(57)【要約】【課題】遺伝子の増幅等を蛍光強度値として計測することにより、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出する装置に関して、正常でない蛍光強度値を検出することにより、これらの測定の精度を向上させることを目的とする。【解決手段】蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、予め特定の条件における遺伝子の増幅パターン情報が記憶部で記憶しており、当該測定の条件に対応でき得る増幅パターン情報を抽出する抽出部、測定するために遺伝子を増幅する過程において順次得られている蛍光強度値が前記増幅パターン情報と比較判定を実行して、前記増幅パターンから逸脱している異常蛍光強度値であるかを監視するデータ監視部、異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部、とを有することを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、
１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、
当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、
当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、
予め特定の条件における遺伝子の増幅パターン情報が記憶部で記憶しており、
当該測定の条件に対応でき得る増幅パターン情報を抽出する抽出部、
測定するために遺伝子を増幅する過程において順次得られている蛍光強度値が前記増幅パターン情報と比較判定を実行して、前記増幅パターンから逸脱している異常蛍光強度値であるかを監視するデータ監視部、
異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部、
とを有することを特徴とする遺伝子測定装置。
【請求項２】
蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、
１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、
当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、
当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、
任意の測定時点における蛍光強度値が当該測定時点の以前での測定時点の蛍光強度値と比して、低い値であって、
その２点間の差分が、当該計測時点における蛍光強度値から計測ベースライン値を減じた値の０．１に相当する値よりも大きい差分である場合に異常蛍光強度値であると判定するデータ監視部、
異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部、
とを有することを特徴とする遺伝子測定装置。
【請求項３】
蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、
１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、
当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、
当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、
前記遺伝子を増幅させる処理数が15回乃至25回から選択される回数以上の回数であっても、若しくは前記遺伝子を増幅させる反応時間が45分乃至75分から選択される時間を経過した後であっても、
当該計測時点における蛍光強度値が計測ベースライン値に比して高い蛍光強度値でない場合には、
計測不能であると判定するデータ監視部、
異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部、
とを有することを特徴とする遺伝子測定装置。
【請求項４】
前記遺伝子増幅部が、予め指示された温度可変条件にしたがって、
遺伝子を含む溶液に対して温度制御することにより、
ＰＣＲ反応を実行できる温度可変恒温部であることを特徴とする、
請求項１乃至３に記載の遺伝子測定装置。
【請求項５】
蛍光強度若しくは電流値を指標として定量的に遺伝子量を測定したデータをコンピューターにより評価する方法であって、
１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅するステップ、
当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定するステップ、
当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶部が記憶するステップ、
