(57)【要約】【課題】ＤＮＡを含む細胞からＲＮＡを抽出する際に、細胞由来のＤＮＡを含まない、精度の高いＲＮＡの抽出方法を提供する。【解決手段】ＤＮＡを含む細胞からＲＮＡを抽出する方法であって、ＲＮＡの抽出過程において、ＤＮＡを含む核酸含有物を添加することを特徴とする、ＲＮＡの抽出方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを含む細胞からＲＮＡを抽出する方法であって、
ＲＮＡの抽出過程において、ＤＮＡを含む核酸含有物を添加することを特徴とする、ＲＮＡの抽出方法。
【請求項２】
前記核酸含有物が、ＲＮＡ抽出後に行う逆転写反応の基質となるＤＮＡを含むことを特徴とする、請求項１に記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項３】
前記基質となるＤＮＡが、ＲＮＡ抽出後に行う逆転写反応のプライマーであることを特徴とする、請求項２に記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項４】
前記逆転写反応のプライマーが、鎖長５から９の範囲のランダムプライマーであることを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項５】
前記逆転写反応のプライマーが、下記配列を有するプライマーを含むことを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡの抽出方法。
5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号:１）
【請求項６】
前記逆転写反応のプライマーが、遺伝子特異的プライマーを含むことを特徴とする請求項３に記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項７】
添加するＤＮＡが、放射性同位体または蛍光物質により標識されていることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡの抽出方法がＡＧＰＣ法であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡの抽出方法がシリカメンブレン法であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡの抽出方法が陰イオン交換法であることを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載のＲＮＡの抽出方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡの抽出方法がアフィニティ精製法であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のＲＮＡの抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞等からのＲＮＡの抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な解析技術の進歩により、生物の分子レベルの機能解明が進んでいる。なかでも疾病に関わる現象については、その解明による効果が大きいことから、積極的に取り組みがなされている。生物をつかさどる物質は様々であり、核酸、タンパク質、糖、ホルモンなど多岐にわたっているが、なかでもＤＮＡやｍＲＮＡなどの核酸については研究が進み、様々な疾病との関連が解明されている。
【０００３】
たとえば重要な疾病の一つである「がん」についても様々な研究が行われており、特定の遺伝子のｍＲＮＡの発現量ががん細胞と正常細胞とで異なることを利用して、ｍＲＮＡを定量することで微少量のがん細胞を検出する手法などが考案されている。
【０００４】
また、核酸の分析方法は近年進歩が著しく、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＧｅｎｅＣｈｉｐに代表されるように、微量のｍＲＮＡであっても厳密に分析できるようになっている。それにより、微量なｍＲＮＡの有無や量を知ることができることはもちろんのこと、これまで知られていなかった遺伝子の存在も知られるようになってきている。
【０００５】
