(57)【要約】【課題】抗老化作用を示す種々の剤、抗老化用皮膚外用剤及び皮膚の抗老化方法を提供する。【解決手段】ヒトリシズカ抽出物を有効成分とする、ＭＭＰ活性阻害剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、IV型コラーゲン産生促進剤、及びエストロゲン様作用発現剤；ヒトリシズカ抽出物を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤；ならびにヒトリシズカ抽出物を供給することによって、繊維芽細胞を賦活化、ＭＭＰ活性を阻害、Ｉ型コラーゲン産生を促進、IV型コラーゲン産生を促進、又はエストロゲン様作用を発現して、皮膚の老化を防止する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分とする繊維芽細胞賦活剤。
【請求項２】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性阻害剤。
【請求項３】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするＩ型コラーゲン産生促進剤。
【請求項４】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするIV型コラーゲン産生促進剤。
【請求項５】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするエストロゲン様作用発現剤。
【請求項６】
ヒトリシズカ抽出物を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤。
【請求項７】
ヒトリシズカ抽出物を供給することによって、繊維芽細胞を賦活化、ＭＭＰ活性を阻害、Ｉ型コラーゲン産生を促進、IV型コラーゲン産生を促進、又はエストロゲン様作用を発現して、皮膚の老化を防止する方法（但し、人間の治療方法は除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化粧料等の皮膚外用剤の有効成分として有用な、老化機構に作用する種々の剤に関する。また、本発明は抗老化用皮膚外用剤及び皮膚の抗老化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、乳液、クリーム、化粧水、パック、洗浄料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の皮膚外用剤には、これらに所定の薬効を付与することを目的として種々の薬効成分が加えられている。近年、皮膚のトラブルの原因が種々解明され、それに伴い、皮膚外用剤、特に化粧料に対する消費者のニーズも細分化されつつある。例えば、老化により、表皮と真皮との間に存在する基底膜が構造変化することや機能低下することが知られている。また、真皮を形成している細胞外マトリックスが、紫外線の照射等により活性化されたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）によって分解されること等も知られている。従って、基底膜を構成するコラーゲンの産生を促進させるエストロゲン様の作用を発揮することにより、細胞外マトリックスを分解するＭＭＰの活性化を阻害することにより、細胞外マトリックスを構成する蛋白質を分泌する繊維芽細胞を賦活化することにより、又は細胞外マトリックスや基底膜を構成するコラーゲンの産生を促進することにより、抗老化作用を示す剤の提供が望まれている。
【０００３】
一方、皮膚外用剤に配合される有効成分としては、皮膚に対する安全性も重要であることから、従来、天然物由来の剤である種々の植物抽出物が皮膚外用剤の有効成分として提案されている。例えば、ヒトリシズカ抽出物からなる保湿剤が提案されている（特許文献１）。
【特許文献１】特許第３６９６８６２号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、皮膚に対する安全性が高く、皮膚外用剤の有効成分等として有用な、新規な、繊維芽細胞賦活剤、ＭＭＰ活性阻害剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、IV型コラーゲン産生促進剤、及びエストロゲン様作用発現剤を提供することを課題とする。
また、本発明は、抗老化効果に優れた、抗老化用皮膚外用剤を提供することを課題とする。
また、本発明は、新規な皮膚の抗老化方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記課題を解決するため、本発明は、ヒトリシズカ抽出物を有効成分とする繊維芽細胞賦活剤；ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性阻害剤；ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするＩ型コラーゲン産生促進剤；ヒトリシズカ抽出物を有効成分とするIV型コラーゲン産生促進剤；及びヒトリシズカ抽出物を有効成分とするエストロゲン様作用発現剤；を提供する。
また、別の観点から、本発明によって、ヒトリシズカ抽出物を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤；及びヒトリシズカ抽出物を供給することによって、繊維芽細胞を賦活化、ＭＭＰ活性を阻害、Ｉ型コラーゲン産生を促進、IV型コラーゲン産生を促進、又はエストロゲン様作用を発現して、皮膚の老化を防止する方法；が提供される。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、老化機構に関与して、抗老化作用を奏する、新規な剤及び新規な方法を提供することができる。また、本発明によれば、抗老化効果に優れた、抗老化用皮膚外用剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明について詳細に説明する。なお、本明細書において、「〜」はその前後の数値を含む範囲を意味するものとする。
本発明の老化機構に関与する種々の剤、即ち、繊維芽細胞賦活剤、ＭＭＰ活性阻害剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、IV型コラーゲン産生促進剤及びエストロゲン様作用発現剤（以下、総称して「抗老化剤」という）は、センリョウ科チャラン属ヒトリシズカ（学名：Chloranthus japonicus）抽出物を有効成分とする。本発明に用いられるヒトリシズカ抽出物は、抽出部位についての制限はなく、ヒトリシズカの根、茎、葉、花序、果実、種子等いずれの部分の抽出物であってもよい。又、本発明の抗老化剤には、ヒトリシズカの２箇所以上から得られた抽出物を混合してもよく、あるいは２箇所以上の部分から異なる溶媒により抽出された抽出物を二種以上混合して用いてもよい。
【０００８】
前記ヒトリシズカ抽出物は、ヒトリシズカの根、茎、葉、花序、果実、種子等の１箇所又は２箇所以上を、適当な溶媒によって抽出し、溶媒を留去することにより得られる。これらの部分に乾燥、細切、圧搾、又は発酵などの適宜の処理を施した後、抽出処理等を施してもよい。抽出は、ヒトリシズカを低温ないし加温下で溶媒中に所定の時間浸漬することによって実施できる。抽出溶媒は特に限定されないが、水、又はメチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン等のケトン類；エチルエーテル等のエーテル類；もしくは酢酸エチル等のエステル類；等の有機溶媒の一種又は二種以上を、及びこれらと水との混合溶媒を用いることができる。
【０００９】
前記ヒトリシズカ抽出物は、そのまま皮膚外用剤に配合してもよいし、適宜の期間そのまま放置し、熟成させた後に用いることもできる。必要ならば、効果に影響のない範囲で、さらにろ過やイオン交換樹脂等による脱臭、脱色等の精製処理を施した後に用いることもできる。又、液体クロマトグラフィー等の分離手段を用いて、活性の高い画分のみを用いることもできる。
