(57)【要約】【課題】アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのプライマーセット、プローブセット、方法及びキットを提供する。【解決手段】アセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）及びアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子で構成された群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーセット、アセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）及びアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ２）遺伝子で構成された群から選択された一つ以上の標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブセット、プローブセットが固定化されているマイクロアレイ、プローブセットを利用してアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測する方法及びプライマーセット及びプローブセットを含む、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのキット。【選択図】  図１
2008079604.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくともいずれか一つのオリゴヌクレオチドセット：
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｃ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号５の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号６の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｄ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号７の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号８の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｅ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号９の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１０の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｆ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
（ｇ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１３の少なくとも１０塩基長の連続したヌクレオチドの断片からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）遺伝子ならびにアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子からなる群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項２】
前記標的配列は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域のうち一つ以上であることを特徴とする請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項３】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
配列番号３で示されるヌクレオチドの配列上において、配列番号３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号４の配列上において、配列番号３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット
からなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含み、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域を増幅させるための請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項４】
配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号５の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号６の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号７の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号８の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含み、かつチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位を増幅させるための請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項５】
配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号９の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１０の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
配列番号１１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含み、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域を増幅させるための請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項６】
配列番号１３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットを含み、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域を増幅させるための請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項７】
配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号３及び配列番号４のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号７及び配列番号８のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号１１及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、および
