする場合、長さ不定、幅１マイクロメートル以下の紐状形状をとる。このような大きさを有する染色体であるため、線維状基体の断面が大きいと多数の染色体が断面方向に多重に配置されることになる。線維状基体の最大断面幅を制限することにより断面方向への多重固定を抑制し、線維状基体横方向に整列した染色体固定を実現するためである。
【００１７】
基体の材料はガラス、プラスチック、カーボン、シリコン、シリコン酸化物、シリコン窒化物、金属、金属酸化物、天然繊維等、あるいはそれらの混合物または複合体であってもよいが、これらの材料に限定されない。好ましい基体材料はガラスである。基体表面は平滑面であってもよく、粗面であってもよく、あるいは凹凸があってもよい。粗面あるいは凹凸があることによって染色体結合性が増大しうる。
【００１８】
線維状基体の表面は受容体で修飾されることが好ましい。ここで、「受容体」とは、染色体に結合されたリガンドあるいは染色体の官能基と結合しうる物質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなど）またはその一部分、あるいは官能基を包含し、該結合は特異的であることが好ましい。「リガンド」とは、上記受容体に結合する物質、その一部分、あるいは官能基を包含する。本明細書において「修飾」というかわりに「結合」という場合がある。リガント特異的受容体での基体の修飾は、あらゆる結合様式により行うことができる。例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、疎水結合、ファンデルワールス力、物理的吸着などにより、基体の修飾を行うことができる。リガント特異的受容体の基体への結合方法としては公知の方法を適宜選択して用いることができる。リガント特異的受容体での基体の修飾は当業者に公知の手段・方法を用いて行うことができる。基体の材料の種類、基体の形状、リガント特異的受容体の種類、特性、結合すべき染色体の大きさ、形状などを考慮して、リガント特異的受容体の種類を選択し、その基体への結合方法を選択することができる。
【００１９】
染色体あるいは染色体に結合したリガンドに直接結合しうる官能基を表面に有する基体を用いてもよい。本明細書においては、かかる基体表面上の官能基も「受容体」に包含される。
【００２０】
本明細書における「染色体ＤＮＡに対してハイブリダイゼーションする核酸」としては、染色体ＤＮＡ上のアデニン、シトシン、チミン、グアニンの四核酸塩基に対して相補的水素結合を連続して形成し、ある染色体ＤＮＡ領域にたいして特異的結合性を有する性質を持つ分子を指すものであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡを含むが、これらに限るものではない。また「核酸結合性を有する基」の例としては、インターカレーション分子、二重ラセン溝に特異的に結合する核酸結合分子、核酸塩基を配位子として金属錯体形成能を有する基などを挙げることが出来るが、これに限るものではない。
【００２１】
展開・伸長すべき染色体にリガンドを結合し、該リガンドを基体表面上の受容体に結合させる。リガンドと受容体の組合せは公知であり、いずれの組合せであってもよい。リガンドと受容体の組合せとしては、ビオチン特異的受容体（例えばストレプトアビジン）とビオチンあるいはストレプトタブ、レクチンと糖、抗体と抗原またはエピトープ（それらの断片も含む）、互いにハイブリダイゼーションする核酸、配位子と金属イオン含有配位子あるいはその逆、グルタチオンとグルタチオンＳトランスフェラーゼ、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基、チオール基とチオール基に対する共有結合性を有する反応基、インターカレションや二重ラセン溝結合その外の結合機序による核酸結合試薬と核酸などが例示される。基体の材料の種類、基体の形状、リガント特異的受容体の種類、特性、結合すべき染色体の大きさ、形状などを考慮してこれらの組合せを適宜選択することができる。好ましくは、基体に修飾される受容体は抗体、レクチン、ビオチン特異的受容体および核酸からなる群より選択される１種またはそれ以上のものである。
【００２２】
上記においては、リガンドと受容体はお互いに相手に対して特異的に結合する関係を有する物質の対であって、物質の種類、結合様式においてリガンドと受容体で区別するものではない。このような特異性を有する物質の対の内、基体側に存在するものを受容体と呼び、基体に対して移動体である染色体側に存在するものをリガンドと呼ぶことにする。この点で染色体に内在するＤＮＡあるいはタンパク質がリガンドとなることもある。さらにまた、リガンドと受容体の結合に介在物が存在し、その介在物とリガンド、介在物と受容体の特異性により、結果としてリガンドと受容体の直接あるいは間接の結合の特異性が保たれている場合も、直接あるいは間接に特異的に結合する関係を有する物質の対であるという点で、リガンドと受容体と呼ぶものである。
【００２３】
リガンドと受容体の組合せを構成するメンバーのどちらを基体に（あるいは染色体に）結合させてもよい。例えば、ストレプトアビジンを基体に結合させ、ビオチンを染色体に結合させてもよく、あるいは、ビオチンを基体に結合させ、ストレプトアビジンを染色体に結合させてもよい。また、リガンドを介さずに染色体を基体に直接結合させてもよい。このような場合、染色体自体が「リガンド」であるということができる。
【００２４】
染色体とリガンドとの結合も公知の方法にて行うことができる。基体の材料の種類、基体の形状、リガント特異的受容体の種類、特性、結合すべき染色体の大きさ、形状などを考慮して、染色体とリガンドとの結合方法を選択することができる。
【００２５】
基体表面を修飾する受容体は１種類であってもよく、複数種類であってもよい。例えば、基体表面にストレプトアビジンのみを結合させてもよく、あるいはストレプトアビジンおよび抗体を基体表面に結合させてもよい。
【００２６】
染色体を線維状基体に結合させるための方法は当業者に公知の方法であってよい。特に、染色体の特定配列にのみ基体への特異的結合性を付与することについては、例えば、特定配列に対するin situハイブリダイゼーション法（実施例２参照）あるいはプライマー伸長法（実施例３参照）により、線維状基体の表面処理試薬に対する特異的結合性を有する基あるいはリガンドの導入を行うことができる。
【００２７】
本発明の基体に結合させる染色体の部位、あるいは染色体へのリガンドの導入部位はいずれの部位であってもよいが、好ましくは染色体の末端あるいは末端付近である。染色体末端付近にて基体に結合させることによって、染色体が展開・伸長時に折れ曲がったり重なり合ったりすることを抑制することができる。
【００２８】
基体表面すべてを受容体にて修飾してもよいが、展開・伸長の際に染色体の錯綜が起こらないよう個々の染色体を展開・伸長前に適度な密度で基体上に整列配置することが好ましい。この目的に合わせて染色体が結合する受容体も適度な密度で基体上に整列配置することが好ましい。さらに、整列配置された位置を始点とし、染色体ＤＮＡの相対位置が明瞭な形態で展開・伸長することが好ましい。
【００２９】
上記を実現するため具体例としては、基体表面に、受容体にて修飾した領域を受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置することが挙げられる。好ましくは、断面最大幅が１００マイクロメートル以下である線維状基体の表面に幅１０マイクロメートル以下の受容体にて修飾した領域を、１ミリメートル以下好ましくは５０マイクロメートル前後の間隔で配置する。このように、受容体にて修飾した領域を受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置し、染色体の大きさに比べて適度な間隔を置いて染色体を基体に結合させることにより、複数の染色体を同時に解析することができる。さらに、展開・伸長された染色体が錯綜、重なり、あるいは断裂することを抑制することができる、整列配置された位置を始点とし、染色体ＤＮＡの相対位置が明瞭な形態で展開・伸長することができる等の利点が生じる。
【００３０】
基体表面に、受容体にて修飾した領域を受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置するための方法は、当業者に公知の方法であってよい。上記方法は、基体の材料、受容体にて修飾した領域の配置間隔、リガンドの種類などの条件に応じて適宜選択することができる。例えば、基体表面の受容体にて修飾した領域以外への染色体の非特異的結合を防止するために、ウシ血清アルブミンや、除去の確認が容易な蛍光タンパク質であるＧＦＰなどのブロッキング用蛋白を基体に被覆してから染色体を結合させ、その後ブロッキング蛋白を除去してもよい。
【００３１】
本発明の線維状基体、特に、受容体にて修飾した領域を表面上に間隔を置いて配置した線維状基体は、電場あるいは流体場を用いた手段・方法、例えば、送液流、電気浸透流や電気泳動等の染色体展開・伸長のための手段・方法と組み合わされた場合に上記のようなメリットを有するので、広範囲に高解像度で染色体を解析するための道具として非常に有用である。
【００３２】
本発明の線維状基体に結合され、解析される染色体はいずれの細胞周期上細胞周期上いずれの段階の染色体であってもよいが、分裂期染色体が好ましい。その理由は、分裂期染色体を展開・伸長させると染色体１個１個に分離するので解析がし易いからである。分裂期染色体の場合、細胞から抽出された全ての染色体を線維状基体への結合に用いることも出来るが、Flow Cytometryなどによる染色体分離方法を用いることによって分離・精製したある特定種類の染色体を線維状基体に結合し、その種類の染色体についてのみ分析することも好ましい。
【００３３】
本発明の線維状基体により、染色体を細長い空間領域に配置することができ、以下に述べるように染色体をうまく展開・伸長することができる。
【００３４】
染色体を結合した本発明の線維状基体もまた本発明に包含される。
【００３５】
好ましい態様において、本発明は、染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸に導入されているリガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している線維状基体に関するものである。この態様においては、さらに染色体ＤＮＡが繰り返し塩基配列を有することが好ましい。ハイブリダイゼーション対象が繰り返し塩基配列であるということにより、一つあるいは少数の核酸を用意するだけで、多くのハイブリダイゼーション対象にリガンドを導入することが出来る。これは受容体を修飾した線維状基体への結合活性を高めることになる。かかる繰り返し塩基配列としては、テロメア領域の繰り返し塩基配列ある、あるいは、セントロメア領域の繰り返し塩基配列などが例示される。
【００３６】
