(57)【要約】【課題】スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）の神経系に特異的な作用・機能を同定し、その成果を神経疾患治療等へ応用すること。【解決手段】本発明は、Ｓ１Ｐが神経細胞からの神経伝達物質の放出を促進するという、今回同定したＳ１Ｐの神経特異的な新規作用に基づくものであり、神経細胞にＳ１Ｐまたはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのＳ１Ｐの生成を制御することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を調節する方法を提供するほか、神経伝達物質の放出制御剤、神経疾患治療薬、および、このような神経伝達物質の放出制御剤や神経疾患治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を調節する方法。
【請求項２】
神経細胞にスフィンゴシン１リン酸受容体のアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を抑制することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を抑制する方法。
【請求項３】
神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を促進することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を促進する方法。
【請求項４】
前記神経伝達物質は、グルタミン酸またはγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
神経細胞でのスフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節することによって、前記神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御する請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記神経細胞は、中枢神経細胞または中枢神経細胞由来である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記神経細胞は、海馬神経細胞または海馬神経細胞由来である請求項６記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出制御剤。
【請求項９】
スフィンゴシン１リン酸受容体のアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を抑制する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出抑制剤。
【請求項１０】
スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を促進する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出促進剤。
【請求項１１】
スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経疾患治療薬。
【請求項１２】
前記神経疾患が、中枢神経疾患である請求項１１記載の神経疾患治療薬。
【請求項１３】
前記神経疾患が、海馬系の疾患、またはグルタミン酸作動性神経系の疾患である請求項１１記載の神経疾患治療薬。
【請求項１４】
前記神経疾患が、てんかん、海馬硬化症、アルツハイマー病、統合失調症および他の精神神経疾患からなる群から選択されるものである請求項１１記載の神経疾患治療薬。
【請求項１５】
神経細胞に発現するスフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することを特徴とする、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１６】
スフィンゴシン１リン酸受容体のサブタイプであるＳ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することを特徴とする、請求項１５記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６記載のスクリーニング方法に使用することができ、神経細胞への候補物質の投与に対し、当該細胞に発現するスフィンゴシン１リン酸受容体の活性化の有無をＦＲＥＴ法により検出できるように調製された、蛍光タンパク質とスフィンゴシン１リン酸受容体との融合タンパク質を発現するベクター。
【請求項１８】
神経細胞または神経組織に候補物質を投与するステップと、候補物質投与の前後におけるスフィンゴシンキナーゼ１の発現変化または活性変化を指標に、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質を探索するステップとを含む、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１９】
神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御することによって、神経細胞間のシナプス形成を調節する方法。
【請求項２０】
神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を抑制することによって、神経細胞間のシナプス形成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スフィンゴシン１リン酸による神経伝達物質の放出促進機能とその応用に関する。例えば、中枢神経系の海馬ニューロンにおいて神経伝達物質であるグルタミン酸の放出を促進または抑制することができ、新規てんかん治療薬の開発など各種神経疾患（特に海馬系の疾患、およびグルタミン酸作動性神経系の疾患）の治療へ応用することができる。
なお、本明細書において、かっこ内に数字のみ記載している場合、その数字は、特に断らない限り、明細書の末尾に掲げる参考文献リストの該当番号を指すものとする。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系の大きな特徴の１つとして、膨大な数の神経細胞（ニューロン）が互いに連絡して無数の情報を統合し、蓄積記憶する能力が挙げられる。ニューロン間の情報伝達は、化学シナプスにおいて神経伝達物質を介して行われ、シナプス前細胞（以下、「前シナプス」という）からシナプス間隙に神経伝達物質が放出されると、シナプス後細胞（以下、「後シナプス」という）がその受容体によってこの情報をとらえるという形で情報が速やかに前シナプスから後シナプスへと伝えられる。
前シナプスからの神経伝達物質の放出には、神経伝達物質の詰まったシナプス小胞の移動、細胞膜への融合、シナプス間隙への神経伝達物質の放出といった現象がみられる（３，１７）。また、膨大な量の情報を蓄積しつつ可塑性を有する中枢神経系の複雑な機能とその研究成果は、神経伝達物質の放出を制御する調節因子が存在する可能性を示唆している。このような調節因子を同定することで、当該因子の調節機能を利用して神経伝達物質の放出を制御し、ひいてはニューロン間の情報伝達を調節し、各種神経疾患の治療、診断、病態解明などへ応用することが期待される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
スフィンゴシン１リン酸（以下、「Ｓ１Ｐ」と略す場合がある。）などのスフィンゴ脂
質代謝物は、その神経系での役割について近年注目されている物質の１つである（７）。スフィンゴシン１リン酸は、スフィンゴシンキナーゼによりスフィンゴシンがリン酸化されることで生成され、細胞の内外で作用する重要な脂質メディエーターと考えられている（２２，３０）。細胞外のスフィンゴシン１リン酸は、Ｇタンパク質共役型のＳ１Ｐ受容体ファミリー（Ｓ１Ｐ1-5）のメンバーと結合して種々の細胞活動を惹起し、血管新生、心発生、免疫、細胞運動、神経伸長等の多岐にわたる生命現象に関与することが報告されている（３１，３３，３８）。その一方、スフィンゴシン１リン酸は、細胞内において、細胞内カルシウムの移動、細胞増殖、アポトーシスの抑制に関与することが報告されている（１４，３５）。さらに他の報告として、高濃度の塩化カリウム（ＫＣｌ）によりＰＣ１２細胞の脱分極を誘導すると、Ｓ１Ｐの蓄積が生じること（１）、小脳の顆粒細胞およびアストロサイトから細胞内生成されたＳ１Ｐが放出されること（２）、Ｓ１Ｐの合成酵素であるスフィンゴシンキナーゼ１、およびＳ１Ｐの受容体が中枢神経系に豊富に存在すること（１２，１３，３６）が報告されている。しかし、神経細胞の活動においてＳ１Ｐがどのような生理活性を有しているのか、その神経特異的な作用、役割については、未だ十分解明されていなかった。
そこで、本発明は、スフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）の神経系に特異的な作用について研究を進め、その作用・機能を同定し、神経疾患治療等へ応用することをその課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
スフィンゴシンをリン酸化してＳ１Ｐを産生する脂質代謝酵素スフィンゴシンキナーゼ１（以下、「ＳＫ１」と略す場合がある。）は、上記のように中枢神経系に豊富に存在する。本発明者は、海馬神経細胞において、このＳＫ１が小胞と共に軸索突起部に局在することを見出した。また、このＳＫ１の発現や活性を抑制すると、脱分極依存性の神経伝達物質（グルタミン酸）の放出が抑制されること、脱分極のときにＳＫ１は細胞膜に移動して基質をリン酸化し、細胞内Ｓ１Ｐ量を増加させること、さらに、生成されたＳ１Ｐは、オートクラインまたはパラクラインな方法でＳ１Ｐ受容体を活性化して、神経細胞からの神経伝達物質の放出を促進すること、Ｓ１Ｐによるこの放出促進作用には異なる２つのメカニズムが存在し、Ｓ１Ｐ自体が神経伝達物質の放出を誘導する誘導因子として作用するほか、Ｓ１Ｐが脱分極依存性の神経伝達物質の放出を亢進・増強する増強因子としての作用を有すること等を明らかにし、これらの新知見が神経疾患治療等へ応用可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
即ち、本発明は、産業上有用な、以下の（１）〜（２０）の発明を包含するものである。
（１）神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を調節する方法。
（２）神経細胞にスフィンゴシン１リン酸受容体のアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を抑制することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を抑制する方法。
（３）神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を促進することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を促進する方法。