配列番号１３及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、からなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含み、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域で構成された群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるための請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項８】
配列番号１及び配列番号２のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号３及び配列番号４のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号５及び配列番号６のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、配列番号７及び配列番号８のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、配列番号９及び配列番号１０のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号１１及び配列番号１２のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
配列番号１３及び配列番号１４のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
を含み、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域を増幅させるための請求項１、２および７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプライマーセット。
【請求項９】
配列番号１５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号１７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号１９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号２１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに
配列番号２３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブからなる群から選択され、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域で構成された群から選択された一つ以上の標的配列にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１０】
配列番号１６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号１８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号２０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号２２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、
配列番号２４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、をさらに有することを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１１】
配列番号１５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１２】
配列番号１７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１３】
配列番号１９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１４】
配列番号２１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１５】
配列番号２３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１６】
配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、
配列番号２３のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットを有し、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域で構成された群から選択された一つ以上の標的配列にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１７】
配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、
配列番号２３のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできることを特徴とする請求項９に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項１８】
請求項９ないし１７のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが固定化されている基板を持つマイクロアレイ。
【請求項１９】
試料を請求項９ないし１７のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットと接触させて、前記試料中の標的配列とプローブ配列とをハイブリダイゼーションさせるステップと、
前記プローブと試料中の標的配列間のハイブリダイゼーションの度合いを検出するステップと、を含むアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測する方法。
【請求項２０】
前記試料は、請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のプライマーセットをプライマーとし、血液または唾液から由来したＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを通じて得られたＰＣＲ産物を含むことを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的配列は、検出可能な標識物質で標識されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標識物質は、蛍光、燐光または放射性を発する物質であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記プローブセットは、マイクロアレイの基板上に固定化されていることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載のプライマーセット、及び請求項９ないし１７のうちいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのプライマーセット、プローブセット、方法及びキットに関するものであり、具体的には、アセトアルデヒド脱水素酵素２（ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２：ＡＬＤＨ２）、チトクロム（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ）Ｐ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）及びアルコール脱水素酵素（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ２：ＡＤＨ２）遺伝子で構成された群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーセット、前記標的配列に特異的にハイブリダイゼーションするプローブまたはプローブセット、前記プローブセットが固定化されているマイクロアレイ、前記プローブセットを利用してアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測する方法及び前記プライマーセット及びプローブセットを含む、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、酒の主成分であるアルコールは、体内で肝臓に存在するアルコール分解酵素（ＡＤＨ：ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）により宿酔誘発物質として知られたアセトアルデヒドに分解された後、アセトアルデヒド分解酵素（ＡＬＤＨ：Ａａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）により酢酸（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と水（Ｈ２Ｏ）とに分解されて体外に排出される。また、人間の肝細胞のミクロソームに存在するＣＹＰ２Ｅ１（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｅ１）は、エタノールとアセトアルデヒドとを酸化させる酵素であり、慢性的なアルコール摂取の場合に誘導されると知られており、アルコール代謝に重要な要因の一つとして指摘されている。
【０００３】
ＡＤＨ２遺伝子、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子及びＡＬＤＨ２遺伝子には、一塩基多型性（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＳＮＰ）が存在し、これを検出するために従来該当領域を増幅した後、制限酵素で切断する方法を行っていた。しかし、この方法は、１つの試料に対する４種の遺伝型を決定するが、それぞれ４回のＰＣＲ反応と４回の制限酵素反応とを行わねばならず、あらゆる解析を肉眼で確認して分析する短所があった。
【０００４】
また、従来技術として、ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  ＫｉｔとＣｙｃｌｅａｖｅ  ｈｕｍａｎ  ＡＬＤＨ２  Ｔｙｐｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ／Ｐｒｉｍｅｒ  Ｓｅｔ（ＴａＫａＲａ  Ｃｏｄｅ  ＣＹ４０３）とを組み合わせて、ＡＬＤＨ２遺伝子のエクソン１２に存在する４８７Ｇｌｕ（ＧＡＡ）→Ｌｙｓ（ＡＡＡ）のＳＮＰを検出している。このプローブ／プライマーセットにはＡＬＤＨ２の多型部分を含む領域を増幅させるためのプライマーセット、ＳＮＰを検出するための野生型検出用ＲＯＸ標識プローブと突然変異型検出用ＦＡＭ標識プローブとの混合液で構成されている。
【０００５】
前記のような従来技術によっても、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できるプライマーセットは開示されておらず。また、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できるプローブは開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できるプライマーセットを提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できるプローブセットを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、本発明のプローブセットが固定化されているマイクロアレイを提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記プライマーセットを利用してアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するための方法を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記プライマーセット及びプローブセットを含むアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、下記（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくともいずれか一つのオリゴヌクレオチドセット：
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｃ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号５の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号６の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｄ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号７の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号８の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｅ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号９の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１０の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｆ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
（ｇ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１３の少なくとも１０塩基長の連続したヌクレオチドの断片からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含み、かつアセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）遺伝子及びアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子からなる群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーセットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のプライマーセット及びプローブセットによれば、アルコール分解能と宿酔の耐性とを効率的に予測できる。
【００１３】