また別の好ましい態様においては、本発明は、染色体ＤＮＡに対して核酸をハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションした核酸をプライマーとし、リガンドによる修飾を受けた核酸塩基を合成基質とし、染色体ＤＮＡを鋳型として、染色体ＤＮＡにハイブリダイゼーションした状態で合成された核酸に結合している該リガンドと、線維状基体に修飾してある受容体とが結合することによって染色体が結合している線維状基体に関するものである。この態様におけるさらに好ましいハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡ末端一本鎖部分に対するものが例示される。ここにおいて末端一本鎖部分はハイブリダイゼーションの前に二重ラセンを解離する操作が必要ない粘着末端のごときものである。
【００３７】
リガンドと受容体との結合はいずれの形態であってもよいが、好ましい結合としては、抗原分子と該抗原分子に対する抗体分子の結合、抗体分子と抗体結合性タンパク質の結合、ビオチンあるいはストレプトタグとビオチン特異的受容体の結合、グルタチオンとグルタチオンＳトランスフェラーゼの結合、糖と該糖に結合性のあるレクチンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合（例えば、リガンド・受容体がアミノ基とＮ−ヒドロキシサクシンイミドである結合、あるいは両者がともにアミノ基であり、グルタールアルデヒドにより両者を架橋する結合）、チオール基とチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合、核酸結合性を有する基を介する結合などが挙げられる。このうち、好ましい結合としては、ビオチンとストレプトアビジン、あるいは、ビオチンとアビジンの結合、あるいは金属錯体配位子を介した結合、あるいは核酸を介した結合（例えば、ハイブリダイゼーション、さらには共有結合性架橋剤を有する核酸によるハイブリダイゼーションおよびその後の架橋結合）などが挙げられる。
【００３８】
本発明の線維状基体に染色体を結合させたものは、一度に複数の染色体を解析できるので、いわゆる染色体チップとしても有用である。本発明の線維状基体に染色体を複数結合させ、これらの染色体を展開・伸長させたものに、マーカーとなる遺伝子あるいはポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションさせて、染色体上の特定部位を検出することもできる。また、本発明の線維状基体に染色体を結合させたものは、染色体ソーティング、染色体タンパク質修飾解析などに有用である。
【００３９】
さらに本発明は、染色体を結合させた本発明の線維状基体を媒体中に置き、これに電場あるいは流体場をかけて染色体を展開・伸長させることを特徴とする、染色体の展開・伸長方法を提供するものである。電場あるいは流体場をかけて染色体を展開・伸長させるための好ましい方法としては電気浸透流を利用する方法、あるいは電気泳動法が挙げられ、電気浸透流を利用する方法がより好ましい。電気浸透流（ＥＯＦ）は、帯電している溶液槽表面に引き寄せられ、その表面近傍で濃度を増した溶液中の対イオンに電場を加え泳動し、これにより溶液槽表面に送液流を発生するというものである。この方法を用いると染色体ＤＮＡ自体を溶液槽表面に吸着させて展開・伸長状態を制御しながら、送液流によって搬送することが出来る利点がある。これにより、伸長後の固定、あるいは、観察において染色体ＤＮＡの好ましい配置を実現することが出来る。
【００４０】
染色体を本発明の基体に結合した後、凝集状態にある染色体の除蛋白を行い、非結合配列のＤＮＡを開放してから、染色体を展開・伸長させることが好ましい。かかる除蛋白法としては、界面活性剤、タンパク質分解酵素、高塩濃度水溶液、ポリアニオンなど、公知の方法を用いることができる。
【００４１】
本発明の染色体を展開・伸長させるための方法の具体的態様は、下記工程：
染色体を固定した本発明の線維状基体を溶液に浸漬し、流動あるいは泳動しないように支持し、
溶液全体を流動し、あるいは溶液中の物質を泳動し、染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長する
を含む。
【００４２】
染色体の展開・伸長に際しては、溶液を入れた展開／伸長槽中で行われが、展開・伸長後の固定、あるいは、観察のために、染色体ＤＮＡが展開／伸長槽内で平滑な表面近傍で展開・伸長されることが好ましい。
【００４３】
また特に線維状基体において、受容体にて修飾されている領域が受容体にて修飾されていない領域によって隔離された状態で複数配置されている場合については、受容体が修飾されているのと同じ間隔をおいて、隔壁によって隔てられている展開／伸長槽が好ましい。このように隔壁によって隔てられることにより、配置された受容体に結合した染色体毎に両側の隔壁によって囲まれた展開／伸長槽で展開・伸長することが出来、他の受容体に結合したり、他の場所から展開・伸長された染色体ＤＮＡと交差することがない。
【００４４】
線維状基体の受容体の配置の間隔が等間隔であり、1ミリメートル以下好ましくは50マイクロメートル前後の間隔で配置されている場合には、その間隔と同じ等間隔で隔壁を配置することが好ましい。
【００４５】
送液を用いる場合には、例えば、平滑な表面に平行な一方向の定常流を形成すると、流体の粘性により流体の速度場は表面近傍で遅く、表面から離れたところで速くなる。かかる状況下において、染色体を結合した線維状基体を平滑な表面近傍に設置すると、平滑な表面より離れたところに展開・伸長された染色体ＤＮＡはより速く移動し張力を発生することになり、結果として、展開・伸長後、平滑な表面近傍に滞留する効果を有する。さらには、好ましい１具体例として、染色体ＤＮＡが展開・伸長される空間を狭い間隔を有する平行で平滑な二つの表面の間に制限し（一例として、図１０（ｃ）参照）、染色体ＤＮＡが上下方向に拡散することを制限した展開／伸長槽を用いることによって、染色体ＤＮＡの平滑な表面近傍における展開・伸長を実現することも出来る。平行で平滑な二つの表面はまた、送液の乱流を制限することも好都合である。該平滑な二つの表面の間隔は展開・伸長の方法、条件、展開・伸長される染色体の特性などを考慮して適宜決定しうるが、通常には、１０〜２００マイクロメートルであろう。
【００４６】
電気浸透流（ＥＯＦ）を用いる場合、例えば、展開／伸長槽にある平滑な表面をガラス基板とし、これを清浄化することによって負に帯電させ、染色体を結合した線維状基体を平滑な表面近傍に設置し、溶液の電解質濃度を低下させた（一価イオン・マイクロモル以下）状態で電界を加印する（５〜１００Ｖ／cm）。このとき負に帯電した表面近傍に正の対イオンが濃縮され、これが加印電場によって溶液の層流を形成する。また一方で負に帯電した染色体ＤＮＡは表面近傍に濃縮された正電荷に吸引されて、表面に吸着した状態を維持しながら、正電荷と共に移動することになる。このような表面吸着状態を維持した泳動は、展開・伸長後の固定、あるいは、観察のために好ましい効果を有する。
【００４７】
電気泳動を用いる場合には、染色体ＤＮＡは加印電場陽極に向かって泳動する。この際、送液による展開・伸長と同様、染色体を結合した線維状基体を平滑な表面近傍に設置することで、展開・伸長を平滑な表面近傍で行うことが出来る。またこの平滑な表面を例えばアミノシラン処理等を施したガラス基板にすることにより正に帯電させ、染色体ＤＮＡを表面に吸着させた状態で泳動することが出来る。さらには、染色体ＤＮＡが展開・伸長される空間を狭い間隔を有する平行で平滑な二つの表面の間に制限することによっても、染色体ＤＮＡの平滑な表面近傍における展開・伸長を実現することが出来る（上記参照）。さらにまた、平行で平滑な二つの表面の間に、アクリルアミド、アガロース、デキストラン等の網目状構造を有する材料を封入することにより、網目状構造によって支持されながら展開・伸長を行うことが出来る。
【００４８】
本発明は、展開・伸長された染色体も包含する。好ましくは、染色体は上記方法にて展開・伸長されたものである。上記方法により展開・伸長された直鎖超高分子である染色体ＤＮＡは展開・伸長力を失うと、環境に依存して変形し、あるいは、安定形態に遷移し、さらにその状態で溶液槽等の構造物に吸着することによって、展開・伸長による本発明の効果が消失することになる。そこで展開・伸長力を失った後においても展開・伸長状態を維持する必要が生じ、この必要に答えるため伸長・展開状態を維持した状態で、染色体は展開／伸長槽内で固定することになる。したがって、本発明は、伸長・展開状態を維持した状態で展開／伸長槽内で固定された染色体を包含する。
【００４９】
かかる固定は展開・伸長中あるいは展開・伸長後のいずれに行われてもよい。固定に用いる染色体の部位はいずれの部位であってもよいが、染色体の大きさ、構造、種類、展開／伸長槽の構造、大きさ、材質などに応じて適宜固定部位を決定することができる。固定様式・方法もまた、当業者が諸条件を考慮して適宜選択することができる。
【００５０】
１の具体例において、本発明の方法により展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡは、展開／伸長槽内の一部あるいは全部が平滑な表面へ固定される。展開／伸長槽内の表面の一部あるいは全部が平滑とは、光学顕微鏡あるいはその他顕微鏡観察にとって好ましい平滑な領域が展開／伸長槽内の一部領域あるいは全面である表面のことを意味し、展開／伸長槽内の表面の一部あるいは全部が平滑であることによって、展開／伸長槽内の表面自体からの信号の干渉が排除され、また染色体ＤＮＡからの信号の減衰を防ぐような表面のことを言う。また、このような表面は展開／伸長槽内の染色体ＤＮＡが展開あるいは伸長される表面全面であることが好ましいが、一部であってもよいということである。
【００５１】
さらなる具体例において、展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡは、展開／伸長槽内の網目状構造、繊維状構造、棒構造、あるいはこれらの混合構造に固定される。網目状構造、繊維状構造、棒構造、あるいはこれらの混合構造を有する展開／伸長槽内に染色体を固定することによって、染色体ＤＮＡが全長にわたってではなく、その一部で展開／伸長槽内で固定されるということを積極的に誘導するものである。これにより、用いた固定方法が染色体ＤＮＡを検査対象として変性するものであった場合においても、固定されていない染色体ＤＮＡ領域において検査をすることが出来る。これら構造の中にはポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル、デキストラン等によって例示される網目状構造、リニアーアクリルアミドなどによって例示される繊維状構造、あるいは、微細加工技術等によって展開／伸長槽内の平滑な表面上に作製されたガラスあるいは樹脂からなる造形物によって例示される棒構造であって、以下によって明らかにされる染色体ＤＮＡを固定するための修飾をうけたこれら構造等がある。
【００５２】
さらなる具体例において、展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡは、展開／伸長槽内の正電荷に帯電した表面あるいは構造に固定され、あるいは、二価金属イオン、金属錯体、ポリアミンからなる群より選択されるものを含む物質を介して負電荷に帯電した展開／伸長槽内の負電荷に帯電した表面あるいは構造に固定される。
