(57)【要約】【課題】本発明は、ＣＯ２識別能力が増加した、ＲｕＢｉｓＣＯの変異型タンパク質およびその利用を提供する。【解決手段】立体構造において、ＲｕＢｉｓＣＯの活性部位のループ構造の近傍に位置する領域に変異を導入する。これにより、上記ループ構造が閉じた状態であるときに、上記ループ構造とその近傍の上記領域との間に水素結合が形成される。それゆえ、ＣＯ２識別能力が向上する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質の変異型タンパク質であって、
上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、
活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、
立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域とを有し、
変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であり、
ＣＯ２識別能力が増加していることを特徴とする変異型タンパク質。
【請求項２】
上記ループ構造が上記活性部位を覆っている状態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位の置換されたアミノ酸残基は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第６位のバリン残基との間で水素結合を形成するものであることを特徴とする請求項１に記載の変異型タンパク質。
【請求項３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする請求項１に記載の変異型タンパク質。
【請求項４】
８つの大サブユニットと８つの小サブユニットとからなり、
該大サブユニットは、上記第１の領域および第２の領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の変異型タンパク質。
【請求項５】
上記大サブユニットは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなることを特徴とする請求項４に記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチド
（ｃ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列と同一性が６５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチド
【請求項６】
請求項４または５に記載の変異型タンパク質の大サブユニットを形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載のポリヌクレオチドであって、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項８】
請求項６または７に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の変異型タンパク質を含むことを特徴とするラン藻または植物。
【請求項１０】
請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチド、または請求項８に記載の組換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１１】
光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物の製造方法であって、
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質に変異を導入する工程を含み、
上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、
活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、
立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、
上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするラン藻または植物の製造方法。
【請求項１２】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする請求項１１に記載のラン藻または植物の製造方法。
【請求項１３】
請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチド、または請求項８に記載の組換え発現ベクターをラン藻または植物に導入することにより、上記変異を導入することを特徴とする請求項１１に記載のラン藻または植物の製造方法。
【請求項１４】
光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物を製造するためのキットであって、
請求項６もしくは７に記載のポリヌクレオチド、または請求項８に記載の組換え発現ベクターを含むことを特徴とするキット。
【請求項１５】
光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物のスクリーニング方法であって、
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質の変異を検出する工程を含み、
上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、
活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、
立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、
上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするラン藻または植物のスクリーニング方法。
【請求項１６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする請求項１５に記載のラン藻または植物のスクリーニング方法。
【請求項１７】
光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物をスクリーニングするためのキットであって、
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質の変異を検出するための抗体、プライマー、およびプローブのうち少なくとも１つを含み、
上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、
活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、
立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、
上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼおよびその利用に関するものであって、ＣＯ２識別能力が増加した変異型のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼおよびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase；以下「ＲｕＢｉｓＣＯ」ともいう）は、植物の光合成における主要な酵素の１つである。具体的には、ＲｕＢｉｓＣＯは、１分子のリブロース−１，５−ビスリン酸（以下、「ＲｕＢＰ」ともいう）と１分子の二酸化炭素（ＣＯ２）とから、２分子のホスホグリセリン酸（以下、「ＰＧＡ」という）を生成するカルボキシラーゼ反応と；１分子のＲｕＢＰと１分子の酸素（Ｏ２）とから、１分子のホスホグリコール酸（以下、「ＰＧＯ」ともいう）と１分子のＰＧＡとを生成するオキシゲナーゼ反応とを触媒する。上記カルボキシラーゼ反応は、植物がＣＯ２を固定するための代謝経路であるカルビンサイクルの初発反応である。一方、上記オキシゲナーゼ反応は、植物がＣＯ２を放出する代謝経路である光呼吸経路の初発反応である。このように、植物において、ＲｕＢｉｓＣＯは、ＣＯ２固定とＣＯ２放出の分岐点を担っている。
【０００３】
ＲｕＢｉｓＣＯは大気条件下においてＣＯ２とＯ２とを識別する能力が低いため、上記の通り、カルボキシラーゼ反応とオキシゲナーゼ反応との両方の反応を触媒し、カルボキシラーゼ反応は、オキシゲナーゼ反応により拮抗的に阻害される。このため、植物によるＣＯ２固定化の観点から見た場合、上記オキシゲナーゼ反応により、植物の光合成ＣＯ２固定化能が２５％〜５０％抑制されると考えることができる。また、ＲｕＢｉｓＣＯは、ＣＯ２識別能力が低く、自然大気環境におかれた植物では、全ＲｕＢｉｓＣＯのわずか２５％がＣＯ２固定に関与しているだけである。さらに、ＲｕＢｉｓＣＯによる触媒反応の反応速度は、一般的な酵素による触媒反応の反応速度の１／１０００〜１／１００と非常に低い。そのため、植物は、全タンパク質の５０重量％以上もの量のＲｕＢｉｓＣＯを合成することによって、上記ＲｕＢｉｓＣＯの質的な問題点を量で克服していると考えられている。
【０００４】
ところで、本発明者らは、地球上に、上述した植物のＲｕＢｉｓＣＯよりも、ＣＯ２識別能力が高いＲｕＢｉｓＣＯが存在することを発見した。具体的には、該ＲｕＢｉｓＣＯは、紅藻由来のＲｕＢｉｓＣＯであり、植物由来のＲｕＢｉｓＣＯの約３倍のＣＯ２識別能力を示す（非特許文献１を参照）。また、本発明者らは、植物由来のＲｕＢｉｓＣＯと紅藻由来のＲｕＢｉｓＣＯとの立体構造比較から、紅藻由来のＲｕＢｉｓＣＯには、高いＣＯ２識別能力に関与する構造が存在することを見出した（非特許文献２および３を参照）。具体的には、非特許文献３には、紅藻由来のＲｕＢｉｓＣＯは、ＲｕＢｉｓＣＯの触媒ループをＣＯ２固定反応のための最適部位に配置するための構造が有することが開示されている。本発明者らは、その構造を、ラッチ構造と命名した。該ラッチ構造は、紅藻ＲｕＢｉｓＣＯの大サブユニットの３８６番目のグルタミン残基のアミド基と、触媒ループ上に位置する大サブユニットの３３２番目のバリン残基の主鎖との間の水素結合である。全ての植物由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、大サブユニットの３８６番目のアミノ酸残基がヒスチジン残基に置換されている。そのため、植物由来のＲｕＢｉｓＣＯではラッチ構造が形成されない。
【非特許文献１】K. Uemura, Anwaruzzaman, S. Miyachi and A. Yokota, Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase from Thermophilic Red Algae with a Strong Specificity for CO2 Fixation. BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 233, 568-571 (1997)
【非特許文献２】Hajime Sugawara, Hiroki Yamamoto, Naoki Shibata, Tsuyoshi Inoue, Sachiko Okada, Chikahiro Miyake, Akiho Yokota, and Yasushi Kai, Crystal Structure of Carboxylase Reaction-oriented Ribulose 1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase from a Thermophilic Red Alga, Galdieria partita. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 274, No. 22, Issue of May 28, pp. 15655-15661, (1999)
【非特許文献３】Yousuke Okano, Eiichi Mizohata, YongXie, Hiroyoshi Matsumura, Hajime Sugawara,Tsuyoshi Inoue, Akiho Yokota, Yasushi Kai, X-ray structure of Galdieria Rubisco complexed with one sulfate ion per active site. FEBS Letters 527, 33-36  (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
植物由来のＲｕＢｉｓＣＯは、上述したように、（１）ＣＯ２だけではなく、Ｏ２とも反応する、（２）ＣＯ２識別能力が低い、（３）触媒反応の反応速度が遅いといった、植物によるＣＯ２固定化の観点からは、不利と考えられる性質を有している。そのため、植物の光合成効率を向上させるため、ＲｕＢｉｓＣＯについて、その酵素学的性質を改変する研究が進めてられてきた。
【０００６】
しかしながら、（Ａ）大腸菌等の異種生物において、植物由来のＲｕＢｉｓＣＯを発現させる系が確立されていない、（Ｂ）植物において、異種生物由来のＲｕＢｉｓＣＯを発現させる系が確立されていない等の理由から、植物の光合成効率を向上させることが可能な変異型ＲｕＢｉｓＣＯの実現には至っていない。
【０００７】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、ＣＯ２識別能力が増加した、ＲｕＢｉｓＣＯの変異型タンパク質およびその利用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、立体構造において、ＲｕＢｉｓＣＯの活性部位のループ構造の近傍に位置する領域に変異を導入することにより、ＣＯ２識別能力を向上させることができることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の産業上有用な発明を包含する。
【０００９】
（１）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質（以下、「ＲｕＢｉｓＣＯ」ともいう）の変異型タンパク質であって、上記ＲｕＢｉｓＣＯは、活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域とを有し、変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であり、ＣＯ２識別能力が増加していることを特徴とする変異型タンパク質。
