(57)【要約】【課題】標的内因性遺伝子がＥＳ細胞に発現していると否とに関係なく、該標的内因性遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを保持するＥＳ細胞を選抜すること、および、このようなＥＳ細胞の選抜方法を利用してトランスジェニック動物を効率的に作製すること【解決手段】ＥＳ細胞に導入された標的外因性遺伝子の発現を指標に、標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡの効果を評価し、これにより所望のｓｉＲＮＡ効果が期待できるＥＳ細胞を選抜する。さらに、選抜したＥＳ細胞を利用してトランスジェニック動物を作製する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を保持するＥＳ細胞を選抜する方法であって、
（ａ）ＥＳ細胞に、（ｉ）該特定の標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子、及び（ｉｉ）該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、を導入し、発現させる工程であって、ここで、少なくとも（ｉｉ）該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、がＥＳ細胞の染色体内に導入される工程、
（ｂ）該ＥＳ細胞における、該外因性遺伝子の発現を検出する工程、並びに、
（ｃ）該外因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞を選抜する工程、
を含む方法。
【請求項２】
該特定の標的内因性遺伝子が、ＥＳ細胞において実質的に発現していないものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該外因性遺伝子がマーカー遺伝子との融合遺伝子としてＥＳ細胞に導入されており、かつ、該外因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞の選抜を該マーカー遺伝子の発現を指標にして行う、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＥＳ細胞がげっ歯類に属する動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
げっ歯類に属する動物がマウスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
特定の標的内因性遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック動物の作製方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれかに記載の方法により、該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を保持するＥＳ細胞を選抜する工程、並びに、
（ｂ）選抜したＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する工程、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的内因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞の選抜方法及び該選抜方法を利用したトランスジェニック動物の作製方法に関し、より詳しくは、ｓｉＲＮＡによる標的内因性遺伝子の発現抑制作用を、ＥＳ細胞に導入した標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子の発現を指標に評価することを特徴とする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉は、２本鎖ＲＮＡがその配列特異的に、標的の遺伝子の発現を抑制する現象である。２本鎖ＲＮＡの細胞内での中間代謝産物であるｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、哺乳動物細胞において副作用なくその抑制効果を発揮できることから、近年急速に研究が進んでいる。この現象を利用したｓｉＲＮＡトランスジェニックマウス（ノックダウンマウス）は、ノックアウトマウスと並んで特定の遺伝子の機能解析や、創薬の強力なツールとなることが期待されている。
既に、本発明者らは、ｓｉＲＮＡを発現するＤＮＡ断片をＥＳ細胞にエレクトロポレーションで導入し、高い抑制効果を示すＥＳクローンを選択し、胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）にマイクロインジェクションするという方法により、ｍｏｕｓｅ  Ｃｕ／Ｚｎ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ（ＳＯＤ１）に対するｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスの作製に成功し（図１）、ＳＯＤ１ノックアウトマウスと同様の表現型を示すことを確認している（非特許文献１）。さらに、このマウスと筋萎縮性側索硬化症モデルマウスを掛け合わせることにより疾患が改善し、ｓｉＲＮＡが遺伝子治療の手段として有用であることを示している。
しかしながら、このような従来の手法においては、遺伝子導入したＥＳクローンの中で、目的の高い抑制効果を示すＥＳクローンを選択する際に、内因性の標的遺伝子の発現抑制を指標としていたため、ＥＳ細胞に発現していない遺伝子を標的とした場合、クローンの選択が不可能であり、ｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスの作製はできないという問題が生じていた。
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５；２８０：４２８２６
