(57)【要約】【課題】  活性な官能基のないポリプロビレン、ポリスチレン、ポリサルフォンなどからなる多孔性中空糸、多孔性ビーズなどの担体に対しても温和な条件で容易にＬＤＬ吸着リガンドを固定することができるＬＤＬ吸着材を提供する。【解決手段】  アニオン性のポリマー材料よりなるＬＤＬ吸着材。該ポリマーは、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では水溶性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では水難溶性である。ポリマー材料は、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとし、これにメタクリル酸を光照射リビング重合させたスター型重合体よりなるホモポリマーに対し、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、その後、メタクリル酸のＨをＮａで置換したものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アニオン性のポリマー材料よりなるＬＤＬ吸着材において、
該ポリマー材料は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では水溶性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では水難溶性であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項２】
請求項１において、前記ポリマー材料は、ホモポリマーとＮ−アルキルアクリルアミドとのブロック共重合体であり、ホモポリマーブロックがアニオン性であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項３】
請求項２において、Ｎ−アルキルアクリルアミドのアルキル基の炭素数が１〜１０であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項４】
請求項３において、Ｎ−アルキルアクリルアミドがＮ−イソプロピルアクリルアミドであることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、前記ポリマー材料は、前記ブロック共重合体をアルカリ水溶液と接触させることによりアニオン性とされたものであることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項６】
請求項５において、該ブロック共重合体の分子量が３，０００〜５００，０００であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記所定温度（Ｔ）は、２４〜２６℃の間の温度であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記ホモポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたスター型重合体であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項９】
請求項８において、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合していることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項１０】
請求項８又は９において、ビニル系モノマーがアクリル酸またはメタクリル酸であることを特徴とするＬＤＬ吸着材。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項のＬＤＬ吸着材が担体に担持されてなるＬＤＬ除去材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中からＬＤＬを除去するためのＬＤＬ吸着材と、このＬＤＬ吸着材がコーティングされたＬＤＬ除去材とに関する。なお、本明細書において、ＬＤＬにはＶＬＤＬも包含される。
【背景技術】
【０００２】
血液中に存在するリポ蛋白、なかでもＬＤＬはコレステロールを多く含み、動脈硬化の原因となることが知られている。ＬＤＬを血液などの体液中から除去する方法としては、従来より吸着体による除去方法が採用されている。当該吸着体には、ＬＤＬに親和性を呈するヘパリン、デキストラン硫酸などのリガンドを多孔性の担体に固定されたものが実用化されている。この多孔性の担体には架橋アガロース、架橋キトサンなどの多糖類からなるものやシリカゲルなどがある。
【０００３】
担体へのリガンドの固定方法としては、担体表面の官能基を利用する方法があり、材料自体が官能基を有しているか、担体へ活性官能基を導入する処理が行われている。官能基としては、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基等があげられ、リガンドの固定は、一般に、滅菌時や血液処理中にリガンドが脱離しないように共有結合的に導入されている。
【０００４】
例えば、特公平６−１１３３０号公報は、架橋アガロースを飽和ＮａＯＨとエピクロルヒドリンで処理することでエポキシ化し、これを濃アンモニア水で処理することでアミノ基を導入し、ここにデキストラン硫酸ナトリウムを含む水溶液２ｍｌを加えｐＨを１２に調整することでリガンドを導入することが記載されている。
【特許文献１】特公平６−１１３３０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記特公平６−１１３３０号では、リガンドの導入にあたって担体を過酷な条件で処理しなければならず、担体として使用できる多孔体を制限するものであった。また、導入反応に使用した活性物質の残存や溶出の危険性もある。さらに、反応活性点のすべてにリガンドを導入する及び又は後処理で残存する活性点（例えば多糖類へ導入したアミノ基や、シリカゲルの残余シラノール基のＯＨ基など）を失活させることはできず、これら極性官能基が血液中の補体Ｃ３ａを活性化してしまうなどの問題もある。
