(57)【要約】      （修正有）【課題】定量性に優れ且つ同一反応液中の複数の増幅産物を各々検出可能な、新たなＰＣＲ増幅産物の検出方法を提供する。【解決手段】標的配列を鋳型とし、これにプライマーと標識化プローブとをアニーリングさせる。ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性により、標的配列にアニーリングしたプライマーから標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を５’→３’方向に伸長させ、且つ、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、標的配列にアニーリングした標識化プローブを分解し、標識化物質が結合した断片を遊離させる。この伸長反応（それに伴う分解反応）を繰り返し、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を増幅する。この反応液について質量分析を行い、遊離した標識化物質結合断片の有無や量を検出して、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または増幅量を検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＲによって増幅した、標的配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｆ）工程を含むことを特徴とする伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
（Ａ）  標的配列、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ならびに、オリゴヌクレオチドプローブに標識化物質が結合した標識化プローブを含む反応液を準備する工程
（Ｂ）  前記標的配列を鋳型として、これに前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｃ）  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングしたプライマーから前記標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を５’→３’方向に向かって伸長させ、且つ、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングした標識化プローブを分解して、前記標識化物質が結合した断片を遊離させる工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で生成した、前記標的配列とそれに相補的な伸長ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖を解離し、両者を鋳型として、前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｅ）  前記工程（Ｃ）および工程（Ｄ）を繰り返し行うことによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を増幅する工程
（Ｆ）  前記反応液について質量分析を行い、前記（Ｃ）工程において遊離する前記標識化物質が結合した断片の有無または量を検出することによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または増幅量を検出する工程
【請求項２】
前記標識化プローブが、オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に標識化物質が結合したプローブである、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記（Ｃ）工程において遊離する前記標識化物質が結合した断片が、前記標識化物質とヌクレオチド１分子との結合体であり、
前記（Ｆ）工程において、質量分析により前記結合体の有無または量を検出することによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または量を検出する、請求項１または２記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項４】
前記（Ａ）工程において、前記反応液が、二種類以上の標的配列、および、前記各標的配列に対応する二種類以上のプライマーならびに二種類以上の標識化プローブを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項５】
前記（Ｃ）工程において、二種類以上の各標識化プローブから、前記標識化物質が結合した断片であり且つ異なる質量の断片を、それぞれ遊離させる、請求項４記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項６】
前記二種類以上の各標識化プローブにおいて、それぞれの標識化物質が、異なる質量の物質である、請求項４または５記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項７】
前記二種類以上の各標識化プローブにおいて、標識化物質が結合するヌクレオチドの塩基がそれぞれ異なる塩基である、請求項４から６のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項８】
前記二種類以上の各標識化プローブにおいて、それぞれの標識化物質が異なる質量の物質であり、且つ、標識化物質が結合するヌクレオチドの塩基がそれぞれ異なる塩基である、請求項４から７のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項９】
前記標識化物質が、フルオレセイン、ローダミンおよびビオチンからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１から８のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１０】
フルオレセインが、６−カルボキシフルオレセインである、請求項９記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１１】
質量分析におけるイオン化法が、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＬＤ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｉｍｐａｃｔ）法、ＣＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＡＰＩ（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＦＩ（Ｆｉｅｌｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＦＤ（Ｆｉｅｌｄ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）法、ＳＩＭＳ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）法、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｎｂａｒｄｍｅｎｔ）法、および、ＴＳＰ（ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法からなる群から選択された少なくとも一つの方法である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１２】
前記（Ｆ）工程において、前記反応液を液体クロマトグラフィーに供した後に質量分析を行う、請求項１から１１のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１３】
前記標的配列が、ＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成したｃＤＮＡである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１４】
前記（Ｅ）工程において、前記（Ｃ）工程のサイクル数が、５以上である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１５】
前記（Ｅ）工程において、経時的に、前記（Ｆ）工程における質量分析を行う、請求項１から１４のいずれか一項に記載の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法。
【請求項１６】
ＰＣＲによって増幅した、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の検出により、標的配列を測定する方法であって、下記（Ｇ）および（Ｈ）工程を含むことを特徴とする測定方法。
（Ｇ）  請求項１から１５のいずれか一項に記載の検出方法により、反応液に含まれる増幅した前記伸長ＤＮＡ鎖を検出する工程
（Ｈ）  前記（Ｇ）工程の検出結果に基づいて、前記反応液における標的配列の定性または定量を行う工程
【請求項１７】
