(57)【要約】【課題】再現性高く、抗原を検出する方法を提供する。【解決手段】抗原と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に、抗原を含むキャリア液を２回以上循環して導入し、前記抗原と前記認識物質とを反応させて認識物質−抗原複合体を生成させる複合体生成ステップを備える抗原の検出方法。好ましくは、前記複合体生成ステップの後、前記抗原を含むキャリア液に代えて、標識物質付き認識物質を含むキャリア液を前記反応部に２回以上循環させることにより、前記反応部において前記標識物質付き認識物質と前記認識物質−抗原複合体とを反応させる標識物質反応ステップを更に備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に、抗原を含むキャリア液を２回以上循環して導入し、前記抗原と前記認識物質とを反応させて認識物質−抗原複合体を生成させる複合体生成ステップを備える抗原の検出方法。
【請求項２】
前記複合体生成ステップの前に、外部環境から抽出部に取り込まれた物質よりキャリア液中に抗原を抽出する抽出ステップを備える、
ことを特徴とする請求項１に記載の抗原の検出方法。
【請求項３】
外部環境から抽出部に取り込まれた物質よりキャリア液中に抗原を抽出する抽出ステップと、
前記抗原を含む抽出キャリア液を、前記抗原と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に導入し、前記抗原と前記認識物質とを反応させて認識物質−抗原複合体を生成させる複合体生成ステップと、
を備える前処理工程を有する抗原の検出方法であって、
前記抽出部と前記反応部との間でキャリア液を循環させることにより、抗原の抽出と、抗原と認識物質との反応とを、同一のキャリア液で２回以上繰り返して行う、
ことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項４】
前記複合体生成ステップの後、前記抗原を含むキャリア液に代えて、標識物質付き認識物質を含むキャリア液を前記反応部に２回以上循環させることにより、前記反応部において前記標識物質付き認識物質と前記認識物質−抗原複合体とを反応させる標識物質反応ステップを更に備える、
ことを特徴とする請求項１、２または３に記載の抗原の検出方法。
【請求項５】
前記複合体生成ステップと前記標識物質反応ステップとの間に、キャリア液を流して、前記反応部を洗浄する洗浄工程を更に備える、
ことを特徴とする請求項４に記載の抗原の検出方法。
【請求項６】
抗原を含むキャリア液と、予め含有量がわかっている標識物質付き抗原を含むキャリア液とを混合して混合キャリア液となす混合ステップと、
前記抗原と特異的に反応する認識物質であり、予め量がわかっている前記認識物質が流去しない状態で固定されている反応部に、前記混合キャリア液を導入し、前記認識物質に対して前記抗原と前記標識物質付き抗原とを競合的に反応させて、認識物質−抗原複合体と認識物質−標識物質付き抗原複合体とを生成する複合体生成ステップと、
を備える前処理工程を有する抗原の検出方法であって、
前記複合体生成ステップにおける前記混合キャリア液の導入方法が、前記混合キャリア液を前記反応部に２回以上循環して流入させる方法である、
ことを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項７】
前記混合ステップにおける混合が前記反応部内で行われ、かつ当該反応部で混合された混合キャリア液を当該反応部に２回以上循環して流入させる、
ことを特徴とする請求項６に記載の抗原の検出方法。
【請求項８】
前記複合体生成ステップの前に、外部環境から抽出部に取り込まれた物質よりキャリア液中に抗原を抽出する抽出ステップを行う、
ことを特徴とする請求項６または７に記載の抗原の検出方法。
【請求項９】
前記抗原が、アレルゲンタンパク質である、
ことを特徴とする請求項１ないし８いずれかに記載の抗原の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンタンパク質を検出する方法及びこの方法を用いたアレルゲンタンパク質検出用チップ並びにこのような装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、大気中の花粉、ダニ、カビなどの浮遊微小物質は、アレルギーの原因として、人体に大きな影響を与えている。このようなアレルギーの中でも特に、杉、ヒノキ等の花粉に対してアレルギー引き起こす、いわゆる花粉症患者は年々増加しており、この花粉症の原因となる花粉粒子を計測する手段として、従来、光学的手段を用いた方法が種々提案されている（例えば、特許文献１〜５参照）。
【０００３】
【特許文献１】特開平７−４３２９９号公報（要約）
【特許文献２】特開平１０−３１８９０８号公報（要約）
【特許文献３】特開２００１−１８３２８４号公報（要約、図３）
【特許文献４】特開２００１−２６４２３４号公報（要約）
【特許文献５】特開２００２−８２０３８公報（要約）
【０００４】
しかし、上記特許文献に記載された方法は、単に花粉と同程度の粒子径（５０ミクロン前後）の粒子の数を計測するだけであり、アレルギーの直接の原因となるアレルゲンタンパク質（抗原）を検出していないという問題があった。
【０００５】
このため、花粉の抗原と特異的に反応する抗原抗体反応を利用した抗原検出方法が、提案されており、例えば特許文献６には、浮遊微小物質の捕集工程、濃縮・反応工程、検出工程を備え、反応、検出工程において浮遊微小物質と特異的に反応する蛍光抗体標識を反応させ、その後、該標識のついた浮遊微小物質に紫外光を照射しその蛍光発光を受光することによりアレルギーの原因となる大気中の浮遊微小物質を検出する技術が提案されている。
【０００６】
【特許文献６】特開平１１−１４５１１公報（要約）
【０００７】
また、特許文献７には、抗原抗体反応をチップ内で行うことができる免疫分析マイクロチップが提案されている。図１０に基づいて、特許文献７の装置の概要を説明する。1枚
の基板６０上に、抗原、標識抗体（金コロイド標識抗体）、バッファー液をそれぞれチップに流入するための複数の注入穴部６１、抗原抗体反応を生じさせるためのマイクロチャネル反応槽部６２、廃液部６３、複数の注入穴部とマイクロチャネル反応部とを連結するマイクロチャネル流入部６４及びマイクロチャネル反応部と廃液部を連結するマイクロチャネル分離部６５が設けられている。
【０００８】
このマイクロチップを用いた抗原検出方法は、抗原や金コロイド標識抗体をバッファー液とともに注入穴部から注入し、マイクロチャネル反応部に移動させ、先にマイクロチャネル反応部に流入させた抗体と抗原抗体反応を生じさせた後、新たなバッファー液を注入穴から注入して、未反応物などを廃液部に流し、その後、マイクロチャネル反応部の光熱変換分析により、抗原の有無や量を調べるというものである。
【０００９】
【特許文献７】特開２００１−４６２８公報（要約）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記特許文献６に記載の技術は、大気中に存在する複数種類のアレルギーの原因物質を補足し検出できるものの、図９に示されるように装置が複雑であるので、小型化を図りにくいという課題を有している。
【００１１】
他方、上記特許文献７に記載の方法は、装置の小型化が可能であるものの、予め抽出した抗原と、標識抗体をマイクロチップ内に注入し、該チップ内で静止した状態で、抗原抗体反応を生じさせるものであるため、抗原と抗体との接触が不十分となり、抗原抗体反応にバラツキが生じる。したがって、この技術は、抗原の有無の判別という定性的な判断には利用できるが、定量的な測定を行うには再現性に乏しいという課題を有している。また、この技術は、１つのマイクロチップを用いて抗原の検出を行うが、この方法では種類の異なる複数の抗原物質を含む浮遊微小物質中の抗原を簡便かつ確実に検出することができないという課題を有している。
【００１２】
本発明は上記課題を解決しようとするものであり、その目的は、複数の抗原物質を含む浮遊微小物質中の抗原を再現性よく検出することのできるアレルゲンタンパク質検出方法を提供することであり、またこのような検出方法を簡便に実施することのできるアレルゲン検出用チップ、およびこのチップを組み込んだアレルゲン検出装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第一の発明は、外部環境から抽出部に取り込まれたアレルゲン物質よりキャリア液中にアレルゲンタンパク質を抽出する抽出ステップと、前記アレルゲンタンパク質を含む抽出キャリア液を、前記アレルゲンタンパク質と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に導入し、前記アレルゲンタンパク質と前記認識物質とを反応させて認識物質−アレルゲンタンパク質複合体を生成させる複合体生成ステップと、を備えるアレルゲンタンパク質検出前処理工程を有するアレルゲンタンパク質の検出方法であって、前記複合体生成ステップにおける前記抽出キャリア液の導入方法が、前記アレルゲンタンパク質を含む抽出キャリア液を前記反応部に２回以上循環して流入させる方法であることを特徴とする。
【００１４】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第二の発明は、外部環境から抽出部に取り込まれた物質よりキャリア液中に抗原を抽出する抽出ステップと、前記抗原を含む抽出キャリア液を、前記抗原と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に導入し、前記抗原と前記認識物質とを反応させて認識物質−抗原複合体を生成させる複合体生成ステップと、を備える前処理工程を有する抗原の検出方法であって、前記抽出部と前記反応部との間でキャリア液を循環させることにより、抗原の抽出と、抗原と認識物質との反応とを、同一のキャリア液で２回以上繰り返して行うことを特徴とする。
【００１５】
上記アレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第一または第二の発明においては、前記複合体生成ステップの後、前記アレルゲンタンパク質を含むキャリア液に代えて、標識物質付き認識物質を含むキャリア液を前記反応部に２回以上循環させることにより、前記反応部において前記標識物質付き認識物質と前記認識物質−アレルゲンタンパク質複合体とを反応させる標識物質反応ステップを更に備える構成とすることができる。
【００１６】
また、前記複合体生成ステップと前記標識物質反応ステップとの間に、キャリア液を流して、前記反応部を洗浄する洗浄工程を更に備える構成とすることができる。
【００１７】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第三の発明は、外部環境から抽出部に取り込まれたアレルゲン物質よりキャリア液中にアレルゲンタンパク質を抽出する抽出ステップと、前記アレルゲンタンパク質を含む抽出キャリア液と、予め含有量がわかっている標識物質付きアレルゲンタンパク質を含むキャリア液とを混合して混合キャリア液となす混合ステップと、前記アレルゲンタンパク質と特異的に反応する認識物質であり、予め量がわかっている前記認識物質が流去しない状態で固定されている反応部に、前記混合キャリア液を導入し、前記認識物質に対して前記アレルゲンタンパク質と前記標識物質付きアレルゲンタンパク質とを競合的に反応させて、認識物質−アレルゲンタンパク質複合体と認識物質−標識物質付きアレルゲンタンパク質複合体とを生成する複合体生成ステップと、を備えるアレルゲンタンパク質検出前処理工程を有するアレルゲンタンパク質の検出方法であって、前記複合体生成ステップにおける前記混合キャリア液の導入方法が、前記混合キャリア液を前記反応部に２回以上循環して流入させる方法であることを特徴とする。
【００１８】
上記アレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第三の発明において、前記混合ステップにおける混合が前記反応部内で行われ、かつ当該反応部で混合された混合キャリア液を当該反応部に２回以上循環して流入させる構成とすることができる。
【００１９】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質検出用チップにかかる第四の発明は、チップ外からチップ内にキャリア液を導入するための導入口を備える導入部と、前記導入部からキャリア液が流入可能なように前記導入部と連通され、かつチップ外よりアレルゲン含有粒子を取り込むための開口を有し、アレルゲン含有粒子よりアレルゲンタンパク質をキャリア液中に抽出する抽出部と、前記抽出部からキャリア液が流入可能なように前記抽出部と連通され、かつアレルゲンタンパク質に特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持された反応部と、前記反応部の下流側に位置し、キャリア液をチップ外に導出するための導出口を備えた導出部と、が一枚の基板上に形成されてなるアレルゲン検出用チップである。
【００２０】
ここで、“一枚の基板”には、元来一枚であるものはもちろんのこと、２以上の基板が接合されて実質的に一枚の基板となっているものも含まれる。また、“連通”とは、液体が流通できる状態で連結された関係をいい、直接接触し合った連結状態、流路等の他の要素が介在されて連結された状態の双方を含む。
【００２１】
上記アレルゲンタンパク質の検出用チップにかかる第四の態様の発明においては、更に、前記導入部と前記導出部の間にキャリア液を循環させるための循環流路が設けられた構成とすることができる。
【００２２】
また、第２の導入部と、標識物質付き認識物質を一時的に貯蔵する標識物質一時貯蔵部とを更に備え、前記標識物質一時貯蔵部は、チップ外よりチップ内にキャリア液を導入する第２の導入部に連通され、且つ前記第２の導入部より導入されたキャリア液が前記反応部に流入可能なように前記反応部とも連通されている、構成とすることができる。
【００２３】
