(57)【要約】【課題】創傷および／または線維性障害の治療のための化合物を提供すること。【解決手段】本出願は、創傷および／または線維性障害の治療における性ホルモン系に影響を与える化合物の使用に関する。このような治療に使用する化合物としては、ステロイドホルモンが好ましく、エストロゲン類が特に好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症を阻害するための医薬の製造のためのエストロゲン活性を阻害するタモキシフェン以外の化合物の使用。
【請求項２】
エストロゲン活性のインヒビターが、エストロゲン受容体アンタゴニストである請求項１記載の化合物の使用。
【請求項３】
エストロゲン受容体アンタゴニストが、クエン酸クロミフェンまたはシクロフェニルである請求項２記載の化合物の使用。
【請求項４】
エストロゲン活性のインヒビターが、アナストロゾール、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、エキセメスタン、エステロン−３−Ｏ−スルフェート、ファドラゾール塩酸塩またはフォルメスタンから選ばれるエストロゲン産生のインヒビターまたはフィトエストロゲンである請求項１記載の化合物の使用。
【請求項５】
瘢痕形成を減少させるか、または予防する請求項１〜４のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項６】
創傷の治癒を促進するための医薬の製造におけるアンドロゲン活性を促進する化合物の使用。
【請求項７】
創傷が、皮膚創傷である請求項６記載の化合物の使用。
【請求項８】
化合物が、テストステロン、ジヒドロテストステロン、５α−アンドロスタンジオール、テストステロンウンデカノエート,テストステロンエナンセート、テストステロンエステル、テストステロンプロピオネート、メステロロン、ダナゾールおよびゲストリノンから選ばれるアンドロゲンホルモンまたはアンドロゲン受容体アゴニストである請求項６または７記載の化合物の使用。
【請求項９】
化合物が、アンドロゲン分解のインヒビター、アンドロゲン受容体アゴニスト分解のインヒビターまたは黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモンまたはコリオゴナドトロフィンのモジュレーターの１つである請求項６または７記載の化合物の使用。
【請求項１０】
アンドロゲン分解のインヒビターまたはアンドロゲン受容体アゴニスト分解のインヒビターが、アミノグルテサミドである請求項９記載の化合物の使用。
【請求項１１】
線維症を阻害するための医薬の製造におけるアンドロゲン活性を阻害する化合物の使用。
【請求項１２】
化合物が、アンドロゲン受容体アンタゴニストである請求項１１記載の化合物の使用。
【請求項１３】
化合物が、シプロテロンアセテートまたはフルタミドである請求項１２記載の化合物の使用。
【請求項１４】
化合物が、アンドロゲン産生のインヒビターである請求項１１記載の化合物の使用。
【請求項１５】
瘢痕形成を減少させるか、または予防するための請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項１６】
線維症を阻害するための医薬の製造におけるプロゲステロン活性を促進する化合物の使用。
【請求項１７】
化合物が、プロゲステロンまたはアリエストレノール、デソゲストレル、ジドロゲステロン、エチノジオールジアセテート、ゲストデン、ゲストラノールヘキサノエート、ヒドロキシプロゲステロンヘキサノエート、レボノルゲストレル、メゲストロールアセテート、メドロキシプロゲステロンアセテート、ノルエチステロン、ノルエチステロンアセテート、ノルエチステロンエナンチオエート、ノルゲスチメートもしくはノルゲステレルから選ばれる他のプロゲステロン受容体アゴニストである請求項１６記載の化合物の使用。
【請求項１８】
化合物が、プロゲステロンまたはプロゲステロン受容体アゴニスト分解のインヒビターまたは黄体ホルモン、濾胞刺激ホルモンもしくはコリオゴナドトロフィンのモジュレーターの１つである請求項１６記載の化合物の使用。
【請求項１９】
瘢痕形成を減少させるか、または予防するための請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項２０】
創傷の治癒を促進するための医薬の製造における性ステロイドホルモン先駆体の使用。
【請求項２１】
化合物が、エストロゲンまたはアンドロゲン性ステロイドホルモンの先駆体である請求項２０記載の化合物の使用。
【請求項２２】
化合物が、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）または硫酸ＤＨＥＡ（ＤＨＥＡＳ）である請求項２１記載の化合物の使用。
【請求項２３】
非全身適用に用いる、前記請求項のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２４】
液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、紛剤、エアロゾル剤またはインプラントの剤形で医薬を製造するための前記請求項のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２５】
点眼剤の剤形で医薬を製造するための請求項１から２３のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項２６】
医薬が０．００１％から４重量％の化合物を含む、前記請求項のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項２７】
治療有効量の請求項１〜５および１１〜１９のいずれか１つに記載の化合物を創傷または線維性障害の部位に供給することを含む線維症を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、創傷の治癒、および線維症が組織修復の主なメカニズムである状態あるいは過剰の線維症が病的障害および組織の機能不全を引き起こす状態の治療における、線維症の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人における創傷治癒は、複雑な修復プロセスである。治癒プロセスは、創傷部位における種々の特殊細胞の漸増から始まり、細胞外マトリックスおよび基底膜の蓄積、血管形成、選択的プロテアーゼ活性および再上皮形成を含んでいる。成人哺乳類における治癒プロセスの重要な構成要素は、線維芽細胞を刺激して細胞外マトリックスを産生させることである。この細胞外マトリックスは、創傷領域の修復を進展させる結合組織の主な構成要素である。
【０００３】
治癒プロセス中に形成される結合組織は、天然においてしばしば線維状であり、通例、結合組織に瘢痕が形成される（線維症として知られるプロセス）。
【０００４】
瘢痕は、損傷および創傷（切開、切除または外傷など）の結果として形成される異常な形態学上の構造である。瘢痕は、主としてＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンならびにフィブロネクチンからなるマトリックスである結合組織を含む。瘢痕は、異常な組織形成にけるコラーゲン線維からなる場合もあり（皮膚の瘢痕）、あるいは結合組織の異常な蓄積である場合もある（中枢神経系の瘢痕）。大部分の瘢痕は、異常に組織されたコラーゲンおよび過剰なコラーゲンからなる。ヒトの皮膚の場合、瘢痕は皮膚表面の下に押し下げられているかまたは上に押し上げられた形状で存在する。肥大した瘢痕は、正常な瘢痕よりも深刻な形態であり、皮膚の正常な表面の上に押し上げられており、異常なパターンで配列された過剰のコラーゲンを含んでいる。ケロイドは、病的瘢痕の他の形態であり、皮膚の表面の上に押し上げられているばかりでなく、もとの損傷の境界を越えて広がる。ケロイドには、膠原性の組織の渦巻き中で主に異常な形式で組織される過剰の結合組織が存在する。肥大性瘢痕とケロイド性瘢痕の両方を形成する遺伝的素因がある。このような素因は、人種としてはアフリカ−カリビアンおよびモンゴロイドに特によく見られる。
【０００５】
創傷の治癒を促進する医薬を提供する必要がある。たとえば、急性創傷（刺し傷、火傷、選択的外科手術の結果生じる神経損傷または創傷など）、慢性創傷（糖尿病性潰瘍形成、静脈潰瘍形成および床ずれ潰瘍形成など）または一般に治癒が困難となっている個体（老年者など）の場合、治癒進度の増進を所望されることが多い。これらの例において、創傷は、生命の状況に重大な影響を及ぼし、死に至らしめることさえもあるので、臨床的に可能な限り、治癒進度の増進が必要とされる。創傷治癒進度が増進すると、瘢痕形成もそれにともなって増進することも多いが、このことは、所望の治癒進度の増進と比べると二次的重要度である。
【０００６】
本明細書で用いる語句「創傷」は、皮膚への損傷を意味するがこれに限定されるものではない。他のタイプの創傷には、肺、腎臓、心臓、腸、腱または肝臓などの内部組織あるいは臓器への障害、損傷または外傷が含まれる。
【０００７】
しかし、瘢痕形成の調節が一次的重要度であり、創傷治癒の進度が二次的に考慮されるという場合もある。このような状況の例は、過剰の瘢痕が、組織の機能を妨げるような場合の皮膚の瘢痕であり、特に、瘢痕拘縮が起こる場合である（たとえば、関節の柔軟性を減損するような皮膚の火傷および創傷）。美容上の考慮が重要である場合の皮膚の瘢痕の減少もまた、強く所望されている。皮膚において、肥大性またはケロイド性瘢痕（特に、アフリカ−カリビアンおよびモンゴロイドにおいて）は、機能的および美容的減損を引き起こすものであり、それらの発生を予防する必要がある。両方(移植部および切除部)の皮膚部位に生じる瘢痕および人工皮膚の適用によって生じる瘢痕もまた、問題であり、最小化あるいは予防が必要とされている。
【０００８】
皮膚の瘢痕と同様に、内部瘢痕または線維症も非常に有害であり、その特定の例として以下のものが挙げられる。
【０００９】
（ｉ）中枢神経系において、グリアの瘢痕形成は、（神経外科手術または脳の穿損傷後などの）神経の再接続を妨げる。
（ｉｉ）眼内の瘢痕形成は、減損性である。角膜において、瘢痕形成は異常な混濁を引き起こし、視覚に問題を与え、盲目に至らしめることさえある。網膜において、瘢痕形成は、ゆがみあるいは網膜剥離を引き起こし、盲目に至らしめる。緑内障において眼圧を低下する手術（緑内障ろ過術など）における創傷治癒後の瘢痕は、水性体液が排出されないことによって外科処置の失敗を引き起こし、その結果として緑内障が再発する。
（ｉｉｉ）心臓における瘢痕形成（外科手術または心筋梗塞後など）は、異常な心臓機能を亢進する。
（ｉｖ）腹部または腎盂における手術は、しばしば、内臓癒着を引き起こす。たとえば、腸と体壁の癒着が形成されると、腸のループがねじれて、虚血、壊疽が生じ、緊急処置が必要となる（処置しなければ死亡する）。腸の外傷または切開は、瘢痕の形成および瘢痕による拘縮を引き起こし、狭窄に至らしめ、腸の管腔閉塞が起こり、その結果再び生命が脅かされる。
