(57)【要約】【課題】  大腸菌と膜構造が異なり元来内毒素を有さず安全性が確立され、かつ高密度培養の可能なコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル生産能を付与した組換えコリネ型細菌、およびこれら組換えコリネ型細菌を用いて医療や食品業界などの生体に接触する生分解性ポリエステルを効率的に生産する製造方法を提供する。【解決手段】  コリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入して生分解性ポリエステル生産能を付与するように改変したことを特徴とする組換えコリネ型細菌。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入して生分解性ポリエステル生産能を付与するように改変したことを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項２】
請求項１において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターとの距離を近接させて転写機能を備えさせたことを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項３】
請求項１または請求項２において、前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム（Corynebacterium）属であり、かつ、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターがコリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来のものであることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項４】
請求項３において、前記コリネバクテリウム（Corynebacterium）属がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項５】
請求項４において、前記コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７であることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれかにおいて、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群が、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモーナス属（Pseudomonas）、およびバチルス属（Bacillus）のいずれかに由来するものであることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項７】
請求項６において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群は、β−ケトチオラーゼ遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子およびポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子から構成されることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項８】
請求項７において、前記β−ケトチオラーゼ遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子およびポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子がオペロンを形成していることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項９】
請求項８において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を変異型Ｇ４Ｄ遺伝子、または前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子のコドンユーセージをコリネ型菌用に変換した重合酵素遺伝子のいずれかを用いることにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項１０】
請求項８において、ベクターの異なるプラスミドｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つをコリネ型細菌に導入することにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることを特徴とする組換えコリネ型細菌。
【請求項１１】
請求項１から請求項１０のいずれかに記載の前記組換えコリネ型細菌を、炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムをそれぞれ添加した所定の培地組成中において、その培養温度が２７℃〜３７℃、ｐＨが７〜８の条件下で培養することにより生分解性ポリエステルを生産させることを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項１２】
請求項１１において、培養温度が３０℃であってｐＨが７．５の条件下で前記組換えコリネ型細菌を培養することを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項１３】
請求項１１において、培地組成が、少なくともグルコース、硫酸アンモニウム、およびビオチンを含み、前記ビオチン濃度が３〜４５０μｇ／Ｌの組成であることを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【請求項１４】
請求項１３において、前記ビオチン濃度が１０〜３０μｇ／Ｌであることを特徴とする生分解性ポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えコリネ型細菌および生分解性ポリエステルの製造方法に関し、詳しくは、生分解性ポリエステル生産能力を本来有していないコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群およびコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入することにより、内毒素を有しない安全な生分解性ポリエステルを効率よく生産させる能力を付与したコリネ型細菌およびこれを用いた生分解性ポリエステルの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
石油など化石燃料由来の合成プラスチックは、自然環境中で分解されないために、環境中に半永久的に蓄積して、様々な環境問題を引き起こしている。このような背景から、自然界に存在する微生物によって分解される生分解性プラスチックは、環境に負荷を与えない高分子材料として注目されはじめ、実用化に向け優れた性能を持つ材料の開発が行われている。また、これら生分解性プラスチックは同時に生体適合性も有することから、生体機能材料としても注目され、生物・医学領域への新たな展開も期待されている。
【０００３】
このような生分解性プラスチックの合成法として、微生物合成、天然物誘導、化学合成法などが検討されているが、糖や油脂などの再生可能な生物有機資源（バイオマス）を原料とできる微生物合成法は、資源の有効利用という観点から高いニーズがある。
【０００４】
そして、これまでに数多くの微生物において、バイオマスを細胞内に取り入れた後に、複数の合成代謝経路を経て生分解性ポリエステルをつくり、菌体内に蓄積することが知られている。
【０００５】
このような微生物によって生合成された生分解性ポリエステルは、微生物細胞から抽出された後、様々な形に成型・加工されて各種用途に提供され、使用後は、環境微生物の作用により二酸化炭素と水に分解されて最初の再生可能なバイオマスに還元される。
【０００６】
これら生分解性ポリエステルの中で、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸は、合成プラスチックと同様に熱可塑性を示し、優れた生分解性を有することから注目を集めている生分解性ポリエステルである。
【０００７】
微生物細胞内でポリ３−ヒドロキシアルカン酸が合成される代謝過程は、バイオマスを原料として、モノマー供給代謝経路を経てポリ３−ヒドロキシアルカン酸のモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡがつくられ、次いでポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素によって重合されポリ３−ヒドロキシアルカン酸が合成される。
【０００８】
このモノマー供給経路は大きく分けて、アセチルＣｏＡを出発物質としたアセチルＣｏＡの二量化経路と、脂肪酸生合成経路（de novo fatty acid synthesis）の中間体からの変換経路と、脂肪酸分解（β-oxidation）の中間体からの変換経路の３つの主経路が挙げられ、これら主経路以外にもいくつかの副経路が存在する。
【０００９】
そして、これら生分解性プラスチックの微生物合成に生産天然菌を利用する場合、前述のような複雑な微生物代謝経路を経たり、生産天然菌自身のプラスチック分解系などが作動してしまうため、人為的に生分解性ポリエステルの生産性を高めたり、所望の共重合組成を有する生分解性ポリエステルを生産させるには限界があり、所望の生分解性プラスチックを作り出せなかった。
【００１０】
そのため、単に生産天然菌を利用するのではなく、近年急速に進んだ遺伝子組換え技術を利用して、生分解性プラスチックを合成する酵素である生分解性プラスチック重合酵素の遺伝子を単離し、組換え微生物を利用した生産が検討されるようになった（特許文献１および２、非特許文献１）。
【００１１】
例えば、生分解性ポリエステル重合酵素遺伝子の一部を改変し、その基質特異性を変換することによって生分解性ポリエステル中の共重合組成を制御し、生産する生分解性ポリエステルの物性をある程度自由に改変する試みがなされている（特許文献１）。
【００１２】
また、代表的な生分解性ポリエステル合成微生物であるラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）の生分解性ポリエステル重合酵素の遺伝子をプロモーターを用いて発現誘導することにより、生分解性ポリエステル合成の検討が推進されている（特許文献２、非特許文献１）。
【００１３】
特許文献２では、該重合酵素遺伝子の誘導性プロモーターを利用して高分子量の生分解性プラスチックの生産性向上に成功したことを開示している。
【００１４】
非特許文献１では、該重合酵素の改変による組換え微生物の生分解性ポリエステル生産量の影響を調べるため、in vivo分析システムの構築に成功している。
【００１５】
そして、上記組換え微生物を利用した生分解性プラスチックの生産には、宿主細菌としてグラム陰性菌である大腸菌が用いられ、発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群もグラム陰性菌由来のものである。
【００１６】