【００５３】
さらなる具体例において、展開あるいは伸長された染色体ＤＮＡは、展開／伸長槽内の表面上あるいは構造上の核酸結合性を有する基による結合を介して展開／伸長槽内の表面あるいは構造に固定される。かかる基およびかかる基の展開／伸長槽内の表面あるいは構造への配置方法は、当業者が適宜選択して用いることができる。
【００５４】
また、染色体ＤＮＡに核酸をハイブリダイゼーションさせ、その核酸に導入されているリガンドと、基体にあらかじめ修飾してある受容体との結合を介して、展開・伸長した染色体を展開／伸長槽内の表面あるいは構造に固定することもできる。染色体ＤＮＡが繰り返し塩基配列のいずれの位置に、どのような核酸をハイブリダイゼーションさせるか、そして核酸にどのようなリガンドを導入するかは、染色体ＤＮＡの性質等を考慮して当業者が適宜決定しうるものである。
【００５５】
上記態様における「リガンド」とは、線維状基体のところで説明したリガンド（線維状基体上の受容体に結合する）とは異なり、展開／伸長槽内の表面上あるいは構造上の受容体に結合するものである。上記以外は、線維状基体のところの「リガンド」および「受容体」についての説明が、ここでもあてはまる。
【００５６】
さらに、上記具体例において、繰り返し塩基配列を有する染色体ＤＮＡであって、その繰り返し塩基配列に核酸をハイブリダイゼーションさせることも好ましい。
【００５７】
上記具体例における、染色体への核酸のハイブリダイゼーションは、展開・伸長前に行われても良く、展開・伸長後に行われてもよい。
【００５８】
また、染色体ＤＮＡのニックを始点とし、リガンドの修飾を受けた核酸塩基を合成基質として用いて合成された核酸中のリガンドと、展開／伸長槽内の表面あるいは構造にあらかじめ修飾してある受容体の結合を介して固定してもよい。この場合、核酸の合成、ならびにリガンドでの核酸の修飾は、展開・伸長前に行われても良く、展開・伸長後に行われてもよい。
【００５９】
上記態様におけるリガンドと受容体の結合は、ビオチンとストレプトアビジンの結合、ビオチンとアビジンの結合、アミノ基とアミノ基に対する共有結合性を有する反応基の結合、チオール基あるいはチオール基に対する共有結合性を有する反応基の結合、金属錯体を介する結合、核酸を介する結合等により行われうる。
【００６０】
展開・伸長した染色体ＤＮＡは、様々な方法で分析出来る汎用性のある分析対象であるが、以下の方法によると、標識や識別の問題（詳細は後述の「本発明のまとめ」参照）を回避して、網羅的な染色体ＤＮＡ上の位置マッピングが可能となる。したがって、本発明は、かかるマッピング方法も包含する。
【００６１】
本発明のマッピング方法の１の具体例は、下記工程：
展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、一種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡの複数個の該繰り返し塩基配列の組について染色体ＤＮＡ上での相互の距離を計測し、
計測された距離の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法である。
【００６２】
この方法における繰り返し塩基配列は、巨視的には各染色体に一様に分布し、しかし観察方法の分解能に応じて、微視的には染色体の領域ごとに異なる特徴的な偏りを持った分布をしていることが好ましい。
【００６３】
また、ある一種類の繰り返し塩基配列をくり返されている要素からなる集合とみなしたとき、この集合の中に塩基配列に多形を有する要素が存在し、それらの多形の分類により、この上位の集合が下位の集合に分割される場合がある。この方法において対象とする繰り返し塩基配列は、上位の集合だけでなく、単一のあるいは複数の下位の集合を意味する場合も含まれる。
【００６４】
繰り返し塩基配列としてＡｌｕ配列を用いる場合、下記Ａｌｕ配列のコンセンサス配列において下線部分以外では少数の多形が確認されるのみである。このため、下線部分以外にハイブリダイゼーションする配列を有する核酸が、実際にＡｌｕ配列の各多形下位集合においてハイブリダイゼーションするかどうかは、その下位集合の塩基配列に左右されることになり、ハイブリダイゼーションの有無を決定することが非常に煩雑になる。さらに、少数の多形部位でハイブリダイゼーションミスマッチを起こす核酸は、ハイブリダイゼーションの成否を予測することが難しく、確実な染色体ＤＮＡ位置マッピングを困難にする。これとは逆に、下線部分ではコンセンサス配列以外は非常に高頻度に多形が確認されている。このため下線部分を含む塩基配列のいずれか、あるいはこれらの相補鎖配列を有する１種またはそれ以上の核酸を用いる場合、高能率にコンセンサス配列以外の多形下位集合に属する塩基配列へのハイブリダイゼーションを除外出来る。これにより、ハイブリダイゼーションの有無を決定することが容易になる。さらに、ハイブリダイゼーションの予測が容易になり、確実な染色体ＤＮＡ位置マッピングを可能にする。上記の関係はまたコンセンサス配列の相補鎖配列についても成立する。
【化１】
2008307020.tif 000002
【００６５】
また、観察方法の分解能を十分に発揮するため、繰り返し塩基配列に対する標識は繰り返し塩基配列の広い範囲にわたる広がりを持った信号を発するものではなく、観察方法の検出感度に応じて、十分に狭い信号を発するものであることが好ましい。ヒト染色体においては、数〜数十マイクロメートル前後の間隔で分布するＡｌｕ配列あるいはＬＩＮＥ−１配列が、観察方法として光学顕微鏡を用いた場合の好ましい繰り返し塩基配列として例示される。狭い信号を発する好ましい標識方法としては、蛍光色素で標識されている、アニーリング温度（Ｔｍ）が統一された、４〜２０個の少数種類のオリゴＤＮＡ（塩基数が２０〜５０残基のＤＮＡ鎖で、オリゴヌクレオチドとも呼ぶ）からなるオリゴＤＮＡ集合による標識が例示される。アニーリング温度の統一により、厳密な温度制御を行うことにより非特異的なハイブリダイゼーションを抑制することが出来る。このようなアニーリング温度の統一は、従来の塩基配列の広い範囲にわたる標識を行う多数のハイブリダイゼーション核酸の集合については作製が困難であった。このような少数種類のオリゴＤＮＡによる十分に有意な識別が可能な標識であれば、これを用いるほうが、より特異的検出が可能になり好ましい。幸い対象となる染色体ＤＮＡが細胞内環境から単離され、他の細胞内物質から隔離された状態で伸長されていることにより、観察方法の検出感度が向上している。このような、アニーリング温度（Ｔｍ）が統一された少数のオリゴＤＮＡの集合は検出可能である。
【００６６】
このような特異的である目的配列以外の染色体ＤＮＡとの結合の低減と、十分な検出感度という拮抗する条件を満たす条件をまとめると以下のようになる。即ち、繰り返し塩基配列にハイブリダイゼーションする核酸として、アニーリング温度の相違が約１０℃の範囲、好ましくは約７℃の範囲、さらに好ましくは５℃の範囲に収まるオリゴＤＮＡの集合であって、通常の１オリゴＤＮＡあたり１，２個の蛍光標識をしたオリゴＤＮＡの集合を蛍光顕微鏡観察に用いる場合、約１００種類以下が好ましい。これは、オリゴＤＮＡの染色体ＤＮＡ上での特異性を確保するため、１種類のオリゴＤＮＡあたり３０残基以上の長さを確保することが必要である。また光学顕微鏡の分解能を最大限利用するために、標識物は展開・伸長された染色体ＤＮＡ上で輝点として観察されることが好ましく、染色体ＤＮＡの上長さ５００ナノメートル以下が好ましい。前記両条件を満たすようにハイブリダイゼーションできるオリゴＤＮＡは片側のＤＮＡ鎖あたり５０個以下であり、両側を合わせた場合においても１００個以下である。従って種類においても１００種類以下ということになる。さらに好ましくは２０種類以下のオリゴＤＮＡを用いることで、特異的標識の目的を達成し、オリゴＤＮＡを作製を節約することが出来る。これらオリゴＤＮＡの換わりに、オリゴＰＮＡなど、一般にＤＮＡに対してハイブリダイゼーションする塩基数が２０〜５０残基である他のオリゴ核酸を用いてもよい。
【００６７】
上記の好ましい繰り返し塩基配列および標識方法を用いることにより、各染色体の広範囲にわたって、観察方法の分解能を十分に発揮する様態での検出を行うことが出来る。このようなマッピング方法を用いることにより、染色体上に生じた変異、例えば塩基配列の増幅あるいは欠失、また、染色体の一部交換に当たる転座等を、広範囲・高解像度で検出することが可能となる。
【００６８】
上記マッピングに使用する展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡはいずれの方法により展開あるいは伸長されたものであってもよい。染色体ＤＮＡの展開あるいは伸長方法の例としては、表面張力による溶液液面の掃引（Wiegant J., et al., Hum Mol Genet 1:587-591(1992)参照）、重力や遠心力による溶液液面の掃引・流動（特願２００６−１５７４２０参照）、送液による流動、電気泳動、電気浸透流などが挙げられる。上記マッピングに使用する展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡは、好ましくは、本発明の線維状基体から、本発明の方法により展開・伸長されたものである。さらに好ましくは、展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡは、本発明の線維状基体から送液流、電気浸透流または電気泳動法により展開・伸長されたものである。
【００６９】
染色体中の繰り返し塩基配列は一種類であってもよいが、複数種類であるほうがマッピングを行う上で情報量が多くなり、マッピングの誤判定を低下させ、また、マッピングする対象塩基配列の解像度も向上することになるという点から好ましい。染色体の繰り返し塩基配列にハイブリダイゼーションする核酸に付される標識物の種類および核酸への結合様式も特に限定されるものではない。標識物としては、例えば、光学顕微鏡を用いる場合には蛍光を発する物質、電子顕微鏡あるは原子間力顕微鏡を用いる場合には重金属コロイド粒子等が挙げられる。蛍光を発する物質としては、蛍光を発する分子（例えば、Fluorescein、Rhodamine、Texas Red、Cy3、Cy5）コロイド粒子（例えば、Quantum Dot、ポリスチレン蛍光ビーズ）、蛍光を発するタンパク質（例えば、ＧＦＰ、DsRed）などが有用であるが、これらに限るものではない。染色体中の繰り返し塩基配列が複数の場合、標識物は繰り返し塩基配列を種類特異的に識別できるものであってもよく、あるいは識別できないものであってもよい。
【００７０】
標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡの複数個の該繰り返し塩基配列の組について染色体ＤＮＡ上での相互の距離を計測することができ、計測された距離の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定することができる。繰り返し塩基配列の種類特異的に識別できるあるいは識別できない標識物を用いる場合にも、複数個からなり複数種類の繰り返し塩基配列を含む繰り返し塩基配列の組について相互の距離を計測することができ、計測された距離、また、識別できる場合においてはその識別内容の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定することができる。
