(57)【要約】      （修正有）【課題】粘度特性およびリン酸含量が変化した修飾澱粉を合成するトランスジェニック植物細胞および植物体、ならびに前記修飾澱粉を提供する。【解決手段】澱粉顆粒結合型ならびに可溶型として植物細胞内に存在する蛋白質をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、前記核酸分子またはベクターによって遺伝的に修飾されたトランスジェニック植物細胞、前記植物細胞を含む植物体、ならびに前記植物細胞もしくは植物体から得られる澱粉。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(e)からなる群より選択される、澱粉顆粒結合型ならびに可溶型として植物細胞内に存在する蛋白質をコードする核酸分子：
（a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸分子、
（b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子、
（c）（a）または（b）に記載の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子、
（d）（a）または（b）に記載の核酸分子の配列と比較して、その配列が遺伝子コードにより縮重している、核酸分子、および
（e）（a）または（d）に記載の核酸分子の断片、誘導体、または対立遺伝子変異体。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
核酸分子が原核細胞および真核細胞において転写を確実にする調節要素と結合している、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分子または請求項２もしくは３記載のベクターによって遺伝的に修飾された、宿主細胞。
【請求項５】
トランスジェニック植物細胞である、請求項４記載の宿主細胞。
【請求項６】
請求項５記載の植物細胞を含む植物体。
【請求項７】
請求項５記載の植物細胞または請求項６記載の植物体から得られる澱粉。
【請求項８】
請求項４記載の宿主細胞を、蛋白質を発現可能な条件下で培養し、蛋白質を細胞および／または培養培地から単離することを含む、澱粉顆粒結合型ならびに可溶型として植物細胞内に存在する蛋白質の産生方法。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分子によってコードされる、または請求項８記載の方法によって得られる蛋白質。
【請求項１０】
請求項９記載の蛋白質を特異的に認識する抗体。
【請求項１１】
請求項１記載の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、長さが少なくとも15ヌクレオチドの核酸分子。
【請求項１２】
請求項１記載のDNA分子の転写物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA分子。
【請求項１３】
請求項１記載のDNA分子の転写物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA分子。
【請求項１４】
植物細胞における発現時に、共抑制効果によって、請求項１記載の核酸分子の発現を減少させるRNAをコードするDNA分子。
【請求項１５】
請求項12〜14のいずれか一項に記載のDNA分子を含むベクター。
【請求項１６】
DNA分子が、植物細胞における転写を確実にするDNA調節要素と結合している、請求項15記載のベクター。
【請求項１７】
請求項12〜14のいずれか一項に記載のDNA分子または請求項15もしくは16記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
植物細胞において転写を確実にするDNA調節要素と共に、請求項12〜14のいずれか一項に記載のDNA分子を含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１９】
澱粉生合成または修飾に関与する少なくともさらに一つの酵素の活性が非形質転換植物と比較して減少している、請求項18記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２０】
分枝酵素の活性が減少している、請求項19記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２１】
澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼアイソタイプI（GBSS I）の活性が減少している、請求項20記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項２２】
請求項18〜21のいずれか一項に記載の植物細胞を再生させることによって得られるトランスジェニック植物体。
【請求項２３】
請求項18〜21のいずれか一項に記載の植物細胞または請求項22記載の植物体から得られる澱粉。
【請求項２４】
請求項12〜14のいずれか一項に記載のDNA分子の転写によって得られるRNA分子。
【請求項２５】
内因性の形で細胞において合成される請求項10記載の蛋白質の量が細胞内で減少していることを特徴とする修飾澱粉を合成するトランスジェニック植物細胞の作製方法。
【請求項２６】
細胞内における請求項10記載の蛋白質の量の減少がアンチセンス効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
細胞内における請求項10記載の蛋白質の量の減少がリボザイム効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
細胞内における請求項10記載の蛋白質の量の減少が共抑制効果によって引き起こされることを特徴とする、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
澱粉生合成および／または修飾に関与する少なくともさらに一つの酵素の酵素活性が減少している、請求項25〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
酵素が分枝酵素である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
酵素が澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼのアイソタイプI（GBSS I）である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
請求項25〜31のいずれか一項に記載の方法によって得られる植物細胞。
【請求項３３】
請求項32記載の植物細胞を再生させることによって得られるトランスジェニック植物体。
【請求項３４】
請求項32記載の植物細胞または請求項33記載の植物体から得られる澱粉。
【請求項３５】
ジャガイモ由来であることを特徴とする、請求項34記載の澱粉。
【請求項３６】
請求項５記載の植物細胞を含む請求項６記載の植物体の繁殖材料。
【請求項３７】
請求項18〜21のいずれか一項に記載の植物細胞または請求項32記載の植物細胞を含む、請求項22または32記載の植物体の繁殖材料。
【請求項３８】
ジャガイモ植物である、請求項22または33記載のトランスジェニック植物体。
【請求項３９】
請求項38記載のジャガイモ植物体の塊茎。
【請求項４０】
野生型植物の塊茎と比較して低温甘味化の減少を示す、請求項39記載の塊茎。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粘度特性が修飾され、リン酸含量が修飾された修飾澱粉を合成するトランスジェニック植物細胞および植物を産生する方法および組換えDNA分子と共に、澱粉顆粒結合型蛋白質をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、これらの方法の結果得られる植物細胞および植物、ならびにトランスジェニック植物細胞および植物から得られる澱粉にも関する。
【背景技術】
【０００２】
植物における最も重要な貯蔵物質の一つである多糖類澱粉は、食品領域で用いられるのみならず、工業製品の製造において再生材料として重要な役割を果たしている。この原材料を可能な限り多くの領域で利用できるようにするため、これらの物質を加工産業の多様な需要に適合させると共に、非常に多様な物質を得ることが必要である。
【０００３】
澱粉は化学的に均一な基本成分、すなわちグルコースで構成されているが、これは均一な原料を表していない。むしろ、澱粉は、その重合の程度およびグルコース鎖の分枝の発生が互いに異なる様々なタイプの分子の複雑な混合物である。特に、α-1,4-グリコシド分枝グルコース分子で構成される基本的に分枝していないポリマーであるアミロース澱粉と、逆により多く分枝しているかまたはより分枝していないグルコース鎖の混合物であるアミロペクチン澱粉とは異なる。分枝はα-1,6-グリコシド相互結合の出現に起因する。
【０００４】
主に、分枝の程度、アミロース／アミロペクチン比、平均的な鎖の長さ、およびリン酸基の存在によって決定される澱粉の分子構造は、それぞれ、澱粉またはその水溶液の重要な機能特性に重要である。重要な機能特性とは、例えば、澱粉の溶解性、老化傾向、薄膜形成能力、粘度、色の安定性、ペースト化特性すなわち結合および接着特性、ならびに低温耐性である。澱粉粒子径もまた、様々な用途にとって重要となりうる。アミロース含量の高い澱粉の産生は特に重要である。さらに、植物細胞に含まれる修飾澱粉は、特定の条件下で、植物細胞の行動を都合良く変化させる可能性がある。例えば、さらなる加工の前に、例えば澱粉抽出によって、種子および塊茎のような澱粉含有器官の貯蔵中の澱粉の分解を減少させることは可能であると考えられる。その上この澱粉を含む植物細胞および植物器官を、例えばジャガイモからのポップコーンもしくはコーンフレークスの生産またはジャガイモからのフライドポテト、ポテトチップスもしくはジャガイモ粉末の生産のようなさらなる加工により適するようにする修飾澱粉の生産にはいくつかの関心が寄せられている。澱粉の「低温甘味化」の減少、すなわち低温で長期保存の際の還元糖（特にブドウ糖）の放出を減少させるように、澱粉を改善することに特に関心が集まっている。特に、ジャガイモは、保存中の澱粉の分解を最小限にするために、しばしば４〜８℃の温度で保存される。その結果、放出された還元糖、特にブドウ糖は、フライドポテトおよびポテトチップスの生産時に望ましからぬ褐変反応（いわゆるマイラール反応）を引き起こす。
【０００５】
植物から単離された澱粉はしばしば、化学修飾によって特定の工業目的に適応されるが、これは一般的に時間および費用が非常にかかる。したがって、その特性が産業の要件をすでに満たしている特性の澱粉を合成する植物体を作製する可能性を探ることが望ましい。
【０００６】
そうした植物体を作製する従来の方法は、古典的な品種改良法および変異株の産生である。したがって、例えば、改変された粘度を有する澱粉を合成するトウモロコシから変異体が作製され（米国特許明細書第5,331,108号(特許文献１))、トウモロコシ変種（ロウ質のトウモロコシ）がほぼ100％アミロペクチンからなる澱粉を作り出すことによって確立された(アカスカ(Akasuka)およびネルソン(Nelson),J.Biol.Chem.241(1966),2280〜2285(非特許文献１))。さらに、アミロース含量の高い（トウモロコシでは70％、またはエンドウでは50％まで）澱粉を合成するジャガイモおよびエンドウの変異株が記述されている。これらの変異株はこれまで、分子レベルでの特徴付けがなされておらず、したがって、他の澱粉貯蔵植物ではこれに相当する変異株の産生は考慮されていない。
【０００７】
または、改変された特性を有する澱粉を合成する植物体は、DNA組換え技術によって作成してもよい。さまざまな事例において、これらの植物体において合成される澱粉を改変する目的で、例えば、ジャガイモ植物を組換え修飾したケースが記載されている(例えば、国際公開公報第92/11376号(特許文献２)；国際公開公報第92/14827号(特許文献３))。しかし、DNA組換え技術を利用するためには、その遺伝子産物が澱粉合成、澱粉修飾または澱粉分解に影響を及ぼすDNA配列が必要である。
【特許文献１】米国特許明細書第5,331,108号
【特許文献２】国際公開公報第92/11376号
【特許文献３】国際公開公報第92/14827号
【非特許文献１】アカスカ(Akasuka)およびネルソン(Nelson),J.Biol.Chem.241(1966),2280〜2285
【発明の開示】
【０００８】
したがって、本発明の基礎となる問題は、植物において天然に合成される澱粉とは物理学的および／または化学的特性が異なる澱粉、特にアミロース含量の高い澱粉を合成するように植物を変化させ、したがって一般的および／または特殊な利用により適する核酸分子および方法を提供することである。
【０００９】
この問題は、請求の範囲に記述される態様を提供することにより解決される。
したがって、本発明は配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする核酸分子に関する。そのような蛋白質は、植物細胞のプラスチド中に、遊離している、すなわち可溶型として存在すると共に澱粉顆粒に結合して存在する。大腸菌の発現の際に、そのような蛋白質の酵素活性により、細胞内に合成されるグリコーゲンのリン酸化が増加する。これらの蛋白質の分子量は、これをSDSゲル電気泳動によって評価する場合、140〜160 kDの範囲内にある。
本発明はさらに、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列、特に配列番号：１に示されるコード領域を有する配列を含む核酸分子に関する。
【００１０】
