(57)【要約】【課題】複数の検出対象物質を同時に高感度に検出することができる蛍光性重合体微粒子セットを提供する。【解決手段】疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、を少なくとも含む蛍光性重合体微粒子セットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、
前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、
を少なくとも含む蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項２】
前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれた配位子と、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれた配位子とが、異なることを特徴とする請求項１に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項３】
前記第１の蛍光性ランタノイド色素の励起波長と、第２の蛍光性ランタノイド色素の励起波長との差が、１０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項４】
前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれたランタノイド陽イオンと、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれたランタノイド陽イオンとが、異なることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項５】
前記第１の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値と、第２の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値との差が、１０ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか1項に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項６】
前記重合体微粒子が、親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニルマクロモノマーによって少なくとも構成された親水性シェルと、疎水性（メタ）アクリル系モノマー又は疎水性ビニルモノマーによって少なくとも構成された疎水性コアとからなる重合体微粒子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項７】
前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は前記親水性ビニルマクロモノマーが、反応性官能基を含むことを特徴とする請求項６に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【請求項８】
前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーポリマーが下記一般式（Ｉ）で表され、前記親水性ビニルマクロモノマーが下記一般式（II）で表されることを特徴とする請求項６又は７に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【化１】
2008074892.tif 000025
［上記一般式において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ６は、水素原子、ホルミル基又はアセチル基を表す。Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌは、２価の連結基を表す。Ｚは、ポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは、１以上の繰り返し数を表す。ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
【請求項９】
前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか1項に記載の蛍光性重合体微粒子セット。
【化２】
2008074892.tif 000026
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）のいずれかで表される原子団、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、又はジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ２０)−を表し、Ｒ２０は水素原子または置換基を表す。
【化３】
2008074892.tif 000027
各式中Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に水素原子又は置換基を表す。Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９及びＲ１７とＲ１９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ１は芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で構成された第１の蛍光検出用複合体と、
前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で構成された第２の蛍光検出用複合体と、
を少なくとも含む蛍光検出用複合体セット。
【請求項１１】
前記第１の連結物質の検出対象物質と、前記第２の連結物質の検出対象物質とが異なることを特徴とする請求項１０に記載の蛍光検出用複合体セット。
【請求項１２】
疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、
前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、
を少なくとも含む蛍光性重合体微粒子組成物。
【請求項１３】
前記第１の蛍光性重合体微粒子が、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と共に第１の蛍光検出用複合体を構成し、
前記第２の蛍光性重合体微粒子が、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と共に第２の蛍光検出用複合体を構成していることを特徴とする請求項１２に記載の蛍光性重合体微粒子組成物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で第１の蛍光検出用複合体を構成する工程と、
前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で第２の蛍光検出用複合体を構成する工程と、
前記第１及び第２の蛍光検出用複合体と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、
第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、
第２の蛍光検出用複合体に含まれる第２の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の検出工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法。
【請求項１５】
請求項１０又は１１に記載の蛍光検出用複合体セットに含まれる蛍光検出用複合体及び／又は請求項１２又は１３に記載の蛍光性重合体微粒子組成物と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、
第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、
第２の蛍光検出用複合体に含まれる第２の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の検出工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光性重合体微粒子セット、蛍光検出用複合体セット、蛍光性重合体微粒子組成物及び蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微量な物質を視覚化又は定量するために、種々の標識物が開発されてきた。特に高感度を必要とする分野では、ラジオアイソトープが代表的な標識物であり、トリチウムや放射性ヨウ素等が代表例として用いられている。しかし、放射性物質の使用には、使用後の廃棄や取り扱いに多くの課題があるため、放射性物質に代わる手法が開発された。このような手法としては、例えば酵素標識法（ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等が利用）や、蛍光物質標識法（フルオレッセイン又はローダミン等が利用）が挙げられる。
しかしこれらの方法では、標識としての絶対的感度が不足するという欠点がある。
【０００３】
測定の精度及び感度を上昇させるために、蛍光物質標識法の一つの発展型として時間分解蛍光測定が開発された（例えば、特許文献１参照）。この方法は、ユーロピウムキレートに代表される蛍光消光時間の長い蛍光物質にパルスの励起光を照射し、直接の励起光や周辺物質に起因する短い蛍光が消光する一定時間の後に蛍光を測定して、ユーロピウム特異的蛍光を測定する方法である。
更に、感度を上げるために、このユーロピウムキレートや色素をポリスチレン粒子に閉じこめ、ポリスチレン粒子の表面に抗原又は抗体をコートして試薬とし、抗原抗体反応によって固定化されたポリスチレン粒子を視覚的に検出しようとする試みもなされている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
しかし、色素や蛍光物質をポリスチレン粒子に閉じこめて標識物質とする公知の方法では、簡便な操作で或る程度の感度が得られるものであるが、感度的に満足できるものでなく、更なる高感度化が求められていた。
更に、表面が疎水性ポリスチレンであるという特質から、（１）コートしたい抗原又は抗体等の機能性分子を結合した後、非結合表面にタンパク質や種々の生体物質の類似物質をコートしてポリスチレンの疎水性を覆い隠す方法、あるいは、（２）反応時に液体中に界面活性剤を加えてポリスチレン粒子が相互に影響し合うのを防ぐ方法等といった種々の工夫をして用いてきた。しかし、それでも非特異的な反応による判定の誤りが生まれることがあった。
【０００５】
一方、ポリスチレン粒子に起因する非特異的反応を改良するために、ポリエチレンオキシ基の片末端に反応性基を有し、もう一方の末端にラジカル重合性基を有する親水性マクロモノマーと疎水性ラジカル重合性モノマーとの重合により、水不溶性高分子化合物からなるコアと反応性基を有する親水性シェル部分とからなるコアシェル型微粒子を作成し、コア部分に蛍光色素を封入する技術及び、これによって得られた高い蛍光強度を安定して有する蛍光分析用組成物などが開発された（例えば、特許文献３参照）。
【０００６】
また、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ（コア／シェル）、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）等の半導体ナノ粒子により作製したビーズ表面に分子プローブを結合することにより標的分子を検出する半導体ナノ粒子蛍光材料が提案されている（例えば、非特許文献１及び２参照）。これらの半導体ナノ粒子は、異なる結晶サイズにすることにより異なる波長の発光を得ることが可能である。また、発光波長と発光強度を組合わせて標識ビーズをコードすることにより同時多重測定も可能とされている。
【特許文献１】特開昭６１−１２８１６８号公報
【特許文献２】特開２０００−３４５０５２号公報
【特許文献３】国際公開第２００２／０９７４３６号パンフレット
【非特許文献１】「サイエンス(Science)」， 1998年， 第281巻， 第25号， p.2013-2016
【非特許文献２】「ネイチャー  バイオテクノロジー（Nature Biotechnology）」， 2001年， 第19巻， p.631-635
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、このコアシェル型微粒子を利用した方法では、非特異的な反応によるノイズが抑制できるものの、蛍光強度的には満足できるものでなく、１回の操作で検出可能な検出対象物質は１種類に限られていた。また、ＣｄＳｅ／ＣｄＳ又はＣｄＳｅ／ＺｎＳ（コア／シェル）等の半導体ナノ粒子を用いた標識ビーズでは、安全上及び環境上の見地から問題があり、検出感度的にも満足できるものではなかった。
【０００８】
本発明の目的は、複数の検出対象物質を同時に高感度に検出することができる蛍光性重合体微粒子セット、蛍光検出用複合体セット、蛍光性重合体微粒子組成物及び蛍光検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
［１］  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、を少なくとも含む蛍光性重合体微粒子セットである。