このように組換え微生物を用いた生分解性プラスチックの生産には、宿主細菌として大腸菌のほかにポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子破壊株ＰＨＢ−４などのラルストニア・ユートロファ、ポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子破壊株などの各種シュードモナス属等が使用されており、これらの微生物はすべて内毒素を有するグラム陰性菌である。そして、発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群もほとんどがグラム陰性菌由来の遺伝子が用いられている。
【００１７】
一方、コリネ型細菌は、ポリエステル生産能を有しておらず、元来、内毒素を内在していないグラム陽性菌であるため、食品など生体内に入るアミノ酸を生産するのに安全性が確立されている菌種である。特にこのコリネ型細菌は、大腸菌の１０倍以上といわれる程の高密度培養が可能な細菌であり、全ＤＮＡ配列が完全解読され、宿主ベクター系が開発されて遺伝子組換え技術による物質生産も盛んに行われており、多くの食品会社において主力のアミノ酸発酵菌となっている。
【００１８】
そのため、組換えコリネ型細菌を作製し、目的タンパク質を生産させる多くの試みがなされており、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを利用した酵素タンパク質の分泌生産に関する検討もなされている（非特許文献２）。
【００１９】
しかし、現在までにこれらコリネ型細菌を宿主細菌に用いて生分解性ポリエステルを生産させた例は報告されていない。
【００２０】
【特許文献１】再表２００３−１０００５５号公報
【特許文献２】特開２００５−２７８５５９号公報
【非特許文献１】FEMS  Microbiology  Letters  198，65-71（2001）
【非特許文献２】Applied  and  Environmental  Microbiology．69，358-366 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
特許文献１〜２、非特許文献１のような大腸菌を宿主細菌とした組換え微生物による生分解性ポリエステルの製造方法では、大腸菌がグラム陰性菌であるため膜中に内毒素（その活性本体は、リポ多糖といわれている）が内在しており、生分解性ポリエステルを生産抽出して生体医療材料や食品接触容器に使用した場合、その混入が問題になる。
【００２２】
そのため、元来膜中に内毒素を有しないグラム陽性菌を宿主細菌とする組換え微生物による生分解性ポリエステルの製造方法が求められる。
【００２３】
しかし、遺伝子発現に利用される発現遺伝子である生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群はグラム陰性菌由来のもが圧倒的に多く、一般的に発現遺伝子と発現宿主細菌が同じグラム陰性菌同士の組み合わせで遺伝子発現が上手く進むため、宿主細菌として大腸菌等のグラム陰性菌が利用されている。
【００２４】
グラム陽性菌とグラム陰性菌は、前述した内毒素の有無のみならず、プロモーターの配列を認識する各細菌が保有するＲＮＡポリメラーゼの認識特異性の相違、遺伝子発現に関連したｍＲＮＡ配列やそれらと相互作用する因子との相互関係等の相違が存在するため、グラム陰性菌由来の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群をグラム陽性菌に発現させるためには、これらの相違を克服しなければならない。
【００２５】
一方、前述のとおり、グラム陽性菌であるコリネ型細菌を宿主細菌として用いた例は、非特許文献２のようにアミノ酸発酵の分野においてタンパク質の生産に利用されているが、生分解性ポリエステルの生産には使用された報告はない。
【００２６】
ここで、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質発現と本発明における生分解性ポリエステル生産の相違について述べる。
【００２７】
タンパク質は、ＤＮＡから転写・翻訳を経て生産される。一方、生分解性ポリエステルは、ＤＮＡから転写・翻訳を経て生産された複数の生分解性ポリエステル合成酵素を利用して、（バイオマス）原料からモノマーを合成し、さらにモノマーを重合して生産される。
【００２８】
このように、生分解性ポリエステルの生産過程は、タンパク質生産過程に加えた複数の酵素反応過程を経なければならない。
【００２９】
そのため、コリネ型細菌に生分解性ポリエステル生産能を付与するには、複数の生分解性ポリエステル合成酵素を機能的に発現させるのに加えて、（バイオマス）原料調達のタイミングや量、モノマーを生産する過程で必要な還元力を整える補酵素（ＮＡＤＰＨ）の供給、モノマーを重合する過程を阻害する遊離ＣｏＡの細胞内存在状態、生産された生分解性ポリエステルによる細胞毒性等を考慮しなければならず、これらの点は宿主細菌固有の代謝経路により異なるため、大腸菌とコリネ型細菌でも大いに異なると考えられる。
【００３０】
また、コリネ型細菌は元来アミノ酸発酵菌であり、通常解糖系から生成したアセチルＣｏＡを原料としてアミノ酸発酵代謝を行っているため、同じ原料であるアセチルＣｏＡから生分解性ポリエステルを生産させるには、アミノ酸代謝経路から生分解性ポリエステル合成経路に移行させる培養条件を検討しなければならない。しかしながら、培養する段階で大腸菌と比べてコリネ型細菌が圧倒的に有利な点は、多くの複合成分から構成される糖質を旺盛に資化できる能力にある。この特長は、複合糖質を多く含むバイオマスの有効利用を考えた上で大変魅力的である。
【００３１】
以上より、グラム陽性菌であるコリネ型細菌にグラム陰性菌由来の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群を導入して生分解性ポリエステルを生産させるためには、上記複数の課題を解決しなければならない。
【００３２】
さらに、生分解性ポリエステルの微生物合成方法では、単一細胞内でその生産性を最適化したり、単一細胞レベルで最適化した組換え微生物をいかに高密度培養するかが重要な課題となる。
【００３３】
本発明は、以上のような問題点を解決するためになされたものであって、大腸菌と膜構造が異なり元来内毒素を有さず安全性が確立され、かつ高密度培養の可能なコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル生産能を付与した組換えコリネ型細菌、およびこれら組換えコリネ型細菌を用いて医療や食品業界などの生体に接触する生分解性ポリエステルを効率的に生産する製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明者は、以上のような問題を解決するために、鋭意研究を行った結果、宿主細菌としてコリネ型細菌を用いて生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群を導入し発現させることにより、高密度培養の可能な生産性に有利な生分解性ポリエステルを生産する組換えコリネ型細菌を構築し、内毒素を含有しない極めて安全性の高い生分解性ポリエステルを製造することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００３５】
本発明に係る組換えコリネ型細菌の特徴は、コリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを導入して生分解性ポリエステル生産能を付与するように改変した点にある。
【００３６】
また、本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群と、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターとの距離を近接させて転写機能を備えさせることが好ましい。
【００３７】
さらに、本発明において、前記コリネ型細菌がコリネバクテリウム（Corynebacterium）属であり、かつ、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターがコリネバクテリウム（Corynebacterium）属由来のものであることが望ましい。
【００３８】
また、本発明において、前記コリネバクテリウム（Corynebacterium）属がコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であることが好ましい。
【００３９】
さらに、本発明において、前記コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７であることが好ましい。
【００４０】
本発明において、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群が、ラルストニア属（Ralstonia）、シュードモーナス属（Pseudomonas）、およびバチルス属（Bacillus）のいずれかに由来するものであることが望ましい。
【００４１】
本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群は、β−ケトチオラーゼ遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子およびポリ３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子から構成されることが望ましく、これらがオペロンを形成していることがより好ましい。
【００４２】
また、本発明において、前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子を変異型Ｇ４Ｄ遺伝子、または前記生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群のポリ３−ヒドロキシアルカン酸重合酵素遺伝子のコドンユーセージをコリネ型菌用に変換した重合酵素遺伝子のいずれかを用いることにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることが好ましい。
【００４３】
また、本発明において、ベクターの異なるプラスミドｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つをコリネ型細菌に導入することにより生分解性ポリエステルの生産を増大させることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の生分解性ポリエステルの製造方法の特徴は、組換えコリネ型細菌を、炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムをそれぞれ添加した所定の培地組成中において、その培養温度が２７℃〜３７℃、ｐＨが７〜８の条件下で培養することにより生分解性ポリエステルを生産させる点にある。
【００４５】
また、本発明において、培養温度が３０℃であってｐＨが７．５の条件下で前記組換えコリネ型細菌を培養することが望ましい。
【００４６】
さらに、本発明において、培地組成が、少なくともグルコース、硫酸アンモニウム、およびビオチンを含み、前記ビオチン濃度が３〜４５０μｇ／Ｌの組成であることが好ましく、前記ビオチン濃度が１０〜３０μｇ／Ｌであることがより望ましい。
【発明の効果】
【００４７】
