(57)【要約】【課題】  本発明は、ＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質、及びその調製方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、Ｓｐｏ１１タンパク質を大腸菌由来のトリガーファクター（ＴＦ）と融合した形態で発現させ、該融合タンパク質を大腸菌抽出物の可溶性画分に回収し、さらに、ヘパリンカラムクロマトグラフィーの過程を含む精製工程により、ＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製する方法を提供する。さらには、該方法によって調製したＳｐｏ１１タンパク質を提供する。【選択図】図４
2008189556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクターと融合させた融合タンパク質の形態で宿主大腸菌内で発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする、ＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質を調製する方法。
【請求項２】
前記融合タンパク質に、さらにＧａｌ４ＢＤタンパク質を融合させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合タンパク質の発現が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドがＤＮＡ結合能を有するポリヌクレオチド
【請求項４】
前記組換えベクターが、請求項３に記載の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを配列番号２８で示される核酸配列からなるタンパク質発現用ベクターに組み込んだものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記融合タンパク質の発現が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド
【請求項６】
前記組換えベクターが、請求項５に記載の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドをコードする核酸を含む配列番号２８で示される核酸配列からなるタンパク質発現用ベクターに組み込んだものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記可溶性成分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通す前に、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに通し、得られた前記融合タンパク質を含む画分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ヘパリンカラムクロマトグラフィーに通して得られた前記融合タンパク質を含む画分を、さらにアフィニティーカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｓｐｏ１１タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド
【請求項１０】
前記トリガーファクターが、配列番号８で表されるアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ヘパリンカラムからの前記融合タンパク質の溶出の下限濃度が、０．０〜０．７Ｍであって、上限濃度が０．９．〜１．５ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌの濃度勾配によって行われることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなり、ＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列
【請求項１３】
請求項１乃至１１に記載のいずれかの方法により調製されたＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の調製法に関する。より詳細には、活性を保持した可溶性タンパク質の調製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
交配による品種改良において、減数分裂期の相同ＤＮＡ組換え（遺伝的組換え、普遍的組換え、相同的組換えともいう）は重要な働きをしていると考えられている。その相同ＤＮＡ組換えは、ゲノムＤＮＡに多数存在する特定の部位にＤＮＡ二本鎖切断が導入されることで開始される。このＤＮＡ二本鎖切断は、真核生物では、パン酵母で発見されたＳｐｏ１１タンパク質若しくはその類縁タンパク質、又は、該タンパク質が核になったタンパク質複合体が行うと考えられている（非特許文献１〜３）。
相同ＤＮＡ組換えのメカニズムをより詳細に解明する上で、Ｓｐｏ１１タンパク質（及び類縁タンパク質）及び該タンパク質を含む複合体の機能を明らかにすることは、極めて重要なことであるが、そのためには、まず、Ｓｐｏ１１タンパク質の生化学的な機能解析を行う必要がある。活性を保持したＳｐｏ１１タンパク質を調製する試みは、これまでに多数行われているが、Ｓｐｏ１１タンパク質の発現自体が困難な上、発現した場合でも、可溶化したタンパク質を調製することに成功した例がない。Ｗｕらは、大腸菌内で発現させた不溶性のＳｐｏ１１（Ｒｅｃ１２）タンパク質を、尿素、グアニジン塩酸等による変性−再折りたたみの過程を経て、可溶性のＳｐｏ１１タンパク質を調製したことを報告している（非特許文献４）。Ｗｕらは、調製されたＳｐｏ１１タンパク質には、一本鎖ＤＮＡへニックを入れる活性及び二本鎖のスーパーコイルＤＮＡに切断を入れる活性を有するとも報告しているが、精製タンパク質とＤＮＡとが実際に接触あるいは結合したとの証拠は示されておらず、活性を有するとの報告には疑問が残る（非特許文献４）。
【０００３】
