(57)【要約】【課題】海水や汽水など高塩濃度環境下にある汚染水を、活性汚泥法により浄化する方法の提供を目的とする。また、浄化過程で生じる余剰汚泥を有効に処理する方法の提供を目的とする。【解決方法】海水由来の活性汚泥を用いて高塩濃度下にある汚染水を浄化する方法を提供する。また、該海水由来の活性汚泥法による浄化過程で生じる余剰汚泥は、基質としてメタン発酵に用いることより処理するするとともにメタンガスを得る方法を提供する。【選択図】図４
2008307459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
海から菌を採取する採取ステップと、
採取した菌を栄養源にて増殖する増殖ステップと、
増殖した菌を浄化対象海水域の海水で馴養する馴養ステップと、
馴養した菌を用いて浄化対象海水を浄化する浄化ステップと、
を有する汚染海水の浄化方法。
【請求項２】
馴養した菌のうち浄化ステップで余剰となる余剰汚泥を浄化ステップ処理装置から取り除く余剰汚泥除去ステップと、
余剰汚泥除去ステップにて取り除かれた余剰汚泥にメタン生成菌を混入する混入ステップと、
混入されたメタン生成菌が生成するメタンガスを収集するメタンガス収集ステップと、
をさらに有する請求項１に記載の汚染海水の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水由来の微生物を用いて汚染海水を浄化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、汚染水の浄化方法として好気性微生物を用いた活性汚泥法が実用化されている。特に下水処理場など淡水の汚染浄化においては幅広く用いられている。
【０００３】
しかし、汚染水浄化過程で生じる余剰汚泥の処理については次のような問題点がある。従来、これらの余剰汚泥は凝集剤を添加し、脱水機で脱水した後、埋め立て、焼却、溶融等の方法により処理されていた。現在、多くの下水処理場では該余剰汚泥を焼却処理している。しかし該余剰汚泥を焼却処理した場合、温室効果ガスである二酸化炭素や一酸化二窒素を発生するという問題点がある。また、当該焼却処理に多量の電力を消費する点や、焼却プラントの設置に近隣住民の合意を得られにくい点などの問題点もある。また、汚泥中には重金属等も含まれるため有機肥料等への利用も難しく、これらの問題を解決する方法の開発が望まれている。
【０００４】
そこで、現在一部の下水処理場では上記問題点の打開策として、余剰汚泥の処理にメタン発酵が行われている。余剰汚泥を基質としてメタン発酵を行うことにより、余剰汚泥を処理でき、更にメタンガスを獲得できるからである。そして該メタン発酵により生成したメタンガスをエネルギー源として、下水処理場における発電等に利用することにより、下水処理場の消費電力削減が可能となる。また、メタン発酵は偏性嫌気性細菌によって行われるため、発酵過程において爆気を必要とせず、省エネルギー性が高く、更に除去有機物あたりの汚泥発生量が少ないという利点もある。
【０００５】
しかし、上記のような活性汚泥法による汚染水の浄化は陸上の汚染水には広く用いられているが、海水や汽水などの塩濃度の高い環境ではまだ実用化には至っていない。その理由は、塩濃度の高い環境においては塩化物イオンの存在により微生物のフロック形成を阻害するなどの理由から活性汚泥法の利用は難しいという問題点があるからである。しかしながら、石油輸送タンカーの事故による海水汚染や生活排水の流入による富栄養化が海の生態系へ多大な悪影響を及ぼすなど、陸上以外の汚染水の浄化方法の確立は急務である。
【特許文献１】特開２００３−１２９９
【特許文献２】特開２００２−３３６８９８
【特許文献３】特開２００１−７９５９０
【非特許文献１】J.Waida, H.Norizi, K.Kasuga, T.Yoshida, H.Habe, T.Omori (2002) Applied Microbiology Biotechnology. 58