【００１０】
前記ヒトリシズカ抽出物の好ましい調製方法の例としては、ヒトリシズカを、含水もしくは非含水のエチルアルコール等のアルコール系溶媒、含水もしくは非含水の１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール系溶媒、又は水を用い、室温又は加温して１〜５日間抽出を行った後、ろ過し、得られたろ液を、さらに１週間程度放置して熟成させ、再び、ろ液をろ過する方法が挙げられる。
【００１１】
抽出物中の成分としては、フラボノイド配糖体、フェノール類、アミノ酸、トリテルペン等が挙げられる。抽出溶媒中のアルコール系溶媒又は多価アルコール系溶媒の含有量が高いほど、トリテルペンの含有量が高くなる。
本発明の繊維芽細胞賦活剤、ＭＭＰ活性阻害剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、又はIV型コラーゲン産生促進剤に用いるヒトリシズカ抽出物は、その抽出溶媒が、水と１価アルコールとの混合溶媒であるのが好ましく、水とエチルアルコールとの混合溶媒であるのがより好ましく、エチルアルコールの混合割合が５０体積％（以下「ｖｏｌ％」という）以上である水とエチルアルコールとの混合溶媒であるのがさらに好ましい。
一方、本発明のエストロゲン様作用発現剤に用いるヒトリシズカ抽出物は、その抽出溶媒が、水のみ、又は水と１価アルコールとの混合溶媒であるのが好ましく、水のみであるのがより好ましい。
【００１２】
前記ヒトリシズカ抽出物は、抽出液として、スプレードライ等により乾燥させて粉末状として、又は使用目的に合わせて乾燥固形分もしくは粉末を適切な溶媒と混合して用いることができる。即ち、液状、ペースト状、ゲル状等のいずれの形態で、本発明の抗老化剤の有効成分として用いてもよい。
【００１３】
ここで、繊維芽細胞の賦活化、ＭＭＰ活性の阻害、Ｉ型又はIV型コラーゲン産生の促進、及びエストロゲン様作用の発現と、抗老化効果との関連性について説明する。
皮膚は主に表皮及び真皮から構成されており、その２層間に基底膜という膜様構造体が存在する。真皮を形成している細胞外マトリックスは、主にＩ型コラーゲン、III型コラーゲン、エラスチン等であり、これらのタンパク質の構成成分は線維芽細胞から分泌される。細胞外マトリックスはＭＭＰにより分解を受ける。ＭＭＰの分泌や活性上昇は、紫外線等により上昇することが知られている。また、IV型コラーゲンは基底膜の一構成成分であることが知られる。基底膜の老化による構造変化や機能低下が知られており、エストロゲンは女性ホルモンの一種であり、コラーゲン産生を促進させることが知られている。
すなわち、真皮を構成するタンパク質を分泌する線維芽細胞を賦活化させること、細胞外マトリックスの分解に関与するＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ−２）の活性を阻害すること、真皮や基底膜の構成成分であるＩ型コラーゲン又はIV型コラーゲンの産生を促進すること、及びコラーゲンの産生を促進するエストロゲン様作用を発現することにより、皮膚の老化防止効果が期待できる。
【００１４】
本発明の抗老化剤は、種々の用途に用いることができる。皮膚に対する安全性が良好であるので、皮膚外用剤中に配合することが好ましい。その他、本発明の抗老化剤は、食品（飲料を含む）に配合することもできる。前記食品としては、特に制限されないが、具体的には、例えば、飴、チューインガム、飲料等が挙げられる。
【００１５】
次に、本発明の皮膚外用剤について詳細に説明する。
本発明の皮膚外用剤は、本発明の抗老化剤であるヒトリシズカ抽出物を有効成分として含有する抗老化用皮膚外用剤である。前記抗老化剤の配合量については特に制限はないが、最終形態である皮膚外用剤の全質量に対して、前記ヒトリシズカ抽出物が固形分として０．００００５〜１．５質量％（以下、単に「％」という）であるのが好ましく、０．０００５〜１．５％であるのがより好ましい。この範囲内であれば、該成分を安定的に配合することができ、且つ高い繊維芽細胞の賦活化、ＭＭＰ活性の阻害、Ｉ型コラーゲン産生の促進、IV型コラーゲン産生の促進、又はエストロゲン様作用の発現をもたらし、それに基づく高い抗老化作用を発揮することができる。また、抽出液を使用する場合は、溶質であるヒトリシズカ抽出物の含有量が上記範囲内であれば、その抽出液濃度は何ら限定されるものではない。
【００１６】
本発明の皮膚外用剤の形態は、特に限定されず、例えば、乳液、クリーム、化粧水、美容液、パック、洗浄料、メーキャップ化粧料、分散液、軟膏、液剤、エアゾール、貼付剤、パップ剤、リニメント剤等の、いずれの形態の化粧料であっても外用医薬品等であってもよい。
【００１７】
又、本発明の皮膚外用剤は、前記ラジカル消去剤以外に、化粧料や医薬部外品、外用医薬品等に通常使用される各種の成分、即ち、水、アルコール、油剤、界面活性剤、増粘剤、粉体、キレート剤、ｐＨ調整剤、紫外線吸収剤、動植物・微生物由来の抽出物、保湿剤・美白剤・抗炎症剤・細胞賦活剤等の各種薬効剤、香料等を、本発明の効果を損なわない範囲で適宜加えることができる。
【００１８】
本発明は、ヒトリシズカ抽出物を供給することによって、皮膚の老化を防止する方法にも関する。例えば、皮膚の表面に適用して、繊維芽細胞を賦活化、ＭＭＰ活性を阻害、Ｉ型コラーゲン産生を促進、IV型コラーゲン産生を促進、又はエストロゲン様作用を発現して、皮膚の老化を防止し、皮膚の状態の改善、より具体的には、皮膚のしわやたるみを防止又は改善するために利用してもよい。皮膚のしわやたるみを防止又は改善して、皮膚の外観の改善、即ち、美容を目的とするのに利用することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
［例１：ヒトリシズカ８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物の製造例］
ヒトリシズカの全草１０ｇに、８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール（エチルアルコールの割合が８０ｖｏｌ％）を１５０ｍＬ加え、室温又は加温して１日抽出を行った後、ろ過し、得られたろ液中の溶媒を留去して乾固し、固形分であるヒトリシズカの８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物（収量０．８ｇ）を得た。
【００２０】
［例２：ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物の製造例］
ヒトリシズカの全草１０ｇに、５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール（エチルアルコールの割合が５０ｖｏｌ％）１５０ｍＬを加え、室温又は加温して１日抽出を行った後、ろ過し、得られたろ液中の溶媒を留去して乾固し、固形分であるヒトリシズカの５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物（収量０．７５ｇ）を得た。
【００２１】
［例３：ヒトリシズカ精製水抽出物の製造例］
ヒトリシズカの全草１０ｇに、精製水を１５０ｍＬ加え、室温又は加温して１日抽出を行った後、ろ過し、得られたろ液中の溶媒を留去して乾固し、固形分であるヒトリシズカ精製水抽出物（収量０．７３ｇ）を得た。
【００２２】
［例４：線維芽細胞賦活作用の評価］
（測定方法）
２４ｗｅｌｌプレートに培地を適量加え、ヒト新生児由来皮膚線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を播種し、３７℃、二酸化炭素濃度５％中にて静置した。翌日、例１で得られたヒトリシズカ抽出物の最終濃度が０（対照）、１、１０、１００μｇ／ｍＬになるように試料をそれぞれ精製水に溶解させ、被験試料溶液を調製した。培養４日目に培地を交換し、再度、試料を添加した。翌日、ＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を５ｍｇ／ｍＬになるよう調製した溶液を、各ｗｅｌｌにそれぞれ１００μＬずつ添加した。４時間培養した後、培地を除去し、イソプロパノールを用いて生成したホルマザンを溶解した。マイクロプレートリーダーを用いてリファレンスを６３０ｎｍと５７０ｎｍとで吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。なお、ブルーホルマザンの生成量が多いほど、繊維芽細胞が賦活化されていることを示す。
