(57)【要約】【課題】  パラインフルエンザ２型ウイルス（ＰＩＶ２）にα抗原等を組み込んだアレルギー性疾患の治療・予防に使用可能な医薬用組成物等を提供すること。【解決手段】  抗酸菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）由来のα抗原（抗原８５複合体構成蛋白８５Ｂ）、その類似体（８５Ａ、または８５Ｃなど）、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込んだ医薬用組成物によって達成される。【選択図】          図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込んだことを特徴とするアレルギー性疾患の予防用または治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記α抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来のものであることを特徴とする請求項１に記載のアレルギー性疾患の予防用または治療用医薬組成物。
【請求項３】
α抗原の類似体が、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａまたは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃであることを特徴とする請求項１または２に記載のアレルギー性疾患の予防用または治療用医薬組成物。
【請求項４】
アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、または潰瘍性大腸炎であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアレルギー性疾患の予防用または治療用医薬組成物。
【請求項５】
抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込み、これをヒトを含む哺乳動物に投与することを特徴とするアレルギー性疾患の予防または治療方法。
【請求項６】
前記α抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来のものであることを特徴とする請求項５に記載のアレルギー性疾患の予防または治療方法。
【請求項７】
α抗原の類似体が、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａまたは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃであることを特徴とする請求項５または６に記載のアレルギー性疾患の予防または治療方法。
【請求項８】
アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、または潰瘍性大腸炎であることを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載のアレルギー性疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラインフルエンザ２型ウイルス（ＰＩＶ２）を用いた医薬組成物等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＩＶ２は、パラミクソウイルス科に属するウイルスである。ゲノムは約１５０００塩基の一本のマイナス鎖ＲＮＡであり、これにヌクレオカプシド蛋白（Ｎ）が結合し、らせん対称ヌクレオプロテイン複合体（ヌクレオカプシド、ＲＮＰ）を形成している。ウイルスゲノムがコードするタンパク質のうち、Ｍ蛋白は、ウイルス糖蛋白の細胞質内ドメイン、エンベロープ脂質二重膜およびＲＮＰと相互作用し、ウイルス粒子の出芽に重要である。遺伝子組換えにより、Ｍ蛋白を欠失させたウイルスゲノムは、細胞に感染して、所定のウイルスタンパク質を発現するものの、出芽することができない。本発明者は、Ｍ蛋白を欠失させたＰＩＶ２が、外来タンパク質を標的細胞で発現させるためのベクターとして使用できることを見出した（非特許文献１）。
一方、本発明者は、抗酸菌由来のα抗原が、アレルギー性疾患の予防・治療に効果的であることを見出した（特許文献１）。
【特許文献１】国際公開公報２００２／０６６０５５
【非特許文献１】第５２回日本ウイルス学会学術集会、M蛋白欠損パラインフルエンザ２型ウイルス(PIV2)及びマウスIL-4を挿入したPIV2の性状解析、２００４年１１月２１日
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特許文献１では、α抗原をＣＭＶプロモーターおよびＴＰＡシグナルペプチドの下流に組み込んだ発現ベクターｐｃＤＮＡ−α−Ｋとして構築し、アトピー性皮膚炎マウスモデルでの検証を行った。しかしながら、α抗原を更に有効に用いるために発現量が多いベクターが求められていた。ここで、ＰＩＶ２は、ウイルス系のベクターとしては、発現量が多いものの、応用例が少ないことから如何なるタンパク質に応用できるのか未知の点が多かった。
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＰＩＶ２にα抗原等を組み込んだアレルギー性疾患の治療・予防に使用可能な医薬用組成物等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者は、鋭意検討の結果、Ｍ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２にα抗原を組み込んだ発現ベクターが、所定の部位でα抗原を発現させることにより、アレルギー性疾患に有効であることを見出し、基本的には本発明を完成させるに至った。