本発明の方法によれば、アルコール分解能と宿酔の耐性を高い特異性で予測できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の望ましい実施形態について詳細に説明する。アルコール分解代謝において主導的な役割を行う酵素であるＡＤＨ２の遺伝子の場合、典型的な遺伝子（ＡＬＤ２＊１）とは異なって、東洋人の一部は、活性の良い酵素を作る非典型的な遺伝子（ＡＨＤ２＊２）を持っている。このようなＡＤＨ２の遺伝子特性調査は、各個人が持っている遺伝的なアルコール分解能が分かり、各遺伝子類型別に飲酒能力をあらかじめ予測できるようにする。
【００１５】
アルコール分解代謝において補助的な役割を行い、エタノールにより発現が誘導される酵素であるチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１は、自身の遺伝子の５’調節部位に多形性が存在し、これら遺伝子の多形性によって、発現される酵素の量が決定される。ｃ１遺伝子は典型的な遺伝子であり、低い転写率を表す。しかし、非典型的なｃ２遺伝子は高い転写率を表し、多量の酵素を生成する。アルコールに対するＣＹＰ２Ｅ１のＫｍは１０ｍＭ程度であり、これはＡＤＨ２のＫｍに比べて１０倍高いレベルである。したがって、低いアルコール濃度では、ＣＹＰ２Ｅ１は全体アルコール酸化中の１０％のみを担当するが、高いアルコール濃度ではかなり多くの部分を担当すると知られている。
【００１６】
宿酔（いわゆる二日酔い）の原因物質であるアルデヒドを分解する主酵素であるＡＬＤＨ２の遺伝子の場合、典型的な遺伝子（ＡＬＤＨ２＊１）とは異なって、東洋人の一部は活性のない酵素を作る非典型的な遺伝子（ＡＬＤＨ２＊２）を持っている。このようなＡＬＤＨ２の遺伝子特性調査は、各個人が持っている遺伝的なアルデヒド分解能が分かり、各遺伝子類型別に宿酔程度をあらかじめ予測できるようにする。
【００１７】
本発明に係る「プライマー」とは、コピーしようという核酸ストランドに相補的な単一ストランドオリゴヌクレオチド配列をいい、プライマー延長産物の合成のための開始点として作用できる。前記プライマーの長さ及び配列は、延長産物の合成を始めるように許容せねばならない。望ましくは、前記プライマーの長さは約５〜５０ヌクレオチドである。具体的な長さ及び配列は、要求されるＤＮＡまたはＲＮＡ標的の複合度だけでなく、温度及びイオン強度のようなプライマー利用条件に依存する。
【００１８】
本発明は、下記（ａ）〜（ｎ）から選択される少なくともいずれか一つのオリゴヌクレオチド：
下記（ａ）〜（ｇ）から選択される少なくともいずれか一つのオリゴヌクレオチドセット：
（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｂ）配列番号３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号３の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｃ）配列番号５で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号５の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号６で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号６の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｄ）配列番号７で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号７の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号８で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号８の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｅ）配列番号９で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号９の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１０で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１０の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、
（ｆ）配列番号１１で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１１の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及び配列番号１２で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１２の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセット、ならびに
（ｇ）配列番号１３で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１３の少なくとも１０塩基長の連続したヌクレオチドの断片からなるオリゴヌクレオチド、及び配列番号１４で示されるヌクレオチド配列上において、配列番号１４の少なくとも１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドセットからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドセットを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素２（ＡＬＤＨ２）遺伝子、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１（ＣＹＰ２Ｅ１）遺伝子ならびにアルコール脱水素酵素２（ＡＤＨ２）遺伝子からなる群から選択された一つ以上の標的配列を増幅させるためのオリゴヌクレオチドプライマーセット。である。
【００１９】
本発明のプライマーセットは、アルコールを分解すると知られたＡＤＨ２とＣＹＰ２Ｅ１、宿酔の原因物質であるアルデヒドを分解させる主酵素であるＡＬＤＨ２の遺伝子特性に基づいて、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するために、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域、及びエクソンＩＸ領域を検出できる特異的プライマーセットを設計しているものである。設計したプライマーは、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域に特異的なプライマー２セット、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位に特異的なプライマー２セット、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域に特異的なプライマー２セット、及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域に特異的なプライマー１セットである。
【００２０】
本発明のプライマーセットを使用してＰＣＲする場合、増幅できる標的配列領域は、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域、及びエクソンＩＸ領域で構成される。
【００２１】
本発明のプライマーセットは、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するための配列で構成される。本発明のプライマーセットの好ましい一例は、下記表１に示す。
【００２２】
