(57)【要約】【課題】分離精度の高いキャピラリ等電点電気泳動技術の提供。【解決手段】対向電極間に介在する電気泳動用のキャピラリの内壁表面に両性担体を固相化した構成を少なくとも備えるキャピラリ等電点電気泳動路を提供する。また、該キャピラリ等電点電気泳動路内に水溶液ｐＨ勾配を形成して行うことを特徴とする等電点電気泳動法、及び、等電点電気泳動法を利用した二次元分離方法を提供する。さらに、該二次元分離方法に使用するための物質分離用基盤をも提供する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対向電極間に介在する電気泳動用のキャピラリの内壁表面に両性担体を固相化した構成を少なくとも備えるキャピラリ等電点電気泳動路。
【請求項２】
前記両性担体は、カルボキシル基とアミノ基を有することを特徴とする請求項１記載のキャピラリ等電点電気泳動路。
【請求項３】
請求項１記載のキャピラリ等電点電気泳動路内に水溶液ｐＨ勾配を形成して行うことを特徴とする等電点電気泳動法。
【請求項４】
内壁面に両性担体が固相化された構成を備えるキャピラリ内で等電点電気泳動を行なう一次元目分離工程と、
前記工程から得られる等電点分離液に遠心力を加えて、分子量による分離を行なう二次元目分離工程と、
を少なくとも行うことを特徴とする二次元分離方法。
【請求項５】
対向電極間に介在する電気泳動用のキャピラリの内壁表面が両性担体によって固相化された構成を少なくとも備えるキャピラリ等電点電気泳動路と、
前記キャピラリ等電点電気泳動路に連設された二次元目分離路と、
が少なくとも設けられたことを特徴とする物質分離用基板。
【請求項６】
円盤状をなす基板であって、
前記二次元目分離路は、基板半径方向外側に延びる遠心分離路であることを特徴とする請求項５記載の物質分離用基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キャピラリ等電点電気泳動技術に関する。より詳しくは、キャピラリ内壁面に両性担体が固相化されたキャピラリ等電点電気泳動路と該泳動路を用いる物質分離方法、並びに物質分離用基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
「等電点」は、アミノ酸やタンパク質などのように、水溶液中で解離して酸と塩基の両方の性質を示す、いわゆる両性電解質において、正味の電荷（の総和）がゼロになるｐＨを言う。異なる種類の両性電解質群が混在する水溶液では、等電点の違いに基づいて両性電解質群を分離することができる。
【０００３】
ｐＨ勾配を形成している泳動ゲル中において電気泳動を行うと、両性電解質をそれぞれの等電点に相当する泳動位置に移動（フォーカシング）させて、泳動ゲル中に並ばせることができるこの方法は、一般に「等電点電気泳動法」と称されている。また、この等電点電気泳動法を一次元目とし、これに続く二次元目にＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下略称、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）を行う方法は、一般に「二次元電気泳動法」と称され、特に、多種類のタンパク質の分離・分析に広く利用されている。
【０００４】
ここで、ｐＨ勾配泳動ゲルを作製する一般的手法として、両性担体をゲルに添加して電場をかける方法や様々な等電点の側鎖を持つアクリルアミド誘導体を用いてゲル作製と同時にｐＨ勾配を形成する方法（ＩＰＧ(Immobilized pH gradient)法）などがある。一般に、プロテオミクス分野の研究では、分離能、再現性などにおいて優れている後者のＩＰＧ法が利用されることが多い。
【０００５】
一方、キャピラリ電気泳動は、キャピラリ（毛細管）内で電気泳動を行う方法の総称である。泳動ゲルなどの担体を用いることなく溶液状態で電気泳動を行った場合は、ジュール熱によって対流が起こり易くなるので扱いが難しいが、キャピラリ内で電気泳動を行えば前記対流現象を防止できるとともに、放熱も容易であるという利点がある。
【０００６】
近年では、マイクロチップの分離チャンネル内に、泳動用緩衝液が充填された泳動電場を形成しておいて、微量のタンパク質試料を、分子量と等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法が提案されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−１５０８９９号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の等電点電気泳動法では、ｐＨ勾配泳動ゲルの調整作業が煩雑で手間がかかり、ｐＨ勾配泳動ゲルによる分離能においても改善の余地があった。キャピラリ内の溶液環境で等電点電気泳動を行う構成を想定すれば、ｐＨ勾配泳動ゲルを使用しないので、当該ゲルの調整作業それ自体は省略できるが、分離精度の点で改善すべき課題があった。