任意の測定時点における蛍光強度値が当該測定時点の以前での測定時点の蛍光強度値と比して、低い値であって、
その２点間の差分が、当該計測時点における蛍光強度値から計測ベースライン値を減じた値の０．１に相当する値よりも大きい差分である場合に異常蛍光強度値であると判定するステップとを有することを特徴とする遺伝子増幅評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光強度変化を指標とした定量的な遺伝子量等の測定における異常値の検出装置、当該異常値を検出する方法、及び当該方法をコンピューターに実行させるためのプログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、蛍光強度変化を指標とした定量的若しくは半定量的な遺伝子量の測定、遺伝子多型の検出などが広く行われている。また、蛍光強度変化の代わりに、インターカレーターを用いて電流値を指標とする場合もある。これらの測定においては、遺伝子を増幅させるPCR法が利用されることや、遺伝子多型の検出においては、インベーダー法が利用される場合があり、いずれも場合でも蛍光強度を測定の指標とする。
【０００３】
定量的な遺伝子量の測定では、リアルタイムPCR法が代表的なものである。リアルタイムPCR法では、PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし解析する技術である。エンドポイントでのPCR増幅産物を確認する従来のPCR法と比べて、DNAやRNAの正確な定量ができること、また、電気泳動を必要とせず簡便なステップでの解析を行うことができる。同法では、遺伝子が増幅される指数関数的な増幅領域で定量を行うため、PCRの増幅速度論に基づいた正確な定量を可能とする。
【０００４】
定量したい遺伝子を段階的に希釈したスタンダードを用いて、リアルタイムPCR反応を行う、遺伝子量が多い順に等間隔で並んだ増幅曲線が得られ、これに対して適当な閾値を設定すると、閾値と増幅曲線が交わる点（Ct値）が算出される。Ct値と初期鋳型量には直線関係があり、検量線を求め初期鋳型量を求めることができる。
【０００５】
リアルタイムPCRでは、PCR増幅産物を蛍光により検出する。検出方法は、インターカレーター法を用いる方法と蛍光標識プローブを用いる方法がある。SYBR  Green１などのインターカレーターでは、PCR反応により合成された二本鎖DNAに結合して、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターする。
【０００６】
次いで、遺伝子多型を検出する方法として、蛍光プローブを用いる方法がある。蛍光プローブは、検出特異性が高いので遺伝子の相同性の高い配列同士でも区別して検出できる。蛍光標識プローブを用いる方法には、TaqManプローブを用いた方法があり、５´末端を蛍光物質で修飾し、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして利用する。このプローブは、蛍光物質とともに、クエンチャー物質が近傍にあるので、蛍光の発生は抑制されている。PCRの伸長反応のステップのときに、Taq  DNAポリメラーゼのもつ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性により、測定したい遺伝子鎖にハイブリダイズしたTaq  Manプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発生する。
【０００７】
また、上記の応用例として、2種類のアレル特異的オリゴをPCR試薬に同時に混入して、遺伝子多型を検出したい遺伝子とTaq  Man  PCR反応を行う。その後に、蛍光検出器にて２種類の蛍光（例、FAMとVIC）の強度を測定する。その結果、鋳型がアレル１若しくはアレル２のホモ接合体であれば、FAM若しくは、VICのいずれかの強い蛍光強度を認め、それと対になる蛍光の蛍光強度が認められず、鋳型が、アレル１とアレル２のヘテロ接合であれば、FAMとVICの両者の蛍光が検出される（図１）。
【０００８】
また、PCR反応を利用しない遺伝子多型の検出方法として、インベーダー法がある。インベーダー法では、一遺伝子多型（SＮＰ）の有無を判定したい標的ＤＮＡと、インベーダーオリゴとシグナルプローブの３つをハイブリダイゼーションさせる。このインベーダーオリゴとシグナルプローブは、ＳＮＰ箇所を含む標的ＤＮＡのフラグメントに対して、相補的配列になるよう設計されており、またインベーダーオリゴとシグナルプローブは、１塩基がオーバーラップする構造としていることを特徴している。次いで、インベーダーオリゴとシグナルプローブが、完全に一致になっていることをCleavase酵素が構造特異的に認識し、Flapを切断し、切断されたFlapは蛍光プローブ（FRET
