(57)【要約】      （修正有）【課題】アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患の診断および治療干渉のための、特異的および特有なパーレカンドメインI変異体ヌクレオチド、ペプチド、抗体および分子生物学プローブ利用を提供する。【解決手段】試料中のパーレカンドメインＩ遺伝子のスプライシング変異体の検出および／または定量法であって、パーレカンドメインＩのスプライシング変異体の増幅および検出において、配列５’ＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＧＴＧＴＣＴＡＣ３’を有するプライマーと配列５’ＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＡＣＣＧＴＣ３’を有するプライマーとを使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のメッセンジャーRNA（mRNA）から相補的DNA（cDNA）を作成し、
パーレカン遺伝子またはその一部に対応するcDNA部分を増幅し、そして
増幅されたcDNAを検出する
ことを含む、試料中のパーレカンドメインI遺伝子のスプライシング変異体の検出および／または定量法であって、パーレカンドメインIのスプライシング変異体の増幅および検出において、配列5' CATCCAGCTCCCGTGTCTAC 3'を有するプライマーと配列5' CTGAGGACATAGAGACCGTC 3'を有するプライマーとを使用する、前記方法。
【請求項２】
パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体のレベルの上昇が、アルツハイマー病の存在、アルツハイマー病への感受性、またはアルツハイマー病の進行の指標である、アルツハイマー病またはアルツハイマー病への感受性を診断するために使用される、請求項1の方法。
【請求項３】
宿主由来の試料中に、SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、アミノ酸22から開始するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、からなる群から選択されるパーレカンドメインIのスプライシング変異体が存在するかを解析することを含む、診断方法。
【請求項４】
a）SEQ ID NO: 4のアミノ酸配列、アミノ酸22から開始するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、およびSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、からなる群から選択されるパーレカンドメインIのスプライシング変異体に対して特異的な抗体を、結合するに十分な時間、マイクロタイターウェルに結合させ、
b）ある量の生物学的液体を加え、
c）前記生物学的液体を、パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体が、マイクロタイターウェル上の工程a）記載の抗体に結合させるために十分な時間、インキュベートさせ、
d）マイクロタイターウェルを洗浄して、すべての非結合試料を除き、
e）パーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体の工程a）に記載の抗体とは異なるエピトープに結合する第二の標識抗体を加え、そして前記工程a）に記載の抗体により結合されたパーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体に第二の標識抗体を結合させ、そして
f）結合成分を検出すること、
を含む、生物学的液体中のパーレカンドメインIのエクソン5欠失スプライシング変異体の検出および定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規パーレカンドメインIスプライシング変異体の発見および同定、並びに、アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患の診断および治療干渉のための、特異的および特有なパーレカンドメインI変異体ヌクレオチド、ペプチド、抗体および分子生物学プローブを産生する際の利用に関連する。さらに、アルツハイマー病およびそれぞれのアミロイドーシスに対する潜在的な治療化合物を効果的にスクリーニングし、そして同定する新規動物モデルが記載される。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、いわゆる「アミロイド疾患」の1つである。文献により、アミロイドタンパク質およびパーレカンとして知られるヘパラン硫酸プロテオグリカン間の相互作用が、アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患の病因において重要であることが示唆されている。アミロイド疾患、アルツハイマー病、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、およびパーレカンのより詳細な記述は、「発明の詳細な説明」に含まれる。
【０００３】
未知であるのは、アルツハイマー病およびその他のアミロイド異常の組織に存在するパーレカン（または関連する巨大分子）が変化しているか、異常であるか、および／または正常とは異なるのかである。これは大変重要で、そして難しい質問で、まだ解答は得られていない。パーレカンは通常、体中、さまざまな器官および組織に見られ、そしてさまざまな異なる細胞で合成されているため、パーレカン（または関連する巨大分子）がアルツハイマー病に苦しむ患者の組織、アミロイド沈着および／または神経原繊維変化に異なる形状で存在することは可能だろうか？
また、パーレカン（または関連する巨大分子）が、その他のアミロイド疾患のいずれかに苦しむ患者の組織および／またはアミロイド沈着に異なる形状で存在することも可能だろうか？
【発明の開示】
【０００４】
発明の概要
本発明は、これらの問いにいくつかの解答を提供し、そしてパーレカンがパーレカンのドメインI（通常、パーレカンの3つのGAG鎖を含む領域）内の「欠失」または「付加」スプライシングの結果、特有のスプライシング変異体型で存在するという新規のそして驚くべき発見に関連する。パーレカンドメインIの当該スプライシングは、普通、付加的なGAG鎖結合部位のコンセンサス配列（すなわちSer-GlyまたはSer-Gly-Asp）を含む、特有のアミノ酸配列を、産生する結果となり、正常パーレカンに見られる3つのGAG鎖の代わりに、4つまたはそれ以上のGAG鎖を有すると予測される新規パーレカン分子を生成する。パーレカンドメインIのスプライシングの結果生じた特有のペプチド領域に対して産生された2つの異なる抗ペプチドポリクローナル抗体により、アルツハイマー病脳で、パーレカンドメインI変異体の、神経原繊維変化（すなわち、「エクソン5欠失」抗体を用いて検出されたパーレカンドメインIエクソン5欠失変異体）またはアミロイド斑（すなわち、「パーレカンドメインI挿入」抗体を用いて検出されたパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3a）への免疫局在が立証された。ポリクローナル抗ペプチド抗体を利用した免疫位置測定研究により、発見されたパーレカンドメインIスプライシング変異体分子のあるもの（すなわちパーレカンドメインIエクソン5欠失）は、正常パーレカンのように基底膜には存在せず、そしてしたがって、パーレカンまたは「基底膜ヘパラン硫酸PG」とは明確に異なるものと見なすべきであることが示唆された。したがって、本発明で同定されたパーレカンドメインIスプライシング変異体は、正常パーレカンとは異なり、これらの1)ヌクレオチド配列、2)対応するアミノ酸配列、3)予測されるGAG鎖数、および4)特定の組織における分布には明確な相違がある。最近の研究により、ヘパラン硫酸GAGは主にアミロイド原繊維形成（Castilloら, Soc. Neurosc. Abst. 22:1172, 1996要旨）、および神経原繊維変化形成の誘導（Goedertら, Nature 383:550-553, 1996）に関与していることが示唆されたため、付加的なヘパラン硫酸GAG鎖を含む可能性があり、そしてアミロイド斑または神経原繊維変化と共に局在する、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体という本発明中の驚くべき発見は、さらにアルツハイマー病のアミロイド斑および神経原繊維変化の病因におけるそれらの重要性を示す。さらに、本発明で発見されたように、パーレカンドメインIスプライシング変異体が中枢神経系の外部の組織に存在することもまた、これらのスプライシング変異体が、全身の器官および組織に影響するその他のアミロイド疾患に関係していることを示す。
【０００５】
本発明はパーレカンドメインIスプライシング変異体を同定し、そしてアルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患の診断および治療干渉のための、特異的および特有のパーレカンドメインI変異体ヌクレオチド、ペプチド、抗体、および分子生物学プローブを提供する。さらに、アルツハイマー病およびそれぞれのアミロイドーシスに対する潜在的な治療化合物を効果的にスクリーニングし、そして同定する新規動物モデルが記載される。
【０００６】
本発明の特徴
パーレカンはアミロイド疾患において、アミロイド疾患それぞれにおける原繊維性アミロイド沈着の形成、沈着、集積、および／または持続への寄与を含む、重要でそして疾患発生に関わる役割を果たすことが知られている。本発明は、新規に同定されたヒトパーレカンのドメインIスプライシング変異体の同定および利用に関連する。本発明に記載されている1つまたはすべてのスプライシング変異体は、アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患において、より重要でないとしても、同様の疾患発生に関わる役割を果たすと考えられる。本明細書に記載される本発明は、これらのパーレカンドメインIスプライシング変異体、およびアルツハイマー病およびその他のアミロイドーシスへの診断および治療干渉へのそれらの使用に関わる。
【０００７】
本発明の主要な目的は、アミロイド疾患の新たな診断および治療法、および適用を確立することである。アミロイド疾患には、限定されるわけではないが、アルツハイマー病およびダウン症候群に関連するアミロイド（特異的アミロイドはベータ−アミロイドタンパク質またはAβと称される）、慢性炎症、さまざまな形態の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド（特異的アミロイドはAAアミロイドまたは炎症関連アミロイドーシスと称される）、多発性骨髄腫およびその他のB細胞疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはALアミロイドと称される）、II型糖尿病に関連するアミロイド（特異的アミロイドはアミリンまたは小島アミロイドと称される）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはPrPアミロイドと称される）、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド（特異的アミロイドはベータ2−ミクログロブリンアミロイドと称される）、老化心臓アミロイドおよび家族性アミロイド性多発神経障害に関連するアミロイド（特異的アミロイドはトランスチレチンまたはプレアルブミンと称される）、および甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍に関連するアミロイド（特異的アミロイドはプロカルシトニンの変異体と称される）が含まれる。
【０００８】
本発明の1つの目的は、当業者に知られる標準的RT-PCR方法論を用いて、ヒト組織中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出する際、新規および特異的プライマー配列を利用することである。
【０００９】
本発明のまた別の目的は、標準的RT-PCR方法論を用いるが、本明細書に記載される特異的プライマーを利用して、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を増幅するのを助け、これらスプライシング変異体をさまざまなヒト組織、細胞および／または生物学的液体中の細胞で最終的に検出することである。さらに、定量的競合RT-PCR技術を利用し（Mareshら, J. Neurochem. 67:1132-1144, 1996）、ヒト組織、細胞、白血球、および／または生物学的液体中の細胞に由来する総RNA中の、これらの特定の変異体の量の相違を測定してもよい。これらパーレカンドメインIスプライシング変異体の量的レベルの変化は、アミロイド疾患に観察される病理経過の一部として、アミロイド、および共存するパーレカンドメインIスプライシング変異体および／または組織中のパーレカン集積を示す患者の、診断および予後のモニターの一助となるであろう。
【００１０】
本発明の別の目的は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を特異的に検出する、多くのin vitro検定に利用することが可能な、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルペプチド抗体を提供することである。本明細書に記載されるすべてのパーレカンドメインIスプライシング変異体のペプチドの一部または断片に対して特異的に作成されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出し、そして定量するのに利用することも可能である。好ましい態様は、スプライシングの結果である特有のパーレカンドメインI配列に対して作成された、本明細書に記載されるポリクローナル抗体（すなわち「エクソン5欠失」抗体および「パーレカンドメインI挿入」抗体）である。これらの抗体は抗原型のペプチドを、適切な宿主に投与することにより作成してもよい。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は当業者により、標準的技術で調製してもよい。
【００１１】
本発明の別の目的は、標準的免疫組織化学技術を用いて、本明細書に記載されるパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体のそれぞれを、ヒト組織、細胞および／または細胞培養中の、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体の検出および特異的位置決定に利用することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、「エクソン5欠失」抗体を用いて、限定されるわけではないが、脳脊髄液、血液、血清、尿、唾液、痰、および便を含む生物学的液体をモニターすることにより、脳の神経原繊維変化の存在および量の特異的指標としてパーレカンドメインI変異体エクソン5（PerDI-v5）を検出することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、「エクソン5欠失」抗体を用いて、限定されるわけではないが、脳脊髄液、血液、血清、尿、唾液、痰、および便を含む生物学的液体をモニターすることにより、アルツハイマー病および／またはその他のアミロイド疾患の存在および進行の特異的指標として、パーレカンドメインI変異体エクソン5（PerDI-v5）を検出することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、「パーレカンドメインI挿入」抗体を用いて、限定されるわけではないが、脳脊髄液、血液、血清、尿、唾液、痰、および便を含む生物学的液体をモニターすることにより、脳中のアミロイド斑の存在および量の特異的指標としてパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、「パーレカンドメインI挿入」抗体を用いて、限定されるわけではないが、脳脊髄液、血液、血清、尿、唾液、痰、および便を含む生物学的液体をモニターすることにより、アルツハイマー病および／またはその他のアミロイド疾患の存在および進行の特異的指標としてパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、化合物または潜在的治療薬が、（本明細書に記載されているような）既定のアミロイドタンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質の、パーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体GAGへの親和性を改変する（減弱する、または除く）能力を評価しうる方法を提供することである。アミロイドタンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質の、こうしたパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGまたはそれらの断片への結合に影響する化合物を同定する方法を提供することにより、本発明は、こうした結合相互作用を防ぐまたは弱めることが可能な化合物の同定にも有用である。したがって、本明細書に記載されているように、アルツハイマー病およびその他のアミロイド疾患に関連するアミロイド形成、アミロイド沈着、および／またはアミロイド持続状態と関連する事象に、特異的に影響する化合物を同定することも可能である。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、パーレカンドメインIスプライシング変異体のそれぞれを認識するように生成された抗体を使用して、in vivo標識を行うことである；例えば、放射ヌクレオチドと共に、in vivo診断およびin vitro診断に使用する放射イメージングに用いることができる。好ましい態様には、限定されるわけではないが、本明細書に記載される「エクソン5欠失」抗体および「パーレカンドメインI挿入」抗体が含まれる。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、パーレカンドメインIスプライシング変異体の新規および特有配列に対して特異的なペプチドまたはその断片を利用することである。これらのペプチドまたはその断片は、多くの生物学的過程および疾患（本明細書に記載されるアミロイド疾患など）において、パーレカンドメインIスプライシング変異体の相互作用を遮断する潜在的治療薬として使用することも可能である。
【００１９】
本発明の別の目的は、ペプチドまたはその断片を、これらのペプチド断片に対して生成されたポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体と共に用いて、in vitro検定でヒトの生物学的液体中の潜在的なパーレカンドメインIスプライシング変異体自己抗体を検出することである。特異的検定系は、生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体に対する自己抗体の存在を検出するだけでなく、パーレカンドメインIスプライシング変異体自己抗体レベルの上昇または減少を追うことにより、疾患進行をモニターするのに利用してもよい。
【００２０】
本発明のさらに別の目的は、パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を利用して、当業者に知られるアフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび免疫沈降方法論などの方法を用い、パーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質を組織から単離することである。パーレカンドメインIスプライシング変異体を組織から単離することにより、前記のパーレカンドメインIスプライシング変異体に結合するGAG鎖をさらに構造的に性質決定することもできるであろう。したがって、本発明の別の目的は、本明細書に記載されるように、パーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGを利用し、診断検定、治療干渉および研究目的で使用することである。
【００２１】
本発明のさらに別の目的は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を利用してオリゴヌクレオチドを作成し、標準的in situハイブリダイゼーション技術により、ヒト組織中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出する新規分子生物学的プローブとして利用することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、アルツハイマー病およびダウン症候群で観察されるような脳中の原繊維性Aβアミロイドの、産生、沈着、集積および／または持続に関する新たな動物モデルを提供することである。これら新規動物モデルはまた、脳中の原繊維性Aβアミロイドの形成、沈着、集積および／または持続を標的とする新規治療薬剤を効果的にスクリーニングし、そして同定するのに利用してもよい。
【００２３】
本発明のさらに別の目的は、他のアミロイドーシスそれぞれで観察される、原繊維性アミロイドの産生、沈着、集積および／または持続に関する新規動物モデルを提供することである。これには、限定されるわけではないが、慢性炎症、さまざまな形態の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド（特異的アミロイドはAAアミロイドまたは炎症関連アミロイドーシスと称される）、多発性骨髄腫およびその他のB細胞疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはALアミロイドと称される）、II型糖尿病に関連するアミロイド（特異的アミロイドはアミリンまたは小島アミロイドと称される）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはPrPアミロイドと称される）、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド（特異的アミロイドはベータ2−ミクログロブリンアミロイドと称される）、老化心臓アミロイドおよび家族性アミロイド性多発神経障害に関連するアミロイド（特異的アミロイドはトランスチレチンまたはプレアルブミンと称される）、および甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍に関連するアミロイド（特異的アミロイドはプロカルシトニンの変異体と称される）が含まれる。これら新規動物モデルはまた、上記のアミロイドーシスの予防および治療のための、候補薬剤および療法の評価に用いることも可能である。
【００２４】
本発明のさらに別の目的は、限定されるわけではないが、アルツハイマー病および／またはその他のアミロイド疾患を含む、多くの疾患および／または病理経過に関連する特異的表現型を作り出す努力として、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体を過剰発現するまたはノックアウトした新規トランスジェニック動物を産生することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、本明細書に記載された、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体および／または分子生物学プローブを利用して、アミロイド疾患におけるヒト組織中のこれらスプライシング変異体を検出することである。
【００２６】
本発明の、これらおよびその他の特徴および利点は、添付の図と共に、後述の本発明の詳細な説明を読むことにより、より完全に明白となるであろう。
【００２７】
図面の簡単な説明
以下の図は、本発明の態様を例証するものであり、そして本発明の範囲を限定するためのものではない。
【００２８】
図1は、正常パーレカンの5つの構造ドメインを図式的に示したものである。
図2は、健常老人1人およびアルツハイマー病患者2人の海馬から単離した総RNAに対し、パーレカンドメインIに特異的なプライマー（FPerDIおよびRPerlDI）を用いて行ったRT-PCRの一例である。図2Aは、エチジウムブロミドで染色した2％アガロースゲル上で解析したRT-PCR産物である。標準は506および298塩基対に示されている。図2Bは、パーレカンドメインIからなるジゴキシゲニン標識cDNAをプローブとして用いたRT-PCR産物のサザンブロットである。
【００２９】
図3は、コントロールまたはアルツハイマー病海馬由来のプールされた総RNAから、高厳密性ポリメラーゼおよびプライマー、FPerlDIEおよびRPerlDIXを用いて、RT-PCRにより産生されたクローンである。RT-PCR産物は、低融点アガロースゲル上で分離し、そして503塩基対のパーレカンバンドの上および下の領域を切りはずし、そしてpBluescriptのEcoRIおよびXhoI部位にクローンした。図3A、3Cおよび3Eは、得られた、そしてEcoRIおよびXhoIで切り出された個々のプラスミドクローンのいくつかの、エチジウムブロミドで染色した2％アガロースゲル上である。図3B、3Dおよび3Fは、パーレカンドメインIに対するジゴキシゲニン標識cDNAプローブ（すなわち、Dig-366）をプローブとして用いた、当該クローンのサザンブロットである。図3Aおよび3Bのレーン4に示された潜在的パーレカンドメインIスプライシング変異体を配列決定すると、続いてパーレカンドメインI変異体エクソン5と同定された。図3Cおよび3Dのレーン1および6に示した潜在的パーレカンドメインIスプライシング変異体を配列決定すると、どちらも続いてパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5と同定された。図3Eおよび3Fのレーン4および6に示された潜在的パーレカンドメインIスプライシング変異体を配列決定すると、それぞれ続いてパーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン4aおよび3aと同定された。図3Eおよび3F（レーン1）の矢印は、正常パーレカンドメインIの期待される大きさを示す（すなわち、〜503塩基対）。
【００３０】
図4Aは、新たに同定された、エクソン5が欠失したヒトパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン5と称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【００３１】
図4Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。上段は、パーレカンドメインI変異体エクソン5であり、そして下段は正常パーレカンドメインIである。
【００３２】
図4Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。クローンPerDI-v5から配列決定した領域を2つの黒いひし形で囲んで示す。下線は、グリコサミノグリカン鎖の潜在的付加部位であるSer-Gly-Asp配列を示す。太字は、正常ヒトパーレカンには見られない新規配列の領域を示す。*は終止コドンを示す。すべて、アミノ酸の標準的1文字略号を用いている。
【００３３】
図5Aは、新たに同定された、エクソン4-6.5が欠失したヒトパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5と称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較している。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【００３４】
図5Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5の決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdoch, A.D.ら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。上段は、パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5であり、そして下段は正常パーレカンドメインIである。
【００３５】
図5Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。下線は、グリコサミノグリカン鎖の潜在的付加部位であるSer-Gly配列を示す。*は終止コドンを示す。すべて、アミノ酸の標準的1文字略号を用いている。
【００３６】
図6Aは、新たに同定された、エクソン4の開始近位に挿入された33ヌクレオチドを有するパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン4aと称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【００３７】
図6Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。上段は、パーレカンドメインI変異体エクソン4aであり、そして下段は正常パーレカンドメインIである。太字は正常ヒトパーレカンには見られない33の新規ヌクレオチド配列を示す。
【００３８】
図6Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。下線は、グリコサミノグリカン鎖の潜在的付加部位であるSer-Gly配列を示す。太字は、正常ヒトパーレカンには見られない新規配列の領域を示す。すべて、アミノ酸の標準的1文字略号を用いている。
【００３９】
図7Aは、新たに同定された、エクソン3の後ろに75ヌクレオチドの挿入を有するパーレカンドメインIスプライシング変異体（すなわち、パーレカンドメインI変異体エクソン3a）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【００４０】