（４）前記神経伝達物質は、グルタミン酸またはγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）神経細胞でのスフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節することによって、前記神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御する上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記神経細胞は、中枢神経細胞または中枢神経細胞由来である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記神経細胞は、海馬神経細胞または海馬神経細胞由来である上記（６）記載の方法。
（８）スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出制御剤。
（９）スフィンゴシン１リン酸受容体のアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を抑制する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出抑制剤。
（１０）スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を促進する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経伝達物質の放出促進剤。
（１１）スフィンゴシン１リン酸、スフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、および、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質からなる群から選択される物質を有効成分とする神経疾患治療薬。
（１２）前記神経疾患が、中枢神経疾患である上記（１１）記載の神経疾患治療薬。
（１３）前記神経疾患が、海馬系の疾患、またはグルタミン酸作動性神経系の疾患である上記（１１）記載の神経疾患治療薬。
（１４）前記神経疾患が、てんかん、海馬硬化症、アルツハイマー病、統合失調症および他の精神神経疾患からなる群から選択されるものである上記（１１）記載の神経疾患治療薬。
（１５）神経細胞に発現するスフィンゴシン１リン酸受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することを特徴とする、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニング方法。
（１６）スフィンゴシン１リン酸受容体のサブタイプであるＳ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することを特徴とする、上記（１５）記載のスクリーニング方法。
（１７）上記（１５）または（１６）記載のスクリーニング方法に使用することができ、神経細胞への候補物質の投与に対し、当該細胞に発現するスフィンゴシン１リン酸受容体の活性化の有無をＦＲＥＴ法により検出できるように調製された、蛍光タンパク質とスフィンゴシン１リン酸受容体との融合タンパク質を発現するベクター。
（１８）神経細胞または神経組織に候補物質を投与するステップと、候補物質投与の前後におけるスフィンゴシンキナーゼ１の発現変化または活性変化を指標に、スフィンゴシンキナーゼ１の発現または活性を調節する物質を探索するステップとを含む、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニング方法。
（１９）神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御することによって、神経細胞間のシナプス形成を調節する方法。
（２０）神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を抑制することによって、神経細胞間のシナプス形成を抑制する方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、各種神経疾患の治療、診断、病態解明などへ応用することが可能である。たとえば、側頭葉てんかん等の難治性てんかんに対する新たな薬物療法の開発に利用できる。側頭葉てんかんの治療法としては現在バルブロ酸（ＶＰＡ）などの薬物療法が主である。しかし、薬物が効かないタイプも多く、またこの薬物による催奇形性が報告され、より安全で有効な薬物の開発が期待されている。本疾患では海馬に病巣が存在することから、本発明により海馬神経細胞からのグルタミン酸の放出を特異的に抑制するなどして、側頭葉てんかんの治療、診断、病態解明などへ応用することができる。
特に小児の難治性側頭葉てんかんでは発作の繰り返しにより知的障害を引き起こすことが今日のてんかん治療の大きな課題となっている。本発明によるてんかん治療の新たな試みは、Ｓ１Ｐが海馬神経細胞からの神経伝達物質（グルタミン酸）の放出を促進し、またＳ１Ｐ産生酵素ＳＫ１の働きを阻害するとその放出が抑制されるという今回の知見に基づき、その１つとしてスフィンゴシンキナーゼ阻害薬をてんかん治療に用いることを包含する。スフィンゴシンキナーゼ阻害薬は免疫抑制薬などで開発が進み、人体に対する安全性も調べられている段階である。そこで、スフィンゴシンキナーゼ阻害薬を難治性側頭葉てんかんなどの薬物治療に臨床応用することにより、より安全で有効な治療効果が期待できる。
もちろん、本発明は、てんかん治療に限らず、各種神経疾患の治療、診断、病態解明などに応用可能である。特に、中枢での神経活動の異常に起因する疾患（神経活動の過剰、あるいは反対に神経活動の低下に起因する疾患）、とりわけ、海馬領域の神経活動の異常に起因する海馬系の疾患や、グルタミン酸を神経伝達物質としてニューロン間の情報伝達を行うグルタミン酸作動性神経系の疾患の治療、診断、病態解明などに有用と考えられる。たとえば、てんかんのほか、海馬硬化症、アルツハイマー病、統合失調症、その他記憶障害や知覚障害がみられる精神神経疾患、海馬萎縮など組織の変性がみられる神経変性疾患への臨床応用が考えられる。
また、免疫組織化学による解析結果などから、Ｓ１Ｐ産生酵素ＳＫ１は、海馬領域のみならず、嗅球および小脳皮質にも豊富に存在することが判明している。したがって、今回同定されたＳ１Ｐの神経伝達物質放出促進作用は、海馬領域に限らず、ＳＫ１が豊富な脳領域においてＳ１Ｐは同様の作用を示す可能性があり、このことは海馬領域以外の異常に起因する脳疾患に対しても本発明を臨床応用できる可能性を示すものである。
さらに、Ｓ１Ｐは神経系の形成・発生において重要な役割を担っていることから、本発明は、神経系の形成異常に起因する疾患にも臨床応用できる可能性がある。これまでに、Ｓ１Ｐ産生酵素であるＳＫ１／ＳＫ２のダブルノックアウトマウスと、Ｓ１Ｐ受容体であるＳ１Ｐ1欠損マウスの双方において、神経管の閉鎖不全など神経系の重大な形成異常を引き起こすことが報告されている（２６）。また、神経新生が盛んに起こる海馬苔状線維（mossy fiber）においてＳＫ１の高い発現が認められることから、今回同定されたＳ１Ｐの神経伝達物質放出促進作用は、シナプス形成ひいては回路形成を含む神経系の形成と新生に大きく関与している可能性がある。本発明は、この分子メカニズムの研究のためにも有用である。
近年、活動電位に依存しない、神経伝達物質の「自発的な（spontaneous）」放出が報告されている（１９）が、その分子メカニズムはよくわかっていない。今回の解析から、Ｓ１Ｐは、脱分極を介さずに、それ自体で神経伝達物質の放出を誘導する放出促進因子（secretagogue）としての作用と、脱分極依存性の神経伝達物質の放出を亢進・増強する増強因子（enhancer）としての作用を有することを明らかにした。Ｓ１Ｐのこの２つの作用のうち、前者の作用は神経伝達物質の自発的な放出のメカニズムに関与している可能性がある。本発明は、この分子メカニズムの研究のためにも有用であり、その他脳神経の研究用に広く利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明について、以下さらに詳しく説明する。
［１］本発明の神経伝達物質の放出制御法
本発明の神経伝達物質の放出制御法は、神経細胞にＳ１Ｐまたはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのＳ１Ｐの生成を制御することによって、神経細胞からの神経伝達物質の放出を調節することを特徴とする。
前述のように、神経細胞でＳＫ１により生成されたＳ１Ｐは、オートクラインまたはパラクラインな方法でＳ１Ｐ受容体を活性化して、神経細胞からの神経伝達物質の放出を促進する。実際に、Ｓ１Ｐで海馬神経細胞を刺激すると、シナプス小胞と小胞内の神経伝達物質グルタミン酸の放出が誘導された（図６ＡＢ）。この放出誘導作用は、ごく微量（ピコモル濃度）で認められ、最大効果は１０ｎＭで認められた。また、ピコモル濃度のＳ１Ｐを投与すると、神経細胞からの脱分極依存性グルタミン酸放出が著名に亢進した（図６Ｄ）。
したがって、神経細胞にＳ１Ｐまたはその受容体のアゴニストを投与することによって、当該細胞からの神経伝達物質の放出を促進することができる。また、Ｓ１Ｐ受容体ファミリーのメンバーのうち、Ｓ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3の発現を抑制すると、神経伝達物質の放出が抑制され、両者の発現を抑制すると、神経伝達物質の放出はほぼ完全に抑制された（図６Ｆ）。この結果から、神経伝達物質放出促進のために投与するＳ１Ｐ受容体のアゴニストとしては、Ｓ１Ｐ受容体のサブタイプであるＳ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3のアゴニスト（即ち、Ｓ１Ｐ受容体に結合して、Ｓ１Ｐと同様、受容体を活性化する物質）を使用することが好ましい。
また、図６Ｆの結果からもわかるように、Ｓ１Ｐ受容体のアンタゴニスト（即ち、Ｓ１Ｐ受容体に結合して、Ｓ１Ｐによる受容体の活性化を阻害する物質）を投与することによって、逆に神経細胞からの神経伝達物質の放出を抑制することができる。このような本発明の方法に使用するアゴニストおよびアンタゴニストとしては、既知のＳ１Ｐ受容体のアゴニストおよびアンタゴニストを使用してもよいが、ＦＲＥＴ法などでＳ１Ｐ受容体の活性化を検出する方法により、本発明に使用するアゴニストおよびアンタゴニストを探索することが可能である。この方法の一例として、図５Ａに示すようなＦＲＥＴ法を採用することができる。この方法では、まずＳ１Ｐ受容体と蛍光タンパク質（フルオロフォア）との融合タンパク質を発現するベクターを調製して、神経細胞に導入する。そして、この融合タンパク質を発現する神経細胞に対して種々の候補物質を投与し、Ｓ１Ｐ受容体の活性化の有無をＦＲＥＴ法により検出する。この結果、Ｓ１Ｐ受容体を活性化する物質は、本発明のアゴニストとして利用可能性を有するし、後述のように、神経伝達物質の放出促進剤、あるいは神経疾患治療薬として利用可能性を有する。
他方、Ｓ１Ｐ受容体と蛍光タンパク質（フルオロフォア）との融合タンパク質を発現する神経細胞に対して、Ｓ１Ｐと一緒に種々の候補物質を投与し、Ｓ１Ｐによる受容体の活性化が、一緒に投与した候補物質により阻害されるかどうかをＦＲＥＴ法により検出してもよい。この結果、Ｓ１Ｐによる受容体の活性化を阻害する物質は、本発明のアンタゴニストとして利用可能性を有するし、後述のように、神経伝達物質の放出抑制剤、あるいは神経疾患治療薬として利用可能性を有する。
