(57)【要約】【課題】本発明は、ＢＭＰ−２の活性を維持する方法を提供することを課題とする。またその方法を応用した剤を提供することを課題とする。【解決手段】ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法を提供する。またヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤を提供する。またヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤及び細胞の分化促進剤を提供する。前期細胞は骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び歯根膜由来細胞からなる群から選ばれる１又は２以上の細胞であることが好ましい。また前記細胞促進剤は骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤に用いられることが好ましく。さらに歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤として用いられることがさらに好ましい。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法。
【請求項２】
ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤。
【請求項３】
ＢＭＰ−２並びにヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤。
【請求項４】
ＢＭＰ−２並びにヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを有効成分として含んでなる、細胞の分化促進剤。
【請求項５】
「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び歯根膜由来細胞からなる群から選ばれる１又は２以上の細胞であることを特徴とする、請求項３又は４に記載の促進剤。
【請求項６】
骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いられることを特徴とする、請求項３に記載の促進剤。
【請求項７】
歯周組織の形成促進又は再生促進剤として用いられることを特徴とする、請求項６に記載の促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘパラン硫酸及び／又はヘパリンを用い骨誘導因子であるＢＭＰの活性を維持する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
まず、本出願書類において用いる略号を説明する。
ＨＳ：ヘパラン硫酸
Ｈｅｐ：ヘパリン
ＢＭＰ：骨形成因子（Bone morphogenetic protein）
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動
骨組織は、骨吸収と骨形成からなる骨代謝が一定のバランスを保ちながら繰り返されている動的組織である。骨吸収と骨形成の均衡は、骨形成を担当する骨芽細胞と骨吸収を担当する破骨細胞の両方により厳密に調節されており（非特許文献１）、この均衡が崩れると、骨組織は異常をきたし、種々の疾患を呈する。
【０００３】
ＨｅｐやＨＳをはじめとするＧＡＧは、細胞外マトリクスの構成成分の一つとして生体内に存在しており、近年、Ｈｅｐを単独投与することによって骨芽細胞の分化を阻害し、骨粗鬆症を誘発するといった報告や、他の増殖因子との相互作用により生物学的活性を持つという報告がなされている（非特許文献２、３）。
【０００４】
ＢＭＰは、異所性骨誘導活性を示す物質であり、皮下組織又は筋組織内の未分化間葉系細胞に作用して、これを軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性タンパク質である。このＢＭＰは、マウス、ラット、ウサギなどの小動物においてはマイクログラムのオーダーで骨形成を誘導することができるが、サルのような高等哺乳動物においては、小動物の場合と比較して骨形成誘導能が低く、骨形成誘導を得るためには通常ミリグラムオーダーのＢＭＰが必要だということが知られている。この原因としては動物種の違いによりＢＭＰの細胞応答性が異なることなどが考えられるが、ＢＭＰが安定して有効濃度を保持されていない、すなわち移植部位からのＢＭＰの速やかな消失や負のフィードバック機構、内因性の阻害物質の存在が疑われている（非特許文献４，５）。ＢＭＰの大量投与では予期できない副作用の危険性があり、従って、体内において安定かつ有効濃度を維持し、より少ない量のＢＭＰ投与量で骨形成を誘導しうる方法の開発が求められている。
【０００５】
【非特許文献１】チャンバース、T（Chambers T）ら、１９９１年、Vitamins Hormones、第４６巻、ｐ．４１−８６
【非特許文献２】ブハンダリ、Ｍ（Bhandari M）ら、１９９８年、Thromb Haemost  第８０巻、p.４１３−４１７
【非特許文献３】タカダ、Ｔ（Takada， T.）ら、２００３年、ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）、第２７８巻、第４４号、ｐ．４３２２９−４３２３５
