(57)【要約】【課題】  本発明は、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する新規プロモーターを提供することを課題とする。【解決手段】  本発明は、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域、或いは、該非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドを有し、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する、プロモーターを提供する。【選択図】  図３
2008154496.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域、或いは、該非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドを有し、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する、プロモーター。
【請求項２】
ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件［０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６８℃にて１６〜２４時間のハイブリダイズを行なった後に、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６８℃にて１５分間の洗浄を２回おこなう］でハイブリダイズし、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する、プロモーター。
【請求項３】
配列番号１〜４８のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有する、請求項１又は２に記載のプロモーター。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーター及び任意のタンパク質をコードする遺伝子を含む（ここで、該プロモーターの下流に、該任意のタンパク質をコードする遺伝子がインフレームで連結されている）、遺伝子コンストラクト。
【請求項５】
任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現する植物体の作製方法であって、
（Ｉ）請求項１〜３のいずれかに記載のプロモーターの下流に、該任意のタンパク質をコードする遺伝子をインフレームで連結し、遺伝子コンストラクトを作製する工程、及び、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で作製した遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換する工程、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で形質転換した植物細胞を分化及び生長させ、植物体を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られた、植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現するプロモーター、該プロモーター及び任意のタンパク質を含む遺伝子コンストラクト、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現する植物体の作製方法、及び、該方法により得られた植物体に主に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物において組織特異的な活性を示すプロモーターが幾つか報告されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、鉄充足条件下では植物の根の導管周辺の内鞘細胞で弱い発現を示し、鉄欠乏条件下では根、地上部で非常に強く発現するように制御され得るイネのニコチアナミン合成酵素のプロモーターが開示されている。
【０００４】
特許文献２〜８には、根特異的プロモーターが開示されている。
【０００５】
特許文献９には、花器特異的プロモーターが開示されている。
【０００６】
植物の根部維管束の外層部には、「内鞘細胞」と呼ばれる細胞が存在することが報告されている。ある種の生理活性有用代謝産物は、この内鞘細胞で生産される。それゆえ、内鞘細胞が多く存在する根部維管束の外層部において高発現するプロモーターは、ある種の生理活性有用代謝産物の収量が改善された植物の育種に有用であると考えられる。しかしながら、根部の維管束の外層部において特に高い活性を有するプロモーターは今まで知られていない。
【特許文献１】特開２００４−１６１５３公報
【特許文献２】特開２００５−４６０３６公報
【特許文献３】特開２００２−１４２７６６公報
【特許文献４】特表２００５−５１４９２０公報
【特許文献５】特表２００３−５１９４７５公報
【特許文献６】特表２００２−５３００７５公報
【特許文献７】特表２００２−５３７７６０公報
【特許文献８】特表平１１−５１００５６公報
【特許文献９】特許第３５３５５２５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する新規プロモーターを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリー（ＡＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属するＰ糖タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流に位置する非コード領域（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）が、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部において高発現させることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明は、以下の事項を提供する。
【００１０】
〔項１〕
ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域、或いは、該非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチドを含み、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する、プロモーター。
【００１１】
〔項２〕
ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件［０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６８℃にて１６〜２４時間のハイブリダイズを行なった後に、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６８℃にて１５分間の洗浄を２回おこなう］でハイブリダイズし、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する、プロモーター。
