(57)【要約】      （修正有）【課題】塩化ビニルを分解する能力を有する微生物を、簡便に検出することのできる方法の提供。【解決手段】塩素化エチレン分解細菌 Dehalococcoidesの、特定の塩基配列を有する１６ｓ ｒＤＮＡの一部を鋳型としてＰＣＲを行ない、その産物の融解曲線分析を行う工程を有する、該細菌の塩化ビニル分解能の判定方法及び上記ＰＣＲプライマー用オリゴヌクレオチドを含む判定用キット。更に土壌等の試料に上記方法を適用する汚染土壌等浄化手段の決定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩素化エチレン分解細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた合成産物の融解曲線分析を行うことを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法。
【請求項２】
配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法。
【請求項３】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用い、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法。
【請求項４】
配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キット。
【請求項５】
配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キット。
【請求項６】
配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キット。
【請求項７】
地下水又は土壌を試料として、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を行い、得られたＴｍ値分布の特徴から、バイオスティミュレーション又はバイオオーグメンテーションの適用好適性を判断することを含む、嫌気的バイオレメディエーションにより汚染地下水又は土壌を浄化するための浄化手段決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩素化エチレン分解細菌の塩素化エチレン分解能を簡便に判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年において科学技術が発展し、それに伴い、種々の化学物質が利用されるようになってきており、土壌や地下水が各種の有害難分解物質によって汚染されることが問題となっている。特に、テトラクロロエチレン（以下、「ＰＣＥ」ともいう）、トリクロロエチレン（以下、「ＴＣＥ」ともいう）、シス−１，２−ジクロロエチレン（以下、「ｃＤＣＥ」ともいう）、塩化ビニル（以下、「ＶＣ」ともいう）等の塩素化エチレンによる環境汚染、特に地下水、土壌の汚染は世界的に深刻な問題となっている。これらの塩素化エチレンは、土壌中に残留したものが雨水等によって地下水中に溶解して、周辺に広がるものとされている。このような塩素化エチレンは、水に対する溶解性が低く、また化学的に安定な化合物であることから、いったん環境中に放出されると、長期間にわたって土壌や地下水中に蓄積してしまう。
【０００３】
一方で、塩素化エチレンのヒトに対する毒性が指摘されており、ＰＣＥ、ＴＣＥ及びｃＤＣＥについてはｐｐｂレベルでの環境基準値が設定されており、これらの塩素化エチレンによって汚染された土壌、地下水の浄化方法について、様々な研究がなされている。そのような研究の中でも、微生物を用いた浄化方法は、物理・化学的方法に比べて浄化コストが低いこと、また大がかりな掘削をする必要がなく、稼働中の工場等に隣接した場所における浄化が可能であること等の理由から、近年特に注目されている。塩素化エチレンを無害化することのできる微生物には、好気性微生物と嫌気性微生物との両者が存在する。前者は、メタン、トルエン、フェノール等の誘導物質の存在下に、共酸化的に塩素化エチレンを分解するものであり、現場での適用には通気を必要とするため、コスト高となることから、現場で実施する例は少ない。これに対し、嫌気性微生物を用いる浄化には通気の必要がなく、かつ分解微生物がエネルギー源として塩素化エチレンを必要とするため、誘導物質を添加する必要がないことから、低コストでの浄化が可能となり、近年注目されつつある。
【０００４】
嫌気性微生物による塩素化エチレンの分解（脱塩素化反応）は、一般的にテトラクロロエチレン→トリクロロエチレン→シス−１，２−ジクロロエチレン→塩化ビニル（以下、「ＶＣ」ともいう）→エチレンの順に進行する。塩素化エチレンを分解することのできる微生物の中で、ｃＤＣＥをＶＣ、エチレンにまで分解できる微生物として、現在知られているのは、Dehalococcoides属の微生物のみである。しかし、Dehalococcoides属の微生物の中にも、種々の種類が存在しており、ＶＣをエネルギー源として利用して生育できるものと、できないものとがあることが報告されている（非特許文献１、２及び３参照）。ＶＣをエネルギー源として利用することのできないDehalococcoides属の場合は、ＶＣの分解はコメタボリズムによるものであり、その分解は非常に遅く進行することが報告されている（非特許文献４）。
従って、ＶＣをエネルギー源として利用できないDehalococcoides属微生物が優占化している塩素化エチレン汚染現場においては、バイオスティミュレーションによる浄化を試みても、塩素化エチレンの分解がＶＣで停止してしまうことが予想される。
【０００５】
