(57)【要約】【課題】顕微鏡下での細胞長期観察時に、細胞培養に必要な各種の液体または気体を細胞への刺激を低減した状態で供給排出できるようにすること。【解決手段】実質的に気密構造であり、気体と培養液２８が接触して貯められた培養液貯留タンク４６と、圧力的に大気に開放された気体層と細胞２６を含む培養液２８の層とを保持する細胞培養容器２４と、上記培養液貯留タンク４６から上記細胞培養容器２４に培養液２８を供給する供給配管４４と、上記細胞培養容器２４から上記培養液貯留タンク４６に向けて上記細胞培養容器２４内の気体又は培養液２８を排出する排出配管４８と、上記細胞培養容器２４から上記培養液貯留タンク４６に至る上記排出配管４８の経路の途中に設けられ、上記排出配管４８内に存在する気体又は培養液２８を上記培養液貯留タンク４６に流入させる圧力を生じさせるベリスタポンプ５０と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に気密構造であり、気体と培養液が接触して貯められた培養液貯留タンクと、
圧力的に大気に開放された気体層と生細胞を含む培養液層とを保持する細胞培養容器と、
上記培養液貯留タンクから上記細胞培養容器に培養液を供給する供給配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに向けて上記細胞培養容器内の気体又は培養液を排出する排出配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに至る上記排出配管の経路の途中に設けられ、上記排出配管内に存在する気体又は培養液を上記培養液貯留タンクに流入させる圧力を生じさせるポンプ手段と、
を具備することを特徴とする細胞培養液供給排出装置。
【請求項２】
上記細胞培養容器は、気体層と大気を連通する大気開放口を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項３】
上記細胞培養容器の大気開放口は、上記供給配管との接続口及び上記排出配管の接続口より、鉛直方向上方に位置することを特徴とする請求項２に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項４】
上記細胞培養容器は、所定の圧力で培養ガスが供給されるガス供給口を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項５】
上記培養液貯留タンク側の上記供給配管の先端は、常に上記培養液貯留タンク内の培養液に接触していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項６】
上記培養液貯留タンクは、当該培養液貯留タンク内の気体を圧力的に大気に開放する弁を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項７】
上記培養液貯留タンクは、上記細胞培養容器より鉛直方向下方に位置することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項８】
上記培養液貯留タンクと上記ポンプ手段との間に培養液排出タンクを更に具備し、
上記排出配管内に存在する気体は、上記培養液排出タンクを介して上記培養液貯留タンクに流入され、
上記排出配管内に存在する培養液は、上記培養液排出タンク内に留まる、
ことを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項９】
上記ポンプ手段は、シリンジピストンポンプであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項１０】
上記ポンプ手段は、更に、上記培養液貯留タンク内に存在する気体を上記細胞培養容器に流入させる圧力を生じさせることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養液供給排出装置。
【請求項１１】
上記培養液貯留タンクは、当該培養液貯留タンク内の気体を圧力的に大気に開放する弁を有し、
上記培養液貯留タンクは、上記細胞培養容器より鉛直方向下方に位置する、
ことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養液供給排出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡上で細胞を生きたまま観察する観察システムにおいて、生細胞を含む培養液層を保持する細胞培養容器内の培養液を交換するための細胞培養液供給排出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子解析技術が進み、ヒトを含む多くの生物における遺伝子配列が明らかにされ、解析された遺伝子産物（タンパク質）と疾病との因果関係についても少しずつ解明されてきた。今後さらに、各種のタンパク質や遺伝子を網羅的に統計的に解析するため、細胞などの生体試料を用いる検査装置の研究開発が鋭意進められている。
【０００３】
通常、細胞は、プラスチック製又はガラス製のディッシュやフラスコ等に播種され、インキュベータ内で培養されている。このインキュベータは、内部が例えば、二酸化炭素濃度５％、温度３７℃、湿度１００％に設定され、細胞の育成に適した環境に保たれている。このような培養中の細胞を観察する方法は、いくつかの方法が知られている。