本発明によれば、生分解性ポリエステル生産能を有する組換えコリネ型細菌を得ることにより、バイオマスを栄養源として成育し、環境に優しい生分解性材料としてだけでなく、安全性の高い高機能性材料として、医療や食品など生体に直接接触しても利用可能な生分解性ポリエステルを効率よく生産できる。さらには、同一菌体においてアミノ酸と生分解性ポリエステルを同時生産させることができ、２種の付加価値の高い生体産物を生産させるトータルエネルギーを省力化させた高効率的な微生物発酵システムを得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明に係る組換えコリネ型細菌および生分解性ポリエステルの製造方法の一実施形態について説明する。
【００４９】
本実施形態における組換えコリネ型細菌は、遺伝子組換え技術を用いて元来生分解性ポリエステル生産能を有しないコリネ型細菌に、生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群（以下、「酵素遺伝子群」と略する場合がある）と前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを含むプラスミドベクターを導入して、生分解性ポリエステル生産能を付与されるように形質転換された組換えコリネ型細菌である。さらに、本実施形態における生分解性ポリエステルの製造方法は、前記組換えコリネ型細菌を所定の条件下にて培養することにより、安全性の高い生分解性ポリエステルを製造する方法である。
【００５０】
すなわち、本発明における組換えコリネ型細菌では、酵素遺伝子群にコリネ型細菌で機能するプロモーターを連結させた遺伝子を含むプラスミドベクターを作製し、当該プラスミドベクターをコリネ型細菌に導入して、当該細菌内で人工的に生分解性ポリエステル生合成経路を構築して、コリネ型細菌に生分解性ポリエステルの生産能力を付与している。
【００５１】
ここで、本発明における生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子群とは、糖や油脂などのバイオマスから生分解性ポリエステルを合成するのに必要な複数の酵素タンパク質をコードした遺伝子のことである。
【００５２】
例えば、アセチルＣｏＡを基質原料として、これを２量化するβ−ケトチオラーゼ（以下、「ＰｈｂＡ」と略する場合がある）、続いて還元してモノマーである３−ヒドロキシブチルＣｏＡを生成するＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（以下、「ＰｈｂＢ」と略する場合がある）、さらに３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを重合して最終的にポリエステルを合成する重合酵素（以下、「ＰｈｂＣ」と略する場合がある）の３つの酵素タンパク質の遺伝子をコードした遺伝子がある。
【００５３】
本発明におけるコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子プロモーターとは、コリネ型細菌の細胞表層上に主要タンパク質として発現合成され、いずれ菌体外へはがれる機能を発揮するものであり、Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳＰ）などが挙げられる。特にＢ ｔｙｐｅのものが好ましい。
【００５４】
ここで、本発明で使用するコリネ型細菌の菌体内代謝経路の一部、およびコリネ型細菌内で人工的に構築する生分解性ポリエステル生合成経路について説明する。例として、コリネ型細菌内で代表的なポリ３−ヒドロキシアルカン酸（以下、「ＰＨＡ」と略する場合がある）であるポリ３−ヒドロキシブタン酸（以下、「ＰＨＢ」と略する場合がある）の合成経路の構築について図１を参照しながら説明する。
【００５５】
コリネ型細菌は、グルコースを細胞内に取り入れた後、解糖系に入り、最終的にアセチルＣｏＡが生成する。通常は、このアセチルＣｏＡがＴＣＡ回路（トリカルボン酸回路あるいはクエン酸回路）に入り、中間代謝物質である２−オキソグルタル酸からアミノ酸であるグルタミン酸が合成される。コリネ型細菌において、このアミノ酸合成ルートは既に確立されている。
【００５６】
一方、コリネ型細菌内に人工的に構築するＰＨＢ合成に関与する３つの酵素遺伝子、β−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）遺伝子、ＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）遺伝子、およびＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）遺伝子は、既に解読されているコリネ型細菌のＤＮＡ配列からは、全て存在しないことが推定されている。そのため、コリネ型細菌において、ＰＨＢの合成経路は確立されていないと考えられ、実際コリネ型細菌ではＰＨＢの合成は確認されていない。
【００５７】
そこで、ＰＨＢを合成する酵素遺伝子群であるＰＨＢ合成酵素遺伝子群のオペロン（以下「ｐｈｂＣＡＢ」と略する場合がある）をコリネ型細菌に導入することで、ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢによるアセチルＣｏＡ二量化経路からのモノマー供給経路とＰｈｂＣが直結した合成経路をデザインして、コリネ型細菌内で解糖系とＴＣＡ回路の中間に位置するアセチルＣｏＡを原料とするＰＨＢの合成経路を人工的に構築する。
【００５８】
本実施形態において、コリネ型細菌で機能するプロモーターとは、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターが好ましく、当該プロモーターと前記酵素遺伝子群との距離を近接させて機能可能なように連結されている。
【００５９】
つまり、コリネ型細菌において、前記酵素遺伝子群の発現のためには、当該酵素遺伝子群の５’上流に前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターのＤＮＡ配列を連結する必要がある。そして、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターのＤＮＡ配列が連結される位置は、酵素遺伝子群が発現可能であれば特に限定されないが、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターとの間に酵素遺伝子群と同一生物由来のプロモーターのＤＮＡ配列が連結されていないことが望ましい。さらに、当該酵素遺伝子群と当該プロモーターとのＤＮＡ配列が隙間を空けずに連結されているのではなく、わずかな間隔を隔てて連結されていることが望ましい。
【００６０】
また、本実施形態で使用するコリネ型細菌は以下のような特徴を有する細菌である。すなわち、元来、生分解性ポリエステル生産能を有していない。大腸菌などのグラム陰性菌と膜構造が異なり、元々内毒素を有していないグラム陽性菌である。アミノ酸発酵菌として頻用されている伝統のある細菌であり、生産物質の安全性が確立されている。細胞培養密度が大腸菌の１０倍以上であり、総合的に物質生産の生産性に有利である。全ＤＮＡ配列が解読されており、操作性のよい宿主ベクター系の開発が進展してきている。したがって、このようなコリネ型細菌の特徴を利用して、安全性の高い生分解性ポリエステルを効率的に合成している。
【００６１】
なお、内毒素を有しない細菌であるという特徴を有するグラム陽性菌において、例えば枯草菌なども挙げられるが、枯草菌はコリネ型細菌と異なり熱耐性の強固な胞子を形成するため、産業的な生産に用いる菌株としては適性を欠く。このような点と上述したコリネ型細菌の特徴とから、グラム陽性菌の中でもコリネ型細菌は、産業的な生産に用いるのに好適な細菌である。
【００６２】
本発明において、宿主細菌として使用するコリネ型細菌は、生分解性ポリエステル生産能を付与し得る上述のような特徴を有するコリネ型細菌であれば特に制限されない。コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、アグロコッカス（Agrococcus）属、アグロマイセス（Agromyces）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、オーレオバクテリウム（Aureobacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、セルロモナス（Cellulomonas）属、クラビバクター（Clavibacter）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ラサイバクター（Rathayibacter）属、テラバクター（Terrabacter）属、ツリセラ（Turicella）属などに属する細菌が挙げられるところ、このうちコリネバクテリウム（Corynebacterium）属がより好ましい。
【００６３】
さらに、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属として、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６等の菌株が挙げられる、生産能力などを考慮するとコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７が好ましい。
【００６４】
そして、前記コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターとして用いるコリネ型細菌については、宿主細菌として使用する前記コリネ型細菌と同種類のものであれば特に制限されない。本発明では上記コリネ型細菌と同様にコリネバクテリウム（Corynebacterium）属が好ましく、具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、およびＡＴＣＣ１４０６７であることが好ましい。なお、上記プロモーターのＤＮＡ配列は、コリネ型細菌で機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換、及び／又は付加されたＤＮＡ配列であってもよい。
【００６５】
前記酵素遺伝子群としては、糖や油脂などのバイオマスから生分解性ポリエステルを合成できる酵素遺伝子群であれば特に限定されないが、細菌由来の酵素をコードする遺伝子であって、ＰＨＡ合成酵素遺伝子群が好ましい。
【００６６】
これらの具体的な酵素遺伝子群としては、例えば以下の３つが挙げられる。
１）アセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡの二量化経路によりモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡに変換後、ＰＨＢに重合する、β−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）とＮＡＤＰＨ依存性アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）とＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）の酵素遺伝子群。
２）脂肪酸β酸化系の中間体であるエノイルＣｏＡからモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換後、ＰＨＡに重合する、Ｒ体特異的エノイルＣｏＡヒドラーゼとＰＨＡ重合酵素の酵素遺伝子群。
