(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸分解細菌を属または科レベルで特異的に定量検出するプライマーセットを提供する。【解決手段】次の何れか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：（ａ）Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒ属菌群をターゲットとした特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、他の特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；（ｂ）Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属菌群をターゲットとした特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、他の特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド;（ｃ）Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ属菌群をターゲットとした特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、他の特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。(ｄ）Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科菌群をターゲットとした特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、他の特定な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。【選択図】図１
2008245585.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸分解細菌を属または科レベルで分別的に定量検出するための下記（ａ）〜（ｄ）のいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ａ）Syntrophobacter属菌群をターゲットとした、配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）Pelotomaculum属菌群をターゲットとした、配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド;
（ｃ）Desulfotomaculum属菌群をターゲットとした、配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）Syntrophomonadaceae科菌群をターゲットとした、配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットを用いたPCRにより、試料中の所定の属または科の脂肪酸分解細菌を検出する方法。
【請求項３】
試料がメタン発酵微生物系から採取された試料であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メタン発酵微生物系を診断する方法であって、メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、請求項１に記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットのいずれか１つ以上を用いた定量PCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解細菌群を検出することを含む、前記診断方法。
【請求項５】
定量PCRとしてリアルタイムPCRを行って、メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解細菌群の菌数及び／または活性を経時的にモニタリングし、該メタン発酵微生物系のメタン生成能を予測することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の（ａ）〜（ｃ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットのいずれか1つ以上を用いた定量PCRを行って、メタン発酵微生物系におけるプロピオン酸分解に係わる所定の酸生成細菌の菌数及び／または活性を定量し、該メタン発酵微生物系のプロピオン酸分解能を推定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の（a）及び(d)のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットのいずれか1つ以上を用いたリアルタイムPCRを行って、メタン発酵微生物系における脂質分解に係わる所定の酸生成細菌の菌数及び／または活性を経時的にモニタリングし、該メタン発酵微生物系の脂質分解能を予測することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、請求項１に記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットのいずれか１つ以上を用いた定量PCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解細菌群の優占状況を調べ、該メタン発酵微生物系にとって有用と思われる菌を推定し、該有用と思われる菌の菌数と活性を制御することを特徴とする、嫌気性処理方法。
【請求項９】
メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、請求項１に記載の（ａ）〜（ｄ）のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットのいずれか１つ以上を用いたリアルタイムPCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解菌群の菌体当たりの活性を経時的にモニタリングし、該メタン発酵微生物系にとって適切な運転制御条件を予測し、該適切な制御条件を実施することを特徴とする、嫌気性処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在する脂質及び脂肪酸分解に関連する細菌を検出する方法及びそれに用いるプライマー等に関し、より詳しくは、嫌気性処理系における脂質、プロピオン酸分解に関連する酸生成細菌群集の挙動を把握及び制御するのに有用な微生物検出方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
高濃度の有機性廃棄物や廃水等を含有する排水や有機性汚泥の処理には、従来から嫌気性処理方式（メタン発酵）が多用されている。この方式は曝気動力が不要なのでエネルギー消費量が節約できること、余剰汚泥の発生量が少ないので処理費用が廉価であること、かつエネルギーとして有用なメタンガスを回収できること等の利点がある。
【０００３】
メタン発酵は、（１）高分子の有機物を可溶化する過程、（２）可溶化された有機物を酸発酵する過程、（３）メタン生成過程と大きく分けて３つのステップに様々な微生物が関与する複雑な生物反応系である。なお本明細書では、この生物反応系を「メタン発酵微生物系」と称するが、「メタン発酵系」、「嫌気性処理系」または単に「処理系」や「反応系」とも記す。
【０００４】
有機性汚濁物質として代表的な油脂は、好気性処理、嫌気性処理のいずれにおいても難分解性物質である。その理由は、油脂の分散性が悪く、処理槽内で浮上してスカムを形成してしまうからである。油脂を含有する排水・廃棄物としては、例えば、厨房排水、惣菜製造排水、豆腐製造排水、食肉加工排水、水産加工排水、洋菓子製造排水、牛乳排水、米糠廃棄物、豆加工廃棄物等多数の事例が挙げられる。
【０００５】
油脂の大部分は炭素と水素から構成されているため、嫌気的分解に際して大量のメタンガスを生成することから、油脂の嫌気性処理法はエネルギー回収の観点から期待される技術である。しかし、高濃度油脂含有排水あるいは汚泥の嫌気性処理においては、高級脂肪酸による反応阻害、すなわち、中性脂肪の加水分解によって生成する高級脂肪酸が分解律速や阻害を生じることが技術課題である。高級脂肪酸はメタン生成菌、とりわけ酢酸利用メタン生成菌を阻害し、高級脂肪酸自身を分解する菌も阻害を受ける。高級脂肪酸が一旦蓄積し始めると阻害作用によってさらに蓄積が進み、メタン生成が停止するといった悪循環におちいる。中性脂肪の分解によって生成する高級脂肪酸が処理排水中に存在すると、嫌気性処理でのメタン発酵に作用するメタン生成菌、特に酢酸資化性メタン生成菌や水素資化性メタン生成菌の働きを阻害し、さらにかかる微生物自体の生育をも阻害するのである（非特許文献１）。従って、油脂系廃棄物の高温メタン発酵において有機物分解率は高く取れると言えるものの、有機物分解量に相当分のメタンガス回収が得られず、メタン発酵槽において高級脂肪酸等の中間代謝産物が蓄積し、油分が発酵槽内で浮上分離していることが推察される。この問題を回避するために、特開2001-321792（特許文献１）の発明で記述したような、嫌気反応系内の高級脂肪酸濃度をモニターしてその濃度を制御することによる、安定的且つ効率的な油脂含有排水あるいは油脂含有廃棄物の嫌気性処理方法がある。しかし、高級脂肪酸及び脂質の濃度のモニタリング方法は、エタノール性苛性カリを用いた化学的な酸価及びケン化価測定法法により、メタン発酵槽内の中性脂肪と脂肪酸濃度を測定する方法や、試料に高級脂肪酸ラベル試薬、例えばアダム試薬（9-anthryldiazomethane, ADAM）等を添加して、高級脂肪酸をラベルし、紫外吸光光度（ＵＶ）検出器あるいは蛍光光度（ＦＬ）検出器を備えた高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて高級脂肪酸を分離・定量する方法、脂質を抽出可能な有機溶媒ノルマルヘキサン／イソプロパノール、クロロホルム／メタノール、アセトン、エーテル類等で抽出し、ＴＬＣ／ＦＩＤ分析計またはガスクロマトグラフ分析計によって脂肪酸を分析する方法が挙げられ、いずれにしても、操作が煩雑で、時間がかかり、廃液排出やガス供給が必要な高度な分析装置による分析を行うために、処理現場でのプロセスモニタリング手段として利用できない。