遺伝子の組み換え技術の進歩により、所望のタンパク質を自由に設計し、大腸菌を用いて大量に取得し得る可能性が示されてきたが、実際には、大腸菌内で発現したタンパク質は正常な立体構造を取らず、その結果、本来の活性を発揮しないことが多かった。そこで、大腸菌内で発現したタンパク質の構造を正常に折りたたませるために、分子シャペロンを利用する試みが行われ、ある程度の成果を上げている。トリガーファクター（ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆａｃｔｏｒ：ＴＦ）は、大腸菌由来の分子シャペロンの１種で、大腸菌を用いた組換えタンパク質の発現において、発現タンパク質を可溶化した状態で取得するために利用することができる。
大腸菌のＴＦは、全長４３２アミノ酸からなり、予想される生化学的機能に基づいて区別される、３つのドメインによって構成される（非特許文献５）。これら３つのドメインは、リボソームとの結合に重要な領域（１−１１８）を含むＮ末端ドメイン（１−１４４）、ＰＰＩａｓｅ活性を有するＰドメイン（１４５−２４７）及びＣ末端ドメイン（２４８−４３２）によって構成されている。結晶構造解析の結果から、ＴＦは立体構造の中心にＣ末端ドメインが位置し、その両端にＰドメイン及びＮ末端ドメインが配置されていることが示された（非特許文献６）。ＴＦのシャペロン活性には、Ｃ末端ドメインが重要であることが予想されていたが、Ｃ末端ドメインを単独で単離するとシャペロン活性を示さず、Ｎ末端ドメイン又はＰドメインと融合させて、Ｃ末端ドメインを構造上安定な状態にしないとシャペロン活性が保持されないことが報告されている（非特許文献５）。
【０００４】
【非特許文献１】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，  ９２：１１２７４−１１２７８，１９９５
【非特許文献２】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｃｅｌｌ，８８：３７５−３８４，１９９７
【非特許文献３】Ｋｅｅｎｅｙら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６１：１７０−１８２，１９９９
【非特許文献４】Ｗｕら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，３８：１３６−１４４，２００４
【非特許文献５】Ｍｅｒｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：３１９６３−３１９７１，２００６
【非特許文献６】Ｈｅｓｔｅｒｋａｍｐら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２１８６５−２１８７１，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み、ＤＮＡ結合能を保持したＳｐｏ１１タンパク質を調製する方法について鋭意研究を行った結果、大腸菌由来のトリガーファクターとの融合タンパク質の形態で発現させることで、ＤＮＡ結合能を持つ可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、ＤＮＡ結合能を持つ可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質の提供を目的とする。
また、本発明は、ＤＮＡ結合能を持つ可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を調製する方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１４）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクターと融合させた融合タンパク質の形態で宿主大腸菌内で発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする、ＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質を調製する方法」である。
（２）本発明の第２の態様は、「前記融合タンパク質に、さらにＧａｌ４ＢＤタンパク質を融合させることを特徴とする上記（１）に記載の方法」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記融合タンパク質の発現が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７又は配列番号９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの相補鎖と高ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドがＤＮＡ結合能を有するポリヌクレオチド」である。
（４）本発明の第４の態様は、「前記組換えベクターが、上記（３）に記載の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドを配列番号２８で示される核酸配列からなるタンパク質発現用ベクターに作用可能に組み込んだものであることを特徴とする上記（３）に記載の方法」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記融合タンパク質の発現が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドをコードする核酸を含む組換えベクターを前記宿主大腸菌内に導入することにより達成されることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記組換えベクターが、上記（５）に記載の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドをコードする核酸を含む配列番号２８で示される核酸配列からなるタンパク質発現用ベクターに作用可能に組み込んだものであることを特徴とする上記（５）に記載の方法」である。
（７）本発明の第７の態様は、「前記可溶性成分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通す前に、アフィニティーカラムクロマトグラフィーに通し、得られた前記融合タンパク質を含む画分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする、上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法」である。
