(57)【要約】【課題】  本発明の目的は、安価かつ簡易に標的DNAを検出する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、より迅速かつ正確に標的DNAを検出する方法を提供することにある。【解決手段】  本発明は、キメラプローブを標的DNAにハイブリダイズさせ、ハイブリッド鎖を形成させる工程と、前記ハイブリッド鎖をリボヌクレアーゼによって切断し、前記キメラプローブの断片を遊離させる工程とを含む第一の反応と、前記断片を検出プローブがハイブリダイズされた鋳型プローブにハイブリダイズさせる工程と、前記断片をDNAポリメラーゼによって伸長させ、同時に前記DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により前記検出プローブを分解し、光マーカー物質を検出する工程とを含む第二の反応とを具備する標的DNAを検出する方法である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラプローブを標的DNAにハイブリダイズさせ、ハイブリッド鎖を形成させる工程と、
前記ハイブリッド鎖をリボヌクレアーゼによって切断し、前記キメラプローブの断片を遊離させる工程とを含む第一の反応と、
前記断片を検出プローブがハイブリダイズされた鋳型プローブにハイブリダイズさせる工程と、
前記断片をDNAポリメラーゼによって伸長させ、同時に前記DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により前記検出プローブを分解し、光マーカー物質を検出する工程とを含む第二の反応と
を具備する標的DNAを検出する方法。
【請求項２】
前記キメラプローブが、第一のDNA領域、第二のRNA領域、および第三のDNA領域から構成され、前記第二のRNA領域が、前記第一のDNA領域と第三のDNA領域との間に位置する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的DNAが、標的RNAから作製され、前記第一の反応を行う前に、前記標的RNAから逆転写酵素によってDNA-RNAハイブリッド鎖を形成し、前記DNA-RNAハイブリッド鎖からリボヌクレアーゼによって標的DNAを形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ハイブリッド鎖が、少なくとも前記標的DNAと前記第二のRNA領域との間で形成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記リボヌクレアーゼが、RNase Hである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記切断が、前記標的DNAと前記第二のRNA領域との間で形成されるDNA-RNAハイブリッド鎖のRNAを分解することによって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遊離が、前記ハイブリッド鎖のTm値が低下することによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型プローブが、前記キメラプローブの断片と相補的な配列を有する第一の鋳型領域と、前記検出プローブと相補的な配列を有する第二の鋳型領域とを含み、前記第一の鋳型領域に前記キメラプローブの断片がハイブリダイズし、かつ前記第二の鋳型領域に前記検出プローブがハイブリダイズする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第二の鋳型領域が、二以上の前記検出プローブと相補的な配列を有し、全体として、二以上の前記検出プローブが前記第二の鋳型領域にハイブリダイズする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出プローブが、光マーカー物質および消光物質を含み、光マーカー物質による発光が消光物質により抑制されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記検出プローブが、FRETプローブである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一の反応と第二の反応とが同時に行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記キメラプローブと、前記リボヌクレアーゼとを含む第一の反応試薬と、
前記鋳型プローブと、前記検出プローブと、前記DNAポリメラーゼと、dNTPとを含む第二の反応試薬と
を具備する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を使用するための反応試薬キット。