図7Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。上段は、パーレカンドメインI変異体エクソン3aであり、そして下段は正常パーレカンドメインIである。太字は正常ヒトパーレカンには見られない75の新規ヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
図7Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。下線は、グリコサミノグリカン鎖の潜在的付加部位であるSer-Gly配列を示す。太字は、正常ヒトパーレカンには見られない新規配列の領域を示す。すべて、アミノ酸の標準的1文字略号を用いている。
【００４２】
図8は、アルツハイマー病の海馬におけるパーレカンドメインIスプライシング変異体の発現を示す。アルツハイマー病患者10人の海馬由来の総RNAに対し、RT-PCRを行った。使用したプライマー、産物の期待される大きさおよびPCRの条件は：パーレカンドメインI変異体エクソン5に対してはF2hPerDIおよびRhPerEX4/6、260塩基対（56℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5に対してはF2hEx3/6.5およびRPerlDI、92塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4aに対してはFhEx178およびRPerlDI、325塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン3aに対してはFhEx181およびRPerlDI、339塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）であった。PCR産物は、エチジウムブロミドで染色した2％または4％アガロースゲル上で解析した。標準の100塩基対ラダーはstdsと示されている。本図は、解析したアルツハイマー病海馬のほとんどに、4つのパーレカンドメインIスプライシング変異体が存在することを示している。
【００４３】
図9は、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列（図4Cも参照されたい）を開示する。黒い太線は、「エクソン5欠失」抗体として知られるペプチド抗体を生成するのに用いた新規配列の領域を表している。17アミノ酸ペプチドP-T-P-G-H-S-A-P-V-P-K-S-L-H-G-G-R（SEQ ID NO: 15）（単点、部位特異的KLH結合のため、アミノ末端にシステイン残基を付加している）を使用して、組織および生物学的液体中のエクソン5欠失変異体（すなわち、PerlDI-v5）を特異的に検出するためのポリクローナル抗体を生成した。
【００４４】
図10は、「エクソン5欠失」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経原繊維変化へのパーレカンドメインI変異体エクソン5の局在を示す白黒顕微鏡写真である。図10Aは、コンゴ−レッドで染色し、そして偏光下で見た、確証されたアルツハイマー病患者の海馬錐体層（pyramidal layer）の多くの神経原繊維変化（矢印）を示している。図10Bは、同一症例（すなわち、図10A）の海馬錐体層神経原繊維変化（矢印）の「エクソン5欠失」抗体による免疫染色を示している。図10Cは、図10Bの神経原繊維変化（矢印）の「エクソン5欠失」抗体による免疫染色をより拡大したものである。図10Dは、確証されたアルツハイマー病の別症例の海馬錐体層神経原繊維変化（矢印）の「エクソン5欠失」抗体による免疫染色を示している。
【００４５】
図11は、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列（図7Cも参照されたい）を開示する。黒い太線は、「パーレカンドメインI挿入」抗体として知られる新規ペプチド抗体を生成するのに用いた新規配列領域を表している。19アミノ酸ペプチドQ-P-L-G-R-P-P-V-A-G-M-M-V-S-E-P-D-E-E（SEQ ID NO: 16）（単点、部位特異的KLH結合のため、アミノ末端にシステイン残基を付加している）を使用して、組織および生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4a（すなわち、PerlDI+4a）および/またはパーレカンドメインI変異体エクソン3a（すなわち、PerlDI+3a）を検出するためのポリクローナル抗体を生成した。
【００４６】
図12は、「パーレカンドメインI挿入」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経およびアミロイド斑へのパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの局在を示す白黒顕微鏡写真である。図12Aは、アルツハイマーAβタンパク質を認識するモノクローナル抗体4G8を使用した、確証されたアルツハイマー病患者皮質中の多くのアミロイド斑（矢印）の免疫染色を示している。図12Bは、抗4G8抗体で免疫染色したアルツハイマー病脳（図12Aより）の2つのアミロイド斑（矢印）をより拡大したものを示している。図12Cは、確証されたアルツハイマー病患者の海馬錐体層神経の「パーレカンドメインI挿入」抗体による免疫染色を示している。。図12Dは、（図12A-Cと）同一症例のアルツハイマー病海馬中の多くのアミロイド斑（矢印）の「パーレカンドメインI挿入」抗体による免疫染色を示している。
【００４７】
図13は、表1およびRT-PCRに使用した海馬組織試料のリストである。
図14は、表2およびRT-PCRに使用したプライマーのリストである。
【発明の実施の形態】
【００４８】
以下の項は、背景を通し、本発明をよりよく理解するために提供される。
アミロイド疾患
「アミロイド疾患」は、いずれも組織中に「アミロイド」として知られる不溶性細胞外基質の顕著な、そして通常、正常な器官機能を損なうに足る量の集積を示す、臨床的および一般的に関連がないヒト疾患の一群からなる。Rokitanskiは1842年（Rokitansky, “Handbuch der pathologischen Anatomie", Vol. 3, Braumuller and Seidel, Vienna）、異なる患者由来の多くの組織でろう状および不定形の組織沈着を最初に観察した。しかし、1850年代にセルロースを示すのに用いられていた硫酸ヨウ素反応で陽性染色を示したことから、1854年に初めて、Virchow（Virchow, Arch. Path. Anat. 8:416, 1854）がこれらの沈着を、「糊様」を意味する「アミロイド」と名づけた。セルロースはアミロイドの構成要素ではないが、にもかかわらず、Virchowが観察した染色はおそらく、すべての型のアミロイド沈着に関連して現れるプロテオグリカン（PG）の存在によるものであろう。FriederichおよびKekuleが1859年にアミロイドにタンパク質の性質があることを発見した（FriedrichおよびKecule, Arch. Path. Anat. Physiol. 16:50, 1859）が、アミロイドという名称は残った。すべてのアミロイドが同じ染色および構造特性を有するという事実に基づき、何年もの間、アミロイド沈着には単一の病原機構が関与しており、そしてアミロイド沈着は単一の構成要素の一群からなると考えられると仮定されていた。現在の研究により、アミロイドは一様な沈着ではなく、そしてアミロイドはまったく関連がない、異なるタンパク質からなる可能性があることが明確に示されてきた（Glenner, N. England J. Med. 302:1283-1292. 1980）。
【００４９】
アミロイド自体の性質は、完全に異なる、そして関連がないタンパク質からなることが発見されてきたが、アミロイドの下層にあるタンパク質構造が原繊維構造に適応しているため、顕微鏡下で観察すると、すべてのアミロイドが同様に見える。下層タンパク質の性質に関わらず、すべてのアミロイドは、1)コンゴ−レッド染色剤により特徴的に染色され、そして偏光下で見ると古典的な赤／緑複屈折を示し（Puchtlerら, J. Histochem. Cytochem. 10:355-364, 1962）、2)超微細構造的に直径7-10 nmで、そして不定長の原繊維からなり、3)顕著なベータひだ状シート二次構造を取る。したがって、電子顕微鏡下で見る、アルツハイマー病患者の死後の脳由来のアミロイド原繊維（30,000倍拡大）は、慢性関節リウマチ患者の生検腎に存在するアミロイドの外見とほとんど同一に見える。これらのアミロイドはどちらも、7-10 nmの同程度の原繊維直径を示すであろう。
【００５０】
1970年代半ばから後期に、アミロイドは臨床的に4つの群、原発性アミロイド、続発性アミロイド、家族性アミロイドおよび隔離アミロイドに分類された。原発性アミロイドは、新規に見られるアミロイドで、先行する障害がない。こうした症例の25-40％で、原発性アミロイドは多発性骨髄腫またはその他のB細胞型悪性疾患の発達などの形質細胞機能障害の前兆であった。ここでは、アミロイドは明白な悪性疾患の後よりも前に現れる。続発性アミロイドは、以前から存在する障害の合併症として現れた。多発性骨髄腫の患者の10-15%は、その後、アミロイドを形成した（Hanadaら, J. Histochem. Cytochem. 19:1-15, 1971）。慢性関節リウマチ、変形性関節症、強直性脊椎炎患者は、結核、肺膿瘍および骨髄炎患者と同様、続発性アミロイドを形成することもある（BensonおよびCohen, Arth. Rheum. 22:36-42, 1979; Kameiら, Acta. Path. Jpn. 32:123-133, 1982; McAdamら, Lancet 2:572-575, 1975）。自己投与を行い、そしてその後慢性皮膚膿瘍を形成した静脈剤使用者もまた、続発性アミロイドを形成することがある（Novick, Mt. Sin. J. Med. 46:163-167, 1979）。続発性アミロイドはまた、ホジキン病および腎細胞癌などの特定の悪性疾患患者にも見られる（Husbyら, Cancer Res. 42:1600-1603, 1982）。これらはすべて当初は続発性アミロイドと分類されたが、ひとたびアミロイドタンパク質が単離され、そして配列決定されると、これらの多くは異なるアミロイドタンパク質を含むことがわかった。
【００５１】
アミロイドの家族性型もまた、アミロイド原繊維沈着の原因であるペプチドに関して一様性を示さなかった。現在、いくつかの地理的集団が、遺伝的に受け継いだ型のアミロイドを持つことが同定されている。1つの群がイスラエル人で見つかっており、そしてこの障害は、家族性地中海熱と呼ばれ、そして再発する炎症および高熱と共に、アミロイド沈着により特徴づけられる（Mataxas, Kidney 20:676-685, 1981）。遺伝性アミロイドの別の型は、家族性アミロイド性多発神経障害であり、そしてスウェーデン人（SkinnerおよびCohen, Biochem. Biophys. Res. Comm. 99:1326-1332, 1981）、ポルトガル人（Saraivaら, J. Lab. Clin. Med. 102:590-603, 1983; J. Clin. Inbest. 74:104-119, 1984）および日本人（Tawaraら, J. Lab. Clin. Med. 98:811-822, 1981）で見つかっている。この疾患のアミロイド沈着は、末梢および自律神経で顕著に起こる。アイスランド起源の遺伝性アミロイド血管障害は、主に脳の血管に影響を及ぼすアミロイド沈着の常染色体優性型であり、そしてアイスランド西部の家族群で同定されている（Jennsonら, Clin. Genet. 36:368-377, 1989）。これらの患者は臨床的に、若い時期に甚だしい脳内出血を起こし、これは通常、40歳前での死亡を引き起こす。
【００５２】
上述の原発性、続発性および家族性型アミロイドは、心臓、腎臓、肝臓、脾臓、消化管、皮膚、すい臓および副腎を含む、体内の多くの器官に関与する傾向がある。これらアミロイド疾患はまた、体内の大変多くの器官がアミロイド集積を示すことから、「全身性アミロイド」とも称される。これらのアミロイドーシスのほとんどに対し、明白な治癒または効果的な治療はなく、そしてアミロイド沈着の結果が、患者に不利益であることもありうる。例えば、腎臓でのアミロイド沈着は腎不全を引き起こす可能性があるし、心臓でのアミロイド沈着は心不全を引き起こす可能性がある。これらの患者にとって、全身器官でのアミロイド集積は、結果として、3から5年以内の死につながる。
【００５３】
一方、隔離型のアミロイドは、単一の器官系に関与する傾向がある。隔離アミロイド沈着は、肺および心臓で見つかっている（Wrightら, Lab. Invest. 30:767-773, 1974; Pitkanenら, Am. J. Path. 117:391-399, 1984）。II型糖尿病（インシュリン非依存型糖尿病）の最高90％の患者が、すい臓のランゲルハンス島のベータ細胞に限定された隔離アミロイド沈着を有する（Johnsonら, New Engl. J. Med. 321:513-518, 1989; Lab. Invest. 66:522-535, 1992）。隔離型アミロイドはまた、甲状腺髄様癌などの、ポリペプチドホルモンを分泌する内分泌腫瘍にも見られている（ButlerおよびKhan, Arch. Path. Lab. Med. 110:647-649, 1986; Bergerら, Virch. Arch. A Path. Anat. Hist. 412:543-551, 1988）。長期血液透析の重症合併症は内側神経内のアミロイド沈着であり、そして臨床的に手根管症候群に関連している（Gejyoら, Biochem. Biophys. Res. Comm. 129:701-706, 1985; Kidney Int. 30:385-390, 1986）。これまで、最もよくある型および臨床的に器官特異的アミロイドに相当する型、および一般的なアミロイドは、アルツハイマー病患者脳に見られるものである（米国特許第4,666,829号および、GlennerおよびWong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Mastersら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985を参照されたい）。この障害では、アミロイドは顕著に中枢神経系に制限される。同様の脳でのアミロイド沈着は、35歳に達したダウン症候群患者にも起こる（Rumbleら, New England J. Med. 320:1446-1452, 1982; Mannら、Neurobiol. Aging 10:397-399, 1989）。その他の型の中枢神経系アミロイド沈着には、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群およびクールーを含む、プリオン疾患として知られるまれだが非常に感染しやすい障害が含まれる（Gajdusekら, Science 197:943-960, 1977; Prusinerら, Cell 38:127-134, 1984; Prusiner, Scientific American 251:50-59, 1984; Prusinerら, Micr. Sc. 2:33-39, 1985; Tateishiら, Ann. Neurol. 24:35-40, 1988）。
【００５４】
関与する主要タンパク質が単離されそして配列決定されると、それらは相異なるものであることがわかったため、さまざまなアミロイド性障害を厳密にその臨床的特徴に基づいてグループ分けするのは、誤解だった。例えば、AAアミロイドとして知られる慢性関節リウマチおよび変形性関節症に見られるアミロイドは、家族性地中海熱として知られる家族性型アミロイド患者に同定されるアミロイドタンパク質と同一のものであった。議論を混乱させないため、発見された主要タンパク質が単離され、配列決定され、そして同定されたら、それに基づいてアミロイドを分類するのが最もよいと決定された。
【００５５】
したがって、アミロイドは今日、沈着する特異的アミロイドタンパク質に従って分類されている。アミロイド疾患には、限定されるわけではないが、アルツハイマー病、ダウン症候群およびオランダ型のアミロイドーシスの遺伝性脳出血に関連するアミロイド（特異的アミロイドは現在、ベータ−アミロイドタンパク質またはAβとして知られる）、慢性炎症、さまざまな型の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド（AAアミロイドまたは炎症関連アミロイドーシス）、多発性骨髄腫およびその他のB細胞異常に関連するアミロイド（ALアミロイド）、II型糖尿病に関連するアミロイド（アミリンまたは小島アミロイド）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン疾患に関連するアミロイド（PrPアミロイド）、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド（ベータ2−ミクログロブリンアミロイド）、老化心臓アミロイドおよび家族性アミロイド性多発神経障害に関連するアミロイド（プレアルブミンまたはトランスチレチンアミロイド）、および甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍に関連するアミロイド（プロカルシトニン変異体）が含まれる。
【００５６】
アルツハイマー病
最も一般的な型のアミロイドーシスは、アルツハイマー病患者の脳で見られる。アルツハイマー病は、中年および老年の痴呆の最も一般的な原因であり、そして記憶、言語、視覚空間知覚および行動の進行性損傷により明らかになる（A Guide to the Understanding of Alzheimer's Disease and Related Disorders, Jorm監修, New York University Press,ニューヨーク1987）。アルツハイマー病の可能性がある疾患の診断は、臨床規準（通常、他の疾患の除外、記憶試験などによる）に基づき行うことが可能であるが、明確な診断には、通常、検死の際得られる脳組織中の特異的異常を組織学的に調べる必要がある。
【００５７】
アルツハイマー病において、記憶、認識、言語および推論などの認知過程に必要不可欠な脳の部分が変性し、自立を含め、我々を人間たらしめているものの多くが奪われる。遺伝性アルツハイマー病のいくつかの型は中年で発病するが、より一般的には症状は60代半ばから現れる。アルツハイマー病は、ベータ−アミロイドタンパク質、Aβまたはβ/A4と称される39-43アミノ酸ペプチドの沈着および集積により特徴づけられる（GlennerおよびWong, Biochem. Biophys. Res. Comm. 120:885-890, 1984; Mastersら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:4245-4249, 1985; Husbyら, Bull. WHO 71:105-108, 1993）。この小さなペプチドは、アルツハイマー病患者脳の神経「斑」および血管壁中のアミロイド沈着（脳血管アミロイド沈着として知られる）を構成する。さらに、アルツハイマー病は、ニューロン細胞質に異常に集積するらせん状繊維対からなる、多くの神経原繊維「変化（tangle）」の存在により特徴づけられる（Grundke-Iqbalら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917, 1986; Kosikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Leeら, Science 251:675-678, 1991）。したがって、アルツハイマー病の病理学的特質は、斑の中央部および血管壁中に沈着したアミロイドと共に、「斑」および「変化」が存在することである。いわゆる「正常加齢脳」にもいくつかのアミロイド斑および神経原繊維変化が存在するのに注目することは大切である。しかし、比較すると、アルツハイマー病脳には、過度に大量の斑および変化が見られる。したがって、診断という観点により、アルツハイマー病脳を健常脳から区別する際、主に「斑」および「変化」の定量的評価に基づく。
【００５８】
アルツハイマー病脳には、通常、何千という神経突起斑がある。神経突起斑は、通常、神経突起として知られる、肥大軸索およびシナプス末端に囲まれたアミロイド中心部からなる細胞外沈着、および異常樹状突起と共に、さまざまな数の浸潤ミクログリアおよび周辺アストログリアにより構成されている。アルツハイマー病脳に存在する神経原繊維変化は、主に、微小管関連タンパク質であるタウタンパク質からなる（Grundke-Iqbalら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917, 1986; Kosikら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4044-4048, 1986; Leeら, Science 251:675-678, 1991）。超微細構造レベルでは、変化はリボンのようにねじれたらせん状繊維対からなり、特異的交差周期は80ナノメートルである。多くの例で、神経原繊維変化中に、らせん状繊維対および直線繊維の両方がある。さらに、多くの場合、神経細胞は繊維を残して死ぬ。これらの変化は、死んだ神経の残存繊維であるため、「幽霊変化」として知られる。
【００５９】
アルツハイマー病患者脳に見られる、その他の主な型の損傷は、脳実質中および脳外にある大髄膜血管壁中の双方に見られる、血管壁中のアミロイド集積である。血管壁に局在するアミロイド沈着は、脳血管アミロイドまたは親コンゴ血管障害と称される（Maydybur, J. Neuropath. Exp. Neurol. 45:79-90, 1986; Pardridgeら, J. Neurochem. 49:1394-1401, 1987）。
【００６０】
さらに、アルツハイマー病患者は、ニューロンおよびシナプスの損傷を示す。さらに、これらの患者はまた、アセチルコリンなどの神経伝達物質も失う。アルツハイマー病に対し、最初にFDAに認可された薬剤、タクリンは、コリンエステラーゼ阻害剤である（CutlerおよびSramek, New Engl. J. Med. 328:808-810, 1993）。しかし、この薬剤はアルツハイマー病患者の認知改善に効いたとしても効果が限られており、そして初期には肝臓毒性のような大きな副作用があった。
【００６１】
何年もの間、アルツハイマー病における「アミロイド」の重要性、およびこの疾患に特徴的な「斑」および「変化」が疾患の原因なのか単なる結果なのかに関して科学的討論が継続してなされてきた。最近数年の研究により、現在、アミロイドは実際にアルツハイマー病の原因因子であり、そして単に無実の傍観者ではないことが示唆されている。細胞培養中のアルツハイマー病Aβタンパク質は、短期間で、神経細胞の変性を引き起こすことが示されている（Pikeら, Br. Res. 563:311-314, 1991; J. Neurochem. 64:253-265, 1994）。研究により、神経毒性効果の原因となるのは、すべてのアミロイドの特徴である原繊維構造であることが示唆されている。Aβもまた、海馬（アルツハイマー病により影響を受ける主要記憶領域）切片培養中で神経毒性があり（Harriganら, Neurobiol. Aging 16:779-789, 1995）、そしてトランスジェニックマウスで神経細胞死を誘導する（Camesら, Nature 373:523-527, 1995; Hsiaoら, Neuron 15:1203-1218, 1995）ことが見出されている。さらに、アルツハイマー病Aβをラット脳に注入すると、アルツハイマーの2つの付加的特徴である、記憶障害およびニューロン機能障害を引き起こす（Floodら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:3363-3366, 1991; Br. Res. 663:271-276, 1994）。おそらく、アミロイド（すなわち、ベータ−アミロイドタンパク質）がアルツハイマー病の疾患形成に直接関与している最も有力な証拠は、最近の遺伝研究から得られるものであろう。Aβの産生は、ベータ−アミロイド前駆体タンパク質として知られるAβ前駆体をコードする遺伝子の変異に起因する可能性があることが発見されている（Van Broeckhovenら, Science 248:1120-1122, 1990; Europ. Neurol. 35:8-19, 1995; Murrellら, Science 254:97-99, 1991; Haassら, Nature Med. 1:1291-1296, 1995）。この前駆体タンパク質は、正常に処理されれば、通常、ごくわずかの毒性Aβしか産生しない。家族性、早期発病アルツハイマー病の原因となるアミロイド前駆体タンパク質遺伝子の突然変異が同定されたことは、アミロイドが本疾患の基礎となる疾患形成過程の中心であるという、最も強い論拠である。家族性アルツハイマー病を引き起こすベータ−アミロイドタンパク質の重要性を立証する疾患原因突然変異が現在、4つ発見され、報告されている（Hardy, Nature Genet. 1:233-234, 1992に総論）。これらの研究により、ヒト患者脳中の原繊維性ベータ−アミロイドタンパク質の形成、沈着、集積および／または持続を減少させる、除くまたは防ぐ薬剤を提供すれば、効果的な治療薬とみなすべきであることが示唆される。
【００６２】
プロテオグリカン
プロテオグリカン（PG）は、すべての器官および組織で、細胞内ではさまざまな型の異なる細胞中、または細胞外ではさまざまな機能のため輸送された細胞外マトリックスに見られる複合巨大分子の一群である。プロテオグリカンは、直線タンパク質コア骨格からなり、ここに1つまたはそれ以上のグリコサミノグリカン（GAG）鎖が共有結合する（HascallおよびHascall, Cell Biology of the Extracellular Matrix中, Hay監修, ニューヨーク, Plenum Press, pp.39, 1981; Hassellら, Ann. Rev. Biochem. 55:539-567, 1986）。非常に陰性のGAG鎖は、1)ヘキソサミン（D-グルコサミンまたはD-ガラクトサミンのどちらか）、およびヘキスロン酸（D-グルクロン酸またはL-イズロン酸のどちらか）を含む反復二糖単位からなる（Muir, Am. J. Med. 47:673-690, 1969）。PGは伝統的に、主に存在するGAGの同定に従って命名され、そしていくつかの主なGAGが同定されてきた。これらはヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸およびケラタン硫酸である。通常、GAG鎖およびタンパク質コア骨格間の結合は、キシロース−ガラクトース−ガラクトース結合領域からなり、キシロース分子がタンパク質コア上のセリン残基の水酸基に共有結合する（RodenおよびArmand, J. Biol. Chem. 241:65-70, 1966）。例外はヒアルロン酸の場合で、タンパク質構成要素を含まず、その代わりD-グルクロン酸およびD-グルコサミンからなる骨格を有する。ケラタン硫酸は、典型的なキシロース−セリン結合を持たないPGの1つである。ケラタン硫酸は、N-アセチルガラクトサミン残基のセリンまたはスレオニンへの結合（軟骨中）、またはN-アセチルグルコサミン残基のアスパラギン残基への直接結合（角膜中）を通してタンパク質と結合する（HascallおよびHascall, Cell Biology of the Extracellular Matrix中, Hay監修, ニューヨーク, Plenum Press, pp.39, 1981; Muir, Am. J. Med. 47:673-690, 1969）。
【００６３】
ヘパラン硫酸プロテオグリカン：すべてのアミロイドに共通する構成要素
アミロイド研究で繰り返される大きな疑問は：なぜ関連がないタンパク質を含むすべてのアミロイドが、同様の特徴を持つアミロイド原繊維を形成する（すなわち、すべてが7-10 nmの原繊維からなり、そして顕著なベータひだ状シート二次構造を含む）のかである。すべてのアミロイドの疾患形成で、同様の役割を果たす可能性がある、共通の構成要素があるのだろうか？
【００６４】
この質問への答えは、アミロイド疾患に関与する機構を理解する上で重要である。初期の研究により、非常に硫酸化されたGAG（後に特異的ヘパラン硫酸PGとわかった）が、確立された実験マウスモデルにおいて、炎症関連アミロイド（すなわち、AAアミロイド）と共に沈着することが立証された（Snowら, Lab. Invest. 56:665-675, 1987）。後の研究により、ヘパラン硫酸PGは一時的にそして構造的に、さまざまな異なる組織において、AAアミロイドの沈着および集積に関連していることが立証された（Snowら, J. Histochem. Cytochem. 39:1321-1330, 1991）。その後、特異的染色技術および免疫組織化学法により、関与する特異的アミロイドタンパク質、アミロイド疾患の病期、およびアミロイド沈着の組織部位に関係なく、非常に硫酸化されたPGが、すべてではなくともほとんどのアミロイド疾患に共通する特徴であることがわかった（Snowら, Lab. Invest. 56:120-123, 1987; Am. J. Path. 133:456-463, 1988; Acta Neuropath. 77:337-342, 1990; Lab. Invest. 63:601-611, 1990）。
【００６５】
アルツハイマー病アミロイドーシスにおける特異的PGの潜在的な関与を理解しようとする研究はさらに続けられた。特異的免疫化学プローブを用いた初期の研究において、まずヘパラン硫酸PGが神経突起斑および脳血管アミロイド沈着におけるアミロイドの重要な成分であることがわかった（Snowら, Am. J. Path. 133:456-463, 1988）。この初期の研究に用いられた抗体は実際には、「パーレカン」として知られる巨大ヘパラン硫酸PGのコアタンパク質を特異的に認識していたことが、後にわかった。ヘパラン硫酸PG（および特にパーレカン）はまた、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、クールーおよび動物スクレイピー中のプリオンタンパク質（PrP）アミロイド斑にも共に局在していた（Snowら, Lab. Invest. 63:601-611, 1990）。続く研究により、ヘパラン硫酸PGはまた、アルツハイマー病の神経原繊維変化にも免疫局在することが立証された（Perryら、J. Neurosc. 11:3679-3683, 1991）。