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題点に鑑み、海水由来の活性汚泥を用いて汚染海水を浄化する方法及び該浄化過程で発生する余剰汚泥を用いてメタン発酵を行う、汚染海水浄化方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、海から採取した菌を用いて、活性汚泥法による汚染海水浄化が可能であることを見出した。また、該浄化過程で発生する余剰汚泥を基質として用いたメタン発酵が可能であることを見出した。
（１）本発明は、海から菌を採取する採取ステップと、採取した菌を栄養源にて増殖する増殖ステップと、増殖した菌を浄化対象海水域の海水で馴養する馴養ステップと、馴養した菌を用いて浄化対象海水を浄化する浄化ステップと、を有する汚染海水の浄化方法を提供する。
（２）本発明は、馴養した菌のうち浄化ステップで余剰となる余剰汚泥を浄化ステップ処理装置から取り除く余剰汚泥除去ステップと、余剰汚泥除去ステップにて取り除かれた菌にメタン生成菌を混入する混入ステップと、混入されたメタン生成菌が生成するメタンガスを収集するメタンガス収集ステップと、をさらに有する上記（１）に記載の汚染海水の浄化方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の、海から採取した活性汚泥を用いて汚染水を浄化する方法によれば、高塩濃度の汚染水に対しても、活性汚泥法を用いることが可能である。そのため陸上の汚染水に限らず、海水や汽水などの汚染水に対しても活性汚泥法による汚染水浄化が可能となる。また、該活性汚泥法による汚染水浄化過程で生じる余剰汚泥は、メタン発酵の基質として用いられるため該余剰汚泥処理に関する従来の問題点を回避できる。更に、該メタン発酵により発生するメタンガスをエネルギー源として使用することができるため、エネルギーコストの削減を可能とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下に、前記各発明を実施するための最良の形態を説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施しうる。なお、実施形態１は主に請求項１に関する。実施形態２は主に請求項２に関する。
<<実施形態１>>
<実施形態１：概要>
【００１０】
実施形態１は、海から採取した活性汚泥を用いて、汚染海水を浄化する方法に関する。
<実施形態１：構成>
図1は本実施形態の、海から採取した活性汚泥を用いて、汚染海水浄化方法を構成する各工程の流れを示した図である。この図で示すように、本実施形態の汚染海水浄化方法は、海から菌を採取する採取工程（０１０１）と、採取した菌を栄養源にて増殖する増殖工程（０１０２）と、増殖した菌を浄化対象海水域の海水で馴養する馴養工程（０１０３）と、馴養した菌を用いて浄化対象海水を浄化する浄化工程（０１０４）とからなることを基本としている。以下で、本実施形態の構成要素及び各工程について具体的に説明する。
【００１１】
海から菌を採取するとは、菌を含む海水を採取することをいう。海水は、表層水であってもいいし、水面下の一定の水深の海水であってもよい。該海水は、後述する、菌増殖工程において、海水培地として用いられる。
図２は菌増殖工程の流れを示した図である。海水培地を一定時間曝気し、海水に含まれる菌を代謝・増殖する（０２０１ａ、０２０１ｂ）。その後、曝気を止め静置して、増殖した菌を沈殿させる（０２０２ａ、０２０２ｂ）。菌が沈殿したら上清の略半分を排出し、その排出した分量に相当する量の新たな海水培地を加える（０２０３ａ、０２０３ｂ）。これを再度曝気する（０２０４ａ、０２０４ｂ）。この工程を繰り返し行い、栄養源が不足しないようにして菌を増殖させる。