前記（Ｈ）工程において、前記（Ｇ）工程の検出結果に基づき、増幅した伸長ＤＮＡ鎖を定量し、前記伸長ＤＮＡ鎖が所定量となった際のＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記反応液における標的配列を定量する、請求項１６記載の測定方法。
【請求項１８】
前記標的配列がＲＮＡから逆転写反応により合成したｃＤＮＡである、請求項１６または１７記載の測定方法。
【請求項１９】
さらに、下記（Ｉ）工程を含む、請求項１８記載の測定方法。
（Ｉ）  前記標的配列であるｃＤＮＡを定量し、この結果に基づいて、前記逆転写反応においてｃＤＮＡの鋳型となったＲＮＡを定量する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲにより増幅させた伸長ＤＮＡ鎖の検出方法、および、ＰＣＲの鋳型となる標的配列の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
病理学や臨床学の様々な分野において、遺伝子の発現解析、機能解析、診断等を目的としてポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法が広く利用されている。ＰＣＲ法は、一般に、（１）二本鎖ＤＮＡから鋳型となる一本鎖ＤＮＡへの解離、（２）鋳型一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸に相補的なＤＮＡを増幅する方法である。
【０００３】
近年では、ＰＣＲにおける増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングする、いわゆるリアルタイムＰＣＲが、様々な用途に利用されている。リアルタイムＰＣＲは、一般的に、ＰＣＲ産物の増幅に伴って発光強度が増大する蛍光物質（もしくは発光強度が減少する蛍光物質）を共存させてＰＣＲを行い、増加する発光強度（もしくは減少する蛍光強度）を、ＰＣＲ機器と光学的な検出器とを組み合わせた装置で、経時的にモニタリングする方法である。このようなリアルタイムＰＣＲによれば、例えば、１サイクルごとの増幅産物の定量や、増幅産物が所定量（閾値）に達する際のサイクル数をカウントすることが可能であり、さらに、それらの情報に基づいて、試料に含まれていた標的配列を定量することも可能である。特に、ＲＮＡの発現解析においては、ＲＮＡの発現量が低い場合でも、逆転写ＰＣＲ法によってＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、目的のｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲで増幅することによって、従来よりも正確な定量が可能となっている。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲにおける蛍光検出法としては、インターカレーター法、Ｔａｑ
Ｍａｎ（商標）プローブ法、ハイブリダイゼーション法等が広く採用されている。「インターカレーター法」は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートし、励起光を照射すると蛍光を発するインターカレーター（例えば、商品名ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ）を使用する方法である。この方法では、相補鎖が伸長されれば、鋳型と相補鎖との二本鎖にインーカレーターが入り込み、励起光照射によって蛍光を発するため、増幅による蛍光強度の増加をモニタリングすればよい。また、「Ｔａｑ  Ｍａｎ（商標）プローブ法」は、５’末端に蛍光物質を、３’末端にクエンチャーを結合させたプローブを使用する方法である。前記プローブは、鋳型にアニールしたのみでは、励起光を照射しても前記クエンチャーにより蛍光物質の蛍光は抑制されるが、相補鎖が伸長されると、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により前記プローブが分解され、蛍光物質がクエンチャーから離れることにより蛍光を発する。このため、この方法では、増幅による蛍光強度の増加をモニタリングすればよい。「ハイブリダイゼーション法」は、３’末端がアクセプター蛍光物質で標識化されたプローブと、５’末端がドナー蛍光物質で標識化されたプローブとを用いる方法である。前記二種類のプローブは、鋳型にアニールすると、アクセプター蛍光物質とドナー蛍光物質とが隣接して蛍光が発生するが、相補鎖が伸長されると、アクセプター蛍光物質で標識されたプローブが分解され、アクセプター蛍光物質がドナー蛍光物質から離れることにより蛍光を発生しなくなる。したがって、この方法では、増幅による蛍光強度の減少を測定すればよい。
【０００５】
しかしながら、前述のようなリアルタイムＰＣＲは、スループットや定量性に優れるものの、蛍光検出が必須であることから、クロストーク（漏話）等が問題視されている。特に、１つの反応液中で二種類以上の標的核酸についてＰＣＲを行った場合、それぞれの標的核酸に対する相補的伸長鎖を検出するには、各プローブについて異なる検出波長の蛍光物質を結合させる必要がある。しかし、各蛍光物質の最大吸収波長が異なっていても、例えば、スペクトルの端部が重複するおそれがあるため、互いの影響を受けることなく、それぞれの発現量を正確に測定することが困難である。また、スペクトルが重複しない蛍光物質を選択する方法も考えられるが、そのような蛍光物質の組み合わせには限りがあるため、一つの反応液中で所望の複数種類の相補的伸長鎖を分析することは現実的ではない。
【非特許文献１】BioTechniques,  27,  342−349.(1999)  “Seven-color,  homogeneous  detection  of  six  PCR  products.”  Lee,L.G.,  Livak,K.J.,  Mullah,B.,  Graham,R.J.,  Vinayak,R.S.  and  Woudenberg,T.M.
【非特許文献２】Nucleic  Acids  Research,  2006,  Vol.34,  No.1  “TaqMan  probe  array  for  quantitative  detection  of  DNA  targets”  Heping  Liu1,  Hong  Wang,  Zhiyang  Shi,  Hua  Wang,  Chaoyong  Yang,  Spering  Silke,  Weihong  Tan  and  Zuhong  Lu
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、ＰＣＲの増幅産物を検出する新たな方法の提供を目的とする。より詳細には、定量性に優れ、且つ、同一反応液中の複数の増幅産物をそれぞれ検出することが可能な、新たなＰＣＲ増幅産物の検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の検出方法は、ＰＣＲによって増幅した、標的配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｆ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  標的配列、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ならびに、オリゴヌクレオチドプローブに標識化物質が結合した標識化プローブを含む反応液を準備する工程
（Ｂ）  前記標的配列を鋳型として、これに前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｃ）  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングしたプライマーから前記標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を５’→３’方向に向かって伸長させ、且つ、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングした標識化プローブを分解して、前記標識化物質が結合した断片（以下、「標識化物質結合断片」という）を遊離させる工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で生成した、前記標的配列とそれに相補的な伸長ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖を解離し、両者を鋳型として、前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｅ）  前記工程（Ｃ）および工程（Ｄ）を繰り返し行うことによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を増幅する工程
（Ｆ）  前記反応液について質量分析を行い、前記（Ｃ）工程において遊離する前記標識化物質が結合した断片の有無または量を検出することによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または増幅量を検出する工程
【０００８】
また、本発明の測定方法は、ＰＣＲによって増幅した、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の検出により、標的配列を測定する方法であって、下記（Ｇ）および（Ｈ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｇ）  本発明の検出方法により、反応液に含まれる増幅した前記伸長ＤＮＡ鎖を検出する工程
