(57)【要約】【課題】  熱処理や特殊な化合物を使用することなく、細胞において発現した目的タンパク質の分解を誘導できるタンパク質分解制御細胞を提供する。【解決手段】  植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有する非植物の真核細胞を、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性細胞とする。この細胞であれば、所望の時期に、オーキシンまたはオーキシン誘導体を添加することによって、細胞内に発現した目的タンパク質を分解することができる。【選択図】  図１
2008187958.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性細胞であって、
前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、
前記細胞が、非植物の真核細胞であり、
前記真核細胞が、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とするタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項２】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子が、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子およびＩＡＡ３４遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項３】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域に対応する、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子の部分配列である、請求項１または２記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項４】
前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子およびＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子の少なくとも一方が、シロイヌナズナ由来の遺伝子である、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項５】
前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子が、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子およびＡＦＢ５遺伝子の少なくとも一つである、請求項１から４のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項６】
前記目的タンパク質の遺伝子が、前記真核細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子、または、前記真核細胞に導入された外来の遺伝子である、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項７】
前記オーキシンまたはオーキシン誘導体が、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−クロロフェノキシ酢酸、（２，４，５−トリクロロフェノキシ）酢酸、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸メチルエステル、１−ナフタレンアセトアミド、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、および、４−パラクロロ酢酸等からなる群から選択された少なくとも一つの化合物である、請求項１から６のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項８】
前記真核細胞が、哺乳類動物の細胞または酵母細胞である、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞。
【請求項９】
誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるモデル動物であって、
前記モデル動物が、ヒト以外の動物であり、
前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、
請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞を有することを特徴とするモデル動物。
【請求項１０】
誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解誘導性細胞の製造方法であって、目的の細胞が、非植物の真核細胞であり、下記工程（Ｉ）および（II）を含むことを特徴とする製造方法。
（Ｉ）宿主細胞である前記真核細胞に、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を導入する工程
（II）宿主細胞である前記真核細胞に、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を導入し、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程
【請求項１１】
前記目的タンパク質の遺伝子が、前記真核細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
前記目的タンパク質の遺伝子が、外来の遺伝子であり、さらに、下記工程（III）を含む、請求項１０記載の製造方法。
（III）前記真核細胞に、前記目的タンパク質の遺伝子を導入する工程
【請求項１３】
前記（II）工程において、前記キメラ遺伝子が、目的タンパク質とＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質とを含む融合タンパク質を発現するキメラ遺伝子である、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子が、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子およびＩＡＡ３４遺伝子からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１０から１３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインＩＩ領域に対応する、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子の部分配列である、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子およびＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子の少なくとも一方が、シロイヌナズナ由来の遺伝子である、請求項１０から１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子が、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子、および、ＡＦＢ５遺伝子の少なくとも一つである、請求項１０から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記真核細胞が、哺乳類動物の細胞または酵母細胞である、請求項１０から１７のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項１０から１８のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法に使用するキットであって、下記（１）の宿主細胞および下記（２）の遺伝子導入用ベクターを含むことを特徴とするキット。
（１）植物由来ＴＩＲ１ファミリーの遺伝子を含む、植物以外の真核細胞
（２）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を含み、前記（１）の真核細胞に導入されることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
【請求項２０】
前記（２）の遺伝子導入用ベクターが、さらに、目的タンパク質の遺伝子を含むベクターである、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
請求項１０から１８のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法に使用する宿主細胞であって、宿主細胞が植物以外の真核細胞であり、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２２】
請求項２１に記載の植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を含む宿主細胞の製造に使用するベクターであって、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子が挿入されていることを特徴とするＴＩＲ１ファミリー遺伝子導入用ベクター。
【請求項２３】
請求項１０から１８のいずれか一項に記載のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法に使用する遺伝子導入用ベクターであって、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を含み、非植物の真核細胞に導入されることによって、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現することを特徴とする遺伝子導入用ベクター。
【請求項２４】
誘導物質により細胞における目的タンパク質の分解を誘導する、タンパク質の分解制御方法であって、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする誘導方法。
（Ａ）請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
（ｂ１）前記細胞に誘導物質を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
（ｂ２）前記細胞に誘導物質を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
（ｂ３）前記細胞に誘導物質を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記誘導物質を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(ｂ４)  前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発現した目的タンパク質の分解を制御(誘導)できる細胞、その製造方法、および、細胞におけるタンパク質分解の制御方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の機能を解析する方法として、目的タンパク質の発現を制御する遺伝子レベルの手法が知られており、例えば、テトラサイクリン等の化学物質による遺伝子発現調節系が広く利用されている。しかしながら、遺伝子レベルでタンパク質の発現を制御した場合、すでに合成されている目的タンパク質は細胞内で維持されてしまい、存在する目的タンパク質を分解等によって除去できない。そこで、目的タンパク質の発現自体は制御せずに、発現した目的タンパク質を所望の時期に破壊する、タンパク質レベルでの手法が開発されている。