［２］  前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれた配位子と、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれた配位子とが、異なることを特徴とする前記［１］に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［３］  前記第１の蛍光性ランタノイド色素の励起波長と、第２の蛍光性ランタノイド色素の励起波長との差が、１０ｎｍ以上であることを特徴とする前記［１］又は［２］に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［４］  前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれたランタノイド陽イオンと、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれたランタノイド陽イオンとが、異なることを特徴とする前記［１］〜［３］のいずれか1項に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［５］  前記第１の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値と、第２の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値との差が、１０ｎｍ以上であることを特徴とする前記［１］〜［４］のいずれか1項に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［６］  前記重合体微粒子が、親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニルマクロモノマーによって少なくとも構成された親水性シェルと、疎水性（メタ）アクリル系モノマー又は疎水性ビニルモノマーによって少なくとも構成された疎水性コアとからなる重合体微粒子であることを特徴とする前記［１］〜［５］のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［７］  前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は前記親水性ビニルマクロモノマーが、反応性官能基を含むことを特徴とする前記［６］に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
［８］  前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーポリマーが又下記一般式（Ｉ）で表され、前記親水性ビニルマクロモノマーが下記一般式（II）で表されることを特徴とする前記［６］又は［７］に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
【００１０】
【化１】
2008074892.tif 000002
【００１１】
［上記一般式において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はハロゲン原子を表す。Ｒ５は水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を表す。Ｒ６は、水素原子、ホルミル基又はアセチル基を表す。Ｒ７及びＲ８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。Ｌは、２価の連結基を表す。Ｚは、ポリマー主鎖末端に結合する原子団を表す。ｘ及びｙは、１以上の繰り返し数を表す。ｗは０以上の繰り返し数を表す。］
【００１２】
［９］  前記蛍光性ランタノイド色素が、下記一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環含有配位子を少なくとも１個有することを特徴とする前記［１］〜［８］のいずれか1項に記載の蛍光性重合体微粒子セットである。
【００１３】
【化２】
2008074892.tif 000003
【００１４】
［一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）のいずれかで表される原子団、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、又はジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。Ｂ１及びＢ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ(−Ｒ２０)−を表し、Ｒ２０は水素原子または置換基を表す。
【００１５】
【化３】
2008074892.tif 000004
【００１６】
各式中Ｒ１１〜Ｒ１９は、それぞれ独立に水素原子または置換基を表す。Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９及びＲ１７とＲ１９は、可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。ｎは０、１又は２を表す。Ｇは置換基を有してもよい炭素原子又は窒素原子を表す。Ｑは５員環又は６員環の含窒素複素環を形成するのに必要な原子団を表し、さらに含窒素複素環は縮合環を形成してもよい。Ａｒ１は芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。］
【００１７】
［１０］  前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で構成された第１の蛍光検出用複合体と、前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で構成された第２の蛍光検出用複合体と、を少なくとも含む蛍光検出用複合体セットである。
［１１］  前記第１の連結物質の検出対象物質と、前記第２の連結物質の検出対象物質とが異なることを特徴とする前記［１０］に記載の蛍光検出用複合体セットである。
［１２］  疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、を少なくとも含む蛍光性重合体微粒子組成物である。
［１３］  前記第１の蛍光性重合体微粒子が、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と共に第１の蛍光検出用複合体を構成し、
前記第２の蛍光性重合体微粒子が、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と共に第２の蛍光検出用複合体を構成していることを特徴とする前記［１２］に記載の蛍光性重合体微粒子組成物である。
［１４］  前記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で第１の蛍光検出用複合体を構成する工程と、前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で第２の蛍光検出用複合体を構成する工程と、前記第１及び第２の蛍光検出用複合体と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、第２の蛍光検出用複合体に含まれる第２の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の検出工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法である。
［１５］  前記［１０］又は［１１］に記載の蛍光検出用複合体セットに含まれる蛍光検出用複合体及び／又は前記［１２］又は［１３］に記載の蛍光性重合体微粒子組成物と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、第２の蛍光検出用複合体に含まれる第２の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の検出工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、複数の検出対象物質を同時に高感度に検出することができる蛍光性重合体微粒子セット、蛍光検出用複合体セット、蛍光性重合体微粒子組成物及び蛍光検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
［蛍光性重合体微粒子セット］
本発明の蛍光性重合体微粒子セットは、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、を少なくとも含むことを特徴としている。
第１の蛍光性重合体微粒子と第２の蛍光性重合体微粒子に含まれる蛍光性ランタノイド色素がそれぞれ異なることにより、検出対象物質に対応するそれぞれの蛍光性重合体微粒子を1回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
【００２０】
本発明において、２つの蛍光性ランタノイド色素が異なるとは、蛍光性ランタノイド色素の構造が異なることを意味する。ランタノイド色素の構造が異なるとは、例えば、ランタノイド陽イオンの種類が異なること及び／又はランタノイド陽イオンに配位する有機配位子が異なることをいう。後述するようにランタノイド色素の構造を制御することにより、その励起波長及び／又は発光波長を任意に制御することができる。
本発明において、対比する蛍光性ランタノイド色素が異なる態様としては、励起波長が異なりかつ発光波長が同一の態様、励起波長が同一でかつ発光波長が異なる態様、励起波長が異なりかつ発光波長が異なる態様を挙げることができる。
本発明においては、励起波長が同一でかつ発光波長が異なる態様又は励起波長が異なりかつ発光波長が異なる態様が好ましく、励起波長が同一でかつ発光波長が異なる態様がより好ましい。
【００２１】
また、本発明の蛍光性重合体微粒子セットにおいては、前記重合体微粒子と、前記第１及び第２の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第３のランタノイド色素と、を含む第３の蛍光性重合体微粒子の少なくとも１種を更に含むことができる。これにより、任意の種類の検出対象物質に対応する蛍光性重合体微粒子を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
【００２２】
本発明においては、前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれる有機配位子の少なくとも１つと、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれる有機配位子の少なくとも１つとが、異なることが好ましい。複数の蛍光性ランタノイド色素に含まれる有機配位子がそれぞれ異なることにより、複数の蛍光性ランタノイド色素の励起波長をそれぞれ異なるものとすることができる。これにより、異なる蛍光性ランタノイド色素を含む複数の蛍光性重合体微粒子をそれぞれ区別して検出することができる。
【００２３】
本発明においては、前記第１の蛍光性ランタノイド色素の励起波長と、第２の蛍光性ランタノイド色素の励起波長との差が、１０ｎｍ以上であることが好ましく、より好ましくは５０ｎｍ以上である。励起波長の差が１０ｎｍ以上であることにより、より容易に、それぞれ異なる蛍光性ランタノイド色素含む複数の蛍光性重合体微粒子を区別して検出することができる。
【００２４】
本発明においては、前記第１の蛍光性ランタノイド色素に含まれるランタノイド陽イオンと、第２の蛍光性ランタノイド色素に含まれるランタノイド陽イオンとが、異なることが好ましい。複数の蛍光性ランタノイド色素に含まれるランタノイド陽イオンがそれぞれ異なることにより、複数の蛍光性ランタノイド色素の発光強度が極大となる発光波長（発光波長の極大値）をそれぞれ異なるものとすることができる。これにより、異なる蛍光性ランタノイド色素を含む複数の蛍光性重合体微粒子をそれぞれ区別して検出することができる。
【００２５】
また、本発明においては、前記第１の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値と、第２の蛍光性ランタノイド色素の発光波長の極大値との差が、１０ｎｍ以上であることもまた好ましい。発光波長の極大値の差が１０ｎｍ以上であることにより、より容易に、それぞれ異なる蛍光性ランタノイド色素含む複数の蛍光性重合体微粒子をそれぞれ区別して検出することができる。
【００２６】
本発明の蛍光性重合体微粒子セットにおいては、前記重合体微粒子の親水性シェルを構成するマクロモノマー及び疎水性コアを構成するモノマーについて、特に制限はないが、少なくとも親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニルマクロモノマーによって親水性シェルが、少なくとも疎水性（メタ）アクリル系モノマー又は疎水性ビニルモノマーによって疎水性コアが、それぞれ構成された重合体粒子であることが好ましい。
ここで、親水性シェルは親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は親水性ビニルマクロモノマー以外の親水性モノマー又は親水性マクロモノマーを更に含んでいてもよく、疎水性コアは疎水性（メタ）アクリル系モノマー又は疎水性ビニルモノマー以外の疎水性モノマーを更に含んでいてもよい。
本発明においては、重合体微粒子を上記構成とすることにより、非特異的吸着が抑制され、蛍光性重合体微粒子の経時安定性が向上する。
【００２７】
また、本発明においては、前記親水性（メタ）アクリル系マクロモノマー又は前記親水性ビニルマクロモノマーが、反応性官能基を含むことが好ましい。これにより、重合体粒子の親水性シェルに反応性官能基が含まれることになり、重合体粒子と検出対象物質とを連結可能な連結物質を高効率で反応することができ、検出感度をより高めることができる。
