(57)【要約】【課題】本発明は、正常ヒトインスリン受容体を発現可能な新規トランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。さらには、正常ヒトインスリン受容体を発現し、薬剤刺激等によりヒトインスリン受容体αサブユニット（以下「ｈＩＲα」ともいう。）を放出可能なｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患のモデル動物を提供することを課題とし、さらにはこれらの動物を使用した疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。【解決手段】正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物を作製することにより、ｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患のモデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供しうる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
正常ヒトインスリン受容体が、以下の１）または２）に記載のアミノ酸配列である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物：
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
２）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１または複数個のアミノ酸配列が変異しており、ヒトの個体差に応じて多型の範囲内のアミノ酸配列。
【請求項３】
請求項１または２に記載の正常ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子を組み込むことによる、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
トランスジェニック非ヒト動物が、ヒトインスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患のモデル動物である請求項１〜３のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５】
ヒトインスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病またはがんである、請求項４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６】
動物がマウスである、請求項１〜５のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とするヒトインスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物に関する。具体的には、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物によるヒトインスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患のモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、生体のエネルギー源であるグルコースの代謝調節において重要な役割を果たしているホルモンである。膵ランゲルハンス島β細胞で産生されたインスリンは、インスリンレセプターを有する細胞に作用し、細胞によるグルコースの取り込みを促す。インスリンの作用によって、生体の血糖値は適切な範囲に維持されている。糖尿病は、なんらかの原因によってインスリンの作用が不十分になった結果としてもたらされる病態の１つである。
【０００３】
インスリンの作用が不十分になる主な原因として、インスリンの分泌機能の異常と、インスリンに対する感受性の低下があげられる。インスリンの分泌機能の異常による糖尿病は１型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus）と呼ばれる。１型糖尿病においては、インスリンに対する応答性は維持されているため、インスリンの投与によって血糖値のコントロールが可能である。１型糖尿病はインスリン依存性の糖尿病（Insulin Dependent Diabetes Mellitus; IDDM）とも呼ばれ、若年性の糖尿病の主な原因となっている。
【０００４】
インスリンに対する感受性の低下による糖尿病として、２型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus）がある。２型糖尿病は、インスリン非依存性糖尿病（Non-Insulin Dependent Diabetes Mellitus; NIDDM）とも呼ばれ、成人に多いタイプの糖尿病である。日本では糖尿病患者の９５％が２型糖尿病であるといわれている。２型糖尿病患者は、生体のインスリンに対する応答性が低下しているため、インスリンを投与しても血糖値をコントロールすることができない。２型糖尿病は幾つかの遺伝子異常と、肥満、ストレス、加齢などの環境因子が加わって発症すると考えられている。現在、日本にも約７４０万人の２型糖尿病患者がいると言われており、その数は高齢化にともなって増加している。糖尿病予備軍も含めると１６２０万人もの患者がいるという予測もある。したがって、２型糖尿病の診断や治療は、現代社会の重要な研究課題である。
【０００５】
現在までのところ、２型糖尿病の原因遺伝子は殆ど明らかになっていない。インスリン作用機構に関与する因子の遺伝子、またはインスリン分泌に関与する因子の遺伝子が候補遺伝子と予想されている。このうち、インスリン作用に関与する因子のひとつとして、インスリンレセプターが考えられる。
