(57)【要約】【課題】本発明の目的は、成長因子溶液と、成長因子の徐放が可能で注射可能なキャリアーとなる両親媒性ペプチド水溶液とを混合することによって、ナノ繊維の三次元的ネットワークを作製することであり、また、虚血心筋病モデルを使ってＥＳ細胞の移植効率を改良するときに、このナノ繊維の三次元的ネットワークから成長因子を徐放させることによって、プレ血管新生の実現可能性が高まるかどうかを調べることである。【解決手段】我々は、ＥＳ細胞の分化と血管成長とを促進する新しいアプローチが、成長因子を含む注射可能な三次元足場を創出し、それが成長因子を持続的に放出し、血管新生を引き起こすのであろうと考えた。そして、本発明を完成することができた。すなわち、本発明は、幹細胞と、成長因子と、両親媒性ペプチドとを組み合わせることによって、心臓病組織を再生する方法を提供するものである。前記成長因子として好ましいものは、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である。【選択図】  図１
2008283991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞と、成長因子と、両親媒性ペプチドとを組み合わせることによって、心臓病組織を再生する方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、幹細胞懸濁液と、成長因子溶液と、両親媒性ペプチド溶液とを心筋梗塞部位に同時的に注入して、直ちに両親媒性ペプチドゲルを形成させ、組織再生を促進する方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法において、上記成長因子として塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を用いる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋梗塞の治療に役立つ心臓病組織再生方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹（ＥＳ）細胞の移植は、血管新生と組織代替とを惹起する能力があることを基礎に、心臓血管疾患を処置する潜在的能力のある有力手段として出現してきた（非特許文献１参照）。移植されたＥＳ細胞が心臓機能を改善するメカニズムはまだはっきりしないけれども、ドナー細胞数あるいはドナー由来の筋量が、ＥＳ細胞の移植に続く心臓機能の分析に重要であることは明らかになってきている(B. Pouzet et al, 2001; K. Tambara et al, 2003)。それゆえ、グラフト量を増加させることはＥＳ細胞による治療効果を最大にする妥当な理由であろう。組織工学では、細胞を利用することにより、傷つき若しくは失われた器官に対し、天然組織を再生させ、あるいは生体代該物を製作させるようにデザインされようとしている。生体における細胞の利用を考えると、移植された細胞へ栄養及び酸素を十分に供給することは、細胞の生存・維持にとって必須であることは疑う余地もないことである(C.K. Colton, 1995)。十分な供給がなければ、足場に予め接種され、あるいは周囲の組織から足場のほうへ移動してきたほんの少数の細胞のみが生き残るだけであろう。細胞移植部位での血管網の急速な形成は、細胞に活力を供給するために有望な方法である。新しい毛細血管系を生じさせるこの「血管新生」と呼ばれるプロセスは、発達及び創傷治癒において生理的に観察されるプロセスである(P.J. Polverini, 1995)。
【０００３】
ｂＦＧＦは、そのような血管新生のプロセスを促進させる作用があると認められている(J.A. Ware et al, 1997)。成長因子は、生体中に既に存在する適当な細胞（例えば、内皮細胞）を刺激して、これを周囲組織から血管へと移動させ、増殖させ、最終的には血管へと分化させる(C.K. Colton, 1995)。しかし、これらタンパク質が溶液の形で注射された場合、注射部位から拡散による放出が起こるので、支えられた血管新生がいつも期待できるとは限らない。in vivoでの効率を上げる可能性ある一つの方法は、成長因子をポリマーキャリアーに取り込むことによって、成長因子を長時間に亘って制御的に放出（徐放）させることである。もしキャリアーが組織増殖と調和して生分解を受けるならば、それ（キャリアー）は、成長因子を放出するキャリアーマトリックスの機能に加えて、組織再生の足場としての機能をもつであろう。実際、媒介マトリックスと足場の組合せで用いられたときに、ｂＦＧＦが血管新生を促進するといういくつかの報告がある（非特許文献２参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Orlic D, et al: Nature. 2001; 410:701-705
【非特許文献２】Y. Tabata et al:Tissue Eng. 1999; 5: 127-138
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、成長因子溶液と、成長因子の制御的放出（徐放）が可能で注射可能なキャリアーとなる両親媒性ペプチド（peptide amphiphile）水溶液とを混合することによって、ナノ繊維の三次元的ネットワークを作製することであり、また、虚血心筋病モデルを使ってＥＳ細胞の移植効率を改良するときに、このナノ繊維の三次元的ネットワークからの成長因子を徐放させることによって、プレ血管新生の実現可能性が高まるかどうかを調べることである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
〔発明の概要〕
心筋梗塞の治療にＥＳ細胞の移植は有効であるけれども、必要不可欠な血液供給については従来、十分に注意が払われていなかった。我々は、ＥＳ細胞の分化と血管成長とを促進する新しいアプローチが、成長因子を含む注射可能な三次元足場を創出し、それが成長因子を持続的に放出し、血管新生を引き起こすのであろうと考えた。そして、本発明を完成することができた。
【０００７】
すなわち、本発明は、幹細胞と、成長因子と、両親媒性ペプチド（peptide amphiphile）とを組み合わせることによって、心臓病組織を再生する方法に関するものである。
【０００８】
＜略号＞
本明細書で略号は以下の意味をもつ。
ＥＳ細胞：胚性幹細胞（embryonic stem cells）
ＰＡ：両親媒性ペプチド（peptide amphiphile）
ｂＦＧＦ：塩基性繊維芽細胞成長因子（basic fibroblast growth factor）
ＰＢＳ：リン酸塩緩衝液（phosphate-buffered saline）
【発明の効果】
【０００９】
本発明方法は、投与された成長因子を、損傷を受けた器官部位内に留めおくのに有効であり、移植されたＥＳ細胞の生存に必要な酸素及び栄養素の供給に有効であり、そして、心筋梗塞の改善に有効である。