【０００６】
また、有機物の酸発酵過程で生じる中間代謝脂肪酸（酪酸、プロピオン酸）は、水素生成酢酸生成細菌（Acetogenic  bacteria）により、メタン生成細菌の基質となる酢酸と水素にまで分解されるが、一般的なメタン発酵汚泥のプロピオン酸分解活性は、酢酸からのメタン生成活性の数分の一から数十分の一程度であるため、プロピオン酸が蓄積しやすい（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。さらに、メタン発酵は、有機物分解の最終反応を担うメタン生成細菌群の至適温度に応じて中温メタン発酵（35℃）、高温メタン発酵（55〜65℃）に大別される。中温メタン発酵と比べると、高温メタン発酵のほうが短い滞留時間で、高効率的に固形性有機物の消化ができ、病原性細菌の低減ができ、消化汚泥の脱水性も向上できる特徴が挙げられる。しかし、高温メタン発酵では、VFA（Volatile  Fatty  Acid：揮発性脂肪酸）、特に中間代謝有機酸としてのプロピオン酸の蓄積が生じやすく反応系が不安定になり易い。その原因としては、高温メタン発酵汚泥では、中温メタン発酵汚泥に対して微生物の多様性に乏しいことによって、中間代謝脂肪酸が蓄積しやすいこと（非特許文献２）、また、酸発酵が進行しやすいことによって、反応系内の水素分圧が比較的に高くなる傾向があり、中間代謝脂肪酸の分解を妨げている可能性もあることが報告されている（非特許文献３）。プロピオン酸のような難分解性の中間代謝脂肪酸の生産抑制あるいは高効率分解技術により、メタン発酵全体プロセスの性能の高効率化、安定化を図ることが期待されるが、特に高温メタン発酵系では、微生物についての知見が乏しく、有効な手段は見出されていない。
【０００７】
高級脂肪酸やプロピオン酸の蓄積を回避することにより、メタン発酵全体プロセスの性能の高効率化、安定化を図ることが期待されるが、複雑な微生物系であるメタン発酵の運転管理は、熟練したオペレーターの経験に頼っており、一旦、メタン生成が悪化すると原因の特定が難しく、回復するまでに長期間要するというのが現状である。
【０００８】
従って、有機性汚濁物質のメタン発酵処理において、脂質及び脂肪酸に関わる微生物菌濃度及び代謝活性に関する情報を把握し、その情報に基づいて的確な汚泥の脂質またはプロピオン酸分解能を評価し、フィードバック制御をしながら嫌気性処理を行う方法の開発が望まれている。
【０００９】
微生物の定量検出方法として従来の長期間の培養が必要なMPN法から、分子生物学的な手法を利用した標的の細菌を培養せずに環境試料から定量検出できる方法へと、より効率的な方法が発達してきた。例えば、目的の細菌遺伝子配列の特異的な部分に相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを作製し、これに蛍光色素をつけたDNAプローブを細胞内でハイブリダイゼーションするFISH（fluorescent in situ hybridization）法や、RNaseHとDNAプローブを利用したSSU（small subunit）rRNA酵素切断法、細菌遺伝子に特異的なプライマーを使用したリアルタイムPCR（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）法が挙げられる。
【００１０】
PCR法は複製連作反応ともいい、DNA鎖の特定部位のみを繰返し複製する反応で、微量のDNAを106倍程度まで増幅できる。リアルタイムPCR法は定量PCR法のひとつであり、PCR増幅産物の増加をリアルタイムでモニタリングし、解析する技術である。反応が終了してから電気泳動を行って増幅産物を確認する従来のPCR法に比べて、核酸の正確な定量ができ、迅速且つ簡便に解析可能であり、コンタミネーションの危険性も小さい等、多くの利点があるため、遺伝子発現定量解析（アレイデータやジーンノックダウンの評価等）、核酸の定性的解析（微生物、ウィルス核酸の検出等）、ジェノタイピング（変異解析、SNPs解析）等に活用されている。リアルタイムPCR法を適用することにより、汚泥等の環境試料中の少量菌群の定量検出も可能である。さらに、PCRの第一回目の反応に逆転写酵素を用いることにより、RNA（16SrRNA, mRNA etc.）からのcDNA増幅も行える（リアルタイムRT-PCR）。従って、同じプライマーセットで、特定微生物の菌数(DNA量)及び活性（RNA量）の定量が可能であり、試料の準備から測定、データ解析まで操作が簡単で、しかも短時間で多量検体の測定が可能であるため、応用範囲が広いと思われる。
【００１１】
現在報告されている脂肪酸分解菌群を図１に示す。プロピオン酸分解菌群として、系統図上で離れたSyntrophobacter属菌群（a）や、Pelotomaculum属菌群(b)及びDesulfotomaculum属菌群(c)が挙げられる。また、プロピオン酸より炭素数を多く含む脂肪酸（C4〜C18）の分解能を持つ脂肪酸分解菌としてはSyntrophomonadaceae科菌群(d)があり、これらの菌群はメタン生成菌と共生した環境で、脂肪酸をβ酸化代謝経路によって分解し、水素と酢酸生成する酸生成菌である。この菌群は単離培養が困難であるため、高温メタン発酵系における生理特性に関する知見はほとんどない。高温条件下で単離された唯一の脂質及び高級脂肪酸分解菌株ThermosyntrophalipolyticaはこのSyntrophomonadaceae科菌群と近縁であることがわかった（非特許文献７）。また、高温の高級脂肪酸分解菌の集積培養体での微生物16S rRNA遺伝子情報を解析した結果からも、Syntrophomonadaceaeグループと近縁であることが分かった（非特許文献８）。
16S rRNA遺伝子を特異的に検出するDNAプローブを用いた高級脂肪酸分解菌の検出法が報告されている（非特許文献８、９）。しかし、試料の準備から測定完成までの操作が煩雑、定量には蛍光顕微鏡を用いて複数視野を計数して平均値を算出することが必要であるため、標的細菌の種類が増えると、労力と時間が非常にかかることが問題である。加えて、細胞内RNAをターゲットとしているため、プローブの細胞への進入効率により検出感度が影響され易い。
【００１２】
また、16S rRNA遺伝子を特異的に検出するプライマーを用いたプロピオン酸分解菌のPelotomaculum属とDesulfotomaculum属菌のクロニング解析用PCRプライマーが報告されている（非特許文献１０）。しかし、これらのPCR増幅産物サイズは700bp以上であり、リアルタイムPCR機器（適用範囲100〜700bp）に適用できない。また、プライマーの特異性を検討した結果（図6）、メタン発酵汚泥中に良く存在している高級脂肪酸分解菌Syntrophomonadaceae科菌群や、セルロース分解菌JC3（非特許文献１１）と炭水化物分解菌S2株（特許文献２）も検出されるため、プロピオン酸分解菌の特異的な検出法としては精度が不十分であり、利用できない。
【特許文献１】特開2001-321792  片岡  直明、ハオ  リンユン、宮  晶子、油脂含有汚濁物質の嫌気性処理方法及び処理システム
【特許文献２】特願2006-099990  宮  晶子、下村  達夫、立澤  知子、ハオ  リンユン、嫌気性微生物による有機性廃棄物の処理方法及び装置
【非特許文献１】チュウ・シュンホウ、李玉友、宮原高志、野池達也ら、土木学会論文集、No. 559/VII-2、第３１〜３８頁、１９９７年。
【非特許文献２】Sekiguchiら、Microbiology,144,pp.2655-2665、1998。
【非特許文献３】原田ら、環境工学研究論文集、第34巻、p327-336、1997。
【非特許文献４】Syutsuboら、Wat.Sci. Tech.,  36, 391-398, 1997。
【非特許文献５】Uemura et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 654-660, 1993。
【非特許文献６】Wiegant et al, Biotech. Bioeng., 27, 1603-1607,1985。
【非特許文献７】Vitalii Svetlitshnyi et al., Thermosyntropha lipolytica gen. Nov.,sp. nov., a Lipolytic, Anaerobic, Alkalitolerant, Thermophilic Bacterium Utilizing Short- and Long-Chain Fatty Acid in Syntrophic Coculture with a Methanogenic Archaeum, International Journal of systematic Bacteriology, 1996, Vol.46, No.10, p.1131-1137.
【非特許文献８】幡本将史、井町寛之、大橋晶良、原田秀樹、分子遺伝子学的手法を併用した嫌気高級脂肪酸分解共生細菌の分離の試み、2004、第38回日本水環境学会年会講演集、 p.241。
【非特許文献９】Kaare H. HANSEN et al., Quantification of Syntrophic Fatty Acid-beta-Oxidizing Bacteria in a Mesophilic Biogas by Oligonucleotide Probe Hybridization, Applied and Environmental Microbiology, 1999, Vol.65, p.4767-4774.
