(57)【要約】      （修正有）【課題】蛍光性GFP変異体を発現する細胞に対する免疫反応を回避した実験動物の提供。【解決手段】EGFPアミノ酸配列の66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置に置換、欠失、又は挿入があり、かつ実質的に非蛍光性であるGFP変異体（例えば、特定の配列を有する蛋白質等）及び該蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。癌細胞の移植実験及び多様な臓器の幹細胞移植実験や再生医療の基礎実験に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示し、かつ実質的に非蛍光性である蛋白質。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質において、下記（１）〜（３）：
（１）66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
（２）66位、67位、及び68位から選択される一個以上のアミノ酸の欠失；及び
（３）66位及び67位アミノ酸間、又は67位及び68位アミノ酸間への1以上のアミノ酸の挿入から選択される何れか1以上の変異が存在し、かつ実質的に非蛍光性である蛋白質。
【請求項３】
67位がアラニン又はグリシンである請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項６】
配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の蛋白質を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
非ヒト哺乳動物がマウスである請求項８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に蛍光性GFP変異体を発現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非蛍光性GFP変異体、及び該GFP変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑色蛍光蛋白質（Green Fluorescent Protein:GFP）はクラゲのAequorea victoria由来の天然蛋白質であり、その蛍光性はアミノ酸配列中のトリペプチド(Ser65-Tyr66-Gly67)からなる環状の蛍光発色団を囲んだβ―バレル構造に由来している。蛍光性を維持又は改善した蛍光性GFP変異体について数多くの報告がなされており（米国特許5625048号明細書、国際公開WO96/23810号、米国特許5804387号明細書、特表2000-509987号公報、米国特許6054321号明細書、国際公開WO03/029286号）、その中で、65位セリンのスレオニンへの置換を含む変異体は、人工的アミノ酸置換によって蛍光を増幅させたEGFP（enhanced GFP）として、生物・医学研究に広く使用されている（非特許文献１：Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003）。
【０００３】
EGFP の有用な用途と１つとして培養癌細胞の標識が挙げられる。例えば、マウスColon26細胞は直腸粘膜下組織に移植されると、組織基質と相互作用して初期癌を形成し、さらに、リンパ節、肝臓、及び肺等の他の組織に広がって転移するが、EGFPを発現させたマウスColon26細胞を用いることによりこの転移が追跡できる。すなわち、EGFPを発現させた癌細胞を実験動物に移植し、インビボでこの蛍光細胞をモニターすることにより、転移工程の制御の解明や、治療薬の試験開発を行うことができる。
【０００４】
しかし、EGFPを発現させたBalb/cマウス系統由来のColon26細胞を同系マウスに移植すると細胞性T細胞応答が引き起こされること（非特許文献３：Gene Therapy，6，1305-1312, 1999）及び、EGFPを発現させるとBalb/cマウス系統由来のColon26細胞の同系マウスの肝臓での転移の効率が落ちること（非特許文献３：Clin. & Exp. Metastasis 20, 135-141, 2003）が報告され、免疫反応によりEGFP発現癌細胞のマウス生体への移植率が低下するという問題点があることがわかった。従って、このような免疫反応を回避したEGFPを有効な指標として使用することのできる実験動物が望まれていた。
【特許文献１】米国特許5625048号明細書
【特許文献２】国際公開WO96/23810号
【特許文献３】米国特許5804387号明細書
【特許文献４】特表2000-509987号公報
【特許文献５】米国特許6054321号明細書
【特許文献６】国際公開WO03/029286号
【非特許文献１】Nature Reviews Genetics 4: 613-625, 2003
【非特許文献２】Gene Therapy 6, 1305-1312, 1999
【非特許文献３】Clin. & Exp. Metastasis 20, 135-141, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、蛍光性GFP変異体を発現する細胞に対する免疫反応を回避した実験動物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題の解決のため鋭意検討した結果、EGFPと同じ抗原性を示すが非蛍光性であるGFP変異体を発見し、このGFP変異体を発現するトランスジェニックマウスがEGFPを発現させたColon26細胞によって抗EGFP抗体を産生しないことを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。
【０００７】
