(57)【要約】【課題】関節炎が確実かつ効率的に発症されるトランスジェニックマウス、前記関節炎が発症した新規な関節炎発症モデルマウス及びその作製方法、ならびに前記関節炎発症モデルマウスを用いた、関節炎等の疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法を提供すること。【解決手段】アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子を導入し、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現するトランスジェニックマウスであって、一次免疫により関節炎が惹起されるトランスジェニックマウス、ならびに該トランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫することによって発症させる、関節炎発症モデルマウス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子を導入し、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現するトランスジェニックマウスであって、一次免疫により関節炎が惹起されるトランスジェニックマウス。
【請求項２】
関節炎発症モデルとして使用可能である、請求項１記載のトランスジェニックマウス。
【請求項３】
関節炎が関節リウマチである、請求項２記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
一次免疫がII型コラーゲンによるものである、請求項１〜３いずれか記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
II型コラーゲンをフロイント完全アジュバントとともに用いる、請求項４記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６】
マウスがC57BL／6系の遺伝的背景を有する、請求項１〜５いずれか記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７】
誘導体がリン酸化誘導体、グリコシル化誘導体、モノメチル化誘導体、ジメチル化誘導体、トリメチル化誘導体、ポリメチル化誘導体、分子内架橋化誘導体及び分子間架橋化誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜６いずれか記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
誘導体がヒトアネキシンVIIのcDNAのオープンリーディングフレーム配列に対し、85％以上の同一性を有する核酸分子によってコードされる誘導体である、請求項１〜６いずれか記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか記載のトランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫することによって発症させる、関節炎発症モデルマウス。
【請求項１０】
請求項１〜８いずれか記載のトランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫誘導する工程を含む、関節炎発症モデルマウスの作製方法。
【請求項１１】
II型コラーゲンによる免疫誘導が一次免疫及び二次免疫を含む、請求項１０記載の関節炎発症モデルマウスの作製方法。
【請求項１２】
請求項９記載の関節炎発症モデルマウスを用いる、関節炎又は関節炎に関連する疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項９記載の関節炎発症モデルマウスを用いる、関節リウマチ治療剤又は予防剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニックマウスに関する。さらに詳しくは、アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子を導入し、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現するトランスジェニックマウスであって、関節炎発症モデル等として用いられるトランスジェニックマウスに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、症状として関節炎が観察される疾患には、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス等がある。これらの疾患の研究には関節炎発症モデル動物が使用されており、モデル動物は発症態様により自然発症モデルと誘発モデルに分類され、それぞれ多数報告されている。