【００７１】
したがって、上記具体例の好ましい実施態様の一例は、下記工程：
展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、複数種類の繰り返し塩基配列に対して核酸をハイブリダイゼーションし、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている、繰り返し塩基配列の種類特異的に識別できるあるいは識別できない標識物を用いることにより、複数個からなり複数種類の繰り返し塩基配列を含む繰り返し塩基配列の組について相互の距離を計測し、
計測された距離、また、識別できる場合においてはその識別内容の特徴に基づき、該組みおよび該組に含まれる該繰り返し塩基配列の染色体上の領域あるいは位置を決定する
を含む、染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法である。
【００７２】
上記染色体ＤＮＡ位置マッピングは一つの装置で全てを行うことが出来るものではなく、その作業工程上必須の要素として、
（１）伸長した染色体ＤＮＡを搭載し、その繰り返し塩基配列について標識物を可視化する観察装置、
（２）観察画像の撮影装置、
（３）撮影画像から繰り返し塩基配列の位置を抽出し、繰り返し塩基配列の位置の組について相互の距離を計測し、ゲノム塩基配列データベース情報あるいは該情報から抽出した情報と照合する計算装置
を含み（１）〜（２）間で光学的に（２）〜（３）間で電気的に連結して使用する装置システムとして運用することが好ましい。
【００７３】
本明細書において、「繰り返し塩基配列」とは、繰り返し塩基配列そのものだけではなく、複数の繰り返し塩基配列が隣接している場合、それら複数の繰り返し塩基配列にまたがる塩基配列である場合や、繰り返し塩基配列の一部の塩基配列である場合、も含むものである。また、本明細書において、「ハイブリダイゼーションする一種類の塩基配列」、あるいは、単に「ハイブリダイゼーションする塩基配列」とは、一種類の塩基配列からなるものだけではなく、ハイブリダイゼーション現象固有の厳密でない塩基配列認識性向があることにより、ある一つの塩基配列に対して一定以上のハイブリダイゼーション活性を有する複数種類の塩基配列を含むものであって、同じ長さの任意塩基配列の集合において、０．１％以下の構成要素がハイブリダイゼーションする特異性を持った塩基配列を含むものとする。
【００７４】
染色体中の繰り返し塩基配列はいずれの配列であってもよいが、利用目的に応じて好ましい配列に分類することが出来る。即ちリガンドと受容体の結合を利用して線維状基体に染色体を固定する場合においては、繰り返し塩基配列が各染色体の一部の領域に偏って分布することが好ましく、その偏った一部にある繰り返し塩基配列においてリガンドと受容体を結合することにより、染色体ＤＮＡはその偏った一部で線維状基体に固定されるということが好ましい。これにより、線維状基体から染色体ＤＮＡの展開・伸長を行う場合において、展開・伸長されるＤＮＡが広範囲にわたることになる。このような偏った一部で固定できる繰り返し塩基配列としては、染色体末端領域のテロメア配列、あるいは分裂期染色体の動原体が形成されるセントロメア領域のセントロメア配列（あるいはアルファサテライト配列ともいう）などが例示される。一方、展開／伸長槽内において展開・伸長した状態で染色体ＤＮＡをリガンドと受容体の結合を利用して固定する場合、あるいは、繰り返し塩基配列の特徴を利用して染色体ＤＮＡ上の位置マッピングを行う場合においては、繰り返し塩基配列が各染色体に一様に分布することが好ましく、その一様に分布する繰り返し塩基配列においてリガンドと受容体を結合することにより、染色体ＤＮＡは一様に展開／伸長槽内にある表面あるいは構造に固定できる、あるいは、染色体ＤＮＡは広範囲にわたりマッピングすることが出来るという好ましい効果を生じる。このような一様な分布を有する繰り返し塩基配列として、染色体がヒト由来のものである場合において好ましい繰り返し塩基配列は、Ａｌｕ配列、ＬＩＮＥ−１配列などが例示される。
【００７５】
上記の染色体ＤＮＡ位置マッピング方法の、もう１つの具体例において、標識対象をメチル化シトシンとして、メチル化シトシンに結合活性があるタンパク質を用いて、染色体ＤＮＡの修飾を分析することが出来る。すなわち、本発明は、下記工程：
展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡにおいて、メチル化シトシンに結合活性があるタンパク質を加え結合させ、
該タンパク質に導入されている標識物を用いることにより、染色体ＤＮＡのメチル化シトシンの位置を同定する
を含む、染色体ＤＮＡ上のメチル化シトシン位置マッピング方法も提供する。
【００７６】
上記のマッピング方法に使用する好ましい標識物は蛍光を発する物質である。かかる物質としては、蛍光を発する分子（例えば、Fluorescein、Rhodamine、Texas Red、Cy3、Cy5）コロイド粒子（例えば、Quantum Dot、ポリスチレン蛍光ビーズ）、蛍光を発するタンパク質（例えば、ＧＦＰ、DsRed）などが有用であるが、これらに限るものではない。
【００７７】
また、上記の方法であるいは他の方法で染色体ＤＮＡ上の位置をマッピングされた染色体は、これを比較対象・参照対象として、この染色体ＤＮＡとは由来の異なる試料核酸をハイブリダイゼーションすることにより、その組成についての情報を取得することができる。かかる組成分析方法の具体例としては以下の方法がある。即ち、本発明は、下記工程：
生体試料から抽出した複数種類の核酸からなる核酸の混合物、それらを断片化した核酸の混合物、それらを鋳型として量を増幅した核酸の混合物、それらの断片化と増幅の両方を行った核酸の混合物のいずれか１つの核酸の混合物を用意し、
展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡをハイブリダイゼーションを受ける核酸とし、前記用意した核酸の混合物をハイブリダイゼーションする核酸とし、ハイブリダイゼーションをおこない、
ハイブリダイゼーションした核酸に導入されている標識物を用いることにより、前記用意した核酸の混合物に含まれていた核酸の種類の判別、相対含有量の計測を行う
を含む、試料に含まれる核酸混合物の組成分析方法を提供する。
【００７８】
種類の判別においては、この組成分析操作の前後あるいは同時に行うことが出来る上記位置マッピング方法によるマッピングによって決定される、ハイブリダイゼーションする染色体ＤＮＡの位置から前記生体試料から抽出した複数種類の核酸由来の混合物のそれぞれの種類を判別することができる。相対含有量の計測においては、含有量の相対値を得るために計測対象となっている生体試料から抽出した核酸の混合物とは別に、既に組成が明らかになっている、あるいは、再現性が確認されている参照核酸の混合物を用いた同様の計測との比較において、相対含有量を計測するものである。好ましくは、前記計測したい生体試料から抽出した複数種類の核酸由来の混合物と、前記参照核酸の混合物とを同時にハイブリダイゼーションし、異なる標識によってこれら２つの混合物を識別し、両者の相対量を比較することを行うものである。
【００７９】
上記の核酸混合物の組成分析方法に使用する展開あるいは伸長した染色体ＤＮＡはいずれの方法により展開あるいは伸長されたものであってもよいが、好ましくは、本発明の線維状基体から展開・伸長されたものである。
【００８０】
上記の核酸混合物の組成分析方法に使用する好ましい標識物は蛍光を発する物質である。蛍光を発する物質についてはマッピング方法のところの説明があてはまる。
【００８１】
最後に、展開・伸長を容易にする関連技術を開示する。染色体を溶液槽中で線維状基体に結合させると、一般に溶液槽にも染色体が非特異的吸着を起こすことになる。この状態で染色体ＤＮＡの展開・伸長を行うと、線維状基体からだけでなく、溶液槽壁面から染色体ＤＮＡが展開、伸長、あるいは浮遊し、結果として、分析に適した形態に展開・伸長した配置とすることが出来ない。
【００８２】
本発明においては、これを回避するために、染色体を線維状基体に結合させる溶液槽と、染色体を展開・伸長する溶液槽の二つの溶液槽に分け、染色体を線維状基体に結合させる溶液槽において染色体を結合させた後、染色体を結合した線維状基体を展開／伸長槽に転載し、染色体を展開・伸長することとした。しかし、この転載の際、溶液から線維状基体を取り出すと乾燥や表面張力により染色体が損傷を受けることになる。これを回避するため、二つの溶液槽の間で溶液の一体化と分離が出来き、分離状態で染色体の結合や染色体の展開・伸長を行い、一体化した状態で線維状基体の転載が出来るようにすることとした。
【００８３】
これを具現化するために本発明では二つの溶液槽を組み合わせて使用することとした。即ち、本発明は、染色体を結合した線維状基体を浸漬した溶液槽と、該線維状基体を浸漬していない溶液槽との二つの溶液槽からなる組であって、溶液に浸漬した状態のままで該染色体を結合した線維状基体が一方の溶液槽から他方の溶液槽に転載されるものであり、溶液の一体化と分離を行う方法を提供する。ここで溶液槽とは、溶液を保持できる機能を有する構造体であり、以下に開示する通り必ずしも凹型のくぼみを形成して溜める構造に限るものではない。
【００８４】
二つの溶液槽の組において好ましい例として、まず取り上げるのは、図８-aにあるような染色体結合槽と展開／伸長槽を一体化・分離ができる隔壁を有する溶液槽がある。この隔壁により、染色体を線維状基体に結合させる処理と、染色体を線維状基体から展開・伸長を行う処理を別の溶液槽で行うことが出来、また、両溶液槽の移動に際しては、染色体を結合させた線維状基体を乾燥させることがない。
【００８５】
二つの溶液槽間の転載の際、線維状基体に結合した染色体が損傷を避けるもう一つの好ましい例としては、線維状基体、および、該線維状基体の一部を浸漬した液滴を表面張力により保持した一枚あるいは複数枚の板状構造体が一体となって、線維状基体を乾燥させることなく、二つの溶液槽間で移動するものである。図８-bは、液滴保持ピンセットという形態をとる二枚の板状構造体で、この操作をおこなう工程を示したものである。
【００８６】
本発明の二つの溶液槽の組においてさらに好ましい例として、一方あるいは両方の溶液槽が、疎水領域に囲まれた親水領域を含む表面を有するものを挙げることができる。図９-aを参照。この場合において溶液槽は、平滑な表面として形成し、この平滑な表面の疎水領域に囲まれた親水領域に溶液を突出する形態で保持することが可能である。これにより、この平滑な表面に保持された液体は、他方の溶液槽の壁面に接することなく、他方の溶液槽の中の溶液と一体化および分離を行うことが出来る。また、線維状基体は、曲げることなく、その一部を親水領域の溶液内に浸漬し、他の一部を疎水領域の溶液外に露出させることが出来る。そこで、この露出部分を溶液内に浸漬されている一部を汚染することなく、線維状基体の移動・操作のハンドルとして用いることが出来る。特に好ましくは、線維状基体の両端領域が溶液外に露出し、移動・操作のハンドルとして用いることが出来る場合である。