【発明の更に詳しい説明】
【００１０】
上で述べたように、本発明は、幹細胞と、成長因子と、両親媒性ペプチド（ＰＡ；peptide amphiphile）とを組み合わせることによって、心臓病組織を再生する方法である。
ここで、幹細胞と、成長因子と、ＰＡとを組み合わせる一つの方法として、幹細胞懸濁液と、成長因子溶液と、ＰＡ溶液とを心筋梗塞部位に同時的に注入して、直ちにＰＡゲルを形成させ、そのまま維持する方法をとることができる。そうすれば、組織再生が促進される。
ただし、このとき、使用（注入）前に成長因子とＰＡ溶液とを混合しないように、注意を払わなければならない。何故ならば、成長因子（例えば、ｂＦＧＦ）とＰＡ溶液との混合は急速なゲル様固体を生じさせ、これらを注射できなくなるからである。
一方、使用前に成長因子と幹細胞とを混合することは差し支えなく、また、使用前にＰＡ溶液と幹細胞とを混合することもできる。    
【００１１】
上記成長因子として、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β1（ＴＧＦ−β１）、骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、又は肝細胞成長因子（ＨＧＦ）が使える。中でも、ｂＦＧＦが好ましい。
【００１２】
本発明を分かりやすく説明したものが、図１（記号の１：ＥＳ細胞、２：ｂＦＧＦ、３：ＰＡ）で、ｂＦＧＦを取り込んだＰＡからのｂＦＧＦの制御的放出（徐放）を介した「血管形成と心筋由来ＥＳ細胞の移植」の模式図である。この図は、ｂＦＧＦを取り込んだＰＡからのｂＦＧＦ（これが、ＥＳ細胞をして心筋細胞へとより良く増殖させ分化させるもの）の投与の間に、血管形成がどのように起こるかを示している。ＥＳ細胞がそのような環境に面すると、それら細胞は閉じた系で、増殖及び心筋への分化のために必要な酸素及び栄養素を供給する新生血管と接触でき、生き残ることができるのである。
【発明の好ましい実施の形態】
【００１３】
本発明で共通的に使用した材料及び方法は次の通り。
＜試薬＞
アミノ酸誘導体、誘導体樹脂は、桑和貿易(株)から購入した。ヒト・リコンビナントｂＦＧＦ（ＭＷ＝１７０００，等電点＝９．６）は、科研製薬(株)から購入した。他の化学試薬は、和光純薬（株）から得た。使用した水はミリポア社のミリＱ純水器で脱イオンした水である。
【００１４】
＜両親媒性ペプチド（ＰＡ）＞
ＰＡは標準的なＦｍｏｃ化学（G.B.Fields et al, Int. J. Peptide Protein Res. 1990; 35: 161-169）を利用した全自動ペプチド・シンセサイザーで、０．５ミリモルのスケールで調製した。ＰＡの化学構造は、ＲＤＧ、グルタミン酸残基、４つのアラニンと３つのグリシン（Ａ４Ｇ３）を有し、これらに１６個の炭素原子をもつアルキルテイルが繋がっている。合成されたペプチドは、Ｃ端カルボキシル基を有し、これは予め誘導体化されたワング樹脂を用いてつくった。ＰＡは飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を用いて分析し、所望の分子量をもつことを確認した。
【００１５】
＜細胞株、及びＥＳ細胞の培養＞
１２９／Ｏｌａ由来ＥＳ細胞株を用いた。この細胞株は、文献（Kawamura T. et al, J.Biol.Chem.2005;20:19682-8）に書かれているようにして、植え継ぎ、分化させた。ここで、ＥＳ細胞の分化は、ＥＢｓ（embryonic bodies）の形成を通じ惹起させた。hanging drops中で２日間、インキュベートした後、分化用培地１０ｍＬと共にＥＢｓ６０個を１０ｃｍペトリ皿に移し、浮遊ＥＢｓとして７日間培養した。その後、これらの細胞をバラバラに解離させ供給した。
【００１６】
実施例１  自己凝集性ＰＡナノファイバーの３次元ネットワークのイン・ビトロ形成とその評価
（ａ）自己凝集性ＰＡナノファイバーの３次元ネットワークのイン・ビトロ形成
自己凝集性ＰＡナノファイバーの３次元ネットワークの形成は、ｂＦＧＦを２，１０，３０，及び５０μｇ含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用して行なった。１０μｇ又はそれ以上の量のｂＦＧＦを含む溶液と１ｗｔ％ＰＡ水溶液とを１：１（容量比）で混合すると、直ちに透明なゲル様固体が形成された。自己凝集性ＰＡナノファイバーの３次元ネットワークは両親媒性ペプチド分子の凝集によって形成されたナノファイバー・ネットワークで構成されており、このプロセスは（ＰＡ）水溶液にｂＦＧＦ懸濁液を添加することで引き金が引かれたのである。
ナノファイバーの形成は、ＰＡの特殊な化学構造に著しく依存する。ＰＡは、その種類、電荷及び環境に依存して、それ自身が凝集し、シート状にも、球体状にも、ロッド状にも、ディスク状にも、あるいは管状にもなりうる。親水性ヘッド基が疎水性テイル（狭い）基よりも少し嵩張っている円錐状ＰＡは、柱状ミセルを形成したことが文献（J.D. Hartgerink et al, Science. 2001; 294,:1684-1689）に示されている。ここで合成されたＰＡは、炭素数１６個の疎水性ドメイン、Ａ４Ｇ３の親水性ドメイン及びグルタミン酸残基と、それにつづくＲＤＧでつくられた円錐とから成る。グルタミン酸残基は、ＰＡに対し、ｐＨ７．４で正味の負電荷を供与し、そのため、ｂＦＧＦ分子の正電荷はそれらの間の静電的反発から守ることができる。このように、静電的反発が電解質によって守られると、その分子（すなわち、ＰＡ）は水素結合を形成することにより、また、その疎水性部分と水分子との間の好ましくない接触によって集合するように仕向けられる。
【００１７】
（ｂ）形態学的観察
図２（Ａ）は、ｂＦＧＦ溶液に１重量％ＰＡ水溶液を１：１（容量比）で加えることで生じたゲルの様子を示すものであり、図２（Ｂ）は、自己凝集して形成されたＰＡナノ繊維の三次元ネットワークのＳＥＭ（S-2380N型; 日立）写真を示すものである。自己凝集したＰＡナノ繊維のＳＥＭ写真は、直径が２０〜３０ｎｍで、長さは数百ｎｍ〜数μｍの、非常に高いアスペクト比及び大きな比表面積を有する繊維状ナノ繊維集合体の形成を示している。
【００１８】
（ｃ）自己凝集したＰＡナノ繊維からのｂＦＧＦ放出の評価（イン・ビトロ）
ｂＦＧＦ放出のイン・ビトロ評価を蛍光スペクトロフォトメーターを用いて行なった。内在性のトリプトファン蛍光は、タンパク質溶液から、励起波長２８０ｎｍ、測定波長３２５ｎｍで観察した。上で述べた方法と同様な操作で調製した自己凝集ＰＡナノ繊維の固体ゲルをＰＢＳ３０ｍｌに投入し、３７±１℃で、５０ｒｐｍでゆっくりかき混ぜた。予め決められた所定間隔ごとにサンプル１ｍｌをとるとともに、同量の新鮮な緩衝液（ＰＢＳ）を加えた。サンプルの蛍光強度は、蛍光スペクトロフォトメーター（Ｆ−２０００型，日立，Ｅｘ  ２８０ｎｍ／Ｅｍ  ３２５ｎｍ）を用い測定し、そして、最初に加えたｂＦＧＦの値で除して放出ｂＦＧＦの量（％）を求めた。各実験は、６サンプルについて別々に行なった。自己凝集したＰＡナノ繊維からのｂＦＧＦの放出量は、図３に示すように、ｐＨ７．０で時間の関数である。図示されるように、放出プロフィールは、開始後１０ｈの間のタンパク質の「初めの急激な放出」（initial burst）と、それに続く長時間（７５０ｈまでの）の持続的放出とで特徴づけられている。