以下に本発明の構成の１例を示す。
【００２８】
【化４】
2008074892.tif 000005
【００２９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
＜蛍光性重合体微粒子＞
（親水性マクロモノマー）
本発明における親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーおよび親水性ビニルマクロモノマーは、重合性二重結合をポリマー主鎖末端に有する。本親水性マクロモノマーは、後述するように、水系溶媒中において、ラジカル重合性モノマーと重合開始剤の反応で生成したラジカル種と反応し、親水性シェルを構成し、親水性マクロモノマーの末端に結合した疎水性ラジカル重合性モノマーから構成された疎水性ポリマーを疎水性コアとするコアシェル型樹脂微粒子を形成する。
【００３０】
また本発明における親水性マクロモノマーは、後述する連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、及び核酸等）］と連結可能な反応性官能基を有することが好ましい。
反応性官能基は、上記親水性ポリマー形成時の親水性マクロモノマーに導入してもよく、及び／又は、後述するコア部分表面に結合させた後から親水性ポリマーに導入することができる。親水性マクロモノマー形成時に反応性官能基として導入することが、反応性官能基反応性の導入率を調整することが容易にできるため好ましい。
【００３１】
これらの反応性官能基は、いずれも水（又は水系溶媒）中で安定であり、しかも、本発明における蛍光性重合体粒子を標識物質として使用する際の連結物質［例えば、生理活性物質（例えば、抗体、酵素、及び核酸等）］と反応可能な官能基である限り、特に限定されるものではない。重合体微粒子表面に設ける官能基として好適なものは、アルデヒド基、カルボキシル基、メルカプト基、酸塩化物基等の酸ハロゲン化物基、酸無水物基、エステル基、アミド基、マレイミド基、ビニルスルホン基、メタンスルホニルオキシ基、チオール基、水酸基、およびアミノ基等、並びにこれらの前駆体構造を有する基を挙げることができる。中でもアルデヒド基、カルボキシル基、酸塩化物基、酸無水物基、マレイミド基、チオール基、アミノ基等が更に好適で、アルデヒド基、マレイミド基、チオール基及びアミノ基並びにこれらの前駆体構造を有する基が好適である。なお、エステル基は加水分解により容易にカルボキシル基に変換できるので、エステル基を表面に有する重合体微粒子は有用な中間体である。
これらの連結物質を結合するための官能基量は、本発明の重合体微粒子の単位質量当たりの官能基当量として表現すると、通常、０．００１〜０．５ミリ当量／グラム、好ましくは０．００５〜０．２ミリ当量／グラム、より好ましくは０．０１〜０．１ミリ当量／グラム、更に好ましくは０．０２〜０．０７ミリ当量／グラム、最も好ましくは０．０３〜０．０５ミリ当量／グラムである。
【００３２】
ここで上記親水性マクロモノマーとしては、粒子形成性の観点及び、後述する連結物質との反応性の観点から下記一般式（I）または（II）で表されるマクロモノマーであることが好ましい。
【００３３】
【化５】
2008074892.tif 000006
【００３４】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立に水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、又はハロゲン原子を表す。アルキル基の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基を挙げることができ、直鎖、環状のいずれであってもよい。また、アルキル基は、置換基を有してもよく、置換基の例としてアリール基、水酸基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、及びシアノ基などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１〜５０が好ましく、より好ましくは１〜３０であり、１〜２０が最も好ましい。アリール基が置換基を有している場合、好ましい置換基の例としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基及びカルボキシル基などが挙げられる。Ｒ１、Ｒ３及びＲ４としては、粒子形成の観点から水素原子又はメチル基が好ましい。
【００３５】
Ｒ５は水素原子または炭素数１〜４のアルキル基を表す。アルキル基の具体例として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基をあげることができ、このうち、Ｒ５としては、マクロモノマーの親水性の観点から水素原子又はメチル基が好ましく、水素原子が特に好ましい。
Ｒ６は、水素原子、ホルミル基又はアセチル基を表す。
Ｒ７、Ｒ８は、それぞれ独立に水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、お互いに結合して含窒素環を形成してもよい。アルキル基の例として、メチル基、エチル基、プロピル基等を挙げることができる。お互いに結合して含窒素環を形成している場合の、含窒素環の例として、ピロリジン環、ピペラジン環、モルホリン環、ピロリドン環、ピロール環を挙げることができる。Ｒ７、Ｒ８としては、マクロモノマーの親水性、粒子形成性の観点から、Ｒ７がメチル基かつＲ８が水素原子又は、Ｒ７、Ｒ８でピロリドン環を形成することが好ましい。
【００３６】
Ｌは、単結合、炭素数１〜４のアルキレン基（例えばメチレン基、エチレン基、プロピレン基等）、炭素数１〜６のアルキレンオキシ基（例えばエチレンオキシ基、プロピレンオキシ基等）、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−（ＣＨ２）ｔＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｋＯＣＯ−、−Ｏ−、−ＳＯ２−、−ＣＯＮＨＣＯＯ−、−ＣＯＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯＮ（Ｒ９）−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）−（ここでＲ９ は水素原子または炭素数１〜２２のアルキル基等の炭化水素基を示し、ｔは、１〜３の整数を示し、ｋは１〜４の整数を示す）、または、下記一般式（IＡ）で表される原子団、
【００３７】
【化６】
2008074892.tif 000007
【００３８】
（ここでＬ１は単結合、メチレン、−Ｏ−、−ＯＣＯ−又は−ＣＯＯ−を表わす）、およびこれらの組合せによって形成される２価の原子団を表す。Ｌが、アルキレン基、アルキレンオキシ基、又は一般式（ＩＡ）で表される原子団の場合、置換基を有していてもよく、置換基の例としては、炭素数１〜６のアルキル基および前述のＲ１、Ｒ３、Ｒ４がアルキル基である場合の置換基と同じものを挙げることができる。
また、Ｌにおいて、−ＣＯＮ（Ｒ９）−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ９）−の連結基におけるＲ９は、好ましくは水素原子又はメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、デシル基、ドデシル基等のアルキル基を表す。
【００３９】
Ｚは、ポリマー主鎖末端の片末端に直接連結する結合、または任意の連結基を介した結合基を表す。
結合基としては炭素原子−炭素原子結合（一重結合あるいは二重結合）、炭素原子−ヘテロ原子結合（ヘテロ原子としては例えば、酸素原子、イオウ原子、窒素原子、ケイ素原子等）、ヘテロ原子−ヘテロ原子結合の原子団の任意の組合せで構成されるものである。例えば、
【００４０】
【化７】
2008074892.tif 000008
【００４１】
Ｚ１、Ｚ２は各々独立に水素原子、ハロゲン原子（例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子等）、シアノ基、ヒドロキシル基又はアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等）等を表す。Ｚ３、Ｚ４は各々独立に水素原子、炭素数１〜８の炭化水素基（例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ベンジル基、フェネチル基、フェニル基及びトリル基等）又は−ＯＺ５等を表し、Ｚ５は、Ｚ３における炭化水素基と同じ意味を表す。
【００４２】
ｘおよびｙは、１以上の繰り返し数を表す。
ｘとｙの合計を仮に１００とした場合、ｘは、マクロモノマーの親水性の観点から１０〜９９の範囲が好ましく、２０〜９９が更に好ましく、６０〜９９が特に好ましい。この場合、ｙは、連結物質の導入量の観点から１〜６０の範囲が好ましく、２〜５０が更に好ましく、５〜４０が特に好ましい。
【００４３】
本発明における親水性アクリルアミド系マクロモノマーは、まず下記一般式（IV）、（Ｖ）および（VI）で表される公知の重合性モノマーを用い、従来公知のラジカル重合（例えばiniferter 法等）、アニオン重合あるいはカチオン重合によって得られるポリマーの末端に種々の二重結合基を含有する試薬を反応させるか、あるいはこのポリマーの末端に特定の反応性基（例えば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＰＯ３Ｈ２、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、
【００４４】
【化８】
2008074892.tif 000009
【００４５】
、−ＣＯＣｌ、−ＳＯ２Ｃｌ等）を含有した試薬を反応させた後、高分子反応により重合性二重結合基を導入する方法（イオン重合法による方法）、または分子中に上記特定の反応性基を含有する重合開始剤および／または連鎖移動剤を用いてラジカル重合させた後、重合体主鎖の片末端に結合した特定の反応性基を利用して高分子反応を行うことにより重合性二重結合基を導入する方法等の合成法によって容易に製造することができる。
【００４６】
【化９】
2008074892.tif 000010
【００４７】
一般式（IV）、（Ｖ）および一般式（VI）において、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８は、前述のＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８と同じ意味を表す。
具体的には、大津隆行、高分子、33 (No.3) 、222 (1984)、P.Dreyfuss & R.P.Quirk, Encycl. Polym. Sci. Eng., 7 , 551 (1987)、中條善樹、山下雄也「染料と薬品」、30, 232 (1985)、上田明、永井進「化学と工業」、60、57 (1986)、P.F.Rempp & E.Franta, Advances in Polymer Science 、58、1 (1984)、伊藤浩一「高分子加工」、35、262(1986)、V.Percec, Applied Polymer Science 、285 、97 (1984) 等の総説およびそれに引用の文献等に記載の方法に従って重合性二重結合基を導入することができる。
【００４８】
さらに、具体的には、（ａ）一般式で（IV）、（Ｖ）および一般式（VI）示される繰り返し単位に相当する単量体の少なくとも１種、および分子中に上記特定の反応性基を含有する連鎖移動剤の混合物を重合開始剤（例えばアゾビス系化合物、過酸化物等）により重合する方法、（ｂ）上記連鎖移動剤を用いずに、分子中に上記特定の反応性基を含有する重合開始剤を用いて重合する方法、あるいは（ｃ）連鎖移動剤および重合開始剤のいずれにも分子中に上記特定の反応性基を含有する化合物を用いる方法、等により重合体主鎖の片末端に特定の反応性基を結合した重合体を合成し、次にこの特定の反応性基を利用して、高分子反応により重合性二重結合基を導入する方法が挙げられる。
【００４９】
用いる連鎖移動剤としては、例えば特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有するメルカプト化合物｛例えば、チオグリコール酸、チオリンゴ酸、チオサリチル酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプト酪酸、Ｎ−（２−メルカプトプロピオニル）グリシン、２−メルカプトニコチン酸、３−［Ｎ−（２−メルカプトエチル）カルバモイル］プロピオン酸、３−［Ｎ−（２−メルカプトエチル）アミノ］プロピオン酸、Ｎ−（３−メルカプトプロピオニル）アラニン、２−メルカプトエタンスルホン酸、３−メルカプトプロパンスルホン酸、４−メルカプトブタンスルホン酸、２−メルカプトエタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−２−ブタノール、メルカプトフェノール、２−メルカプトエチルアミン、２−メルカプトイミダゾール、２−メルカプト−３−ピリジノール等｝、あるいは特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有するヨード化アルキル化合物（例えばヨード酢酸、ヨードプロピオン酸、２−ヨードエタノール、２−ヨードエタンスルホン酸、３−ヨードプロパンスルホン酸等）が挙げられる。好ましくはメルカプト化合物が挙げられる。
【００５０】