【０００６】
本発明は、活性な官能基のないポリプロピレン、ポリスチレン、ポリサルフォンなどからなる多孔性中空糸、多孔性ビーズなどの担体に対しても温和な条件で容易にＬＤＬ吸着リガンドを固定することができるＬＤＬ吸着材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のＬＤＬ吸着材は、ポリマー材料よりなるＬＤＬ吸着材において、該ポリマー材料は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では水溶性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では水難溶性であることを特徴とするものである。
【０００８】
このポリマー材料は、ホモポリマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−アルキルアクリルアミドとのブロック共重合体であり、このホモポリマーブロックがアニオン性となっていることが好ましい。
【０００９】
このポリマー材料は、このブロック共重合体をＮａＯＨ水溶液等のアルカリ水溶液と接触させることによりアニオン性とされたものであることが好ましい。
【００１０】
このホモポリマーの分子量は、５００〜３００，０００が好ましい。
【００１１】
このブロック共重合体の分子量は、３，０００〜５００，０００であることが好ましい。
【００１２】
前記所定温度（Ｔ）は、２４〜２６℃の間の温度であることが好ましい。
【００１３】
このホモポリマーは、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたスター型重合体であることが好ましい。
【００１４】
このＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物としては、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として４個以上の該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が結合しているものが好ましい。
【００１５】
このビニル系モノマーは、アクリル酸又はメタクリル酸、特にメタクリル酸が好ましい。
【００１６】
本発明のＬＤＬ除去材は、かかる本発明のＬＤＬ吸着材が担体に担持されたものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＬＤＬ吸着材は、上記所定温度よりも低い温度では水溶性である。これは、本発明のＬＤＬ吸着材の一部を構成するＮ−イソプロピルアクリルアミドなどのＮ−アルキルアクリルアミドのポリマー鎖は、低温度では親水性であり、高温度では疎水性になるという温度依存性を有していることに起因する。従って、本発明のＬＤＬ吸着材は、前記所定温度よりも低い温度でこれを水に溶解させてＬＤＬ除去材用の担体に付着させ、その後、所定温度よりも高い温度とすることにより、水不溶性となり、該担体に担持される。
【００１８】
このＬＤＬ吸着材は、活性な官能基のないポリプロピレン、ポリスチレン、ポリサルフォンなどからなる多孔性中空糸、多孔性ビーズなどの担体に対しても温和な条件で容易に固定することができる。
【００１９】
このＬＤＬ吸着材は、生体温度では水難溶性であり、担体にされた状態を維持する。従って、生体温度の血液を本発明のＬＤＬ除去材と接触させてもＬＤＬ吸着材が担体から流出することはない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明のＬＤＬ吸着材は、生体温度よりも低温の所定温度（Ｔ）よりも低い温度では水溶性であり、該所定温度（Ｔ）よりも高い温度では水難溶性であるポリマー材料よりなる。
【００２１】
上記のポリマー材料としては、ホモポリマーと、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド等のＮ−アルキルアクリルアミドとのブロック共重合体であり、このホモポリマーブロックがアニオン性となっていることが好ましい。
【００２２】
このホモポリマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたスター型重合体が好適である。
【００２３】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２４】
Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団を同一分子内に４個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル分子団が４個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００２５】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としてはハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特にクロロホルム又は塩化メチレン特にクロロホルムが好適である。
【００２６】
このイニファターに重合させて疎水性ホモポリマーを形成するためのビニル系モノマーとしては、アクリル酸又はメタクリル酸、とりわけメタクリル酸が好ましい。
【００２７】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００２８】
このビニル系モノマーの該原料溶液中の濃度は７０重量％以上、例えば７０〜９９重量％が好適である。
【００２９】
イニファターの濃度は１０〜１０００ｍＭ／Ｌ程度が好適である。
【００３０】
