(57)【要約】      （修正有）【課題】ダイフラクトースアンハイドライドＩＶ（ＤＦＡ  ＩＶ）の製造方法の提供。【解決手段】レバン生産菌の1つであるＢａｔｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに外来性のレバンフルクトトランスフェラーゼ（ＬＦＴａｓｅ、ＥＣ  ４．２．２．１６）遺伝子を発現させ、砂糖を原料に、一液系でダイフラクトースアンハイドライドＩＶを製造する方法。枯草菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｉ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１  ＦＥＲＭＰ  ＡＰ−２１３０４）である、ＤＦＡ  ＩＶの製造方法。【選択図】図２
2008307010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバン生成能を持つ枯草菌を宿主として、レバンフルクトトランスフェラーゼ遺伝子を導入した微生物を用いて、砂糖を原料に、一液系でダイフラクトースアンハイドライドＩＶ（ＤＦＡ  ＩＶ）を製造する方法。
【請求項２】
請求項１の枯草菌が、Ｂａｃｉｌｌｕｓｉ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１  ＦＥＲＭＰ  ＡＰ−２１３０４）であるＤＦＡ  ＩＶの製造方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ダイフラクトースアンハイドライドＩＶ（ＤＦＡ  ＩＶ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイフラクトースアンハイドライド類（ＤＦＡ類）は、フルクトース二分子から成る環状の二糖であり、これまでに４種類のＤＦＡ（ＤＦＡ  Ｉ，ＤＦＡ  ＩＩＩ，ＤＦＡ  ＩＶ，およびＤＦＡ  Ｖ）が微生物の酵素によって生産されることが報告されている（非特許文献１参照）。その中でもｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｒａｎｏｓｙｌ１、２’：２，３’ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（ＤＦＡ  ＩＩＩ）およびｄｉ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｆｒａｎｏｓｙｌ２、６’：２’、６ａｎｈｙｄｒｉｄｅ（ＤＦＡ  ＩＶ）はその特殊な機能から注目を集めている。
ＤＦＡ  ＩＩＩやＤＦＡ  ＩＶは、様々な栄養分の吸収に関わるタイトジャンクションの透過性を上げ、小腸および大腸におけるカルシウム、マグネシウム、亜鉛の吸収を促進することがラットを用いた試験により報告されている（非特許文献２および３参照）。また、ＤＦＡ  ＩＩＩおよびＤＦＡ  ＩＶは、難消化性のオリゴ糖であり、ヒトの消化酵素によっては分解されない。しかし、腸内細菌によって腸内発酵が起こり、酢酸や酪酸、乳酸などの有機酸に変換される。これらの有機酸は盲腸内容物のｐＨを低下させ、カルシウムの可溶化度を上げることにより、カルシウム吸収を促進させる（非特許文献４参照）。以上の点からＤＦＡ  ＩＩＩやＤＦＡ  ＩＶは新規の機能性食品素材として重要である。
【０００３】
ＤＦＡ  ＩＩＩはイヌリン（フルクトースがβ−２、１結合したフルクタン）からＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．Ｈ６５−７の持つ酵素ｉｎｕｌｉｎｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＥＣ  ２．４．１．９３；ｉｎｕｌａｓｅ  ＩＩ）によって生産される（非特許文献５参照）。この酵素を用いたＤＦＡ  ＩＩＩの商業的な大量生産が行われており、ＤＦＡ  ＩＩＩについてはさらに詳細な機能解析が進められている。ヒトおよびラットにおけるＤＦＡ  ＩＩＩの腸内菌叢への影響が報告されており（非特許文献６および７参照）、ＤＦＡＩＩＩを資化する細菌がヒトの糞便（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  ＡＨＵ１７６０、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２００４２）（非特許文献８および９参照）およびラットの盲腸内容物から（Ｒ．ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ  Ｍ−１およびＭ−２）単離されている（非特許文献７および１０参照）。
【０００４】
ＤＦＡ  ＩＶはレバン（フルクトースがβ−２、６結合したフルクタン）からＤＦＡ  ＩＶ合成酵素ｌｅｖａｎｆｒｕｃｔｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＬＦＴａｓｅ、ＥＣ  ４．２．２．１６）の働きによって生産されＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９（ＡＨＵ１８４０、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２８５）やＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ  Ｋ２０３２がＬＦＴａｓｅを発現することが報告されている（非特許文献参照１１、１２）
【０００５】
ＤＦＡ  ＩＶの大量生産はＤＦＡ  ＩＶの詳細な機能解析や食品、医薬品産業への応用に必要な技術であるが、原料となるレバンの生産が困難であることが大量生産を難しくしている。
