(57)【要約】【課題】分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、高収率に細胞を得る。【解決手段】生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、消化酵素を含む消化液内に生体組織を浸漬させた状態で、分解開始から分解終了までの期間内に、所定時間にわたって連続的にあるいは段階的に、消化液内に消化酵素を追加供給する生体組織分解方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、
消化酵素を含む消化液内に生体組織を浸漬させた状態で、分解開始から分解終了までの期間内に、所定時間にわたって連続的にあるいは段階的に、消化液内に消化酵素を追加供給する生体組織分解方法。
【請求項２】
生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する総量決定ステップと、
決定された消化酵素の総量が生体組織の分解開始から分解終了までに供給されるように消化酵素を追加供給する酵素供給ステップとを備える請求項１に記載の生体組織分解方法。
【請求項３】
前記酵素供給ステップが、
消化酵素の活性を推定する活性推定ステップと、
推定された消化酵素の活性が減少傾向にあるか否かを判定する判定ステップと、
判定の結果、推定された消化酵素の活性が減少傾向にある場合に、消化酵素を追加供給する追加供給ステップとを備える請求項２に記載の生体組織分解方法。
【請求項４】
活性推定ステップが、消化酵素を含む細胞懸濁液内の細胞密度を測定する密度測定ステップと、測定された細胞密度の時間変化を演算する密度変化演算ステップとを備え、
前記判定ステップは、演算された細胞密度の時間変化がほぼ極大となる時点で消化酵素の活性が減少傾向にあると判定する請求項３に記載の生体組織分解方法。
【請求項５】
消化液が、リンゲル液またはリン酸緩衝溶液と消化酵素との混合液からなる請求項１から請求項４のいずれかに記載の生体組織分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織分解方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、消化酵素を含む消化液内に生体組織を浸漬して攪拌することにより生体組織を分解する生体組織分解方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、消化液内の酵素は、生体組織の分解の進行とともにその活性が低下し、分解の効率が低下してしまう不都合がある。そのままの状態で分解を進行しても、生体組織の分解完了までに長時間を要することになり、また、分解により得られる細胞の収率を向上させることができないという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、高収率に細胞を得ることができる生体組織分解方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、消化酵素を含む消化液内に生体組織を浸漬させた状態で、分解開始から分解終了までの期間内に、所定時間にわたって連続的にあるいは段階的に、消化液内に消化酵素を追加供給する生体組織分解方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、生体組織を消化液内に浸漬させ、攪拌等することにより分解を開始すると、生体組織が分解されて細胞が消化液内に浮遊するようになる。そして、分解の進行とともに消化酵素の活性が低下していく。そこで、分解開始から分解終了までの期間内に、連続的にあるいは段階的に消化液内に消化酵素を追加供給することにより、消化液内における消化酵素の活性を維持し、生体組織の分解効率を向上することができる、これにより、最初に消化液内に消化酵素を投入し、その後に追加することなく生体組織を分解する場合と比較して、細胞の収率を向上することができる。
【０００８】
上記発明においては、生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する総量決定ステップと、決定された消化酵素の総量が生体組織の分解開始から分解終了までに供給されるように消化酵素を追加供給する酵素供給ステップとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、総量決定ステップにより決定された消化酵素の総量が、分解開始から分解終了までに供給されるので、分解開始直後に高濃度の酵素に細胞が晒されることがない。さらに、必要以上の消化酵素が添加されることがなく、分解終了後に活性の高い消化酵素が細胞に作用することが防止され、細胞の健全性を維持することができる。
