(57)【要約】【課題】間葉系細胞の分化に関与するｍｉＲＮＡについて新たな知見を得、前記知見を利用して、間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）するための薬剤、及び前記薬剤を利用した医薬、並びに間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかを有効成分とする間葉系細胞の分化抑制剤、及び前記分化抑制剤を利用した医薬；ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質を有効成分とする間葉系細胞の分化促進剤、及び前記分化促進剤を利用した医薬；ｍｉＲ１２５ｂの機能の向上を指標とした間葉系細胞の分化を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法；並びに、ｍｉＲ１２５ｂの機能の低下を指標とした間葉系細胞の分化を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法；である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする間葉系細胞の分化抑制剤。
【請求項２】
間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞の少なくともいずれかである請求項１に記載の間葉系細胞の分化抑制剤。
【請求項３】
ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質を有効成分とすることを特徴とする間葉系細胞の分化促進剤。
【請求項４】
ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質が、ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかの相補鎖である請求項３に記載の間葉系細胞の分化促進剤。
【請求項５】
間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞の少なくともいずれかである請求項３から４のいずれかに記載の間葉系細胞の分化促進剤。
【請求項６】
間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、請求項１から２のいずれかに記載の間葉系細胞の分化抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
【請求項７】
間葉系細胞が脂肪細胞であり、疾患が肥満、糖尿病、高脂血症、及び高血圧からなる群より選択される少なくともいずれかである請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、請求項３から５のいずれかに記載の間葉系細胞の分化促進剤を含むことを特徴とする医薬。
【請求項９】
間葉系細胞が骨芽細胞であり、疾患が骨粗鬆症、骨形成不全、及び発達期における成長阻害からなる群より選択される少なくともいずれかである請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
間葉系細胞の分化を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ１２５ｂの機能の向上を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１１】
間葉系細胞の分化を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ１２５ｂの機能の低下を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）するための薬剤、及び前記薬剤を利用した医薬、並びに間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）は、細胞内在性の、２０〜２５塩基程度の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ上のｍｉＲＮＡ遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、次いで、プロセシングを受け、約６０〜７０塩基程度のヘアピン構造を有するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとなる。その後、核から細胞質内に移り、更にプロセシングを受けて、２０〜２５塩基程度の二本鎖の成熟ｍｉＲＮＡとなる。成熟ｍｉＲＮＡは、そのうちの一本鎖がＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のｍＲＮＡに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
ｍｉＲＮＡは、ヒトやマウス等で約４００種類が知られており、それぞれが複数の標的遺伝子の発現を調節し、細胞の増殖や分化など、様々な生命現象に関与することが示唆されている。例えば、神経細胞の分化、血液細胞の分化などに関与するｍｉＲＮＡについて報告がある（例えば、非特許文献２〜３参照）。また、癌細胞の増殖に関与するｍｉＲＮＡについても報告があり、前記ｍｉＲＮＡの発現パターンを癌の臨床診断に利用することや、前記ｍｉＲＮＡの発現を制御することで癌細胞の増殖を抑制する癌の治療方法等について、提案がなされている（例えば、特許文献１〜２参照）。
しかしながら、骨芽細胞、脂肪細胞等の間葉系細胞の分化に関与するｍｉＲＮＡについては、従来報告が無いのが現状である。
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１９２４８４号公報
【特許文献２】特開２００６−５０６４６９号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５，５２２−５３１（２００４）
【非特許文献２】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｖｏｌ．２４  Ｎｏ．４  Ａｐｒｉｌ  ２００６，ｐｐ．８５７−８６４
【非特許文献３】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２  Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４：Ｖｏｌ．３０３．ｎｏ．５６５４，ｐｐ．８３−８６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、間葉系細胞の分化に関与するｍｉＲＮＡについて新たな知見を得、前記知見を利用して、間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）するための薬剤、及び前記薬剤を利用した医薬、並びに間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、ｍｉＲＮＡの１種であるｍｉＲ１２５ｂ（ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ）が、骨芽細胞や脂肪細胞の分化を抑制する機能を有しているという知見である。骨芽細胞、脂肪細胞等の間葉系細胞の分化にｍｉＲＮＡが関与しているとする報告は従来には無く、前記知見は、本発明者らによる新たな知見である。