【非特許文献４】タカセ、Ｍ（Takase M）ら、１９９８年、Biochem Biophys Res Commun.、第２４４巻、p.２６−２９
【非特許文献５】ヴァレンティン−オプラン、Ａ（Valentin-Opran A）ら、２００２年、Clin Orthop.、第３９５巻、p.１１０−１２０
【非特許文献６】フジイ、Ｍら（Fujii M）ら、１９９９年、Mol Biol Cell、第１０巻、p.３８０１−３８１３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐをＢＭＰと共存させることにより、低濃度のＢＭＰで骨形成を誘導し、骨欠損を有効に治療しうる薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＨＳ及びＨｅｐがＢＭＰの活性を有意に持続させることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法（以下、「本発明方法」という。）を提供する。
【０００９】
また、本発明方法を用いることにより、ＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤（以下、「本発明維持剤」という。）を提供する。
【００１０】
また本発明は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤（以下、「本発明促進剤１」という。）を提供する。
【００１１】
また本発明は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞の分化促進剤（以下、「本発明促進剤２」という。）を提供する。
【００１２】
上記本発明促進剤１及び２をあわせて単に「本発明促進剤」という。
【００１３】
本発明促進剤は「細胞」が、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞及び歯根膜由来細胞の群から選ばれる１又は２以上の細胞であることが好ましく、骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いられることがさらに好ましく、特に歯周組織の形成促進又は再生促進剤として用いられることが極めて好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ＢＭＰの活性を維持する方法が提供される。また、共存させるＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度を調節することにより、ＢＭＰの活性を調節する方法が提供される。また本発明促進剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、発明を実施するための最良の形態により本発明を詳説する。
＜１＞  本発明方法
本発明は、ＨＳ及び／又はＨｅｐを共存させることを特徴とする、ＢＭＰ−２の活性の維持方法である。
【００１６】
本発明方法において用いる「ＨＳ」及び「Ｈｅｐ」は広く市販されているもの（例えば生化学工業（株）社製）を用いることができる。またこれらは既知の方法を用いて適宜調製することができる。
【００１７】
本発明方法において用いる「ＢＭＰ−２」は強力な骨分化誘導性を有しており、筋肉内に存在する骨分化に感受性をもつ幹細胞に作用し、軟骨細胞、骨芽細胞、脂肪細胞への分化の振り分けを行う。またＢＭＰ−２は、前骨芽細胞に作用し、アルカリ性ホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略記する。）活性、副甲状腺ホルモンに対する応答性、オステオカルシン産生、コラーゲン合成等を上昇させて骨芽細胞への分化を誘導するタンパク質であり広く市販されているものを用いることができる。また既知の方法を用いて適宜調製することもできる。
【００１８】
本発明方法において用いる「共存」とはＨＳ及び／又はＨｅｐとＢＭＰ−２とが相互に接触する状態である限りにおいて特に限定されない。例えば、これらを培地に同時に添加してもよく、ＨＳ及び／又はＨｅｐが存在する培地中に後からＢＭＰ−２を添加してもよい。
【００１９】
また、共存させる条件もＨＳ及び／又はＨｅｐのＢＭＰ−２の活性の持続効果及びＢＭＰ−２の活性自体に悪影響を与えない限りにおいて特に限定されないが、２５〜４５℃程度であることが好ましく、３０℃〜４０℃であることがより好ましく、３５〜３８℃であることが極めて好ましい。
【００２０】
また、ＢＭＰ−２とＨＳ及び／又はＨｅｐとを共存させるときのそれぞれの濃度の割合も特に限定はされず、その持続させる目的に応じて当業者が適宜選択できるが、例えば１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２に対して０．１〜１００μｇ／ｍＬ、１〜１０μｇ／ｍＬ等の条件で行うことができる。
【００２１】
ＡＬＰ活性は、幹細胞や骨芽細胞の前駆細胞が骨芽細胞に分化する際のその分化の程度を示す指標となるものであり、この活性が高いほど骨形成能が高いことを示すものである。
【００２２】