【０００３】
自然発症モデルとしては、発症機序が不明であるが、MRL／lprマウスが報告されている(非特許文献１参照)。
【０００４】
誘発モデルとしては、II型コラーゲン誘発関節炎マウス(以下、CIAマウスともいう)、アジュバント誘発関節炎マウス(以下、AAマウスともいう)、連鎖球菌細胞壁誘発関節炎マウス等が挙げられる。これらの関節炎マウスは誘導可能な系統と誘導が困難又は不能な系統が存在することが知られており、CIAマウスとしてはDBA／1J系マウスを用いるCIAマウスがよく知られている(非特許文献２、３、４参照)。一方、CIA耐性のマウスとしては、BALB／c系やC57BL／6系が知られている。
【０００５】
このような関節炎発症モデルを関節炎治療剤又は予防剤のスクリーニングに用いることは従来行われており、例えば、Miharaらは、メトトレキセート及びMX-68をコラーゲン誘発関節炎マウスの一次免疫時から数日間隔で投与し、関節炎抑制作用を示した化合物が抗リウマチ薬として有用であることを報告している(非特許文献５参照)。
【０００６】
一方、関節リウマチを発症したヒト患者の滑膜においては、アネキシンVII(Annexin A7)のリン酸化が亢進していることが明らかになっている(特許文献１参照)。
【特許文献１】特開２００５−３１５８６９号公報
【非特許文献１】安部  千之、澤井  高志，関節炎モデル，第１版，株式会社  日本医学館，2000年，p35-39
【非特許文献２】Paul H.Wooley，METHODS IN ENZYMOLOGY，1988年，Vol.162，p361-373
【非特許文献３】小橋  修，関節炎モデル，第１版，株式会社  日本医学館，2000年，p51-56
【非特許文献４】Sandra Kuiper 他７名，CYTOKINE，1998年，Vol.10，No.9，p690-702
【非特許文献５】Mihara M, Immunopharmacology,1996年,Vol.35,p41-46
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、これら従来技術に拠って、関節炎発症モデル動物を作製することができるものの、MRL／lprマウス等の自然発症モデルは発症機序が不明であるがゆえに、関節炎発症をコントロールすることは難しい。CIAマウスやAAマウス等の誘発モデルは、免疫誘導に対する応答によっては関節炎発症が不十分な場合もあり、いずれもモデル動物としては十分なものとは言えない。また、誘発モデル及びヒトの関節炎を伴う疾患の双方において、関節炎が生じる機序が十分に解明されているとは言えないことから、新たな関節炎モデル動物の作出が望まれる。
【０００８】
本発明の課題は、関節炎が確実かつ効率的に発症されるトランスジェニックマウスを提供することにある。また、本発明は、前記関節炎が発症した新規な関節炎発症モデルマウス及びその作製方法、ならびに前記関節炎発症モデルマウスを用いた、関節炎等の疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、これまで、関節リウマチを発症した患者の滑膜においてアネキシンVIIのリン酸化が亢進することを見出しているが、前記課題を解決するために鋭意検討した結果、アネキシンVIIの遺伝子を導入したトランスジェニックマウスがアネキシンVIIを過剰発現することにより、一次免疫誘導のみでも、関節リウマチ患者と同様に関節局所でアネキシンVIIのリン酸化が亢進し、さらには関節炎を発症していることが判明したので、本発明を完成させるに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、
〔１〕  アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子を導入し、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現するトランスジェニックマウスであって、一次免疫により関節炎が惹起されるトランスジェニックマウス、
〔２〕  前記〔１〕記載のトランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫することによって発症させる、関節炎発症モデルマウス、
〔３〕  前記〔１〕記載のトランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫誘導する工程を含む、関節炎発症モデルマウスの作製方法、
〔４〕  前記〔２〕記載の関節炎発症モデルマウスを用いる、関節炎又は関節炎に関連する疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニング方法、ならびに
〔５〕  前記〔２〕記載の関節炎発症モデルマウスを用いる、関節リウマチ治療剤又は予防剤のスクリーニング方法