照射する光の波長は２４０〜３００ｎｍが好適である。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００３１】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型スター型重合体（疎水性ホモポリマー）が生成するので、必要に応じ精製して分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーを得る。
【００３２】
この分岐型スター型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、３千〜５０万、特に５千〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度が好ましい。
【００３３】
このようにして生成した分岐型スター型重合体よりなるホモポリマーに対し、Ｎ−アルキルアクリルアミド（アルキル基の炭素数は好ましくは１〜１０）、特に好ましくはＮ−イソプロピルアクリルアミドをブロック共重合させてポリマー材料とする。このＮ−アルキルアクリルアミドのポリマー鎖は、低温度では水溶性、高温では水難溶性となる温度依存性を有し、これにより上記ポリマー材料が上記温度応答性を具備するようになる。
【００３４】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドをブロック共重合させるには、上記のようにして合成したスター型重合体ホモポリマーをメタノール等の溶媒に溶解させ、これにＮ−イソプロピルアクリルアミドを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるスター型ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３０分、照射強度１μＷ〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３５】
このブロック共重合体（ポリマー材料）の分子量は３，０００〜５００，０００、特に１０，０００〜１００，０００であることが好ましい。
【００３６】
このポリマー材料をＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｎａ2ＣＯ3などのアルカリ性水溶液（濃度は、好ましくは０．１〜４．０Ｎ）に好ましくは０．５〜１２０分程度接触させることによりホモポリマーブロックがアニオン性となる。好ましくは、ポリマー材料を担体に担持させてからこのアルカリ処理を行うのが好ましい。
【００３７】
この担体としては、ポリフッ化ビニリデン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリサルフォン、ポリウレタン、塩化ビニルなどの樹脂膜が好適であるが、パウダーなどのソリッドビーズや発泡ビーズ、不織布などの繊維集合体、フィルムであっても良い。
【００３８】
上記ポリマー材料は前記所定温度Ｔよりも低い温度では水に溶けるので、該所定温度よりも低い温度の水溶液とし、これを担体に接触させ、次いで乾燥させることによりポリマー材料を担体に担持させることができる。担体表面へのポリマー材料の担持量は、０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３９】
上記のアルカリ処理は、ポリマー材料が溶出しないように、前記所定温度Ｔよりも高い温度条件下で行われる。
【００４０】
この担体に担持されたＬＤＬ吸着材は、約２５℃よりも高い温度で水不溶性であり、２５℃よりも低い温度で水溶性である。
【００４１】
従って、２５℃よりも高い温度、好ましくは生体温度にて血液とＬＤＬ吸着材担持ＬＤＬ除去材とを接触させることにより、血液からＬＤＬが除去される。
【００４２】
血液のＬＤＬ除去処理を行うには、粒子状のＬＤＬ除去材をカラムやチューブ等に充填し、血液を通過させてもよい。また、ＬＤＬ除去材を中空糸とし、中空糸内又は中空糸外に血液を流通させてもよい。
【００４３】
なお、上記スター型ポリマー材料の分岐鎖の数が多いほどＬＤＬ吸着材の担体への付着性が向上することが認められた。
【００４４】
この理由としては、分岐鎖中におけるＮ−アルキルアクリルアミドのポリマー鎖が担体への親和性を有していること；ＬＤＬ吸着材は、このＮ−アルキルアクリルアミドのポリマー鎖を介して担体に付着すること；従って、分岐鎖が多いほど、ＬＤＬ吸着材の担体への付着性が向上すること；仮に１本の分岐鎖が生体から剥離しても、他の分岐鎖によってＬＤＬ吸着材の担体への付着が保たれ、この間に、剥離した分岐鎖が再び担体に付着すること；が考えられる。
【００４５】
また、スター型ポリマー材料のベンゼン核から上記分岐鎖が放射方向に延出している。このベンゼン核は担体への付着性が乏しく、放射方向に延出した分岐鎖の数が多いほど、ベンゼン核付近の担体からの離反方向の動きが抑制される。従って、この理由によっても、分岐鎖の数が多いほど、ＬＤＬ吸着材の担体への付着性が向上すると考えられる。
【実施例】
【００４６】
実施例１
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００４７】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）２．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム１２．０ｇをエタノール１０ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム４０ｍＬへ溶解し、５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を約１０ｇの硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、微かに淡青色を帯びた１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの白色結晶を得た（収率９０％）。
