(57)【要約】【課題】基板上の所定の位置に存在する生体試料のハイブリダイゼーション反応を用いた検出において、標識物質間の立体障害を抑制することにより、検出感度を向上することのできる基板および測定方法を提供する。【解決手段】ハイブリダイゼーション反応を用いて生体試料検出を行う基板表面上に凹凸加工を施すことにより、標識物質間の立体障害を抑制し、標識数の増加による検出感度の向上を実現する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料を検出するための基板であって、基板表面に凹凸を形成し、前記生体試料を検出するためのプローブおよび前記基板凹凸面上に前記プローブを固定した領域を有することを特徴とする生体試料測定基板。
【請求項２】
前記生体試料が核酸であることを特徴とする請求項１に記載の生体試料測定基板。
【請求項３】
前記プローブを固定した領域が、インクジェット法を用いて形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載の生体試料測定基板。
【請求項４】
前記基板に形成した前記凹凸面のくぼみ部の幅が０．１μｍ〜１μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の生体試料測定基板。
【請求項５】
前記基板に形成した前記凹凸面の凹部の底面と凸部の端面との差が０．１μｍ〜１μｍであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の生体試料測定基板。
【請求項６】
生体試料の測定方法であって、請求項１〜５に記載の基板上で生体試料がハイブリダイゼーション反応を行う工程と、前記生体試料を検出するための標識物質を前記固定した生体試料に標識する工程と、該標識物質を検出する工程と、を有することを特徴とする生体試料測定方法。
【請求項７】
前記標識物質が酵素であることを特徴とする請求項６に記載の生体試料測定方法。
【請求項８】
前記標識物質の検出が化学発光法であることを特徴とする請求項６に記載の生体試料測定方法。
【請求項９】
前記標識物質が蛍光物質であることを特徴とする請求項６に記載の生体試料測定方法。
【請求項１０】
前記標識物質がインターカレータであることを特徴とする請求項６に記載の生体試料測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応を用いた生体試料を測定するための基板およびその基板を用いた生体試料測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の検出方法として、ＤＮＡチップを用いて遺伝子配列の相補性を利用したハイブリダイゼーション法による検出が行われている。ＤＮＡチップを用いた核酸検出においては測定対象物資となるターゲットに対して、相補的な配列を持った核酸プローブをチップ上にスポット状に固定化し、それらがチップ上でハイブリッド形成をすることにより検出する方法が一般的である。検出方法としてはターゲットに検出マーカーを標識して検出することが挙げられる。検出マーカーとしては、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質を直接ターゲットに標識する、またはインターカレータをハイブリダイゼーション反応後に添加することにより、核酸検出が行われている。
【０００３】
生体試料の高感度検出法として、化学発光法が注目されている。化学発光法は励起光源を必要としないため、光散乱の影響が無く、バックグラウンドノイズを抑えることが可能なこと、および光源を必要としないため装置の小型化および単純化が可能なことから注目されている。ＤＮＡチップを用いて化学発光検出を行う場合、基板上に形成したハイブリッドに酵素を標識し、化学発光試薬をＤＮＡチップ上に添加することによりスポット上に発光した発光量を測定する。
【０００４】
遺伝子検出においては、更なる微量検出の実現のために、効率的にハイブリダイゼーション反応を行う必要がある。例えば特許文献１には凹凸面上に固定化した選択結合性物質に交流電圧を印加することにより、効率的にハイブリダイゼーション反応を行う装置が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２０２３４３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
プローブの固定化量に対してターゲットがハイブリッド形成をする効率（ハイブリダイゼーション効率）は１０数％である。このため、検出感度を向上するためにはハイブリダイゼーション効率を向上しなければならない。一方、化学発光法はハイブリッド形成をした後に更に酵素を修飾するため、蛍光物質を直接標識するよりも標識数は少なくなる。このため、化学発光法による感度向上を実現するためには、酵素をより多くの形成ハイブリッドに標識する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