また、特定の反応性基または特定の反応性基に誘導しうる置換基を含有する重合開始剤としては、例えば、アゾビス化合物｛例えば、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸クロライド）、２，２’−アゾビス（２−シアノプロパノール）、２，２’−アゾビス（２−シアノペンタノール）、２，２’−アゾビス［２−（５−ヒドロキシ−３，４，５，６−テトラヒドロピリミジン−２−イル）プロパン］、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）−２−ヒドロキシエチル］プロピオアミド｝、２，２’−アゾビス｛２−メチル−Ｎ−［１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル］プロピオアミド｝、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−プロピオアミド］、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）｝、チオカルバメート化合物｛例えば、ベンジル−Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチルジチオカルバメート、２−カルボキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメート、３−ヒドロキシプロピル−Ｎ，Ｎ−ジメチルジチオカルバメート｝等が挙げられる。
【００５１】
これらの連鎖移動剤または重合開始剤の使用量は、各々全単量体１００質量部に対して０．０１〜１０質量部であり、粒子形成の観点から好ましくは０．０５〜５質量部である。親水性マクロモノマーの数平均分子量は、特に制限されないが粒子形成の観点から、５００〜２００，０００が好ましく、１，０００〜１００，０００がより好ましく、２０００〜５００００が更に好ましい。
【００５２】
親水性マクロモノマーを合成するためには、親水性、溶剤溶解性等を調節する目的で、上記（IV）、（Ｖ）および一般式（VI）で表されるモノマーに加えて、公知の重合性モノマーを共重合することができる。
公知の重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、ビニルイミダゾール等のビニルモノマーを挙げることができる。これらの重合性モノマーの共重合量としては、全重合性モノマーに対して０．１〜３０モル％が好ましく、1〜１０モル％がより好ましい。
以下に親水性マクロモノマーの具体例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５３】
【化１０】
2008074892.tif 000011
【００５４】
【化１１】
2008074892.tif 000012
【００５５】
【化１２】
2008074892.tif 000013
【００５６】
【化１３】
2008074892.tif 000014
【００５７】
また、本発明において粒子形成性補助の観点から、上記親水性マクロモノマー以外の親水性マクロモノマーを併用することができる。その具体例として、ポリアルキレンオキシ基含有親水性マクロモノマーを挙げることができ、市販のマクロモノマーを使用することができる。市販品の具体例としては、日本油脂株式会社製のブレンマー（登録商標、以下同じ）ＰＥ−９０、ブレンマーＰＥ−２００、ブレンマーＰＥ−３５０、ブレンマーＡＥ−９０、ブレンマーＡＥ−２００、ブレンマーＡＥ−３５０、ブレンマー７０ＰＥＰ−３５０Ｂ、ブレンマーＡＥＰ、ブレンマー５５ＰＥＴ−８００、ブレンマーＰＭＥ−１００、ブレンマーＰＭＥ−２００、ブレンマーＰＭＥ−４００、ブレンマーＰＭＥ−１０００、ブレンマーＰＭＥ−４０００、ブレンマーＡＭＥ−４００、新中村化学工業株式会社製のメトキシポリエチレングリコールアクリレートＡＭ−９０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールアクリレートＡＭ−２３０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートＭ−９０Ｇ、メトキシポリエチレングリコールメタクリレートＭ−２３０Ｇを挙げることができる。
【００５８】
（疎水性ラジカル重合性モノマー）
疎水性ラジカル重合性モノマーとしては、公知のラジカル重合性モノマーを使用することができる。
公知のラジカル重合性モノマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン、４−メトキシスチレン、４−アセトキシスチレン等のスチレン系モノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸プロピル、（メタ）アクリル酸ブチル、（メタ）アクリル酸ヘキシル、（メタ）アクリル酸オクチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル、（メタ）アクリル酸シクロヘキシル、（メタ）アクリル酸ドデシル、（メタ）アクリル酸ステアリル、（メタ）アクリル酸フェニル、（メタ）アクリル酸ベンジル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の（メタ）アクリル酸エステル類、酢酸ビニル、塩化ビニル、ビニルイミダゾール、ビニルピリジン等のビニルモノマーを挙げることができる。これらのモノマーは、単独で重合することも可能であり、２種以上のモノマーを共重合しても良い。
【００５９】
本発明においては、蛍光性重合体微粒子の安定性の観点から、疎水性ラジカル重合性モノマーの少なくとも1種が、極性基を有するモノマーであることが好ましい。前記極性基としては、アルコキシ基、エステル基、アセトアセチル基、複素環基等を挙げることができる。
重合体微粒子の疎水性コアにおいて、極性基と蛍光性ランタノイド色素が相互作用することにより、蛍光性ランタノイド色素がより安定に疎水性コアに存在できることになる。これにより、異なる蛍光性ランタノイド色素を有する蛍光性重合体微粒子が複数混在する状態においても、異なる蛍光性重合体微粒子間における蛍光性ランタノイド色素の交換をより効果的に抑制することができる。すなわち、蛍光性ランタノイド色素の検出時における検出感度と検出特異性とが、より向上する。
【００６０】
また、粒子の強度向上の観点から、粒子ポリマーに架橋構造を導入することが可能である。このためには、ジビニルベンゼン、エチレングリコールジメタクリレート等の２価のラジカル重合性モノマーを使用することができる。２価のラジカル重合性モノマーは、粒子を形成する全ラジカル重合性モノマーに対し、１〜２０モル％の範囲で使用することができ、２〜１０モル％が更に好ましい。
【００６１】
（重合体微粒子）
重合体微粒子の粒径には特に制限はないが、通常、体積平均粒径として０．０１〜２０μｍの範囲とすることができる。特に蛍光検出用複合体として用いる場合には、体積平均粒径が０．０１〜２μｍであることが好ましい。体積平均粒径を１μｍ以下とすることで沈降性等の問題の発生を抑制することができる。また、０．０１μｍ以上であることにより操作性が良好になる。こうした理由で、本発明の重合体微粒子の体積平均粒径はより好ましくは０．０５〜１μｍ、更に好ましくは０．０５〜０．５μｍ、最も好ましくは０．０５〜０．３μｍである。なお、体積平均粒径は、通常の測定方法で測定することができ、例えば、粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ（ベックマン・コールター株式会社製）、ナノトラック粒度分析装置ＵＰＡ−ＥＸ（日機装株式会社製））を用いて簡便に測定することができる。
【００６２】
前記コア部分の形状は特に限定されるものではないが、一般的には大略球状あるいは大略楕球状である。また、前記コア部分の寸法も特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜変化させることができるが、大略球状のコア部分の直径は、一般的には５ｎｍ〜２００ｎｍ程度である。
【００６３】
前記コア部分の直径と前記シェル部分の厚さとの比率は、用途に応じて適宜変化させることができる。例えば、コア部分の直径を、例えば、５ｎｍ〜２００ｎｍとすることができ、また、シェル部分の厚さを、例えば、５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
【００６４】
（重合体微粒子の製造方法）
本発明にかかる重合体微粒子は、親水性（メタ）アクリル系マクロモノマーまたは親水性ビニルマクロモノマーと、ラジカル発生剤の存在下、前記のスチレン誘導体や（メタ）アクリル酸誘導体等の疎水性ラジカル重合性モノマーを、水系溶媒中に分散し、ラジカル重合させることによって製造することができる。
【００６５】
重合においては、ラジカル重合性モノマーと親水性マクロモノマーとを全量、水系溶媒、即ち水または含水有機溶媒中に混合溶解し、ラジカル発生剤（重合開始剤）を添加する方法が可能であるが、反応温度、及び粒子径を制御するために、親水性マクロモノマーをあらかじめ溶解した水または含水有機溶媒中に、ラジカル重合性モノマー及び重合開始剤を徐々に添加する方法も好ましい。
【００６６】
親水性マクロモノマーの使用量は、目的とする粒径、コア部分とシェル部分との比率、ラジカル重合性モノマーの種類に応じ、適宜調整することができる。粒子形成性の観点から、ラジカル重合性モノマーの全重量に対し、１〜３００質量％の範囲で使用することができ、得られる微粒子の粒径の観点から２０〜２００質量％が更に好ましい。
好適な含水有機溶媒としては、例えば、水とメタノール、エタノール、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド等との混合物が挙げられる。
【００６７】
ラジカル発生剤として一般的なものは、水溶性のラジカル開始剤、例えば過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過硫酸リチウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩等、ラジカル重合性モノマーまたは含水有機溶媒に溶解性のもの、例えば、２,２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル等の過酸化物等であるが、異種の重合開始剤を併用しても構わない。重合開始剤は、ラジカル重合性モノマーの全重量に対し０．０１〜５質量％の範囲で使用することが好ましく、０．１〜３質量％より好ましい。
反応温度は、使用する開始剤の分解温度に応じ適宜設定できるが、４０℃〜１００℃が好ましく、６０〜８０℃がより好ましい。
【００６８】
なお、本発明の蛍光性重合体微粒子において、本発明の趣旨を著しく損なわない限りにおいて任意の添加剤、例えばトリオクチルホスフィンオキシドやトリブチルホスフィンオキシド等の有機リン化合物のように、ランタノイド陽イオンに配位することで水和等による蛍光強度の低下を抑制することのできる添加剤を使用することも可能であり、かかる添加剤は重合時のモノマー溶液にあらかじめ添加しておくことが好適である。
【００６９】
次に、本発明における蛍光性重合体微粒子について説明する。該蛍光性重合体微粒子は、上記の重合体粒子と、その中に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する蛍光性ランタノイド色素とを含むものである。
（蛍光性ランタノイド色素）
本発明に用いられる蛍光性ランタノイド色素とは、ランタノイド陽イオンと有機配位子を少なくとも１個有する蛍光色素である。この蛍光色素は、可視光で励起することができ、また該配位子の増感作用（配位子を励起する光のエネルギーによりランタノイド陽イオンが発光する現象）を示す。
配位子として、高蛍光強度及び長い蛍光寿命を有する一般式（Ｌ−１）で表される含窒素複素環含有配位子を用いることが好ましい。
【００７０】
【化１４】
2008074892.tif 000015
【００７１】
一般式（Ｌ−Ｉ）において、Ａ１、Ａ２及びＡ３は、下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団、水酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、又はジアリールアミノ基を表し、互いに同一であってもよい。アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アリールアミノ基、ジアリールアミノ基である場合には、それぞれ重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から炭素数１〜１２であることが好ましい。
Ａ１、Ａ２及びＡ３は、蛍光強度、励起波長の調節、ランタノイドイオンとの親和性調節、重合体微粒子への取り込まれやすさ、溶剤溶解性の観点から下記一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）で表される原子団であることが好ましい。
【００７２】
【化１５】
2008074892.tif 000016
【００７３】
各式中Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立に水素原子または置換基を表すが、置換基の例としてアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが挙げられる。ここで挙げた置換基の例において、水素原子以外の原子数は１〜５０が好ましく、より好ましくは１〜３０であり、１〜２０が最も好ましい。また、置換基がアルキル基を含む場合には環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。アルキル基やアリール基が置換基を有している場合、好ましい置換基の例としてはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基などが挙げられる。