【００６６】
これらの研究により、特定のヘパラン硫酸PGが、1)アミロイド形成タンパク質が顕著なベータひだ状シート構造を取る（すなわち、アミロイドの指標）のに影響を与え、2)アミロイド沈着の解剖学的局在を決定し、そして3)アミロイドの安定性および組織内でアミロイドがタンパク質分解による分解を受けにくくするのに寄与し、それにより体が望ましくないアミロイド沈着を適切に分解しそして除去するのを防ぐことにより、アミロイドーシスに重要な役割を果たすという仮説が導かれた（SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989）。
【００６７】
アルツハイマー病におけるヘパラン硫酸プロテオグリカンの重要性
ヘパラン硫酸PGは、アルツハイマー病アミロイドーシスと共に、他の型の中枢神経系および全身性アミロイドーシスの疾患形成においても主要な役割を果たしていると仮定された（SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989に総論）。ヘパラン硫酸PGだけが、アルツハイマー病脳の3つの主要な損傷（神経突起斑、神経原繊維変化および脳血管アミロイド沈着）すべて、およびアミロイド斑および親コンゴ血管障害双方のAβを含むアミロイド原繊維に特異的に、免疫局在していることが見出された（Snowら, Am. J. Path. 133:456-463, 1988; SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989; PerlmutterおよびChui, Brain Res. Bull. 24:677-686, 1990; Snowら, Am. J. Path.137:1253-1270, 1990; Suら, Neuroscience 51:801-813, 1992; Van Goolら, Dementia 4:308-314, 1993）。証拠の蓄積により、パーレカンがアルツハイマー病のAβを含むアミロイド沈着に存在する主要なヘパラン硫酸PGであり（Snowら, Am. J. Path. 133:456-463, 1988; SnowおよびWright, Neurobiol. Aging 10:481-497, 1989; Snowら, Am. J. Path.137:1253-1270, 1990; Snowら, Am. J. Path.144:337-347, 1994）、そしてAβ原繊維の形成、沈着、集積および持続に主要な役割を果たしている可能性があることが示唆された。パーレカンが原繊維および非原繊維型、どちらに存在するAβ沈着にも常に共局在していた（Snowら, Am. J. Path.144:337-347, 1994）のは、おそらく、パーレカンがAβ（Snowら, J. Neuropath. Exp. Neurol. 48:352, 1989要旨; Bueeら, Brain Res. 601:154-163, 1993; Bueeら, Brain Res. 627:199-204, 1993; Snowら, Arch. Biochem. Biophys. 320:84-95, 1995）およびベータ−アミロイド前駆体タンパク質（Narindrasorasakら, J. Biol. Chem. 266:12878-12883, 1991）と高い親和性で相互作用するためであろう。Aβの13-16残基は、パーレカン結合部位と同定された（Snowら, J. Neuropath. Exp. Neurol. 48:352, 1989要旨; Brundenら, J. Neurochem. 61:2147-2154, 1993; Snowら, Arch. Biochem. Biophys. 320:84-95, 1995）。この領域はヘパリン／ヘパラン硫酸結合コンセンサス配列（CardinおよびWeintraub, Arterioscl. 9:21-32, 1989）を含んでおり、そしてAβ上で、アルファ−セクレターゼ切断部位と見られる部位（Lys-16）に隣接している。ひとたび結合すると、パーレカンは、Aβおよび／またはベータ−アミロイド前駆体タンパク質の二次構造および／または凝集特性に影響を与えると考えられていた（Fraserら、J. Neurochem. 59:1531-1540, 1992）。パーレカンはまた、in vivoで沈着したとき、原繊維Aβアミロイドを安定化し（Snowら, Neuron 12:219-234, 1994; Snowら, Soc. Neurosc. Abst. 21:1292, 1995要旨）、そして最近in vitroで実証されたように、Aβをプロテアーゼによる分解から守る（Gupta-Banselら, J. Biol. Chem. 270:18666-18671, 1995）役割を果たしているようであった。上記の結果を組み合わせることにより、パーレカンは、アルツハイマー病におけるAβアミロイドーシス疾患形成において、いくつかの重要な段階に関係する重要な巨大分子である可能性があることが示唆された。
【００６８】
パーレカンおよび／またはヘパラン硫酸PGがさまざまな異なるアミロイドタンパク質と共に集積するのは、また、初期の事象のようであり、そして単に二次的および非特異的沈着ではないようであった。実験的炎症関連アミロイドーシスにおいて、パーレカン発現は実際にAAアミロイド沈着に先行しており（Aillesら, Lab. Invest. 69:443-447, 1993）、これにより、特定のPGのアップレギュレーションは後のアミロイド形成および／または沈着につながる初期事象である可能性を示唆する。以前の研究（Snowら, Am. J. Path. 137:1253-1270, 1990）において、AβおよびPG沈着につながる可能性がある一連の事象を決定するため、ダウン症候群患者（1日齢から51歳）脳の研究がされた。どのようなAβ免疫反応もまったく見られないダウン症候群患者では、ニューロンにおいて、同じ年齢のダウン症候群ではない脳には見られない顕著なヘパラン硫酸免疫反応が、生後1日でも見られることが立証された。より加齢した、18歳および24歳の患者では、細胞外マトリックスに、拡散したAβ免疫反応性（コンゴ−レッド陰性でそしてしたがって非原繊維沈着と示唆される）があり、共局在するヘパラン硫酸沈着を伴っていた。35歳以上の患者では、神経突起内の原繊維性Aβ沈着および脳血管内アミロイド集積にも、ヘパラン硫酸免疫反応性の共局在が観察された。この研究により、ニューロン内のヘパラン硫酸集積は、最初の事象であり、その後、細胞外マトリックスにヘパラン硫酸およびAβの共集積が起こる可能性が示唆された。ひとたびヘパラン硫酸およびAβ（またはその前駆体タンパク質）間の相互作用が起こると、事象のカスケードが起こり、原繊維形成、沈着および後の持続につながるのはありうる話であった。
【００６９】
正常パーレカンのDNA配列および構造
パーレカンは、ヒトでは467キロダルトンの分子量を有すると予測されるパーレカンコアタンパク質配列の、94エクソンからなる単一コピー遺伝子である（KallunkiおよびTryggvason, J. Cell Biol. 116:559-571, 1992; Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992）。パーレカンのドメインIは、5つのエクソン（エクソン2から6）にコードされており、3つのヘパラン硫酸GAG結合部位（図1）を含むと仮定され、そして他の既知の配列には相同性を示さない、パーレカン特有のものである。
【００７０】
正常ヒトパーレカンのDNA配列は、分子量およそ467キロダルトンのタンパク質コアをコードし（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992）、マウスパーレカンのDNA配列は、分子量およそ396キロダルトンのタンパク質コアをコードする（Noonanら, J. Biol. Chem. 266:22939-22947, 1991）。パーレカンの5つの構造ドメインを図1に図式的に示す。本発明のすべての目的において、パーレカンは、基底膜ヘパラン硫酸PG、および／または基底膜のヘパラン硫酸PGとも称されている（Katoら, J. Cell. Biol. 106:2203-2210, 1988）。ヒト（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; KallunkiおよびTryggvason, J. Cell Biol. 116:559-571, 1992）およびマウス（Noonanら, J. Biol. Chem. 266:22939-22947, 1991）パーレカン遺伝子がクローンされ、そして予測されるコアタンパク質は5つの別個のドメインからなる（図1）。ドメインIはヘパラン硫酸GAG結合部位と仮定される部位を含み、そして他の既知のタンパク質配列とまったく類似性を示さないパーレカン特有のものである。N末端の3つのSer-Glyコンセンサスヘパラン硫酸GAG結合部位の位置は、既知のGAG鎖の数および位置に対応する（KokenyesiおよびSilbert, Biochem. Biophys. Res. Comm. 211:262-267, 1995）。ドメインIIはLDL受容体に存在するLDL結合ドメインと相同であり、ドメインIIIはラミニン短腕の小球−棒領域に相同性を有する。ドメインIVは、免疫グロブリン様リピートが多い、繰り返しを多く含む領域で、神経細胞接着分子（N-CAM）に最も高い類似性を示す。ドメインVは、ラミニンA鎖のドメインGリピートおよびA鎖同族体、メロシンの相当する部分に非常によく似た3つの小球リピート、および2つの上皮増殖因子様領域を有する（NoonanおよびHassell, Kidney Int. 43:53-60, 1993）。したがって、パーレカンコアタンパク質は多くの他のよく知られるタンパク質に相同性を有する、特有の、そして大きな巨大分子である。
【００７１】
異なる型の細胞による正常パーレカン産生
パーレカンは普通、すべての基底膜上に存在し（Dziadekら, EMBO J. 4, 905-912, 1985; Katoら, J. Cell. Biol. 106:2203-2210, 1988; Murdochら, J. Histochem. Cytochem. 42: 239-249, 1994）、そして内皮細胞（KinsellaおよびWight, Biochem. 27:2136-2144, 1988; SakuおよびFurthmayr, J. Biol. Chem. 264:3514-3523, 1989; Rescanら, Am. J. Path. 142:199-208, 1993）、平滑筋細胞（Nikkariら, Am. J. Path. 144:1348-1356, 1994）、繊維芽細胞（Murdochら, J. Histochem. Cytochem. 42:239-249,1994; Heremansら, J. Cell Biol. 109:3199-3211,1989）、上皮細胞（Morrisら, In Vitro Cell Dev. Biol. 30:120-128, 1994; Ohjiら, Invest. Opth. Vis. Sci. 35:479-485, 1994; Van Detら, Biochem. J. 307:759-768, 1995）、および滑膜細胞（Dodgeら, Lab. Invest 73:649-657, 1995）を含む異なる型の細胞により産生されることが知られている。パーレカンはまた、骨髄由来細胞（Grasselら, Mol. Cell Biochem. 145:61-68, 1995）でも合成され、そして転移性黒色腫（Cohenら, Cancer Res. 54:5771-5774, 1994）、ヒト乳房腫瘍（Guelsteinら, Int. J. Cancer 53: 269-277, 1993）および肝臓腫瘍（Kovalskyら, Acta Biomed. Ateneo Parmense 64:157-163, 1993）を含む癌性組織にも存在する。F9胚癌細胞（体壁内胚葉を形成する）およびP19胚癌細胞（コリン作動性神経を形成する）どちらにおいてもまた、分化すると、パーレカン発現および合成の顕著な上昇を示す（Chakravartiら, Dev. Dyn. 197:107-114, 1993; Sekiguchiら, J. Neurosc. Res. 38:670-686, 1994）。
【００７２】
パーレカンドメインIスプライシング変異体
パーレカンはまた、特異的ヘパラン硫酸PG（以前基底膜ヘパラン硫酸PGと称された）でもあり、特定のアミロイドタンパク質が関与しているかどうかに関係なく、すべてのアミロイド沈着に一般的な成分である。パーレカンは、一般的にアミロイドーシスの疾患形成に主要な役割を果たしていると考えられ、そしてさまざまな組織および異なる臨床背景において、アミロイドの形成、沈着、集積および／または持続に寄与する。しかし、特徴的な損傷（すなわち、アミロイド沈着および神経原繊維変化）および／またはアルツハイマー病および他のアミロイド障害の組織に存在するパーレカンまたは密接に関連する巨大分子が、正常のものと比べ改変、異常および／または相違を示しているかどうかは知られていない。RT-PCR技術およびクローニング方法論を使用することにより、本発明は、アルツハイマー病または老化脳由来の総RNAに存在し、そして中枢神経系外部にあるその他のヒトアルツハイマー病組織（腎臓、肝臓、脾臓、心臓およびすい臓）に存在する、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体を同定した。最初に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン5の欠失の結果生じたものであり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン5と称される（PerDI-v5）。エクソン5をスプライシングにより切り離した結果、169アミノ酸、分子量〜17-18キロダルトンと予測されるタンパク質をコードする、エクソン7に終止コドンを含む新たな読み枠ができる。エクソン6の始めから、エクソン7の一部までを含む72アミノ酸からなる新たな配列が生じる。この新規72アミノ酸配列内には、Ser-Gly-Asp（SGD）配列が、新たなGAG結合部位と示唆される。したがって、この最初のパーレカンスプライシング変異体は、4つのGAG結合部位を潜在的に含む、〜17-18キロダルトンのパーレカンコアタンパク質からなる。エクソン5の欠失に起因する特有配列の17アミノ酸を含むペプチドを利用して、ポリクローナル抗ペプチド抗体（「エクソン5欠失」抗体と称される）を産生した。アルツハイマー病脳部位を、この特有の抗体で免疫染色すると、パーレカンドメインI変異体エクソン5が、アルツハイマー病の主要な病理学的特徴の1つである神経原繊維に特異的に免疫局在することが示された。二番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン4、5および6の一部が欠失した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5（PerDI-v4-6.5）と称される。この欠失は終止コドンを生じ、その結果、82アミノ酸、分子量〜8-9キロダルトンと予測されるタンパク質となる。三番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン4の開始部分近傍に新たな配列（すなわち、エクソン4a）を付加した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン4a（PerDI+v4a）と称される。11アミノ酸をコードするこの新規配列（33塩基対）は、他のタンパク質いずれとも既知の相同性を持たず、そして潜在的GAG結合部位として働く可能性がある、新たなSer-Gly対の存在を含む。四番目に同定されたパーレカンドメインI変異体は、エクソン3の後に新たな配列（すなわち、エクソン3a）を付加した結果であり、そしてパーレカンドメインI変異体エクソン3a（PerDI+v3a）と称される。この配列は26新規アミノ酸（75塩基対）をコードし、他のタンパク質いず���とも既知の相同性を持たず、そして潜在的GAG結合部位として働く可能性がある、新たなSer-Gly対の存在を含む。一部にパーレカンドメインI変異体エクソン4aエクソンおよびパーレカンドメインI変異体エクソン3a配列を含む、特有配列である19アミノ酸を含むペプチドを利用して、ポリクローナル抗ペプチド抗体（「パーレカンドメインI挿入」抗体と称される）を産生した。。アルツハイマー病脳部位を、この特有の「パーレカンドメインI挿入」抗体で免疫染色すると、パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aが、神経原繊維変化を持たないニューロン、およびアミロイド斑（もう1つのアルツハイマー病の主要な病理学的特徴）に特異的に免疫局在することが示された。パーレカンは、特定のアミロイドタンパク質の関与に関係なく、すべてのアミロイド沈着に常に見られる構成要素であり、そしてアミロイドの形成、沈着、集積および／または持続に役割を果たすと仮定されるため、これらの新規に同定されたパーレカンスプライシング変異体は、アミロイドーシスの疾患形成において、より重要ではなくても、同様の役割を果たしていると思われる。本発明は、したがって、特有のパーレカンドメインIスプライシング変異体を同定し、そして、アルツハイマー病および他のアミロイド障害の診断および治療干渉のため、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチド、ヌクレオチド、抗体および分子生物学プローブの産生および利用を提供する。さらに、それぞれのアミロイドーシスに対し、潜在的治療化合物を効果的にスクリーニングする新規動物モデルが開示される。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、一般的な当業者に、本発明の4つのパーレカンドメインIスプライシング変異体の開示および説明を提供するために公表される。しかし、本発明はこれらの特定の実施例に限定されると見なしてはならない。
【００７４】
実施例1  パーレカンドメインIスプライシング変異体のクローニング
ワシントン大学アルツハイマー病研究センター脳バンク（the University of Washington Alzheimer's Disease Research Center Brain Bank）より入手した、検死の際得られた痴呆でない成人（コントロール）10人およびアルツハイマー病10人の海馬試料から、以前記載されたように総RNAを単離し、そして-70℃で直ちに凍結した（Nochlinら, Acta Neuropath. 86:645-650, 1993）。表1（図13を参照されたい）に示されたように、アルツハイマー病症例の平均年齢（+/-平均の標準誤差）は86.4 +/- 3.1歳で、範囲は69-101歳であり、非アルツハイマー病症例の平均年齢は77.0 +/- 1.8歳で、範囲は67-86歳であった。平均死後遅延は、アルツハイマー病症例で5.1 +/- 0.6時間、非アルツハイマー病症例で6.7 +/- 0.9時間であり、そして2つの群間で、有意な差は見られなかった。アルツハイマー病症例の平均疾患期間は、11.3 +/- 1.4年だった。
【００７５】
総細胞RNAを、ChomzynskiおよびSacchi（Anal. Biochem. 162:156-159, 1987）に記載された酸グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム法により、またはBiotech（テキサス州ヒューストン）のキットを用いて抽出した。ヒト脳組織からのRNA単離は、脳試料中の脂質含量が高いため、さらにフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出を含むことにより、修正した。RNA濃度は、それぞれの試料を順次希釈して、260 nmおよび280 nmの吸光度を測定することにより決定した。RNA定量の正確さはスロットブロット解析により確認した。簡潔には、分光光度計（260および280 nm）で測定された、減少量のRNA（2μgから0.5μg）を、製造者の指示にしたがってBio-Dot SF微量ろ過装置（Bio-Rad）を用いて、ナイロン膜（Boehringer Mannheim）に適用した。膜はその後UVクロスリンクし、そして後述するサザンブロット解析に記載されるように、ジゴキシゲニン標識したヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPD）標準プローブ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）より入手）でハイブリダイズした。この遍在する転写物をプローブとして用い、RNA量の分光光度計による定量は正確であることがわかった。
【００７６】
一本鎖cDNAは、2000UのRNase H陰性逆転写酵素（Superscript II, Gibco-BRL/Life Technologies,米国ニューヨーク州グランドアイランド）および1.5μgの六量体プライマー（Gibco-BRL）によるランダムプライム法を用いて合成した。正常加齢およびアルツハイマー病（AD）RNAのプールは、それぞれの患者のRNA 5μgを、コントロールまたはADと標識された一本の試験管内で混合して産生した。100μl反応液は、50 mM Tris-HCl（pH 8.3）、75 mM KClおよび3 mM MgCl2中に、5μgのプールされたコントロールまたはAD RNA、500μMの各デオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP; Boehringer Mannheim）、200Uのリボヌクレアーゼ阻害剤（rRNasin, Promega）、10 mMのジチオスレイトールを含んでいた。RNAおよびランダムプライマーは、最初に70℃で10分、熱変性させ、42℃で1.5時間、逆転写し、そして95℃で10分、酵素を失活させた。その後、使用するまで-20℃で貯蔵した。
【００７７】
プライマー配列は、ヒトパーレカンの公表された配列に基づいていた（KallunkiおよびTryggvason, J. Cell. Biol. 116:559-571, 1992; Genbank寄託番号X62515; Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289）。例えば、プライマーFPerlDIE配列およびプライマーRPerlDIX配列を表2（図14を参照されたい）に示す。すべてのプライマーはOperon Technologiesから入手した。
【００７８】
一本鎖cDNA（ssDNA）をプログラム可能なサーモサイクラー（DNA Thermal Cycler; Perkin Elmer Cetus, 米国カリフォルニア州フォスターシティー）で、2.5Uの高厳密性ポリメラーゼ混合物（Expand High Fidelity PCR System, Boehringer Mannheim）およびセンスおよびアンチセンスプライマー、FPerlDIEおよびRPerlDIX（使用したすべてのプライマーの配列は表2を参照されたい）各50 pmolを含む100μl反応混合物中、5-15μlのssDNAを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により増幅した。試料の上にミネラルオイルを重層し、94℃で3分熱変性し、その後72℃で3分、51℃で2分処理し、増幅し（94℃で45秒、変性、51℃で1.5分、プライマーアニーリング、および72℃で45秒、DNA伸長を35サイクル）、そして伸長を終わらせるため、最後に72℃で5分、インキュベーションした。試料はその後、使用するまで4℃に貯蔵した。
【００７９】
PCR産物はフェノール抽出により精製し、そしてEcoRIおよびXhoI（Boehringer Mannheim）で消化した。消化したcDNAは、調製低融点4％アガロースゲル上で電気泳動し、そしてパーレカンドメインIの主要な500 bpバンドの上および下の領域を切りはずし、GENECLEAN（Bio 101, Inc.）を用いて精製した。これらのcDNAは、pBluescript II SK（Stratagene）のEcoRIおよびXhoI部位中に連結され、そして製造者に従いコンピテントXL-Iブルー大腸菌（E. coli）を形質転換する（Epicurian Coli, Stratagene）のに用い、そしてカルベニシリンを含み、X-galおよびIPTGでコーティングし、L寒天プレートにまいた。個々のカルベニシリン耐性陽性白色コロニーを2 mlのL培地で増殖させ、そしてQuiagen Miniprepキットを用いてプラスミドを単離し、そして挿入cDNAを解析するため、EcoRIおよびXhoIで消化した。2％ Nu-Sieveアガロースゲル（FMC Bioproducts,米国メイン州ロックヴィル）上で電気泳動した後、cDNA挿入物を含むプラスミドを、サザン法としてよく知られる方法により、ナイロン膜に移し、そしてUVクロスリンクした。ハイブリダイゼーションプローブは、パーレカンプラスミドpBS-19J（ドメインIおよびIIに対応）およびpBS-366（ドメインIの内部領域に対応）（Mareshら, J. Neurochem. 67:1132-1144, 1996）より、プラスミドをEcoRIおよびXhoIで切断し、パーレカン挿入物を精製し、そして製造者に従い（Genius System Use's Guide to Filter Hybridization, Boehringer Mannheim）、それらをランダムプライマー法を用いてジゴキシゲニン-11-dUTPで標識することにより生成した。プローブ（Dig-19JまたはDig-366）はブロットと、42℃で1晩ハイブリダイズさせ、65℃で、0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む2X食塩クエン酸ナトリウム（SSC）で5分間2回洗浄し、そして0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.5X SSCで15分間2回洗浄した。ハイブリダイズしたプローブは、製造者に従い、アルカリホスファターゼと結合した抗ジゴキシゲニン抗体（抗ジゴキシゲニンAP, Boehringer Mannheim）により検出し、そして化学発光基質であるLumi-Phos 530（Boehringer Mannheim）により視覚化した。陽性クローン（パーレカンプローブにハイブリダイズしたもの）を、pBluescriptプラスミドに見られるT3およびT7領域に対するプライマーを使用し、そしてApplied BioSystems 373A Automated SequencerおよびApplied BioSystems Prism* Dye Terminatorキット、またはGenomis, Inc.（ジョージア州デュルース）によるPE Applied Biosystems 377 DNA Sequencerを利用して、配列決定した。本発明中に報告されているクローンはそれぞれ2回ずつ配列決定した。
【００８０】
実施例2  高および低分子量パーレカンドメインIバンドの同定：潜在的選択的スプライシング転写物が存在する可能性
アルツハイマー病患者または正常加齢コントロールの海馬由来の総RNAを解析することにより（表1；図13を参照されたい）、パーレカンドメインIの選択的スプライシング転写物が存在する可能性が示唆された。図2Aは、パーレカンドメインIに特異的なプライマー（FPerDIおよびRPerlDI）（表2；図14および図4Aを参照されたい）を使用して、正常加齢コントロール（C）1例およびアルツハイマー病（AD）患者2例の海馬由来の総RNAに行ったRT-PCR産物のエチジウムブロミド染色アガロースゲルを示している。コントロールおよびADレーンに見られる主要な503塩基対バンドは、パーレカンドメインIの期待される大きさであり、PCR条件を変えてもなくならない、より小さい、および大きいバンド（図2A）を伴っている。パーレカンドメインIに特異的なプローブ（Dig-366）を用いたサザンブロット解析（図2B）により、期待されたパーレカンの503塩基対が示された。さらに、少なくとも2つの小さいバンド（1つはパーレカンドメインIの503バンドのすぐ下、そしてもう1つは298塩基対の標準マーカーのすぐ下）もまた、パーレカンプローブにより認識され、アルツハイマー病およびコントロール海馬のどちらにも期待された大きさではないパーレカン転写物が存在する可能性が示唆された。より多くの正常加齢コントロールおよびアルツハイマー病患者海馬由来の総RNAを、同一の技術（上述）を用いてさらに解析することにより、時々、期待された503塩基対バンドの上により大きいバンドが観察された（未提示）。ヒトパーレカンmRNAは〜14キロ塩基であり、そして大きさが数100ヌクレオチドしか違わない潜在的転写物を認識しないであろうから、これらのパーレカン関連バンドに代表される全長mRNAは、ノーザン解析により区別されない可能性が高いことに注目することが重要である。
【００８１】
実施例3  パーレカンドメインIスプライシング変異体のクローニングおよび配列決定
