(57)【要約】【課題】本発明は、３次元培養細胞による脂肪肝モデルに関する。また、この脂肪肝モデルを用いた脂質代謝改善薬や抗肥満薬などの脂質代謝に作用する薬剤の評価方法に関する。【解決手段】以下の工程を含む脂肪肝モデル作成方法。（１）肝細胞を、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填する。（２）（１）で得られた肝細胞を保持した中空糸を、細胞培養用液に浸漬させた状態で細胞を培養し、その組織内に脂肪滴を有する肝細胞組織体を形成させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む脂肪肝モデル作成方法。
（１）肝細胞を、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填する。
（２）（１）で得られた肝細胞を保持した中空糸を、細胞培養用液に浸漬させた状態で細胞を培養し、その組織内に脂肪滴を有する肝細胞組織体を形成させる。
【請求項２】
中空糸の内腔に細胞を充填する際に圧力または遠心力を負荷して、細胞を凝集した状態にする、請求項１に記載の脂肪肝モデル作成方法。
【請求項３】
中空糸内腔に充填する細胞が、肝細胞単独または肝細胞を含む複数種の細胞である請求項１〜２のいずれか１項に記載の脂肪肝モデル作成方法。
【請求項４】
肝細胞および肝細胞以外の細胞がヒト由来の細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載の脂肪肝モデル作成方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法により製造された脂肪肝モデル。
【請求項６】
請求項５に記載の脂肪肝モデルを使用して脂質代謝に影響を与える薬剤の影響を評価する薬剤評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３次元培養細胞による脂肪肝モデルに関する。また、この脂肪肝モデルを用いた脂質代謝改善薬や抗肥満薬などの脂質代謝に作用する薬剤の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食生活の欧米化などによる脂肪摂取量の増加や運動不足により、多くの成人に脂肪肝の徴候がみられると言われている。特に、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：以下、ＮＡＦＬＤ）の患者はここ２０年くらいの間に急増し、成人の約２０％に達するといわれている。また、ＮＡＦＬＤの患者のうち２０％は、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：以下、ＮＡＳＨ）に、更にそのうちの２０％が肝硬変にまで進展すると言われている。米国では小児でさえも１０％近くがＮＡＦＬＤに罹患している可能性が示されており、世界的、将来的にも極めて重要な疾患である。
ＮＡＦＬＤは単なる肝疾患であるのみならず、インスリン抵抗性などメタボリックシンドロームに密接に関わる疾患であることが知られており、今後益々適切な治療が必要とされる。
しかしながら、ＮＡＦＬＤの病理に関する機能的な解明は未だなされていない。このため、ＮＡＦＬＤの有効な治療薬の開発は順調に進んでいるとは言い難い状況である。
有効な薬剤の開発を効率よく進めるためには、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価系が必要不可欠であるが、現在、脂肪肝を擬似するような細胞培養系は存在せず、病態モデル動物と呼ばれるマウスやラットなどの実験動物の脂肪肝モデルが存在するのみである。例えば、レプチン欠損のｏｂ／ｏｂマウスやコリン欠乏・低メチオニン食によって誘導される脂肪肝モデルマウスなどが知られている。
しかし、これら動物に対し人為的に働きかけて脂肪肝を誘導するには時間や費用がかかるうえ個体差や再現性にも問題があるだけではなく、動物愛護という観点からもその利用には制限がある。このような背景から、有効な脂質代謝改善薬の開発を実現するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脂肪肝モデルが真に望まれていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、培養細胞を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脂肪肝モデルを作成し、更にその脂肪肝モデルを用いることにより、脂質代謝改善薬の影響を評価する薬剤評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記のような目的を達成するために、本発明者らは鋭意研究を行った結果、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に充填された肝細胞を培養することにより、組織内に脂肪滴を有する肝細胞組織体、すなわちｉｎ  ｖｉｔｒｏの脂肪肝モデルを安定して作成できることを見出した。
