(57)【要約】【課題】エレクトロポレーション法の遺伝子導入効率の上昇を達成することが、本発明の課題である。【解決手段】本発明により、グルコサミン及び／又はその誘導体並びに導入しようとする目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む緩衝液中で細胞にエレクトロポレーション法を行うことにより、該細胞に該目的遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法が提供された。本発明の方法によれば遺伝子導入効率の向上を図ることができる。またグルコサミン及び／又はその誘導体は細胞活性化能及び組織再生効果を有するので、エレクトロポレーション時の電気パルスによる物理的な細胞膜への傷害に対応することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコサミン及び／又はその誘導体並びに導入しようとする目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む緩衝液中で細胞にエレクトロポレーション法を行うことにより、該細胞に該目的遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
【請求項２】
前記グルコサミンの誘導体が、グルコサミンの塩である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記グルコサミンの塩が、塩酸塩、乳酸塩、酢酸塩、リン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記グルコサミン及び／又はその誘導体の濃度が0.0005％から0.1％である請求項１から請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記グルコサミン及び／又はその誘導体の濃度が0.002％から0.01％である請求項４項記載の方法。
【請求項６】
前記グルコサミン及び／又はその誘導体の濃度が0.005％である請求項５項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコサミン及び／又はその誘導体並びに導入しようとする目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む緩衝液中で細胞にエレクトロポレーション法を行うことにより、該細胞に該目的遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞へ遺伝子を導入する方法として現在知られているものには、DNA-デキストラン法、プロトプラスト法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター法の７つがあげられる。これらのうち、エレクトロポレーション法は電気穿孔法とも呼ばれるように、適切な電気刺激（電圧パルス）によって細胞の機能を損なうことなく、一時的に細胞膜構造を不安定にして穴をあけ、そこから外来の核酸を取り込ませる方法である。エレクトロポレーション法は簡便に行えるために、あらゆる細胞に対して利用可能であるが、特に付着培養細胞への遺伝子導入には便利である。しかし付着細胞への遺伝子導入効率は50-60%であり、その効率において必ずしも満足がいくものではない。
【０００３】
一方、キトサンはカニ、エビなどの甲殻類に含まれている天然の多糖類であり、健康補助食品、特定保健用食品として利用されている。その安全性、生体親和性および生分解性という特性に着目し、キトサンに関して、創傷治癒・硬組織形成促進、免疫能亢進、抗菌効果を期待した基礎的、および臨床的な研究が進められている。本発明者らは水溶性、低分子量のキトサンモノマー、すなわちグルコサミンを用いて、初期炎症の誘発を起こすことなく組織再生効果ならびに石灰化能の亢進効果を得られ、組織再生剤として使用できることを見出している（例えば、特許文献１、非特許文献１参照）。よってキトサンモノマーは、天然由来の有用な有機生理活性素材である。
【０００４】
また、培養細胞へ遺伝子を導入する際にキトサンを使用することは従来から行われている。しかし、これまでの報告はオリゴマー、ポリマータイプのキトサンに関するものである。そして、遺伝子を導入する際にモノマータイプのキトサン、すなわちキトサンの構成単位であるグルコサミンを利用した報告はこれまでない。オリゴマー、ポリマータイプのキトサンはそれ自体で遺伝子のキャリアとなり、導入しようとする遺伝子と複合体をつくって細胞内へ取り込まれる。このようなオリゴマー、ポリマータイプのキトサンを利用した遺伝子導入は、キトサンの細胞膜への為害作用、すなわち、キトサンを用いて細胞膜に傷害を起こすことによって細胞内へ遺伝子が取り込ませるという発想に基づいている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００５】
