(57)【要約】【課題】微生物の動態とその役割に着目し、水溶性切削油の腐敗の要因となる微生物を特定し、かかる微生物の検出を通して高感度かつ迅速に水溶性切削油の腐敗を判定できる技術の確立、および、有機塩素化合物を分解する微生物に代表される嫌気性微生物の生育環境の形成に関連する微生物を特定し、かかる微生物の検出を通して土壌又は地下水の浄化能力を判定できる技術の確立。【解決手段】特定の硫酸還元菌の検出を指標として水溶性切削油の腐敗を判定する、水溶性切削油の腐敗判定方法、及び前記特定の硫酸還元菌の検出を指標として嫌気的生物分解による前記土壌又は地下水の浄化能力を判定する土壌又は地下水の浄化能力判定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性切削油中のDesulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を指標として水溶性切削油の腐敗を判定する、水溶性切削油の腐敗判定方法。
【請求項２】
配列認識番号１に示す塩基配列、配列認識番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて前記硫酸還元菌を検出する請求項１に記載の水溶性切削油の腐敗判定方法。
【請求項３】
水溶性切削油中のDesulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を行う検出手段と、
前記検出手段による検出結果に基づいて水溶性切削油を清浄化する清浄化手段とを有する水溶性切削油の管理システム。
【請求項４】
土壌又は地下水中の、Desulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を指標として、嫌気的生物分解による前記土壌又は地下水の浄化能力を判定する、土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【請求項５】
配列認識番号１に示す塩基配列、又は配列認識番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記硫酸還元菌を検出する請求項４に記載の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【請求項６】
乳酸菌の検出を指標とする、請求項４又は５に記載の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【請求項７】
配列認識番号５に示す塩基配列、又は配列認識番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記乳酸菌を検出する請求項６に記載の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【請求項８】
Dehalococcoides属細菌の検出を指標とする、請求項４〜７のいずれか一項に記載の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【請求項９】
配列認識番号３に示す塩基配列、又は配列認識番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記Dehalococcoides属細菌を検出する請求項８に記載の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸還元菌の検出を利用した水溶性切削油の腐敗判定方法及び土壌又は地下水の浄化能力判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
旋盤やドリル等の工作機械を用いて金属やセラミックス等を研削する切削加工に際して、潤滑、冷却、溶着防止、防錆効果を目的として、切削油が使用される。近年、加工時の冷却効果が高く、発火の恐れがない水溶性の切削油の使用量が増加している。しかしながら、水溶性切削油は腐敗しやすいため、同じ切削油を長期に亘って継続使用すると、加工性能の低下及び悪臭の発生等の不具合が発生するため定期的な交換が必要となる。
【０００３】
そこで、かかる使用済みの水溶性切削油の処理方法について種々の報告されている。例えば、使用済みの水溶性切削油を酸化チタン等の光触媒と接触させて、一般微生物や嫌気性微生物等の微生物を殺菌する技術が報告されている（特許文献１を参照）。かかる技術は、悪臭原因物質の発生を促進する硫酸還元菌に対して優れた殺菌効果を発揮すると共に、同時に悪臭の原因となる硫化水素を酸化することで切削油の腐敗を防止するものである。また、多孔質セラミックと、嫌気性微生物と好気性微生物とを共生させた有用微生物群との組み合わせで、有用微生物群から作り出される抗酸化物質の作用によって水溶性切削油の腐敗を防止する技術も報告されている（非特許文献１を参照）。かかる技術は、抗酸化物質の作用により、硫酸還元菌等の嫌気性微生物が増殖する環境を作らないようにするものであるが、使用環境により効果を発揮できない場合があることが記載されている。つまり、これらの技術では腐敗の要因となる微生物が大量に存在する場合にはその効果を十分に発揮できないことが推定される。したがって、効果的な処理のためには処理能力範囲内で処理を行うことが必要となり、腐敗の程度を的確に把握する技術の確立が求められる。しかしながら、上記の技術はいずれも、微生物増殖の抑制に主眼をおくものであり、腐敗の要因となる微生物の存在や量を知るための技術を何ら提供しないものであった。
【０００４】
微生物の存在や量の検出は、汚染土壌や地下水を、有用微生物群を用いて浄化するバイオレメディエーション技術においても重要であることが報告されている（特許文献２、非特許文献２等を参照）。例えば、特許文献２には、有機塩基化合物汚染を嫌気処理によって修復するために必要な期間を推定する技術が報告され、微生物の定量値と修復期間の相関を求め、修復するために必要な期間を推定する技術が開示されている。また、非特許文献２には、クロロエチレン類等の有機塩素化合物の嫌気的微生物分解技術が開示されている。そして、当該分野では、嫌気条件下でのクロロエチレン類の完全分解を誘導するため、適切な電子供与体、栄養分、還元剤、分解微生物を供給する研究がなされていること、微生物の脱ハロゲン化は水素を電子供与体として用いることから、水素の生産する微生物、水素を利用する他の微生物の競争等がクロロエチレン類の分解に影響することも開示されている。
【０００５】
また、微生物による汚染土壌や地下水浄化は、単一の微生物にのみ依存する場合は稀で、多種多様の微生物が共存する微生物集団により担われていることが知られている。例えば、ジクロロエチレンや塩化ビニルを分解する微生物群には、乳酸菌等の多種多様の微生物が共存することが報告されている（非特許文献３）。また、ダイオキシン分解微生物群についても、同様、多種多様の微生物の共存が報告されている（非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、これらの報告は、微生物による汚染土壌や地下水の浄化は、多種多様の微生物が共存する微生物集団により担われていることを明確にするのみであり、かかる多種多様の微生物の役割については何ら開示されるものではなかった。特に、有機塩素化合物の分解能を有する微生物は嫌気的条件下でその生物活性を発揮することがよく知られていたが、かかる嫌気的環境の形成と共存微生物との関連性についての何ら情報を与えるものではなった。