また、本発明方法において用いる「ＢＭＰ−２の活性の維持」とは、ＢＭＰ−２を単独で投与した場合その活性が消失してしまうような期間（本実施例１で示す実験条件において細胞を培養した場合の６日以降の期間）であっても、活性を保持することをいう。この維持の効果を測定する方法は後述する実施例１の通りである。すなわち実施例１の条件において、６日以上活性を有していればＢＭＰ−２の活性を維持している。
【００２３】
また後述する実施例からわかるように、ＢＭＰ−２の活性は共存させるＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度依存的に抑制することができる。また、ＨＳ及び／又はＨｅｐの濃度によって維持されるＢＭＰ−２の活性も調節することができる。その活性を増強の方向へ調節させるには、実施例の条件で６日以上ＨＳ及び／又はＨｅｐをＢＭＰ−２と共存させることで、通常ならば消失してしまうＢＭＰ−２の活性が維持されているので、例えば１〜１０μｇ／ｍＬ投与し、６日以上共存させることにより増強できる。また、共存させてから４日程度までは濃度依存的に抑制させる方向に調節することができる。このことから、本発明方法は、ＢＭＰ−２の活性調節方法としての思想を含有するものである。
＜２＞  本発明維持剤
本発明方法を応用することにより、ＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、ＢＭＰ−２の活性維持剤を提供することができる。
【００２４】
本発明維持剤によりＢＭＰ−２の活性は初期（例えば本明細書実施例１の条件において細胞を培養した場合の４日程度の期間）の段階ではその活性は抑制されるが、ＢＭＰ−２の活性が消失してしまうような期間（本実施例１で示す実験条件において細胞を培養した場合の６日以降の期間）も本発明維持剤を用いることによりその活性を維持することができる。
【００２５】
本発明維持剤のＢＭＰ−２の活性が維持されることが望まれる細胞や組織への適用方法も、本発明維持剤による維持効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明維持剤の具体的用途に応じて適宜選択することができる。例えば細胞や組織への適応方法もその具体的用途に応じて適宜選択できる。例えば細胞や組織の実験用試薬として用いる場合には、培養液等に本発明維持剤を添加してこれを用いて細胞や組織を培養してもよいし、細胞や組織に本発明維持剤を直接添加してもよい。
【００２６】
本発明維持剤は、ＢＭＰ−２の維持が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。
【００２７】
本発明維持剤を医薬として用いる場合、そのエンドトキシン濃度は、溶液形態の剤とした場合においては０．３ＥＵ／ｍＬ以下であることが好ましい。エンドトキシン濃度は、当業者に周知慣用のエンドトキシン測定法を用いて測定することができるが、カブトガニ・アメボサイト・ライセート成分を用いるリムルス試験法が好ましい。なお、ＥＵ（エンドトキシン単位）は、日本工業規格生化学試薬通則（ＪＩＳ Ｋ８００８）、又は米国薬局方等に従って測定・算出できる。
【００２８】
また、本発明維持剤はＨＳ及び／又はＨｅｐのＢＭＰ−２の活性の持続効果に悪影響を与えない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、ヒアルロン酸）や、慣用の安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、通常医薬に用いられる成分を使用することができる。
【００２９】
本発明維持剤を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＨＳ又はＨｅｐの量として１ｎｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
【００３０】
また本発明維持剤は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて経口投与または非経口投与することができる。
【００３１】
また本発明維持剤は、ＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２と共存しているときの濃度を変化させることによりＢＭＰ−２の活性を調節する活性調節剤としても使用でき、その概念も包含するものである。
【００３２】
本発明維持剤において用いる「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」、「Ｈｅｐ」及び「共存」等の用語は本発明方法と同じ意義で用いられる。
＜３＞本発明促進剤１
本発明促進剤１はＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞増殖促進剤である。
【００３３】
ＢＭＰ−２は、未分化間葉系細胞に作用して、これを軟骨芽細胞又は骨芽細胞に分化させ、軟骨又は骨を形成させる活性タンパク質であり、その活性を維持することにより細胞の増殖を促進することができる。
【００３４】