【００７４】
Ｒ１３〜Ｒ１６はそれぞれ独立に水素原子または置換基を表す。Ｒ１３〜Ｒ１６が置換基を表す場合、好ましい例としては置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、アルキル又はアリールスルホニルアミノ基、アシル基、アルキル又はアリールスルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、ハロゲン原子またはシアノ基である。
Ｒ１３〜Ｒ１６に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
【００７５】
Ｒ１７、Ｒ１８及びＲ１９はそれぞれ独立に水素原子または置換基を表し、Ｒ１７とＲ１８、Ｒ１８とＲ１９及びＲ１７とＲ１９は互いに結合して環を形成してもよい。ここで、置換基とは、アルキル基、アリール基、カルボアミド基、スルホンアミド基、アルキオチオ基、複素環基、アルコキシ基、アリールオキシ基及びこれらの組合せからなる群から選択される置換基を示す。ｎは０、１又は２を表す。
Ｒ１７〜Ｒ１９に関して、水素を除いた原子数は１〜６０が好ましく、１〜４５がより好ましく、１〜３５が最も好ましい。
Ｇは、炭素原子又は窒素原子を表すが、炭素原子の場合には置換基を有していてもよく、この場合の置換基としてはＲ１１およびＲ１２の例で挙げたものが使用できる。
Ｑは５又は６員の含窒素複素環を形成するのに必要な原子群を表し、さらに該含窒素複素環は縮合環を形成していてもよい。また、Ｒ１７、Ｒ１８又はＲ１９と結合して環を形成してもよい。
【００７６】
以下にＱとして好ましい複素環の例を挙げる。以下の例においては複素環の骨格を表すものであり、部分的に飽和された骨格として用いられてもよく、ヘテロ原子の位置はそれぞれの環系で適宜選択が可能であり、縮合環については任意の位置で縮合してもよい。また、これらの環の組み合わせで表される環であってもよい。
ピロール、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、チオフェン、フラン、オキサゾール、チアゾール、オキサジアゾール、チアジアゾール、セレナゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、トリアジン、テトラジン、オキサジン、チアジン、オキサジアジン、チアジアジン、ピロロピロール、インドール、ピロロピラゾール、ピロロイミダゾール、ピロロトリアゾール、ピロロテトラゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、チエノピロール、ピロロオキサゾール、ピロロチアゾール、ピロロピリジン、ピロロピリミジン、ピロロピラジン、ピロロピリダジン、ピロロトリアジン、ピロロテトラジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジン、ピロロオキサジン、ピロロチアジアジン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ベンゾオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサジアゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾセレナゾール、キノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、ベンゾトリアジン、ベンゾオキサジン、ベンゾチアジン、ピラゾロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、ピラゾロチアジアゾール、ピラゾロピリジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロピラジン、ピラゾロピリダジン、ピラゾロトリアジン、ピラゾロオキサジン、ピラゾロチアジン、ピラゾロチアジアジン、イミダゾロピラゾール、ピラゾロトリアゾール、ピラゾロテトラゾール、チエノピラゾール、フロピラゾール、ピラゾロオキサゾール、イミダゾロイミダゾール、イミダゾロトリアゾール、イミダゾロテトラゾール、チエノイミダゾール、フロイミダゾール、イミダゾロオキサゾール、チエノイミダゾール、イミダゾロオキサジアゾール、イミダゾロチアジアゾール、イミダゾロセレナゾール、イミダゾロピリジン、イミダゾロピリミジン、イミダゾロピラジン、イミダゾロピリダジン、イミダゾロトリアジン、イミダゾロオキサジン、イミダゾロチアジン、イミダゾロオキサジアジン、イミダゾロチアジアジン、トリアゾロトリアゾール、チエノトリアゾール、フロトリアゾール、トリアゾロオキサゾール、トリアゾロチアゾール、トリアゾロオキサジアゾール、トリアゾロチアジアゾール、トリアゾロピリジン、トリアゾロピリミジン、トリアゾロピラジン、トリアゾロピリダジン、トリアゾロトリアジン、トリアゾロオキサジン、トリアゾロチアジン、トリアゾロオキサジアジン、トリアゾロチアジアジン、テトラゾロオキサゾール、テトラゾロチアゾール、テトラゾロピリジン、テトラゾロピリミジン、テトラゾロピラジン、テトラゾロピリダジン、テトラゾロオキサジン、テトラゾロチアジン、チエノチオフェン、チエノフラン、チエノオキサゾール、チエノチアゾール、チエノオキサジアゾール、チエノチアジアゾール、チエノセレナゾール、チエノピリジン、チエノピリミジン、チエノピラジン、チエノピリダジン、チエノトリアジン、チエノテトラゾール、チエノオキサジン、チエノチアジン、チエノオキサジアジン、チエノチアジアジン、フロオキサゾール、フロチアゾール、フロオキサジアゾール、フロチアジアゾール、フロピリジン、フロピリミジン、フロピラジン、フロピリダジン、フロトリアジン、フロオキサジン、フロチアジン、オキサゾロオキサゾール、チアゾロオキサゾール、オキサゾロオキサジアゾール、オキサゾロチアジアゾール、オキサゾロピリジン、オキサゾロピリミジン、オキサゾロピラジン、オキサゾロピリダジン、オキサゾロトリアジン、オキサゾロオキサジン、オキサゾロチアジン、オキサゾロオキサジアジン、オキサゾロチアジアジン、チアゾロチアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロオキサジアゾール、チアゾロセレナゾール、チアゾロピリジン、チアゾロピリミジン、チアゾロピラジン、チアゾロピリダジン、チアゾロトリアジン、チアゾロオキサジン、チアゾロチアジン、チアゾロオキサジアジン、チアゾロチアジアジン、ジチオール、ジオキソール、ベンゾジチオール、ベンゾジオキソール。
Ｑに関して、水素を除いた原子数は４〜７０が好ましく、５〜５５がより好ましく、６〜４５が最も好ましい。
【００７７】
Ｂ１、Ｂ２は、それぞれ独立に、窒素原子または＝Ｃ（−Ｒ２０）−を表し、Ｒ２０は水素原子または置換基を表す。Ｂ１及びＢ２のうち少なくとも一方が窒素原子を表すことが好ましい。
Ｒ２０は水素原子または置換基を表す。Ｒ２０が置換基を表す場合、好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、複素環基、シリル基、アルコキシ基、アミノ基、アシルアミノ基、スルホニルアミノ基、アシル基、スルホニル基、ホルミル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、スルファモイル基、ハロゲン原子、シアノ基、スルホ基またはカルボキシル基であり、より好ましくは置換されてもよいアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アシル基、スルホニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ハロゲン原子またはシアノ基である。Ｒ２０に関して、水素原子以外の原子数は１〜３０が好ましく、１〜２０がより好ましく、１〜１０が最も好ましい。
【００７８】
Ａｒ１は炭素数６〜３０の芳香族炭素環、芳香族複素環を表す。芳香族炭素環の例としては、ベンゼン環、チオフェン環、フラン環、ピロール環、ピラゾール環、トリアゾール環、チアゾール環、イミダゾール環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジアゾール環などが好ましく、これらの環に対してさらに環が縮合していてもよい。Ａｒ１は置換基を有する場合、置換基の例としては、前述のＲ１１、Ｒ１２の置換基の例と同じ基を挙げることができる。
一般式（Ｌ−II）〜（Ｌ−Ｖ）において、＃は一般式（Ｌ−Ｉ）で表される含窒素複素環と結合する位置を表す。
本発明にかかる含窒素複素環配位子としては、蛍光強度及、吸収波長および重合体微粒子への取り込まれやすさの観点から一般式（Ｌ−VI）で表されるものが好ましく、更に好ましくは一般式（Ｌ−VII）で表されるものが好ましい。
【００７９】
【化１６】
2008074892.tif 000017
【００８０】
［式中Ａ１は前記一般式（Ｌ−Ｉ）のＡ１と同じ意味を表す。Ｒ１１、Ｒ１２及びＧは、前記一般式（Ｌ−II）のＲ１１、Ｒ１２及びＧと同じ意味を表す。］
【００８１】
【化１７】
2008074892.tif 000018
【００８２】
［式中、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１７、Ｇ及びＱは、前記一般式（Ｌ−II）及び（Ｌ−IV）のＲ１１、Ｒ１２、Ｒ１７、Ｇ及びＱと同じ意味を表す。］
以下に、本発明にかかる含窒素複素環配位子の具体例を示す。
【００８３】
【化１８】
2008074892.tif 000019
【００８４】
【化１９】
2008074892.tif 000020
【００８５】
【化２０】
2008074892.tif 000021
【００８６】
【化２１】
2008074892.tif 000022
【００８７】
上記例示化合物は公知の化合物を用い、公知の反応条件において反応することにより合成することができる。一般式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、シアヌル酸クロリドへの、Ａ１〜Ａ３原子団の求核置換反応により合成できる。
例えば、下記一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を反応させることにより合成することができる。
【００８８】
【化２２】
2008074892.tif 000023
【００８９】
一般式（ＬＰ−Ｉ）中、Ａは前記Ａ１、Ａ２、Ａ３で記述したものと同様であり、Ｅは、離脱性の基またはＡを表し、一般式（ＬＰ−III）中、Ｒ１７は前述したものと同様であり、Ｒ２１は、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアリール基（ヘテロアリール基を含む）を表すが、好ましくは炭素数１乃至３０のものであり、１乃至２０がより好ましく、１乃至１２がさらに好ましい。
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ水素原子または置換基を表し、Ｒ２１とＲ２２およびＲ２２とＲ２３は可能な場合には互いに結合して環を形成してもよい。Ｒ２２およびＲ２３が置換基を表す場合、好ましい置換基としてはアルキル基、アリール基、アミノ基、複素環基、アルキルチオ基、アリールチオ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アミド基、ウレイド基およびハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）などが好ましい。ここで挙げた置換基の例において、水素を除いた原子数は１乃至６０が好ましく、より好ましくは１乃至４５であり、１乃至３５が最も好ましい。
Ｄは、一般式（ＬＰ−III）中のアンモニウムイオンの対イオンを表す。Ｊは、酸素原子、−Ｃ（Ｒ２４）（Ｒ２５）−、−Ｎ（Ｒ２６）−、硫黄原子を表し、可能な場合にはＲ１７と互いに結合して環を形成してもよい。ここでＲ２４、Ｒ２５、Ｒ２６は、置換されてもよいアルキル基またはアリール基を表すが、アルキル基の例としては炭素数１乃至３０が好ましく、１乃至２０がより好ましく、１乃至１０が最も好ましく、環状であっても、鎖状であってもよく、鎖状の場合には直鎖でも分枝しているものであってもよく、飽和であっても不飽和結合を含むものであってもよい。
【００９０】
一般式（ＬＰ−Ｉ）におけるＥとしての離脱性の基の例には、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アリールオキシ基（フェノキシ基、４−ニトロフェノキシ基など）、アリールチオ基（フェニルチオ基、４−ブロモフェニルチオ基など）、スルホニルオキシ基（ｐ−トルエンスルホニルオキシ基、トリフルオロメタンスルホニルオキシ基など）、カルバモイルオキシ基（ジメチルカルバモイルオキシ基、モルホリノカルボニルオキシ基など）が好ましく、ハロゲン原子が最も好ましい。
【００９１】
一般式（ＬＰ−III）におけるＤとしての対イオンには、好ましくは、ハライドイオン（フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン）、硫酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸イオン、硫酸水素イオン、スルホン酸イオン（ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ｐ−クロルベンゼンスルホン酸イオンなど）、硫酸エステルイオン（モノメチル硫酸イオンなど）、テトラフルオロボレートイオン、ヘキサフルオロホスフェートイオンなどが挙げられる。
【００９２】
