(57)【要約】【課題】    冠動脈再狭窄を予防し、血管内の内皮を温存できる血管内皮温存化組成物の提供。【解決手段】  PDGF−A鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存を用いることで、血管平滑筋細胞の異常な増殖を抑制し、血管内の内皮を温存することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物。
【請求項２】
さらに、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
誘導体は、フォスフォロチオエート型に化学修飾したものである請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物を含むステント塗布剤。
【請求項５】
血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物又はこれを含むステント塗布剤を塗布した薬剤溶出ステント。
【請求項６】
血管内皮温存化組成物又はこれを含むステント塗布剤が、ハイドロゲルによりコーテイングされている請求項５に記載の薬剤溶出型ステント。
【請求項７】
血管内の内皮を温存する方法であって、血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を患部に投与することからなる冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
【請求項８】
冠動脈再狭窄が、ステント留置後のものである請求項７に記載の冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
【請求項９】
投与が、血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体がコーテイングされたステントにより行う冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、冠動脈再狭窄を予防し、さらに血管内の内皮を温存できる血管内皮温存化組成物に関する。更に詳しくは、血小板由来成長因子−A鎖(以下単にPDGF−A鎖)に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物に関する。そして、この血管内皮温存化組成物をステント塗布剤等に用いることによる冠動脈再狭窄の予防又は治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療として、経皮的冠動脈形成術でのバルーン又はステントによって冠動脈を広げる方法が行われている。この方法は効果が高い反面、バルーンやステントの挿入により血管内皮に損傷が起こり、その損傷箇所において血管平滑筋細胞が異常に増殖することによって、冠動脈再狭窄が起こりやすいという問題があった。
近年、冠動脈再狭窄を防ぐために、ステントに抗凝固剤、抗血小板物質、抗腫瘍薬、抗炎症、免疫抑制剤等の薬剤を塗布した薬剤溶出性ステントが開発され、その効果が検討され、臨床応用が開始された（例えば、特許文献1参照）。
【０００３】
なかでも、免疫抑制剤であるシロリムス（商品名ラパマイシン）を塗布した薬剤溶出性ステント（例えば、特許文献2参照）は、米国で多用されており、近年、日本においても認可を受け、平成16年より臨床応用が開始された。
シロリムスは細胞周期をG1期で強制的に止め、血管平滑筋細胞の増殖を抑制するため、シロリムス塗布薬剤溶出性ステント(登録商標、CYPHER)は、強力に血管内の細胞の増殖を抑え、冠動脈再狭窄を予防する効果がある。大規模臨床試験では、ステント留置半年後の冠動脈再狭窄率が、従来のステントを使用した場合に比べ再狭窄率が4分の1以下に激減したという報告が得られている（例えば、非特許文献1、2参照）。
【０００４】
しかし、シロリムスは細胞周期を停止させる薬剤であるため、血管平滑筋細胞だけではなく血管内皮細胞の増殖をも抑制してしまうことから、冠動脈再狭窄は予防できても、ステント内腔の内皮を温存することはできず、ステントの金属面は露出してしまう問題がある。
この薬剤溶出ステントを使用する場合、治療後3ヶ月以上の抗血小板薬である塩酸チクロピジンの服用が必要であり、この服用期間は従来のステントを使用した場合の約3倍にあたる。
また2003年までにシロリムス塗布薬剤溶出ステントを留置した患者において米国Food  and  Drug  Administration（FDA）へ約300例の亜急性血栓症(subacute  thrombosis,  SAT)があり、そのうち60例が死亡に至ったと報告され、FDAは緊急安全性情報としてシロリムス塗布薬剤溶出ステント装着においてSATを充分注意するよう勧告を出した（例えば、非特許文献3参照）。さらに、塩酸チクロピジンには重い肝臓障害や、白血球、血小板の減少という副作用があり、長期の服用による副作用の危険性も心配される。
そこで、冠動脈再狭窄を予防し、さらに血管内の内皮細胞の増殖を維持し、内皮を温存でき、副作用の危険性が低い組成物の提供が望まれている。
【特許文献１】特表平5−502179号公報
【特許文献２】特開平6−9390号公報
【非特許文献１】Regar E, Serruys PW, Bode C, Holubarsch C, Guermonprez JL, Wijns W, Bartorelli A, Constantini C, Degertekin M, Tanabe K, Disco C, Wuelfert E, Morice MC; RAVEL Study Group. Circulation. 106:1949-1956, 2002.