【００１２】
〔項３〕
配列番号１〜４８のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有する、項１又は２に記載のプロモーター。
【００１３】
〔項４〕
項１〜３のいずれかに記載のプロモーター及び任意のタンパク質をコードする遺伝子を含む（ここで、該プロモーターの下流に、該任意のタンパク質をコードする遺伝子がインフレームで連結されている）、遺伝子コンストラクト。
【００１４】
〔項５〕
任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現する植物体の作製方法であって、
（Ｉ）項１〜３のいずれかに記載のプロモーターの下流に、該任意のタンパク質をコードする遺伝子をインフレームで連結し、遺伝子コンストラクトを作製する工程、及び、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で作製した遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換する工程、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で形質転換した植物細胞を分化及び生長させ、植物体を得る工程、
を包含する、方法。
【００１５】
〔項６〕
項５に記載の方法により得られた、植物体。
【００１６】
プロモーター
ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーは、植物、動物、細菌、真菌等において広く存在し、膜を貫通し基質特異性を決める疎水性ドメイン及びＡＴＰを結合するヌクレオチド結合ドメインを含む構造を有し、糖類、アミノ酸、ポリペプチド、疎水性物質等の輸送機能、チャネル制御機能等の機能を有する一群のタンパク質として一般的に知られている。
【００１７】
Ｐ糖タンパク質(本書において、ＰＧＰとも呼ぶ)は、上記ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーのうち疎水性物質の輸送及びＣｌ−チャネルの活性調節に主に関与するタンパク質である。Ｐ糖タンパク質としては、ＡｔＰＧＰ２１、ＡｔＰＧＰ４、ＯｓＰＧＰ１０、ＣｊＭＤＲ１等を好適に例示できるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のプロモーターは、（１）〜（３）のいずれかを有し、且つ、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する：
（１）ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリーに属するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域、
（２）上記（１）に記載の非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド、
（３）上記（１）に記載の非コード領域とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件［０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６８℃にて１６〜２４時間のハイブリダイズを行なった後に、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６８℃にて１５分間の洗浄を２回おこなう］でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【００１９】
生理活性を有するポリヌクレオチドが少し改変された場合でも（例えば、１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加された場合でも）、該ポリヌクレオチドの生理活性が維持される場合があることは周知の事実である。従って、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する限りにおいて、（１）の代わりに（２）又は（３）を有するポリヌクレオチドも、本発明のプロモーターに含まれる。
【００２０】
また、本発明者らは、（１）の非コード領域のさらに上流に位置する別の遺伝子を含むポリヌクレオチドも（１）の非コード領域とほぼ同様の発現様式を示すことを確認した。従って、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する限りにおいて、（１）の非コード領域のさらに上流に位置する別の遺伝子の少なくとも一部まで含むポリヌクレオチドも、本発明のプロモーターに含まれる。
【００２１】
植物から単離されたプロモーターの転写開始点より上流域数百ｂｐ（例えば、３００〜５００ｂｐ）の領域が、該単離されたプロモーター全体の機能をほぼ完全に保持していたことが数多く報告されている（本書においてその全体が援用されるＴａｋａｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １６：４９−５８，  １９９１、  Ｄｚｅｌｚｋａｌｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：８５５−８６３，１９９３、  Ｍｏｈａｎ  ｅｔ  ａｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２：４７５−４９０，１９９３等。従って、本発明において（１）〜（３）のいずれかを有するものをプロモーターとして特定しているが、この配列の一部を有するポリヌクレオチドであっても、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する限りにおいて、本発明のプロモーターに含まれる。
【００２２】
本発明のプロモーターは、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する。
【００２３】
根部とは、植物の生命維持に必要な水及び養分を吸収し且つ植物体を支持する器官を一般的に意味する。根部には、根、根茎、塊根、付着根、毛状根等が含まれる。
【００２４】
根部維管束とは、根部から吸収した水分又は養分、根部で生産された物質等を茎、葉、花器、果実等に輸送するための組織を一般的に意味する。根部維管束は、篩部と木部とから構成され、篩部は、糖類、アミノ酸、金属イオン、同化物質、ＲＮＡ、タンパク質等の輸送に関与し、木部は水、無機塩類の輸送に関与することが一般的に知られている。これより根部維管束の外層部において任意のタンパク質を高発現できる本発明のプロモーターは、物質輸送を改善した植物の育種に有用であると考えられる。
【００２５】
根部維管束の外層部とは、根部維管束の中心部よりも皮層に近い部分を意味する。根部維管束の外層部には、多くの場合、内鞘と呼ばれる薄い柔組織層が存在する。内鞘の数細胞は、外方へ伸びて並層分裂し、側根の原基となる。内鞘細胞は、側根の発生の基盤となる細胞である。内鞘細胞における様々な遺伝子の制御は、根の発生、分岐、生長、発育に大きな影響がある。これより、本発明のプロモーターは、根部の収量が改善された植物、根部に特異的なアルカロイド等の生理活性有用二次代謝産物の生産性が改善された植物の育種に有用であると考えられる。また、維管束組織は物質を根部から地上部へ転流する機能を有していることから、本発明のプロモーターは、根部から地上部への物質（例えば、水、養分、汚染物質）の転流が制御された植物の育種に有用である。