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のトランスジェニックマウスは、一次免疫誘導のみによっても確実かつ効率的に関節炎が発症されるという優れた効果を奏するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のトランスジェニックマウスは、アネキシンVII(Annexin A7)及び／又はその誘導体の遺伝子を導入することにより、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現したトランスジェニックマウスであって、一次免疫により関節炎を発症するという大きな特徴を有するものである。
【００１３】
アネキシンVIIは、カルシウムイオンとリン脂質に結合するという特性を有するアネキシン(Annexin)ファミリーに属するタンパク質であり、Ca2+／GTP依存性膜結合タンパク質として、アポリポタンパク質A-1に結合することが知られている。アネキシンVIIは、リン脂質からなる小胞を融合する機能を有し、PKCによるリン酸化を受けてexocytosisに関与する。また、アネキシンVIIは、galectin-3と結合することによりgalectin-3の抗アポトーシス作用を抑制したり、腫瘍細胞の増殖を抑制するなど腫瘍抑制に関与したりするなどの作用も知られている。
【００１４】
本発明におけるアネキシンVIIは、アネキシンVIIの活性を有するものであれば特に限定はなく、アネキシンVIIの公知のアミノ酸配列からなるポリペプチド、アネキシンVIIの公知のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質等が例示できる。また、アネキシンVIIの活性を有するものであれば、アネキシンVIIの公知のポリペプチド配列において１個以上の、好ましくは１もしくは数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は保存的置換を有する変異ポリペプチドも含まれる。かかる変異ポリペプチドは、公知のポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも60％以上、好ましくは85％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有するものであることが望ましい。なお、本明細書において、同一性は、例えば、BLAST(David W.Mount 著、岡崎康司ら監訳、バイオインフォマティクス 第2版 メディカルサイエンスインターナショナル参照)など、公知の配列検索プログラムを用いることにより計算される。
【００１５】
アネキシンVIIの誘導体とは、アネキシンVIIの活性を有し、かつ、ポリペプチドに対する修飾として生体内で一般的に生じることが知られている修飾を受けたアネキシンVIIの誘導体のことであり、具体的には、アセチル化誘導体、パルミトイル化誘導体、ミリスチル化誘導体、アミド化誘導体、アクリル化誘導体、ダンシル化誘導体、ビオチン化誘導体、リン酸化誘導体、サクシニル化誘導体、アニリド化誘導体、ベンジルオキシカルボニル化誘導体、ホルミル化誘導体、ニトロ化誘導体、スルフォン化誘導体、アルデヒド化誘導体、環状化誘導体、グリコシル化誘導体、モノメチル化誘導体、ジメチル化誘導体、トリメチル化誘導体、ポリメチル化誘導体、グアニジル化誘導体、アミジン化誘導体、マレイル化誘導体、トリフルオロアセチル化誘導体、カルバミル化誘導体、トリニトロフェニル化誘導体、ニトロトロポニル化誘導体、分子内架橋化誘導体、分子間架橋化誘導体等が例示される。これらのなかでも、リン酸化誘導体、グリコシル化誘導体、モノメチル化誘導体、ジメチル化誘導体、トリメチル化誘導体、ポリメチル化誘導体、分子内架橋化誘導体及び分子間架橋化誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることが好ましい。
【００１６】
また、本発明における誘導体としては、アネキシンVIIとしての活性を有し、かつ、ヒトアネキシンVIIのcDNAのオープンリーディングフレーム配列に対して同一性を有する核酸分子によってコードされる誘導体も例示され、好ましくは80％以上、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の同一性を有する核酸分子によってコードされる誘導体であることが望ましい。また、誘導体がアネキシンVIIの活性を有するものであれば、数個のアミノ酸残基の置換又は欠失を伴う一塩基多型、１個のアミノ酸残基の置換を伴う一塩基多型、アミノ酸配列が変化しない一塩基多型を含む核酸分子によってコードされる誘導体も含まれる。
【００１７】