【非特許文献１０】Hiroyuki Imachi et al, No-sulfate-reducing, Syntrophic  Bacteria  Affiliated with DesulfotomaculumCluster I Are Widely Distributed in Methanogenic Environments, Applied and Environmental Microbiology, 2006,Vol.72, No.3, p.1〜12．
【非特許文献１１】長屋由亀、珠坪一晃、宮  晶子、高温メタン発酵系における優占セルロース分解細菌の同定と検出、第37回水環境学会年会講演集p.282。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
脂質の嫌気性分解（メタン発酵）におけるメタン生成悪化の原因として、上述した高級脂肪酸による酸発酵及びメタン生成過程の阻害並びに難分解性のプロピオン酸の蓄積が挙げられる。本発明では、脂肪酸の蓄積に関与する微生物群集の挙動に着目し、そのような微生物の菌濃度及び代謝活性のモニタリングによって、反応系内の脂肪酸分解能または脂肪酸蓄積状況を簡便且つ迅速に把握し、フィードバック制御することによる高効率な嫌気性処理方法の開発を目指す。
【００１４】
従って、本発明の課題は、脂質の嫌気性分解における脂肪酸分解に関連する細菌の濃度及び代謝活性をモニタリングするための新規な手段を提供し、さらに、得られた結果をメタン発酵装置の適切な運転管理指標とするための方策を見出すことである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題を解決するため、本発明では、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在する酢酸以外の脂肪酸分解に関連する酸生成細菌を、分子生物学的手法を用いて定量的に検出する手段を提供する。
【００１６】
具体的には、酸生成細菌の16S rRNA遺伝子の特定の部分を標的とする定量ＰＣＲに適用するための新規なプライマー、及び、該プライマーを用いて、メタン発酵処理汚泥中に存在する特定の属または科の酸生成細菌を特異的に定量検出する方法を提供する。さらに、該プライマーを用いて、有機性廃棄物・廃水のメタン発酵処理汚泥中に存在する脂肪酸分解に関連する細菌のDNA及びRNAを経時的に定量検出することにより、菌濃度及び代謝活性をモニタリングし、その結果からメタン発酵微生物系全体における脂質及び脂肪酸の分解能を推定する方法を提供する。さらに、得られた結果をフィードバックして嫌気性処理装置の運転制御に利用する方法も提供する。
すなわち、本発明は以下の内容に関するものである。
（１）脂肪酸分解細菌を属または科レベルで分別的に定量検出するための下記（ａ）〜（ｄ）に記載のいずれか一組のオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット：
（ａ）Syntrophobacter属菌群をターゲットとした配列番号１の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号２の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｂ）Pelotomaculum属菌群をターゲットとした配列番号３の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号４の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド;
（ｃ）Desulfotomaculum属菌群をターゲットとした配列番号５の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号６の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド；
（ｄ）Syntrophomonadaceae科菌群をターゲットとした配列番号７の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号８の塩基配列又はそれと実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
（２）上記（１）に記載のプライマーセットを用いたPCRにより、試料中の所定の属または科の脂肪酸分解細菌を検出する方法。
（３）試料がメタン発酵微生物系から採取された試料であることを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）メタン発酵微生物系を診断する方法であって、メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、上記（ａ）〜（ｄ）のプライマーセットのいずれか１つ以上を用いた定量PCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解細菌群を検出することを含む、前記診断方法。
（５）定量PCRとしてリアルタイムPCRを行って、メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解菌群の菌数及び／または活性を経時的にモニタリングし、そのモニタリング結果から該メタン発酵微生物系のメタン生成能を予測することを含む、（４）に記載の方法。
（６）上記（ａ）〜（ｃ）のプライマーセットのいずれか1つ以上を用いた定量PCRを行って、メタン発酵微生物系におけるプロピオン酸分解に係わる所定の酸生成細菌の菌数及び／または活性を定量し、その定量結果から該メタン発酵微生物系のプロピオン酸分解能を推定することを含む、（４）に記載の方法。
（７）上記（a）及び(d)のプライマーセットのいずれか1つ以上を用いたリアルタイムPCRを行って、メタン発酵微生物系における脂質分解に係わる所定の酸生成細菌の菌数及び／または活性を経時的にモニタリングし、そのモニタリング結果から該メタン発酵微生物系の脂質分解能を予測することを含む、（４）に記載の方法。
（８）メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、上記（ａ）〜（ｄ）のプライマーセットのいずれか１つ以上を用いた定量PCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解細菌群の優占状況を調べ、該メタン発酵微生物系にとって有用と思われる菌を推定し、該有用と思われる菌の菌数と活性を制御することを特徴とする、嫌気性処理方法。
（９）メタン発酵微生物系から採取された試料を対象にして、上記（ａ）〜（ｄ）のプライマーセットのいずれか１つ以上を用いたリアルタイムPCRを行って、該メタン発酵微生物系における所定の脂肪酸分解菌群の菌体当たりの活性を経時的にモニタリングし、そのモニタリング結果から該メタン発酵微生物系にとって適切な運転制御条件を予測し、該適切な制御条件を実施することを特徴とする、嫌気性処理方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理汚泥中に存在する脂肪酸分解に関連する嫌気性細菌について、長期間培養することなく、属または科レベルでの特異的な検出と定量が可能となった。特に、これまで知見の乏しかった高温メタン発酵系の微生物、中でも、油脂含有廃棄物や廃水等からのメタン生成効率に影響を及ぼすと考えられる、高級脂肪酸やプロピオン酸の分解を担う細菌について、本発明により初めて、十分な精度で検出することができるようになった。さらに、リアルタイムＰＣＲを用いて検出及び定量を実施することで、脂肪酸分解に関連する細菌の挙動を処理現場で経時的にモニタリングすることができる。
【００１８】
このようなメタン発酵処理汚泥中に存在する脂肪酸分解に関連する細菌をモニタリングすることにより、メタン生成阻害要因となる中間代謝産物の蓄積を予測することができる。そして、予測結果に基き、阻害要因となる中間代謝産物の蓄積を抑制することにより、メタン発酵プロセス全体の高効率化及び安定化を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００２０】
１．  脂肪酸分解細菌
本明細書において、脂肪酸分解細菌（脂肪酸分解菌）とは酢酸以外の脂肪酸分解に関連する細菌を指す。現在報告されている脂肪酸分解菌群を図１に示す（上述の背景技術の説明も参照されたい）。
【００２１】
