(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト白血球抗原−Ｃ（以下ＨＬＡ−Ｃと略す）のサブタイプのひとつであるＣｗ０３に含まれる新規アリルを提供する。【解決手段】オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いるＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子型の解析による既知のアリルと全く異なる陽性反応を示す特定のアミノ酸配列をコードするＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル及び特定の塩基配列又はその相補配列を有するＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル。移植時の適合性の判定、疾患に対する個人の感受性の判定に有用。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル
【請求項２】
配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＨＬＡ−Ｃw０３新規アリルでコードされるペプチドを有する、タンパク質。
【請求項４】
遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とするＨＬＡ−Ｃw抗原のタイピング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen；以下ＨＬＡと略す）−Ｃの新規アリルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＬＡのタイピングは移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて重要性が注目されている。
【０００３】
臓器移植を行う場合、臓器の提供者と患者の間でＨＬＡの型がどれだけ一致しているかが移植成功率に大きく影響する。ＨＬＡ型が一致しない場合、拒絶反応のため臓器が患者に生着せず、逆に提供者由来の免疫細胞のためにＧＶＨＤ（移植片対宿主病(Graft-Versus-Host Disease)）が発生し、患者の生命が危険にさらされることになる。また糖尿病など特定の病気の発症率とＨＬＡ型の関連も指摘されている。ＨＬＡのタイピングはこのような医療技術の高度化に従い重要性を増したといえる。
【０００４】
従来のＨＬＡタイピングは抗体を用いて行われる血清学的手法であったが、近年の技術革新によりＨＬＡ抗原をコードする遺伝子の配列より型分けを行う、いわゆる遺伝子タイピング法が主流となってきた。骨髄移植において遺伝子型でのマッチングが移植成績と相関することが明らかとなり、ＨＬＡの遺伝子タイピングは医療現場においても重要度を増してきている。
【０００５】
塩基配列を確認する方法としては、シークエンシング反応により配列を決定するサンガー法（例えば、非特許文献１参照）などがあるが、コスト面からＨＬＡの遺伝子タイピングは部分的な配列をプローブやプライマーとして利用し、その反応性から遺伝子配列を推定し、ＨＬＡ型を決める方法が利用されている（例えば、非特許文献２、３参照）。
【０００６】
ＨＬＡ−Ｃ抗原のサブタイプのひとつであるＣｗ０３に含まれる遺伝子型は２００７年３月２６日の時点で、４５種類が報告されている（例えば、非特許文献４参照）が、アリルの存在については充分検討されていないのが現状である。
【非特許文献１】Santamaria P. et al. HLA class I sequence-based typing. Hum Immunol. 37(1):39-50, 1993.
【非特許文献２】Bunce M. et al. Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCR-SSP). Tissue Antigens. 46(5):355-67, 1995.
【非特許文献３】Kawai S. et al. Routine low and high resolution typing of the HLA-DRB gene using the PCR-MPH (microtitre plate hybridization) method. Eur J Immunogenet. 23(6):471-86, 1996.
【非特許文献４】Allele Frequencies ［online］、[平成１９年３月２６日検索]、インターネット＜URL：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/＞
【発明の概要】
【０００７】
従って、本発明の目的は、ＨＬＡ−Ｃ抗原のサブタイプのひとつであるＣｗ０３に含まれる新規アリルを提供することにある。
【０００８】
本発明者らは今般、オリゴヌクレオチドプローブを固相した複数のビーズを用いてＨＬＡ−Ｃｗ抗原の遺伝子型を決める方法によって、既知のアリルとは異なる陽性反応を示す遺伝子を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００９】
即ち、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする、ＨＬＡ−Ｃw０３新規アリルを提供するものである。
【００１０】
また本発明は、配列番号２の塩基配列又はその相補配列を有する、ＨＬＡ−Ｃw０３新規アリルを提供するものである。
【００１１】
本発明により、ＨＬＡ−Ｃ抗原の詳細なタイピングが可能となるため、移植時の適合性を判定するのみならず、疾患に対する個人の感受性の判定などにおいて、極めて有用となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
