(57)【要約】【課題】本発明は、新規なキチナーゼ、特にカイコキチナーゼを提供することを目的としている。また、本発明は、マツノマダラカミキリに対し、殺虫効果を有する新規なキチナーゼを提供し、生物由来の安全な松食い虫防除剤として有効なキチナーゼ薬剤の開発を可能にしようとするものである。【解決手段】  下記の性質を有することを特徴とするキチナーゼを提供する。（１）安定ｐＨ域：７〜１２、（２）安定温度域：０〜４０℃、（３）ｋｃａｔ／Ｋｍ値：０．６８ｍｌ／ｍｇ／ｓｅｃ、（４）切断様式：エンド型。さらに、また、ファミリー１８キチナーゼに属し、Ｎ−末端アミノ酸配列１０残基がＡＤＳＸＡＸＩＶＸＹであり、カイコ由来の分子量７５ｋＤａであること特徴とするキチナーゼを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有することを特徴とするキチナーゼ。
（１）安定ｐＨ域：７〜１０
（２）至適ｐＨ：高分子基質の至適ｐＨは１０であり、低分子基質に対してはｐＨ６である。
（３）安定温度域：０〜４０℃
（４）至適温度：高分子基質に対しては２５℃であり、低分子基質に対しては６０℃である。
（５）ｋｃａｔ／Ｋｍ値：０．６８ｍｌ／ｍｇ／ｓｅｃ
（６）切断様式：エンド型
【請求項２】
ファミリー１８キチナーゼに属し、Ｎ−末端アミノ酸配列１０残基がＡＤＳＸＡＸＩＶＸＹであることを特徴とするキチナーゼ。
【請求項３】
Ｎ−末端アミノ酸配列１０残基の４位と６位がアルギニンであり、かつ９位がシステインであることを特徴とする請求項２に記載のキチナーゼ。
【請求項４】
ファミリー１８キチナーゼに属するキチナーゼが、カイコ由来の分子量７５ｋＤａであること特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のキチナーゼ。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載のキチナーゼを含有してなる昆虫防除剤。
【請求項６】
マツノマダラカミキリの成虫に対して殺虫効果を有するキチナーゼを含有してなる請求項５に記載の昆虫防除剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キチナーゼ、特にカイコ由来の７５ｋＤａカイコキチナーゼ、該キチナーゼを含有してなる昆虫防除剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
キチナーゼは、キチンの分解、生体構成成分の分解、生体防御機構、さらにシグナルトランスダクションに関与している可能性もあり、生態系で有意義な酵素である。キチナーゼの種類は、Ｘ線結晶構造解析により決定され、３種が明らかになっている。ファミリー１９に属する大麦由来エンド型キチナーゼ（分子量２６ｋＤａ，ＰＤＢコード２ＢＡＡ，１ＣＮＳ、非特許文献１〜３）、ファミリー１８に属するセラチア菌由来のキチナーゼ（分子量６０ｋＤａ、ＰＤＢコード１ＣＴＮ、非特許文献４）、ゴムの木由来でリゾチーム活性を持つキチナーゼ（分子量２９ｋＤａ、ＰＤＢコード１ＨＶＭ、非特許文献５）が報告されている。ファミリー１８と１９のキチナーゼは立体構造においても大きく異なるとされている。
【０００３】
また、キチナーゼは、β−１，４連鎖によって結合されたＮ−アセチルグルコサミン単位から成る直鎖多糖ポリマーであるキチンを攻撃する型によって、２つの異なる群に分けることができる。即ち、鎖の非還元末端にあるＮ−アセチルグルコサミン単位を除去することができるエキソキチナーゼ類および、鎖を分断することができ、インビトロの菌糸体の菌糸の成長を阻害することができるエンドキチナーゼ類である。
【０００４】
本発明者らは、ヤマイモ由来のキチナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにし、ヤマイモ由来のキチナーゼがファミリー１９に属することを報告している（特許文献１）。また、ファミリー１８に属する昆虫由来のキチナーゼに関しては、本発明者らが、マツノマダラカミキリの幼虫からキチナーゼを取得し、そのマツノマダラカミキリキチナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにし、特許出願を行なった。ファミリー１８に属する昆虫由来のキチナーゼとして、本発明者らは、カイコ由来のキチナーゼを数種類取得し、その諸性質を明らかにしている（非特許文献６、７）。
【０００５】
キチナーゼの農業用利用としては、本発明者らが、ヤマイモ由来のキチナーゼを有効成分として含有する植物病原菌防除剤を提供している（特許文献２）。昆虫防除剤としてのキチナーゼの利用は、特許文献３により、キチナーゼをコードするヌクレオチド配列を含んだ形質転換植物を用いる方法が提供されている。しかしながら、キチナーゼを用いた、昆虫そのものに対し殺虫作用を有する昆虫防除剤の報告はない。
【０００６】
日本在来のアカマツ、クロマツ、リュウキウマツなどのマツ類が被害にあう、松食い虫によるマツ枯損の主要因は、マツノマダラカミキリがマツノザイセンチュウを媒介するためであることが明らかになっている。マツノマダラカミキリが、マツの小枝の皮をかじる（後食）際に、マツノザイセンチュウは、その後食痕から樹体内に侵入するとされている。マツの樹体内に侵入し、増殖したマツノザイセンチュウは、マツを弱らせ、マツノマダラカミキリの産卵に適したマツにしてしまう。マツノマダラカミキリの幼虫は、孵化すると、内樹皮を食害して松を枯らしてしまう。このように、マツノマダラカミキリとマツノザイセンチュウの共生により、マツ枯損は拡大されることになる。
【０００７】
