(57)【要約】【課題】Ｂ細胞悪性腫瘍のための治療方法をていきょうすること。【解決手段】Ｂ細胞悪性腫瘍のための治療方法が提供される。この方法は、治療的に有効量のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを、それらを必要とする患者に対して投与する工程を包含する。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、その抗体がヒト正常Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合に有意なアゴニスト活性を有さず、その抗体が悪性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合にアンタゴニスト活性を示し、そしてその抗体がヒト正常Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合にアンタゴニスト活性を示し得る。抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントのアンタゴニスト活性は、悪性ヒトＢ細胞の増殖および／または分化を有益に阻害する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性Ｂ細胞を含む疾患を処置するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、悪性Ｂ細胞およびＢ細胞由来の腫瘍によって特徴付けられる疾患に対する、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いた治療の方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｂ細胞はインビボでの通常の免疫応答の間に、重要な役割を果たす。外来の抗原は特定Ｂ細胞の免疫グロブリン表面に結合し、エンドサイトーシス、プロセシング、クラスＩＩ−ＭＨＣ分子上にプロセシングされたペプチドの提示、およびＢ細胞表面上へのＢ７抗原の上方調節を含む一連の事象を誘発する。その後、特定のＴ細胞は、クラスＩＩ−ＭＨＣ分子上への提示されたプロセシングされた抗原のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）認識を介してＢ細胞に結合する。ＴＣＲを介した刺激によって、Ｔ細胞が活性化され、Ｔ細胞がサイトカインの産生を開始する。Ｔ細胞をさらに活性化する二番目のシグナルは、Ｔ細胞上のＣＤ２８抗原とＢ細胞上のＢ７抗原との間の相互作用である。上記シグナルが受容されると、ＣＤ４０リガンド（これは休止ヒトＴ細胞上には提示されていない）が、Ｔ細胞表面上で上方調節される。ＣＤ４０リガンドが、Ｂ細胞表面上のＣＤ４０抗原に結合することにより、Ｂ細胞が刺激され、Ｂ細胞を可溶性免疫グロブリンを高レベルで分泌する形質細胞へ成熟させる。
【０００３】
ＣＤ４０は、正常ヒトＢ細胞および新生物ヒトＢ細胞の両方、樹状細胞、単核細胞および上皮細胞、いくつかの上皮癌ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に存在する細胞表面性抗原である。ＡＰＣ上でのＣＤ４０の発現は、ヘルパーＴリンパ球および細胞傷害性Ｔリンパ球両方の活性化において重要な、同時刺激の役割を果たす。ＣＤ４０受容体は、好酸球、慢性関接リウマチにおける滑膜、活性化血小板、炎症を起こした血管内皮細胞、表皮繊維芽細胞、およびその他の非リンパ球性細胞型の上にもみられる。このＣＤ４０受容体は、活性化Ｔ細胞、活性化血小板、および炎症を起こした血管性平滑筋細胞上で発現されている。ＣＤ４０は、低レベルで血管内皮細胞上でも発現されていて、局所的な炎症の領域では、上方調節されている。
【０００４】
ヒトＣＤ４０は、推定分子量３０，６００である２７７アミノ酸のペプチドで、主に疎水性アミノ酸を含む１９アミノ酸の分泌シグナルペプチドを有する。このＣＤ４０受容体は、細胞表面に高度に改変された糖タンパク状態で存在し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル中で約５０ｋＤａのポリペプチドとして移動する。
【０００５】
ＣＤ４０抗原は、ヒト神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体、およびＦａｓに関係することが知られている。このことは、ＣＤ４０がＢ細胞の活性化に重要な機能を有するリガンドに対する受容体であることを示唆する。Ｂ細胞の分化において、その分子はプレＢ細胞上にまず発現され、その後、Ｂ細胞が形質細胞に変化したとき細胞表面から消失する。そのＣＤ４０細胞表面抗原は、Ｂ細胞の増殖および分化において重要な役割を果たす。
【０００６】
そのリガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４と呼ぶ）のＣＤ４０受容体への結合は、Ｂ細胞の増殖および分化、抗体の産生、アイソタイプスイッチ、ならびにＢ細胞記憶生成を刺激する。ヒトＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０受容体）遺伝子およびマウスＣＤ４０Ｌ遺伝子はクローン化されている（Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（非特許文献１）；Ａｒｍｉｔａｇｅら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０（非特許文献２）；および米国特許第６，２６４，９５１号（特許文献１））。ＡＰＣ、（例えば、マクロファージおよび樹状細胞など）の上のＣＤ４０リガンドによるＣＤ４０受容体の結合は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ８０／８６の細胞表面での発現を上方調節し、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＴＮＦのようなプロ炎症性サイトカインの分泌を誘導し、これらすべてはＴ細胞への抗原提示能を増強する。
【０００７】
すべてのＢ細胞は、ＣＤ４０を含む共通の分子表面マーカーを発現している。低悪性度およびに高悪性度のＢ細胞リンパ腫、急性Ｂリンパ芽球性白血病、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病、ならびにホジキン病の患者由来の形質転換細胞は、ＣＤ４０を発現する。ＣＤ４０の発現は、急性骨髄芽球性白血病の三分の二の症例およびＡＩＤＳ関連のリンパ腫の５０％でも、検出されている。さらに、Ｂ細胞系統のいくつかの腫瘍由来の悪性Ｂ細胞は、高度のＣＤ４０を発現し、生存および増殖に対するＣＤ４０のシグナル伝達に依存するようである。
【０００８】
さらに、免疫芽球性Ｂ細胞リンパ腫は、例えば同種移植片レピシエントおよび長期の免疫抑制療法を受けている他患者、ＡＩＤＳ患者、ならびに例えばＸ連鎖性リンパ増殖症候群またはヴィスコット−オルドリッチ症候群（Ｔｈｏｍａｓら（１９９１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３２９（非特許文献３）；Ｓｔｒａｕｓら（１９９３）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１８：４５（非特許文献４））のような、一次免疫不全症候群の患者のような、免疫システムが損なわれた患者に発生する。これらの腫瘍は、潜在性エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）感染による損傷Ｔ細胞の制御の結果として生じるようである。同様のヒト由来リンパ腫は、健康なＥＢＶ陽性個体から採取された末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をマウスに接種することにより（Ｍｏｓｉｅｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：２５６（非特許文献５）；Ｒｏｗｅら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４７（非特許文献６））、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）とともに、誘導されうる。
【０００９】
非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ球性白血病を含む、低悪性度のＢ細胞系統悪性疾患の病原論は、ＣＤ４０による成長／生存シグナルおよびＦａｓによる不良細胞死シグナルの不均衡に強く影響される。低悪性度の非ホジキンリンパ腫の研究によって、その疾患はＦａｓ媒介性アポトーシスの減少によるリンパ腫性細胞の蓄積およびＣＤ４０をとおした生存シグナルの増加の結果であることが示唆される。ＣＤ４０は、非ホジキンＢ細胞リンパ腫患者から採取したリンパ腫細胞の生存シグナルを提供し、それらのインビトロでの増殖を刺激する（Ｒｏｍａｎｏら（２０００）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３６：２５５−２６２（非特許文献７）；Ｆｕｒｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２２００−２２０６（非特許文献８）、Ｋｉｔａｄａら（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０６：９９５−１００４（非特許文献９）；Ｒｏｍａｎｏら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：９９０−９９５（非特許文献１０）、Ｊａｃｏｂら（１９９８）Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２２：３７９−３８２（非特許文献１１）；Ｗａｎｇら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９７：４０９−４１７（非特許文献１２）；Ｐｌａｎｋｅｎら（１９９６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：４８８−４９３（非特許文献１３）；およびＧｒｅｉｎｅｒら（１９９７）Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：１５８３−１５９３（非特許文献１４））。
【００１０】
非ホジキンリンパ腫および悪性疾患の多様なグループの約８５％は、Ｂ細胞起源である。非ホジキンリンパ腫は、脾臓、胸腺、およびリンパ節の構成物起源である。作用方式（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）分類スキーム中に、これらのリンパ腫は、これらの自然な歴史によって、低悪性度、中悪性度、および高悪性度の範疇に分類されてきた（「非ホジキンリンパ腫病理学分類プロジェクト」，Ｃａｎｃｅｒ  ４９（１９８２）：２１１２−２１３５（非特許文献１５）参照）。低レベルまたは快方に向かっているリンパ腫は、進行が遅く、メジアンは、５年から１０年生存である（ＨｏｒｎｉｎｇおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：１４７１−１４７５（非特許文献１６））。化学療法によって、進行の遅いリンパ腫の大部分で寛解を誘導し得るが、回復はまれで、ほとんどの患者は結局再発し、さらなる治療を必要とする。中悪性度および高悪性度のリンパ腫は、より攻撃的な腫瘍であるが、これらは化学療法によって回復するより高い可能性がある。しかし、これら患者のかなりの数は、やはり再発し、寛解を誘導するさらなる治療が必要である。さらに、化学療法を受けた患者らは、毒性効果を経験しうる。従って、悪性腫瘍Ｂ細胞の疾患を処置するための新しい治療法が必要である。
【特許文献１】米国特許第６，２６４，９５１号明細書
【非特許文献１】Ｓｐｒｉｇｇｓら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３
【非特許文献２】Ａｒｍｉｔａｇｅら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：８０
【非特許文献３】Ｔｈｏｍａｓら（１９９１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３２９
【非特許文献４】Ｓｔｒａｕｓら（１９９３）Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１８：４５
【非特許文献５】Ｍｏｓｉｅｒら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：２５６
【非特許文献６】Ｒｏｗｅら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４７
【非特許文献７】Ｒｏｍａｎｏら（２０００）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３６：２５５−２６２
【非特許文献８】Ｆｕｒｍａｎら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２２００−２２０６
【非特許文献９】Ｋｉｔａｄａら（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０６：９９５−１００４
【非特許文献１０】Ｒｏｍａｎｏら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：９９０−９９５
【非特許文献１１】Ｊａｃｏｂら（１９９８）Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．２２：３７９−３８２
【非特許文献１２】Ｗａｎｇら（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９７：４０９−４１７
【非特許文献１３】Ｐｌａｎｋｅｎら（１９９６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０：４８８−４９３
【非特許文献１４】Ｇｒｅｉｎｅｒら（１９９７）Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０：１５８３−１５９３
【非特許文献１５】Ｃａｎｃｅｒ  ４９（１９８２）：２１１２−２１３５
【非特許文献１６】ＨｏｒｎｉｎｇおよびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：１４７１−１４７５
【００１１】
（発明の要旨）
非ホジキンリンパ腫（高悪性度リンパ腫、中悪性度リンパ腫、および低悪性度リンパ腫）、ホジキン病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、および骨髄芽球性白血病のようなリンパ腫を含む、悪性Ｂ細胞を含む疾患の患者を処置する方法を、提供する。本方法は、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて患者を処置する工程を含む。この抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントは、正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、有意なアゴニスト活性がなく、悪性のヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。本発明の方法での使用に適したモノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントは、以下の性質を示す：１）ヒト細胞の表面に発現されているヒトＣＤ４０抗原へ特異的に結合し得る、２）正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原へ結合した場合、有意なアゴニスト活性がない、および３）悪性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。いくつかの実施形態において、本抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントはまた、正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。モノクローナル抗体は、ＣＤ４０へ強い親和性を示し、少なくとも１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも約１０−８Ｍから約１０−２０Ｍ、より好ましくは少なくとも約５×１０−９Ｍから約１０−１６Ｍの解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。適切なモノクローナル抗体は、ヒト定常領域を有する。その定常領域は、好ましくは、全体的または部分的にヒト化したフレームワークを有し、および、最も好ましくは、完全にヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを有する。そのようなモノクローナル抗体の例は、本明細書中で１５Ｂ８と記載されている抗体、１５Ｂ８と記載されているハイブリドーマ細胞株から産生されるモノクローナル抗体、配列番号２および配列番号４からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、配列番号１および配列番号３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；およびヒトＣＤ４０への特異的な結合能を有している、これらモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントである。
【００１２】
本発明の一つの実施形態において、治療法は、適切な抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物の治療的有効用量を患者に投与する工程を含む。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療的有効用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約１ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約３ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約３ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの範囲内、約３ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲内、約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲内、または約７ｍｇ／ｋｇから約１２ｍｇ／ｋｇの範囲内である。処置は、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントの単一の治療的有効用量の投与または複数回の治療的有効量の投与を含み得ることが認識される。
【００１３】
本発明の方法において使用に適した抗ＣＤ４０抗体は、改変され得る。抗ＣＤ４０抗体の改変として、免疫学的に活性なキメラ抗ＣＤ４０抗体、ヒト化抗ＣＤ４０抗体、および免疫学的に活性なマウス抗ＣＤ４０抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）  悪性Ｂ細胞を含む疾患を有する患者を処置する方法であって、該方法は、治療有効量のヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを、該患者に投与する工程を包含し、ここで、該抗体またはそのフラグメントが正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、該抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントには有意なアゴニスト活性がなく、かつ該抗体またはそのフラグメントが、悪性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、該抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントがアンタゴニスト活性を示し、ここで、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、以下：
