(57)【要約】【課題】パッチクランプ法において、一つの細胞に高精度にマイクロピペットを顕微鏡下で挿入することは困難であった。特に、浮遊性細胞の場合は浮遊性細胞を固定してからでないと、マイクロピペットを細胞の表面に高精度に持って行くことが困難であった。【解決手段】第一の開口部７と第二の開口部８を備えた中空構造を有するソケット６と、第一の開口部７の内部に挿入設置した筒状の筒部品１と、少なくとも一つ以上の貫通孔５を備えた薄板３と枠体４からなるセンサチップ２を前記筒部品１の先端に設けた構成とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の開口部と第二の開口部を備えた中空構造を有するソケットと、前記第一の開口部の内部に挿入設置した筒状の筒部品と、少なくとも一つ以上の貫通孔を備えた薄板と枠体からなるセンサチップを前記筒部品の先端に設けた細胞電気生理センサ。
【請求項２】
第二の開口部の第一の開口部側の断面形状を第一の開口部の断面形状より小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
第二の開口部を、第一の開口部側の内径が小さくなるテーパ形状とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
筒部品をガラスとし、センサチップをシリコンまたは酸化シリコン、あるいはこれらの積層体からなる材料を主体とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
ソケットを樹脂とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項６】
ソケットを金属とした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項７】
ガラスからなる筒部品の内壁部とセンサチップの外壁部とを直接接合した請求項４に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項８】
センサチップの上面を筒部品の先端より内側の中間部に設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項９】
センサチップの上面を筒部品の先端より１ｍｍ以上離した中間部に設けた請求項８に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１０】
第一の開口部と第二の開口部を備えた中空構造を有するソケットと、前記第一の開口部の内部に、少なくとも一つ以上の貫通孔を備えた薄板と枠体からなるセンサチップを設置した細胞電気生理センサ。
【請求項１１】
第二の開口部の第一の開口部側の断面形状を第一の開口部の断面形状より小さくした請求項１０に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１２】
第二の開口部を、第一の開口部側の内径が小さくなるテーパ形状とした請求項１０に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１３】
ソケットを樹脂とし、センサチップをシリコンもしくは酸化ケイ素、あるいはこれらの積層体からなる材料を主体とした請求項９に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１４】
樹脂製の内壁部とセンサチップの外壁部を溶着接合面とした請求項１３に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１５】
センサチップの上面をソケットの先端より内側の中間部に設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項１６】
センサチップの上面をソケットの先端より１ｍｍ以上離した中間部に設けた請求項１５に記載の細胞電気生理センサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を観測するために用いられ、細胞内電位あるいは細胞外電位あるいは細胞膜通過電流等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサに関する。
【背景技術】
【０００２】
電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するタンパク質の機能の一つであるイオンチャネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャネルの様々な機能が解明されてきた。そして、このイオンチャネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
このパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要である。これは、１個の細胞にマイクロピペットを挿入するために、顕微鏡による観測下で一つの細胞に狙いを定め、マイクロマニュピレータ等の手段により高精度にマイクロピペットの先端を細胞の膜表面に接触させる必要がある。従って、このパッチクランプ法は高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない（例えば、非特許文献１参照）。
【非特許文献１】新パッチクランプ実験技術法  岡田泰伸編  吉岡書店発行