前記ｍｉＲ１２５ｂが骨芽細胞や脂肪細胞の分化を抑制するメカニズムの詳細は未だ明らかではないが、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＭＰＲ２、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ２等の骨芽細胞分化や脂肪細胞分化に重要な役割を果たす遺伝子を標的とし、それらの翻訳を阻害することによって、骨芽細胞分化や脂肪細胞分化を効果的に抑制しているメカニズムが考えられる（実施例参照、後述）。
【０００７】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかを有効成分とすることを特徴とする間葉系細胞の分化抑制剤である。
＜２＞  間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞の少なくともいずれかである前記＜１＞に記載の間葉系細胞の分化抑制剤である。
＜３＞  ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質を有効成分とすることを特徴とする間葉系細胞の分化促進剤である。
＜４＞  ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質が、ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかの相補鎖である前記＜３＞に記載の間葉系細胞の分化促進剤である。
＜５＞  間葉系細胞が、骨芽細胞及び脂肪細胞の少なくともいずれかである前記＜３＞から＜４＞のいずれかに記載の間葉系細胞の分化促進剤である。
＜６＞  間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の間葉系細胞の分化抑制剤を含むことを特徴とする医薬である（第１の医薬）。
＜７＞  間葉系細胞が脂肪細胞であり、疾患が肥満、糖尿病、高脂血症、及び高血圧からなる群より選択される少なくともいずれかである前記＜６＞に記載の医薬である。
＜８＞  間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患を治療又は予防するための医薬であって、前記＜３＞から＜５＞のいずれかに記載の間葉系細胞の分化促進剤を含むことを特徴とする医薬である（第２の医薬）。
＜９＞  間葉系細胞が骨芽細胞であり、疾患が骨粗鬆症、骨形成不全、及び発達期における成長阻害からなる群より選択される少なくともいずれかである前記＜８＞に記載の医薬である。
＜１０＞  間葉系細胞の分化を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ１２５ｂの機能の向上を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法である（第１のスクリーニング方法）。
＜１１＞  間葉系細胞の分化を促進する作用を有する物質のスクリーニング方法であって、ｍｉＲ１２５ｂの機能の低下を指標とすることを特徴とするスクリーニング方法である（第２のスクリーニング方法）。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、従来における諸問題を解決することができ、間葉系細胞の分化に関与するｍｉＲＮＡについて新たな知見を得ることができ、前記知見を利用して、間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）するための薬剤、及び前記薬剤を利用した医薬、並びに間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）する作用を有する物質のスクリーニング方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（間葉系細胞の分化抑制剤）
本発明の間葉系細胞の分化抑制剤は、ｍｉＲ１２５ｂ及びその前駆体の少なくともいずれかを有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１０】
＜有効成分＞
−ｍｉＲ１２５ｂ−
ｍｉＲ１２５ｂ（ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ）は、その成熟型配列がＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡ（配列番号：１）で表されるマイクロＲＮＡである（ｍｉＲ１２５ｂの成熟型配列はマウス、ヒト等で保存されている）。本発明者らは今回、このｍｉＲ１２５ｂが、間葉系細胞の分化を抑制する機能を有することを見出し（実施例参照、後述）、間葉系細胞の分化抑制剤の有効成分として好適に利用可能であることを見出した。
したがって、前記有効成分として使用される前記ｍｉＲ１２５ｂとしては、例えば、従来知られている成熟型のｍｉＲ１２５ｂ（前記配列番号：１）を適宜利用することができる。前記成熟型ｍｉＲ１２５ｂは、例えば、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、又は組換え的に産生させることにより得ることができる。
また、前記ｍｉＲ１２５ｂとしては、内在性の成熟型ｍｉＲ１２５ｂを模倣するように合成された、ｍｉＲ１２５ｂ類似物質なども同様に使用することができる。前記ｍｉＲ１２５ｂ類似物質は、例えば、Ａｍｂｉｏｎ社などから入手可能である。
なお、前記ｍｉＲ１２５ｂは、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
−ｍｉＲ１２５ｂ前駆体−
また、前記有効成分としては、前記した成熟型のｍｉＲ１２５ｂに限らず、ｍｉＲ１２５ｂの前駆体を使用することもできる。
