(57)【要約】  【課題】カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われているが、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルスが存在することが報告された。カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ウイルス安全性保証を高めるために、カイコマキュラ様ウイルスを不活化する方法を提供する。  【解決手段】カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、カイコマキュラ様ウイルスを不活化するために、製造工程で中間製品をｐＨ０．５〜３．０の酸性処理を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マキュラ様ウイルスが感染したカイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、製造工程中間製品をｐＨ０．５〜３．０にすることを特徴とするカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項２】
有用タンパク質の製造が、有用蛋白質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞に接種することを特徴とする請求項１記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項３】
有用タンパク質の製造が、有用蛋白質をコードする遺伝子により組換えられた遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ虫体に接種することを特徴とする請求項１記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項４】
カイコ虫体がカイコ幼虫であることを特徴とする請求項３記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【請求項５】
カイコ虫体がカイコ蛹であることを特徴とする請求項３記載のカイコマキュラ様ウイルスの不活化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、カイコ由来細胞に存在しているカイコマキュラ様ウイルスを不活化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カイコ由来細胞を用いて遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製し、その遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスをカイコ由来細胞やカイコ虫体に接種して、有用タンパク質を培地中やカイコ体内に蓄積させることが行われている（特許文献１）。しかしながら、多くのカイコ由来細胞にカイコマキュラ様ウイルス（以下ＢｍＭＬＶと略称する）が存在することが報告された（非特許文献１）。そのため、有用タンパク質の製造工程にカイコ由来細胞を使用する際には、ＢｍＭＬＶに関する安全性保証のために、ＢｍＭＬＶを不活化または／かつ除去することが必要となる。
【特許文献１】特許第２６２１６５６号明細書
【非特許文献１】Ｋａｔｓｕｍａら著、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７９巻、５５７７−５５８４ページ（２００５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで、カイコマキュラ様ウイルスの不活化が可能となれば、カイコ由来細胞を利用した有用タンパク質の生産法のウイルス安全性保証のレベルは向上し、カイコ由来細胞を利用した生産法による有用タンパク質の量産の道は更に広がると期待される。本発明の目的は、カイコ由来細胞を利用して有用タンパク質を製造する際に、ＢｍＭＬＶを不活化する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、カイコマキュラ様ウイルスを酸性処理で不活化することに成功し、カイコ由来細胞を用いて有用タンパク質を生産する方法を確立し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、ＢｍＭＬＶが感染したカイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に、製造工程中間製品をｐＨ０．５〜３．０にすることを特徴とするＢｍＭＬＶの不活化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、以下に説明するとおり、カイコ由来細胞を使用して有用タンパク質を製造する際に効率よくＢｍＭＬＶを不活化することができ、生産された有用タンパク質のウイルス安全性保証レベルを高めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下、本発明の最良の実施形態の例を説明する。
【０００７】
本発明の有用タンパク質としては特に限定されないが、酸性で安定なタンパク質が好ましい。酸性で安定なタンパク質としては種々報告され、今後も多くのものが報告されるであろうが、それらへの応用が可能である。例えば、酸性で安定なタンパク質として、ヒトインターフェロン−β、ネコインターフェロン−ω、マウスインターフェロン−βなどのインターフェロン類が挙げられる。
【０００８】
本発明は、製造のいずれかの工程でカイコ由来細胞を使用する有用タンパク質の方法であれば適用できる。例えば、カイコ由来のＢＭ−Ｎ細胞を用いて遺伝子組換えウイルスを作製し、それをＢＭ−Ｎ細胞、カイコ幼虫やカイコ蛹などのカイコ虫体に接種して有用タンパク質を製造する方法に適用できる。また、遺伝子組換えカイコ細胞、遺伝子組換えカイコ虫体を用いた有用タンパク質の製造法にも適用できる。
【０００９】