ａ）ハイブリドーマ細胞株１５Ｂ８により生成されるモノクローナル抗体；
ｂ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；ならびに
ｄ）モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであり、かつ該フラグメントが、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体からなる群より選択され、ここで、該患者を処置する方法が、該患者における望ましい治療応答を促進する、方法。
（項目２）  項目１に記載の方法であって、前記抗体またはそのフラグメントが、前記正常ヒトＢ細胞上の前記ＣＤ４０抗原に結合する場合、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントがアンタゴニスト活性を示す、方法。
（項目３）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−５Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−８Ｍ〜約１０−２０ＭのＫｄを有する、項目３に記載の方法。
（項目５）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約５×１０−９Ｍ〜約１０−１６ＭのＫｄを有する、項目４に記載の方法。
（項目６）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株１５Ｂ８により生成されるモノクローナル抗体である、項目１に記載の方法。
（項目７）  項目１に記載の方法であって、前記悪性Ｂ細胞が、Ｂ細胞リンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、中悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞およびホジキン病細胞からなる群より選択される、方法。
（項目８）  項目１に記載の方法であって、前記処置が、前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の、少なくとも１治療有効用量を、前記患者に投与する工程を包含する、方法。
（項目９）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントの治療有効用量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの範囲内である、項目８に記載の方法。
（項目１０）  前記処置が、複数の治療有効用量の前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはそのフラグメントを投与する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（項目１１）  前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントおよび単鎖Ｆｖフラグメントからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）  Ｂ細胞系統の悪性細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法が、ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を、該悪性細胞に接触させる工程を包含し、該抗体またはそのフラグメントには有意なアゴニスト活性がなく、ここで、該抗体またはそのフラグメントが該悪性細胞上のＣＤ４０抗原に結合する場合、該悪性細胞の増殖は阻害され、ここで、該ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は以下：
ａ）ハイブリドーマ細胞株１５Ｂ８により生成されるモノクローナル抗体；
ｂ）配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体；
ｃ）配列番号１および配列番号３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体；ならびに
ｄ）モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載のモノクローナル抗体のフラグメントであり、かつ該フラグメントが、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する能力を保持する、モノクローナル抗体からなる群より選択される、方法。
（項目１３）  項目１２に記載の方法であって、前記悪性細胞が、Ｂ細胞リンパ腫細胞、非ホジキンリンパ腫細胞、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、中悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫細胞、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞、多発性骨髄腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、骨髄芽球性白血病細胞およびホジキン病細胞からなる群より選択される、方法。
（項目１４）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−５Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１５）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約１０−８Ｍ〜約１０−２０ＭのＫｄを有する、項目１２に記載の方法。
（項目１６）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、少なくとも約５×１０−９Ｍ〜約１０−１６ＭのＫｄを有する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）  前記ヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体が、ハイブリドーマ細胞株１５Ｂ８により生成されるモノクローナル抗体である、項目１２に記載の方法。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、悪性Ｂ細胞由来の疾患を有するヒト患者を治療するための方法に関する。本方法は、抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた処置を含み、その処置法において、抗体またはその抗原結合フラグメントの投与が、この治療法を受けた患者内に正の治療上の応答を促進する。本発明の方法での使用に適切な抗ＣＤ４０抗体は、以下の特徴を有する：１）これらはヒト細胞表面上に発現しているヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する；２）これらは、正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原へ結合した場合、有意なアゴニスト活性がない；および３）これらは、悪性ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原へ結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。これら抗ＣＤ４０抗体およびその抗原結合フラグメントは、本明細書では、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体として、参照されている。このような抗体は、以下に記載されている完全なヒトモノクローナル抗体１５Ｂ８およびモノクローナル抗体１５Ｂ８の結合特性を有するモノクローナル抗体を含むが、これらに限定されない。以下により詳細に議論されているように、これら抗体は、ＣＤ４０受容体に特異的である。正常なヒトＢ細胞表面上に提示されたＣＤ４０に、これら抗体が結合した場合、その抗体は有意なアゴニストの活性がない。いくつかの実施形態において、正常なヒトＢ細胞表面上に提示されたＣＤ４０へのそれら抗体の結合は、結果として、これら正常なヒトＢ細胞の増殖および分化を阻害する。従って、本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、細胞表面にＣＤ４０抗原を発現している正常なヒトＢ細胞へのアンタゴニスト活性を示し得るこれらのモノクローナル抗体を含む。アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が悪性ヒトＢ細胞表面上に提示されているＣＤ４０に結合した場合、抗体は本明細書中の他の箇所で定義されたアンタゴニスト活性を示す。
【００１５】
「処置」は、本明細書中で抗ＣＤ４０抗体アンタゴニストまたはその抗原結合フラグメントの患者に対する適用または投与として、あるいはアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの患者から単離された組織または患者由来の細胞株に対する適用または投与として、定義される。この場合、その患者は疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因を有し、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因に対する治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転、または作用である。「処置」によってもまた、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体あるいはそのフラグメントを含む薬学的組成物の患者に対する適用または投与、あるいは抗ＣＤ４０抗体あるいはそのフラグメントを含む薬学的組成物の患者から単離された組織または患者由来の細胞株に対する適用または投与を意図されている。ここで、その患者は疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因を有し、その目的は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する疾病素因に対する治療、回復、緩和、軽減、改変、矯正、改善、好転、または作用である。
【００１６】
「抗腫瘍活性」によって、悪性Ｂ細胞増殖もしくは蓄積の速度の減少、それによる既存の腫瘍の成長速度の減少もしくは治療中に生じた腫瘍の減少、および／または既存の新生物（腫瘍）細胞もしくは新たに形成された新生物細胞の破壊、それによる治療中の腫瘍全体のサイズの減少、が意図される。少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体（または、その抗原結合フラグメント）を用いた処置によって、ヒトの悪性Ｂ細胞を含む疾患の状態の処置に関して有益な、生理学的応答が生じる。
【００１７】
モノクローナル抗体１５Ｂ８は、本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を表す。この抗体は、２０００年１０月２日に「ヒト抗ＣＤ４０抗体」と題して出願された米国仮特許出願番号、第６０／２３７，５５６、および２００１年１０月２日に「ヒト抗ＣＤ４０抗体」と題して出願されたＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０１／＿＿＿（代理人登録番号ＰＰ１６０９２．００３）に記載されている。両参考文献はその全体が参考として本明細書中に援用される。１５Ｂ８抗体は、１５Ｂ８ハイブリドーマ細胞株から産生されるＩｇＧ２アイソタイプの完全なヒト抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である。その細胞株は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座Ａｂｇｅｎｉｘを含む、免疫された異種型のマウス由来の脾細胞を使用して生成された。その脾臓細胞を、マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞（Ｓｉｅｒｒａ  ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）と融合させた。結果としてできたハイブリドーマは、安定なモノクローナル細胞株１５Ｂ８を作るために、数回サブクローニングされた。
【００１８】
１５Ｂ８細胞株は無タンパク質培地中での生育に適応させられており、これはマスター細胞バンクの生成に使われた。マスター細胞バンクを同一性と、偶発的および外来性夾雑物に対して試験した。マスター細胞バンクは、所望のヒトＩｇＧ２の製造に使われた。各々の１５Ｂ８抗体は、クロマトグラフィーおよびろ過の手順を経て精製した。モノクローナル抗体１５Ｂ８を生成するハイブリドーマ細胞株は、２００１年１０月２５日付けで、Ｐａｔｅｎｔ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａに寄託にされ、そして特許受託番号ＰＴＡ−３８１４が割り当てられた。この寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて維持される。この寄託物は、当業者にとって単に好都合なように作製され、そして寄託物が米国特許法第１１２条の下で要求されるという承認ではない。
【００１９】
抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８は１，２８４アミノ酸残基からなり、推定分子量１４９，７５５およびヘテロ二量体の配置中に二本の重鎖および二本の軽鎖を有するポリペプチドである。アミノ酸分析により、抗体は等モル量の重鎖および軽鎖からなる。軽鎖の可変領域についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号１および配列番号２に示す。重鎖の可変領域についてのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３および配列番号４に示す。１５Ｂ８モノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡ型アッセイにおける可溶性ＣＤ４０に結合する。数々の霊長類由来のＢ細胞の増殖における効果をインビトロでテストした場合、１５Ｂ８はカニクイザル、ヒヒ、およびアカゲザルにおいてアゴニスト性抗ＣＤ４０抗体としてはたらく。ヒト、チンパンジー、およびマーモセットに対するアッセイ中で、１５Ｂ８はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である。ヒトＣＤ４０への１５Ｂ８の結合親和性は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭアッセイによって決定されるように、３．１×１０−９Ｍである。
【００２０】
本発明の方法における使用に適切なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ＣＤ４０細胞表面抗原に対して強い単一部位結合親和性を示す。本発明のモノクローナル抗体は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭのような標準アッセイを使用して測定すると、少なくとも１０−５Ｍ、少なくとも３×１０−５Ｍ、好ましくは少なくとも１０−６Ｍから１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍから約１０−２０Ｍ、さらに好ましくは少なくとも５×１０−９Ｍから約１０−１８Ｍ、最も好ましくは少なくとも約５×１０−９Ｍから約１０−１６Ｍ、例えば１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、１０−１５Ｍ、５×１０−１６Ｍ、または１０−１６ＭのＣＤ４０に対する解離定数を示す。ビアコア解析は、当該技術分野において公知で、詳細は「ＢＩＡアプリケーション
ハンドブック」に提供されている。
【００２１】
「ＣＤ４０抗原」によって、グリコシル化された膜貫通ペプチドまたはそのフラグメントのどれかが意図される（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号第Ｘ６０５９２；米国特許第５，６７４，４９２および４，７０８，８７１；Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら（１９８９）ＥＭＢＯ  ８：１４０３；Ｃｌａｒｋ（１９９０）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ３６：３３；Ｂａｒｃｌａｙら（１９９７）Ｔｈｅ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ（第二版；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ））。ＣＤ４０受容体は、本明細書中の他の箇所に記載されているように、種々の細胞型の表面上に提示されている。「表面上に提示される」および「表面上に発現される」によって、ＣＤ４０抗原のすべてまたは一部が細胞の外側にされされることが意図される。提示または発現されるＣＤ４０抗原は、完全にまたは部分的にグリコシル化される。
【００２２】
「アゴニスト活性」によって、物質がアゴニストとして機能することが意図される。アゴニストは細胞上の受容体に結合し、この受容体の天然のリガンドにより開始される反応もしくは活性と似たまたは同様の、反応または活性を開始する。ＣＤ４０のアゴニストは、以下の応答のいくつかまたはすべてを誘導するが、それらに限定されない：Ｂ細胞増殖および分化、抗体の産生、細胞間接着、Ｂ細胞記憶創生、アイソタイプスイッチ、クラスＩＩ  ＭＨＣまたはＣＤ８０／８６の細胞表層発現の上方調節、ならびにＩＬ−８、ＩＬ−１２、およびＴＮＦのようなプロ炎症性サイトカインの分泌。「アンタゴニスト活性」によって、物質がアンタゴニストとして機能することが意図される。ＣＤ４０のアンタゴニストは、アゴニストリガンド、特にＣＤ４０Ｌ、のＣＤ４０受容体への結合によって誘導された任意の応答の誘導を防止あるいは減少する。アンタゴニストは、アゴニストの結合に対する任意の１以上の応答の誘導を、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、好ましくは４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、より好ましくは７０％、８０％、または８５％、最も好ましくは９０％、９５％、９９％、または１００％減少し得る。Ｂ細胞の応答を測定する方法は、当業者に公知であり、これらの方法としては、Ｂ細胞増殖アッセイ、バンチェロー（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）様Ｂ細胞増殖アッセイ、抗体産出に対するヘルパーＴ細胞アッセイ、Ｂ細胞増殖アッセイの共誘導、およびＢ細胞活性化マーカーの上方調節に対するアッセイが挙げられるが、それらに限定されない。これらのアッセイのいくつかは、本明細書の他の箇所でより詳細に議論される。
【００２３】
