(57)【要約】【課題】本発明の目的は、添加剤を検討し、様々なＤＮＡ末端の連結を効率化するリガーゼ組成物、および使用方法を提供することである。また、それらを含有する試薬・キットおよび製造法を提供することである。【解決手段】（Ａ）ＤＮＡリガーゼ、（Ｂ）ポリエチレングリコール、（Ｃ）スペルミジン、（Ｄ）ベタインの各成分を含有するＤＮＡリガーゼ組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｄ）の各成分を含有するＤＮＡリガーゼ組成物。
（Ａ）ＤＮＡリガーゼ
（Ｂ）ポリエチレングリコール
（Ｃ）スペルミジン
（Ｄ）ベタイン
【請求項２】
請求項１に記載の組成物に加え、ＤＮＡ以外の「ライゲーション反応に必要な成分」を含むＤＮＡリガーゼ組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
【請求項５】
請求項１または２に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡの相補末端を効果的に連結するための新規ＤＮＡリガーゼ組成物、およびその方法に関わる。さらには、本組成物を含有する試薬および／またはキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡリガーゼは、隣接したＤＮＡの５’側のリン酸基と３’側の水酸基をホスホジエステル結合によって連結する酵素であり、様々な生物由来のものが知られている。その中でも、分子生物学実験で頻繁に用いられているのが、Ｔ４バクテリオファージに由来する「Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｅ．Ｃ．６．５．１．１）」である。この酵素は、反応にＭｇイオンとＡＴＰを要求し、平滑末端、及び突出末端の２本鎖ＤＮＡの連結や、２本鎖ＤＮＡのニック部分の修復に働くことが知られている。この他にも大腸菌に由来するＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  リガーゼや好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼなども頻繁に使用されている。
【０００３】
Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼとＥ．  Ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼが主に分子生物学実験におけるＤＮＡの連結反応に使用される一方、好熱性菌由来のＤＮＡリガーゼは、リガーゼチェインリアクション法などの診断用途に用いられることが多い。
【０００４】
近年、様々な分子生物学用試薬やキットが販売されるに至っている。その中、リガーゼ試薬も様々な工夫がなされてきている。特に、ＤＮＡ以外の反応に必要な全ての成分を含んだ組成物（ＤＮＡリガーゼ反応組成物）、すなわち１液タイプのリガーゼ試薬が世に出て久しい。１液タイプのリガーゼ試薬は、一般的には連結したいＤＮＡを含むＤＮＡ溶液と２：１〜１：０．５の比率で混合してライゲーションを行う。
【０００５】
分子生物学実験におけるＴ４  ＤＮＡ  リガーゼの使用の歴史は古く、１９７０年代まで遡ることができる。また、効率化の検討も種々行われており、特に添加剤を用いる検討の歴史は古い。
【０００６】
特許文献１には、ポリエチレングリコールなどの体積排除効果があり、かつＤＮＡと相互作用しないポリマーを、ライゲーション反応に添加することによる反応促進効果が記載されている。
【特許文献１】ＵＳ４５８２８０２
【０００７】
また、特許文献２には、（Ａ）ポリエチレングリコール、（Ｂ）ポリアミン、一価カチオン及び二価カチオンから成る群から選択した少なくとも１種のもの、が添加剤として挙げられており、（Ａ）と（Ｂ）をリガーゼと共存させることにより、反応効率を格段に向上させることができることが記載されている。
【特許文献２】特開昭６２−３６１８７
【０００８】
さらに、特許文献３には、ベタインを添加することによるＴＡクローニングの効率の向上の効果が記載されている。ＴＡクローニングとは、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどを使用したＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）での増幅ＤＮＡ断片の３’末端にアデニン（ｄＡ）が一塩基付加されることを利用するクローニング方法である。この一塩基付加は、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼなどが有する、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＴｄＴ）活性による。通常３’端にチミン（ｄＴ）の一塩基突出を有するベクター（通常Ｔベクターと呼ばれる）とＰＣＲプロダクトを混合し、リガーゼを反応させことによって行うことにより、ベクターとＤＮＡ断片を連結させる。本方法は、従来の制限酵素突出末端や、平滑末端を利用する方法にくらべ、迅速で簡便であるという利点があり、従来の方法に加えて頻繁に利用される方法のひとつとなっている。この方法は突出末端を用いる方法のカテゴリーに分類されるが、手法的には特許文献１及び２の時代にはなかった方法である。