本発明が対象とする脂肪酸分解細菌は、主として、有機性廃棄物や廃水等のメタン発酵処理系において存在が知られている酸生成菌の一部である。メタン発酵処理系に存在する脂肪酸として、本発明ではメタン生成阻害要因となる中間代謝産物と考えられるものに着目しているため、具体的には、高級脂肪酸、及び特に高温メタン発酵において蓄積しやすいプロピオン酸が重要である。従って、本発明の一部の態様では、脂肪酸分解細菌としては、プロピオン酸分解菌及び高級脂肪酸分解菌を対象とする。
【００２２】
本発明のさらに具体的な態様では、高温メタン発酵におけるプロピオン酸分解菌及び高級脂肪酸分解菌の代表的なものとして、次の菌群を対象とする。すなわち、プロピオン酸分解細菌としては、（ａ）Syntrophobacter属菌群；（ｂ）Pelotomaculum属菌群;（ｃ）Desulfotomaculum属菌群であり、高級脂肪酸分解菌としては、（ｄ）Syntrophomonadaceae科菌群である。
【００２３】
上述の「プロピオン酸分解菌」及び「高級脂肪酸分解菌」という呼称は便宜的なものであり、これらの細菌が専らプロピオン酸あるいは高級脂肪酸のみを分解するという意味ではない。
【００２４】
通常の脂肪酸には、炭素数の少ない、典型的には炭素数11未満の「低級（短鎖）脂肪酸」（例えば、酪酸、吉草酸、カプロン酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシル酸等）と、炭素数の多い、典型的には炭素数11以上の「高級脂肪酸」がある。高級脂肪酸としては、例えば、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、ヘプタデシル酸、ステアリン酸、ノナデカン酸、アラキン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、ヘプタコサン酸、モンタン酸、メリシン酸、ラクセル酸等の飽和脂肪酸、オレイン酸、エライジン酸、セトレイン酸、エルカ酸、ブラシジン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ステアロール酸などの不飽和脂肪酸、及びこれらの混合物が挙げられる。Syntrophomonadaceae科菌群は、炭素数18の高級脂肪酸から炭素数４までの低級脂肪酸を分解する基質資化性を持っている。一方、Syntrophobacter属菌群が炭素数11以下の低級脂肪酸を分解する基質資化性も持っているので、プロピオン酸分解菌として限定しない。
２．  本発明のプライマー
本発明においては、脂肪酸分解細菌の16SｒRNAに由来する核酸の存在に対してPCR法（ポリメラーゼ連鎖反応）を介して特異的に定量検出することを特徴とする。ここで、「16SrRNAに由来する」核酸とは16SｒRNA遺伝子である16SｒDNA、及び蛋白質の合成工場であるリボソーム（ribosome）小サブユニットを構成するRNAである16SｒRNAの両方またはいずれか一方に由来するものを意味する。PCR法を介して特異的に定量検出するとは、具体的には、特定のプライマーを用いて、定量PCRを行い、脂肪酸分解細菌の16SｒRNA遺伝子中の特定の塩基配列を増幅し、その増幅産物を定量的に検出することにより、もとの試料中の16SｒDNAあるいは16SrRNAを定量的に検出することである。
【００２５】
本発明において使用されるプライマーは、所定のPCR条件下で、脂肪酸分解細菌のうち、プロピオン酸分解細菌（ａ）Syntrophobacter属菌群；（ｂ）Pelotomaculum属菌群;（ｃ）Desulfotomaculum属菌群と高級脂肪酸分解菌（ｄ）Syntrophomonadaceae科菌群由来の16SｒDNAにはアニールできるが、それと同一の条件下では、真正細菌及びその他のメタン生成細菌由来の16S ｒDNAにはアニールしないような塩基配列を有するように設計された。また、これらのプライマーは、嫌気性処理現場での脂肪酸分解細菌群の迅速なモニタリング手段として使用できるように、リアルタイムPCR法に適用可能な定量検出用プライマーとして設計された。
【００２６】
プライマーの設計は概ね次のような手法に従って行った。まず、GenBank等のデータベースや文献等に公開されている配列情報から、（ａ）Syntrophobacter属菌群；（ｂ）Pelotomaculum属菌群;（ｃ）Desulfotomaculum属菌群；（ｄ）Syntrophomonadaceae科菌群のそれぞれの菌群の16S ｒDNAの塩基配列を取得し、これらの塩基配列を他の真正細菌及びメタン生成細菌由来の16S ｒDNAと比較して、対象とする各菌群に特異的な領域を特定した。領域の特定は、リアルタイムPCR機器に適用できるように、100bp〜700bpとなるように行なった。そして特定された領域の塩基配列を基にプライマーの対（Forwardプライマー： F と Reverse プライマー： Rからなるプライマーセット）を設計し、代表的な純菌株のDNA抽出液またはその16S rDNA全長増幅産物、次いで実際の汚泥試料のDNA抽出液をテンプレートとして用い、リアルタイムPCRを行い、検出の特異性及び反応効率を検討した。対象とする脂肪酸分解細菌群に対する特異性が確認されたものを、次の（ａ）〜（ｄ）の検出用プライマーセットとして得た。
（a）配列番号１（SYN330F 5' TTCGGGTTGTAAAGCTCGTC 3'）及び配列番号２（SYN575R   5' CTCCAGCACTCAAGACGAACA 3'）の各塩基配列からなる一組のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。このプライマーセットによると、プロピオン酸分解細菌Syntrophobacter属細菌16S ｒDNAのうち、代表的なSyntrophobacter wolinii（Accession  No.X70905, 16SrDNA全長塩基数約1427個）においては、５’末端側から数えた塩基位置で330番目〜575番目の領域に相当する246塩基数の断片が増幅される。
（ｂ）配列番号３（Pelot255F  5' GGGAACCCGCTGACA 3'）及び配列番号４（Pelot525R   5' CGGGGCTTCCTCCTCA 3'）の各塩基配列からなる一組のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。このプライマーセットによると、プロピオン酸分解細菌Pelotomaculum属細菌16S ｒDNAのうち、代表的なPelotomaculum thermopropionicumstrain SI（Accession  No.AB035723, 16SrDNA全長塩基数約1532個）においては、５’末端側から数えた塩基位置で255番目〜525番目の領域に相当する271塩基数の断片が増幅される。
（c）配列番号5 （DFM 628F 5' CAAGAAGTCAGGGGTGAAATACC 3'）及び配列番号6 （DFM 1176R 5' CGCTGGCAACTAACCGTAG 3'）の各塩基配列からなる一組のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。このプライマーセットによると、プロピオン酸分解細菌Desulfotomaculum属細菌16S ｒDNAのうち、代表的なDesulfotomaculumthermobenzoicum（Accession  No.AY007190, 16SrDNA全長塩基数約1551個）においては、５’末端側から数えた塩基位置で628番目〜1176番目の領域に相当する549塩基数の断片が増幅される。
（d）配列番号7（SYM373F  5' GAAGGCGGCTTTCTGGACTGACC 3'）及び配列番号8（SYM788R 5' CCCGTTAGCAACTAACAGC 3'）の各塩基配列からなる一組のオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット。このプライマーセットによると、脂肪酸分解細菌Syntrophomonadaceae科菌16S ｒDNAのうち、代表的な高温パルミチン酸分解菌Uncultured clone TPA（Accession  No.AB232551, 16SrDNA全長塩基数約1246個）においては、５’末端側から数えた塩基位置で373番目〜788番目の領域に相当する416塩基数の断片が増幅される。
【００２７】
