(57)【要約】【課題】標的タンパク質に特異的に結合し、非標的タンパク質とは結合することのないＤＮＡを容易に得る方法の提供。【解決手段】標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ候補を選択すること、前記候補の内、非標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択すること、標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡ候補から非標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡを削除して標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡする。【選択図】図１
2008283883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）多種タンパク質混合物から標的タンパク質と非標的タンパク質群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的タンパク質に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的タンパク質に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的タンパク質を選択して、前記選択された標的タンパク質に結合している標的タンパク質特異的候補ＤＮＡからなる標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｉｖ）非標的タンパク質に前記標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを適用して、前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補ＤＮＡを前記非標的タンパク質に結合させる工程、
（ｖ）前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補ＤＮＡが結合した前記非標的タンパク質に結合している標的タンパク質特異的候補ＤＮＡからなる非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉ）前記工程（ｉｉｉ）において取得した前記標的タンパク質特異的候補ＤＮＡの内、工程（ｖ）において取得した前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去して標的タンパク質特異的ＤＮＡを決定する工程、
を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の選択法。
【請求項２】
（ｉ）多種タンパク質混合物から標的タンパク質と非標的タンパク質群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的タンパク質に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的タンパク質に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的タンパク質を選択して、前記選択された標的タンパク質に結合している１本鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして、該結合している１本鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅する工程、
（ｉｖ）前記増幅された１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを選択して、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｖ）前記非標的タンパク質に前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを適用して前記非標的タンパク質にも特異的に結合する前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを前記非標的タンパク質に結合させる工程、
（ｖｉ）前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡが結合した前記非標的タンパク質に結合している前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する工程、
（ｖｉｉ）前記増幅された標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択して、非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉｉｉ）前記工程（ｉｖ）において取得した前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、前記工程（ｖｉｉ）において取得した前記非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去する工程、
を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の選択法。
【請求項３】
前記工程（ｉ）が、
前記標的タンパク質に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを前記タンパク質群に適用して、前記磁気ビーズが結合した前記標的タンパク質を磁気的に分離すること、
を含む、請求項２記載の核酸選択法。
【請求項４】
前記工程（ｖｉ）が、
前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、
を含む、請求項２記載の核酸選択法。
【請求項５】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項２記載の核酸選択法。
【請求項６】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項２記載の核酸選択法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはアミノ基で修飾され、
前記増幅されたセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項２記載の核酸選択法。
【請求項８】
前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡが除去されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
請求項２記載の核酸選択法。
【請求項９】
前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム内に設けられている担体に固定すること、および
前記クロマトグラフィーのカラムに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去すること、