【表１】
2008079604.tif 000003
【００２３】
前記配列番号１及び２のプライマーセット及び配列番号３及び４のプライマーセットは、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域を増幅し、配列番号５及び６のプライマーセット及び配列番号７及び８のプライマーセットは、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位を増幅し、配列番号９及び１０のプライマーセット及び配列番号１１及び１２のプライマーセットは、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域を増幅し、配列番号１３及び１４のプライマーセットは、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域を増幅させる。
【００２４】
本明細書において、プライマーとして利用されたオリゴヌクレオチドはまたヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエートまたはペプチド核酸を含むことができるか、または挿入物質を含むことができる。
【００２５】
なお、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号１のオリゴヌクレオチドの塩基配列のうち、少なくとも１０塩基長さの連続した配列を有するものを意味する。したがって、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１の全配列を有するものであってもよい。
【００２６】
本発明はまた、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、配列番号１７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、配列番号１９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、配列番号２１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブ、ならびに配列番号２３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブからなる群から選択され、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域で構成された群から選択された一つ以上の標的配列にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００２７】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１６で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号１８で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号２０で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号２２で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、配列番号２４で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドで構成される群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドと、をさらに有するオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００２８】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１５で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１１番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００２９】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１７で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００３０】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１９で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットである。
【００３１】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号２１で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１２番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを含み、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００３２】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列上において、ヌクレオチド番号１３番目のヌクレオチドを含む１０塩基長の連続したオリゴヌクレオチド、及びその相補的オリゴヌクレオチドからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドを有し、かつアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００３３】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２３のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブとからなる群から選択された一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域で構成された群から選択された一つ以上の標的配列にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００３４】
本発明の一具体例は、本発明のプローブセットにおいて、配列番号１５のオリゴヌクレオチドを含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１７のオリゴヌクレオチドを含む、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号１９のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２１のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２３のオリゴヌクレオチドを含む、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブと、を含む、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域にハイブリダイゼーションできるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが好ましい。
【００３５】
本発明のプローブセットのうち、配列番号１５、１７、１９、２１及び２３と関連したプローブは、それぞれ本発明のプライマーセットをプライマーとして使用したＰＣＲを通じて増幅されたＰＣＲ産物内の一部配列に該当し、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域のうち一つに特異的に結合する。