【００８７】
上で説明した本発明の二つの溶液槽の組において、一方の溶液槽が、本発明の染色体を結合させた線維状基体を作製するための溶液槽であって、本発明の線維状基体の一部あるいは全体を、可逆あるいは不可逆に、把持あるいは固着する要素を有する溶液槽であり、他方の溶液槽が、本発明の染色体ＤＮＡを展開あるいは伸長するための方法を実施するための溶液槽であって、線維状基体の一部あるいは全体が取り付けあるいは取り外し可能な状態で把持あるいは固着されるものである溶液槽であることが好ましい。特に好ましい例としては、線維状基体の両端領域において取り付けあるいは取り外し可能な状態で溶液槽構造物に把持されている場合であり、あるいは、また線維状基体の全長にわたり、その一面が取り付けあるいは取り外し可能な状態で溶液槽底面に固着されている場合である。
【００８８】
展開／伸長槽は電気浸透流あるいは電気泳動を利用して染色体を展開・伸長するためのものである。さらに好ましくは、該泳動槽は電気浸透流を利用して染色体を展開・伸長するためのものである。該泳動槽は電気泳動槽の形態であるのが一般的である。該装置の基板、特に電場をかけた「泳動槽」の底面は負に帯電した材料からできていることが好ましい。かかる材料としてはガラスが例示され、顕微鏡用のスライドグラス等を基板として利用してもよい。
【００８９】
かかる二つの溶液槽の組の具体例を説明する。図８（ｂ）参照。染色体を含む液８０２（図８（ｂ）では染色体をＸ字様構造で示す）を、二つの板を有する板状構造体８１３間に把持された線維状基体８０４に加え、表面張力で二つの板を有する板状構造体８１３間に保有されている染色体液８０２において染色体を線維状基体に結合させる。この際、二つの板を有する板状構造体８１３にも染色体は吸着する。結合しなかった染色体を溶液から取り除くため、二つの板を有する板状構造体８１３間に保有されている染色体液８０２に洗浄液を流し込み置換する。染色体を結合したガラス線維８０４を二つの板を有する板状構造体８１３に挟まれた状態で、展開／伸長槽に浸漬する。この状態で二つの板を有する板状構造体８１３を取り除き、線維状基体の把持を展開／伸長槽に移す、あるいは、線維状基体を展開／伸長槽の底面に固着させる。この状態で基体８０８のみに染色体が結合して残る。染色体の除蛋白処理を行い、染色体ＤＮＡを凝集状態から開放する。この除蛋白処理の際、高温による置換溶液８０２の蒸発を防止するために密閉蓋を被せてもよい。密閉蓋がある場合にはこれを取り、基体８０８の両側の置換溶液８０２に正負電極８１２を接続し、電源８１０に繋ぎ、電気浸透流により、除蛋白された染色体ＤＮＡを展開・伸長させる。
【００９０】
かかる二つの溶液槽の組のさらなる具体例を説明する。図９参照。染色体を含む液９０２（図９では染色体をＸ字様構造で示す）を線維状基体９０４に加え、染色体を結合させる。ガラス基板９０５は予め中央領域より外に染色体液が広がらないよう、その周辺領域に疎水性表面処理を施しておくことが好ましい。基体９０４に染色体液９０２を添加した結果、ガラス基板９０５の中央領域にも染色体が吸着する。基体９０４との結合反応の終了後、染色体液９０２中に浮遊状態で留まっていた染色体を置換溶液９０２で洗い落とす。洗い落とした後も、ガラス基板９０５の中央領域は置換溶液９０２にて満たす。枠９０３によって生じる間隔を隔てて、置換溶液９０２と基体９０４を挟んだ状態で、ガラス基板９０５とガラス基板９０１とを対面させる。ガラス基板９０１は、ガラス基板９０５と同様、中央領域より外に染色体液が広がらないよう、その周辺領域に疎水性表面処理を施しておくことが好ましい。対面後、ガラス基板９０１に基体９０４と置換溶液９０２を転載する形でガラス基板９０５を取り除く。この状態で基体９０４のみに染色体が結合して残る。染色体の除蛋白処理を行い、染色体ＤＮＡを凝集状態から開放する。この除蛋白処理の際、高温による置換溶液９０２の蒸発を防止するために密閉蓋９０６を被せてもよい。密閉蓋９０６を取り、基体９０４の両側の置換溶液９０２に正負電極９０８を接続し、電源９０７に繋ぎ、電気浸透流により、除蛋白された染色体ＤＮＡを展開・伸長させる。
【００９１】
線維状基体の修飾については、受容体にて修飾した領域が受容体にて修飾していない領域によって隔離された状態で複数配置されている本発明の線維状基体が好ましいものであるが、本発明は、かかる線維状基体の製造方法も提供する。該方法は、下記工程：
線維状基体を平滑な表面を有する樹脂層の表面近傍に包埋し、
該樹脂表面に沿って線維状基体に交差する方向に複数本の切削を行い、線維状基体の複数個所で基体面を露出し、
切削によって露出していない基体面を樹脂層により受容体修飾から保護し、切削によって露出した基体面に受容体の修飾をおこない、
線維状基体を樹脂層から解放する、
を含む方法である。図１参照。
【００９２】
本発明の上記方法、あるいは装置、あるいはキットを用いて展開・伸長された染色体を染色体標本として用いてもよい。かかる標本を、疾病と遺伝子異常の関連性を示す標準として用いて、疾病の診断を行うこともできる。例えば疾病を有する検体から得た染色体ＤＮＡと健常者の検体から得た染色体ＤＮＡを並行して伸長することにより、両者の遺伝子やタグ配列位置の変異をより明瞭に発見することが出来る。また健常者検体から得た染色体ＤＮＡを伸長した標本に、断片化した疾病を有する検体から得た染色体ＤＮＡ由来であって、これを断片化し標識されたＤＮＡをこの標本にハイブリダイゼーションを行うことによって、ＣＧＨと同様の染色体ＤＮＡ量検定をおこなうことも出来る。
【００９３】
さらに本発明は、上記線維状基体および泳動槽のいずれかまたは両方を必須として含む、染色体解析用キットを提供する。通常、キットには取扱説明書を添付する。
【００９４】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００９５】
実施例１  染色体特異的結合活性がある線維状基体
染色体を結合させる線維状基体の一つの好ましい具体例として、標識された染色体部位特異的な結合活性を有するガラス線維の作製方法について述べる。
【００９６】
染色体結合活性があるガラス線維として、線維表面に一様に結合活性があるガラス線維と線維表面の分離した狭い領域に等間隔に結合活性があるガラス線維を作製した。ガラス線維上の結合活性はストレプトアビジンが担い、これに染色体上に標識したビオチンが結合するものである。
【００９７】
一様に結合活性があるガラス線維
ガラス線維（直径約６マイクロメートル：ユニチカ製  ＤＥ１５０Ｇ  １／０−０．７Ｚ）をあらかじめジクロロジメチルシラン（ＷＡＫＯ製）処理を施しアミノシランの結合性を阻害したガラス基板上に両端を接着剤で留めて、ガラス基板に平行に配置した。ガラス基板に１％（ｖ／ｖ）アミノシラン水溶液（サイラエース  Ｓ３３０：チッソ製）、リン酸緩衝液に溶解した１００μｇ／ｍｌアミノ基ビオチン化剤（Ｂｉｏｔｉｎ‐ＡＣ５‐Ｓｕｌｆｏ‐ＯＳｕ：ＤＯＪＩＮＤＯ製）、リン酸緩衝液に溶解した１０μｇ／ｍｌストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ製）を順次加えた。各試薬を添加後３０分間放置して、その後試薬を溶解している溶媒で洗うことによって反応しなかった試薬を取り除き、次の試薬を加えた。最後の洗浄の後は蒸留水で洗い乾燥した。
【００９８】
分離した狭い領域に等間隔に結合活性があるガラス線維
上記ガラス線維を作製する各工程を図１に示した。複数のガラス線維１０１をガラス基板１０３上に両端を接着剤１０２で留めて、互いに平行になるように配置する。ガラス基板１０３に２−ブタノールに溶解した７．５％（ｖ／ｖ）ＰＶＢ（ポリビニルブチラール）樹脂を５００ｒｐｍで３０秒間スピンコートし、ガラス線維１０１をＰＶＢ樹脂の包埋剤層１０４に包埋した。加重１５〜３０ｇを加えた鋭利な切削刃１０５でＰＶＢ樹脂１０４を切削した。切削は切削線が５０ミクロン間隔で互いに平行で、包埋されているガラス線維１０１に直交するように行った。これにより出来た切削溝１０６のガラス線維部分に幅１〜１０ミクロンのガラス線維の露出面が現れた。この後、一様に結合活性があるガラス線維の場合と同様のアミノシラン処理、ビオチン化処理、ストレプトアビジン修飾を順次行った（図１の１０７はこれら受容体処理液を表す）。ストレプトアビジン処理後の洗浄が済んだガラス線維をエタノールで洗い、ＰＶＢ樹脂を溶解し取り除き、ストレプトアビジン受容体で修飾されたガラス線維１０８をガラス基板から切り出した。図２は、以上工程により作製したガラス線維２０１が分離した狭い領域に等間隔にストレプトアビジン受容体を有することを確認した蛍光顕微鏡観察画像である。ストレプトアビジン修飾位置が確認できるようストレプトアビジンはＦＩＴＣ標識されているもの（Ｓｉｇｍａ製）を用いた。ガラス線維上に５０ミクロン間隔でＦＩＴＣの輝点状蛍光が確認された。これにより確かにガラス線維上にストレプトアビジン受容体は分離した狭い領域に等間隔に配置されていた。図３はストレプトアビジン受容体のビオチン結合活性を確認したものである。蛍光標識を行っていないストレプトアビジンで修飾されたガラス線維３０１にリン酸緩衝液に溶解した１μｇ／ｍｌＦＩＴＣ標識されたビオチン（Ｓｉｇｍａ製）を加え、結合活性の確認を行った。図３は未結合のＦＩＴＣ標識ビオチンをリン酸緩衝液で洗いとった後、観察したものである。やはり、ガラス線維上に５０ミクロン間隔でＦＩＴＣの輝点状蛍光が確認された。これによりガラス線維上にストレプトアビジン受容体はビオチン活性を有することが確認できた。図２、３では、ガラス線維の位置を示すため明視野像を蛍光像に重ねてある。
【００９９】
分離した狭い領域に等間隔に結合活性があり、かつ、それ以外の領域において非特異吸着を阻害するガラス線維
ガラス線維をあらかじめジクロロジメチルシラン処理を施しアミノシランの結合性を阻害したガラス基板上に両端を接着剤で留めて、ガラス基板に平行に配置した。ガラス基板に１％（ｖ／ｖ）アミノシラン水溶液、リン酸緩衝液に溶解した１００μｇ／ｍｌのジスルフィド結合を有する二価アミノ基架橋剤ＤＰＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ製）、リン酸緩衝液に溶解した１ｍＭのジスルフィド結合還元剤ＤＴＴ、リン酸緩衝液に溶解した１００μｇ／ｍｌのチオール基修飾活性のある金属錯体配位子Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ‐Ｃ（３）‐ＮＴＡ（ＤＯＪＩＮＤＯ製）を順次加えた。各試薬を添加後３０分間放置して、その後試薬を溶解している溶媒で洗うことによって反応しなかった試薬を取り除き、次の試薬を加えた。最後の洗浄の後は蒸留水で洗い乾燥した。以上により、一様に金属錯体配位子ＮＴＡが結合したガラス線維を作製した。この後「分離した狭い領域に等間隔に結合活性があるガラス線維」の場合と同様のＰＶＢ樹脂包埋、等間隔の切削を行い、樹脂および前記修飾をおこなった金属錯体配位子を引き剥がし新鮮なガラス面を露出させた。次にアミノシラン処理、ビオチン化処理、ストレプトアビジン修飾を順次行った。ストレプトアビジン処理後の洗浄が済んだガラス線維をエタノールで洗い、ＰＶＢ樹脂を溶解し取り除いた。以上の工程でストレプトアビジンがガラス線維上分離した狭い領域に等間隔に配置された。ＰＶＢ樹脂の溶解によって再び露出したガラス線維上の金属錯体配位子を修飾するためにリン酸緩衝液に溶解した１００μＭの塩化ニッケル（ＩＩ）を加え、つぎにリン酸緩衝液に溶解した１００μｇ／ｍｌの６連のヒスチジンタグを有する蛍光タンパク質ＧＦＰを加えた。この工程によりストレプトアビジン修飾されていない領域において非特異吸着を阻害するＧＦＰが結合したガラス線維が製造された。ガラス線維は、リガンドとしてビオチンを有する染色体をそのストレプトアビジン領域において結合した後、それ以外のＧＦＰ領域に非特異吸着した染色体を、リン酸緩衝液に溶解した１００μｇ／ｍｌイミダゾール液を加えヒスチイジンタグで固定されているＧＦＰを解離することにより、共に解離させた。