【非特許文献２】Cohen DJ, Bakhai A, Shi C, Githiora L, Lavelle T, Berezin RH, Leon MB, Moses JW, Carrozza JP Jr, Zidar JP, Kuntz RE; SIRIUS Investigators. Circulation. 110:508-514, 2004.
【非特許文献３】FDA public health web notification: Food and Drug Administration. 2003. Available at: 1113809079625_0.%20Accessed March  12, 2004.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は冠動脈再狭窄を予防し、さらに血管内の内皮細胞の増殖を維持し、内皮を温存できる血管内皮温存化組成物の提供を課題とする。そして、この血管内皮温存化組成物を用いることによる冠動脈再狭窄の予防又は治療方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、PDGF−A鎖のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする組成物が、ステント等の挿入による、血管内皮の損傷に伴う血管平滑筋細胞の異常な増殖を特異的に抑制し、血管内の内皮を温存できることを見出した。
さらに、この血管内皮温存化組成物を、ステント塗布剤等に利用することにより、冠動脈再狭窄の予防又は治療に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、次の(1)〜(9)に関する。
(1)  血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物。
(2)  さらに、血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する上記(1)に記載の組成物。
(3)  誘導体は、フォスフォロチオエート型に化学修飾したものである上記(1)又は(2)に記載の組成物。
(4)  血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物を含むステント塗布剤。
(5)  血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする血管内皮温存化組成物又はこれを含むステント塗布剤を塗布した薬剤溶出ステント。
(6)  血管内皮温存化組成物又はこれを含むステント塗布剤が、ハイドロゲルによりコーテイングされている上記(5)に記載の薬剤溶出型ステント。
(7)  血管内の内皮を温存する方法であって、血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を患部に投与することからなる冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
(8)  冠動脈再狭窄が、ステント留置後のものである上記(7)に記載の冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
(9)  投与が、血小板由来成長因子−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体がコーテイングされたステントにより行う冠動脈再狭窄の予防又は治療方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の血管内皮温存化組成物は、血管平滑筋細胞の増殖を特異的に抑制し、かつ血管内皮細胞の増殖が維持され、血管内の内皮を温存することができる。この血管内の内皮の温存により、狭心症や心筋梗塞等における冠動脈再狭窄の予防又は治療を行うことができ、根本的な疾病の回復を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の「血管内の内皮の温存」とは、血管内における血管内皮の損傷に伴う、血管平滑筋細胞の過剰増殖を抑制することで、血管内皮細胞の増殖が維持し、血管内の内皮を温存することをいう。
本発明の血管内の内皮の温存により、血管平滑筋細胞の過剰増殖を主な原因とする、心臓、脳等の器官における疾患、特に血管の狭窄、再狭窄に関する全ての疾患において、その治療や予防に用いることができる。血管平滑筋細胞の過剰増殖を主な原因とする疾患の例としては、例えば、狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療における冠動脈再狭窄が挙げられる。
【００１０】
本発明の予防又は治療の対象のひとつとなる冠動脈再狭窄とは、主に血管内皮の損傷に伴い、血小板が凝集し血小板由来成長因子(以下、単にPDGFということがある)を含む増殖因子を放出し、中膜平滑筋細胞が内膜側に遊走する、また流血中の血管芽細胞が修復機転として内膜側に血管平滑筋細胞として増殖し新生内膜形成を起こす過程を経て、血管平滑筋細胞の異常な増殖による血管の閉塞のことをいう。
