(57)【要約】      （修正有）【課題】相補的なヌクレオチド塩基配列を有する標的核酸へのオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる、１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、およびこれら修飾オリゴヌクレオチドを用いる方法の提供。【解決手段】窒素性塩基に結合する２'-O-メチルリボフラノシル部分を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドを含む修飾ヌクレオチド。オリゴヌクレオチドは優先的にＲＮＡ標的に結合するよう修飾してもよい。該ヌクレオチドは、同一のヌクレオチド塩基配列を有する未修飾オリゴヌクレオチドより早い速度で標的配列にハイブリダイズする。【選択図】図２
2008283973.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸の存在を決定するために用いるプローブ分子であって、前記プローブは、少なくとも１の２’−Ｏ−アルキルリボヌクレオチドを含有するハイブリッドを形成する、相補的な第１及び第２の塩基領域を含み、前記プローブは、標的核酸が検出されるように、核酸アッセイ条件下で、標的核酸の標的配列と安定した複合体を形成するが、非標的核酸とは複合体を形成せず、かつ、前記複合体はプローブの１本鎖構造を含む、前記プローブ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は増加した標的親和性を生じる修飾または複数の修飾を持つ一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを使用する、核酸配列を検出または増幅するための方法および組成物に関している。そのようなオリゴヌクレオチドは、同一の標的に対して対応する非修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするよりも著しく速い速度で標的核酸にハイブリダイズすることが予想外にも発見された。その結果、本発明の方法および組成物は、医学的および獣医学的診断、食品試験および法医学のような核酸ハイブリダイゼーションを用いる応用に有利である。
【背景技術】
【０００２】
近年、核酸ハイブリダイゼーションは与えられた試料における特定の核酸の存在を同定、測定および検出する手段としてますます重要になってきた。従って、例えば、医学診断、環境および食品試験および法医学の分野はすべて、与えられた生物学的夾雑物または試料中の微生物の存在または不在を試験する迅速で、簡単なおよび並外れて正確な方法としての核酸ハイブリダイゼーション使用の恩恵を被ってきた。
【０００３】
ほとんどの核酸ハイブリダイゼーションスキームは共通の特色を持っている。一つのそのような特色は、定義されたまたは既知のヌクレオチド配列を持っている一本鎖核酸プローブ（または変性二本鎖プローブ）の使用である。プローブ分子はゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような生物源から誘導されてもよいし、または原核生物かまたは真核生物宿主細胞またはインビトロで酵素的に合成されてもよい。現在、普通に使用されるほとんどの核酸プローブは化学合成法を用いて作製されたオリゴヌクレオチドプローブである（”合成オリゴヌクレオチド”）。一つのそのような合成法は、成長する、固相に結合されたオリゴヌクレオチド鎖の５’末端に３’−活性化、保護ヌクレオチドの自動化された連続的付加、続いて支持体からの完成したオリゴヌクレオチドの切断および脱保護である。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１）を参照されたい。
【０００４】
ハイブリダイゼーションプローブとして使用するための合成オリゴヌクレオチドは典型的には検出されるべき核酸のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つデオキシリボヌクレオチドである。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは多くの理由により伝統的に好まれている。それらの中の一つはＤＮＡは普通の試料に暴露された場合に酵素的加水分解に対してより高い安定性を持っていることである（種々のＲＮａｓｅが試料のほとんど至る所に存在するため）。ＲＮＡはＤＮＡより化学的に安定性が悪いことも知られており、例えば、ＲＮＡ分解は塩基、重金属の存在により容易に起こる。ＲＮＡと比較して、ＤＮＡはアッセイ条件下、安定な二次構造をとる傾向は高くない。そのような二次構造は、オリゴヌクレオチドを分子間ハイブリダイゼーションに利用できなくすることができる。ＲＮＡがより好ましいものでないにしても、それにも関わらず、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用してもよい。
【０００５】
核酸ハイブリダイゼーションは、相補的ヌクレオチド配列を持つ核酸鎖の対応する領域と安定なハイブリッドを形成する一本鎖核酸の能力を利用する。そのようなハイブリッドは三本鎖構造も知られているが、通常は二本鎖の二重鎖から成っている。一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖は塩基、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）またはイノシン（Ｉ）を含むヌクレオチドから形成されている。一本鎖はハイブリダイズして相補的塩基対間の水素結合により一緒になって保たれた二本鎖構造を形成する。一般に、ＡはＴまたはＵと水素結合され、一方、ＧまたはＩはＣへ水素結合される。二本鎖に沿って、ＡＴまたはＡＵ、ＴＡまたはＵＡ、ＧＣまたはＣＧが存在している。加えて、いくつかの不適正塩基対（例えば、ＡＧ、ＧＵ）が存在するかもしれない。適当なハイブリダイゼーション条件下、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドが形成できる。
【０００６】
”相補的”とは、二つの二本鎖核酸の対応する領域、または同一の一本鎖核酸の二つの異なった領域の核酸配列が、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、一本鎖が一緒になってハイブリダイズして安定な二本鎖水素結合領域となることを可能にするようなヌクレオチド塩基組成を持っていることを意味している。一つの一本鎖領域のヌクレオチドの隣接配列が、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似の配列と連続した”基準的”水素結合塩基対（ＡがＵまたはＴと対を作りおよびＣがＧと対を作るような）を形成できる場合、ヌクレオチド配列は”完全に”相補的である。
【０００７】
いくつかの条件下ではたった一つの塩基が異なった核酸の区別が可能である核酸ハイブリダイゼーションの極度の特異性は、特定の微生物、与えられた遺伝子マーカーを運んでいる核酸、組織、生物体液などを含む試料のハイブリダイゼーションに基づいた開発を可能にしてきた。そのようなアッセイはしばしば他の近縁種を含む試料中の特定の微生物種に属する核酸の同定を可能にする。核酸ハイブリダイゼーションアッセイはまた、ヒト起源試料のＲＦＬＰ（制限断片長多形）およびＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）試験の法医学的使用のように、種内のある個体または個体の群を特異的に検出または同定できる。
【０００８】
核酸ハイブリダイゼーション試験における診断道具としてのオリゴヌクレオチドの使用には、オリゴヌクレオチドプローブ分子またはプローブおよび標的の両方に結合されたレポーター基または”標識”の使用がしばしば含まれる（しかし必ずしも含まれている必要はない）。そのようなレポーター基残基には、例えば、放射性同位元素、化学発光または蛍光試薬またはオリゴヌクレオチドに結合された酵素が含まれるであろう。標識は、特にプローブが標的核酸にハイブリダイズされた場合にプローブを検出可能にするために用いられる。
【０００９】
核酸を用いるアッセイ法の大多数は、非結合プローブからプローブ：被検体ハイブリッドを分離するために物理的分離工程を利用している。これらのアッセイ法は”不均一”アッセイと称されている。核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、被検体分子は検出、定量および／または同定が試みられている標的核酸種である。”ハイブリッド”とは、アッセイおよび／または増幅条件下、分子間水素結合を生じる相補性領域を持っている、プローブおよび標的核酸のような二つの一本鎖核酸から成る部分的または完全な二本鎖核酸である。
【００１０】
物理的分離工程を利用するアッセイ法には分離過程にガラス、鉱物またはポリマー性物質のような固相マトリックスを用いる方法が含まれる。分離は、固相マトリックスへ優先的にプローブ：被検体複合体を結合し、一方、会合しないプローブ分子を液相に残存させることを必要とする。そのような結合は例えば、ヒドロキシアパタイトの場合のように非特異的であるものでもよいし、例えば、標的核酸と、固体保持体上に直接または間接的に固定されている”捕捉”プローブとの配列特異的相互作用による特異的なものであってもよい。そのような場合、洗浄工程後に固相支持体へ結合されて残存しているプローブの量は、試料中の被検体の量に比例している。
【００１１】
もしくは、アッセイはハイブリダイズしていないプローブを優先的に結合し、一方、ハイブリッドを液相に存続して残す必要があるであろう。この場合、洗浄工程後の液相中のプローブの量が本来の試料の被検体の量に比例している。プローブが核酸またはオリゴヌクレオチドの場合、固体支持体はヒドロキシアパタイトのような吸着剤、多カチオン性部分分子、疎水性または”逆相”物質、ＤＥＡＥのようなイオン交換物質、ゲル濾過マトリックスまたは一つまたはそれ以上のこれらの固相物質の組み合わせを含むことができるが、これらに制限されるわけではない。これらの固相支持体は、直接または間接的にプローブ、標的またはその両方を捕捉するために一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドまたは他の特異的結合残基を含んでいるであろう。ゲル濾過、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲルのような媒質の場合においては、分離はオリゴヌクレオチドの結合によるものではなく、それは異なった大きさまたは形の分子の分子ふるい分けにより行われている。後者の二つの場合、二本鎖および一本鎖核酸のような異なった大きさまたは形の核酸のゲルを通しての異なった移動を起こす電流をゲルに与えることにより、電気泳動的に分離が行われるであろう。
【００１２】
不均一アッセイ法では、問題とする被検体を含んでいることが疑われる試料の添加に先立っての、固相マトリックスへのプローブの結合も行われるであろう。試料は標識と、所望の核酸（もし、試料混合物中に存在するなら）の標識を起こすであろう条件下で接触させることができる。固相マトリックスは、プローブおよびマトリックス間に共有結合が形成されるように誘導化または活性化される。もしくは、プローブは以下の相互作用を含む（制限するわけではない）強力な非共有結合相互作用によりマトリックスに結合されるであろう：イオン性、疎水性、逆相、免疫結合、キレート形成および酵素基質。ハイブリッドの形成が可能な条件下、マトリックス−結合プローブを標識核酸に暴露した後、非結合、標識被検体を遊離させるために固相マトリックスを洗浄することにより分離工程が達成される。逆に、被検体を固相マトリックスに結合でき、標識プローブと接触させ、標識検出の前にマトリックスから過剰の遊離プローブを洗浄することもできる。
【００１３】
さらに別の型のアッセイ系は”均一アッセイ”と称されている。均一アッセイは一般的に溶液中で行うことができ、固相分離工程がなく、通常遊離プローブおよび被検体：プローブ間の化学的相違を利用する。均一および不均一様式で使用できるアッセイ系の例は、Ａｒｎｏｌｄらによる米国特許第５，２８３，１７４号に開示されているハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡＴＭ）であり、プローブは化学発光残基に結合されており、被検体と接触させ、次に被検体：プローブ複合体に結合または連結されている化学発光試薬を変化させることなく、ハイブリダイズされていないプローブに結合または連結されている化学発光試薬を変化させる条件下、選択的化学分解または安定性の検出可能な変化をさせる。続いての化学発光反応の開始により、ハイブリッド−会合標識が発光を起こす。この特許は本出願と共通の所有権を保持しており、特別に本明細書において援用される。
【００１４】
標識プローブまたは被検体がその非標識類似体との結合を競合する競合アッセイもまた不均一形式で普通に使用される。どのように系が設計されるかに依存して、結合標識プローブの量かまたは非結合標識プローブの量を試料中の被検体の量に相関させることができる。しかしながら、そのようなアッセイはまた、物理的分離工程を含まない均一形式、または均一および不均一アッセイの両方の要素を取り込んだ形式においても使用できる。
【００１５】
本明細書に記載したアッセイ法は単に例示のためであり、当業者には既知である核酸を用いるアッセイ形式を余す所なく述べていると理解してはならない。
核酸ハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドを生きている生物体内の遺伝子発現を修飾または阻害するための治療薬として用いることを目的とした方法で利用されてきた。そのような利用の例において、オリゴヌクレオチド”アンチセンス”剤は、ウイルスタンパク質または癌遺伝子のような障害性遺伝子産物をコードしているｍＲＮＡ種を特異的に標的化することができる。例えば、Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，７５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），２８０−２８４（１９７８）；Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｚａｍｅｃｎｉｋ，７５  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），２８５−２８８（１９７８）；およびＴｙｌｌｉｓ,米国特許第５，０２３，２４３号を参照されたい。出願人は理論に縛られるのを望んでいるわけではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮＡ標的への結合により生じるＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖はＲＮＡｓｅ（ほとんどの細胞に存在するＲＮＡ分解酵素であり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖に含まれているＲＮＡに特異的である）の基質になるであろうと考えられている。このモデルに従うと、標的ＲＮＡ分子はアンチセンスオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションにより分解される。この一般戦略の変法も存在し、例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上に酵素活性（いわゆるリボザイムと称されるＲＮＡｓｅ活性のような）を与える構造を持っている。例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１５１９４号を参照されたい。
【００１６】
治療用アンチセンスオリゴヌクレオチドは主としてインビボで機能するように設計されているため、そのような薬剤を送達するための処方は正常の細胞機能を有意に阻害してはならない。従って、インビトロでのオリゴヌクレオチド分解を防止するために診断試薬にしばしば含まれているであろうヌクレアーゼ阻害剤はインビボでの使用には適していない。このことから、非修飾ＤＮＡよりも高いヌクレアーゼ耐性を持たせるため、ヌクレオチド結合間で、塩基または糖残基で、またはこれらの部位を組み合わせた部位で修飾された種々のオリゴヌクレオチドが設計された。
【００１７】
従って、窒素性塩基に修飾を持ついくつものオリゴヌクレオチド誘導体が作製され、アデノシンの６位アミノ基の水素による置き換えにより得られたプリン；グアノシンの６−ケト酸素の水素による置換により得られた２−アミノプリン、または硫黄による置換により得られた６−チオグアノシン、およびチミジンの４−ケト酸素を硫黄または水素で置き換えることによる、各々、４−チオチミジンまたは４−ヒドロチミジンなどが含まれる。これらすべてのヌクレオチド類似体がオリゴヌクレオチド合成のための反応体として使用できる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（前記文献）を参照されたい。他の置換塩基が本分野で知られている。例えば、Ｃｏｏｋらにより”遺伝子発現を検出および調節するヌクレアーゼ耐性、ピリミジン修飾オリゴヌクレオチド”と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０２２５８号（本明細書において援用される）を参照されたい。塩基修飾ヌクレオチド誘導体はオリゴヌクレオチド合成のために商業的に手に入れることができる。
【００１８】
同様に、リボフラノシルまたはデオキシリボフラノシル残基の修飾を持ついくつものヌクレオチド誘導体が報告されている。例えば、Ｃｏｏｋらにより”シクロブチル  アンチセンスオリゴヌクレオチド、作製方法およびその使用”と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１９０２３号；ＭｃＧｅｅらにより”新規２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドおよびその製造のためのホスホロアミダイト過程およびその使用”と題されたＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０２５０１号；Ｃｏｏｋにより”ギャップを持つ２’−修飾オリゴヌクレオチド”と題されたとＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１号を参照されたい。これら三つの文献は本明細書において援用される。
【００１９】
そのような修飾塩基を含んでいるほとんどのオリゴヌクレオチドは、増加した細胞取り込み、ヌクレアーゼ耐性および／または増加した基質結合性を考慮して処方された。言い換えると、そのようなオリゴヌクレオチドは治療用遺伝子調節薬剤として記載されている。
【００２０】
修飾ヌクレオチド残基を持つ核酸は天然にも存在している。従って、型または起源に依存して、ＲＮＡ中の修飾塩基はメチル化またはジメチル化塩基、脱アミノ化塩基、カルボキシル化塩基、チオ化塩基およびこれらの修飾の種々の組み合わせを持つ塩基を含むことができる。加えて、２’−Ｏ−アルキル化塩基が天然の核酸として存在することが知られている。Ａｄａｍｓ，ＴｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，７，８(１１版、１９９３）を参照されたい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
発明の要約