（ｖ）卵管の領域における腎盂の瘢痕形成は、不妊症を引き起こす。
（ｖｉ）筋肉の損傷後の瘢痕形成は、異常な拘縮をもたらし、筋肉の機能が減損する。
（ｖｉｉ）腱および靭帯の損傷後の瘢痕形成または線維症は、重篤な機能減損をもたらす。
【００１０】
上記に関連して、事実、過剰の線維症が病的障害および組織の機能不全を引き起こす線維性障害として知られる多数の医療的対処を必要とする体調がある。線維性障害は、組織内に異常な形式で線維性組織（主にコラーゲン）が蓄積することを特徴とする。このような線維性組織は、種々の障害プロセスから生じる。これらの障害は、必ずしも外科手術、外傷あるいは創傷によって引き起こされるとは限らない。線維性障害は通常慢性的である。線維性障害の例として、肝硬変、肝臓線維症、糸球体腎炎、肺線維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症、発作後または神経退行性障害（アルツハイマー病）後の中枢神経系線維症、増殖性硝子体網膜症および関節炎が挙げられる。したがって、これらの線維性障害において、線維症／瘢痕形成を調節する（すなわち、予防、阻止または回復させる）ことによってこのような体調の治療に用いうる医薬も必要である。
【００１１】
上記考察は主としてヒトの体調、障害あるいは疾病に対して適用するものであるが、他の動物、特に愛玩動物または家畜（ウマ、ウシ、イヌ、ネコなど）においても、創傷治癒、瘢痕形成および線維性障害が問題であることが理解されよう。たとえば、腱と靭帯の損傷から瘢痕形成または線維症に至るために、腹部創傷または癒着は、ウマ（特に競走馬）を引退させる主な原因である。
【００１２】
創傷治癒、瘢痕形成および線維性障害の分野において、最近幾らかの発展がなされている。これらの発展の幾つかは、一連のサイトカインおよび成長因子が組織の修復に深くかかわっているという最近の知識に関連するものである。
【００１３】
ＷＯ−Ａ−９２／１７２０６には、線維症促進成長因子に対して中和剤を使用することにより、創傷治癒中に瘢痕形成が阻害されることが開示されている。たとえば、ＷＯ−Ａ−９２／１７２０６は、組成物がトランスフォーミング成長因子β１およびβ２を特に阻害すること、および瘢痕形成を減少させるのに血小板由来成長因子が特に有用であることを実証している。
【００１４】
ＷＯ−Ａ−９３／１９７６９には、トランスフォーミング成長因子β３といったような非線維性因子を使用することにより、線維症を誘発することなく創傷治癒が促進されるという驚くべき発見が開示されている。
【００１５】
ＧＢ−Ａ−２２８８１１８には、成長因子に対して産生された特異的抗体を用いることにより、該成長因子の作用が強化されて治癒を促進することが開示されている。
【００１６】
他の発展の例として、マンノース−６−ホスフェートを、細胞外マトリックスの蓄積およびトランスフォーミング成長因子β１またはβ２の濃度上昇に関連した線維性障害の治療に使用することが挙げられる（ＧＢ−Ａ−２２６５３１０）。マンノース−６−ホスフェートは、これらのトランスフォーミング成長因子の潜伏型から活性型への転換を妨げると考えられる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
これらの進歩にもかかわらず、創傷治癒を調節するのに用い得る医薬を発達させることを継続する必要性は依然として残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の第１の態様は、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物を、創傷または線維性障害の治療用医薬の製造に使用することである。
【００１９】
本発明の第２の態様は、創傷または線維性障害の部位に、治療上有効量の性ホルモン系に影響を及ぼす化合物を適用することを特徴とする創傷または線維性障害の治療方法である。
【００２０】
本発明の第３の態様は、創傷または線維性障害を治療するための、治療上有効量の性ホルモン系に影響を及ぼす化合物の相当量ならびに医薬的に許容しうるビヒクルを含む治癒組成物である。
【００２１】
「性ホルモン系」とは、性、性的発達、受精能力、第２次性徴および雌性における月経周期ならびに妊娠に影響を及ぼす内分泌系を意味する。有用な化合物は、この系に影響を及ぼす化合物である。このような化合物としては、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲステロン、コリオゴナドトロフィン、濾胞刺激ホルモン放出ホルモンおよび黄体形成ホルモンならびにそれらの先駆体といったような内因性ホルモンが挙げられる。
【００２２】
本発明にしたがって、本発明者らは、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物を用いて創傷および線維性障害を治療しうることを見出した。該化合物を用いることにより、創傷または線維性障害を治療するための種々の調節効果が提供されるが、それについて以下にさらに詳しく説明する。
【００２３】
本発明は、創傷の治癒進度が、再上皮形成、細胞外マトリックスおよび基底膜の蓄積などの点で、患者の年齢とともに低下するということを示す我々の研究に基づいている。我々は、老年の女性の方が、老年の男性よりも治癒が迅速であることも明らかにした。これには、老年の女性は、老年の男性よりも、創傷線維芽細胞の数の増加、トランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦ−β１）濃度の上昇およびタンパク質分解活性の増加において優れているが、若年の男性および女性と比べると低下していることが関連していた。若年の男性と若年の女性では、男性の方が瘢痕の形成が少ないということもわかり、それは両性の間で、ＴＧＦ−β１の濃度が相異することに関連している。両性間で存在するもう一つの差異は、女性の創傷治癒が、通常、男性よりもエラスチン濃度が高く、血管形成が速いことが関連している。
【００２４】
これらの発見が、我々を、性ホルモンおよび性ホルモン系に影響を及ぼす他の化合物が創傷治癒の進度と質（瘢痕形成または線維症の広がり）に影響を与え、かつまた線維性障害における線維性組織の蓄積にも影響を与えるということに気づかせた。閉経後の女性において、創傷治癒の進度と質に対するホルモン置換療法（ＨＲＴ:hormone replacemant therapy）の効果を評価することによって、この仮説を検証し、確認した。エストロゲン単独またはエストロゲンとプロゲステロンのＨＲＴを受けた女性は、薬物を投与されなかった同年齢の女性と比べて、皮膚創傷治癒（再上皮形成および細胞外マトリックスの蓄積の点で）の進度が有意に増大した。ＨＲＴにおいて、閉経後の女性の正常な（傷害を受けていない）皮膚および創傷の両方において、タンパク質分解活性は、２０〜３０歳の女性グループよりも低かった。このような影響もまた、正常皮膚における年齢に関連した、トランスフォーミング成長因子β１の変化の退行またはインターロイキン１のプロフィールに関連していた。
【００２５】
本発明者らは、いかなる仮説によっても強制されることを望まないが、性ホルモンおよび性ホルモン系に影響を及ぼす他の化合物がその創傷治癒効果を現すメカニズムが、サイトカイン類（ＴＧＦ−β１、血小板由来成長因子またはインターロイキン１など）などの創傷治癒を調節する分子の活性を調節し、それによって細胞機能（線維芽細胞の機能など）に影響を及ぼすことによるものである可能性があると考える。たとえば、我々のインビトロでの研究は、エストロゲンが線維芽細胞のＴＧＦ−β１産生を増加させ、そのことが、創傷治癒進度を増大させるエストロゲンの効果に関連していることを発見した。性ホルモン系に影響を及ぼす他の化合物もまた線維芽細胞の活性を調節する。たとえば、プロゲステロンは、老年期の線維芽細胞の増殖を阻害するが、アンドロゲンは、エストロゲンの効果と類似した効果をもつ。
【００２６】
我々は、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物もまた、創傷または線維性傷害を受けている組織において、酵素プロフィールを調節することを見出した。特に、我々は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）（特に、ＭＭＰ２およびＭＭＰ９）ならびにエラスターゼといったような他の分解性酵素の酵素濃度が、エストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロンといったような化合物によって調節されることを見出した。我々は、この調節が、創傷治癒進度に影響を及ぼすのに充分であるかまたは線維症を調節する（そして、それによって瘢痕形成または線維性障害に影響を及ぼす）のに充分であり、これらの影響が、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物が創傷または線維性障害を治療することができる、補足的、付加的または二者択一的メカニズム（先のパラグラフで議論した）を説明する可能性があると考える。
【００２７】
幾つかのクラスの化合物が、性ホルモン系に影響を及ぼす能力をもつ。このような化合物としては、ホルモン、ホルモン受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、ホルモン受容体の内因性アクチベーターまたはインヒビターの放出を調節する作用剤、内因性ホルモン受容体リカンドの合成を調節する作用剤、内因性ホルモン受容体リカンドの分解を調節する作用剤、ホルモン受容体の発現または活性を調節する作用剤、および性ホルモン系の受容体とエフェクター系間のシグナルトランスダクションに含まれるメカニズムを強化する作用剤が挙げられる。
【００２８】
好ましい性ホルモン系に影響を及ぼす化合物は、ホルモン（またはその生物学的に活性な誘導体）およびホルモン受容体のアゴニストならびにアンタゴニストである。最も好ましい性ホルモン系に影響を及ぼす化合物は、ステロイド性ホルモン（エストロゲン、プロゲステロンまたはテストステロンなど）または性ステロイドホルモン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである。
【００２９】
本発明に従って、２つの主要な方法のうちのひとつ（使用した特定の化合物に応じて）において、創傷治癒を調節するための性ホルモン系に影響を及ぼす化合物が見出されている。本発明の第１および第２の具体例として、この方法を以下に述べる。
【００３０】
本発明の第１の具体例において、我々は、性ホルモン系に影響を及ぼすある化合物は、瘢痕形成または線維症を増加するけれども、創傷治癒を促進する能力を有することを発見した。このような化合物は、創傷治癒の進度が優先し、瘢痕の程度が２次的に考慮される場合に、特に非常に有用である。このような創傷は、生命の状況に重大な影響を及ぼし、死に至らしめることさえもあるので、したがって、臨床的に可能な限り、治癒進度の増進が必要とされる。