マツ樹体内に侵入したマツノザイセンチュウやマツノマダラカミキリの幼虫を直接駆除して、マツの樹勢を回復させる方法として、天敵利用や誘引剤利用があるが、現在のところ実用段階に至ってはいない。また、薬剤の土壌施用は、予防効果が解明されているが、安全性が慎重に検討されている段階で使用は許可されていない。したがって、現在は、マツノマダラカミキリの後食を予防することによる、マツノザイセンチュウの侵入を防ぐ対策がなされている。即ち、大規模の面積で、薬剤による危被害の恐れがない場合は、空中からスミチオンやセビモールなどの薬剤散布が行なわれ、小規模の面積，または薬剤による危被害の恐れがあるような場合は、樹冠までとどくような強力な噴霧機でスミチオンまたはバイジット等の薬剤を地上から散布している。しかしながら、このような防除方法は、人体へも悪影響を及ぼし、残留された農薬の環境汚染が問題となっている。
【非特許文献１】Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２９，１８９−１９３．
【非特許文献２】Ｈａｒｔ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，４０２−４１３．
【非特許文献３】Ｓｏｎｇ，Ｈ．Ｋ．&Ｓｕｈ，Ｓ．Ｗ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，Ｄ５２，２８９−２９８．
【非特許文献４】Ｐｅｒｒａｋｉｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１１６９−１１８０．
【非特許文献５】Ｔｅｒｗｉｓｓｃｈａ  ｖａｎ  Ｓｃｈｅｌｔｉｎｇａ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２，１１８１−１１８９．
【非特許文献６】Ｋｏｇａ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７
【非特許文献７】Ａ/Ｂａｎａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７
【特許文献１】特開２００３−２５０５６１公報
【特許文献２】特開２０００−１０９４０５公報
【特許文献３】特表平１０−５０６２７４公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なキチナーゼ、特にカイコキチナーゼを提供することを目的としている。また、本発明は、上記のように、有機合成化合物を利用した従来の松食い虫防除剤の、人体や環境への影響が問題になっていることに対して、マツノマダラカミキリに対し、殺虫効果を有する新規なキチナーゼを提供し、生物由来の安全な松食い虫防除剤として有効なキチナーゼ薬剤の開発を可能にしようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意研究を行ない、精製したカイコ由来の新規なキチナーゼが、マツノマダラカミキリへの殺虫効果を有することを見出した。
【００１０】
即ち、本発明は、カイコの５齢幼虫の表皮から精製して新規なキチナーゼを取得したこと、さらに取得した新規なキチナーゼが、マツノマダラカミキリの消化管の内張の栄養囲膜キチンを分解することを見出したこと、に係るものである。
【００１１】
本発明は、下記の発明を要旨とする。
【００１２】
１．下記の性質を有することを特徴とするキチナーゼ。
（１）安定ｐＨ域：７〜１０
（２）至適ｐＨ：高分子基質の至適ｐＨは１０であり、低分子基質に対してはｐＨ６である。
（３）安定温度域：０〜４０℃
（４）至適温度：高分子基質に対しては２５℃であり、低分子基質に対しては６０℃である。
（５）ｋｃａｔ/Ｋｍ値：０．６８ｍｌ/ｍｇ/ｓｅｃ
（６）切断様式：エンド型
【００１３】
２．ファミリー１８キチナーゼに属し、Ｎ−末端アミノ酸配列１０残基がＡＤＳＸＡＸＩＶＸＹであることを特徴とするキチナーゼ。
【００１４】
３．Ｎ−末端アミノ酸配列１０残基の４位と６位がアルギニンであり、かつ９位がシステインであることを特徴とする２に記載のキチナーゼ。
【００１５】
４．ファミリー１８キチナーゼに属するキチナーゼが、カイコ由来の分子量７５ｋＤａであること特徴とするキチナーゼ。
【００１６】
５．上記１乃至４のいずれかに記載のキチナーゼを含有してなる昆虫防除剤。
【００１７】
６．マツノマダラカミキリの成虫に対して殺虫効果を有するキチナーゼを含有してなる５．に記載の昆虫防除剤。
【発明の効果】
【００１８】
７５ｋＤａのカイコキチナーゼを用いることにより、生物由来の、安全な松食い虫防除剤が提供される。また７５ｋＤａのカイコキチナーゼの分子量、Ｎ−末端アミノ酸配列、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、温度安定性、酵素反応パラメータなどの酵素化学的性質を提供することによって、マツノマダラカミキリへの殺虫効果を有する特性が明らかになり、バイオ農薬としてのキチナーゼ薬剤の開発に寄与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のキチナーゼは、カイコ表皮から得ることができる。即ち、吐糸時期の１、２日前に購入した５齢幼虫のカイコ（錦秋ｘ鐘和）を２７℃で桑の葉で飼育し、吐糸後２日目または３日目の表皮を解剖により集め、−８０℃で保存する。凍結保存していたカイコ表皮を乳鉢で粉末にして、氷冷したリン酸バッファーでホモゲナイズし、そのホモゲナイズ液を遠心分離した後、上澄み液を陰イオン交換樹脂に混合し一晩放置する。この時用いる陰イオン交換樹脂としては特に限定されないが、好ましくは弱塩基性陰イオン交換樹脂であるＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、ＤＥＡＥ−セルロファインなどが、特に好ましくはＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌが用いられる。
【００２０】
