(57)【要約】      （修正有）【課題】男性不妊の原因遺伝子としてプロタミン−２変異遺伝子、当該遺伝子の発現したタンパク質、及び弾性不妊の診断方法の提供。【解決手段】男性不妊関連遺伝子プロタミン−２から転写されるｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドであって、特定のＤＮＡ配列において特定のｃがｔに置換されているポリヌクレオチドまたはその相補配列。当該ポリヌクレオチドの発現産物であって特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド。および該ポリペプチドの一部であって、５〜３０の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体ＤＮＡ中に当該ポリヌクレオチドが存在するか否かを検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
男性不妊関連遺伝子プロタミン-2から転写されるmRNAに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１のDNA配列において第248位cがtに置換されているポリヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項２】
請求項１のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む20〜100の連続したDNA配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列。
【請求項３】
請求項１のポリヌクレオチドまたは請求項２のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１のポリヌクレオチド、請求項３のポリヌクレオチド、または請求項３のポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む15〜30の連続したDNA配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
【請求項５】
請求項１または３のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列の第1-49位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項６】
請求項５のポリペプチドの一部であって、5〜30の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
【請求項７】
請求項６のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項８】
配列番号２の第50-91位、または配列番号３の第1-11位のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
【請求項９】
男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項３のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項１０】
被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、請求項１のポリヌクレオチド、または請求項２のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する請求項９の方法。
【請求項１１】
被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、請求項４のプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出する請求項９の方法。
【請求項１２】
男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項５のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
【請求項１３】
被験者から単離した生体試料中に、請求項７の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項１２の方法。
【請求項１４】
被験者から単離した生体試料中に、請求項７の抗体には反応し、請求項８の抗体には反応しないポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項１２の方法。
【請求項１５】
請求項２のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするDNAプローブ。
【請求項１６】
請求項２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするDNAチップ。
【請求項１７】
請求項７または８の抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願の発明は、男性不妊関連遺伝子変異と、この遺伝子変異を検査対象とする男性不妊の診断方法に関するものでる。さらに詳しくは、点突然変異によって特徴付けられる男性不妊関連遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドと、その遺伝子産物である変異ポリペプチド、並びにこれらの変異ポリヌクレオチドまたは変異ポリペプチドを対象とする男性不妊の診断方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
夫婦の約10%が何らかの形態の不妊問題を経験していることが知られており、これらの約半数が男性側の因子に起因している可能性がある。男性不妊の原因の一部として示唆されているのは、内分泌障害、染色体異常を含む遺伝的因子、環境因子、潜伏精巣や精索静脈瘤を含む奇形などである（非特許文献1、2）。しかしながら男性不妊の原因の大半は不十分な精子形成や精子欠失であり、この問題の原因は現時点では未解明である（非特許文献3）。また男性不妊の中には様々な遺伝的因子に関係すると考えられる事例が存在するが（非特許文献4）、それらの全てについて原因遺伝子が特定されている訳ではない。
【０００３】