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２００３；１０：９１−９２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、標的内因性遺伝子がＥＳ細胞に発現していると否とに関係なく、該標的内因性遺伝子が発現した際に、その発現抑制作用を示すｓｉＲＮＡを発現しているＥＳ細胞を選抜しうる方法を提供することにある。さらなる本発明の目的は、このようなＥＳ細胞の選抜方法を利用して、該標的内因性遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック動物を効率的に作製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ｓｉＲＮＡを安定発現させたＥＳ細胞において、そのｓｉＲＮＡの標的内因性遺伝子が発現している場合、標的内因性遺伝子の発現抑制効率はそのＥＳ細胞から作製されたｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスにおける標的内因性遺伝子の発現抑制効率（ノックダウン効率）とほぼ一致することが報告されている（非特許文献２）。
このことから本発明者等は、「ＥＳ細胞に発現させた標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子のｍＲＮＡが、標的内因性遺伝子のｍＲＮＡと同様に、ｓｉＲＮＡによって抑制されれば、この外因性遺伝子の発現抑制効率が、ｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスにおける標的内因性遺伝子の発現抑制効率を反映する」との仮説を立て、この仮説に基づく検証を行った。即ち、本発明者らは、標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子が染色体内に導入され安定的に発現するＥＳ細胞を調製し、このＥＳ細胞に、標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子を導入し、ｓｉＲＮＡによる該外因性遺伝子の発現抑制効果を評価した。この評価においては、該外因性遺伝子の発現抑制効果と標的内因性遺伝子の発現抑制効果との比較検討を行った。
その結果、このＥＳ細胞においては、外因性遺伝子と標的内因性遺伝子の発現が、ｓｉＲＮＡによって同等に抑制されていることが示された。さらに、本発明者らは、このＥＳ細胞からトランスジェニックマウスを作製し、該マウスにおける標的内因性遺伝子のｓｉＲＮＡによる発現抑制効率を検討した結果、マウスレベルでの発現抑制効率とＥＳ細胞における発現抑制効率がほぼ一致することを見出した。ｓｉＲＮＡによる外因性遺伝子の発現抑制は、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子及び該外因性遺伝子の双方を染色体に組み込んで安定的に発現させたＥＳ細胞においても同様に認められた。
以上から、本発明者らは、外因性遺伝子におけるｓｉＲＮＡによる発現抑制率を指標に、ＥＳ細胞における標的内因性遺伝子の発現抑制率を評価しうること、及びこの評価は、ＥＳ細胞レベルだけでなく、個体レベルでも有効であることを見出し、これにより本発明を完成するに到った。
【０００６】
即ち、本発明は、ＥＳ細胞に導入された、標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子の発現を指標に、標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡの効果を評価し、これにより所望のｓｉＲＮＡ効果が期待できるＥＳ細胞を選抜する方法、及び該方法により選抜したＥＳ細胞を利用したトランスジェニック動物の作製方法に関するものであり、より詳しくは、下記の発明を包含するものである。
（１）特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を保持するＥＳ細胞を選抜する方法であって、
（ａ）ＥＳ細胞に、（ｉ）該特定の標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子、及び（ｉｉ）該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、を導入し、発現させる工程であって、ここで、少なくとも（ｉｉ）該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、がＥＳ細胞の染色体内に導入される工程、
（ｂ）該ＥＳ細胞における、該外因性遺伝子の発現を検出する工程、並びに、
（ｃ）該外因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞を選抜する工程、
を含む方法。
（２）該特定の標的内因性遺伝子が、ＥＳ細胞において実質的に発現していないものである、（１）に記載の方法。
（３）該外因性遺伝子がマーカー遺伝子との融合遺伝子としてＥＳ細胞に導入されており、かつ、該外因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞の選抜を該マーカー遺伝子の発現を指標にして行う、（１）に記載の方法。
（４）ＥＳ細胞がげっ歯類に属する動物由来である、（１）に記載の方法。
（５）げっ歯類に属する動物がマウスである、（４）に記載の方法。
（６）特定の標的内因性遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック動物の作製方法であって、
（ａ）（１）から（５）のいずれかに記載の方法により、該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を保持するＥＳ細胞を選抜する工程、並びに、
（ｂ）選抜したＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する工程、
を含む方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、標的内因性遺伝子がＥＳ細胞レベルで発現していると否とに関らず、ｓｉＲＮＡにより標的内因性遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック動物を効率的に作製することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（ＥＳ細胞選抜方法）