下記表に、対照に対する比率を算出した。
【００２３】
【表１】
2008088074.tif 000002
【００２４】
［例５：ＭＭＰ−２活性抑制作用の評価］
（１）ＭＭＰ−２の調製
ヒトＭＭＰ−２  ｃＤＮＡを、５’ＰＣＲプライマー（５’−ｇｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｃｇｃｃｇｔｃｇｃｃｃａｔｃａｔｃ−３’）、及び３’ＰＣＲプライマー（３’−ｇｃｃｇｔｃｇａｃｔａｃａａｔｇｔｃｃｔｇｔｔｔｇｃａｇａｔ−５’）を用い、ＭＭＰ−２の３．３ｋｂ  ｃＤＮＡ断片を含むｐＳＧ−ＧｅｌＡを鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られた30Ａｌａから474Ｖａｌまでをコードする１．３ｋｂ  ＰＣＲ断片をＢａｍ  ＨＩ／Ｓａｌ  Ｉで消化し、ｐＴＨ−７２発現ベクター（ｐＴＨ−ＭＭＰ２−ＰＣ）のＢａｍ  ＨＩ／Ｓａｌ  Ｉ部位にクローン化した。
ヒトＭＭＰ−２の発現は、Itoh, M. et al.; J.Biolchem.,119:667-673(1996)、精製及び巻き戻し（以下「リフォールディング」とする。）は、西村義文、大野茂雄  監修：タンパク実験プロトコール、細胞工学別冊  実験プロトコールシリーズ２  構造解析編、１９９７に準じて行った。また、ｃＤＮＡは、Collier, I. E. et al.; J. Biol. Chem., 263(14), 6579-6587(1998)に記載されているものを使用した。
具体的には、ＭＭＰ−２のｃＤＮＡを含む発現ベクター（ｐＴＨ−ＭＭＰ−２）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフェクトし、ＩＰＴＧで発現誘導した。発現タンパクは、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（ＱＵＩＡＧＥＮ  ＩＮＣ．，米国）を用いてアフィニティー精製後、リフォールディングを行い、酢酸４−アミノフェニル水銀と３７℃、６０分間反応を行なうことで活性型へ移行させた後、ＥＤＴＡを加えた。これを酵素標本とし、蛍光性ペプチド基質（ＭＯＣＡｃ／ＤＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ）切断活性反応を行ない、高速液体クロマトグラフィー（カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ５Ｃ１８、溶離液：３０％アセトニトリル＋０．１％ＴＨＦ、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出：励起波長３２５ｎｍ、蛍光波長４１０ｎｍ）による生成物のピーク面積を測定し、これを酵素活性の指標とした。
【００２５】
（２）ヒトリシズカ抽出物のＭＭＰ−２阻害活性の測定
被験試料を、蒸留水に溶解させて８．０ｍｇ／ｍＬとした後、蒸留水にて４．０ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬに希釈し、懸濁物を除くため、ろ過を行った。ＭＭＰ−２阻害活性の測定は、上記調製した活性型ＭＭＰ−２の４０μＬ、被験試料溶液２０μＬ、アッセイバッファー２０μＬ（トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍｍｏｌ／Ｌ、塩化ナトリウム１．５ｍｏｌ／Ｌ、塩化カルシウム１００ｍｍｏｌ／Ｌ、硫酸亜鉛５００μｍｏｌ／Ｌ、アジ化ナトリウム３０ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｂｒｉｊ３５  ０．０５％）を、３７℃で１５分間プレインキュベーションした後、ＭＯＣＡｃ／ＤＮＰ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １２０μＬ（４．１６μｍｏｌ／Ｌ）を添加し、３７℃で２時間反応させた後、ＥＤＴＡ  １０μＬ（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）を添加した。反応液中の生成物について高速液体クロマトグラフィー分析によるピーク面積を測定した。被験試料溶液の代わりに蒸留水を加えた反応液の生成物を１００％として、被験試料のＭＭＰ−２活性阻害率（％）を求めた。
なお、各被験試料として、ヒトリシズカ抽出物の水溶液（濃度は４００μｇ／ｍＬ）を用いた。
【００２６】
【表２】
2008088074.tif 000003
【００２７】
［例６：Ｉ型コラーゲン産生促進作用の評価］
ヒト正常線維芽細胞（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５５１）を、１０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウム含有ＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．５％のＦＢＳ含有ＭＥＭに溶解した被験試料を、各ｗｅｌｌに１５０μＬ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
コラーゲン産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ  ：被験試料添加時のコラーゲン量
Ｂ  ：被験試料無添加時のコラーゲン量
なお、各被験試料として、ヒトリシズカ抽出物の水溶液（濃度は１００μｇ／ｍＬ）を用いた。
【００２８】
【表３】
2008088074.tif 000004
【００２９】
［例７：IV型コラーゲン産生促進作用の評価］
ヒト正常線維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を１０％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を１．６×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に上記培地で希釈した後、９６ｗｅｌｌマイクロプレートに１ｗｅｌｌ当たり１００μＬずつ播種し、一晩培養した。培養終了後、培地を抜き、０．２５％のＦＢＳ含有ダルベッコＭＥＭに溶解した被験試料を、各ｗｅｌｌに１５０μＬ添加し、３日間培養した。培養後、各ｗｅｌｌの培地中のＩＶ型コラーゲン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
ＩＶ型コラーゲン産生促進作用の計算方法は以下のとおりである。
ＩＶ型コラーゲン産生促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ  ：被験試料添加時のＩＶ型コラーゲン量
Ｂ  ：被験試料無添加時のＩＶ型コラーゲン量
なお、各被験試料として、ヒトリシズカ抽出物の水溶液（濃度は下記表中に記載）を用いた。
【００３０】
【表４】
2008088074.tif 000005
【００３１】
［例８：エストロゲン様作用の評価］
