(57)【要約】      （修正有）【課題】レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムの核酸配列の発現、キャプシド形成、逆転写及び組込みを行うためにシス作用するエレメントを含んでいる。しかしこれらのエレメントは、組込み型のプロウイルス中では無用であり、多くの問題の原因となり得る。このようなウイルスエレメントの大部分が除去されたレトロウイルスベクターを提供。【解決手段】ベクターはバクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘ組換え系を使用。３２個のヌクレオチドから成るｌｏｘＰ部位が、細胞に導入すべき遺伝子と共に３′ＬＴＲのＵ３領域に挿入される。ＬＴＲの介在によってｌｏｘＰが重複された後、酵素ＣｒｅによってＬＴＲの組換えが生じる。宿主ゲノム中で得られるプロウイルスの構造は、細胞に導入すべき遺伝子の単一コピーを含む単一ＬＴＲに対応する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロエレメント配列を含むレトロウイルスが標的細胞に感染したときに標的細胞に移入され得る領域に取込まれており組換えプロウイルスに組込まれる挿入配列を含み、前記挿入配列が、標的細胞のゲノムに組込まれ得る有益なヌクレオチド配列と、認識配列、好ましくはリコンビナーゼによって認識され得る単独認識配列と、を含むことを特徴とする特にレトロウイルスＤＮＡの天然または合成のレトロエレメント配列。
【請求項２】
前記挿入配列が、前記レトロエレメント配列のシス作用領域に取込まれていることを特徴とする請求項１に記載のレトロエレメント配列。
【請求項３】
前記挿入配列が、前記レトロエレメント配列の３′ＬＴＲ領域または５′ＬＴＲ領域に取込まれていることを特徴とする請求項１に記載のレトロエレメント配列。
【請求項４】
前記挿入配列が、前記レトロウイルス配列の３′ＬＴＲのＵ３領域、５′ＬＴＲのＵ５領域またはＲ領域に取込まれていることを特徴とする請求項１に記載のレトロエレメント配列。
【請求項５】
リコンビナーゼによって認識され得る前記認識配列が前記有益なヌクレオチド配列の上流に位置することを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載のレトロエレメント配列。
【請求項６】
前記認識部位を認識し得るリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のレトロエレメント配列。
【請求項７】
リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列が前記レトロエレメント配列の５′ＬＴＲ領域と３′ＬＴＲ領域との間に位置することを特徴とする請求項６に記載のレトロエレメント配列。
【請求項８】
リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列がＣｒｅタンパク質をコードすることを特徴とする請求項６または７に記載のレトロエレメント配列。
【請求項９】
認識配列がＬｏｘＰ認識部位を含むことを特徴とする請求項１から８のいずれか一項に記載のレトロエレメント配列。
【請求項１０】
有益なヌクレオチド配列が有益なタンパク質またはＲＮＡ、特にアンチセンスＲＮＡまたはリボザイム配列をコードする配列を含むことを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載のレトロエレメント配列。
【請求項１１】
１９９５年６月１３日付けでＣＮＣＭにＮｏ．１−１５９９で寄託されたプラスミドに含まれるレトロエレメント配列。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載のレトロエレメント配列を含むことを特徴とするレトロウイルスベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが３′ＬＴＲのＵ３領域、５′ＬＴＲのＵ５領域またはＲ領域に認識部位を含む欠損モロニーマウス白血病プロウイルスであることを特徴とする請求項１２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクターの単独ＬＴＲ配列を含むプロウイルス構造をゲノムに組込んでおり、前記ＬＴＲ配列が有益なヌクレオチド配列の単一コピーを含むことを特徴とする細胞性宿主。
【請求項１５】
ＰＢＳ配列とキャプシド形成及びダイマー形成シグナルとＰＰＴとを本質的に含まないプロウイルス構造をもつ真核細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞性宿主。
【請求項１６】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法であって、請求項１２または１３に記載のベクターを宿主細胞に感染させる段階を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
有益な配列の支援によって宿主細胞内で分子を発現させる方法であって、
前記有益なヌクレオチド配列を含む請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクターを前記宿主細胞に感染させ、
前記有益なヌクレオチド配列を発現させ得る条件下で宿主細胞を増殖させ、
所望の分子を回収する段階とから成る方法。
【請求項１８】
有益なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡを宿主細胞に産生させるための請求項１から１１のいずれか一項に記載のレトロウイルス配列の使用方法。
【請求項１９】
有益なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を宿主細胞に産生させるための請求項１から１２または１３に記載のレトロウイルスベクターの使用方法。
【請求項２０】
有益なヌクレオチド配列を標的細胞のゲノムに組込むことを目的とする患者の医学的治療のための請求項１から１１のいずれか一項に記載のレトロウイルス配列の使用方法。
【請求項２１】
有益なヌクレオチド配列を標的細胞のゲノムに組込むことを目的とする患者の医学的治療のための請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクターの使用方法。
【請求項２２】
請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクターを医薬として許容される賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項２３】
発現可能なヌクレオチド配列を含む有益なヌクレオチド配列を標的細胞のゲノムに組込むために請求項２２に記載の組成物を使用する方法であって、前記組成物が請求項１２または１３に記載のレトロウイルスベクターを有効量で含むことを特徴とする使用方法。
【請求項２４】
請求項１４に記載の宿主細胞から成る医薬組成物。
【請求項２５】
（ａ）トランス相補性ウイルス細胞系を請求項１乃至１０のいずれかに記載のレトロエレメント配列でトランスフェクトすること、および
（ｂ）当該レトロウイルスベクターを得ることを含む、レトロウイルスベクターを得る方法。
【請求項２６】
前記レトロエレメント配列がプラスミドの形態である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記レトロエレメント配列がそのＬＴＲの１つに対象のヌクレオチド配列および認識配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラスミドが、前記対象の配列の上流または下流に、前記認識部位を認識し得るリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記認識部位を認識し得るリコンビナーゼをコードする前記ヌクレオチド配列が、都合よく３’ＬＴＲ領域と５’ＬＴＲ領域の間に位置している請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記レトロエレメント配列が、
（ａ）少なくとも合成または天然のレトロエレメントの３’ＬＴＲまたは５’ＬＴＲ、および
（ｂ）細胞のゲノム内に挿入されるヌクレオチド配列および与えられた組換え系のためのリコンビナーゼの単独認識配列を含む挿入配列
を含むポリヌクレオチドである請求項２５に記載の方法であって、当該挿入配列が、宿主細胞にヌクレオチド配列が挿入された後には必要でないプロウイルス配列を挿入することなく、レトロウイルスベクターの仲介を介して標的細胞のゲノムに前記のヌクレオチド配列を挿入することを可能にするために、前記３’ＬＴＲまたは５’ＬＴＲに取込まれている前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然または合成のレトロエレメント配列、特にレトロウイルスＬＴＲのヌクレオチド配列、より特定的にはレトロウイルスのＤＮＡ配列に関する。本発明はまた、上記の配列を含むレトロウイルスベクターに関する。本発明のレトロウイルスベクターは、該ベクターが内包する有益な遺伝子を細胞に組込ませるために所望の細胞に感染し、組換えプロウイルスの組込み後に不要となったプロウイルス配列の大部分を除去し得る。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスを遺伝子ベクターとして使用する技術が進歩し、最近では、（ｉ）キャプシド形成細胞系の改良、（ｉｉ）エンベロープタンパク質の向性の操作、（ｉｉｉ）多重遺伝子の発現、という３つの目的に使用されるようになっている。組込み状態のプロウイルスは、シス作用するいくつかの必須エレメントを含むので、プロウイルス構造の修飾が十分に利用されてはいなかった。これらのエレメントが多くの問題の原因となっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
構造面から見ると、レトロウイルスベクター系は、２つのエレメント、即ち、トランス相補性遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）と、シス作用する配列（Ｕ３、Ｒ、Ｕ５、ポリプリントラック（ＰＰＴ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）並びにキャプシド形成及びダイマー形成シグナル）と、から構成されている。
【０００４】
トランス相補性遺伝子はトランス相補性細胞に取込まれている。これらの遺伝子は標的細胞に導入されない。
【０００５】
シス作用する配列はレトロウイルスベクターに取込まれている。これらの配列の大部分は感染標的細胞に移入され、組換えプロウイルスに組込まれる。シス作用するこれらの配列のいずれかが除去されると、レトロウイルス系が機能しなくなる。キャプシド形成シグナルは、ウイルス粒子内のレトロウイルスゲノムのキャプシド形成に必要である。ＰＢＳ、ＰＰＴ及びＲは逆転写に必要である。Ｕ３配列及びＵ５配列は逆転写のため及び細胞に導入されたレトロウイルス産物の組込みに必須である。
【０００６】