【０００３】
前記タンパク質レベルでの方法としては、例えば、目的タンパク質を、高温で破壊される温度感受性デグロン（ｔｓ-ｄｅｇｒｏｎ）との融合タンパク質として発現させる方法がある。この方法では、前記融合タンパク質を発現させ、所望の時期に加熱することによって、目的タンパク質を分解できる。しかしながら、この方法は、約３７℃に加熱する必要があるため、一般に約３６℃で生育する恒温生物の細胞には利用できないという問題がある。
【０００４】
また、温度制御ではなく、化学物質によってタンパク質分解を誘導する方法がある。前記化学物質としては、例えば、ＰＲＯＴＡＣ（非特許文献１）やその誘導体Ｓｈｌｄ１（非特許文献２）が報告されている。前記Ｓｈｌｄ１を使用する系では、タンパク質を不安定化させるドメイン（１０７アミノ酸残基）をＹＦＰレポータータンパク質に結合させ、さらに、前記ドメインにＳｈｌｄ１を結合させて、前記ドメインの不安定性を改善（安定化）することにより、発現した前記レポータータンパク質の量を調節している。しかしながら、ＰＲＯＴＡＣやＳｈｌｄ１は、非常に大きく、複雑な構造の化合物であるため、合成が困難である。そして、合成が困難なことから高コストで入手し難い。また、これらの化合物は、例えば、動物等の個体やそれらの細胞に対する影響、例えば、吸収性や生理機能への影響、毒性等が不明である。特に、前記両化合物は、２つの（ｄｉ,ｔｒｉ）メトキシベンゼン環を有しており、また、これらのリード化合物は、変異型の免疫系において重要なタンパク質に結合する化合物として見出されたこと等からも、例えば、動物等の個体に投与した際、サイドエフェクトの可能性が危惧される。
【非特許文献１】Ｊｏｈｎ  Ｓ．Ｓｃｈｎｅｅｋｌｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．ＡＭ．ＣＨＥＭ．ＳＯＣ．２００４，１２６，３７４８−３７５４
【非特許文献２】Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １２６，９９５−１００４
【非特許文献３】Ｄｈａｒｍａｓｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５、４４１−４４５
【非特許文献４】Ｋｅｐｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｌｅｙｓｅｒ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００５，４３５，４４６-４５１
【非特許文献５】Ｚｅｎｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ＰＮＡＳ  ９８  ２００６，１１７９５-１１８００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、従来のように熱処理や特殊な化合物を使用することなく、細胞において発現した目的タンパク質の分解を誘導できるタンパク質分解制御細胞、その製造方法ならびにタンパク質分解の制御方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明の細胞は、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解制御細胞であって、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、前記細胞が、非植物の真核細胞であり、前記真核細胞が、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とする。オーキシンおよびオーキシン誘導体を、以下、「オーキシン類」ともいう
【０００７】
本発明のモデル動物は、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるモデル動物であって、前記モデル動物が、ヒト以外の動物であって、本発明のタンパク質分解制御細胞を有することを特徴とする。
【０００８】
本発明のタンパク質分解制御細胞の製造方法は、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるタンパク質分解制御細胞の製造方法であって、目的の細胞が、非植物の真核細胞であり、下記工程（Ｉ）および（II）を含むことを特徴とする。
（Ｉ）前記真核細胞に、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を導入する工程
（II）前記真核細胞に、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を導入し、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程
【０００９】
本発明のキットは、本発明のタンパク質分解制御細胞の製造方法に使用するキットであって、下記（１）の宿主細胞および下記（２）の遺伝子導入用ベクターを含むことを特徴とする。
（１）植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を含む、植物以外の真核細胞
（２）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を含み、前記（１）の真核細胞に導入されることによって、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
【００１０】
本発明の宿主細胞は、本発明のタンパク質分解制御細胞の製造方法に使用する宿主細胞であって、細胞が植物以外の真核細胞であり、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を含むことを特徴とする。また、本発明のＴＩＲ１ファミリー遺伝子導入用ベクターは、前記本発明の宿主細胞の製造に使用するベクターであって、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子が挿入されていることを特徴とする。また、本発明のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターは、本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法に使用する遺伝子導入用ベクターであって、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を含み、非植物の真核細胞に導入されることによって、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現することを特徴とする。
【００１１】
本発明の分解制御方法は、誘導物質により細胞における目的タンパク質の分解を制御する分解制御方法であって、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）本発明のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
（ｂ１）前記細胞に誘導物質を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
（ｂ２）前記細胞に誘導物質を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
（ｂ３）前記細胞に誘導物質を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記誘導物質を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(ｂ４)  前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
【発明の効果】
【００１２】
動物、植物、菌類等の種々の真核生物において、ユビキチン／プロテアソーム系のタンパク質分解が知られている。この分解システムは、ユビキチン活性化酵素（Ｅ１）−ユビキチン結合酵素（Ｅ２）−ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）という３つの酵素によって、ターゲットタンパク質にユビキチンが結合され、ポリユビキチン化されたターゲットタンパク質がプロテアソームによって特異的に認識され、分解されるシステムである。このシステムにおいて重要なのが、いずれのタンパク質をターゲットとし、どの時点でターゲットタンパク質をユビキチン化し、プロテアソームによる分解に導くかという点であり、これを担っているのがユビキチンリガーゼである。このユビキチンリガーゼとして、Ｅ３ユビキチン化酵素複合体（ＳＣＦ複合体）が報告されている。このＳＣＦ複合体は、Ｆ−ｂｏｘタンパク質、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎ−１タンパク質およびＲｂｘ１タンパク質という４つのサブユニットから構成されている。本発明者らは、中でも、植物に特有のＳＣＦ複合体とその機能とに着目した。植物のＳＣＦ複合体について、Ｆ−ｂｏｘタンパク質としてＴＩＲ１ファミリータンパク質を有し、これが成長ホルモンであるオーキシンの受容体となっており、オーキシンを受容することによって、オーキシン情報伝達系の抑制因子Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識して、前記タンパク質を分解することが、近年解明された（非特許文献３〜５）。そこで、本発明者らは、オーキシンを誘導物質として、ＴＩＲ１ファミリータンパク質により、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識させ、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化した目的タンパク質を分解する系を、植物以外の真核細胞において機能させることに着想した。そして、植物以外の真核細胞において、植物以外の真核細胞では非存在のＴＩＲ１ファミリータンパク質を含むＳＣＦ複合体を発現させ、且つ、ＴＩＲ１ファミリータンパク質が認識するＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現させ、オーキシン類を添加することによって、目的タンパク質の分解を実現したのである。
【００１３】
