(57)【要約】      （修正有）【課題】ＷＷドメインあるいは機能上それと同等なものを有するポリペプチドの同定、単離およびこれらのポリペプチドの様々な利用方法を提供する。また、ＷＷドメインに結合する様々なペプチド認識単位をも提供する。【解決手段】ＷＷドメインを有する新規ポリペプチド、それをコードするＤＮＡ配列。これらポリペプチドを配列非依存的（すなわち、探索されるポリペプチドの一次配列に非依存的）手段で同定する方法および認識単位に基づいた機能的スクリーニング方法の提供。当該方法および同定されたポリペプチドの多様な適用が、薬剤発見、修飾および精練のための検定キットに使用できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の容器中に：
（ａ）ＷＷドメインを含む精製ポリペプチド；および
（ｂ）前記ポリペプチド中の前記ＷＷドメインに対し選択的結合親和性を有する精製認識単位を含む検定キット。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、配列番号３０−３８、４６、４８、５０および１２６−１２９からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む、請求項１の検定キット。
【請求項３】
前記ポリペプチドまたは認識単位が、酵素、エピトープ、クロモゲン、またはビオチンによって標識されたペプチドであり、前記ポリペプチドまたは認識単位が固体支持体に固定されている、請求項１の検定キット。
【請求項４】
１つ以上の容器中に：
（ａ）複数の異なる精製ポリペプチドであって、それぞれのポリペプチドが別々の容器中にあり、そしてそれぞれのポリペプチドがＷＷドメインを含む前記の複数のポリペプチド；および
（ｂ）前記の複数のポリペプチドのそれぞれのＷＷドメインに対し選択的親和性を有する、少なくとも１つのペプチド
を含む検定キット。
【請求項５】
ＷＷドメインを含む複数の精製ポリペプチドを含むキットであって、それぞれのポリペプチドが異なる配列のＷＷドメインを有するが、同じ結合特異性を示すことができる前記キット。
【請求項６】
当該ポリペプチドが配列番号３０−３８、４６、４８、５０、および１２６−１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５のキット。
【請求項７】
潜在的な薬剤候補をスクリーニングする方法であって：
（ａ）ＷＷドメインを含む少なくとも１つのポリペプチドを、前記ポリペプチドの前記ＷＷドメインに対し選択的親和性を有する少なくとも１つの認識単位に、相当量の潜在的な薬剤候補の存在下で接触させ、前記ポリペプチドおよび前記認識単位が前記薬剤候補の非存在下で互いに接触させられた時には相互作用できるようにし；そして
（ｂ）前記ポリペプチドの前記認識単位との相互作用への、相当量の前記薬剤候補の存在の効果を決定することを含む前記方法。
【請求項８】
前記薬剤候補の、相互作用する複数の異なるポリペプチド−認識単位対への効果が決定される請求項７の方法であって、少なくともいくつかの前記ポリペプチドが、別の前記ポリペプチドのＷＷドメインと配列は異なるが同じ結合特異性を示すことができるＷＷドメインを有する、前記方法。
【請求項９】
前記の少なくとも１つのポリペプチドまたは認識単位の、少なくとも１つが、それぞれコンセンサスＷＷドメインおよびコンセンサス認識単位を含む、請求項７の方法。
【請求項１０】
当該ポリペプチドが請求項１の方法で同定されるポリペプチドである、請求項７の方法。
【請求項１１】
薬剤候補が、ポリペプチド−認識単位相互作用の阻害剤であって、こうした阻害剤の存在下で、ポリペプチドの認識単位に対する結合能減少が検出されることで同定される阻害剤である、請求項７の方法。
【請求項１２】
ＷＷドメインを含む精製ポリペプチドまたはＷＷドメインを含むポリペプチドをコードする精製ＤＮＡであって、前記ＷＷドメインが配列番号３０−３８、４６、４８、５０および１２６−１２９からなる群より選択されたアミノ酸配列からなる前記精製ポリペプチドまたはＤＮＡ。
【請求項１３】
ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードする精製ＤＮＡであって、ＤＮＡ配列が配列番号４５、４７、４９および１２５からなる群より選択された配列を含む前記精製ＤＮＡ。
【請求項１４】
（ａ）配列番号４６、４８、５０または１２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＷＷドメインを含むアミノ酸配列であって、ペプチド結合を通じて、（ｂ）異なるポリペプチド由来の少なくとも６アミノ酸のアミノ酸配列と結合しているものを含む融合タンパク質、またはその融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
機能可能であるように非天然プロモーターに連結された請求項１４のＤＮＡを含む核酸ベクター、およびそれを宿す組換え細胞。
【請求項１６】
機能可能であるように非天然プロモーターに連結された請求項１２または１３のＤＮＡを含む核酸ベクター、およびそれを宿す組換え細胞。
【請求項１７】
配列番号４５、４７、４９および１２５からなる群より選択された配列を有する核酸にハイブリダイズ可能な精製核酸。
【請求項１８】
請求項１４の融合タンパク質を産生する方法であって、前記融合タンパク質をコードする核酸ベクターを含む組換え細胞を、融合タンパク質が発現されるように培養し、そして発現された融合タンパク質を回収することを含む前記方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが：
（ａ）  ペプチドライブラリーをＷＷドメインによりスクリーニングし、ＷＷドメインに結合する１つ以上のペプチドを得て；
（ｂ）段階（ａ）のペプチドの１つを使用し、ポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含む１つ以上のポリペプチドを同定し；
（ｃ）段階（ｂ）で同定された当該ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；
（ｄ）ＷＷドメインを含む段階（ｂ）の１つ以上の新規ポリペプチドを産生し；
（ｅ）段階（ａ）で得られた複数のペプチドについてコンセンサス配列を決定し；
（ｆ）段階（ｅ）のコンセンサス配列を含むペプチドを産生し；
（ｇ）段階（ｆ）で産生されたペプチドを使用し、ポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含む１つ以上のポリペプチドを同定し；
（ｈ）段階（ｇ）で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして
（ｉ）ＷＷドメインを含む段階（ｇ）由来の１つ以上のポリペプチドを産生することを含む方法で産生されたＷＷドメインを含むポリペプチドである、請求項７の方法。
【請求項２０】
分子の潜在的薬理学的活性を決定する方法であって：
（ａ）結合を促す条件下で、当該分子とＷＷドメインを含む化合物を接触させ；
（ｂ）発生したいかなる特異的結合も検出し、または測定し；そして
（ｃ）段階（ａ）および（ｂ）を、それぞれの化合物が異なる配列のＷＷドメインを含むが同じ結合特異性を示すことができるような、異なる複数の化合物で繰り返すことを含む前記方法。
【請求項２１】
ＷＷドメインを含む分子の、当該ＷＷドメインに選択的に結合する認識単位への結合に影響を及ぼす化合物を同定する方法であって：
（ａ）結合を促す状況下において候補化合物の存在下で、ＷＷドメインを含む当該分子と認識単位を接触させ、そして当該分子と当該認識単位の間の結合の量を測定し、ここにおいて、当該ＷＷドメインは配列番号３０−３８および１２７−１２９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し；
（ｂ）段階（ａ）の結合量を、候補化合物の非存在下での当該分子と当該認識単位の間に起こったことが既知であるかもしくは決定された結合の量と比較し、ここで段階（ａ）の結合量と、候補化合物の非存在下での当該分子と当該認識単位の間に起こったことが既知であるかもしくは決定された結合の量との違いは、候補化合物が、ＷＷドメインを含む当該分子と認識単位の結合に影響を及ぼす化合物であることを示すことを含む前記方法。
【請求項２２】
配列番号３０−３８、４６、４８、５０および１２６−１２９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体。
【請求項２３】
ＨＥＣＴドメインを含む精製ポリペプチドであって、前記ＨＥＣＴドメインが配列番号１１５、１１６、１２４および１３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する前記精製ポリペプチド。
【請求項２４】
ＨＥＣＴドメインを含むポリペプチドを同定する方法であって：
（ａ）多価認識単位複合体を複数のポリペプチドと接触させ、ここで当該複合体の当該認識単位はＨＥＣＴドメインに対し選択的結合親和性を有し；そして
（ｂ）前記認識単位複合体に対して選択的結合親和性を有するポリペプチドを同定することを含む前記方法。
【請求項２５】
配列番号１８３−２３０からなる群より選択されたアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド、または当該アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする精製ＤＮＡ。
【請求項２６】
本質的にＷＷドメインからなる精製ポリペプチドであって、前記ＷＷドメインが配列番号３０−３８、４６、４８、５０および１２６−１２９からなる群より選択されたアミノ酸配列を有する前記精製ポリペプチド。
【請求項２７】
本質的に、配列番号３０−３８、４６、４８、５０および１２６−１２９からなる群より選択されたアミノ酸配列からなる精製ポリペプチド、または本質的に当該アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする精製ＤＮＡ。
【請求項２８】
（ａ）配列番号４６、４８、５０または１２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＷＷドメインを含むアミノ酸配列が、ペプチド結合を通して、（ｂ）異なるポリペプチド由来の少なくとも６アミノ酸のアミノ酸配列と結合したものを含む融合タンパク質、または当該融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２９】
機能可能であるように非天然プロモーターに連結された請求項２８のＤＮＡを含む核酸ベクター、およびそれを宿す組換え細胞。
【請求項３０】
機能可能であるように非天然プロモーターに連結された請求項２５のＤＮＡを含む核酸ベクター、およびそれを宿す組換え細胞。
【請求項３１】
機能可能であるように非天然プロモーターに連結された請求項２７のＤＮＡを含む核酸ベクター、およびそれを宿す組換え細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の属する分野
本発明は、ＷＷドメインあるいは機能上それと同等なものを有するポリペプチドの同定および単離を目指したものである。目的とする薬剤の発見を含めて、しかしそれに限定するのではないが、これらのポリペプチドの様々な利用方法を記載する。ＷＷドメインに結合する様々なペプチド認識単位をも提供する。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
２．１．  タンパク質内の機能ドメイン
多くの生物学的過程は、タンパク質相互の特異的な結合を伴う。このような過程の例には、シグナル伝達、転写、ＤＮＡ複製、細胞骨格の形成、膜輸送などがある。特異的な結合は関係するタンパク質の小さな部分によって仲介されること、およびこれらの部分はタンパク質の残りの部分とは独立に、大いに機能し得ることが多くの事例において示された。あるタンパク質が別のタンパク質を特異的に認識あるいは結合するのを仲介する、タンパク質のこのような独立した部分は、「機能ドメイン」と呼ばれるようになった。様々な機能ドメインが様々な理解の程度で述べられてきた。これらのいくつかを以下に記載する。
【０００３】
Ｓｒｃホモロジー２ドメイン（ＳＨ２）は、もともとは非膜結合チロシンキナーゼＳｒｃに見出された、短い（約１００残基）アミノ酸配列である。それ以来、他の約２０個のタンパク質内に存在することが示されてきた。ＳＨ２ドメインはタンパク質上の、リン酸化チロシンを含む特定の部位を認識する。ＳＨ２ドメインを含むタンパク質は、様々なシグナル伝達経路に関与している。ＳＨ２ドメインについて議論している総説としては、Pawson，1995，Nature 373:573-580;Cohen et al.，1995，Cell 80:237-248;Pawson and Gish，1992，Cell 71:359-362;Koch et al.，1991，Science 252:668-674を参照のこと。
【０００４】
Ｓｒｃホモロジー３（ＳＨ３）ドメインは、もともとはＳｒｃタンパク質のアミノ酸配列をＣｒｋ、ホスホリパーゼＣ−γ、α−スペクトリン（spectrin）、ミオシンＩＢ，Ｃｄｃ２５、およびＦｕｓ１と比較することによって見出された、別の種類の短いアミノ酸配列である（Lehto et al.，1988，Nature 334:388;Mayer et al.，1988，Nature 332:272-275;Stahl et al.，1988，Nature 332:269-272;Rodaway et al.，1989，Nature 342:624）。Ｓｒｃに加えて、およそ３０個のタンパク質がＳＨ３ドメインを含むと認められており、これらのタンパク質は幅広い機能を果たしている。
【０００５】
ＳＨ３ドメインについて議論している総説としては、Pawson，1995，Nature 373:573-580;Cohen et al.，1995，Cell 80:237-248;Pawson and Gish，1992，Cell 71:359-362;Koch et al.，1991，Science 252:668-674を参照のこと。
【０００６】
ＳＨ３ドメインはプロリンに富んだ特定のアミノ酸配列と特異的に結合することが示されてきた（Chen et al.，1993，J．Am．Chem．Soc．115:12591-12592;Ren et al.，1993，Science 259:1157-1161;Feng et al.，1994，Science 266:1241-1247;Yu et al.，1994，Cell 76:933-945;Sparks et al.，1994，J．Biol. Chem．269:23853-23856;Sparks et al.，1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1540-1544）。しかし、一般にＳＨ３ドメインと結合する異なる配列間の相同性は低い傾向にある。
【０００７】
この低い相同性は、ＳＨ３ドメインとその天然のリガンドの間の相互作用に関して通例観察されているような特異性を説明し得る。一般に、特定のＳＨ３ドメインに結合するものをスクリーニングすることによって同定される配列は、他のＳＨ３ドメインに結合するよりもずっと強くその特定のＳＨ３ドメインに結合するだろう。例えば、Cicchetti et al.,1992,Science 257:803-806では、Ａｂ１の５５アミノ酸ＳＨ３領域を含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質にてλｇｔｌｌ  ｃＤＮＡ発現ライブラリーをプローブし、Ａｂ１のＳＨ３ドメインに特異的に結合することができるタンパク質を産生するクローンを２つ単離した。これらのクローンの１つを分析したところ、コードされるタンパク質のＳＨ３ドメインへの結合にあずかる領域が明らかになった。この領域は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質の一部分として、Ａｂ１由来のＳＨ３ドメインには非常に強く、Ｓｒｃ由来のＳＨ３ドメインにはもっと弱く、そしてＣｒｋおよび神経性Ｓｒｃ由来のＳＨ３ドメインには非常に弱く結合した。
【０００８】
プレクストリンは血小板におけるプロテインキナーゼＣの主要な基質である。プレクストリン内の約１００アミノ酸からなる２つのドメインは、多くのシグナル伝達および細胞骨格のタンパク質の中にそれに相当するものを有するとわかった。これらのドメインはプレクストリン相同ドメインあるいはＰＨドメインとして知られている（Haslam et al.，1993，Nature 363:309-310;Mayer et al.，1993，Cell 73:629-630）。様々なタンパク質由来のＰＨドメインの間の配列上の相同性は低いにもかかわらず、ＰＨドメインは逆平行βシート２つおよび長いＣ末端αヘリックス１つを含む類似した高次構造に折りたたまれることが、構造研究により示された（Gibson et al.，1994，Trends in Biochem．Sci．19:349-353）。ＰＨドメインを有することがわかっているタンパク質には、例えばスペクトリン、ダイナミン、ホスホリパーゼＣ−γ、Ｂｔｋ、ＲａｓＧＡＰ、ｍＳＯＳ−１、Ｒａｃ、Ａｋｔなどの、シグナル伝達あるいは細胞骨格構成において重要な役割を持つ多くのタンパク質がある。
【０００９】
ロイシンジッパーは、ヘリックスに沿って７つおきにロイシン残基が現れるような、タンパク質のアルファヘリックス領域から成り立っている。このロイシンは、別のタンパク質あるいは同じタンパク質の別の分子のロイシンジッパー由来のロイシンを互いに指状にあわせ、ロイシンジッパーを有するタンパク質の２量化を導く。ロイシンジッパーは、例えばＣ／ＥＢＰ、Ｍｙｃ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＧＣＮ４など転写因子として機能すると思われている多くのタンパク質内に見出されてきた。これらのタンパク質の多くで、ロイシンジッパーを介した２量化がその転写因子のＤＮＡ結合活性に必要であることが示された。
【００１０】
いくつかのロイシンジッパーが他の特定のロイシンジッパーに好んで結合するというように、ロイシンジッパーの結合は特異性を示す。例えば、ＦｏｓとＪｕｎのロイシンジッパーが結合して形成されるＪｕｎ−Ｆｏｓヘテロ２量体は、２つのＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーが結合して形成されるＪｕｎ−Ｊｕｎホモ２量体に優先して形成される。
【００１１】
Ｆａｓ／ＡＰＯ−１（ＣＤ９５）は、プログラム細胞死あるいはアポトーシスの現象に関与することが示されている種類の膜貫通受容体の一員である（Itoh et al.，1991，Cell 66:233-243）。腫瘍壊死因子受容体１（ＴＮＦＲ−１）もこのクラスの一員である（Baglioni，C.，1992，"The Molecules and Their Emerging Roles in Medicine,"in Tumor Necrosis Factors，B．Beutler，ed．(New York:Raven Press)）。Itoh，N.およびNagata，S.（1993，J．Biol．Chem．268:10932-10937）では、Ｆａｓ／ＡＰＯ−１（ＣＤ９５）の細胞質ドメイン内の特定のアミノ酸配列が、この受容体によって仲介されるプログラム細胞死に必要であることを示している。Tartagliaら（1993，Cell 74:845-853）では、ＴＮＦＲ−１内の類似の領域もプログラム細胞死にあずかっていると提唱している。Ｆａｓ／ＡＰＯ−１（ＣＤ９５）とＴＮＦＲ−１のあいだで類似しているこの領域は、細胞死ドメインと呼ばれるようになった。
【００１２】
産物がＦａｓ／ＡＰＯ−１（ＣＤ９５）およびＴＮＦＲ−１の細胞死ドメインに特異的に結合するような遺伝子を、３つのグループが酵母２ハイブリッドシステムを用いてクローン化した（Hsu et al.，1995，Cell 81:495-504;Chinnaiyan，et al.，1995，Cell 81:505-512;Stanger et al.，1995，Cell 81:513-523）。これらの遺伝子をある種類の細胞に過剰発現させると、アポトーシスを誘導することが示されたが、これらの遺伝子がＦａｓ／ＡＰＯ−１（ＣＤ９５）およびＴＮＦＲ−１からの死のシグナルを細胞内で変換するものであると論ずる結果である。
【００１３】
２．１．１．  ＷＷドメイン
ＷＷドメインは、ヒト、線虫、および酵母を含む様々な種由来の多数のタンパク質内に見出される、小さな機能ドメインである。その名前は、２つのトリプトファン残基、すなわちＷＷドメインのアミノ末端部に１つ、カルボキシル末端部に１つ、がほとんど一定不変に保存されているという観察に由来している。機能ドメインのほとんどが、長さ５０から１５０残基という傾向にあって、ＷＷドメインは長さにして約３０から４０のアミノ酸であり、機能ドメインとしては極めて小さい。ＷＷドメインにはしばしば、ヒスチジンあるいはシステインに富んだアミノ酸の範囲が隣接しているだろう。そしてこれらの範囲は金属結合部位であり得る。ＷＷドメインの中心は極めて疎水性であるが、ドメインの残りの部分の至る所にちりばめられているのは、大多数の荷電した残基である。これらの特性は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する機能ドメインに特徴的なものである（Bork and Sudol，1994，Trends in Biochem．Sci．19:531-533）。
【００１４】
様々なＷＷドメインに関する彼らの研究に基づき、AndreおよびSpringael（1994, Biochem．Biophys．Res．Comm．205:1201-1205(AndreおよびSpringael")）では、ＷＷドメインに関する以下の共通配列を提唱した。すなわち、
WX7G(K/R)X1(Y/F)(Y/F)X1(N/D)X2(T/S)(K/R)X1(T/S)(T/Q/S)WX2P（配列番号２）
であって、Ｘはいずれかのアミノ酸を表し、太字は高度に保存されたアミノ酸を表す。ＷＷドメインに関するAndreおよびSpringaelの分析により、ＷＷドメインはα−ヘリックスを含まず、代わりに非構造領域が隣接した中心のβ鎖領域を有している、と彼らは結論づけた。他の研究は、４つの芳香族残基から成り立つ疎水性コアが隣接している、荷電した残基を含むβ鎖構造を予測している（Chen and Sudol，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:7819-7823，およびその中で引用されている参考文献）。
【００１５】
ＷＷドメインは、様々な機能の幅広い種類のタンパク質内に見出された。その機能はこのように多様であるにもかかわらず、ＷＷドメインを含む、機能の知られているタンパク質のほとんどは、細胞シグナル伝達および増殖調節、あるいは細胞骨格の構成のいずれかに何らかの作用をするようである。
【００１６】
例えば、ＷＷドメインを有するタンパク質であるジストロフィンは、α−アクチニンおよびβ−スペクトリンを含む細胞骨格タンバク質のファミリーに属している。ジストロフィンの変異はデュシャンヌおよびベッカー型筋ジストロフィーの原因である。ジストロフィン遺伝子は、オータナティブにスプライシングされた転写産物の一群をうみだす。これらのうち最も長いものは４つのドメインを有するタンパク質をコードしている。すなわち、（１）球状の、アクチン結合領域；（２）２４のスペクトリン様繰返し；（３）システインに富んだＣａ２＋結合領域；および（４）カルボキシル末端の球状領域、である。スペクトリン様繰返しより後でＣａ２＋結合領域より前にある、ジストロフィンタンパク質の短い範囲にＷＷドメインが含まれている。このＷＷドメインは、β−ジストログリカンに結合することが示された領域にある。このことはＷＷドメインがタンパク質−タンパク質相互作用に関与し得ることを示唆している（Bork and Sudol，1994，Trends in Biochem．Sci．19:531-533）。
【００１７】
ジストロフィンとの配列上の相同性が７０％であり、ジストロフィンのようにスペクトリン様繰返しを介して４量体を形成できるタンパク質であるユートロフィン（Utrophin）も、ＷＷドメインを有する。ユートロフィンとジストロフィンは、膜安定性および細胞外環境への収縮力伝達に関与していると考えられている（Bork and Sudol，1994，Trends in Biochem．Scl．19:531-533）。
【００１８】
ＹＡＰは、前癌遺伝子ＹｅｓのＳＨ３ドメインに結合することから発見されたタンパク質である（Sudol，1994，Oncogene 9:2145-2152）。マウスＹＡＰは２つのＷＷドメインを有することがわかっているが、興味深いことに、ニワトリおよびヒトＹＡＰはそれぞれ単一のＷＷドメインのみを有する（Sudol，et al.，1995，J．Biol．Chem.270:14733-14741）。ChenおよびSudol（1995，Proc Natl．Acad．Sci．USA 92:7819-7823）では、細菌に産生させた、ＹＡＰ由来のＷＷドメインのグルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質にてｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした。彼らはそのライブラリーから、ＹＡＰ  ＷＷドメインに特異的に結合する２つのタンパク質（ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２）を同定し単離した。ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２のアミノ酸配列を比較することにより、各タンパク質中に相同なプロリンに富んだ領域が明らかになった。このプロリンに富んだ領域は共通のモチーフＰＰＰＰＹ（配列番号３）を含んでいた。その後、ChenおよびSudolは、このモチーフを含むわずかに１０残基が、融合タンパク質にＹＡＰ  ＷＷドメインと特異的に結合する能力を与えたことを示した。この結合は非常に特異的で、そのモチーフはＹＡＰ  ＷＷドメインには結合したが、ジストロフィン由来のＷＷドメインあるいはＳＨ３ドメインのパネルには結合しなかった。
【００１９】
Ｎｅｄｄ−４は３つのＷＷドメインを有するタンパク質である。マウスにおいては、Ｎｅｄｄ−４は胚発生および中枢神経系の分化に役割を果たしているようである（Kumar et al.，1992，Biochem．Biophys．Res．Comm．185:115-1161）。
【００２０】
ＲＳＰ５は、酵母がＮＨ４＋などの十分な窒素源にさらされた際に、窒素化合物を細胞内に取り込む多くの透過酵素が不活性化されるという窒素代謝の不活性化現象に関与する、酵母タンパク質である。ＲＳＰ５の特定の対立遺伝子がＳＰＴ３における変異を相補し得るため、ＲＳＰ５は恐らく転写因子ＳＰＴ３と相互作用している（Eisenmann et al.，1992，Genes Dev．6:1319-1331）。
【００２１】
ＲＳＰ５はそのアミノ末端に３つのＷＷドメインを含んでいる。ＲＳＰ５は脊椎動物のタンパク質Ｎｅｄｄ−４の相同体であると思われる。ＲＳＰ−５およびＮｅｄｄ−４の計６個のＷＷドメインは、アミノ酸配列の３０％の同一性と５０％の類似性を有している。ＲＳＰ−５およびＮｅｄｄ−４両者のカルボキシル末端ドメインは、ヒトのユビキチンタンパク質リガーゼであるＥ６−ＡＰのカルボキシル末端ドメインと相同である（Andre and Springael）。ＨＥＣＴとして知られるＲＳＰ５の領域は、ユビキチンと高エネルギーチオエステル結合を形成することができ、ＲＳＰ５はユビキチンタンパク質リガーゼであると議論される（Scheffner et al.，1995，Cell 75:495-505;Huibregste et al.，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:2563-2567）。
【００２２】
別の酵母タンパク質であるｅｓｓ−１はＷＷドメインを１つ含み、細胞質分裂および／または細胞分離に関与すると考えられている（Hanes et al.，1989，Yeast 5:55-72）。
Ｎｅｄｄ−４およびＲＳＰ５のＷＷドメインを用いてタンパク質データベースを検索することにより、Saccharomyces cerevesiae由来のＹＫＬＯ１２Ｗ、およびCaenorhabditis elegans由来のＺ２２１７６という、それぞれ２つのＷＷドメインをアミノ末端に含む、未知の機能のタンパク質２つを同定した（Andre and Springael）。
【００２３】
ＷＷドメインを有する他のタンパク質中では、ラットの転写因子ＦＥ６５がＷＷドメイン１つを含むアミノ末端活性化領域を有する（Bork and Sudol，1994，Trends in Biochem．Sci．19:531-533）。ヒトのタンパク質ｋｉａａ９３は４つのＷＷドメインを有し、ＲＳＰ５との配列類似性の他の領域を共有しており、恐らくマウスＮｅｄｄ−４のヒト版でありうる（Hoffman and Bucher，1995，FEBS Lett．358:153-157）。ヒトのタンパク質ＨＵＭＯＲＦ１は機能は未知であるが、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質と相同な、およそ３５０アミノ酸の領域を有する（AndreおよびSpringael）。
【００２４】
本明細書中で上に参考文献を引用したが、それらが本発明の先行技術であると認めたとは解釈されないだろう。
【発明の開示】
【００２５】
３．発明の概要