（８）本発明の第８の態様は、「前記ヘパリンカラムクロマトグラフィーに通して得られた前記融合タンパク質を含む画分を、さらにアフィニティーカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法」である。
（９）本発明の第９の態様は、「前記Ｓｐｏ１１タンパク質が以下の（ａ）又は（ｂ）で示されるポリペプチドであることを特徴とする上記（１）乃至（８）のいずれかに記載の方法。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するポリペプチド」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「前記トリガーファクターが、配列番号８で表されるアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とする上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「前記ヘパリンカラムからの前記融合タンパク質の溶出の下限濃度が、０．０〜０．７Ｍであって、上限濃度が０．９．〜１．５ＭのＮａＣｌ又はＫＣｌの濃度勾配によって行われることを特徴とする上記（１）乃至（１０）のいずれかに記載の方法」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなり、ＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８又は配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列」である。
（１３）本発明の第１３の態様は、「上記（１）乃至（１１）のいずれかに記載の方法により調製されたＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質」である。
（１４）本発明の第１４の態様は、「上記（１２）又は（１３）に記載のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体」である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、可溶性かつ完全長のＳｐｏ１１タンパク質であって、ＤＮＡ結合能を保持したタンパク質を調製することができる。
【０００８】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、可溶性であり、かつ、完全長の形態を備えているため、完全長のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体の作製の用に供することができる。
【０００９】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いることで、減数分裂期相同ＤＮＡ組換えにおいて誘導されるＤＮＡの二本鎖切断の分子メカニズムを明らかにすることが可能となる。
【００１０】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いることで、これまで明らかにされていなかった、Ｓｐｏ１１タンパク質との相互作用因子（活性化因子など）の同定、及び、Ｓｐｏ１１タンパク質を含む機能複合体の作用機序の解明が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の実施態様の１つは、「Ｓｐｏ１１タンパク質を、トリガーファクターと融合させた融合タンパク質の形態で宿主大腸菌内で発現させ、該宿主大腸菌細胞を破砕し、可溶性成分を回収し、該可溶性成分をヘパリンカラムクロマトグラフィーに通すことを特徴とする、ＤＮＡ結合能を有するＳｐｏ１１タンパク質を調製する方法」である。
本発明の「Ｓｐｏ１１タンパク質」とは、配列番号２、４、６、８又は１０で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質である。
あるいは、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質としては、配列番号２、４、６、８又は１０で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質である。上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
【００１２】
本発明の調製方法において、Ｓｐｏ１１タンパク質は、トリガーファクター（ＴＦと称する）との融合タンパク質の形態で調製される。なお、ＴＦは大腸菌由来のものが好ましい。この融合タンパク質を調製するために、Ｓｐｏ１１タンパク質をコードする核酸（Ｓｐｏ１１遺伝子と称する）とＳｐｏ１１遺伝子の５’側にＴＦをコードする核酸を同一の発現ベクターに組み込むことができる。発現ベクターの構築において、Ｓｐｏ１１遺伝子とＴＦをコードする核酸との間に介在配列（介在ヌクレオチド配列）を配置させてもよいが、Ｓｐｏ１１タンパク質及びＴＦとの融合タンパク質が正しいアミノ酸配列によって構成される状態で発現可能なように、読み枠を合わせて構築する必要がある。また、この介在ヌクレオチド配列の部分を特定のペプチダーゼ（例えば、トロンビンなど）が認識し得るペプチド配列をコードする配列として構築することもできる。このように構築することにより、生産された融合タンパク質に特定のペプチダーゼ（例えば、トロンビン）を作用させることで、Ｓｐｏ１１タンパク質とＴＦを分離し、Ｓｐｏ１１タンパク質のみの形態を取得することが可能となる。さらに、該融合タンパク質のコード領域の５’側、３’側等に、タンパク質の精製に有効なタグ配列（例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグなど）をコードする核酸配列を配置してもよい。本発明のＳｐｏ１１タンパク質には、Ｓｐｏ１１タンパク質の全長が含まれているものであれば、Ｓｐｏ１１タンパク質のみの形態、ＴＦ及び／又はタグ配列及び／又はＧａｌ４ＢＤタンパク質との融合した形態のいずれも含まれるものとする。
【００１３】