【請求項１４】
逆転写酵素および逆転写プライマーをさらに含む、請求項１３に記載の反応試薬キット。
【請求項１５】
標的DNAを含む各試料を入れる容器と、
前記容器の温度を制御する温度制御手段と、
前記容器内の光マーカー物質の発光を検出する発光検出手段と、
前記検出された発光量を測定する測定手段と
を具備する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を使用するための検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的DNAを検出する方法、該方法を使用するための反応試薬キット、および該方法を使用するための検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノムサイエンスの進展により、特定の疾患と遺伝子の多型との関係が急速に明らかになっている。現在、既に一部の疾患において、遺伝子の多型分析が、疾患の診断、予防または治療において極めて有用な手段になりうることが実証されている。
【０００３】
ヒトの場合、各個体間のゲノムDNAの同一性は99%を超え、ごく僅かな塩基配列の相違が存在するにすぎない。ヒトの多型遺伝子のうち、特に単ヌクレオチド多型（SNP；Single Nucleotide Polymorphism）の分析が注目を集めている。
【０００４】
現在、遺伝子の多型分析方法として、例えば、サードウェーブテクノロジーズ社のインベーダー法（特許文献１）、アプライドバイオシステムズ社のTaqMan法（特許文献２）、およびタカラバイオ社のUCAN法（特許文献３）がある。
【０００５】
インベーダー法は、塩基配列の標的部位において特異的な侵入構造を作り、その侵入構造を酵素CLEAVASE(登録商標)で切断することに特徴がある。しかし、インベーダー法は、特殊な酵素CLEAVASE（登録商標）の使用が必要不可欠である。酵素CLEAVASE（登録商標）は現在のところ一般には市販されておらず、入手が困難である。
【０００６】
TaqMan法は、ターゲット核酸の標的部位に相補的なオリゴヌクレオチドと、ラベル化されたオリゴヌクレオチドとを、ターゲット核酸に結合させ、DNAポリメラーゼの伸長反応によってラベル化されたオリゴヌクレオチドを分解し、ラベル化断片を放出させることに特徴がある。しかし、TaqMan法は、リアルタイムＰＣＲ法に該当し、温度を定期的に変化させるため試験に時間がかかる。
【０００７】
UCAN法は、SNPサイトに形成されたDNA-RNAハイブリッド鎖をRNase Hによって切断し、予めDNA伸長反応の阻害処理を施された3’末端を遊離させ、新たに出現した3’末端からDNA伸長反応を行うことに特徴がある。しかし、UCAN法は、SNPを検出するために、増幅反応を別途行わなければならないという問題がある。増幅反応としては、等温遺伝子増幅法（ICAN法）が挙げられているが（特許文献４）、ICAN法は、鎖置換活性を有する特殊なDNAポリメラーゼが必要不可欠である。
【０００８】
このように、既存の遺伝子の多型分析方法は、特殊な酵素または専用機器を必要とし、高額な費用負担および自由な使用の制限という問題がある。また、別途増幅反応を行わなければならないなど、簡易性に欠けるという問題がある。
【０００９】
遺伝子の多型分析方法に対するニーズは、臨床現場を中心に日々高まっており、安価かつ簡易な分析方法の提供が求められる。また、性能面では、より迅速かつ正確な分析方法の提供が求められている。
【特許文献１】特許第３６６５６４８号明細書
【特許文献２】米国特許第５２１００１５号明細書
【特許文献３】特許第３６８１７２９号明細書
【特許文献４】国際公開第０２／１６６３９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、安価かつ簡易に標的DNAを検出する方法を提供することにある。また、本発明の目的は、より迅速かつ正確に標的DNAを検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、鋭意研究の結果、新たな標的DNAを検出する方法を提供することに成功した。
【００１２】
本発明は、キメラプローブを標的DNAにハイブリダイズさせ、ハイブリッド鎖を形成させる工程と、前記ハイブリッド鎖をリボヌクレアーゼによって切断し、前記キメラプローブの断片を遊離させる工程とを含む第一の反応と、前記断片を検出プローブがハイブリダイズされた鋳型プローブにハイブリダイズさせる工程と、前記断片をDNAポリメラーゼによって伸長させ、同時に前記DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性により前記検出プローブを分解し、光マーカー物質を検出する工程とを含む第二の反応とを具備する標的DNAを検出する方法である。
