(57)【要約】      （修正有）【課題】真皮の構成成分である、コラーゲン、特にＩＩＩ型コラーゲンの産生を促進するコラーゲン産生促進剤の提供。【解決手段】加水分解性タンニン、特にドゥアバンガ属植物からの抽出物に高含有率で含まれ、次の式（１）で示されるオイゲニインを有効成分とする、コラーゲン産生促進剤。2008074747.tif 000043本コラーゲン産生促進剤を皮膚外用剤に配合することにより、肌のシワ、タルミ、ハリ等の皮膚老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加水分解性タンニンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤
【請求項２】
加水分解性タンニンを有効成分とするＩＩＩ型コラーゲン産生促進剤。
【請求項３】
下記化学式（１）
【化１】
2008074747.tif 000033
（式１中、
Ｒ１は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ２と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ２は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ１と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ３は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ４は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ５は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ６は同一若しくは異なってもよく、水素基若しくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）で示される基であり、
Ｒ１〜Ｒ５すべてが水酸基であることはない）
で示される加水分解性タンニンを有効成分とする請求項１若しくは請求項２に記載のコラーゲン産生促進剤。
【化２】
2008074747.tif 000034
【化３】
2008074747.tif 000035
【化４】
2008074747.tif 000036
【化５】
2008074747.tif 000037
【化６】
2008074747.tif 000038
【請求項４】
加水分解性タンニンが、化学式（７）
【化７】
2008074747.tif 000039
で示されるオイゲニインである、請求項１若しくは請求項２に記載のコラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
加水分解性タンニンが、化学式（８）
【化８】
2008074747.tif 000040
（式８中Ｒ７は同一若しくは異なってもよく、水素基もしくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）であり、
Ｒ８は水素基もしくは化学式（９）若しくは化学式（１０）
【化９】
2008074747.tif 000041
【化１０】
2008074747.tif 000042
で示される化合物である）で示される化合物である、請求項１若しくは請求項２に記載のコラーゲン産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コラーゲン産生促進剤、特にＩＩＩ型コラーゲン産生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢や紫外線等外来ストレスにより生じるしわ、シミの発生、皮膚弾性の低下といった皮膚の老化症状には、皮膚真皮の線維芽細胞の機能低下、コラーゲンの変性や減少、ヒアルロン酸をはじめとするムコ多糖類の減少、紫外線によるメラニンの形成と沈着、細胞の酸化が重要な要因となっている。しかし、従来の化粧品のように、ムコ多糖類やコラーゲンなどの生化学製品および合成高分子製品を配合して水分保持に努めるだけでは、皮膚の老化症状を十分に防止することができないことも明らかとなっている。そこで、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るため、細胞賦活作用、コラーゲン産生促進作用、メラニン産生抑制作用、ヒアルロン酸産生促進作用及び抗酸化作用等のいずれかまたはこれらの作用のうち複数の作用を有する成分の検索と配合が試みられているが、安定性、副作用、効果などの点から未だ十分なものはない。
【０００３】
また真皮組織に存在するコラーゲンとしては、Ｉ型とＩＩＩ型が知られている。Ｉ型コラーゲンは弾力を保ち守る働きがあり、ＩＩＩ型コラーゲンは、みずみずしさを保ち柔軟性をサポートする働きがあると言われている。ＩＩＩ型とＩ型コラーゲンの割合は、乳児期には１対４であるのに対し、成人では１対１０になるといわれており、ＩＩＩ型コラーゲンは加齢に伴い急速に減少していく。皮膚の弾力性を維持、回復させるためには、Ｉ型コラーゲンのみではなく、ＩＩＩ型コラーゲンが重要な役割を担っている。
【０００４】