【０００４】
その一つとして、インキュベータから上述したディッシュやフラスコ等を取り出し、位相差顕微鏡等の倒立型顕微鏡を用いて観察を行う方法が知られている。上記の方法では、可能な限り速やかに細胞の観察を行い、観察終了後、細胞をインキュベータ内に戻す必要がある。これは、細胞が通常環境下に長く置かれることにより、細胞の活性が損なわれるのを防止するためである。即ち、細胞の活性が不安定であると、正確な評価を行うことが困難であるためである。また、細胞をインキュベータから取り出す際は、コンタミネーション等が起こらないように十分注意して行われている。
【０００５】
一方、観察光学系のステージ上で長期間培養をしながら細胞を観察する生体試料培養観察システムも提案されてきた。このような検査装置においては、細胞などの生体試料を長期間培養しながら所定の情報を検出する事が行われている。この場合、培養液中の細胞からの老廃物（乳酸等）がある一定以上の濃度にならないように、観察途中で培養液の交換が必要となる。
【０００６】
しかし、清浄に保たれていないステージ上で、培養容器を開放して培養液を交換すると、培養容器内が汚染されるおそれがある。当然、汚染された状態で観察を続けても正確な情報は得られない。また、ステージ上とは別個所に設けられたクリーンベンチ上で培養液の交換を行えば、汚染は避けられるものの、観察位置が培養液交換の前後でずれるため、継続的な観察を行うことができない。一方、細胞からの伝達物質等が所定値以上の濃度にならないほどの大量の培養液を使用して培養しようとしても、細胞の増殖能を低下させてしまう。
【０００７】
そこで、顕微鏡等の観察光学系下に細胞培養チップを配置し、細胞培養チップ内のウェルへ供給口から新たな培養液を供給しながら、排出口からウェルの培養液を排出することにより、ウェル内を一定の環境に保ち、この状態で、細胞培養チップ内の細胞の観察を行うことができる、生体試料培養観察システムが提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−１１３０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前述した特許文献１に開示されているような生体試料培養観察システムにあっては、次のような問題があった。
【０００９】
即ち、このシステムでは、ウェル内が密閉した小空間であるため、ウェルの内圧が培養液の供排液によって変動する。つまり、細胞は培養液の交換時に圧力の変動という物理的刺激を受けることとなる。細胞は微細な刺激に対してさまざまな反応を起こすため、内圧の変動による影響も無視できない場合がある。
【００１０】
また、供給される培養液の流速も細胞に刺激を与える要因となり、細胞活性を左右することになるため、注意が必要である。
【００１１】
本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、顕微鏡下での細胞長期観察時に、細胞培養に必要な各種の液体または気体を細胞への刺激を低減した状態で供給排出できる細胞培養液供給排出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の細胞培養液供給排出装置の一態様は、
実質的に気密構造であり、気体と培養液が接触して貯められた培養液貯留タンクと、
圧力的に大気に開放された気体層と生細胞を含む培養液層とを保持する細胞培養容器と、
上記培養液貯留タンクから上記細胞培養容器に培養液を供給する供給配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに向けて上記細胞培養容器内の気体又は培養液を排出する排出配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに至る上記排出配管の経路の途中に設けられ、上記排出配管内に存在する気体又は培養液を上記培養液貯留タンクに流入させる圧力を生じさせるポンプ手段と、
を具備することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞培養に必要な各種の液体または気体を細胞への刺激を低減した状態で供給排出できるので、細胞活性を維持した状態で、顕微鏡下での細胞長期観察が実現できる細胞培養液供給排出装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を実施するための最良の形態を図面を参照して説明する。
【００１５】
［第１実施形態］
図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養液供給排出装置と顕微鏡とからなる観察システムの構成を示す図である。
【００１６】
顕微鏡は、対物レンズ１０、撮像するためのＣＣＤ１２、透過観察（位相差観察）を行うためのランプ１４及びコンデンサレンズ１６等、試料を観察するため光学系を搭載している。また、この顕微鏡には、試料をのせるためのステージ１８が配置される。このステージ１８には、試料を観察するための穴が設けられており、対物レンズ１０が試料観察位置（焦点位置）までＺ方向に移動すると共に、ステージ１８がＸＹ方向に移動して所望の位置を観察できるようになっている。ステージ１８外周には筐体２０が設けられ、該筐体２０内の温度を３７度に維持するために、筐体２０の側面部にヒータ２２が設置されている。なお、この筐体２０は、特に図示しないが、蓋を有しており、この蓋を開けて、ステージ１８の観察位置に細胞培養容器２４を設置するようになっている。