【発明の効果】
【００１３】
上記構成によって、安価かつ簡易に標的DNAを検出する方法を提供することができる。また、上記構成によって、より迅速かつ正確に標的DNAを検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の実施態様について図面を参照して詳細に説明する。以下の実施態様は、本発明の例証に過ぎない。本発明は、請求項の構成を満たす全ての実施態様を含み、かつ本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々の修飾および改変が可能である。
【００１５】
１．前反応
先ず、検体の二本鎖DNAを高温条件下で変性させ、一本鎖の標的DNA 10を得る（図１）。前反応は、以後の第一および第二の反応と同一容器内で行うことができる。二本鎖DNAのうち、いずれか一方を標的DNA 10に設定し、該標的DNA 10を検出できるように各プローブの塩基配列をあらかじめ設計しておく。
【００１６】
標的DNA 10が標的RNAから作製されてもよい。標的RNAから標的DNAを作製する方法を図４に示す。先ず、標的RNA 130にプライマー135を結合させ（図４Ａ）、逆転写酵素によって標的RNA 130からDNA-RNAハイブリッド鎖を形成する（図４Ｂ）。次に、RNAリボヌクレアーゼによってDNA-RNAハイブリッド鎖のうち、RNA鎖のみを分解し、標的DNA 10を得る（図４Ｃ）。RNAリボヌクレアーゼには、RNase Hを使用する。RNase Hは、DNA-RNAハイブリッド部位を認識し、RNAを分解する酵素である。なお、RNase H活性を有する逆転写酵素を使用してもよい。RNase H活性を有する逆転写酵素は、標的RNA 130を鋳型として標的DNA 10を合成すると同時に、RNase H活性によって鋳型となった標的RNA 130を分解する。従って、追加のRNase Hを用意する必要がないため、より単純な反応系を提供することができる。標的RNAから標的DNAを作製する場合として、例えば、RNA型ウイルス性疾患の判定および治療などが挙げられる。また、検体試料中にRNAが大量に発現している場合、該RNAから変異を検出することができる。
【００１７】
２．第一の反応
以下の反応は、等温条件下において進行する。
【００１８】
前反応において得られた一本鎖の標的DNA 10にキメラプローブ20をハイブリダイズし、標的DNA 10とキメラプローブ20との複合体を得る（図２Ａ）。キメラプローブ20は、第一のDNA領域30、第二のRNA領域40、および第三のDNA領域50から構成され、第二のRNA領域40が、第一のDNA領域30と第三のDNA領域50との間に位置する。第二のRNA領域40は、標的DNA 10の変異部位60の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的DNAとDNA-RNAハイブリッド鎖を形成する。第一のDNA領域30は、標的DNA 10の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的DNA 10とDNA-DNA二本鎖を形成する（以下、第一のDNA-DNA二本鎖という）。同じく、第三のDNA領域50は、標的DNA 10の塩基配列と相補的な塩基配列を有し、標的DNA 10とDNA-DNA二本鎖を形成する（以下、第三のDNA-DNA二本鎖という）。
【００１９】
標的DNA 10とキメラプローブ20とのハイブリッド複合体が形成された後（図２Ａ）、DNA-RNAハイブリッド鎖を形成する第二のRNA領域40がリボヌクレアーゼによって切断される（図２Ｂ）。
【００２０】
本発明で使用されるリボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼH（RNase H）である。RNase Hは、DNA-RNAハイブリッド部位を認識し、RNAを分解する酵素である。RNase Hには、細胞性RNase Hおよびウイルス性RNase Hが存在する。細胞性RNase Hには、例えば大腸菌RNase HIがあり、ウイルス性RNase Hには、例えばヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素がある。商業的に利用可能なRNase Hには、例えば、Tli RNaseH II（耐熱性RNAヌクレアーゼII）がある（タカラバイオ株式会社）。耐熱性RNase Hは、高温条件下の前反応においても失活しないので、前反応の前に添加することができる。
【００２１】