また、第２の導入部と、標識物質付きアレルゲンタンパク質を一時的に貯蔵する標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部とを更に備え、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部は、チップ外よりチップ内にキャリア液を導入する第２の導入部に連通され、且つ前記第２の導入部より導入されたキャリア液が前記反応部に流入可能なように前記反応部とも連通されており、前記反応部に存在する認識物質の量が予めわかっている構成とすることができる。
【００２４】
また、前記抽出部から流出したアレルゲンタンパク質を含むキャリア液と、前記標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部から流出した標識付きアレルゲンタンパク質とを混合する混合部が、前記抽出部と前記反応部との間で、且つ前記標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部と前記反応部との間に有する構成とすることができる。
【００２５】
また、前記抽出部から流出したキャリア液と、前記抽出部以外から導入されたキャリア液で希釈する希釈部を、前記抽出部と前記反応部との間に有する構成とすることができる。
【００２６】
また、前記混合部と前記反応部との間に、キャリア液の流れを遮断または通過させる開閉手段を有する構成とすることができる。
【００２７】
また、前記希釈部と前記反応部との間に、キャリア液の流れを遮断または通過させる開閉手段を有する構成とすることができる。
【００２８】
また、前記抽出部と前記反応部との間に、キャリア液中の不溶性物質を取り除く分離手段が設けられている構成とすることができる。
【００２９】
また、前記分離手段は、抽出部と反応部との間に存在する流路の最小径が、キャリア液中に存在する不溶物質の最大径よりも小さく構成された流路である、とすることができる。
【００３０】
上記課題を解決するためのアレルゲン検出装置にかかる第五の発明は、上記したアレルゲン検出用チップの何れかを有し、更にキャリア液を貯蔵するキャリア液貯蔵部と、前記キャリア液を流通させる流通配管群と、前記キャリア液を前記流通配管群内に流通させる送液手段と、前記アレルゲン検出用チップの反応部に存在するアレルゲンタンパク質の量及び／又は種類を検出する検出手段と、を備え、前記キャリア液貯蔵部と前記送液手段と前記アレルゲン検出用チップの導入部と前記アレルゲン検出用チップの導出部とが、前記流通配管群によって連結され、前記キャリア液が循環して流通可能な流路が形成されてなるアレルゲン検出装置である。
【００３１】
上記アレルゲン検出装置にかかる第五の発明においては、前記アレルゲン検出装置が更に、アレルゲンタンパク質と特異的に反応する標識物質付き認識物質を貯蔵する標識物質付き認識物質一時貯蔵部を有する構成とすることができる。
【００３２】
また、前記アレルゲン検出装置が更に、予め量のわかっている標識物質付きアレルゲンタンパク質を貯蔵する標識物質付き認識物質一時貯蔵部を有する構成とすることができる。
【００３３】
また、前記流通配管群が、前記アレルゲン検出装置の導入部および導出部にそれぞれ脱着可能に連結させることのできる連結手段を備えるものとすることができる。
【発明の効果】
【００３４】
第一の本発明構成では、アレルゲンタンパク質を含む抽出キャリア液を反応部に２回以上循環して流入させるが、この方法であると、抽出キャリア液中のアレルゲンタンパク質と反応部に保持されている認識物質との接触機会が増える。よって、１回目の流入により反応できなかったアレルゲンタンパク質もその後の繰り返し流入により反応するので、アレルゲンタンパク質と認識物質との反応が十分に行われる。この結果、アレルゲンタンパク質と認識物質の反応性に起因する検出バラツキがなくなるので、定性、定量における再現性が向上する。
【００３５】
また、第二の本発明構成においては、キャリア液中にアレルゲンタンパク質を抽出する抽出部と、アレルゲンタンパク質と認識物質とを反応させる反応部との間でキャリア液を循環させることにより、アレルゲンタンパク質の抽出と、アレルゲンタンパク質と認識物質との反応とを同一のキャリア液で２回以上繰り返して行うが、この方法であると、反応部における反応ステップのみならず、抽出部における抽出ステップをも繰り返して行われる。よって、アレルゲン物質からのアレルゲンタンパク質の抽出が十分に行われ、かつ抽出されたアレルゲンタンパク質と認識物質との反応も十分に行われるので、アレルゲンタンパク質の定性、定量における再現性および検出精度が顕著に向上する。
【００３６】
また、第三の本発明構成においては、いわゆる競合反応を利用するが、この方法においても、測定抗原と標識抗原との両者を含む混合キャリア液を循環させるので、抗原抗体反応の機会が多くなり、その結果として検出の再現性および検出精度が向上する。
【００３７】
また、第四の本発明構成にかかるアレルゲンタンパク質検出用チップは、構造が簡単であるので、例えば縦約５０ｍｍ×横約３０ｍｍ×厚さ約２ｍｍ程度の微小サイズのアレルゲンタンパク質検出用チップを実現でき、このような微小なチップであると、密閉包装が容易であるので、長期保存が可能な使い捨てチップを低コストでもって実現することができる等の顕著な作用効果を奏する。このようなアレルゲンタンパク質検出用チップを用いると、上記本発明にかかるアレルゲンタンパク質の検出方法を簡便に実施できる。
【００３８】
また、第五の本発明構成にかかるアレルゲン検出装置は、上記本発明にかかるアレルゲンタンパク質の検出方法を簡便に実施できるという作用効果を奏する。このアレルゲン検出装置は、上記本発明にかかる検出用チップを必須要素とするが、測定時に測定目的物に合わせて検出用チップの種類を選択する等の簡単な操作により、様々な種類のアレルゲンタンパク質を再現性よく定性、定量することができるという顕著な作用効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明を実施するための最良の形態を、スギ花粉に含まれるアレルゲンタンパク質を例にして、図面を参照しながら説明する。
【００４０】
［実施の形態１］
図１は、実施の形態１に係るアレルゲン検出用チップ及びこれを用いたアレルゲン検出装置を示す概念図である。図１に示すように、実施の形態１に係るアレルゲン検出装置は、検出用チップ１０１と、装置本体（チップを除く部分）２０１とから構成されている。
【００４１】
アレルゲン検出用チップ１０１は、基板４０上に、導入部４１、導出部４２、抽出部４３、反応部４４及びそれらを連結する流路４５、４６、４７を有し、更に抽出部４３と流路４６との間には分離部４９が設けられている。ここで、例えば上記導入部４１及び導出部４２は、直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍ〜１ｍｍの穴であり、抽出部４３は直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍから１ｍｍの穴からなる。これらの穴の形状（基板の垂直方向から見た形状）は円形、正方形、長方形等何れであっても良い。
【００４２】
分離部４９は、複数の円柱を約５〜５０ミクロンの隙間を空けた構造になっており、この分離部４９は、花粉粒子や割れた花粉の殻、砂などの不溶性粒子が反応部４４に流入しないようにするためのものである。すなわち、キャリア液が抽出部４３から流路４６に流れる時、花粉の殻等は分離部４９の柱によって止められる。よって、花粉の殻等の不溶成分と抗原（アレルゲンタンパク質）などの溶解成分とを分離することができる。ここで、前記分離部４９の隙間は、花粉の殻、砂等の不溶物質の最大径よりも小さく構成されていることが好ましく、不溶物質の最小径よりも小さく構成されていることが更に好ましい。  
【００４３】
反応部４４は、アレルゲンタンパク質（抗原）と認識物質（抗体）とを反応させる部位であり、反応部４４には直径約５０ミクロンのビーズ５０が複数配置されており、このビーズにはアレルゲンタンパク質と特異的に反応する認識物質が固定され保持されている。また、反応部４４の下流側にある流路４７は、その幅がビーズ５０の直径よりも小さく形成されている。よって、反応部４４に配置されたビーズ５０が流路４７側に流去することがない。この例では、スギ花粉の抗原と特異的に反応する抗体（例えば、抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体）がビーズ５０の表面に固定保持されており、キャリア液に抽出され、反応部４４に移動したスギ花粉抗原がビーズ表面の抗体と結合し、ここに留まることになる。
【００４４】
このようなチップ構造は、ウェットエッチング等を用いてガラス基板等を加工することにより容易に形成することができ、チップ形成用の基板４０としては、例えば、光硬化性樹脂、熱硬化性樹脂、ガラス、プラスチック材料を用いることができる。また、チップ基板４０上に形成される流路４５、４６、４７の横断面形状としては、正方形、長方形、台形等の形成が一般的な形状として例示でき、流路の底を円の一部のように丸くしてもよい。
【００４５】
図１には示していないが、このチップは基板４０の上に蓋板（材質は基板４０と同様）で覆われている。この蓋板は、導入部４１、導出部４２、及び抽出部４３のそれぞれに対応する位置に対応する孔が設けられている。このうち抽出部４３上の孔は、外気中からアレルゲン含有粒子を取り入れるためのものである。なお、抽出部４３へのアレルゲン含有粒子の取り込みが、外付けの吸引装置を介して外気中からアレルゲン含有粒子を強制的に取り込む方法であってもよく、また、粒子を取りこむ捕集部を別途設ける構成としてもよい。
【００４６】
ここで、分離部４９の構造として、複数の円柱を並べた構造を示したが、これに限定されるものではない。例えば不溶物のサイズ以下の平均空孔サイズをもつゲル状高分子を、抽出部と反応部との境界または両者を繋ぐ流路内に設けてもよい。また、同様な箇所に目開きが不溶物のサイズ以下であるフィルタを配置してもよい。また、図６に示すように、抽出部４３と反応部４４を繋ぐ流路４６に深さが不溶物のサイズ以下となる隘路を設けてもよい。
【００４７】
また、導出部等は上記したサイズに限定されるものではない。また、反応部５０内のビーズが流去しないようにするために、流路４７をビーズ５０の径よりも小さく形成しているが、この構造に限定されるものではない。例えば、反応部４４の下流側に、分離部４９のような隘路を設けてもよい。またビーズ５０を磁性ビーズとし、外部から磁力を作用させて反応部に固定してもよい。
【００４８】
また、反応部４４は、その中に認識物質の固定されたビーズ５０を配するのではなく、反応部４４（その上部に位置する蓋の内壁を含む）壁に認識物質を直接固定し保持させてもよい。固定方法としては、吸着、共有結合などが例示できるが、共有結合の方がより堅固に固定されるので好ましい。
【００４９】
なお、抽出部４３と反応部４４との間に、液の流れを開閉する手段を設ける必要がないときには、抽出部４３と反応部４４との間に流路４６を設けなくてもよい。
【００５０】
また、アレルゲン検出用チップ１０１は、装置本体２０１から脱着可能に構成されており、アレルゲン検出に使用するまでの間、他の物質の混入を防止し、抗体活性を失活させないことが必要である。したがって、装置本体２０１から取り外し、チップ１０１単独で密閉包装し、冷蔵又は冷凍保存することが好ましい。この場合、固体状態（キャリア液を含まない状態）であってもよく、キャリア液に溶解した状態であってもよい。
【００５１】
次に検出用チップ１０１に連結される装置本体２０１について説明する。装置本体２０１は、チップ１０１の導入部４１の導入口に連結してチップ１０１内にキャリア液を流入させる流通配管５１ａと、導出部４２の導出口から流れ出るキャリア液を装置本外部側に導く流通配管５１ｂ、装置本体２０１内でキャリア液が流れる５１ｃ、キャリア液の流れを制御するコック４８ａ〜ｄ、キャリア液を送液するポンプ５２（送液手段）、キャリア液を貯蔵するキャリア液タンク５３（キャリア液貯蔵部）、標識物質付認識物質を含む標識物質付認識物質溶液タンク（標識物質付認識物質一時貯蔵部）５４、標識を検出する検出手段５５、過剰な標識物質付認識物質等を廃液する廃液タンク５６を備えている。この例では、標識物質付認識物質溶液タンクには、キャリア液に溶解した標識物質付認識物質（標識抗体）が含まれるが、固体状態で存在していてもよい。
【００５２】
ポンプ５２は、流路内にキャリア液を流通させるためのものであり、マイクロリットル／秒からミリリットル／秒の液を流すことのできるマイクロポンプやシリンジタイプなどの送液ポンプが利用できる。
【００５３】
流路変更手段であるコックについては、特段の制約はないので、通常のものが使用できる。流通配管群についても同様である。
【００５４】
装置本体２０１とチップ１０１とを液漏れさせることなく連結するために、流路を結合することのできる種々の連結具を利用することができる。例えば吸盤形状のゴム製連結具を用いることができ、配管群の末端にこのようなゴム製連結具が設けられていると、チップ１０１の導入口や導出口にこの連結具を押し当てることにより簡単に両者を連結でき、両者間で液を流通させることが可能になる。なお、このような連結具をチップ１０１側に設けてもよく、この場合にも同様な便宜が得られる。
【００５５】
上記検出手段５５は、適用する測定方法に応じて具体的構成が変わるが、例えば蛍光標識法により検出する場合は、紫外線を発生させる光源、紫外線をチップの反応部に照射するための光学系、及び標識抗体からの蛍光を検出するディテクターから構成される。
【００５６】
実施の形態１に係るアレルゲン検出装置は、上記チップ１０１と装置本体２０１とからなる。次にこのアレルゲン検出装置を用いたアレルゲンタンパク質の検出方法について説明する。
【００５７】
工程１
まず、図１に示すように、装置本体２０１のコック４８ｃから導出した流通配管５１ａをチップ１０１の導入部４１の導入口に連結するとともに、導出部４２の導出口に流通配管５１ｂを連結する。
【００５８】
工程２
コック４８ａ、４８ｂ、４８ｃを調整し、導入部４１、流路４５、抽出部４３、流路４６、反応部４４、流路４７、導出部４２、流通配管５１ｂ、流通配管５１ｃ、ポンプ５２、流通配管５１ａからなる循環流路を形成する。ポンプ５２を駆動させるとともに、コック４８ｄを開放しキャリア液タンク５３内のキャリア液を循環流路に供給し、循環流路内をキャリア液で満たす。この工程は、流路内の空気を追い出す工程であり、これによりチップ内への空気の混入を防止することができる。