ただし、実際に利用する場合、上記に記載した塩基配列と100％の相同性を持つものである必要はない。これらの配列と1〜6塩基の違いがあり、実質的にターゲット菌種遺伝子との反応効率や特異性の変化がない塩基配列を有するオリゴヌクレオチドも、検出用プライマーとして同様に利用できる。本明細書では、このような塩基配列を「実質的に相同な塩基配列」という。従って、上述の配列番号で示された塩基配列中の１〜6個の塩基（場合により、より好ましくは１〜３個の塩基、さらに好ましくは１〜２個の塩基）が欠失あるいは他の塩基で置換または付加されていても、所定のPCR条件下で各菌群の16S ｒDNAにアニールでき、それと同一の条件下ではその他の真正細菌及びメタン生成古細菌由来の16S rDNAにはアニールせず、その結果、上述の16S ｒDNAの特定領域を特異的に増幅可能であるようなオリゴヌクレオチドも、「実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド」として本発明のプライマーに包含される。
【００２８】
本発明のプライマーで検出される脂肪酸分解細菌の種類を図2〜5に示す。（菌の系統図とプライマーの名称については、図１も参照されたい。）Syntrophobacter属、Pelotomaculum属、Desulfotomaculum属、Syntrophomonadaceae科のそれぞれの脂肪酸分解細菌のDNAまたはRNAを属または科レベルで分別的に定量検出することができていることがわかる。本明細書において「属または科レベルで分別的に定量検出する」とは、所定の属または科に分類される細菌を特異的に検出できることを意味する。ここで「特異的」という用語は、検出対象の範囲が、所定の属または科に分類される菌群のターゲットDNAまたはRNAに対して包括性を有し、他の属または科の対応DNAまたはRNAに対して充分な排他性を有することを意味する。ただし、それら包括性及び排他性は、完全な包括性及び排他性を意味するものではなく、本法の有用性を損なわない程度の実質的な包括性及び排他性を意味する。従って、「特異的」な検出には、脂肪酸分解能を持つ所定の属または科の細菌の代表的な菌群と表現形質が非常に類似し、系統分類学的位置が非常に近い属または科の細菌を検出できる場合も含まれる場合がある。例えば、Syntrophobacter属菌群をターゲットにするプライマーセット（ａ）では、属名が異なるが、脂肪酸分解能を持つ二種類のSyntrophobacter属菌群（図２、レーン9、11）及びSmithella propionica（図２、レーン8）を検出できる。従って、汚泥の脂肪酸分解能の変化がなく、このプライマーセットの検出範囲内での優占菌種が変化しても、汚泥の脂肪酸分解能と相関する分解菌としての検出が可能である。Pelotomaculum属菌群をターゲットにするプライマーセット（ｂ）では、Desulfotomaculumクラスターに属する硫酸還元能を持っていないプロピオン酸分解菌群を特異的に検出でき、硫酸還元菌との分別ができる。このプライマーセットを用いた検出により、硫酸還元能を持っていないプロピオン酸分解菌群が優占化していることが判明した場合、反応系におけるプロピオン酸分解能を高めるためには、硫酸塩を添加する手段ではなく、フマル酸等の添加が有効であると考えられる。Desulfotomaculum属菌群をターゲットにするプライマーセット（ｃ）では、Pelotomaculum属菌群と区別して硫酸還元能を持つプロピオン酸分解菌群の検出ができる。この菌群が優占化した反応系では、適当な硫酸塩の添加によって、プロピオン酸分解能を高める制御方法が有効であることが予測できる。Syntrophomonadaceae科菌群をターゲットにするプライマーセット（ｄ）では、従来から報告されている中温の脂肪酸分解細菌Syntrophomonas wolfeii、Syntrophomonassapovorans、Syntrothermorus lipocalidus、及び高温の脂肪酸分解細菌 Thermosyntropha lypolyticaが検出可能であり、さらに、単離できない中温及び高温の高級脂肪酸分解菌群Clone  MPA、  MOL、  MLI及びTPA、TST、TOLも網羅している。この検出法によって、既知の高級脂肪酸分解菌のほぼ全体をモニタリングすることが実現できる。
３．  定量ＰＣＲ
本発明のプライマーは通常のＰＣＲにも適用可能であるが、定量PCR（Quantitative polymerase chain reaction：Q-PCR）に適用するのが好適である。本発明のプライマーを用いて、脂肪酸分解細菌を、様々な微生物を含有する試料から培養操作を行うことなく、特異的に検出することができる。本発明のプライマーを適用して脂肪酸分解細菌の検出を行う試料としては、脂肪酸分解細菌が存在する可能性があれば特に限定されない。脂肪酸分解細菌が存在する可能性がある試料の例として、本発明の好適な実施態様に関連が深いものは、有機物の嫌気性分解が生じていると思われる系に由来する試料であり、例えば、各種廃棄物の嫌気性処理汚泥または排水（メタン発酵微生物系）を採取したもの、そのような汚泥または排水からの集積培養等が挙げられる。
【００２９】
ＰＣＲ増幅の鋳型としては、試料中に含有される微生物の核酸（DNA、またはRT-PCRの場合はRNA）を抽出したものを用いる。核酸の抽出は当業者であれば種々の公知の方法に従って、あるいは市販のキット等を用いて、容易に行うことができる（例えば、Miller,t.L.,Evaluation and Optimization of DNA Extraction and Purification  Proceduresfor Soil and Sediment Samples, Appl. Environ. Microbiol., 65: 4715-4724, 1999；またはQIAGEN 社のRNA protect Bacteria ReagentとRNeasy（登録商標） Mini Kit の操作マニュアル）。微生物DNAの安定性は高く、取り扱い易いため、ルーチン的に採取し、冷凍保存した試料からの抽出が簡単にできる。DNAの抽出方法としては、一般的なフェノール/クロロホルムーエタノール沈殿法も利用できるし、市販のDNA抽出用キットやDNA抽出装置でも迅速且つ簡単に使える。一方、微生物RNAは分解され易いため、新鮮試料（2４時間）からの抽出が望ましいが、市販のRNA安定剤を添加して、冷凍保存した試料からの抽出も可能である。また、RT-PCR法によりRNAを増幅でき、RNAの検出感度が高くなることによって、少々分解されたRNA液からターゲット菌の検出も可能になる。従って、試料は採取後、保存及び利用の便宜のために、試料中に含まれる核酸が極度に破損、変性、分解、または消失されない条件下で任意の処理（粉砕、分離、濾過等）をしたものであってもよい。
【００３０】
定量PCRはその産物を迅速に定量できる、PCRの改良型である。これは DNA、cDNA または RNA の増幅が行われる前の総量を間接的に測る方法である。そして通常は目的の遺伝子配列が存在するかどうか、何コピー存在するのかを確かめる目的で利用される。定量PCRの方法として、アガロースゲル電気泳動、SYBRグリーン（二重鎖DNA染色）、蛍光プローブのうちのどれかがよく利用される。後者2つはリアルタイムPCRを使いリアルタイムに分析が可能である。本発明のプライマーはこの3つの方法のいずれにも利用できる。
【００３１】
定量PCRは次のような一般的手順に従って実施することができる。環境試料に由来する核酸試料を鋳型としてプライマーを接触させ、一連のポリメラーゼ連鎖反応条件下で断続的な増幅反応を繰り返す。このときの増幅反応条件は、当該技術分野において技術常識ないし経験則に従って適宜設定するとよい。その結果、使用した３’側プライマーと５’側プライマーとの間の、特定の断片長の核酸領域が特異的に増幅される。増幅された核酸は、例えば、その断片長を電気泳動法によって確認したり、その断片に特異的なプローブ等を用いる等して、それが目的核酸であることを確認できる。リアルタイムPCRはサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用装置で実施され、PCR増幅産物を蛍光により検出する。
増幅される核酸の量は、細菌の遺伝子DNAを増幅する場合、被検試料中の菌数とほぼ相関しているので、その増幅核酸の定量値に基づいて菌数を求めることができる。
【００３２】
定量PCR法のうち、アガロースゲル電気泳動法は、一般的にプローブまたはプライマーの標的配列が存在するか否かを単純にみるために使われる半定量法である。未知の試料と既知の試料を濃度の判明している近いサイズの DNA断片と共に用意する。それぞれの試料の反応を同じ条件で同じ時間だけ（できれば同じプライマーを用い、または少なくとも同じ位のアニーリング温度で）行う。 アガロースゲル電気泳動で PCR産物を分離する。 既知と未知の試料の相対的な量を測る事で未知の試料を定量する。
【００３３】