アネキシンVII及びその誘導体の遺伝子は、当該分野で公知の方法により作製され得る。例えば、公知のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするDNAを化学合成することによっても調製することができ、DNAの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のDNA合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のDNA合成機model 1392などを用いて行うことができる。
【００１８】
また、アネキシンVII及びその誘導体の遺伝子は、適切なcDNAライブラリから、適切なプライマーを使用して増幅し取得することもできる。cDNAライブラリは、由来する種としてはアネキシンVIIを有する種であれば特に限定無く使用できるが、ヒト又はマウス由来のものが好ましく、アネキシンVIIを発現する組織に由来するものであれば良い。プライマーは当業者であればアネキシンVIIの配列に基づいて設計することができ、前述のDNA合成機を用いて作ることができる。
【００１９】
アネキシンVIIとしての活性を有するポリペプチドをコードするcDNAは当業者であれば選択可能であるが、例えば、後述の方法によって調製したベクター又はDNA断片をＣＨＯなどの株化細胞に導入してcDNAによってコードされるポリペプチドを発現させ、発現したポリペプチドがアポリポタンパクA-I及び／又はgalectin-3と結合能を有することを確認することにより、アネキシンVIIとしての活性を有するcDNAを含むベクター又はDNA断片が選択できる。使用する株化細胞はアポリポタンパクA-I及び／又はgalectin-3を発現していればよく、好ましくは導入されるアネキシンVIIのcDNAと同じ種に由来する細胞であることが望ましいが、アポリポタンパクA-I及び／又はgalectin-3を導入することにより発現させた細胞であってもよい。cDNAによってコードされるポリペプチドとアポリポタンパクA-I及び／又はgalectin-3の結合の確認は公知のいかなる方法も用い得るが、例えば、免疫沈降法によってアネキシンVIIと当該結合するタンパクが共沈することを確認すれば良い。免疫沈降法による結合確認方法の解説は成書、例えばMethods in Enzymologyに記載されており、当業者であればこの方法に準じてアネキシンVIIとアポリポタンパクA-I及び／又はgalectin-3の結合を検出することができる。
【００２０】
また、アネキシンVIIの遺伝子としては、試薬として市販されているアネキシンVIIをコードするcDNAを使用することができ、このような試薬の例としてはインビトロジェン社のクローンＩＤ：３６１０５４１等を使用することができる。
【００２１】
アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子のマウスへの導入方法としては、特に限定はなく、例えば、アネキシンVII又はその誘導体の遺伝子を含むDNA断片、あるいは、アネキシンVII又はその誘導体の遺伝子を導入した発現ベクターを用いてマイクロインジェクション法等によりマウスに導入する方法が挙げられる。なお、前記DNA断片、あるいは、発現ベクターを注入することにより別途作製した受精卵を、マウスに導入する方法も本発明に含まれる。
【００２２】
DNA断片は直鎖状であり、かつ、プロモーター、アネキシンVII又はその誘導体をコードする遺伝子及びポリＡ末端により構成されていることが好ましい。ベクターを用いる場合、ベクターは宿主において自律複製可能であると同時に、プロモーター、アネキシンVII又はその誘導体をコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、DNA断片及び／又はベクターには、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００２３】
本発明に用いられる好適なベクターとしては、pxCANLacZ等が挙げられる。
【００２４】
プロモーターとしては、β-アクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。これらのなかでも、β-アクチンが細胞骨格を構成するタンパク質であり、ベクターが導入されたほぼ全ての細胞で発現可能となるので、β-アクチンプロモーターが好ましい。
【００２５】
上記DNA断片又は発現ベクターは、公知の方法に準じて調製することができる。
【００２６】
また、アネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子が導入されるマウスとしては、特に限定はなく、公知のマウスを使用することが出来るが、トランスジェニックマウスの作製が容易であること、汎用性があること、及び、遺伝的背景等の情報が豊富であること等の観点から、本発明においては、C57BL／6J等のC57BL／6系の遺伝的背景を有するマウスを好適に使用する。なお、既にアネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子が導入されたマウスに、他の系統をバッククロスさせることにより得られるマウスも本発明に用いることができる。