（Ｈ）  前記（Ｇ）工程の検出結果に基づいて、前記反応液における標的配列の定性または定量を行う工程
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検出方法では、質量分析によって、ＰＣＲ反応において遊離する標識化物質結合断片の有無や量を検出し、間接的に、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を検出する方法である。質量分析は、非常に定量性に優れることから、これを利用した本発明は、定量性に優れる新たな増幅産物の検出方法といえる。また、蛍光物質を使用した蛍光強度の測定とは異なり、質量分析においては、例えば、クロストーク等の問題がない。このため、同一反応液中の複数の伸長ＤＮＡ鎖を検出する場合でも、各標的配列に対応する標識化プローブから遊離する標識化物質結合断片のそれぞれが、例えば、イオン化によって、異なる分子イオンのピークを示したり、異なるフラグメントイオンピークを示せば、質量分析によって各々を検出することが可能である。したがって、本発明の検出方法によれば、分析対象試料について、複数の標的配列の定性・定量を行う場合であっても、同一反応液において複数の標的配列に対するＰＣＲを行うことができ、且つ、互いの影響を受けることなく、各々の伸長ＤＮＡ鎖を高精度で分析することができる。このため、本発明は、病理学や臨床学、分子生物学等の様々な分野において、極めて有用な方法といえる。なお、ＰＣＲにより増幅した伸長ＤＮＡ鎖自体を質量分析により検出することは試みられているが、本発明のように、ＰＣＲ反応によって標識化プローブより遊離する標識化物質結合断片を質量分析により検出することは、本発明者らが初めて見出した手法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の検出方法は、前述のように、ＰＣＲによって増幅した、標的配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を検出する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｆ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  標的配列、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ならびに、オリゴヌクレオチドプローブに標識化物質が結合した標識化プローブを含む反応液を準備する工程
（Ｂ）  前記標的配列を鋳型として、これに前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｃ）  ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングしたプライマーから前記標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を５’→３’方向に向かって伸長させ、且つ、前記ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、前記標的配列にアニーリングした標識化プローブを分解して、前記標識化物質結合断片を遊離させる工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で生成した、前記標的配列とそれに相補的な伸長ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖を解離し、両者を鋳型として、前記プライマーおよび前記標識化プローブをアニーリングさせる工程
（Ｅ）  前記工程（Ｃ）および工程（Ｄ）を繰り返し行うことによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を増幅する工程
（Ｆ）  前記反応液について質量分析を行い、前記（Ｃ）工程において遊離する前記標識化物質結合断片の有無または量を検出することによって、前記標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または増幅量を検出する工程
【００１１】
ＰＣＲにおける標的配列は、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）の他に、ＲＮＡから逆転写により合成したｃＤＮＡ等があげられる。特に、ＲＮＡから合成したｃＤＮＡを標的配列とすれば、例えば、低発現のＲＮＡの有無を間接的に検出することが可能である。
【００１２】
前記標識化物質としては、何ら制限されず、あらゆる物質が使用できる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、標識化プローブから標識化物質のみが切断されるものでないことが好ましい。前記標識化物質としては、例えば、イオン化可能な有機化合物が好ましく、より好ましくはイオン化可能な芳香族有機化合物である。具体例としては、例えば、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）等のフルオレセイン、ローダミン、ビオチン等があげられるが、これらは本発明における一例であり、何ら制限されない。
【００１３】
オリゴヌクレオチドプローブにおいて、標識化物質を結合させる基は、特に制限されず、例えば、塩基、糖、リン酸のいずれの基でもよい。また、前記（Ｆ）工程においては、標識化プローブの分解物のうち標識化物質が結合した断片を、質量分析によって検出することから、前記標識化物質は、少なくとも前記（Ｃ）工程においてＤＮＡポリメラーゼにより遊離されることとなる部位に結合していればよい。中でも、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によれば、通常、プローブの５’側から断片が遊離するため、例えば、前記オリゴヌクレオチドプローブの５’末端に結合させることが好ましい。
【００１４】
前記（Ｃ）工程において、標識化プローブの分解により遊離する標識化物質結合断片（以下、質量分析の対象となることから、「ターゲット物質」ともいう）としては、例えば、前記標識化物質とヌクレオチド１分子とが結合した結合体であることが好ましい。このヌクレオチドは、前記標識化プローブにおいて、前記標識化物質が結合した部位のヌクレオチドである。遊離する断片が、前記標識化物質とヌクレオチド１分子との結合体であることは、特に、１つのＰＣＲ反応液で、二種類以上の伸長ＤＮＡ鎖をそれぞれ検出する際に好ましい。この理由については後述する。遊離する断片としては、この他に、前記標識化物質がオリゴヌクレオチドに結合した結合体であってもよい。なお、この結合体は標識化プローブの分解物であるため、前記結合体を構成するオリゴヌクレオチドは、少なくとも前記オリゴヌクレオチドプローブよりも短い配列となる。
【００１５】
なお、本発明においては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により遊離したヌクレオチドを「遊離ヌクレオチド」、遊離したオリゴヌクレオチドを「遊離オリゴヌクレオチド」、標識化物質を結合させるプローブを「オリゴヌクレオチドプローブ」、前記プローブの構成成分であるヌクレオチドを「構成ヌクレオチド」という。
【００１６】
前記遊離する断片を、標識化物質が結合した「遊離ヌクレオチド」とするか、標識化物質が結合した「遊離オリゴヌクレオチド」とするかは、通常、使用するＤＮＡポリメラーゼの種類に応じて決定できる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、ポリメラーゼ活性および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していれば、その種類は特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のＤＮＡポリメラーゼがあげられる。ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、自家調製してもよいし、市販のものを使用してもよい。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９１／０９９５０）（ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９２／９６８８）（Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅｓ社製）、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ４５５４３０）（商標Ｖｅｎｔ：Ｂｉｏｌａｂ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ社製）等が商業的に入手可能である。中でも、５’末端からヌクレオチドを１分子ずつ遊離させる場合は、テルムス・アクアティカス由来ＤＮＡポリメラーゼ（商品名Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）等を使用することが好ましい。なお、ＤＮＡポリメラーゼが、ヌクレオチドを遊離するかオリゴヌクレオチドを遊離するかが不明の場合でも、例えば、予め確認すれば足り、当業者であれば容易に行うことができる。
【００１７】