塩化ビニルについては、現在のところ、環境基準値が設定されていないが、塩素化エチレンの中では、唯一、発癌性が証明されている物質であり、浄化工程においては、当然ながら残存することは好ましくない。また、ＶＣに対しては、「水質汚濁に関わる要監視項目」として、０．００２ｍｇ／Ｌ以下という低い指針値が設定されている。
【０００６】
従来より、塩素化エチレン分解菌であるDehalococcoides属微生物を検出する方法として、Dehalococcoides属の１６Ｓ  ｒＤＮＡの解析が行われているが、１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列と、塩素化エチレン分解能との関連性は明確ではない。
【０００７】
さらに、ＴＣＥ分解酵素遺伝子であるｔｃｅＡの配列および検出に関する報告もなされている（非特許文献４）が、本遺伝子がコードする酵素であるＴｃｅＡのＶＣ分解能は非常に低く、浄化現場地下水、土壌においてｔｃｅＡ遺伝子を有する微生物が検出されたとしても、塩素化エチレンの分解はＶＣで停止してしまうという事態が起こり得ると考えられる。
【０００８】
近年、ＶＣ分解遺伝子に関し、相次いで２例の報告がなされている。一方はDehalococcoides sp. VS株のｖｃｒＡ（非特許文献５）であり、他方はDehalococcoides sp. BAV1株のｂｖｃＡ（非特許文献６）である。これら２つの報告には、特定のDehalococcoides属微生物株のＶＣ分解遺伝子の存在およびその配列について記載されている。さらに近年、ｖｃｒＡ遺伝子およびｂｖｃＡ遺伝子の定量検出方法についても提案がなされている（非特許文献７）。しかし、ＶＣ分解酵素遺伝子を持つDehalococcoides属微生物が環境中にどの程度存在しているのか、これらのＶＣ分解酵素遺伝子の塩基配列に多様性はあるのか、またＶＣ分解遺伝子としてはこれら２種類以外には存在しないのか、といった点についてはまだ、明らかとなっていない。
【０００９】
上記のとおり、Dehalococcoides属細菌にはＶＣを分解できるものと、できないものとが存在することが明らかになりつつある。そのため、地下水、土壌を汚染している塩素化エチレンをバイオレメディエーションにより確実にエチレンにまで分解させるためには、浄化開始前にあらかじめＶＣ分解菌が汚染現場に存在するか確認することが好ましく、このための簡便な方法の確立が望まれている。
【００１０】
しかし、ＶＣ分解菌および分解遺伝子に関する報告例、知見はまだ数少ないため、限定された知見に基づき特定の配列を有する遺伝子のみを調べることで、塩素化エチレン汚染現場でのバイオレメディエーションの適用性を判断することには不安があった。
上記非特許文献７の定量検出法によるＶＣ分解遺伝子の検出においては、当然ながら対象とする遺伝子と塩基配列が異なるＶＣ分解遺伝子を検出することはできず、ＶＣ分解能を有するDehalococcoides属微生物の存在を過小評価してしまう可能性がある。さらに、定量検出に用いるプライマーやプローブ等の塩基配列が少しでも測定対象の塩基配列と異なっていれば原理的に検出不可能となる恐れがある。
【００１１】
【非特許文献１】He et al., Nature, vol.424, 62-65
【非特許文献２】Szewzyk et al., Nature, vol.408, 580-583
【非特許文献３】Maymo-Gatell et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.65, 3108-3113, 1999
【非特許文献４】Magnunson, J. K. et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.66, 5141-5147, 2000
【非特許文献５】Muller J. A. et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.70, 4880-4888, 2004
【非特許文献６】Krajmalnik-Brown R. et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.70, 6347-6351, 2004
【非特許文献７】Sung Y. et al., Applied and Environmental Microbiology, vol.72, 2765-2774, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来の特定のVC分解遺伝子に着目した定量検出法による、バイオレメディエーションの適用可否判断においては、当然ながら対象とする遺伝子とは塩基配列が異なるVC分解遺伝子を検出することはできず、VC分解能を有するDehalococcoides属細菌の存在を過小評価してしまう可能性があるとともに、定量検出に用いられるプライマーやプローブ等の塩基配列が少しでも測定対象の塩基配列と異なっていると、原理的に検出不可能となる恐れがある。
【００１３】
また、VC分解遺伝子としては、これまでに２タイプのみが知られているが、これらが環境中に存在するVC分解遺伝子の主要なタイプであるのか、あるいは２タイプの環境中での存在割合はどの程度かといった点については明らかにされていない。
浄化現場地下水や回分バイアル試験の培養液中におけるVCの分解性と、その時に優占的に存在するDehalococcoides属細菌のタイプの関連性を調べ、VC分解能を有するDehalococcoides属細菌の存在を簡便かつ短時間で調べることのできる方法はこれまで考案されていなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、特定の塩基配列を有するＤＮＡを用いることにより、簡便にＶＣ分解細菌を検出することが可能であるという知見を得た。
