(57)【要約】【課題】吸着容量が大きく、かつ、吸着容量や吸着力・固定化力を制御することが可能となる、簡便に製造できるレクチン吸着剤を提供する。【解決手段】式（２）【化２】2008012460.tif 000006（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基を、ｎは２以上の整数を表し、Ｇは糖類残基を表す。）で表される糖側鎖型ウレアポリマー（糖類残基が異なるものを含む）、該糖側鎖型ウレアポリマーが架橋材と共重合されたもの、あるいは、該糖側鎖型ウレアポリマーを高分子材料又は無機微粒子に結合したもの、を用いたレクチン吸着剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖側鎖型ウレアポリマーからなるレクチン吸着剤。
【請求項２】
糖側鎖型ウレアポリマーが２種以上の糖側鎖型ウレアモノマーのコポリマーである、請求項１記載のレクチン吸着剤。
【請求項３】
糖側鎖型ウレアポリマーが２種以上の糖側鎖型ウレアポリマーのブレンドポリマーである、請求項１記載のレクチン吸着剤。
【請求項４】
糖側鎖型ウレアポリマーが架橋材と共重合されたものである、請求項１乃至２記載のレクチン吸着剤。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか１項記載の糖側鎖型ウレアポリマーを高分子材料又は無機微粒子に結合した、レクチン吸着剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レクチンを認識するための分子素子をもち、効率的にレクチンを分離、精製できる、レクチンの吸着剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
レクチンとは、血液凝集素とも呼ばれ、糖と相互作用する蛋白質あるいは糖蛋白質であり、赤血球等の細胞を凝集させたり、糖複合体を沈降させたりする特異な性質を持っており、動物、植物、微生物などの殆どの生物種に存在している生理活性物質である。
現在では、植物性から動物性のものまで、抗体など免疫学的産物ではない、結合価が２価以上の糖結合性細胞凝集素を広く、レクチンと呼ぶようになっている。１９５１−１９５２年には、Ｗ．Ｔ．Ｊ．ＭｏｒｇａｎとＷ．Ｍ．Ｗａｔｉｋｉｎｓは、ＡＢＯ式血液型特異的レクチンがそれぞれの血液型特異性の違いに対応して、異なった単糖で凝集活性が阻害されることを発見した。この知見は、ＡＢＯ式血液型決定基の構造を推定する初めての手かがりを与えた。たとえば、Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐｅｕｓ  Ｉ（ハリエニシダ）やＬｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（ミヤコグサ）、Ｅｌｅ  ｓｅｒｕｍ（ウナギ血清）は、Ｌ−Ｆｕｃと結合するためにＯ型決定基の検出に使用される。また、Ｃｙｔｉｓｕｓ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｏｌｉｕｓ（シチサスマメ） 、Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐｅｕｓ  ＩＩ（ハリエニシダ） は、Ｄ−ＧｌｃＮＡｃｂ１→４Ｄ−ＧｌｃＮＡと結合するために、これもまた、Ｏ型決定基の検出に使用される。Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｌｉｍｅｎｓｉｓ（リママメ） 、Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ（ドリコスマメ） 、Ｖｉｃｉａ  ｃｒａｃｃａ（クサフジ）は、Ｄ−ＧａｌｃＮＡｃと結合するために、Ａ型決定基の検出に使用される。Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｉは、Ｄ−Ｇａｌと結合するために、Ｂ型決定基の検出に使用される。
【０００３】
また、細胞表面の糖の検索に各種レクチンが使用され、各種レクチンの認識する細胞表面糖タンパク質糖鎖、さらに糖鎖中の糖配列を推定できるようになった。
【０００４】
また、コンカナバリンＡのようなグルコース、マンノース結合型レクチンは、主に免疫機能における補体系に作用することが知られている。すなわち、これまで補体系の活性化経路としては、免疫グロブリンを異物の認識分子とし、補体第一成分が活性化されるいわゆる古典的経路と、細菌などの異物に補体第三成分が直接結合する第二経路が知られていたが、近年になって、マンノースあるいは、グルコース結合型レクチンがグルコース、マンノースやＮ−アセチルグルコサミンなどの微生物表面の糖鎖を特異的に認識して補体の活性化を起こす、レクチン経路と呼ばれる第三の補体活性化経路の存在が見いだされた。このレクチン経路は、抗原を認識して記憶するいわゆる獲得性免疫を持たない無脊椎動物を含め、普遍的に存在する自然免疫の一つであり、その中でも重要な位置を占める生体防御機能であると考えられている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７  ２６２  ７４５１−７４５４；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９８９  ８４  １８２１−１８２９）。