海水培地とは、採取した海水をろ過し、固形物等を除去して栄養源を添加したものをいう。該ろ過は、目視可能な大きさの固形物等を除去できる程度であればよく、目視可能な大きさの固形物等がなければ、ろ過する必要はない。また、該海水培地の物理化学的条件、つまりpHやEh、塩濃度、水分含量などは、採取した菌の生育に適した条件にするのが好ましい。
栄養源とは、窒素源、炭素源、無機塩類、その他の栄養素をいう。炭素源としては、例えばグルコースやスクロース、デンプン、セルロース、酵母エキスなどが該当する。窒素源としては、例えば、アンモニウム塩や硝酸塩、亜硝酸塩などの無機窒素源や、アミノ酸、尿素、ペプトン、酵母エキスなどの有機窒素源などが該当する。無機塩類は炭素源や窒素源などに比べると少量で足りるが、不可欠であり、必要な無機元素はリン酸、硫黄、マグネシウム、鉄、カリウムなどである。また、海洋細菌はナトリウムイオンを必要とする。これらの栄養源は採取した菌の生育に適したものを選ぶことが好ましい。
菌増殖工程にて増殖した菌は、活性汚泥として、後述する馴養工程において、浄化対象海水域の海水で一定期間馴養する。
図３は、馴養工程の流れを示した図である。
浄化対象海水域の海水に菌増殖工程にて増殖した菌群を活性汚泥として添加し（０３０１）、所定時間曝気する（０３０２）。その後、曝気を停止し静置して活性汚泥を沈殿させる（０３０３）。活性汚泥が沈殿し上清が略透明になったら、該上清のうち略半分を除去し、除去した分量に相当する量の新たな浄化対象海水域の海水を加え上清交換を行う（０３０４）。
馴養工程は、該曝気ステップ及び静置ステップ、上清交換ステップを複数回繰り返すことにより行う。該繰り返しは、浄化処理能力の向上又は活性汚泥を構成する菌叢の安定が見られるまで行うのが望ましい。しかし、必ずしも浄化処理能力の向上又は活性汚泥を構成する菌叢の安定が見られるまで該繰り返しを行う必要はない。また、活性汚泥となる菌を採取した海水に含まれる有機物と浄化対象海水域の海水に含まれる有機物の組成が類似している場合等、馴養工程を経なくてもかかる菌が該浄化対象海水域の海水に対して浄化処理能力を有する場合は、該馴養工程は省略し、増殖工程から直接、後述する浄化工程に移行してもよい。
浄化処理能力の向上を判断する一例として、汚染海水に含まれる窒素量やリン量などを測定し、その減少量を見る。
活性汚泥を構成する菌叢の安定とは、該馴養工程により浄化対象海水域の海水に含まれる有機物にたいして良好な資化能力を有する菌群が増殖し、該菌群が活性汚泥の主な構成生物となることをいう。該菌叢の安定は、例えばrep-PCRやDGGE法により判断する。    
rep-PCR法とは、DNA中に存在するREP配列をプライマーとして用いて行う核酸増幅反応（PCR）をいう。該PCR産物の電気泳動の結果の結果は活性汚泥を構成する菌群により変化するため、経時時間による電気泳動バンドパターンにより、菌叢の変遷を判断できる。REP配列とは、各生物種固有の繰り返し配列をいう。
【００１２】
DGGE法とは、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Grandient Gel Electrophoreisis）のことであり、同一鎖長のDNAを、その配列の違いにより分離する方法えある。１６SrDNAの３４１番目から５３４番目を増幅したPCR産物について該DGGE法を用いることにより、電気泳動バンドパターンにより、経時時間による菌叢の変遷を判断できる。
図4は浄化工程の流れを示した図である。浄化対象海水域の海水に前記馴養工程を経た、又は経ていない菌群からなる活性汚泥を添加し（０４０１）、所定時間曝気する（０４０２）。その後、曝気を停止し静置して活性汚泥を沈殿させる（０４０３）。活性汚泥が沈殿し上清が略透明になったら、該上清を浄化水として取得する（０４０５）。該沈殿した活性汚泥は、次の浄化工程の活性汚泥として利用し、これに新たな汚染水を添加して（０４０４）次の浄化工程に移行する。なお、活性汚泥を沈殿させた際、該活性汚泥の一部を余剰汚泥として除去（０４０６）してもよい。
