(57)【要約】【課題】B／F分離操作が不要であり、簡便かつ短時間での測定が可能であり、また酵素反応により検出シグナルを増幅することができることにより高感度の測定が可能である、被験物の測定方法を提供すること。【解決手段】（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；及び（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に、前記酵素の基質を接触させる工程を含む、被験物の測定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；及び（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に、前記酵素の基質を接触させる工程を含む、被験物の測定方法。
【請求項２】
補助因子が金属イオン、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、ヘム、ニコチンアデニンジヌクレオチド（NAD）、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）、ピリドキサールリン酸、S−アデノシルメチオニン、チアミンリン酸、又はビタミン類である、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
アポ酵素が、グルタチオンレダクターゼ、チトクロームレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、コリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、ホモシステイン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トランスフェリン、ラクトフェリン、アミラーゼ、カタラーゼ、又はトランスカルボキシラーゼのいずれかから各々の補助因子を取り除いたものである、請求項１又は２に記載の測定方法。
【請求項４】
第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位が、抗原、抗体、抗体フラグメント、受容体、DNA、RNA、及びアプタマーからなる群より選択される１種類またはその組み合わせである、請求項１から３のいずれかに記載の測定方法。
【請求項５】
第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位が、抗体である、請求項１から４の何れかに記載の測定方法。
【請求項６】
第１反応体と被験物と第２反応体との結合物中の第１反応体の補助因子と第２反応体のアポ酵素とが結合して生成するホロ酵素と、その基質との反応による生成物の量を指標として、被験物の量を測定する、請求項１から５の何れかに記載の測定方法。
【請求項７】
ホロ酵素とその基質との反応による生成物の量を、吸光度、蛍光強度、発光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴、又は近接場光のいずれかにより算出する、請求項６に記載の測定方法。
【請求項８】
被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体を含む、請求項１から７のいずれかに記載の測定方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の補助因子及びアポ酵素の系を用いた被験物の測定方法に関する。本発明は、サンドイッチアッセイにおいて酵素の補助因子及びアポ酵素の系を用いた被験物の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、抗原抗体反応を利用した免疫測定法では、いわゆる「サンドイッチ法」が用いられることが多い。この方法は、 被験物と特異的に結合する２種類の抗体（反応体）が、被験物の異なる部位に結合することにより、「第１反応体−被験物−第２反応体」を形成し、被験物を「第１反応体−被験物−第２反応体」として検出する。
【０００３】
この場合、ラジオアイソトープや蛍光色素の様なレポーター分子や酵素標識された第１反応体または第２反応体を用い、レポーター分子の強度や酵素反応生成物の濃度として被験物濃度は算出される。しかし、被験物に対して過剰量のレポーター分子や酵素で標識された第１反応体または第２反応体を洗浄操作などにより系外に除去する操作（B／F分離）必要がある。このB／F分離は測定操作を煩雑にし、測定時間が長くなる事に加え、B／F分離やそれに続く洗浄操作により、第１反応体または第２反応体に結合した被験物が除去されてしまい、検出感度の低下をもたらす欠点を有している。
【０００４】
この様な問題を解決するB／F分離不要な方法として、第１反応体と第２反応体に別々の蛍光色素や蛍光タンパク質を結合させ、２つの蛍光物質間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）により被験物濃度を算出する方法が開示されている。しかしこの方法は、検出シグナルを増幅する事ができない為、一般的には検出感度が低い。
【０００５】
第１反応体と第２反応体に酵素の別々の断片を結合させ、「第１反応体−被験物−第２反応体」が形成された時にのみ、2つの断片が相互作用し酵素活性を発現する方法が、特開平５−２７６９５９号公報に開示されている。しかし、この方法は遺伝子工学的に酵素の断片を発現させる必要があり、また発現させた酵素断片が不安定な事が多いという問題点を有している。
【０００６】