本発明は、上記知見に基づいてなされたものであり、塩素化エチレン分解細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた合成産物の融解曲線分析を行うことを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用い、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して      ９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットを提供する。
【００１８】
また、本発明は、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、  配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットを提供する。
【００１９】
また、本発明は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットを提供する。
【００２０】
また、本発明は、地下水又は土壌を試料として、前記方法を行い、得られたＴｍ値分布の特徴から、バイオスティミュレーション又はバイオオーグメンテーションの適用好適性を判断することを含む、嫌気的バイオレメディエーションにより汚染地下水又は土壌を浄化するための浄化手段決定方法を提供する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法によれば、ＰＣＲ合成により得られた１６ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を決定し、Dehalococcoides属細菌のタイプを調べたり、またｖｃｒＡやｂｖｃＡ等の、個々のＶＣ分解酵素遺伝子の定量解析を行うといった煩雑な手順を踏むことなく、塩素化エチレン汚染地下水、土壌中に存在するDehalococcoides属細菌のＶＣ分解能を調べることが可能となる。また、調べた結果に基づき、その地下水、土壌のバイスティミュレーションによる浄化が可能であるか、又はＶＣ分解細菌を利用したバイオオーグメンテーションの適用が好ましいかの判断をすることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、先ず本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法について説明する。
まず、本明細書において使用される用語についての定義を説明する。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸」は、同じ意味で使用されるものとし、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味する。
本明細書において、「核酸」は、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドと互換可能に用いられる。
本明細書において、「ヌクレオチド」は、天然のものであっても非天然のものであってもよい。
【００２３】
本明細書において、「プライマー」、「ハイブリダイゼーションプローブ」とは、適切な条件下（例えば、４種類の異なるヌクレオシド三リン酸及びポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、又は逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中、適切な温度の下、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される用途に依存するが、少なくとも１０オリゴヌクレオチドの長さであり、好ましくは１５ヌクレオチド以上の長さであり、より好ましくは１７ヌクレオチド以上の長さである。また、長さの上限は、通常は４０ヌクレオチド以下であり、好ましくは３０ヌクレオチド以下である。更に好ましくは、本発明のプライマー又はハイブリダイゼーションプローブは、長さが１８〜２９ヌクレオチドの範囲である。
【００２４】
発明者らはこれまで、日本国内各所における塩素化エチレン汚染現場に存在するDehalococcoides属細菌の16S rDNAの解析を行ってきた。その結果、国内の汚染現場においてはVCを分解できるDehalococcoides属細菌と、分解できないDehalococcoides属細菌の16S rDNAの配列の一部に、明確な違いが存在することを見出した。そこで、この違いを利用してVC分解能の有無を評価できるよう、この部分の配列をハイブリダイゼーションプローブ配列として利用することを考えた。その結果、リアルタイムPCR法に融解曲線分析を組み合わせることにより、Tm値の相違からVC分解能を判定することが可能であることを見出した。
すなわち、本発明は、塩素化エチレン分解細菌の１６ｓ  ｒＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、得られた合成産物の融解曲線分析を行うことを含む、塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を提供する。
【００２５】
以下に、VCを分解できるタイプのDehalococcoides属細菌（配列番号５）及びVCを分解できないタイプのDehalococcoides属細菌（配列番号６）の16S rDNAの一部を示す。該当部分の配列を示す
