(57)【要約】【課題】本発明は、活性化型ＮＨＥ１を心臓に発現させ、心肥大モデルまたは心不全モデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供することを課題とする。【解決手段】自己阻害ドメインを欠失するアミノ酸配列からなる活性化型ＮＨＥ１を発現させてなる非ヒトトランスジェニック動物により、心肥大モデルまたは心不全モデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供しうる。自己阻害ドメインは、例えばヒトＮＨＥ１のうち第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
活性化型ＮＨＥ１が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち自己阻害ドメインを欠失するアミノ酸配列からなる請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
自己阻害ドメインが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分である、請求項２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
活性化型ＮＨＥ１が、１）または２）に記載のアミノ酸配列である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物：
１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分を欠損するアミノ酸配列；
２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する領域内において、１〜複数個のアミノ酸が置換または欠失してなり、ＮＨＥ１が活性型ＮＨＥ１となりうるアミノ酸配列。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の活性化型ＮＨＥ１をコードする遺伝子を組み込むことによる、活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
トランスジェニック動物が、心肥大モデル動物または心不全モデル動物である請求項１〜５のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
動物がマウスである、請求項１〜６のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心肥大または心不全の非ヒトモデル動物に関する。より具体的には、活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物の作製による心肥大または心不全の非ヒトモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞膜を介するCa2+、H+、Na+などのイオン輸送を担うトランスポーターやチャンネルは、循環器系組織に極めて重要で、その異常は重篤な疾患を招く。Na+/H+交換輸送体（Na+/H+ Exchangers：ＮＨＥ）は、細胞内pH、Na+濃度、細胞容積の制御、および腎臓・小腸などの上皮細胞におけるNa+・HCO3-吸収に関わる主要な輸送体ファミリーである（図１参照）。ＮＨＥはイオン代謝が関与する多様な細胞機能に重要であることから、心臓病や癌など様々な疾患の成因に関与する。ＮＨＥ１は、細胞の恒常性を保つ重要なイオントランスポーターであり、ホルモンやストレッチ刺激に反応して活性化されることも知られており、虚血性心疾患や慢性心臓疾患に関与するとりわけ重要なタンパク質である。
【０００３】
近年、高血圧、糖尿病等に起因する心肥大や心不全において、ＮＨＥ１が異常亢進していること、ＮＨＥ１の特異的阻害剤（例えばカリポライドなど）により、心肥大、心筋繊維化が抑制されること等から、ＮＨＥ１の異常な活性化と心肥大・心不全発症との関連が示唆されている（図１）。心肥大は、一般に受容体刺激などにより、細胞内のCa2+濃度が上昇し、カルシニュリンの活性化を介してその下流のシグナルにより引き起こされると考えられているが、細胞内Na+上昇に起因する心肥大発症説はいまだ立証されていない。
【０００４】
各種ホルモンのリセプターを介して間接的にＮＨＥ１が活性化される心肥大・心不全モデル動物が報告されている（非特許文献１、２）。例えば、β−リセプター心臓特異的高発現トランスジェニックマウスや、ＡＮＰレセプターのノックアウトマウスでは、心肥大や心不全が観察されるが、これらのマウスでは間接的にＮＨＥ１が活性化される。これらの報告において、ＮＨＥ１の活性化が、心肥大や心不全の成因として病態的に重要であることが示唆される。
【０００５】
ＮＨＥ１はリセプターを介して間接的にＮＨＥ１が活性化される他、ＮＨＥ１を構成するアミノ酸残基のうち、カルモデュリン（ＣａＭ）結合ドメインである第６３７−６５６位の領域、即ち自己阻害ドメインを欠損させることによりＮＨＥ１が活性化されることが報告されている（非特許文献３〜５）。しかし、自己阻害ドメインを欠損させることによる恒常的に活性化させたＮＨＥ１の機能と、心肥大や心不全との関係について報告されていない。
【０００６】