【００１９】
実施例２  自己凝集したＰＡナノ繊維から放出されたｂＦＧＦにより引き起こされた血管新生のイン・ビボ評価
（ａ）方法
麻酔下に、ＰＡ水溶液５０μｌとｂＦＧＦ溶液５０μｌ（２、１０、３０、及び５０μｇ）とを、別々に同時的に、雄マウス（５週齢；清水ラボラトリー）の背中皮下に注意深く注射した。その後、１、３、７、１０、１４、２１、及び２８日目に、これらマウスに麻酔薬を過剰に注射して殺し、引き続く生物学的調査のために、注射部位を含む皮膚（２×２ｃｍ２）を注意深く切り取った。対照群としては、ＰＡ水溶液１００μｌ又はｂＦＧＦ溶液１００μｌを皮下に注射した。処置した部位周辺の組織状況を記録するために、皮膚切片の写真をとった。
組織学的評価のために、皮膚切片を注射部位の中央部で外科用メスによって切り取った。皮膚切片を１０％中性ホルマリン溶液で固定し、パラフィン包埋し、切断し（厚み２ｍｍ）、引き続きヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）で染色した。３匹の異なるマウスからの三つの断面写真を異なる倍率で撮った。
【００２０】
（ｂ）結果（ＰＡ有り又は無しでｂＦＧＦと共に処置したあとの血管形成）
図４は、ｂＦＧＦのみの皮下注射、ＰＡのみの皮下注射又はＰＡとｂＦＧＦの両方の皮下注射の７日後の各々のマウス皮下結合組織における組織切片を示す写真である。ＰＡ溶液と共にｂＦＧＦを注射したとき、注射部位で毛細血管が新しく形成された。ｂＦＧＦのみの注射は血管形成に寄与せず、その組織外見はＰＡ単独注射と同様であった。
【００２１】
図５は、ｂＦＧＦのみの皮下注射、ＰＡ溶液のみの皮下注射又はＰＡとｂＦＧＦの両方の皮下注射の７日後の各々のマウス皮下結合組織における組織学的切片の写真である。ＰＡとｂＦＧＦの両方を皮下注射した部位の周りに、新しい血管が形成されたことは明らかである一方、ｂＦＧＦ溶液のみでは効果は見られない。問題となる重篤な炎症応答は観察されなかった。
【００２２】
実施例３  エコー心電図で評価したときの処置後の心機能
（ａ）方法
＜心筋梗塞（ＭＩ）モデル＞
心筋梗塞をもつ雄の成熟したＣ５７ＢＬ／６マウス（１００〜１６０ｇ）は、文献（S. Miyamoto et al, Circulation. 2006;113:679-90）に記載されているように近位左側下向冠状動脈（ＬＡＤ）を５−０ポリプロピレン縫合糸で結サツすることによって調製した。
【００２３】
＜実験群＞
ＬＡＤ結サツの５週後に、中くらいの大きさのＭＩ（梗塞サイズ：３５％−５５％）をもつマウス６４匹を４群に分けた。対照群（ｎ＝１８）では培地を注射した。グループＩ（ｎ＝１８）では、損傷部へＥＳ細胞（３×１０６）を培地と共に移植した。グループII（ｎ＝１８）では、ｂＦＧＦ（１０μｇ）を取り込んだＰＡを注射し、また、グループIII（ｎ＝１８）では、ＥＳ細胞（３×１０６）とｂＦＧＦ（１０μｇ）を取り込んだＰＡとを、細いシリンジを使って左心室壁の損傷組織の中央部に注射した。
【００２４】
＜エコー心電図＞
エコー心電図による評価は、文献（K. Tambara et al, Circulation. 2005;112:129-134）に記載の方法に従って行なった。映像は、１０−２０ＭＨｚ位相配列変換器（HP SONO 5500 映像システムを有する21380A型, Agilent Technologies社）を用いて記録した。
【００２５】
＜組織学的染色＞
体外培養された心臓は組織学的検討を行なった。試験片は全て、注射点を含む短軸切断面によって半分に切断し、そのうちの一つはＨＥ染色のために１０％ホルマリンで固定し、他の一つはＰＫＨ２６で標識したＥＳ細胞の蛍光顕微鏡観察のためにクリオミクロトームによって薄片に切断した。免疫組織化学は、先に記載の文献（K. Tambara et al, Circulation. 2005;112:129-134）にあるように、von Willebrand因子のため、また、分化したＥＳ細胞の心臓タンパクの検出のために行ない、この際、心臓トロポニンＩ（Santa Cruz Bio社）、心臓ミオシン重鎖（Cell Signaling社）及び心臓α−アクチニン（Santa Cruz Bio社）を用いた。
【００２６】
＜統計的分析＞
全てのデータは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で表し、統計的に分析した。Studentのｔ検定はｐが０．０５以下であるときに、統計的に有意差ありとして受け入れた。
【００２７】
（ｂ）結果
＜心電図エコーによる心機能データ＞
表１は、ＰＡ及びＥＳ細胞と共にｂＦＧＦを注射した場合の、梗塞した心臓の心機能をまとめたものである。処置前には、全ての実験群の間に心機能における有意な差は無かった。各々の処置の５週後に、グループII及びグループIIIにおけるＬＶＤｄは対照群におけるものよりも有意に小さかった。また、グループII及びグループIIIにおけるＬＶＤｓは、対照群におけるよりも有意に小さかった。三つ（グループI, II及びIII）のグループは、対照群よりも良好なＦＡＣであった。
【００２８】
【表１】
2008283991.tif 000003
【００２９】
＜イン・ビトロ及びイン・ビボにおける、ＥＳ細胞の心筋細胞への分化＞
マウスのＥＳ細胞は、未分化状態（図６ａ）を維持するために、ゼラチン・コート培養皿の上で、白血球阻害因子（ＬＩＦ）１０００単位／ｍｌを含む培地で培養した。分化を惹起するためには、ペトリ皿で７日間、hanging drop分析（図６ｂ）して、その中にembryonic bodies (EBs)を産生させ、つづいてこれらのEBsをゼラチン・コートしたペトリ皿に移して分化を更に進行させた。鼓動するEBsの塊は９日目に見られた（図６ｃ）。これら鼓動する塊が心筋であるかどうかを決定するために、心臓トロポニンI 、心臓ミオシン重鎖（β−ＭＨＣ）、及び心臓α−アクチニンに対する免疫染色を実行した（図６ｄ、６ｅ、６ｆ）。鼓動する塊が心筋であることを確認した。これらの細胞もまたイン・ビボで分化できるかどうかを決定するために、次に、７日目のEBsを各々の細胞にまでバラバラに解離させたのち、この細胞を受容細胞と区別するためにＰＫＨ２６で標識した。３×１０６個の細胞をＭＩモデルのマウス心臓に注射し、その５週後にそのマウスを殺し、免疫化学的に分析するため注射部位を薄片化した。図６ｇは、ＰＫＨ２６で蛍光標識したＥＳ細胞のポジ写真である。免疫蛍光染色は、ＰＫＨ２６で蛍光標識されたＥＳ細胞の心臓ミオシン重鎖（MHC）に対して行なった。図６ｇにおける矢印は、心臓ミオシン重鎖（MHC）に対して陽性であることを示しており、図６ｈにおける矢印についても同様である。図６ｉにおける合体は、ＰＫＨ２６染色及び心臓ミオシン重鎖（MHC）に対する染色の二つを重ね合わせたものである。この結果は、ＥＳ細胞が心筋に分化したことを示している。