【実施例２】
【０１００】
ガラス線維への染色体結合（ハイブリダイゼーション）
染色体は、２００ｎｇ／ｍｌコルセミドを含む培養液で分裂期中期に同調した子宮頸部由来上皮細胞の培養株細胞であるＨｅＬａ細胞より抽出し、酢酸／メタノール固定液にて保存したものを用いた。染色体に変性条件下での相補鎖ハイブリダイゼーションによりビオチン標識を行った。ビオチン標識された染色体はこの後、ストレプトアビジン修飾されたガラス線維に加え、ビオチン・ストレプトアビジン結合を利用して両者を結合させた。
【０１０１】
染色体のビオチン標識は染色体の末端領域にあるテロメア配列に対する相補鎖のハイブリダイゼーションによって行う。以下のビオチン基を３’末端に有し、二本鎖架橋剤であるソラーレンを５’末端に有する合成オリゴヌクレオチドを用意した。
Psolaren-5'TAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTA3'（配列番号：１）-Biotin
Psolaren-5'TAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTA3'（配列番号：２）-Biotin
【０１０２】
ホルムアミドとＳＴＥ水溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を７：３に混合し、これにＨｅＬａ細胞約百万個から抽出した分裂期染色体、上記２種類の合成オリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌを小容積量加え攪拌して１００マイクロリットルの溶液とした。７０℃で２分間加熱した後、直ちに０℃に冷却ＳＴＥ水溶液をさらに４０マイクロリットル加え３０分かけて３７℃まで再び温度を上げた。この操作によりビオチン標識合成オリゴヌクレオチドが染色体末端領域に取り込まれた。３７℃で１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＳＴＥ水溶液を加えて、遠心沈殿を３回行い、結合しなかったビオチン標識合成オリゴヌクレオチを洗い落とした。最後の遠心沈殿物を１００マイクロリットルのＳＴＥ水溶液に懸濁した。図４はソラーレンの代わりに蛍光基であるＦＩＴＣを５’末端に標識した合成オリゴヌクレオチドを用いて、染色体のテロメア配列にオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションしたことを確認したものである。溶液中でのＦＩＳＨ画像であるため、染色体４０１の輪郭は明瞭ではないが、染色体領域の端に輝点状（図３右において黒点で示されてる）のＦＩＴＣ標識すなわちテロメア４０２へのハイブリダイゼーション核酸の結合を確認した。図５はこの染色体をストレプトアビジン修飾されたガラス線維の加えたものである。中程度の強さの蛍光像で示されているＤＡＰＩ染色された染色体５０２の中でＦＩＴＣの輝点状の強い蛍光像で示されるビオチン標識５０３が弱い自家蛍光による像で示されるガラス線維５０１上に結合していることが確認できる。ハイブリダイゼーション核酸の結合処理を行っていない染色体はこのようなガラス線維への結合は見られなかった。
【実施例３】
【０１０３】
ガラス線維への染色体末端の固定（酵素反応）
分裂期中期に同調培養したＨｅＬａ細胞より抽出した染色体を用いた。染色体ＤＮＡ末端領域６０１にあるテロメア配列の３’端は短い突出一本鎖（数百ｂｐ）であることが知られている（Vladimir L. Makarov他、Cell 88:657-666 1997）。これに対する非変性ハイブリダイゼーションを行い。末端修飾を行う。非変性ハイブリダイゼーションを行うのは、変性ハイブリダイゼーションにおいては染色体の不可逆な変性が染色体ＤＮＡ伸長に対して抑制的に作用するのであるが、これを改善するためである。しかしこの短いテロメア一本鎖配列ではハイブリダイゼーションによる染色体末端結合標識には十分でない。そこで図６にある生合成による末端修飾を行うことにした。非変性ハイブリダイゼーションを行ったオリゴヌクレオチドをプライマー６０４とし、一部ビオチン基修飾されている核酸塩基６０５を基質とし、ＤＮＡ複製酵素６０７を用いた重合伸長反応を行い、ビオチン基を導入したＤＮＡの染色体ＤＮＡ上での伸長をおこなうことで、末端標識６０６を増幅することにした。
【０１０４】
染色体は実施例２同様ＨｅＬａ細胞から抽出した分裂期染色体であるが、抽出に際して染色体はテロメア一本鎖に結合しているタンパク質を選択的に取り除くために、一本鎖と同じ塩基配列である下記の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド６０３を用いた。
5'TTAGGGTTAGGG3'（配列番号：３）
【０１０５】
テロメア一本鎖結合タンパク質ＰＯＴ１６０２は核内平衡状態での置換半減期は１２８秒であるので（Karin A. Mattern他、Mol Cell Biol 24:5587-5594、2004）、上記オリゴヌクレオチド６０３を過剰（細胞約百万個から抽出した分裂期染色体当たり１００ｐｍｏｌ）に加え、３７℃、３０分間染色体処理することでテロメア一本鎖結合タンパク質に競争的結合をさせ、染色体から取り除くことを行った。次にテロメア一本鎖配列に非変性ハイブリダイゼーションを行わせる下記のオリゴヌクレオチド６０４を用意した。
5'CCCTAACCCTAACCCTAA3'（配列番号：４）
【０１０６】
非変性バッファ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、９０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅＡ）に細胞約百万個から抽出した分裂期染色体と上記の合成オリゴヌクレオチド５ｐｍｏｌを小容積量加え攪拌し５０マイクロリットル溶液とした。４０℃で１２時間ハイブリダイゼーション反応を行った後氷冷下にもどし、０．５マイクロリットルの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．５マイクロリットルの１Ｍ  ＤＴＴ、０．５マイクロリットルの１ｍＭ  ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、０．５マイクロリットルの１ｍＭ  ｄＡＴＰ／ｄＧＴＰ／ｄＣＴＰミックス、１マイクロリットルの５Ｕ／μｌ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩを加え、１４℃で１時間プライマー・エクステンション反応を行った。再び氷冷下にもどし２マイクロリットルの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加え反応を停止した。未反応物を取り除くため、２００マイクロリットルのエタノールを加え攪拌後、遠心沈殿を行い、上清を捨て、さらに７０％エタノールで３回同様の遠心沈殿を行った。最後の沈殿物を１００マイクロリットルの前記のＳＴＥ水溶液に懸濁した。図７はビオチンの代わりに蛍光基であるＦＩＴＣを３’に標識した核酸塩基が反応基質として、染色体７０１内のテロメア配列７０２を出発点とする酵素反応による複製反応によって、導入されていることを蛍光顕微鏡により観察したものである。染色体導入時の複製反応の長短により蛍光強度は異なるが、染色体領域へ取り込まれている。
【実施例４】
【０１０７】
線維状基体に染色体を結合する際、線維状基体を収容する容器に染色体が非特異的吸着する。この染色体を残した状態で染色体の展開・伸長を行うと線維状基体だけでなく容器に吸着した染色体からもＤＮＡが展開・伸長されることになり問題である。これに対処するため、線維状基体に染色体を結合させた後、別の容器に移し替える必要がある。しかし、この移し替えの際、線維状基体に乾燥や溶液攪拌が生じると、線維状基体および結合染色体が破損・変性することになる。
【０１０８】
ガラス線維横断二槽セル
そこで図８（ａ）にある溶液槽を用いることにした。この溶液槽は隔壁８０５によって、染色体をガラス線維に結合させる処理を行う染色体結合槽８０１と、ガラス線維に結合した染色体を展開・伸長する処理を行う展開／伸長槽８０６に分かれている。先ず、染色体液８０２を染色体結合槽８０１に加え、染色体結合槽内で支持弓８０３によって支持されているガラス線維８０４に染色体を結合させた。その後溶液中に残った染色体を洗い取り、隔壁８０５を引き抜き、染色体結合槽８０１と展開／伸長槽８０６の溶液を一体化した。これにより、染色体を結合したガラス線維は溶液中から取り出すことなく、展開／伸長槽へ移動させることが出来る。隔壁８０５を元の位置に戻し、二つの溶液を分離し、展開／伸長槽内除タンパク処理を行った染色体８０９を準備した。次に展開／伸長槽に電源８１０につながれた電極８１２を配置し、電気浸透流にて展開・伸長した染色体８１１を得た。この際、展開／伸長槽内は染色体はガラス線維上にのみ結合しているので、展開／伸長槽に吸着した染色体からもＤＮＡが展開・伸長されることはない。
【０１０９】
液滴保持器具
上記のガラス線維横断二槽セルにおいて隔壁を取り除くことによって溶液の一体化・分離を行うことにより、線維状基体上の染色体の乾燥を防ぐことが出来た。別の好ましい乾燥防止方法として、液滴保持器具を用いる方法を取り上げることが出来る。即ち線維状基体、および、該線維状基体の一部を浸漬した液滴を表面張力により保持した一枚あるいは複数枚の板状構造体が一体となって、線維状基体を乾燥させることなく、二つの溶液槽間で移動するものである。図８（ｂ）は、液滴保持ピンセットという形態をとる二枚の板状構造体８１３で、この操作をおこなう工程を示したものである。さらに好ましい例としては、染色体の線維状基体への結合をこの板状構造体の上で行い、そのまま展開／伸長槽に浸漬する方法である。即ち、液滴保持ピンセットに挟み込んだ形で線維状基体を保持し、染色体液を液滴保持ピンセットの間に満たし、線維状基体を染色体液に浸漬する。結合せず浮遊している染色体を液滴保持ピンセットの間で洗い落としたあと、そのまま液滴保持ピンセットと共に線維状基体を展開／伸長槽に浸漬し、線維状基体が浸漬している状態を維持したままで、液滴保持ピンセットを取り除くというものである。
