(57)【要約】【課題】低濃度から高濃度まで幅広い範囲で濃度を測定することのできる、電気化学式のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）測定装置を提供する。【解決手段】絶縁性の基板１と、前記絶縁性の基板のある端に形成された検体の取り込み口４と、前記基板上に形成された複数の電極部１８及び１９と、酵素及び試薬を含む反応層７・８とから構成され、前記反応層の構成成分は全て同一であるが、特定の酵素あるいは試薬濃度が各々異なる反応層にすることで、１装置で同一試料の濃度測定に対して異なった濃度測定範囲を保持することを可能にし、結果幅広い範囲で濃度を測定することができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性の基板と、前記基板上に形成された複数の電極部と、酵素及び試薬を含む複数の反応層と、光を使用する事無く前記複数の電極部における電流値を検出する装置と前記複数の電極部との接続端子と、から構成され、
前記複数の反応層は、前記電極部毎に形成され、前記反応層の構成成分の種類は全て同一であり、特定の酵素濃度が各々異なるものであるＡＴＰ測定装置。
【請求項２】
前記複数の反応層が、それぞれ、同一の検体の異なる濃度範囲を測定するものである請求項１記載のＡＴＰ測定装置。
【請求項３】
前記複数の反応層が、全ての反応層において同一の時間で検体を測定可能なように各反応層の反応速度を異ならせたものである請求項１に記載のＡＴＰ測定装置。
【請求項４】
前記複数の反応層のそれぞれにおける各電極部での測定結果から１つの濃度を得るものである請求項１に記載のＡＴＰ測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰと略す）を測定するための装置に関するものである。
本発明は、ＡＴＰを測定するための装置に関し、より詳細には、ＡＴＰを電気化学的に測定する装置の、幅広い濃度を検出可能にする技術に関する。
本発明は、ＡＴＰを測定するための装置に係り、特に酵素センサに好適に利用できるものである。
【背景技術】
【０００２】
ＡＴＰは、多くの生物体のエネルギー代謝に関与している。生体内で起こる種々の化学反応には、ＡＴＰが加水分解されてＡＤＰまたはＡＭＰとなる際に放出されるエネルギーを利用して行われるものが多い。また、ＡＴＰは、生体内においてリボ核酸（ＲＮＡ）の前駆体、生体内リン酸化反応におけるリン酸供与体などとしても利用される。
このように、ＡＴＰは、生体において極めて重要な役割を果たす化合物であることから、ＡＴＰの測定は、様々な分野において、重要な役割を担っている。
【０００３】
例えば、食品衛生分野においては、細菌などの微生物や、微生物による汚染の温床となる食物残渣など、汚染の程度の指標として利用される。また、生細胞数、細胞の代謝変化のモニタリングや、食品の成熟度や腐敗度などを含む食品の品質管理、水質浄化における水質検査など、様々な指標として用いられている。
【０００４】
従来から、ＡＴＰを測定する方法として生物発光法であるルシフェリン−ルシフェラーゼ反応を利用した方法が知られている。この方法は、二価の金属イオン存在下、試料から抽出したＡＴＰにルシフェリンおよびルシフェラーゼを作用させることで発光させる。この発光は、１分子あたり１個のフォトンが放出されるので、発光時間に対する値を積分することによってＡＴＰを定量的に検出できる。
【０００５】
しかしながら、ルシフェリン−ルシフェラーゼによる生物発光法は、ＡＴＰを迅速に定量できる利点がある反面、発光が非常に短時間で消失する発光安定性が悪いという課題を有していた。この発光安定性の課題を解決すべく、ＡＴＰ再生反応系を形成することで、発光を減衰することなく発光安定性を獲得する方法が考案された（特許文献１参照）。
【０００６】
この方法を以下詳細に説明する。まず、ＡＭＰ、ピロリン酸、ホスホエノールピルビン酸およびマグネシウムイオンに、ピルビン酸オルトホスフェイトジキナーゼを作用させることにより、ＡＴＰ、ピルビン酸およびリン酸を生成させる反応（反応１）を行う。次いでＡＴＰ、ルシフェリン、溶存酸素およびマグネシウムイオンに、ルシフェラーゼを作用させることにより、ＡＭＰ、ピロリン酸、オキシルルシフェリン、炭酸ガスおよび光を生じせしめる反応（反応２）を行う。前記反応１と反応２を組み合わせ、繰返し反応させることでＡＴＰの再生反応系が形成され、発光安定性を獲得できる。この反応を以下に示す。
【化１】
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【０００７】
また、試料中のＡＴＰに、ＡＭＰとミオキナーゼとを反応させて、二分子のＡＤＰに変換させる反応（反応３）と、ポリリン酸化合物の存在下で、ＡＤＰとポリリン酸キナーゼとを反応させて、ＡＴＰとポリリン酸化合物に変換させる反応（反応４）において、反応３と反応４を一対の反応系となし、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増幅させ、増幅されたＡＴＰを生物発光法により検出することで、極微量のＡＴＰを検出する方法も考案されている（特許文献２参照）。この反応を以下に示す。
【０００８】
しかしながら、前記生物発光法を基とした従来技術は、発光検出装置が高価な上、光学経路や集光部、受光部等の光学系の空間を必要とし、小型化が困難であり、食品検査等の各現場簡易に測定する用途には不向きである。
【０００９】
また、一般的に、発光検出法による分析方法は、濁りのある試料には適用困難である。したがって、上記手法では、牛乳や血液のような濁度の高い試料は、そのまま測定することが困難で、測定前に、濁りの要因となっている物質を除去する処理や、溶解するための処理、または試料を希釈する必要があるという課題を有していた。
【化２】
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【００１０】
一方、電気化学的測定方法として、グルコースオキシダーゼとヘキソキナーゼを用いたＡＴＰ測定法が提案されている（特許文献３参照）。本測定法は、グルコースに対してグルコースオキシダーゼとヘキソキナーゼとの競合反応の割合がＡＴＰの量によることを利用したものである。
【００１１】
また、ＡＴＰ加水分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）を作用させることにより、ＡＴＰを加水分解させ、水素イオンを生成することを利用し、そのｐＨ変化を水素イオン感応性電界効果型トランジスタで検出するＡＴＰ測定法も提案されている（特許文献４および特許文献５参照）。
【００１２】
電気化学的な測定方法では、生物発光法の課題である、光学系のスペースが不要であり、また濁度に関係なく測定できる。さらに、電気化学的な測定方法は、人工電子受容体（メディエータ）を用いることで、溶存酸素のない試料を測定できるという利点を有する反面、ＡＴＰ測定感度が、１０-4Ｍ〜１０-6Ｍ程度に過ぎず、食品衛生分野など、実用に用いられる感度といわれている１０-12Ｍ〜１０-7Ｍに到達しておらず、高感度な電気化学式のＡＴＰ測定方法は実現されていなかった。