加水分解性タンニンに関しては、収斂作用、抗酸化作用等が古くから知られている。加水分解性タンニンの１種であるオイゲニインに関しては、抗ウィルス作用（特許文献１参照）、ＤＮＡ合成阻害作用（特許文献２参照）、ＩｇＥ−ＩｇＲレセプター結合阻害作用（特許文献３参照）、グルコシダーゼ阻害作用（特許文献４参照）、フリーラジカル消去作用（特許文献５参照）等が知られている。しかしながら、加水分解性タンニンが、コラーゲンの産生を促進する事に関しては、これまで知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開昭５７−９１９２２号公報
【特許文献２】特開平１０−１９５０９５号公報
【特許文献３】特開平１１−２６９０７５号公報
【特許文献４】特開２０００−７２６８２号公報
【特許文献５】特開２００１−３３５５０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、真皮の構成成分である、コラーゲン、特にＩＩＩ型コラーゲンの産生を促進するコラーゲン産生促進剤を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、加水分解性タンニンを有効成分とするコラーゲン産生促進剤、特にＩＩＩ型コラーゲン産生促進剤である。
【０００８】
本発明のコラーゲン産生促進剤、時にＩＩＩ型コラーゲン産生促進剤の有効成分である、加水分解性タンニンとしては、化学式（１）
【０００９】
【化１】
2008074747.tif 000002
【００１０】
（式１中、
Ｒ１は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ２と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ２は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ１と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ３は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ４は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ５は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ６は同一若しくは異なってもよく、水素基若しくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）で示される基であり、
Ｒ１〜Ｒ５すべてが水酸基であることはない）
【００１１】
【化２】
2008074747.tif 000003
【００１２】
【化３】
2008074747.tif 000004
【００１３】
【化４】
2008074747.tif 000005
【００１４】
【化５】
2008074747.tif 000006
【００１５】
【化６】
2008074747.tif 000007
【００１６】
で示される加水分解性タンニンを用いることができる。
【００１７】
本発明において、加水分解性タンニンとしては、化学式（７）で示されるオイゲニインを用いることができる。
【００１８】
【化７】
2008074747.tif 000008
【００１９】
本発明において、加水分解性タンニンとしては、化学式（８）で示される化合物を用いることができる。
【００２０】
【化８】
2008074747.tif 000009
【００２１】
（式８中Ｒ７は同一若しくは異なってもよく、水素基もしくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）であり、
Ｒ８は水素基もしくは化学式（９）若しくは化学式（１０）で示される化合物である）
【００２２】
【化９】
2008074747.tif 000010
【００２３】
【化１０】
2008074747.tif 000011
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、真皮線維芽細胞におけるコラーゲン特にＩＩＩ型コラーゲン産生促進効果に優れたコラーゲン産生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、加水分解性タンニンを有効成分とする、コラーゲン産生促進剤、特にＩＩＩ型コラーゲン産生促進剤に関する。
【００２６】
本発明で用いる加水分解性タンニンは、没食子酸やエラグ酸などの芳香族化合物とグルコースなどの糖がエステル結合を形成した構造を有する化合物であり、植物界に普遍的に存在する。本発明においては、かかる加水分解性タンニンの中でも、一般式（１）
【００２７】
【化１１】
2008074747.tif 000012
【００２８】
（式１中、
Ｒ１は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ２と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ２は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基、若しくはＲ１と共同して化学式（３）に示される残基であり、