【００１０】
（２）上記ループ構造が上記活性部位を覆っている状態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位の置換されたアミノ酸残基は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の第６位のバリン残基との間で水素結合を形成するものであることを特徴とする（１）に記載の変異型タンパク質。
【００１１】
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする（１）に記載の変異型タンパク質。
【００１２】
（４）８つの大サブユニットと８つの小サブユニットとからなり、
該大サブユニットは、上記第１の領域および第２の領域を含むことを特徴とする（１）に記載の変異型タンパク質。
【００１３】
（５）上記大サブユニットは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドからなることを特徴とする（４）に記載の変異型タンパク質。
（ａ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチド
（ｃ）配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列と同一性が６５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチド。
【００１４】
（６）（４）または（５）に記載の変異型タンパク質の大サブユニットをコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
（７）（６）に記載のポリヌクレオチドであって、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
（ｇ）配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１６】
（８）（６）または（７）に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
【００１７】
（９）（１）〜（５）のいずれかに記載の変異型タンパク質を含むことを特徴とするラン藻または植物。
【００１８】
（１０）（６）もしくは（７）に記載のポリヌクレオチド、または（８）に記載の組換え発現ベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【００１９】
（１１）光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物の製造方法であって、ＲｕＢｉｓＣＯに変異を導入する工程を含み、上記ＲｕＢｉｓＣＯは、活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするラン藻または植物の製造方法。
【００２０】
（１２）配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする（１１）に記載のラン藻または植物の製造方法。
【００２１】
（１３）（６）もしくは（７）に記載のポリヌクレオチド、または（８）に記載の組換え発現ベクターをラン藻または植物に導入することにより、上記変異を導入することを特徴とする（１１）に記載のラン藻または植物の製造方法。
【００２２】
（１４）光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物を製造するためのキットであって、（６）もしくは（７）に記載のポリヌクレオチド、または（８）に記載の組換え発現ベクターを含むことを特徴とするキット。
【００２３】
（１５）光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物のスクリーニング方法であって、
リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質の変異を検出する工程を含み、上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするラン藻または植物のスクリーニング方法。
【００２４】
（１６）配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の置換変異は、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることを特徴とする（１５）に記載のラン藻または植物のスクリーニング方法。
【００２５】
（１７）光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物をスクリーニングするためのキットであって、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質の変異を検出するための抗体、プライマー、およびプローブのうち少なくとも１つを含み、上記リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質は、活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成するポリペプチドであり、かつ、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第１の領域と、立体構造において該第１の領域の近傍に位置するポリペプチドであり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される第２の領域と、を有し、上記変異は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基の他のアミノ酸残基への置換変異であることを特徴とするキット。
【発明の効果】
【００２６】
以上のように、本発明にかかる変異型タンパク質は、ＲｕＢｉｓＣＯの活性部位を覆うことが可能なループ構造と立体構造において近傍に位置する領域に変異が導入されている。そのため、上記ループ構造が活性部位を覆っている状態において、該ループ構造を形成するポリペプチドと、その近傍に位置する領域を形成するポリペプチドとの間で水素結合が形成させることができる。それゆえ、野生型ＲｕＢｉｓＣＯと比較して、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性を増加させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明にかかる一実施形態について、図１〜図４に基づいて説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
＜Ｉ．変異型タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド＞
本発明にかかる変異型タンパク質について説明するに先立ち、ここでは、まず本発明にかかる変異型タンパク質のベースとなるリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼタンパク質（以下、「ＲｕＢｉｓＣＯ」ともいう）について説明する。
【００２９】
植物、ラン藻、緑藻および紅藻など多くの光合成生物は、８つの大サブユニットと８つの小サブユニットとからなるＲｕＢｉｓＣＯを有している。本明細書では、このような構造のＲｕＢｉｓＣＯを、Ｌ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯと称する。上記ＲｕＢｉｓＣＯは、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性と、リブロース−１，５−ビスリン酸オキシゲナーゼ活性とを有するタンパク質である。本明細書では、説明の便宜上、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ活性およびリブロース−１，５−ビスリン酸オキシゲナーゼ活性を、それぞれ、「ＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性」もしくは単に「カルボキシラーゼ活性」、および「ＲｕＢＰオキシゲナーゼ活性」もしくは、「オキシゲナーゼ活性」と称する。また、本明細書では、ＲｕＢｉｓＣＯの大サブユニットを形成するポリペプチドを、「ＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵ」もしくは単に「ＬＳＵ」と称する。さらに、ＲｕＢｉｓＣＯの小サブユニットを形成するポリペプチドを、「ＲｕＢｉｓＣＯのＳＳＵ」もしくは単に「ＳＳＵ」と称する。
【００３０】
Ｌ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯは、活性部位を覆うことが可能なループ構造を形成する第１の領域と、立体構造において該第１の領域の近傍に位置する第２の領域とを有する。本明細書において、「活性部位を覆う」とは、ＲｕＢｉｓＣＯのポケット状の活性部位（アクティブサイト）に蓋をするように覆うことを意図する。上記ループ構造は、上記活性部位を完全に覆うことができなくてもよく、活性部位を覆うように、その方向に移動可能であればよい。つまり、図１に示すように、上記ＲｕＢｉｓＣＯにおいて、上記ループ構造（図１中、「loop 6」と記載）は、開いた状態（図１中、「open」と記載）および閉じた状態（図１中、「closed」と記載）をとればよい。なお、上記開いた状態は、上記ループ構造が活性部位を覆っていない状態であり、上記閉じた状態は、上記ループ構造が活性部位を覆っている状態を指す。このループ構造の開いた状態と閉じた状態との変換は、ＲｕＢｉｓＣＯに基質が結合しているか否か、換言すれば、ＲｕＢｉｓＣＯが反応を触媒している状態であるか否かによって起こる。具体的には、ＲｕＢｉｓＣＯに基質が結合していないとき、すなわち、ＲｕＢｉｓＣＯが反応を触媒していないときには、上記ループ構造は開いた状態に位置する。一方、ＲｕＢｉｓＣＯの活性部位に基質が結合しているとき、すなわち、ＲｕＢｉｓＣＯが反応を触媒しているときには、上記ループ構造は閉じた状態に位置する。したがって、ＲｕＢｉｓＣＯがカルボキシラーゼ反応およびオキシゲナーゼ反応を触媒する上で、上記ループ構造が重要な働きを担っていると考えられている。
【００３１】
本明細書では、上記ループ構造を形成している領域を、第１の領域と称する。上記第１の領域は、Ｌ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵの一部のポリペプチド、具体的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって形成される。より具体的に説明すると、例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる。そのうち、上記第１の領域を形成するポリペプチドは、配列番号３の第３２７位〜第３３７位のアミノ酸配列からなる（図３を参照）。また、上記第１の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列および、該ポリペプチドのＬＳＵにおける位置は、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）由来のＲｕＢｉｓＣＯでも同様である（図３、配列番号４を参照）。このように、上記第１の領域は、高等植物由来のＲｕＢｉｓＣＯにおいて、非常に配列保存性の高い領域である。なお、タバコおよびホウレンソウ由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵのアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩタンパク質データベースの、アクセション番号ＣＡＡ７７３６１、およびアクセション番号ＣＡＢ８８７３７に登録されている。
【００３２】
また、植物と進化的に近縁であるラン藻（図２を参照）のＲｕＢｉｓＣＯにおいても、上記第１の領域は、完全に保存されている（図３を参照）。具体的には、Synechocystis sp. PCC 6803由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる。そのうち、上記第１の領域を形成するポリペプチドは、配列番号５の第３２２位〜第３３２位のアミノ酸配列からなる。また、上記第１の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列および、該ポリペプチドのＬＳＵにおける位置は、Synechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯでは第３２３位〜第３３３位のアミノ酸配列からなる（配列番号３１を参照）。なお、Synechocystis sp. PCC 6803およびSynechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵのアミノ酸配列は、それぞれ、ＮＣＢＩタンパク質データベースの、アクセション番号ＮＰ＿４４２１２０およびＢＡＡ０３０７６に登録されている。
【００３３】
一方、植物とラン藻の進化距離から見て遠縁である紅藻（図２を参照）のＲｕＢｉｓＣＯにおいては、配列番号１の第２位がアミノ酸置換されたポリペプチドにより、上記ループ構造は形成される。具体的には、Galdieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、第１の領域は配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって形成される。この第１の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列は、Galdieria partita、Porphyridum aerugineum、Cyanidium caldariumなど紅藻では完全に保存されている（図３を参照）。紅藻のGaldieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる。そのうち、上記第１の領域を形成するポリペプチドは、配列番号８の第３３５位〜第３４５位のアミノ酸配列からなる。なお、紅藻のGaldieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベースのアクセション番号ＢＡＡ７５７９６に登録されている。