さらに、本発明は上記の方法により作成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ脂肪肝モデルを用いて脂質代謝改善薬の影響を評価する薬剤評価方法を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
上述したように、本発明によって、透過性を有する膜からなる中空糸の内腔に肝細胞を充填し培養することによって肝細胞組織内に効率よく脂肪滴形成を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脂肪肝モデルを作成することが可能となった。さらに、本発明は、上記の方法により作成した脂肪肝モデルを使用して脂質代謝改善薬の影響を評価する薬剤評価方法を提供することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下に本発明の具体的な実施の形態を説明する。本発明のひとつの方法では、まずヒト細胞を透過性膜からなる中空糸の内腔に充填する。細胞の中空糸内腔への充填方法については、本発明者が既に特許公開２００５−１１０６９５にて開示した中空糸付き器具が好適に使用できる。
そのような中空糸付き器具は、典型的には、（１）着脱可能に連結された流入側流通管と流出側流通管とからなる、一端が開口した細胞懸濁液流通管と、（２）細胞懸濁液流通管の他端に設けられた中空糸固定部と、（３）一端が封止され他端が開口しているとともに、開口端が細胞懸濁液流通管と連通し中空糸固定部に液体が漏れない状態で貫通している１本又は複数本の中空糸とを備えており、さらに、（４）細胞懸濁液流通管の開口端が、細胞注入用器具の排液口と嵌め合わせ可能な形状を有するもの、あるいは、（５）さらに、内部に中空糸を配置できる遠心容器を備え、遠心容器の蓋が細胞懸濁液流通管の流入側流通管に支持されているものであってもよい。
中空糸内に充填する細胞の密度については、とくに限定はしないが、本発明者が特許公開２００４−１６６７１７および特許公開２００４−２８３０１０で示したように、細胞充填に際して水圧や遠心力を負荷し、細胞が凝集した状態にすることが望ましい。これは人為的に細胞を凝集させた状態で培養することにより、効率良く組織体形成が誘導されるためである。
【特許文献１】特開２００５−１１０６９５
【特許文献２】特開２００４−１６６７１７
【特許文献３】特開２００４−２８３０１０
【０００７】
中空糸の素材については、細胞を中空糸内腔に保持でき、溶液や低分子の物質を透過させるような構造をとることができるものであれば、特に限定されるものではないが、例えば、セルロース系素材、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスルホン等が好適に利用できる。
物質交換の効率を高くするため、平均孔径はできるだけ大きいことが望ましく、通常０．１〜５μｍ程度、特に０．２〜３μｍ程度が好適に採用されるが、特にこの範囲に限定されるものではない。
【０００８】
中空糸の大きさについても特に制限はないが、内径は好ましくは２０〜１０００μｍ、より好ましくは５０〜５００μｍ程度のものが利用される。中空糸の内径が余りに大きいと中空糸中心部付近の細胞における各種物質交換が困難となり、余りに小さいと充分な細胞数の注入が困難となる。
膜厚についても、特に制限はないが、中空糸が適度の強度を保ち、かつ物質の透過性も良好な範囲で設定すればよく、例えば１０〜２００μｍ程度、特に２０〜１００μｍ程度が好ましい。
【０００９】
多孔性膜中空糸の場合、平均孔径は細胞の培養を考慮すると物質交換の効率のよい大きな孔径を有する方が望ましく、０．１〜５μｍ程度、特に０．２〜３μｍ程度が好適に選択されるが、特にこの範囲に限定されるものではない。
【００１０】
中空糸の長さは、特に制限されないが、通常０．５〜２０ｃｍ程度、特に１〜１０ｃｍ程度が好ましい。中空糸が余りに長いとハンドリングや細胞の注入が困難となり、余りに短いと注入できる細胞数が少なくなる。本発明の範囲であればこのような問題は生じない。
【００１１】
細胞を充填する方法としては、たとえば、上述の中空糸付き器具の細胞懸濁液流通管の開口端から細胞懸濁液を注入することにより中空糸内腔に細胞を堆積させ、遠心容器内に中空糸を配置した状態で中空糸内腔の細胞に遠心力をかけることにより中空糸内腔に細胞の凝集体を形成することができる。