【特許文献３】特開２００６−２５６３７
【０００９】
上記をまとめると、頻繁にライゲーション反応を行うＤＮＡ末端の形状は、突出末端もしくは平滑末端であり、突出末端は制限酵素で得られる末端とポリメラーゼのＴｄＴ活性によって付加された一塩基の突出からなる末端の２種類に分類され、それぞれの末端に適した効率化方法が開発されてきたことになる。しかし、使用する上で、すべての組み合わせで効果的であることが望まれているといえる。
【００１０】
一般的に、ライゲーション反応は、一本鎖の相補的な突出部分が長いほど効率が高くなると言われており、通常２塩基以上の突出末端が形成される制限酵素サイト間でのライゲーション反応は効率は問題となりにくい。これは、相補的一本鎖部分が容易にハイブリダイズしやすいことによると考えられている。
【００１１】
よって、本発明においては、一般的に効率が低いとされる、平滑末端ライゲーションとＴＡクローニングを主な評価対象として検討を実施した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、添加剤を検討し、様々なＤＮＡ末端の連結を効率化するリガーゼ組成物、および使用方法を提供することである。また、それらを含有する試薬・キットおよび製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
今まで様々なライゲーションの効率化方法が検討されてきたが、上でも述べたように様々な方法すべてに適応し得るような組成の検討はあまりなされていなかった。また、分子生物学実験においては、多くの場合、ベクターと目的遺伝子の連結が目的である場合が多く、実質、大腸菌への形質転換効率も含めた形で検討する配慮も必要となってくる。これは、ライゲーション組成を含んだままのライゲーション産物をそのまま用いて大腸菌を形質転換することが多いことに起因する。
【００１４】
よって、本発明においては、様々な切断末端を持つベクターとＤＮＡ断片を様々な添加剤の存在下でライゲーション反応を行った後、大腸菌へトランスフェクションすることで評価を行っている。
【００１５】
様々な条件を検討した結果、基本反応組成（Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ、トリスバッファー、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、およびＡＴＰ）に加え、ポリエチレングリコール、スペルミジン、及びベタインを添加することで、幅広い条件でライゲーション効率が向上することが明らかとなり、本発明に至ることができた。
【００１６】
本発明は以下の構成からなる
［項１］下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、及び（Ｄ）の各成分を含有するＤＮＡリガーゼ組成物。
（Ａ）ＤＮＡリガーゼ
（Ｂ）ポリエチレングリコール
（Ｃ）スペルミジン
（Ｄ）ベタイン
［項２］項１に記載の組成物に加え、ＤＮＡ以外の「ライゲーション反応に必要な成分」を含むＤＮＡリガーゼ組成物。
［項３］項１または２に記載の組成物を用いてリガーゼ反応を行う、ライゲーション反応方法。
［項４］項１または２に記載の組成物を含有する試薬および／またはキット。
［項５］項１または２に記載の組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬および／またはキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、様々な末端を有するＤＮＡ同士の連結反応を、従来法に比べ、より効率的に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、（Ａ）ＤＮＡリガーゼ、（Ｂ）ポリエチレングリコール、（Ｃ）スペルミジン、および（Ｄ）ベタインを含有することを特徴とするＤＮＡリガーゼの組成物である。
【００１９】
本発明においてＤＮＡリガーゼの種類は、特に限定されるものではないが、好ましくはＴ４ファージ由来のＴ４  ＤＮＡ  リガーゼを用いる。この酵素は、ファージを感染させた大腸菌の破砕物から調製したものや、Ｔ４ファージのリガーゼ遺伝子を大腸菌に組み換えて発現させ、その破砕物から調製されたものなど様々なものを用いることができる。特に、ＤＮＡ分解酵素などの混入の少ない高純度の高度を用いることが重要である。
【００２０】
本発明におけるポリエチレングリコールは、様々な分子量のものを使用することができるが、好ましくは分子量が２００−２０，０００、好ましくは５，０００−１０，０００、最も好ましくは６，０００を用いる。ポリエチレングリコールの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜３％（Ｗ／Ｖ）が好ましく用いられる。最も好ましくは０．７５〜１．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度で使用するのが良い。
