(57)【要約】【課題】  本発明は、細胞培養液の中から簡便に必要細胞を洗浄、回収する方法、及び該方法に使用するフィルター、該方法によって調製される細胞組成物を提供する。【解決手段】  目的とする細胞を捕捉し、その他夾雑物を通過させるフィルターを見出した。これによって遠心操作を伴わずに洗浄を行うことが可能となり、簡便に目的細胞を洗浄、回収することが出来る。【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養液から、すくなくとも培養細胞をフィルターに捕捉する工程、捕捉した培養細胞を回収する工程、以上の順序で行われる細胞回収方法。
【請求項２】
請求項１記載のフィルターが、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル、ナイロン、ポリウレタンなどの少なくとも１種より選択される合成高分子よりなることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項３】
請求項１記載のフィルターが、ポリエステルおよびポリプロピレン、またはレーヨンおよびポリオレフィン、またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンなどの合成高分子の組み合わせからなることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項４】
必要とする細胞を回収する工程として、細胞培養液を通液した方向と逆方法に回収液を通液することを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の細胞回収方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のフィルターが、不織布であることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項６】
請求項５記載の不織布の繊維径が３〜４０μｍであることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載したフィルターの目開きの短径が３μｍ以上で、かつ長径が１２０μｍ以下であることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の細胞が、コロニー形成細胞であることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項９】
請求項８記載のコロニー形成細胞が接着性であることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の細胞が、酵素処理で回収したものであることを特徴とする細胞回収方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞回収方法に用いるためのフィルター。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞回収方法によって調製される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を含む細胞培養液の中から、培養細胞を洗浄、回収する方法及び該方法に用いるフィルターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者本人または提供者の体液や組織から細胞を採取し、それらを培養にて増幅・加工して患部へ移植する治療、いわゆる再生医療・細胞医療が注目を集めている。既に、皮膚、骨、軟骨、角膜などの臓器では一部の疾患においてその安全性と有効性が示されており、患者に有益な治療方法として、普及が待望されている（非特許文献１）。
【０００３】
再生医療・細胞医療において多くの場合、体液や組織から採取した細胞から治療に有効な細胞数を得るために、培養による細胞増幅が実施されている。
【０００４】
培養により増幅された細胞は回収され、治療のため患者に移植されたり、更なる増幅の必要があれば繰り返し培養されたのち患者に移植されたりする。
【０００５】
患者への移植ならびに繰り返し培養するには、血清、成長因子などの培養液由来する物質、細胞由来のデブリス、および老廃物などを培養細胞から分離する必要があり、本目的のために遠心分離による培養細胞の回収及び洗浄が実施されている。
【０００６】
間葉系幹細胞に代表される接着性細胞においては、細胞培養液からの培養細胞の回収の際に、酵素、キレート剤などの処理により、培養細胞を細胞培養器から剥離する必要があり、培養細胞の移植又は繰り返し細胞培養をするにあたっては、当然のことながら、これら酵素、キレート剤などを、培養細胞より分離、除去する必要がある。
【０００７】