を含む、請求項７記載の核酸選択法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィーのカラムから流出する前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記クロマトグラフィーのカラムに繰り返し導入することを含む、請求項９記載の核酸選択法。
【請求項１１】
前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去すること、
を含む、請求項８記載の核酸選択法。
【請求項１２】
前記非標的タンパク質特異的センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去された残りの前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを繰り返し導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去することを含む、請求項１１記載の核酸選択法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか記載の核酸選択法を使用する工程を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の選択法に関する。特に、本発明は、標的タンパク質に特異的に結合する核酸のハイブリダイゼーションによる選択法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一本鎖核酸はその高次構造により、特定の標的分子に対して結合能を有することが、１９９０年にC. Tuerkらのグループによって報告（非特許文献１：Science, 249, 505-510 (1990)）され、それらの核酸は「アプタマー」と命名された。これまでイオンや糖鎖、タンパク質、生細胞表面上の分子に親和性のあるアプタマー、さらにはタンパク質のリン酸化状態を判別するアプタマーなどが先行研究により多数報告されている。アプタマーは大別して一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡから成るが、他にもペプチドアプタマーなどが報告されている。またそれらの中には人工塩基を用いたアプタマー、ポリエチレングリコールなどの有機分子により修飾されたアプタマーなど、使用目的に合わせた修飾アプタマーも開発されている。
【０００３】
これらアプタマーは、C. Tuerkらによって提案されたＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）という、目的の核酸分子の選別と、それら分子の増幅という２つのステップによって選択される。
【０００４】
一般的には、まず、１０14〜１０16分子種の、両端が１８〜３８塩基ほどのプライマー配列に挟まれた３０〜１００塩基のランダム配列からなる全長が約６０〜１４０塩基の核酸プールを準備する。次に、この核酸プールから、標的分子に親和性をもつ配列を選別するが、この操作にはこれまで様々な方法が開発されている。一般に、標的分子のみを用いて親和性をもつ核酸を選別する場合、最終的に得られたアプタマーの中には、非標的分子にも親和性を持つ（抗体で言う“cross reactivity”）アプタマーが存在することも珍しくない。そのため、用いることが想定される多種類の分子が混合されているようなサンプルにおいて、標的分子には親和性をもつが非標的分子に親和性を持たないというアプタマーを、対向選別法（Counter Selection）によって選別することも行われている。
【０００５】
その例として、２０００年にScott D Seiwertらによって報告（非特許文献２：Chemistry & Biology, 7, 833-843 (2000)）された、同じタンパク質のリン酸化状態を１０倍の親和性の違いで識別するアプタマーがある。これは、はじめリン酸化状態のタンパク質ppERK2に結合するＲＮＡを選別し、同時に非標的タンパク質として、リン酸化されていないタンパク質ERK2に選別されたＲＮＡを導入して、それに結合しなかったＲＮＡを回収する、という目的のＲＮＡアプタマーを取得するものである。
【非特許文献１】Science, 249, 505-510 (1990)
【非特許文献２】Chemistry & Biology, 7, 833-843 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、従来のＳＥＬＥＸ法では核酸プールを標的タンパク質に結合させ回収し、（対向選別法の操作を経るならば、非標的タンパク質に適用した後に）ＰＣＲによって増幅後、核酸を再度、標的分子に結合させるという操作を行う。上記例はＤＮＡの場合であったが、ＲＮＡの場合は、標的タンパク質に結合したＲＮＡを回収し、（ここでも、対向選別法の操作を経るならば、非標的タンパク質に適用した後に）ＲＴ−ＰＣＲによる増幅後に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡプールを再生し、再度、標的分子に結合させる。通常、このプロセスを１回行っただけではアプタマーを選別することができないため、１０〜２０回は繰り返す必要がある。非標的分子に親和性を持つ核酸を除去するための対向選別法も、各ラウンドについてその都度行わなければならないため、操作が非常に煩雑であり時間を要する方法である。
【０００７】
これは、選別初期では選別予定核酸の絶対量・相対量がともに少なく、この中から選別予定の核酸のみを分離することが困難だからである。もし、この中からそれら選別予定以外の配列のみを除去できる方法が開発されれば、操作は非常に簡便なものになると考えられる。また上記先行研究では非標的タンパク質として単一タンパク質を用いているが、本件のような方法で、多種類の非標的タンパク質を用いて、それら全てに親和性を持たないが標的タンパク質にのみ親和性を持つような核酸を選別したという報告はされていない。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、多種類からなるタンパク質の混合物から、短時間で標的タンパク質に特異的に結合し、かつ非標的タンパク質に結合しない核酸を選択できる方法を提案することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明は、以下の核酸選択方法および核酸製造方法を提供する。
（１）（ｉ）多種タンパク質混合物から標的タンパク質と非標的タンパク質群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的タンパク質に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的タンパク質に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的タンパク質を選択して、前記選択された標的タンパク質に結合している標的タンパク質特異的候補ＤＮＡからなる標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｉｖ）非標的タンパク質に前記標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを適用して、前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補ＤＮＡを前記非標的タンパク質に結合させる工程、