遠心力は、細胞の凝集体を形成できるのであれば特に限定されず、細胞の種類に応じて細胞に傷害を与えない範囲で定めればよい。細胞の種類によって異なるが、概ね２〜２０００×Ｇ程度、特に４〜５００×Ｇ程度の遠心力をかけることが好ましい。例えば初代ラット肝細胞の場合、通常１５００×Ｇ以下、特に４００×Ｇ以下とすることが好ましい。初代ラット肝細胞の場合、遠心力の下限は、細胞の凝集体を形成できる範囲であればよく特に限定されないが、５×Ｇ程度である。遠心時間は、細胞凝集体を形成できる範囲で適宜設定すればよい。例えばラット肝細胞では、５０×Ｇ程度で９０秒間程度遠心力を負荷することにより５×１０７〜１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度の密度の細胞凝集体が得られる。
本発明において、圧力には、注射器、アスピレーター（水流ポンプ）、エバポレーター、ポンプ等を用いて細胞に陽圧又は陰圧の圧力をかけることが含まれる。また、圧力は連続して１回でかけてもよく、又は、複数回に分けて間欠的にかけてもよい。目的や細胞の状態に応じた方法を選択することができる。また、細胞に圧力を加える総時間は、通常６０分間以内、特に１秒間〜１０分間程度が好ましい。
【００１２】
中空糸内腔に細胞を充填した後、細胞凝集体を保持した中空糸を細胞培養用液又は細胞保存用液に浸漬させた状態で、これを培養容器に移し３７℃、５％ＣＯ２環境のもとで振とう機などで培養容器を振とうさせながら培養することにより、中空糸内腔の細胞に対して効率よく栄養や酸素を供給することができる。
【００１３】
本願発明で用いる肝細胞の由来は、目的により適宜選択されればよく、特に限定されない。たとえば、ヒトの脂肪肝発生のメカニズム解明や、ヒト向けの優れた脂質代謝改善薬の開発を目的にする場合は、ヒト由来の細胞を用いることが好ましい。
また、本発明で用いる肝細胞は、肝細胞単独であってもよいし、または、肝細胞を含む複数種の細胞であってもよい。
【００１４】
上記のような培養方法により、脂肪滴を有する組織体形成を効率よく誘導することができる。脂肪滴を有する組織体形成の確認は、組織を凍結させ凍結切片を作成した後にオイルレッド染色による脂肪滴染色やホルマリン固定後のＨＥ染色像において組織中に丸く抜けた穴として観察することができる。
【００１５】
更に本発明では、上記のごとく培養細胞を用いて脂肪滴形成すなわち脂質代謝におよぼす各種薬剤の影響を調べることができる。すなわち細胞を培養する培養液中に目的とする薬剤を加え、一定期間培養した後、組織切片を作製し組織内の脂肪滴形成具合の変化を調べたり、あるいはＰＰＡＲ等の脂質代謝に関連する遺伝子発現の変化を質的または量的に解析することで脂質代謝に対する薬剤の影響を知ることができる。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例及び試験例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１７】
実施例１
凍結ヒト肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｃｏｄｅ：，ｌｏｔ．ＬＯＦ）を融解し、ヒト肝細胞無血清培地（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）中に、ヒト肝細胞が約１．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度となるように細胞浮遊液を調製した。このヒト肝細胞浮遊液をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）を用い中空糸内腔に注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培地（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。  
【００１８】
培養開始翌日に培地交換を行い、その後２日毎に培地を交換しながら１４日目まで培養を継続した。培養１４日目に細胞を中空糸に入れたままホルマリン固定した。常法に従いこれをパラフィン包埋した後に、組織切片を作製しヘマトキシリン・エオジン染色を施して観察したところ肝細胞で形成された組織中に丸く抜けた脂肪滴の穴が観察された。この穴は、同じ組織の凍結切片のオイルレッド染色の結果から脂肪滴であると確認できた。
【００１９】
上記と同じ実験をヒト肝細胞の由来を変えて３回繰り返したところ、１００％の確率で脂肪滴を形成した。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脂肪肝モデルを一定の割合で安定的に作製できることが示された。