細胞のプラスチド中で部分的に顆粒に結合しているジャガイモ由来の蛋白質をコードし、本発明の上記核酸分子またはその相補鎖とハイブリダイズする核酸分子もまた、本発明の主題である。この意味において、「ハイブリダイゼーション」という用語は従来のハイブリダイズ条件下、好ましくは例えばサムブルック（Sambrook）らの、分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記述されたように、好ましくは厳密な条件下でのハイブリダイゼーションを示す。本発明の核酸分子とハイブリダイズするこれらの核酸分子は主として、そのような核酸分子を含むいかなる所望の有機物（すなわち、原核生物または真核生物、特に細菌、真菌、藻類、植物または動物の有機物）に由来してもよい。それらは、好ましくは単子葉植物または双子葉植物、特に有用な植物に由来し、澱粉貯蔵植物由来であることが特に好ましい。
【００１１】
本発明に係る分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えば多様な生物のゲノムまたはcDNAライブラリから単離してもよい。
それによって、そのような核酸分子の同定および単離は、本発明に係る分子もしくはこれらの分子の一部、または場合により、例えば標準的な方法（例えば、サムブルック（Sambrook）ら（1989）、分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）第２版 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）に従うハイブリダイゼーションにより、これらの分子の逆相補鎖を用いることによって行ってもよい。
【００１２】
ハイブリダイゼーションのプローブとして、例えば配列番号：１に示すヌクレオチド配列またはその一部を、正確にまたは基本的に含む核酸分子を用いてもよい。ハイブリダイゼーションプローブとして用いるDNA断片はまた、従来のDNA合成法によって産生され、その配列が本発明の核酸分子の配列と基本的に同一である合成DNA断片であってもよい。本発明に係る核酸配列とハイブリダイズさせる遺伝子を同定および単離後、配列を決定し、この配列によってコードされる蛋白質の特性を分析しなければならない。
【００１３】
さらに本発明は、上記分子の配列と比較して、その配列が遺伝子コードにより縮重され、植物細胞のプラスチド中で部分的に顆粒に結合する蛋白質をコードする核酸分子に関する。
上記蛋白質をコードする上記核酸分子の断片、誘導体、および対立遺伝子変異体もまた、本発明の主題である。それによって、断片は、上記蛋白質をコードするには十分な長さの核酸分子の一部として記述される。この意味において、「誘導体」という用語は、これらの分子の配列が上記核酸分子の配列とは１つ以上の位置において異なり、これらの分子配列と高度の相同性を示すことを意味する。ここで、相同性とは少なくとも40％の配列同一性を意味し、特に少なくとも60％の配列同一性、好ましくは80％以上の配列同一性、およびより一層好ましくは90％以上の配列同一性を意味する。上記核酸分子と比較して生じる逸脱は、欠失、置換、挿入または組換えによって引き起こされてもよい。
【００１４】
さらに相同性は、各核酸分子またはそれらがコードする蛋白質間に機能的および／または構造的等価性が存在することを意味する。上記核酸分子と相同で、これらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般にこれらの核酸分子の変異体であり、同じ生物学的機能を発揮する修飾となる。これらの変異体は天然に起こる変異体、例えば、それによってこれらの変異が天然に起こる可能性があり、またはそれらが故意に導入される可能性がある異なる生物由来の配列または変異体であってもよい。その上、変異体は合成して産生された配列であってもよい。
【００１５】
対立遺伝子変異体は、合成して作製された変異体またはDNA組換え技術によって作製された変異体と共に天然に起こるものであってもよい。
本発明に係る核酸分子の様々な変異体によってコードされる蛋白質は、特定の共通の特徴を示す。酵素活性、分子量、免疫学的反応性、コンフォーメーション等は、ゲル電気泳動における移動度、クロマトグラフィー特徴、沈降係数、可溶性、分光的特性、安定性、至適pH、至適温度等のような物理学的特性と共に、これらの特徴に属してもよい。
【００１６】
本発明の核酸分子は、主として記述の蛋白質を発現するいかなる生物に由来するものでもよい。それらは好ましくは、植物、特に澱粉合成または澱粉貯蔵植物に由来する。穀物（大麦、ライ麦、オート麦、小麦等）、トウモロコシ、米、エンドウ、キャッサバ、ジャガイモ等は特に好ましい。それらはまた、当業者に既知の合成法によって産生することができる。
本発明の核酸分子は、RNA分子と共にcDNAまたはゲノムDNAのようなDNA分子であってもよい。
【００１７】
さらに、本発明は、ベクター、特に本発明の上記核酸分子を含むプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作に一般的なその他のベクターに関する。
好ましい態様において、ベクターに含まれる核酸分子は原核生物および真核生物細胞において翻訳可能なRNAの転写および合成を確実にする調節要素に結合している。
さらなる態様において、本発明は、宿主細胞、特に、本発明の上記核酸分子または本発明のベクターによって、形質転換されたおよび／または組換え操作された原核細胞または真核細胞と共に、そのような細胞に由来し、本発明の核酸分子または本発明のベクターを含む細胞に関する。これは、好ましくは細菌細胞または植物細胞である。
【００１８】
本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質は、澱粉合成または修飾に影響を及ぼし、植物細胞における蛋白質量の変化により、植物の澱粉代謝の変化、特に物理化学的特性が修飾された澱粉の合成が起こることが今や判明した。
【００１９】
本発明の核酸分子を提供することによって、その構造および物理化学的特性が野生型植物で合成される澱粉とは異なる修飾澱粉を合成するDNA組換え技術によって植物を作製することが可能である。この目的のため、本発明の核酸分子は、植物細胞において転写および翻訳を確実にする調節要素に結合し、植物細胞中に導入される。
したがって、本発明はまた、それによって植物細胞において転写を確実にする調節要素に結合している本発明の核酸分子を含むトランスジェニック植物細胞に関する。調節要素は、好ましくは核酸分子に関して異種である。
【００２０】
当業者に既知の方法によって、トランスジェニック植物細胞は、完全な植物体に再生させることが可能である。本発明のトランスジェニック植物細胞の再生によって得られる植物体もまた、本発明の主題である。本発明のさらなる主題は、上記トランスジェニック植物細胞を含む植物である。トランスジェニック植物は原則としていかなる所望の種の植物、すなわち双子葉植物ならびに単子葉植物であってもよい。これらは、好ましくは有用植物であり、特に穀類（ライ麦、大麦、オート麦、小麦等）、米、トウモロコシ、エンドウ、キャッサバ、およびジャガイモのような澱粉貯蔵植物であることが好ましい。
【００２１】
本発明の核酸分子の発現または付加的発現のため、本発明のトランスジェニック植物細胞および植物は、野生型植物、すなわち非形質転換植物の澱粉と比較して、特にこの澱粉の水溶液の粘度および／またはリン酸含量が修飾されている澱粉を合成する。後者は一般にトランスジェニック植物細胞または植物の澱粉では増加しており、これにより澱粉の物理学的特性が変化する。
【００２２】
したがって、本発明のトランスジェニック植物細胞および植物から得られる澱粉もまた、本発明の主題である。
本発明のさらなる主題は、その中で蛋白質の発現を可能にするような条件下で本発明の宿主細胞を培養し、その蛋白質を培養細胞および／または培養培地から単離する、可溶性型と共に顆粒結合型として植物細胞に存在する蛋白質の産生法である。
【００２３】
さらに、本発明は、上記方法によって得られる蛋白質と共に、本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質に関する。これらは、好ましくは、核遺伝子によってコードされる蛋白質で、プラスチド中に位置する蛋白質である。プラスチドの中で、これらの酵素は遊離型と共に顆粒結合型として存在する。SDSゲル電気泳動では、ソラナム・ツベロッサム（Solanum tuberosum）由来の各蛋白質は分子量140〜160 kDを示し、大腸菌の発現の際に、細胞内で合成されるグリコーゲンのリン酸化の増加が起こる。
【００２４】
本発明のさらなる主題は、本発明の蛋白質を特異的に認識する抗体である。これらはポリクローナル抗体と共にモノクローナル抗体であってもよい。
【００２５】
さらに本発明は、本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオチドの長さを示す核酸分子に関する。この意味において、特異的にハイブリダイズするとは、従来のハイブリダイゼーション条件下で、好ましくは厳密な条件下で、他の蛋白質をコードする配列とのクロスハイブリダイゼーションが有意に起こらないことを意味する。そのような核酸分子は、好ましくは長さが少なくとも20ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチドであり、最も好ましくは少なくとも100ヌクレオチドである。そのような分子は例えば、PCRプライマーとして、ハイブリダイゼーションプローブとして、またはアンチセンスRNAをコードするDNA分子として用いることができる。
【００２６】
さらに、細胞内の、本発明に係る核酸分子によってコードされる蛋白質の量を減少させることによって、植物細胞において合成される澱粉の特性に影響を及ぼすことが可能であることが判明した。この減少は例えば、本発明の核酸分子のアンチセンス発現、適当なリボザイムの発現、または共抑制によって得てもよい。
【００２７】
したがって、本発明のDNA分子の転写物に相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA分子もまた、これらのアンチセンス分子と共に本発明の主題である。ここで、相補的とは、コードされたRNAが100％相補的でなければならないことを意味しない。植物細胞での発現時に本発明の蛋白質の発現を阻害するのに十分高い相補性であれば、低い程度の相補性で十分である。転写されたRNAは、本発明の核酸分子の転写物に対して、好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％の相補性を有する。植物細胞において転写の間にアンチセンス効果を引き起こすためには、該DNA分子が少なくとも15 bpの長さであり、好ましくは100 bp以上の長さであり、最も好ましくは500 bp以上の長さであるが、通常5000 bpより短く、好ましくは2500 bpより短い。
【００２８】
本発明はさらに、植物細胞における発現の間、共抑制効果により植物細胞において上記蛋白質をコードする本発明の核酸分子の発現を減少させるRNAの合成に至るDNA分子に関する。対応するDNA配列の産生と共に共抑制の原理は例えば、国際公開公報第90/12084号に正確に記述されている。そのようなDNA分子は、好ましくは本発明の核酸分子の転写物と高い相同性を示すRNAをコードする。しかし、コードするRNAが蛋白質に翻訳可能であることは必ずしも必要ではない。
【００２９】
さらなる態様において、本発明はこれらのコードされたRNA分子と共に、本発明のDNA分子の転写物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNA分子をコードするDNA分子に関する。
リボザイムは、RNA分子および特異的標的配列を開裂することが可能な触媒活性のあるRNA分子である。組換えDNA技法を用いて、リボザイムの特異性を変化させることが可能である。リボザイムには多様なクラスがある。特定の遺伝子の転写物の特異的開裂を目的とする実際の応用では、好ましくは、典型的な異なる２つのグループのリボザイムが用いられる。第一のグループはグループIイントロンリボザイムタイプに属するリボザイムから成る。第二のグループは、特徴的な構造特性としていわゆる「ハンマーヘッド」モチーフを示すリボザイムから成る。標的RNA分子の特異的認識は、このモチーフに隣接する配裂を変化させることによって修飾してもよい。標的分子における配列との塩基対合によって、これらの配列から、触媒反応が起こり、したがって標的分子の開裂が起こる位置が決定される。効率的な開裂に対する配列要件は極めて低いため、事実上それぞれの所望のRNA分子に対して特異的なリボザイムを開発することが原則的には可能である。
【００３０】
本発明のDNA分子の転写物を特異的に開裂するリボザイムをコードするDNA分子を作製するために、例えば、リボザイムの触媒ドメインをコードするDNA配列を標的酵素の配列と相同なDNA配列の両側に結合させる。触媒ドメインをコードする配列は例えば、SCMoウイルスのサテライトDNAの触媒ドメイン（デービーズら（Davies）、Virology 177（1990）、216〜224）であってもよく、TobRウイルスのサテライトDNAの触媒ドメイン（スタイネッケら（Steinecke）、EMBO J.11（1992）、1525〜1530；ハセロフ&ゲルラック（Haseloff and Gerlach）、Nature 334（1988）、585〜591）であってもよい。触媒ドメインに隣接するDNA配列は、好ましくは本発明の上記DNA分子に由来する。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は上記DNA分子を含むベクター、特に記述のDNA分子が植物細胞において転写を確実にする調節要素に結合しているベクターに関する。
さらに、本発明は記述のDNA分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞であっても、または真核細胞であってもよい。真核生物宿主細胞は、好ましくは植物細胞である。