（ｖ）前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補ＤＮＡが結合した前記非標的タンパク質に結合している標的タンパク質特異的候補ＤＮＡからなる非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉ）前記工程（ｉｉｉ）において取得した前記標的タンパク質特異的候補ＤＮＡの内、工程（ｖ）において取得した前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去して標的タンパク質特異的ＤＮＡを決定する工程、
を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の選択法。
（２）（ｉ）多種タンパク質混合物から標的タンパク質と非標的タンパク質群とを分離する工程、
（ｉｉ）標的タンパク質に１本鎖ＤＮＡプールを適用して前記標的タンパク質に特異的に結合する１本鎖ＤＮＡを結合させる工程、
（ｉｉｉ）前記特異的に結合する１本鎖ＤＮＡが結合した前記標的タンパク質を選択して、前記選択された標的タンパク質に結合している１本鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして、該結合している１本鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅する工程、
（ｉｖ）前記増幅された１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡを選択して、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、
（ｖ）前記非標的タンパク質に前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールを適用して前記非標的タンパク質にも特異的に結合する前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを前記非標的タンパク質に結合させる工程、
（ｖｉ）前記非標的タンパク質にも特異的に結合する標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡが結合した前記非標的タンパク質に結合している前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをセンス鎖ＤＮＡとして前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅する工程、
（ｖｉｉ）前記増幅された標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選択して、非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールを作成する工程、および
（ｖｉｉｉ）前記工程（ｉｖ）において取得した前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、工程（ｖｉｉ）において取得した前記非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡと相補的に対合するＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去する工程、
を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の選択法。
（３）前記工程（ｉ）が、
前記標的タンパク質に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを前記タンパク質群に適用して、前記磁気ビーズが結合した前記標的タンパク質を磁気的に分離すること、
を含む、上記（２）記載の核酸選択法。
（４）前記工程（ｖｉ）が、
前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、
を含む、上記（２）記載の核酸選択法。
（５）前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（２）記載の核酸選択法。
（６）前記工程（ｉｉｉ）および（ｉｖ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に除去されて、１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみが選択されて、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（２）記載の核酸選択法。
（７）前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはアミノ基で修飾され、
前記増幅されたセンス鎖ＤＮＡはフィルタにより除去されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（２）記載の核酸選択法。
（８）前記工程（ｉｉｉ）および（ｖｉ）において、
アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーはビオチンで修飾され、センス鎖ＤＮＡの増幅のためのプライマーは無修飾とされ、
前記増幅されたアンチセンス鎖ＤＮＡはビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡが除去されて、非標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡプールが作成される、
上記（２）記載の核酸選択法。
（９）前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム内に設けられている担体に固定すること、および
前記クロマトグラフィーのカラムに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去すること、
を含む、上記（７）記載の核酸選択法。
（１０）前記クロマトグラフィーのカラムから流出する前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記クロマトグラフィーのカラムに繰り返し導入することを含む、上記（９）記載の核酸選択法。
（１１）前記工程（ｖｉｉｉ）が、
前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去すること、
を含む、上記（８）記載の核酸選択法。
（１２）前記非標的タンパク質特異的センス鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去された残りの前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲにより増幅して、前記ビオチンと結合するストレプトアビジン磁気ビーズを利用して磁気的に残されたアンチセンス鎖ＤＮＡに前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡを繰り返し導入して前記非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補の前記標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションにより除去することを含む、上記（１１）記載の核酸選択法。