【００４８】
１Ｈ  ＮＭＲ（ｉｎ  ＣＤＣｌ３）の測定結果はσ７．４８（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ），σ４．５７（ｓ，２Ｈ×４，Ａｒ−ＣＨ２Ｓ−），σ４．０３（ｑ，２Ｈ×４，Ｎ−ＣＨ２−，Ｊ＝１０．７Ｈｚ），σ３．７２（ｑ，２Ｈ×４，Ｎ−ＣＨ２−，Ｊ＝１０．７Ｈｚ）,σ１．２６−１．３１（ｔ，３Ｈ×８，−ＣＨ２−ＣＨ３，Ｊ＝６．６Ｈｚ）となった。
【００４９】
【化１】
2008086558.tif 000002
【００５０】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなるポリメタクリル酸系ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリメタクリル酸）（以下、ｐＭＡと記載することがある。）よりなるポリメタクリル酸系ホモポリマーの合成を行った。
【００５１】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン０．４３ｇを１０ｍＬのトルエンへ溶解し、メタクリル酸５．２ｇを加えて混合し、全量をトルエンで２０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３０分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリメタクリル酸）（ｐＭＡ）よりなるポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより６０，０００と測定された。
【００５２】
【化２】
2008086558.tif 000003
【００５３】
iii)ポリメタクリル酸ホモポリマーへのＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロック共重合によるポリマー材料（４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ）の合成
下記反応式に従い、次のようにして、テトラキス（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル（ポリメタクリル酸）−ブロック−ポリ−（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（以下、ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭと記すことがある。）の合成を行った。
【００５４】
即ち、上記ii）で合成した４分岐型ｐＭＡホモポリマー６４５ｍｇを１０ｍＬのメタノールへ溶解し，Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）１．２ｇを混合して全量をメタノールで２０ｍＬに調整した。ii）と同様の条件で光照射重合を行って、メタノール／ジエチルエーテル系で精製を行って４分岐型ｐＭＡとポリＮ−イソプロピルアクリルアミド（ｐＮＩＰＡＭ）とのブロックポリマーよりなるポリマー材料を得た（重合率８０％）。分子量はＧＰＣにより１３０，０００と測定された。イオン交換容量は、０．０５規定ＮａＯＨによる中和滴定により約３．２ｍＥｑ／ｇと測定された。
【００５５】
【化３】
2008086558.tif 000004
【００５６】
iv）多孔性担体への固定及びアニオン化
ポリフッ化ビニリデン膜（孔径０．４５μｍ、膜厚１００μｍ）をエタノールへ浸漬し、続いて純水で洗浄することで微細孔へ水が浸潤されたポリフッ化ビニリデン膜とした。この膜をiii）で合成した４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭを２０℃下で水へ溶解して調整した０．１％溶液へ浸漬し、膜を破損しないように６０分間撹拌した。
【００５７】
膜を４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ溶液から取り出し、ドライヤーで風乾させた。
【００５８】
この４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ処理ポリフッ化ビニリデン膜を３７℃の水へ浮かべると微細孔へ水が毛細管現象で吸い込まれ、空気側表面まで貫通し、ポリメタクリル酸ブロックによる親水性化が確認された。風乾と３７℃水への浸漬を繰り返しても親水性は維持され、４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭが、反応活性点のないポリフッ化ビニリデン膜微細孔表面に固定されていることが分かった。
【００５９】
続いて３７℃において、０．０５規定ＮａＯＨへ１０分間浸漬することでｐＭＡブロックをＨ型からＮａ型とし、ｐＭＡブロック鎖のうちのポリアクリル酸部分をアニオン性とした。このような温和な条件でポリアニオン性に改質することができた。なお、上記アルカリ処理後、３７℃の純水で洗浄した。
【００６０】
ｖ）ＬＤＬの吸着性評価
血中ＬＤＬ濃度１４０ｍｇ／ｄＬ以上の高脂血ドナーより採取したヒト新鮮血を３．８％クエン酸で抗凝固処理し、遠心分離により血漿成分を分取した。２ｍＬエッペンチューブへ１ｍＬの血漿を入れ、温和に振盪撹拌しながら３７℃に温調した。ここへ４５ｍｍ２（約２０ｍｇ）の４分岐型ｐＭＡ−ｂ−ｐＮＩＰＡＭ処理ポリフッ化ビニリデン膜を約３ｍｍ×３ｍｍ大に細断して浸漬し、３時間インキュベートした。３時間後、血漿のみを吸い上げ、総コレステロール、ＨＤＬ、中性脂肪を臨終検査試験キットにて測定し、ＬＤＬの濃度をＦｒｉｅｄｅｗａｌｄの式で計算し、元の血漿中の濃度との比較によりＬＤＬ吸着除去率を求めたところ（除去率１２．２％±３．４％）であった。
【００６１】
比較例１
未処理のポリフッ化ビニリデン膜をエタノールで親水化し、生理食塩水で置換した。この膜を用いて実施例のｖ）と同様のＬＤＬ除去処理を行ったところ、ＬＤＬ除去率は３．４％±０．７％であった。