マンノース結合型レクチンがウイルスや細菌などの表面の糖鎖にあるマンノースやＮ−グルコサミンを認識してそれらと結合することが起点となり、ＭＡＳＰ（マンノース結合型レクチン−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）との複合体の形成下に補体経路を活性化させ、ウイルスや細菌などの殺傷を引き起こす。
【０００５】
また、同様にマンノース結合型レクチンがウイルスや細菌などに結合することが起点となり、食細胞がそれらを貧食すること、すなわちマンノース結合型レクチンはオプソニン作用を有していることが知られている。食細胞が細菌などへの貧食作用を起こさず易感染性を呈しているＭＢＬ欠損患者に対して、マンノース結合型レクチンを補充する治療を行ったところ、易感染性が改善されたとの報告もある（Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８  ４８  １１６−１２３）。
さらに、マンノース結合型レクチンがインフルエンザの感染を抑制するとの報告（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９９  ９７  ３８５−３９２）、ＨＩＶの感染を抑制するとの報告（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １９８９  １６９  １８５−１９６）、がん増殖を抑制するとの報告（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９  ９６  ３７１−３７５）などがこれまでに行われている。
【０００６】
また、レクチンは、主に細胞表面の顕微鏡的研究のために使用されてきたが、近年になって、生理活性物質として、各種生物細胞の制御や分化の機構に深く関与していることが見出され、ある種のレクチンにはアルツハイマー型痴呆症の予防や治療への有効性が指摘されている神経成長因子の合成を促進する働きがあることが判明するなど、その重要な機能が明らかになりつつある。
【０００７】
このような知見と共に、生物種に於けるレクチンの分布状況やそれらの性質についての研究が盛んに行われている。
【０００８】
それらのレクチンの中に、グルコピラノシル構造、マルトース構造、マンノピラノシル構造、ガラクトピラノシル構造、６−デオキシガラクトピラノシル構造、Ｎ−アセチルガラクトサミニル構造、Ｎ，Ｎ’−アセチルキトビオース構造、を含む官能基に対して結合する性質を有する一群が知られているが、これらのレクチンを各種用途に使用する際には、生物から抽出したレクチン含有物をそのまま使用すると、含まれる不純物の影響が発現することがあるので、多くの場合、精製する必要がある。
【０００９】
レクチンを生物から分離するには、適切な緩衝液で抽出する方法が採用されるが、それを更に精製する場合には、通常、硫安等による分画とレクチンが糖と結合する性質を利用したアフィニティークロマトグラフィー等が主な手法として採用される。
例えば、グルコピラノシル構造、マンノピラノシル構造、マルトース構造を含む官能基に対して結合する性質を有するレクチンをカラムクロマトグラフィーに吸着させた後、その吸着材から溶出剤としてＤ−グルコースやマンノース、メチル−β−Ｄ−マンノピラノシドを用いて溶出させる。
吸着させるカラムクロマトグラフィーとしては、表面にマンノース残基が露出している基材が該レクチンの吸着率が高い等の理由から有利に採用される。たとえば、市販のアガロースゲル（セファロース４Ｂ、ファルマシアバイオテク社）にマンノース、あるいはマンナンを固定化した吸着剤が使用されるが、レクチンの回収率は４３％と低い（例えば、非特許文献１）。
これは、アガロース表面にマンノースが単層で結合しており、吸着サイトが小さいことに由来すると考えられる。また、アガロース表面で、分子は無秩序に固定化されているだけである。また、マンナン固定化アガロースの場合は、マンナンの分量などの記載はなく、分子量制御されたマンナンを固定化したものではないため、固定化力、あるいは、吸着容量を制御できるものではない。
同様に、ガラクトピラノシル構造を含む官能基に対して結合する性質を有するレクチンをアフィニティークロマトグラフィーに吸着させた後、その吸着材から溶出するさせる方法も採用されている。
吸着させるカラムクロマトグラフィーは、表面にガラクトース残基が露出している基材が該レクチンの吸着率が高い等の理由から有利に採用される。たとえば、市販のアガロースゲルや各種機材の表面にガラクトピラノシル構造を付加したもの等がある。これらも、マンノース結合型レクチンの場合と同様に、アガロース表面にラクトースやガラクトースが単層で、結合しており、吸着サイトが小さく、また、アガロース表面で、分子は、無秩序に固定化されている。
【００１０】
また、コーンの低温エタノール分画法によって得られる第ＩＩ＋ＩＩＩ画分からイムノグロブリンを抽出した残渣を原料として、グルコース結合型レクチン、マンノース結合型レクチンを工業レベルで精製する方法も報告されている（特許文献１）。しかし、この技術では、マンナンなどを固定化していないアガロース（セファロースＣＬ４Ｂ、ファルマシアバイオテク社）を用いたアフィニティークロマトグラフィー処理工程の前処理として、不溶物を除去するための複数回の通常ろ過工程およびデリピドフィルターを用いたろ過工程が必要とされており、精製方法として煩雑であるほか、そのための設備も必要となる。
【００１１】