（１３）上記（１）〜（１２）のいずれか記載の核酸選択法を使用する工程を含む、標的タンパク質に特異的に結合する核酸の製造方法。
【００１０】
本発明では、標的タンパク質のみに親和性を持ち、非標的タンパク質（非標的タンパク質は複数種であってもよい）には親和性を持たない核酸を選別する。この選別過程は以下のようである。
【００１１】
まず、多種タンパク質混合物から標的タンパク質を選択する。次いで、核酸プールを標的タンパク質に適用し、標的タンパク質に親和性を持つ核酸を選別する。この段階では、非標的タンパク質にも親和性のある核酸が存在する。
【００１２】
そこで、次に、上記選別した標的タンパク質に親和性を持つ核酸プールを非標的タンパク質にも適用し、非標的タンパク質に対して親和性のある核酸を分離する。
【００１３】
次いで、標的タンパク質に親和性を持つ核酸からこの非標的タンパク質に対して親和性のある核酸を分離・除去することによって、標的タンパク質に特異的に結合するのみならず、非標的タンパク質に親和性を持たない核酸のみを選別する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、多種類からなるタンパク質の混合物から、標的タンパク質に特異的に結合するのみならず、非標的タンパク質に親和性を持たない核酸を短時間で簡便に得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１は本発明を説明するフロー図である。すなわち、標的タンパク質に特異的に結合するのみならず、非標的タンパク質に親和性を持たない核酸のみを選別する過程である。
【００１６】
本明細書中、ある核酸があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その核酸が、そのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して、他の（タンパク質またはその断片の）アミノ酸配列に対する親和性よりも、実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、当業者に利用可能な所望の測定装置または方法によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋa）が少なくとも１０7Ｍ-1、好ましくは、少なくとも１０8Ｍ-1、より好ましくは、１０9Ｍ-1、さらにより好ましくは、１０10Ｍ-1、１０11Ｍ-1、１０12Ｍ-1またはそれより高い、例えば、最高で１０13Ｍ-1またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００１７】
図１（Ａ）は、標的タンパク質と非標的タンパク質とからなる多種のタンパク質を含む混合物から標的タンパク質と非標的タンパク質を含むタンパク質群とに分離する過程であり、たとえば、標的タンパク質に特異的に結合する抗体を利用して標的タンパク質Ａと非標的タンパク質Ｂ，Ｃ，Ｄ，‐‐‐，Ｚとに分離した状態を示す。
【００１８】
図１（Ｂ）は、分離された標的タンパク質に、あらかじめ準備された１０15レベルの種類の１本鎖ＤＮＡプールを適用することを示す図である。
【００１９】
図１（Ｃ）は、標的タンパク質Ａに核酸が結合した状態を模式的に示す図である。標的タンパク質Ａには核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄが結合している。したがって、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールは核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄである。
【００２０】
図１（Ｄ）は、非標的タンパク質Ｂ，Ｃ，Ｄ，‐‐‐，Ｚに標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールである核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄを適用することを示す図である。
【００２１】
図１（Ｅ）は、非標的タンパク質Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅそれぞれに核酸が結合した状態を模式的に示す図である。非標的タンパク質Ｂには核酸Ｂ，ｄが、非標的タンパク質Ｃには核酸Ｂ，ｄが、非標的タンパク質Ｄには核酸ｂが、非標的タンパク質Ｅには核酸Ｂ，ｄが、それぞれ、結合している。したがって、これらの非標的タンパク質に結合したすべての核酸から、非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールとして核酸Ｂ，ｂ，ｄが得られる。この結果、標的タンパク質Ａに標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄと評価された核酸の内、核酸Ｂ，ｂ，ｄは不適切なものであることが分かる。
【００２２】
図１（Ｆ）は、この処理を示す図である。すなわち、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールの核酸Ａ，Ｂ，ａ，ｂ，ｄから非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄを取り除き、核酸Ａ，ａが標的タンパク質特異的ＤＮＡプールであることを示す。この処理は、例えば、図１（Ｇ）の下段部に示すように、非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールの核酸Ｂ，ｂ，ｄをクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２に固定し、これにトラップされる核酸を除去することにより、容易に実行できる。
【００２３】
上述の各過程について、以下により具体的な処理について説明する。
【００２４】
（実施例１）
実施例１では、以下の手順により標的タンパク質に特異的に結合する核酸を得る。
【００２５】
（Ｉ）標的タンパク質と非標的タンパク質の分離
【００２６】
（１）標的タンパク質の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを準備し、多種のタンパク質が懸濁されているバッファーに混ぜる。図２（Ａ）はこの状態を模式的に示す図であり、１１1は試験管、１２1はバッファー、１３は標的タンパク質、１４は非標的タンパク質、１５は抗体が固定化された磁気ビーズである。バッファー１２1内で抗体が固定化された磁気ビーズ１５が標的タンパク質１３に結合するのを待って試験管１１1の外から磁石１６を接近させて、磁気ビーズ１５を引き付ける。その状態のまま、バッファー１２1とともに磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的タンパク質１４を他の試験管１１2に移動させてタンパク質の磁気分離を行う。図２（Ｂ）、（Ｃ）はこの状態を模式的に示す図であり、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合した標的タンパク質１３は試験管１１1に残り、磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的タンパク質１４は試験管１１2に移される。磁気分離の方法は、確立している手順に従って行う。