本発明のタンパク質分解誘導性細胞であれば、オーキシン類の添加によって、任意の時期に、発現した目的タンパク質を分解できる。つまり、本発明のタンパク質分解誘導性細胞によれば、例えば、ＴＩＲ１ファミリータンパク質を含むＳＣＦ複合体およびＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質が発現する。このため、オーキシン類の共存下であれば、前記ＳＣＦ複合体のＴＩＲ１ファミリータンパク質がオーキシン類を受容し、これによってＴＩＲ１ファミリータンパク質によるＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の認識、ならびに、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質へのポリユビキチン化が生じる。そして、プロテアソームによって、ポリユビキチン化Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質が分解されると解される。このため、例えば、オーキシン類の添加、無添加によって、発現した目的タンパク質の分解を制御することが可能である。なお、本発明は、この推定メカニズムによって限定されるものではない。
【００１４】
また、植物以外の真核細胞や個体生物は、基本的にオーキシンが存在しないため、本発明のタンパク質分解誘導性細胞やモデル動物であれば、オーキシン類の存否によって、極めて特異的に目的タンパク質の分解を制御できる。また、オーキシン類は、非常に単純な構造の安価な化合物であり、農業利用も認められており、例えば、動物等に対する影響も極めて小さいことが証明されている。したがって、本発明のタンパク質分解誘導性細胞およびモデル動物であれば、従来のように熱処理や特殊な化合物を使用することなく、目的タンパク質を分解できる。このため、本発明のタンパク質分解誘導性細胞およびモデル動物、その製造方法、また、製造に使用する本発明のキット等は、例えば、タンパク質の機能解析等の分野において、非常に有用なツールといえる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
＜タンパク質分解誘導性細胞＞
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、前述のように、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導される細胞であって、前記誘導物質が、オーキシン類であり、前記細胞が、非植物の真核細胞であり、前記真核細胞が、植物由来ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子と、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子とを有することを特徴とする。以下、前記ＴＩＲ１ファミリータンパク質の遺伝子を「ＴＩＲ１ファミリー遺伝子」、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質の遺伝子を「Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子」、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を「標識化目的タンパク質」、目的タンパク質の遺伝子を「目的遺伝子」という。なお、「Ａｕｘ／ＩＡＡ」とは、「ａｕｘｉｎ／ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ」の略であり、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質は、一般に、転写因子ＡＲＦファミリ-に結合することで、それらによる転写活性化を阻害するタンパク質として知られている。
【００１６】
本発明において、前記細胞は、植物以外（非植物）の真核生物の細胞であればよく、制限されない。前記真核生物としては、例えば、動物、菌類、原生生物等の細胞があげられる。前記動物としては、制限されないが、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等の哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ.ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物があげられる。また、その細胞の種類も制限されず、例えば、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＣＦ、ＨＥＫ２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＯＳ細胞、ＤＴ４０等の培養細胞；初代培養細胞；造血幹細胞；Ｂ細胞、Ｔ細胞、白血球、単球・マクロファ−ジ、赤血球、血小板等の血球系細胞、血液細胞；受精卵母細胞；ＥＳ細胞等があげられる。また、その他の各種組織細胞等でもよい。また、菌類としては、例えば、出芽酵母、分裂酵母等があげられる。
【００１７】
本発明において、前記キメラ遺伝子は、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子である。発現した目的タンパク質は、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化されていればよく、その形態は制限されないが、例えば、目的タンパク質とＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質とを含む融合タンパク質であることが好ましい。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質は、例えば、目的タンパク質のＮ末側およびＣ末側のいずれに付加されてもよい。
【００１８】
また、目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の位置関係は、制限されず、発現した目的タンパク質が、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化されるように、両遺伝子が機能的に配置されていればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、前記目的遺伝子の上流（５’側）または下流（３’側）に隣接して配置されていることが好ましい。目的タンパク質が発現され、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化される限りにおいて、例えば、目的遺伝子の内部に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が介在してもよい。なお、本発明において、「機能的に連結」、「機能的に配置」とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で配置または連結していることを意味する。
【００１９】
前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、植物由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子であれば、その種類は制限されない。前記植物の種類は、制限されないが、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ、マツ、シダ、ヒメツリガネゴケ等があげられる。前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の具体例としては、例えば、ＴＩＲ１遺伝子、ＡＦＢ１遺伝子、ＡＦＢ２遺伝子、ＡＦＢ３遺伝子、ＦＢＸ１４遺伝子およびＡＦＢ５遺伝子等があげられる。前記タンパク質分解誘導性細胞は、いずれか一種類のＴＩＲ１ファミリー遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表１の通りである。
【００２０】
【表１】
2008187958.tif 000003
【００２１】
前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、植物から抽出した天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列またはｃＤＮＡにおける全長配列であってもよい。また、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、発現したタンパク質が、ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列またはｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。本発明において、「ＴＩＲ１ファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識することを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質がＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質を認識できれば、前述のようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を分解できるからである。この際、本発明のタンパク質分解誘導性細胞においては、ＴＩＲ１ファミリータンパク質が、他のサブユニット（Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質およびＲｂｘ１タンパク質）とともに、ＳＣＦ複合体（Ｅ３ユビキチン化酵素複合体）を形成していると推測される。
【００２２】
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列をさらに有することが好ましい。これによって、より確実にＴＩＲ１ファミリータンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。
【００２３】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、植物由来のＴＩＲ１ファミリー遺伝子であれば、その種類は制限されない。前記植物の種類は、制限されないが、例えば、シロイヌナズナ、イネ、ヒャクニチソウ等があげられる。Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の具体例としては、例えば、ＩＡＡ１遺伝子、ＩＡＡ２遺伝子、ＩＡＡ３遺伝子、ＩＡＡ４遺伝子、ＩＡＡ５遺伝子、ＩＡＡ６遺伝子、ＩＡＡ７遺伝子、ＩＡＡ８遺伝子、ＩＡＡ９遺伝子、ＩＡＡ１０遺伝子、ＩＡＡ１１遺伝子、ＩＡＡ１２遺伝子、ＩＡＡ１３遺伝子、ＩＡＡ１４遺伝子、ＩＡＡ１５遺伝子、ＩＡＡ１６遺伝子、ＩＡＡ１７遺伝子、ＩＡＡ１８遺伝子、ＩＡＡ１９遺伝子、ＩＡＡ２０遺伝子、ＩＡＡ２６遺伝子、ＩＡＡ２７遺伝子、ＩＡＡ２８遺伝子、ＩＡＡ２９遺伝子、ＩＡＡ３０遺伝子、ＩＡＡ３１遺伝子、ＩＡＡ３２遺伝子、ＩＡＡ３３遺伝子およびＩＡＡ３４遺伝子等があげられる。前記タンパク質分解誘導性細胞は、いずれか一種の前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を有していてもよいし、二種類以上を有していてもよい。例えば、シロイヌナズナ由来のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の配列は、ＴＡＩＲウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）に登録されており、各遺伝子のアクセッションナンバーは、下記表２の通りである。