<実施形態１：効果>
【００１３】
本実施形態の汚染海水浄化方法によれば、塩濃度の高い海水や汽水の汚染水についても、活性汚泥法により浄化が可能となる。
<<実施形態２>>
<実施形態２：概要>
【００１４】
実施形態２は、前記実施形態１の汚染海水浄化過程で生じる余剰汚泥の処理工程をさらに有する汚染海水浄化方法に関する。
<実施形態２：構成>
【００１５】
図５は本実施形態の、海から採取した活性汚泥を用いて、汚染海水浄化し、該浄化過程で生じる余剰汚泥の処理方法を構成する各工程の流れを示した図である。
【００１６】
この図で示すように、本実施形態の汚染海水浄化方法は、海から菌を採取する採取工程（０５０１）と、採取した菌を栄養源にて増殖する増殖工程（０５０２）と、増殖した菌を浄化対象海水域の海水で馴養する馴養工程（０５０３）と、馴養した菌を用いて浄化対象海水を浄化する浄化工程（０５０４）と、浄化工程で生じた余剰汚泥を浄化処理装置から除去する余剰汚泥除去工程（０５０５）と、除去した余剰汚泥にメタン生成菌を混入する混入工程（０５０６）と、混入したメタン生成菌が生成するメタンガスを収集するメタンガス収集工程（０５０７）とからなることを基本としている。以下で、本実施形態の構成要素及び各工程について具体的に説明する。
【００１７】
採取工程及び増殖工程、馴養工程、浄化工程については前記実施形態１と同様である。したがってこれらの説明については省略する。
【００１８】
余剰汚泥とは、浄化工程において増殖した菌のことをいい、本発明においては、１度に浄化する汚染海水量に対して、良好な分解能を示す活性汚泥量を超える分の汚泥をいう。該余剰汚泥は、沈降分離、凝集分離、遠心分離、膜分離等の公知の固液分離方法により除去する。
【００１９】
メタン発酵に用いるメタン生成菌は、Methanosarcina sp. やMethanosaeta sp.  など既存の菌を用いればよく、また雑多な微生物の集団をメタン生成菌として用いてもよい。メタン生成菌による余剰汚泥のメタン発酵処理において分解されずに残った余剰汚泥の一部は、前記浄化工程の活性汚泥として再利用してもよい。
【００２０】
メタン発酵処理方法としては、より高効率化のため５０℃以上でメタン発酵を行う高温メタン発酵や、３０℃以上でメタン発酵を行わせる中温メタン発酵が好ましい。また、メタン発酵処理の前段階として、該余剰汚泥に対して前処理を施すのが好ましい。前処理方法としては、例えば余剰汚泥に酸素を添加し、低圧条件下で低温過熱処理する方法や、超音波処理方法などがある。該前処理を施すことにより、余剰汚泥を構成する菌群の凝集形態が変化するとともに、菌の細胞壁は破壊されメタン生成菌により分解されやすくなる。さらには、メタン発酵処理を常に撹拌下で行うことが望ましい。基質である余剰汚泥とメタン生成菌が接触する機会が増え、メタン発酵がより促進されるからである。該撹拌方法は既存の方法を用いればよい。
【００２１】
メタンガス収集方法は、メタンガスを収集できる方法であれば特に限定しない。
【００２２】
なお、本発明者らは海水をメタン発酵培地に用いてメタンを生成する方法を見出した。該培地を用いてメタン発酵を行う場合は、図５に示す各工程を基本として、更に余剰汚泥を除去工程後であって、メタン生成菌の混入工程前に硫酸還元処理を行うのが望ましい。海水中には多くの硫酸イオンが存在し、該硫酸イオンはメタン発酵におけるメタン生成に対して強い阻害作用を示すからである。そこで、メタン生成菌と硫酸還元菌の混合物を余剰汚泥に混入して余剰汚泥を硫酸還元菌により還元処理を行い硫酸イオンを除去するとともにメタンを生成する。これにより、硫酸イオンによるメタン生成の阻害を回避できる。