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、前記従来の構成では、顕微鏡下において、一つの細胞に高精度にマイクロピペットを挿入することに困難が伴うことにある。特に、パッチクランプ法で測定する細胞は、基本的には細胞が顕微鏡下で固定されたガラスプレートなどの基板に接着されている必要があり、浮遊性細胞の場合は何らかの手段により細胞を固定した状態にしてからでないと、細胞の表面にマイクロピペットを移動させて高精度に配置することが困難である。
【０００５】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、顕微鏡下でマイクロピペットの位置制御をする必要が無く、浮遊性の細胞であっても高い確率で細胞を保持することができ、パッチクランプ法と同等の高精度な信号を検出することができる細胞電気生理センサを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の細胞電気生理センサは、第一の開口部と第二の開口部を備えた中空構造を有するソケットと、第一の開口部の内部に挿入設置した筒状の筒部品と、この筒部品の先端に設けた、少なくとも一つ以上の貫通孔を備えた薄板と枠体からなるセンサチップを筒部品の先端に設けた構成とするものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の細胞電気生理センサは、センサチップが、筒部品の内部に設置しているため、細胞を含む溶液および測定の際に添加する溶液を、それぞれセンサチップの薄板によって仕切られている筒部品の中空部に投入し、センサチップを介して圧力差を発生させることで細胞をセンサチップの貫通孔に容易に密着させることができる。これによって、顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども必要とすることなく、浮遊性の細胞であっても簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサを実現できるとともに、筒部品がソケットによって保持されているので、測定電極、吸引治具などの筒部品の内部空間へのアクセスが容易にできるという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサについて、図面を参照しながら説明する。
【０００９】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図であり、図２は要部拡大断面図である。
【００１０】
図１および図２において、１はガラスよりなる筒部品であり、この筒部品１の外径は円柱状で内部は中空構造をしている。この筒部品１の先端にはシリコンからなるセンサチップ２を設置しており、このセンサチップ２は、図２に示すようにシリコンを主成分とする材料よりなる薄板３と枠体４とから構成しており、この薄板３には貫通孔５を少なくとも一つ設けている。
【００１１】
そして、このセンサチップ２は筒部品１の内壁部に隙間無く強固に固着している。これによって、センサチップ２は筒部品１の上部と下部を仕切るとともに、貫通孔５を通してのみ、上部と下部の空間が連通した構成としている。
【００１２】
さらに、前記筒部品１は樹脂よりなるソケット６の内部の第一の開口部７へ挿入することによって本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成となる。
【００１３】
また、ソケット６の下方にある第二の開口部８における第一の開口部７側の内径は第一の開口部７の内径より小さくしている。これによって、複数のソケット６の第一の開口部７の内部に筒部品１を効率よく挿入することができる。
【００１４】
また、第二の開口部８を、第一の開口部７側へ行くに従って内径が小さくなるテーパ形状としており、これによって後述する測定電極１４ｂあるいは吸引治具１５などの挿入を容易にできる。
【００１５】
以上説明してきたような構成によって、センサチップ２の薄板３を隔てた上部と下部の領域に測定用の溶液や細胞懸濁液を効率よく導入できる構造を実現できることから、容易に細胞を薄板３の貫通孔５に密着させることができる。
【００１６】
これによって、顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要もなく、浮遊性の細胞であっても簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサを実現することができる。
【００１７】
さらに好ましくは、第二の開口部８の第一の開口部７側の内径を筒部品１の内径より小さくすることが好ましい。これによって、測定の際に必要な測定電極（図示せず）、吸引治具（図示せず）などを筒部品１の内部空間へ挿入する、あるいはアクセスする作業を容易にすることができるという利点を有している。
【００１８】
また、センサチップ２が固着される場所は筒部品１の端部のみでなく、図３に示したように筒部品１の中間部であってもよい。この場合は、後に使用方法でも説明するが、センサチップ２の上下の空間に溶液を入れて貯留するスペースを確保することが容易にできるという利点を有している。
【００１９】
特に、センサチップ２の上面部を筒部品１の先端より１ｍｍ以上、筒部品１の内側に配置させることによって、蒸発しやすい溶液などを蓄積しておくスペースをより多く確保できる。
【００２０】
次に、別の例の細胞電気生理センサについて図４〜図６を用いて説明する。
【００２１】