Probe）とハイブリダイゼーションして、ここに再度、Cleavase酵素が作用する。このFRET Probeには、蛍光色素（F）と消光剤（Q）が隣接して配置されていると、蛍光シグナルを発することを抑制されている。ここに、Cleavase酵素が作用すると、蛍光色素（F）と消光剤（Q）が切り離されることで、蛍光シグナルを発する。このようにして、PCR反応を利用せず、遺伝子多型の検出方法を検出することができる（特許文献１）。
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５１５７３７号公報  核酸の侵入的開裂
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、従来の遺伝子増幅等を伴う遺伝子量の定量、又は遺伝子の変異等を検出するにあたっては、その増幅量等の値を基準にして、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出するだけであり、その増幅量等の値が正常値であるか異常値であるかは判定されていなかった。仮に見かけの増幅量等がある値を示したとしても、それが正常値ではない場合には、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出について、誤差を生じさせたり、また、誤ったデータを得ることになる。
【００１１】
遺伝子の増幅量等の値が正常でない場合とは、遺伝子を増幅するための溶液に異物等が混入しており、正常に遺伝子の増幅がされず、遺伝子を増幅されるためのプライマーが異物等に反応してしまい、目的外遺伝子が増幅され、見かけの増幅がある。また、異物等が正常の遺伝子の増幅を障害させ、部分的な遺伝子増幅となることや、プライマー配列の設計が適当ではなく、遺伝子増幅のプロセスが障害されることなどが挙げられる。
【００１２】
そこで、本発明は、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出に関して、正常でない値を検出することにより、これらの測定の精度を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意工夫を重ねた結果、遺伝子増幅のプロセス、インベーダー法にあっては、遺伝子が切断され蛍光が増強されるプロセスにおける蛍光強度曲線や一定時間以上経過しても遺伝子増幅が無い実験例に着目して、この曲線の全体若しくは特定の範囲について評価することで、正常でない遺伝子増幅等を検出できることを、本発明により明らかにした。
【００１４】
本発明は、蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、予め特定の条件における遺伝子の増幅パターン情報が記憶部で記憶しており、当該測定の条件に対応でき得る増幅パターン情報を抽出する抽出部、測定するために遺伝子を増幅する過程において順次得られている蛍光強度値が前記増幅パターン情報と比較判定を実行して、前記増幅パターンから逸脱している異常蛍光強度値であるかを監視するデータ監視部、異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部とを有することを特徴とする遺伝子測定装置を提供するものである。図２は、本装置の処理工程を、フローチャートで説明したものである。
【００１５】
ここで、遺伝子とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸をいう。また、遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置とは、リアルタイムＰＣＲを行うことができる装置等をいい、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化したリアルタイムＰＣＲ専用装置がある。サーマルサイクラーでＤＮＡをＰＣＲ増幅しつつ、分光光度計でその増幅物をモニタリングする。リアルタイムＰＣＲ専用装置は、様々な機種が販売されており、９６ウエルのプレート単位で反応できるもの（Thermal Cycler Dice Real Time Systemなど）、高速でＰＣＲ反応が実行できるもの（Smart
Cycler Systemなど）が挙げられる。また、警告信号を発するとは、異常増幅パターンに対応するデータ値である場合には、モニター等で当該データを表示した場合に、特定の色などで強調表示されることなどが挙げられる。
【００１６】
「予め特定の条件における遺伝子の増幅パターン情報が記憶部で記憶する」とは、プライマー配列条件、ＰＣＲ反応の条件等により、遺伝子増幅パターンが異なる場合があるが、1又は２以上の遺伝子増幅パターンをコンピューターの記憶部で記憶することにより、実際にＰＣＲ反応で遺伝子を増幅させる条件に類似した条件における遺伝子増幅パターンと比較することができることとしている。また、請求項１記載の発明と異なる点として、測定するために遺伝子を増幅する過程において順次得られている蛍光強度値が、比較すべき遺伝子増幅パターンと異なるものである場合に、検出するものであり、遺伝子増幅が終了した段階とともに、増幅過程においても異常な計測データについて捕捉できることが特徴である。