【００２７】
（２）本発明の目的とする標的タンパク質に特異的に結合する核酸となり得る核酸候補を選定するために、５’末端側に所定の数の固有の配列の塩基よりなる固定部、３’末端側に所定の数の固有の配列の塩基よりなる固定部を有し、両固定部の間にランダムな塩基配列を有するランダム部よりなる１本鎖ＤＮＡプールを準備する。５’末端側の固定部および３’末端側の固定部の塩基配列は、それぞれ、同一であり、塩基の数は１８から３８、ランダム部の塩基の数は３０〜１００程度とすればよい。１本鎖ＤＮＡプールは全体で１０15程度の種類のＤＮＡとすればよい。この１本鎖ＤＮＡプールは核酸合成装置で作成してもよいし、市販されているものを購入するものとしてもよい。図３の上部にはこれを模式的示す。２１1，２１2，---，２１nはそれぞれＤＮＡを意味する参照番号であり、両側に示す塗りつぶし部が塩基配列の固定部、これら固定部に挟まれたパターン表記部が塩基配列のランダム部である。
【００２８】
（３）前記１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを熱変性し、次いで適する温度制御を行うことで、１本鎖ＤＮＡプール内の各ＤＮＡの高次構造を均一にする。この高次構造を保ったＤＮＡを、前記標的タンパク質１３を集めた試験管１１1のバッファー１２2へ添加し、タンパク質と結合させる。このとき標的タンパク質１３には、前記１０15程度の種類のＤＮＡのうちのいくつかの配列のＤＮＡが結合する。実際には、親和性の大きい配列のＤＮＡほど、多く結合する。図３の下部の左側にこれを模式的に示す。図３では、１本鎖ＤＮＡプールに模式的に示した７つのＤＮＡパターンの内、４つのＤＮＡが標的タンパク質１３に結合した様子を模式的に示す。このとき標的タンパク質１３に結合したＤＮＡは、標的タンパク質１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性があるものである。このとき用いるバッファー１２2はマグネシウムイオンＭｇ2+を含むバッファーなどの標準的なものを用い、さらに結合時には非特異的結合を抑えるために酵母のｔＲＮＡとウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加しておくのが良い。
【００２９】
（ＩＩ）標的タンパク質に結合するＤＮＡの増幅
【００３０】
（４）次に、リアルタイムＰＣＲによって、そのタンパク質表面上に結合した１本鎖ＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１1が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には無修飾のプライマー２３を用いる。一方、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には、５’末端がビオチン２４で修飾されたプライマー２２を用いる。図３の下部の中央にこれを模式的に示す。ここで、標的タンパク質１３に特異的に結合するＤＮＡと非特異的に結合するＤＮＡとのＳ／Ｎ比を大きくするため、リアルタイムＰＣＲによって増幅量を確認し、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
【００３１】
（５）次に、リアルタイムＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるアンチセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。図３の下部の右側にこれを模式的に示す。リアルタイムＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファーは、ビオチン２４を透過させないフィルタ２６を有する試験管１１3に注入される。フィルタ２６を透過したバッファー２７は、したがって、標的タンパク質１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性があるＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。図３では、これを標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的タンパク質１３に結合した４つのＤＮＡが該当する。
【００３２】
（６）次に、得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、アンチセンス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図３では、この過程は図示されていない。
【００３３】
（ＩＩＩ）非標的タンパク質１４に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅
【００３４】
（７）次に、図４（Ｃ）に示したように、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的タンパク質１４が入っている試験管１１2のバッファー１２2に、前記操作（６）で得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールのＤＮＡを注入して非標的タンパク質１４に結合させる。図４の左側にこれを模式的に示す。図４では、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールに模式的に示した４つのＤＮＡパターンの内、３つのＤＮＡが非標的タンパク質１４に結合した様子を模式的に示す。このとき非標的タンパク質１４に結合したＤＮＡは、標的タンパク質１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡであるとともに、非標的タンパク質１４にも特異的に結合する可能性があるものである。
【００３５】
（８）次に、試験管１１2内のタンパク質１４表面上に結合したＤＮＡを、通常のＰＣＲにより増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１2が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端がビオチン２４で修飾されたプライマー２３を、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端がアミノ基２５で修飾されたプライマー２２を用いる。図４の中央にこれを模式的に示す。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００３６】
（９）次に、ＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるセンス鎖ＤＮＡについては、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してフィルタを用いて除去する。図４の右側にこれを模式的に示す。ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファー１２2は、ビオチン２４を透過させないフィルタ２６を有する試験管３５に注入される。フィルタ２６を透過したバッファー３７は、したがって、非標的タンパク質１４に特異的に結合する配列を持つＤＮＡのアミノ基修飾アンチセンス鎖ＤＮＡのみを有するものとなる。図４では、これを非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的タンパク質１３に結合した４つのＤＮＡの内の３つのＤＮＡが該当する。