「有意な」アゴニスト活性によって、Ｂ細胞応答のアッセイ中に測定されるように、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性より、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％より大きな、アゴニスト活性が意図される。「有意なアゴニスト活性がない」物質は、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性の、約２５％以下のアゴニスト活性、好ましくはＢ細胞応答のアッセイにおいて測定されるように、中立物質またはネガティブコントロールによって誘導されたアゴニスト活性の、約２０％以下で、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．５％以下、または約０．１％以下でさえ、示す。本発明の方法で有用なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、正常なヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、上記のように、有意なアゴニスト活性がない。本発明の一つの実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、一つのＢ細胞の応答において、有意なアゴニスト活性がない。本発明の他の実施形態において、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、一を超えるＢ細胞の応答（例えば、増殖および分化、または増殖、分化、および抗体産生）のアッセイにおいて、主要なアゴニスト活性がない。
【００２４】
本明細書中で使用されたように、「抗ＣＤ４０抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖのようなこれらのフラグメント、ならびに親抗ＣＤ４０抗体の抗原結合能を保持している他のフラグメントを含む、特異的にＣＤ４０Ｂ細胞抗原を認識するどの抗体でも含む。ポリクローナル血清は、通常の方法で調製され得る。一般的には、ＣＤ４０抗原を含む溶液を、適切な動物、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、またはヤギ、を最初に免疫するのに用いた。入手可能な血清の量および標識された抗ウサギおよび抗ヤギ抗体の有効性のために、ウサギまたはヤギは、ポリクローナル血清の調製に好まれる。ポリクローナル血清は、トランスジェニック動物、好ましくはヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス内で調製され得る。好ましい実施形態において、ＣＤ４０を発現しているＳｆ９細胞は、免疫原として使用される。免疫は、生理食塩水中に、好ましくはフロイントの完全アジュバンドのようなアジュバンド中に、抗原含有溶液を混合または乳化し、非経口的（一般的には皮下または筋肉内に）この混合物または乳濁物を注射することによって実行され得る。一投与あたり５０−２００μｇの投与量は、代表的には十分量である。免疫は、生理食塩水中、好ましくはフロイント不完全アジュバンドを用いて、タンパク質の一度以上の注射によって、一般的に２−６週間後に増強される。あるいは、当該技術分野中で公知の方法を使用したインビトロでの免疫によって、当業者は抗体を産生し得る。本発明の目的に対して、この方法は、インビトロ免疫と等価であると考えられている。ポリクローナル抗血清は、ガラスまたはプラスチック容器へ免疫された動物から採血し、２５度で１時間血液をインキュベーションし、続いて４度で２−１８時間インキュベーションすることによって得られる。その血清は遠心分離（例えば、１０００×ｇで１０分間）によって回収される。１回の採血あたり約２０−５０ｍｌがウサギから得られ得る。
【００２５】
好ましくは、抗体は本質的にモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」によって、実質的に均質な抗体、すなわち、少量しか存在しないかもしれないが、天然に存在し得る変異をのぞいて、同じ集団を含む個々の抗体の集団から得られる抗体が意図される。モノクローナル抗体は、高度に特異的で、それは単一の抗原部位、例えば、本発明におけるＣＤ４０Ｂ細胞表面抗原、に対して方向付けられている。さらに、異なる抗原決定基（エピトープ）に対して方向付けられている異なった抗体を代表的に含む通常の（ポリクローナル）抗体の調製とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の一つの抗原決定基に対して方向付けられている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体の集団から得られたものとしての、抗体の性質を示し、そして、いずれかの特定の方法による抗体の産出が要求されるとして解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって記載された、ハイブリドーマ法によって作製され得るか、または、組換えＤＮＡ法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；および米国特許第５，５１４，５４８号中に、記載されている技術を用いることにより、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００２６】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９６の方法またはその改変法を用いることによって、調製され得る。代表的には、マウスを、抗原を含む溶液を用いて免疫する。免疫は、生理食塩水中に、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバントに、抗原含有溶液を混合または乳化し、この混合液または乳化液の非経口的注射によって実行され得る。当該技術分野において公知の、任意の免疫方法が、本発明のモノクローナル抗体を得るために用いられ得る。動物の免疫後、脾臓（および選択肢として、いくつかの大きなリンパ節）を取り出し、単一の細胞へと分離した。脾臓細胞を、細胞懸濁液を目的の抗原を用いてコーティングしたプレートまたはウェルへ適用することによりスクリーニングし得る。抗原に対して特異的な免疫グロブリンに結合する膜を発現しているＢ細胞は、プレートに結合し、洗い落とされない。次いで、結果として生じるＢ細胞またはすべての分離された脾臓細胞は、ハイブリドーマを形成するために骨髄腫細胞と融合するように誘導され、選択培地中で培養される。その結果として生じた細胞を、連続的希釈液によって培養し、目的の抗原に特異的に結合する（および関連のない抗原には結合しない）抗体の産生に対してアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するハイブリドーマを、インビトロ（例えば、組織培養液ボトル中または中空繊維反応器中）またはインビボ（マウス内の腹水として）どちらかで培養する。
【００２７】
ハイブリドーマの使用法に代わるものとして、本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，５４５，４０３号、同第５，５４５，４０５号、および同第５，９９８，１４４号に開示されるように、ＣＨＯ細胞株のような細胞株中で、抗体が産生され得る。簡単に言えば、その細胞株を、軽鎖および重鎖それぞれを発現しうるベクターを用いてトランスフェクトする。別々のベクター上の二つのタンパク質をトランスフェクトすることにより、キメラ抗体が産生され得る。もう一つの利点は、抗体の正確なクリコシル化である。
【００２８】
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知である。例えば、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編（１９８７；および１９８９）Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｔｙｐｉｎｇ  ＩＩＩおよびＩＶ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中の、Ｂ細胞抗原へ取り分けられた部、米国特許第５，６７４，４９２号、同第５，８７４，０８２号、同第５，６７７，１６５号、同第６，０５６，９５９号、ＷＯ００／６３３９５号、２０００年１０月２日に、「ヒト抗ＣＤ４０抗体」と題して出願された、同時係属中の米国仮特許出願番号第６０／２３７，５５６、Ｇｏｒｄｏｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５、Ｖａｌｌｅら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３、Ｃｌａｒｋら（１９８６）ＰＮＡＳ  ８３：４４９４、Ｐａｕｌｉｅら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０、Ｇｏｒｄｏｎら（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５、Ｊａｂａｒａら（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１、Ｚｈａｎｇら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６、Ｇａｓｃａｎら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ３：８、およびＢａｎｃｈｅｒｅａｕら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７０を参照のこと。これら全ての文献は、参考文献として本明細書中に援用される。
【００２９】
さらに、本明細書で使用されているように、用語「抗ＣＤ４０抗体」は、キメラ抗ＣＤ４０抗体を含む。「キメラ」抗体によって、組換えデオキシリボ核酸技術を使用することによって最も好ましく誘導され、ヒト（免疫学的に「関連した」種、例えばチンパンジーを含む）および非ヒトの構成部分の両方を含む抗体、が意図される。従って、キメラ抗体の定常領域は、最も好ましくは、天然のヒト抗体の定常領域と事実上同一である。キメラの抗体の可変領域は、好ましくは非ヒト供給源から誘導され、ＣＤ４０細胞表面抗原に対して望まれた抗原特異性を有する。その非ヒト供給源は、ヒトＣＤ４０細胞表面抗原またはヒトＣＤ４０細胞表面抗原を含む物質に対する抗体を生成するために使用され得る、任意の脊椎動物であり得る。そのような非ヒト供給源としては、齧歯類（例えば、ウサギ、ラット、マウスなど；例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）および非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など、例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第５，７５０，１０５号および同第５，７５６，０９６号）が挙げられるが、それらに限定されない。本明細書中で使用されるように、句「免疫学的に活性な」は、キメラ抗ＣＤ４０抗体に関して使用するとき、ヒトＣＤ４０を結合するキメラ抗体を意味する。
【００３０】
ヒト化抗ＣＤ４０抗体はまた、本明細書中で使用されているように、用語抗ＣＤ４０抗体に含まれる。「ヒト化」によって、非ヒト免疫グロブリン配列由来の最小限の配列を含む抗ＣＤ４０抗体の型が、意図される。そのほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンで（レシピエント抗体）あり、レシピエントの超可変領域（相補性決定領域またはＣＤＲとして公知）の残基は、望まれた特異性、親和性、および受容力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基によって置き換えられる。齧歯類または変異型齧歯類のＣＤＲまたはヒト抗体の対応する配列についてのＣＤＲ配列を置換することによって、ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒおよびその共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−３２７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３９：１５３４−１５３６）に従って実行され得る。参考として本明細書中に援用される、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、同第５，８５９，２０５号もまた参照のこと。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンの１以上の可変領域のフレームワーク領域中の残基は、対応する非ヒト残基（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号を参照のこと）で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエントの抗体またはドナー抗体中にみられない残基を含み得る。これらの改変は、さらに抗体の能力を精密にするために（例えば、望まれる親和性を得るために）行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、および代表的に二つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。その可変ドメイン中の、超可変領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てが、ヒトヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に対応する。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、代表的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、参考として本明細書中に援用される、Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９、およびＰｒｅｓｔａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６を参照のこと。よって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にあまりインタクトではないヒト可変ドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている抗体を含み得る。実際には、ヒト化抗体は、代表的に、いくつかのＣＤＲ残基および可能ならばいくつかのフレームワーク領域の残基が、齧歯類の抗体中の類似の部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第５，８５９，２０５号を参照のこと。ヒト化抗体および所定の抗原に対する改善された親和性を有するヒト化抗体を産生する技術が開示されている、米国特許第６，１８０，３７０号、および国際公開ＷＯ０１／２７１６０号もまた参照のこと。
【００３１】
用語、抗ＣＤ４０抗体によって含まれるものは、不活性化された内性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座によって特徴付けられる異種のまたは非ヒト哺乳動物宿主、より具体的には、トランスジェニックマウスにおいて産生されている、改変抗ＣＤ４０抗体である。そのようなトランスジェニック動物において、宿主免疫グロブリンの軽鎖サブユニットおよび重鎖サブユニットの発現について能力のある内性遺伝子を非機能的にし、類似したヒト免疫グロブリン遺伝子座と置換した。これらのトランスジェニック動物は、宿主の免疫グロブリン軽鎖サブユニットまたは重鎖サブユニットの実質的非存在下で、ヒト抗体を産生する。例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第５，８７７，３９７号および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。
【００３２】
抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、これらが全長抗体の望まれる親和性を保持している限り、本発明の方法において用いるのに適している。従って、抗ＣＤ４０抗体のフラグメントは、ＣＤ４０Ｂ細胞表面抗原に結合する能力を保持する。このようなフラグメントは、対応する全長のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体と似ている性質によって特徴づけられる。すなわち、このフラグメントは、１）ヒト細胞の表面に発現しているヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合する；２）正常ヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、有意なアゴニスト活性がない；および３）悪性のヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合した場合、アンタゴニスト活性を示す。全長のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体が、正常ヒトＢ細胞の表面上のＣＤ４０抗原に結合したときにアンタゴニスト活性を示す場合、そのフラグメントもまた、そのようなアンタゴニスト活性を示す。そのようなフラグメントは、本明細書中で「抗原結合」フラグメントといわれる。
【００３３】
抗体の適切な抗原結合フラグメントは、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合性領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「単鎖Ｆｖ」抗体フラグメントまたは「ｓＦｖ」抗体フラグメントによって、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むフラグメントが意図され、ここでこれらドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。例えば、参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，９４６，７７８号；同第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第５，８５６，４５６号を参照のこと。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４）ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），２６９−３１５頁を参照のこと。
【００３４】
抗体または抗体フラグメントは、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら  （１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）  そして米国特許第５，５１４，５４８号に記載された技術を使用して作製された抗体ファージライブラリーより単離され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８）およびＭａｒｋｓら（（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７）は、ファージライブラリーを使用したマウスおよびヒト抗体のそれぞれの単離を記載する。次の刊行物は、チェーンシャッフリングによる高アフィニティー（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）、および、非常に大きなファージライブラリーの構築のためのストラテジーとしてのコンビナトリアル感染およびインビボ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６）を記載する。このように、これらの技術はモノクローナル抗体を単離するための、従来のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの技術に対する実現可能な代替手段である。
【００３５】