精子形成段階では精子核に著しい再編成が生じるが、この過程ではヒストンが除去されて特定の核タンパク質による置換を受け、最終的に高い陽電荷を帯びたプロタミン（protamine）により置換されて、高度に圧縮される（非特許文献5、6）。ヒト精子のDNAはプロタミン-1および-2の2種類のプロタミンによって、高度に凝縮した状態で精子頭部にまとめられている。プロタミン-1は50個のアミノ酸を有する単一のポリペプチド分子であるが、プロタミン-2は57個および54個のアミノ酸を有する少なくとも2個の異なる形態の複合体である（非特許文献7）。プロタミン-2ファミリータンパク質は第16染色体に存在する単一のコピー遺伝子を元に、66個から101個の間の残基を有する前駆体として合成される（非特許文献8、9）。
【０００４】
核濃縮障害の結果として男性不妊が生じる可能性があることが示唆されている。マウスにおいて、プロタミン-1のmRNAの早期翻訳の結果、未成熟な核濃縮が生じて精子の分化が停止する（非特許文献10）。不妊患者を対象とした様々な研究ではプロタミン-2含有量の減少が報告されており（非特許文献11、12）、一部の男性不妊患者の精子核に完全に選択的なプロタミン-2欠損が見られるという報告もなされている（非特許文献13）。しかしながら、その後これらの患者より得たプロタミン-2遺伝子の配列解析の結果では、検出されたプロタミン-2減少の原因となる変異の存在は見られなかった（非特許文献13、14）。また一部の不妊症患者ではプロタミン-2前駆体分子のプロセッシングが不完全であるため、プロタミン-2減少が生じることが示唆されている（非特許文献15）。
【非特許文献１】Rubio C, et al. Human Reprod 2001; 10: 2084-2092
【非特許文献２】Lee PA, et al. (2000) J Urol., 164(5), 1697-1701
【非特許文献３】Cram DS, et al. (2001) J Androl 22(5), 738-746
【非特許文献４】Thielemans BFJ, et al. Eur. J. Obst Gynec 1998; 81: 217-225
【非特許文献５】Wouters-Tyrou, D. et al. (1998) Biochimie, 80, 117-128
【非特許文献６】Sassone-Corsi P. (2002) Science, 296, 2176-2178
【非特許文献７】McKay, D. J. et al. (1986) Eur. J. Biochem., 158, 361-366
【非特許文献８】Krawetz, S. A. et al. (1989) Genomics. 5, 639-645
【非特許文献９】Reeves, R. H. et al. (1989)  J. Hered, 80, 442-446
【非特許文献１０】Lee, K. et al. (1995) Proc. Nat.l. Acad. Sci. USA, 92, 12451-12455
【非特許文献１１】Balhorn, R. et al. (1988) Experientia., 44, 52-55
【非特許文献１２】Belokopytova, J. A. et al. (1993) Mol. Reprod. Dev., 34, 53-57
【非特許文献１３】de Yeba, L. et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 10553-10557
【非特許文献１４】Schlicker, M. et al. (1994) Hum Reprod., 9, 2313-2317
【非特許文献１５６】de Yebra, L. et al. (1998) Fertil Steril., 69, 755-759
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
遺伝的要因による男性不妊について、その遺伝的要因を特定することは、その正確な診断や治療法の確立にとって重要である。
【０００６】
前記のとおり、プロタミン遺伝子の何らかの変異が男性不妊に関連づけられることが指摘されているが、その実体は全く解明されていない。
【０００７】
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、男性不妊の原因遺伝子としてプロタミン-2遺伝子変異を提供することを課題としている。
【０００８】
またこの出願は、遺伝子変異に伴って発現する変異ポリペプチド、この変異ポリペプチドに対する抗体、並びに、これらの変異遺伝子や変異ポリペプチドを検査対象とする男性不妊診断方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明は、ヒト男性不妊関連遺伝子プロタミン-2から転写されるmRNAに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１のDNA配列において第248位cがtに置換されているポリヌクレオチド（プロタミン-2変異ポリヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
【００１０】
この発明は、プロタミン-2変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む10〜99の連続したDNA配列からなるオリゴヌクレオチド（プロタミン-2変異オリゴヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
【００１１】
この発明は、前記のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドまたはプロタミン-2変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド（プロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチド）を提供する。
【００１２】
この発明は、前記のプロタミン-2変異ポリヌクレオチド、プロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチド、またはプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む15〜45の連続したDNA配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットを提供する。
【００１３】
この発明は、前記のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドまたはプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列の第1-49位までのアミノ酸配列からなるポリペプチド（プロタミン-2変異ポリペプチド）を提供する。