従って、この冠動脈再狭窄を予防又は治療するためには、血管平滑筋細胞の異常な増殖を特異的に抑制し、血管内皮細胞の増殖が維持されることで、血管内の内皮を温存することが必要となる。
本発明の「血管平滑筋細胞の増殖抑制作用」とは、血管平滑筋細胞の増殖に関与するPDGFの作用を妨げることで、血管平滑筋細胞の増殖を特異的に抑制することをいい、これにより、血管内皮細胞の増殖が維持されることで、血管内の内皮を温存することができる。
【００１１】
本発明の「PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、PDGF−A鎖の発現を抑制するためのPDGF−A鎖の塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドのことをいう。
PDGF−A鎖の発現を抑制するためには、PDGF−A鎖の転写開始コドンに相補的な配列を含むことが好ましい。この配列を含み、さらにPDGF−A鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドであることが好ましく、PDGF−A鎖の塩基配列に相補的な塩基配列であれば、その全体又はいずれかの断片を用いてもよい。特に長さが15〜17塩基程度の断片が取り扱いやすく好ましい。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、例えば配列表配列番号1のオリゴヌクレオチドが挙げられる。
これらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばキアゲン社、プロリゴ社等の合成受託業者によって合成したものを用いることができる。オリゴヌクレオチドの塩基はDNAでもRNAでもいずれでもよい。
【００１２】
本発明の「PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体」とは、PDGF−A鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにおいて、その安定性を高めるために、オリゴヌクレオチドに含まれる1つ以上の塩基の原子を化学的に修飾したもののことをいう。例えば、フォスフォロチオエート体、モルフォリノ体等が挙げられ、このようなオチゴヌクレオチドの誘導体は、核酸分解酵素に耐性となり、安定性が高く、組織や生体内で核酸分解酵素に耐性となり、吸収が良くなり投与量が少なくてすむ。
本発明のPDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体は、血管平滑筋細胞増殖を抑制し、かつ血管内の内皮細胞を温存するものであればそのまま用いることもできるが、安定化剤等の製薬上許容される添加物等と共に組成物として用いることもできる。
【００１３】
本発明者らは、本発明の「PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体」が血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有することを、血管平滑筋細胞を用いたin  vitroの実験で確認している。（例えば、Fukuda N, Kubo A, Watanabe Y, Nakayama T, Soma M, Izumi Y, Kanmatsuse K: Antisense oligodeoxynucleotide complementary to platelet-derived growth factor A-chain messenger RNA inhibits the arterial proliferation in spontaneously hypertensive rats without alterating their blood pressure. J Hypertens 15: 1123-1136, 1997.）
【００１４】
本発明の「血管内皮温存化組成物」とは、PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする組成物をいい、必要に応じて製薬的に許容される安定化剤等の添加物を加えた組成物のことをいう。
添加物としては、リポフェクチン、リポフェクタミン、ポリエチレネミン、HVJ―エンベロープ等を利用できるが、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を安定に保存する上で特にポリエチレネミンを利用することが好ましい。
本発明の「血管内皮温存化組成物」は血管平滑筋細胞増殖を抑制し、かつ血管内の内皮細胞を温存するものであればいずれの医薬組成物、医薬品、医療器具にも用いることができる。
例えば血管の再狭窄を予防又は治療する場合には、対象となる部位、薬剤送出の態様等に応じて、ステント塗布剤の有効成分として用いる以外に、カテーテルや注射用の医薬組成物等の有効成分として用いることもできる。
【００１５】