本発明における含窒素複素環含有配位子は、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物とを、好ましくは溶媒を用いて混合し、好ましくは塩基の存在下、適切な温度にて反応を行うことにより得ることができる。
【００９３】
この場合、塩基としては、通常有機合成で用いられる塩基であればほとんどのものが使用できるが、好ましくはピリジン類（ピリジン、２，６−ルチジンなど）、３級アミン類（トリエチルアミン、Ｎ−エチルジイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、トリブチルアミンなど）、グアニジン類（トリフェニルグアニジン、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンなど）、アミジン類（１，８−ジアザビシクロ〔５．４．０〕−７−ウンデセン、１，５−ジアザビシクロ〔４．３．０〕−５−ノネンなど）、アニリン類（Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンなど）、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水素化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、ナトリウムエトキンド、ナトリウム−ｔ−ブトキシド、カリウム−ｔ−ブトキシド、酢酸カリウム、酢酸ナトリウムなどを好ましく用いることができるが、ピリジン類、３級アミン類、グアニジン類、アミジン類がより好ましい。
【００９４】
用いる溶媒に関してはプロトン性溶媒、非プロトン性溶媒のいずれも用いることができるが、非プロトン性溶媒が好ましく、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンなどが好ましい。
反応温度は反応によってそれぞれ適当な温度が設定されるべきであるが、本発明においては一般に−２０℃乃至１５０℃が好ましく、０℃乃至１２０℃がより好ましく、０℃乃至１００℃が最も好ましい。
反応の仕込み順はどの順に仕込んでもよいが、一般式（ＬＰ−Ｉ）で表される化合物と一般式（ＬＰ−III）で表される化合物を溶媒に溶解または懸濁し、撹拌しながら塩基を添加するのが好ましい。
【００９５】
（合成例）含窒素複素環配位子、例示化合物４の合成
例えば、上記例示化合物４は、下記の方法により合成することができる。
１８．４ｇの塩化シアヌルを１００ｍＬのジメチルアセトアミドに溶解し、室温で６９．２ｇの３，５−ジメチルピラゾールを添加した。ついで反応温度を８０℃として２時間反応した。
冷却後、反応液を水に注ぎ、析出した結晶を濾取し、ジメチルホルムアミドから再結晶して、下記（ＬＰ−Ｉ−１）を得た。収量２１．０ｇ、収率５７．９％
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：６．１１（３Ｈ，ｓ）、２．８１（９Ｈ，ｓ）、２．３３（９Ｈ，ｓ）
【００９６】
【化２３】
2008074892.tif 000024
【００９７】
４１９ｍｇの６−クロロ−５−シアノ−１，３−ジエチル−２−メチル−１Ｈ−ベンズイミダゾリウムｐ−トルエンスルホナートと３６３ｍｇの上記化合物（ＬＰ−Ｉ−１）を８ｍＬのジメチルスルホキシドに懸濁し、０．５ｍＬのテトラメチルグアニジンを加えて、８０℃で３０分間反応した。
冷却後、水を加えて析出した結晶に減圧ろ過を施して、得られた結晶をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製を行った。さらに、メタノールと酢酸エチルの混合溶媒から再結晶を行い、目的物を得た。収量２８７ｍｇ、収率５５．７％。
ｎｍｒスペクトルデータ（重クロロホルム）：７．３４（１Ｈ，ｓ）、７．２１（１Ｈ，ｓ）、６．０４（２Ｈ，ｓ）、５．３１（１Ｈ，ｓ）、４．５３（２Ｈ，ｑ）、４．３９（２Ｈ，ｑ）、２．７０（６Ｈ，ｓ）、２．３３（６Ｈ，ｓ）、１．３１（３Ｈ，ｔ）、１．２８（３Ｈ，ｔ）
他の例示化合物も、Ａ１〜Ａ３に相当する部分を、対応する化合物に変更することにより、例示化合物４と同様に合成することができる。
【００９８】
本発明にかかる含窒素複素環配位子は、ランタノイド陽イオンに対して、０．１〜１０当量の範囲で使用することができ、より好ましくは１〜５当量の範囲で使用することができる。
ランタノイド陽イオンとしては、２〜４価の陽イオンをあげることができ、具体例として、Ｃｅ３＋，Ｐｒ３＋，Ｎｄ３＋，Ｎｄ４＋，Ｓｍ２＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ２＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｄｙ４＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ３＋，Ｔｍ２＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ２＋，Ｙｂ３＋等が挙げられ、中でも、Ｐｒ３＋，Ｎｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，Ｈｏ３＋，Ｅｒ３＋，Ｔｍ３＋，Ｙｂ３＋等の３価陽イオンは、紫外〜近赤外領域、長い寿命、狭い波長幅等の特徴を持つ蛍光を発することから好適であり、中でもＮｄ３＋，Ｓｍ３＋，Ｅｕ３＋，Ｔｂ３＋，Ｄｙ３＋，およびＴｍ３＋が更に好適であり、Ｅｕ３＋およびＴｂ３＋が発光強度の点で最も好適である。
【００９９】
一般式（Ｌ−Ｉ）以外の配位子に代え、又はこれを組み合わせて、蛍光強度、ランタノイド色素合成の容易さの観点から公知のランタノイド陽イオンの有機配位子を用いることもできる。
他の有機配位子の例としては、芳香族アミン類（Helv. Chim. Acta, Vol.79, P.789, 1966）、β―ジケトン類（Anal. Chem., Vol.70, P.596-601, 1998）、芳香族基含有カルボン酸類（Chem.Mater., Vol.10, 286-296，特開２０００−３４５０５２号公報）をあげることができる。具体例として、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−フェニル−１，３−ブタンジオン、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−ナフチル）−１，３−ブタンジオンを挙げることができる。芳香族カルボン酸としては、フォーカルポイントにカルボキシレート基を有しかつ繰り返し単位に芳香環を有するデンドロンを挙げることができる。
【０１００】
また、これらの配位子とともに、ランタノイド色素の蛍光強度低下を抑制する目的で、ホスフィンオキシド類、リン酸エステル類、スルホキシド類、亜リン酸エステル類、ホスフィン類、スルフィド類、アミン類、窒素含有芳香族複素環化合物を同時に用いることができる。
【０１０１】
ランタノイド元素含有溶液に、本発明における配位子を少なくとも含む配位子溶液を加えることにより、蛍光性ランタノイド錯体、即ち本発明における蛍光性ランタノイド色素を、容易に合成することができる。蛍光性ランタノイド錯体が、溶液中から析出する場合には、ろ別することができる。蛍光性ランタノイド錯体析出しない場合は、溶媒を留去して結晶を得た後、必要に応じ精製して使用することができる。
本発明の重合体微粒子中の蛍光性ランタノイド錯体の濃度に制限はないが、通常、重合体粒子の質量に対して、０．０１〜５０質量％、輝度の点で好ましくは０．０５〜２０質量％、より好ましくは０．１〜１０質量％である。
【０１０２】
＜蛍光性重合体微粒子の製造方法＞
本発明における蛍光性重合体微粒子は、先に説明した種々の公知方法により調製した微粒子に、ランタノイド蛍光色素を導入（内蔵）することにより製造することができる。
色素の導入は次のように行うことができる。微粒子の疎水性部を形成する水不溶性高分子化合物を膨潤させる有機溶媒（例えば、アセトン又はトルエン等）が一定比率で含まれる溶液中に、微粒子及びランタノイド蛍光色素を浸漬させる。前記浸漬により、前記水不溶性高分子化合物は膨潤し、その膨潤に伴ってランタノイド蛍光色素が微粒子に取り込まれる。続いて、この混合物から、有機溶媒を除去すると、前記水不溶性高分子化合物は収縮するが、疎水的なランタノイド蛍光色素は微粒子から外に出ることができず、微粒子に封入される。所望により、微粒子に取り込まれなかったランタノイド蛍光色素を除去することにより、本発明の蛍光性重合体微粒子を得ることができる。
【０１０３】
上記製造方法において、前記混合物から有機溶媒を除去する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、エバポレートなどにより有機溶媒を蒸発乾固する方法、あるいは、非溶媒中で収縮させる方法（例えば、有機溶媒を含有する溶液を、前記有機溶媒を含有しない溶液に置換する方法）などを挙げることができる。
また、微粒子を膨潤するのに用いる前記有機溶媒含有溶液における有機溶媒の割合は、ランタノイド蛍光色素が水不溶性高分子化合物に取り込まれる程度まで、前記水不溶性高分子化合物を膨潤させることができる割合である限り、特に限定されるものではないが、例えば、２〜５０（vol/vol）％であることができる。
上記の方法の他に、重合性モノマー、マクロモノマーを含有する液体にランタノイド蛍光色素を溶解し、次いで重合することにより、微粒子形成と同時にランタノイド蛍光色素を導入する方法をとることも可能である。
【０１０４】
本発明にかかる親水性マクロモノマーに反応性官能基が含まれる場合には、反応性官能基を活性化することを更に含む。このような活性化としては、反応性官能基ユニットの種類によって適宜選択することができる。
例えば反応性官能基ユニットとしてアミノ基前駆体構造を含む場合には、アミノ基前駆体構造をアミノ基に変換するために、重合体微粒子に対して酸またはアルカリ性処理を行う。酸としては、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酢酸等の有機酸が使用できる。ｐＨとしては、５以下が好ましく、３以下がより好ましい。アルカリとしては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液が使用できる。ｐＨとしては、９以上が好ましく、１１以上がより好ましい。反応温度としては、２５〜１００℃が好ましく、４０〜９０℃がより好ましい。
このような活性化処理は、適用される具体的な処理に応じて蛍光性ランタノイド色素の導入工程の前及び後のいずれに行ってもよい。
【０１０５】
＜蛍光検出用複合体＞
本発明における蛍光検出用複合体は、前記蛍光性重合体微粒子と、蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な連結物質とから構成されている。これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
連結物質としては、抗原又は抗体を挙げることができる。このような抗体としては、ウサギ、ヤギ等のポリクローナル抗体、マウスのモノクローナル抗体のＩｇＧ、ＩｇＭ、またはこれらを酵素処理又は還元剤処理して得るＦ（ａｂ’)２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’分画等が挙げられる。一方、抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、薬物、花粉など種々のものが挙げられる。
【０１０６】
かかる抗体又は抗原の結合方法としては、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原の糖鎖を過ヨウ素酸を使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して抗体又は抗原のアミノ基をグルタルアルデヒドを使用して結合する方法、重合体微粒子のアミノ基に対して、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルフォスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）との反応によりマレイミド基を導入し、抗体のメルカプト基と結合させる方法等をあげることができる。その結合量としては、重合体微粒子１ミリグラム当たりの質量として、通常５０ナノグラム〜５００マイクログラムが好ましく、５００ナノグラム〜２００マイクログラムがより好ましい。これにより、蛍光能を有する免疫分析試薬（蛍光免疫分析試薬）として使用可能である
【０１０７】
また、連結物質としては、抗原及び抗体の他に、アレルゲン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、ホスト化合物、ホルモン、ホルモンレセプター、タンパク質、血液タンパク質、組織タンパク質、細胞、細胞破砕物、核物質、ウイルス、ウイルス粒子、代謝産物、神経伝達物質、ハプテン、薬物、核酸、金属、金属錯体、微生物、寄生虫、細菌、ビオチン、アビジン、レクチン、糖、生理活性物質、生理活性物質受容体、環境物質、化学種又はこれらの誘導体などから、検出対象物質に応じて適宜選択してもよい。例えば、予め検出対象物質をアビジン化処理することが可能である場合には、ビオチンを連結物質とすることができる。検出対象物質が所定のリガンドである場合、該リガンドに特異的に結合するレセプター及びその断片であってもよい。また、標的物質が核酸である場合、該核酸に特異的に結合するタンパク質やペプチド（アプタマー）であってもよい。
これらの連結物質との結合方法は、前述と同様に行ってもよく、その他の既知の結合方法によって結合してもよい。
このような連結物質は、検出対象物質そのものであってもよく、また蛍光性重合体微粒子と同様に検出対象物質に対して結合処理することにより、本蛍光検出用複合体によって検出可能としてもよい。