前記ｍｉＲ１２５ｂ前駆体としては、例えば、前記ｍｉＲ１２５ｂの、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡなどが挙げられ、その具体例としては、例えば、下記配列番号：２〜配列番号：５で表される前駆体などが挙げられる（マウスｍｉｒ−１２５ｂ−１；ＵＧＣＧＣＵＣＣＣＣＵＣＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＵＧＵＵＵＡＣＣＧＵＵＵＡＡＡＵＣＣＡＣＧＧＧＵＵＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧ（配列番号：２）、マウスｍｉｒ−１２５ｂ−２；ＧＣＣＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＡＧＵＡＡＣＡＵＣＡＣＡＡＧＵＣＡＧＧＵＵＣＵＵＧＧＧＡＣＣＵＡＧＧＣ（配列番号：３）、ヒトｍｉｒ−１２５ｂ−１；ＵＧＣＧＣＵＣＣＵＣＵＣＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＵＧＵＵＵＡＣＣＧＵＵＵＡＡＡＵＣＣＡＣＧＧＧＵＵＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧＣＧＡＧＵＣＧＵＧＣＵ（配列番号：４）、ヒトｍｉｒ−１２５ｂ−２；ＡＣＣＡＧＡＣＵＵＵＵＣＣＵＡＧＵＣＣＣＵＧＡＧＡＣＣＣＵＡＡＣＵＵＧＵＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＡＧＵＡＡＣＡＵＣＡＣＡＡＧＵＣＡＧＧＣＵＣＵＵＧＧＧＡＣＣＵＡＧＧＣＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号：５））。前記ｍｉＲ１２５ｂ前駆体は、例えば、従来公知の手法を用いて、天然物から単離することにより、化学的に合成することにより、又は組換え的に産生させることにより得ることができる。
また、前記ｍｉＲ１２５ｂ前駆体としては、内在性のｍｉＲ１２５ｂ前駆体を模倣するように合成された、ｍｉＲ１２５ｂ前駆体類似物質なども同様に使用することができる。
なお、前記ｍｉＲ１２５ｂ前駆体は、一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
【００１１】
前記有効成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
また、前記間葉系細胞の分化抑制剤中の前記有効成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記間葉系細胞の分化抑制剤は、前記有効成分そのものであってもよい。
【００１２】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記有効成分を所望の濃度に希釈等するための、水、各種緩衝液などが挙げられる。
また、前記その他の成分としては、間葉系細胞への分化を抑制したい細胞（対象細胞；例えば、間葉系幹細胞）に前記有効成分を導入するための、導入用試薬なども挙げられる。前記導入用試薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などが挙げられる。
【００１３】
＜間葉系細胞＞
前記間葉系細胞の分化抑制剤は、間葉系細胞への分化能を有する細胞の、間葉系細胞への分化を効果的に抑制することができる。
前記間葉系細胞への分化能を有する細胞（前記分化抑制剤を導入する対象となる細胞；本明細書中において「対象細胞」と称することがある）の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、間葉系幹細胞などが挙げられる。前記間葉系幹細胞の入手方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、個体の骨髄等から単離することにより得ることもできるし、或いは、既にクローン化された間葉系幹細胞として各種機関から入手することもできる。このような既にクローン化された間葉系幹細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、マウスの細胞として、マウスＳＴ２細胞、マウスＮＲＧ細胞などが挙げられる（それぞれ独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手可能である）。なお、前記間葉系幹細胞以外の細胞であっても、前記間葉系細胞への分化能を有する細胞であれば、いずれも前記分化抑制剤の対象細胞として好適に使用することができる。
また、前記間葉系細胞（前記分化抑制剤により、それへの分化が抑制される間葉系細胞）の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞などが挙げられる。これらの中でも、前記間葉系細胞の分化抑制剤は、骨芽細胞、及び脂肪細胞への分化の抑制に、特に好適である。
【００１４】
＜分化抑制＞
前記間葉系細胞の分化抑制剤は、例えば、前記対象細胞（例えば、間葉系幹細胞）に導入（トランスフェクト）することにより使用することができる。前記対象細胞への前記間葉系細胞の分化抑制剤の導入方法としては、特に制限はなく、例えば、従来公知の核酸導入方法を適宜利用することができる。
なお、前記間葉系細胞の分化抑制剤は、前記有効成分（ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれか）をコードする配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミド、組換えウイルス）を、前記対象細胞に導入することにより使用される態様であってもよい。前記態様では、前記対象細胞において、前記有効成分（ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれか）が発現される。
【００１５】
＜用途＞
前記間葉系細胞の分化抑制剤は、ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかを有効成分として含むので、対象細胞の間葉系細胞への分化を好適に抑制することができる。したがって、前記間葉系細胞の分化抑制剤は、例えば、後述する本発明の第１の医薬（間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患の治療又は予防のための医薬）に好適に利用可能である。
【００１６】
（第１の医薬）
本発明の第１の医薬は、間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患の治療又は予防のための医薬であり、前記した本発明の間葉系細胞の分化抑制剤を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００１７】
＜間葉系細胞の分化抑制剤＞
前記「間葉系細胞の分化抑制剤」としては、前記した本発明の間葉系細胞の分化抑制剤の項目に記載した通りである。
前記第１の医薬中の前記間葉系細胞の分化抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記第１の医薬は、前記間葉系細胞の分化抑制剤そのものであってもよい。
【００１８】
＜その他の成分＞
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
＜剤型＞