【００１３】
【特許文献１】特開平９−２３４０９９号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３９０号公報
【特許文献３】特開昭６０−１７３４７号公報
【特許文献４】特開昭６１−１２２５６０号公報
【特許文献５】特開昭６１−２６９０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
そこで、発明者らのグループでは、ＡＴＰを高感度に電気化学的に測定する手法として、試料中のＡＴＰに、ＡＭＰとミオキナーゼとを反応させて、二分子のＡＤＰに変換させる反応（ＡＴＰ増幅反応）と、リン酸供与体の存在下で、ＡＤＰとリン酸化酵素とを反応させて、ＡＴＰと脱リン酸化されたリン酸供与体に変換させる反応（ＡＴＰ再生反応）において、ＡＴＰ増幅反応とＡＴＰ再生反応を一対の反応系となし、その反応回数に応じて２のべき乗でＡＴＰを増幅させ、反応の過程で発生する脱リン酸化されたリン酸供与体をＡＴＰ量として換算せしめ、酸化還元酵素を使用して、該脱リン酸化されたリン酸供与体の酸化還元反応を電気化学的に検出することを特徴とするアデニンヌクレオチドの測定方法を提案している（特願２００５−３２８９６２号）。
【化３】
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【００１５】
これによって、低濃度の検体を、電気化学式で測定できる濃度にまで増幅して測定することが可能になり、測定装置の小型化が実現でき、濁りの原因となる物質の前処理操作不要な高感度電気化学式のアデニンヌクレオチドの測定方法を提供することが可能になった。
【００１６】
しかしながら、この構成では、ＡＴＰ測定のもうひとつの課題である、広い濃度範囲を短時間に電気化学式で測定することができないという課題を有していた。
【００１７】
図１に、ＡＴＰ測定に必要な感度と、現存する発光による測定の感度の関係を示している。同図に示すように、ＡＴＰ測定に必要な感度は、１０-12Ｍ〜１０-6Ｍであり、６桁の幅広いレンジで定量化できる必要がある。発光で検出する場合、この感度（１０-12Ｍ〜１０-6Ｍ）のまま測定可能である。
【００１８】
電気化学式で安価に例えば酵素反応を使用したチップで測定する範囲は、例えば１０-3Ｍから１０-4Ｍ、高感度で１０-6Ｍレベルという２〜３桁レベルである。前述の増幅技術を使用することにより、ＡＴＰ測定に必要な最も低い濃度１０-12Ｍに対して増幅を実施し、電気化学的に検出可能な感度である１０-6Ｍあるいはそれ以上に濃度をあげることが可能である。その例を図２に示している。この増幅技術を使用すれば、例えば１０-6以上に増幅することが可能であり、１０-12Ｍ〜１０-6Ｍを低感度の電極で測定できる。しかし、電気化学的測定において、広範囲な濃度を測定する様な電極は、従来の例えば血糖値センサの様な電気化学的センサや酵素反応を利用した酵素電極センサ等では存在しない。よって、増幅を実施した場合、低濃度に対応すると、高濃度が飽和してしまい定量できないといった問題を有する。
【００１９】
また、もうひとつの考え方として、ある電気化学的に測定可能な一定濃度に達するまでの時間を計測して、濃度を割り出すという手法も考えられる。ただこの場合も、測定濃度の幅が幅広い為、発明者らが試した実験では、例えば１０-6Ｍを４分程度で測定できる酵素活性を利用しても、１０-10Ｍは１５分程度かからないと測定できない等、測定濃度に依存して測定に必要な時間が多大な影響を受ける。すなわち、測定装置として実現する際に測定時間に大きなムラが発生するという問題を有する。
【００２０】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、電気化学式で、低濃度から高濃度までの広い範囲を短時間で測定できるＡＴＰ測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明のＡＴＰ測定装置は、絶縁性の基板と、前記基板上に形成された複数の電極部と、酵素及び試薬を含む複数の反応層と、光を使用する事無く前記複数の電極部のそれぞれにおける電流値を検出する装置と前記複数の電極部との接続端子と、から構成され、前記複数の反応層が、前記電極部毎に形成され、前記反応層の構成成分の種類は全て同一であり、特定の酵素濃度が各々異なるものである。
上記構成によれば、電気化学式の測定法により、広い濃度範囲を短時間で測定できる。
【００２２】
また、本発明のＡＴＰ測定装置は、前記複数の反応層が、それぞれ、同一の検体の異なる濃度範囲を測定するものである。
【００２３】
また、本発明のＡＴＰ測定装置は、前記複数の反応層が、各反応層の反応速度を変えることによって、全ての反応層において同一の時間で検体を測定するものである。
【００２４】
さらに、本発明のＡＴＰ測定装置は、前記複数の反応層のそれぞれにおける各電極部での測定結果から１つの濃度を得るものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のＡＴＰ測定装置によれば、幅広い濃度の電気化学式測定を、短時間で実現することができる。したがって、小型で、かつ、濁りの原因となる物質の処理操作が不要なＡＴＰ測定装置を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に、本発明のＡＴＰ測定装置の実施の形態を図面とともに詳細に説明する。
【００２７】
本発明のＡＴＰ測定装置の説明に先立ち、発明者らのグループが提案する、ＡＴＰを高感度に電気化学的に測定する手法について、詳細に説明する。
下記は、この測定手法の概略を示すスキームである。
【００２８】
【化４】
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【００２９】
このアデニンヌクレオチドの測定手法は、下記工程Ａ〜Ｃまたはそれらを行う手段によって実現される。
ＡＴＰを酵素Ｅ1によりＡＤＰに変換させる工程Ａ、
ＡＤＰおよびリン酸供与体Ｐ2を酵素Ｅ2によりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'に変換させる工程Ｂ、および
供与体Ｐ2'を酸化還元反応に供することで供与体Ｐ2'を電気化学的に測定する工程Ｃ。
【００３０】
尚、本発明において、アデニンヌクレオチドとは、主としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＡＤＰ（アデノシン二リン酸）、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）、およびその類似体、の各々またはその組み合わせを示す。
また、本発明における測定とは、たとえば存在の有無を確かめる検出や、存在量を測る定量などを表す。
【００３１】