これらの課題を解決する手段として、本発明では凹凸を形成した基板上に測定対象物質のプローブをスポット状に固定化し、ハイブリダイゼーション反応を行なう。化学発光法を用いる場合はハイブリダイゼーション反応後に化学発光反応における触媒となる酵素を修飾する。このとき、スポット内に凹凸が形成されることにより、立体障害が抑制され、ハイブリッドの数および核酸ハイブリッドへの修飾酵素数が増加する。その結果、検出感度の向上が可能となる。
【０００７】
すなわち、以下の本発明により、上記課題を解決できる。
【０００８】
生体試料を検出するための本発明の生体試料測定基板は、基板表面に凹凸を形成し、前記生体試料を検出するためのプローブおよび前記基板凹凸面上に前記プローブを固定した領域を有する。
【０００９】
さらに、本発明の生体試料測定方法は、上記生体試料測定基板上で生体試料がハイブリダイゼーション反応を行う工程と、前記生体試料を検出するための標識物質を前記固定した生体試料に標識する工程と、前記標識物質を検出する工程と、を有する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、形成ハイブリッドおよび化学発光反応における標識酵素間の立体障害を抑制することにより、ハイブリダイゼーション効率の向上および標識酵素数の増加による検出感度の向上が実現される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明による生体試料測定基板は、基板凹凸面上のスポット領域内に凹凸を形成することにより、形成されるハイブリッドおよび標識酵素の立体障害を抑制する。その結果、ハイブリダイゼーション反応後の形成ハイブリッド数の増加および酵素標識数増加を実現することにより検出感度の向上が可能となる。
【００１２】
基板上のスポット領域内に凹凸を形成する。スポット径は５０μｍ〜１００μｍであることが好ましい。凹凸面を形成するためには、公知の方法により、フォトリソグラフィーおよびエッチングを用いて形成した。
【００１３】
本発明において測定することが可能である生体試料としては、核酸、抗原、ウイルスを挙げることができ、特に生体試料の大きさの点から核酸を測定するのに適している。
【００１４】
前記生体試料を検出するためのプローブを基板に固定する方法として、本発明においては簡便性とプローブ純度の点からインクジェット法を用いることが好ましいが、その他当業者に公知の固定化方法を用いることができる。
【００１５】
また、一般的に化学発光反応に用いられる酵素の直径は約０．１μｍであるため、酵素間の立体障害を抑制するためには、凹凸面のくぼみ部の幅および凹部の底面と凸部の端面との差は、それぞれ０．１μｍ〜１μｍ程度であることが望ましい。上記凹凸面のくぼみ部の幅および凹部の底面と凸部の端面との差はそれぞれ均一に形成されることが望ましいが、立体障害の抑制が可能であればそれぞれ均一でなくてもよい。
【００１６】
生体試料を測定するための標識物質はＣｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質を直接ターゲットに標識したもの、およびインターカレータが使用可能である。
【００１７】
化学発光法を用いる場合において、標識物質として用いることができる酵素は西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの一般的な化学発光反応に用いられる酵素であれば適用可能である。
【００１８】
本発明の一形態につき、図１を用いて説明する。
【００１９】
基板１には、第１の核酸（検出対象としての試料、プローブ核酸）および第１の核酸に対して特異的に結合し得る第２の核酸（ターゲット核酸）との複合体が固定されている。この複合体は、基板１のスポット２内に固定された第１の核酸に第２の核酸を反応させることにより得ることができる。第２の核酸が既知のものであれば、これと特異的に結合する第１の核酸が特定可能となる。第１の核酸と第２の核酸との結合は、相補配列間のハイブリダイゼーションである。第２の核酸の末端には酵素と結合可能な架橋物質が標識されている。架橋物質はビオチンが一般的であるが本発明はこれによって限定されるものではない。複合体形成後アビジン結合酵素を添加することにより、複合体に酵素を標識する。酵素としては、化学発光反応に関して触媒となる公知の酵素を適宜用いることができる。例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼを用いることができる。
【００２０】