ヒト乳癌由来細胞（ＭＣＦ−７）を、１０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞を、活性炭処理した１０％のＦＢＳ、１％のＮＥＡＡ、及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するフェノールレッド不含ＭＥＭ（Ｔ−ＭＥＭ）を用いて、３．０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度に希釈した後、４８ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌあたり４５０μＬずつ播種し、細胞を定着させるため培養した。６時間後（０日目）にＴ−ＭＥＭで、最終濃度の１０倍に調製した被験試料を各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し培養を続けた。３日目に培地を抜き、Ｔ−ＭＥＭで終濃度に調製した被験試料を各ｗｅｌｌに１ｍＬ添加し、さらに培養を続けた。エストロゲン様作用は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。培養終了後、培地を抜き、１％のＮＥＡＡ及び１ｍｍｏｌ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含有するＭＥＭに終濃度０．４ｍｇ／ｍＬで溶解したＭＴＴを、各ｗｅｌｌに２００μＬずつ添加した。２時間培養した後に、細胞内に生成したブルーホルマザンを２−プロパノール２００μＬで抽出した。抽出後、波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。同時に濁度として波長６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の差をもってブルーホルマザン生成量とした。なお、ブルーホルマザンの生成量が多いほど、エストロゲン様作用が高いことを示す。ポジティブコントロールとして、１０-9ｍｏｌ／Ｌエストラジオールを使用した。
エストロゲン様作用の計算方法は以下のとおりである。
エストロゲン様作用率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
Ａ  ：被験試料添加時の吸光度
Ｂ  ：被験試料無添加時の吸光度
なお、各被験試料として、ヒトリシズカ抽出物の水溶液（濃度は下記表中に記載）を用いた。
【００３２】
【表５】
2008088074.tif 000006
【００３３】
［例９：クリーム］
下記表７に示す組成のクリームを以下の方法により各々調製した。
まず、表７に示す成分（１）〜（６）及び（９）を混合し、加熱して７０℃に維持した。この混合物に成分（１１）の一部を加熱して７０℃に維持したものを加え乳化し、さらに、（１１）の残部で溶解した（７）〜（８）及び（１０）を混合した。その後、冷却してクリームを各々得た。
【００３４】
（試験方法）
被験クリーム１品につき３５〜５９才の女性１５名をパネルとし、毎日朝と夜の２回、１２週間にわたって洗顔後に被験クリームの適量を顔面に塗布した。塗布によるしわ改善効果を以下の基準によって評価し、各評価基準に該当する人数を表７に示した。
【００３５】
（評価基準）
＜評価＞＜内容＞
有効      肌のしわが目立たなくなった。
やや有効  肌のしわがあまり目立たなくなった。
無効      使用前と変化なし。
【００３６】
（組成及び結果）
【表６】
2008088074.tif 000007
【００３７】
表７に示す結果から、ヒトリシズカ８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物及びヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物を配合した、本発明品１及び２のクリームは、これらを皮膚に適用することにより、肌のしわを改善することができ、張りのある美しい肌とすることが明らかとなった。
【００３８】
以下、化粧料への配合例を示すが、これらの処方に限るものではない。
［例１０：クレンジングクリーム］
（成分）                                                      （％）
（１）ステアリン酸                                              ２．０
（２）ステアリルアルコール                                      ３．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリル                          ２．０
（４）ミツロウ                                                  １．５
（５）ワセリン                                                  ６．０
（６）流動パラフィン                                          ４０．０
（７）ジメチルポリシロキサン（１００ＣＳ）                      ０．５
（８）セスキオレイン酸ソルビタン                                １．０
（９）防腐剤                                                    適量
（１０）トリエタノールアミン                                    １．０
（１１）プロピレングリコール                                  １０．０
（１２）ポリエチレングリコール２００００                        ０．５
（１３）カルボキシビニルポリマー                                ０．０５
（１４）精製水                                                  残量
（１５）ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊１  ０．５
（１６）カミツレ抽出物＊２                                      ０．５
（１７）ウイキョウ抽出物＊３                                    ０．５
（１８）香料                                                    適量
＊１：例２で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：丸善製薬社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（９）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．成分（１０）〜（１４）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＢにＡを加え乳化する。
Ｄ．Ｃを冷却後、成分（１５）〜（１８）を加え混合し、クレンジングクリームを得た。
得られたクレンジングクリームは軽やかな伸び広がりでメイクの汚れ落ちもよく、皮膚の老化を防止し、健康的な肌を維持するクレンジングクリームであった。
【００３９】
［例１１：洗顔料］
（成分）                                                      （％）
（１）ラウリン酸                                                ５．０
（２）ミリスチン酸                                            １８．５
（３）ステアリン酸                                              ６．０
（４）グリセリン                                              １２．０
（５）ポリエチレングリコール１５００                            ５．０
（６）水酸化カリウム                                            ６．５