【特許文献１】特願２００４−１０７２６５号公報
【非特許文献１】T. Matsunagaら、「Journal of Biomedical Materials Research」76A, 711-720, 2006
【非特許文献２】M. Koping-Hoggardら、「Gene Therapy」11, 1441-1452, 2004
【非特許文献３】M. Mohamed et alら、「Journal of Controlled Release」115, 103-112, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、エレクトロポレーション法により細胞へ遺伝子導入する際の、遺伝子導入効率の上昇を達成することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明者らは、生体親和性の高いキトサンを中心に鋭意研究を進めた結果、キトサンの構成単位であるグルコサミンが、エレクトロポレーション法の遺伝子導入効率の向上に有効であることを見出した。キトサンの構成単位であるグルコサミンを用いることにより、導入細胞への保護効果を期待することができる。
【０００８】
よって本発明は、グルコサミン及び／又はその誘導体並びに導入しようとする目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む緩衝液中で細胞にエレクトロポレーション法を行うことにより、該細胞に該目的遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法を提供する。そのグルコサミン誘導体は、好ましくは塩であり、特に塩酸塩、乳酸塩、酢酸塩、リン酸塩およびクエン酸塩からなる群から選択される少なくとも１種の塩であるとより好ましい。更に本発明においてグルコサミンおよび／またはその誘導体の濃度は0.0005％から0.1％であり、好ましくは0.002％から0.01％であり、最も好ましくは0.005％である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、グルコサミン及び／又はその誘導体並びに導入しようとする目的遺伝子を挿入したプラスミドベクターを含む緩衝液中で細胞にエレクトロポレーション法を行うことにより、該細胞に該目的遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法が提供された。本発明は、エレクトロポレーション法による遺伝子導入の効率の向上に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明を詳細に説明する。本発明の方法によればエレクトロポレーション法を行う際にグルコサミンを添加するだけで遺伝子導入効率の上昇を達成することができるので、本発明の方法は操作が容易かつ簡便である。キトサンの構成単位であるグルコサミンは、カニ、エビの殻を原料として得られ、グルコサミンは１Kgが5000円程度と、試薬としては極めて安価である。またグルコサミンは生体成分であることから安全性も高く、汎用性が極めて高い。
【００１１】
更にグルコサミンを添加することによって、特許文献１や非特許文献１に記載されているような細胞保護効果を期待することができる。すなわち、培養細胞でエレクトロポレーションを行う際にグルコサミンによる細胞膜に対する保護効果を期待することができ、ひいては動物の組織や臨床において細胞の創傷治癒の促進を期待することができる。
【００１２】
上記で述べたように、オリゴマー、ポリマータイプのキトサンはそれ自体で遺伝子のキャリアとなる。しかしオリゴマー、ポリマータイプのものを含めてキトサンがエレクトロポレーション法で併用されたことはなく、エレクトロポレーション法においてキトサンを用いることは本発明において初めて行なわれた。
【００１３】
本発明で使用するグルコサミンを使用する場合、脱アセチル化したものが効果的であり、脱アセチル化度は高い方が好ましく、脱アセチル化度１００％であると最も好ましい。さらに、グルコサミンの誘導体としては、非限定的に、下記に示すカルボキシメチル化グルコサミン［化１］あるいは硫酸化グルコサミン［化２］を例示でき、細胞保護効果を損なわない範囲で、他の誘導体も使用可能である。
【００１４】
【化１】
2008278815.tif 000002
【００１５】
【化２】
2008278815.tif 000003
【００１６】