【０００７】
そして、微生物の存在や量の検出する方法については、種々な方法が報告されている。例えば、16Ｓリボソーム遺伝子を利用して硫酸還元菌を分類する方法が報告されている（非特許文献５）。また、乳酸菌群の検出ための技術（非特許文献６）や、Dehalococcoides、Desulfitobacterium、Dehalobacter属細菌の定量的PCR解析技術について報告されている（非特許文献７）。しかしながら、これらの技術も、特定微生物の存在や量を検出する方法を提供するのみであり、切削油や、土壌及び地下水中に存在する微生物について、その種類やその役割に関する情報を何ら提供するものではなった。
【０００８】
【特許文献１】特開2006-312219号公報
【特許文献２】特開2005-254084号公報
【非特許文献１】中農製作所、“切削油及び洗浄液の腐敗遅延処理技術”、［online］、環境技術コーディネート事業−事業紹介、 HYPERLINK "http://www.epcc.pref.osaka.jp/reaf/index.php" 大阪府環境農林水産総合研究所、［平成19年４月18日検索］、インターネット〈URL： HYPERLINK "http://www.epcc.pref.osaka.jp/center/etech/etc04/2004-2/tech4.pdf" http://www.epcc.pref.osaka.jp/center/etech/etc04/2004-2/tech4.pdf〉
【非特許文献２】陶山明子、李泰鍋、古川謙著、「クロロエチレン類の嫌気的微生物分解」、土壌環境センター技術ニュース、「バイオレメディエーション特集」、寄稿１、2003年
【非特許文献３】水本正浩著、「塩化エチレンの嫌気分解に関する研究開発」、独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構（NEDO）委託、「生分解・処理メカニズムの解析と制御技術の開発」事業、平成17年度成果報告会、講演要旨集
【非特許文献４】Yoshida N., Takahashi N., Hiraishi A.,著、“Phylogenetic characterization of a polychlorinated-dioxin-dechlorinating microbial community by use of microcosm studies.”、Applied and Environmental Microbiology.、2005年８月、第71巻、第８号、第4325〜4334頁
【非特許文献５】Daly K., Sharp RJ., McCarthy AJ.著、“Development of oligonucleotide probes and PCR primers for detecting phylogenetic subgroups of sulfate-reducing bacteria.”、Microbiology. 2000年7月、第146巻、第1693〜1705頁
【非特許文献６】Walter J., Hertel C., Tannock GW., Lis CM., Munro K., Hammes WP.著、“Detection of Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, and Weissella Species in Human Feces by Using Group-Specific PCR Primers and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis”、Applied and Environmental Microbiology. 2001年６月、第67巻、第６巻、第2578〜2585頁
【非特許文献７】Smits TH., Devenoges C., Szynalski K., Maillard J., Holliger C.著、“Development of a real-time PCR method for quantification of the three genera Dehalobacter, Dehalococcoides, and Desulfitobacterium in microbial communities.”、Journal of Microbiological Methods、2004年６月、第57巻、第３号、第369〜378頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明は、上記実情を鑑みて、微生物の動態とその役割に着目し、水溶性切削油の腐敗の要因となる微生物を特定し、かかる微生物の検出を通して高感度かつ迅速に水溶性切削油の腐敗を判定できる技術の確立を目的とする。さらに、同様にして、有機塩素化合物を分解する微生物に代表される嫌気性微生物の生育環境の形成に関連する微生物を特定し、かかる微生物の検出を通して土壌又は地下水の浄化能力を判定できる技術の確立を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解消すべく、鋭意研究を行ったところ、切削油の腐敗に特定の硫酸還元菌が関与していることを見出した。また、さらに、かかる特定の硫酸還元菌が有機塩素化合物を分解する微生物に代表される嫌気性微生物の生育環境の形成に重要な役割を果たしていることを見出すに至り、これらの知見をもとに本発明を完成した。
【００１１】
上記目的を達成するため、本発明は以下の［１］〜［３］を提供する。
［１］水溶性切削油中のDesulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を指標として水溶性切削油の腐敗を判定する、水溶性切削油の腐敗判定方法。
［２］配列認識番号１に示す塩基配列、配列認識番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて前記硫酸還元菌を検出する上記［１］の水溶性切削油の腐敗判定方法。
［３］水溶性切削油中のDesulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を行う検出手段と、
前記検出手段による検出結果に基づいて、水溶性切削油を清浄化する清浄化手段を有する水溶性切削油の管理システム。
【００１２】
上記［１］〜［３］の構成によれば、特定の硫酸還元菌の検出を通して、高感度かつ迅速に水溶性切削油の腐敗を判定できる。そして、切削油の腐敗が進行する前に、切削油の腐敗を検知できることから、切削油の腐敗に起因する不具合を回避することができる。具体的には、切削油の腐敗による工作機械の加工性能の低下及び金属腐食を抑制することができ、工作機械の寿命や生産性、及び加工品質を向上させることができる。また、悪臭の発生を抑制でき、快適な作業環境を形成することができる。これにより、作業効率の向上を図ることができる、また、腐敗が進行する前に腐敗を検出することができることから、殺菌等により切削油を容易に処理することができ、切削油の交換に要する費用及び時間、交換した廃液の焼却処理費等のコスト低減することにもつながる。