ＤＮＡタイピング法の1つであるＰＣＲ−ＳＳＯＰ（Sequence Specific Oligonucleotide probe）法に基づき、Ｌｕｍｉｎｅｘ社の ｘＭＡＰ測定技術（http://www.luminexcorp.com/01_xMAPTechnology/index.html）を用いてＨＬＡ遺伝子のタイピングが可能なＷＡＫＦｌｏｗ ＨＬＡタイピング試薬（湧永製薬製）を用いてＨＬＡ−Ｃ抗原の遺伝子型をタイピングしたところ、血液より抽出したＤＮＡ検体で既知の遺伝子型の反応性が示されなかった。
【００１３】
ダイレクトシークエンシング法（Wong C. et al. Characterization of beta-thalassaemia mutations using directgenomic sequencing of amplified single copy DNA. Nature. 330:384-6, 1987.）によりエクソン２およびエクソン３の配列を確認した。エクソン2およびエクソン3のそれぞれ上流と下流に設定したプライマーを用いて、センス鎖アンチセンス鎖の両側から配列を確認したところ、エクソン2はＣｗ＊０８０１とＣｗ＊０３０４の配列であるが、エクソン3はＣｗ＊０８０１の配列とこれまでに報告されていない配列とが検出された。よって、この検体がＣｗ＊０８０１と未知のアリルのヘテロ接合である可能性が考えられた。
【００１４】
配列を詳細に調べるため、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のエクソン２からエクソン３にかけて約１Ｋｂの領域をサブクローニングにより単離した。ＨＬＡ−Ｃ遺伝子のエクソン２上流とエクソン３下流に設定したプライマーを用いて、ＰＣＲ反応によりこの領域を増幅し、電気泳動で目的とする長さの断片を取り出してＴＡクローニングによりプラスミドベクターに取り込ませた。このプラスミドを用いて形質転換させた大腸菌を少量の培地で培養し、培地から回収した大腸菌よりプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの中から約１Ｋｂのインサートの入ったものを制限酵素処理により選び出し、得られた１２クローンのプラスミドについて配列を確認した。
【００１５】
その結果、ＨＬＡ−Ｃｗ＊０８０１が５クローン、ダイレクトシークエンシング法で確認された新規配列を有する変異型が４クローン得られた。また、ＰＣＲ反応によって人工的に生じたと考えられる２種類のアリルの組換え体が３クローン得られた。
【００１６】
新規配列を有する変異型４クローンについて、遺伝子の塩基配列の確認を行った結果、図１のようにＣｗ＊０３０４の配列のエクソン３内に２箇所の変異を確認した。これらの変異のうち１箇所は図２に示す１７３番目のアミノ酸がリジンからグルタミン酸へと置き換わる非同義置換であり、残りの１箇所は同義置換であった。Ｃｗ０３に含まれる遺伝子型の中でこのアミノ酸は共有されている。また、１７３番目のアミノ酸はＨＬＡ−Ｃ抗原において抗原ペプチドをはさみこむ領域の内側に位置している。
【００１７】
このことから、これらのアミノ酸はＨＬＡ−Ｃ抗原に結合するペプチドモチーフにも重要な部位であり、免疫系において重要な役割を果たしている可能性が高い。したがって、Ｃｗ＊０３０４と本発明の変異をもつ遺伝子型（Ｃｗ＊０３０４Ｖ）とは、移植医療においては区別する必要があり、移植時の適合性判定などにおいて、ＨＬＡ−Ｃ抗原のタイピング精度を高める上で、極めて有用かつ重要なものである。
なお、本発明において見出された新規アリルは、ＷＨＯ命名によれば「Ｃｗ＊０３４１」とされている。このため本明細書においては、新規アリルを「Ｃｗ＊０３０４Ｖ」または「Ｃｗ＊０３４１」のいずれかで表示する。
【００１８】
よって、本発明による新規アリルは、前記したように、配列番号1記載のアミノ酸配列をコードしてなるものであり、また、配列番号2記載の塩基配列又はその相補配列を有するものである。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、本発明によるＨＬＡ−Ｃw０３新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質が提供される。本発明によるＨＬＡ−Ｃw０３新規アリルでコードされるペプチドを有するタンパク質も、アリルと同様に移植時の適合性判定などにおいて、極めて有用かつ重要なものである。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、ＨＬＡ−Ｃw０３抗原のタイピング方法であって、遺伝子型の判定の際に、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号２の塩基配列もしくはその相補配列、またはそれらから得られる配列変異情報を用いることを特徴とする方法が提供される。ここで、それらから得られる配列変異情報とは、図１および図２にも示されているように既知のアリル（Ｃｗ＊０３０４）と本件新規アリル（Ｃｗ＊０３０４Ｖ）とを塩基配列またはアミノ酸配列を比較することにより得られる配列上の変異情報である。例えば、アミノ酸配列の場合であれば、前記したような、Ｃｗ＊０３０４のアミノ酸配列上、１７３番目のアミノ酸がリジンからグルタミン酸へと置き換わっている場合が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】既知のアリル（Ｃｗ＊０３０４）とＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル（Ｃｗ＊０３０４Ｖ）との塩基配列の比較。
【図２】既知のアリル（Ｃｗ＊０３０４）とＨＬＡ−Ｃw０３新規アリル（Ｃｗ＊０３０４Ｖ）とのアミノ酸配列の比較。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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