本発明は核酸ハイブリダイゼーション技術を用いる診断法および組成物に関する。出願人は驚いたことに、相補的ヌクレオチド配列を持っている標的核酸への増加した結合親和性を持つ一つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、非修飾オリゴヌクレオチドよりも速い速度で標的核酸へハイブリダイズするであろうことを発見した。本明細書に記載されている発明は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅プライマー、ヘルパーオリゴヌクレオチドおよび所望の核酸の捕捉および固定化のためのオリゴヌクレオチドとしてのそれらの使用を含む方法においての、オリゴヌクレオチド（全体的または部分的にそのように修飾されている）の使用に注意を引かれた。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明はそのように制限されているようにみなされるものではないが、本発明の特に好適な態様はリボフラノシル（またはデオキシリボフラノシル）残基の２’修飾を含むヌクレオチドを持っているオリゴヌクレオチドを利用する診断法に関している。特に、出願人は合成オリゴヌクレオチドの一部にそのような修飾を持っているヌクレオチドを取り込むと、核酸ハイブリダイゼーションの速度を大いに増加でき、ＤＮＡ標的よりもＲＮＡ標的へのそのようなオリゴヌクレオチドの結合が優先される。現在好適な態様では、窒素性塩基へ連結された２’−Ｏ−メチルリボフラノシル残基を持つヌクレオチド類似体を含んでいるオリゴヌクレオチドを使用している。糖の２’位での他の置換も、本開示を考慮すれば、置換がハイブリダイゼーションの立体的阻害を起こさない限りは同様の特性を持っていると期待される。
【００２３】
加えて、本発明のもとになった発見を考慮すると、修飾オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドのＴｍを増加させる他の修飾も、同様にハイブリダイゼーション速度を増加させるのに寄与することを期待するのは合理的であろう。そのような修飾はデオキシリボフラノシルまたはリボフラノシル残基の２’位（または他の位置）（２’ハライド置換のような）、窒素性塩基上（Ｎ−ジイソブチルアミノメチリデン−５−（１−プロピニル）−２’−デオキシシチジン；シチジン類似体または５−（１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン；チミジン類似体）または連結残基中に起こるであろう。従って、本明細書を通して２’修飾を特に参考にしていくが、当業者は同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドを含んでいるハイブリッドよりも修飾オリゴヌクレオチド：標的ハイブリッドのＴｍの増加を導く他の修飾もハイブリダイゼーション動力学に対して同様の性質および効果を持つと期待されることを理解するであろう。
【００２４】
用語Ｔｍはその温度で等量の相補的核酸鎖の総数の５０％が二本鎖形で存在していることを意味しており、本開示を通して”オリゴヌクレオチドのＴｍ”または核酸（一本鎖）のＴｍとは標的との核酸二重鎖中のオリゴヌクレオチドまたは核酸のＴｍを意味することが意図されており、ここで核酸は特に指示しない限りオリゴヌクレオチドの塩基配列領域に正確に相補的である塩基配列領域を含んでいる。
【００２５】
修飾オリゴヌクレオチドのＴｍは同一塩基配列の対応する非修飾オリゴヌクレオチドのＴｍよりも高いため、本明細書に記載されている組成物および診断法は、核酸標的（好適にはＲＮＡ標的）の特異的ハイブリダイゼーションおよび検出に実際的であるよりも短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にする。与えられた温度で標的核酸へ特異的に結合する、より短い長さのオリゴヌクレオチドの使用はさらなる利点を持っている。例えば、より短いオリゴヌクレオチドは一般的に”不適正”塩基配列領域と完全に相補的である標的を区別するより大きな能力を持っているであろう。より短いオリゴヌクレオチドはまた、所望しない塩基配列とは重なりにくいであろう。さらに、より高いＴｍのため、修飾オリゴヌクレオチドはそれらの非修飾相対物よりもより高い温度で安定にハイブリダイズできる。
【００２６】
より高いハイブリダイゼーション温度の使用は速度論的にハイブリダイゼーション反応を動かし、より低い温度で起こるよりも速いハイブリダイゼーション速度が得られる。さらに、本発明の方法で使用された修飾オリゴヌクレオチドでは、温度を上げなくても非修飾相対物よりも速いハイブリダイゼーション速度が得られた。
【発明の効果】
【００２７】
速くなったハイブリダイゼーション速度は診断アッセイにおいていくつかの他の利点を導いた。例えば、本発明に従って実施される診断アッセイは、従来存在するハイブリダイゼーションアッセイよりも迅速に実施できる。アッセイの結果が医学処置または他の行動の進行を指示する場合、より速いアッセイ結果は明らかな予後徴候利点を持っており、より有効な処置が行える。また、標的、特にＲＮＡ標的に対する修飾オリゴヌクレオチドのより速いハイブリダイゼーション速度およびより大きな親和性のため、同一量の信号を達成するためにより低い濃度のプローブが使用されるであろう。従って、アッセイバックグラウンド（または”ノイズ”）が低減でき、より低い濃度のプローブは非標的核酸との望ましくない交差反応を除去するのを助けることができる。加えて、これらのアッセイは多量の試料で実施してもよく、従ってアッセイの感度が増加する。
【００２８】
従って、ハイブリダイゼーションアッセイプローブ、増幅オリゴヌクレオチド、試料調製オリゴヌクレオチドおよび／またはヘルパーオリゴヌクレオチドはすべて、標的特異的ハイブリダイゼーションの速度を増加させる利点を持つ修飾塩基を含むように設計できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
定義
特に指示しない限り、以下の用語は本明細書を通して指示された意味を持っているであろう。
【００３０】
”核酸被検体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｙｔｅ）”または”被検体”とは、試料中の検出されるべきと考えられる核酸、または核酸増幅反応の結果として合成された核酸を意味しており、それは試料中で検出されるべきと考えられた核酸またはそれらの相補体のヌクレオチド塩基配列の少なくとも約２０ヌクレオチドを含んでいる。
【００３１】
核酸またはオリゴヌクレオチドを”合成する”とは、化学合成または酵素的手段により核酸を作製することを意味している。ある種の核酸ポリメラーゼ酵素は、酵素的合成の間に修飾ヌクレオチドを取り込めることが知られている。
【００３２】
”修飾された”、”修飾されたヌクレオチド”または”修飾”とは、古典的リボ−およびデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵからの目的を持った変異体を意味している。本明細書で使用された場合、修飾されたとは古典的ヌクレオチドの変異体を意味するであろうし、該修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズされた場合、古典的ヌクレオチドを含む同一のオリゴヌクレオチドよりも高い結合効率が該変異体からは得られる。いくつかの場合、修飾された３’末端を持っているオリゴヌクレオチドが参照されるであろう。このことは、オリゴヌクレオチドの３’末端が核酸ポリメラーゼによる３’末端の伸長を阻害または防止する置換を含んでいることを意味している。
【００３３】
”複合された分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）”とは、分子およびオリゴヌクレオチド両方の少なくともいくつかの特性が結合された生成物中で保持されているようにオリゴヌクレオチドと結合できる分子を意味している。しばしば、複合された分子はオリゴヌクレオチドに対して新しい物理的または化学的性質を与えるが、一方、オリゴヌクレオチドは塩基対形成の能力は保持している。
【００３４】
”結合親和性”とは定義された核酸ハイブリダイゼーション条件下、少なくとも部分的に相補的な核酸間の水素結合強度の尺度を意味している。結合親和性の都合のよい尺度はＴｍであり、それは該二つの鎖の５０％が二本鎖またはハイブリダイズされた形で存在する温度である。
【００３５】
”標識（ｌａｂｅｌ）”とはオリゴヌクレオチドの存在の指標として検出されるレポーター部分を意味しており、それはオリゴヌクレオチドに結合されている。標識オリゴヌクレオチドが一つまたはそれ以上の他のオリゴヌクレオチドへハイブリダイズされている場合、標識の存在は同様に他のオリゴヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドの存在の指標となりうる。適したレポーター部分は本分野ではよく知られており、例えば、放射性同位元素、色素、化学発光物質、蛍光物質、化学発光および電気化学発光物質、核酸配列、酵素、酵素基質、発色団およびハプテンが含まれる。
【００３６】
”核酸アッセイ条件”とは非相補的塩基配列領域間の安定なハイブリッド形成よりも相補的塩基配列領域間の安定なハイブリッドの優先的な形成のための環境条件を意味しており、温度および塩濃度を含んでいる。
【００３７】
”アクリジニウムエステル誘導体（ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  ｅｓｔｅｒ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）”または”ＡＥ”とは、アクリジニウム環と脱離基をＣ９位で結合している、標識エステルまたはエステル様結合を持つアクリジニウム環から誘導される化学発光性化合物の一群を意味している。脱離基は好適にはアリールまたは置換アリール基である。アルキル（例えば、メチル）アルコキシ（例えば、メトキシ）、アリールおよびハライド（例えば、ＢｒおよびＦ）のような置換をアクリジニウム環または脱離基の片方または両方に行ってもよい。そのようなアクリジニウムエステルの例は図１に提供されている。
【００３８】
本発明の方法および組成物は、オリゴヌクレオチドが与えられた標的に対してより高いＴｍを持つように修飾された一つまたはそれ以上のヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチド（修飾がなければ非修飾オリゴヌクレオチドと比較しても同一である）は非修飾オリゴヌクレオチドと比較してより速い速度で与えられた標的にハイブリダイズするであろうという予期されなかった発見の結果である。修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度の最大の増加は、ヌクレオチドの”クラスター”が修飾された場合に起こる。”クラスター”とは少なくとも約４から５の連続したヌクレオチドがそのように修飾されていることを意味している。従って、修飾および非修飾ヌクレオチドの混合物を含んでいるオリゴヌクレオチドも、１００％修飾ヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドが標的ハイブリダイゼーション速度を増加させるのと同様に有効である。本発明の態様は、修飾および非修飾ヌクレオチドの両方を含んでいる”キメラ”オリゴヌクレオチドを特色としている。
【００３９】
本明細書の文脈で使用される場合、”標的”核酸とはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされることが試みられている核酸である。そのような核酸は天然に存在する核酸（例えば、リボソームＲＮＡ）であってもよいし、ＰＣＲまたは以下により詳細に説明される転写に基づいた増幅法のような核酸増幅法の生成物（即ち、”アンプリコン”）であってもよいし、または他の合成オリゴヌクレオチドであってもよい。
【００４０】
従って、本発明は同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドよりもオリゴ：標識ハイブリダイゼーション速度の増加を示す修飾オリゴヌクレオチドを含む診断法および組成物に関している。
【００４１】
好適な態様において、本発明はデオキシリボフラノシル（またはリボフラノシル）環の２’位での修飾を利用している。２’−修飾にはリボフラノシル環の２’位での水素またはヒドロキシル以外の基の置換が含まれている。置換の性質に関わらず、相補的ヌクレオチド塩基配列を持っている一本鎖オリゴヌクレオチドへハイブリダイズする、一つまたはそれ以上のそのようなヌクレオチド修飾を含んでいるオリゴヌクレオチドの能力を立体的に妨げてはならない。一つの鎖がそのような修飾を含んでいる、相補的二本鎖核酸のハイブリダイゼーションは、どちらの鎖もそのように修飾されていない状態と比較すると著しく増加している。
【００４２】
修飾されたオリゴヌクレオチドが”増加した”または”より大きな”親和性または速度を持っていると呼ばれる場合、修飾されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度または親和性が、同一標的に対する同一の長さおよび塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度または結合親和性よりも大きいことを意味している。
【００４３】
特に好適なオリゴヌクレオチドは２’糖位置がメトキシ基で置換されているものである。これらの２’−修飾オリゴヌクレオチドはＴｍおよびハイブリダイゼーション速度論の両方に関して、ＲＮＡ標的と同一の配列を持っている（しかし、ＴはＵで置換されている）ＤＮＡよりもＲＮＡに対する優先性を示した。別のそのようなオリゴヌクレオチドは本分野で既知である。
【００４４】
本明細書に記載したように修飾されたオリゴヌクレオチドに結合された複合体分子はこれらのオリゴヌクレオチドの標的への結合親和性およびハイブリダイゼーション速度をさらに増加させるように機能するであろう。そのような複合体分子には、例えば、カチオン性アミン、インターカレーティング色素、抗生物質，タンパク質、ペプチド断片および金属イオン錯体が含まれる。普通のカチオン性アミンとしては、例えば、スペルミンおよびスペルミジン（即ち、ポリアミン）が挙げられる。本分野で知られているインターカレーティング色素には、例えば、エチジウムブロミド、アクリジンおよびプロフラビンが含まれる。核酸に結合できる抗生物質には、例えば、アクチノマイシンおよびネトロプシンが含まれる。核酸に結合できるタンパク質には、例えば、制限酵素、転写因子およびＤＮＡおよびＲＮＡ修飾酵素が含まれる。核酸に結合できるペプチド断片には、例えば、ＳＰＫＫ（セリン−プロリン−リジン（アルギニン）−リジン（アルギニン））モチーフ、ＫＨモチーフまたはＲＧＧ（アルギニン−グリシン−グリシン）ボックスモチーフが含まれるであろう。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，ＥＭＢＯＪ，８：７９７−８０４（１９８９）；およびＢｕｎｄ，ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５：６１５−６２１（１９９４）を参照されたい。核酸に結合する金属イオン錯体には、例えば、コバルト  ヘキサミンおよび１，１０−フェナントロリン−銅が含まれる。例えば、生じたハイブリッドが三つまたはそれ以上の核酸を含んでいる場合、オリゴヌクレオチドはさらに別の種類の複合体分子を意味している。そのようなハイブリッドの例は、標的核酸、標的にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブおよびプローブにハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド複合体分子から成る三重鎖であろう。複合体分子は、インターカレーション、グルーブ相互作用、静電結合および水素結合を含む種々の手段により（これらに制限されるわけではない）オリゴヌクレオチドに結合される。当業者は本発明の修飾オリゴヌクレオチドに結合できる他の複合体分子を認識するであろう。例えば、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１（３）：１６５−１８７（１９９０）を参照されたい。さらに、複合体分子は、ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドの合成前または後にヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドへ結合またはつなぐことができる。
【００４５】
出願人はまた、標的への修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度の観測された増加量は、特に標的がオープンまたは折り畳まれていない構造を持っている場合、またはヘルパープローブが存在する場合には連続した修飾ヌクレオチドの数を増加させても、必ずしも無限には増加しないことを予想外にも発見した。そのような状況下では、オリゴヌクレオチド中に実質的に連続した配置での（即ち、５つの連続したヌクレオチドの内の約４つ）修飾ヌクレオチドの配置、続いての相補的標的へのハイブリダイゼーションは、与えられた数の修飾までのみ、ハイブリダイゼーション速度の増加を生じるであろう。この数を超えたクラスターへの修飾ヌクレオチドの追加は、一般的に、ハイブリダイゼーション速度を実質的にさらには増加させないであろう。
【００４６】
２’−Ｏ−メチル−置換ヌクレオチドを用いる現在のところ好適な修飾において、約８つの連続した修飾残基のクラスターを持つオリゴヌクレオチドで最適のハイブリダイゼーション速度が得られている。発見が修飾オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション速度を増加させることができるということだとすれば、この効果がそのような追加が寄与するＴｍの増加とは必ずしも一致しないことは予想外のことであった。即ち、速度−至適クラスターサイズを超えた修飾オリゴヌクレオチドの追加は引き続いてＴｍを増加させるであろう。
【００４７】
出願人は理論に縛られるのを望んでいるわけではないが、そのようなクラスターは、律速段階において、オリゴヌクレオチドまたは核酸が水素結合する最初の領域である”核形成中心”として機能し、続いて残りの塩基の急速な水素結合が起こることが信じられている。全オリゴヌクレオチドまたは核酸がそのように修飾されているとしても、最適クラスターサイズを実質的に超えることによりハイブリダイゼーション速度を増加させる利点はほとんど得られないようである。
【００４８】
しかしながら、標的の構造が天然には閉じているまたは折り畳まれている場合、およびヘルパープローブが含まれていない場合、オリゴヌクレオチドおよび標的間のハイブリダイゼーション速度は一般的に、修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに約４つの連続したヌクレオチドを超えて加えることにより改良されるようである。好適な態様において、構造的に閉じた標的に相補的なオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの実質的にすべてが修飾されているであろう。
【００４９】
２つの相補的一本鎖核酸の溶液中ハイブリダイゼーション速度は、核酸の濃度、ハイブリダイゼーション温度および溶媒溶液の性質（塩濃度のような）のような種々の因子に依存している。種々の方法論がハイブリダイゼーション速度を増加させるために用いられてきたが、それらの大多数は混和しない溶液の乳濁液を形成させることによる；核酸沈殿剤（例えば、Ｋｏｈｎｅら、米国特許第５，１３２，２０７号）または体積排除剤（ポリエチレングリコールのような）を用いることによる；または核酸鎖濃度を増加させることによるように溶液系を変化させることを含んでいる。