【００３７】
（１０）次に、得られた非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したアンチセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図４では、この過程は図示されていない。
【００３８】
（ＩＶ）アフィニティクロマトグラフィーによるＤＮＡ精製
【００３９】
（１１）次に、前記（１０）の過程で得られた非標的タンパク質特異的アンチセンス鎖ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡをクロマトグラフィーのカラム４１内に設けられている担体ＮＨＳ４２等に固定する。これを、図５の中央部に模式的に示す。担体へのＤＮＡの固定はすでに確立されている従来の方法に従って行う。
【００４０】
（１２）次に、カラム４１全体を９５℃にして担体４２に固定されたＤＮＡを熱変性させる。
【００４１】
（１３）次に、前記（ＩＩ）標的タンパク質に結合するＤＮＡの増幅の過程（６）で精製した標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを熱変性し、カラム４１に添加する。これを、図５の上部に模式的に示す。
【００４２】
（１４）次に、カラム４１をハイブリダイゼーション温度（例えば、６０〜７０℃）に保持することで、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡと、非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを対合させることで、相補的なＤＮＡをカラム４１内でトラップさせる。その結果、標的タンパク質特異的候補センス鎖ＤＮＡの内、非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補であるＤＮＡはカラム４１内でトラップされ、逆に、非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡと相補でないＤＮＡのみがカラム４１から流出する。これを、標的タンパク質特異的センス鎖ＤＮＡと表示し、図５の下部に模式的に示す。
【００４３】
本明細書中、核酸（ヌクレオチド）配列について「ハイブリダイゼーション」とは、ヌクレオチド配列同士の相補性が高い場合、二本鎖を形成することをいう。通常、二本鎖は、互いの核酸が相補的になるように設計されているが、必要に応じて（例えば、核酸を検出に使用する場合は、その目的上、問題が生じない範囲において）、その核酸中に、１または複数個（例えば、２〜５個）のミスマッチを含んでいてもよい。存在してもよいミスマッチの数は、例えば、要求される検出精度、ヌクレオチド配列（または塩基配列もしくは核酸（配列）もしくはポリヌクレオチド）の長さに応じて変化し得る。なお、核酸配列と、それがハイブリダイズする相手の核酸配列とのハイブリダイゼーション条件を適宜変更することにより、ミスマッチが存在する場合を排除したり、許容できるミスマッチの数を調整したりすることができることは当業者に周知である。
【００４４】
なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５０℃、のように決定され得る。ただし、用いられる核酸配列の担体への固定部分は、通常、どの核酸配列でも共通であることから、ハイブリダイゼーションは、この固定部分の融解温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）よりは少なくとも高い温度で行うこと、また、これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有する核酸が効率的に得られることは当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、核酸の濃度、核酸の長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００４５】
（１５）もっとも、カラム４１から流出してくるＤＮＡには、それでもなお標的タンパク質に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡのみならず、完全にトラップしきれなかった非標的タンパク質に結合するセンス鎖ＤＮＡも含まれることが予想される。このため、カラム４１から流出してくるＤＮＡを前記過程（４）−（６）と同様にリアルタイムＰＣＲによって増幅し、再度カラム４１に適用する。ここではＳ／Ｎ比を大きくするために、増幅量が確認できるリアルタイムＰＣＲを行い、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。このリアルタイムＰＣＲによる増幅および再度カラム４１に適用する処理は、必要により、繰り返し行うことができる。これを、図５の中央部右側に模式的に示す。図５では、標的タンパク質に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡの内、非標的タンパク質に結合するセンス鎖ＤＮＡを除いたセンス鎖ＤＮＡが１つのみであるように表示したが、これは複数種であることが一般的である。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
【００４６】
（Ｖ）選択されたＤＮＡのシーケンシング
【００４７】
（１６）次に、過程（１５）で選択された複数種の標的タンパク質に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡをＴＡクローニング法によって、プラスミドベクター内に挿入し、大腸菌に導入してクローニングするとともに増幅する。
【００４８】
（１７）次に、通常のシーケンス反応により、各々の標的タンパク質に特異的に結合するセンス鎖ＤＮＡの配列を決定する。
【００４９】
（１８）次に、必要に応じて、各々のセンス鎖ＤＮＡの配列を標的タンパク質に結合させて結合定数を評価する。
【００５０】
前記手順の内、図４で説明した通常のＰＣＲによるＤＮＡの増幅をリアルタイムＰＣＲとしても良い。この場合、図３で説明したリアルタイムＰＣＲで増幅するほどの精密さは要求されないので、プラトーの管理をする必要はない。
【００５１】
また、過程（５）、（９）のプライマーを除去するための電気泳動を用いる方法は、フィルタを用いて分子量の相違によって除去しても良い。
【００５２】
また、過程（５）のアンチセンス鎖除去、過程（９）のセンス鎖除去については、担体にストレプトアビジンが結合したカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行っても良い。
【００５３】
（実施例２）
実施例２では、以下の手順により標的タンパク質に特異的に結合する核酸を得る。実施例１との違いは、ビオチンが修飾されたＤＮＡの除去をフィルタで行うのに代えて、ビオチンと結合するストレプトアビジンが付加された磁気ビーズを利用して行うことにある。以下の説明では、処理過程（４１）からはじめるが、処理過程５０までは実施例１の処理過程（１）から（１０）対応し、実施例１の処理過程に付した番号に４０を加えた番号となっている。
【００５４】