一般的には、本発明は、WWドメインとの結合相互作用に関与する、機械的（operationally）に定義されたリガンドと結合する化合物の完全な集合を同定する方法を目指したものである。
【００２６】
さらに具体的には、本発明はＷＷドメインを有するポリペプチドあるいはポリペプチドのファミリーを同定する方法を目指したものである。この方法の基本的なステップには、（ａ）目的とする標的分子内のＷＷドメインに対して選択的な親和性を有する認識単位あるいは認識単位のセットを選択すること；（ｂ）その認識単位を多数のボリペプチドと接触させること；（ｃ）目的のＷＷドメインに対して選択的な親和性を有する１つあるいはそれ以上のボリペプチドであって、そのポリペプチドが目的のＷＷドメインあるいは機能上それと同等なものを含む、そのようなポリペプチドを同定すること、が含まれる。
【００２７】
本発明の特定の一態様においては、望ましいＷＷドメインを有するタンパク質の完全なスクリーニングは、スクリーニングの第一ラウンドに同定された、ＷＷドメインに対する認識単位を用いて、引き続く発現ライブラリーのスクリーニングにおいてＷＷドメインを含むタンパク質を検出することによる、繰返しの過程を伴う。
【００２８】
さらに詳しく言うと、本発明の方法は、目的のＷＷドメインに対して選択的な親和性を有する認識単位を選択することを含む。この認識単位に対して選択的な親和性を有する特定のポリペプチドを同定し得るようなやり方で、様々な起源由来の多数のポリペプチドを検討し得るということが、この認識単位を用いて発見された。そのように同定されたポリペプチドは、ＷＷドメインを１つ含むことが示された、すなわち、見出されたＷＷドメインは、目的のＷＷドメインと同じ結合特異性（特に、本発明が教える多価の認識単位のスクリーニング条件下で、同じ認識単位に結合する）を示すことができる、作用型（working version）である。従って、本方法によって同定されたポリペプチドは、最初の標的分子の目的のＷＷドメインと同一、類似した、あるいは相似な（しかし機能的には同等である）選択的結合親和性特性をこれらの関連するポリペプチドに示させるような、目的のＷＷドメインの特質をも有する。
【００２９】
本発明の特定の一態様においては、多数のポリペプチドはｃＤＮＡ発現ライブラリーによって産生されるタンパク質から得られる。ＷＷドメインあるいは機能上それと同等なものを持つポリペプチドの、様々なペプチドあるいは認識単位に対する結合特異性を続いて検討することができ、それにより特定のポリペプチド／認識単位相互作用の生理的な役割がより大きく理解される。実際、本発明は、認識単位−ポリペプチド対、あるいは認識単位と、それぞれがＷＷドメインのコピーあるいは機能的に同等なもの（例えば、同じ結合特異性を示すことができる）を持った関連するポリペプチドの「パネル」との間の相互作用に対する、ある薬剤候補の観察された効果に基づいて、標的とされた薬剤を発見する方法を提供する。
【００３０】
本発明は特定のアミノ酸配列を含むポリペプチドをも提供する。さらに、本発明は、特定のコーディング配列を含む特定のＤＮＡ構築物を含む核酸をも提供する。本発明の方法の産物である他の物質も、同様に意図される。
【００３１】
本発明者は、発現ライブラリーあるいは他のポリペプチド源をスクリーニングするのに用いる認識単位の価数（すなわち、それが単量体、２量体、３量体などのいずれであるか）が、認識単位−ＷＷドメイン相互作用の特異性に対して著しい影響を及ぼすらしいということを思いがけず見出した。本発明者は、小さなペプチドの形態、多価の形態における認識単位は、特異性が失われてはいないが緩まっていることを発見した。特に、多価の（４価であると考えられている）ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体に結合したビオチン化ペプチドは、予期しない族の特異性を持つ。これにより、そのようなペプチドを、ペプチドの、標的ＷＷドメインと配列上同一ではないが類似したＷＷドメインを含むポリペプチドのクラスを同定するために、ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。
【００３２】
本発明は、新規薬剤の潜在的な候補（および潜在的な前駆化合物）を同定し、その特異性を決定する方法をも提供する。例えば、１つのＷＷドメインと１つの認識単位を持つ、例えば結合ペプチドのようなポリペプチドが、互いに選択的な親和性を示すことを知っていれば、ポリペプチド−認識単位の相互作用に影響を及ぼし得る薬剤、例えば相互作用のアゴニストとしてあるいはアンタゴニスト（阻害剤）としてのいずれか、を同定しようと試みるこどができる。続いて、このアッセイを用いて、最も望ましい性質を示す、例えば相互作用を妨害することあるいはポリペプチドとの結合を認識単位と競合することにおいて最も効果的なものを求めて、候補となる「薬剤」の集合をスクリーニングし得る。
【００３３】
加えて、本発明は、ある種のアッセイキット、および薬剤候補をスクリーニングするのにこれらのアッセイキットを用いる方法をも提供する。本発明の特定の観点においては、アッセイキットは、（ａ）ＷＷドメインを含むポリペプチド；および（ｂ）このポリペプチドに対して選択的な親和性を有する認識単位、を含む。別のアッセイキットは多数のポリペプチドを含み得るが、それぞれのポリペプチドは、好ましくは異なる配列のWWドメイン、および多数のポリペプチドのそれぞれに対して選択的な親和性を有する少なくとも１つの認識単位を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
５．発明の詳細な説明
本発明は、ＷＷドメインを有するポリペプチド、これらのポリペプチドおよびその誘導体を同定し利用する方法、および上記のものをコードする核酸に関係する。本発明をさらに説明し、本発明の特定の観点の実施に興味を持ち得る当業者のさらなる助けとなるために、以下の詳細な説明を提供する。
【００３５】
まずはじめに、ある種の定義づけが適切である。それに応じて、「ポリペプチド」という言葉は、ペプチド（すなわちアミド）結合で結合されたアミノ酸残基を含む分子に適用され、タンパク質およびペプチドを含む。従って、本発明のポリペプチドは、１本あるいは複数の共有結合したアミノ酸の鎖を持つ可能性があり、ジスルフィド結合を含む鎖内あるいは鎖間結合をさらに含む可能性がある。いくつかのポリペプチドは、複数の単位の巨大分子の複合体のサブユニットを形成する可能性もある。もちろん、このポリペプチドは高次構造上の選択性（reference）を持ち、ある３次元構造をとると予想され得る。高次構造上の選択性と３次元構造の両者は、通常ポリペプチドの１次（すなわちアミノ酸）配列および／またはジスルフィド結合あるいは他の共有または非共有結合性の鎖内あるいは鎖間相互作用の存在（または非存在）によって定められるだろう。
【００３６】
本発明のポリペプチドはどんな大きさでもあり得る。予想され得るように、このポリペプチドは広範な分子量をとる可能性があり、１５０から２００キロダルトン（ｋＤ）を越えるものもある。典型的には、このポリペプチドは約５，０００から約１００，０００ダルトンの範囲の分子量を持ち得る。さらに、より狭い範囲、例えば約１０，０００から約７５，０００ダルトン、あるいは約２０，０００から約５０，０００ダルトンに落ち着くものもある。
【００３７】
ＷＷドメインは、そのようなドメインが特定のポリペプチド（あるいは標的分子）に１回あるいはそれ以上現れ得るか、あるいは別のポリペプチドのファミリーに見出され得るという点で、モジュールとなる傾向にある。特定のポリペプチドあるいは別のポリペプチドに１度以上見出される場合、モジュールであるＷＷドメインは、実際には１次配列および／または３次元構造の点で同一の構造を有する可能性があり、あるいは目的のＷＷドメインの異なる型の間にわずかなあるいは大きな変異または修飾を含む可能性がある。
【００３８】
しかし、重要なのは、これらの関連するＷＷドメインが、標的分子に存在する、目的のＷＷドメインの機能的な観点を少なくとも１つは維持しているということである。実際、それが本発明の方法によって同定され、定義され、そして開発され得るＷＷドメインの、２つあるいはそれ以上の可能な型の間の、この機能上の関係であるということを強調するのである。好ましい観点においては、目的の機能は、目的の分子（例えばペプチドなど）に結合する能力である。
【００３９】
本発明は、新規ＷＷドメイン含有タンパク質に関して系統的に遺伝子の発現ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーなど）をスクリーニングするのに、ＷＷドメイン含有タンパク質に結合する認識単位を用い得る、一般的な戦略を提供する。特定の態様においては、認識単位は、ランダムペプチドライブラリーから先に単離されるか、あるいは既知のペプチド認識単位であるか、あるいは目的の結合特異性を有するペプチド認識単位と相同性がある配列をデータベースで検索することにより同定される認識単位である。
【００４０】
先行技術においては、新規遺伝子（および、したがってそれにコードされるタンパク質産物）は最も一般的にはｃＤＮＡライブラリーから単離される。通例、適切なｃＤＮＡライブラリーを、オリゴヌクレオチドあるいは抗体のいずれかのプローブにてスクリーニングする。いずれの場合にも、ライブラリー中の無関係な遺伝子という広大なバックグラウンドから、同定するべき遺伝子を拾い出すために、プローブはその遺伝子に対して十分特異的でなければならない。先行技術での新規遺伝子の同定において克服するべき最も高い障害は、このように特異的なプローブが必要であるということなのである。ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を同定する別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてライブラリーから望みの遺伝子の区分を増幅することによる。ＰＣＲには、望みの遺伝子に配列上の類似性を持つオリゴヌクレオチドが入手可能であることが必要である。
【００４１】
先行技術の方法で用いるプローブが核酸である場合、そのｃＤＮＡクローンによってコードされるであろういかなるタンパク質産物の発現も必要とせずに、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし得る。先行技術の方法で用いるプローブが抗体である場合、そのときはｃＤＮＡライブラリーを適した発現ベクター中で構築することが必要である。ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を同定する技術に関する包括的な議論に関しては、Sambrook、FritschおよびManiatis、Cloning，A Laboratory Manual、第2版、Chapter 8 "Construction and Analysis of cDNA Libraries,"（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）を参照のこと。Sambrook、FritschおよびManiatis、Cloning，A Laboratory Manual、第2版、Chapter 12 "Screening Expression Libraries with Antibodies and Oligonucleotides,"（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）も参照のこと。
【００４２】
ｃＤＮＡライブラリーに替わるものとしては、ゲノムライブラリーを用い得る。先行技術の方法においてゲノムライブラリーを用いる場合、プローブは事実上常に核酸プローブである。Sambrook、FritschおよびManiatis、Cloning，A Laboratory Manual、第2版、Chapter 9 "Analysis and Cloning of Eukaryotic GenomicDNA,"（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989）を参照のこと。
【００４３】
先行技術においては、ライブラリーのスクリーニングに用いる核酸プローブは、しばしば単離したいと思う遺伝子に相同であると考えられる、既知の遺伝子の配列に基づいている。その手順の成功は、プローブと標的遺伝子の間の相同性の度合いが十分に高いかどうかに依存する。ＷＷドメインの配列は共通なドメインとして認識されるほどに類似したが、プローブを、ＷＷドメインを含む遺伝子に関してｃＤＮＡあるいはゲノムライブラリーをスクリーニングするために用い得るように、成功についてのもっともな予測をもって設計できるほどにはその類似性は高くはなかったため、既知のＷＷドメインの配列に基づくプローブは有用性が限られていた。ＷＷドメイン間の１次配列上の相同性の程度を説明するものに関しては、図５を参照のこと。
【００４４】
ＰＣＲを用いてゲノムライブラリーから遺伝子を同定することもできる。しかし、ｃＤＮＡライブラリーから遺伝子を同定するのにＰＣＲを用いる場合のように、望みの遺伝子に対して配列上の類似性を持つオリゴヌクレオチドが入手可能であることが必要である。
【００４５】
本発明が提供するスクリーニング方法を用い、望みのＷＷドメインを有するタンパク質をコードするＤＮＡを、認識単位に対する機能的な結合特異性によって同定することができる。本発明のスクリーニング方法によって課せられる、結合特異性の必要条件が容易であるために、多くの新規な、機能的に相同な、ＷＷ含有タンパク質が同定され得る。いずれの力学的な説明によっても束縛するつもりはないが、結合特異性におけるこの容易さは、遺伝子ライブラリーをスクリーニングするのに用いた多価の認識単位、好ましくは二価以上の価数で、さらに好ましくは四価またはそれ以上、そして最も好ましくはストレプトアビジン−ビオチン化ペプチドの認識単位複合体、を用いた結果であると考えられる。
【００４６】
本発明の特定の一態様においては、ＷＷドメインを有するタンパク質の完全なスクリーニングは、スクリーニングの第一ラウンドに同定された、ＷＷドメインに関する認識単位を使用して、続く発現ライブラリーのスクリーニングの際にＷＷドメイン含有タンパク質を検出するという、繰返しの過程に関する（図２および６Ｂ参照）。この戦略により、続くそれぞれのサイクルに関して、常に広がり続ける円として考えられ得るものの中に「配列空間」を探ることができる。この繰返しの戦略は、たった１つのＷＷドメイン含有タンパク質と認識単位が利用可能な場合でさえ、はじめることができる。
【００４７】
本発明は、新規ＨＥＣＴドメインを含むポリペプチドおよび、それらのポリペプチドをコードする核酸を提供する。特に、本発明は配列番号１１５、１１６、１２４および１３０から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する新規ＨＥＣＴドメインを提供する。それらの新規ＨＥＣＴドメインをコードする核酸をも提供する。本発明の新規ＨＥＣＴドメインは、さらなるＨＥＣＴドメイン含有ポリペプチドを同定し単離するのに用い得るような認識単位を同定し単離するのに用い得る。
【００４８】
５．１．  ＷＷドメインを含む新規遺伝子およびポリペプチドの発見
本発明は、あらかじめ決定された標的分子に存在するＷＷドメインに相当するかあるいは機能的に同等なＷＷドメインを含む、一つあるいはそれ以上のポリペプチド（特に、ポリペプチドの「ファミリー」で、標的分子を含む。）の同定を可能にする。
【００４９】
本発明は、事実上いずれかのＷＷドメインをコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡなど）をすみやかに同定する機構を提供する。配列上の類似性よりはむしろ認識単位の結合に関して、ｃＤＮＡライブラリーあるいは他のポリペプチド源をスクリーニングすることにより、本発明は、ＤＮＡに基づいた従来のスクリーニング方法の限界を、回避し、同等の機能的な活性を有する全く異なるタンパク質配列を同定できるようにする。特定のモジュールであるＷＷドメインを含むタンパク質の完全なレパートリーを単離する能力が、染色体の分子生物学的な研究および薬剤発見計画において新しい標的をもたらすことの両方において計り知れないほど貴重であるとわかるだろう。
【００５０】
ＷＷドメインを有する幅広いポリペプチドが、本発明の過程によって同定され得ることも同様に明白であろう。その過程は：
（ａ）多価の認識単位複合体を多数のポリペプチドと接触させること：および、
（ｂ）前記認識単位複合体に対して選択的な結合親和性を有するポリペプチドを同定すること（その際、認識単位はＷＷドメインに選択的に結合する）、を含む。
【００５１】
特定の態様においては、この過程は：
（ａ）多価の認識単位複合体を、そこからその認識単位に対して選択的な結合親和性を有するポリペプチドを同定することが望まれるような、多数のポリペプチドと接触させること（その際、複合体における認識単位の価数は少なくとも２、あるいは少なくとも４であって、その認識単位はＷＷドメインに選択的に結合する）；および、
（ｂ）認識単位複合体に対して選択的な結合親和性を有するポリペプチドを同定すること、そして好ましくは回収すること、を含む。
【００５２】
別の特定の態様においては、この過程は：
（ａ）多価の認識単位複合体であって、その複合体が（ｉ）アビジンあるいはストレプトアビジン、および（ｉｉ）ビオチン化認識単位を含むような複合体を、ｃＤＮＡ発現ライブラリー由来の多数のポリペプチドと接触させること（その際、その認識単位は、６から６０の範囲のアミノ酸残基を有ずるペプチドであって、ＷＷドメインに選択的に結合する）；および、
（ｂ）前記認識単位複合体に対して選択的な結合親和性を有するポリペプチドを同定すること、を含む、ＷＷドメインを有するポリペプチドを同定する方法を含む。
【００５３】
別の態様においては、本発明はＷＷドメインを有する一つまたはそれ以上の新規ポリペプチドを同定する方法を含み、前記方法は：
（ａ）そのＷＷドメインにてペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより、そのＷＷドメインに対して選択的な親和性を有する認識単位を同定すること；
（ｂ）前記認識単位を作出すること；
（ｃ）前記認識単位をポリペプチド源と接触させること；および、
（ｄ）前記認識単位に対して選択的な親和性を有する一つまたはそれ以上のＷＷドメインを含む新規ポリペプチドを同定すること、を含む。
【００５４】
別の特定の態様においては、この過程は：
（ａ）ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングして目的のＷＷドメインに選択的に結合するペプチドを同定すること；および、
（ｂ）前記ペプチドあるいはその結合部分にてｃＤＮＡあるいはゲノム発現ライブラリーをスクリーニングして、前記ペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定すること、を含む、目的のＷＷドメインあるいは機能上それと同等のものを有するポリペプチドを同定する方法を含む。
【００５５】
上記方法の特定の態様においては、スクリーニング段階（ｂ）は、複合抗原ペプチド（ＭＡＰ）の形態の前記ペプチドを用いて、あるいはウシ血清アルブミンあるいはキーホールリンペットヘモシアニンに架橋した前記ペプチドを用いて、実行される。
【００５６】
別の特定の態様においては、この過程は：
（ａ）ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングして目的のＷＷドメインに選択的に結合するペプチドを同定すること；
（ｂ）前記ペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定すること；
（ｃ）前記ペプチドの決定されたアミノ酸配列に基づいて共通配列を決定すること；および、
（ｄ）その共通配列を含むペプチドにてｃＤＮＡあるいはゲノム発現ライブラリーをスクリーニングして、前記ペプチドに選択的に結合するポリペプチドを同定すること、を含む、目的のＷＷドメインあるいは機能上それと同等のものを有するポリペプチドを同定する方法を含む。
【００５７】
別の特定の態様においては、この過程は：
（ａ）ランダムペプチドライブラリーをスクリーニングして目的のＷＷドメインに選択的に結合する第一のペプチドを同定すること；
（ｂ）前記第一のペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定すること；
（ｃ）発現される天然の多数のタンパク質のアミノ酸配列を含むデータベースを検索して、前記第一のペプチドのアミノ酸配列に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質を同定すること；および、
（ｄ）前記第一のペプチドのアミノ酸配列に相同な、前記タンパク質の配列を含む第２のペプチドにてｃＤＮＡあるいはゲノム発現ライブラリーをスクリーニングすること、を含む、目的のＷＷドメインあるいは機能上それと同等のものであり得るようなＷＷドメインを有するポリペプチドを同定する方法を含む。
【００５８】
上に記載の方法にて同定されたポリペプチドは、それゆえ、目的のＷＷドメインあるいは機能上それと同等のものを含むはずである（すなわち、同一のＷＷドメインを有するか、あるいは配列は異なるが同じ認識単位に結合できるＷＷドメインを有する）。特定の一態様においては、同定されたポリペプチドは新規ポリペプチドである。好ましい一態様においては、多価の認識単位複合体を形成するのに用いる認識単位を、ランダムペプチドライブラリーから単離あるいは同定する。
【００５９】
本発明は、ＷＷドメインを含む新規タンパク質をコードするあらゆるＤＮＡ配列のアミノ酸配列を提供する。このＷＷドメインは、配列は様々だが、ＷＷドメイン認識単位に対する結合特異性は保持している。ＷＷドメインを含む新規タンパク質の断片および誘導体も、それをコードするＤＮＡ配列とともに提供する。当業者には、保存的なアミノ酸置換のために新規タンパク質とは配列がわずかに異なるタンパク質をも提供するということは明白であろう。当業者には、この新規タンパク質が標準的な方法によって組換え体として発現され得るということも明白であろう。この新規タンパク質は、例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼなどの他の様々なタンパク質との融合タンパク質としても発現させ得る。
【００６０】
本発明は、配列番号３０−３８および１２７−１２９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するＷＷドメインを含む、精製ポリペプチドを提供する。そのポリペプチドをコードする精製ＤＮＡをも提供する。
【００６１】
配列番号４６、４８、５０、および１２６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＷＷドメインを含む精製ポリペプチドをも提供する。そのポリペプチドをコードするＤＮＡをも提供する。
【００６２】
配列番号４５、４７、４９、および１２５から成る群から選択される配列を有し、ＷＷドメインをコードする精製ＤＮＡをも提供する。この精製ＤＮＡを含む核酸ベクターをも提供する。この核酸ベクターを含む組換え細胞をも提供する。
【００６３】
配列番号４６、４８、５０、および１２６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする精製ＤＮＡをも提供する。この精製ＤＮＡを含む核酸ベクターをも提供する。この核酸ベクターを含む組換え細胞をも提供する。
【００６４】
配列番号３０−３８、および１２７−１２９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする精製ＤＮＡをも提供する。この精製ＤＮＡを含む核酸ベクターをも提供する。この核酸ベクターを含む組換え細胞をも提供する。
【００６５】
配列番号４６、４８、５０、および１２６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのＷＷドメインを含む精製分子をも提供する。
（ａ）配列番号４６、４８、５０、１２６、３０−３８、および１２７−１２９のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＷＷドメインを含むアミノ酸配列を含み、（ｂ）少なくとも６あるいは１０あるいは２０の異なるポリペプチド由来のアミノ酸のアミノ酸配列に、ペプチド結合を介して結合する、融合タンパク質をも提供する。この融合タンパク質をコードする精製ＤＮＡをも提供する。この融合タンパク質をコードする精製ＤＮＡを含む核酸ベクターをも提供する。この核酸ベクターを含む組換え細胞をも提供する。前記融合タンパク質をコードする核酸ベクターを含む組換え細胞を、前記融合タンパク質が発現されるように培養すること、および発現した融合タンパク質を回収することを含む、この融合タンパク質を作出する方法をも提供する。
【００６６】
本発明は、配列番号４５、４７、４９、および１２５から成る群から選択される配列を有する核酸とハイブリッド形成可能な、精製核酸をも提供する。
本発明は、配列番号３０−３８および１２７−１２９から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体をも提供する。
【００６７】
本発明は、配列番号４６、４８、５０および１２６から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する抗体をも提供する。
本明細書中の例として、コンビナトリアルペプチドライブラリーに由来するＷＷドメインのリガンドを含む認識単位を、本発明の方法においてＷＷ機能ドメインを含む新規タンパク質をすみやかに発見するためのプローブとして用いられ得ることを論証した。本発明の方法には、発見の過程をはじめるためにＷＷドメインの天然の細胞のリガンドの特徴があらかじめ知られている必要がない。ランダムペプチドライブラリーからペプチドを選択するためには、十分な精製ＷＷドメイン含有タンパク質（例としては、１−５μｇ）のみが必要となる。加えて、本発明の方法は結合特性のみに基づいてｃＤＮＡ発現ライブラリーから新規タンパク質を同定するため、標的ＷＷドメインと発見される新規タンパク質との間の１次配列の同一性が低いことは、もしこれらのＷＷドメイン間の機能的な類似性がいくらか保存されているならば、制限となる必要はない。その上、本発明の方法は、すみやかであり、安い試薬を必要とし、かつ単純で十分確立された実験室手法を採用している。
【００６８】
これらの方法を用い、異なる６つのＷＷドメイン含有タンパク質を同定したが、これらのうちの４つは以前に記載されていないものである。これらの新規タンパク質を、６．１および６．１．１．節にてより完全に記載する。本発明の方法によって同定された新規タンパク質の高い出現率は、多数のＷＷドメイン含有タンパク質が発見されずにあることを示している。
【００６９】
上に記載の新規タンパク質を、本明細書中に記載のタンパク質の様々な応用においてまるごと用いる必要がないことを、当業者は理解するだろう。多くの場合、新規タンパク質の、ＷＷドメインを含む部分を採用することで十分であろう。ＷＷドメイン含有タンパク質のこのような典型的な部分を図５に示す。従って、本発明は、例えば図５に示すような、ＷＷを含む新規タンパク質の誘導体（例えば、断片およびこれらの断片を含む分子）を提供する。これらの断片あるいは他の誘導体をコードする核酸をも提供する。
【００７０】
５．１．１．  ＷＷドメイン
本発明の実施における目的のＷＷドメインは、多くの形態をとることができ、様々な機能を果たし得る。例えば、このようなＷＷドメインは、細胞シグナル伝達、転写調節、タンパク質のユビキチン化、細胞接着、細胞骨格形成など、細胞の、生化学的な、あるいは生理的な過程の多くに関与し得る。本発明の特定の態様においては、目的のＷＷドメインは、ＹＡＰ、Ｎｅｄｄ−４、ＲＳＰ５、ジストロフィン、ユートロフィン、ｅｓｓ１、ＦＥ６５、ＨＵＭＯＲＦ１、および多数の他のものなどのタンパク質内に見出され得る。
【００７１】
本発明の一態様においては、選択された目的のＷＷドメインを含む、標的となる適した分子を選択する。ＹＡＰ、Ｎｅｄｄ−４、ＲＳＰ５、ジストロフィン、ユートロフィン、ｅｓｓ１、ＦＥ６５、およびＨＵＭＯＲＦ１を含む、しかしそれらに限定されない、多数のタンパク質を標的分子として選択し得る。あるいは、ＷＷドメインを含む、上に述べたタンパク質の一部分を標的分子として選択し得る。
【００７２】
５．１．２．  認識単位
「認識単位」という用語によって、標的分子のＷＷドメインに対する選択的親和性を有する、そして、好ましくは約２０，０００ダルトンまでの分子量を有する分子が表現される。本発明の特定の態様において、認識単位は、約１００から約１０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。
【００７３】
したがって、本発明の好ましい認識単位は約１００から約５，０００ダルトンの分子量を有しており、好ましくは約１００から約２，０００ダルトンの、そしてもっとも好ましくは約５００から約１，５００ダルトンの分子量を有する。さらに以下に記述するように、本発明の認識単位は、ペプチド、炭水化物、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、いずれかの小さな合成分子、または天然産物であり得る。認識単位がペプチドであるとき、そのペプチドは、好ましくは、約６から約５０アミノ酸残基からなる。
【００７４】
認識単位がペプチドの時、そのペプチドは約１４０より少ないアミノ酸残基を有することができ、好ましくは、そのペプチドは約１００より少ないアミノ酸残基を有し、好ましくは、そのペプチドは約７０より少ないアミノ酸残基を有し、好ましくはそのペプチドは２０から５０アミノ酸残基を有し、もっとも好ましくはそのペプチドは約６から６０アミノ酸残基を有する。
【００７５】