【００５９】
工程３
次に、抽出部４３の上部開口からスギ花粉を取り込んだ後、ポンプ５２を駆動させることにより、抽出部４３にキャリアが導入され、キャリア液中に花粉表面や内部のアレルゲンタンパク質が抽出される。この抽出キャリア液を少なくとも２周り以上流路内を循環させる。所望回数だけキャリア液を循環させた後、コック４８ａを操作して、チップ内のキャリア液を廃液タンク内に流すようにするとともに、コック４８ｄを開きキャリア液タンク５３から新鮮なキャリア液が供給されるようにする。この状態で数分間かけてチップ内のキャリア液を廃液タンクに廃液しつつ、流路内を新しいキャリア液に入れ替える。
【００６０】
なお、キャリア液タンク５３内には、新鮮なキャリア液が貯蔵されており、タンク内圧が循環流路よりも高くしてある。したがって、タンク５３内のキャリア液が循環済みのキャリア液で汚染されることはない。
【００６１】
ここで、スギ花粉の取り込み方法としては、抽出部４３の上部開口へスギ花粉等が自然落下するのを待ってもよく、また吸引等して捕集してもよい。また、別途で捕集したスギ花粉等を入れる方法であってもよい。上記キャリア液としては、アレルゲンタンパク質及び認識物質を変性させない溶媒であればよいが、被検出物がスギ花粉の場合には、抽出性、安定性の面から、弱アルカリ性炭酸水素アンモニウム溶液を用いるのがよい。更に、花粉粒子からアレルゲンタンパク質を効率よく抽出する方法として、抽出部４３に磁性ボールを配置しておき外部より磁力を作用させてボールを揺動させるボールミル方式を採用するのもよい。
【００６２】
また、反応部４４における反応効率を一層高める好ましい方法としては、例えばビーズ５０を磁性体で構成し、外部より磁力を作用させることによりビーズ自体をランダムに揺動させ方法が挙げられる。この方法であると、抗原と抗体とが反応する機会が格段に増加し、反応効率が高まる。
【００６３】
工程４
次に、コック４８ｂ、４８ｃを操作して、標識物質付認識物質タンク５４に貯蔵されている標識物質付認識物質を流路内に導入し、上記と同様に操作して、標識物質付認識物質（標識抗体）を含むキャリア液を流路内に循環させる。これにより、工程１〜３で反応部に結合されたアレルゲンタンパク質と標識物質付認識物質とが反応する。ここで、標識物質付認識物質としては、例えば蛍光色素標識物質をつけたＣｒｙ  ｊ−１のモノクローム抗体等を用いる。なお、Ｃｒｙ  ｊ−１はスギ花粉に含まれるアレルゲンタンパク質である。
【００６４】
工程５
標識抗体を含むキャリア液を所望回数だけ循環させた後、コック４８ａを操作して、チップ内のキャリア液が廃液タンクに流れるようするとともに、キャリア液タンク５３から新鮮なキャリア液が供給されるようにして、反応部に残存した過剰な標識付き抗体を洗い流す。
【００６５】
工程６
反応部４４上に設けた検出手段５５より反応部４４に紫外線を照射し、蛍光強度を測定する。これによりアレルゲンタンパク質の量が定量できる。
【００６６】
工程７
以上により１回の測定が終了する。次の測定を新しいチップで行う場合には、チップ１０１を入れ代える。
【００６７】
工程７−２
他方、同一のチップを用いて、引き続いて測定を行う場合には、抽出部４３に残っている花粉殻等を除去する。なお、同一のチップを用いて複数回の測定を行う方式を採用する場合には、チップ１０１に残留した花粉殻を取り除く手段を設けるのが好ましい。この手段としては、例えば抽出部４３に大開口をもった花粉殻除去口を付設し、かつ抽出部４３と花粉殻除去口との間に開閉バルブを設けて、バルブ開放状態で洗浄用キャリア液を流すことにより、花粉殻を花粉殻除去口から洗い流す方法が例示できる。
【００６８】
工程７−３
花粉殻を除去後、導入部４１の導入口から、反応部に結合している認識物質−アレルゲンタンパク質複合体および認識物質−標識物質付きアレルゲンタンパク質複合体からアレルゲンタンパク質（抗原）及び標識物質付きアレルゲンタンパク質（標識抗体）を分離するイオン濃度の溶液を流し、導出部４２を通じて廃液タンク５６に排出する。この作業の後、キャリア液を流して、抽出部、反応部、及び関連する流路を洗浄する。これにより、反応に用いた標識抗体は全て除去されるので、連続測定を行うためには、標識物質付き認識物質タンク５４に再び標識物質付き標識物質を加えるか、もしくは標識物質付認識物質タンクを複数設けておく必要がある。上記工程７−２，７−３は、順序が逆であってもよい。
【００６９】
ところで、上記では、スギ花粉を例にして説明したが、他のアレルゲンについても本発明が応用できることは勿論である。また、上記では、一種類の抗体を用いた場合について説明したが、大気中のアレルゲン含有粒子（浮遊微小粒子）は多様であり、また、一つのアレルゲン含有粒子に二種以上のアレルゲンが含まれる場合もあるので、大気中の粒子には多種類のアレルゲンが含まれることが多い。多種類のアレルゲンタンパク質（抗体）を同時に検出する場合は、例えば反応部に多種類の抗体を配置し、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に標識抗体として抗体の種類毎に蛍光色の異なる蛍光色素を付けたものを用意することで、多種類の抗原を蛍光色の違いにより同時に検出することができる。また反応部を複数個設け、それぞれに異なる抗体及び標識抗体を配置し、標識付き認識物質溶液タンク内にそれぞれに対応した標識付き認識物質を用意する方法を採用してもよい。
【００７０】
また、上記では、抗原を抗体と標識抗体で挟む、所謂サンドイッチ法と呼ばれる方法を用いた場合を例として説明したが、他の公知の方法を用いてもよい。例えば、競合反応を利用する方法（競合反応法）がある。この方法は、予め量が分かっている固定化した抗体（固定化抗体）に対して、測定する抗原（測定抗原）と、予め量が分かっており、且つ標識を付けた測定する抗原と同種の抗原（標識抗原）を競合させて反応させ、標識抗原と反応して形成された固定化抗体−標識抗原の量を測定し、その標識量から測定抗原の量を算出する方法である。この競合反応においても、測定抗原と標識抗原との両者（混合キャリア液）を同時に循環させることにより、抗原抗体反応の機会を多くすることができるので、検出の再現性や検出精度が向上する。
【００７１】
この場合、標識物質付き認識物質溶液タンク５４の代わりに、予め量のわかっている標識物質付きアレルゲンタンパク質を含む標識物質付きアレルゲンタンパク質溶液タンク（標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部）５７とし、工程３において循環流路を、標識物質付アレルゲンタンパク質溶液タンク５７に貯蔵されている標識抗原を抽出部に導入し、抽出部で抽出された抗原と混合され、混合キャリア液となして、反応部に循環して流す構成とすればよい。競合法を用いる場合、更にチップ１０１の反応部に含まれる認識物質の量も予めわかっていることが必要である。この場合、標識抗体を導入する必要がないので、工程４は不要になる。
【００７２】
認識物質や、標識抗原量が予めわかっていることが必要であるのは、チップ１０１の反応部に含まれる認識物質の量が過大であり、抽出されたアレルゲンタンパク質及び標識物質付きアレルゲンタンパク質の量が過小である場合、両アレルゲンタンパク質全てが、反応部に含まれる認識物質と反応して複合体を生成し、正確なアレルゲンタンパク質量が検出できない等の不具合が生じるからである。
【００７３】
また、上記では、抗原抗体反応を例に説明したが、アレルゲンタンパク質を認識する反応であれば、抗原抗体反応に限られるものでなく、抗体以外のアレルゲンタンパク質を認識する認識物質、例えばペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡやアレルゲンタンパク質と特異的に反応する反応基をもつ高分子化合物又は低分子化合物などを用いてもよい。
【００７４】
また、上記では蛍光色素標識を用いて検出する方法を説明したが、これ以外にも、従来提案されている酵素標識法、金コロイド法、ラジオアイソトープ標識法、水晶振動子法、化学発光物質による方法、表面プラズモン共鳴法などの検出方法を用いることができる。
例えば、酵素標識の場合、標識として例えばグルコース分解酵素を用いるときには、上記の工程５の後に、反応部４４にグルコース溶液を流して、反応部４４に形成された抗体−抗原−標識抗体複合体とグルコースとを反応させる。この方法を実施するには、例えば、予め装置本体２０１にグルコース溶液を入れたタンクを設けておき、これと送液手段を接続して、キャリア液の場合と同様にしてグルコース溶液を循環させ、抗体−抗原−標識抗体複合体と反応させる。そして、この反応によって生じた過酸化水素を反応部に設けた過酸化水素検出電極により検出し、検出した電圧又は電流を本体２０１に設けた検出手段で必要に応じて増幅すればよい。この工程では、循環中に電流又は電圧をモニタリングすることで、反応の完了を判定することができる。
なお、例えば水晶振動子法を用いる場合には、標識物質付き認識物質は必要でないので、標識物質付認識物質タンク５４がなくてもよい。
【００７５】
［実施の形態２］
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図２に示すように、実施の形態２のアレルゲン検出装置は、少なくとも、アレルゲン検出用チップ１０２と装置本体２０２から構成され、上記実施の形態１と同様に、アレルゲン検出用チップ１０２と装置本体２０２とは脱着自在に構成されている。
【００７６】
先ず装置本体２０２について説明する。装置本体２０２は、チップに注入する液を溜めておく貯蔵手段２、チップに液を流すための送液手段３、流量調整をするバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを有する流量調整手段、流路を変えるコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを有する流路変更手段、チップ１０２に設けた開閉手段（マイクロバルブ１５ａ、１５ｂ）を作動させるためのマイクロバルブ駆動手段（図示せず）、以上の各手段の動作を制御する制御手段４、液を流通させるための流通配管群５、５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、チップと流通配管群を連結するための連結手段６、抗原抗体反応の後、抗原の有無を検出するための検出手段７、及び使用後のキャリア液や洗浄液を捨てる廃液溜２４を備えている。
【００７７】
上記貯蔵手段２としては、一般的なマイクロタンクがそのまま利用でき、タンク内には抗原を抽出するためのキャリア液等が溜められている。後述するが、流路内を循環中のキャリア液には抗原や標識抗体、その他の溶解性物質が含まれているので、このようなキャリア液と貯蔵タンク内の新鮮なキャリア液と分ける必要がある。このため、この貯蔵手段２（タンク２）では、循環中のキャリア液が流れる部分２ａと、流路内に新鮮なキャリア液を供給する部分２ｂとに分けられている。
【００７８】
流量調整手段等の動作を制御する制御手段４については、コンピュータを備え、予め設定されたプログラムにしたがって自動的に制御できるものが好ましいが、手動で制御するものであってもよい。
【００７９】
また、送液手段（ポンプ）、コック、流通配管群は、上記実施の形態１と同様のものを用いることができる。また、流路を開閉するバルブは、公知のマイクロバルブを用いればよい。
【００８０】
また、連結手段６ａ〜ｄは、装置本体２０２とチップ１０２とを液漏れさせることなく連結するために、上記実施の形態１で示した流路を結合することのできる種々の連結具を利用することができる。
【００８１】
廃液溜２４は、流路内のキャリア液を入れ替える場合や、流路を洗浄した後の洗浄液等を捨てるためのタンクであり、タンクの形状、材質等については特段の制約はない。なお、装置本体２０２から外部に廃液を捨てる必要があるが、廃液溜２４は必ずしも必要ではない。
【００８２】
検出手段７は、チップ１０２の反応部１１（後記）に化学的に固定された抗原（アレルゲンタンパク質）の種類及び／又は量を検出するものであり、上記実施の形態１と同様なものを用いればよい。
【００８３】
なお、装置本体２０２において重要なのは、キャリア液をチップ１０２に供給し循環させることであるので、これが満たされているのであれば、貯蔵タンク２（貯蔵手段２）、送液ポンプ３（送液手段３）、検出手段７、バルブ群、コック群、配管群、連結手段６、廃液溜２４などの数や配置などは、図２に示されるものに限定されない。
【００８４】
次に、実施の形態２における検出用チップ１０２について説明する。
実施の形態２の検出用チップ１０２は、大気中から花粉を収集することのできる開口を有し、取り込まれた花粉から抗原（アレルゲンタンパク質）を抽出する抽出部１０と、検出目的物である抗原に特異的に反応する抗体（認識物質）が流去しない状態で保持させられた反応部１１と、抗原−抗体複合体と特異的に反応し、反応により抗原−抗体−標識抗体複合体を形成する標識抗体が保存されている標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２と、装置本体２０２からチップ１０２内にキャリア液を流入させるための導入口を備えた導入部１３ａと、装置本体２０２からチップ１０２内の標識物質付き認識物質貯蔵部１２にキャリア液を流入させるための導入口を備えた第２の導入部１３ｃと、チップ１０２からキャリア液を装置本体２０２側に流出させるための導出口を備えた導出部１３ｂ、１３ｄと、チップ１０２内にキャリア液を流す流路１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆが基板４０上に形成され、更にチップ内の液の流れを遮断または通過させる開閉手段としてのマイクロバルブ１５ａ、１５ｂが基板４０上に設けられている。
【００８５】
この基板４０は蓋板（図６の符号３１を参照）で覆われており、蓋板は上記導入部および導出部の導入口、導出口部分と、抽出部１１の開口部分には開口が設けられた構造になっており、基板４０と蓋板は一体化された構造になっている。なお、抽出部１１上の開口は花粉を取込む取込穴９であり、この取込穴９の上には必要に応じ開閉できる開閉蓋を設けてもよい。