本発明の検出方法によれば、一種類の伸長ＤＮＡ鎖を検出するのはもちろんのこと、一つの反応液において二種類の伸長ＤＮＡ鎖を増幅させた場合であっても、それぞれの伸長ＤＮＡ鎖を検出することができる。以下に、一種類の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法ならびに二種類以上の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法のそれぞれについて、例をあげて説明する。なお、本発明は、これらには限定されない。
【００１８】
まず、一種類の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法の例について説明する。
【００１９】
実施形態１
（Ａ）ＰＣＲ反応液の準備
標的配列を含むＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（ヌクレオシド三リン酸）、前記標的配列に特異的なプライマー、ならびに、標識化プローブを含む反応液を準備する。
【００２０】
前記標識化プローブとしては、特に制限されないが、前述のようにオリゴヌクレオチドプローブの５’末端に標識化物質を結合させたものが好ましい。このように５’末端に標識化物質が結合した標識化プローブであれば、例えば、ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチドを１分子ずつ遊離する場合であっても、２ｍｅｒ以上のオリゴヌクレオチドを遊離させる場合であっても、確実に、はじめに遊離した断片が標識化物質を有することとなる。本発明においては、この標識化物質が結合した遊離断片の有無または量が、伸長ＤＮＡ鎖の増幅の有無または増幅量に相当するため、はじめに遊離した断片を検出できれば、分析精度を十分に確保できる。
【００２１】
標識化プローブならびにプライマーの配列ならびに長さは、特に制限されず、標的配列に応じて、従来公知の方法により適宜決定できる。また、本発明では、後述する（Ｃ）工程において、ＤＮＡポリメラーゼによって、プライマーからの伸長反応を行うとともに、標的配列にアニーリングした標識化プローブを５’末端から分解するが、この反応自体は、例えば、Ｔａｑ  Ｍａｎ（商標）Ｐｒｏｂｅ法等において公知であることから、プライマーならびにプローブの長さや配列は、当業者であれば技術常識に基づいて設計可能である。通常、標識化プローブは、プライマーのアニーリング部位よりも５’側（鋳型の５’側）にアニーリングするように設計することが好ましい。なお、プライマーとしては、フォワードプライマーのみでもよいが、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマーセットを用いることが好ましい。また、プライマーの長さは、一般的に１０〜５０ｍｅｒ程度であり、プローブの長さは、一般的に２０〜３０ｍｅｒであるが、これらには制限されない。
【００２２】
前記ＰＣＲ反応液中のプライマーの添加割合は、特に制限されないが、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーとが、それぞれ０．０１〜５μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜３μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、前記ＰＣＲ反応液中の標識化プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜５μｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．２〜０．５μｍｏｌ／Ｌである
【００２３】
また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、ヌクレオチドを１分子ずつ遊離するものでも、２ｍｅｒ以上のオリゴヌクレオチドを遊離させるものでもよいが、前者が好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、前述のようなテルムス・アクアティカス由来ＤＮＡポリメラーゼ（商品名Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）があげられる。
【００２４】
前記ＰＣＲ反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、５〜５０Ｕ／ｍｌであり、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍｌである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液（２５ｍＭ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＴＴＰ、１００μＭ「α−３２Ｐ」ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍｌ活性化サケ精子ＤＮＡ）中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。
【００２５】
前記ｄＮＴＰとしては、通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物があげられる。前記ＰＣＲ反応液中のｄＮＴＰの添加割合（合計添加割合）は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２６】
前記ＰＣＲ反応液の溶媒としては、特に制限されないが、例えば、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等の緩衝液、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。反応液のｐＨは、例えば、７〜９である。
【００２７】
（Ｂ）〜（Ｅ）ＰＣＲ工程
つぎに、標的配列を鋳型としてＰＣＲ反応を行う。この反応自体は、特に制限されず、従来公知の方法に基づいて行うことができる。
【００２８】
すなわち、まず、（Ｂ）：鋳型である前記標的配列に、プライマーおよび標識化プローブをアニーリングさせる。鋳型である前記標的配列が二本鎖ＤＮＡを形成している場合には、この（Ｂ）工程に先立って、例えば、熱処理等によって一本鎖ＤＮＡへの解離を行うことが好ましい。そして、（Ｃ）：ＤＮＡポリメラーゼによって、前記プライマーから前記標的配列に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させ、且つ、前記標的配列にアニーリングした標識化プローブを分解して、前記標識化物質結合断片を遊離させる。さらに、（Ｄ）：前記（Ｃ）工程で生成した、前記標的配列とそれに相補的な伸長ＤＮＡ鎖とからなる二本鎖を解離し、両者を鋳型として、前記プライマーおよび標識化プローブをアニーリングさせてから、前記（Ｃ）工程および（Ｄ）工程を繰り返す。このように、一本鎖ＤＮＡへの解離、アニーリングおよびＤＮＡポリメラーゼ反応の３ステップを１サイクルとして、繰り返し行うことによって、標的配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を増幅することができる。前記（Ｃ）工程および（Ｄ）工程のサイクル数は、特に制限されないが、例えば、３０サイクル以上であれば、標的配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の増幅を十分に確認することができ、好ましくは３５サイクル以上、より好ましくは４０サイクル以上である。なお、本発明においては、最終サイクルの（Ｄ）工程は割愛することができる。
【００２９】
二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離の処理条件は、特に制限されないが、例えば、温度９３〜９５℃、時間１５〜６０秒であり、好ましくは温度９４℃、時間３０秒であり、アニーリングの処理条件は、特に制限されないが、例えば、温度（Ｔｍ値−５℃）〜（Ｔｍ値−２℃）、時間２０〜６０秒であり、好ましくは温度（Ｔｍ値−４℃、時間４５秒であり、ＤＮＡポリメラーゼ反応は、特に制限されないが、例えば、温度６０〜８０℃、時間１〜４５秒であり、好ましくは温度６５〜７５℃、時間３０秒である。なお、各ステップにおける処理温度や処理時間は、例えば、サーマルサイクラー等の装置を用いて自動的に制御することができる。
【００３０】
（Ｆ）標識化物質が結合した断片の質量分析による検出
そして、前記反応液について質量分析を行い、前記（Ｃ）工程において遊離する前記標識化物質結合断片の有無または量を検出することによって、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の有無または増幅量を検出する。
【００３１】
前記（Ｂ）工程において、標識化プローブは、プライマーのアニーリング部位よりも５’側（鋳型の５’側）にアニーリングする。そして、前記（Ｃ）工程において、ＤＮＡポリメラーゼメラーゼは、プライマーを開始部位として５’→３’方向に伸長反応を進めると同時に、鋳型の３’→５’方向に向かって移動する。そして、移動したＤＮＡポリメラーゼが、プライマーのアニーリング位置より５’側の標識化プローブのアニーリング部位に近づくと、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により、標識化プローブを５’側から切断していく。他方、ポリメラーゼ活性による伸長反応が起こらなかった場合には、ＤＮＡポリメラーゼも標識化プローブのアニーリング部位に近づかないため、エキソヌクレアーゼ活性による標識化プローブの切断は生じない。したがって、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により切断された断片の有無を検出すれば、それは、ポリメラーゼ活性により相補的な伸長ＤＮＡ鎖が合成されたことを間接的に検出することとなる。このため、遊離する前記標識化物質結合断片の有無や量を検出すれば、伸長鎖ＤＮＡの有無や量を検出することができる。