抗体フラグメントを生産するための実現可能な技術が進みつつある。伝統的に、これらフラグメントはインタクトな抗体のプロテアーゼ消化を介して誘導された（例えば、以下を参照のこと、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７（１９９２）そしてＢｒｅｎｎａｎら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１）。しかし、これらフラグメントは現在では組換え宿主細胞より直接生産され得る。例えば、抗体フラグメントは上記の抗体ファージライブラリーより単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントはＥ．ｃｏｌｉより直接回収され得、そしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成するよう化学的に結合し得る（Ｃａｒｔｅｒら、（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）。別の取組みによると、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組換え宿主細胞培養物より直接単離され得る。抗体フラグメント生産のための他の技術は当業者に明らかである。
【００３６】
本方法に有益なアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、本明細書にて開示される１５Ｂ８モノクローナル抗体およびこの抗体とは異なる抗体だが、ＣＤＲを保有する抗体；そして一つ以上のアミノ酸の付加、欠失、または置換を持つ抗体を含み、ここで、アンタゴニスト活性は、悪性Ｂ細胞の増殖および／または分化の阻害により測定される。また本発明は、脱免疫された（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅ）アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含み、この抗体は例えば本明細書で参考として援用される国際公開第ＷＯ  ９８／５２９７６およびＷＯ  ００３４３１７に記載されるように生産され得る。この様式において、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体中の残基は、抗体がヒト悪性Ｂ細胞に対するアンタゴニスト活性を保持しながら、ヒトに対しては全く、またはほとんど免疫原性ではないよう改変される。ここで、その活性は本明細書のいずれか記載されたアッセイで測定される。また、特許請求の範囲の範囲内に含まれるのは、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む融合タンパク質であり、そしてこの融合タンパク質は、当該分野で公知のように、合成されるかまたは対応するポリヌクレオチドベクターより発現され得る。そのような融合タンパク質は、以下に記す抗体の結合体化に関して記載される。
【００３７】
本発明の抗体は、例えば本明細書で参考として援用される欧州特許公開第０  ９８３  ３０３  Ａｌ号、ＷＯ  ００／３４３１７号およびＷＯ  ９８／５２９７６号に記載される方法を用いて生産される配列バリエーションを有し得る。例えば、ＣＤＲ内の配列は、抗体をＭＨＣクラスＩＩと結合させ、そして所望されないヘルパーＴ細胞応答を引き起こし得ることが示されてきた。保存的置換は、抗体が結合活性を保持するが、所望されないＴ細胞応答を引き起こす能力を喪失することを可能にし得る。このような、任意の保存的置換または非保存的置換は、当該分野で認識される方法（例えば、本明細書の他所に記載するような方法）を使用して作製され得る。そして生じる抗体は本発明の範囲内に帰属する。改変抗体は本明細書に記載される方法を用いて、アンタゴニスト活性、アフィニティーおよび特異性について慣用的に検査され得る。
【００３８】
任意の上記方法、または本明細書で開示されない他の任意の方法により生産された抗体は、次の生物学的活性のうち少なくとも一つの活性を有する場合、本発明の範囲内に帰属する：Ｔ細胞により刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞による免疫グロブリン分泌の阻害；Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞により刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の増殖阻害；ＣＤ４０Ｌ発現細胞により刺激された正常ヒト末梢Ｂ細胞の増殖阻害；以下に記されるようなヒト悪性Ｂ細胞の増殖阻害。これらのアッセイは本明細書の実施例に記載されるよう実施され得る。次の文献にも記載されるアッセイについてもまた参照のこと：Ｓｃｈｕｌｔｚｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４；Ｄｅｎｔｏｎら、（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら、（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎら、（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｃｏｌｉｇａｎら、（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら、（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４；そして米国特許第５，６７４，４９２号および同第５，８４７，０８２号；これらは本明細書で参考として援用される。
【００３９】
これまで記載された任意のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗体フラグメントは、本発明の方法での使用に先立ち、結合体化され得る。結合体化した抗体の生産方法は当該分野で公知である。従って、抗ＣＤ４０抗体は、間接的な標識か、または間接的に標識する手法を使用して標識され得る。「間接的な標識」または「間接的に標識する手法」により、キレート剤は共有結合で抗体に結合し、そして少なくとも一つの放射性核種がキレート剤に挿入されることが意図される。例えば、本明細書で参考として援用されるＳｒｉｖａｇｔａｖａおよびＭｅａｓｅ（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏ．１８：５８９−６０３に記載されたキレート剤および放射性核種を参照のこと。あるいは、抗ＣＤ４０抗体が「直接標識」、または「直接的に標識する方法」を使用して標識され得、ここで放射性核種は直接（典型的にはアミノ酸残基を介して）抗体と共有結合される。好まれる放射性核種は上記のＳｒｉｖａｇｔａｖａおよびＭｅａｓｅ（１９９１）に提供される。間接的に標識する手法が特に好ましい。また、例えば国際公開ＷＯ  ００／５２０３１およびＷＯ  ００／５２４７３も参照のこと。そこには放射性標識を抗体に結合させるためにリンカーが使用され；そして抗ＣＤ４０抗体の標識された形状が米国特許第６，０１５，５４２号（本明細書で参考として援用される）に記載される。
【００４０】
さらに、抗体（またはそのフラグメント）は、例えば細胞毒、治療薬剤または放射性金属イオンといった、治療の部分と結合体化され得る。細胞毒または細胞毒性薬剤とは、細胞に有害な全ての薬剤を含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン，マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシン  ジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−ジヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらのアナログまたはホモログが挙げられる。治療薬剤としては、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラシン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の結合体は、所定の生物学的応答を改変するために使用され得る；薬剤部分は、古典的な化学療法剤に限定されるように解釈されるべきではない。例えば、薬物部分は所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は例えば、アブリン、リシンＡ，シュードモナス属エンドトキシン、またはジフテリア毒素を例とする毒素；腫瘍壊死因子、インターフェロン−α、インターフェロン−β、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲン活性化因子を例とするタンパク質；または、例えばリンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の増殖因子を例とする生物学的応答調節物質、を含み得る。
【００４１】
以上のような治療的な部分を抗体に結合体化させる技術は周知である。例えば、Ａｒｎｏｎら（１９８５）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、編（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．），２４３−２５６頁；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、編（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、編（第２版；Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．），６２３−６５３頁；Ｔｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ
Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａら、編、４７５−５０６頁（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ  Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）；「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ
Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５），３０３−３１６頁；および  Ｔｈｏｒｐｅら（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−１５８を参照のこと。
【００４２】
あるいは、Ｓｅｇａｌが米国特許第４，６７６，９８０号に記載したように、抗体が二次抗体と結合体化され抗体ヘテロ結合体を形成し得る。さらに、標識と本発明の抗体との間にリンカーが使用され得る（米国特許第４，８３１，１７５号参照のこと）。抗体または抗原に結合する抗体フラグメントは、放射性のヨウ素、インジウム、イットリウム、または当該分野で公知の他の放射性分子を用いて直接標識され得る（米国特許第５，５９５，７２１号）。処置は、同時にまたは連続して投与する、結合体化された抗体または結合体化されていない抗体を用いた治療の組み合せから成り得る（ＷＯ  ００／５２０３１号およびＷＯ  ００／５２４７３号）。
【００４３】
本発明の方法は、悪性Ｂ細胞を含む疾患を抱える患者の処置するためのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に関する。「悪性」Ｂ細胞とは、任意の腫瘍性のＢ細胞のことを意味し、これには、低悪性度、中悪性度および高悪性度のＢ細胞リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）誘導性リンパ腫、およびＡＩＤＳ関連リンパ腫、ならびにＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、骨髄腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄芽球性白血病などを含むリンパ腫に由来するＢ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本発明の方法は、異常で制御不能なＢ細胞増殖または蓄積に関係する非ホジキン型リンパ腫の処置における使用を見出す。本発明のために、Ｂ細胞リンパ腫を低悪性度、中悪性度および高悪性度に分類する「Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」の分類図式に従って、このようなリンパ腫を称する（「Ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｊｅｃｔ」Ｃａｎｃｅｒ  ４９（１９８２）：２１１２−２１３５参照のこと）。従って、低悪性度Ｂ細胞リンパ腫は、小さなリンパ球性の、濾胞状の小切れ込み核細胞リンパ腫、ならびに濾胞状の小切れ込み核細胞および大細胞の混ざったリンパ腫を含む；中悪性度リンパ腫は、濾胞状大細胞リンパ腫、びまん性核切れ込み小細胞リンパ腫、びまん性の小細胞および大細胞の混合リンパ腫、ならびにびまん性大細胞型リンパ腫を含む；そして高悪性度リンパ腫は、大細胞免疫芽球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、ならびにバーキット型および非バーキット型の非小切れ込み核細胞リンパ腫を含む。
【００４５】
本発明の方法は、Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＥＡＬ）系に従って分類されたＢ細胞リンパ腫の治療的処置において有用であることが認識される。そのようなＢ細胞リンパ腫としては、前駆体Ｂ細胞新生物（例えば、リンパ芽球性白血病／リンパ芽球性リンパ腫）；末梢Ｂ細胞新生物（Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ性リンパ腫、リンパプラズマ細胞性リンパ腫／免疫担当細胞腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞中心リンパ腫（濾胞性）（びまん性小細胞、びまん性の小細胞と大細胞の混合物、およびびまん性大細胞のリンパ腫が挙げられる）、辺縁層Ｂ細胞リンパ腫（節外性型、節性型、および脾性型が挙げられる）、毛様細胞白血病、プラズマ細胞腫／骨髄腫、原発性縦隔（胸腺）のサブタイプのびまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびバーキット様高悪性度Ｂ細胞リンパ腫が挙げられる）；急性白血病；急性リンパ性白血病；骨髄芽球性白血病；急性骨髄性白血病；前骨髄球性白血病；骨髄単球性白血病；単球性白血病；赤白血病；顆粒球性白血病（慢性骨髄性白血病）；慢性リンパ性白血病；真性赤血球増加症；多発性骨髄腫：ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；重鎖病；および分類されない低悪性度または高悪性度のＢ細胞リンパ腫のように分類されるリンパ腫が挙げられるが、それらに限定されない。
【００４６】
本発明の方法は、治療中に生じるさらなる腫瘍増殖を防ぐことに有用であり得ることが認識される。本発明の方法は、低悪性度のＢ細胞リンパ腫を有する被験体、特に標準的な化学療法の後の再発を有する被験体、の処置において特に有用である。低悪性度Ｂ細胞リンパ腫は、中悪性度および高悪性度のＢ細胞リンパ腫よりもより無痛であり、そして再発／経過の軽減によって特徴付けられる。従って、再発のエピソードが数値および重度において減少するので、これらリンパ腫の処置は本発明の方法を使用することで改善される。
【００４７】
本明細書に記載されたアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体はまた、炎症性疾患および免疫系の不全または免疫系の障害（これらとしては、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、ＣＲＥＳＴ症候群、炎症性筋炎、シェーグレン症候群、複合結合組織病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、炎症性腸疾患、急性呼吸窮迫症候群、肺性の炎症、特発性肺線維症、骨粗鬆症、遅延型過敏症、喘息、原発性胆汁性肝硬変、および特発性血小板減少性紫斑病が挙げられるが、それらに限定されない）の処置においても使用を見出し得る。
【００４８】
本発明の方法に従って、本明細書の他の箇所にて定義したような、少なくとも一つのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはその抗原結合性フラグメント）は、悪性ヒトＢ細胞に関して正の治療応答を促進させるために使用される。「正の治療応答」によって、これら抗体またはそのフラグメントの抗腫瘍活性に関係する疾患の改善、および／または疾患に関係する症状の改善が意図される。すなわち、抗増殖効果、さらなる腫瘍の増殖の防止、および／またはＢ症状の減少、が観察され得る。従って、例えば疾患の改善は完全な応答として特徴付けられる。「完全な応答」とは、それまでの異常であった任意の、Ｘ線写真調査、骨髄および脳脊髄液（ＣＳＦ）を正常化させ、臨床的に検出可能な疾患の消失が意図される。そのような応答は、本発明の方法に従った処置後、少なくとも１ヶ月間持続しなければならない。あるいは、疾患の改善は、部分的な応答として分類され得る。「部分的な応答」とは、新たな病変の非存在下で、全ての測定可能な全身腫瘍組織量（すなわち、被験体中に存在する腫瘍細胞の数）における、少なくとも約５０％の減少、および少なくとも１ヶ月間の持続が意図される。そのような応答は、測定可能な腫瘍に対してのみ適用可能である。これら正の治療応答に加え、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて治療を受ける被験体は、疾患に関係した症状について、有益な改善効果を経験し得る。従って、被験体はいわゆるＢ症状、すなわち、寝汗、熱、体重減少および／または蕁麻疹の減少を経験し得る。
【００４９】
「治療有効用量または治療有効量」によって、投与される場合、悪性Ｂ細胞を含む疾患を有する患者の処置に関して正の治療応答をもたらす量の、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントが意図される。治療有効用量または治療有効量を含む薬学的組成物の投与は、当該分野で公知である任意の許容される投与方法を使用して達成され得る。好ましくは、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを含む薬学的組成物は、静脈内に投与され、好ましくは、約１時間〜約１０時間の期間にわたる注入、より好ましくは約１時間〜約８時間の期間にわたる注入、さらにより好ましくは約２時間〜約７時間の期間にわたる注入、なおより好ましくは、約４時間〜約６時間の期間にわたる注入であり、投与される抗ＣＤ４０抗体に依存する。薬学的組成物の初期注入は、約４時間〜約６時間の期間にわたり投与され得、後の注入はより早く送達される。後の注入は約１時間〜約６時間の期間、好ましくは約１時間〜約４時間の期間、より好ましくは約１時間〜約３時間の期間、なおより好ましくは約１時間〜約２時間の期間にわたる投与であり得る。
【００５０】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路に適するよう処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、口腔（例えば吸入）、経皮（局所的）、経粘膜、および直腸の投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に使用される溶液または懸濁液としては、次の成分が挙げられ得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート剤、（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）、そして張度調整剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは酸または塩基を用いて調整され得る（例えば、塩酸または水酸化ナトリウム）。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数の用量のバイアルに充填され得る。