工程ＡでＡＴＰが酵素Ｅ1によりＡＤＰに変換され、工程ＢでＡＤＰおよびリン酸供与体Ｐ2が酵素Ｅ2によりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'に変換される。そして工程Ａと工程Ｂが一対となり、一対の反応がｎ回起きるとｎ個の脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'が生じる。このように、リン酸供与体Ｐ2を過剰に存在させることにより、反応系に存在するアデニンヌクレオチドの量に比例して脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'が生じるので、脱リン酸化されたリン酸供与体の量を測定することにより、検査対象中のアデニンヌクレオチドの量を求めることができる。尚、この反応系において測定されるアデニンヌクレオチドの量は正確にはＡＴＰとＡＤＰの合計量であるが、一般的な検査対象においてはＡＤＰが残存している可能性は低いため、本願においては単純化してＡＴＰ量と見做す。
【００３２】
また、上述のように工程Ａと工程Ｂが一対となり繰り返し反応が生じるため、産出される脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'の量は時間にも比例して増えていく。これにより、ごく低濃度のサンプルであっても高い感度で測定することができる。
【００３３】
さらに、工程ＡはＡＭＰおよびＡＴＰを酵素Ｅ1により２個のＡＤＰに変換させる工程であることも好ましい。この場合、工程Ａおよび工程Ｂの酵素反応が一対となり、その一対の酵素反応をｎ回おこなうことで２n個の供与体Ｐ2'が生成するので、短時間で感度を大幅に向上できる。この場合、リン酸供与体Ｐ2に加えてＡＭＰの量を過剰量存在させることにより、検査対象中のＡＴＰおよびＡＤＰの合計量を測定することができる。また、ＡＴＰおよび／またはＡＤＰを過剰量存在させると、全体の反応量（すなわち脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'の量）はＡＭＰの量に比例するので、検査対象中のＡＭＰの量を測定することもできる。
また、本発明においては、Ｃ工程を介することにより、電気化学的に測定することが可能となり、簡単な装置を用いて短時間に測定することが可能となる。
以下、各工程について詳述する。
【００３４】
まず、工程Ａについて詳述する。
工程Ａで使用する酵素Ｅ1として、上述のようにＡＴＰをＡＤＰに分解する酵素であれば特に限定されず、たとえば下記のようなものがあげられる。
１）ＥＣ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｄｅ)２．７．に属するリンを含む基を転移するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
２）ＥＣ３．５．に属するペプチド結合以外のＣ−Ｎ結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
３）ＥＣ３．６．に属する酸無水物に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
４）ＥＣ４．１．に属する炭素−炭素結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
５）ＥＣ４．６．に属するリン−酸素結合に作用するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
６）ＥＣ６．２．に属する炭素−硫黄結合を生成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
７）ＥＣ６．３．に属する炭素−窒素結合を生成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
８）ＥＣ６．４．に属するリン酸エステル結合を合成するＡＴＰからＡＤＰに変換する酵素
また、上記したようにＡＭＰとＡＴＰを基質として２ＡＤＰを作る酵素も好ましい。このような酵素としては、たとえばミオキナーゼがあげられる。
【００３５】
次に工程Ｂについて詳述する。
工程Ｂにおいて、リン酸供与体Ｐ2は反応系に対して過剰に存在させることが必要である。ここで、過剰量とは、後述する電気化学的測定法に供するのに充分な量であり、多いほうが好ましく、測量対象および検体に応じて適宜設定することができる。
リン酸供与体Ｐ2としては、ＡＤＰとともに酵素Ｅ2の基質となりＡＴＰおよび脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'となるものであれば特に制限されず、酵素Ｅ2とともに適宜選択される。
リン酸供与体Ｐ2および酵素Ｅ2の好ましい組み合わせについては後述する。
【００３６】
次に工程Ｃについて詳述する。
工程Ｃは、脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'を酸化還元反応に供することで供与体Ｐ2'を電気化学的に測定する工程である。
酸化還元反応は脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'に対して酸化型電子受容体Ｐ3を反応させることにより酸化して酸化した脱リン酸化されたリン酸供与体Ｐ2'に、電子受容体が還元型Ｐ3'となることによって行われる。本発明においてはこの還元型の電子受容体の量もアデニンヌクレオチドの量に比例する（基本的に同じとなる）ので、還元型の電子受容体の量を電気化学的検出手段によって測定することで、アデニンヌクレオチドの量を知ることが可能となる。還元型の電子受容体は、電気化学的測定手段により再度酸化型の電子受容体となり、工程Ｃの反応に循環的に利用されることが好ましい。尚、酸化型の電子受容体についてもリン酸供与体Ｐ2と同様に反応系に過剰にある必要があるが、電子受容体が電気化学的測定手段によって再利用される場合はそれも鑑みて量を設定できる。
ここで酸化還元反応は好ましくは酵素Ｅ3によって触媒される酵素反応である。
酵素Ｅ3は、基質となる供与体Ｐ2'の種類により適宜選択される。
工程Ｃにおいて、電子受容体として電子メディエータを用いることが好ましい。
電子メディエータは、酸化還元酵素反応において、酵素と電極間の電子伝達を触媒する化合物であり、溶存酸素の存在しない試料の測定を可能となるので好ましい。
具体的には、たとえばフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムなどを用いることが好ましい。
また、該供与体Ｐ2'を酸素分子を消費する酸化還元反応に供し、消費された酸素量を検出することも、既存の酸素分子測定手段を利用できるので好ましい。
あるいは、該供与体Ｐ2'を過酸化水素を産生する酸化還元反応に供し、産生した過酸化水素量を検出することも好ましい。
ここで、電気化学的測定手段としては、たとえば電流、電圧、電気量、インピーダンスなどを用いた測定手段があげられる。
電気化学的に測定することで、前述したように発光などの従来の測定手段に比べて簡単な装置を用いて短時間に測定することが可能となる。さらに、本願の測定手段で検出される電気化学的量を予め各基質量において測定して検量線を引いておくなどの方法で、任意の測定対象に含まれる基質を容易に定量することも可能となる。