また、ＳＫ１阻害薬であるジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）で神経細胞を処理し、あるいはＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）によりＳＫ１の発現を抑制すると、いずれの場合にもＳ１Ｐ受容体の活性化が抑制された（図５Ｃ）。この結果からもわかるように、神経細胞でのＳＫ１の発現または活性を調節し、当該細胞でのＳ１Ｐの生成を調節することにより、神経細胞からの神経伝達物質の放出を制御することが可能である。たとえば、ＳＫ１阻害剤を投与してＳ１Ｐの生成を抑制することにより、神経細胞からの神経伝達物質の放出を抑制することが可能である。使用するＳＫ１阻害剤としては、既知のスフィンゴシンキナーゼ阻害剤（たとえば特開２００１−１２２８４６号参照）、あるいはスクリーニングにより新たなＳＫ１阻害剤を探索して使用してもよい。
以上のように、本発明の神経伝達物質の放出制御法は、本発明者により明らかにされたＳ１Ｐによる神経伝達物質の放出促進機能に着目し、その機能を抑制し、あるいは促進することによって、神経伝達物質の放出を制御する方法である。この方法は、生体外では培養神経細胞に対して、また生体内ではヒト以外の動物に対して使用することができる。
【０００８】
なお上述した、Ｓ１Ｐによる神経伝達物質グルタミン酸の放出促進作用は、培養海馬神経細胞のみならず、海馬組織切片を用いた解析によっても確認された（図１０）。電気生理学的解析の結果、Ｓ１Ｐは、海馬のＣＡ３錐体細胞において電気刺激によらない自発的グルタミン酸放出を促進し（図１１）、また電気刺激による神経伝達物質の放出を増強する増強因子としての作用も認められた（図１３）。
さらに、グルタミン酸以外の神経伝達物質として、Ｓ１Ｐは、抑制性の神経伝達物質γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の放出促進作用をも有しており（図１４）、海馬のＣＡ３錐体細胞ならびにＣＡ１錐体細胞において自発的なＧＡＢＡの放出を促進した（図１５）。
また、本発明は、神経細胞にスフィンゴシン１リン酸またはその受容体のアゴニストもしくはアンタゴニストを投与し、あるいは神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を制御することによって、神経細胞間のシナプス形成を調節する方法を提供する。例えば後述のように、神経細胞でスフィンゴシンキナーゼ１の発現を抑制すると、神経細胞間のシナプス形成が強く抑制された（図１６）。このように、神経細胞でのスフィンゴシン１リン酸の生成を抑制することによって、神経細胞間のシナプス形成を抑制することが可能である。
【０００９】
［２］本発明の神経伝達物質放出制御剤、および神経疾患治療薬
本発明の神経伝達物質放出制御剤、および神経疾患治療薬は、前述したように、Ｓ１Ｐ、Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト、あるいは、ＳＫ１の発現または活性を調節する物質を有効成分とするものである。Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストとアンタゴニストには、前述同様、既知のＳ１Ｐ受容体のアゴニストとアンタゴニストのほか、ＦＲＥＴ法などでＳ１Ｐ受容体の活性化を検出する方法により、Ｓ１Ｐ受容体の新規アゴニストまたは新規アンタゴニストを探索して、得られた物質を使用してもよい。
神経疾患治療薬に用いる場合は、治療対象の疾患に応じて候補物質群の中から有効適切な物質を選別することが望ましい。たとえば、ＳＫ１の発現または活性を阻害するＳＫ１阻害物質を側頭葉てんかん治療薬に用いる場合には、既存のＳＫ１阻害物質あるいはスクリーニングにより新たに取得したＳＫ１阻害物質の中から、側頭葉てんかんモデルマウス等を用いて、各物質の安全性や脳内移行性、てんかん発作への有効性や特異性を調査し、より有効適切な物質を選別することが望ましい。
【００１０】
［３］本発明のスクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、Ｓ１Ｐ受容体の活性化を介した神経伝達物質の放出促進作用に着目し、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニングにおいて、Ｓ１Ｐ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストを探索することを特徴とする。たとえば前述したように、Ｓ１Ｐ受容体のサブタイプであるＳ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3を神経細胞に発現させ、ＦＲＥＴ法によりそのアゴニストまたはアンタゴニストを探索するスクリーニング方法が例示される。
また、本発明の他のスクリーニング方法は、神経伝達物質の放出制御剤、または神経疾患治療薬のスクリーニングにおいて、神経細胞または神経組織に候補物質を投与するステップと、候補物質投与の前後におけるＳＫ１の発現変化または活性変化を指標に、ＳＫ１の発現または活性を調節する物質を探索するステップとを含むことを特徴とする。ＳＫ１の発現変化や活性変化の調査は、遺伝子・タンパク質の発現量、キナーゼのリン酸化活性の変化等を調べる従来公知の種々の方法を適用することができ、特に限定されるものではない。また、in vitroおよびin vivoスクリーニング系のいずれであってもよいし、cell-free systemでスクリーニングを行ってもよい。また、ＳＫ１遺伝子・タンパク質は、ヒト由来のもののほか、ラット、マウスその他の動物由来のものを使用してもよい。勿論、ＳＫ１タンパク質の高次構造の情報を利用してインシリコ・スクリーニングを行ってもよい。
【実施例】
【００１１】
次に、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記の実施例によって何ら制限されるものではない。
［実施例１］
［１］材料と方法
［１−１］プラスミドの作製
ＨＡ−ｍＳＫ１およびＨＡ−ｒＳＫ２プラスミドを、参考文献１６と同様の方法で作製し、ベクターpEGFP-C1（Clontech, Palo Alto, CA）へクローニングした。
ｈＳＫ１（GenBank accession number, AF266756）とｒＳＫ１（GenBank accession number, NM_133386）のｃＤＮＡは、ＰＣＲでヒト脳ｃＤＮＡライブラリー（Invitrogen）とラット脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）とからそれぞれＰＣＲをもちいて増幅した。ＰＣＲでは、Ｎ末端にＨＡタグをつけるため、ｈＳＫ１については下記［１］［２］のプライマーを使用し、ｒＳＫ１については下記［３］［４］のプライマーを使用した（これ以降に記載される［１］〜［３１］の各配列は、それぞれ配列表の配列番号１〜３１に示す配列に対応する）。
［１］sense primer, 5’-GCCGGTACCCCGCGGGTCGAGGTTATGG-3’
［２］antisense primer, 5’-GCCGGTACCTCATAAGGGCTCTTCTGGC-3’
［３］sense primer, 5’-CGGGGTACCATGCAACCAGCAGACTGTCCC-3’
［４］antisense primer, 5’-CGGGGTACCTCATATTGGTTCTTCTGGAGGTGG-3’
Stratagene (La Jolla, CA) Quick Change site-directed mutagenesis kitを用いた部位特異的突然変異誘発法により、キナーゼ活性が不活性の変異体ｈＳＫ１Ｇ８２Ｄを作製した。得られたコンストラクトは、コード配列全体をシークエンスして変異が導入されていることを確認した。
Ｃ末端にＧＦＰを融合させたラットシナプトフィジンをコードするコンストラクトを、シナプトフィジン−ＣＦＰが組み込まれたpECFPから再構築した。
マウスＳ１Ｐ受容体であるｍＳ１Ｐ1（GenBank accession number, NM_007901）のｃＤＮＡを、マウス脳ｃＤＮＡから増幅した。より詳細には、まずマウス胎仔脳ｍＲＮＡ（Invitrogen）から逆転写後、下記［５］［６］のプライマーを使用したＰＣＲを行い、Ｃ末端にＣＦＰを融合させたコンストラクトを発現するpECFP-N1を作製した。
［５］sense primer, 5’-CGGAATTCGCCACCATGGTGTCCACTAGCATCC-3’
［６］antisense primer, 5’-CGGAATTCGGGAAGAAGAATTGACGTTTCCAG-3’
マウスβ−アレスチン２（GenBank accession number, NM_004313）のｃＤＮＡを、マウス脳ｃＤＮＡから増幅した。より詳細には、まずマウス胎仔脳ｍＲＮＡ（Invitrogen）から逆転写後、下記［７］［８］のプライマーを使用したＰＣＲを行い、Ｎ末端にＹＦＰを融合させたコンストラクトを発現するpEYFP-C1を作製した。
［７］sense primer, 5’-GCCGGTACCCCGCGGGTCGAGGTTATGG-3’
［８］antisense primer 5’-GCCGGTACCTCATAAGGGCTCTTCTGGC-3’
【００１２】
［１−２］細胞培養
すべての動物実験は、神戸大学の動物実験ガイドラインにしたがって行われた。
海馬ニューロンは、胎生１８日（Ｅ１８）ラット（Wistar）から調製した。海馬ニューロンは、300μg/ml poly-D-lysineと25μg/ml lamininでコートしたガラス底の培養皿（Matsunami Glass, Osaka, Japan）で、５％ＣＯ2雰囲気中、Neurobasal培地（Ｂ−２７（Invitrogen），１ｍＭ L−グルタミン, 100 units/mlペニシリンと100μg/mlストレプトマイシンを添加）にて培養した。
培養ニューロン（５×１０4個、密度38,000/cm2）に対し、アッセイの２−５日前に、リポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて、種々のｃＤＮＡ（0.53μg）を細胞内導入した。すべての実験は、インビトロでの培養日数（ＤＩＶ）１０−１４日目に行われた。
【００１３】
［１−３］ｓｉＲＮＡの作製
ラットＳＫ１のｓｉＲＮＡとして、下記［９］［１０］の配列のものを合成し、使用した。
［９］5’-GGGCAAGGCUCUGAAGCUCdTdT-3’
［１０］5’-GAGCUUCAGAGCCUUGCCCdTdT-3’
また、コントロールｓｉＲＮＡとして下記［１１］［１２］の配列のものを、Ｓ１Ｐ1のｓｉＲＮＡとして下記［１３］［１４］の配列のものを、Ｓ１Ｐ3のｓｉＲＮＡとして下記［１５］［１６］の配列のものを、それぞれ合成し使用した。
［１１］5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’
［１２］5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’
［１３］5'-CUGACUUCAGUGGUGUUCAdTdT-3'
［１４］5'-UGAACACCACUGAAGUCAGdTdT-3'
［１５］5'-CCCUCUACUCCAAGAAAUACA-3'
［１６］5'-UAUUUCUUGGAGUAGAGGGGC-3'
実験では、作製したｓｉＲＮＡと、空ベクターまたは種々の発現ベクターコンストラクトとを、アッセイの２−５日前に、ニューロンにトランスフェクションした。
【００１４】
［１−４］抗ＳＫ１抗体の作製
ウサギポリクローナル抗マウスＳＫ１抗体を、下記［１７］のアミノ酸配列からなる合成ペプチド（３６２−３８１番目のアミノ酸残基に相当）とglutathione S-transferaseとの融合タンパク質を抗原に使用して常法により作製した。得られた抗ＳＫ１抗体は、抗原固相化セファロース４Ｂを使用してアフィニティ精製した。
