(57)【要約】 【課題】数ｍＧｙ程度の低線量での放射線による影響を判定又は検出する方法、低線量被ばくによる該細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニング誘導を予測する方法等を提供すること。【解決手段】幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該幹細胞での低線量被ばくを判定又は検出する方法、並びに、低線量被ばくによる該幹細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該幹細胞での低線量被ばくを判定又は検出する方法。
【請求項２】
幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、低線量被ばくによる該幹細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法。
【請求項３】
（１）被検物質との共存下で幹細胞に低線量放射線を照射する工程、及び（２）該幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項４】
（１）低線量放射線を照射された幹細胞に被検物質を接触させる工程、及び（２）該幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法。
【請求項５】
低線量被ばく後の細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該細胞が幹細胞又は体細胞のいずれかであるかを判定又は検出する方法。
【請求項６】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の変動を該遺伝子のｍＲＮＡの発現量に基づき測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＨｉＣＥＰ法に基づき作製される遺伝子発現プロファイルから求めることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＰＣＲで測定することを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の変動を該遺伝子産物（蛋白質）の発現量に基づき測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ蛋白質の発現量をウェスタンブロット法で測定することを特徴とする、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
幹細胞が胚性幹細胞である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
胚性幹細胞がマウス胚性幹細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現産物から成る、幹細胞における低線量被ばくの検出マーカー。
【請求項１４】
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現産物が、該遺伝子のｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ，若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードする蛋白質である、請求項１３記載の検出マーカー。
【請求項１５】
ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の部分塩基配列である配列番号１を含む核酸分子から成る、請求項１４記載の検出マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞における低線量被ばくの検出マーカー、及び、該マーカーを用いる幹細胞での低線量被ばくレベルを推定又は検出する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療分野において数ｍＧｙ程度の低線量放射線の使用が増加するに伴い、その影響による白血病又はガンに対する懸念が高まってきている（非特許文献１）。医療診断で主に使用される放射線の線量はきわめて低く、例えば、ＣＴスキャン用には０．０７〜５５．９ｍＧｙ，Ｘ線用には０．０５〜１１．６９ｍＧｙが使用されている（非特許文献２）。
【０００３】
しかしながら、これまで、放射線防護や放射線管理の立場からは、このような低線量放射線による影響は統計的現象であり、その生物、特に、人体・生命への影響又は分子的メカニズム直接評価する方法はなく、その評価が困難であった。そこで、主に原子爆弾による被爆被害を受けた生存者のような、高線量放射線被ばく集団からの疫学的研究（情報）に基づき、それらを外挿することによって、低線量放射線への被ばくによるリスクを予防的に安全側に評価することが行われてきた。このような外挿モデルは、細胞には、低線量放射線への被ばくの際にも、高線量放射線への被ばくと同様に放射線による損傷を修復する機能がある、との前提に立っている（非特許文献３）。
【０００４】
しかしながら、近年、低線量域の放射線において、高線量域の単なる延長上とは異なる生物学的な反応が指摘され始めている。例えば、極低線量域の放射線により引き起こされる分子的現象として、Ｈ２Ａ変異体であるγ−Ｈ２ＡＸのセリン（１３９）のリン酸化が解明され、これは細胞における最も深刻な損傷であるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）への細胞の初期段階の応答の一つとして、信頼度の高い高感度のバイオマーカーになり得ることが示された（非特許文献４）。γ−Ｈ２ＡＸの解析により、１〜２ｍＧｙ程度の極めて低線量域の放射線でさえも、ヒト繊維芽細胞にＤＮＡ二本鎖切断を誘発し、しかも、細胞の修復機能はこれを適切に機能しないことが解明され、高線量放射線被ばくと低線量放射線被ばくとではその影響が異なることが示唆された。
【０００５】
これまでに、放射線による影響の分子論的解析のためにゲノム規模のアプローチが試みられ（１８，１９）、２０以上もの報告がなされて来たが、その殆どは、高線量放射線に焦点を当てたものである。最近になって、ＤＮＡマイクロアレイを用いて、２０ｍＧｙの低線量放射線への被ばくに対して幾つかの転写産物が減少することが同定された（非特許文献５）。更に、ヒト繊維芽細胞が１０ｍＧｙの放射線に被ばくした際に、ＣＸＣケモカインをコードする遺伝子が発現したことが見出されている（非特許文献６）。
【０００６】
【非特許文献１】Brenner DJ, Doll R, Goodhead DT, et al. Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation: assessing what we really know. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:13761-13766.
【非特許文献２】Kawaura C, Aoyama T, Koyama S, et al. Organ and Effective Dose Evaluation in Diagnostic Radiology Based on in-Phantom Dose Measurements with Novel Photodiode-Dosemeters. Radiat Prot Dosimetry 2006;26:26.
【非特許文献３】Clarke R. Control of low-level radiation exposure: time for a change? J Radiol Prot 1999;19:107-115.
【非特許文献４】Rothkamm K, Lobrich M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5057-5062.
【非特許文献５】Amundson SA, Lee RA, Koch-Paiz CA, et al. Differential responses of stress genes to low dose-rate gamma irradiation. Mol Cancer Res 2003;1:445-452.