ペプチド認識単位は好ましくは、（随意にアルカリホスファターゼ、あるいはホースラディッシュペルオキシダーゼのようなラベルと結合した）アビジンあるいはストレプトアビジン、そしてビオチン化ペプチドを含む多価ペプチド複合体の形態である。
【００７６】
本発明によると、認識単位（好ましくは多価認識部位複合体の形態）は、天然のＲＮＡあるいはＤＮＡ（たとえば、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムライブラリー）に存在する核酸配列を含む遺伝子配列の発現産物の多数をスクリーニングするのに用いられる。
【００７７】
認識単位を選択する段階は、目的のＷＷドメインへ結合するペプチドのために、ｃＤＮＡライブラリーあるいはランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることを含むが、それに限定されない、当業者に既知の多くので成し遂げられる。本質的には、ＷＷドメインに結合するペプチドに対して、ｃＤＮＡライブラリーあるいはランダムペプチドライブラリーを選別する事は、ＳＨ３ドメインへ結合するペプチドに対する、ｃＤＮＡライブラリーあるいはランダムペプチドライブラリーのスクリーニングについてと同様の手法によって成し遂げられることができる。たとえば、ＳＨ３ドメインに結合するペプチドを探索するためのペプチドライブラリーのスクリーニングについてのYuら（1994 Cell 76，933-945）；Sparksら（1994，J．Biol．Chem．269，23853-23856）；Sparksら（1996，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:1540-1544）を参照。あるいは、小さな分子、あるいは薬は、ＷＷドメインを含むある標的分子に結合することが当業者に既知である可能性がある。認識単位はまた、リード物質から合成されてさえもよく、それは、再びペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド、小さい薬分子などでよい。認識単位はまた、他の、ＷＷドメインに選択的に結合する能力を有する既知の認識単位と相同性を有する分子の調査（好ましくはデータベースを介して）を行うことによって使用するために同定されうる。
【００７８】
特定の態様において、利用のための認識単位の選別の段階は、たとえば、ＷＷドメインに特異的に結合する分子に対してスクリーニングされ得る、ランダム、あるいはコンビナトリアルのペプチド、あるいは非ペプチドライブラリーのような多様性ライブラリーの利用によってもたらされうる。たとえば化学的に合成されたライブラリー、組換え体（たとえばファージディスプレイライブラリー）、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に基礎をおくライブラリーを用いることができる多くのライブラリーが、当該技術分野において知られている。
【００７９】
化学的に合成されたライブラリーの例は、Fodorら（1991，Science 251:767-773）；Houghtenら（1991，Nature 354:84-86）；Lamら（1991，Nature 354:82-84）；Medynski（1994，Bio/Technology 12:709-710）；Gallopら（1994，J．Medicinal Chemistry 37(9):1233-1251）；Ohlmeyerら（1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10922-10926）；Erbら（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:11422-11426）；Houghtenら（1992，Biotechniques 13:412）；Jayawickremeら（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:1614-1618）；Salmonら（1993，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:11708-11712）；PCT国際公開第WO93/20242号;そしてBrennerおよびLerner（1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5381-5383）に記載されている。
【００８０】
ファージディスプレイライブラリーの例は、scottおよびSmith（1990，Science 249:386-390）；Devlinら（1990，Science，249:404-406）；Christian，R.B.ら（1992，J．Mol．Biol．227:711-718）；Lenstrd（1992，J．Immunol．Meth．152:149-157）；Kayら（1993，Gene 128:59-65）；そして1994年8月18日に発行されたPCT国際公開第WO 94/18318号に記載されている。
【００８１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳に基礎をおいたライブラリーは、１９９１年４月１８日に発行されたＰＣＴ国際公開第WO 91/05058号;Mattheakisら（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9022-9026）に記載されているものを含むが、それに限られない。
【００８２】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー(たとえばBunin et al.，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:4708-4712を参照。)は利用に適合しうる。ペプトイド（peptoid）ライブラリー（Simon et al.，1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9367-9371）もまた利用することができる。ペプチド内のアミド相関性（functionality）が、化学的に変換したコンビナトリアルライブラリーを生み出すために過メチル化（permethylate）されている、利用できうるライブラリーの別の例は、Ostreshらによって記述されている(1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:11138-11142)。
【００８３】
本発明で利用可能な非ペプチドライブラリーの多様性は大きい。たとえば、EckerおよびCrooke（1995，Bio/Technology 13:351-360）は、多様なライブラリーの基礎を形成する化学的種の中である、ベンゾジアゼピン類、ヒダントイン類、ピペラジネディオン類、ビフェニル類、糖アナログ類、β−メルカプトケトン類、アリールアセトン酸類、アシルピペラジン類、ベンゾピラン類、キュバン類、キサンチン類、アミニミド類、及びオキサゾロン類を列挙している。
【００８４】
非ペプチドライブラリーは、広くは二つの種類に区分できる。装飾された単量体とオリゴマーである。装飾された単量体ライブラリーは、様々な官能基を付加した、比較的簡単な骨格構造を用いている。しばしば骨格は既知の有用な薬理学的活性のある分子であり得る。たとえば、骨格はベンゾジアゼピン構造であり得た。
【００８５】
非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単量体の順序に依存した新しい形を作り出す方法にて、一緒に組み立てられる多数の単量体を利用する。使用された単量体部位の中には、カルバメート類、ピロリノン類、そしてモルイホリノ類がある。その側鎖が、α−炭素というよりα−アミノ基についているペプトイド、ペプチド類似オリゴマーは、非ペプチドオリゴマーライブラリーの別の型の基礎を形成する。第一の非ペプチドオリゴマーライブラリーは、単量体の単一型を利用し、故に繰り返し骨格を含んだ。最近のライブラリーは一つ以上の単量体を利用しており、それはライブラリーに柔軟性を加えた。
【００８６】
ライブラリーのスクリーニングは、一般に知られている多数の方法の多様性のいずれかによって成し遂げられる。たとえば、ペプチドライブラリーのスクリーニングをあらわす以下の参考文献を参照。ParmleyおよびSmith（1989，Adv．Exp．Med．Biol．251:215-218）；ScottおよびSmith(1990，Science 249:386-390)；Fowlkesら（1992;BioTechniques 13:422-427）；Oldenburgら（1992，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 89:5393-539７）；Yuら（1994，Cell 76:933-945）；Staudtら（1988，Science 241:577-580）；Bockら（1992，Nature 355:564-566）；Tuerkら（1992，Proc．Natl．Acad．Scu．USA 89:6988-699２）；Ellingtonら(1992，Nature 355:850-852)；すべてLadnerらに対する米国特許第5,096,815号、米国特許第5,223,409号、米国特許第5,198,346号;RebarおよびPabo（1993，Science 263:671-673）；およびPCT国際公開第WO 94/18318号。
【００８７】
特定の態様において、認識単位を同定するためのスクリーニングは、ライブラリー構成物を、固相上に固定化されたＷＷドメインと接触させ、ＷＷドメインへ結合したそれらのライブラリー構成物を採取することで行うことができる。「パニング」といわれるこのようなスクリーニング技術の例は、ParmleyおよびSmith（1988，Gene 73:305-318）；Fowlkesら（1992，BioTechniques 13:422-427）；PCT国際公開第WO 94/18318号および本明細書中で  すでに引用した参考文献中に実施例の方法として記述されている。
【００８８】
別の態様において、イーストの中での相互作用しているタンパク質の選別のための２ハイブリッド系（two-hybrid system）（Fields and Song，1989，Nature 340:245-246;Chienet al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:9578-9582）は、ＷＷドメインへ特異的に結合する認識単位を同定するのに使用することができる。
【００８９】
認識単位がペプチドの場合には、ペプチドは、ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、または偏ったペプチドライブラリーを含むいずれかのペプチドライブラリーから簡単に選別することができる。「偏った」という語は本明細中では、ライブラリーを生成するための方法が、結果として生じている分子、この場合ペプチド、の収集物の、多様性を支配している一つか、またはそれ以上のパラメーターを制限するために扱われることを意味するために用られている。
【００９０】
ゆえに、本当にランダムなペプチドライブラリーは、その中でペプチドの所定の位置に特定のアミノ酸が見いだされる確率が、すべての２０アミノ酸について同じであるペプチドの収集物を生じるだろう。しかしながら、偏りは、たとえば、リシンは毎５個目のアミノ酸に現れる、または、デカペプチドライブラリーの４、８、および９の位置は、アルギニンのみを含むように固定されているなどと条件設定することで、ライブラリー内に導入され得る。わかりやすくいえば、多くの型の企図することができ、本発明はいずれかの特定の偏りに制限されない。さらに、本発明はファージディスプレイライブラリー及びＤＮＡインサートを伴うラムダファージベクターを含むＤＮＡ構築物を利用するもののような特定の型のペプチドライブラリーを企図している。
【００９１】
以上で言及したように、認識単位がペプチドである場合、ペプチドは約６から約６０以下のアミノ酸残基を有し、好ましくは約６から約２５アミノ酸残基、そして、もっとも好ましくは、約６から約１５アミノ酸残基を有する。別の態様において、ペプチド認識単位は２０−１００アミノ酸、あるいは、２０−５０アミノ酸の範囲である。
【００９２】
選択された認識単位は、化学的合成または、組換え発現によって取得すること。ができる化学的合成は当該技術分野で既知の技術を用いて成し遂げられ得る。
例として、しかしながら限定するための物ではないが、ペプチドは、ポリスチレンまたはTentaGelR（Tubingen，Germany）を含むが、これには限定されない、標準支持レジン上の標準固相Ｆｍｏｃペプチド化学物質（Knorr et al.，1989，Tetrahedron Lett．30:1927-1930）の変形物を用いて合成することができる。産物収量は合成に使用するＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）溶媒混合物を変化させることで増加させうる。具体的には、プロリンの豊富な領域は妥当な収量を得るために、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）あるいはＮＭＰ（Ｎ−メチルピラリドン）との共溶媒として５０％ＤＭＳＯを使用することを必要とする。加えて、ビオチン化に関しては、ビオチンは純のＤＭＦまたはＮＭＰにほんのわずかしか溶けないので、ゆえに本試薬はカップリングの前に、ＤＭＳＯに溶かし、それからＮＭＰまたはＤＭＦ中で５０％に希釈した。さらに、特定のリガンドに依存して、ビオチンは時々それとリガンドとの間にスペーサー部分を必要とする。多くのスペーサーは一般にビオチン化ペプチドの合成に用いられるが、水溶媒系での可溶性を改善するために、スペーサー領域にリシンを組み込むことが必要であることが見つかった。具体的には、典型的な１５−２０マーのプロリンに富んだペプチドにおいて、二つの酸性部分が、いずれかの所定の塩基性部分の代わりになり、可溶性を保存するが、その可溶性は、ペプチドが３もしくはそれ以上の塩基性部分を含むときに最もよいことがわかった。
【００９３】
選別された認識単位は、化学合成あるいは，組換え発現のいずれかによって手に入れたかどうかにかかわらず、好ましくは、多数の遺伝子配列のスクリーニングにおいて使用する前に精製する。
【００９４】
５．１．３．  ポリペプチドの源のスクリーニング
認識単位を選んだ後、認識単位は、好ましくはＷＷドメインを含んでいる多数のポリペプチドと接触する。本発明の特定の態様において、多数のポリペプチドは、ポリペプチド発現ライブラリーから入手される。ポリペプチド発現ライブラリーは、次には、ｃＤＮＡ、断片化されたゲノムＤＮＡ、などから入手しうる。特定な態様において、スクリーニングされたライブラリーは、一般には生物体の全ポリＡ＋ＲＮＡのｃＤＮＡライブラリー、あるいは一般的には、細胞あるいは組織型の、あるいは発現段階の、あるいは疾病状態または疾患段階のｃＤＮＡライブラリーである。発現ライブラリーは、組換えバクテリオファージ、ラムダファージ、Ｍ１３、組換えプラスミドあるいはコスミドなどを含む（しかしそれに限定されない）当業者に既知の、多くの発現媒体を利用しうる。
【００９５】
多数のポリペプチド、あるいはそれをコードするＤＮＡ配列は、原核生物性、あるいは真核生物性細胞、天然型、組換え体、または変異体のいずれかのような、天然または非天然の様々な源から入手されうる。特に、多数のポリペプチドはバクテリア、酵母、または真菌のような微生物に対して、ウイルスに対して、（ほ乳類、無脊椎動物、は虫類、鳥類、及び昆虫を含む）動物に対して、あるいは植物細胞に対して内因的でありうる。
【００９６】
加えて、多数のポリペプチドは、ビリオン粒子の表面コート、特定な細胞溶解物、組織抽出物のようなより特定の源から得られる可能性があり、あるいは、それらは、細胞膜の表面に発現しているそれらのポリペプチドに限定されうる。
【００９７】
さらに、多数のポリペプチドは、血液、血漿、血清、尿、便、粘液、精液、膣液、羊水、または脳脊髄液を含む（しかしそれらに限定されない）、特にヒト由来の、生物学的体液より入手しうる。多数のポリペプチドは発酵ブロスまたはコンディション培養液より入手してさえよく、それは、すでにブロスまたは培養液中で細胞により分泌または産成されたすべてのポリペプチド産物を含む。
【００９８】
認識単位を多数のポリペプチドと接触する段階は、いくつかの経路でもたらされる可能性がある。例えば、一つは認識単位を固相支持体に固定し、その固定化された認識単位と接触する多数のポリペプチドの溶液をもってくることを企図しうる。そのような手順は、固定化した認識単位を含む親和性基質を有する、アフィニティークロマトグラフィーの行程に類似している。認識単位に対する選択的な親和性を有するポリペプチドは、親和性選別によって精製されうる。固相支持体の性質、固相支持体への認識単位の接着のための工程、溶媒、そして親和性分離、あるいは選別手順の条件は使用する認識単位の型に依存しうるが、多くは伝統的で、当業者によく知られているものである。さらに、ポリペプチドをスクリーニングするために使用する認識単位複合体中の認識単位の価数は、スクリーニング段階の特異性に影響すると信じられており、したがって、価数は、希望する特異性の観点において適切な様に選ぶことができる。（セクション５．２および５．２．１を参照。）
もしくは、多数のポリペプチドを、実質的に個々のポリペプチドを含む分離画分に分けうる。例えば、多数のポリペプチドをゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、またはポリペプチドの分離のための当業者に既知の類似の方法によって分離することができる。個々のポリペプチドはまたその外側の表面の上に、または周りに発現させるためのそのような方法において形質転換させた宿主細胞によって生み出すこともできる。次いで個々の単離物は、認識単位及び個々のクローン間に何らかの選択的親和性相互作用が起こっているかどうか決定するために、場合により発現するために要求されるべき誘導物質の存在下で、認識単位によって「プローブ化」することができる。認識単位を個々のポリペプチドを含むそれぞれの画分と接触する前に、ポリペプチドをまず付加的な簡便さのために固相支持体へ移すことができた。そのような固相支持体は、単に、ニトロセルロースまたはナイロンで作られたもののようなフィルター膜の一部分でありうる。
【００９９】
この方法において、陽性クローンは発現ライブラリーの形質転換された宿主細胞の収集によって同定され得、それは、認識単位に対する選択的な親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構造を収容する。陽性クローンによって作られるポリペプチドは、目的のＷＷドメイン、またはそれと機能的に等しいものを含む。さらに、認識単位に対する選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は、伝統的な手法によって直接決定されるか、または、ポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列はしばしば、より簡便に決定されうる。次いで一次配列は、相当するＤＮＡ配列から導き出すことができる。
【０１００】
アミノ酸配列がポリペプチドそれ自身から決定すべき場合は、ミクロ配列決定技術を使うことができる。配列決定技術はマススペクトロスコピーを含みうる。
ある状況において、選択的親和性相互作用の存在（例えば、洗浄段階後に結合したまま残っている認識単位の存在）の決定、あるいは検出を試みる前に、認識単位と多数のポリペプチドとの混合物から非結合の認識単位を洗い流すことが望ましい。そのような洗浄段階は、多数のポリペプチドが固相支持体に結合したときに、特に望まれる可能性がある。
【０１０１】
予想できるように、観察された選択的親和性の度合いは、広く変化し、一般的に約１ｎｍから約１ｍＭの範囲に落ち着く。本発明の好ましい態様においては、選択的親和性は約１０ｎＭから約１００μＭまでのオーダー、さらに好ましくは約１００ｎＭから約１０μＭ、そしてもっとも好ましくは、約１００ｎＭから約１μＭ間でのオーダーに落ち着く。
【０１０２】
５．２．  認識単位の特異性
特定の認識単位はＷＷドメイン（同一のＷＷドメインあるいは、異なった種類のＷＷドメイン、あるいは目的のＷＷドメインの機能的相同物）を有するポリペプチドの「パネル」のいくつかの構成物（例えば、３つまたは４つ、またはそれ以上）に対するかなりの一般的選択性を有し、または、同一の「パネル」の間でポリペプチドの一つもしくは二つ、あるいは三つだけに対するかなりの特異的選択性を有する可能性がある。さらに、それぞれがポリペプチドの「パネル」の間で選択性の範囲を示す複数の認識単位を使用して、ＷＷドメインを含む付加的なポリペブチドのますます広範囲にわたるセットを単離することができる。
【０１０３】
よって、関連するポリペプチド母集団において、それぞれの構成物のＷＷドメインは円によって略図的に表現されうる。例として、図６Ａを参照。一つのポリペプチドの円は、他のポリペプチドのものと重なりうる。そのような重なりはそれぞれのポリペプチドについて、ほとんどない場合、たくさんある場合もある。特定の認識単位であるＡは、認識され、あるいは他のいずれかの円と重ならない所定のポリペプチドの円の一部と相互作用しうる。このような認識単位はそのポリペプチドに対してかなり特異的であろう。一方、第二の認識単位であるＢは、２つあるいはそれ以上のポリペプチドとの間で重なる領域を認識しうる。このような認識単位はしたがって、認識単位Ａに比べて特異性は小さく、そしてそれが認識し、相互作用するポリペプチドの数に依存して、より一般的な特異性を有すると特徴づけることができる。
【０１０４】
おのおの違うポリペプチドの「パネル」を認識する、いくつかの数のＢ−型認識単位（Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３その他）が存在しうることは、当業者には明らかであるに違いない。よって、複数の認識単位の使用は、ますます網羅的なポリペプチドの母集団を提供し、それらはおのおの当初の標的分子に存在するＷＷドメインに変化、あるいは、進化を提示する。本方法が、ある特定のポリペプチドの同定が、別の認識単位の選択につながり得るような繰り返し様式にて応用することができることも明らかである。例えば図６Ｂを参照。この新しい認識単位の利用は、次いで、「関連する」ポリペプチドの集団の表現型的、及び／あるいは遺伝子型的多様性を高めるＷＷドメインを含む他のポリペプチドの同定につながるであろう。
【０１０５】
ゆえに、所定の認識単位を用い、ただ一つ、または二つの異なるポリペプチドとの相互作用を観察しうる。他の認識単位によって、三つ、四つ、またはそれ以上の選択的相互作用を探すことができる。ただ一つの相互作用が観察された状況において、選択的親和性相互作用が、認識単位と当初の標的分子（あるいは、構造的、および「機能的」に当初の標的分子と非常に類似の分子）の複製物（replica）の間にあることは、必須ではないけれど、起こりそうである。
【０１０６】
５．２．１．  認識単位−ＷＷドメイン相互作用の特異性への認識単位の提示の影響
本発明者は、思いがけなく、発現ライブラリーあるいは他のポリペプチド源をスクリーニングするために利用される、認識単位の価数（例えば、それが単量体か、二量体か、三量体などかどうかにかかわらず）が、発現ライブラリーまたはポリペプチド源から同定される、遺伝子あるいはポリペプチドに、一見すると著しい影響を与えることを発見した。特に、認識単位−ＷＷドメイン相互作用の特異性は、スクリーニングする過程での認識単位の価数に影響されるようである。この特異性によって、スクリーニング過程においての認識単位が結合するＷＷドメインにおける選択性が表現される。
【０１０７】
以上で議論したように、一つの態様において、認識単位は、認識単位源、例えばファージディスプレイライブラリーを、特定の標的のＷＷドメインに結合する認識単位としてスクリーニングすることで入手する。あるいは既知の認識単位と相同する配列を用いた、認識単位のデータベース検索を行うことができる。もちろん、もし特定の標的のＷＷドメインに対する認識単位がすでに知られているならば、ライブラリーあるいは他の認識単位源をスクリーニングする必要はない。単にその特定の認識単位を合成できる。しかしながら、次いで得られた認識単位を使用して、認識単位が結合するポリペプチドを同定するために、発現ライブラリーあるいは他のポリペプチド源をスクリーニングすることができる。標的のＷＷドメインのみを同定する認識部位は、完全に特異的な認識部位である。その標的のＷＷドメインを含む分子を同定するのに加えて、多数のポリペプチド（例えば、１０４、１０６、または１０８より多い数）の間から、全く同様な標的のＷＷドメインを含まない、一つまたは二つの他のポリペプチドを同定する認識単位は、とても、あるいは大いに特異的である。標的のＷＷドメインを同定するのに加えて、標的のＷＷドメインを含まない多数の他のポリペプチドの存在を同定する認識単位は、非特異的認識単位である。非常に特異的な認識単位と非特異的認識単位の間で、本発明者はその標的のＷＷドメイン以外の少数のＷＷドメインを有する分子を認識する認識単位があることを発見した。これらの認識単位は一般的特異性を持っているという。
【０１０８】
したがって、完全に特異的なものおよび非常に特異的なものから、一般的に特異的なものを介して非特異的なものまで、認識部位が明示できうる「特異性連続体」が存在する。この特異性連続体の描写としては図１３を参照。出願人は、認識単位によって提示された特異性に影響する主な因子が、発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いた複合体内の、多価の認識単位でありうることを発見した。
【０１０９】
通常、高い特異性はライブラリーをスクリーニングするときに望ましいと考えられる。高い特異性は、例えば、一般的にはとても特異的な、親和性精製ポリクローナル抗血清によって提示される。モノクローナル抗体もとても特異的である。一方、一価の型の小さなペプチドは一般的にライブラリーをスクリーニングするときにはとても弱く、非特異的なシグナルを出し、故に、それらは非特異的と見なされる。
【０１１０】
本発明者は、小さなペプチドの型での、多価型での、認識単位が、抗体の高い特異性と、一価ペプチドの低／非特異性の中間の特異性を有することを発見した。遺伝子ライブラリーをスクリーニングするために利用する認識単位複合体の、少なくとも二つの認識単位の多価性は、その中で、特異性が弱められ、しかし消滅はしないスクリーニングを達成するために好ましく、少なくとも４つの多価性をもつことはさらに好ましい。特に、（好ましくは、標識、例えばアルカリフォスファターゼ、またはホースラディッスフォスファターゼ、またはグリーンフルオロッセンスタンパク質の様な蛍光物質（fluorogen）といった酵素と結合している）ストレプトアビジンまたはアビジンを含む多価の（四価と考えられている）認識単位複合体、及びビオチン化ペプチド認識単位は、予期しない一般的特異性を有す。これは、このようなペプチドをライブラリーをスクリーニングするのに使用して、ペプチドの標的のＷＷドメインに似ているが、しかし同一ではないＷＷドメインを含むポリペプチドのクラスを同定することができる。このクラスの構成物のＷＷドメインのアミノ酸レベルにおいて、低いレベルでの相同物にもかかわらず、ポリペプチドのこれらのクラスは同定される。
【０１１１】
別の特定の態様において、多価のペプチド認識単位は、多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）（Tam，1989，J．Imm．Meth．124:53-61;Tam，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5409-5413）の型であり得る。この型ではペプチド認識単位は、固相ペプチド合成法を用いた分岐リシル基質上で合成される。MAPの型の認識単位は、当該技術分野で知られている方法(Tam，1989，J．Imm．Meth．124:53-61;Tam，1988，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5409-5413)、または、例えば、製造者によって確立された方法論を用いる、ＭＡＰレジン上の段階的固相手法（Applied Biosystems）によって調製されうる。（認識単位ペプチド）２Ｌｙｓ１、（認識単位ペプチド）４Ｌｙｓ３、（認識単位ペプチド）８Ｌｙｓ６または、さらなる分岐を含むＭＡＰペプチドを合成されうる。
【０１１２】
多価ペプチド認識単位複合体はまた、坦体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などに、既知の架橋試薬を用いることでペプチドを架橋して調製しうる。そのような架橋されたペプチド認識単位は、例えば、坦体タンパク質に対する抗体、または、坦体タンパク質の酵素的活性の検出によって検出することができる。
【０１１３】
さらに、本発明者は、様々な型の認識単位及びその複合体によってどんな特異性が提示されているか、すなわち、これらの認識単位及びその複合体がどこの特異性連続体に落ち着くかを発見した。本発明者は、ライブラリーをスクリーニングするために用いた認識単位を提示するためのフォーマットの範囲を発見した。一価ペプチド、例えば、合成ペプチドそれ自身は、非特異的である。二価の、アルカリホスファターゼとの融合タンパク質の型のペプチドは非常に特異的である。バクテリオファージ由来のＭ１３のＰＩＩＩタンパク質との融合タンパク質で、ファージ表面に発現している型と同一のペプチドは、やや少ないが、まだ高い特異性を持つ。その同一のペプチドは、四価の、ストレプトアビジンーアルカリホスファターゼ複合体の型のビオチン化したとき、一般的な特異性を持つ。このような一般的な特異性ペプチドを使用することで、広い範囲の、発現ライブラリーあるいは他のポリペプチド源由来のタンパク質の同定を可能にし、おのおののタンパク質は特定のＷＷドメインの例を含む。