【００２６】
本発明のプロモーターは、任意のタンパク質を少なくとも根部維管束の外層部で高発現させることができればよく、このとき根部維管束の外層部以外の組織での任意のタンパク質の発現レベルは問わない。即ち、本発明のプロモーターは、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部以外の組織で発現してもよいし、発現しなくてもよい。
【００２７】
「高発現」とは、本発明のプロモーターを用いて任意のタンパク質を発現させるときの発現量が、本来のプロモーター（野生型における任意のタンパク質の発現を制御しているプロモーター）を用いて任意のタンパク質を発現させるときの発現量よりも高いことを意味する。本発明のプロモーターを用いて任意のタンパク質を発現させるときの発現量は、本来のプロモーターを用いて任意のタンパク質を発現させるときの発現量の例えば約１．２倍以上、好ましくは約２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上である。
【００２８】
プロモーターの由来は、特に限定されず、植物、藻類、細菌、動物、魚類、昆虫等を用いることができる。
【００２９】
ところで、本発明者らは、ＰＧＰが、植物の根部維管束の外層部で高発現することを見いだした。植物の根部維管束の外層部には内鞘細胞が多く存在することから、ＰＧＰは内鞘細胞で主に発現すると考えられる。一方、ＰＧＰと相同性があり且つ同様の機能をもったタンパク質が動物等の生物に広く存在することから、動物等の生物でも内鞘細胞に相当する細胞が存在すると考えられる。例えば、消化管、血管又はそれらの周辺に存在する細胞が、内鞘細胞と同様の機能を果たし得る。つまり、植物だけでなく、動物等の生物においても、ＰＧＰに相当する遺伝子が存在し、その遺伝子上流に存在する非翻訳領域が、任意のタンパク質を内鞘細胞で高発現させるプロモーターとして機能し得る。それゆえ、本発明のプロモーターには、植物だけでなく、内鞘細胞に相当する細胞が存在する動物、細菌、真菌、昆虫等に由来するプロモーターも包含される。
【００３０】
後述するように本発明のプロモーター及び任意のタンパク質をコードする遺伝子を含む本発明の植物発現用ベクターを用いて、植物細胞を形質転換する場合、本発明のプロモーターの由来は、該植物細胞と同種であることが望ましい。
【００３１】
プロモーターの由来となる植物としては、維管束をもつ維管束植物が好ましく、発達した維管束を有するシダ植物又は種子植物が特に好ましい。シダ植物又は種子植物に由来するプロモーターは、発達した維管束を有するため、任意のタンパク質を根部維管束の外層部において非常に高いレベルで発現し得る。
【００３２】
シダ植物としては、ゼンマイ科、サンショウモ科等のシダ植物、具体的には、ゼンマイ、サンショウモ等が例示できるが、これらに限定されない。
【００３３】
種子植物としては、アブラナ科、イネ科、マメ科、ナス科、セリ科、ミカン科、ラン科、ユリ科、アヤメ科、キク科、ツツジ科、バラ科、マツ科、クスノキ科、クルミ科、ヤナギ科、クマツヅラ科等の種子植物、具体的には、シロイヌナズナ、イネ、アワ、ヒエ、キビ、サトウキビ、モロコシ、トウモロコシ、ソバ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ライコムギ、カラスムギ、ハトムギ、ダッタンソバ、コウリャン等の穀類；ダイズ、アズキ、エンドウマメ、ソラマメ、インゲンマメ、アルファルファ、ラッカセイ、クルミ、アーモンド、ケシ、コーヒー、ピスタチオ、マカデミア等の豆類又はナッツ類；サツマイモ、ジャガイモ、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバ、ナガイモ、タロイモ等のイモ類；ゴマ、ナタネ、ベニバナ、ヒマワリ、ココナッツ、ヤシ、オリーブ、綿実、カカオ、サフラワー、アボガド等の油脂植物；ニンジン、ダイコン、カブ、ラディッシュ、レンコン、ゴボウ、タマネギ、ネギ、セロリ、ニラ、ミツバ、シュンギク、チンゲンサイ、ハクサイ、ホウレンソウ、ミズナ、パセリ、レタス、キャベツ、ブロッコリー、アスパラガス、カリフラワー、ピーマン、シシトウ、キュウリ、ウリ、ゴーヤ、ズッキーニ、スイカ、トマト、カボチャ、ナス、ショウガ、ミョウガ、ニンニク、ラッキョウ、コマツナ等の野菜類；オレンジ、グレープフルーツ、レモン、ブドウ、マスカット、モモ、スモモ、アンズ、リンゴ、ナシ、カキ、ウメ、イチジク、ザクロ、イチゴ、メロン、パイナップル、マンゴー、マンゴスチン、パパイヤ、アセロラ、キウイ、ブルーベリー、ラズベリー、クランベリー、サクランボ等の果実類；スギ、ヒノキ、マツ、ヤナギ、キリ、カエデ、ポプラ、オーク、ニレ、ペカン、チーク、サクラ、ウメ、モミジ等の樹木類；シロイヌナズナ、バラ、カーネーション、チューリップ、トルコギキョウ、リンドウ、ペチュニア、カスミソウ、ナデシコ、ユリ、スミレ、パンジー、ラベンダー、ガーベラ、コスモス、キク、ゼラニウム、ツルウリクサ、ベゴニア、シクラメン、ニーレンベルギア、ニチニチソウ、テンジクアオイ、ラン、ヒマワリ、アイビー、アジアンタム、アレカヤシ、インドゴム、オリヅルラン、サンセベリア、シェフレラ、スパティフィラム、ドラセナ、ネオレゲリア、パキラ、ベンジャミン、ポトス、モンステラ、ポインセチア、アネモネ、キキョウ等の草木類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明のプロモーターは、常法に従って入手することができる。例えば、ゲノムＰＣＲ（ｇｅｎｏｍｅ  ＰＣＲ）により本発明のプロモーターを作製することができる。
【００３５】
本発明のプロモーターの作製方法として、以下の方法が挙げられる。例えば、ゲノムテンプレート、プライマーペア（例えば、Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を増幅するためのプライマーペア）、耐熱性ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（デオキシヌクレオシド三リン酸の混合物）及びＰＣＲバッファーを含む一反応液を用いてＰＣＲを行なうことにより、Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域を増幅することができる。ゲノムテンプレートは、常法により抽出することができる。プライマーペアとしては、例えば、非コード領域の５’末端付近の約１０〜３０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計したフォワードプライマーと、非コード領域の３’末端付近の約１０〜３０ｂｐのヌクレオチド配列に基づき設計したリバースプライマーとのペアを用いることができる。耐熱性ポリメラーゼとしては、例えば、Ｐｆｕ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、Ｔａｑ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ＫＯＤ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、Ｖｅｎｔ（ＮＥＢ社製）、ＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社製）、ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を好適に使用できる。ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅは市販品を好適に用いることができる。ＰＣＲバッファーは、上記耐熱性ポリメラーゼに付属のものを用いることができる。