【００５１】
抗ＣＤ４０抗体は、代表的に、薬学的に許容される緩衝液（例えば、滅菌生理食塩水、滅菌緩衝水溶液、プロピレングリコール、上記のものの物質の組み合わせなど）中で、標準技術により、提供され得る。非経口で投与され得る薬剤の調製方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版；Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９０）（本明細書では参考として援用される）に記載される。また、本発明の方法における使用に適した、安定化抗体の薬学的処方物を記載した、例えばＷＯ  ９８／５６４１８も参照のこと。
【００５２】
少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投与される量は、当業者により、過度の実験なく容易に決定される。少なくとも一つのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（またはそのフラグメント）の、投与様式およびそれぞれの量に影響する要因としては、治療を受ける特定のリンパ腫、疾患の重篤度、病歴、ならびに治療を受ける個人の年齢、身長、体重、健康、および身体状態が挙げられるが、それらに限定されない。同様に、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの投与される量は、投与様式に依存し、そして被験体がこの抗腫瘍剤を単一の用量を受けるか、または複数の用量を受けるか否かに依存する。一般的に、高投薬量の抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントは、治療を受ける患者の体重増加に合わせることが好まれる。投与される抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの用量は、約０．００３ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って例えば、用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、この方法は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの複数用量の投与を包含する。その方法は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の治療有効用量の、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、２５回、３０回、３５回、４０回またはそれより多い回数の投与を含み得る。抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントを含む薬学的組成物の複数用量を投与する頻度および期間は、当業者により過度の実験なしに容易に決定され得る。さらに、治療有効量の抗体を用いた被験体の処置は、単一の処置を含み得るか、または、好ましくは一連の処置を含み得る。好ましい例において、被験体はアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその抗原結合フラグメントを用いて、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の範囲で、約１〜１０週間の間に週１回、好ましくは約２〜８週間の間に、より好ましくは約３〜７週間の間に、そしてさらにより好ましくは約４週間、５週間または６週間に週１回、処置される。再発防止のため年１回、または再発の兆候のときに、処置が生じ得る。処置に使用される有効投薬量の抗体またはその抗原結合フラグメントは、特定の処置の過程にわたって、増加あるいは減少され得ることもまた認識される。本明細書に記載されるように、投薬量の変更は、診断アッセイの結果より導かれ、そして明らかになり得る。従って、一つの実施形態では、投与レジメンは、処置期間の１日、７日、１４日および２１日に、少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する。別の実施形態では、投与レジメンは、処置期間中の１週間のうちの１日、２日、３日、４日、５日、６日および７日に、少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する。さらなる実施形態は、処置期間中の１週間のうちの１日、３日、５日および７日に、少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を有する、投与レジメン；処置期間中の１週間のうちの１日、および３日に、少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する、投与レジメン；そして、処置期間中の１週間のうちの１日に、少なくとも一つの抗ＣＤ４０抗体またはそのフラグメントの治療有効用量の第一の投与を包含する、好ましい投与レジメンを包含する。処置期間は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、または１年を含み得る。処置期間は続いてでもよいし、互いに１日、１週、２週、１ヵ月、３ヵ月、６ヵ月または１年間隔で分割されてもよい。
【００５４】
本明細書に記載した、本発明の方法における使用のための薬学的組成物中に存在するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、ネイティブであっても、組換え技術によって得られてもよく、そして哺乳動物生物供給源（例えばマウス、ラット、ウサギ、霊長類、ブタ、およびヒト）を含む任意の供給源に由来し得る。好ましくは、そのようなポリペプチドはヒト供給源に由来し、そしてより好ましくは、ハイブリドーマ細胞株由来の組換えヒトタンパク質である。
【００５５】
本発明の方法において有用な薬学的組成物は、本発明のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な改変体を含み得る。そのような改変体は、改変体ポリペプチドを含む薬学的組成物が被験体に投与された場合に、ネイティブのポリペプチドを含む薬学的組成物と同じ治療効果を有するように、ネイティブのポリペプチドの所望される生物学的活性を保持するべきである。つまり、改変体の抗ＣＤ４０抗体は、ネイティブのアンタゴニスト抗体（例えばハイブリドーマ細胞株１５Ｂ８により発現される１５Ｂ８）に観察される様式と同様の様式で、薬学的組成物中の治療活性成分として役立つ。改変体抗ＣＤ４０抗体が所望される生物学的活性を保持するかを決定する方法は、当該分野で利用可能であり、ゆえに、薬学的組成物中の治療活性成分として役立つ。抗体改変体の生物学的活性は、本発明で記載されるアッセイを含め、ネイティブのアンタゴニスト抗体の活性を測定するよう特別に設計したアッセイを使用して測定され得る。
【００５６】
ネイティブのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の適切な生物学的に活性な改変体、または天然に存在する抗ＣＤ４０抗体の適切な生物学的に活性な改変体の改変体は、フラグメント、アナログ、そしてそのポリペプチドの誘導体であり得る。「フラグメント」によって、本明細書の他所に記載したように、インタクトなポリペプチド配列および構造の、一部のみからなるポリペプチドが意図される。「アナログ」によって、ネイティブポリペプチドまたはネイティブポリペプチドのフラグメントのいずれかのアナログが意図され、そこでアナログは一つ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有するネイティブのポリペプチド配列および構造を含む。「誘導体」によって、ネイティブのポリペプチドの所望される生物学的活性が保持される限り、目的のネイティブのポリペプチド、もしくはネイティブのポリペプチドのフラグメント、またはそれらそれぞれのアナログの任意の適切な改変（例えば、グリコシル化、リン酸化、ポリマー結合体化（例えばポリエチレングリコールと）、または他の外来部分の付加）、が意図される。ポリペプチドフラグメント、アナログ、および誘導体の作製方法は、当該分野で一般的に利用可能である。
【００５７】
例えば、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体のアミノ酸配列改変体は、目的の抗体をコードするクローンＤＮＡ配列中の変異により、調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；米国特許第４，８７３，１９２号；およびそれらに引用される参考文献を参照のこと；これらは本明細書で参考として引用される。目的のポリペプチドの生物活性に影響しない適切なアミノ酸置換に関する手引きは、本明細書にて参考として援用される、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）中のＤａｙｈｏｆｆら（１９７８）のモデルに見出され得る。保存的置換（例えばあるアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸に交換すること）が好まれ得る。保存的置換の例として、Ｇｌｙ⇔Ａｌａ、Ｖａｌ⇔Ｉｌｅ⇔Ｌｅｕ、Ａｓｐ⇔Ｇｌｕ、Ｌｙｓ⇔Ａｒｇ、Ａｓｎ⇔Ｇｌｎ、およびＰｈｅ⇔Ｔｒｐ⇔Ｔｙｒが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５８】
目的のアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体ポリペプチド改変体の構築において、所望される活性（すなわち、同様の結合親和性および次の特性を有する：１）ヒトの細胞表面に発現されるヒトＣＤ４０抗原に特異的に結合可能である；２）正常なヒトＢ細胞上のＣＤ４０抗原に結合している場合に有意なアゴニスト活性を有さない；および３）ヒトＢ細胞悪性腫瘍上のＣＤ４０抗原に結合している場合にアンタゴニスト活性を示す）を、改変体が有し続けるように、改変が施される。明らかに、改変体ポリペプチドをコードするＤＮＡになされる任意の変異は、読み枠外に配列を配置してはならず、且つ好ましくはｍＲＮＡの二次構造を作り得る相補的な領域を生じない。欧州特許出願公開番号７５，４４４を参照のこと。
【００５９】
抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な改変体は、一般的に、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは約９０％〜９５％以上、および最も好ましくは、約９８％以上のアミノ酸配列同一性を、比較の基準となる参照ポリペプチド分子のアミノ酸配列に対して有する。本明細書に記載される特異性特性および結合特性を有する参照アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の生物学的に活性な改変体は、参照ポリペプチドとは、僅か約１〜１５アミノ酸、僅か約１〜１０アミノ酸（例えば６〜１０アミノ酸）、僅か５アミノ酸、僅か４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸または１アミノ酸残基だけ異なり得る。「配列同一性」によって、改変体のアミノ酸配列の特定の連続するセグメントが、参照分子のアミノ酸配列と並べられ且つ比較される場合、その改変体ポリペプチドと参照となるポリペプチド分子との間に同一のアミノ酸残基が見い出されることが、意図される。二つのアミノ酸配列間の配列同一性のパーセントは、一致する位置数を得るように、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置数を決定し、参照分子と比較されるセグメント内の総位置数で一致する位置数を除算し、そして配列同一性のパーセントを得るように、その結果を１００培することによって、計算される。
【００６０】
この二つの配列の最適なアライメントのため、改変体のアミノ酸残基の連続するセグメントは、参照分子のアミノ酸配列に対してさらなるアミノ酸残基または欠失アミノ残基を有し得る。参照アミノ酸配列との比較に使用される連続するセグメントは、少なくとも２０個連続するアミノ酸残基を含み、３０残基、４０残基、５０残基、１００残基またはそれ以上の残基であり得る。改変体のアミノ酸配列中にギャップを含むことに関係するよう増加した配列同一性の訂正は、ギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を割り当てることによってなされ得る。配列アライメントの方法は、アミノ酸配列およびアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の双方に関して、当該分野で周知である。
【００６１】
従って、任意の２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な一つの好ましい例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（１９９８）ＣＡＢＩＯＳ４：１１−１７である。そのようなアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）にて利用され、このプログラムはＧＣＧ配列アライメントのソフトウェアーパッケージの一部である。ＰＡＭ１２０重み付き残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ（ｇａｐ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｅｎａｌｔｙ）１２、およびギャップペナルティ（ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）４が、アミノ酸配列を比較する場合にＡＬＩＧＮプログラムと共に使用され得る。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な別の好ましい例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４である。そのようなアルゴリズムは、ＡｌｔｓｃｈｕｌらのＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３に組み込まれている。目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相同性のあるヌクレオチド配列を得るため、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行され得る。目的のポリペプチドと相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は実施され得る。比較のためにギャップアライメント（ｇａｐ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢｌａｓｔがＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように使用され得る。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔは、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実行するように、使用され得る。上記Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）参照のこと。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。ＡＬＩＧＮプログラム（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：Ｓｕｐｐｌ．３（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＤａｙｈｏｆｆ（１９７８））、および、プログラムの標準パラメーターが利用される場合、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎより使用可能）（例えばＧＡＰプログラム）も参照のこと。
【００６２】
アミノ酸配列同一性の割合を考慮する場合、タンパク質機能の特質に影響しない保存的なアミノ酸置換の結果として、いくつかのアミノ酸残基の位置は異なり得る。これらの場合、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸の類似性を計上して上方修正され得る。このような調整は、当該分野で周知である。例えば、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４：１１−１７を参照のこと。
【００６３】
ＣＤ４０に特異的に結合可能であり、かつ特にＢ細胞悪性腫瘍上のＣＤ４０に結合している場合にアンタゴニスト活性を保持する、ポリペプチドの正確な化学構造は、多数の要素に依存する。イオン化可能なアミノ基およびカルボキシル基が分子内に存在するため、特定のポリペプチドが、酸性塩もしくは塩基性塩として、または中性形態で得られ得る。適切な環境状況に配置された場合に生物活性を有するそのような調製物すべてが、本明細書にて使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の定義に包含される。さらに、そのポリペプチドの一次アミノ酸配列は、糖部分（グリコシル化）を使用するか、または他の追加分子（例えば脂質、リン酸、アセチル基など）による誘導体化により、増強され得る。糖類との結合によっても、その一次アミノ酸配列は増強され得る。そのような増強のある局面は、産生宿主の翻訳後修飾系を通じて達成され得る；他のこのような改変はインビトロで導入され得る。いずれの場合でも、そのような改変は、抗ＣＤ４０抗体のアンタゴニスト特性を破壊しない限り、本明細書で使用される抗ＣＤ４０抗体の定義に包含される。そのような改変は、様々なアッセイにおいてポリペプチドの活性の増強または減少のいずれかによって量的または質的に活性に影響し得ると予期される。さらに、鎖中の個々のアミノ酸残基は、酸化、還元、または他の誘導体化によって改変され得、そしてポリペプチドは、活性を保持するフラグメントを得るために切断され得る。アンタゴニスト活性を破壊しないこのような改変は、本明細書で使用される目的の抗ＣＤ４０抗体の定義から、そのポリペプチド配列を除かない。
【００６４】
当該技術は、ポリペプチド改変体の調製および使用に関する実質的な指針を提供する。抗ＣＤ４０抗体改変体の調製において、天然のタンパク質ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に対するどの改変が、本発明の方法にて使用される薬学的組成物の治療上活性な成分としての使用に適した改変体を生じ得るかを、当業者は容易に決定し得る。
【００６５】
治療上活性な成分としてアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体を含む、任意の薬学的組成物が、本発明の方法にて使用され得る。従って、当該分野で公知であるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体またはその改変体を含む、液体組成物、凍結乾燥組成物または噴霧乾燥組成物は、本発明の方法に従って被験体に後で投与するための、水溶液もしくは非水溶液または水性懸濁液もしくは非水性懸濁液として、調製され得る。これらの組成物の各々は、治療的または予防的に活性な成分として、抗ＣＤ４０抗体またはその改変体を含む。「治療的または予防的に活性な成分」により、抗ＣＤ４０抗体またはその改変体が、被験体における疾患または健康状態の処置、予防または診断に関して、薬学的組成物がその被験体に投与される場合、所望される治療的応答または予防的応答をもたらすために、その組成物に特に組み込まれることが、意図される。好ましくは、その薬学的組成物は、調製中および保存中のタンパク質の安定性の消失および生物学的活性の消失に関係する問題を最小限にするため、適切な安定化剤、充填剤、またはその両方を含む。
【００６６】
