(57)【要約】【課題】シバＳＳＲマーカーを検出するプライマー対及び簡便かつ正確にシバ属種間及び種内雑種の鑑別を行う方法を提供する。【解決手段】シバ属内の種間及び種内雑種の鑑別に有用なプライマー対であって、シバゲノム上におけるＳＳＲ領域を検出するためのプライマー対、及びシバ種間及び種内雑種を鑑別する方法であって、シバ属のゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を検出するプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のシバ種間及び種内雑種ＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物を両親と照合することで雑種個体の鑑別を行うことを特徴とする雑種個体の鑑別方法。【効果】シバ種間及び種内雑種の雑種個体の鑑別方法を提供することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シバ属内の種間及び種内雑種の鑑別に有用なプライマー対であって、シバゲノム上におけるＳＳＲ領域を検出するためのプライマー対。
【請求項２】
シバゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成された、請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
表１のＦ（Ｆｏｗａｒｄ）プライマー１〜８３８及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー８３９〜１６７６の対を１対とするシバ属のＳＳＲ増幅用プライマー対である、請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項４】
シバ種間及び種内雑種を鑑別する方法であって、シバ属のゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を検出するプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のシバ種間及び種内雑種ＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物を両親と照合することで雑種個体の鑑別を行うことを特徴とする雑種個体の鑑別方法。
【請求項５】
請求項３に記載のプライマー対から増幅されるＳＳＲマーカーを使用し、雑種ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲによる増幅断片のバンドサイズ及び／又はバンドパターンを指標として雑種の鑑別を行う、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
識別対象のシバ属が、ノシバ、コウライシバ、コウシュンシバ、又はオニシバである、請求項４又は５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シバ属内の種間及び種内雑種を鑑別するため、特定のＳＳＲ領域を増幅させるための遺伝子増幅用プライマーのＦプライマー及びＲプライマー対及び該プライマー対を利用したシバ属の種間及び種内雑種の鑑別方法に関するものである。従来、シバの種間及び種内での系統間の形態的特徴に差異が少なく、簡単で確実に真の雑種を同定する方法がなかったが、本発明は、特定のＳＳＲマーカー検出用プライマーを利用することで、幼苗期において、シバ属の種間及び種内雑種を簡単かつ正確に鑑別することを可能とする雑種個体の鑑別方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
シバ属（Ｚｏｙｓｉａ）は、８種ほど存在するが、日本では、主にノシバ（Ｚ．ｊａｐｏｎｉｃａ）、コウライシバ（Ｚ．ｔｅｎｕｉｆｏｌｉａ）及びコウシュンシバ（Ｚ．ｍａｔｒｅｌｌａ）が栽培され、主に芝生用で、ノシバは、暖地型飼料作物としても利用される。シバ属は、多年生のイネ科植物である。シバ属の植物は、栄養繁殖と種子繁殖をするが、種子繁殖では、部分自殖も行う他殖性である。
【０００３】
シバの品種識別法として、先行技術文献では、例えば、ＳＳＲマーカーを使用した品種識別法が提案されている（特許文献１参照）。この方法では、シバ品種の「朝駆」から１３７種類の特定のＳＳＲマーカーを開発し、これらのマーカーを鋳型としてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の分子量を確認することでシバの品種識別を行っている。
【０００４】
シバの育種は、栄養系から選抜する方法が主流であるが、現在、交配育種も盛んに行われている。しかし、シバの多くは、生殖器官である花が小さく、その他の植物で行われる雄蘂の除去が特に難しい。また、シバの多くは、自殖も行い、特にノシバでは、自殖率も高く、交配で得た個体は、真の雑種かどうか形態的な観察に頼るしかない。ただし、シバの種間及び種内での系統間の形態的特徴に差異が少なく、簡単で確実に真の雑種を同定する方法がないのが現状である。
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２７５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このような状況の中で、本発明者らは、上記従来技術に鑑みて、シバの種間及び種内雑種の鑑別に有用なＳＳＲプライマー対及び当該雑種の鑑別方法を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた結果、シバのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対を利用することにより所期の目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明は、従来の形態的な観察法より正確で、幼苗期で少量の葉由来のＤＮＡをテンプレートＤＮＡとすることにより植物を育てる時間を省き、なおかつ正確なシバ属種間及び種内雑種の鑑別を可能にするＰＣＲ用のＳＳＲマーカープライマー対及び当該雑種の鑑別方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）シバ属内の種間及び種内雑種の鑑別に有用なプライマー対であって、シバゲノム上におけるＳＳＲ領域を検出するためのプライマー対。