前述した遠心分離などによる培養細胞分離方法においては、その操作が煩雑であり、また、閉鎖系での分離操作が容易でないことより、細胞処理工程におけるコンタミネーションのリスクが指摘されている。
【非特許文献１】Robert  P.  Lanza  ：  再生医学  ティッシュエンジニアリン                    グの基礎から最先端技術まで（２００２年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞を含む細胞培養液の中から、簡便に培養細胞を洗浄、回収する方法、及び該方法に使用するフィルター、該方法によって調製される細胞組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、細胞を含む細胞培養液の中から、簡便に培養細胞を洗浄、回収する方法、及び該方法に使用するフィルター、該方法によって調製される細胞組成物を見出した。よって、本発明が提供するのは以下の通りである：
[１]
細胞培養液から、すくなくとも培養細胞をフィルターに捕捉する工程、捕捉した培養細胞を回収する工程、以上の順序で行われる細胞回収方法。
[２]
[１]記載のフィルターが、ポリエステル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル、ナイロン、ポリウレタンなどの少なくとも１種より選択される合成高分子よりなることを特徴とする細胞回収方法。
[３]
[１]記載のフィルターが、ポリエステルおよびポリプロピレン、またはレーヨンおよびポリオレフィン、またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンなどの合成高分子の組み合わせからなることを特徴とする細胞回収方法。
[４]
必要とする細胞を回収する工程として、細胞培養液を通液した方向と逆方法に回収液を通液することを特徴とする請求項[１]〜[３]いずれかに記載の細胞回収方法。
[５]
[１]〜[４]のいずれかに記載のフィルターが、不織布であることを特徴とする細胞回収方法。
[６]
[５]記載の不織布の繊維径が３〜４０μｍであることを特徴とする細胞回収方法。
[７]
[１]〜[６]のいずれかに記載したフィルターの目開きの短径が３μｍ以上で、かつ長径が１２０μｍ以下であることを特徴とする細胞回収方法。
[８]
[１]〜[７]のいずれかに記載の細胞が、コロニー形成細胞であることを特徴とする細胞回収方法。
[９]
[８]記載のコロニー形成細胞が接着性であることを特徴とする細胞回収方法。
[１０]
[８]または[９]に記載の細胞が、酵素処理で回収したものであることを特徴とする細胞回収方法。
[１１]
[１]〜[１０]のいずれかに記載の細胞回収方法に用いるためのフィルター。
[１２]
[１]〜[１０]のいずれかに記載の細胞回収方法によって調製される組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明について、以下具体的に説明する。
【００１１】
本発明における細胞とは、動物の体液や組織から採取した細胞、人工的に癌化させた株化細胞、さらにはこれら細胞を生体外で培養したもの等を指すが、好ましくはヒトの体液や組織から採取した細胞を培養したもの、より好ましくはヒトの骨髄液、血液（末梢血、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血等を含む）、臍帯血液、脂肪組織等から採取した細胞を培養したものを指す。
【００１２】
中でもヒトの骨髄液、血液、臍帯血液、脂肪組織等から採取し、培養したコロニー形成細胞が好ましく、ヒトの骨髄液、血液、臍帯血液、脂肪組織等から採取し、培養した接着性のコロニー形成細胞がより好ましく、ヒトの骨髄液、血液、臍帯血液、脂肪組織等から採取し、培養した間葉系幹細胞が最も好ましい。
【００１３】
本発明におけるコロニー形成細胞とは、生体外で任意条件の下培養すると、コロニーを形成する細胞を指す。例としては、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞等が挙げられるが、この限りではない。
【００１４】
接着性のコロニー形成細胞とは、該細胞が増殖していく際に、任意の足場に接着して増殖していく細胞を指す。例としては、血管内皮前駆細胞、間葉系幹細胞等が挙げられるが、この限りではない。
【００１５】
本発明における細胞培養液とは、水性液体であり、好ましくは緩衝液、生理食塩水、培養培地等が挙げられるが、この限りではない。
【００１６】
また、細胞を含んだ細胞培養液とは、細胞が液体中に懸濁されている任意の水性液体を意味する。
【００１７】
培養細胞が非接着性である場合、培養中の細胞培養液そのままであっても良く、ピペッティングを行った後の細胞培養液であっても良い。