【００２４】
【表２】
2008187958.tif 000004
【００２５】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、天然のＤＮＡでもよいし、遺伝子工学によって合成したＤＮＡであってもよい。また、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、エキソンとイントロンを含むＤＮＡでもよいし、エキソンからなるｃＤＮＡであってもよい。前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡにおける全長配列またはｃＤＮＡにおける全長配列のいずれでもよい。また、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、発現したタンパク質が、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質として機能する範囲において、ゲノムＤＮＡにおける部分配列またはｃＤＮＡにおける部分配列であってもよい。なお、本発明において、「Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質として機能する」とは、例えば、オーキシン類の存在下で、ＴＩＲ１タンパク質により認識されることを意味する。ＴＩＲ１ファミリータンパク質が、部分配列から発現したタンパク質（ポリペプチド）を認識できれば、前述のようにポリユビキチン化され、目的タンパク質を分解できるからである。
【００２６】
前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が前記部分配列の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質のドメインIIのＤＮＡ配列があげられる。前記ドメインIIのアミノ酸配列の具体例を、前記表２にあわせて示す。前記部分配列は、前述のように、ドメインIIのアミノ酸配列をコードするＤＮＡでもよいし、ドメインIIのアミノ酸配列の部分配列をコードするＤＮＡ配列であってもよい。ドメインIIの最小アミノ酸残基数は、１３である。
【００２７】
前記部分配列について、ＩＡＡ１７のドメインIIを一例にあげて説明する。前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質間において、例えば、ＩＡＡ１７のドメインIIのアミノ酸配列ＱＶＶＧＷＰＰＶＲＳＹＲＫ（１３アミノ酸残基、配列番号１７）が高く保存されている。そして、この配列からなるポリペプチドやこの配列を含むタンパク質は、ＴＩＲ１タンパク質により認識されることが知られている（Ｚｅｎｓｅｒ，Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５  ４３５，４４６−４５１）。このため、前記部分配列の具体例として、例えば、配列番号１７のアミノ酸配列（ＱＶＶＧＷＰＰＶＲＳＹＲＫ）をコードする塩基配列からなるＤＮＡ配列や、前記塩基配列を含むＤＮＡ配列があげられる。また、前記部分配列は、前述のように、配列番号１７のアミノ酸配列（ＱＶＶＧＷＰＰＶＲＳＹＲＫ）の部分配列をコードするＤＮＡ配列でもよい。
【００２８】
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、さらに、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。これによって、より確実に、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現できる。前記プロモーターは、制限されず、例えば、細胞の種類等に応じて適宜決定できる。
【００２９】
本発明において、前記目的タンパク質の遺伝子は、前記真核細胞のゲノムに存在する内在の遺伝子でもよいし、前記真核細胞に導入された外来の遺伝子であってもよい。また、前記外来遺伝子は、例えば、ゲノムＤＮＡに組み込まれてもよいし、組み込まれていなくてもよい。前者の場合、例えば、外来遺伝子を連結した遺伝子導入ベクター等によって、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれた状態である。また、後者の場合、例えば、前記遺伝子導入用ベクター等が、プラスミドとして存在している状態であり、前記遺伝子導入用ベクターにおいて、前記目的遺伝子は、複製起点に機能的に連結されていることが好ましい。
【００３０】
本発明において、前記真核細胞は、例えば、Ｓｋｐ１遺伝子、Ｃｕｌｌｉｎ遺伝子、および、Ｒｂｘ１遺伝子を有することが好ましい。これらの各遺伝子は、前記真核細胞の内在遺伝子であることが好ましい。なお、動物、植物、菌類、原生生物等の真核生物は、通常、これらの遺伝子を内在的に備えているが、導入された外来遺伝子であってもよい。本発明のタンパク質分解誘導性細胞では、これらの遺伝子から発現したタンパク質（すなわち、Ｓｋｐ１タンパク質、Ｃｕｌｌｉｎタンパク質およびＲｂｘ１タンパク質）と、植物由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子から発現したＴＩＲ１ファミリータンパク質とから、ＳＣＦ複合体が構成されると推測される。
【００３１】
＜タンパク質分解誘導性細胞の製造方法＞
本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、特に制限されないが、例えば、本発明の製造方法があげられる。すなわち、本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、前述のように、目的の細胞が、非植物の真核細胞であり、下記工程（Ｉ）および（II）を含むことを特徴とする。
（Ｉ）宿主である前記真核細胞に、植物由来ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を導入する工程
（II）宿主である前記真核細胞に、植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を導入し、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するキメラ遺伝子を形成する工程
【００３２】
本発明において、前記工程（Ｉ）および工程（II）の順序は制限されず、同時に行ってもよい。前記工程（Ｉ）における植物由来ファミリー遺伝子の導入と、前記工程（II）におけるＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の導入とは、例えば、それぞれ別個のベクターを用いて行ってもよいし、前記植物由来ファミリー遺伝子および前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とが挿入された一つのベクターを用いて行ってもよい。
【００３３】
本発明において、目的遺伝子は、前述のように、真核細胞のゲノムＤＮＡに存在する内在遺伝子でもよいし、外来遺伝子であってもよい。前記内在遺伝子の場合、前記工程（II）において、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を真核細胞に導入し、内在の目的遺伝子に機能的に連結させることによってキメラ遺伝子を形成できる。また、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子と目的遺伝子とを連結させたキメラ遺伝子を形成し、これを真核細胞に導入し、ゲノムとの組換えによりキメラ遺伝子をゲノムに挿入してもよい。
【００３４】
目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子の導入に先立って、外来遺伝子を前記真核細胞に導入してもよい（III）。また、目的遺伝子が外来遺伝子の場合、例えば、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とともに、真核細胞に導入されてもよい。具体的には、予め、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子と目的タンパク質の遺伝子とが機能的に連結したキメラ遺伝子を作製し、これを真核細胞に導入することができる。
【００３５】
以下に、本発明の製造方法について、例をあげて説明する。なお、これらの例は、本発明を制限しない。
【００３６】
（１）第１の実施形態
本実施形態は、目的遺伝子が外来遺伝子であり、ベクターを用いた組換えによって、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子とキメラ遺伝子とを導入する例である。
【００３７】
まず、植物由来ＴＩＲ１遺伝子をベクターに組み込み、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターを作製する。ベクターの種類は、制限されず、例えば、真核細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例として、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記プラスミドベクターとしては、例えば、ｐＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ、ｐＡＣＴ等があげられ、前記ウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス発現系等があげられる。
【００３８】
ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、前記ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、制限されず、例えば、真核細胞の種類等に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＧＡＬ４結合配列等があげられる。前記プロモーターは、通常、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子の上流（５’側）に機能的に連結することが好ましい。さらに、細胞種特異的、器官特異的プロモーターでもよい。また、プロモーター配列をもたないＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、宿主細胞や宿主動物個体における内在プロモーターの下流に組み込んでも良い。この場合、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子を、例えば、特定遺伝子にターゲッティングしてもよいし、ランダムに組み込んでもよい。
【００３９】