キチナーゼを吸着した樹脂はカラムに充填し、リン酸バッファーで他のタンパク質を十分溶出した後、さらにＮａＣｌの濃度勾配によりキチナーゼ画分を溶出する。得られた活性画分について、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、調製用電気泳動など通常用いられる手法を適宜組み合わせて精製することにより、精製されたキチナーゼを得ることができる。この時、特にＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  カラム、Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅカラム、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムを組み合わせて精製することが好ましい。このようにして精製された画分を回収することにより、精製された７５ｋＤａカイコキチナーゼを得ることができる。
【００２１】
精製されたカイコキチナーゼのマツノマダラカミキリ駆除への有効性は、カイコキチナーゼをマツノマダラカミキリに経口投与して確認することができる。マツノマダラカミキリの消化管の内張の栄養囲膜キチンが分解されていることは、ＵＶ照射で青白い蛍光を発するＦｌｕｏｓｔａｉｎで処理し、発生する蛍光を肉眼で観察することによって、あるいは、蛍光顕微鏡で観察することによって確認することができる。
【００２２】
さらに、カイコキチナーゼをマツノマダラカミキリに経口投与することにより、殺虫効果を観察することができる。４８時間後の致死率と松枝皮の食餌量は、実施例に示すように、カイコキチナーゼの投与量に依存することが明らかである。カイコキチナーゼは、松食い虫の要因であるマツノマダラカミキリに対して、消化管の内張のキチンを分解することにより食餌行動を妨げ、殺虫効果を持つことが示唆される。
【００２３】
精製された７５ｋＤａカイコキチナーゼの分子量、Ｎ−末端アミノ酸配列、至適ｐＨ、至適温度、ｐＨ安定性、温度安定性、酵素反応パラメータ等を測定することにより、マツノマダラカミキリへの殺虫効果を有する特性が、どのような酵素化学的性質に由来するのかを明らかにすることができる。本発明のカイコキチナーゼは、これらの測定値から、古賀等が報告している他のカイコキチナーゼと比較して、バイオ農薬として生体外のフィールドで散布する場合の有用性が推測される。
【００２４】
他のカイコキチナーゼについては、５４ｋＤａと６５ｋＤａのカイコキチナーゼが、ｐＨ５からｐＨ１１．０、また８８ｋＤａカイコキチナーゼがｐＨ６からｐＨ１２．０で安定であると報告されている。本発明の７５ｋＤａカイコキチナーゼは、ｐＨ６．０からｐＨ１１．０でも良いが、ｐＨ７．０からｐＨ１０．０で作用させることが好ましい。グリコールキチンなどの高分子基質に対しては、他のカイコキチナーゼと同様にｐＨ８．０からｐＨ１１．０で作用させることができる。７５ｋＤａカイコキチナーゼについては、ｐＨ９．０からｐＨ１０．５で作用させることが好ましく、ｐＨ１０で作用させることが最も好ましい。また、Ｎ−アセチルキトペンタサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ５）などの低分子基質に対しては、他のカイコキチナーゼと同様にｐＨ４．０からｐＨ８．０で作用させることができる。７５ｋＤａカイコキチナーゼについては、ｐＨ５．０からｐＨ７．０で作用させることが好ましく、ｐＨ６で作用させることが最も好ましい。
【００２５】
また、本発明の７５ｋＤａカイコキチナーゼは、他のカイコキチナーゼに比べて高温で安定であり、０℃から５０℃の温度で作用させることができるが、０℃から４０℃の温度で作用させることが好ましい。グリコールキチンなどの高分子基質に対しては、１０℃から５０℃の温度で作用させることが好ましく、２５℃から４０℃がより好ましく、２５℃の温度で作用させることが最も好ましい。また、ＧｌｃＮＡｃ５などの低分子基質に対しては、４０℃から７０℃の温度で作用させることが好ましく、５０℃から７０℃の温度で作用させることがより好ましく、６０℃の温度で作用させることが最も好ましい。
【００２６】
本発明の７５ｋＤａカイコキチナーゼの酵素反応パラメータは、古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７．）で求めることができるが、グリコールキチンを基質に用いた場合は、基質との親和性（Ｋｍ値で表す）は、０．０２ｍｇ/ｍｌ．から０．２５ｍｇ/ｍｌ．であり、酵素が基質と結合した後、反応物を生じるときの素反応（ｋｃａｔ値で表す）は、０．０２/ｓｅｃから０．１５/ｓｅｃである。それにより、基質を加水分解する速さ（ｋｃａｔ/Ｋｍ値で表す）は、０．１ｍｌ/ｍｇ/ｓｅｃから２．６ｍｌ/ｍｇ/ｓｅｃということができる。
【００２７】
キチナーゼの加水分解反応型が、エンド型である場合は、Ｎ−アセチルキトサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ）を基質として反応させて確認することができる。公知の５４ｋＤａおよび６５ｋＤａカイコキチナーゼの加水分解反応型については、古賀らの報告（Ａｂｄｅｌ−Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｚｈｏｕ，Ｗ．，Ｋａｒａｓｕｄａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，２００２．