すなわち本発明は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質と同じ抗原性を示し、かつ実質的に非蛍光性である蛋白質を提供する。本発明の好ましい態様によれば、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質において、下記（１）〜（３）：
（１）66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
（２）66位、67位、及び68位から選択される一個以上のアミノ酸の欠失；及び
（３）66位及び67位アミノ酸間、又は67位及び68位アミノ酸間への1以上のアミノ酸の挿入から選択される何れか1以上の変異が存在し、かつ実質的に非蛍光性である蛋白質が提供される。
本発明のさらに好ましい態様によれば、67位がアラニン又はグリシンである該蛋白質、及び配列表の配列番号２に記載の配列を有する蛋白質が提供される。
【０００８】
本発明の別の観点からは、上記のいずれかの蛋白質をコードする遺伝子；配列表の配列番号３に記載の塩基配列を有する遺伝子；上記のいずれかの遺伝子を含むベクター；上記のいずれかの蛋白質を発現するトランスジェニックマウス等のトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
本発明のさらに別の観点からは、上記のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に蛍光性GFP変異体を発現する細胞を移植する工程を含む生物化学的実験法が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により癌細胞の移植実験及び多様な臓器の幹細胞移植実験や再生医療の基礎実験に有用なトランスジェニック非ヒト哺乳動物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の蛋白質は、蛍光性GFP変異体と同じ抗原性を示すが実質的に非蛍光性であるGFP変異体（以下MGFPということがある。）であることを特徴とする。本明細書において「実質的に非蛍光性」とは、GFPの蛍光と比較して１％以下の蛍光を有し、蛍光顕微鏡で実質的に蛍光が観測されないことをいう。本明細書において「蛍光性GFP変異体」とは、「配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列又は配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されていてもよいアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質」を意味し、野生型GFP（配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質）を含む意味である。その他の蛍光性GFP変異体の例としては例えばEGFP（配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質）などが挙げられる。
【００１１】
蛍光性GFP変異体と同じ抗原性を示す蛋白質としては、細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示されるアミノ酸残基を維持する蛋白質が挙げられる。細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示されるアミノ酸残基については、提示されたアミノ酸断片の配列分析などの手法により実験的に確認するか、又はプログラムにより予測することができる。プログラムを用いた予測としては例えば、HLA peptide Binding Predictions (http://bimas.dcrt.nih.gov:80/molbio/hla_bind/; Parker, 1994)を使用することができる。本発明者らが、HLA peptide Binding Predictions を使用してEGFP のアミノ酸配列を基に細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）により提示されるアミノ酸残基を予測した結果、EGFPの蛍光発色団を構成する３アミノ酸(66位-68位)は、図１に示すようにMHCによってBalb/cマウスの細胞表面に提示されていないことが分かった。なお、図中、Kdはマウスゲノム中のH-2K遺伝子座にコードされるクラスI MHC分子、Ddはマウスゲノム中のH-2D遺伝子座にコードされるクラスI MHC分子を示し、囲われた文字に該当するアミノ酸残基がMHC分子により提示されないことを示す。
【００１２】
蛍光性のないGFP変異体としては、例えばEGFP の66位、67位、及び68位からなるトリペプチドから構成される蛍光発色団の形成を阻害するような改変のあるMGFPであればよく、そのようなGFP変異体としては、EGFP又はEGFPのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質において下記（１）〜（３）：
（１）66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置のアミノ酸置換；
（２）66位、67位、及び68位から選択される一個以上のアミノ酸の欠失；及び
（３）66位及び67位アミノ酸間、又は67位及び68位アミノ酸間への1以上のアミノ酸の挿入から選択される何れか1以上の変異が存在する蛋白質が挙げられる。ここで、EGFPのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されているアミノ酸配列を有する蛍光性蛋白質については、アミノ酸の欠失又は付加等により配列番号にズレが生じる場合があるが、該蛋白質における66位、67位、及び68位は、EGFPのアミノ酸配列における66位、67位、及び68位（Thr66-Tyr67-Gly68）に該当する位置を示す。上述の本発明者らの予測からこのようなペプチドは蛍光性GFP変異体と同じ抗原性を示す蛋白質でもある。これらのうちで、66位、67位、及び68位から選択される一個以上の位置にアミノ酸置換がある蛋白質が好ましい。