【０００６】
すなわち、インスリンが標的細胞に作用するには、その細胞膜上に存在するインスリンレセプターと結合することが必須である。また２型糖尿病の初期には、インスリン抵抗性が存在するという多くの報告がある（Taylor, S. I., Diabetes 41:1473-1490,1992）。これらのことから、インスリンレセプターの異常と糖尿病の関係についても検討されてきた。インスリンレセプターの機能に異常が存在すると、高度のインスリン抵抗性を示し、重篤な糖尿病となるはずである。
【０００７】
近年、多くのインスリンレセプター異常症が発見され、変異の種類により患者の検査結果と症状が多彩であることが明らかとなった（M. Taira et al., Science 245: 63-66, 1989、F. Shimada et al., Lancet 335 1179-1181, 1990）。
【０００８】
インスリンレセプターは、αとβの２つのサブユニットで構成されるヘテロ４量体構造の受容体タンパク質である。αサブユニットは細胞外にあり、βサブユニットは細胞膜を貫通している。αサブユニットはそのＣ末端側にあるシステイン(Cys)残基のＳＨ基を介して、βサブユニットの細胞外ドメインとＳＳ結合によって結合している。
【０００９】
インスリンがαサブユニットと結合すると、βサブユニットの細胞内ドメインのチロシン残基が自己リン酸化され、インスリンのシグナルが細胞に伝達される。細胞膜に位置するインスリンレセプターは、インスリンとの結合の後にエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。インスリンレセプターの数はインスリン濃度の増加に伴って減少する。これを下降調節（down regulation）という。
【００１０】
インスリン受容体αサブユニット（ＩＲα）を血中に放出するトランスジェニックマウスについて報告がある（非特許文献１）。このトランスジェニックマウスは高血糖、高インスリン血症が観察されている。ここでは、ヒトについての遊離のＩＲαが存在することは報告されていない。また、チロシンキナーゼ欠損ヒトインスリン受容体を発現するトランスジェニックマウスについて報告がある（非特許文献２）。ここでは、該チロシンキナーゼ欠損ヒトインスリン受容体を発現する動物と糖尿病との関係は、不明であった。
【００１１】
本発明者らにより、ヒトにおいて血中に遊離のＩＲαが存在することが見出され、該ＩＲαの測定方法および該遊離のＩＲαは糖尿病またはがんのマーカーとして有用であることが開示されている（特許文献１）。さらに、糖尿病薬の治療方法のスクリーニング方法について、開示がある（特許文献２）。ここでは、インスリン受容体発現細胞を、高い糖濃度条件で培養したときに、培養上清中にＩＲαが放出されることから、培養上清中のＩＲα濃度を指標として、血中可溶性ＩＲα濃度の上昇を伴う疾患に対する治療効果を評価することができるというものである。すなわち、この条件下で、ＩＲαの培養上清中への放出を抑制しうる化合物を選択することにより、当該疾患の治療薬をスクリーニングすることができるというものである。
【非特許文献１】DIABETES, Vol.43, 143-153 (1994)
【非特許文献２】Endocrine Journal, Vo. 51, p.133-144 (2004)
【特許文献１】国際公開パンプレットWO2004/097414
【特許文献２】特開2004-345722号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、正常ヒトインスリン受容体を発現可能な新規トランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。さらには、正常ヒトインスリン受容体を発現し、薬剤刺激等によりヒトインスリン受容体αサブユニット（以下「ｈＩＲα」ともいう。）を放出可能な、たとえば糖尿病やがんの疾患モデルとして機能しうる非ヒト動物を提供することを課題とし、さらにはこれらの動物を使用した該疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物を作製することにより、ｈＩＲαを放出可能でありｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患、例えば糖尿病モデルとして機能しうる新規非ヒト動物モデルを提供しうることを見出し、本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は以下よりなる。
１．正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
２．正常ヒトインスリン受容体が、１）または２）に記載のアミノ酸配列である前項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物：
１）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
２）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち、１または複数個のアミノ酸配列が変異しており、ヒトの個体差に応じて多型の範囲内のアミノ酸配列。
３．前項１または２に記載の正常ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子を組み込むことによる、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物。
４．トランスジェニック動物が、インスリン受容体αサブユニット濃度の上昇を伴う疾患のモデル動物である前項１〜３のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