【非特許文献６】Fujimori A, Okayasu R, Ishihara H, et al. Extremely low dose ionizing radiation up-regulates CXC chemokines in normal human fibroblasts. Cancer Res 2005;65:10159-10163.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既に記載したように、医療分野で使用される放射線は１０ｍＧｙ以下、数ｍＧｙ程度のものが多く、従って、このような低線量域の放射線による影響に関する分子的メカニズムを解明することが望まれている。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、数ｍＧｙ程度の低線量での放射線による影響を判定又は検出する方法、低線量被ばくによる該細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニング誘導を予測する方法等を提供することである。
【０００９】
本発明者は、ＨｉＣＥＰ法を用いることによって、幹細胞の一種であるマウス胚性幹細胞（ES細胞）において、低線量域の放射線照射の１時間後に、ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及びＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現が有意に増加することを見出し、これら遺伝子が低線量被ばくの検出マーカーとなり得ることを確認して、本発明を完成させた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記知見に基づきなされたものである。
即ち、本発明は第一の態様として、幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該幹細胞での低線量被ばくを判定又は検出する方法に係る。
【００１１】
本発明は第二の態様として、幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、低線量被ばくによる該幹細胞のアポトーシスへの誘導を予測する方法に係る。
【００１２】
本発明は第三の態様として、（１）被検物質との共存下で幹細胞に低線量放射線を照射する工程、及び（２）該幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法に係る。
【００１３】
本発明は四の態様として、（１）低線量放射線を照射された幹細胞に被検物質を接触させる工程、及び（２）該幹細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現の変動を測定する工程を含む、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングする方法に係る。
【００１４】
本発明は五の態様として、低線量被ばく後の細胞におけるＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現量の増加を測定することにより、該細胞が幹細胞又は体細胞のいずれかであるかを判定又は検出する方法に係る。
ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現産物から成る、幹細胞における低線量被ばくの検出マーカー。
【００１５】
本発明は六の態様として、ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現産物から成る、幹細胞における低線量被ばくの検出マーカーに係る。
【発明の効果】
【００１６】
本発明方法により、幹細胞での低線量放射線被ばくを分子的メカニズムに基づき、判定又は検出することが出来る。これによって、生体の発生や細胞の分化など生命の根幹へ放射線の与える影響・リスクを評価することが可能となる。又、低線量被ばくによる幹細胞のアポトーシスへの誘導を予測したり、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングしたり、幹細胞と体細胞との応答性の相違に基づき、幹細胞を判定することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明方法において、低線量被ばくの原因となる、放射線の発生源、種類、被爆態様・経緯等に特に制限はない。因みに、放射線には、物質に電離作用を及ぼす電離放射線と非電離放射線があり、更に電離放射線は、エックス線及びガンマ線等の電磁放射線とα線及びβ線などの粒子線とに大別される。このうち、エックス線は１ｐｍ〜１００ｎｍ程度の波長を有する電磁波であり、波長範囲はガンマ線と一部重なるが、加速した電子を原子にぶつけることにより人工的に得られる放射線である。エックス線の有する透過、吸収、散乱、電離、及び励起等多様な相互作用を利用して、医療分野におけるエックス線撮影及びエックス線CTに代表される各種診断、各種材料の非破壊検査、結晶構造解析等に利用されている。又、医療器具・装置、放射光利用施設、又は原子力発電所等の産業施設等における不慮の事故によって発生する恐れがある。
【００１８】
本発明方法の目的を考慮すると、エックス線のような電磁放射線、特に、上記のような各種医療器具・装置、及び産業施設における事故によって発生したエックス線を代表的な例として挙げることができる。
【００１９】
尚、放射線の吸収線量とは、実際に人体等の被ばく対象物質に吸収された放射線のエネルギーを示す物理量であり、電離放射線の照射による物質１ｋｇ当り１ジュールの吸収エネルギーを単位にとり、これを１グレイ（Gy）と呼ぶ。尚、かかる放射線の吸収線量は当業者に公知の任意の方法、例えば、放射線の測定にはＧＭ管（ガイガーミューラー計数管）を被ばく対象物質の横に置くことにより測定することができる。因みに、ＧＭ管には円筒形の内部にヘリウム、アルゴン等の不活性ガスが詰められており、高電圧をかけておくと、放射線が入射するとＧＭ管内部のある原子が励起され、壁材と反応して内部に電子を放出させ、電子は内部のガスに電離を引き起こす。電離によって生じたイオンがきっかけとなって管内に放電が起き、放電によるパルスを計測することにより測定が行われる。
【００２０】
例えば、本発明のスクリーニング方法において、幹細胞に対する低線量放射線の照射は、例えば、当業者に公知の適当な方法で実施することが出来る。例えば、エックス線を用いる場合には、放射線発生源として、PANTAC-320S型Ｘ線発生装置（島津）等の当業者に公知の任意の市販の装置を用いて、適当な培地で培養されている幹細胞に適当な量の放射線を照射することが出来る。
【００２１】