【００１４】
この発明は、前記のプロタミン-2変異ポリペプチドの一部であって、5〜30の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（プロタミン-2変異ポリペプチド）を提供する。
【００１５】
この発明は、前記のプロタミン-2変異オリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗変異プロタミン-2抗体）を提供する。
【００１６】
この発明は、配列番号２の第50-91位、または配列番号３の第1-11位のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗プロタミン-2抗体）を提供する。
【００１７】
この発明はまた、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中にプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
上記の診断方法においては、被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、プロタミン-2変異ポリヌクレオチド、またはプロタミン-2変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出することを好ましい態様としている。またこの診断方法では、被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、前記のそれぞれのプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出することを好ましい態様としてもいる。
【００１９】
この発明は、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中にプロタミン-2変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
【００２０】
上記の診断方法においては、被験者から単離した生体試料中に、抗変異プロタミン-2抗体には反応し、抗プロタミン-2抗体には反応しないポリペプチドが存在するか否かを検出することを好ましい態様としてもいる。
【００２１】
この発明は、前記のプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするDNAプローブを提供する。
【００２２】
この発明は、前記のプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするDNAチップを提供する。
【００２３】
この発明は、前記の抗変異プロタミン-2抗体または抗プロタミン-2抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体を提供する。
【００２４】
すなわち、この出願の発明者らは、プロタミン遺伝子について528名の男性（不妊症258例、健常者270例）のDNA資料について分析した結果、そのcDNA（プロタミン-1：配列番号４、プロタミン-2：配列番号１）には、表１に示したようなヌクレオチド変異と、それに伴うアミノ酸変異が存在し、その一塩基置換およびアミノ酸変異、並びにプロタミン-2における一つの塩基置換によるタンパク質の短縮化が、男性不妊の原因として重要であることを見出した。なお、配列番号４は、公知のヒトプロタミン-1 cDNA（GenBank/M60331）の第532-1089塩基配列に相当する。また配列番号１は公知のヒトプロタミン-2 cDNA（GenBank/M60332）の第804-1629塩基配列に相当する。表１におけるヌクレオチド変異およびアミノ酸変異の位置（数字）は、配列表の塩基位置およびアミノ酸位置に対応する。また「−」は非コード領域であることを示す。し、「Silent」はヌクレオチド変異にともなってアミノ酸が変異しないことを示す。「***」は停止コドンに変異したことを示す。また「deletion」はヌクレオチドの欠失を、「addition」はヌクレオチドの付加を示す。
【００２５】
【表１】
2008173125.tif 000002
【００２６】
この出願の各発明において、「遺伝子」とは、ゲノムDNAに存在し、特定のポリペプチド（タンパク質）をコードする２本鎖DNAであり、そのコード領域（open readig frame：ORF）、およびORFに対する発現制御領域（プロモーター／エンハンサー配列、リプレッサー配列）を含む。
【００２７】
この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のヌクレオチド鎖であり、ポリヌクレオチドが100bp以上、オリゴヌクレオチドが100bp未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
【００２８】
この出願の発明において、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のペプチド鎖であり、ポリペプチドが30アミノ酸残基以上、オリゴペプチドが30アミノ酸残基未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
【００２９】
また、以下の説明において、「生殖に及ぼす影響」とは、催奇性ではなく、精子形成および妊よう性に及ぼす影響を意味する。
【００３０】
さらに、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
【００３１】
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
この発明のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドは、配列番号173（プロタミン-2 cDNA）において第248位のcがtに置換している。
【００３３】
このプロタミン-2変異ポリヌクレオチドは、例えば、後記のプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、男性不妊者の全mRNAから調製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記発明のプライマーセットを用い、男性不妊者のmRNAを鋳型とするRT-PCRによって単離することもできる。あるいは、野性型プロタミン-2 cDNAに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