【００１８】
培養細胞が接着性である場合、ピペッティングやセルスクレイパー等、細胞を物理的に剥離させた後の培養液であっても良く、トリプシン、コラゲナーゼ、ディスパーゼ等のタンパク質分解酵素、ＥＤＴＡ、クエン酸等のキレート剤等の処理によって細胞を剥離させた後の酵素液等、及びその酵素液を含む培養液であっても良い。
【００１９】
本発明におけるフィルターとは、培養細胞を捕捉し、不必要な夾雑物を通過させるものを指す。
【００２０】
ここでいう夾雑物とは、細胞培養液に含まれる目的細胞以外の微粒子、例えば、細胞の分解物、細胞由来の分泌物、培地成分、培養操作中に混入する微粒混入物、酵素、キレート剤、さらには目的細胞以外の細胞、例えば、赤血球、血小板、リンパ球等が挙げられる。
【００２１】
フィルターの材質は、ポリプロピレン、ポリエチレン、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリビニルアルコール、塩化ビニリデン、レーヨン、ビニロン、ポリスチレン、アクリル（ポリメチルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸エステルなど）、ナイロン、ポリウレタン、ポリイミド、アラミド、ポリアミド、キュプラ、ケブラー、カーボン、ポリアクリレート、フェノール、テトロン、パルプ、麻、セルロース、ケナフ、キチン、キトサン、ガラス、綿などの少なくとも１種より選択される材質が好ましく、より好ましくは、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル、レーヨン、ポリオレフィン、ビニロン、ポリエチレン、ナイロン、ポリウレタンなどの少なくとも１種より選択される合成高分子である。
【００２２】
２種以上の合成高分子を組み合わせる場合は、その組み合わせに特に限定はないが、ポリエステルおよびポリオレフィン、またはレーヨンおよびポリオレフィン、またはポリエステル、レーヨンおよびビニロンなどからなる組み合わせが挙げられる。
【００２３】
２種類以上の合成高分子を組み合わせる場合の繊維の形態としては、１本の繊維が異成分同士の合成高分子よりなる繊維、あるいは異成分同士が剥離分割した分割繊維でもよい。また、成分の異なる合成高分子単独よりなる繊維をそれぞれ複合化した形態でもよい。ここでいう複合化とは、特に限定はないが２種類以上の繊維が混在した状態より構成される形態、あるいは合成高分子単独よりなる形態をそれぞれ張り合わせたものなど挙げられるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２４】
また、フィルターの形状は、連通孔構造の多孔質体形状でも、繊維の集合体、織物などでも良いが、不織布であることがより好ましい。
【００２５】
フィルターの繊維径は、目的細胞の回収率から、３〜４０μｍが好ましい。３μｍより細いと白血球との相互作用が高まり、不用細胞の除去効率が低くなる。また４０μｍより太いと有効接触面積の低下やショートパスが起こりやすくなり、目的細胞の回収率の低下につながる。目的細胞とフィルターとの相互作用を上げ、収率を上げるためには、５μｍ〜３５μｍがより好ましい。さらに好ましくは５μｍから３０μｍである。
【００２６】
また、フィルターの目開きは、下記方法により求めることができる。フィルターを走査型電子顕微鏡にて写真撮影し、異なる２本以上の繊維が交差することにより形成される実質的な孔の長径、および短径を画像解析装置にて５０ポイント以上測定し、それぞれの平均値を求める。すなわち請求項記載の目開きの範囲とは、下限値が上記のようにして求めた短径の平均値を、上限値が長径の平均値を示す。なお、長径は実質的な孔の２点間の最長の距離を、短径は長径を求めた際の２点間の距離の中央値を通り、実質的に孔に接する最短の距離をいう。
【００２７】
本発明のフィルターの目開きは、目的細胞の捕捉性から短径が３μｍ以上で、長径が１２０μｍ以下であることが好ましい。３μｍより小さいと、夾雑物の除去効率が低下する恐れがある。また１２０μｍより大きいと目的細胞の捕捉が困難となる。赤血球等の比較的大きな夾雑物の除去効率から、より好ましくは、５μｍ〜８０μｍである。目的細胞の捕捉性から、さらに好ましくは、５μｍ〜３０μｍである。
【００２８】
フィルターの仕様形態は、球、コンテナ、カセット、バッグ、チューブ、カラム等、任意の形態をとりうるが、好ましい具体例としては、例えば、容量約０．１〜１０００ｍｌ程度、直径約０．１〜１５ｃｍ程度の透明または半透明の円柱状容器、あるいは一片の長さ０．１ｃｍ〜２０ｃｍ程度の正方形あるいは長方形で、厚みが０．１ｃｍ〜５ｃｍ程度の四角柱状の形態等が挙げられる。
【００２９】