SYBRグリーン法はSYBRグリーンの利用によりゲル電気泳動法よりも正確で、リアルタイムに結果が出る。DNA結合色素は新たに合成された二重鎖DNA へ結合し、緑の蛍光を増加させる。これを測ることで最初の濃度を計測する。しかしながらSYBRグリーンは目的の配列以外にも結合するため結果が混乱する可能性がある。この方法の手順としては、二重鎖DNA結合蛍光色素を加えてPCRを行い、PCRを行うと同時に蛍光の強さを計測する。このとき、色素は二重鎖DNA と結合した際にのみ蛍光を発する。標準の（蛍光色素を加えない）試料と比較することで二重鎖DNA の濃度が定量される。
【００３４】
蛍光プローブ法は増幅領域両端の2種類のプライマーに加えて、増幅領域内に相補的に結合する蛍光プローブを用いる。 増幅される DNA に特異的なプローブを用いるので、目的の配列のみを定量できる。すなわち前述の方法の様にすべての二重鎖DNA に反応することはない。 通常はプローブはRNA を基にし、蛍光レポーターとその隣りにクエンチャー（励起エネルギー吸収剤）を入れる。クエンチャーの近くのレポーターは蛍光が抑制される。従って蛍光がみられるのはプローブが分解した時のみである。この過程は使用する DNAポリメラーゼの 5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性による。この方法の基本操作としては、プローブを加えて PCR を行う。 反応を開始して DNA が一本鎖化するとプローブがその相補配列（すなわちその鋳型DNA）へ結合する。 ポリメラーゼが働く温度になると、それはプライマーの結合した一本鎖DNAに相補鎖を作る。DNA の合成がプローブの位置に達すると、プローブはエキソヌクレアーゼ活性によって「上書き」される。結果、元あったプローブはバラバラになり個々のヌクレオチドとなる。すると蛍光レポーターはクエンチャーと分離するので、蛍光を発する。 PCR が進むごとに蛍光レポーターはクエンチャーから分離するので、蛍光ははっきりと幾何級数的に増加していく。これにより DNA の最初の量を正確に計測することが可能である。
【００３５】
本発明で使用される検出用プライマーセットの塩基配列及び典型的な定量PCR条件を表1と表2で示す。
【００３６】
【表１】
2008245585.tif 000003
【００３７】
【表２】
2008245585.tif 000004
【００３８】
４．  脂肪酸分解細菌の検出及び挙動解析、並びに嫌気性処理への応用
本発明のプライマーを用いて、各種の脂肪酸分解細菌（プロピオン酸分解菌群及び高級脂肪酸分解菌群）の16SrDNAを定量検出し、各菌群の菌数の変動がモニタリングできる。「菌数」は、PCR法の検出結果を考察する場合には「菌濃度」としても言及される。これらは一般に「菌数」と正の相関関係にあり、特にターゲット16Sr RNAのコピー数/菌体を考慮に入れることで同義に用いられる。さらに、16SrRNAを逆転写PCR法（RT-PCR）法により定量検出し、各菌群の活性も測定できる。
【００３９】
これらの脂肪酸分解細菌の定量検出法を用いて、先ず有機物の嫌気性処理系における脂肪酸分解細菌群の診断を行い、処理系の性能と相関関係があると思われる菌種の生理学的な特徴に対応した制御方法を行い、安定な嫌気性処理が可能になる。本明細書において、脂肪酸分解細菌群の「診断」とは、メタン発酵微生物系における酸生成菌群集の挙動を把握するために必要なデータ収集、解析及び得られたデータに基く判断（推定、予測）までを含む概念であり、具体的には、定量PCRにより所定の脂肪酸分解細菌の16SrRNAに由来する核酸を定量検出し、その菌数（DNA）及び活性(RNA）を定量し、メタン発酵微生物系の脂質及び／または脂肪酸の分解能及び／またはメタン生成能を判断する各ステップの一部または全てを意味する。
【００４０】
また、各種の脂肪酸分解細菌の菌数あるいは活性の変動のモニタリングにより、連続処理系の限界負荷や、原水由来の阻害因子の存在を予測し、適当な対策を取ることにより、バイオガス生成量やpH等の従来の管理パラメターに基くモニタリングの場合より早くメタン発酵系が安定性を失うことを回避できる。
【００４１】
以下、具体的な実施態様を例示して説明する。
【００４２】
第１の実施態様
第１の実施態様は、本発明のプライマーを使用したリアルタイムPCRにより、各種廃棄物の嫌気性処理微生物系における脂肪酸分解細菌群の優占状況を把握することである。
【００４３】
実際に、本発明のプライマーでPCRを行って検出した結果、プロピオン酸分解菌である、Syntrophobacter属菌群が多くのメタン発酵処理系で存在していること；Pelotomaculum属菌群が豆乳の高温メタン発酵処理系及びプロピオン酸分解菌の集積培養系に存在していること；Desulfotomaculum属菌群が硫酸イオンを添加していないメタン発酵処理系内に存在していないことがわかった。また、高級脂肪酸及び脂質分解菌Syntrophomonadacea科菌群が多くのメタン発酵処理系に存在することが確認された。
【００４４】
これらの菌群の挙動と活性をモニタリングすることによって、処理系の脂肪酸分解能を評価することが可能になる。
【００４５】
第２の実施態様
本発明のプライマーを使用したリアルタイムPCRにより、有機性廃棄物の高温メタン発酵連続処理系や回分実験系における脂肪酸分解細菌の挙動解析を行い、菌体のDNAあるいはRNA濃度変化と脂肪酸分解酸生成活性との相関性に関する知見が得られる。先ず、処理系において優占化している脂肪酸分解細菌群の診断を行い、優占化している菌種あるいは不足していると思われる有用な菌種の生理学的な特徴に対応した制御を実施することにより、安定な嫌気性処理が可能になる。菌体DNAまたはRNA濃度の変化と脂肪酸分解や系内の蓄積状況やメタン生成効率とがリンクしている菌群が制御すべき菌群として挙げられ、その生理学的な情報を参考にして安定運転の制御方法を見出すことが考えられる。
【００４６】
例えば、豆乳のような蛋白質が豊富に存在する処理系ではメタン発酵効率が高いが、コーヒー粕やセルロース系廃棄物の系はメタン発酵しにくい。これらの処理系における優占化した脂肪酸分解細菌群の種類、量及び活性の違いを比較することで、メタン発酵効率の向上に有用な脂肪酸分解細菌を見出すことができると思われる。そして、例えば、難分解のコーヒー粕処理系に豆乳処理系と同様の種類と量の脂肪酸分解細菌を補充する、さらにその菌に対する増殖因子を補充する、またはその菌種の阻害因子（高い水素分圧等）を除去する、等の手段によりメタン発酵効率の向上が期待できる。
【００４７】
また、有用な細菌の公知の生理学的な情報と、本発明を適用して新たに得られる知見とを組合わせて、適切な制御方法を考案することができる。例えば、硫酸塩が存在する条件下では、有機物の酸発酵や水素生成酢酸化反応に硫酸塩還元細菌が寄与することが知られている（嫌気性微生物学、第3章  硫酸還元細菌の種類と生態、上木勝司、長井史郎編、養賢堂、p.51-67、1993）。現在報告されている脂肪酸分解細菌群（図１）のうち、プロピオン酸分解菌群として、系統図上で離れたSyntrophobacter属菌群（a）や、Pelotomaculum属菌群(b)及びDesulfotomaculum属菌群(c)が挙げられ、硫酸塩に依存しないプロピオン酸分解能を持つ菌群は菌群（a）と（ｂ）であり、Pelotomaculum属菌群(b)はプロピオン酸だけを資化する生理特性を持ち、それに対してSyntrophobacter属菌群のSmithella propionicaは、プロピオン酸以外に酪酸とクロトン酸も資化でき、メタン生成菌との共生培養系では酪酸によってプロピオン酸からのメタン生成活性も少し促進される特徴を持つことが知られている（Yitai  Liu  et al., Characterization of the anaerobic propionate-degrading syntrophs Smithellapropionica, gen.nov., sp. nov. and Syntrophobacter wolinii, International  Journal of Systematic Bacteriology,1999, vol.49,p.545-556.）。本発明のプライマーを使用した検出により、これらの（a）、(b)、(c)の菌群の分別的な検出が初めて可能となった。これらの菌群の生理特性に基き、そのプロピオン酸分解活性を向上するような制御方法が有効であると思われる。例えば、本発明のプライマーを用いた定量検出により、硫酸塩含量が少ない廃棄物処理系では、硫酸還元代謝経路を利用したプロピオン酸分解細菌群Desulfotomaculum属菌群が存在していないことがわかった。これらの硫酸塩還元細菌を補充したり、系内に一定濃度まで増殖させるまたは維持することにより、難分解性のプロピオン酸の分解と水素分圧の低減を促進することによって、メタン発酵全体プロセスの性能の高効率化が可能になる。さらに、例えば、本発明のプライマーを用いたリアルタイムPCRで硫酸還元菌の濃度及び／又は硫酸還元活性をモニターし、その濃度及び／又は活性に応じて、フマル酸を添加することによって、硫酸還元菌濃度が所定の範囲内に保持されるように運転条件を制御することによって、プロピオン酸の分解反応を促進できる。さらに、反応槽内気相の水素濃度及び／又は汚泥中の酢酸濃度をモニターし、その値に応じて硫酸塩を所定濃度になるように添加して、硫酸還元菌の水素資化性反応を促進させることにより、反応槽内の水素分圧を低減させることができ、その結果メタン生成細菌の増殖及び／またはメタン生成活性を促進し、安定な嫌気性処理を維持することができる。