本発明者は、抗酸菌由来のα抗原遺伝子をＰＩＶ２に組み込んで呼吸器に投与することにより、呼吸器粘膜のみならず他の粘膜（例えば、消化管の粘膜）においても特異的な抗体が発現されることを見出した。α抗原遺伝子あるいはα抗原蛋白は、Ｔｈ２型サイトカイン優位の免疫状態を改善し、さらにアレルギー性疾患の諸症状を抑制・改善でき、広くアレルギー性疾患の予防もしくは治療に有効であることは、既に本発明者の検討によって明らかとされていることから（特許文献１）、今回の発明はα抗原を更に有効に用いるものとなる。
【０００５】
こうして、第一の発明に係るアレルギー性疾患の予防用または治療用医薬組成物は、抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体（以下、「α抗原等」という）をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込んだことを特徴とする。
また、第二の発明に係るアレルギー性疾患の予防または治療方法は、抗酸菌由来のα抗原、その類似体、それらと同様の機能を有するそれらの変異体をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込み、これをヒトを含む哺乳動物に投与することを特徴とする。
なお、α抗原が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来のものであることが好ましい。また、α抗原の類似体が、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａまたは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃであることが好ましい。
また、アレルギー性疾患が、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、または潰瘍性大腸炎であることが好ましい。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、α抗原等をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込んだ発現ベクターをアレルギー性疾患患者に投与した場合に、アレルギー性疾患の改善をもたらし極めて有効な効果を発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【０００８】
本発明に用いるＰＩＶ２は病原性が極めて少なく、かつ蛋白質の発現量が多い。このため、そのまま外来蛋白質であるα抗原等をコードする遺伝子を組み込んだＰＩＶ２を調整して、これを用いることも不可能ではない。しかしながら、ＰＩＶ２のＭ蛋白質を欠損させることにより、感染および蛋白質の発現は同等に行われるものの、出芽ができないために次世代のＰＩＶ２を生産しないという、より安全なＰＩＶ２ベクターとなる。このため、本発明においては、Ｍ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２にα抗原等をコードする遺伝子を組み込むこととした。α抗原等を組み込む場所としては、ＰＩＶ２ゲノムのいずれの位置でも良いが、アンチセンスウイルスゲノムの５’末端側に組み込むことにより、外来蛋白質の発現量が多くなるので好ましい。アンチセンスPIV2ゲノムは、一本鎖ＲＮＡであり、５’末端から３’末端に向かって、リーダー（Leader：プロモーター配列)、ＮＰ、Ｖ／Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌ、トレイラー(Trailer)という構造を持っている。このため、α抗原等をコードする遺伝子は、リーダー（プロモーター配列）の直後、またはＮＰとＶ／Ｐの間等の５’末端側に近い位置であることが好ましい。
【０００９】
Ｍ蛋白質を欠損させるには、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子部分の全部または一部を取り除く方法、またはＭ蛋白質をコードする遺伝子のどこかにストップコドンを組み込む方法などが例示される。
本発明において、アレルギー性疾患とは、正常人が反応しない環境抗原・自己抗原などに対して過敏に反応を示し、自己の免疫系により各臓器の破壊、障害を生ずる疾患である。具体的には、アトピー性皮膚炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、潰瘍性大腸炎などが含まれるが、本発明の適用はこれらの具体的疾患には限定されない。
【００１０】
本発明において、α抗原とは、抗酸菌に普遍的に存在する蛋白の一つであり、抗原８５複合体の一つである抗原８５複合体構成蛋白８５Ｂとして同定されたものである。この抗原８５複合体は、分子量が３０−３２ｋｄ程度の抗原８５複合体構成蛋白８５Ａ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３１２３−３１３０，１９８９）、抗原８５複合体構成蛋白８５Ｂ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３８４７−３８５４，１９８８）、および抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：３２０５−３２１２，１９９１）から構成され、これらは抗酸菌の主要な分泌蛋白である。これらの分泌蛋白は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ等の同属の細菌間では、遺伝子・アミノ酸配列が種を超えて高い相同性を示し、モノクローナル抗体に対する交差反応性を示す（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：６４８−６６１，１９９２）。α抗原（抗原８５複合体構成蛋白８５Ｂ）の類似体としては、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａ、抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃなどが挙げられる。