したがって本発明促進剤１は、前記本発明方法を利用しＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２の活性を維持することにより、長い時間ＢＭＰ−２の細胞増殖能を維持することができる剤である。
【００３５】
本発明促進剤１により、細胞の増殖が促進される効果は濃度依存的に初期の段階では抑制されるが、その活性が長期にわたり維持されることにより細胞の増殖を促進することができる。
【００３６】
本発明促進剤１の、促進が望まれている細胞や組織への適用方法も、本発明促進剤１による促進効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明促進剤１の具体的用途に応じて適宜選択することができる。実験試薬としての例示としては本発明維持剤又は実施例を参照されたい。
【００３７】
本発明促進剤１を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＢＭＰ−２の量として１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
【００３８】
本発明促進剤１を医薬とする場合、これが投与される動物も特に限定されないが、脊椎動物が好ましく、哺乳動物がより好ましく、ヒトが特に好ましい。
【００３９】
本発明促進剤１は、細胞の増殖が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、又は歯根膜由来細胞の増殖が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の増殖が望まれている状態としては、例えば歯周疾患、骨折、骨欠損、骨粗鬆症、関節疾患、整形外科的疾患（離断性骨軟骨炎、変形性膝関節症など）、腫瘍等に罹患している場合や、歯科治療（歯周治療など）、整形外科治療（培養細胞移植術、骨穿孔術、骨軟骨柱移植術など）、腫瘍摘出術による骨移植、骨補填が施された直後の状態等が例示される。
【００４０】
また本発明促進剤１を骨若しくは軟骨の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。骨若しくは軟骨の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞の増殖の場合と同様である。
【００４１】
本発明において骨形成促進作用とは、骨や軟骨の形成作用を促すものであれば特に限定されず、例えば、間葉系幹細胞からの得が細胞への分化促進作用、未分化間葉系細胞からの骨芽細胞への分化促進作用、前骨芽細胞からの骨芽細胞への分化促進作用、骨基質の形成促進作用、骨基質の石灰化作用、骨芽細胞からの骨細胞への分化促進作用、軟骨内骨化誘導作用等が例示される。また、骨形成促進作用の有無については、特に限定されないが実施例のようにＡＬＰ活性の測定を行うことにより簡便に測定することができる。
【００４２】
また、歯周組織の形成促進剤又は再生促進剤として用いる場合には、歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。歯周組織の形成促進又は再生促進が望まれている状態の例示は、前記の細胞の増殖の場合と同様である。
【００４３】
その他の本発明促進剤１の好ましい条件は、前述した本発明維持剤を参照されたい。
【００４４】
また、本発明促進剤１において用いる「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」及び「Ｈｅｐ」の用語は本発明方法と同じ意義で用いられる。
＜４＞本発明促進剤２
本発明促進剤２は、ＢＭＰ−２並びにＨＳ及び／又はＨｅｐを有効成分として含んでなる、細胞の分化促進剤である。
【００４５】
本発明促進剤２は、前記本発明方法を利用しＨＳ及び／又はＨｅｐがＢＭＰ−２の活性を維持することにより、より長い時間ＢＭＰ−２の細胞の分化作用を維持する方法を利用したものである。
【００４６】
本発明促進剤２の、促進が望まれている細胞や組織への適用方法も、本発明促進剤２による促進効果が発揮される限りにおいて特に限定されず、本発明促進剤２の具体的用途に応じて適宜選択することができる。実験試薬としての例示としては本発明維持剤又は実施例を参照されたい。
【００４７】
本発明促進剤２は、細胞の分化が望まれている状態にある動物に対して投与することができる。特に、骨芽細胞、軟骨芽細胞、セメント芽細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、又は歯根膜由来細胞の分化が望まれている状態にある動物に投与されることが好ましい。このような細胞の分化が望まれている状態の例示は、前記の本発明促進剤１における場合と同様である。
【００４８】
本発明促進剤２を医薬とする場合、その投与量は、投与の目的（予防、悪化防止、症状の改善又は治療）、疾患の種類、患者の症状、性別、年齢、体重、投与部位、投与方法等
によって個別に設定されるべきものであり特に限定されないが、成人１人１回あたり概ね、ＢＭＰ−２の量として１ｐｇ／投与部位〜３０ｍｇ／投与部位程度を投与することができる。
【００４９】
また、その他の本発明促進剤２の好ましい条件や好ましい投与形態等は前述した本発明維持剤や本発明促進剤１等を参照されたい。
【００５０】