本発明は、特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子を保持するＥＳ細胞を選抜する方法を提供する。
【０００９】
本発明のＥＳ細胞を選抜する方法においては、まず、ＥＳ細胞に、（ｉ）該特定の標的内因性遺伝子に対応する外因性遺伝子、及び（ｉｉ）該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、を導入し、発現させる（工程（ａ））。
【００１０】
本発明における「標的内因性遺伝子」は、本発明において用いるｓｉＲＮＡによりその発現が抑制される内因性の遺伝子を意味する。本発明の本質上、標的内因性遺伝子としては、特に制限はなく、その発現を抑制したい所望の遺伝子である。本発明においては標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡの発現抑制効果を、それに対応する外因性遺伝子の発現抑制効果を指標に検出するため、ＥＳ細胞において実質的に発現していない内因性遺伝子であっても標的とすることができる。この点が、従来のｓｉＲＮＡトランスジェニック動物の作製方法と比較した大きな利点である。
ここで、標的内因性遺伝子が「実質的に発現していない」とは、標的内因性遺伝子の発現が、汎用された発現検出技術により検出できないレベルにあることを意味する。汎用された発現検出技術としては、例えば、転写レベルであれば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティングなどが、翻訳レベルであればウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。
【００１１】
本発明は、標的内因性遺伝子の発現に対するｓｉＲＮＡの抑制能力の評価において、ＥＳ細胞において発現させた外因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡの抑制能力を指標とすることを特徴としている。従って、本発明に用いる「外因性遺伝子」は、標的内因性遺伝子のｍＲＮＡのうち、少なくともｓｉＲＮＡに対応する領域と同一の配列を含むｍＲＮＡをコードする外因性の遺伝子（以下、「標的外因性遺伝子」と称する場合がある）である。本発明の標的外因性遺伝子の形態は、その転写産物に対してｓｉＲＮＡが作用しうる限り、ｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡであってもよい。
【００１２】
本発明における「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉作用を有する短い二本鎖オリゴヌクレオチドであり、標的内因性遺伝子および標的外因性遺伝子の発現を抑制しうるものである。ここで「遺伝子の発現の抑制」には、完全な抑制および部分的な抑制が含まれ、本発明においては、目的に応じて所望の抑制効果を有するｓｉＲＮＡを用いることができる。
本発明に用いるｓｉＲＮＡは、その鎖長に特に制限はないが、細胞内で毒性を示さない範囲の短鎖からなることが好ましい。この目的のため、ｓｉＲＮＡは、例えば、１５〜５０塩基対以内、好適には２０〜３０塩基対以内、さらに好ましくは２０〜２５塩基対以内（例えば、２０塩基対、２１塩基対、２２塩基対、２３塩基対、２４塩基対、２５塩基対）とすることができる。
ｓｉＲＮＡにおける二重鎖ＲＮＡの部分は、本発明の目的が達せられる限り、完全に対合しているものに限らず、ミスマッチ（対応する塩基が相補的でない）、バルジ（一方の鎖に対応する塩基がない）などにより不対合部分が含まれていてもよい。このように不対合部分（ミスマッチまたはバルジ等）を設けることにより、ｓｉＲＮＡにおけるアンチセンスＲＮＡ側（標的遺伝子のｍＲＮＡと相補する配列からなるＲＮＡ）をコードするＤＮＡとセンスＲＮＡ側（上記アンチセンスＲＮＡと相補するＲＮＡ）をコードするＤＮＡとの間での組換えを抑制しうる。また、対合する二重鎖ＲＮＡ領域中に、ミスマッチまたはバルジを含むｓｉＲＮＡは、細胞内で安定となる利点をも有しうる。
ｓｉＲＮＡの末端構造は、標的内因性遺伝子および標的外因性遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、平滑末端あるいは粘着（突出）末端のいずれでもよい。また、粘着（突出）末端構造は、３’末端側が突出している構造だけでなく、目的の効果を発揮し得る限り５’末端側が突出している構造も含めることができる。
また、本発明に用いるｓｉＲＮＡの末端構造は両側が断端構造を有している必要はなく、二重鎖ＲＮＡの一方の端部がリンカーＲＮＡにより接続されたステムループ型構造であってもよい。即ち、本発明に用いるｓｉＲＮＡの形態には、タンデム型のみならず、ステムループ型（ヘアピン型）も含まれる。リンカーの長さはステム部分の対合に支障のない長さであれば特に限定はない。
本発明に用いるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ分子と他の分子（例えば、ＤＮＡ）とのキメラ分子であってもよく、また、これら分子の置換体又は修飾体であってもよい。
【００１３】
標的外因性遺伝子を発現させるためのプロモーターは、ｓｉＲＮＡによる標的外因性遺伝子の発現抑制効果をＥＳ細胞において検出する必要性から、ＥＳ細胞における標的外因性遺伝子の発現を保証するものである。また、ｓｉＲＮＡを発現させるためのプロモーターは、ＥＳ細胞において標的外因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡ効果を検出する必要性から、ＥＳ細胞におけるｓｉＲＮＡの発現を保証するものであり、さらに、少なくとも、標的内因性遺伝子の発現を抑制する必要がある所望の時期（例えば、ＥＳ細胞の発生過程、あるいは成体）に、該ｓｉＲＮＡの発現を保証するものである。上記目的にかなうプロモーターであれば、本発明に用いるプロモーターの種類に特に制限はないが、ｓｉＲＮＡのような短いＲＮＡを発現させる場合には、Ｕ６プロモーター、ｔＲＮＡプロモーター、レトロウイルス性ＬＴＲプロモーター、アデノウイルスＶＡ１プロモーター、５Ｓ  ｒＲＮＡプロモーターなどのｐｏｌ  ＩＩＩ系のプロモーターが好適である。
【００１４】