【００１７】
また、本発明は、蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、任意の測定時点における蛍光強度値が当該測定時点の以前での測定時点の蛍光強度値と比して、低い値であって、その２点間の差分が、当該計測時点における蛍光強度値から計測ベースライン値を減じた値の０．１に相当する値よりも大きい差分である場合に異常蛍光強度値であると判定するデータ監視部、異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部とを有することを特徴とする遺伝子測定装置を提供するものである。
【００１８】
これは、遺伝子増幅パターンによらず、測定するための遺伝子増幅データのみに基づいて、異常蛍光強度値を検出する手段に特徴がある。また、当該計測時点における蛍光強度値から計測ベースライン値を減じた値の０．１に相当する値よりも大きい差分である場合に異常蛍光強度値であると判定する」としたのは下記の理由である。通常、計測のゆらぎ等から、任意の測定時点における蛍光強度値が当該測定時点の以前での測定時点の蛍光強度値と比して低い値であることがあるが、このケースと異常蛍光強度値であり、計測不能であることを区別するために、経験値から、一定の余裕分を持たせていることが特徴である。図３は、本装置の処理工程を、フローチャートで説明したものである。
【００１９】
また、本発明において、比較すべき増幅パターンが無い場合であっても、サイクル数が０回から、任意に決めたＰＣＲ反応のサイクル数に至っても、蛍光強度値が向上しない場合や、ＰＣＲ反応の後期に至っても、向上した蛍光強度値がプラトーに達しないことなどを、異常蛍光強度値を含むデータであることを判断する基準としても良い。
【００２０】
また、本発明は、前記遺伝子増幅部が、予め指示された温度可変条件にしたがって、遺伝子を含む溶液に対して温度制御することにより、ＰＣＲを実行できる温度可変恒温部であることを特徴としてもよい。
【００２１】
また、本発明は、蛍光強度を指標とする遺伝子量を定量的に測定できる遺伝子測定装置であって、１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅部、当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定する測定部、当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶される記憶部とを有し、前記遺伝子を増幅させる処理数が15回乃至25回から選択される回数以上の回数であっても、若しくは前記遺伝子を増幅させる反応時間が45分乃至75分から選択される時間を経過した後であっても、当該計測時点における蛍光強度値が計測ベースライン値に比して高い蛍光強度値でない場合には、計測不能であると判定するデータ監視部、異常蛍光強度値がある場合に警告信号を発信する信号発信部、とを有することを特徴とする遺伝子測定装置を提供するものである。
【００２２】
ここで、遺伝子を増幅させる処理数とは、ＰＣＲのように、３種類の温度条件を順に変化させ、遺伝子を増幅させるサイクル工程を処理数１とするものである。PＣＲの場合は、通常、このサイクル数、すなわち処理数は、20-45回数程度である。遺伝子を増幅させる処理数が15回乃至25回から選択される回数以上の回数であっても、S字曲線を描くように計測ベースラインから上昇しない場合には、増幅条件やそのサンプルに問題があるとして判断される。この15回乃至25回から選択される回数としたのは、発明者の経験から、同回数以上であっても、計測ベースラインから上昇しない場合には、遺伝子増幅工程に問題があることを見出して、これを自動化したものである。図４は、本装置の処理工程を、フローチャートで説明したものである。
【００２３】
他方で、遺伝子増幅の処理時間を基準としたのは、SNPのタイピングの際に利用されるインベーダー法のように、ある遺伝子が切断されることで蛍光を発し、これを検出する場ので、この反応時間により、より多くの遺伝子断片が生成され蛍光強度が増すことからである。ここで、遺伝子を増幅させる反応時間が45分乃至75分から選択される時間としたのは、先と同様に、発明者の経験から、同回数以上であっても、計測ベースラインから上昇しない場合には、遺伝子増幅工程に問題があることを見出して、これを自動化したものである。
【００２４】
また、本発明は、前記遺伝子増幅部が、予め指示された温度可変条件にしたがって、遺伝子を含む溶液に対して温度制御することにより、ＰＣＲ反応を実行できる温度可変恒温部であることを特徴とする遺伝子測定装置としてもよい。
【００２５】