【００３４】
次に、上記第２の領域について説明する。上記第２の領域は、ＲｕＢｉｓＣＯの立体構造において、上記第１の領域の近傍に位置する領域である。具体的には、植物およびラン藻では、上記第２の領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって形成される。該ポリペプチドもまた、上記第１の領域を形成するポリペプチドと同様に、ＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵの一部のポリペプチドである。具体的には、タバコ由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、第２の領域を形成するポリペプチドは、配列番号３の第３７６位〜第３９０位のアミノ酸配列からなる（図３および図４を参照）。上記第２の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列および、該ポリペプチドのＬＳＵにおける位置は、ホウレンソウ由来のＲｕＢｉｓＣＯでも同様である（図３および図４、配列番号４を参照）。
【００３５】
さらに、ラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯでも、上記第２の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列は、保存されている。例えば、該ポリペプチドは、Synechocystis sp. PCC 6803由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、配列番号５の第３７１位〜第３８５位のアミノ酸配列からなる（図４を参照）。また、Synechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、配列番号３１の第３７２位〜第３８６位のアミノ酸配列からなる（図３を参照）。
【００３６】
一方、紅藻（図２を参照）のＲｕＢｉｓＣＯにおいては、配列番号２の第９位、第１０位、第１１位、第１３位、および第１４位がアミノ酸置換されたポリペプチドにより、上記第２の領域は形成される（図３および図４を参照）。具体的には、Galdieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによって形成される。この第２の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列は、紅藻間では非常に高い保存性を有する（図４を参照）。また、Galdieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵでは、上記第２の領域を形成するポリペプチドは、配列番号８の第３８４位〜第３９８位のアミノ酸配列からなる。
【００３７】
以上のように、植物およびラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯ（以下、「植物型ＲｕＢｉｓＣＯ」ともいう）では、上記第１の領域および第２の領域を形成するポリペプチドは共に、配列相同性が非常に高い。一方、進化的に、植物およびラン藻とは遠縁にある紅藻由来のＲｕＢｉｓＣＯ（以下、「紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯ」ともいう）では、上記第１の領域および第２の領域は、植物型ＲｕＢｉｓＣＯとは異なるポリペプチドで形成されている。また、ここでは、詳述しないが、図３に示されるように、植物型ＲｕＢｉｓＣＯと、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯとは、上記第１の領域と第２の領域に限らず、配列相同性は低い。
【００３８】
このように、植物型ＲｕＢｉｓＣＯと、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯとは、上記第１の領域および第２の領域を形成するポリペプチドが異なるため、立体構造として、異なる特徴を有する。具体的には、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯでは、上記第１の領域を形成するポリペプチドの一部のアミノ酸残基と、上記第２の領域を形成するポリペプチドの一部のアミノ酸残基とが、水素結合を形成することが可能である。より具体的には、例えば、Galdieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯでは、配列番号６に示されるアミノ酸配列の第６位のバリン残基が、配列番号７に示されるアミノ酸配列の第１１位のグルタミン残基と水素結合を形成することが可能である。この水素結合は、上記第１の領域により形成されるループ構造が、活性部位を覆っている状態、換言すれば、上述の閉じた状態にあるときに、形成される。上記水素結合を形成可能な構造は、ラッチ構造と称される。
【００３９】
一方、植物型ＲｕＢｉｓＣＯの第２の領域を形成するポリペプチドでは、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯの第２の領域を形成するポリペプチドのグルタミン残基に対応する位置（配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位）に、ヒスチジン残基が存在する。そのため、植物型ＲｕＢｉｓＣＯでは、上記ループ構造が活性部位を覆っている状態、すなわち閉じた状態であっても、第１の領域にあるバリン残基と水素結合を形成することができない。つまり、ラッチ構造をとることができない。
【００４０】
Ｌ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯでは、上述したように、上記ループ構造は反応を触媒しているときに閉じた状態となる。ところで、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯは、植物型ＲｕＢｉｓＣＯよりもＣＯ２識別能力が高いことが知られている。そのため、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯの上記第１の領域のアミノ酸残基と上記第２の領域のアミノ酸残基との間で形成される水素結合、すなわちラッチ構造が、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯにおける高ＣＯ２識別能力と関連している可能性が示唆されている（非特許文献２および３を参照）。しかしながら、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯにおいて、上記ラッチ構造がＣＯ２識別能力に寄与しているか否かは実証されていない。また、図３に示すように、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯと植物型ＲｕＢｉｓＣＯとの配列相同性は、植物型ＲｕＢｉｓＣＯ間の配列相同性と比較して低いため、上記ラッチ構造が、全てのＬ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯにおいてＣＯ２識別能力に影響を及ぼすか否かについても、全く解明されていない。
【００４１】
このような状況下において、本発明者らは、紅藻型ＲｕＢｉｓＣＯとは遠縁にある植物型ＲｕＢｉｓＣＯにおいて、上記水素結合を形成可能とする変異、つまり、ラッチ構造を形成可能な変異を導入することにより、植物型ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力が向上することを独自に見出し、本発明を完成させるに至ったのである。以下、本発明にかかる変異型タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチドについて詳細に説明する。
【００４２】
本発明にかかる変異型タンパク質は、上述した第１の領域と、第２の領域とを有するＲｕＢｉｓＣＯの変異型タンパク質である。具体的には、上記第２の領域に変異を有する変異型タンパク質である。つまり、本発明にかかる変異型タンパク質は、植物、ラン藻、および紅藻などの光合成生物がもつＬ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯの変異型タンパク質、すなわち変異型ＲｕＢｉｓＣＯということができる。また、本発明にかかる変異型タンパク質のベースとなるタンパク質は、Ｌ８Ｓ８構造のＲｕＢｉｓＣＯであればよく、その由来は特に限定されない。例えば、ラン藻、緑藻、および植物（コケ植物、シダ植物、高等植物を含む）由来のＲｕＢｉｓＣＯを挙げることができる。中でも、ラン藻または植物由来のＲｕＢｉｓＣＯであることが好ましく、植物由来のＲｕＢｉｓＣＯであることがより好ましい。これらＲｕＢｉｓＣＯによれば、上記第２の領域に変異を導入することにより、ＣＯ２識別能力を向上させることができる。本明細書において、「ＣＯ２識別能力が高い」とは、上記変異が導入されていないタンパク質と比較して、ＲｕＢｉｓＣＯのカルボキシラーゼ反応とオキシゲナーゼ反応の比特異性（relative specificity:以下、「Ｓｒ」ともいう）が高いことが意図される。好ましくは、Ｓｒが、反応速度定数は、上記変異が導入されていないタンパク質と同等もしくは増加していることが意図される。なお、Ｓｒは、後述の実施例に示す計算式により、算出することができる。
【００４３】
また、上記第１の領域および第２の領域について、タバコ、ホウレンソウ、Synechocystis sp. PCC 6803およびSynechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯを例に、上述したが、植物およびラン藻間では、ＲｕＢｉｓＣＯの配列相同性が高い。そのため、本発明にかかる変異型タンパク質のベースとなる野生型タンパク質として、上記例示した植物またはラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯを用いることもできる。例えば、本明細書において例示されていない植物由来のＲｕＢｉｓＣＯを用いる場合、該ＲｕＢｉｓＣＯのアミノ酸配列を、上記例示したタバコ、ホウレンソウ、またはラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯのアミノ酸配列と比較することにより、該ＲｕＢｉｓＣＯにおける第１の領域および第２の領域を容易に特定することができる。具体的には、例えば、上記ホウレンソウやタバコ由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵのアミノ酸配列と、対象となる生物由来のＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵのアミノ酸配列とを、アライメントすることにより、上記第１の領域および第２の領域を特定することができる。なお、アライメントは、後述するＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを用いた手法により行うことができる。
【００４４】
ここで、本発明にかかる変異型タンパク質における上記第２の領域における変異について詳細に説明する。なお、以下の説明では、本発明にかかる変異型タンパク質のベースとなるタンパク質が、タバコ、ホウレンソウ、Synechocystis sp. PCC 6803およびSynechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯである実施形態について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。具体的には、上述した方法で、他の植物やラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯの第１の領域および第２の領域を容易に特定できる。こうして特定された第２の領域において、後述する変異が導入された変異型タンパク質も本発明に含まれる。
【００４５】
上述したように、タバコ、ホウレンソウ、Synechocystis sp. PCC 6803およびSynechococcus PCC7002由来のＲｕＢｉｓＣＯのような植物型ＲｕＢｉｓＣＯは、上記第１の領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される。また、上記第２の領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにより形成される。本発明にかかる変異型タンパク質は、植物型ＲｕＢｉｓＣＯの第２の領域に変異を有し、具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位のヒスチジン残基に変異を有する。この変異は、本発明にかかる変異型タンパク質において、上記第１の領域により形成されるループ構造が閉じた状態にあるとき、上記第２の領域を形成するポリペプチドの一部と、上記第１の領域を形成するポリペプチドの一部とが水素結合を形成可能となる変異であることが好ましい。具体的には、上記ヒスチジン残基の側鎖にアミド基を有するアミノ酸残基への置換変異を挙げることができる。より具体的には、ヒスチジン残基からグルタミン残基またはアルギニン残基への置換変異であることが好ましく、ヒスチジン残基からグルタミン残基への置換変異であることがより好ましい。上記変異によれば、本発明にかかる変異型タンパク質において、第１の領域により形成されるループ構造が閉じた状態であるとき、上記グルタミン残基は、上記第１の領域を形成するポリペプチドを構成するバリン残基（配列番号１に示されるアミノ酸配列の第６位のバリン残基）と水素結合を形成することができる。そのため、上記変異型タンパク質の活性部位は、上記ループ構造が閉じた状態であるときに、より強い力で覆われる。ＲｕＢｉｓＣＯは、反応を触媒しているときに上記ループ構造が閉じた状態となる。つまり、上記ループ構造が閉じた状態となることは、ＲｕＢｉｓＣＯの活性に影響を与える。したがって、本発明にかかる変異型タンパク質は、上記活性部位は上記ループ構造によって強固に覆われるため、野生型のＲｕＢｉｓＣＯよりも高いカルボキシラーゼ活性を有する。
【００４６】