【００３７】
以下に、リン酸供与体Ｐ2および酵素Ｅ2、ならびに酵素Ｅ3とその他の基質の好ましい組み合わせを示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３８】
（１）Ｅ2：ピルビン酸キナーゼ（ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ピルビン酸）Ｅ3：ピルビン酸オキシダーゼ（ピルビン酸＋Ｏ2＋リン酸＋Ｈ2Ｏ→アセチルリン酸＋Ｈ2Ｏ2＋ＣＯ2）
【００３９】
（２）Ｅ2：ピルビン酸キナーゼ（ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ピルビン酸）Ｅ3：ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ピルビン酸＋酸化型電子受容体＋リン酸＋→アセチルリン酸＋還元型電子受容体＋ＣＯ2）
【００４０】
（３）Ｅ2：グルコキナーゼ（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）Ｅ3：グルコースオキシダーゼ
（Ｄ−グルコース＋Ｏ2→Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋Ｈ2Ｏ2）
【００４１】
（４）Ｅ2：グルコキナーゼ（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）Ｅ3：ピラノースオキシダーゼ
（Ｄ−グルコース＋Ｏ2→２−デヒドロ−Ｄ−グルコース＋Ｈ2Ｏ2）
【００４２】
（５）Ｅ2：グルコキナーゼ（ＡＤＰ＋Ｄ−グルコース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコース）Ｅ3：グルコースデヒドロゲナーゼ
（Ｄ−グルコース＋酸化型電子受容体→Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン＋還元型電子受容体）
【００４３】
（６）Ｅ2：ガラクトキナーゼ（ＡＤＰ＋α−Ｄ−ガラクトース１−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−ガラクトース）Ｅ3：ガラクトースオキシダーゼ
（Ｄ−ガラクトース＋Ｏ2→Ｄ−ガラクト−ヘキソジアルドース＋Ｈ2Ｏ2）
【００４４】
（７）Ｅ2：グルコノキナーゼ（ＡＤＰ＋６−ホスホ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋Ｄ−グルコネート）Ｅ3：グルコネート−２−デヒドロゲナーゼ
（Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体→２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体）
【００４５】
（８）Ｅ2：デヒドログルコノキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート）Ｅ3：グルコネート−２−デヒドロゲナーゼ
（２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体→Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体）
【００４６】
（９）Ｅ2：デヒドログルコノキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート→ＡＴＰ＋２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート）Ｅ3：デヒドログルコネートデヒドロゲナーゼ
（２−デヒドロ−Ｄ−グルコネート＋酸化型電子受容体→２，５−ジデヒドロ−Ｄ−グルコネート＋還元型電子受容体）
【００４７】
（１０）Ｅ2：アデノシンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＡＭＰ→ＡＴＰ＋アデノシン）Ｅ3：ヌクレオシドオキシダーゼ
（アデノシン＋２Ｏ2→９−リブロノシルアデニン＋２Ｈ2Ｏ2）
【００４８】
（１１）Ｅ2：グリセロンキナーゼ
（ＡＤＰ＋グリセロンリン酸→ＡＴＰ＋グリセロン）Ｅ3：グリセロールデヒドロゲナーゼ
（グリセロン＋還元型電子受容体→グルセロール＋酸化型電子受容体）
【００４９】
（１２）Ｅ2：グリセロールキナーゼ
（ＡＤＰ＋ｓｎ−グリセロール３−リン酸→ＡＴＰ＋グリセロール）Ｅ3：グリセロールデヒドロゲナーゼ
（グリセロール＋酸化型電子受容体→グリセロン＋還元型電子受容体）
【００５０】
（１３）Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）Ｅ3：コリンオキシダーゼ
（コリン＋Ｏ2→ベタインアルデヒド＋Ｈ2Ｏ2）
【００５１】
（１４）Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）Ｅ3：コリンデヒドロゲナーゼ
（コリン＋酸化型電子受容体→ベタインアルデヒド＋還元型電子受容体）
【００５２】
（１５）Ｅ2：Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン）Ｅ3：Ｎ−アシルへキソサミンオキシダーゼ
（Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン＋Ｏ2→Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミネート＋Ｈ2Ｏ2）
【００５３】
（１６）Ｅ2：エタノールアミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホエタノールアミン→ＡＴＰ＋エタノールアミン）Ｅ3：エタノールアミンオキシダーゼ
（エタノールアミン＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→グリコアルデヒド＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2）
【００５４】
（１７）Ｅ2：β−グルコシドキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−β−グルコシル−（１，４）−Ｄ−グルコース→ＡＴＰ＋セロビオース）Ｅ3：セロビオースオキシダーゼ
（セロビオース＋Ｏ2→セロビオノ−１，５−ラクトン＋Ｈ2Ｏ2）
【００５５】
（１８）Ｅ2：β−グルコシドキナーゼ
（ＡＤＰ＋６−ホスホ−β−グルコシル−（１，４）−Ｄ−グルコース→ＡＴＰ＋セロビオース）Ｅ3：セロビオースデヒドロゲナーゼ
（セロビオース＋酸化型電子受容体→セロビオノ−１，５−ラクトン＋還元型電子受容体）
【００５６】
（１９）Ｅ2：チアミンキナーゼ
（ＡＤＰ＋チアミンリン酸→ＡＴＰ＋チアミン）Ｅ3：チアミンオキシダーゼ
（チアミン＋２Ｏ2→チアミン酢酸＋２Ｈ2Ｏ2）
【００５７】
（２０）Ｅ2：キシリトールキナーゼ
（ＡＤＰ＋キシリトール５−リン酸→ＡＴＰ＋キシリトール）Ｅ3：キシリトールオキシダーゼ