【００１３】
さらに、上記目的を達成するため、本発明は以下の［１］〜［３］を提供する。
［４］土壌又は地下水中の、Desulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicusのうち少なくともいずれか１種の硫酸還元菌の検出を指標として、嫌気的生物分解による前記土壌又は地下水の浄化能力を判定する、土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
［５］配列認識番号１に示す塩基配列、又は配列認識番号２に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記硫酸還元菌を検出する上記［４］の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
［６］乳酸菌の検出を指標とする、上記［４］又は［５］の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
［７］配列認識番号５に示す塩基配列、又は配列認識番号６に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記乳酸菌を検出する上記［６］の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
［８］Dehalococcoides属細菌の検出を指標とする、上記［４］〜［７］のいずれかの土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
［９］配列認識番号３に示す塩基配列、又は配列認識番号４に示す塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、若しくは前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、前記Dehalococcoides属細菌を検出する上記［８］の土壌又は地下水の浄化能力判定方法。
【００１４】
上記［４］〜［９］の構成によれば、特定の硫酸還元菌の検出を通して、高感度かつ迅速に、有機塩素化合物の分解に関与する還元的脱ハロゲン化能を有する微生物等の嫌気性微生物の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成されているか否かを判定することができる。これにより、浄化対象となる汚染土壌及び地下水が有する浄化能力を判定することができる。そして、かかる判定結果に基づき、高効率的な汚染浄化系の構築、ひいては処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
特に上記［６］〜[９]の構成によれば、上記硫酸還元菌に加え、Dehalococcoides属、乳酸菌を検出することより、より正確に浄化対象となる汚染土壌及び地下水が有する浄化能力を判定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施の形態により限定的に解釈されるものではない。
【００１６】
［水溶性切削油の腐敗判定方法］
本発明の水溶性切削油の腐敗判定方法、Microbiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁における分類上、硫酸還元菌第６群に分類される細菌を検出することにより行われる。本発明の方法により、切削油の腐敗が進行する前に、切削油の腐敗を検知できることから、切削油の腐敗に起因する不具合を回避することができる。具体的には、切削油の腐敗による工作機械の加工性能の低下及び金属腐食を抑制することができ、工作機械の寿命や生産性、及び加工品質を向上させることができる。また、悪臭の発生を抑制でき、快適な作業環境を形成することができる。これにより、作業効率の向上を図ることができる、また、腐敗が進行する前に腐敗を検出することができることから、殺菌等により切削油を容易に処理することができ、切削油の交換に要する費用及び時間、交換した廃液の焼却処理費等のコスト低減することにもつながる。
【００１７】
ここで、検出の対象となるのは、例えば、上記Microbiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁における分類で、硫酸還元菌第６群に分類される微生物である。具体的には、Desulfovibrio bastinii、Desulfovibrio salexigens、Desulfovibrio caledoniensis、Desulfovibrio halophilus、Desulfovibrio gracilis、Desulfovibrio longus、Desulfovibrio gabonensis、Desulfovibrio gigas、Desulfovibrio africanus、Desulfovibrio termitidis、Desulfovibrio longreachensis、Desulfovibrio vulgaris、Desulfovibrio desulfuricans、Desulfovibrio fairfieldensis、Desulfomicrobium baculatum、Desulfomicrobium escambiense、及びDesulfovibrio acrylicus等が含まれる。
【００１８】
本発明の水溶性切削油の腐敗を検出する方法は、上記硫酸還元菌第６群に属する細菌を検出するものである。かかる上記硫酸還元菌第６群に属する細菌の検出は公知の方法によって行うことができるが、好ましくは、上記硫酸還元菌第６群に属する細菌が有する特徴的な配列を指標とした遺伝子解析に基づき検出する。
【００１９】
したがって、検出対象試料となる水溶性切削油は、直接、本発明の検出方法に適用してもよく、また、標的核酸を顕在化せしめることを目的として、必要に応じて公知の核酸抽出、濃縮、精製等の処理を行った後に適用してもよい。ここで、環境試料から調製される核酸としては、例えば、ゲノムDNA、total RNA、mRNA及びcDNAが挙げられる。核酸の抽出、精製は、任意の方法で行うことができる。例えば、水溶性切削油から微生物を分離し、次に核酸を抽出することによって行うことができ、必要に応じて精製を行ってもよい。核酸の抽出方法としては、SDS等の界面活性剤処理、リゾチーム及びプロテインナーゼ等の酵素処理、熱処理、超音波処理、カオトロピック塩等、或いはこれらの組み合わせにより細胞等を破壊し、フェノール／クロロホルム等の常法に基づいて核酸を抽出することにより行うことができる。
【００２０】