【００３２】
さらに、本発明は、それによってDNA分子が植物細胞において転写を確実にするDNAエレメントに結合する、アンチセンスRNAをコードする上記のDNA分子、リボザイムまたは共抑制効果を起こすRNAを含むトランスジェニック植物細胞に関する。これらのトランスジェニック植物細胞は、周知の技法に従って完全な植物体に再生させてもよい。このように、本発明はまた、記述のトランスジェニック植物細胞を含む植物と共に、記述のトランスジェニック植物細胞からの再生を通じて得てもよい植物に関する。トランスジェニック植物そのものは、いかなる所望の植物種の植物であってもよく、好ましくは有用植物、特に上記に示したような澱粉貯蔵植物であってもよい。
【００３３】
トランスジェニック植物細胞におけるアンチセンスDNA、リボザイムまたは共抑制RNAをコードする記述のDNA分子の発現により、細胞内に内因性の形で存在する本発明のDNA分子によってコードされる蛋白質量は減少する。驚くべきことに、この減少は、植物細胞または植物部分の低温での貯蔵における還元糖の放出と共に、植物細胞において合成される澱粉の物理化学的特性、特にこの澱粉の水溶液の粘度特性、リン酸含量に劇的な変化をもたらす。トランスジェニック植物細胞において合成される澱粉の特性は以下に明白に記述する。
【００３４】
したがって、記述のトランスジェニック植物細胞および植物から得られる澱粉もまた、本発明の主題である。
さらに、本発明は、リボザイム活性を有するRNA分子、および例えば転写によって得られる共抑制効果を引き起こすRNA分子と共に、記述のDNA分子によってコードされるアンチセンスRNA分子に関する。
本発明のさらなる主題は、非形質転換細胞と比較して修飾された澱粉を合成するトランスジェニック植物細胞の作製方法である。この方法では、細胞内に内因性の形で存在する本発明のDNA分子によってコードされる蛋白質量は、植物細胞において減少している。
【００３５】
好ましい態様において、この減少はアンチセンス効果によって行われる。この目的のため、本発明のDNA分子またはその一部を、植物細胞において転写を確実にするプロモーター、およびおそらく転写物のポリアデニル化と共に転写を確実に終結させる終止シグナルとアンチセンス方向で結合させる。植物細胞において効果的なアンチセンス効果を確実に得るために、合成されたアンチセンスRNAは最少でも15ヌクレオチドの長さを示さなければならず、好ましくは少なくとも100ヌクレオチドであり、最も好ましくは500ヌクレオチド以上である。さらに、アンチセンスRNAをコードするDNA配列は、形質転換すべき植物種に関して同種でなければならない。しかし、細胞内に内因性の形で存在するDNA配列と高度の相同性を示すDNA配列を用いてもよく、好ましくは90％以上の相同性、最も好ましくは95％以上の相同性を有する。
【００３６】
さらなる態様において、本発明のDNA分子によってコードされる蛋白質の量の減少はリボザイム効果によって行われる。リボザイムの基本的効果は、そのようなRNA分子をコードするDNA分子の構築と共に、既に先に記述されている。トランスジェニック細胞においてリボザイム活性を有するRNAを発現するためには、リボザイムをコードする上記のDNA分子を、植物細胞において転写を確実にするDNAエレメント、特にプロモーターおよび終止シグナルに結合させる。植物細胞において合成されるリボザイムにより、植物細胞に内因性の形で存在する本発明のDNA分子の転写物が開裂される。
【００３７】
本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質の量を減少させるためのさらなる可能性は、共抑制である。したがって、本発明の方法によって得られる植物細胞がさらに主題である。これらの植物細胞は、本発明のDNA分子によってコードされる蛋白質量が減少しており、野生型の細胞と比較して修飾された澱粉を合成するという点を特徴とする。
【００３８】
さらに、本発明は、本発明の記述の細胞を含む植物と共に、記述の植物細胞の再生によって得られる植物に関する。
記述の植物細胞および植物から得られる澱粉もまた、本発明の主題である。この澱粉は、その物理および／または化学的特性が非形質転換細胞または植物から得られる澱粉と異なる。野生型植物の澱粉と比較すると、この澱粉はリン酸含量の減少を示す。その上、この澱粉の水溶液は修飾された粘度特性を示す。
好ましい態様において、記述の澱粉のリン酸含量は、野生型植物由来の澱粉と比較して少なくとも50％減少し、より好ましくは少なくとも75％、特に好ましい態様においては80％以上減少している。
この澱粉の水溶液の修飾粘度はその最も有利な特徴である。
【００３９】
粘度を決定するよく確立された試験はいわゆるブラベンダー試験である。この試験は、例えばビスコグラフEとして知られる器具を用いることによって実施される。この装置は、数ある中でブラベンダーfOHGデュースブルグ（ドイツ）が製造および販売している。
試験は基本的に、澱粉顆粒の水和および膨張が起こる時間を評価するために、まず水の存在下で澱粉を加熱する工程を含む。ゼラチン化またはペースト化とも呼ばれるこのプロセスは、水素結合の分解に基づき、澱粉懸濁液における粘度の測定可能な増加に関与している。ゼラチン化後にさらに加熱すると澱粉粒子が完全に溶解し、粘度が減少するが、ゼラチン化後急速に冷却すると典型的に粘度の増加が起こる（図３参照）。ブラベンダー試験の結果は、時間に対する粘度を示すグラフで、ここでまず溶液をゼラチン化温度以上に加熱し、次に冷却する。
【００４０】
ブラベンダーグラフの解析は一般に、ペースト化温度、加熱時の最大粘度、冷却時の粘度の増加と共に、冷却後の粘度の測定を目的とする。これらのパラメータは、澱粉の品質および様々な目的への利用の可能性に関する重要な特徴である。
例えば、細胞内の本発明の蛋白質量がアンチセンス効果によって減少しているジャガイモ植物から単離される澱粉は、野生型植物から単離される澱粉の特徴とは大きく異なる特徴を示した。これらと比較すると、この澱粉のみが冷却時の粘度のより大きな増加と共に、加熱時の粘度の小さな増加、低い最大粘度を示す（図３、４および５参照）。
【００４１】
好ましい態様において、本発明は、その水溶液が図４または５に描写するような特徴的な粘度特性を示す澱粉に関する。特に、ブラベンダー粘度計を用いて粘度を決定するために実施例８aで述べた条件下では、修飾澱粉は野生型植物と比較して、溶液の加熱時の粘度の増加はごく僅かであるという特徴を示す。これにより、高濃縮接着剤の産生に澱粉を用いる機会が提供される。
その上、最大粘度に達した後、修飾澱粉の場合では粘度の減少はごく僅かである。一方、冷却時には粘度は非常に増加する；このように、修飾澱粉の粘度は野生型植物の澱粉の粘度より高い。
【００４２】
トランスジェニック植物細胞における本発明の蛋白質量を減少させることによって、さらに、この澱粉を含む植物部分を低温、特に４〜８℃で保存する場合、非形質転換細胞の澱粉の場合より還元糖の放出がより少ない、という効果を有する澱粉を産生することが可能である。この特性は例えば、低温保存の際の還元糖の放出が少なく、したがって低温甘味化が減少したジャガイモを提供するのに特に有利である。そのようなジャガイモは、望ましからぬ褐変反応（マイラール反応）を回避できるため、または使用中少なくとも非常に減少するため、フライドポテト、ポテトチップス、または同類製品の製造に特に適している。
【００４３】
本発明の特に好ましい態様において、本発明の蛋白質の合成が形質転換植物細胞において減少しているばかりでなく、少なくとも１つのさらなる酵素の合成も澱粉合成および／または修飾に関与している。この意味において、例えば、澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼまたは分枝酵素が好ましい。驚くべきことに、分枝酵素の合成と共に、本発明の蛋白質の合成がアンチセンス効果のために減少しているジャガイモ植物は、その特性が野生型植物の澱粉の特性とは大きく異なる澱粉を合成することが判明した。
野生型澱粉と比較すると、この修飾澱粉の水溶液は加熱または冷却時に粘度の増加をほとんど示さない（図６参照）。
【００４４】
さらに、澱粉粒子を加熱前後に顕微鏡分析すると、野生型植物と比較して、そのように修飾された植物の澱粉顆粒は開裂していないが、その構造は依然として基本的に不変であることが明らかに示される。したがって、これは加熱工程に耐性な澱粉である。この澱粉のアミロース含量を実施例に記述の方法によって測定する場合、この澱粉について測定されるアミロース含量は50％以上であり、好ましくは60％以上であり、最も好ましくは70％以上である。この植物から単離された澱粉の水溶液は、好ましくは図６に描写した特徴的な粘度特性を示す。
【００４５】
本発明のそのようなアミロース含量の高い澱粉は、野生型植物と比較して様々な利用に多くの利点を提供する。このように、アミロース含量の高い澱粉は、ホイルおよびフィルムでの使用に高い可能性を有する。アミロース含量の高い澱粉に基づいて産生されるホイルおよびフィルムは、包装産業の広い領域に用いられる可能性があり、生物分解性という本質的な利点を有する。古典的な、石油化学的に産生されたポリマーによって基本的にカバーされるこの利用法とは別に、アミロースはさらに、ヘリックスを形成するというアミロースの特性によって生じる独自の応用分野を有する。アミロースによって形成されるヘリックスは、内部が疎水性で、外部が親水性である。このため、アミロースは低分子または高分子物質の複合体形成および分子カプセル化に用いてもよい。従って実施例としては以下のものがある：
−  酸化、揮発、熱分解または水性環境への移行から保護するためのビタミンおよび物質の分子カプセル化；
−  可溶性を増加させるための芳香性物質の分子カプセル化；
−  安定化および制御放出のための化学肥料／殺虫剤の分子カプセル化；
−  用量調節の安定化および遅延製剤の調節放出のための医用物質の分子カプセル化。
アミロースのもう一つの重要な特性は、これがキラル分子であるという事実である。キラル性のため、これは好ましくは、エナンチオマーを分離するために例えば、カラム上に固定化した後に用いる。
【００４６】
さらに、驚くべきことに、細胞内の本発明の蛋白質量がアンチセンス効果のために減少しているジャガイモ植物から単離される澱粉は、澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼアイソタイプI（GBSS I）の酵素活性を示す蛋白質の減少と共に、野生型植物から単離される澱粉の特徴とは大きく異なる特徴を示すことが判明した。野生型植物の澱粉と比較すると、この澱粉の水溶液は、加熱時に粘度のごくわずかな増加、低い最大粘度ならびに冷却時に粘度の増加がほとんどないことを示す（図７参照）。この澱粉のアミロース／アミロペクチン比を求めると、この澱粉はほとんどアミロースが測定できないという特徴を有する。この澱粉のアミロース含量は、好ましくは５％未満であり、最も好ましくは２％未満である。さらに、本発明の澱粉は、組換えDNA技法だけでGBSS I遺伝子を阻害することによってトランスジェニックジャガイモ植物において産生される既知の澱粉とは異なる。このように、この澱粉は加熱時に粘度の強い増加を示す。本発明の澱粉の水溶液は、好ましくは図７に示した特徴的な粘度特性を示す。特に、実施例13に記述するラピッドビスコアナライザー（Rapid Visco Analyser）によって粘度を測定する条件下では、修飾澱粉は野生型澱粉と比較しても、ロウ質澱粉と比較しても加熱時の粘度の増加はごく僅かであるという特徴を有する。このことから、高濃縮接着剤の作製のために本発明の澱粉を利用する機会が提供される。修飾澱粉はさらに、冷却時の粘度の増加がほとんどないことと共に、最大粘度に達した後の粘度の減少がごく僅かであるという特性を有する。
【００４７】
植物細胞における分枝酵素活性を減少させる可能性については既に、例えば、国際公開公報第92/14827号および国際公開公報第95/26407号に記述されている。澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼのアイソタイプI（GBSS I）活性の減少は、当業者に既知の方法を用いることによって、例えば、アンチセンス効果によって実施してもよい。ジャガイモ由来のGBSS IをコードするDNA配列は例えば、ヘゲルスベルグ（Hegersberg）（ケルン大学学位論文（1988））、ビッサーら（Visser）（Plant Sci. 64（1989）、185〜192）またはファンデルレイら（van der Leiy）（Mol.Gen.Genet. 228（1991）、240〜248）からも既知である。
【００４８】
本発明の方法は、原則としていかなる植物種に対して用いてもよい。単子葉植物および双子葉植物は、特に有用な植物で好ましくは穀類（ライ麦、大麦、オート麦、小麦等）、米、トウモロコシ、エンドウ、キャッサバ、およびジャガイモのような澱粉貯蔵植物が関心対象である。
【００４９】
本発明の枠組みにおいて、「植物細胞において転写を確実にするDNA調節要素」という用語は、植物細胞において転写を開始または終結させるDNA領域である。転写開始を確実にするDNA領域は特にプロモーターである。
植物における本発明の多様な上記DNA分子の発現のためには、植物細胞において機能するいかなるプロモーターを用いてもよい。プロモーターは使用する植物種に関して同種または異種であってもよい。例えば、全ての植物組織において構成的な発現を確実にするカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（オーデルら（Odell）、Nature 313（1985）、810〜812）および国際公開公報第94/01571号に記述されたプロモーター構築物を利用してもよい。しかし、外因性因子によって決定される時点でのみ（国際公開公報第93/07279号のように）、または植物の特定の組織（例えば、ストックハウスら（Stockhaus）、EMBO J.8（1989）、2245〜2251参照）において、その後の配列を発現させるプロモーターを利用してもよい。好ましくは、形質転換すべき植物の澱粉貯蔵部分において活性なプロモーターを用いる。ジャガイモ（potato）の場合、これらの部分は種いも、ジャガイモ（potatoes）の場合は塊茎である。ジャガイモを形質転換させる場合には、塊茎特異的B33-プロモーター（ロチャソサら（Rocha-Sosa）、EMBO J. 8（1989）、23〜29）を特に用いてもよいがこれに限定しない。