一方、補酵素−アポ酵素系を用いる酵素免疫検定法については、補助因子を結合させた被験物とアポ酵素（酵素全体から補助因子を取り除いた部分）を用いる方法を開示されている（特許文献２及び３）。しかし該技術はいわゆる競合法である。競合法とは、例えば、測定対象である抗原とともに、一定量の抗体および抗体と親和性のある標識された抗原を反応させ、測定対象である抗原と標識された抗原との割合を求め、試料中の測定対象物質を測定するものである。上記のような競合法は、サンドイッチ法に比べ測定のダイナミックレンジが狭いという問題点を有している。
【０００７】
【特許文献１】特開平５−２７６９５９号公報
【特許文献２】米国特許第4,213,893号
【特許文献３】米国特許第4,318,983号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、B／F分離操作が不要であり、簡便かつ短時間での測定が可能であり、また酵素反応により検出シグナルを増幅することができることにより高感度の測定が可能である、被験物の測定方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、酵素を補助因子とアポ酵素とに分割した形でサンドイッチ法において用いることによって、B／F分離操作を必要とすることなく、簡便、短時間かつ高感度に被験物の測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、（１）（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程；及び（２）上記工程（１）で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に、前記酵素の基質を接触させる工程を含む、被験物の測定方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、補助因子は金属イオン、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、ヘム、ニコチンアデニンジヌクレオチド（NAD）、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）、ピリドキサールリン酸、S−アデノシルメチオニン、チアミンリン酸、又はビタミン類である。
【００１２】
好ましくは、アポ酵素は、グルタチオンレダクターゼ、チトクロームレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、コリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、ホモシステイン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トランスフェリン、ラクトフェリン、アミラーゼ、カタラーゼ、又はトランスカルボキシラーゼのいずれかから各々の補助因子を取り除いたものである。
【００１３】
好ましくは、第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位は、抗原、抗体、抗体フラグメント、受容体、DNA、RNA、及びアプタマーからなる群より選択される１種類またはその組み合わせである。
【００１４】
好ましくは、第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位は、抗体である。
【００１５】
好ましくは、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物中の第１反応体の補助因子と第２反応体のアポ酵素とが結合して生成するホロ酵素と、その基質との反応による生成物の量を指標として、被験物の量を測定する。
【００１６】
好ましくは、ホロ酵素とその基質との反応による生成物の量を、吸光度、蛍光強度、発光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴、又は近接場光のいずれかにより算出する。
【００１７】
本発明の別の側面によれば、被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体を含む、本発明の測定方法に用いるためのキットが提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の被験物の測定方法においては、B／F分離操作が不要であり、簡便かつ短時間での測定が可能である。また、本発明の被験物の測定方法においては、酵素反応により検出シグナルを増幅することができることにより高感度の測定が可能である。即ち、本発明の被験物の測定方法は、（１）従来のサンドイッチ法で必要なB／F分離操作が不要である点、（２）FRETなどのB／F分離が不要な方法に比べて、検出シグナルを増幅することができるため高感度の測定が可能である点、（３）酵素断片を利用する方法は遺伝子工学的に非常に煩雑であるが、本発明の方法は簡便に測定系を構築することができる点で、既存の方法に対する利点を有している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の被験物の測定方法においては、先ず、（ａ）被験物、（ｂ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに（ｃ）該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体、を反応させて、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物を得る工程を行い、その後に、上記工程で生成した第１反応体と被験物と第２反応体との結合物に、前記酵素の基質を接触させる工程を行って被験物の測定を行う。本発明の方法の概要を図１に示す。