【００３０】
＜梗塞部位でのＥＳ細胞の維持に対するｂＦＧＦ徐放の効果＞
マウス心臓の梗塞部位に移植されたＥＳ細胞が維持されるかどうかを調べるために、７日目のＥＢｓを各々の細胞までにバラバラに解離させ、受容細胞と区別するために、これをドナー細胞としてＰＫＨ２６（PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma Chemical Co.）で染色した。ＭＩ領域へのＰＫＨ２６蛍光標識されたＥＳ細胞の移植５週後に、ＭＩ領域の中心部及び周縁部において標識ＥＳ細胞を観察した。図７のグループIIIに示されるように、他のグループと比べて、ＰＫＨ２６蛍光標識されたＥＳ細胞はＭＩ領域の中心部及び周縁部（それぞれ、図７Ｄと図７Ｈ）で著しく増加していた。ＭＩ領域の中心部では、グループＩとグループII（それぞれ、図７Ｂと図７Ｃ）の間で標識ＥＳ細胞の数に少し違いがある。図７Ａと図７Ｅはそれぞれ梗塞部位中央部及び周縁部における対照群である。これらの知見は、高度に加水されたネットワークを通り抜ける栄養素、ｂＦＧＦ及び酸素の拡散が、大多数の細胞の長期間に亘る生存のために十分であることを示唆するものである。
【００３１】
＜ｂＦＧＦの徐放による血管形成の亢進と左室壁の再生＞  
ＰＡによるｂＦＧＦの徐放が、ＥＳ細胞が存在する梗塞部位中心部又は周縁部での血管形成を引き起こしているかどうかを調べた。複合物（（Ａ）：バラバラに解離させたＥＢｓのみを７日目にマウスの心臓の梗塞部位に注射、（Ｂ）：ｂＦＧＦと共に注射、（Ｃ）：ｂＦＧＦ及びＰＡと共に注射、）を投与した５週後に、von Willebrand 因子（図８Ｃにおける矢印）に向けた免疫組織化学を用いて血管の数をカウントすることによって、梗塞部位中心部又は周縁部における血管密度を分析した。梗塞部位中心部における血管密度はグループIII（Ｃ）において他のグループよりも高かった（図８Ｃ）。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ｂＦＧＦを取り込んだＰＡのｂＦＧＦ制御的放出（徐放）を介した血管形成と心筋由来ＥＳ細胞の移植を説明する模式図。下の部分は、注射可能なＰＡとｂＦＧＦとによる血管形成（これはプレ血管形成と呼ばれる）の惹起を示すものである。
【図２】イン・ビトロで自己凝集したＰＡナノ繊維の三次元ネットワークを示す写真。（Ａ）：ＰＡ溶液にｂＦＧＦ溶液を添加することで生じたゲルの光学的顕微鏡写真で、ｂＦＧＦの使用量は１０μｇ。（Ｂ）：この自己凝集したＰＡナノ繊維の三次元ネットワークのＳＥＭ写真。
【図３】自己凝集したＰＡナノ繊維からの、イン・ビトロでのｂＦＧＦ放出速度を示すグラフ。ｂＦＧＦの使用量は１０μｇ。
【図４】処置７日後のマウス皮下結合組織における組織出現を示す写真で、その処置としては（Ａ）がＰＡの皮下注射、（Ｂ）がｂＦＧＦのみの皮下注射、（Ｃ）がＰＡとｂＦＧＦの両方の皮下注射。ｂＦＧＦの使用量は１０μｇで、横棒は５ｍｍを表す。
【図５】処置７日後のマウス皮下結合組織における組織切片を示す写真で、その処置としては（Ａ）がＰＡの皮下注射、（Ｂ）がｂＦＧＦのみの皮下注射、（Ｃ）がＰＡとｂＦＧＦの両方の皮下注射。ｂＦＧＦの使用量は１０μｇで、横棒は２００μｍを表す。矢印は新たに生じた毛細血管を示す（倍率：×１００、ＨＥ染色）。
【図６】ＥＳ細胞の心筋細胞への分化を示す写真で、（ａ−ｆ）はイン・ビトロ、（ｇ−ｉ）はイン・ビボ。（ａ）〜（ｉ）については本文参照。
【図７】保持物へ及ぼすｂＦＧＦの制御的放出（徐放）の影響と心筋梗塞部位におけるＥＳ細胞の増殖へ及ぼす影響を示す写真。Ａ〜Ｈについては本文参照。
【図８】ｂＦＧＦの制御的放出（徐放）によって引き起こされた血管形成及び左心室（ＬＶ）壁の再生亢進を示す写真。バラバラに解離させたEBs(embryonic bodies)を７日目に単独で（Ａ）、ｂＦＧＦと共に（Ｂ）、又はｂＦＧＦ及びＰＡと共に（Ｃ）、マウス心臓の心筋梗塞部に注射した。
【符号の説明】
【００３３】
１：ＥＳ細胞
２：ｂＦＧＦ
３：ＰＡ
【図１】
2008283991.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【外国語明細書】
[Title of the Invention]
A method for cardiac tissue regeneration
[Field of the Invention]
[0001]
This invention relates to a method for cardiac tissue regeneration toward myocardial infarction therapy.
[Background of the Invention]
[0002]
Embryonic stem (ES) cell transplantation has emerged as a potential modality for the treatment of the cardiovascular diseases on the basis of its possible ability to induce neovascularization and tissue replacement (see non-patent ref. 1). Although the mechanism by which transplanted ES cells improved cardiac function remain unclear, it has been clarified that donor cell number or donor-derived muscle volume are critical to assay cardiac function following ES cells transplantation (B. Pouzet et al, 2001; K. Tambara et al, 2003). Therefore, increasing graft volume may be a reasonable strategy to maximize the efficacy of ES cells therapy. Tissue engineering is designed to regenerate natural tissues or to create biological substitutes for defective or lost organs by making use of cells. Considering the usage of cells in the body, it is no doubt that a sufficient supply of nutrients and oxygen to the transplanted cells is vital for their survival and functional maintenance (C.K. Colton, 1995).  