【００５０】
診断アッセイにおいて後者の方法に付随する問題は、標的核酸が通常非常に少量しか存在しないことである。従って、核酸濃度を増加させるためには過剰のオリゴヌクレオチドの使用を必要とし、費用および試薬廃棄物が増加し、およびもしオリゴヌクレオチドが標識されているならば受容できないほどの高いバックグラウンドの危険性が生じる。多数の溶媒および試薬（ポリエチレングリコールのような）の使用を必要とするような他の方法には、過度の試料操作および時間のような実施上の困難が存在するであろう。
【００５１】
それ故、本発明の一つの側面は、リボフラノシル環の２位に置換を持つヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド（”２’−修飾オリゴヌクレオチド”、好適にはアルコキシ置換、最も好適にはメトキシ置換）を用いることによるＲＮＡ標的に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度並びに結合親和性を増加させるための手段を提供する。これらの特性は、ハイブリダイズする核酸濃度の同時の増加、ハイブリダイゼーション溶液の性質および組成の変化、Ｈｏｇａｎ  ＆  Ｍｉｌｌｉｍａｎ、米国特許第５，０３０，５５７号に開示されている”ヘルパーオリゴヌクレオチド”の添加、またはハイブリダイゼーション温度の増加を必要とせずにそのようなオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの速度および程度を増加させることにより、診断ハイブリダイゼーションアッセイ様式において、そのようなオリゴヌクレオチドを用いる方法を有用にしている。米国特許第５，０３０，５５７号は本発明と共通の所有権を保持しており、本明細書において援用される。それでもなお、本発明の方法は、核酸ハイブリダイゼーション速度の増加が都合がよいであろう方法において、一つまたはそれ以上のこれらの他の方法を補うものとして使用されるであろう。
【００５２】
前に説明したように、本発明のこの側面の利点はＤＮＡよりもＲＮＡに優先してハイブリダイズする２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチドの能力に関している。この特質はＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドの設計を可能にする。プローブは、たとえＤＮＡ配列がＲＮＡ標的配列と同一であっても（ただし、ＴはＤＮＡ配列においてはＵで置換されている）、ストリンジェント条件下ではＤＮＡへ結合する傾向がないように作製できる。そのような特性は、ＲＮＡの特異的検出が都合がよいであろう多くの異なった形式で使用できる。例えば、特定のＲＮＡ種（例えば、特異的ｍＲＮＡ種）の転写速度の変化を示すおよび測定するため、与えられた治療の有効性をモニターするため、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡをこれらのＲＮＡ種をコードしている遺伝子に優先して特異的に探査するため、および大量の染色体ＤＮＡを含んでいる核酸調製試料中のＲＮＡウイルスを特異的に検出するために（たとえＤＮＡ調製試料がウイルス配列のＤＮＡ版を含んでいても）使用できる。
【００５３】
このおよびその他の側面のさらなる利点は、オリゴヌクレオチドがデオキシオリゴヌクレオチドである標的：オリゴハイブリッドのＴｍと比べて、２’−修飾ヌクレオチドのような修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合の増加した標的：オリゴＴｍである。”標的：オリゴ”とは水素結合した、一本鎖オリゴヌクレオチドから成る二本鎖核酸複合体を意味している。標的：オリゴ複合体の安定性はプローブ中に含まれている２’−修飾ヌクレオチド残基の数が増すにつれて増加する。対照的に、ハイブリダイゼーション速度の増加は約８の２’−修飾ヌクレオチド残基のクラスターを持っている核酸で最適であるようであり、この数以上の連続的修飾オリゴヌクレオチド残基の追加によっても有意に増加しない。さらに、少なくとも一つのそのようなクラスターを持っている”キメラ”オリゴヌクレオチドが、標的に対して全体としてオリゴヌクレオチドのＴｍを有意に増加させる必要なしにより速いハイブリダイゼーション速度を持つように設計できた。
【００５４】
増加したＴｍは核酸二重鎖の加えられた安定性が望まれる診断法に利用されるであろう。例えば、より高いハイブリダイゼーション温度がハイブリダイゼーション速度を促進するために使用できる。より高いＴｍはまた、これまで実際的であったオリゴヌクレオチドより実質的に短いオリゴヌクレオチドの使用を可能にし、従ってハイブリダイゼーション並びに前記の他の利点のためのオリゴヌクレオチド産生に付随する費用を節約することができる。
【００５５】
本発明の他の側面および実施態様において、キメラオリゴヌクレオチドは、標的核酸に結合するように設計された修飾部分を含んでいてもよく、およびまた固相−結合オリゴヌクレオチドへ直接または間接的に結合できるデオキシヌクレオチド部分も含んでいてもよい。例示のためであるが（制限するためではない）、そのようなオリゴヌクレオチドとは標的核酸に結合するように設計された（例えば、溶液中で）標的捕捉オリゴヌクレオチドであり、結合した標的核酸を、ビーズ、マイクスフェアー、アガロースまたはデキストランのようなポリマー性物質または磁化粒子のような誘導体化固相マトリックスへ連結する。そのようなマトリックスに連結されている誘導体には抗生物質、リガンドまたは捕捉オリゴヌクレオチドまたは中間体オリゴヌクレオチドを結合するように設計されたホモポリマー管のような特異的ヌクレオチド配列を持つ全体的にまたは部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドが含まれる。結合された標的は次にさらにプローブ（ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾）とハイブリダイズでき、標的核酸の存在を検出する前に固定化標的：プローブ複合体から非結合プローブを洗い流す。
【００５６】
ある種の例においては修飾オリゴヌクレオチドをその標的へハイブリダイズさせるために温度を上げることが都合がよい。前に説明したように、ハイブリダイゼーション温度が所望のハイブリッドのＴｍよりも十分に低い限り、ハイブリダイゼーション温度を上げるにつれて、ハイブリダイゼーション速度も増加する。その非修飾相対物よりも高いＴｍを持っている修飾オリゴヌクレオチドを用いる本明細書で特許請求されたハイブリダイゼーション法は非修飾相対物を使用するよりも高い温度で実施できる。そのような場合、修飾物単独に付随する速度増加は、温度を上げることによりさらに増加される。
【００５７】
以下は本発明の態様の実施例であり、それらに本発明の範囲を制限するものと理解してはならない。当業者は容易に本明細書に含まれている開示に基づいて追加の態様を理解するであろう。追加の態様もまた本明細書で結論づける請求の範囲内に含まれている。
【００５８】
修飾核酸ハイブリダイゼーションアッセイプローブ
核酸ハイブリダイゼーションアッセイは検出が考えられている核酸を標的とする（即ち、実質的に相補的なヌクレオチド塩基配列を持っている）一つまたはそれ以上の核酸プローブを利用する。しばしば、プローブは、与えられたヌクレオチド配列を持つように合成的に作製されたオリゴヌクレオチド（約１０から約１００ヌクレオチドの間の長さを持つ一本鎖核酸）から成っているであろう。”実質的に相補的”とは、オリゴが適当な選択的条件下でその標的に結合し、水素結合した二重鎖を形成することを意味している。
【００５９】
ハイブリダイゼーションアッセイプローブは一般的には検出可能な標識に連結されるであろうが、プローブは非標識にでき、プローブ：標的ハイブリッドを例えば、ＵＶ吸光度、ＨＰＬＣクロマトグラフィー、ゲル電気泳動および続いての核酸ハイブリッドの染色または本分野でよく知られている他の方法により検出できる。ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、プローブおよび標的は、安定で特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件下でお互いに接触させる。生じたハイブリッドは次に非標識ハイブリッドから分離して標識を検出するか、または、非標識プローブの存在下でハイブリッドの検出を可能にする条件下、標識が検出できる。
【００６０】
ゲル排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーおよびハイドロキシアパタイト吸着のような核酸を分離する方法は本分野では既知である。標識ハイブリッドおよび標識非ハイブリダイズプローブが二重らせん形成のおかげで化学的に識別できるアッセイ形式が推薦される。特に好適なアッセイ形式はハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）（Ａｒｎｏｌｄらによる米国特許第５，２８３，１７４号を参照されたい）であり、標識非ハイブリダイズプローブは選択的に検出不可能にでき、一方、ハイブリダイズプローブは相対的に影響を受けない。従って、この形式における標識の検出は、標識ハイブリッドの指標である。
【００６１】
これらの態様において、本発明はハイブリダイゼーションアッセイにおけるプローブとしての修飾オリゴヌクレオチドの使用を含んでいる。一つの実施態様において、同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドよりも高い標的特異的Ｔｍを持っている修飾オリゴヌクレオチドが、同一塩基配列の非修飾オリゴヌクレオチドを用いたアッセイと比較して、アッセイのハイブリダイゼーション速度を増加させるために使用された。そのようなアッセイ法は、非修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合に実行可能であるよりも高いハイブリダイゼーション温度を利用できる。より高いハイブリダイゼーション温度はさらにハイブリダイゼーション速度を増加でき、および交差ハイブリダイゼーション（プローブと非標的配列とのハイブリダイゼーション）の量を減少させることができ、それによりアッセイの特異性が増加する。
【００６２】
本発明のプローブは、非修飾残基と混合された、約４またはそれ以上の実質的に連続した修飾ヌクレオチド残基のクラスターから成っているであろう。もしくは、プローブは１００％の修飾残基を含んでいてもよい。好適な実施態様において、修飾はリボフラノシルヌクレオチド部分の２’炭素へのアルキル、アルコキシおよびハライド置換のような２’置換である。特に好適な実施態様において、置換はメトキシ基である。
【００６３】
２’−Ｏ−メチル置換を含む特定のプローブ修飾は、ＲＮＡ標的に対して増加した親和性および増加したハイブリダイゼーション速度を持つが、ＤＮＡ親和性またはプローブ：ＤＮＡハイブリッド形成の速度にはほとんど影響を与えないオリゴヌクレオチドを生じさせる。再び、このＲＮＡに対する優先性は、オリゴヌクレオチドが少なくとも一つの約４から約８の修飾塩基から成るクラスターを持っている場合に最適であることが観察された。
【００６４】
本明細書で説明したように、修飾されたオリゴヌクレオチドは劇的に増加したハイブリダイゼーション速度を持っているので、そのような修飾オリゴヌクレオチドプローブは、標的に対するプローブのハイブリダイゼーション速度を増加させる手段としての非標識”ヘルパープローブ”（Ｈｏｇａｎ、上記文献に記載されている）を添加する必要なく多くの場合に使用される。しかしながら、いくつかの場合にはそのような修飾オリゴヌクレオチドおよびヘルパープローブを併せて使用すると、協力して作用しハイブリダイゼーション速度をさらに速くすることが観察された。どちらの場合でも、診断法におけるそのような修飾オリゴヌクレオチドの使用は生物学的被検体のより迅速な同定を導き、順に、例えば、そのような被検体により起こされるまたは示される疾患状態のより有効な処置を導く。
【００６５】
以下により詳しく説明するように、ＲＮＡ標的に対して優先的親和性を示しているプローブは同一の配列のＤＮＡよりもＲＮＡ（ただし、ＲＮＡ配列においてＵはＴに置換されている）を特異的に検出するために使用されうることを出願人は見出した。そのような方法は、例えば、ウイルスゲノムのＤＮＡ版を含んでいる細胞中でのＲＮＡウイルスの特異的検出、または細胞中のＲＮＡ転写レベルの検出に応用される。
【００６６】
プローブはまた、標的相補的配列並びに追加の標的非相補的配列の両方を含むようにも考案された。これらの標的非相補的配列は別の機能を持っている。例えば、この配列は別のオリゴヌクレオチドまたは標的核酸に相補的でありうるし、またはプロモーター配列および制限部位のような機能的特性を持っていてもよい。従って、プローブは一つより多い機能を持っていてもよく、そのただ一つが標的存在の指標として検出されるべきものである。
【００６７】
さらに、標的核酸にハイブリダイズできる少なくとも二つの別々の標的−相補的配列を持つ少なくとも一つの核酸鎖を持つようにプローブを設計してもよい。そのようなプローブの例はＨｏｇａｎらによる、米国特許第５，４２４，４１３および５，４５１，５０３号（これらは本出願と共通した所有権を保持しており、特に本明細書において援用される）に記載されている。Ｈｏｇａｎらにより開示されたプローブはさらに、標的とはハイブリダイズしないが、お互いにハイブリダイズ可能な相補的領域を持つ少なくとも二つの異なったアーム領域を含んでいる。これらのアーム領域は、適したハイブリダイゼーション条件下、それらの相補的配列がハイブリダイズするために標的の存在を必要にするように設計できる。従って、プローブの標的相補的配列は相補的アーム領域がお互いにハイブリダイズできる前に標的へハイブリダイズしなければならない。生じた構造は分岐核酸と称されている。
【００６８】
標的に特異的に結合できない他のプローブが設計されるであろう。標的の検出に有用であるためには、これらのプローブは標的を（直接または間接的に）結合できる別の核酸とハイブリダイズできなければならない。一つのそのような配置において、核酸は少なくとも第一のおよび第二の重なり合わないヌクレオチド塩基配列領域を含むように構築でき、ここで第一のヌクレオチド領域は標的のヌクレオチド塩基配列と相補的であり、および第二のヌクレオチド領域はプローブのヌクレオチド塩基配列と相補的である。この配置において、核酸の第二のヌクレオチド領域は、核酸の第一のヌクレオチド領域に標的がハイブリダイズするまでは、プローブとの結合には利用できないであろう。核酸および標的の結合は核酸のコンフィグレーションを変化させ、核酸の第二のヌクレオチド領域がプローブと結合するのを可能にする。図２を参照されたい。もちろん、この配置は核酸および標的間が間接結合するように修飾でき、一つまたはそれ以上の介在または結合核酸により達成でき、核酸の第二のヌクレオチド領域をプローブとの結合に利用可能にするであろう。  
【００６９】
修飾核酸増幅オリゴヌクレオチド
さらに別の態様において、本発明は核酸増幅のために修飾オリゴヌクレオチドプライマー、プロモーター−プライマーおよび／またはスプライス鋳型を用いる方法、およびそのようなオリゴヌクレオチドから成る組成物を含んでおり、ここでオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション速度の増加を起こす少なくとも一つの修飾塩基のクラスターを含んでいる。
【００７０】
プライマーを用いる増幅法にはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）およびその変法が含まれる（米国特許第４，６８３，１９５、４，６８３，２０２および４，８００，１５９号、欧州特許出願第８６３０２２９８．４、８６３０２２９９．２および８７３００２０３．４号および１５５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、３３５−３５０（１９８７）を参照されたい）。ＰＣＲ方法論は当業者には現在では普通の知識である。
【００７１】
ＰＣＲ反応で使用されるプライマーの一つ内へプロモーター配列を取り込むことによりＰＣＲをＲＮＡ転写と結合させ、ＰＣＲ法により増幅後、一本鎖ＲＮＡの転写のための鋳型として二本鎖ＤＮＡを使用する（例えば、Ｍｕｒａｋａｗａら、ＤＮＡ、７：２８７−２９５（１９８８）を参照されたい）。
【００７２】
他の増幅法はＲＮＡ−指向性ＤＮＡ合成およびＤＮＡまたはＲＮＡ標的を増幅するための転写の多数回サイクルを使用する。例えば、Ｂｕｒｇら、米国特許第５，４３７，９９０；８９／１０５０号；Ｇｉｎｇｅｒａｓら、ＷＯ８８／１０３１５号ＤａｖｅｙおよびＭａｌｅｋ、ＥＰＯ公開第０  ３２９  ８２２号；Ｍａｌｅｋら、ＷＯ９１／０２８１８号；ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ、米国特許第５，４８０，７８３号；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、ＷＯ９４／０３４７２号；およびＫａｃｉａｎら、ＷＯ９３／２２４６１号（これらの特許の後ろの三つは本出願と共通の所有権を保持しており、本明細書で援用される）を参照されたい。Ｕｒｄｅａら、ＷＯ９１／１０７４６号はＴ７プロモーター配列を用いて信号増幅を達成する方法を記載している。
【００７３】
これらの方法の各々は与えられた問題とするヌクレオチド配列にハイブリダイズまたは接近できる一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーまたはスプライス鋳型を使用している。プライマーのハイブリダイゼーション後、標的−相補的核酸鎖は、プロモーター−プライマーまたはプライス鋳型を用いるプライマーの３’末端伸長または転写により、酵素的に合成された。ＰＣＲのようないくつかの増幅法において核酸ポリマー化酵素によるプライマー伸長のラウンドは相補的核酸鎖の熱変性により変化させた。Ｋａｃｉａｎ  ＆  Ｆｕｌｔｚ（上記文献）、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら（上記文献）、Ｋａｃｉａｎら（上記文献）の方法のような他の方法は等温転写に基づいた増幅法である。
【００７４】
しかしながら、各々の増幅法において、プライマーの非標的配列へのハイブリダイゼーションにより起こされる副反応は、標的−特異的反応の感度を減少させるであろう。これらの競合する”ミスマッチ”は温度を上げることにより減少するであろう。しかしながら、温度を上げることはまた同様に標的−特異的プライマー結合の量を減少させるであろう。
【００７５】
従って、本発明のこの態様に従うと、高い標的親和性を持ち、および標的結合領域に修飾ヌクレオチドを含むプライマーは、上昇させた温度、および従って標的分子へのハイブリダイゼーションの増加した速度のおかげで、一方、非特異的プライマー結合により競合する副反応（交差反応性）の程度を減少させたので、より感度よく検出するおよび少量の標的核酸配列を増幅する核酸増幅法で使用される。好適なオリゴヌクレオチドは少なくとも一つの修飾塩基のクラスターを含んでいるが、好適なオリゴヌクレオチドにおいてはほとんどすべてのヌクレオチドが修飾されている。
【００７６】