製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｎｔ）は、本発明の抗ＣＤ４０抗体を含む薬学的組成物に加えられ得る。これら製剤化剤としては、油、ポリマー、ビタミン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤または充填剤が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくは、炭水化物としては、糖または糖アルコール（例えば単糖類、二糖類もしくは多糖類）または水溶性グルカンが挙げられる。糖類またはグルカンとしては、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ショ糖、デキストラン、プルラン、デキストリン、αシクロデキストリンおよびβシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、およびカルボキシメチルセルロース、またはそれらの混合物が挙げられ得る。「糖アルコール」はヒドロキシ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として定義され、そして、この「糖アルコール」としては、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロールおよびアラビトールが挙げられる。これらの糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて使用され得る。糖または糖アルコールの濃度は、１．０％〜７％（Ｗ／Ｖ）の間であり、より好ましくは２．０％〜６．０％（Ｗ／Ｖ）の間である。好ましくは、アミノ酸としては、左旋性（Ｌ）型のカルニチン、アルギニン、およびベタインが挙げられる。；しかし、他のアミノ酸も加えられ得る。好ましいポリマーとしては、平均分子量２，０００〜３，０００の間のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量３，０００〜５，０００の間のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。この処方物に添加され得る界面活性剤は、欧州特許第２７０，７９９号および同第２６８，１１０号に示される。
【００６７】
さらに、抗体は、例えば循環中の半減期を増加させるため、ポリマーとの共有結合により化学的に改変され得る。好ましいポリマー、およびペプチドにポリマーを結合させる方法は、米国特許第４，７６６，１０６号；同４，１７９，３３７号；同第４，４９５，２８５号；および同第４，６０９，５４６号（これらは全て本明細書により参考としてその全体が援用される）に示される。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、室温で水に可溶であり、そして一般式：Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒを有し、ここでＲは水素または保護基（例えばアルキル基またはアルカノール基）で有り得る。好ましくは、この保護基は、１と８との間の個数の炭素であり、より好ましくは、メチル基である。記号ｎは自然数であり、好ましくは１と１，０００との間、より好ましくは２と５００との間である。ＰＥＧは、好ましい平均分子量１，０００と４０，０００との間を有し、より好ましくは２，０００と２０，０００との間を有し、最も好ましくは３，０００と１２，０００との間を有する。好ましくは、ＰＥＧは、少なくとも一つのヒドロキシ基、より好ましくは末端ヒドロキシ基を有する。好ましくは活性化されて、インヒビターの遊離アミノ基と反応するものが、このヒドロキシ基である。しかし、本発明の共有結合ＰＥＧ／抗体が達成されるように、反応基の型および量は変更され得ることが理解される。
【００６８】
水溶性ポリオキシエチル化ポリオールもまた、本発明において有用である。それらは、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）などを含む。ＰＯＧが好ましい一つの理由は、ポリオキシエチル化グリセロール中のグリセロール骨格は、例えば動物およびヒトにおいてモノグリセリド、ジグリセリドまたはトリグリセリド中に天然に存在するものと同じ骨格であるからである。ＰＯＧは、ＰＥＧと同範囲の好ましい平均分子量を有する。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５０６４−１５０７０に示され、そしてＰＯＧ／ＩＬ−２結合体についての議論は、米国特許第４，７６６，１０６号に見出され、両方とも本明細書によりその全体が参考として援用される。
【００６９】
循環中の半減期を増加させる別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系の調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ６４９：１２９；およびＳｚｏｋａ（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｅｎｇ．９：４６７に論じられる。他の薬物送達系は、当該分野では公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（１９８０）Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎ．Ｙ．）２５３−３１５頁；Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｖｓ  ３６：２７７に記載される。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態は、臨床試験手順の一部として、例えば、所定の治療レジメンの有効性を決定するための、組織中のタンパク質レベルを診断モニターするための、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体の使用である。抗体を検出可能な物質と結合させることにより、検出は容易になり得る。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例としては、アンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例としてルミノールが挙げられる；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられる；そして適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【００７１】
アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、悪性Ｂ細胞を含む疾患状態の処置のための、公知の化学療法剤およびサイトカインと組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、サイトカイン（例えばインターロイキン２）と組み合わせて使用され得る。別の実施形態では、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と組み合わせて使用され得る。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂは、ヒトＩｇＧ１およびヒトκ鎖の定常領域を、マウス抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ＩＤＥＣ−２Ｂ８（Ｒｅｆｆら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８３：４３５−４４５）より単離されたマウス可変領域と共に含む、キメラ抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００７２】
本明細書に記載された抗ＣＤ４０抗体は、試薬（例えば、（例えばＣＤ４０を発現する細胞の同定に）使用され得る、標識抗体または標識され得る抗体）を提供するために、さらに使用され得る。このような抗体は、未知試料の細胞型を決定する場合に非常に有用であり得る。複数のモノクローナル抗体は、種別におよび／または器官型別に組織を同定するために使用され得る。同様の様式で、これらの抗ＣＤ４０抗体は、混入物について組織培養細胞をスクリーニングするため、すなわち、培養物中のＣＤ４０発現細胞およびＣＤ４０非発現細胞の混合物についてスクリーニングするために使用され得る。
【００７３】
次の実施例は、例示のために提供されるが、限定のためには提供されるものではない。
【００７４】
（実験）
下記の実施例において使用されるアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、１５Ｂ８である。１５Ｂ８は、ヒトＩｇＧ２重鎖の遺伝子座およびヒトＫ軽鎖の遺伝子座を有するトランスジェニックマウス（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ、Ａｂｇｅｎｉｘ）の免疫により生産される、ヒトＩｇＧ２サブタイプの抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体である。ＦＡＣＳ分析により示されるように、１５Ｂ８は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、かつサル（カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒ）およびチンパンジー由来の末梢血Ｂ細胞上のＣＤ４０と交差反応する。１５Ｂ８は、霊長類でない動物種由来のＣＤ４０と交差反応せず、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析により実証されるように、ＴＮＦレセプターファミリーの他のメンバーと結合もしない。ヒトＣＤ４０に対する１５Ｂ８の結合親和力は、ＢＩＡＣｏｒｅアッセイにより測定した場合、３．１×１０−９Ｍである。
【００７５】
（実施例１：インビトロにおけるＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用に対する１５Ｂ８の影響）
ＣＤ４０結合との直接競合が１５Ｂ８のアンタゴニスト活性の機構であるか否かを決定するために、競合結合アッセイを実施した。
【００７６】
ＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子を含みかつ細胞表面上にＣＤ４０Ｌを発現する、チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）株を作製した。このＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞を、１５Ｂ８とＣＤ４０とのインキュベーションの前および後に、精製されたＣＤ４０と共にインキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した抗ｈｕＩｇＧを、上記細胞に添加した。ＦＡＣＳ分析を実施し、ＣＤ４０を介してこのＣＨＯ細胞に結合した１５Ｂ８を検出した。ＣＤ４０への１５Ｂ８の結合は、その後のＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を阻害した。しかし、ＣＤ４０ＬおよびＣＤ４０を、１５Ｂ８の添加前に一緒にインキュベートした場合、１５Ｂ８は、その後ＣＤ４０への結合が可能であった。いかなる作用機構にも結び付けられないが、このことは１５Ｂ８がＣＤ４０上の結合部位に対してＣＤ４０Ｌと直接は競合しないこと、そしてＣＤ４０への１５Ｂ８の結合は、おそらくＣＤ４０分子内にＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合を妨げる高次構造変化を引き起こしたことを、示唆する。１５Ｂ８の結合により誘導されるＣＤ４０分子の推定構造変化もまた、上記細胞にネガティブシグナルを伝達し得、アンタゴニスト効果を起こし得る。
（実施例２：ＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞における１５Ｂ８の薬理作用）
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の前臨床インビトロモデルにおいて、１５Ｂ８の可能な効力を実証するために、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ処置されたＮＨＬ患者または未処置のＮＨＬ患者のいずれかより採取された悪性Ｂ細胞（ＮＨＬ細胞）を使用して、１５Ｂ８を試験した。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ（ＩＤＥＣ−Ｃ２Ｂ８；Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）は、再発性または治療抵抗性の、低悪性度または濾胞性の、ＮＨＬ処置用抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である。
【００７７】
初代リンパ腫細胞は通常の培養培地で増殖せずそして培養２〜３日後にアポトーシスを受けるので、腫瘍細胞を、Ｂ細胞増殖因子であるインターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下または非存在下で、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）でトランスフェクトした照射フィーダー細胞（Ａｒｐｉｎら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：７２０−７２２）と共に、共培養した。指示された濃度（０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）の抗体（アゴニスト抗ＣＤ４０  ＭＳ８１、アンタゴニスト抗ＣＤ４０  １５Ｂ８、またはアイソタイプコントロールヒトＩｇＧ２（ｈｕＩｇＧ２））を、その後その培養物に添加した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、培養細胞を、３Ｈ−チミジンで１８時間パルスした。その後細胞を収集し、そして３Ｈ−チミジン取り込み量を分析した（Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：８２００−８２０４）。全てのサンプル条件は、３組あった。
【００７８】
これらのＮＨＬ細胞の初代培養アッセイにおいて、１５Ｂ８単独、またはＩＬ−４と組み合わせた１５Ｂ８は、インビトロにおいてＮＨＬ細胞を刺激して増殖させなかった。対照的に、アゴニスト抗ＣＤ４０  ＭＳ８１は、同じ条件下でＮＨＬ細胞増殖を誘導した。１５Ｂ８は、ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＮＨＬ細胞増殖、およびＩＬ−４添加ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＮＨＬ細胞増殖の、統計的に有意な阻害（前者：Ｐ＝０．０５、後者：Ｐ＜０．０５）をインビトロで示した。それぞれ１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、１５Ｂ８は、ＣＤ４０ＬによりまたはＩＬ−４添加ＣＤ４０Ｌにより刺激されたＮＨＬ細胞増殖を、統計的に有意に用量相関的な阻害（Ｐ＜０．００５）を示した（データは示さず）。
【００７９】
リンパ腫の治療法の開発において、ヒト抗原特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）の評価のため通常使用される、２つのタイプの前臨床モデルがある。一つのモデルは、異種移植マウスのインビボにおけるモデルであり、そのモデルでは、ＥＢＶにより形質転換させたリンパ腫細胞株（例えばＤａｕｄｉ細胞（バーキットリンパ腫）またはＲａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫））が、ＳＣＩＤ／ヌードマウスに異種移植される。これらのモデルの欠点は、その結果が、特定の不死化細胞株（あるＥＢＶにより形質転換した細胞に由来するもの）に対する影響のみを反映することである。バーキットリンパ腫細胞がリンパ芽球様細胞であることは公知であり（Ａｍｂｉｎｄｅｒら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．９９：２７−４５；Ｑｕｉｎｔａｎｉｌｌａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９８）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３０：１１１−１２１；Ｋｌｅｉｎ（１９９６）Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｈｕｎｇ．４３：９７−１０５）、一方、ＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞は、成熟Ｂ細胞の段階であると考えられている（Ｇｈｉａら（２０００）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７９：１５７−１７３）。Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換は、ＣＤ４０シグナル伝達経路において多くの成分の変化をもたらす（Ｕｃｈｉｄａら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：３００−３０３；Ｆａｒｒｅｌら（１９９７）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５１：２５８−２６７）。ＮＨＬ細胞および正常Ｂ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達とは対照的に、ＣＤ４０シグナル伝達は、ＥＢＶ形質転換バーキットリンパ腫細胞株において増殖阻止をもたらす（Ｆｕｋｕｄａら（２０００）Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２１５−２２９；Ｂａｋｅｒら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９２：２８３０−２８４３）。従って、この異種移植モデルにおけるアンタゴニスト抗ＣＤ４０  ＭＡｂ（１５Ｂ８）の試験の結果から、ＮＨＬ患者によるこの抗体（１５Ｂ８）に対する応答を推定することは、不可能である。
【００８０】
もう１つのモデルは、上で使用したＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞の、インビトロにおける増殖阻害アッセイである。その有利な点は、その結果により、試験される因子（１５Ｂ８）に対するＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞の感受性が予想されることである。しかし、その結果は、限定された条件下でのインビトロにおける研究から得られる。これまでに開示された研究は、ラット抗マウスＣＤ４０抗体は、インビトロにおいてＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導不能であるが、２つの同系マウスＢ細胞リンパ腫モデル（ＢＣＬ１およびＡ３１）において、良好な有効性を示したことを記した（Ｔｕｔｔら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３１７６−３１８５）。抗マウスＣＤ４０の抗腫瘍効果は、試験された抗Ｉｄより時間的に遅く生じた。仮説の一つは、試験されたマウスモデルにおいて、抗マウスＣＤ４０は、抗Ｉｄのように直接のシグナル伝達をブロックするのではなく、表面上のＣＤ４０発現に依存した主要増殖シグナルをブロックすることにより作用したことであった。１５Ｂ８は、ヒトＩｇＧ２サブタイプであるので、試験した場合、インビトロにおいてＦｃγレセプターに結合せず、そしてインビトロにおいてＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導しなかった（データは示さず）。１５Ｂ８は、ラット抗マウスＣＤ４０と類似の特性を有する。これらのデータは、１５Ｂ８が、ＮＨＬ患者（特にＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）抵抗性患者）に利益をもたらすという仮説を支持する。