GTAGTGAACTGAAAGGGGAACGACCTGTTAAGTCAGGAACTTGCACAGGTG(配列番号５)
GTAGTGAACCGAAAGGGAAACGACCTGTTAAGTCAGGAGTTTGCACAGGTG（配列番号６）
両者の相違点は、１０番目の塩基が配列番号５においてはTであるのに対し、配列番号６においてはCになっている点、１８番目の塩基が配列番号５においてはGであるのに対し、配列番号６においてはAになっている点、３９番目の塩基が配列番号５においてはAであるのに対し、配列番号６においてはGになっている点、及び４０番目の塩基が配列番号５においてはCであるのに対し、配列番号６においてはTになっている点である。
【００２６】
また、既に報告されている、Dehalococcoides ethenogenes 195株（上野俊洋ら, 地下水・土壌汚染とその防止対策に関する第8回講演集, pp361〜362, 2002）（Maymo-Gatellら、Science, 276, 1568-1571）の１６ｓ  ｒＤＮＡ（Accession Number:AF004928）の配列、及び独自に流動床式塩素化エチレン連続処理リアクターより採取した１６ｓ  ｒＤＮＡクローンの塩基配列を元にプライマーを設計した（以下の配列番号１及び配列番号２）。なお、Dehalococcoidesethenogenes 195株の１６ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を、配列番号７に示す。
ＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＴＴ（配列番号１）
ＧＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＴＡＧＣ（配列番号２）
【００２７】
本発明において用いられるプライマーとしては、上記配列番号１及び配列番号２で表わされるオリゴヌクレオチドに限定されず、配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドが用いられる。すなわち、特異性が確認されているものであれば、特に制限なく用いることが可能である。用いられるプライマーは、より好ましくは１７塩基以上の長さであり、また長さの上限は、通常は４０ヌクレオチド以下であり、好ましくは３０ヌクレオチド以下である。更に好ましくは、本発明のプライマーは、長さが１８〜２９ヌクレオチドの範囲である。
【００２８】
なお、上述した、配列番号５で表わされる塩基配列と、配列番号６で表わされる塩基配列との相違箇所は、配列番号７においては、それぞれ、９５４番目、９６２番目、９８３番目及び９８４番目となる。すなわち、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法においては、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いている。本発明において用いられるプローブとしては、少なくとも１０ヌクレオチドの長さのものが用いられ、好ましくは１５ヌクレオチド以上の長さであり、より好ましくは１７ヌクレオチド以上の長さである。また、長さの上限は、通常は４０ヌクレオチド以下であり、好ましくは３０ヌクレオチド以下である。更に好ましくは、本発明のハイブリダイゼーションプローブは、長さが１８〜２９ヌクレオチドの範囲である。
【００２９】
本発明において用いられるハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、以下の配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
GTAGTGAACTGAAAGGGGAACGACC  （配列番号３）
GTTAAGTCAGGAACTTGCACAGGTG  （配列番号４）
【００３０】
本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法は、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用いて、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法は、配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションプローブとして用い、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行い、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無を判定することを特徴とする。
【００３２】
本発明においては、上記構成を有することにより、リアルタイムＰＣＲ法及び融解曲線分析を組み合わせて、検体中の塩化ビニル分解能を有する塩素化エチレン分解菌の有無の判定が可能となる。すなわち、リアルタイムＰＣＲ法により得られるオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行った場合、ＶＣ分解能を有するDehalococcoides属細菌においては、Ｔｍ値が６６〜６７℃を示すのに対し、ＶＣ分解能を有しないものの場合には、そのＴｍ値が５７〜５８℃であることから、容易に区別をすることができる。ＶＣ分解能を有するDehalococcoides属細菌の場合、配列番号５で表わされる塩基配列を、その１６ｓ  ｒＤＮＡ中に有しており、従って、上記ハイブリダイゼーションプローブからヌクレオチドが増幅され、この産物を検出することになる。一方、ＶＣ分解能を有しないDehalococcoides属細菌の場合、配列番号５で表わされる塩基配列を、その１６ｓ  ｒＤＮＡ中に有していないため、上記ハイブリダイゼーションプローブからヌクレオチドが増幅されない。このため、両者では、増幅されるＰＣＲ産物の長さと塩基配列が異なっており、両者の融解温度が異なるため、融解曲線分析を実施することにより、両者を区別することが可能となる。ＶＣ分解能を有するDehalococcoides属細菌と、ＶＣ分解能を有しないDehalococcoides属細菌とが共存するサンプルの場合は、その融解曲線分析を行った場合、２種の顕著のピークが出現する。