本発明に使用されるＴＦは、大腸菌のｔｉｇ遺伝子（配列番号１１及び１２）に由来するもので、ｐＴＩＧ２（Ｇｕｔｈｒｉｅら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７：１８３１−１８３５，１９８８）などのｔｉｇ遺伝子を保持するベクターから取得することが好適である。取得したｔｉｇ遺伝子を適当なタンパク質発現用のベクターに導入することで、ＴＦとの融合タンパク質発現用のベクターを構築するができる。あるいは、ｔｉｇ遺伝子が予め構築された市販の発現プラスミド（例えば、ｐＣｏｌｄＴＦ  ＤＮＡ（配列番号２８）、ＴａＫａＲａ社）にＳｐｏ１１遺伝子を構築して、発現用のベクターを調製することもできる。本発明で使用可能なＴＦは、ＴＦの部分アミノ酸から構成されるものであっても、シャペロン活性を有するものであれば、使用することができる。例えば、配列番号８で表されるアミノ酸配列において、２４８〜４３２番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｃ領域と称する）を必須構成部分とし、１〜１４４番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｎ領域と称する）又は１４５〜２４７番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド（Ｐ領域と称する）と融合した形態を用いてもよい。
【００１４】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質をコードする核酸は、配列番号１、３、５、７又は９で表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡのみならず、配列番号１、３、５、７又は９で表されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡと高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、ＤＮＡ結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなるものも含まれる。配列番号１、３、５、７又は９で表わされるヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７又は９で表わされるヌクレオチド配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。
【００１５】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。
【００１６】
本発明のＳｐｏ１１遺伝子は、全ての真核生物のゲノムデータベース、又は、ｃＤＮＡバンクデータからの抽出により推認することができる。なお、本願出願時点までに、パン酵母（出芽酵母）、分裂酵母、ヒトを含む哺乳類、又はショウジョウバエにおいては、各々、１種類、イネからは４種類以上、シロイヌナズナからは３種類の遺伝子が推認できている。本発明の調製方法において使用可能なＳｐｏ１１遺伝子は、真核生物由来のものであれば、使用可能であるが、特に、イネ又はシロイヌナズナ由来のものが好ましい。
【００１７】
本発明の調製方法においては、ＴＦとＳｐｏ１１遺伝子を連結させた形態の他、さらにに、Ｇａｌ４ＢＤをコードする遺伝子を連結させた核酸を用いて、ＴＦ−Ｇａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１の融合タンパク質として発現させることもできる。Ｇａｌ４ＢＤは、出芽酵母由来のＧａｌ４タンパク質のＵＡＳＧＡＬ配列と結合する部分ポリペプチドである。Ｇａｌ４ＢＤをコードする核酸（例えば、配列番号１３）は、出芽酵母のゲノムライブラリーなどから、定法に従って容易に取得することができる。Ｇａｌ４ＢＤタンパク質との融合体として発現させたＳｐｏ１１タンパク質を用いると、ＵＡＳＧＡＬ配列を含むゲノム上の特定領域にＳｐｏ１１タンパク質をターゲティングさせることができるため、所望の領域においてＳｐｏ１１タンパク質を機能させることが可能となる。また、特にイネのＳｐｏ１１蛋白質の発現においては、Ｇａｌ４ＢＤとの融合体として発現させることで、非常に効率のよい発現が可能となる。
【００１８】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質を発現させるための発現ベクターは、予めＴＦをコードする遺伝子が挿入されている市販のベクター（例えば、ｐＣｏｌｄＴＦ  ＤＮＡ、ＴａＫａＲａ社）を利用し、Ｓｐｏ１１遺伝子又はＧａｌ４ＢＤ−Ｓｐｏ１１融合タンパク質をコードする核酸を該ベクターに挿入することで取得することができる。その他使用可能なベクターとしては、例えば、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等を用いることもできる。
また、発現ベクターに用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。例えば、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター等が挙げられる。
【００１９】
上述のベクターに対するＳｐｏ１１遺伝子又はＴＦをコードする核酸の挿入は、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを構築することができる。また、本発明のＳｐｏ１１タンパク質をコードする核酸を保持した発現ベクターを宿主大腸菌に導入する方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。
【００２０】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、宿主大腸菌を破砕して得られる可溶性画分から取得するこができる。宿主大腸菌を培養するにあたり、培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、宿主大腸菌に適した条件下で行う。例えば、培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。培養は、通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
【００２１】