【００１３】
蛍光性GFP変異体については上述のように数多く報告されているが、本発明の蛋白質はこれらの蛍光性GFP変異体を含まない。蛍光性GFP変異体としては、野生型GFP（配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列）において、65位セリンのグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、又はスレオニンへの置換を有する変異体及び66位チロシンのヒスチジン、トリプトファン、又はフェニルアラニンへの置換を有する変異体が挙げられる。野生型GFPアミノ酸配列において、65位、66位、又は67位の2箇所以上に置換があることにより、上述の65位セリン及び66位チロシンの置換を含むが非蛍光性である変異体は本発明の範囲に含まれる。MGFPとしては、野生型GFP のアミノ酸配列において、66位がグリシン又はアラニンであるのが好ましく、66位がアラニンであることが最も好ましい。このとき65位セリンはスレオニンであることが好ましい。さらに好ましくは、MGFPは、EGFPのアミノ酸配列において、好ましくは、67位のグリシン又はアラニンへの置換を有する蛋白質であり、さらに好ましくは67位のアラニンへの置換を有する蛋白質であり、最も好ましくは配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質である。
【００１４】
上記のMGFP（本発明の蛋白質）をコードする遺伝子の作製方法としては、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発を用いた方法等の当業者に既知の方法のいずれを用いてもよい。例えば、野生型GFP又はEGFPをコードするDNAに対して変異原となる薬剤を接触作用させたり、紫外線を照射したり、あるいはPCR法などの遺伝子工学的手法を用いることによりMGFPをコードする遺伝子を得ることができる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法については、Molecular Cloning: A laboratory  Mannual, 2nd ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,  NY.,1989、及びCurrent Protocols in Molecular Biology， Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)を参照することができる。また、市販の変異用キットを用いることもできる。市販の変異用キットとしては、QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)等を挙げることができる。
【００１５】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法などによりMGFPをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などにMGFPをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製することもできる。
【００１６】
トランスジェニック 非ヒト哺乳動物の作製のために用いる導入遺伝子は、上記のMGFPをコードする遺伝子を適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した遺伝子構築物とすることが好ましい。例えば、各種プロモーターの下流に、上記のMGFPをコードする遺伝子を含む導入遺伝子を連結した発現ベクターを用いてもよく、また、発現ベクターとして作製した後、制限酵素で切断して精製等を行った遺伝子構築物を用いてもよい。
【００１７】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられ、公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。
【００１８】
遺伝子構築物に用いる哺乳動物用プロモーターの種類は、非ヒト哺乳動物で作動可能であれば特に限定されないが、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーターなどが用いられる。各哺乳動物由来のプロモーターとしては、例えば、アルブミン、エンドセリン、メタロチオネイン、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなどのプロモーターを用いることができる。
【００１９】
好ましいプロモーターとしては、βアクチンプロモーター及びＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターなどが挙げられる。これらのプロモーターは一般的にＣＭＶエンハンサーとの組み合わせとして使用される。このような組み合わせとしては例えば、pCAGGS；chicken beta-actin promoter and cytomegalo virus enhancer. Beta-actin intron and bovine globin poly-adenylation signal（Gene, 108,1 93, 1991参照）等が挙げられる。
【００２０】
遺伝子構築物においては、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含んでいてもよい。使用できるエンハンサー配列としては上記したＣＭＶエンハンサーなどが挙げられる。