【００２３】
該硫酸還元処理は余剰汚泥を乾燥したものを用いてもよい。海水中には重金属が含まれているため、海水由来菌による余剰汚泥にも銅、亜鉛、鉛等の重金属が含有されており、これらの重金属イオンと硫酸イオンとが硫化物の形成に寄与するからである。生成した硫化物は沈殿除去すればよい。
<実施形態２：効果>
【００２４】
本実施形態の汚染海水浄化方法によれば、汚染海水浄化過程で生じる余剰汚泥を処理できるとともに、バイオエネルギーを得ることができる。
<<実施例>>
【００２５】
以下の実施例をもって本発明を具体的に説明する。なお、以下の実施例は単に例示するのみであり、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２６】
<活性汚泥作成方法の具体例>
【００２７】
実施形態１の活性汚泥の作成方法についての具体例を挙げる。
【００２８】
（１）大洗海水を７００ｍｌ採取し、後述する（３）の窒素源、リン源、微量成分、及び炭素源となる成分を加えて海水培地とする。前記海水培地を２Ｌペットボトル培養容器に入れ、ポンプ吐出量１Ｌ／ｍｉｎで７日間曝気する。曝気を止め、汚泥を静置沈殿させる。沈殿が完了したら、上清５０ｍｌを取り除き、新たに海水培地５０ｍｌ加え、海水の交換を行い、再度同条件で曝気する。
【００２９】
（２）前記海水の交換を１週間に３回の頻度で行う。これを３ヶ月続け、最終的に沈殿した汚泥を活性汚泥とする。
【００３０】
（３）海水培地成分は表1に示したとおりである。
【表１】
2008307459.tif 000003
【００３１】
<活性汚泥馴養方法の具体例>
【００３２】
（１）浄化対象海水として新芝運河水３Ｌを採取し、活性汚泥運転装置に入れる。これに前記の方法で大洗海水から作成した活性汚泥を３ｇ（湿重量）添加し、撹拌及び曝気を３日間行う。
【００３３】
（２）３日間経過後、撹拌及び曝気を止め活性汚泥運転装置を静置し、汚泥を沈殿させる。沈殿が完了したら、上清１．５Ｌを取り除き、新たに浄化対象海水１．５Ｌ加える海水の交換を行い、再度同条件で撹拌及び曝気する。
【００３４】
（３）前記海水の交換を１週間に３回の頻度で行う。取り除いた上清は後述する活性汚泥処理能力の測定及び活性汚泥を構成する菌叢解析に用いる。該処理能力及び菌叢の安定が見られるまで、本方法による馴養を行う。
<活性汚泥法による汚染海水浄化方法の具体例>
【００３５】
前記馴養過程において、活性汚泥処理能力及び活性汚泥を構成する菌叢の安定が見られたら、汚染海水浄化に移行する。なお、活性汚泥法による汚染海水浄化の方法は、前記活性汚泥馴養方法と同じ方法をとるため、ここではその説明を省略する。
【００３６】
<活性汚泥処理能力の測定の具体例>
【００３７】
活性汚泥処理能力を、汚染海水中の全窒素量、全リン量の減少量から測定する。
【００３８】
（汚泥量の測定）
【００３９】
前記馴養過程及び汚染水浄化過程において撹拌及び曝気中の液を活性汚泥液とし、該活性汚泥液を５０ｍｌ採取し、５０００ｒｐｍで５分間遠心する。その後、上清を捨て、新たに蒸留水を加え、再度５０００ｒｐｍで５分間遠心する。遠心後の上清を捨て、沈殿をあらかじめ１１５℃で２時間加熱した後、デシケータ内で放冷し、重量を測定しておいたるつぼに移し、これを１３０℃で加熱し水分を蒸発させてから１１５℃で２時間以上過熱する。その後、該るつぼをデシケータ内で放冷し、重量を測定する。
【００４０】
（全窒素量の測定）
【００４１】
全窒素量の測定は、Ｔｅｓｔ'Ｎチューブ全窒素試薬キット（セントラル科学社）を用いてＤＲ／２４００型水質分析計（ハック社）により行った。
【００４２】