【００３６】
ここで、Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等の検索システムから入手できる。特にゲノムが解明されている種では、この手法により非コード領域のヌクレオチド配列を容易に入手することができる。Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域のヌクレオチド配列をＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等から入手できない場合は、非コード領域の下流に位置するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を利用して５’ＲＡＣＥを行なうことにより、或いは、非コード領域の上流に位置する別の遺伝子のヌクレオチド配列を利用して３’ＲＡＣＥを行なうことにより、非コード領域を決定することができる。非コード領域の下流に位置するＰ糖タンパク質をコードする遺伝子及び非コード領域の上流に位置する別の遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ等の検索システム等から入手できる。５’ＲＡＣＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製の５’ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ等の市販のキットを用いて実施することができる。３’ＲＡＣＥは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製の３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製の３’ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ等の市販のキットを用いて実施することができる。
【００３７】
また、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を損なわない限りにおいて、Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域の１又は複数のヌクレオチドを欠失、置換若しくは付加させてもよい。該非コード領域の１又は複数のヌクレオチドの欠失、置換若しくは付加は、公知の部位特異的変異誘発法により行なうことができる。部位特異的変異誘発法としては、例えば、本書においてその全体が援用されるＭａｒｋ  Ｊ．  Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９８２，  Ｖｏｌ．  １０，  Ｎｏ．  ２０  ６４８７−６５００に記載の方法、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ法、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いる方法等を用いることができるが、これらに限定されない。本書において「１又は複数のヌクレオチド」とは、例えば、部位特異的変異誘発法により欠失、置換又は付加できる程度の数のヌクレオチドを意味する。
【００３８】
また、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を損なわない限りにおいて、Ｐ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域の３’及び／又は５’末端領域を欠失又は付加させてもよい。３’及び／又は５’末端領域の欠失又は付加法としては、制限酵素法、３’及び／又は５’末端領域を欠失又は付加させるプライマーペアを用いたＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
上記のように得られたＰ糖タンパク質をコードする遺伝子の上流に位置する非コード領域、該非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド、或いは、該非コード領域の３’及び／又は５’末端領域が欠失又は付加したポリヌクレオチドを本発明のプロモーターとして用いることができる。
【００４０】
前記非コード領域の１又は複数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリヌクレオチド、或いは、前記非コード領域の３’及び／又は５’末端領域が欠失又は付加したポリヌクレオチドは、非コード領域とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズし得る。
【００４１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、下記の通りである：０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で６８℃にて１６〜２４時間のハイブリダイズを行なった後に、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡからなる緩衝液中で６８℃にて１５分間の洗浄を２回おこなう。
【００４２】
本発明のプロモーターの具体例として、以下の表に示される配列番号１〜４８のいずれかに記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００４３】
【表１−１】
2008154496.tif 000003
【００４４】
【表１−２】
2008154496.tif 000004
【００４５】
遺伝子コンストラクト
本発明は、さらに、本発明のプロモーター及び任意のタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子コンストラクト（例えば、植物発現カセット、植物発現ベクター、植物発現プラスミド）を提供する。ここで、該任意のタンパク質をコードする遺伝子は、該プロモーターの下流にインフレームで連結されている。また、プロモーターと任意のタンパク質をコードする遺伝子とは、直接連結されてもよいし、適当な介在配列を介して連結されてもよい。
【００４６】
本発明のプロモーターについては、前述の通りである。
【００４７】
任意のタンパク質をコードする遺伝子は、特に限定されないが、根部の発生、分岐、生長又は発育を促進するタンパク質をコードする遺伝子、根部における有用物質の生産性を高めるタンパク質をコードする遺伝子、根部において毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子、及び、根部における物質輸送を司るタンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１種が好適に例示される。