５．ｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患が、糖尿病またはがんである、前項４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
６．動物がマウスである、前項１〜５のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
７．前項１〜６のいずれかに１に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とするｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物により、容易にｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患のモデルを作製することができる。また、本モデル動物にインスリンを投与することにより、ｈＩＲα濃度の上昇や血糖値の上昇を抑制できたことから、ｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患の予防または治療薬をスクリーニングすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、正常ヒトインスリン受容体を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物である。
【００１７】
本発明において、正常ヒトインスリン受容体の種類は特に限定されない。すなわち、当該インスリン受容体を非ヒト動物で発現させたときに、何らかの刺激によりそのαサブユニットの放出が誘導されるものであれば、任意のインスリン受容体を用いることができる。例えば、ヒトインスリン受容体は既にその遺伝子が単離され、決定されている（GenBank Accession No. M10051：配列番号１）。本発明における正常ヒトインスリン受容体は、例えばGenBank Accession No. M10051、X02160やNM_000208で示されるアミノ酸配列からなるものが挙げられる。例えば、GenBank Accession No. M10051（配列番号２）に示されるヒトインスリン受容体は、１３８２個のアミノ酸から構成される。その他、本発明の正常ヒトインスリン受容体は、個体差に応じて、多型の範囲で１〜複数個のアミノ酸が異なっているものも含まれる。
【００１８】
本発明における正常ヒトインスリン受容体をコードする遺伝子（以下、単に「正常ヒトインスリン受容体遺伝子」ともいう。）は、本発明における正常ヒトインスリン受容体を発現しうる塩基配列からなるＤＮＡであればよい。そのような塩基配列としては、例えばGenBank Accession No. M10051（配列番号１）、X02160やNM_000208で示される塩基配列からなり、また、個体差に応じて、多型の範囲で１〜複数個の塩基が異なっているものも含まれる。さらには上記に示す塩基配列からなるＤＮＡの他、遺伝子コドンと縮重のため、正常ヒトインスリン受容体と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするいずれかのＤＮＡも含み、さらにはそれらの相補鎖も含まれる。
【００１９】
本発明におけるトランスジェニック非ヒト動物としては、ヒト以外の哺乳動物が挙げられ、例えば、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、モルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類の取扱いが容易であるため好ましく、中でもマウスが好ましい。
【００２０】
本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより導入遺伝子である正常ヒトインスリン受容体遺伝子を導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする正常ヒトインスリン受容体遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることによりトランスジェニック動物を作製することもできる。
【００２１】
正常ヒトインスリン受容体ｃＤＮＡを対象動物に導入させる際、正常ヒトインスリン受容体ｃＤＮＡを対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。
【００２２】
正常ヒトインスリン受容体遺伝子の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、など）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］のプロモーターなどが挙げられる。上記ベクターは、トランスジェニック非ヒト動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結するターミネターを有していてもよい。
【００２３】
その他、正常ヒトインスリン受容体遺伝子をさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも所望により可能である。
【００２４】
受精卵細胞段階における正常ヒトインスリン受容体遺伝子の導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。トランスジェニック後の作出動物の胚芽細胞において正常ヒトインスリン受容体遺伝子が過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに正常ヒトインスリン受容体遺伝子を過剰に有することを意味する。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに正常ヒトインスリン受容体タンパク質を過剰に有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００２５】
トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性正常ヒトインスリン受容体遺伝子を、好ましくはマウスなどの対象動物、またはその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ））、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ））を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
【００２６】
得られた受精卵に前述の方法により外来性正常ヒトインスリン受容体遺伝子を導入した後、雌動物に人工的に移植、着床させることにより、外来性遺伝子を組み込んだＤＮＡを有する非ヒト動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）を投与後、雄動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させることができる。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出効率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、ＤＮＡのマイクロインジェクションが好ましい。
【００２７】
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からＤＮＡを抽出し、サザン解析やＰＣＲ法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
【００２８】
あるいは、正常ヒトインスリン受容体発現トランスジェニック非ヒト動物は、上記した正常ヒトインスリン受容体遺伝子を導入遺伝子としてＥＳ細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞に由来するＨＰＲＴ陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ＥＳ細胞(embryonic stem cell)に、正常ヒトインスリン受容体遺伝子を導入する。正常ヒトインスリン受容体遺伝子がマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたＥＳ細胞をＨＡＴセレクション法により選別する。次いで、選別したＥＳ細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。
【００２９】
上記した本発明のトランスジェニック非ヒト動物の子孫、並びに該トランスジェニック動物の一部も本発明の範囲内である。トランスジェニック非ヒト動物の一部としては、該トランスジェニック動物の組織、器官および細胞などが挙げられる。
【００３０】
以下哺乳動物としてマウスを用いた場合を例にしてトランスジェニックマウスを製造する方法の一例についてさらに具体的に説明する。
【００３１】
１．遺伝子のクローニング
本発明の病理モデル動物を製造するには、まず、正常ヒトインスリン受容体遺伝子をクローニングする。このクローニング方法としては公知の様々な方法が可能である。例えば、正常ヒトインスリン受容体遺伝子のｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡをプラスミド等のベクターのＤＮＡに組込み、更に該ＤＮＡ組替えベクターを大腸菌等の宿主に組込んで、大腸菌を増殖させる。大量に産生された大腸菌からＤＮＡ組替えベクターを取りだし、正常ヒトインスリン受容体遺伝子をカラムクロマトグラフ法、あるいは電気泳動法等により分取、精製することによりクローニングすることができる。目的の塩基配列をもつ遺伝子が精製されていることの確認は、ＤＮＡシーケンシングなどにより確定することが望ましい。
【００３２】
２．正常ヒトインスリン受容体遺伝子のスクリーニング
ヒト遺伝子ライブラリーから得られた本件正常ヒトインスリン受容体をコードするｃＤＮＡ、あるいは、マウスｍＲＮＡから直接ＲＴ−ＰＣＲ等の方法により得られた同ｃＤＮＡをプラスミドベクター等にライゲーションにより挿入する。
【００３３】
３．ベクター
クローニング用ベクターとしては、宿主内で特定遺伝子を増幅できる細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来およびこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。
【００３４】
４．宿主
本発明の正常ヒトインスリン受容体遺伝子は、好ましくはベクターを経由して宿主細胞により増殖させる。本件正常ヒトインスリン受容体遺伝子の宿主細胞への導入は、Davisら(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986)およびSambrookら(MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Habor LABORATORY Press, Cold Spring Habor, NY., 1989)などの自体公知の実験室マニュアルに記載される形質転換や感染等により行うことができる。
そして、上記宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞等を挙げることができる。
【００３５】
５．トランスジェニックマウスの製造
正常ヒトインスリン受容体過剰発現トランスジェニックマウスを製造するには、例えばマウスの受精卵の細胞核に上記方法で得た正常ヒトインスリン受容体遺伝子をマイクロインジェクトする。注入する遺伝子の量は１個の受精卵当り２００〜１０００コピーであることが好ましい。別に精管切断術を施した雄マウスと交尾させ偽妊娠状態にした仮親を用意して、この仮親の卵管内にこの受精卵を移植し、マウスを誕生させる。