【００３１】
本発明の第１の具体例の最も有効な化合物は、通常、創傷部位においてエストロゲン活性を促進する化合物である。この促進作用によって創傷治癒が加速される。
【００３２】
エストロゲン活性を促進するのに用いる化合物としては、エストロゲン、エストロゲン受容体アゴニスト（エチニルエストラジオール、ジエンエストロール、メストラノール、エストラジオール、エストリオール、複合エストロゲン、ピペラジンエストロンスルフェート、スチルベストロール、フォスフェステロールテトラナトリウム、ポリエストラジオールフォスフェート、チボロンなど）、エストロゲンまたはエストロゲン受容体アゴニスト分解のインヒビター、フィトエストロゲン、または黄体形成ホルモン,濾胞刺激ホルモン放出ホルモンおよびコリオゴナドトロピンのモジュレーターが挙げられる。
【００３３】
エストロゲン活性のプロモーターに代わる物として、本発明の第１の具体例において、アンドロゲン活性のプロモーターを使用することが可能である。
【００３４】
好ましいアンドロゲン活性のプロモーターとしては、アンドロゲンホルモン（テストステロン、ジヒドロテストステロン、５α−アンドロスタンジオールなど）、アンドロゲン受容体アゴニスト（テストステロンウンデカノエート,テストステロンエナンセート、テストステロンエステル、テストステロンプロピオネート、メステロロン、ダナゾールおよびゲストリノンなど）、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体アゴニスト分解のインヒビター（アミノグルテサミンなど）、黄体形成ホルモン および濾胞刺激ホルモン放出ホルモンのモジュレーター、アナボリックステロイド（ナンドロロンまたはスタノゾロールなど）が挙げられる。
【００３５】
本発明の第１の具体例として使用するのにこのましい化合物は、エストロゲンホルモン受容体アゴニストである。１７β−エストラジオールが特に好ましい。
【００３６】
本発明の第２の具体例において、我々は、性ホルモン系に影響を及ぼすある化合物は、創傷治癒の進度は犠牲にするけれども、瘢痕形成の程度を改善するかまたは望ましくない線維症を予防することによって、創傷治癒または線維性障害を調節し得る能力を有することを発見した。
【００３７】
本発明の第２の具体例で使用する、このような化合物（線維症を阻止する）は、瘢痕形成を予防あるいは軽減する必要がある場合に有用である。
【００３８】
すなわち、本発明の第２の具体例において使用される、このような化合物（線維症を阻止する）は、瘢痕形成が予防または軽減されることが必要な以下のような状況あるいは体調において有用である。
【００３９】
（ｉ）皮膚の瘢痕が組織機能に対して過剰および／または有害である場合、特に、瘢痕の拘縮が起こるかまたは起こる可能性がある場合（たとえば、関節の柔軟性を損なう皮膚の火傷および創傷、特に子供の瘢痕）。
（ｉｉ）美容上の考慮が重要である皮膚における瘢痕形成。
（ｉｉｉ）機能的および美容的減損を引き起こす、肥大性またはケロイド性瘢痕（特に、アフリカ−カリビアンおよびモンゴロイドにおいて）が生じる場合。
（ｉｖ）両方(移植部および切除部)の皮膚部位に生じる瘢痕および人工皮膚の適用によって生じる瘢痕形成。
（ｖ）（神経外科手術または脳の穿損傷後などの）中枢神経系における瘢痕形成。たとえば、グリアの瘢痕形成は、傷んだ神経の再接続を妨げる。
（ｖｉ）眼内、特に角膜における瘢痕形成（瘢痕形成が異常な混濁を引き起こし、視覚に問題を与え、盲目に至らしめることさえある）、網膜における瘢痕形成（ゆがみあるいは網膜剥離を引き起こし、盲目に至らしめる）、および緑内障において眼圧を低下する手術（緑内障ろ過術など）における創傷治癒後の瘢痕形成（水性体液が排出されないことによって外科処置の失敗を引き起こし、その結果として緑内障が再発する）。
（ｖｉｉ）異常な心臓機能を亢進する心臓における瘢痕形成（外科手術または心筋梗塞後など）。
（ｖｉｉｉ）腹部または腎盂における手術は、しばしば、内臓癒着を引き起こす。たとえば、腸と体壁の癒着が形成されると、腸のループがねじれて、虚血、壊疽が生じ、緊急処置が必要となる（処置しなければ死亡する）。腸の外傷または切開は、瘢痕の形成および瘢痕による拘縮を引き起こし、狭窄に至らしめ、腸の管腔閉塞が起こり、その結果再び生命が脅かされる。
（ｉｘ）不妊症を引き起こす、卵管の領域における腎盂の瘢痕形成。
（ｘ）異常な拘縮をもたらし、筋肉の機能が減損する、筋肉の損傷後の瘢痕形成。
（ｘｉ）重篤な機能減損をもたらす、腱および靭帯の損傷後の瘢痕形成または線維症。
【００４０】
本発明の第２の具体例において使用される、このような化合物（線維症を阻止する）はまた、線維性障害、たとえば、肝硬変、肝臓線維症、糸球体腎炎、肺線維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症、発作後または神経退行性障害（アルツハイマー病）後の中枢神経系線維症、増殖性硝子体網膜症および関節炎の治療または予防においても有用である。
【００４１】
本発明の第２の具体例において使用する化合物の例としては、プロゲステロンおよび他のプロゲステロン受容体アゴニスト（アリエストレノール、デソゲストレル、ジドロゲステロン、エチノジオールジアセテート、ゲストデン、ゲストラノールヘキサノエート、ヒドロキシプロゲステロンヘキサノエート、レボノルゲストレル、メゲストロールアセテート、メドロキシプロゲステロンアセテート、ノルエチステロン、ノルエチステロンアセテート、ノルエチステロンエナンチオエート、ノルゲスチメートまたはノルゲステレルなど）、プロゲステロンまたはプロゲステロン受容体アゴニスト分解のインヒビターおよび黄体ホルモンおよび／または濾胞刺激ホルモンのモジュレーターといったようなプロゲステロン活性のプロモーターが挙げられる。
【００４２】
別の態様において、本発明の第２の具体例で用いる化合物は、エストロゲン活性のインヒビターである。好ましいエストロゲン活性のインヒビターとしては、エストロゲン受容体アンタゴニスト（タモキシフェン、クエン酸クロミフェン、またはシクロフェニルなど）、エストロゲン産生のインヒビター（アナストロゾール、４−ヒドロキシアンドロステンジオン、エキセメスタン、エステロン−３−Ｏ−スルフェート、ファドラゾール塩酸塩またはフォルメスタンなど）およびフィトエストロゲンが挙げられる。本発明の第２の具体例において使用する化合物として、タモキシフェンが、特に有用である。
【００４３】
さらなる可能性として、本発明の第２の具体例において用いる化合物は、アンドロゲン活性のインヒビターである。好ましいアンドロゲン活性のインヒビターとしては、アンドロゲン受容体アンタゴニスト（シプロテロンアセテートまたはフルタミドなど）およびアンドロゲン産生のインヒビターが挙げられる。
【００４４】
本発明の第２の具体例において、性ホルモンに影響を及ぼす他の化合物を使用してもよい。たとえば、次に活性化合物に変換される、性ホルモンの先駆体を用いてもよい。デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）およびその硫酸エステル。硫酸ＤＨＥＡ（ＤＨＥＡＳ）およびその類縁体は、エストロゲンおよびアンドロゲンの先駆体であり、本発明の第１の具体例において性ホルモンに影響を及ぼす化合物として用いて、創傷治癒を促進することができる。我々は、グルココルチコイドといったような他のステロイド（血中濃度が年齢を重ねても比較的よく保存される）とはコントロール的に、ＤＨＥＡとＤＨＥＡＳの循環濃度が、年齢とともに急速かつ著しく低下すること（このことを我々は、創傷治癒の遅延化と関連付けた）を観察した後、ＤＨＥＡおよびＤＨＥＡＳおよびその類縁体が、創傷治癒の調節においてどのように有効かを研究した。我々は、各個体にＤＨＥＡを処置することが、創傷修復の進度を刺激することによって老年者の創傷治癒に影響を及ぼすことを立証する実験を行った。このように、本発明の第１の具体例において、ＤＨＥＡまたはＤＨＥＡＳならびにその類縁体を用いることができる。
【００４５】
医薬の効力を最大化するために、上述の化合物を組み合わせて使用しうることが理解されよう。たとえば、プロゲステロン受容体アゴニストおよびエストロゲン受容体アンタゴニストを組み合わせて用いて、瘢痕形成および／または線維症に対する効果を最大化することができる。
【００４６】
他の好ましい組み合わせは、治癒の進度が増進され、かつ線維症も阻止されるような、創傷の治療に有効なものである。エストロゲン受容体アゴニストおよびプロゲステロン受容体アゴニストの組み合わせがこの目的において用いられる。
【００４７】
別の態様として、本発明の化合物の組み合わせを逐次等よしてもよい。たとえば、エストロゲンアゴニストを手術前（または手術時）に使用して外科切開の治癒を促進することができる。その後、患者が手術から回復してから、プロゲステロンアゴニストを投与して瘢痕形成を軽減することができる。
【００４８】
非全身投与（皮膚への局所投与など）のみが、局所的作用を示し、それゆえに望ましくない影響を及ぼさないのに対して、性内分泌系に影響を及ぼす化合物を全身に適用することは、第２次性徴に影響を及ぼすといったような望ましくない影響を与えるので、本発明によって企図される好ましい処置処方は、非全身的処置である。しかし、全身適用が有用である場合もある（たとえば、重篤な傷害または急速な治療が必要である場合など）。
【００４９】
本発明組成物は、特に該組成物が用いられるべき作法に応じて多くの異なる形態をとることができる。したがって、たとえば、組成物は、液剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、粉剤またはエアロゾル剤の形態であってよい。本発明組成物のビヒクルが、患者にとって充分に寛容であり、創傷に有効化合物を放出しうるものであるべきだということが理解されよう。このようなビヒクルとして、生体崩壊性、生体分解性および／または非炎症性であるものが好ましい。
【００５０】
化合物がステロイド（エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲンまたはＤＨＥＡなど）である場合、ビヒクルに化合物の水に対する溶解性を改良する担体分子を含有させる。適当な担体は、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンであり、ステロイドとほぼ同じ濃度で組成物中に存在するのが好ましい。
【００５１】
本発明組成物は、多くの適用方法で用いることができる。したがって、たとえば、本発明の第１および第２の具体例の組成物を、患者の創傷の内部および／または周囲に適用して所望の創傷治癒調節を提供することができる。
【００５２】
もし、当面の創傷、損傷あるいは外傷に直接組成物を適用するならば、次いで医薬的に許容しうるビヒクルは、炎症応答を引き起こさず、組織に対して毒性のないものである。
【００５３】