（キシリトール＋Ｏ2→キシロース＋Ｈ2Ｏ2）
【００５８】
（２１）Ｅ2：アスパラギン酸キナーゼ
（ＡＤＰ＋４−ホスホ−Ｌ−アスパラギン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−アスパラギン酸）Ｅ3：Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ
（Ｌ−アスパラギン酸＋Ｈ2Ｏ＋Ｏ2→オキサロ酢酸＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2）
【００５９】
（２２）Ｅ2：グルタミン酸５−キナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｌ−グルタミン酸５−リン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸）Ｅ3：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ2＋Ｈ2Ｏ→２−オキソグルタレート＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2）
【００６０】
（２３）Ｅ2：グルタミン酸１−キナーゼ
（ＡＤＰ＋α−Ｌ−グルタミルリン酸→ＡＴＰ＋Ｌ−グルタミン酸）Ｅ3：Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｌ−グルタミン酸＋Ｏ2＋Ｈ2Ｏ→２−オキソグルタレート＋ＮＨ3＋Ｈ2Ｏ2）
【００６１】
（２４）Ｅ2：ケトヘキソキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−フルクトース１リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−フルクトース）Ｅ3：マンニトールデヒドロゲナーゼ（Ｄ−フルクトース＋酸化型電子受容体→Ｄ−マンニトール＋還元型電子受容体）
【００６２】
（２５）Ｅ2：フルクトキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｄ−フルクトース６−リン酸→ＡＴＰ＋Ｄ−フルクトース）Ｅ3：マンニトールデヒドロゲナーゼ（Ｄ−フルクトース＋酸化型電子受容体→Ｄ−マンニトール＋還元型電子受容体）
【００６３】
（２６）Ｅ2：コリンキナーゼ
（ＡＤＰ＋Ｏ−ホスホコリン→ＡＴＰ＋コリン）Ｅ3：コリンモノオキシゲナーゼ
（コリン＋Ｏ2＋２還元型電子受容体＋２Ｈ+→ベタインアルデヒドハイドレート＋Ｈ2＋２酸化型電子受容体）
【００６４】
（２７）Ｅ2：グルクロノキナーゼ
（ＡＤＰ＋１−ホスホ−α−Ｄ−グルクロネート→ＡＴＰ＋Ｄ−グルクロネート）Ｅ3：イノシトールオキシゲナーゼ
（Ｄ−グルクロネート＋Ｈ2Ｏ→ミオ−イノシトール＋Ｏ2）
【００６５】
（２８）Ｅ2：ウリジンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＵＭＰ→ＡＴＰ＋ウリジン）Ｅ3：ピリミジン−デオキシヌクレオシド２'−ジオキシゲナーゼ
（ウリジン＋コハク酸塩＋ＣＯ2→２'−デオキシウリジン＋２−オキソグルタレート＋Ｏ2）
【００６６】
（２９）Ｅ2：イノシトール３−キナーゼ
（ＡＤＰ＋１Ｄ−ミオ−イノシトール３リン酸→ＡＴＰ＋ミオ−イノシトール）Ｅ3：イノシトールオキシゲナーゼ
（ミオ−イノシトール＋Ｏ2→Ｄ−グルクロネート＋Ｈ2Ｏ）
【００６７】
（３０）Ｅ2：イノシンキナーゼ
（ＡＤＰ＋ＩＭＰ→ＡＴＰ＋イノシン）Ｅ3：ヌクレオシドオキシダーゼ
（イノシン＋Ｏ2→９−リブロノシルハイポキサチン＋Ｈ2Ｏ）
【００６８】
（３１）Ｅ2：アセテートキナーゼ
（ＡＤＰ＋アセチルリン酸→ＡＴＰ＋酢酸）Ｅ3：アセチルアセトンジオキシゲナーゼ
（酢酸＋２−オキソプロパノール→ペンタン−２，４ジオン＋Ｏ2）
【００６９】
（３２）Ｅ2：アセテートキナーゼ
（ＡＤＰ＋アセチルリン酸→ＡＴＰ＋酢酸）Ｅ3：ラクテート２−モノオキシゲナーゼ
（（Ｓ）−ラクテート＋Ｏ2→酢酸＋ＣＯ2＋Ｈ2Ｏ）
【００７０】
酵素Ｅ1〜Ｅ3は各々市販されているものを使用することもできるし、一般的な方法により生体から精製あるいは合成した酵素を使用することもできる。酵素の使用に際しては、安定化剤やｐＨ調整剤、緩衝剤等、使用する酵素の公知の最適環境に合わせて適宜調整することができる。
酵素Ｅ1〜Ｅ3の使用量は特に限定されない。
【００７１】
尚、本発明においては、工程Ａ〜Ｃを分離・精製等をさしはさまずに同一の反応系において行うことが簡便のため好ましい。
【００７２】
また、本発明の各酵素はそれぞれ反応系に溶解していてもよいし、固定化していてもよい。固定化については、たとえば、「生物化学実験法２８  バイオリアクター実験入門」（学会出版センター）等に記載の一般的な方法でおこなうこともできる。また、リン酸供与体Ｐ2などの基質も固定化されていてもよい。
固定化した反応系として、たとえば薄膜に各基質や酵素が固定化されているものや、その積層体などがあげられる。
【００７３】
次に、本発明の測定装置について説明する。
図３は、本発明の一実施形態におけるＡＴＰ測定装置のセンサ構成図を示す。
図３において、ＡＴＰ測定装置のセンサは、ガラスあるいはポリエチレンテレフタレートより構成される絶縁基板であるベース１、試料供給口４より供給される液状試薬を毛細管現象によって引き込む流路を形成する為のスペーサー２、毛細管現象を引き起こす為の空気口５，６を設けたカバー３で、構成される。なお、スペーサー２及カバー３は、ベース１と同様ガラスあるいはポリエチレンテレフタレートで構成するのが好ましい。
【００７４】
また、絶縁基板のベース１上には、試料供給口４より供給された試料が、スペーサー２で形成される流路を流れる途中に設けられた反応層７，８を有する、反応層７，８で、増幅・再生及び酸化還元反応・電気的検出用試薬及び酵素と混合され、反応する。反応層７，８で発生する脱リン酸化されたリン酸供与体の酸化還元反応より生じた還元型電子受容体を、ベース１上に形成された電極部１８，１９を用いて電気化学的に測定する。電極部１８は、測定極９と対極１０から構成され、電極部１９は、測定極１１と対極１２から構成される。また、ベース１は、電極部１８，１９と、電流値を検出する検出装置（図示せず）とを電気的に接続するリード１３，１４−１，１４−２，１５を備える。ここで、電流値を検出する装置とは、例えば、パナソニック四国エレクトロニクス株式会社製血糖値測定システムの様な、センサが挿入される部分を持ち、センサ挿入後、試料をセンサの試料供給口より供給する事によって、電流値を計測し分析して、試料の濃度を把握する事ができる装置である。尚、あらかじめ、ＡＴＰの濃度とその時に発生する電流値との検量線を作成しておけば、得られた電流値よりＡＴＰの濃度を算出することが可能である。
【００７５】