【０１１４】
よって、本発明は、多数のポリペプチドをスクリーニングするための認識単位として利用できうるペプチドのような、ペプチドの特異性を調整する方法、従って、ＷＷドメインを有するポリペプチドを同定する方法を提供する。特定の態様において、特異性は、高い特異性の条件下で、認識単位に結合すると知られている標的のＷＷドメインを有するポリペプチドから、配列が変化するＷＷドメインを有するポリペプチドを同定するために提供するくらい、一般的である。特定の態様において、本方法は、発現ライブラリーをスクリーニングするのに使用する前に、ビオチン化ペプチドおよびストレプトアビジンーアルカリホスファターゼの四価複合体を形成することを含む。
【０１１５】
５．３．  キット
本発明は、薬物候補のスクリーニングにおいて有用でありうる検定用キットにも関する。本発明の具体的な実施態様において、１個またはそれ以上の容器中に（ａ）ＷＷドメインを含有するポリペプチド；および（ｂ）そのポリペプチドに選択的親和性を有する認識単位を含む検定用キットが企図される。そのキットは、場合により、ポリペプチド−認識単位相互作用の存在またはその不存在を確認するための検出手段を更に含む。
【０１１６】
具体的な実施態様において、ＷＷドメイン含有ポリペプチドかまたは認識単位を標識する。広範囲の標識を本発明において役立つように用いることができ、慣用的な手段によるビオチンに対する認識単位の結合が含まれるが、これに制限されるわけではない。或いは、標識は、例えば、フルオロジェン（fluorogen）、酵素、エピトープ、色素原または放射性核種を含むことができる。好ましくは、ビオチンは、ポリペプチドかまたは認識単位に対して共有結合によって結合される。ポリペプチドまたは、好ましくは、認識単位は、固体支持体上に固定されている。標識を検出するのに用いられる検出手段は、標識の性状に依存するであろうし、そして当該技術分野において知られているいずれか、例えば、放射性核種を検出するフィルム；酵素の存在を検出するための検出可能なシグナルを生じる酵素基質；エピトープの存在を検出する抗体等でありうる。
【０１１７】
本発明の検定用キットのもう一つの実施態様は、それぞれのポリペプチドがＷＷドメインを含有している複数のポリペプチドの使用を含む。検定用キットは、複数のポリペプチドそれぞれに選択的親和性を有する少なくとも一つの認識単位およびポリペプチド−認識単位相互作用の存在またはその不存在を確認するための検出手段を更に含む。
【０１１８】
１個またはそれ以上の容器中に、ＷＷドメインを含む第一分子およびＷＷドメインに対して結合する第二分子、すなわち、認識単位を含み、そのＷＷドメインは、本発明の方法によって識別される新規ＷＷドメインであるキットを提供する。
【０１１９】
上の検定用キットにおいて、ポリペプチドは、配列番号１２〜２８および２９から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。そのポリペプチドは、配列番号４６、４８、５０、１２６、３０〜３８および１２７〜１２９から成る群より選択されるアミノ酸配列も含むことができる。
【０１２０】
上記の検定用キットの他の実施態様において、認識単位はペプチドであってよい。その認識単位は、例えば、酵素、エピトープ、色素原またはビオチンで標識することができる。
【０１２１】
本発明はまた、１個またはそれ以上の容器中に、
（ａ）複数の精製された種々のポリペプチドであって、それぞれのポリペプチドが別々の容器中にあり、そしてそれぞれのポリペプチドがＷＷドメインを含有する上記ポリペプチド；および
（ｂ）前記複数のポリペプチドのそれぞれのＷＷドメインに選択的親和性を有する少なくとも１個のペプチドであって、場合により、２個以上のペプチドとして存在する場合、それぞれのペプチドも別々の容器中にあることができる上記ペプチドを含む検定用キットを提供する。
【０１２２】
本発明はまた、ＷＷドメインを含む複数の精製されたポリペプチドを含み、それぞれのポリペプチドが別々の容器中にあり、そしてそれぞれのポリペプチドは異なった配列のＷＷドメインを有するが、同様の結合特異性を示す（適当な条件下において同様の分子に対して結合する）ことができる、キットを提供する。
【０１２３】
上記のキットにおいて、ポリペプチドは、配列番号１２〜２８および２９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することができる。そのポリペプチドは、配列番号４６、４８、５０、１２６、３０〜３８および１２７〜１２９から成る群より選択されるアミノ酸配列も有することができる。
【０１２４】
キットの分子成分は、好ましくは、精製されている。
本発明のキットは、５．４節で記載される新規薬物候補を同定し且つそれらの特異性を確認する方法で用いることができる。
【０１２５】
５．４．  可能性のある薬物候補の発見およびそれらの特異性の確認のための検定
本発明はまた、可能性のある薬物候補（およびリード化合物）を識別し且つそれらの特異性を確認する方法を提供する。例えば、ＷＷドメインを含有するポリペプチドおよび認識単位、例えば、結合ペプチドが、互いに選択的親和性を示すということが分かれば、ポリペプチド−認識単位相互作用に対して、例えば、その相互作用のアゴニストとしてかまたはアンタゴニスト（阻害剤）として作用することができる薬物の同定を試みることができる。この検定を用いて、次に、最も望ましい特性、例えば、相互作用を中断させる場合にまたはポリペプチドに対する結合に関して認識単位と競合する場合に最も有効性を示すものについて候補「薬物」の集合をスクリーニングすることができる。
【０１２６】
或いは、特定の認識単位が、同一の、類似のまたは機能的に同等のＷＷドメインを含有する異なったポリペプチドに対して示すことがある種々の選択性を用いることができる。したがって、可能性のある「パネル」の中で、特異的ポリペプチド−認識単位相互作用に対して向けられた一層選択的な活性を示す薬物候補を同定するスクリーニング法を特別に作ることができる。したがって、例えば、薬物候補は、望ましくない副作用をもたらすかもしれない特定の結合相互作用に対する作用の存在または不存在を確認するためにスクリーニングすることができる。
【０１２７】
一つの実施態様において、多数の異なった相互作用性ポリペプチド−認識単位対に対する薬物候補の作用が確認されるが、この場合、少なくとも若干の前記ポリペプチドは、ＷＷドメインの配列は異なるが、もう一つの前記ポリペプチドのＷＷドメインと同様の結合特異性を示すことができるＷＷドメインを有する。
【０１２８】
もう一つの実施態様において、前記少なくとも一つのポリペプチドまたは認識単位の少なくとも一つは、共通ＷＷドメインおよび共通認識単位をそれぞれ含有する。
もう一つの実施態様において、薬物候補は、ポリペプチド−認識単位相互作用の阻害剤であり、このことは、このような阻害剤の存在下における認識単位に対するポリペプチドの結合の減少を検出することによって確認される。
【０１２９】
もう一つの実施態様において、前記ポリペプチドは、
（ｉ）ペプチドライブラリーをＷＷドメインでスクリーニングして、ＷＷドメインを結合する１個またはそれ以上のペプチドを得；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのペプチドの一つを用いてポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上のポリペプチドを同定し；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして
（ｉｖ）ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上の新規ポリペプチドを製造することを含む方法によって製造されたＷＷドメイン含有ポリペプチドである。
【０１３０】
もう一つの実施態様において、前記ポリペプチドは、
（ｉ）ペプチドライブラリーをＷＷドメインでスクリーニングして、ＷＷドメインを結合する複数のペプチドを得；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたペプチドの共通配列を決定し；
（ｉｉｉ）その共通配列を含むペプチドを製造し；
（ｉｖ）その共通配列を含むペプチドを用いてポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上のポリペプチドを同定し；
（ｖ）工程（ｉｖ）で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして
（ｖｉ）ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上のポリペプチドを製造することを含む方法によって製造されたＷＷドメイン含有ポリペプチドである。
【０１３１】
好ましい実施態様において、多数の異なった相互作用性ポリペプチド−認識単位対に対する薬物候補の作用が確認されるが、この場合、好ましくは、少なくとも若干（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、７個または１０個）の前記ポリペプチドは、配列が異なるにもかかわらず同様の結合特異性を示す、すなわち、同様の認識単位に対して結合することができるＷＷドメインを有する。もう一つの具体的な実施態様において、前記ポリペプチドおよび／または認識単位の少なくとも一つは、共通ＷＷドメインおよび認識単位をそれぞれ含有する（したがって、天然に発現されたタンパク質であるということは分からない）。別の態様においては、ポリペプチドは本発明の方法により同定された新規ポリペプチドである。
【０１３２】
特定の実施態様において、ポリペプチド−認識単位相互作用の阻害剤は、このような阻害剤の存在下における認識単位に対するポリペプチドの結合の減少を検出することによって同定される。
【０１３３】
新規薬物の開発における共通の問題は、望ましい特性を欠いた多数の化合物のバックグラウンドの中から、望ましい特性を有する１種類のまたは少数の化合物を同定するということである。この問題は、植物、動物または微生物源からの天然産物である化合物を調べる場合にも、人工化合物を調べる場合にも生じる。典型的に、何百または何千もの化合物は、何等かの酵素活性に対する化合物の作用、受容体若しくは他のタンパク質などの標準物質に対して結合するそれらの能力、または受容体とそのリガンドとの間の結合を破壊するそれらの能力を監視するようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定の使用によって無作為にスクリーニングされる。
【０１３４】
この最初のスクリーニング試験に合格した化合物は、「リード」化合物として知られる。次に、これらリード化合物は、最終的には動物およびヒトでのｉｎ  ｖｉｖｏ試験を含めた更に別の試験を施され、それによって、最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験においてリード化合物によって示された可能性が確認されるかまたは反論される。Remington’s Pharmaceutical Sciences、1990年、A.R.Gennaro監修、第8章、60-62頁、Mack Publishing Co.,Easton,PA;EckerおよびCrooke（1995年,Bio/Technology 13:351-360）を参照されたい。
【０１３５】
上記の最初の試験段階を構成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定において新規化合物を試験することは引続き必要である。これら化合物の薬理活性を試験することができる新規検定もまた引続き必要である。本発明の目的は、候補化合物が、ＷＷドメインを含有するポリペプチドとそのＷＷドメインに対して結合する認識単位との間の結合に影響を与えることができるかどうかを確認するこのような新規検定を提供することである。特に、本発明の目的は、上記の検定において用いるためのＷＷドメインを含有するポリペプチド、特に、新規のポリペプチドおよびそれらの対応する認識単位を提供することである。これらポリペプチドの使用は、有用な薬理活性に可能性のある薬物候補をスクリーニングする（更には、不利なまたは望ましくない薬理活性を示す、可能性のある薬物候補を同定する）のに用いることができる検定の数を大きく増加させる。
【０１３６】
本発明の一つの実施態様において、このようなポリペブチドは、予め決定されたＷＷドメインに対して結合できる認識単位を用いてポリペプチド源をスクリーニングし、それによって、ＷＷドメインまたは類似のＷＷドメインを含有する新規ポリペプチドを同定することを含む方法によって同定される。
【０１３７】
上記の方法の特定の実施態様において、ＷＷドメインを含有する新規ポリペプチドは、
（ｉ）ペプチドライブラリーをＷＷドメインでスクリーニングして、ＷＷドメインを結合する１個またはそれ以上のペプチドを得；
（ｉｉ）工程（ｉ）からのペプチドの一つを、好ましくは、多価複合体の形で用いてポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上の新規ポリペプチドを同定し；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で同定されたポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして
（ｉｖ）ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上の新規ポリペプチドを製造することによって得られる。
【０１３８】
上記の方法のもう一つの実施態様において、ＷＷドメインを含有する新規ポリペプチドは、
（ｉ）ペプチドライブラリーをＷＷドメインでスクリーニングして、ＷＷドメインを結合するペプチドを得；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたペプチドの共通配列を決定し；
（ｉｉｉ）その共通配列を含むペプチドを製造し；
（ｉｖ）その共通配列を含むペプチドを用いてポリペプチド源をスクリーニングして、ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上の新規ポリペプチドを同定し；
（ｖ）工程（ｉｖ）で同定された新規ポリペプチドのアミノ酸配列を決定し；そして
（ｖｉ）ＷＷドメインを含有する１個またはそれ以上の新規ポリペプチドを製造することによって得られる。
【０１３９】
当業者は、本明細書中で記載の検定において、ＷＷドメインを含有する完全な新規ポリペプチドを用いることは必ずしも必要ではないということを理解するであろう。しばしば、ＷＷドメイン含有ポリペプチドの一部分、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＷＷドメイン融合タンパク質で充分であろう。ＷＷドメインを含有する典型的な新規ポリペプチドの一部分の表示については図５を参照されたい。
【０１４０】
本発明の典型的な検定は、少なくとも次の成分から成る。（１）ＷＷドメインを含む分子（例えば、タンパク質またはポリペプチド）；（２）ＷＷドメインに対して選択的に結合する認識単位；（３）ＷＷドメイン含有タンパク質と認識単位との間の結合に影響を与える能力を有すると考えられる候補化合物。検定成分は、更に、（４）ＷＷドメイン含有タンパク質と認識単位との結合を検出する手段を含むことができる。このような手段は、例えば、ＷＷドメインを含むタンパク質、認識単位または候補化合物に付けられた検出可能な標識でありうる。特定の実施態様において、ＷＷドメインを含むタンパク質は、本発明の方法によって発見された新規タンパク質である。
【０１４１】
もう一つの特定の実施態様において、本発明は、ＷＷドメインを含む分子とそのＷＷドメインに対して選択的に結合する認識単位との結合に影響を与える化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＷＷドメインを含む分子および認識単位を、候補化合物の存在下において結合の助けとなる条件下で接触させ、そして分子および認識単位間の結合の量を測定し；
（ｂ）工程（ａ）での結合の量と、候補化合物の不存在下において分子および認識単位間で起こることが知られているまたは確認された結合の量とを比較することを含み、ここにおいて、工程（ａ）での結合の量と、候補化合物の不存在下において分子および認識単位間で起こることが知られているまたは確認された結合の量との差は、その候補化合物が、ＷＷドメインを含む分子と認識単位との結合に影響を与える化合物であるということを示す上記方法を提供する。
【０１４２】
もう一つの特定の実施態様において、本発明は、ＷＷドメインを含む分子とそのＷＷドメインに対して選択的に結合する認識単位との結合に影響を与える化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＷＷドメインを含む分子および認識単位を、候補化合物の存在下において結合の助けとなる条件下で接触させ、そして分子および認識単位間の結合の量を測定し、ここにおいて、ＷＷドメインは、配列番号３０〜３７および３８から成る群より選択されるアミノ酸配列を有し；
（ｂ）工程（ａ）での結合の量と、候補化合物の不存在下において分子および認識単位間で起こることが知られているまたは確認された結合の量とを比較することを含み、ここにおいて、工程（ａ）での結合の量と、候補化合物の不存在下において分子および認識単位間で起こることが知られているまたは確認された結合の量との差は、その候補化合物が、ＷＷドメインを含む分子と認識単位との結合に影響を与える化合物であるということを示す上記方法を提供する。
【０１４３】
一つの実施態様において、検定は、ＷＷドメイン含有ポリペプチドを、そのＷＷドメインに対して選択的に結合する認識単位と、候補化合物の存在下および不存在下において、ＷＷドメイン含有ポリペプチドに対する認識単位の結合が候補化合物によって中断されるまたは妨げられることがなければその結合が起こるような条件下で接触させることを含む。候補化合物の存在下におけるＷＷドメイン含有ポリペプチドに対する認識単位の結合の量を検出し、そしてその結合量を、候補化合物の不存在下におけるＷＷドメイン含有ポリペプチドに対する認識単位の結合の量と比較することにより、その候補化合物が結合に影響を与えるかどうか、したがって、ＷＷドメイン含有ポリペプチドの活性の調節に有用なリード化合物であるかどうかを確認することが可能である。候補化合物の作用は、結合を増加させるかまたは減少させることであってよい。
【０１４４】
本発明において用いるのに適した検定の一つの変法は、マイクロタイタープレートのウェルなどの固体支持体に対してＷＷドメイン含有ポリペプチドを結合することを含む。それらウェルは、ウェル中の条件が、ＷＷドメイン含有ポリペプチドをその認識単位に対して結合させることを確実にする適当な緩衝液および他の物質を含有する。次に、認識単位および候補化合物をそれらウェルに対して加える。認識単位は、好ましくは標識されていて、例えば、それはビオチニル化されていてよいしまたは放射性部分で標識されていてよいし、またはそれは酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼに対して結合していてよい。適当なインキュベーション時間後、それらウェルを洗浄して、結合していない認識単位および化合物を全て除去する。候補化合物が、標識された認識単位に対するＷＷドメイン含有ポリペプチドの結合の妨げにならないならば、その標識された認識単位は、ウェル中のＷＷドメイン含有ポリペプチドに対して結合するであろう。次に、この結合を検出することができる。候補化合物が、ＷＷドメイン含有ポリペプチドおよび標識された認識単位の結合の妨げになるならば、標識はウェル中に存在しないであろうし、またはＷＷドメイン含有ポリペプチドおよび標識された認識単位を含有するが、候補化合物は加えられていない対照ウェルと比較した場合より少なく存在するであろう。当然ながら、候補化合物の存在は、ＷＷドメイン含有ポリペプチドと標識された認識単位との間の結合を増加させることが可能である。或いは、認識単位を、検定中に固体支持体に対して固定できる。
【０１４５】
上記の方法の特定の実施態様において、ＷＷドメイン含有ポリペプチドは、本発明の方法によって同定されたＷＷドメインを含有する新規ポリペプチドである。
５．５．  薬理活性に関与するポリペプチドを発見するためのＷＷドメイン含有ポリペプチドの使用
本発明の方法を用いると、多数のＷＷドメイン含有ポリペプチドを同定し且つ単離することが可能である。これらポリペプチドを用いると、一連の候補薬物化合物に対するポリペプチド関連マトリックスを構築することができる。例えば、表１は、このようなマトリックスを示す。
【０１４６】
【表１】
2008173124.tif 000002
【０１４７】
表１において、表の文字で見出しを付けた上欄は、種々のＷＷドメイン含有ポリペプチド（好ましくは、本発明の方法によって同定された新規ポリペプチド）を示す。表の左側に番号を付した列は、ＷＷドメインに対して種々の特異性を有する認識単位を示す。それぞれの候補薬物化合物について、結合検定の結果から表１のような表を作成する。特定の番号の行および文字の欄の交点に置かれたＸは、正の結合検定、すなわち、候補薬物化合物は、その特定の欄のＷＷドメインに対するその特定の行の認識単位の結合に影響を与えたことを示す。
【０１４８】
上で例示されたようなデータを用いて、新規ポリペプチドまたは他の分子が、望ましいまたは望ましくない生理活性または薬理活性を示すかどうかまたは示す危険があるかどうかを確認する。例えば、表１において、薬物化合物は、ポリペプチドＢ、ＤおよびＨのＷＷドメインに対する認識単位２の結合を阻害し；その化合物は、ポリペプチドＦのＷＷドメインに対する認識単位５の結合を阻害し；その化合物は、ポリペプチドＣおよびＨのＷＷドメインに対する認識単位７の結合を阻害し；そしてその化合物はポリペプチドＡのＷＷドメインに対する認識単位９の結合を阻害する。
【０１４９】
ポリペプチドＨとの相互作用が所望の生理活性または薬理活性をもたらすならば、この薬物候補は充分なリードであるかもしれない。しかしながら、ポリペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦとの相互作用は、可能性のある副作用について評価される必要があると考えられる。
【０１５０】
地図（ｍａｐ）を作成し且つ薬理作用を観察するにつれて、それら地図は、所望の薬理作用を得るのに必要な特異性の戦略的評価を可能にするであろう。例えば、化合物２および７は何等かの薬理活性に影響を与えることができるが、化合物５および９はその活性に影響を与えない場合、ポリペプチドＨは、その薬理活性に関与していると考えられる。例えば、化合物２および７は両方ともマスト細胞脱顆粒を阻害することができるが、化合物５および９は阻害しない場合、ポリペプチドＨは、マスト細胞脱顆粒に関与していることが考えられる。
【０１５１】
したがって、本発明は、本発明のＷＷドメインを含むポリペプチドを検定において用いて、それらポリペプチドの薬理活性における関与を確認する方法を提供する。
一つの実施態様において、その方法は、
（ａ）ＷＷドメインを含む分子と薬物候補を、結合の助けとなる条件下で接触させ、そして生じる何等かの特異的結合を検出しまたは測定し；そして
（ｂ）工程（ａ）を、それぞれが異なったＷＷドメインを含むが、適当な条件下において１種類の予め決定された認識単位に対して結合できる複数の異なった分子を用いて繰返すことを含む。
【０１５２】
好ましくは、前記分子の少なくとも一つは、本発明の方法によって同定された新規ポリペプチドである。
本発明はまた、分子の可能な薬理活性を確認する方法であって、
（ａ）ＷＷドメインを含む化合物と分子を、結合の助けとなる条件下で接触させ；
（ｂ）生じる何等かの特異的結合を検出しまたは測定し；そして
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）を、それぞれの化合物が異なった配列のＷＷドメインを含むが、同じ結合特異性を示すことができる複数の異なった化合物を用いて繰返すことを含む上記方法を提供する。
【０１５３】
５．６．  ２種類以上の認識単位の同時使用
ポリペプチド源を認識単位でスクリーニングする場合、２種類以上の認識単位を同時に用いることが可能である。特定の態様に、おいて、５種類程度の異なる認識単位を同時に用いて、ポリペプチド源をスクリーニングすることができる。
【０１５４】
特に、認識単位がビオチニル化ペプチドであり、そしてポリペプチド源がｃＤＮＡ発現ライブラリーである場合、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼに対するビオチニル化ペプチドの予備結合の工程、更には、そのｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングに関与する工程は、１種類のビオチニル化ペプチドを認識単位として用いる場合に行われるのと本質的に同様に行うことができる。詳細については６．１．節を参照されたい。２種類以上のピオチニル化ペプチドを同時に用いる場合の重要な違いは、それらペプチドを、選択が行われるポリペプチドと接触した状態に置く工程の前かまたはその工程でそれらが混合されることである。
【０１５５】
バクテリオファージ発現ライブラリー用いてポリペプチドを発現する実施態様において、陽性のクローンを、単離されたプラークのレベルまで処理する場合、単離されたプラークからのクローン性バクテリオファージは、一次スクリーニングにおいて認識単位として用いられたいくつかのペプチドのどれに対してファージが実際に結合しているかを確認するために、ビオチニル化ペプチドそれぞれに対して個々に試験することができる。
【０１５６】
５．７．  既知のアミノ酸配列からの認識単位の使用
多くの場合、ある与えられたＷＷドメインの認識単位を得るために、物質の集合、例えば、ペプチドライブラリーをスクリーニングする必要はないかもしれない。例えば、ペプチド認識単位の場合、時々、既知のアミノ酸配列の検査によって認識単位を同定することが可能である。ＷＷドメインの既知の結合配列に似ているこれらアミノ酸配列の伸長は、与えられたＷＷドメインを含む複数のポリペプチドを得るために、ポリペプチド源に対して合成し且つスリーニングすることができる。本発明の一つの実施態様において、タンパク質ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２（ＷＷドメイン含有タンパク質ＹＡＰに対して結合することが知られている（Chen and Sudol，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7819-7823）を認識単位として用いた。
【０１５７】
一般的特異性を有する認識単位を製造する方法の本発明の開示以前には、このアプローチを遂行することは無益であると考えられていた。その予想は、上記のような公表されたアミノ酸配列から選択された認識単位は、せいぜい、ＷＷドメインを含有する１種類のタンパク質を同定するのに有用であると考えられ、そして正の結合とバックグラウンドとを区別するのに充分なシグナル強度を与えたとは考えられないということであったろう。
【０１５８】
５．８．  ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている核酸の単離および発現
特定の態様において、本発明は、ＷＷドメインを含むポリペプチド、好ましくは、ヒトポリペプチドのアミノ酸配列、および抗原決定基を含む（すなわち、抗体によって認識されうる）または機能的に活性であるそれらのフラグメントおよび誘導体、並びに前記のものをコードしている核酸配列を提供する。本明細書中で用いられる「機能的に活性な」物質は、１種類またはそれ以上の機能活性、例えば、生物活性、抗原性（抗体に対して結合できる）免疫原性を示す、または認識単位に対して特異的に結合できるＷＷドメインを含むその物質を意味する。特定の実施態様において、本発明は、少なくとも４０個のアミノ酸または少なくとも７５個のアミノ酸から成るＷＷドメインを含むポリペプチドのフラグメントを提供する。前記のものをコードしている核酸を提供する。
【０１５９】
他の特定の実施態様において、本発明は、ＷＷドメインを含むポリペプチド、好ましくは、ヒトポリペプチドをコードしている、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチドまたは少なくとも１５０ヌクレオチドから成るヌクレオチド配列および部分配列を提供する。ＷＷドメインを含むポリペプチドのフラグメントをコードしている核酸、更には、このような核酸に対して相補的な且つハイブリッド形成できる核酸を提供する。一つの実施態様において、このような相補的配列は、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも１００ヌクレオチドのｃＤＮＡ配列に対して相補的でありうる。好ましい態様において、本発明は、ＷＷドメインを含むヒトポリペプチドまたはそれらの一部分をコードしているｃＤＮＡ配列を用いる。
【０１６０】