しかし、予防薬として、本発明組成物を使用することもまた可能である。たとえば、外科手術（特に選択的外科手術）の前に、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物を投与して、創傷治癒進度が増進するように（本発明の第１の具体例）または瘢痕形成および／または線維性障害が軽減するように（本発明の第２の具体例）、適切に手術傷の治癒を調節するのが望ましい。この場合、組成物のビヒクルには、化合物を用的部位にデリバリーしうるものが必要である。たとえば、ビヒクルは、皮膚のケラチン層を通って該化合物を運搬するのに適していることが必要である。この目的に適当なビヒクルの例としては、ジメチルスルホキシドおよび酢酸が挙げられる。
【００５４】
組成物は、治療されるべき創傷を覆うかまたは封じるために用い得る滅菌包帯またはパッチに塗布して適用してもよい。この事項については、慣例のホルモン復活療法パッチを用いて創傷および／または線維性障害を治療するのが適当である。
【００５５】
本発明化合物のさらに重要な適用は、眼の創傷治癒に関するものである。たとえば、網膜に涙を修復することを所望する場合、本発明の第１の具体例の組成物を用いて、強膜と網膜の間に、瘢痕形成（ならびに治癒進度の増進）を提供することができる。この場合、本発明組成物は、注射液である。別法として、本発明の第２の具体例の組成物を用いて、角膜におけるレーザー手術などの眼の外科手術後の瘢痕形成を軽減または制御することができる。この場合、本発明組成物は点眼剤で用いる。
【００５６】
本発明組成物は、体内の創傷治癒に用いることができる（上記眼の治療に加えて）。したがって、たとえば、肺の創傷治癒用の吸入薬、または肺の線維症ならびに狭窄の予防および治療用の吸入薬として、組成物を製剤する。
【００５７】
本発明組成物に配合されるべき性ホルモン内分泌系に影響を及ぼす化合物の量および／または創傷部位に適用されるべき化合物の量は、化合物の生物学的活性およびバイオアベイラビィティなどの複数の因子、さらに投与形態ならびに化合物の生理化学的特性に依存する。他の因子として、Ａ)処置される患者における化合物の半減期；Ｂ)治療される特定の状況；Ｃ）迅速治癒または瘢痕形成減少のいずれを所望するか；Ｄ）患者の年齢；Ｅ）患者の性別が挙げられる。
【００５８】
また、投与頻度、特に、処置された患者の体内における化合物の半減期が上記因子に関与する。
【００５９】
一般に、該組成物を用いて存在する創傷または線維性障害を治療する場合、創傷が生じた直後、あるいは障害が診断された直後に、化合物を投与すべきである。該組成物を用いる療法は、臨床医が満足する創傷治癒結果が得られるまで、または線維性障害の場合、異常な線維組織形成の恐れあるいは原因が排除されるまで継続すべきである。
【００６０】
創傷治癒を促進する、本発明の第１の具体例の組成物は、創傷が形成された直後に、創傷に適用されるべきである。急性の創傷および回復中の患者の創傷に対しては、創傷形成時、好ましくは、創傷形成後数時間以内、遅くとも２、３日以内に、組成物の完全投与（若年者向けなど）を、行うのが理想的である。慢性創傷または回復した創傷に対しては、できるだけ早くに、妥協投与（老年者向けなど）を行うべきである。
【００６１】
瘢痕形成および／または線維性障害を調節する、本発明の第２の具体例の組成物もまた、創傷が形成された直後に、創傷に適用されるべきである。しかし、線維症は、数日あるいは数週間にわたって進行することが可能である。したがって、創傷形成または障害進行（またはその診断）の数日後あるいは数週間後に該組成物が投与される場合でさえも、化合物（プロゲステロンまたはタモキシフェンなど）を投与することによって、治療される患者は恩恵を受けることができる。
【００６２】
予防的に使用する場合（たとえば、外科手術前あるいは線維性障害が進行する恐れのある場合）、望ましくない線維症の恐れまたは創傷治癒の進度が遅いという可能性が確認されたら（老年者の患者の場合など）すぐに、組成物を投与すべきである。たとえば、任意の外科手術が行われる予定であり、その後の創傷治癒の進度を増進したい患者の皮膚の部位に、１７β−エストラジオールを含有するクリーム剤または軟膏剤を適用する。この場合、、患者に手術前処置をしているとき、または、外科手術の数時間前もしくは数日前に、（患者の健康状態および年齢ならびに形成される予定の創傷の大きさに応じて）組成物を適用するのが望ましい。
【００６３】
投与頻度は、使用する化合物の生物学的半減期によって決定する。典型的には、創傷部位または線維性障害に冒された組織における化合物の濃度が、治療効果を得るのに適した濃度に維持されるように、標的組織に化合物を含有するクリーム剤または軟膏剤を投与すべきである。このためには、一日一回投与または一日数回投与が必要である。創傷に対して、１７β−エストラジオールを用いる場合、創傷形成の２４時間後に化合物の投与を行えば、創傷治癒進度を改善するのに十分であることがわかった。
【００６４】
製薬業界において通例用いられる公知の操作（インビボ実験用、臨床施療用など）を用いて、特定の組成物を配合し、厳密な（化合物の一日投与量および投与頻度について）治療養生法を行う。
【００６５】
通常、本発明組成物は、０．００１〜４重量％の性ホルモン系に影響を及ぼす化合物を含有する。例えば、０．００５〜１重量％のエストリオール、エストラジオール、エチニルエストラジオールまたはテストステロンを含有する組成物が現存する（すなわち開口している）創傷への適用に適しているが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
さらに例を挙げると、予防剤として手術前に用いる組成物は、所望の創傷治癒効果を得るために、０．０１〜２重量％のエストリオール、エストラジオール、エチニルエストラジオールまたはテストステロンを含有する。
【００６７】
好ましい本発明に用いる組成物は、最大１％（０．００５〜１％など）の１７β−エストラジオールを含有する。
【００６８】
性ホルモン系に影響を及ぼす化合物の好適な一日投与量は、前述の因子ならびに治療される創傷の大きさに応じて決定する。創傷または線維性障害の治療に必要な化合物の代表的な量は、２４時間当たり、１ｎｇ〜１００ｇの範囲の有効化合物であり、創傷の大きさまたは線維症の程度ならびに他の幾つかの因子に応じて決定する。
【００６９】
例示として、皮膚の４ｍｍパンチ生検によってできた創傷の治療(治療進度を増進するための)には、０．５〜５００μｇ／２４時間の１７β−エストラジオールが適当な投与量であり、１０〜１００μｇ／２４時間の１７β−エストラジオールを用いるのが好ましく、２５μｇ／２４時間の１７β−エストラジオールが最も好ましい。
【００７０】
性ホルモン系に影響を及ぼすタンパク質またはペプチド化合物を使用する好ましい手段は、遺伝子治療の手段によって創傷へ化合物をデリバリーすることである。たとえば、遺伝子手段を用いて、慢性ゴナドトロフィン受容体、濾胞刺激ホルモン受容体または黄体ホルモン受容体に対するペプチドリガンドの発現を増加することができる。別法として、遺伝子手段を用いて、ステロイド系性ホルモン（エストロゲン、アンドロゲンまたはプロゲステロンなど）の合成に関与する酵素の発現を調節することもできる。したがって、本発明の第４の態様は、遺伝子治療技術に使用するためのデリバリーシステムを提供することであり、該デリバィーシステムは、性ホルモン系に影響を及ぼすことによって、直接的または間接的に、創傷を治癒および／または線維症もしくは瘢痕形成を調節するタンパク質をコードするＤＮＡ分子を特徴とし、該ＤＮＡ分子は、転写されて該タンパク質を発現する能力をもつ。
【００７１】
本発明の第５の態様は、前パラグラフで定義した、創傷治癒および／または線維症もしくは瘢痕形成の調節用の医薬の製造に用いるデリバリーシステムを提供することである。
【００７２】
本発明の第６の態様は、治療を必要とする患者に、治療上有効量の、本発明の第４の態様で定義したデリバリーシステムを投与することを特徴とする、創傷を治療および／または線維症もしくは瘢痕形成を調節する方法を提供することである。
【００７３】
該デリバリーシステムは、大部分の慣例のデリバリーシステムと比較して、有効成分の濃度を創傷部位または線維症部位において長期にわたって維持するのに非常に適している。創傷部位または線維症部位において、本発明の第４の態様のＤＮＡ分子で形質転換された細胞から、タンパク質が継続的に発現される。したがって、該タンパク質が、インビボにおいて作用剤としての半減期が非常に短かったとしても、治療上有効量のタンパク質が、処置された組織から継続的に発現される。
【００７４】
さらに、本発明のデリバリーシステムを用いて、創傷に塗布される軟膏剤またはクリーム剤に必要であった慣例の医薬的ビヒクルを使用することなく、ＤＮＡ分子（およびそれによって、有効な治療剤であるタンパク質）が提供される。これは、創傷治癒に用いる化合物に対する満足できるビヒクル（非炎症性、生体適合性、生体吸収性が要求され、有効成分を崩壊または不活性化してはならない（貯蔵中または使用中に））を提供するのが困難である場合において、特に有利である。
【００７５】
デリバリーシステムは、ＤＮＡ分子が発現して、直接的または間接的に、創傷を治癒および／または線維症もしくは瘢痕形成を治療する、タンパク質を産生しうるものである。“直接的”とは、遺伝子発現産物それ自体が、創傷治癒および／または線維症もしくは瘢痕形成の調節に必要な活性をもつことを意味する。“間接的”とは、遺伝子発現産物が、少なくとも一つのさらなる反応を受けるかまたは媒介して、創傷治癒および／または線維症もしくは瘢痕形成の調節に有効な作用剤を提供することを意味する。
【００７６】
該ＤＮＡ分子を、適当なベクターに導入して組換えベクターを作製することができる。ベクターは、たとえば、プラスミド、コスミドまたはファージである。このような組換えベクターは、本発明のデリバリーシステムにおいて、該ＤＮＡ分子で細胞を形質転換するのに非常に有用である。
【００７７】
組換えベクターには他の機能要素を含めることもできる。たとえば、細胞の核内で自律複製するように、組換えベクターを設計することができる。この場合、ＤＮＡ複製を誘発する要素は、組換えベクター内に必要である。別法として、ベクターおよび組換えＤＮＡ分子が細胞のゲノムに組み込まれるように、組換えベクターを設計することができる。この場合、標的となる組み込みに有利なＤＮＡ配列が望ましい。組換えベクターは、クローニング過程において選択可能なマーカーとして用いる遺伝子をコードするＤＮＡを含むこともできる
【００７８】
組換えベクターは、さらに、遺伝子発現のコントロールに必要とされる、プロモーターまたはレギュレーターを含むこともできる。
【００７９】
ＤＮＡ分子は、必須ではないが、治療される患者の細胞のＤＮＡに組み入れられてもよい。未分化細胞は、安定に形質転換されて、遺伝子的に修飾された娘細胞が産生される（この場合、患者における発現の調節は、特定の転写因子または遺伝子アクチベーターなどを必要とする）。別法として、治療される患者の分化細胞の不安定または過渡的形質転換を補助するように、該デリバリーシステムを設計することができる。この場合、ＤＮＡ分子の発現は、形質転換細胞が死亡するかまたはタンパク質の発現を止めた時に停止するので、発現の調節は、さほど重要ではない（理想的には、創傷、線維症もしくは瘢痕形成が治療されるかまたは予防された時点）。