本発明の「ステント塗布剤」とは、PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とする内皮温存化組成物と、製薬的に許容される担体等を組み合わせ、ステントに塗布できるように調製した薬剤のことをいう。
製薬的に許容される担体は、固体でも液体でも利用できる。例えば、固体担体として、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、デキストリン、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びポリビニルピロリドン等の添加物を用いることができる。また、液体担体として、水、添加剤を部分的に含有した溶液、アルコール類及びそれらの誘導体、油脂類や有機溶媒等を用いることができる。
【００１６】
これらの担体と血管内皮温存化組成物を組み合わせ、さらに必要に応じてセルロース、グリセリン脂肪酸エステル、リン酸カルシウム等の賦形剤と混合し、打錠したり、粉末、顆粒、カプセル、チュアブル等の形態や、クリーム、軟膏、ペースト、ゲル、粘調液体のような形態にしたりしてもよい。固体状に形成したステント塗布剤は、ステントへの塗布時に塗布しやすいように、液体状やクリーム状に調製して用いることもできる。
【００１７】
本発明の「薬剤溶出ステント」とは、ステントに塗布した薬剤が血管内壁に溶け出し、血管平滑筋細胞の異常な増殖を抑制することで、血管内皮細胞の増殖が維持され、血管内の内皮を温存しつつ、冠動脈再狭窄を予防する効果を有するステントのことをいう。
本発明の薬剤溶出ステントは、PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を有効成分とするステント塗布剤を用いることが好ましく、例えば、3.5mm×20mmのステントを用いた場合、ステント１つあたり、ステント塗布剤を10μg〜100μg、好ましくは100μg塗布したものを用いることが好ましい。
【００１８】
本発明のステント塗布剤を塗布するステントとしては、血管内に挿入されて治療又は予防の対象となる場所に保持され、血管の膨張を伴い、薬剤を溶出できるステントであれば、いかなるステントも用いることができる。さらに、金属製ステントの場合、少なくとも金属部分を覆う薬剤の担持被覆が可能なステントを用いることが好ましい。  
【００１９】
本発明のステント塗布剤をステントに塗布する方法としては、ハイドロゲルコーティング、ゼラチン等が挙げられ、例えばハイドロゲルコーティングにより塗布することができる。
【００２０】
「PDGF−A鎖に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を患部に投与する」とは、例えば、本発明の薬剤溶出ステントを、冠動脈再狭窄の予防又は治療の対象となる部位に挿入し、ステントに塗布した薬剤が徐々に血管内壁に溶け出し、局所的に作用するようにステントを留置することをいう。この患部への投与は、ステント以外にも、注入、カテーテル挿入、注射により行うことができ、る。
本発明の薬剤溶出ステントの投与経路は、挿入部位は患者の症状の程度によって異なるが、例えば静脈内投与によって、冠動脈再狭窄を予防又は治療できる部位に留置することができる。
また、この薬剤溶出ステントは、薬剤の塗布量にもよるが、挿入後1〜60日間、血管平滑筋細胞の異常な増殖の抑制作用を有する。
【００２１】
このように、本発明の血管内皮温存化組成物を用い、血管平滑筋細胞の過剰増殖を抑制することで、狭心症や心筋梗塞等の虚血性心疾患の治療における冠動脈再狭窄について血管内皮細胞の増殖が維持され、血管内の内皮を温存することができる。さらに、本発明の血管内皮温存化組成物を有効成分とするステント塗布剤を用い、これを塗布した薬剤溶出ステントを用いることで、冠動脈再狭窄の予防又は治療をすることができる。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。
【実施例１】
【００２２】
＜血管内皮温存化組成物の作成＞
１．アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
ヒト及びラットのPDGF−A鎖の配列より、開始コドンの相補的な塩基配列を中心に含み、前後の配列も合わせて全長15塩基となるようにアンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligodeoxynucleotides、以下単にODN）を設計した。ODNをApplied  Biosystems  DNAシンセサイザ394（Foster社）を用いて合成を行い、OPCカラム（Applied  Biosystems社）によって精製した。精製したアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列は配列表配列番号１に記載した。
得られたODNを3H−1,2−benzodithiol−3−one 1,1−dioxideのリン酸結合の酸化によってフォスフォロチオエート体として修飾した。
２．血管内皮温存化組成物の作成
血管内皮温存化組成物は次の方法により作成した。