RNase Hは、標的DNA 10と第二のRNA領域 40との間で形成されるDNA-RNAハイブリッド鎖のRNA部分を分解し、キメラプローブを第一の断片70および第二の断片80に切断する。第一および第二の断片70、80は、Tm値の低下によって標的DNA 10から自然に遊離する（図２Ｃ）。また、第二の断片80の3’末端側には、第二の反応において伸長反応が起こらないように、その形態または配列に予め修飾を入れておく。
【００２２】
ここで、上述した第一および第三のDNA-DNA二本鎖は、少なくとも以下の二つの要件を満たす長さに設定する。
【００２３】
（i）標的DNA 10とキメラプローブ20とのハイブリッド鎖を維持することができる長さ
DNA-RNAハイブリッド鎖は、標的DNA 10の変異部位60の塩基配列とキメラプローブ20の第二のRNA領域40との間に形成される。第二のRNA領域40は標的DNA 10の変異部位60に相補的な配列を有し、かつリボヌクレアーゼによって切断可能な配列領域を有する。例えば、標的DNA 10の一塩基多型(SNP)を検出する場合、第二のRNA領域40は少なくとも1塩基以上に設定される。第二のRNA領域40が1塩基である場合、DNA-RNAハイブリッド鎖の長さは1塩基対になるが、標的DNAの検出反応系において1塩基対のハイブリッド鎖を形成および維持することは非常に困難である。従って、第一および第三のDNA-DNA二本鎖において結合を補う必要がある。上記SNPを検出する場合、第一および第三のDNA-DNA二本鎖の長さは、少なくとも1〜50塩基、好ましくは1〜20塩基、最も好ましくは5塩基〜15塩基の長さに設定する。また、第二のRNA領域40が変異部位60に相補的な配列を含んでいれば、第二のRNA領域40をより長い領域に設定することもできる。例えば、上述したSNPの検出において第二のRNA領域40を2〜10塩基に設定した場合、第一および第三のDNA-DNA二本鎖の長さは、第二のRNA領域40を1塩基に設定した場合と比較して短くすることができる。
【００２４】
なお、1塩基対で反応が実行できることが実験で確認された。このように1塩基対とする方が、2塩基対以上で反応を行う場合よりも、反応の再現性がよくなり、特異性が高まるので好ましい。
【００２５】
（ii）第一および第二の断片70、80を遊離することができる長さ
標的DNA 10にハイブリダイズしたキメラプローブは、リボヌクレアーゼによって、第一の断片70と第二の断片80に切断される（図２Ｂ）。第一の断片70のハイブリッド領域は、第一のDNA-DNA二本鎖のみで構成される。第二の断片80のハイブリッド領域は、第三のDNA-DNA二本鎖のみで構成される。従って、第一の断片70および第二の断片80は、切断前のキメラプローブ20と比較して標的DNA 10に対するハイブリダイズ領域が短くなるので、Tm値が必然的に低下する。
【００２６】
ここで、第一の反応を等温条件下で進行させるためには、第一および第二の断片70、80の結合を担う第一および第三のDNA-DNA二本鎖のTm値が、反応系の温度T0以下になるように設定しなければならない。すなわち、キメラプローブ20のTm値をTm1、第一および第二の断片70、80のTm値をそれぞれTm2、Tm3、反応系の温度をT0とすると、以下の不等式(1)の関係が成立する。
【数１】
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【００２７】
上記関係が成立する場合、図２Ｂにおける切断後のキメラプローブの断片70、80は、標的DNA 10から自然に遊離し、反応系中に分散する（図２Ｃ）。
【００２８】
反応系の温度T0は、50℃〜80℃、好ましくは55℃〜75℃、最も好ましくは60℃〜70℃である。なお、第一のDNA-DNA二本鎖の長さと第三のDNA-DNA二本鎖の長さは、異なる長さに設定してもよい。但し、いずれの断片70、80も反応系の温度T0において自然に遊離する必要がある。
【００２９】
また、本発明の反応の律速段階は、第一の反応にある。第一の反応において、標的DNA 10に結合したキメラプローブ20は、RNase Hによって切断された後、標的DNA 10から遊離する。遊離反応は、第一の断片70のTm2値および第二の断片80のTm3値が、反応温度T0よりも低下することによって起こる。従って、遊離反応は等温下で自然発生的に進行する。反応系中には、キメラプローブ20が過剰に存在するため、第一および第二の断片70、80が遊離後、新たなキメラプローブ20が標的DNA 10に結合し、以下の反応が繰り返される。
【表１】
2008307029.tif 000004
【００３０】
３．第二の反応
以下の反応は、等温条件下において進行する。
【００３１】