【００８１】
（実施例３：インビトロでの悪性Ｂ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の効果）
１５Ｂ８がインビトロにおいてＣＤ４０Ｌ様の増殖シグナルを提供するかどうかを試験するため、腫瘍に浸潤されたリンパ節由来のＢ細胞（ＮＨＬ細胞）を、抗体未処置のＮＨＬ患者１人、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性のＮＨＬ患者１人およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性のＮＨＬ患者１人より、採取した。これらのＮＨＬ細胞を、以下の４つの異なる培養条件下で研究した：抗体の添加なし（培地）；ヒトアイソタイプ抗体ＩｇＧの２添加（コントロール；ｈｕＩｇＧ２と呼ぶ）；抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１（アゴニスト抗体）の添加；および１５Ｂ８の添加。ＩＬ−４の存在下または非存在下にて、全ての抗体を１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌで試験した。２人の患者由来のＮＨＬ細胞を、上記のように同じ４つの条件下でＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、培養した。Ｂ細胞増殖を、上記の３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。
【００８２】
抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８は、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの濃度では、ＩＬ−４の存在下または非存在下のどちらでも、ＮＨＬ細胞が増殖するように刺激しなかった。対照的に、同じ濃度で試験したアゴニスト抗ＣＤ４０抗体（ＭＳ８１）は、ＩＬ−４の存在下および非存在下の両方で、全ての患者のサンプルにおいてＮＨＬ細胞増殖を刺激した。１人の患者からの代表的な結果を、図１および図２に示す。上記２人の患者由来のＮＨＬ細胞のＩＬ−４存在下での結果、および３人の患者由来のＮＨＣ細胞のＩＬ−４非存在下での結果は、同等であった。これらの結果は、１５Ｂ８が、アゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではなく、そしてインビトロにおいてＲｉｔｕｘｉｍａｂ感受性のＮＨＬ患者、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ抗体未処理のＮＨＬ患者またはＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性のＮＨＬ患者由来のＮＨＬ細胞の増殖を刺激しないことを、示す。
【００８３】
ＮＨＬ細胞のＦＡＣＳ分析を、直接標識した１５Ｂ８−ＦＩＴＣまたは１５Ｂ８＋抗ｈｕＩｇＧ２−ＦＩＴＣの一方を用いて実施し、試験されたＮＨＬ細胞表面にＣＤ４０が発現されていること、および１５Ｂ８がＮＨＬ細胞に結合することを確認した。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性の患者４人（合計６人の患者）由来のＮＨＬ細胞を試験した。全ての患者由来のＮＨＬ細胞は、ＣＤ４０を発現し、そして１５Ｂ８に結合した。所定のどの患者における１５Ｂ８結合陽性細胞集団も、約６６％〜９１％であった。
【００８４】
（実施例４：１５Ｂ８は、インビトロにおけるＮＨＬ細胞のＣＤ４０Ｌ刺激性増殖を阻害する）
インビトロにおいてＣＤ４０Ｌによって提供される増殖シグナルをブロックする１５Ｂ８の能力を評価するため、患者由来のＮＨＬ細胞を、４つの異なる条件下で上記のようにＣＤ４０Ｌ発現フィーダー細胞上の懸濁物中にて培養した：抗体の添加なし（ｍｅｄｉｕｍ）；ヒトアイソタイプ抗体ＩｇＧ２の添加（コントロール）；抗ＣＤ４０抗体ＭＳ８１（アゴニスト抗体）の添加；および１５Ｂ８の添加。全ての抗体を、ＩＬ−４存在下または非存在下で１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの濃度で添加した。抗体未処置の患者１人、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性の患者５人（合計８人の患者）由来のＮＨＬ細胞を、上記と同じ４つの条件下で、ＩＬ−４の存在下（２ｎｇ／ｍｌ）にて培養した。Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者３人およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性の患者４人（合計７人の患者）由来のＮＨＬ細胞を、同様の条件下でＩＬ−４の非存在下にて培養した。ＮＨＬ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した。
【００８５】
以下の表１は、インビトロにおいてＣＤ４０Ｌ単独で刺激した、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人（一方の患者からのデータは、２回の別々の実験において再現性があった）、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性の患者４人（合計６人の患者）由来のＮＨＬ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の阻害効果を示す。１人の患者（Ａ）由来の細胞の代表的な結果を、図３に示す。６人の患者において１５Ｂ８は、コントロールと比較した場合、増殖を約１２％〜６８％阻害した。１５Ｂ８による阻害の程度は、患者のサンプルおよび１５Ｂ８の用量レベルに依存して変動した。試験した７人の患者サンプル中６サンプルからのデータの統計的な解析は、ＣＤ４０Ｌ刺激性のＮＨＬ細胞増殖の１５Ｂ８による阻害は、１μｇ／ｍｌで有意である（ｐ＝０．０５）ことを示す。阻害効果が１５Ｂ８の用量の増加に伴って増加するので、統計的に有意な用量応答（ｐ＜０．００５）が存在する。
【００８６】
（表１：ＩＬ−４非存在下でのＣＤ４０Ｌ刺激によるＮＨＬ患者細胞増殖に対する１５Ｂ８  ＭＡｂの効果１）
【００８７】
【表１】
2008074870.tif 000002
１．患者由来のＮＨＬ細胞を、培地、アゴニスト抗ＣＤ４０（ＭＳ８１）、アンタゴニスト抗ＣＤ４０（１５Ｂ８）またはｈｕＩｇＧ２アイソタイプコントロールの存在下で、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するマウスＬ細胞と共にインビトロにて培養した。ＮＨＬ細胞の増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ感受性の１人の患者由来のデータは、ＣＤ４０ＬのＣＰＭ＜２０００であるので表にはない）
２．抗ＣＤ２０  ＭＡｂ治療に対する患者の応答；ＣＲ、完全な応答を示す患者；ＮＲ、応答のない患者
３．１５Ｂ８  ％阻害＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ｈｕＩｇＧ２  ｃｐｍ  ×  １００）；３つの結果の平均を示す。
【００８８】
（以下の）表２は、インビトロにおいてＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４の両方によって刺激された、抗体未処置の患者１人、Ｒｅｔｕｘｉｍａｂ感受性の患者２人（両患者のサンプルからのデータを２回繰り返した）、およびＲｉｔｕｘｉｍａｂ抵抗性の患者５人（合計８人の患者）由来のＮＨＬ細胞の増殖に対する１５Ｂ８の阻害効果を示す。１５Ｂ８は、１μｇ／ｍｌの濃度で、ＮＨＬ細胞のＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４を介した増殖を有意に（ｐ＜０．０５）阻害した。阻害の程度は、インビトロにおいて８人全ての患者由来のサンプルにおいて、高用量（５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌ）で、１８％〜６９％の範囲であった。１５Ｂ８の濃度範囲０．０１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌで、１５Ｂ８によるこの阻害効果の統計的に有意な（ｐ＜０．００５）用量応答が存在した。図４は、１つの代表的な用量応答曲線を示す。これらのインビトロにおける結果は、１５Ｂ８を用いた処置が患者のＮＨＬ細胞に対するＣＤ４０媒介性増殖シグナルをブロックし得ることを、示唆する。
【００８９】
（表２：ＩＬ−４存在下での、ＣＤ４０Ｌ刺激されたＮＨＬ患者細胞に対する１５Ｂ８  ＭＡｂの効果１）
【００９０】
【表２】
2008074870.tif 000003
１．患者由来のＮＨＬ細胞を、表１に記載した条件下で、ヒトＣＤ４０Ｌを発現するマウスＬ細胞と共にＩＬ−４（ヒトインターロイキン−４）（２ｎｇ／ｍｌ）存在下で培養した
２．抗ＣＤ２０  ＭＡｂ治療に対する患者の応答；ＣＲ、完全な応答を示す患者；ＮＲ、応答のない患者；未処置、未処置の患者
３．ｈｕＩｇＧ２と比較した％阻害。１５Ｂ８  ％阻害＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ｈｕＩｇＧ２  ｃｐｍ  ×  １００）。
【００９１】
（実施例５：１５Ｂ８は、ヒト末梢血Ｂ細胞を活性化せず、そしてヒト、チンパンジー、およびマーモセットではインビトロにおけるＰＢＭＣ増殖を引き起こさない）
１５Ｂ８がアゴニスト抗ＣＤ４０であるか、またはアンタゴニスト抗ＣＤ４０であるかを決定するために、１５Ｂ８を、ヒトおよび５つの異なる霊長類種（チンパンジー（ｃｈｉｍｐ）、マーモセット、カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒを含む）由来の細胞を用いて、以下に記載するいくつかのインビトロアッセイにて試験した。
【００９２】
（表３：１５Ｂ８抗体による、ヒト、チンパンジー（ｃｈｉｍｐ）、およびマーモセットにおけるＰＢＭＣ／Ｂ細胞増殖の刺激１）
【００９３】
【表３】
2008074870.tif 000004
１．Ｂ細胞／ＰＢＭＣを、ＣＤ４０Ｌ、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２アイソタイプコントロールの存在下でインビトロにおいて培養した
２．細胞増殖の結果を、ｈｕＩｇＧ２コントロールに対する１５Ｂ８の３Ｈ−チミジン取り込みの比として記録する。いくつかのサンプルからのデータは、ＣＤ４０Ｌ（陽性コントロール）により誘導されるＣＰＭが＜２０００のため、表中に含まれない
３．表中に示すＣＤ４０Ｌの増加倍数は、５μｇ／ｍｌでのｈｕＩｇＧ２のｃｐｍに対するＣＤ４０Ｌのｃｐｍの比である。
【００９４】
Ｂ細胞活性化の際に、多くの細胞表面タンパク質が上方制御される（Ｄｅｎｔｏｎら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｄｅｒｍａｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６）。１５Ｂ８が、ＣＤ４０に結合する場合に、ヒトＢ細胞を活性化せず、そしてアゴニストシグナルを誘導しないことを確認するために、Ｂ細胞活性化マーカーを上方制御するその能力を、精製されたヒトＰＢＭＣを使用するＦＡＣＳ分析により試験した。１５Ｂ８処置したヒトＢ細胞において、活性化マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４））の発現における上方制御はなかった（表４）。これらのマーカーのレベルは、細胞を１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールのいずれかを用いて処置した場合と同様であった（表４）。対照的に、ＣＤ６９は、試験された３人の健常提供者由来のＰＢＭＣサンプルにおいて、ＣＤ４０Ｌにより常に上方制御された。
【００９５】
（表４：ＦＡＣＳによる、インビトロにおけるＢ細胞活性化マーカーの上方制御に対する１５Ｂ８の効果）
【００９６】
【表４】
2008074870.tif 000005
１．「−」は上方制御なしを意味する
２．「Ｎ／Ａ」は測定されなかったか、または成功しなかったことを意味する。
【００９７】
Ｂ細胞活性化のさらなる意義は、表面上のＦａｓＬおよびアポトーシスの上方制御である（Ｒｅｖｙら（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：３６４８−３６５４；Ｃａｒｅｙら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１０５−１１５；Ｊｕら（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４８５−５１３；Ｂａｕｍｇａｒｔｈら（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７６：１７１−１８０）。１５Ｂ８がアゴニスト性の抗ＣＤ４０抗体ではないことを確認するために、ヒトＢ細胞のＦａｓＬ発現およびアポトーシスを誘導するその能力についてもまた、試験した。細胞表面上のアネキシンＶ染色を、初期アポトーシスマーカーとして使用し得る（Ｊｕら（１９９９）Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：４８５−５１３）。ヒトＢ細胞を末梢血より精製し、そして１５Ｂ８と共にインキュベートした。ＦＡＣＳ分析を使用して、アネキシンＶおよび抗ＦａｓＬの陽性染色を伴う細胞を同定した。１５Ｂ８またはアイソタイプコントロール（ｈｕＩｇＧ２）抗体とともにインキュベートした細胞間では、その２つの試薬による表面染色における有意な差異はなかった（データは示さず）。この結果は、１５Ｂ８がインビトロにおいてヒトＢ細胞のアポトーシスを誘導しないことを示す。これらのデータは、１５Ｂ８がヒトＢ細胞に対してアゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではないというさらなる証拠を提供する。
【００９８】
１５Ｂ８は、霊長類由来のＣＤ２０陽性ＰＢＭＣの表面上に発現するＣＤ４０と交差反応する。１５Ｂ８が、他の霊長類種（例えば、チンパンジーおよびマーモセット）由来のＢ細胞上のＣＤ４０を活性化するか否かを試験するために、１５匹のチンパンジー（ｃｈｉｍｐ）および５匹のマーモセットから新たに単離したチンパンジーＰＢＭＣおよびマーモセットＰＢＭＣを使用して、同一の増殖アッセイを実行した。ヒトＰＢＭＣを用いた結果と同様に、１５Ｂ８は、１μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの濃度では、６匹のチンパンジーおよび５匹のマーモセット由来のＰＢＭＣのインビトロにおける増殖を、刺激しなかった（上記の表３）。１５Ｂ８はまた、試験された３つのチンパンジーＰＢＭＣサンプルにおいて、活性化マーカーＣＤ６９の発現を上方制御しなかった（表４）。１５Ｂ８は、試験された６匹のチンパンジー由来のサンプル全てにおいて、インビトロでの２４時間および４８時間の刺激後、ヒトＰＢＭＣコントロールと同様に、チンパンジーＰＢＭＣにおけるＦａｓＬ発現およびアポトーシスに対して全く影響を示さなかった（データは示さず）。
【００９９】
プラスチック表面に固定化された二次抗体によって架橋されている１５Ｂ８は、Ｂ細胞増殖を刺激するその効力を増加しなかった（データは示さず）。この架橋アッセイにてヒトおよびチンパンジー由来のＰＢＭＣを用いて試験した場合、１５Ｂ８は、細胞の増殖を刺激しなかった。この観察は、インビボで投与される場合で、他のＦｃレセプターを発現する細胞に対して抗１５Ｂ８（ＨＡＨＡ）またはＦｃの結合を導入する場合、１５Ｂ８がＢ細胞増殖に対して刺激性である（すなわち、アゴニスト性であるかまたはアゴニスト活性を有する）危険性が減少されたことを示す。
【０１００】
要約すると、１５Ｂ８は、インビトロにおいてヒトＢ細胞／ＰＢＭＣにおいても、チンパンジーＰＢＭＣ／マーモセットＰＢＭＣにおいても活性化シグナルを開始しない。従って、１５Ｂ８は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてアゴニスト抗ＣＤ４０抗体ではない。
【０１０１】
（実施例６：１５Ｂ８は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるインビトロでのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体である）
１５Ｂ８がアンタゴニスト抗ＣＤ４０であるか否かを決定するために、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を阻害するその能力を、ＣＤ４０Ｌ媒介性のヒトＢ細胞増殖アッセイ（Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４）にて試験した。ヒトＣＤ４０Ｌを発現するトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株を使用して、精製されたヒト末梢血Ｂ細胞またはＰＢＭＣの増殖を刺激した。１０人の健常提供者由来のヒトＢ細胞および３人の健常提供者由来のヒトＰＢＭＣを試験した。試験されたサンプル全てにおいて、１５Ｂ８は、濃度範囲０．２〜５μｇ／ｍｌで、ＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞媒介性の増殖を４２％〜８８％抑制した（表５）。図５は、３人の個体由来の細胞を使用した代表的な用量応答曲線を示す。１５Ｂ８の無効用量は０．００８μｇ／ｍｌであり、そして０．２μｇ／ｍｌで飽和用量に達する（図５）。この観察は、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体としての１５Ｂ８がヒトＢ細胞およびＰＢＭＣにて細胞表面に発現されたＣＤ４０Ｌにより提供される増殖信号を阻害し得ることを示す。
【０１０２】
（表５：１５Ｂ８抗体を用いるＰＢＭＣ／Ｂ細胞のＣＤ４０Ｌ誘導性増殖の阻害１）
【０１０３】
【表５】
2008074870.tif 000006
１．Ｂ細胞／ＰＢＭＣを、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールの存在下でＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞と共にインビトロにおいて培養した
ＣＤ−４０ＬをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、実験前にホルムアルデヒドを用いて固定化した
細胞増殖を、３Ｈ−チミジン取り込みにより測定した
２．「１５Ｂ８  ％阻害」＝１００−（１５Ｂ８  ｃｐｍ／ＣＤ４０Ｌ  ｃｐｍ
×  １００）
いくつかのサンプルからのデータは、ＣＤ４０Ｌ（陽性コントロール）によって誘導される増殖が＜５倍なので、表中にはない。
【０１０４】
９匹のチンパンジーおよび３匹のマーモセットより新たに単離されたＰＢＭＣを使用して、さらなるアッセイを実行した。ヒトＰＢＭＣと同様に、１５Ｂ８は、１μｇ／ｍｌの濃度レベルで、ＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞により刺激されたチンパンジーＰＢＭＣおよびマーモセットＰＢＭＣの増殖を阻害し得た（上記の表５）。３匹のチンパンジーおよび３匹のマーモセット由来のＰＢＭＣサンプルにて、１５Ｂ８による阻害は、それぞれおよそ５５％〜７３％および６８％〜８４％であった（上記の表５）。
【０１０５】