【００４８】
根部の発生を促進するタンパク質をコードする遺伝子としては、ＫＮＯＸホメオボックス遺伝子、ＰＬＡＳＴＯＣＨＲＯＮ１遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
根部の分岐を促進するタンパク質をコードする遺伝子としては、発根遺伝子（ｒｏｏｔｉｎｇ  ｌｏｃｕｓ  ｇｅｎｅ、ｒｏｌ遺伝子）、スルホニルウレアレセプター１−８遺伝子（ｓｕｌｆｏｎｙｌｕｒｅａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ１−８  ｇｅｎｅ、ｓｕｒ１−８遺伝子）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
根部の生長又は発育を促進するタンパク質をコードする遺伝子としては、イソプレン合成酵素遺伝子、５−ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子、ＰＬＥＴＨＯＲＡ遺伝子、Ｐａｎｃｒｅａｓ  ｄｕｏｄｅｎｕｍ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  １遺伝子（ＰＤＸ１遺伝子）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
根部における有用物質の生産性を高めるタンパク質をコードする遺伝子としては、β−アミリン合成酵素、ストリクトシジン合成酵素等の合成酵素遺伝子、ゲラニルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
根部において毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子としては、酵母カドミウムファクター１（ＹＣＦ１）遺伝子、ボウマン・バークセリンプロテアーゼインヒビター（ＢＢＩ）遺伝子、クニッツインヒビター遺伝子、マルチドラッグレジスタンスアソシエーテッドプロテイン（ＭＲＰ）遺伝子、Ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（Ｎｒａｍｐ）、メタロチオネイン合成遺伝子、ファイトケラチン合成遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。根部において毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子は、環境浄化（ファイトリメディエーション）に使用される植物の育種に有用である。さらに、根部において毒性物質に対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子と毒性物質の地上部への転流を促進する遺伝子と組み合わせれば、汚染環境においても良好に生長し且つ毒性物質の転流を効率的に行なうようなファイトリメディエーションに適した植物を作製することができる。
【００５３】
根部における物質輸送を司るタンパク質をコードする遺伝子としては、ＡＴＰ結合カセットスーパーファミリー遺伝子、ファゴソーム輸送タンパク質遺伝子、植物ペプチド輸送遺伝子、等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明の遺伝子コンストラクトは、さらに、薬物耐性遺伝子、染色タンパク質遺伝子等の選択マーカー、制限酵素認識部位、標識タグ、ｓｉＲＮＡ配列、ノックアウト部位等を適当に含んでもよいし、発現用ベクター、発現用プラスミド等に挿入されてもよい。
【００５５】
根部維管束の外層部で任意のタンパク質を高発現する植物体の作製方法
本発明は、さらに、下記工程（Ｉ）〜（ＩＩＩ）を包含する、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現する植物体の作製方法を提供する：
（Ｉ）本発明のプロモーターの下流に、任意のタンパク質をコードする遺伝子をインフレームで連結し、遺伝子コンストラクトを作製する工程、及び、
（ＩＩ）工程（Ｉ）で作製した遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換する工程、
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）で形質転換した植物細胞を分化及び生長させ、植物体を得る工程。
【００５６】
本発明のプロモーター及び任意のタンパク質をコードする遺伝子については、前述の通りである。
【００５７】
工程（Ｉ）において本発明のプロモーターと任意のタンパク質をコードする遺伝子とを連結する方法は、常法、例えば、ライゲーション等の方法を用いることができる。このとき、プロモーターと任意のタンパク質をコードする遺伝子とを直接連結してもよいし、適当な介在配列を介して連結してもよい。また、遺伝子コンストラクト中に、薬物耐性遺伝子、染色タンパク質遺伝子等の選択マーカー、制限酵素認識部位、標識タグ、ｓｉＲＮＡ配列、ノックアウト部位等を適当に連結してもよい。遺伝子コンストラクトは、宿主染色体とは独立して自己複製能を有するコンストラクト（例えば、プラスミド）であってもよいし、かかる自己複製能を有さないコンストラクトであってもよい。
【００５８】
工程（ＩＩ）において、植物細胞を形質転換する方法としては、常法を用いることができる。例えば、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト法、又は、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｖｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｓｔａｎｔｏｎ  Ｂ．  Ｇｅｌｖｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ．  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９８８）等の文献（これらは、本書においてその全体が援用される）に記載の方法を好適に用いることができる。形質転換後、常法により遺伝子コンストラクトでの植物細胞の形質転換を確認することが望ましい。確認方法としては、例えば、細胞レベルでは、薬物耐性試験、栄養要求性試験、染色試験等の常法を用いることができる。遺伝子又はタンパク質レベルでは、ゲノムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノザンハイブリダイゼーション、ウェスタン解析等の常法を用いることができる。
【００５９】
植物細胞（宿主）は、維管束を有する限りにおいて特に限定されないが、発達した維管束を有する植物、根部で有用物質を生産する植物等を用いることができる。
【００６０】
本書において「植物細胞」とは、植物体の個々の細胞、培養細胞、細胞の集合体（例えば、カルス、組織切片、不定胚）が含まれる。
【００６１】
発達した維管束を有する植物としては、シダ植物、種子植物等を好適に用いることができる。シダ植物又は種子植物の具体例としては、プロモーターの由来に関する箇所で述べたものが好適に挙げられる。