本発明では、測定したい試料の測定濃度幅、及び電極で測定可能な濃度幅に対応して、電気化学的に測定する箇所を１装置（センサ）上に複数箇所設ける。すなわち、各測定箇所は、測定対象物は同一試料ではあるが、異なる測定濃度幅を保持している。これら複数の測定箇所より得られた情報を基に、試料の濃度を算出するのが目的である。本実施例では、低濃度測定用と高濃度測定用の２つの測定箇所を設けた例を示す。各測定箇所は、反応層と一対の電極とからなる。
【００７６】
低濃度測定用の測定箇所は、試料供給口４より試料が取り込まれると、空気口５によって、試料が毛細管現象にて流路１６を経て、反応層７に至る。反応層７には、ＡＴＰを増幅及び検出する為の試薬が添加されており、特に低いＡＴＰ濃度を早く増幅するために、濃い濃度の増幅酵素あるいは試薬を含んでいる。すなわち、増幅の酵素活性を高くしている。この反応層で、試料となるＡＴＰが増幅され、該試料生成に付随して発生する脱リン酸化されたリン酸供与体は、酸化還元反応が進み、更に電子受容体による電子の授受も促進される。リード線（接続端子）１３と１４−１に外部の装置より電圧を印加すると、電極部１８の測定極９と対極１０の間に電位差が生じ、その時のＡＴＰ濃度に応じた電流を生じる。
【００７７】
同時に、高濃度測定用の測定箇所は、試料供給口４より試料が取り込まれると、空気口６によって、試料が毛細管現象にて流路１７を経て、反応層８に至る。反応層８には、ＡＴＰを増幅及び検出する為の試薬が添加されており、特に高いＡＴＰ濃度をゆっくり増幅するために、薄い濃度の増幅酵素あるいは試薬を含んでいる。すなわち、増幅の酵素活性を低くしている。この反応層で、試料となるＡＴＰが増幅され、該試料生成に付随して発生する脱リン酸化されたリン酸供与体は、酸化還元反応が進み、更に電子受容体による電子の授受も促進される。リード線１４−２と１５に外部の装置より電圧を印加すると、電極部１９の測定極１２と対極１１の間に電位差が生じ、その時のＡＴＰ濃度に応じた電流を生じる。
【００７８】
図４は、本発明の一実施形態において、高濃度測定用反応層と低濃度測定用反応層を使用して測定する、ＡＴＰ測定装置の測定原理を示している。
電気化学式で測定可能なＡＴＰ濃度を、従来技術のセンサで実現可能な、１０-3Ｍ〜１０-6Ｍとする。把握したい試料のＡＴＰ濃度は１０-12Ｍ〜１０-6Ｍである。
増幅によって、試料のＡＴＰ濃度１０-12Ｍという低いＡＴＰ濃度を、電気化学で検出できる１０-6Ｍレベルにまで引き上げることは可能であるが、増幅するのに時間がかかる。よって、増幅反応を促進する為に、反応層内の酵素の濃度を濃くして、酵素活性を上げる。ただ、この高濃度測定用反応層で１０-6Ｍの濃いＡＴＰ濃度を測定しようとした場合、増幅反応により１０-0Ｍに到達してしまい、測定可能濃度である１０-3Ｍを超えて電気化学的に飽和しており、正確に測定できない。
そこで逆に、試料のＡＴＰ濃度１０-6Ｍという高いＡＴＰ濃度を、電気化学式で検出できる１０-3Ｍレベルまでの増幅に抑えて、測定の飽和状態を避けることは可能である。増幅反応の活性化を抑える為に、反応層内の酵素の濃度を薄くして、酵素活性を下げる。ただ、この低い濃度測定用反応層で１０-12ＭのＡＴＰ濃度を測定しようとした場合、増幅反応により１０-9Ｍにしかならず、測定可能濃度である１０-6Ｍ以下の為電気化学的に検出できず、正確に測定できない。
【００７９】
そこで、本発明では、高濃度測定用反応層と低濃度測定用反応層を併用して測定する方法を実現可能にする。高濃度測定用反応層では、１０-12Ｍ〜１０-9Ｍを１０-6Ｍ〜１０-3Ｍに増幅する様、反応層内の酵素の濃度を濃くして、酵素活性を上げている。また、低濃度測定用反応層では、１０-9Ｍ〜１０-6Ｍを１０-6Ｍ〜１０-3Ｍに増幅する様、反応層内の酵素の濃度を薄くして、酵素活性を下げている。この様に構成することで、１０-12Ｍ〜１０-6Ｍまでの幅広い範囲をいずれかの電極で測定することが可能である。
尚、増幅酵素及び再生酵素の基質となる、アデノシン一リン酸及びホスホノールピルビン酸の試薬量は、酵素活性に影響の与えない飽和濃度であり、かつ大量に存在する事によって酵素に阻害影響を与えない飽和濃度で、両反応層とも統一されている事が望ましく、具体的には終濃度で数ｍＭ程度（たとえば１ｍＭ前後）が最適である。
また、低濃度測定用反応層と高濃度測定用反応層との速度差を作製する酵素活性比率は、由来酵素や何桁単位で層を形成するかによる。よって、酵素活性を変化させて、各ＡＴＰ濃度における増幅曲線を作成し、電極感度の範囲に応じて適宜調整される。具体的には、実施例としてあげている市販酵素で３桁分を一層に形成する場合、低濃度測定用反応層：高濃度測定用反応層＝０．６〜０．８：１．０程度が好ましい。
【実施例】
【００８０】
以下、図５〜図７で具体的な実験例を示す。
本実験では、まず従来の生物発光法によって原理を検証している。ＡＴＰの濃度とその時に発生する電流値との検量線作成の代わりに、ＡＴＰの濃度とその時に発生する発光値（単位ＲＬＵ）との検量線を作成することで、測定したＡＴＰ濃度を割り出すことが可能である。
まず図５は、ＡＴＰが各ＡＴＰ濃度に応じて、時間経過と共に増幅されていることを示している。
以下に概要を説明する。反応試薬・濃度は以下の通りである。尚、試薬の濃度（Ｍ）及び酵素のユニット数(Ｕ）は、終濃度で記載している。また、リン酸緩衝液のｐＨは７．０としている。
【００８１】
（試薬１）
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ
（ロ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；１ｍＭ
（ハ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；２ｍＭ
（ニ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；０．５Ｕ／ｍＬ
（ホ）オリエンタル酵母製  酵母由来  ミオキナーゼ；０．１Ｕ／ｍＬ
（ヘ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；測定濃度（ＭｉｌｌｉＱ水（蒸留・イオン交換カラム処理を行った超純水）のみ、１ｎＭ，１０ｎＭ、１００ｎＭ）
（ト）リン酸緩衝液；５０ｍＭ
【００８２】
実験手順は以下の通りである。
（実験手順）
まず、試薬（イ）〜（ト）を指定の濃度で合計１ｍＬとなる様、エッペンチューブＡ（容量１．５ｍＬ）に滴下して混合試薬を作製する。最後に（ヘ）を投入すると同時に増幅反応が開始される。
次にルミノメーター用セルを準備し、（イ）〜（ト）の混合試薬をエッペンチューブＡより１００μＬ抽出した後、キッコーマン製  ルシフェール２５０プラスの発光試薬を１００μＬ滴下して、ルミノメーターで発光強度を測定する。本実験では、ルミノメーターとしてキッコーマン社製ＰＤ−１０を利用した。尚、あらかじめＡＴＰ濃度と発光強度の関係を把握する為に、検量線を作成している。これにより、得られた発光強度値よりＡＴＰ濃度を換算することが可能である。定期的（この場合３分毎）にＡＴＰの濃度を把握していき、増幅を確認する。
実験結果が、図５に示されている。終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭのＡＴＰが指数関数的に増幅されていること、個々の増幅曲線が識別できることが解る。（注：図では縦軸を対数表現にしている為増幅の推移は直線状に見えるが、実際は指数関数を描いた曲線状に推移している）。