【０１０８】
［蛍光検出用複合体セット］
本発明の蛍光検出用複合体セットは、前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で構成された第１の蛍光検出用複合体と、前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で構成された第２の蛍光検出用複合体と、を少なくとも含むセットである。
それぞれ異なる蛍光性重合体微粒子に異なる連結物質が結合していることにより、それぞれの連結物質に対応した蛍光性重合体微粒子を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
また、蛍光検出用複合体を用いることで、蛍光性重合体微粒子と連結物質とから蛍光検出用複合体を構成する工程を要することなく、より簡便に検出対象物質を検出することができる。
本発明における蛍光検出用複合体については、既述の蛍光検出用複合体に関する事項をそのまま適用することができる。
【０１０９】
本発明においては、前記第１の連結物質の検出対象物質と、前記第２の連結物質の検出対象物質とが異なることが好ましい。これにより、異なる検出対象物質を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
また、本発明においては、連結物質の検出対象物質が同一であって、前記第１の連結物質の検出感度と、前記第２の連結物質の検出感度が異なるものであることもまた好ましい。これにより、より広い感度範囲で検出対象物質を定量的に検出することができる。
【０１１０】
また、本発明の蛍光検出用複合体セットにおいては、前記第１及び第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１及び第２の連結物質とは異なる第３の連結物質とで構成された第３の蛍光検出複合体の少なくとも１種を、更に含むことができる。これにより、任意の種類及びより広範な感度範囲の検出対象物質を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
【０１１１】
［蛍光性重合体微粒子組成物］
本発明の蛍光性重合体微粒子組成物は、疎水性コアと親水性シェルからなるコアシェル構造を有する重合体微粒子と、該重合体微粒子に内蔵されると共にランタノイド陽イオンを含有する第１の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第１の蛍光性重合体微粒子と、前記重合体微粒子と、前記第１の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第２の蛍光性ランタノイド色素と、を含む第２の蛍光性重合体微粒子と、を少なくとも含むものである。
これにより、より簡便に複数の検出対象物質を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。また、このような蛍光性重合体微粒子組成物は、例えば、単一の励起波長の励起エネルギー線で、複数の発光波長の蛍光を発生させることができ、例えば、表示装置、照明装置、装飾装置等にも応用することができる。
本発明における前記蛍光性重合体微粒子については、既述の蛍光性重合体微粒子に関する事項をそのまま適用することができる。
【０１１２】
また、本発明の蛍光性重合体組成物においては、前記重合体微粒子と、前記第１及び第２の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第３の蛍光性ランタノイド色素とを含む第３の蛍光性重合体微粒子の少なくとも１種を、更に含むことができる。これにより、任意の種類の励起波長及び／又は発光波長を有する蛍光性重合体微粒子組成物とすることができる。
【０１１３】
本発明の蛍光性重合体微粒子組成物は、前記第１の蛍光性重合体微粒子が、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と共に第１の蛍光検出用複合体を構成し、前記第２の蛍光性重合体微粒子が、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と共に第２の蛍光検出用複合体を構成していることが好ましい。これにより、より簡便に複数の検出対象物質を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
また、本発明の蛍光性重合体組成物においては、前記重合体微粒子と、前記第１及び第２の蛍光性ランタノイド色素とは異なる第３の蛍光性ランタノイド色素とを含む第３の蛍光性重合体微粒子と、前記第１及び第２の連結物質とは異なる第３の連結物質とから構成される第３の蛍光検出用複合体の少なくとも１種を、更に含むことができる。これにより、任意の種類の検出対象物質を１回の操作で、別々に高感度で検出することができる。
本発明における蛍光検出用複合体については、既述の蛍光検出用複合体に関する事項をそのまま適用することができる。
【０１１４】
［蛍光検出方法］
本発明の蛍光検出方法は、本発明の蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第１の蛍光性重合体微粒子と、該蛍光性重合体微粒子及び検出対象物質を連結可能な第１の連結物質と、で第１の蛍光検出用複合体を構成する工程と、前記蛍光性重合体微粒子セットに含まれる第２の蛍光性重合体微粒子と、前記第１の連結物質とは異なる第２の連結物質と、で第２の蛍光検出用複合体を構成する工程と、前記第１及び第２の蛍光検出用複合体と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、第２の蛍光検出用複合体に含まれる第２の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の検出工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法である。
【０１１５】
上記構成とすることにより、必要に応じて上記連結物質を選択することができる。これにより、検出対象物質に対応した蛍光検出用複合体セットを、より効率的に構成することができ、より効率的に検出対象物質を検出することができる。
本発明における蛍光検出用複合体については既述の蛍光検出用複合体についての事項をそのまま適用することができる。
【０１１６】
また、本発明の蛍光検出方法は、上記蛍光検出用複合体セットに含まれる蛍光検出用複合体及び／又は上記蛍光性重合体微粒子組成物と、検出対象物質を含む検体とを接触させる工程と、第１の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第１の検出工程と、第２の蛍光検出用複合体に含まれる第１の蛍光性ランタノイド色素を検出する第２の工程と、を少なくとも含む蛍光検出方法である。本発明においては、予め蛍光検出複合体が構成されていることにより、より簡便に検出対象物質を検出することができる。
【０１１７】
本発明の蛍光検出方法は、２種以上の蛍光検出用複合体の混合物を用いて、蛍光検出複合体の連結物質に対応する検出対象物質を検出することを含む。これにより、複数の検出対象物質を１回の操作で、高感度に検出することができる。
【０１１８】
蛍光検出方法は、蛍光物質を利用した公知の蛍光検出方法における手順及び条件をそのまま適用することができ、測定対象物質と、蛍光検出用複合体とを接触させて検出試料を調製すること、蛍光検出用複合体を励起する励起光を照射すること、該照射による蛍光発光を測定することを含む。
【０１１９】
本発明の蛍光検出方法は、２種以上の蛍光検出複合体に含まれる蛍光性ランタノイド色素の励起波長が異なる場合には、第１の蛍光性ランタノイド色素に対応する励起波長の励起光の照射及び該照射による蛍光発光を測定する第１の検出工程と、第２の蛍光性ランタノイド色素に対応する励起波長の励起光の照射及び該照射による蛍光発光を測定する第２の検出工程と、を少なくとも含むものである。
本発明においては、第３の蛍光性ランタノイド色素に対応する励起波長の励起光の照射及び該照射による蛍光発光を測定する第３の検出工程の少なくとも１つを更に含んでいてもよい。
【０１２０】
また、本発明の蛍光検出方法は、２種以上の蛍光検出複合体に含まれる蛍光性ランタノイド色素の発光波長が異なる場合には、対応する励起波長の励起光の照射と、該照射による第１の蛍光性ランタノイド色素に由来する蛍光発光を測定する第１の検出工程と、該照射による第２の蛍光性ランタノイド色素に由来する蛍光発光を測定する第２の検出工程と、を少なくとも含むものである。
更に、本発明においては、蛍光性ランタノイド色素に対応する励起波長の励起光の照射及び該照射による第３の蛍光性ランタノイド色素に由来する蛍光発光を測定する第３の検出工程の少なくとも１つを更に含んでいてもよい。
更に、本発明においては、それぞれの蛍光性ランタノイド色素に由来する異なる発光波長の蛍光発光を同時に測定することもできるし、それぞれの蛍光検出用複合体に応じた励起光の照射と発光蛍光の測定を順次行うこともできる。
【０１２１】
また本発明の蛍光検出方法は、発光寿命の長いランタノイド錯体（特にユーロピウム、テルビウム、ルテニウム）を蛍光色素として用いているので、バックグランド蛍光が消滅した後に、目的の蛍光を検出する遅延蛍光分析法であることが好ましい。例えば、ユーロピウム錯体の発光寿命は、数百μｓｅｃからｍｓｅｃであり、一般的な有機色素の１０万〜１００万倍である。さらに２５０ｎｍ以上の大きいストークスシフト、シャープな蛍光ピーク等の特徴を有している。分析のためには、ランタノイドイオンの配位子を励起し、発生する遅延を時間分解蛍光測定装置で測定する。
【０１２２】
また、本発明における上記蛍光性ランタノイド色素は、含窒素複素環配位子の吸収光である可視光、例えば波長４００ｎｍ〜５００ｎｍの光による励起が可能である。このため、ＵＶ光のような高エネルギーの励起光を使用する必要がなく、励起光源の選択の幅を広くすることができる。
これにより、低エネルギーの励起光源による蛍光検出を高感度に行うことができる。
本蛍光検出方法は、時間分解蛍光測定によるものであることが、測定の精度及び感度の観点から更に好ましい。時間分解蛍光測定における条件は、選択された金属イオンに応じて適宜選択することができる。
【０１２３】
＜蛍光検出キット＞
本発明の蛍光性重合体微粒子セットを用いて、蛍光検出キットを構成することもできる。これにより、標的物質の検出を、連結物質を介した蛍光性重合体微粒子の蛍光発光に基づいて効率よく且つ高感度に行うことができる。
本蛍光検出キットにおける蛍光性重合体微粒子は、連結物質と共に含まれるものであってもよく、また蛍光検出用複合体として含まれるものであってもよい。
また連結物質の種類に応じて、検出対象物質を蛍光検出用複合体によって検出可能にするための試薬を含むものであってもよい。このような試薬としては、例えば、蛍光検出用複合体中の連結物質としてビオチンを選択した場合では、検出対象物質をアビジン化するための試薬が挙げられる。
【実施例】
【０１２４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１２５】
実施例１
＜親水性マクロモノマーＭＭ−３１の合成＞
窒素気流下、Ｎ−ビニルアセトアミド４２．５６ｇ、メルカプトプロピオン酸５．３１ｇを、エタノール１２７ｇに溶解し、６０℃に加熱した。次に２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）２．４８ｇを加え、６０℃で４時間攪拌した後、７５℃に昇温して２時間攪拌した。室温まで冷却後、反応混合物にエタノール５０ｇを加えて希釈した。次にこれを酢酸エチル２Ｌに注ぎ、析出したポリマーを吸引ろ過し、室温で真空乾燥した。３４．７ｇのポリマーが得られた。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液で、滴定し酸価を測定したところ、このポリマー１ｇあたり、０．２９ミリモルの酸が含有されていた。またＧＰＣ測定からこのポリマーの数平均分子量Ｍｎは３５００であった。
【０１２６】
次に、上記で得られたポリマー３３ｇをジメチルスルホキシド１３２ｇに溶解し、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル１５．１ｇ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．３９ｇ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド７．３ｇを加え、４０℃で４時間攪拌した。室温まで冷却後、３０ｇのエタノールを加え希釈した。次にこの反応混合物を、酢酸エチル２Ｌ中に注ぎ、沈殿したポリマーを吸引ろ過後、室温で真空乾燥し、３１．３ｇのマクロモノマーＭＭ−３１を得た。０．１モル／Ｌの水酸化カリウム水溶液による滴定では、酸が検出されず、ポリマー中のカルボン酸がメタクリル酸ヒドロキシエチルとの反応によって消失していることが判った。またＧＰＣ測定からこの親水性マクロモノマーＭＭ−３１の数平均分子量Ｍｎは３６００であった。
【０１２７】
＜蛍光微粒子分散液−１の合成＞
上記で合成した親水性マクロモノマーＭＭ−３１（数平均分子量３６００）３．６ｇを、蒸留水３２ｇとエタノール１０ｇの混合溶液中に溶解し、毎分５０ｍＬの窒素を流しつつ、６０℃に加熱した。次に、この溶液中に、メタクリル酸メチル１ｇ、２,２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．０３ｇおよびエタノール１０ｇからなる溶液を、６時間かけて滴下した。滴下終了後７０℃で３時間攪拌し、更に７５℃で２時間攪拌し、室温まで冷却した。分散物を、蒸留水を用いて一日透析（分画分子量＝１２０００〜１４０００）して精製を行った。更に遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を用いて希釈再分散し、粒子濃度を５質量％とした。粒度分布測定装置（コールターＮ４Ｐｌｕｓ、ベックマン・コールター株式会社製）を用いて粒径を測定したところ体積平均粒径が３５０ｎｍであった。