Without a sufficient supply, only a small number of cells pre-seeded in the scaffold or migrated into the scaffold from the surrounding tissue would survive. Rapid formation of a vascular network at the transplanted site of cells must be a promising way to provide cells with the vital supply. This process of generating new microvasculature, termed neovascularization, is a process observed physiologically in development and wound healing(P.J. Polverini, 1995). 
[0003]
It is recognized that bFGF function to promote such an angiogenesis process (J.A. Ware et al, 1997). The growth factors stimulate the appropriate cells (e.g., endothelial cells), already present in the body, to migrate from the surrounding tissue, proliferate, and finally differentiate into blood vessels (C.K. Colton, 1995). However, one cannot always expect the sustained angiogenesis activity when these proteins are only injected in the solution form probably because of their rapid diffusional excretion from the injected site. One possible way for enhancing the in vivo efficacy is to achieve its controlled release over an extended time period by incorporating the growth factor in a polymer carrier. If this carrier is biodegraded, harmonized with tissue growth, it will work as a scaffold for tissue regeneration in addition to a carrier matrix for the growth factor release. Indeed, some studies have demonstrated that bFGF promoted angiogenesis when used in combination with delivery matrices and scaffold (non-patent ref. 2). 
[0004]
[non-patent ref. 1] Orlic D, et al: Nature. 2001; 410:701-705
[non-patent ref. 2] Y. Tabata et al:Tissue Eng. 1999; 5: 127-138
[Disclosure of the Invention]
[Purpose of the Invention]
[0005]
A purpose of this invention is to fabricate the 3-D networks of nanofibers by mixing a growth factor solution with aqueous solution of peptide amphiphile as an injectable carrier for controlled release of growth factors and used it for feasibility of prevascularization by the growth factor release from the 3-D networks of nanofibers in improving efficiency of ES cells transplantation in a ischemic cardiomyopathy model. 
[Summary of the Invention]
[0006]
Although embryonic stem (ES) cells transplantation are effective for the therapy of myocardial infarction but little care has been taken for the blood supply indispensable. We hypothesized that a novel approach to promote ES cells differentiation and vascularization would be to create injectable three dimensional (3-D) scaffolds containing growth factor that enhance the sustained release of the growth factor and induce angiogenesis.  Then we completed this invention. 
[0007]
This invention provides a method for cardiac tissue regeneration by combination of stem cells, growth factor and peptide-amphiphile.
[0008]
<Abbreviation>
Abriviated words have the following meaning in this specificaton.