また、真核細胞への導入の有無を確認できることから、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターは、さらに、選択マーカーコード配列を有してもよい。前記選択マーカーコード配列としては、制限されず、公知の薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、細胞表面レセプターマーカー等のマーカーをコードする配列があげられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、制限されず、例えば、ネオマイシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー等があげられる。前記蛍光タンパク質マーカーとしては、例えば、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（変異型ＧＦＰ：Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）等があげられる。また、酵素マーカーとしては、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等があげられる。これらの選択マーカーコード配列は、その配列にしたがってＰＣＲ等により合成してもよいし、前記選択マーカーコード配列を有する市販のベクターから調製することもできる。なお、ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターと後述するキメラ遺伝子導入用ベクターとを併用する場合、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーと、キメラ遺伝子導入用ベクターにおける選択マーカーは、異なるマーカーであることが好ましい。さらに、ＴＩＲ１ファミリー遺伝子は、例えば、他のタンパク質遺伝子またはタグ配列と機能的に連結させ、前記タンパク質とＴＩＲ１タンパク質とを含むタンパク質（例えば、融合タンパク質）として、また、タグで標識化されたＴＩＲ１タンパク質として、発現させてもよい。
【００４０】
他方、目的遺伝子および植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子をベクターに連結して、キメラ遺伝子の導入用ベクターを作製する。キメラ遺伝子とは、前述のように、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で標識化された目的タンパク質を発現する遺伝子である。前記ベクターにおいて、前記目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子との位置は、制限されず、前述のように、標識化タンパク質を発現できる関係であればよい。具体例として、前記Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子は、前記目的遺伝子の上流（５’側）または下流（３’側）に隣接して配置されてもよく、目的遺伝子の内部に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が介在してもよい。
【００４１】
前記ベクターとしては、制限されず、前述と同様のものがあげられる。また、キメラ遺伝子導入用ベクターは、前記キメラ遺伝子の転写を制御するプロモーター配列を有することが好ましい。前記プロモーターとしては、前述のようなものがあげられる。また、真核細胞への導入の有無を確認できることから、キメラ遺伝子導入用ベクターは、さらに、前述のような選択マーカーコード配列を有してもよい。
【００４２】
そして、宿主細胞である真核細胞に、前述のＴＩＲ１遺伝子導入用ベクター、ならびに、キメラ遺伝子導入用ベクターを導入する（工程（Ｉ）および工程（II））。前記両ベクターの導入順序は、制限されない。前記宿主細胞としては、前述のような植物を除く真核細胞があげられる。
【００４３】
ベクターの導入方法は、特に制限されず、例えば、使用するベクターの種類や宿主細胞の種類等に応じて、適宜決定できる。導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクョン法、エレクトロポレーション法があげられ、この他にも、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター等を用いた方法があげられる。
【００４４】
このように、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターとキメラ遺伝子導入用ベクターとを導入することによって、本発明のタンパク質分解誘導性細胞を作製できる。なお、各種遺伝子を導入するためのベクターは、例えば、前述のように、２種類のベクター（前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターおよびキメラ導入用ベクター）を使用してもよいし、ＴＩＲ１遺伝子とキメラ遺伝子とが挿入された一種類のベクターを使用してもよい。ＴＩＲ１遺伝子および前記キメラ遺伝子は、目的に応じて、ベクターの導入により宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込んでもよいし、ゲノムＤＮＡに組み込まず、プラスミドとして存在させてもよい。また、各種遺伝子から発現するタンパク質を細胞の核内に導入する場合は、例えば、核内導入シグナルのコード配列（例えば、核移行シグナル（例えば、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ等）をコードするＤＮＡ）を各種遺伝子に機能的に連結させてもよい。また、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターとキメラ遺伝子導入用ベクターは、それぞれ目的の遺伝子を導入でき、それによって各遺伝子がコードするタンパク質が細胞内で発現できればよい。このため、各ベクターは、その範囲で全体を導入してもよいし、部分を導入してもよい。
【００４５】
（２）第２の実施形態
本実施形態は、目的遺伝子が真核細胞のゲノムＤＮＡ内に存在する場合の製造方法の一例である。目的遺伝子がゲノムＤＮＡ内に存在する形態としては、例えば、目的遺伝子が真核細胞の内在遺伝子である場合や、目的遺伝子が外来遺伝子であるが、すでに真核細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている場合等があげられる。なお、特に示さない限りは、前記第１の実施形態と同様にして製造できる。
【００４６】
本実施形態においては、前記第１の実施形態におけるキメラ遺伝子導入用ベクターに代えて、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子を挿入したＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターを使用する。この遺伝子導入用ベクターは、例えば、真核細胞のゲノムＤＮＡに対して、タンパク質発現の際、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリータンパク質で目的タンパク質を標識化できる部位に、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子が組み込まれる構造であることが好ましい。つまり、前記遺伝子導入用ベクターの構造は、ゲノムＤＮＡとの組換えによって、ゲノムＤＮＡ内の目的遺伝子とＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子とが機能的連結して、キメラ遺伝子を形成するものであればよい。このようにＡｕｘ／ＩＡＡファミリーが組み込まれることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーで標識化された目的タンパク質を発現できる。なお、キメラ遺伝子導入用ベクターは、例えば、ゲノムＤＮＡにおける目的遺伝子の遺伝子座やその配列等から、当業者であれば構築可能である。
【００４７】
＜タンパク質分解誘導性細胞の製造用キット＞
本発明のタンパク質分解誘導性細胞の製造方法は、例えば、本発明のキットを用いて行うことができる。このようなキットを使用することによって、より簡便に、本発明のタンパク質分解誘導性細胞を製造できる。
【００４８】
本発明のキットは、下記（１）の宿主細胞および下記（２）の遺伝子導入用ベクターを含むことを特徴とする。
（１）植物由来ＴＩＲ１ファミリーの遺伝子を含む、植物以外の真核細胞
（２）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーの遺伝子を含み、前記（１）の真核細胞に導入されることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
【００４９】
前記（１）の宿主細胞は、例えば、前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターを目的真核細胞に導入することによって調製できる。また、前記（２）の遺伝子導入用ベクターは、例えば、前述のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターや、目的遺伝子を含む前述のキメラ遺伝子導入用ベクター等があげられる。
【００５０】
＜タンパク質分解の制御方法＞
本発明のタンパク質分解誘導性細胞は、例えば、以下のような方法によってタンパク質の分解を制御できる。すなわち、本発明の分解制御方法は、誘導物質により細胞における目的タンパク質の分解を制御する分解制御方法であって、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、下記工程（Ａ）および（Ｂ）を含むことを特徴とする。
（Ａ）本発明のタンパク質分解制御細胞を準備する工程
（Ｂ）下記（ｂ１）〜（ｂ４）の少なくとも一つの処理によって、前記細胞における目的タンパク質の分解を制御する工程
（ｂ１）前記細胞にオーキシン類を添加することによって、発現した目的タンパク質の分解を誘導する
（ｂ２）前記細胞にオーキシン類を添加しないことによって、発現した目的タンパク質の分解を抑制する
（ｂ３）前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、前記オーキシン類を除去して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
(ｂ４)  前記細胞にオーキシン類を添加して、発現した目的タンパク質の分解を誘導した後、さらに、オーキシン阻害物質を添加して、新たに発現した目的タンパク質の分解を抑制する
【００５１】
前記（Ｂ）工程は、例えば、前記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）および（ｂ４）のいずれか一つの処理を行ってもよいし、二つ以上の処理を行ってもよい。また、これらの処理を繰り返し行ってもよい。本発明の方法は、前述のように、機能が不明なタンパク質の解析に利用することができる。具体例として、細胞の成長期に応じて、目的タンパク質の維持や分解を行う場合は、例えば、オーキシン類の非存在下で細胞を培養し、所望の時期に、培地にオーキシンを添加する方法があげられる。これによって、タンパク質が欠損することによる影響を確認することができる。また、例えば、オーキシンの存在下で細胞を培養し、所望の時期に、培地から前記オーキシン類を除去する方法またはオーキシン阻害物質によりオーキシンの活性を阻害する方法等があげられる。これによって、タンパク質が存在することによる影響を確認することができる。前記オーキシン類の除去は、例えば、培養細胞を洗浄し、新たなオーキシン未添加の培地で培養することによって行える。
【００５２】
