(57)【要約】【課題】ＤＮＡマーカーを利用した大和トウキの他生産地トウキとの簡便な識別方法、その識別用材料およびその応用製品を提供すること。【解決手段】大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）および北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）の識別用ＤＮＡマーカー、およびそのＤＮＡマーカーをＰＣＲにより選択的に増幅する識別用プライマー対、その識別用プライマー対を用いる大和トウキと他生産地トウキとの識別方法、ならびにその識別用プライマー対を含有するキットなどを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウキまたはトウキ含有物から抽出したＤＮＡに、少なくとも１対の識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片によって識別することを特徴とする大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）の識別方法。
【請求項２】
前記識別用プライマー対が配列番号１と配列番号２で示される塩基配列である請求項１記載の識別方法。
【請求項３】
配列番号１と配列番号２および／または配列番号１６と配列番号１７で示される塩基配列からなる識別用プライマー対を用いることを特徴とする請求項１記載の識別方法。
【請求項４】
配列番号１９と配列番号２０および／または配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなる識別用プライマー対を追加して用いることを特徴とする請求項２または３記載の識別方法。
【請求項５】
ＤＮＡ断片が配列番号３で示される塩基配列である請求項１記載の識別方法。
【請求項６】
ＤＮＡ断片が配列番号３または／および配列番号１８で示される塩基配列である請求項１記載の識別方法。
【請求項７】
少なくとも配列番号１と配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする大和トウキ識別用キット。
【請求項８】
配列番号１と配列番号２および／または配列番号１６と配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする大和トウキ識別用キット。
【請求項９】
配列番号１９と配列番号２０および／または配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする請求項７または８記載の大和トウキ識別用キット
【請求項１０】
請求項１に記載の方法で識別した大和トウキを含有することを特徴とする医薬品、化粧品または食品。
【請求項１１】
北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）との識別方法である請求項１記載の識別方法。
【請求項１２】
配列番号４と配列番号５の識別用プライマー対を追加して用いることを特徴とする請求項１１記載の識別方法。
【請求項１３】
配列番号３もしくは配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有する識別用材料。
【請求項１４】
配列番号３、配列番号６、配列番号１８および配列番号２１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片の１つ以上を含有する識別用材料。
【請求項１５】
配列番号１と配列番号２もしくは配列番号４と配列番号５で示される塩基配列からなるプライマー対を含有する識別用材料。
【請求項１６】
配列番号１と配列番号２、配列番号４と配列番号５、配列番号１６と配列番号１７、配列番号１９と配列番号２０、および配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー対の１つ以上を含有することを特徴とする識別用材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トウキの品種識別に関し、生薬として優良な品質を持つと言われる奈良産の大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）を識別する簡便な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、植物体の品種識別方法としては、植物から抽出したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法により増幅して得られるＤＮＡの多型に基づく植物品種の鑑定法が盛んに研究されている（特許文献１）。特にイネやイグサ等の品種識別方法が多く報告されている（特許文献２、３、４、５）。
【０００３】
一方、トウキに関するゲノムＤＮＡの多型に基づく識別法としては、トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ）とミシマサイコ（Ｂｕｐｌｅｕｒｕｍ  ｆａｌｃａｔｕｍ）もしくはハマボウフウ（Ｇｌｅｈｎｉａ  ｌｉｔｔｏｒａｌｉｓ）との識別に関する報告（非特許文献１）、ならびに唐トウキ（Ａｎｇｅｒｉｃａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、韓トウキ（Ａｎｇｅｒｉｃａ  ｇｉｇａｓ）及び日本産トウキ（Ａｎｇｅｒｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ）間の識別に関する報告（非特許文献２）があるが、各種トウキの識別法としては未完成であり、特に各種日本産トウキの識別には利用出来ないものである。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−５７０７３号公報