【００３６】
正常ヒトインスリン受容体遺伝子を導入する方法としては、他に受精卵にレトロウイルスベクターを感染させる方法も採用しうる。また、受精卵の代わりにＥＳ細胞を用いて同様の方法により正常ヒトインスリン受容体を発現するマウスを製造することができる。
【００３７】
上記方法でクローニングされた正常ヒトインスリン受容体をコードするｃＤＮＡを、例えばＡＧプロモーターに結合してプラスミドコンストラクションを行い、トランスジーンベクターを作製する。作製されたトランスジーンベクターを線状化し、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた感染等によって受精卵に導入する。
【００３８】
マイクロインジェクション後、一般的には、生まれた胚の１０−４０％に染色体への導入遺伝子の安定な組み込みが起こっている。選択されたマウス染色体に目的とする遺伝子の組み込みが起こっているかどうかをＰＣＲ法、サザンブロット法等により確認することが好ましい。このマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、本発明の本件正常ヒトインスリン受容体発現マウスを作製することができる。
【００３９】
本件正常ヒトインスリン受容体発現マウスが生起しているか否かを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからＲＮＡを単離してノーザンブロット法等により調べ、またはタンパク質を抽出してウェスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００４０】
本発明の正常ヒトインスリン受容体発現トランスジェニック非ヒト動物は、ｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患モデル動物としても使用可能であり、本発明の範囲に含まれる。本発明のｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患モデル動物は、正常ヒトインスリン受容体発現トランスジェニック非ヒト動物において、例えば前述のように高い糖濃度などの刺激により、ｈＩＲαが遊離したモデルのほか、ｈＩＲαが遊離した動物であれば、刺激の種類や刺激の有無にかかわらず、ｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患モデル動物となりうる。特に刺激によらずとも、ｈＩＲαが遊離した状態になれば、本発明のモデル動物となりうる。本発明者により特許文献１および２に開示するように、糖尿病やがん患者の血中において、遊離ｈＩＲαの増加が観察されることを明らかにした。非特許文献２では、高い糖濃度におかれた細胞が、ヒトインスリン受容体のｈＩＲαを放出することを報告している。したがって、ｈＩＲαの上昇を伴う疾患モデル動物とは、例えば糖尿病モデル動物であり、またはがんモデル動物でありうる。
【００４１】
例えば、生体においては、血中に放出されたｈＩＲαはインスリンと結合し、インスリンの作用を妨害するため、これが糖尿病におけるインスリン抵抗性のメカニズムのひとつと考えられる。したがって、糖によって誘導されるｈＩＲαの放出を抑制することが、インスリン抵抗性の解除による糖尿病治療のための戦略として有効であると考えられる。
【００４２】
さらに本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いることを特徴とするｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法にもおよぶ。
【００４３】
ｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患としては、上述のように糖尿病またはがんが挙げられる。該疾患の予防または治療薬のスクリーニング方法の手法として、具体的には以下の１）〜３）の工程を含む方法を例示するが、スクリーニング方法としてはこれらに限定されるものではない。
１）本発明のトランスジェニック非ヒト動物の血中にｈＩＲαを遊離させる工程；
２）上記ｈＩＲαを遊離させる工程前または後に、被験化合物をトランスジェニック非ヒト動物に投与する工程；
３）２）の被験化合物を投与した上記トランスジェニック非ヒト動物の血中ｈＩＲαを測定する工程；
４）３）で測定されたｈＩＲαの濃度が、被験化合物を投与しない対照コントロールの動物の血中ｈＩＲαと比較して低下したときに、前記疾患の予防または治療効果が検出される工程。
【００４４】
ｈＩＲαを測定する方法は、特に制限されない。具体的には、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、各種のイムノアッセイなどによってｈＩＲαを測定することができる。具体的には、特許文献１に開示される方法を用いて測定するのが好適である。
【００４５】
血中に含まれる可溶性のｈＩＲαの測定結果を対照コントロールと比較することによって、被験化合物のｈＩＲαの放出に与える影響が評価される。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の理解を深めるために実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではないことはいうまでもない。
【００４７】
（実施例１）正常ヒトインスリン受容体発現用コンストラクト
正常ヒトインスリン受容体の遺伝子（配列番号１）は、ヒトｃＤＮＡライブラリーからクローニングし(Ebina et al.(Cell, Vol. 40, p.747-758(1985))、制限酵素で切り出した。それを、哺乳動物発現ベクター pCXN2のマルチクローニングサイトにサブクローニングし、トランスジェニックマウス作製用正常ヒトインスリン受容体発現コンストラクトを作製した。