第一および第三の断片70、80が、Tm値の低下によって標的DNAから自然に遊離した後（図２Ｃ）、第一の断片70は、鋳型プローブ100にハイブリダイズされる（図３Ａ）。鋳型プローブ100は、検出プローブ90と相補的な配列を有する第二の鋳型領域を含み、検出プローブ90が第二の鋳型領域にハイブリダイズする（図３Ａ）。検出プローブ90は、光マーカー物質110および消光物質120を含み、光マーカー物質110による発光が消光物質120により抑制されている。光マーカー物質110には、化学発光物質、蛍光物質または生物発光物質等、一般的に使用される如何なる発光を生じる物質も含まれる。商業的に利用可能な検出プローブ90には、例えば、FRETプローブ（シグマアルドリッチジャパン株式会社）がある。
【００３２】
また、複数種類の光マーカー物質を反応容器内に予め加えることによって、複数種類の配列を同時に測定することができる。例えば、4種類のSNPの存在を判定する場合、各SNPに対応する光マーカー物質を同一容器内に予め入れておく。各光マーカー物質は発光色の違い等によって識別可能なものとする。第一および第二の反応が進行し、光マーカー物質の発光が検出される。その結果、判定基準値以上のシグナル量が得られた光マーカー物質に対応するSNPのみが存在していることが決定できる。
【００３３】
次に、第二の鋳型領域が、二以上の前記検出プローブと相補的な配列を有し、全体として、二以上の検出プローブ90が第二の鋳型領域にハイブリダイズしてもよい。３つの検出プローブ90a、90b、90cが第二の鋳型領域にハイブリダイズした鋳型プローブ100を図５に示す。各検出プローブ90a、90b、90cが、第二の鋳型領域に一定の間隔を空けて連続的に結合する（図５Ａ）。各検出プローブ90a、90b、90cは、それぞれ独立したシグナル単位を構成する。各検出プローブ90a、90b、90cの光マーカー物質110a、110b、110cは、同じ検出プローブ中にある消光物質120a、120b、120cによって発光を抑制されている。理論上、検出プローブ90の数が２倍になれば、シグナル量も２倍になる。シグナル量の増大により、より迅速かつ正確に標的DNAの検出を行うことができる。但し、検出プローブ90の数が多くなると、鋳型プローブ100の合成が複雑になる。従って、結合する検出プローブ90の数は、2〜10個、好ましくは2〜8個、最も好ましくは2〜5個に設定する。
【００３４】
さらに、鋳型プローブ100は、第一の断片70と相補的な配列を有する第一の鋳型領域を含み、第一の反応において遊離した第一の断片70が、第一の鋳型領域にハイブリダイズする。第一の鋳型領域の5’末端は、第一の断片70の3’末端と一致し、第一の鋳型領域に結合した第一の断片70は、DNAポリメラーゼによる伸長反応が可能である。
【００３５】
鋳型プローブ100に検出プローブ90および第一の断片70が結合した後（図３Ａ）、DNAポリメラーゼが第一の断片70の3’末端を認識して結合する。第一の断片70の3’末端は、DNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性によって伸長する。第一の断片70の伸長方向に存在する検出プローブ90は、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって分解される（図３Ｂ）。分解された検出プローブ90は、消光物質120による抑制が解除され、光マーカー物質110が光を発する。発した光を検出し、シグナルとして表示する。
【００３６】
一回の反応で得られるシグナルを一単位とすると、各鋳型プローブ100は、一単位のシグナルをもたらす。律速反応である第一の反応において生成された第一の断片70が、逐次的に鋳型プローブ100に結合していくので、経時的にシグナル量が増加していく。シグナル量を時間軸に沿ってプロットし、シグナル量の経時的変化を観察する。シグナル量が変異の存在を確定可能な閾値以上（判定基準値以上）に達したとき、標的DNAの変異の存在を決定する（すなわち、標的DNAの多型の型の決定）。
【００３７】
第二の鋳型領域に二以上の検出プローブ90が結合している場合、DNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって各検出プローブ90が次々に分解されていく。例えば、図５では、３つの検出プローブ90a、90b、90cがDNAポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって次々に分解される。分解された検出プローブ90a、90b、90cは、消光物質120a、120b、120cによる抑制が解除され、光マーカー物質110a、110b、110cが光を発する（図５Ｂ）。二以上の検出プローブ90が結合している場合、一回の反応で得られるシグナル強度が増大されるので、より短時間に標的DNAの多型の型を決定できるシグナル量を得ることができる。短時間での多型の型の決定は、例えば、術中診断において大きな威力を発揮する。