【０００８】
そこで、本発明は、分離精度の高いキャピラリ等電点電気泳動技術を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明では、第１に、対向電極間に介在する電気泳動用のキャピラリの内壁表面に両性担体を固相化した構成を少なくとも備えるキャピラリ等電点電気泳動路を提供する。前記両性担体は、水素イオンを電離し得る官能基（例えば、カルボキシル基）と、水素イオンを受け取る官能基（例えば、アミノ基）を有している。
【００１０】
本発明では、第二に、上記構成のキャピラリ等電点電気泳動路内に水溶液ｐＨ勾配を形成して行う等電点電気泳動法を提供する。
【００１１】
第三に、キャピラリ内壁面に両性担体を固相化した構成を備えるキャピラリ等電点電気泳動路で等電点電気泳動を行なう一次元目分離工程と、前記工程から得られる等電点分離液に遠心力を加えて、分子量による分離を行なう二次元目分離工程と、を少なくとも行う二次元分離方法を提供する。
【００１２】
ここで、遠心力を利用して分子量による分離を行なう二次元目分離工程には、通常の遠心分離法の他、沈降平衡法により、分子量に依存した濃度勾配を形成させる工程をも含みえるものとする。
【００１３】
第四には、上記キャピラリ等電点電気泳動路と、該キャピラリ等電点電気泳動路に連設された二次元目分離路と、が少なくとも設けられた物質分離用基板を提供する。この基板は、例えば、円盤状をなす基板であって、前記二次元目分離路は、基板半径方向外側に延びる遠心分離路である構成を採用できる。なお、遠心分離路では、基板の回転によって得られる遠心力に基づいて、遠心分離法及び沈降平衡法を行うことができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、分離精度の高いキャピラリ等電点電気泳動や二次元分離を行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。
【００１６】
初めに、本発明に係るキャピラリ等電点電気泳動路を用いた等電点電気泳動の手順について図１及び図２に基づいて説明する。図１は、作業手順を示したワークフロー図、図２はキャピラリ等電点電気泳動路を現す模式図である。
【００１７】
まず第１の手順において、キャピラリ等電点電気泳動路１内へ等電点電気泳動により分離したい被分離物質２を注入する（図１のＳ１参照）。被分離物質２は両性電解質であれば分離の対象とすることができ、通常はタンパク質が被分離物質とされる場合が多い。第２の手順においては、キャピラリ等電点電気泳動路１の正極３１側に酸性溶液３１１、負極３２側に塩基性溶液３２１を注入する（図１のＳ２参照）。酸性溶液３１１としてはリン酸溶液、塩基性溶液３２１としては水酸化ナトリウム溶液が汎用されるが、それぞれ酸性、塩基性の溶液であれば用いることができる。続いて第３の手順において、キャピラリ等電点電気泳動路１の正極３１及び負極３２に外部電源Ｖから電圧を印加する（図１のＳ３参照）。
【００１８】
以上の手順Ｓ１〜Ｓ３により、キャピラリ等電点電気泳動路１内には、正極３１側を酸性、負極３２側を塩基性としたｐH勾配が形成され、被分離物質２はそれぞれの等電点に相当する泳動位置へフォーカシングされる。
【００１９】
一般に等電点電気泳動は、定電流条件下において行なわれるが、等電点電気泳動開始後、イオン勾配の形成が進んで、キャピラリ等電点電気泳動路１の正極３１及び負極３２間を移動するイオン性物質が減少してくると、キャピラリ等電点電気泳動路１の電気的抵抗は次第に大きくなる。
【００２０】
従って、上記定電流を維持するため、正極３１及び負極３２間には大きな電圧を印加する必要があり、この際、キャピラリ等電点電気泳動路１内では多量のジュール熱が発生する。このジュール熱は、キャピラリ等電点電気泳動路１内に対流を発生させてイオン勾配を不安定化するとともに、特に被分離物質がタンパク質である場合には、被分離物質の化学的性状に変化を及ぼすおそれもある。
【００２１】
ここで、図２に示すように、キャピラリ等電点電気泳動路１の外壁には温度管理ユニット４を設けて、ジュール熱を放熱して、イオン勾配の不安定化及び被分離物質の熱変性を防止できるように工夫した。
【００２２】
温度管理ユニット４は、熱伝導部４１と熱交換部４２とから構成することができ、熱伝導部４１には銅板やヒートパイプ等の熱伝導性素材を、熱交換部４にはペルチェ素子やヒートポンプ、放熱板とファン等の熱交換手段を、それぞれ特に限定されることなく採用することが可能である。