パーレカン関連RT-PCR産物は、パーレカンmRNAスプライシング変異体またはパーレカンドメインIと高い相同性を持つ遺伝子に由来している可能性があったため、これらの転写物をクローニングおよび配列決定により同定するための実験が開始され、そして設計された。増幅およびクローニングのため、プライマーを以下のように設計した（表2；図14）：順行プライマー（FPerlDIE）は、ヒトパーレカンドメインI（Genbank寄託番号M85289）の5'端近くの領域に特異的であり、そしてEcoRI制限酵素部位を含み、逆行プライマー（RPerlDIE）は、ヒトパーレカンドメインIの3'端近くの領域に特異的であり、そしてXhoI制限酵素部位を含む。プールしたアルツハイマー病10人または正常加齢コントロール患者10人（表1；図13を参照されたい）の海馬試料に対し、RT-PCR（高厳密性ポリメラーゼを使用）を行い、そしておよそ500塩基対より小さいまたは大きいcDNA産物を、pBluescriptのEcoRIおよびXhoI部位にクローニングした。図3は、EcoRIおよびXhoIにより消化された、500塩基対のパーレカンドメインI（図3Eおよび3Fの矢印は、各図のレーン1の503塩基対にある正常パーレカンを示す）より小さいまたは大きい挿入物を有するプラスミドクローンの例を示す（エチジウムブロミド染色ゲル、図3A、CおよびE）。挿入物を含むすべてのプラスミドを、2つのプローブのうち1つを用いるサザンブロットにより解析した。使用した2つのプローブは；パーレカンドメインIおよびIIにハイブリダイズするDig-19J（図3D）、またはパーレカンドメインIの中央部分にハイブリダイズするDig-366（図3BおよびF）である。プールされたアルツハイマー病海馬RNA試料由来の61クローンのうち、18クローンがパーレカンドメインIまたはパーレカンドメインIおよびIIに特異的なプローブにハイブリダイズすることがわかった。プールされた正常加齢コントロール海馬RNA試料由来の48クローンのうち、18クローンがやはり、パーレカンドメインIまたはパーレカンドメインIおよびIIに特異的なプローブにハイブリダイズすることがわかった。図3に示されたプラスミドをいくつか配列決定すると、後述の4つの異なるパーレカンドメインIスプライシング変異体が存在することが立証された。例えば、図3AおよびBのレーン4に示されたバンドは、エクソン5が除去されたパーレカンドメインIスプライシング変異体（後述）を含むことがわかった。図3CおよびDのレーン1および6に示されたバンドは、エクソン4、5および6の一部が除去されたパーレカンドメインIスプライシング変異体（後述）を含むことがわかった。最後に、図3EおよびFのレーン4および6に示されたバンドは、エクソン3の後そしてエクソン4の開始部分に、異なる大きさの付加挿入物を含む(後述)ことがわかった。
【００８２】
実施例4  エクソン5を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体の同定
プールされたアルツハイマー病海馬cDNAから配列決定されたクローンの1つは、エクソン5を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、エクソン5がパーレカンドメインIから欠失していることを表すため、PerDI-v5（パーレカンドメインI変異体エクソン5）と命名された。図4Aは、正常ヒトパーレカンドメインI（エクソン5を含む）と比較したこの変異体のエクソン構造を表している。図4Bでは、このクローンの核酸配列（SEQ ID NO: 1およびSEQ ID NO: 2）を正常ヒトパーレカンと比較している（Genbank寄託番号M85289のヌクレオチド番号系を使用）。最初の相違は、ヌクレオチド252のTからGへの変化で、その結果、チロシン（アミノ酸番号58）からアスパラギン酸への非保存的アミノ酸変化が起きている（図4C；SEQ ID NO: 3）。59塩基対のエクソン5（Cohenら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:10404-10408, 1993）は、既知のスプライシング部位で正確に欠失していることがわかった。この予測されるパーレカンドメインI変異体の完全なアミノ酸配列を図4Cに示す（SEQ ID NO: 3）。図4Cに示された2つの黒いひし形に囲まれた配列は、我々が得たcDNAクローンの配列である。残りのパーレカン配列は、正常ヒトパーレカンから予測されるものである。エクソン5の欠失の結果、エクソン6以降の読み枠が変化した。新規アミノ酸配列（SEQ ID NO: 4）は、ヌクレオチド651に終止コドンがあると予測され、その結果は190アミノ酸（シグナルペプチド配列を除くと169アミノ酸）のタンパク質となる。スプライシング変異体PerDI-v5の新規アミノ酸配列は、アミノ酸番号142-144に、アミノ酸番号65-78の間に存在する3つのSer-Gly-Asp（SGD）配列と同一のSGD配列を含む（図4C；SEQ ID NO: 3）。SGD配列は、（各セリン残基上に）グリコサミノグリカン鎖を付加するためのコンセンサス配列であり、したがって、予測される169アミノ酸タンパク質（分子量〜17-18キロダルトン）は最大4つのGAG鎖が結合する小さなプロテオグリカンであろう。パーレカンドメインI変異体エクソン5中の新規アミノ酸配列（SEQ ID NO: 4）の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、30％を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン5中の新規アミノ酸配列（SEQ ID NO: 4）は特有であることが示された。
【００８３】
実施例5  エクソン4、5および6の一部を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体の同定
プールされたアルツハイマー病海馬cDNAから配列決定された3つのクローンは、エクソン4、5および6の一部を失ったパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、パーレカンドメインIからエクソン4、5および6のほぼ半分が欠失していることを表すため、PerDI-v4-6.5（パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5）と命名された。図5Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。図5Bでは、このクローンの核酸配列（SEQ ID NO: 6）を正常ヒトパーレカンと比較しており（Genbank寄託番号M85289のヌクレオチド番号系を使用）、236塩基対が除去されていることを示している。エクソン6のこの領域における正常パーレカン配列はコンセンサススプライシング部位のGT/AG原則（JacobおよびGallinaro, Nucleic Acid Res. 17:2159-2180, 1989）にのっとっていない。とはいえ、非コンセンサスmRNAスプライシング部位の例は、いくつか知られている（Jackson, Nucleic Acid Res. 19:3795-3798, 1991）。欠失により読み枠に変化が生じ、アミノ酸配列中に直ちに終止コドン（*）をコードする結果になっている（図5C中の*）（SEQ ID NO: 7）。この結果、3つのGAG結合部位を含む非常に小さな（82アミノ酸または分子量〜8-9キロダルトン）パーレカンドメインI様タンパク質が産生されると予測される。ヌクレオチド252でTからGへの変異があるため、アミノ酸58でも、チロシンからアスパラギン酸への変異がある（図5C；SEQ ID NO: 7）。
【００８４】
実施例6  エクソン4中に付加された新規配列（33ヌクレオチド）を含むパーレカンドメインIスプライシング変異体の同定
プールされた正常加齢海馬cDNAから配列決定されたクローンの1つは、エクソン4の開始部位近傍に33の新規ヌクレオチド（SEQ ID NO: 9）が挿入された、パーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、新たな配列がエクソン4の開始部分に存在する（すなわち、エクソン4aと称される新たな配列）ことを表すため、PerDI+4a（パーレカンドメインI変異体エクソン4a）と命名された。図6Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。新規配列の挿入はエクソン4の開始から14塩基の部位で起きていた（図6B）。この挿入による読み枠の変化はなく、そしてしたがってこの変異体は残りの正常パーレカンをコードしているはずであり、転写物は、読み枠13,173 bp + 33 bp =13,206 bpの、およそ14,000塩基対である。33挿入ヌクレオチドは11新規アミノ酸（SEQ ID NO: 10）をコードし、そのうち5つは疎水性である（図6C）。やはりグリコサミノグリカン鎖結合部位となる可能性があるセリン−グリシン対も、当該新規配列中に存在している。この変異体および正常パーレカンの間には、ヌクレオチド164および252で、2つのヌクレオチド相違がある（図6B、6C）。ヌクレオチド164でのAからCへの変異はアミノ酸（アラニン）の変異にはつながらないが、ヌクレオチド252でのTからGへの変異は、チロシンからアスパラギン酸への非保存性アミノ酸変異となる（図6C）。パーレカンドメインI変異体エクソン4a中の新規11アミノ酸配列（SEQ ID NO: 10）の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、20％を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン4a中の新規11アミノ酸配列（SEQ ID NO: 10）は特有であることが示された。
【００８５】
実施例7  エクソン3の後に付加された新規配列（75ヌクレオチド）を含むパーレカンドメインIスプライシング変異体の同定
プールされた正常加齢海馬cDNAから配列決定された2つのクローンは、エクソン3の後に75の新規ヌクレオチド（SEQ ID NO: 12）が挿入されたパーレカンドメインIスプライシング変異体からなることがわかった。この変異体は、新規配列がエクソン3の後に存在する（すなわち、エクソン3aと称される新規配列）ことを表すため、PerDI+3a（パーレカンドメインI変異体エクソン3a）と命名された。図7Aは、正常ヒトパーレカンドメインIと比較したこの変異体のエクソン構造を表している。新規配列の挿入は正確にエクソン3および4の間で起きていた（図7B）。この挿入による読み枠の変化はなく、そしてしたがってこの変異体は残りの正常パーレカンをコードしているはずであり、転写物は、読み枠13,173 bp + 75 bp =13,248 bpの、およそ14,000塩基対である。このパーレカンドメインI変異体は、変異体PerDI+4aと非常によく似ており、a) 75塩基対挿入物の最初の33塩基対（そしてしたがってコードされる11アミノ酸；SEQ ID NO: 10）は同一であり、そしてb)ヌクレオチド252でも、チロシンからアスパラギン酸への非保存性アミノ酸変異となるTからGへの変異がある（図7C）。新規挿入物は26アミノ酸（ちょうどスプライシング部位でバリンからグリシンへの変異がある）をコードし、そのうち13は疎水性である（図7C；SEQ ID NO: 13）。さらに、新規配列はまた、潜在的グリコサミノグリカン鎖結合部位であると示唆されるセリン−グリシン配列を含んでいる。パーレカンドメインI変異体エクソン3a中の新規26アミノ酸配列（SEQ ID NO: 13）の相同性を、現在のゲノムおよびタンパク質データベースで検索したところ、20％を超えるアミノ酸同一性を持つマッチはないことが示された。このことにより、パーレカンドメインI変異体エクソン3a中の新規26アミノ酸配列（SEQ ID NO: 13）は特有であることが示された（上述の例外がある）。
【００８６】
実施例8  アルツハイマー病の異なる個人の海馬から得たRNA中の4つのパーレカンドメインIスプライシング転写物の存在
本発明に記載されるこれら4つのスプライシング変異体がアルツハイマー病患者の海馬から得られるRNA中に存在するのか、その後決定した。これらの研究のため、新規エクソン結合部位にまたがる特異的プライマーを設計し（表2-図14；図4A、5A、6Aおよび7A；およびSEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 14を参照されたい）、そして正常ヒトパーレカン配列へのプライマーの結合を最小にするRT-PCR反応条件を用いた。特異性を最大にするためのPCRパラメーターの最適化には、アニーリング温度および増幅サイクル数の変化が含まれる。使用したプライマー、産物の期待される大きさおよびPCRの条件は：パーレカンドメインI変異体エクソン5に対してはF2hPerDIおよびRhPerEX4/6（SEQ ID NO: 5）、260塩基対（56℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5に対してはFhEx3/6.5およびRPerlDI（SEQ ID NO: 8）、92塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4aに対してはFhEx178およびRPerlDI（SEQ ID NO: 11）、325塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン3aに対してはFhEx181およびRPerlDI（SEQ ID NO: 14）、339塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）であった。コントロールとして、逆転写酵素反応を酵素なしで行うこと（RNA調製中のゲノムDNAの引き続いて起こる増幅をチェックするため）、および試薬中のDNA混入をチェックするためテンプレートなしでPCRを行うことを含んだ。上述のコントロールはどちらも、常に陰性だった。図8に示すように、RT-PCRはアルツハイマー病患者10人（表1-図13を参照されたい）の海馬から単離した総RNAに対し、特異的パーレカンドメインIスプライシング変異体プライマー対を用いて行った。結果（図8）は、a)パーレカンドメインIエクソン5スプライシング変異体はAD患者10人中10人に存在し；b)パーレカンドメインIエクソンスプライシング4-6.5変異体はAD患者10人中10人に存在し；c)パーレカンドメインIエクソン+4a挿入変異体はAD患者10人中10人に存在し；そしてd)パーレカンドメインIエクソン+3a挿入変異体はAD患者10人中9人に存在することを示した。これらの結果は4つのスプライシング変異体がすべて、ほとんどすべてのアルツハイマー病患者の海馬由来RNAに存在していることを示している。
【００８７】
実施例9  パーレカンドメインI変異体エクソン5の特有なアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体の産生
Zymed Laboratories（米国南サンフランシスコ）と契約し、パーレカンドメインI変異体エクソン5の特有なアミノ酸配列（SEQ ID NO: 4）を解析し、どの特異的領域がカスタムペプチド合成およびポリクローナル抗ペプチド抗体の生成に有用であるか決定した。KyteおよびDoolittle親水性モデル、および柔軟性、タンパク質表面可能性、両親媒性、および好ましい二次構造各指標のペプチド領域の決定を含む、異なるペプチド領域の免疫原性を決定するコンピューターアルゴリズムを使用した。最初の5つのカテゴリーに基づいた全体の評価により、考慮したそれぞれの特異的ペプチド領域に対する抗原性指標が得られた。主に、好ましい二次構造を取ることから、抗体産生のためにP-T-P-G-H-S-A-P-V-P-K-S-L-H-G-G-R（SEQ ID NO: 15）に対応する17アミノ酸部分を選択した。ペプチド合成、精製および部位特異的KLH結合、およびPolyQuikTM法を用いた迅速抗体サービスはZymed Laboratories（米国南サンフランシスコ）により行われた。部位特異的KLH結合のため以下のペプチドを合成し、そしてポリクローナル抗ペプチド抗体産生のためウサギに免疫した：(C)-P-T-P-G-H-S-A-P-V-P-K-S-L-H-G-G-R-COOH。システイン残基（C）は、単点部位特異的KLH結合に用いるよう割り当てられた。
【００８８】
2匹のウサギをポリクローナル抗体産生のため、上記のペプチドで免疫した。ウサギ免疫前血清、およびペプチド免疫後に得られた血清をその後、上述の特異的ペプチド配列を利用してELISAにより調べた。ELISAデータにより、非常に優れたペプチド特異的抗体タイターが示された（未提示）。
【００８９】
実施例10  パーレカンドメインI変異体エクソン5のアルツハイマー病神経原繊維変化への免疫局在
パーレカンドメインI変異体エクソン5に存在する特有配列領域である17アミノ酸ペプチド（SEQ ID NO: 15）に対するポリクローナル抗ペプチド抗体（「エクソン5欠失」抗体として知られる）を、その後、このパーレカン変異体のアルツハイマー病患者脳における免疫位置決定に使用した。アルツハイマー病であることが確定された5症例の海馬または前頭皮質を含む脳組織部位を、ワシントン大学アルツハイマー病研究センターから入手し、そして利用した。パラフィン包埋物のそれぞれの塊から、6-8μmの連続切片を切り取り、そしてゼラチンコーティングしたプレート上においた。アミロイド含有斑および神経原繊維変化は、コンゴ−レッド染色（Puchtlerら、J. Histochem. Cytochem. 10:335-364, 1962）後、偏光下で観察して同定した。パーレカンドメインI変異体エクソン5の検出は、上述の「エクソン5欠失」抗体を1:300または1:500希釈で用いて行った。コントロールは、隣接する連続切片の過剰17アミノ酸ペプチド（やはりZymed Laboratoriesにより提供された）で前吸収した、同一の「エクソン5欠失」抗体での染色、および／または隣接する連続切片の「エクソン5欠失」抗体を作成するのに利用した同じウサギから得られた免疫前血清での染色からなった。組織部位の免疫染色は、ヘマトキシリン逆染色と共にアビジン−ビオチン複合体（Hsuら, J. Histochem. Cytochem. 29:577-580, 1981）を用いて行った。免疫細胞化学染色には、最も低いバックグラウンド染色で、最良の特異性を得るために、一次抗体を異なる希釈で試した。一次抗体の最適な希釈の結果のみが報告される。隠れた抗原部位を暴露するのを助けるため、免疫染色前に、「エクソン5欠失」抗体と共に組織部位を88％のギ酸で5分、前処理した（Kitamotoら, Lab. Invest. 57:230-236, 1987）。
【００９０】
アルツハイマー病と確定された患者由来の海馬および前頭皮質をコンゴ−レッド染色し、そして偏光下で観察することにより、数多くのアミロイド斑（未提示）および神経原繊維変化（図10A、矢印）が明らかにされた。「エクソン5欠失」抗体は神経原繊維変化に強い染色（図10B、10Cおよび10D）を表し、隣接する連続切片上で陽性コンゴ−レッド染色により同定された幽霊変化およびニューロン内変化の両方が含まれていた。「エクソン5欠失」抗体は、いくつかの異なるアルツハイマー病症例で、神経原繊維変化のみを免疫染色し、そしてアミロイドまたは神経突起斑は染色しなかった。さらに、この抗体はまれに、変化を含まないニューロンも免疫染色した。「エクソン5欠失」抗体を、過剰17アミノ酸ペプチド（抗体産生に抗原として用いたもの）の存在下で使用する、前吸収実験により、完全に陽性免疫染色が失われ、使用した抗体の特異性が示された（未提示）。さらに、免疫前血清で免疫染色したアルツハイマー病症例由来部位は、神経原繊維にいかなる陽性免疫染色も示さなかった。ポリクローナルパーレカン「エクソン5欠失」抗体を利用した免疫位置決定研究により、驚くべきことに、基底膜または脳血管は免疫染色されないことが示され、このパーレカン変異体は、パーレカンまたは「正常基底膜ヘパラン硫酸PG」とは明らかに異なる分布を有する可能性があることが示唆された。したがって、本研究により、アルツハイマー病脳において、パーレカンドメインIエクソン5欠失変異体は脳に存在する神経原繊維変化に特異的に局在することが立証された。
【００９１】
実施例11  パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aの特有なアミノ酸配列に対するポリクローナル抗体の産生
Zymed Laboratories（米国南サンフランシスコ）と契約し、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの特有なアミノ酸配列（SEQ ID NO: 13）もまた解析し、どの特異的領域がカスタムペプチド合成およびポリクローナル抗ペプチド抗体の生成に有用であるか決定した。KyteおよびDoolittle親水性モデル、および柔軟性、タンパク質表面可能性、両親媒性、および好ましい二次構造各指標のペプチド領域の決定を含む、異なるペプチド領域の免疫原性を決定するコンピューターアルゴリズムを使用した。最初の5つのカテゴリーに基づいた全体の評価により、考慮したそれぞれの特異的ペプチド領域に対する抗原性指標が得られた。主に、全体の評価が優れていることから、抗体産生のためにQ-P-L-G-R-P-P-V-A-G-M-M-V-S-E-P-D-E-E（SEQ ID NO: 16）に対応する19アミノ酸部分を選択した。抗体産生のため選択されたペプチド領域は、パーレカンドメインI変異体エクソン3a（SEQ ID NO: 10）に存在する（11アミノ酸の内）8アミノ酸、およびパーレカンドメインI変異体エクソン4aに特有な11アミノ酸からなることに注目されたい。したがって、この19アミノ酸領域に対して産生されたペプチド抗体は、パーレカンドメインI変異体4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体3aに存在する配列を検出すると考えられる。ペプチド合成、精製および部位特異的KLH結合、およびPolyQuikTM法を用いた迅速抗体サービスはZymed Laboratories（米国南サンフランシスコ）により行われた。部位特異的KLH結合のため以下のペプチドを合成し、そしてポリクローナル抗ペプチド抗体産生のためウサギに免疫した：(C)-Q-P-L-G-R-P-P-V-A-G-M-M-V-S-E-P-D-E-E-COOH。システイン残基（C）は、単点部位特異的KLH結合に用いるよう割り当てられた。
【００９２】
2匹のウサギをポリクローナル抗体産生のため、上記のペプチドで免疫した。ウサギ免疫前血清、およびペプチド免疫後に得られた血清をその後、上述の特異的ペプチド配列を利用してELISAにより調べた。ELISAデータにより、非常に優れたペプチド特異的抗体タイターが示された（未提示）。
【００９３】
実施例12  パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aのアルツハイマー病アミロイド斑への免疫局在
パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aに存在する19アミノ酸ペプチド（SEQ ID NO: 15）配列領域に対するポリクローナル抗ペプチド抗体（「パーレカンドメインI挿入」抗体として知られる）を、その後、これらのパーレカン「挿入」変異体のアルツハイマー病患者脳における免疫位置決定に使用した。アルツハイマー病であることが確定された5症例の海馬または前頭皮質を含む脳組織部位を、ワシントン大学アルツハイマー病研究センターから入手し、そして利用した。パラフィン包埋物のそれぞれの塊から、6-8μmの連続切片を切り取り、そしてゼラチンコーティングしたプレート上においた。アミロイド含有斑および神経原繊維変化は、コンゴ−レッド染色（Puchtlerら、J. Histochem. Cytochem. 10:335-364, 1962）後、偏光下で観察して同定した。さらに、Aβ含有沈着（アミロイド斑および脳血管アミロイド沈着に存在）をAβの残基17-24を認識するモノクローナル抗体（抗4G8として知られる；Senetek）を用いて検出した。パーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの検出は、上述の「パーレカンドメインI挿入」抗体を1:250および1:350希釈で用いて行った。コントロールは、隣接する連続切片の過剰19アミノ酸ペプチド（やはりZymed Laboratoriesにより提供された）で前吸収した、同一の「パーレカンドメインI挿入」抗体での染色、および／または隣接する連続切片の「パーレカンドメインI挿入」抗体を作成するのに利用した同じウサギから得られた免疫前血清での染色からなった。組織部位の免疫染色は、ヘマトキシリン逆染色と共にアビジン−ビオチン複合体（Hsuら, J. Histochem. Cytochem. 29:577-580, 1981）を用いて行った。免疫細胞化学染色には、最も低いバックグラウンド染色で、最良の特異性を得るために、一次抗体を異なる希釈で試した。一次抗体の最適な希釈の結果のみが報告される。隠れた抗原部位を暴露するのを助けるため、免疫染色前に、「パーレカンドメインI挿入」抗体と共に組織部位を88％のギ酸で5分、前処理した（Kitamotoら, Lab. Invest. 57:230-236, 1987）。
【００９４】
アルツハイマー病と確定された患者由来の海馬および前頭皮質をコンゴ−レッド染色し、そして偏光下で観察することにより、数多くのアミロイド斑および神経原繊維変化が明らかにされた（未提示）。Aβ含有アミロイド斑をさらに、抗4G8抗体を利用してアルツハイマー病脳で同定しそして免疫位置決定した（図12Aおよび12B）。「パーレカンドメインI挿入」抗体は、ほとんどのアルツハイマー病症例において、変化を含まないニューロン（海馬に存在するいくつかの錐体ニューロンなど）に免疫局在した（図12C）。さらに、「パーレカンドメインI挿入」抗体は、アミロイド含有斑を免疫染色した（図12D）。「パーレカンドメインI挿入」抗体による斑の免疫染色は、固定法に影響されることがわかり、そして驚くべきことに、概してホルマリン固定された組織で顕著に観察された。「パーレカンドメインI挿入」抗体は、概して神経原繊維変化を免疫染色せず、中程度の大きさの小動脈および毛細管を含む血管壁を免疫染色した（正常パーレカン（すなわち非スプライシング変異体）の免疫染色を連想させる）。「パーレカンドメインI挿入」抗体を、過剰19アミノ酸ペプチド（抗体産生に抗原として用いたもの）の存在下で使用する、前吸収実験により、完全に上述の陽性免疫染色がすべて失われ、使用した抗体の特異性が示された（未提示）。さらに、免疫前血清で免疫染色したアルツハイマー病症例由来部位は、ニューロンまたはアミロイド斑にいかなる陽性免疫染色も示さなかった。したがって、本研究により、アルツハイマー病脳において、パーレカンドメインI変異体エクソン3aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン4aは主に、脳に存在するニューロンおよびアミロイド斑に特異的に局在することが立証された。
【００９５】
実施例13  中枢神経系外部のアルツハイマー病組織由来のRNA中の4つのパーレカンドメインIスプライシング変異体の存在
脳（海馬、皮質）、脾臓、肝臓、腎臓、心臓および／またはすい臓を含むヒト組織を、ワシントン大学病理学部検死施設から得た。脳およびその他の組織は、アルツハイマー病と確定された80歳男性に由来した。総RNAを上述（実施例1中）のように単離し、そして1μgのRNA、200UのRNase H陰性逆転写酵素（Superscript II, Gibco-BRL）および150 ngの六量体プライマーを含む反応緩衝液中、1.5時間42℃という条件で、一本鎖cDNAを合成した。増幅は、a) Taqポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を用い、b)プライマーアニーリングは使用したプライマー対により決定される温度で行われ、そしてc)アニーリング時間は1分で、そしてサイクル数は30‐35の間であったことを除けば、上述（実施例1中）のように行った。特異性を最大にするためのPCRパラメーターの最適化には、アニーリング温度および増幅サイクル数の変化が含まれる。使用したプライマー対、産物の期待される大きさおよびPCRの条件は：パーレカンドメインI変異体エクソン5に対してはF2hPerDIおよびRhPerEX4/6、260塩基対（56℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5に対してはFhEx3/6.5およびRPerlDI、92塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン4aに対してはFhEx178およびRPerlDI、325塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）；パーレカンドメインI変異体エクソン3aに対してはFhEx181およびRPerlDI、339塩基対（60℃アニーリング、35サイクル）であった。コントロールとして、逆転写酵素反応を酵素なしで行うこと（RNA調製中のゲノムDNAの引き続いて起こる増幅をチェックするため）、および試薬中のDNA混入をチェックするためテンプレートなしでPCRを行うことを含んだ。上述のコントロールはどちらも、常に陰性だった。RT-PCR産物は、エチジウムブロミド染色した2％または4％アガロースゲル上で解析した。
【００９６】
特異的パーレカンドメインIプライマー（実施例8に記載される）を使用して、これらのスプライシング変異体が中枢神経系外部の他の組織から得られるRNAにも存在するかどうかを測定した。同じアルツハイマー病患者の、脳（皮質）、すい臓、肝臓、脾臓および腎臓を含むいくつかの組織で、正常パーレカンドメインI発現が検出された（表3）。特異的パーレカンドメインI変異体プライマーおよびRT-PCR方法論を用いた初期の解析（本明細書に記載される）により、4つのパーレカンスプライシング変異体すべてが、解析されたほとんどの他の器官（中枢神経系外部にあるもの）に存在することも示唆された。例えば、パーレカンドメインIエクソン5変異体（表3中でv5と称される）は、RT-PCR解析により、すい臓、肝臓、心臓、脾臓、脳および腎臓で検出された。同様に、パーレカンドメインIエクソン4-6.5変異体は、同じアルツハイマー病患者の、すい臓、肝臓、心臓、脾臓、脳および腎臓で検出された。これらの結果により、本発明で同定された4つのパーレカンスプライシング変異体は、脳のみに存在するのでなく、中枢神経系外部のいくつかの組織にも存在らしいことが示された。これらのパーレカンドメインIスプライシング変異体が中枢神経系外部のさまざまな組織に存在することにより、これらの変異体が脳中（すなわち、Aβアミロイド、PrPアミロイド）または中枢神経系外部の特定の器官（すなわち、AAアミロイド、ALアミロイド、ベータ2‐ミクログロブリンアミロイド、小島アミロイド、内分泌型アミロイドーシス、トランスチレチン／プレアルブミンアミロイド）のアミロイド沈着を示すアミロイドーシスそれぞれに重要である可能性が高いという概念を強化する。これらのパーレカンドメインIスプライシング変異体が脳および全身器官に存在する可能性があるとしても、これら変異体の量的レベルもまた、本明細書に記載されるように、診断または治療への適用に重要な根拠を与えるであろう。