本発明方法において、「低線量」とは、既に記載したような医療分野、特に医療診断において主に用いられる範囲を意味し、通常、１０ｍGy以下、例えば、１ｍGy〜１０ｍGy、特に、５ｍGy〜１０ｍGy程度の範囲を意味する。
【００２２】
「ＰＰＰ１ＣＡ」遺伝子はタンパク質ホスファターゼ１の触媒サブユニットであるαアイソフォーム（ＰＰＰ１ＣＡ）をコードする（１０）。又、ＢＡＤ（Bcl−antagonistof cell death）はミトコンドリア外膜にあるＢＣＬ−２を阻害し、その結果シトクロムＣの放出を促進してアポトーシスを誘導する機能を有する。又、ＢＣＬ−ＸＬもミトコンドリア外膜に存在し、シトクロムＣの放出を抑制することによってしてアポトーシスを阻害する機能を有する。尚、ＰＰＰ１ＣＡはＢＡＤ及びＢＣＬ−ＸＬと結合して、ＢＣＬ−ＸＬの抗アポトーシス活性を中和することによって、アポトーシスを誘導することが知られている（１３）。
【００２３】
本発明方法において、上記遺伝子の発現の変動（増加、減少）は、例えば、該遺伝子のｍＲＮＡ又はその蛋白質の発現量に基づき、当業者に公知の任意の方法で半定量的又は定量的に測定することが出来る。又、発現変動の影響が十分に現れ、信頼度の高い結果を得るには、低線量放射線被ばく後の数時間後、例えば、約１〜３時間以内、特に、本発明方法の特異性を十分に発揮するには、出来るだけ短い時間の経過後、例えば、１時間程度の後に遺伝子の発現量の測定を行うことが好ましい。
【００２４】
尚、上記各遺伝子の塩基は公知である。例えば、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子（Carninci,P. and Hayashizaki,Y., “High-efficiency full-length cDNA cloning”, Meth. Enzymol. 303, 19-44 (1999); Carninci,P., Shibata,Y., Hayatsu,N., Sugahara,Y., Shibata,K., Itoh,M., Konno,H., Okazaki,Y., Muramatsu,M. and Hayashizaki,Y., “Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genes”, Genome Res. 10 (10), 1617-1630 (2000)）はNCBI RefSeq: NM_031868で登録されており、Bcl-xL（Bcl2l1）遺伝子（Gonzalez-Garcia M, Perez-Ballestero R, Ding L, Duan L, Boise LH, Thompson, CB, Nunez G., “bcl-XL is the major bcl-x mRNA form expressed during murine development and its product localizes to mitochondria”, Development 120, 3033-3042 (1994)）はNCBI RefSeq: NM_009743、及び、Bad遺伝子（Yang E, Zha J, Jockel J, Boise LH, Thompson CB, Korsmeyer SJ. Bad, “a heterodimeric partner for Bcl-XL and Bcl-2, displaces Bax and promotes cell death”, Cell 80, 80285-80291(1995)）はNCBI RefSeq: NM_007522で登録されている。
【００２５】
従って、該遺伝子の発現量は、このような公知の情報に基づき設計したプライマーを用いるＨＩＣＥＰ法、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、又は競合的ＰＣＲ等の当業者に公知の任意の定量的方法で定量的に測定することが出来る。或いは、電気泳動後に染色等の適当な手段で可視化したｃＤＮＡを検出すること、又はノーザンブロット法によっても半定量的に測定することが可能である。一方、該遺伝子の蛋白質の発現は、例えば、その蛋白質に対する抗体を用いるウェスタンブロット法又は固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で定量的に測定することが出来る。
【００２６】
ここでＨｉＣＥＰ法は、制限酵素ＤＮＡ断片長多型（ＲＦＬＰ）とポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づき開発された遺伝子発現プロファイル法であり、ＰＣＲ産物の電気泳動から得られる移動距離とピークのデータから、ある条件下における特定の細胞における遺伝子の発現パターン、公知及び未知遺伝子の発現の有無、それらの発現量等に関する情報から成る遺伝子発現プロファイルを得、それらに基づき、遺伝子発現頻度の解析及び各遺伝子の同定をする方法である。このＨｉＣＥＰ法では、擬陽性シグナルを２％以下にすることが可能であり、その結果、存在率の高い４塩基認識制限酵素を使用することにより、８０％という非常に高いカバー率（全発現転写物の中で観察可能な転写物の割合）を達成することが出来、更に、１．２倍までの発現差を検出することも可能である。
【００２７】
ＨｉＣＥＰ法の例として、例えば、遺伝子発現プロファイルを作製する方法であって、
(a)ポリ(A)RNAを鋳型として一本鎖cDNAを合成する工程であって、該一本鎖cDNAを基準として5'末端にタグ物質が付加された一本鎖cDNAを合成する工程、
(b)工程(a)で合成された一本鎖cDNAを鋳型として二本鎖cDNAを合成する工程であって、該二本鎖cDNAを基準として3'末端側にタグ物質が付加された二本鎖cDNAを得る工程、
(c)工程(b)で得られた二本鎖cDNAを第1の制限酵素Xで切断する工程、
(d)該タグ物質に高親和性を有する物質を用いて、工程(c)で得られた断片から該タグ物質が付加している断片を回収する工程、
(e)工程(d)で回収された断片の第1の制限酵素Xによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びXプライマーに相補的な配列を含むXアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として5'末端側にXアダプターが結合している断片を得る工程、
(f)工程(e)で回収された断片を、該Xアダプターを切断しない第2の制限酵素Yで切断する工程、
(g)該タグ物質に高親和」性を有する物質を用いて、工程(f)で得られた断片から該タグ物質が結合している断片を取り除くことにより、二本鎖cDNAを基準として3'末端側に第2の制限酵素Yによる切断部位を含む断片を回収する工程、