【００８０】
デリバリーシステムは、ベクターに組み入れることなく、患者にＤＮＡ分子を提供することができる。たとえば、ＤＮＡ分子をリポソームまたはウイルス粒子に組み入れることができる。別法として、直接のエンドサイトーシスによる飲み込みなどの適当な手段により、“裸の（naked）”ＤＮＡ分子を患者の細胞に挿入することができる。
【００８１】
ＤＮＡ分子を、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、原形質融合または弾道衝撃によって、治療される患者の細胞に移入することができる。たとえば、被覆金粒子を用いる弾道トランスフェクション、ＤＮＡ分子を含むリポソーム、ウイルスベクター（アデノウイルスなど）および、局所適用または注射によりプラスミドＤＮＡを直接創傷領域に適用することによる直接ＤＮＡ取り込みを提供する手段（エンドサイトーシスなど）などによって、移入を行う。
【００８２】
該ＤＮＡ分子からタンパク質の発現すると、瘢痕形成の減少とともに創傷治癒を直接的または間接的に提供する場合、同時に瘢痕形成の増加がもたらされる場合もある創傷治癒進度の増進を提供する場合、あるいは線維症の調節（阻止、予防または回復）を提供する場合がある。
【００８３】
上記考察がは主としてヒトの創傷および線維性障害に対して適用されるが、他の動物種（特に、ウマ、イヌ、ネコといったような家畜）においても、創傷治癒、瘢痕形成および線維症は、問題となりうることが理解されよう。たとえば、腱と靭帯の損傷から瘢痕形成または線維症に至るために、腹部創傷または癒着は、ウマ（特に競走馬）を引退させる主な原因である。上記検討した化合物、組成物およびデリバリーシステムは、このような動物の治癒にも適している。
【００８４】
次に記載する実施例および図面において本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１
創傷治癒に対する卵巣切除術（すなわち、エストロゲンの除去）の影響を調べる実験を行った。
１．１方法
１．１．１ラットの準備
雌性のスプラーグドーリーラットを、９匹からなる３つのグループ（１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ）に分けて飼育し、発情周期を同調させた。１Ａグループは、創傷形成の１８日前に卵巣切除術（ＯＶＥ）を行い、循環する性ホルモンがなくなるようにした。１Ｂグループ（コントロール）は手術せず、１Ｃグループは、ＯＶＸと同じ手術操作をおこなったが、ＯＶＸ手術操作が創傷実験において影響を及ぼさないことを確証するために、卵巣は除去しなかった（偽試験：ｓｈａｍ）。
【００８６】
１．１．２処置
０．１％および０．２％の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンをそれそれ含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に、１７β−エストラジオール（シグマ）を０．１％および１％含有する滅菌溶液を調製した。２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは、調製物において、β−エストラジオールの水への溶解度を増加するための担体分子として用いる。ＰＢＳ／シクロデキストリンは、ビヒクルコントロールとして用いた。
１Ａ、１Ｂおよび１Ｃグループの動物の頭蓋骨基底部の下４．５〜５．５cmおよび７．５〜８．５cmの部位に、１cmの長さの全厚切開創傷を４箇所作製した。次いで、４つの創傷部位それぞれに１回の１００μlの皮内注射を行った。各創傷には、１００μlのエストラジオール（０．１％または１％）、１００μlのビヒクルコントロール（０．１％または１％のシクロデキストリン）を処置するか、またはなにも処置せず（注射なし）に放置するかのいずれかであった。
【００８７】
１．１．３創傷形成後第７日におけるテスト
組織学的分析用に創傷を切除した後、7日間創傷が治癒するように放置した。
７μmのパラフィン固定切片をＨ＆Ｅおよびマッソンのトリクロームで染色した。再上皮形成の進度(創傷形成後第７日における)、および面積測定法により測定した創傷の大きさを、オリンパスバノックス（Ｖａｎｏｘ）カメラおよびＰＣ画像捕捉システムを用いる画像分析を行って決定した。創傷内のコラーゲンの量を、サンプルの由来を知らない二人の観察者によって決定した。
【００８８】
１．２結果（創傷形成後第７日）
非処置の偽グループ（１Ｃグループ）およびコントロールグループ（１Ｂグループ）では、再上皮形成されたが、細胞性であり、新しいコラーゲンが蓄積された。非処置の卵巣切除グループ（ＯＶＸ；１Ａグループ）の創傷は、再上皮形成が遅く、非常に幅が広く、偽／コントロールグループ（１Ｂおよび１Ｃ）の創傷と比べて、細胞性であり、新しいコラーゲンは非常に少ししか蓄積されなかった。これらの事実から、創傷形成後第７日において、ＯＶＸが創傷治癒進度を遅らせることが示された（表１参照）。
【００８９】
高投与量（１％）のシクロデキストリン（ビヒクルコントロール）は、創傷治癒において逆効果をもたらす。３つのグループすべてにおいて、創傷は広く、細胞性であり、新しいコラーゲンは少ししかなかった。このような効果は、０．１％シクロデキストリンでは顕著ではなく、創傷はコントロールＰＢＳの創傷と同程度であり、細胞はより少なく、幾らかの新しいコラーゲンが蓄積された。
【００９０】
１％β−エストラジオ−ルで処置された創傷はすべて、再上皮形成され、新しいコラーゲンが蓄積された。ＯＶＸグループの創傷は、コントロール／偽グループの創傷よりも狭く、ＯＶＸ処置グループが、コントロールＰＢＳ処置および非処置グループと比べて、創傷治癒進度を増進したことを示している。ＯＶＸグループの創傷はすべて、多くの新しいコラーゲンを有し、炎症細胞は非常に少ししかなく、非常に狭かった。ＯＶＸ０．１％β−エストラジオール処置グループの創傷において、０．１％β−エストラジオールを一回適用することにより、シクロデキストリンビヒクルおよびＯＶＸの逆効果が克服され、コントロール創傷と比べて、創傷治癒が加速されることがわかった。これらの知見は、閉経後の女性がエストロゲンおよびプロゲステロンＨＲＴを投与される場合に、早期時点で創傷治癒の加速が示されるというヒトの創傷データと相互に関連している。
【００９１】
β−エストラジオールの２種類の投与量の間には差異があり、０．１％のβ−エストラジオールの方が、１％のβ−エストラジオールよりも好結果を示した。１％β−エストラジオール溶液には１％のシクロデキストリンが存在し、０．１％β−エストラジオール溶液には０．１％のシクロデキストリンが存在するので、この現象は、シクロデキストリンビヒクルの逆効果の結果といえる。
【００９２】
これらの知見から、β−エストラジオールの最適用量が１％以下であることが示され（特に、シクロデキストリンが担体として用いられる場合）、異なるビヒクル、異なる投与量および異なる投与回数を採用しても、創傷の治癒の加速を同程度に増加することができる。
【００９３】
図１では、切片をマロリーのトリクロームで染色した。ａ＝非手術の雌性ラット（１Ｂ）の第７日の創傷；ｂ＝ＯＶＸラット（１Ａ）の第７日の創傷（再上皮形成が遅くなり、コラーゲンの蓄積が減少し、創傷の幅の有意な増加が見られないことに注目せよ）；ｃ＝５mmのエストロゲンで処置した非手術の雌性ラットの第７日の創傷；ｄ＝ＯＶＸラットの第７日の創傷である（ｃおよびｄにおいて、狭くなった創傷の中に多量の成熟コラーゲンが存在し、完全に再上皮形成がなされて、創傷治癒が改善されていることに注目せよ）。スケールバー＝１００μmである。
【００９４】
【表１】
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【００９５】
実施例２
閉経後の女性の創傷治癒におけるホルモン復活療法（ＨＲＴ）（すなわちエストロゲン補充）の効果を検討し、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物がどのように創傷治癒を調節しうるのかを明らかにした。
【００９６】
２．１方法
２．１．１患者
この実験に対する認可は、地方倫理委員会から得た。健康な閉経後の年齢５５〜６５歳の女性２０人を２つのグループに分けた。
（ｉ）２Ａグループは、ホルモン復活療法（ＨＲＴ）以外は薬物投与なしの１０人の被験者で構成した（平均年齢５５．９歳、標準偏差２．９２；エストロゲンパッチおよび経口プロゲステロン投与３ヶ月以上）。
（ｉｉ）２Ｂグループは、薬物投与なしの１０人の被験者で構成した（老年グループ：平均年齢５９．５歳、標準偏差４．２８）。
【００９７】
さらに、薬物投与なしの年齢２０〜３９歳の健康な若年者の女性１０人（２Ｃグループ：平均年齢２９．８歳、標準偏差５．０３）で第３の実験グループを構成した。
【００９８】
すべての被験者は正常な医療履歴ならびに診察結果、ＣＸＲ、ＥＣＧ、血液、脂質および生化学的プロフィールの持ち主であった。被験者はすべて非喫煙者であり、正常なダイエット履歴および体重であった。
【００９９】
２．１．２生検
インフォームドコンセントの後、２Ａ、２Ｂおよび２Ｃグループの被験者それぞれにおいて、１％リグノカインで局所浸潤麻酔を行った後、上腕内側（日光に曝されない部分）に２箇所の４mmパンチ生検を行った。正常な皮膚の生検材料を二分し、一方を最適切断温度化合物（Optimal Cutting Temperature compound）（マイルズ・インコーポレイテッド、エルクハーツ、ＩＮ）に固定し、液体窒素で凍結し、−７０℃で貯蔵し、他方は液体窒素で急速凍結して−７０℃で貯蔵した。
創傷は、マルチソーブ乾燥ガーゼ包帯（スミス＆ネフュー、ＵＫ）で２４時間覆い、次いで覆いを外して放置した。
【０１００】
２．１．３再生検
２Ａ、２Ｂおよび２Ｃグループからの被験者５人に対し、創傷形成後第７日に、再切除を行い、他の５人には、創傷形成後第８４日に再切除を行った。
左の上腕内側をイソプロピルアルコールで消毒し、１％リグノカインで局所浸潤麻酔を行った後、創傷の楕円切除を行い、２針縫合により傷口を閉じた。各創傷を二分し、上述（２．１．２）と同様に処理した。
【０１０１】
２．１．４生検材料の実験
生検材料の幾つかを用いて分子分析を行った。正常な皮膚によるコンタミネーションがないことを確認するために、これらの創傷の微細解体を行った。
【０１０２】
２．１．４．１免疫染色
７μmの凍結切片を調製し、ＴＧＦ−β１抗体（ＢＤＡ１９：Ｒ＆Ｄシステムズ、オックスフォードシャー）を用いて免疫染色を行い、創傷中のＴＧＦ−β１の存在をテストした。
【０１０３】
２．１．４．２創傷の画像分析および瘢痕形成評価