【００４８】
また、メタン発酵の最終ステップである水素と酢酸からのメタン生成の効率に対する影響を、連続処理や回分実験の条件変動に伴う脂肪酸分解酸生成細菌の菌数または活性変動から推定することができ、得られた情報に基き、適切な対策を取ることにより、メタン発酵系内の酸生成活性とメタン生成活性のバランスを安定維持することが可能となる。
【００４９】
例えば、高級脂肪酸分解菌群の濃度または活性が急減した場合、系内の高級脂肪酸、特にオレイン酸やリノール酸のような不飽和高級脂肪酸の蓄積によって、メタン生成菌にダメージを与える恐れがある。このような場合、本発明者らは、メタン生成菌を含む培養液や汚泥の添加によってメタン生成菌の量を増加させる手段によって、系内の水素生産性酢酸生成細菌群と酢酸資化性メタン生成古細菌、水素資化性メタン生成古細菌の割合を一定にする方法、また、カルシウムのような薬剤を添加して、高級脂肪酸の阻害を防ぐ対策をすることによって、メタン発酵処理プロセスの安定性を保持する方法を、特開2002‐68454で記載した。しかし、これまでは水素生産性酢酸生成細菌群の菌種を特定できなかったため、真正細菌全体の網羅的な検出法でしか酸生成細菌群を反映できなかった。本発明により、脂肪酸分解細菌である水素生産性酢酸生成細菌の種類を特異的にモニタリングし、その菌の生理特性に応じたより適切な処理が可能となる。
【００５０】
例えば、高級脂肪酸分解菌であるSyntrophomonadaceae科菌群(d)は、メタン生成菌との共生環境で水素と酢酸を生成する酸生成菌であるといわれているが、この菌群は単離培養が困難であるため、高温メタン発酵系における生理特性に関する知見はほとんどない。中温の共生系でSyntrophomonas属菌群の生理特性を調べた報告（Williamh. Lorowitz et al., Syntrophomonas wolfei subsp. saponavidasubsp.nov., a Long-Chain Fatty-Acid-Degrading, Anaerobic, Syntrophic Bacterium; Syntrophomonas wolfei subsp. Wolfei subsp. Nov.; and Emended Descriptions of the Genus and Species, International Journal of Systematic Bacteriology, 1989, Vol 39, No.2,p. 122-126.  及び  Yuji Sekiguchi et al., Syntrophothermus lipocalidus gen. Nov., sp. nov., a novel Thermophilic, syntrophic, fatty-acid-oxidizing anaerobic which utilizes isobutyrate, International Journal of Systematic Bacteriology, 2000, Vol 50, p.771-779.）があり、資化する脂肪酸の種類によってプロピオン酸の生成があるが、プロピオン酸分解能を持っていない。本発明により、高温メタン発酵系におけるSyntrophomonadaceae科菌群(d)について、メタンガス生成活性が減少する前に菌濃度の減少またはpHの上昇によって菌濃度が増加するという新たな知見が得られた。この知見に基き、メタン発酵の安定制御につながる方策を見出すことができると思われる。
【００５１】
また、高分子有機物（セルロース、糖質、蛋白質、脂質等）の分解代謝経路では、窒素以外の全ての炭素組成が炭素数10以下の低級脂肪酸を経由して酢酸を生産することがわかっている。従って、有機物の中間代謝物を分解する第二分解者としての脂肪酸分解菌群（水素生産性酢酸生成細菌群）の濃度と活性を制御することが、メタン生成反応の基質（酢酸、水素）濃度を制御することにつながり、メタン発酵系内の酸生成活性とメタン生成活性のバランスを安定維持するために重要であると考えられる。これまで、本発明者らは、高分子有機物の第一分解者としてのセルロースや糖質分解水素生産性酢酸生成細菌群（特開2004-261125）、蛋白質分解水素生産性酢酸生成細菌群（特開2005-253429）の定量検出方法を開発してきた。さらに、本発明によって、水素生産性酢酸生成細菌群としての高級脂肪酸分解菌とプロピオン酸分解菌群の分別的なモニタリングを実現できるようになった。さらに特開2006‐325581で記載した酢酸資化性メタン生成古細菌、水素資化性メタン生成古細菌の定量検出方法と併用して、より正確にこれらの菌群の比率が把握でき、その制御方法の開発に大きく寄与すると思われる。
【００５２】
第３の実施態様
本発明のプライマーを用いてリアルタイムPCRを実施することにより、環境の変動によって、菌体濃度変動が速いまたは激しい菌群の動きをモニタリングして、メタン発酵効率が低減する前に予測することができる。一方、菌体濃度変動が小さいまたは少ない菌群に対しては、そのRNAの定量検出及び監視をすることによって、菌体当りの活性から脂肪酸分解能または蓄積可能性を評価することが望ましい。また、同じ機能を持つ２種類の菌群が共存している微生物系において、それぞれの菌濃度変動と酸生成活性の変動との相関性からその菌の酸生成活性に対する寄与度を推定できる。
【００５３】
微生物の菌体内には一定量のDNAを含むため、DNA濃度は菌体濃度と比例関係があり、DNA濃度が菌体濃度を反映でき、汚泥の微生物濃度を評価する指標として利用できる。メタン発酵汚泥のメタン生成能を評価するための最も直接的な指標は単位時間当たりのメタンガスの生成量であり、汚泥中のメタン生成菌体濃度を把握することによって、単位菌体あたりのメタン生成活性の評価が可能になる。または、汚泥の単位時間当たりの酸生成量や有機物分解量のデータを採って、菌体の酸生成活性や有機物加水分解活性の評価も可能になる。
【００５４】
一方、RNAの定量検出の目的は次の通りである。現在、メタンガスの生成量と酢酸を含む揮発性有機酸量を簡単、かつ迅速にオンラインモニタリングすることが可能である。しかし、高分子有機物（セルロース、脂質、糖質、蛋白質等）の分析測定方法は煩雑で、時間が掛かるため、嫌気性処理プロセスの現地でオンラインモニタリングすることが困難である。そこで、有機物の分解反応に関わる各種代謝酵素の蛋白質を合成する際に遺伝子情報を伝えるためのメッセンジャーRNA（ｍRNA）を定量検出し、有機物の分解能を評価することが考えられるが、ｍRNAは寿命が短く、普通は合成後数分以内にヌクレアーゼで分解されてしまう。この特徴があるため、ｍRNAの取り扱いは困難である。これに対して、蛋白質の合成工場であるリボソーム粒子に含まれるRNA（rRNA）は代謝的に安定なRNAである。その発現量の増減は菌体の蛋白質合成活性を反映するものと考えられる。
【００５５】
そこで、本発明では、菌のRNA対DNA濃度比から、菌体の蛋白質合成活性を評価することによって、間接的に菌体の有機物分解活性または酸生成活性を評価する方法を提供する。ここで、蛋白質合成活性は、リボソーム小サブユニットを構成するRNA、つまり16S rRNAの発現量を指標として測定する。有機物分解量や酸生成量、各種ガス生成量及び速度との相関性を検討した上で、微生物菌群の活性及び環境因子に対する適応性を評価することが可能である。
【００５６】
本発明のプライマーを用いたリアルタイムPCRにより、高級脂肪酸分解菌とプロピオン酸分解菌のDNA及びRNAを経時的にモニタリングすることによって、嫌気性微生物菌体当たりの代謝活性（酸生成、メタン生成）をそれぞれ特定の属または種ごとに分別的に評価することができるので、酸生成活性とメタン生成活性の比率の経時的な変動を菌の挙動を指標にしてモニタリングすることが可能になった。これにより、ガス生成が安定した系においても、微生物菌体の濃度及び活性変動から処理負荷、環境阻害因子の存在等運転条件の予測が実現できる。さらに、このような予測に基き、発酵系の酸生成速度とメタン生成速度の相対比率を一定範囲に制御することによって、メタン発酵反応のバランスを崩すことなく、効率良く処理することが期待できる。また、各種菌群のDNA及びRNA濃度と真正細菌とメタン生成菌全体の相対比率の比較によって、酸生成菌群やメタン生成菌群の菌相構成や各種菌群の活性度の評価が実現できる。これらの情報と発酵系の酸生成及びメタン生成能の相関関係を把握することによって、発酵系の制御条件を見出すことが期待できる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】