尚、ＭｉｌｌｉＱ水もこの実験時には、終濃度１ｎＭの増幅曲線と識別できる状態で、増幅されている。これは、ＭｉｌｌｉＱ水に含まれる微量のＡＴＰも含めて、環境中に存在する（コンタミ）ＡＴＰが、１ｎＭ以下ではあるが存在していると考えられる。
【００８３】
次に図６では、ＡＴＰの終濃度を１０ｎＭに固定し、再生酵素ピルビン酸キナーゼの希釈率すなわち活性を固定にし、増幅酵素ミオキナーゼの原液からの希釈倍率を変化させることによって、酵素の活性を変化させ、その際のＡＴＰ増幅の推移を示している。反応試薬・濃度は以下の通りである。尚、試薬の濃度（Ｍ）及び酵素のユニット数(Ｕ）は、終濃度で記載している。また、リン酸緩衝液のｐＨは７．０としている。
【００８４】
（試薬２）
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ
（ロ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；１ｍＭ
（ハ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；２ｍＭ
（ニ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；０．５Ｕ／ｍＬ
（ホ）オリエンタル酵母製  酵母由来  ミオキナーゼ；測定用希釈倍率（６６７倍〜２０００倍）
（ヘ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；１０ｎＭ
（ト）リン酸緩衝液；５０ｍＭ
実験手順は前述の実験手順と同様である。
実験結果を、図６に示している。この様に、増幅酵素の希釈率を変化させることによって、酵素の活性を変化することが可能で、これにより、目的であるＡＴＰの増幅割合を変化させることが可能である。また、ここでは示していないが、増幅酵素の希釈率を固定し、再生酵素の希釈率を変化させて酵素の活性を変化させる事も可能である。センサ製造時には、酵素の希釈倍率を調整して、高濃度測定用と低濃度測定用個々の反応層に添加することで、本発明の目的である、複数の電極による広範囲な測定濃度を実現することが可能である。
これを基に、２つの反応層による実現例を示したのが、図７である。
試薬は、以下のとおりである。尚、試薬の濃度（Ｍ）及び酵素のユニット数(Ｕ）は、終濃度で記載している。また、リン酸緩衝液のｐＨは７．０としている。
【００８５】
（試薬３）
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ
（ロ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；１ｍＭ
（ハ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；２ｍＭ
（ニ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；０．５Ｕ／ｍＬ
（ホ）オリエンタル酵母製  酵母由来  ミオキナーゼ；測定希釈倍率
高濃度測定用に８００倍希釈    酵素活性  ０．８４Ｕ／ｍＬ
低濃度測定用に１０００倍希釈  酵素活性  １．０８Ｕ／ｍＬ
（ヘ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；測定濃度（０．１〜１０００ｎＭ），１００μＬ
（ト）リン酸緩衝液；５０ｍＭ
【００８６】
実験手順は前述実験手順と同様である。
実験結果を、図７に示している。図の中で黒く塗りつぶした点で繋がる増幅曲線が、高濃度測定用で、１０-9Ｍ〜１０-6Ｍの範囲での定量化に使用する。白抜きの点で繋がる増幅曲線が、低濃度測定用で、１０-12Ｍ〜１０-9Ｍの範囲での定量化に使用する。ちなみにこの時の高濃度測定用の酵素活性（Ｖｍａｘ）は、０．８４Ｕ／ｍＬ、低濃度測定用の酵素活性は、１．０８Ｕ／ｍＬである。この様に、増幅酵素の活性を調整して添加した２つの反応層を設けることで、幅広い測定濃度を、一定の時間で測定することが可能である。
【００８７】
次に、実際に複数の電極より、どの電極の測定値を選択して、ＡＴＰ濃度とするかを説明する。
【００８８】
図８では、測定するＡＴＰ濃度と、２つの電極で検出されるＡＴＰ濃度との相関を示している。この図では、理想的な増幅で電気化学的に検出できることを想定している。すなわち、低濃度測定用電極では、１０-12Ｍ〜１０-9ＭのＡＴＰ濃度を、１０-6Ｍ〜１０-3Ｍに増幅して測定する。高濃度測定用電極では、１０-9Ｍ〜１０-6ＭのＡＴＰ濃度を、１０-6Ｍ〜１０-3Ｍに増幅して測定する。この様なＡＴＰ濃度と、電気化学的に増幅して検出するＡＴＰ濃度との相関は、あらかじめ製品化前等に把握可能である。これを表にまとめたのが以下である。
【００８９】
【表１】
2008096163.tif 000007
【００９０】
すなわち、
（１）高濃度測定用電極で、１０-6Ｍあるいはそれ以下の濃度が検出された場合、
→  低濃度測定用電極で検出された濃度の値を参照する
図８で低濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度１８に相当する部分
（２）低濃度測定用電極で、１０-3Ｍあるいはそれ以上の濃度が検出された場合、
→  高濃度測定用電極で検出された濃度の値を参照する
図８で高濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度１９に相当する部分
（３）高濃度測定用電極で１０-6Ｍが検出され、なおかつ、低濃度測定用電極で１０-3Ｍが検出された場合、
→１０-9Ｍが検出されたと判断する。
で、試料のＡＴＰ量を算出する。
【００９１】
図９では、測定するＡＴＰ濃度と、２つの電極で検出されるＡＴＰ濃度との相関を示している。実際にはこの様に、検出限界に近くなるにしたがって、低い濃度では検出不能（１０-6Ｍ）に、高い濃度では飽和状態に（１０-3Ｍ以上）になっていくので、一例としてこの様な図を想定している。この場合のＡＴＰ濃度と、電気化学的に増幅して検出するＡＴＰ濃度との相関は、以下の表の通りである。
【００９２】
【表２】
2008096163.tif 000008
【００９３】
すなわち、
（４）高濃度測定用電極で、３＊１０-4Ｍあるいはそれ以下の濃度が検出された場合、
→  低濃度測定用電極で検出された濃度の値を参照する
図９で低濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度１８に相当する部分
（５）低濃度測定用電極で、１０-4Ｍあるいはそれ以上の濃度が検出された場合、
→  高濃度測定用電極で検出された濃度の値を参照する
図９で低濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度１８に相当する部分
（６）高濃度測定用電極で３＊１０-4Ｍが検出され、なおかつ、低濃度測定用電極で１０-4Ｍが検出された場合、
→１０-8Ｍが検出されたと判断する。