ここで、本発明にかかる変異型タンパク質のＬＳＵについて、具体例を挙げて、より詳細に説明する。本発明にかかる変異型タンパク質のＬＳＵ（以下、「変異型ＬＳＵ」ともいう）は、ＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵに変異を有するポリペプチドである。本発明には、このような変異型ＬＳＵも含まれる。すなわち、本発明にかかるポリペプチドは、一実施形態として、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。該ポリペプチドは、タバコ由来のＬＳＵ（配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）に変異が導入されたポリペプチドである。具体的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列の第３８６位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されている。また、別の実施形態として、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。該ポリペプチドは、ホウレンソウ由来のＬＳＵ（配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）に変異が導入されたポリペプチドである。具体的には、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第３８６位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されている。さらに別の実施形態として、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。該ポリペプチドは、Synechocystis sp. PCC 6803由来のＬＳＵ（配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）に変異が導入されたポリペプチドである。具体的には、配列番号５に示されるアミノ酸配列の第３８１位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されている。また、別の実施形態として、本発明にかかるポリペプチドは、配列番号３２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドでありうる。該ポリペプチドは、Synechococcus PCC7002由来のＬＳＵ（配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）に変異が導入されたポリペプチドである。具体的には、配列番号３１に示されるアミノ酸配列の第３８２位のヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されている。
【００４７】
上記例示した変異型ＬＳＵでは、ヒスチジン残基がグルタミン残基に置換されているが、本発明はこれらに限定されない。上記ヒスチジン残基は、他のアミノ酸残基に置換されていればよく、具体的には、上記ヒスチジン残基は、側鎖にアミド基を有するアミノ酸残基に置換された実施形態がありうる。より具体的には、上記ヒスチジン残基が、アスパラギン残基に置換された実施形態がありうる。
【００４８】
また、本発明にかかるポリペプチドは、１つの局面として、上記例示した配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号３に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチドでありうる。これらポリペプチドは、上記例示した配列番号９、配列番号１０、配列番号１１または配列番号３１に示されるアミノ酸配列からなる変異型ＬＳＵの変異体ということもできる。
【００４９】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、上記変異を有する本発明にかかる変異型ＬＳＵであって、かつ、カルボキシラーゼ活性を有する変異型ＲｕＢｉｓＣＯを形成可能なポリペプチドが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」は「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。
【００５０】
上記変異体には、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が含まれる。
【００５１】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸残基が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００５２】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法、例えば、実施例の方法を用いれば、作製した変異体が所望のカルボキシラーゼ活性を有するか否か、また、上記変異を有するか否かを容易に決定することができる。
【００５３】
さらに、本発明にかかるポリペプチドは、１つの局面として、配列番号９、１０、１１または３１に示されるアミノ酸配列と同一性が６５％以上、好ましくは８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、配列番号２に示されるアミノ酸配列の第１１位に対応するアミノ酸残基がグルタミン残基であるポリペプチドでありうる。
【００５４】
本願明細書において、アミノ酸配列または塩基配列の同一性は、T hompson, J.DらによるＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994), CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Res. 1994 Nov 11;22(22):4673-80.）を用いて、比較したい２つのアミノ酸配列または塩基配列をアライメントした後、一致するアミノ酸残基数または塩基数を全アミノ酸残基数または塩基数で除した値（百分率）によって決定される。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（http://align.genome.jp/）を用いて、アミノ酸配列または塩基配列をアライメントする場合、デフォルトパラメーターを用いる。具体的には、アミノ酸配列をアライメントする場合、パラメーターは、Output Format：CLUSTAL、Pairwise Alignment：FAST/APPROXIMATE、K-tuple(word) size:：１、Window size:５、Gap Penalty:３、Number of Top Diagonals:５、Scoring Method:PERCENT、Weight Matrix:BLOSUMとする。一方、塩基配列をアライメントする場合、パラメーターは、Output Format：CLUSTAL、Pairwise Alignment：FAST/APPROXIMATE、K-tuple(word) size:：１、Window size:５、Gap Penalty:３、Number of Top Diagonals:５、Scoring Method:PERCENT、Weight Matrix:CLUSTALWとする。なお、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗを用いたアライメントおよび配列の同一性解析の具体的な手法は公知である。
【００５５】
また、本発明にかかるポリペプチドは、そのアミノ酸配列において、配列番号４に示されるアミノ酸配列の第６０位、第６５位、第１２３位、第１７５位、第１７７位、第１９６位、第１９８位、第１９９位、第２０１位、第２０３位、第３２７位、第３３４位、第３７９位、第３８１位、第４０３位、および第４０４位に対応する位置のアミノ酸残基が、それぞれ、グルタミン酸残基、スレオニン残基、アスパラギン残基、リジン残基、リジン残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、ヒスチジン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基、リジン残基、セリン残基、グリシン残基、グリシン残基、およびグリシン残基である。これらのアミノ酸残基は、カルボキシラーゼ活性を有するＲｕＢｉｓＣＯにおいて１００％保存されている。したがって、上記アミノ酸残基の有無を検出することにより、上述した変異型ＬＳＵの変異体を容易にスクリーニングすることができる。
【００５６】
以上のように、本発明にかかるポリペプチド、すなわち、変異型ＬＳＵについて具体的に例を挙げて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。上記例示したポリペプチドのアミノ酸配列とのアライメントにより、上記変異箇所に対応する位置に、同様の変異を有するポリペプチドも本発明に含まれる。
【００５７】
また、本発明は、１つの局面として、本発明にかかる変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。具体的には、上述の変異型ＬＳＵをコードするポリヌクレオチド（以下、「変異型ｒｂｃＬ」ともいう）を提供する。
【００５８】
植物において、ＬＳＵをコードするポリヌクレオチド（以下、ｒｂｃＬ）は、葉緑体ゲノムにコードされている。本発明にかかるポリヌクレオチドは、ｒｂｃＬに変異が導入された変異型ｒｂｃＬである。具体的には、上述した本発明にかかるポリペプチドをコードするように、変異が導入された変異型ｒｂｃＬである。
【００５９】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、一実施形態として、配列番号１２または配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。該ポリヌクレオチドは、タバコ由来のｒｂｃＬ（配列番号１４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）に変異が導入されたポリヌクレオチドである。具体的には、配列番号１４に示される塩基配列の第１１５６位〜第１１５８位のＣＡＴがＣＡＡ（配列番号１２）またはＣＡＧ（配列番号１３）に置換されている。なお、タバコ由来の野生型ｒｂｃＬは、ＮＣＢＩ核酸データベースのアクセション番号Ｚ０００４４ Ｓ５４３０４に登録されている。また、別の実施形態として、配列番号１５または配列番号１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。該ポリヌクレオチドは、ホウレンソウ由来のｒｂｃＬ（配列番号１７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）に変異が導入されたポリヌクレオチドである。具体的には、配列番号１７に示される塩基配列の第１１５６位〜第１１５８位のＣＡＴがＣＡＡ（配列番号１５）またはＣＡＧ（配列番号１６）にに置換されている。なお、ホウレンソウ由来の野生型ｒｂｃＬは、ＮＣＢＩ核酸データベースのアクセション番号ＡＪ４００８４８ Ｊ０１４４２ Ｍ１２０２８ Ｍ１６８７３ Ｍ１６８７８ Ｍ２７３０８ Ｍ５５２９７ Ｘ００７９５ Ｘ００７９７ Ｘ０１７２４ Ｘ０４１３１ Ｘ０４１８５ Ｘ０５９１６ Ｘ０６８７１に登録されている。さらに別の実施形態として、配列番号１８または配列番号１９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。該ポリヌクレオチドは、Synechocystis sp. PCC 6803由来のｒｂｃＬ（配列番号２０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）に変異が導入されたポリヌクレオチドである。具体的には、配列番号２０に示される塩基配列の第１１４１位〜第１１４３位のＣＡＣがＣＡＡ（配列番号１８）またはＣＡＧ（配列番号１９）に置換されている。なお、Synechocystis sp. PCC 6803由来の野生型ｒｂｃＬは、ＮＣＢＩ核酸データベースのアクセション番号ＮＣ＿０００９１１に登録されている。また、別の実施形態として、本発明にかかるポリヌクレオチドは、配列番号３３または配列番号３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。該ポリヌクレオチドは、Synechococcus PCC7002由来のｒｂｃＬ（配列番号３５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド）に変異が導入されたポリヌクレオチドである。具体的には、配列番号３５に示される塩基配列の第１１４４位〜第１１４６位のＣＡＣがＣＡＡ（配列番号３３）またはＣＡＧ（配列番号３４）に置換されている。なお、Synechococcus PCC7002由来の野生型ｒｂｃＬは、ＮＣＢＩ核酸データベースのアクセション番号Ｄ１３９７１に登録されている。
【００６０】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、１つの局面において、上記例示した配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。また、別の局面において、上記例示した配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、配列番号３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドでありうる。さらに別の局面において、上記例示した配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドでありうる。これらポリヌクレオチドは、上記例示した配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなるポリヌクレオチドの変異体ということもできる。なお、これら変異体において、配列番号１４もしくは配列番号１７に示される塩基配列の第１１５６位〜第１１５８位のＣＡＴ、配列番号２０に示される塩基配列の第１１４１位〜第１１４３位のＣＡＣ、もしくは配列番号３５に示される塩基配列の第１１４４位〜第１１４６位のＣＡＣに対応する塩基のＣＡＡまたはＣＡＧへの置換は維持されている。
【００６１】