ES cells: embryonic stem cells
PA : peptide-amphiphile
bFGF: basic fibroblast growth factor
PBS: phosphate-buffered saline
[Advantageous effects]
[0009]
This invented method is effective in maintaining the administered growth factor within damaged site of organ and supplying oxygen and nutrients necessary for the survival of transplanted ES cells in organ, and effective in improving myocardial infarction.
[Detailed Description of the Invention]
[0010]
As above described, the invention is a method for cardiac tissue regeneration by combination of stem cells, growth factor and peptide-amphiphile.
As one means of combination of stem cells, growth factor and peptide-amphiphile,  we can adopt simultaneous injection of stem cells suspension, growth factor solution and peptide-amphiphile solution into a cardiac infracted site to form peptide-amphiphile gel promptly and keep as it is. Then, tissue regeneration is promoted.
But, we should take care we do not mix the growth factor and peptide-amphiphile solution before use, because the mixing of both growth factor(e.g. bFGF) and peptide-amphiphile solution results in forming a immediate transparent gel-like solid, and therefore we can not inject them.
On the other hand, we can mix the growth factor and stem cells before use, and we can mix peptide-amphiphile and stem cells before use.
[0011]
As the above growth factor, we can use, e.g. basic fibroblast growth factor(bFGF), and transforming growth factor β1(TGF-β1), bone morphogenetic protein-2(BMP-2), vascular endothelial growth factor(VEGF) or hepatocyte growth factor (HGF). Among them we can preferably use basic fibroblast growth factor(bFGF).
[0012]
It is Fig.1 to elucidate this invention plainly(1:embryonic stem cells, 2 : basic fibroblast growth factor(bFGF),3: peptide-amphiphile), which shows a schematic illustration of vascularization and transplantation of cardiomyocytes-derived ES cells through controlled release of bFGF from bFGF-incorporated PA. This figure represents how vascularization occur during administration of bFGF from bFGF-incorporated PA which induced better proliferation and differentiation of ES cells into cardiomyocytes. When ES cells faced to such an environment, they could survive due to closed contact with neovascular vessels which supply oxygen and nutrients for them in order to proliferation and differentiation into cardiac myocytes.
[Preferred Embodiments of the Invention]
[0013]
Materials and method commonly used in this invention are as followed. 
<Reagents>
Amino acid derivatives, derivatized resins, were purchased from Sowa Trading Co., Inc.. Human recombinant bFGF (Mw = 17000, isoelectric point (IEP) = 9.6) was purchased from Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.. Other chemicals were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd., and used as obtained.  All water used was deionized with a Millipore Milli-Q water purifier.
[0014]
< Peptide-amphiphile(PA)>
PA was prepared on a 0.5-mmol scale by using standard fluorenylmethoxycarbonyl chemistry (F-moc) (G.B.Fields et al, Int. J. Peptide Protein Res. 1990; 35: 161-169) on a fully automated peptide synthesizer. The chemical structure of PA contain RGD, a glutamic acid residue, four alanine and three glycine residues (A4G3), followed by an alkyl tail of 16 carbons. Peptide prepared has a C-terminal carboxylic acid and was made by using prederivatized Wang resin. PA was characterized bymatrix-assisted laser desorption ionization-time of time-of-flight mass spectroscopy and was found to have the expected molecular weight. 
[0015]
<Cell line and culture of embryonic stem cells>
129/Ola-derived ES cells lines were used. These cells were maintained and differentiated as described in the literature(Kawamura T. et al, J.Biol.Chem.2005;20:19682-8.). Here, differentiation of ES cells was induced through formation of embryonic bodies (EBs). After incubation in hanging drops for 2 days, 60 EBs were transferred into 10cm bacterial Petri dishes together with 10 ml of differentiation medium and cultured as floating EBs till day 7. Then these cells were dissociated for the delivery.
[0016]
Example 1  In vitro formation of 3-D network of self-assembled PA nanofibers and its estimation
(a)Formation of 3-D network of self-assembled PA nanofibers
Formation of 3-D network of self-assembled PA nanofibers was carried out by use of PBS(pH 7.4) containing 2, 10, 30, and 50 μg  of bFGF. A transparent gel-like solid was formed immediately by mixing of bFGF solution at the amount of 10 μg or higher with 1 wt % PA aqueous solution in a 1:1 volume ratio. The 3-D network of self-assembled PA nanofibers consists of nanofiber networks formed by the aggregation of the amphiphilic molecules, and this process was triggered by the addition of bFGF suspensions to the aqueous solutions. 
Formation of nanofibers strongly depends on the particular chemical structure of PA. PA can self assemble into sheets, spheres, rods, disks, or channels depending on the shape, charge, and environment. Amphiphiles with a conical shape in which the hydrophilic head group is somewhat bulkier than its narrow hydrophobic tail have been shown to form cylindrical micelles(J.D. Hartgerink et al, Science. 2001; 294,:1684-1689). The PA synthesized here contains a hydrophobic domain of 16 carbons and a hydrophilic domain of A4G3, a Glu residue, following a conical shape made of RGD. The Glu residue provides a net negative charge at pH 7.4 for PA, so that the positive charge of bFGF molecules can screen electrostatic repulsion among them. Thus once electrostatic repulsions are screened by electrolytes; the molecules are driven to assemble by hydrogen bond formation and by the unfavorable contact among hydrophobic segments and water molecules.
[0017]
(b)Morphological observation
Fig. 2(A) shows the appearance of gel formed by adding of 1 wt % PA aqueous solution to bFGF solution in a 1:1 volume ratio. Fig.2(B) shows SEM(S-2380N; Hitachi) photograph of nanofibers formed through self assembly of PA. SEM photograph of self-assembled PA revealed the formation of fibrous assemblies of nanofibers with an extremely high aspect ratio, and high surface areas, 20 to 30 nm in diameter and with lengths of hundreds of nanometers to a few micrometers.