そして、上記硫酸還元菌第６群に属する細菌が有する特徴的な配列を指標として、硫酸還元菌第６群に属する細菌を検出する場合には、硫酸還元菌第６群に属する細菌が有する特徴的な塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを利用することにより行うことができる。つまり、被検試料と当該オリゴヌクレオチドを接触させることにより、試料中に含まれる硫酸還元菌第６群に属する細菌に由来する核酸分子を検出することにより行なうことができる。例えば、前記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイゼーション法により行なうことができる。また、前記オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してPCR等の核酸増幅法により行なうことができる。
【００２１】
ここで、相補的とは、検出対象となる微生物の遺伝子と当該オリゴヌクレオチドとが、塩基対合則に従って特異的に結合し安定な二重鎖構造を形成できることを意味する。必要とされる相補性の程度は、好ましくは100％であるが、完全な相補性のみならず、検出対象となる本発明の遺伝子と当該オリゴヌクレオチドとが互いに安定な二重鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。具体的には、相補性領域の長さや、塩基対ミスマッチの分布等により変動するが、一般的には、70％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上である。
【００２２】
オリゴヌクレオチドの鎖長は、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定されるが、好ましくは、20〜50塩基長である。
【００２３】
当該オリゴヌクレオチドは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等により調製され、必要に応じてHPLC等の手段により精製される。化学合成に際しては、市販の自動合成装置を利用することも可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計され、標的核酸の配列を予め調査し決定される。標的核酸の塩基配列の調査には、GeneBank、EBI等のデータベースを好適に利用できる。また、既に標的となる核酸が取得されている場合には、微生物に特徴的な塩基配列を有する限り制限酵素断片等も利用可能である。
【００２４】
前記オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、PNAの制限はないが、好ましくはDNAである。また、前記オリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖の制限はないが、好ましくは一本鎖である。そして、前記オリゴヌクレオチドには、標的核酸とハイブリダイズする領域に加えて、他の化学構造が付加されていてもよい。例えば、検出のための標識を導入した形態や、適当な固相担体上に固定化したマイクロアレイを作製して検出を行う等の場合には、固相化のための官能基が導入された形態等が例示される。
【００２５】
本発明の方法において、使用に適したオリゴヌクレオチドとしては例示的に以下の配列が示される。
【００２６】
硫酸還元菌第６群検出用
5´−GRGYCYGCGTYYCATTAGC−3´  （配列認識番号１）
5´−SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC−3´  （配列認識番号２）
【００２７】
当該オリゴヌクレオチドは、検出感度を高めるべく、必要に応じて検出可能な標識物を導入することができる。この場合、検出可能な標識物導入される位置は、ハイブリダイゼーション効率、及びそれに続く伸長反応の効率に大きく影響を与えない限り特に制限はないが、プローブの塩基配列や長さ等を考慮し適宜決定する。例えば、３'末端や５'末端の水酸基部分、塩基部分、リン酸ジエステル部分などを挙げることができ、特には５´末端の水素基部分が好ましい。
【００２８】
このような標識物質は公知であるので当業者は適宜選択して使用でき、反応において必要とされる安定性と機能性を保持できる限りは、公知のいずれをも使用できる。したがって、直接標識、間接標識の別を問わない。放射性同位体元素、酵素、蛍光色素、化学発光物質等が例示される。具体的には、適切な放射性同位元素標識として、32Ｐ、35Ｓ、131Ｉ、45Ｃａ、3Ｈ等が例示される。酵素標識として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが例示される。また、蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRICA）、テキサスレッド、シアニン３（Cy3）およびシアニン５（Cy5）等のシアニン色素等が例示される。化学発光物質としては、アクリジウムエステル等が例示される。更に、ビオチン、ジオキシゲニン等のハプテンをも好適に利用できる。例えば、ジゴキシゲニンにより標識し、標識抗ジゴキシゲニン抗体により可視化する、ビオチンにより標識化し、標識抗ビオチン抗体によって、若しくは標識ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて可視化することができる。また、二次プローブと特異的に結合する核酸や核酸結合タンパク質等をも利用した標識も例示される。しかしながら、これらに限定するものではなく公知の標識技術を利用できる。
【００２９】
標識物質の導入は既知の手法により行うことができる。例えば、５´末端を放射線同位体元素32Ｐにて標識する場合には、プローブと32Ｐ標識ヌクレオチド（γ-32Ｐ-ATP）を含む反応液に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加することにより行うことができる。
標識される。
【００３０】
また、当該オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入されたものであってもよい。固相担体上での標的核酸の捕捉を観察することで迅速な検出が可能となり、固相担体に捕捉された標的核酸のみを分離することで容易にクローニングができる。固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入される位置は、ハイブリダイゼーション効率、及びそれに続く伸長反応の効率に大きく影響を与えない限り特に制限はないが、プローブの塩基配列や長さ等を考慮し適宜決定する。例えば、３'末端や５'末端の水酸基部分、塩基部分、リン酸ジエステル部分などを挙げることができ、特には５´末端の水素基部分が好ましい。５´末端付近の水素基部分、塩基部分或いはリン酸ジエステル部分の活性基が好適である。
【００３１】
固相担体としては、通常のハイブリダイゼーション法や増幅反応に用いられる反応液に不溶性の担体を用いることができる。例えば、ガラス、シリカゲル、ベンナイト等の無機物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成高分子物質、アガロース、デキストラン、ポリサッカライド等の不溶性多糖が好ましく使用できる。また、これらの支持体は、球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレート、メンブラン等の形態で使用することができる。
【００３２】