なお本発明による遺伝子導入方法は、初代培養細胞と株化細胞の両者に使用することができる。また付着細胞、浮遊細胞の両者に対して本発明による遺伝子導入方法を使用することができるが、付着細胞の方がより好適である。使用できる付着細胞の例として、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞（特に歯科領域では歯髄細胞、歯根膜細胞を含む）、骨芽細胞、心筋細胞、筋肉細胞、神経細胞、肝細胞（実質細胞、胎児細胞）、癌細胞、胚細胞（胎生幹細胞、間葉系幹細胞）などを挙げることができる。しかし使用される細胞は発明の実施の目的に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。
【００１７】
また本発明の方法により導入される目的遺伝子としては、アルカリフォスファターゼ、Cbfa 1/Runx 2、オステリックス、オステオポンチン、骨シアロタンパク質、骨形成タンパク質、オステオネクチン、形質転換成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子などの蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。更には、これらの遺伝子の発現及び蛋白質合成を抑制するためのsiRNAs (small interfering RNAs)も使用することが可能である。しかし導入される目的遺伝子は発明の実施の目的に応じて適宜選択され、特に限定されるものではない。
【００１８】
本発明の方法を実施する１態様を以下に述べるが、本発明は以下の態様に限定されるものではない。
【００１９】
まず付着細胞を培養して準備しておく。しかし本発明の方法を付着細胞のみならず、浮遊細胞に用いることも可能である。なおエレクトロポレーションを行う時点の細胞の状態がサブコンフルエントであることは本発明において好ましい。
【００２０】
次にエレクトロポレーション用の緩衝液を調製する。ここで用いる緩衝液として、Earle液、Hanks液、Ringer液、Locke液、Tyrode液、Krebs液、Dulbeccoリン酸緩衝液など本技術分野において通常に使用されるものを挙げることができ、かかる緩衝液にキトサンを添加してエレクトロポレーションを行うことができる。なおエレクトロポレーション用緩衝液におけるグルコサミン及び／又はその誘導体の濃度は0.0005％から0.1％、好ましくは0.002％から0.01％、最も好ましくは0.005％であり、血清および抗生剤無添加の培地に溶解して用いるのが好ましい。
【００２１】
培養培地をエレクトロポレーション用の緩衝液に交換しエレクトロポレーションを行う。エレクトロポレーション用の電極は板状、線状のものを使用することができ、線状のものが特に好ましい。エレクトロポレーションの好適な条件は、電圧は100-150Vであり；電流は1.0-10.0A、好ましくは2.0-6.0Aであり；パルス幅はON 1-10m秒、OFF 50-150m秒の間隔、好ましくは5m秒、OFF 95秒の間隔であり；通電回数は1-10回、好ましくは5回であり；実抵抗は5-30Ωである。また、導入効率向上のためプラスとマイナス極を入れ替えて2回通電することが好ましい。しかし、エレクトロポレーションを行う条件はこれに限定するものではなく、当業者は使用する細胞や導入する目的遺伝子などの性質に応じて、最も適したエレクトロポレーションの条件を適宜設定することができる。なおエレクトロポレーションを行った後は、1〜２日間は抗生剤無添加の培地で培養することが好ましい。
【００２２】
また本発明の方法は培養細胞のみならず、エレクトロポレーションにより組織へ遺伝子を導入する目的にも利用することができる。すなわち、本発明の方法を、動物実験や臨床に応用することができる。なお臨床応用を行うにあたっては、組織への過剰な電流による電気傷害が起きない条件を事前に動物実験で検討・確認しておく必要がある。なお、組織への適用や、臨床的な応用の態様について以下に述べる。
【００２３】
（軟組織）
遺伝子とグルコサミンを含有した緩衝液を遺伝子導入部へ注射器で注入する。その後、注入部組織を挟むように板状あるいはクリップ状の電極を装着し、電圧を負荷する。通電後はグルコサミン粉末を表面に塗布する。
【００２４】
（硬組織）
（１）歯
齲蝕（虫歯）により生じた歯質欠損が特に深い時、露髄によって歯髄が露出することがある。このような場合に本法を行うには、まず露出歯髄に遺伝子とグルコサミンを含有した緩衝液を滴下したのち、専用の針電極（＋、−極を1mm幅で固定）を挿入する。その後、電圧を負荷する。通電後はグルコサミン粉末を露髄面に塗布し、歯科用セメントで被覆する。
【００２５】
（２）骨
骨の欠損部への応用時は、まず欠損部に遺伝子とグルコサミンを含有した緩衝液を滴下あるいは注入し、針電極ないしは線電極を挿入する。その後、電圧を負荷する。通電後はグルコサミン粉末を露出骨面に塗布し、皮膚弁を縫合する。
【実施例】
【００２６】
本発明を実施例により具体的に説明する。
（１）細胞の調製