ｍＲＮＡの解析を行う上で重要なことは、提供される検体からのｍＲＮＡの抽出である。検体とは多くの場合、組織片や細胞浮遊液であるが、遠心分離、ホモジナイズ等により検体中のｍＲＮＡ成分を抽出している。いずれの場合であっても、壁を有する細胞の状態で検体は提供されることが多いため、細胞中のＲＮＡ成分を抽出するためには、細胞壁を破砕し、細胞壁内に含有するＲＮＡまたはｍＲＮＡを抽出する必要がある。
【０００６】
ところで、ＲＮＡはＲＮＡ分解酵素にさらされると急速に分解される。ＲＮＡ分解酵素は実験環境においても比較的多くの場所に存在するため、ＲＮＡの抽出作業には注意を必要とする。ＲＮａｓｅフリーもしくは不活性化してある抽出キットもしくは専用の抽出試薬が様々なメーカーから供給されており、一般的にはそれらを利用してＲＮＡの抽出および精製を行う。これらのキット類を使用することによって、微量のｍＲＮＡも収率を下げることなく高い収率で回収を行うことができる。
【０００７】
多くのＲＮＡ回収方法が知られている。ＡＧＰＣ法、シリカメンブレン法、陰イオン交換法、アフィニティ精製法などが一般によく知られている。ＡＧＰＣ法は、例えば非特許文献１に詳しい記載があるが、その概要は以下の通りである。（１）細胞等の生物材料に、グアニジンチオシアン酸塩、フェノール、クロロホルムを含む溶液を添加して細胞膜や細胞壁を破壊し、含有するタンパク質を変性させ、ＤＮＡを有機溶媒相へ抽出する。（２）遠心分離により、ＲＮＡが含まれる水相のみを回収する。（３）水相にエタノール又はイソプロパノールを添加することにより、ＲＮＡを析出させる（エタノール沈殿またはイソプロパノール沈殿）。（４）さらに遠心分離によってＲＮＡのみを分離する。
【０００８】
シリカメンブレン法について技術の詳細は、例えば特許文献１に記載がある。細胞などの生物材料から核酸を一段階で抽出することが可能なうえ、溶出液として水またはＴＥバッファーなど低濃度の緩衝液を使用する。従ってエタノール沈殿法などの脱塩、濃縮のための操作を経ることなく、抽出した核酸を直ちに後の解析に直接使用することができる特徴を有している。
【特許文献１】特開平２−２８９５９６号公報
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６２，１５６−１５９(１９８７)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
すでに述べたように、発現解析をはじめとした核酸解析技術の進歩は著しく、例えば癌細胞のメカニズム解明などにおいても多くのことがわかってきた。特に、これまではその存在量の少なさのために注目されていなかった遺伝子でも、癌のキャラクタリゼーションや正常細胞との区別をするために重要な遺伝子であることがわかってきている。
【００１０】
通常、ｍＲＮＡを測定するためには、酵素による逆転写反応等を行い、一本鎖ＤＮＡを合成したのち、その配列や含有量を定量ＰＣＲなどの分子生物学の技法を用いて測定することが多い。ＲＮＡはＲＮＡ分解酵素により速やかに分解されてしまうことや、ＰＣＲあるいはｃＲＮＡ合成を行う上でも、逆転写を経る方が良いというのが、その理由である。
【００１１】
微少量のｍＲＮＡを測定対象とする場合、細胞に由来するＤＮＡの混入は絶対に避けなければならない。なぜなら、ｍＲＮＡはＤＮＡからの転写により合成されており、ｍＲＮＡの各部分配列はＤＮＡ中に少なくとも１コピーは存在するからである。
【００１２】
背景技術に記載したＲＮＡ抽出法もＤＮＡの混入を防ぐための工夫はされている。ＡＧＰＣ法では有機相と水相の液量比やｐＨ値の制御を厳密におこなっている。シリカメンブレン法でもカラム洗浄を繰り返すなどの工夫がされている。しかし、これらの手法を用いても物性が類似しているＤＮＡを完全に除去することは困難である。混入したＤＮＡを除去するためにＤＮＡ分解酵素（ＤＮａｓｅ）などによる処理を追加することもあるが、操作が煩雑な上、ＲＮＡの回収率を低下させることにもなりかねない。また、ＤＮＡ分解酵素自体の精製度が低く、ＲＮＡ分解酵素が含まれていることもあるため、特に微少量のｍＲＮＡの抽出には不向きである。
【００１３】
したがって、細胞由来のＤＮＡを含まない、精度の高いＲＮＡの抽出方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために研究を重ねた結果、細胞からの抽出過程において、細胞に由来しないＤＮＡ含有物を添加することにより、細胞由来のＤＮＡ成分の混入を大幅に低減できることを見出した。
【００１５】