リアクターの電源を入れ、１０５℃まで加熱した。全窒素水酸化物試薬バイアルに全窒素過硫酸塩試薬パウダーピロー１包を加えた。該バイアルに前記馴養過程及び汚染水浄化過程において撹拌及び曝気し、静置後の上清２ｍｌをピペッターで加えた。これをキャップして３０秒間混合した後、１０５℃まで熱してあるリアクターに３０分間入れた。その後、バイアルをリアクターから取り出し、室温まで冷まし、全窒素試薬Ａパウダーピロー１包をバイアルに加え、１５秒間混合した後、３分間静置した。さらに全窒素試薬Ｂパウダーピロー１包をバイアルに加え、１５秒間混合した後、２分間静置した。その後、該バイアルの反応液２ｍｌを、全窒素試薬Ｃが入ったバイアルに添加し、ゆっくり１０回反転し、その後５分間静置した。該バイアルを８８０nmの吸光度で測定した。
【００４３】
（全リン量の測定）
【００４４】
全リン量の測定は、Ｎチューブ測定試薬キット（セントラル科学社）を用いてＤＲ／２４００型水質分析計（ハック社）により行った。
【００４５】
リアクターの電源を入れ、１５０℃まで加熱した。全酸加水分解測定バイアルに前記馴養過程及び汚染水浄化過程において撹拌及び曝気し、静置後の上清５ｍｌをピペッターで加えた。リン酸塩用過硫酸カリウムパウダーピロー１包を該バイアルに加え、キャップをして混合した。該バイアルをあらかじめ１５０℃まで熱しておいたリアクターに３０分間入れた。３０分経過後、該バイアルをリアクターから取り出し、室温まで冷ました。１．５４Ｎ水酸化ナトリウム２ｍｌを、該バイアルに添加し、振とうした。０点補正を行った後、該バイアルにＰｈｏｓＶｅｒ３パウダーピロー１包加え、１０〜１５秒振とうし、２分間静置したの後４１０ｎｍの吸高度で測定した。
【００４６】
（全窒素量、全リン量の測定結果）
【００４７】
図６に、全窒素量及び全リン量の測定結果を示す。（ａ）及び（ｂ）は、馴養工程を経ない活性汚泥を用いて活性汚泥法により浄化した汚染海水中の全窒素量及び全リン量をそれぞれ示す。（ａ）、（ｂ）ともに、測定開始から２０日経過後から減少量が安定してきたことがわかる。したがって、馴養工程は短期間で汚染海水を浄化するためには有効である。
【００４８】
また、（ｃ）及び（ｄ）は、３ヶ月間の馴養工程を経た活性汚泥を用いて活性汚泥法により浄化した汚染海水中の全窒素量及び全リン量をそれぞれ示す。前記馴養工程を経ない活性汚泥を用いた場合と比較し、測定初日から全窒素量及び全リン量の減少が安定して見られる。
【００４９】
以上より、本実施例に基づいて作成した活性汚泥は、汚染海水中の全窒素量及び全リン量は減少させ、活性汚泥法により汚染海水を浄化することができる。また、所定の期間の馴養工程を経た活性汚泥を用いることにより、高効率に汚染海水を浄化することができる。
<活性汚泥を構成する菌叢解析の具体例>
【００５０】
前記汚泥処理能力の測定とともに、該能力の変化に対応する菌叢の変遷をｒｅｐ−ＰＣＲ法及びＤＧＧＥ法において解析した。
【００５１】
（total DNAの抽出）
【００５２】
特に明記しない限り、操作は室温で行った。
前記馴養過程において撹拌及び曝気中の液を活性汚泥液とし、該活性汚泥液を１．５ｍｌ採取し、１３０００ｒｐｍで５分間で遠心分離した。上清を除いた後、５００μＬの生理食塩水を加え、撹拌し、再度１３０００ｒｐｍで５分間で遠心分離した。再び、上清を除き、５６７μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ）を加え、菌体をｖｏｒｔｅｘを用いて撹拌、懸濁した。前記菌体懸濁液に６０ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ溶液を１０μｌ加え、穏やかに５分間転倒混和し、３７℃で６０分間インキュベートした。その後、１０％ＳＤＳ溶液を３０μｌ、プロテインキナーゼＫ溶液を３μｌ加えて５分間転倒混和し、再度３７℃で９０分間インキュベートした。これに５ＭＮａＣｌを１１０μｌ加え５分間転倒混和し、さらにＣＴＡＢ／ＮａＣｌを８０μｌ加え５分間転倒混和した。その後、６５℃で２０分間インキュベートした。