レバンは砂糖からｌｅｖａｎｓｕｃｒａｓｅ（ＥＣ  ２．４．１．１０）によって生産される多糖であり、フルクトースがβ−２、６結合した主鎖およびβ−２、１結合による枝分かれ構造からなる（非特許文献参照１３）。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（非特許文献参照１４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ（非特許文献参照１５）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ（非特許文献参照１６）、およびＳｅｒｒａｔｉａ  ｌｅｖａｎｉｃｕｍ（非特許文献参照１７）などがレバン生産菌として報告されている。レバン生産においては、レバンが生産されると培養液の粘性が上昇し、攪拌の障害となることや培地からのレバンの精製に大量の有機溶剤が使用されるなどの問題がある（非特許文献参照１８）。
【０００６】
これまでにＡ．ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９およびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ  Ｋ２０３２からＬＦＴａｓｅをコードする遺伝子（ｌｆｔｇｅｎｅ）がクローニングされ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９における発現が報告されている。（非特許文献参照１９、２０）しかし、いかにＬＦＴａｓｅの発現が行われても、ＤＦＡ  ＩＶの生産には別に調製したレバンが必要となり、ＤＦＡ  ＩＶ生産において問題となるレバン生産の困難さは解決されずに残っていた。
【０００７】
【非特許文献１】斎藤および冨田、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２０００年６４巻、ページ１３２１−１３２７．
【非特許文献２】原および近藤、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００５年６９巻、ページ８３９−８４１．
【非特許文献３】峰尾ら、Ｄｉｇ．  Ｄｉｇ．  Ｓｃｉ．  ２００４年４９巻、ページ１２２−１３２．
【非特許文献４】斎藤ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９９年６３巻、ページ６５５−６６１．
【非特許文献５】横田、榎本、および冨田  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ.  １９９１年７２巻、ページ２６２−２６５．
【非特許文献６】南田ら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００４年９８巻、ページ２４４−２５０．
【非特許文献７】南田ら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００５年９９巻、ページ２３０−２３６．
【非特許文献８】南田ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００６年７０巻、ページ３３２−３３９．
【非特許文献９】南田ら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００６年１０１巻、ページ１４９−１５６.
【非特許文献１０】南田ら、Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００５年９９巻、ページ５４８−５５４．
【非特許文献１１】斎藤ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９７年６１巻、ページ１７０５−１７０９．
【非特許文献１２】Ｓｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ．  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００年、２７巻、ページ２１２−２１８.
【非特許文献１３】Ｈｅｓｔｒｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９４３年、３７巻、ページ４５０−４５６．
【非特許文献１４】Ｌｅｐｅｓａｎｔら、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９７２年、１１８巻、ページ１３５−１６０．
【非特許文献１５】Ｈｅｔｔｗｅｒら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １９９５年、１７７巻、ページ２８３４−９.
【非特許文献１６】Ｄａｗｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １９６６年、９８巻、ページ８０４−８１２．
【非特許文献１７】小島ら、Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  １９９３年、７５巻、ページ９−１２.
【非特許文献１８】Ｈａｎら、Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９０年、３５巻、ページ１７１−９４．
【非特許文献１９】斎藤ら、Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９７年、６１巻、ページ２０７６−２０７９．
【非特許文献２０】Ｋｉｍら、Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００５年、４０巻、ページ２２８−２３４．
【非特許文献２１】Ｘｕｅら、Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １９９９年、３４巻、ページ１８３−１９１.