別の好適な態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸がＲＮＡである核酸増幅反応に使用される。ＫａｃｉａｎおよびＦｕｌｔｚ（上記文献）を参照されたい。標的は試料中に最初に存在している核酸、または核酸増幅反応の中間体であってよい。この実施態様においては、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含んでいるオリゴヌクレオチドのような好適な２’−修飾プライマーの使用は、同一配列のデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、ハイブリッドに与えられた相対的に高いＴｍのため、より高いハイブリダイゼーション温度でのそれらの使用を可能にしている。また、そのような２’−修飾オリゴヌクレオチドのＤＮＡよりもＲＮＡに対する優先性のため、試験試料中の非標的ＤＮＡ配列によるプライマー分子に対する競合もまた減少しているであろう。さらに、同一（ＵおよびＴが等価であると仮定すると）核酸配列を持つＤＮＡ分子集団の真ん中にある特異的ＲＮＡ配列が検出されるべきと試みられている応用において、ＲＮＡに対して動力学的および平衡優先性を持っている修飾オリゴヌクレオチドプライマーの使用は、試料中のＤＮＡの存在を克服してＲＮＡの特異的増幅を可能にする。
【００７７】
試料加工
本発明により、非修飾類似体と比較して増加した標的特異的ハイブリダイゼーション動力学および結合親和性を持っている修飾オリゴヌクレオチドは種々のハイブリダイゼーションアッセイ試料加工方法論において使用されうるであろう。
【００７８】
試料加工（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）とは被検体および非−被検体核酸の識別を可能にするまたは促進する方法を意味している。そのような方法には、例えば、不均一アッセイにおける液相からの核酸またはオリゴヌクレオチドの直接的または間接的固定が含まれる。そのような方法のいくつかでは、そのような固定を生じるには２回またはそれ以上のハイブリダイゼーションが含まれているであろう。
【００７９】
例えば、Ｒａｎｋｉら、米国特許第４，４８６，５３９および４，５６３，４１９号、は標的相補的配列を持つ固相結合核酸および標的核酸の離れた場所に相補的な標識核酸プローブの使用を含む一工程核酸”サンドイッチ”ハイブリダイゼーション法を議論している。Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号は、固体支持体からの固定化オリゴヌクレオチドの漏出に付随するＲａｎｋｉ法の感度の問題を克服したと伝えている”仲介物（ｍｅｄｉａｔｏｒ）”ポリヌクレオチドの使用を含んだ方法を議論している。
【００８０】
他の方法は固定化オリゴヌクレオチド、例えば、ポリＴまたは単純な短い反復配列のようなホモポリマー管を含んでいるオリゴヌクレオチド、二つまたはそれ以上の結合オリゴヌクレオチド（その一つは固定化オリゴヌクレオチドへハイブリダイズでき、その異なった一つは標的に特異的にハイブリダイズできる）を用いている。各々の結合オリゴヌクレオチドは少なくとも一つの他の結合オリゴヌクレオチドに結合できる。もし、結合オリゴヌクレオチドが標的または固定化オリゴヌクレオチドと相補的である配列を含んでいないとすれば、少なくとも二つの他の結合オリゴヌクレオチドに同時にハイブリダイズできる。固体支持体は、ニトロセルロース、ポリアクリルアミドまたはデキストランのようなポリマー性物質、金属製物質または制御孔ガラスを含む物質から成っているであろう。支持体はシート、膜または粒子のような形で存在していてもよい。更に、固相支持体は、試料の回収および／または未結合の核酸もしくは他の試料成分の洗浄を容易にするために、磁気を帯びていても良い。
【００８１】
固定されたオリゴヌクレオチドの固相支持体への結合は、アッセイ段階の間中、固定されたオリゴヌクレオチドを結合し続けるような方法のいずれを使用して行ってもよい。更に、固相支持体をアッセイに使用すべき場合、アッセイ条件下では、非標的オリゴヌクレオチドもしくは核酸の非特異的結合または吸収が本質的になされないことは重要である。
【００８２】
一般的な固定化法には、核酸またはオリゴヌクレオチドのニトロセルロース、誘導体化されたセルロースまたはナイロン、および同種の物質への結合がある。これらの物質のうち後者二つは固定されたオリゴヌクレオチドと共有結合性相互作用を生成し、前者は疎水的相互作用を介してオリゴ（ｏｌｉｇｏ）と結合する。これらの物質を使用する場合、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質を含有するような“遮断”溶液、またはサケ精子ＤＮＡのような“キャリアー”核酸を使用して、アッセイに使用する前に固相支持体上の残存する結合可能部位をふさぐことが重要である。
【００８３】
他の固定化法では、例えばＮ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）およびその誘導体のようなリンカーアームを使用してオリゴヌクレオチドを固相支持体に結合してもよい。そのような方法における一般的な固相支持体はシリカ、ポリアクリルアミド誘導体、および金属物質であるが、それらに限定されるものではない。そのような方法においては、リンカーの一方の末端は固相支持体と共有結合する反応基（アミド基のような）を含有してもよく、一方、リンカーの他の末端はオリゴヌクレオチドと結合して固定化できるような別の反応基を含有してもよい。特に好ましい態様では、オリゴヌクレオチドはその３’末端でリンカーと結合する。好ましくはリンカーは実質的に、固相支持体の表面からある程度離れた位置に固定されたオリゴヌクレオチドを配置する直鎖の炭化水素である。しかしながら、キレート化または抗原−抗体複合体のような非共有結合を使用して、固相支持体にオリゴヌクレオチドを結合してもよい。
【００８４】
後者のアッセイ系の好ましい態様は、二つのカップリングオリゴヌクレオチドを含む：（i）例えば固定されたオリゴ上のポリＴ配列に相補的なポリＡヌクレオチド配列を有する、固定されたオリゴヌクレオチドに十分相補的であるヌクレオチド配列を含有する第一のカップリングオリゴヌクレオチド、および（ii）標的核酸、検出可能な標識されたプローブ、またはその両方に十分相補的なヌクレオチド配列を含有する第二のカップリングオリゴヌクレオチド。好ましい態様では、第二のカップリングオリゴヌクレオチドは標的核酸に十分相補的なヌクレオチド配列を含有する。更に、好ましい態様においてそれぞれのカップリングオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で第一および第二のカップリングオリゴヌクレオチドが互いにハイブリダイズできるような別のヌクレオチド配列を含有する。しかしながら、一個またはそれ以上の更なるカップリングオリゴヌクレオチドを系に導入し、これらの更なる介在型カップリングオリゴヌクレオチドによって第一および第二のカップリングオリゴヌクレオチドを間接的に結合させてもよい。更なるカップリングオリゴヌクレオチドは、アッセイ条件下で、標的核酸、検出可能な標識オリゴヌクレオチドプローブ、または固定されたオリゴヌクレオチドのいずれとも実質上ハイブリダイズできないものである。
【００８５】
使用が容易かつ迅速であるという実用的な利点を有する更に別のアッセイ系は、捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な部分を有する固定されたオリゴヌクレオチドを含有してもよい。捕獲オリゴヌクレオチド（捕獲プローブ）は標的とハイブリダイズできる塩基配列を含有する。また捕獲オリゴヌクレオチドは、標的が結合するヌクレオチド配列領域内、またはその近傍に結合する、置換された、または置換されていないアクリジニウムエステルのような標識を有し、これを均一または準均一アッセイ系に使用して、捕獲プローブそのもののような一本鎖の核酸を検出することなくハイブリッド核酸を特異的に検出してもよい。出願人が好ましいと考える系はＨＰＡＴＭであり、これは上記で検討し、参照により組み込まれる。ＨＰＡＴＭ形式では、標的とハイブリダイズしていない捕獲プローブ上に含有される標識は塩基を添加して加水分解し、一方、標的：捕獲プローブハイブリッドはこれと結合する標識を加水分解から保護する。
【００８６】
この後者のアッセイ系に対する利点は、標的を検出するために、ここに記載する他の試料処理法におけるような二つの標的特異的ハイブリダイゼーションの事象（捕獲プローブ：標的、および標識されたプローブ：標的）ではなく、一つのそのような事象（標識された捕獲プローブ：標的）しか必要でないことである。標識された標的が捕獲される全速度は最も遅くハイブリダイズするプローブによって制限されるので、アッセイにおけるオリゴヌクレオチドが少ないほどアッセイは迅速かつ単純となり、最も効果的となる。更に、これらの他のアッセイ系において、捕獲オリゴヌクレオチドに相補的な標的の部分は標的のプローブ結合領域ほど特異的である必要はない一方、この塩基配列は、捕獲プローブが非標的核酸で有意に飽和することを防止するのに十分なだけ稀なものでなければならない。従って、二つの独立した特異的な標的の配列の選択により、そのようなアッセイが向けられるべき適当な標的を見出す上で制約を受けうる。対照的に、後者のアッセイでは、同一のヌクレオチド配列が標的核酸の固定化および検出に同時に機能するので、そのような標的配列を一つしか必要としない。
【００８７】
使用するアプローチにかかわらず、アッセイに必要とされる要素は所望の標的の検出方法である。当業者に知られる多くの選択肢が可能である。そのような選択肢の一つは標識された核酸プローブを直接使用することである。そのようなプローブは、興味のある標的核酸と特異的にハイブリダイズでき、かつ十分相補的であるヌクレオチド配列領域を有する。標的へのハイブリダイゼーションおよび標的：プローブハイブリッドの固定化と同時に、結合していないプローブを洗浄または不活性化し、残存する標識ハイブリッド結合体を検出および／または測定することができる。
【００８８】
別の選択肢は、検出および核酸増幅の要素を合わせ持つ。そのような系では、例えば（それに限定されるものではないが）上記のアッセイ法において、標的核酸を記載したように固定化する。標的核酸の特定の領域とハイブリダイズできる、プライマー、プロモーター−プライマー、またはスプライス鋳型のような、一個またはそれ以上の増幅オリゴヌクレオチド（例えばＫａｃｉａｎら，国際特許公開ＷＯ９３／２２４６１号を参照すること）を、核酸増幅の条件下で（例えば一個またはそれ以上の核酸ポリメラーゼ、およびリボおよび／またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で）固定された標的核酸と接触させてもよい。
【００８９】
生成するポリヌクレオチド鎖（増幅子（ａｍｐｌｉｃｏｎ））は、標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブと特異的にハイブリダイゼーションさせて検出するか、または核酸増幅の条件下でポリヌクレオチド鎖を一個またはそれ以上の更なる増幅オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて更に増幅するために、直接利用できるようにすることができる。後者の選択肢を選ぶ場合、所望の水準の増幅が達成されるまで増幅反応を継続することができ、その後、固定された標的核酸の少なくとも一部、固定された核酸の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド、またはその両方のコピーを含有しうる生成した増幅子を、一個またはそれ以上の標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して検出することができる。標的を固定化する間に増幅反応が行われる場合、増幅子の鋳型として使用すべき標的分子の部分が、標的核酸の固定化に必要なヌクレオチド配列領域を含有しないことが重要である。いずれかまたは両方のセンスの増幅子を標識されたプローブで検出することができるが、好ましい態様では、固定された標的に対して逆のセンスの、すなわち相補的な増幅子のみを検出する。
【００９０】
臨床粗試料は増幅反応を阻害または干渉する物質を含有しうるので、このような不均一系の標的捕獲法は特に有用である。従って、標的核酸をそのような干渉物質から分離することにより、核酸増幅を可能にするか、またはその感度を向上することができる。
【００９１】
この固相結合型増幅機構を、上記のものを含む多くのアッセイ系に使用することができる。現在のところ出願人は、標的核酸を固相支持体に間接的に結合することができる、上記のような一個またはそれ以上のカップリングオリゴヌクレオチドを使用するアッセイ系が好ましいと考える。また、固相に結合するオリゴヌクレオチドの相補的なヌクレオチド配列領域、およびそれにハイブリダイズするように設計された捕獲オリゴヌクレオチドが少なくとも部分的にホモポリマーであるか、または単純な繰返しヌクレオチド配列を含有することによって、迅速なハイブリダイゼーションを促進することも好ましい。更に、または、そのかわりに、固定されたオリゴヌクレオチドおよび捕獲オリゴヌクレオチドのいずれか、またはその両方のこれらの領域を、本明細書に一致する方法で修飾し、これらのオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーション速度を増加させてもよい。そのような系では、固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする前に、標的捕獲オリゴヌクレオチドおよび標的核酸を溶液中でハイブリダイズさせるのが好ましい。現時点での好ましい態様では、固定された標的を洗浄し、核酸増幅条件下で増幅オリゴヌクレオチド（単数または複数）を固定された標的と接触させ、そして増幅に次いで標識された増幅子指向性（ａｍｐｌｉｃｏｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）プローブを添加および検出する。
【００９２】
出願人は、すでに参照により組み込まれたＫａｃｉａｎ  ＆  Ｆｕｌｔｚ（上記）に記載される転写に基づく増幅法を使用するのが好ましいと考える。この方法に従って、標的の一部および５’領域に相補的な３’領域を有するプロモーター−プライマー、および標的の一部と同一のヌクレオチド配列を有するプライマーを標的ＲＮＡ分子と接触させる。プライマーおよびプロモーター−プライマーにより、標的分子およびその相補体に存在するセンスの両方を含む、増幅されるべき標的領域の境界が定められ、従って増幅子の長さと配列が定められる。この好ましい態様では、増幅オリゴヌクレオチドおよび固定された標的ＲＮＡを、有効量のモロニーマウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、リボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド三リン酸、そして必要な塩および補助因子と４２℃で接触させる。これらの条件下で、核酸が増幅され、標的核酸と逆のセンスのＲＮＡ増幅子が主に生成される。その後、例えば標的核酸と同じセンスのアクリジニウムエステルで標識したハイブリダイゼーションアッセイプローブを使用して、すでに参照により組み込まれたＡｒｎｏｌｄ（上記）に開示されるハイブリダイゼーション保護アッセイでこれらの増幅子を検出する。
【００９３】
この好ましい態様では、出願人は、固定されたオリゴヌクレオチドの３’末端、標的捕獲オリゴヌクレオチド、およびカップリングオリゴヌクレオチドを“キャッピング”または遮断して、それらが核酸ポリメラーゼ活性の鋳型として使用されるのを防止または阻害するのが好ましいと考える。キャッピングは、３’デオキシリボヌクレオチド（コルジセピンのような）、３’，２’−ジデオキシヌクレオチド残基、Ａｒｎｏｌｄら（上記）に開示されるような非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオール修飾、または非相補ヌクレオチド残基の３’末端への添加を伴ってもよい。
【００９４】
出願人は現在のところ、プライマーを標的に接触させた後に標的を固定化するのが好ましいと考えるが、標的捕獲オリゴヌクレオチドを添加すると同時に標的核酸およびそれに相補的な少なくとも一個のプライマーを合一すれば、ハイブリダイゼーション速度に利点がありうる。出願人は、核酸が固定されている場合に比較して溶液中の方がより迅速にハイブリダイゼーションを行うことができるので、標的の固定化の前に溶液中で標的のハイブリダイゼーションを行うのが有利であると考える。
【００９５】
更に、出願人は、標的と逆のセンスの増幅子を生成および検出するのが好ましいと考えるが、どちらか、または両方のセンスの増幅子を生成および検出してはいけないという理由はない。更に、臨床粗試料中に含有される標的核酸を増幅する場合、試料中に存在する物質による酵素の阻害および／または核酸の分解を防止するために、増幅段階に先立って洗浄段階を実施することが重要と考えられる。
【００９６】
この方法論が、記載したように、または明らかな修飾を伴って、ポリメラーゼ連鎖反応を含む種々の他の増幅機構に従うことは、当業者に明白であろう。
【００９７】
試料処理（ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）における修飾型オリゴヌクレオチド
相補的な標的に増加された速度でハイブリダイズすることができる修飾型オリゴヌクレオチドを、上記の標的捕獲法を含む核酸ハイブリダイゼーションを使用する試料処理法に使用してもよい。本明細書の観点から、そのような部分的に、または完全に修飾されたオリゴヌクレオチドを、これらの系においてハイブリダイゼーションアッセイプローブまたは増幅オリゴヌクレオチドとして使用してもよいことは明白である。更に、核酸ハイブリダイゼーションを使用する不均一系アッセイにおいて、標的へのハイブリダイゼーション速度が増加された完全または部分的修飾型オリゴヌクレオチドを固定されたオリゴヌクレオチド、標的捕獲オリゴヌクレオチド、そして／または一個またはそれ以上のカップリングオリゴヌクレオチドとして使用してもよい。例えばそのような修飾を使用して全アッセイ時間を短縮するか、またはアッセイのハイブリダイゼーション段階を単一の温度で行ってもよい。それによって得られる臨床上でのアッセイの時間短縮および操作の簡便さの利点は当業者に明白であろう。
【００９８】
更に、ＲＮＡまたはＤＮＡのような特定の型の核酸に好適なハイブリダイゼーション速度および／または平衡を有するようにオリゴヌクレオチドを修飾してもよい。上に開示したように、例えば、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはＤＮＡよりＲＮＡと優先的にハイブリダイズする。従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する標的捕獲オリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドがそのゲノム型にハイブリダイズするのを促進しない条件下で、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡのようなＲＮＡ標的核酸を特異的に捕獲してもよい。更に、２’−Ｏ−メチル修飾型増幅オリゴヌクレオチドおよび／または標識されたプローブを設計し、それによってＤＮＡよりＲＮＡを上記のような増幅および／または検出の標的にすることができる。
【００９９】
修飾型ヘルパーオリゴヌクレオチド