図４は本実施の形態１における別の例の細胞電気生理センサの構成を説明するための断面図、図５は下面図、および図６は要部拡大断面図である。
【００２２】
図４〜図６に示したように、筒部品１の内壁に断面と平行方向に凸形状の段差部９を設けておくことによって、筒部品１の空洞内にセンサチップ２を挿入する際に所定の位置に容易に設置できることから生産性が向上する。また、凸形状の段差部９を筒部品１の内壁面の溶液の流れ方向に沿って連続して形成しておくことによって、気泡の発生を抑制することができるとともに気泡の除去を効率良く行うことができる。これは、筒部品１の内壁面の溶液の流れ方向に沿って段差部があると、その段差部に気泡が滞留し、その除去が困難となることが分かっている。
【００２３】
そして、この凸形状の段差部９を設ける手段としては筒部品１がガラス管などの場合には、内壁面に同材料のガラスからなる棒材１０をあらかじめ溶着する、あるいは筒部品１が樹脂の場合には金型で段差部９を成型する等の方法などを用いることによって容易に実現することが可能である。そして、図５に示したように前記棒材１０としてガラス棒を二本左右対称に配置した構成としているが、この段差部９はセンサチップ２を固定するためのものであり、少なくとも一つの段差部９を形成することができればその効果を発揮することができる。
【００２４】
さらには、筒部品１の内周部の全体に形成することも可能である。このような構成はガラス管からなる筒部品１の先端の内周部を回転させながら研削することによって段差部９を筒部品１の内周部に連続して形成することができる。これによって、さらに気泡の発生の抑制と気泡の除去が容易となる細胞電気生理センサを実現することができる。
【００２５】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサの製造方法について図面を用いて説明する。
【００２６】
まず始めに、図７に示したようにガラス管として供給される筒部品１と、シリコンを主成分とするセンサチップ２を所定の位置に挿入する。なお、筒部品１は所定の寸法を有するガラス管を加工することによって作製することが可能であり、センサチップ２はシリコン基板などを用いて半導体製造プロセスによる微細加工技術を用いることによって、微細な形状のセンサチップ２を高精度に一括して大量に作製することができる。
【００２７】
次に、筒部品１の内部にセンサチップ２を挿入した後、接着剤で固着させることでセンサチップ２は所定の位置に固着することができる。
【００２８】
しかしながら、より好ましくは図８に示したように、センサチップ２を挿入した後、筒部品１を外周部から熱源によって加熱する方法を用いることが好ましい。特に、筒部品１を構成する材料がガラス管などの場合、筒部品１が６００−７００℃以上に加熱されると、ガラスは溶融を起こし、センサチップ２の主材料であるシリコンと強固に直接接合して固着する。これによって、筒部品１とセンサチップ２は接着剤等の異種材料を使うことなく、強固に隙間なく直接接合することができることから、接着剤による汚れ等の発生を心配する必要のない封止性の高い細胞電気生理センサを作製することができる。
【００２９】
なお、熱源の種類としてはヒータ、赤外線、ガスバーナ等、あるいはＩＨ加熱によってシリコンによるセンサチップ２を直接発熱させる方法等があるが加熱方法については特に限定するものでない。
【００３０】
また、本実施の形態１では筒部品１の材料をガラスとしたが、特にアクリル、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、環状ポリオレフィンポリマー、および環状ポリオレフィンコポリマーのうち少なくともいずれか一つを主成分として含む熱可塑性樹脂を用いることも可能である。この材料を用いた場合において、ガラスの軟化温度より低い温度で熱可塑性樹脂を溶融させることができることから、製造工程において高温を使うことが好ましくない場合に有効である。
【００３１】
例えば、実験ではＴｇが１３０℃の環状ポリオレフィンコポリマーを用いて、１５０−２００℃で周囲を熱することでセンサチップ２と筒部品１を直接溶融固着することができた。
【００３２】
なお、前記加熱工程によって、図８に示したように筒部品１の外形と内形は角部が丸められた形状としている。この外形の周辺部は丸くなることで、筒部品１のエッジ部の欠けが起こりにくくなる。
【００３３】
さらに、内形の角部を丸めた形状とすることによって、筒部品１の内形がセンサチップ２に近づいていくに従って小さくなることから、後で説明するようにセンサチップ２の下部に培養液あるいは薬液などの溶液を充填する際に気泡が残留することなく確実に充填できるという利点を有している。このセンサチップ２の下部の溶液に気泡が残留していると正確な測定ができないという課題を有しており、これを解決することができる。
【００３４】
そして、最後に図１に示すように前記筒部品１を樹脂からなるソケット６の第一の開口部７側に挿入することによって本実施の形態１における細胞電気生理センサの構成となっている。
【００３５】
なお、ソケット６の材料は樹脂としたが、これによって筒部品１を挿入する際に圧入によって固着させることが容易であるという製造上の利点を有している。
【００３６】
また、ソケット６の製造方法については射出成形による方法が効率がよい。
【００３７】
また、ソケット６の材料は樹脂以外にもセラミック、ガラス、金属、とすることも可能である。特に、金属材料としたとき、この金属部分がシールドとなることから外部からのノイズの影響を受けにくい細胞電気生理センサを実現することができる。