(h)工程(g)で回収された断片の第2の制限酵素Yによる切断部位へ、該切断部位の配列に相補的な配列及びYプライマーに相補的な配列を含むYアダプターを結合させて、二本鎖cDNAを基準として3'末端側にYアダプターが結合している二本鎖配列の断片を得る工程、
(i)該Xアダプターの配列に相補的な配列を含むXプライマーであって、該Xプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるNlN2(Nl及びN2は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むXプライマーと、該Yアダプターの配列に相補的な配列を含むYプライマーであって、該Yプライマーを基準として3'末端に2塩基配列であるN3N4(N3及びN4は同一又は異なっていてもよい、アデニン、チミン、グアニン及びシトシンからなる群より選ばれる塩基である)を含むYプライマーとからなるプライマーセットを用いて、工程(h)で得られた二本鎖配列の断片を鋳型としてPCR反応を行う工程、及び、
(j)得られたPCR産物を電気泳動し、その移動距離及びピークを検出することにより遺伝子発現プロファイルを作製する工程、を含む方法である。
【００２８】
上記方法で、遺伝子プロファイル作成に際して、プライマーのミスアニーリングに起因する偽ピークの発生を減少させるためには、工程(i)において、Xプライマー及びYプライマーのそれぞれXアダプター及びYアダプターへのアニーリングを、プライマーのTmMAX+6℃〜TmMAX+14℃の温度で行うことが好ましい。又、特に断りのないかぎり、二本鎖cDNAのセンス鎖(鋳型となるポリ(A)RNAに相同な配列を有する鎖)の5'末端側を二本鎖cDNAの5'末端側とし、当該センス鎖の3'末端側を二本鎖cDNAの3'末端側とする。
【００２９】
「タグ物質」及び「タグ物質に高親和性を有する物質」とは、互いに高親和性をもって特異的に結合することが可能な結合対を構成する一方の物質を意味する。互いに高親和性をもって特異的に結合するこが可能な結合対であれば使用することが可能である。本発明に使用可能なタグ物質とタグ物質に高親和性を有する物質との組合せの例には、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとアビジン、FITCとFITC抗体、DIGとアンタイDIG及びプロテインAとマウスIgG及びラテックス粒子等が含まれるが、これらに限られるものではない。タグ物質のDNA配列への付加は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。また、「タグ物質」と「タグ物質に高親和性を有する物質」との間の親和性に基づくDNA断片の回収(工程(d)及び(g))は、当業者に公知の適当な条件により達成することが可能である。
【００３０】
「制限酵素」とは、一般的に、制限エンドヌクレアーゼとも称される酵素であり、特定の配列において二本鎖DNAを加水分解し切断する酵素である。本発明においては、適切な断片を得るために2種類の制限酵素X及びYを組み合わせて使用する。本発明に使用可能な制限酵素は、発現された遺伝子であるmRNAから合成された二本鎖cDNAを、識別可能な長さを有する断片に切断することが可能な酵素が好ましい。また、得られた当該二本鎖のより多くを、好ましくはほとんど全ての二本鎖を切断するような酵素が好ましい。例えば、国際公開０２／４８３５２号パンフレットに記載されているような当業者に公知の６塩基認識酵素又は４塩基認識酵素を使用することが出来る。但し、既に記載したように、高いカバー率を達成する為には、例えば、ＭｓｐＩ及びＭｓｅＩのような４塩基認識酵素を組み合わせて使用することが好ましい。
【００３１】
「アダプター」は、ＰＣＲ反応においてプライマーを結合させるために使用され、使用する制限酵素及びプライマーの構造に種類等に応じて適宜設計することが出来る。安定したＰＣＲ反応を行わせるためには、通常、プライマーの長さは３０塩基程度である。
【００３２】
「Ｘプライマー」及び「Ｙプライマー」は、対象ＲＮＡ配列と出来るだけ一致させないために、１６塩基以上の長さを有することが好ましい。更に、例えば、「バイオラッド実験イラストレイテッド（３）新版  本当にふえるＰＣＲ」中山広樹  著、秀潤社、２００２年、第２版、第４刷に記載されているような、ＰＣＲプライマーとして一般的に要求される条件を満たしている必要がある。また、各プライマーは当業者に公知の一般的なプライマー合成方法（Letsinger et al., Nucleic Acids Research, 20, 1879-1882, 1992; 特開平１１−０８０１８号公報）に従い調製することができる。
【００３３】
更に、ＰＣＲ反応後の検出を容易にするために、これらプライマーの少なくともいずれかの末端に、当業者に公知の任意の蛍光物質等の標識物質が結合していることが好ましい。例えば、適当な蛍光物質として、６−カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）、４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロー６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）、ＮＥＤ（アプライドシステムズジャパン社）及び６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（Ｒｏｘ）等を挙げることが出来る。
【００３４】
更に、ＨｉＣＥＰ法の実施に際してのその他の条件及び使用する装置等は、国際公開02/48352号パンフレット及び国際公開2005/118791号パンフレットの記載を参照することが出来る。尚、得られた遺伝子発現プロファイルは、当業者に公知の解析ソフトウェア、例えば、ＧｅｎｅＳｃａｎTM （アプライドバイオシステムズジャパン社）を使用して解析することが出来る。尚、上記の基本的特徴を有している限り、更なる技術的改良又は変更が加えられた方法であっても、本明細書中の「ＨｉＣＥＰ法」に含まれるものである。
【００３５】
「幹細胞」とは、潜在的にどのような体細胞にも分化できる多分化能を有する細胞である。本発明の各種方法で使用される幹細胞の種類及び由来等に特に制限はないが、マウス、サル、ヒトなどの哺乳動物由来の胚性幹細胞（ＥＳ細胞：個体になり得る全分化能を有する細胞）、例えば、本明細書の実施例で使用されている、Ｅ１４，ＭＧ１．１９及びＲ１等のマウス胚性幹細胞を挙げることが出来る。特に、本発明のスクリーニング方法で使用する幹細胞としては、経済的及び効率的観点からは既に樹立されて入手容易な適当な幹細胞株を使用することが好ましい。これに対して、「体細胞」とは、多細胞生物における生殖細胞以外の全ての種類の細胞を意味する。
【００３６】