【００５０】
プロモーターは別として、転写を開始させるDNA領域はまた、いわゆるエンハンサー要素のような、転写を確実にさらに増加させるDNA配列を含んでいてもよい。さらに、「DNA調節要素」という用語はまた、転写を正確に終結させ、転写物を安定化させると考えられているポリAテールを転写物に付加する役割を果たす終止シグナルを含んでいてもよい。そのような要素は文献に記載されており、自由に交換可能である。そのような終止配列の例は、ノパリン・シンターゼ遺伝子(NOS遺伝子)もしくはアグロバクテリア由来のオクトピン・シンターゼ遺伝子(ジーレン(Gielen)ら,EMBO J.8(1989),23〜29)のポリアデニル化シグナルを含む3'-非翻訳領域、または大豆由来の保存蛋白の遺伝子の3'-非翻訳領域、並びにリブロース-1,5-ビスフォスフェートカルボキシラーゼの小さいサブユニットの遺伝子(ssRUBISCO)である。  
【００５１】
本発明のDNA分子の植物細胞への導入は、好ましくはプラスミドを用いて行う。植物ゲノムへのDNAの安定的な組み込みを確実にするプラスミドが好ましい。
本発明の実施例において、バイナリベクターpBinAR（ホフゲン&ウィルミッツァー（Hofgen and Wilmitzer）、Plant Sci.66（1990）、221〜230）を利用する。このベクターはバイナリベクターpBin19（ビーバン（Bevan）,Nucl.Acids.Res. 12（1984）、8711〜8721）の誘導体で、これは市販されている（クロンテック・ラボラトリーズ、インク、USA）。
しかし、発現カセットに導入することができ、植物ゲノムへの発現カセットの組み込みを確実にするその他の植物形質転換ベクターを利用してもよい。
【００５２】
高等植物において異物遺伝子の導入を調製するためには、大腸菌に対する複製シグナルおよび形質転換した菌細胞の選択に対するマーカー遺伝子を含む大量のクローニングベクターが自由に使える。そのようなベクターの実施例は、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184等である。所望の配列を適当な制限部位でベクターに組み込んでもよい。得られたプラスミドは、大腸菌細胞の形質転換に用いる。形質転換大腸菌細胞を適当な培地で培養し、その後回収して溶解する。プラスミドは定法によって回収する。得られたプラスミドDNAの特徴付けのための分析法として、一般に制限分析および配列分析が用いられる。各操作後、プラスミドDNAを開裂し、得られたDNA断片を他のDNA配列と結合させてもよい。
【００５３】
DNAを植物宿主細胞に導入するためには、幅広い技術が自由に使える。これらの技法は、さらなる可能性もあるが、形質転換媒体としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲンス（Agrobacterium rhizogenes）を用いたT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、DNAのインジェクションおよび電気穿孔、バイオリスティック法によるDNAの導入を含む。
DNAの植物細胞へのインジェクションおよび電気穿孔の場合、用いるプラスミドに特殊な要件はない。pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いてもよい。しかし、そのように形質転換した細胞から完全な植物体を再生させる場合には、選択的なマーカー遺伝子が存在しなければならない。
所望の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、さらなるDNA配列が必要となることがある。Ti-またはRi-プラスミドを、例えば植物細胞の形質転換のために用いる場合、Ti-またはRi-プラスミドのT-DNAの少なくとも右境界、しかしよりしばしば左右境界を、隣接領域として導入すべき異物遺伝子に結合しなければならない。
【００５４】
アグロバクテリウムを形質転換に用いる場合、導入すべき遺伝子は特殊なプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリベクターのいずれかにクローニングしなければならない。T-DNA内の配列と相同な配列のため、中間ベクターは同種組換えによるアグロバクテリウムのTi-またはRi-プラスミドに組み込んでもよい。これはまた、T-DNAのトランスファーに必要なvir-領域を含む。中間ベクターはアグロバクテリウム中では複製できない。ヘルパープラスミドによって、中間ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）にトランスファーしてもよい（接合）。バイナリベクターは、アグロバクテリウムにおけると共に大腸菌において複製してもよい。それらは、左右T-DNA境界領域によって枠組みされるリンカーまたはポリリンカーと共に、選択的マーカー遺伝子を含む。それらは、アグロバクテリウムに直接形質転換してもよい（ホルスターズら（Holsters）、Mol.Gen.Genet.163（1978）、181〜187）。アグロバクテリウムの形質転換に用いるプラスミドはさらに、形質転換バクテリアの選択が許されるNPT II遺伝子のような選択的マーカー遺伝子を含む。宿主細胞として作用するアグロバクテリウムは、vir-領域を有するプラスミドを含まなければならない。vir-領域は植物細胞へのT-DNAのトランスファーに必要である。別のT-DNAが存在してもよい。そのような方法で形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞の形質転換に用いられる。
【００５５】
植物細胞の形質転換にT-DNAを用いることは、十分に研究され、欧州特許第120 516号；ホーケマ「バイナリ植物ベクターシステム（Binary Plant Vector System）」Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam（1985）、５章；フレイリーら（Fraley）、Crit.Rev.Plant Sci.,4、１〜46およびアンら（An）、EMBO J. 4（1985）、277〜287に十分に記述されている。pBIN19（クロンテック・ラボラトリーズ、インク、USA）のようないくつかのバイナリシステムは、既に市販されているかも知れない。
【００５６】
DNAを植物細胞にトランスファーするためには、植物抽出物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾゲンス（Agrobacterium rhizogenes）と共に適切に共培養してもよい。感染した植物材料（例えば、葉片、茎の一部、根、プロトプラスト、または懸濁培養植物細胞）から、形質転換細胞の選択のために抗生物質またはバイオザイドを含んでもよい適当な培地中で完全な植物体を再生させてもよい。そのようにして得られた植物は次に、導入されたDNAが存在するか否かを調べる。
【００５７】
導入DNAが植物細胞のゲノムに組み込まれると、通常それはその場に安定して存在し続け、最初に形質転換された細胞の子孫内にも留まる。通常、これは、バイオザイドまたはカナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、またはフォスフィノトリシン等のような抗生物質に対する耐性を形質転換された植物細胞に付与する選択的マーカーを含む。したがって、マーカーの個別選択により、導入DNAを欠如する細胞からの形質転換細胞の選択が可能となるはずである。
【００５８】
形質転換細胞は通常の方法で細胞内で増殖する（マコーミックら（McCormick）、Plant Cell Reports 5（1986）、81〜84も参照）。得られた植物は通常の方法で培養し、同じ形質転換された遺伝子の遺伝物または別の遺伝子の遺伝物を有する植物と交配することができる。得られたハイブリッド個体は対応する表現型特性を有する。表現型特徴が安定的に維持されているか否か、およびそれがトランスファーされているか否かを確認するためには、２代以上増殖させなければならない。さらに、対応する表現型またはその他の特性が残っていることを確認するために種子を採取しなければならない。
【００５９】
その特性のため、本発明の植物細胞または植物から得られた澱粉は、本明細書に既に記載の特殊な目的に適しているのみならず、多様な工業的利用にも適している。
【００６０】
基本的に、澱粉は大きく２つの分野に分類できる。一方の分野には、澱粉の加水分解産物およびいわゆる天然の澱粉が含まれる。加水分解産物には本質的に、酵素または化学処理によって得られるグルコースおよびグルカンの成分が含まれる。それらは、発酵および化学修飾などのさらなるプロセスに用いることができる。これに関連して、加水分解プロセスが単純かつ安価に実施できることは重要であるかもしれない。現在、これはアミログルコシダーゼを用いて実質的に酵素的に実施される。用いる酵素のアプローチを制限する澱粉構造の変化、例えば、顆粒表面の増加、より少ない分枝または立体構造による消化性の改善により、加水分解に要する酵素量を減少させることによってコストが軽減されることが考えられる。
【００６１】
そのポリマー構造のために用いられるいわゆる天然澱粉の用途は、さらに２つの領域に分類される：
(a) 食品における利用
澱粉は、様々な食品に対する典型的な添加剤であって、本質的に水性添加剤を結合する目的を果たし、および／または粘度の増加もしくはゲル形成の増加を引き起こす。重要な特徴的特性は、流動および収着作用、膨張およびペースト化温度、粘度および濃化作用、澱粉の可溶性、透明性およびペースト構造、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、薄膜形成能力、凍結／融解抵抗性、消化性ならびに例えば無機または有機イオンなどとの複合体形成能である。
(b) 食品以外における利用
その他の主な適応分野は、様々な生産プロセスにおける補助剤、または技術的製品の添加剤としての澱粉の利用である。補助剤としての澱粉の利用に関する主な適応分野は、第一に、紙および厚紙産業である。この分野では、澱粉は主に保持力(固体の引き留め)のため、固化物質として整粒充填剤および細粒のため、ならびに脱水のために用いられる。さらに、堅さ、硬度、音、握り、つや、なめらかさ、離断強度ならびに表面に関する澱粉の有利な特性が利用されている。
【００６２】
製紙過程では、４つの適応分野、すなわち表面、コーティング、重量および吹き付けを区別することができる。
表面処理に関する澱粉の必要条件は、本質的に、高度の輝き、相応な粘度、高度の粘度安定性、良好な薄膜形成ならびにほこりの低発生である。固体内容物のコーティングに用いる場合には、相応する粘度、高度の結合能力ならびに高度の色素親和性が重要な役割を果たす。塊体に対する添加剤としては、急速、均一、無駄のない拡散、高い機械的安定性および紙パルプにおける完全な保持性が重要である。澱粉を吹き付けに用いる場合には、相応な固体含量、高い粘度ならびに高い結合能力も重要である。
【００６３】
主な適用分野は例えば、接着産業であり、ここでは適用分野は４つの領域に分割される：純粋な澱粉糊としての利用、特殊化学物質を用いて調製した澱粉糊における利用、合成樹脂およびポリマー分散物に対する添加剤としての澱粉の利用ならびに合成接着剤の拡張剤としての澱粉の利用である。澱粉に基づく接着剤全体の90％が、段ボール紙、紙袋および紙バッグ、紙およびアルミニウムの合成材料、箱、ならびに封筒、切手等の水糊の産生に利用される。
【００６４】
澱粉の補助剤および添加剤として考えられるもう一つの利用可能性は、紡績および紡績ケア製品の産生においてである。紡績産業において、以下の４つの適用分野に分類することができる：整粒剤、すなわち、なめらかにし、織り上げの際の着用抵抗性の増加と共に、織り上げの際に働く張力に対する保護のためのぎざぎざ作用(burring behaviour)を強化するための補助剤として、漂白、染色等の、主として品質を劣化させる前処置後の織物改善剤として、色素拡散防止のための染料ペースト産生における濃縮剤としての、および織り糸の整経剤のための添加剤としてとしての澱粉の利用。
【００６５】
さらに、澱粉は、建築材料における添加剤として利用してもよい。一つの例は、石膏ボードの産生であり、薄い石膏と混合させた澱粉を水と共にペースト状にし、石膏ボードの表面に拡散させ、厚紙をボードに結合させる。もう一つの適用領域は、これを石膏および鉱物繊維と混合することである。予め混合させたコンクリートにおいて、澱粉を整粒プロセスの減速のために用いてもよい。
【００６６】
さらに、澱粉は、人工的な地盤シフトにおいて水に対する地盤粒子の一時的な保護のために用いられる地盤安定化手段の産生に有用である。先端技術の知識に従って、澱粉およびポリマー乳化剤を含む配合製品は、これまで用いられていた製品と同じ腐食減少および表皮形成減少効果を有すると見なすことができる；しかし、それらはかなり安価である。
【００６７】
もう一つの適用分野は、植物保護剤におけるこれらの調製物の特殊な特性の修飾における澱粉の利用である。例えば澱粉は、植物保護剤および肥料の湿化の改善に、活性成分の一定量放出に、液体、揮発性および／または臭いがある活性成分の、微小結晶の安定で変形可能な物質への転化に、相容れない組成の混合に、および分散低下による効果持続の延長に用いられる。
【００６８】