Ｒ３は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ４は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ５は水酸基若しくは化学式（２）で示される残基であり、
Ｒ６は同一若しくは異なってもよく、水素基若しくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）で示される基であり、
Ｒ１〜Ｒ５すべてが水酸基であることはない）
で示される加水分解性タンニンを用いることができる。
【００２９】
【化１２】
2008074747.tif 000013
【００３０】
【化１３】
2008074747.tif 000014
【００３１】
【化１４】
2008074747.tif 000015
【００３２】
【化１５】
2008074747.tif 000016
【００３３】
【化１６】
2008074747.tif 000017
【００３４】
本発明において、加水分解性タンニンとしては、化学式（７）で示されるオイゲニインを用いることもできる。
【００３５】
【化１７】
2008074747.tif 000018
【００３６】
本発明において、加水分解性タンニンとしては、化学式（８）で示される化合物を用いることができる。
【００３７】
【化１８】
2008074747.tif 000019
【００３８】
（式８中Ｒ７は同一若しくは異なってもよく、水素基もしくは化学式（４）若しくは化学式（５）若しくは化学式（６）であり、
Ｒ８は水素基もしくは化学式（９）若しくは化学式（１０）で示される化合物である）
【００３９】
【化１９】
2008074747.tif 000020
【００４０】
【化２０】
2008074747.tif 000021
【００４１】
本発明の有効成分である、加水分解性タンニンは、市販の加水分解性タンニンを用いても、また植物から抽出したものを用いてもよい。
【００４２】
なお、オイゲニインは、丁子、チユ、ゲンノショウコ、バラなどに含まれる加水分解性タンニンである。本発明においては、これらの植物から公知の方法により分離したオイゲニインを用いることもできるが、これらのオイゲニインを含有する植物の抽出物を使用することもできる。また、市販されているオイゲニイン（例えば、長良サイエンス社製ｅｉｇｅｎｉｉｎ）を用いることもできる。
【００４３】
本発明者等は、今回ドゥアバンガ属植物の抽出物に、オイゲニインが高含有率で含まれていることを見いだした。ドゥアバンガ、丁子、バラのオイゲニインの含有量を表１に示す。
【００４４】
【表１】
2008074747.tif 000022
【００４５】
表１の通り、ドゥアバンガの葉部には、これまでオイゲニインの含有が知られていたバラや丁子よりも高含有率で、オイゲニインを含有することが示された。
【００４６】
オイゲニインは、例えば、ドゥアバンガ属植物抽出物に、液−液分配抽出、各種クロマトグラフィー、膜分離等、加水分解性タンニンを濃縮するのに有効な精製操作を施した後、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）等を用いた液体クロマトグラフィー処理を行うことにより得ることができる。
【００４７】
オイゲニインは、具体的には、下記工程（ａ）〜（ｃ）により得ることができる。
工程（ａ）
工程（ａ）は、ドゥアバンガ属植物を水、親水性有機溶媒又はこれらの混合溶媒で抽出する工程である。
【００４８】
抽出原料として用いるドゥアバンガ属植物の部位は特に限定されるものではなく、例えば、葉部、枝部、幹部等の地上部、果皮等の部位を抽出原料として用いることができるが、これらのうち、特に葉部等を抽出原料として用いることが好ましい。
【００４９】
抽出原料は、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用いて粉砕し、抽出溶媒による抽出に供する。この際、抽出原料の乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
【００５０】
抽出溶媒としては、極性溶媒を用いることが好ましく、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を、室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが特に好ましい。
【００５１】
抽出溶媒として用い得る水としては、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として用い得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００５２】
抽出溶媒として用い得る親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコール等が挙げられる。
【００５３】
２種以上の極性溶媒の混合液を抽出溶媒として用いる場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水と低級脂肪族アルコールとの混合液を使用する場合には、水と低級脂肪族アルコールとの混合比を１：９９〜９９：１（容量比）とすることができる。
【００５４】