【００２１】
本発明におけるスペルミジンは、ポリアミンの一種であり、様々な由来のものが販売されているが起源は特に限定されない。スペルミジンの濃度は、反応時の濃度として、０．１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．２〜２ｍＭで使用するのが良い。
【００２２】
本発明におけるベタインは、具体的にはトリメチルグリシンを指す。この分子は、グリシンのアミノ基にメチル基が３つ結合した構造を持つ。ベタインの濃度としては、反応時の濃度として、０．１〜１．５Ｍが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．５〜１．２５Ｍが好適に用いられる。
【００２３】
さらに本発明は、ＤＮＡリガーゼ、ポリエチレングリコール、スペルミジン、及びベタインに加え、ＤＮＡ成分以外のライゲーション反応に必要な成分を含むＤＮＡリガーゼ組成物である。ＤＮＡ成分以外のライゲーション反応に必要な成分とは、ＡＴＰ、マグネシウム、緩衝液成分、塩成分、及び還元剤などであり、特にＡＴＰとマグネシウムは反応の必須の成分であり重要である。
【００２４】
本発明に用いられるＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）は、アデノシンのリボースの５’位の水酸基にリン酸が３分子連続して結合したヌクレオチドのことを指す。ＡＴＰの濃度としては、反応時の濃度として、０．０１〜０．２ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、０．０２〜０．１ｍＭが好適に用いられる。
【００２５】
本発明に用いられるマグネシウムは、様々な塩を用いることができ、特に限定されないが、好ましくは塩化マグネシウムを用いる。塩化マグネシウムの濃度は、反応時の濃度として、１〜１０ｍＭが好ましく用いられる。最も好ましくは、２〜４ｍＭが好適に用いられる。
【００２６】
緩衝液成分はｐＨを至適条件に保つのに重要である。Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼの反応は、ｐＨ７．５前後が最も至適とされており、ｐＨ７．５前後のｐＨを保つことのできるバッファー成分を含むことが好ましい。バッファーとしては特に限定されるものではないが、トリス緩衝液やＨＥＰＥＳ緩衝液が好適に用いられる。特に、トリス−塩酸緩衝液が最も好ましい。緩衝液の濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられるが、最も好ましくは２０〜５０ｍＭが最も好適用いられる。
【００２７】
塩成分としては、塩化ナトリウムや塩化カリウムなどの一般的なアルカリ土類金属の塩を用いることができる。特に、塩化ナトリウムが好適に用いることができる。塩化ナトリウムの濃度は、反応時の濃度として、１０〜１００ｍＭが好適に用いられ、特に、好ましくは２０〜５０ｍＭが用いられる。
【００２８】
還元剤成分としては、２−メルカプトエタノールやジチオスレイトール（ＤＴＴ）など、一般的に生化学実験で用いられている還元成分を用いることができ、特に限定されない。特に好ましくは、還元維持能力の高いＤＴＴが用いられる。ＤＴＴの濃度は、反応時の濃度として、０．５〜１０ｍＭが好適に用いられる。特に好ましくは、１〜５ｍＭが用いられる。
【００２９】
本発明では、上に記述したような成分を含む組成物を１液で供給する。Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼは凍結融解や長期保存に対して安定な性質を有していることから、この用途には好適に用いることができる。
【００３０】
また本特許は、上記組成物を用いてリガーゼ反応を行うことを特徴とする。具体的には、ＤＮＡと上述の成分、酵素を混合して反応を行う。また、ＤＮＡ以外の成分を予め混合しておいて、ＤＮＡ成分と、１：１や０．５：１などの比率で混合して反応させることもできる。
【００３１】
反応に用いるＤＮＡ断片は、基本的には２本鎖であり、末端が相補的である必要がある。様々なパターンの連結反応が予想されるが、大きく分けると、突出末端を有するＤＮＡ同士、及び平滑末端を有するＤＮＡ同士の連結が考えられる。突出末端には、５’側のＤＮＡ鎖の突出したものと、３’側のＤＮＡ鎖の突出したものの２種類が考えられる。それらの多くは、制限酵素によって作り出される末端である。一方、平滑末端を有する断片は、末端の配列に関わらず連結することが可能である。
【００３２】
また、ＤＮＡポリメラーゼの作用により作り出される、３’末端にアデニンが一塩基基突出したＤＮＡ断片を、３’側にチミンが一塩基基突出したベクター（Ｔベクター）に連結するクローニング方法（ＴＡクローニング）が近年盛んに行われるようになっている。この方法にも本発明を用いることができる。