固相担体への固定化は、公知の方法に従って行うことができ、プローブの種類、固相担体、固相担体表面の官能基等の種類に応じて最適な方法を選択すればよく、物理的な結合、化学的な結合いずれによるものでもよい。具体的には、DNAの荷電を利用してポリリシン、ポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で表面処理された固相担体に、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、SH基の反応活性基を予め導入されたDNAとを共有結合させる方法等を好ましく例示することができる。抗原（ハプテン）−抗体、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン、抗原−抗体、リガンド−レセプター、相互にハイブリダイズし得る核酸等を利用して固定化することもできる。さらに、プローブを標識し得る物質と、これに結合可能な物質を固定化された固相担体を利用して固定化することもできる。例えば、ビオチンで標識されたプローブとストレプトアビジンを固定化された固相担体とを利用することで、ビオチン−ストレプトアビジンの結合を介して、プローブを固相担体に固定化することができる。固定化に際しては、非特異的結合の抑制のため、必要に応じて紫外線照射によるクロスリンク形成、ブロッキング、洗浄等の処理を行うことができる。
【００３３】
ハイブリダイゼーションによって検出する場合、例えば、試料と当該オリゴヌクレオチドプローブとをストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの有無、及び強度により、対象試料中の微生物の存在の有無を検出し、或いは存在量を定量的に検出する。ハイブリダイゼーションそれ自体は公知の方法により行うことができる。例えば、サザン、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、及びプラークハイブリダイゼーション等が挙げられる。
【００３４】
ここで、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、洗浄の条件は、ハイブリダイズされる配列の長さ、GCヌクレオチド配列の含有量に応じて経験的に適宜選択して設定されるものであり、プローブと相同性の高い塩基配列とが、特異的にハイブリダイズし、十分な検出感度、特異性を示す条件を適宜選択することができる。当該分野において、そのようなハイブリダイゼーション条件のバリエーションのための十分に確立された公式は周知であり、例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning： A Laboratory Manual"， 第２版、p.9.47-9.51， Cold Spring Harbor, New York： Cold Spring Harbor Laboratory、1989年、等を参照することができる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションの検出の方法は特に制限されない。例えば、標識プローブとハイブリダイゼーション後、標識を検出することにより行うことができる。また、プローブを固定化する場合には、試料核酸を予め標識物質で標識しておき、ハイブリダイゼーションに続いて担体を洗浄後、標識を検出することによって行うことができる。試料核酸の標識化検出は使用する標識物に応じて一般的手法を用いればよい。例えば、標識物が放射線同位体である場合には、放射活性をシンチレーションカウンターで測定、Ｘ線フィルムを感光させて放射活性を可視化することにより行うことができる。また、標識物が蛍光物質であれば、蛍光強度を蛍光光度計や共焦点顕微鏡等で測定することにより行うことができる。また、標識物が酵素である場合には、酵素反応により発色する酵素基質を用い、その発色を検出すればよい。直接検出可能な標識物以外の標識物を導入した場合には、その標識物を間接的に測定するための試薬が用いられる。例えば標識物がビオチンである場合には、例えば蛍光標識アビジン又はストレプトアビジンとの反応生成物等を、標識物がハプテンである場合には、例えば、ハプテンと特異的に結合する蛍光標識抗体との反応生成物の測定により、間接的に測定することができる。また、ゲル電気泳動による分離と組み合わせてもよい。
【００３６】
核酸増幅法によって検出する場合には、例えば、対象試料とオリゴヌクレオチドプライマーを接触させ、核酸増幅反応を行い、特異的な増幅産物の有無、及び強度により、対象試料中の微生物の存在の有無を検出し、或いは存在量を定量的に検出する。核酸増幅法は、それ自体は公知の方法により行うことができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）等が挙げられる。PCR法によって増幅反応を行なう場合、その温度設定、時間、サイクル数は、対象となる鋳型核酸の量、プライマー対によって適宜選択される。また、PCR反応におけるアニーリング条件は、上記ストリンジェントな条件に適合されることが好ましい。
【００３７】
特異的な増幅産物の検出は、増幅産物の検出方法に従って行うことができる。例えば、増幅産物をアガロースゲル電気泳動に付して目的断片が増幅されているか確認することにより検出してもよい。また、その他の電気泳動法やクロマトグラフィー法をも利用することができる。オリゴヌクレオチドとして標識プライマーを用いた場合には、標識を検出することによっても行うことができ、また、核酸増幅の際に、標識ヌクレオチドを基質として取り込ませ、増幅後に標識を検出することによっても行うことができる。経時的に蛍光強度を観察するリアルタイムPCR等によって検出することもでき、例えば、5’末端を蛍光物質で、3’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドを利用することによって行うことができる。
【００３８】
また、硫酸還元菌第６群属する細菌の量を定量的に検出する場合には、コントロールとして、例えば、検出対象となる硫酸還元菌第６群のDNA標準試料を同時に用いることができる。コントロールのDNA試料を用いて得られたハイブリダイゼーション強度又は特異的核酸増幅産物の量等と検出対象試料を用いて得られたハイブリダイゼーション強度又は特異的核酸増幅産物の量等とを比較して、対象中の細菌量を算出することができる。このようにして硫酸還元菌第６群に属する細菌の量を定量的に検出することにより、腐敗の程度の解析が可能となる。
【００３９】
本発明の腐敗判定方法を利用して、水溶性切削油の管理システムを構築することができる。具体的には、切削油中の上記硫酸還元細菌第６群に属する細菌の挙動を検出する検出手段と、かかる検出結果に基づいて、水溶性切削油を清浄化する清浄化手段とを有して構成される。
【００４０】
清浄化手段として、切削油を新鮮な水溶性切削油に交換する手段が例示される。例えば、水溶性切削油中に上記硫酸還元細菌第６群に属する細菌が検出された場合に、切削油の全部又は一部を交換するように制御する手段が挙げられる。この場合、切削油の交換時に、必要に応じて切削油の貯留槽や配管の洗浄をするように制御することもできる。また、清浄化手段は、切削油を濾過や殺菌等により水溶性切削油中に含まれる微生物等の不純物を除去する手段であってもよい。