澱粉はまた、薬物、医薬品および化粧品産業の分野で用いてもよい。製薬産業において、澱粉を錠剤の結合剤として、またはカプセル中の結合剤の希釈に用いてもよい。さらに、澱粉は、飲み込む際に水を吸収し、短時間で活性成分を放出するにつれ膨張するため、錠剤の崩壊剤としても適している。品質的理由から、医薬品の流化剤および粉剤がさらに適応分野となる。化粧品分野において、澱粉は例えば、香水およびサリチル酸などの粉末添加剤の担体として用いてもよい。澱粉の比較的広範な適応分野は歯磨きである。
【００６９】
石炭および練炭における添加剤としての澱粉の利用もまた考えられる。澱粉を加えることによって、石炭を定量的に塊にし、および／または高品質の練炭にすることができ、このように練炭の未成熟崩壊を防ぐことができる。バーベキュー用木炭は付加澱粉を４〜６％、熱発生石炭を0.1〜0.5％含有する。さらに、澱粉は、これを石炭および練炭に加えると、毒性物質の放出をかなり減少させることができるため、結合剤として適している。
さらに、澱粉は鉱石および石炭スラリーの加工において凝集剤として用いてもよい。
【００７０】
もう一つの適用分野は、鋳造において物質を加工するための添加剤としての利用である。様々な鋳造プロセスにおいて、結合剤と混合した砂から産生された中心核が必要とされる。今日では、最も一般的に用いられている結合剤は、たいていの場合、膨張する澱粉である修飾澱粉と混合したベントナイトである。
澱粉を加える目的は、結合力の改善と共に、流体抵抗の増加である。加えて、膨張澱粉は、冷水における分散性、再水和性、砂との良好な混和性、および水の高い結合能力などの、生産プロセスに対して予めさらに必要な条件を満たす可能性がある。
【００７１】
ゴム産業では、澱粉を技術的および視覚的品質の改善のために用いてもよい。この理由は、表面のつや、握り、および外観の改善である。この目的のために、低温加硫前に、ゴム物質の粘着性のゴム引き表面上に澱粉を拡散させる。ゴムの印刷可能性を改善するために用いてもよい。
【００７２】
修飾澱粉のもう一つの適用分野は、皮革代用品の産生である。
【００７３】
プラスチック市場において、以下の適用分野が明らかである：澱粉由来製品の加工プロセスへの組み込み(澱粉は単なる充填剤で、合成ポリマーと澱粉との間の直接結合はない)、または澱粉に由来する製品のポリマー産生への組み込み(澱粉とポリマーは安定な結合を形成する)。
【００７４】
澱粉を純粋な充填剤として用いても、タルカムのような他の物質に匹敵することは不可能である。この状況は、特殊な澱粉特性が有効になる場合、および最終製品の特性プロフィールがこのように明らかに変化する場合には異なる。一つの例は、ポリエチレンなどの熱可塑性材料の加工における澱粉製品の利用である。これによって、澱粉と合成樹脂は、「マスターバッチ」を形成するために、共発現によって１：１の比で配合し、ここから様々な製品が顆粒化ポリエチレンを用いた一般的技法によって産生される。ポリエチレン薄膜への澱粉の組み込みは、水性染料による印刷可能性の改善と共に、中空体における物質透過性の増加、水蒸気透過性の改善、抗静電気防止作用の改善、抗ブロック作用の改善を引き起こす。
【００７５】
もう一つの可能性は、ポリウレタンフォームにおける澱粉の利用である。加工技術の最適化によるばかりでなく澱粉誘導体の適合により、合成ポリマーと澱粉の水酸基との反応を特異的に調節することが可能である。結果は、澱粉の利用によって以下の特性プロフィールを有するポリウレタン薄膜である；熱膨張係数の減少、収縮作用の減少、圧／張力作用の改善、水許容性の変化を伴わない水蒸気透過性の増加、可燃性およびひび割れの減少、可燃性部分の落下なし、ハロゲン化物なし、および加齢の減少。現在なお存在する不利な点は、圧および衝突強度の減少である。
【００７６】
薄膜の製品開発が唯一の選択肢ではない。ポット、プレート、およびボウルなどの固形プラスチック製品は、50％以上の澱粉含量を用いて産生することができる。さらに、澱粉／ポリマー混合物はそれらがはるかに容易に生体崩壊するという長所を付与する。
さらに、それらの水との強い結合能力により、澱粉接合ポリマーは最も重要となった。これらは、澱粉の骨格を有し、ラジカル連鎖メカニズムの原理に従って合成モノマーの側面格子を接合した製品である。今日利用できる澱粉接合ポリマーの特徴は、結合の改善、および高い粘度での澱粉１g当たり1000 gまでの水の保持能力である。これらの超吸収剤は、農業分野、例えば種子ペレットと共に、主として衛生分野、例えば、紙おむつやシートなどの製品で用いられている。
【００７７】
組換えDNA技術によって修飾した新しい澱粉の使用に関して決定的なことは、一方では、構造、水分含量、蛋白含量、脂質含量、繊維含量、灰／リン酸含量、アミロース／アミロペクチン比、相対モル重量配分、分枝程度、顆粒径、および結晶と共に形状、ならびに一方では以下の特徴となる特性：流体および吸収作用、ペースト化温度、粘度、濃化能力、可溶性、ペースト構造、透明度、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、ゲル形成能力、凍結／融解抵抗性、複合体形成能力、ヨウ素結合、薄膜形成、接着力、酵素安定性、消化性および反応性である。最も顕著な特徴は粘度である。
【００７８】
その上、本発明の植物細胞から得られた修飾澱粉を、上記の特定の応用分野に対する品質のさらなる改善が成されるよう、さらに化学修飾を施してもよい。これらの化学修飾は主として当業者には既知である。これらは特に以下によって修飾される：
−  酸処理
−  酸化および
−  エステル化（リン酸、硝酸、硫酸、キサントゲン酸、酢酸およびクエン酸澱粉の形成につながる。その他の有機酸をエステル化に用いてもよい）。
−  澱粉エーテルの形成（澱粉アルキルエーテル、O-アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、O-カルボキシメチルエーテル、N-含有澱粉エーテル、S-含有澱粉エーテル）
−  分枝澱粉の形成
−  澱粉接合ポリマーの形成。
本発明はまた、この繁殖材料が本発明の植物細胞を含む、種子、果実、挿し木、塊茎、または根茎のような本発明の植物の繁殖材料にも関する。
【００７９】
寄託物
本発明の枠組みにおいて産生されたおよび／または用いられたプラスミドは、特許手続きの目的のための微生物保管の国際承認に関するブダペスト条約の規定に従って、国際的に認められた保管官庁である、ドイツ連邦共和国のブランズウィックにある「ドイツ微生物収集所(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen)( DSM)」に寄託されている（寄託番号；寄託日）。
プラスミドpBinAR Hyg (DSM 9505) (10/20/94)
プラスミドp33-anti-BE (DSM 6146) (08/20/90)
プラスミドpRL2 (DSM 10225) (09/04/95)  
【００８０】
使用培地および溶液
溶出緩衝液：    25 mM  トリス pH 8.3
250 mM  グリシン
透析緩衝液：    50 mM  トリス塩酸  pH 7.0
50 mM  NaCl
２ mM  EDTA
14.7 mM  β-メルカプトエタノール
0.5 mM  PMSF
蛋白質緩衝液：  50 mM  リン酸ナトリウム緩衝液  pH 7.2
10 mM  EDTA
0.5 mM  PMSF
14.7 mM  β-メルカプトエタノール
ルゴール液：    12 g   KI
６ g   I２
ddH２Oを加えて全量を1.8 Lとする
20×SSC       175.3g   塩化ナトリウム  
88.2g   クエン酸ナトリウム  
超純水で1000 mlとする
10N 水酸化ナトリウムでpH 7.0に調整
10×MEN       200 mM   MOPS  
50 mM   酢酸ナトリウム  
10 mM   EDTA  
pH 7.0
NSEB緩衝液    0.25 M   リン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.2  
7％   SDS    
1 mM   EDTA  
1％   BSA  （重量／体積）
【００８１】
実施例により本発明を説明する。
１. クローニング
大腸菌におけるクローニングに関しては、ベクターpBluescriptSKを用いた。
植物の形質転換のために、遺伝子構築物をバイナリーベクターpBinAR(HofgenおよびWillmitzer, Plamt Sci. 66(1990), 221〜230)およびB33-Hygにクローニングした。
【００８２】
２.細菌の菌株
BluescriptベクターならびにpBinARおよびB33-Hyg構築物については、大腸菌菌株DH5α（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburgh, USA）を使用した。
ジャガイモ植物体の形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1 pGV2260株（Debleareら、Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777:4788）を用いて行った。
【００８３】
３.アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Agrobacterium tumefaciens）の形質転換
DNAのトランスファーはホフゲン（Hofgen）およびウィルミッツァー（Willmitzer）の方法（Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877）を用いて直接形質転換により行った。形質転換されたアグロバクテリアのプラスミドDNAはバーンボイム（Birnboim）およびドリー（Doly）の方法（Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523）を用いて単離し、適当な制限酵素消化により切断し、電気泳動により解析した。
【００８４】
4.ジャガイモの形質転換
メスで傷をつけた、無菌培養ジャガイモ培養物（ソラナム・ツベロサム・L（Solanum tuberosum L）品種名Desiree）の小型の葉10枚を、2％ショ糖を含むMS培地（Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15 (1962), 473〜497）10 mlで処理した。培地には、選択下で終夜培養したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）50 μlが含まれていた。３〜５分緩やかに振とうさせた後、暗所でさらに２日間培養した。その後、葉を1.6％グルコース、5 mg/ｌナフチル酢酸、0.2 mg/ｌベンジルアミノプリン、250 mg/ｌクラフォラン、50 mg/ｌカナマイシンもしくは1 mg/ｌハイグロマイシンBおよび0.80％バクトアガー（Bacto Agar）を含むMS培地に置いてカルスを誘導した。25℃および3000ルクスで１週間培養後、葉を1.6％グルコース、1.4 mg/ｌゼアチンリブロース、20 mg/ｌナフチル酢酸、20 mg/ｌジベレリン酸、250 mg/ｌクラフォラン、50 mg/ｌカナマイシンもしくは3 mg/ｌハイグロマイシンBおよび0.80％バクトアガーを含むMS培地に置き、苗条を誘導した。
【００８５】
５.DNA断片の放射性標識化
DNA断片の放射性標識化は、ベーリンガー社(Boehringer)（ドイツ）のDNAランダムプライマーラベリングキットを用い、製造者による指示に従って行った。
【００８６】
６.ノーザンブロット解析
RNAは標準的なプロトコルに従って葉組織から抽出した。50 μgのRNAをアガロースゲル上で分離した（1.5％アガロース、1×MEN緩衝液、16.6％ホルムアルデヒド）。泳動後、ゲルを簡単に水洗した。RNAは、20×SSCを用い、ブロッティング法によりハイボンドNタイプのナイロンメンブレン（アマシャム、英国）に転写した。つぎにメンブレンを減圧下で80℃2時間、乾熱処理した。メンブレンをNSEB緩衝液中で68℃で2時間プレハイブリダイゼーションし、つづいて放射性標識したプローブの存在下、NSEB緩衝液中で68℃で１晩ハイブリダイゼーションした。
【００８７】
７.植物の維持管理
ジャガイモ植物体を温室中、以下の条件で保持した：
明期  22℃、2500ルクスで16時間
暗期  15℃、8時間
空中湿度  60％。
【００８８】
８. ジャガイモ植物から得られた澱粉におけるアミロース／アミロペクチン比の決定。
澱粉は定法に従ってジャガイモ植物体から単離し、アミロース／アミロペクチン比は、ホーベンカンプ-ハーメリンクら（Hovenkamp-Hermelink）（Potato Research 31（1988）241〜246）の記載の方法に従って測定した。
【００８９】
９. ブドウ糖、果糖、および蔗糖の定量
ブドウ糖、果糖および／または蔗糖含量を測定するためには、ジャガイモ塊茎の小片（直径約10 mm）を液体窒素中で凍結させ、その後10 mM HEPES pH 7.5；80％（vol./vol.）エタノール0.5 mLで80℃で30分抽出する。可溶性成分を含む上清を採取し、容量を求める。上清は可溶性糖の量を決定するために用いる。可溶性ブドウ糖、果糖、および蔗糖の定量は以下の組成物を含む反応混合液中で行う：
100.0 mM  イミダゾール／塩酸、pH 6.9
1.5 mM  MgCl２
0.5 mM  NADP＋
1.3 mM  ATP
10〜50 μL  試料
1.0 U   酵母由来のグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
反応混合液を室温で５分インキュベートする。次に、糖の定量は、以下のものを連続的に加えた後、標準的な測光法によって340 nmでの吸光度を測定することによって、実施する：
酵母由来のヘキソキナーゼ1.0単位（ブドウ糖の定量用）
酵母由来のフォスフォグルコイソメラーゼ1.0単位（果糖の定量用）
酵母由来のインベルターゼ1.0単位（蔗糖の定量用）。
【実施例１】
【００９０】
ジャガイモ澱粉からの澱粉顆粒結合型蛋白質の単離