【００３６】
また、本発明のプローブセットのうち、配列番号１６、１８、２０、２２及び２４と関連したプローブは、それぞれ１５、１７、１９、２１及び２３と関連したプローブの突然変異型に該当する。具体的に、配列番号１５及び１６の１１番目塩基は多形性部位であり、野生型の配列番号１５の場合にはＧであり、突然変異型の配列番号１６の場合にはＡである。したがって、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域が野生型である場合に、配列番号１５と関連したプローブはハイブリダイゼーションするが、配列番号１６と関連したプローブはハイブリダイゼーションしない。仮に、本発明の一実施形態によるプライマーセットにより増幅された個人の脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域が配列番号１５と関連したプローブにはハイブリダイゼーションし、配列番号１６と関連したプローブにはハイブリダイゼーションしない場合に、その個人はアセトアルデヒド分解能に優れているので、宿酔があまり発生しない。したがって、このようなハイブリダイゼーション差を利用して個人のアルコール分解能と宿酔のかかりやすさ（二日酔いに対する耐性）との程度を予測できる。
【００３７】
配列番号１７及び１８の１２番目塩基は多形性部位（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｉｔｅ）であり、野生型である配列番号１７の場合にはＧであり、突然変異型である配列番号１８の場合にはＣである。したがって、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位が野生型である場合に配列番号１７と関連したプローブはハイブリダイゼーションするが、配列番号１８と関連したプローブはハイブリダイゼーションしない。仮に、本発明の一実施形態によるプライマーセットにより増幅された個人のチトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位が配列番号１７と関連したプローブにはハイブリダイゼーションし、配列番号１８と関連したプローブにはハイブリダイゼーションしない場合に、その個人はアルコール分解能に優れている。したがって、このようなハイブリダイゼーション差を利用して個人のアルコール分解能を予測できる。
【００３８】
配列番号１９及び２０の１２番目塩基は多形性部位であり、野生型である配列番号１９の場合にはＧであり、突然変異型である配列番号２０の場合にはＡである。したがって、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域が野生型である場合に配列番号１９と関連したプローブはハイブリダイゼーションするが、配列番号２０と関連したプローブはハイブリダイゼーションしない。仮に、本発明の一実施形態によるプライマーセットにより増幅された個人のアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域が配列番号２０と関連したプローブにはハイブリダイゼーションし、配列番号１９と関連したプローブにはハイブリダイゼーションしない場合に、その個人はアルコール分解能に優れている。アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域の場合には、突然変異型が野生型よりアルコール分解能に優れているためである。したがって、このようなハイブリダイゼーション差を利用して個人のアルコール分解能を予測できる。
【００３９】
配列番号２１及び２２の１２番目塩基及び配列番号２３及び２４の１３番目塩基は多形性部位であり、野生型の配列番号２１及び２３の場合にはＴであり、突然変異型である配列番号２２及び２４の場合にはＧである。したがって、アルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域が野生型である場合に、配列番号２１または２３と関連したプローブはハイブリダイゼーションするが、配列番号２２または２４と関連したプローブはハイブリダイゼーションしない。もし、本発明の一実施形態によるプライマーセットにより増幅された個人のアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＸ領域が、配列番号２１または２３と関連したプローブにはハイブリダイゼーションし、配列番号２２または２４と関連したプローブにはハイブリダイゼーションしない場合に、その個人はアルコール分解能が突然変異型に比べて優れている。したがって、このようなハイブリダイゼーション差を利用して個人のアルコール分解能を予測できる。
【００４０】
したがって、本発明の実施形態によるプローブセットを利用すれば、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できるのである。望ましいプローブセットの一例は、下記の表２に表した。
【００４１】
【表２】
2008079604.tif 000004
【００４２】
本明細書の「プローブ」とは、相補的な単一ストランド標的配列とハイブリダイゼーションして二重ストランド分子（混成体）を形成する単一ストランド核酸配列をいう。
【００４３】
本明細書において、プローブとして利用されたオリゴヌクレオチドはまた、ヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオエート、アルキルホスホロチオエートまたはペプチド核酸を含むことができるか、または挿入物質を含むことができる。
【００４４】
本発明はまた、本発明の一実施形態による一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットが固定化されている基板を持つマイクロアレイを提供する。
【００４５】
本発明のマイクロアレイにおいて、「マイクロアレイ」とは、基板上にポリヌクレオチドのグループが高密度で固定化されているものであり、前記ポリヌクレオチドグループはそれぞれ一定の領域に固定化されているマイクロアレイを意味する。このようなマイクロアレイは当業界で周知である。マイクロアレイについては、例えば、米国特許第５，４４５，９３４号明細書及び第５，７４４，３０５号明細書に開示されており、これら特許の内容は参照によって本明細書に含まれる。前記オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブセットについては前記の通りである。
【００４６】
また、本明細書の用語「基板」は、ハイブリダイゼーション特性を保有し、ハイブリダイゼーションの背景レベルが低く維持される条件下でオリゴヌクレオチドプローブがカップリングされうる任意の基板をいう。通例的に、前記基板は、微細力価（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）または微細球（ビード）またはチップでありうる。基板に適用または固定前に、核酸プローブを変形させて固定化を促進させるか、ハイブリダイゼーション効率を改善させることができる。前記変形は、単独重合体テーリング、脂肪族基、ＮＨ２基、ＳＨ基及びカルボキシル基のような異なる反応性作用基とのカップリング、またはビオチン、ハプテンまたは蛋白質とのカップリングを含むことができる。
【００４７】