【００８６】
基板４０や蓋板には、上記実施の形態１と同様の材料を用いることができる。基板４０に形成された導入部１３ａ、１３ｃ、導出部１３ｂ、１３ｄは、直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍから１ｍｍの縦穴であり、抽出部１０は、直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍから１ｍｍの縦穴である。この抽出部１０は流路１４ａを介して導入部１３ａとと連通しており、下流側に位置する流路１４ｂとの間には、図６の符号４９に示すと同様な分離部が設けられている。この分離部４９は、蓋板との隙間が花粉や花粉の殻、砂等の不溶物質のサイズ以下（例えば２０μｍ以下）となるようにした隘路であり、このような隘路を設けると、キャリア液が抽出部１０から流路１４ｂに流れるときに、花粉の殻等がせき止められるので、花粉殻等の不溶物と抗原などの溶解物とを分離することができる。
【００８７】
反応部１１は、花粉の抗原と抗体とを反応させる空間であり、ここには被検出物である特定の抗原と特異的に反応する抗体が固定保持されている。抗体の固定保持方法については実施の形態１の場合と同様にすればよい。反応部１１の形状は、抽出部と同様でよく、例えば円柱形状の縦穴、半球状の形状、直方体形状の穴とする。大きさは１００μｍ以上で、深さは５０μｍから１ｍｍが好ましい。
【００８８】
標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２は、標識物質を結合した標識抗体（標識物質付き認識物質）を貯蔵する部位であり、標識抗体はそのままの状態で貯蔵されていてもよく、ビーズなどの担体に保持させた状態でもよい。但し、ビーズなどの担体に保持させた場合においても、キャリア液の流れによって標識抗体が流路１４ｆ流出することを防止する必要があり、ビーズの流出を防止する構造とするのがよい。この構造は、上記実施の形態１における分離部と同じでよい。また、標識抗体が、反応部１１内にとどまることを防止するため、流路１４ｃを通って装置本体２０２に導出される構造であることも必要である。
【００８９】
チップ１０２内の流れを開閉する開閉手段（マイクロバルブ１５ａ、１５ｂ）は、微小な流れを開閉できるものであれば公知の種々な手段が利用できる。例えば熱により膨張し、冷却するともとにもどる性質を有する図７に示されるような形状の樹脂成形物（樹脂膜２１）が使用できる。この樹脂膜２１は、狭い流路に設けられているので、装置本体２０２に設けられたマイクロバルブ駆動手段（図示せず）により光照射され又はヒーターで加熱されると体積膨張して流路を塞ぐ一方、光照射又はヒーター加熱を止め樹脂膜の温度が下がると、体積が元に戻り流路が開かれる。よって、流路の開閉を制御できる。
【００９０】
流路１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆは、幅０．１μｍから１ｍｍであり、深さは深さは０．１μｍから１ｍｍの溝である。その断面形状は、例えば矩形、台形であり、流路の底は円の一部のように丸くなっていてもよい。ただし、これらのサイズ、形状に限定されるものではない。
【００９１】
以上に説明した実施の形態２に係るアレルゲン検出用チップ１０２は、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２（実施の形態１でいう標識物質付認識物質タンク）を装置本体２０２ではなくチップ１０２内部に設けた点で、実施の形態１のチップ１０１と異なる。このような実施の形態２に係るアレルゲン検出装置を用いた抗原検出方法を、サンドイッチ法を例として図２を参照しながら以下に説明する。
なお、ここでは標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に含まれる標識物質付き認識物質（標識抗体）が不溶性担体に固定されているとして説明する。
【００９２】
工程１
まず、チップ１０２を装置本体２０２に装着する。装着に際しては、チップ１０２の導入部・導出部１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄの導入口および導出口と、それらに対応する装置本体側の配管群５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄとを連結手段６ａ〜ｄを介して連結する。
【００９３】
工程２
次に、マイクロバルブ１５ａを開け、１５ｂを閉じて、貯蔵手段２内のキャリア液を経路２ｂから配管５ｂに供給し、導入部１３ａ、１３ｃを介して抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に流入させる。この場合、キャリア液の流れが、装置本体２０２内の貯蔵手段２０から配管５ｂを通り、導入部１３ａの導入口を介してチップ１０２に入り、更に流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って装置本体２０２内の配管５に流れ込み、送液手段３を経て貯蔵手段２のバイパス２ａに戻るルートと、貯蔵手段２から配管５ｂを通り、コック２２ｃで分流されて、コック２２ｂを経て、５ｃをとおり、第２の導入部１３ｃからチップ１０２に入り、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｆ、導出部１３ｄを通って本体２０２内の配管５ｄに入り、送液手段３を経て貯蔵手段２のバイパス２ａに戻るルートとなるように、制御装置４により、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを制御する。２つのルートに沿って流す操作は同時に行ってもよく、また一方のルートに沿って流した後、もう１つのルートに沿って流す方法としてもよい。予め、抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２などの容積は分かっているので、制御手段４により必要量だけ流入して、流入を止める。
【００９４】
ここで第２の導入部１３ｃから流入したキャリア液の流路系の標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２と流路１４ｆの間には、標識抗体の固定された担体の大きさよりも幅又は厚みを小さくした流路を設ける。このような構成とすることにより、標識抗体が本体２０２に流れ込まないようにできる。
【００９５】
以上の操作により、チップ１０２内の各流路、及び抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２をキャリア液で満たすことができる。これにより、キャリア液中に空気などの気体が混入するのを防ぐことができ、以降の工程での反応を確実に行うことができる。
【００９６】
工程３
次に、マイクロバルブ１５ｂを閉じた状態で、キャリア液が、送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ａ、導入部１３ａ、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って装置本体２０２内の配管５に戻して循環するように、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作する。
【００９７】
キャリア液を上記のルートで循環させながら、取込穴９から一定時間花粉を収集する。この時必要であれば、大気を強制的に吸引する手段を設けてもよい。花粉は、取込穴９からチップ１０２の抽出部１０内のキャリア液に入り、花粉表面又は内部に含まれるアレルゲンタンパク質（抗原）がキャリア液中に抽出される。この時、必要であれば、抽出部に大きさが１μｍから１００μｍの複数の磁性ビーズを配置して、別途本体に設けた磁性ビーズ攪拌手段で磁性ビーズを運動させる方法により、花粉をキャリア液中で攪拌するのもよい。このようにすると、花粉からの抗原抽出効率が向上する。
【００９８】
キャリア液は、上記循環ルートを循環しているので、花粉から抽出された抗原は、順次流路１４ｂを通り、反応部１１に送られる。この時、花粉の殻等はキャリア液に不溶であり、この花粉のからが反応部に混入すると正確な検出・計測が難しくなるので、花粉の殻等の不溶物質とキャリア液に溶けている抗原や他のタンパク質などの可溶物質とを分離する必要がある。この分離は、上記実施の形態１で示したものと同様でよい。また、上述の磁性ビーズによる攪拌を併用することで、花粉の殻により分離部がつまるということを防ぐことができる。
【００９９】
反応部１１送られた抗原は、反応部に設けられた抗体と抗原抗体反応を起こし、抗原は反応部に固定される。抗原抗体反応は、抗体の抗原に対する特異的な反応性、抗原と抗体が出会う機会に左右され、１回の反応過程で、すべての抗原が抗体と反応するとは限らない。しかし、この実施の形態では、花粉収集中にキャリア液を送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ａ、導入部１３ａ、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻すという循環を連続的に繰り返す構成を採用して、抗原と抗体とが反応する機会を多くしているので、未反応の抗原量を少なくでき、結果として毎回の測定の再現性を高くできる。この循環は、花粉取込穴９に蓋をして、花粉の収集を止めた後も、抽出された抗原を抗体と反応させるために、しばらく循環を続けることが好ましい。
【０１００】
他の方法としては、例えば花粉収集中はマイクロバルブ１５ａ、１５ｂを閉じて、抽出部１０と反応部１１とを独立させ、一定時間後、例えば花粉取込穴９に蓋をして、花粉の収集を止めた状態で、マイクロバルブ１５ａを開放して、装置本体２０２内の送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ａ、導入部１３ａ、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻して循環するように、本体２０２内のコック２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作して、キャリア液の循環を行う方法である。この方法においても、本発明の特徴である循環により抗原抗体反応を確実に行わせることができる。
【０１０１】
工程３終了後、すぐに以下の工程４に移ってもよいが、系内に残留した可溶物質等を洗浄するために一度工程３で循環させたキャリア液を排出し、新しいキャリア液でチップ内の流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃのキャリア液を置き換えることが好ましい。この場合、装置本体２０２内の送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ｂを通り、導入部１３ａからチップ内に入り、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻し、コック２２ｄを経て廃液溜め２４に入るように、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作する。
【０１０２】
本操作により、花粉から抗原とともに抽出された抗原以外の溶解物を反応部から除去することができ、より効果的に、後に続く抗体−抗原複合体と標識抗体との反応性を上げることができる。
【０１０３】
工程４
工程３の循環を停止した後、バルブ１５ａを閉じて、バルブ１５ｂを開放し、本体２０２内のバルブ２３ａ、２３ｃを閉じて、バルブ２３ｂを開放することで、キャリア液が装置本体２０２内の送液手段３により、貯蔵手段２から配管５ａ、５ｃを通り、第２の導入部１３ｃからチップ１０２内に入り込み、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質（標識抗体）一時貯蔵部１２、流路１４ｅ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂから装置本体２０２の配管５へ戻る循環ルートを通して循環させる。反応する標識抗体の量は、抗原の量により変化するので、全ての抗体−抗原複合体と反応させるために、標識抗体は予め過剰に保存していることが好ましい。
【０１０４】
不溶性担体に固定された標識抗体は、この循環により反応部１１に送られ、反応部１１で、工程３で形成された抗体−抗原複合物と反応し、抗体−抗原−標識抗体複合体を形成する。この工程でも、先に形成されたすべての抗体−抗原複合体と標識抗体とを効率よく反応させるために、上記のような循環ルートを通じて標識抗体を循環させることで、抗体−抗原複合体と反応する機会が増加し、また常に標識抗体を含むキャリア液を流している状態で反応させているので、抗原抗体反応の反応効率検出結果の再現性が高まる。
【０１０５】
工程５
また、反応部で形成された抗体−抗原−標識抗体複合体の量を検出するためには、反応部に残っている未反応の標識抗体を取り除く必要がある。このため、装置本体２０２内の送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ｂ、５ｃを通り、導入部１３ｃからチップ内に入り、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｅ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻し、コック２２ｄを経て廃液溜め２４に入るように、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作し、未反応標識抗体含有キャリア液を、本体２０２内に設けた廃液タンク２４に流す。
【０１０６】
工程６
次に、反応部１１に形成された抗体−抗原−標識抗体複合体の検出を、装置本体２０２内に設けた検出手段７で行う。例えば、標識として蛍光材料を用いた場合では、検出手段７に設けた紫外線光源から紫外線を検出手段７に設けた光学系を介して反応部の抗体−抗原−標識抗体複合体に照射し、標識である蛍光材料から発光される蛍光を検出手段７に設けたディテクターにより検出することで、抗原の有無、抗原の量を測定することができる。