酵素との発光反応に寄与する物質（発光反応寄与物質）を基板上に付与する付与手段は、液滴を所望の位置に所望の量で局所的に付与することができる手段であれば、どのような構成であってもよい。例えばピンスポッターなどが挙げられる。
【００２１】
インクジェット法は、インクジェットヘッドを用いて微小な液滴を吐出する方法である。インクジェットヘッドは、吐出オリフィス、該吐出オリフィスに連通した液体を収容する液室、および該液室内に設けられた液体に吐出エネルギーを付与する発熱部、を有する担体からなる。担体内の発熱部に電気信号が加わると、ここに接している液体に気泡が発生し、その圧力で吐出オリフィスから液滴が吐出し、固層表面に向かって飛翔する。もちろん、使用できる液体はインクに限られない。このような構造を備えたヘッドを用いて吐出可能な液体の量は、２〜５０ピコリットル程度に制御することが可能である。
【００２２】
発光反応は化学発光反応を用いることができる。発光寄与物質としては、化学発光試薬、化学発光反応における基質、および化学発光反応における増感剤の少なくとも一つを用いることができる。
【００２３】
化学発光試薬として、化学発光に用いられる公知の試薬を適宜用いることができる。例えばルミノール、イソルミノールを用いることができる。
【００２４】
化学発光反応における基質として、化学発光に用いられる公知の基質を適宜用いることができる。例えば過酸化水素を用いることができる。
【００２５】
化学発光反応における増感剤として、化学発光に用いられる公知の増感剤を適宜用いることができる。例えばｐ−ヨードフェノールを用いることができる。
【００２６】
なお、発光寄与物質は適宜溶媒に溶解させて用いることができる。
【００２７】
以上説明したように、本発明によれば、ハイブリッド複合体上に標識する酵素数を増大することにより、化学発光反応における発光量の増加が可能になり、検出感度の高感度化が可能になる。
【００２８】
一方、蛍光法を用いた場合においても、形成ハイブリッド間の立体障害が抑制されるため、ハイブリダイゼーション効率が向上し、検出感度の高感度化が可能になる。
【実施例】
【００２９】
図１に示す構成を有する装置を用いて酵素検出を行った。
【００３０】
〔実施例１〕
（１）基板凹凸面の形成
プローブ担持担体の基材として、１インチ×３インチの合成石英ガラス基板を用いた。基板上の凹凸面は、公知の一般的なエッチング法により、１辺１μｍ深さ１μｍの格子状となるように形成した。凹凸面形成後、セミクリーンＫＧ（横浜油脂工業株式会社製）の１ｗｔ％水溶液に浸漬し、超音波を２分間照射した。さらに純水に浸漬して同様に超音波を２分間照射し、エアナイフで乾燥させた。さらにエキシマランプにてＵＶを２分間照射し、清浄面を有する基板を用意した。
【００３１】
次にポリプロピレン製容器に入れたアミノシランカップリング剤（商品名：ＫＢＭ−９０３；信越化学工業（株）社製）と洗浄済みの凹凸ガラス基板をポリカーボネート製チャンバに密閉封入した。１０分間ダイアフラムポンプでチャンバ内の空気をシランカップリング剤蒸気と置換した後、常温で３０分間シランカップリング剤蒸気に該ガラス基板を暴露した。次に、常圧クリーンオーブン内で１２０℃、１時間ベーキングを行い、純水で未反応のシランカップリング剤を洗浄除去して、アミノシランカップリング剤処理された凹凸基板を得た。
【００３２】
次いで、Ｎ−マレイミドカプロイロキシスクシンイミド（Ｄｏｊｉｎ社製；以後、ＥＭＣＳと略す）を０．０１ｗｔ％になるように１，４−ジオキサンに溶解させた。次に該ＥＭＣＳジオキサン溶液に上記アミノシランカップリング剤処理された凹凸基板を３０分間浸漬して、凹凸基板表面のアミノ基とＥＭＣＳを反応させた。続いて、ジオキサンで未反応のＥＭＣＳを除去洗浄したあと、ドラフト内でジオキサンをエアー除去して、表面にマレイミド基を導入した凹凸基板を得た。
【００３３】
（２）プローブＤＮＡの合成
本実施例においてプローブは、検出しようとする標的核酸の全部または一部に対して相補的な塩基配列を有し、該標的核酸の塩基配列と特異的にハイブリダイズ（交雑反応）することで該標的核酸を検出する一本鎖核酸を用いた。ＤＮＡ自動合成機を用いて配列番号１の一本鎖核酸を合成した。なお配列番号１の一本鎖ＤＮＡ末端にはＤＮＡ自動合成機での合成時にチオールモディファイア（Thiol−Modifier）（グレンリサーチ（GlenResearch）社製）を用いてメルカプト基を導入した。続いて通常の脱保護を行い、ＤＮＡを回収し、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、以下の実験に用いた。
【００３４】
５’ＨＳ−ＣＧＴＡＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣ  ３’（配列番号：１）
（３）プローブの固定