活性化されたＢ細胞は、多くの生物学的応答（例えば、増殖および抗体生産）を受ける。Ｔ細胞依存性抗原によるＢ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞を含む。このＴ細胞ヘルパープロセスは、他の同時刺激因子およびサイトカインの相互作用と一緒に、Ｂ細胞上のＣＤ４０とＴｈ細胞表面上のＣＤ４０Ｌとの相互作用の協調的な作用により媒介される（Ｄｅｎｔｏｎら（１９９８）Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：６−１５；Ｅｖａｎｓら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：６８８−６９７；Ｎｏｅｌｌｅ（１９９８）Ａｇｅｎｔｓ  Ａｃｔｉｏｎｓ  Ｓｕｐｐｌ．４９：１７−２２；Ｌｅｎｄｅｒｍａｎら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３：７７−８６；Ｍａｃｋｅｙら（１９９８）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６３：４１８−４２８）。１５Ｂ８がＴヘルパー細胞媒介性のＢ細胞抗体生産をブロックし得るか否かを試験するために、精製されたヒト末梢血Ｂ細胞を、抗ＣＤ３抗体を用いて活性化された、精製され、照射されたＴ細胞の存在下で培養した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＩｇＭ生産のレベルを測定した。このアッセイにおいて、１５Ｂ８は、ＩｇＭ生産を約３０％減少させた（データは示さず）。従って、１５Ｂ８は、Ｔ細胞媒介性のＢ細胞免疫グロブリン生産を減少させ得る。
【０１０６】
要約すると、１５Ｂ８は、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおけるＣＤ４０Ｌ誘導性のＢ細胞／ＰＢＭＣの増殖を阻害し、そして、精製されたヒトＢ細胞によるＴ細胞誘導性の抗体生産をインビトロにおいて阻害する。これらのデータは、１５Ｂ８がヒトＢ細胞ならびにチンパンジーおよびマーモセット由来のＰＢＭＣにおいてインビトロでのアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることを実証する。
【０１０７】
（実施例７：１５Ｂ８は、インビトロでのアゴニスト抗サル（カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ）ＣＤ４０抗体である）
ＦＡＣＳ分析は、１５Ｂ８がサル（カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ）末梢血由来のＢ細胞表面上に発現されたＣＤ４０に結合することを実証する。新たに単離されたカニクイザルＰＢＭＣに対する１５Ｂ８の効果を、ヒトおよびチンパンジーについて上記した同一の増殖アッセイ（Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：１２；Ｋｗｅｋｋｅｂｏｏｍら（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：４３９−４４４）にて、試験した。３Ｈ−メチルチミジン取り込みにより測定する場合、ヒトＰＢＭＣとは対照的に、１５Ｂ８が、カニクイザルＰＢＭＣを刺激してインビトロにおいて増殖させることを見出した（下記の表６）。１μｇ／ｍｌのレベルで、１５Ｂ８は、試験された１７匹のサル由来の２２サンプル（５匹のサル由来のサンプルを２回試験した）にて、ｈｕＩｇＧ２コントロールと比較してＰＢＭＣの増殖を６倍〜１２９．７倍刺激した（下記の表６）。５μｇ／ｍｌのレベルで、１５Ｂ８により刺激された増殖は、２匹のサル由来の４つのサンプルにおいて１４倍〜２４倍、および２匹のサル由来の２つのサンプルにおいて約１．２５倍または約１．８５倍である（表６）。このことは、１５Ｂ８が５μｇ／ｍｌの濃度レベルで、カニクイザル由来のＰＢＭＣに対するその増殖刺激効果についての飽和用量を超える限界であり得ることを、示唆する。表面マーカーによる活性化状態についてのＢ細胞のさらなるＦＡＣＳ分析は、１５Ｂ８がサルＢ細胞に対してＣＤ６９、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの上方制御を誘導することを示した（表７）。こららのデータは、１５Ｂ８が、カニクイザル由来の末梢血Ｂ細胞上に発現されるＣＤ４０に対するインビトロでのアゴニスト抗体であることを、示唆する。
【０１０８】
１５Ｂ８のこのアゴニスト性の効果がカニクイザル特異的ではないことを確認するために、同一のアッセイを、アカゲザルおよびヒヒ由来のＰＢＭＣを用いて実施した。表６に示すように、カニクイザルの細胞より得られた結果と同等の結果を、観察した。１５Ｂ８は、インビトロにおいてアカゲザルおよびヒヒ由来のＰＢＭＣの増殖を刺激した（表６）。１５Ｂ８のアゴニスト活性を、５匹のアカゲザルおよび３匹のヒヒ由来のＰＢＭＣを使用して示した（表６）。
【０１０９】
（表６：１５Ｂ８により刺激された、ヒト、カニクイザルおよびアカゲザル、ならびにヒヒ由来のＰＢＭＣの増殖１）
【０１１０】
【表６】
2008074870.tif 000007
１．ＰＢＭＣを、ＣＤ４０Ｌ、１５Ｂ８またはｈｕＩｇＧ２コントロールの存在下でインビトロにおいて培養した
２．細胞増殖の結果を、ｈｕＩｇＧ２コントロールに対する１５Ｂ８の３Ｈ−チミジン取り込みの比として記録する
いくつかのサンプルからのデータは、ＣＤ４０Ｌ（陽性コントロール）により誘導されたＣＰＭが＜２０００のため、表中にはない
３．表中に示されるＣＤ４０Ｌについての増加倍数は、５μｇ／ｍｌでのｈｕＩｇＧ２のｃｐｍに対するＣＤ４０Ｌのｃｐｍの比である
ＣＤ４０ＬをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、実験前にホルムアルデヒドを用いて固定化した。
【０１１１】
（表７：ＦＡＣＳ分析によるインビトロにおけるＢ細胞活性化マーカーの上方制御に対する１５Ｂ８の影響）
【０１１２】
【表７】
2008074870.tif 000008
１．「−」は、上方制御なしを意味する
２．「Ｎ／Ａ」は、測定されなかったか、または成功しなかったことを意味する。
３．細胞数が制限されたので、１匹のカニクイザル由来の細胞のみをＦＡＣＳによって３日目に分析した。
【０１１３】
（実施例８：１５Ｂ８は、カニクイザルにおけるインビボでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体である）
１５Ｂ８は、カニクイザル由来のＰＢＭＣにて、インビトロで増殖を刺激し得、そして細胞表面の活性化マーカーを上方制御し得る。１５Ｂ８がこれらのサルにおいてインビボでのアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であるか否かを決定するために、１５Ｂ８の生体分布および影響を受けた末梢血Ｂ細胞の運命（すなわち、血管外分布、アポトーシス、状態の活性化、または補体の溶解）を試験するため、研究を実施した「Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  １５Ｂ８．７２  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｎｏｎ−Ｎａｉｖｅ  Ｍａｌｅ  ａｎｄ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙｓ（ＳＮＢＬ．２１８．３、ＳＮＢＬ（ＵＳＡ））」。
【０１１４】
カニクイザル（雌１匹および雄２匹）は、３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ８の静脈投与を１回受けた。以下のパラメーターを、モニターした：臨床徴候、食物消費、体重、薬物動態、血清補体（ＣＨ５０）、Ｂ細胞（アポトーシス様Ｂ細胞を含む）、Ｔ細胞および単球についてのフローサイトメトリー。１５Ｂ８を用いるＢ細胞ＣＤ４０レセプター飽和もまた、測定した。動物を、単回用量の１５Ｂ８を受けた２４時間後に剖検し、そして標準的な器官を秤量した。脾臓および腋窩リンパ節の外科的生検の予備研究を、基準線コントロールとして用いた。剖検にて、リンパ組織および非リンパ組織を、組織病理学および免疫組織化学のためにサンプリングした。組織を、ＣＤ３抗原、ＣＤ４０抗原、ＣＤ２０抗原、ＣＤ２７抗原およびＣＤ３８抗原に対する抗体を用いて免疫染色した。その研究の予備的な結果を、以下に論じる。
【０１１５】
全ての動物は、予定された剖検まで生存し、そして摂食量、体重、ＣＨ５０レベルに対しても、末梢血のＴ細胞数または単球数にも影響がなかった。器官重量にも変化がなかった。脾臓の顕微鏡検査は、１５Ｂ８処置された動物全ての胚中心において、ネクローシスを伴う中程度のびまん性濾胞の過形成および／または好中球の浸潤を示した。腸間膜リンパ節および鼡径部リンパ節の検査は、３匹の動物中２匹において軽度の濾胞の過形成を示した。処置に関連した顕微鏡下での効果は、他の組織（肝臓、皮膚、脳、胸腺、胚、骨髄、副腎および腎臓）では見られなかった。
【０１１６】
ＣＤ２０抗体、ＣＤ２７抗体、ＣＤ４０抗体およびＣＤ８６抗体を用いた免疫染色は、脾臓およびリンパ節濾胞においてこれらのマーカーの増加を明らかにし、このことは、これら同一の組織において見られた濾胞の過形成と相関した。ＣＤ２０およびＣＤ４０の増加された染色は、脾臓およびリンパ節に限定されるが、ＣＤ２７を用いる肝組織の幾分かのさらなる染色があり、そしてＣＤ８６による肝臓のクップファー細胞および炎症細胞の幾分かのさらなる染色があった。ＣＤ８６染色はまた、胸腺髄質細胞および副腎間隙白血球においても増加された。１５Ｂ８処置動物におけるＣＤ３免疫染色では、コントロールと比較した場合、変化がなかった。
【０１１７】
これらの発見は、カニクイザルに投与された３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ８の単回用量が、２４時間の期間内に脾臓およびリンパ節において、リンパ濾胞の増殖および／または末梢血由来のＢ細胞の再拡散を起こし得ることを示す。ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ４０およびＣＤ８６に対する抗体は、他の細胞型の認識に伴い、Ｂ細胞上および／あるいは活性化Ｂ細胞上に発現される抗原を認識する。これら抗原を発現する細胞数の増加が、処置された動物の脾臓およびリンパ節に見られ、このことは活性化されたＣＤ２０＋  Ｂ細胞数の増加を示唆する。この研究は、カニクイザルにてインビボにおいて１５Ｂ８がアゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることを示唆する。カニクイザルにおいてインビボおよびインビボで得られた結果は一致している。
【０１１８】
（実施例９：チンパンジーにおける、末梢Ｂ細胞に対する１５Ｂ８の影響）
３匹の雄チンパンジーの２つの集団は、静脈内投与により０．０３ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのいずれかの１５Ｂ８を受けた。血清１５Ｂ８濃度および末梢Ｂ細胞数を、１５Ｂ８の投与直後より投与後２９日にかけてモニターした。この実験結果を図６に示す。３ｍｇ／ｋｇでの１５Ｂ８の投与後、血清１５Ｂ８濃度は、短期拡散期、対数線形性の消失期および非線形性の消失期を含む３相の様式で減少した。およそ１０μｇ／ｍｌ未満の濃度では、非線形性の消失期が優先的であった。対数線形期中の半減期はおよそ４日であった。末梢Ｂ細胞数は１５Ｂ８投与後直ぐに減少し、そして３〜４週間以内に回復した。１５Ｂ８は、血清中において検出され、循環しているＢ細胞上の表面ＣＤ４０レセプターに結合した。結合の程度は、２日目から投与後８日まで相対的に変わらないままであり、そしてそれから投与後２９日にかけて消失するようであった。
【０１１９】
０．０３ｍｇ／ｋｇの１５Ｂ８の投与後、Ｂ細胞は３０分までは僅かに減少するようであるが、４時間以内に投与前の値に復帰した。血清１５Ｂ８濃度は、投与後３０分に検出限界未満であった。
【０１２０】
（実施例１０：免疫グロブリン定量のためのＥＬＩＳＡアッセイ）
ヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧの濃度をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを、４μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂ、または１．２μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＭ  ｍＡｂを用いて、０．０５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ＝９．６）中で１６時間４℃でコートした。プレートをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）を用いて３回洗浄し、ＢＳＡで１時間飽和させた。２回洗浄後、プレートを１時間３７℃で希釈率の異なる試験サンプルと共にインキュベートした。３回洗浄後、１μｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識された、マウス抗ヒトＩｇＧ  ｍＡｂまたはマウス抗ヒトＩｇＭ  ｍＡｂと共に１時間３７℃でインキュベートすることにより、結合したＩｇを検出した。プレートを４回洗浄し、そして結合したペルオキシダーゼ活性をｏ−フェニレンジアミンを基質として添加することにより示した。
【０１２１】
（結論）
（インビトロアッセイの要約）
本結果は、１５Ｂ８が、カニクイザル、アカゲザルおよびヒヒにおいて、アゴニスト性の抗ＣＤ４０抗体であること、および、ヒト、チンパンジーおよびマーモセットにおいてアンタゴニスト性の抗体であることを示唆する。実施された実験を以下の表に要約する。
【０１２２】
（表８：アゴニスト活性を測定したアッセイ）
【０１２３】
【表８】
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（表９：アンタゴニスト活性を測定したアッセイ）
【０１２４】
【表９】
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１５Ｂ８は、ヒトＩｇＧ２サブタイプを有し、そして非ヒト霊長類のみに由来するＣＤ４０に対して交差反応性を有する、抗ヒトＣＤ４０特異的モノクローナル抗体である。インビトロにおける広範な試験を通して、１５Ｂ８が、ヒトＢ細胞、ヒトＰＢＭＣ、チンパンジー（ｃｈｉｍｐ）ＰＢＭＣおよびマーモセットＰＢＭＣにおいて発現されるＣＤ４０に対する、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体であることを示した。しかし１５Ｂ８は、インビトロにおいてサル（カニクイザル、アカゲザル、およびヒヒ）由来のＰＢＭＣにおいて発現されるＣＤ４０に結合する場合、アゴニスト活性を有することが示された。この１５Ｂ８のアゴニスト活性は、インビボにおいてカニクイザルにて確認された。Ｒｉｔｕｘａｎ感受性およびＲｉｔｕｘａｎ抵抗性のＮＨＬ患者由来のリンパ腫細胞の初代培養において試験した場合、１５Ｂ８は、ＩＬ−４存在下または非存在下においてアゴニスト活性を全く有さない。１５Ｂ８はまた、両条件下で同様の集団の患者のからのリンパ腫細胞のＣＤ４０Ｌ刺激性増殖を阻害し得る。１５Ｂ８は、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ経路が疾患の病因において役割を果たし得るＢ細胞悪性腫瘍（例えば非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ））を緩和する潜在能を有する。
【０１２５】
本明細書に言及した全ての刊行物および特許出願は、本発明の帰属する分野の当業者のレベルの指標である。全ての刊行物および特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が、特定におよび個別に参考として援用されることが示される場合と同程度に、本明細書において参考として援用される。
【０１２６】
当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの等価物を認め、または慣用的な実験法以上のものは使用せずに突きとめ得る。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、インターロイキン４（ＩＬ−４）非存在下で、インビトロでの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞の増殖に対する、アゴニスト（ＭＳ８１）およびアンタゴニスト（１５Ｂ８）抗ＣＤ４０抗体の濃度、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌでの効果の代表的結果を示す。悪性Ｂ細胞を、ＮＨＬ患者の腫瘍が浸潤したリンパ節から得た。ＮＨＬ細胞のＦＡＣＳ解析により、これらの細胞はＣＤ４０を発現し、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８に結合することが確認された。詳細は、上記の実施例３を参照のこと。
【図２】図２は、ＩＬ−４存在下（２ｎｇ／ｍｌ）で、インビトロでの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）細胞の増殖に対する、アゴニスト（ＭＳ８１）およびアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（１５Ｂ８）の濃度、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌでの効果の代表的結果を示す。悪性Ｂ細胞を、ＮＨＬ患者の腫瘍が浸潤したリンパ節から得た。ＮＨＬ細胞のＦＡＣＳ解析により、これらの細胞はＣＤ４０を発現し、アンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体に結合することが確認された。詳細は、上記の実施例３を参照のこと。
【図３】図３は、ＩＬ−４非存在下で、インビトロでのＣＤ４０Ｌ刺激ＮＨＬ細胞の増殖に対する、アゴニスト（ＭＳ８１）およびアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体（１５Ｂ８）の濃度、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、または５μｇ／ｍｌでの効果の代表的結果を示す。ＮＨＬ細胞をＲｉｔｕｘｉｍａｂ感受性ＮＨＬ患者から得た。詳細は、上記の実施例４を参照のこと。
【図４】図４は、ＣＤ４０ＬおよびＩＬ−４（２ｎｇ／ｍｌ）によってインビトロで刺激されたＮＨＬ細胞の増殖に対するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体１５Ｂ８による代表的な用量応答曲線を示す。ＮＨＬ細胞をＲｉｔｕｘｉｍａｂ感受性ＮＨＬ患者から得た。詳細は、上記の実施例４を参照のこと。
【図５】図５は、ＣＤ４０Ｌ発現ＣＨＯ細胞媒介性ヒトＢ細胞増殖アッセイにおいて、インビトロで刺激された精製ヒト末梢血Ｂ細胞の増殖に対するアンタゴニスト抗ＣＤ４０抗体、１５Ｂ８についての用量応答曲線を示す。Ｂ細胞を健康な３名の個体から得た。詳細は、上記の実施例６を参照のこと。
【図６】図６は、０．０３ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの投与量の１５Ｂ８を投与後の、雄性チンパンジーにおける末梢Ｂ細胞数に対する効果を示す。３体のチンパンジーに、各々の投与レベルを静脈内投与し、平均末梢Ｂ細胞数（μｌあたり）を決定した（右ｙ軸）。血清中の１５Ｂ８の平均濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、左ｙ軸に示す。４回目の投与に対して、日数で測定した時間をＸ軸に示す。３ｍｇ／ｋｇでの１５Ｂ８の投与後、血清１５Ｂ８濃度は、短い分布期、対数線形減衰期、および非線形減衰期の３相のパターンで、減衰した。対数線形減衰期中の半減期は、約４日であった。末梢Ｂ細胞数は、１５Ｂ８投与後ただちに減少し、３−４週間以内に回復した。詳細は、上記の実施例９を参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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