【００９７】
【表１】
2008086313.tif 000002
【００９８】
本発明のさらなる側面、利用および好ましい態様
核酸
本発明の1つの側面のとおり、mRNA、DNA、cDNAと共に、類似体（analog）および生物学的に活性があり、そして診断上または治療上有用なその断片を含む、単離核酸分子が提供される。
【００９９】
本発明の別の側面のとおり、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）のアミノ酸配列を有すると推測される成熟ポリペプチドをコードする単離核酸（ポリヌクレオチド）が提供される。
【０１００】
本発明のポリヌクレオチドは、RNA型でもDNA型でもよく、DNAにはcDNA、ゲノムDNA、および合成DNAが含まれる。DNAは二本鎖でも一本鎖でもよく、そして一本鎖であればコード鎖でも非コード（アンチセンス）鎖でもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、図11（SEQ ID NO: 16）に示されたコード配列と同一でもよいし、または遺伝暗号の重複または縮重の結果、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、図11（SEQ ID NO: 16）のDNAまたはcDNAとして同一の成熟ポリペプチドをコードする、異なるヌクレオチド配列であってもよい。
【０１０１】
図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）の成熟ポリペプチド、または寄託されるcDNAによってコードされる成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、限定されるわけではないが：成熟ポリペプチドのコード配列のみ、成熟ポリペプチドのコードする配列およびリーダーまたは分泌配列またはプロタンパク質配列などの付加的コード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および所望により付加的コード配列）およびイントロンまたは成熟ポリペプチドのコード配列の5'および／または3'の非コード配列などの非コード配列をコードする配列を含んでもよい。したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語には、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチドと共に、付加的コードおよび／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含まれる。
【０１０２】
本発明には、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）に示されるものと同一の成熟ポリペプチド、または寄託クローンのcDNAにコードされるものと同一の成熟ポリペプチドと共に、こうしたポリヌクレオチドの変異体、つまり、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）のポリペプチド、または寄託クローンcDNAがコードするポリペプチドの、断片、誘導体または類似体をコードする変異体が含まれる。こうしたヌクレオチド変異体には、欠失変異体、置換変異体、および付加または挿入変異体が含まれる。
【０１０３】
前条に示されたように、ポリヌクレオチドは、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）に示されたコード配列、または寄託クローンのコード配列の、天然発生対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。当業に知られるように、対立遺伝子変異体は、1つまたはそれ以上のヌクレオチドに置換、欠失または付加を有してもよい、コードされるポリペプチドの機能を実質的に改変しないポリヌクレオチド配列の別型である。
【０１０４】
本発明はまた、ポリヌクレオチドであって、成熟ポリペプチドの当該コード配列が、発現および宿主細胞からのポリペプチドの分泌を助けるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプチド輸送を調節する分泌配列として機能するリーダー配列と、同じ読み枠で融合してもよい前記ポリヌクレオチドを含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そしてポリペプチドの成熟型を形成するため、宿主細胞によりリーダー配列を切断されてもよい。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質に付加的なN末端アミノ酸残基が加えられたプロタンパク質をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟タンパク質はプロタンパク質であり、そしてタンパク質の不活性型である。プロ配列が切断されると、活性型成熟タンパク質が残る。したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、成熟タンパク質、またはプロ配列を有するタンパク質、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）双方を有するタンパク質をコードしてもよい。
【０１０５】
本発明はさらに、配列間の同一性が、少なくとも70％、好ましくは少なくとも90％、およびより好ましくは少なくとも95％であるならば、前条で記載された配列とハイブリダイズする、ポリヌクレオチドに関連する。本発明は特に、前条に記載のポリヌクレオチドと厳密な（stringent）条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関連する。ここで用いた場合、「厳密な条件」という用語は、配列間に少なくとも95％の同一性があるときのみ、ハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい態様において、前条に記載されたポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）のcDNA、または寄託されたcDNAにコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする。
【０１０６】
本発明はさらに、前条に記載された、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）のアミノ酸配列を有すると推定されるポリペプチド、または寄託クローンのcDNAによりコードされるポリペプチドの、断片、類似体および誘導体をコードするポリヌクレオチドの変異体に関連する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然発生対立遺伝子変異体またはポリヌクレオチドの天然発生変異体であってもよい。
【０１０７】
本発明のさらに別の側面では、ヒト組織、細胞、および／または生物学的液体中の細胞由来mRNAに対し、さらに転写物の大きさを測定するために、本明細書に記載されるパーレカンドメインI変異体プラスミドを用いてノーザンブロット解析を行ってもよい。さらに、本発明の同一のプローブを用いたノーザンブロットを利用して、正常患者のパーレカンドメインIスプライシング変異体mRNAの比較レベルを、特定の疾患（アミロイド疾患など）患者と比較してもよい。
【０１０８】
本発明のさらに別の側面では、全長遺伝子の断片をcDNAライブラリーのハイブリダイゼーションプローブとして用い、全長遺伝子を単離し、そして当該遺伝子と高い配列類似性または同様の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離してもよい。この型のプローブは、少なくとも19塩基を有し、そして例えば、50またはそれ以上の塩基を含んでいてもよい。プローブはまた、全長転写物に対応するcDNAクローン、および制御およびプロモーター領域、エクソン、およびイントロンを含む完全パーレカンドメインIスプライシング変異体を含むゲノムクローンを同定するのに使用してもよい。スクリーニングの一例には、既知のDNA配列を使用してオリゴヌクレオチドプローブを合成することにより、コード領域を単離することが含まれる。本発明の遺伝子に相補的な配列を有する標識オリゴヌクレオチドを用い、ヒトcDNA、ゲノムDNAまたはmRNAライブラリーをスクリーニングし、ライブラリーのどのメンバーにプローブがハイブリダイズするか決定する。
【０１０９】
本発明の別の側面は、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターにより遺伝学的に処理された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関連する。宿主細胞は、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターでもよい、本発明のベクターにより、遺伝学的に処理（形質転換または形質導入またはトランスフェクション）される。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージの形でもよい。処理された宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または遺伝子の増幅に適するよう修飾された慣用的な栄養培地中で培養してもよい。温度、pHおよび匹敵する培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前利用されたものであり、そして一般的な当業者には明白であろう。
【０１１０】
本発明の別の側面において、本発明のポリヌクレオチドは、組換え技術によりポリペプチドを産生するのに使用してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するさまざまな発現ベクターのいずれに含まれてもよい。こうしたベクターには、染色体、非染色体、および合成DNA配列、例えばSV40誘導体；細菌プラスミド；ファージDNA；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージDNAの組み合わせに由来するベクター；ワクシニア、アデノウイルス、トリポックスウイルス、および偽狂犬病などのウイルスDNAが含まれる。しかし、宿主中で複製可能で、そして生存可能であれば、その他のいかなるベクターを使用してもよい。
【０１１１】
したがって、本発明は、真核生物発現が好ましいが、原核または真核細胞どちらにおけるパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの発現も含む。
好ましい宿主は細菌または真核宿主であり、in vivoまたはin situにおける細菌、酵母、昆虫、菌類、トリおよび哺乳動物細胞、または哺乳動物、昆虫、トリまたは酵母起源の宿主細胞が含まれる。哺乳動物細胞またはヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、げっ歯類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌまたはネコ起源の組織が好ましいが、他の哺乳動物細胞いずれを使用してもよい。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、研究試薬およびヒト疾患の治療および診断法の発見のための材料として利用してもよい。
【０１１３】
ペプチド、アミノ酸およびGAG
本発明中に引用されるポリペプチドは、天然ポリペプチド、合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドでもよい。本明細書に引用されるすべてのパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの、断片、誘導体または類似体は、a) 1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が保存性または非保存性アミノ酸残基により置換され、そしてこうした置換アミノ酸残基が遺伝暗号によりコードされるかもしれないまたはされないかもしれないもの、またはb) 1つまたはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、またはc)成熟ポリペプチドが他の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加させるために使用される化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの、またはd)付加アミノ酸、例えばリーダーまたは分泌配列または成熟ポリペプチドまたはプロタンパク質配列の精製に使用される配列が成熟ポリペプチドに融合しているもの、でもよい。こうした断片、誘導体および類似体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１１４】
本発明のポリペプチドには、図4C（SEQ ID NO: 4）、図5C（SEQ ID NO: 7）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）に示されたそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体推定アミノ酸配列内に含まれるポリペプチドまたはその中の断片と共に、上記のポリペプチドに少なくとも70％類似性（好ましくは70％同一性）およびより好ましくは少なくとも90％類似性（好ましくは90％同一性）を有するポリペプチドが含まれる。
【０１１５】
本発明のポリペプチド断片または部分は、ペプチド合成により対応する全長ポリペプチドを産生するのに使用してもよく；したがって、断片を全長ポリペプチド産生の中間体として使用してもよい。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するのに使用してもよい。
【０１１６】
本発明の1つの側面のとおり、本明細書に記載される新規パーレカンドメインIスプライシング変異体中の新規ペプチド配列が、生物学的に活性があり、そして診断上または治療上有用な、その断片、類似体および誘導体と共に提供される。本発明に記載されるペプチド配列は、ヒト配列である。
【０１１７】
本発明のポリペプチドは、天然精製産物、または化学合成法産物、または組換え技術による原核または真核宿主（例えば、培養中の細菌、酵母、より高次の植物、昆虫および哺乳動物細胞）からの産物でもよい。組換え法に使用する宿主次第で、本発明のポリペプチドは、糖修飾されているかもしれないし、糖修飾されていないかもしれない。本発明のポリペプチドはまた、最初にメチオニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明のパーレカンドメインIポリペプチドは、開示される新規パーレカンドメインIポリペプチド、その保存性置換誘導体またはその機能的誘導体の一部を含み、既知の方法段階に従って合成してもよい。
【０１１９】
化学的ポリペプチド合成は、当業で急速に発展している領域であり、そして固相ポリペプチド合成は、本明細書中に完全に援用される、次の参考文献によく記載されている（Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963; Merrifield, Science 232:341-347, 1986; Fields, Int. J. Polypeptide Prot. Res. 35, 161, 1990）。
【０１２０】
パーレカンドメインIポリペプチド組換え体産生は、既知の方法段階により行ってもよい。組換えDNA技術の一般的原理を説明する標準的な参考文献著作には、Watson, Molecular Biology of the Gene, Volumes IおよびII, The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc.出版, カリフォルニア州メンロパーク 1987; Ausubelら監修, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience出版, ニューヨーク州ニューヨーク 1987; 1992;およびSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory出版, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー 1989が含まれ、これらの参考文献のすべての内容は、本明細書中に援用される。
【０１２１】
本発明のポリペプチドは、研究試薬およびヒト疾患の治療および診断法の発見のための材料として利用してもよい。
パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体もまた、当業者に知られる方法を用いて、組織からパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質を単離するのに用いてもよい。例には、限定されるわけではないが、アフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび免疫沈降方法論の使用がある。組織からのパーレカンドメインIスプライシング変異体の単離により、前記パーレカンドメインIスプライシング変異体に結合するGAG鎖のさらなる構造決定が可能になるであろう。こうしたGAG鎖を単離し、そしてGAGの種類、GAG鎖の長さおよび大きさ、および特異的単糖、二糖、および多糖構造に従って性質決定することが可能である。こうした解析は、記載されるすべての参考文献も含めて本明細書に完全に援用される、HampsonおよびGallagher, Biochem. J. 221:697-705, 1984; Farach-Carsonら, Biotech. 7:482-493, 1989; GyoおよびConrad, Anal. Biochem. 176:96-104, 1989; DaColら, J. Chromatography 647:289-300, 1993; Hovinghら, Eur. J. Biochem. 211:771-779, 1993;に記載されるものを含む、当業者に知られる方法により行うことも可能である。
【０１２２】
抗体
特定の配列に対応するポリペプチドに対して生成され、本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体を認識する抗体は、ポリペプチドを動物に直接注射するか、または好ましくはヒトでない動物にポリペプチドを投与するかして得ることが可能である。こうして得られた抗体は、その後、ポリペプチド自体に結合するであろう。こうした方法において、ポリペプチドの断片のみをコードする配列であっても、完全な天然ポリペプチドに結合する抗体を生成するのに使用することが可能である。こうした抗体は、その後、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離するのに使用してもよい。好ましい態様には、限定されるわけではないが、それぞれパーレカンドメインIエクソン5変異体、およびパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの存在および局在を検出するのに利用する「パーレカンエクソン5欠失」抗体および「パーレカンドメインI挿入」抗体などの、本明細書に記載される抗ペプチド抗体が含まれる。これら抗体の作成に利用する好ましいペプチドには、限定されるわけではないが、SEQ ID NO: 15およびSEQ ID NO: 16に記載されるペプチド配列が含まれる。これらの記載される配列を用いた抗ペプチド抗体の生成に関して、好ましい態様には、単点部位特異的KLH結合のためのSEQ ID NO: 15および／またはSEQ ID NO: 16のアミノ末端へのシステイン残基の付加が含まれる。
【０１２３】
「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドと共にその断片に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含むものを意味する。
【０１２４】
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫された動物血清由来の抗体分子の異種集合である。
モノクローナル抗体には、抗原に特異的な抗体の、実質的に同種の集合が含まれ、集合には実質的に同様のエピトープ結合部位が含まれる。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞株培養により産生される抗体を提供する技術のいずれを使用してもよい。例には、ハイブリドーマ技術（KohlerおよびMilstein, Nature 256:495-497, 1975）、トリオーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozborら, Immunology Today 4:72, 1983）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBVハイブリドーマ技術（Coleら, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy中, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96, 1985）が含まれる。こうした抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、GILDを含む免疫グロブリンクラスおよびそれらのサブクラスのいずれであってもよい。
【０１２５】
キメラ抗体は、ネズミモノクローナル抗体由来の可変部およびヒト免疫グロブリン定常部を有するものなど、異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、主に適用に際し免疫原性を減少させ、そして産生量を増加させるために使用する。キメラ抗体およびその産生法は当業に知られている（例、Cabillyら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 81:3273-4377, 1984; HarlowおよびLane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988）。
【０１２６】
抗イディオタイプ抗体は、抗体の抗原結合部位と一般的に結合している特有の決定基を認識する抗体である。抗イディオタイプ抗体は、抗イディオタイプ抗体を調製しようとするモノクローナル抗体により、モノクローナル抗体原となったものと同一種および遺伝型（例えばマウス系）の動物を免疫することにより調製することが可能である。免疫された動物は、免疫した抗体のイディオタイプ決定基を認識しそして反応して、これらイディオタイプ決定基に対する抗体（抗イディオタイプ抗体）を産生するであろう。例として、本明細書に援用される、米国特許第4,699,880号を参照されたい。
【０１２７】
「抗体」という用語はまた、損なわれていない（intact）分子と共にその断片も含むものを意味する。例えば、抗原に結合できるFabおよびF(ab')2などである。FabおよびF(ab')2断片は、損なわれていない抗原のFc断片を欠いており、循環系からより迅速に排除され、そして損なわれていない抗体より、非特異的組織結合が低い可能性がある（Wahlら, J. Nucl. Med. 24:316-325, 1983）。
【０１２８】
本発明中で有用な抗体または抗体断片は、試料中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を定量的または定性的に検出する、または本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドを発現する細胞の存在を検出するのに用いてもよい。これは、蛍光標識された抗体を、光学顕微鏡、フローサイトメトリーまたは蛍光定量法検出と共に使用する、免疫蛍光技術により達成してもよい。
【０１２９】
パーレカンドメインI変異体抗体を検出可能であるように標識する方法の1つに、当該抗体を酵素に結合させ、そして酵素免疫検定（EIA）を使用する方法がある。この酵素はその後、適切な基質に曝露されると、例えば、分光光度、蛍光定量または視覚的方法により検出可能な化学部分を産生するという方式で、基質と反応するであろう。抗体を検出可能であるよう標識できる酵素には、限定されるわけではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ-5-ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが含まれる。検出は、酵素に対する発色原基質を用いる比色法により行ってもよい。検出はまた、同様に調製した標準と基質の酵素反応量を視覚的に比較することにより、行ってもよい（HarlowおよびLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1988; Ausubelら監修、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, ニューヨーク 1987, 1992）。
【０１３０】
検出は、さまざまな他の免疫検定のいずれを用いて行ってもよい。例えば、抗体または抗体断片を放射標識することにより、放射性免疫検定（RIA）を使用することでR-PRPaseを検出することが可能である。RIAの優れた記載は、本明細書中に完全に援用される、Workら、North Holland Publishing Company, ニューヨーク（1978）によるLaboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology、と共にChardによる"An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"と題された章の特定の参考文献に見られるかもしれない。放射性同位体はガンマカウンター、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーを使用するなどの手段により検出することが可能である。
【０１３１】
抗パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド抗体を、蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識された抗体が、適切な波長の光に曝露されると、その後、その存在が蛍光のため検出可能になる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、例えばMolecular Probe, Inc.（米国オレゴン州ユージーン）より商業的に入手可能な、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、o-フタルデヒドおよびフルオレサミンがある。
【０１３２】
抗体はまた、152EU、またはその他のランタニド群のような蛍光放出金属を用いて検出可能であるように標識してもよい。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（EDTA）のような金属基を用いて抗体に結合させることが可能である。
【０１３３】
抗体はまた、化学発光化合物と抗体を共役させることにより、検出可能であるように標識してもよい。化学発光標識抗体の存在は、その後、一連の化学反応の間に生じる発光の存在を検出することにより測定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。
【０１３４】
同様に、本発明の抗体を標識するのに生物発光化合物を使用してもよい。生物発光は、生物系に見られ、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより測定される。標識目的に関して重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１３５】
本発明中で有用な抗体（またはその断片）は、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡でのように、組織学的に使用し、本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体のin situ検出を行ってもよい。In situ検出は、組織学的標本を患者から除き、そして本発明の標識抗体をこうした標本に提供することにより、行ってもよい。抗体（またはその断片）は、好ましくは生物学的試料に標識抗体（またはその断片）を接触させるまたは上層することにより提供される。こうした方法を使用することにより、パーレカンドメインI変異体ポリペプチドの存在だけでなく、調べた組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明の使用に関し、一般的な当業者は、in situ検出などを達成するため広範囲の組織学的方法（染色方法など）を修飾してもよいことを、容易に認識するであろう。
【０１３６】
本発明のまたさらなる側面のとおり、パーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドまたはその断片のそれぞれに対する抗体が提供される。これら抗体は、本明細書に記載されるように、多くの重要な診断および／または治療への適用に使用してもよい。本発明の1つの側面において、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体（実施例9に記載される「パーレカンエクソン5欠失」抗体および実施例11に記載される「パーレカンドメインI挿入」抗体など）を、ウェスタンブロット解析に使用して（当業者に知られる標準的なウェスタンブロット解析技術を用いる）、ヒト組織および他種の組織中のパーレカンドメインIスプライシング変異体の存在を検出してもよい。ウェスタンブロット解析はまた、それぞれの全長パーレカンドメインIスプライシング変異体の見かけの大きさを測定するのに使用してもよい。さらに、ウェスタンブロット後にスキャン濃度測定（当業者に知られる）を行うことにより、特定の疾患（アミロイド疾患など）の個人から得た組織試料または生検中のそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体のレベルを定量しそして、正常個人またはコントロールから得た組織試料または生検と比較してもよい。