ジョイス・レベル・ミニ−マグニスキャン（Joyce Loebel Mini-magniscan）を用いた画像分析により再上皮形成の進度（創傷形成後第７日のみ）を決定した。マッソンのトリクロームで染色した、治癒過程にあるヒトの創傷の肉眼で見た外観を、次の方式に基づいて評点した。
ａ）色合い（周囲の皮膚との比較）：１＝完全；２＝少し相異；３＝明らかに相異；４＝大きく相異。
ｂ）外形：１＝正常；２＝触診可能；３＝肥大；４＝ケロイド。
ｃ）感触：１＝正常な皮膚と同じ；２＝盛り上がった状態／デコボコ；３＝硬い；４＝非常に硬い。
【０１０４】
治癒過程にあるヒトの創傷の顕微鏡で見た外観を、次の方式に基づいて評点した。
ａ）コラーゲンの方向性（創傷の上部乳頭皮膚層と深部網状皮膚層を別々に評価）：１＝正常な網み籠；２＝編み籠＞平行な線維；３＝平行な線維＞編み籠；４＝平行な線維。
ｂ）線維束密度（創傷の上部乳頭皮膚層と深部網状皮膚層を別々に評価）：１＝全ての束が正常；２＝＞５０％の束が正常；３＝＜５０％の束が正常；４＝全ての束が異常（密度の増加もしくは減少）。
ｃ）乳頭間隆起の形成：１＝正常な外観；２＝数の減少；３＝なし。
【０１０５】
２．１．５インビボ線維芽細胞実験
線維芽細胞を２Ａ、２Ｂおよび２Ｃグループの第１生検サンプルから抽出し、細胞からのＴＧＦ−β１の発現を測定するために培養した。
２．１．５．１細胞培養
正常な皮膚の４mmパンチ生検片からヒト皮膚線維芽細胞を外植した。実験に用いる線維芽細胞を湿度１００％の９５％空気；５％ＣＯ２下、フェノールレッドフリーのＤＭＥＭ（ギブコ）,１００Ｕ／mlのペニシリン,１００mg／mlのストレプトマイシン,１ｍＭのピルビン酸ナトリウム,２ｍＭのＬ−グルタミン,非必須アミノ酸および活性炭処理した（charcoal-stripped）１０％ＦＣＳ（ギブコ）中、３７℃で培養した（内因性ステロイドを除去するため）。
【０１０６】
２．１．５．２線維芽細胞の処理
２４ウエルのプレート上に、血清フリーの培地中、１ウエル当たり２×１０５個の細胞密度にて、継代数３−５において培養した細胞を植え、一夜培養した。翌朝、エストロゲンまたはプロゲステロン（シクロデキストリンを担体として配合することにより可溶性にしたもの；シグマ、プール）を１ｐＭ〜１ｍＭの範囲で加え、２４時間置く。全てのサンプルを３回評価した。２４時間培養後、培地を除去した。次いで、１mg/mlのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンＡを培地に加え、ＴＧＦ−βアッセイ（下記参照）において迅速に使用した。コントロールには、適当な濃度にてシクロデキストリンを含んだ血清フリー培地のみを使用した。
【０１０７】
２．１．５．３線維芽細胞増殖の評価
次いで、血清フリー培地中、［３Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウエル）とともに、細胞をインキュベートして、線維芽細胞増殖におけるエストロゲンまたはプロゲステロンの影響を評価した。２４時間後、チミジン溶液を吸引ろ過し、１０％ＴＣＡを加えて４℃で４時間置く。ＴＣＡを２５０μｌの１Ｍ  ＮａＯＨ溶液と交換し、１８時間置く。各ウエルから２個の１００ｍｌのアリコートを採り、シンチレーションカウンターにて放射活性を測定した。平行実験において、２４時間のインキュベーションの１５分前に、２０μｇ／ｍｌのシクロデキストリンを加えることにより（タンパク質の翻訳を阻止するため）、タンパク質合成におけるホルモン／コントロールの影響を検討した。
【０１０８】
２．１．５．４ＴＧＦ−βアッセイ
Danielpourらの（J.Cell Physiol.１３８、ｐ７９−８６）に記載されている、ミンク肺成長阻害アッセイを用いて、培地（２．１．５．２）中のＴＧＦ−β濃度を決定した。簡略に述べる。１０％ＣＯ２下、３７℃において、ＤＭＥＭおよび１０％ＦＣＳ中でミンク肺上皮細胞（mink lung epithelial cells：ＭＬＥＣｓ）を維持した。サブコンフルエントな細胞をトリプシン処理し、１０％ＦＣＳに再懸濁し、５００Ｇで５分間処理してペレット化し、１０mlのアッセイ緩衝液（ＤＭＥＭ、２％ＦＣＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ,ｐＨ７．４、ペニシリン２５Ｕ／ml、ストレプトマイシン２５μｇ／ml）で洗浄し、アッセイ緩衝液に再懸濁し、次いで、２４ウエルのコスタープレートにおいて１ウエル当たり１０５個の細胞を植えた。１時間後、ならし培地または調整培地（１ｐＭ〜１ｍＭの範囲の種々の濃度のホルモンあるいはシクロデキストリンのみを加えたもの）を加えた。２２時間後、３７℃にて２時間、［３Ｈ］チミジン（０．５μＣｉ／ウエル）とともに細胞をパルス処理し、前述の抽出および放射活性測定操作（２．１．５．３）を行った。１０〜１０００ｐｇ／ｍｌのＴＧＦ−βスタンダード（Ｒ＆Ｄ）用いて、標準曲線を作成し、該曲線から阻害データをｐｇ／ｍｌに変換した。結果は、１０５個の細胞当たりのＴＧＦ−βのｐｇ／ｍｌで示した（各個のホルモン濃度に対するコントロールの値に相対的である）。
【０１０９】
２．１．６定量的ＲＴ−ＰＣＲ
定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、急性創傷およびインビトロ実験（２．１．５）で用いた線維芽細胞由来の１０５個の細胞におけるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡの定常状態の濃度を決定した。チョムシンスキおよびサッチの方法（Anal. Biochem.、１５６−１５９（１９８７））を用いて標本から細胞性ＲＮＡを単離した。分光光学的手法により、Ａ２６０／２８０の比率を用いて、抽出物の純度を評価したが、すべてにおいて１．７５以上であった。各時点における、組織湿潤重量１μｇ当たりの全ＲＮＡ含量には有意な差はなかった。タムッツァーらの記載（Biotechniques、２０、６７０−６７４（１９９６））にしたがって、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。簡略に述べる。１μgの真正の細胞性ＲＮＡを含むテンプレートの８減少希釈液を用いて、逆転写反応を行った。β−アクチンをポジティブコントロールとして用いた。次いで、エレクトロ４タンク（Hybayd、テディントン、ＵＫ）を用いて、２５ng／mlの臭化エチジウムを含む２％寒天ゲル上にて、１００ｖで１時間、電気泳動を行い、デュアル・インテンシティー・トランスイルミネーター（ジェネティック・リサーチ・インスツルメンテーション、ダンモウ、ＵＫ）およびポラロイドＭＰ４＋カメラならびに６６５ポラロイド白黒フィルムを用いて撮影した。４８６ＤＸ２Ｄａｎコンピューター（Ｄａｎ、ＵＫ）およびＣＣＤカメラ（Ｓｗｉｆｔ、ＵＫ）においてＰＣイメージ・ソフトウェア・システムを用い、写真画像を捕捉した。マッキントッシュコンピューターおよびＮＩＨソフトウェアプログラムを用いる画像分析により、バンド強度を決定した。生成物の分子量に基づいて、バンド強度を標準化した。各レーン内のバンド強度比の対数を反応毎に追加したテンプレートのコピー数の対数に対してプロットした。テンプレートと標的バンド強度の比が１に等しい場所で、標的メッセージの量を決定した。コピー数は、全ＲＮＡ当たりの量（創傷組織）で現すかまたは細胞当たりの量（インビボ実験）で現した。後者は、２６ｐｇのＲＮＡ／細胞を仮定することにより算出した。
【０１１０】
２．１．７統計学的分析
すべてのデータを、平均±標準偏差で表した。全てのデータは標準分布であった。平均間の差は、適宜、独立したスチューデントｔ試験およびターキー−ＨＳＡ試験で補足されたワンファクター・アンド・マルチプルＡＮＯＶＡ（分散の分析）によって算出した。すべての状況において、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０１１１】
２．２結果
２．２．１ヒト創傷の修復における年齢および循環する性ステロイドの影響
２．２．１．１治癒進度：再上皮形成およびコラーゲン蓄積
本来の加齢（２Ｂグループ）は、創傷形成後第７日における再上皮形成（図２）および第７日ならびに第８４日におけるコラーゲンマトリックスの減少の点で、創傷治癒進度の減少に関連があった。しかし、ＨＲＴグループ（２Ａ）は、第７日の再上皮形成の進度において、若年グループ（２Ｃ）に見られるのと同程度の著しい増進を示した（図２）。さらに、ＨＲＴグループは、老年グループと比べて、第７日および第８４日におけるコラーゲン蓄積のレベルを著しく増進した（若年グループ２Ｃにおいて観察されるレベルに至る）。
【０１１２】
図３は、Ｈ＆Ｅで染色された創傷の組織学的切片を示す。ａ＝２８歳（グループ２Ｃ）、ｂ＝５７歳（グループ２Ｂ）、ｃ＝ＨＲＴ処置５８歳（グループ２Ａ）である。Ｈ＆Ｅ染色から、２Ａグループおよび２Ｃグループの創傷における（ｃおよびａ）コラーゲンの蓄積（ＣＯ）が示される。ｂ（２ｂグループ）では、コラーゲン染色が認められず、顆粒組織（Ｇ）は未成熟である。ａ（２Ｃ）およびｃ（２Ａ）においては、創傷を完全に覆う新しい表皮（Ｅ）が形成され、再上皮形成は完全である（矢印は、表皮の基底層を示す）。ｂでは、矢印は、創傷の縁のみに存在する移動する新表皮を示す。Ｃ＝クロッツ。スケールバー＝１００μｍである。
【０１１３】
２．２．１．２治癒の質：顕微鏡および肉眼による瘢痕の程度
成熟瘢痕組織の肉眼で見た外観は、若年の被験者（２Ｃ）において肥大した瘢痕形成が見られるのとは逆に、老年の被験者（２Ａおよび２Ｂグループ）において、色合い、感触および外形の点で、非常に優れていた[各グループの評点（ｎ＝５）：若年（２Ｃ）の平均＝１０、ＳＤ＝１；老年（２Ｂ）の平均＝４、ＳＤ＝２；ＨＲＴ（２Ａ）の平均＝１０、ＳＤ＝２；ｐ＜０．００１]。若年者のグループ（２Ｃ）の瘢痕が、色濃く、反り返った損傷となっているのに対し，老年者のグループ（２Ｂ）の瘢痕は、それぞれ一致して淡く、平坦であった。老年グループの創傷における皮膚の構造の修復に関し、顕微鏡で見た場合の修復の質の決定においても、加齢は重要な因子であった[評点：若年（２Ｃ）の平均＝１３、ＳＤ＝２；老年（２Ｂ）の平均＝９、ＳＤ＝２；ＨＲＴ（２Ａ）の平均＝１３、ＳＤ＝２；ｐ＜０．００１]。注目すべきことに、老年の被験者の創傷において、乳頭間隆起が再生され、大きな乳頭状の血管が観察され、正常な皮膚の状態に似たコラーゲンの網み籠組織が確認された。若年グループ（２Ｃ）の創傷においては、皮膚−表皮の接合部は平坦であり、稠密に充填された平行な層のコラーゲンが創傷中くまなく存在した。ＨＲＴ（２Ａ）では、顕微鏡および肉眼による評価の両方において、若年の女性にみられるものと同様の逆行性瘢痕形成プロフィールが認められた。微視的には、皮膚−表皮接合部は平坦であり、皮膚は、瘢痕組織コラーゲンの平行な層および線維芽細胞からなる。巨視的には、創傷は例外なく隆起し、着色していた。
【０１１４】
２．２．１．３ＴＧＦ−β１免疫染色およびｍＲＮＡ濃度