【００３３】
上でも述べたが、リガーゼによる連結反応が生じるには、ＤＮＡの５’側の末端がリン酸化されている必要がある。２本鎖の連結が連結されるには、最低片方の鎖が連結される必要がある（片方のみが連結された場合は、もう片方は連結されないが、ＤＮＡ断片としては連結されたことになる）。少なくとも片方のＤＮＡ断片の５’末端がリン酸化されていることが、２本鎖ＤＮＡの連結反応には必要である。多くの場合、片方だけが連結されたＤＮＡは、大腸菌などへ導入すると、大腸菌の修復機構で連結されることが知られている。
【００３４】
さらに、本発明は、上記組成物を含有する試薬・キットにも関する。また、組成物を１液で供給することを特徴とする、試薬・キットにも関する。該組成物を１液で供給することは、実験の簡便性において、大きな利点であり、好ましい供給形態であるといえる。
【００３５】
本発明の実施の一態様としては、ＤＮＡとリガーゼ以外の上述の成分を含む溶液と、リガーゼを含む、ライゲーション用キットを挙げることができる。
【００３６】
また、本発明の実施の一態様としては、ＤＮＡ以外のライゲーション反応に必要な上述の成分を含む１液のライゲーション試薬を挙げることができる。
【実施例】
【００３７】
以下に本発明の実施例を挙げることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
【００３８】
実施例１：ＴＡクローニング効率に及ぼす添加剤種類の検討
最終濃度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  塩化マグネシウム（ナカライテスク製）、０．１ｍＭ  ＡＴＰ（東洋紡製）、４ｍＭ  ＤＴＴ（ナカライテスク製）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ナカライテスク製）、０．１Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ（東洋紡製）からなる基本組成に、様々な添加剤を添加したリガーゼ組成物を調製した。調製した組成物の種類は以下に示すとおりである。添加物はすべてナカライテスクより購入して使用した。
Ｐ  ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００
Ｐ＋Ｓ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００＋３ｍＭ  スペルミジン
Ｐ＋Ｂ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００＋２Ｍ  ベタイン
Ｓ＋Ｂ：基本組成＋３ｍＭ  スペルミジン＋２Ｍ  ベタイン
Ｐ＋Ｓ＋Ｂ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）ＰＥＧ６，０００＋３ｍＭ  スペルミジン＋２Ｍ  ベタイン
クローニングする（ベクターに連結する）ＤＮＡはＰＣＲ法を用いて調製した。具体的には、２種類のプライマー（５’−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴ−３’、および：５’−ＧＧＴ−ＴＡＴ−ＣＧＡ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＧ−ＣＧＣ−Ｃ−３’）を使用し、λファージＤＮＡ（東洋紡製）を鋳型として、ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を準備した（Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて増幅したＤＮＡ断片の３’末端には、主にアデニンが一塩基付加されている）。増幅反応は、ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの取扱い説明書に従い、増幅後、１％アガロースゲルを用いた電気泳動解析でバンドが生じていることを確認した。増幅したＤＮＡ断片は、精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ  ＆  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−：東洋紡製）を用いて精製し、濃度測定の後、使用した。
一方、クローニングベクターは、ＴＡクローニングキット（ＴＡｒｇｅｔ  Ｃｌｏｎｅ：東洋紡製）に添付されているＴベクター（ｐＴＡ２）を用いた。
ライゲーション反応は、以下のように行った。上記ＤＮＡ断片（７５  ｆｍｏｌ）とＴベクター（２５ｆｍｏｌ）を含有する７．５μｌの溶液に、上記リガーゼ組成物７．５μｌを添加し、１６℃で３０分間反応させ実施した。
評価は、連結産物でＤＨ５αを形質転換し、生じてくるコロニー数で評価を行った。今回用いたｐＴＡ２ベクターは、目的ＤＮＡが挿入された場合、Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ寒天培地上で白いコロニーを形成し、目的ＤＮＡが挿入されなかった場合は青いコロニーを形成する性質を有している。