1) 上記で調製したアンチセンスオリゴヌクレオチドを生理食塩水に溶解した、アンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（１μg/μl）を原液として用い、生理食塩水で希釈してアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液（50μg/1.25ml）を調製し、A液とした。
2) ポリエチレネミン（ExGen500）を生理食塩水に溶解したポリエチレネミン溶液（10μl/50μl）を原液として用い、生理食塩水で希釈してポリエチレネミン溶液（250μl/1.25ml)を調製し、B液とした。
3）B液をA液に加え、10秒間ボルテックス下後、10分間室温でインキュベートした。
4) 得られた溶液を基質液に混ぜ、血管内皮温存化組成物とした。
【実施例２】
【００２３】
＜ステント塗布剤の作成＞
上記で調製した血管内皮温存化組成物100μgに、ハイドロゲル（ニチバン社製）を100μg混ぜ合わせ、ステント塗布剤を作成した。
【実施例３】
【００２４】
＜薬剤溶出ステントの作成＞
上記で調製したステント塗布剤を、ステント（ジェンティア・バイオシステムズ社製）に塗布し、薬剤溶出ステントを作成した。
ステントへのステント塗布剤の塗布は、次の方法により行った。操作はいずれも無菌状態で行った。  
1)  チューブ（2.5mlのアンチセンス＋ポリエチレネミンの溶液を含む）にステントを入れる。
2)  ステントを完全に浸した後、ステントをチューブから出して、空気乾燥させた。
3)  ステントを完全に乾かした後、もう一回チューブに入れる。
4)  以上の工程を6回繰り返す。
5)  ステントを完全に浸した後、ステントをチューブから出して、空気乾燥させる。
6)  ステントを完全に乾かした後、もう一回チューブに入れる。
以上の工程を6回繰り返し、薬剤溶出ステントを作成した。
【実施例４】
【００２５】
＜薬剤溶出ステントを用いた血管内の内皮の温存の検討＞
【実施例５】
【００２６】
＜薬剤溶出ステントを用いた冠動脈再狭窄の防止の検討＞
24匹の雄ブタ（BW:25〜28kg:procedure success=100％）をコントロール、対照、本発明用の3群に分け、上記に記載の方法で作成した薬剤溶出ステントのうち、表1に記載の3種類のステントを各群にそれぞれ移植した。1群をコントロール群、2群を対照群、3群を本発明の群として用いた。
ステントの移植にあたり、各ブタに移植の１日前にアスピリン（325mg）を投与して1晩絶食させた後、前投薬として25mg/kgのペントバルビタールナトリウムを筋肉内注射し、続けて1mg/kg/hのケタミン塩化物を静脈注射することで麻酔をした。5000IUのボーラスとしてヘパリンを静脈注射した。
気管内挿管後、ボリューム・サイクルベンチレーター（Servo 900−E，Siemems−Elema Inc.製）の10〜15ml/kgの周期的な通気によって、コントロールされた機械的な通気を行った。6Fシースによって右頚動脈に挿入した。
【００２７】
【表１】
2008174450.tif 000002
【００２８】
<アンチセンスODNの分布の確認＞
ブタの冠動脈に移植されたFITC（fulorescein−isothiocyanate）でラベルされた100μgのアンチセンスODNがコートされている3群のステントにより、ステントに塗布されたアンチセンスODNの冠動脈中の分布を調べた。移植後24時間でブタから心臓を取り出し、さらにステントを含む冠動脈を取り出し、4％パラホルムアルデヒドで固定した後、蛍光顕微鏡でFITCの発光を確認することにより、アンチセンスODNが分布している部位を調べた。図1は発光確認前後のステントを含む冠動脈を示した図である。図1Aに示した上記冠動脈を蛍光顕微鏡によって発光確認したところ、図1Bに示したように、FITCラベルされたアンチセンスODNがステントから流出し、冠動脈の内皮細胞に分布したことが確認された。
【００２９】
＜ステント内再狭窄の血管造影法及びＩＶＵＳによる検出＞
上記の過程の間、血流と体表面心電図（ECG）のモニタリングを行った。標準の冠動脈造影の後、機械的な血管内超音波法（IVUS:登録商標Atlantis  40MHz、Boston Scientific Corporation）を左心房（anterior descending)(LAD）動脈中に行った。IVUSカテーテルを2秒間に0.5mmずつ自動的に後退し、解析のためにIVUSイメージをSVHSビデオに継続的に録画した。ステントの移植を示すために、IVUSのイメージから直径約3.0mmの断片を選んだ。10−12atmの膨張圧によってステント-動脈比が1.3:1に達した3.5mm×20mmのコートされたステントを用いた。ステント移植後、ステント動脈比を確かめるためにIVUSを速やかに行い、その比に達していない場合は、ステントが挿入された部位に高い圧で再びステントバルーンを膨らませた。
さらに、冠動脈造影とIVUSを28日後に行いし、ステントされた部位の冠動脈を病理解析のために取り出した。
【００３０】
結果