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤（錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等）、経口液剤（内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等）、注射剤（溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等）、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
【００２０】
前記経口固形剤としては、例えば、前記有効成分に、賦形剤、更には必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
【００２１】
前記経口液剤としては、例えば、前記有効成分に、矯味・矯臭剤、緩衝剤、安定化剤等の添加剤を加え、常法により製造することができる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
【００２２】
前記注射剤としては、例えば、前記有効成分に、ｐＨ調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下用、筋肉内用、静脈内用等の注射剤を製造することができる。
前記ｐＨ調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
【００２３】
前記軟膏剤としては、例えば、前記有効成分に、公知の基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等を配合し、常法により混合し、製造することができる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
【００２４】
前記貼付剤としては、例えば、公知の支持体に前記軟膏剤としてのクリーム剤、ゲル剤、ペースト剤等を、常法により塗布し、製造することができる。前記支持体としては、例えば、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルム、発泡体シートなどが挙げられる。
【００２５】
＜投与＞
前記第１の医薬は、間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患の治療又は予防に好適である。前記間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患としては、例えば、脂肪細胞の分化過剰に起因する、肥満、糖尿病、高脂血症、高血圧などが挙げられる。
【００２６】
前記第１の医薬の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【００２７】
前記第１の医薬の投与方法としては、特に制限はなく、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射などが挙げられる。
また、前記第１の医薬は、例えば、前記第１の医薬の有効成分（ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれか）を、対象細胞（例えば間葉系幹細胞）に直接導入（トランスフェクト）し、その細胞を患者に移植することにより投与することもできる。
また、前記第１の医薬は、例えば、前記第１の医薬の有効成分（ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれか）をコードする配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミド、組換えウイルス）を、対象細胞（例えば間葉系幹細胞）に導入（トランスフェクト）し、その細胞を患者に移植することにより投与することもできる。この場合、前記有効成分は、前記対象細胞において発現する。
前記第１の医薬の有効成分、又は前記第１の医薬の有効成分をコードする配列を含む核酸を対象細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、例えば、従来公知の核酸導入方法を適宜利用することができる。また、前記導入後の対象細胞を患者に移植する方法としても、特に制限なく、例えば、従来公知の細胞移植方法を適宜利用することができる。
【００２８】
前記第１の医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
前記第１の医薬の投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００３０】
前記第１の医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【００３１】
（間葉系細胞の分化促進剤）
本発明の間葉系細胞の分化促進剤は、ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質を有効成分として含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００３２】
＜ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質＞
前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍｉＲ１２５及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかの相補鎖などが挙げられる。前記相補鎖としては、必ずしも前記ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する完全な相補鎖である必要はなく、前記ｍｉＲ１２５の機能を低下させる作用を有する限り、前記ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する不完全な相補鎖であってもよい。また、前記相補鎖としては、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。
また、前記相補鎖としては、前記ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかと強固に二本鎖を形成し、より効果的に前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を阻害する（低下させる）ことができる点で、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の修飾を有したものであることが好ましい。前記ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の修飾を有する相補鎖としては、例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ  Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｘｉｑｏｎ社）などを利用することができる（例えば、Ｂｉｏｍｅｄｅｃｉｎｅ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ６０，Ｉｓｓｕｅ９，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００６，Ｐａｇｅｓ６３３−６３８参照）。