目的タンパク質の分解誘導において、オーキシン類の添加量は、制限されず、例えば、オーキシン類の種類やＴＩＲ１ファミリータンパク質の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば出芽酵母の場合、１μＭ〜１ｍＭであり、好ましくは１００μＭ〜５００μＭ培地に添加する。
【００５３】
前記誘導体の種類は、制限されないが、オーキシンやオーキシン誘導体が使用できる。オーキシンとしては、例えば、１−ナフタレン酢酸（１−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ；ＮＡＡ）、インドール−３−酢酸（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）等があげられる。また、この他にも、前記ＮＡＡ等と同様の生理活性を有する化合物群があげられ、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、４−クロロフェノキシ酢酸（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、（２，４，５−トリクロロフェノキシ）酢酸（（２，４，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）  Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、１−ナフタレンアセトアミド（１−Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−パラクロロ酢酸等がある。また、本発明において、オーキシン誘導体とは、例えば、代謝によってオーキシンの生理活性を有することとなる前躯体である。前記誘導体としては、例えば、宿主細胞や宿主動物個体におけるエステラーゼやβ−酸化酵素によりオーキシン活性を有する物質に変換される物質が好ましい。具体例としては、例えば、インドール−３−酢酸メチルエステル（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ）やインドール−３−酪酸（Ｉｎｄｏｌｅ−３−ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）等があげられる。例えば、対象細胞や対象組織に対して親和性や透過性に優れる構造の誘導体を使用し、対象細胞等に前記誘導体が投与された後にオーキシンに変換させることで、より確実に対象細胞等への投与を行うことができる。また、前記オーキシン阻害物質としては、例えば、２，３，５−トリヨード安息香酸（２，３，５−Ｔｒｉｉｏｄｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）等があげられる。
【００５４】
＜モデル動物＞
本発明のモデル動物は、誘導物質により目的タンパク質の分解が誘導されるモデル動物であって、前記モデル動物が、ヒト以外の動物であって、前記誘導物質が、前記誘導物質が、オーキシンおよびオーキシン誘導体の少なくとも一方であり、本発明のタンパク質誘導細胞を含むことを特徴とする。
【００５５】
本発明のモデル動物は、前述のような本発明のタンパク質分解誘導性細胞や本発明の製造方法によって製造でき、オーキシン類によってタンパク質の分解を誘導できる。製造方法の一例としては、まず、目的の動物個体（例えば、マウス）の胚幹細胞を宿主細胞として、本発明のタンパク質分解誘導性細胞を作製する。そして、この胚幹細胞からキメラ胚細胞を作製して、仮親動物個体（例えば、マウス）に移植し、生まれた動物個体の交配を行うことによって、植物由来ＴＩＲ１遺伝子ならびに前記キメラ遺伝子を有するモデル動物（例えば、モデルマウス）が作製できる。この他に、例えば、本発明のタンパク質分解誘導性細胞を、モデル動物に移植することによっても作製できる。前記モデル動物としては、制限されないが、ヒトを除く哺乳類、ゼブラフィッシュ、アフリカツメガエル等の魚類や両生類、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓやショウジョウバエ等の無脊椎動物等があげられる。前記哺乳類動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ等があげられる。
【００５６】
本発明のモデル動物における目的タンパク質の分解は、例えば、前記目的タンパク質が発現する組織等に、オーキシン類を投与することによって行うことができる。
【００５７】
また、モデル動物の製造には、例えば、本発明のキットを用いることができる。本発明のキットは、下記（１’）の宿主動物個体および下記（２’）の遺伝子導入用ベクターを含むことを特徴とする。
（１’）植物由来ＴＩＲ１ファミリーの遺伝子を含む、動物個体
（２’）植物由来Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーの遺伝子を含み、前記（１）の真核細胞に導入されることによって、Ａｕｘ／ＩＡＡファミリーのタンパク質で標識化された目的タンパク質を発現するベクター
【００５８】
前記（１’）の動物個体は、例えば、前述のような前記ＴＩＲ１遺伝子導入用ベクターを導入したＥＳ細胞等を用いて、移植、交配等を行うことによって調製できる。また、前記（２’）の遺伝子導入用ベクターは、例えば、前述のＡｕｘ／ＩＡＡファミリー遺伝子導入用ベクターや、目的遺伝子を含む前述のキメラ遺伝子導入用ベクター等があげられる。
【００５９】
［実施例］
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００６０】
１．出芽酵母株の作製
分解目的のタンパク質をＥＧＦＰとし、ＮＡＡ添加によってＥＧＦＰを分解する出芽酵母株を作製した。なお、使用した出芽酵母のプロモーター配列や遺伝子配列は、ＳＧＤウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／に登録されている。
【００６１】
（１）シロイヌナズナＴＩＲ１発現株（ＹＮＫ２）
ｐＲＳ３０６−ＧＡＬプラスミドベクターをＳａｌ１およびＸｈｏ１で切断し、セルフライゲーションさせた。ｐＲＳ３０６−ＧＡＬプラスミドベクターは、文献（Ｌ．Ｄｒｕｒｙ，Ｇ．Ｐｅｒｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄｉｆｆｌｅｙ“Ｔｈｅ  Ｃｄｃ４／３４／５３  ｐａｔｈｗａｙ  ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃｄｃ６ｐ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ”ＥＭＢＯ  Ｊ  １６，５９６６−５９７６，１９９７）に開示されている。これにより、前記プラスミドベクターのマルチクローニングサイトにあるＳａｌＩサイトを除去した。シロイヌナズナのＴＩＲ１遺伝子（ＴＡＩＲ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＴ１Ｇ０４２５０．１）を、下記プライマーセット１を用いたＰＣＲで増幅し（１７８５ｂｐ）、この増幅物を、前記プラスミドベクターのＳｐｅ１−Ｎｏｔ１サイトにクローニングした。得られたベクターを、ｐＭＫ２６という。
＜プライマーセット１＞
Ｆプライマー７（配列番号２６）
５’−AGCTAGACTAGTATGCAGAAGCGAATAGCCTT−３’
Ｒプライマー８（配列番号２７）
５’−ATCGATGCGGCCGCAGATCTGCTAGTCGACTAATCCGTTAGTAGTAATGA−３’
【００６２】
ｐＹＭ１８プラスミドベクター（Ｊａｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．文献名からＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ断片を切断して、９Ｍｙｃタグ部分（４３５ｂｐ）を切り出し、これを、前記ベクターｐＭＫ２６のＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩサイトにクローニングした。ｐＹＭ１８プラスミドベクターは、文献（Ｃ．Ｊａｎｋｅ，Ｍ．Ｍａｇｉｅｒａ，Ｎ．Ｒａｔｈｆｅｌｄｅｒ，Ｃ．Ｔａｘｉｓ，Ｓ．Ｒｅｂｅｒ，Ｈ．Ｍａｅｋａｗａ，Ａ．Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｏｒｃｈａｒｔ，Ｇ．Ｄｏｅｎｇｅｓ，Ｅ．Ｓｃｈｗｏｂ，Ｅ．Ｓｃｈｉｅｂｅｌ，ａｎｄＭ．Ｋｎｏｐ．“Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｓ：  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ｍｏｒｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．”Ｙｅａｓｔ  ２１，９７４−９６２，２００４）に開示されている。得られたベクターをｐＭＫ２７という。このベクターｐＭＫ２７を、ＵＲＡ３マーカー内部にあるＳｔｕ１で切断して、出芽酵母野生株Ｗ３０３−１ａにトランスフォーメーションし、相同組換えによって、前記プラスミドベクターを出芽酵母ゲノム上のＵＲＡ３部位に挿入した。得られた組換え体を、シロイヌナズナＴＩＲ１発現株「ＹＮＫ２」とした。なお、ＹＮＫ２において、ＴＩＲ１遺伝子の上流には、ベクター由来のＧＡＬ１−１０プロモーターが配置されている。
【００６３】
野生株Ｗ３０３−１ａおよびＹＮＫ２の遺伝型を以下に示す。
Ｗ３０３−１ａ
ＭＡＴａ  ａｄｅ２−１  ｕｒａ３−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｃａｎ１−１００
ＹＮＫ２
ＭＡＴａ  ａｄｅ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＩＲ１  （ｐＭＫ２７  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
【００６４】
（２）ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ発現株（ＹＮＫ３）
出芽酵母野生株Ｗ３０３−１ａから抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、下記プライマーセットを用いたＰＣＲにより、ＡＤＨ１プロモーター（７０６ｂｐ）を増幅した。増幅したＡＤＨ１プロモーターを、ｐＲＳ３０４プラスミドベクターのＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１サイトにクローニングした。得られたベクターをｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１という。なお、ｐＲＳ３０４プラスミドベクターは、文献（Ｒ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ“Ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２，１９−２７，１９８９）に開示されている。
＜プライマーセット２＞
Ｆプライマー１４２（配列番号２８）
５’−ACGTATGGATCCGGGTGTACAATATGGACTTCCTC−３’