（Ｉ）標的タンパク質と非標的タンパク質の分離
【００５５】
（４１）標的タンパク質の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを準備し、多種のタンパク質が懸濁されているバッファー１２1に混ぜ、磁気ビーズ１５が結合した標的タンパク質１３と磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的タンパク質１４と分離する。この過程は、図２に示す実施例１と同じであるので図示は省略する。
【００５６】
（４２）本発明の目的とする標的タンパク質に特異的に結合する核酸となり得る核酸候補を選定するため、１本鎖ＤＮＡプールを準備して標的タンパク質１３に結合させる手順についても、図３に示す実施例１と同じであるので、説明および図示は省略する。
【００５７】
（ＩＩ）標的タンパク質に結合するＤＮＡの増幅
【００５８】
（４３）次に、実施例１と同様、図６の下部の左側に模式的に示すように、磁気ビーズ１５が結合した標的タンパク質１３の入った試験管１１1のバッファー１２2中に１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡを添加し、標的タンパク質と１本鎖ＤＮＡプールとを結合させる。
【００５９】
（４４）次に、実施例１と同様、リアルタイムＰＣＲによって、そのタンパク質表面上に結合したＤＮＡを増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１1が増幅されるものとした。このときセンス鎖ＤＮＡの増幅には無修飾のプライマー２３を用いる。一方、アンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には、５’末端がビオチン２４で修飾されたプライマー２２を用いる。図６の中央にこれを模式的に示す。
【００６０】
（４５）次に、リアルタイムＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、不要であるアンチセンス鎖ＤＮＡ５２については、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してストレプトアビジン磁気ビーズ５０を添加することで除去し、必要とするセンス鎖ＤＮＡ５１を回収する。磁気ビーズ５０とビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡの結合は、従来の方法に従って行う。図６の右側にこれを模式的に示す。リアルタイムＰＣＲ後のＤＮＡを含む試験管２８1内のバッファー４６には、ビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０が注入される。その結果、ビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡ５２のビオチン２４と磁気ビーズ５０は結合するから、試験管２８1の外部から磁石１６を接近させるとビオチン２４修飾アンチセンス鎖ＤＮＡ５２のＤＮＡは、磁石１６に引き付けられる。一方、試験管２８1内のバッファー４６に残っているＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡ５１を試験管２８2に移す。
【００６１】
その結果、試験管２８2には標的タンパク質１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡである可能性がある１本鎖ＤＮＡのセンス鎖ＤＮＡ５１のみを有するものとなる。図６では、これを標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールと表示した。図の例では、実施例１の試験管１１1の標的タンパク質１３に結合した４つのＤＮＡが該当する。
【００６２】
（４６）次に、得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールを希塩酸ＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、アンチセンス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図６では、この過程は図示されていない。
【００６３】
（ＩＩＩ）非標的タンパク質に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅
【００６４】
（４７）次に、図２（Ｃ）に示したように、抗体が固定化された磁気ビーズ１５が結合しなかった非標的タンパク質１４が入っている試験管１１2に、前記操作（２６）で得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールのＤＮＡを非標的タンパク質１４に結合させる。図７の左側にこれを模式的に示す。図７では、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールに模式的に示した４つのＤＮＡパターンの内、３つのＤＮＡが非標的タンパク質１４に結合した様子を模式的に示す。このとき非標的タンパク質１４に結合したＤＮＡは、標的タンパク質１３に特異的に結合する配列を持つＤＮＡであるとともに、非標的タンパク質１４にも特異的に結合する可能性があるものである。
【００６５】
（４８）次に、試験管１１2内のタンパク質１４表面上に結合したＤＮＡを、通常のＰＣＲにより増幅する。ここでは、１本鎖ＤＮＡプールのＤＮＡ２１2が増幅されるものとした。このときアンチセンス鎖ＤＮＡの増幅には５’末端がビオチン２４で修飾されたプライマー２２を、センス鎖ＤＮＡの増幅には無修飾のプライマー２３を用いる。図７の中央にこれを模式的に示す。ここで行うＰＣＲは既に確立されている従来の方法に従って行う。
【００６６】
（４９）次に、ＰＣＲ後、電気泳動によって未反応のプライマーを除去し、アルカリ処理により２本鎖を解離させ、必要であるアンチセンス鎖ＤＮＡ６２については、その５’末端にビオチン２４が修飾されていることを利用してビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０と結合させて試験管内に残し、ＰＣＲ後のＤＮＡを含むバッファー４６中にあるセンス鎖ＤＮＡ６１は廃棄する。図７の右側にこれを模式的に示す。ＰＣＲ後の試験管２８1にはビオチン２４と結合するストレプトアビジンを固定した磁気ビーズ５０が注入される。ストレプトアビジンとビオチン２４が結合し、試験管２８1に磁石１６を近づけて、磁気ビーズ５０を引き寄せると、アンチセンス鎖ＤＮＡ６２が試験管２８1の壁に引き寄せられる。この状態でバッファーとセンス鎖ＤＮＡ６１を廃棄する。したがって、試験管２８1内は非標的タンパク質１４に特異的に結合する配列を持つＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２のみを有するものとなる。図７では、これを非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールと表示した。図の例では、試験管１１1の標的タンパク質１３に結合した４つのＤＮＡの内の３つのＤＮＡが該当する。
【００６７】
（５０）次に、得られた非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡをＨＣｌなどで中和後、ＴＥバッファーなどの一般的な試薬で洗浄する。これにより、センス鎖ＤＮＡ除去のためのアルカリ処理によりアルカリ変性したアンチセンス鎖ＤＮＡを復帰させる。図７では、この過程は図示されていない。