ヘルパーオリゴヌクレオチドはＨｏｇａｎ（上記）に記載されている。一般にヘルパーオリゴヌクレオチドは標識されておらず、標識されたハイブリダイゼーションアッセイプローブと共に使用して、二次構造に関係しうる標的ヌクレオチド配列領域を「開裂（ｏｐｅｎｉｎｇ  ｕｐ）」し、その結果それらの領域が標識されたプローブとハイブリダイゼーションできるようにすることにより、標識されたプローブのＴｍおよびハイブリダイゼーション速度を増加する。
【０１００】
本明細書の観点から、それに対応する非修飾型のものより速い速度で標的核酸とハイブリダイズするように修飾されたヘルパーオリゴヌクレオチドの使用により、その標的への標識されたプローブのハイブリダイゼーション速度を更に増加することができることは、当業者に容易に認識される。従って、そのような修飾型ヘルパーオリゴヌクレオチドを使用するオリゴヌクレオチドの検出のための方法および組成物は、本発明の範囲に含まれるものである。好ましいヘルパーオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡよりＲＮＡとより強く結合するような修飾を有する。好ましい態様では、そのような修飾は少なくとも約４個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを含有する。特に好ましい態様では、そのような修飾は約８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを含有する。
【０１０１】
診断キット
ここに記載される方法はまた、明らかに、そのような方法に使用するために特別に処方された診断キットを示唆する。これらのキットは、診断用の核酸ハイブリダイゼーションアッセイに使用されるべきオリゴヌクレオチドを一個またはそれ以上含有する。これらのオリゴヌクレオチドの少なくとも一個は、他の点は同一であるオリゴヌクレオチドより速い速度で標的核酸領域にハイブリダイズするように設計された、少なくとも約４個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを含有する。
【０１０２】
そのような診断キットは、ここに記載されるプローブ、増幅、ヘルパー、および試料処理オリゴヌクレオチドを一つまたはいずれの組合せで含有してもよいが、それらに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明の好ましい態様では、キットは、少なくとも約４個の隣接する２’−修飾型ヌクレオチド残基のクラスターを一個またはそれ以上含有する領域を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを少なくとも一個含有する。更に好ましい態様では、領域は約８個の２’−修飾型ヌクレオチドのクラスターを一個またはそれ以上含有する。
【０１０４】
出願人は現在のところ、非放射性標識としてアクリジニウムエステル誘導体を使用し、そして２’の修飾としてメトキシ基を添加するのが好ましいと考える。特に好ましい態様では、少なくとも一個の修飾型オリゴヌクレオチドは、少なくとも約４個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを一個またはそれ以上含有する。更に好ましくは、少なくとも一個のオリゴヌクレオチドは約８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを一個またはそれ以上含有する。
【０１０５】
ここに開示される修飾型オリゴヌクレオチドを一個またはそれ以上含有するキットを、本発明の診断用ハイブリダイゼーションアッセイ法のいずれか、または関連する増幅法に使用するために販売できるかもしれない。そのようなアッセイでは、キットに含有される修飾型オリゴヌクレオチドの少なくとも一個は、標的核酸とハイブリダイズすることができるプローブとして機能する。修飾型プローブが標的核酸を含有する試料と接触すると、プローブは、同一の塩基配列を有する非修飾型プローブより向上されたハイブリダイゼーションの特性を表す。例えば、同一のハイブリダイゼーションアッセイ条件下では、標的およびプローブ間のハイブリダイゼーションの結合の親和性は、標的および非修飾型プローブ間のハイブリダイゼーションの結合の親和性より大きいであろう。更に、同一のハイブリダイゼーションアッセイ条件下では、標的およびプローブ間のハイブリダイゼーション速度は、標的および非修飾型プローブ間のハイブリダイゼーション速度より速い。
【０１０６】
プローブのハイブリダイゼーションの特性を更に向上するために、一個またはそれ以上の共役分子が、好ましくは、少なくとも約４個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを含有する領域で、プローブに結合してもよい。また、本発明の診断用ハイブリダイゼーションアッセイにおいて一個またはそれ以上の修飾型オリゴヌクレオチドを使用するための説明書をキットに同封することも考えられる。
【０１０７】
目的
従って、一個またはそれ以上の修飾型ヌクレオチド、好ましくは約４個またはそれ以上、より好ましくは約８個の修飾型ヌクレオチドのクラスターを有するプローブ分子を利用して、診断用核酸プローブおよびその標的核酸間の結合力およびハイブリダイゼーション速度の両方を向上するための方法を提供することが、本発明の目的である。好ましい態様では、修飾はリボフラノシル環の２’修飾を含有する。最も好ましい態様では、修飾は２’−Ｏ−メチル置換を含有する。
【０１０８】
また、オリゴヌクレオチドへの多くの修飾型ヌクレオチドの取り込みによって、一本鎖オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションの速度を増加する方法を提供することも目的である。このようにして達成されるハイブリダイゼーション速度の増加は、温度、塩濃度および／または核酸反応物の濃度の上昇によって達成されるハイブリダイゼーション速度の増加より大きい。
【０１０９】
標的の結合率を高め、ＤＮＡより速い速度でＲＮＡとハイブリダイズするように修飾されたオリゴヌクレオチドの使用により、ＤＮＡよりＲＮＡを選択的に標的とする診断法の提供は、本発明の別の目的である。好ましい態様では、そのようなヌクレオチドはリボフラノシル環に２’−Ｏ−メチル修飾を含有する。
【０１１０】
固定されたオリゴヌクレオチドを使用して直接または間接的に標的核酸を捕獲する試料処理法の提供は、本発明の更なる目的である。好ましい態様では、そのような方法は、標的核酸と特異的にハイブリダイズすることができ、それによってその検出および固定化が可能となるようなオリゴヌクレオチドを一個またはそれ以上使用する。好ましい態様では、単一の標識されたオリゴヌクレオチドにより標的の捕獲および検出の両方が行われる。特に好ましい態様では、カップリングまたは架橋核酸が、固定されたオリゴヌクレオチド、および標的の捕獲および検出のためのオリゴヌクレオチドの両方に結合する。更なるカップリング核酸が可能である。試料処理法に使用されるオリゴヌクレオチドの一部または全ては、標的に特異的なハイブリダイゼーションの速度を増加するような修飾を含有してもよい。
【０１１１】
同一部位にハイブリダイズするように設計されたより長い非修飾型オリゴヌクレオチドに比較して、標的に特異的な結合率を向上し、同時に標的および非標的ヌクレオチド配列間の差を大きくするように修飾された、少なくとも約４個のヌクレオチド、より好ましくは約８個のヌクレオチドのクラスターを好ましくは少なくとも１個含有する、約１０から約１００塩基、好ましくは約１０から約１５塩基、そしてより好ましくは約１２から約１５塩基の標的特異的オリゴヌクレオチドの提供は、本発明の更に別の目的である。
【０１１２】
オリゴヌクレオチドおよび標的核酸間のハイブリダイゼーション速度を増加するように機能する修飾型ヌクレオチドを含有する一個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含有するキットの提供は、本発明の更なる目的である。本発明のキットは、プローブ、増幅、ヘルパー、および試料処理オリゴヌクレオチドをいずれの組合せでも含有しうる。好ましい態様では、これらのキットの修飾型オリゴヌクレオチドは、リボフラノシル環に約４個の２’−Ｏ−メチル修飾のクラスターを少なくとも１個含有する。これらの修飾型オリゴヌクレオチドを含有するキットは、診断用ハイブリダイゼーションアッセイおよび増幅アッセイの両方の使用のために供給されてもよい。そのようなキットは、診断用ハイブリダイゼーションアッセイまたは増幅アッセイのいずれか、または両方における修飾型オリゴヌクレオチドの使用を実務者に指導する説明書を更に含有してもよい。
【０１１３】
従って、本発明の診断法は、結合の親和性を向上させた修飾型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特性を活用するのに特に適合する。これらの方法をいずれの標的核酸の検出または定量に使用してもよい。好ましい態様では、標的核酸はＲＮＡである。方法には、修飾型オリゴヌクレオチドの領域と結合した非修飾型オリゴデオキシ−またはオリゴリボ−ヌクレオチド領域からなる“キメラの”オリゴヌクレオチドを使用してもよく、または、完全に修飾されたオリゴヌクレオチドを利用してもよい。オリゴヌクレオチドは完全に修飾されていないのが好ましい。領域は標的へのプローブの迅速なハイブリダイゼーションを促進するようにだけ設計されてもよく、または他の機能を有してもよい。例えば、キメラのオリゴヌクレオチドをＲＮＡとＤＮＡの両方と結合するように設計してもよい。そのような場合、オリゴヌクレオチドのＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ標的を優先的に結合するような多くの修飾型ヌクレオチドを含有してもよい。あるいはまた、修飾された残基の領域は、ハイブリダイゼーション速度を増加するために、少量存在する標的に向けられるように設計してもよい。
【０１１４】
本明細書に示されるように、キットを含む本発明の方法および組成物のある態様では、得られるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特性、すなわちＴｍおよびハイブリダイゼーション速度に影響を及ぼす修飾を１種より多く有するオリゴヌクレオチドを使用してもよいことは理解されるであろう。そのような複数の修飾は、協同で作用してハイブリダイゼーション速度を更に増加するか、または、得られるオリゴヌクレオチドの、ＲＮＡのような与えられた型の核酸標的に対する特異性を向上しうる。更にまた、キメラのオリゴヌクレオチドは２’−修飾型ヌクレオチドまたは他の修飾を有するヌクレオチドのいずれか、またはその両方を含有する、異なる修飾をされたオリゴヌクレオチドの領域を有するか、またはそれらの領域からなるものでもよい。
【０１１５】
ここに明記する本発明の目的および観点は、本明細書の観点から当業者に明白である本発明の方法および組成物の目的または観点の網羅的な記載を意図するものではない。また、上記の説明または後に記載する実施例は、そこに明記する態様に対する本発明の制限と解釈すべきではない。
【実施例】
【０１１６】
特に示さない限り、以下の全ての実施例において、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、および修飾型オリゴヌクレオチドは標準的なホスフォルアミダイト化学を利用した当業者に周知の種々の方法を使用して合成した。例えばＣａｒｒｕｔｈｅｒｓら，  １５４  “酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）”，  ２８７（１９８７）（これは参照により本明細書の一部としてここに組み込まれる）を参照されたい。ここで特に記載しない限り、修飾型ヌクレオチドは２’Ｏ−メチル−ヌクレオチドであり、ホスフォルアミダイト類似体として合成に使用した。出願人はＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、マサチューセッツ州）を使用してオリゴヌクレオチドを調製した。
【０１１７】
また、特に示さない限り、標識された、と表されるオリゴヌクレオチドはアクリジニウムフェニルエステルを含有する。アクリジニウムフェニルエステル化合物は四級窒素の中心を有し９位が誘導されてフェニルエステル部分となったアクリジンの誘導体である。しかしながら、フェニル部分以外の脱離基は当業者に周知のものである。アクリジニウムエステルは過酸化水素と反応して、アクリジニウム環のＣ−９炭素を含むジオキセタン環を一時的に生成し、次いで励起されたアクリドンを生成する特性を有する。励起されたアクリドンの放射緩和により発光が生じる。アクリジニウムエステルの合成は、その化学発光標識試薬としての使用の一般的な説明と同様に、Ｗｅｅｋｓら，  “イムノアッセイにおける高比活性標識としてのアクリジニウムエステル（Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ａｓ  Ｈｉｇｈ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｌａｂｅｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）”，  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  ２９：  １４７４−１４７８（１９８４）に記載されており、これは参照によりここに組み込まれる。
【０１１８】
これらの実施例では、標準的な化学技術を使用して、アクリジニウムエステル部分に結合する第一級アミンの“リンカーアーム”を有する非ヌクレオチド単量体単位にアクリジニウムエステルを結合させ、これをオリゴヌクレオチドの化学合成の際にヌクレオチドの隣接する配列間に挿入するか、またはオリゴヌクレオチドの末端の位置に配した。Ａｒｎｏｌｄら，“ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合試薬（Ｎｏｎ−Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｎｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ）”，  ＥＰＯ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＥＰＯ  ３１３２１９（これは本発明と共通の所有権を有し、参照によりここに組み込まれる）を参照されたい。しかしながら、２’−修飾型オリゴヌクレオチドのＲＮＡ標的に対する選択性、およびＤＮＡ標的とのハイブリダイゼーション速度に対する修飾型オリゴヌクレオチドの効果が標識の存在または特性によって決定されないことは理解されるところである。従って、当業者には、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドが種々のラベルで標識されてもよく、または、例えば増幅プライマーもしくはヘルパーオリゴヌクレオチドとして使用される場合、または捕獲アッセイに使用される場合は、標識されなくてもよいことは認識されるであろう。
【０１１９】
当業者に周知の技術を使用して、アクリジニウムエステル誘導体をリンカーアーム：ハイブリダイゼーションプローブ複合体に結合してもよい。好ましくは、出願人はＮｅｌｓｏｎら，“非同位体プローブ技術における化学発光によるアクリジニウムエステルの検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｎｏｎ−Ｉｓｏｔｏｐｉｃ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）”，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）、および、Ａｒｎｏｌｄら，  “ヌクレオチドプローブのための非ヌクレオチド結合試薬”，  ＥＰＯ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．  ＥＰＯ  ３１３２１９（すでに参照によりここに組み込まれている）に記載される方法を使用する。
【０１２０】
更に、特に示さない限り、全ての標的核酸はＲＮＡである。
しかしながら、ここに開示する本発明の意図から逸脱することなく他の標識を本発明の方法および組成物に使用してもよいことは、本明細書の観点から当業者に明白である。
【０１２１】
実施例１：  プローブ：標的ハイブリッドのＴｍに対する２’修飾の効果
種々の量の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する同一配列のオリゴヌクレオチドプローブを、それぞれ独立して、完全に相補的に合成した同じ長さのＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた。プローブの配列はSEQ ID NO:1を有し、標的の配列はSEQ ID NO:2を有した。これらのオリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基配列は以下の通りである：
SEQ ID NO:1    5'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT-3'
SEQ ID NO:2    5'-ATGTTGGGTT AAGTCCCGCA ACGAGC-3'
以下に説明するように、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有しない（プローブＡ）、全て２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する（プローブＢ）、またはデオキシ−および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを組み合わせて含有する（プローブＣ、Ｄ、およびＥ）ように、プローブを合成した。プローブＣは、リンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する４個の連続したデオキシリボヌクレオチドを、そして他の全ての塩基に２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含有し；プローブＤはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する４個の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基にデオキシリボヌクレオチドを含有し；そして、プローブＥはリンカー結合部位のそれぞれの側に直接隣接する８個の連続した２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを、そして他の全ての塩基にデオキシリボヌクレオチドを含有する。それぞれのハイブリッドのＴｍは化学発光法および光学法の両方を使用して測定した。
【０１２２】
化学発光法
