(57)【要約】【課題】生体試料のような複雑なサンプルの分離には、多次元液体クロマトグラフィが有効であるが、現行のいるシステム（イオン交換（ＩＥＸ）―逆相（ＲＰ）カラムを連結した２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＨＰＬＣ））では、蛋白質などのプロテオームしか応用されていない。一方、親水性の大きい成分（例えば、糖鎖や糖ペプチド）の分離分析では、上記の逆相型２次元液体クロマトグラフィの適用が困難である。【解決手段】ＩＥＸカラムとＨＩＬＬＩＣカラムを用い、アセトニトリル溶媒（５０％以上）でＨＩＬＬＩＣモードを機能させることで、ＩＥＸ−ＨＩＬＬＩＣカラムを連結したオンライン２Ｄ（ＩＥＸ−ＨＩＬＬＩＣ）ＨＰＬＣシステムで親水性の高い成分（例えば、糖鎖や糖ペプチド）の分離分析を可能にする。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の溶液を混合し送液する手段と、試料注入手段と、イオン交換による前段分離カラムおよび（順相／ヒリック）による後段分離カラムと、分離された成分を検出する一つまたは複数の検出手段から構成される液体クロマトグラフ装置において、イオン交換と（順相／ヒリック）分離モードを組み合わせて分離分析を行うことを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項２】
前記試料注入手段はグラジエントポンプであることを特徴とする請求項１記載の２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項３】
前記後段分離カラムは、親水性相互作用を持つものである特徴とする請求項１記載の２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項４】
請求項１記載の２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオン、または陰イオン交換カラムであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項５】
請求項１記載の２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオンと陰イオン交換充填剤を１本のカラムに充填したものであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項６】
請求項１記載の２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオンと陰イオン交換充填剤を１本のカラムに充填し、陽（陰）イオンと陰（陽）イオン交換カラムを直列に接続したものであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置。
【請求項７】
請求項１に記載の２次元液体クロマトグラフィ装置において、前記検出手段として質量分析計を用いることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィ装置に係わり、特に、順相及びイオン交換分離カラムを有する順相型２次元液体クロマトグラフィ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料のような複雑なサンプルの分離には、多次元液体クロマトグラフィ（ｎＤ−ＨＰＬＣ）が有効である。プロテオミックスの分野では、イオン交換（ＩＥＸ）―逆相（ＲＰ）カラムを連結した２次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＨＰＬＣ）で分離し、質量分析計（ＭＳ）でオンライン分析する方法および装置がよく使われている（非特許文献１）。
【０００３】
一方、親水性の大きい成分（例えば、糖鎖や糖ペプチド）の分離分析では、上記の逆相型２次元液体クロマトグラフィの適用が困難である。従って、イオン交換（ＩＥＸ）―逆相（ＲＰ）―順相（ＮＰ／ＨＩＬＬＩＣ）カラムを組み合わせた３次元液体クロマトグラフィ（２Ｄ−ＨＰＬＣ）が、最も分離能力が高く、よく用いられてきた（図１参照）（非特許文献２）。しかし、逆相モードと順相モードではグラヂエント溶出溶媒の組成が逆転するために（“溶離液の干渉”とも言われる）、分取、脱溶媒および濃縮、再注入を繰り返すオフライン処理が必要となり、時間と労力がかかるだけでなく、サンプルの損失や検出感度の低下を招く恐れがある。
【０００４】
【非特許文献１】Ａ．Ｊ．Ｌｉｎｋ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９）６７６．