また、フィルターは適切な大きさに切断した平板状で体液を処理してもよいし、またロール状に巻いた形状で体液の処理を行ってもよい。ロール状で使用する場合、該ロールの内側から外側に向け体液を処理することにより、必要細胞の捕捉を行ってもよいし、あるいはこの逆に、ロールの外側から内側に体液を流入させ、目的細胞の捕捉を行ってもよい。
【００３０】
以上、具体例を挙げたが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３１】
細胞培養液のフィルターへの通液は、細胞培養液をプールしたバッグなどから自然落下で通液してもよいし、細胞培養液を入れたシリンジを直接該フィルターが収納された容器に接続し、手でシリンジのプランジャーを押して体液を注入してもよい。またポンプなどを使用して送液してもよい。
【００３２】
また、この際の通液速度は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する被処理液の通過速度（線速）で表した時、０．１〜１，０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化し、１，０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと被処理液の流水圧により必要なコロニー形成細胞がフィルターに捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、０．５〜５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらにより好ましくは１〜２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
【００３３】
フィルターの洗浄は、例えば、細胞培養液を流した方向と同方向から洗浄液を流すことによって、フィルター中に溜まっている不要夾雑物をフィルターから通過させることが出来る。
【００３４】
ここで用いられる洗浄液は、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理的食塩液やリンゲル液など注射用剤として使用実績のあるものや、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等、細胞培養用の培地などが挙げられる。細胞への負の影響が小さいこと、医療用途に用いられている実績があることから、生理食塩水を用いることが好ましい。
【００３５】
この際の洗浄液を通液する速度は、特に限定されないが、フィルターの厚さに対する被処理液の通過速度（線速）で表した時、０．１〜１，０００ｍｍ／ｍｉｎの範囲にあることが好ましい。線速が０．１ｍｍ／ｍｉｎより低いと処理時間が長期化し、１，０００ｍｍ／ｍｉｎより高いと被処理液の流水圧により必要なコロニー形成細胞がフィルターに捕捉されにくくなる。より好ましい線速は、０．５〜５００ｍｍ／ｍｉｎであり、さらにより好ましくは１〜２５０ｍｍ／ｍｉｎである。
【００３６】
洗浄量は、フィルター容積により異なるが、夾雑物該フィルター容積の約１〜１００倍程度の体積で洗浄することが望ましく、治療用として人体に投与することを前提とした場合、夾雑物を極力除くために１０〜１００倍程度の体積で洗浄することが望ましい。
【００３７】
フィルターに捕捉された細胞の回収は、細胞培養液を流した方向とは逆方向から回収液を流すことにより、回収することができる。
【００３８】
この際、回収液を勢いよく流すと、捕捉細胞の回収率が上がる。このような方法として、例えば、回収液をシリンジに入れ、手でシリンジのプランジャーを勢いよく押す方法などが挙げられる。
【００３９】
回収液は、細胞に対して負の影響を与えない液体であれば特に限定されないが、具体例としては、生理的食塩液やリンゲル液など注射用剤として使用実績のあるものや、リン酸緩衝液等の緩衝液、αＭＥＭ培地やＤＭＥＭ培地等、細胞培養用の培地などが挙げられる。
【００４０】
また、フィルターに捕捉された細胞の回収率を上げるため、回収液の粘張度を上げてもよい。そのために上記回収液にアルブミン、フィブリノーゲン、グロブリン、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシエチルセルロースなどを添加することができる。本発明はこれに限定されるものではない。
【００４１】
回収液量及び流速は、フィルター容量により異なるが、フィルター容積の１〜１００倍量程度の細胞回収液を、０．５〜２０ｍｌ／ｓｅｃ程度で注入することが好ましいが、これに限定されるものではない。
【００４２】
回収後の細胞は、治療用の注入細胞画分として使用しても良く、継代培養として培養基材に播種しても良い。
【００４３】
本発明におけるフィルターは、単独で使用しても良く、自動培養装置において調製された細胞培養液を処理しても良く、自動培養装置と組み合わせて処理しても良い。