【０００９】
また、上記発明においては、前記酵素供給ステップが、消化酵素の活性を推定する活性推定ステップと、推定された消化酵素の活性が減少傾向にあるか否かを判定する判定ステップと、判定の結果、推定された消化酵素の活性が減少傾向にある場合に、消化酵素を追加供給する追加供給ステップとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、活性推定ステップにより推定された消化酵素の活性が、判定ステップにより減少傾向にあると判定された場合には、追加供給ステップにより消化酵素が追加供給されるので、消化酵素の活性を高い状態に維持したまま生体組織を分解することができる。その結果、生体組織の分解の効率を向上し、細胞の収率を高めることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、活性推定ステップが、消化酵素を含む細胞懸濁液内の細胞密度を測定する密度測定ステップと、測定された細胞密度の時間変化を演算する密度変化演算ステップとを備え、前記判定ステップは、演算された細胞密度の時間変化がほぼ極大となる時点で消化酵素の活性が減少傾向にあると判定することとしてもよい。
このようにすることで、密度測定ステップにより細胞懸濁液内の細胞密度を測定し、密度変化演算ステップにより細胞密度の時間変化を演算することによって、細胞密度の時間変化が極大となった時点において、判定ステップにより消化酵素の活性が減少傾向であると判定することができる。消化酵素の活性自体を検出することは困難であるが、細胞密度の時間変化を用いて簡易に消化酵素の活性を推定することができる。
【００１１】
また、上記発明においては、消化液が、リンゲル液またはリン酸緩衝溶液と消化酵素との混合液からなることとしてもよい。
このようにすることで、生体組織をｐＨが中性付近に調整されたリンゲル液またはリン酸緩衝溶液と消化酵素との混合液により分解するので、分解後に得られた細胞の生存率の低下を防止することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、高収率に細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態に係る生体組織分解方法について、図１〜図７を参照して説明する。
本実施形態に係る生体組織分解方法は、例えば、脂肪組織の分解方法であって、図１に示されるように、分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する総量決定ステップＳ１と、消化酵素の供給量を決定する供給量決定ステップＳ２と、消化酵素を供給した消化液内で生体組織を分解させる分解ステップＳ３と、消化酵素の活性を推定する活性推定ステップＳ４と、推定された消化酵素の活性を判定する判定ステップＳ５と、判定結果に基づいて消化酵素の総量が供給済みであるか否かを判定し未供給の場合に消化酵素を追加供給する追加供給ステップＳ６とを備えている。
【００１４】
総量決定ステップＳ１は、分解する脂肪組織の総重量または体積に基づいて、分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する。供給量決定ステップＳ２は、決定された消化酵素の総量を複数に分割して、最初に供給する消化酵素の量および、その後追加供給する消化酵素の量を決定する。分解ステップＳ３は、供給量決定ステップＳ２において決定された最初に供給する量の消化酵素をリンゲル液に混合する酵素供給ステップＳ３１と、調製された消化液内に脂肪組織を浸漬させて攪拌する攪拌ステップＳ３２とを備えている。
【００１５】
活性推定ステップＳ４は、図２に示されるように、所定時間間隔で消化液をサンプリングし、消化液内に浮遊する細胞数を測定することにより消化液内の細胞密度を測定する密度測定ステップＳ４１と、密度測定ステップＳ４１において測定された細胞密度の時間変化を演算する密度変化演算ステップＳ４２とを備えている。図３に示されるように、生体組織の分解の進行とともに、生体組織から分離されて消化液内に浮遊する細胞が増加するので、その細胞密度は増加していく。その一方で、消化酵素の活性は低下していく。
【００１６】
その結果、細胞密度の時間変化を見ると、その増加の度合いは一定ではなく、分解開始後所定時間内においては、細胞密度の時間変化の増加の度合いは増大していくが、ある時点ｔ１を経過すると鈍化し、その後は時間の経過とともに減少していく。図４は、図３に示される細胞密度の時間変化のグラフを、時間で１次微分したもの、図５は２次微分したものである。すなわち、これらの図によれば、単位時間あたりの細胞数の増加量（細胞密度の時間変化）は、時点ｔ１において増加傾向から減少傾向に転じる。