【非特許文献２】Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６（１９９５）１３９．
【非特許文献３】Ｍ．Ａ．Ｓｔｒｅｇｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（２０００）４６２９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、イオン交換（ＩＥＸ）―順相（ＮＰ／ＨＩＬＩＣ）カラムを直列に組み合わせた２Ｄ−ＨＰＬＣを順相（ヒリック）モードで用いることにより、上記の従来型技術である逆相型２Ｄ−ＨＰＬＣや３Ｄ−ＨＰＬＣの問題点を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一般に、ＩＥＸカラムは水系で用いられるので、ＲＰカラムとの相性がよい。しかし、ＩＥＸカラムがアセトニトリル溶媒（５０％以上）、つまり、ＨＩＬＬＩＣモードでも機能することはあまり知られていなかった（非特許文献３）。本発明は、この点に注目してＩＥＸ−ＨＩＬＬＩＣカラムを連結したオンライン２Ｄ（ＩＥＸ−ＨＩＬＬＩＣ）ＨＰＬＣシステムで親水性の高い成分（例えば、糖鎖や糖ペプチド）の分離分析の実現を図るものである。
【０００７】
本発明は、特に、生体内に存在する親水性物質を分析する、液体クロマトグラフ装置において、イオン交換と順相（／ヒリック）分離モードを組み合わせて分離分析を行うものに適する２次元液体クロマトグラフィ装置を提供するものである。
【０００８】
より具体的には、本発明は、複数の溶液を混合し送液する手段（例えばグラジエントポンプ）と、試料注入手段と、前段分離カラム（例えばイオン交換を行う）および後段分離カラム（順相／ヒリック（親水性相互作用））と、分離された成分を検出する一つまたは複数の手段から構成される液体クロマトグラフ装置において、イオン交換と順相（／ヒリック）分離モードを組み合わせて分離分析を行うことを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、サンプル中の非イオン性、イオン性の親水性成分（例えば、糖鎖や糖ペプチド）の一斉分離分析をオンラインで実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の好ましい実施形態としては、前記２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオン、または陰イオン交換カラムであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置がある。また、前記２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオンと陰イオン交換充填剤を１本のカラムに充填したものであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置がある。更に、前記２次元液体クロマトグラフィ装置において、前段分離カラムが陽イオンと陰イオン交換充填剤を１本のカラムに充填し、陽（陰）イオンと陰（陽）イオン交換カラムを直列に接続したものであることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置もある。
【００１１】
そして、前記２次元液体クロマトグラフィ装置において、検出手段として質量分析計を用いることを特徴とする２次元液体クロマトグラフィ装置がある。
【００１２】
以下に、本発明の実施形態を添付図面を参照しながら説明する。
【００１３】
図１はプロテオミックスで一般的に用いられている２次元液体クロマトグラフィ装置の構成を示し、図２はイオン交換（ＤＥＡＥ），逆相、順相（ＮＰ／ＨＩＬＩＣ）カラムを組み合わせた、従来のオフライン３次元液体クロマトグラフィ装置の構成を示す。
【００１４】
図３は、本発明の第１の実施形態であり、最も単純な順相型２次元液体クロマトグラフィ装置の構成である。各構成ユニットの機能と動作原理を以下に記述する。
【００１５】
ステップ１：ポンプは、水溶液Ａおよび有機溶媒溶液Ｂを混合（Ｂの組成比が高い）し、一定流量で送液を行う。試料注入装置（ＡＳ）は、一定量の試料を高圧流路に注入する。
【００１６】
ステップ２：注入された試料中のイオン性の成分は前段のイオン交換（ＩＥＸ）カラムで保持され、非イオン性の成分は後段の順相（ＨＩＬＩＣ）カラムに保持される。
【００１７】
ステップ３：順相（ＨＩＬＬＩＣ）カラムに保持された成分を、次第に有機溶媒液Ｂの組成比下げて送液することにより、分離、溶出させる（ＨＩＬＩＣモードでのグラジエント溶出）。
【００１８】