【００２３】
さらに、温度管理ユニット４には、ジュール熱の放熱機能のみならず、キャピラリ等電点電気泳動路１全体を一定温度に保つ機能を付与することが好ましい。これにより、等電点電気泳動ごとの温度条件のバラつきをなくし、等電点電気泳動の再現性を高めることが可能となる。
【００２４】
次に、本発明に係るキャピラリ等電点電気泳動路１の内壁表面の構成について説明する。上述した通り、キャピラリ等電点電気泳動路１の内側表面には両性担体が固相化されている。図３は、キャピラリ等電点電気泳動路１の断面図であって、キャピラリ等電点電気泳動路１の内壁及び該内壁に固相化された両性担体および該両性担体の有するカルボキシル基とアミノ基を模式的に現している。
【００２５】
図３中、符号１１で示されるキャピラリ等電点電気泳動路１の内壁には、その表面に両性担体１１１が均一に固相化されている。両性担体１１１は、例えば、グリシン、ギリシルグリシン、アミン、エピクロロヒドリン等が重合した高分子化合物であって、その分子構造中にカルボキシル基とアミノ基を有するものである。ここでは、両性担体１１１はカルボキシル基とアミノ基を各１つ有する模式図として示したが、両性担体１１１が有するカルボキシル基とアミノ基はそれぞれ複数であってよい。
【００２６】
両性担体１１１の分子構造中に存在するカルボキシル基は、キャピラリ等電点電気泳動路１内の溶液のｐHに依存して、水素イオンを電離して放出する。一方、アミノ基は溶液のｐHに依存して、溶液中の水素イオンを配位結合により取り込み、溶液中に水酸化物イオンが多い状態を形成する。
【００２７】
上述したように、キャピラリ等電点電気泳動路１の正極３１及び負極３２に電圧を印加すると（図１のＳ３参照）、キャピラリ等電点電気泳動路１内に正極３１側を酸性、負極３２側を塩基性としたｐH勾配が形成される。このとき両性担体１１１のカルボキシル基及びアミノ基は、ｐH勾配の形成に伴って周囲の溶液のｐHが変化すると、上記のように溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、ｐH勾配の形成を促進する機能を発揮する。
【００２８】
そして、一旦形成されたｐH勾配が何らかの要因で変化した場合にも、同様に溶液中に水素イオンを放出したり、逆に取り込んだりすることで、ｐH勾配を安定して維持する機能を発揮するので、両性担体１１１を内壁１１に固相化したキャピラリ等電点電気泳動路１においては、迅速にｐH勾配を形成することができ、かつ、安定して精度の高い等電点電気泳動を行なうことが可能となる。
【００２９】
図４は、本発明に係る物質分離用基板の一実施形態を示す模式図である。
【００３０】
図４において、図４中に符号Ａで示された物質分析用基板（以下、単に「基板」と称する。）は、上方外観視、円盤状を呈す形態を備えている。この基板Ａの口径サイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、基板上の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変形可能である。
【００３１】
この基板Ａは、所定波長の励起光（例えば、蛍光励起光）を透過可能な材料で形成されており、例えば、石英等のガラス、ポリカーボネートやポリスチレン等の合成樹脂材料で形成されている。なお、射出成形可能な合成樹脂材料を採用すると、ランニングコストの低減を達成できる。
【００３２】
基板Ａは、円盤中央部に上方視円形のキャピラリ等電点電気泳動路１を備えている。この等電点電気泳動路１は、図１〜３において説明したキャピラリ等電点電気泳動路１と同様の構成であって、キャピラリ内側表面に両性担体を固相化したものである。
【００３３】
基板Ａにおいては、このキャピラリ等電点電気泳動路１において等電点電気泳動による一次元目分離工程を行なった後、これに続いて、キャピラリ等電点電気泳動路１に連設した二次元目分離路５において、遠心力を利用した二次元目分離工程を行なうことができるように構成されている。
【００３４】
すなわち、基板Ａは、その中心部に中心孔６を備え、中心孔６に図示しない回転軸を挿過させた上で、図４中矢印Ｒ方向へ所定速度で回転させることで、基板の半径方向に、上方視放射状に形成された二次元分離路５に遠心力を加えることができる構成となっている。なお、本図においては、二次元目分離路５は８つのみ図示しているが、二次元目分離路５の数は任意に設計することが可能である。
【００３５】
基板Ａを用いた二次元分離方法について、図４を参照しながら以下により具体的に説明する。
【００３６】