［１７］GSRDAPSGRDSRRGPPPEEP
【００１５】
［１−５］免疫沈降
培養海馬ニューロンを、細胞溶解用バッファー（20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% (w/v) Triton X-100, protease inhibitors (Roche Applied Science)）で処理し、得られた溶解物を超音波処理後に10,000 x gで遠心した。その上澄みを、抗ＳＫ１抗体（1:100希釈）で１時間、４℃でインキュベーションした後、プロテインＡ−セファロースを加えてさらに１時間インキュベーションした。その後、サンプルを、４℃、2,000 x gで５分遠心し、得られたペレットを、界面活性剤を含まない細胞溶解用バッファーで３回洗浄した。そして、このペレットを、界面活性剤を含まない細胞溶解用バッファーに溶かし、イムノブロット解析およびスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）アッセイに供した。
【００１６】
［１−６］免疫蛍光染色
参考文献１１の方法と同様に、ラット海馬ニューロンを培養１０−１４日に免疫染色した。
抗ＳＫ１抗体（1:100希釈）および抗ＳＫ２抗体（1:1000希釈）は、ポリクローナル抗体を使用した。抗Ｔａｕ抗体（Sigma Aldrich; 1:100）、抗ＭＡＰ２抗体（Sigma Aldrich; 1:100）、および抗シナプトフィジン抗体（CHEMICON International, Temecula, CA; 1:50）は、モノクローナル抗体を使用した。
蛍光観察は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Germany）を使用した。より詳細には、Alexa488の蛍光を、505-530 nm band-pass barrier filterを使用して励起波長４８８ｎｍで、またAlexa594 の蛍光を、560 nm long-pass barrier filterを使用して励起波長５４３ｎｍで、それぞれ観察した。
また、ＧＦＰ−ＳＫ１をコードするプラスミドＤＮＡをニューロンにトランスフェクションし、ＦＭ４−６４色素で標識した後に活性突起部（functional puncta）を検出する実験を行った。
【００１７】
［１−７］ＦＭ４−６４によるモニタリング
前シナプスのシナプス小胞を、参考文献３４の方法とほぼ同様に、膜染色用のスチリル蛍光色素プローブＦＭ４−６４（Molecular Probes, Eugene, OR）を用いて標識した。実験では、５０ｍＭ  ＫＣｌ中、１５μＭのＦＭ４−６４で１分間シナプス小胞を標識した後、色素を含まない溶液で１０分間洗浄した。そして、高濃度カリウム（５０ｍＭ  ＫＣｌ）またはグルタミン酸により誘導される小胞の細胞外放出を、バッファー（135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2, 10 mM glucose, 5 mM HEPES, pH 7.3）中で測定した。
ＦＭ４−６４蛍光は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（Zeiss LSM 510 META）で、640 nm long-pass barrier filterを使用して励起波長４８８ｎｍで測定した。各突起部（少なくとも１００個の異なる領域）での蛍光を、Zeiss LSM 510 softwareを用いて解析した。３回独立に行った実験からの蛍光値の平均をとり、ＦＭ４−６４蛍光の経時変化（減衰）をプロットした。また、ｓｉＲＮＡ実験などにおいては、シナプトフィジン−ＧＦＰを発現するＧＦＰ陽性の突起部において、ＦＭ４−６４蛍光を測定した。
【００１８】
［１−８］グルタミン酸の測定
培養海馬ニューロンから放出されたグルタミン酸は、AmplexTM Red Glutamic Acid/Glutamate Oxidase Assay Kit（Invitrogen）を用いて測定した。初代海馬ニューロンを、５０ｍＭ  ＫＣｌまたは１０ｎＭ  Ｓ１Ｐの存在下または非存在下で１分間処理した。その後、培地を回収し、上記キットを用いてグルタミン酸量を測定した。蛍光の経時的な変化は、蛍光分光計（F-2500, Hitachi, Tokyo）を用いて、励起波長５４０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍで測定した。
【００１９】
［１−９］海馬ニューロンにおけるＳ１Ｐ量の測定
海馬ニューロンでのＳ１Ｐ量を、参考文献１０の方法を少し改変して測定した。実験では、ＫＣｌ処理した（またはコントロールの）海馬ニューロン（2.5 x 106 細胞／サンプル）をメタノールで回収し、Ｓ１Ｐを抽出した。抽出したＳ１Ｐは、ウシ小腸粘膜由来アルカリホスファターゼ（Sigma）で脱リン酸化し、 [γ-32P]ATP標識組み換えｍＳＫ１を用いて再びリン酸化した。そして、標準品のＳ１Ｐを用いた薄層クロマトグラフィによって、放射性Ｓ１Ｐを定量した。
【００２０】
［１−１０］リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ
ISOGEN（Nippon gene, Toyama, Japan）を用いて、全ＲＮＡをラット海馬ニューロン（4 x 105 細胞）から抽出した。ｃＤＮＡの合成と定量ＰＣＲは、参考文献２７と同様の方法で行った。使用した各遺伝子増幅用のプライマー配列は次のとおりである。
ラットＳ１Ｐ1のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［１８］5'-TTG TTG CAA ATG CCC CAA CG-3'
［１９］5’-TTT GCT GCG GCT AAA TTC CAT G-3’
ラットＳ１Ｐ2のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［２０］5'-TCG CCA AGG TCA AGC TCT ACG-3'
［２１］5'-AGA CAA TTC CAG CCC AGG ATG G-3'
ラットＳ１Ｐ3のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［２２］5’-CAC CTG ACC ATG ATC AAG ATG AG-3’
［２３］5’-ACC CAG CGA GAA GGC AAT TAG C-3’
ラットＳ１Ｐ4のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［２４］5’-TGT GTA TGG CTG CAT CGG TCT G-3’
［２５］5’-GAG CAC ATA GCC CTT GGA GTA G-3’
ラットＳ１Ｐ5のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［２６］5’-GCT CTA CGC CAA GGC CTA TGT G-3’
［２７］5’-GCA CCT GAC AGT AAA TCC TTG C-3’
ラットglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［２８］5'-TGC CCC CAT GTT TGT GAT G-3'
［２９］5'-TGT GGT CAT GAG CCC TTC C-3'
ラットＳＫ１のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー
［３０］5'-CTGGAGGAGGCTGAGGTATC-3'
［３１］5'-CCAGTGACCCAGTTCTTCTGC-3'
各ｍＲＮＡの発現は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現により標準化された。
【００２１】
［１−１１］ＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）
ＦＲＡＰ解析は、参考文献６の方法と同様に、Zeiss LSM 510 META共焦点レーザスキャン顕微鏡を用いて行った。実験では、ＧＦＰ−ＳＫ１、ＧＦＰ−変異ＳＫ１、シナプトフィジン−ＧＦＰまたはＧＦＰ単独を、初代海馬ニューロンにトランスフェクションし、５０ｍＭ  ＫＣｌまたは１００μＭのグルタミン酸の存在下または非存在下で１分間処理した。その後、選択した各突起部の環状領域を、最高出力のアルゴンレーザで８秒間スキャンして、フォトブリーチした。フォトブリーチ後、低レーザ出力の共焦点蛍光顕微鏡によって、各選択領域での蛍光の回復を経時的に解析した。line scan averagingによって、得られたすべての画像のノイズレベルを低減させた。
各選択領域でのＦＲＡＰは、下記の式により算出した（３２）。
[F(t) - Fp]/[Fi - Fp] x 100
（「Fi」はフォトブリーチ前の選択領域での蛍光、「Fp」はフォトブリーチ直後の選択領域での蛍光、「F(t)」はフォトブリーチ後ｔ（秒）経過時点の選択領域での蛍光である）。
【００２２】
［１−１２］ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）
ガラス底の培養皿で培養された初代海馬ニューロンに、Ｓ１Ｐ1−ＣＦＰ（ドナー）とＹＦＰ−β−アレスチン（アクセプター）の発現プラスミドを、ドナー／アクセプター比１：１で、コトランスフェクション（共に細胞内導入）した。励起波長４５８ｎｍに続き、Zeiss LSM 510 META共焦点レーザスキャン顕微鏡のラムダモードおよびその解析用ソフトウエアを用いて、４７３ｎｍから６３３ｎｍまで２０ｎｍ間隔の８チャンネルで、（Ｓ１Ｐ1−ＣＦＰまたはＹＦＰ−β−アレスチンを単独で発現させた細胞から）ＣＦＰとＹＦＰの発光スペクトルを得た。コトランスフェクションして２日後に、ニューロンを種々のアゴニストで処理し、各突起部をＦＲＥＴ解析した。ＦＲＥＴ効率は、参考文献４の方法と同様に、アクセプターのフォトブリーチ後に測定した。コトランスフェクション細胞の混合スペクトルイメージを得た後、ＹＦＰのフォトブリーチのため対象となる突起部または樹状突起の領域を選択した。そして、１００％  ５１４ｎｍレーザ出力で２秒間、選択領域をフォトブリーチ（アクセプターフォトブリーチ）する一方で、フォトブリーチを制限する１０％レーザ出力、励起波長４５８ｎｍを用いてフォトブリーチ前後の画像を記録する方法を採用した。ＦＲＥＴは、ＹＦＰ（アクセプター）のフォトブリーチ後に近接するＣＦＰ（ドナー）シグナルの増加として把握される。ＦＲＥＴ効率（Ｅ）は、フォトブリーチ後のエネルギードナー（ＣＦＰ）の蛍光強度（Ipost）と、フォトブリーチ前のエネルギーアクセプター（ＹＦＰ）の蛍光強度（Ipre）との相対蛍光強度から、次式により決定される（２５）。
E = 1-(Ipre/Ipost)
【００２３】
［１−１３］イムノブロット解析等
イムノブロット解析は、参考文献２０と同様の方法で行った。スフィンゴシンキナーゼ１の活性は、参考文献１６とほぼ同様に測定したが、スフィンゴシンキナーゼ２（ＳＫ２）活性を抑制するため、反応液に0.5% Triton x-100を添加した（２４）。
【００２４】
［２］結果
［２−１］海馬ニューロン軸索の活性突起部（functional puncta）でのＳＫ１の発現
ニューロン活動におけるＳ１Ｐの役割、そのニューロン特異的機能を調べるため、まず海馬ニューロンにおけるスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）の細胞内分布を検討した。