ドゥアバンガ属植物からオイゲニインを抽出する際の抽出方法は特に限定されるものではなく、室温又は還流加熱下で、任意の装置を用いることができる。例えば、抽出溶媒を満たした処理槽に抽出原料を投入し、必要に応じて時々攪拌しながら、１〜４８時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の１〜１００倍量（重量比）であり、抽出温度は、通常２０〜９０℃である。
【００５５】
工程（ｂ）
工程（ｂ）は、前記工程（ａ）で得られた抽出物を吸着剤に吸着させた後、水、水溶性溶媒又はこれらの混合溶媒で溶出する工程である。
工程（ｂ）は、前記工程（ａ）で得られた抽出物の加水分解性タンニン含量を高めるとともに、脱色、脱臭、活性向上等を目的として精製する工程である。
【００５６】
抽出物に含まれる親水性有機溶媒は、吸着剤に吸着させる前に、必要に応じて留去する。親水性有機溶媒を留去した抽出物は、例えば、水、水溶性溶媒又はこれらの混合溶媒に溶解又は懸濁させた後、吸着剤に吸着させる。
【００５７】
溶解、懸濁又は溶出に用いられる水溶性溶媒としては、上記した親水性有機溶媒を用いることができるが、上記した炭素数１〜５の低級アルコール、この中でも特に、メタノール、エタノール等を用いることが好ましい。水及び水溶性溶媒の混合溶媒を用いる場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水とエタノールとの混合溶媒を使用する場合、水とエタノールとの混合比を９０：１０〜１：９９（容量比）、好ましく８０：２０〜２０：８０（容量比）とすることができる。
【００５８】
吸着剤は、特に限定されるものではないが、イオン交換樹脂、合成吸着樹脂、活性炭、キレート樹脂、シリカゲル、アルミナゲル系吸着剤、多孔質ガラス等の公知の吸着剤を単独で又は組み合わせて用いることができる。好ましくは、多孔性合成吸着樹脂であるダイヤイオンＨＰ−２０、セパビーズＳＰ−２０７（いずれも三菱化学（株）製）等の多孔性合成吸着剤を用いたカラムクロマトグラフィーと、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）であるクロマトレックスＯＤＳ、ＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア化学（株）製）等を充填剤として用いた逆相カラムクロマトグラフィーとを併用する。
【００５９】
工程（ｃ）
工程（ｃ）は、前記工程（ｂ）で得られた溶出液を、移動相として水、水溶性溶媒又はこれらの混合溶媒を用いた液体クロマトグラフィーにより分画する工程である。
【００６０】
液体クロマトグラフィーによる分画方法は特に制限されるものではなく、通常の方法で行うことができる。例えば、固定相としては、シリカゲル、ＯＤＳ、イオン交換樹脂等の公知の担体を単独で又は組み合わせて用いることができる。
【００６１】
水溶性溶媒としては、上記した親水性有機溶媒を用いることができるが、上記した炭素数１〜５の低級アルコール、この中でも特にメタノール、エタノール、アセトニトリル等を用いることが好ましい。水及び水溶性溶媒の混合溶媒を用いる場合、その混合比は適宜調整することができる。例えば、水とメタノールとの混合溶媒を使用する場合、水とエタノールとの混合比を２：８〜６：４（容量比）、好ましく３：７（容量比）とすることができる。
【００６２】
液体クロマトグラフィーを利用してオイゲニインを含有する画分を分画することにより、精製されたオイゲニインを得ることができる。
【００６３】
本発明のコラーゲン産生促進剤は、皮膚に外用するだけではなく、経口摂取も可能であり、食品、飲料、あるいは医薬品などにも応用することが可能である。
【００６４】
また、本発明のコラーゲン産生促進剤を皮膚外用剤に配合することにより、肌のシワ、タルミ、ハリ等の皮膚老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する皮膚外用剤を得ることができる。さらに、発明のコラーゲン産生促進剤は、美容、健康維持、又は栄養補給を目的とするような食品や飲料にも用いることもできる。
【００６５】
本発明のコラーゲン産生促進剤を皮膚外用剤に配合する際の配合量は、皮膚外用剤の種類や使用目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して０．０００１〜５０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜２５．０質量％である。
【００６６】
本発明のコラーゲン産生促進剤を配合する皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系、クリームや乳液などの乳化系、カラミンローション等の分散系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填したエアゾール、軟膏剤、粉末、顆粒などの種々の剤型で提供することもできる。
【実施例】
【００６７】
以下に本発明の詳細を実施例を用いて説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００６８】
［製造例１］  加水分解性タンニン含有植物抽出物の調製
ドゥアバンガ属植物（Duabanga grandiflora）の葉乾燥粉砕物１００ｇを、1Lの５０容量％エタノール水溶液に分散させ、撹拌しながら70℃にて２時間抽出した。抽出上清を濾別した。ろ液を減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、ドゥアバンガ抽出物１９．１ｇを得た。