【００１１】
本発明において、抗酸菌由来のα抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子とは、α抗原蛋白あるいは抗原８５複合体構成蛋白８５Ａ、抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃなどのα抗原蛋白の類似体を発現することが可能な遺伝子を指す。具体的には、α抗原もしくはその類似体をコードする遺伝子を含む発現ベクターの形態にある遺伝子が挙げられる。α抗原をコードする遺伝子としては、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：５５０−５５６，１９９０）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６１：１１７３−１１７９，１９９３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４６６−１４７３，１９９３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：１５３−１６３，１９９２）などの抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子のいずれも本発明に用いることができる。これらのうち、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉのα抗原をコードする遺伝子として、配列番号１に示す３９０番目〜１２４４番目までの塩基配列を有するＤＮＡが挙げられる。このＤＮＡ以外にも、このＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする変異体ＤＮＡ、このＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来のα抗原と同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体ＤＮＡを用いることもできる。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来のα抗原と同様の機能とは、同様のアレルギー性疾患の予防効果または治療効果を奏することを示している。
【００１２】
変異体ＤＮＡを得るための具体的方法としては、例えば次の方法が挙げられる。即ち、５０％ホルムアミド、４ｘＤｅｎｈａｒｄｔ、５ｘＳＳＰＥ（ＳＳＰＥ溶液：ＥＤＴＡリン酸ナトリウム塩（ＳＳＰＥ）、１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ：０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン）、０．２％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ、および１２．５ｎｇのプローブ（配列番号１に示す３９０番目〜１２４４番目までの塩基配列を有するｃＤＮＡ断片１２．５ｎｇを、ＢｃａＢｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）により標識したもの）存在下で、４５℃で１４〜１６時間コロニーハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを１ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ溶液中で４５℃にて３０分間、その後０．１ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ溶液中で５５℃にて１時間、最後に０．１ｘＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ溶液中で６５℃にて１時間洗浄し、バックグラウンドを落とした後、Ｘ線フィルム（Ｆｕｊｉ）に−８０℃で７２時間露出し、対応するコロニーの位置を決定して単離することによって変異体ＤＮＡを得ることができる。これらの変異体がコードするアミノ酸配列は、α抗原のアミノ酸配列に対して通常６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性を有する。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ以外の抗酸菌由来のα抗原をコードする遺伝子の場合にも、同様にそれらの変異体であってもよい。
【００１３】