化学発光法を使用して、ＲＮＡ標的約１ｐｍｏｌ、および上記のように“標準的な”アクリジニウムエステル（４−（２−スクシンイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジニウム９−カルボキシレートフルオロスルフォネート）で標識したそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブ０．１ｐｍｏｌを、３０μｌのコハク酸リチウム緩衝液（１．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、３１０ｍＭ  ラウリル硫酸リチウム、０．１Ｍ  コハク酸リチウム（ｐＨ５．２））中で６０℃、６０分間、ハイブリダイズさせた。その後、得られた溶液をコハク酸リチウム緩衝液で５００μｌに希釈し、その５０μｌアリコートを種々の温度で７分間インキュベートした。次いでそれぞれの試料を氷上で更に７分間冷却した。１９０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ７．６）、７％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮＲ  Ｘ−１００（ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェノール）、および０．０２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含有する溶液１５０μｌを添加し、試料を６０℃で１０分間加熱して、ハイブリダイズしていないプローブ分子と結合したアクリジニウムエステルを加水分解した。それぞれの試料の残存する（ハイブリッド結合した）化学発光を、LEADERＲ 50 ルミノメーター（MGM Instruments社、Hamden、コネチカット州）を使用して、０．００１Ｍ  ＨＮＯ３に溶解した０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２を含有する溶液を自動注入し、次いで０．５〜２秒後に２００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを注入して測定した。生じた発光を２秒間隔で積分した。
【０１２３】
光学法
光学法を使用して、一組の同一のオリゴヌクレオチドプローブをリンカーアームを有するように合成し、アクリジニウムエステルでは標識しなかった。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブ４マイクログラムを、２００ｍＭ  水酸化
リチウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＥＧＴＡ、１７％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム、および１９０ｍＭ  コハク酸（ｐＨ５．２）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液３０μｌ中で６０℃、６０分間加熱し、４μｇの相補的なＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液６００μｌを添加し、試料を二分し、マイクロＴｍ分析アクセサリー（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）を装備したＢｅｃｋｍａｎ  ＤＵ６４０  分光光度計でそれぞれの試料画分の融解性を測定した。温度は、Ｔｍに比べて１０℃より多く低い、または高い温度では毎分１℃、その他の全ての温度では０．２℃間隔で毎分０．５℃ずつ変化させた。減色度（ｈｙｐｏｃｈｒｏｍａｔｉｃｉｔｙ）の変化をモニターし、温度の関数として記録した。結果を以下の表−１に示す。
【０１２４】
【表１】
2008283973.tif 000003
【０１２５】
表−１に示すように、化学発光および光学法を使用して得られたＴｍのデータは互いによく一致した。化学発光法で観測されたＴｍ値がやや低いのは、光学法に対して化学発光法ではより低い濃度の核酸を使用したためであると考えることができる。データは、プローブＡの全てのデオキシリボヌクレオチド残基を２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換することにより（プローブＢ）、プローブ：ＲＮＡ標的ハイブリッドのＴｍが約２０．４℃上昇したことを示している。プローブＣ、Ｄ、およびＥでは、それぞれ１５℃、４℃、および１１．６℃のＴｍ上昇を示した。それぞれの２’−Ｏ−メチルヌクレオチド置換のＴｍに対する効果を算出することにより、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド：ＲＮＡ標的ハイブリッドのＴｍはそのような置換毎に約０．８℃上昇することが明らかとなった。この効果は、試験した置換数の範囲でほぼ直線的であった。
【０１２６】
実施例２：  プローブ：ｒＲＮＡハイブリッドのＴｍに対する２’−修飾型ヌクレオチドの効果
３組の異なる長さおよび配列のオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それぞれの組は同一の塩基配列のオリゴヌクレオチドを２個含有させた。プローブＦの長さは１７塩基で、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブＧの長さは１８塩基で、同様に、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブＨの長さは２０塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。
【０１２７】
それぞれの組のプローブは、完全にデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドと、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのみを含有する別のオリゴヌクレオチドを含有する。その後、それぞれのプローブを対応するリボソームＲＮＡにハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドのＴｍを上記の化学発光法で測定した。結果を以下の表−２に示す。
【０１２８】
【表２】
2008283973.tif 000004
【０１２９】
データは、デオキシリボヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの置換により、生じるプローブ：ＲＮＡ標的ハイブリッドのＴｍが上昇することを示し、実施例１の結果が確認された。更に、３個のプローブの修飾型ヌクレオチド当たりのＴｍ上昇の平均値を計算したところ、それぞれの修飾型ヌクレオチドの寄与は、修飾型ヌクレオチド当たり０．８℃の上昇であった。
【０１３０】
実施例３：  プローブ：ＤＮＡハイブリッドのＴｍに対する２’−修飾型ヌクレオチドの効果
この実施例では、プローブ：ＤＮＡ標的に対する２’−修飾の効果を検討した。種々の量の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するプローブＩを同じ長さの完全に相補的なＤＮＡ標的にハイブリダイズさせ、生じたハイブリッドの融解性を上記の化学発光法で測定した。プローブＩの長さは２９塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。
【０１３１】
プローブＩは（i）全てデオキシリボヌクレオチド；（ii）全て２’−Ｏ−メチルヌクレオチド；および（iii）標識結合部位のそれぞれの側に隣接する４個のデオキシリボヌクレオチド以外は全て２’−Ｏ−メチルヌクレオチド：からなるように設計した。Ｔｍの測定結果を以下の表−３に示す。
【０１３２】
【表３】
2008283973.tif 000005
【０１３３】
データに示されるように、プローブＪおよびＫにおいてデオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換することにより、標識されたプローブ：ＤＮＡ標的のＴｍは２’−Ｏ−メチル残基当たり約０．３℃上昇した。
【０１３４】
３組の異なるオリゴヌクレオチドを使用して同様の試験を行った。それぞれの組は同一の塩基配列を有する２つのオリゴヌクレオチドを含有し、その一つはデオキシリボヌクレオチドを含有し、もう一方は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを１００％含有する。プローブＪの長さは１６塩基で、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブＫの長さは１８塩基で、同様に、チミン塩基およびアデニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。プローブＬの長さは２９塩基で、チミン塩基およびグアニン塩基の間にある部位に結合するアクリジニウムエステル標識を含有する。
【０１３５】
それぞれの場合で、合成ＤＮＡ標的は完全にプローブに相補的とした。結果を以下の表−４に示す。
【０１３６】
【表４】
2008283973.tif 000006
【０１３７】
表−３および４に含まれるデータは、２’−Ｏ−メチル置換をプローブに導入した場合のＤＮＡ標的のＴｍの増加の程度は、ＲＮＡ標的より有意に少ないことを示している。
【０１３８】
実施例４：  異なる型の核酸ハイブリッドの安定度の分析
ＤＮＡ、ＲＮＡ、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチド鎖を種々の組合せで含有するハイブリッドの相対的な安定度を比較するために、SEQ ID NO:1（上記の実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを、完全に相補的な塩基配列を有する合成標的にハイブリダイズさせた。１００％リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、１００％デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、または１００％  ２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するプローブおよび標的の組合せを表−５に示した。それぞれの試験したハイブリッドの化学発光または光学法のいずれかを使用して測定した融解性を以下の表−５に示す。表中の一より多いデータは独立した重複実験を示す。
【０１３９】
【表５】
2008283973.tif 000007
【０１４０】
従って、この実験は、標識されたプローブ：標的ハイブリッドの安定度は以下の順に従うことを示している：２’−Ｏ−メチル／２’−Ｏ−メチル  ≧  ２’−Ｏ−メチル／ＲＮＡ  ＞  ＲＮＡ／ＲＮＡ  ＞  ＤＮＡ／ＤＮＡ  ＞  ２’−Ｏ−メチル／ＤＮＡ  ＞  ＤＮＡ／ＲＮＡ。
【０１４１】
実施例５：  安定度を向上した２’−修飾型オリゴ（２'−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｌｉｇｏ）：ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡを特異的に標的とする能力
実施例４に示すように、２’−Ｏ−メチル：ＲＮＡハイブリッドは２’−Ｏ−メチル：ＤＮＡハイブリッドよりかなり安定度が高い。この安定度の相違を診断アッセイに利用して同一配列を有する（しかしＤＮＡ中のチミンはＲＮＡ中ではウラシルに置き換わっている）ＤＮＡ分子よりＲＮＡ分子を特異的に検出することができることを示すために、以下の実験を実施した。
【０１４２】
１００％  ２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるSEQ ID NO:1（上記の実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを、完全に相補的な合成ＲＮＡまたはＤＮＡ標的にハイブリダイズさせた。オリゴヌクレオチドを標識したこと以外は、ハイブリダイゼーションおよびＴｍの測定は、実施例１の光学法の項目に記載する通りに実施した。結果を上記の表−５に示し、図−３に更に図示する。
【０１４３】
図−３に示すように、８１．６℃で２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドはＲＮＡ標的と検出可能なハイブリッドを形成したが、ＤＮＡ標的とはしなかった。対照的に、表−５は、同一配列の標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドが同一のＲＮＡまたはＤＮＡ標的とハイブリダイズする場合、生じるハイブリッドはかなり類似した融解性を有することを示している。
【０１４４】
従って、ここに記載する本発明の観点から、容易に決められるハイブリダイゼーション条件下でＤＮＡ標的よりＲＮＡ標的を特異的に検出することが可能である。非限定的な例として、そのような方法を使用して、アッセイする生体のゲノムＤＮＡに存在する同一配列の干渉を受けることなくｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡのような種々のＲＮＡ類を特異的に検出してもよい。そのような方法は、特定の遺伝子産物の発現率のモニタリングを含む適用に有用でありうる。２’−修飾型オリゴヌクレオチドのこの能力を利用した他の使用は当業者に明白である。
【０１４５】
実施例６：  オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度に対する２’−修飾型ヌクレオチドの効果
ハイブリダイゼーション速度に対する２’−修飾型ヌクレオチドの効果を４つの異なる方法を用いて例証した。この実施例で使用したプローブ分子は上記のように標準的なアクリジニウムエステルで標識した。
【０１４６】
ａ）  第一のアプローチでは、２ｆｍｏｌのSEQ ID NO: 1（上記の実施例１を参照すること）を有するアクリジニウムエステル標識プローブを種々の量の完全に相補的なＲＮＡ標的と一定時間ハイブリダイズさせ、次いで標識を分別加水分解（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）および検出した。ハイブリダイゼーションは本質的には実施例１の化学発光法の項目に記載する通りに実施したが、相違点は以下の通りである。種々の量のＲＮＡ標的を標識されたプローブと６０℃で４５分間ハイブリダイズさせた。図−４にこの実験結果を示すが、図中、プローブはＤＮＡオリゴヌクレオチド（□）または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるか（◆）のいずれかである：これらの結果は以下の表−６にも示す。ハイブリダイゼーションの程度は相対光度単位（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ；ｒｌｕ）で表すが、これはアクリジニウムエステル標識が放射する光子数の測定値である。
【０１４７】
【表６】
2008283973.tif 000008
【０１４８】
結果は、プローブが非修飾型ヌクレオチドではなく２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する場合、ハイブリダイゼーション速度が標的濃度の関数として有意に増加することを示している。これは試験した標的濃度の範囲を通して当てはまる。比較のために、これらのデータの初期勾配を使用して、デオキシ−（勾配＝１．０）および２’−Ｏ−メチル（勾配＝２．５）オリゴヌクレオチドプローブの相対ハイブリダイゼーション速度を評価した。
【０１４９】
ｂ）  第二のアプローチでは、上記ａ）で使用したものと同一の標的の一定量（２ｆｍｏｌ）を種々の量の完全に相補的なプローブと一定時間ハイブリダイズさせた。図−５にこの実験結果を示すが、図中、プローブはＤＮＡオリゴヌクレオチド（□）または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるか（◆）のいずれかである。ハイブリダイゼーションおよび検出段階は、ハイブリダイゼーション反応を４５分間ではなく３０分間実施した以外は、上記ａ）に記載されるものと同一である。データを以下の表−７に示す。
【０１５０】
【表７】
2008283973.tif 000009
【０１５１】
ここでも、この実施例の結果は、プローブが非修飾型ヌクレオチドではなく２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有する場合、プローブ濃度の関数であるハイブリダイゼーション速度は有意に増加することを示している。これらのプロットの勾配は図−４のものと同様であり、プローブ濃度または標的濃度が多様であるかどうかに関わらず、２’−Ｏ−メチル／ＤＮＡおよびＤＮＡ／ＤＮＡ相互作用間のハイブリダイゼーション速度の差は同じであった。この実験で、ＤＮＡプローブを含有する反応の初期勾配は１．０であり、２’−Ｏ−メチルプローブを含有する反応のそれは３．１であった。
【０１５２】
ｃ）  ２’−修飾型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度増加能力の第三の例証として、一定量の修飾型または非修飾型プローブのいずれか（１ｆｍｏｌ）と標的（１００ａｍｏｌ）を種々の時間でハイブリダイズさせた。それ以外は、ハイブリダイゼーションおよび検出のプロトコールはｂ）と同様である。図−６に結果を示すが、図中、プローブはＤＮＡオリゴヌクレオチド（□）または完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるか（◆）のいずれかである。データを以下の表−８に示す：
【０１５３】
【表８】
2008283973.tif 000010
【０１５４】
ここでも、曲線の初期勾配からハイブリダイゼーションの相対速度を測定することができる（デオキシ＝１．０；２’−Ｏ−メチル＝２．２）。この実験では、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含有する反応の初期勾配は１．０であり、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブを含有する反応の初期勾配は２．２倍であった。
【０１５５】
ｄ）  ２’−修飾型および非修飾型プローブのハイブリダイゼーション速度間の差を証明するために使用した第四の方法はＣｏｔ分析である。 SEQ ID NO:1（上記の実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識プローブを使用した。一定量のプローブおよび種々の量の標的（“プローブ過剰”）、または一定量の標的および種々の量のプローブ（“標的過剰”）のいずれかを６０℃で種々の時間ハイブリダイズさせた。一定量のプローブまたは標的は０．２５ｆｍｏｌであり、種々の量のプローブおよび標的は０．２５〜５０ｆｍｏｌの範囲で含有する。ハイブリダイゼーションは、それ以外は実施例１の化学発光法の項目に記載した通りである。
【０１５６】
１５０μｌの１９０ｍＭ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７（ｐＨ７．６）、７％（ｖ／ｖ）ＴＲＩＴＯＮ(r)  Ｘ−１００、および０．０２％（ｗ／ｖ）ゼラチンを試料に添加し、混合液を６０℃で１０分間加熱して、ハイブリダイズしていないアクリジニウムエステルの分別加水分解およびハイブリダイズしたプローブの検出を行った。上記のようにルミノメーターで化学発光を測定した。最大ハイブリダイゼーション率は、観測されたｒｌｕ値を、飽和量のプローブまたは標的をハイブリダイゼーション反応に使用した場合に観測される最大ｒｌｕ値で除した比率と定義した。
【０１５７】
図−７に示すＣｏｔプロットでは、 ｌｎ（ｌ−Ｈ）の量を標的濃度とハイブリダイズ時間の乗数に対してプロットした。Ｈ値は特定標的濃度における特定時間後のプローブのハイブリダイゼーション率と定義する。
【０１５８】
このプロットでは、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションの相対速度は、５０％ハイブリダイゼーションでのＣｏｔの相対速度の逆数で得られる（ｌｎ（１−０．５）；デオキシ＝１．０および２’−Ｏ−メチル＝２．２）。