本明細書中においてＤＮＡまたはポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、上記変異を有する変異型ＬＳＵをコードするポリヌクレオチドが意図される。
【００６２】
また、本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、例えば、「配列番号９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号９の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００６３】
本発明にかかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。
【００６５】
ハイブリダイゼーションは、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1989)に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。
【００６７】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドは、１つの局面において、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを、オープンリーディングフレーム（以下、「ＯＲＦ」ともいう）中に含むポリヌクレオチドでありうる。具体的には、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの５’側または３’側に、タグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドを付加したポリヌクレオチドでありうる。本発明では、上記タグ標識のような付加配列は、５’側に付加されることが好ましい。上記構成によれば、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＲｕＢｉｓＣＯの大サブユニットを形成することができる。なお、本明細書において、オープンリーディングフレームとは、ポリヌクレオチドにおいて、実際にポリペプチドに翻訳される領域、すなわち、ポリペプチドのコード領域を指す。
【００６８】
さらに、本発明にかかるポリヌクレオチドは、１つの局面として、配列番号１２、１３、１５、１６、１８、１９、３３または３４に示される塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは８０％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチドでありうる。このようなポリヌクレオチドは、上述した変異型ＬＳＵの変異体をコードするものである。
【００６９】
以上のように、本発明にかかるポリヌクレオチドについて、具体的に例を挙げて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。具体的には、本発明にかかる変異型ＬＳＵをコードするポリヌクレオチドであれば、本発明に含まれる。
【００７０】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドを取得する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の変異導入法を用いて、取得することができる。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Hashimoto-Gotoh, Gene 152, 271-275(1995)参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入することにより、取得することができる。このようなポリヌクレオチドの作製には、市販のキットを利用してもよい。
【００７１】
本発明にかかるポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。本明細書では、タバコ、ホウレンソウ、ラン藻、紅藻が例示されているが、これらに限定されない。
【００７２】
また、本発明にかかるポリヌクレオチドには、上述した変異型ＬＳＵのフラグメントをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
【００７３】
本発明にかかるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、後述するように、光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻や植物を製造するために使用され得る。また、本発明によれば、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物をスクリーニングすることができる。このような光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物の製造方法や、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物のスクリーニング方法は、例えば、植物育種の分野などに用いることができる。
【００７４】
また、本発明にかかるポリペプチドおよびポリヌクレオチド、並びにそれらの変異体の用途は、上記光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物の製造方法や、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物のスクリーニング方法に限定されるものではない。具体的には、上述した変異型タンパク質の第２の領域における変異が、光合成ＣＯ２固定化能の向上に関与することを利用したあらゆる用途が本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００７５】
＜ＩＩ．変異型タンパク質の製造方法＞
本発明は、本発明にかかる変異型タンパク質、換言すれば、変異型ＲｕＢｉｓＣＯを製造する方法を提供する。一実施形態において、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、本発明にかかる変異型タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いる。具体的には、変異型ＬＳＵをコードするポリヌクレオチド、すなわち、上述した本発明にかかるポリヌクレオチドを含むベクターを用いる。
【００７６】
本実施形態の１つの局面において、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、上記変異型ＬＳＵをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる変異型タンパク質を精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましい実施形態として、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。さらに、本発明にかかる変異型タンパク質を含む細胞または組織の抽出液から当該変異型タンパク質を精製する工程を包含することが好ましい。
【００７７】
宿主に上記ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。また、組換え的に製造された変異型タンパク質を精製する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いて精製することができる。例えば、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製することが好ましいが、これらに限定されない。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製のために用いることもできる。
【００７８】
組換え発現系の宿主として、大腸菌を用いる場合、上記変異型タンパク質のベースとなるタンパク質は、ラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯであることが好ましい。ラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯを上記変異型タンパク質のベースとして用いると、本発明にかかる変異型タンパク質を効率よく製造することができる。
【００７９】
また、本発明では、組換え発現系の宿主として、製造する本発明にかかる変異型タンパク質のベースとなるタンパク質の由来生物を用いることが好ましい。宿主として、植物を用いる場合、葉緑体の形質転換を用いたタンパク質発現系を用いることが好ましい。本発明にかかる変異型タンパク質は、上述したようにＲｕＢｉｓＣＯのＬＳＵに変異を有するタンパク質である。植物では、ＬＳＵをコードするポリヌクレオチドは、植物葉緑体ゲノム中にコードされている。したがって、上記ベクターを葉緑体形質転換用ベクターとして用い、従来公知の葉緑体形質転換技術により宿主植物の葉緑体ゲノムに、本発明にかかるポリヌクレオチドを導入することができる。こうして得られた植物から、従来公知の方法を用いて、変異型タンパク質を取得することができる。また、該変異型タンパク質を精製する場合、上述の従来公知の精製技術を適宜用いて精製することができる。なお、上記葉緑体形質転換技術については、後述の＜ＩＩＩ．光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物およびその製造方法、並びに製造キット＞において詳述するので、参照されたい。
【００８０】
本実施形態の１つの局面において、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられる。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態にかかるポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【００８１】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされている様々なタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。
【００８２】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。
【００８３】
なお、種々のウイルス由来遺伝子産物は、その翻訳後に、小胞体、ゴルジ体等の細胞内膜が関与する複雑な生化学反応を経て活性を発現するものが多いので、各種生化学反応を試験管内で再現するためには細胞内膜成分（例えば、ミクロソーム膜）が添加される必要がある。特開２００５−６５６５１号公報（平成１７年３月１７日公開）に記載されるような植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液は、細胞内膜成分を保持した無細胞タンパク質合成液として利用し得るのでミクロソーム膜の添加が必要とされないので、好ましい。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、「細胞内膜成分」は、細胞質内に存在する脂質膜よりなる細胞小器官（すなわち、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞内顆粒全般）が意図される。特に、小胞体およびゴルジ体はタンパク質の翻訳後修飾に重要な役割を果たしており、膜タンパク質および分泌タンパク質の成熟に必須な細胞成分である。
【００８５】
さらに他の実施形態において、本発明にかかる変異型タンパク質は、化学合成により製造することができる。当業者は、本明細書中に記載される本発明にかかる変異型タンパク質を構成するポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明にかかるポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【００８６】
また、別の実施形態において、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、本発明にかかる変異型タンパク質を天然に発現する細胞または組織から当該変異型タンパク質を精製するものであってもよい。本実施形態にかかる変異型タンパク質の製造方法は、後述する抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて、本発明にかかる変異型タンパク質を天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態においても、変異型タンパク質を精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【００８７】
以上のように、本発明にかかる変異型タンパク質の製造方法は、少なくとも、本発明にかかる変異型ＬＳＵのアミノ酸配列、または変異型ｒｂｃＬの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよい。つまり、本発明の目的は、本発明にかかる変異型タンパク質を製造する方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する製造方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。また、本発明にかかる変異型タンパク質を生産する方法によって取得される変異型タンパク質は、天然に存在するものであっても、人為的に作製されたものであってもよい。
【００８８】
＜ＩＩＩ．光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物およびその製造方法、並びに製造キット＞
本発明は、上述した本発明にかかる変異型タンパク質または本発明にかかるポリヌクレオチドを用いて、光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物を製造する方法を提供する。本発明にかかる光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物の製造する方法（以下、単に「本発明にかかる植物の製造方法」とも称する）は、一実施形態として、ラン藻または植物体内において、上述した本発明にかかる変異型タンパク質を発現させる工程を含む。上記構成によれば、上記変異型タンパク質は野生型のＲｕＢｉｓＣＯよりも高いＣＯ２識別能力を有するため、野生株と比較して光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物を製造できる。つまり、光合成活性が高いラン藻または植物を提供することができる。本発明にかかる製造方法は、上記工程以外の具体的な構成、例えば、ラン藻または植物体内において、本発明にかかる変異型タンパク質を発現させる方法、使用装置、および使用器具等は特に限定されるものではない。