Ｓｐｏ１１タンパク質を培養菌体から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液は、からＤＮＡ結合能を保持したＳｐｏ１１タンパク質を精製にあたり、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｈｉｓタグを用いた場合には、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂やＣｏベースの樹脂を、ＨＡタグを用いた場合には、抗ＨＡ抗体結合カラムが使用可能である）などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。ただし、本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、プロテアーゼ等によるタンパク質分解の影響を受け易いため、Ｓｐｏ１１タンパク質の完全長を安定に取得するためには、ヘパリンカラムクラマトグラフィーを精製過程のいずれかの工程で用いることが望ましい。また、ＴＦタンパク質と有効に分離するためには、ヘパリンカラムクロマトグラフィーを用いてグラジエント溶出を行うことが有効である。グラジエントは、例えば、ＮａＣｌ又はＫＣｌなどの塩による濃度勾配により実施することができ、例えば、塩濃度の下限を０Ｍ、０．３Ｍ、０，５Ｍ又は０．７Ｍとし、上限を０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．２Ｍ又は１．５Ｍとすることができ、好ましくは、下限が０Ｍ、０．３Ｍ、０，５Ｍ又は０．７Ｍ、上限が０．９Ｍ、１．０Ｍ又は１．２Ｍであり、より好ましくは、下限が０，５Ｍ又は０．７Ｍ、上限が０．９Ｍ又は１．０Ｍであり、最も好ましくは下限が０．７Ｍ、上限が１．０Ｍである。
【００２２】
本発明の他の実施態様は、「本発明のＳｐｏ１１タンパク質に対する抗体」である。本発明の抗体には、完全長のＳｐｏ１１タンパク質と特異的に結合する抗体、及びそのＦａｂ又はＦ(ａｂ’)２などの抗体断片が含まれる。
本発明の「抗体」（Ｓｐｏ１１タンパク質の活性（ＤＮＡ結合能）を促進又は阻害する抗体を含む）には、ＤＮＡ結合能を保持するＳｐｏ１１タンパク質に対するモノエピトープ特異抗体、ポリエピトープ特異抗体、単一鎖抗体、及びこれらの断片が含まれる。これらの抗体には、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体などが含まれる。
ポリクローナル抗体は、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原及びアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原及び／又はアジュバントを宿主動物の皮下又は腹腔内へ複数回インジェクトする。免疫原には本発明のＤＮＡ結合能を保持した可溶性Ｓｐｏ１１タンパク質を使用することができる。アジュバントの例には、完全フロイト及びモノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が含まれる。
【００２３】
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。
この方法には以下に示す４つの工程が含まれる：（ｉ）宿主動物または、宿主動物由来のリンパ球を免疫する、（ｉｉ）モノクローナル抗体分泌性（又は潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（ｉｉｉ）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（ｉｖ）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。
マウス、ラット、モルモット、ハムスター、又は他の適当な宿主動物が、免疫動物として選択され免疫原がインジェクトされる。或いは、免疫動物から取得したリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望ましい場合には、末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）が一般に使用される。しかしながら、他の哺乳類由来の脾臓細胞又はリンパ球がより一般的で好ましい。
【００２４】
免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、トランスフォーメーションによって不死化されたげっ歯類、ウシ、又はヒトのミエローマ細胞が使用されるか、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球及び不死化細胞株の成長又は生存を阻害する一又は複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンがＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（ＨＡＴ培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマが生育する培地から、定法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
【００２５】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
１．ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｇａｌベクターの構築
ＴＦとＳｐｏ１１との間にＧａｌ４ＢＤを挿入した融合タンパク質を発現させるベクターを構築するために、ｐＣｏｌｄＴＦ（ＴａＫａＲａ社）にＧａｌｅＢＤをコードするＤＮＡ（配列番号１３）をクローニングした。ＧａｌｅＢＤをコードするＤＮＡは、ｐＡＳ２−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を鋳型とし、下記のプライマー対を用いてＰＣＲにより増幅した。得られたＧａｌｅＢＤをコードするＤＮＡをｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏへ導入した。その後、プライマーに付加されたＢａｍＨＩおよびベクターポリリンカー部分のＥｃｏＲＩサイトを切断し、ｐＣｏｌｄＴＦのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩサイトへ導入し、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｇａｌを構築した。