以上の各測定に使用する材料及び器具・装置などは当業者に容易に入手可能であり、各測定操作の手順・条件等は、使用する器具・装置に添付のマニュアルに従うか、又は、使用する細胞の種類等のその他条件に応じて適宜設定することが出来る。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法は、低線量放射線被ばくした幹細胞においてＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現の増大が関与してアポトーシスが誘導されることを利用し、低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する物質をスクリーニングするものである。従って、スクリーニングの対象となる被検物質の幹細胞に対する影響は、それらが何等かの態様で互いに作用することが出来る状態を設けることによって観察することが可能であり、その具体的な方法に特に制限はない。例えば、被検物質と幹細胞を共培養すること等によって共存せしめ、そこに低線量放射線を照射する工程、又は幹細胞に低線量放射線を照射した後に、該被ばく細胞の培養培地に被検物質を添加すること等によって、該被ばく細胞に被検物質を接触させる工程などがある。従って、被検物質が低線量放射線誘導性の細胞アポトーシスを阻害する活性を有する場合には、低線量放射線被ばくした幹細胞においては上記遺伝子の発現の増大が抑制されることが予想される。
【００３８】
本発明の幹細胞における低線量被ばくの検出マーカーは、ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ及び／又はＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現産物からなり、これは当業者に公知の任意の形態、分子でありえる。例えば、該遺伝子の発現産物とは、該遺伝子のｍＲＮＡ，ｃＤＮＡ，若しくは、それらの部分塩基配列を含む核酸分子、又は、該遺伝子がコードする蛋白質を含む。尚、これらの検出マーカーは、既に記載したような当業者に公知の方法で容易に測定することが出来る。例えば、実施例にあるように、ＨｉＣＥＰ法で検出される検出マーカーとしては、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の部分塩基配列である配列番号１を含む核酸分子を挙げることが出来る。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の技術的範囲を何等限定するものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することが可能である。
【００４０】
細胞とその培養法
Ｅ１４細胞（ノックアウトマウス作出用に世界中中で最も広く使用されているＥＳ細胞株の一つ。エジンバラ大学のDr. M Hooper 研究室にて保管され、希望により分与可能）は、15% KSR (GIBCO), 6 mM L-glutamine, 100 μM 2-mercaptoethanol (2-ME) 及び500 unitsの白血球阻害因子(LIF, CHEMICON, Temecula, CA) を添加したKO-DMEM (GIBCO, Gaithersburg, MD) で培養した。ＭＧ１．１９細胞は10% FCS, 4 mM L-glutamate, 非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、100 μM 2-ME 及び1,000 unitsの白血球阻害因子を添加したGMEM (GIBCO)で培養した。マウスｐｒｅＢ４６−６細胞は10% FCS及び50 μM 2-ME添加のRPMI1640 (SIGMA, St Louis, MO) で維持した。ＭＥＦ／３Ｔ３細胞はクローンテック社(Palo Alto, CA)から購入し、10% FCS及び 4 mM L-glutamate添加のＤＭＥＭ培地で培養した。
【００４１】
尚、ＭＧ１．１９細胞は理研・丹羽仁史先生より分与された（Niwa H, Miyazaki J and Smith AG, Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genetics  24, 372 - 376 (2000)参照）。又、マウスｐｒｅＢ４６−６は国立感染症研究所・竹森利忠先生より分与された（Takemori T, Miyazoe I, Shirasawa T, Taniguchi M and Graf T, A temperature-sensitive mutant of Abelson murine leukemia virus confers inducibility of IgM expression to transformed lymphoid cells. EMBO J. 6, 951-956(1987)参照）。
【００４２】
低線量放射線照射
各艇線量放射線の照射（又は、偽照射）にはＸ線発生装置（200 kV, 20mA, Pantak HF-320;Shimazu, Kyoto, Japan）を使用した。線量はＸ線量計model C-110, AE-1321M, OYOGIKEN Co., Japan) を使用して測定した。
【００４３】
ＨｉＣＥＰ解析
ＨｉＣＥＰ法は既報告文献（７）に若干の修正を加え、総ＲＮＡ量1.0 μgで２回ずつ実施した。即ち、SuperScriptIII First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、該製造者のプロトコールに従い、5.0μl 反応容量で一本鎖ＤＮＡを合成した。50 mM Biotin-d(T)18 (0.25μl), 10 mM dNTP(0.25μl)及び2μl RNA溶液を慎重に混合し、その後、６５℃で５分間インキュベートした。直ちに、氷上で３分間冷やした。製造者マニュアルに記載されている緩衝混合液2.5μlを加えて十分に混合し、５０℃で６０分間維持し、その後、８５℃で５分間維持した。これらの全ての操作は200μl試験管内で実施した。この一本鎖ＤＮＡ合成後の反応工程は、上記文献（７）に記載のとおりに実施した。修正点としては、既報告にあるエタノール沈殿工程に代えて、磁気ビーズ技術（Dinabeads M-280 Streptavidin; Veritas, Oslo, Norway）を使用したことである。
【００４４】