【０１５９】
これら４方法で測定した、完全にデオキシまたは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドからなるアクリジニウムエステル標識プローブの相対ハイブリダイゼーション速度の概要を表−９に示す。これらの実験から得られたデータは、６０℃で、完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが、相当するデオキシリボヌクレオチドプローブより２．３倍速くハイブリダイズすることを示している。
【０１６０】
【表９】
2008283973.tif 000011
【０１６１】
実施例７：  ２’−修飾型オリゴヌクレオチドの更なる標的へのハイブリダイゼーション速度の分析
これらのハイブリダイゼーション速度の比較を他のプローブおよび標的配列に拡大するため、上記の実施例２のプローブＨを完全にデオキシまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのどちらかからなるように合成し、ヘルパープローブの存在下でｒＲＮＡにハイブリダイズさせた。実施例６（ｄ）のようにＣｏｔ分析を実施した。結果を以下の表−１０に示す。
【０１６２】
【表１０】
2008283973.tif 000012
【０１６３】
この実施例では、完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるプローブは同一配列のデオキシリボヌクレオチドプローブより３．７５倍速くハイブリダイズした。従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含有するアクリジニウムエステル標識プローブによるハイブリダイゼーションの向上は、特定のプローブまたは標的配列に限定されないと考えられる。
【０１６４】
実施例８：  ２’−修飾型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度に対する温度上昇の効果
上記のように、核酸のハイブリダイゼーション速度は温度の上昇により加速される。しかしながら、特に診断アッセイおよび比較的短いオリゴヌクレオチド（約１０〜約５０塩基の長さ）を使用する核酸増幅法においては、この加速の利点は二本鎖型に対する温度上昇による不安定化効果によって相殺されうる。以下に示すように、ここに記載するように修飾したオリゴヌクレオチドによって提供される二本鎖の安定度の向上は、この不安定化効果を最小限にし、他に可能なものより高い温度でハイブリダイゼーションを行うことによって、ハイブリダイゼーション速度を更に増加することができる。従って、修飾型オリゴヌクレオチドおよびより高いハイブリダイゼーション温度により、ハイブリダイゼーション速度に対する協同効果が提供される。
【０１６５】
完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるSEQ ID NO:1（上記の実施例１を参照すること）のアクリジニウムエステル標識オリゴヌクレオチドプローブを、上記のように同一の長さの完全に相補的なＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションおよびＣｏｔのプロトコールは、ハイブリダイゼーション温度が６０℃または７０℃のいずれかであった以外は、実施例６（ｄ）に記載した通りである。以下の表−１１のデータが示すように、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの標的へのハイブリダイゼーション温度を６０℃から７０℃に上昇することにより、ハイブリダイゼーション速度は１．５倍に加速された。
【０１６６】
【表１１】
2008283973.tif 000013
【０１６７】
実施例９：  ２’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度への塩濃度増加の影響
また、ハイブリダイゼーション反応速度は、塩濃度の増加によっても加速される。以下の例は、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度への様々な塩、例えばＬｉＣｌ、の濃度の影響について説明している。完全に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる配列番号１のアクリジニウムエステル−標識プローブ（上記の実施例１を参照のこと）を、実施例６（ｄ）に上記したように、８０゜Ｃで同じ長さの正確に相補的なＲＮＡ標的にハイブリダイズさせ、そしてＣｏｔ分析を行った。ハイブリダイゼーションは、２種類の異なる濃度のＬｉＣｌで行われた。以下の表１２に示したように、ＬｉＣｌの０．５から１．０Ｍへの塩濃度の増加は、ハイブリダイゼーション反応速度を２．９倍に強化した。
【０１６８】
【表１２】
2008283973.tif 000014
【０１６９】
これらの結果は、ハイブリダイゼーション反応での塩濃度を２倍に増加させると、修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度が２．９倍に増加することを、示している。
【０１７０】
実施例１０：  塩濃度および温度の上昇によるハイブリダイゼーション反応速度への組み合わせ影響
２’−修飾オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのハイブリダイゼーション温度および塩濃度を同時に上昇させた影響を証明するために、以下の反応を行った。アクリジニウムエステル−標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドおよび１００％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを持つアクリジニウムエステル−標識オリゴヌクレオチド（両方共、配列番号１）（上記実施例１を参照のこと）は、それぞれ別々に正確に相補的なＲＮＡ標的分子にハイブリダイズさせＣｏｔ分析を行った。ハイブリダイゼーション条件は実施例６（ｄ）に記載した条件に従った。ハイブリダイゼーション温度および塩濃度は以下の表１３に示したとおりである。結果を以下に示す。
【０１７１】
【表１３】
2008283973.tif 000015
【０１７２】
データに示しているように、ハイブリダイゼーション温度８０゜Ｃおよび１．０ＭのＬｉＣｌで行った２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのその標的へのハイブリダイゼーション速度は、温度６０゜Ｃおよび０．５ＭのＬｉＣｌの塩濃度で行った相当するＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション速度より８．６倍速かった。
【０１７３】
実施例１１：  ＲＮＡ、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−修飾オリゴヌクレオチドがその相補的ＤＮＡおよびＲＮＡ標的とハイブリダイズするハイブリダイゼーション速度の比較
標識されたＲＮＡ、ＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチル−含有オリゴヌクレオチドと完全に相補的なＤＮＡおよびＲＮＡ標識との相対ハイブリダイゼーション速度を、個別的に測定した。速度の測定は、上の実施例６（ｃ）または６（ｄ）のいずれかに開示された方法に従って行った。標識されたオリゴヌクレオチドは配列番号１と同一の塩基配列を持つ（上記の実施例１を参照のこと）。結果を以下の表１４に要約している。
【０１７４】
【表１４】
2008283973.tif 000016
【０１７５】
列１−４に示した実験は、３ｆｍｏｌの標識プローブおよび０．３ｆｍｏｌの標的を用いて、実施例６（ｃ）に開示した方法に従って、行われた。列５および６に示した実験は、実施例６（ｄ）に記載した方法を用いて、行われた。一つより多い結果を示しているところでは、それぞれの値は、異なる独立的実験に該当する。
【０１７６】
表１４の結果は、デオキシリボヌクレオチド残基を２’−ＯＨ残基（ＲＮＡ）または２’−Ｏ−メチル残基のいずれかで置換すると、ＲＮＡ標的へのプローブのアフィニティーならびにハイブリダイゼーション反応速度が強められることを証明している。それとは対照的に、デオキシリボヌクレオチド残基を２’−Ｏ−メチル残基で置換しても、ＤＮＡ標的へのプローブのアフィニティーまたはハイブリダイゼーション反応速度は強化されなかった。
【０１７７】
表１４に示した結果は、デオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル残基で置換すると、プローブのＲＮＡ標的へのアフィニティーおよびハイブリダイゼーション速度は強化されるが、ＤＮＡ標的へのアフィニティーおよびハイブリダイゼーション速度は強化されないことを示している。しかしながら、これらの実験は、アクリジニウムエステル標識および／またはリンカーが、プローブに付着したことによって、これらのハイブリダイゼーション速度特性の原因となるかもしれないと言う、可能性を除去するわけではない。アクリジニウムエステル標識および／またはリンカーが感知される程度の影響をハイブリダイゼーション速度に与えないと言うことを示すために、以下の実験を行った。
【０１７８】
アクリジニウムエステルで標識され、そしてラベルをプローブに付着させるための非ヌクレオチドリンカーを含む、配列番号１のＲＮＡプローブ（上記の実施例１を参照のこと）は、全体が２’−Ｏ−メチルまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかからなる完全に相補的な標的と完全にハイブリダイゼーションさせることが可能である。実施例６（ｄ）に記載の方法に従ってハイブリダイゼーションおよびＣｏｔ分析を行った。結果を以下の表１５に示している。
【０１７９】
【表１５】
2008283973.tif 000017
【０１８０】
これらのデータは、デオキシリボヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル残基で置換すると、アクリジニウムエステルおよび／またはリンカーを欠くオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度が強化されることを、表している。このように、２’−Ｏ−メチル修飾プローブに認められたハイブリダイゼーション速度の増加は、標識またはリンカーアームの存在によるものではなく、２’−Ｏ−メチル修飾オリゴヌクレオチド本来の性質によるものである。
【０１８１】
実施例１２：  ＤＮＡプローブ混合物および２’−Ｏ−修飾プローブ混合物からのプローブのｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションでのヘルパープローブの影響の比較
Ｈｏｇａｎ（上記）に開示されたように、核酸、特に有意な量の二次構造を持つ核酸、へのいくつかのプローブのハイブリダイゼーションは、「ヘルパー」プローブと称される、さらなるプローブの使用によって促進される。唯一の例ではないが、高度の二次構造を持つ核酸の例として、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）が挙げられる。ヘルパープローブは、標的領域を覆うであろう二次構造の崩壊を助けることができる。通常、ヘルパープローブは、プローブ標的配列の近くに位置するが、好ましくはそれとオーバーラップしない、配列領域を標的とする。実際には、ヘルパープローブは一般的には標識されておらず、通常、モル大過剰で用いられる。標識されたプローブハイブリダイゼーションへのヘルパープローブの使用の影響は、通常、Ｔｍ  および標識プローブ：標的ハイブリッドのハイブリダイゼーション速度の増加として表される。
【０１８２】
２’−修飾オリゴヌクレオチドプローブが、多量の二次構造を含む、与えられた標的領域に向けられた場合のＤＮＡプローブのそれと同様の要求を、ヘルパープローブに対しても持つか否かを試験するために、以下の実験を行った。２つのプローブ混合物を作成した。それぞれのプローブ混合物は、上記の実施例２のプローブＦ、ＧおよびＨを含んでいた。一つのプローブ混合物のオリゴヌクレオチドは、１００％の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで成り立っており、その他のプローブ混合物のオリゴヌクレオチドは、その全体がデオキシリボヌクレオチドから成り立っていた。示したように、プローブ混合物は、それぞれ３３、３６、４１、３１、２９および４０の塩基の長さを持つ、非標識のＤＮＡヘルパープローブ１、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆを含んでいた。
【０１８３】
それぞれのヘルパープローブは、標識プローブの一つの標的部位のすぐ近くにあるｒＲＮＡ塩基配列に向けられた。ハイブリダイゼーションの程度は、上記のようなハイブリダイゼーション保護アッセイ（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）（ＨＰＡＴＭ）を用いて測定された。結果は、相対光単位（ｒｅｌａｔｉｂｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔｓ）（ｒｌｕ）として報告される。
【０１８４】
以下の表１６に示したように、ヘルパープローブ非存在下では、ＤＮＡプローブ混合物は、充分にはｒＲＮＡにハイブリダイズしない。それとは対照的に、ＤＮＡプローブ混合物と同一配列の２’−Ｏ−メチルプローブを用いたプローブ混合物をヘルパープローブの非存在下でｒＲＮＡにハイブリダイズさせた場合、より高い程度のハイブリダイゼーションが認められた。さらに、ヘルパープローブを両方のプローブ混合物と共に用いた場合に、プローブのそれら標的へのハイブリダイゼーションは、２’−修飾オリゴヌクレオチドプローブ混合物と共に用いた場合に、より強められた。ＤＮＡプローブのｒＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、ヘルパープローブの存在に強く依存するため、同一の２’−Ｏ−メチルプローブのハイブリダイゼーションが起こらない場合でさえ、２’−Ｏ−メチルプローブは、ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションできない条件下で、リボソームＲＮＡのような複雑な構造を持つＲＮＡ分子と効率良くハイブリダイズすることができる。
【０１８５】
【表１６】
2008283973.tif 000018
【０１８６】
さらに、表１６のデータは、２’−修飾オリゴヌクレオチドを用いた場合、プローブ結合を容易にするためにヘルパープローブが必要とされないことを、示している。
【０１８７】
実施例１３：  単一のＤＮＡプローブおよび単一の２’−修飾プローブの、ｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーションにおけるヘルパープローブの影響の比較
実施例１２に記載の実験結果は、実施例１２で同定された６つのヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下または非存在下のいずれかで、３つの別々の標識プローブを用いてもたらされた。本実施例では、完全にデオキシリボ−または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる実施例２のプローブＦおよびＨを、示されたヘルパープローブの存在下または非存在下で、標的ｒＲＮＡにハイブリダイズさせた。ヘルパープローブには、上記実施例１２のａ、ｂ、ｃおよびｄを用いた。表１７は、プローブＡのＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの特徴を示している。表１８は、プローブＨのＤＮＡおよび２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性を示している。示された様々なヘルパープローブとヘルパープローブの組合せの存在下または非存在下で、それぞれの標識プローブを、試験した。
【０１８８】
【表１７】
2008283973.tif 000019
【０１８９】
【表１８】
2008283973.tif 000020
【０１９０】
表１７および１８は、標識ＤＮＡプローブが、アッセイ条件下でそれらの標的に効率良くハイブリダイズするために、ヘルパーオリゴヌクレオチドを必要としていたことを、示している。さらに、表１８は、２’−修飾オリゴヌクレオチドはヘルパープローブ非存在下でも、付加ヘルパー存在下でＤＮＡオリゴヌクレオチドが同一の標的にハイブリダイズするより、より高い程度でそれらの標的にハイブリダイズしたことを、示している。結局、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドは、ヘルパーオリゴヌクレオチド存在下でもより高いハイブリダイゼーション特性を示した。
【０１９１】
実施例１４：  ヘルパープローブの存在下および非存在下でのＤＮＡプローブおよび２’−Ｏ−修飾プローブのｒＲＮＡ標的へのハイブリダイゼーション特性への、温度の影響の比較
実施例１３に示したデータは、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドが、ヘルパープローブの非存在下で、ｒＲＮＡのように高度に折り畳まれた構造のＲＮＡ標的にさえ、検出可能な範囲でハイブリダイズすることを示している。しかし、ヘルパープローブは、複雑な構造のＲＮＡへの２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを加速することができる。ヘルパープローブの効果をさらに綿密に試験するために、デオキシ−および２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブを、ヘルパー細胞の存在下または非存在下、異なる温度で、ｒＲＮＡにハイブリダイズさせた。表１９は、上記実施例２のプローブＦのヌクレオチド配列を持つアクリジニウムエステル標識のプローブおよび上記実施例１２のヘルパープローブｃおよびｄを用いて行った研究を示している。表２０は、配列番号１のヌクレオチド配列（上記実施例１を参照のこと）を持つアクリジニウムエステル−標識プローブおよびそれぞれ４１および３２の塩基を持つヘルパープローブｇおよびｈを用いて行った研究を示している。
【０１９２】
【表１９】
2008283973.tif 000021
【０１９３】
【表２０】
2008283973.tif 000022
【０１９４】
これらの実験は、６０゜Ｃおよび７５゜Ｃで、ヘルパープローブが、２’−Ｏ−メチルプローブのそれらの標的へのハイブリダイゼーション速度を３．１−４．３倍に強めることを示している。
【０１９５】
実施例１５：  アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への２’−修飾ヌクレオチドの影響