ＮＨＥ１を構成するアミノ酸残基を変異させることにより、活性化させたＮＨＥ１を発現させたトランスジェニックマウスについて報告がある（非特許文献６）。しかしながら、得られたトランスジェニックマウスは、心疾患モデルとして使用できるほどの心機能の違いは認められていない。恒常的に活性化させたＮＨＥ１を心筋特異的に発現させ、心肥大・心不全を発症したマウスはこれまで存在しなかった。
【非特許文献１】Circ. Res. 90:814-819, 2002
【非特許文献２】Circulation 112:2307-2317, 2005
【非特許文献３】J. Biological Chemistry 269:13703-13709, 1994
【非特許文献４】J. Biological Chemistry 269:13710-13715, 1994
【非特許文献５】J. Biological Chemistry 270:26460-26465, 1995
【非特許文献６】Articles in Press. Am J Physiol Heart Circ Physiol (January 5, 2007).doi:10.1152/ajpheart.00855.2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、活性化型ＮＨＥ１を心臓に発現させ、心肥大モデルまたは心不全モデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、自己阻害ドメインを欠失するアミノ酸配列からなる活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物により、心肥大モデルまたは心不全モデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供しうることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
２．活性化型ＮＨＥ１が、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち自己阻害ドメインを欠失するアミノ酸配列からなる前項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
３．自己阻害ドメインが、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分である、前項２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
４．活性化型ＮＨＥ１が、１）または２）に記載のアミノ酸配列である前項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物：
１）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分を欠損するアミノ酸配列；
２）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する領域内において、１〜複数個のアミノ酸が置換または欠失してなり、ＮＨＥ１が活性型ＮＨＥ１となりうるアミノ酸配列。
５．前項１〜４のいずれかに記載の活性化型ＮＨＥ１をコードする遺伝子を組み込むことによる、活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
６．トランスジェニック動物が、心肥大モデル動物または心不全モデル動物である前項１〜５のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
７．動物がマウスである、前項１〜６のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の活性化型ＮＨＥ１遺伝子を過剰発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物により、従来のリセプターを介して間接的にＮＨＥ１が活性化される心肥大モデルとは異なり、恒常的にＮＨＥ１が活性化されており、細胞内Na+濃度上昇が引き金となっている心肥大・心不全モデルを構築することができた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、活性化型ＮＨＥ１を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物である。
【００１２】
ＮＨＥ１をコードする遺伝子は、GenBank Accession No. NM_003047（配列番号１）に示される塩基配列からなり、ＮＨＥ１タンパク質は、配列番号２に示される、８１５個のアミノ酸からなる。
【００１３】
本発明において、活性化型ＮＨＥ１とは、ＮＨＥ１が活性型であれば良く、特に限定されない。具体的には、例えば配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち自己阻害ドメインを欠失するアミノ酸配列からなるＮＨＥ１が挙げられる。ここにおいて、自己阻害ドメインとは、カルモデュリン（ＣａＭ）結合ドメインをいう。ＮＨＥ１におけるいわゆる自己阻害ドメインとは、ＮＨＥ１の活性を抑制しうるドメインをいい、例えば図２に示す阻害ドメインが例示される。具体的には、自己阻害ドメインは、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、少なくとも第６３７−６５６位のアミノ酸に該当する部分をいう。ＮＨＥ１は、自己阻害ドメインとＮＨＥ１の他の領域との相互作用等により、自己阻害ドメインによってＮＨＥ１の活性が部分的に抑えられており、生体内の恒常性が維持される。しかし、例えばホルモン等の刺激により、自己阻害ドメインによるＮＨＥ１の部分的阻害効果が解除される場合がある。