本発明促進剤で用いられる、「ＢＭＰ−２」、「ＨＳ」、「Ｈｅｐ」並びに本発明促進剤を医薬として用いる場合の好ましい条件等は本発明促進剤１と同様である。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例により更に具体的に詳説するが、本発明は以下の具体例に限定されるものではない。
【００５２】
参考例１
ＡＬＰ活性のＢＭＰ−２濃度依存性
マウス頭頂骨由来前骨芽細胞様細胞（MC3T3-E1細胞）を５％のウシ胎児血清（ベーリンガー社製、以下ＦＢＳと略記する。）含有Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ社製、以下αＭＥＭと略記する。）培地にて、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。２４時間の培養の後、４０、８０ng/mLの遺伝子組換えヒトBMP-2（rhBMP-2、山之内製薬社製）添加又は無添加の条件にて培養した。ALP活性の定量的解析は、Fujiiらの方法（例えば、非特許文献６参照）に従い、Sigma Fast p-nitrophenyl phosphate tablet setを用いて行った。その結果を図１に示す。
【００５３】
図１に示す通り、MC3T3-E1細胞において、rhBMP-2刺激により濃度依存的に骨芽細胞への分化を誘導することがわかる。
【００５４】
実施例１
ＨＳ及びＨｅｐのＢＭＰ−２によるＡＬＰ活性の促進作用に及ぼす影響
MC3T3-E1細胞を、５％ＦＢＳを含むαＭＥＭ（コントロール）培地、ＨＳ（生化学工業社製）若しくはＨｅｐ（生化学工業社製）のみをそれぞれ１００μｇ／ｍＬ添加した同培地又はＨＳ若しくはＨｅｐを０〜１００μｇ／ｍＬ添加し、さらに８０ng/mLのrhBMP-2を含む培地で、３７℃、ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。その後さらに、それぞれの細胞を２、４及び６日間培養し、参考例１と同様の方法でＡＬＰ活性を測定した。その結果を図２〜７に示す。
【００５５】
コントロールと比較することにより、ＨＳ及びＨｅｐの単独投与では、ＡＬＰ活性は低下していることがわかる。また図２、３、５及び６の結果より、ＢＭＰ−２との併用投与の際におけるＨＳ及びＨｅｐの濃度依存的にＡＬＰ活性を抑制していることがわかる。図４及び７より６日後の結果よりＢＭＰ−２単独の場合と比較して、ＨＳ又はＨｅｐとの併用投与の場合の方が、ＡＬＰ活性が高いことがわかる。これらの結果よりＨＳ又はＨｅｐと共存させることによってＢＭＰの活性が維持されることがわかる。
【００５６】
実施例２
ＧＡＧのOsterix ｍＲＮＡ及びRunx2 ｍＲＮＡの発現に及ぼす影響
次にＢＭＰ−２が発現する転写因子である、Osterix及びRunx2に及ぼすＨＳ及びＨｅｐの影響についてＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法）を行うことにより検討した。
【００５７】
MC3T3-E1細胞を５％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地に播種し、１２ウェルプレート中で２４時間培養した。細胞濃度を４×１０５個／ｍＬに調整し、ここにＨｅｐ、ＨＳそれぞれ単独で１００μｇ／ｍＬ、１００ng/mLのＢＭＰ−２、１００μｇ／ｍＬのＨｅｐと１００ng/mLのＢＭＰ−２とを共存させたもの又は１００μｇ／ｍＬのＨＳと１００ng/mLのＢＭＰ−２とを共存させたものをそれぞれ添加し、４，１２，７２時間培養した。
【００５８】
培養後、細胞を回収し、Total RNA  Extraction Miniprep System（バイオジーン社製）を使用し、Total RNAを抽出した。その後Dnase Iにて処理し、oligo-dT primer を使用し逆転写を行った。
【００５９】
その後ＲＴ−ＰＣＲを行った（９分間  ９５℃、３５サイクル、４０秒間  ９４℃、４０秒間  ６０℃、９分間  ７２℃）。PCRプライマーとしては以下のプライマーを用いた。また対照としてはグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（以下、ＧＡＰＤＨと略記する。）用いた。
使用したプライマー
Osterix-forward：5’-ctggggaaaggaggcacaaagaag-3’
Osterix-reverse：5’-gggttaaggggagcaaagtcagat-3’
Runx2-forward：5’-ccagatgggactgtggttacc-3’
Runx2-reverse：5’-acttggtgcagagttcaggg-3’
GAPDH-forward: 5’-accacagtccatgccatcac-3’
GAPDH-reverse: 5’-tccaccaccctgttgctgta-3’
ＰＣＲを行ったものを、２％アガロースゲルを用いて電気泳動し、エチルブロマイドにて染色を行った。その結果得られた電気泳動図を図８及び９に示す。
【００６０】