また、遺伝子構築物においては、必要に応じて、上記のMGFPをコードする遺伝子の下流には、ポリＡシグナルを連結してもよい。ポリＡ付加シグナル配列の具体例としては、ＳＶ４０ポリＡ付加シグナルなどが挙げられるが、これに限定されない。また、必要に応じて真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３'下流 に連結してもよい。
【００２１】
例えば、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵にMGFPをコードする遺伝子又は該遺伝子を含む遺伝子構築物を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト哺乳動物に移植し、当該非ヒト哺乳動物からMGFPをコードする遺伝子が導入された非ヒト哺乳動物を分娩させることにより作製することができる。
受精卵細胞段階で遺伝子導入する場合は、対象の哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するようにすることが好ましい。トランスジェニック後の作出動物の胚芽細胞において導入遺伝子が存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに導入遺伝子を有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てにMGFPをコードする遺伝子を有する。MGFPをコードする遺伝子を相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００２２】
導入遺伝子を対象非ヒト哺乳動物またはその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン（PMSG））、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG））を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
【００２３】
得られた受精卵に前述の方法によりMGFPをコードする遺伝子等を導入した後、雌哺乳動物に人工的に移植・着床することにより、MGFPをコードする遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト哺乳動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）を投与後、雄哺乳動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌哺乳動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させる方法が好ましい。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵のほかに初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック非ヒト哺乳動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、DNAのマイクロインジェクションが好ましい。また、注入する導入遺伝子の数は受精卵１個当たり、例えば１００〜３０００分子であればよい。
【００２４】
遺伝子注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子（F1）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（F2）を作成することができる。
【００２５】
あるいは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、MGFPをコードする遺伝子をＥＳ細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞（blastcyst）に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞（embryonic stem cell）に、遺伝子を導入する。遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をHATセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。
【００２６】
上記した本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の子孫、並びに該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部も本発明の範囲内である。トランスジェニック非ヒト哺乳動物の一部としては、該非ヒト哺乳動物の細胞内小器官、細胞、組織および臓器のほか、頭部、指、手、足、腹部、尾などが挙げられる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびサルなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。非ヒト哺乳動物としてはマウス、ラット、モルモットなどの齧歯目の哺乳動物が好ましく、マウスが特に好ましい。マウスとしては、例えば、純系としてはC57BL/6系統，DBA2系統などが挙げられ、交雑系としてはB6C3F1系統，BDF1系統，B6D2F1系統， Balb/c系統，ICR系統などが挙げられるが、Balb/c系統マウスが好ましい。
【００２７】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に、蛍光性GFP変異体を発現する細胞を移植し、その蛍光を指標として該細胞の移動、増殖等を追跡し、生物化学的実験を行うことができる。
蛍光性GFP変異体としては例えばEGFPを用いることが好ましい。
蛍光性GFP変異体を発現する細胞は、上述の発現ベクター等の遺伝子構築物を受精卵等に導入する方法と同様に、蛍光性GFP変異体をコードする遺伝子を細胞に導入し培養すること等により調製することができる。蛍光性GFP変異体を発現させる細胞としては、Colon26細胞、HCA-7ヒト大腸癌細胞などの培養癌細胞、又は胚細胞・胎児細胞や分化初期の臓器細胞等が挙げられる。