【００６２】
根部で有用物質を生産する植物としては、種子植物、シダ植物等を好適に用いることができる。有用物質には、アミノ酸代謝物、窒素代謝物、脂質、糖類（デンプン、ショ糖等）、カロテノイド類、有機酸、ビタミン類、色素、セルロース類等の様々な有用物質が含まれる。
【００６３】
アミノ酸代謝物又は窒素代謝物（アルカロイド等）を根部で生産する植物としては、アカネ科、キョウチクトウ科、ケシ科、セリ科、ミカン科、ユリ科、マチン科、キンポウゲ科、ナス科、ツズラフジ科、アブラナ科等の植物を好適に用いることができる。
【００６４】
糖類を根部で生産する植物としては、特に、ナス科、ヒルガオ科、イネ科、アカザ科、ユリ科、マメ科等の植物を好適に用いることができる。
【００６５】
脂質を根部で生産する植物としては、アカザ科、マメ科、キク科等の植物を好適に用いることができる。
【００６６】
カロテノイド類を根部で生産する植物としては、セリ科、ヒルガオ科、ナス科、アブラナ科等の植物を好適に用いることができる。
【００６７】
ビタミン類を根部で生産する植物としては、アブラナ科、セリ科、ハス科等の植物を好適に用いることができる。
【００６８】
有機酸を根部で生産する植物としては、タデ科、マメ科、イネ科等の植物を好適に用いることができる。
【００６９】
色素を根部で生産する植物としては、アカネ科、ヒルガオ科、アブラナ科等の植物を好適に用いることができる。
【００７０】
セルロースを根部で生産する植物としては、キク科、ハス科、セリ科、アカザ科、ヒルガオ科等の植物を好適に用いることができる。
【００７１】
（ＩＩＩ）工程において、形質転換した植物細胞を分化及び生長させる方法としては、例えば、本書においてその全体が援用される「Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ  ＆  Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  １９８１，ＩＳＢＮ  ４−７６２２−６３６５−６  ［８３．５刊］（植物の成長と分化（上）Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス  著／古谷雅樹  監訳）」及び「Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐ．Ｆ．Ｗａｒｅｉｎｇ  ＆  Ｉ．Ｄ．Ｊ．Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  １９８１，ＩＳＢＮ  ４−７６２２−７３６６−Ｘ  ［８３．１１刊］（植物の成長と分化（下）、Ｐ．Ｆ．ウェアリング・Ｉ．Ｄ．Ｊ．フィリップス  著／古谷雅樹  監訳）」に記載の方法を好適に用いることができるが、これら以外の常法を用いてもよい。
【００７２】
本書において「植物体」とは、あらゆる成長過程（例えば、種子、芽生え、稚苗、中苗、成苗、結実又はこれらの間の成長過程）における植物体又はその一部が含まれる。
【００７３】
本発明は、さらに、上記方法により得られた植物体を提供する。
【００７４】
本発明の植物体は、任意のタンパク質を根部維管束の外層部において高発現する。本発明の植物体における任意のタンパク質の根部維管束の外層部における発現量は、本発明のプロモーターの代わりに本来のプロモーター（野生型における任意のタンパク質のプロモーター）を用いた場合の植物体の約１．２倍以上、好ましくは約２倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上である。
【発明の効果】
【００７５】
本発明によれば、任意のタンパク質を植物の根部維管束の外層部で高発現させる活性を有する新規プロモーターが得られた。
【００７６】
本発明のプロモーターは、物質輸送にとって重要な組織である維管束の外層部において任意のタンパク質を高発現させるため、物質輸送を改善した植物の育種に有用である。
【００７７】
本発明のプロモーターは、側根の基盤となる内鞘細胞が多く存在する根部維管束の外層部で任意のタンパク質を高発現させるため、根の発生、分岐、生長、発育、根における有用物質の生産性を改善した植物の育種に有用である。
【００７８】
さらに、植物による環境浄化（ファイトリメディエーション）技術の将来的な発展目標において、汚染物質の地上部への転流技術は多くの研究者が目指す輸送工学デザインであるが、このプロモーターを利用することでこの環境浄化植物が確立されるものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７９】
本発明の実施例を以下に示すが、該実施例は、本発明をより容易に理解するための説明であって、本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００８０】
１．ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡの抽出
以下の組成のＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒを作製し、ろ過滅菌後、室温保存した。
【００８１】
［ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ］
２００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
２５０  ｍＭ  ＮａＣｌ
２５  ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．５％  ＳＤＳ
植物体のロゼット葉が８枚以上になってから、そのうち１枚をＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ２００  μｌ中ですりつぶした。１０分間静置後、１５，０００  ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心し、上清（１５０  μｌ程度）を新しいエッペンチューブに移し、等量のイソプロパノールを加え、１５，０００  ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心を行った。得られたペレットを７０％エタノールでｗａｓｈし、ＴＥ  ５０  μｌに溶解した。
【００８２】
２．ｇｅｎｏｍｅ  ＰＣＲ
ＡｔＰＧＰ２１のプロモーター及びレポーターを含むコンストラクトを作製するために、ＡｔＰＧＰ２１遺伝子の開始コドンより上流のゲノム配列を増幅するプライマーペア（Ｆｗ  ｐｒｉｍｅｒ及びＲｖ  ｐｒｉｍｅｒ）を作製した。開始コドンを＋１とし、−７３５〜＋１５ｂｐの部分を増幅できるようにデザインした。
Fw primer（配列番号４９）:
5'-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcTCACTAATCCAGTTTATTAAAATATTGTATAG-3'
Rv primer（配列番号５０）:
5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcTATTACACTATCCATTGTTCTTTGATCC-3'