【００３４】
この発明のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドは、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。また、後記発明のプロタミン-2変異ポリペプチドを遺伝子工学的に作製するための材料としても使用することができる。
【００３５】
この発明のプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドは、前記のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む10〜99の連続したDNA配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列である。
【００３６】
このプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成して作製することができる。また、プロタミン-2変異ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
【００３７】
このプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドもまた、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。あるいは、プロタミン-2変異オリゴペプチドを遺伝子工学的に作成するための材料として使用することもできる。
【００３８】
この発明のプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドは、プロタミン-2変異ポリヌクレオチドまたはプロタミン-2変異オリゴヌクレオチド若しくはそれらの相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド（ゲノムDNA）である。ここで、ストリンジェント（stringent）な条件とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75 mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい態様としては、750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500 mM NaCl、50 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250 mM NaCl、25 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3 mM以下、最も好ましくはNaCl約15 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5 mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。１つの好ましい態様としては、30 mM NaCl、3 mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
【００３９】
このプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えば、プロタミン-2変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、以上のとおりのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、男性不妊者の染色体DNAから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
【００４０】
このプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えばこの発明の診断方法において検出対象となる。
【００４１】
この発明のプロタミン-2プライマーセットは、前記発明のプロタミン-2変異ポリヌクレオチド、プロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、またはプロタミン-2変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１（プロタミン-2 cDND）の少なくとも１箇所のヌクレオチド変異箇所を含む15〜45nt、好ましくは15〜30ntの連続したDNA配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の各変異箇所の5’側または3’側の任意の連続DNA配列またはその相補配列とすることができる。
【００４２】
これらのプライマーセットは、それぞれの変異箇所を含む配列番号１に基づいて公知のDNA合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
【００４３】
この発明のプロタミン-2プライマーセットは、この発明の男性不妊診断方法等に使用することができる。
【００４４】
この発明のプロタミン-2変異ポリペプチドは、前記発明のプロタミン-2変異ポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列の第1-49位までのアミノ酸配列からなる短鎖のポリペプチドである。すなわちこのポリペプチドは、プロタミン-2変異ポリヌクレオチドの第248位の一塩基置換（cがt）によって第50番目グルタミン酸コドンが停止コドンに変異し、それ以降のタンパク質コード領域が発現しないことによる短鎖のポリペプチドである。
【００４５】
この変異ポリペプチドは、男性不妊者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは前記発明の変異ポリヌクレオチド（変異cDNA）を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得することができる。これらの変異ポリペプチドは、例えば、この発明の男性不妊診断方法の検査対象とすることができる。
【００４６】
この出願の変異オリゴペプチドは、前記発明の変異ポリペプチドの一部であって、各々のアミノ酸変異を含む5-30の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらの変異オリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは前記の変異ポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、この発明の抗体作製のための抗原として使用することができる。