【００２０】
本発明で用いることができる被験物の種類は特に限定されないが、例えば、医薬品、抗原、抗体、酵素、ホルモン、サイトカイン、糖質、脂質、ビタミン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、血球、細胞、細菌、又はウィルスなどが挙げられる。また、環境ホルモンなど自然界に存在する物質であってもよい。被験物としては、上記した被験物を含有する血液、尿、唾液、骨髄液、脳脊髄液などの体液；河川水、又は廃液などを用いてもよい。
【００２１】
本発明で用いる第１反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有するものである。また、本発明で用いる第２反応体は、被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有するものである。
【００２２】
第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位は、例えば、抗原、抗体、抗体フラグメント、種々の受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、これらを結合した血球などの細胞性物質を挙げることができる。反応部位は、上記の中でも、抗体又は抗体フラグメントであることが好ましい。
【００２３】
本発明による被験物の測定方法は、サンドイッチ法の原理を採用している。従って、第１反応体及び第２反応体における被験物と特異的に結合する反応部位はそれぞれ、被験物の異なる部位に特異的に結合するものであることが必要である。
【００２４】
次に、酵素の補助因子とアポ酵素について説明する。酵素の中には、その酵素活性を発現するために、低分子有機物質や金属等の補助因子（または補酵素とも言う）を必要とするものがある。補助因子（補酵素）と結合した状態の酵素をホロ酵素と言い、補助因子が結合していない状態の酵素をアポ酵素と言う。アポ酵素と補助因子（補酵素）の親和性は様々であるが、ｐＨ等の条件を変化させることにより、その補助因子をアポ酵素から遊離することができるような親和性の弱いものもある。
【００２５】
本発明で用いる第１反応体は、酵素の補助因子を有する部位を有する。酵素の補助因子としては、以下の（１）〜（３）が挙げられる。
（１）共有結合した色素（補欠分子族とも言う）
FAD、 ヘム（シトクローム類、カタラーゼ、ヘモグロビンなど）、ビオチン、リポ酸など；
【００２６】
（２）金属イオン：
Mg2+：  ヘキソキナーゼ，ホスホグルコムターゼ，グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼ
Ca2+：  a-アミラーゼ
Zn2+（配位）：  アルコールデヒドロゲナーゼ，カルボキシペプチダーゼA，アルカリホスファターゼ，カルボニックアンヒドラーゼ(CA)，サーモリシン
Cu2+（配位）：  チロシナーゼ
Mo6+,Fe3+：  キサンチンオキシダーゼ，硝酸レダクターゼ
Cu2+, Zn2+（配位）：  スーパーオキシドレダクターゼ，アルギナーゼ
Se：  グルタチオンペルオキシダーゼ
K+：  プロピオニルCoAカルボキシラーゼ
【００２７】
（３）補酵素（非共有結合でアポ酵素に結合した有機化合物）
NAD+, NADP+, FAD, FMN, TPPなどビタミンB類はこれらの補酵素の原料である。
【００２８】
本発明で用いることができる補助因子は、好ましくは、金属イオン、フラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、ヘム、ニコチンアデニンジヌクレオチド（NAD）、ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP）、ピリドキサールリン酸、S−アデノシルメチオニン、チアミンリン酸、又はビタミン類である。
【００２９】
本発明で用い第２反応体は、酵素のアポ酵素部位を有する。アポ酵素の種類は、特に限定されるものではないが、例えば、グルタチオンレダクターゼ、チトクロームレダクターゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、リポアミドデヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、サルコシンオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、コリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ、トランスケトラーゼ、ホモシステイン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ、グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、トランスフェリン、ラクトフェリン、アミラーゼ、カタラーゼ、又はトランスカルボキシラーゼのいずれかから各々の補助因子を取り除いたものなどを挙げることができる。
【００３０】
本発明で用いることができる、補助因子とアポ酵素の具体的な組み合わせを以下に示す。
補助因子（ＮＡＤ、ＮＡＤＰ）／アポ酵素（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ）
補助因子（ＡＴＰ）／アポ酵素（ヘキソキナーゼ、ピリビン酸キナーゼ）
補助因子（カルシウムイオン）／アポ酵素（アミラーゼ）
補助因子（ＦＡＤ等のフラビン）／アポ酵素（サルコシンオキシダーゼ）
補助因子（ピリドキサールリン酸）／アポ酵素（アラニンアミノトランスフェラーゼ）