ジャガイモ澱粉からの澱粉顆粒結合型蛋白質の単離は、「モデル422電気溶出器」（バイオラッド・ラボラトリーズインク、USA）と類似の構成であるが、容量がかなり大きい（約200 ml）溶出器での電気溶出によって実施した。乾燥澱粉25 gを溶出緩衝液に溶解した（最終容量80 ml）。この澱粉は、ジャガイモ由来の澱粉顆粒結合型澱粉シンターゼI（GBSS I）をコードするDNA配列のアンチセンス発現のため、ほとんどアミロースを含まない澱粉を産生するジャガイモに由来した。懸濁液を水浴中で70〜80℃に加熱した。次に、尿素72.07 gを加え（最終濃度８ M）、溶出緩衝液で全量を180 mlとした。絶えず攪拌すると澱粉は溶解し、ペースト状の粘稠度が得られた。溶出器具によって蛋白質を溶液から一晩電気溶出した（100 V；50〜60 mA）。溶出蛋白質は注意深く器具から除去した。懸濁粒子を短時間遠心して除去した。上清を４℃で１時間、透析緩衝液に対して透析し、これを２〜３回行った。その後、蛋白質溶液の容量を測定した。硫酸アンモニウム（最終濃度90％）を加えることによって蛋白質を沈殿させ、これは０℃で絶えず攪拌しながら行った。沈殿した蛋白質を遠心によってペレットにし、蛋白質緩衝液に再懸濁した。
【実施例２】
【００９１】
澱粉顆粒結合型蛋白質をコードするcDNA配列の同定および単離
実施例１によって単離した蛋白質を用いて、澱粉顆粒結合型蛋白質を特異的に認識するウサギ由来のポリクローナル抗体を産生した。
そのような抗体によって、次に定法を用いて、澱粉顆粒結合型蛋白質をコードする配列に関してcDNA発現ライブラリをスクリーニングした。
発現ライブラリは以下のように作製した：
ポリ（A＋）-mRNAを「ベロリナ」品種のジャガイモ塊茎から単離した。ポリ（A＋）-mRNAから開始して、cDNAは、Xho I-オリゴd(t)１８プライマーを用いて、ガブラー&ホフマン法（Gubler and Hoffmann）（Gene 25（1983）、263〜269）に従って産生した。EcoR I-リンカーを加えた後このcDNAをXho Iで切断し、EcoR IおよびXho Iで切断したラムダZAP IIベクター（ストラタジーン）に指向方向にライゲーションした。そのように構築されたcDNAライブラリの約500,000プラークを、澱粉顆粒結合型蛋白質に対するポリクローナル抗体によって認識される配列に関してスクリーニングした。
【００９２】
ファージプラークを分析するため、これらを10 mM IPTG溶液で30〜60分予めインキュベートして、その後濾紙上で乾燥させたニトロセルロースフィルターにトランスファーした。トランスファーは37℃で３時間行った。次にフィルターをブロック試薬と共に室温で30分インキュベートし、TBST緩衝液中で５〜10分洗浄した。フィルターを、澱粉顆粒結合型蛋白質に対するポリクローナル抗体の適当な希釈液と共に室温で１時間、または４℃で16時間振とうした。ポリクローナル抗体によって認識される蛋白質を発現するプラークの同定は、製造元の指示に従って、「ウサギ抗体のブロッティング検出キットRPN 23」（アマシャム、UK）によって実施した。
ポリクローナル抗体によって認識される蛋白質を発現しているcDNAライブラリのファージクローンは、定法を用いることによってさらに精製した。
インビトロ切除法によって、対応するcDNAインサートと共に二本鎖pBluescriptプラスミドを含む陽性ファージクローンから大腸菌クローンを得た。インサートのサイズおよび制限パターンをチェックした後、適当なクローン、pRL1をさらに分析した。
【実施例３】
【００９３】
プラスミドpRL1のcDNAインサートの配列分析
実施例２によって得られた大腸菌クローンからプラスミドpRL1を単離し、そのcDNAインサートの配列の一部を、ジデスオキシヌクレオチド法（サンガーら（Sanger）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463〜5467）を用いた標準的技法によって決定した。インサートの長さは約2450 bpである。それに由来するアミノ酸配列と共にヌクレオチド配列の一部を、配列番号：３および配列番号：４に示す。
配列分析および既知のDNA配列との配列比較により、配列番号：３に示す配列は新規で、これまでに知られているDNA配列との有意な相同性を示さないことが示された。その上、配列分析は、cDNAインサートが、５'-末端でのコード領域の一部が欠失している部分的cDNAに過ぎないことを示した。
【実施例４】
【００９４】
ソラナム・ツベロッッサム（Solanum tuberosum）由来の澱粉顆粒結合型蛋白質をコードする完全なcDNAの同定および単離
プラスミドpRL1の部分的cDNAインサートに対応する完全なcDNAを単離するために、さらなるcDNAライブラリを作製した。これは、以下のように構築されたジャガイモ由来の保護細胞特異的cDNAライブラリであった。
【００９５】
まず、温室に保たれた６週令のジャガイモ植物の葉約60枚を採取することによって、本質的にヘドリッチら（Hedrich）の方法（Plant Physiol.89（1989）、148）に従って、「Desiree」種のジャガイモ植物の葉から表皮断片を産生した。中心葉脈を葉から除去した。次に葉を大きい「ワーリングブレンダー」（容量１ L）を用いて最高レベルで冷蒸留水中で各15秒間４回破砕した。懸濁液をメッシュサイズ220 μmのナイロンメッシュ（ナイボルト、チューリッヒ、スイス）に通して、冷蒸留水で数回洗浄した。懸濁液そのものを220 μmナイロンメッシュで濾過し、冷蒸留水で十分に洗浄した。残査（表皮断片）は、より小さい「ワーリングブレンダー」（容量250 ml）を用いてより低いレベルで蒸留水および氷で４回各15秒間破砕した。懸濁液を220 μmナイロンメッシュで濾過し、冷蒸留水で十分に洗浄した。顕微鏡下で表皮断片（残査）の葉肉細胞の混入を調べた。混入が認められれば、小さい「ワーリングブレンダー」で破砕工程を繰り返した。
【００９６】
表皮断片の保護細胞の破壊は、冷却モルタル中の液体窒素中で約２時間微粉にすることによって実施した。保護細胞の破壊を調べるため、定期的に試料を採取して顕微鏡で調べた。２時間後、または十分量の保護細胞が破壊されれば、得られた粉末を反応チューブ（容量50 ml）に加え、１容量のGTC緩衝液中に再懸濁した（チャーギンら（Chirgwin）、Biochem. 18（1979）、5294〜5299）。懸濁液を遠心して上清をミラクロス（カルビオケム、ラホヤ、カリフォルニア）で濾過した。濾液をグリシンら（Glisin）（Biochemistry 13（1974）、2633〜2637）およびモルネックスら（Mornex）（J.Clin.Inves. 77（1986）、1952〜1961）において記述のように16時間超遠心した。遠心後、RNA沈殿物をGTC緩衝液250 μLに溶解した。RNAは、１ M酢酸0.05容量およびエタノール0.7容量を加えて沈殿させた。RNAを遠心によって沈殿させ、沈殿物を３ M酢酸ナトリウム（pH 4.8）および70％エタノールで洗浄した。RNAを手早く乾燥させ、DEPC処置水に溶解した。
【００９７】
ポリA＋-RNAは、定法に従って単離RNAから単離した。ポリ（A＋）-mRNAから開始して、Xho I-オリゴd(t)１８プライマーを用いて、cDNAをガブラー&ホフマン法（Gubler and Hoffmann）（Gene 25（1983）、263〜269）に従って産生した。EcoR I-リンカーを加えた後このcDNAをXho Iで切断し、EcoR IおよびXho Iで切断したラムダZAP IIベクター（ストラタジーンGmbH、ハイデルベルク、ドイツ）に指向方向にライゲーションした。ファージヘッドでのパッケージングは、製造元の指示に従って、ギガパックIIゴールドキット（ストラタジーンGmbH、ハイデルベルク、ドイツ）を用いて実施した。
【００９８】
そのようなcDNAライブラリから、pRL1プラスミドのcDNAインサートとハイブリダイズするファージクローンを定法によって単離精製した。インビボ切除法を用いて、対応するcDNAインサートと共に二本鎖pBuescriptプラスミドを含む陽性ファージクローンから大腸菌クローンを得た。インサートのサイズおよび制限パターンをチェックした後、適当なクローンの制限マッピングおよび配列分析を行った。適当なクローンから、ジャガイモ由来の澱粉顆粒結合型蛋白質をコードする完全なcDNAを含むプラスミドpRL2（DSM 10225）を単離した。
【実施例５】
【００９９】
pRL2プラスミドのcDNAインサートの配列分析
pRL2プラスミドのcDNAインサートのヌクレオチド配列は実施例３に記述のように決定した。インサートの長さは4856 bpである。ヌクレオチド配列と共にそれに由来するアミノ酸配列を、配列番号：１および／または配列番号：２に示す。以降、対応する遺伝子をRL-遺伝子と呼ぶ。
【実施例６】
【０１００】
プラスミドp35S-anti-RLの構築およびジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドの導入
制限エンドヌクレアーゼAsp718によって、長さが約1800 bpのDNA断片をpRL1から単離した。これは配列番号：３に示すDNA配列に対応し、オープンリーディングフレームの一部を含む。この断片をAsp718で切断したバイナリベクターpBinARにライゲーションした（ホフゲン&ウィルミッツァー（Hofgen and Willmitzer）、Plant Sci.66（1990）、221〜230）。これはバイナリベクターpBin19の誘導体である（ビーバン（Bevan）、Nucl.Acids.Res.12（1984）、8711〜9821）。pBinARは以下のように構築する：
カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（フランクら（Franck）、Cell 21（1980）、285〜294）のヌクレオチド6909〜7437を含む長さ529 bpの断片を、EcoR I/Kpn I断片としてプラスミドpDH51（ピエトルザックら（Pietrzak）、Nucl.Acids.Res. 14、5857〜5868）から単離し、pBin19ポリリンカーのEcoR IとKpn I部位の間にライゲーションした。これにより、プラスミドpBin19-Aが得られた。
【０１０１】
制限エンドヌクレアーゼPvu IIおよびHind IIIによって、長さ192 bpの断片をTi-プラスミドpTiACH5（ギーレンら（Gielen）、EMBO J. 3、835〜846）のT-DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナルを含むプラスミドpAGV40（ヘレラ-エストレラら（Herrera-Estrella）、Nature 303、209〜213）から単離した（ヌクレオチド11749〜11939）。Sph IリンカーをPvu I部位に加えた後、断片をpBin19-AのSph IとHind III部位の間にライゲーションした。これによりプラスミドpBinARが得られた。
【０１０２】
制限および配列分析によって、pRL1からのcDNAインサートのコード領域の一部が35Sプロモーターとアンチセンス方向に結合するようにDNA断片がベクターにインサートされている組み替えベクターを同定した。得られたプラスミドp35S-anti-RLを図１に示す。
【０１０３】
cDNA断片をインサートすることによって、断片A、B、およびCを含む発現カセットを産生する：
断片A（529 bp）は、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーターを含む。断片BはCaMVのヌクレオチド6909〜7437を含む（フランクら（Franck）、Cell 21（1980）、285〜294）。
【０１０４】
隣接領域は別として、断片BはプラスミドpRL1からのcDNAインサートの蛋白質コード領域の一部を含む。これは上記のようにpRL1のAsp718断片として単離され、35Sプロモーターにアンチセンス方向に融合した（ギーレンら（Gielen）、EMBO J. 3（1984）、835〜846）。
【０１０５】
プラスミドp35S-アンチ-RLのサイズは約12.8 kbである。プラスミドは、上記のように、アグロバクテリウム媒介形質転換によってジャガイモ植物にトランスファーされた。形質転換細胞から完全な植物体を再生させた。形質転換植物は、温室条件下で栽培した。cDNAに相補的な転写物の消失に関するノザンブロット分析において総RNAの分析によって、植物の遺伝子修飾の成否を評価した。この目的のため、定法に従って総RNAを形質転換植物の葉から単離し、その後アガロースゲル上で電気泳動的に分離した。次に、これをナイロン膜にトランスファーし、配列番号：１に示す配列またはその一部を有する放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。ノザンブロット分析では、形質転換植物の約５〜10％において、配列番号：１の特異的転写物を示すバンドが消失していた。植物は澱粉の性質の分析に用いた。
【実施例７】
【０１０６】
プラスミドpB33-anti-RLの構築およびジャガイモ植物のゲノムへのプラスミドの導入
制限エンドヌクレアーゼAsp718によって、cDNAインサートのオープンリーディングフレームの一部を含む長さ約1800 bpのDNA断片をプラスミドpRL1から単離し、Asp718で切断したベクターp33-Hygにライゲーションした。このベクターは以下のように構築された：
制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびAsp718によって、35SプロモーターをpBinAR Hygベクター（DSM 9505）から除去した。B33プロモーターを含む約1526 bpの長さの断片を、EcoR IおよびAsp718によってプラスミドp33-anti-BE（DSM 6146）から単離し、EcoR IおよびAsp718で切断したpBinAR Hygベクター（DSM 9505）にインサートした。