外因性遺伝子及びｓｉＲＮＡを発現させるためのベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどの染色体への組み込み性のウイルスベクターを挙げることができる。これにより導入遺伝子を細胞内で安定的に発現させることが可能である。本発明においては、少なくともｓｉＲＮＡをコードする遺伝子は、ノックダウン動物の作製のため、ＥＳ細胞の染色体内に導入して発現させることが必要である。一方、標的外因性遺伝子は、ＥＳ細胞において発現していればよく、必ずしも作製したノックダウン動物において発現している必要がないため、本発明の目的においては、それをＥＳ細胞の染色体外において発現させてもよい。この場合、染色体への非組み込み性のウイルスベクターや種々のプラスミドベクターを用いることも可能である。
ベクターには、必要に応じて、ベクターが導入された細胞を選択し得る選択マーカーなどをさらに保持させることができる。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子のような薬剤耐性マーカー、ガラクトシダーゼなどの酵素活性を指標に選択し得るマーカーなどが挙げられる。このように選択マーカーを用いることにより、該ベクターが導入されたＥＳ細胞のみを選択することが可能となる。
ベクターにおいて、例えば、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの上流にプロモーターをそれぞれ備えれば、タンデム型発現システムとすることができる。また、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡとセンスＲＮＡをコードするＤＮＡを逆向きに配置し、さらにこれらＤＮＡをリンカーＤＮＡにより接続し、その片側にプロモーターを連結することにより、ステムループ型発現システムとすることもできる。
【００１５】
本発明における「ＥＳ細胞」は、トランスジェニック動物の作製に利用しうるものであれば、特に制限はない。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、アカゲザル、カニクイザル、コモンマーモセット、チンパンジーなどに由来するものが挙げられるが、個体発生及び繁殖が容易という観点からは、マウス、ラットなどのげっ歯類に由来するものが好ましく、特にマウス由来が好ましい。ＥＳ細胞の由来するマウスとしては、例えば、１２９系が好適に用いられる。倫理的観点に立つ場合には、本発明におけるＥＳ細胞から、ヒト細胞は除外されうる。
【００１６】
ＥＳ細胞へのベクターの導入方法は、例えば、エレクトロポーレーション法やマイクロインジェクション法により行うことができる。また、ウイルスベクターを利用して、その感染力により導入することも可能である。導入効率の観点から、ベクターを制限酵素処理等により直鎖状化して、エレクトロポレーション法により導入することが、特に好ましい。
【００１７】
次いで、本発明においては、該ＥＳ細胞における、標的外因性遺伝子の発現を検出する（工程（ｂ））。
【００１８】
ＥＳ細胞における標的外因性遺伝子の発現の検出においては、該遺伝子を直接的に検出してもよく、また、マーカー遺伝子を利用して間接的にその発現を検出してもよい。
標的外因性遺伝子の発現を直接的に検出する方法としては、例えば、転写レベルであれば、ＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンブロッティングなどが、翻訳レベルであればウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。標的外因性遺伝子の発現をマーカー遺伝子を利用して間接的に検出する場合において用いるマーカー遺伝子としては、ＥＳ細胞においてその発現を検出しうるものであれば特に制限はない。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子を用いれば、発光によりその発現を検出することができ、Ｍｙｃ、ｆｌａｇ、ＨＡなどの遺伝子を用いれば、ウェスタンブロッティングによりその発現を検出することができる。また、ＧＦＰ遺伝子を用いれば、蛍光あるいはウェスタンブロッティングによりその発現を検出することが可能である。
マーカー遺伝子を指標に標的外因性遺伝子の発現を検出する場合、マーカー遺伝子は標的外因性遺伝子との融合遺伝子として、ＥＳ細胞に導入し、発現させるのが一般的である。しかしながら、マーカー遺伝子と標的外因性遺伝子とを融合遺伝子としない場合であっても、マーカー遺伝子のストップコドンの後方であり、かつ、ポリＡシグナルの前方に、外因性遺伝子を導入すれば、ｍＲＮＡとしては、一つになるため、マーカー遺伝子の発現量で、外因性遺伝子の発現（即ち、ｓｉＲＮＡの効果）を評価することが可能である（この場合、外因性遺伝子は、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡとなる）。
【００１９】
次いで、本発明においては、標的外因性遺伝子の発現が抑制されたＥＳ細胞を選抜する（工程（ｃ））。
【００２０】
ＥＳ細胞の選抜は、必ずしも標的外因性遺伝子発現の抑制効率が高いものを選抜する必要はなく、目的に応じて、所望の抑制効率のものを選抜すればよい。一般的には、ＥＳ細胞を用いて標的内因性遺伝子の機能を解析する場合や、遺伝子治療目的でＥＳ細胞を使用する場合は、可能な限り標的内因性遺伝子を抑制することが、その目的の達成において好ましいため、抑制効率が高いものを選択する場合が多い。しかしながら、生存に必須な遺伝子が標的である場合（例えば、ＶＥＧＦなど発現量が半減するだけでも胎生致死になり、その後、必要な解析ができなくなってしまう場合等）や、ある遺伝子の疾患への関与を評価する際に、必ずしもその遺伝子の発現を著しく減少させなくても疾患が発症することが想定される場合（例えば、ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎなど、ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙによって疾患が起こることが想定される場合等）には、標的外因性遺伝子発現の抑制が適度なものを選択することが好ましい。
【００２１】