定量的ＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲは既報告文献（８）の記載に従い実施した。即ち、Ｅ１４細胞から調製した全ＲＮＡをDnase(Invitrogen)で処理し、SuperScriptIII First Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて、これから一本鎖ｃＤＮＡを合成した。反応にはオリゴd(T)18 プライマーを使用した。リアルタイムＰＣＲは、FG, SYBER GREEN PCR MASTER MLX (Applied Biosysteems, Foster City, CA) を用いて行い、ABI PRISM 7700(Applied Biosysteems)で分析した。各試料の結果は、グリッセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素(GAPDH)の発現レベルに対して標準化した。ＰＣＲ条件は、95.0℃で10分間、95.0℃で15秒間を50サイクル、60.0℃で30秒間、及び、78.0℃で40秒間であった。
【００４５】
このリアルタイムＰＣＲに使用した各プライマーの配列は以下のとおりである。
Ppp1ca: Sense, 5'- AACTACTGTGGAGAGTTTGA -3' （配列番号１）
Antisense, 5'- AGAAGGGCAGCACATGGAAG -3'（配列番号２）
Bad:    Sense, 5'- GGGATGGAGGAGGAGCTTAG -3'（配列番号３）
Antisense, 5'- CCCACCAGGACTGGATAATG -3'（配列番号４）
Bcl-xL: Sense, 5'- GCGTGTCTGTATTTATGTGT -3'（配列番号５）
Antisense, 5'- GCACTTTCACCTTCACACAA -3'（配列番号６）
GAPDH:  Sense, 5'- GAGGCCGGTGCTGAGTATGTCGT -3'（配列番号７）
Antisense, 5'- GGTGGTGCAGGATGCATTGCTG -3'（配列番号８）
【００４６】
ウェスタンブロット法
尚、ウェスタンブロット法は既報告文献（９）の記載に従い実施した。即ち、まず、試料を溶解緩衝液（10% グリセロール、5% ドデシル硫酸マトリウム、50 mM DTT、62.5 mM Tris-HCl, pH6.8）中で沸騰処理し、15% SDS-PAGE 上で電気泳動させ、その後、タンパク質をImmunoBlot PVDF 膜(BioRAD, Hercules, CA) に電気的に移動させた。膜を0.1 % Tween 20含有のTris 緩衝食塩水(TBST)で洗浄した。5%非脂肪ミルク含有TBSTで膜を1時間ブロック処理し、第一次抗体（抗ＰＰＰ１ＣＡウサギポリクローナル抗体、又は、抗カスパーゼ−３ウサギモノクローナル抗体：Cell Signaling, Beverly, MA）と共に、４℃で一晩インキュベートした。尚、第一次抗体は全て、3%ウシ血清アルブミン含有TBSTで１０００倍に希釈して使用した。この第一次抗体による処理後、膜をTBSTで３回洗浄し、１０００倍に希釈した、抗ラビットIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体 (DAKO, Glostrup, Denmark) と反応させてＰＰＰ１ＣＡ及び抗カスパーゼ−３を検出するか、又は、１０００倍に希釈した、抗マウスIgG−西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合体(DAKO, Glostrup, Denmark) と反応させてα-チューブリンを検出した。これら第二次抗体との反応は室温で１時間おこなった。その後、膜をTBSTで３回洗浄し、SuperSignal West Dura Extended duration substrate 試薬(PIERCE, Rockford, IL)を用いてシグナルを検出した。定量的測定はLightCapture(AE-6960, ATTO, Tokyo, Japan)を用いて実施した。
【００４７】
カスパーゼ活性のin situ アッセイ
Ｅ１４細胞は放射線照射の２時間後に回収し、カスパーゼの活性型とのみ結合する蛍光カスパーゼ阻害剤(FITC-VAD-FMK: Promega, Madison, WI)と共に２０分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで洗浄して余分なプローブを除き、10% 緩衝ホルマリン溶液を用いて３０分間固定した。この細胞をLumina Vision ソフトウェアを用いる蛍光顕微鏡(Mitani, Tokyo, Japan)で直接解析した。
【００４８】
TUNEL染色
TUNEL試験はIn Situ Cell Death Detection Kit (Roche Applied Science, Indianapolis,IN)を使用して製造者のプロトコールに従い実施した。この細胞を蛍光顕微鏡で直接解析した。尚、各試料ポイントについて、2,500個以上の細胞を調査した。
【００４９】
結果及び考察（１）
ＨｉＣＥＰ法を用いることによって、マウスES細胞であるＥ１４において検出される22,000のシグナルの中から、5, 10, 25,50,100, 250 及び500 ｍＧｙの低線量域の放射線照射の１時間後に発現が増加する唯一の断片（１８８ｂｐ：配列番号９）を見出し、この断片はＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の塩基配列に由来するものであることを確認した。小文字で書かれた部分がHiCEP法で用いられる共通のアダプター配列であって、大文字部分が実際の遺伝子の配列である。
【００５０】
（配列番号９）
actcggttcatgacaCGGAGGCCGGCCCATCACTCCACCCCGCAATTCTGCCAAAGCCAAGAAATAGCCTCCATGTGCTGCCCTTCTGCCCCAGATCGTTTGTACAGAAATCATGCTGCCATGGGTCACACTGGCCTCTCAGGCCCACCCGTCACGGGGAACACACAGCGTTAcgcagtaggacgcct
【００５１】
ＨｉＣＥＰ法を用いて、上記低線量域の放射線照射の１時間後に測定した、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子、ｐ２１遺伝子（放射線誘導性遺伝子として知られている）、及びＧａｄｄ４５遺伝子（急性ガンマ線照射応答性）の相対発現強度を求めた。図１（Ａ）に示されるように、５ｍＧｙの極低線量域においても、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の転写物（黒バー）が増加（約１．５８倍）しているのに対して、ｐ２１遺伝子の転写物（白バー）は上記低線量域のいずれにおいて誘導されないことが判明した。Ｇａｄｄ４５遺伝子についても同様であった。因みに、放射線照射の３時間後では、１００ｍＧｙより高い領域ではｐ２１遺伝子の発現が誘導され、これは以前に報告されている結果に一致した（１２）。
【００５２】