ヒト骨肉腫由来の骨芽細胞株NOS-1細胞を使用する。エレクトロポレーションを行う前日に細胞が100%コンフルエント手前（70-80%）となるよう継代培養を行っておく。定法により継代操作を行い、直径35mmのガラス底培養皿（MatTek 社、No.P35Gcol-1.5-14-C）へ5×105個/培養皿となるよう細胞を播種する。この時の培地としては、抗生剤(ペニシリン、ストレプトマイシン)無添加のα-MEMを使用する。
【００２７】
（２）キトサンの調製
0.1%(v/v)酢酸で溶解し1%(v/v)キトサンモノマー（D-グルコサミンの塩酸塩、甲陽ケミカル社）のストック溶液を作製する。
【００２８】
（３）使用したベクター（vector、媒介体）
pIRE2-EGFP(BD Bioscience Clontech社)のXhol-BamHIサイトにBMP-2遺伝子を挿入してプラスミドを構築し、緩衝液中で10μg/mLの濃度とする。このプラスミドが導入された細胞は緑色蛍光蛋白質（GFP）に由来する蛍光を発するので、その蛍光は遺伝子導入のインディケーターとなる。
【００２９】
（４）電極および導入装置（エレクトロポレーター）
付着細胞用の線電極、および遺伝子導入装置としてトキワサイエンス社のCUY21Bを使用する。
【００３０】
（５）エレクトロポレーション用緩衝液の調製
エレクトロポレーション用の緩衝液として、血清無添加の培地を使用する。血清無添加のα-MEM（抗生剤なし）で細胞を1回洗浄した後、同液を1mL加える。エレクトロポレーション用緩衝液にグルコサミンを添加し、濃度が0.005%とする。
【００３１】
今回の実施例におけるエレクトロポレーション時の通電設定条件は、以下のとおりである。
(i)    設定電圧：120V
(ii)   シャーレ底に気泡が残らないように圧接・確認
(iii)  ON 5msec, OFF 95m秒の間隔で、5回通電
(iv)   電極のプラスとマイナスを入れ替える。
(v)    ON 5msec, OFF 95m秒の間隔で、5回通電
(vi)   電流を流す前に抵抗を測定・確認する。抵抗：10-15Ω程度
(vii)  実効電圧：40-70V程度
(viii) 電流：4.0-4.4A程度
【００３２】
（６）エレクトロポレーション後の調整
抗生剤を含まない10%FBS添加α-MEMで1回洗浄後、同液を入れ培養する。抗生剤添加培地は次回交換時から使用する。
【００３３】
（７）蛍光顕微鏡観察条件の調整
１日後に蛍光観察を行う。ネガテイブコントロールで細胞から自家蛍光の認められない最大電圧を設定して細胞を観察する。
【００３４】
（８）観察結果の評価
細胞内を明瞭に観察するため63倍対物オイルレンズ使用する。透過光で観察した視野を画像として取り込み、次に同部位の蛍光（GFPの緑色）画像を取り込む。導入効率は、透過光で認識されるNOS-1細胞数に対する蛍光発色細胞数の割合で求めた。細胞の蛍光画像を図１に示す。図１において、左列は蛍光画像であり、右列は透過光画像である。さらに図１において、上段はエレクトロポレーションを行わない無処置群であり、中段はグルコサミン無添加でエレクトロポレーションを行なった群であり、下段はグルコサミン添加してエレクトロポレーションを行った群である。
【００３５】
図１に示した画像では、グルコサミン添加群（下段）では蛍光発色細胞数の割合は約82％であるのに対して、グルコサミン無添加群（中段）では約50％であった。この結果から、エレクトロポレーションを行う際にグルコサミンを添加することにより、遺伝子導入効率は30％程度上昇した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明により、エレクトロポレーション法の遺伝子導入効率を向上させるための方法が提供された。本発明においては、エレクトロポレーション時の緩衝液中にキトサンモノマー（グルコサミン）が存在していることにより、細胞の電気的刺激やストレスに対して防御効果を示している。本発明によれば、安価なキトサンモノマー（グルコサミン）を用いて、それを添加するという簡便な方法により遺伝子導入効率を向上させることができるので、その意義は大きく、種々の応用を期待することができる。また、エレクトロポレーターの製造、販売メーカーが付着細胞への一連の遺伝子挿入法のマニュアルに記載して付加価値を付けた機器の販売が可能となる。さらに将来的には、本発明の方法を細胞のみならず組織に適用することや、臨床的に応用することも期待することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、NOS-1細胞において、グルコサミンの有無におけるエレクトロポレーションの効率を比較した細胞の顕微鏡画像である。
【図１】
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