いずれの真核細胞も、ＷＷドメインを含むポリペプチドの分子クローニングのための核酸源として役立つことができるかもしれない。ＤＮＡは、当該技術分野において知られている標準法（例えば、ＤＮＡ「ライブラリー」）によって、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡ若しくはそのフラグメントのクローニングにより得ることができる（例えば、Sambrookら，1989年，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，第2版，Cold Spring Harbor，New York；Glover'，D.M．(監修)，1985年，DNA Cloning:A Practical Approach，MRL Press,Ltd.，オックスフォード，英国，Ｉ，II巻を参照）。ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コード領域に加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含むことができ；ｃＤＮＡに由来するクローンは、エクソン配列だけを含むであろう。どんな源であれ、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子は、遺伝子の増殖に適したベクター中に分子クローニングされるはずである。
【０１６１】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラグメントを生じさせるが、そのいくつかは、所望の遺伝子をコードするであろう。ＤＮＡは、種々の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。或いは、マンガンの存在下においてＤＮアーゼを用いてＤＮＡをフラグメント化することができるし、またはＤＮＡを、例えば、音波処理によるように物理的に切断することができる。次に、直鎖状ＤＮＡフラグメントを、アガロースおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを含むが、これらに制限されない標準的な技法により、サイズによって分離することができる。
【０１６２】
いったん、ＷＷドメインを含む特定のポリペプチドをコードしている遺伝子が第一の種から単離されたら、別の種から対応する遺伝子を単離することは日常的なことである。所望の遺伝子を含有する別の種からの特定のＤＮＡフラグメントの同定は、多数の方法で行うことができる。例えば、第一の種からある量の遺伝子の一部分若しくはその特異的ＲＮＡまたはそのフラグメント、例えば、ＷＷドメインが入手可能であり、しかも精製され且つ標識されうる場合、別の種から生じたＤＮＡフラグメントは、その標識されたプローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングされうる（Benton，W．and Davis，R.，1977，Science196,180；Grunstein，M．and Hogness，D.，1975，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．72，3961）。プローブに対して実質的に相同のそれらＤＮＡフラグメントは、ハイブリッド形成するであろう。好ましい実施態様において、一つの種の遺伝子の既知の配列に対してハイブリッド形成するプライマーを用いるＰＣＲは、別の種のこのような遺伝子の類似体を増幅させるのに用いることができる。次に、増幅したフラグメントを単離し、そして発現ベクターまたはクローニングベクター中に挿入することができる。１種類または複数の制限酵素消化および、既知の制限地図が入手可能である場合、これにしたがって予想されるものとのフラグメントサイズの比較によって適当なフラグメントを同定することも可能である。更に別の選択は、遺伝子の性質に基づいて行うことができる。或いは、遺伝子の存在は、その発現産物の物理的、化学的または免疫学的性質に基づく検定によって検出することができる。例えば、ｃＤＮＡクローン、または適当なｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選択することができ、これらは、例えば、第一の種からのＷＷドメインを含む特定のポリペプチドについて知られているのと同様のまたは同一の電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解消化地図、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ凝集活性（「接着性」）または抗原性を有するタンパク質を生産する。その特定のポリペプチドに対する抗体が入手可能である場合、別の種からの対応するポリペプチドは、クローンを合成する推定上のポリペプチドに対する標識抗体の結合によってＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）型の手順で同定することができる。
【０１６３】
ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションに続くｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によるｍＲＮＡ選択によって同定することもできる。
この手順では、フラグメントを用いて、ハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離する。このようなＤＮＡフラグメントは、第一の種のＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子の入手可能な精製ＤＮＡを示してもよい。単離されたｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物の免疫沈降分析または機能検定（例えば、認識単位に対して結合する能力）は、ｍＲＮＡを同定し、したがって、所望の配列を有する相補的ＤＮＡフラグメントを同定する。更に、特異的ｍＲＮＡは、ＷＷドメインを含むポリペプチドに対して特異的に向けられた固定化抗体に対する細胞から単離されたポリソームの吸着によって選択することができる。ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子の放射性標識ｃＤＮＡは、鋳型として（吸着ポリソームから）選択されたｍＲＮＡを用いて合成することができる。次に、放射性標識されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブとして用いて、他のゲノムＤＮＡフラグメントの中から別の種のＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子を示すＤＮＡフラグメントを同定することができる。特定の実施態様において、マウス遺伝子のヒト類似体は、上記の方法によって得られる。種々の実施態様において、ヒト類似体は、低度、中度または高度に厳しい条件下においてマウス類似体に対してハイブリッド形成する。例として、制限するわけではないが、このような低度に厳しい条件を用いる手順は次の通りである(Shilo and Weinberg，1981，Proc.Natl．Acad．Sci．USA 78:6789-6792を参照)。ＤＮＡを含有するフィルターは、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液中において４０℃で６時間前処理される。ハイブリダイゼーションは、次の改変を伴う同様の溶液中において行われる。０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（重量／容量）硫酸デキストランおよび５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを用いる。フィルターは、ハイブリダイゼーション混合物中において４０℃で１８〜２０時間インキュベートされた後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中において５５℃で１．５時間洗浄される。その洗浄溶液を新しい溶液と交換し、そして６０℃で更に１．５時間インキュベートされる。フィルターを吸取乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーで暴露する。必要ならば、フィルターを３回目に６５〜６８℃で洗浄し、そしてフィルムに対して再度暴露する。用いることができる他の低度に厳しい条件は、当該技術分野において周知である（例えば、種間ハイブリダイゼーンョンに用いられるような）。
【０１６４】
制限ではなく例として、高度に厳しい条件を用いる手順は次の通りである。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含んで成る緩衝液中において６５℃で８時間〜一晩中行われる。フィルターは、１００ｍμｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中において６５℃で４８時間ハイブリッド形成される。フィルターの洗浄は、２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコールおよび０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中において３７℃で１時間行われる。この後、オートラジオグラフィーの前に、０．１×ＳＳＣ中において５０℃で４５分間の洗浄を行う。用いることができる他の高度に厳しい条件は、当該技術分野において周知である。
【０１６５】
次に、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている同定されそして単離された遺伝子を、適当なクローニングベクター中に挿入することができる。当該技術分野において知られている多数のベクター−宿主系を用いることができる。可能なベクターには、プラスミドまたは変種ウイルスが含まれるが、これらに制限されるわけではなく、しかしながら、そのベクター系は、用いられる宿主細胞と融合性（compatible）できなければならない。このようなベクターには、λ誘導体などのバクテリオファージまたはＰＢＲ３２２などのプラスミド若しくはｐＵＣプラスミド誘導体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。クローニングベクター中への挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクター中にＤＮＡフラグメントを連結することによって行うことができる。しかしながら、ＤＮＡをフラグメント化するのに用いられる相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合、ＤＮＡ分子の末端は酵素によって修飾することができる。或いは、何等かの望まれる部位は、ＤＮＡ末端上へヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって生じることができ；これら連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードしている特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。別の方法において、切断されたベクターおよび遺伝子は、ホモポリマー末端結合によって修飾することができる。組換え分子は、遺伝子配列の多数のコピーを生じるように、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等によって宿主細胞中に導入することができる。
【０１６６】
別の方法において、所望の遺伝子は、適当なクローニングベクター中への「ショットガン」アプローチでの挿入後に同定しそして単離することができる。所望の遺伝子の、例えば、サイズ分別による濃縮は、クローニングベクター中への挿入前に行うことができる。
【０１６７】
特定の実施態様において、単離された遺伝子、（ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ配列を包含する組換えＤＮＡ分子を用いる宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの形成を可能にする。したがって、その遺伝子は、形質転換体を成長させ、組換えＤＮＡ分子をその形質転換体から単離し、そして必要な場合、挿入された遺伝子をその単離された組換えＤＮＡから回収することによって多量に得ることができる。
【０１６８】
本発明のＷＷドメインを含むポリペプチドをコードする核酸は、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。それら必要な転写および翻訳シグナルは、ポリペプチドおよび／またはその隣接する領域をコードしている天然遺伝子によっても供給されうる。種々の宿主−ベクター系を用いて、タンパク質コード配列を発現することができる。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母などの微生物、またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が含まれるが、これらに制限されるわけではない。ベクターの発現要素は、それらの強度および特異性が異なる。用いられる宿主−ベクター系に依存して、多数の適当な転写および翻訳要素の内いずれか一つを用いることができる。
【０１６９】
ベクター中へのＤＮＡフラグメントの挿入に関して前に記載された方法のいずれを用いても、タンパク質コード配列に対して機能的に結合した適当な転写／翻訳調節シグナルから成るキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術および合成技術並びにｉｎ  ｖｉｖｏ組換え体（遺伝的組換え）が含まれうる。タンパク質またはペプチドフラグメントをコードしている核酸配列の発現は、そのタンパク質またはペプチドが、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現されるように、二次核酸配列によって調節されうる。例えば、タンパク質の発現は、当該技術分野において知られているいずれかのプロモーター／エンハンサー要素によって調節することができる。遺伝子発現を調節するのに用いることができるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Benoist and Chambon，1981，Nature 290，304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復中に含まれたプロモーター(Yamamoto et al.，1980，Cell 22，787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner etal.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78，1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al.，1982，Nature 296，39-42）；β−ラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroff et al.，1978，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．75，3727-3731）またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al.，1983，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80，21-25）などの原核生物発現ベクター；Scientific American（1980，242，74-94）中の「組換え細菌からの有用なタンパク質(Useful proteins from recombinant bacteria)」も参照されたい；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Herrera-Estrella et al.，Nature 303，209-213）またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター(Gardner et al.，1981，Nucl．Acids Res.，9，2871)、および光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrella et al.，1984，Nature 310，115-120）；Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリ性ホスファターゼプロモーターなどの酵母または他の真菌からのプロモーター要素、および組織特異性を示し且つトランスジェニック動物中で用いられてきた次の動物転写調節領域、すなわち、膵臓腺房細胞中で活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al.，1984，Cell 38，639-646;Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol.，50，399-409;MacDonald，1987，Hepatology 7，425-515）；膵臓β細胞中で活性であるインスリン遺伝子調節領域(Hanahan，1985，Nature 315，115-122)、リンパ系細胞中で活性である免疫グロブリン遺伝子調節領域(Grosschedl et al.，1984，Cell 38，647-358;Adames te al.，1985，Nature 318，533-538;Alexander et al.，1987，Mol．Cell．Biol.，7，1436-1444)、精巣、乳房、リンパ系およびマスト細胞中で活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス調節領域(Leder et al.，1986,Cell 45，485-495)、肝中で活性であるアルブミン遺伝子調節領域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel．1，268-276)、肝中で活性であるαフェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlauf et al.，1985，Mol．Cell．Biol．5，1639-1648;Hammer et al.，1987，Science 235，53-58；肝中で活性であるα−１−抗トリプシン遺伝子調節領域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel．1，161-171)、骨髄��細胞中で活性であるβ−グロビン遺伝子調節領域（Mogramet al.，1985, Nature 315，338-340;Kollias et al.，1986，Cell 46，89-94）；脳内の希突起神経膠細胞中で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al.，1987，Cell 48，703-712）；骨格筋中で活性であるミオシン軽鎖２遺伝子調節領域(Sani，1985，Nature 314，283-286)、および視床下部中で活性である性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al.，1986，Science 234，1372-1378）が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１７０】
ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子のインサートを含有する発現ベクターは、次の３種類の一般的なアプローチによって同定することができる。（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または不存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第一のアプローチにおいて、発現ベクター中に挿入された外来性遺伝子の存在は、挿入された遺伝子に対して相同である配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第二のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター中への外来性遺伝子の挿入によって引き起こされたある種の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成(occlusion body formation)等）の存在または不存在に基づいて同定されそして選択されることができる。例えば、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子を、ベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入する場合、その遺伝子を含有する組換え体は、そのマーカー遺伝子機能の不存在によって同定することができる。第三のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現された外来性遺伝子産物を検定することによって同定することができる。このような検定は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検定システムにおける遺伝子産物の物理的または機能的性質、例えば、認識単位に対して結合する能力に基づくことができる。
【０１７１】
いったん、特定の組換えDNA分子が同定されそして単離されたら、当該技術分野において知られているいくつかの方法を用いてそれを増殖させることができる。適当な宿主系および増殖条件が確立されたら、組換え発現ベクターを増殖させそして多量に製造することができる。前に説明したように、用いることができる発現ベクターには、次のベクターまたはそれらの誘導体が含まれるが、これらに制限されるわけではない。いくつか名前を挙げると、ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなどのヒトまたは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(例えば、λ)、およびプラスミドおよびコスミドDNAベクター。
【０１７２】
更に、挿入された配列の発現を調節する、または望まれる特定の様式で遺伝子産物を修飾しそして処理する宿主細胞系統を選択することができる。ある種のプロモーターからの発現は、ある種の誘導物質の存在下で増加させることができ；
したがって、タンパク質の発現を調節することができる。更に、種々の宿主細胞は、タンパク質の翻訳時および翻訳後のプロセッシングおよび修飾（例えば、糖付加、切断）に特有でそして特異的機序を有する。適当な細胞株または宿主系は、発現される外来性タンパク質の所望の修飾およびプロセッシングを確実にするように選択することができる。例えば、細菌系における発現は、非糖付加コアタンパク質産物を生じるのに用いることができる。酵母における発現は、糖付加産物を生じるであろう。哺乳動物細胞における発現は、異種タンパク質の「天然」糖付加を確実にするのに用いることができる。更に、種々のベクター／宿主発現系は、タンパク質分解切断などのプロセッシング反応をいろいろな程度に行うことができる。
【０１７３】
他の特定の実施態様において、ＷＷドメインを含むポリペプチドまたはそれらのフラグメント、類似体若しくは誘導体は、融合タンパク質またはキメラタンパク質産物（（種々のタンパク質の）異種タンパク質配列に対するペプチド結合によって結合したポリペプチド、フラグメント、類似体または誘導体を含む）として発現させることができる。このようなキメラ産物は、所望のアミノ酸配列をコードしている適当な核酸配列を当該技術分野において知られている方法によって適当な読み枠内で互いに連結し、そして当該技術分野において一般的に知られている方法によってキメラ産物を発現させることによって製造することができる。或いは、このようなキメラ産物は、タンパク質合成技術によって、例えば、ペプチド合成機の使用によって製造することができる。
【０１７４】
５．８．１．  発現された遺伝子産物の同定および精製
いったん、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子配列を発現する組換え体が同定されたら、その遺伝子産物を分析することができる。これは、その産物の放射性標識に続きゲル電気泳動による分析を含めた、その産物の物理的または機能的性質に基づく分析によって行うことができる。
【０１７５】
ＷＷドメインを含むポリペプチドが同定されたら、それを、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、デイファレンシャルな溶解度を含めた標準法によって、または何等かの他の標準的なタンパク質精製技術によって単離しそして精製することができる。機能的性質は、制限されるわけではないが、認識単位に対する結合を含めた何等かの適当な検定を用いて評価することができる。
【０１７６】
５．９．  ＷＷドメインを含むポリペプチドの誘導体および類似体
本発明は、更に、ＷＷドメインを含むポリペプチドの誘導体（フラグメントを含むが、これに制限されない）および類似体を提供する。特定の実施態様において、その誘導体または類似体は、機能的に活性である、すなわち、完全長の野生型ポリペプチドに結合した１種類またはそれ以上の機能的活性を示すことができる、例えば、認識単位に対して結合することができる。一つの例として、このような誘導体または類似体は、完全長ポリペプチドの抗原性を有していてよい。
【０１７７】
特に、誘導体は、機能的に同等の分子を提供する置換、付加または欠失によって、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子配列を変更することにより製造することができる。ヌクレオチドコード配列の縮重のために、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子と実質的に同様のアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列は、本発明の実施において用いることができる。これらには、配列中の機能的に同等のアミノ酸残基をコードする別のコドンに置換することによって変更されるこのような遺伝子の全部または一部分を含むヌクレオチド配列が含まれるが、これに制限されるわけではなく、それによって、サイレント変化を生じる。同様に、本発明の誘導体には、機能的に同等のアミノ酸残基が、配列中に残基の代りに置換されてサイレント変化をもたらしている変更された配列を含めた、ＷＷドメインを含むポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部分を一次アミノ酸配列として含有するものが含まれるが、これらに制限されるわけではない。例えば、配列中の１個またはそれ以上のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用する同様の極性を有する別のアミノ酸によって置換され、結果としてサイレント変化をもたらすことができる。配列中のアミノ酸の置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。陽電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが含まれる。負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。
【０１７８】
ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子の誘導体または類似体には、それら遺伝子若しくはそれらのフラグメントに対して実質的に相同であるポリペプチド、またはそれをコードしている核酸がそれら遺伝子の核酸配列に対してハイブリッド形成できるものが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１７９】
本発明の誘導体および類似体は、当該技術分野において知られている様々な方法によって製造することができる。それらの製造をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで存在しうる。例えば、クローン化遺伝子配列は、当該技術分野において知られている多数の戦略のいずれによっても修飾することができる(Maniatis，T.ら、1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York)。その配列は、１種類または複数の制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断した後、所望ならば、更に酵素修飾を行い、単離し、そしでｉｎ  ｖｉｔｒｏで連結することができる。ＰＣＲプライマーは、所望のポリペプチドをコードしている核酸のＰＣＲ増幅中に望ましい配列変化を導入するように構築することができる。誘導体または類似体をコードしている遺伝子の製造では、修飾された遺伝子が、所望の活性がコードされている遺伝子領域において、翻訳停止シグナルによって分断されないまま、同様の翻訳読み枠中に残っていることを確実にするように注意すべきである。
【０１８０】
更に、ＷＷドメインを含むポリペプチドをコードしている遺伝子の配列は、翻訳、開始および／または終結配列を生じるおよび／または破壊するように、またはコード領域中で変化を生じるおよび／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する若しくは以前から存在するものを破壊するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで変異して、追加のｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾を容易にすることができる。当該技術分野において知られているいずれの変位誘発技術も用いることができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的変異誘発(Hutchinson，C．et al.，1978，J．Biol．Chem 253:6551)、ＴＡＢＲリンカーの使用（Pharmacia，Piscataway，NJ）等が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１８１】