Ｒプライマー１４３（配列番号２９）
５’−ACGTATGAATTCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC−３’
【００６５】
ＥＧＦＰ遺伝子に核移行シグナル３ＮＬＳを付加するために、下記プライマーセット３を用いて、ｐＥＧＦＰ−ｃ１（クロンテック社）を鋳型として、ＥＧＦＰ遺伝子をＰＣＲによって増幅させた（７１８ｂｐ）。前記プライマーセット３のＲプライマーは、核移行シグナル３ＮＬＳの配列を有するため、得られた増幅物のＣ’末端には、核移行シグナル３ＮＬＳが付加している。この増幅物を、ＥＧＦＰ−３ＮＬＳという。このＥＧＦＰ−３ＮＬＳをｐＥＴ２１ａプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢａｍＩ-ＸｈｏＩサイトにクローニングした。さらに、このプラスミドベクターを鋳型として、下記プライマーセット４を用いて、ＥＧＦＰ−３ＮＬＳを増幅し（７７１ｂｐ）、この増幅物を、前述のｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１プラスミドベクターのＡｐａ１−Ｋｐｎ１サイトにクローニングした。得られたベクターをｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＥＧＦＰという。
＜プライマーセット３＞
Ｆプライマー１３９（配列番号３０）
５’−CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT−３’
Ｒプライマー１４０（配列番号３１）
５’−CCGCTCGAGCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGCACCTTTCTCTTCTTCTTGGGCACCTTTCTCTTCTTCTTTGGGCCTCCTCCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA−３’
＜プライマーセット４＞
Ｆプライマー１４３（配列番号３２）
５’−ACGTATGGGCCCGGAGCTGGTGCAGGCGCTGGAGCGGGTGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC−３’
Ｒプライマー１４４（配列番号３３）
５’−ACGTATGGTACCTCACACCTTTCTCTTCTTCTTGGGC−３’
【００６６】
シロイヌナズナのゲノムＤＮＡを鋳型として、ＩＡＡ１７（ＴＡＩＲ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＴ３Ｇ６２９８０．１）のドメインIIのコード領域を、下記プライマーセット５を用いたＰＣＲによって増幅した（６９０ｂｐ）。この増幅物を、前記ベクターｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＥＧＦＰのＳａｌ１−Ａｐａ１サイトにクローニングした。得られたベクターを、ｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰという。このｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰを、ＴＲＰ１マーカー内部にあるＢｓｕ３６  Ｉで切断後、前記（１）で得られたＴＩＲ１発現株ＹＮＫ２にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、前記プラスミドベクターを出芽酵母ゲノムのＴＲＰ１部位に挿入した。得られた組換え体を、ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ発現株「ＹＮＫ３」とした。
＜プライマーセット５＞
Ｆプライマー１４５（配列番号３４）
５’−ACGTATGTCGACATGATGGGCAGTGTCGAGCTG−３’
Ｒプライマー１４６（配列番号３５）
５’−ACGTATCTCGAGAGCTCTGCTCTTGCACTTCTC−３’
【００６７】
ＹＮＫ３の遺伝型を以下に示す。
ＹＮＫ３
ＭＡＴａ  ａｄｅ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：：ＵＲＡ３−ＡＤＨ１−ＴＩＲ１
ｔｒｐ１−１：：ＴＲＰ１−  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ  （ｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
【００６８】
２．出芽酵母株の培養
細胞株を、ＹＰＲ培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％ラフィノース）で２５℃一晩前々培養した。得られた培養細胞を新たなＹＰＲ培地で希釈し、さらに、１×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌとなるまで前培養した。なお、前培養後に、培養液のサンプリングを行った。そして、前培養した培養細胞を遠心分離によって回収した。得られた培養細胞をＹＰＧ培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％ラフィノース）に移し、さらに、２５℃で４０ｍｉｎ、本培養し、ＴＩＲ１の発現を誘導した。なお、ＴＩＲ１発現誘導後の培養液のサンプリングを行った。そして、さらに、前記培地に終濃度０．５ｍＭとなるように０．５Ｍ  ＮＡＡ（ナフタレン酢酸）を添加し、所定の時間（０、１、２、３時間）に培養液のサンプリングを行った。
【００６９】
続いて、前記ＮＡＡ添加から３時間後、培養細胞を回収して、ＹＰＧ培地で洗浄した。回収した培養細胞を、ＮＡＡ無添加のＹＰＧ培地で培養し、所定の時間（０、１、２、３時間）に培養液のサンプリングを行った。
【００７０】
これらのサンプルについて、誘導タンパク質の分解の有無を確認するため、後述するウェスタンブロット解析ならびに顕微鏡観察を行った。すなわち、ＮＡＡを添加したサンプルによって、複合タンパク質の分解を確認し、ＮＡＡを除去したサンプルによって、複合タンパク質の未分解を確認した。なお、ネガティブコントロール（ＮＡＡ無添加）としては、前記ＮＡＡに代えて、１／１０００体積量となるようにＤＭＳＯをＹＰＧ培地に添加した以外は、同様にして培養ならびに分析を行った。
【００７１】
３．ウェスタンブロット
サンプリングした培養液１０ｍＬを遠心分離によって集菌し、ＴＣＡ法により全タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロースメンブレンに転写した。抗Ｍｙｃ抗体（マウスモノクローナル９Ｅ１０）、抗ＧＦＰ抗体（マウスモノクローナル  ９Ｅ１）、抗Ｓｋｐ１抗体（ヤギポリクローナル  ｙＣ−２０  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ウェスタンブロッティングにより、各種タンパク質の検出を行った。なお、二次抗体として、ＨＲＰ標識されたＩｇＧ抗体を使用した。泳動コントロールとして、ポンソー染色により、全抽出タンパク質を検出した。シロイヌナズナＴＩＲ１遺伝子には９Ｍｙｃタグを付加していることから、前記Ｍｙｃ抗体とのウェスタンブロッティングにより、ＴＩＲ１タンパク質を検出できる。また、複合タンパク質における分解対象タンパク質ＥＧＦＰは、ＧＦＰ抗体とのウェスタンブロッティングにより検出できる。ＳｋｐＩ抗体により、Ｓｋｐ１タンパク質が検出できる。このＳｋｐ１タンパク質は、ＴＩＲ１タンパク質とともにオーキシン受容体であるＳＣＦ複合体を構成することから、その検出によってＳＣＦ複合体の形成を確認できる。
【００７２】
４．顕微鏡観察
サンプリングした培養液１ｍＬに、８％パラホルムアルデヒド１ｍＬを加え、１０分間固定した後、前記培養液中の培養細胞をＰＢＳで洗浄した。この培養細胞を共焦点顕微鏡により観察し、ＥＧＦＰの有無を確認した。
【００７３】
５．結果
（１）ＮＡＡ添加によるＥＧＦＰの分解
ＮＡＡを添加した各培養液サンプルについてウェスタンブロット解析を行った結果を、図１に示す。同図において、「Ｒ」は、前培養用のサンプルであり、「０」は、ＮＡＡ添加直後（０時間）のサンプル、「１」は、ＮＡＡ添加１時間後のサンプル、「２」は、ＮＡＡ添加２時間後のサンプル、「３」は、ＮＡＡ添加３時間後のサンプルである。また、「−ＮＡＡ」は、ＮＡＡ無添加のネガティブコントロールの結果であり、「＋ＮＡＡ」は、ＮＡＡ添加の結果である（以下、他の図においても同様）。「ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ」は、ＩＡＡ１７とＥＧＦＰと３ＮＬＳとを含む融合タンパク質を示し、「Ｓｋｐ１」は、Ｓｋｐ１タンパク質を示し、「Ｔｉｒ１」は、ＴＩＲ１タンパク質を示す（以下、他の図においても同様）。
【００７４】
同図に示すように、ＮＡＡ無添加の系では、常時、ＥＧＦＰを含む融合タンパク質の存在が確認された。なお、Ｓｋｐ１タンパク質およびＴＩＲ１タンパク質の存在も確認されていることから、Ｓｋｐ１タンパク質およびＴＩＲ１タンパク質を含むＳＣＦ複合体は、細胞中で形成されていると推測される。これに対して、ＮＡＡ添加した系では、前培養ならびにＮＡＡ添加直後（０時間）ではＥＧＦＰ（ＥＧＦＰを含む融合タンパク質）の存在が確認されたものの、ＮＡＡ添加から１時間で、すでに前記融合タンパク質が検出限界以下であり、確認できなかった。この結果から、ＮＡＡ添加により、ＥＧＦＰが分解されていることがわかった。
【００７５】
同じ各培養サンプルについてＥＧＦＰ顕微鏡観察を行った結果を、図２に示す。同図において、「０ｈ」は、ＮＡＡ添加直後（０時間）のサンプル、「１ｈ」は、ＮＡＡ添加１時間後のサンプル、「２ｈｒ」は、ＮＡＡ添加２時間後のサンプルである。同図に示すように、ＮＡＡ無添加の系では、いずれのサンプルにおいても緑の蛍光が見られることから、ＥＧＦＰの存在が確認された。これに対して、ＮＡＡ添加の系では、経時的に緑の蛍光が減少したことから、ＥＧＦＰが分解されていることが確認された。
【００７６】
（２）ＮＡＡ除去によるＥＧＦＰ分解の停止
添加したＮＡＡを除去した各培養液サンプルについてウェスタンブロット解析を行った結果を、図３に示す。同図において、「Ｒ」は、前培養のサンプルであり、「Ｇ」は、ＴＩＲ１発現誘導後のサンプルである。また、「０」は、ＮＡＡ除去後（０時間）のサンプル、「１」は、ＮＡＡ除去１時間後のサンプル、「２」は、ＮＡＡ除去２時間後のサンプル、「３」は、ＮＡＡ添加３時間後のサンプルである。
【００７７】
同図に示すように、前培養およびＴＩＲ１発現誘導後のサンプルでは、ＥＧＦＰが確認されたのに対して、ＮＡＡ存在下で培養した後、ＮＡＡを除去したサンプル（０）では、ＥＧＦＰを含む融合タンパク質が検出されなかった。そして、ＮＡＡ除去後１時間で、すでに前記融合タンパク質が検出された。この結果から、ＮＡＡ存在下では、合成された前記融合タンパク質は直ぐに分解されるが、ＮＡＡ除去によって、ＦＧＦＰを含む融合タンパク質は、合成された後、分解されることなく存在していることがわかる。
【実施例２】
【００７８】
１．出芽酵母株の作製
（３）Ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７（１３ａａ）−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ発現株