ＧａｌｅＢＤに対するプライマー
ＧａｌＦ：５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴ−３’（配列番号１４；下線部はＢａｍＨＩサイトを示す）
ＧａｌＲ：５’−ＧＧ  ＧＡＧＣＴＣ ＧＣＧＧＣＣＧＣ ＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＴＡＣＡＧＴＣＡＡＣＴＧＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１５；下線部は左からＳａｃＩ、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩの各サイトを示す）
【００２７】
２．Ｓｐｏ１１タンパク質発現ベクターの構築
２−１．シロイヌナズナのＳｐｏ１１タンパク質（ＡｔＳｐｏ１１−１）
シロイヌナズナの減数分裂期を含む未成熟葯よりＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを利用した逆転写反応によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡに対して、下記のプライマー対を用いて、ＡｔＳｐｏ１１−１をコードする遺伝子（配列番号１）をＰＣＲ増幅した後、プライマーに設定しておいたＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトにて切断し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へＴＡクローニングした。次に、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにクローニングされた各遺伝子を、プライマーに設定しておいたＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトにて切断し、ｐＣｏｌｄＴＦ（ＴａＫａＲａ社）にサブクローニングして発現ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１−１）を構築した。
ＡｔＳｐｏ１１−１に対するプライマー対
Ａｔ１−Ｆ：５’−  ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＧＡＡＡＡＴＴＣＧＣＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡ  −３’（配列番号１６）
Ａｔ１−Ｒ：５’−  ＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＧＧＡＧＡＧＣＴＴＡＣＴＴＣＡＣＧＡＣＧ−３’（配列番号１７）
下線部はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを示す。
【００２８】
２−２．シロイヌナズナのＳｐｏ１１タンパク質（ＡｔＳｐｏ１１−２）
シロイヌナズナの減数分裂期を含む未成熟葯よりＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを利用した逆転写反応によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡに対して、下記のプライマー対を用いて、ＡｔＳｐｏ１１−２をコードする遺伝子（配列番号３）をＰＣＲ増幅した後、プライマーに設定しておいたＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトにて切断し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）へＴＡクローニングした。次に、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙにクローニングされた各遺伝子を、プライマーに設定しておいたＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトにて切断し、ｐＣｏｌｄＴＦ（ＴａＫａＲａ社）にサブクローニングして発現ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１−２）を構築した。
ＡｔＳｐｏ１１−２に対するプライマー対
Ａｔ２−Ｆ：５’−  ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴＡＴＣＡＴＣＧ  −３’（配列番号１８）
Ａｔ２−Ｒ：５’−  ＧＧＡＴＣＣ  ＴＴＡＴＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＴＣ−３’（配列番号１９）
下線部はＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩサイトを示す。
【００２９】
２−３．イネのＳｐｏ１１タンパク質（ＯｓＳｐｏ１１Ａ）
イネ（品種：日本晴）の減数分裂期を含む未成熟葯よりＲＮＡを抽出し、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーを利用した逆転写反応によってｃＤＮＡを作製した。このｃＤＮＡに対して、下記のプライマー対を用いて、ＯｓＳｐｏ１１Ａをコードする遺伝子（配列番号５）をＰＣＲ増幅した後、プライマーに設定しておいたＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩサイトにて切断し、ｐＣｏｌｄＴＦ（ＴａＫａＲａ社）にサブクローニングして発現ベクター（ｐＣｏｌｄＴＦ−ＯｓＳｐｏ１１Ａ）を構築した。下記プライマーＯｓＡ−Ｆ（配列番号２０）のＮｄｅＩサイトをＡｓｃＩサイトへ変更したプライマーおよびＯｓＡ−Ｒ（配列番号２１）のＢａｍＨＩサイトをＳｐｅＩサイトへ変更したプライマーを用い、再増幅後、ｐＣｏｌｄＴＦ−ＧａｌベクターのＡｓｃＩ−ＸｂａＩサイトへ導入し、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｇａｌ−ＯｓＳｐｏ１１Ａを構築した。
ＯｓＳｐｏ１１Ａに対するプライマー対