また、本発明は、蛍光強度若しくは電流値を指標として定量的に遺伝子量を測定したデータをコンピューターにより評価する方法であって、１又は２以上の測定したい遺伝子を増幅する遺伝子増幅するステップ、当該増幅された遺伝子の遺伝子量が蛍光強度として経時的に測定するステップ、当該経時的な遺伝子量の測定データを記憶部が記憶するステップ、任意の測定時点における蛍光強度値が当該測定時点の以前での測定時点の蛍光強度値と比して、低い値であって、その２点間の差分が、当該計測時点における蛍光強度値から計測ベースライン値を減じた値の０．１に相当する値よりも大きい差分である場合に異常蛍光強度値であると判定するステップとを有することを特徴とする遺伝子増幅評価方法を提供するものである。ここで、「記憶された増幅パターン情報を抽出部から抽出するステップ」では、いくつかの増幅パターンについて、作業者が選択指示するための入力信号に基づいて、コンピューターが予め記憶された増幅パターンから抽出してもよく、また、遺伝子増幅のための溶液条件、ＰＣＲ反応の条件やプライマー配列条件等について、当該装置への指示情報に基づいて、特定の増幅パターンを抽出してもよい。この場合には、これらの条件情報と増幅パターンが関連付けられた情報が予め記憶されていることでも良い。
【００２６】
ここで、「電流値」を挙げたのは、PCRで遺伝子断片が増幅されることを計測するには、蛍光強度だけではなく、２本鎖に特異的に結合して導電性の物質を反応液に入れ、それらが局所的に集積することによる、電流等の変化により計測可能となるからである。本発明では、２本鎖の遺伝子を生成させながら、遺伝子が増幅する場合には、蛍光強度による計測とともに、電流等の変化で計測してもよい。なお、本発明において、遺伝子の増幅とは、PCRのように、鋳型となる遺伝子からそのコピーが指数関数的に生成されるもののほかに、インベーダー法にように、FRAT（蛍光エネルギー移動）ができ得る、蛍光検出用の遺伝子が切断され、遺伝子断片が増加するものも含まれる。
【００２７】
また、本発明において、異常データと判断する蛍光強度値は、１点の蛍光強度値に基づくものであっても、複数の蛍光強度値に基づくものであってもよい。計測処理のゆらぎから、１点のみの蛍光強度値が異常値であっても、特段問題の無い場合もあるので、複数の蛍光強度値に基づくものであってもよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出装置又はその方法に関して、正常でない値を検出することにより、これらの測定の精度を向上させることができる。これにより、増幅量等がある値を示したとしても、それが正常値ではない場合には、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出について、誤差を生じさせたり、また、誤ったデータを得ることを防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下に、本発明の異常データを検出することを特徴とする遺伝子計測装置、評価方法の構成等について、実施例をあげて説明する。なお、本発明の技術的範囲はこれら実施例によって制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（正常なＰＣＲ反応とＳ字曲線）
図８の下図では、ＰＣＲによる遺伝子増幅パターンを示している。横軸は、時間（Ｔime）、PCRの回転数を示し、縦軸は、蛍光強度値（Ｓignal）を示している。蛍光強度値の変化量を時間（ＰＣＲ方法の場合はサイクル数）の関数として、通常のグラフにプロットするとＳ字型（シグモイド）曲線になることが示される（Ｓignal２）。ＰＣＲ反応は、プライマーと標的遺伝子がアニーリングして、標的遺伝子の一部がコピーされ、再度、このコピーされた標的遺伝子の一部がプライマーとアニーリングを繰り返して、遺伝子増幅が指数関数的に増加されるが、同曲線はこれを示しており、ＰＣＲ反応の初期では、アリーリングできる標的遺伝子数も少なく、その確率が低いので、遺伝子が増幅されないか、若しくは増幅されたとしても僅かな増幅に留まる。次いで、コピーされた標的遺伝子数が一定以上の数になると、指数関数的に遺伝子増幅が増加する。ＰＣＲ反応の後期では、遺伝子増幅させるための材料、核酸が消費されること等で、遺伝子増幅が抑制され、プラトーに達する。
【００３１】
定量的ＰＣＲ方法は、従来公知のものを利用して、dATP、ｄＧＴＰ，ｄＣＴ及びｄＴＴＰ若しくはｄＵＴＰ，標的遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、Taqポリメラーゼ、プライマー、蛍光色素で標識した核酸プローブを用いて、Ｍｇイオン存在下に、温度を低温、高温を繰り返しつつ標的遺伝子を増幅し、増幅過程の蛍光色素の発光の増加量をリアルタイムでモニタリングする。
【００３２】
図５の上図では、下図と同じ条件でのＰＣＲ反応であるが、標的遺伝子のみを変えている。これにより、本実施例で用いたプライマーでは標的遺伝子とアニーリングできず、遺伝子が増幅していないことが分かる（Ｓignal１）。すなわち、このプライマー配列と相補的な標的遺伝子の有無が分かり、これが一部の遺伝子配列のみが異なるといった遺伝子多型の検出に利用できる。左図は、通常のグラフにプロットするとＳ字型（シグモイド）曲線について、時間軸を無くし、ＰＣＲ反応における検出できた蛍光強度値を示したものである。Ｓignal１では、遺伝子増幅が見られないので、蛍光強度は、ほぼ０を示す一方で、Ｓignal２では、遺伝子増幅が示されるので、蛍光強度値では、各サイクルの数のさまざまな値を示す。