診断用プローブ分子の性能特性への修飾オリゴヌクレオチドの影響をさらに証明するために、数多くのさらなる実験を行った。これらの実験は、ＨＰＡＴＭ検出アッセイを用いて出願人の選択した検出方法を基にした。一つのＨＰＡＴＭフォーマットに従って、化学発光アクリジニウムエステルをプローブに付着させ、プローブをアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）  にハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズしなかったプローブに関連する化学発光を、ホウ酸バッファー中で短時間加水分解することによって選択的に破壊する。プローブ：アナライト分子は、このプロセスで崩壊されないので、ハイブリダイズしたプローブに残された化学ルミネセンスは、存在するアナライトを直接測定する。この適用では、プローブ−アナライトハイブリッド複合体としてよりもハイブリダイズしていない場合により速く加水分解される、そのようなアクリジニウムエステル標識プローブが好ましい。プローブおよびハイブリッドの加水分解は、擬一次反応であり、ｔ１／２  値として特徴付けることができる。このｔ１／２  値は、プローブまたはハイブリッドのいずれかに付着したアクリジニウムエステルの５０％の加水分解に要する時間であり、分で測定される。このように、大きな差別的加水分解（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ）  （ＤＨ）率（ｔ１／２［ハイブリッド］／ｔ１／２［プローブ］）を示すプローブが、非常に好ましい。
【０１９６】
アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への修飾オリゴヌクレオチドの影響を調べるために、異なるヌクレオチド塩基配列を持つそれぞれのセットおよび同一のヌクレオチド塩基配列を持つセットのそれぞれのメンバーからなる、４セットのプローブを構築した。それぞれのプローブのセットには、全体が未修飾のヌクレオチドからなる一つのプローブおよび全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるもう一つのプローブが、含まれる。用いられたプローブは、上記実施例１のプローブＡおよびＢ、ならびに上記実施例２のプローブＦ、ＧおよびＨであった。完全に相補的なＲＮＡ標的へのそれぞれのプローブのＤＨ率は、例えば、実施例１のような、上記の方法に従って、測定した。以下の表２１に示すように、デオキシ−または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むハイブリダイズしなかったプローブは、非常に類似した速度で加水分解された。
【０１９７】
【表２１】
2008283973.tif 000023
【０１９８】
対照的に、３つの配列で、修飾プローブ；標的ハイブリッド−関連標識は、もう一つの同一の未修飾のプローブ：標的ハイブリッドより、加水分解に対しておおよそ２倍耐性であった。ある場合、アクリジニウムエステルリンカー周辺にＡＴＡＴ配列を含むプローブでは、ＤＨ率は、修飾プローブ：標的ハイブリッド−関連標識で１．４倍減少した。
【０１９９】
実施例１６：  アクリジニウムエステル標識プローブの加水分解特性への２’−修飾ヌクレオチドの位置的影響
アクリジニウムエステルのＤＨ動性を強めるためには修飾ヌクレオチドが標識付着部位の近くに位置しなければならないか否かを試験するために、アクリジニウムエステルリンカー部位と比較して異なる位置に２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのクラスターを含む、配列番号１のアクリジニウムエステル−標識プローブを、相補的ＲＮＡ標的とハイブリダイズさせた。２’−Ｏ−メチル置換を含むそのようなヌクレオチドを、下線によって以下に示している：
プローブＭ：  ５’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＮ：  ５’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＯ：  ５’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＰ：  ５’−GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACCCAACAT−３’
以下の表２２に示したように、アクリジニウムエステルリンカー部位のどちらかの側への４つの隣接する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、アクリジニウムエステル−標識プローブのＤＨ動性を、全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるプローブと同程度に充分に強化することを、測定は示している。表中の一つより多いデータ点は、独立的に行った重複実験を示している。
【０２００】
【表２２】
2008283973.tif 000024
【０２０１】
実施例１７：  ２’−修飾アクリジニウムエステル−標識プローブの加水分解特性への温度の影響
上記のように、それらのより高い熱安定性故に、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは未修飾のオリゴヌクレオチドより、より高い温度で標的核酸にハイブリダイズすることができる。そのようなより高い温度では、ハイブリダイゼーション速度は、その他の反応の速度と同様に、増加することが期待されるであろう。そのようなその他の反応の中に、アクリジニウムエステル標識の加水分解速度があげられる。出願人らの選択した検出方法は、上記の参照に記載され採用されているハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡＴＭ）を用いているため、ハイブリダイゼーション速度の増加によって授けられた診断アッセイへの恩恵が、このより高い温度でのハイブリッド−関連および非関連のアクリジニウムエステル標識のＤＨ率の減少によってオフセットされるか否かを決定するために、以下の実験を行った。
【０２０２】
全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるアクリジニウムエステル−標識プローブを、６０゜Ｃ、７０゜Ｃおよび８０゜Ｃでの相補的ＲＮＡ標的にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション条件は、前記の通りである。
【０２０３】
以下の表２３に示したように、７０゜Ｃおよび８０゜Ｃでの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むアクリジニウムエステルー標識プローブは、６０゜Ｃでのデオキシリボヌクレオチドを含むアクリジニウムエステル−標識プローブに匹敵するＤＨ率を示した。このように、温度を上昇させても、標識の分解によるアッセイ感受性が検出できる程は減少することなく、本発明の方法および組成物を用いる診断アッセイに用いることができる。
【０２０４】
【表２３】
2008283973.tif 000025
【０２０５】
実施例１８：  様々なアクリジニウムエステル−標識プローブの加水分解特性への２’−修飾ヌクレオチドの影響
検出可能な化学発光標識として標準アクリジニウムエステルを用いて、前述の実験を行った。標準アクリジニウムエステル以外の標識の差別的加水分解動向が、Ｔｍ  −強化修飾ヌクレオチドによって強化されるか否かを試験するために、デオキシ−または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドのいずれかを含む配列番号１のプローブを、標準アクリジニウムエステル、ｏ−ｄｉＢｒアクリジニウムエステル、２−Ｍｅアクリジニウムエステル、ナフチル−アクリジニウムエステル、ｏ−Ｆアクリジニウムエステル、２，７−ジイソプロピルアクリジニウムエステル、または１−および３−Ｍｅアクリジニウムエステルの混合物で、同じ様式で同じ位置を正確に標識し（上記実施例１を参照のこと）、そしてそれらのＤＨ動向を試験した。
【０２０６】
アクリジニウムエステルの例として図１を参照のこと。以下の表２４を要約しているように、修飾ヌクレオチドプローブを用いると、結果として、試験したアクリジニウムエステル誘導体のすべてのＤＨ率が１．１−６倍まで増加した。
【０２０７】
【表２４】
2008283973.tif 000026
【０２０８】
実施例１９：  ハイブリダイゼーション反応速度論とプローブ配列内に含まれる２’−修飾ヌクレオチドの数との間の関係
ハイブリダイゼーション反応速度論とプローブ配列内の２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの数との間の関係を試験するために、配列番号１（上記実施例１を参照のこと）のアクリジニウムエステル標識プローブを合成した。これらの合成プローブは、ＡＥリンカーの両側に増加した量の２’−Ｏ−メチル残基（２’−Ｏ−メチル残基の存在を下線で示す）を含んでいる：
プローブＱ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＲ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＳ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＴ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACCCAACAT−３’
プローブＵ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
プローブＶ：  ５'-GCTCGTTGCG GGACTT(AE)AACC CAACAT−３’
結果を以下の表２５に要約している。
【０２０９】
【表２５】
2008283973.tif 000027
【０２１０】
上に要約したように、片側のアクリジニウムエステルリンカー部位に４つづつの、８つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（プローブＴ）程の少なさでも、ほぼ全体が２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなるプローブ（プローブＶ）と同レベルにアクリジニウムエステルプローブのハイブリダイゼーション速度を加速するのに充分であった。これとは対照的に、アクリジニウムエステルリンカー部位のそれぞれの側に４つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプローブのＴｍ  は、プローブがさらなる２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むプローブ：標的ハイブリッドのＴｍ  より低い。従って、本発明に従って、そのハイブリダイゼーション速度、差別的加水分解、および融解特性に関して、アクリジニウムエステル標識プローブの性能を最適化、または「チューニングする」ことが可能である。例えば、アクリジニウムエステルリンカー部位のそれぞれの側に４つの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むアクリジニウムエステル標識プローブは、最大に最適化されたそのハイブリダイゼーション速度および差別的加水分解特性を持つであろうが、このプローブを含むハイブリッドの融解温度は、わずかな上昇を示すのみであろう。
【０２１１】
実質的に隣接する２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは、標識プローブ内のデオキシリボヌクレオチドと置き換えるために追加されるので、プローブ：標的ハイブリッドのハイブリダイゼーション速度および差別的加水分解特性は、実質的に一定のまま残るであろうが、これに対してそのＴｍ  は、増加し続けるであろう。
プローブ：標的ハイブリッドのＴｍ  へのプローブの影響を一定量ずつ増加させる能力は、上記表２５に示すように、それが密接に関係した配列と交差反応しないようにプローブの特異性を調整することができる。
【０２１２】
実施例２０：  プローブ：標的ハイブリッドのＴｍへのプロピン−修飾の影響
核酸ハイブリダイゼーション技術の診断への応用における、本発明の組成物および方法の一般的有用性を説明するために、リボフラノシル部分への２’−修飾以外の修飾を持つオリゴヌクレオチドを構築したが、それは、その標的へのプローブの結合アフィニティーを増加させる原因ともなった。この実施例では、窒素含有塩基を修飾した２つのヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを合成した。具体的には、Ｎ−ジイソブチルアミノメチリデン−５−（１−プロピニル）−２’−デオキシシチジン；（シチジン類似体）および５−（１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン）（チミジン類似体）。これらのヌクレオチド類似体は、例として、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）で市販されている。
【０２１３】
第一の縮合では、プローブＷおよびＹ内のチミン塩基およびグアニン塩基の間、ならびにプローブＸ内の２つのチミン塩基の間に位置する部位に付着したアクリジニウムエステル、ならびに２２の塩基を持つプローブ（変化する数のプロピン修飾ヌクレオチドを含む）を、ヘルパープローブの存在下で標的ｒＲＮＡにハイブリダイズし、アクリジニウムエステルハイブリッドのＴｍ  への修飾の影響について試験した。プローブＷは、プロピン修飾を含んでいなかった。プローブＸは、２つのプロピン修飾を含んでおり、標識付着部位のそれぞれの側に直接隣接している。プローブＹは、１１のプロピン修飾を含み、標識付着部位の５’側も直接隣接した４つの連続修飾を、ならびに標識付着部位から３’側に３、４、６、９−１１および１４塩基離れた塩基に位置する７つの修飾を含んでいる。
【０２１４】
ハイブリダイゼーションおよびＴｍの測定は、アクリジニウムエステル標識ハイブリッド検出法を用いて、上記の方法に従って、行われた。以下の表２６に要約するように、これらのデータは、オリゴヌクレオチドのＴｍは、ＲＮＡ標的にハイブリダイズした場合に、プロピン−置換ピリミジンでピリミジンのすべてを置き換えると、平均で１゜Ｃ上昇した。
【０２１５】
【表２６】
2008283973.tif 000028
【０２１６】
実施例２１：  オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応速度へのプロピン修飾の影響
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション反応速度へのプロピン基の影響を試験するために、実施例２０のプロピン−標識プローブのＲＮＡへのハイブリダイゼーション速度を、実施例６記載の方法に従って、Ｃｏｔ分析によって、試験した。以下の表２７に要約するように、２つのプロピレン基を含むプローブ（プローブＷ）は、プロピン基を含まないプローブ（プローブＸ）と同じ速度でハイブリダイズしたが、これに対して、１１のプロピン基を含むプローブ（プローブＹ）は、１．９倍より速くハイブリダイズした。
【０２１７】
【表２７】
2008283973.tif 000029
【０２１８】
これらのデータは、結果としてＴｍを増加させるオリゴヌクレオチドへの修飾がまた、その標的への修飾されたオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション速度を、同一塩基配列の未修飾オリゴヌクレオチドと比較して上昇させる原因となることを証明することによって、本発明の普遍性を支えている。さらに、また、この実施例は、そのような修飾が窒素含有塩基部分ならびに糖部分内にも起こりうることを、示している。当業者らは、そのような修飾もまた、ヌクレオチド内結合にもた起こりうることを、認識しているであろう。
【０２１９】
前述の開示は、本発明の好ましい実施態様について説明しているが、出願人は、それに限定されるとは思わない。本発明が適用される当業者らは、この開示にかんがみて、さらなる実施態様を理解するであろう。さらなる実施様態もさらに、この明細書およびそれらの均等物を含む添付請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１Ａ】図１Ａは本開示において検出可能化学発光標識として使用されるアクリジニウムエステルのサンプリングのためのＩＵＰＡＣ命名法を提供している。
【図１Ｂ】図１Ｂは本開示において検出可能化学発光標識として使用されるアクリジニウムエステルのサンプリングのためのＩＵＰＡＣ命名法を提供している。
【図１Ｃ】図１Ｃは本開示において検出可能化学発光標識として使用されるアクリジニウムエステルのサンプリングのためのＩＵＰＡＣ命名法を提供している。
【図２】図２は被検体の検出は最初に被検体のプローブ以外の核酸へのハイブリダイゼーションを必要とする配置を示している。この配置に従うと、被検体が非プローブ核酸にハイブリダイズされる前は、プローブは被検体かまたは非プローブ核酸に結合できない。（ボールド体の部分は被検体および非プローブ核酸間の相補的な領域を示している。）しかしながら、被検体の非プローブ核酸へのハイブリダイゼーションは、非プローブ核酸のコンフィギュレーションを非プローブ核酸のプローブへのハイブリダイゼーションを十分に可能にするように変化させ、被検体の検出を可能にする。
【図３】図３は２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブとＲＮＡ標的またはＤＮＡ標的との融解曲線を示しており（二つの独立した実験）、融解は２６０ｎｍでの光吸光度の増加として示されている（濃色シフト）。
【図４】図４は固定したハイブリダイゼーション時間内での、単一濃度の同一塩基配列アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの、種々の量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示している。
【図５】図５は固定したハイブリダイゼーション時間内での、種々の濃度の同一塩基配列アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの、固定した量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示している。
【図６】図６は種々のハイブリダイゼーション時間内での、固定した濃度の同一塩基配列アクリジニウムエステル標識デオキシ−または２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドの、種々の量の完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示している。
【図７】図７はＤＮＡまたは２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチドプローブの完全相補的ＲＮＡ標的に対するハイブリダイゼーションを示している。データは式ｌｎ（１−Ｈ）＝（ｋ）（Ｃ０ｔ）に従ってプロットされており、ここでＨはパーセントハイブリダイゼーション、ｋはハイブリダイゼーション速度定数、Ｃ０はプローブの濃度であり、ｔは時間である。
【図１Ａ】
2008283973.tif 000030
【図１Ｂ】
2008283973.tif 000031
【図１Ｃ】
2008283973.tif 000032
【図２】
2008283973.tif 000033
【図３】
2008283973.tif 000034
【図４】
2008283973.tif 000035
【図５】
2008283973.tif 000036
【図６】
2008283973.tif 000037
【図７】
2008283973.tif 000038
【配列表】
2008283973000001.xml