【００４８】
C57BL/6L雌マウスにＰＭＳおよびｈＣＧを腹腔投与して過排卵を誘発し、C57BL/6L雄マウスと同居・交配した。交尾の成立した雌マウスを頚椎脱臼により殺し、腹腔を開き卵管膨大部を切り出して、ヒアルロニダーゼを含むＭ１６培地中に移し、実体顕微鏡下で卵管膨大部を裂いて受精卵を培地中に移 し、ガラスピペットを用いて受精卵を回収した。
【００４９】
次に、ガラスディッシュに受精卵を含むＭ１６培地および注入ＤＮＡ（前記正常ヒトインスリン受容体発現コンストラクトをあらかじめ制限酵素SalIおよびHind IIIで消化切断し、発現プロモーターとヒトインスリン受容体ｃＤＮＡ及びポリＡシグナル配列を含むフラグメントを精製したたもの；濃度は５ｎｇ／μｌ）のドロップをそれぞれ作製し、パラフィンオイルでカバーした。マイクロマニュピレーター付き倒立顕微鏡下でインジェクション用ピペットに注入ＤＮＡをおおよそ０．１μｌ吸引して、ホールディング用ピペットで固定した受精卵の前核内にＤＮＡを注入した。
【００５０】
ＤＮＡ注入した受精卵を移植するための偽妊娠雌マウス（ＩＣＲマウス）を、精管を切除した雄マウス（ＩＣＲマウス）と交配させることにより作製した。受精卵にＤＮＡを注入した当日に、偽妊娠雌マウスを麻酔し、後背部より卵巣、卵管を引出し、卵管開口部を露出する。実体顕微鏡下で移植用ピペットを用いておよそ１０個の受精卵を吸引して、左右の卵管開口部からそれぞれ受精卵を移植した。受精卵の移植後、偽妊娠雌マウスは約２０日で子マウス（活性化ＮＨＥ１−トランスジェニック（ＴＧ）マウス）初代(Founder)（ヘテロ）を出産した。
【００５１】
（実験例１）
本実験例では、正常ヒトインスリン受容体トランスジェニック（ＴＧ）マウス（８週齢）における正常ヒトインスリン受容体の発現結果を確認した。
【００５２】
正常ヒトインスリン受容体ＴＧマウスについて、膵臓、肝臓、胃、脂肪、腎臓、脳、脾臓、心臓および肺の各臓器をホモジェネートしたものについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、正常ヒトインスリン受容体の発現をウェスタンブロット法により確認した。ウェスタンブロット法では、ウサギで作製した抗インスリン受容体β画分抗体を用いた。ます、ヒトトランスジーンおよびマウスの内在性のインスリン受容体を確認し（図３Ａ）、さらに、マウス（内在性）インスリン受容体を５Ｄ９抗体により免疫沈降させて、ヒトトランスジーンにより発現したインスリン受容体についても調べた（図３Ｂ）。
【００５３】
その結果、正常ヒトインスリン受容体ＴＧマウスでは、各臓器においてヒトインスリン受容体の発現を認めた、特に特に膵臓および脳に高い発現を認めた。
【００５４】
（実験例２）
本実験例では、正常ヒトインスリン受容体ＴＧマウス（８週齢）に、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を２００ｍｇ／ｋｇ投与したときの、遊離血漿ｈＩＲαの推移および血糖値の推移を調べた。
【００５５】
遊離血漿ｈＩＲαは、マウスの尾静脈から経時的に採血し、特開2006-345722号公報（特許文献２）の実施例１に記載のＥＬＩＳＡの手法により測定した。また、前記経時的に採血した検体について血糖値を測定した。血糖値の測定は、グルコースオキシダーゼ法によった。
【００５６】
その結果、ＳＴＺ投与後遊離血漿ｈＩＲα値は上昇し、インスリンを６−１４単位／個体／日投与したとき、遊離血漿ｈＩＲα値は低下した。インスリン投与を中止すると、再度ｈＩＲα値は上昇し、再度インスリンを６−１４単位／個体／日投与するとｈＩＲα値は低下した（図４）。さらに、血糖値について推移を調べたところ、遊離血漿ｈＩＲα値の推移と同様に、ＳＴＺ投与後血糖値は上昇し、インスリンを投与したとき血糖値は低下した。インスリン投与を中止すると、再度血糖値は上昇し、再度インスリンを投与すると血糖値は低下した（表１）。
【００５７】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５８】
以上説明したように、本発明の正常ヒトインスリン受容体遺伝子を発現させてなるトランスジェニック非ヒト動物により、容易にｈＩＲα濃度の上昇を伴う疾患のモデルを作製することができた。また、ｈＩＲα濃度の上昇により、血糖値が上昇することも確認されており、糖尿病の優れた動物モデルとなることが確認された。
本動物モデルにおいて、インスリンを投与したところ、ｈＩＲα濃度および血糖値の低下が認められた。これにより、本動物モデルを使用することにより、ｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患に対する新規薬剤、特に血糖値を低下せしめる新規薬剤、すなわちｈＩＲα濃度の上昇に伴う疾患の予防または治療薬のスクリーニングを行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＴＧマウス作製における組込用正常ヒトインスリン受容体を示す図である。（実施例１）
【図２】ＴＧマウス作製における正常ヒトインスリン受容体を組み込んだベクターを示す図である。（実施例１）
【図３】ＴＧマウスの各臓器における正常ヒトインスリン受容体の発現結果を示す図である。（実験例１）
【図４】ＴＧマウスにおけるＳＴＺおよびインスリン投与によるｈＩＲαおよび血糖値の推移を示す図である。（実験例２）
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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【配列表】
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