豆乳の高温メタン発酵処理系における脂肪酸分解菌群の定量検出（図7〜10）
各菌群のリアルタイムPCR法による定量検出には、LightCycler(登録商標）FastStart DNA Master SYBR Green I（Roche社製 No.2239264）DNA増幅キットとLightCycler(登録商標）システム(Roche Diagnostics社製)を用い、それぞれ最適化されたアニーリング温度、伸長反応時間とマグネシウム濃度条件下で行った（表２、上述）。
【００５８】
図7では、豆乳高温メタン発酵連続処理系の運転結果を示した。連続実験に用いた油脂含有排水は、市販の豆乳を希釈し用いた（豆乳:水＝1:3.8で希釈）。連続実験装置は、前段リパーゼ前処理槽（有効容積2.0Ｌ）、後段に完全混合型メタン発酵槽（有効容積24L）からなる高温（55℃）連続処理装置を用いた。
【００５９】
高温メタン発酵槽では、最初の5ヶ月間はHRT18日で運転し、その後、プロピオン酸が蓄積したため、HRT25日で負荷を下げて2ヶ月運転してから、HRT103日〜41日の低負荷条件で半年の運転を維持していた。系内の揮発有機酸は500〜5000mgCOD/Lの範囲での蓄積が見られた。汚泥の総脂質濃度と高級脂肪酸濃度は最初6ヶ月間に測定した結果ほぼ安定して存在していた。
【００６０】
図8では処理系内のプロピオン酸と総脂質及び各検出できた脂肪酸分解細菌の挙動を経時的にモニタリングした結果を示す。系内プロピオン酸の増減と2種類の分解菌Pelot(b)とSYN(a)の挙動変化の相関が認められた。
【００６１】
図9では、各種菌濃度と系内プロピオン酸蓄積濃度の相関関係を解析した結果、Pelot(b)とSYN(a)との負の相関関係が認められ、相関関係が高いのはPelot(ｂ)であったことが示唆された。
【００６２】
図10では、各種菌濃度と系内総脂質蓄積濃度の相関関係を解析した結果、Pelot(ｂ)とSYN(a)との正の相関関係が認められ、相関関係が高いのはSYN(a)であることも認められた。総脂質の存在はプロピオン酸分解菌濃度に影響があることが示唆された。
【実施例２】
【００６３】
コーヒー粕高温メタン発酵処理系における脂肪酸分解細菌の定量検出（図11〜17）
コーヒー粕を原水として、pHを7.0に制御した5Lの酸発酵槽の後段に、55℃に保たれ有効容積10Lのメタン発酵槽からなる2相式の高温メタン発酵連続処理実験を行った。
【００６４】
メタン発酵槽のHRTを67日から33日に短縮してメタン発酵連続処理をさせ、毎日pHやガス量等を記録、また汚泥の分析用サンプルを採取し、揮発性有機酸、高級脂肪酸、総脂質等の水質分析と菌相解析に用いた。各種有機物はすべてCOD換算後、水質分析データとしてまとめた。菌相解析では酸発酵槽、メタン発酵槽の汚泥を毎日採取し、抽出処理を経て、定量PCRにかけた。
【００６５】
図11は、メタン発酵槽のガス、総脂質、プロピオン酸及び高級脂肪酸濃度、脂肪酸分解細菌DNA及びRNA濃度の経時的変化をまとめた結果である。
【００６６】
メタン発酵槽では有機酸消費によるpHの上昇が観察され、これが菌相のバランスを著しく乱していると予想されたため、336日目より、18％塩酸によるpH調節を開始した。そのため336日目以降は酸発酵槽とメタン発酵槽の両方のpHを人為的に制御して運転した。しかしこの後も発酵槽内の環境が回復していないと考えられたことから、原水の投入停止や汚泥の入れ替えを行った。434日目にはメタン発酵槽の汚泥を5L引き抜き、他系列のメタン発酵槽である余剰汚泥を同量投入、通常運転を再開した。
【００６７】
SYM(d)ではDNA量、RNA量がほぼ一致して動き、脂質の蓄積量は菌の減少によって増加していることから、SYM(d)菌群が脂質をある程度の濃度まで分解していると考えられ、脂質は菌数の減少前と比べて約1.8倍のレベルまで蓄積した。このことから、SYM(d)のモニタリングは脂質の分解活性の推定に有効であることが示された。
【００６８】
SYN(a)では、DNA量とRNA量で一部リンクがしない部分があるが、発酵基質であるプロピオン酸の蓄積量と菌数に相関が見られ、プロピオン酸の分解にSYN(a)が関わっていることが分かる。
【００６９】
図12は、SYN(a)のRNA/DNA濃度比と系内の総脂質と脂肪酸蓄積量を比較した結果を示す。系内の蓄積したプロピオン酸を分解する反応が進むときに高級脂肪酸の蓄積濃度が高くなる現象が見られた。また、SYN(a)のRNA/DNA濃度比が高くなる時にプロピオン酸分解反応が進む時間と一致することが認められた。SYN(a)の菌濃度の増加とプロピオン酸分解活性の高まる時期が異なることが示唆された。SYN(a)のこの生理特徴を把握して、そのプロピオン酸分解活性を高く保持する運転条件を見出すことが考えられる。
【００７０】
図13では、SYN(a)の菌濃度と活性と汚泥中の総脂質の相関関係を調べた結果を示す。SYN(a)のDNAとRNA濃度は総脂質濃度と正の相関関係が認められた。この結果は、豆乳処理系で得られた結果と一致した。この結果から、検出されたSYN(a)が総脂質または高級脂肪酸の分解にも係わる可能性が示唆された。
【００７１】
図14では、SYN(a)の菌濃度と活性と汚泥中の高級脂肪酸の相関関係を調べた結果を示す。SYN(a)のDNA濃度が汚泥中の高級脂肪酸濃度が高くなると減少する傾向が認められた。
【００７２】
図15と16では、SYM(d)の菌濃度と活性と汚泥中の総脂質及び脂肪酸（プロピオン酸、高級脂肪酸）の相関関係を調べた結果を示す。どちらも、一定濃度以上蓄積するときにSYM(d)菌の濃度と活性の低減が認められた。これらの知見から、SYM(d)とSYN(a)の総脂質及び脂肪酸分解に係わる寄与度と寄与の特徴に関する情報が得られる。
【００７３】
図17では、検出されたSYN(a)とSYM(d)の菌濃度と活性と汚泥中pHの相関関係を調べた結果を示す。この2種類の菌群濃度ともpH増加との正の相関関係が認められた。脂肪酸分解細菌が高いpH範囲で活性化し、その条件下でメタン生成菌の活性が充分発揮できない場合、系内の脂肪酸が蓄積する原因になると考えられるので、pHを二つの菌群の共通範囲に維持しながら運転を制御する必要があることがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】現在知られている、脂肪酸分解に関わる菌種の系統図と本発明の検出プライマーを示す。
【図２】本発明のプロピオン酸分解菌検出用プライマー（ａ）で検出される脂肪酸分解細菌の種類を示す。
【図３】本発明のプロピオン酸分解菌検出用プライマー（ｂ）で検出される脂肪酸分解細菌の種類を示す。
【図４】本発明のプロピオン酸分解菌検出用プライマー（ｃ）で検出される脂肪酸分解細菌の種類を示す。
【図５】本発明の脂肪酸分解菌検出用プライマー（ｄ）で検出される脂肪酸分解細菌の種類を示す。
【図６】文献報告プライマーの特異性を検討した結果を示す。
【図７】豆乳高温メタン発酵連続処理系の運転結果を示す。
【図８】豆乳高温メタン発酵連続処理系内のプロピオン酸と総脂質の濃度及び検出できたそれぞれの脂肪酸分解細菌の挙動を経時的にモニタリングした結果を示す。
【図９】各種菌濃度と系内プロピオン酸濃度の相関関係を解析した結果を示す。
【図１０】各種菌濃度と系内総脂質濃度の相関関係を解析した結果を示す。
【図１１】メタン発酵槽のガス、総脂質、プロピオン酸及び高級脂肪酸濃度、脂肪酸分解細菌DNA及びRNA濃度の経時的変化をまとめた結果を示す。
【図１２】SYN(a)のRNA/DNA濃度比と系内の総脂質と脂肪酸蓄積量を比較した結果を示す。
【図１３】SYN(a)の菌濃度と活性と汚泥中の総脂質の相関関係を調べた結果を示す。
【図１４】SYN(a)の菌濃度と活性と汚泥中の高級脂肪酸の相関関係を調べた結果を示す。
【図１５】SYM(d)の菌濃度と活性と汚泥中の総脂質濃度の相関関係を調べた結果を示す。
【図１６】SYM(d)の菌濃度と活性と汚泥中の脂肪酸濃度の相関関係を調べた結果を示す。
【図１７】SYN(a)とSYM(d)の菌濃度と活性と汚泥中pHの相関関係を調べた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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