（７）精製水                                                    残量
（８）ヤシ油脂肪酸ジエタノールアミド                            ５．０
（９）ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム                      １．８
（１０）ポリオキシエチレン（７．５Ｅ．Ｏ．）ラウリル
エーテル                                                  ２．０
（１１）ジステアリン酸エチレングリコール                        １．０
（１２）ヒドロキシプロピルメチルセルロース１％水溶液            ５．０
（１３）ヒトリシズカ精製水抽出物＊１                            ０．５
（１４）ペパーミント抽出物＊２                                  ０．５
（１５）ムクロジ抽出物＊３                                      ０．５
（１６）香料                                                    適量
＊１：例３で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：香栄興業社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（７）を加熱溶解する。
Ｂ．成分（８）〜（１１）を加熱溶解する。
Ｃ．ＡにＢを加え混合する。
Ｄ．Ｃを冷却後、成分（１２）〜（１６）を加え混合し、洗顔料を得る。
得られたクレンジングクリーム及び洗顔料、はキメ細やかな豊かな泡立ちとさっぱりとした使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、健康的な肌を維持する洗顔料であった。
【００４０】
［例１２：化粧水１］
（成分）                                                      （％）
（１）クエン酸                                                  ０．０５
（２）クエン酸ナトリウム                                        ０．２
（３）ピロリドンカルボン酸ナトリウム（５０％）液＊１            ０．５
（４）グリセリン                                                ３．０
（５）１，３−ブチレングリコール                                ８．０
（６）Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド＊２                      ２．０
（７）水酸化ナトリウム                                          ０．２５
（８）ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊３    １．０
（９）エゾウコギ抽出物＊４                                      １．０
（１０）ニンジン抽出物＊５                                      １．０
（１１）精製水                                                    残量
（１２）エチルアルコール                                      １０．０
（１３）香料                                                    適量
（１４）防腐剤                                                  適量
（１５）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                ０．５
＊１：味の素社製
＊２：林原生物化学研究所社製
＊３：例２で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊４：丸善製薬社製
＊５：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（１１）を混合溶解する。
Ｂ．成分（１２）〜（１５）を混合溶解する。
Ｃ．ＡにＢを加え混合し、化粧水を得た。
得られた化粧水１はみずみずしくさっぱりとした使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚をみずみずしく保ち、皮膚を滑らかにする化粧水であった。
【００４１】
［例１３：化粧水２］
（成分）                                                      （％）
（１）メドウホーム油                                            ０．１
（２）ホホバ油                                                  ０．０５
（３）香料                                                      適量
（４）防腐剤                                                    適量
（５）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                ０．５
（６）イソステアリン酸ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．）                                  １．０
（７）エチルアルコール                                          ８．０
（８）グリセリン                                                ５．０
（９）１，３−ブチレングリコール                                ５．０
（１０）ポリエチレングリコール１５００                          ０．１
（１１）ヒトリシズカ精製水抽出物＊１                            １．０
（１２）グリチルリチン酸ジカリウム＊２                          ０．５
（１３）レイシ抽出物＊３                                        ０．５
（１４）精製水                                                  残量
＊１：例３で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：丸善製薬社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（７）を混合溶解する。
Ｂ．成分（８）〜（１４）を混合溶解する。
Ｃ．ＢにＡを加え混合し、化粧水を得る。
得られた化粧水２はみずみずしくまろやかな使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚をみずみずしく保ち、皮膚を滑らかにする化粧水であった。
【００４２】
［例１４：化粧水３］
（成分）                                                      （％）
（１）トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ０．０８