【００１７】
図２（Ａ）及び（Ｂ）は、上記細胞培養容器２４の断面図及び蓋を取り除いて示す平面図である。
【００１８】
上記細胞培養容器２４の中に、観察試料となる細胞２６が底面に貼り付いて播種されている。この細胞培養容器２４には、培養液２８を供給する供給口３０、培養液２８を排出する排出口３２、５％ＣＯ２混合ガスを供給するガス供給口３４、細胞培養容器２４内の空間を大気に開放する大気開放口３６が設置されている。また、上記細胞培養容器２４内の上記供給口３０近傍には、微小な間隔が空けられた複数のスリットが形成されており、供給口３０から細胞培養容器２４の内部に供給される培養液２８は、この複数のスリットが整流子３８となり、細胞培養容器２４内に均一に流し込まれ、細胞２６が播種されている細胞播種領域４０に供給される。
【００１９】
なお、供給口３０は細胞培養容器２４の底面付近に設置され、排出口３２はこの供給口３０よりも上に設置される。そして、ガス供給口３４と大気開放口３６は、さらに上に（細胞培養容器２４の蓋４２付近）に設置される。
【００２０】
細胞培養容器２４は、細胞２６に毒性を与えない透明な樹脂で構成されている。好ましくは、細胞播種領域４０は、光学的な観察が行えるように、ガラスの材質で構成されている。また、細胞培養容器２４の蓋４２は、内部を露出できるように、細胞培養容器２４の底面積と略同一面積の着脱可能な透明な材質（樹脂又はガラス）で構成されている。これら細胞培養容器２４と蓋４２は、完全な密閉構造でも、接触するだけの略密閉構造でも良い。
【００２１】
本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置では、上記のような細胞培養容器２４の供給口３０に、オートクレープ滅菌処理可能な供給配管（テフロン（登録商標）製配管等）４４が接続されている。そして、この供給配管４４の配管口は、所定温度（３７度又は４度）に恒温化された培養液貯留タンク４６内の培養液２８に浸積されている。
【００２２】
また、細胞培養容器２４の排出口３２には、オートクレープ滅菌処理可能な排出配管（テフロン製配管等）４８が接続されている。この排出配管４８は、回転方向が可逆できるベリスタポンプ５０を経由して、上記培養液貯留タンク４６内に接続されている。但し、上記供給配管４４とは異なり、この排出配管４８は、培養液貯留タンク４６内の培養液２８には接触していない。
【００２３】
培養液貯留タンク４６は、培養液２８が内部に入れられるように着脱式の蓋や開閉できる供給口があるものが望ましいが、完全に内部が密閉構造にする事ができ、オートクレープ滅菌処理可能なガラスやテフロン材質で構成されている。培養液送液初期状態では、内部に、クリーンな空気と培養液２８が充填されている。
【００２４】
また、上記細胞培養容器２４のガス供給口３４には、オートクレープ滅菌処理可能なガス供給配管（テフロン製配管等）５２が接続され、加湿瓶５４を経由して５％ＣＯ２混合ガス発生器（ボンベ）５６に接続される。この５％ＣＯ２混合ガス発生器（ボンベ）５６からのガスは、図示しない滅菌フィルタを経由して、細胞培養に影響を与えないクリーンなガスが発生される。加湿瓶５４は、滅菌水が入れられており、５％ＣＯ２混合ガス発生器（ボンベ）５６からの配管が滅菌水に接続され、多数の泡を発生させる。これにより、加湿された５％ＣＯ２混合ガスが、ガス供給口３４より上記細胞培養容器２４内に流入する。
【００２５】
上記細胞培養容器２４は、上述した筐体２０内のヒータ２２により３７度に加温され、さらに、この加湿された５％ＣＯ２混合ガスにより、該細胞培養容器２４の蓋４２の内側が曇らないようになっている。
【００２６】
また、上記細胞培養容器２４の大気開放口３６は、上記流入する５％ＣＯ２混合ガスにより、該細胞培養容器２４の内部の圧力が上がらないように、大気に内部のガスを放出する。つまり、細胞培養容器２４周辺の環境空気は細胞培養容器２４内には流入してこない。なお、細胞培養容器２４の大気開放口３６は、大きな開放口である必要は無く、φ０．５ｍｍ程度の穴で良い。
【００２７】
次に、上記のような構成の本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の動作を説明する。
【００２８】
図３（Ａ）は、ベリスタポンプ５０の動作タイミングチャートを示す図であり、図３（Ｂ）乃至（Ｄ）はそれぞれ、図３（Ａ）中の各状態における細胞培養容器２４の培養液水面５８の動きを示す図である。
【００２９】
ステージ１８上に最初に細胞培養容器２４が設置されるときは、図３（Ｂ）に示す状態であり、排出口３２よりも、細胞培養容器２４内の培養液水面５８が下に形成して設置される。
【００３０】
この状態で、ベリスタポンプ５０を図１に矢印で示すような正転方向に駆動（ＯＮ）し、細胞培養容器２４の空間の５％ＣＯ２混合ガス（又は空気を含む）を培養液貯留タンク４６内に送る。すると、培養液貯留タンク４６は密閉されているために、培養液貯留タンク４６内の圧力が上昇する（正圧となる）。培養液２８を供給する供給配管４４が培養液貯留タンク４６内の培養液２８に浸積されているため、この圧力上昇により、培養液貯留タンク４６内の培養液２８が供給配管４４内に流入し、細胞培養容器２４内に培養液２８を送液する。