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６６，１１１９−１１２２;  Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７）にあるが、Ｎ−アセチルキトトリサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ３）を基質として用いた場合では、３糖が１糖と２糖に分解され、その様式は、○↓○○と○○↓○で表す（○はキチンを構成するＮ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）ことができ、Ｎ−アセチルキトテトラサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ４）を基質として用いた場合では、４糖が２つの２糖あるいは、１糖と３糖に分解され、その様式は、○○↓○○あるいは、○↓○○○と○○○↓○で表すことができ、さらに、Ｎ−アセチルキトペンタサッカライド（ＧｌｃＮＡｃ５）を基質として用いた場合では、５糖が２糖と３糖に分解され、その様式は、○○↓○○○と○○○↓○○で表すことができた。本発明の７５ｋＤａカイコキチナーゼの加水分解反応型も同様にして確認することができる。
【００２８】
カイコキチナーゼをマツノマダラカミキリに対する昆虫防除剤として使用する場合は、カイコキチナーゼ含む他の材料を、高圧または低圧の噴霧、注入、被覆、散布、および浸漬を含む処理法によって、マツノマダラカミキリに直接与えるかあるいは、マツの幹に適用することができる。
【００２９】
本発明の昆虫防除剤は、カイコキチナーゼをそのまま使用してもよいが、一般には適当な液体担体に溶解するか若しくは分散させ、又は適当な粉末担体と混合するか若しくはこれに吸着させ、所要の場合にはさらにこれに乳化剤、分散剤、懸濁剤、展着剤、浸透剤、湿潤剤、安定剤などを添加し、乳剤、油剤、水和剤、粉剤等の製剤として使用することができる。
【００３０】
製剤に使用する液体担体としては、水、リン酸緩衝液、有機酸類の水溶液、液体肥料、海藻・植物・木材抽出液、ミネラル類水溶液、アミノ酸類水溶液、漢方薬類水溶液等が適当であり、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３１】
また、製剤に使用する粉末担体としては、タルク・クレー・葉ろう石（パイロフィライト）等の粘土鉱物、活性炭、ゼオライト、シリカ、セルロース、カルシウム、キトサン、デンプン等が適当であり、これらの１種又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３２】
本発明の昆虫防除剤は、有効成分であるカイコキチナーゼの濃度として、一般に乳剤の場合には０．００１〜０．１％、油脂剤の場合には０．００１〜０．０５％、水和剤の場合には０．００１〜０．１％、粉剤の場合には１〜２０％が適当であり、これらの濃度を適宜変更してもよい。
【００３３】
カイコキチナーゼを有効成分として含有する昆虫防除剤の使用量は、１０ａ当たり０．０１〜１．０ｋｇとすることができるが、１０ａ当たり０．０５〜０．５ｋｇとするのが好ましい。
【００３４】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
１、７５ｋＤａカイコキチナーゼの精製（図１参照）
１−１、カイコ表皮の採取
吐糸時期の１、２日前に購入した５齢幼虫のカイコ（錦秋ｘ鐘和）を２７℃で桑の葉で飼育し、吐糸後２と３日後（それぞれ、ＳＰ２，ＳＰ３と命名）の表皮を用いた。ＳＰ２とＳＰ３の比較のため、各々の表皮をホモゲナイズして、遠心分離後得られた上澄みをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、キチナーゼの活性染色した結果７５ｋＤａキチナーゼはＳＰ３に多く含まれていた。そのため、７５ｋＤａキチナーゼの精製は、ＳＰ３の表皮を解剖により集め、−８０℃で保存して使用した。
【００３６】
１−２、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍカラムクロマトグラフィーによる精製
以降の実験は基本的に４℃で行った。凍結保存していたカイコ表皮を乳鉢で粉末にして、表皮重量の３倍量の氷冷した０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）でホモゲナイズした。そのホモゲナイズ液を１０，０００ｘｇで２０分間、遠心分離した後、その上澄み液を０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍ樹脂（３５０ｍｌ）（東ソー株式会社製）に混合し一晩放置した。未吸着部分を、樹脂の３倍量の同じリン酸バッファーで洗浄後、キチナーゼを吸着した樹脂をカラム（直径３ｃｍ×高さ５０ｃｍ）に充填し、０．０１Ｍ  ＮａＣｌを含む同じリン酸バッファーで他のタンパク質を十分溶出した後、さらに０．０１Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配によりキチナーゼ画分を溶出した。また、溶出は５０ｍｌ/ｈ．の流速で行った。
【００３７】
１−３、Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅカラムクロマトグラフィーによる精製
ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｍカラムクロマトグラフィーで溶出されたキチナーゼ画分を０．０１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ６．８）で平衡化されたＨｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅカラム（直径２ｃｍ×高さ２０ｃｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）にかけ、同じリン酸バッファーで未吸着の他のタンパク質を溶出した後、キチナーゼ画分を同じリン酸バッファーの０．０１Ｍから０．３Ｍまでの濃度勾配で溶出した。また、溶出は２０ｍｌ/ｈの流速で行った。
