(57)【要約】【課題】生きたままの細胞を観察するには細胞の大部分を占める水に吸収されることのない軟X線を用いその透過像を１００nｍ程度の高空間分解能で動画として記録し、立体像を構築し、さらには可視域顕微鏡との同時観察を可能とするコンパクトな装置が必要である。【解決手段】短パルス電子線あるいは短パルスレーザーを金属ターゲットに衝撃させることにより発生するX線を多層膜コーティングX線ミラーで反射させることにより水に吸収をほとんど持たない水の窓波長の光としこれを用いて顕微鏡光学系を縦方向の軟X線光軸を持つようにコンパクトに組み上げるとともに生きたままの細胞を観察できるホルダー並びにホルダ内細胞をレーザー光を用いて非接触法により顕微鏡焦点に保持するとともに、これを用いて細胞を回転し、多方向より細胞透視像を取得し、立体像を構築する装置を構築した。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一乃至は複合細胞（生体組織）或いは生体中の微細粒子を30μ秒以下のX線（波長２.２ｎｍ〜４.５ｎｍ領域の水に対する吸収が極めて少ない波長領域の光）を顕微鏡光学系を用いて上述生物細胞などに照射することによりその透過像を瞬時にかつ1秒間に20画面以上の数を捉えることにより生きたままでリアルタイムで細胞内部の構造を100nm程度の高い空間分解能で取得することを特徴とする高分解顕微鏡。
【請求項２】
対象となる細胞を捕捉するために円偏光レーザービームを用いることにより高効率で、顕微鏡焦点に補足できる細胞サンプルホルダーを用いて長時間映像を取得すること、及び捕捉用レーザービームを用いて焦点位置の対象物を回転しながらあるいは平行移動しながら多方向からの像を得しこれを用いてコンピュータトモクラフィー（CT）の手法を用いて立体像を構築すること、並びに捕捉用レーザービームで補足した対象に蛍光を発生する色素やナノ粒子を選択的に付着させ、これを刺激用レーザーにより励起することにより付加的に細胞などから発する蛍光像を捉え、これを上述した方法で取得した軟X線像と重ね合わせることにより、蛍光像と高分解実態像とを比較しながら蛍光発生場所を特定できることを特徴とする上記請求項に記載の方法。
【請求項３】
X線を短パルス電子銃を金属に衝撃させて発生させること、或いはX線を10mm以下の極めて短いレーザー共振器より発生する光を用いて極めてコンパクトな装置として増幅することにより得られた光をターゲットに衝撃させて発生させることを特徴とする上記請求項の方法。
【請求項４】
X線が幅広い光を有する場合でも、この光を軟X線用多層膜により水の窓波長に合致した波長成分のみを選択して顕微光学システムで試用できること、並びにX線の収差を少なくするためにX線ミラーの径方向に膜厚を調整したコーティング膜を用いた顕微光学システムを用いること、並びにX線の収差を少なくするためにX線ミラーの径方向に膜厚を調整したコーティング膜を用いた顕微光学システムを用いること、及びX線像を直接X線用CCD或いはシンチレータを用いて可視光に変換しこれを光学像倍システムで増倍し原像を拡大するCCDを用いることを特徴とする上記請求項の方法。
【請求項５】
X線光軸を縦型として極めてコンパクトに配置することを特徴をする上記請求項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学顕微鏡では見ることの出来ない極めて高い空間分解能を有する生きた細胞などの微粒子の内部構造を実体像として把握すると共に、その立体像を取得し、さらには、細胞内部のタンパク質や分子の情報を得るための蛍光顕微鏡観察像を合わせることによりタンパク質や遺伝子の産出源を明らかにすることの出来る装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞などの生体微粒子を観察するには、通常の光学顕微鏡、特定のタンパク質などと結合する色素を用いた蛍光顕微鏡、微細な構造を高分解能で観察する電子顕微鏡などが用いられている。しかしながら、通常の光学顕微鏡では光の波長が長いために分可能が悪く詳細な情報が得られない。