【００３１】
図３（Ｃ）に示すように、細胞培養容器２４内の培養液水面５８が上昇し、排出口３２の高さまで来ると、培養液２８が排出口３２より排出され、培養液貯留タンク４６内に培養液２８（液体）を戻す流路系に切り替わる。
【００３２】
このようにして、細胞培養器内の培養液２８の供給量と排出量がつりあい、培養液水面５８の高さが一定となる。この一定水面を維持した状態で、細胞培養容器２４内の培養液２８を細胞２６に影響を与えない緩やかな流れにより、培養液２８を交換することができる。
【００３３】
細胞培養容器２４への培養液２８供給は、培養液貯留タンク４６の気体部分がダンピング作用を生み、ベリスタポンプ５０の脈動成分を除去した培養液２８供給が実現でき、脈動流れによる細胞２６への影響を低減できる。
【００３４】
そして、ベリスタポンプ５０を停止（ＯＦＦ）すると、図３（Ｄ）に示すように、培養液貯留タンク４６内の残存圧力により、培養液２８の供給が継続され、細胞培養容器２４内の培養液水面５８はさらに上昇するが、培養液貯留タンク４６内の残存圧力が大気圧に近づくにつれ、培養液２８の供給は少なくなり、最後には、一定水面を維持した状態で、細胞培養容器２４内に培養液２８が保持される。
【００３５】
以上のようにして、本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置は、培養液２８を循環させる循環培養装置として動作する。
【００３６】
一般的な細胞２６（Ｈｅｌａ細胞、ＨＥＫ細胞、ＣＯＳ細胞等）の活性を維持するためには、培養液２８の流入量は０．１〜１ｍＬ／分が望ましいが、観察する細胞２６の種類に応じて、ベリスタポンプ５０の回転速度を変更すれば、培養液２８の流入排出速度が変更でき、最適な培養液２８の交換流速を選択できる。
【００３７】
また、ベリスタポンプ５０は常時動作させる必要も無く、間欠動作で動作させても良い。培養している細胞２６の種類、個数にもよるが、１〜３日間間隔でベリスタポンプ５０を動作させ、細胞培養容器２４内の全培養液総量分を置換する動作を行っても良い。
【００３８】
細胞培養容器２４に流入する５％ＣＯ２混合ガスにより、培養液２８のペーハ（ＰＨ）は所定値に整えられ、細胞活性を維持できる。一般に、細胞２６種類に応じて、ＣＯ２混合ガスの濃度は変更されるべきであり、５％が必須ではない。
【００３９】
培養液２８を細胞培養容器２４から排出する場合は、図４に示すように、ベリスタポンプ５０を逆転駆動することにより、培養液貯留タンク４６内の空間のガス（又は空気）を細胞培養容器２４に供給する。このため、培養液貯留タンク４６内の圧力が低下し（負圧となり）、細胞培養容器２４の培養液２８を供給口３０より吸引して培養液貯留タンク４６に戻すように流路系が切り替わる。この動作を継続する事により、培養液２８を吸引することが可能となる。なお、図面の簡略化のため、図４では、顕微鏡の図示を省略している。
【００４０】
細胞培養容器２４に培養液２８を供給するために、供給配管４４側にベリスタポンプ５０を配置して供給する方法が一般的に用いられているが、培養液２８が脈動して細胞培養容器２４内に流入する。細胞２６の培養において、培養液２８の流れは細胞２６に刺激を与える事になり、増殖効率が低下する原因と考えられている。本実施形態では、培養液貯留タンク４６内の圧力上昇により、培養液２８を送液するため、流入する培養液２８の脈動成分は非常に少ない。また、非常に均一で低速な流れを形成できるため、培養液２８流入による細胞２６への刺激を極限まで低く抑えることができる。
【００４１】
培養液貯留タンク４６内は正圧になるが、大気に開放されている穴（大気開放口３６）が形成されているため、細胞培養容器２４内は大気圧とほぼ同じであり、細胞活性に影響を与えない。
【００４２】
これに対して、流路系は密閉されているために、外部の環境雰囲気中のゴミや細菌等が入りづらく、コンタミネーションが少ない培養を維持し、長時間継続できる。
【００４３】
また、培養液２８の供給排出は、ベリスタポンプ５０のみの動作で実現できるため、コンピュータ（図示せず）との接続により、自動動作が可能となり、観察時の使用者負担を低減できる。
【００４４】
［第２実施の形態］
図５は、本発明の第２実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図で、図４と同様に図面の簡略化のため、本細胞培養液供給排出装置が適用される観察システムにおける顕微鏡の図示は省略している。
【００４５】
なお、上記第１実施形態に係る細胞培養液供給排出装置と同様の機能を果たすものには同じ参照番号を付すことで、その説明は省略するものとし、第１実施形態と異なる部分のみ説明する。
【００４６】
本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置は、上記第１実施形態のようなベリスタポンプ５０の代わりに、２個の電磁弁６０，６２とシリンジピストンポンプ６４とを用いている。
【００４７】
即ち、細胞培養容器２４の排出口３２には、オートクレープ滅菌処理可能な排出配管（テフロン製配管等）４８が接続され、電磁弁６０を経由して、シリンジピストンポンプ６４に接続されている。そして、シリンジピストンポンプ６４より、新たな配管６６により、電磁弁６２を経由して、培養液貯留タンク４６内に接続されている。この場合、配管６６は、培養液貯留タンク４６内の培養液２８には接触していない。