又、５Ｇｙ及び１０Ｇｙの線領域の放射線照射の場合には、１時間又は３時間後においてもＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の発現は見られなかった。更に、上記の低線量域におけるＰＰＰ１ＣＡ遺伝子の発現の誘導（増加）の程度は、照射１時間後のほうが照射３時間後よりも大きいものであり、このような応答が非常に迅速なものであることが分かった。これは、高線量放射線による誘導が照射の３時間後までは殆ど観察されないこと（２０）と対照的である。
【００５３】
更に、ウェスタンブロット法を用いて、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子産物及びα−チューブリンの発現量を測定したところ、５ｍＧｙの照射において、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子産物の１．４４倍の発現誘導が認められた。これに対して、このような低線量域ではα−チューブリンには発現誘導は起こらなかった（図１Ｂ）。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）を用いて測定したところ、５ｍＧｙの線量照射において、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子産物の発現量が１．４４に増加したことが示された。内部標準であるα−チューブリンの発現産物量には変化がなかった。以上の結果を図１（Ｂ）に示す。
【００５５】
結果及び考察（２）
更に、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）を用いて、５ｍＧｙ〜１０００ｍＧｙの線量域の照射１時間後のＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びｐ２１各遺伝子の発現量を測定した。その結果、５ｍＧｙの低線量域において、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子に加えて、ＢＡＤ遺伝子及びＢＣＬ−ＸＬ遺伝子の発現も増加していることが確認された（図２）。以上の結果は、低線量の放射線を照射された幹細胞でアポトーシスが誘発されていることを示唆するものである。
【００５６】
結果及び考察（３）
そこで、まず、アポトーシスにおいて重要な役割を担うカスパーゼファミリーの一種であるカスパーゼ３（１４）の活性型であるペプチド（１７ｋＤａ）の発現をウェスタンブロット法により測定したところ、５ｍＧｙ及び１０ｍＧｙの低線量放射線への被ばくによって、それら活性型ペプチドが発現していることが観察された（図３Ａ）。又、カスパーゼの活性型とのみ結合する蛍光カスパーゼ阻害剤(FITC-VAD-FMK)を用いるin situ アッセイにより測定したところ、同様に、カスパーゼ活性が、５ｍＧｙ及び１０ｍＧｙの低線量放射線への被ばくによって有意に増加することが確認された（図３Ｂ，Ｃ）。
【００５７】
結果及び考察（４）
更に、ゲノムＤＮＡの断片化を検出するために、TUNEL（TdT-mediated dUTP nick-end labeling）アッセイ（染色）（１５）により、低線量域照射を受けたＥＳ細胞である、マウスＥＳ細胞である、Ｅ１４細胞、ＭＧ１．１９細胞及びＲ１細胞について検査した。その結果、これら３種類のＥＳ細胞に共通して、５ｍＧＹ及び１０ｍＧｙの低線量放射線照射においてアポトーシスが観察された（図４、Ａ）。このアポトーシス誘導は２５０ｍＧｙで顕著に低下し、５００ｍＧｙ以上の線量域で再び観察された（図４、Ａ）。
【００５８】
尚、Ｒ１細胞はDivision of Molecular and Developmental Biology, Samuel Lumenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, Toronto, ON, Canada.(http://www.mshri.on.ca/nagy/）から分与された（Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder JC. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A 1993;90:8424-8428参照）。
【００５９】
結果及び考察（５）
次に、このような低線量域における放射線照射によるアポトーシスの誘導が幹細胞に特異的か否かを検討すべく、マウスｐｒｅＢ（４６−６）細胞及びマウス繊維芽細胞（ＭＥＦ／３Ｔ３についても同様な実験を行った。その結果、５ｍＧＹ〜１０ｍＧｙの低線量域ではこれら細胞においてアポトーシスの誘導は観察されなかったが、５Ｇｙではアポトーシスの誘導が見られた（図４、Ｂ）。これは、以前に報告された結果と一致する（１６）。
【００６０】
以上の結果から、ＥＳ細胞に置いて観察されたアポトーシスは低線量域における放射線照射に特異的なものであることが判明した。尚、これまでに、腸管幹細胞において、このような低線量域放射線によるアポトーシスが報告されている（１７）。
【００６１】
尚、本明細書中で括弧内の数字で引用した公知文献は以下の通りである。
1. Brenner DJ, Doll R, Goodhead DT, et al. Cancer risks attributable to low doses of ionizing radiation: assessing what we really know. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:13761-13766.
2. Kawaura C, Aoyama T, Koyama S, et al. Organ and Effective Dose Evaluation in Diagnostic Radiology Based on in-Phantom Dose Measurements with Novel Photodiode-Dosemeters. Radiat Prot Dosimetry 2006;26:26.
3. Clarke R. Control of low-level radiation exposure: time for a change? J Radiol Prot 1999;19:107-115.
4. Rothkamm K, Lobrich M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:5057-5062.
5. Amundson SA, Lee RA, Koch-Paiz CA, et al. Differential responses of stress genes to low dose-rate gamma irradiation. Mol Cancer Res 2003;1:445-452.