[0018]
(c)Estimation of bFGF release from self-assembled PA nanofibers in vitro
In vitro bFGF release assay was performed using a fluorescence spectrophotometer. The intrinsic trypthophan fluorescence was observed from protein solutions at 280 nm excitation and 325 nm emission wavelengths. The solid gel of self-assembled peptide amphiphile nanofibers prepared by the similar procedure described above was placed in 30 ml of PBS with gentle stirring at 50 rpm at 37 °C ± 1 °C. At predetermined time intervals, 1 ml of the releasing medium was sampled and the same volume of fresh buffer solution was added. The fluorescent intensity of the sample solution was measured by a fluorescent spectrophotometer (F-2000 Fluorescent Spectrophotometer, Hitachi Ltd., Ex 280 nm/Em 325 nm) and divided by that initially added to obtain the percentage of bFGF released. Each experiment was carried out independently for six samples. The amount of released bFGF from the self-assembled peptide amphiphile nanofibers as a function of time at pH = 7.4 is shown in Fig. 3 As shown, the release profile was characterized by an “initial burst” of protein during the first 10 h followed by a longer period (up to 750 h) of sustained release. 
[0019]
Example 2  In vivo assessment of angiogenesis induced by bFGF released from self-assembled PA nanofibers
(a)Method
Under anesthesia, 50 μl of PA aqueous solution and 50 μl of bFGF solutions (at the amount of 2, 10, 30, and 50 μg), were carefully injected separately at the same time into the back subcutis of male mice (5 weeks old; Shimizu Laboratory Supply). At 1, 3, 7, 10, 14, 21, and 28 days post-treatment, the mice were sacrificed by an overdose injection of anesthetic and the skin including the injected site (2 × 2 cm2) was carefully taken off for the subsequent biological examinations. As the control groups, 100 μl of PA or 100 μl of bFGF solutions were injected subcutaneously. Photographs of the skin flaps were taken to record tissue appearance around the treated site. 
For histological evaluation, the skin flaps were cut at the central portion of injected site by a scalpel. One cut of the skin was fixed with 10% neutralized formalin solution, embedded in paraffin, and sectioned (2 mm in thickness), followed by staining with hematoxylin and eosin (HE). Photomicrographs of three cross sections from 3 different  mice were taken at different magnifications to evaluate histologically vascularization. 
[0020]
(b)Results of vascularization following treatment of bFGF with or without PA injection 
Fig. 4 shows the tissue appearance of mouse subcutis 7 days after subcutaneous injection of free bFGF, PA solution, and bFGF injection with PA. A transparent gel was formed immediately after injection of bFGF with PA. When bFGF was injected together with PA solution, capillaries were newly formed at the injected site. bFGF injection alone did not contribute to vascularization, and the tissue appearance was similar to that of PA injection alone. 
[0021]
Fig. 5 shows the histological sections of mouse subcutis 7 days after subcutaneous injection of free bFGF, PA solution, and bFGF injection with PA. It is apparent that new blood vessels were formed around the subcutaneous injection site of bFGF injection with PA, whereas free bFGF was not effective. No problematic and severe inflammatory response was observed.
[0022]
Example 3   Cardiac function after treatment estimated by echocardiography
(a)Method
<Myocaridal Infarction (MI) model>
C57BL/6 adult male mice (100-160 g) with myocardial infarction were prepared by the proximal left anterior descending coronary artery (LAD) ligation as described in the literature (S. Miyamoto et al, Circulation. 2006;113:679-90) with a 5-0 polypropylene suture.  
[0023]
<Experimental groups>
Five weeks after LAD ligation, 64 mice with moderate-sized MI (infarct size, 35 % to 55 %) were divided into 4 groups. Control group (n=18), had culture medium injection. In group I (n=18), ES cells (3×106) were transplanted in the scar with culture medium. Group II (n=18), had bFGF (10 μg)-incorporated with PA and group III (n=18) had ES cells (3x106) plus bFGF (10 μg) incorporation with PA were injected with a fine syringe into the central portion of scar tissue of the left ventricular (LV) free wall. 
[0024]
<Echocardiography>
Echocardiogaphy assessment was performed according to the method described in the literature (K. Tambara et al, Circulation. 2005;112:129-134). Images were recorded using a 10 to 12 MHz phased-array transducer (Model 21380A with HP SONO 5500 imaging system, Agilent Technologies). 
[0025]
<Histological Staining>
The explanted hearts were processed for histological study. Every specimen was cut in half by the short-axis section including the injection point; one part was fixed with 10% formalin for hematoxylin and eosin staining, and the other part was sectioned by cryomicrotome for fluorescent microscopic observation of PKH26 dye-labeled ES cells.  Immunolohistochemistry was performed for von Willebrand factor and detection of cardiac protein of differentiated ES cells for Cardiac troponin I (Santa Cruz Bio) and cardiac myosin heavy chain (Cell Signaling) as well as for cardiac α-actinin (Santa Cruz Bio) as described previously(K. Tambara et al, Circulation. 2005;112:129-134). 
[0026]
<Statistical analysis>
All the data were statistically analyzed to express the mean ± the standard deviation (SD) of the mean. Student’s t test was performed and p < 0.05 was accepted to be statistically significant.
[0027]
(b) Results
<Cardiac function data by echocardiography>
Table 1 summarizes the cardiac functions of infarcted hearts treated by bFGF injection together with PA and ES cells. There was no significant difference in cardiac function before treatment among all the experimental groups. Five weeks after each treatment, LVDd in the group II and group III was smaller than in the control group. Groups II and III had significantly smaller LV systolic dimension (LVDs) than the control group did. These three groups had better FAC than the control group.