（２）スクワラン                                                ０．０２
（３）セスキオレイン酸ソルビタン                                ０．０５
（４）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                ０．０５
（５）ポリオキシエチレン（８Ｅ．Ｏ．）アルキレン（１２〜1５）
エーテルリン酸                                            ０．１
（６）防腐剤                                                    適量
（７）香料                                                      適量
（８）エチルアルコール                                          ８．０
（９）ジプロプレングリコール                                    ８．０
（１０）グリセリン                                              ４．０
（１１）ヒトリシズカ８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊１  ０．５
（１２）ヒアルロン酸ナトリウム１％水溶液＊２                    ３．０
（１３）テンチャ抽出物＊３                                      ０．５
（１４）精製水                                                  残量
＊１：例１で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：紀文フードケミファ社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（８）を混合溶解する。
Ｂ．成分（９）〜（１４）を混合溶解する。
Ｃ．ＢにＡを加え乳化し、化粧水を得る。
得られた化粧水３はすっきりとした軽やかな使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚をみずみずしく保ち、皮膚を滑らかにする化粧水であった。
【００４３】
［例１５：乳液］
（成分）                                                      （％）
（１）ステアリン酸                                              １．０
（２）セタノール                                                ０．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ０．５
（４）流動パラフィン                                            ２．０
（５）スクワラン                                                ３．０
（６）ホホバ油                                                  ３．０
（７）パルミチン酸セチル                                        ０．２
（８）防腐剤                                                    適量
（９）モノステアリン酸ソルビタン                                ０．３
（１０）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                ０．５
（１１）ニコチン酸トコフェロール＊１                            ０．１
（１２）トリエタノールアミン                                    ０．５
（１３）１，３−ブチレングリコール                            １５．０
（１４）グリセリン                                              ３．０
（１５）ポリエチレングリコール６０００                          ０．５
（１６）精製水                                                  残量
（１７）カルボキシビニルポリマー１％溶液                        ８．０
（１８）ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊２  ０．５
（１９）ゲンノショウコ抽出物＊３                                ０．５
（２０）シイタケ抽出物＊４                                      ０．５
（２１）香料                                                    適量
＊１：エーザイ社製
＊２：例２で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊３：丸善製薬社製
＊４：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（１１）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．成分（１２）〜（１６）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを加え乳化し、更に成分（１７）を加え混合する。
Ｄ．Ｃを冷却し、成分（１８）〜（２１）を加え混合し、乳液を得る。
得られた乳液は滑らかでまろやかな使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚に保湿感と適度なエモリエント感を付与し、皮膚を柔軟にする乳液であった。
【００４４】
［例１６：クリーム］
（成分）                                                      （％）
（１）ステアリン酸                                              ２．５
（２）セタノール                                                ２．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
（４）ワセリン                                                  ２．０
（５）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル＊１                    ２．０
（６）ミリスチン酸イソトリデシル                                ５．０
（７）流動パラフィン                                            ８．０
（８）スクワラン                                                ５．０
（９）ミツロウ                                                  １．０
（１０）パルミチン酸セチル                                      ２．０
（１１）セスキオレイン酸ソルビタン                              ０．５