ＯｓＡ−Ｆ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＧ−３’（配列番号２０）
ＯｓＡ−Ｒ：５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２１）
下線部はＮｄｅＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトを示す。
【００３０】
２−４．イネのＳｐｏ１１タンパク質（ＯｓＳｐｏ１１Ｂ）
イネ由来のＯｓＳｐｏ１１Ｂをコードする遺伝子（配列番号７）の３’末端部を、イネのｃＤＮＡ（上述）に対して、下記のＯｓＢ−Ｆ２２１（配列番号２２）およびＯｓＢ−Ｒ（配列番号２３）プライマー対にてＰＣＲ増幅後、ｐＴ７ＢｌｕｅへＴＡクローニングしｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＯｓＳｐｏ１１Ｂ−Ｃを構築した。さらに、５’末端部をイネｃＤＮＡに対して、下記のＯｓＢ−Ｆ（配列番号２４）およびＯｓＢ−Ｒ２５６（配列番号２５）プライマー対にてＰＣＲ増幅後、プライマー配列に付加されたＳａｃＩサイトおよび増幅断片内部のＡａｔＩＩサイトで切断し、これをｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＯｓＳｐｏ１１Ｂ−Ｃのベクター配列上のＳａｃＩおよび遺伝子内部のＡａｔＩＩサイトへ導入し、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−ＯｓＳｐｏ１１Ｂを構築した。その後ベクター上のサイトＳａｃＩ（平滑化）およびＳｐｅＩにて断片を切り出し、ｐＣｏｌｄＴＦ−ＧａｌのＮｏｔＩ（平滑化）およびＸｂａＩサイトへ導入し、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｇａｌ−ＯｓＳｐｏ１１Ｂを構築した。
ＯｓＳｐｏ１１Ｂに対するプライマー対
ＯｓＢ−Ｆ２２１：５’−ＧＡＣＧＴＣ  ＴＣＧＴＣＧＧＴＧＴＡＣＣＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２２）
下線部はＡａｔＩＩサイトを示す。
ＯｓＢ−Ｒ：５’−ＧＧＡＡＴＴＣＡＡＡＴＧＴＡＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＣ−３’（配列番号２３）
ＯｓＢ−Ｆ：５’−ＴＴＴ  ＧＡＧＣＴＣ  ＣＣＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＧＡＧＴ−３’（配列番号２４）
下線部はＳａｃＩサイトを示す。
ＯｓＢ−Ｒ２５６：５’−ＡＧＧＡＧＧＣＧＴＡＧＧＡＧＡＧＧＴＡＣＡＣＣＧＡＣＧＡ−３’（配列番号２５）
【００３１】
２−５．イネのＳｐｏ１１タンパク質（ＯｓＳｐｏ１１Ｃ）
イネ由来のＯｓＳｐｏ１１Ｃをコードする遺伝子（配列番号９）を、イネのｃＤＮＡ（上述）に対して、下記のプライマー対にてＰＣＲ増幅後、ｐＴ７ＢｌｕｅにＴＡクローニングした。ベクター配列に存在するＥｃｏＲＩサイトし、ｐＣｏｌｄＴＦ−ＧａｌベクターのＥｃｏＲＩサイトへ導入し、ｐＣｏｌｄＴＦ−Ｇａｌ−ＯｓＳｐｏ１１Ｃを構築した。
ＯｓＳｐｏ１１Ｃに対するプライマー対
ＯｓＣ−Ｆ：５’−ＡＴＧＴＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＡ−３’（配列番号２６）
ＯｓＣ−Ｒ：５’−ＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＴＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＴＧＡＧ−３’（配列番号２７）
【００３２】
３．Ｓｐｏ１１タンパク質の調製
上述の方法で構築した各Ｓｐｏ１１発現ベクターを大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株）に導入した。
形質転換した大腸菌を４ＬのＬＢ培地にてＯＤ６００＝０．４になるまで、３７℃で液体培養し、ＩＰＴＧを０．４ｍＭになるように加え、さらに、１５℃にて２４時間培養した。次に、培養した大腸菌を、遠心分離によって回収し、菌体１ｇ当たり２０ｍｌの５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭＮａＣｌに懸濁した。さらに、リゾチームを最終濃度０．６ｍｇ／ｍｌ、Ｂｒｉｊｉ５８を０．５％となるように加え、菌体の粘性が低下するまでソニケーションを行った（約３分程度）。その後、６０，０００×ｇ、３０分間、遠心分離を行い、その上清を回収した（図１）。回収された上清を、ＴＦのＮ末端に付随しているＨｉｓ−ｔａｇ（ｐＣｐｌｄＴＦに予めコードされている）を利用し、ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に通した。５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭＮａＣｌにてカラムの洗浄を行い、その後、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）、３００ｍＭＮａＣｌ、０〜１５０ｍＭイミダゾールによって、グラジエント溶出を行った。
目的サイズのタンパク質が溶出されているフラクションを、Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）カラムに通し、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）にて洗浄を行った。その後、０〜１ＭＮａＣｌグラジエント溶出を行った。
【００３３】
ＴＦとの融合体として、大腸菌内でタンパク質を発現させる場合、ＴＦのみの発現も生じるため、これを分離する必要がある。特に、Ｓｐｏ１１タンパク質との融合体を発現させる場合には、ＴＦのみの発現が顕著であったため、有効な分離手段を導入する必要があった。発明者らは、ＴＦのみのタンパク質とＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質の分離がヘパリンカラムによって有効に行われることを見出した。ヘパリンカラムクロマトグラフィーをグラジエント溶出により実施することで、ＴＦのみ又は不完全な融合タンパク質（大腸菌由来のプロテアーゼによって消化されたタンパク質などを含む）を有効に除去することに成功した（図２）。ＴＦのみのタンパク質は０．８Ｍ程度までに、ＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質はそれよりも高い塩濃度で溶出されることから（図３）、１．０Ｍ付近の塩濃度のグラジエントを緩やかにすることで（例えば、０．５〜１．２Ｍ、０．５〜１．０Ｍ、０．５〜０．９Ｍ、０．７Ｍ〜１．２Ｍ、０．７〜１．０Ｍ、０．７〜０．９Ｍなど）、より有効に夾雑タンパク質との分離が可能となる。