更に、アミノ糖を利用し、これを支持体に共有結合で結合させた吸着剤も報告されており、例えば特許文献２には、第一級アミノ基を有するアミノ糖で誘導体化した固形支持体、具体的には、Ｄ−マンノサミンあるいはＤ−グルコサミンをＮＨＳ−活性化セファロースＦＦにカップリングさせた支持体が、また、特許文献３には、ポリ−（β−１，４−Ｄ−グルコサミン）誘導体にグリコピラノシルアミド結合を介して糖質が結合した高分子材料が、それぞれ報告されている。
しかしながら、前者の方法は単糖類を使用するため吸着サイトが小さくなり、一方、後者の方法はアセチル化糖を用いて高分子へ糖を導入後脱アセチル化する、というように操作が煩雑である、という欠点があった。
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３  ９４  ９３７−９４７
【特許文献１】特表２００２−５１７５１３号公報
【特許文献２】特表２００５−５１１５３７号公報
【特許文献３】特開２００５−３６１６３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、従来の方法では、吸着容量が小さかった各種糖結合ゲルよりも、吸着容量が大きく、また、固定化力が制御された、簡便に製造できる基材を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、かかる課題を解決するため研究の結果、糖を側鎖に有するウレア型ビニルモノマーを重合したものが分子素子となり得ることを見いだし、本発明に到達した。
すなわち本発明は、
（１）糖側鎖型ウレアポリマーからなるレクチン吸着剤、
（２）糖側鎖型ウレアポリマーが２種以上の糖側鎖型ウレアモノマーのコポリマーである、上記（１）記載のレクチン吸着剤、
（３）糖側鎖型ウレアポリマーが２種以上の糖側鎖型ウレアポリマーのブレンドポリマーである、上記（１）記載のレクチン吸着剤、
（４）糖側鎖型ウレアポリマーが架橋材と共重合されたものである、上記（１）乃至（２）記載のレクチン吸着剤、
（５）上記（１）乃至（３）のいずれか一に記載の糖側鎖型ウレアポリマーを高分子材料又は無機微粒子に結合した、レクチン吸着剤、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の糖側鎖型ウレアポリマーは、分子量が大きく巨大な結合サイトを提供できる分子素子と成り得（Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ  ２００５  ３０  １１３９−１１４２）、また、重合の際に分子量を自在に制御できる。
そのため、その吸着容量が大きく、かつ、吸着容量や吸着力・固定化力を制御することが可能となる。
また、糖側鎖がウレア結合で結合しているため、ベンズアミド系糖側鎖型ポリマーのように会合形態が球状ではなく凝集力が弱い、あるいは、アミド型ポリマーように糖鎖が直鎖状の異性体が混合した物質となり物性が安定しない、という欠点もない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいう、糖側鎖型ウレアポリマーとは、式（１）で表される糖側鎖型ウレアモノマーを重合した、式（２）で表されるポリマーである。
式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基を、ｎは２以上の整数を表し、Ｇは糖類残基で、アノマー位をアミノ基に変換できる糖類の残基である。かかる糖類としては、具体的には、グルコピラノシル残基を有するグルコース、β−１，４の結合様式を有するセロビオース、セロトリオース、セロテトラオースあるいはセルロースを分解したセロオリゴ糖ならびにそれらの混合物、α−１，４の結合様式を有するマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、アミロースを分解したマルトオリゴ糖ならびにそれらの混合物、ガラクトピラノシル残基を有するガラクトース、ラクトース、ガラクトオリゴ糖、更にβ−１，６結合を有するラフィノース、メリビオース、ゲンチビオースなどの還元糖を挙げることができる。
式（１）あるいは式（２）で表される化合物は、例えば、本発明者らが開発した特開２００４−２０３８７０号公報に記載の方法に準じて、製造することができる。
【００１６】
【化１】
2008012460.tif 000002
【００１７】
【化２】
2008012460.tif 000003
【００１８】
本発明のレクチン吸着剤は、上記式（２）のポリマーからなるものであり、ポリマーの糖類残基は、目的とするレクチンに合わせて適宜選択することができる。
【００１９】
また、式（２）で表されるポリマーにおいて、異なった糖類残基をもつもの（異なる糖類残基をもつ式（１）で表される化合物を共重合したもの）、あるいは、異なった糖類残基をもつホモポリマーをブレンドしたものも用いることもできる。
これらは、グルコピラノシル構造、マルトース構造、マンノピラノシル構造、ガラクトピラノシル構造、６−デオキシガラクトピラノシル構造、Ｎ−アセチルガラクトサミニル構造、Ｎ，Ｎ’−アセチルキトビオース構造を含む官能基に対して結合する性質を有するレクチンの二種以上に特異的親和性を有するマルチな分子素子として、二種以上のレクチンの吸着剤として使用できる。
【００２０】