α抗原の類似体である抗原８５複合体構成蛋白８５Ａをコードする遺伝子としては、上記したα抗原遺伝子についての各種抗酸菌と同様の抗酸菌由来の遺伝子が挙げられる。より具体的には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原８５複合体構成蛋白８５ＡをコードするＤＮＡが挙げられる（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３１２３−３１３０，１９８９）。抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃをコードする遺伝子についても、同様に各種抗酸菌由来の遺伝子が挙げられ、より具体的には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原８５複合体構成蛋白８５ＣをコードするＤＮＡが挙げられる（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：３２０５−３２１２，１９９１）。これらのＤＮＡについても、上記と同様に、これらのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡや、このＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡであって、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａあるいは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃと同様の機能を有する蛋白質をコードする変異体を用いることができる。
【００１４】
上記ＤＮＡは、前記文献に記載されている配列情報、Ｇｅｎｂａｎｋ等の配列情報等に基づき適当なＤＮＡ部分をＰＣＲのプライマーとして用い、抗酸菌由来のｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことなどにより、クローニングすることができる。また、アミノ酸配列情報に基づき化学合成することもできる。上記ＤＮＡの変異体は、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができる。
【００１５】
本発明では、アレルギー性疾患の予防もしくは治療に抗酸菌由来のα抗原蛋白、その類似体である抗原８５複合体構成蛋白８５Ａもしくは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃそのもの、あるいはそれらの変異体蛋白を用いることもできる。このようなα抗原としては、上記したα抗原をコードする遺伝子によってコードされる蛋白質が挙げられる。具体的には、例えば配列番号１に示したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ由来の塩基配列を有するＤＮＡによってコードされるα抗原であって配列番号２に示したアミノ酸配列を有するα抗原が挙げられる。このアミノ酸配列を有するα抗原以外にも、配列番号２のアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって該α抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ以外の抗酸菌由来のα抗原の場合にも、同様にそれらのアミノ酸配列に対して１若しくは複数（好ましくは数個）のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質であって該α抗原と同様の機能を有する変異体蛋白質であってもよい。また、抗原８５複合体構成蛋白８５Ａもしくは抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃについても、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原８５複合体構成蛋白８５Ａ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７：３１２３−３１３０，１９８９）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来の抗原８５複合体構成蛋白８５Ｃ（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：３２０５−３２１２，１９９１）などが挙げられる。これらのα抗原蛋白の類似体についても、α抗原蛋白の変異体と同様の変異体であってもよい。
【００１６】
このような蛋白質は、それをコードする遺伝子を用いた組換えＤＮＡ法により製造することもでき、また化学合成によって製造することもできる。あるいは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉなどの抗酸菌を適当な培地で培養し、その培養液から公知の精製法によって精製して得ることもできる（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２０２−２０９，１９９６；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３８４７−３８５４，１９８８；Ｈｉｒｏｓｈｉｍａ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２：１−８，１９８３）。
本発明において、アレルギー性疾患の予防もしくは治療に、抗酸菌由来のα抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を用いる場合には、具体的には、抗酸菌由来のα抗原、その類似体またはそれらの変異体をコードする遺伝子を含むＰＩＶ２の形態で用いられる。組換えＰＩＶ２は、予めＭ蛋白質を欠失させたＰＩＶ２ゲノムを用いることができる。Ｍ蛋白質欠失ＰＩＶ２ゲノムにα抗原等をコードする遺伝子を組み込むことにより、α抗原等を発現するＰＩＶ２ベクターが構築される。
【００１７】
この発現ベクターは、通常、噴霧剤・経口剤・経粘膜剤・注射剤などの形態としてヒトを含む哺乳動物に投与できる。各剤は常法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。各剤には、必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。こうして得られた発現ベクターをアレルギー性疾患の治療に用いるためには、通常の方法によって投与することができる。
【００１８】