ａ＝２２歳（グループ２Ｃ）、ｂ＝６０歳（グループ２Ｂ）、ｃ＝ＨＲＴ処置６１歳（グループ２Ａ）であり、ＴＧＦ−β１に対する染色を示す、図４において明らかなように、創傷後第７日において、若年者のグループ（２Ｃ）およびＨＲＴグループ（２Ａ）と比べて、老年者のグループ（２Ｂ）における創傷のＴＧＦ−β１濃度は、著しくかつ一貫して減少した。
【０１１５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲデータから、ＴＧＦ−β１に対する定常状態のｍＲＮＡの濃度が、若年グループ（２Ｃ）では創傷形成後第７日において、平均５６５６コピー／全ＲＮＡｐｇ（ＳＤ７４）および創傷形成後第８４日において、減少して平均１４０コピー／全ＲＮＡｐｇ（ＳＤ９）であるのに対し、２Ｂグループの女性では、創傷形成後第７日において、平均８４コピー／全ＲＮＡｐｇ（ＳＤ６）および創傷形成後第８４日において、平均１１６コピー／全ＲＮＡｐｇ（ＳＤ９）と低いことに、本来の加齢が関連していることが示された。
【０１１６】
異なるグループ間における第７日のｍＲＮＡ濃度の差異を図５に示す。図５では、ｍＲＮＡをａ＝２２歳（グループ２Ｃ）、ｂ＝６０歳（グループ２Ｂ）、ｃ＝ＨＲＴ処置６１歳（グループ２Ａ）で示す。老年グループ（２Ｂ）と若年グループ（２Ｃ）もしくはＨＲＴグループ（２Ａ）の間のｍＲＮＡの差異は、非常に有意であった（ｐ＝０．０００６）。したがって、ＨＲＴでは、創傷治癒の初期に観察される、局所的なＴＧＦ−β１のｍＲＮＡ定常状態の濃度における年齢相関性の減少が逆行する。このことは、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物が、ＴＧＦ−β発現の調節を含むメカニズムによってそのように作用していることを示唆している。
【０１１７】
２．２．１．４マクロファージの数におけるＨＲＴの影響
単球／マクロファージマーカーの免疫染色から、ＨＲＴ（２Ａ）が、第７日におけるマクロファージの数が、平均３９細胞／領域（ＳＤ６）と、増加していることに関連していることが示された。これは、若年の女性（２Ｃ）の創傷においてマクロファージの数が平均３５細胞／領域（ＳＤ４）であることに類似していた。老年のグループ（２Ｂ）の創傷におけるマクロファージの数は、平均１２細胞／領域（ＳＤ４）（ワンファクターＡＮＯＶＡにおいてＦ（２．１４）＝１４．３、ｐ＝０．０００７、０．０５レベルに対するターキーＨＳＤレンジ＝３．７７）と、他の２つのグループのマクロファージの数に比べて、有意に少なかった。老年のグループよりもＨＲＴグループの創傷において観察されるマクロファージの浸潤の方が多いことは、創傷治癒プロセスについて、重要な結果となった：食作用におけるマクロファージの役割に加えて、マクロファージは、細胞移動、増殖およびマトリックス産生の刺激において重要である、ＴＧＦ−β１を含む種々のサイトカインも産生している。
【０１１８】
２．２．３ヒト皮膚線維芽細胞増殖およびＴＧＦ−β１産生におけるエストロゲンおよびプロゲステロンの影響
創傷治癒における、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物の影響をさらに検討するために、線維芽細胞増殖およびＴＧＦ−β１産生におけるエストロゲンおよびプロゲステロンの影響を決定した。２４時間後の線維芽細胞増殖の平均ベースラインは（培地のみ）、３つのグループ間で有意な差異はなかった。
【０１１９】
１ｐＭから１ｍＭの範囲のエストロゲンを投与すると、若年および老年被験者の両方において増殖が阻害された（コントロールと比べて）（図６）。増殖の阻害の程度は、若年および老年の女性グループにおいて類似していた。プロゲステロンは、１ｐＭから１ｍＭの範囲を投与するとすべての被験者において線維芽細胞の増殖を阻害し、阻害の程度は、１ｍＭのエストロゲンよりも有意に大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１２０】
トリパン・ブルー切除テストで調べたところ、細胞の生存能力は、ホルモン処置によって影響を受けなかった。細胞に加える前に、ＴＧＦ−β１に対する中和抗体（１０μｇ／ｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）を含む培地を３０分間プレインキュベートしても、ホルモンの効果は低下せず、このことから、増殖の阻害が、ＴＧＦ−β１とは独立して起こることがわかった。
【０１２１】
ミンク肺細胞アッセイ（２．１．５．２）を用い、血清フリー培地（ホルモンまたはシクロデキストリン担体を含まない）のみで処理した若年女性被験者（２Ｃグループ）由来のベースラインコントロール線維芽細胞培養物からのならし培地は、ミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）の増殖において、老年女性線維芽細胞（２Ａおよび２Ｂ）と比較して、有意に大きい阻害を示した（ｐ＜０．０５：表ＩＩ）。ＭＬＥＣに加える前に、ＴＧＦ−β１に対する中和抗体を含む培地を３０分間プレインキュベートすると、ホルモンの効果は低下し、このことから、ＭＬＥＣ増殖の阻害が、ＴＧＦ−β１に従属して起こることがわかった。
【０１２２】
線維芽細胞をエストロゲンまたはプロゲステロンとともにインキュベートした場合、ならし培地は、問題のホルモンおよびその濃度に従属して、ＭＬＥＣの成長阻害を誘発した（コントロールと比較して）（表ＩＩ）。ＴＧＦ−β１に対する中和抗体（１０μｇ／ｌ；Ｒ＆Ｄシステムズ）は、ＭＬＥＣに加える前に３０分間プレインキュベートした場合、すべての濃度においてホルモンの影響を排除した（ＴＧＦ−β２およびβ３に対する抗体は効果がなかった）。この濃度では、ＭＬＥＣ（コントロール培地において）に加えた抗体は、コントロール培地単独の場合と比較して、チミジン採りこみに影響を及ぼさなかった。すべての被験者において、エストロゲン処置の２４時間後、加熱活性化ならし培地中の全ＴＧＦ−β１濃度は増加し、ｍＭエストロゲン投与において、若年細胞（２Ｃ）において四倍、老年被験者（２Ａおよび２Ｂ）において１２倍と、最大に増加した（表ＩＩ）。若年線維芽細胞（２Ｃ）に対しては、プロゲステロン処置は、コントロールと比べて、ＴＧＦ−β１産生において有意な影響は及ぼさなかったが、老年被験者（２Ａまたは２Ｂ）由来の線維芽細胞においてｎＭおよびｍＭ投与を行うと２倍増加するという有意な結果が得られた。エストロゲンまたはプロゲステロンのいずれかを処置した後は、活性ＴＧＦ−β１は増加しなかった（すなわち、非加熱活性化サンプルはＭＬＥＣアッセイにおいてコントロールと比べた場合影響がなかった）。これらのデータから、エストロゲンが皮膚線維芽細胞産生／ＴＧＦ−β１の分泌にかかわる主要な性ステロイドであり、性ホルモン系に影響を及ぼす化合物が創傷治癒において効果を現すメカニズムがＴＧＦ−β１濃度の調節によるものであることが示唆される。
表ＩＩ．ミンク肺細胞の成長阻害アッセイにより決定した若年（２Ｃ）および老年の女性（２Ａまたは２Ｂ）の皮膚線維芽細胞が分泌するＴＧＦ−β１量
2008174566.tif 000003
【０１２３】
ＴＧＦ−β１量の転写制御および転写後の制御の間の識別をするため、本発明者らは種々の濃度のエストロゲンで処置した線維芽細胞のｍＲＮＡ定常状態量を決定した。コントロール標準およびすべての女性由来の処置線維芽細胞の間に（年齢にかかわらず）ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ量の有意な差は見られなかった（表ＩＩＩ)。ホルモンまたは培地のみとともに加えられたシクロヘキシミドは観察された総ＴＧＦ−β１タンパク質量に影響しなかったことから、タンパク質合成の阻害はエストロゲン処置を受けた培地中の高いＴＧＦ−β１量には影響しないことが示される。シクロヘキシミドは実験に用いた用量では細胞の生存能力に影響しなかった。このデータはエストロゲン処置を受けた培地中の総サイトカイン量の増加は転写後の現象によるものであることを示す。
表ＩＩＩ．定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定した皮膚線維芽細胞ＴＧＦ−β１ｍＲＮＡ量に対する年齢およびホルモン処置の影響
2008174566.tif 000004
【０１２４】
実施例３
男性および女性に関する臨床試験での創傷治癒に対する局所的エストロゲンの効果を示す実験を行った。
【０１２５】
３．１  方法
３．１．１  患者
地方倫理委員会からこの実験に関する承認を得た。健康状態の明らかな４０人のボランティアを４つの群に分けた：
（ｉ）群３Ａにはエストロゲン補給（エストラジオール２５μｇ／２４時間）を受けた平均年齢７６．３歳（Ｓｄ ５．６）の女性１０人が含まれ；
（ｉｉ）群３Ｂにはエストロゲンのかわりにプラセボを受けた平均年齢７２．５歳（Ｓｄ ７．１）の女性１０人が含まれ；
（ｉｉｉ）群３Ｃにはエストロゲン補給を受けた平均年齢６９．６歳（Ｓｄ ３．６）の男性１０人が含まれ；
（ｉｉ）群３Ｄにはエストロゲンのかわりにプラセボを受けた平均年齢７１．８歳（Ｓｄ ８．９）の男性１０人が含まれていた。
【０１２６】
すべての被験者は正常な医療履歴および検査、ＣＸＲ、ＥＣＧ、血液学、脂質および生化学的プロファイルを有していた。被験者はすべて非喫煙者であり、正常な食事歴および体重指数を有していた。
【０１２７】
３．１．２  生検
群３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄのそれぞれ由来の被験者は同意した後、１％リグノカイン１ｍＬで局所浸潤麻酔を受けた上部内腕（太陽に露出していない部位）から２回の４ｍｍパンチ生検に従った。正常な皮膚の各生検物を二分し、半分をOptimal Cutting Temperature化合物（Miles Inc. Elkhart, IN）に包埋し、液体窒素で凍結し、−７０℃で保存し、もう半分を液体窒素で急速凍結し、−７０℃で保存した。
【０１２８】
生検領域を２×３ｃｍパッチ（プラセボ群３Ｂおよび３Ｄまたは活性エストラジオール３Ａおよび３Ｃ）で覆い、これを通して生検物を作成した。このパッチは多吸着（Multisorb）乾燥ガーゼ包帯（Smith＆Nephew）で覆い、２４時間後に両者を取り除いた。活性なパッチは創傷部位がエストラジオール２５μｇ／２４時間に暴露されるのに十分なエストラジオールを含んでいた。
【０１２９】
３．１．３  再生検
群３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄの被験者５人は創傷後７日目に、それぞれの群の他の５人は創傷後８４日目に創傷の再摘出を受けた。
【０１３０】
左上部内腕をイソプロピルアルコールで消毒し、１％リグノカイン浸透後に創傷の切除摘出を行い、二針縫合して間隙を閉じた。各創傷を二分し、上記（３．１．３）のように操作した。
【０１３１】
３．１．４  内生ホルモンの測定
女性群（３Ａおよび３Ｂ）における循環エストロゲン量は、プロゲステロンで＜５０ｐｍｏｌ／Ｌ、最初の生検および再生検の両方において＜２ｎｍｏｌ／Ｌであった。
【０１３２】