ＲＮＡとＤＮＡの混合物からＲＮＡを精製（抽出）する工程においては、ＤＮＡとＲＮＡの物理的性質の差を利用し、溶液中や担体表面にＲＮＡだけが残るような条件を設定する。しかしながら、ＤＮＡを排除する（ＤＮＡが存在しない）ような条件であっても、ＤＮＡを完全に排除できるわけではなく、ごく微量ではあるが、一定量のＤＮＡの溶解または吸着は避けられない。
【００１６】
そこで、無害なＤＮＡを添加することにより全ＤＮＡの絶対量を増やし、相対的に細胞由来のＤＮＡの比率を下げ、「一定量」中の細胞由来ＤＮＡの絶対量を低減させるというのが本発明である。即ち、わずかながら混入してしまうＤＮＡを、無害なＤＮＡ（細胞由来ではないＤＮＡ）とするために、細胞由来ではない全く異なるＤＮＡで置換してしまうというのが本発明のメカニズムである。
【００１７】
したがって、本発明によるＲＮＡの抽出方法は、細胞由来のＤＮＡおよびその他の夾雑物を含む混合物からのＲＮＡの抽出方法であり、抽出対象であるＲＮＡの精製時に、ＤＮＡを主成分とする核酸混合物を添加することを特徴とするＲＮＡの抽出方法である。
【００１８】
本発明のＲＮＡの抽出方法は細胞由来のＤＮＡおよびその他の夾雑物を含む混合物からのＲＮＡの抽出方法であり、ＲＮＡ抽出後に行う逆転写反応において用いる基質またはプライマーＤＮＡを、ＲＮＡ抽出工程において添加することを特徴とするＲＮＡの抽出方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、組織片や細胞からのＲＮＡ抽出時に、細胞由来ＤＮＡ成分の混入を限りなくゼロにすることができるＲＮＡの抽出方法を提供することができた。本発明によるＲＮＡの精製方法は、測定対象のサンプルに含まれるＤＮＡの混入を防ぐことができるため、わずかなＤＮＡの混入が大きく定量性を損なう微少量のｍＲＮＡを測定対象とすることができる。癌細胞などの検出や解析においては、わずかなｍＲＮＡの有無により検出や解析（診断）が行われることがあるが、細胞中に含まれる微少量のｍＲＮＡを精度よく検出することで、質の高い診断や分析が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明を利用してＲＮＡ抽出することができる生物試料としては、ＲＮＡを含むものであればいずれの生物試料も用いることが可能である。すなわち、ヒトを含む動物から採取した組織切片、細胞が浮遊する細胞浮遊液やそれらを凝集したペレット、人工的に培養した細胞などを挙げることができ、それらは液状、固体状いずれの形態でもよい。また、細菌、植物、ウィルスなど動物組織以外の生物試料からのＲＮＡ抽出においても適用することができる。また、ＲＮＡ抽出対象の生物試料以外の夾雑物が混入していても、何ら障害なく本発明のＲＮＡ抽出方法が適用可能である。例えば、白血球や赤血球を含む、全血や血清、唾液、尿、精液なども適用可能である。
【００２１】
細胞などからのＲＮＡの抽出は、通常、ＤＮＡやタンパク質、脂質などの混入があるため、各種のＲＮＡ抽出方法が採用されている。代表的な手法としては、ｐＨのコントロールにより有機溶媒にＤＮＡを抽出するＡＧＰＣ法、シリカゲルなどの担体にＲＮＡを吸着させ、細胞由来ＤＮＡを含む不要な成分を除去するシリカメンブレン法などである。
【００２２】
ＡＧＰＣ法は、細胞壁などの破砕とＲＮＡ分解酵素の失活のため、グアニジンチオシアネートの溶液を加えた後、２Ｍの酢酸ナトリウム、水飽和した平衡酸性フェノール、クロロホルムを加え遠心分離する。その結果、中間相を除いて２相に分かれた液体の水相にＲＮＡ、有機相にＤＮＡを抽出する。
【００２３】
本発明のＤＮＡ含有物は水溶液の状態で添加するのが好ましく、ＲＮＡ抽出工程のいずれの段階においても添加することが可能である。水相中に含まれる細胞由来のＤＮＡを置換する効率が大きい方が、本発明による細胞由来ＤＮＡの除去効果は大きいので、できるだけ早い工程においてＤＮＡを添加することが好ましく、グアニジンチオシアネートの溶液を加える前にサンプルに直接添加することが好ましい。
【００２４】
添加するＤＮＡ溶液の量および濃度は特に制限はないが、予め抽出試薬等を準備している場合には、その抽出精度に影響を与えない範囲で液量を調整することが望ましい。一般的に抽出試薬はＲＮＡが純度良く抽出できるように最適化されているため、添加する核酸含有液の液量、すなわち水の持込量をできるだけ少なくした方が、影響が少ない。
【００２５】