小文字の部分は人為的に付加した配列で、下線部はそれぞれＧＡＴＥＷＡＹ  ｓｙｓｔｅｍの組換え配列ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２を示している。このプライマーペアを用いて、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ，  Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）を用いて、ＤＮＡ断片の増幅を行った。増幅した断片をインビトロジェン社製ＧＡＴＥＷＡＹ  ｓｙｓｔｅｍを用いてＢＰ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎにより、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした後、シークエンスにより配列を確認した。このコンストラクトをｅｎｔｒｙ  ｖｅｃｔｏｒとし、目的部分の配列をＧＵＳ発現用のｂｉｎａｒｙ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒであるｐＧＷＢ２０３にＧＡＴＥＷＡＹ  ｓｙｓｔｅｍを用いてＬＲ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎにより移しかえた。ＡｔＰＧＰ２１プロモーター領域の配列を図２に示す。
【００８３】
３．エレクトロポーレーション
上述のコンストラクト  ０．５〜１．０  μｇ  と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＭＰ９０）を予め氷冷していたキュベット（Ｄｉｓｐ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＰＫＧ／５０、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）に入れ、Ｃｅｌｌ  Ｐｏｒａｔｏｒ（７１６００−Ｓ、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用い、Ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ：  ３３０、Ｃｈａｒｇｅ  ｒａｔｅ  ：  Ｆａｓｔ、Ｖｏｌｔａｇｅ  ｂｏｏｓｔｅｒ  ：  ４ｋΩ、ＤＣ  ｖｏｌｔｓ  ：  ＬｏｗΩの設定条件で、トランスフォーメーションを行い、２８℃で培養後、ＰＣＲによってプラスミドの導入を確認した。このアグロバクテリウムを用いて花序浸透法によりシロイヌナズナ（ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ−０）を形質転換した。
【００８４】
４．植物体の育成
予めオートクレーブをしたバーミキュライト：コンパルの混合比１：１の土に播種を行い、約１ヶ月後、一次花序が数ｃｍになった個体の一次花序を切り取り、二次花序を誘導した。一次花序を切り取ってから、約１週間後の個体を形質転換に用いた。
【００８５】
５．アグロバクテリウム懸濁液の調整
抗生物質（５０  μｇ／ｍｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ、５０  μｇ／ｍｌ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）を含むＬＢ培地にＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｐＭＰ９０）を植菌し、２５℃、２００  ｒｐｍでＯＤ６００が１．２〜１．５になるまで振盪培養した。培養液を４８００  ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を取り除き、ＯＤ６００が０．８程度になるように５％  ｓｕｃｒｏｓｅ水溶液を加え、菌体を懸濁し、この溶液にＳｉｌｗｅｔ  Ｌ−７７（日本ユニカー）を終濃度０．０５％となるように加えた。
【００８６】
６．形質転換
植物体を逆さにして、アグロバクテリウム懸濁液に約１０秒間浸けた後、植物体を横向きに倒し、１０分程乾燥させた。この植物体を２  ｌのコニカルビーカーに入れ、サランラップでふたをして湿度の高い状態を保ち、人工気象機（長日条件）に移して１日置いた。植物体を容器から取り出し、水を与えて２週間ほど生育させた後、乾燥させ、茶こし（ダイソー）を用いて種を収穫した。
【００８７】
７．形質転換体の選抜
〔Ｔ１種子の選抜〕
形質転換により得られた種子を  １／２  ＭＳ、０．５  ％  ｓｕｃｒｏｓｅ、５０  μｇ／ｍｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ、５０  μｇ／ｍｌ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  プレートに播種し、３日間低温処理（４℃）後、２１℃、長日条件（ｌｉｇｈｔ  １６ｈ，  ｄａｒｋ  ８ｈ）で生育させた。１４日後の抗生物質耐性の個体を土に移植し、ロゼット葉が８枚以上になってからそのうち１枚を上述の方法でサンプリングし、ゲノムＰＣＲによってＴ−ＤＮＡの挿入を確認した。
〔Ｔ２種子の選抜〕
Ｔ１個体から採取した種子をＴ１種子の選抜と同様に１／２  ＭＳ、０．５  ％  ｓｕｃｒｏｓｅ、５０  μｇ／ｍｌ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ、５０  μｇ／ｍｌ  ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  プレートに播種し、３日間低温処理（４℃）後、２１℃、長日条件（ｌｉｇｈｔ  １６ｈ，  ｄａｒｋ  ８ｈ）で生育させた。ＧＵＳ活性はライン間でばらつきがあるため、１４日後の抗生物質耐性の個体を用いてＧＵＳ染色を行い、強く染色されたラインを選抜し、その後の解析に用いた。
【００８８】
９．植物材料および生育条件
ＡｔＰＧＰ２１  プロモーター及びＧＵＳで形質転換した形質転換体Ｔ３  世代の種子の表面を種子滅菌液（３０％  ［ｖ／ｖ］  ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｄｅ，  ０．０２％  Ｔｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００）で２０分間滅菌した後、滅菌水で４回洗浄し、その種子を１／２ＭＳ（０．５％  ｓｕｃｒｏｓｅ，  ｐＨ  ５．８，  １．０  ％  ｂａｃｔｏａｇａｒ）培地に播種し、３日間低温処理（４℃）後、２１℃、長日条件（ｌｉｇｈｔ  １６ｈ，  ｄａｒｋ  ８ｈ）で、観察を行う目的の大きさまで生育させた。
【００８９】
１０．ＧＵＳ染色
［ＧＵＳ染色ｂｕｆｆｅｒ］  
以下の組成のＧＵＳ染色ｂｕｆｆｅｒを使用時にその都度調製した。
１００  ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
５  ｍＭ  Ｋ−ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ
５  ｍＭ  Ｋ−ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
［Ｘ−Ｇｌｕｃ］