【００８９】
以下、本発明にかかる植物の製造方法について説明する。なお、以下の説明では、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物の製造方法について詳述するが、光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻についても、以下の説明と、公知のラン藻の形質転換法および変異誘発法とを組み合わせることにより製造できることは、当業者であれば容易に理解できる。
【００９０】
本発明にかかる植物の作製方法は、植物体内において、本発明にかかる変異型タンパク質を発現させる工程を包含していればよい。一実施形態として、上記工程は、上記変異型ｒｂｃＬを、発現可能に植物体内に導入する工程でありうる。また、別の実施形態として、上記工程は、野生型のｒｂｃＬに、上述した変異を導入する工程でありうる。これらの工程によれば、該植物体内で、上記変異型タンパク質を発現させることができる。本発明にかかる植物の製造方法では、ＬＳＵに上述した変異を導入することができればよいが、該ポリペプチドの由来等に応じて、該ポリペプチドと会合するＳＳＵを形成するポリペプチドを改変してもよい。例えば、変異型タンパク質のベースとなるタンパク質の由来植物と、該変異型タンパク質を発現させる宿主植物とが異なる場合、上記変異型ｒｂｃＬに加えて、該ＳＳＵをコードするポリヌクレオチドを上記宿主植物に導入することが好ましい。このような構成とすることにより、上記宿主植物において、上記変異型タンパク質をより安定して発現させることができる。なお、本明細書において、「植物の光合成ＣＯ２固定化能が高い」とは、野生型の宿主植物よりも光合成ＣＯ２固定化能が高いことを意図するものであり、その程度は限定されない。
【００９１】
一実施形態において、本発明にかかる植物の製造方法に従って光合成ＣＯ２固定化能が高い植物体は、植物形質転換体または植物変異体であり得る。
【００９２】
本実施形態にかかる植物変異体は、例えば、天然に存在する変異体から、ＬＳＵに上述した変異を有する植物を選抜することによって得ることができる。また、上記植物変異体は、化学的突然変異原である公知な化合物で種子などを処理する方法（化学的突然変異誘発法）ことによっても取得することができる。上記化学的突然変異原としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、及びマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）などが例示できる。また、ＵＶ照射を用いてもよい。上記方法によれば、ＬＳＵに上述した位置に上記変異を導入することができる。これにより、本発明にかかる変異型タンパク質を発現する植物を製造することができる。
【００９３】
また、本実施形態にかかる植物形質転換体を製造する方法は、特に限定されるものではなく、本発明にかかる変異ｒｂｃＬを発現可能に植物体に形質転換できる方法であればよい。植物では、ｒｂｃＬは葉緑体ゲノム中にコードされている。したがって、本実施形態にかかる植物形質転換体は、葉緑体ゲノム中にコードされたｒｂｃＬを、変異型ｒｂｃＬに、相同組換えにより置換する方法により製造することができる。このような技術は、一般的に、葉緑体形質転換技術と称される。葉緑体形質転換技術は、核に遺伝子を導入する形質転換技術と比較して、次のような利点を有する。葉緑体形質転換技術では、葉緑体への遺伝子導入は相同組み換えを利用する。そのため、核への遺伝子導入法に見られる位置効果（position effect）が起こらない。それゆえ、上記技術によれば、変異型タンパク質を安定して発現させることができる。また、葉緑体は母性遺伝をする。そのため、上記技術により製造された形質転換体は、導入した遺伝子が花粉を介して、環境への飛散することがない。なお、葉緑体形質転換技術の具体的な方法論については、例えば、特開２００２−２７２４７６号公報（平成１４（２００２）年９月２４日公開）、特開２００６−７５０７８号公報（平成１８（２００６）年３月２３日公開）、特開２００６−３０４６３１号公報（平成１８（２００６）年１１月９日公開）、および特開２００６−３１４３０１号公報（平成１８（２００６）年１１月２４日公開）に開示されているので、参照されたい。
【００９４】
本発明にかかる植物の製造方法において、上記葉緑体形質転換技術を用いる場合、葉緑体ゲノムに導入するポリヌクレオチドは、変異型ｒｂｃＬに限定されるものではなく、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子を共に導入していもよい。また、変異型タンパク質のＳＳＵをコードするポリヌクレオチドを、変異型ｒｂｃＬと共に導入してもよい。
【００９５】
また、本実施形態にかかる植物形質転換体を製造する方法は、核に変異型ｒｂｃＬを導入する方法であってもよい。本実施形態においても、形質転換体を選抜するためのマーカー遺伝子や変異型タンパク質のＳＳＵをコードするポリヌクレオチドを、変異型ｒｂｃＬと共に導入してもよい。
【００９６】
本実施形態にかかる植物形質転換体を製造する方法において、組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、葉緑体形質転換法または核への遺伝子導入法に応じて、当該植物内で本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。また、該ベクターには、本発明にかかるポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターが含まれることが好ましい。このようなベクターとしては、例えば、葉緑体形質転換用ベクターでは、ｐｓｂＡプロモーター、ｒｒｎプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓｂＤプロモーター、ａｔｐＢプロモーター等を挙げることができる。また、核遺伝子導入用ベクターでは、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等を挙げることができる。また、外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを用いてもよい。
【００９７】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【００９８】
植物へのポリヌクレオチドの導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Micribiol. Lett., 67, 325 (1990)）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをPlant Molecular Biology Manual（S.B.Gelvinら、Academic Press Publishers）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【００９９】
また、ポリヌクレオチドを直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。葉緑体形質転換法では、遺伝子銃を用いてポリヌクレオチドを葉緑体へ導入することが好ましい。
【０１００】
ポリヌクレオチドが導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【０１０１】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法などによって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【０１０２】
ポリヌクレオチドが植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、植物形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１０３】
上記のような方法で製造した植物から、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物を選抜する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、該植物から抽出したタンパク質溶液、またはそこから精製したＲｕＢｉｓＣＯのカルボキシラーゼ活性を測定する方法；該植物の光合成ＣＯ２固定化能をガス交換測定法により評価する方法などが例示できる。また、本発明にかかる変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵの発現を、本発明にかかる変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウエスタンブロット法などの免疫学的方法により検出する方法を用いることができる。
【０１０４】
本発明にかかるポリヌクレオチドがゲノムまたは葉緑体ゲノム内に組み込まれた植物形質転換体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明にかかるポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【０１０５】
本発明にかかる植物の製造方法によって作製された光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物は、特に限定されず、光合成ＣＯ２固定化能が増加したことによりその有用性を有し得る植物が挙げられる。このような植物としては、被子植物でも裸子植物でもよい。また、被子植物としては、単子葉植物でも双子葉植物でもよい。
【０１０６】
本発明はまた、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物を製造するためのキット（以下、単に「植物の製造キット」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物の製造キットは、植物体内において、本発明にかかる変異型タンパク質を発現させるために用いるものを備えていればよい。例えば、本発明にかかる変異型ｒｂｃＬを、植物体に発現可能に導入させることが可能な形態で備える構成、およびｒｂｃＬに上述の変異を導入するための化学的突然変異原を備える構成が挙げられる。
【０１０７】
なお、本発明にかかる植物の製造キットは、上記ポリヌクレオチドまたは化学的突然変異原以外に、上述した植物の製造方法を実施するために必要とされる試薬および／または器具を備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物を製造するためのキットの構成品が、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物を製造する方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【０１０８】
＜ＩＶ．光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物のスクリーニング方法およびスクリーニングキット＞
本発明は、光合成ＣＯ２固定化能が増加したラン藻または植物をスクリーニングするための方法（以下、単に「植物のスクリーニング方法」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物のスクリーニング方法は、ＲｕＢｉｓＣＯの変異を検出する工程（以下、「検出工程」ともいう）を含んでいればよい。上記変異は、本発明にかかる変異型タンパク質の変異であればよい。上記検出工程は、具体的には、例えば、ラン藻細胞内または植物体内における変異型タンパク質の発現、植物体内における変異型ＬＳＵの発現、植物体内におけるＲｕＢｉｓＣＯの活性（例えば、ＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性）、植物のＣＯ２ガス交換測定、および植物体内における変異型ｒｂｃＬの発現のうち、少なくともいずれか１つを測定するする工程（以下、「測定工程」ともいう）を包含していればよい。一実施形態において、本発明にかかる植物のスクリーニング方法に従ってスクリーニングされた植物は、天然であっても、形質転換体であっても、変異体であってもよい。
【０１０９】
上記測定工程としては、具体的には、例えば、目的の植物から抽出したＲｕＢｉｓＣＯ（粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい）を、変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体と反応させ、変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵと結合した抗体を検出することによって、植物体内における変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵの発現（蓄積）を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ウエスタンブロット法や、ＥＬＩＳＡ法を用いて、植物体内における変異型タンパク質および／または変異型ＬＳＵの発現量を測定する工程を挙げることができる。上記工程によれば、変異型タンパク質を発現する植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。このような変異型タンパク質を発現する植物体は、多くの場合、植物の光合成ＣＯ２固定化能が増加しているため、上記工程により、光合成ＣＯ２固定化能が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において用いることが可能な抗体としては、後述するので、ここでは詳細な説明を省略する。
【０１１０】