【０１０７】
cDNA断片をp33-HygプラスミドのAsp718部位にインサートすることによって、以下の断片A、BおよびCを含む発現カセットを産生する（図４）：
断片Aはジャガイモ（Solanum tuberosum）由来のB33プロモーターを含む（欧州特許第3775 092号；ロチャソサら（Rocha-Sosa）、EMBO J. 8（1989）、23〜29）。
【０１０８】
隣接領域は別として、断片BはpRL1プラスミドのcDNAインサートの蛋白質コード領域の一部を含む。これは、上記のようにpRL1からのAsp718断片として単離され、B33-HygにおいてB33プロモーターにアンチセンス方向に融合した。
【０１０９】
断片C（192 bp）は、Ti-プラスミドpTiACH5（ギーレンら（Gielen）、EMBO J. 3（1984）、835〜846）のT-DNAの遺伝子３のポリアデニル化シグナルを含む。
【０１１０】
プラスミドp33-anti-RLのサイズは約12.8 kbである。上記のように、アグロバクテリウム媒介形質転換によってプラスミドをジャガイモ植物にトランスファーした。形質転換細胞から完全な植物体を再生させた。形質転換細胞は温室条件下で栽培した。cDNAに相補的な転写物の消失に関するノザンブロット分析において総RNAの分析によって、植物の遺伝子修飾の成否を評価した。この目的のため、定法に従って総RNAを形質転換植物の塊茎から単離し、その後アガロースゲル上で電気泳動的に分離した。次に、これをナイロン膜にトランスファーし、配列番号：１に示す配列またはその一部を有する放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。ノザンブロット分析では、形質転換植物の約５〜10％において、本発明のcDNAとハイブリダイズする転写物を示すバンドが消失していた。これらの植物から、実施例８に記述のように塊茎から澱粉を単離し、分析した。
【実施例８】
【０１１１】
形質転換ジャガイモ植物の分析
実施例６および実施例７によって形質転換したジャガイモ植物は、合成された澱粉の特性に関して調べた。プラスミドp35S-anti-RLまたはプラスミドpB33-anti-RLによって形質転換し、ノザンブロット分析では、本発明のDNA配列とハイブリダイズする転写物を示すバンドを示さなかったジャガイモ植物の様々な株について分析を行った。
【０１１２】
a)  澱粉水溶液の粘度の決定
形質転換したジャガイモ植物において合成された澱粉水溶液の粘度を測定するため、定法を用いてプラスミドp35S-anti-RLまたはプラスミドpB33-anti-RLによって形質転換した植物の塊茎から澱粉を単離した。澱粉30 gをそれぞれ水450 mlに溶解し、Eビスコグラフ（ブラベンダーOHGデュースブルグ（ドイツ））での分析に用いた。装置は製造元の指示に従って使用した。澱粉水溶液の粘度を求めるためには、まず澱粉懸濁液を３℃／分の速度で50℃から96℃に加熱した。その後、温度を96℃で30分維持した。次に溶液を96℃から50℃に３℃／分の速度で冷却した。全工程の間、粘度を測定した。そのような測定の代表的な結果を、図３、４および５に時間に対する粘度を示すグラフの形で示す。図３は、ジャガイモ品種デジレ（Desiree）の野生型植物から単離された澱粉のブラベンダーグラフを示す。図４および５は、プラスミドp35S-anti-RLまたはプラスミドpB33-anti-RLによって形質転換したジャガイモ植物から単離した澱粉の典型的なブラベンダー曲線を示す。
【０１１３】
野生型植物の特徴的な値は以下の通りである：
【表１】
2008173128.tif 000002
値は異なる２回の測定から得られた値の平均値である。
表１および以下の表２および３において、略語は以下を表す：
A： ペースト化開始
B： 最大粘度
C： 96℃期間の開始
D： 冷却期間の開始
E： 冷却期間の終了
F： 最終50℃期間の終了
【０１１４】
プラスミドp35S-anti-RLで形質転換した植物（株P2）に関しては、特徴的な値は以下の通りである：
【表２】
2008173128.tif 000003
【０１１５】
プラスミドpB33-anti-RLで形質転換した植物（株P3）に関しては、特徴的な値は以下の通りである：
【表３】
2008173128.tif 000004
【０１１６】
図３、４および５は、形質転換植物から得られた澱粉が、特に加熱時の粘度の増加は非常に僅かに過ぎないという点において野生型植物の澱粉とは異なることを明白に示している。このように、加熱時に形質転換植物由来の修飾澱粉の最大粘度は野生型澱粉の場合の50％以上低い。
一方、冷却時には、形質転換植物から単離した澱粉の粘度は野生型植物の場合より増加する。
【０１１７】
b)  澱粉のリン酸含量の測定
澱粉のリン酸含量は、グルコース残基のC-6-位に結合したリン酸量を測定することによって決定した。この目的のため、まず、澱粉を酸加水分解によって分解し、次にグルコース-6-リン酸含量を、以下に記述するような酵素試験によって測定した。
澱粉100 mgを0.7 N HCl 500 μLと共に100℃で４時間インキュベートした。酸加水分解後、反応液10 μLをイミダゾール緩衝液（100 mMイミダゾール、５ mM MgCl２、pH 6.9、0.4 mMNAD＋）600 μLに加えた。反応混合液中のグルコース-6-リン酸含量は、酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼによる変換によって測定した。この目的のため、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ１ U（ロイコノストック・メセンテロイデス由来（ベーリンガー・マンハイム））を反応混合液に加え、産生されたNADHを340 nmでの吸収の測定によって求めた。
【０１１８】
プラスミドp35S-anti-RLで形質転換したトランスジェニックジャガイモ植物の２つの株（P1（35S-anti-RL）；P2（35S-anti-RL））と共に、品種デジレ（Desiree）の非形質転換ジャガイモ植物の澱粉１ mg中のグルコース-6-リン酸含量を以下の表に示す。
【表４】
2008173128.tif 000005
【０１１９】
以下の表は、非形質転換植物（ジャガイモ品種デジレ（Desiree））由来の澱粉と比較して、プラスミドpB33-anti-RLで形質転換したジャガイモ植物における澱粉１ mg当たりのグルコース-6-リン酸含量を示す。
【表５】
2008173128.tif 000006
植物７、37、45および31は、プラスミドpB33-anti-RLで形質転換した独立形質転換株を表す。植物37は、ブラベンダーグラフを図５にプロットする株P3を表す。
この値は、トランスジェニックジャガイモ植物由来の修飾澱粉のリン酸含量が、野生型植物の澱粉と比較して少なくとも50％少ないことを示している。
【０１２０】
c)  ４℃で保存後の塊茎のブドウ糖、果糖、および蔗糖含量の測定
野生型植物の塊茎と共に、アンチセンス構築物p35S-anti-RLで形質転換した様々なトランスジェニック株からの植物の塊茎を４℃で保存またはそれぞれ、20℃の暗所で２ヶ月間保存した。その後、ブドウ糖、果糖、および蔗糖量を上記のように測定した。２つのトランスジェニック株に関して、得られた代表的な値は以下の通りであった：
【表６】
2008173128.tif 000007
表中の数値はμmolヘキソースまたは蔗糖/g新鮮重量で表す。
【０１２１】
表６の値から、塊茎における還元糖の蓄積は、４℃で保存したトランスジェニック植物では、野生型植物よりかなり低い。
概して、トランスジェニックジャガイモ植物から単離した修飾澱粉は、トウモロコシの野生型植物由来の澱粉に類似している。しかし、比較すると、その味は淡く、したがって食品領域での多様な利用により適しているという長所を有する。
【実施例９】
【０１２２】
大腸菌におけるpRL2プラスミドのcDNAインサートの発現
(a)  細菌細胞の形質転換
プラスミドpRL2のcDNAインサートを発現させるために、大腸菌株DH5α細胞をまず、pACACプラスミドで形質転換する。このプラスミドは、lac Zプロモーターの調節下で、大腸菌由来のADP-グルコース-ピロフォスフォリラーゼ（AGPアーゼ）をコードするDNA断片を含む。この断片は、サイズ約1.7 kbのDraI/HaeII断片としてベクターpEcA-15から単離され（ミューラー-レーバー（Muler-Rober）（1992）学位論文、FUベルリン参照）、その粘着末端を塞いだ後これをHindIIIで直線にしたpACAC184ベクターにクローニングした。AGPアーゼの発現は、形質転換した大腸菌細胞においてグリコーゲン合成の増加を引き起こすことである。そのように形質転換した細胞は以降、大腸菌-K1-細胞と呼ぶ。
プラスミドpRL2のcDNAによってコードされる蛋白質の酵素活性を測定するため、大腸菌-K1-細胞をpRL2プラスミドで形質転換した。pRL2プラスミドと共にpACACプラスミドを含む形質転換大腸菌細胞は以降、大腸菌-K2-細胞と呼ぶ。プラスミドDNAの細菌細胞へのトランスファーは、ハナハン法（Hanahan）（J. Mol. Biol. 166（1983）、557〜580）に従って実施した。形質転換した大腸菌細胞を、以下の組成からなる寒天培養皿上に播種した。
YT培地は以下を含む：
1.5％      バクトアガー
50 mM      リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.2
１％       ブドウ糖
10 μg/ml  クロラムフェニコール（大腸菌K1細胞の場合）
または
10 μg/ml  クロラムフェニコール  および
10 μg/ml  アンピシリン（大腸菌K2細胞の場合）。
プラスミドpRL2＋pACACで形質転換したDH5α系の大腸菌細胞（大腸菌-K2-細胞）および同様に−対照として−pACACプラスミドのみで形質転換した大腸菌細胞（大腸菌-K1-細胞）を寒天皿上で培養した。以下に記述するように、様々な培養から形成されたグリコーゲンのリン酸化の程度（ブドウ糖分子のC-6位）を調べた。
【０１２３】
（b）  細菌グリコーゲンの単離
細菌グリコーゲンを単離するため、形質転換後増殖する細菌コロニーを、各皿のYT培地５ mlを含む各６枚の寒天皿（Φ135 mm）に浮遊させた。細菌懸濁液を4500×gで５分遠心した。細菌沈殿物をYT培地10 mlに再懸濁した。細菌の破壊は、破壊培地（0.2 N NaOH；１％SDS）２容量を加え、室温で５分インキュベートすることによって実施した。無水EtOH３容量を加え、４℃で30分インキュベートし、その後8000×gで15分遠心することによって、グリコーゲンを沈殿させた。次に沈殿物を70％EtOH 100 mlで洗浄し、再度遠心工程（8000×gで10分）によって沈殿させた。洗浄技法は４回繰り返した。
【０１２４】
（c）  総グリコーゲン含量の測定
単離および沈殿したグリコーゲンはまず、酸加水分解（沈殿物を0.7 N HCl２ mLに溶解し；100℃で４時間インキュベートする）によってブドウ糖単分子に分解した。溶液のブドウ糖含量は、製造元（ベーリンガー・マンハイム）の指示に従って、澱粉試験の酵素反応と波長340 nmでの測光計（コントロン）の組み合わせによって測定した。
反応緩衝液は以下を含む：
100 mM     MOPS、pH 7.5
10 mM     MgCl２
２ mM     EDTA
0.25 mM     NADP
１ mM     ATP
１ U/ml     グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
２ U/ml     ヘキソキナーゼ
測定は、10 μLブドウ糖溶液で25℃で実施した。
【０１２５】
（d）  グルコース-6-リン酸含量の測定
C-6位でリン酸化されたブドウ糖分子の程度を決定するため、様々な細菌培養のブドウ糖の等量を用いた。グリコーゲンに等容量の0.7 N KOHを加えて、酸加水分解（上記のように）によってグリコーゲンをそのブドウ糖分子へと分解し、溶液を中和した。
反応緩衝液は以下を含む：
100 mM     MOPS、pH 7.5
10 mM     MgCl２
２ mM     EDTA
0.25 mM     NADP
２ U/ml     グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ
測定は、ブドウ糖溶液100〜150 μLで25℃で実施した。
【０１２６】
（e）  細菌グリコーゲンをリン酸化する酵素活性の同定
細菌細胞において合成されたグリコーゲンのリン酸含量の測定結果は、pACAC＋pRL2プラスミドで形質転換した大腸菌細胞のグリコーゲンは、対照（pACYCプラスミドで形質転換した大腸菌細胞）反応と比較して、ブドウ糖のC-6位でのリン酸化の290±25％増加を示す（以下の表参照）。
大腸菌細胞              グルコース-6-リン酸：グリコーゲン中のブドウ糖
大腸菌-K1               １：（4600±1150）
大腸菌-K2               １：（1570± 390）
本明細書に示すリン酸化の程度は、６個の独立した形質転換およびグリコーゲン単離から始めて少なくとも６回測定の平均値である。
【実施例１０】
【０１２７】
プラスミドp35S-anti-RLとプラスミドp35SH-anti-BEのジャガイモ植物のゲノムへの同時組み込み