【００３８】
第二の反応は、第一の反応によって生成される第一の断片70の生成速度に依存する。反応系中には過剰に鋳型プローブ100が存在しているので、第一の反応によって生成された第一の断片70は、順次、以下の反応を行う。
【表２】
2008307029.tif 000005
【００３９】
第一の断片70の伸長反応によって、最終的には第一の断片70と鋳型プローブ100とのDNA-DNA二本鎖が形成される（図３Ｂ）。該ハイブリッド鎖は、以後反応には関与せず、反応系中に安定な状態でとどまる。
【００４０】
上記反応は、第一の反応と同じ温度で行われる等温反応であり、等温下で自然発生的に進行する。従って、第一および第二の反応は、同一系内および同一温度下で同時に行うことができる。本発明は、煩雑な温度制御手段が不要であり、簡易な装置系で反応を進行させることができる。
【００４１】
４．反応試薬キット
本発明の反応試薬キットは、キメラプローブと、リボヌクレアーゼとを含む第一の反応試薬と、鋳型プローブと、検出プローブと、DNAポリメラーゼと、dNTPとを含む第二の反応試薬とを具備する、上記第一および第二の反応に使用するための反応試薬キットである。dNTPは、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）を含む試薬である。標的RNAから標的DNAを作製する場合、上記反応試薬キットには、さらに逆転写酵素および逆転写プライマーが含まれる。前反応、第一の反応および第二の反応は、全て同一容器内で進行するため、上記各反応試薬は、別々に梱包されている必要はなく、同一梱包であってもよい。
【００４２】
５．検出装置
本発明の検出装置を図８に示す。
【００４３】
本発明の検出装置は、標的DNAを含む各試料を入れる容器140と、該容器の温度を制御する温度制御手段150と、該容器内の光マーカー物質の発光を検出する発光検出手段160と、前記検出された発光量を測定する測定手段170とを具備する。
【００４４】
本発明は同一容器内で進行する。従って、容器140は、標的DNAを含む本発明で使用される試薬類を保持可能な容積を備える。容器140をマイクロアレイ型にしてもよい。マイクロアレイ型の容器140は、複数の検体のSNPの型を同時に判定することができる。また、本発明は等温反応条件で進む。従って、本発明の温度制御手段150は、前反応で90℃以上に上昇させた温度を60℃程度に下げ、以後温度を一定に保つ機能のみを備えていればよい。検出手段160は、光マーカー物質の発光を検出できる任意の検出手段を用いることができる。例えば、容器140として市販のマイクロプレートを使用する場合、市販のマイクロプレートリーダーを使用してもよい。この場合、本発明の専用機器は不要である。
【００４５】
本発明の方法は、同一容器内および等温条件下で進行するため、装置の構成が比較的単純であり、装置を小型化することが可能である。装置の小型化によって、例えば、臨床現場での持ち運びおよび設置が容易になり、術中診断等において威力を発揮する。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４７】
（実施例１）
１．実験材料
（１）標的DNA
標的DNAとして、CYP2C9（HS研究資源バンクより入手）を使用する。CYP2C9は、5’末端側から256番目の塩基に一塩基多型(SNP)を含む511塩基対からなるDNAである。5’末端側から256番目の塩基がAのものがメジャー配列であり、256番目の塩基がCのものがマイナー配列である。以下にCYP2C9の塩基配列を示す。SNP部位は斜体太字で表記する。
【化１】
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【００４８】
（２）キメラプローブ
キメラプローブ（グライナージャパン株式会社より入手）は、全長36塩基対からなるDNA-RNA-DNAプローブである。5’末端側から1〜21番目の塩基が第一のDNA領域に相当し、22番目の塩基が第二のRNA領域に相当し、23〜36番目の塩基が第三のDNA領域に相当する。第一のDNA領域のうち、12〜21番目の10塩基は、標的DNAの257〜266番目の10塩基と相補的な配列に設定する。第三のDNA領域のうち、23〜34番目の12塩基は、標的DNAの244〜255番目の12塩基と相補的な配列に設定する。相補的な配列部分は、それぞれ標的DNAとDNA-DNA二本鎖を形成する。
【００４９】
第二のRNA領域は、標的DNAの256番目の塩基と相補的な配列に設定する。相補的な配列部分は、標的DNAとDNA-RNAハイブリッド鎖を形成する。第二のRNA領域がTに設定されたキメラプローブは、メジャー配列に対応する。一方、第二のRNA領域がGに設定されたキメラプローブは、マイナー配列に対応する。