【００１４】
本発明において、活性化型ＮＨＥ１は、上述のように自己阻害ドメインを欠失しているものであっても良いし、自己阻害ドメインが変異していることにより、ＮＨＥ１が活性型となりうるものであってもよい。例えば、自己阻害ドメインを構成するアミノ酸配列のうち、１〜複数個のアミノ酸が置換または欠失してなり、ＮＨＥ１タンパク質が活性型ＮＨＥ１となりうるアミノ酸配列からなるものであってもよい。さらには第６３７−６５６位の部分の欠失の他、他の部位を欠失しつつ、ＮＨＥ１タンパク質が活性型ＮＨＥ１となりうるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００１５】
本発明における活性化型ＮＨＥ１をコードする遺伝子（以下、単に「活性化型ＮＨＥ１遺伝子」ともいう。）は、本発明における活性化型ＮＨＥ１を発現しうる塩基配列からなるＤＮＡであればよい。そのような塩基配列としては、上述の本発明の活性化型ＮＨＥ１をコードする塩基配列からなるＤＮＡの他、遺伝子コドンと縮重のため、活性化型ＮＨＥ１と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのＤＮＡも含み、さらにはそれらの相補鎖も含まれる。
【００１６】
本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳動物が挙げられ、例えば、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、モルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類の取扱いが容易であるため好ましく、中でもマウスが好ましい。
【００１７】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、未受精卵、受精卵、精子及びその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより導入遺伝子である活性化型ＮＨＥ１遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする活性化型ＮＨＥ１遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジェニック動物を作製することもできる。
【００１８】
活性化型ＮＨＥ１ｃＤＮＡを対象動物に導入させる際、活性化型ＮＨＥ１ｃＤＮＡを対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。特に心筋特異的に活性化型ＮＨＥ１を発現させるために、心筋α−ミオシン重鎖プロモーターに結合したプラスミドコンストラクションを行うのが好適である（図３参照）。このプロモーターの制御下では、心筋のみに目的遺伝子を発現させることができる。全身に発現させる場合には、各種哺乳動物由来のＮＨＥ１遺伝子を発現させうる各種プロモーターに結合したプラスミドコンストラクションを行うことが必要である。本発明の目的の主要な部分は、心肥大または心不全の非ヒトモデル動物を提供することであるから、心筋特異的に活性化型ＮＨＥ１を発現させるのがより好適である。
【００１９】
活性化型ＮＨＥ１遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、など）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）及び鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０及びＫ１４、コラーゲンＩ型及びＩＩ型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩ及びＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１及び２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］のプロモーターなどが挙げられる。上記ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結するターミネターを有していてもよい。
【００２０】
その他、活性化型ＮＨＥ１遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも所望により可能である。
【００２１】
受精卵細胞段階における活性化型ＮＨＥ１遺伝子の導入は、対象動物の胚芽細胞及び体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。トランスジェニック後の作出動物の胚芽細胞において活性化型ＮＨＥ１遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞及び体細胞の全てに活性化型ＮＨＥ１遺伝子を過剰に有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞及び体細胞の全てに活性化型ＮＨＥ１タンパク質を過剰に有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００２２】
トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性活性化型ＮＨＥ１遺伝子を好ましくはマウスなどの対象動物、又はその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ））、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
【００２３】
得られた受精卵に前述の方法により外来性活性化型ＮＨＥ１遺伝子を導入した後、雌動物に人工的に移植、着床させることにより、外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を投与後、雄動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させることができる。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡのマイクロインジェクションが好ましい。
【００２４】
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
【００２５】
あるいは、活性化型ＮＨＥ１発現トランスジェニック非ヒト動物は、上記した活性化型ＮＨＥ１遺伝子を導入遺伝子としてＥＳ細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞に由来するＨＰＲＴ陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞(embryonic stem cell)に、活性化型ＮＨＥ１遺伝子を導入する。活性化型ＮＨＥ１遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。
【００２６】
上記した本発明のトランスジェニック非ヒト動物の子孫、並びに該トランスジェニック動物の一部も本発明の範囲内である。トランスジェニック非ヒト動物の一部としては、該トランスジェニック動物の組織、器官及び細胞などが挙げられる。
【００２７】
以下哺乳動物としてマウスを用いた場合を例にしてトランスジェニックマウスを製造する方法の一例についてさらに具体的に説明する。
【００２８】
１．遺伝子のクローニング
本発明の病理モデル動物を製造するには、まず、ＮＨＥ１遺伝子をクローニングする。このクローニング方法としては公知の様々な方法が可能である。例えば、ＮＨＥ１のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをプラスミド等のベクターのＤＮＡに組込み、更に該ＤＮＡ組替えベクターを大腸菌等の宿主に組込んで、大腸菌を増殖させる。大量に産生された大腸菌からＤＮＡ組替えベクターを取りだし、活性化型ＮＨＥ１遺伝子をカラムクロマトグラフ法、あるいは電気泳動法等により分取、精製することによりクローニングすることができる。目的の塩基配列をもつ遺伝子が精製されていることの確認は、ＤＮＡシーケンシングなどにより確定することが望ましい。
【００２９】
２．活性化型ＮＨＥ１遺伝子のスクリーニング
ヒト遺伝子ライブラリーから得られた本件活性化型ＮＨＥ１をコードするｃＤＮＡ、あるいは、マウスｍＲＮＡから直接ＲＴ−ＰＣＲ等の方法により得られた同ｃＤＮＡをプラスミドベクター等にライゲーションにより挿入する。活性化型ＮＨＥ１は、ＮＨＥ１を構成するアミノ酸残基から、一部のアミノ酸を欠失しているものであるので、ＲＴ−ＰＣＲ等の方法により得られた同ｃＤＮＡを用いることができる。さらには、非特許文献３に記載の方法に従い、活性化型ＮＨＥ１のｃＤＮＡを得ることができる。
【００３０】
３．ベクター
クローニング用ベクターとしては、宿主内で特定遺伝子を増幅できる細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。
【００３１】
４．宿主
本発明の活性化型ＮＨＥ１遺伝子は、好ましくはベクターを経由して宿主細胞により増殖させる。本件活性化型ＮＨＥ１遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986)及びSambrookら(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Habor LABORATORY Press, Cold Spring Habor, NY., 1989)などの自体公知の実験室マニュアルに記載される形質転換や感染等により行うことができる。
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞等を挙げることができる。
【００３２】
５．トランスジェニックマウスの製造
活性化型ＮＨＥ１過剰発現トランスジェニックマウスを製造するには、例えばマウスの受精卵の細胞核に上記方法で得た活性化型ＮＨＥ１遺伝子をマイクロインジェクトする。注入する遺伝子の量は１個の受精卵当り２００〜１０００コピーであることが好ましい。別に精管切断術を施した雄マウスと交尾させ偽妊娠状態にした仮親を用意して、この仮親の卵管内にこの受精卵を移植し、マウスを誕生させる。
【００３３】
活性化型ＮＨＥ１遺伝子を導入する方法としては、他に受精卵にレトロウイルスベクターを感染させる方法も採用しうる。また、受精卵の代わりにＥＳ細胞を用いて同様の方法により活性化型ＮＨＥ１を発現するマウスを製造することができる。
【００３４】
