(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔ細胞から得られるγδＴ細胞を、増殖・活性化する方法を提供する。【解決手段】抗原提示細胞である樹状細胞を、ＢＣＧ（弱毒性結核生菌）を用いて刺激することにより、ＢＣＧ刺激樹状細胞を作成し、該ＢＣＧ刺激樹状細胞によってＴ細胞を刺激して、γδＴ細胞を増殖・活性化することを特徴とする、γδＴ細胞を増殖・活性化する方法。本方法により活性化されたγδＴ細胞は、多種の癌細胞に対する細胞傷害活性が増強している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞をＢＣＧ（弱毒性結核生菌）により刺激を与えＢＣＧ刺激樹状細胞を作成し、該ＢＣＧ刺激樹状細胞によってＴ細胞を刺激することにより、γδＴ細胞を増殖・活性化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＢＣＧ刺激樹状細胞によりＴ細胞を刺激し、γδＴ細胞を増殖・活性化す
る方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体の型によってαβＴ細胞とγδＴ細胞に分類されるが、後者は前者に比べ極めて少ない。
【０００３】
γδＴ細胞は結核患者や癌患者に頻度が高く、結核などの感染（Ｊ．Ｊａｍｅｓｏｎ，ｅｔ．ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３、Ｖｏｌ．１５ ３４９−３５３）、免疫や癌免疫に関係があるとされているが、その性質は不明の点が多い。これまでは、γδＴ細胞は抹消血中に僅かしか存在しないため、その性質を明らかにできなかったが、近年、γδＴ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−２やパラミドン酸等を用いて増殖させる方法が開発され（Ｒ．Ｃａｓｅｔｔｉ、ｅｔ． ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、Ｖｏｌ．１７５，１５９３−１５９８、Ｌ．Ｃｏｎｔｉ，ｅｔ．ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５、Ｖｏｌ．１７４、２５２−２６０）、いくつかの重要な性質が明らかになった。
【０００４】
特に、γδＴ細胞は多種の腫瘍細胞に対し細胞傷害活性を有することで注目をされている。これまで、活性化したγδＴ細胞が樹状細胞を成熟させることが報告されているが（Ｃ．Ｍｕｎｚ，ｅｔ．ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００５、Ｖｏｌ．２０２、２０３−２０７）、樹状細胞の単独刺激でγδＴ細胞を増殖、活性化するという報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｔ細胞から得られるγδＴ細胞を増殖し活性化する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するため、本発明に係るγδＴ細胞を増殖・活性化する方法は、樹状細胞をＢＣＧ（弱毒性結核生菌）により刺激を与えることによりＢＣＧ刺激樹状細胞を作成し、該ＢＣＧ刺激樹状細胞によってＴ細胞を刺激して、γδＴ細胞を増殖・活性化することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明は、ＣＤ７０陽性樹状細胞を作製する手法を応用してＢＣＧ刺激樹状細胞を作製し、該ＢＣＧ刺激樹状細胞によってＴ細胞を刺激したところγδＴ細胞を有効に増殖させ、活性化することを明らかにすることによって完成されたものである。これにより、新たな手法でγδＴ細胞を増殖、活性化することにより、γδＴ細胞の研究を発展させて行くことが可能となる。また、活性化したγδＴ細胞は、多種の腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を有するという効果を奏することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
・  本発明に係るγδＴ細胞を増殖・活性化方法のそれぞれの工程で予想される反応機作
当該発明の特徴は、γδＴ細胞の増殖活性化を抗原提示細胞である樹状細胞によって行うことにある。それは、本来、生体内で生理的に行われているであろう反応であり、これまで報告されたような増殖因子で増殖活性化を図る既存の方法と根本的に異なるものである。それは、結核菌を捕捉貪食した樹状細胞がγδＴ細胞に結核菌成分をγδ型TCRに抗原提示してT細胞を活性化することである。しかるに、これまでの方法で活性化された樹状細胞には、該γδＴ細胞活性化能は乏しかったので、その報告がなかったものと思われる。しかしながら、我々は未熟な単球由来樹状細胞を洗浄後BCG刺激して得た成熟樹状細胞には十分な該γδＴ細胞活性化能を持つことを発見し、当該発明とした。おそらく、この発見は、結核患者でγδＴ細胞が増殖し同患者の癌の罹患率が低いという現象に結びつくものであろう。
【０００９】
（２）本発明に係るγδT細胞増殖・活性化方法の一般的記載
ヒト末梢血から採取した単核白血球（一般に10７-10９細胞）のCD14陽性単球に抗CD14抗体結合マイクロビーズを結合させ、磁気カラムに通して精製する。好ましくは、ヒトリコンビナントIL-4（好ましくは１-50 ng/mlの範囲）およびヒトリコンビナントGM-CSF（好ましくは（1-100ng/mlの範囲）を加えて、無血清培地または１０％牛胎児血清含有RPMI1640培地で好ましくは5-8日間の範囲で培養する。温かな培養液で好ましくは３-５回遠心で洗浄し、好ましくは0.1-10μg/mlの範囲のBCGを加えて２-５日間の範囲で培養する。好ましくは10４-107個の範囲の樹状細胞と好ましくは105-108個の範囲の精製した末梢血T細胞を混合培養し、5-14日間の範囲で共培養する。