また、前記相補鎖としては、細胞内で分解されることを阻止してより安定に存在することができ、そのため、より効果的に前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を阻害する（低下させる）ことができる点で、例えば、２’Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ等の修飾を有したものであることも好ましい。（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１１  ２７０５−２７１６参照）。
【００３３】
前記有効成分は、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
また、前記間葉系細胞の分化促進剤中の前記有効成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記間葉系細胞の分化促進剤は、前記有効成分そのものであってもよい。
【００３４】
＜その他の成分＞
前記「その他の成分」としては、前記した本発明の間葉系細胞の分化抑制剤と同様である。
＜間葉系細胞＞
前記「間葉系細胞」としては、前記した本発明の間葉系細胞の分化抑制剤と同様である。
【００３５】
＜分化促進＞
前記間葉系細胞の分化促進剤は、例えば、前記対象細胞（例えば、間葉系幹細胞）に導入（トランスフェクト）することにより使用することができる。前記対象細胞への前記間葉系細胞の分化促進剤の導入方法としては、特に制限はなく、例えば、従来公知の核酸導入方法を適宜利用することができる。
なお、前記間葉系細胞の分化促進剤は、前記有効成分（例えば、ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する相補鎖）をコードする配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミド、組換えウイルス）を、前記対象細胞に導入することにより使用される態様であってもよい。前記態様では、前記対象細胞において、前記有効成分（例えば、ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する相補鎖）が発現される。
【００３６】
＜用途＞
前記間葉系細胞の分化促進剤は、ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させる作用を有する物質を有効成分として含むので、対象細胞の間葉系細胞への分化を好適に促進させることができる。したがって、前記間葉系細胞の分化促進剤は、例えば、後述する本発明の第２の医薬（間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患の治療又は予防のための医薬）に好適に利用可能である。
【００３７】
（第２の医薬）
本発明の第２の医薬は、間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患の治療又は予防のための医薬であり、前記した本発明の間葉系細胞の分化促進剤を含有し、更に必要に応じてその他の成分を含有してなる。
【００３８】
＜間葉系細胞の分化促進剤＞
前記「間葉系細胞の分化促進剤」としては、前記した本発明の間葉系細胞の分化促進剤の項目に記載した通りである。
前記第２の医薬中の前記間葉系細胞の分化促進剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、前記第２の医薬は、前記間葉系細胞の分化促進剤そのものであってもよい。
【００３９】
＜その他の成分＞
前記「その他の成分」としては、前記した本発明の第１の医薬と同様である。
＜剤型＞
前記「剤型」としては、前記した本発明の第１の医薬と同様である。
【００４０】
＜投与＞
前記第２の医薬は、間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患の治療又は予防に好適である。前記間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患としては、例えば、骨芽細胞の分化抑制に起因する、骨粗鬆症、骨形成不全、発達期における成長阻害などが挙げられる。
【００４１】
前記第２の医薬の投与対象となる哺乳動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、サル、イヌ、ネコなどが挙げられる。
【００４２】
前記第２の医薬の投与方法としては、特に制限はなく、前記医薬の剤型等に応じて適宜選択することができ、例えば、経口投与、腹腔内投与、血液中への注射などが挙げられる。
また、前記第２の医薬は、例えば、前記第２の医薬の有効成分（例えば、ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する相補鎖）を、対象細胞（例えば間葉系幹細胞）に直接導入（トランスフェクト）し、その細胞を患者に移植することにより投与することもできる。
また、前記第２の医薬は、例えば、前記第２の医薬の有効成分（例えば、ｍｉＲ１２５ｂ及びｍｉＲ１２５ｂ前駆体の少なくともいずれかに対する相補鎖）をコードする配列を含む核酸（例えば、組換えプラスミド、組換えウイルス）を、対象細胞（例えば間葉系幹細胞）に導入（トランスフェクト）し、その細胞を患者に移植することにより投与することもできる。この場合、前記有効成分は、前記対象細胞において発現する。
前記第２の医薬の有効成分、又は前記第２の医薬の有効成分をコードする配列を含む核酸を対象細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、例えば、従来公知の核酸導入方法を適宜利用することができる。また、前記導入後の対象細胞を患者に移植する方法としても、特に制限なく、例えば、従来公知の細胞移植方法を適宜利用することができる。
【００４３】
前記第２の医薬の投与量としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００４４】
前記第２の医薬の投与回数としては、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができる。
【００４５】
前記第２の医薬の投与時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患に対して、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
【００４６】
（第１のスクリーニング方法）
本発明の第１のスクリーニング方法は、ｍｉＲ１２５ｂの機能の向上を指標として、間葉系細胞の分化を抑制する作用を有する物質をスクリーニングする方法である。