プロウイルスが組込まれた後、これらの配列は遺伝子発現に不要になる。逆に、これらの配列が多くの問題の原因となることさえある。例えば、（ｉ）Ｕ３配列の強いプロモーターの存在によって転写妨害が生じることもある。（ｉｉ）ＰＢＳは内部プロモーターに対してシス配置の阻害エレメントとして作用することもある。例えば、多機能細胞中で、ＰＢＳは強いリプレッサーに対する認識配列であり、更に、阻害エレメントとして作用する。（ｉｉｉ）Ｕ３配列は、−３４５と−３０６との間の直接反復配列から成る遠隔アクチベーター中に位置する負の調節要素の少なくとも１つを含む。（ｉｖ）３′ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ、末端反復配列）は細胞の隣接遺伝子を活性化し得るが、その結果はしばしば細胞に悪影響を及ぼす。（ｖ）５′ＬＴＲのプロモーターから発現されたＲＮＡはキャプシド形成シグナルを含み、その結果として、レトロウイルス粒子中に回収され得る。このＲＮＡは、表現型の細胞性ＲＮＡまたはレトロウイルスＲＮＡとの間で組換えを生じ、（生命に危険を及ぼすことも有り得る）新規な特性を獲得したレトロウイルスが回収される。ゲノム内のウイルスの複製及び挿入にはこれらのすべてのエレメントが必要であるため、これらの問題はまだ完全には解決されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のような状況下で本発明の発明者らは、宿主細胞内へのプロウイルスの組込み後に不要になったプロウイルス配列の大部分を除去し得るように設計された天然または合成のレトロエレメント配列、特にレトロウイルスヌクレオチド配列、より特定的にはこのような配列を含むレトロウイルスベクターを開発した。より詳細にはこのレトロウイルス配列は、単独ＬＴＲ配列、レトロトランスポゾンまたはＵ３、ＲもしくはＵ５領域を含む配列を、宿主細胞のゲノムに組込ませ得るレトロウイルスＤＮＡである。
【０００８】
本発明はまた、本発明のレトロエレメント配列または該配列を含むベクターによるトランスフェクション後に得られる宿主細胞、好ましくは真核細胞に関する。
【０００９】
従って本発明は、レトロエレメント配列を含むレトロウイルスが標的細胞に感染したときに標的細胞に移入され得る領域に取込まれており組換えプロウイルスに組込まれる挿入配列を含むことを特徴とするレトロエレメント配列に関する。より特定的には上記挿入配列は、シス作用する領域、より詳細には３′ＬＴＲ領域または５′ＬＴＲ領域、好ましくは、このレトロウイルス配列の３′ＬＴＲのＵ３領域または５′ＬＴＲのＵ５領域に取込まれている。この挿入配列は、宿主細胞のゲノムに組込まれ得る有益なヌクレオチド配列と、リコンビナーゼ認識配列とを含む。好ましくは、レトロウイルス配列のアセンブリが有益な配列に対して例えば上流または下流に位置する認識配列を１つだけ含むが、この位置関係は必須要因ではない。レトロウイルス配列を含むレトロウイルスが標的細胞に感染したときに標的細胞に移入される領域に認識配列が含まれているならば、有益なヌクレオチド配列は認識配列の下流に存在してもよい。本発明のレトロウイルスベクターが含む挿入配列の最大長さは通常は０．５〜１０ｋｂの範囲である。
【００１０】
より詳細には、本発明の配列はまた、その認識部位の配列を認識し得るリコンビナーゼをコードするＤＮＡ配列を含む。リコンビナーゼをコードするこのＤＮＡ配列は、ベクターの５′ＬＴＲ領域と３′ＬＴＲ領域との間に位置するのが有利である。本発明はまた、上記配列を含むレトロウイルスベクターまたは組換えレトロウイルスに関する。好ましくは、レトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスの形態で存在することができ、標的細胞に移入され得る領域に取込まれた認識配列を１つだけ含んでいる。
【発明の効果】
【００１１】
従って本発明のＤＮＡは、有益な配列がプロウイルスに組込まれた後に不要となるプロウイルス配列の挿入を伴うことなく、有益なヌクレオチド配列をレトロウイルスベクターを介して真核細胞などの宿主細胞に挿入し得る。
【００１２】
上記に使用した「有益なヌクレオチド配列」なる用語は、宿主細胞のゲノムに挿入され、特に治療またはワクチン接種のために有益な分子を宿主細胞に産生させ得る配列に関して使用されている。これらの有益な配列としては特に、本発明のレトロウイルスベクターを遺伝子治療に使用するときにはタンパク質（ホルモン、免疫グロブリン、酵素など）があり、ワクチン接種プロトコルの分野で本発明のレトロウイルスベクターを使用するときにはヒトまたはヒト以外のタンパク質（例えばウイルスタンパク質）、などをコードする遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列がある。有益なヌクレオチド配列の一部はまた、一方で宿主細胞に同種または異種の調節要素（即ち、プロモーター、アクチベーター）から構成され、他方で１つもしくは複数の遺伝子または相補的ＤＮＡの全部または一部をコードする配列から構成されている。更に、有益なヌクレオチド配列はまた、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイム配列をコードし得る。
【００１３】
本発明のレトロエレメント配列は多くの用途を有し得る。遺伝子がより発現し易い環境で真核細胞のような宿主細胞にヌクレオチド配列を挿入するという単純な目的で本発明の配列を使用してもよく、または、遺伝子治療もしくはワクチン接種のために本発明の配列を使用してもよい。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｎｏ．７，１９９５年７月、に記載されているプラスミドｐＭＥＰＶＨ／ｐＭＥＰＶＬまたはｐＭＥＰＶＨ／ｐＲＥＰＶＫのインサートに対応する配列を有益な配列として使用してもよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現産物は治療用組成物の１成分であってもよい。
【００１４】
本発明のレトロウイルスベクターは、トランス相補性ウイルス細胞系を、好ましくはプラスミドの形態を有しておりかつ好ましくはＬＴＲの１つ、特に右のＬＴＲに有益なヌクレオチド配列と認識配列とを含んでいる本発明のレトロエレメント配列によってトランスフェクションすることによって得られる。プラスミドは更に、有益な配列の上流または下流に位置する認識部位を認識し得るリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。このヌクレオチド配列は好ましくは３′ＬＴＲ領域と５′ＬＴＲ領域との間に位置している。ウイルス細胞系のトランスフェクションの終了後にレトロウイルスベクターが得られる。このレトロウイルスベクターを所望の宿主細胞に感染させ、有益なヌクレオチド配列を宿主細胞に組込ませる。
【００１５】
上記に定義のプラスミド、及び、該プラスミドによる細胞系のトランスフェクション方法も本発明の範囲に包含される。
【００１６】
本発明はまた、有益なヌクレオチド配列を真核細胞のような宿主細胞に導入する方法またはプロセスに関する。方法の特徴は、Ｕ３領域、Ｕ５領域及び／またはＲ領域のようなレトロエレメントに対応する配列を真核細胞に導入し、該配列を有益なヌクレオチド配列に結合させることである。この方法の特徴は、真核細胞に導入すべきヌクレオチド配列から成る本発明のレトロウイルス配列を含むレトロウイルスベクターを真核細胞に感染させる第一段階と、組換えられた細胞から有益な配列を発現させ次いで該配列の産生物の諸成分を発現させる第二段階とを含み、第一段階が、宿主細胞ゲノムに導入すべき配列を含むレトロウイルスベクターの単独ＬＴＲが細胞の細胞性ゲノムに組込まれるような条件下で行われることである。
【００１７】
本発明はまた、患者の複数の標的細胞のゲノムに組込まれ得る遺伝子を含むヌクレオチド配列から成る本発明のレトロウイルスベクターを有効量で投与する医学的治療方法に関する。従って、本発明のレトロウイルスベクターは遺伝子治療に使用され得る。
【００１８】
本発明はまた、レトロウイルスの単独ＬＴＲ領域を含むプロウイルス構造をそのゲノムに組込んだ細胞宿主に関する。このＬＴＲ配列は、有益なヌクレオチド配列の単一コピーを含む。より詳細には、本発明の細胞宿主は真核細胞であり、プロウイルス構造の特徴は、ＰＢＳ配列、キャプシド形成及びダイマー形成シグナル、及び／またはＰＰＴを本質的に含まないことである。
【００１９】
本発明はまた、単一のＬＴＲ配列またはその一部分と有益な配列とを含む組換え細胞宿主に関する。
【００２０】
本発明はまた、本発明のレトロエレメント配列またはレトロウイルスベクターの使用方法に関する。本発明のレトロエレメント配列またはレトロウイルスベクターは、本発明のレトロウイルスＤＮＡに含まれている有益なヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質を宿主細胞中で産生させる目的で使用されてもよく、または、有益なヌクレオチド配列を患者の標的細胞のゲノムに組込むという医学的治療目的で使用されてもよい。
【００２１】
より特定的には、本発明の配列はまた、抗体をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し得る。これを細胞外免疫感作と呼ぶ。その理由は、これらの配列から産生された抗体がこれらの配列を組込んだ細胞の内部で効果を発揮するからである。本発明のレトロウイルス配列及びレトロウイルスベクターを使用して宿主細胞に組込まれ得る抗体をコードするヌクレオチド配列の非限定例としては、ＨＩＶウイルスのエンベロープタンパク質の認識抗体、特にＨＩＶ−１ウイルス及びＨＩＶ−２ウイルスのｇｐ１２０タンパク質、並びに、逆転写酵素を阻害し得る抗体がある。このような抗体は特に、Ｍａｃｉｅｊｅｗｓｋｉらの刊行物（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  Ｎｏ．７，１９９５年７月）に記載されている。本発明のレトロウイルスベクターはこれらの有益なヌクレオチド配列をより有効に組込むことができるので、その組込みに相応して治療効果も向上する。
【００２２】
従って本発明は、ＨＩＶウイルスのタンパク質またはタンパク質のフラグメントを認識する抗体をコードする有益なヌクレオチド配列と、認識ヌクレオチド配列とを含むレトロウイルスベクターの使用に関する。これらの２つのヌクレオチド配列は、感染後にヒトリンパ球に導入され得る領域に存在する。好ましくは、これらの２つの配列は、レトロウイルスベクターの３′ＬＴＲ領域に存在する。
【００２３】
本発明はまた、有益なヌクレオチド配列によってコードされた分子を宿主細胞中で発現させる方法またはプロセスに関する。方法は以下の段階を含む：
−有益なヌクレオチド配列を含む本発明のレトロウイルスベクターを宿主細胞に感染させる段階；
−有益なヌクレオチド配列が発現し得る条件下で宿主細胞を増殖させる段階；及び、
−所望の分子を回収する段階。
【００２４】
本発明のレトロウイルスヌクレオチド配列及びレトロウイルスベクターは、所望の有益なヌクレオチド配列の組込みが可能になるような複数の方法で使用され得る。実際、発明者らは、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列がベクターの構成要素であるときに組込み効率が高いが、リコンビナーゼの発現をレトロウイルスベクターに直接関連させる必要がないことを証明した。
【００２５】