また、蛍光顕微鏡は蛍光を発生するシステムを構築することが必要であり任意の対象を見ることは出来ず、見ることが出来た場合でも精細な実体構造が分からないために場所の特定が出来ない。電子顕微鏡は詳しい位置情報を与えるものの、細胞などの対象を固定させる必要があるために生きたままでの測定は出来ない。また、高い分解能を誇る電子顕微鏡では立体像を得ることが出来ないために複雑な細胞の位置情報の特定が十分に行い得ない。さらに、蛍光顕微鏡や電子顕微鏡は計測のための準備段階に専門的な知識や経験を必要とし数時間から数日を要する場合もあり迅速な計測技術とはなっていない。そのために、こうした手法は主として医学研究などに利用されているのみであり臨床の場で用いられることは極めて少ない。
【０００３】
光源技術
このような問題点を解決するために、軟X線を用いて細胞像を取得しようとする試みが長年行われてきた。こうした光源を実現するために通常のX線管を用いることが考えられるが、短いパルス駆動でないこと、発生スポットのサイズが大きいこと、生体観察のためには内部に含まれる水の吸収を除きながら細胞骨格となる炭素、窒素、リンなどの元素に吸収されるような2.2ｎｍ〜4.5ｎｍの波長(水の窓波長と呼ばれ、水に吸収を持たない波長域)の光が必要となるにもかかわらず、X線よりも短い光が発生することなどにより実現できていない。水の窓波長でレーザー光を発生する技術も長年開発されているが実現されるには至っていない。現在高輝度でこのような光の得られる光源は放射光装置に限られている。こうした光源は加速器を用いるために放射線防護などの施設なども含み膨大な価格と巨大な施設を必要とするため可搬型装置として個別の施設に設置することは出来ない。そこで短パルスの電子ビームやレーザービームを発生させるときに生じる短パルスX線を得ることを考えた。この際出来るだけ電子ビームやレーザービームの照射スポットを小さくする必要があった
【０００４】
顕微鏡
水の窓波長の光を用いて顕微鏡を製作するには極めて精密な基板とこれに反射多層膜をコーティングすることが必要となるためにこうした顕微鏡光学系は実現していなかった。従来の装置では真空系なども含めて大型装置とならざるを得ないためにコンパクト化する必要があった。また、生体の大部分を占める水による吸収を排除するために水の窓波長を用いなければならないが、こうした波長のみを発生する光源を作成することが極めて困難であることから、幅広いスペクトルの中から必要な波長を選択できるようにする必要があった。
【０００５】
細胞の焦点位置への捕捉
極めて高い分解能で像を得るために逆に対象となる細胞などは焦点位置に長時間保持しておく必要がある。細胞のように小さい物質を生きたま見る場合にはブラウン運動と呼ばれる熱運動や細胞自体の運動のために動いており、当該細胞を顕微鏡の焦点を位置に保持したまま長時間像を観察することが出来ない。この保持のまま機械的操作を用いることなくレーザー光を用いて補足する技術が必要である。同時に細胞を特定波長のレーザー光で刺激することにより細胞の動的応答について観察を行うためにレーザー光を導入できる観察用セルを用いる必要があった。
【０００６】
細胞サンプルホルダ
生きた細胞を見るには細胞は溶液中に浮遊するために真空中ではそのまま見ることは出来ない。しかし水の窓の波長で見る場合には見るべきX線は真空中で取り扱う必要があり細胞を生かしたまま真空中に置くための工夫が必要であった。同時に捕捉用並びに刺激用  レーザーを導入しつつX線で観察できる細胞サンプルホルダが必要であった。
【０００７】
極端紫外画像と可視画像との合成
タンパク質などの情報は特殊なタンパク質結合色素を用いて蛍光で計測される。これに対して軟Ｘ線画像は細胞などのきめ細かい構造の実体像を与える。これらふたつの画像を合成することにより細胞の機能把握が可能となるが、今までこうした波長の異なる画像を合成するような装置はなかった。
【０００８】
リアルタイム画像及び立体画像