【非特許文献２２】Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  第２版  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；１９８９年．
【非特許文献２３】田中ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｒｅｓ．  １９８２年、９９巻、ページ１９７−２０４．
【非特許文献２４】Ｓｈｉｎら、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００５年、５３巻、ページ８２１１−８２１５．
【０００８】
今般、発明者らは、レバン生産菌である枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とすることでＤＦＡ  ＩＶを砂糖から直接生産することを可能とし、レバン生産の難しさを避けることを可能とし、発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
解決しようとする問題点は、天然多糖類であるレバンを原料として用いないとＤＦＡ  ＩＶが、作れないことである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、レバン生産菌である枯草菌Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主とすることでＤＦＡ  ＩＶを砂糖から直接生産することを可能とし、レバン生産の難しさを避けることを可能とし、発明を完成させるに至った。
より具体的には、レバン生産菌の１つであるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓに外来性のｌｆｔｇｅｎｅを発現させることで、ＤＦＡ  ＩＶを砂糖から直接、１つの培養系で生産できるシステムを構築した。
【発明の効果】
【００１１】
この生産系の利点は、レバンの精製工程を避けることができるため、レバン生産の難しさ、および精製の際に大量に使用される有機溶媒を削減できる点にある。
様々なレバン生産菌の中からＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓを宿主として選択した理由は、様々な遺伝子工学的な手法が使えること、組換え酵素を培地中に分泌できること、さらにＧＲＡＳに認定された菌であることが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ＤＦＡ  ＩＶを効率的に生産する目的を、原料であるレバンも微生物で生産させ、かつ、同じ培養液系で、同時にＤＦＡ  ＩＶへの反応が進行し、１液系でＤＦＡ  ＩＶの生産ができる仕組みを実現したい。
【実施例１】
【００１３】
材料と方法
（１）供試菌株、使用したプラスミド、培地など
Ａ．ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９より取得したゲノムＤＮＡを使用した。ｉｉｋｏｒｉ  ＴＯＰ１０およびＤＢ３．１はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）より購入し、発現ベクターの構築に使用した。レバン生産菌であることが報告されているＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８（（非特許文献参照１４）、ＪＣＭ  １０６２９）を発現、およびＤＦＡ  ＩＶ生産の宿主とした。ＰＣＲによって増幅した断片のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯへのＴＯＰＯ−ｃｌｏｎｉｎｇおよびＬＲｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）の反応は製品に添付のプロトコルに従った。Ｇａｔｅｗａｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｋｉｔはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．より購入し、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）およびＴ４−ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓＩｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）をＰＣＲおよびライゲーション反応に用いた。塩基配列はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて解析した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８のコンピテント細胞はＸｕｅらの方法に従って作成した（非特許文献参照２１）
Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎは１００μg／ｍｌの濃度で、ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌは１０μｇ／ｍｌの濃度で適時使用した。
【００１４】
（２）ｌｆｔ遺伝子発現ベクターの構築
エントリークローンの作成