【特許文献２】特開２００１−９５５８９号公報
【特許文献３】特開２００５−７３６５５号公報
【特許文献４】特開２００５−１６８３０８号公報
【特許文献５】特開２００５−１６８３０９号公報
【非特許文献１】バイオロジカル  ファーマソイティカル  ブルテイン（Ｂｉｏｌ．  Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）１８巻、１２９９−１３０１頁、１９９５年
【非特許文献２】ジャーナル  オブ  アグリカルチュラル  アンド  フード  ケミストリー（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．）  ５１巻  ２５７６−２５８３頁  ２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
トウキ（当帰）は古来より漢方生薬として用いられている。日本で自生しているトウキには多くの変種が存在しているが、なかでも奈良産の大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）と北海道産の北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）が生薬原料として多く取り扱われている。トウキは、葉の形状、茎の色素、あるいは香気など、地上部による区別は可能であるものの、生薬原料である根茎部の識別には、伝承的な経験による五感識別が行われているのが現状である。奈良産の大和トウキは、古くから高品質な生薬として評価されてきているため、他の生産地品種と簡便に識別する方法が望まれている。
【０００６】
本発明の目的は、大和トウキを他の生産地トウキと簡便に識別する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）および北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）の識別用ＤＮＡマーカーおよび該マーカーをＰＣＲにより特異的に増幅する識別用プライマーを見出し、大和トウキを他の生産地品種と簡便に識別する方法を確立した。
【０００８】
即ち、トウキまたはトウキ含有物から抽出したゲノムＤＮＡをＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）法を利用して、大和トウキおよび北海トウキの識別用ＤＮＡマーカーとなりうるＤＮＡ断片を見出し、その塩基配列を決定し、更にその塩基配列に基づいて設計し合成した識別用プライマー対を用いて上記大和トウキおよび北海トウキの識別用ＤＮＡマーカーを増幅させて電気泳動により検出することによって上記目的が達成できることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
一方、合弁花類に保存されて存在するシングルコピーのオルソログ遺伝子から開発された保存されたオルソログセットＩＩ（ＣＯＳＩＩ；Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇ  Ｓｅｔ  ＩＩ）マーカーを利用する方法がある（ＣＯＳＩＩホームページを参照；アドレスはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｇｎ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ｍａｒｋｅｒｓ／ｃｏｓｉｉ＿ｍａｒｋｅｒｓ．ｐｌ）。即ち、トウキまたはトウキ含有物から抽出したゲノムＤＮＡを、ＣＯＳＩＩマーカーの４９種のプライマー対を用いたＰＣＲ反応に供し、増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動に付し、大和トウキおよび北海トウキを識別できるＤＮＡマーカーとなり得るＤＮＡ断片を見出した。そのＤＮＡ断片の塩基配列を上記と同様に決定し、更にその塩基配列に基づいて設計し合成した識別用プライマー対を用いて同様に大和トウキを他の生産地トウキと識別できる。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）トウキまたはトウキ含有物から抽出したＤＮＡに、少なくとも１対の識別用プライマーを共存させてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片によって識別することを特徴とする大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）の識別方法；
（２）前記識別用プライマー対が配列番号１と配列番号２で示される塩基配列である（１）記載の識別方法；
（３）配列番号１と配列番号２および／または配列番号１６と配列番号１７で示される塩基配列からなる識別用プライマー対を用いることを特徴とする（１）記載の識別方法；
（４）配列番号１９と配列番号２０および／または配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなる識別用プライマー対を追加して用いることを特徴とする（２）または（３）記載の識別方法；
（５）ＤＮＡ断片が配列番号３で示される塩基配列である（１）記載の識別方法；
（６）ＤＮＡ断片が配列番号３または／および配列番号１８で示される塩基配列である（１）記載の識別方法；