プラスミドp35S-anti-RLは実施例６に記述のように構築した。プラスミドp35SH-anti-BEは、出願国際公開公報第95/07355号、実施例３に記述したように構築した。いずれのプラスミドも、上記のようにアグロバクテリウム媒介形質転換によってジャガイモ植物に連続的にトランスファーした。この目的のため、プラスミドp35SH-anti-BEをまず、ジャガイモ植物に形質転換した。完全な植物体を再生させて、分枝酵素遺伝子発現が減少した植物を選択した。その後、分枝酵素の発現の減少を既に示しているトランスジェニック植物に、プラスミドp35S-anti-RLを形質転換した。形質転換細胞から、トランスジェニック植物を再度再生し、形質転換植物を温室条件下で栽培した。分枝酵素cDNAまたはRL cDNAに対して相補的な転写物の消失を調べるRNAブロット分析において、総RNAを分析することにより、RL遺伝子の発現の高度減少と共に分枝酵素遺伝子の発現の高度減少に関する植物の遺伝子修飾の成否を評価した。この目的のため、記述の方法に従って総RNAを形質転換植物の葉から単離し、次にゲル電気泳動によって分離して、膜にトランスファーし、配列番号：１に示す配列またはその一部を示す放射性標識プローブとハイブリダイズさせ、次に分枝酵素cDNAの配列（国際公開公報第92/14827号、実施例１）またはその一部を示す放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。RNAブロット分析では、形質転換植物の約５〜10％において、分枝酵素cDNAの特異的転写物を示すバンド（国際公開公報第92/14827号参照）と共に、配列番号：１に示す配列の特異的転写物を示すバンドが消失していた。R4植物と命名されるこれらの植物を用いて、塊茎に含まれる澱粉の品質を分析した。
【実施例１１】
【０１２８】
プラスミドpB33-anti-RLとプラスミドpB33-anti-GBSS Iのジャガイモ植物のゲノムへの同時組み込み
プラスミドpB33-anti-RLは実施例７に記述のように構築した。プラスミドpB33-anti-GBSS Iは以下のように構築した：
ジャガイモ（Solanum tuberosum）のヌクレオチド-1512〜+14（ロシャソサら（Rocha-Sosa）、EMBO J.8（1989）、23〜29）を含むパラチンクラスI遺伝子B33のプロモーター領域のDraI/DRaI断片を、pUC19プラスミドのSmaI部位にライゲーションした。得られたプラスミドから、プロモーター断片をEcoRI/HindIII断片としてpBin19プラスミド（ビーバン（Bevan）、Nucleic Acids Research 12（1984）、8711〜8721）のポリリンカー領域にライゲーションした。続いてジャガイモ（Solanum tuberosum）のGBSS I遺伝子の３'EcoRI断片（ヘルゲルスベルク（Hergersberg）、学位論文（1988）、ケルン大学）を得られたプラスミドのEcoRI部位にライゲーションした。
【０１２９】
両プラスミドを、実施例10に記述のように、アグロバクテリウム媒介形質転換によってジャガイモ植物に連続的にトランスファーした。形質転換細胞から、完全な植物体を再生させ、形質転換植物を温室条件下で栽培した。２つのcDNAに相補的な転写物の消失を調べるRNAブロット分析において、完全なRNAの分析によって、植物の遺伝子修飾の成否を評価した。この目的のため、定法によって形質転換植物の塊茎から総RNAを単離し、その後ゲル電気泳動によってアガロースゲル上で分離し、膜にトランスファーして、配列番号：１に示す配列またはその一部を示す放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。その後、同じ膜を、GBSS I遺伝子またはこの配列の一部（ヘルゲルスベルク（Hergersberg）、学位論文（1988）、ケルン大学）を有する放射性標識プローブとハイブリダイズさせた。RNAブロット分析では、形質転換植物の約５〜10％において、本発明のcDNAまたはGBSS I cDNAとハイブリダイズする転写物を示すバンドが消失していた。R3植物と命名されたこれらの植物の塊茎から、澱粉を単離して分析した。
【実施例１２】
【０１３０】
R4植物の澱粉分析
実施例10に従って形質転換したジャガイモ植物の合成澱粉の特性を調べた。プラスミドp35S-anti-RLおよびp35SH-anti-Eで形質転換し、本発明のDNA配列またはRNAブロット分析において分枝cDNAの配列とハイブリダイズする転写物を示すバンドをもはや示さない、または極微量の形で存在するジャガイモ植物の様々な株について、分析を行った。
【０１３１】
a）  澱粉水溶液の粘度の測定
形質転換ジャガイモ植物において合成された澱粉の水溶液の粘度を測定するために、プラスミドp35S-anti-RLおよびプラスミドp35SH-anti-BEで形質転換した植物の塊茎から定法を用いて単離した。澱粉２ gをそれぞれ水25 mlに溶解し、これを用いてラピッドビスコアナライザー（ニューポートサイエンティフィックPty Ltd、投資支援グループ、ワリーウッド、NSW 2102、オーストラリア）による分析を行った。機器は製造元の指示に従って使用した。澱粉水溶液の粘度を測定するため、澱粉懸濁液をまず、12℃／分の速度で50℃から95℃に加熱した。次に温度を95℃で2.5分維持した。その後溶液を12℃／分の速度で95℃から50℃に冷却した。全ての工程において粘度を測定した。そのような測定の代表的な結果を、粘度を時間に対して示したグラフの形で表す。図６は、品種デジレ（Desiree）のジャガイモの野生型植物から単離した澱粉に対する典型的なRVAグラフを示す。線２および３はそれぞれ、プラスミドp35SH-anti-BEおよびプラスミドp35S-anti-RLで形質転換した植物の塊茎から単離した澱粉に関する典型的なRVAグラフを示す。線４は、プラスミドp35SH-anti-BEとプラスミドp35S-anti-RLで同時形質転換した植物の塊茎から単離した澱粉の典型的なRVAグラフを示す。線４は、粘度の温度依存的増加はないという特徴を有する。
【０１３２】
b）  アミロース／アミロペクチン比の決定
形質転換ジャガイモ植物の塊茎から単離した澱粉のアミロース対アミロペクチンの比を調べた。植物株R4-1（図６の線４に示す）は、70％以上のアミロース含量を示した。植物株R4-3では、アミロース含量の測定値は27％であったが、デジレ（Desiree）品種の野生型澱粉におけるアミロース含量は19〜22％の範囲であった。
【実施例１３】
【０１３３】
R3植物の澱粉分析
実施例11によって形質転換したジャガイモ植物の、合成された澱粉の特性にを調べた。プラスミドpB33-anti-RLおよびpB33-anti-GBSS Iで形質転換し、RNAブロット分析において、本発明のDNA配列またはGBSS I cDNAの配列とハイブリダイズする転写物を示すバンドをもはや示さない、またはごく微量存在するに過ぎないジャガイモ植物の様々な株について分析を行った。
【０１３４】
a）  澱粉水溶液の粘度の測定。
形質転換ジャガイモ植物において合成された澱粉水溶液の粘度を測定するため、定法を用いてプラスミドpB33-anti-RLとプラスミドpB33-anti-GBSS Iによって同時形質転換したジャガイモの塊茎から、澱粉を単離した。粘度は、実施例12（a）に記述の方法に従ってラピッドビスコアナライザーによって測定した。結果を図７に示す。線１では、図７は、デジレ（Desiree）ジャガイモ品種の野生型植物から単離した澱粉に関する典型的なRVAグラフを示す。線２および３はそれぞれ、pB33-anti-GBSS Iおよびプラスミドp35S-anti-RLによって形質転換したジャガイモ植物から単離した澱粉に関する典型的なRVAグラフを示す。線４は、pB33-anti-GBSS IとプラスミドpB33-anti-RLによって同時形質転換したジャガイモ植物から単離した澱粉の典型的なRVAグラフを示す。このグラフの特徴は、RVA処置後に得られる糊が数日間室温でインキュベートしてもほとんど老化現象を示さないという点である。
【０１３５】
b）  アミロース／アミロペクチン比の測定
形質転換ジャガイモ植物の塊茎から単離された澱粉のアミロース対アミロペクチンの比を調べた。植物株R3-5（図７の線４に示す）は、アミロース含量４％未満を示した。植物株R3-6では、アミロース含量の測定値は３％未満であった。デジレ（Desiree）品種の野生型澱粉のアミロース含量は19〜22％の範囲であった。
【０１３６】
c）  澱粉のリン酸含量の測定
澱粉のリン酸含量は、ブドウ糖残基のC-6位に結合したリン酸量の測定によって求めた。この目的のため、まず澱粉を酸加水分解によって分解し、次に、グルコース-6-リン酸含量を以下に記述するように酵素試験によって測定した。
澱粉100 mgを0.7 N HCl 500 μLと共に100℃で４時間インキュベートした。酸加水分解後、反応混合液10 μLをイミダゾール緩衝液（100 mMイミダゾール、５ mM MgCl２、pH 6.9、0.4 mMNAD＋）600 μLに加えた。調製物中のグルコース-6-リン酸含量は、酵素グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼによる変換によって測定した。この目的のため、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ１ U（ロイコノストック・メセンテロイデス由来（ベーリンガー・マンハイム））を反応混合液に加え、産生されたNADHを340 nmでの吸収の測定によって定量した。
プラスミドpB33-anti-RLとプラスミドpB33-anti-GBSS Iで同時形質転換したトランスジェニックジャガイモ植物のR3-5およびR3-6株と共に、品種デジレ（Desiree）の非形質転換ジャガイモ植物の澱粉１ mg当たりのグルコース-6-リン酸含量を以下の表に示す。比較として、プラスミドpB33-anti-GBSS Iで形質転換したいわゆるロウ質ジャガイモ（US2-10）由来の澱粉の値も同様に示す。
【表７】
2008173128.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１はプラスミドp35S-anti-RLを示す。プラスミドの構造：  A＝断片A：CaMV 35Sプロモーター、ヌクレオチド6909〜7437（フランクら（Franck）、Cell 21（1980）、285〜294）    B＝断片B：pRL1からの長さ約1949 bpのAsp718断片  プロモーターに対する方向：アンチセンス   矢印はオープンリーディングフレームの方向性を示す。    C＝断片C：Ti-プラスミドpTiACH5 T-DNAのT-DNAのヌクレオチド11748〜11939（ギーレンら（Gielen）、EMBO J.3（1984）、835〜846）
【図２】図２はプラスミドpB33-anti-RLを示す。プラスミドの構造：A＝断片A：ソラナム・ツベロッサム（Solanum tuberosum）由来のパタチン遺伝子B33のB33プロモーター（ロチャソサら（Rocha-Sosa）、EMBO J.8（1989）、23〜29）    B＝断片B：pRL1からの長さ約1949 bpのAsp718断片   プロモーターに対する方向：アンチセンス   矢印はオープンリーディングフレームの方向性を示す。    C＝断片C：Ti-プラスミドpTiACH5 T-DNAのT-DNAのヌクレオチド11748〜11939  （ギーレンら（Gielen）、EMBO J.3（1984）、835〜846）
【図３】図３は、ビスコグラフE型ブラベンダー粘度計で記録した、品種Desireeの非形質転換ジャガイモ植物（実施例８も参照）から単離された澱粉水溶液のブラベンダー曲線を示す。ここで：Drehm.  トルク、[BE]  ブラベンダー単位、Temp.   温度、A   ペースト化開始、B  最大粘度、C  96℃期間の開始、D   冷却期間の開始、E   冷却期間の終了、F   最終50℃期間の終了  を意味する。青線は粘度を示し、赤線は温度を表す。
【図４】図４は、ビスコグラフE型ブラベンダー粘度計で記録した、プラスミドp35S-anti-RLで形質転換されたジャガイモ植物から単離された澱粉水溶液のブラベンダー曲線を示す（実施例８も参照）。略語の意味に関しては図３参照。
【図５】図５は、ビスコグラフE型ブラベンダー粘度計で記録した、プラスミドpB33-anti-RLで形質転換されたジャガイモ（実施例８も参照）から単離された澱粉水溶液のブラベンダー曲線を示す。略語の意味に関しては図３参照。
【図６】図６は、ラピッドビスコアナライザーで記録された、ジャガイモ植物（実施例12も参照）から単離された澱粉水溶液の曲線を示す。赤線は温度を表し；青線１、２、３および４は以下の澱粉溶液の粘度を示す：  線１： 野生型植物から単離された澱粉、線２： 分枝酵素のみが阻害されている植物から単離された澱粉（特許出願国際 公開公報第92/14827号の実施例１参照）、線３： 本発明の蛋白質濃度のみが減少している植物から単離された澱粉（実施 例６参照）、線４： p35SH-anti-BEプラスミドと共にプラスミドp35S-anti-RLで形質転換した 植物から単離された澱粉（実施例12参照）。
【図７】図７は、ラピッドビスコアナライザーで記録された、ジャガイモ植物（実施例13も参照）から単離された澱粉水溶液の曲線を示す。赤線は温度を表し；青線１、２、３および４は以下の澱粉溶液の粘度を示す：  線１： 野生型植物から単離された澱粉、線２： プラスミドpB33-anti-GBSS Iで唯一形質転換された植物から単離された 澱粉（いわゆるロウ質ジャガイモ）、線３： プラスミドp33S-anti-RLで形質転換された植物から単離された澱粉（実 施例６参照）、線４： プラスミドpB33-anti-GBSS Iと共にプラスミドpB33-anti-RLで形質転換 した植物から単離された澱粉（実施例13参照）。  図８は、R1酵素をコードするジャガイモ由来の完全長のcDNAを含むpRL2プラスミドを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2008173128.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【配列表】
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