（１２）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                １．５
（１３）防腐剤                                                  適量
（１４）トリエタノールアミン                                    １．２
（１５）１，３−ブチレングリコール                              ８．０
（１６）グリセリン                                              ２．０
（１７）ポリエチレングリコール２００００                        ０．５
（１８）精製水                                                  残量
（１９）カルボキシビニルポリマー１％水溶液                    １０．０
（２０）アルブチン＊２                                          ３．０
（２１）ヒトリシズカ８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊３  １．０
（２２）セリン＊４                                              １．０
（２３）甘草抽出物＊５                                          ０．５
（２４）ヨクイニン抽出物＊６                                    ０．５
（２５）香料                                                    適量
＊１：コスモール１６８ＡＲ（日清オイリオグループ社製）
＊２：和光純薬工業社製
＊３：例１で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊４：味の素社製
＊５：丸善製薬社製
＊６：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（１３）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．成分（１４）〜（１８）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＡにＢを加え乳化し、更に成分（１９）を加え混合する。
Ｄ．Ｃを冷却し、成分（２０）〜（２５）を加え混合し、クリームを得る。
得られたクリームは滑らかでコクのある使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚に高いエモリエント感を付与し、皮膚を柔軟にするクリームであった。
【００４５】
［例１７：美容液］
（成分）                                                      （％）
（１）トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ０．１
（２）メドウホーム油                                            ０．０５
（３）ホホバ油                                                  ０．０５
（４）パルミチン酸レチノール＊１                                ０．２
（５）酢酸トコフェロール＊２                                    ０．１
（６）防腐剤                                                    適量
（７）香料                                                      適量
（８）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                ０．５
（９）イソステアリン酸ポリオキシエチレン硬化
ヒマシ油（５０Ｅ．Ｏ．）                                  １．５
（１０）エチルアルコール                                        ５．０
（１１）グリセリン                                              ４．０
（１２）ジプロピレングリコール                                  ８．０
（１３）１，３−ブチレングリコール                              ８．０
（１４）乳酸ナトリウム                                          ０．５
（１５）ピロリドンカルボン酸ナトリウム（５０％）液＊３          ０．５
（１６）ヒドロキシエチルセルロース                              ０．０８
（１７）アルギン酸ナトリウム                                    ０．０５
（１８）ヒトリシズカ８０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊４  ０．２
（１９）ハマナス抽出物＊５                                      ０．５
（２０）ゲンチアナ抽出物＊６                                    ０．５
（２１）精製水                                                  残量
＊１：ロシュ社製
＊２：エーザイ社製
＊３：味の素社製
＊４：例１で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊５：丸善製薬社製
＊６：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（９）を混合溶解する。
Ｂ．成分（１０）〜（２１）を混合溶解する。
Ｃ．ＢにＡを加え混合し、美容液を得る。
得られた美容液はまろやかでマイルドな使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、皮膚に高い保湿感とエモリエント感を付与し、皮膚をみずみずしく柔軟にする美容液であった。
【００４６】
［例１８：パック（ピールオフ型）］
（成分）                                                      （％）
（１）ポリビニルアルコール                                    １２．０
（２）メチルセルロース                                          ０．１
（３）グリセリン                                                ３．０
（４）１，３−ブチレングリコール                                ５．０
（５）精製水                                                    残量
（６）香料                                                      適量
（７）防腐剤                                                    適量
（８）トリ２−エチルヘキサン酸グリセリル                        ０．１
（９）モノオレイン酸ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタン                                                １．０