（７）少なくとも配列番号１と配列番号２で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする大和トウキ識別用キット；
（８）配列番号１と配列番号２または／および配列番号１６と配列番号１７で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする大和トウキ識別用キット；
（９）配列番号１９と配列番号２０および／または配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー対を含有することを特徴とする（７）または（８）記載の大和トウキ識別用キット；
（１０）（１）に記載の方法で識別した大和トウキを含有することを特徴とする医薬品、化粧品または食品；
（１１）北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）との識別方法である請求項１記載の識別方法；
（１２）配列番号４と配列番号５の識別用プライマー対を追加して用いることを特徴とする（１１）記載の識別方法；
（１３）配列番号３もしくは配列番号６で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片を含有する識別用材料；
（１４）配列番号３、配列番号６、配列番号１８および配列番号２１で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片の１つ以上を含有する識別用材料；
（１５）配列番号１と配列番号２もしくは配列番号４と配列番号５で示される塩基配列からなるプライマー対を含有する識別用材料；
（１６）配列番号１と配列番号２、配列番号４と配列番号５、配列番号１６と配列番号１７、配列番号１９と配列番号２０、及び配列番号２２と配列番号２３で示される塩基配列からなるプライマー対の１つ以上を含有することを特徴とする識別用材料；
（１７）前記ＤＮＡ断片がＣＯＳＩＩ遺伝子由来である（１）記載の識別方法；
（１８）前記識別用プライマー対が、（１６）記載のＤＮＡ断片を特異的に増幅するプライマー対である（１）記載の識別方法；
（１９）トウキ試料からゲノムＤＮＡ抽出する工程において、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）  Ｐｌａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と、ＣＴＡＢおよびＮａＣｌ存在下で行うクロロホルム抽出とを組み合わせる方法；
などを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）を他生産地トウキと簡便に識別することができる。特に近縁種である北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）とも容易に識別できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下において、本発明を詳細に説明する。本明細書における「トウキ」は、トウキの種子、葉、茎、根を含む植物体の全ての部分、組織、細胞を意味し、更に生薬原料となる乾燥等の加工あるいは処理したものも含まれる。また、「トウキ含有物」とはトウキ由来の物質を含有する医薬品、健康食品、化粧品、食料品、飲料などの組成物が含まれるがこれらに限られず、トウキに由来する物質を一部にでも含有していればよい。「トウキ試料」とは、トウキの種子および植物体の全ての部分およびそれらを原料とするもの全般を意味する。
【００１３】
本発明の大和トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  Ｋｉｔａｇａｗａ）および北海トウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ａｃｕｔｉｌｏｂａ  ｖａｒ．  ｓｕｇｉｙａｍａｅ  Ｈｉｋｉｎｏ）以外の生産地トウキの品種について特に限定はなく、例えばイヌトウキ（Ａｎｇｅｌｉｃａ  ｓｈｉｋｏｋｉａｎａ  Ｍａｋｉｎｏ）、唐トウキ（Ａｎｇｅｒｉｃａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、韓トウキ（Ａｎｇｅｒｉｃａ  ｇｉｇａｓ）等のいずれの品種であっても対象として適用可能である。しかも、試料として用いるトウキの品種は１種に限定されず、２品種以上を混合したものであってもよく、他の品種の植物が含まれていても良い。
【００１４】
これらのトウキ試料は、例えば液体窒素下で粉砕して粉末化した後、ゲノムＤＮＡ抽出操作に供する。粉砕は、適当な粉砕機器、例えば超遠心粉砕機（レッチェ社製）やサイクロンミル（ユーディ社製）、乳鉢等によってなされ、粉末化された試料は、以下の検出操作に供される。
【００１５】
はじめに、トウキ試料からゲノムＤＮＡの抽出を行う。抽出は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、フェノール抽出法、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）法、アルカリＳＤＳ法等を挙げることができる。特にＣｈｅｎｇらのＣＴＡＢ改変法（Ｈｏｒｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２（５），９２１−９２２  （１９９７））などが好ましい。例えば、１０％Ｓａｒｋｏｓｙ、５ＭＮａＣｌおよび８．６％ＣＴＡＢ／０．７ＭＮａＣｌを加えて、６５℃で２０分間保温しておくことにより、ＤＮＡを抽出することができる。
【００１６】