【００４７】
この発明の抗変異プロタミン-2抗体、抗プロタミン-2抗体は、前記発明のオリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、この発明の変異ポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、MSGs発明について説明した抗体と同様にして作成することができる。またこれらの抗体は、前記の変異ポリペプチドを特異的に認識することができ、この発明の診断方法等に使用することができる。
【００４８】
この発明の診断方法は、被験者が男性不妊であるか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体DNAを単離し、このDNA中に、前記発明の変異ゲノムポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。被験者は、不妊男性、あるいは母方の親族に男性不妊者を有する男児等とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。変異ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、以下の方法が好ましい。
【００４９】
第１には、被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、前記発明のプロタミン-2変異ポリヌクレオチド、またはプロタミン-2変異オリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体DNAまたはそのmRNAと変異ポリヌクレオチドまたは変異オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、例えば、この発明のDNAプローブやDNAチップを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、DNAチップは、変異ポリヌクレオチドおよび／または変異オリゴヌクレオチドを基盤上に直接合成したものであってもよく、あるいはヌクレオチドが結合するような素材でコーティングした基盤上にオリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよい。そして、標識化した被験サンプルDNAと基盤上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を指標として、被験サンプルDNAにおけるヌクレオチド変異を同定することができる。
【００５０】
第２の好ましい方法では、被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、前記発明のプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのPCR産物が得られる。PCRまたはRT-PCRは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、PCR産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばPCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法等を行ってもよい。また、Rolling Circle Amplification法、Primer Oligo Base Extension法の公知の方法を採用することもできる。
【００５１】
この発明の別の男性不妊診断方法出願は、被験者から単離した生体試料中に、前記発明のプロタミン-2変異ポリペプチドが存在する場合に、その被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。ポリペプチドの検出は様々な公知方法によって行うことができるが、例えば、抗変異プロタミン-2抗体と、抗プロタミン-2抗体（配列番号２の第50-91位、または配列番号３の第1-11位のアミン酸配列からなるオリゴペプチドを抗原として作製された抗体）を組み合わせて用いる方法である。すなわち、短鎖のプロタミン-2変異ポリペプチドの場合には、抗変異プロタミン-2抗体は反応するが、長鎖のプロタミン-2ポリペプチドを抗原として作成された抗プロタミン-2抗体は反応しないからである。
【００５２】
以上の抗体を用いる診断方法の場合には、特にこの発明に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ELISA法」）も好ましく用いることができる。
【００５３】
以下、前記発明の基礎となった遺伝子変異を確認したスクリーニングの手続と結果を示す。
1.  方法
1-1. 被験者とゲノムDNAの抽出
プロタミン遺伝子の分析には、合計258例の不妊患者を精液学に従って複数の下位群に分けた。153例（59%）は非閉塞性の無精子症であり、73例（28%）には重度の精子減少症（精子数は5×106細胞/ml未満）、28例（11%）は精子運動性が低い無力精子症であり、4例（2%）が精子の数、形態および運動に異常がない特発性不妊症であった。対照群としては、前記と同様の健常者270例を対象とした。
【００５４】
前記の各不妊患者および健常者のゲノムDNAを、プロテアーゼおよびフェノールを用いる公知の方法（Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）により抽出して使用した。
1-2.  プロタミン-1および-2ゲノムDNAの変異同定