前記第１のスクリーニング方法としては、例えば、（ａ）被験物質がｍｉＲ１２５ｂの機能を向上させるか否かを評価する工程、及び（ｂ）前記工程（ａ）で前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を向上させると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
【００４７】
−（ａ）評価工程−
前記評価工程における、被験物質がｍｉＲ１２５ｂの機能を向上させるか否かを評価する評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質の存在下及び非存在下でのｍｉＲ１２５ｂの発現量を調べる方法などが挙げられる。なお、前記被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
被験物質の存在下では、被験物質の非存在下と比べて、ｍｉＲ１２５ｂの発現量が増加するという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を向上させると評価することができる。
【００４８】
−（ｂ）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ）でｍｉＲ１２５ｂの機能を向上させると評価された前記被験物質を選択する。
【００４９】
前記第１のスクリーニング方法でスクリーニングされた物質は、例えば、前記した本発明の第１の医薬（間葉系細胞の分化過剰に起因する疾患の治療又は予防のための医薬）に好適に利用可能である。
【００５０】
（第２のスクリーニング方法）
本発明の第２のスクリーニング方法は、ｍｉＲ１２５ｂの機能の低下を指標として、間葉系細胞の分化を促進する作用を有する物質をスクリーニングする方法である。
前記第２のスクリーニング方法としては、例えば、（ａ’）被験物質が、ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させるか否かを評価する工程、及び（ｂ’）前記工程（ａ’）で前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させると評価された前記被験物質を選択する工程、を含む方法などが挙げられる。
【００５１】
−（ａ’）評価工程−
前記評価工程における、被験物質がｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させるか否かを評価する評価方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、被験物質の存在下及び非存在下でのｍｉＲ１２５ｂの発現量を調べる方法などが挙げられる。なお、前記被験物質としては、特に制限はなく、各種候補物質の中から、目的に応じて適宜選択することができる。
被験物質の存在下では、被験物質の非存在下と比べて、ｍｉＲ１２５ｂの発現量が低下するという結果が得られた場合、前記被験物質は、前記ｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させると評価することができる。
【００５２】
−（ｂ’）選択工程−
前記選択工程では、前記工程（ａ’）でｍｉＲ１２５ｂの機能を低下させると評価された前記被験物質を選択する。
【００５３】
前記第２のスクリーニング方法でスクリーニングされた物質は、例えば、前記した本発明の第２の医薬（間葉系細胞の分化抑制に起因する疾患の治療又は予防のための医薬）に好適に利用可能である。
【００５４】
［効果］
本発明の間葉系細胞の分化抑制剤／分化促進剤、及び、本発明の第１の医薬／第２の医薬によれば、対象細胞（例えば間葉系幹細胞）からの間葉系細胞への分化を制御（抑制／促進）することが可能となり、そのため、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患（例えば、脂肪細胞分化過剰に起因する肥満、骨芽細胞分化抑制に起因する骨粗鬆症等）に対して効果的な治療又は予防方法を提供することができる。
また、本発明の第１のスクリーニング方法／第２のスクリーニング方法によれば、間葉系細胞の分化を制御（抑制／促進）する作用を有する物質を探索することができ、そのため、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患に対する医薬の有効成分となり得る物質を提供することができる。
【実施例】
【００５５】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００５６】
（実施例１：骨芽細胞分化に関与するｍｉＲＮＡの探索）
骨芽細胞分化に関与するｍｉＲＮＡを、以下のような方法で探索した。
【００５７】
＜方法＞
マウス骨髄由来の培養細胞であるＳＴ２細胞について、骨芽細胞分化を誘導した細胞サンプルと未分化の細胞サンプルとで、発現量に違いのあるｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析により探索した。各実験方法の詳細は以下の通り。
【００５８】
［ＳＴ２細胞の培養］
ＳＴ２細胞は、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター（ＢＲＣ）から入手し（細胞番号：ＲＣＢ０２２４）、ＢＲＣから提供されているプロトコルに従って培養した（１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養した）。
【００５９】
［骨芽細胞分化誘導］
前記ＳＴ２細胞をセミコンフルエントな状態まで培養した後、前記ＳＴ２細胞の培養に用いた培地を、１０％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍｌ骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４；Ｒ＆Ｄシステムズ社）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に置き換えることにより、骨芽細胞分化を誘導した。培地は３日ごとに交換した。
【００６０】
［ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析］