さらに乾燥根などのトウキ試料の場合、根に蓄積する二次代謝産物や多糖類が後ほど行うＰＣＲ反応を阻害するため、これらを除去する必要がある。加えて、乾燥根由来のゲノムＤＮＡは分解していることがあるため、トウキ試料の判別には高純度のゲノムＤＮＡを抽出することが必要である。乾燥根からのゲノムＤＮＡを抽出するための改良方法として、市販のゲノムＤＮＡ抽出キットであるＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｌａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＣＴＡＢ及びＮａＣｌ存在下で行うクロロホルム抽出を組み合わせると高純度のゲノムＤＮＡをトウキ乾燥根から抽出することができることを見出した。
【００１７】
ＤＮＡの抽出後、必要に応じてクロロホルム／イソアミルアルコール処理、イソプロパノール沈澱、フェノール／クロロホルムによる除蛋白、エタノール沈澱等の精製工程を加えてもよい。その後、ＴＥ（トリス−ＥＤＴＡ）緩衝液に溶解し、更にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を加えて反応させ、ＲＮＡを除去したものをゲノムＤＮＡ試料とすることができる。
【００１８】
続いて、ランダムプライマーを使用してＲＡＰＤ分析により識別用ＤＮＡマーカーを見出す。即ち、ランダムプライマーの共存下に、上記の操作により得られるゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行う。ここで、本発明におけるＰＣＲとは、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の連鎖反応を指す。すなわち、鋳型となるＤＮＡに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの共存下で９０−９６℃の高温処理過程（変性）、約３０−７５℃のプライマー・ＤＮＡ結合過程（アニーリング）、約７０−７５℃のＤＮＡ複製過程（伸長）の３過程を繰り返すことにより、増幅させる反応をいう。なお、ランダムプライマーとしては、通常用いられているものを使用することができ、例えばオペロン社から市販されている１０量体ランダムプライマーや、和光純薬社から市販されているＤＮＡオリゴマーセット（１２量体）等を挙げることができる。ＰＣＲに使用する際に用いるＤＮＡ合成酵素としては、例えばＰｕＲｅ  Ｔａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ−Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）などが用いられる。
【００１９】
続いてＰＣＲで得られる増幅したＤＮＡ断片の電気泳動を行い、品種間に識別性のあるバンド部分（識別用ＤＮＡ断片）を単離し塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、ゲルより回収し、そのＤＮＡ断片を、例えばｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（ｐＧＥＭは登録商標）に連結後、大腸菌に導入し増殖させ、次いで、例えばＦｌｅｘｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、これを鋳型としてＰＣＲ法で増殖し、ＤＮＡ自動シークエンサーにより塩基配列を決定する。
【００２０】
更に続いて、決定された塩基配列から、識別用プライマー対の設計を行う。先のランダムプライマーによるＰＣＲ法において、鋳型であるトウキ試料由来のＤＮＡ断片のうちのランダムプライマーが結合した部位は、当該ランダムプライマーと同一あるいは相補的な（相同な）配列を有している筈である。つまり、この鋳型ＤＮＡから切り出して抽出した品種識別性の高いＤＮＡ塩基配列（これがＰＣＲ法におけるプライマー対の母体となる）は、両端にランダムプライマーと同一あるいは相同な配列を有していることになる。したがって、この識別性の高いＤＮＡ塩基配列のフォワード側およびリバース側のそれぞれから、適当な配列と長さとを有するトウキの品種判定に有用なプライマー対を設計し合成
することができる。設計した識別用プライマー対の使用のためのオリゴヌクレオチドは、化学合成の分野において公知の方法、例えばホスホロアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２，１８５９−１８６２（１９８１）やトリエステル法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０３，３１８５（１９８１））などによって化学的に合成される。これらの合成は自動合成機も使用しうる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，６１５９−６１６８（１９８４））。
【００２１】
得られた識別用プライマー対を用いることにより、最初のＰＣＲにおいてランダムプライマーが鋳型ＤＮＡに結合する複数個所のうち、識別用プライマー対を使用する第２次のＰＣＲにおいては、品種識別に有用な識別バンドとなる塩基配列部分のみに選択的に結合し、増幅することになり、容易に安定したトウキの品種識別が可能になる。
【００２２】