本発明では、上記式（２）で表されるポリマー（ホモポリマー、コポリマー）を、セルロース、グルコマンナン、プルラン、アガロース等の多糖粒子、ポリビニルアルコールやポリヒドロキシエチルアクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリルアミド、ポリスチレン等の合成高分子、シリカゲルやアルミナ、チタニア、ジルコニアなどの無機微粒子等微粒子表面にグラフト化した吸着剤が提供される。
グラフト化方法は、それ自体公知の方法が適用でき、例えば、微粒子にラジカルを生成させそこから重合する方法、あるいは、先に重合してポリマーを得て、これを微粒子に修飾させてもよい。
【００２１】
本発明では、更に、上記式（１）で表される化合物を、重合性基を有する架橋剤、例えば、メチレンビスアクリルアミド、エチレングルコールジメタクリレート、エチレングルコールジアクリレート、ブチレンビスアクリルアミド、トリメチロールプロパントリメタクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリアリルシアヌレート、ジビニルベンゼンなどの多官能モノマーと共重合せしめ、塊状物あるいは、微粒子とした吸着剤とすることもできる。
【００２２】
本発明の吸着剤の使用方法としては、定法のカラムクロマトグラフィー用の基材として、あるいは特定のレクチンを含む溶液に本発明の吸着剤を添加し溶液から沈殿させ、固液分離することによって特定のレクチンを回収することができる。
レクチンの溶出は、公知の方法に準じ、対応する糖や糖アルコールを用いることにより実施することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
製造例１  ２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマー（式（３）、ポリマー１）の合成
（１）マルトシルアミンの合成
マルトース１．０ｇ（２．９３ｍｍｏｌ）を３００ｍｌビーカー中、水５０ｍｌに溶かし、炭酸水素アンモニウムを１８．５ｇずつ２４時間毎３回加え（全量５５．５ｇ）、開放したまま３７℃で７２時間撹拌した。反応終了後、蒸留水１００ｍｌを加え、２０ｍｌまで水を留去した後、１００ｍｌの水を加え、１０ｍｌまで濃縮した。この操作をアンモニア臭が消失するまで繰り返し、凍結乾燥することにより、マルトシルアミンを白色固体として得た。該白色固体のＨＰＬＣ分析を行ったところ、純度は７８．４％であった。
得られたマルトシルアミン（白色固体）の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図１に示す。４．１ｐｐｍ付近にβ型構造に由来するピーク、４．３ｐｐｍ付近にα型構造に由来するピークが確認され（１位の炭素原子にアミノ基が結合したことにより、高磁場側にシフトしたと考えられる）、また４．５ｐｐｍ付近にはα型構造とβ型構造共通のピーク、５．２ｐｐｍ付近にマルトースのα型構造に由来すると推測されるピークが確認された。これらの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果より、生成物の構造を確認した。
【００２４】
（２）２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースの合成
（１）で得たマルトシルアミン０．８ｇ（純度７８．４％、１．８４ｍｍｏｌ）を１×１０−３Ｍ−ＫＯＨ水溶液２０ｍｌに溶解させた。その水溶液に、２−イソシアナートエチルメタクリレート（２−ＩＥＭ）を０．７１３ｇ（４．６ｍｍｏｌ）を加えて、３℃に保ったまま１２時間、激しくかき混ぜた。反応終了後、フラスコ内に析出した白色固体を濾去し、濾液を、未反応の２−ＩＥＭを除去するため３０ｍｌのジエチルエーテルを用いて４回洗浄した後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、得られた白色固体を水２ｍｌ、メタノール３ｍｌの混合溶液に溶解させ、ジエチルエーテル１００ｍｌとアセトン１５０ｍｌの混合溶液に滴下し冷却した。析出した白色固体を濾取、減圧下乾燥することにより、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトース０．５５ｇを白色物として得た。
得られた白色物のＨＰＬＣ分析を行った。クロマトグラムを図２に示す。マルトシルアミンのピークが消失し、新たに紫外可視領域に吸収を有する化合物の出現が認められた。これは目的生成物である２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースのビニル基に由来する吸収と考えられる。ピークの面積比より純度を算出したところ、純度は６５．０％であった。
得られた白色物のＦＴ−ＩＲスペクトルを図３に示す。１５７０ｃｍ−１にＮＨ−ＣＯ−ＮＨ相互伸縮、１６５０ｃｍ−１にＣ＝Ｏ伸縮振動（ｕｒｅａ）、１７０５ｃｍ−１にＣ＝Ｏ伸縮振動（ｅｓｔｅｒ）、に由来するピークが確認された。
また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図４に示す。１．９ｐｐｍにメチル基、４．２ｐｐｍ付近付近にはメチレン基、５．７ｐｐｍと６．１ｐｐｍにはビニル基に由来するピークが確認され、３．３〜４．０ｐｐｍ付近には糖骨格に由来するピークが確認され、目的物の構造を確認した。
【００２５】
（３）２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースの重合