添加するＤＮＡとしては、抽出したＲＮＡの利用（測定、定量、解析）において影響の少ない配列であればいかなるＤＮＡでも利用可能である。合成されたＤＮＡであっても、また天然、非天然のＤＮＡであってもよい。例えば、アデニンのポリマーであるＰｏｌｙ−ＡやチミンのポリマーであるＰｏｌｙ−Ｔは本発明に用いる核酸として利用可能である。また、抽出しようとするＲＮＡの生物種とは異なる生物種を利用することも可能であり、その場合、抽出したＲＮＡの用途に応じて障害となるＤＮＡが含まれない核酸含有物であれば用いることができる。
【００２６】
また、発現解析などを目的としてｍＲＮＡを抽出する場合には、抽出したＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成したり、あるいはプロモーター配列を有するｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡをテンプレートとしたｃＲＮＡ合成を行ったりすることもある。このような場合には、逆転写反応の工程において、反応に必要なＤＮＡを使用するが、そこで用いるＤＮＡを本発明の核酸含有物の一部もしくは全部として用いることも可能である。例えば、インビトロジェン社が市販しているＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔシリーズの逆転写酵素などでは、逆転写用のプライマーとして、１２から１８ｍｅｒのオリゴｄＴや、５ｍｅｒから９ｍｅｒのランダムプライマーの使用が推奨されている。この場合、それらのＤＮＡを本発明のＲＮＡ抽出時の添加ＤＮＡとして使用することが可能である。また、ｃＲＮＡ合成を行う場合には合成するｃＤＮＡにプロモーター配列が必要となるため、逆転写反応時にプロモーター配列を有するプライマーを用いることが多い。プロモーターの種類としては様々なものが知られているが、主なプロモーターとしてＳＰ６、Ｔ７、Ｔ３などが挙げられる。なかでもＴ７プロモーターは広く利用されており、この為のプライマーとして下記のプライマーが逆転写反応に使用される。
5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'（配列番号:１）
【００２７】
本発明によるＲＮＡの抽出においても、上記配列番号１のＤＮＡを使用することが可能である。
【００２８】
また、遺伝子特異的なプライマーにより逆転写を行う場合には、それらのプライマーを添加するＤＮＡとして用いることもできる。
【００２９】
ＲＮＡ抽出後に逆転写反応を行い、その際、蛍光色素や放射線同位体などで直接標識する場合には、添加するＤＮＡにそれらの標識をしておくことも可能である。
【００３０】
ＡＧＰＣ法及び同じ原理による抽出は広く利用されており、関連する試薬やキットも多く市販されている。ニッポンジーン社から市販されているＩＳＯＧＥＮは広く利用されているキットである。同キットを使用する場合においても、本発明のＲＮＡ抽出法を適用することは可能であり、細胞や組織片に対してＩＳＯＧＥＮを添加する際に、本発明のＤＮＡ溶液を予め添加しておく事が好ましい。この場合、ＩＳＯＧＥＮの液組成を著しく変えないようなるべく少量の液量でＤＮＡを添加することが好ましい。
【００３１】
また、より精製度の高いＲＮＡの抽出を行う場合には、１回目の抽出で得られたＲＮＡをサンプルとして、複数回のＲＮＡ抽出を施すこともあるが、本発明のＲＮＡ抽出は、いずれの状況でも適用することが可能である。
【００３２】
ＡＧＰＣ法以外のＲＮＡ抽出においても本発明によるＲＮＡ抽出は適用可能である。シリカメンブレン法は、キアゲン社やアジレント社などから同法を利用したキットが市販されている。シリカメンブレン法はイオン条件制御下でのシリカゲルメンブレンへの選択的な吸着メカニズムを利用したＲＮＡの抽出方法である。塩濃度の違いによりＤＮＡとＲＮＡの選択を行うため、厳密には抽出ＲＮＡへの細胞由来ＤＮＡ由来の混入が避けられない。本発明によるＲＮＡ抽出方法は、細胞由来ゲノムを含む夾雑物に対し、障害とならないＤＮＡを添加することによりゲノム由来のＤＮＡの混入を防ぐ事ができる。
【００３３】
シリカメンブレン法において本発明のＲＮＡ抽出法を用いる場合には、サンプルをアプライする前のシリカメンブレンに対し、事前にＤＮＡを添加する方法も効果的である。すなわち、事前にシリカメンブレンにＤＮＡをアプライすることにより、物理的な吸着や結合を添加したＤＮＡにより飽和させることができるためである。
【００３４】