一方、ＣＯＳＩＩマーカーから４９種のプライマー対を選択し合成した。上記操作と同様にトウキまたはトウキ含有物から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、合成した４９種のプライマー対の共存下にＰＣＲを実施した。続いて増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルの電気泳動にて展開した結果、４９種のプライマー対のうち３種のプライマー対を用いた場合に、大和トウキおよび北海トウキ識別用ＤＮＡマーカーとなり得るバンド（ＤＮＡ断片）を見出した。そのＤＮＡ断片の塩基配列を上記と同様に決定し、更にその塩基配列に基づいて設計し合成した識別用プライマー対を用いることにより、同様に大和トウキを他の生産地トウキと識別できる。
【００２３】
本発明の識別用プライマー対は単一でも複数組み合わせて用いることが出来、その組み合わせは任意である。
【００２４】
本発明のプライマーはまた、トウキの品種の識別のためのキットの構成要素にもなり得る。キットは、上述したようなプライマー対を少なくとも１つを含む。
【００２５】
本発明により得られた識別用プライマー対、ならびに識別用ＤＮＡマーカー（ＤＮＡ断片）は、植物を遺伝子レベルにて鑑定するための試薬やキットを製造するための原材料としても用いられる。
【００２６】
以下に、本発明を実施例に基づいて説明する。本発明は以下の実施例によってなんら限定されるものではなく、本発明の属する技術分野における通常の変更を加えて実施することが出来ることは言うまでもない。
【実施例】
【００２７】
実施例１  ゲノムＤＮＡの抽出
ゲノムＤＮＡは、ＣｈｅｎｇらのＣＴＡＢ改変法により抽出した。表１に示す植物を液体窒素下で粉末状に破砕した組織（３０ｍｇ）に１ｍｌの抽出Ｂｕｆｆｅｒを加え懸濁後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、４℃、１０分）を行った。上清を除去し、６００μｌのＷａｓｈｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、沈殿をよく懸濁した。さらに、７２μｌの１０％Ｓａｒｋｏｓｙｌ、９６μｌの５ＭＮａＣｌおよび７８μｌの８．６％ＣＴＡＢ／０．７Ｍ  ＮａＣｌを加えてよく懸濁し、６５℃で２０分間保温した。次に、４５０μｌのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）混合液を加え懸濁後、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、室温、１０分）を行った。得られた上清を新しいマイクロチューブに移し、４５０μｌのイソプロパノールを加えて懸濁後、氷中で１０分間静置した。遠心分離（１５００００ｒｐｍ、４℃、１０分）して得られた沈殿を乾燥後、１５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、さらにＲＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３０分間反応させ、ＲＮＡを除去したものをゲノムＤＮＡとした。
【００２８】
【表１】
2008086309.tif 000002
【００２９】
実施例２  ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＤＮＡ）分析
実施例１で得られたゲノムＤＮＡおよび２７種類のランダムプライマーをそれぞれ１００ｎｇ／μｌ、１０μＭに調製したものを使用した。ＰＣＲ反応液は、ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、ランダムプライマーを０．４μＭ、ＤＮＡ合成酵素としてＰｕＲｅ  Ｔａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ−Ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）またはＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、Ｈ２Ｏでそれぞれ総量２５μｌまたは２０μｌとした。ＰＣＲ装置はＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＰＴＣ−２００を使用し、反応後、１５μｌのＰＣＲ溶液を１．５％アガロースゲルで１００ｖ、４０分間電気泳動し、０．０５％エチジウムブロマイド溶液で染色後、ＵＶ照射下で検出された増幅ＤＮＡ断片から分析を行った。なお、ＰＣＲの反応条件は表２に示した。
【００３０】
ＲＡＰＤ法分析の際にプライマーＧＣＣＴＧＣＣＴＣＡＣＧ（配列番号７）を用いると大和トウキ特異的なＤＮＡ断片（５３０ｂｐ）および北海トウキ特異的なＤＮＡ断片（６５０ｂｐ）が見出された。
【００３１】
【表２】
2008086309.tif 000003
【００３２】
実施例３  特異的断片のＴＡ−ｖｅｃｔｏｒへのサブクローニングと大腸菌への形質転換
まず、実施例２で得られた特異的ＤＮＡ断片をゲルから切り出し、抽出を行った。ゲル抽出には、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、手順は添付のプロトコルに従った。そのＤＮＡ断片を、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ（ｐＧＥＭは登録商標）内へライゲーションさせ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α株）に導入した。コンピタントセルは、野島の高効率コンピタントセル調製法（岡山博人、松村正実  遺伝子工学ハンドブック  実験医学別冊（１９９１）：４６−５１）のプロトコルに従って調製し、ヒートショック法を用いて大腸菌への形質転換を行った。