本発明の第一の実施態様においては、有益なヌクレオチド配列と有益な配列の下流または上流に位置する認識配列とから成りレトロウイルスベクターの３′ＬＴＲ領域または５′ＬＴＲ領域に存在する第一ヌクレオチド配列と、第一ヌクレオチド配列に等しい配列でありベクターの５′ＬＴＲ領域に挿入された第二ヌクレオチド配列とを含むレトロウイルスベクターを感染によって宿主細胞のゲノムに挿入する。認識配列を認識し得るリコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドもトランスフェクションによって細胞に導入する。トランスフェクションによって導入されたリコンビナーゼの発現がプロウイルスの構造を形質転換させ、２つのＬＴＲをもつプロウイルスが単独ＬＴＲをもつプロウイルスになる。この種の反応では、修飾されたプロウイルスを含む安定な形質転換体の割合は約５０％である。この程度の結果しか得られない理由は、トランスフェクション後に、リコンビナーゼをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドが一過的に発現し、組込まれることなく組換えられたためであると説明できる。
【００２６】
本発明の第二の実施態様では、有益な配列とこの有益な配列の下流または上流に位置する認識配列とを含むヌクレオチド配列から成るレトロウイルス配列を使用する。完全配列をレトロウイルスの３′ＬＴＲ領域に挿入する。このようにして得られたレトロウイルスベクターを次に、認識配列を認識し得るリコンビナーゼを構成的に発現するかまたは誘導によって発現する細胞系に感染させる。このような系は、特にリコンビナーゼをコードする遺伝子がレトロウイルス感染直後から発現されるときには、高い効率を示す。
【００２７】
本発明の第三の実施態様では、レトロウイルスベクターがその３′ＬＴＲ領域に挿入されたヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、有益な配列とリコンビナーゼによって認識され得る認識配列とを含む。認識配列は、有益な配列の下流または上流に位置する。更に、リコンビナーゼをコードする遺伝子とプロモーターとが、レトロウイルスベクターの２つのＬＴＲの間でこのレトロウイルスベクターに挿入されている。次に、このレトロウイルスを細胞に感染させる。このようなレトロウイルスベクターは、単独のＬＴＲを有するプロウイルスだけを産生する。組込み後に分析した全部のイベントがこの構造を有しているので、この系の効率は高い。このようなレトロウイルスベクターの主な利点は、２つのＬＴＲの間で惹起し易い組換えイベントと、リコンビナーゼをコードする遺伝子の欠失とを結び付けたことである。従って、感染細胞はリコンビナーゼを一過的に発現するだけである。
【００２８】
本発明の好ましい実施態様の１つにおいて、発明者らは、バクテリオファージＰ１の部位特異的リコンビナーゼ系Ｃｒｅｌｏｘを使用した。認識部位ＬｏｘＰをΔＥｎｈ型のベクターの有益なヌクレオチド配列の上流の３′ＬＴＲに挿入し、リコンビナーゼｃｒｅをコードする遺伝子を２つのＬＴＲの間に挿入した。産生細胞系において、タンパク質Ｃｒｅはプロウイルスプラスミドの構築によって発現される。しかしながら、プラスミドは標的ｌｏｘＰを１つしか含まないので、タンパク質Ｃｒｅによって組換えられない。感染後、ｌｏｘＰ部位は３′ＬＴＲから５′ＬＴＲに複写される。Ｃｒｅは２つの直接反復部位ｌｏｘＰの組換えを生じさせ、その結果、ＰＢＳ、キャプシド形成及びダイマー形成シグナル及びＰＰＴも含めて、２つのｌｏｘＰの間に含まれているすべての配列が欠失する。結局、リポーター遺伝子を含む単独ＬＴＲだけが細胞のゲノムに組込まれた状態で残る。ｃｒｅ遺伝子も組換えによって消失する。
【００２９】
上述したすべての好ましい実施態様において、一般にはレトロウイルスに外来の配列である有益なヌクレオチド配列は、レトロウイルス配列の３′ＬＴＲのＵ３領域に導入されるのが有利である。実際、３′ＬＴＲのＵ３領域に配列を導入する可能性、完全転写ユニットさえも導入できるという可能性に関しては極めて十分な情報が提供されている。しかしながら、レトロウイルスベクターの３′ＬＴＲのＵ３領域以外の領域に有益な配列を導入することを計画してもよい。その例としては、５′ＬＴＲのＵ５領域がある。更に、認識部位は有益なヌクレオチド配列の直ぐ下流または上流に位置することが好ましいが、この配列が３２ｎｔと４．５Ｋｂと間の範囲のかなりの遠距離に配置されてもよく、この場合にも標的細胞への有益な配列の最終的な組込みに対する影響は生じない。
【００３０】
ウイルスＤＮＡのＵ３領域に導入される外来遺伝子産物の量は多い量でもよく、いくつかの場合には４ｋｂｐを上回る量でもよい。これらの配列はまた独立プロモーターを有する完全転写ユニットに対応してもよく、このことはこれらのベクターの多様性を証明する。
【００３１】
本発明のレトロウイルスベクターの３′ＬＴＲにはかなりの量の外来遺伝子産物を導入できるので、これらのレトロウイルスベクターから、細胞、より特定的には真核細胞に遺伝子配列を挿入するための極めて優れた系を作製し得る。従って、複数の基準真核細胞を形質転換させることが可能である。本発明の状況下で使用され得る真核細胞としては特に、ＮＩＨ３Ｔ３、ＢＲＬ、ＨＭ１、Ｄ３、ＰＬＬ４、ＬＴなどの基準細胞株がある。
【００３２】
本発明の特定実施態様は、レトロウイルスベクターの３′ＬＴＲ領域にマーカーをコードするヌクレオチド配列が挿入されるように設計されている。このマーカーの存在は新規な産生物の挿入を証明するために役立つ。
【００３３】
使用可能なマーカーの非限定例としては、以下のマーカー、即ち、ＬａｃＺ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＤ９、ＰＡＬ（アルカリ性ホスファターゼ）及びＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を例示し得る。
【００３４】
リコンビナーゼ系Ｃｒｅｌｏｘは本発明のレトロウイルスベクターに極めて好適な系を構成しているが、別のリコンビナーゼ系も使用できる。使用可能なリコンビナーゼ系の非限定例としては以下の系、即ち、酵母ＦＬＰ系（いわゆる“Ｆｌｌｐ”）及び細菌Ｒ系を例示し得る。
【００３５】
従って本発明のレトロウイルスベクターは、宿主細胞にＤＮＡを有効に移入する手段を提供する。プロウイルスの組込みは正確であり、染色体の再構成は生じない。重複ベクターの構想は、５′ＬＴＲの内部の遺伝子をレトロウイルス転写ユニットの外部に転位させることによって遺伝子の発現が向上するという理論から生まれたものである。
【００３６】
キャプシド形成シグナルの存在は、レトロウイルスと内在性プロウイルスとの間の配列組換えによる複製にコンピテントなウイルスを発生させることがあり、ＰＰＴ及び他のシス作用エレメントの存在は転位を生じさせることがあり、ＰＢＳ配列の存在は、トランスジーンの発現に負の効果を与えることがあり得るが、本発明のレトロウイルスベクターを使用した場合にはこれらのウイルス配列がすべて欠失しているので上記のようなイベントはいずれも極めて発生し難い。
【００３７】
ｓＬＴＲ（単独ＬＴＲ）系は一般的なレトロエレメントの構築に導入された新規な構想である。例えばヒトのＨＩＶ、ＨＴＬＶウイルスまたはヤギのＣＡＥＶウイルスのように、粒子が有利な宿主スペクトルを有している多数のレトロウイルスが存在しているが、これらをベクターとするためには、ビリオンを正確に組立ててビリオンを感染性にすることができるシス作用性またはトランス作用性のいくつかの配列が存在する必要があり、これらの配列は上記に引用した配列とは異なった配列である。組込み終了後にシス作用性またはトランス作用性の調節要素は、翻訳された遺伝子には不要になるが、細胞に対しては病原性効果を有しており、野生型ウイルスが再出現する確率が有意に増加する。この種のレトロウイルスは上記のような配列を必要とするので、ベクターとして実用可能ではなかった。本発明のｓＬＴＲ系をこれらのレトロウイルスに応用することによって、これらのレトロウイルスがより高い安全度及びより高い転写信頼度をもつ遺伝子の形質導入用ベクターとして有効になり得る。
【００３８】
添付図面を参照した非限定実施例に関する以下の記載より本発明がより明らかに理解されよう。
【００３９】
図１Ａは、プラスミドｐＭｌｏｘＰＬの構造を表す。
【００４０】
図１Ｂは、レトロウイルスＭｌｏｘＰＬの感染によって生じたプロウイルスＭｌｏｘＰＬの構造を表す。
【００４１】
図１Ｃは、ＬＴＲの内部の２つのｌｏｘＰ部位を利用してｃｒｅによって誘発された組換え後のプロウイルスを表す。
【００４２】
図１Ｄは、ＭｌｏｘＰＬに感染した繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析を表す。
【００４３】
図１Ｅは、プラスミドｐＭＣ１−ＣｒｅによってトランスフェクトされたクローンＮＩＨ３Ｔ３  ＭｌｏｘＰＬ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析を表す。
【００４４】
図２Ａは、レトロウイルスＭｌｏｘＰＬの感染及びＬＴＲの内部の２つのｌｏｘＰ部位を利用してＣｒｅによって誘発された組換え後に得られたプロウイルスＭｌｏｘＰＬの分子の構造及び分析を表す。
【００４５】
図２Ｂは、制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ消化によってＭｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３  Ｃｒｅ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【００４６】
図２Ｃは、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ消化によってＭｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３  Ｃｒｅ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【００４７】
図３Ａは、プラスミドｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬの構造を表す。
【００４８】
図３Ｂは、本発明のレトロウイルスベクターのいくつかの好ましい実施態様の３′ｓＬＴＲの概略図を表す。
【００４９】
図３Ｃは、制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【００５０】
図３Ｄは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【００５１】
図３Ｅは、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【００５２】
図４は、レトロウイルスベクターＭｃｒｅｌｏｘＰＬによるｓＬＴＲの作製メカニズムを示す概略図である。
【００５３】
（実施例）
命名法
種々のベクター及び種々の細胞は以下の法則に従って命名した。ｐはプラスミドベクターを表す（例えばｐＭｌｏｘＰＬ）；ψ２（１９９３年３月１０日にＥＣＡＣに番号９３０３１００２で寄託）の付いた名称はこのベクターによってトランスフェクトした補助野生型ウイルスψ２の細胞系を表す（例えばψ２−
ＭｌｏｘＰＬ）；ｐの付かない名称は補助野生型ウイルスの細胞によって産生されたウイルスを表す（例えばＭｌｏｘＰＬ）；細胞系の名称とウイルスの名称との連記は、感染によって生じたプロウイルスを含む細胞系を表す（例えばＮＩＨ３Ｔ３ＭｌｏｘＰＬ）。
【００５４】
細胞の培養及び選択