【００５０】
以下にキメラプローブの塩基配列を示す。第一および第三のDNA領域のうち、標的DNAと相補的な塩基配列を有する部分を下線で表記する。RNAは小文字で表記し、かつSNPに対応するRNAを斜体で表記する。
【化２】
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【００５１】
（３）鋳型プローブ
鋳型プローブ（シグマアルドリッチジャパン株式会社より入手）は、全長55塩基対からなる一本鎖DNAである。5’末端側から3〜27番目の25塩基は、FRETプローブの塩基配列と相補的な配列に設定する。33〜53番目の21塩基は、キメラプローブの断片と相補的な配列に設定する。以下に鋳型プローブの塩基配列を示す。FRETプローブがハイブリダイズする位置を一重下線で表記し、キメラプローブの断片がハイブリダイズする位置を二重下線で表記する。
【化３】
2008307029.tif 000008
【００５２】
（４）検出プローブ
検出プローブとしては、FRETプローブを使用することができる。FRETとは、蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer）のことであり、ドナー物質からアクセプター物質への蛍光エネルギーの転移の有無を利用して、目的配列の有無を検出することができる。本発明においては、光マーカー物質（ドナー、エネルギー供与体）と消光物質（アクセプター、エネルギー受容体）がナノメートルオーダーの距離に近接しているとき、ドナーからアクセプターへの蛍光のエネルギー転移が起こり、ドナーの蛍光が検出されず、この２物質が離れたとき、ドナーの蛍光が検出されるようになる。したがって、ドナーの蛍光が検出されない場合には、検出対象の核酸配列が存在せず、ドナーの蛍光が検出された場合に、検出対象の核酸配列が存在することが分かる。
【００５３】
FRETプローブの一例として、シグマアルドリッチジャパン株式会社製のものを使用することができる。例えば、全長25塩基対からなる一本鎖DNAであり、5’末端が光マーカー物質（FAM）で修飾され、かつ3’末端が消光物質（TAMRA）で修飾されている。FAMの光発光はTAMRAによって抑制されている。以下にFRETプローブの塩基配列を示す。
【化４】
2008307029.tif 000009
【００５４】
（５）リボヌクレアーゼおよびDNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼとして、KOD（東洋紡）を使用する。リボヌクレアーゼとして、Tli RNaseH II（耐熱性RNAヌクレアーゼH）を使用する。Tli RNaseH IIは、CycleavePCR Core Kit（タカラバイオ株式会社）から入手可能である。
【００５５】
（６）その他の試薬
その他、以下の試薬を用意する。各試薬は、CycleavePCR Core Kit（タカラバイオ株式会社）の中から選択して使用する。
【００５６】
CycleavePCR Buffer（緩衝液）
dNTP Mixture（基質）
Mg Solution（塩類）
（７）分析機器
Applied Biosystems 7900HT FastリアルタイムPCRシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）を使用する。
【００５７】
２．実験の反応機構
図６に上述の実験系における反応機構を示す。図６では、各核酸の塩基配列を明記した。
【００５８】
先ず、第一の反応において、キメラプローブ20が標的DNA 10に結合する（図６Ａ）。キメラプローブ20は、RNase Hによって切断部位Ｘで切断される。切断されたキメラプローブ断片は、Tm値の低下によって自然に標的DNAから遊離する。
【００５９】
次に、第二の反応において、キメラプローブの断片70が鋳型プローブ100に結合する（図６Ｂ）。同時に、FRETプローブ90が鋳型プローブ100に結合する。FRETプローブ90は、5’末端がFAM 110で修飾され、かつ3’末端がTAMRA 120で修飾されている。TAMRA 120は、FAM 110の蛍光発光を抑制する消光作用Ｙを示す。また、KOD（DNA ポリメラーゼ130)が、キメラプローブの断片70と鋳型プローブ100のハイブリッド領域を認識して結合する（図６Ｂ）。
【００６０】