【００５３】
８００μｌのクロロホルムを加えて２０分間転倒混和した後、１３０００ｒｐｍで５分間で遠心分離し、上清を新しく用意した２ｍｌチューブへ移した。
【００５４】
７００μｌのフェノール／クロロホルムを加え、１０分間転倒混和後、１３０００ｒｐｍで５分間で遠心分離し、上清を新しく用意した１．５ｍｌチューブへ移した。
【００５５】
４００μｌの２−プロパノールを加え５分間転倒混和した後、１３０００ｒｐｍで５分間で遠心分離し、ペレットを７０％エタノール５００μｌでリンスした。
【００５６】
ＲＮａｓｅを含むＴＥ  ｂｕｆｆｅｒでペレットを溶解し３０℃の恒温槽内で一晩処理した。
【００５７】
（rep-PCRによる菌叢解析）
【００５８】
（１）ＰＣＲ反応溶液の組成
【００５９】
total  DNA  ２００ng、  10×Ex  Taq  buffer  １０μｌ、  dNTP  ８μｌ、  Ex  Taq  ０．５μｌ、  プライマーとして、REP-IR-1 100pmol  、  REP-２-1 100pmol  、及びｄH2Oを、合わせて１００μｌになるように調整した。
【００６０】
（２）プライマー
【００６１】
REP-IR-1、REP-２-1プライマーペアの塩基配列をそれぞれ配列番号１、２に示す。より多くの菌に対応するため、保存性の低い塩基をイノシンに置換した。
【００６２】
（３）ＰＣＲ反応プログラム
【００６３】
９５℃で２分間熱変性処理した後、９２℃で３０秒間→４０℃で１分間→６５℃で８分間のサイクルを３５サイクル行った。その後、４℃に冷却した。
【００６４】
（４）電気泳動
【００６５】
２．０％アガロースゲルを用いて前記ＰＣＲ産物を１００Ｖで４０分間電気泳動した。
【００６６】
（DGGEによる菌叢解析）
【００６７】
（１）ＰＣＲ反応溶液の組成
【００６８】
total  DNA  ２００ng、  10×Ex  Taq  buffer  １０μｌ、  dNTP  ８μｌ、  Ex  Taq  ０．５μｌ、  プライマーとして、F341  25pmol  、  R534  25pmol  、及びｄH2Oを、合わせて１００μｌになるように調整した。
【００６９】
（２）ＰＣＲ反応プログラム
【００７０】
（第1増幅反応）９４℃で4分間熱変性処理した後、９４℃で1分間→６５℃で１分間→７２℃で３分間のサイクルを２０サイクル行った。このとき、アニーリング温度である６５℃は１サイクルごとに０．５℃低下するタッチダウンで行った。
【００７１】
（第２増幅反応）第１増幅反応に引き続き、９４℃で1分間→５５℃で１分間→７２℃で３分間のサイクルを１０サイクル行った。
【００７２】
その後、７２℃で７分間処理し、最後に１５℃に冷却した。
【００７３】
（３）電気泳動
【００７４】
２．０％アガロースゲルを用いて前記ＰＣＲ産物を１００Ｖで３０分間電気泳動した。
【００７５】
（４）DGGE法に用いるゲルの作成
【００７６】
後述する変性剤溶液１及び２を作成し、溶液１を８ｍｌ、溶液２を８ｍｌの混合液に１０％ＡＰＳ１６０μｌ、ＴＥＭＥＤ１６μｌを添加し、撹拌した。また、１６ｍｌの溶液２にも同様に１０％ＡＰＳ１６０μｌ、ＴＥＭＥＤ１６μｌを添加し、撹拌した。その後、それぞれの溶液をシリンジに吸い込みクラジエントフォーマーに取り付けた。クラジエントフォーマーを回転し、ゲルをガラス板の間に流し込んで、３０分後、溶液をゲル状に固めた。また、３ｍｌの溶液１に１０％ＡＰＳ３０μｌ、ＴＥＭＥＤ３μｌを添加し、撹拌したものを、前記ガラス板の間に流し込みコームを差し込んだ。これを１時間静置した。
【００７７】
変性剤溶液１  ：  40%Acrylamid/Bis 10ml、  50×TAE buffer 1ml  及び蒸留水を全部で５０ｍｌになるように調製した。