【００３３】
なお、リアルタイムＰＣＲによる定量の例としては、二本鎖に特異的に結合し、かつ結合することにより蛍光強度が増大する蛍光色素を反応液に存在させてＰＣＲを行い、ＰＣＲ反応サイクル毎に反応液の蛍光を測定することにより増幅産物の量を定量するものが挙げられる。ＰＣＲ合成産物の融解曲線分析を行うためには、サーマルサイクラー（ＰＣＲ合成装置）及び蛍光検出器より構成された「リアルタイムPCR装置」を利用するのが最も便利である。このようなリアルタイムＰＣＲ装置は、市販品としても入手可能であり、例えば、LightCycler（ロシュ）、Thermal Cycler（タカラバイオ（株））、Smart Cycler（Cepheid社）、Fast Real Time PCR System（アプライドバイオシステムズ）などが使用可能であり、いずれを利用しても良い。さらに、検出フォーマットについても、サイバーグリーン法、ハイブリダイゼーションプローブ法のいずれかが利用可能である。
【００３４】
サイバーグリーンを用いた場合を例として説明すると、以下の通りである。ＰＣＲ増幅による二本鎖の副溝（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ）に、反応液中のサイバーグリーンが結合して蛍光を発する。ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されると、増幅されたＤＮＡにサイバーグリーンが結合し、蛍光強度が増大する。そして、融解曲線分析における昇温とともに2本鎖DNAは分離し、その結果としてサイバーグリーン分子が遊離するため、蛍光値は減少していく。
【００３５】
一方、ハイブリダイゼーションプローブ法では、昇温にともない2つのハイブリダイゼーションプローブが解離するため、蛍光強度は減少していく。これら融解曲線分析により、サンプル中に含まれるDNA（PCR反応により合成されたDNA断片）配列に特有な融解曲線、Tm値を得ることができる。したがって、VC分解能を有するDehalococcoides属細菌、VCを分解できないDehalococcoides属細菌に特有のTm値を予め決定しておくことにより、VC分解能が異なるDehalococcoides属細菌がサンプル中にどの程度存在しているか、定性的に判断することが可能となる。すなわち、リアルタイムＰＣＲ法により得られるオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行った場合、Ｔｍ値が６５〜６６℃を示す場合には、検体のDehalococcoides属細菌はＶＣ分解能を有し、一方、Ｔｍ値が５７〜５８℃を示す場合には、検体のDehalococcoides属細菌がＶＣ分解能を有していないと判定できる。
【００３６】
本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法においては、前述した通りのプライマー及びハイブリダイゼーションプローブを用いるが、その他については、通常のリアルタイムＰＣＲ法、及び融解曲線分析の説明が適用される。
【００３７】
次に、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットは、前述した、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法に用いられるものであり、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、
配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して１〜９４４番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号７で表わされる塩基配列の一部であって、配列番号７で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドの５’末端側から起算して９９５〜１４１９番目の塩基の少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する少なくとも１０塩基を含むオリゴヌクレオチドとを含む。
【００３８】
本発明の第二の実施の形態にかかる塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットは、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して９５４番目、９６２番目、９８３番目又は９８４番目の塩基のうちの少なくとも１個の塩基を含む少なくとも１０塩基の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、  配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとを含む。
【００３９】