３）ｄｅ  ｎｏｖｏ脂肪酸生合成系の中間体である（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸−アシル・キャリア・タンパク質からモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡに変換後、ＰＨＡに重合する、アシルトランスフェラーゼとＰＨＡ重合酵素の酵素遺伝子群。
【００６７】
これらは、ＰＨＡのモノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシアシルＣｏＡをつくるモノマー供給酵素と、次いでモノマーを重合してＰＨＡを合成するＰＨＡ重合酵素で構成されている。また、１）および３）の遺伝子群については後述する実施例により適用可能であることが明らかであるし、２）の遺伝子群についても、この経路に関与することで知られている「エノイルＣｏＡヒドラターゼ」の遺伝子の導入株で油脂からＰＨＡが生産できる過去の例からも本実施形態として適用可能であることがわかる。
【００６８】
これらの酵素遺伝子群のうち、本実施形態では、遺伝子配列が明確な点やオペロンを形成している点、扱いやすさの点等に鑑みて、ＰｈｂＡとＰｈｂＢとＰｈｂＣとから構成される酵素遺伝子群を使用している。
【００６９】
ここで、ＰＨＢの生合成経路におけるアセチルＣｏＡから、アセチルＣｏＡ二量化経路によりＰＨＢを合成する経路について説明する。まず、２分子のアセチルＣｏＡが、ＰｈｂＡの作用によって縮合され、アセトアセチルＣｏＡとなる。続いてＮＡＤＰＨの還元力を利用してＰｈｂＢの作用により、モノマーである（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡへと変換される。最後に、ＰｈｂＣが（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを重合してＰＨＢが合成される。
【００７０】
これら３つの生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）などでは、ＰｈｂＡ遺伝子−ＰｈｂＢ遺伝子−ＰｈｂＣ遺伝子から構成されるオペロンｐｈｂＣＡＢを形成しているが、ＰＨＡを生産する細菌によって遺伝子構成は様々である。そのため、前記３つの生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子がオペロンを形成していない場合には、遺伝子組換え技術により、人工的に３種類の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子のオペロンを形成して使用することが好ましい。これは、形質転換効率を高めることを目的としたプラスミドの最小化、および１つのプロモーターから当該３種類の生分解性ポリエステル合成酵素遺伝子を時期同調的に効率よく転写させる目的のためである。
【００７１】
また、本発明の酵素遺伝子群の由来微生物としては、本発明における効果を奏すれば、特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ralstonia）属、シュードモーナス（Pseudomonas）属、バチルス（Bacillus）属、アロクロマチウム（Allochromatium）属、シネコシスチス（Synechocystis）属、アエロモナス（Aeromonas）属等が挙げられる。好ましくは、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、シュードモーナスsp．（Pseudomonas sp．）、およびバチルスsp．（Bacillus sp．）が挙げられ、具体例としては、ラルストニア・ユートロファＨ１６株およびシュードモーナス６１−３株、バチルスＩＮＴ００５株であることが望ましい。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在のWautersiaを指す。
【００７２】
本発明の酵素遺伝子群のＰｈｂＣ遺伝子として、ＰｈｂＣ遺伝子に変異を加えた変異ＰｈｂＣ遺伝子を使用することもできる。変異ＰｈｂＣ遺伝子としては、前記変異ＰｈｂＣ遺伝子を構成遺伝子とした酵素遺伝子群をコリネ型細菌に導入した際に発現可能であれば特に限定されないが、シュードモーナスｓｐ．由来の変異ＰｈｂＣ１である遺伝子ＥＤ／ＱＭ、ラルストニア・ユートロファ由来の変異ＰｈｂＣであるＧ４Ｄ、ラルストニア・ユートロファ由来の変異ＰｈｂＣであるＰｈｂＣ’が望ましい。シュードモーナス属由来のＰｈｂＣはＰｈｂＣ１およびＰｈｂＣ２が存在し、どちらを用いてもよいがＰｈｂＣ１がより好ましい。これら変異ＰｈｂＣ遺伝子は、後述する実施例により適用可能であることが明らかであり、変異を加えていないＰｈｂＣよりもＰＨＢの生産量が多くなることが示されているためである。
【００７３】
なお、ＥＤ／ＱＭとは、ＰｈｂＣ１遺伝子の１３０番目のグルタミン酸（Ｅ）がアスパラギン酸（Ｄ）に、４８１番目のグルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換した変異ＰｈｂＣ遺伝子である。Ｇ４Ｄとは、ＰｈｂＣのＮ末端４番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）にアミノ酸置換した変異ＰｈｂＣ遺伝子である。ＰｈｂＣ’とは、ＰｈｂＣのコドンユーセージをコリネ型細菌用に最適化したものである。
【００７４】
次に、本発明においてコリネ型細菌に導入されるプラスミドベクターの構築例を以下に示す。
【００７５】
酵素遺伝子群は、例えばラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢを用いることができる。同遺伝子群の塩基配列を配列番号１に示し、同遺伝子中のβ−ケトチオラーゼ（ＰｈｂＡ）遺伝子、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素（ＰｈｂＢ）遺伝子、ＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）遺伝子にコードされるアミノ酸配列を配列番号２から配列番号４に示す。
【００７６】
宿主のコリネ型細菌としては、例えばコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７を使用することができ、プロモーターは宿主と同一であることが好ましいため、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを用いることが望ましい。
【００７７】
そして、前記ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢの５’上流にコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターを連結する。
【００７８】
構築に使用するベクターは、コリネ型細菌において自立増殖するプラスミドであれば特に制限されないが、大腸菌においても自立増殖可能なベクターが好ましい。この点から、コリネ型細菌と大腸菌との間で複製可能なシャトルベクターであるｐＰＳＰＴＧ１、ｐＶＣ７［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］を用いることができる。
【００７９】
前記プロモーターが前記酵素遺伝子群ｐｈｂＣＡＢの５’上流に配置されるように、プロモーターを含むｐＰＳＰＴＧ１またはｐＶＣ７に酵素遺伝子群を連結・挿入して、当該プロモーターによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢまたはｐＶＣ７−ＣＡＢを構築することができる。
【００８０】
このとき、酵素遺伝子群とプロモーターの遺伝子配列を直接連続して連結せずに、間に遺伝子の翻訳過程に好適な配列を含むように連結挿入する。
【００８１】
さらに、酵素遺伝子群とプロモーターの遺伝子配列の間に前記ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のプロモーターを挟まないように連結挿入する。
【００８２】
以上の方法により、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７において、ＰＨＢを合成可能なプラスミドベクターを構築できる。
【００８３】
構築した上記プラスミドベクターをコリネ型細菌に導入する方法は、公知の方法により行うことができ、例えばエレクトロポレーション法やカルシウム法等を用いることができる。これにより、ＰＨＢ生産能を付与されるように形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７が得られる。
【００８４】
なお、後述する実施例から明らかなように、上記プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＶＣ７−ＣＡＢは、各々一つをコリネ型細菌に導入しても良いし、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つをコリネ型細菌に導入してもよい。
【００８５】
また、本発明における生分解性ポリエステルの製造方法は、上記組換えコリネ型細菌を所定の培養条件にて培養して得られる培養物から生分解性ポリエステルを採取する方法である。
【００８６】
所定の培養条件として、培地組成、培養温度およびｐＨは、組換えコリネ型細菌が生育でき、生分解ポリエステルを生産できる条件であれば特に限定されないが、酵素遺伝子群としてラルストニア・ユートロファＨ１６株由来またはシュードモーナスｓｐ．６１−３株、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株を用い、宿主および細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーターのコリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９またはＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７であって、当該プロモーターが酵素遺伝子群の上流に機能可能に配置されている場合には、次のような培養条件が好ましい。
【００８７】
培養温度としては、２７℃〜３７℃が好ましく、特に３０℃が好ましい。培養ｐＨとしては、７〜８の条件下で培養するのが好ましく、特に７．５が好ましい。
【００８８】
一方、培地組成としては、例えば、炭素源としてグルコースおよび窒素源として硫酸アンモニウムを用いることができる。より具体的には、少なくともグルコース、硫酸アンモニウム、およびビオチンを含んでおり、前記グルコースが前記硫酸アンモニウムよりも２倍以上高く、また、前記ビオチン濃度が３〜４５０μｇ／Ｌの組成であることが好ましく、より好ましくは前記ビオチン濃度が１０〜３０μｇ／Ｌである。
【００８９】
さらに、前記組換えコリネ型細菌をビオチンが含まれない培地で培養後、ビオチンおよびグルコースを追加した培地で培養する２段階培養方法を用いてもよい。このビオチン濃度の異なる２段階培養方法では、前記組換えコリネ型細菌は、ビオチンが含まれない培地での培養によりグルタミン酸を生産し、その後ビオチンおよびグルコースを追加した培地での培養により生分解性ポリエステルを生産することができる。
【００９０】
ｐＨ、攪拌速度、温度等を制御できる発酵槽（Jar fermentor）を用いて前記組換えコリネ型細菌を培養し、生分解性ポリエステルを生産させてもよい。
【００９１】