形質転換は、具体的には以下のように実施した。すなわち、連結反応の終了したベクター溶液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡製）１００μｌと混和後、氷上に３０分間放置し、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、その一部を５０μｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び０．２５％Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ナカライテスク製）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した後、生じたコロニー数をカウントした。
その結果を図１に示した。図１から分かるように、Ｐ＋Ｓ＋Ｂの組み合わせにおいて、極めて高い効率が得られていることが分かる。また、ここには示さなかったが、ＤＮＡ溶液に対して、１／２、つまり３．７５μｌ、を添加したものについても有意に高い効果を確認できた。
また、同様の評価系を用いて、それぞれの添加物の至適濃度を調べた結果を以下に示す。
表１は、基本組成＋２．５％ＰＥＧ６，０００＋２Ｍベタインを用いた場合のスペルミジンの濃度効果（濃度は調製試薬中：反応時の終濃度はこの１／２の濃度）を示す。
０．２〜４ｍＭのスペルミジンで良好な結果が得られた。さらに、ＰＥＧ６０００を０．５、１、２．５および５％のうちいずれかと、ベタインを０．５、１、２および３Ｍのうちいずれかの組み合わせにおいても、０．２〜４ｍＭのスペルミジンで良好な結果が得られた。
【００３９】
【表１】
2008271833.tif 000002
【００４０】
表２は、基本組成＋３ｍＭ  スペルミジン＋２Ｍベタインを用いた場合のＰＥＧ＃６，０００の濃度効果（濃度は調製試薬中：反応時の終濃度はこの１／２の濃度）を示す。
０．５〜５％のＰＥＧ６０００で良好な結果が得られた。さらに、スペルミジンを０．２、０．５、１および４ｍＭのうちいずれかと、ベタインを０．５、１、２および３Ｍのうちいずれかの組み合わせにおいても、０．５〜５％のＰＥＧ６０００で良好な結果が得られた。
【００４１】
【表２】
2008271833.tif 000003
【００４２】
表３は、基本組成＋３ｍＭ  スペルミジン＋２．５％ＰＥＧ６，０００を用いた場合のベタインの濃度効果（濃度は調製試薬中：反応時の終濃度はこの１／２の濃度）を示す。
０．５〜３Ｍのベタインで良好な結果が得られた。さらに、スペルミジンを０．２、０．５、１および４ｍＭのうちいずれかと、ＰＥＧ６０００を０．５、１、２．５および５％のうちいずれかの組み合わせにおいても、０．５〜３Ｍのベタインで良好な結果が得られた。
【００４３】
【表３】
2008271833.tif 000004
【００４４】
この結果より、これら３成分はある程度の濃度以上の幅広い濃度で強調して働くことがし示された。また、ＰＥＧについては、６，０００以外に、２０，０００においてもほぼ同様の効果を示すことが示されている。
【００４５】
実施例２：保存安定性
実施例１のＰ＋Ｓ＋Ｂの試薬を−２０℃にて１ヶ月保存した後、用事調製した同じ試薬とクローニング効率を比較した。また、用事調製品を１０回凍結融解したものとも比較を行った。方法は実施例１の方法に準じた。保存安定性試験結果を表４に示す。
【００４６】
【表４】
2008271833.tif 000005
【００４７】
結果、活性が保持されており、１液試薬として問題なく供給できることが示された。
【００４８】
実施例３：平滑末端連結の効率に及ぼす添加剤種類の検討
最終濃度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、８ｍＭ  塩化マグネシウム（ナカライテスク製）、０．１ｍＭ  ＡＴＰ（東洋紡製）、４ｍＭ  ＤＴＴ（ナカライテスク製）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ナカライテスク製）、０．１Ｕ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ（東洋紡製）からなる基本組成に、様々な添加剤を添加したリガーゼ組成物を調製した。調製した組成物の種類は以下に示すとおりである。添加物はすべてナカライテスクより購入して使用した。
Ｐ  ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００
Ｐ＋Ｓ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００＋３ｍＭ  スペルミジン
Ｐ＋Ｂ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００＋２Ｍ  ベタイン