（２）で得た２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトース４．４６ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）を脱気水２０ｍｌに溶解させ、氷冷下で窒素通気を３０分間行った。その後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡｍ）を１００．８ｍｇ（０．５８５ｍｍｏｌ）を加え、開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を１３．３５ｍｇ（０．０５８５ｍｍｏｌ）を添加し、氷冷下、窒素雰囲気下３時間撹拌した。反応終了後、反応液を２倍に希釈し３日間透析により精製した後、凍結乾燥を行い、１．２ｇのの白色物を得た（収率６０％）。
得られた白色物のＦＴ−ＩＲスペクトルを図５に示す。該スペクトルは図４に示したモノマーのスペクトルに比べ、ブロードになっている。これはポリマー化に伴うポリマー側鎖の自由度の低下に起因していると考えられる。
また、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図６に示す。該スペクトルでは、ポリマー化に伴うピークのブロードニングが確認できとともに、５．７ｐｐｍと６．１ｐｐｍのビニル基に由来するピークが消失し、メチレン基に由来する新たなピークが１．５ｐｐｍ付近に観察され、白色物が、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマーであることを確認した。
【００２６】
【化３】
2008012460.tif 000004
【００２７】
製造例２  ２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドラクトースポリマー（ポリマー２）の合成
（１）ラクトシルアミンの合成
ラクトース １．０（２．９３ｍｍｏｌ）を３００ｍｌビーカー中、水５０ｍｌに溶かし、炭酸水素アンモニウムを１８．５ｇずつ２４時間毎３回加え（全量５５．５ｇ）、開放したまま３７ ℃で７２時間撹拌した。反応終了後、蒸留水１００ｍｌを加え、２０ｍｌまで水を留去した後、１００ｍｌの水を加え、１０ｍｌまで濃縮した。この操作をアンモニア臭が消失するまで繰り返し、凍結乾燥することにより、ラクトシルアミンを白色固体として得た。生成物は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによりその構造を確認した。
【００２８】
（２）２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドラクトースの合成
（１）で得たラクトシルアミン０．８ｇ（純度７８．４％、１．８４ｍｍｏｌ）を１×１０−３Ｍ−ＫＯＨ水溶液２０ｍｌlに溶解させた。その水溶液に、２−イソシアナートエチルメタクリレート（２−ＩＥＭ）を０．７１３ｇ （４．６ｍｍｏｌ）を加えて、３℃に保ったまま１２時間、激しくかき混ぜた。反応終了後、フラスコ内に析出した白色固体を濾去し、濾液を、未反応の２−ＩＥＭを除去するため３０ｍｌのジエチルエーテルを用いて４回洗浄した後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥終了後、得られた白色固体を水２ｍｌ、メタノール３ｍｌの混合溶液に溶解させ、ジエチルエーテル１００ｍｌとアセトン１５０ｍｌの混合溶液に滴下し冷却した。析出した白色固体を濾取、減圧下乾燥することにより、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドラクトース０．５５ｇを白色物として得た。
生成物は、ＦＴ−ＩＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによりその構造を確認した。
【００２９】
（３）２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドラクトースの重合
（２）で得た２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドラクトース４．４６ｇ（５．８５ｍｍｏｌ）を脱気水２０ｍｌに溶解させ、氷冷下で窒素通気を３０分間行った。その後、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルエチレンジアミン（ＴＥＥＤＡｍ）を１００．８ｍｇ（０．５８５ｍｍｏｌ）を加え、開始剤として過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を１３．３５ｍｇ（０．０５８５ｍｍｏｌ）を添加し、氷冷下、窒素雰囲気下３時間撹拌した。反応終了後、反応液を２倍に希釈し３日間透析により精製した後、凍結乾燥を行い、１．２ｇの白色物を得た（収率８３．６％）。
生成物は、ＦＴ−ＩＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによりその構造を確認した。
【００３０】
製造例３  ２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドセロビオースポリマー（ポリマー４）の合成