【０１０７】
工程７
以上により１回の測定が終了する。次の測定を新しいチップで行う場合には、チップ１０２を入れ代える。
【０１０８】
工程７−２
他方、同一のチップを用いて、引き続いて測定を行う場合には、抽出部１０に残っている花粉殻等を除去する。なお、同一のチップを用いて複数回の測定を行う方式を採用する場合には、チップ１０２に残留した花粉殻を取り除く手段を設けるのが好ましい。この手段としては、例えば抽出部１０に大開口をもった花粉殻除去口を付設し、かつ抽出部４０と花粉殻除去口との間に開閉バルブを設けて、バルブ開放状態で洗浄用キャリア液を流すことにより、花粉殻を花粉殻除去口から洗い流す方法が例示できる。
【０１０９】
工程７−３
花粉殻を除去後、導入部１３ａの導入口から、反応部に結合している認識物質−アレルゲンタンパク質複合体および認識物質−標識物質付きアレルゲンタンパク質複合体からアレルゲンタンパク質（抗原）及び標識物質付きアレルゲンタンパク質（標識抗体）を分離するイオン濃度の溶液を流し、導出部１３ｂを通じて廃液溜２４に排出する。この作業の後、キャリア液を流して、抽出部、反応部、及び関連する流路を洗浄する。上記工程７−２，７−３は、順序が逆であってもよい。
【０１１０】
これにより、反応に用いた標識抗体は全て除去される。このため、再度同じチップを用いて検出を行うためには、図３に示すように、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２と、それと反応部１１を連結するマイクロバルブの付いた流路１４ｅと、本体と連結できる導入・導出部１３ｃ、１３ｄと、それと標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２を連結する流路１４ｄ、１４ｆと、マイクロバルブ１５ｂを含む標識物質付き認識物質一時貯蔵部セットＡ（図中、破線四角で囲んだ部分）を複数個設ける構成を採用するとよい。
【０１１１】
この場合、１つのセットを使用して検出を行っている時には、他のセットが関与しないようにチップ上のマイクロバルブ又は本体のコック、バルブ類を調整し、また、該標識物質付き認識物質一時貯蔵部セットＡを用いて上記工程1から工程６まで行った後、上記実
施の形態１で説明した工程７−２，７−３を行い、別の標識物質付き認識物質一時貯蔵部セットＡ’を用いて、新たに工程１から工程６を行えばよい。
【０１１２】
実施の形態２では、標識抗体が不溶性担体に固定化したものを例に説明を行ったが、不溶性担体に固定化させない場合には、上記の工程２を以下に示す工程２’に置き換えればよい。
【０１１３】
工程２’
次に、マイクロバルブ１５ａを開け、１５ｂを閉じて、送液手段３により、貯蔵手段２内のキャリア液を導入部１３ａ、１３ｃを介して抽出部、反応部、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に流入する。
この時、装置本体２０２では、キャリア液が配管５と配管５ｂを通る送液ルート及び配管５、５ｂ、５ｃ、５ｄのルートを流れるように、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作する。キャリア液は、装置本体２０２内の貯蔵手段２から配管５ｂを通り、導入部１３ａからチップ１０２に入る。チップ内では、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１に入り、その後流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に流れ込み、送液手段３を経て貯蔵手段２に戻る。
【０１１４】
他方、コック２２ｃは、配管５ｃにもキャリア液が流れるように制御されているので、キャリア液は、配管５ｃからチップ１０２の第２の導入部１３ｃから入り、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｆ、導出部１３ｄから装置本体２０２の配管５ｄに入る。この時、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２内の標識抗体がチップ外に流出しないよう、バルブ２３ｂで調整する。
これは、予め標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２及び配管の容積が分かっているので、流速から計算した時間制御でも制御できる。また、標識として、蛍光色素など光学的に検出できる標識を用いた場合は、例えば、装置本体２０２の導出部１３ｄ付近に光学的検出手段を設けて、配管５ｄ内の標識抗体を検出することと、バルブ２３ｂの操作を連動させることでも実現できる。導入部１３ａからキャリア液を入れる工程と第２の導入部１３ｃから入れる操作は、同時に行っても、一方の操作を行った後、もう１つの操作を行ってもよい。
【０１１５】
また、実施の形態２においても、上記実施の形態１と同様に、競合反応法を用いることもできる。この場合、チップ１０２の標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に標識抗体の代わりに、予め量のわかった標識抗原を存在させて標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７となし、反応部１１に固定された抗体の量が予めわかっている点が異なるだけで、他のチップ構成、本体構成は同じでよい。検出方法は、上記実施例の工程４及び５を省いて、工程３を以下のような工程３’に置き換えることもできる。この場合、他の工程は上記実形態と同様でよく、工程１−工程２−工程３’−工程６という工程を行えばよい。必要であれば、工程６の後、上記実施の形態１で説明した工程７、工程８を行う。また、図３に示すように、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７を含む標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部セットＡを複数設けてもよい。
【０１１６】
次に、競合法を用いた場合の検出方法について説明する。
【０１１７】
検出用チップの構造として、サンドイッチ法と大きな差はないが、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２として形成されている穴に、予め量のわかった標識物質付きアレルゲンタンパク質が含まれ、この穴は標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７として機能する。また、チップの反応部に存在する認識物質量も予めわかっていることが必要である。
【０１１８】
工程１，２
上記サンドイッチ法と同様でよい。
【０１１９】
工程３’
次に、マイクロバルブ１５ａ、１５ｂを開放した状態で、キャリア液が、送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ａ、導入部１３ａ、流路１４ａ、抽出部１０、１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻すルートと、送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ａ、５ｃを通り、導入部１３ｃ、流路１４ｄ、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７、１４ｅ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻すルートを通して、同時に循環するように、本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作する。
【０１２０】
キャリア液を上記のルートで循環させながら、一定時間花粉を装置に設けた取込穴９から収集する。この時必要であれば、大気を強制的に吸入する手段を設けてもよい。花粉は、取込穴９から入って抽出部１０内のキャリア液に入り、花粉表面又は内部のアレルゲンタンパク質（抗原）がキャリア液中に抽出される。この時、必要であれば、抽出部に大きさが１μｍから１００μｍの複数の磁性ビーズを設けて、別途本体に設けた磁性ビーズ攪拌手段により磁性ビーズを攪拌することで花粉をキャリア液中で攪拌してもよい。この撹拌により、花粉からの抗原抽出効率を上げることができる。
【０１２１】
キャリア液は、上記循環ルートを循環しているので、花粉から抽出された抗原は、順次流路１４ｂを通り、反応部１１に送られる。この時、花粉の殻はキャリア液に不溶であり、その殻とキャリア液に溶けている抗原や他のタンパク質などの可溶物質とを分離する必要がある。この分離は、上記実施の形態１で説明したものと同様でよい。
【０１２２】
反応部に設けられた抗体に対して、反応部１１に送られた抗原は、標識物質付きアレルゲンタンパク質（標識抗原）一時貯蔵部１７から送られた標識抗原と混合され（混合キャリア液）、競合して抗原抗体反応を起こし、一定の分率に従って、抗原及び標識抗原は反応部に固定される。しかし、競合反応は、抗体の抗原及び標識抗原に対する特異的な反応性、抗原及び標識抗原と抗体が出会う機会に左右され、１回の反応では、すべての抗原及び標識抗原が抗体と十分に競合反応し、両方の数量及び反応性に応じた分率で再現性よく反応部に固定されるとは限らないが、両者を同時に（混合キャリア液）循環することを連続に繰り返すことにより、抗原抗体反応が確実に起こり、測定の再現性を高くできる。この循環は、例えば花粉取込穴９に蓋をして、花粉の収集を止めた後も、抽出された抗原及び標識抗原を抗体と反応させるために、しばらく循環を続けることが好ましい。
【０１２３】
工程５
工程４は行わずに、未反応の標識抗体を取り除く必要があるため、装置本体２０２内の送液手段３により、貯蔵手段２、配管５ｂ、５ｃを通り、導入部１３ｃからチップ内に入り、流路１４ｄ、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７、流路１４ｅ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って本体２０２内の配管５に戻し、コック２２ｄを経て廃液溜め２４に入るように、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作し、未反応標識抗体含有のキャリア液を、本体２０２内に設けた廃液タンク２４に流す。
【０１２４】
工程５
サンドイッチ法と同様に工程６，７を行う。
【０１２５】
［実施の形態３］
以下に、実施の形態３を図４を参照して詳細に説明する。図４に示すように、実施の形態２のアレルゲン検出装置は、少なくとも、アレルゲン検出用チップ１０３と装置本体２０３から構成され、上記実施の形態１と同様に、アレルゲン検出用チップ１０３と装置本体２０３とは脱着自在に構成されている。
【０１２６】
先ず装置本体２０３について説明する。装置本体２０３は、チップに注入する液を溜めておく貯蔵手段２、チップに液を流すための送液手段３、流量調整をするバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄを有する流量調整手段、流路を変えるコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを有する流路変更手段、チップ１０３に設けた開閉手段（マイクロバルブ１５ａ、１５ｂ）を作動させるためのマイクロバルブ駆動手段（図示せず）、以上の各手段の動作を制御する制御手段４、液を流通させるための流通配管群５、５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｆ、チップと流通配管群を連結するための連結手段６、抗原抗体反応の後、抗原の有無を検出するための検出手段７、及び使用後のキャリア液や洗浄液を捨てる廃液溜２４を備えている。
【０１２７】
装置本体２０３の構成要素である、貯蔵手段、送液手段、流量調整バルブ、コック制御手段、連結、検出手段、マイクロバルブ駆動手段、制御手段４には、上記実施の形態２記載のものと同じ構成要素を用いることができる。
【０１２８】
次に、実施の形態３における検出用チップ１０３について説明する。
実施の形態３の検出用チップ１０３は、大気中から花粉を収集することのできる開口を有し、取り込まれた花粉から抗原（アレルゲンタンパク質）を抽出する抽出部１０と、検出目的物である抗原に特異的に反応する抗体（認識物質）が流去しない状態で保持させられた反応部１１と、抗原−抗体複合体と特異的に反応し、反応により抗原−抗体−標識抗体複合体を形成する標識抗体が保存されている標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２と、装置本体２０３からチップ１０３内にキャリア液を流入させるための導入口を備えた導入部１３ａ、１３ｃと、装置本体２０３からチップ１０３内の標識物質付き認識物質貯蔵部１２にキャリア液を流入させるための導入口を備えた第２の導入部１３ｅと、チップ１０３からキャリア液を装置本体２０３側に流出させるための導出口を備えた導出部１３ｂ、１３ｄと、チップ１０３内にキャリア液を流す流路１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆ、１４ｇ、１４ｈと、抽出部１０から導入されるアレルゲンタンパク質を含むキャリア液を、流路１４ｈを通って導入されるキャリア液で希釈する希釈部１８が基板４０上に形成され、更にチップ内の液の流れを遮断または通過させる開閉手段としてのマイクロバルブ１５ａ、１５ｂ、１５ｃが基板４０上に設けられている。
【０１２９】
チップの構成要素のうち、希釈部１８を除いた要素は、実施の形態２記載のものと同じでよい。希釈部１８は、従来提案されている液を均一混合する構成が使用でき、例えば図８（ａ）に示すような、長い流路を折りたたんだもの、又は図８（ｂ）に示すような直径１００μｍ以上であり、深さは深さは５０μｍから１ｍｍの穴が設けられ、その底に磁性ビーズを設けた構成が例示できる。図８（ａ）に示した構成では、長い流路を流れていくうちに２つの液が、均一に混合することを利用したものであり、図８（ｂ）では、装置本体２０３に設けた磁石（図示せず）により磁性粒子８をランダムに動かすことにより２つの液を攪拌して混合させるものである。ただし、上記構成に限定されるものではない。