【００４８】
シリンジピストンポンプ６４のピストン６８は、ラックピニオン機構７０やボールネジ等の往復−回転動作変換部を介して、モータ７２の可逆回転動作により、ピストン６８を往復動作し、シリンジ７４内の容積を変化させることができる。
【００４９】
次に、上記のような構成の本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の動作を説明する。
【００５０】
まず、電磁弁６０を開き且つ電磁弁６２を閉じて、シリンジピストンポンプ６４のピストン６８を下降させて、シリンジ７４内の容積を膨張させると、細胞培養容器２４内の培養液２８（又はガス又は空気）がシリンジ７４内に吸引される。
【００５１】
次に、電磁弁６０を閉じ、電磁弁６２を開いて、シリンジピストンポンプ６４のピストン６８を上昇させ、シリンジ７４内の容積を収縮させると、上記シリンジ７４内に補給された培養液２８（又はガス又は空気）が培養液貯留タンク４６内に送液される。すると、培養液貯留タンク４６内の圧力が上昇し、該培養液貯留タンク４６内の培養液２８が供給配管４４を通じて、細胞培養容器２４に送液される。
【００５２】
また、上記電磁弁６０、６２とシリンジピストンポンプ６４のピストン６８の動作を逆転すると、培養液貯留タンク４６内の空気を細胞培養容器２４に送り、培養液貯留タンク４６の圧力が低下し、細胞培養容器２４の培養液２８を抜き取る事ができる。
【００５３】
上記第１実施形態においては、細胞培養容器２４の排出口３２を経由してベリスタポンプ５０で培養液２８を排出する際に、排出流速に脈動成分が潜在的に残っている。本実施形態では、シリンジピストンポンプ６４が一定流速で、培養液２８を細胞培養容器２４から吸引するため、排出流速が均一となり、より、流速による細胞刺激が少なくできる。
【００５４】
また、上記第１実施形態においては、細胞培養容器２４に培養液２８を供給する際に、ベリスタポンプ５０で培養液２８を培養液貯留タンク４６に供給する際の脈動成分が潜在的に残っている。本実施形態では、シリンジピストンポンプ６４が定流速で、培養液２８を培養液貯留タンク４６に送液するため、細胞培養容器２４への供給流速が均一となり、より、流速による細胞刺激が少なくできる。
【００５５】
［第３実施形態］
図６は、本発明の第３実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図で、図４と同様に図面の簡略化のため、本細胞培養液供給排出装置が適用される観察システムにおける顕微鏡の図示は省略している。
【００５６】
ここで、上記第１実施形態に係る細胞培養液供給排出装置と同様の機能を果たすものには同じ参照番号を付すことで、その説明は省略するものとし、第１実施形態と異なる部分のみ説明する。
【００５７】
本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置は、上記第１実施形態の構成において、培養液貯留タンク４６に新たに、大気に開放する大気開放配管７６を接続し、弁７８により開閉可能となっているものである。なお、弁７８は、電磁弁あるいはマニュアル弁どちらでも良い。
【００５８】
次に、上記のような構成の本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の動作を説明する。
【００５９】
上記第１実施形態では、細胞培養容器２４の培養液水面５８は、細胞培養容器２４に供給される培養液２８の供給量と排出される排出量が釣り合うことにより、一定となっていた。このため、培養液水面５８の高さは、培養液貯留タンク４６の内部に形成される空間（空気又はガス）の容積により支配的となっていた。また、培養液貯留タンク４６と細胞培養容器２４の設置位置関係（水頭値）によっても支配されていた。
【００６０】
上記第１実施形態の構成では、通常、最初に、細胞培養液２８内の５％ＣＯ２混合ガス又は空気が培養液貯留タンク４６に流入し、内部圧力を上昇させ、この後に、培養液２８が培養液貯留タンク４６に送液されるため、初期の圧力上昇は培養液貯留タンク４６内に維持されたままとなる。このため、上記の支配的なパラメータによっては、細胞培養容器２４に多めの培養液２８を供給することになり、培養液水面５８が高いまま（培養液２８総量が多いまま）に維持される場合がある。
【００６１】
この場合、細胞培養容器２４の培養液水面５８の高さが一定となった後に、培養液貯留タンク４６の弁７８を開け、該培養液貯留タンク４６内部を大気に開放する事により、細胞培養容器２４への培養液２８の供給が停止し、（細胞培養容器２４の培養液２８の排出は継続されるため）培養液水面５８を下げる（細胞培養容器２４内の培養液２８の総量を減少させる）ことができる。
【００６２】
また、細胞培養容器２４よりも培養液貯留タンク４６を、位置的に下に構成した場合、培養液貯留タンク４６内部を大気に開放する事により、細胞培養容器２４への培養液２８の供給が停止後、排出側に切り替える（逆流する）ことができる。この場合は、ベリスタポンプ５０を停止していても、細胞培養容器２４内の培養液２８を減少させることができる。
【００６３】
そして、細胞培養容器２４の培養液水面５８の高さが所望の高さとなったところで、弁７８を閉じることで、その高さを維持することができる。