樹立細胞系ＮＩＨ３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）及びψ２（マウスの異種指向性レトロウイルスのキャプシド形成細胞系）は参考文献（７）及び（１３）に記載されている。これらの細胞系を、５％のウシ胎仔血清を加えた高濃度（４．５ｇ／リットル）のグルコースを含むＤＭＥＭ（ダルベッコ改質イーグル培地）で培養する。１２％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中で細胞を３７℃でインキュベートする。Ｇ４１８を６００ｍｇ／ｍｌの濃度で適当な培地に加える。個々のコロニーをピペットで採集し異なる培養容器に単離することによってＧ４１８耐性コロニーをクローニングした。感染４８時間後に限界希釈法によって感染細胞のクローニングを行う。
【００５５】
細胞のトランスフェクション、感染、染色、及び、“サザンブロット”による核酸の分析
参考文献（１２）に記載の手順でリン酸カルシウム分画を調製した。ウイルスを含む上清を使用し、参考文献（３７）に記載の手順によって５マイクログラム／ｍｌのポリブレンの存在下でＮＩＨ３Ｔ３細胞にウイルスを感染させた。“サザンブロット”によるハイブリダイゼーションは参考文献（６）の方法で準備した。参考文献（３８）に記載の手順でＸ−ｇａｌ染色によってβ−ガラクトシダーゼ活性を証明した。
【００５６】
ＰＣＲによるＬａｃＺの検出
４０マイクロリットルの反応液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９）、１５０マイクログラム／ｍｌのウシ血清アルブミン、１６ｍＭの（ＮＨ４）２ＯＳ４、７ｍＭのＭｇＣｌ２、各２５０マイクロモルのｄＮＴＰ、１．２５単位のＴａｑ  ＤＮＡｐｏｌ（ＵＳＢ）、０．０７８単位のＶｅｎｔ（ｅｘｏ＋）ＤＮＡｐｏｌ（ＮｅＥ．Ｂｉｏｌａｂｓ））中で１マイクログラムの細胞性ゲノムＤＮＡのＰＣＲを実施する。プライマーを０．２５マイクロモルの最終濃度で加えた（２０量体に対して）。反応を開始させる前にＰＣＲの反応液を８０℃で５分間加熱した。ＬａｃＺの検出にはプライマーとして、
５′−ＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＴＡＡＴＡＡＧＣＧＴＴＧＧＣＡＡＴ−３′、及び、
５′−ＧＡＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴＡＧＣＧＡＣ−３′
を用い、内部対照となるマウスの内在性ＲＡＰ−ＳＹＮの検出にはプライマーとして、
５′−ＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＧＣＴＴＣＣＡＡＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＣ−３′、及び、
５′−ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＴＴＧＣＴＧＣＧＣＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧ−３′を用いて、３５サイクル（９４℃，５５分；５９℃，３０秒；７０℃，３分３０秒）のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応生成物をゲル電気泳動によって分析した。
【実施例１】
【００５７】
レトロウイルスベクターｐＭｌｏｘＰＬの構築及び細胞系のトランスフェクション
（ａ）ベクターｐＭｌｏｘＰＬの構築
ｐＭｌｏｘＰＬは、プラスミドｐＧ−ＭＰＬ（Ｃｈｏｕｌｉｋａら，１９９５、に記載）に由来し、このプラスミド中の認識部位ｌｏｘＰが、Ｉ−ＳｃｅＩ部位の代わりに、結合アダプター（５′−ＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＣＡＴＡＣＡＴＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴＣ−３′及び５′−ＣＡＴＧＧＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＧＴＴＡＴＡＴＧ−３′）のＮｃｏＩ部位の内部に挿入されている。ｌｏｘＰ部位の配列をＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００５８】
使用したレトロウイルスを図１ａに示す。（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の欠失した）欠損モロニーマウス白血病プロウイルスを出発材料とし、遠隔アクチベーター配列に置換して右側ＬＴＲのＵ３領域にＰｈｌｅｏＬａｃＺをコードする配列を挿入することによって、ｐＭｌｏｘＰＬを構築する。遺伝子ＰｈｌｅｏＬａｃＺに由来の５′は、ＭｏＭｕＬＶのｅｎｖ遺伝子のスプライス受容部位とバクテリオファージＰ１に由来の３２ｂｐの長さのｌｏｘＰ部位との間に配置されていた。感染細胞中では、この型のウイルスは、隣接する細胞性プロモーターのトラッピングによって活性化される遺伝子を含むＬＴＲを有している。
（ｂ）プラスミドｐＭｌｏｘＰＬによる細胞系のトランスフェクション
キャプシド形成機能の欠損した異種指向性補助野生型ウイルスを発現する補助野生型ウイルスの細胞系ψ２にプラスミドｐＭｌｏｘＰＬを選択プラスミドｐＵＳＶｎｅｏと共にトランスフェクトすることによって、ウイルスを産生する細胞系を作製した。Ｇ４１８（ネオマイシン）で選択した後でβ−ガラクトシダーゼ活性に基づいて選択した個々のクローンのウイルス力価を測定した。ウイルス力価の測定は、感染直後のＮＩＨ３Ｔ３細胞を限界希釈法によってクローニングし、ＬａｃＺを含むプロウイルスの存在をＰＣＲで検出することによって行った。ＮＩＨ３Ｔ３細胞系においてψ２−ＭｌｏｘＰＬ．１及びψ２−ＭｌｏｘＰＬ．２を産生する細胞系は、夫々２．５×１０４及び５×１０４（表１）の力価を示した。ウイルス上清１ｍｌあたりの青色コロニー形成単位（ＢＣＦＵ／ｍｌ）で表されるψ２−ＭｌｏｘＰＬ．１及びψ２−ＭｌｏｘＰＬ．２の力価は夫々３及び６であり、これは１０４の組込みあたり約１つの青色コロニーという比に対応する。前述したように、これらのプロウイルスはプロモータートラップとして機能し、１０４あたり１つの組込みだけが繊維芽細胞系ＮＩＨ３Ｔ３中でリポーター遺伝子を発現する。
【００５９】
組込み後のプロウイルスＭｌｏｘＰＬのＤＮＡの構造を図１ｂに概略的に示す。本明細書の図面には、ＬＴＲの位置と制限部位ＢｃｌＩとフラグメントのサイズとを示す。ｘは左アームの任意のサイズのＢｄＩフラグメントを示し、ｙは右アームの任意のサイズのＢｃｌＩフラグメントを示す。Ｐは３２Ｐで放射性標識したプローブＬａｃＺを示す。これらの構造を次に、独立の６つのＮＩＨ３Ｔ３クローンの“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによって分析する。この分析の結果を図１ｄに示す。全部のクローンがプロウイルスを含み、プロウイルスの３′ＬＴＲのＵ３領域の内部の配列が５′ＬＴＲに重複している。エンドヌクレアーゼＢｃｌＩで消化すると、ＰｈｌｅｏＬａｃＺを含む２つのＬＴＲをもつプロウイルスから所望のフラグメントが生じる（制限酵素ＢｃｌＩはＬＴＲの各ＬａｃＺ配列中に認識部位を有している）。ＬａｃＺをプローブとして用いた“サザンブロット”ハイブリダイゼーションは、Ｕ３領域の正確な重複を証明する６ｋｂｐの開裂フラグメントを示す。一定でないサイズの追加の２つのバンドは、プロウイルスのＢｃｌＩ部位から隣接する細胞性ＤＮＡまで伸びるフラグメントを表す。追加の２つのバンドは、１クローンあたり１つのプロウイルス組込みがあることを証明し、これらのバンドのサイズが一定でないことは、各細胞系が独立クローンであったことを確認する。
【実施例２】
【００６０】
細胞系とプラスミドｐＭｏｌｘＰＬ及びｐＭＣｌ−Ｃｒｅとのコトランスフェクション
ＬＴＲに介在されたｌｏｘＰの重複がリコンビナーゼＣｒｅによって組換えられるか否かを試験した。タンパク質Ｃｒｅによる組換えの標的としてクローン細胞系ＮＩＨ３Ｔ３ＭｌｏｘＰＬ．１を使用した。この細胞系に発現ベクターｐＭＣ１−Ｃｒｅを選択ベクターｐＵＳＶｎｅｏと共にコトランスフェクトした。Ｃｒｅによって誘発された組換え後のプロウイルスの構造を図１ｃに示す。
【００６１】
２４のネオマイシン耐性クローンのＤＮＡを“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによって分析した。ＢｃｌＩ消化物を分析することによって組換え型のプロウイルスの検出を行った。クローンの制限されたＤＮＡを３２Ｐで放射性標識したＬａｃＺによってプローブした。この分析の結果を図１ｅに示す。プロウイルスの親構造は、ＬａｃＺを含むＵ３配列の正確な重複に対応する６ｋｂｐのバンドと夫々８ｋｂｐ及び２ｋｂｐの追加の２つのバンド（前述）とを示す（図１ｂ及びｄ）。ネオマイシン耐性クローンのＤＮＡの分析は、２４個のうちの５個のクローンで、６．０ｋｂｐのバンドが除去されていたことを示す（図１ｅ）。プロウイルスに隣接する細胞性ＤＮＡに対応する８ｋｂｐ及び２ｋｂｐのバンドは残存しており、これは、プロウイルス組込み部位が再構成されていなかったことを示す。この結果は、プロウイルスＭｏｌｘＰＬを含む細胞中のｃｒｅ遺伝子の発現はＬＴＲに含まれた２つのｌｏｘＰ部位の組換えを生じさせ易いことを示唆する。
【００６２】
Ｃｒｅｌｏｘに介在される組換えの効率を試験するために、更に、Ｇ４１８耐性の２５のクローンのＤＮＡを“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによって分析し、ｃｒｅ配列の存在を試験した。ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩによって消化し、３２Ｐで放射性標識した全長ｃｒｅＤＮＡによってプローブした。この分析の結果を図１ｅに示す。ｌｏｘＰで組換えられた５つのクローンのうちの３つのクローンが１．９ｋｂｐのｃｒｅプローブとハイブリダイズするバンドを示し、これは、ｐＭＣ１−Ｃｒｅの全長ｃｒｅ発現ユニットが存在することを示唆する。ｌｏｘＰで組換えられた５つのクローンのうちの１つはｃｒｅプローブとハイブリダイズするバンドを示さなかった。ｌｏｘＰで組換えられた１つのクローンがプラスミドｐＭＣ１−Ｃｒｅの再構成の結果として生じる５ｋｂｐのバンドを示す。ｃｒｅとハイブリダイズする１．９ｋｂｐのバンドを示す残りの４つのクローンは、組込み型のプロウイルスＭｌｏｘＰＬ中に組換えを有していない。残りの１６のクローン中にｃｒｅＤＮＡの存在は検出されなかった。この結果は、安定なトランスフェクト細胞系中ではプラスミドｐＭＣ１−Ｃｒｅの存在によって誘発される組換えが完全な効率で生じないこと、組換えが生じたのはｌｏｘＰ部位の５０％に過ぎないことを示している。この結果はまた、２つのｌｏｘＰ部位の間の組換えがｐＭＣ１−Ｃｒｅの一過的な発現によって得られることを示唆する（表２）。
【実施例３】
【００６３】
Ｃｒｅ酵素を発現する細胞に対するＭｌｏｘＰＬの感染
プラスミドｐＭＣ１−ＣｒｅとプラスミドｐＵＳＶｎｅｏとのコトランスフェクションによってプラスミドｐＭＣ１−Ｃｒｅを含むＮＩＨ３Ｔ３細胞系を作製した。Ｇ４１８を含む培地中でクローンを選択し、それらのＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩで消化した後、“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによって分析した。３２Ｐで放射性標識した全長ｃｒｅＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによってＣｒｅ遺伝子の存在を検出した。分析したＧ４１８耐性の１２のクローンのうちの１０のクローンが種々のコピー数（約１〜１０コピー）のＣｒｅ配列の存在を示した（データ示さず）。