【００３８】
１−４、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーによる精製
Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉｔｅカラムクロマトグラフィーで溶出されたキチナーゼ画分を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）で平衡化されたＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥカラム（直径２ｃｍ×高さ２０ｃｍ）（Ｍｅｒｃｋ  ＡＧ．会社製）にかけ、同じリン酸バッファーで未吸着の他のタンパク質を溶出した後、さらに０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの濃度勾配によりキチナーゼ画分を溶出した。また、溶出は５０ｍｌ/ｈ．の流速で行った。
【００３９】
種々のカラムクロマトグラフィーによる精製表を表１に示す。この結果、最終的に３７０倍の活性を有する精製度が得られた。
【００４０】
【表１】
2008079501.tif 000002
【実施例２】
【００４１】
２、７５ｋＤａカイコキチナーゼの分子量推定
２−１、分子量推定
Ｌａｅｍｍｌｉの手法（Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，１９７０．Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５．）に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて推定した。
【００４２】
２−２、キチナーゼの活性染色
キチナーゼの活性染色は、古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｔ．，Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｕｗａｎｏ，Ｅ．，Ｅｔｏ，Ｍ．，Ｉｄｅ，Ａ．，１９９１．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，２７７−２８４．）に従い行なった。即ち、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、グリコールキチン入りのＳＤＳ−ＰＡＧＥと同じゲルに電気泳動でトランスブロットし、酵素反応のため一晩インキュベートしたあと、０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）に溶解した０．０１％  Ｆｌｕｏｓｔａｉｎ（Ｄｏｊｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ会社製）で染色し、ＵＶランプ照射により、未反応で残存しているグリコールキチンから発生する蛍光を見た。キチナーゼのバンドは蛍光を発しないので黒く見える。
【００４３】
図２に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢによるタンパク質染色の結果、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にグリコールキチンを基質に用いた活性染色の結果より、精製されたキチナーゼの分子量は７５ｋＤａであることが確認された。
【実施例３】
【００４４】
３、７５ｋＤａカイコキチナーゼの諸性質
３−１、キチナーゼの活性測定
キチナーゼ活性は古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７．）に準じて、グリコールキチンを基質にして、加水分解されて生じる還元量の増加を測定した。キチナーゼのタンパク質量はＢＳＥを標準タンパク質としてＬｏｗｒｙ法（Ｌｏｗｌｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｒｏｓｅｎｂｒｏｕｇｈ，Ｎ．Ｊ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｌ．，Ｒｎｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．，１９５１．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９３．２６５−２７５．）を用いて測定した。
【００４５】
３−２、至適ｐＨとｐＨ安定性
高分子基質に対する至適ｐＨは、０．０５％グリコールキチンを用いて、２７ｎＭの７５ｋＤａキチナーゼにより、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ３から１１まで）中で、３２℃で３時間反応して求めた。さらに、低分子基質に対する至適ｐＨは、０．１ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ５（Ｎ−アセチルキトペンタサッカライド、５糖）を用いて、１０ｎＭ７５ｋＤａキチナーゼにより、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ３から９まで）中で、２５℃で２０分間反応して求めた。反応の解析は、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）カラムを用いてＨＰＬＣ分析により行った。溶出液は７０％アセトニトリルを用いた。分析と解析は古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ａｒａｋａｎｅ，Ｙ．１９９８，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，１６４３−１６４６）に従った。