そして、組換えコリネ型細菌から生産された生分解性ポリエステルの回収方法は、特に限定されず、公知の溶媒抽出法、物理的破砕法、化学的処理などが挙げられる。例えばクロロホルム等の有機溶媒に溶解後、エタノールにて再沈殿する定法により抽出・精製することができる。
【００９２】
また、細胞内に合成された生分解性ポリエステルの定量は、例えば、乾燥菌体を濃硫酸によりクロトン酸に変換（脱離反応）後、１０倍量の０．０１４Ｎ硫酸を加え、得られたサンプルを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供試し他成分と分離させ、２１０ｎｍでの吸収を分光学的に検出する方法等によって行うことができる［Ｋａｒｒ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，46，1339-1344（1983）］。
【００９３】
細胞内のＰＨＢ重合酵素の活性測定は、得られる培養物を遠心して回収し、超音波処理にて細胞を破砕後、モノマーである基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢへの重合反応時に遊離するＣｏＡを４１２ｎｍの波長にて定量する方法等により測定できる。［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，95，335-341（2003）］
【００９４】
そして、生分解性ポリエステルの組成は、細胞からクロロホルム等の有機溶媒を用いて抽出後、抽出物をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）などに供試することで測定・分析することができる。
【００９５】
生分解性ポリエステルの分子量は、ゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）、などを用いて測定することができる。また、細胞内での生分解性ポリエステルの合成の有無は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などにより直接的に観察することができる。
【００９６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。
【実施例１】
【００９７】
『生分解性ポリエステル生産能を有するコリネ型細菌の作製のためのプロモーター検討』
【００９８】
グラム陽性菌であるコリネ型細菌でグラム陰性菌由来ＰＨＢ合成遺伝子群を発現させ、ＰＨＢを合成させるために、５’上流にプロモーターを連結し、３’下流にターミネーターを連結し、プロモーターのパターンの異なる３種類のプラスミドベクターを下記の手順で構築した。構築した３種類のプラスミドベクターの遺伝子コンストラクトを図２に示す。
【００９９】
プロモーターは、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のｐｈｂＣＡＢプロモーター（Ｐｐｈｂ）を用いた場合、Ｐｐｈｂとコリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）とを用いた場合、そしてＰｃｓｐを用いた場合の３パターンである。
【０１００】
「プロモーターにＰｐｈｂを用いた場合」
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）を含むｐＰＳＰＴＧ１プラスミド［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］をＫｐｎＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターに、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のプロモーター（Ｐｐｈｂ）とｐｈｂＣＡＢ、ターミネーター（Ｔｐｈｂ）を含むｐＧＥＭ−ＣＡＢ［Ｔａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｌｏ．Ｌｅｔｔ．，198，65-71（2001）］プラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた、プロモーターＰｐｈｂ・ｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む約５．０ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結した。これにより、プロモーターＰｐｈｂによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢを構築した（図２（Ａ））。
【０１０１】
「プロモーターにＰｐｈｂとＰｃｓｐを用いた場合」
ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターに、ｐＧＥＭ−ＣＡＢプラスミドをＳｍａＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた、プロモーターＰｐｈｂ・ｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む約５．０ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結した。これにより、プロモーターＰｐｈｂとＰｃｓｐによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢを構築した（図２（Ｂ））。
【０１０２】
「プロモーターにＰｃｓｐを用いた場合」
ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドとｐＧＥＭ−ＣＡＢプラスミドを各々ＢｓｔＥＩＩとＣｓｐ４５Ｉで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理した。これらをゲル抽出方法にて、ベクター部分とｐｈｂＣＡＢ・ターミネーターＴｐｈｂを含む４．３ｋｂの遺伝子断片を得て連結反応させた。これにより、プロモーターＰｃｓｐによってｐｈｂＣＡＢ遺伝子を発現する発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを構築した（図２（Ｃ））。
【０１０３】
得られた３種類のプラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳ−ＣＡＢ各々をエレクトロポレーションによりコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］に導入し、形質転換された組換えコリネ型細菌を得た。
【０１０４】
得られた３種類の組換えコリネ型細菌を、ＭＭＴＧ培地中［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］において、培養温度３０℃、ｐＨ７．５で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１０５】
菌体内に蓄積されたＰＨＢの定量は、乾燥菌体を濃硫酸によりクロトン酸に変換後、１０倍量の０．０１４Ｎ硫酸を加え、得られたサンプルをＨＰＬＣに供し、２１０ｎｍの波長にて定量した［Ｋａｒｒ，Ｄ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，46，1339-1344（1983）］。
【０１０６】
つまり、菌体にＴＥ緩衝液を加えて懸濁し、遠心分離により菌体を回収し、−８０℃で２時間凍結後に２日間真空乾燥して乾燥菌体の重量を測定した。得られた乾燥菌体に硫酸1 ｍＬを加え、１２０℃のヒートブロックで４０分間加熱してクロトン酸に変換した後、氷中にて急冷した。その後、４ｍｌの０．０１４Ｎ硫酸溶液を撹拌、冷却しながらゆっくり加えた。得られたサンプルは孔経０．４５μｍのＰＴＦＥ膜［Ａｄｖａｎｃｅ Ｍｆｓ．Ｉｎｃ，Ｔｏｋｙｏ］に通し、ＨＰＬＣに供し、クロトン酸を吸光度２１０ｎｍにて測定した。カラムは、アミネックスＨＰＸ−８７Ｈイオンカラム［７．８ｍｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ］を６０℃で使用し、移動相は０．０１４Nの硫酸溶液を用い、流速は０．７ｍｌ／分で行った。ＰＨＢの蓄積率は、ＨＰＬＣで得られたクロトン酸量と面積の関係式（検量線）を基に、純正のポリ３−ヒドロキシブタン酸からクロトン酸への変換効率５０％を用いて算出した。
【０１０７】
その結果、プラスミドベクターｐＰＧＥＭ−ＣＡＢ、ｐＰＳＧＥＭ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌では、ＰＨＢが生産されず、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみＰＨＢの生産が確認された。
【０１０８】
さらに、上記組換えコリネ型細菌について、ｐｈｂＣＡＢのＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）を測定したところ、プラスミドｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみ活性が検出された。
【０１０９】
総菌体抽出物のＰＨＢ重合酵素の活性測定は、モノマーである基質（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡからＰＨＢへの酵素反応時に遊離するＣｏＡを４１２ｎｍの波長にて定量した［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，95，335-341（2003）］。
【０１１０】
つまり、まず上記組換えコリネ型細菌を３０℃で７２時間培養した。その後、１４，０００ｘｇで２分間遠心し、氷上で４秒間、１５回の超音波破砕により菌体を破壊後、１４，０００ｘｇで２分間遠心して、総菌体抽出物を得た。次に、４．０８ｍＭの（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリルＣｏＡを含む１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を２５℃で１０分間予熱後、前記総菌体抽出物を添加して酵素反応を開始した。経時的に２０μＬずつサンプリングし、得られたサンプリング液に５％のＴＣＡを５０μＬ加えて撹拌し酵素反応を停止させた。４℃、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた上清６２．５μＬに、５００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を３３７．５μＬと１０ｍＭのＤＴＮＢ溶液を５μL添加し、２分以上室温に放置した。その後、生成したＴＮＢアニオンを吸光度４１２ｎｍ（モル吸光係数１３６００）にて測定した。反応１分間当たり１μｍｏｌのＴＮＢアニオンが生成する酵素量を１Ｕ（ユニット）とした。
【０１１１】
以上の結果から、組換えコリネ型細菌でｐｈｂＣＡＢの遺伝子発現には、ｐｈｂＣＡＢのプロモーター（Ｐｐｈｂ）は機能せず、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質の遺伝子プロモーター（Ｐｃｓｐ）が機能することが明らかとなった。また、このｐｈｂＣＡＢの生産能を付与された組換えコリネ型細菌は、ＰｈｂＣ活性が認められ、ｐｈｂＣＡＢはオペロンを形成していることからモノマーを供給する酵素ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢも機能的に発現していることが示唆された。