配列の操作は、タンパク質レベルで行うこともできる。本発明の範囲内に包含されるのは、翻訳中または後に、例えば、糖付加、アセチル化、リン酸化、アミノ化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞性リガンドに対する結合等によってディファレンシャルに修飾されるタンパク質フラグメントまたは他の誘導体若しくは類似体である。多数の化学修飾はいずれも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成；等を含めた既知の技術によって行うことができるが、これらに制限されるわけではない。
【０１８２】
更に、類似体および誘導体は、化学的に合成することができる。例えば、ＷＷドメインを含むポリペプチドの一部分に該当するペプチドは、ペプチド合成機の使用によって合成することができる。更に、所望ならば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、配列中への置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ異性体；α−アミノイソ酪酸；４−アミノ酪酸；ヒドロキシプロリン；サルコシン；シトルリン；システイン酸；ｔ−ブチルグリシン；ｔ−ブチルアラニン；フェニルグリシン；シクロヘキシルアラニン；β−アラニン；β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸およびＮα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１８３】
５．１０．  ＷＷドメインを含むポリペプチドに対する抗体
一つの実施態様により、本発明は、ＷＷドメインを含むポリペプチドに対して向けられた抗体およびそれらの結合ドメインを含有するフラグメントを提供する。したがって、ＷＷドメインを含むポリペプチド、それらのフラグメント、類似体または誘導体は、特に、免疫原として用いられて、このようなポリペプチド、フラグメント、類似体または誘導体に対する抗体を生じることができる。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ発現ライブラリー由来のものでありうる。特定の実施態様において、ＷＷドメインを含むポリペプチドのＷＷドメインに対して特異的な抗体を製造することができる。
【０１８４】
当該技術分野において知られている様々な手順を、ポリクローナル抗体の製造に用いることができる。特定の実施態様において、ＷＷドメインを含むポリペプチドのエピトープに対するウサギポリクローナル抗体またはそれらの部分配列を得ることができる。抗体の製造には、制限されるわへではないが、ウサギ、マウス、ラット等を含めた種々の宿主動物を、ＷＷドメインを含む天然ポリペプチドまたは合成変種、またはそのフラグメントの注射によって免疫感作することができる。種々のアジュバントを、宿主の種に応じて、免疫学的応答を増加させるのに用いることができ、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール(pluronic polyol)、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Calmette-Guerin杆菌）およびCorynebacterium parvumなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１８５】
モノクローナル抗体の製造には、培養物中の連続的継代細胞株による抗体分子の生産を提供するいずれの技法を用いてもよい。例えば、KohlerおよびMilstein（1975，Nature 256，495-497）によって最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4，72)、およびヒトモノクローナル抗体を生産するＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cole et al.，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss,Inc.，77-96頁中）を用いることができる。
【０１８６】
分子のイディオタイプ（結合ドメイン）を含有する抗体フラグメントは、既知の技法によって生じることができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって生じることができるＦ（ａｂ’）２フラグメント；そのＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生じることができるＦａｂ’フラグメント；および抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生じることができるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
【０１８７】
抗体の生産において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当該技術分野において知られている技法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベント検定）によって行うことができる。
【実施例】
【０１８８】
６．実施例
６．１．  ＷＢＰ−１、ＷＢＰ−２、ＥｎａＣβおよびＥｎａＣγより誘導された認識ユニットを用いる、ｃＤＮＡ発現ライブラリーからの遺伝子の同定
ペプチド認識ユニットが、それらの標的であるＷＷドメインと同一または類似しているが、それらの標的であるＷＷドメインを含むタンパク質以外のタンパク質内に含まれる、ＷＷドメインを認識することができるか否かを決定するために、研究を開始した。比較的小サイズの認識ユニットを用いた、そのような「機能的」スクリーンは、今までに知られておらず、また、ＷＷドメイン含有タンパク質間の配列相同性の程度が低いため、開発が困難である。従って、例えば、ＷＷドメインの一次配列の程度の低い相同性を基にして、オリゴヌクレオチドプローブを、ある程度の信頼性を持つように設計することはできなかった。
【０１８９】
認識ユニットとして、ＹＡＰ  ＷＷドメイン結合タンパク質、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２の配列を基にした合成ペプチドを用いて、Ｎｏｖａｇｅｎ（Madison,WI）から入手した１６日マウス胚ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングした（Chen and Sudol,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92,7819-7823）。ＹＡＰペプチドは、ＷＷ結合ペプチドのＰＰＰＰＹ（配列番号３）共通モチーフに似た配列について、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースを検索した結果、選択された。１６日マウス胚ｃＤＮＡ発現ライブラリーをこれらの認識ユニットを用いてスクリーニングし、マウスＮｅｄｄ−４およびマウスＹＡＰを発現するクローンを単離した。
【０１９０】
用いられたペプチド認識ユニットは：
ＴＰ＝ビオチン−ＨＰＧＴＰＰＰＰＹＴＶＧＰ（配列番号６）
ＹＰ＝ビオチン−ＰＧＹＰＹＰＰＰＰＰＥＦＹ（配列番号７）
ＱＰ＝ビオチン−ＹＶＱＰＰＰＰＰＹＰＧＰＭ（配列番号８）
である。
【０１９１】
ペプチド認識ユニットのビオチニル化およびストレプトアビジン  アルカリホスファターゼを持つそれらの複合体化を含む、ライブラリーのスクリーニングは、以下の通りである。
【０１９２】
１６日マウス胚のｃＤＮＡ発現ライブラリーを、ＳＭ溶液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．０１％ゼラチン）で、１：１０００に希釈した。滅菌試験管に、２μｌの希釈したマウス胚のライブラリー、１００μｌ  １０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１００μｌの１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１００μｌのＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細菌細胞（一晩増殖）を加え、３７℃で３０分間、インキュベートした。試験管の内容物を、２５ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む３ｍｌの０．６％トップアガロースと混合し、２ｘＹＴプレート（９０ｍｍ直径）上に注いだ。大規模一次スクリーニング用に、１０−２０のプレートを、プレート当たり３ｘ１０４ｐｆｕに調製した。３７℃で６時間インキュベーションした後、１０ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）内に浸したニトロセルロースフィルターをそれぞれのプレート上に置き、３７℃で３−６時間、インキュベートした。フィルターをプレートから取り除く前に、１８ゲージの注射針内に入れたＩｎｄｉａインクで、フィルターを非対称的ににマークした。二次スクリーニングの準備ができるまで、プレートを４℃で保存した。フィルターを、ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）−０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で、３回、室温でそれぞれ１５分間洗浄し、次いで、非特異的ブロッキング溶液（ＰＢＳ  ２％ＢＳＡ）を含むプラスチックバッグ内に１時間置いた。その間に、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１ｍＭのビオチニル化ペプチド（１ｍｌ）を、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中の１ｍｇ／ｍｌストレプトアピジン  アルカリホスファターゼ（２０ｍｌ）に加え、４℃で３０分間インキュベートした。多価複合体を形成するその他の方法として、５０ｐｍｏｌのビオチニル化ペプチドを、２μｇのＳＡ−ＡＰ（ビオチン：ビオチン結合部位比率、１：１）と共にインキュベートすることもできた。その後、過剰のビオチン結合部位は、５００ｐｍｏｌのビオチンを加えることによって、ブロックされるであろう。さらなる代替法としては、３１．２μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ＳＡ  ＡＰを、１５μｌの０．１ｍＭビオチニル化ペプチドと共に、４℃で３０分間、インキュベートすることもできた。次に、１０μｌの０．１ｍＭビオチンを加え、そして、溶液をさらに１５分間インキュベートした。
【０１９３】
前結合させたペプチド認識ユニットを、ニトロセルロースフィルターを含むプラスチックバック内に入れて、室温で一晩、インキュベートした。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、５０ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、１００ｍｌの５０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および１５ｍｌのアルカリホスファターゼバッファー（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ２）中で、フィルターをインキュベートした。強い陽性のシグナルは、５−１０分の間、現れた。
【０１９４】
ｃＤＮＡ全ライブラリーを広げて、５００μｌのＳＭ中、室温に１時間置くか、または一滴のクロロホルム存在下、４℃で一晩置いたペトリ皿から、陽性プラークをパスツールピペットで円形に型抜きして集めた。再スクリーニングするために、スクリーンニング時に全てのプラークが陽性である範囲内で、プラーク形成ユニット（plaque forming units）（ｐｆｕ）数を１／１０倍ずつ減少させる（即ち、一次スクリーニングでは３ｘ１０４、二次スクリーニングでは３ｘ１０３等）意図で、溶離ファージを１：１００に希釈した溶離ファージ５μｌをプレートに塗布した。
【０１９５】
３ラウンドの希釈スクリーニングを行うと、単離された陽性プラークが得られた。ＢＭ２５．８大腸菌細胞の前仲介摘出（cremediated excision）によって単離されたファージの組換えラムダゲノムから、ｐＥＸＩｏｘプラスミドを回収した。個々のラムダクローンごとに、５μｌの希釈したファージ（ＳＭ中１：１００）を、Ｉ００μｌのＳＭおよび１００μｌの一晩培養したＢＭ２５．８細胞を含む滅菌試験管に加えた。３７℃で３０分インキュベーションした後、この混合物を、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｘＹＴペトリプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。単一コロニーをプレートから採取し、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ｘＹＴブロス内に接種して、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Qiagen,Chatsworth,CA）を用いて単離し、化学的にコンピテントなＤＨ５αＦ’細胞内に形質転換した。少なくとも２つのコロニーを、それぞれの形質転換株から選択し、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ｘＹＴブロス内で一晩増殖させた。前記の方法に従って、ＤＮＡを調製した。それぞれのプラスミド内のｃＤＮＡ挿入物の大きさを評価するために、精製されたそれぞれのＤＮＡサンプルのおおよそ１／２０をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、挿入物を遊離させ、そしてアガロースゲル電気泳動で分析した。ＤＮＡは、Ｔ７遺伝子１０オリゴヌクレオチドプライマーを用いたジデオキシ法によって、配列決定された。
【０１９６】
cDNAライブラリーをペプチドQPでスクリーニングした場合、5つのクローンが同定され単離された。これらのクローンのcDNA挿入物は、それらを同定するために、配列決定された。これらのクローンの概略図を図８に示す。図８に示したように、ＱＰペプチドでのスクリーニングから、マウスＮｅｄｄ−４遺伝子の部分を含む５つのクローンを同定した。
【０１９７】
また、ｃＤＮＡライブラリーを、ペプチドＴＰ、ＹＰおよびＱＰ（配列番号６  ８）１：１：１混合物でスクリーニングした。図９は、このスクリーニングによってマウスＹＡＰ遺伝子の部分を含む２つのクローンが同定されたことを、示している。
【０１９８】
上記の方法は、また、認識ユニットとして、ＹＡＩ  ＷＷドメイン結合タンパク質ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２の配列を基にした以下の合成ペプチド：
ＷＢＰ−１    ビオチン−ＳＧＳＧＰＧＴＰＰＰＰＹＴＶＧＰＧＹ（配列番号９）
ＷＢＰ−２Ａ  ビオチン−ＳＧＳＧＹＶＱＰＰＰＰＰＹＰＧＰＭ（配列番号１０）
ＷＢＰ−２Ｂ  ビオチン−ＳＧＳＧＰＧＴＰＹＰＰＰＰＥＦＹ（配列番号１１）
を用いて、行われた。
【０１９９】
上記の方法に従って、３つのペプチドをビオチニル化し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼと複合させたが、ＷＢＰ−１ペプチドのみは、ストレプトアビジン西洋わさびペルオキシダーゼと複合させた。結合したペプチドの検出は、上記の方法に従ったが、ＷＢＰ−１のみは、ＩＢＩ  ｅｎｚｙｇｒａｐｈｉｃＴＭ  Ｗｅｂ（Kodak.New Haven,CT）を用いて、製造者記載の方法に従って、検出した（６．５節を参照のこと）。代替法として、ＴＳＡチラミドシグナル増幅システム(DuPont，Wilmington，DE)を用いることもできた。
【０２００】
ヒト骨髄および脳のｃＤＮＡライブラリー（Clontech,Pa1o A1to,CA）をスクリーニングするために、これら３つのペプチドを混合物として用いた。１３のｃＤＮＡクローンを同定し単離した。これらのクローンは、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ３と名付けられた、３つの新しいヒト遺伝子を示した。ＷＷＰ１およびＷＷＰ２は、脳および骨髄ライブラリーの両方から単離されたが、ＷＷＰ３は、脳のライブラリーから単離された。
これら３つの新規遺伝子は、合わせると、９つの新しいＷＷドメインを持っていた。
図１０に、これら３つの新規のＷＷドメイン含有遺伝子の概略図を示す。これらの新規遺伝子を含むｃＤＮＡクローンの挿入物のヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列が得られた。ＤＮＡは、PRISM DyeDeoxy Terminator Cycle chemistry（Perkin/Elmer，Foster City，CA）を用いて、両ストランドを配列決定した。これらＤＮＡ配列、ならびに相当するアミノ酸配列を、図１６−２１に示す。
【０２０１】
上記の方法は、また、認識ユニットとしてＥｎａＣβおよびＥｎａＣγを用いて、ＬＮＣａｐ前立腺癌細胞株から生成されたｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングにも適用された。これらの認識ユニットは、上皮のＮａ＋チャンネルタンパク質のαおよびγサブユニットのＷＷ結合ドメインの配列に基づいた合成ペプチドである。
ＥｎａＣβ  ビオチン−ＰＧＴＰＰＰＮＹＤＳＬＲＬ（配列番号５９）
ＥｎａＣγ  ビオチン−ＰＧＴＰＰＰＫＹＮＴＬＲＬ（配列番号６０）
上記の方法に従って、2つのペプチドをビオチニル化し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼと複合させた。バンドペプチドも検出もまた、上記の方法に従った。
【０２０２】
これらの２つのペプチドを、混合物として用いで、ヒト前立腺ライブラリーをスクリーニングした。このスクリーニングによって、上述のＷＷＰ１および新規の３つのＷＷドメインを持つＷＷＰ４と呼ばれる新規の遺伝子が同定された。図１０に、遺伝子を含むこの新規のＷＷドメインの概略図を示す。この新規遺伝子を含むｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列を得た。ＤＮＡは、PRISM Dye Deoxy Terminator Cycle chemistry（Perkin/Elmer，Foster City，CA）を用いて、両ストランドを配列決定した。これらのDNA配列、ならびに相当するアミノ酸配列を、それぞれ、図22および23に示す。
【０２０３】
図１５Ａおよび１５Ｂに示したクロスアフィニティーマッピングのデータより、タンパク質ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４のそれぞれの２つまたはそれより多くのＷＷドメインは、認識ユニットＷＢＰ−１、ＷＢＰ−２ＡおよびＷＢＰ−２Ｃと特異的に結合するが、これらのタンパク質のＷＷドメインのいずれもが、ＷＢＰ−２Ｂとは特異的には結合しないことを、示すことができる。ＷＷＰ３は、認識ユニットＷＢＰ−２Ａと特異的に結合するが、ＷＢＰ−１またはＷＢＰ−２Ｂとは特異的に結合しない。
【０２０４】
それらがＨＥＣＴドメインを所有していることから（図１０および図１４を参照のこと）、３つの新規遺伝子（ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４）は、ユビキチンリガーゼ活性を持つ、ＲＳＰ５およびＮｅｄｄ−４を含む、タンパク質ファミリーの一員であると考えられる。３つの遺伝子の内の２つ、ＷＷＰ１およびＷＷＰ２は、それぞれ４つのＷＷドメインを持つ。第三の遺伝子ＷＷＰ４は、３つのＷＷドメインを持つ。残りの新規の遺伝子ＷＷＰ３は、一つのＷＷドメインおよび第二の短縮型ＷＷドメインのＮ末端部分を持つ。ＷＷＰ３もまた、グアニル酸キナーゼ様領域を持っている。
【０２０５】
６．１．１．  ｃＤＮＡ発現ライブラリーより同定された新規遺伝子のヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列
ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３およびＷＷＰ４のヌタレオチド配列を、それぞれ、図１６、１８Ａおよび１８Ｂ、２０そして２２に示す。ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３およびＷＷＰ４のアミノ酸配列は、それぞれ、図１７、１９、２１および２３に示されている。
【０２０６】
図５は、ＷＷＰ１からの４つのＷＷドメイン、ＷＷＰ２からの４つのＷＷドメイン、ＷＷＰ４からの３つのドメイン、およびＷＷＰ３からのＷＷドメインのアミノ酸配列と、さまざまな既知タンパク質からのＷＷドメインのアミノ酸配列との比較を示している。１２の新らしいＷＷドメイン配列と、以前から同定されていたいくつかのＷＷドメインとのアライメントは、ドメインのコアに隣接した相同性を持つ２つの重要なブロックを示している。これらのブロックは、今日までに知られている全てのＷＷドメイン内に完全に保存されているＮ末端のトリプトファン残基およびＣ末端のプロリン残基を含む。また、示された様々なＷＷドメイン配列を基にした共通配列も示される。他のＷＷドメインとの相同性を最大にするために、ＷＷＰ２の第三のＷＷドメインの配列（図５のＷＷＰ２−３）の位置１２と１３との間に、一つのアミノ酸ギャップを導入した。
【０２０７】
ＷＷドメインに加えて、新規クローンの一次配列を分析すると、様々なその他の興味ある構造形が示された。クローンＷＷＰ２およびＷＷＰ４は、Ｃ末端に完全なＨＥＣＴドメインを含み、ＷＷＰ１は、カルボキシ末端に部分的ＨＥＣＴドメインを含む（図１０、図１４および図２３）。このドメインは、インビトロでは、酵母Ｒｓｐ５およびヒトのパピローマウイルスＥ６−ＡＰタンパク質において、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ活性を持つことを示し、ユビキチンチオエステル形成に有望な部位である最後の４０アミノ酸内にある保存されたシステイン残基をコードしている(Huibregste et al.，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，2563-2567)。構造的および機能的に関連するＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼは、ユビキチン分解システムの基質特異性を決定する際に主な役割を果たすと考えられるので、このことは注目に値する(Ciechanover，1994，Cell，79，13-21)。事実、Ｒｓｐ５は、最近になって、酵母内のいくつかの窒素パーミアーゼの誘導分解物に関与することが示された(Hein et al.，1995，Mol．Microbiol.，18，77-87)。ＷＷＰ２はまた、プロテインキナーゼＣ(Kaibuchi et al.，1989，J．Biol．Chem.，264，13489-13496)およびシナプトタガミン（Sutton et al.，1995，Cell，80，929-938）を含むタンパク質の大きいファミリーを特徴付けるＮ末端のＣ２様ドメインをコードしている。Ｃ２ドメインは、カルシウム依存様式で膜リン脂質を結合することが示され、細胞内タンパク質の区画化において作用すると考えられる(Davletov and Sudhof，1993，J．Biol．Chem.，268，26386-26390)。ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４内に存在する様々なドメインは、Ｎｅｄｄ−４およびＲｓｐ５内に認められるそれらと高い相同性を持つが、これらのドメインに隣接する領域では、これらのタンパク質間に有意の相同性はなく、それらが具体的機能を除いて関連していることを示している。また、興味あるのは、ヒト赤血球膜タンパク質ｐ５５（Ruff et al.，1991，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88，6595-6599）およびラットの前シナプス密度タンパク質(presynatic density protein)（ＰＳＤ−９５）（Cho et al.，1992，Neuron，9,929-942）を含むいくつかの膜関連タンパク質のＧＭＰ結合にかかわるものと類似するグアニル酸キナーゼ様ドメインが、クローンＷＷＰ３内のＮ末端に存在することである。
【０２０８】
６．２．  ジストロフィンンのＷＷドメインに結合する認識ユニットの同定およびｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
標的ＷＷドメインとして、ジストロフィンのＷＷドメインを選んだ。ジストロフィンＷＷドメインの認識ユニットとして機能するペプチドを同定し単離するために、このＷＷドメインをプローブとして用いて、ランダムペプチドファージ表示ライブラリーをスクリーニングした。これらの認識ユニットペプチドを合成し、ビオチニル化し、さらにこれを用いてλＥＸｌｏｘマウスの１６日胚ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Novagen,Madison,WIより入手した）をスクリーニングした。
【０２０９】
ＷＷドメインは、ジストロフィンの中央部桿状体領域の末端、システインに富むドメインの近く、に位置する。このＷＷドメインを含むグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質は、以下のように調製された。２つのオリゴヌクレオチドプライマー：５’−ＣＴＧＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＴＧＧＡ−３’（配列番号４０）および５’−ＣＴＧＴＧＣＧＧＡＴＴＣＣＡＡＡＧＴＣＴＣＧＡＡＣＡＴ−３’（配列番号４１）：を、ジストロフィンＷＷドメインに隣接するように設計した。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位を下線で示す。ジストロフィンＷＷドメインは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を２４サイクル行うことによって増幅させた。２２０ｂｐの増幅フラグメントを、アガロースゲル電気泳動した後、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（Bio 101,San Diego,CA）で精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、フェノールクロロホルム抽出し、エタノール沈殿し、そしてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたｐＧＥＸ  ２ＴベクターＤＮＡ（Pharmacia，Piscataway，NJ）内に結合した。大腸菌（ＤＨ５αＦ’）細胞を結合ＤＮＡで形質転換し、アンピシリン耐性形質転換株を選択した。組換え体を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２１０】
ＧＳＴ−ジストロフィンＷＷドメイン融合タンパク質を持つ大腸菌コロニーを用いて、２％グルコースおよび１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５０ｍｌの２ｘＹＴ培地に接種した。３７℃で一晩増殖された後、５００ｍｌの培養フラスコに細胞を接種した；細胞は、光学吸光度（５９０ｎｍ）が０．６から０．８光学単位に到達するまで、激しく通気して、増殖させた。融合タンパク質の発現を誘導するために、イソプロピルβＤチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、最終濃度が０．１ｍＭになるまで、培地に加えた。４−６時間後、細胞を遠心容器に移し、７，７００ｘｇ、４℃で１０分間、遠心分離し、そして、ペレットを、２５ｍｌの氷冷ＰＢＳ（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ．２．７ｍＭ  ＫＣｌ、４．３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）中に再懸濁した。次いで、細胞懸濁液を音波処理で破壊した。過剰の音波処理は収率の低下を導くので、音波処理はショートバーストで行われた。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤を、最終濃度が１％になるように加え、溶解物を、４℃で３０分間、穏やかに混合し、次いで、１２，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した。２ｍｌのグルタチオンセファロース４Ｂ（Pharmacia,Piscataway,NJ）（ＰＢＳを含む５０％スラリー）を、それぞれ１００ｍｌの音波処理した細胞溶解物の上清に加えた。混合物を、穏やかに攪拌しながら、室温で３０分間インキュベートした。次いで、混合物を５００ｘｇで５分間遠心分離してマトリックスを沈降させ、上清を捨てた。ペレットを１０倍容量のＰＢＳで３回洗浄し、遠心分離し、そして結合ＧＳＴ−ジストロフィンＷＷドメイン融合タンパク質を、１ｍｌのグルタチオン溶離パッファー（３．０７ｍｇ／ｍｌグルタチオン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）／ｍｌセファロース容量で溶離した。融合タンパク質を、５００ｘｇ、５分間の遠心分離によって、ビーズから分割した。回収された融合タンパク質の量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパタ質アッセイによって概算し、その純度を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびクーマシーブルー染色によって、評価した。