リアルタイム画像を得るには、瞬時に撮像できることのほか多くの角度から一つの対象像物の像を短時間に取得することが必要となる。共焦点型蛍光顕微鏡では対象画像をスキャニングしながら取得するために1枚の画像を得るには数10ミリ秒以上を必要とする。しかし、視覚細胞などの高速現象を把握するには極めて短いパルス光源で像を取得する必要がある。また、精細な観察の可能な電子顕微鏡では立体画像を得ることは出来ない。さらに生物構造とレーザー刺激像とを同時に捉えることの出来る光学系により実体像と細胞の機能とを対比しながら観察できる装置が望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
軟Ｘ線光源として従来の大型加速器を用いる巨大な放射光光源でなくコンパクトな可搬型光源を用いた安価なシステムとして医療分野など各分野で活用できる装置とする。
【００１０】
生きたままの細胞の実体像を得るためには、従来のX線管が単なる点光源から放射される光を用いて像を拡大する方法とは異なり、細胞の殆どを占める水によって吸収されず細胞骨格となる炭素、窒素、リンなどの元素によって吸収され細胞骨格を明瞭化できるいわゆる水の窓波長を選択的に活用し、これを高分解能光学系として組み上げる。
【００１１】
従来より高分解顕微鏡は生体ではなく動きがないために焦点面に細胞などの対象物を捕捉することは容易でありピントを合わせるのは容易であるが、生きた細胞は液体の中に保持されるためにブラウン運動や細胞自身のなどの運動により焦点面に対象物を非接触で強く捕捉できる手法を開発する必要がある。
【００１２】
従来より細胞を高分解能で見る手法は電子顕微鏡などにより行われているが、このような手法では透過像ではなく表面像を捉える方法であるため立体視することが出来ないことから細胞内の多数の透視像を取得することになり、コンピュータトモグラフィー技術により立体像を構築するための工夫をする必要がある。
【００１３】
細胞の機能と超微細構造とを合わせて見ることは従来の顕微鏡では不可能であったためこれを可視顕微鏡と極端紫外顕微鏡とを合わせて撮影できる手法を実現する必要がある。
【００１４】
細胞のイメージングを行うためには細胞が光源の照射により劣化或いは死滅しないように或いは死滅する前に像を取得する必要がある。このためには極めて短時間に映像を取得することが不可欠となる。また、光に耐性のある細胞を長時間にわたって観察する場合には熱運動などの動きに基づくぼけを防止することが必要であるため瞬時に撮影を行うことが不可欠となる。生きた細胞の機能の中では高速で反応する生体システムが存在するが、従来はスキャニング型顕微鏡であるために1つの画像を得るためには数10ミリ秒を要することから、スキャニングすることなく瞬時に１ショットで画像を取得する技術を実現する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
コンパクトな可搬型光源とするために、短パルス電子銃或いは短パルスレーザーをターゲット金属に衝撃させることによりパルス状に高輝度でX線を極めて小さなスポットで発生できる光源を実現した。
【００１６】
正確に水の窓波長を得るために、多層膜ミラーの有する選択的反射特性を用いて上述の光源で発生した光から計測にとってコントラストを下げる有害な光を除去する工夫を行った。
【００１７】
生きた細胞を液体中で顕微鏡焦点面に正確に保持するために700nm以上の生物に無害の波長を有するトラップ用レーザー光の偏光を調整して非接触で捕捉できる手法を考案するとともにこれを実現するために必要となる軟X線とトラップ用レーザー光が直交して透過する細胞サンプルホルダーを発案した。
【００１８】
コンピュータトモグラフィー技術により立体像を得るために、上述の細胞捕捉用レーザーにより細胞を微細に回転あるいは平行移動させることにより多方面から像を取得し、これに基づいて立体像を構築する方法を実現した。
【００１９】
細胞の機能を明らかにする可視域のレーザーで励起した可視顕微鏡と微細構造を明らかにするための極端紫外顕微鏡とを合わせて撮影するために同一の顕微鏡光学系を共用する光学システムを実現した。
【００２０】
スキャニングで像を構築するのではなく、1ショットで1つの画像をマイクロ秒からナノ秒までの短時間で取得する技術を実現した。
【発明の効果】
【００２１】