本発明の第三の実施の形態にかかる塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、配列番号２で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、配列番号３で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表わされる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む。
【００４０】
上述した、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能判定用キットは、前述した、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を実施する際に用いることができる。
【００４１】
次に、本発明の汚染地下水又は土壌を浄化するための浄化手段決定方法について説明する。
本発明の汚染地下水又は土壌を浄化するための浄化手段決定方法は、地下水又は土壌を試料として、前述した、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を行い、得られたＴｍ値分布の特徴から、バイオスティミュレーション又はバイオオーグメンテーションの適用好適性を判断することを含む、嫌気的バイオレメディエーションにより汚染地下水又は土壌を浄化するための浄化手段決定方法である。
【００４２】
本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法を実施し、検体から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線分析により得られたＴｍ値によって、検体のDehalococcoides属細菌がＶＣ分解能を有するものか否かを調べることができる。すなわち、リアルタイムＰＣＲ法により得られるオリゴヌクレオチドの融解曲線分析を行った場合、Ｔｍ値が６６〜６７℃を示す場合には、検体のDehalococcoides属細菌はＶＣ分解能を有し、一方、Ｔｍ値が５７〜５８℃を示す場合には、検体のDehalococcoides属細菌がＶＣ分解能を有していないと判定できる。
この結果に基づき、検体がＶＣ分解能を有する場合には、その地下水、土壌のバイスティミュレーションによる浄化が可能であると判定できる。また、ＶＣ分解能を有しない場合には、ＶＣ分解細菌を利用したバイオオーグメンテーションの適用が好ましいかの判断をすることが可能となる。
【実施例】
【００４３】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。なお、本発明の範囲は、かかる実施例に限定されないことはいうまでもない。
参考例１
Dehalococcoides ethenogenes 195株（Maymo-Gatellら, Science, 276, 1568-1571, 1997）の16S rDNA（Accession Number: AF004928）配列、および独自に流動床式塩素化エチレン連続処理リアクターより採取した16S rDNAクローンの塩基配列をもとに、Dehalococcoides属細菌の16S rDNAの一部をPCRにより合成するためのプライマーペアをデザインした。
このプライマーを利用して、バイアル試験によりTCEの分解を検討した14種類（14ヶ所の異なる現場の汚染土壌と地下水を植種して得られた検体）のサンプルから抽出されたDNAをテンプレートにPCRを行った結果、TCEからエチレンまでの完全分解が認められた7つのバイアルではPCRによりDNAの増幅が認められた。これに対し、エチレンまでの脱塩素化が認められなかった残り7つバイアルについては、DNAの明瞭な増幅は確認できなかった。さらにDNAの増幅が認められたサンプルについては、その上下流域もPCR合成を行い、最終的に16S rDNAのほぼ全域の配列を決定した。その結果、配列番号７で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの５’末端側から起算して１４８番目の塩基がＡ又はＧであることを除いて、全てのサンプル由来のＤＮＡの塩基配列は同じであった。
この結果より、配列番号７で表わされる塩基配列を有する１６ｓ  ｒＤＮＡを保有したDehalococcoides属細菌が優占化している場合には、ＴＣＥ以降の脱塩素化が順調に進むことが示唆された。
【００４４】
実施例１
cDCE集積培養体によるcDCEおよびVCの分解挙動とTm値の変化
塩素化エチレン汚染現場より採取した地下水を植種源とし、cDCE（濃度：６ｍｇ／Ｌ）および有機物を含む合成培地（下記組成を有する）で複数回植え継ぐことにより得られた集積培養体を前培養液として本試験に利用した。
培地組成
Ｃ３H４（OH）（COONａ）３        ５００ｍｇ／Ｌ
酵母エキス                        １００ｍｇ／Ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ                １５ｍｇ／Ｌ
ＮａＨＣＯ３                  ２，５２０ｍｇ／Ｌ
Ｔｒｉｓ                      ２，２９０ｍｇ／Ｌ
レザズリン                            １ｍｇ／Ｌ
ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ              ５００ｍｇ／Ｌ
ＮａＣｌ                        ５００ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４                    ２００ｍｇ／Ｌ