【００６４】
なお、上記弁７８の開閉は、細胞培養容器２４を配置した筐体２０の図示しない蓋を開けて、細胞培養容器２４の培養液水面５８の高さを観察しながら行う。勿論、光学的手段等により、培養液水面５８の高さを計測して自動的に弁７８の開閉を行わせるようにしても構わない。
【００６５】
以上のように、本実施形態によれば、細胞活性にもっとも最適な培養液２８量を細胞培養容器２４内に形成することができる。
【００６６】
［第４実施形態］
図７は、本発明の第４実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図で、図４と同様に図面の簡略化のため、本細胞培養液供給排出装置が適用される観察システムにおける顕微鏡の図示は省略している。
【００６７】
なお、上記第３実施形態に係る細胞培養液供給排出装置と同様の機能を果たすものには同じ参照番号を付すことで、その説明は省略するものとし、第３実施形態と異なる部分のみ説明する。
【００６８】
細胞培養容器２４の供給口３０にオートクレープ滅菌処理可能な供給配管（テフロン製配管等）４４が接続され、所定温度（３７度又は４度）に恒温化された培養液貯留タンク４６内の培養液２８に配管口が浸積されていることは、上記第３実施形態と同様であるが、本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置では、細胞培養容器２４の排出口３２には、オートクレープ滅菌処理可能な排出配管（テフロン製配管等）４８が接続され、回転方向が可逆できるベリスタポンプ５０を経由して、培養液排出タンク８０内に接続されている。この培養液貯留タンク４６と培養液排出タンク８０の間は、新たな接続配管８２にて接続される。この接続配管８２の口は何れもタンク内部の培養液２８には接触しないように構成されている。
【００６９】
次に、上記のような構成の本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の動作を説明する。
【００７０】
上記第１実施形態は、細胞培養容器２４に培養液２８を循環する循環培養装置として構成した場合であるが、本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置は、培養液２８を灌流する灌流培養装置として構成した場合の例である。
【００７１】
即ち、ベリスタポンプ５０により、培養液排出タンク８０内の圧力が上昇し、同時に、接続配管８２で接続された培養液貯留タンク４６内の圧力も上昇する。よって、上記第１実施形態で説明したように、細胞培養容器２４に培養液貯留タンク４６内の培養液２８を送液できる。
【００７２】
培養液貯留タンク４６からの培養液２８の供給量と、細胞培養容器２４からの培養液２８の排出量が釣り合うと、培養液水面５８は上昇を停止し、一定高さを維持する。その後、培養液貯留タンク４６に構成された大気に開放する弁７８を開け、細胞培養容器２４内の培養液水面５８の高さ（培養液２８の総量）を任意の高さに調整する。
【００７３】
本実施形態に係る細胞培養液供給排出装置では、細胞培養容器２４から排出される培養液２８は、培養液貯留タンク４６には戻らない。従って、細胞培養容器２４には、常に新鮮な培養液２８が供給される。細胞伝達物質などが細胞２６から生成され、細胞増殖時に有利に働く場合も有るが、使用者の実験系によっては、培養液２８を循環させない用途も存在する。本実施形態ではそれらに対応することができる。
【００７４】
以上実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。
【００７５】
（付記）
前記の具体的実施形態から、以下のような構成の発明を抽出することができる。
【００７６】
（１）  実質的に気密構造であり、気体と培養液が接触して貯められた培養液貯留タンクと、
圧力的に大気に開放された気体層と生細胞を含む培養液層とを保持する細胞培養容器と、
上記培養液貯留タンクから上記細胞培養容器に培養液を供給する供給配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに向けて上記細胞培養容器内の気体又は培養液を排出する排出配管と、
上記細胞培養容器から上記培養液貯留タンクに至る上記排出配管の経路の途中に設けられ、上記排出配管内に存在する気体又は培養液を上記培養液貯留タンクに流入させる圧力を生じさせるポンプ手段と、
を具備することを特徴とする細胞培養液供給排出装置。
【００７７】
（対応する実施形態）
この（１）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、培養液２８が上記培養液に、培養液貯留タンク４６が上記培養液貯留タンクに、細胞２６が上記生細胞に、細胞培養容器２４が上記細胞培養容器に、供給配管４４が上記供給配管に、排出配管４８が上記排出配管に、ベリスタポンプ５０又はシリンジピストンポンプ６４が上記細ポンプ手段に、それぞれ対応する。
【００７８】
（作用効果）
この（１）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、細胞培養に必要な各種の液体または気体を細胞への刺激を低減した状態で供給排出できるので、細胞活性を維持した状態で、顕微鏡下での細胞長期観察が実現できる。