結合したKOD（DNA ポリメラーゼ130)は、伸長方向Ｚに向かって伸長反応を行う（図６Ｃ）。同時に、KOD（DNA ポリメラーゼ130)は、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により、FRETプローブ90を分解する。分解されたFRETプローブは、TAMRA 120による消光作用Ｙが消失し、結果としてFAM 110が光を発する（図６Ｃ）。FAM 110が発する光のシグナル量を経時的にプロットすることによって、標的DNAの変異を検出する。
【００６１】
３．実験の手順
本実施例では便宜上、リアルタイムPCRシステムを分析機器として選択したので、以下、リアルタイムPCR用チューブ内で本発明の反応を行い、かつリアルタイムPCRシステムでシグナル強度を測定することとする。しかし、本発明の反応は等温で進行し、かつPCR操作は不要である。従って、本発明を行う反応容器はいかなる制約も受けない。また、シグナル強度は経時毎のシグナル量が測定できれば足り、サイクル数のカウントは不要である。従って、本発明を行う分析機器はリアルタイムPCRシステムに何ら限定されない。
【００６２】
リアルタイムPCR用チューブ内に、上述した試薬を下記の組成になるように分注する。
【表３】
2008307029.tif 000010
【００６３】
次に、リアルタイムPCRシステムにて、下記の反応温度で測定を行う。
【００６４】
94℃、3分間（二本鎖の標的DNAを一本鎖に解離）
64℃、20分間（第一および第二の反応）
前反応として、試料を94℃で3分間静置し、二本鎖の標的DNAを一本鎖に解離する。標的DNAが一本鎖に解離した後、温度を64℃まで下げる。以下、本発明の第一および第二の反応は等温下で進行する。
【００６５】
検出はFRETプローブの5’末端に結合した蛍光物質FAMを対象とし、リアルタイムで測定を行う。
【００６６】
図７にリアルタイムPCRを用いて測定される結果を示す。縦軸はシグナル量を表わし、横軸は経過時間（分）を表わす。シグナル量が判定基準値Sdに達したとき、標的DNA中にキメラプローブのSNPの型が存在することを確定する。最初の3分間は、94℃で二本鎖の標的DNAを一本鎖に解離する。
【００６７】
標的DNAとキメラプローブのSNPの型が一致しない場合：
シグナル量は反応20分経過後もほとんど変化せず、シグナル量は判定基準値Sdに達しない（曲線Ｉ）。
【００６８】
標的DNAとキメラプローブのSNPの型が一致する場合：
鋳型プローブに一つの検出プローブを結合した場合、シグナル量は時間とともに増幅し、少なくとも反応20分経過後には判定基準値Sdに達する（曲線II）。
【００６９】
鋳型プローブに二以上の検出プローブを結合した場合、シグナル量は時間とともに急速に増幅し、少なくとも一つの検出プローブを結合した場合と比べてより短時間で判定基準値Sdに達する（曲線III）。
【００７０】
より短時間でSNPの型を確定できることによって、例えば術中診断等に使用する場合、患者の負担を著しく軽減しつつ、かつ患者に合ったオーダーメードの手術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】前反応を表わす模式図。
【図２】第一の反応を表わす模式図。
【図３】第二の反応を表わす模式図。
【図４】標的RNAから標的DNAを合成する模式図。
【図５】鋳型プローブに二以上の検出プローブを結合した場合の第二の反応を表わす模式図。
【図６】実施例１における第一および第二の反応を表わす模式図。
【図７】シグナル量の経時変化を表わすグラフ。
【図８】本発明の方法を使用するための検出装置の模式図。
【符号の説明】
【００７２】
１０・・・標的DNA、２０・・・キメラプローブ、３０・・・第一のDNA領域、４０・・・第二のRNA領域、５０・・・第三のDNA領域、６０・・・変異部位、７０・・・第一の断片、８０・・・第二の断片、９０・・・検出プローブ、１００・・・鋳型プローブ、１１０・・・光マーカー物質、１２０・・・消光物質、１３０・・・標的RNA、１３５・・・プライマー、１４０・・・容器、１５０・・・温度制御手段、１６０・・・発光検出手段、１７０・・・測定手段、Ｘ・・・RNase Hによる切断部位、Ｙ・・・消光作用、Ｚ・・・伸長方向、I・・・SNPの型が一致しない場合のシグナル量を表わす曲線、II・・・SNPの型が一致する場合のシグナル量を表わす曲線、III・・・SNPの型が一致する場合であって、鋳型プローブに二以上の検出プローブを結合した場合のシグナル量を表わす曲線。
【図１】
2008307029.tif 000011
【図２】
2008307029.tif 000012
【図３】
2008307029.tif 000013
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008307029.tif 000017
【図８】
2008307029.tif 000018
【配列表】
2008307029000001.app