【０１３７】
本発明のさらに別の側面において、パーレカンドメインIスプライシング変異体に対して作成されたポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を免疫沈降研究（当業者に知られる標準的免疫沈降技術を用いる）に利用して、組織、細胞および／または生物学的液体中のそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質を検出してもよい。パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を免疫沈降研究に用いて、定量的に、組織、細胞および／または生物学的液体中の特定のスプライシング変異体の比較レベルを測定してもよい。定量的免疫沈降を利用して、特定の疾患（アミロイド疾患など）の個人から得た組織試料または生検中のそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体のレベルを、正常個人またはコントロールから得た組織試料または生検と比較してもよい。
【０１３８】
ポリペプチド、その断片または他の誘導体、またはその類似体、またはそれらを発現する細胞を免疫原として使用して、それらに対する抗体を産生してもよい。これらの抗体は、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体でもよい。本発明はまた、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体と共にFab断片、またはFab発現ライブラリーの産物も含む。当業に知られるさまざまな方法を、こうした抗体および断片の産生に使用してもよい。
【０１３９】
診断への適用
プライマーおよびまたは核酸の使用
本発明は、1つの側面において、試料中のパーレカンドメインI変異体遺伝子発現の解析を含む、アミロイドーシスの診断法を提供する。特定の態様において、本発明は、パーレカン遺伝子およびその一部の産物に関し試料を検定する方法を提供する。この方法は、試料中のメッセンジャーRNA（mRNA）からcDNAを作成し、パーレカン遺伝子またはその一部に対応する相補的DNA（cDNA）の一部を増幅し、そして増幅されたcDNAを検出することを含み、増幅されたcDNAがアミロイドーシスの診断および予後に使用されることが特徴である。アミロイド疾患には、限定されるわけではないが、アルツハイマー病およびダウン症候群に関連するアミロイド（特異的アミロイドはベータ−アミロイドタンパク質またはAβと称される）、慢性炎症、さまざまな形態の悪性疾患および家族性地中海熱に関連するアミロイド（特異的アミロイドはAAアミロイドまたは炎症関連関連アミロイドーシスと称される）、多発性骨髄腫およびその他のB細胞疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはALアミロイドと称される）、II型糖尿病に関連するアミロイド（特異的アミロイドはアミリンまたは小島アミロイドと称される）、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−ストラウスラー症候群、クールーおよび動物スクレイピーを含むプリオン疾患に関連するアミロイド（特異的アミロイドはPrPアミロイドと称される）、長期血液透析および手根管症候群に関連するアミロイド（特異的アミロイドはベータ2−ミクログロブリンアミロイドと称される）、老化心臓アミロイドおよび家族性アミロイド性多発神経障害に関連するアミロイド（特異的アミロイドはトランスチレチンまたはプレアルブミンと称される）、および甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍に関連するアミロイド（特異的アミロイドはプロカルシトニン変異体と称される）が含まれる。検定を行う試料は、好ましくは体内組織または体内液体である。試料は生検により得られた組織断片、または細針吸引された細胞でもよい。また別に、血液または尿または他の体内液体試料、例えば子宮切屑、または非侵入的に得られた試料、例えば痰、尿または便でもよい。
【０１４０】
表2に記載されるプライマーは、組織、細胞、および／または生物学的液体中の細胞由来のmRNA中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を特異的に検出するのに利用してもよい。1つの好ましい態様において、表2中およびSEQ ID NO: 5に記載されるRhPEREx4/6と称されるプライマーは、パーレカンドメインIのエクソン4-6結合部の範囲に渡るプライマー（図4A）であり、そしてプライマーF2hPerDI（表2）（SEQ ID NO: 5）と共に使用して、当業者に知られる標準的RT-PCR方法論を用いてヒト組織中のパーレカンドメインI変異体エクソン5を検出してもよい。別の好ましい態様において、表2中およびSEQ ID NO: 8に記載されるFhEx3/6.5と称されるプライマーは、パーレカンドメインIのエクソン3-6.5結合部の範囲に渡るプライマー（図5A）であり、そしてプライマーRPerDI（表2）（SEQ ID NO: 8）と共に使用して、当業者に知られる標準的RT-PCR方法論を用いてヒト組織中のパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5を検出してもよい。さらに別の好ましい態様において、表2中およびSEQ ID NO: 11に記載されるFhEx178と称されるプライマーは、パーレカンドメインIのエクソン4a-4（エクソン4aは本発明中で同定される付加的エクソンである）の範囲に渡るプライマー（図7A）であり、そしてプライマーRPerDI（表2）（SEQ ID NO: 11）と共に使用して、当業者に知られる標準的RT-PCR方法論を用いてヒト組織中のパーレカンドメインI変異体エクソン4aを検出してもよい。さらに別の好ましい態様において、表2中およびSEQ ID NO: 14に記載されるFhEx181と称されるプライマーは、パーレカンドメインIのエクソン3a-4（エクソン3aは本発明中で同定される付加的エクソンである）の範囲に渡るプライマー（図8A）であり、そしてプライマーRPerDI（表2；SEQ ID NO: 11）と共に使用して、当業者に知られる標準的RT-PCR方法論を用いてヒト組織中のパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出してもよい。本発明に記載されるプライマーのこうした使用は、RNA中にそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出するためのプライマー対（上記）を含むキット中の使用でもよい。
【０１４１】
さらに、プライマーは、定量的競合RT-PCR（Mareshら, J. Neurochem. 67:1132-1144, 1996）に使用し、ヒト組織、細胞、白血球および／または生物学的液体中の細胞由来の総RNAにおける、これら特定のパーレカンドメインI変異体の量の相違を測定してもよい。これらパーレカンドメインIスプライシング変異体の量の変化は、アミロイド疾患の病理学的経過の一部として、組織中のアミロイドおよび同時発生するパーレカンドメインIスプライシング変異体集積を示す患者の診断および予後の一助となるであろう。好ましい態様において、特定のプライマー（上述）を定量的RT-PCRに利用し、アミロイド疾患患者の特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体レベルを測定し、年齢が一致したコントロールと比較する。アミロイドーシスの一型において、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体が組織、細胞および／または生物学的液体中の細胞で、有意に上昇または減少していることが測定されれば、特定のアミロイド疾患に苦しむ既定の患者の診断および予後のモニターの一助となるであろう。特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体レベルの上昇または減少は、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体の沈着、集積および／または持続の指標となり、既定の患者中のアミロイドの沈着、集積および／または持続に相関するであろう。一定の間隔（すなわち、6か月おき）で患者から得られる生検または生物学的液体試料中で、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体が次第に上昇していれば、このパーレカンドメインIスプライシング変異体がアミロイドと共に連続して沈着および集積していることが示唆され、疾患が悪化していることを暗示する可能性がある。上述の診断検定は、キットの形で産生してもよい。
【０１４２】
本発明はまた、パーレカンドメインIスプライシング変異体遺伝子の診断法としての使用にも関連する。パーレカンドメインIスプライシング変異体の突然変異型を検出することにより、パーレカンドメインIスプライシング変異体の過剰発現または発現不足に起因する疾患または疾患感受性を診断することが可能になるであろう。ヒトパーレカンドメインIスプライシング変異体遺伝子に突然変異を持つ個人を、さまざまな技術により、DNAレベルで検出することが可能である。診断に用いる核酸は、患者細胞、血液、尿、唾液、組織生検、便および検死成分から得てもよい。ゲノムDNAを検出に直接用いてもよいし、解析前にPCRを用いることにより酵素で増幅してもよい。RNAまたはcDNAもまた、同じ目的に使用してもよい。1例として、パーレカンドメインIスプライシング変異体をコードする核酸に相補的なPCRプライマー（本明細書に記載；表2）を使用して、突然変異を同定しそして解析してもよい。例えば、欠失および挿入は、増幅産物が正常遺伝子型と比較して変化していることにより、検出することが可能である。点突然変異は、増幅DNAを放射標識したパーレカンドメインIスプライシング変異体RNA、また別に、放射標識したパーレカンドメインIスプライシング変異体アンチセンスDNA配列とハイブリダイズすることにより、同定してもよい。完全に一致した配列は、RNase H消化または融解温度差により、ミスマッチの二重鎖と区別することが可能である。
【０１４３】
参考遺伝子および突然変異を有する遺伝子との配列の相違は、直接DNA配列決定法を用いることにより、明らかにしてもよい。さらに、クローンされたDNA部分は、特定のDNA部分を検出するプローブとして使用してもよい。この方法の感度は、PCRと組み合わせることにより大幅に高められる。例えば、配列決定プライマーを二重鎖PCR産物または修飾PCRにより合成された一本鎖テンプレート分子と共に使用する。配列決定は、放射標識ヌクレオチドを使用する慣用的方法、または蛍光標識を使用する自動配列決定方法により、行われる。DNA配列相違に基づく遺伝的試験は、変性剤を含むまたは含まないゲル中でDNA断片の電気泳動移動度に変化があるか検出することにより行われる。小さな配列欠失および挿入は、高解像度ゲル電気泳動により視覚化してもよい。異なる配列のDNA断片は、異なるDNA断片の移動度がその特異的融解または部分融解温度により、異なる部位で遅れることにより、変性ホルムアミド勾配ゲル上で識別する（Myersら, Science 230:1242, 1985）ことも可能である。特定の部位での配列変化はまた、RNase、およびS1防御、または化学的切断法などのヌクレアーゼ防御検定により明らかにしてもよい（例えば、Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 85:4379-4401, 1985）。したがって、特定のDNA配列の検出は、ハイブリダイゼーション、RNase防御、化学的切断、直接DNA配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限断片長多型（RFLP））、およびゲノムDNAのサザンブロットなどの方法により、行うことが可能である。より慣用的なゲル電気泳動およびDNA配列決定に加え、突然変異をin situ解析により検出してもよい。
【０１４４】
本発明のさらに別の側面は、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を利用してオリゴヌクレオチドを作成し、当業者に知られる標準的in situハイブリダイゼーション技術により、ヒト組織中のパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出する、新規分子生物学的プローブとして利用することである。好ましい態様において、これには、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、および／またはSEQ ID NO: 12に記載される核酸配列の利用が含まれる。
【０１４５】
ペプチドおよび／または抗体の使用
本発明の別の側面は、ヒト組織および／または生物学的液体中のそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を特異的に検出するのに利用できる、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルペプチド抗体を提供することである。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン5（SEQ ID NO: 3）のペプチドの一部または断片、および／またはパーレカンドメインI変異体エクソン5中に含まれる特有の72アミノ酸ペプチド（図4CおよびSEQ ID NO: 4に示される）に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン5を検出しそして定量するのに用いることが可能である。好ましい態様において、SEQ ID NO: 15のアミノ酸配列に対して作成されたポリクローナル抗体（すなわち、本明細書中では「パーレカンエクソン5欠失」抗体と称される）は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン5を検出するのに用いることが可能であり、そして診断および治療双方への適用を有するであろう（本明細書に記載）。ポリクローナルおよび／またはモノクローナルペプチド抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン4-6.5を特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体エクソン4-6.5（SEQ ID NO: 6）のペプチドの一部またはアミノ酸配列領域断片、および／またはその一部に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5を検出しそして定量するのに用いることが可能である。ポリクローナルおよび／またはモノクローナルペプチド抗体はまた、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4aを特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン4a中に含まれる特有の11アミノ酸配列領域（図6CおよびSEQ ID NO: 10に示される）のペプチドの一部または断片に対して特異的に作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン4aを検出しそして定量するのに用いることが可能である。ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗ペプチド抗体はまた、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン3aを特異的に検出するのに用いることも可能である。好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン3a中に含まれる新規26アミノ酸ペプチド（図7CおよびSEQ ID NO: 13に示される）に対して作成された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体は、ヒト組織および／または生物学的液体中のパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出しそして定量するのに用いることが可能である。別の好ましい態様において、パーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aを検出することが可能な、SEQ ID NO: 16のアミノ酸配列に対して作成されたポリクローナル抗体を、組織および／または生物学的液体中のこれらパー���カンドメインI「挿入」変異体の検出に利用する。
【０１４６】
ヒト組織、細胞、および／または細胞培養中の上述のパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出するため、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体を、当業者に知られる標準的免疫組織化学および免疫細胞化学技術に用いて利用してもよい。
【０１４７】
脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、痰、および／または便を含む生物学的液体におけるパーレカンドメインIスプライシング変異体を検出し、そして定量するため、当業者に知られるさまざまな型のELISA検定を利用してもよい。本発明の抗体分子は、「二部位」または「サンドイッチ」検定としても知られる免疫測定検定への利用に適合させてもよい。典型的な免疫測定検定では、未標識抗体（または抗体断片）の相当量を固体支持体またはキャリアーに結合させ、そして検出可能であるように標識した可溶性抗体量を加えて、固体支持体抗体、抗原、および標識抗体間で形成された三重複合体の検出および／または定量を可能にする。
【０１４８】
好ましい態様において、「サンドイッチ」型ELISAを使用してもよい。この好ましい方法を用い、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体モノクローナル抗体がマイクロタイターウェルに結合する量を測定する試験的研究を最初に行う。これを測定した後、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体の一部（通常40μlのTBS（pH 7.4）中）をマイクロタイターウェル（Maxisorb Cプレート、Nunc）に4℃で1晩結合させる。主なパーレカンドメインIスプライシング変異体に特異的なモノクローナル抗体のいずれをも含まない一連のブランクウェルもまた、コントロールとして利用する。翌日、マイクロタイターウェルから非結合モノクローナル抗体を振り落とす。すべてのマイクロタイターウェル（ブランクウェルを含む）をその後、2%ウシ血清アルブミンを加えた0.05% Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水（TTBS）300μlで2時間インキュベーションしてブロッキングし、その後TTBSで5回リンスする。200μlの脳脊髄液、血液、血漿、血清、尿、痰および／または便および／または他の種類の生物学的試料いずれかをその後、2％ウシ血清アルブミンを含むTTBSで希釈（経験的に決定される）して、そして結合したパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を含むウェル（またはブランク）に置き（三重測定）、そして室温で2時間インキュベーションする。ウェルをその後、TTBSで5回洗浄する。同一のパーレカンドメインIスプライシング変異体に対する（が、異なるエピトープに対する）第二のビオチン化モノクローナル抗体をその後、それぞれのウェルに加え（通常40μlのTBS（pH 7.4）中）、そして第一の抗体に捕捉されたすべてのパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質と、室温で2時間結合させる。インキュベーション後、ウェルをTTBSで5回洗浄する。結合した成分をその後、100μlのペルオキシダーゼ−アビジン複合体（0.1％BSAを含むTTBS中で1：250希釈）と、回転震蕩機上で1時間インキュベーションして検出する。TTBSで5回洗浄した後、基質溶液（100μl、OPD-Sigma Fast、Sigma Chemical Co.米国ミズーリ州セントルイス）を加え、そして顕著な色を出現させる（通常8-10分）。反応を50μlの4Nスルフィン酸により停止し、そして標準的分光光度計を用い490 nmで読み取る。このELISAは、生物学的液体中の特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体の差を測定するのに利用し、疾患進行中の生存患者の進行を追う（すなわち、一例としてアミロイド疾患のモニター）ための診断マーカーとして用いてもよい。さらに、パーレカンドメインIスプライシング変異体量の変化はまた、生存患者が既定のアミロイド疾患を標的とする治療にどのように反応するかをモニターする予後指標として用いてもよい。こうした検定はキットの形で提供してもよい。
【０１４９】
競合検定もまた、使用することが可能である。ここで、パーレカンドメインIスプライシング変異体に特異的な抗体を固体支持体に結合させ、そして標識されたパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質および宿主由来の試料を固体支持体上に通過させ、そして固体支持体に結合していることが検出された標識の量を試料中のパーレカンドメインIスプライシング変異体の量と相関させてもよい。この標準的技術は、当業者に知られている。
【０１５０】
本発明の別の目的は、パーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドまたはその断片をパーレカンドメインI変異体特異的抗体と共同で、ELISA検定に使用し、ヒト生物学的液体中の潜在的なパーレカンドメインIスプライシング変異体自己抗体を検出することである。こうした診断検定は、キットの形で産生してもよい。好ましい態様において、図4C（SEQ ID NO: 4）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図11（SEQ ID NO: 16）に示されたパーレカンドメインIスプライシング変異体の新規配列を含む、または図5C（SEQ ID NO: 7）に示された新規エクソン3からエクソン6.5結合部に渡るアミノ酸配列を含むペプチドが、ELISAプレート中のマイクロタイターウェルへの最初の結合に使用されるであろう。まず、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドがマイクロタイターウェルに結合する量を測定する試験的研究を行う。これを測定した後、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチド（本明細書に記載される）の一部（通常40μlのTBS（pH 7.4）中に1-2μg）をマイクロタイターウェル（Maxisorb Cプレート、Nunc）に4℃で1晩結合させる。すべてのマイクロタイターウェル（パーレカンドメインIスプライシング変異体を含まないブランクウェルを含む）をその後、2%ウシ血清アルブミンを加えた0.05% Tween-20を含むTris緩衝生理食塩水（TTBS）（pH 7.4）300μlで2時間インキュベーションしてブロッキングし、その後TTBSで5回リンスする。その後、患者生物学的液体（すなわち、脳脊髄液、血液、血漿、血清、痰、尿および／または便）を利用して、そして200μlを、2％ウシ血清アルブミンを含むTTBSで希釈（経験的に決定される）して、そして特定のパーレカンドメインI変異体ペプチドを含むマイクロタイターウェル（三重測定）またはブランククウェル（ペプチドを含まない）に置き、そして室温で1.5時間インキュベーションする。特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体に対する生物学的液体中に存在する自己抗体はすべて、基質結合パーレカンドメインI変異体ペプチド（またはその断片）に結合するであろう。ウェルをその後、TTBSで5回洗浄する。0.1％BSAを含むTTBSで1:500希釈された100μlのビオチン化ポリクローナルヤギ抗ヒトIgG（Sigma Chemical社, 米国ミズーリ州セントルイス）をその後、各ウェルに分注する。結合した成分を、100μlのペルオキシダーゼ−アビジン複合体（0.1％BSAを含むTTBS中で1：250希釈）と、回転震蕩機上で1時間インキュベーションして検出する。TTBSで5回洗浄した後、基質溶液（100μl、OPD-Sigma Fast、Sigma Chemical社, 米国ミズーリ州セントルイス）を加え、そして顕著な色を出現させる（通常8-10分）。反応を50μlの4Nスルフィン酸を各ウェルに加えることにより停止し、そして標準的分光光度計を用い490 nmで読み取る。この検定系は、生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体に対する自己抗体の存在を検出するだけでなく、パーレカンドメインIスプライシング変異体自己抗体レベルの上昇または減少を追うことにより、疾患の進行をモニターするのに用いてもよい。アミロイド疾患において観察されるように、過剰パーレカンドメインIスプライシング変異体形成、沈着、集積および／または持続を示す患者はまた、その生物学的液体中に1つまたは多く��パーレカンスプライシング変異体に対する自己抗体も有するであろう。当業者に知られるさまざまなELISA検定系を、生物学的液体中のパーレカンドメインIスプライシング変異体の程度を正確にモニターするのに用い、疾患進行中の患者の潜在的診断指標および予後マーカーとしてもよい（すなわち、例えばアミロイド疾患のモニター）。こうした検定はキットの形で提供してもよい。さらに、パーレカンドメインIスプライシング変異体自己抗体レベルの量変化もまた、生存患者が既定のアミロイド疾患を標的とする治療にどのように反応するかモニターする予後指標として用いてもよい。
【０１５１】
本発明を利用するその他の診断法には、さまざまな組織で、正常コントロール組織試料と比較して、変化したそれぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体レベルを測定するための診断検定が含まれる。宿主由来の試料中のパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質レベルを検出するのに使用する検定は、当業者に周知であり、そして放射性免疫検定、競合的結合検定、ウェスタンブロット解析および好ましくはELISA検定（上述）が含まれる。
【０１５２】
本発明のさらに別の側面は、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を認識する抗体を、例えば放射ヌクレオチドで標識し、放射性映像または放射性誘導手術、in vivo診断、および／またはin vitro診断に使用することである。1つの好ましい態様において、放射標識核酸またはパーレカンドメインIスプライシング変異体に対して（当業者により）作成された抗体を、最小侵入技術として用い、生存患者中のパーレカンドメインIスプライシング変異体および同時発生するアミロイド沈着の位置決定を行ってもよい。これらと同じ映像技術をその後、定期的間隔（すなわち、6か月おき）に使用して、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体のレベルを追うことにより、アミロイド疾患の進行をモニターしてもよい。
【０１５３】
本発明のさらに別の側面は、化合物が、既定のアミロイドタンパク質（本明細書に記載される）またはアミロイド前駆体タンパク質の、パーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGへの親和性を改変（減少または除去）する能力を評価することが可能である方法を提供することである。アミロイドタンパク質またはアミロイド前駆体タンパク質の、こうしたパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGまたはそれらの断片への結合に影響する化合物を同定する方法を提供することにより、本発明はまた、こうした結合相互作用を防ぐまたは損なうことができる化合物を同定する上でも有用である。したがって、本明細書に記載されるアルツハイマー病および他のアミロイド疾患に関与するアミロイド形成、アミロイド沈着および／またはアミロイド持続状態と関連する事象に特異的に影響する化合物を、同定することが可能である。
【０１５４】
本発明の1つの側面に従い、アミロイドタンパク質または前駆体タンパク質の、パーレカンドメインIスプライシング変異体への相互作用を阻害する化合物を同定するために、アミロイドまたはパーレカンドメインIスプライシング変異体を固定し、そして2つのうちもう1つが遊離物として維持される。試験化合物の存在下で、遊離物が固定物と結合するのに十分な時間、遊離物を固定物と接触させ、その後、未結合の遊離物を除去する。遊離物を認識する抗体または他の手段を使用することにより、結合構成要素の存在を検出し、固定物に結合する遊離物の量を測定することが可能である。一連の既知の濃度の試験化合物の存在下、および、コントロールとして試験化合物がまったく存在しない条件で、この検定を行い、試験化合物が遊離物の固定物への結合を妨げる効果を測定してもよく、そして試験化合物の遊離物の固定物への親和性に対する効果の定量測定を行ってもよい。試験化合物存在下でのアミロイド−パーレカンドメインIスプライシング変異体複合体の結合親和性を、試験化合物が存在しない条件でのアミロイド−パーレカンドメインIスプライシング変異体複合体の結合親和性と比較することにより、試験化合物が結合を調節する能力を測定することも可能である。
【０１５５】