【００３２】
遊離する断片の長さは、前述のようにＤＮＡポリメラーゼの種類によって異なるが、５’末端からヌクレオチドを１分子ずつ遊離するＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、前記（Ｃ）工程において、標識化プローブの５’末端ヌクレオチドの３’側が切断され、標識化物質が結合した前記５’末端ヌクレオチドが遊離する。具体例としては、標識化プローブの５’末端ヌクレオチドがデオキシアデノシンリン酸であれば、デオキシアデノシンリン酸に標識化物質が結合した結合体が遊離される。同様に、５’末端ヌクレオチドにおける塩基の種類によって、デオキシグアノシンリン酸、デオキシシチジンリン酸またはデオキシチミジンリン酸に標識化物質が結合した結合体が遊離される。
【００３３】
前記反応液は、例えば、質量分析に供する前に脱塩処理等の不純物除去処理を施すことが好ましい。これによって分析精度をさらに向上することができる。
【００３４】
質量分析の方法は、何ら制限されず、従来公知の方法が採用できる。質量分析におけるイオン化法としては、例えば、ＥＳＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＬＤ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＥＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｉｍｐａｃｔ）法、ＣＩ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＡＰＩ（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＦＩ（Ｆｉｅｌｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法、ＦＤ（Ｆｉｅｌｄ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）法、ＳＩＭＳ（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｉｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）法、ＦＡＢ（Ｆａｓｔ  Ａｔｏｍ  Ｂｏｎｂａｒｄｍｅｎｔ）法、ＴＳＰ（ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）法等があげられ、特に制限されないが、中でもＥＳＩ法が好ましい。
【００３５】
質量分析において、前述のようなイオン化法により生成したイオンは、通常、磁場や電場により分離され、分析される。分析方法の原理としては、特に制限されないが、例えば、磁場単収束型、電場磁場二重収束型、四重極型、三次元四重極型、飛行時間（ｔｉｍｅ  ｏｆ  ｆｌｉｇｈｔ、ＴＯＦ）型、イオンサイクロトロン共鳴（Ｉｏｎ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、ＩＣＲ）型、イオントラップ（Ｉｏｎ  Ｔｒａｐ、ＩＴ）型、フーリエ変換（ＦＴ）型等があげられる。
【００３６】
質量分析は、通常、質量分析装置（ＭＳ）により行うことができる。前記ＭＳは、通常、イオン化室、質量分析部およびイオン検出器を備え、一般に、磁場型質量分析装置、四重極質量分析装置等に大別されるが、本発明においては、従来公知のあらゆる装置を使用することができる。質量分析装置の種類は、例えば、必要とされる分解能に応じて選択可能であり、例えば、高分解能が必要な場合には、ＭＳ／ＭＳ法を採用したり、二重収束質量分析装置を使用することも好ましい。また、本発明における分析対象試料はＰＣＲ反応液であって、例えば、未反応のｄＮＴＰやタンパク質、他の分解物等が含まれるため、例えば、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を質量分析装置（ＭＳ）に連結させたＬＣ−ＭＳや、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ等を使用することが好ましい。これにより、分析精度をさらに向上することができる。
【００３７】
質量分析は、例えば、ＰＣＲの反応終了時のみ、または、ＰＣＲの反応途中のみに行ってもよいし、経時的に行ってもよい。このように経時的に質量分析を行えば、増幅産物（増幅した伸長ＤＮＡ鎖）の生成過程を経時的にモニタリングすることができ、いわゆる従来のリアルタイムＰＣＲと同様の解析が可能となる。経時的に分析を行う場合、例えば、断続的な分析でもよいし、連続的な分析でもよい。このため、本発明において、（Ｆ）工程の実施時期は、何ら制限されず、例えば、（Ｃ）工程と共に行ってもよいし、（Ｃ）工程後に行ってもよく、また、（Ｃ）工程を繰り返し行う間、連続的または断続的に行ってもよい。
【００３８】
なお、標的核酸がＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）の場合には、通常、前記ＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを生成させ、このｃＤＮＡを標的配列とすればよい。そして、これをＰＣＲの鋳型として使用する以外は、前述と同様にしてＰＣＲを行えばよい（いわゆる、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＰＣＲ）。
【００３９】
逆転写反応は、例えば、従来公知の逆転写酵素、前記ＲＮＡに対するプライマーおよびヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を含む逆転写反応液を使用することができる。逆転写反応の反応条件は、特に制限されないが、例えば、反応温度３０〜７０℃、反応時間１〜１２０分であり、好ましくは反応温度４０〜６０℃、反応時間１０〜６０分であり、より好ましくは反応温度４５〜５０℃、反応時間２０〜４０分である。
【００４０】
つぎに、同一反応液中における二種類以上の伸長ＤＮＡ鎖の検出方法の例について説明する。
【００４１】
同一反応液において、二種類以上の標的配列に相補的なＤＮＡ鎖をそれぞれ伸長させた場合、各伸長ＤＮＡ鎖を検出することが必要となる。本発明は、遊離した標識化物質結合断片を質量分析で検出することによって、間接的に伸長ＤＮＡ鎖を検出できる。したがって、本発明において二種類以上の伸長ＤＮＡ鎖を検出する場合には、各標識化プローブから遊離される各標識化物質結合断片が、例えば、イオン化によって、異なる分子イオンピークを示したり、異なるフラグメントピークを示すもの等であれば、ターゲット物質とすることができる。なお、各標識化物質結合断片の質量が同じであっても、例えば、各フラグメントイオンが異なるｍ／ｚ値にピークを示せば、それぞれを検出することが可能である。
【００４２】
具体例としては、前記（Ｃ）工程において、二種類以上の標的配列に対応する各標識化プローブの分解により、前記標識化物質が結合した断片がそれぞれ遊離するが、これらの各断片が、それぞれ異なる質量であることが好ましい。各標識化物質結合断片の質量を変化させる方法は、特に制限されないが、例えば、異なる標識化物質を使用する方法、標識化物質結合断片として、異なる塩基のヌクレオチドと標識化物質との結合体を遊離させる方法、さらに、これらを組み合わせた方法等があげられる。これらの方法について、以下に具体例をあげるが、本発明は、これらには制限されない。
【００４３】
実施形態２−１
この実施形態は、各標的配列に対応する標識化プローブについて、それぞれ質量が異なる標識化物質を使用する形態である。なお、本実施形態においては、オリゴヌクレオチドの５’末端に標識化物質が結合された標識化プローブであり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、５’末端ヌクレオチド１分子と標識化物質との結合体が遊離する例をあげて説明する。
【００４４】
本実施形態においては、前記（Ａ）工程における反応液として、二種類以上の標的配列、および、前記各標的配列に対応する二種類以上のプライマーならびに二種類以上の標識化プローブを含む反応液を使用する。なお、各標的配列に対応するプライマーの配列や長さは、特に制限されず、例えば、標的配列に応じて、従来公知の方法によって適宜決定できる。
【００４５】
本実施形態のように、異なる質量の標識化物質を使用する場合、例えば、各標識化プローブにおける５’末端のヌクレオチドは、同じ塩基のヌクレオチドであってもよい。例えば、各標識化プローブの５’末端ヌクレオチドが同じデオキシアデノシンリン酸であっても、５’末端に結合した標識化物質が質量の異なる物質であれば、遊離する標識化物質結合断片の全体の質量は、それぞれ異なる。したがって、各標的配列について相補的なＤＮＡ鎖を伸長する場合、各標識化プローブの標識化物質を異なる質量とすることで、各伸長ＤＮＡ鎖を質量分析によって検出することが可能となる。