【００４４】
ここでいう自動培養装置とは、通常は手作業によっておこなう細胞培養操作の全部または一部を、機械または器具で代替することにより自動または半自動的に行うことを可能とした装置のことを指す。
【００４５】
ここでいう細胞培養操作とは、例えば培地の交換や細胞回収の操作等が挙げられる。
【００４６】
好ましい具体例としては、ＡａｓｔｒｏｍＲｅｐｌｉｃｅｌｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａａｓｔｒｏｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、また、特開２００４−３４４１２８、特開２００４−８９０９５、特開２００１−２７５６５９により開示されている培養装置等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
また、自動培養装置とフィルターとを組み合わせる場合、外気と閉鎖された系で組み合わせることが好ましく、コンタミネーションのリスクを軽減させるために完全閉鎖系で一連の工程を行えることが好ましい。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００４９】
（実施例１）
以下、ヒト骨髄液由来間葉系幹細胞を培養した後の洗浄、回収方法を示す。
【００５０】
レーヨンとポリオレフィンからなる不織布（目開き＝５〜４８μｍ）を１２枚積層し、該積層不織布の上下を外形１ｃｍ、内径７ｍｍ、高さ５ｍｍのストッパーにて挟み込むことにより固定した。
【００５１】
次に、ヒト骨髄液由来間葉系幹細胞を培養中の組織培養用フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ社製  Ｔ-７５組織培養用フラスコ）から培養液を除去し、リン酸緩衝液にてフラスコ内をリンスした。
【００５２】
リンス液を除去したフラスコへトリプシン-ＥＤＴＡ液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＧＩＢＣＯ社製）を３ｍｌ加え、３７℃条件下、５分間静置することによって細胞を剥離した。
【００５３】
さらに培地を７ｍｌ加え、撹拌することによって細胞培養液を調製した。
【００５４】
このときの細胞濃度を血球計算盤にて測定したところ、２×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった。また、この細胞培養液中に含まれるトリプシン濃度は３０％（ｖ／ｖ、上記ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ原液を１００％とした場合）であった。
【００５５】
この細胞培養液を、先程の不織布に０．５ｍｌ／ｍｉｎ（線速１３ｍｍ／ｍｉｎ）の速度で１ｍｌ通液した。ここで通過した液体中に細胞は存在しなかった。
【００５６】
次に、細胞培養液を通液した方向と同一方向に、生理食塩水を細胞培養液と同流速で１ｍｌ通液することで、不織布を洗浄した。
【００５７】
次に、細胞培養液を通液した方向と逆方向に、２ｍｌのα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）を勢い良く流すことにより、捕捉された細胞を回収した。回収された液体中の細胞濃度を血球計算盤にて測定し、以下の計算式によって細胞回収率を算出した。
【００５８】
細胞回収率＝（回収細胞濃度×回収液量）／（通液前細胞濃度×通液量）
その結果、細胞回収率は７３％であった。また、最終的に残存したトリプシンの濃度は、０．５％（ｖ／ｖ、上記ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ原液を１００％とした場合）であった。また、細胞培養液から必要細胞を洗浄、回収するまでに要した時間は、５分であった。
【００５９】
（比較例１）
実施例１と同様の方法で細胞培養液を調製した。１ｍｌの細胞培養液を１４００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ遠心処理（遠心機 : ＫＵＢＯＴＡ５９００、ローター : ＲＳ−７２０Ｍ）し、上清をピペットにて除き、２ｍｌのα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）にて再懸濁した。この際の細胞回収率は７０％であった。また、最終的に残存したトリプシンの濃度は３％（ｖ／ｖ、上記ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ原液を１００％とした場合）であった。また、細胞培養液から必要細胞を洗浄、回収するまでに要した時間は、１５分であった。