補助因子（補酵素Ａ）／アポ酵素（コリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ）
補助因子（Ｓ−アデノシルメニオニン）／アポ酵素（ホモシステイン−Ｓ−メチルトランスフェラーゼ）
補助因子（チアミン二リン酸）／アポ酵素（トランスケトラーゼ）
補助因子（ビタミン類）／アポ酵素（グルタミン酸ホルムイミノトランスフェラーゼ）
補助因子（亜鉛）／アポ酵素（クレアチニンデイミダーゼ）
補助因子（ヘム）／アポ酵素（カタラーゼ、ペルオキシダーゼ）
補助因子（ビオシチン）／アポ酵素（トランスカルボキシラーゼ）
【００３１】
第１反応体における反応部位と酵素の補助因子を有する部位との結合は、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。また、同様に、第２反応体における反応部位とアポ酵素部位との結合も、共有結合、イオン結合又は配位結合等の化学結合でもよいし、物理的吸着でもよい。
【００３２】
本発明においては、被験物と、第１反応体と、第２反応体とを反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体結合物を得る。反応の順番は特に限定されない。即ち、被験物と第１反応体と第２反応体とを同時に混合して反応させて、第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、被験物と第１反応体を反応させて第１反応体−被験物の結合物を得た後に第２反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよいし、あるいは被験物と第２反応体を反応させて被験物−第２反応体の結合物を得た後に第１反応体を反応させて第１反応体−被験物−第２反応体の結合物を得てもよい。
【００３３】
本発明においては、第１反応体と被験物と第２反応体との結合物中の第１反応体の補助因子と第２反応体のアポ酵素とが結合して生成するホロ酵素と、その基質との反応による生成物の量を指標として、被験物の量を測定することができる。また、本発明においては、ホロ酵素とその基質との反応による生成物の量を、吸光度、蛍光強度、発光強度、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴、又は近接場光のいずれかにより算出することができる。近接場光としては、例えば、エバネッセント光を用いることができる。エバネッセント光とは、光が全反射したときに第２媒質中にわずかに滲み出した光で、伝搬せず、第２媒質との境界面から１００ｎｍ程度の領域にだけ発生する。試料収容部と接触させた光導波路又はプリズムに臨界角度以上で光を入射することにより、試料収容部との境界面でエバネッセント波を生じさせることができる。
【００３４】
本発明によれば、被験物と特異的に結合する反応部位及び酵素の補助因子を有する部位を有する第１反応体、並びに該被験物と特異的に結合する反応部位及び前記酵素のアポ酵素部位を有する第２反応体を含む、本発明による被験物の測定方法に用いるためのキットが提供される。第１反応体及び第２反応体は、溶液状態、乾燥状態、凍結状態、凍結乾燥状態等で提供することができる。保存安定性の点から、凍結乾燥状態であることが好ましいが、液状で安定なアポタンパク質である場合、液状試薬として提供することが好ましい。また、本発明のキットには、第１反応体の補助因子と第２反応体のアポ酵素とが結合して生成するホロ酵素の酵素活性を測定するための試薬（即ち、ホロタンパク質の基質、発色（光）基質、安定化剤など）を含めることもできる。
【００３５】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
J.Am.Chem.Soc.,124(10),2120-2121(2002)の記載を参考に、末端にカルボキシル基を有しフェニルボロン酸を介しフラビンアデニンジヌクレオチド（FAD）と結合した化合物１を合成する。２種類の抗CRP（C反応性タンパク）抗体（Fitzgerald社製）（製品番号；M7111422、M701289）の各々に、化合物１を縮合剤EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、同仁化学研究所製）により、グルコースオキシダーゼ（Sigma社製）から透析によりFADを除去したアポ酵素（apo-Gox）を２価性縮合剤Sulfo-KMUS（同仁化学研究所製）により結合させ、反応生成物「FAD化抗CRP１次抗体」と「apo-Gox化２次抗体」を得る。
【００３７】
「FAD化抗CRP１次抗体」、「apo-Gox化２次抗体」各１μg/mLを含むPBS水溶液各40μLと、被験物であるCRP（オリエンタル酵母社製）10nMを含むPBS水溶液40μL、グルコース 1mM、西洋ワサビペルオキシダーゼ  １μg/mL、アミノアンチピリン  10mg/mL、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリン  10mg/mLの各濃度で含むPBS水溶液40μLを混合し30分間振とうする。その結果、アミノアンチピリン、N-エチル-N-スルホプロピル-3-メトキシアニリンが酸化カップリングし形成された色素を波長630nmで検出することにより、CRP  10nMが検出可能である。一方、被験物であるCRPを含まない場合は、色素は検出されない。
【００３８】
【化１】
2008082917.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、本発明の方法の概要を示す図である。
【図１】
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