選択プレートは、２％５−ブロモ−４−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクシド（Ｘ−ｇａｌ）を６０μｌ、１００ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピレノシド（ＩＰＴＧ）を４０μｌ添加し、カルベニシリンの最終濃度が１０μｇ／ｍｌとなるように調製したＬＢ寒天培地を使用した。３７℃で１６−２０時間培養した後、青色を呈したコロニーをＤＮＡ断片がベクターに挿入されていない形質転換体とし、白色コロニーをＤＮＡ断片が挿入された形質転換体として区別した。選抜した白色コロニーをコロニーＰＣＲした後、電気泳動で目的のＤＮＡ断片のサイズを確認した。プライマーは、Ｍ１３ｆｏｒｗａｒｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧ）（配列番号８）およびｒｅｖｅｒｓｅ（ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）（配列番号９）、ＤＮＡ合成酵素はＴａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いた。
【００３３】
実施例４  塩基配列の決定と解析
塩基配列の決定は、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて抽出したプラスミドＤＮＡをＢｉｇＤｙｅ（商標）  Ｔｅｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて蛍光標識し、そのＤＮＡ試料をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｄｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で分析した。プライマーは１０μＭに調製したＭ１３ｆｏｒｗａｒｄおよびｒｅｖｅｒｓｅをシークエンスに使用した。解析ソフトは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０とＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｃｏ．Ｌｔｄ社製）を用いた。
【００３４】
配列番号７のランダムプライマーを用いて増幅した大和トウキ特異的ＤＮＡ断片（５３０ｂｐ）（配列番号３）および北海トウキ特異的ＤＮＡ断片（６５０ｂｐ）（配列番号６）をＴＡクローニングし、その塩基配列を解析した。それぞれの塩基配列を配列表に示す。
【００３５】
実施例５  大和トウキ識別用プライマーの設計と作製
実施例４で得られた大和トウキ識別用ＤＮＡ断片（５３０ｂｐ）（配列番号３）の配列から識別用プライマー対を設計し、配列番号１および２のプライマーを合成した。
ＣＣＴＣＡＣＧＴＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＧＡ（配列番号１）
ＧＣＣＴＣＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＡＧＡＡＡ（配列番号２）
次にトウキ葉組織から抽出したゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）を配列番号１および２のプライマー０．４μＭずつおよびＤＮＡ合成酵素としてＴａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、Ｈ２Ｏで希釈して総量２０μｌのＰＣＲ反応液とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で４０秒を３０回繰り返して行い増幅した。電気泳動の結果を図１Ａに示すごとく、大和トウキのみに増幅ＤＮＡ断片（５３０ｂｐ）が検出された。
【００３６】
実施例６  北海トウキ識別用プライマーの設計と作製
実施例４で得られた北海トウキ識別用ＤＮＡ断片（６５０ｂｐ）（配列番号６）の配列から識別用プライマー対を設計し、配列番号４および５のプライマーを合成した。
ＣＡＣＧＴＧＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＡＴＧＡＡ（配列番号４）
ＣＡＣＧＡＴＡＣＧＴＡＣＡＣＣＣＣＴＧＣ（配列番号５）
次にトウキ葉組織から抽出したゲノムＤＮＡ（２００ｎｇ）を配列番号４および５のプライマー０．４μＭずつおよびＤＮＡ合成酵素としてＴａｑ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、Ｈ２Ｏで希釈して総量２０μｌのＰＣＲ反応液とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で３０秒、５８℃で３０秒および７２℃で４０秒を３０回繰り返して行い増幅した。電気泳動の結果を図１Ｂに示すごとく、北海トウキのみに増幅ＤＮＡ断片（６５０ｂｐ）が検出された。
【００３７】
実施例７  ＣＯＳＩＩマーカーの探索