生物化学的実験としては、例えば、蛍光性GFP変異体を発現する培養癌細胞を用いて癌細胞転移の等を行う実験等を挙げることができる。蛍光性細胞の増減を指標として治療薬の試験開発を行うことも可能である。その他、生物化学的実験としては、臓器の幹細胞移植実験や再生医療の基礎実験等が挙げられる。
【実施例】
【００２８】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、MGFPとしては配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を用いた。
（例１）MGFP発現ベクターの作製
サイトメガロウイルスエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモーター、βアクチンイントロン、EGFPのｃDNA、及び牛グロブリンポリアデニル化シグナルを含むｐCX-EGFPベクターを既に報告されている方法（FEBS Letters, 407,313,1997）に従って作製した。QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてEGFPのｃDNA の66位チロシンのTACコドンをGCCコドン（アラニン）に変えて、pCX-EGFPベクターと同様にpCX-MGFPベクターを作製した。
【００２９】
（例２）MGFPトランスジェニックマウスの作製
プロモーター、MGFPｃDNA、及びポリアデニル化シグナルを含む挿入部分はpCX-MGFPベクターからBamHI and SalIで切断し、得られたフラグメントをフェノール及びクロロホルムで精製した（FEBS Lett. 407: 313-319, 1997参照）。精製したフラグメントをBalb/cマウス受精卵にマイクロインジェクション法により挿入し、トランスジェニックマウス株を産生した（トランスジェニックマウス株の産生は（財）実験動物中央研究所 (川崎)において行った）。DNA挿入した受精卵を393個、擬妊娠母親マウスに移植し、45の仔マウスを得た。トランス遺伝子の有無は、尾部組織から採取したDNAをMGFPcDNAをテンプレートとしたサザンブロッティングを行うことにより確認した。
【００３０】
（例３）発現ベクターの293T及びColon26細胞への挿入
ｐCX-EGFP及びｐCX-MGFPプラスミドをそれぞれLipofectamine (Invitrogen)を用いて製造元のプロトコルに従って、293T及びColon26細胞に挿入した。72時間後、細胞溶解液を調製、分離してナイロン膜にブロットして抗EGFP抗体（Molecular Probes）とインキュベートした。このウェスタンブロッティングの結果を図２に示す。293T及びColon26細胞において挿入された遺伝子に基くEGFP 又はMGFPが産生されていることがわかる。
【００３１】
（例４）蛍光細胞の解析
例３と同様の遺伝子導入を行ったColon26及び293T細胞を、遺伝子導入70時間後、蛍光顕微鏡（(Leica)によって観測、撮影した。それぞれの細胞における結果を図３及び４（上、中）に示す。定量化のため細胞はFACS Calibur (Becton Dickinson)を用いて解析した。EGFP遺伝子を導入した細胞で観測されている蛍光がMGFPを導入した細胞では観測されていないことがわかる。この結果はフローサイトメトリーによっても確認した（図３及び４下）。
【００３２】
（例５）マウス血清中の抗EGFP抗体の解析
EGFPを発現するColon26細胞を雌性Balb/cマウス(CLEA)の直腸粘膜下組織に、既に報告されている方法（Cancer Lett. 169: 77-85, 2001）に従って移植した。MGFPトランスジェニックマウスについても同様にした。2週間後、移植されたマウスからそれぞれ血清を採取し一次抗血清としてウェスタンブロッティングに用いた。結果を図５に示す。EGFPを発現するColon26細胞を移植したBalb/cマウスの血清に抗EGFP抗体及び抗MGFP抗体が産出されていることがわかる。一方、トランスジェニックマウスの血清には、抗EGFP抗体及び抗MGFP抗体のいずれも産出されていないことがわかる。
（例６）細胞の移植率の解析
Colon26細胞又はEGFPを発現するColon26細胞（1×106個）を、Balb/cマウス又はMGFPトランスジェニックマウス直腸粘膜下結合組織内に移植した。４週間後、直腸に形成された原発巣の体積を測定して、両マウスで比較した。結果を図６に示す。EGFPを発現するColon26細胞はEGFPを発現しないColon26細胞と比較して免疫応答性Balb/cマウス中での増殖が遅いことがわかる。MGFPトランスジェニックマウス中での増殖は両者で同じであった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】EGFPにおける抗原性エピトープのコンピューター解析の結果である。囲われた文字はKd及びDdそれぞれによって提示されないアミノ酸を示す。
【図２】EGFP及びMGFPの293T及びColon26細胞における発現を示したウェスタンブロッティングである。
【図３】EGFP又はMGFP を発現するColon26細胞の蛍光顕微鏡撮影写真及びフローサイトメトリーである。
【図４】EGFP又はMGFP を発現する293T細胞の蛍光顕微鏡撮影写真及びフローサイトメトリーである。
【図５】細胞移植によりマウス血清中に産出された抗体を検出するウェスタンブロッティングである。
【図６】通常のBalb/cマウスと本発明のトランスジェニックマウスにおけるEGFP発現細胞の原発巣体積を比較したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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