【００２７】
以上のようにしてアネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子が導入されたトランスジェニックマウスが得られるが、前記トランスジェニックマウスは、アネキシンVII及び／又はその誘導体が過剰発現するものの、免疫誘導されるまでは、外見上、野生型とは変わらないものである。
【００２８】
本発明のトランスジェニックマウスは、一次免疫により関節炎を十分発症することができる。従って、本発明における好適な免疫誘導方法としては、II型コラーゲン、TNF-α、IL-1、リポポリサッカライド等の免疫誘導因子を用いる方法が挙げられ、II型コラーゲンを用いる場合には、免疫応答を増強するため、フロイント完全アジュバントとともに用いることが好ましい。また、より確実に関節炎を発症させるためには、II型コラーゲンによる一次免疫及び二次免疫を行うことが好ましい。
【００２９】
免疫誘導因子の導入は、公知の方法に従って行えばよく、皮下注射(足裏、尾根部など)、皮内注射(背部、尾根部など)、関節内注射等の注射による導入方法が例示される。
【００３０】
かくして免疫誘導される本発明のトランスジェニックマウスは、用いる免疫誘導因子の種類や量等の免疫条件により、関節炎の発症時期を特定することは一概には出来ないが、例えば、C57BL／6系の遺伝的背景を有するマウスにアネキシンVII及び／又はその誘導体の遺伝子を導入したトランスジェニクマウスに、II型コラーゲンとフロイント完全アジュバントを皮内注射して一次免疫を行った場合には、一次免疫後19〜21日後には関節炎を発症し、一次免疫の少なくとも35日後まで関節炎が安定して維持されるため、関節炎発症モデルマウスとして使用可能となる。従って、本発明はまた、本発明のトランスジェニックマウスをII型コラーゲンにより免疫することによって発症させる、関節炎発症モデルマウスを提供する。本発明のトランスジェニックマウスは一次免疫により関節炎を十分発症することから、本発明の関節炎発症モデルマウスの作製における免疫誘導の回数は特に制限無く、関節炎発症モデルマウスとしては、II型コラーゲンによる一次免疫のみを行う１回誘導型モデルマウスと、II型コラーゲンによる一次免疫と二次免疫を行う２回誘導型モデルマウスが挙げられる。なお、上記免疫条件以外にも、マウスの飼育条件(温度、湿度、換気回数、照明、臭気、騒音、飼育ケージ等の交換頻度、食餌の組成、微生物学的条件等)により発症日や持続期間が変動する場合があるが、これらの条件を調整し最適な発症条件を設定することは当業者には自明なことである。
【００３１】
本発明のトランスジェニックマウスが発症する関節炎は、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス等のいずれの疾患も反映するものであるが、これらのなかでも、関節炎局所におけるアネキシンVIIのリン酸化が亢進していることから、関節リウマチをより反映しているものといえる。
【００３２】
また、本発明の関節炎発症モデルマウスは、より確実に関節炎を発症し、その症状が一定期間維持されることから、関節炎又は関節炎に関連する疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニングに好適に用いることができる。関節炎又は関節炎に関連する疾患としては、関節リウマチ、変形性関節症、全身性エリテマトーデス等が挙げられるが、本発明の関節炎発症モデルマウスは滑膜増殖、骨軟骨破壊並びに炎症を伴う、関節リウマチに類似した関節炎を生じることから、関節リウマチ治療剤又は予防剤のスクリーニングにより好適に用いることができる。
【００３３】
スクリーニングの方法としては、特に限定はないが、例えば、本発明の関節炎発症モデルマウスに免疫誘導を行った直後又は発症を確認した直後から、スクリーニングに供する薬物を単回又は連続投与し、その際の関節炎の状態変化を評価することにより行うことができる。関節炎の評価方法としては、手関節や足関節の腫脹や発赤などの炎症を肉眼的に観察しスコア化する方法、手関節や足関節のX線写真を観察する方法、各組織の病理組織学的検査を行う方法など特に限定はない。
【００３４】
スクリーニングに用いる関節炎発症モデルマウスとしては、一次免疫のみで誘導した１回誘導型モデルマウスを用いることができるが、必要に応じさらに二次免疫を行った２回誘導型モデルマウスを用いてもよい。
【実施例】
【００３５】
実施例１  ヒトアネキシンVII発現用DNA断片の調製