まず、マウスＳＫ１（ｍＳＫ１）を抗原に使用して作製された抗ＳＫ１抗体は、ラットＳＫ１（ｒＳＫ１）を特異的に認識する一方、ラットＳＫ２（ｒＳＫ２）を認識しなかった（図１Ａ）。この抗ＳＫ１抗体を使用したラット脳溶解物に対するイムノブロット解析の結果、組み換えラットＳＫ１（ｒＳＫ１）の分子量に相当する４０ｋＤａ付近に、単一バンドが認められた（図１Ｂ左）。このバンドは、抗ＳＫ１抗体による反応に抗原ペプチドを入れると消失した（同図右）。
また、抗ＳＫ１抗体を用いてラット脳溶解物から免疫沈降を行い、免疫沈降物のスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性を解析した。その結果、抗原ペプチド非存在下に抗原抗体反応を行うとＳＫ活性が認められる一方、抗原ペプチド存在下ではＳＫ活性は認められなかった（図１Ｃ）。
さらに、単離した初代培養ラット海馬ニューロンを、抗ＳＫ１抗体および種々のマーカータンパク質に対する抗体を用いて染色した。この初代海馬ニューロンに対する免疫組織化学の結果、ＳＫ１は、神経突起（neurites）に沿って点状パターンに染色された。また、ほとんどすべてのＳＫ１は、軸索マーカーであるＴａｕと共局在したが、樹状突起のマーカーである微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）との共局在は認められなかった（図１Ｄ）。
ＳＫ１の点状パターンは、前シナプスから細胞外に放出されるシナプス小胞のマーカーであるシナプトフィジンとも共標識された。また、前シナプスの活発なシナプス小胞を標識する膜染色物質ＦＭ４−６４を用いると、ほとんどすべてのＧＦＰ−ＳＫ１を含む点状パターンは、ＦＭ４−６４と共標識された（図１Ｄ）。
以上の結果から、ＳＫ１は、海馬ニューロンにおいて、前シナプスの活性突起部（functional puncta）に局在すると考えられる。これとは対照的に、ＳＫ１のアイソザイムであるＳＫ２は、主として海馬ニューロンの核に局在し、軸索の突起部や樹状突起の棘部には存在しなかった。この観察結果は、以前の報告と一致する（１６，２７）。
【００２５】
［２−２］海馬ニューロンでの脱分極による神経伝達物質放出におけるＳＫ１の関与
ＳＫ１が前シナプスの活性突起部（functional puncta）に局在するという観察結果から、次に、ＳＫ１が神経伝達物質の放出といったニューロン特異的な作用に関与しているかどうかを検討した。
まず、ＳＫ１の競合的酵素阻害剤であるジメチルスフィンゴシン（ＤＭＳ）の神経伝達物質放出に対する影響を検討した。海馬ニューロンから放出される神経伝達物質グルタミン酸は、酵素蛍光アッセイによって定量することができる。高濃度のカリウムにより誘導された脱分極によってニューロンから放出されるグルタミン酸は、ＤＭＳの添加によって強く抑制されたので（図２Ａ）、神経伝達物質の放出へのスフィンゴシンキナーゼの関与が示唆された。
さらに、脱分極によって誘導される神経伝達物質の放出へのスフィンゴシンキナーゼの関与を、ＦＭ色素法によって詳しく調べた。実験では、ＤＭＳの存在下または非存在下で海馬ニューロンを前処理した後、５０ｍＭ  ＫＣｌ含有バッファーを用いた脱分極条件下、前シナプスの活発なシナプス小胞を、ＦＭ４−６４で短時間（１分）標識した。そして、種々の脱分極刺激後に、ＦＭ４−６４色素の蛍光変化（減衰）を調べることによってシナプス小胞の放出（分泌）を評価した（図２Ｂ）。その結果、ＤＭＳは、高濃度カリウムによる脱分極によって誘導される放出（分泌）を顕著に抑制した（図２Ｃ）。この結果は、小胞放出（分泌）へのスフィンゴシンキナーゼの関与を裏付けるものである。脱分極前後においてＦＭ色素の発光スペクトルに変化はなかったので、観察された蛍光変化は、脱分極後の膜脂質環境の変化の結果ではないと考察される。また、ＤＭＳ自体は、蛍光標識効率に何ら実質的な影響を与えなかった。
さらに、グルタミン酸によって誘導される前シナプスからのシナプス小胞（および小胞内の神経伝達物質）の放出においても、ＤＭＳによる放出抑制効果が認められた（図２Ｄ）。なお、シナプス小胞の放出は、グルタミン酸による誘導のほうが、高濃度カリウムによる誘導よりも時間的に早く観察された。
次に、ｓｉＲＮＡによるＳＫ１発現抑制実験によって、神経伝達物質放出における内因性ＳＫ１の関与を検討した。培養海馬ニューロンをｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡ処理すると、組み換えｒＳＫ１の発現を強く抑制したが、ヒトＳＫ１（ｈＳＫ１）およびｈＳＫ１Ｇ８２Ｄの発現は抑制しなかった（図３Ａ）。海馬ニューロンをｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡ処理すると、コントロールｓｉＲＮＡ処理した神経細胞に比べて、ＳＫ１タンパク質の発現が約６０％抑制された（図３Ｂ）。
海馬ニューロンをｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡ処理すると、高濃度カリウム（５０ｍＭ）により誘導されるシナプス小胞（および小胞内の神経伝達物質）の放出を顕著に抑制した（図３Ｃ）。この放出抑制は、野生型ｈＳＫ１を共発現させると、ほぼ完全にレスキューされたが、不活性型の変異体ｈＳＫ１Ｇ８２Ｄを共発現させてもレスキューされなかった。この結果は、脱分極により誘導される放出機構においてＳＫ１キナーゼ活性が非常に重要であることを示している。
ｒＳＫ２−ｓｉＲＮＡ処理しても、高濃度カリウムにより誘導される放出に顕著な差異は認められなかった。また、グルタミン酸を用いて放出を誘導すると、特に早い段階においてｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡ処理細胞での放出が抑制された（図３Ｄ）。この放出抑制は、野生型ｈＳＫ１を共発現させるとレスキューされたが、不活性型の変異体ｈＳＫ１Ｇ８２Ｄを共発現させてもレスキューされなかった。
以上の結果から、内因性ＳＫ１は、Ｓ１Ｐの産生を通じて、脱分極により誘導される海馬ニューロンからの神経伝達物質の放出をアップレギュレーションする作用、役割を有していると考えられる。
【００２６】
［２−３］脱分極における、細胞質から膜へのＳＫ１の移動
細胞を種々のアゴニストで処理すると、細胞内のＳＫ１は刺激を受けて、細胞膜や小器官膜へ移動することが報告されている（８，１８，２９，３７）。そこで、ＦＲＡＰ（fluorescence recovery after photobleaching）解析により、ＳＫ１が多く存在する軸索突起部（図１Ｄ）において、脱分極によりＳＫ１の位置移動が誘導されるかどうかを検討した。種々のＧＦＰ融合タンパク質をコードするプラスミドを、海馬ニューロンにトランスフェクションし、前シナプスの突起部におけるフォトブリーチ後の融合タンパク質の動きを観測した。
脱分極による誘導前には、ＧＦＰ単独をトランスフェクションした細胞において、ＧＦＰタンパク質は細胞質で自由に拡散し移動している様子であったが、前シナプスの膜タンパク質であるシナプトフィジンについては自由に拡散する様子は認められなかった。一方、ＳＫ１は、２通りの動きが認められ、大多数のＳＫ１は自由に拡散し移動している様子であったが、一部は膜に局在し、自由に拡散していない様子であった（図４Ａ）。
ＫＣｌによって脱分極が誘導されると、自由に拡散しないＳＫ１の割合が増加し、脱分極によって突起部のＳＫ１は細胞質から膜へと移動した。これに対して、ＧＦＰタンパク質およびシナプトフィジンの分布パターンは、ＫＣｌによって脱分極が誘導されても変わらなかった（図４Ａ）。さらに、グルタミン酸によって脱分極が誘導された場合にも、自由に拡散しないＳＫ１の割合が増加し、細胞質から膜へのＳＫ１の移動が観察されたが、その割合は、ＫＣｌによって脱分極を誘導した場合に比べて少なかった（図４Ｂ）。
【００２７】
［２−４］脱分極における、ＳＫ１活性依存的なＳ１Ｐ受容体の活性化
脱分極によって軸索突起部で細胞質から膜へのＳＫ１の移動が誘導され（図４）、また、ＳＫ１活性が神経伝達物質の放出に非常に重要である（図３ＣＤ）という前述の結果に鑑み、次に、ＳＫ１により新たに産生されたＳ１ＰがＳ１Ｐ受容体（Ｓ１Ｐ1）を活性化するかどうかを検討した。実験では、Ｓ１Ｐ受容体（Ｓ１Ｐ1）の活性化を調べるため、ＦＲＥＴ（fluorescence resonance energy transfer）解析を行った。β−アレスチンは、Ｇタンパク質共役型受容体が活性化されると速やかに受容体に結合する（５，２１）。そこで、Ｓ１Ｐ1−ＣＦＰおよびＹＦＰ−β−アレスチンの融合タンパク質をそれぞれ発現するベクターを作製した。もしβ−アレスチンがＳ１Ｐ1に結合し、ＣＦＰとＹＦＰとが非常に接近したならば、ＣＦＰを励起すると、ＹＦＰフルオロフォアからの発光を刺激することになる（図５Ａ）。この方法により、細胞でのＳ１Ｐ受容体の活性化を空間的および時間的にとらえることが可能である。前記２つの発現ベクターを海馬ニューロンにコトランスフェクションして、アクセプターフルオロフォアＹＦＰの特異的フォトブリーチ後、ＣＦＰシグナルのdequenchingに基づくＦＲＥＴ効率の値を用いて、２つのフルオロフォア共役タンパク質により生じるＦＲＥＴシグナルを確認した。
ＦＲＥＴ効率は、ＫＣｌまたはグルタミン酸により誘導される脱分極によって、受容体のリガンドであるＳ１Ｐによる刺激と同程度にまで上昇した（図５Ｂ）。このことは、脱分極のときにＳ１Ｐ受容体が刺激されることを示す。ＤＭＳまたはｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡでニューロンを処理すると、Ｓ１Ｐによって刺激した場合を除き、ＫＣｌまたはグルタミン酸によって脱分極を誘導した場合にＦＲＥＴ効率の上昇は消失した（図５Ｃ）。この結果は、脱分極のときにＳＫ１によりＳ１Ｐが産生される領域近傍でＳ１Ｐ1受容体が活性化されることを示している。また、この結果は、脱分極により誘導される放出が、ＤＭＳ（図２）またはｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡ（図３ＣＤ）処理によって抑制されるという前述の結果とも一致する。
さらに、脱分極により誘導されるＦＲＥＴ効率の増加が、ＳＫ１が多く存在する軸索突起部（図１Ｄ）でのみ検出され、ＳＫ１量が少ない樹状突起領域では検出されなかったという結果（図５Ｃ）から、脱分極のときにＳＫ１によるＳ１Ｐ産生の重要性が一層強く確認された。
【００２８】
［２−５］神経伝達物質放出における外因性Ｓ１Ｐの役割
脱分極におけるＳ１Ｐ受容体の活性化がどのような効果をもたらすのか検討するため、次に、海馬ニューロンからの神経伝達物質の放出に対して、外因性Ｓ１Ｐと、ＳＫ１のリン酸化産物であるdihydro S1P（ＤＨＳ１Ｐ）がどのような影響を与えるかを検討した。
ＦＭ色素法で測定すると、Ｓ１Ｐ自体が、用量依存的にＥＣ50＝〜２０ｐＭで小胞（および小胞内の神経伝達物質）の放出を促進する作用を有し、最大効果は１０ｎＭで認められた（図６Ａ）。ＤＨＳ１Ｐもまた、Ｓ１Ｐと同様に放出を促進した。このことは、Ｓ１Ｐの放出促進作用が受容体を介して作用することを示している。
同様の結果が、海馬ニューロンからのグルタミン酸放出を直接測定することによって得られた。外因性Ｓ１Ｐは、ＦＭ色素法を用いて測定した結果と同程度のＳ１Ｐ濃度でグルタミン酸放出を促進した（図６Ｂ）。Ｓ１Ｐの効果は迅速で、最大の細胞外放出（エキソサイトーシス）は２秒程度で生じた（図６Ｃ）。