ステップ４：高塩濃度水溶液Ｃと有機溶媒溶液Ｂを混合し、一定時間送液することにより、前段のイオン交換（ＩＥＸ）カラムに保持されていた成分を溶出させる。溶出した成分は後段の順相（ＨＩＬＬＩＣ）カラムに保持される。
【００１９】
ステップ５：ステップ３に戻る。
【００２０】
ステップ６：ステップ４−５を繰り返す。
【００２１】
図４は、ヒト血清中の２−アミノピリジン（ＰＡ）誘導体化糖鎖を上記の方法で分離分析したクロマトグラムである。検出手段としては、蛍光検出器（励起波長：３００ｎｍ、蛍光波長：４２０ｎｍ）を使用した。また、イオン交換カラム（内径２ｍｍ、長さ７５ｍｍ）としてはＤＥＡＥ（デエチルアミノエタン）型を、また、ＨＩＬＩＣカラム（内径２ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）としてはツヴィッターイオン（ＺＩＣ）型を用いている。ポンプ流量（０．２ｍｌ／ｍｉｎ）は一定である。最初の（０−６５）分までの１回目のＨＩＬＬＩＣグラジエント溶出（水／ＡＣＮ＝２０／８０３５／６５）では、中性糖鎖とＩＥＸカラムでの保持が弱いモノシアリル糖鎖が溶出し分離される（ステップ３）。（６５−７０）分間、５００ｍＭ酢酸アンモニューム（２５％）を送液することにより（ステップ４）、保持が強いジシアリル糖鎖はＤＥＡＥカラムからＺＩＣ−ＨＩＬＬＩＣカラムに移動し、（７０−１１０）分間の２回目のＨＩＬＬＩＣグラジエント溶出（水／ＡＣＮ＝２５／７５    ３５／６５）で分離分析される（ステップ５）。同様に、保持が強いトリ、テトラシアリル糖鎖も、順次分離分析が可能である（ステップ６）。このように、全体の分離分析時間は１８０分と長いが、本方法では一回の試料注入で中性からテトラシアリル糖鎖までを一斉分離することが可能となる。
【００２２】
図５は、本発明の第２の実施形態である。図３の第１の実施形態との違いは、１０方流路切り替えバルブと順相（ＨＩＬＬＩＣ）トラップカラムＡ，Ｂを追加し、２台のポンプでＩＥＸ分離カラムおよびＨＩＬＩＣトラップ＆ＨＩＬＬＩＣ分離カラムに最適な溶液組成の送液を行えるようにしたものである。各構成ユニットの機能と動作原理を以下に記述する。
【００２３】
ステップ１：ポンプ１は、水溶液Ａおよび有機溶媒溶液Ｂを混合（Ｂの組成比が高い）し、一定流量で送液を行う。試料注入装置（ＡＳ）は、一定量の試料を流路に注入する。
【００２４】
ステップ２：注入された試料中のイオン性の成分は前段のイオン交換（ＩＥＸ）カラムで保持され、非イオン性の成分は１０方バルブのＨＩＬＩＣトラップカラムＡに、一端保持される。
【００２５】
ステップ３：１０方バルブの流路を切り替えて、ＨＩＬＬＩＣトラップカラムＡに保持された成分を、ポンプ２において次第に有機溶媒溶液Ｂの組成比下げて送液することにより、分離、溶出させる（ＨＩＬＬＩＣモードでのグラジエント溶出）。この間に、ポンプ１は高塩濃度水溶液Ｃと有機溶媒溶液Ｂを混合し、一定時間送液することにより、前段のイオン交換（ＩＥＸ）カラムに保持されていた成分を溶出させ、もう一方のトラップカラムＢに保持させる。その後、水溶液Ａおよび有機溶媒溶液Ｂを混合（Ｂの組成比が高い）した溶液を、一定時間、送液を行い、トラップカラムＢ中の塩（高塩濃度水溶液Ｃ）を洗い流す。
【００２６】
ステップ４：ステップ３を繰り返す。
【００２７】
この第２の実施形態の利点は、イオン交換カラムからの溶出し使用する、塩濃度が高い溶液（Ｃ）を、ＨＩＬＬＩＣ分離カラムに導入しないようにできる点である。本方法は、検出器として質量分析計（ＭＳ）を用いる場合、検出感度、装置のメインテナンス上有効である。ただし、ＨＩＬＬＩＣトラップカラムＡ，Ｂで保持が弱い成分はドレインに流出してしまうといった欠点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】プロテオミックスで一般的に用いられている２次元液体クロマトグラフィ装置の構成を示す。
【図２】イオン交換（ＤＥＡＥ），逆相、順相（ＮＰ／ＨＩＬＩＣ）カラムを組み合わせた、従来のオフライン３次元液体クロマトグラフィ装置の構成を示す。
【図３】本発明の第１の実施形態である順相型２次元液体クロマトグラフィ装置の応用例である。
【図４】ヒト血清中の２−アミノピリジン（ＰＡ）誘導体化糖鎖を本発明の方法で分離分析したクロマトグラムである。
【図５】本発明の第２の実施形態である順相型２次元液体クロマトグラフィ装置の構成と示す。
【符号の説明】
【００２９】
Ａ…水溶液、Ｂ…有機溶媒溶液、ＡＳ…試料注入装置、ＩＥＸ…イオン交換カラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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