[0028] 
2008283991.tif 000012
[0029]
<Differentiation of ES cells into cardiac myocytes in vitro and in vivo>
Mouse ES cells were cultured on gelatin-coated dishes in medium containing 1000 units/ml leukemia inhibitory factor(LIF) to maintenance in undifferentiated state(Fig.6a). To induce differentiation, we produced embryonic bodies (EBs) in hanging drop assay(Fig.6b) for 7 days in Petri dishes following transfer these EBs into gelatin coated culture dishes for further differentiation. Cluster of beating EBs were seen on day 9 (Fig.6c). To determine whether these beating cluster are cardiac myocytes, we performed immunostaining for cardiac troponin I(CTnI), cardiac myosin heavy chain(β-MHC) and cardiac α-actinin (Fig.6d, 6e, and 6f respectively). We found that beating clusters are cardiomyocytes. Next to determined whether these cells also could differentiate in vivo, EBs at day 7 were dissociated into single cells and labeled with PKH26 to distinguish from recipient cells. 3 × 106 cells were injected into MI model of mouse heart and five weeks later we sacrificed the mouse and injected site was sectioned for immunohistoligical analysis. (Fig.6g) represent positive PKH26 labeled ES cells. Immunofluorescence staining was performed for cardiac myosin heavy chain (MHC) for the PKH26 labeled ES cells. We found that arrowheads indicated in Fig.6g are positive for cardiac-MHC as indicated by arrowhead in Fig.6h. Merge in Fig.6i represents overlap of both staining for PKH26 and cardiac-MHC. Above results indicates that ES cells were differentiated into cardiac myocytes.
[0030]
<Effect of controlled release of bFGF on the maintenance of the ES cells in infarcted area> 
To examined whether the ES cells-transplanted into MI area of mouse heart maintained, EBs at day 7 were dissociated into single cells and stained with PKH26 (PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma Chemical Co.) as donor cells to distinguish from recipient cells. Five weeks after delivery of ES cells-labeled PKH26 into the MI area, we observed positive labeled ES cells in central and peri-MI area. As shown in Fig. 7, in group III, the number of PKH26 dye-labeled ES cells was markedly increased in central and peri-MI areas (Fig. 7D and 7H, respectively) compare with other groups. In central MI, there is slight difference of number of labeled ES cells between group II and group I (Fig. 7B and 7C, respectively). Fig. 7A and 7E represent control groups among central and peri-MI area, respectively. These findings suggest that diffusion of nutrients, bFGF, and oxygen through these highly hydrated networks is sufficient to survival of large numbers of cells for extended periods of time.
[0031]
<Enhancement of the vascularity and LV wall regeneration via controlled release of bFGF>
We examined whether controlled release of bFGF by PA could induce vascularization in central and peri-MI area where the ES cells are existed. Five weeks after delivery of complex ((A):Dissociated EBs day 7 were injected alone into MI area of mice hearts, (B):with FGF, (C):with bFGF&PA ), we analyzed vascular density in central-MI and peri-MI by counting the number of vessels using immunohistochemistry for von Willebrand factor(arrowhead in C). The vascular density in central-MI area was higher in Group III(C)than the other groups (Fig. 8C). 
[Brief Description of drawings]
[0032]
[Fig.1] Schematic illustration of vascularization and transplantation of cardiomyocytes-derived ES cells through controlled release of bFGF from bFGF-
incorporated PA. Lower part indicates induction of vascularization by injectable PA and bFGF which is called prevascularization.
[Fig.2] Photographs showing formation of 3-D network of self-assembled PA nanofibers in vitro. (A);Light microscopic photographs of a gel formed by adding bFGF solution to a PA aqueous solution. The amount of bFGF used is 10μg. (B);SEM photographs of the above self-assembled PA nanofibers network. 
[Fig.3] In vitro bFGF release kinetic from bFGF incorporated self-assembled PA nanofibers. The amount of bFGF used is 10μg.
[Fig.4] Photographs showing tissue appearance of mouse subcutis at day 7 after subcutaneous injection of PA solution (A), free bFGF solution (B), and bFGF with PA (C). The amount of bFGF used is 10μg. Bar represents 5 mm.
[Fig.5] Photographs showing histological sections of mouse subcutis at day 7 after subcutaneous injection of PA solution (A), free bFGF solution (B), and bFGF with PA (C). The amount of bFGF used is 10μg. Bar represents 200 μm. The arrows indicate newly formed capillaries (Magnification: × 100, HE staining).
[Fig.6] Photographs showing differentiation of ES cells into cardiac myocytes in vitro (a-f)and in vivo(g-i). See in the text regarding (a)- (i). 
[Fig.7] Photographs showing effect of controlled release of bFGF on the sustained and proliferation of ES cells in MI area. See in the text regarding A to H. 
[Fig.8] Photographs showing vascularization induced by controlled release of bFGF and enhanced regeneration of LV wall.  Dissociated EBs day 7 were injected alone (A), with FGF (B) and with FGF&PA (C) into MI area of mice hearts. 
[Meaning of symbol]
[0033] 
1: Embryonic stem cells
2: basic fibroblast growth factor(bFGF)
3: peptide-amphiphile(PA)
1. A method for cardiac tissue regeneration by combination of stem cells, growth factor and peptide-amphiphile.
2. The method of claim 1, wherein stem cells suspension, growth factor solution and peptide-amphiphile solution are injected simultaneously into a cardiac infracted site to form peptide-amphiphile gel promptly, and tissue regeneration is promoted.
3. The method of claim 1 or 2, basic fibroblast growth factor is used as the above growth factor.
[Abstract]
[Purpose] A purpose of this invention is to fabricate the 3-D networks of nanofibers by mixing a growth factor solution with aqueous solution of peptide amphiphile as an injectable carrier for controlled release of growth factors and used it for feasibility of prevascularization by the growth factor release from the 3-D networks of nanofibers in improving efficiency of ES cells transplantation in a ischemic cardiomyopathy model.
[Summary] We hypothesized that a novel approach to promote ES cells differentiation and vascularization would be to create injectable three dimensional (3-D) scaffolds containing growth factor that enhance the sustained release of the growth factor and induce angiogenesis.  Then we completed this invention. This invention provides a method for cardiac tissue regeneration by combination of stem cells, growth factor and peptide-amphiphile. As the above growth factor, we can preferably use basic fibroblast growth factor(bFGF).
[Typical figure]    Fig.1
[Fig. 1] 
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[Fig. 2] 
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[Fig. 3] 
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[Fig. 4] 
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[Fig. 5] 
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[Fig. 6] 
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[Fig. 7] 
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[Fig. 8] 
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