【００４６】
質量分析では、例えば、１原子質量単位が異なるのみであっても、別の物質として検出することができる。このため、本実施形態においては、質量が異なれば、どのような標識化物質でも使用することができるため、同一反応液において検出できる伸長ＤＮＡ鎖の数は、何ら制限されない。なお、検出できる伸長ＤＮＡ鎖の数としては、特に制限されないが、下限は、例えば、２以上であり、上限は、例えば、１００以下、好ましくは２０以下、より好ましくは１０以下である。
【００４７】
実施形態２−２
この実施形態は、各標的配列に対応する標識化プローブにおいて、各標識化物質が同じ質量であり、各標識化物質結合断片として、異なる塩基のヌクレオチドと標識化物質との結合体を遊離させる形態である。なお、本実施形態においては、オリゴヌクレオチドの５’末端に標識化物質が結合された標識化プローブであり、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によって、５’末端ヌクレオチド１分子と標識化物質との結合体が遊離する例をあげて説明する。
【００４８】
本実施形態においては、前記実施形態２−１と同様に、前記（Ａ）工程における反応液として、二種類以上の標的配列、および、前記各標的配列に対応する二種類以上のプライマーならびに二種類以上の標識化プローブを含む反応液を使用する。なお、各標的配列に対応するプライマーの配列や長さは、特に制限されず、標的配列に応じて、従来公知の方法によって適宜決定できる。
【００４９】
本実施形態では、前述のように、前記標識化物質結合断片におけるヌクレオチドの塩基の違いによって、各断片を検出する。したがって、各標識化プローブにおいて、標識化物質が結合するヌクレオチドの塩基がそれぞれ異なる塩基であればよい。例えば、各標識化プローブの標識化物質が同じであっても、５’末端ヌクレオチドの塩基が異なれば、遊離する標識化物質結合断片の全体質量はそれぞれ異なる。したがって、各標的配列について、相補的なＤＮＡ鎖を伸長する場合、各標識化プローブにおいて、標識化物質を結合するヌクレオチドの塩基を異なる塩基に設定することで、それぞれを質量分析により検出することが可能となる。具体例としては、オリゴヌクレオチドプローブを、その５’末端ヌクレオチドが、デオキシアデノシンリン酸、デオキシグアノシンリン酸、デオキシシチジンリン酸またはデオキシチミジンリン酸となるように設計し、これに標識化物質を結合して標識化プローブを調製すればよい。このように５’末端ヌクレオチドの塩基を異なる塩基とすれば、各標識化プローブから遊離する断片は、質量が異なるため、同一反応液であっても、少なくとも４種類の伸長ＤＮＡ鎖の検出を行うことが可能となる。
【００５０】
実施形態２−３
この実施形態は、二種類以上の標的配列に対応する各標識化プローブとして、それぞれの標識化物質が異なる質量の物質であり、且つ、標識化物質が結合するヌクレオチドの塩基がそれぞれ異なる塩基であるプローブを使用する形態である。このような形態であれば、標識化物質の組み合わせと塩基の組み合わせが使用できるため、同一反応液であっても、極めて多くの種類塩基の種類の数×標識化物質の種類の数）の伸長ＤＮＡ鎖を検出できる。
【００５１】
つぎに、本発明の測定方法は、ＰＣＲによって増幅した、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖の検出により、標的配列を測定する方法であって、下記（Ｇ）および（Ｈ）工程を含むことを特徴とする。
（Ｇ）  本発明の検出方法により、反応液に含まれる増幅した前記伸長ＤＮＡ鎖を検出する工程
（Ｈ）  前記（Ｇ）工程の検出結果に基づいて、前記反応液における標的配列の定性または定量を行う工程
【００５２】
本発明の検出方法により、反応液に含まれる増幅した前記伸長ＤＮＡ鎖を検出すれば、その結果から、前記反応液における標的配列の有無（定性）または量（定量）を測定することができる。具体的には、前記（Ｇ）工程の検出結果に基づき、増幅した伸長ＤＮＡ鎖を定量し、前記伸長ＤＮＡ鎖が所定量となった際のＰＣＲサイクル数をカウントすることによって、前記反応液における標的配列を定量することができる。
【００５３】
また、反応液における標的配列がＲＮＡから逆転写反応により生成させたｃＤＮＡであれば、ｃＤＮＡを定性または定量することによって、その鋳型であるＲＮＡの有無または量を定性もしくは定量することもできる。
【００５４】
ＰＣＲでは、通常、増幅産物がある一定の量（閾値）に達するとそれ以上の増幅は起こらないため、最終的に生成した増幅産物の量を測定するのみでは、反応液に含まれる標的核酸の量を定量することは困難である。しかし、このようなリアルタイムＰＣＲ様の方法によれば、サイクルごとの増幅産物の生成をモニタリングし、設定した閾値に達するサイクル数（Ｃｔ値）をカウントするため、例えば、閾値とＣｔ値とに基づいて、反応液に含まれる標的配列を定量することも可能である。
【００５５】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は以下の実施例および比較例により制限されない。
【実施例１】
【００５６】
ＬＣ／ＭＳ分析によって、１分子のヌクレオチドと標識化物質とが結合したターゲット物質を定量的に検出できるか否かを確認した。
【００５７】
１．サンプルの調製
ＦＡＭにアデニンを有するヌクレオチド（デオキシアデノシンリン酸）を付加したターゲット物質（ＳＩＧＭＡ ＧＥＮＯＳＹＳ社製、以下、「ＦＡＭ＋Ａ」ともいう）を準備し、これを水で希釈した希釈系列をサンプルとした。なお、「ＦＡＭ＋Ａ」の構造を下記式に表すが、後述する他のターゲット物質（ＦＡＭ＋ヌクレオチド）は、下記式における塩基が異なるのみで、その他は同様の構造である。
【化１】
2008154498.tif 000003
【００５８】
２．ＬＣ／ＭＳ分析
ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＬＣシステムは、Ｕｌｔｉｍａｔｅ、ＳｗｉｔｈｏｓＩＩ、Ｆａｍｏｓ（ＬＣ  ｐａｃｋｉｎｇｓ、日本ダイオネクス社製）を、質量分析計は、Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００ｐｌｕｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）をそれぞれ用いた。分析カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ０．３００ｍｍ  ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ（ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、プレカラムはμ−Ｐｒｅｃｏｌｕｍｎ（商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ０．３００ｍｍ  ｉ．ｄ．×５ｍｍ（ＬＣ  ｐａｃｋｉｎｇｓ社製）を使用した。前記「ＦＡＭ＋Ａ」の各サンプル５μｌをインジェクトし、０．１体積％ギ酸を用いて流速１０μｌ／ｍｉｎで５分間プレカラムに送液することによって、前記サンプルを前記プレカラムに吸着させた。その後、バルブを切り替え、前記プレカラムに吸着したサンプルを分析カラムに導入した。この際の溶離液は、Ａ液として、Ｈ２Ｏ（和光純薬社製）／アセトニトリル（キシダ化学、以下同じ）／ギ酸（体積比９５／５／０．１）、Ｂ液として、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル／ギ酸（体積比５／９５／０．１）をそれぞれ使用し、Ａ液とＢ液との混合液におけるＢ液の割合（体積％）が下記条件となるグラジェントで溶離を行った。前記溶離液の流量は、４μｌ／ｍｉｎとした。
【００５９】
Ｂ液体積％                溶離時間          
４０％              ０ｍｉｎ〜１０ｍｉｎ
９０％            １０ｍｉｎ〜２５ｍｉｎ
４０％            ２５ｍｉｎ〜３５ｍｉｎ
【００６０】
（質量分析計の分析パラメーター）
ｐｏｌａｒｉｔｙ：ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅ
ｔａｒｇｅｔ  ｍａｓｓ：７８７ｍ／ｚ
ｓｃａｎ  ｒａｎｇｅ：１００−１２００ｍ／ｚ
ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３５００Ｖ
ｎｅｂｕｌｉｚａｒ  ｇａｓ：１５．０ｐｓｉ
ｄｒｙ  ｇａｓ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：８．０  ｌ／ｍｉｎ
ｄｒｙ  ｇａｓ  ｔｅｍｐ．：３００℃
ＩＣＣ  ｔａｒｇｅｔ：２００００
ａｖｅｒａｇｅ：７
【００６１】
このＬＣ／ＭＳ分析の結果を図１に示す。同図は、各サンプルにおけるターゲット物質の量とカウント（イオン強度）との相関関係を示すグラフである。同図に示すように、ターゲット物質とカウントとの関係を示す相関係数は０．９９９９と非常に高く、ターゲット物質の量が数百ｐｇ〜数百ｎｇの間で優れた相関性を示した。このことから、「ＦＡＭ＋Ａ」は、イオン化効率に優れ、ターゲット物質として本発明の方法に非常に適していると言える。
【実施例２】
【００６２】
塩基のみが異なる４種類のターゲット物質を含む混合液についてＬＣ／ＭＳ分析を行い、各ターゲット物質の検出が可能であるか否かを確認した。
【００６３】