【００６４】
発明者らは相補的分析の目的で約１０コピーのプラスミドｐＭＣ１−Ｃｒｅを含むクローンＮＩＨ３Ｔ３Ｃｒｅ．１を選択した。クローンＮＩＨ３Ｔ３Ｃｒｅ．１をＭｌｏｘＰＬウイルスに感染させた。クローンを限界希釈法で単離した。
【００６５】
レトロウイルスＭｌｏｘＰＬの感染及びＣｒｅによって誘発された組換えによって生じたプロウイルスの構造を図２ａに示す。組込み型のベクターは単独ＬＴＲ（ｓＬＴＲ）構造を有している。組込み型のプロウイルスでは、１つのＬＴＲが欠失し、また、２つのＬＴＲ間に存在していた全部の配列が欠失している（図２ａ及びｃ参照）。
【００６６】
プロウイルス構造中に重複ＬＴＲが存在するか否かを検出するために、プロウイルスＭｌｏｘＰＬの細胞性ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩで消化した後、“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによってプロウイルスＭｌｏｘＰＬのＤＮＡの構造を分析した。図２ｂに示すように、ＮＩＨ３Ｔ３Ｃｒｅ．１をＭｌｏｘＰＬに感染させることによって得られた１２のクローンの分析は、重複の指標となる６ｋｂｐのバンドはどのクローンにも存在していないことを示した。
【００６７】
プロウイルス中に５′ＬＴＲが存在しないことを証明するために、ＤＮＡをＥｃｏＲＶによって制限した。エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶによって制限したＮＩＨ３Ｔ３Ｃｒｅ．１．ＭｌｏｘＰＬのＤＮＡの“サザンブロット”ハイブリダイゼーションを放射性標識プローブＬａｃＺを用いて実施すると（図２ａ及びＣ）、２．１ｋｂｐのバンドと任意のサイズのバンドとの存在が観察される。３．９ｋｂｐのバンドが存在しないことは、５′ＬＴＲが存在しないことを示す。
【実施例４】
【００６８】
レトロウイルスベクターｐＭｃｒｅｌｏｘＰＬの構築及び細胞系のトランスフェクション
（ａ）プラスミドｐＭｃｒｅｌｏｘＰＬの構築
この実施例で使用したレトロウイルスの構造を図３ａに示す。ｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬは、ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原に核局在的に融合した１．３ｋｂｐのｃｒｅ遺伝子を、プラスミドｐＭｌｏｘＰＬの２つのＬＴＲの間に挿入することによって得られた。ｃｒｅ遺伝子は、ｐＭｌｏｘＰＬのＰｓｔＩ部位の処の結合アダプターによる突然変異ポリオーマウイルスＰＹＦ４４１の遠隔アクチベーターの重複によって隣接した単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）の遺伝子のプロモーターの転写コントロール下にある。配列Ｃｒｅはウイルスゲノムと同じ配向である。プラスミドｐＭｃｒｅｌｏｘＰＬは
１９９５年６月１３日付けでＣＮＣＭに番号１−１５９９で寄託された。
【００６９】
（ｂ）プラスミドｐＭｃｒｅｌｏｘＰＬによる細胞系のトランスフェクション
キャプシド形成細胞系ψ２中でプラスミドｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬを選択プラスミドｐＵＳＶｎｅｏとコトランスフェクトすることによって、ウイルスを産生する細胞系を作製した。トランスフェクトされた細胞ψ２をＧ４１８を含む培地中で選択した後、ＬａｃＺを発現するレトロウイルスの産生に基づいて個々のクローンを選択した。１つのクローンが感染性ウイルスを産生した。このクローンをψ２−ＭＣｒｅｌｏｘＰＬ．１と命名した。ψ２−ＭＣｒｅｌｏｘＰＬ．１中では、プラスミドｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬが宿主細胞ゲノムに単一コピーとして組込まれていた（データ示さず）。ψ２−ＭＣｒｅｌｏｘＰＬ．１を産生する細胞系は、１ミリリットルあたり１×１０４の感染性ウイルスを産生する。ＬａｃＺ遺伝子の存在はＰＣＲによって検出される（表１）。ψ２−ＭＣｒｅｌｏｘＰＬ．１のウイルス上清１ミリリットルあたりで測定した青色コロニー形成単位（ＢＣＦＵ／ｍｌ）の力価は３ＢＣＦＵ／ｍｌであり、これは予想した通り、ＰＣＲで測定した力価の約１／１０４の減少に相当する。ψ２−ＭＣｒｅｌｏｘＰＬの産生効率はψ２−ＭｌｏｘＰＬの産生効率に比べて低下していたが、複数のコトランスフェクション実験後に産生性クローンが１つだけ回収された。このクローンはウイルスプラスミド構築物の単一コピーを組込んでいた。この結果から、プラスミドの２つ以上のコピーを組込んだ細胞は、組込み型トランスジーンを修飾するリコンビナーゼ活性が存在するので回収されることができないという結論が得られた。
【００７０】
（ｃ）ＭＣｒｅｌｏｘＰＬのプロウイルス構造
ＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞の単離は、細胞あたり０．５の多重度でウイルス粒子を感染させた後、限界希釈法で実施した。レトロウイルスｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬの感染によって生じたプロウイルスの構造を図３ｂに示す。この図において、αは左アームの任意のサイズのフラグメントを示す。
【００７１】
組込み型のプロウイルスのＤＮＡの構造を、独立の６つのクローンＮＩＨ３Ｔ３ＭＣｒｅｌｏｘＰＬ中の“サザンブロット”ハイブリダイゼーションによって分析した。エンドヌクレアーゼＢｃｌＩによって制限し放射性標識ＬａｃＺプローブによって検出したプロウイルスＤＮＡの“サザンブロット”分析によって、異なるサイズの２つのフラグメントが生じたが、これらのクローンは７．５ｋｂｐの追加のバンドを生じていなかった（図３ｃ）。この７．５ｋｂｐの追加フラグメントが存在しないことは、ＰｈｌｅｏＬａｃＺを含む単独ＬＴＲの存在を証明する。プロウイルス構造が単独ＬＴＲに対応することを更に確認するために、付加的な分析を試みた。プロウイルス中に５′ＬＴＲが存在しないことを最終的に証明するために、細胞性ＤＮＡをＥｃｏＲＶによって制限した。エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶによって制限したＮＩＨ３Ｔ３ＭＣｒｅｌｏｘＰＬのＤＮＡの“サザンブロット”ハイブリダイゼーションを放射性標識ＬａｃＺプローブを用いて実施すると（図３ｄ）、２．１ｋｂｐのバンドと任意のサイズのバンドとの存在が判明する。６ｋｂｐのバンドが存在しないことは、５′ＬＴＲが存在しないことを示す。次にこの“ブロット”を、放射性標識したｃｒｅプローブとハイブリダイズさせた。ＮＩＨ３Ｔ３ＭＣｒｅｌｏｘＰＬのＤＮＡ中にバンドが存在しないことは、プロウイルスＤＮＡがｃｒｅ遺伝子を含まないことを示す（図３ｄ）。最後に、残りのＬＴＲの構造が再構成されなかったことを確認するために、ＮＩＨ３Ｔ３ＭＣｒｅｌｏｘＰＬのＤＮＡをエンドヌクレアーゼＫｐｎＩによって制限し、放射性標識したＬａｃＺのＤＮＡでプローブした。どの場合にも４．３ｋｂｐのフラグメントが観察され、これは、ＬＴＲ  ＰｈｌｅｏＬａｃＺが予想されたサイズであったことを示す（図３ｅ）。結局、単離されたどのクローンも、再構成されていない単独ＬＴＲをもつ組込み型のプロウイルスを含んでいた。
【００７２】
【表１】
2008086321.tif 000002
ａψ２細胞に、ｐＭｌｏｘＰＬ＋ｐＵＳＶｎｅｏまたはｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬ＋ｐＵＳＶｎｅｏを夫々トランスフェクトした。Ｇ４１８を含む培地中でＧ４１８耐性クローンを選択した。８ｍｌの培地をＧ４１８耐性の各クローンの５×１０６の細胞と共にインキュベートすることによってウイルス原液を調製し、５×１０４のＮＩＨ３Ｔ３細胞に種々の希釈度のウイルスを８時間作用させ、次いで限界希釈法でクローニングするかまたはＸ−ｇａｌ染色によってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
ｂ力価は、クローニング後に単離しＰＣＲで検出した感染クローン（ＩＰ：感染性粒子）と非感染クローンとの比によって算出した（（ＰＣＲ＋／ＰＣＲ−）／１×１０５）。
ｃＢＣＦＵは“青色コロニー形成単位（ｂｌｕｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）の頭字語である。ＢＣＦＵはＸ−ｇａｌ染色によって検出されるＰｈｌｅｏＬａｃＺ遺伝子を活性化する遺伝子をトラップできた感染の数を表す。
ｄ比は感染クローンあたりのＢＣＦＵ数である。
【００７３】
【表２】
2008086321.tif 000003
ａｐＭＣ１−Ｃｒｅ及びｐＵＳＶｎｅｏとコトランスフェクトしたクローンＮＩＨ３Ｔ３ＭｌｏｘＰＬ．１に由来のＧ４１８耐性クローン。
ｂ配列ｐＭＣ１−Ｃｒｅの存在の指標。
（＋）は３２Ｐで放射性標識したｃｒｅプローブで検出されたｐＭＣ１−Ｃｒｅに由来の正確に１．９ｋｂｐのＸｈｏＩフラグメントの存在を示す。
（＊）は３２Ｐで放射性標識したｃｒｅプローブとハイブリダイズするが不正確なサイズのＸｈｏＩフラグメントの存在を示す。
（−）はプラスミドｐＭＣ１−Ｃｒｅが存在しないことを示す。
ｃＣｒｅを用いたｌｏｘＰ組換えの“サザンブロット”分析によって検出された結果。
【００７４】
参考文献目録
１．Ｂａｒｋｅｒ，Ｄ．Ｄ．，Ｈ．Ｗｕ，Ｓ．Ｈａｒｔｕｎｇ，Ｍ．Ｂｒｅｉｎｄｌ  ＆  Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，１９９１，レトロウイルス誘発性挿入型突然変異誘発：Ｍｏｖ１３マウス中のコラーゲン突然変異のメカニズム（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ   ｃｏｌｌａｇｅｎ
ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｖ１３  ｍｉｃｅ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５１５４−５１６３；
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４．Ｃｈｏｕｌｉｋａ，Ａ．，Ａ．Ｐｅｒｒｉｎ，Ｂ．Ｄｕｊｏｎ  ＆  Ｊ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａｓ，１９９５，パン酵母のＩ−ＳｃｅＩ系の使用による哺乳類染色体中の相同的組換えの誘発（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉ−ＳｃｅＩ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），  Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９６８−１９７３；
５．Ｃｈｕ，Ｔ．Ｈ．Ｔ．＆  Ｒ．Ｄｏｒｎｂｕｒｇ，１９９５，抗体の抗原結合部位を提示するレトロウイルスベクター粒子は細胞型特異的遺伝子導入を可能にする（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎａｂｌｅ  ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２６５９−２６６３；