各細胞サンプル（骨芽細胞分化を誘導した細胞サンプル（骨芽細胞分化誘導開始後６日目の細胞サンプル）、及び、未分化ＳＴ２細胞サンプル）から、ｍｉｒＶａｎａＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｍｉＲＮＡを精製し、ＦｌａｓｈＰＡＧＥ  ｍｉＲＮＡ  ｆｌａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて更に精製した。次いで、マイクロアレイ解析のため、ｍｉｒＶａｎａＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いてｍｉＲＮＡを標識化した。標識化ｍｉＲＮＡサンプルを、ｍｉｒＶａｎａＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｂｉｏａｒｒａｙ（Ａｍｂｉｏｎ社）上でハイブリダイズさせ、洗浄した。前記各手法は、Ａｍｂｉｏｎ社の各製品プロトコルに従って行った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇ２５６５ＢＡ，Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてマイクロアレイのシグナルを測定し、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてシグナルを定量化した。
【００６１】
＜結果＞
マイクロアレイ解析結果を図１に示す（なお、図１中、縦軸は骨芽細胞分化を誘導した細胞サンプルにおける各ｍｉＲＮＡの発現量を、横軸は未分化ＳＴ２細胞サンプルにおける各ｍｉＲＮＡの発現量を示す）。図１の結果から、骨芽細胞分化を誘導した細胞サンプルと未分化ＳＴ２細胞サンプルとで、発現量に違いのあるｍｉＲＮＡが複数確認された。
本発明者らは、未分化ＳＴ２細胞サンプルよりも、骨芽細胞分化を誘導した細胞サンプルで発現量が低くなるｍｉＲＮＡ数種に着目し、データベース（ＰｉｃＴａｒ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＰｉｃＴａｒ＿ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ．ｃｇｉ））を用いて、それらのｍｉＲＮＡの標的となり得る遺伝子を調べた。その結果、骨芽細胞分化に重要な働きを有することが報告されている、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＭＰＲ２、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ２等の遺伝子の標的となり得る、ｍｉＲ１２５ｂ（ｍｉＲＮＡ−１２５ｂ）を見出すことができた（図２に、ｍｉＲ１２５ｂとＯｓｔｅｒｉｘとの結合の予測モデルを示す）。
この結果から、ｍｉＲ１２５ｂは、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＢＭＰＲ２、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ２等の翻訳を阻害することによって、骨芽細胞分化の抑制に機能している可能性が示された。また、ｍｉＲ１２５ｂの標的候補の１つであるＳｃｈｎｕｒｒｉ２は、脂肪細胞分化においても重要な働きを有することが報告されていることから、ｍｉＲ１２５ｂは、Ｓｃｈｎｕｒｒｉ２の翻訳を阻害することによって、脂肪細胞分化の抑制に機能している可能性も示された。
【００６２】
（実施例２：ｍｉＲ１２５ｂの機能亢進による骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化への影響）
ｍｉＲ１２５ｂの機能亢進が骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化に及ぼす影響を、以下のような方法で調べた。
【００６３】
＜方法＞
ＳＴ２細胞にｍｉＲ１２５ｂを導入してｍｉＲ１２５ｂの機能を亢進させ、骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化に与える影響を調べた。なお、骨芽細胞への分化はアルカリホスファターゼ染色及びオステオカルシン発現量により確認した。また、脂肪細胞への分化はナイルレッド染色により確認した。各実験方法の詳細は以下の通り。
【００６４】
［ＳＴ２細胞の培養］
ＳＴ２細胞の培養は、前記実施例１と同様にして行った。
【００６５】
［ｍｉＲ１２５ｂの導入（トランスフェクション）］
ＳＴ２細胞におけるｍｉＲ１２５ｂの機能亢進のため、ｍｉＲ１２５ｂのＰｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ａｍｂｉｏｎ社）をＳＴ２細胞に導入した。対照実験のため、ネガティブコントロールｓｉＲＮＡをＱＩＡＧＥＮ社から入手し、ＳＴ２細胞に導入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と２０ｎＭ  Ｐｒｅ−ｍｉＲ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（又はネガティブコントロールｓｉＲＮＡ）との複合体を、製品説明書に従って調製し、ＳＴ２細胞培養プレートに直接添加し、混合することによりトランスフェクションを行った。トランスフェクションから４〜６時間後、培地を新鮮培地（骨芽細胞分化誘導の場合は１０％ＦＢＳ及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４を含む培地、脂肪細胞分化誘導の場合は後述する脂肪細胞分化用培地）に置き換え、骨芽細胞分化誘導、又は脂肪細胞分化誘導を行った。
【００６６】
［骨芽細胞分化誘導］
骨芽細胞分化誘導は、前記実施例１と同様にして行った。
【００６７】
［アルカリホスファターゼ染色］
骨芽細胞分化誘導開始後６日目に、各細胞を１０％ホルマリンで２０分間固定し、更にエタノール及びアセトンの等量混合物で１分間固定して、ＰＢＳで洗浄した。１ｍｇのナフトール  ＡＳ−ＭＸ（Ｓｉｇｍａ社）を１滴のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｗａｋｏ社）に溶解させ、１０ｍｌの２ｍＭ  ＭｇＣｌ２含０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．５）に懸濁することによりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色液を調製した。６ｍｇのＦａｓｔ  ｂｌｕｅ  ＢＢ  ｓａｌｔ（Ｓｉｇｍａ社）を加えたＡＬＰ染色液を濾過した。固定後の各細胞を、前記ＡＬＰ染色液中で３７℃、２０分間インキュベートした。
【００６８】
［オステオカルシン発現量の測定］