ターゲット物質として、ＦＡＭに異なる塩基（Ａ，Ｔ、Ｃ、Ｇ）を有するヌクレオチド（デオキシアデノシンリン酸、デオキシチミジンリン酸、デオキシグアノシンリン酸、デオキシシチジンリン酸）を付加した４種類の物質を使用した。そして、４種類のターゲット物質をそれぞれ１ｐｐｍずつ含有する混合液を調製し、この混合液をサンプルとして、前記実施例１と同様にしてＬＣ／ＭＳ分析を行い、Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）で解析した。なお、前記ターゲット物質は、塩基に応じてそれぞれ「ＦＡＭ＋Ａ」、「ＦＡＭ＋Ｔ」、「ＦＡＭ＋Ｃ」および「ＦＡＭ＋Ｇ」という（以下、同様）。
【００６４】
これらのＬＣ／ＭＳ分析の結果を図２に示す。同図において、（Ａ）はＦＡＭ＋Ｃのクロマトグラム、（Ｂ）はＦＡＭ＋Ａのクロマトグラム、（Ｃ）はＦＡＭ＋Ｇのクロマトグラム、（Ｄ）はＦＡＭ＋Ｔのクロマトグラムである。これらのターゲット物質は、それぞれＦＡＭに付加したヌクレオチドにおける塩基が異なるのみであるが、図２に示すように、それぞれ異なるリテンションタイムにピークが見られた。このことから、１つの反応液に塩基が異なる複数のターゲット物質（例えば、２〜４種類）が含まれる場合であっても、検出可能であることがわかった。
【実施例３】
【００６５】
亜熱帯性植物Ｔｏｒｅｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ（以下、「トレニア」という）の葉由来のｍＲＮＡよりｃＤＮＡを調製し、ＣＨＳ（ｃｈａｌｃｏｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）遺伝子およびＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）遺伝子を標的配列としてＰＣＲを行い、増幅産物についてＬＣ／ＭＳ分析を行った。
【００６６】
１．  ＲＴ−ＰＣＲ
（１）ｃＤＮＡの調製
トレニアの葉から、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＴｏｔａｌＲＮＡを調製し、さらにＤＮａｓｅＩで処理した後、同キットを用いてＴｏｔａｌＲＮＡを精製した。
【００６７】
次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、以下に示す逆転写反応を行い、さらにＲＮａｓｅＨで処理して一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００６８】
まず、精製した前記ＴｏｔａｌＲＮＡを用いて、全量５μｇのＴｏｔａｌ  ＲＮＡ溶液を調製した。これに、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（１μｌ）および０．５μｇ／μｌ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（１μｌ）を添加し、全量１０μｌとなるようにＤＥＰＣ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｗａｔｅｒを添加して、６５℃で５分インキュベートした後、氷上で１分静置した。前記混合液に、さらに、１０×ＲＴ  ｂｕｆｆｅｒ（２μｌ）、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（４μｌ）、０．１Ｍ  ＤＴＴ（２μｌ）およびＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（１μｌ）を順に添加し、４２℃で２分インキュベートした。インキュベート後の混合液に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ  ＲＴ（１μｌ）を添加し、４２℃で５０分、７０℃で１５分の条件で順次インキュベートを行ってから、ＲＮａｓｅＨ（１μｌ）を添加した。これらの処理によって一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
【００６９】
（２）ＰＣＲ
調製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、下記プライマー、プローブおよびＨｏｔＳｔａｒＴａｑ（登録商標）ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、以下に示す条件で、ＣＨＳ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子のそれぞれについてＰＣＲを行った。なお、下記ＰＣＲ反応液ＡおよびＰＣＲ条件Ａは、ＣＨＳ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子の一方を検出する際の組成と条件である。
【００７０】
ＣＨＳ用プライマー
フォワードプライマー（配列番号１）
５’−ＡＴＡＣＴＧＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡ−３’
リバースプライマー  （配列番号２）
５’−ＡＴＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＣＣＡ−３’
ＧＡＰＤＨ用プライマー
フォワードプライマー（配列番号３）
５’−ＴＧＴＣＧＡＴＧＴＣＴＣＣＧＴＡＧＴＧＧ−３’
リバースプライマー  （配列番号４）
５’−ＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＧＧＴＡＴＡＧＣＣＣ−３’
【００７１】
ＣＨＳ用プローブ    （配列番号５）
５’−ＦＡＭ−ＡＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧ−ＭＧＢ−３’ 
ＧＡＰＤＨ用プローブ（配列番号６）
５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＧ−ＭＧＢ−３’
【００７２】
【表１】
2008154498.tif 000004
【００７３】
【表２】
2008154498.tif 000005
【００７４】
２.  ＬＣ／ＭＳ分析
得られた二種類のＰＣＲ増幅産物（ＣＨＳ遺伝子の増幅産物およびＧＡＰＤＨ遺伝子の増幅産物）のそれぞれについて、ＬＣ／ＭＳ分析前、ｚｉｐｔｉｐ（商品名、ＳＩＧＭＡ  ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて脱塩処理を行った。
【００７５】
まず、ｚｉｐｔｉｐをアセトニトリルで２回ピペッティング（ピペッティングは全て１０μｌ、以下同様）してから、精製水で２回ピペッティングすることにより平衡化した。つぎに、前記ＰＣＲ増幅産物（５０μｌ）を５回ピペッティングし、ＰＣＲ反応により遊離したターゲット物質（ＦＡＭ＋ヌクレオチド）をトラップさせてから、精製水で２回ピペッティングして平衡化した。続いて、精製水１２．５μｌとアセトニトリル１２．５μｌの混合液中で５回ピペッティングを行い、トラップした前記ターゲット物質を溶出させた（計２５μｌ）。この溶出液に、内部標準物質として、１ｐｐｍの「ＦＡＭ＋Ｇ」（標準品、ＳＩＧＭＡ
ＧＥＮＯＳＹＳ社製）５μｌを添加して（計３０μｌ）、分析用サンプルとした。
【００７６】
この分析用サンプルを、前記実施例１と同様の条件でＬＣ／ＭＳ分析に供し、その結果をＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）で解析した。
【００７７】
ＬＣ／ＭＳ分析の結果を図３に示す。同図において、（Ａ）は、ＣＨＳ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に、５’末端のＡがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号５）を使用した結果であり、（Ｂ）は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に、５’末端のＣがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号６）を使用した結果である。同図（Ａ）および（Ｂ）に示すように、それぞれのＰＣＲ増幅産物について、異なるリテンションタイムでピークが検出された。同図（Ａ）で検出されたピークは、「ＦＡＭ＋Ａ」、同図（Ｂ）で検出されたピークは、「ＦＡＭ＋Ｃ」である。これらの結果から、ＬＣ／ＭＳ分析によって、ＰＣＲ反応で遊離されたヌクレオチドが付加したターゲット物質を検出でき、この検出により、ＰＣＲにおける増幅の有無や増幅量を確認（定性、定量）できることがわかった。また、この結果から、サイクル数４０で、十分にＰＣＲ増幅産物を検出できることが確認できた。
【実施例４】
【００７８】
１つのＰＣＲ反応液内でＣＨＳ遺伝子およびＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲを同時に行い、それぞれのＰＣＲ増幅産物をＬＣ／ＭＳにより分析した。
【００７９】
１.  ＲＴ−ＰＣＲ
前記実施例３で調製した一本鎖ＤＮＡを鋳型として、下記ＰＣＲ反応液Ｂを用いて、下記ＰＣＲ条件ＢによりＰＣＲを行った。なお、ＧＡＰＤＨ用プローブとしては、以下に示す２種類のプローブを使用し、各プローブを用いて別個にＰＣＲを行った。なお、下記ＰＣＲ反応液ＢおよびＰＣＲ条件Ｂは、それぞれ１つの反応液でＣＨＳおよびＧＡＰＤＨの両方を検出するマルチプレックスＰＣＲの組成ならびに条件である。