ＮＨ４Ｃｌ                      ３００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ                        ３００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ              ４８０ｍｇ／Ｌ
ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ            ２００ｍｇ／Ｌ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                １ｍｇ／Ｌ
ＣｏＣｌ２・２Ｈ２Ｏ            １．９ｍｇ／Ｌ
ＺｎＣｌ２                    ０．７ｍｇ／Ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ          ０．０４ｍｇ／Ｌ
Ｈ３ＢＯ３                    ０．０６ｍｇ／Ｌ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ          ０．２５ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ      ０．４４ｍｇ／Ｌ
ＨＣｌ                          １μＬ／Ｌ
【００４５】
液中濃度が約6 mg/LとなるようcDCEを加えた100 mLの嫌気合成培地に1 mLの前培養液を加え、30 ℃条件下に静置した。適宜、マイクロシリンジを用いてヘッドスペースの気相を採取し、ガスクロマトグラフにてcDCE、VCおよびエチレンの定量分析を行った。またDehalococcoides属細菌の定量は、1 mLの培養液から抽出したDNAを用い、特異的なプライマー（配列番号1、2）およびハイブリダイゼーションプローブ（配列番号3の3’末端をFITC標識したもの、および配列番号4の3’末端をリン酸化、5’末端をLCRed640標識したもの）を用いたリアルタイムＰＣＲ法を行って、ＤＮＡを合成し、得られたＤＮＡの融解曲線分析を行い、Ｔｍ値を求めた。融解曲線分析は、培養開始後５、１３、１５、２０、２９、３４日目に測定した。cDCE、VCおよびエチレンの濃度、Dehalococcoides属細菌の16S rDNA濃度の経時変化を図１に、またＴｍ値（メルティングピーク）の経時変化を図２に示す。
【００４６】
なお、１６ｓ  ｒＤＮＡの抽出は以下のように行った。
１ｍLの培養液を、孔径０．２μmのフィルター（MILLIPORE製、GTBP2500）でろ過し、このフィルターを２ｍL容のエッペンドルフチューブに入れた。次いで、エッペンドルフチューブに、BIOSPEC-CSC社製 Zirconia/Silica Beads（直径０．１ mm）１ｍL及びExtraction Buffer（100 mM Tris-HCl [pH8.0], 100 mM sodium EDTA [pH8.0], 100 mM sodium phosphate [pH8.0], 1.5 M NaCl）1 mLを加え、細胞破砕機Bead Beater（BIOSPEC-CSC社製、Mini-Bead-Beater-8）により、ダイヤルHomogenizeにて２分間処理して細胞を破砕した。次いで、破砕した細胞について凍結融解を3回繰り返した後、10 μLのProteinaseK（10 mg/mL）を加え、37 ℃にて30分間保温した。次いで、この液に250 μLの10% SDS溶液を加え、65 ℃で2時間保温す、再び上記のBead Beater処理を行った。その後、8,000×ｇにて室温で10分間遠心分離し、上清を採取した。上清をクロロホルム抽出し、等量のイソプロパノールを添加した後、室温で60分間静置し、8,000×ｇにて室温で20分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。沈殿を70％エタノールを用いて洗浄した後、乾燥させ、５０μLの滅菌蒸留水に溶解し、１６ｓ  ｒＤＮＡを得た。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲの条件は以下の通りである。
リアルタイムＰＣＲの反応にはロシュ・ダイアグノスティックス社製のLightCyclerを用いた。また、検出にはハイブリダイゼーションプローブ法を利用した。反応液の全容量は２０μLとし、サンプル１ μLに対して０．５ＵのEx Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造製）、添付緩衝液（MgCl2を含まず）2 μLおよび10 pmolのプライマーを使用した。その他、dNTP 200 μM、DMSO 5%（v/v）、MgCl2 3 mM、BSA 250 μg/mL、蛍光標識プライマー2種類（3’FITC標識、5’LC Red 640標識および3’リン酸化）をそれぞれ4 pmolの濃度になるように添加した。なお、プライマーとしてはDe624f（配列番号１で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）、De1232r（配列番号２で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を、またハイブリダイゼーションプローブとしてはDe971fL (3’FITC標識した、配列番号３で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）、De997fR (5’LC Red 640標識, 3'-リン酸化した、配列番号４で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド）を用いた。リアルタイムＰＣＲの反応条件を下記表１に示す。なお測定に利用するスタンダードＤＮＡとしては、PCE分解流動床式リアクターより得られた16S rDNAクローンを利用した。