【０１１０】
ガラス線維対面転載セル
また、さらにガラス線維の染色体結合槽から展開／伸長槽への移動を、より円滑に行うことが出来る以下のガラス線維転載セルを作製した。
図９はガラス線維転載セルを模式的に表したものである。ガラス線維対面転載セルは、疎水領域によって囲まれた親水領域を有する二枚のガラス基板と、その間にスペーサーをガラス線維を配置した構成からなる。
【０１１１】
ガラス基板はまずジクロロジメチルシラン処理（クロロベンゼンに溶解した２％（ｖ／ｖ）  ジクロロジメチルシランへ３０分間浸漬）により一旦表面を疎水化した。次に方形の窓枠を有するマスクをガラス基板に被せ、ＵＶ照射（波長２５４ｎｍにおいて２８ｍＷ／ｃｍ２の強度の水銀灯光３０分間照射）により窓面のガラス基板のシラン層を分解し、方形の親水性表面を再生した。
【０１１２】
一枚目の方形の親水領域を有する染色体結合用ガラス基板９０５上に親水領域をまたぐ形でガラス線維９０４を固定し、この親水領域に染色体液９０２を加え、親水領域内のガラス線維に染色体を結合させた。このとき染色体液を穏やかに震盪し、ガラス線維への染色体の結合を促進した。結合しなかった染色体を洗い落とし、一枚目のガラス基板の親水領域に洗浄液が残っている状態で、二枚目の展開・伸長用ガラス基板９０１を方形の親水領域を互いに対面させる形で重ね、後から重ねたガラス基板９０１の親水領域にも溶液を付着させた。この際、二枚のガラス基板はスペーサー９０３を隔てることにより、直接にガラス線維に触れることを防いである。この状態で、一枚目９０５から二枚目９０１のガラス基板にガラス線維の固定を移し、一枚目のガラス基板９０５を引き離すと、二枚目のガラス基板９０１の親水領域をまたぐ形でガラス線維が固定された状態で、親水領域に洗浄液が残った。
【０１１３】
上記一連の操作により染色体が結合したガラス線維は、染色体の非特異吸着のない展開・伸長用ガラス基板に転載されることとなった。この状態で除タンパク処理を行った。展開・伸長用ガラス基板上の溶液は少量であるため、除タンパク処理過程での乾燥を防ぐため密閉蓋９０６を被せる場合がある。除タンパク後、電源９０７に接続された電極９０８からの電界により電気浸透流を惹起させ染色体を展開・伸長した。この際、展開・伸長用ガラス基板９０１に染色体の吸着はなく、ガラス線維からの展開・伸長に干渉することはない。
【実施例５】
【０１１４】
伸長染色体の流路
染色体ＤＮＡが伸長する場所である展開／伸長槽流路としては図１０にあるような種々形態が可能であるが、これに限るものではない。図１０の一つ目の例（図１０（ａ））では展開／伸長槽１００３に平坦面において、その両端に置かれた電極１００１およびこれに接続された電源１００２によってガラス線維１００５に結合した染色体ＤＮＡ１００４をそれに沿って泳動し、伸長状態を平坦面上で観察することが出来る。二つ目の例（図１０（ｂ））では、この平坦面上に伸長方向に沿って壁面１００６を平行に配置した平行流路を形成したものであり、この壁面によって分かたれたほかの流路に伸長染色体ＤＮＡが入り込み、絡み合うことを防ぐものである。三つ目の例（図１０（ｃ））は流路を蓋１００７で覆い、伸長過程にある染色体ＤＮＡが流路上側へ逸れていくことを防止する機能を付加したものである。四つ目の例（図１０（ｄ））では、流路が平行流路である場合に蓋１００８で覆った例である、五つ目の例（図１０（ｅ））平行流路であるが、平行壁面を蛇行させたもの１００９であり、伸長過程にある染色体ＤＮＡが壁面に接触し支持されることにより、染色体ＤＮＡに働く張力の分散をはかり、染色体ＤＮＡの切断を抑制するものである。伸長力分散の効果は、流路を壁面等で互いに隔離しない柱状構造物１０１０を複数有する流路（図１０（ｆ））や、三次元的網目状構造１０１１を有する流路（図１０（ｇ））にもある。図１０の例ではいずれも、染色体伸長のため電場を加え電気泳動／電気浸透流を惹起する構成となっているが、流路に一定の送液を行う構成に換えることも可能である。
【実施例６】
【０１１５】
染色体の展開・伸長
まず染色体からＤＮＡを解放するために除タンパク処理を行う。これは、実施例４におけるガラス線維対面転載セルにおける展開・伸長ガラス基板においてガラス線維をガラス基板上で、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、７．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．２ｍｇ／ｍｌ  ヘパリン，２０ｍＭ  ジチオスレイトール，０．７ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫを組成とする除タンパク液で４５℃、２時間処理を行った。この除タンパク処理に対して、染色体固定のためのストレプトアビジンとビオチンの結合は損なわれず、ガラス線維から染色体が遊離することはない。除タンパク後、ＤＮＡ蛍光染色液ＹＯ−ＰＲＯ−１を最終濃度２５０ｎＭとなるように加え、１〜５Ｖ／ｃｍの直流電界を加えて電気泳動を行った。あるいは電気浸透流では、除タンパク後、穏やかに除タンパク液を取り除き、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水を加える操作を５回行うことで、泳動溶液の脱塩を行い、ＤＮＡ蛍光染色液ＹＯ−ＰＲＯ−１存在下で１〜５Ｖ／ｃｍの直流電界を加えた。図１１は「実施例２」で用意したガラス線維１１０１に結合している除タンパク処理を行った染色体１１０２であり、図１２はこれに電界を加え電気浸透流を惹起し、ガラス線維１２０１から染色体ＤＮＡが伸長されていくところ１２０３である。一部伸長しない塊１２０２が確認できる。画面右手の明るい部分が付着した染色体ＤＮＡおよび自家蛍光により光を発するガラス線維であり、右側に伸びる微細な蛍光を発する線維が伸長した染色体ＤＮＡである。図１３は長距離にわたって伸長した染色体ＤＮＡを追った例である。
【０１１６】
図１４は「実施例３」において用意したガラス線維１４０１に結合している除タンパク処理を行った染色体１４０２であり、図１５はこれに電界を加え電気浸透流を惹起し、ガラス線維１５０１から染色体ＤＮＡが伸長されていくところ１５０２である。図１２と比較して塊は確認されなかった。以上の例はいずれもガラス線維からの染色体ＤＮＡの展開・伸長が良好に行われていることを示すものである。
【実施例７】
【０１１７】
伸長染色体ＤＮＡの繰り返し塩基配列を用いた染色体位置マッピング
分裂期中期に同調培養したＨｅＬａ細胞より抽出した染色体を用いた。染色体伸長は以下のような回転伸長方法（特願２００６−１５７４２０参照）を用いた。先ず、７０％エタノール水溶液に懸濁したＨｅＬａ細胞を２マイクロリットル（約２万個の細胞を含有）をガラス基板上に滴下し、直ちに１０マイクロリットルの前記除タンパク液を加えた。２分間放置後５００マイクロリットルのＭｉｌｌｉ‐Ｑ水を加えて、除蛋白され解放された染色体ＤＮＡを膨潤させた後、５０００ｒｐｍで３０秒間、ガラス基板を垂直な回転軸に対して水平回転させ、遠心力により流れ去る添加液の流動によって染色体ＤＮＡを伸長した。この回転は同時に添加液の除去、染色体ＤＮＡのガラス基板に伸長した状態での乾燥固定効果もある。７０％エタノール水溶液で表面に残留している除蛋白液成分を洗い流した後、６０℃で３０分間染色体ＤＮＡをガラス基板上で乾燥させた。なお上記染色体を滴下するガラス基板として、あらかじめ１０万倍希釈したアミノシラン溶液（サイラエースＳ３３０：チッソ製）で３０分処理したガラス基板を用いた。乾燥した染色体ＤＮＡを有するガラス基板表面に、下記塩基配列を有し、５’末端、３’末端それぞれに蛍光基Ｃｙ３を有するオリゴＤＮＡプローブをそれぞれ５０ｎＭを含有し、この他に、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有するハイブリダイゼーション溶液を１平方センチメートル当たり２００マイクロリットル加えた。
【０１１８】
Cy3-5'AGCCGGGCGTGGTGGCGCGCGCCTGTAATCCCA3' （配列番号：５）-Cy3
Cy3-5'GATTACAGGCGCGCGCCACCACGCCCGGCTAAT3' （配列番号：６）-Cy3
Cy3-5'GTTGCAGTGAGCCGAGATCGCGCCACTGCACTC3' （配列番号：７）-Cy3
Cy3-5'TGCAGTGGCGCGATCTCGGCTCACTGCAACCTC3' （配列番号：８）-Cy3
Cy3-5'GCCTGGGCGACAGAGCGAGACTCCGTCTCAAAA3' （配列番号：９）-Cy3
Cy3-5'TGAGACGGAGTCTCGCTCTGTCGCCCAGGCTG3' （配列番号：１０）-Cy3
【０１１９】
溶液が蒸発しガラス基板が乾燥しないよう、シリコンゴムの覆いでガラス基板を密閉した後、８０℃で２分間、４℃で１０分間、３７℃で１０分間とガラス基板の温度を変化させた。特に４℃で１０分間と３７℃で１０分間の間は３０分間一定の割合で温度を上昇させた。温度制御の後、３７℃の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する水溶液でガラス基板を洗浄した後、前記ＳＴＥ水溶液で洗浄を行い、５０ｎＭ  ＹＯ−ＰＲＯ−１を含むＳＴＥ水溶液を加えた。図１６は上記処理を行った伸長染色体ＤＮＡ１６０１の観蛍光観察画像である。染色体は右上一点での接着基点から基板上左下に伸長している。弱い蛍光像で示される線維状の染色体ＤＮＡ１６０１の上に分散している輝点状の強い蛍光像で示される、繰り返し塩基配列にハイブリダイゼーションした上記標識核酸プローブ１６０２が観察出来る。これら繰り返し塩基配列は染色体領域によって固有の分散状態を有するものであり、この特徴に基づき、観察している染色体領域を同定することが可能である。
【０１２０】
本発明のまとめ
展開・伸長された染色体は、例えば、ＦＩＳＨ染色においても高解像度観察を実現するものであり、従来技術と組み合わせた汎用な観察を約束する。しかし、通常のＦＩＳＨ染色においては、識別可能な染色色素数の制限により展開・伸長した染色体ＤＮＡの特性を十分に生かしきれないと言える。染色体ＤＮＡの広い範囲にわたって高解像度で一度に観察可能にするために、染色体ＤＮＡ各部分に対してそれぞれ特異的な標識方法を用意することが考えられる。しかし、この方法では例えば３Ｇｂの総塩基数を有するヒトゲノムを１００ｋｂの分解能で各部分の位置情報をマッピングする場合においては、３万箇所を標識し識別する必要が生じる。現状では、このような多種類の標識対象に対する高い識別能を有する標識・識別方法はない。
【０１２１】
一つの解決方法としては、染色体ＤＮＡの固有の特徴を利用することでる。即ち、染色体ＤＮＡ上には進化の途上で増幅・転移・変異を繰り返して出来た、共通あるいは類似の塩基配列が多数散在する。ヒトにおいてはこれら繰り返し塩基配列に対する標識を行うことが出来れば、多くの部分に標識を入れることが出来る。さらに、この繰り返し塩基配列の分布は一様ではなく、その分布の多様性は各部分の繰り返し塩基配列の固有な位置関係の特徴を有する。この繰り返し塩基配列の固有な位置関係の特徴を識別対象として注目すれば、染色体ＤＮＡ各部分に対する高い識別能を提供し、全体として染色体ＤＮＡ上の位置マッピング方法を提供することになる。