実施例１で得られたゲノムＤＮＡおよびＣＯＳＩＩのプライマー対４９種類を、それぞれ５０ｎｇ／μｌおよび２μＭに調製したものを使用した。ＰＣＲ反応液は、ゲノムＤＮＡを２μｌ、ＣＯＳＩＩプライマー対各５μｌならびにＤＮＡ合成酵素としてＡｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１２μｌを用いて表３に示す反応条件でＰＣＲ反応した。反応後ＰＣＲ溶液を１．５％アガロースゲルで電気泳動すると、図２に示すごとく、プライマー対としてＴＡＧＴＧＡＣＧＡＴＡＣＣＴＡＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧ（配列番号１０）とＴＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＴＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＡＧＣ（配列番号１１）を用いると大和トウキ特異的なＤＮＡ断片（約２８０ｂｐ）および北海トウキ特異的なＤＮＡ断片（約４８０ｂｐ）が見出され、プライマー対としてＴＡＧＧＣＣＴＣＴＡＣＴＣＧＣＣＧＴＡＣＡＧＣ（配列番号１２）とＴＴＡＧＴＴＣＴＴＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＧ（配列番号１３）を用いると大和トウキ特異的なＤＮＡ断片（約２２０ｂｐ）および北海トウキ特異的なＤＮＡ断片（約２８０ｂｐ）が見出され、更にプライマー対としてＡＣＴＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＧ（配列番号１４）とＡＧＣＴＴＴＧＧＴＣＣＡＡＧＣＧＡＣＡＡＡＴＣ（配列番号１５）を用いると大和トウキ特異的なＤＮＡ断片（約３６０ｂｐ）および北海トウキ特異的なＤＮＡ断片（約３００ｂｐ）が見出された。
【００３８】
【表３】
2008086309.tif 000004
【００３９】
続いて、上記操作で見出された大和トウキの特異的バンドおよび北海トウキ特異的バン
ドを実施例３、４と同様にしてゲルから切り出し、ＱＩＡＧＥＮ社製のＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔにより精製を行い、ｐＧＥＭ  Ｔ−ｖｅｃｔｏｒにクローニングした後、配列の解析を行い、得られた配列情報から実施例５ならびに実施例６と同様に識別用プライマーの設計・合成し、得られる識別用プライマーと各種トウキから抽出したゲノムＤＮＡとをＤＮＡ合成酵素存在下にＰＣＲ反応により増幅し電気泳動すると、大和トウキならびに北海トウキ特異的増幅ＤＮＡが得られ、大和トウキと他生産地トウキとを識別できる。
【００４０】
実施例８  ＤＮＡ抽出改良方法
大和トウキの乾燥根を市販のゲノムＤＮＡ抽出キット、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｌａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用い、キット製造者が推奨する実験方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の液量を１４９μｌにあわせ、５ＭのＮａＣｌを２８μｌ、８．６％ＣＴＡＢを２３μｌ混合し、液量２００μｌとし、２００μｌのクロロホルムにて三回抽出を繰り返した。得られた水層に等量のイソプロパノール及び１／４量の８Ｍ酢酸アンモニウムを加え、−２０℃に一時間静置した。続いて定法の遠心操作によりゲノムＤＮＡを回収した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いて配列番号１６および１７のプライマー対にてＰＣＲ増幅した結果を図３に示す（レーン７）。
【００４１】
比較例として、市販のＤＮＡ抽出液のＤＮＡｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により得られたゲノムＤＮＡ、およびＣＴＡＢ法により得られたゲノムＤＮＡ、さらにそれぞれをＮａＣｌとＣＴＡＢ存在下でクロロホルム抽出操作を行い得られたゲノムＤＮＡ、さらにクロロホルム抽出に加えて定法に従ってフェノール抽出操作を行い得られたゲノムＤＮＡを、鋳型として用いて配列番号１６および１７のプライマー対にてＰＣＲ増幅した結果を図３のレーン１〜６に示す。また、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（商標）Ｐｌａｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により得られたゲノムＤＮＡを鋳型として用いた場合の結果をレーン８に示す。なお、フェノール抽出は、ＤＮＡ溶液と等量のフェノール溶液（Ｓｉｇｍａ社製  ｐＨ７．９）を混合し、転倒混和後に遠心操作により二層を分離することにより行い、さらに得られた水層を回収して、エタノール沈殿をおこなった。一方、葉組織由来のゲノムＤＮＡを鋳型とした場合のＰＣＲ増幅結果をレーン９に示す。以上の図３に示す結果から、実施例８の方法にて抽出すると高純度のゲノムＤＮＡが得られることが明らかである。
【００４２】
実施例９  大和トウキ特異的プライマー（配列番号１６，１７）
実施例２におけるＲＡＰＤ法分析のプライマーとしてＧＡＴＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号２５）を用いて、実施例１〜４と同様の方法により得られたＤＮＡ断片（５５０ｂｐ）（配列番号１８）の配列から識別用プライマー対を設計し、配列番号１６および１７のプライマーを合成した。
ＧＡＴＣＡＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＡＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１６）
ＧＡＴＣＡＡＴＣＧＣＴＡＴＡＡＡＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号１７）