Osterixの発現において、ＢＭＰ−２のみを投与したものと比較してＨＳ又はＨｅｐをＢＭＰ−２と併用投与した場合には投与３日後に強く発現していることがわかる。また、投与後１２時間後のバンドを見ると、ＨｅｐとＢＭＰ−２の併用投与ではバンドが見えなかったが、ＨＳとＢＭＰ−２との併用投与ではバンドが見られた。この結果から本発明を医薬として用いる際、ＢＭＰ−２とＨｅｐとの併用に比較して、ＨＳとの併用投与の方が初期の段階から効果があることが示唆される。
【００６１】
またRunx2の発現に関しても同様の結果が得られた。
【００６２】
実施例３
ＧＡＧ及びＢＭＰ−２のSmad1/5/8及びp38のシグナル伝達活性に及ぼす影響
次にＢＭＰに関連するシグナル伝達物質のSmadとp38に及ぼす影響を調べた。ＢＭＰは２種類のセリン−スレオニンキナーゼ型レセプターに結合し、Ｓｍａｄと呼ばれる分子を介して細胞内にシグナル伝達することが知られている。
【００６３】
MC3T3-E1細胞を５％ＦＢＳ含有αＭＥＭ培地に播種し、６ ウェルプレート中で２４時間培養した。細胞濃度を４×１０５個／ｍＬに調整し、ここにＨｅｐ、ＨＳそれぞれ単独で１００μｇ／ｍＬ、１００ng/mLのＢＭＰ−２又はＨｅｐ若しくはＨＳとＢＭＰ−２とを共存させたものをそれぞれ添加し、２４時間培養した。
【００６４】
得られた試料を還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度７．５％）に付し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質をウエスタンブロッティングの常法に従ってニトロセルロース膜に転写した。転写後の膜を、１０％スキムミルク及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（以下、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０と略記する。）で洗浄した。
【００６５】
膜を、１次抗体（phospho-Smad1/5/8、phospho-p38及びp38）と共に４℃で一昼夜インキュベートし、その膜を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
【００６６】
次いで、膜を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で３，０００倍に希釈したホースラディッシュペルオキシターゼ結合抗ウサギＩｇＧ二次抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）と共に１時間震盪しながらインキュベートし、その膜をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した。
【００６７】
次いで、ＥＣＬ検出キット（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて前記抗体に反応したタンパク質を検出した。その結果を図１０及び１１に示す。
【００６８】
p-smad1/5/8及びp-p38の３０分後及び６０分後に関しては、共にＢＭＰ−２単独及びＨｅｐ又はＨＳとの併用の場合にバンドが現れているが、Ｈｅｐと併用の場合はバンドが薄かった。このことからも、Ｈｅｐと併用投与の場合には初期の段階での抑制効果が強いことがわかる。
【００６９】
これらの実施例よりＨＳ、ＨｅｐはＢＭＰによる骨芽細胞分化増強作用を初期には抑制するものの、ＢＭＰによる作用の遷延効果を有していることが示唆された。また、ＨＳの方が初期の抑制効果が低いため、初期の段階からＢＭＰの効果を持続させることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＡＬＰ活性のＢＭＰ−２の濃度依存性を示す図である。
【図２】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨＳの２日後の影響を示す図である。
【図３】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨＳの４日後の影響を示す図である。
【図４】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨＳの６日後の影響を示す図である。
【図５】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨｅｐの２日後の影響を示す図である。
【図６】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨｅｐの４日後の影響を示す図である。
【図７】ＢＭＰ−２により促進されたＡＬＰ活性に対するＨｅｐの６日後の影響を示す図である。
【図８】ＢＭＰ−２により促進されたOsterixのｍＲＮＡにおけるＨＳ及びＨｅｐの影響を示す図である。
【図９】ＢＭＰ−２により促進されたRunx2のｍＲＮＡにおけるＧＡＧが及ぼす影響を示す図である。
【図１０】Ｓｍａｄシグナル伝達系におけるＢＭＰ−２とＧＡＧが及ぼす影響を示す図である。
【図１１】ｐ３８シグナル伝達系におけるＢＭＰ−２とＧＡＧが及ぼす影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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