アミロイドが固定された場合、一連の濃度の試験化合物の存在下で、遊離パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、パーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAG、またはその断片と接触させる。コントロールとして、固定アミロイドを、試験化合物が存在しない条件で、遊離パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、パーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAG、またはその断片と接触させる。一連の濃度のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、パーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAG、またはその断片を用いることにより、解離定数（Kd）またはアミロイド−パーレカンドメインIスプライシング変異体結合の結合親和性の他の指標を測定することが可能である。当該検定において、パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、パーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAG、またはその断片を固定アミロイドと、結合に十分な時間接触させた後、非結合パーレカンドメインIスプライシング変異体を除去する。続いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体−アミロイド結合を観察してもよい。1つの方法は、本発明中に記載されるように、パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を使用し、アミロイドに特異的に結合したパーレカンドメインIスプライシング変異体量または溶液中に残存する遊離パーレカンドメインIスプライシング変異体量を検出する。この情報は、まず定性的に、試験化合物がパーレカンドメインIスプライシング変異体およびアミロイド間の結合を防ぐまたは減少させることが可能であったかどうかを決定するのに使用する。次に、一連の試験化合物をさまざまな濃度で使用して行った検定から得たデータを使用して、パーレカンドメインIスプライシング変異体−アミロイド複合体の結合親和性を定量的に測定し、そしてそれにより、試験化合物がパーレカンドメインIスプライシング変異体およびアミロイド間の親和性に及ぼす効果を決定してもよい。この情報を使用して、パーレカンドメインIスプライシング変異体のアミロイドへの結合を調節する化合物を同定し、そしてそれによりアミロイド形成、沈着、集積および／または持続、および続くアミロイドーシスの発展および持続を防ぐまたは減少させることも可能である。
【０１５６】
好ましい態様において、上述のようなスクリーニング検定は、本明細書に記載されるパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質、ポリペプチド、またはそれらの断片、またはパーレカンドメインIスプライシング変異体GAG鎖と共に使用してもよい。後者は、当業に知られる方法を用いて組織から単離してもよい。パーレカンドメインIスプライシング変異体GAG単離の例として、本明細書に記載された特異的パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を利用して、そしてアフィニティーカラムクロマトグラフィーおよび免疫沈降方法論などの、当業に知られる方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体をまず、脳などの組織から単離する。パーレカンドメインIスプライシング変異体からのパーレカンドメインIスプライシング変異体GAG鎖の単離は、本明細書に完全に援用される、CastilloおよびTempleton（Biochem. Biophys. Acta 1136:119-128, 1992）が以前記載したアルカリホウ化水素処置を使用することにより行ってもよい。
【０１５７】
したがって、パーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質、またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGの、固定アミロイドタンパク質への結合を改変させるのに有用な化合物を同定する方法を実行するキットであって、前記キットが、a)内部表面上に固定されたアミロイドタンパク質を有する第一の容器、b)溶液中に溶解したパーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGを含む第二の容器、c)前記パーレカンドメインIスプライシング変異体タンパク質またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGに特異的な抗体を含む第三の容器、前記抗体は溶液中に溶解している、およびd)パーレカンドメインIスプライシング変異体またはパーレカンドメインIスプライシング変異体由来GAGに特異的な抗体に特異的な標識抗体を含む第四の容器、前記標識抗体は溶液中に溶解している、を含む。
【０１５８】
治療への適用
プライマーおよび／または核酸の使用
本発明の別の側面は、アンチセンス技術を使用した潜在的治療法を提供するこどである。アンチセンス技術は、遺伝子発現を三重らせん形成またはアンチセンスDNAまたはRNAにより調節するのに使用してもよい。どちらの方法もポリヌクレオチドのDNAまたはRNAへの結合に基づいている。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列の5'コード部分を使用して、およそ10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドを設計する。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域（Leeら, Nucleic Acids Res. 6:3073, 1979; Cooneyら, Science 241:456, 1988; Dervanら, Science 251:1360, 1991）に相補的であるよう設計され、それにより、パーレカンドメインIスプライシング変異体の転写および産生を妨げる。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはin vivoでmRNAとハイブリダイズし、そしてmRNA分子のパーレカンドメインIスプライシング変異体への翻訳を遮断する（Okano, J. Neurochem. 56:560, 1991）。上述のオリゴヌクレオチドはまた、当該アンチセンスRNAまたはDNAがin vivoで発現され、パーレカンドメインIスプライシング変異体の産生を阻害するように、細胞に届けてもよい。
【０１５９】
本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドおよびポリペプチドであるアンタゴニストもまた、本発明のとおり、しばしば「遺伝子治療」と称されるこうしたポリペプチドのin vivo発現により、使用してもよい。例えば、患者からの細胞をポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）によりex vivoで処理して、その後処理細胞を患者に提供し、ポリペプチドにより治療してもよい。こうした方法もまた、当業に周知である。例えば、細胞は、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含むレトロウイルス粒子を用いて、当業に知られる方法により、処理してもよい。
【０１６０】
ペプチドおよび／または抗体の使用
本発明のさらに別の態様は、図4C（SEQ ID NO: 4）、図6C（SEQ ID NO: 10）、図7C（SEQ ID NO: 13）、図9（SEQ ID NO: 15）、および図10（SEQ ID NO: 16）に示されたパーレカンドメインIスプライシング変異体の新規配列に対して特異的なペプチドまたはその断片を使用することである。さらに、図5C（SEQ ID NO: 7）に示されたエクソン3からエクソン6.5の新規結合部に対して作成されたペプチドまたはその断片を使用してもよい。ペプチド配列または断片は、標準的技術を利用（すなわち、自動合成機を利用）して、合成してもよい。ペプチドは、多くの生物学的過程および疾患（上述のアミロイド疾患など）におけるパーレカンドメインIスプライシング変異体の相互作用に対する潜在的遮断治療薬として使用してもよい。好ましい態様において、1つまたはそれ以上のパーレカンドメインIスプライシング変異体中に含まれる新規配列に対して作成された特異的ペプチドは、既定の標的（すなわち、アミロイド沈着）とのこれら変異体の相互作用を遮断するのに用いてもよい。これらペプチドによる阻害は、既定の患者において観察される連続アミロイド形成、沈着、集積および／または持続を緩和する可能性がある。同様に、別の好ましい態様において、それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体（上述）に対して作成された抗体は、既定の患者における連続アミロイド形成、沈着、集積および／または持続を崩壊させる潜在的遮断抗体として、ヒト患者に投与してもよい。
【０１６１】
パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの非経口投与のための調製には、当業に知られる補助剤（auxiliary agents）または賦形剤を含んでもよい、無菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。錠剤、丸薬、錠剤、カプレット、軟および硬質ゼラチンカプセル、ドロップ（lozenge）、サシェー剤（sachet）、カシェー剤（cachet）、ベジキャップ（vegicap）、液体ドロップ、エリキシル剤（elixir）、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ、ティーバッグ、エアロゾル（固体または液体媒体中）、座薬、無菌注射可能溶液、無菌包装粉末などの薬剤組成物を、ルーチンの方法により調製してもよく、そして薬剤組成物は当業に知られる。
【０１６２】
本発明のさらに別の側面において、パーレカンドメインI変異体抗体は、パーレカンドメインIスプライシング変異体、およびしたがってアミロイド疾患において観察されるような、アミロイド形成、沈着、集積および／または持続を遮断する効果的な療法として使用してもよい。例えば、本発明は、薬剤として有効な量のパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体および薬剤として認められるキャリアーを含む、アミロイドーシス治療に使用する薬剤組成物を含む。当該組成物は、修飾されない、潜在的な治療化合物と結合した、第二のタンパク質またはタンパク質部分と結合した、または組換え型の（すなわち、キメラまたは二重特異性パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体）パーレカンドメインIスプライシング変異体抗体を含んでもよい。組成物はさらに、他の抗体または結合体を含んでもよい。本発明の抗体組成物は、限定されるわけではないが、局所的、静脈内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ管内または筋内を含む、慣用的な投与法を用いて投与してもよい。静脈内投与が好ましい。本発明の組成物は、さまざまな投薬型であってもよく、投与法および治療適用に依存して好ましい型がある。個々の患者に対する、最適投薬および投与法は、慣用的プロトコルにより、容易に決定される可能性がある。
【０１６３】
本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、または抗体は、その意図した目的を達成するいかなる手段により投与してもよい。例えば、本明細書に記載されるパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドを薬剤組成物の形で使用し、アルツハイマー病および他のアミロイド疾患または他の関連する病変などのパーレカンドメインIスプライシング変異体関連病変を治療してもよい。
【０１６４】
例えば、こうした組成物の投与は、皮下、静脈内、皮内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経皮または頬経路などの、さまざまな非経口経路で投与してもよい。また別に、または同時に、投与を経口経路により行ってもよい。非経口投与は時間をかけて大丸薬または漸次灌流により行ってもよい。
【０１６５】
本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド、または抗体薬剤組成物を使用する好ましい様式は、経口投与または静脈内適用によるものである。
パーレカンドメインIスプライシング変異体関連病変を防ぎ、抑制しまたは治療する典型的な処方計画は、パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの有効量を、1または数日から最高1週間およびおよそ24か月の間の期間に渡り投与することを含むものなどである。
【０１６６】
In vivoまたはin vitroに投与する本発明のパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチド投薬は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、あるとすれば同時に受けている治療の種類、治療頻度、および望ましい効果の性質に依存するであろうと理解される。最も好ましい投薬は、当業者に理解され、そして決定可能であるように、不当な実験なしに、個々の患者に合わせて行われるであろう。
【０１６７】
それぞれの治療に必要な総用量は、複数投与により、または単回投与により投与してもよい。パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドは、単独で、または本明細書に記載されるように、アルツハイマー病またはアミロイド疾患などの、パーレカンドメインIスプライシング変異体関連病変に向けられた他の治療薬と併せて使用してもよい。
【０１６８】
パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドまたはパーレカンドメインIスプライシング変異体抗体も含んでもよい組成物の効果量は、約0.01μgから約100 mg/kg体重であり、そして好ましくは約10μgから約50 mg/kg体重であり、0.05、0.07、0.09、0.1、0.5、0.7、0.9、1、2、5、10、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95または100 mg/kg体重などである。
【０１６９】
非経口投与のための調製には、当業に知られる補助剤または賦形剤を含んでもよい無菌水性または非水性溶液、懸濁液および乳剤が含まれる。本発明の1-10または1、2、3、4、5、6、7、8、9または10パーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドなどの、少なくとも1つのパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドを含む薬剤組成物は、すべての組成物を含んでもよく、ここでパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドの意図する目的を達成する効果量が含まれている。少なくとも1つのパーレカンドメインIスプライシング変異体ポリペプチドに加え、薬剤組成物は、薬剤に使用可能な、活性組成物を調製する過程を容易にする賦形剤、キャリアーおよび／または補助剤などの薬剤に認められる適切なキャリアーを含んでもよい。
【０１７０】
少なくとも1つのパーレカンスプライシング変異体ポリペプチドまたは抗体を含む薬剤組成物はまた、静脈内、皮下、皮膚、経口、粘膜、直腸に、また、注射または経口により投与するのに適した溶液を含んでもよく、そして約0.01から99％、好ましくは約20から75％の活性組成物（すなわち、ポリペプチドまたは抗体）を賦形剤と共に含んでもよい。経口投与のための薬剤組成物には、丸薬、錠剤、カプレット、軟および硬質ゼラチンカプセル、ドロップ、サシェー剤、カシェー剤、ベジキャップ、液体ドロップ、エリキシル剤、懸濁液、乳液、溶液、およびシロップが含まれる。
【０１７１】
パーレカンドメインIスプライシング変異体の新規動物モデル産生への使用
アルツハイマー病およびダウン症候群アミロイドーシスに対する注入モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。この適用目的のため、パーレカンドメインIスプライシング変異体は、a)コアタンパク質および結合するGAG鎖両方を含むパーレカン変異体、b)パーレカンコアタンパク質のみ、またはc)パーレカンスプライシング変異体由来のパーレカンGAG鎖、または上記のすべての断片またはすべての組み合わせを指す可能性がある。例えば、新規アルツハイマー病アミロイドーシスモデルとして、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ベータ−アミロイドタンパク質（Aβ）と共に連続的に複数群のラットまたはマウスの海馬に注入してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体（25μg）を50μgのAβ（1-40）または（1-42）を含む微量遠心管中で水に溶解する。本明細書に援用される、Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβを連続的に1週間、複数群（通常10）の3か月齢SD（Sprague-Dawley）ラットの海馬に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。1週間注入した後、動物を屠殺し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されたように脳を除き、そしてパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、全注入部位に渡るように6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性Aβアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、原繊維性Aβアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβ＋治療化合物は、一群の動物の海馬に直接注入（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβのみを注入された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンS蛍光により測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７２】
別の好ましい態様において、潜在的治療化合物は、延長された期間に渡り、アミロイド持続を減少か試験してもよい。本モデルにおいて、複数群の動物（通常1群10匹）にパーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβ＋治療化合物を注入し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβを注入した複数群の動物（通常1群10匹）と直接比較する。1週間（上述のように）注入した後、動物を麻酔してカニューレを取り除き、動物を回復させ、1、3、6または12か月後に屠殺する。連続切片を切り、そして上述のようにアミロイドをスコアリングする。持続するアミロイド沈着は、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβを注入された動物で観察されると予測される。潜在的治療化合物は、当該治療化合物を投与されなかった動物と比較して、アミロイド量の効果的な減少が観察されるものであろう。これら化合物はしたがって、in vivoで効果的にアミロイド沈着を減少させるまたは除去する化合物と呼んでもよい。さらに別の好ましい態様において、潜在的治療化合物は、あらかじめ形成されたアミロイド沈着を減少させるまたは除去するか試験してもよい。本モデルにおいて、2群（通常1群10匹）の動物にパーレカンドメインIスプライシング変異体＋Aβを注入する。一週間（上述のように）注入した後、カニューレおよび浸透ポンプを交換し（動物を麻酔下におき）、そしてビニル管で新しい浸透ポンプに連結した新しいカニューレは、賦形剤のみ（すなわち再蒸留水）または潜在的治療化合物を含む。賦形剤または関心事の潜在的治療化合物を1週間連続注入した後、動物を屠殺する。全注入部位に渡る連続切片を切り、そして上述のように恣意的盲検スコアリングによりアミロイド量を測定する。潜在的治療化合物は、あらかじめ形成されたアミロイド沈着を効果的に除去することができるものであろう。賦形剤のみを注入された動物群では、アミロイド量の減少はほとんどまたはまったく観察されないことが予期される。これら化合物は、したがって、in vivoであらかじめ形成されたアミロイド沈着を効果的に減少させる化合物と呼んでもよい。
【０１７３】
AAアミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、AAアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、AAアミロイドタンパク質と共に、ラットまたはマウスの全身器官（すなわち、腎臓、肝臓、脾臓、肺または心臓）に連続的に注入、または尾静脈に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をAAアミロイドタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋AAアミロイドを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの、選択した全身器官に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。また別に、AAアミロイドタンパク質+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のマウスまたはラットの尾静脈内に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして全身器官を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化した。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性AAアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、AAアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋AAアミロイド＋治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋AAのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７４】
ALアミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、ALアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ALアミロイドタンパク質と共に、ラットまたはマウスの全身器官（すなわち、腎臓、肝臓、脾臓、肺または心臓）に連続的に注入、または尾静脈に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をALアミロイドタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋ALアミロイドを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの、選択された全身器官に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。また別に、ALアミロイドタンパク質+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のラットまたはマウスの尾静脈内に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして全身器官を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性ALアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、ALアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋ALアミロイド＋治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋ALアミロイドのみを注入された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７５】
トランスチレチン／プレアルブミンアミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、トランスチレチン／プレアルブミンアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、さまざまな正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミンタンパク質と共に、ラットまたはマウスの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体を正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミンタンパク質を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミンアミロイドを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。また別に、正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミン+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のマウスまたはラットの坐骨神経、脊髄神経節または自律神経節に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして関係する組織を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoの原繊維性トランスチレチン／プレアルブミンアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、トランスチレチン／プレアルブミンアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミン＋治療化合物を、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋正常または突然変異トランスチレチン／プレアルブミンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７６】
ベータ2−ミクログロブリンアミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、ベータ2−ミクログロブリンアミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ベータ2−ミクログロブリンと共に、ラットまたはマウスの血流（例えば、外頚静脈から上大静脈を通して）に連続的に注入、または腱または後肢（内側神経に隣接）に毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をベータ2−ミクログロブリンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋ベータ2−ミクログロブリンを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの血流に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。また別に、ベータ2−ミクログロブリン+/-パーレカンドメインIスプライシング変異体を一群のラットまたはマウスの腱または後肢に毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして関係する組織を除き、そして関心事の組織を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。動物あたりのそれぞれの組織中のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoのベータ2−ミクログロブリンアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、ベータ2−ミクログロブリンアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋ベータ2−ミクログロブリン＋治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋ベータ2−ミクログロブリンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７７】