ＡＧＰＣ法、シリカメンブレン法以外に、陰イオン交換法、アフィニティ精製法などにも本発明によるＲＮＡの抽出方法が利用できる。いずれの抽出方法も、対象とする検体に対し本発明で適用可能なＤＮＡを添加することにより、細胞由来ＤＮＡの混入を大幅に低減することが可能である。また、シリカメンブレン法と同様に、抽出精製用の担体が存在する場合には、事前に担体にＤＮＡをアプライしておくほうがより効果的であり、ＲＮＡの利用において障害となる細胞由来のＤＮＡの混入を避けることができる。
【００３５】
シリカメンブレン法、陰イオン交換法、アフィニティ精製法などＡＧＰＣ法以外のＲＮＡ抽出法においても、添加するＤＮＡの種類はＡＧＰＣ法と同様に各種のＤＮＡの選択が可能である。また、標識されたＤＮＡ、逆転写反応用プライマーなども好適に用いることができる。
【実施例】
【００３６】
以下具体的な実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。
【００３７】
＜実施例１＞
（１）細胞からのｔｏｔａｌ ＲＮＡ回収とｃＤＮＡの調製
（１−１）ＩＳＯＧＥＮ（ＡＧＰＣ法）によるｔｏｔａｌ ＲＮＡの回収
ヒト胃より採取された胃がん由来細胞株(セルライン) ＫＡＴＯ ＩＩＩを入手して、定法に従って培養を行い、約１×１０5個の培養細胞を得た。得られた培養細胞は遠心分離を行い、ペレット状にし、上ずみを除去して細胞を回収した。
【００３８】
続いて、下記の塩基配列を有するＤＮＡを合成した。通常の方法に従って合成し、ＨＰＬＣ精製した後、最終濃度が１００μＭの濃度となるように水に溶解した。
5'GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3'(配列番号:１)
得られたＤＮＡ溶液の５０μｌを、ペレット状に回収した細胞に添加した。
【００３９】
続いてニッポンジーン社製ＲＮＡ抽出キット「ＩＳＯＧＥＮ」を用い、ＩＳＯＧＥＮ ５００μｌを加えてペレットを懸濁させた。攪拌装置等を用いて充分懸濁させた後、室温にて５分間放置した。
【００４０】
次に、１００μｌのクロロホルムを加え再びよく攪拌した後、数分間室温で静置した。
【００４１】
４℃に設定した微量高速遠心器を用いて、１２０００ｇで１５分間遠心し、上部にたまった水相成分を回収した。回収は、フェノール相と水相の中間部分を取らないよう注意して行った。
【００４２】
回収された水相成分を別のチューブに移し、そのチューブにイソプロパノール５００μｌを添加した。イソプロパノールにて軽くペレットをリンスしたのち、約１０分間室温で静置し、４℃に設定した微量高速遠心器を用いて１２０００ｇで１０分間遠心した。
【００４３】
チューブ底部に沈殿したペレット成分を吸引しないよう注意して、上部のイソプロパノールを吸引除去し、７０％の濃度に調製したエタノールを５００μｌ添加した。イソプロパノールと同様、エタノール溶液にて軽くペレットをリンスし、４℃に設定した微量高速遠心器を用いて７５００ｇで５分間遠心した。チューブ底部に沈殿したペレット成分を吸引しないよう注意して、上部のエタノールを除去し、軽く風乾した。
【００４４】
（１−２）ｃＤＮＡの合成
得られたｔｏｔａｌ ＲＮＡのうち０．２μｇを、インビトロジェン社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Synthesisを用いて、Ｔ７プロモーター配列を有するプライマー(配列番号１の核酸と同じ)による逆転写を行った。具体的には下記の方法で行った。なお、反応は最終液量が２０μｌとなるように調製した。
【００４５】
１１μlの液量としたｔｏｔａｌ ＲＮＡ ０．２μｇにＴ７プロモーター配列を有するプライマー（１００μＭ）１μｌを加え、７０℃で１０分間熱変性させた。急冷後、キットに添付の５×バッファー４μｌ、０．１ＭのＤＴＴ ２μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ １μｌを加えたのち、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴを１μｌ加え、４２℃で１時間インキュベートした。１時間後、急冷し１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ溶液約２０μlを回収した。
【００４６】
（１−３）逆転写(２ｎｄ ｓｔｒａｎｄの合成)