【００３３】
遺伝子多型を検出するためのデータ分析では、ＰＣＲ反応における全てのサイクル数における蛍光強度値を利用するのではなく、図６に示すように、ＰＣＲ反応の後期における、指数関数的に遺伝子が増幅している部分及び遺伝子増幅がプラトーに達した部分をカバーするサイクル数を対象とする。ここでは網掛けで示すＰＣＲ反応の後期の15サイクルを対象としている。
【実施例２】
【００３４】
（異常なＰＣＲ反応とＳ字曲線）
図７及び図８では、正常なＰＣＲ反応（Signal２）とともに、異常なＰＣＲ反応（Signal１）を示している。図７の上図（Signal１）では、本来、遺伝子の増幅が無く、蛍光強度を示すことはないものであるが、ＰＣＲ反応の後期において、蛍光強度値が向上している。または、本来は、遺伝子が増幅されるべきで、その蛍光強度を示すものであると考えられるものである。正常なＰＣＲ反応をしない場合とは、ＰＣＲ反応溶液に異物があり、これと蛍光プローブ等が反応してしまったことや、標的遺伝子とアニーリングするプライマー配列の設計にミスがあり、理論的なアニーロングをせず、ＰＣＲ反応の後半になり、遺伝子増幅反応が見られることが考えられる。ＰＣＲの終点のみのデータを評価すると、Signal１の反応があるとされてしまう。
【００３５】
図８の上図（Signal１）では、本来、遺伝子の増幅が無く、蛍光強度を示すことはないものであるが、ＰＣＲ反応の後期において、ＰＣＲ反応とは関係のない蛍光強度値が観察される。これは、ＰＣＲ反応溶液に異物があり、これと蛍光プローブ等が反応してしまったことなどが考えられる。図７及び図８において、ＰＣＲ反応の終点のみに着目すると、これらの蛍光強度値が、遺伝子増幅の結果によるものか否かが不明であり、遺伝子の定量測定や遺伝子多型の検出において精度を低めるものとなる。
【００３６】
図９では、異常な蛍光強度値が含まれる場合の、データ分析の結果を示す。異なるアレルで遺伝子型を計測するときに、アレル１のみに反応したことに起因するsignal１と、アレル１のみに反応したことに起因するsignal２、また、両方のアレルに反応したことに起因するsignalが、signal１とsignal２の中間で検出されることがわかる。異常な蛍光強度値は、これらのシグナルの群とは、離れた領域にあることがあり、計測精度を低下させている。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の遺伝子計測装置及び測定評価方法は、標的遺伝子の遺伝子量を計測するために、ＰＣＲ反応により遺伝子量を増幅するに当たり、その増幅曲線や増幅パターンに着目をすることで、正常な遺伝子量の増幅がなされているかを判断することにより、異常なデータ（蛍光強度値）を検出できる。本発明によれば、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出装置又はその方法に関して、正常でない値を検出することにより、これらの測定の精度を向上させることができる。これにより、増幅量等がある値を示したとしても、それが正常値ではない場合には、遺伝子量の定量、遺伝子変異等の検出について、誤差を生じさせたり、また、誤ったデータを得ることを防止できる。また、本発明は遺伝子の増幅を伴わない、インベーダー法における蛍光強度値の変化を伴う計測においても利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】蛍光強度値を指標とする遺伝子多型の結果を示すグラフ
【図２】予め記憶された増幅パターンに基づく異常データの検出方法の処理工程を示すフローチャート
【図３】蛍光強度が低下することを指標とする異常データの検出方法の処理工程を示すフローチャート
【図４】一定の処理工程を経た後の蛍光強度値に基づく異常データの検出方法の処理工程を示すフローチャート
【図５】正常なＰＣＲ反応を示す遺伝子増幅パターンを表すグラフ
【図６】特定のＰＣＲ反応のサイクル数間でのデータを収集することを示す説明図
【図７】異常なＰＣＲ反応を示す遺伝子増幅パターンを表すグラフ１
【図８】異常なＰＣＲ反応を示す遺伝子増幅パターンを表すグラフ２
【図９】異常な蛍光強度値を含む遺伝子多型の結果を示すグラフ
【図１】
2008278783.tif 000002
【図２】
2008278783.tif 000003
【図３】
2008278783.tif 000004
【図４】
2008278783.tif 000005
【図５】
2008278783.tif 000006
【図６】
2008278783.tif 000007
【図７】
2008278783.tif 000008
【図８】
2008278783.tif 000009
【図９】
2008278783.tif 000010