【００３８】
さらに、後ほど説明するが、筒部品１の内部に入れる測定溶液と金属からなるソケット６とが接触するようにすれば、金属からなるソケット６が測定電極とすることも可能である。
【００３９】
次に、本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いて、細胞の電気生理現象を測定する方法について図面を用いて説明する。図９〜図１３は測定方法を説明するための断面図である。また、図１４は別の例の細胞電気生理センサを用いて測定するための使用方法を説明するための断面図である。
【００４０】
まず始めに、図９に示したようにセンサチップ２の下面側の筒部品１の内部に細胞の電気生理現象を測定するために用いる溶液の１種である細胞内液１１を充填する。ここで、細胞内液１１とは被検体細胞１３の内部を満たす溶液とほぼ同じ成分に調整された溶液であり、細胞の種類によって成分は変更される。具体的には、例えば哺乳類筋細胞の場合、細胞内液１１とはＫ+イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ+イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液である。
【００４１】
また、本実施の形態１のように筒部品１の内部が中空であり、センサチップ２の下部より垂直方向に細胞内液１１が貯留される領域を有することで、細胞内液１１を投入する際に内部に気泡が残留してしまうことが少なくなる。
【００４２】
さらに、筒部品１の内形は角部が丸めた構造とすることによって、筒部品１の内壁がセンサチップ２の方向に向かって狭くなっていることから、より細胞内液１１を投入する際に内部に気泡の残留を抑制することができる。
【００４３】
ここで、図６に示したように筒部品１の内壁に、断面と垂直方向な面に凸形状の段差部９を形成した構成とすることで、細胞内液１１の投入時において、段差部９の周辺部で気泡の抜け道ができることから、気泡の流れをスムーズにし、より気泡の残留を抑制することができる。
【００４４】
さらに、ソケット６の第二の開口部８の内径を筒部品１の内径より小さくすることによって、筒部品１の内部に細胞内液１１を投入するためのディスペンサなどを挿入することが容易にできる。
【００４５】
次に、図１０に示したように筒部品１の上部に細胞の電気生理現象の測定に用いる溶液の一種である細胞外液１２を投入する。この細胞外液１２は細胞内液１１と同様に被検体細胞１３の種類によって成分調整されるものであり、通常は被検体細胞１３が生体内で活動するときの細胞外の溶液とほぼ同じ成分に調整される。具体的には、例えば哺乳類筋細胞の場合、細胞外液１２とはＫ+イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ+イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ-イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。
【００４６】
その後、筒部品１の空洞部の上部および下部から、それぞれに測定電極１４ａ，１４ｂを挿入する。このとき、測定電極１４ｂは筒部品１の内部側に設けた吸引治具１５の中にセットされた状態で挿入する。そして、好ましくは、この吸引治具１５の外形は第二の開口部８の第一の開口部７側の内径よりわずかに大きくしている。これによって、吸引治具１５は圧入するように隙間無くソケット６にセットすることができることから、筒部品１の下部が密閉され、吸引治具１５で吸引することによって圧力リークが発生することなく細胞内液１１を充填した下部側の圧力を容易に変更することができる。
【００４７】
次に、図１１に示すように、測定電極１４ａ，１４ｂ間に計測器１６を接続すると、センサチップ２によって仕切られた細胞外液１２と細胞内液１１の間の電気的変化を測定することができる。これは、貫通孔５が細胞内液１１および細胞外液１２によって満たされることで構成される電気的回路であり、その特性として、例えば、電気抵抗、Ｉ−Ｖ特性等として観測することができ、例えば電気抵抗値を測定すると通常、１ＭΩ程度の電気抵抗値を持つ。
【００４８】
なお、計測器１６としては通常のパッチクランプ法で用いるアンプ計測器などを使用することができ、これは細胞の電気生理現象を測定するのに好都合である。
【００４９】
つまり、パッチクランプ用のセットを大きく変えることなく、ガラスマイクロピペットに代えて本実施の形態１における細胞電気生理センサを用いることで、顕微鏡やマニュピレータ等で頻雑な作業を行うことなく細胞の電気生理現象の測定を行うことができるようになる。
【００５０】
次に、図１２に示したように細胞外液１２側に被検体細胞１３を投入する。このとき、被検体細胞１３は細胞外液１２と同成分の溶液に所定の濃度で分散させたものとして供給することができる。これによって、浮遊性細胞であっても容易に測定部である貫通孔５の近傍へ細胞を供給することができる。
【００５１】
その後、細胞内液１１側から吸引治具１５を通して吸引すると、被検体細胞１３は貫通孔５へ引きつけられて貫通孔５の上で薄板３と密着するようになる。このとき、被検体細胞１３が貫通孔５に密着したかどうかは、計測器１６によって電気抵抗を測定することで判別することができる。
【００５２】