【００１７】
そこで、判定ステップＳ５においては、図４に示される細胞密度の時間変化の極大値、具体的には、図５に示される細胞密度の時間変化の２次微分がほぼゼロとなる時点ｔ１を判定し、追加供給ステップにおいて、あらかじめ定められていた追加供給量の消化酵素が消化液内に追加供給されるようになっている。また、判定ステップにおいては、図４に示される細胞密度の時間変化の増加量がほぼゼロになった（しきい値を下回った）時点ｔ２を判定し、分解ステップＳ３による生体組織の分解処理を終了するようになっている。
【００１８】
このように構成された本実施形態に係る生体組織分解方法によれば、細胞密度の時間変化の２次微分がほぼゼロになる時点ｔ１で、消化酵素を追加供給するので、細胞密度の時間変化は、図６に実線で示されるように、図６に破線で示されるそれまでの時間変化の曲線とは異なり、細胞密度の時間変化の増加量をさらに増加傾向に変更した新たな曲線を描いて変化するようになる。その結果、得られる細胞数、すなわち細胞収率を向上させることができるという利点がある。
【００１９】
この場合において、測定に時間を要する消化酵素の活性自体を利用するのではなく、細胞密度の時間変化を用いて消化酵素の活性を推定するので、リアルタイムに消化酵素の追加供給時期を決定することができる。その結果、より効率的に生体組織を分解して、分解に要する時間を短縮し、細胞の収率を向上することができる。
【００２０】
また、消化酵素を追加供給することにより、生体組織の分解が促進されるので、生体組織を短時間で分解することができるという利点もある。
さらに、本実施形態に係る生体組織分解方法によれば、分解完了までに消化液に供給される消化酵素の総量は、分解開始前にあらかじめ、生体組織の重量あるいは体積により決定されており、それを越えることがない。したがって、高い活性の残る消化酵素に、分解された細胞が接触することを防止して、得られる細胞の健全性を向上することができるという利点もある。
【００２１】
図７に、生体組織を分解完了するのに必要とされる消化酵素の総量の３／４を初回に、残りの１／４を分解の途中で追加供給した場合の細胞の収率（Ａ），（Ｂ）を、初回に消化酵素の総量全体を添加する従来の場合（コントロール）と比較して示す。これによれば、細胞の収率は、従来の方法と比較して５〜１５％向上していることがわかった。また、分解完了までに要する時間も、短縮されたことがわかった。
【００２２】
なお、本実施形態においては、分解完了に必要な消化酵素の総量を複数回に分割して追加供給していくこととしたが、これに代えて、上記消化酵素の総量の範囲内において所定時間をかけて連続的に追加供給していくことにしてもよい。
【００２３】
また、本実施形態においては、細胞密度の時間変化の２次微分がほぼゼロとなる時点ｔ１を検出して消化酵素の追加供給時期を判定することとしたが、厳密にこの時点ｔ１における判定が必要とされるものではない。例えば、細胞密度の時間変化が減少傾向に転じる前後のいずれかの時期において消化酵素を追加供給することとしてもよいし、細胞密度の時間変化が所定の値となったときに消化酵素を追加供給することにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織分解方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の生体組織分解方法における活性推定ステップを示すフローチャートである。
【図３】図１の生体組織分解方法の分解ステップにおける消化液内の細胞密度の時間変化を示すグラフである。
【図４】図２の細胞密度の時間変化の１次微分を示すグラフである。
【図５】図２の細胞密度の時間変化の２時微分を示すグラフである。
【図６】図１の生体組織分解方法の分解ステップの途中において、消化液内に消化酵素を追加供給した場合の細胞密度の時間変化を示すグラフである。
【図７】図１の生体組織分解方法の一実施例において得られる細胞の収率を従来の分解方法との比較において示すグラフである。
【符号の説明】
【００２５】
Ｓ１  総量決定ステップ
Ｓ４  活性推定ステップ
Ｓ５  判定ステップ
Ｓ６  追加供給ステップ
Ｓ３１  酵素供給ステップ
Ｓ４１  密度測定ステップ
Ｓ４２  密度変化演算ステップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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