また、上記測定工程としては、例えば、目的の植物から抽出したＲｕＢｉｓＣＯ（粗抽出物であってもよいし、部分精製物であってもよいし、精製物であってもよい）の活性を測定する工程を挙げることができる。より具体的には、ＲｕＢｉｓＣＯが有するＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性を測定する工程を挙げることができる。上記工程によれば、野生株との比較により、植物体内におけるＲｕＢｉｓＣＯのＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性が増加した植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。このようなＲｕＢｉｓＣＯのＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性が増加した植物体は、多くの場合、植物の光合成ＣＯ２固定化能が増加しているため、上記工程により、光合成ＣＯ２固定化能が向上した植物を容易にスクリーニングできる。上記工程において、ＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性を測定する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。具体的には、後述の実施例で用いた方法を挙げることができる。
【０１１１】
さらに、上記測定工程としては、例えば、変異型ｒｂｃＬのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、上記ポリヌクレオチドの発現を測定する工程を挙げることができる。このような工程によれば、変異型ｒｂｃＬを発現する植物体を容易に検出（スクリーニング）することができる。変異型ｒｂｃＬを発現する植物体は、多くの場合、植物の光合成ＣＯ２固定化能が増加しているため、上記工程により、光合成ＣＯ２固定化能が向上した植物を容易にスクリーニングできる。
【０１１２】
上記測定工程として例示した工程は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。単独で用いることにより、迅速にＣＯ２固定能が増加した植物をスクリーニングすることができる。一方、複数を組み合わせて用いることにより、スクリーニングの精度を高めることができる。
【０１１３】
本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられる上記オリゴヌクレオチドは、変異型ｒｂｃＬまたはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。上記オリゴヌクレオチドはまた、特定の組織における変異型ｒｂｃＬの発現を検出するためのノーザンブロット分析に用いることもできる。
【０１１４】
なお、当業者は、上述した用途がいずれも、本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドと目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）との間で生じるハイブリダイゼーションに起因しており、当該オリゴヌクレオチドが、目的の遺伝子（ポリヌクレオチド）とハイブリダイズさせるために用いられることを容易に理解する。
【０１１５】
本発明にかかるポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも７ｎｔ（ヌクレオチド）、１０ｎｔ、１２ｎｔ、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図されるが、当業者は、上述した用途に応じて好ましい長さを適宜設定し得る。「少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメント」は、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基配列またはその相補配列を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば、例えば、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１２、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３３、または配列番号３４に示される塩基配列に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Applied Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【０１１６】
本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。
【０１１７】
このように、本発明にかかる植物のスクリーニング方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、変異型ｒｂｃＬを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該変異型ｒｂｃＬを増幅するためのプライマーとして利用することによって、変異型タンパク質を発現する植物体または組織を容易に検出（スクリーニング）することができる。
【０１１８】
さらに、本発明にかかる植物のスクリーニング方法を用いれば、ＬＳＵや、ｒｂｃＬの変異の検出を容易に行うことができるため、様々な植物変異体の集合から、上述の変異を有する変異型ＬＳＵや変異型ｒｂｃＬを有する植物変異体をスクーリングすることができる。本発明にかかる植物のスクリーニング方法において、スクリーニング可能な植物変異体としては、上記本発明にかかる植物の製造方法で説明した植物変異体を挙げることができる。
【０１１９】
本発明はまた、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物をスクリーニングするためのキット（以下、単に「植物のスクリーニングキット」ともいう）を提供する。本発明にかかる植物のスクリーニングキットは、植物体内における本発明にかかる変異型タンパク質の発現を検出するためのものを備えていればよい。例えば、変異型ＬＳＵを検出するための抗体を含むキット、変異型ｒｂｃＬを検出するためのプローブおよび／またはプライマーを含むキット、およびＲｕＢｉｓＣＯのＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性を検出するための試薬を含むキットなどを挙げることができる。
【０１２０】
なお、本発明にかかる植物のスクリーニングキットは、上記抗体や、プローブおよび／またはプライマー、ＲｕＢｉｓＣＯのＲｕＢＰカルボキシラーゼ活性を測定するための試薬以外に、上述した植物のスクリーニング方法を実施するために必要とされる試薬などを備えていることが好ましい。すなわち、本明細書を読んだ当業者は、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物をスクリーニングするためのキットの構成品が、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物をスクリーニングする方法において用いられるものであることを容易に理解する。
【０１２１】
＜Ｖ．抗体＞
本発明は、本発明にかかる変異型タンパク質と特異的に結合する抗体を提供する。また、本発明にかかる抗体は、変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体であってもよい。つまり、本発明にかかる抗体は、変異型タンパク質全体を認識する抗体であってもよいし、該変異型タンパク質を構成するサブユニットを認識する抗体であってもよい。
【０１２２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２３】
本明細書中で使用される場合、用語「変異型ＬＳＵと特異的に結合する」は、変異型ＬＳＵと特異的に結合するが、変異型ＬＳＵ以外のポリペプチド、例えば、野生型のＬＳＵとは結合しないことが意図される。同様に、「変異型タンパク質と特異的に結合する」は、変異型タンパク質と特異的に結合するが、変異型タンパク質以外のタンパク質、例えば、野生型ＲｕＢｉｓＣＯとは結合しないことが意図される。よって、本発明にかかる抗体によれば、変異型タンパク質を発現する植物体を容易にスクリーニングすることができる。すなわち、本発明にかかる抗体を目的の植物体由来の組織抽出物とインキュベートする工程を包含する植物のスクリーニング方法、および、本発明にかかる抗体を備えている植物のスクリーニングキットもまた、本発明の範囲に含まれることが容易に理解されるべきである。
【０１２４】
本明細書中で使用される場合、用語「変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体」は、変異型ＬＳＵと特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。同様に、「変異型タンパク質と特異的に結合する抗体」は、変異型タンパク質と特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)を参照）。従って、これらのフラグメントが好ましい。
【０１２５】
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、HarLow et al., Antibodies:A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)；岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」を参照）に従って、製造することができる。
【０１２６】
本発明にかかる抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。
【０１２７】
モノクローナル抗体は、例えば、以下のような方法を用いて製造することができる。ここでは、変異型ＬＳＵに対するモノクローナル抗体の製造方法について説明するが、同様の方法を用いて、変異型タンパク質に対するモノクローナル抗体を製造することができる。
【０１２８】
変異型ＬＳＵもしくはそのフラグメントまたはその他の誘導体あるいはこれらのアナログ、あるいはこれらを発現する細胞を免疫原として用いてマウス脾臓リンパ球を免疫し、免疫したマウス脾臓リンパ球とマウスのミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマによりモノクローナル抗体を産生させる。モノクローナル抗体を取得するために必要な技術は当該分野において公知である。例えば、ハイブリドーマ法（Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256, 495-497 (1975)を参照）、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Kozbor, Immunology Today 4, 72 (1983)を参照）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., 77-96 (1985)を参照）などが挙げられる。
【０１２９】
ペプチド抗体は、当該分野に公知の方法によって製造することができる。例えば、Chow, M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:910-914;及びBittle, F. J. et al., J. Gen. Virol. 66:2347-2354 (1985)を参照されたい。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化することができる。しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫することができる。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングさせることができ、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングさせることができる。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリア−カップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出可能な有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
【０１３０】
さらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、変異型タンパク質の大サブユニットを形成するポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体に結合する能力が変異型ＬＳＵまたはそのフラグメントからなる抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなる変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
【０１３１】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明にかかる抗体の他のフラグメントが、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、変異型タンパク質または変異型ＬＳＵに結合するフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【０１３２】
このように、本実施形態にかかる抗体は、変異型タンパク質または変異型ＬＳＵと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
【０１３３】
つまり、本発明の目的は、変異型タンパク質または変異型ＬＳＵと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１３５】
本発明について、実施例、および図５および図６に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。
【０１３６】
〔実施例１：変異型ＲｕＢｉｓＣＯの製造〕
（１）ラン藻RuBisCOの大腸菌発現ベクターの構築