また、ｐＨ安定性はＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ３から１１まで）中で２７ｎＭの７５ｋＤａキチナーゼを５時間放置した後、残存活性を測定して求めた。
【００４６】
結果を図３に示す。高分子基質のグリコールキチンに対する至適ｐＨは１０であったのにたいし、低分子基質のＧｌｃＮＡｃに対してはｐＨ６であった。この違いは、本７５ｋＤａカイコキチナーゼが触媒部位の他にキチン結合部位を有するため、そのキチン結合部位が高分子基質に結合するときの至適ｐＨに依存するものと考えられた。また、この至適ｐＨは他のカイコキチナーゼとほとんど同じであった。
【００４７】
また、ｐＨ安定性はｐＨ７．０からｐＨ１０．０の間であった。他のカイコキチナーゼと比較すると、他のキチナーゼの方がｐＨ５（５４ｋＤａと６５ｋＤａカイコキチナーゼ）まで、あるいはｐＨ６（８８ｋＤａカイコキチナーゼ）までと、少し安定であった。即ち、本７５ｋＤａカイコキチナーゼのほうが酸性領域で不安定であった。（参照文献：Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７;Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７．）
【００４８】
３−３、至適温度と温度安定性
至適温度は２７ｎＭの７５ｋＤａキチナーゼを用いて、Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ１０）中で０．０５％グリコールキチンを基質として、１０℃から７０℃で３時間反応して求めた。さらに、低分子基質に対する至適温度は、０．１ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ５を用いて、１０ｎＭ７５ｋＤａキチナーゼにより、至適ｐＨの４ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６）中で、１０℃から７０℃で反応して求めた。反応の解析は、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）カラムを用いてＨＰＬＣ分析により行った。溶出液は７０％アセトニトリルを用いた。分析と解析は古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ａｒａｋａｎｅ，Ｙ．１９９８，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，１６４３−１６４６）に従った。
温度安定性はＢｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ１０）中で２７ｎＭの７５ｋＤａキチナーゼを０℃から７０℃で１５分間放置した後、残存活性を測定して求めた。
【００４９】
結果を図４に示す。高分子基質のグリコールキチンに対する至適温度は２５℃と低く、低分子基質ＧｌｃＮＡｃ５に対しては６０℃と高かった。一方、温度安定性は４０℃までであった。このことは、基質が存在すると、酵素がさらに安定化されるという一般的性質から考えて、ＧｌｃＮＡｃ５を基質にしたときの至適温度を適用した方がいいと思われた。即ち、７５ｋＤａキチナーゼは６０℃が至適温度といえる。高分子基質に対する至適温度については、他のカイコキチナーゼでは実験されていなかったため、７５ｋＤａカイコキチナーゼだけなのかわからないが、グリコールキチンが高温度では酵素の基質になりにくくなったと考えられた。
【００５０】
一方、温度安定性については、７５ｋＤａカイコキチナーゼは８８ｋＤａカイコキチナーゼと同様に４０℃まで安定であったが、６５ｋＤａカイコキチナーゼが３０℃まで、そして５４ｋＤａカイコキチナーゼは２０℃までであった．本キチナーゼは、昆虫のキチナーゼにおいて温度安定性が高い方であることがわかった。（参照文献：Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７;Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７．）
【００５１】
３−４、酵素反応解析
酵素反応は、古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７．）に準じて行なった。即ち、グリコールキチンを基質に用いて４０ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ１０の緩衝液中２５℃で行なった。初速度と基質濃度の両逆数プロットにより、酵素反応パラメータを算出した。
【００５２】
結果を他のカイコキチナーゼと比較して、表２に示す。基質のグリコールキチンとの親和性を示すＫｍ値（Ｋｍ値が小さいほど親和力が大きい）は、他のキチナーゼと比べて基質との親和力は悪い。酵素が基質と結合した後、反応物を生じるときの素反応を示すｋｃａｔ（ｋｃａｔが大きいほど、その素反応は大きい）は、他のカイコキチナーゼよりかなり大きい。結果として、基質（グリコールキチン）を加水分解する速さを示すｋｃａｔ/Ｋｍ値を比べると、８８ｋＤａカイコキチナーゼに次いで２番目に良いことがわかった。（参照文献：Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７;Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７．）
【００５３】
【表２】
2008079501.tif 000003