α抗原等をコードする遺伝子を含む発現ベクターは、通常ヒトを含む哺乳動物の皮膚、粘膜、筋肉、腹腔等に投与される。投与量としては、投与形態、投与方法、対象患者、疾患の種類などにより変動し得るが、通常、発現ベクターとして、約1ｘ106〜1ｘ1010個のウイルス、好ましくは約1ｘ107〜1ｘ109個のウイルスであり、通常数ヶ月に亘って１日１回、合計２〜３回投与するのが好ましい。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
【００１９】
実施例１  ＜Ｍ蛋白欠失アンチセンスｒＰＩＶ２ゲノムの構築＞
図１には、Ｍ蛋白質をコードする遺伝子の所定の位置にストップコドンを組み込んだアンチセンスｒＰＩＶ２ゲノムの概要を示した。図１には、Δ１１９（Ｍ蛋白遺伝子の２５９位のＡＡＧをＴＡＧとしたもの）およびΔ２８９（Ｍ蛋白遺伝子の８９位のＡＴＧをＴＡＧ、２５９位のＡＡＧをＴＡＧとしたもの）の２種類のＭ蛋白質欠損ＰＩＶ２（それぞれ、ｒＰＩＶ２（Δ１１９）、およびｒＰＩＶ２（Δ２８９））アンチセンスｒＰＩＶ２ゲノムをT7プロモーターの下流にcDNAとして組み込んだプラスミドベクターの様子を示した。Ｍ蛋白を欠損させたＰＩＶ２を構築するには、当業者に公知の遺伝子手法（例えば、ＰＣＲ法）を用いることができる。
【００２０】
実施例２  ＜ｒＰＩＶ２の調製方法＞
次に、T7プロモーターの下流に挿入したアンチセンスrPIV2ゲノムcDNAを含むプラスミドからのウイルス粒子の回収方法について説明する。図２には、その方法の概要を示した。図１のようにして構築したアンチセンスｒＰＩＶ２ゲノム（ｒＰＩＶ２、ｒＰＩＶ２（Δ２８９）、ｒＰＩＶ２（Δ１１９））をＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞（例えば、ＢＳＲ−Ｔ７／５）にトランスフェクションした。このとき、ＰＩＶ２ポリメラーゼユニット（すなわち、ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白、Ｌ蛋白）を発現するベクターであるＰＩＶ２−ＮＰ、ＰＩＶ２−Ｐ、ＰＩＶ２−Ｌの３種類の発現ベクターを共にトランスフェクションした。なお、ＤＮＡのトランスフェクションには、当業者に周知の方法を用いることができる（本実施形態では、リポフェクトアミンを用いた）。
【００２１】
４８時間毎にＶｅｒｏ細胞との共培養を５〜７回行ったところ、細胞変性効果（Cytopathic effect：ＣＰＥ）が９０％以上の効率で確認された。このとき、ｒＰＩＶ２では、上清中に大量の組換えウイルス粒子が認められたが、ｒＰＩＶ２（Δ２８９）およびｒＰＩＶ２（Δ１１９）では、ほとんど組換えウイルス粒子が確認されなかった。これは、Ｍ蛋白質を欠損すると、ＰＩＶ２の出芽が行われないことを示している。
そこで、Ｖｅｒｏ細胞に代えて、ＰＩＶ２−Ｍを発現するＣｏｓ細胞（Ｍ蛋白を発現するベクターであるＰＩＶ２−ＭをトランスフェクションしたＣoｓ細胞）を用いて共培養した。その結果、ｒＰＩＶ２（Δ２８９）およびｒＰＩＶ２（Δ１１９）についても、上清中に大量の組換えウイルス粒子が認められた。
なお上記では、Ｔ７プロモーターを用いたｒＰＩＶ２の調製方法について説明したが、本発明によれば、いずれのベクター（ファージベクター、プラスミドベクターなど）を用いて調製したｒＰＩＶ２であっても使用することができる。
【００２２】
実施例３  ＜α抗原をコードする遺伝子を含むｒＰＩＶ２の構築＞
配列番号１に示した３９０番目〜１２４４番目の塩基配列からなるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉのα抗原遺伝子（α−Ｋ）をＭ蛋白欠損ｒＰＩＶ２のＮｏｔＩ部位に挿入することにより、α抗原遺伝子を組み込んだＭ蛋白欠損ｒＰＩＶ２（以下、「ｒＰＩＶ２−αＫ」、または「ＰＩＶ２Ａｇ８５Ｂ」という）を構築した（図３を参照）。ＮｏｔＩ部位はｒＰＩＶ２ゲノムのリーダー配列の直後に組み込まれたものであり、アンチセンスｒＰＩＶ２ゲノムの５’末端付近に設けられている。なおコントロールとして、ＮｏｔＩ部位にＥＧＦＰ（オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質）遺伝子を組み込んだｒＰＩＶ２（以下、「ｒＰＩＶ２−ＥＧＦＰ」という）を構築した。
実施例２の方法により、ｒＰＩＶ２−αＫおよびｒＰＩＶ２−ＥＧＦＰを大量に調製した。
【００２３】
実施例４  ＜ハムスターにおけるＥＧＦＰの発現確認＞
ハムスターにｒＰＩＶ２−ＥＧＦＰを経鼻投与（ＩＮ：５ｘ１０５ウイルス）したところ、気道および肺の上皮細胞において、ＥＧＦＰの蛍光が確認された。このことから、ｒＰＩＶ２は経鼻投与により、気道や肺に極めて高い外来遺伝子の発現を促すことが分かった。
実施例５  ＜マウスを用いた卵白アルブミン感作に対する効果確認＞
４群（６匹／群）のＢＡＬＢ／Ｃマウスに、一匹あたり500μlのリン酸緩衝液−生理食塩水（ＰＢＳ）に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１０μｇとAlum(水酸化アルミニウム)１ｍｇを溶かした溶液を実験開始1日目及び１４日目に腹腔内投与（ＩＰ）による免疫を行い、２１日目から５日間エアロゾルにて５％−ＯＶＡ（ＰＢＳ）溶液を吸入させ、喘息モデルを作製した。各群については、下記それぞれの処置を施した。
【００２４】
１群：ＰＢＳ（ＩＰ）−ＰＢＳ（ＩＮ）：上記喘息モデルを作製する際に、ＯＶＡに代えて、一匹あたり500μlのＰＢＳにAlum１ｍｇを溶かした溶液をＩＰした。また、実験開始−20日目（ＯＶＡ感作の前日）にそれぞれ2０μlのＰＢＳをＩＮした。
２群：ＯＶＡ（ＩＰ）−PBS（ＩＮ）：実験開始−20日目（ＯＶＡ感作の前日）に2０μＬのＰＢＳを経鼻投与（ＩＮ）した。