【００７９】
（２）  上記細胞培養容器は、気体層と大気を連通する大気開放口を有することを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００８０】
（対応する実施形態）
この（２）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、大気開放口３６が上記大気開放口に対応する。
【００８１】
（作用効果）
この（２）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、細胞培養容器内部の圧力をほぼ大気圧と同じにすることができ、圧力が細胞活性に影響を及ぼさないようにすることができる。
【００８２】
（３）  上記細胞培養容器の大気開放口は、上記供給配管との接続口及び上記排出配管の接続口より、鉛直方向上方に位置することを特徴とする（２）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００８３】
（対応する実施形態）
この（３）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、供給口３０が上記供給配管との接続口に、排出口３２が上記排出配管の接続口に、それぞれ対応する。
【００８４】
（作用効果）
この（３）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、培養液を排出することなく、培養液層の上に存在する気体層の気体のみを排出できる。
【００８５】
（４）  上記細胞培養容器は、所定の圧力で培養ガスが供給されるガス供給口を有することを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００８６】
（対応する実施形態）
この（４）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、５％ＣＯ２混合ガスが上記培養ガスに、ガス供給口３４が上記ガス供給口に、それぞれ対応する。
【００８７】
（作用効果）
この（４）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、細胞の育成に適した培養ガスを細胞培養容器内に供給できる。
【００８８】
（５）  上記培養液貯留タンク側の上記供給配管の先端は、常に上記培養液貯留タンク内の培養液に接触していることを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００８９】
（対応する実施形態）
この（５）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。
【００９０】
（作用効果）
この（５）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、上記ポンプ手段による培養液貯留タンク内の圧力上昇により、培養液貯留タンク内の培養液を上記供給配管内に流入させ、細胞培養容器内に培養液を送液することができる。
【００９１】
（６）  上記培養液貯留タンクは、当該培養液貯留タンク内の気体を圧力的に大気に開放する弁を有することを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００９２】
（対応する実施形態）
この（６）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第３及び第４実施形態が対応する。それらの実施形態において、弁７８が上記弁に対応する。
【００９３】
（作用効果）
この（６）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、細胞培養容器の培養液水面の高さが一定となった後に、弁を開けることで該培養液貯留タンク内部を大気に開放する事により、細胞培養容器への培養液の供給を停止させると共に、細胞培養容器の培養液の排出は継続されるため培養液水面を下げることができる。
【００９４】
（７）  上記培養液貯留タンクは、上記細胞培養容器より鉛直方向下方に位置することを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００９５】
（対応する実施形態）
この（７）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。
【００９６】
（作用効果）
この（７）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、制御無しに培養液貯留タンク内の培養液が細胞培養容器内に流入してしまうことがない。
【００９７】
（８）  上記培養液貯留タンクと上記ポンプ手段との間に培養液排出タンクを更に具備し、
上記排出配管内に存在する気体は、上記培養液排出タンクを介して上記培養液貯留タンクに流入され、
上記排出配管内に存在する培養液は、上記培養液排出タンク内に留まる、
ことを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【００９８】
（対応する実施形態）
この（８）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第４実施形態が対応する。その実施形態において、培養液排出タンク８０が上記培養液排出タンクに対応する。