【００２０】
比較例１（単層培養法との比較）  
実施例１で用いたものと同じヒト肝細胞をフラスコに播種し、広く一般に実施される単層培養法で培養を行った。
培養開始翌日に培地交換を行い、その後２日毎に培地を交換しながら１４日目まで培養を継続した。培養１４日目に細胞を常法に従いオイルレッド染色を施して観察したところ脂肪滴は確認できなかった。
上記と同じ実験をヒト肝細胞の由来を変えて（実施例１で用いたものと同じヒト肝細胞浮遊液を用いて）３回繰り返したところ、いずれも脂肪滴の形成は認められなかった。
【００２１】
実施例２（薬剤添加実験）  
凍結ヒト肝細胞（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．Ｉｎｃ．，Ｃｏｄｅ：，ｌｏｔ．ＬＯＦ）を融解し、ヒト肝細胞無血清培地（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）中に、ヒト肝細胞が約１．０×１０６個／ｍｌの細胞濃度となるように細胞浮遊液を調製した。このヒト肝細胞浮遊液をセルローストリアセテート製中空糸モジュール（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＦＫ−００１、中空糸内径２８５μｍ、外径３８７、孔径０．２μｍ）を用い中空糸内腔に注入し、６０Ｇで９０秒間遠心力を負荷して中空糸内腔に細胞を充填した。内腔に細胞が入った中空糸部分を切り取って細胞培養用１２ウェルプレートに移した後、ヒト肝細胞培養に適した市販のヒト肝細胞無血清培地（東洋紡績、Ｃｏｄｅ：ＴＭＨＨＭ−００１）に入れ、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気環境下にて振とう培養を行った。  
【００２２】
培養開始翌日に培地交換を行い、その後２日毎に培地を交換しながら７日間培養したところで、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅを１００μＭの濃度になるように添加したヒト肝細胞無血清培地に切り替え、２日毎に培地交換を行いながら更に１４日間培養を継続した。対照群は、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅを含まないヒト肝細胞無血清培地で同様に培養を続けた。
【００２３】
培養２１日目に培養肝細胞を中空糸ごとホモジナイズすることにより、ＲＮＡを抽出し、脂質代謝に関わる遺伝子Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ  （ＰＰＡＲ  ａｌｐｈａ）およびａｃｅｔｙｌ−Ｃｏｅｎｚｙｍｅ  Ａ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ａｌｐｈａ（ＡＣＡＣＡ）のｍＲＮＡ発現を常法に従いＲｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ法を用いて調べたところ、ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅの薬効を反映する量的変化が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００２４】
これまで培養細胞を用いて、組織内に脂肪滴を形成させる培養系は報告が無く、本発明は脂肪肝発生のメカニズム解明や優れた脂質代謝改善薬の開発に非常に有用となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本特許に記載された培養方法にて中空糸内腔にヒト肝細胞を充填し培養した像。中空糸内に円柱状の肝細胞組織体が形成されている様子が観察される（外観）。
【図２】本発明を用いた実施例１における、肝細胞組織体の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像であり、組織中に形成された脂肪滴が観察される（長方向に対し垂直な断面を観察した像、矢印が指す丸い穴が脂肪滴である）。
【図３】本発明を用いた実施例１における、肝細胞組織体の組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色像であり、組織中に形成された脂肪滴が観察される（長方向に対し平行な断面を観察した像、矢印が指す丸い穴が脂肪滴である）。
【図４】本発明を用いた実施例２における、脂質代謝関連遺伝子発現量の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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