上記（２）で合成したＤＮＡ断片（配列番号：１）を、グリセリン１５重量％、尿素１５重量％、ジエチレングリコール９重量％、アセチレンアルコール（商品名：アセチレノールＥ１００；川研ファインケミカル（株）社製）０．０１重量％を含む水溶液に、１０μＭになるように溶解した。
【００３５】
これらのＤＮＡ断片を含む水溶液をインクジェットプリンター（キヤノン（株）社製；型番ＢＪＦ−８５０）をガラス基板上に付与できるように改良した装置で、上記（１）の方法によって作製した凹凸基板上に別々にスポッティングした。この際、１５倍のルーペによる観測ではサテライトスポット（液体が固相表面に着弾したときの飛沫に由来するスポット）は観測されなかった。
【００３６】
プローブを含む溶液をインクジェット法にてスポッティングした上記凹凸基板を室温で３０分間放置し、１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）で洗浄し、さらに純水で洗浄後、スピンドライを行って乾燥させた。
【００３７】
（４）ハイブリダイゼーション
基板に結合させたＤＮＡと相補的な配列を持つ２５ｍｅｒのビオチン標識ＤＮＡを、シグマアルドリッチジャパン株式会社に依頼して合成した。ビオチン標識ＤＮＡを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解し、得られた溶液２ｍｌを基板とともにハイブリパックに封入し、ハイブリダイゼーション反応を３時間行なった。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて洗い流した。
【００３８】
（５）酵素標識
ストレプトアビジン結合西洋わさび由来ペルオキシダーゼを１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に最終濃度１μＭとなるように溶解した。得られた溶液２ｍｌを基板上に滴下し室温で１時間インキュベーションを行うことにより、アビジン−ビオチン結合を用いた酵素標識を行った。その後、基板を１Ｍ ＮａＣｌ／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）溶液にて洗い流し、測定対象である基板１を得た。
【００３９】
（６）化学発光反応
三つの溶液タンク４に、５．０×１０-2Ｍのルミノール、１．０×１０-2Ｍの過酸化水素溶液、５．０×１０-2Ｍのｐ−ヨードフェノール溶液（各和光純薬製）をそれぞれ入れた。ルミノールは水酸化ナトリウム水溶液を用いてアルカリ条件で溶解した後、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝液を用いてｐＨ７．２に調製した。ｐ−ヨードフェノール溶液に関してもＭＯＰＳ緩衝液を用いてｐＨを７．２に調製した。化学発光試薬の添加は、インクジェットプリンター（キヤノン（株）社製；型番 ＢＪＦ−８５０）を改良して作成したインジェクション装置を用いて行った。
【００４０】
（７）化学発光検出
図１に示すように、基板１を設置したステージ（載置台）３の下に検出器４を固定し、化学発光試薬を基板上に滴下した直後からの発光量を検出した。検出器は浜松ホトニクス株式会社製の高解像度デジタルＢ／Ｗ冷却ＣＣＤカメラであるＯＲＣＡ ＩＩ−ＥＲ−１３９４（商品名）を使用した。ＣＣＤカメラの露出時間は１０秒とした。その結果、プローブ濃度が１０μＭにおけるスポット当りの化学発光強度１５０およびＳ/Ｎ比１５の発光量が得られた。凹凸の無い平面基板を用いた場合におけるスポット当りの化学発光強度は８０およびＳ/Ｎ比８の発光量であった。また、５回測定における化学発光強度の平均値に対する３σ（σは標準偏差）は０．０５８となり、化学発光強度の再現性が非常に高いことが明らかとなった。一方、検出限界をＳ/Ｎ比３と定義した場合、従来法における検出限界であるプローブ濃度１００ｎＭに対して、プローブ濃度が５０ｎＭの場合にも検出が可能となり、従来法に比べ検出感度が２倍向上した。
【００４１】
〔実施例２〕
ストレプトアビジン結合西洋わさび由来ペルオキシダーゼに替えてストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを用いたこと以外は実施例１と同様の試験を行った。その結果、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼも本発明において好適に用いることができることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の測定方法の例を示す模式図である。
【符号の説明】
【００４３】
１  基板
２  スポット
３  ステージ（載置台）
４  受光手段
５  プローブ核酸
６  ターゲット核酸
７  ビオチン
８  アビジン
９  標識酵素
【図１】
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