【００９９】
（作用効果）
この（８）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、細胞培養容器から排出される培養液は培養液貯留タンクには戻らないので、細胞培養容器に常に新鮮な培養液を供給することができる。
【０１００】
（９）  上記ポンプ手段は、シリンジピストンポンプであることを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【０１０１】
（対応する実施形態）
この（９）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第２実施形態が対応する。それの実施形態において、シリンジピストンポンプ６４が上記シリンジピストンポンプに対応する。
【０１０２】
（作用効果）
この（９）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、シリンジピストンポンプが一定流速で培養液を細胞培養容器から吸引するため、排出流速が均一となり、流速による細胞刺激が少なくできる。また、細胞培養容器に培養液を供給する際にシリンジピストンポンプが定流速で培養液を培養液貯留タンクに送液するため、細胞培養容器への供給流速が均一となり、より、流速による細胞刺激が少なくできる。
【０１０３】
（１０）  上記ポンプ手段は、更に、上記培養液貯留タンク内に存在する気体を上記細胞培養容器に流入させる圧力を生じさせることを特徴とする（１）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【０１０４】
（対応する実施形態）
この（１０）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第１乃至第４実施形態が対応する。
【０１０５】
（作用効果）
この（１０）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、培養液貯留タンク内の空間の気体を細胞培養容器に供給することで、培養液貯留タンク内の圧力を低下させて、細胞培養容器の培養液を吸引し、細胞培養容器から培養液を排出させることができる。
【０１０６】
（１１）  上記培養液貯留タンクは、当該培養液貯留タンク内の気体を圧力的に大気に開放する弁を有し、
上記培養液貯留タンクは、上記細胞培養容器より鉛直方向下方に位置する、
ことを特徴とする（１０）に記載の細胞培養液供給排出装置。
【０１０７】
（対応する実施形態）
この（１１）に記載の細胞培養液供給排出装置に関する実施形態は、第３及び第４実施形態が対応する。
【０１０８】
（作用効果）
この（１１）に記載の細胞培養液供給排出装置によれば、弁を開けて培養液貯留タンク内部を大気に開放する事により、細胞培養容器への培養液の供給が停止後、排出側に切り替える（逆流する）ことができ、この場合は、上記ポンプ手段を停止していても、細胞培養容器内の培養液を減少させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養液供給排出装置と顕微鏡とからなる観察システムの構成を示す図である。
【図２】図２（Ａ）及び（Ｂ）はそれぞれ細胞培養容器の断面図及び蓋を取り除いて示す平面図である。
【図３】図３（Ａ）は、ベリスタポンプの動作タイミングチャートを示す図であり、図３（Ｂ）乃至（Ｄ）はそれぞれ図３（Ａ）中の各状態における細胞培養容器の培養液水面の動きを示す図である。
【図４】図４は、第１実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図である。
【図５】図５は、本発明の第２実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図である。
【図６】図６は、本発明の第３実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図である。
【図７】図７は、本発明の第４実施形態に係る細胞培養液供給排出装置の構成を示す図である。
【符号の説明】
【０１１０】
１０…対物レンズ、  １２…ＣＣＤ、  １４…ランプ、  １６…コンデンサレンズ、  １８…ステージ、  ２０…筐体、  ２２…ヒータ、  ２４…細胞培養容器、  ２６…細胞、  ２８…培養液、  ３０…供給口、  ３２…排出口、  ３４…ガス供給口、  ３６…大気開放口、  ３８…整流子、  ４０…細胞播種領域、  ４２…蓋、  ４４…供給配管、  ４６…培養液貯留タンク、  ４８…排出配管、  ５０…ベリスタポンプ、  ５２…ガス供給配管、  ５４…加湿瓶、  ５６…混合ガス発生器、  ５８…培養液水面、  ６０，６２…電磁弁、  ６４…シリンジピストンポンプ、  ６６…配管、  ６８…ピストン、  ７０…ラックピニオン機構、  ７２…モータ、  ７４…シリンジ、  ７６…大気開放配管、  ７８…弁、  ８０…培養液排出タンク、  ８２…接続配管。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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