【００６８】
（ＩＶ）ストレプトアビジン磁気ビーズ上でのハイブリダイゼーション
【００６９】
（５１）次に、前記（４６）、（５０）の過程で得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡ５１と磁気ビーズ５０付の非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２を試験管２８2に一緒に入れて混合し、ハイブリダイゼーションさせる。その結果、前記過程（４６）と過程（５０）で得られた標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールのセンス鎖ＤＮＡ５１の内、非標的タンパク質特異的ＤＮＡプールのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２と相補であるものについては、相補的に対合させることができ、それらの配列をもつセンス鎖ＤＮＡ５１を磁気ビーズ５０上でトラップさせることができる。磁石１６を試験管２８2の外部から近づけると、磁気ビーズ５０が試験管２８2の外壁に引き付けられる。したがって、試験管内２８2のバッファー４６には、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡプールの内、その相補鎖が非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２に含まれないＤＮＡのみが残される。これを、標的タンパク質特異的ＤＮＡのセンス鎖プールと表示し、図８の下部に模式的に示す。
【００７０】
（５２）もっとも、試験管２８2のバッファー４６に残されたＤＮＡには、それでもなお標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡのみならず、完全にトラップしきれなかった非標的タンパク質に結合するＤＮＡも含まれることが予想される。このため、試験管２８2のバッファー４６に残されたＤＮＡを前記過程（２４）−（２６）と同様にリアルタイムＰＣＲによって増幅し、再度、磁気ビーズ５０付の非標的タンパク質特異的ＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡ６２と試験管２８2に一緒に入れて、磁気ビーズ５０上でトラップさせる。ここではＳ／Ｎ比を大きくするために、増幅量が確認できるリアルタイムＰＣＲを行い、プラトーに達する前に反応を終了するのが良い。このリアルタイムＰＣＲによる増幅および再度磁気ビーズ５０上でトラップさせる処理は、必要により、繰り返し行うことができる。これを、図８の中央部右側に模式的に示す。図８では、標的タンパク質に特異的に結合するＤＮＡの内、非標的タンパク質に結合するＤＮＡを除いたＤＮＡが１つのみであるように表示したが、これは複数種であることが一般的である。リアルタイムＰＣＲの条件は、既に確立されている方法に従う。
【００７１】
（Ｖ）選択されたＤＮＡのシーケンシング
【００７２】
（５３）次に、過程（５２）で選択された複数種のＤＮＡをＴＡクローニング法によって、プラスミドベクター内に挿入し、大腸菌に導入してクローニングするとともに増幅する。
【００７３】
（５４）次に、通常のシーケンス反応により、各々のＤＮＡの配列を決定する。
【００７４】
（５５）次に、必要に応じて、各々のＤＮＡの配列を標的タンパク質に結合させて結合定数を評価する。
【００７５】
実施例２においても、前記図７で説明した通常のＰＣＲによるＤＮＡの増幅をリアルタイムＰＣＲとしても良いが、図６で説明したリアルタイムＰＣＲで増幅するほどの精密さは要求されないので、簡便に通常のＰＣＲとすればよい。
【００７６】
また、過程（４５）、（４９）のプライマーを除去するための電気泳動を用いる方法は、フィルタを用いて分子量の相違によって除去しても良い。
【００７７】
また、過程（４５）のアンチセンス鎖除去、過程（４９）のセンス鎖除去については、担体にストレプトアビジンが結合したカラムを用いて、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行っても良い。
【００７８】
以上、本発明の例示的実施形態を説明したが、種々の変更、改変、および改良が当業者に容易に想起される。上記は、本発明の原理を例示的に示したものに過ぎず、当業者であれば、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変を為し得る。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば標的タンパク質に特異的に結合し、非標的タンパク質とは結合することのないＤＮＡを容易に得ることができるので、創薬、医療分野の研究発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】（Ａ）−（Ｇ）は本発明を説明するフロー図である。
【図２】（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は実施例１の標的タンパク質と非標的タンパク質の分離をタンパク質の表面に結合する抗体が固定化された磁気ビーズを利用して行う手順を模式的に示す図である。
【図３】実施例１の標的タンパク質特異的候補ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図４】実施例１の標的タンパク質特異的候補ＤＮＡの内の非標的タンパク質に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図５】アフィニティクロマトグラフィーにより、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡから、非標的タンパク質に結合するＤＮＡを除去してＤＮＡを精製する手順を模式的に示す図である。
【図６】実施例２の標的タンパク質特異的候補ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図７】実施例２の標的タンパク質特異的候補ＤＮＡの内の標的タンパク質に結合するＤＮＡのアンチセンス鎖ＤＮＡを選定する手順を模式的に示す図である。
【図８】ストレプトアビジン磁気ビーズ上でのハイブリダイゼーションにより、標的タンパク質特異的候補ＤＮＡの内の標的タンパク質に結合するＤＮＡを除去してＤＮＡを精製する手順を模式的に示す図である。
【符号の説明】
【００８１】
１１1，１１2，１１3，２８1，２８2，３５…試験管、１２1，１２2，２７，３７，４６…バッファー、１３…標的タンパク質、１４…非標的タンパク質、１５…抗体が固定化された磁気ビーズ、１６…磁石、２１1，２１2，---，２１n…ＤＮＡ、２２，２３…プライマー、２４…ビオチン、２５…アミノ基、２６…フィルタ、４１…クロマトグラフィーのカラム、４２…カラム内の担体、５０…ストレプトアビジン磁気ビーズ、５１，６１…センス鎖ＤＮＡ、５２，６２…アンチセンス鎖ＤＮＡ。
【図１】
2008283883.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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