６．Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．＆  Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８４，ゲノム配列決定（Ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１９９１−１９９５；
７．Ｅｙｃｈｅｎｅ，Ａ．，Ｃ．Ｂｅｃｈａｄｅ，Ｍ．Ｍａｒｘ．Ｄ．Ｌａｕｇｉｅｒ，Ｐ．Ｄｅｚｅｌｅｅ  ＆  Ｇ．Ｃａｌｏｔｈｙ，１９９０，ニワトリの視神経網膜細胞内の１型ラウス関連ウイルスの継代中に発生するｃ−ｍｉｌ形質導入レトロウイルスの分子的及び生物学的特性（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃ−ｍｉｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐａｓｓａｇｅ  ｏｆ  Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｎｅｒｏｒｅｔｉｎａ  ｃｅｌｌｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２３１−８；
８．Ｆｅｌｄｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ａ．Ｅｙｃｈｅｎｅ，Ｊ．Ｖ．Ｂａｒｎｉｅｒ，Ｉ．Ｃａｌｏｇｅｒａｋｉ，Ｇ．Ｃａｌｏｔｈｙ  ＆  Ｍ．Ｍａｒｘ，１９９１，１型ラウス関連ウイルスに感染したニワトリ視神経網膜細胞内のレトロウイルスの活性化並びにｃ−ｍｉｌ及びｃ−Ｒｍｉｌの形質導入に関する共通メカニズム（Ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ−ｍｉｌ  ａｎｄ  ｃ−Ｒｍｉｌ  ｉｎ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｎｅｕｒｏｒｅｔｉｎａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３６３３−４０；
９．Ｆｅｕｅｒ，Ｇ．，Ｍ．Ｔａｋｅｔｏ，Ｒ．Ｃ．Ｈａｎｅｃａｋ  ＆  Ｈ．Ｆａｎ，１９８９，一過的な発現アッセイによって測定した未分化のＦ９胚性癌腫細胞中のモロニーマウス白血病ウイルス発現の２ブロック（Ｔｗｏ  ｂｌｏｃｋｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｆ９  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３−２３１７−２３２４；
１０．Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｋ．Ｇ．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｄ．Ｌ．Ｅｎｎｉｓｔ，Ｓ．Ｌ．Ｇｌｅａｓｏｎ，Ｐ．Ｈ．Ｄｒｉｇｇｅｒｓ，Ｂ．Ｚ．Ｌｅｖｉ，Ｅ．Ａｐｐｅｌｌａ  ＆  Ｋ．Ｏｚａｔｏ，１９９２，モロニーマウス白血病ウイルスの上流保存領域に結合する負の転写因子のクローニング（Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ＢＩｏｌ１２：３８−４４；
１１．Ｇａｍａ  Ｓｏｓａ，Ｍ．Ａ．，Ｄ．Ｈ．Ｒｏｓａｓ，Ｒ．ＤｅＧａｓｐｅｒｉ，Ｅ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｍ．Ｒ．Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｒｕｐｒｅｃｈｔ，１９９４，ネズミのプロウイルスゲノム中の３′ＬＴＲによる５′ＬＴＲ（末端反復配列）の負の調節（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５′  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ（ＬＴＲ）  ｂｙ  ｔｈｅ  ３′ＬＴＲ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｏｍｅ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．６８：２６６２−２６７０；
１２．Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｉ．＆  Ａ．Ｊ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３，ヒトの５型アデノウイルスのＤＮＡの感染力の新規なアッセイ方法（Ａ  ｎｅｗ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ５  ＤＮＡ），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６−４６７；
１３．Ｇｕ，Ｈ．，Ｙ．Ｒ．Ｚｏｕ  ＆  Ｋ．Ｒａｊｅｗｓｋｙ，１９９３，Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ媒介性遺伝子ターゲティングによって証明された個々のスイッチ領域における免疫グロブリンスイッチ組換えの独立コントロール（Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｔ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｓｗｉｔｃｈ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｅｖｉｄｅｎｃｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ），Ｃｅｌｌ，７３：１１５５−１１６４；
１４．Ｈａｎｌｅｙ，Ｔ．＆  Ｊ．Ｐ．Ｍｅｒｌｉｅ，１９９１，ポリメラーゼ連鎖反応による未精製マウステールＤＮＡ中のトランスジーンの検出（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｎｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｔａｉｌ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｃｓ  １０：５６；
１５．Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐ．Ａ．，Ｂ．Ａ．Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ，Ｇ．Ｕｎｇｅｒｓ  ＆  Ｅ．Ｇｉｌｂｏａ，１９８９，レトロウイルスベクターの転写ユニットの外部にアデノシンデアミナーゼミニ遺伝子を導入したときの遺伝子発現の向上（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｐｏｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｍｉｎｉｇｅｎｅ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３５１９−３５２３；
１６．Ｈｏｅｂｅｎ，Ｒ．Ｃ．，Ａ．Ａ．Ｍｉｇｅｈｉｅｌｓｅｎ，ｄ．Ｊ．Ｒ．ｖａｎ，Ｏ．Ｈ．ｖａｎ，＆  ｄ．Ｅ．Ａ．ｖａｎ，１９９１，マウス繊維芽細胞中のモロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲの失活はメチル化に関連しその染色体位置に依存する（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：９０４−１２；
１７．Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．，１９９１，胚幹細胞を用いる遺伝ターゲティング及び遺伝子トラップスクリーン：哺乳動物発達の新しい方法（Ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｐ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｅｍｂｒｏｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），ＢｉｏＥｓｓａｙｓ  １３：６４９−６５６；
１８．Ｋａｓａｈａｒａ，Ｎ．，Ａ．Ｍ．Ｄｏｚｙ  ＆  Ｙ．Ｗ．Ｋａｎ，１９９４，リガンド−レセプター相互作用によるレトロウイルスベクターの組織特異的ターゲティング（Ｔｉｓｓｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌｉｇａｎｄ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１３７３−１３７６；
１９．Ｋｉｌｂｙ，Ｎ．Ｊ．，Ｍ．Ｒ．Ｓｎａｉｔｈ  ＆  Ｊ．Ａ．Ｈ．Ｍｕｒｒａｙ，１９９３，部位特異的リコンビナーゼ：ゲノム工学のツール（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓ：ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ），Ｒｅｖｉｅｗ  ９：４１３−４２１；
２０．Ｌｉｎｎｅｙ，Ｅ．，Ｂ．Ｄａｖｉｓ，Ｊ．Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ，Ｅ．Ｃｈａｏ  ＆  Ｈ．Ｆａｎ，１９８４，Ｆ９胚性癌腫細胞中のモロニーマウス白血病ウイルス調節配列の機能喪失（Ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｆ９  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３７４８−３７５２；
２１．Ｌｏｃｈｅｔ，Ｍ．，Ｍ．Ａｂｏｕｄ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｆｌｕｇｅｌ，１９９３，シス位置の相同的ＬＴＲプロモーターによるヒト泡沫状ウイルスの内部プロモーターの基底転写活性の増加（Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｓａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｏａｍｙ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  ｃｉｓ），ＮＡＲ  ２１：４２２６−４２３０；
２２．Ｌｏｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｌ．Ｌ．Ｓｉｅｖｅｒｔ  ＆  Ｒ．Ｗ．Ｓｃｏｔｔ，１９８８，遺伝子内ドメインによって媒介される胚性癌腫細胞中のレトロウイルス発現の負の調節（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｒａｇｅｎｉｃ  ｄｏｍａｉｎ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：４０８６−４０９５；