本発明は、水の窓波長の光を用いて生物の大部分を占める水に吸収されることなく、また、運動する微小生物や細胞をレーザーにより焦点面にトラップさせることにより生きたまま精密にリアルタイムに観察できることに利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
コンパクトな可搬型X線源
Cr三価イオンを含むYAG結晶を過飽和吸収体としこれに直接Ndイオンを含むYAGレーザー結晶を結合し、長さが5mm以下の極めて短い共振器を作成しこれをパルス駆動の半導体レーザーでポンプすることにより１ナノ秒以下のパルス幅の波長1μｍ程度のレーザー光を発生させる。この光を小型のフラッシュランプNd:YAGレーザーで増幅することにより50mJ以上の光を得る。この光を10μｍ程度の範囲に集光することによりPW/cm2級の強度を得る。このような光では金属のプラズマを短時間に誘起し、イメージング必要な水の窓波長を含む1ナノ秒以下の強い光を得る。また、極めて短パルスが必要でない場合には1ショット撮影に必要となる50μ秒以下の電子ビームパルスを金属に照射し発生する制動放射線を用いる。
【００２３】
正確な水の窓波長の選択
上述の光源は水の窓近辺の波長を発生するが幅広いスペクトルを有している。これを多層膜コーティングを行ったミラーの反射により水の窓範囲にある極めて波長幅の狭い光だけを選択する。これは波長幅が広いと焦点にぼけが発生するために鮮明な像が得られないからである。
【００２４】
非接触レーザー細胞捕捉
顕微鏡の焦点は極めて浅いために正確にこの焦点に対象となる細胞を長時間捕捉しイメージングを行う。このためによく知られたレーザー光による光圧を用いたトラッピングを行う。本発明ではトラッピングを強く行うために円偏光の光を用いる。
【００２５】
立体像の構築
上述のトラッピング光源を活用して2種類の方法により立体像を得る。一つは、レーザー光の偏光を回転することによって細胞を回転し、各回転角度毎のイメージングを行う。もう一つの方法では上述のトラップ焦点面をわずかずつ焦点軸方向にずらしながら多数の面のイメージングを得ることにより多数枚のイメージングを得る。こうした複数の像を用いてコンピュータにより立体像を実現する。
【００２６】
可視顕微鏡と極端紫外顕微鏡の共用
細胞の構造を明らかにするためのX線による像は4nm程度の波長を反射するミラーによりシュバルツシルト型顕微鏡を構築してイメージングを行う。細胞機能などを得るための通常の光学顕微鏡については同じ顕微鏡光学系を用いて可視光を反射させることによりX線の軸から横方向にはねることにより可視光イメージングを得る。可視光イメージングはX線と同じように対象となる細胞を移動させることにより立体像を得るようにしてある。
【００２７】
瞬時画像の撮像
高い強度の短パルス光照射により1ショットで全体画像が取得できる。このためにCCDカメラのゲート時間を50μ秒以下に設定して瞬時画像をコマドリで取得する。
【実施例１】
【００２８】
解像度及び透過性
ラクトバチルス カゼイ シロタの電子顕微鏡写真(左)と本装置で得られた画像(右)の比較。ほぼ同じ大きさで撮影したもので電子顕微鏡では表面構造しか得られないのに対して透過像が得られる(長さが約1μｍの桿菌)。
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【実施例２】
【００２９】
光学顕微鏡(左)と同じ倍率で比較した本装置での画像(右)との比較写真では内部構造や膜構造等がより精密に観察出来る。
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【実施例３】
【００３０】
水の窓波長
水の窓波長の光を用いるために、ミドリムシ（左）やミジンコ（右）などの水中生物を水中で直接高いコントラストで撮影できる。
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【実施例４】
【００３１】
リアルタイム画像
水中での生物の運動をコマ落とし(0．1秒間隔)で撮影した例。矢印で示すように排泄行為が動画で観察される。
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【実施例５】
【００３２】
画像
乳酸菌を立体的に合成し半割にして回転イメージとした例。