以上により、ＥＳ細胞に導入された標的外因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡの発現抑制効果を指標として、標的内因性遺伝子に対する所望のｓｉＲＮＡ効果を有するＥＳ細胞を効率的に選抜することが可能となる。
【００２２】
（トランスジェニック動物作製方法）
また、本発明は、上記ＥＳ細胞を選抜する方法を利用した、特定の標的内因性遺伝子の発現が抑制されたトランスジェニック動物の作製方法を提供する。即ち、本発明のトランスジェニック動物の作製方法は、上記本発明のＥＳ細胞を選抜する方法により、該特定の標的内因性遺伝子の発現を抑制する機能を有するｓｉＲＮＡを保持するＥＳ細胞を選抜する工程、および、それに次ぐ、選抜したＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する工程を含む。
【００２３】
本発明におけるトランスジェニック動物の作製には、大きく次の２つの方法が好適に用いられる。
第一の方法においては、標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子をＥＳ細胞の染色体内に導入し、これを安定的に発現するＥＳ細胞を調製し、このＥＳ細胞に、標的外因性遺伝子を導入し、染色体外で発現させる。次いで、所望の外因性遺伝子の発現抑制効果が認められたＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する。この方法は、ＥＳ細胞への遺伝子導入や動物の掛け合わせ等の手間が少ない点で有利である。
第二の方法においては、標的内因性遺伝子に対するｓｉＲＮＡをコードする遺伝子及び標的外因性遺伝子をＥＳ細胞の染色体内に導入し、これら遺伝子を安定的に発現するＥＳ細胞を調製する。次いで、所望の外因性遺伝子の発現抑制効果が認められたＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する。この方法では、ＥＳ細胞からは、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子及び標的外因性遺伝子の双方の遺伝子が染色体に導入されたトランスジェニック動物が作製されることから、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子のみが染色体に導入されたトランスジェニック動物を作製するために、双方の遺伝子が染色体に導入されたトランスジェニック動物を野生型と掛け合わせる。そして、その子孫から、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子のみが染色体に導入された個体を選抜する。この方法では、ＥＳ細胞や胎仔発達の過程において標的内因性遺伝子の機能が標的外因性遺伝子により補われることになるため、良好なキメラ動物の作製効率が得られる点で有利である。
【００２４】
なお、ＥＳ細胞からトランスジェニック動物を作製する手法は確立されている。例えば、ＥＳ細胞を８細胞期又は胚盤胞期の動物胚に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた非ヒト動物の子宮に移植し、これにより妊娠した仮親から生まれた子のうち、キメラ動物を選択すればよい。キメラマウスを作製する場合の受容胚としては、例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系、ＢＡＬＢ／ｃ系、ＤＢＡ２系等、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系、ＢＤＦ１系、Ｂ６Ｄ２Ｆ１系、ＩＣＲ系等が挙げられるが、中でもＣ５７ＢＬ／６系が好ましく用いられる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００２６】
［実施例１］
ＥＳ細胞に実際に内因性に発現している遺伝子を標的に、その標的遺伝子とマーカー遺伝子を融合させた発現ベクターを発現させ、内因性と外因性に発現した２つのｍＲＮＡの抑制率を比較検討した。また、ＥＳ細胞における外因性遺伝子の抑制率が、該ＥＳ細胞から作製したトランスジェニックマウスにおける内因性遺伝子の抑制率を反映することを以下のようにして確認した。
【００２７】
（１）ＥＳ細胞における内因性遺伝子抑制率と外因性遺伝子抑制率との比較
以前、本発明者らがＳＯＤ１−ｓｉＲＮＡ  Ｔｇマウスを作製する際に使用した、マウスＳＯＤ１−ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより導入したＳＯＤ１−ｓｉＲＮＡ発現マウス１２９系ＥＳ細胞を用いて実験を行った（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００５；２８０：４２８２６参照）。
【００２８】
まず、ｓｉＲＮＡによる外因性遺伝子の抑制効果を評価するために、マウスＳＯＤ１のｃｏｄｉｎｇ領域のｃＤＮＡとマーカー遺伝子であるＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子を融合させた発現ベクターを構築した（図２）。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡを導入した、抑制効果の異なる複数のＥＳクローン、及び、コントロールとしてｓｉＲＮＡが発現していない野生型ＥＳ細胞を２４ウェルプレートに培養し、このＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＳＯＤ１発現ベクターと、遺伝子導入効率の補正のためにｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクター（図３）の両者をリポフェクション法により共発現し、２４時間後にタンパク質を抽出した。蛍光測定法（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）により、各ＥＳクローンでのｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ及びＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発光シグナルを測定し、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ値をｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ値で除することにより遺伝子導入効率を補正し、コントロールの値と比較することによりＳＯＤ１抑制率を算出した。