（２）シバゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成された、前記（１）に記載のプライマー対。
（３）表１のＦ（Ｆｏｗａｒｄ）プライマー１〜８３８及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー８３９〜１６７６の対を１対とするシバ属のＳＳＲ増幅用プライマー対である、前記（１）に記載のプライマーセット。
（４）シバ種間及び種内雑種を鑑別する方法であって、シバ属のゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を検出するプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のシバ種間及び種内雑種ＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物を両親と照合することで雑種個体の鑑別を行うことを特徴とする雑種個体の鑑別方法。
（５）前記（３）に記載のプライマー対から増幅されるＳＳＲマーカーを使用し、雑種ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行う、前記（４）に記載の方法。
（６）ＰＣＲによる増幅断片のバンドサイズ及び／又はバンドパターンを指標として雑種の鑑別を行う、前記（４）又は（５）に記載の方法。
（７）識別対象のシバ属が、ノシバ、コウライシバ、コウシュンシバ、又はオニシバである、前記（４）又は（５）に記載の方法。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
本発明は、シバ属内の種間及び種内雑種の鑑別に有用なプライマー対であって、シバゲノム上におけるＳＳＲ領域を検出するためのプライマー対である。本発明は、上記プライマー対が、シバゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成されたこと、表１のＦ（Ｆｏｗａｒｄ）プライマー１〜８３８及びＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマー８３９〜１６７６の対を１対とするシバ属のＳＳＲ増幅用プライマー対である、こと、を好ましい実施の態様としている。
【００１０】
また、本発明は、シバ種間及び種内雑種を鑑別する方法であって、シバ属のゲノム上におけるＳＳＲ（Ｓｉｍｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｅｐｅａｔｓ）領域を検出するプライマーから増幅されるマーカーを使用し、識別対象のシバ種間及び種内雑種ＤＮＡのＰＣＲによる増幅を行い、その増幅産物を両親と照合することで雑種個体の鑑別を行うことを特徴とするものである。本発明では、上記のプライマー対から増幅されたＳＳＲマーカーを使用し、雑種ＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うこと、を好ましい実施の態様としている。
【００１１】
この発明の特徴は、シバのゲノム上におけるＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いて作成したプライマー対から、鑑別対象の雑種個体及びそれらの親個体のゲノム領域の特定マーカーをＰＣＲ増幅し、そのマーカーのサイズ及びバンドパターンを確認することで雑種の鑑別を行う点にある。
【００１２】
本発明で使用されるＳＳＲプライマー対は、ノシバとコウシュンシバの雑種系統Ｆ８由来のＳＳＲ濃縮ライブラリーから単離したもので、具体的に、まず、ＳＳＲ繰り返し配列モチーフＧＡ／ＣＴ、ＣＡ／ＴＧ、ＡＡＧ／ＴＴＣ及びＡＡＴ／ＴＴＡの濃縮ライブラリーを作成した。その後、各ライブラリーからそれぞれ２０００クロンの塩基配列を決定した。これらの塩基配列からＳＳＲ繰り返しモチーフを含むクロンを重複したものを除き、プライマーを設計した。更に設計したプライマーを８系統のシバＤＮＡをスクリーニングし、増幅しかつ多型があるものを本発明のＳＳＲプライマー対とした。ノシバ、コウライシバ、コウシュンシバ及びオニシバ（Ｚ．ｍａｃｒｏｓｔａｃｈｙａ）に使用できる。なお、プライマー設計は、ソフトウエア「Ｐｒｉｍｅｒ  ５．０，ｆｔｐ：／／ｆｔｐ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／Ｐｒｉｍｅｒ０．５」を使用してゲノム領域増幅用プライマーの８３８対のプライマーを設計した（表１参照）。
【００１３】
本発明では、２〜３塩基が高頻度に繰り返された配列からなるＳＳＲ領域の両側を挟むように設計したゲノム領域増幅用プライマーの８３８対のプライマー（表１参照）で、使用する系統によって一つのプライマー対を使用し、対象となる雑種個体ＤＮＡのテンプレートについてＰＣＲ増幅を行い、その増幅断片を交配親のバンドと比較することで雑種を鑑別する。
【００１４】