Ｓ＋Ｂ：基本組成＋３ｍＭ  スペルミジン＋２Ｍ  ベタイン
Ｐ＋Ｓ＋Ｂ：基本組成＋２．５％（Ｗ／Ｖ）  ＰＥＧ６，０００＋３ｍＭ  スペルミジン＋２Ｍ  ベタイン
クローニングするＤＮＡはＰＣＲ法を用いて調製した。具体的には、５’末端をあらかじめリン酸化した２種類のプライマー（５’−ＧＡＴ−ＧＡＧ−ＴＴＣ−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＧＴＡ−ＣＡＡ−ＣＴ−３’、および：５’−ＧＧＴ−ＴＡＴ−ＣＧＡ−ＡＡＴ−ＣＡＧ−ＣＣＡ−ＣＡＧ−ＣＧＣ−Ｃ−３’）を使用し、λファージＤＮＡ（東洋紡製）を鋳型として、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたＰＣＲ試薬：ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−（東洋紡）を用いて、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を準備した（ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅは、強い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片の末端は平滑化されている）。プライマーのリン酸化は、Ｔ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡製）を用い、取扱説明書に従って行った。増幅反応は、ＫＯＤ  −Ｐｌｕｓ−の取扱い説明書に従い、増幅後、１％アガロースゲルを用いた電気泳動解析でバンドが生じていることを確認した。増幅したＤＮＡ断片は、精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ  ＆  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ−：東洋紡製）を用いて精製し、濃度測定の後、使用した。
一方、クローニングベクターの調製は、まず、ｐＵＣ１９ベクター（東洋紡製）を制限酵素Ｈｉｎｃ  ＩＩを用いて消化し（Ｈｉｎｃ  ＩＩは平滑末端を生じる）、精製キットを用いて精製を行った。その後、大腸菌由来アルカリホスファターゼ（東洋紡製）を用いて脱リン酸化を行った。具体的には、添付緩衝液と酵素を至適濃度になるように添加した後、６０℃で３０分間反応させた。反応後、ベクターを同様に、精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −ＰＣＲ  ＆  Ｇｅｌ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ：東洋紡製）を用いて精製し、濃度測定の後、使用した。
ライゲーションは、以下のように行った。上記ＤＮＡ断片（７５  ｆｍｏｌ）とＴベクター（２５ｆｍｏｌ）を溶解した７．５μｌの溶液に、上記リガーゼ組成物７．５μｌを添加し、１６℃で３０分間反応させ行った。
評価は、実施例１動揺に、連結産物でＤＨ５αを形質転換し、生じてくるコロニー数で評価を行った。
形質転換は、具体的には、以下のように実施した。すなわち、連結反応の終了したベクター溶液１０μｌを大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡製）１００μｌと混和後、氷上に３０分間放置した後、４２℃で３０秒間ヒートショックを行い、その一部を、２００μｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）、及び０．２５％Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：ナカライテスク製）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１６時間培養した後、生じたコロニー数をカウントした。
その結果を図２に示した。図２から分かるように、Ｐ＋Ｓ＋Ｂの組み合わせにおいて、極めて高い効率が得られていることが分かった。このことにより、本発明の有意性を示すことができた。
また、本実施例では示さなかったが、制限酵素Ｈｉｎｄ  ＩＩＩの切断によって生じる突出末端を用いたライゲーション実験においても実証実験を行っており、高い効率を示すことを確かめている。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
分子生物学実験に用いられるライゲーショ試薬・キットに好適に用いられる。特に、広く用いられている高効率ライゲーション試薬・キットへの応用は、産業上の大きな進歩であると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ＴＡクローニング効率に及ぼす添加剤種類の検討
【図２】平滑末端連結効率に及ぼす添加剤種類の検討
【図１】
2008271833.tif 000006
【図２】
2008271833.tif 000007