【００４１】
また、上記検出手段により得られる情報を含めた切削油の管理に関する様々な情報をデータベース化し、かかるデータベースを用いることにより切削油の使用状況に適した切削油の管理システムを構築することもできる。
【００４２】
このように水溶性切削油の管理システムを構築することにより、切削油の腐敗に起因する不具合を的確に回避することができ、更に作業効率を向上させることができる
【００４３】
［土壌又は地下水の浄化能力判定方法］
上記硫酸還元菌第６群に分類される細菌の検出は、バイオレメディエーションによる汚染浄化系においても利用することができる。具体的には、嫌気性微生物の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成されているか否かを、上記硫酸還元菌の第６群に属する細菌を検出することで判断するものである。これは、嫌気的環境の形成において、上記硫酸還元菌の第６群に属する細菌が重要な役割を担っているとの本発明者らの知見に基づくものである。そして、嫌気性微生物の多くは、還元的脱ハロゲン化能を有する等、有機塩素化合物等の難分解性の有害物質等に対して分解活性を有する。したがって、嫌気性微生物の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成されている場合には、嫌気性微生物の有する還元的脱ハロゲン活性等により有機塩素化合物等の難分解性の有害物質の分解が良好に行われることとなる。したがって、かかる判定結果をもって、土壌又は地下水の浄化が良好に行えるかどうかを予め判定することができ、土壌及び地下水のもつ浄化能力、ひいてはバイオレメディエーションの状態を判定することができる。
【００４４】
したがって、本発明の対象となるのは、難分解性の有害物質、特には有機塩素化合物により汚染された土壌、及び地下水であり、好ましくは地下水である。分解の対象となる有機塩素化合物は、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、クロロエチレン等のクロロエチレン類、ダイオキシン類、PCB類等が例示される。特には、Dehalococcoides属細菌によって、好適に脱塩素化されるクロロエチレン類である。
【００４５】
ここで、有機塩素化合物で汚染された土壌又は地下水の浄化能力を判定する場合を例示する。土壌及び地下水中に、硫酸還元菌の第６群に属する細菌の存在が確認された場合には、還元的脱ハロゲン化能を有する微生物の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成され、良好に有機塩素化合物の分解が行えると判断する。一方、検出結果により、硫酸還元菌の第６群に属する細菌の存在が確認できない場合には、還元的脱ハロゲン化能を有する微生物の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成されておらず、有機塩素化合物の分解には適していないと判断する。そして、かかる判定に基づき、嫌気的環境を整える当該硫酸還元菌の第６群に属する細菌を添加、若しくは、所望の栄養剤、例えば嫌気環境を形成するための栄養剤を添加するなどして、浄化環境を整えることができる。
【００４６】
なお、ここで、バイオレメディエーションは、嫌気的プロセスによるものを指し、嫌気的プロセスで処理する限り処理形態についての制限はない。したがって、汚染サイトの掘削をせずに処理を行う原位置バイオレメディエーション法、汚染サイトを掘削して処理を行うオンサイトバイオレメディエーション法を含む、一般的なバイオレメディエーション法に対して適用できる。オンサイトバイオレメディエーション法に基づいて処理を行う場合、密閉型、若しくは半密閉型の反応槽を利用して処理を行うこともできる。
【００４７】
そして、好ましくは、有機塩素化合物の還元的脱ハロゲン化反応を触媒できる微生物、特には、Dehalococcoides属細菌を主体として構成されるバイオレメディエーションに適用することができる。Dehalococcoides属細菌は、クロロエチレン類の還元的脱ハロゲン化反応により、クロロエチレン類の塩素置換基を水素に置換する嫌気性微生物である。Dehalococcoides属細菌としては、Dehalococcoides ethenogenes 195株、Dehalococcoides属CBDB1株等が知られている。
【００４８】
また、上記硫酸還元菌の第６群に属する細菌に加え、Dehalococcoides属、乳酸菌を検出することより、より正確に土壌又は地下水の浄化能力を判定することができる。
【００４９】
したがって、Dehalococcoides属細菌、乳酸菌、硫酸還元菌の第６群に属する細菌の共存が確認された場合には、Dehalococcoides属細菌の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成され、良好に有機塩素化合物の分解が行えると判断する。一方、検出結果により、Dehalococcoides属細菌、乳酸菌、硫酸還元菌の第６群に属する細菌の存在が確認できない、又は、いずれかの存在量が少ない場合には、Dehalococcoides属細菌の生育、及びその生物活性を発現するのに十分な嫌気的環境が形成されておらず、有機塩素化合物の分解には適していないと判断する。そして、かかる判定に基づき、存在が確認されない、もしくはその存在量が少ないDehalococcoides属細菌、乳酸菌、硫酸還元菌の第６群に属する細菌を添加、若しくは、所望の栄養剤、例えば嫌気環境を形成するための栄養剤を添加するなどして浄化環境を整える。
【００５０】
ここで、Dehalococcoides属細菌、及び乳酸菌の検出は、公知の方法によって行うことができるが、好ましくは、上記微生物が有する特徴的な配列を指標とした遺伝子解析に基づいて検出する。その場合には、Dehalococcoides属細菌、及び乳酸菌群が有する特徴的な塩基配列に相補的なオリゴヌクレオチドを利用することにより行うことができる。このようなオリゴヌクレオチドの設計及び調製並びに、これを利用する遺伝子解析方法については上記した通りである。
【００５１】
なお、ここで、Dehalococcoides属細菌、及び乳酸菌群の検出に好適に利用できるオリゴヌクレオチドを以下に例示する。
【００５２】
Dehalococcoides属細菌検出用
5´−AAGGCGGTTTTCTAGGTTGTCAC−3´  （配列認識番号３）
5´−CTTCATGCATGTCAAAT−3´  （配列認識番号４）
【００５３】
乳酸菌群検出用
5´−AGCAGTAGGGAATCTTCCA−3´  （配列認識番号５）
5´−ATTYCACCGCTACACATG−3´  （配列認識番号６）
【００５４】