【０１３０】
実施の形態３のアレルゲン検出装置を用いた抗原検出方法を図４を用いて、詳細に説明する。
但し、以下では、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２の標識抗体が不溶性担体に固定されているとして説明を行う。不溶性担体に固定されていない場合は、下記工程２を、上記実施の形態２の工程２’と同様にすればよい。
【０１３１】
工程１
花粉の抗原を検出する場合、まずチップ１０３が装置本体（本体）２０３に装着される。装着時に、チップ１０３に設けられた導入・導出部１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１３ｄ、１３ｅとそれらと対応した本体２０３の連結手段６により、本体に設けられた配管５と連結する。
【０１３２】
工程２
次に、マイクロバルブ１５ａ、１５ｃを開け、１５ｂを閉じて、送液手段３により、貯蔵手段２内のキャリア液を導入・導出部１３ａ、１３ｅ、１３ｃを介して抽出部、反応部、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に流入する。
【０１３３】
この時、本体２０３では、キャリア液が本体２０３内の貯蔵手段２から配管５ｂ、５ｆを通って導入部１３ａからチップ１０３に入り、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｇ、希釈部１８、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に流れ込む流れと、貯蔵手段２から配管５ｂ、５ｅを通って導入部１３ｅからチップ１０３に入り、流路１４ｈ、希釈部１８、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に流れ込む流れが生じるように本体２０３内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。また、コック２２ｃは、配管５ｃにもキャリア液が流れるように制御されているので、キャリア液は、配管５ｃからチップ１０３の第２の導入部１３ｃから入り、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｆ、導出部１３ｄから本体２０３の配管５ｄに入る。導入部１３ａ、１３ｅからキャリア液を入れる工程と第２の導入部１３ｃから入れる操作は、同時に行っても、一方の操作を行った後、もう１つの操作を行ってもよい。予め、抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２などの容積は分かっているので、制御手段４により必要量だけ流入して、流入を止める。
【０１３４】
以上の操作により、チップ内の各流路、抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２をキャリア液で満たすことができ、以降の工程で、キャリア液中に空気などの気体が混入を防ぐことができ、反応を確実に行わせる事ができる。
【０１３５】
ここで、上記実施の形態２と同様に、工程３〜６を行うこともできるが、希釈部１８を用いて、アレルゲンタンパク質を含むキャリア液を希釈する構成について以下に説明する。
【０１３６】
工程３−１
本体２０３のマイクロバルブ駆動手段によりマイクロバルブ１５ａを開放し、マイクロバルブ１５ｃ、１５ｂを閉じる。その状態で送液手段３により、キャリア液が、装置本体２０３内の貯蔵手段２から配管５ａ、５ｅを通って、導入部１３ｅから入り、流路１４ｈを通って、希釈部１８、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に流れ込み循環を行い、この時、導入部１３ａからは、キャリア液が入らないよう、本体２０３内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。上記ルートでキャリア液を循環させながら、一定時間花粉をチップに設けた取込穴９から収集する。一定時間後、取り込み穴に蓋（図示せず）をして花粉が入らないようにする。
【０１３７】
工程３−２
次に、マイクロバルブ１５ｃを開放し、キャリア液が、本体２０３内の貯蔵手段２から配管５ａ、５ｆを通って、導入部１３ａから入り、流路１４ａ、抽出部１０、希釈部１８、流路１４ｇを通って希釈部１８に入るように、装置本体２０３内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。希釈部１８では、導入部１３ｅからのキャリア液と、抗原を含んだ抽出部１０からのキャリア液とが混合され、反応部１１に流入するキャリア液のアレルゲンタンパク質濃度が薄められる。この後、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に流れ込み、循環される。花粉の殻等の不溶物質と、抗原などキャリア液に溶解している溶解物質との分離は、実施の形態１に記載の方法で行うことができる。
【０１３８】
反応部１１送られた抗原は、反応部に設けられた抗体と抗原抗体反応を起こし、抗原は反応部に固定される。本実施の形態では、上記のように、導入部１３ａから入り、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｇを通って希釈部１８に入るキャリア液と、導入部１３ｅから入り、流路１４ｈを通って、希釈部１８に入る液とを希釈部１８で均一に混合し、この混合液を流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に流れ込むという循環を行うため、未反応の抗原は、複数回抗体と反応する機会が生じるので、未反応の抗原を少なくでき、結果として毎回の測定の再現性を高くできる。
【０１３９】
また、抗原抗体反応の反応性は、抗原と抗体の接触する回数に関係するが、その回数は、抗原の濃度にも関係する。抽出部１０から流れ込む抗原が高濃度の場合、そのまま反応部１１に流しても、反応部で拡散が生じにくく、反応効率が低くなる場合が考えられるが、本実施の形態では、希釈部１８において、抽出部１０からの抗原含有キャリア液を希釈する構成を採用しているので、反応部１１に流れ込んだ後、短時間で拡散し反応性を向上できる。
【０１４０】
工程３−３
一定時間この循環を行った後、工程３−１に戻る。
上記工程３−１から工程３−３までの工程を数回繰り返す。
【０１４１】
実施の形態３では、希釈部と抽出部の間に、それらを分断及び連結するような手段を設け、一定時間分断することで、花粉の収集及び抗原抽出工程と、本体２０３内の貯蔵手段２から配管５ａ、５ｅを通って、導入部１３ｅから入り、流路１４ｈを通って、希釈部１８、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０３内の配管５に入る循環による抗原抗体反応とを独立にできるという構成が特徴である。
実施の形態３の構成によれば、花粉数の比較的少ない状態で抗原抗体反応を行うことができ、また、花粉収集中も抗原抗体反応を何回も行うことができるので、抗原抗体反応をより確実に行うことができる。
【０１４２】
また、花粉収集中に抗原抗体反応を行えるので、花粉収集から抗原抗体反応完了までの時間を短縮できる。
【０１４３】
工程４
工程３−１から３−３の繰返しを終了した後、マイクロバルブ１５ａを閉じて、マイクロバルブ１５ｂを開放し、本体２０３内の送液手段３により、キャリア液が、貯蔵手段２から配管５ａ、５ｃを通り、第２の導入部１３ｃからチップ１０３内に入り込み、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｅ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂから装置本体２０３の配管５へ戻る循環ルートを通して循環させるように装置本体２０３内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。
【０１４４】
不溶性担体に固定された標識抗体は、この循環により反応部１１に送られ、反応部１１で、抗体と反応した抗原と反応し、抗体−抗原−標識抗体複合体を形成する。この工程でも、先に形成されたすべての抗体−抗原複合体と標識抗体とを確実に反応させるため、上記循環ルートを通じて標識抗体を循環させることで、抗体−抗原複合体と反応する機会を増やしている。
【０１４５】
工程５及び工程６については、実施の形態１に記載の方法と同様に行えばよい。また、必要であれば、上記実施の形態１で示した、工程７を行えばよい。また、上記実施の形態２と同様にして競合法を用いることができる。また、複数の標識物質付き認識物質一時貯蔵部セットＡを設けてもよい。こららの場合の検出方法は、上記実施の形態２で示した方法を採用すればよい。
【０１４６】
実施の形態３では、図４に示す装置及びチップを参照して説明したが、本発明は上記装置及びチップ構成、方法に限定されるものではない。
【０１４７】
［実施の形態４］
以下に、実施の形態４を図５を参照して詳細に説明する。
【０１４８】
まず、抗原を固定化した抗体及び標識抗体で挟み込む、所謂サンドイッチ法で、抗原を捕獲し、検出する方法を用いた場合については、図２において、抽出部１０と反応部１１の間に希釈部を設けたこと以外は同じ構成であるので、実施の形態１に記載した方法と同様にして抗原の検出ができる。
【０１４９】
実施の形態４では、競合反応を用いる場合について説明する。
【０１５０】
チップ１０４の構成は、図５に示すように、標識物質付きアレルゲンタンパク質（標識抗原）一時貯蔵部１７をマイクロバルブ１５ｂを設けた流路１４ｅを介して混合部１６に連結していること、導入部１３ｅ、流路１４ｈを設けていないこと、及び標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７に予め量がわかっている標識抗原を設け、且つ固定化抗体の量が予めわかっていることを除けば、上記実施の形態３で述べた構成と同様である。
【０１５１】
上記混合部は、上記実施の形態３の希釈部の構成をそのまま採用することができる。
【０１５２】
装置本体２０４の構成は、図５に示すように、上記実施の形態３のチップ１０３の構成の変更に対応して、配管５ｅ、バルブ２３ｃ及びチップ１０４の導入部１３ｅとの連結手段を設けていないことを除けば、実施の形態３に記載した構成と同様でよい。
【０１５３】
実施の形態４のアレルゲン検出装置を用いた抗原検出方法を図５を用いて、詳細に説明する。
但し、以下では、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７の標識抗原が不溶性担体に固定されているとして説明を行う。不溶性担体に固定されていない場合は、上記実施の形態２の工程２’と同様にすればよい。
【０１５４】
実施の形態４のアレルゲン検出装置では、実施の形態２及び３記載の発明と同様、アレルゲン検出用チップ１０４と装置本体２０４は、脱着できるようになっている。また、花粉検出を行わない時は、抗原・抗体が失活しないように、抗原・抗体がキャリア液に溶解した状態、又は固体状態でチップを冷蔵又は冷凍保存することが好ましい。
【０１５５】
工程１
１３ｅと連結を行わないことを除けば、上記実施の形態３と同様に行う。
【０１５６】
工程２
次に、マイクロバルブ１５ａ、１５ｃを開け、１５ｂを閉じて、送液手段３により、貯蔵手段２内のキャリア液を導入部１３ａ、１３ｃを介して抽出部１０、反応部１１、標識物質アレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７に流入する。
【０１５７】
この時、装置本体２０４では、キャリア液が、本体２０４内の貯蔵手段２から配管５ｂ、５ｆを通って導入部１３ａからチップ１０４に入り、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｇ、混合部１６、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０４内の配管５に流れ込む流れが生じるように本体２０４内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。また、コック２２ｃは、配管５ｃにもキャリア液が流れるように制御されているので、キャリア液は、配管５ｃからチップ１０４の第２の導入部１３ｃから入り、流路１４ｄ、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７、流路１４ｆ、導出部１３ｄから本体２０４の配管５ｄに入る。導入部１３ａからキャリア液を入れる工程と第２の導入部１３ｃから入れる操作は、同時に行っても、一方の操作を行った後、もう１つの操作を行ってもよい。予め、抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２などの容積は分かっているので、制御手段４により必要量だけ流入して、流入を止める。
【０１５８】
第２の導入部１３ｃから入れる操作では、チップ構成として、標識物質付きアレルゲンタンパク質１２と流路１４ｆの間に、標識抗体が固定された担体の大きさよりも小さいサイズの幅又は厚みの分離部を設けることで標識抗体を装置本体２０４に流れ込まないようせきとめることができる。
以上の操作により、チップ内の各流路、抽出部、反応部、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７をキャリア液で満たすことができ、以降の工程で、キャリア液中に空気などの気体が混入を防ぐことができ、反応を確実に行わせる事ができる。
【０１５９】
工程３
次に本体のマイクロバルブ駆動手段によりマイクロバルブ１５ｃ及び装置本体２０４内のバルブ２３ａを閉じて、抽出部１０を孤立させ、一定時間、花粉の収集及び花粉からの抗原の抽出を行う。この時、抽出部１０内に磁性粒子を設けて、別途装置本体２０４に設けた磁石などにより磁性粒子を攪拌させてもよい。こうすることで、抽出効率を高めることができる効果がある。一定時間後、装置本体２０４に設けた蓋を閉めて、花粉の収集を終了する。
【０１６０】
工程４