【００７８】
変性剤溶液２  ：  40%Acrylamid/Bis 10ml、  50×TAE buffer 1ml、Hormamide 16ml、  Urea 16.8g  及び蒸留水を全部で５０ｍｌになるように調製した。
【００７９】
（５）ＤＧＧＥ法
【００８０】
前記（４）のゲルを用いて、前記（３）のバンドから同一鎖長のＤＮＡバンドを回収し、５５℃にて２０Ｖで１０分間泳動したのち、５５℃にて１００Ｖで１２時間泳動した。
【００８１】
（菌叢解析の結果）
【００８２】
図７に、本実施例のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示す。（ａ）は、馴養工程の経過日数に対するｒｅｐ-ＰＣＲ産物の電気泳動バンドパターンを示す。馴養工程開始から１５日目以降において、４００ｂｐ及び９００ｂｐ付近のバンドが安定して見られるようになり、バンドパターンが類似してきた。
【００８３】
（ｂ）は、馴養工程の経過日数に対するＤＧＧＥ法による電気泳動パターンを示す。馴養工程開始０日目に見られたＡ，Ｂ，Ｃのバンドは、３日目以降は消失した。また、１５日目以降はＤ，Ｅが安定して見られるようになった。
【００８４】
以上より、１５日間の馴養工程により活性汚泥中の菌叢が安定する。
【実施例２】
【００８５】
<メタン発酵の具体例>
【００８６】
実施形態２のメタン発酵について具体例を挙げる。
【００８７】
（海水培地を用いて行うメタン発酵）
【００８８】
（１）海水を用いてメタン発酵用培地を作成し、該メタン発酵用培地８００ｍｌに種菌としてメタン生成菌２００ｍｌ及び所定量の硫酸還元菌を添加した。これに基質として余剰汚泥７０ｇ（湿重量）を添加し、５０℃の恒温槽で静置培養した。発生したメタンガスは、水上置換法により、その発生量を測定した。
【００８９】
（２）メタン発酵用培地成分は表２に示したとおりである。
【表２】
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【００９０】
（前処理：超音波処理）
【００９１】
活性汚泥１０ｇ（湿重量）を採取し、ソニケーターを用いて超音波処理を行った。その後、メタン発酵を行った。
【００９２】
（メタン発酵の結果）
【００９３】
図８に、メタンガス発生量を示す。Ａは余剰汚泥をそのまま基質として用いた場合を示し、Ｂは余剰汚泥を超音波処理した後、基質として用いた場合のメタンガス発生量を示す。これにより、海水培地を用いたメタン発酵により、メタンガスが発生することが分かる。また、余剰汚泥を基質とするメタン発酵によりメタンガスが発生し、更には、メタン発酵の前処理として基質である余剰汚泥を超音波処理することがメタンガス発生に有効であることがわかる。これは、超音波処理により、菌体の細胞膜が破壊されメタン生成菌による分解を受けやすくなったためと考えられる。また、メタン発酵の際、培養液を常に撹拌することも、メタンガス発生に有効である。これは、撹拌することにより、基質とメタン生成菌が接触する機会が増えるためと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】実施形態１の流れを示す図。
【図２】菌増殖ステップの流れを示す図及びその概念図。
【図３】馴養ステップの流れを示す図。
【図４】浄化ステップの流れを示す図。
【図５】実施形態２の流れを示す図。
【図６】汚染海水中の全窒素量、全リン量の減少量を示グラフ。
【図７】菌叢を変化をrep-PCR産物の電気泳動及びDGGEのバンドパターンで示す図。
【図８】メタンガス発生量を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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