次に、グルタミン酸により誘導される神経伝達物質放出に対する、受容体を介したＳ１Ｐの作用を検討するため、グルタミン酸と組み合わせてＳ１Ｐの影響を解析した。グルタミン酸により誘導される放出は、ＤＭＳ処理によって強力（７５％）に抑制される（図２Ｄ、図６Ｃ）。これは、グルタミン酸誘導放出におけるスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性の重要性を示す。また重要なことに、このＤＭＳによる抑制は、suboptimalな濃度（１ｐＭ）のＳ１Ｐ同時投与によって軽減された（図６Ｃ）。もっとも、この程度の濃度のＳ１Ｐ単独投与では、十分なエキソサイトーシスは得られなかった（図６ＡとＣの黒三角印）。この結果は、Ｓ１Ｐ自体が放出を誘導する誘導因子としての作用を有するほかに、グルタミン酸により誘導される神経伝達物質の放出が、Ｓ１Ｐによって増強されること、つまり、Ｓ１Ｐが増強因子としての作用を有することを示すものである。実際に、グルタミン酸により誘導される神経伝達物質の放出（エキソサイトーシス）の用量依存的カーブは、１ｐＭの外因性Ｓ１Ｐの投与によって左側にシフトした（図６Ｄ）。
外因性Ｓ１Ｐの上記作用がＳ１Ｐ受容体の活性化を介して作用しているかどうかを検討するため、Ｓ１Ｐ受容体ノックダウン細胞において、Ｓ１Ｐにより誘導される神経伝達物質放出を測定した。
まず、海馬ニューロンでのＳ１Ｐ受容体の発現を、リアルタイム定量ＰＣＲによって評価すると、５つのＳ１Ｐ受容体サブタイプ（Ｓ１Ｐ1〜Ｓ１Ｐ5）のうち、主にＳ１Ｐ1とＳ１Ｐ3のｍＲＮＡが海馬ニューロンで発現していた（図６Ｅ）。そこで、Ｓ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3のｓｉＲＮＡを海馬ニューロンにトランスフェクションすると、コントロールｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたニューロンに比べて、Ｓ１Ｐ誘導放出はいずれも明らかに抑制された（図６Ｆ）。さらに、Ｓ１Ｐ1とＳ１Ｐ3のｓｉＲＮＡをコトランスフェクションすると、Ｓ１Ｐ誘導放出はほぼ完全に抑制された。このことはＳ１Ｐ誘導放出に、Ｓ１Ｐ1受容体とＳ１Ｐ3受容体の活性化がいずれも関与していることを示している。
【００２９】
［２−６］グルタミン酸放出の誘導および増強における、Ｓ１Ｐのオートクラインまたはパラクラインな作用
受容体を介したＳ１Ｐの放出促進因子（secretagogue）としての作用（図６ＡＢ）を、Ｎａ+-チャンネルブロッカーであるテトロドトキシン（ＴＴＸ）を用いてさらに検討した。
海馬ニューロンをＴＴＸで処理すると、Ｓ１Ｐ誘導放出は、穏やかにではあるが（約５０％）抑制された（図７Ａ）。これに対して、受容体が主に後シナプス膜に存在するＮＭＤＡ（N-メチル-D-アスパラギン酸）で誘導した場合には、ＮＭＤＡによって誘導される放出は、ＴＴＸ処理によってほぼ完全に消失した（図７Ｂ）。
このことは、Ｓ１Ｐが異なる２つのメカニズムで神経伝達物質の放出を促進することを示す。第１は、ＴＴＸ非感受性の前シナプスの突起部に直接作用して神経伝達物質（グルタミン酸）の放出を誘導するメカニズム、第２は、ＴＴＸ感受性のＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体の活性化を介した脱分極により誘導される神経伝達物質の放出を増強するメカニズム、である。実際に、Ｓ１Ｐのグルタミン酸放出促進作用は、ＴＴＸ処理によって部分的に抑制された（図７Ｃ）。これは、Ｓ１Ｐによるグルタミン酸放出促進作用において、異なる２つのメカニズム（すなわち、放出の誘導機構と増強機構）が関与していることを示す。
ＫＣｌにより誘導されるグルタミン酸放出は、ＤＭＳによって強く抑制されたが（図２Ａ）、これに対して、Ｓ１Ｐにより誘導されるグルタミン酸放出は、ＤＭＳに非感受性であった（図７Ｃ）。この結果から、脱分極のときにＳＫ１が移動した局所領域で生成されるＳ１Ｐが、その後近傍のＳ１Ｐ受容体を活性化し、前シナプスからグルタミン酸の放出を誘導する効果と、グルタミン酸により誘導される神経伝達物質の放出を増強する効果とを奏することが考えられる。これを支持するデータとして、ＦＭ４−６４で標識した活発な前シナプス小胞と、Ｓ１Ｐ1またはＳ１Ｐ3受容体との共局在が観察された（図７Ｅ）。
さらに、脱分極前後の細胞内Ｓ１Ｐ量を測定した。高濃度のカリウムでニューロンを処理すると、細胞内Ｓ１Ｐ量は未処理のニューロンと比べて約５０％増加した（図７Ｄ）。これは脱分極のときに生成されたＳ１Ｐが、グルタミン酸放出の誘導と増強の両面で重要な役割を果たすことを示すものといえる。
【００３０】
［実施例２］
［１］材料と方法
［１−１］細胞培養
すべての動物実験は神戸大学の動物実験ガイドラインに沿って行われた。海馬の神経細胞は胎生１８日目のWisterラットまたは胎生１６日のＣ５７ＢＬマウスを用いた。神経細胞は底がガラスの培養皿に300μg/mlのポリリジンと25μg/mlのラミニンをコートしたものにNeurobasal培地にＢ２７を加え、1 mMグルタミン、100単位のペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンを加えて５％の常圧炭酸ガスのもとで培養した。培養神経細胞（38,000/cm2当たり5 x 104 個の細胞密度）は種々のｃＤＮＡ（0.53μg）をリポフェクタミン2000（Invitrogen）を用いて遺伝子導入を行い、４〜５日後に実験に用いた。すべての実験は神経細胞の培養後１０〜１４日目に行われた。
【００３１】
［１−２］グルタミン酸およびＧＡＢＡの放出実験
６週齢の雄Wisterラットから海馬のスライス（400μmの厚さ）を調製し、標準脳神経人工液（ＡＣＳＦ）（117 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 11.5 mM glucose）に９５％酸素と５％炭酸ガスを通しながら室温で１時間培養し、更に５０分間３４℃で培養した。その後スライスをテトロドトキシン（ＴＴＸ, 0.5μM）、Ｓ１Ｐの存在下あるいは非存在下の条件のＡＣＳＦ培地を満たした培養シャーレに移し、３４℃で２０分間９５％酸素と５％炭酸ガスを通しながら培養した。操作後培養液を集め、グルタミン酸およびＧＡＢＡを4-fluoro-7-nitrobenzofurazan（ＮＢＤ−Ｆ）を用いて標識した。２４μlのサンプルをＨＰＬＣシステム（Shimadzu, Kyoto, Japan）に接続したカラムに注入した。ＮＢＤ−Fは３５０nmの波長で励起し、４５０nmの放射光を蛍光測定器（Shimadzu, Kyoto, Japan）を用いて測定した。全タンパク量はタンパク定量キット（Dojindo, Osaka, Japan）を用いて測定した。統計解析はunpaired t testを用いて行った。
【００３２】
［１−３］ＥＰＳＣｓおよびＩＰＳＣｓの記録
スライスパッチは、６週齢の雄Wisterラットから調製された海馬のスライスのＣＡ３またはＣＡ１領域を用いて行われた。自発的なＡＭＰＡ（α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid）受容体を介した微少興奮性シナプス後電流（AMPA-mEPSCs）は、標準ＡＣＳＦ液に、ＮＭＤＡ受容体に特異的阻害薬のDL-2-amino-5-phosphonovaleric acid（ＤＬ−ＡＰ５, 100μM）、GABA-A受容体の特異的阻害薬bicuculline（20μM）およびＴＴＸ（0.5μM）を加えて、３４℃で９５％酸素と５%炭酸ガスを通しながら培養し、Axopatch-200A 増幅器（Axon Instruments, USA）を用いて測定した。
ＧＡＢＡ受容体依存性微小抑制性シナプス後電位（GABA-mIPSCs）は、標準ＡＳＣＦ液に、ＡＭＰＡ受容体の特異的阻害薬6,7-dinitro-2,3-dihydroxyquinoxaline（ＤＮＱＸ）（20 μM）、ＤＬ−ＡＰ５（100 μM）およびＴＴＸ（0.5μM）を加え、９５％酸素５％炭酸ガスを通気して３４℃でスライスを培養しながら測定した。記録チャンバーは絶えずＡＣＳＦ液を毎分２ｍｌの流速で還流しながら実験を行った。また、Ｓ１Ｐ（１μM）, ＤＭＳ（10μM, Sigma）またはＨＡＣＰＴ（３μM）を加える際は、三方活栓を用いてスライスが浸る様に加えた。パッチの電極液はmEPSC測定のときはCs2SO4（110 mM）, tetraethylammonium chloride （5 mM）, MgCl2（2 mM）, CaCl2（0.5 mM）, ethylene glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetate（EGTA）（5 mM）, Hepes（5 mM）, MgATP（5  mM）を用い、mIPSC測定のときはCsSO4（110 mM）の替わりにCsCl（135 mM）を用いた。統計解析にはKolmogorov-Smirnovテストを用いた。
【００３３】
［１−４］In situ ハイブリダイゼーション組織化学染色
生後１０日の雄Ｃ５７ＢＬマウスを経心臓的に４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸バッファーで還流し、脳を頭部より摘出し、同液を用いて一晩固定した。次に特級エタノールを用いて脱水し、トルエンで洗浄し、パラフィン包埋を行い、４μmの厚さで連続切片を作成した。マウスのＳ１Ｐ1-5受容体の全遺伝子に対するｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて作成した。ＤＩＧ標識されたアンチセンスとセンスＲＮＡプローブはｃＤＮＡフラグメントを鋳型にしてin vitroでＤＩＧ標識ｄＵＴＰ（Roche, Sydney, Australia）存在下で作成した。In situ ハイブリダイゼーションは製造元が作成したマニュアルを参考にして行った。
【００３４】
［１−５］スフィンゴシンキナーゼ１（ＳＫ１）のｓｉＲＮＡの調製等
ラットスフィンゴシンキナーゼ１（ｒＳＫ１）のｓｉＲＮＡ（5’-GGGCAAGGCUCUGAAGCUCdTdT-3’(配列番号９), 5’- GAGCUUCAGAGCCUUGCCCdTdT-3’(配列番号１０)）とコントロールｓｉＲＮＡ（5’- UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(配列番号１１), 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT- 3’(配列番号１２)）は、Japan Bio Services（埼玉, 日本）において合成された。ＨＡ−ｈＳＫ１とその活性欠損変異株の作成に関しては、実施例１と同様に行った。神経細胞は空ベクターまたは種々のｈＳＫ１を含んだプラスミドベクター存在下に上述のｓｉＲＮＡを遺伝子導入し、２−５日後に実験に用いた。
【００３５】
［１−６］抗ＳＫ１抗体
合成ペプチドに対して作成されたウサギの抗マウスＳＫ１ポリクローナル抗体の作成は、実施例１と同様に行った。
【００３６】
［１−７］免疫組織化学染色
アフィニティー精製された抗マウスＳＫ１ポリクローナル抗体は５００倍に希釈して使用した。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脳の水平断の切片は、Sakai et al., Genes Cells 9:945-957 (2004)記載の方法にしたがって免疫染色された。
【００３７】
［１−８］シナプス形成の解析