ＩＡＡコード遺伝子として、ＩＡＡ１７ドメインIIの１３アミノ酸領域のコード配列を使用した発現株を作製した。まず、シロイヌナズナのゲノムＤＮＡを鋳型として、下記プライマーセット６を用いたＰＣＲによって、ＩＡＡ１７ドメインIIの１３アミノ酸領域（ＱＶＶＧＷＰＰＶＲＳＹＲＫ）のコード領域を増幅した（３９ｂｐ）。他方、前記（２）で作製したベクターｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰをＳａｌＩ−ＡｐａＩで処理し、ＩＡＡ１７のコード領域を除去し、この部分に、前述の増幅物をクローニングした。このベクターを、ｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７  （１３ａａ）−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳという。
＜プライマーセット６＞
Ｆプライマー２１２（配列番号３６）
５’−ACGTATGGGCCCCTTCCGGTATGATCTCACCG−３’
Ｒプライマー２１３（配列番号３７）
５’−ACGTATGTCGACATGCAAGTTGTGGGATGGCCACC−３’
【００７９】
得られたベクターｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７（１３ａａ）−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳをＴＲＰ１マーカー内部にあるＢｓｕ３６  １で切断後、前記（１）で得られたＴＩＲ１発現株ＹＮＫ２にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、前記プラスミドベクターを出芽酵母ゲノムのＴＲＰ１部位に挿入した。得られた組換え体を、「ＹＮＫ５」とした。
【００８０】
ＹＮＫ５の遺伝型を以下に示す。
ＹＮＫ５
ＭＡＴａ  ａｄｅ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：：ＵＲＡ３−ＡＤＨ１−ＴＩＲ１
ｔｒｐ１−１：：ＴＲＰ１−  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７  （１３ａａ）−ＥＧＦＰ  （ｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７  （１３ａａ）−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
【００８１】
このＹＮＫ５株を用いて、前記実施例１と同様にして、培養ならびにウェスタンブロット解析を行った。
【００８２】
２．結果
この結果を図４に示す。また、同図には、前記実施例１で作製したＩＡＡ１７−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ発現株（ＹＮＫ３）の結果をあわせて示す。同図において、左４レーンが、ＹＮＫ３の結果、右４レーンがＹＮＫ５の結果である。また、「Ｍｉｎｉｍａｌ  ＩＡＡ１７（１３ａａ）−ＥＧＦＰ−３ＮＬＳ」は、ＩＡＡ１７の１３アミノ酸領域とＥＧＦＰと３ＮＬＳとを含む融合タンパク質を示す。
【００８３】
同図に示すように、ＹＮＫ３およびＹＮＫ５は、ともに、ＮＡＡ添加０時間では、ＥＧＦＰを含む融合タンパク質が確認されているが、添加１時間においては、前記融合タンパク質の検出量は極めて低くなり、１時間をこえると、検出限界以下となった。この結果から、ＩＡＡは、１３アミノ酸領域を融合タンパク質の一部として発現させるのみであっても、十分に目的タンパク質の分解に機能できることがわかった。
【実施例３】
【００８４】
１．出芽酵母株の作製
（４）内在性蛋白質Ｍｃｍ４のＡｕｘｉｎ  ｄｅｇｒｏｎ（ｍｃｍ４−ａｄ）株
内在性タンパク質Ｍｃｍ４を分解目的タンパク質とし、ＮＡＡ添加によりこれを分解する株を作製した。内在性タンパク質Ｍｃｍ４は、ＤＮＡ複製に関与するタンパク質である。
【００８５】
まず、ＩＡＡ１７ドメインIIのコード領域に５ｘＧＡリンカー（５ｘＧｌｙ−Ａｌａ）を付加するために、下記プライマーセット７を用いて、前記実施例１「１．（２）」で作製したベクターｐＲＳ３０４−ＡＤＨ１−ＩＡＡ１７−ＥＧＦＰを鋳型としたＰＣＲによって、ＩＡＡ１７のコード領域の増幅を行った（７４６ｂｐ）。下記プライマーセット７のＲプライマーは、５ｘＧＡリンカーを有しているため、得られた増幅物のＣ’末端側には、５ｘＧＡリンカーが付加している。なお、下記配列番号３９において、下線部がリンカーである。
＜プライマーセット７＞
Ｆプライマー１４２（配列番号３８）
５’−ACGTATGAATTCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGC−３’
Ｒプライマー１７２（配列番号３９）
５’−ATACGTGGTACCGAGCTCTGGCACCCGCTCCAGCGCCTGCACCAGCTCCCAAGTCCTTAGATTCAATTTGAAGTTCTTCCTCGAGAGCTCTGCTCTTGCACTTCTC−３’
【００８６】
このリンカーが付加された断片を、ｐＫＬ１８７プラスミドベクター（Ａ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｄｉａｚ，Ｍ．Ｋａｎｅｍａｋｉ，Ｖ．Ｍａｒｃｈｅｓｉ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｌａｂｉｂ“Ｒａｐｉｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｕｄｄｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｏ  ａ  ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅｇｒｏｎ．”Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２２３，ＰＬ８，２００４）のＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１に挿入することにより、１ステップＰＣＲでＩＡＡ１７のコード配列を導入するプラスミドベクターを作製した。このベクターをｐＭＫ３８という。このベクターｐＭＫ３８を、下記プライマーセット８を用いてＰＣＲにより増幅した。そして、得られた増幅物を用いて、直接、前記（１）で得られたＴＩＲ１発現株ＹＮＫ２にトランスフォーメーションし、相同組換えによって、出芽酵母ゲノム上のＭＣＭ４  ５’部分に、ＣＵＰ１プロモーター−ＩＡＡ１７を導入した。この組換え体を、「ＹＮＫ４」という。なお、ゲノムへの挿入はＰＣＲにより確認した。
＜プライマーセット８＞
Ｆプライマー１８０（配列番号４０）
５’−TTCTTTAAGAACATCTTCAATACTAAATAAGACAACCCATCTTCAGTTATATTAAGGCGCGCCAGATCTG−３’
Ｒプライマー１８１（配列番号４１）
５’−GAGCTGGAGTTATTATCCTCTTTTGTTGGAGAGCTAGACTGTTGAGACATGGCACCCGCTCCAGCGCCTG−３’
【００８７】
ＹＮＫ４の遺伝型を以下に示す。
ＹＮＫ４
ＭＡＴａ  ａｄｅ２−１  ｈｉｓ３−１１，１５  ｔｒｐ１−１  ｌｅｕ２−３，１１２  ｃａｎ１−１００
ｕｒａ３−１：：ＵＲＡ３−ＧＡＬ１−１０  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＴＩＲ１  （ｐＭＫ２７  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）
ｍｃｍ４：：ＣＵＰ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｍｃｍ４−ａｄ  （ｋａｎＭＸ）
【００８８】
２．出芽酵母株の生育実験
ＹＮＫ４株を、ＮＡＡ未添加のＹＰＤＣｕ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％グルコース、０．１ｍＭ  ＣｕＳＯ４、２％寒天）および、ＮＡＡ添加のＹＰＧＮＡＡ寒天培地（２％ペプトン、１％酵母粉末、２％ガラクトース、０．１ｍＭ  ＮＡＡ、２％寒天）に、プレート１枚あたりの細胞数が所定の数（３．３×１０５、３．３×１０４、３．３×１０３、３．３×１０２、３．３×１０個）となるようにスポットし、２５℃で二日間培養した。そして、細胞の成育を観察した。コントロールとして、出芽酵母野生株Ｗ３０３−１ａおよび実施例１で作製したＹＮＫ２株についても同様に生育を観察した。
【００８９】
これらの結果を図５に示す。同図において、左がＮＡＡ未添加の寒天培地、右がＮＡＡ添加の寒天培地を使用した結果であり、各株について、左から、スポットした細胞数が３．３×１０５、３．３×１０４、３．３×１０３、３．３×１０２、３．３×１０個である。同図に示すように、野生株Ｗ３０３−１ａおよびＹＮＫ２株は、スポットの細胞数に応じて増殖割合で、細胞の成育が確認された。これに対して、ＹＮＫ４は、ＮＡＡ添加のＹＰＧＮＡＡ寒天培地においては、全く生育が見られなかった。この結果から、ＹＮＫ４は、ＮＡＡの添加により、複製に関与するＭｃｍ４タンパク質が分解されたため、細胞が成育できなかったことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明のタンパク質分解誘導性細胞であれば、オーキシン類の有無によって、任意の時期に、発現した目的タンパク質を分解することできる。また、植物以外の真核細胞や個体生物は、基本的にオーキシンが存在しないため、本発明のタンパク質分解誘導性細胞やモデル動物であれば、オーキシン類の存否によって、極めて特異的に目的タンパク質の分解を制御できる。また、オーキシン類は、非常に単純な構造の安価な化合物であり、農業利用も認められており、例えば、動物等に対する影響も極めて小さいことが証明されている。したがって、本発明のタンパク質分解誘導性細胞およびモデル動物であれば、従来のように熱処理や特殊な化合物を使用することなく、目的タンパク質の分解を行うことができる。このため、本発明のタンパク質分解誘導性細胞およびモデル動物、その製造方法、また、製造に使用する本発明のキット等は、例えば、タンパク質の機能解析等の分野において、非常に有用なツールといえる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図１は、本発明の一実施例におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図２】図２は、本発明の前記実施例における顕微鏡観察の結果を示す写真である。
【図３】図３は、本発明のその他の実施例におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明のさらにその他の実施例におけるウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】図５は、本発明のさらにその他の実施例における酵母細胞の成育状態を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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