ヒトアネキシンVIIトランスジェニックマウスを作製するためのDNA断片は、β-アクチンプロモーターの下流に、5'イントロンとポリＡ配列を伴うヒトアネキシンVII cDNAを結合したものを含むベクターから調製した。なお、5'イントロン領域、ヒトアネキシンVIIのコーディング領域及びポリＡ末端を含むヒトアネキシンVII全長cDNAはインビトロジェン社(Carlsbad, CA)より購入して使用した(クローンＩＤ：３６１０５４１；配列番号１)。
【００３６】
アネキシンVIIをコードする遺伝子を含むDNA断片の作製には、ラムダファージの部位特異的な組み換え(Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58: 913.)をキット化したインビトロジェン社のゲートウェイシステムを利用した。
【００３７】
即ち、アネキシンVII全長cDNAを制限酵素EcoRI(タカラバイオ)及びXhoI(タカラバイオ)によって切断し得られた断片を、EcoRI及びXhoIによって切断したゲートウェイpENTR1Aベクターにサブクローニングし、エントリーベクターを作製した。エントリーベクターとデスティネーションベクターpxCANLacZ(理研バイオリソースセンター社製;図１)を用い、ゲートウェイＬＲクロナーゼ(登録商標)酵素によってＬＲ反応を行い、発現ベクター(pBS-CAG-Annexin7)を得た。得られた発現ベクターはキアゲンtip-100を用いて精製し、制限酵素FspIにて切断後、さらにQIAquickゲル抽出キットを用いて精製して、β-アクチンプロモーター、ヒトアネキシンVIIの5'イントロン領域、ヒトアネキシンVIIのコーディング領域、ポリＡ末端をこの順に含むDNA断片を得た。
【００３８】
実施例２  ヒトアネキシンVIIトランスジェニックマウスの樹立
実施例１で調製したDNA断片をC57BL／6Jマウスより採取した未卵割の受精卵にマイクロインジェクション法で注入した。その後、ヒトアネキシンVII DNA断片を注入した受精卵200個を、偽妊娠マウスの卵管に約30個ずつ移植し、自然分娩により47匹の新生仔を出産させた。
【００３９】
次いでトランスジェニックマウスである個体を選別するため、トランスジーンの確認を実施した。即ち、出生した各個体の血液から、常法を用いて抽出したDNAに対してKpn1断片をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ヒトアネキシンVIIをトランスジーンとして持つ個体は４匹であった。これらの個体を野生型と交配してF1を作出し、その子孫を近親交配して、ヒトアネキシンVIIトランスジェニックマウスを樹立した。本トランスジェニックマウスにおいて、肝臓、関節、血球系にヒトアネキシンVIIトランスジーンの発現を認めた。
【００４０】
実施例３  関節炎マウスの作製と評価
(関節炎マウスの作製)
本発明のトランスジェニックマウスを用いる関節炎発症モデルマウス(以下、関節炎マウス)は本発明のトランスジェニックマウスを以下の方法により免疫誘導することにより作製した。
【００４１】
先ず、免疫誘導に用いる免疫用抗原としてフロイントの完全アジュバント(CFA)を公知の方法により調製した。即ち、市販の結核死菌(H37Ra株, Difco)を5mg/mLとなるように市販のフロイントの不完全アジュバント(Sigma)に加え、混和して調製した。市販のニワトリ由来II型コラーゲン(Sigma)を10mM 酢酸に2mg/mLとなるように溶解し、上記CFAと混合してエマルジョン化して免疫用抗原とした。
【００４２】
実施例２で作製し、SPF環境下にて飼育している10週齢のトランスジェニックマウスに、100μLの上記エマルジョンを尾根部皮内の数箇所に分割して注射し、一次免疫を行った。
【００４３】
一次免疫を行った関節炎マウスの群(13匹)と、比較対照として、前記関節炎マウスと同じ遺伝的背景を持つ野生型のC57BL／6Jマウスに、前記関節炎マウスと同様にして一次免疫を行った群(11匹)について、一次免疫後21日目までの関節炎の推移を観察し、下記の表１に従って関節炎の評価を行った。結果を図２に示す。なお、図２中の関節炎のスコアは、各群の平均値±標準誤差を示し、各観察日においてトランスジェニックマウス群と対照群をマンホイットニーのＵ検定で比較した際の危険率も併せて記載した。
【００４４】
(関節炎の評価)
関節炎の評価は表１に従ってスコア付けすることにより実施する。各個体の四肢それぞれの状態を目視で観察し、四肢それぞれについて表１に従ってスコア付けを行い、その合計を個体の関節炎スコアとし、個体あたり0点〜16点で評価する。
【００４５】
【表１】
2008289477.tif 000002
【００４６】