５万個の培養海馬神経細胞を、シナプトフィジン（synaptophysin）−ＧＦＰとラットＳＫ１に対するｓｉＲＮＡ、またある実験では更にヒトＨＡ−ＳＫ１のｃＤＮＡを含むプラスミドとともに遺伝子導入し、５日後に実験に用いた。培養後１４日目に神経細胞を固定し、抗ＰＳＤ９５抗体（Bioreagents, Golden, CO；５００倍希釈で使用）を用いて免疫染色を行った。蛍光画像は共焦点顕微鏡を用いて連続画像取得モードで取り込み、解析した。個々の解析では各シリーズで少なくとも５００のシナプトフィジン−ＧＦＰで標識された粒状構造（puncta）を任意に選び解析し、これを３シリーズ行い統計解析を加えた。ＰＳＤ−９５集積サイズの測定においては、シナプトフィジン−ＧＦＰ由来のＧＦＰとＰＳＤ−９５由来の蛍光を共に発現する単一punctaを任意に選び、ＰＳＤ−９５陽性後シナプス領域のサイズを Zeiss LSM 510ソフトを用いて解析し、累積度数分布解析を行った。
【００３８】
［２］結果
［２−１：ＳＫ１とＳ１Ｐ1受容体は共に海馬体の歯状回顆粒細胞に豊富に発現する］
先の実施例１では、Ｓ１Ｐが海馬の初代神経細胞において神経伝達物質の放出に関与していることを示した。さらにＳ１Ｐの神経伝達物質放出における機能解析を行うため、まずＳ１Ｐの産生に関与する酵素ＳＫ１の免疫組織化学の解析を成体マウス脳を用いて行った。その結果、図８ＡＢに示すように、ＳＫ１は嗅球、尾状核−淡蒼球、黒質、海馬、小脳皮質に多く分布した。興味深いことに、ＳＫ１は海馬のＣＡ３領域の透明層（これは歯状回顆粒細胞からの苔状線維がＣＡ３錐体細胞の近位樹状突起にシナプス結合するところ）に優先的に認められ、ＣＡ３錐体細胞がＣＡ１錐体細胞に投射を行うSchaffer側副路には認められなかった（図８Ｃ−Ｆ）。このことは苔状線維にはＳ１Ｐが高濃度に存在することを示唆している。
Ｓ１ＰはＳ１Ｐ受容体を介してシグナルを伝達する。In situ ハイブリダイゼーション組織化学を用いて解析すると、Ｓ１Ｐ1受容体のｍＲＮＡ陽性細胞は歯状回顆粒細胞に多く分布し、その他ＣＡ３からＣＡ１にかけて弱く分布した（図９の矢印）。これと類似の結果はＳ１Ｐ3受容体ｍＲＮＡを用いても得られた。そしてこれらＳ１Ｐ1、Ｓ１Ｐ3受容体は共に海馬の神経細胞からグルタミン酸の放出に関与することを実施例１で明らかにしている。以上から、Ｓ１Ｐ1受容体の分布はＳＫ１のそれと海馬において一致していることが分かった。
【００３９】
［２−２：ラット海馬スライスにおいてＳ１ＰはＣＡ３錐体細胞でAMPA-mEPSCを引き起こすが、ＣＡ１錐体細胞では引き起こさない］
神経伝達物質放出におけるＳ１Ｐの効果を更に調べるために、ラットの海馬スライスを用いて、電位依存性ナトリウムチャンネルブロッカーＴＴＸ存在下にグルタミン酸放出におけるＳ１Ｐの影響を調べた。その結果、Ｓ１Ｐは海馬のスライスから濃度依存性（0.01-１μM）にグルタミン酸の放出を引き起こした（図１０）。このことはＳ１Ｐが静止状態の脱分極が起こらない状態のシナプスからグルタミン酸の放出を引き起こすことを示すものである。
Ｓ１Ｐのグルタミン酸放出における更なる知見を得るために、ラット海馬スライスを用いて、AMPA-mEPSCを測定した。その結果、Ｓ１Ｐ（１μM）は、ＣＡ３錐体細胞から記録されるAMPA-mEPSCの強度は変化させずに、頻度を優位に増加させた（P<0.01, Kolmogorov-Simirnovテスト, 図１１Ａ）。このことはＳ１Ｐが苔状線維からＣＡ３錐体細胞の近位樹状突起へ投射するシナプスにおける自発的グルタミン酸放出を促進していることを示す。一方、ＳＫ１（図８Ｃ）やＳ１Ｐ1受容体（図９）の発現量の低いＣＡ１錐体細胞では、Ｓ１Ｐによるこの様な現象は認められなかった（図１１Ｂ）。これらの結果から、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）／Ｓ１Ｐシグナルは少なくとも海馬においては自発的グルタミン酸放出を引き起こす重要因子であり、Schaffer側枝の存在するＣＡ１ではなく、苔状線維の存在するＣＡ３領域においてこのシグナルが自発的興奮性シグナル伝達に重要な役割を果たしていることが強く示唆された。
【００４０】
［２−３：グルタミン酸の自発的放出は、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）の阻害薬で認められなくなった］
実施例１では、内因性に産生されたＳ１Ｐが近傍のＳ１Ｐ1受容体を活性化させるいわゆる「自動活性化」がグルタミン酸放出を引き起こすことを初代海馬の神経培養細胞を用いて示した。これと関連して、ＳＫの阻害薬ＤＭＳが、顕著にＣＡ３錐体細胞からの自発的AMPA-mEPSCの強度ではなく、頻度を低下させた（P<0.01, Kolmogorov-Simirnovテスト, 図１２Ａ）。同様の抑制は、別のより特異的なＳＫ阻害薬2-(p-Hydroxyanilino)-4-(p-chlorophenyl)thiazole（ＨＡＣＰＴ）を用いても認められた（P<0.01, Kolmogorov-Simirnov test, 図１２Ｂ）。これらを総合すると、ＳＫの作用により産生された内因性Ｓ１Ｐが、Ｓ１Ｐ受容体の自動活性化を介してグルタミン酸の自発的放出を調節するということを、具体的現象から裏付けたことになる。
【００４１】
［２−４：Ｓ１Ｐは電気刺激により引き起こされたＥＰＳＣを増強する］
次に、電気刺激により引き起こされるＣＡ３錐体細胞における興奮性後シナプス電位（ｅＥＰＳＣ）とＳ１Ｐの影響を海馬スライスを用いて検討した。実施例１の結果と符合して、Ｓ１Ｐ（１μM）はｅＥＰＳＣを増強させ（図１３Ａ）、またこの増強効果はＤＭＳでは抑制されず、ｅＥＰＳＣの強度には影響を与えなかった（図１３Ｂ）。したがって、外から加えたＳ１ＰはＳ１Ｐ受容体を介して脱分極依存性のグルタミン酸放出を促すが、スフィンゴシンキナーゼの作用を介して産生される内因性のＳ１ＰはｅＥＰＳＣに影響を与えないようである。
【００４２】
［２−５：Ｓ１Ｐはラット海馬のスライスにおいてＣＡ３，ＣＡ１のどちらの錐体細胞からもGABA-mIPSCsを引き起こす］
Ｓ１Ｐは興奮性の神経伝達物質のみの放出を引き起こすのかどうかを検討するため、ＴＴＸ（0.5μM）存在下でラット海馬のスライスからの抑制性神経伝達物質であるＧＡＢＡの放出とＳ１Ｐの関係を調べた。その結果、グルタミン酸放出のときのように、Ｓ１ＰはＧＡＢＡの放出を濃度依存性に（0.01-１μM）引き起こした（図１４）。
さらに、ラット海馬のスライスを用いてＣＡ３あるいはＣＡ１錐体細胞におけるＧＡＢＡ受容体依存性微小抑制性シナプス後電位（GABA-mIPSCs）を調べた。その結果、Ｓ１Ｐ（１μM）はＣＡ３錐体細胞におけるGABA-mIPSCsの強度を変えることなく優位に頻度を増加させた（P<0.01, Kolmogorov-Simirnovテスト, 図１５Ａ）。これらのことからＳ１Ｐはグルタミン酸とＧＡＢＡのどちらの自発的放出も引き起こすことが示された。さらに、AMPA-mEPSCsのときとは異なり、Ｓ１Ｐ（１μM）はＣＡ１錐体細胞におけるGABA-mIPSCsの頻度も増加させた（P<0.01, Kolmogorov-Simirnov テスト, 図１５Ｂ）。ＣＡ１及びＣＡ３錐体細胞はＧＡＢＡ性介在ニューロン（interneurons）により神経支配を受けていることが知られており、おそらくこれらの介在ニューロンにはスフィンゴシンキナーゼやＳ１Ｐ受容体が発現していると考えられる。
【００４３】
［２−６：スフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）／Ｓ１Ｐシグナルはラット初代海馬の神経細胞培養実験でシナプス形成を促進する］
これまでの報告によると、神経伝達物質の放出とシナプス形成に因果関係が存在することが分かっている（Han et al., Nature 349:697-700 (1991); Kabayama et al., Neurosci. 88:999-1003 (1999)）。そこで、Ｓ１Ｐがシナプス形成に関与しているかについてラット初代海馬の神経細胞培養を用いて検討した。ＳＫ１特異的なｓｉＲＮＡを用いると内在性ＳＫ１の発現は抑制された（図１６Ｂ）。次にＳＫ１特異的なｓｉＲＮＡを処理した神経細胞ではシナプス前マーカーであるシナプトフィジンとシナプス後マーカーであるＰＳＤ−９５の共染色される頻度は対照実験に比べて約６０％減少していた（図１６ＡＣ）。ＰＳＤ−９５の集合サイズは、コントロールに比べ、明らかに減少していた（図１６Ｄ）。さらに、ＳＫ１特異的なｓｉＲＮＡによって引き起こされた現象はヒトのＳＫ１を発現させることで回復されたが、活性欠損型変異体を発現させても回復できなかった（図１６ＡＣＤ）。このことからＳ１Ｐシグナルはシナプス形成に必要であると考えられる。
【００４４】
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】海馬ニューロン軸索の活性突起部（functional puncta）でのＳＫ１の発現について検討した結果を示す図である。（Ａ）ＨＡ−ｒＳＫ１またはＨＡ−ｒＳＫ２を一過性に発現させたＣＯＳ７細胞に対し、抗ＳＫ１抗体または抗ＨＡ抗体を使用してイムノブロット解析を行った結果である。（Ｂ）ラット脳溶解物に対し、抗原ペプチドの存在下または非存在下に、抗ＳＫ１抗体を用いたイムノブロット解析を行い、内因性ＳＫ１発現を解析した結果である。（Ｃ）抗原ペプチドの存在下または非存在下に、抗ＳＫ１抗体を用いてラット脳溶解物から免疫沈降を行い、免疫沈降物のスフィンゴシンキナーゼ（ＳＫ）活性を解析した結果である。（Ｄ）ラット初代海馬ニューロンを、抗ＳＫ１抗体または抗ＳＫ２抗体と、抗Ｔａｕ抗体、抗ＭＡＰ２抗体または抗シナプトフィジン（ＳｙｎＰｈｙ）抗体とで、二重染色した結果である。また、一過性にＧＦＰ−ＳＫ１を発現するニューロンを膜染色物質ＦＭ４−６４で標識し、生細胞での蛍光局在を観察した。微分干渉（DIC）像と二重染色の重ね合せ（Merge）像も示される。スケールバー１０μｍ
【図２】脱分極によるグルタミン酸の放出がＤＭＳによって抑制されたことを示す図である。（Ａ）６ｃｍ培養皿で培養したニューロンをＰＢＳで３回洗浄後、１０μＭのＤＭＳの存在下または非存在下で３０分間前処理し、５０ｍＭ  ＫＣｌ含有または非含有（Buffer）のバッファーで処理し、１分後にグルタミン酸放出を解析した結果を示すグラフである。（Ｂ）ＦＭ４−６４色素法を用いた神経伝達物質放出測定のプロトコールを説明する図である。（Ｃ）ラット海馬ニューロンを、１０μＭのＤＭＳの存在下または非存在下（control）で３０分間処理した。ニューロンを洗浄後、ＦＭ色素で標識し、前シナプスの活発なシナプス小胞に導入した。そして、５０ｍＭ  ＫＣｌにより誘導された脱分極後に、各突起部での色素の蛍光変化（Ｆｔ％）を経時的に測定した。（Ｄ）１０μＭのＤＭＳの存在下または非存在下（control）で処理したニューロンを、上記同様にＦＭ色素で標識した。そして、１００μＭのグルタミン酸処理後に、各突起部での色素の蛍光変化（Ｆｔ％）を経時的に測定した。矢印は、グルタミン酸の添加時点を示す。データは３回独立に行った実験の平均±ＳＥＭである（Ｃ，Ｄ）。