特開２００４−２０３８７０号公報実施例１記載の方法に準じ、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドセロビオースポリマーを得た。
【００３１】
実施例１  マルトース残基を有するウレアポリマーを用いた吸着実験
塩化カルシウム２７．７５ｍｇをトリス塩酸緩衝液に２５０ｍｌに溶解し、１ｍＭ塩化カルシウム／トリス塩酸緩衝液（Ｉ）を調製した。Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ（Ｃｏｎ  Ａ）５０ｍｇを（Ｉ）１００ｍｌに溶解し、０．５ｍｇ／ｍｌのＣｏｎ  Ａ溶液（ＩＩ）を調製した。
また、製造例１で得た２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマー５ｍｇを（Ｉ）１０ｍｌに溶解（１×１０−６ｕｎｉｔ  ｍｏｌ／ｍｌ、（ＩＩＩ））し、（ＩＩＩ）から５０μｌ（５×１０−８ｕｎｉｔ  ｍｏｌ）、１００μｌ（１×１０−７ｕｎｉｔ  ｍｏｌ）、５００μｌ（５×１０−７ｕｎｉｔ  ｍｏｌ）を採取し、それぞれに（ＩＩ）を１．５ｍｌずつ加え、２５℃で１５分おきに２時間、５００ｎｍにおける透過率測定を行った。
測定の結果を図７に示す。図７から明らかなように、これら濃度において１５分までに全て白濁した。
【００３２】
実施例２
マルトース、アミロース、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマー（ポリマー１）、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトトリオースポリマー（ポリマー４）、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドセロビオースポリマー（ポリマー３）、及びポリビニルベンズアミドマルトース（ＰＶ−ＭＡ、生化学工業株式会社製）を用い、実施例１に準じ（上記（Ｉ）、（ＩＩ）及び糖溶液の混合溶液）、溶液を２５℃１時間静置させ、５００ｎｍにおける透過率を測定した。
結果を図８に示す。
図８から明らかなように、ポリマー１、ポリマー２、ＰＶ−ＭＡにおいて透過率の減少が確認された。これは、α−グルコース残基と選択的に結合するＣｏｎ  Ａが、ポリマー側鎖のマルトース、マルトトリオースのα−グルコース残基と結合し、架橋構造を形成したためと考えられる。さらに、ポリマー１、ポエイマー４において、それぞれ一定濃度以上になると沈澱の凝集による透過率の上昇が確認された。これに対して、同様な糖側鎖型ポリマーであるＰＶ−ＭＡは、白く濁るものの凝集沈殿しなかった。このことから、本発明のレクチン吸着剤は、より強い結合能を示すことが示唆された。
また、マルトース、アミロースがα−グルコース残基を有するにも関わらず透過率の減少が確認されなかったことについては、Ｃｏｎ  Ａとの結合が生じても、α−グルコース残基が片末端にしか存在せず架橋構造が形成できないため、ポリマー３においては、β−グルコース残基であるためＣｏｎ  Ａとの結合が起こらず透過率の減少は見られなかった。
【００３３】
製造例４  糖側鎖型ウレアポリマーグラフト化無機微粒子(シリカゲル)の調製
（１）メルカプトトリメトキシシリカゲル（Ｓｉｌ−ＭＰＳ）の調製
脱水トルエン９０ｍｌにシリカゲル５．０ｇを加え、３０分外部超音波照射を行い分散させた。その後、３−メルカプトプロピル トリメトキシシラン７．２４ｇ（ ３６．８８ｍｍｏｌ）を加えて、２００ｒｐｍ、５０℃で２４時間撹拌した。反応終了後、放冷し沈殿物を濾取後、トルエン、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下乾燥することにより白色固体（Ｓｉｌ−ＭＰＳ）を得た。
元素分析値（測定値）  Ｈ：１．３７％、Ｃ：３．８７％、Ｓ：２．５１％
元素分析の結果から、炭素含量、硫黄含量の増加が確認され、また、ＭＰＳの固定化量は８．０９３％と算出された。
【００３４】
２，２−ジチオビリジン（２ＰＤＳ）８．４３ｍｇをメタノール２５０ｍｌに溶解させ、採取したＳｉｌ−ＭＰＳ３．５ｍｇに１０ｍｌずつ加え、外部超音波照射を３０分間行った。その後８時間撹拌したのち、ＵＶスペクトル測定を行った。３６０ｎｍにおける吸光度はＳｉｌ−ＭＰＳが０．２６６であった。その結果を、検量線（ｙ＝０．５９６８ｘ＋０．０２０２）に代入し、Ｓｉｌ−ＭＰＳの固定化量を、５．８７×１０−４ｍｏｌ／ｇと算出した。
【００３５】
（２）グラフト化反応
十分に脱気した蒸留水９ｍｌにＳｉｌ−ＭＰＳ０．０５ｇ（０．０３９２ｍｍｏｌ）と２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースモノマー０．１０９ｇ、０．２１８ｇ、０．４３６ｇ、０．６５４ｇ（純度８９．４％、それぞれ０．１９６ｍｍｏｌ、０．３９３ｍｍｏｌ、０．７８９ｍｍｏｌ、１．１７６ｍｍｏｌ；ＭＰＳ残基に対して、それぞれ、５倍（Ｓｉｌ−Ｍａｌ５）、１０倍（Ｓｉｌ−Ｍａｌ１０）、２０倍（Ｓｉｌ−Ｍａｌ２０）、３０倍（Ｓｉｌ−Ｍａｌ３０）当量）を加え、１５分間外部超音波照射を行いＳｉｌ−ＭＰＳを分散させ、５℃で窒素通気を３０分間行った。その後、ＴＥＥＤＡｍ０．０８４ｍｌを加え、開始剤としてＡＰＳ８．９５ｍｇ（０．０３９２ｍｍｏｌ）を加えて、５℃窒素雰囲気下で３時間撹拌した。反応終了後、沈殿物を濾取し、蒸留水、エタノール、ジエチルエーテルの順で洗浄後、減圧下乾燥することにより白色固体を得た。