【実施例２】
【０１１２】
『菌種の異なるコリネ型細菌での検討』
【０１１３】
宿主細菌であるコリネ型細菌において、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９だけでなく、異なる種類でもＰＨＢを合成できるか検討を行った。
【０１１４】
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９およびＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された３種類の組換えコリネ型細菌を得た。得られた３種類の組換えコリネ型細菌を、ＭＭＴＧ培地中において、培養温度３０℃、ｐＨ７．５で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１１５】
その結果、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のみならず菌種の異なる組換えコリネ型細菌ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１４０６７を宿主細菌としてもＰＨＢを合成することができた。宿主細菌の違いによりＰＨＢの蓄積量および生産量は違う値を示し、組換えコリネ型細菌ＡＴＣＣ１４０６７が最も高い値を示した（図３Ａ，図３Ｂ）。
【実施例３】
【０１１６】
『他菌種由来の酵素遺伝子群を用いた検討』
【０１１７】
ラルストニア属由来だけでなく、他菌種由来酵素遺伝子群をコリネ型細菌に導入してもＰＨＢを合成できるか検討を行った。
【０１１８】
酵素遺伝子群は、モノマー供給酵素とモノマーを重合させてＰＨＢを合成するＰＨＢ重合酵素とから構成されており、本実施例ではモノマー供給酵素およびＰＨＢ重合酵素のそれぞれについて、ラルストニア属由来以外の菌種由来の遺伝子を用いて検討を行った。
【０１１９】
モノマー供給酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のＰｈｂＡとＰｈｂＢ、または大腸菌由来のＦａｂＨを用いた。ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来のモノマー供給酵素は、アセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡの二量化経路によりモノマーを合成するのに対して、大腸菌由来のモノマー供給酵素は、de novo脂肪酸生合成系の中間体である（Ｒ）−３−ヒドロキシアルカン酸−アシル・キャリア・タンパク質からモノマーを合成する。
【０１２０】
ＰＨＢ重合酵素遺伝子は、ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来、またはシュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型由来、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型由来、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株由来の４種類を用いた。シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型の重合酵素遺伝子（ＥＤ／ＱＭ）とは、ＰｈａＣ１の１３０番目のグルタミン酸（Ｅ）がアスパラギン酸（Ｄ）、４８１番目のグルタミン（Ｑ）がメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換したものである。
【０１２１】
実験方法は、ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクター部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＧＥＭ−ＣｌＰｓＡＢ［Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，6，99-104（2005）］またはＥＤＱＭＰｓＡＢプラスミド［Ｋｅｎ’ｉｃｈｉｒｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，6，99-104（2005）］をＸｂａＩで、ｐＧＥＭ−ＲＣＢｓＡＢプラスミド［Ｓａｔｏｈ，Ｙ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，94，343-350（2002）］をＮｃｏＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた各遺伝子断片をそれぞれ挿入・連結し、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣｌＰｓＡＢ、ｐＰＳ−ＥＤＱＭＰｓＡＢ、ｐＰＳ−ＲＣＢｓＡＢをそれぞれ得た。
【０１２２】
さらに、ｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＡＢをＳａｃＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＸｂａＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＴｒｃＦａｂＨ(F87H)プラスミド［Nomura CT et al, Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ, 5(4), 1457-1464(2004)］をＮｃｏＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＸｂａＩで制限酵素処理して得られた遺伝子断片を挿入・連結し、プラスミドベクターｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＨを得た。なお、ｐＰＳ−ＣＡＢは実施例１に示したとおり構築した。
【０１２３】
ｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＧＥＭ−ＣｌＰｓＡＢ、ｐＧＥＭ−ＥＤＱＭＰｓＡＢ、ｐＧＥＭ−ＲＣＢｓＡＢは、モノマー供給酵素遺伝子がラルストニア・ユートロファＨ１６株由来であり、重合酵素遺伝子がそれぞれラルストニア・ユートロファＨ１６株、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型、シュードモーナスｓｐ．６１−３株の変異型、バチルスｓｐ．ＩＮＴ００５株由来である遺伝子を導入している。ｐＰＳ−Ｃ１ＰｓＨは、モノマー供給酵素遺伝子が大腸菌由来であり、重合酵素遺伝子がシュードモーナスｓｐ．６１−３株の野生型由来である遺伝子が導入している。
【０１２４】
得られた５種類のプラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された５種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１２５】
その結果、由来菌種の異なる上記のモノマー供給酵素遺伝子または重合酵素遺伝子を含むプラスミドベクターを導入した５種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９すべてにおいてＰＨＢの合成が確認された。またｐＰＳ−ＥＤＱＭＰｓＡＢは、ｐＰＳ−ＣｌＰｓＡＢに比べて約１０倍高いＰＨＢ蓄積が確認された（図４Ａ，図４Ｂ）。
【０１２６】
上記実施例３の結果から、モノマー供給酵素としてラルストニア属のみならず大腸菌由来のものでもＰＨＢ合成させることに成功し、モノマー供給経路としてアセチルＣｏＡの二量化経路だけでなく脂肪酸生合成系という新たな経路からもＰＨＢを生産できることが明らかになった。また、重合酵素についても、ラルストニア属由来のものだけでなく、シュードモナス属および、バチルス属由来のものを用いてもＰＨＢを合成することができることが示された。また、変異重合酵素（ＥＤ／ＱＭ）を用いると、ＰＨＢを高生産することができることが示された。
【０１２７】
これらより本システムは、多様な生物種由来の多様なモノマー供給酵素および重合酵素の導入によりＰＨＢ生産が可能であると期待される。
【実施例４】
【０１２８】
『ＰＨＢ合成に関与する遺伝子発現量を増加されることによるＰＨＢ高生産の検討』
【０１２９】
コリネ型細菌を用いてＰＨＢをさらに効率的に合成するために、ＰＨＢ合成に関与する遺伝子の発現量を増加させることでＰＨＢの高生産を試みた。
【０１３０】
（１）変異重合酵素遺伝子を用いたＰＨＢ合成
ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来の酵素遺伝子群（ｐｈｂＣＡＢ）のうち、ＰＨＢ重合酵素（ＰｈｂＣ）を変異させた変異ＰＨＢ重合酵素Ｇ４Ｄを含む変異酵素遺伝子群ｐｈｂＧ４ＤＡＢを用いてＰＨＢの高生産を試みた。
【０１３１】
Ｇ４Ｄは、ＰｈｂＣのＮ末端４番目のグリシン（Ｇ）がアスパラギン酸（Ｄ）にアミノ酸置換した変異ＰＨＢ重合酵素であり、これまでの研究で大腸菌およびラルストニア・ユートロファ菌体内で野生型のＰｈｂＣよりも発現量が高く、ＰＨＢ生産量も多くなることが報告されている［Normi et al, Macromol. Biosic., 2005, 5, 197-206］。
【０１３２】
実験方法は、ｐＰＳＰＴＧ１プラスミドをＢｓｔＥＩＩで制限酵素処理し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理したベクターの部分をゲル抽出方法で得た。このベクターにｐＧＥＭ−ｐｈｂＧ４ＤＡＢプラスミド［Normi Ｙ． et al, Macromol. Biosic., 5, 197-206（2005）］をCｓｐ４５Ｉで制限酵素処理しＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化させた後、ＢａｍＨＩで制限酵素処理して得られた４．３ｋｂの遺伝子断片を挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＰＳ−Ｇ４ＤＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。
【０１３３】
得られた発現プラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１３４】
その結果、変異ＰＨＢ重合酵素Ｇ４Ｄを発現させてもＰＨＢ合成が確認され、野生型のＰｈｂＣを発現させたものより３３％高いＰＨＢ生産が認められた（図５，図６Ｂ）。
【０１３５】
この組換えコリネ型細菌におけるＧ４ＤのＰＨＢ生産の増大は、大腸菌やラルストニア・ユートロファを用いたときと同様にＧ４Ｄの発現量の増加によるものと考えられ、抗体を用いたウエスタン分析法によっても重合酵素タンパク質が確認された。そして、宿主細菌が大腸菌やラルストニア・ユートロファのようなグラム陰性菌だけでなく、グラム陽性菌であるコリネ型細菌でもＧ４ＤによるＰＨＢ生産の増大が観察され、宿主細菌がグラム陽性・陰性を問わず、Ｇ４Ｄの変異によって本重合酵素の発現量が上昇する結果を得た。
【０１３６】
（２）ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを用いたＰＨＢ合成
ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢとは、ラルストニア・ユートロファ由来の重合酵素遺伝子のコドンユーセージをコリネ型細菌用に変換したものである。実験方法は、ｐＰＳ−ＣＡＢをＫｐｎＩとＢｇｌＩＩで制限酵素処理し、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理したｐＵＣ１９（TOYOBO）ベクターに導入した。
２つのプライマー（５′−GCAGCATCCACCCAGGAAGGCAAGTCCCAG−３′（配列番号５）、５′−TGCGCCCTTGCCGGTTGCCATGATTTGA−３′（配列番号６））を用いたＰＣＲ増幅でｐＵＣ１９Ｃ’を作製した。ｐＵＣ１９Ｃ’はＥｃｏＲＶとＭｕｎＩで制限酵素処理し、同じ制限酵素処理したｐＰＳ−ＣＡＢに挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。
【０１３７】
得られた発現プラスミドベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入し、形質転換された組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を作製した。これをＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１３８】
その結果、ｐＰＳ−Ｃ’ＡＢを導入した組換えコリネ型細菌は、ｐＰＳ−ＣＡＢやｐＰＳ−Ｇ４ＤＡＢよりもさらにＰＨＢの生産量が上昇した（図５，図６Ｂ）これは、翻訳レベルで重合酵素の発現量が上昇したためであると考えられる。
【０１３９】
（３）異なるベクターを用いたＰＨＢ合成
ｐＰＳＰＴＧベクター以外のｐＶＣ７ベクターを用いることによりＰＨＢの高生産を試みた。ｐＶＣ７ベクターはｐＰＳＰＴＧベクターと複製起点が異なり、コピー数が少ない特徴をもつベクターである［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］
【０１４０】
実験方法は、ｐＰＳ−ＣＡＢプラスミドとｐＶＣ７ベクターをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで制限酵素処理し、ゲル抽出方法で得られたＣＡＢを含む遺伝子断片をベクターに挿入・連結し、発現プラスミドベクターｐＶＣ７−ＣＡＢを構築した。ｐＰＳ−ＣＡＢの構築方法は実施例１に示したとおりである。
【０１４１】
得られた発現プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢ、ｐＶＣ７−ＣＡＢそれぞれと、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つ一緒にコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーション法によりそれぞれ導入した。得られた形質転換された３種類の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をＭＭＴＧ培地、３０℃で７２時間培養した後、ＰＨＢの含量を測定した。
【０１４２】
その結果、ｐＶＣ７−ＣＡＢはｐＰＳ−ＣＡＢよりもＰＨＢ生産が低かった。一方、ｐＰＳ−ＣＡＢとｐＶＣ７−ＣＡＢの２つの発現プラスミドベクターを導入すると、各々１つを導入するよりも高いＰＨＢの生産が認められた（図６Ａ，図６Ｂ）。
【０１４３】
このように複製起点の異なる２種類のプラスミドを導入してＰＨＢを高生産化することができたのは、ＰｈｂＡおよびＰｈｂＢの発現量増強によるモノマー３−ヒドロキシブチリルＣｏＡの供給量上昇とさらに重合酵素ＰｈｂＣの発現量増加の２つの正の効果が発揮された効果と考えられる。
【０１４４】
以上のことから、 進化酵素の使用およびベクターコピー数の増加という新たな手法より、ＰＨＢ生産量を上昇させることができた。
【実施例５】
【０１４５】
『コリネ型細菌における最適培養条件の検討』
【０１４６】
ラルストニア・ユートロファＨ１６株由来ＰＨＢ酵素遺伝子群のオペロン（ｐｈｂＣＡＢ）をコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９にエレクトロポレーションにより導入し［Ｌｉｂｅｌ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．：ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，65，299-303（1989）］、この遺伝子群を発現する組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９において、ＰＨＢ合成に好適な培養培地および培養温度・ｐＨについての検討を行った。
【０１４７】
まず、培養培地の検討では、ＬＢ培地［ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎｅ，ＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ，ＮａＣｌ（Ｊｕｎｓｅｉ）］、富栄養培地ＣＭ２Ｇ［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］、最小培地ＭＭＴＧ［Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，69，358-366（2003）］の３種類について温度３０℃で７２時間培養後に評価を行った。各培地組成について図７に示す。
【０１４８】
その結果、最小培地に炭素源としてグルコース、窒素源として硫酸アンモニウムを添加したＭＭＴＧ培地のみがＰＨＢ合成を実現した。ＬＢ培地、ＣＭ２Ｇ培地の天然培地を主体としたものではＰＨＢ合成は実現しなかった。このことから、今後組換えコリネ型細菌を用いた生分解性ポリエステル合成についての検討では、成分内容が明確で炭素と窒素の栄養バランス（Ｃ／Ｎ比）を自在に変動可能なＭＭＴＧ培地は好適と考えられる。
【０１４９】
次に、培養温度・ｐＨの検討では、ＭＭＴＧ培地にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを添加した培地を用いて検討した。温度条件は２７℃から３７℃、ｐＨは７から８で行った。
【０１５０】
その結果、図８および図９に示すように、ＰＨＢの合成は、検討したどの培養温度・ｐＨにおいても認められたが、合成の至適温度と至適ｐＨは、それぞれ３７℃と７．５であった。これは、コリネ型細菌自身の増殖の至適培養条件と合致していた。すなわち、組換えコリネ型細菌での生分解性ポリエステル合成は、コリネ型細菌自身の増殖条件と連動させた形で条件設定することが重要であることを示している。
【実施例６】
【０１５１】
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌の培養時間の検討』
【０１５２】
プロモーターの検討において、ｐＰＳ−ＣＡＢを保有した組換えコリネ型細菌のみに、ＰＨＢ合成が検出された。このことから、コリネ型細菌の細胞表層タンパク質遺伝子用プロモーター（Ｐｃｓｐ）が、ｐｈｂＣＡＢの発現に対してコリネ型細菌で有効に機能したことが推定される。そこで、このＰＨＢ合成能を有する組換えコリネ型細菌の培養は、最適の条件であるＭＭＴＧ培地にて３０℃、ｐＨ７．５を採用し、培養時間の検討を行った。
【０１５３】
培養時間の検討は、組換えコリネ型細菌の成長とＰＨＢの合成を経時的に９６時間まで測定した。組換えコリネ型細菌の成長曲線は、経時的に培養液をサンプリングして、乾燥菌体重量（ｍｇ／ｍｌ）を測定しながらプロットして作成した（図１０中●印）。一方、ＰＨＢの合成は菌の成長曲線と同一時間にサンプリングして、上記乾燥菌体試料から分析後に算出してＰＨＢの細胞内合成蓄積量（％，ＰＨＢ重量／乾燥菌体試料重量）をプロットして作成した（図１０中○印）。
【０１５４】
その結果、図１０に示すように、菌の成長とＰＨＢ合成はほぼ連動しており、４８時間後にはＰＨＢの合成は約２２．５％の一定レベルに達し、その後９６時間培養後まで安定的に蓄積した。したがって、ＰＨＢの細胞内合成蓄積量を再現性よく安定して測定できる培養時間として、７２時間を設定した。
【実施例７】
【０１５５】
『バイオ工学的アプローチによるＰＨＢの高生産』
【０１５６】
ｐＨ、攪拌速度、温度等を制御できる発酵槽（Jar fermentor）を用いて 、ｐＨと攪拌速度を制御してＰＨＢの高生産を試みた。発酵槽は試験管スケールよりも培養管理が行き届きＰＨＢ生産量を高める効果のあることが確認された。
【０１５７】
実験条件は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９を５Ｌ容の発酵槽で２ＬのＭＭＴＧ培地を用い、３０℃で７２時間培養した。ｐＨは７．５、攪拌速度は３００ｒｐｍ、温度は３０℃に固定した。
【０１５８】
その結果、発酵槽を用いずに７２時間培養したＰＨＢ生産量が２２ｗｔ％であるのに対し、発酵槽を用いて７２時間培養したＰＨＢ生産量は４０ｗｔ％であり、最終的な生産量だけではなく、生産性も試験管スケールの実験より優れることがわかった（図１１Ａ，図１１Ｂ）。これは、攪拌方法の違いによって通気性が良くなった効果によるものと考えられる。今後は、培養条件のバイオ工学的な制御によるＰＨＢの高生産が期待される。
【実施例８】
【０１５９】
『培養培地中のビオチン濃度の検討』
【０１６０】
コリネ型細菌は、グルタミン酸生産菌として代謝経路等がよく研究されている。ビオチンは、グルタミン酸生産の原料となるアセチルＣｏＡを脂肪酸生産もしくはグルタミン酸生産へと誘導するスイッチ的な役割を果たすことが知られている。アセチルＣｏＡはＰＨＢの原料でもあり、アセチルＣｏＡをＰＨＢ生産へ促すにもビオチン濃度が重要だと考えられる。（図１参照）
【０１６１】
そこで、実施例５においてＭＭＴＧ培地においてＰＨＢ合成に成功したため、さらにこのＭＭＴＧ培地のビオチン濃度を変化させ、ＰＨＢ合成に最適なビオチン濃度を調べた。
【０１６２】
実験方法は、ｐＰＳ―ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチン濃度が異なるＭＭＴＧ培地で３０℃、７２時間培養した。この際のグルコース濃度は６重量パーセント濃度に固定した。
【０１６３】
その結果、ＭＭＴＧ培地中のビオチン濃度の変化によりＰＨＢ生産量も変化し、ビオチン濃度１０〜３０μｇ／ＬにおいてＰＨＢを好適に生産し、特に１０μｇ／Ｌの場合に最も多く生産する結果が得られた。このことからビオチンが脂肪酸生産やグルタミン酸生産だけでなくＰＨＢ生産にも影響を及ぼしていることが示された（図１２Ａ，図１２Ｂ）。
【実施例９】
【０１６４】
『ビオチン濃度の調節によるＰＨＢおよびグルタミン酸のダブル生産の検討』
【０１６５】
実施例８で示したとおり、ビオチン濃度はアセチルＣｏＡを脂肪酸またはグルタミン酸、ＰＨＢのどの生産に誘導するか決めるのに重要であることが示された。そのため、培養中に添加するビオチン濃度を調節することによって、菌体外にグルタミン酸を分泌させ、菌体内にＰＨＢを蓄積させるダブル生産を試みた。
【０１６６】
（１）グルタミン酸およびＰＨＢを生産するビオチン濃度の検討
まず、グルタミン酸を生産するビオチン濃度とＰＨＢを生産するビオチン濃度を調べるため、ＭＭＴＧ培地のビオチン濃度を変化させ各物質の生産量を測定した。
【０１６７】