アミリン（小島アミロイド）アミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、アミリン（小島アミロイド）アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、ヒトアミリンと共に、ラットまたはマウスのすい臓または血流に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をアミリンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋アミリンを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスのすい臓または血流に注入（当業者に知られる定位固定手術による）または毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そしてすい臓を除き、そしてすい臓を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのすい臓のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoのアミリン（小島アミロイド）アミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、アミリン（小島アミロイド）形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋アミリン＋治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋アミリンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７８】
内分泌型アミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、II型（インシュリン非依存性）糖尿病患者のすい臓ランゲルハンス島だけでなく、甲状腺髄様癌などの内分泌腫瘍にカルシトニン変異体が見られる場合などの、内分泌アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、カルシトニンと共に、ラットまたはマウスの甲状腺またはすい臓に連続的に注入または毎日注射してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をカルシトニンを含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋カルシトニンを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの甲状腺またはすい臓に注入（当業者に知られる定位固定手術による）または毎日注射する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そして甲状腺またはすい臓を除き、そして甲状腺またはすい臓を含むパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりの甲状腺またはすい臓のアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoの内分泌アミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、内分泌アミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋カルシトニン＋治療化合物は、一群の動物に直接注入または注射（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋カルシトニンのみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１７９】
PrPアミロイドーシスの新規動物モデル
それぞれのパーレカンドメインIスプライシング変異体を十分量産生し、プリオンタンパク質（PrP）アミロイドーシスの新規動物モデルの産生に利用することも可能である。例えば、パーレカンドメインIスプライシング変異体を、PrPタンパク質と共に、複数群のラットまたはマウスの海馬に連続的に注入してもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体をPrP27-30を含む微量遠心管中で水に溶解する。Snowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載された方法を用いて、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋PrPを連続的に1週間、複数群（通常10）の成獣ラットまたはマウスの海馬に注入（当業者に知られる定位固定手術による）する。1週間の実験期間の後、動物を屠殺し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように脳を除き、そしてパラフィン包埋ブロックまたは凍結切片から、全注入部位に渡る6-8μmの連続切片を切り取る。その後、動物あたりのアミロイド沈着量をコンゴ−レッド染色（偏光下で視覚化）またはチオフラビンS蛍光により検出し、そしてSnowら（Neuron 12:219-234, 1994）に記載されるように、恣意的スコアリング法を用いた盲検により定量化する。本モデル中でパーレカンドメインIスプライシング変異体ペプチドおよび／またはタンパク質を使用することにより、in vivoのPrPアミロイド沈着、集積および持続の迅速モデルとして使用することが可能である。さらに、本モデルは、PrPアミロイド形成、沈着、集積および／または持続を標的とする潜在的治療薬を迅速にスクリーニングするのに用いてもよい。好ましい態様において、パーレカンドメインIスプライシング変異体＋PrP27-30＋治療化合物を、一群の動物に直接海馬に注入（上述のように）し、そしてパーレカンドメインIスプライシング変異体＋PrP27-30のみを注入または注射された一群の動物との比較を行う。In vivoでアミロイド形成、沈着、集積および／または持続（コンゴ−レッドまたはチオフラビンSスコアリングにより測定）を減少させることがわかった化合物または薬剤はその後、潜在的治療的価値を有すると同定される。
【０１８０】
パーレカンドメインIスプライシング変異体トランスジェニック動物
トランスジェニック動物、特にFukuchi, A. SnowおよびJ. Hassellにより1997年6月に提出され、そして本明細書中に完全に説明されるかのように援用される米国特許出願第08/870,987号に見られるトランスジェニックマウスを作成する手段および方法の開示に従い、本発明の別の側面は、多くの疾患および／または病変過程に関連する特定の表現型を産生する努力の中で、特定のパーレカンドメインIスプライシング変異体を過剰発現するまたはノックアウトされた新規トランスジェニック動物を産生することである。これら新規パーレカンドメインIスプライシング変異体トランスジェニック動物の産生のため、一般的に、プラスミドクローン（本明細書に記載）由来のスプライシング変異体cDNA配列を、正常ヒトパーレカンcDNA（上述の援用される参考文献に記載されるように、正しいプロモーターおよびエンハンサー領域を持つ発現ベクター中のものが入手可能）の正しい領域に連結させることが関与するであろう。パーレカンスプライシング変異体発現ベクターはその後、マウス卵または胚性幹細胞に挿入され、そして上述の援用される参考文献に記載されるような既知の、ルーチンの方法により、トランスジェニックマウスが産生されるであろう。これらトランスジェニックマウスを産生し、そしてこれらマウスを既定のアミロイドタンパク質またはその前駆体タンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物と交配させることにより、既定のアミロイド疾患の表現型病変の多くまたはすべてを発現する子孫が産生されるであろう。アミロイド疾患の新規トランスジェニック動物モデルを産生し、アミロイドーシスの、およびこれら疾患に関連する臨床表現（上述の援用される参考文献に記載される）治療の、リード治療薬を同定する一助となるin vivoスクリーニングの道具として使用してもよい。パーレカンドメインIスプライシング変異体をうまく過剰発現したトランスフェクションされた細胞もまた、さまざまなin vitroおよびin vivo検定のためにパーレカンドメインIスプライシング変異体を使用したいという増大しつつある要求に答えるであろう、これらパーレカンドメインIスプライシング変異体を単離する新規手段として用いてもよい。
【０１８１】
配列表
(2) 配列情報 SEQ ID NO:1:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 573 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類:cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:1:
ATGGGGTGGC GGGCGCCGGG CGCGCTGCTG CTGGCGCTGC TGCTGCACGG 130
GCGGCTGCTG GCGGTGACCC ATGGGCTGAG GGCATACGAT GGCTTGTCTC 180
TGCCTGAGGA CACAGAGACC GTCACAGCAA GCCAAATGCG CTGGACACAT 230
TCGTACCTTT CTGATGATGA GGACATGCTG GCTGACAGCA TCTCAGGAGA 280
CGACCTGGGC AGTGGGGACC TGGGCAGCGG GGACTTCCAG ATGGTTTATT 330
TCCGAGCCCT GGTGAATTTC ACTCGCTCCA TCGAGTACAG CCCTCAGCTG 380
GAGGATGCAG GCTCCAGAGA GTTTCGAGAG GTGTCCGAGG CTGTGGTAGA 430
CACGGGAGCT GGATGGCTGG GTTTTTGTGG AGCTCGATGT GGGCTCCGAA 480
GGGAATGCGG ATGGTGCTCA GATTCAGGAG ATGCTGCTCA GGGTCATCTC 530
CAGCGGCTCT GTGGCCTCCT ACGTCACCTC TCCCCAGGGA TTCCAGTTCC 580
GACGCCTGGG CACAGTGCCC CAGTTCCCAA GAGCCTGCAC GGAGGCCGAG 630
TTTGCCTGCC ACAGCTACAA TGA                              635
(2) 配列情報 SEQ ID NO:2:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 219 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:2:
....GGAGCT GGATGGCTGG GTTTTTGTGG AGCTCGATGT GGGCTCCGAA 480
GGGAATGCGG ATGGTGCTCA GATTCAGGAG ATGCTGCTCA GGGTCATCTC 530
CAGCGGCTCT GTGGCCTCCT ACGTCACCTC TCCCCAGGGA TTCCAGTTCC 580
GACGCCTGGG CACAGTGCCC CAGTTCCCAA GAGCCTGCAC GGAGGCCGAG 630
TTTGCCTGCC ACAGCTACAA TGA                              635
(2) 配列情報 SEQ ID NO:3:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 190 アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
((xi) 配列: SEQ ID NO:3:
Met Gly Trp Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Gly Arg Leu Leu Ala Val Thr His Gly Leu Arg Ala Tyr Asp
20                  25                  30
Gly Leu Ser Leu Pro Glu Asp Thr Glu Thr Val Thr Ala Ser Gln
35                  40                  45
Met Arg Trp Thr His Ser Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Asp Met Leu
50                  55                  60
Ala Asp Ser Ile Ser Gly Asp Asp Leu Gly Ser Gly Asp Leu Gly
65                  70                  75
Ser Gly Asp Phe Gln Met Val Tyr Phe Arg Ala Leu Val Asn Phe
80                  85                  90
Thr Arg Ser Ile Glu Tyr Ser Pro Gln Leu Glu Asp Ala Gly Ser
95                  100                 105
Arg Glu Phe Arg Glu Val Ser Glu Ala Val Val Asp Thr Gly Ala
110                 115                 120
Gly Trp Leu Gly Phe Cys Gly Ala Arg Cys Gly Leu Arg Arg Glu
125                 130                 135
Cys Gly Trp Cys Ser Asp Ser Gly Asp Ala Ala Gln Gly His Leu
140                 145                 150
Gln Arg Leu Cys Gly Leu Leu Arg His Leu Ser Pro Gly Ile Pro
155                 160                 165
Val Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Leu His
170                 175                 180
Gly Gly Arg Val Cys Leu Pro Gln Leu Gln End
185                 190
(2) 配列情報 SEQ ID NO:4:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 72アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:4:
Gly Ala Gly Trp Leu Gly Phe Cys Gly Ala Arg Cys Gly Leu Arg
123                 128                 133
Arg Glu Cys Gly Trp Cys Ser Asp Ser Gly Asp Ala Ala Gln Gly
138                 143                 148
His Leu Gln Arg Leu Cys Gly Leu Leu Arg His Leu Ser Pro Gly
153                 158                 163
Ile Pro Val Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser
168                 173                 178
Leu His Gly Gly Arg Val Cys Leu Pro Gln Leu Gln End
183                 188
(2) 配列情報 SEQ ID NO:5:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々20ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:5:
RhPerEx4/6   5'CATCCAGCTCCCGTGTCTAC 3'
F2hPer1DI    5'CTGAGGACATAGAGACCGTC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:6:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 312 ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:6:
ATGGGGTGGC GGGCGCCGGG CGCGCTGCTG CTGGCGCTGC TGCTGCACGG 130
GCGGCTGCTG GCGGTGACCC ATGGGCTGAG GGCATACGAT GGCTTGTCTC 180
TGCCTGAGGA CATAGAGACC GTCACAGCAA GCCARATGCG CTGGACACAT 230
TCGTACCTTT CTGATGATGA GGACATGCTG GCTGACAGCA TCTCAGGAGA 280
CGACCTGGGC AGTGGGGACC TGGGCAGCGG GGACTTCCAG ATGGTTTAAG 330
GAGATGCTGC TCAGGGTTCA TCTCCAGCGG CTCTGTGGCC TCCTACGTCA 380
CCTCTCCCCA GG                                          392
(2) 配列情報 SEQ ID NO:7:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 82アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:7:
Met Gly Trp Arg Ala Pro Gly Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu
1               5                   10                  15
His Gly Arg Leu Leu Ala Val Thr His Gly Leu Arg Ala Tyr Asp
20                  25                  30
Gly Leu Ser Leu Pro Glu Asp Ile Glu Thr Val Thr Ala Ser Gln
35                  40                  45
Met Arg Trp Thr His Ser Tyr Leu Ser Asp Asp Glu Asp Met Leu
50                  55                  60
Ala Asp Ser Ile Ser Gly Asp Asp Leu Gly Ser Gly Asp Leu Gly
65                  70                  75
Ser Gly Asp Phe Gln Met Val End
80
(2) 配列情報 SEQ ID NO:8:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々22及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:8:
FhEx3/6.5    5'CAGATGGTTTAAGGAGATGCTG 3'
RPer1DI      5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:9:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 33ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:9:
GGCTCAGGGC AGCCCCTGGG CCGCCCGCCC GTG 371
(2) 配列情報 SEQ ID NO:10:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 11アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:10:
Gly Ser Gly Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val
91                  96
(2) 配列情報 SEQ ID NO:11:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々21及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:11:
FhEx178    5'CGCCCGTGGCTGGTGAATTTC 3'
RPer1DI    5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:12:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 75ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)核酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: cDNA
(xi)配列: SEQ ID NO:12:
GCTCAGGGCA GCCCCTGGGC CGCCCGCCCG TGGCTGGCAT GATGGTCTCG 374
GAGCCTGATG AGGAGTCCCC TCTCA                            399
(2) 配列情報 SEQ ID NO:13:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 26アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数:
(D)トポロジー: 直鎖状
(E)アミノ酸番号はTRANSLATION OF GENBANK ACCESSION #M85289による
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:13:
Gly Ser Gly Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val Ala Gly Met Met
86                  91                  96
Val Ser Glu Pro Asp Glu Glu Ser Pro Leu Ile
101                 106
(2) 配列情報 SEQ ID NO:14:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 各々22及び19ヌクレオチド
(B)型: 核酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: オリゴヌクレオチドプライマー
(xi)配列: SEQ ID NO:14:
FhEx181    5'GTCCCTCTCATTTATTTCCGA 3'
RPer1DI    5'TGTGCCCAGGCGTCGGAAC 3'
(2) 配列情報 SEQ ID NO:15
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 17アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:15:
Pro Thr Pro Gly His Ser Ala Pro Val Pro Lys Ser Leu His Gly
Gly Arg
(2) 配列情報 SEQ ID NO:16:
(i) 配列の特性:
(A)長さ: 19アミノ酸
(B)型: アミノ酸
(C)鎖の数: 一本鎖
(D)トポロジー: 直鎖状
(ii)配列の種類: タンパク質
(xi)配列: SEQ ID NO:16:
Gln Pro Leu Gly Arg Pro Pro Val Ala Gly Met Met Val Ser Glu
Pro Asp Glu Glu
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
以下の図は、本発明の態様を例証するものであり、そして本発明の範囲を限定するためのものではない。
【図１】図1は、正常パーレカンの5つの構造ドメインを図式的に示したものである。
【図２】図2は、健常老人1人およびアルツハイマー病患者2人の海馬から単離した総RNAに対し、パーレカンドメインIに特異的なプライマー（FPerDIおよびRPerlDI）を用いて行ったRT-PCRの一例である。
【図３】図3は、コントロールまたはアルツハイマー病海馬由来のプールされた総RNAから、高厳密性ポリメラーゼおよびプライマー、FPerlDIEおよびRPerlDIXを用いて、RT-PCRにより産生されたクローンである。
【図４Ａ】図4Aは、新たに同定された、エクソン5が欠失したヒトパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン5と称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【図４Ｂ】図4Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。
【図４Ｃ】図4Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。
【図５Ａ】図5Aは、新たに同定された、エクソン4-6.5が欠失したヒトパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5と称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較している。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【図５Ｂ】図5Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5の決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdoch, A.D.ら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。
【図５Ｃ】図5Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン4-6.5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。
【図６Ａ】図6Aは、新たに同定された、エクソン4の開始近位に挿入された33ヌクレオチドを有するパーレカンドメインIスプライシング変異体（パーレカンドメインI変異体エクソン4aと称される）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【図６Ｂ】図6Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。
【図６Ｃ】図6Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン4aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。
【図７Ａ】図7Aは、新たに同定された、エクソン3の後ろに75ヌクレオチドの挿入を有するパーレカンドメインIスプライシング変異体（すなわち、パーレカンドメインI変異体エクソン3a）のエクソン構造を、正常ヒトパーレカンドメインIと比較する。増幅に用いたPCRプライマーを示している。
【図７Ｂ】図7Bは、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列を開示し、そしてそれを正常パーレカンドメインIの核酸配列（Murdochら, J. Biol. Chem. 267:8544-8557, 1992; Genbank寄託番号M85289のパーレカン配列番号を使用）と比較する。
【図７Ｃ】図7Cは、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列を開示する。
【図８】図8は、アルツハイマー病の海馬におけるパーレカンドメインIスプライシング変異体の発現を示す。
【図９】図9は、パーレカンドメインI変異体エクソン5の決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列（図4Cも参照されたい）を開示する。
【図１０−１】図10は、「エクソン5欠失」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経原繊維変化へのパーレカンドメインI変異体エクソン5の局在を示す白黒顕微鏡写真である。
【図１０−２】図10は、「エクソン5欠失」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経原繊維変化へのパーレカンドメインI変異体エクソン5の局在を示す白黒顕微鏡写真である。
【図１１】図11は、パーレカンドメインI変異体エクソン3aの決定された核酸配列および対応する推定アミノ酸配列（図7Cも参照されたい）を開示する。
【図１２−１】図12は、「パーレカンドメインI挿入」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経およびアミロイド斑へのパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの局在を示す白黒顕微鏡写真である。
【図１２−２】図12は、「パーレカンドメインI挿入」抗体を利用して、アルツハイマー病脳の神経およびアミロイド斑へのパーレカンドメインI変異体エクソン4aおよび／またはパーレカンドメインI変異体エクソン3aの局在を示す白黒顕微鏡写真である。
【図１３】図13は、表1およびRT-PCRに使用した海馬組織試料のリストである。
【図１４】図14は、表2およびRT-PCRに使用したプライマーのリストである。
【図１】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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