定性分析はＦＴ−ＩＲで行い、１６５０ｃｍ−１にＣ＝Ｏ（ｕｒｅａ）伸縮振動、１７０５ｃｍ−１にＣ＝Ｏ（ｅｓｔｅｒ）伸縮振動に由来するピークが確認された。
元素分析値（測定値）
Ｓｉｌ−Ｍａｌ５  Ｈ：１．５０％、Ｃ：６．５０％、Ｎ：０．６４％
Ｓｉｌ−Ｍａｌ１０  Ｈ：１．４７％、Ｃ：６．６１％、Ｎ：０．６５％
Ｓｉｌ−Ｍａｌ２０  Ｈ：１．９０％、Ｃ：９．６５％、Ｎ：１．１８％
Ｓｉｌ−Ｍａｌ３０  Ｈ：２．３４％、Ｃ：１２．３％、Ｎ：１．４１％
【００３６】
実施例３
製造例４で得たＳｉｌ−Ｍａｌ５、Ｓｉｌ−Ｍａｌ１０、Ｓｉｌ−Ｍａｌ２０、Ｓｉｌ−Ｍａｌ３０及びシリカゲルを３ｍｇずつサンプル管に採取し、実施例１で用いた緩衝液（Ｉ）９００μｌとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｃｏｎ  Ａ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、暗所で１時間静置したのちディスクフィルターでろ過し、ろ液を蛍光スペクトルにより測定した。
結果を図９に示す。
図９から、シリカゲルを添加した場合が最も蛍光強度が低く、シリカゲルにＣｏｎ  Ａが吸着されることが示唆された。Ｓｉｌ−Ｍａｌ５において吸着量が減少したことについては、担体のシリカゲルにポリマー鎖が吸着され、側鎖のマルトースの自由度が奪われてＣｏｎ  Ａが結合できなかったことに加え、吸着されたポリマー鎖によってシリカゲル自体にもＣｏｎ  Ａの吸着が起こらなかったためと考えられる。また、重合度が伸びるにつれて自由なマルトースが増加するためＣｏｎ  Ａの吸着量は増加し、Ｓｉｌ−Ｍａｉ３０では高分子効果により吸着量が一気に上昇したものと考えられる。
【００３７】
製造例５  糖側鎖型ウレアポリマーグラフト化高分子微粒子(セルロース)の調製
（１）メルカブトトリメトキシセルロース微粒子（Ｃｅｌｌ−ＭＰＳ）の調製
セルロースビーズ２３．８１ｇをメタノールで洗浄したのち、トルエンで洗浄し、減圧下乾燥後に白色固体を得た。そのうち４ｇを採取し、脱水トルエン９０ｍｌを加え３０分間外部超音波照射を行い、セルロース微粒子を分散させた。その後、３−メルカプトトリメトキシシラン７．２４ｇ（３６．８８ｍｍｏｌ）を加えて、２００ｒｐｍ、５０℃で２４時間撹拌した。反応終了後、放冷し、沈殿物を濾取し、トルエン、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下乾燥することにより白色固体（Ｃｅｌｌ−ＭＰＳ）を得た。
元素分析値（測定値）  Ｈ：６．６６％、Ｃ：４１．２％、Ｓ：２．１８％
【００３８】
２ＰＤＳ８．４３ｍｇをメタノール２５０ｍｌに溶解させ、採取したＣｅｌｌ−ＭＰＳ３．５ｍｇに１０ｍｌずつ加え、外部超音波照射を３０分間行った。その後、８時間撹拌したのちＵＶスペクトル測定を行った。３６０ｎｍにおける吸光度はＣｅｌｌ−ＭＰＳが０．２６６であった。その結果を、検量線（ｙ＝０．５９６８ｘ＋０．０２０２）に代入し、Ｃｅｌｌ−ＭＰＳの固定化量を、４．５９×１０−４ｍｏｌ／ｌと算出した。
【００３９】
（２）グラフト化反応
十分に脱気した蒸留水１３．５ｍｌにＣｅｌｌ−ＭＰＳ０．１２ｇ（０．０５５１ｍｍｏｌ）と２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースモノマー０．１６８ｇ、０．４５７ｇ、０．６７２ｇ、１．００８ｇ（純度８９．４％、それぞれ０．２７５ｍｍｏｌ、０．０５５０ｍｍｏｌ、１．１０ｍｍｏｌ、１．６５０ｍｍｏｌ；ＭＰＳ残基に対して、それぞれ、５倍（Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ５）、１０倍（Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ１０）、２０倍（Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ２０）、３０倍（Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ３０）当量）を加え、15分間外部超音波照射を行いＳｉｌ−ＭＰＳを分散させ、５℃で窒素通気を３０分間行った。その後、ＴＥＥＤＡｍ０．１１９ｍｌを加え、開始剤としてＡＰＳ１２．６ｍｇ（０．０５５１ｍｍｏｌ）を加えて、５℃窒素雰囲気下で３時間撹拌した。反応終了後、沈殿物を濾取し、蒸留水、エタノール、ジエチルエーテルの順で洗浄後、減圧下乾燥することにより白色固体を得た。
定性分析はＦＴ−ＩＲで行い、１６５０ｃｍ−１にＣ＝Ｏ（ｕｒｅａ）伸縮振動、１７０５ｃｍ−１にＣ＝Ｏ（ｅｓｔｅｒ）伸縮振動に由来するピークが確認された。
元素分析値（測定値）
Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ５  Ｈ：６．３７％、Ｃ：３９．９％、Ｎ：０．１９％
Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ１０  Ｈ：６．４２％、Ｃ：４０．５％、Ｎ：０．２５％
Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ２０  Ｈ：６．３９％、Ｃ：３９．９％、Ｎ：０．３５％
Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ３０  ｈ：６．３４％、Ｃ：４０．４％、Ｎ：０．４２％