酸性処理を行う工程は、製造工程中のどの段階でも可能である。細胞培養で有用タンパク質の製造する場合であれば、培養終了後の培養液でも、精製工程の中間工程製品でも酸性にすることが可能であるし、また、カイコ虫体で有用タンパク質の製造する場合であれば、カイコ殻の抽出液でも、精製工程の中間工程製品でも酸性にすることが可能である。カイコ虫体として幼虫を用いる場合はカイコ体液を酸性処理することが好ましい。カイコ体液を酸性にするには、カイコ体液に酸を加える方法、酸中に体液を受ける方法、もしくは開腹カイコをそのまま酸中に入れて攪拌する方法が可能である。これらの酸性処理の操作は氷水浴中で行うのが好ましいが、限定されない。
【００１０】
使用する酸としては、塩酸、硫酸、硝酸などの鉱酸、または蟻酸、酢酸などの有機酸を用いることができる。この中でも塩酸が特に好ましい。
【００１１】
酸性領域は、有用タンパク質の失活がなくＢｍＭＬＶが不活化される範囲であり、酸性領域は通常ｐＨ０．５〜３．０である。特にｐＨ１．５〜２．５にするのが好ましい。また、酸性処理の時間も、有用タンパク質の失活がなくＢｍＭＬＶが不活化される範囲なら限定されないが、好ましい時間は３〜４０時間、特に６〜２４時間にするのが好ましい。
【実施例】
【００１２】
実施例１
ＢｍＭＬＶ液の調製
ＢｍＭＬＶは、ＢｍＭＬＶに慢性感染したＢＭ−Ｎ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８９１０）から調製した。１０％牛血清アルブミンを含むＴＣ−１００培地で培養したＢＭ−Ｎ細胞３Ｘ１０９個を遠心分離で集め、３０ｍＬの燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した後、冷蔵下で超音波処理することによって細胞を破砕した。この細胞破砕液を１００ｋＤａで限外濾過して１００ｋＤａ以上の分子量を有する画分を５ｍＬを回収した。この回収液をＢｍＭＬＶ液とした。ＢｍＭＬＶ液１００μＬからＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン）によってＲＮＡを調製し、２．４μｇのＲＮＡを回収した。次に、ＢｍＭＬＶの塩基配列のうちＢｍＭＬＶのコートタンパク質をコードする全領域をＰＣＲにより増幅し、ＣＵＧＡ  ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（（株）ニッポン・ジーン）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  転写によってＲＮＡを合成した。得られたＲＮＡはモル換算すると６３ｐｍｏｌであった。このＲＮＡとＢｍＭＬＶ液をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III ワンステップ  ＲＴ−ＰＣＲ  システム  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（インビトロジェン）によってＲＴ−ＰＣＲを行った。図１に示したように、両者の楔印をつけた検体の比較により半定量したところ、ＢｍＭＬＶ液にはゲノム換算で約３０ａｍｏｌ／μＬのＢｍＭＬＶが存在した。
【００１３】
実施例２
ＢｍＭＬＶの検出法
活性を有するＢｍＭＬＶの検定系として、ＢｍＭＬＶを昆虫由来Ｓｆ−９細胞に感染させる方法の利用が可能か試験した。実施例１で調製したＢｍＭＬＶ液１Ｘ１０−７〜２０μＬを１２穴培養プレートで培養した１Ｘ１０５個のＳｆ−９細胞に添加し、１時間２６℃で保温後、新鮮な１０％牛血清アルブミンを含むＴＣ−１００培地で細胞を洗浄し、同培地を添加して２６℃で５日間培養した。培養プレートのそれぞれの穴からＳｆ−９細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄後、３ｍＬのＰＢＳで懸濁した。各細胞サンプルからＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（（株）キアゲン）によってＲＮＡを抽出し、３０μＬの水でＲＮＡを回収した。このＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  III ワンステップ  ＲＴ−ＰＣＲ  システム  ｗｉｔｈ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ（インビトロジェン）によってＲＴ−ＰＣＲを行った。図２の楔印に示したように、１Ｘ１０−４μＬのＢｍＭＬＶ液を添加した検体までＢｍＭＬＶは検出され、Ｓｆ−９細胞を用いて活性を有するＢｍＭＬＶを高感度に検出することができた。
【００１４】
実施例３
塩酸処理によるＢｍＭＬＶの不活化
実施例１で調製したＢｍＭＬＶ液１００μＬに０．１Ｎ塩酸を加えてｐＨ２に調整し、室温で６時間放置した。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７に中和後、遠心分離し、孔径０．２２μｍのフィルターにて濾過した。本ＢｍＭＬＶの処理液を、実施例２の方法により、Ｓｆ−９細胞へ添加し５日間培養後にＳｆ−９細胞からＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。図３の楔印で示した比較のとおり、塩酸処理したＢｍＭＬＶサンプルからはＢｍＭＬＶの核酸は検出されなかった。すなわちＢｍＭＬＶは酸性処理するによって不活化されたことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明は、遺伝子組換えカイコ核多角体病ウイルスを用いた有用タンパク質の製造に限らず、形質転換カイコ細胞や形質転換カイコを用いた有用タンパク質の製造に応用することができるが、その応用範囲が、これらに限られるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は実施例１においてＢｍＭＬＶ液中に存在するＢｍＭＬＶをゲノム換算で半定量した電気泳動の結果である。
【図２】図２は実施例２においてＢｍＭＬＶをＳｆ−９細胞に添加後培養し、Ｓｆ−９細胞からＢｍＭＬＶの検出することによって、活性のあるＢｍＭＬＶを検出する検出系を構築した電気泳動の結果である。
【図３】図３は実施例３において酸性処理することにってＢｍＭＬＶが不活化されることを確認した電気泳動の結果である。
【図１】
2008079551.tif 000002
【図２】
2008079551.tif 000003
【図３】
2008079551.tif 000004