（１０）エチルアルコール                                      １３．０
（１１）ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊１  ０．５
（１２）甘草抽出物＊２                                          ０．５
（１３）オノニス抽出物＊３                                      ０．５
＊１：例２で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：丸善製薬社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（５）を加熱溶解する。
Ｂ．成分（６）〜（１０）を混合溶解する。
Ｃ．Ａを冷却後、Ｂ、成分（１１）〜（１３）を加え混合し、パックを得る。
得られたパックは適度な清涼感と高い緊張感を有しており、皮膚の老化を防止し、パックした後の皮膚に適度な保湿感とはり感を付与し、皮膚を柔軟にするパックであった。
【００４７】
［例１９：マッサージクリーム］
（成分）                                                      （％）
（１）ステアリン酸                                              ２．０
（２）ステアリルアルコール                                      ２．５
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                          ２．０
（４）セスキオレイン酸ソルビタン                                １．０
（５）パルミチン酸セチル                                        １．０
（６）ジペンタエリトリット脂肪酸エステル＊１                    ４．０
（７）ワセリン                                                ２０．０
（８）流動パラフィン                                          ２８．０
（９）ジメチルポリシロキサン（１００ＣＳ）                      ０．５
（１０）水酸化ナトリウム                                        ０．１
（１１）ジプロピレングリコール                                  ７．０
（１２）カルボキシビニルポリマー                                ０．１
（１３）精製水                                                  残量
（１４）ヒトリシズカ精製水抽出物＊２                            ０．５
（１５）加水分解コンキオリン抽出物＊３                          ０．５
（１６）ローズマリー抽出物＊４                                  １．０
（１７）香料                                                    適量
＊１：コスモール１６８ＡＲ（日清オイリオグループ社製）
＊２：例３で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊３：丸善製薬社製
＊４：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（９）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｂ．成分（１０）〜（１３）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｃ．ＢにＡを加え乳化する。
Ｄ．Ｃを冷却後、成分（１４）〜（１７）を加え混合し、マッサージクリームを得た。
得られたマッサージクリームはコクがある滑らかな使用感を有しており、マッサージ効果が高く、皮膚の老化を防止し、皮膚に潤いとはり感を付与し、皮膚を滑らかにするマッサージクリームであった。
【００４８】
［例２０：リキッドファンデーション］
（成分）                                                    （％）
（１）ステアリン酸                                              ２．０
（２）セタノール                                                ０．５
（３）ベヘニルアルコール                                        １．０
（４）ワセリン                                                  ２．５
（５）流動パラフィン                                            ５．０
（６）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン                      １．０
（７）防腐剤                                                    適量
（８）酸化チタン                                                ６．０
（９）着色顔料                                                  ４．０
（１０）マイカ                                                  ２．０
（１１）タルク                                                  ４．０
（１２）カルボキシメチルセルロース                              ０．２
（１３）ベントナイト                                            ０．４
（１４）精製水                                                  残量
（１５）ヒトリシズカ５０ｖｏｌ％含水エチルアルコール抽出物＊１  ０．５
（１６）オウバク抽出物＊２                                      ０．５
（１７）茶抽出物＊３                                            ０．５
（１８）香料                                                    適量
＊１：例２で製造した抽出物を含有量１％となるように５０ｖｏｌ％含水１，３−ブチレングリコールに溶解したもの
＊２：丸善製薬社製
＊３：丸善製薬社製
（製法）
Ａ．成分（１）〜（７）を加熱溶解する。
Ｂ．Ａに成分（８）〜（１１）を加え、均一に混合し、７０℃に保つ。
Ｃ．成分（１２）〜（１４）を加熱溶解し、７０℃に保つ。
Ｄ．ＣにＢを加えて乳化する。
Ｅ．Ｄを冷却後、成分（１５）〜（１８）を加え混合し、リキッドファンデーションを得た。
得られたリキッドファンデーションは軽やかな伸び広がりのある使用感を有しており、皮膚の老化を防止し、均一で美しい仕上がりとなるリキッドファンデーションであった。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の繊維芽細胞賦活剤、ＭＭＰ活性阻害剤、Ｉ型コラーゲン産生促進剤、IV型コラーゲン産生促進剤及びエストロゲン様作用発現剤は、皮膚外用剤、食料品等の有効成分として利用することができる。特に、化粧料等の皮膚外用剤に有用である。