表２にあっては、７５ｋＤａカイコキチナーゼの酵素反応はグリコールキチンを基質に用いて４０ｍＭ  Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ１０の緩衝液中で、２５℃で行ったものである。酵素反応パラメータは両逆数プロットにより算出した。
【００５４】
３−５、酵素反応特性
キチナーゼの反応特性（加水分解反応型（エンド型かエキソ型か）と生成物のアノマー形成）を調べるため、１０ｎＭの７５ｋＤａカイコキチナーゼを０．１ｍＭ  ＧｌｃＮＡｃ５（Ｎ−アセチルキトペンタサッカライド、５糖）を基質に用いて、至適ｐＨの４ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６）中で、２５℃で２０分間反応し、その反応物をＴｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ａｍｉｄｅ−８０（東ソー株式会社製）カラムを用いてＨＰＬＣ分析を行った。溶出液は７０％アセトニトリルを用いた。分析と解析は古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ａｒａｋａｎｅ，Ｙ．１９９８，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６２，１６４３−１６４６）に従った。
【００５５】
結果を図５に示す。この図から７５ｋＤａカイコキチナーゼは、５糖を２糖と３糖に加水分解するエンド型酵素であることがわかった。また、反応物のアノマー型を調べた結果、生成物の２糖の方に多くβ型が見られたため、リテイニング（アノマー保持）型であることがわかった。このことは７５ｋＤａカイコキチナーゼがファミリー１８であることを強く示唆している。また、この結果は、Ｎ−末端アミノ酸配列の結果も支持している。以上の７５ｋＤａカイコキチナーゼのアノマー型とエンド型加水分解型（分解パターンも含め）の特性は、他の６５ｋＤａカイコキチナーゼと同じであった。ＧｌｃＮＡｃ５の５糖が２糖と３糖に分解される様式は、○○↓○○○が８３．３％、○○○↓○○が１６．７％であった。この分解パターンは８８ｋＤａカイコキチナーゼのデータはないが、６５ｋＤａで○○↓○○○が９６．６３％、○○○↓○○が３．３７％であり、５４ｋＤａで○○↓○○○が１００％、○○○↓○○が０％であることから、７５ｋＤａカイコキチナーゼは、○○○↓○○の分解型の割合が多くなっているということができる。また、ＧｌｃＮＡｃ５の加水分解速度は１０ｎＭ  ７５ｋＤａカイコキチナーゼでは３５．３ｎＭ/ｓｅｃであった。即ち、１ｎＭキチナーゼでは３．５３ｎＭ/ｓｅｃに相当する。これまで報告されているデータと比較すると、５４ｋＤａカイコキチナーゼが１．５３ｎＭ/ｓｅｃ、６５ｋＤａカイコキチナーゼが２．０１ｎＭ/ｓｅｃであることから、カイコキチナーゼの分子量が大きくなるにつれて、ＧｌｃＮＡｃ５にたいしては反応性が高くなることが分かった。このこともＣ末端側に存在するキチン結合領域が関係していることが推測された。（参照文献：Ａｂｄｅｌ−Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｚｈｏｕ，Ｗ．，Ｋａｒａｓｕｄａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，２００２．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６６，１１１９−１１２２;  Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７．）
【実施例４】
【００５６】
４−１、Ｎ−末端アミノ酸配列の解析
古賀等の方法（Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７．）に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後ＰＶＤＦ膜に電位泳動によりトランスブロットし、クマシーブリリアントブルーによるタンパク質染色後、キチナーゼバンド切り出して、ＰＳＱ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ島津製作所社製）に供して調べた。
【００５７】
４−２、Ｎ−末端アミノ酸配列の決定
７５ｋＤａカイコキチナーゼのＮ−末端アミノ酸配列１０残基をＰＳＱにより調べたところ、ＡＤＳＸＡＸＩＶＸＹであることが分かった。ここで、Ｘは未決定を意味する。この配列をこれまで我々が報告した８８ｋＤａ、６５ｋＤａ、５４ｋＤａのカイコキチナーゼのＮ末端配列と比較すると、一致することが分かった。ちなみに、これらの４番目と６番目のＸはＰＳＱで回収率が悪いと言われているＲ（アルギニン）であり、９番目のＸは通常の手法では解析不能のＣ（システイン）であった。この結果から、７５ｋＤａカイコキチナーゼは他のカイコのキチナーゼと同様に、分子量の大きい同一のキチナーゼ分子がＣ末端側からプロッセッシングを受けて生じたものと思われた。（参照文献：Ｋｏｇａ，Ｄ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｕｃｈｉｕｍｉ，Ｙ．，Ｈｉｒａｉ，Ｎ．，Ａｒａｍａｎｅ，Ｙ．，Ｎａｇａｍａｔｓｕ，Ｙ．，１９９７．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７，７５７−７６７;Ａ/Ｂａｎａｔ，Ｍ．Ａ．，Ｋａｍａｅｙａｍａ，Ｙ．，Ｙｏｓｈｉｏｋａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｋｏｇａ，Ｄ．，１９９９．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９，５３７−５４７．）
【実施例５】
【００５８】
５、７５ｋＤａカイコキチナーゼのマツノマダラカミキリに対する殺虫効果