本発明はまた、試料を本発明の一実施形態による一つ以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブセットと接触させて、前記試料中の標的配列とプローブ配列とをハイブリダイゼーションさせるステップと、前記プローブと試料中の標的配列とのハイブリダイゼーション程度を検出するステップとを含む、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測する方法を提供する。
【００４８】
本明細書において、‘‘ハイブリダイゼーション’’とは、核酸の２個の相補的ストランドが組み合わせられて二重ストランド分子（混成体）を形成する過程をいう。
【００４９】
本発明の一具体例は、本発明の方法において、前記ハイブリダイゼーションは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で行われる方法である。本具体例で、前記高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、望ましくは６５℃で同じモル濃度のＮａ２ＨＰＯ４及びＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％ドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１２Ｍリン酸塩バッファーを含むことである。
【００５０】
また、本明細書において、「ストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」とは、ハイブリダイゼーション及びその後の処理ステップ中に存在する温度及び溶媒組成を記述するために使われる用語である。高いストリンジェンシー条件下では、高度に相同的な核酸混成体が形成されるであろう。すなわち、十分な程度の相補性がない混成体は形成されないだろう。したがって、分析条件のストリンジェンシーは、混成体を形成する２核酸ストランド間に必要な相補性の量を決定する。ストリンジェンシーは、標的と非標的核酸で形成された混成体との安定性の差を最大化するために選択される。
【００５１】
本発明の一具体例は、本発明の方法において前記試料は、本発明の一実施形態によるプライマーセットをプライマーとし、血液または唾液などから由来したＤＮＡをテンプレートとしたＰＣＲを通じて得られたＰＣＲ産物を含む。テンプレートとして利用されたＤＮＡの由来は血液または唾液などであるが、これに制限されず、本発明の遺伝子を保有している試料はいずれも可能である。
【００５２】
本発明の一具体例は、本発明の方法において、前記核酸は、染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びこれらの断片からなる群から選択された方法である。
【００５３】
また、本明細書において「ＰＣＲ」とは、重合酵素連鎖反応を意味するものであり、重合酵素を利用して標的核酸に特異的に結合するプライマー対から標的核酸を増幅させる方法である。このようなＰＣＲ方法は、周知であり、商業的に利用可能なキットを利用してもよい。標的核酸を増幅させる方法は、前記ＰＣＲ以外にも、リガーゼ連鎖反応、核酸配列基材増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、転写基材増幅システム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）、ストランド置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）またはＱβコピー酵素（ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）を通じた増幅または当業界で周知の核酸分子を増幅させるための任意のその他の適当な方法がある。
【００５４】
本発明の一具体例は、本発明の方法において、前記標的配列は検出可能な標識物質で標識されうる。本具体例で、前記標識物質は、蛍光、燐光または放射性を発する物質であるが、これに制限されない。望ましくは、前記標識物質は、Ｃｙ−５またはＣｙ−３である。標的配列の増幅時にプライマーの５’−末端にＣｙ−５またはＣｙ−３を標識してＰＣＲを行えば、標的配列が検出可能な蛍光標識物質で標識されうる。また、放射性物質を利用した標識は、ＰＣＲ実行時に３２Ｐまたは３５Ｓのような放射性同位元素をＰＣＲ反応液に添加すれば、増幅産物が合成されつつ放射性が増幅産物に混入されて増幅産物が放射性で標識されうる。
【００５５】
本発明の一具体例は、本発明の方法において、前記プローブまたはプローブセットはマイクロアレイの基板上に固定化されうる。マイクロアレイ基板上に固定化されるオリゴヌクレオチドプローブセットについては、前記で記載した通りである。
【００５６】
本発明の方法において、前記アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測する方法は、検出可能な信号を発生させる物質で前記ＰＣＲ産物を標識し、これを前記プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせ、それから発生する信号を検出してなされうる。前記検出可能な信号は、例えば、光学的信号または電気的信号になりうるが、これらの例に限定されるものではない。前記光学的活性物質は、蛍光または燐光を発生させる物質でありうる。前記蛍光物質は、例えば、フルオレシン、Ｃｙ−５及びＣｙ−３でありうる。また、前記ＰＣＲ産物はハイブリダイゼーション前または後に検出可能な信号を発生させる物質で標識されるか、または標識されていない。標識されていない場合の前記ＰＣＲ産物とプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション結果は、例えば、電気的信号を通じて検出できるが、これらの例に限定されるものではない。
【００５７】
本発明はまた、本発明の一実施形態によるプライマーセット及び本発明の一実施形態によるオリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブセットを含む、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の一実施形態によるプライマーセットを利用して該当遺伝子を増幅した後に、該当プローブまたはプローブセットを利用してハイブリダイゼーションを行うことによって、個人のアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測できる。前記キットは、増幅反応を行うための試薬を含むことができ、前記試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、バッファーなどを含むことができる。また、本発明のキットは、最適の反応実行条件を記載したユーザー説明書を追加で含むことができる。
【００５８】
以下、本発明は実施例を通じてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例１：  アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのプライマーの選抜
本実施例では、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するためのプライマーを選択した。このために、Ｇｅｎｅｂａｎｋからアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子及びアルコール脱水素酵素遺伝子配列を入手し、ＤＮＡＳＴＡＲプログラムを利用して、これからアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するための標的配列であるアセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域を分析した。