ＲＮｅａｓｙ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、製品説明書に従って、骨芽細胞分化誘導後の各細胞からトータルＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて、トータルＲＮＡの収量及び質を測定した。オステオカルシンの遺伝子発現量を定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。オリゴｄＴプライマーを用いて、製品プロトコルに従い、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ社）によりトータルＲＮＡを逆転写した。得られた逆転写産物をテンプレートとして使用し、Ｍｘ３０００Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）及びＰｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。プライマーとしては、ＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧ（ＧＡＰＤＨ−ｆｏｒｗａｒｄ，配列番号：６）、ＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧ（ＧＡＰＤＨ−ｒｅｖｅｒｓｅ，配列番号：７）、ＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＡＧ（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ−ｆｏｒｗａｒｄ，配列番号：８）、及びＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣ（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ−ｒｅｖｅｒｓｅ，配列番号：９）を用いた。
【００６９】
［脂肪細胞分化誘導］
前記ＳＴ２細胞をセミコンフルエントな状態まで培養した後、前記ＳＴ２細胞の培養に用いた培地を、１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＭＩＸ）、０．２５μＭ  デキサメタゾン（ＤＥＸ）、及びインスリン−トランスフェリン−セレン−Ｘ  サプリメント（５μｇ／ｍｌのインスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１μＭのロシグリタゾンを含む）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地に置き換えることにより、脂肪細胞分化を誘導した。４８時間後、前記脂肪細胞分化用培地を１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に置き換えた。
【００７０】
［ナイルレッド染色］
脂肪細胞分化誘導開始後４日目に、脂肪細胞に蓄積された脂質をナイルレッドで染色し、蛍光強度を測定することで定量化した。各細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、１０％ホルマリン含ＰＢＳを用いて室温で１時間、固定した。固定後、ナイルレッド（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）を用いて室温で１０分間反応させることにより、脂質の蓄積を検出した。Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて蛍光強度（励起４８５ｎｍ；発光５３５ｎｍ）を測定した。
【００７１】
＜結果＞
結果を図３Ａ及び図３Ｂ（骨芽細胞分化）、並びに図４Ａ及び図４Ｂ（脂肪細胞分化）に示す。図３Ａ及び図３Ｂの結果から、ｍｉＲ１２５ｂの導入により、ＳＴ２細胞における骨芽細胞分化が顕著に抑制されたことがわかる（ＡＬＰ染色性の低下、オステオカルシン発現量の低下）。また、図４Ａ及び図４Ｂの結果から、ｍｉＲ１２５ｂの導入により、ＳＴ２細胞における脂肪細胞分化が顕著に抑制されたことがわかる（ナイルレッド染色性の低下）。なお、図３Ａ〜図４Ｂにおいて、「ＮＣ」はネガティブコントロールを示す。
これらの結果から、ｍｉＲ１２５ｂは、骨芽細胞分化及び脂肪細胞分化を抑制する機能を有していることが示された。
【００７２】
本実施例の結果から、ｍｉＲ１２５ｂが骨芽細胞及び脂肪細胞の分化に抑制的に機能していることが示され、ｍｉＲ１２５ｂの発現を調整することにより、骨芽細胞及び脂肪細胞への分化の程度をコントロールできる可能性が示された。このｍｉＲ１２５ｂの新たな機能の発見は、様々な医薬用途に応用可能であると考えられる。例えば、ｍｉＲ１２５ｂを用いることにより、脂肪細胞分化を抑制し、肥満の治療又は予防に応用することなどが考えられる。また、ｍｉＲ１２５ｂの機能を抑制する物質（例えばｍｉＲ１２５ｂの相補鎖）を用いることにより、骨芽細胞分化を促進させ、骨粗鬆症の治療又は予防に応用することなどが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の間葉系細胞の分化抑制剤／分化促進剤、本発明の第１の医薬／第２の医薬、及び、本発明の第１のスクリーニング方法／第２のスクリーニング方法は、間葉系細胞の分化異常に起因する疾患（例えば、脂肪細胞分化過剰に起因する肥満、骨芽細胞分化抑制に起因する骨粗鬆症）に対する治療又は予防方法の開発に、好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、実施例１におけるｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析の結果を示す図である。
【図２】図２は、ｍｉＲ１２５ｂとその標的遺伝子候補であるＯｓｔｅｒｉｘとの結合の予測モデルを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、実施例２において、ｍｉＲ１２５ｂの導入によりアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色性が低下したことを示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実施例２において、ｍｉＲ１２５ｂの導入によりオステオカルシン（Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）発現量が低下したことを示す図である（縦軸は、ネガティブコントロール（ＮＣ）処理区におけるオステオカルシン発現量を１としたときの相対的オステオカルシン発現量を示す）。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例２において、ｍｉＲ１２５ｂの導入によりナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）染色性が低下したことを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例２において、ｍｉＲ１２５ｂの導入によりナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）染色性が低下したことを示す図である（縦軸は、ナイルレッドの蛍光強度値を示す）。
【図１】
2008184450.tif 000002
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【配列表】
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