マツノマダラカミキリに対する殺虫効果を持つカイコキチナーゼの特性を調べるため、下記の実験を行った。即ち、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解した精製７５ｋＤａキチナーゼ（０μＭ，０．３μＭ，３μＭ）の各種溶液の５０μｌを、松林から採取したマツノマダラカミキリの成虫（各８匹）に経口投与し、４８時間後の致死率を調査した。
【００５９】
また、消化管の内張を構成しているキチンヘの影響を調べるため、経口投与２０時間後、実験に供したマツノマダラカミキリ（各３匹）の消化管を摘出した。０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ９．０）に溶解した０．０１％  Ｆｌｕｏｓｔａｉｎ（Ｄｏｊｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を用いて、消化管キチンに選択的に結合させたあと、ＵＶ照射により発生する蛍光を肉眼と蛍光顕微鏡で観察した。
【００６０】
マツノマダラカミキリ（図６）への殺虫効果を調べた実験スキームを図７に示す。先ず、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に溶解した７５ｋＤａキチナーゼの０μＭ，０．３μＭおよび３μＭの各種溶液の５０μｌを、マツノマダラカミキリの成虫（各３匹）に経口投与し、２０時間後、マツノマダラカミキリの消化管を解剖により摘出し、キチンに特異的に結合し、ＵＶ照射で青白い蛍光を発するＦｌｕｏｓｔａｉｎで処理した。その発生する蛍光を肉眼と蛍光顕微鏡で観察した結果を図８と図９に示す。図８から分かるように、コントロールに比べ、カイコキチナーゼを投与した消化管は内張のキチンが分解したため蛍光が薄くなっている。また、図９の蛍光顕微鏡写真により、そのことがさらに証明された。
【００６１】
同様にカイコキチナーゼを経口投与した後、４８時間後の致死率と松枝皮の食餌量を調査した。その結果を表３に示す。０μＭから０．３μＭ、３μＭとキチナーゼの濃度に依存して０％から３７．５％、７５％と致死率が上昇していることがわかる。また、キチナーゼ経口投与後、キチナーゼの濃度に依存して松枝皮の食餌量が激減していることがわかる。この結果から、この７５ｋＤａカイコキチナーゼが松食い虫の要因であるマツノマダラカミキリに対して、消化管の内張のキチンを分解することにより食餌行動を妨げ、その結果、殺虫効果を持つことが示唆された。
【００６２】
【表３】
2008079501.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００６３】
日本での松食い虫被害は重大なものである。その対策としてこれまで化学農薬（神経毒のマラソン、スミチオンなど）が使われてきたが、人への影響や環境問題から考えて、このような化学農薬に替わる対策が必要になってきた。本発明の７５ｋＤａカイコキチナーゼは、マツのマダラカミキリの成虫に対して経口的に摂取させて殺虫効果を有することが明らかになり、害虫に対するバイオ農薬の可能性を示している。また７５ｋＤａカイコキチナーゼは他のカイコキチナーゼ（８８ｋＤａ，６５ｋＤａ，５４ｋＤａキチナーゼ）と基本的に酵素反応特性（エンド型加水分解酵素、アノマー保持型のファミリー１８キチナーゼ）は同じである。しかし、本酵素は、熱安定性が他のカイコキチナーゼより高いため、フィールドで用いる場合、バイオ農薬（人や環境に優しい）として最も有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】７５ｋＤａカイコキチナーゼの精製スキームを説明する図面である。
【図２】精製７５ｋＤａカイコキチナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ＣＢＢによるタンパク質染色（Ａ）と、また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にグリコールキチンを基質に用いた活性染色の結果（Ｂ）を示す図面に代わる写真である。ゲル上の数字は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーの溶出区分、ｓｔは、分子量標準タンパク質を表す。
【図３】７５ｋＤａカイコキチナーゼの至適ｐＨ（Ａ、Ｂ）とｐＨ安定性（Ｃ）を示す図面である。
【図４】７５ｋＤａカイコキチナーゼの至適温度（Ａ、Ｂ）と温度安定性（Ｃ）を示す図面である。
【図５】７５ｋＤａカイコキチナーゼのＧｌｃＮＡｃ５の加水分解反応のＨＰＬＣ分析を示す図面である。
【図６】マツノマダラカミキリの、メス（上）とオス（下）を示す図面に代わる写真である。
【図７】７５ｋＤａカイコキチナーゼのマツノマダラカミキリへの効果実験を説明する図面である。
【図８】７５ｋＤａカイコキチナーゼを経口投与した後２０時間後の、マツノマダラカミキリの消化管の、図面に代わる蛍光顕微鏡写真である。
【図９】７５ｋＤａカイコキチナーゼを経口投与した後２０時間後の、マツノマダラカミキリの消化管の、図面に代わる蛍光写真である。
【図１】
2008079501.tif 000005
【図３】
2008079501.tif 000006
【図４】
2008079501.tif 000007
【図５】
2008079501.tif 000008
【図７】
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【図２】
2008079501.tif 000010
【図６】
2008079501.tif 000011
【図８】
2008079501.tif 000012
【図９】
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