Ａ．ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９の遺伝子ｌｆｔの配列は既に報告されている（非特許文献参照１９）。この配列をもとにＬＦＴａｓｅの成熟タンパク部分を含むように2つのプライマー、Ｒ１（５‘−ｃａｃｃｃａｇｇｃａｔｃｃｃｔｃｃｇｇｇｃｇａ−３’）とＦ１（５’−ｇｃｔｃｔａｇａｇｔｃａｇａｔｇｃｇａａｃｔｇｃｃｃａａ−３’）を設計した。また、Ｒ１プライマーの５’末端にはＴＯＰＯクローニングの際に必要となるＣＡＣＣの配列が付与するように設計した。Ａ．ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９のゲノムＤＮＡ、設計した２つのプライマーを用いてＰＣＲにより目的のＤＮＡ配列を増幅した。ＰＣＲは以下の条件で行った。９４℃４分間の熱変性後、９４℃３０秒間（熱変性）、６０℃３０秒間（アニーリング）、６８℃１分間（伸長，２５サイクル）及び６８℃７分間（伸長）で行った。
増幅したＤＮＡ断片をｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯに挿入し、エントリークローンｐＬＦＴ−ＥＮＴＲを構築した。
【００１５】
デスティネーションベクターの構築
ｐＨＴ４３  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ（ＭｏＢｉＴｅｃ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＧａｔｅｗａｙシステムにおけるｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒとするため、まずｐＨＴ４３をＳｍａＩ（タカラ（株））で消化し、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）をＴ４−ｌｉｇａｓｅを用いて挿入した。ここで構築したｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒをｐＨＴ４３−ＧＡＴＥとし、ｐＬＦＴ−ＥＮＴＲと共にＬＲ反応に使用した。
【００１６】
形質転換
ＬＲ反応の結果、構築された発現用ベクターをｐＬＦＴ−Ｇとした。ｐＬＦＴ−Ｇおよびインサートを含まないコントロールベクターｐＨＴ４３をＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８に形質転換し、それぞれＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ（ＡＨＵ１８４１、ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３とした。
【００１７】
（３）ＬＦＴａｓｅ活性の検出。
基質として使用するレバンはＳｅｒｒａｔｉａ  ｌｅｖａｎｉｃｕｍ由来のものを和光純薬（株）から購入して使用した。反応はリン酸ナトリウム緩衝液（終濃度５０ｍＭ、ｐＨ６．０）とレバン（終濃度１０ｍｇ／ｍｌ）、および０．２５ｍｌの培養上清を混合し、最終的に体積が０．５ｍｌとなるようにして、３７℃で３時間反応を行った。反応産物をＴＬＣまたはＨＰＬＣにより分析した。ＴＬＣには参考文献（非特許文献参照５）に記載されている方法Ｂを使用し、ＨＰＬＣによる測定ではｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  ｉｎｄｅｘ  ｄｅｔｅｃｔｏｒを検出に使用し、カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱ  ６×２５０ｍｍ、（ＹＭＣ（株）京都）を使用し、移動相は水とした。１ＵのＬＦＴａｓｅ活性は１分間に１μｍｏｌのＤＦＡ  ＩＶを生産するのに必要な酵素量とした。
【００１８】
（４）ＤＦＡ  ＩＶの精製
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）の培養上清に市販パン酵母を添加し、２７度で４８時間反応を行うことでＤＦＡ  ＩＶ以外の糖を除去した。これは、パン酵母が砂糖やフルクトース、グルコース、およびレバン型のオリゴ糖を資化する一方でＤＦＡ  ＩＶを資化しないという性質を利用したものである（非特許文献参照１）。
反応後、酵母菌体は遠心により除去し、上清に吸着剤として活性炭を添加した。この活性炭をカラム（２．６×３０ｃｍ）に充填し、超純水で十分に洗浄した。その後２５％エタノールで溶出を行い、溶出液をエバポレーターで濃縮、乾燥後、重水に溶解した。１３Ｃ−ＮＭＲ解析はＢｒｕｋｅｒＡＭＸ−５００を用いて行った。
【００１９】
結果と考察
（１）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるｌｆｔｇｅｎｅの発現の検出
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３をＬＢ培地で培養し、生育が１．０（ＯＤ６６０）に達した時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（以下ＩＰＴＧ）を添加した。培養３時間後および６時間後に培養液の一部を回収し、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｅｖａｎを基質として上清のＬＦＴａｓｅ活性を検出した。ＴＬＣによる解析の結果、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）のサンプルにのみＤＦＡ  ＩＶに一致するスポットが検出された（図１）。この結果からＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）においてｌｆｔ遺伝子が発現されたことが示唆された。
【００２０】
（２）単一培養系における砂糖からのＤＦＡ  ＩＶの生産
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）をＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ（ＴＢ培地）（非特許文献参照２２）で１０時間培養した。５００  ｍｌの培養液を２５  ｍｌのＴＢ培地に接種し、５００ｍｌ容の坂口フラスコを用いて１２０ｒｐｍ、３７℃の条件で振盪培養した。生育、ＬＦＴａｓｅ活性、ＤＦＡ  ＩＶ生産量を図２に示した。