【００６９】
［製造例２］  加水分解性タンニン含有植物抽出物分画物の調製
得られたドゥアバンガ抽出物１７．１９ｇに水５０ｍＬを加え懸濁させ、オープンカラムに充填した多孔性樹脂（ダイヤイオンＨＰ−２０：三菱化学社製）上に付し、水：エタノール溶媒を１００：０、８０：２０、６０：４０、４０：６０、２０：８０、０．５：９９．５の順で順次溶出させ、溶出物を濃縮乾固して、各溶出画分０、２、４、６、８、１０を得た。
【００７０】
［製造例３］  
溶出画分４を４０容量％メタノール水溶液に溶解し、ＬＣ−ＭＳにて、紫外部吸収画分を分取し、濃縮乾固する事により、ドゥアバンガＡ相（分子量：９３８）並びにドゥアバンガＢ相（分子量：１１０６）を単離した。それぞれ収率は、４．０６％、８．５１％であった。
［液体クロマトグラフィー条件］
固定相：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ-３（ＧＬサイエンス社製）
カラム径：４．６ｍｍ
カラム長：１５０ｍｍ
移動相：３０容量％メタノール水溶液
移動相流量：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ
【００７１】
単離したオイゲニイン並びに化学式（７）で示される化合物について、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行った。結果を図１〜図４に示す。分子量並びに１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析の結果、ドゥアバンガＡ相は、化学式（６）で示されるオイゲニインであることが確認された。
【００７２】
【化２１】
2008074747.tif 000023
【００７３】
［ＩＩＩ型コラーゲン産生促進作用］
正常ヒト真皮繊維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０4個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間後、０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて各濃度に調整したサンプル培養液に交換しさらに２４時間培養した。
培養上清中に分泌されたタイプＩＩＩコラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＳＳＡＹ  Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位タンパク量当りのコラーゲン産生量を求めた。
評価はネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を１００とした時の相対値を求めて行った。また、コントロールとの有意差検定（ｔ検定）を行い、表中の*及び**にて示した。有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表した。
【００７４】
【表２】
2008074747.tif 000024
【００７５】
【表３】
2008074747.tif 000025
【００７６】
【表４】
2008074747.tif 000026
【００７７】
【表５】
2008074747.tif 000027
【００７８】
【表６】
2008074747.tif 000028
【００７９】
【表７】
2008074747.tif 000029
【００８０】
【表８】
2008074747.tif 000030
【００８１】
【表９】
2008074747.tif 000031
【００８２】
【表１０】
2008074747.tif 000032
【００８３】
評価結果を、試料無添加のコントロールにおけるＩＩＩ型コラーゲン産生作用を１００とした相対値にて表２〜表１０に示す。また、コントロールとの有意差検定（ｔ検定）を行い、表中の*及び**にて示した。有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を*で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を**でそれぞれ表した。
【００８４】
表３〜表１０より明らかなように、本発明の加水分解性タンニンを含有する植物抽出物、並びに加水分解性タンニンは、高いＩＩＩ型コラーゲン産生促進効果を発揮していた。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ドゥアバンガＡ相  13Ｃ−ＮＭＲスペクトル
【図２】ドゥアバンガＡ相  1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図３】ドゥアバンガＢ相  13Ｃ−ＮＭＲスペクトル
【図４】ドゥアバンガＢ相  1Ｈ−ＮＭＲスペクトル
【図１】
2008074747.tif 000044
【図２】
2008074747.tif 000045
【図３】
2008074747.tif 000046
【図４】
2008074747.tif 000047