半割りにした像を回転して見たところ。（ほぼ９０°間隔で測定）
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【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】システムの概念図解 励起ビーム（１）（短パルス電子ビーム或いは短パルス高強度レーザービーム）はターゲット（３）に集光されスポット照射される。ターゲット照射により発生するデブリなどの飛散粒子は励起ビームは通すが粒子は通過さない薄膜（２）を置いて飛散粒子から周囲機器の汚染を防止する。短パルス電子ビームは制動放射により発生され弱い光量で長時間観察する場合に使用し、短パルス高強度レーザービームは極めて短時間に強い光量で計測する場合に使用する。ターゲットから放射される軟X線ビームは観察対象である生きた細胞の入っている試料ホルダ（４）を透過して透過像が光学系に送られる。試料セル内の細胞は細胞を固定するためのトラップ用レーザー（５）により軟X線光学系の焦点に補足される。細胞をレーザー光で励起する場合には特定の波長の励起用レーザー（６）により励起される。透過軟X線は光学系（７）により集光されて軟X線用ＣＣＤ（８）上に記録され読み取られる。一方レーザー光で励起された細胞のイメージは可視域の蛍光観察用ミラー（９）により可視光用ＣＣＤ（１０）上に記録される。またコンパクトな配置とするために（９）、（７）、（８）のX線光軸を縦型に配置してある。
【００３４】
【図２】細胞観察用の試料ホルダー（４）の図解  細胞観察用の試料ホルダー（４）の図解である。試料ホルダー（４）は、軟X線（１２）は窒化珪素などのX線を透過できる素材で構成されている。他の面はトラップ用レーザー（５）や細胞励起用レーザー（６）である可視光が透過するようになっている。
【００３５】
【図３】試料ホルダー（４）への光の供給の図解      トラップ用レーザー（５）は分割されてそれぞれ試料ホルダー（４）に供給される。また、細胞励起用レーザー（６）は別途試料ホルダー（４）に供給される。  トラップ用レーザー（５）はそれぞれ集光用レンズ（１２）で集光されホルダー（４）に送られる。ホルダー内部の細胞の立体像を取得するために、これを回転させるために（１３）と回転楕円ホール（１４）が用いられる。これは（１５）に示す非円形断面を持ちこれを回転することにより細胞のトラップと移動が安定して実施できる。また（５）−（５）のレーザービーム光軸をホルダー（４）に対して移動させることにより、あるいはホルダー（４）のみを機械的に移動させることにより細胞の平行断面図を取得できるようになっている。
【００３６】
【図４】短パルス高強度レーザー（１）の図解（１６）は短パルスレーザー発振器を駆動するための光を発生する半導体レーザーである（１７）の集光光学部品を用いて（１８）のNd:YAGレーザーを励起する。Nd:YAGレーザーのNd濃度は2％以上であり、（２０）の面は半導体レーザーを透過しNd:YAGレーザー光を全反射するようなコーティングを行う。共振器はレーザーを構成する（２０）の図と（１９）Cr:YAG結晶の1面で1.06μｍに高い反射を有するコーティングを行ってある（２１）よりなる全長5mm以下の短い共振器長を有している。（２１）のコーティングはNd:YAGレーザーの発振光である1064nmの一部を反射するように構成されている。発振器から発生する光はパルス幅500ps程度或いはそれ以下であり、（２２）フラッシュランプで励起される（２３）Nd:YAGレーザーにより折り返して増幅される。折り返しのために（２５）、（２６）、（２７）のミラーやプリズムを使用する。発生した光は（２８）集光光学系で（３）ターゲットに集光される。ターゲットからターゲット材がスパッタリングなどにより飛散するため、光学素子を防御する観点から、これを（２９）薄膜ロールにより粒子のみを防止し光を透過するようになっている
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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