得られた１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ溶液約２０μl全量を、精製せずにＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Synthesisのマニュアルに従って２ｎｄ ｓｔｒａｎｄ合成した。具体的には、５×バッファー ３０μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ Ｍｉｘ ３μｌ、ＤＮＡリガーゼ １μｌ（１０ユニット)、ＤＮＡポリメラーゼＩ ４
μｌ（４０ユニット）、ＲＮａｓｅＨ １μｌ（２ユニット）を加えたのち、１６℃で２時間反応させた。これにより得られた二本鎖ｃＤＮＡは、末端が平滑化されていないため、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ ２μｌ（１０ユニット）により平滑化処理した。
【００４７】
得られた二本鎖ｃＤＮＡは、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出精製し、フェーズロックゲルにて核酸成分を精製した。得られたｃＤＮＡは適当量の水に溶解し、吸光度測定により純度と収量を測定した。
【００４８】
（２）定量ＰＣＲによる発現量定量
得られた二本鎖ｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲにより含まれる遺伝子の発現量を測定した。測定対象はＣＥＡとＣＣＬ５の各遺伝子とした。
【００４９】
定量ＰＣＲのシステムは、アプライドバイオシステム社から提供されている７５００ＲｅａｌＴｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを利用した。
【００５０】
各遺伝子を定量するために、ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを利用した。測定用のプローブはアプライド社から提供されている調製済みのプローブを使用した。具体的には、ＣＥＡ測定用としてＨｓ００２３７０７５、ＣＣＬ５用としてＨｓ００１７４５７５を用いた。
【００５１】
ＰＣＲは２０ｎｇのテンプレートを用い、液量は５０μｌのスケールで行った。ＰＣＲ用のＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘとして、ＴａｑＭａｎ ２× Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＮＯ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧを使用した。
ＰＣＲのサイクルは下記表１の２段階 ＰＣＲサイクルで行った。
【００５２】
【表１】
2008086283.tif 000002
【００５３】
解析は上記定量ＰＣＲシステムに付属する解析ソフトにより行い、ＰＣＲ産物の量に応じて高くなるソフト上の数値であるＤｅｌｔａ Ｒｎの値が、０．１を上回った時のサイクル数をＣｔ値として定義し、各遺伝子の定量を行った。
ＣＥＡおよびＣＣＬ５のＣｔ値を下記表２に示す。
【００５４】
【表２】
2008086283.tif 000003
【００５５】
この結果から、本実施例でサンプルとしたＫＡＴＯＩＩＩは、ＣＥＡが一定の発現を示すことがわかり、ＣＣＬ５の発現が全く無いこと（測定感度以下）がわかった。各種報告されているデータベースから、ＫＡＴＯＩＩＩではＣＣＬの発現はほぼゼロであることが知られている。したがって、この結果から、ＲＮＡ由来ではなく細胞が有するＤＮＡ由来のノイズが出ていないこと、すなわちＤＮＡの混入がゼロであることが示された。
【００５６】
＜比較例１＞
実施例１と同様の実験を、Ｔ７プライマーの添加をすることなく行った。すなわち、ＩＳＯＧＥＮ処理を行う前のＴ７プライマーの添加を行わず、通常通りの処理方法に従ってＲＮＡ抽出を行った。
【００５７】
Ｔ７プライマーを添加しない以外は、ｔｏｔａｌ ＲＮＡの抽出、二本鎖ｃＤＮＡの合成までは実施例１と同様に行った。また、定量ＰＣＲについてもアプライドバイオシステム社の同様のシステムにより行った。測定されたＣｔ値を下記表３に示す。
【００５８】
【表３】
2008086283.tif 000004
【００５９】
この結果から、Ｔ７プライマー処理を施さないＲＮＡ抽出物はＣＣＬ５の発現が示された。既に述べたとおり、ＫＡＴＯＩＩＩではＣＣＬの発現はほぼゼロであることが知られている。従って本比較例１で示されたＣＣＬ５の発現はＤＮＡ由来のシグナルである可能性が高いと考えられる。
【配列表】
2008086283000001.app