初期プロシージャ（initial procedure）におけるステント/動脈比は、1、2、3群においてそれぞれ1.31±0.05、1.32±0.13、1.37±0.10であった。これらは3群間の違いは見られなかった。図2は1群及び3群による内腔の存在の有無を示した図である。図2C、Eに示すように、1群において、閉塞による新生内膜が内腔を詰め込み（cram）、超音波カテーテルを取り囲んだ。一方で、図2A、Bに示したように3群にはとても明確な内腔が存在した。
冠動脈のステント中の再狭窄の容積比は1、2、3群においてそれぞれ63.7±11.9%、44.4±3.4%、25.5±3.8%であった。図3に示すように、ステント中の再狭窄の容積比は、1群、2群と比較して3群で著しく低かった。
【００３１】
<IVUS測定及び病理解析＞
SVHSテープに録画したIVUSイメージを3次元復元と容積測定のためのコンピューターによる輪郭（contour）検出プログラム（登録商標、NetraIVUS software package for Windows NT，ScImage Corporation,USA）によって解析した。IVUSイメージに記録されたクロスグリッド（cross grid）は目盛りとして用いられた。新生内膜と内腔の間の境界面、そして外の弾性膜の境界の外を手動で追跡した。手動追跡の基準として、測定パラメーターをコンピューターソフトによって次のように定めた。
LV:内腔volume、VV:vessel volume．
ステント中の再狭窄部分の容積比は（VV−LV)/VVにより求めた。
【００３２】
病理解析のために、各々のステントに沿って、中央（central）と先端（distal）の部分、隣接した（proximal）部分から1つずつ断片を切断した。それぞれの断片は約50μmの薄さにし、ヘマトキシンーエオシンで染色した。コンピューターによるイメージシステム（ImageJ 1.30）を次のパラメーターの病理解析に用いた。
IEL：internal elastic lamina
内腔領域はneointima−luminal borderによって制限された領域と定義され、neointima領域は内腔戸IELの間のエリアとして定義された。
ステント中の再狭窄はneointima領域/IEL領域として評価された。
血管内皮細胞の免疫組織化学的ラベリングは0.25％pepsin−HCl液による前処理と、1：250ウサギ抗vWfポリクローナル抗体（DAKO Diagnostika，Hamburg，Germany）により行った。解析によって得られた値はmean±SEで示し、変数の平均値はtwosided unpaired tテストによって比較した。P<0.05の値を有意であるとした。
【００３３】
結果
2群又は3群を留置した冠動脈の病理所見を図4に示した。図4Aに示したように2群のノンセンス ODNを塗布したステントを用いた場合に比べ、図4Bに示したように3群のアンチセンスODNを塗布したステントを用いた場合は再狭窄の形成を抑制した。
図5に1群又は3群におけるステントの中央（central）と先端（distal）の部分、隣接した（proximal）部分におけるステント中の再狭窄部分の面積比を示した。3群は1群と比較してステント中の再狭窄をproximal、central及びdistalのいずれにおいても削減することが確認できた。従って、フォスフォロチオエート型アンチセンスODNを塗布したステントを用いることにより、再狭窄が予防されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の血管内皮温存化組成物は、血管平滑筋細胞の増殖を特異的に抑制し、かつ血管内皮細胞の増殖が維持され、血管内の内皮を温存することができる。さらに、本発明の血管内皮温存化組成物を有効成分とするステント塗布剤、及び薬剤溶出ステントを用いることにより、この血管内の内皮の温存による狭心症や心筋梗塞等における冠動脈再狭窄の予防又は治療を行うことができ、根本的な疾病の回復を行うことができる。
この血管内皮温存化組成物を含む薬剤溶出ステントでは、塩酸チクロピジン等の服用は不要であるため、併用する薬剤による副作用の危険性がなくなる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】アンチセンスODNがステントから流出し、冠動脈の内皮細胞に分布したことを確認した図である（実施例5）。
【図２】冠動脈の内腔の存在の有無を示した図である（実施例5）。
【図３】冠動脈のステント中の再狭窄部分の容積比を示した図である（実施例5）。
【図４】冠動脈の病理所見を示した図である（実施例5）。
【図５】冠動脈のステント中の再狭窄部分の面積比を示した図である（実施例5）。
【図３】
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【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
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