次に、マイクロバルブ１５ｂ、１５ｃを開ける。その状態で送液手段３により、キャリア液が、装置本体２０４内の貯蔵手段２から配管５ａ、５ｆを通って導入部１３ａからチップ１０４に入り、流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｇ、混合部１６、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃを通って、導出部１３ｂを通り、本体２０４内の配管５に流れ込むルートと、貯蔵手段２から配管５ａ、５ｃを通り、導入部１３ｃからチップ１０４内に入り込み、流路１４ｄ、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７、流路１４ｅ、混合部１６、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂから装置本体２０４の配管５へ戻るルートを流れるように、装置本体２０４内の流量調整バルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｄ、コック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄを操作する。
【０１６１】
上記２つのルートでキャリア液を同時に循環させることで、抽出部１０から混合部１６に流れ込む、抗原を含んだキャリア液と、標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７から混合部１６に流れ込む標識抗原を含んだキャリア液が、混合部１６で混合されキャリア液中で抗原と標識抗原が均一に混ざり合った状態（混合キャリア液）で、反応部１１に流れ込む。抗原と標識抗原は、反応部１１に設けた抗体に対して競合して反応し、キャリア液中の抗原と標識抗原との比に応じて固定化抗体に固定される。
【０１６２】
競合反応においても、１回の反応ですべての抗原及び標識抗原と抗体が反応しないという問題があるが、両抗原を含む混合キャリア液循環を連続して一定時間行うことで、何回も反応を行わせて競合反応を確実に行わせる事ができ、反応の再現性、効率が向上する。
【０１６３】
実施の形態４の構成の特徴は、抗原と標識抗体がほぼ同じ割合で均一に混ざり合った状態で反応部１１に送られること、抽出部１０から混合部１６に流れ込む量と標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部１７から混合部１６に流れ込む量を調整することで反応部１１に送られるキャリア液中の抗原と標識抗体の割合を変えられることであり、この特徴から、反応部１２での競合反応の条件を一定にできるとともに最適化できるので、反応の再現性及び効率をより向上できる。
【０１６４】
工程５
系内から未反応の抗原・標識抗原を取り除くため、キャリア液が装置本体２０４内のコック２２ｄを経て廃液溜め２４に入るように、装置本体２０４内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを操作し、未反応標識抗原含有キャリア液を、本体２０４内に設けた廃液タンク２４に流すことで実現できる。
【０１６５】
工程６
上記実施の形態１に記載の方法と同様に行えばよい。
【０１６６】
同一チップで複数回測定を行う場合は、実施の形態２で示したチップ１０２で反応部１１の回りに標識物質付き認識物質一時貯蔵部セットＡを複数設けている構成に代えて、混合部１６の回りに標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部セットＡを複数設けている構成を用いればよい。
【０１６７】
実施の形態４では、図５の装置及びチップを参照して説明したが、本発明は、反応部を含んだ循環工程により抗原抗体反応を何回も行うことで、当該反応を確実に行わせ、反応の再現性を得るという効果を生じさせるものであり、また、循環工程により同様の効果が得ることができれば、実施の形態４に述べた装置及びチップ構成、方法に限定されるものではない。
【０１６８】
（実施例１）
実施例１にかかるアレルゲン検出装置を製作しその性能を確かめた。実施例１の基本構成は上記実施の形態１と同様であるので、実施の形態１で説明した内容は省略し、より具体的内容のみについて以下に説明する。
【０１６９】
チップ１０１を次のようにして作製した。５２ｍｍ角のガラス基板をイソプロピルアルコールで超音波洗浄した。このガラス基板上に、フォトリソグラフィー法によりレジストパターンを形成した後、フッ化水素及びフッ化アンモニウム水溶液によるウェットエッチングにより、導入部４１、導出部４２、抽出部４３、反応部４４、それらを連結する流路４５、４６、４７、複数の円柱からなる分離部４９を作製した。導入部４１および導出部４２は直径３ｍｍ、深さ０．１ｍｍの円形穴であり、抽出部４３および反応部４４は直径５ｍｍ、深さ０．１ｍｍの円形穴であった。また、流路４５・４６は幅０．６ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ５ｍｍの溝であり、流路４７は幅０．０４ｍｍ、深さ０．１ｍｍ、長さ５ｍｍの溝であった。
【０１７０】
また、抽出部４３と流路４６の間には、直径約１００ミクロンの円柱４９が約２０ミクロンの隙間で４本形成されてなる分離部４９をフォトリソグラフィー法とウェットエッチング法により形成した。更に、反応部４４には、その表面にブロッキング処理を施した認識物質（抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体：固定抗体）を固定した直径約０．０５ｍｍ（５０μｍ）のプラスチックビーズ５０を５０００個配置した。この後、導入部・導出部および抽出部４３に対応する箇所に孔を空けたプラスチック板で蓋をして、測定用チップとした。
なお、上記プラスチックビーズの直径が流路４７の幅（０．０４ｍｍ）よりも大きいので、ビーズが流路４７側に流去することはない。また、ビーズ直径が流路４７の深さ方向長（０．１ｍｍ）よりも小さいので、流路４７を塞いでしまうこともない。
【０１７１】
上記チップ１０１を４枚作製し、その各々を装置本体２０４に組み込み、キャリア液を循環させることによる測定の再現性を確かめる試験を行った。試験条件は次の通りである。
〈被検出用抗原〉
Ｃｒｙ  ｊ−１をキャリア液に１．５マイクロモル濃度で溶解した抗原溶液を用意し、この溶液２μｌを抽出部４３に入れた。
〈固定抗体〉
上記したプラスチックビーズに固定保持された抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体を用いた。なお、反応部４４に配置した抗体数が、上記被検出用の抗原数よりも十分に多くなるようにした。
〈キャリア液〉
リン酸濃度０．０１モル、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液を用いた。
〈標識抗体〉
キャリア液に３モル濃度で溶解した蛍光色素をつけた抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体を用いた。
【０１７２】
〈循環条件等〉
キャリア液の循環速度を２μｌ／秒とし、１０分間循環（約４回循環）させた。抽出反応工程が終了後に新鮮なキャリア液による３〜５分間の洗浄運転を行った（実施の形態１の工程３参照）。その後、標識物質付認識物質タンク５４に入っている蛍光色素をつけた抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体溶液を導入部４１からチップ内に導入し、２μｌ／秒で１０分間循環（約４回循環）させ、その後上記と同様にして新鮮なキャリア液による３〜５分間の洗浄運転を行った（実施の形態１の工程４，５参照）。この後、検出手段５５から反応部４４に紫外線光を照射して蛍光強度を測定した（実施の形態１の工程６参照）。なお、ここに記載していない事項については実施の形態１と同様である。
【０１７３】
４枚のチップをそれぞれ用いて行ったアレルゲン検出試験の結果、各チップ間の測定値は理論値（抽出部に入れたアレルゲンタンパク質量）に対して９２〜１０２％の範囲であり、最小値と最大値の誤差は１０％以内であることが確認された。
【０１７４】
（比較例）
上記実施例１と同じ装置を用い、抽出反応工程（実施の形態１の工程３）において反応部４３に抗原と固定化抗体とを存在させた状態で、キャリア液が流出しないようにバルブ４８ｃを調整し、抽出部４３にキャリア液を静止させた状態で１０分間の反応を行った。また、標識物質付認識物質との反応工程（実施の形態１における工程４）において標識抗体を導入して、抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体溶液が流出しないようにバルブ４８ｃを調整し、液の流れを止め抗Ｃｒｙ  ｊ−１モノクローム抗体とアレルゲンタンパク質複合体とを１０分間反応させた。これら以外については上記実施例１と同様にして、アレルゲンタンパク質の検出試験を４回行った。
【０１７５】
その結果、各チップ間の測定値は理論値（抽出部に入れたアレルゲンタンパク質量）に対して７９〜９１％の範囲であり、最小値と最大値の誤差は１５％であり、実施例１に比較し検出精度および再現性が悪かった。
【０１７６】
なお、上記実施例１では、反応部に固定した抗体、および反応部で生成した抗原−抗体複合体に反応させる標識抗体ともにモノクローナル抗体を用いたが、どちらか一方をモノクローナル抗体とし、他方をポリクローナル抗体としてもよいことは勿論である。なお、固定化させる抗体は、他の物質と反応しないようにブロッキング処理を施すことが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０１７７】
上述したように、本発明によると、アレルゲンタンパク質粒子中に含まれるアレルゲンタンパク質の量及び／又は種類を再現性よく測定できるアレルゲンの検出方法を提供でき、また本発明によると、そのような検出方法を簡便に実現できるチップおよびこのチップを用いた装置を安価に提供することができる。よって、その産業上の意義は大きい。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】実施の形態１に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図２】実施の形態２に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図３】複数の標識部物質貯蔵部セットを含むチップの概念図。
【図４】実施の形態３に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図５】実施の形態４に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図６】本発明に係る抽出部の概略部分断面図。
【図７】マイクロバルブの概略部分断面図。
【図８】希釈部・混合部の概略部分図。
【図９】特許文献６に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図１０】特許文献７に係るアレルゲン検出用チップの概念図。
【符号の説明】
【０１７９】
１０１、１０２、１０３、１０４  アレルゲン検出用チップ
２  貯蔵手段
３  送液手段
４  制御手段
５、５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｆ  配管
６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ、６ｅ  連結手段
７、５５  検出手段
８  磁性粒子
９  取込穴
１０、４３  抽出部
１１、４４  反応部
１２    標識物質付き認識物質一時貯蔵部
１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、４１  導入部（第２の導入部）
１３ｂ、１３ｄ、１３ｆ、４２  導出部
１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆ、１４ｇ、
１４ｈ、４５、４６、４７  流路
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ  マイクロバルブ
１６  混合部
１７  標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部
１８  希釈部
２０１、２０２、２０３、２０４  装置本体
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、４８  コック
２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ  バルブ
２４  廃液溜
３１  蓋
４０  基板
４９  分離部
５１  流通配管
５２  ポンプ
５３  キャリア液タンク
５４  標識物質付認識物質溶液タンク
５６  廃液タンク
５７  標識物質付アレルゲンタンパク質溶液タンク
【図１】
2008107365.tif 000003
【図２】
2008107365.tif 000004
【図３】
2008107365.tif 000005
【図４】
2008107365.tif 000006
【図５】
2008107365.tif 000007
【図６】
2008107365.tif 000008
【図７】
2008107365.tif 000009
【図８】
2008107365.tif 000010
【図９】
2008107365.tif 000011
【図１０】