次にトウキ根組織から実施例８に示す方法にて抽出したゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）、配列番号１６および１７のプライマー各０．５μＭおよびＤＮＡ合成酵素としてＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．２５Ｕを用い、Ｈ２Ｏで希釈して総量２０μｌのＰＣＲ反応液とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で２０秒、５６℃で２０秒および７２℃で３０秒を３５回繰り返して行い増幅した。電気泳動の結果を図４に示すごとく、大和トウキのみに増幅ＤＮＡ断片（５５０ｂｐ）が検出された。
【００４３】
実施例１０  大和トウキおよび北海トウキ特異的プライマー（配列番号１９，２０）
実施例２におけるＲＡＰＤ法分析のプライマーとしてＧＡＴＣＡＡＴＣＧＣ（配列番号２５）を用いて、実施例１〜４と同様の方法により得られたＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）（配列番号２１）の配列から識別用プライマー対を設計し、配列番号１９および２０のプライマーを合成した。
ＡＣＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＧＡＧ（配列番号１９）
ＣＣＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＡＴＡ（配列番号２０）
次にトウキ根組織から実施例８に示す方法にて抽出したゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）、配列番号１９および２０のプライマー各０．５μＭおよびＤＮＡ合成酵素としてＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．２５Ｕを用い、Ｈ２Ｏで希釈して総量２０μｌのＰＣＲ反応液とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で２０秒、５６℃で２０秒および７２℃で３０秒を３５回繰り返して行い増幅した。電気泳動の結果を図４に示すごとく、大和トウキおよび北海トウキから増幅ＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）が検出された。
【００４４】
実施例１１  大和トウキおよび北海トウキ特異的プライマー（配列番号２２，２３）
実施例２におけるＲＡＰＤ法分析のプライマーとしてＴＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡ（配列番号２６）を用いて、実施例１〜４と同様の方法により得られたＤＮＡ断片（３００ｂｐ）（配列番号２４）の配列から識別用プライマー対を設計し、配列番号２２および２３のプライマーを合成した。
ＧＧＡＡＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＧＡＴＴＴＣ（配列番号２２）
ＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣ（配列番号２３）
次にトウキ根組織から実施例８に示す方法にて抽出したゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ）、配列番号２２および２３のプライマー各０．５μＭおよびＤＮＡ合成酵素としてＥｘＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）０．２５Ｕを用い、Ｈ２Ｏで希釈して総量２０μｌのＰＣＲ反応液とした。ＰＣＲ反応条件は９４℃で２０秒、５６℃で２０秒および７２℃で３０秒を３５回繰り返して行い増幅した。電気泳動の結果を図４に示すごとく、大和トウキおよび北海トウキから増幅ＤＮＡ断片（３００ｂｐ）が検出された。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明により、ＤＮＡマーカーを指標とした大和トウキと北海トウキはじめ他の生産地品種との簡便で精度の高い識別方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】特異的プライマーを用いたＰＣＲで増幅した電気泳動結果。Ａは配列番号１と配列番号２のプライマー対を用いた結果、Ｂは配列番号４と配列番号５のプライマー対を用いた結果を示す。
【図２】ＣＯＳＩＩプライマー対を用いたＰＣＲで増殖した電気泳動結果。Ｐ２は配列番号１０と配列番号１１のプライマー対、Ｐ１０は配列番号１２と配列番号１３のプライマー対ならびにＰ４９は配列番号１４と配列番号１５のプライマー対を用いた結果を示す。
【図３】乾燥根由来のトウキ試料から改良抽出方法（レーン７）、従来抽出方法（レーン１〜６およびレーン８）、ならびに葉由来のトウキ試料から従来抽出方法で、それぞれ抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅・電気泳動した結果を示す。
【図４】大和トウキおよび北海トウキの乾燥根由来のゲノムＤＮＡを鋳型として配列番号１６と１７、配列番号１９と２０、および配列番号２２と２３のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅・電気泳動した結果を示す。
【図１】
2008086309.tif 000005
【図２】
2008086309.tif 000006
【図３】
2008086309.tif 000007
【図４】
2008086309.tif 000008
【配列表】
2008086309000001.app