粒子分散物に塩酸を加え、ｐＨを１とした後、９５℃で２４時間攪拌し、粒子表面に結合した親水性ポリマー中のアセトアミド基の加水分解を行いアミノ基に変換した。室温まで冷却し、ｐＨを７とし、蒸留水を用いて一日透析精製を行い、水溶性物質を除去した後、遠心分離機を用いて粒子を分離した後、蒸留水を加えて希釈濃度調節し、４質量％の表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａを得た。
【０１２８】
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）７．０ｍｇと、化合物例１２のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａ１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液−１を得た。この蛍光微粒子分散液―１は、４２０ｎｍの励起光の照射により、６１５ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１２９】
＜抗体連結微粒子−１の合成＞
次に、通常のヒンジ法（「酵素免疫測定法第３版」；石川栄治等編、医学書院）により上記で合成した蛍光微粒子へ抗体Ｆａｂ’の導入を行った。
上記で合成した蛍光微粒子分散液―１を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗テオフィリン抗体（コスモ・バイオ（株））７．２ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画３．９ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子−１を得た。
【０１３０】
＜蛍光微粒子分散液−２の合成＞
次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）７．０ｍｇと、化合物例２８のトリアジン環を有する配位子４．６ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａ１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液−２を得た。この蛍光微粒子分散液―２は、４８０ｎｍの励起光の照射により、６１５ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１３１】
＜抗体連結微粒子−２の合成＞
上記で合成した蛍光微粒子分散液―２を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗葉酸抗体（コスモ・バイオ（株））１０ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画４．０ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子−２を得た。
【０１３２】
＜テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Sigma）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を１０ｍｌを混合し、テオフィリン-７-酢酸（和光純薬工業）３５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Sulfo−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過しテオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
【０１３３】
＜葉酸結合ポリ−Ｌ−リジンの調製と石英基板への結合＞
０．１％ポリ−Ｌ−リジン（Sigma）４０ｍｌと０．１Ｍ ＭＥＳ（ｐＨ６．０）を１０ｍｌを混合し、葉酸（和光純薬工業）６５ｍｇ、ＷＳＣ（同仁化学）３０ｍｇ、Sulfo−ＮＨＳ（Pierce）３４ｍｇを添加し室温で６時間反応させた。反応液をセファデックスＧ−２５でゲルろ過し葉酸結合ポリ−Ｌ−リジンを精製した。表面をアルカリ処理した合成石英基板を精製水で十分に洗浄した後、葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン溶液に室温で２時間浸漬した。精製水で洗浄、風乾し以下の実験に用いた。
【０１３４】
＜検出＞
上記で合成した抗体連結蛍光微粒子−１および２を、微粒子濃度０．００１％に希釈し等量を混合した。この混合微粒子１μｌを、上記で作成したテオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上および葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上へスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄し、表面の水滴を除いた。次に、この石英基板へ、４２０ｎｍおよび４８０ｎｍの光を照射し、基板からの蛍光を時間分解モードで測定した。その結果、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、４２０ｎｍの光照射で強い蛍光が観測されたが、４８０ｎｍの光照射では、蛍光はほとんど観測されなかった。また、葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、４２０ｎｍの光照射ではほとんど蛍光が観測されなかったのに対し、４８０ｎｍの光照射では、強い蛍光が観測された。このことから、混合微粒子液を使用し、励起光の波長を変えることによって、同一波長の検出光で、テオフィリン、葉酸を独立して検出することが可能である。
【０１３５】
実施例２
＜蛍光微粒子分散液−３の合成＞
実施例１と同様にして、表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａを合成した。次に、トリス（４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオノ）ユーロピウム（III）７．０ｍｇと、化合物例５のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａ１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液−３を得た。この蛍光微粒子分散液―３は、４１０ｎｍの励起光の照射により、６１５ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１３６】
＜抗体連結微粒子−３の合成＞
上記で合成した蛍光微粒子分散液―３を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗テオフィリン抗体（コスモ・バイオ（株））７．２ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画３．９ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子−３を得た。
【０１３７】
＜蛍光微粒子分散液−４の合成＞
実施例１と同様にして、表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａを合成した。次に、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオン５．６ｍｇ、塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物３．２ｍｇおよび、化合物例２９のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａ１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液−４を得た。この蛍光微粒子分散液―４は、４８０ｎｍの励起光の照射により、５４３ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１３８】
＜抗体連結微粒子−４の合成＞
上記で合成した蛍光微粒子分散液―４を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗葉酸抗体（コスモ・バイオ（株））１０ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画４．０ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子−４を得た。
【０１３９】
＜検出＞
上記で合成した抗体連結蛍光微粒子−３および４を、微粒子濃度０．００１％に希釈し等量を混合した。この混合微粒子１μｌを、実施例１と同様にして作成したテオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上および葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上へスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄し、表面の水滴を除いた。次に、この石英基板へ、４１０ｎｍおよび４８０ｎｍの光を照射し、基板からの蛍光を時間分解モードで測定した。その結果、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、４１０ｎｍの光照射で波長６１５ｎｍの強い蛍光が観測されたが、４８０ｎｍの光照射では、蛍光は観測されなかった。また、葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、４１０ｎｍの光照射ではほとんど蛍光が観測されなかったのに対し、４８０ｎｍの光照射では、波長５４３ｎｍの強い蛍光が観測された。このことから、混合微粒子液を使用し、照射光の波長、及び検出光の波長を変えることによって、テオフィリン、葉酸を独立して検出することが可能である。
【０１４０】
実施例３
＜蛍光微粒子分散液−５の合成＞
実施例１と同様にして、表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａを合成した。次に、４，４，４−トリフルオロ−１−（２−チエニル）−１，３−ブタンジオン５．６ｍｇ、塩化テルビウム（ＩＩＩ）６水和物３．２ｍｇおよび、化合物例５のトリアジン環を有する配位子４．５ｍｇを、メタノール０．５ｇで溶解した。次にこれを、上記で合成した表面にアミノ基を有する微粒子分散液Ａ１０ｇに加え、室温で３時間攪拌した。その後、アスピレータを用いて分散液中のメタノールを減圧留去した。不溶物をフィルターろ過後、４５℃で３日間静置した後、室温に冷却して、蛍光微粒子分散液−５を得た。この蛍光微粒子分散液―５は、４１０ｎｍの励起光の照射により、５４３ｎｍに強い蛍光を示した。
【０１４１】
＜抗体連結微粒子−５の合成＞
上記で合成した蛍光微粒子分散液―５を、濃度１４ｍｇ／ｍｌで０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）緩衝液に分散した。微粒子分散液１ｍｌにＳｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（同仁化学）０．６ｍｇを添加し室温で１時間反応させ、ＰＤ−１０カラム（ファルマシアバイオサイエンス）で精製し表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液を得た。
次に、抗葉酸抗体（コスモ・バイオ（株））１０ｍｇからペプシン処理、メルカプトエチルアミン還元により精製したＦａｂ’分画４．０ｍｇを、ｐＨ７．４ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。表面にマレイミド基を有する蛍光微粒子溶液（１ｍｇ／ｍｌ ０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））と等容量混合し、４℃で一晩攪拌した後、ゲルろ過により精製、抗体連結蛍光微粒子−５を得た。
【０１４２】
＜検出＞
実施例２で合成した抗体連結蛍光微粒子−３および上記で合成した抗体連結蛍光微粒子−５を、微粒子濃度０．００１％に希釈し等量を混合した。この混合微粒子１μｌを、実施例１と同様にして作成したテオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上および葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板上へスポットし、室温で２時間静置後、精製水で洗浄し、表面の水滴を除いた。次に、この石英基板へ、４１０ｎｍの光を照射し、基板からの蛍光を時間分解モードで測定した。その結果、テオフィリン結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、波長６１５ｎｍの強い蛍光が観測されたが、５４３ｎｍの蛍光は観測されなかった。また、葉酸結合ポリ−Ｌ−リジン石英基板においては、波長６１５ｎｍの蛍光が観測されなかったのに対し、波長５４３ｎｍの強い蛍光が観測された。このことから、混合微粒子液を使用し、同一波長の励起光で、検出光の波長を変えることによって、テオフィリン、葉酸を独立して検出することが可能である。