なお、ここで乳酸菌群とは、乳糖やブドウ糖等の糖を分解して、乳酸等の有機酸を産生する微生物の総称である。例えば、Leuconostoc属、Pediococcus 属、Streptococcus属、Lactobcillus属、Melisscoccus属、Enterococcus属、Lactococcus属、Carnobacterium属、Vagococcus属、Tetragenococcus属、Atopobium属、Weissella属、Lactosphaera属、Oenococcus属、Abiotrophia属、Paralactobacillus属、Granulicatella属、Atopobactor属、Alkalibacterium属、Olsenella属細菌が知られている。
【００５５】
そして、検出結果に基づいて、有機塩素化合物の分解に関与する還元的脱ハロゲン化能を有する微生物等の嫌気性微生物が、その生物活性を最大限に発揮できるよう、浄化現場の環境の調整をすることができる。例えば、検出結果に基づいて栄養源投与量、微生物投与量、温度、ｐＨ等の制御に例示される汚染浄化系の制御を行なうように構成することができ、これにより高効率的な環境汚染浄化系を構築することができ、浄化処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００５６】
したがって、土壌又は地下水中の、硫酸還元菌第６群に属する細菌のうち少なくともいずれか１つの硫酸還元菌を検出する検出手段と、前記検出手段によって検出された検出結果に基づき、前記土壌又は地下水の浄化環境を制御する制御手段とを備える土壌又は地下水の浄化能力監視システムについても本発明の一部を構成することができる。また、乳酸菌群およびDehalococcoides属細菌を検出するべく構成してもよい。
【００５７】
さらに、上記方法を用いて得られる情報を含めた汚染浄化に関する様々な情報をデータベース化し、かかるデータベースを用いることにより汚染現場の状況に適した浄化系を構築することができる。例えば、汚染現場における汚染物質の種類、及び汚染物質量を含めた汚染状況、及び汚染現場の酸化還元電位等の物理学的性質などの情報に基づき、硫酸還元菌第６群に属する細菌、乳酸菌、Dehalococcoides属細菌の最適投入量を設定し、設定された投入量を汚染現場に適用する。これにより、高効率的な環境汚染浄化系を構築することができ、浄化処理時間の短縮化を図ることが可能となる。
【実施例】
【００５８】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定的に解釈されるものではない。
【００５９】
［検討例１］  使用済み水溶性切削油に存在する微生物の探索−１
使用済み水溶性切削油中に存在する微生物の探索を行った。
【００６０】
（方法）
使用済み水溶性切削油中に存在する微生物の探索を行った。本検討例においては、使用済み水溶性切削油として、(鉄製品の切削に６カ月間使用した出光社製ダフニーアルファクール)について検討した。まず、当該使用済み水溶性切削油に含まれる微生物から16Sリボソーム遺伝子を取得し、配列決定を行った。なお、かかる配列情報につき、配列認識番号７として配列表に示す。続いて、得られた16Sリボソーム遺伝子の塩基配列を、既知のデータベースとの比較により解析した。解析は、国立遺伝学研究所の日本DNAデータバンク（DDBJ：http://www.ddbj.nig.ac.jp/）により行った。
【００６１】
（結果）
解析の結果を図１に示す。
かかる解析の結果、当該使用済み水溶性切削油に、硫酸還元菌Desulfovibrio属のKRS1株（配列認識番号８）と相同性が99％と非常に高い微生物が存在することが判明した。
【００６２】
［検討例２］  使用済み水溶性切削油に存在する微生物の探索−２
検討例１の結果をうけ、使用済み水溶性切削油中に存在する硫酸還元菌の探索を行った。
【００６３】
（方法）
検討例１の結果をうけ、使用済み水溶性切削油中に存在する硫酸還元菌の探索を行った。本検討例においては、使用済み水溶性切削油として、(鉄製品、鋳物切削に２〜６カ月間使用した出光社製ダフニーアルファクール等)を水で希釈した水溶性切削油希釈水について検討した。具体的には、Microbiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁に記載のプライマーを公知の合成手段により合成し、PCR法を利用して当該水溶性切削油希釈水に含まれる硫酸還元菌を網羅的に探索した。なお、ここで使用したプライマーにつき、以下に記載する。
【００６４】
第１群検出用
5´−TAGMCYGGGATAACRSYKG−3´  （配列認識番号９）
5´−ATACCCSCWWCWCCTAGCAC−3´  （配列認識番号１０）
第２群検出用
5´−CGCGTAGATAACCTGTCYTCATG−3´  （配列認識番号１１）
5´−GTAGKACGTGTGTAGCCCTGGTC−3´  （配列認識番号１２）
第３群検出用
5´−CTAATRCCGGATRAAGTCAG−3´  （配列認識番号１３）
5´−ATTCTCARGATGTCAAGTCTG−3´  （配列認識番号１４）
第４群検出用
5´−GATAATCTGCCTTCAAGCCTGG−3´  （配列認識番号１５）
5´−CYYYYYGCRRAGTCGSTGCCCT−3´  （配列認識番号１６）
第５群検出用
5´−GATCAGCCACACTGGRACTGACA−3´  （配列認識番号１７）
5´−GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC−3´  （配列認識番号１８）
第６群検出用
5´−GRGYCYGCGTYYCATTAGC−3´  （配列認識番号１）
5´−SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC−3´  （配列認識番号２）
なお、ここで、硫酸還元菌の群は、Microbiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁に記載の硫酸還元菌の分類による。
【００６５】
また、PCRについても、Microbiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁に記載の方法に準じて行った。具体的には、95℃にて１分間の変性工程、1分間のアニーリング工程、72℃にて１分間の伸長工程からなるサイクルを30サイクル繰り返すことにより行った。反応液は100μlのチューブに、2μlの各プライマー（10ｐmol/μl）、2μlのdNTP（各10mM）、85μlの蒸留水、10μlの10×PCR Buffer（HT Biotech）、0.2μlの10％(w/v)BSA、1UのSuperTaq polymerase、100〜150ngの鋳型核酸を含んで調製した。
【００６６】
（結果）
結果を表１に示す。
【表１】
2008289379.tif 000002
【００６７】
以上の結果より、水溶性切削油中にMicrobiology、2000年７月、第146巻、第1693〜1705頁に記載の分類上、硫酸還元菌の第６群に属する細菌が存在することが確認された。かかる微生物は、検討例１で相同性が認められたDesulfovibrio属の近縁種が属することから、水溶性切削油の腐敗の要因が硫酸還元菌の第６群に属する細菌であるとの知見が導かれた。
【００６８】
［実施例１］  水溶性切削油の腐敗の検出（検出感度の検討）
水溶性切削油の腐敗の検出につき、本発明による硫酸還元菌の遺伝子解析と、腐敗臭検知とをその検出感度につき比較検討した。