【００４０】
実施例４
製造例５で得たＣｅｌｌ−Ｍａｌ５、Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ１０、Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ２０、Ｃｅｌｌ−Ｍａｌ３０及びセルロース微粒子を３ｍｇずつサンプル管に採取し、実施例１で用いた緩衝液（Ｉ）９００μｌとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｃｏｎ  Ａ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、暗所で１時間静置したのちディスクフィルターでろ過し、ろ液を蛍光スペクトルにより測定した。
結果を図１０に示す。
図１０から、セルロース微粒子自体には吸着は起きず、ポリマー鎖の重合度増加に伴う吸着量の増加が確認された。
【００４１】
製造例６  架橋材との共重合による塊状物
十分に脱気した蒸留水２．２ｍｌに表１のような所定比で、２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースモノマーとメチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＡｍ）を混合し、５℃で窒素通気を３０分間行った。その後、ＴＥＥＤＡｍ０．０２１７ｍｌを加え、開始剤としてＡＰＳ２．３ｍｇ（０．０１０１ｍｍｏｌ）を加えて５℃窒素雰囲気化で３時間撹拌した。反応終了後、蒸留水でよく洗浄したのち凍結乾燥により白色固体を得た。
定性的同定は、ＦＴ−ＩＲで行った。
【００４２】
【表１】
2008012460.tif 000005
【００４３】
実施例５
［２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースモノマー］／［ＭＢＡＡｍ］＝０／１０、５／５、６／４、７／３、８／２のゲルを３ｍｇずつサンプル管に採取し、実施例１で用いた緩衝液（Ｉ）９００μｌとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｃｏｎ  Ａ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、暗所で１時間静置したのちフィルターでろ過し、ろ液を蛍光スペクトルにより測定した。
結果を図１１に示す。
図１１から、マルトースの組成比増加に伴い吸着量の増加が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上説明してきたように、本発明によると、吸着容量が大きく、かつ、吸着容量や吸着力・固定化力を制御することが可能となる、簡便に製造できるレクチン吸着剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】マルトシルアミンの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースとマルトシリアミンのＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図３】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースのＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図４】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図５】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマーのＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図６】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースポリマーの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図７】ポリマー１水溶液とＣｏｎ  Ａとを混合した溶液の５００ｎｍの透過率の経時変化を示した図である。
【図８】各種ポリマー水溶液とＣｏｎ  Ａとを混合した溶液の、ポリマー添加量と５００ｎｍの透過率の関係を示した図である。
【図９】シリカ上にグラフト化されたポリマーの重合度とＣｏｎ  Ａの吸着量の関係を示した図である。
【図１０】セルロース上にグラフト化されたポリマーの重合度とＣｏｎ  Ａの吸着量の関係を示した図である。
【図１１】２−（メタクリロイルオキシ）エチルウレイドマルトースとメチレンビスアクリルアミドの原料比とＣｏｎ  Ａの吸着量の関係を示した図である。
【図１】
2008012460.tif 000007
【図２】
2008012460.tif 000008
【図３】
2008012460.tif 000009
【図４】
2008012460.tif 000010
【図５】
2008012460.tif 000011
【図６】
2008012460.tif 000012
【図７】
2008012460.tif 000013
【図８】
2008012460.tif 000014
【図９】
2008012460.tif 000015
【図１０】
2008012460.tif 000016
【図１１】
2008012460.tif 000017