【００４８】
【表１】
2008154521.tif 000002
【００４９】
融解曲線分析方法は以下の通りに実施した。
LightCyclerのマニュアルにしたがい、融解曲線取得のための測定プログラムを作成し、（上表のMeltの項）測定を行った。測定終了後、LightCyclerのTmコーリング機能を利用して、Tm値の自動計算を実施した。
【００５０】
図１において、横軸は培養開始時からの日数を表わし、縦軸は、塩素化エチレンの濃度を表す。図１より、cDCEとVCの脱塩素化は同時には起こらず、ほぼ全てのcDCEがVCへ脱塩素化された20日目前後より、VCからエチレンへの脱塩素化が始まっていることがわかる。一方、図２から明らかなように、培養開始から２0日目までは57〜58 ℃にTm値の顕著なピークが認められているが、その後このピークは除々に小さくなり、相対的に65〜66 ℃のピークが大きくなっていくことがわかる。このことからcDCEからVCの脱塩素化には57〜58 ℃のTm値を有するDehalococcoides属細菌が、またVCからエチレンまでの脱塩素化には65〜66 ℃のTm値を有するDehalococcoides属細菌が、それぞれ優占的に働いていることが容易に予想される。
【００５１】
上記結果より、例えば塩素化エチレン汚染現場にバイオレメディエーションを適用しようと考えた場合、まず現場地下水から抽出したDNAを用いて上記同様の手順で、リアルタイムPCR及び融解曲線分析を行い、メルティングピークを検出する。汚染の主体がcDCEであり、かつ顕著なメルティングピークが57〜58 ℃のみ1つであった場合、VCを脱塩素化できるタイプのDehalococcoides属細菌を利用したバイオオーグメンテーションの実施の検討を行う、といった対応が可能となる。
【００５２】
参考例１
VCを脱塩素化できない集積培養体によるcDCEの分解挙動とTm値の変化
基本的な実験操作は実施例１の項に記したとおりに実施した。ただし本集積培養体の場合、cDCEをVCにまで脱塩素化できるDehalococcoides属細菌のみを含んでおり、VCはエチレンにまで脱塩素化されることなく、培養液中に蓄積していくことが分かっている。本集積培養体によるcDCEの脱塩素化と、Tm値（メルティングピーク）の経時変化をそれぞれ図３、図４に示す。なお、融解曲線分析は、培養開始後４、２０、２５、３２、４７日目に測定した。
【００５３】
図３から明らかなように、培養開始後から、ｃＤＣＥ濃度が減少し、ＶＣ濃度が上昇していくが、エチレンの検出はできなかった。図４から明らかなように、Ｔｍ値は、57〜58 ℃にの顕著なピークが認められており、６５〜６６℃のピークは認められなかった。このことから、本参考例で用いた菌株は、ＶＣを分解する能力を有していないことがわかる。また、この菌株の１６ｓ  ｒＤＮＡのＴｍ値は５７〜５８℃であることがわかった。すなわち、ＶＣを分解する能力を有しないDehalococcoides属細菌から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線により得られたＴｍ値は５７〜５８℃であることがわかった。
【００５４】
参考例２
VCを脱塩素可能な集積培養体によるVCの分解挙動とTm値の変化
基本的な実験操作は実施例１の項に記したとおりに実施した。ただし、培地中には、cDCEに代えＶＣを含ませ、また、本集積培養体は、VCを単一の塩素化エチレン源として利用、脱塩素化できることが分かっているものである。VCの脱塩素化と、Ｔｍ値（メルティングピーク）の経時変化をそれぞれ図５、図６に示す。なお、融解曲線分析は、培養開始後１、６、８、１３日目に測定した。
【００５５】
図５から明らかなように、培養開始後から、ＶＣ濃度が減少し、エチレン濃度が上昇していくことがわかった。また、図６から明らかなように、Ｔｍ値は、６５〜６８ ℃に顕著なピークが認められており、５７〜５８℃のピークは認められなかった。このことから、本参考例で用いた菌株は、ＶＣを分解する能力を有することがわかる。また、この菌株の１６ｓ  ｒＤＮＡのＴｍ値は６５〜６６℃であることがわかった。すなわち、ＶＣを分解する能力を有するDehalococcoides属細菌から抽出したＤＮＡを鋳型としてリアルタイムＰＣＲ法を行ってオリゴヌクレオチドを合成し、得られたオリゴヌクレオチドの融解曲線により得られたＴｍ値は６５〜６６℃であることがわかった。
上記参考例の結果より、本発明の塩素化エチレン分解菌の塩化ビニル分解能の判定方法によれば、検体である菌株が塩化ビニル分解能を有するか否かの判定が可能であることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】塩素化エチレンの分解の経時変化を表すグラフである。
【図２】Ｔｍ値の測定結果を示すグラフである。
【図３】塩素化エチレンの分解の経時変化を表すグラフである。
【図４】Ｔｍ値の測定結果を示すグラフである。
【図５】塩素化エチレンの分解の経時変化を表すグラフである。
【図６】Ｔｍ値の測定結果を示すグラフである。
【図１】
2008154521.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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