【００６９】
（方法）
水溶性切削油の腐敗の検出につき、本発明による上記硫酸還元菌の第６群に属する細菌の遺伝子解析と、腐敗臭検知とをその検出感度につき比較検討した。具体的には、硫酸還元菌が存在することが確認された地下水をプラスチックチューブに分取し、各々、最終濃度を10mMのメタノール、１mMのクエン酸、0.1％牛乳となるように調整した有機栄養素分を添加し、キャップで密栓して20℃にて２週間培養したものを使用した。なお、硫酸還元菌の遺伝子解析については、検討例２における硫酸還元菌の第６群の微生物の探索手法に準じて行った。また、腐敗臭の検知は硫化水素臭の検知により行った。
【００７０】
（結果）
結果を表２に示す。
【００７１】
【表２】
2008289379.tif 000003
【００７２】
栄養素分を無添加で培養を行った場合、及びメタノールを添加して培養を行った場合には硫化水素臭を確認することができなかったのに対し、遺伝子解析では硫酸還元菌第６群に属する細菌の検出が確認された。以上の結果より、本発明の硫酸還元菌の遺伝子解析により高感度に不溶性切削油の腐敗を検出できることが判明した。
【００７３】
［検討例３］  酸化還元電位の低下に関連する微生物の検討−１
酸化還元電位の低下に関連する微生物の検討を行った。
【００７４】
（方法）
有機塩素化合物の分解に関与することが知られるDehalococcoides属細菌の増殖及びその生物活性の発現には嫌気的環境が必要であることが知られている。また、Dehalococcoides属細菌の共在菌として乳酸菌群が知られており、Dehalococcoides属細菌が必要とする嫌気的環境の形成過程において重要な役割を果たしている可能性が指摘されている。そこで、Dehalococcoides属細菌、及び乳酸菌群の存在量と、酸化還元電位の関連について、以下の栄養成分を添加して培養することにより検討した。ここで、検討を行った栄養成分は以下の通り。
【００７５】
１．無添加
２．10mMメタノール
３．１mM クエン酸
４．0.01％ 脱脂粉乳
５．10mMメタノール、１mM クエン酸、0.01％ 脱脂粉乳
ここで、添加量は最終濃度を示す。
【００７６】
地下水を15mlのプラスチックチューブに満たし、栄養成分を添加して、キャップで密封した状態で、20℃にて２週間培養した。培養後、Dehalococcoides属細菌、乳酸菌群の存在量、並びに酸化還元電位を測定した。Dehalococcoides属細菌の検出は、Journal of Microbiological Methods、2004年６月、第57巻、第３号、第369〜378頁に記載の方法で行った。乳酸菌の検出は、Applied and Environmental Microbiology. 2001年６月、第67巻、第６巻、第2578〜2585頁に記載の方法により行った。ここで、使用したプライマーを以下に示す。
【００７７】
Dehalococcoides属細菌検出用
5´−AAGGCGGTTTTCTAGGTTGTCAC−3´  （配列認識番号３）
5´−CTTCATGCATGTCAAAT−3´  （配列認識番号４）
乳酸菌群検出用
5´−AGCAGTAGGGAATCTTCCA−3´  （配列認識番号５）
5´−ATTYCACCGCTACACATG−3´  （配列認識番号６）
【００７８】
(結果)
結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2008289379.tif 000004
【００８０】
栄養成分としてクエン酸を単独で添加した場合には、乳酸菌群の増殖は認められなかったが、Dehalococcoides属細菌の増殖が誘導されることが確認された。また、栄養成分として、脱脂粉乳を単独で添加した場合には、十分な乳酸菌群の増殖が確認された。しかしながら、酸化還元電位は、栄養成分としてメタノール、クエン酸及び脱脂粉乳を添加した場合に比べて低下せず、その差は顕著であった。以上の結果から、乳酸菌群以外のDehalococcoides属細菌が必要とする嫌気的環境の形成過程において重要な役割を果たす微生物の存在が示唆された。
【００８１】
そして、メタノール、クエン酸及び脱脂粉乳を添加した場合に、培養物から硫化水素臭が検知されたことから、硫酸還元菌の存在が予想された。
【００８２】
［検討例４］  酸化還元電位の低下に関連する微生物の検討−１
検討例３に続いて、酸化還元電位の低下に関連する微生物の検討を行った。
【００８３】
（方法）
検討例３における検討の結果、メタノール、クエン酸及び脱脂粉乳を添加した場合に、培養物から硫化水素臭が検知されたことから、硫酸還元菌の探索を行った。
【００８４】
具体的には、メタノール、クエン酸及び脱脂粉乳を添加した地下水を15mlのプラスチックチューブに満たし、栄養成分を添加して、キャップで密封した状態で、20℃にて２週間培養した。培養後、硫酸還元菌微生物の網羅的な検出を行った。検出は、検討例２の手法に準じて行った、
【００８５】
また、上記栄養成分を添加しなかった場合と比較した。
【００８６】
（結果）
結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
2008289379.tif 000005
【００８８】
硫酸還元菌第５群、及び第６群に属する細菌の増殖が確認された。以上の結果より、Dehalococcoides属細菌が必要とする嫌気的環境の形成過程において、硫酸還元菌第５群、及び第６群に属する細菌が重要な役割を果たす可能性が示唆された。
【００８９】
［実施例２］  硫酸還元菌と酸化還元電位の低下との関連性
検討例２、３の結果をうけ、硫酸還元菌第５群と第６群の増殖と、酸化還元電位の低下との関連性を確認した。
【００９０】
（方法）
検討例３で検討した各栄養成分を添加した地下水を培養し、硫酸還元菌第５群と第６群の増殖と、酸化還元電位の低下との関連性を確認した。
【００９１】
ここで、検討を行った栄養成分は実施例１の場合と同様であり、同様にして地下水を培養した。培養後、硫酸還元菌第５群及び第６群に属する細菌の検出を行った。検出は、検討例２における硫酸還元菌第５群及び第６群に属する細菌の探索手法に準じて行った。
【００９２】
（結果）
結果を表５に示す。
【００９３】
【表５】
2008289379.tif 000006
【００９４】
以上の結果から、酸化還元電位が低下した場合には、すべて硫酸還元菌第５群に属する細菌が検出された。一方、硫酸還元菌第６群に属する細菌については、検出されない場合があった。以上の結果から、硫酸還元細菌第６群に属する細菌が、Dehalococcoides属細菌が必要とする嫌気的環境の形成に重要な役割を果たすことが判明した。そして、かかる硫酸還元細菌第６群に属する細菌が、土壌及び地下水の浄化、特に分解微生物としてDehalococcoides属細菌を主体とする汚染浄化系において重要な微生物であることが判明した。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】検討例１の相同性解析の結果を示す図
【図１】
2008289379.tif 000007
【配列表】
2008289379000001.app