男性群（３Ｃおよび３Ｄ）については、すべてのプロゲステロン量は＜２ｎｍｏｌ／Ｌであった。群３Ｃについて：テストステロン量は１５．９ｎｍｏｌ／Ｌ（Ｓｄ ３．９）であった。ＳＨＢＧは４７．３（ＳＤ １４．２)、エストロゲン量は９２ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｓｄ １６．６）であった。群３Ｄについては：テストステロン量は１３．０ｎｍｏｌ／Ｌ（Ｓｄ ３．５）であった。ＳＨＢＧは４６．９（ＳＤ ２７．４)、エストロゲン量１００ｐｍｏｌ／Ｌ（Ｓｄ １４．７）であった。プロラクチン量およびＰＳＡ量（３Ｃおよび３Ｄ）は正常範囲内にあった。
【０１３３】
３．１．５  生検物の実験
分子分析にいくつかの生検物を用い、正常皮膚からの混入がないことを確認するために創傷を顕微鏡下で切開した。
３．１．５．１  創傷のイメージ分析
７μｍパラフィン包埋切片をＨ＆ＥおよびMasson'S Tricromeで染色した。面積測定により求めた(創傷後７日目の）再上皮化率および創傷サイズをOlympus VanoxカメラおよびＰＣイメージキャプチャーシステムを用いたイメージ分析で決定した。以下の尺度に基づいて、サンプルの由来を知らない二人の観察者によって創傷内のコラーゲン量を決定した：＋＝最少量：＋＋＝正常な皮膚より少ない：＋＋＋＝正常な皮膚と同等：＋＋＋＋＝正常な皮膚より多い。
【０１３４】
３．１．５．２  次元解析システム
非破壊次元解析システム（Ｄａｓ）を用いて８０日目での創傷の堅さを求めた。以前の実験では、このシステムを用いて創傷崩壊強度値（破壊の際の終局圧力）を創傷の堅さと相関させていた。このシステムは多軸性負荷（陰圧）を創傷に適用し、高解像度カメラおよびビデオ処理装置を用いて、創傷のへりに設置した２個の反映標的への荷重によるひずみを測定する。圧力を最大１００ｍｍＨｇにまで適用し、その後解放する。堅さは２０および８０ｍｍＨｇの間で測定した。
【０１３５】
３．１．５．３  フィブロネクチンザイモグラフィー
フィブロネクチンを分解するプロテアーゼをフィブロネクチン含有アクリルアミドゲル（１２％アクリルアミドおよび０．３３ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン、Central Blood Products Ltd）を用いたザイモグラフィーによって同定した。組織サンプルを凍結乾燥し、緩衝液（１００ｍＭトリス／ＨＣｌ、６Ｍ尿素、１５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．２５％トリトン−Ｘ１００、ｐＨ７．４）０．５ｍＬを含むすりガラスホモジナイザーを用いてホモジナイズした。１１，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した後、サンプル（乾燥重量２０μｇ）を３７℃で３０分間、２×レムリサンプル緩衝液でインキュベートし、非還元条件下で電気泳動に付した（Laemmli、1990)。電気泳動後、ゲルを２．５％トリトン−Ｘ１００で２回、１時間洗浄し、ＳＤＳを除去した。このゲルを蒸留水で２回、手短に洗浄し、５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４を含む発育緩衝液中、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベート終了後、ゲルを０．５％クーマシーブリリアントブルーで染色し、脱染した。プロテアーゼ領域の活性は暗青色背景に対する透明な区域として現れた。もう１つのゲルを１０ｍＭ金属プロテアーゼ阻害物質、ＥＤＴＡ（ＢＤＨ、Poole）添加物か、または１．７ｍＭセリンプロテアーゼ阻害物質、アミノエチルベンゼンスルホニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ：Sigma）添加物かどちらかとともにインキュベートした。広い領域の染色前の分子量標準（Bio-rad）を分子量マーカーとして用いた。別のレーンにヒト好中球エラスターゼ（ICN）５００ｎｇおよび５０ｎｇを載せた。
【０１３６】
３．１．５．４  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロッティング
上記のように抽出したタンパク質サンプル（乾燥重量２０μｇ）を１２％アクリルアミドゲル電気泳動に付した。同時に並行フィブロネクチンザイモグラムを行った。免疫ブロッティングのために、転移緩衝液（２５ｍＭトリス／ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、１０％メタノール、ｐＨ８．３）中、ポリペプチドを２０Ｖで３０分間電気泳動（Bio-Rad、半乾燥転移ブロット装置、Semi dry transfer blot apparatus）することによってニトロセルロース紙（０．４５μｍ孔サイズ、Bio-Rad）に移した。非特異的結合を遮断するために、免疫ブロッティング物をＴＢＳＴ（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トゥイーン−２０、ｐＨ７．５）中の４％マーベル（Marvel）低脂肪乳中、４℃で１８時間インキュベートした。転移タンパク質をＴＢＳＴ中１：５００希釈したポリクローナル抗ヒト好中球エラスターゼ抗体（Calibiochem Co）と室温で２時間浸とうしながらインキュベートし、次いでヤギ抗ウサギＩｇＧ（Sigma）と複合させたホースラディッシュペルオキシダーゼと４％低脂肪乳を含むＴＢＳＴ中１：３０００希釈で、室温で１時間インキュベートした。ＥＣＬキットを用い、製造元の指示にしたがって（Amersham Int.）抗体結合を明視化した。
【０１３７】
３．１．５．５  エラスターゼ決定
組織サンプル（乾燥重量２０μｇ）およびヒト好中球エラスターゼ（０．０１−０．３μｇ／ｍＬ）を０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％ジメチルスホキシドおよび０．１ｍＭエラスターゼ基質（メトキシスクシニル−ala−ala−pro−val−p−ニトロアニリド；Calbiochem Co；）を含む０．１Ｍヘペス緩衝液、ｐＨ７．５、２００μＬ中、３７℃で１時間までインキュベートした。ＯＤ４１０を測定（Dynatech ＭＲ５０００）することによって基質分解を求めた。エラスターゼのデータから分解の標準曲線を調製した。結果をｎｇ／ｍＬエラスターゼ活性／２０μｇ乾燥重量として表した。
【０１３８】
３．１．６  統計分析
独立のスチューデントｔ−試験（student t-test）を用いてすべてのデータを標準化し、評価した。Ｐ＜０．０５を有意と考える。
【０１３９】
３．２  結果
３，２．１  創傷治癒の速度に対するエストロゲンの効果
エストロゲン処置は女性（３Ａ）および男性被験者（３Ｃ）の両方において、プラセボコントロール標準（それぞれ３Ｂおよび３Ｄ）と比べ、再上皮化の速度を加速させた（表ＩＶ参照)。プラセボ群における性別間の不一致（男性の再上皮化は女性より急速）のため、この結果は女性群（ｐ＞０．００５）において有意であるだけであった。男性群３Ｃおよび３Ｄの両方の間において、創傷後７日目での創傷領域はエストロゲン処置で有意に減少した（ｐ＜０．０５)。エストロゲン処置した男女両方（３Ａおよび３Ｃ）ではプラセボ（３Ｂおよび３Ｄ）と比べ、創傷後７日目および８０日目の両方でのコラーゲン量が一貫して増加した。創傷後８０日目での創傷の堅さはエストロゲン処置によって影響されなかった。
【０１４０】
３．２．２  創傷エラスターゼ活性に対するエストロゲンの効果
７日目急性創傷の組織抽出物はすべて、約３０ｋｄの位置の主要なバンドを示すフィブロネクチンを分解するが、エストロゲン処置群（３Ａおよび３Ｃ）において起こる分解は一貫してこれより少なかった。すべてのサンプルでの３０ｋｄフィブロネクチン特異的プロテアーゼの活性は広い範囲のセリンプロテアーゼ阻害物質、ＡＥＢＳＦとインキュベートすることによって完全に破壊されたが、金属プロテアーゼ阻害物質、ＥＤＴＡによっては破壊されず、このことから主要なフィブロネクチン分解活性は、セリンプロテアーゼによるものであり、市販の好中球エラスターゼとともに移動することが示された。フィブロネクチンザイモグラムに見られた３０ｋｄプロテアーゼ活性はエラスターゼの活性であることが免疫ブロッティングにより確認された。エラスターゼ活性はプラセボ処置群（３Ｂおよび３Ｄ）においてのみ存在した。合成エラスターゼ基質分解アッセイを用いてエラスターゼ活性を定量し、これによりエストロゲン処理がプラセボと比べ、７日目創傷において有意にエラスターゼ活性を減少させることが示された（ウエスタンブロッティングデータと一致するプラセボ群の組織乾燥重量２０μｇ当たり＜５０ｎｇエラスターゼ)。(表ＩＶ)。
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【０１４１】
３．２．３  瘢痕形成に対するエストロゲンの効果
図７および図８は２．１．４．２で決定した瘢痕形成に対するエストロゲンの効果（ｅ）を（それぞれ顕微鏡的および巨視的に）示す。エストロゲン処置は（ＴＧＦ−β量と相関するかもしれない）創傷の非優先性に関連していた。このことはエストロゲンアンタゴニストが瘢痕の優先性に関連し（ならびにＴＧＦ−β量を減少させ)、本発明の第２の具体例にしたがって瘢痕形成および／または線維形成障害を妨げるのに用いることができることを示す。
図７および図８はまた、プロゲステロン処置（ｐ）が優先的な瘢痕形成に関連し、それゆえプロゲステロンが本発明の第２具体例にしたがう使用に適した化合物であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】図１は、実施例１のラットの創傷の着色された組織学的切片の写真である。
【図２】図２は、実施例２の被験者における、創傷形成後第７日の再上皮形成の進度を現すグラフである。
【図３】図３は、実施例２の被験者において、Ｈ＆Ｅ染色を行った創傷の組織学的切片の写真である。
【図４】図４は、実施例２の創傷サンプルに対する免疫染色を示す。
【図５】図５は、実施例２の被験者における、創傷形成後第７日のＴＧＦ−β１のmＲＮＡ濃度を示す。
【図６】図６は、実施例２の被験者由来のヒトの線維芽細胞の増殖におけるエストロゲンの影響を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例３において顕微鏡で評価された、瘢痕形成におけるエストロゲンおよびプロゲステロンの影響を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例３において顕微鏡で評価された、瘢痕形成におけるエストロゲンおよびプロゲステロンの影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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