【００３４】
目的のタンパク質が溶出されているフラクションから溶液を回収し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０（ミリポア社）によって適量までタンパク質の濃縮を行った。その後、ゲル濾過クロマトグラフィーを行うために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）カラムに通し、目的タンパク質のフラクションを回収した。回収したタンパク質をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３０にて濃縮し、ＤＮＡ結合実験等に用いた。
【００３５】
４．ＤＮＡ結合実験
調製したＳｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合能について検討を行った。Ｓｐｏ１１タンパク質（０．４μｇ、０．８μｇ、１．２μｇ、図４参照）とＤＮＡ（ｐＵＣ１８、１００ｎｇ）とを反応液中（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  ＢＳＡ）で、３７℃、５分間反応させた後、アガロースゲル電気泳動を行った（図４）。その結果、Ｓｐｏ１１タンパク質が結合して、量依存的に上方にシフトしたＤＮＡのバンドを確認した（図４、レーン８〜１０）。一方、Ｓｐｏ１１タンパク質を欠いたＴＦのみを発現させた調製物では、バンドのシフトが起こらなかった（図４、レーン３〜５）。以上のことから、本発明の方法により調製したＳｐｏ１１タンパク質は可溶性の状態で取得することができ、かつ、ＤＮＡ結合能を保持していることが明らかとなった。
同様の結果は、Ｇａｌ４ＢＤ融合体として調製したＳｐｏ１１タンパク質でも確認することができた（図５、レーン１３〜１７）。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、ＤＮＡ結合能を有する可溶性のタンパク質として、初めて調製されたものである。Ｓｐｏ１１タンパク質は、減数分裂期相同ＤＮＡ組換えにおけるＤＮＡ二重鎖の切断過程において、重要な働きを行っていることから、本発明のＳｐｏ１１タンパク質を用いた作用メカニズムの解明により、高等動植物の減数分裂期相同ＤＮＡ組換えの人為的な制御方法を開発することが可能となる。さらに、本発明のＳｐｏ１１タンパク質は、ゲノムの特定部位や特定遺伝子を標的とした効率的な遺伝情報修飾技術の開発の促進に多大なる効果をもたらすものである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】各種ベクターを用いてＡｔｓｐｏ１１−１タンパク質を発現させた場合の可溶化状態を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ｐＥＴ１７ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＥＴ４４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）、ｐＣｏｌｄＩ（ＴａＫａＲａ社）及びｐＣｏｌｄＴＦ（ＴａＫａＲａ社）の各ベクターを使用した。Ｓは遠心後の上清、Ｐは遠心後の沈殿を表し、矢印がＳｐｏ１１タンパク質のバンドを示す。
【図２】ＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１−１タンパク質の精製プロファイルを示す。ｐＣｏｌｄＴＦベクターを用いてＡｔＳｐｏ１１−１を発現させ、各精製過程のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認を行った。Ｓは遠心上清、Ｐは遠心沈殿を表す。Ｈｉｓ−ｔａｇは、ＴＡＬＯＮ  ＣｅｌｌＴｈｒｕ  Ｒｅｓｉｎカラム、ＨｅｐａｒｉｎはＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて精製したことを表す。
【図３】図３は、ヘパリンカラムクロマトグラフィーによるＴＦのみのタンパク質とＴＦ−Ｓｐｏ１１タンパク質の分離プロファイルを示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】ＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１タンパク質のＤＮＡ結合性を確認したゲルシフトアッセイの結果を示す。レーン２〜５は、ＴＦタンパク質を、レーン７〜１０はＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１タンパク質を用いて実験を行った結果である。レーン１，６：マーカー、レーン２，７：タンパク質なし、レーン３，８：タンパク質０．４μｇ、レーン４，９：タンパク質０．８μｇ、レーン５，１０：タンパク質１．２μｇ。
【図５】ＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１−１及びＴＦ−Ｇａｌ４ＢＤ−ＡｔＳｐｏ１１−１タンパク質のＤＮＡ結合性を確認した結果を示す。レーン３〜７は、ＴＦタンパク質を、レーン８〜１２はＴＦ−ＡｔＳｐｏ１１タンパク質を、レーン１３〜１７はＴＦ−Ｇａｌ４ＢＤ−ＡｔＳｐｏ１１−１タンパク質を用いて実験を行った結果である。レーン１：マーカー、レーン２：タンパク質なし、レーン３，８，１３：タンパク質０．４μｇ、レーン４，９，１４：タンパク質０．８μｇ、レーン５，１０，１５：タンパク質１．２μｇ。
【図１】
2008189556.tif 000003
【図２】
2008189556.tif 000004
【図３】
2008189556.tif 000005
【図４】
2008189556.tif 000006
【図５】
2008189556.tif 000007
【配列表】
2008189556000001.app