５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄｅ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓａｌｔ（Ｘ−Ｇｌｕｃ、ナカライテスク）１００  ｍｇをＮ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ  １．９２  ｍｌで溶解し、１００  ｍＭのＸ−Ｇｌｕｃ（ストック溶液）を調製し、−３０℃保存で保存した。
【００９０】
染色直前に終濃度２  ｍＭになるようにＸ−Ｇｌｕｃを加えてＧＵＳ染色ｂｕｆｆｅｒとした。
【００９１】
サンプルの大きさに応じて、１４−ｄａｙｓ−ｏｌｄのｓｅｅｄｌｉｎｇはエッペンチューブを、成熟植物体なら１５  ｍｌか５０  ｍｌのファルコンチューブを用いて、氷冷した９０％アセトン中に１５分間浸し、組織を固定した。アセトンを除去し、１００  ｍＭ  ｐｈｏｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒをサンプルが浸るまで加え、３０秒間程  ｖｏｒｔｅｘでｗａｓｈした。サンプルが十分に浸る程度のＧＵＳ染色ｂｕｆｆｅｒを加え、染色具合を観察しながら、ｓｅｅｄｌｉｎｇは３時間、成熟植物体は８時間、３７℃でインキュベートした。クロロフィルなどの色素は染色パターンの検出の障害となるため、染色ｂｕｆｆｅｒを取り除いて、７０％エタノールを加え、２晩静置した。色素が完全に抜けていない時は、７０％エタノールを交換し、振とうしながら脱色を行った。
【００９２】
１１．ＧＵＳ染色切片の調製
ＧＵＳ染色を行ったサンプルを２００  μｌ容ＰＣＲチューブに入る程度の大きさに切断した。細胞の収縮をおさえるため、７０％エタノールで満たしたシャーレの中で切断した。切断したサンプルを９０％エタノールに置換して室温で１時間浸透し、さらに１００％エタノールに置換して室温で１時間浸透した後、予備浸漬液に置換して室温で２時間〜１晩浸透した。その後、２００  μｌ容ＰＣＲチューブに浸漬液を入れ、そこにサンプルを移して室温でサンプルの大きさに応じて２４時間以内で浸漬を行った。ただし、根など組織が小さいものは２時間で十分に浸漬されているが、葉や茎などの組織が大きいものは５時間以上浸漬を行わないと、十分に浸漬されていない可能性が高かった。その後、包埋液をサンプルが十分に浸かる程度入れ、室温で１時間〜１晩硬化させた。
［予備浸漬液］
１００％エタノール／Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００（Ｈｅｒａｅｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ  ＧｍｂＨ，  Ｗｅｈｒｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）等量液
［浸漬液］
Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７１００  １００ｍｌ
硬化剤Ｉ                      １ｇ
［包埋液］
浸漬液                        １５ｍｌ
硬化剤II                      １ｍｌ
（１）サンプルを包埋した樹脂をＰＣＲチューブから取り出し、（２）ヒストブロック（Ｋｕｌｚｅｒ）にＴｅｃｈｎｏｖｉｔ３０４０（Ｋｕｌｚｅｒ）を用いてしっかりと固定した。固定後、サンプルを濡れたキムワイプと一緒にタッパーに入れ、２時間程、湿度を保ちながら静置した。（３）断面の面積が大きいと切片が丸まり、観察が困難になるため、ｖｉｖａ−ｍａｔｅ３（ナカニシ）を用いてサンプルが包埋されていない余分なところをトリミングし、断面の面積を少なくした。（４）トリミングを行ったサンプルをミクロトーム（ＬＥＩＣＡ  ＲＭ２１５５）を用いて、２〜８  μｍの厚さで切片を調製し、１０  μｌの水滴をのせたスライドガラス（スーパーフロスト  Ｓ−９４４１、マツナミ）の上に置き、表面張力の力を利用して切片を平らにした。５０℃のオーブンで水分を蒸発してから顕微鏡観察を行った。
【００９３】
なお、当初はＧＵＳ染色に汎用される以下の組成の染色液を使用していたが、この染色法によると、木部の導管も染色されてしまう。酸化重合を助ける酸化性物質（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ、ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ）を染色液に加えないと、ＧＵＳ活性産物であるインドキシル誘導体が拡散してしまい、ＧＵＳ活性の存在する細胞でのインディゴ色素の生成が減少し、ＧＵＳ活性の存在しない細胞でインディゴ色素が生成されてしまい、非特異的な染色が生じてしまう（モデル植物実験プロトコール改訂３版、秀潤社、２００５年発行）。よって、これは非特異的な染色であると考えられたため、酸化性物質の濃度を従来の１０倍程濃くした上記の染色液を採用した。
［従来のＧＵＳ染色ｂｕｆｆｅｒ］
１００  ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）
０．５  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ
０．５  ｍＭ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００
【００９４】
１２．結果と考察
生育の各段階でＧＵＳ染色を行った結果、地上部においては、花弁や茎葉などの付け根で強いＧＵＳの染色（すなわち、ＡｔＰＧＰ２１の発現）が認められた。根部においては、すべての生育時期を通じて成熟した組織の維管束の外層部に強いＧＵＳの染色が認められた。図３に、ＧＵＳ染色された根部の横断面及び縦断面の切片を示す。このＧＵＳ染色の結果と内鞘細胞が維管束の外層部で多くみられるという事実から、ＡｔＰＧＰ２１は内鞘細胞で高発現していると考えられる。それゆえ本発明のプロモーターは、器官レベルでは「根部維管束の外層部」で任意のタンパク質を高発現させることができるプロモーターであるといえるが、細胞レベルでは「内鞘細胞」で任意のタンパク質を高発現させることができるプロモーターであるといえる。また、先端部と他の部分とでは濃淡に差がある。これは、先端部と他の部分とで細胞密度に差があるからと考えられる。なお、本書では、先端部も根部維管束の外層部に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図１はＡｔＰＧＰ２１及びその上流の模式図を示す。
【図２】図２はＡｔＰＧＰ２１プロモーター領域の配列を示す。
【図３】図３はＧＵＳ染色の写真を示す。
【図４】図４は切片試料の作製方法を図示する。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号４９は、プライマーである。
配列番号５０は、プライマーである。
【図１】
2008154496.tif 000005
【図２】
2008154496.tif 000006
【図３】
2008154496.tif 000007
【図４】
2008154496.tif 000008
【配列表】
2008154496000001.app