【０２１１】
精製されたＧＳＴ−ジストロフィンＷＷドメイン融合タンパク質を用いて、ランダムペプチドファージ表示ライブラリーをスクリーニングした。ライブラリーは、ＣＷ１と呼ばれ、以下の方法に従って調製された。２つのオリゴヌクレオチド（図１１を参照のこと）を合成し、アニールし、そしてＳｅｑｕｅｎａｓｅ（US Biochemical Corp.,Cleveland，OH）およびデオキシヌクレオチドを文献のプロトコール（Kay et al.，1993，Gene，128，59-65）に従って用い、二本鎖ＤＮＡに変換した。オリゴヌクレオチドは、コドンＮＮＳ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの等モル混合物を示し；Ｓは、ＣおよびＧの等モル混合物に対応する）のランダムペプチドをコードしていた。ＮＮＳコードスキームは２０アミノ酸をコードする３２コドンを用い；１つのアミノ酸あたりのコドンの数は、１（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｗ、Ｙ）、２（Ａ、Ｇ、Ｐ、Ｖ、Ｔ）、または３（Ｌ、Ｒ、Ｓ）のいずれかである。組み立てられたオリゴヌクレオチドを、制限酵素ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで切断し、そして、バクテリオファージＭ１３ベクター、ｍＢＡＸ、内に結合した。結合されたＤＮＡをエレクトロポレーションによって大腸菌ＪＳ５内に導入し、おおよそ１０９の組換体のライブラリーを作成した。ランダムペプチドは、ファージ粒子当たり３−５コピーで、成熟ｐＩＩＩのＮ末端に表示された。ＣＷ１ライブラリーのそれぞれのファージ粒子は、成熟ｐＩＩＩのＮ末端に配列Ｓ（Ｓ／Ｒ）Ｘ１２ＳＲＰＴ（配列番号４２）（Ｘは２０のアミノ酸のいずれかを示す）を表示する。
【０２１２】
ｍＢＡＸベクターは、Fowlkesら（1992，Biotechniques，13，422-427）の方法で、Ｍ１３ｍｐ１８ベクターの遺伝子ＩＩＩ（Messing，J.，1991，Gene，100，3-12）内にクローニング部位を作成することによって、作り出された。ｍＢＡＸベクターは、マウスのモノクローナル抗体７Ｅ１１のエピトープをコードする成熟ｐＩＩＩタンパク質のＮ末端に、ペプチド配列を表示している（図１２を参照のこと）；それはコード領域内に終止コドンＴＡＧを含み、それはｓｕｐＥまたはｓｕｐＦをして知られているサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子変異を持つ大腸菌内で抑制される。ｍＢＡＸゲノム内にその他の終止コドンはない。ｍＢＡＸベクターもまた、β−ガラクトシダーゼのαフラグメントのセグメントを持っている；α−フラグメントを発現するバクテリオファージを感染させた、β−ガラクトシダーゼのωフラグメントを発現する細菌細胞は、透明なＸ−Ｇａｌ基質を不溶性の青色沈殿物に変換する。従って、そのような細胞上のそのようなバクテリオファージのプラークは、青色を示す。
【０２１３】
組換えｍＢＡＸ分子は、ｍＢＡＸの遺伝子ＩＩＩ内のＸｈｏＩ−ＸｂａＩセグメント内のＴＡＧコドンのために、非組換え分子から容易に識別され得る。ランダムペプチドをコードするオリゴヌクレオチドでＸｈｏＩ−ＸｂａＩフラグメントを置き換えることによって組換え体を作成する場合、組換え体は、サプレッサーｔＲＮＡ変異遺伝子を持つ（例えば、ＤＨ５αＦ’）または持たない（例えば、ＪＳ５）細菌内で増殖させることができる。他方、非組換えｍＢＡＸ分子は、そのようなサプレッサー遺伝子を欠く細菌（例えば、ＪＳ５）の細菌絨毬(bacterial lawns)の上に、プラークを生成することができない。このことはＪＳ５内において、ＴＡＧコドンは終止コドンとして提供され、翻訳中に短縮型ｐＩＩＩ分子が得られるためである；ｐＩＩＩは生存可能なＭ１３ウイルス粒子の重要なタンパク質成分であるために、プラークは形成しないであろう。
【０２１４】
ＧＳＴ−ジストロフィンＷＷドメイン融合タンパク質（３−１０μｇ）を、１００ｍｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）を入れたミクロタイター皿の表面上に、２５℃で１−３時間または４℃で一晩、固定化した。蒸発を最少にするために、ウェルをＳｃｏｔｃｈテープでシールした。次に、ウェル表面上の非特異的結合部位は、１５０μｌの１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えて、２５℃で１−３時間または４℃で一晩、ブロックした。プレートを逆さまにしてその内容物を振り出すことによって、溶液を捨てた；残りの液体は、逆さまにしたプレートをペーパータオルのマット上に数回平手でたたく（slapping）ことによって除去した。ウェルを、ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で数回洗浄し、非結合タンパク質を除去した。おおよそ１０１２ｐｆｕのＣＷ１ファージ粒子を、それぞれのウェル中の１５０μｌのＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に加え、２５℃で１−３時間インキュベートした。非結合ファージを過剰のＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄除去した。それぞれの穴に５０μｌの５０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）を加え、さらに６５℃で５分間インキュベートすることによって、結合ファージを溶離した。溶液を、５０μｌの２００ｍＭ  ＮａＰＯ４バッファー（ｐＨ７．５）を含む新しいウェルに移して、ｐＨを中性にした。このプロトコールは、アフィニティー選択、「パニング」（”panning”）とも呼ばれる、の一ラウンドを示している。
【０２１５】
アフィニティー選択の次のラウンドを行う前に、第一ラウンドで回収したファージを増幅させた。回収ファージを増幅させるために、ファージを、一晩培養したＦ’大腸菌（例えば、ＤＨ５αＦ’）２００μｌに加え、混合物を５ｍｌの２ｘＹＴに移した。３７℃で６８時間インキュベーションの後、チューブを遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。この上清は、次のラウンドの選択に用いられた。表示ペプチドのタンパク質分解を最少にするために、培養物は、８時間より長くはインキュベートしなかった。
【０２１６】
２および３ラウンドでは、第一ラウンドでの上記の方法に従って、標的ＧＳＴ−ジストロフィンＷＷドメイン融合タンパク質を、ミクロタイターウェル上に固定化し、１００μｌの培養上清（即ち１０１１−１０１２ｐｆｕ）をそれぞれのウェルに加えた。プレートは、２５℃で１−３時間インキュベートされた。非結合ファージは洗浄除去され、そして、上記の方法に従って、結合ファージを溶離し、pHを中性にした。回収されたファージは、第三ラウンドのスクリーニングに直接用いられた。
【０２１７】
アフィニティー選択実験から個々のプラークを得るために、回収されたファージを含む最終溶液を、ミクロタイターブレートを用いて連続希釈し、細菌絨毬上につけた。無菌のミクロタイタープレートのウェルに、１２−チャンネルのマルチピペッターを用いて、８０μｌのＰＢＳをそれぞれ満たした。２０μｌの回収されたファージをカラム＃１内のウェルに加え、混合し、そして２０μｌをカラム＃２内の隣接したウェルに移した。連続希釈をさらに５回繰り返した。この方法で、６つの別々の１０倍希釈シリーズを作り出すことができる。ペトリプレートは、３ｍｌの液状化された１．２％トップアガーおよび一晩培養した２００μｌのＤＨ５αＦ’細胞、２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  ＩＰＴＧおよび２５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを加え、そして２ｘＹＴ寒天プレート上に注ぐことによって、調製された。プレート表面が硬化した後、ミクロタイタープレート希釈シリーズ内に、フレームを滅菌した４８−刺し針(frame-sterilized 48-pronger)を置き、注意深くペトリプレート上に置いた。プラークを３７℃で一晩インキュベートした。個々のプラークを円形に型抜きし、クローナルファージストックを作成するために用いた。
【０２１８】
ジストロフィンＷＷドメイン結合ファージの挿入物を、標準ＤＮＡ配列決定技術を用いて配列決定し、そして挿入物の相当するアミノ酸配列を決定した。決定された配列に相当する６つのこれらペプチドを合成し、ビオチニル化した。これらのペプチドの配列を以下に示す。
ＳＬＱＷＭＤＧＶＧＷＹＭＥ（配列番号６４）
ＲＷＡＷＤＤＧＷＭＦＧＳＶ（配列番号６５）
ＳＧＬＥＧＷＹＷＥＲＧＷＶ（配列番号６６）
ＳＩＷＥＭＧＸＤＷＷＡＲＰ（配列番号６７）
ＲＭＳＷＷＥＥＷＥＦＧＬＧ（配列番号６８）
ＳＷＧＬＤＧＷＬＶＤＧＷＳ（配列番号６９）
これらのビオチニル化ペプチドをストレプトアビジンと複合させ、６．１節に記載の方法に従って、λＥＸｌｏｘマウスの１６日胚ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Novagen,Madison,WIから入手した）のスクリーニングに用いた。この方法で、これらのペプチドと結合することができるタンパク質を発現するｃＤＮＡクローンを同定し単離した。
【０２１９】
６．３．  クロスアフィニティーマッピング
６．１および６．１．１節に記載の新規のＷＷドメイン含有クローンのリガンド選択を決定するために、ならびに様々なタンパク質から誘導されたＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフを含むペプチドもまた、認識ユニットとして提供され、そしてこれらクローンと結合することができるか否かの結果を出すために、クロスアフィニティーマッピング実験を行った（図１５Ａ−Ｄ）。図１５Ａ−Ｄに示すペプチドを合成し、ビオチニル化し、ストレプトアビジン  アルカリホスファターゼと複合させ、そしてＧＳＴ融合タンパク質として発現されるＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３およびＷＷＰ４の１２のそれぞれ新規のＷＷドメインと結合するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡを基本としたアッセイで試験した。ＥＬＩＳＡを基本としたクロスアフィニティー実験は、本質的には、Sparksら（1996,Proc.Natl.Acad.Sci.,93,1540-1544）に記載の方法に従って、以下の修飾を加えることによって成し遂げられた。簡単に言えば、ミクロタイターウェルを、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３中１−５μｇの融合タンパク質でコートし、ＳｕｐｅｒＢＩｏｃｋ  ＴＢＳ（Pierce）でブロックし、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。特定ペプチド  ストレプトアビジン／アルカリホスファターゼ複合体を上記のように加え、非結合複合体をＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。ＰＮＰ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、Kirkegard & Perry Labs）を加えた後、ペプチド結合を３０分後、Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍで定量した。３つの別々の定量からの相対結合量を、以下のようなスケールに割り当てた：Ｏ．Ｄ．ユニット  ０−０．５＝（−）、０．５−１．０＝（＋）、１．０−２．０＝（＋＋）、２．０−３．０＝（＋＋＋）、＞３．０＝（＋＋＋＋）。ヒトのＦｙｎならびにＬｙｎ  ＳＨ３およびＳＨ２ドメインに結合するペプチドを、フィルター結合アッセイ（６．１節およびSparksら、（1996,Proc.Natl.Acad.Sci.,93,1540-1544）を参照のこと）によって評価した。クロスアフィニティー実験に用いたペプチド配列は、以下の遺伝子：すなわちＲａｓＧａｐ（データベース寄託番号＃Ｐ２０９３６）、ＡＰ−２（Ｐ０５５４９）、ｐ５３ＢＰ−２（Ｕ０９５８２）、ＩＬ−６Ｒα（Ｐ２２２７２）、ボルテージゲート型塩素チャンネルＣＬＣＮ５（Ｘ９１９０６）、ＩＬ−２Ｒγ（Ｄ１１１０８６）、ＲＳＶ（Ｄ１０６５２）、ＨＴＬＶ−１（Ｄ１３７８４）、β−ジストログリカン（Ｌ１９７１１）、Ｆｏｒｍｉｎ（Ｘ５３５９９）、アミロライド感受性上皮Ｎａ＋チャンネルＥｎａＣα（Ｐ３７０８９）、ＥｎａＣβ（Ｘ８７１５９）およびＥｎａＣγ（Ｘ８７１６０）、ムスカリン性アセチルコリンレセプターＭ４  ＡＣｈＲ（Ｐ０８１７３）、ならびにｃ−Ａｂｌ（Ｐ００５２２）：のセグメントに相当する。ＳｒｃおよびＣｒｋ  ＳＨ３結合ペブチド配列を、ファージ表示ランダムペプチドライブラリースクリーニングから誘導した（６．１節およびSparksら、(1996，Proc．Natl．Acad．Sci.，93，1540-1544)）。タンパク質配列相同性検索は、ＢＬＡＳＴ（Altschul et al.，1990，J．Mol．Biol.，215，403-410）およびＰＲＯＦＩＬＥＳ（Gribskov et al.，1987，Proc．Natl．Acad．Sci.，84，4355-4358）プログラムを用いて行われた。
【０２２０】
図１５ＡおよびＢに示した結果から、ＷＢＰ−１、ＷＢＰ−２ＡおよびＷＢＰ−２Ｃ認識ユニットペプチドが、異なる程度でいくつかの別々のＷＷドメインと結合したことが証明される。しかしながら、ＷＢＰ−２Ａ認識ユニットペプチドのみは、ＷＷＰ３  ＷＷドメインと結合し、このドメインがペプチドリガンド結合するためのコアＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフの外側にさらなる決定基を必要とするであろうことを示唆している。さらに、連続するプロリンと相関してＮ末端にチロシン残基を含むＷＢＰ−２Ｂペプチドは、結合活性を持たず、このことは、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフ内のＣ末端にチロシンが必要であることを示唆している。ＷＷドメイン結合についてのＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフ内の個々のプロリン残割の相対重要性を、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２Ａペプチドの両方のアラニン置換変異体によって評価した。ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフ内の第三のプロリン位置（ＷＢＰ−１−Ｐｒｏ３）の置換を除いて、全ての変異体が、クローンＷＷＰ１およびＷＷＰ２内に存在するＷＷドメインへの結合活性を残存しており、このことは、第三のプロリン残基の役割の重要性を示唆している。さらに、ＷＢＰ−１の第二のプロリン残基（ＷＢＰ−１−Ｐｒｏ２）の置換は、結果として、クローンＷＷＰ４内に存在するＷＷドメインへの結合活性を損失させる。興味あることには、第二のプロリン残基（ＷＢＰ−１−Ｐｒｏ２）の置換は、ＷＷドメインＷＷＰ１．２およびＷＷＰ２．３への結合を排除しなかった。第二および第三のプロリン残基の両方が結合に重要であると言う、ＹＡＰ  ＷＷドメインへのＷＢＰ−１の結合について得られた結果（Chen and Sudol，1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，7819-7823）と照らし合わせて見れば、このことは予期されなかった。この知見は、ＷＷドメインＷＷＰ１．１およびＷＷＰ２．３が、ＷＷＰ４のＷＷドメインおよびＹＡＰ  ＷＷドメインより、より無差別な結合特異性を持つことを、示唆している。
【０２２１】
ＷＢＰ−２Ａペプチドのプロリンの置換は、第三のプロリン残基（ＷＢＰ−２Ａ  Ｐｒｏ４）がＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３およびＷＷＰ４内のＷＷドメインとの結合に絶対的に重要であり、これに対して、第二プロリン（ＷＢＰ−２Ａ−Ｐｒｏ３）の置換はそうではないことを、示唆している。
【０２２２】
図１５Ａ−Ｄおよび図２４ＡおよびＢは、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）およびＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフを含むペプチドが、ＲａｓＧａｐ；ＡＰ−２転写因子；ｐ５３結合タンパク質−２（ｐ５３ＢＰ−２）；腎臓の塩素チャンネルＣＬＣＮ５；インターロイキンレセプターであるＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−６ＲおよびＩＬ−７Ｒ；ジストロフィン相互作用分子β−ジストログリカン（β−ジストログリカン−１およびβ−ジストログリカン−２）；ＨＴＬＶ−１およびＲＳＶ−１からのレトロウイルスＧａｇタンパク質；ＥＧＲ２；ＦＩＢＮＥＣＴ；ＭＥＬ．ＡＧ；およびＩｎｓｃｕｔｅａｂｌｅを含む、様々な調節タンパク質内に認められ、４つの新規クローンの一つまたはそれより多くからのＷＷドメインと結合することを示している。ＥｎａＣアミロライド−感受性上皮Ｎａ＋チャンネルのα、β、およびγサブユニットからのペプチドもまた、新規クローンのＷＷドメインと結合した（図２４Ａおよび２４Ｂを参照のこと）。タンパク質ＲａｓＧａｐ、ＡＰ−２、ｐ５３ＢＰ−２、ＩＬ−６Ｒα、およびＣＬＣＮ５塩素チャンネルについての記載に関しては、Williamsら（1988，Genes Dev.，2，1557-1569）；Choら（1992，Neuron，9，929-942）；Iwabuchiら（1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91，6098-6102）；Sugitaら（1990，J．Exp．Med.，171，2001-2009）；Traheyら（1988，Science，242，1697-1700）：Helpsら（1995，FEBS Lett.，377，295-300）；Lloydら（1996，Nature，379，445-449）を参照のこと。興味あることに、これらペプチドは全て、一般的にＷＷドメインを結合する能力を示したが、特異性および相対結合性の違いは存在した。特に、試験したペプチドの全ての内、ＣＬＣＮ５ペプチドのみが、ＷＷＰ１．４およびＷＷＰ２．４ドメインと多少の結合を示した。
いくつかのその他のタンパク質からのＰＰＰＰＹ（配列番号３）−モチーフ含有ペプチドが如何なるＷＷドメインとも結合しないと言う知見は、これらの相互作用が特異的であり、潜在的に生物学的関連を持つことを示唆している。
【０２２３】
小サイスで配列保存程度の高いＷＷドメインからすると、精巧なリガンド選択性が認められることは、驚くべきことである。ヒトのＹＡＰ  ＷＷドメインおよびそのペプチドリガンドの結晶構造は、疎水性残基Ｙ１８８、Ｌ１９０およびＷ１９９（図５を参照のこと）がリガンドと接触する結合部位を形成することを、示している（Macias et al.,1991,Nature,382,646-649）。このデータと照らし合わせて、興味あることに、トリプトファンの代わりにＣ末端にフェニルアラニン残基を含むドメインＷＷＰ１．４およびＷＷＰ２．４が、より限定的なリガンド結合選択性を示すことは、特記に値する。さらに、Ｌ１９０の代わりにバリンまたはイソロイシン残基が存在すると、新規のＷＷドメインのリガンド特異性の決定に、異なる役割を演ずるであろう。ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４内に異なるリガンド特異性を持つ複数のＷＷドメインの存在は、これらのタンパク質が広範囲の細胞標的と結合できることを示唆している。あるいは複数のＷＷドメインは、複数のＰＰＰＰＹリガンドモチーフを含む標的分子との付加的な結合アフィニティーを授与するであろう。
【０２２４】
Ｇａｇタンパク質のプロリンを多く含む「Ｌドメイン」から誘導されたＨＴＬＶ−１およびＲＳＶ−１ペプチドがいくつかのＷＷドメインと結合することが証明されたことは特記に値する。Ｌドメイン領域は、レトロウイルス内で保存性が高く、レトロウイルスの出芽（budding）に必要な位置非依存性様式で作用することが示された(Parent et al.，1995，J．Virol.，69，5455-5460)。我々の結果を、ＹＡ  ＰＷＷドメインとｋＳＶのＬドメインとの相互作用を証明した最近の報告（Garnler et al.，1996，Nature，381，744-745）と結びつけて考えると、このプロセスでのＷＷドメイン（類）−Ｇａｇタンパク質相互作用の直接的役割が示唆される。β−ジストログリカンペプチドといくつかのＷＷドメインとの相互作用もまた、興味深い。β−ジストログリカンは、Ｃ末端ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフを含み、ジストロフィン内に存在する１つのＷＷドメインと相互作用することが、以前から示されていた(Einbold c-t al.，1996，FEBS Lett.，384，1-8)。我々の結果から、おそらくいくつかの異なるＷＷドメイン含有タンパク質がβジストログリカンのＣ末端のＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフと相互作用できると考えられる。最近、マウスの四肢変形座（limb deformity locus）によってコードされるタンパク質（Woychik et al.,1985,Nature,318,36-40）である、ホルミンの１２アミノ酸のプロリンを多く含む領域ＳＨ３およびいくつかの新規のＷＷドメイン含有タンパク質の両方と結合することが示された（Chan et al.,1996,EMBO J.,15,1045-1054）。意義深いことには、ホルミンの同じプロリンを多く含む領域を取り囲むペプチドは、我々の新規のＷＷドメインのいずれとも結合しなかった（図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｄ）。このペブチドは、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフを含まないので、このことから、本明細書に記載の新規のＷＷドメインは、ホルミン結合タンパク質中に存在するそれらと違って、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）またはＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフを結合に必要とすると、考えられる。
【０２２５】
合わせて考えると、上記の知見から、上記の調節タンパク質およびＷＷドメイン含有タンパク質との間の相互作用はｉｎ  ｖｉｖｏでの前者の調節に役割を演ずることができるであろうと考えられる。例えば、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４がＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼとして作用する可能性があるならば、それによって、初期の基質特異的認識が、ＷＷドメイン基質相互作用、次にユビキチントランスファー、それに続くタンパク質分解を通して起こると言う単純モデルを発案することもできた。
【０２２６】
上皮Ｎａ＋チャンネルのβおよびγサブユニットがら誘導されたＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフを含むペプチドと、クローンＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３およびＷＷＰ４内に認められるＷＷドメインとの正の相互作用（図２４Ａおよび２４Ｂを参照のこと）は、医学的に特に興味がある。最近、上皮Ｎａ＋チャンネル（ＥｎａＣ）のβおよびγサブユニットの両方内の数多くの突然変異が、リドル症候群と呼ばれる腎臓のＮａ＋の再吸収の上昇を特徴とする慢性の常染色体型高血圧症の患者で証明された(Shimkets et al.，1994，Cell，79，407-414)。具体的には、様々なナンセンス突然変異が両サブユニットの細胞質ドメインの短縮を導く。加えて、細胞質ドメインの保存されたプロリンを多く含むセグメント内に含まれるβサブユニットのコドン６１６および６１８内でＰＰＰＮＹモチーフをＰＰＬＮＹ（Ｐ６１６Ｌと標識）またはＰＰＰＮＨ（Ｙ６１８Ｈ）に変えるβサブユニット内の２つのミスセンス突然変異を同定したSchildら（1995,Proc．Natl．Acad．Sci.，92，5699-5703）；Hanssonら（1995，Proc．Natl．Acad．Sci.，92，11495-11499）；およびTamuraら(1996，Clin．Invest.，97，1780-1784)。これらの突然変異は、活性チャンネルの総数の増加をもたらし、結果としてＮａ＋チャンネルの活性を３から８倍に増加させる。これらの結果から、βおよびγサブユニットの細胞質セグメントは、モジュレータータンパク質（類）との相互作用を介してチャンネル活性の正常な負の調節に関与すると考えられる。事実、Ｎｅｄｄ−４は、２つの酵母ハイブリドシステムを用いて、ラットＥｎａＣβサブユニットのＣ末端への結合相手として、最近同定された(Staub et al.，1996, EMBO J.，15，2371-2380；およびSchild et al.，1996，EMBO J.，15，2381-2387)。さらに、以下に考察したように、ＥｎａＣβおよびＥｎａＣδサブユニットに相当するペブチドを用いて、我々はＷＷＰ１およびＷＷＰ４を単離した。
【０２２７】
リドル症候群患者に認められるミスセンス置換を含む突然変異ペプチド（ＥｎａＣβ−Ｐ６１６ＬおよびＥｎａＣβ−Ｙ６１８Ｈ）がクローンＷＷＰ１、ＶＷＰ２およびＷＷＰ４内のＷＷドメインと結合しない（図２４Ａおよび２４Ｂを参照のこと）と言う我々の知見は、上の仮定と一致する。この結果からもまた、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフ内の第三のプロリン残基およびチロシンがＷＷドメインとの結合に重要であるという知見が確認される。βサブユニットＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフおよび隣接配列のその他の置換もまた、ＷＷドメインへの特異的結合の減少を示した。このように、コアＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフの第二のプロリン残基の置換は、ＷＷドメイン結合を完全になくした。さらに、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフのＣ末端に隣接する特定の残基の突然変異もまた、ＷＷドメイン結合を減少に導いた。これらの結果は、アメリカツメガエル卵母細胞内の機能アッセイによって測定されたいくつかのＥｎａＣβ変異体の活性と直接堅連する関連する(Snyder et al.，1995，Cell，83，969-978)。ＥｎａＣのαサブユニット（ＥｎａＣα−ＷＴ）の細胞質ドメインからのペプチドを含むＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフもまた、様々なＷＷドメインとの結合を示し、このことから、このサブユニットもまた、ＷＷドメインの仲介する相互作用によって調節されうると考えられる。合わせて考えると、上記の所見から、それによってＮｅｄｄ−４ファミリーの構成物のＷＷドメイン仲介相互作用は、結果として起こるユビキチン仲介破壊およびＮａ＋チャンネルの負の調節を導き、さらにリドル症候群の分子病理を理解を導く、直接メカニズムを示唆する。
【０２２８】
図２６Ａおよび２６Ｂは、Ｎｅｄｄ−４ファミリーの構成物のＷＷドメイン仲介相互作用が、Ｎａ＋チャンネルの負の調節を導くことができ、リドル症候群と関連する突然変異がどのようにして結果としてこの負の調節をなくすことになり、それによって、正常個体と比較した場合に、罹患した個体内の活性なＮａ＋チャンネルの数を増加させると言う機構の概略モデルを示している。このモデルによって、ＷＷドメインを含むＮｅｄｄ−４様タンパク質が野生型の上皮Ｎａ＋チャンネルタンパク質と結合し、それによってタンパク質のユビキチンタグ化を仲介できるタンパク質近辺内にＨＥＣＴドメインを持ってくることができる。ユビキチンのタグは、タンパク質が分解されるべきであるという合図である。これによってチャンネルタンパク質の自然なターンオーバーが可能になる。しかしながら、リドル症候群では、ＷＷ  Ｎｅｄｄ−４様タンパク質は、チャンネルタンパク質のプロリンに富む領域が失われる、または変異するために、チャンネルタンパク質と結合することができない。タンパク質は、ユビキチンによってタグ付けされることなくそして分解されることもない。このことは、結果として、リドル症候群患者内のチャンネルタンパク質の過剰発現を生ずる。