6. Fujimori A, Okayasu R, Ishihara H, et al. Extremely low dose ionizing radiation up-regulates CXC chemokines in normal human fibroblasts. Cancer Res 2005;65:10159-10163.
7. Fukumura R, Takahashi H, Saito T, et al. A sensitive transcriptome analysis method that can detect unknown transcripts. Nucleic Acids Res 2003;31:e94.
8. Karsai A, Muller S, Platz S, Hauser MT. Evaluation of a homemade SYBR green I reaction mixture for real-time PCR quantification of gene expression. Biotechniques 2002;32:790-792, 794-796.
9. Takahashi H, Umeda N, Tsutsumi Y, et al. Mouse dexamethasone-induced RAS protein 1 gene is expressed in a circadian rhythmic manner in the suprachiasmatic nucleus. Brain Res Mol Brain Res 2003;110:1-6.
10. Garcia A, Cayla X, Guergnon J, et al. Serine/threonine protein phosphatases PP1 and PP2A are key players in apoptosis. Biochimie 2003;85:721-726.
11. Gupta M, Gupta SK, Balliet AG, et al. Hematopoietic cells from Gadd45a- and Gadd45b-deficient mice are sensitized to genotoxic-stress-induced apoptosis. Oncogene 2005;24:7170-7179.
12. Ding LH, Shingyoji M, Chen F, et al. Gene expression profiles of normal human fibroblasts after exposure to ionizing radiation: a comparative study of low and high doses. Radiat Res 2005;164:17-26.
13. Ayllon V, Cayla X, Garcia A, et al. The anti-apoptotic molecules Bcl-xL and Bcl-w target protein phosphatase 1alpha to Bad. Eur J Immunol 2002;32:1847-1855.
14. Woo M, Hakem A, Elia AJ, et al. In vivo evidence that caspase-3 is required for Fas-mediated apoptosis of hepatocytes. J Immunol 1999;163:4909-4916.
15. Griffin C, Waard H, Deans B, Thacker J. The involvement of key DNA repair pathways in the formation of chromosome rearrangements in embryonic stem cells. DNA Repair (Amst) 2005;4:1019-1027.
16. Voehringer DW, Hirschberg DL, Xiao J, et al. Gene microarray identification of redox and mitochondrial elements that control resistance or sensitivity to apoptosis. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:2680-2685.
17. Potten CS. Radiation, the ideal cytotoxic agent for studying the cell biology of tissues such as the small intestine. Radiat Res 2004;161:123-136.
18. Amundson SA, Fornace AJ, Jr. Gene expression profiles for monitoring radiation exposure. Radiat Prot Dosimetry 2001;97:11-16.
19. Bucca G, Carruba G, Saetta A, et al. Gene expression profiling of human cancers. Ann N Y Acad Sci 2004;1028:28-37.
20. Sugioka R, Shimizu S, Funatsu T, et al. BH4-domain peptide from Bcl-xL exerts anti-apoptotic activity in vivo. Oncogene 2003;22:8432-8440.
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明の方法又はバイオマーカーを使用することによって、生態の放射線に対する防御機能レベルの評価、防護服や遮断材等の放射線防護システムの評価を行うことが出来る。更に、職業被ばく又は検査被ばく等の被ばく線量を判定したり、被ばく線量限界を推定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】Ａは、ＨｉＣＥＰ法を用いて、低線量域（〜５００ｍＧｙ）の放射線照射の１時間後に測定した、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子（黒バー）及びｐ２１遺伝子（白バー）の相対発現強度（Ｙ軸）の結果を示す。相対強度は０Ｇｙにおける強度を「１」としてを求めた。Ｂは、ＰＰＰ１ＣＡ遺伝子産物（タンパク質）をウェスタンブロット法を用いて測定した結果を示す。尚、比較としてα−チューブリンを内部標準として用いた。
【図２】リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ）を用いた、５ｍＧｙ〜１０００ｍＧｙの線量域の照射１時間後の各遺伝子の発現量を示す（各線量値において、左側から順に、ＰＰＰ１ＣＡ，ＢＡＤ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びｐ２１各遺伝子の発現量を示す）。尚、個別に調製した細胞を使用して４回の実験を繰り返し、同様の結果を得た。
【図３−１】ウェスタンブロット法によりカスパーゼ３の活性型であるペプチド（１７ｋＤａ）の発現を測定した結果を示す（Ａ）。４回の独立した実験を行った。又、カスパーゼの活性型とのみ結合する蛍光カスパーゼ阻害剤(FITC-VAD-FMK)を用いるin situ アッセイにより得られた蛍光顕微鏡写真（Ｂ）である。
【図３−２】０Ｇｙにおけるカスパーゼ３の活性を「０」としたときの、蛍光の相対強度（Ｘ軸）を標準偏差（４回の独立実験）と共に示したものである（Ｃ）。
【図４】TUNEL（TdT-mediated dUTP nick-end labeling）アッセイによる、低線量域照射を受けたＥ１４細胞（白バー）、Ｒ１細胞（黒バー）及びＭＧ１．１９（灰色バー）細胞におけるアポトーシスの誘導について測定結果を標準偏差（夫々、５回、７回、及び４回の独立実験）と共に示したものである。各線量照射における１回の実験に2,500個以上の細胞を使用した。同様な実験をマウスｐｒｅＢ（４６−６）細胞（白バー）及びマウス繊維芽細胞（ＭＥＦ／３Ｔ３）（黒バー）について行った結果を示す（Ｂ）。
【図１】
2008173034.tif 000003
【図２】
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【図３−２】
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【図４】
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【図３−１】
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【配列表】
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