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチン濃度の異なるＭＭＴＧ培地で３０℃、７２時間培養した。グルタミン酸の濃度の測定は、ヤマサグルタミン酸キットを利用した。
【０１６８】
その結果、ビオチン濃度０〜３μｇ／Ｌではグルタミン酸が生産され、３〜４５０μｇ／ＬではＰＨＢが生産され、グルタミン酸とＰＨＢの生産のための最適のビオチン濃度が異なり、ビオチン濃度が低ければグルタミン酸が、高ければＰＨＢが生産される傾向が明らかになった（図１３Ａ，図１３Ｂ）。
【０１６９】
（２）ビオチン濃度の調節によるＰＨＢおよびグルタミン酸のダブル生産の検討
上記（１）の結果におけるＰＨＢとグルタミン酸の最適なビオチン濃度の違いを利用して、ビオチンが入ってない培地からグルタミン酸を醗酵させた後、ビオチンおよび炭素源になるグルコースを加えるビオチン濃度の異なる２段階の培養方法により、ＰＨＢとグルタミン酸の両方を一度に生産させるダブル生産を試みた。
【０１７０】
実験方法は、プラスミドベクターｐＰＳ−ＣＡＢを導入した組換えコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９をビオチンの入ってないＭＭＴＧ培地に３０℃で５３時間培養した後、最終濃度をビオチン３０μｇ／Ｌ、グルコース６ｗｔ％濃度となるように加えた。グルタミン酸の濃度の測定は、ヤマサグルタミン酸キットを利用した。
【０１７１】
その結果、ビオチン濃度の違いによる２段階培養によって同じコリネ型細菌で二つの有効物質の生産ができた。それだけではなく、今まで終始ビオチン濃度を３０μｇ／Ｌにして培養した１段階培養の時よりもＰＨＢの生産量が上昇した（図１４Ａ，図１４Ｂ）。
【実施例１０】
【０１７２】
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産される生分解性ポリエステルの組成分析』
【０１７３】
ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産される生分解性ポリエステルの組成を、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて分析した。その結果、図１５のチャート上に示されるように、ＰＨＢに相当するピークのみしか検出されなかった。これより、生産される生分解性ポリエステルは、（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸以外のモノマーユニットが導入されていない（Ｒ）−３−ヒドロキシブタン酸のホモポリマーであることが確認された。
【実施例１１】
【０１７４】
『ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産されるＰＨＢの分子量測定』
【０１７５】
ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産されるＰＨＢの分子量についてゲルパミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて測定した。
【０１７６】
測定方法は、ＴＳＫ ｇｅｌ ＧＭＨＨＲ−Ｍカラム［７．８ｎｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｔｏｓｈｏ  Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ］とＳｈｏｄｅｘ  ＸＦ−８０４Ｌカラム［８ｎｍＩ．Ｄ．ｘ３００ｍｍ；Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｋ．Ｋ．，Ｔｏｋｙｏ］を備えたＪａｓｃｏ  ＧＰＣ−９００を使用して４０℃で行った。移動相はクロロホルムを用い、流速０．８ｍｌ／分で行った。純正のポリスチレンを用いて検量線を作成した。
【０１７７】
その結果、図１６に示すように、宿主のみをコリネ型細菌から大腸菌に換えた組換え大腸菌Ｅ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株において合成されるＰＨＢに比べて一桁小さい分子量であった。
【実施例１２】
【０１７８】
『ｐＰＧＥＭ−ＣＡＢおよびｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌によるＰＨＢの発現』
【０１７９】
ｐＰＧＥＭ−ＣＡＢおよびｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌内でのＰＨＢの発現の有無を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により直接的に観察した。
【０１８０】
方法は、組換えコリネ型細菌を塩化カコジル緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した２％グルタルアルデヒドで１時間、２％四酸化オスミウムで３０分間処理して二重固定化した。そのサンプルをエタノールに置換して脱水し、エポキシ樹脂Ｅｐｏｎ８１２で包埋した。エポキシ樹脂の切片を作製し、ウラシルアセテートおよび鉛アセテートにより染色後、電子顕微鏡（JEM-2010；Ｊｅｏｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により観察した。
【０１８１】
その結果、図１７で示すようにｐＰＧＥＭ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌には、ＰＨＢの顆粒は観察されず（図１７（Ａ））、ｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌のみに、ＰＨＢの顆粒を示す白い固まり（不溶性物）が明確に観察された（図１７（Ｂ））。
【０１８２】
以上のように本実施形態によれば、野生型コリネ細菌等の元来、生分解性ポリエステル生産能を有さないコリネ型細菌を改変して生分解性ポリエステル生産能を付与された組換えコリネ型細菌を得ることにより、環境に優しい生分解性であって安全性の高い高機能性材料として、医療や食品など生体に直接接触しても利用可能な生分解性ポリエステルを効率よく生産できる。しかも同一菌体においてアミノ酸と生分解性ポリエステルを同時生産させることができ、２種の付加価値の高い生体産物を生産させるトータルエネルギーを省力化させた高効率的な微生物発酵システムを得ることができる。
【０１８３】
なお、本発明に係る生分解性ポリエステル生産能を有する組換えコリネ型細菌およびそれを用いた製造方法は、前述した実施形態に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】コリネ型細菌の菌体内代謝経路の一部、およびコリネ型細菌内で人工的に構築するＰＨＢ生合成経路を示した図である。
【図２】構築した３種類のプラスミドベクターの遺伝子コンストラクトを示した図である。
【図３Ａ】実施例２における各種の組換えコリネ型細菌を用いたＰＨＢの生産に関する結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】実施例２における各種の組換えコリネ型細菌を用いたＰＨＢの生産に関する結果を示す表である。
【図４Ａ】実施例３における各種のＰＨＢ重合酵素遺伝子を導入した組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】実施例３における各種のＰＨＢ重合酵素遺伝子を導入した組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示す表である。
【図５】実施例４における変異ＰＨＢ重合酵素遺伝子等を導入した組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示すグラフである。
【図６Ａ】実施例４におけるＰＨＢ合成に関与する遺伝子発現量の増加による組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示すグラフである。
【図６Ｂ】実施例４におけるＰＨＢ合成に関与する遺伝子発現量の増加による組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示す表である。
【図７】実施例５における組換えコリネ型細菌における培養培地組成の検討に使用した培地組成を示した図である。
【図８】実施例５における組換えコリネ型細菌における培養温度に対するポリエステル合成量を示した図である。
【図９】実施例５における組換えコリネ型細菌における培養ｐＨに対するポリエステル合成量を示した図である。
【図１０】実施例６におけるｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌の培養時間（横軸）に対する組換えコリネ型細菌の成長曲線（左縦軸●印）とＰＨＢの細胞内合成蓄積量（右縦軸（○印）を示した図である。
【図１１Ａ】実施例７における発酵槽での組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示すグラフである。
【図１１Ｂ】実施例７における発酵槽での組換えコリネ型細菌のＰＨＢ生産に関する結果を示す表である。
【図１２Ａ】実施例８においてビオチン濃度に対するＰＨＢ生産量等の結果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】実施例８においてビオチン濃度に対するＰＨＢ生産量等の結果を示す表である。
【図１３Ａ】実施例９において培養培地のビオチン濃度に対するグルタミン酸とＰＨＢ生産の関係の結果を示すグラフである。
【図１３Ｂ】実施例９において培養培地のビオチン濃度に対するグルタミン酸とＰＨＢ生産の関係の結果を示す表である。
【図１４Ａ】実施例９においてビオチン濃度の異なる培養培地での２段階培養によるグルタミン酸とＰＨＢ生産の関係の結果を示すグラフである。
【図１４Ｂ】実施例９においてビオチン濃度の異なる培養培地での２段階培養によるグルタミン酸とＰＨＢ生産の関係の結果を示す表である。
【図１５】実施例１０におけるｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌により生産される生分解性ポリエステルをガスクロマトグラフィーで分析したチャートを示した図である。
【図１６】実施例１１におけるｐＰＳ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌および大腸菌により生産されるＰＨＢの分子量を示した表である。
【図１７】実施例１２におけるＰＨＢ発現を観察した透過型電子顕微鏡写真画像であって、（Ａ）はｐＰＧＥＭ−ＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌内、（Ｂ）はｐＰＳ−ｐｈｂＣＡＢを保有する組換えコリネ型細菌内の写真画像である。
【図１】
2008245633.tif 000003
【図２】
2008245633.tif 000004
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2008245633.tif 000009
【図６Ａ】
2008245633.tif 000010
【図６Ｂ】
2008245633.tif 000011
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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