３群：ＯＶＡ（ＩＰ）−ＰＩＶ２（ＩＮ）：実験開始−20日目（ＯＶＡ感作の前日）に 1x107 ウイルス/２０μlのｒＰＩＶ２をＩＮした。
４群：ＯＶＡ（ＩＰ）−ＰＩＶ２Ａｇ８５Ｂ（ＩＮ）：実験開始−20日目（ＯＶＡ感作の前日）に1x107ウイルス/２０μlのｒＰＩＶ２−αＫをＩＮした。
各群については、実験開始から２５日目に、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度（OVA-specific IgE）、気管支肺胞洗浄液（BALF）中の総細胞数（Total cell）、総タンパク濃度（Total protein）、インターロイキン５濃度（IL-5）、及びインターロイキン１３濃度（IL-13）を測定した。また、肺組織における好酸球を染色（メイギムザ染色）し、顕微鏡にて細胞数を測定した。
【００２５】
結果を図４〜図９に示した。図４〜図８に示すように、第２群または第３群においては、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度、ＢＡＬＦ中の総細胞数、総タンパク濃度、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３濃度は、第１群に比べると有意に（ｐ＜0.01）増加した。また、第２群と第３群との間には、有意差は認められなかった。
第４群においては、第２群及び第３群と比べると、全てのデータについて、有意に減少が認められた（ｐ＜0.01）。また、総タンパク濃度とＩＬ−１３濃度については、第４群と第１群との間で有意差が認められない程度まで減少した。
図９に示すように、第２群および第３群では、第１群と比較すると、好酸球の浸潤が認められた。一方、第４群では、第２群および第３群と比べると、これらの炎症像は明らかに減少しており、第１群とほとんど差異が認められなかった。
これらの結果より、ＰＩＶ２Ａｇ８５Ｂは、ＯＶＡが起こすアレルギー性の炎症反応に対して、非常に予防的及び治療的に作用することが明らかとなった。特に、先に本発明者らが明らかにした特許文献１では、予防効果は認められるものの、治療効果については十分には認められにくかったが、本実施形態では、治療効果についても十分に証明された。
【００２６】
実施例６  ＜マウスにおけるα抗原の免疫効果確認＞
マウスにｒＰＩＶ２−αＫを経鼻投与（ＩＮ：1x107ウイルス）した後、18日後に血清中および糞便(200mg/ml)中のＰＩＶ２に対する各種抗体量を測定した。図１０〜図１２には、結果を示した。図より、ｒＰＩＶ２−αＫを経鼻投与することにより、血清中のみならず、糞便中にもＰＩＶ２に対する特異的な抗体が増加することが示された。これは経鼻的に取り込まれたｒＰＩＶ２から発現されたα抗原が、局所部位のみならず他の粘膜にも免疫的な効果を示したことを意味している。
【００２７】
こうして、経鼻的にｒＰＩＶ２−αＫを投与することにより、その局所におけるアレルギー性疾患であるアレルギー性鼻炎および喘息に代表される呼吸器におけるアレルギー性炎症疾患に効果的であることに加え、他の部位におけるアレルギー性疾患（例えば、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、潰瘍性大腸炎）にも有効であることを示している。
このように本実施形態によれば、α抗原等をコードする遺伝子をＭ蛋白質を欠損させたＰＩＶ２に組み込んだ発現ベクターをアレルギー性疾患患者に投与することにより、アレルギー性疾患の改善をもたらし極めて有効な効果を発揮することができた。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】Ｍ蛋白を欠失させたアンチセンスｒＰＩＶ２ゲノムの概要を説明する図である。
【図２】T7プロモーターの下流に組込んだアンチセンスrPIV2ゲノムcDNAを含むプラスミドベクターからのウイルス粒子を回収する方法を説明する図である。
【図３】α抗原遺伝子を組み込んだＭ蛋白欠損アンチセンスｒＰＩＶ２（ｒＰＩＶ２−αＫ）の構造を示す図である。
【図４】喘息様モデルマウスにおける経鼻投与による効果を以下のパラメーターにより比較した図であり、第１群（ＰＢＳ）、第２群（ＯＶＡ）、第３群（ＰＩＶ２）、および第４群（ＰＩＶ２−Ａｇ８５Ｂ）において、ＢＡＬＦ中の総細胞数を比較したグラフである。
【図５】第１群〜第４群において、ＢＡＬＦ中の総タンパク濃度を比較したグラフである。
【図６】第１群〜第４群において、血清中ＯＶＡ特異的ＩｇＥ濃度を比較したグラフである。
【図７】第１群〜第４群において、ＢＡＬＦ中のＩＬ−５濃度を比較したグラフである。
【図８】第１群〜第４群において、ＢＡＬＦ中のＩＬ−１３濃度を比較したグラフである。
【図９】第１群〜第４群において、呼吸器の炎症像を観察したときの代表的な顕微鏡写真図である。
【図１０】ｒＰＩＶ２−αＫを経鼻投与した動物の血清中および糞便中のＩｇＡ量を示すグラフである。ｎａｉｖｅは、ｒＰＩＶ２−αＫを投与しない動物のデータであり、ＰＩＶ２／Ａｇ８５Ｂは、ｒＰＩＶ２−αＫを投与した動物のデータである。また、一対となったデータのうち、左側は血清中データ（ｘ１００）を、右側は糞便中データ（ｘ５）を示している（図１１および図１２においても同じである）。
【図１１】ｒＰＩＶ２−αＫを経鼻投与した動物の血清中および糞便中のＩｇＧ１量を示すグラフである。
【図１２】ｒＰＩＶ２−αＫを経鼻投与した動物の血清中および糞便中のＩｇＧ２a量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図９】
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【配列表】
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