本発明では、シバゲノム上のＳＳＲ領域の両側の塩基配列を用いてプライマー対として設計する。対象となるシバ属種間及び種内雑種の親個体のＤＮＡをまずＳＳＲマーカーで選抜し、両親が違うサイズのバンドを示すマーカーを鑑別マーカーとする。その後、選抜した鑑別マーカーを使って雑種集団の個体を真の雑種として識別する。つまり、両親から１本ずつのバンドを継承しているので真の雑種である。逆に、それ以外の個体は真の雑種ではない。
【００１５】
本発明で使用されるＳＳＲ領域としては、シバゲノム上に分布するＧＡ／ＣＴ、ＣＡ／ＴＧ、ＡＡＧ／ＴＴＣ及びＡＡＴ／ＴＴＡの繰り返しをある程度（２塩基繰り返しの場合は９反復以上、３塩基の場合は５反復以上）含む領域である。上記ＳＳＲ領域を検出するプライマーとして表１に示す８３８対のプライマーを設計した。
【００１６】
後記する実施例では、シバＳＳＲマーカーのＺ００２８〜Ｚ００３２、ＳＳＲマーカーＺ０４１６を上記プライマー対で分析し、これらのマーカーは、雑種の鑑別に適していることが認められたが、本発明者らの同じ８シバ系統を使った試験をした結果、同様に配列表にあるすべてのプライマー対は本発明の鑑別に有用である。
【００１７】
本発明で使用する機器としては、例えば、Ｔ  ＧＲＡＤＩＥＮＴ  Ｔｈｅｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）、及びＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ）、ＤＮＡシーケンシングシステムＬＩＣ−４２００Ｌ（ｓ）（アロカ社）が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
本発明で使用する試薬としては、以下のものが例示される。
〈５０％アクリルアミドゲル〉
尿素（和光）、Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  Ｇｅｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ用（タカラバイオ株式会社）、１０ｘＴＢＥ  ｂｕｆｆｅｒ、１０％ＡＰＳ、ＴＥＭＥＤ（和光）。
【００１９】
〈ＰＣＲ反応液〉
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（和光純薬工業株式会社）、１ｐｍｏｌ／μｌ  Ｍ１３Ｆｏｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒは、ＩＲＤ７００もしくはＩＲＤ８００の蛍光標識を含む（日清紡）。
色素マーカー：
５０−３５０ｂｐ  ＳＩＺＩＮＧ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ−ＢＵＬＫ  （アロカ）
本発明では、アロカ社のプロトコールに基づいてゲルと色素マーカーの作成を行うことができる。しかし、試薬は、上記のものに限定されるものではない。
【００２０】
国内で育成されたシバ８品種・系統からＣＴＡＢ法を用いてゲノムＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡ溶液は、例えば、滅菌水でＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調整し、ＰＣＲ用のテンプレートＤＮＡとして用いた。ＰＣＲ反応液及びＰＣＲ反応条件は、例えば、以下のものが例示されるが、使用する機器及び試薬によって、適宜変更することができる。
【００２１】
ＰＣＲ反応液：〈計１０μｌ〉
検定対象系統から抽出したＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）：１μｌ
１０ｘＧｅｎｅ  Ｔａｑ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｂｕｆｆｅｒ：１μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ：０．８μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：６．５μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｆｏｒｗａｄ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．０６μｌ
Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｖｅｒｓｅ（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：０．３μｌ
Ｍ１３Ｆｏｒｗａｒｄ（−２９）Ｐｒｉｍｅｒ：０．３μｌ
Ｇｅｎｅ  Ｔａｑ  ＮＴ（５  ｕｎｉｔ／μｌ）：０．１μｌ
【００２２】
ＰＣＲ反応条件
最初に９５℃５分、それから９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（２サイクル）、９５℃１分−６５℃１分−７２℃１分３０秒（１０サイクル。１サイクルごとに６５℃を１℃ずつ下げていく）、９５℃１分−５５℃１分−７２℃１分３０秒（３０サイクル）、最後に７２℃７分で反応させた。ＰＣＲ増幅産物は、色素マーカー５μｌを加え、９０℃３分のディネーチャーを行った後、遮光し、氷上で１時間以上静置させることで安定させた後、アクリルアミドゲルを使用して電気泳動を行い、マーカーの増幅を確認する。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）本発明により、シバ属の種間及び種内雑種を簡単かつ正確に鑑別するシバのＳＳＲマーカーを検出するプライマーセットが提供される。
（２）これらのマーカーを利用することでほとんどの雑種を鑑別することが可能となる。
（３）シバ種間及び種内雑種の雑種個体の鑑別方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