２３．Ｌｏｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｌ．Ｌ．Ｓｉｅｖｅｒｔ  ＆  Ｒ．Ｗ．Ｓｃｏｔｔ，１９９０，胚性癌腫細胞中のモロニーマウス白血病ウイルスの発現の幹細胞特異的リプレッサーの証明（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｏｆ  ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１０：４０４５−４０５７；
２４．Ｌｏｈ，Ｔ．Ｐ．，Ｌ．Ｌ．Ｓｉｅｖｅｒｔ  ＆  Ｒ．Ｗ．Ｓｃｏｔｔ，１９８７，マウス胚性癌腫細胞中のレトロウイルスの発現を制限するプロウイルス配列（Ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，７：３７７５−３７８４；
２５．Ｍａｎｎ，Ｒ．，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３，レトロウイルスパッケージング突然変異体の構築及びヘルパー欠失型欠損レトロウイルスを作製するためのその使用（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍｕｔａｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ），Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１６０；
２６．Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｋ．Ｒ．Ｔｈｏｍａｓ  ＆  Ｃ．Ｍ．Ｒ，１９８８，マウス胚由来の幹細胞中の癌原遺伝子ｉｎｔ−２の破壊：選択可能でない遺伝子を突然変異の目標とするための普遍的計画（Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｉｎｔ−２  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｎｏｎ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｓ），Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２；
２７．Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｄ．Ｒ．Ｔｒａｕｂｅｒ  ＆  Ｃ．Ｂｕｌｔｉｍｏｒｅ，１９８６，ヘルパーウイルスの無いレトロウイルスベクターの産生に関与する因子（Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｌｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ−ｆｒｅｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ），Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１２：１７５−１８３；
２８．Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｏ．Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｒａｇｈｅｂ，Ｂ．Ｍｏｓｓ  ＆  Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，内部リボソーム侵入部位を含むと推定されるレトロウイルスベクター：ポリシストロン性遺伝子導入の開発及びヒト遺伝子治療への応用（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅｓ：ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ），Ｎ．Ａ．Ｒ．，２０：１２９３−１２９９；
２９．Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｃ．Ｂｏｎｎｅｒｏｔ，１９９３，全能性細胞中のネズミのレトロウイルスの抑制及び活性化（Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｅｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｍｕｒｉｎｓ  ｄａｎｓ  ｌｅｓ  ｃｅｌｌｕｌｅｓ  ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｓ），Ｍｅｄｅｃｉｎｅ／Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９：１９１−１９７；
３０．Ｎｉｃｏｌａｓ，Ｊ．Ｆ．＆  Ｊ．Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８７，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，ｐ．４９３−５１２，Ｅ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ−Ｊｕｌｉａｎ  Ｅ．Ｄａｖｉｅｓ（ｅｄ．），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｄｕｒｂａｎ  Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｓｙｄｎｅｙ  Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎ；
３１．  Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，Ｇ．Ｐ．Ｎｏｌａｎ，Ｍ．Ｌ．Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９３，一過性トランスフェクションによるヘルパーの無い高力価レトロウイルスの産生（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ  ｈｅｌｐｅｒ−ｆｒｅｅ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６；
３２．Ｐｅｔｅｒｓ，Ｇ．，Ａ．Ｆ．Ｌｅｅ  ＆  Ｃ．Ｄｉｃｋｓｏｎ，１９８６，マウス乳腫瘍ウイルスによって誘発される癌腫中の２つの潜在的癌原遺伝子の協奏的活性化（Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｏｕｓｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｕｒ  ｖｉｒｕｓ），Ｎａｔｕｒｅ  ３２０：６２８−６３１；
３３．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．，Ｇ．Ｋｅｍｐｌｅｒ  ＆  Ｅ．Ｂａｒｋｌｉｓ，１９９１，レトロウイルスのプライマー結合部位の幹細胞特異的サイレンサー（Ａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．１１：１２１４−１２２１；
３４．Ｐｕｌｓｉｎｅｌｌｉ，Ｇ．Ａ．＆  Ｈ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ，１９９１，１回のレトロウイルスベクター複製中に生じる大きい欠失のキャラクタリゼーション：鎖導入中のエラーを含む新規な欠失メカニズム（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｏｕｎｄ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：ｎｏｖｅｌ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｅｒｒｏｒｓ  ｉｎ  ｓｔｒａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４７８６−４７９７；
３５．Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．，Ｊ．Ｖ．ＤｅＧｒｅｇｏｒｉ，Ｈ．Ｖｏｎ  Ｍｅｌｃｈｎｅｒ  ＆  Ｈ．Ｆ．Ｒｕｌｅｙ，１９９１，哺乳類細胞中でＬａｃＺ遺伝子融合を誘発するレトロウイルスプロモータートラップベクター（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｔｒａｐ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ＬａｃＺ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１５０７−１５１５；
３６．Ｒｅｄｄｙ，Ｓ．，Ｈ．Ｒａｙｂｕｒｎ，Ｖ．Ｍ．Ｈ．＆  Ｒ．Ｈ．Ｅ．，１９９２，発達的に調節されたｌａｃＺ融合遺伝子を発現する全能性胚性肝細胞の蛍光活性化ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｌａｃＺ  ｆｕｓｉｏｎ  ｇｅｎｅｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：６７２１−６７２５；
３７．Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｊ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａ  ＆  Ｆ．Ｊａｃｏｂ，１９８４，多能性胚性幹細胞中で遺伝子を形質導入し発現させ得るレトロウイルスの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１３７−７１４０；
３８．Ｓａｎｅｓ，Ｊ．，Ｊ．Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ  ＆  Ｊ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａｓ，１９８６，マウス胚における移植後細胞系を研究するための組換えレトロウイルスの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｐｏｓｔ−ｉｍｐｌａｎａｔａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｓ），ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３１３３−３１４２；
３９．Ｓａｕｅｒ，Ｂ，１９８７，パン酵母中のｃｒｅ−ｌｏｘ部位特異的組換え系の機能性発現（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｒｅ−ｌｏｘ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０８７−２０９６；
４０．Ｓａｕｅｒ，Ｂ．＆  Ｎ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，１９８８，バクテリオファージＰ１のＣｒｅリコンビナーゼによる歩にゅぅるい細胞中の部位特異的ＤＮＡ組換え（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐ１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５１６６−５１７０；