また、上記で一次免疫を行った関節炎マウスの群(13匹)と、比較対照のマウスの群(11匹)について、一次免疫後21日目に、一次免疫と同様にして二次免疫を引き続き行った。その後、一次免疫から35日後まで関節炎の推移を観察し、一次免疫のみを行った際と同様にして、表１に従って関節炎の評価を行った。結果は一次免疫を行った際の評価結果と併せて図２に示す。即ち、図２における21日目までが一次免疫のみを行った際の評価結果、21日目以降が二次免疫も行った際の評価結果を示す。なお、図２中の二次免疫を行った後の関節炎のスコアは前述と同様に示され、危険率も前述と同様に検定したものを記載した。
【００４７】
アネキシンVIIトランスジェニックマウスを用いる関節炎モデルマウスは一次免疫のみで関節炎の発症を認めた。一次免疫後19日で有意な関節炎の発症を認め、さらに、一次免疫21日後、即ち、二次免疫を行う前には既に関節炎が急激に増悪していた。一方、対照群は、一次免疫後19日の時点では関節炎の発症は全く認められず、21日後でも極わずかな発症を認めるに留まった。これらの対比から、本発明の関節炎モデルマウスは一次免疫のみで顕著な関節炎の増悪を示す関節炎モデルであることが判明した。また、二次免疫を行った後も、アネキシンVIIトランスジェニックマウスを用いる本発明の関節炎発症モデルマウスでは、観察期間の最後まで関節炎は維持された。一方、対照群は、二次免疫を行った後も関節炎は軽微なものにとどまり、同系マウスは関節炎耐性であることが改めて示された。
【００４８】
また、これらのマウスの関節破壊を確認する目的で後肢足関節の軟X線写真を撮影した。一次免疫35日後の関節炎が誘導されたトランスジェニックマウス足関節の軟X線写真を図３に、一次免疫35日後の対照群である野生型C57BL／6マウス足関節の軟X線写真を図４に示した。
【００４９】
図３と４を対比すると、関節炎が誘導されたトランスジェニックマウスにおいて関節境界が不鮮明になり、骨密度の低下及び骨新生が認められ、顕著な関節破壊が生じていることが認められた。
【００５０】
実施例４  病理組織学的検査
実施例３で作製した関節炎マウスの病理組織学的検査を常法に従い実施した。
【００５１】
即ち、組織(膝関節)をホルムアルデヒド溶液で固定した後、10％ EDTA溶液に浸漬し脱灰を行った。脱灰後の組織を水洗し、パラフィン包埋後薄切してプレパラート(組織切片)を作製し、HE染色を行って光学顕微鏡下で観察し、下記の表２に従って組織学的評価を行った。また、各組織切片の染色像の典型例について光学顕微鏡写真を撮影した。顕微鏡写真の結果を図５、７、８に、組織学的評価の結果を図９に示す。なお、対照群の組織(膝関節)についても同様に組織切片を作製し、光学顕微鏡写真を撮影した(図６)。
【００５２】
(組織学的評価)
組織学的評価は、病理組織学的検査において観察される組織の状態を表２に従ってスコア付けすることにより実施する。上述の方法によって作製した各個体四肢の組織切片の染色像について、光学顕微鏡を用いて、滑膜の状態、細胞浸潤の有無及び軟骨の状態を目視で観察し、表２に従ってスコア付けを行い、その合計を個体の組織学的スコアとし、個体あたり0点〜32点で評価する。
【００５３】
【表２】
2008289477.tif 000003
【００５４】
図５と６の対比より、関節炎マウスの膝関節では顕著な軟骨の厚み(図中の記号幅)と軟骨細胞の減少が認められた。また、図７の矢印部に顕著なように、関節炎マウスにおいてヒト関節リウマチと同様に、滑膜細胞が増殖して腫瘍様のパンヌスが形成され、パンヌスが軟骨表面から軟骨及び骨に浸潤しこれらを破壊する像が観察された。また、関節炎マウスにおいて、図８の矢印部に顕著なように、ヒト関節リウマチと同様の典型的な滑膜細胞の増殖、リンパ球浸潤及び壊死像が認められた。また、図９より、関節炎マウスにおいて、対照群と比較して顕著な組織学的スコアの悪化が認められ、組織学的にも重篤な関節炎を生じていることが示された。
【００５５】
実施例５  抗アネキシンVII抗体による関節炎治療実験
抗アネキシンVII抗体による関節炎の治療実験を、以下のとおり実施した。
【００５６】
抗ヒトアネキシン抗体は、市販のウサギ抗ヒトアネキシンVIIポリクローナル抗体(AVIVA Systems Biology, カタログ番号ARP36585 T200)を購入して使用した。コントロール抗体は市販のウサギIgGを使用した。これらの抗体を用時、生理食塩水に１mg/mLの濃度に溶解して用いた。
【００５７】
実施例３の方法と同様にして作製した、本発明のトランスジェニックマウスを用いる関節炎発症モデルマウスの２回誘導型モデルマウスにおいて、一次免疫及び二次免疫直後に抗ヒトアネキシンVII抗体を1個体あたり200μgずつ腹腔内に投与した(3匹)。初回免疫後14、16、19、21、23、26、28、31、33、35日後に実施例３と同様にして関節炎の評価を行った。なお、対照群には、上記と同様に作製した関節炎発症モデルマウスの２回誘導型モデルマウスに、コントロール抗体(IgG抗体)を同様に投与して、関節炎の評価を行った(3匹)。