【００８０】
【表３】
2008154498.tif 000006
【００８１】
ＧＡＰＤＨ用プローブ
５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＧ−ＭＧＢ−３’（配列番号６）
５’−ＦＡＭ−ＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣ−ＭＧＢ−３’（配列番号７）
【００８２】
【表４】
2008154498.tif 000007
【００８３】
そして、得られたＰＣＲ増幅産物について、前記実施例３と同様に脱塩処理を施した後、前記実施例１と同様にＬＣ／ＭＳ分析を行い、その結果をＤａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）で解析した。
【００８４】
これらのＬＣ／ＭＳ分析の結果を図４に示す。同図において、（Ａ）と（Ｂ）は、同じＰＣＲ反応液についての結果、（Ａ）は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に、５’末端のＣがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号６）を使用した結果、（Ｂ）は、ＣＨＳ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に、５’末端のＡがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号５）を使用した結果である。また、（Ｃ）と（Ｄ）は、同じＰＣＲ反応液についての結果であり、（Ｃ）は、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に、５’末端のＴがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号７）を使用した結果、（Ｄ）は、ＣＨＳ遺伝子のＰＣＲ増幅産物の分析に５’末端のＡがＦＡＭで標識されたプローブ（配列番号５）を使用した結果である。同図（Ａ）および（Ｂ）、ならびに、（Ｃ）および（Ｄ）に示すように、一つのＰＣＲ反応液において２つの遺伝子の増幅を行った場合でも、両方のターゲット物質をそれぞれ検出することができた。なお、同図（Ａ）で検出されたピークは「ＦＡＭ＋Ｃ」、同図（Ｂ）および（Ｄ）で検出されたピークは「ＦＡＭ＋Ａ」、同図（Ｃ）で検出されたピークは「ＦＡＭ＋Ｔ」である。このため、本発明によれば、同一反応液において複数の遺伝子を分析することが可能であるといえる。
【実施例５】
【００８５】
本発明の測定方法による定量性を確認するために、トレニアの葉と花弁におけるＣＨＳ発現量について、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲとの比較を行った。
【００８６】
（ＬＣ／ＭＳ分析）
まず、前記実施例３と同様の方法により、トレニアの葉と花弁とからＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれの一本鎖ｃＤＮＡを調製した。そして、トレニア葉由来ｃＤＮＡおよびトレニア花弁ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、前記実施例４と同様にしてＬＣ／ＭＳ分析を行った。なお、ＰＣＲ反応液ＢにおけるＧＡＰＤＨ用プローブとＣＨＳ用プローブの組み合わせも、前記実施例４と同様とした。
【００８７】
（ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ）
前述のＬＣ／ＭＳ分析用に調製したトレニア葉由来ｃＤＮＡおよびトレニア花弁由来ｃＤＮＡを鋳型として、下記ＰＣＲ反応液Ｃを用いて、下記条件ＣでＰＣＲを行い、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ（登録商標）５７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により検出を行った。なお、標準化のため、前記ＬＣ／ＭＳ分析と同じプライマーセットおよび下記ＧＡＰＤＨ用プローブを用いて、ＧＡＰＤＨ遺伝子についてもリアルタイムＰＣＲを行った。これらのデータ解析は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により行った。この結果を参考例とした。
【００８８】
ＣＨＳ用プローブ
５’−ＦＡＭ−ＡＧＡＣＣＧＴＴＧＴＧＣＴＧ−ＭＧＢ−３’（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ用プローブ
５’−ＦＡＭ−ＣＴＧＣＴＡＴＣＡＡＧＧＡＧ−ＭＧＢ−３’（配列番号６）
【００８９】
【表５】
2008154498.tif 000008
【００９０】
【表６】
2008154498.tif 000009
【００９１】
これらの結果を、図５および図６に示す。図５は、葉および花弁由来ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ増幅産物についてＬＣ／ＭＳ分析を行った実施例５の結果であり、同図（Ａ）は、配列番号５（ＣＨＳ用）および配列番号６（ＧＡＰＤＨ用）のプローブを用いたＣＳＨ遺伝子／ＧＡＰＤＨ遺伝子の結果であり、同図（Ｂ）は、配列番号５（ＣＨＳ用）および配列番号７（ＧＡＰＤＨ用）のプローブを用いたＣＳＨ遺伝子／ＧＡＰＤＨ遺伝子の結果である。また、図６（Ｃ）は、リアルタイムＰＣＲによるＣＨＳ遺伝子／ＧＡＰＤＨ遺伝子の結果（参考例）である。
【００９２】
図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、ＬＣ／ＭＳ分析による実施例５の結果は、いずれのプローブを用いた場合も、同様の傾向、すなわち、葉と比較して花弁の方がＧＡＰＤＨ遺伝子よりもＣＨＳ遺伝子が多く発現しているという傾向を示した。さらに、図６（Ｃ）に示す、ＴａｑＭａｎプローブを用いたリアルタイムＰＣＲの結果（参考例）とも同じ挙動を示した。これらの結果より、本発明は、従来のリアルタイムＰＣＲの代替法となり得ることが確認できた。さらに、本発明によれば、同一ＰＣＲ反応液内で複数の標的遺伝子を増幅させた場合であっても、それぞれの増幅産物を検出可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
以上のように、本発明の検出方法では、質量分析によって、ＰＣＲ反応において遊離する標識化物質結合断片の有無や量を検出し、間接的に、標識配列に相補的な伸長ＤＮＡ鎖を検出する。質量分析は、非常に定量性に優れることから、本発明は、ＰＣＲの増幅産物の新たな検出方法となる。また、蛍光物質を使用した蛍光強度の測定とは異なり、質量分析においては、例えば、クロストーク等の問題がない。このため、同一反応液中の複数の伸長ＤＮＡ鎖を検出する場合でも、各標的配列に対応する標識化プローブから遊離する標識化物質結合断片が、例えば、異なる質量や異なるｍ／ｚ値等であれば、質量分析によって各々を検出することが可能である。したがって、本発明の検出方法によれば、分析対象試料について、複数の標的配列の定性・定量を行う場合であっても、同一反応液において複数の標的配列に対するＰＣＲを行うことができ、且つ、互いの影響をうけることなく、各々を高精度で分析することができる。このため、本発明は、病理学や臨床学、分子生物学等の様々な分野において、極めて有用な方法といえる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、本発明の一実施例であり、標識化物質とヌクレオチド１分子との結合体（ターゲット物質）に関するＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図２】図１は、本発明のその他の実施例であり、ヌクレオチドの塩基が異なる４種類のターゲット物質に関するＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すクロマトグラムである。
【図３】図３は、本発明のさらにその他の実施例であり、トレニア由来ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物のＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すクロマトグラムである。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例であり、トレニア由来ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物のＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すクロマトグラムである。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例であり、トレニア由来ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ産物のＬＣ／ＭＳ分析の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、参考例であり、トレニア由来ｃＤＮＡを鋳型とするリアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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