上記方法でクローニングされた活性化型ＮＨＥ１をコードするｃＤＮＡを、心筋−αミオシン重鎖プロモーターに結合してプラスミドコンストラクションを行い、トランスジーンベクターを作製する。作製されたトランスジーンベクターを線状化し、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた感染等によって受精卵に導入する。
【００３５】
マイクロインジェクション後、一般的には、生まれた胚の１０−４０％に染色体への導入遺伝子の安定な組み込みが起こっている。選択されたマウス染色体に目的とする遺伝子の組み込みが起こっているかどうかをＰＣＲ法、サザンブロット法等により確認することが好ましい。このマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、本発明の本件活性化型ＮＨＥ１発現マウスを作製することができる。
【００３６】
本件活性化型ＮＨＥ１発現マウスが生起しているか否かを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べ、またはタンパク質を抽出してウェスタンブロット法等により調べる方法がある。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の理解を深めるために実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００３８】
（実施例１）活性型ＮＨＥ１発現用細胞
ＮＨＥ１タンパク質を構成するアミノ酸残基は、GenBank Accession No. NM_003047（配列番号２）に示される。本実施例において、前記アミノ酸配列のうち、第６３７−６５６位のアミノ酸残基を欠損させた恒常的活性型ＮＨＥ１変異体を発現したトランスジェニックマウスを構築した。
【００３９】
ヒトＮＨＥ１遺伝子はヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングし、哺乳動物発現ベクターpECEのマルチクローニングサイトにクローニングされている。そのプラスミドを元にして、ＰＣＲ法により第６３７−６５６位のアミノ酸残基を欠損したｃＤＮＡを得た（非特許文献３）。
【００４０】
上記調製したｃＤＮＡを基にして、ＰＣＲ法で制限酵素Sal1及びXba1認識部位、polyA配列と制限酵素Sal1を付加したｃＤＮＡを作製し、あらかじめ制限酵素Sal1で消化切断したサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐｈＣＭＶトランスファーベクターに組込み、発現ベクターｐＣＭＶ−活性化型ＮＨＥ１を作製し、トランスジーンを作製した。
【００４１】
C57BL/6L雌マウスにＰＭＳ及びｈＣＧを腹腔投与して過排卵を誘発し、C57BL/6L雄マウスと同居・交配した。交尾の成立した雌マウスを頚椎脱臼により殺し、腹腔を開き卵管膨大部を切り出して、ヒアルロニダーゼを含むＭ１６培地中に移し、実体顕微鏡下で卵管膨大部を裂いて受精卵を培地中に移し、ガラスピペットを用いて受精卵を回収した。
【００４２】
次に、ガラスディッシュに受精卵を含むＭ１６培地及び注入ＤＮＡ（濃度は５ｎｇ／μｌ）のドロップをそれぞれ作製し、パラフィンオイルでカバーした。マイクロマニュピレーター付き倒立顕微鏡下でインジェクション用ピペットに注入ＤＮＡをおおよそ０．１μｌ吸引して、ホールディング用ピペットで固定した受精卵の前核内にＤＮＡを注入した。
【００４３】
ＤＮＡ注入した受精卵を移植するための偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス）を、精管を切除した雄マウス（ＩＣＲマウス）と交配させることにより作製した。受精卵にＤＮＡを注入した当日に、偽妊娠雌マウスを麻酔し、後背部より卵巣、卵管を引出し、卵管開口部を露出する。実体顕微鏡下で移植用ピペットを用いておよそ１０個の受精卵を吸引して、左右の卵管開口部からそれぞれ受精卵を移植した。受精卵の移植後、偽妊娠雌マウスは約２０日で子マウス（活性化ＮＨＥ１−トランスジェニック（ＴＧ）マウス）初代(Founder)（ヘテロ）を出産した。
【００４４】
（実験例１）
本実験例では、活性化ＮＨＥ１トランスジェニック（ＴＧ）マウスの心筋における活性化型ＮＨＥ１の発現結果を確認した。
【００４５】
活性化型ＮＨＥ１を導入していないC57BL/6Lを対照コントロールとし、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスおよび、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスにＮＨＥ阻害剤（カリポライド）を０．３ｍｇ／ｋｇ投与したものについて、各々心筋ホモジェネートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、活性化型ＮＨＥ１の発現をウェスタンブロット法により確認した。また、内部コントロールとして、ＧＡＰＤＨについても並行して行った。
ウェスタンブロット法に用いた抗体は、ウサギで作製した抗ヒトＮＨＥ１抗体である（非特許文献３）。
【００４６】
その結果、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスではＮＨＥ阻害剤（カリポライド）の投与の有無に関係なく、ＮＨＥ１の高い発現を認めたのに対し、対照コントロールでは、ほとんど発現は認めなかった（図４）。
【００４７】
（実験例２）
本実験例では、活性化ＮＨＥ１ＴＧマウスでの心臓形態を調べた。