ゲノムDNAはプロテアーゼおよびフェノールを用いた公知の方法によって血液から単離した。5'および3'の側面領域の両方におけるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーセットを2種類構築し、これらのプロタミンのゲノムDNAを増幅した。プロタミン-1（Domenjoud, L. et al. (1990) Genomics, 8, 127-133）では、5'プライマーには転写開始部位上流の-42から-19までの24個のオリゴヌクレオチド（P1A; cccctggcatctataacaggccgc：配列番号6）、そして3'プライマーにはカノニカルポリA追加シグナルAATAAAの下流492から515までの24個のオリゴヌクレオチド（P1B; tcaagaacaaggagagaagagtgg：配列番号7）を用いた。プロタミン-2（Domenjoud, L. et al. (1990) Genomics, 8, 127-133）では5'プライマーには+49から+72までの24個のオリゴヌクレオチド（P2A; ctccagggcccactgcagcctcag：配列番号8）、3'プライマーには625から648までの24個のオリゴヌクレオチド（P1B; gaattgctatggcctcacttggtg：配列番号9）を用いてPCR増幅を行った。このプライマー設定により、ここではプロタミン-1および-2遺伝子の-42から515までの557個のポリヌクレオチド（配列番号４）と、49から648までの599個のポリヌクレオチド（配列番号１）をそれぞれ増幅することができた（図2）。なお、PCR条件は次のとおりとした；プロタミン-1では96℃で変性（45秒）、66℃でアニーリング（45秒）、および72℃で伸張（1分）を40サイクルにわたり行い、プロタミン-2では98℃で変性（10秒）、68℃でアニーリング（45秒）、および72℃で伸張（45秒）を40サイクルにわたり行った。PCR増幅した断片の精製をSUPREC PCRスピンカラム（Takara, Siga, Japan）を用いて行い、熱サイクルシーケンス分析（ABI, CA, USA）を行った。DNAシーケンスの決定は同じPCRプライマーを用いて行った。
2.  結果
2-1.  ヒトプロタミン-1 DNAの配列分析
PCRにより増幅された557bpのDNA断片は204から294までの91個のヌクレオチドから成るイントロンを含んでいた（配列番号４、図１）。各プライマー内部の509bp中のSNPsの同定を、557bpのDNA断片に対する配列分析により行った（図１）。全てのDNA試料がほぼ等量のPCR産物を増幅したことから、プライマー配列領域にはSNPsは一切含まれていないことが確認された。男性不妊患者を対象にSNPの発現率を評価し、生殖能力が証明されたボランティアの場合と比較した。合計528例の男性被験者（不妊患者258例と対象の生殖能力を持つボランティア270例）において、SNPsは5箇所で発見され、うち4箇所は133、160、320および321番目のコーディング領域に、1箇所は431番の3'未翻訳領域に存在していた（図１および表２）。観察されたSNPsは全てアミノ酸の変化を引き起こさなかった（サイレント変異）。a133g、c160gおよびg320aに位置する3箇所のSNPsと、14および46番目のアミノ酸に位置するSNP（図１）は全てメジャーホモ接合とヘテロ接合であり、マイナーホモ接合SNPsは見られなかった（表２）。47番目アミノ酸に位置する他のc321a SNPでは、不妊症および生殖能力を持つ対照母集団において、それぞれ56.6%（146例）および47.8%（129例）がホモ接合メジャーc/cタイプであり、34.5%（89例）および43.3%（117例）がヘテロ接合（c/a）、そして8.9%（23例）および8.9%（24例）がホモ接合マイナータイプ（a/a）SNPであった。3'非コーディング領域におけるa431g SNPに加えて、これらのSNPはいずれもアミノ酸変化を生じず、不妊症患者において生殖能力の証明されたボランティアより有意に発生率が高いことも示されなかった（表２：なお、表２におけるヌクレオチド位置は図１のヌクレオチド位置に対応している）。
2-2.  ヒトプロタミン-2 DNAの配列分析
各プライマー内部の551bpにおけるSNPsを、599bpのDNA断片（配列番号１）に対する配列分析により同定した（図２）。全てのPCRは、アガロースゲル電気泳動上で調べてほぼ等量のDNAを増幅したため、プライマー配列領域はSNPsを含んでいないことを確認した。ここでは、プロタミン-2遺伝子の599個のヌクレオチド中に3箇所のSNPsが観察されたが、1箇所はエクソン中に、2箇所はイントロン内に存在していた（図２）。248番ヌクレオチドにおける1箇所のヘテロ接合SNPはcからtへ変化しており、グルタミンをストップコドンに変えているものであるが、これは153例の無精子症患者のうち1例の不妊症患者にのみ観察され、270例の生殖可能な対照母集団中には見られなかった（表２）。この変化は、たとえヘミ接合状態であったとしても無精子症の原因に関連している可能性がある。さらにイントロン内部にはg398cとa473cの2箇所のSNPsが見られた。g398cでは、不妊症および生殖可能な対照母集団中において、それぞれ57.4%（148例）および47.0%（127例）がメジャー型のホモ接合、34.1%（88例）および43.7%（118例）がヘテロ接合（g/c）、そして8.5%（22例）および8.9%（24例）がマイナーホモ接合（c/c）型であった。さらに、g/a型である異なったヘテロ接合SNPの存在が1例の対照群において観察された。もう一つのa473cのSNPでは、不妊症および生殖可能な対照母集団中においてそれぞれ56.6%（146例）および47.0%（127例）がメジャー型のホモ接合、34.9%（90例）および43.7%（118例）がヘテロ接合、そして8.5%（22例）および9.3%（25例）がc型のマイナーホモ接合型であった。これらのイントロンSNPsの不妊症の母集団における発現率は、生殖能力の証明されたボランティアでの場合に対して有意差がなかった（表２）。
【００５５】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】プロタミン-1のゲノムDNA配列と、PCR増幅および配列分析のためのプライマーを示す。翻訳開始点、イントロンおよびカノニカルポリA付加シグナルは、それぞれ+1、白ヌキ箱およびカゲ付きで示した。プライマー配列は下線部分である。各タンパク質のアミノ酸配列は、ヌクレオチドシーケンスの下に大文字で記入した。右余白の数字は、ヌクレオチドおよびアミノ酸（太字）配列の位置番号を示している（ヌクレオチド位置番号は翻訳開始点（+1）からの番号であり、配列番号３とは異なることに注意）。SNPsは太字で示した。星印はGenBank登録配列（EMBL/DDBJ/GenBank/Y00443、M29706、M60331、M60332）に対して、不妊および生殖能力が証明された母集団の528例のヒト男性患者の持つヌクレオチドの違いを示す。
【図２】プロタミン-2のゲノムDNA配列と、PCR増幅および配列分析のためのプライマーを、図２と同様に示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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