2008107365.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月4日(2008.1.4)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、抗原を検出する方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明は上記課題を解決しようとするものであり、その目的は、複数の抗原物質を含む浮遊微小物質中の抗原を再現性よく検出することのできる抗原の検出方法を提供することである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第一の発明は、抗原と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に、抗原を含むキャリア液を２回以上循環して導入し、前記抗原と前記認識物質とを反応させて認識物質−抗原複合体を生成させる複合体生成ステップを備える抗原の検出方法である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第二の発明は、外部環境から抽出部に取り込まれたアレルゲン物質よりキャリア液中にアレルゲンタンパク質を抽出する抽出ステップと、前記アレルゲンタンパク質を含む抽出キャリア液を、前記アレルゲンタンパク質と特異的に反応する認識物質が流去しない状態で保持されてなる反応部に導入し、前記アレルゲンタンパク質と前記認識物質とを反応させて認識物質−アレルゲンタンパク質複合体を生成させる複合体生成ステップと、を備えるアレルゲンタンパク質検出前処理工程を有するアレルゲンタンパク質の検出方法であって、前記抽出部と前記反応部との間でキャリア液を循環させることにより、アレルゲンタンパク質の抽出と、アレルゲンタンパク質と認識物質との反応とを同一のキャリア液で２回以上繰り返して行うことを特徴とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
上記課題を解決するためのアレルゲンタンパク質の検出方法にかかる第三の発明は、抗原を含むキャリア液と、予め含有量がわかっている標識物質付き抗原を含むキャリア液とを混合して混合キャリア液となす混合ステップと、前記抗原と特異的に反応する認識物質であり、予め量がわかっている前記認識物質が流去しない状態で固定されている反応部に、前記混合キャリア液を導入し、前記認識物質に対して前記抗原と前記標識物質付き抗原とを競合的に反応させて、認識物質−抗原複合体と認識物質−標識物質付き抗原複合体とを生成する複合体生成ステップと、備える前処理工程を有する抗原の検出方法であって、前記複合体生成ステップにおける前記混合キャリア液の導入方法が、前記混合キャリア液を前記反応部に２回以上循環して流入させる方法であることを特徴とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
第一の本発明構成では、抗原を含むキャリア液を反応部に２回以上循環して流入させるが、この方法であると、キャリア液中の抗原と反応部に保持されている認識物質との接触機会が増える。よって、１回目の流入により反応できなかった抗原もその後の繰り返し流入により反応するので、抗原と認識物質との反応が十分に行われる。この結果、抗原と認識物質の反応性に起因する検出バラツキがなくなるので、定性、定量における再現性が向上する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
また、第二の本発明構成においては、キャリア液中に抗原を抽出する抽出部と、抗原と認識物質とを反応させる反応部との間でキャリア液を循環させることにより、抗原の抽出と、抗原と認識物質との反応とを同一のキャリア液で２回以上繰り返して行うが、この方法であると、反応部における反応ステップのみならず、抽出部における抽出ステップをも繰り返して行われる。よって、抗原物質からの抗原の抽出が十分に行われ、かつ抽出された抗原と認識物質との反応も十分に行われるので、抗原の定性、定量における再現性および検出精度が顕著に向上する。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
本発明を実施するための最良の形態を、抗原としてスギ花粉に含まれるアレルゲンタンパク質を使用した例を用いて、図面を参照しながら説明する。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
［実施の形態１］
図１は、実施の形態１に係る抗原検出用チップ及びこれを用いた抗原検出装置を示す概念図である。図１に示すように、実施の形態１に係る抗原検出装置は、検出用チップ１０１と、装置本体（チップを除く部分）２０１とから構成されている。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
抗原検出用チップ１０１は、基板４０上に、導入部４１、導出部４２、抽出部４３、反応部４４及びそれらを連結する流路４５、４６、４７を有し、更に抽出部４３と流路４６との間には分離部４９が設けられている。ここで、例えば上記導入部４１及び導出部４２は、直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍ〜１ｍｍの穴であり、抽出部４３は直径が１００μｍ以上、深さが５０μｍから１ｍｍの穴からなる。これらの穴の形状（基板の垂直方向から見た形状）は円形、正方形、長方形等何れであっても良い。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
また、抗原検出用チップ１０１は、装置本体２０１から脱着可能に構成されており、アレルゲン検出に使用するまでの間、他の物質の混入を防止し、抗体活性を失活させないことが必要である。したがって、装置本体２０１から取り外し、チップ１０１単独で密閉包装し、冷蔵又は冷凍保存することが好ましい。この場合、固体状態（キャリア液を含まない状態）であってもよく、キャリア液に溶解した状態であってもよい。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施の形態１に係る抗原検出装置は、上記チップ１０１と装置本体２０１とからなる。次にこの抗原検出装置を用いたアレルゲンタンパク質（抗原）の検出方法について説明する。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ところで、上記では、スギ花粉を例にして説明したが、他の抗原についても本発明が応用できることは勿論である。また、上記では、一種類の抗体を用いた場合について説明したが、大気中のアレルゲン含有粒子（浮遊微小粒子）は多様であり、また、一つのアレルゲン含有粒子に二種以上のアレルゲンが含まれる場合もあるので、大気中の粒子には多種類のアレルゲンが含まれることが多い。多種類のアレルゲンタンパク質（抗体）を同時に検出する場合は、例えば反応部に多種類の抗体を配置し、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に標識抗体として抗体の種類毎に蛍光色の異なる蛍光色素を付けたものを用意することで、多種類の抗原を蛍光色の違いにより同時に検出することができる。また反応部を複数個設け、それぞれに異なる抗体及び標識抗体を配置し、標識付き認識物質溶液タンク内にそれぞれに対応した標識付き認識物質を用意する方法を採用してもよい。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
［実施の形態２］
本発明の実施の形態２を図２に基づいて説明する。図２に示すように、実施の形態２の抗原検出装置は、少なくとも、抗原検出用チップ１０２と装置本体２０２から構成され、上記実施の形態１と同様に、抗原検出用チップ１０２と装置本体２０２とは脱着自在に構成されている。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
以上に説明した実施の形態２に係る抗原検出用チップ１０２は、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２（実施の形態１でいう標識物質付認識物質タンク）を装置本体２０２ではなくチップ１０２内部に設けた点で、実施の形態１のチップ１０１と異なる。このような実施の形態２に係る抗原検出装置を用いた抗原検出方法を、サンドイッチ法を例として図２を参照しながら以下に説明する。
なお、ここでは標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に含まれる標識物質付き認識物質（標識抗体）が不溶性担体に固定されているとして説明する。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
工程２
次に、マイクロバルブ１５ａを開け、１５ｂを閉じて、貯蔵手段２内のキャリア液を経路２ｂから配管５ｂに供給し、導入部１３ａ、１３ｃを介して抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２に流入させる。この場合、キャリア液の流れが、装置本体２０２内の貯蔵手段２から配管５ｂを通り、導入部１３ａの導入口を介してチップ１０２に入り、更に流路１４ａ、抽出部１０、流路１４ｂ、反応部１１、流路１４ｃ、導出部１３ｂを通って装置本体２０２内の配管５に流れ込み、送液手段３を経て貯蔵手段２のバイパス２ａに戻るルートと、貯蔵手段２から配管５ｂを通り、コック２２ｃで分流されて、コック２２ｂを経て、５ｃをとおり、第２の導入部１３ｃからチップ１０２に入り、流路１４ｄ、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２、流路１４ｆ、導出部１３ｄを通って本体２０２内の配管５ｄに入り、送液手段３を経て貯蔵手段２のバイパス２ａに戻るルートとなるように、制御装置４により、装置本体２０２内のコック２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ及びバルブ２３ａ、２３ｂ、２３ｃを制御する。２つのルートに沿って流す操作は同時に行ってもよく、また一方のルートに沿って流した後、もう１つのルートに沿って流す方法としてもよい。予め、抽出部１０、反応部１１、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２などの容積は分かっているので、制御手段４により必要量だけ流入して、流入を止める。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
［実施の形態３］
以下に、実施の形態３を図４を参照して詳細に説明する。図４に示すように、実施の形態２の抗原検出装置は、少なくとも、抗原検出用チップ１０３と装置本体２０３から構成され、上記実施の形態１と同様に、抗原検出用チップ１０３と装置本体２０３とは脱着自在に構成されている。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
実施の形態３の抗原検出装置を用いた抗原検出方法を図４を用いて、詳細に説明する。
但し、以下では、標識物質付き認識物質一時貯蔵部１２の標識抗体が不溶性担体に固定されているとして説明を行う。不溶性担体に固定されていない場合は、下記工程２を、上記実施の形態２の工程２’と同様にすればよい。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
実施の形態４の抗原検出装置では、実施の形態２及び３記載の発明と同様、抗原検出用チップ１０４と装置本体２０４は、脱着できるようになっている。また、花粉検出を行わない時は、抗原・抗体が失活しないように、抗原・抗体がキャリア液に溶解した状態、又は固体状態でチップを冷蔵又は冷凍保存することが好ましい。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
（実施例１）
実施例１にかかる抗原検出装置を製作しその性能を確かめた。実施例１の基本構成は上記実施の形態１と同様であるので、実施の形態１で説明した内容は省略し、より具体的内容のみについて以下に説明する。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
上述したように、本発明によると、抗原の量及び／又は種類を再現性よく測定できる抗原の検出方法を簡便に実現できるチップを用いた装置を安価に提供することができる。よって、その産業上の意義は大きい。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
【図１】実施の形態１に係る抗原検出装置の概念図。
【図２】実施の形態２に係る抗原検出装置の概念図。
【図３】複数の標識部物質貯蔵部セットを含むチップの概念図。
【図４】実施の形態３に係る抗原検出装置の概念図。
【図５】実施の形態４に係る抗原検出装置の概念図。
【図６】本発明に係る抽出部の概略部分断面図。
【図７】マイクロバルブの概略部分断面図。
【図８】希釈部・混合部の概略部分図。
【図９】特許文献６に係るアレルゲン検出装置の概念図。
【図１０】特許文献７に係るアレルゲン検出用チップの概念図。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７９】
１０１、１０２、１０３、１０４  抗原検出用チップ
２  貯蔵手段
３  送液手段
４  制御手段
５、５ａ、５ｂ、５ｃ、５ｄ、５ｆ  配管
６ａ、６ｂ、６ｃ、６ｄ、６ｅ  連結手段
７、５５  検出手段
８  磁性粒子
９  取込穴
１０、４３  抽出部
１１、４４  反応部
１２    標識物質付き認識物質一時貯蔵部
１３ａ、１３ｃ、１３ｅ、４１  導入部（第２の導入部）
１３ｂ、１３ｄ、１３ｆ、４２  導出部
１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１４ｄ、１４ｅ、１４ｆ、１４ｇ、
１４ｈ、４５、４６、４７  流路
１５ａ、１５ｂ、１５ｃ  マイクロバルブ
１６  混合部
１７  標識物質付きアレルゲンタンパク質一時貯蔵部（標識物質付抗原一時貯蔵部）
１８  希釈部
２０１、２０２、２０３、２０４  装置本体
２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、４８  コック
２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ  バルブ
２４  廃液溜
３１  蓋
４０  基板
４９  分離部
５１  流通配管
５２  ポンプ
５３  キャリア液タンク
５４  標識物質付認識物質溶液タンク
５６  廃液タンク
５７  標識物質付アレルゲンタンパク質溶液タンク（標識物質付抗原溶液タンク）
【手続補正４１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2008107365.tif 000013