通常、被検体細胞１３が貫通孔５に到達したときには数ＭΩとなり、十分密着した場合には数十ＭΩから数ＧΩになる。このときの抵抗値はシール抵抗と呼ばれ、この抵抗値が高いほどノイズが少なくなるので、測定したい対象によって必要なシール抵抗値が得られるように吸引圧力を最適化すべきであるが、この工程はギガシール形成工程と呼ばれ、パッチクランプ法と全く同じである。
【００５３】
次に、図１３に示したように、さらに吸引圧力を高めることで、貫通孔５の被検体細胞１３の微小な細胞膜の一部分に細胞膜穴１７を形成する。
【００５４】
これによって、一つの被検体細胞１３の全細胞膜の領域に存在するイオンチャネルを流れる電流を測定できるようになり、各種のイオンチャネルの電気的特性（例えば、Ｉ−Ｖ特性）、薬剤に対する反応特性、その他外的刺激に対する反応等を測定することができる。
【００５５】
なお、細胞膜に微小な細胞膜穴１７を形成する工程はホールセルと呼ばれ、パッチクランプ法で行うのと全く同じである。
【００５６】
さらに、図１４に示したように本実施の形態１の別の例の細胞電気生理センサを用いた測定方法として、センサチップ２が筒部品１の中間にある細胞電気生理センサを用いることによって、センサチップ２の上部に細胞外液１２をより投入しやすくなり、細胞内液１１の投入と同様、気泡が残留することなく容易に細胞外液１２を充填することができる。
【００５７】
以上、述べてきたように本実施の形態１における細胞電気生理センサでは、貫通孔５が形成された薄板３を持つセンサチップ２を筒部品１の内部に設置しているため、被検体細胞１３を含む溶液および測定の際に要する溶液を、それぞれ、センサチップ２によって仕切られている筒部品１の中空部に投入し、センサチップ２を介して圧力差を発生させることで、容易に被検体細胞１３を薄板３の貫通孔５に容易に密着させることができるようになる。
【００５８】
これによって、たとえ浮遊性の細胞であっても顕微鏡などを必要とすることなく、また高精度なマニュピレータ制御なども行う必要のない、簡便な取り扱いのできる細胞電気生理センサを実現することができる。
【００５９】
（実施の形態２）
以下、本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサについて、図面を用いて説明する。図１５は本発明の実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図であり、図１６はその要部拡大断面図である。図１５および図１６において、本実施の形態２における細胞電気生理センサの構成は、第一の開口部２０と第二の開口部２１を有するソケット１８と、枠体２４と貫通孔２２を持つ薄板２３とからなるセンサチップ１９から構成しており、基本的な構成は実施の形態１における細胞電気生理センサとほぼ同様の構成をしており、本実施の形態２における細胞電気生理センサの構成で、特に異なっている点はソケット１８を一体材料にて構成していることである。このように、ソケット１８を一体材料にて形成していることによって、細胞電気生理センサの製造をより簡単に行うことができるという利点を有している。そして、その使用方法等は実施の形態１で説明したものとほぼ同じであり、同じ効果を有している。
【００６０】
なお、ソケット１８に用いる一体材料としては樹脂、ガラス、セラミック等の絶縁体であることが望ましい。そして、金属を用いる場合には、少なくとも金属の表面を絶縁化しておく必要がある。この絶縁化の方法としては、樹脂またはガラスを被覆しておくことによって実現することができる。
【００６１】
また、特にソケット１８を樹脂あるいはガラスとした場合、実施の形態１と同様に加熱によってセンサチップ１９を接着剤を使わずに強固に接合することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
以上のように本発明にかかる細胞電気生理センサは、細胞の電気生理現象の効率的な測定を可能にするので、高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの断面図
【図２】同要部拡大断面図
【図３】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図４】同さらに別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図５】同下面図
【図６】同要部拡大断面図
【図７】同細胞電気生理センサの製造方法を説明するための断面図
【図８】同断面図
【図９】同細胞電気生理センサの使用方法を説明するための断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同断面図
【図１２】同要部拡大断面図
【図１３】同要部拡大断面図
【図１４】同別の例の細胞電気生理センサの使用方法を説明するための断面図
【図１５】本実施の形態２における細胞電気生理センサの断面図
【図１６】同要部拡大断面図
【符号の説明】
【００６４】
１  筒部品
２  センサチップ
３  薄板
４  枠体
５  貫通孔
６  ソケット
７  第一の開口部
８  第二の開口部
９  段差部
１０  棒材
１１  細胞内液
１２  細胞外液
１３  被験体細胞
１４ａ  測定電極
１４ｂ  測定電極
１５  吸引治具
１６  計測器
１７  細胞膜穴
１８  ソケット
１９  センサチップ
２０  第一の開口部
２１  第二の開口部
２２  貫通孔
２３  薄板
２４  枠体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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