【図３】脱分極により誘導される神経伝達物質放出におけるＳＫ１の関与を検討した結果を示す図である。（Ａ）ラット海馬ニューロンに対し、ｒＳＫ１、ｈＳＫ１、またはｈＳＫ１Ｇ８２Ｄをコードする発現ベクターとともに、コントロールｓｉＲＮＡまたはｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。その２日後に、イムノブロット解析により、ニューロンのＳＫ１発現を解析した。（Ｂ）抗ＳＫ１抗体を用いたイムノブロット解析により、コントロールｓｉＲＮＡまたはｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたニューロンにおいて、内因性ＳＫ１タンパク質を検出した。（Ｃ，Ｄ）ｈＳＫ１またはｈＳＫ１Ｇ８２Ｄをコードする発現ベクターあるいは空ベクター（ｍｏｃｋ）とともに、コントロールｓｉＲＮＡまたはｒＳＫ１−ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたニューロンを、ＦＭ４−６４色素で前処理し、５０ｍＭ  ＫＣｌ（Ｃ）または１００μＭのグルタミン酸（Ｄ）で処理した後に、各突起部での色素の蛍光変化（Ｆｔ％）を経時的に測定した。矢印は、グルタミン酸の添加時点を示す。データは３回独立に行った実験の平均±ＳＥＭである（Ｃ，Ｄ）。
【図４】脱分極によりＳＫ１の位置移動が誘導されるかどうか調べた結果を示すグラフである。ＧＦＰ−ＳＫ１、ＧＦＰ単独またはＳｙｎＰｈｙ−ＧＦＰをコードする発現ベクターを、海馬ニューロンにトランスフェクションした。その２日後、共焦点レーザスキャン顕微鏡を用いて、生細胞のＦＲＡＰ解析を行った。５０ｍＭ  ＫＣｌ（Ａ）または１００μＭのグルタミン酸（Ｂ）で脱分極を誘導し、または誘導を行わずに、ＧＦＰ融合タンパク質を発現する軸索の突起部をフォトブリーチし、その後、経時的に撮像した。各突起部での蛍光強度（最小の蛍光強度は０秒）を測定し、フォトブリーチ前の初期値に基づいて、蛍光の回復（fluorescence recovery）の割合を算出した。データは３回独立に行った実験の平均±ＳＥＭである。
【図５】脱分極によってＳ１Ｐ受容体（Ｓ１Ｐ1）の活性化が誘導されることをＦＲＥＴ解析により示す図である。（Ａ）Ｓ１Ｐ1活性化後のＳ１Ｐ1とβ−アレスチン（βＡｒｒ）との結合をＦＲＥＴにより検出することを説明する図である。（Ｂ）Ｓ１Ｐ1−ＣＦＰとＹＦＰ−β−アレスチンをそれぞれコードする発現プラスミドを一緒に海馬ニューロンにトランスフェクションし、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１００μＭのグルタミン酸、または１０ｎＭ  Ｓ１Ｐの存在下または非存在下（buffer）で処理し、生細胞をＦＲＥＴ解析した。各突起部において、アクセプターフォトブリーチ後のドナー蛍光の増加からの検出光を測定し、ＦＲＥＴ効率として表した。ＫＣｌやグルタミン酸によって脱分極を誘導した場合のみならず、Ｓ１Ｐで処理した場合にも、ＦＲＥＴ効率は実質的な増加を示した（n = 50, p<0.01, Student’s paired t test）。（Ｃ）Ｓ１Ｐ1−ＣＦＰとＹＦＰ−β−アレスチンをそれぞれコードする発現プラスミドを一緒に海馬ニューロンにトランスフェクションし、種々のアゴニストで刺激する前に３０分間、１０μＭ  ＤＭＳの存在下または非存在下（１０μＭメタノール）で処理した。あわせて、蛍光物質共役タンパク質をコードするプラスミドと一緒に、コントロールｓｉＲＮＡまたはｒＳＫ1−ｓｉＲＮＡをニューロンにトランスフェクションする実験を行った。ニューロンを、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１００μＭのグルタミン酸、または１０ｎＭ  Ｓ１Ｐの存在下または非存在下（buffer）で刺激し、固定した後、フォトブリーチ後の軸索突起部または樹状突起領域のＦＲＥＴ効率を測定した。
【図６】神経伝達物質放出の誘導因子並びに増強因子としての外因性Ｓ１Ｐの作用、役割を明らかにした実験結果を示す図である。（Ａ）ラット初代海馬ニューロンをＦＭ４−６４色素で予め標識した後、標識細胞を、種々の濃度のＳ１ＰまたはＤＨＳ１Ｐで６秒間刺激し、蛍光強度の変化を測定した。すべての場合に、vehicle（メタノール）の濃度を一定（１μＭ）に保持した。（Ｂ）ＰＢＳでニューロンを３回洗浄後、種々の濃度のＳ１Ｐで６秒間刺激した。その後、放出されたグルタミン酸を、酵素蛍光アッセイにより測定した。（Ｃ）ニューロンを、１０μＭ  ＤＭＳの存在下または非存在下（vehicle）で３０分間処理し、ＦＭ色素で標識した。その後、ニューロンを、１ｐＭ  Ｓ１Ｐと１００μＭグルタミン酸の種々の組み合わせで刺激し、蛍光強度の変化を経時的に測定した。矢印は、アゴニストの添加時点を示す。（Ｄ）ＦＭ色素で予め標識したニューロンを、種々の濃度のグルタミン酸と、１ｐＭ  Ｓ１Ｐの存在下または非存在下で６秒間処理し、蛍光強度の変化を測定した。（Ｅ）リアルタイム定量逆転写ＰＣＲによって、ラット初代海馬ニューロンから、各々のＳ１Ｐ受容体ｍＲＮＡを定量化した。ｍＲＮＡ量の値は、ＧＡＰＤＨ発現によって標準化した。（Ｆ）海馬ニューロンに、コントロールｓｉＲＮＡ、Ｓ１Ｐ1−ｓｉＲＮＡ、Ｓ１Ｐ3−ｓｉＲＮＡを種々の組み合わせでトランスフェクションし、ＦＭ４−６４で予め標識した。その後、１０ｎＭ  Ｓ１Ｐでニューロンを刺激し、蛍光強度の変化を測定した。矢印は、Ｓ１Ｐの添加時点を示す。データは３回（Ａ−Ｄ，Ｆ）と６回（Ｅ）独立に行った実験の平均±ＳＥＭである。
【図７】グルタミン酸放出の誘導および増強におけるＳ１Ｐの作用の解析結果を示す図である。（Ａ，Ｂ）ＦＭ色素で予め標識した海馬ニューロンを、１μＭのＴＴＸの存在下または非存在下で１０分間処理した。その後、１０ｎＭ  Ｓ１Ｐ（Ａ）または１００μＭのＮＭＤＡ（Ｂ）でニューロンを刺激し、蛍光強度の変化を測定した。矢印は、アゴニストの添加時点を示す。（Ｃ）６ｃｍ培養皿で培養したニューロンを、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０μＭのＤＭＳで３０分間、または１μＭのＴＴＸで１０分間、あるいはこれらの非存在下（control）で前処理した。その後、１０ｎＭ  Ｓ１Ｐ含有または非含有のバッファーでニューロンを処理し、１分後にグルタミン酸放出を解析した。（Ｄ）１０ｃｍ培養皿で培養したニューロンを、ＰＢＳで３回洗浄した後、５０ｍＭ  ＫＣｌの存在下（depolarization）または非存在下（control）で１分間処理した。その後、ニューロンから脂質を抽出し、Ｓ１Ｐ量を解析した（n = 5, p<0.05, Student’s paired test）。（Ｅ）Ｓ１Ｐ1−ＧＦＰまたはＳ１Ｐ3−ＧＦＰを発現するラット初代海馬ニューロンを膜染色物質ＦＭ４−６４で標識し、生細胞の蛍光局在を解析した。微分干渉（DIC）像と二重染色の重ね合せ（Merge）像も示される。スケールバー１０μｍ
【図８】成体マウス海馬でのスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＫ１）の発現について検討した結果を示す図である。（Ａ）大脳、（Ｂ）小脳であり、ＯＢ：嗅球、ＣＰｕ：尾状核−淡蒼球、ＳＮ：黒質、Ｈｐ：海馬である。（Ｃ）は海馬領域を拡大（x 100）した図であり、ＤＧ：歯状回である。（Ｄ）は歯状回顆粒細胞からの苔状線維を模式的に示し、（Ｅ）（Ｆ）は、（Ｃ）をさらに部分拡大（x 8）した図である。
【図９】In situ ハイブリダイゼーションにより、マウス海馬でのＳ１Ｐ1受容体ｍＲＮＡの発現について検討した結果を示す図である。Ｓ１Ｐ1受容体ｍＲＮＡは、歯状回（ＤＧ）顆粒細胞において高発現し、その他ＣＡ３からＣＡ１にかけて弱く分布した（矢印）。バーの長さは５００μｍ、左下は低倍率（x 1/12）のもの。
【図１０】前述した方法により、ＴＴＸ存在下において、ラット海馬スライスからのグルタミン酸の放出がＳ１Ｐ濃度によってどのように変化するか検討した結果を示すグラフである。実験を８回行った平均を示し、＊はＳ１Ｐ非存在下のときに比べて有意差（P<0.01）があることを示す。
【図１１】Ｓ１Ｐ（１μM）の存在下または非存在下（Control）において、ラット海馬スライスの（Ａ）ＣＡ３錐体細胞、および（Ｂ）ＣＡ１錐体細胞からの自発的AMPA-mEPSCs（ＡＭＰＡ受容体を介した微少興奮性シナプス後電流）の測定結果を示す図である。実験は保持電位−７０ｍＶで４回行い、それぞれ典型的な電流を示すとともに、記録されたAMPA-mEPSCsの強度（amplitude, pA）および頻度（inter-event interval, s）についての累積確率をグラフに示す。
【図１２】ラット海馬スライスのＣＡ３錐体細胞を用いて、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤（Ａ：ＤＭＳ、Ｂ：ＨＡＣＰＴ）の存在下または非存在下（Control）において自発的AMPA-mEPSCsを測定した結果を示す図である。実験は保持電位−７０ｍＶで４回行い、それぞれ典型的な電流を示すとともに、記録されたAMPA-mEPSCsの強度（amplitude, pA）および頻度（inter-event interval, s）についての累積確率をグラフに示す。
【図１３】電気刺激により引き起こされるＣＡ３錐体細胞における興奮性後シナプス電位（ｅＥＰＳＣ）に対するＳ１Ｐの影響を、ラット海馬スライスを用いて検討した結果を示すグラフである。電気刺激の際に、ＤＭＳ（10μM）の非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で１０分間Ｓ１Ｐ（１μM）処理し、ｅＥＰＳＣを測定した。実験を４回行い、各値は０分時のｅＥＰＳＣの強さに対する平均パーセンテージを示す。
【図１４】前述した方法により、ＴＴＸ存在下において、ラット海馬スライスからのＧＡＢＡの放出がＳ１Ｐ濃度によってどのように変化するか検討した結果を示すグラフである。実験を８回行った平均を示し、＊はＳ１Ｐ非存在下のときに比べて有意差（P<0.01）があることを示す。
【図１５】Ｓ１Ｐ（１μM）の存在下または非存在下（Control）において、ラット海馬スライスの（Ａ）ＣＡ３錐体細胞、および（Ｂ）ＣＡ１錐体細胞からの自発的GABA-mIPSCs（ＧＡＢＡ受容体依存性微小抑制性シナプス後電位）の測定結果を示す図である。実験は保持電位−７０ｍＶで４回行い、それぞれ典型的な電流を示すとともに、記録されたGABA-mIPSCsの強度（amplitude, pA）および頻度（inter-event interval, s）についての累積確率をグラフに示す。
【図１６】シナプス形成へのＳ１Ｐの関与について検討した結果を示す図である。（Ａ）ラット初代海馬ニューロンに、シナプトフィジン（ＳｙｎＰｈｙ）−ＧＦＰとともに、i) コントロールｓｉＲＮＡ、ii)ラットスフィンゴシンキナーゼ１（ｒＳＫ１）特異的なｓｉＲＮＡ、iii) ｒＳＫ１特異的なｓｉＲＮＡ＋ヒトスフィンゴシンキナーゼ１（ｈＳＫ１）発現プラスミド、またはiv)ｒＳＫ１特異的なｓｉＲＮＡ＋活性欠損型変異ヒトスフィンゴシンキナーゼ１（ｈＳＫ１Ｇ８２Ｄ）発現プラスミドを導入した後、抗ＰＳＤ−９５抗体を用いて免疫染色した結果である。ＳｙｎＰｈｙおよびＰＳＤ−９５の重ね合せ（Merge）像も示される。スケールバー５μｍ。（Ｂ）各条件下、ラット海馬ニューロンにおけるスフィンゴシンキナーゼ１（ＳＫ１）の発現をイムノブロットにより解析した結果である。（Ｃ）シナプトフィジン（ＳｙｎＰｈｙ）が陽性であった全punctaのうち、ＳｙｎＰｈｙおよびＰＳＤ−９５がともに陽性であったpunctaの割合を算出し、これを「Synaptic index」としてグラフにしたもの。（Ｄ）ＳｙｎＰｈｙおよびＰＳＤ−９５がともに陽性であったpunctaについて、ＰＳＤ−９５の集合サイズの累積頻度（％）をグラフに示したものである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１６】
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【配列表】
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