（雑種個体鑑別ＳＳＲマーカーの選定）
本実施例では、俵山北１、首里、Ｆ２、室蘭２、松島２、Ｆ８、Ａ２９及び首里２の８系統をテンプレートとして使用した。そのうち、Ｆ８は、室蘭２と松島２の雑種個体、Ｆ２は、俵山北１と首里の雑種個体であると言われている。
【００２６】
上記８系統のＤＮＡを使って、シバＳＳＲマーカーのＺ００２８〜Ｚ００３２のＦ及びＲプライマーで分析した結果、Ｚ００３１プライマーは、８系統すべてで近いバンドを示すため、このマーカーは、上記の８系統の雑種の判別に適してないと思われる。これに対して、その他の４マーカーでは、雑種のＦ２とＦ８を除く６系統でほとんど異なるバンドを持っているので、これらのマーカーは、雑種の鑑別に適していると考えられる（図１）。
【００２７】
また、図１から、Ｆ８は、Ｚ００３１プライマー（８系統すべてで近いバンドを示すため除外）以外の４マーカーでは、すべて両親の室蘭２と松島２から１バンドずつ継承し、両親のヘテロ状態であるから、Ｆ８は、この両親の室蘭２と松島２の真の雑種であることを証明した。これに対して、Ｆ２は、Ｚ００３１プライマー以外の４マーカーは、すべて母親の俵山北１から１バンド継承するだけで、父親の首里からバンドを継承していないことから、このＦ２系統は、その両親と言われている俵山北１と首里の真の雑種ではなく、母親俵山北１の自殖後代であることが明らかになった（図１）。
【実施例２】
【００２８】
（人工交配で得た雑種集団からの真の雑種個体の鑑別）
室蘭２と俵山北１を使って、人工交配を行った。具体的には、開花期に両親個体を同じ交配用袋に入れ、自由に受粉させることで交配した。
【００２９】
室蘭２から得た種子を播種、育苗し、植物が４葉期ぐらいに、０．２ｇの葉をサンプリングし、ＤＮＡをＣＴＡＢ法で抽出した。
【００３０】
抽出したＤＮＡを２０ｎｇ／μｌの濃度に薄め、該ＤＮＡをテンプレートとして、シバＳＳＲマーカーＺ０４１６をＦ及びＲプライマー対で増幅した。Ｚ０４１６マーカーは、交配親の室蘭２と俵山北１において、それぞれ違う位置に２本のバンドを持っている。つまり、両方の親は、Ｚ０４１６の遺伝子座において、ともにヘテロ状態である。
【００３１】
図２に示したように、＊印の個体は、ともに両親から１本ずつのバンドを継承しているので、真の雑種である。逆に、それ以外の個体は、母親室蘭２の２本のバンドのうち、１本か２本継承しただけで、もう一方の親俵山北１から継承していないため、真の雑種ではない。
【００３２】
表１に、マーカーリスト及び本発明のプライマー対の塩基配列を示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
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【００４０】
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【００４１】
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【００４２】
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【００４３】
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【００４４】
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【００４５】
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【００５４】
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【００５５】
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【００５６】
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【００５７】
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【００５８】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
以上詳述したように、本発明は、シバ属内の種間及び種内雑種の鑑別に有用なＳＳＲプライマー対とその利用に係るものであり、本発明により、シバ属の種間及び種内雑種を簡単かつ正確に鑑別するシバのＳＳＲマーカーを検出するプライマーセットが提供される。これらのマーカーを利用することでほとんどの雑種を鑑別することが可能となる。本発明は、シバ種間及び種内雑種の雑種個体の鑑別方法を提供するものとして有用である
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】実施例１におけるＺ００２８〜Ｚ００３２マーカーをＦ及びＲプライマー対を用いたＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す。
【図２】実施例２におけるＺ０４１６マーカーをＦ及びＲプライマー対を用いた雑種集団のＰＣＲ増幅産物の電気泳動の結果を示す。＊印の個体：本当の雑種個体。
【符号の説明】
【００６１】
１  俵山北１
２  首里
３  Ｆ２
４  室蘭２
５  松島２
６  Ｆ８
７  Ａ２９
８  首里２
【図１】
2008245572.tif 000029
【図２】
2008245572.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月18日(2007.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008245572000001.app