生育が１．０（ＯＤ６６０）になった時点でＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加した。誘導後１５．５時間までＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）のＬＦＴａｓｅ活性が上昇した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）の最大活性（０．０６２  Ｕ／ｍｌ）はこれまでに報告されているＡ．  ｎｉｃｏｔｉｎｏｖｏｒａｎｓ  ＧＳ−９のＬＦＴａｓｅ活性（３．３  Ｕ／ｍｌ）（非特許文献参照１９）よりも低いものであった。誘導１５．５時間後、終濃度が２００  ｇ／ｌとなるように砂糖溶液を培地中に添加した。ＨＰＬＣによる分析の結果、ＤＦＡ  ＩＶに一致する生産物はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）の培養上清にのみ検出された。砂糖添加７８時間後、２０．５ｇ／ｌのＤＦＡ  ＩＶの生産が確認された。また、１３９．３ｇ／ｌの砂糖の消費が確認された。
培養上清から精製したＤＦＡ  ＩＶのＨＰＬＣ純度は９５．４％であった。
【００２１】
１３Ｃ−ＮＭＲ解析の結果、精製産物の化学シフトはこれまでに報告されているＤＦＡ  ＩＶのケミカルシフト（非特許文献参照２３）に一致した。値を表１に示す。この結果からＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）が単一培養系において砂糖からＤＦＡ  ＩＶを生産したことが示された。
【００２２】
（表１）
１３Ｃ−ＮＭＲ 培地上清から精製した物質の化学シフトＡｓｓｉｇｎｍｅｎｔ
―――――――――――――――――――――――――
炭素番号        １３Ｃ−ＮＭＲ化学シフト
――――――――――――――――――――
精製物質（ａ）                  ＤＦＡ  ＩＶ（ｂ）
―――――――――――――――――――――――――
１           ６０．７                            ６０．７
２           １０３．５                         １０３．５
３           ８１．２                            ８１．２
４           ７７．２                           ７７．４
５           ７２．１                            ７２．３
６           ５９．６                           ５９．８
―――――――――――――――――――――――――
（ａ）ＴＳＰを外部標準として用いた．
（ｂ）非特許文献参照２３に記載された化学シフト
【００２３】
これまでに砂糖からＤＦＡ  ＩＶを生産した報告例は無い。そこで２分子の砂糖から２分子のフルクトースが遊離し、１分子のＤＦＡ  ＩＶが合成されると仮定した。
この仮定の下で砂糖からのＤＦＡ  ＩＶ生産の理論重量収率は４７．３％であり、本研究における重量収率は１４．７%であった。（１３９．３ｇ／ｌの砂糖２０．５ｇ／ｌのＤＦＡ  ＩＶが生産された）
この収率は理論収率の３１．１％であった。
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）とほぼ同じ生育を示したが、培養上清にＬＦＴａｓｅ活性やＤＦＡ  ＩＶの生産は確認されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
複雑な工程を経ることなく、１液系で、原料の砂糖から最終生成物であるＤＦＡ  ＩＶまでの反応が行われるため、より狭い場所で、より少ない工数でＤＦＡ  ＩＶを製造することができるため、量産化、コスト低減が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】Ｓｅｒｒａｔｉａレバンを基質とした反応のＴＬＣ分析の結果を示している（実施例１）
【図２】砂糖からのＤＦＡ  ＩＶ生産における生育とＬＦＴａｓｅ活性を示している（実施例１）
【符号の説明】
【００２６】
Ｓ１，セラチアレバン
Ｓ２  ＤＦＡ  ＩＶおよびフルクトース
レーン１および２，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３の反応物（それぞれ誘導後３時間または６時間後のもの）
レーン３および４，Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）の反応物（それぞれ誘導後３時間または６時間後のもの）
Ｓ３，フルクトース
１８時間の点線はスクロースを入れた時点を示す（図２）。
黒丸と実線はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３の生育を示す
黒三角と実線はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）の生育を示す。
白三角と実線はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）のＬＦＴａｓｅ活性を示す。
白三角と破線はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＬＦＴ−Ｇ  （ＡＨＵ１８４１，ＦＥＲＭ  ＡＰ−２１３０４）のＤＦＡ  ＩＶ生産量を示す。なお、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ／ｐＨＴ４３の上清にはＤＦＡ  ＩＶの生産は確認できなかった。
【図１】
2008307010.tif 000003
【図２】
2008307010.tif 000004