で、試料のＡＴＰ量を算出する。
【００９４】
次に、発明者らのグループが提案する前述の手法により、電気化学的にＡＴＰの増幅を１０-9Ｍ（ｎＭ）レベルから確認及び識別できる様になったので、この電気化学による２つの反応層による実現例を実験した内容を以下に示すと共に、結果を図１０に示す。
【００９５】
まず、電極の作製手順は以下の通りである。
（電極の作製）
検出系酵素及び固定化法としては、酵素及び固定化法を組み合わせてピルビン酸による感度試験を実施した結果、感度が高く、安定している、ピルビン酸デヒドロゲナーゼをグルタルアルデヒドの組み合わせによって固定化する手法を採用している。
作製方法としては、まず東洋紡製Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来ピルビン酸デヒドロゲナーゼを、０．１１Ｕｎｉｔ直径３ｍｍの白金（Ｐｔ）電極に滴下し、4℃で一晩風乾する。尚、固定化する酵素量は、酵素量を変化させてピルビン酸による感度試験を実施した結果、０．１０Ｕｎｉｔ程度が最適な固定量であったという結果に基づいている。風乾後、電極表面を和光純薬製２５％グルタルアルデヒド溶液の蒸気に約３０分曝して、グルタルアルデヒドとピルビン酸デヒドロゲナーゼの架橋を形成し、酵素を電極上に固定する。固定後、ｐＨ７．０の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ緩衝液に約３０分浸して電極表面を平衡化し、更にｐＨ７．０の５０ｍＭリン酸緩衝液に約３０分浸して電極を洗浄する。以上の様に、検出酵素を固定化した電極を作製する。尚、参照電極としては、銀（Ａｇ）／塩化銀（ＡｇＣｌ）、対極は白金（Ｐｔ）電極を使用している。印加電圧は＋６００ｍＶとし、ＡＴＰ増幅反応の推移を、時間経過と応答電流値で測定している。
試薬は、以下のとおりである。尚、試薬の濃度（Ｍ）及び酵素のユニット数(Ｕ）は、終濃度で記載している。また、リン酸緩衝液のｐＨは７．０、温度は２５℃としている。
【００９６】
（試薬４）
（イ）関東化学製  塩化マグネシウム六水和物；１０ｍＭ
（ロ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製  塩化チアミンピロリン酸；０．２ｍＭ
（ハ）和光純薬製  フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウムん水和物；０．０１ｍＭ
（ニ）和光純薬製  アデノシン一リン酸；１ｍＭ
（ホ）和光純薬製  ホスホエノールピルビン酸；１ｍＭ
（へ）ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ製  ウサギ筋肉由来  ピルビン酸キナーゼ；
高濃度測定用  ０．２６Ｕ／ｍＬ
低濃度測定用  ０．３４Ｕ／ｍＬ
（ト）シグマ製  鳥筋肉由来  ミオキナーゼ；０．０８Ｕ／ｍＬ固定
（チ）和光純薬製  アデノシン三リン酸；
高濃度測定用  ３３ｕＭ、３．３ｕＭ
低濃度測定用  ３３ｎＭ、３．３ｎＭ、ＭｉｌｌｉＱ水のみ
（リ）リン酸緩衝液；５０ｍＭ
【００９７】
尚、今回ピルビン酸キナーゼの酵素活性を変化させて各々２つの層を形成している理由は、ミオキナーゼの活性の低下が顕著な為、活性が飽和状態になりなおかつ原液にできるだけ近い高濃度で使用して環境の影響を受けない様にし、希釈倍率が高くても比較的活性が安定しているためである。この様にして、ピルビン酸キナーゼの酵素活性差が直接反応速度の差として反映できるよう、２つの層でピルビン酸キナーゼの濃度を変化させている。
結果、各ＡＴＰ濃度に応じて、応答電流値が増加してＡＴＰが増幅している事、更に増幅曲線が各濃度で区別できる事がわかる。また、高濃度用ＡＴＰであるＡＴＰ濃度３３ｕＭと３．３ｕＭの増幅曲線のグループと、低濃度用ＡＴＰであるＡＴＰ濃度３３ｎＭと３．３ｎＭ及びＭｉｌｌｉＱ水の増幅曲線のグループが、違った増幅率で増加しており、結果飽和までの時間が、重複している事がわかる。この様に、増幅酵素の活性を調整して添加した２つの反応層を設けることで、幅広い測定濃度を、一定の時間で測定することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明にかかるＡＴＰ測定装置は、小型でかつ濁りの原因となる物質の処理操作が不要で、１つのセンサで電気化学的に低濃度から幅広い濃度を測定可能にすることができるものであり、食品あるいは臨床における衛生分野における細菌などの微生物や、微生物による汚染の温床となる食物残渣などによる汚染の程度指標であるＡＴＰ検査の利用や、水質浄化での水質検査などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】発明が解決しようとする課題における、ＡＴＰ測定に必要な感度と従来の発光による測定濃度との関係図
【図２】ＡＴＰ測定に必要な感度と、増幅で実現可能な濃度の関係図
【図３】本発明の一実施形態における、ＡＴＰ測定装置のセンサ構成図
【図４】本発明の一実施形態における、２つの反応層を使用したＡＴＰ測定装置の測定原理図
【図５】本発明の一実施例における、各ＡＴＰ濃度に応じたＡＴＰ増幅の推移図
【図６】本発明の一実施例における、ＡＴＰの終濃度を１０ｎＭに固定し、増幅酵素の希釈倍率を変化させることによる、ＡＴＰ増幅の推移図
【図７】本発明の一実施例における、従来の生物発光法で実施した、２つの反応層によるＡＴＰ増幅の推移図
【図８】本発明の一実施例における、測定するＡＴＰ濃度と、２つの電極で検出されるＡＴＰ濃度との関係例１図
【図９】本発明の一実施例における、測定するＡＴＰ濃度と、２つの電極で検出されるＡＴＰ濃度との関係例２図
【図１０】本発明の一実施例における、電気化学的に実施した、２つの反応層によるＡＴＰ増幅の推移図
【符号の説明】
【０１００】
１  ベース、絶縁性の基板
２  スペーサー
３  カバー
４  試料供給口
５  低濃度測定用の空気口
６  高濃度測定用の空気口
７  低濃度測定用の反応層
８  高濃度測定用の反応層
９  低濃度測定用の測定極
１０  低濃度測定用の対極
１１  高濃度測定用の測定極
１２  高濃度測定用の対極
１３、１４−１、１４−２、１５  リード
１６  低濃度測定用流路
１７  高濃度測定用流路
１８  低濃度測定用電極部
１９  高濃度測定用電極部
２０  低濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度
２１  高濃度測定用電極で測定するＡＴＰ濃度
【図１】
2008096163.tif 000009
【図２】
2008096163.tif 000010
【図３】
2008096163.tif 000011
【図４】
2008096163.tif 000012
【図５】
2008096163.tif 000013
【図６】
2008096163.tif 000014
【図７】
2008096163.tif 000015
【図８】
2008096163.tif 000016
【図９】
2008096163.tif 000017
【図１０】
2008096163.tif 000018