【００５８】
関節炎スコアの経時変化を図１０に示す。コントロール抗体を投与した群では二次免疫後に経時的な関節炎の増悪が認められるのに対し、抗アネキシンVII抗体を投与した群では関節炎の増悪は殆ど認められず、抗ヒトアネキシンVII抗体は顕著な関節炎抑制効果を示した。即ち、抗ヒトアネキシンVII抗体は関節炎、特に関節リウマチの治療剤又は予防剤として有用である可能性が示された。また、本発明のアネキシンVIIトランスジェニックマウスは、関節炎、特に関節リウマチの治療剤又は予防剤のスクリーニングに使用可能であり、本発明のトランスジェニックマウスにII型コラーゲンを免疫して得られる関節炎発症モデルは、関節炎、特に関節リウマチの治療剤又は予防剤のスクリーニング方法として有用であることが示された。
【００５９】
実施例６  医薬のスクリーニング
抗関節炎薬として、抗リウマチ薬のスクリーニングを、以下の方法で実施する。なお、被験物質としてはメトトレキセートを用いる場合を例示する。
【００６０】
5〜10週齢の本発明のアネキシンVIIトランスジェニックマウスを用い、体重を元に1群8匹ずつ4群に無作為層化割付を行う。この際、極端に平均体重からの偏差が大きい個体は除外する。１群を媒体投与群、他の群を薬物投与群とする。全個体に対し、実施例３の方法に従い、関節炎を誘導する。なお、関節炎を誘導する際の免疫誘導の回数は、関節炎が十分に発症されていれば特に限定されない。
【００６１】
メトトレキセートは常法に従い、0.3、1、3mg／kgの投与量となるように1％メチルセルロースに懸濁する。経口ゾンデを用い、媒体投与群には1％メチルセルロースを、薬物投与群にはそれぞれの投与量の薬物を、初回免疫直後から観察終了前日まで毎日１回経口投与する。関節炎の評価は実施例３の方法に従って初回免疫後随時行い、35〜60日目頃まで随時観察する。観察終了後、安楽死させた各個体の脾臓、胸腺、副腎、手関節、足関節を採取し、手関節及び足関節のX線写真を撮影した後、病理組織学的検査に供する。
【００６２】
手関節及び足関節のX線写真、ならびに、定法に従って作製したプレパラートを光学顕微鏡により観察し、異常の程度をスコア化する。
【００６３】
得られた実験結果を総合して評価することにより、薬物の治療効果を判定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明のトランスジェニックマウスは、一次免疫誘導のみによっても確実かつ効率的に関節炎が発症されるため、関節炎発症モデル等として関節炎又は関節炎に関連する疾患の治療剤のスクリーニングに好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】pxCANLacZベクターを説明する図である。
【図２】本発明のトランスジェニックマウス(Tg)と、前記マウスと同じ遺伝的背景を持つ野生型のC57BL／6Jマウス(WT)に、免疫誘導を行った際の関節炎の推移を示す図である。
【図３】一次免疫35日後の関節炎が誘導された本発明のトランスジェニックマウス足関節の軟X線写真である。
【図４】一次免疫35日後の野生型C57BL／6マウス足関節の軟X線写真である。
【図５】関節炎が誘導された本発明のトランスジェニックマウスの膝関節の組織染色像である。
【図６】野生型のC57BL／6Jマウスの膝関節の組織染色像である。
【図７】関節炎が誘導された本発明のトランスジェニックマウスの膝関節の組織染色像である。
【図８】関節炎が誘導された本発明のトランスジェニックマウスの膝関節の組織学的評価の結果を示す図である。
【図９】関節炎が誘導された本発明のトランスジェニックマウス(Tg)と、前記マウスと同じ遺伝的背景を持つ野生型のC57BL／6Jマウス(B6)の膝関節の組織学的評価結果を比較した図である。
【図１０】本発明の関節炎発症モデルマウスに抗ヒトアネキシンVII抗体(Anti-Anx7 Ab)又はコントロール抗体としてIgG抗体(Control)を投与した場合の関節炎の推移を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００６６】
配列表の配列番号１は、ヒトアネキシンVII全長cDNAである。
【図１】
2008289477.tif 000004
【図２】
2008289477.tif 000005
【図９】
2008289477.tif 000006
【図１０】
2008289477.tif 000007
【図３】
2008289477.tif 000008
【図４】
2008289477.tif 000009
【図５】
2008289477.tif 000010
【図６】
2008289477.tif 000011
【図７】
2008289477.tif 000012
【図８】
2008289477.tif 000013
【配列表】
2008289477000001.app