【０１２２】
上記のような染色体ＤＮＡの広い範囲にわたって高解像度で一度に観察可能にする、染色体ＤＮＡの展開・伸長から解析に至るまでの、方法を用いることで、染色体異常や多形について、高分解能で広範囲な種レベル、個体レベル、体内組織レベルで、網羅的・発見的な検査が可能になる。
【０１２３】
この大規模診断においては、検査薬が密に基板上に集積したチップ技術に比べた場合、以下の点で注目するに値する効果がある。即ち、
（１）検査薬を集積する必要がないので、比較して安価である。
（２）検査薬を集積するとその仕様が細分化され、複数目的に対して複数のチップを用意する必要があるが、比較して汎用性が高い。
【０１２４】
また、この方法により、他の方法によって染色体ＤＮＡの各部分の位置をマッピングされた染色体は、その上の塩基配列以外の情報を得ることが出来る。例えば、染色体ＤＮＡのメチル化部位塩基配列に対して、標識されたメチル化塩基配列結合タンパク質を加えることにより、染色体ＤＮＡ上での高分解能で広範囲にわたるメチル化を検出することが出来る。染色体ＤＮＡのメチル化は、個体発生や癌や老化現象に関与していることが、知られている重要な染色体修飾現象であるが、これまで染色体ＤＮＡの広範な領域にわたって、検出した例がないので、大変有効であると考えられる。
【０１２５】
メチル化を検出する方法は、染色体ＤＮＡ上の他の特徴を有する部分に対する結合活性があるタンパク質を結合させ、その特徴を検出するのにも同様に有用である。例えば、ニック部位、脱プリン部位、チミジン二量体などの染色体損傷部位、および、ミスマッチ部位などの複製・修復不全部位などの検出が挙げられる。
【０１２６】
上記方法により、あるいは、また他の方法により染色体ＤＮＡの各部分の位置をマッピングされた、本発明により展開・伸長した染色体ＤＮＡは、これを比較対象・参照対象として、この染色体ＤＮＡとは由来の異なる試料核酸をハイブリダイゼーションすることにより、その組成について情報を取得することができる。
【０１２７】
例えば、試料核酸として、比較対象・参照対象として展開・伸長されている染色体ＤＮＡとは異なる由来の染色体ＤＮＡ断片を加えて、ハイブリダイゼーションを行うと、先の述べたComparative Genome Hybridization法の高分解能化を実現することが出来る。
【０１２８】
さらに、染色体に含まれるヒストンタンパク質がメチル化アセチル化等の修飾を受けたクロマチンを免疫沈降法により回収し、このクロマチンに結合していた染色体ＤＮＡ断片を抽出し、その標識物を作製し、比較対象・参照対象としての展開・伸長した染色体にハイブリダイゼーションさせることが出来る。これはChIP法と呼ばれる修飾ヒストンの存在位置のゲノム上でのマッピングする方法を展開・伸長した染色体ＤＮＡに応用したものであるが、やはり広い範囲にわたって高解像度で一度に観察可能にする。
【０１２９】
また本発明は、展開・伸長を行わない場合においても有用である。通常、細胞には複数種類の染色体を含み、細胞から精製された段階では染色体はこれらの混合物である。種類特異的に結合性を有する上記線維状基体を用いて、特定の種類の染色体を結合することにすると、染色体の選別に有用である。また、先に述べたとおり、線維状基体に結合した染色体を試料としてではなく、比較対象・参照対象として試料ＤＮＡの組成についての情報を取得するために利用する場合、これら染色体の比較対象・参照対象としての再現性・模範性を維持するため、同一の細胞由来の同一種類の染色体を多量に管理することが必要となる。このような場合において、同一細胞由来で同一種類染色体を結合した線維状基体を多量に用意し管理保存することは有用である。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明は、損傷を抑えつつ染色体を展開し、染色体内部に埋もれた遺伝子を含めて広い範囲にわたって高解像度で染色体を解析するための手段・方法を提供するものである。それゆえ本発明は、染色体の大規模解析ならびに疾病の大規模診断を可能とするものである。さらに本発明は、展開・伸長された染色体標本の調製にも有用である。かかる標本は、疾病と遺伝子の異常との関係を示す標準として用いることができる。したがって、本発明は、生物資源調査、生物資源保存記録、エピジェネティクス研究、遺伝子機能研究、集団遺伝学研究などの基礎研究分野；ガン診断、先天性遺伝病診断、生活習慣病診断、テーラーメイド処方診断などの医療分野；ならびに品種改良、品種管理などの食品農業分野などにおいて利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、結合活性がある受容体が分離した狭い領域に等間隔に修飾されたガラス線維を作製する各工程を模式的に示したものである。
【図２】図２は「実施例１」においてストレプトアビジンに蛍光標識を施したガラス線維を蛍光顕微鏡で観察したものである。切削間隔に対応するストレプトアビジンの分布がガラス線維上に確認できる。ガラス線維の位置を示すために明視野像を蛍光像に重ねてある。
【図３】図３は「実施例１」の蛍光標識していないストレプトアビジンを有するガラス線維に、蛍光標識されたビオチンを加えたものを蛍光顕微鏡観察したものである。切削間隔に対応するビオチン結合活性あるストレプトアビジンの分布がガラス線維上に確認できる。ガラス線維の位置を示すために明視野像を蛍光像に重ねてある。
【図４】図４は「実施例２」においてビオチンの代わりに蛍光基FITCを5'に標識した合成オリゴヌクレオチドを用いて、染色体のテロメア配列にオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションしたことを確認したものである。
【図５】図５は図４のテロメア標識染色体を、一様にストレプトアビジンで修飾されたガラス線維に結合したものを蛍光顕微鏡観察したものである。FITCの輝点状の強い蛍光で示されるビオチン標識が、弱い自家蛍光像で示されるガラス線維上に結合していることが確認できる。
【図６】図６は「実施例３」において、ビオチン基が酵素反応によって、染色体テロメア配列へ反応基質と共に導入される過程を模式的に示したものである。
【図７】図７は、図６と同様の操作により、ビオチンの代わりに蛍光基FITCが反応基質と共に染色体テロメア配列へ導入されているのを蛍光顕微鏡観察により確認したものである。
【図８】図８は「実施例４」における、展開／伸長槽に対する染色体の非特異結合を防ぐためのガラス線維横断二槽セルおよび液滴保持器具について、これらを用いて非特異結合を防ぐ操作工程を示したものである。
【図９】図９は「実施例４」における、展開／伸長槽に対する染色体の非特異結合を防ぐためのガラス線維対面転載セルについて、これを用いて非特異結合を防ぐ操作工程を示したものである。
【図１０】図１０は、「実施例５」の線維状基体を用いた染色体ＤＮＡ伸長過程において用いる展開／伸長槽として、様々な流路を示したものである。
【図１１】図１１は「実施例２」（ハイブリダイゼーション）で用意したガラス線維に結合した染色体について、「実施例６」の操作に基づき除タンパク処理を行い、染色体ＤＮＡ全体の蛍光像を観察したものである。
【図１２】図１２は、「実施例２」（ハイブリダイゼーション）で用意したガラス線維に結合した染色体について、「実施例６」の操作に基づいた除タンパク、電気浸透流により、ガラス線維から染色体ＤＮＡが伸長されていく過程を、ＤＮＡの蛍光像として観察したものである。
【図１３】図１３は、図１２と同様の処理を行った染色体ＤＮＡについて、長距離にわたって伸長を追った蛍光観察画像である。
【図１４】図１４は「実施例３」（酵素反応）で用意したガラス線維に結合した染色体について、「実施例６」の操作に基づき除タンパク処理を行い、染色体ＤＮＡ全体の蛍光像を観察したものである。
【図１５】図１５は「実施例６」の操作に基づき（酵素反応）で用意したガラス線維に結合した染色体について、「実施例６」の操作に基づいた除タンパク、電気浸透流により、ガラス線維から染色体ＤＮＡが伸長されていく過程を、ＤＮＡの蛍光像として観察したものである。
【図１６】図１６は、「実施例７」の操作に基づきヒト由来株細胞から抽出した染色体ＤＮＡを伸長し、この伸長ＤＮＡの繰り返し塩基配列（Ａｌｕ配列）に対して蛍光標識されたプローブをハイブリダイゼーションし、蛍光顕微鏡観察したものである。弱い蛍光像で示される線維状の染色体ＤＮＡの上に、輝点状の強い蛍光像で示されるプローブが確認できる。
【符号の説明】
【０１３２】
１０１  ガラス線維
１０２  接着剤
１０３  ガラス基板
１０４  包埋剤層
１０５  切削刃
１０６  切削溝
１０７  受容体修飾液
１０８  受容体付きガラス線維
２０１  ガラス線維
３０１  ガラス線維
４０１  染色体
４０２  標識されたテロメア
５０１  ガラス線維
５０２  染色体
５０３  標識されたテロメア
６０１  染色体ＤＮＡ末端標識
６０２  ＰｏｔＩ
６０３  競争的結合性を有するオリゴヌクレオチド
６０４  プライマー
６０５  標識された核酸塩基
６０６  生合成で取り込まれた標識
６０７  ＤＮＡ複製酵素
７０１  染色体
７０２  標識されたテロメア
８０１  染色体結合槽
８０２  染色体液
８０３  支持弓
８０４  ガラス線維
８０５  隔壁
８０６  展開／伸長槽
８０７  染色体結合槽に吸着した染色体
８０８  線維状基体に結合した染色体
８０９  除タンパク処理された染色体
８１０  電源
８１１  展開・伸長された染色体
８１２  電極
８１３  板状構造体
９０１  展開・伸長用ガラス基板
９０２  染色体液
９０３  スペーサー
９０４  線維状基体
９０５  染色体結合用ガラス基板
９０６  密閉蓋
９０７  電源
９０８  電極
１００１  電極
１００２  電源
１００３  展開／伸長槽
１００４  染色体ＤＮＡ
１００５  ガラス線維
１００６  平行隔壁
１００７  平行隔壁の上の蓋
１００８  蛇行平行隔壁
１００９  柱状構造物
１０１０  三次元網目状構造物
１１０１  ガラス線維
１１０２  伸長する前の染色体
１２０１  ガラス線維
１２０２  伸長せず塊となった染色体
１２０３  伸長した染色体
１４０１  ガラス線維
１４０２  伸長する前の染色体
１５０１  ガラス線維
１５０２  伸長した染色体
１６０１  染色体
１６０２  繰り返し塩基配列核酸プローブ
【図１】
2008307020.tif 000003
【図２】
2008307020.tif 000004
【図３】
2008307020.tif 000005
【図４】
2008307020.tif 000006
【図５】
2008307020.tif 000007
【図６】
2008307020.tif 000008
【図７】
2008307020.tif 000009
【図８】
2008307020.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008307020.tif 000017
【図１６】
2008307020.tif 000018
【配列表】
2008307020000001.app