【０２２９】
ＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフ配列の個々のＷＷドメインの特異性は、ＳＨ３ドメインの共通リガンド配列ＰＸＸＰ（配列４４）（図１５、ＳｒｃおよびＣｒｋが含まれる）を含むペプチドならびにムスカリン性アセチルコリンレセプター（Ｍ４  ＡＣｈＲ）およびｃ−Ａｂｌを含むいくつかのタンパク質から誘導された一般にプロリンに富むペプチド制御ペプチドとの間で識別する能力によって、証明される。さらに、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフペプチドはどれも、ＳＨ３およびＳＨ２ドメインの両方を含む、ＦｙｎまたはＬｙｎのいずれとも結合しなかった。合わせて考えると、これらの結果から、ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフはＷＷ修飾タンパク質ドメインに関して別個の結合配列を示すと考えられる。
【０２３０】
ＷＷＰ２およびＷＷＰ４のＨＥＣＴドメイン内に含まれるＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフのリガンド選択性を試験するために、６．１節に示した方法の次に、これらのモチーフに相当するペプチドをビオチニル化しそしてアッセイを行った。ＷＷＰ２およびＷＷＰ４の野生型ＰＰＰＰＹ様ドメインに相当するペプチドを、それぞれ、ｂＷＷＯ６１およびｂＷＷＯ５９と名付けた。ＷＷＰ２およびＷＷＰ４のＰＰＰＰＹ様ドメインのチロシン残基のアラニン置換ペプチド変異体は、それぞれｂＷＷＯ６２およびｂＷＷＯ６０と名付けられた。図２５に示した結果は、ＷＷＰ４およびＷＷＰ２の両方のＨＥＣＴドメイン内のＰＰＰＰＹ様モチーフに相当するタンパク質が、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４内の個々のＷＷドメインと結合することを、証明している。特に、ＷＷＰ４  ＨＥＣＴドメイン内のＰＰＰＰＹ様モチーフに相当するペプチドは、ＷＷＰ１．１、ＷＷＰ１．４、ＷＷＰ２．１、ＷＷＰ２．２、ＷＷＰ２．４（３０分後のＯ．Ｄ．は４０５ｎｍで３．０であった）、ＷＷＰ４．１、ＷＷＰ４．２およびＷＷＰ４．３の個々のＷＷドメインと結合する。ＷＷＰ２およびＷＷＰ４の両方のＨＥＣＴドメインＰＰＰＰＹ様モチーフ内のチロシンのアラニン置換がＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ４のＷＷドメインへの結合活性をなくすという知見から、このチロシンは、ＨＥＣＴドメインＰＰＰＰＹ様モチーフおよびＷＷドメインとの間の結合相互作用に重要な役割を演ずると考えられる。
【０２３１】
ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフ内の重要なチロシン残基の存在から、チロシンのリン酸化がＷＷドメイン結合を修飾することができるか否かという疑問が起こる。ＰＰＰＰＹモチーフがｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されるか否かは知られていないが、本発明者は、ｐＷＢＰ−１ペプチド内にホスホチロシン残基（図１５Ａおよび１５Ｂでは、小文字の「ｐ」で示される）が存在すると、ＷＷＰ１，ＷＷＰ２およびＷＷＰ４との結合がなくなることを、発見した。さらに、ｐＷＢＰ−１ペプチドの結合は、アルカリホスファターゼとのストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体と結合していないペプチドまたは結合したペプチドのいずれかによる前処埋で、リン酸部分を除去することによって、回復することができた。この結果から、ＷＷドメインリガンド相互作用の修飾において、チロシンのリン酸化による潜在的な調節的役割が証明される。
【０２３２】
様々なタンパク質からのＰＰＰＰＹ（配列番号３）およびＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフを含むペプチドと、クローンＷＷＰ１およびＷＷＰ２内のＷＷドメインとの相互作用は、これらのタンパク質のユビキチン−仲介分解の役割を示唆している。この点で、ＰＤＧＦレセプターおよび酵母のα因子レセプターＳｔｅ２Ｐを含むいくつかの細胞膜タンパク質がリガンド結合時にユビキチン化され結果として分解されることは、注目に値する(Mori et al.，1992，J．Biol．Chem.，267，6429-6434；Hicke and Riezman，1996，Cell，84，277-287)。
【０２３３】
新しく同定されたタンパク質、ＷＷＰ１、ＷＷＰ２およびＷＷＰ３のＷＷドメインの結合選択性をさらに明らかにするため、本発明者らは、数多くの公表されたアミノ酸配列を検査し、そして共通のＷＷドメイン結合配列に似たプロリンに富むアミノ酸の広がりを同定した。共通のＷＷドメイン結合配列についての考察は、ChenおよびSudol（1995，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，92，7819-7823）を参照のこと。これらのプロリンを多く含む配列を含むペプチドを合成し、６．１および６．１．１節に記載の新規のＷＷドメインと特異的に結合するそれらの能力について、本発明の方法に従って試験した。結果を図７に示す。認められるように、多くの場合、合成されたペプチドは新規のＷＷドメインと結合させることができた。このことから、それらの合成ペプチドを用いて、ポリペプチドの起源からそれらの新規のＷＷドメインを同定できることが、示唆された。
【０２３４】
新しく同定されたＷＷドメインの結合選択性を明らかにするためのさらなる試みに於いて、偏ったファージ表示ライブラリー（ｃｗ、ｐｐおよびｘｙとして図２７中に同定）をスクリーニングして、ＷＷドメインの認識ユニット：ＷＷＰ１．１、ＷＷＰ１．４およびＷＷＰ３：として機能するペプチド配列を同定した。これらの個々のドメインは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現され、本明細書中に記載の方法（例えば、６．１、６．１．１および６．２節を参照のこと）に従って、結合活性についてアッセイした。図２７は、これらの各々のスクリーニングのそれぞれによって同定された認識ユニットペプチドおよび試験したＷＷドメインとこれらの認識ユニットとのそれぞれの相対結合アフィニティー（上記の技術を用いて定量した）を示している。
【０２３５】
６．４．  第６節およびその亜節に用いた材料
２ｘＹＴ培地（１リットル）
バクトトリプトン            １６ｇ
酵母エキス                  １０ｇ
ＮａＣｌ                      ５ｇ
２ｘＹＴ寒天プレート
２ｘＹＴ  ＋  １５ｇ寒天／Ｌ
２ｘＹＴトップアガロース（８％）
２ｘＹＴ  ＋  ８ｇアガロース／Ｌ
ＳＤＳ／ＤＴＴロード用バッファー
（１０ｍｌの５ｘ溶液）
０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基                ０．６１ｇ
８．５％ＳＤＳ                        ０．８５ｇ
２７．５％  スクロース                ２．７５ｇ
１００ｍＭ  ＤＴＴ                    ０．１５４ｇ
０．０３％  ブロモフェノールブルー    ３．０ｍｇ
細胞培養（一晩）：
適当な細胞型の一つの単離されたコロニーを培地に接種し、３７℃  Ｏ／Ｎで振とうしながらインキュベートする。
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ
２ｘＹＴ培地
マルトース              ０．２％
ＭｇＳＯ４              １０ｍＭ
クロラムフェニコール    ３４μｇ／ｍｌ
カナマイシン            ５０μｇ／ｍｌ
６．５  チラミド増幅システムを用いたビオチニル化ペプチドの検出
以下のプロトコールは、アルカリホスファターゼを用いて認識ユニットとＷＷドメインの結合を検出する、本明細書記載の方法の代替法である。ホスホペプチドである認識ユニットの使用が許される。
【０２３６】
材料：
ＴＳＡチラミドシグナル増幅システム（Dupont NEL-700）；ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ、ＳＡ−Ｐ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｈ２Ｏで複合（Sigma S-5512）；ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ、ＳＡ−ＡＰ、１ｍｇ／ｍｌ  Ｈ２Ｏで複合（Sigma S-2890）；ダルベッコのＰＢＳ（Sigma D1408）；ＰＢＳ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＰＢＳ／Ｔｒ；ＰＢＳ／Ｔｒ＋２０％ＤＭＳＯ；ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋＴＭＴＢＳ中ブロッキングバッフアー（Pierce 37535）；ｄ−ビオチン０．１ｍＭ；ビオチニル化ペプチドプローブ０．１ｍＭ；ニトロセルロース上へのプラークリフト（Schleicher & Schuell、ＢＡ８５、０．４５ｕｍ、８５ｎｍ）；ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴＴＭＢＣＩＰ／ＮＢＴバッファー化基質タブレット（Sigma B-5655）
方法：
１．  ＰＢＳ／Ｔｒ中のプラークリフトを攪拌しながら、室温（ＲＴ）で３ｘ５−１０分間洗浄する。
２．  フィルターを５０−７５ｍｌのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中、ＲＴで６０−９０分間ブロックするか、または必要になるまで４℃に保存する。
３．  フィルターをブロックしている間に、ＳＡ−Ｐ／ビオチニル化ペプチドプローブ複合体を調製する。
９３．６μｌのＳＡ−Ｐ  １ｍｇ／ｍｌおよび４５μｌの０．１ｎＭビオチニル化ペプチドプローブを混合する。
４℃で３０分間、インキュベートする。
３０μｌの０．１ｍＭ  ｄ−ビオチンを加え、混合する。
４℃で１５分間、インキュベートする。
上記複合体を６０ｍｌのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋに加える。
４．  フィルターを、ＳＡ−Ｐ／ビオチニル化ペプチドプローブ複合体に加え、攪拌しながら、ＲＴで２時間、インキュベートする。
５．  プラークリフトを、ＰＢＳ／Ｔｒ中で攪拌しながら、室温（ＲＴ）で５ｘ１０分間、洗浄する。
６．  各々のフィルターをペトリ皿中に置き、以下のように調製した５ｍｌのビオチニルチラミド試薬を加えた；
同容量の２ｘアンピシリン希釈物および脱イオン水を混合する。
４０μｌのビオチニルチラミド試薬／５ｍｌの増幅希釈物を加え、そして混合する。
７．  ビオチニルチラミド試薬をフィルター上、ＲＴで１０分間インキュベートする。フィルターのビオチニルチラミド試薬の露光時間および濃度は、経験的に決定されねばならないであろう。
８．  以下のようにフィルターを洗浄する：
１５ｍｌ  ＰＢＳ／ｔｒ＋２０％ＤＭＳＯ中に４ｘ１０分；
１５ｍｌ  ＰＢＳ／ｔｒ中に３ｘ５分；
１０ｍｌ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ中に２ｘ３分。
９．  フィルターを、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（０．３３μｌの１ｍｇ／ｍｌ保存液／２０ｍｌ  ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）で希釈したＳＡ−ＡＰに加える。フィルターへのＳＡ−ＡＰの露光時間および濃度は、経験的に決定されるべきであろう。フィルター当たり約１０ｍｌを用いる。
１０．  ＲＴで３０分間、インキュベートする。
１１．  以下のようにフィルターを完全に洗浄する；
１５ｍｌのＰＢＳ／ｔｒ中で４ｘ５分；
ＰＢＳ中で３ｘ５分。
１２．  ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴＴＭＢＣＩＰ／ＮＢＴバッファー化基質タブレットを用いて、フィルターを現像する。１０フィルター当たり６０ｍｌを用いる。
１錠を１０ｍｌの脱イオン水中に溶解する。
ノイズレベルに対する所望のシグナルが視覚的に得られるまで、攪 拌しながらRTで5-30分間現像させる。
水中でフィルターをリンスし、空気乾燥させる。
【０２３７】
本発明は、本明細書中に記載された具体的実施態様によって、範囲が制限させるものではない。事実、本明細書中に記載のそれらに加えて、本発明の様々な修飾が、前述の記載および添付図面から、当業者らに明らかになるであろう。そのような修飾は、特許請求の範囲内に入れるつもりである。
【０２３８】
様々な文献を本明細書中に引用したが、その開示は参照文献としてその全体を採用する。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】図１は、ＷＷドメインを含んだ標的分子に対して選択的な親和性を示す認識単位を同定する方法の、一般的な観点を図で表したものである。この説明図では、標的分子はＷＷドメインを有するポリペプチドで、そして認識単位はファージディスプレイライブラリーに発現させた、ＷＷドメインに対して選択的な親和性を有するペプチドである。
【図２】図２は、ＷＷドメイン含有タンパク質に関して発現ライブラリーを完全にスクリーニングする戦略を説明したものである。ペプチド認識単位は、ＧＳＴ融合タンパク質として細菌に発現させたＷＷドメインに結合するものに関して、コンビナトリアルペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって生み出される。続いてこのペプチドを使用して、ｃＤＮＡ発現ライブラリーに表現されるＷＷドメイン含有タンパク質のサブセットを選択する。コンビナトリアルライブラリーを再度用いて、発現ライブラリーの最初のスクリーニングの際に同定されたＷＷドメインの認識単位を同定する。そしてこれらの認識単位により、発現ライブラリーから重複するタンパク質のセットが同定される。この過程を複数回繰り返すことにより、特定のｃＤＮＡ発現ライブラリーに表現されるＷＷドメインの全てを体系的にクローン化することができるはずである。
【図３】図３は、適した認識単位を用いて多数のポリペブチドをスクリーニングすることにより、ＷＷドメインを含むポリペプチドを同定する一般的な方法を図で表したものである。この説明図では、多数のポリペプチドはｃＤＮＡ発現ライブラリーから得られ、そして認識単位はＷＷドメイン結合ペプチドである。
【図４】図４は、ＷＷドメイン含有ペプチドを使用して、いかにして他のＷＷドメイン含有タンパク質を同定することができるかを説明したものである。ＷＷドメインを含む標的分子の最初の選別からの工程、ペプチド認識単位の選択、およびその認識単位に対して選択的な親和性を持ち、かつ標的となる最初の分子のＷＷドメインあるいはそれに機能的に相当するものを含むポリペプチドの同定が、図で表わされている。
【図５】図５は、既知の多数のタンパク質由来のＷＷドメインと同時に、新規タンパク質ＷＷＰ１、ＷＷＰ２、ＷＷＰ３、およびＷＷＰ４由来の１２の新規ＷＷドメインのアラインメントも示す。このアラインメントは、様々な既知のＷＷドメインの間の最小限の一次配列上の相同性を説明している。「ｐｏｓ」は、既知である場合、表示配列の最初のアミノ酸の、示してあるタンパク質における位置を示す。「ａｃｃ．ｎｏ．」は、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号を表す。太字の残基は、これらの配列の７５％以上で保存されている残基である。ＷＷＰ２の３番目のＷＷドメイン（ＷＷＰ２−３）のアミノ酸配列位置１２と１３の間に、他のＷＷドメインとの相同性を最大化するためにアミノ酸のギャップを１つ導入した。共通配列において、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す；ｈは疎水性アミノ酸を表す；そして、ｔは極性アミノ酸を表す。
【図６】図６Ａは、ＷＷドメインの集合を円で図示したものである。「Ａ」は１つの円にみに特異的な認識単位である。一方、「Ｂ」は３つのＷＷドメインを認識し、他方、Ｂ１およびＢ２はそれぞれ２つのみを認識する。図６Ｂは、最初の認識単位によって発見されたポリペプチドに基づき新規の認識単位を選択するという、繰返しの方法を説明したものである。これらの新規の認識単位は関連する他のポリペプチドなどの同定を誘導し、関連する集団のますます多様なメンバーについての研究範囲を広げる。
【図７】図７は、示した遺伝子由来のペプチド配列を合成し、６．１および６．１．１．節に記載の新規ＷＷドメインに結合する能力について検討した実験の結果を描いたものである。精製ファージクローンを細菌の芝生（ｌａｗｎ）の上にのせ、適切な時間培養し、そしてフィルターリフトを６．１節にあるように進めた。マイナスは結合しないことを示し、プラスは結合を示すが、プラスの数は結合の強さを示す。さらなる詳細については、６．３節を参照のこと。
【図８】図８は、１６日齢のマウス胚ｃＤＮＡライブラリーをＱＰペプチド（配列番号８）にてスクリーニングすることにより単離されたＮｅｄｄ−４遺伝子のクローン５つを図で示したものである。黒い囲みはＷＷドメインを表す。詳細は６．１節を参照のこと。
【図９】図９は、１６日齢のマウス胚ｃＤＮＡライブラリーをペプチドＴＰ、ＹＰ、およびＱＰ（配列番号６、７、および８）の１：１：１の混合物にてスクリーニングすることにより単離されたＹＡＰ遺伝子のクローン２つを図で描いたものである。黒い囲みはＷＷドメインを表し、／／は依然として配列決定を行っている領域を表す。詳細は６．１節を参照のこと。
【図１０】図１０は、ヒト骨髄および脳のｃＤＮＡ発現ライブラリーをペプチドＷＢＰ−１、ＷＢＰ−２Ａ、およびＷＢＰ−２Ｂにてスクリーニングすることにより単離された新規ＷＷドメイン含有遺伝子のクローン３つ、およびヒト前立腺のｃＤＮＡ発現ライブラリーをＥＮａＣβおよびＥＮａＣγにてスクリーニングすることにより単離された新規ＷＷドメイン含有遺伝子の第４のクローンを、図で描いたものである。黒い囲みはＷＷドメインを表し、横線の付いた囲みはＨＥＣＴドメインを表し、空の囲みはグアニル酸キナーゼ様ドメインを表す。点を打ってある囲みはＣ２ドメインを表す。矢印は不完全なＮ−およびＣ末端のコーディング配列を意味する。詳細は６．１および６．１．１節を参照のこと。
【図１１】図１１は、ＣＷ１ランダムペプチドライブラリーの構築に用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。詳細は６．２節を参照のこと。
【図１２】図１２は、ｍＢＡＸベクターにコードされる、成熟したｐＩＩＩタンパク質のＮ末端に位置するペプチド配列を説明したものである。TCCTCGAGTA TCGACATGCC TTAGACTGCT AGCACTATGT ACAACATGCT TCATCGCAAC GAGCCAGGTG GGAGGAAGTT GAGCCCGCCC GCCAACGACA TGCCGCCCGC CCTCCTGAAG AGGTCTAGAは配列番号４である。TASTMYNMLH RNEPGGRKLS PPANDMPPAL LKRSRは配列番号５である。SSIDMPは配列番号５１である。
【図１３】図１３は、５．２．１．節に記載の特異性の連なりを描いたものである。「ＳＡ−ＡＰペプチド複合体」は、その節に記載のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼとビオチン化ペプチドの４価の複合体を表す。
【図１４】図１４は、ＷＷＰ１およびＷＷＰ２に由来するＨＥＣＴドメイン配列と様々なタンパク質のＨＥＣＴドメインとの比較を示す。６．１．１．節を参照のこと。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた個々のＷＷドメインに対する相対的な結合について、ビオチン化ペプチドを検討した交差親和性マッピング実験の結果を示す。そのペプチド配列内のＰＰＰＰＹおよびＰＰＰＰＹ様モチーフには下線を引いてあり、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２Ａペプチドの特異的アラニン置換変異体は太字で示してある。相対的結合は３つの独立な測定から評価した。全てのＰＰＰＰＹモチーフペプチドは、ＧＳＴ対照タンパク質あるいはＢＳＡに対して検出できるような結合は示さなかった。詳細は6.3節を参照のこと。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた個々のＷＷドメインに対する相対的な結合について、ビオチン化ペプチドを検討した交差親和性マッピング実験の結果を示す。そのペプチド配列内のＰＰＰＰＹおよびＰＰＰＰＹ様モチーフには下線を引いてあり、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２Ａペプチドの特異的アラニン置換変異体は太字で示してある。相対的結合は３つの独立な測定から評価した。全てのＰＰＰＰＹモチーフペプチドは、ＧＳＴ対照タンパク質あるいはＢＳＡに対して検出できるような結合は示さなかった。詳細は6.3節を参照のこと。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた個々のＷＷドメインに対する相対的な結合について、ビオチン化ペプチドを検討した交差親和性マッピング実験の結果を示す。そのペプチド配列内のＰＰＰＰＹおよびＰＰＰＰＹ様モチーフには下線を引いてあり、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２Ａペプチドの特異的アラニン置換変異体は太字で示してある。相対的結合は３つの独立な測定から評価した。全てのＰＰＰＰＹモチーフペプチドは、ＧＳＴ対照タンパク質あるいはＢＳＡに対して検出できるような結合は示さなかった。詳細は6.3節を参照のこと。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた個々のＷＷドメインに対する相対的な結合について、ビオチン化ペプチドを検討した交差親和性マッピング実験の結果を示す。そのペプチド配列内のＰＰＰＰＹおよびＰＰＰＰＹ様モチーフには下線を引いてあり、ＷＢＰ−１およびＷＢＰ−２Ａペプチドの特異的アラニン置換変異体は太字で示してある。相対的結合は３つの独立な測定から評価した。全てのＰＰＰＰＹモチーフペプチドは、ＧＳＴ対照タンパク質あるいはＢＳＡに対して検出できるような結合は示さなかった。詳細は6.3節を参照のこと。
【図１６Ａ】図１６Ａは、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ１のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号４５）。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ１のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号４５）。
【図１７】図１７は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ１のアミノ酸配列を示したものである（配列番号４６）。
【図１８Ａ】図１８Ａは、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ２の位置１−１８００のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号４７の一部分）。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ２の位置１８００−３４７６のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号４７の一部分）。
【図１９】図１９は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ２のアミノ酸配列を示したものである（配列番号４８）。
【図２０】図２０は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ３のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号４９）。
【図２１】図２１は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ３のアミノ酸配列を示したものである（配列番号５０）。
【図２２】図２２は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ４のヌクレオチド配列を示したものである（配列番号１２５）。
【図２３】図２３は、新規ヒト遺伝子であるＷＷＰ４のアミノ酸配列を示したものである（配列番号１２６）。３つのＷＷドメインに下線を引いてある（これらのドメインは配列番号１２７−１２９として同定されるが、この同定はアミノ末端からのそれぞれの順序に対応している。）。ＨＥＣＴドメイン（配列番号１３０）はＷＷＰ４の最後の３００アミノ酸に含まれる。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＷＷ−ＧＳＴ融合タンパク質に対する相対的な結合について、ヒトＥＮａＣのα、β、およびγ野生型サブユニットおよびいくつかの変異体に由来する、ＰＰＰＰＹモチーフ含有ペプチドを検討した、交差親和性マッピング実験の結果を示す。ＥＮａＣβＰ６１６ＬおよびＥＮａＣβ−Ｙ６１８Ｈは、リドル（Liddle）症候群患者に見出される特定のミスセンス置換を含むペプチドを意味する。アミノ酸置換は太字で示す。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ＷＷ−ＧＳＴ融合タンパク質に対する相対的な結合について、ヒトＥＮａＣのα、β、およびγ野生型サブユニットおよびいくつかの変異体に由来する、ＰＰＰＰＹモチーフ含有ペプチドを検討した、交差親和性マッピング実験の結果を示す。ＥＮａＣβＰ６１６ＬおよびＥＮａＣβ−Ｙ６１８Ｈは、リドル（Liddle）症候群患者に見出される特定のミスセンス置換を含むペプチドを意味する。アミノ酸置換は太字で示す。
【図２５】図２５は、ＧＳＴ融合タンパク質として発現させた個々のＷＷドメインに対する相対的な結合について、ビオチン化ペプチド（ＷＷＰ２（ペプチドｂＷＷＯ６１）（配列番号３）およびＷＷＰ４（ペプチドｂＷＷＯ５９）のＰＰＰＰＹ様モチーフに対応する）を検討した、交差親和性マッピング実験の結果を示す（６．１節に示すような下記の方法）。ＰＰＰＰＹ（配列番号３）モチーフおよびＰＰＰＰＹ（配列番号３）様モチーフに下線を引いてあり、そしてＷＷＰ２およびＷＷＰ４のＨＥＣＴドメイン内のＰＰＰＰＹ様モチーフの特異的アラニン置換ペプチド変異体（この変異体はそれぞれペプチドｂＷＷＯ６１およびｂＷＷＯ６０として同定される。）を太字で示してある。
【図２６Ａ】図２６Ａは、上皮性Ｎａ＋チャネルおよび、リドル症候群に関連する変異を示したものである。野生型の上皮性Ｎａ＋チャネルタンパク質はα、β、およびγサブユニットから成り立っている。各サブユニットはプロリンに富んだモチーフ、すなわちＷＷドメイン結合配列を１つ含む。リドル症候群では、上皮性Ｎａ＋チャネルタンパク質が変異している。すなわち、βあるいはγサブユニットのいずれかがプロリンに富んだモチーフを欠損するように短縮しているか、あるいはＰＰＰＮＹモチーフをＰＰＬＮＹ（Ｐ６１６Ｌと表示）またはＰＰＰＮＨ（Ｙ６１８Ｈ）に変えるような点突然変異のいずれかがβサブユニット内に見出された。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、野生型上皮性Ｎａ＋チャネルタンパク質に結合するＷＷドメインを含み、それによりＨＥＣＴドメインを、このタンパク質の近くであって、ＨＥＣＴドメインがタンパク質のユビキチンタグ付け（tagging）を仲介し得るような場所に運ぶ、Ｎｅｄｄ−４様タンパク質を示したものである。ユビキチンタグは、タンパク質が分解されるべきだというシグナルを送る。これにより、チャネルタンパク質の天然の代謝回転ができるのである。しかし、リドル症候群では、チャネルタンパク質のプロリンに富んだ領域が失われているかあるいは変異しているために、ＷＷ  Ｎｅｄｄ−４様タンパク質がチャネルタンパク質に結合できない。このタンパク質はユビキチンによってタグ付けされず、分解されない。それが、リドル症候群患者におけるチャネルタンパク質の過剰発現という結果になる。
【図２７】図２７は、ＷＷドメインの特異性を分析するためにペプチド認識単位（「リガンド」）を得ようと、ＷＷＰ１．１、ＷＷＰ１．４、あるいはＷＷＰ３ドメインにてランダムなあるいは偏ったライブラリーをスクリーニングすることにより得られた、ＷＷドメイン結合クローンの配列を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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