【００１０】
（３）本発明に係るγδT細胞増殖・活性化方法を実施する際の留意点
（ｉ）「樹状細胞をＢＣＧ（弱毒性結核生菌）により刺激を与えることによりＢＣＧ刺激樹状細胞を作成する」工程
当該行程に於いて、樹状細胞の洗浄を省いてはならない。更に、過量のBCGを加えることは好ましくない。
【００１１】
（ｉｉ）「該ＢＣＧ刺激樹状細胞によってＴ細胞を刺激して、γδＴ細胞を増殖・活性化する」工程
当該行程に於いて、T細胞を予め精製しておくことが望ましい。
【００１２】
近年、病原体構成成分がToll-like Receptor (TLR)を介して免疫を誘導することが、生体防御に於いて重要であることが明らかとなっている。現在、11種類のTLRが報告され、その種類によって多様な免疫の誘導がなされるとこが明らかとなっている。本発明では、大腸菌由来のLPSでは見られない、gdT細胞の強い増殖、活性化がBCG刺激によって特異的に誘導されることが示された。
【００１３】
なお、実施例で用いているFACS解析は、複数の蛍光抗体で標識した細胞の１細胞当たりの蛍光強度測定することによって、試料となる細胞群の種類やその頻度を測定する器械である。約１０６個の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、FITC,またはPE標識された抗体10μg/mlを約２0分間、室温で反応させ、0.2%FBS含有PBSで2回洗浄する。フィルターで大きな細胞塊やゴミ等を除去した後に、FACS解析する。
【実施例】
【００１４】
（実施例１）
末梢血単球をそれぞれ１０ng/mlの濃度のＩＬ−４，及び、ＧＭ−ＣＳＦで７日間培養し、培養液約１０ｍｌで計５回洗浄し樹状細胞を得、１０mg／ｍｌのＢＣＧ水溶液、１μｌを１０mlの培養液に加え、３日間培養しＢＣＧ刺激樹状細胞を得た。活性化した樹状細胞（3x１０５細胞）と自己末梢血Ｔ細胞（3x１０６個）とを７日間共培養することによって、活性化したγδＴ細胞を得た。得られたＴ細胞培養液について、γδＴ細胞の割合とＩＦＮ−γ産生量をＦＡＣＳによって解析した。
【００１５】
結果を図１（ａ）と図１（ｂ）とに示す。同結果から、γδＴ細胞が全T細胞中の２〜３％の割合であったものが３０％以上に増殖していた。さらに、ＩＦＮ−γ産生細胞は約４０％になった。
【００１６】
（比較例１）
比較例として、上記実施例１においてＢＣＧによって刺激しなかった非刺激樹状細胞を用いて自己末梢血Ｔ細胞と共培養した以外は、実施例１と同じ条件で得た培養Ｔ細胞を得た。結果を図１（ａ）と図１（ｂ）とに示す。同結果から、該培養Ｔ細胞は、γδＴ細胞の割合の上昇も少なく、またγδＴ細胞はほとんど活性化もしていなかった。
【００１７】
以上のことから、洗浄後のＢＣＧ刺激の樹状細胞は特異的なγδＴ細胞刺激活性を有していることは明らかである。
【００１８】
（実施例２）活性化γδＴ細胞の多種の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性
細胞傷害活性の実験法には様々な手法がある。実施例２で用いた方法は極一般的に行われている51Cr releasing assayである。その原理は、放射性物質51Crを所定期間細胞と一生に培養すると非特異的に細胞内に取り込まれる。細胞が何らかの傷害を受け死滅すると培養液中に放出されるため、培養液中の51Crの放射活性をカウントすることによって細胞傷害の程度を測定することができる。実験の工程では、標的細胞である腫瘍細胞を９６well培養デイシュに３x１０4個／wellで捲き、１μCi/mlの51Cr溶液中で約１時間培養する。2回洗浄後、標的細胞の５-50倍の数量（E/T 比）のT細胞と混合培養する。5-6時間、もしくはそれ以上の時間で培養後培養上清中の放射活性をγカウンターで測定する。標的細胞のみの培養上清をブランクとして、1N NaOH溶液等で全細胞の溶解液の測定値を100％として、％細胞傷害活性を算出する。
【００１９】
図2は、膀胱癌細胞株T24をBCG処理樹状細胞で活性化したT細胞の細胞傷害活性である。T細胞はT24細胞（O）に対し抗原非特異的に細胞傷害を起こした。更に、T24細胞にBCGを感染させた細胞（●）では更に細胞傷害活性が増強した。
【００２０】
γδT細胞の抗腫瘍作用、細胞傷害活性については、最近のレビュー（Lawrence S. et. al. gdT cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation, Vol. 11: 161-168, 2005）等を参照。
【００２１】
本発明によれば、Ｔ細胞から得られるγδＴ細胞を増殖し活性化することができ、従来その性質が不明であったγδＴ細胞の研究を発展させることが可能となり、また、活性化したγδＴ細胞は、多種の腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するという産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】（ａ）は培養後の全Ｔ細胞中のγδＴ細胞数の比率を示し、（ｂ）は培養後のＩＦＮ−γ産生γδＴ細胞に対する全ＩＦＮ−γ産生γδＴ細胞の比率を示す。
【図２】膀胱癌細胞株T24をBCG処理樹状細胞で活性化したT細胞の細胞傷害活性を示す。
【図１】
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【図２】
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