【００２９】
続いて、ｓｉＲＮＡによる内因性ＳＯＤ１の抑制効果をｍＲＮＡレベルで評価するために、２４ウェルプレートに培養したＳＯＤ１−ｓｉＲＮＡ発現ＥＳ細胞の各クローン及び野生型ＥＳ細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製した。マウスＳＯＤ１及び内因性コントロールとしてマウスＧＡＰＤＨに特異的なプライマー、プローブを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ値でＳＯＤ１値を除することにより各ＥＳ細胞における内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量を定量し、コントロールである野生型ＥＳ細胞と比較することによりｓｉＲＮＡによる内因性ＳＯＤ１の抑制効果を算出した。
同様に、ｓｉＲＮＡによる内因性ＳＯＤ１の抑制効果をタンパクレベルで評価するために、２４ウェルプレートに培養した各ＥＳクローンからタンパクを抽出し、ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）を行った。等量の総タンパク量を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを施行し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ膜に転写し、一次抗体として抗ＳＯＤ１抗体及び内因性コントロールとして抗β−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いて検出を行った。シグナル強度を定量し、β−ｔｕｂｕｌｉｎ値でＳＯＤ１値を除することによりｓｉＲＮＡによる内因性ＳＯＤ１の抑制効果を算出した。
得られたｍＲＮＡおよびタンパクレベルでの内因性ＳＯＤ１の抑制効果と、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた外因性遺伝子の発現抑制効果とを比較した。
【００３０】
その結果、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙにより、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＳＯＤ１発現ベクターによって外因性に発現させたＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率が得られ、３±５％〜８４±１％と、ＥＳクローンによって著しく異なることが判明した（図４）。また、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法によって内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの定量を行った結果、内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率が得られ、２０±９〜８８±１％と、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙの結果と同様に、ＥＳクローンによって抑制効果が異なることが判明した（図５）。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた抑制率と、定量的ＲＴ−ＰＣＲで得られた内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率を比較すると、非常に高い相関が得られた（Ｒ＝０．９８７）（図６）。ＷＢ法により評価した内因性ＳＯＤ１タンパクの定量の結果においても、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた抑制率をよく反映していた（図７）。以上のことから、ＥＳ細胞においては、ベクターによって発現させた外因性ｍＲＮＡと内因性ｍＲＮＡが、ＥＳ細胞に安定発現したｓｉＲＮＡによって同等に抑制されていることが示され、本発明者らが考案したｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙによるｓｉＲＮＡの抑制能力の評価法が、内因性遺伝子の抑制率の測定法の代替法、すなわちｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスにおける標的遺伝子のノックダウン効率の指標となることが判明した。
【００３１】
（２）ＥＳ細胞における外因性遺伝子抑制率とトランスジェニックマウスにおける内因性遺伝子抑制率との比較
さらに、ＥＳ細胞でのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られたｓｉＲＮＡによる抑制率がトランスジェニックマウスにおける抑制効率を反映しているか否かを検討した。以前本発明者らが作製したＳＯＤ１−ｓｉＲＮＡ  Ｔｇマウス及びその同腹の野生型マウスを致死量のペントバルビタールで麻酔後、ＰＢＳで灌流し、大脳を摘出した。得られた大脳からＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを作製し、マウスＳＯＤ１及び内因性コントロールとしてマウスＧＡＰＤＨに特異的なプライマー及びプローブを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＡＰＤＨ値でＳＯＤ１値を除することによりマウス大脳でのＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量を定量し、Ｔｇマウスと野生型マウスを比較することにより、抑制効果を算出した。また、Ｔｇマウス作製に用いたＥＳクローン（クローン＃４２）における外因性遺伝子の抑制効果は、前述したようにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙにより測定した。