まず、基板中央部に円形状に設けた一次元目分離路であるキャピラリ等電点電気泳動路１には、その円周上の一点に絶縁部１２が設けられており、該絶縁部１２を隔てて正極３１と負極３２が配設されている。図１に示した作業手順に従って、キャピラリ等電点電気泳動路１に、被分離物質、酸性溶液及び塩基性溶液を注入し、正極３１と負極３２間に電圧を印加すると、正極３１と負極３２間にｐH勾配が形成され、被分離物質はそれぞれの等電点にフォーカシングされ、キャピラリ等電点電気泳動路１内に配列する。
【００３７】
ここで、中心孔６の近傍には、所定容量の被分離物質を導入することができる被分離物質導入部７を設けて、流路１７を介して被分離物質をキャピラリ等電点電気泳動路１へ導入できる構成とした。
【００３８】
続いて、キャピラリ等電点電気泳動路１内において円周状に配列されている被分離物質を、二次元目分離路５へ導入して遠心力を利用して二次元目分離工程を行なう。この際、被分離物質を含む等電点分離液をキャピラリ等電点電気泳動路１から二次元目分離路５へ導入する方法としては、毛細管現象を利用して移動させる方法、遠心力によって移動させる方法、負圧吸引、正圧押出、又は通過制御領域を設ける方法などを、特に限定されず採用することができる。
【００３９】
このうち、通過制御領域を設ける方法は、キャピラリ等電点電気泳動路１と二次元目分離路５との接続部１５に、物質の通過を制御可能な通過制御領域を設けて、キャピラリ等電点電気泳動路１から二次元目分離路５への等電点分離液の移動を制御する方法である。
【００４０】
具体的には、疎水性の通過制御領域を設けて、親水性の物質の通過を遮断しておき、適切なタイミングで、当該疎水性領域を親水性へ変換して親水性の物質を通過させるといった方法が考えられる。
【００４１】
好適な一例としては、疎水性領域を酸化チタンで形成する方法が挙げられる。酸化チタンは、通常は疎水性であるが、紫外線を照射することにより親水性へと変化する物質である。そのため、通過制御領域を酸化チタンで形成すれば、一次元目分離工程においては等電点分離液の二次元目分離路５への移動を遮断することができ、一次元目分離工程終了後に紫外線を照射して通過制御領域を親水性へと変換すれば、等電点分離液を二次元目分離路５へ導入することが可能となる。
【００４２】
このようにしてキャピラリ等電点電気泳動路１から二次元目分離路５へ導入された等電点分離液は、二次元目分離路５において、基板Ａの回転によって付与される遠心力を利用した遠心分離法及び沈降平衡法による二次元目分離工程に供される。
【００４３】
遠心分離法においては、被分離物質の分子量に基づいた分離を行なう。一例として、ショ糖濃度勾配遠心がある。本法によれば、二次元目分離路５内にショ糖溶液を充填し、遠心してショ糖濃度勾配を形成することで、該濃度勾配中において、被分離物質をそれぞれの分子量に基づいて分離することができる。このようにして、二次元目分離の分離を行なった被分離物質は、二次元目分離路５より分取され、例えば質量分析計による同定等の後段の解析に供されることとなる。
【００４４】
また、沈降平衡法は、溶媒中に存在する物質（溶質）を遠心力の作用によって沈降させて、この沈降力とこれに逆らう溶質の拡散力とが平衡（沈降平衡）した時における溶質の濃度分布を、干渉光学系あるいは光電走査装置等により測定し、溶質の分子量を求める方法である。沈降平衡法で求められる分子量は、溶質の分子構造によらないのが特徴であり、高度に荷電している溶質であっても、精度良く分子量を計測することができる。
【００４５】
従って、沈降平衡法は、等電点電気泳動後の二次元目分離工程に好適に採用することができ、二次元目分離路５における二次元目分離工程として適した方法ということができる。沈降平衡法により、分子量を計測された被分離物質は、分子量に基づく物質同定解析等の後段の解析に供される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明に係るキャピラリ等電点電気泳動路を用いた等電点電気泳動の作業手順を示したワークフロー図である。
【図２】キャピラリ等電点電気泳動路１の模式図である。
【図３】キャピラリ等電点電気泳動路１の内壁に固相化された両性担体を現す模式図である。
【図４】本発明に係る分室分離用基板の一実施形態の上面図である。
【符号の説明】
【００４７】
A  物質分離用基板
Ｖ  外部電源
１  キャピラリ等電点電気泳動路
１１  内壁
１２  絶縁部
１５  接続部
１１１  両性担体
２  被分離物質
３１  正極
３２  負極
３１１  酸性溶液
３２１  塩基性溶液
４  温度管理ユニット
４１  熱伝導部
４２  熱交換部
５  二次元目分離路
６  中心孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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