【００６０】
その結果、配列番号１及び２、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１０、配列番号１１及び１２、及び配列番号１３及び１４の７個のオリゴヌクレオチドプライマーセットを設計した。これらオリゴヌクレオチドプライマーセットは、それぞれ、アセトアルデヒド脱水素酵素遺伝子のエクソンＸＩＩ領域、チトクロムＰ４５０  ２Ｅ１遺伝子の５’−調節部位及びアルコール脱水素酵素遺伝子のエクソンＩＩＩ領域及びエクソンＩＸ領域のうち一つを増幅できる。
【００６１】
実施例２：本発明のプライマーセットを利用したアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するための遺伝子の増幅
本発明のプライマーセットを利用して、アルコール分解能と宿酔の耐性とを予測するための遺伝子を増幅した。
【００６２】
１）口腔細胞のｇＤＮＡ抽出
臨床試料対象は、実験者から唾液を取ってＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡミニキットプロトコルによってｇＤＮＡを抽出した。ｇＤＮＡは、定量分析をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅ社から提供されるＰｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬を利用して測定し、定性分析は、ゲル電気泳動とシーケンシング（ＡＢＩ  ３７００）とを実施して分解程度と塩基配列の分析とを実施した。
【００６３】
２）標的配列の増幅
上記１）で用意されたｇＤＮＡを、Ｃｙ３末端標識されたプライマーを利用してＰＣＲ法による試料を調製した。なお、ＰＣＲ法は次の通りである。順方向及び逆方向プライマーそれぞれ４００ｎＭ、ｄＮＴＰ  ２００μＭ、１０Ｘバッファー５μｌ及びＴａｑポリメラーゼ１．２５ユニットを含む混合液中に前記抽出されたゲノムＤＮＡ５μｌを含む５０μｌの反応液を９５℃で１２０秒間初期変性した後、９５℃で２０秒変性、５８℃で２０秒アニーリング及び７２℃で２０秒延長を３５回反復した後、７２℃で１８０秒間最終延長した。増幅が終了したＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎから提供するＰＣＲ精製キットを利用して精製した後、チップに適用した。
【００６４】
実施例３：本発明のプライマーセットにより増幅された遺伝子のチップ上での検出
本実施例では、実施例２で増幅された増幅産物をチップ上に固定化されているプローブとハイブリダイゼーションさせ、そのハイブリダイゼーションの度合いを検出することによってアルコール分解能と宿酔の耐性とを予測した。
【００６５】
１）チップの製造
チップに使われる基板として、ＳｉＯ２  １０００Ａウェーハを用いて、２０％３−アミノプロピルエトキシラン（ｓｉｇｍａ）と５％  ＦＣ４４３０との混合物でコーティングした後、オーブンで１２０℃、４０分間ベーキング及び３回蒸溜水で洗浄してチップを作製した。
【００６６】
チップに固定化されるオリゴヌクレオチドプローブ溶液は、アミン改質されたヌクレオチド８０ｕＭ（ｂｉｏｎｅｅｒ）を９ｍＭ  ＰＥＧ  １００００（ｓｉｇｍａ）及び１００％  ホルムアミド（ｓｉｇｍａ）に溶かして、最終の２０ｕＭヌクレオチド溶液を調製し、これを、マイクロアレイスポッタ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ，ｐｉｓｙｓ  ５５００）とＳＭＰ３ピン（Ａｒｒａｙｉｔ）とを利用して前記チップ上にプリントした。ヌクレオチドの固定化は、オーブンで７０℃、相対湿度（ＲＨ）４０％の条件で１時間反応し、反応された基板は、５０ｍＭコハク酸無水物を１−メチル−２−ピロリドン溶媒に溶かした溶液に反応させた。
【００６７】
２）チップのハイブリダイゼーション
増幅された標的ＤＮＡを９４℃で５分間変性させた後、直ちに氷に入れてｓｓＤＮＡ状態を維持させた後、２Ｘハイブリダイゼーションバッファー（１２Ｘ  ＳＳＰＥＴバッファー）を１：１に混合してチップ上に塗布した。４８℃で１時間ハイブリダイゼーションさせた後、洗浄バッファーＩ（３Ｘ  ＳＳＰＥＴバッファー）で５分間攪拌しつつ洗浄し、洗浄バッファーＩＩ（１Ｘ  ＳＳＰＥＴバッファー）で５分間攪拌しつつ洗浄した。３０００ｒｐｍで１分間乾燥させた後、Ａｘｏｎ社製のスキャナーでスキャニングしてイメージを得た後、Ｇｅｎｅｐｉｘ  ３．１プログラムで強度値を得て分析に使用した。
【００６８】
３）試料の種類
Ａグループ：焼酎１杯で顔が赤くなり、宿酔現象を示す群（３人）
Ｂグループ：焼酎１瓶以上飲酒後、翌朝無理がない群（５人）
Ｃグループ：焼酎１瓶飲酒時に顔が赤くなり、宿酔現象を示す群（３人）
４）チップ上のプローブの配列
チップ上にスポッティングされたプローブの配列を下記に図式的に示す。
【００６９】
【表３】
2008079604.tif 000005
【００７０】
なお、上記表のプローブの配列は、図１のチップに固定化されているオリゴヌクレオチドプローブと対応するものである。
【００７１】
図１は、本発明のチップに固定化されているオリゴヌクレオチドプローブと本発明のプライマーセットを利用して増幅されたＰＣＲ産物とのハイブリダイゼーション結果を示す図面である。図１で、上段のパネルはＡグループ、中間のパネルはＢグループ及び下段のパネルはＣグループを表す。図１のチップイメージの強度を共に表３に整理した。
【００７２】
【表４】
2008079604.tif 000006
【００７３】
上記表４で、ＣＹＰ、ＡＬＤＨ２及びＡＤＨ２−３の野生型対突然変異型の相対的な強度（ｐ）が１超過ならば、各遺伝子が野生型を表し、ｐが０〜１ならば野生型：突然変異型＝１：１を表し、ｐが０未満ならば突然変異型を表すのである。
【００７４】
Ｓ２のようにＡＬＤＨ２は、突然変異型（ｐ＜０）でありつつＡＤＨ２−３も突然変異型（ｐ＜０）である人は、酒を一杯だけ飲んでも酔って宿酔が直ちに発生する人と判断でき、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ７及びＳ８のようにＡＬＤＨ２は野生型（ｐ＞１．０）であり、ＡＤＨ２−３は突然変異型（ｐ＜０）である人は、焼酎１瓶以上の酒を飲んでもすぐには酔わず、翌日宿酔もないと判断できる。また、Ｓ９、Ｓ１０及びＳ１１のようにＡＬＤＨ２はヘテロ型（０＜ｐ＜１）であり、ＡＤＨ２−３は突然変異型（ｐ＜０）である人は、焼酎１瓶ほど飲めば宿酔現象を示す。
【００７５】
ＣＹＰの場合、野生型の場合（ｐ＞０．５）、高度酒（焼酎、ウィスキー）をよく飲める能力を持っていると言える。
【００７６】
したがって、本発明のプライマーセット及びプローブセットを利用すれば、アルコール分解能と宿酔の耐性とを効率的に予測できる。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明は、飲酒関連の技術分野に好適に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明のチップに固定化されているオリゴヌクレオチドプローブと本発明のプライマーセットとを利用して増幅されたＰＣＲ産物のハイブリダイゼーション結果を示す図面である。
【図１】
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【配列表】
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