【００３２】
その結果、ＥＳクローン（クローン＃４２）では、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙでの標的外因性遺伝子の抑制率は８４％であった。一方、このＥＳクローンから得られたｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスの中枢神経での標的内因性遺伝子の抑制率は約８０％であった（図８）。ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙでの標的外因性遺伝子の抑制率はｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスでの標的内因性遺伝子の抑制率とほぼ同等であり、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙによる評価結果がマウスレベルの結果と一致したと考えられた。
【００３３】
［実施例２］
本来はＥＳ細胞において未発現である標的遺伝子（変異遺伝子）と、該標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡとを段階的に発現させ、該標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡを安定に発現するＥＳ細胞を作製した。次いで、得られたＥＳ細胞を用いて、該ｓｉＲＮＡ発現トランスジェニックマウスを作製する方法を以下に示した。
【００３４】
（１）標的遺伝子（変異遺伝子）のクローニングとｓｉＲＮＡ発現ベクター構築
家族性筋萎縮性側索硬化症病の原因であるＳＯＤ１のｃＤＮＡをヒト脳ｃＤＮＡよりＰＣＲによって増幅し、これにＧ９３Ａ変異をｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎに導入後、ＨＡタグ遺伝子を融合させて、ハイグロマイシン耐性遺伝子をもったＣＭＶプロモーターの発現ベクターにクローニングした。
変異遺伝子（Ｇ９３ＡＳＯＤ１）を切断して野生型遺伝子に作用しない、変異遺伝子特異的なｓｉＲＮＡの作製はすでに成功しており（ＢＢＲＣ  ３１４：２８３−２９１，２００４参照）、これを発現するヘアピン型のｓｉＲＮＡ発現ベクターを構築した。
さらに、ｓｉＲＮＡ配列をＤＮＡベクターに挿入後に複製の際に生じる変異を防ぐため、独自のミスマッチ変異をデザインした。この際に、ヒトｐｏｌ  ＩＩＩ系のプロモーターを使用したが、ヘアピンＲＮＡが有効に核外に輸送されるようにするために、核外輸送タンパク（エクスポーチン５）などに認識されやすいヘアピンループ配列を用いた。この発現ベクターにＥＳ細胞で発現するＧ４１８性遺伝子（ＰＧＫｎｅｏ）を挿入して完成させた。
【００３５】
（２）標的遺伝子のＥＳ細胞への導入による第１段階の安定発現
直鎖状化したＨＡタグ遺伝子を融合させたターゲット変異遺伝子発現ベクターをエレクトロポレーションによりＥＳ細胞に導入した。ハイグロマイシン耐性フィーダー上にＥＳ細胞を培養し、ハイグロマイシンを添加し、耐性ＥＳ細胞を選択し、クローン化した。ＥＳクローンからタンパクを抽出し、ＨＡタグでウエスタンブロットを行い、標的遺伝子安定発現ＥＳ細胞クローンを選択した。
【００３６】
（３）Ｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列のＥＳ細胞への導入による第２段階の安定発現
第２段階として未発現遺伝子安定発現ＥＳ細胞ラインに、直鎖状化したＳｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ  タイプのｓｉＲＮＡ発現ベクターをエレクトロポレーションにより導入した。ネオマイシンを添加し、ｓｈＲＮＡを安定発現するＥＳ細胞をクローン化した。このＥＳ細胞のＳＯＤに対するウエスタンブロットを示す。第１段階で安定発現したＨｕｍａｎ  Ｇ９３Ａ  ＳＯＤは、第２段階で安定発現したｓｈＲＮＡによって、有効にその発現が抑制された（図９）。
【００３７】
（４）ｓｉＲＮＡ過剰発現トランスジェニックマウスの作製
抑制効果の最も高いｓｉＲＮＡ安定発現ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞にマイクロインジェクションして、これを偽妊娠させたＩＣＲマウスの子宮内に移植してキメラマウスを作製した。これをｗｉｌｄ  ｔｙｐｅマウスと掛け合わせることにより、２つのトランスジーンは分離されてｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスが作製できる（図１０）。その手法は、次の通りである。キメラマウスの雄からキメラ率の高い個体を選び、Ｃ５７ＢＬ／６野生型雌マウスと交配してＦ１を得る。２つのトランスジーンであるタグ付き遺伝子とｓｈＲＮＡ配列の有無をＰＣＲで確認して、タグ付き遺伝子はないがｓｈＲＮＡ配列のみが発現しているマウスを選択する。更に、このｓｉＲＮＡ過剰発現トランスジェニックマウスとＧ９３ＡＳＯＤ１過剰発現トランスジェニックマウスを掛け合わせてＧ９３ＡＳＯＤ１遺伝子特異的な発現抑制を確認する。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
従来のｓｉＲＮＡトランスジェニック動物の作製では、ＥＳ細胞に発現しているごく一部の遺伝子を標的とした場合のみ可能であったが、本発明によれば、理論的には、いかなる遺伝子を標的にした場合でもｓｉＲＮＡトランスジェニック動物を作製することが可能である。遺伝子の機能評価目的においてノックアウト動物の有用性は確立しているが、ｓｉＲＮＡトランスジェニック動物は、（１）複数の遺伝子を同時に抑制した動物を作製できる点、（２）ｍＲＮＡレベルでのスプライスバリアントに選択的な抑制をした動物を作製できる点、（３）ノックアウト動物では遺伝子の抑制率は１００％か５０％であったが、ｓｉＲＮＡトランスジェニック動物では遺伝子の抑制率は任意にコントロールできる点、（４）比較的短期間で作製できる点、において、ノックアウト動物と比較した利点がある。本発明により、ｓｉＲＮＡトランスジェニック動物の作製において、ＥＳ細胞において発現していない遺伝子までをも標的とすることを可能としたことは、ｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスの産業上の利用において大きく貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、従来のｓｉＲＮＡ  Ｔｇマウス作製法を示す図である。ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡ断片をエレクトロポレーションにより１２９系ＥＳ細胞に導入し、抑制効果の高いＥＳクローンを選択する。そのＥＳ細胞をｂｌａｓｔｏｃｙｓｔにマイクロインジェクションにより導入し、キメラマウス（Ｆ０）を得る。このキメラマウスと野生型マウス（Ｂ６）と掛け合わせることにより、ｓｉＲＮＡ  Ｔｇマウス（Ｆ１）が得られる。