【００４８】
活性化型ＮＨＥ１を導入していないC57BL/6Lを対照コントロールとし、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスおよび、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスにＮＨＥ阻害剤（カリポライド）を投与したものについて、心臓の形態を確認した。各々４０日令のマウスについて確認し、ＮＨＥ阻害剤は、２０日令のマウスにカリポライドを０．３ｍｇ／ｋｇ／日で２０日間腹腔内投与したものについて確認した。心臓の形態は、心臓を１０％中性ホルマリン固定後パラフィン切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色した組織標本を位相差顕微鏡で調べた。
【００４９】
その結果、４０日令の活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスでは、心室および心房筋の肥大を経過したのちに拡張型心筋症の様相を呈し、収縮能の著しい低下が観察された。一方、ＮＨＥ阻害剤を投与した活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスでは、心肥大および心不全の抑制が認められ、収縮能についても著明な改善が観察された（図５〜７）。活性化型ＮＨＥ１の存在は認められても、ＮＨＥ阻害剤により心肥大および心不全の抑制が認められたことから、間接的にＮＨＥ１が活性化された場合のみならず、恒常的な活性化型ＮＨＥ１により、心肥大および心不全の症状に影響することが示唆された。すなわち、Ca2+レベルのみならず、活性化型ＮＨＥ１によるNa+レベルの上昇も心肥大および心不全の症状に影響することが示唆された。
【００５０】
（実験例３）
本実験例では、活性化ＮＨＥ１ＴＧマウスでの心筋細胞内のCa2+レベルを確認した。
【００５１】
活性化型ＮＨＥ１を導入していないC57BL/6Jを対照コントロールとし、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスについて、４０日令における心筋細胞内のCa2+レベルをCa2+蛍光指示薬Ｉｎｄｏ−１ (sodium-binding benzofuran isophthalate)を用いた蛍光測定法により、確認した（図８）。
【００５２】
その結果、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスのほうが、コントロールと比較して、明らかに高いCa2+レベルを示した。
【００５３】
（実験例４）
本実験例では、活性化ＮＨＥ１ＴＧマウスでの心筋細胞内のNa+濃度を確認した。
【００５４】
活性化型ＮＨＥ１を導入していないC57BL/6Jを対照コントロールとし、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスについて、４０日令における心筋細胞内のNa+濃度をNa+蛍光指示薬ＳＢＦＩを用いた蛍光測定法により、確認した（図９）。
【００５５】
その結果、活性化型ＮＨＥ１ＴＧマウスのほうが、対照コントロールと比較して、明らかに高いNa+レベルを示した。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
以上説明したように、本発明の活性化型ＮＨＥ１遺伝子を過剰発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物により、従来のリセプターを介して間接的にＮＨＥ１が活性化される心肥大モデルとは異なり、ＮＨＥ１活性化による細胞内Na+濃度上昇が引き金となっている心肥大または心不全モデルを構築することができた。本モデルにより、心肥大・心不全発症を導く新たなシグナル経路の発見、特にイオン代謝異常に起因する心肥大・心不全発症のメカニズムの検討および治療法の開発に貢献することができる。さらに、新規経路を標的とした心不全治療薬、心筋保護薬の開発に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】心不全におけるNa+/H+交換輸送体(Na+/H+exchaner, ＮＨＥ）の関与を説明する図である。
【図２】活性化型ＮＨＥ１を示す図である。
【図３】トランスジェニックマウス作製における活性化型ＮＨＥ１を組み込んだベクターを示す図である。（実施例１）
【図４】トランスジェニックマウスの心筋における活性化型ＮＨＥ１の発現結果を示す図である。（実験例１）
【図５】４０日令のマウスの心臓を示す図である。（実験例２）
【図６】４０日令の活性化型ＮＨＥ１発現トランスジェニックマウスの心臓を示す図である。（実験例２）
【図７】４０日令の活性化型ＮＨＥ１発現トランスジェニックマウスにおいて、２０日令からＮＨＥ阻害剤を投与したときの心臓を示す図である。（実験例２）
【図８】活性化型ＮＨＥ１発現トランスジェニックマウスの心筋細胞内のCa2+レベルを示す図である。（実験例３）
【図９】活性化型ＮＨＥ１発現トランスジェニックマウスの心筋細胞内のNa+濃度を示す図である。（実験例４）
【符号の説明】
【００５８】
ＴＧマウス：トランスジェニックマウス
【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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