４１．Ｓａｖａｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｄ．Ｒｏｃａｎｃｏｕｒｔ，Ｃ．Ｂｏｎｎｅｒｏｔ  ＆  Ｊ．Ｆ．Ｎｉｃｏｌａｓ，１９８９，抗レトロウイルス薬をスクリーニングするための新規な系（Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２６：２２９−２３６；
４２．Ｓｈａｆｅｒ，Ｇ．Ｅ．，Ｄ．Ｗ．Ｅｍｅｒｙ，Ｋ．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｓ．Ｇｅｒｍａｎａ，Ｗ．Ｆ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．Ｓａｃｈｓ  ＆  Ｃ．ＬｅＧｕｅｒｎ，１９９１，レトロウイルス媒介性遺伝子導入によるネズミの骨髄造血細胞中のブタのクラスＩＩ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｗｉｎｅ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｈｅｍａｔｏｐｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９７６０−９７６４；
４３．Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｂ．Ｓａｕｅｒ，Ｒ．Ｈｏｅｓｓ  ＆  Ｋ．Ａｂｒｅｍｓｋｉ，１９８６，バクテリオファージＰ１  ｃｒｅ遺伝子及びその調節領域：多重プロモーター及びＤＮＡメチル化による調節の証拠（Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｐ１  ｃｒｅ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｇｉｏｎ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７：１９７−２１２；
４４．Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｍ．，Ｓ．Ｈａｇｇｅｒｔｙ，Ｃ．Ａ．Ｌａｍｏｎｉｃａ，Ｃ．Ｍ．Ｍｅｉｅｒ，Ｓ．Ｋ．Ｗｅｌｃｈ  ＆  Ａ．Ｊ．Ｗａｓｉａｋ，１９９０，ヒト免疫不全ウイルス１型のタンパク質産物の発現に組込みは不要である（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：２４２１−２４２５；
４５．Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ，Ｈ．＆  Ｐ．Ｂｅｒｇ．，１９９２，逆転写中のコパッケージドレトロウイルスＲＮＡの相同的組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｐａｋａｇｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ＲＮＡｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３７８−２３８８；
４６．Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ，Ｒ．，Ｒ．Ｃ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｈ．Ｅ．Ｖａｒｍｕｓ  ＆  Ｊ．Ｍ．Ｂｉｓｈｏｐ，１９８３，細胞性癌遺伝子の形質導入：ラウス肉腫ウイルスの発生（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ；ｔｈｅ  ｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｒｕｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２５１９−２５２３；
４７．Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｇ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｇ．Ｖｉｌｅ，Ｒ．Ａ．Ｗｅｉｓｓ  ＆  Ｍ．Ｋ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，１９９２，Ｄ型レトロウイルスにはできないＣ型レトロウイルスによるモロニーマウス白血病ウイルスベクターの救助によって産生される偽性レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｂｙ  Ｃ−ｔｙｐｅ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  Ｄ−ｔｙｐｅ，ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ），Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：７９２−７９４；
４８．Ｔｒａｍｂｌａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｃ．Ａ．Ｋｏｚａｋ  ＆  Ｐ．Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，１９９２，プロウイルス挿入性突然変異誘発によるマウス白血病ウイルス誘発性Ｔ細胞白血病中の新規な遺伝子Ｖｉｎ−Ｉの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｇｅｎｅ，Ｖｉｎ−Ｉ，ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ｂｙ  ｐｒｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６：１３４４−１３５３；
４９．Ｔｒｕｓｋｏ，Ｓ．Ｐ．，Ｅ．Ｋ．Ｈｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｄ．Ｌ．Ｇｅｏｒｇｅ，１９８９，レトロウイルスプロモーター挿入によって得られるｃＫｉ−ｒａｓ癌原遺伝子の転写活性化（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＫｉ−ｒａｓ  ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ），Ｎ．Ａ．Ｒ．１７：９２５９−９２６５；
５０．Ｖａｒｅｌａ−Ｅｃｈａｖａｒｒｉａ，Ａ．，Ｃ．Ｍ．Ｐｒｏｒｏｃｋ，Ｙ．Ｒｏｎ，＆  Ｊ．Ｐ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，１９９３，モロニーマウス白血病ウイルス主体のベクターの複製中の高速遺伝子再構成（Ｈｉｇｈ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６３５７−６３６４；
５１．ｖｏｎ  Ｍｅｌｃｈｎｅｒ，Ｈ．＆  Ｈ．Ｅ．Ｒｕｌｅｙ，１９８９，レトロウイルスプロモータートラップを用いる細胞性プロモーターの同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｐ），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３２２７−３２３３；
５２．Ｗｅｉｓｓ，Ｒ．，Ｎ．Ｔｅｉｃｈ，Ｈ．Ｖａｒｍｕｓ  ＆  Ｊ．Ｃｏｆｆｉｎ，１９８５，ＲＮＡ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ．，ｐ．１２２２（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；
５３．Ｙｅｅ，Ｙ．Ｋ．，Ｊ．Ｃ．Ｍｏｏｒｅｓ，Ｄ．Ｊ．Ｊｏｌｌｙ，Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ｇ．Ｒｅｓｐｅｓｓ  ＆  Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８７，転写不能なレトロウイルスベクターからの遺伝子発現（Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓａｂｌｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５１９７−５２０１；
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１Ａは、プラスミドｐＭｌｏｘＰＬの構造を表す。図１Ｂは、レトロウイルスＭｌｏｘＰＬの感染によって生じたプロウイルスＭｌｏｘＰＬの構造を表す。図１Ｃは、ＬＴＲの内部の２つのｌｏｘＰ部位を利用してｃｒｅによって誘発された組換え後のプロウイルスを表す。図１Ｄは、ＭｌｏｘＰＬに感染した繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析を表す。図１Ｅは、プラスミドｐＭＣ１−ＣｒｅによってトランスフェクトされたクローンＮＩＨ３Ｔ３  ＭｌｏｘＰＬ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析を表す。
【図２】図２Ａは、レトロウイルスＭｌｏｘＰＬの感染及びＬＴＲの内部の２つのｌｏｘＰ部位を利用してＣｒｅによって誘発された組換え後に得られたプロウイルスＭｌｏｘＰＬの分子の構造及び分析を表す。図２Ｂは、制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ消化によってＭｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３  Ｃｒｅ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。図２Ｃは、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ消化によってＭｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３  Ｃｒｅ．１に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【図３】図３Ａは、プラスミドｐＭＣｒｅｌｏｘＰＬの構造を表す。図３Ｂは、本発明のレトロウイルスベクターのいくつかの好ましい実施態様の３′ｓＬＴＲの概略図を表す。図３Ｃは、制限エンドヌクレアーゼＢｃｌＩ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。  図３Ｄは、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＶ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。図３Ｅは、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ消化によってＭＣｒｅｌｏｘＰＬに感染させた繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３に由来の細胞性ＤＮＡの“サザンブロット”分析の結果を表す。
【図４】図４は、レトロウイルスベクターＭｃｒｅｌｏｘＰＬによるｓＬＴＲの作製メカニズムを示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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