【図２】図２は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＳＯＤ１発現ベクターを示す図である。ｐｓｉＣＨＥＣＫ−Ｉベクターを元に、制限酵素処理によりＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の下流にマウスＳＯＤ１のｃｏｄｉｎｇ領域ｃＤＮＡを挿入した。このベクターからはＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅとＳＯＤ１が融合したｍＲＮＡが発現されるため、ｓｉＲＮＡによってそのｍＲＮＡの標的部位が切断されるとＲｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの発現量も低下し、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ値が低下する。
【図３】図３は、ｆｉｒｅｆｌｙ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ発現ベクターを示す図である。該発現ベクターはＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ効率補正用に、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＳＯＤ１発現ベクターとｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎされる。
【図４】図４は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙによって得られた各ＥＳクローンでの外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ抑制率を示す図である。Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＳＯＤ１発現ベクターによって発現させた外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率は、ＥＳクローンによって著しく異なり、３±５％〜８４±１％であった。
【図５】図５は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法による内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率を示す図である。内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率も２０±９〜８８±１％と、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙの結果と同様にＥＳクローンによって抑制効果が異なることが判明した。
【図６】図６は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率と内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率との相関を示す図である。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率と、定量的ＲＴ−ＰＣＲで得られた内因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率を比較すると、非常に高い相関を示すことが判明した（Ｒ＝０．９８７）。
【図７】図７は、ウェスタンブロッティング法による内因性ＳＯＤ１タンパクの抑制効果を示す図（上段）である。ＷＢ法により評価した内因性ＳＯＤ１タンパクの抑制効果の結果も、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制効果（下段）をよく反映していた。
【図８】図８は、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡトランスジェニックマウス組織における内因性ＳＯＤ１の抑制効果を示す写真である。ＥＳ細胞においてｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙで得られた外因性ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの抑制率と、ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスの組織から抽出したＲＮＡ（Ａ）及びタンパク（Ｂ）における抑制効果はよい相関を示した。
【図９】図９は、ＥＳ細胞における標的遺伝子の発現とｓｉＲＮＡによるその発現抑制を示す写真である。標的遺伝子とそれに対するｓｉＲＮＡの２段階発現により、ＥＳ細胞に未発現の標的遺伝子（Ｈｕｍａｎ  Ｇ９３Ａ  ＳＯＤ）の発現を有効に抑制するｓｉＲＮＡが安定発現したＥＳ  ｃｌｏｎｅを選択できた。
【図１０】図１０は、本発明におけるキメラマウス作製の一態様を示す図である。作製したキメラマウスには２つのトランスジーンが導入されているが、これをｗｉｌｄ  ｔｙｐｅマウスと掛け合わせることにより、２つのトランスジーンは分離されてｓｉＲＮＡトランスジェニックマウスが作製できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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