ラン藻Synechococcus sp. PCC7002のｒｂｃプロモーター-rbcL-orf134-rbcSが挿入されたｐＵＣプラスミドを鋳型として、変異体作製を行った。ラン藻ＲｕＢｉｓＣＯの３８６番目（ラン藻ＲｕＢｉｓＣＯでは３８２番目であるが、ホウレンソウのアミノ酸配列を基準に他のＲｕＢｉｓＣＯのアミノ酸残基番号を合わせることとする）のヒスチジン残基をグルタミン残基に置換するための塩基置換には、Quickchange multi site-directed mutagenesis kit (STRATAGENE社製)を用いた。キットのプロトコールに従い、変異導入プライマーには5’- TATCCACGTATGGCAAATGCCTGCCCTCGTTG-3’（配列番号３６）を用いた。尚、下線部が３８６番目のヒスチジン残基のコドンＣＡＣの３塩基目のＣをグルタミン残基に置換するために塩基置換したＡの位置を示す。塩基置換の確認は、ＤＮＡ配列を解読することにより行った。このようにして塩基置換を行ったｒｂｃＬ（Ｈ３８６Ｑ）を含む、ｐＵＣ／ｒｂｃプロモーター-rbcL (H386Q)-orf 134-rbcSからＢａｍＨＩとＳａｌＩによる制限酵素処理により、ｒｂｃプロモーター-rbcL (H386Q)-orf 134-rbcSのＤＮＡ断片を作製した。この断片をｐＡＱＪ４のＢａｍＨＩとＳａｌＩ切断部位の挿入し、Ｈ３８６Ｑ ＲｕＢｉｓＣＯを大腸菌で発現させるための、pAQJ4-H386Q RuBisCOベクターを作製した。野生型ＲｕＢｉｓＣＯを大腸菌で発現させるためのベクターの構築も以下に示すように同様に行った。ｐＵＣ／ｒｂｃプロモーター-rbcL-orf134-rbcSからＢａｍＨＩとＳａｌＩの制限酵素処理により、変異導入を行っていないrbcプロモーター-rbcL-orf134-rbcSのＤＮＡ断片を調製し、この断片をｐＡＱＪ４のＢａｍＨＩとＳａｌIサイトに挿入することで、野生型ＲｕＢｉｓＣＯを発現させるための発現ベクターpAQJ4-WT RuBisCOを構築した。
【０１３７】
（２）大腸菌組換えラン藻ＲｕＢｉｓＣＯの調製
pAQJ4-WT RuBisCOまたはpAQJ4-H386Q RuBisCOのプラスミドを形質転換したＪＭ １０９株を、５０μｇ／ｍｌ濃度となるようにアンピシリンを添加した７ＬのＬＢ培地を用いて２５℃で培養を行い、組換えＲｕＢｉｓＣＯを発現させた。遠心により回収した菌体を抽出バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭメルカプトエタノール、２ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波破砕により粗酵素溶液を調製した。粗酵素溶液に終濃度が１５％となるようにポリエチレングリコールを添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心により回収した。タンパク質沈殿をＴＥＭバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２-メルカプトエタノール）に溶解した。これを、ＤＥＡＥ陰イオン交換カラム（Hiprep 16/10, DEAE, GE healthcare社製）に供し、０〜０．３５Ｍ ＮａＣｌへのリニアーグラジェントによりタンパク質を溶出し、ＲｕＢｉｓＣＯ溶出画分を回収した。回収したＲｕＢｉｓＣＯ溶液に、粉末状の硫酸アンモニウムを終濃度６０％になるように添加し、タンパク質を沈殿させ、遠心により回収した。タンパク質の沈殿をゲルろ過バッファー（ＴＥＭバッファーに終濃度１００ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加したバッファー）に溶解し、ゲルろ過カラム Hiload 16/26, superdex 200, prepgrade (GE healthcare社製)に供し、ゲルろ過バッファーにより、ＲｕＢｉｓＣＯを溶出した。ＲｕＢｉｓＣＯ溶出画分を回収し、回収した溶出画分と等量のＴＥＭバッファーを加えることでNaCl濃度を希釈し、このＲｕＢｉｓＣＯ溶液を陰イオン交換カラム、MonoQ 5/50 GL (GE healthcare社製)に供し、０〜０．３５Ｍ ＮａＣｌへのリニアーグラジェントにより溶出し、ＲｕＢｉｓＣＯ溶出画分を回収した。
【０１３８】
〔実施例２：変異型ＲｕＢｉｓＣＯによるＣＯ２識別能力測定〕
実施例１で製造された変異型ＲｕＢｉｓＣＯについて、以下の方法にＣＯ２識別能力を評価した。
【０１３９】
ＲｕＢｉｓＣＯのカルボキシラーゼ反応とオキシゲナーゼ反応の比特異性(relative specificity: Ｓｒ)は、下記式（１）で示され、ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力を示すパラメーターとして用いられる。このＳｒの値が高いほど、カルボキシラーゼ反応を特異的に行うことになる。
【０１４０】
【数１】
2008187988.tif 000002
【０１４１】
（式中、Ｖｃｍａｘ、およびＶｏｍａｘは、それぞれカルボキシラーゼ反応の最大速度およびオキシゲナーゼ反応の最大速度を表し、ＫｃおよびＫｏは、それぞれカルボキシラーゼ反応のＣＯ２に対するＫｍ値、およびオキシゲナーゼ反応のＯ２に対するＫｍ値を表す。）
ＲｕＢｉｓＣＯのＳｒ値は、カルボキシラーゼ反応産物である３-ホスホグリセリン酸（ＰＧＡ）とオキシゲナーゼ反応生成物である２-ホスホグリコール酸（ＰＧＯ）の生成量を測定することにより算出することができる。ＲｕＢｉｓＣＯの反応生成物の測定は、以下のように行った。
【０１４２】
内容量が５ｍｌのサイドアームを付加したコニカルフラスコに１００μｇ ＲｕＢｉｓＣＯ、２５ｍＭ Ｂｉｃｉｎｅ−ＫＯＨ（ｐＨ８．３）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ６−ホスホグルコン酸、１ｍｇ 牛赤血球由来carbonic anhydraseを含む１ｍｌの反応液を添加した。また、サイドアームに１０μｌの１０ｍＭ リブロースビスリン酸を添加した。このコニカルビーカーを天井がゴム製のスクリューキャップで蓋をし、蓋の周りをパラフィルムでシーリングし、スクリューキャップのゴム製天井からシリンジにより５００ｌのエアーバックに蓄えた空気を、０．３ｌ／ｍｉｎの速度で通気して、ビーカー内の溶液が通気している空気と平衡になるまで、２５℃において１２０サイクル／ｍｉｎの速度で６０分間振盪した。尚、空気は、コニカルフラスコに通気する前に蒸留水に通気し加湿した。また、エアーバックに蓄えた空気のＣＯ２濃度は、ＣＯ２アナライザー model LI-COR 6252 (LI-COR社製)を用いて測定した。６０分後、アーム部のリブロースビスリン酸と混合し、反応を開始し、２５℃で１２０サイクル／ｍｉｎで振盪しながら３０分間、反応させた。Ｍｇ２＋を除去するために、反応液４００μｌをあらかじめ１Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＨＣｌ、ＭｉｌｌｉＱ水で順次洗浄した１０ｍｇのＤｏｗｅｘ ５０樹脂 （Ｈ＋ ｆｏｒｍ） (ダウ・ケミカル社製)と混合した。その後、Ｄｏｗｅｘ樹脂を除去するために、Microcon YM-3 (Amicon社製)にアプライし、５，０００ｒｐｍで３０分間遠心し、スルー画分を回収し、ＨＰＬＣサンプルとした。ＲｕＢｉｓＣＯの反応生成物、ＰＧＡとＰＧＯは、ＡＳ１１陰イオン交換カラム (Dionex社製)を用い、Dionex HPLC 陰イオン交換クロマトグラフィーシステムにより、分離検出を行った。ＲｕＢｉｓＣＯ反応生成物をは２０ｍＭ ＮａＯＨで溶出し、オートサプレッサーＳＲＳを用いてバックグラウンドを抑制しながら、電気伝導度により検出した。得られた結果から、ＰＧＡとＰＧＯの面積を算出し、Sr= 0.5×(PGA*-PGO*)/PGO* (PGA*とPGO*はそれぞれPGAとPGOの面積)の式を用いて計算した。
【０１４３】
上記方法により、実施例１で製造された変異型ＲｕＢｉｓＣＯおよび野生型ＲｕＢｉｓＣＯについて、ＣＯ２識別能力を評価した。その結果、図５（ａ）および表１に示すように、ラッチ構造を導入した変異型ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力は、５０．１±３．６６であった。一方、野生型ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力は、図５（ｂ）および表１に示すように、４３．３±３．３６であった。つまり、ラッチ構造を導入した変異型ＲｕＢｉｓＣＯでは、ＣＯ２識別能力が、１．２倍に増加していた。以上の結果から、本発明にかかる変異型タンパク質によれば、ＣＯ２識別能力を向上させることができることが分かった。
【０１４４】
【表１】
2008187988.tif 000003
【０１４５】
〔実施例３：変異型ＲｕＢｉｓＣＯを発現する植物の光合成ＣＯ２固定化能のシミュレーション〕
実施例２の結果に基づき、実施例１で製造された変異型ＲｕＢｉｓＣＯを植物に導入した場合の該植物の光合成ＣＯ２固定化能を以下に示す方法により評価した。
【０１４６】
これまでの光合成研究から、植物の光合成ＣＯ２固定速度、例えばタバコのＣＯ２固定速度はＲｕＢｉｓＣＯの酵素学的パラメーターに依存することが明らかとなっている。また、ＲｕＢｉｓＣＯの酵素学的パラメーターを用いてシミュレーションしたＣＯ２固定速度はタバコ葉を用いて実際に測定した値とよく一致することが報告されている。植物のＣＯ２固定速度と葉内ＣＯ２分圧の関係は、下記式（２）および式（３）で表される。式（２）はＣＯ２濃度が低く、ＣＯ２固定速度がＲｕＢｉｓＣＯによって律速されている段階（ＲｕＢｉｓＣＯ律速段階）をシミュレーションし、ＣＯ２濃度がＲｕＢｉｓＣＯ律速段階よりも高い場合には、基質のリブロースビスリン酸の再生速度が律速している（リブロースビスリン酸再生律速段階）ために、この段階は式（３）を用いてシミュレーションできる。
【０１４７】
【数２】
2008187988.tif 000004
【０１４８】
【数３】
2008187988.tif 000005
【０１４９】
（式中、Ｂは葉におけるＲｕＢｉｓＣＯの触媒サイトモル数、ｐｃは葉内のＣＯ２分圧、ｓｃは水に対するＣＯ２の溶解度、［Ｏ２］は葉内Ｏ２濃度、ＳｒはＲｕＢｉｓＣＯのカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ反応の比特異性、Ｋｃａｔはカルボキシラーゼ反応の最大反応速度、ＫｃはＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２に対するＫｍ値、ＫｏはＲｕＢｉｓＣＯのＯ２に対するＫｍ値、Ｒｄは暗呼吸速度、Jは光合成電子伝達速度を、それぞれ示す。タバコのCO2固定速度のシミュレーションで用いられているＢ＝２０μｍｏｌ／ｍ２、ｓｃ＝０．０３３４（Ｍ／ｂａｒ）、［Ｏ２］＝２５２μＭ、Ｓｒ＝８２、Ｋｃａｔ＝３．４、Ｋｃ＝１０．７、Ｋｏ＝２９５、Ｒｄ＝１(μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ２)、Ｊ＝１２０（μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍ２）の値を用いて、タバコ葉におけるＣＯ２固定速度と葉内ＣＯ２分圧の関係をシミュレーションした。また、ラッチ構造を導入することによってタバコＲｕＢｉｓＣＯのＳｒが１．２倍に向上した場合のシミュレーションには、用いるＲｕＢｉｓＣＯの酵素学的パラメーターにおいて、Ｓｒが１．２倍の９８．４になり、Ｓｒ増加のため同時にＫｃが１．２分の１倍の８．９に変化するが、それ以外のパラメーターは変化しないと仮定して、シミュレーションを行った。なお、上記シミュレーション方法は、例えば、T. John Andrews and Spencer M. Whitney, Archives of Biochemistry and Biophysics 414, 159-169 (2003)に記載されているので、参照されたい。
【０１５０】
その結果、図６に示すように、自然大気中に植物が置かれている状態（葉内ＣＯ２濃度が約２５０μｂａｒである状態）では、野生型植物と比較して、光合成ＣＯ２固定速度が１．２倍に増加すると見積もられた。本実施例では、変異型ＲｕＢｉｓＣＯのベースとなるタンパク質としてラン藻由来のＲｕＢｉｓＣＯを用いたが、ラン藻のようなバクテリア由来のＲｕＢｉｓＣＯを植物で発現させる場合、本実施例で行ったようなシミュレーション結果が、実際に行った実験結果とよく整合することは知られている（例えば、Spencer M. Whitney and T. John Andrews, Plant Physiology, Vol. 133, pp. 287-294 (2003)を参照）。したがって、本実施例のシミュレーション結果は、本実施例にかかる変異型ＲｕＢｉｓＣＯを植物で実際に発現させた場合の該植物の光合成ＣＯ２固定化能を反映するものである。
【０１５１】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
以上のように、本発明は、ＣＯ２識別能力が向上した変異型ＲｕＢｉｓＣＯを提供するので、光合成ＣＯ２固定化能が増加した植物体を製造することができる。したがって、本発明は、育種分野に用いることができるだけではなく、本発明にかかる植物が有する高い光合成ＣＯ２固定化能を用いる農業や園芸、環境産業等の産業分野に適用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１（ａ）は、Galdieria partita由来のＲｕＢｉｓＣＯにおけるラッチ構造を示す図であり、図１（ｂ）は、該ラッチ構造において、第１の領域のバリン残基と第２の領域のグルタミン残基とが水素結合を形成している状態を示す図である。
【図２】図２は、様々な生物由来のＲｕＢｉｓＣＯの系統樹を示す図である。
【図３】図３は、様々な生物由来のＲｕＢｉｓＣＯの大サブユニットを形成するポリペプチドのアミノ酸配列を比較する図である。
【図４】図４は、様々な生物由来のＲｕＢｉｓＣＯの第２の領域を形成するポリペプチドのアミノ酸配列を比較する図である。
【図５】図５（ａ）は、本実施例にかかる変異型ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力を測定した結果を示す図であり、図５（ｂ）は、野生型ＲｕＢｉｓＣＯのＣＯ２識別能力を測定した結果を示す図である。
【図６】図６は、本実施例にかかる変異型ＲｕＢｉｓＣＯを発現する植物の光合成ＣＯ２固定化能をシミュレーションにより評価した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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