(57)【要約】      （修正有）【課題】乳酸合成能力を有する酵母を用いた乳酸の製造方法において、乳酸の収量や収率を効率的に向上させることができる方法を提供する。【解決手段】カルシウム、マグネシウム、銅、バナジウム、ニッケル、バリウム、ストロンチウム、カドミウム、ベリリウム、亜鉛、コバルト、鉄等の水酸化物を発酵培地に添加し、カエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来の乳酸合成酵素（Ｌ−乳酸脱水素酵素）遺伝子を導入した酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を用いる、乳酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を用いた発酵による乳酸の製造方法であって、二価イオンの水酸化物を用いる乳酸の製造方法。
【請求項２】
二価イオンの水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化銅(二価)、水酸化バナジウム、水酸化ニッケル、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化カドミウム、水酸化ベリリウム、水酸化亜鉛、水酸化コバルト、水酸化鉄から選ばれる少なくとも１種類である請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
乳酸が、Ｌ−乳酸である請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
酵母が、乳酸合成酵素遺伝子を導入した酵母である請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
乳酸合成酵素遺伝子が、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子である請求項４に記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
乳酸合成酵素遺伝子が、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子である請求項４に記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されている請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【請求項８】
Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されている請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【請求項９】
酵母が、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１〜８のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項１０】
乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地が、シュクロース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトースから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地である請求項１〜９に記載の乳酸の製造方法。
【請求項１１】
乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地が、デンプン、及び、デンプン加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖、ケーンジュースからの精製または結晶化された精製糖、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地である請求項１〜１０に記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母を用いた発酵による乳酸の乳酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、資源循環型社会構築に向け、生物資源由来の材料を用いた工業原料の生産が盛んに行われている。それらの中で生物由来材料である乳酸を原料とするポリ乳酸は、優れた性質を持つポリマーとして注目されており、その原料となる乳酸をいかに安価に供給するかが課題となっている。
【０００３】
乳酸の生産は、ラクトバチラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属やラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に代表される乳酸菌によって主に実施されているが、乳酸を培養液中に多量に蓄積させるためには、乳酸菌が酸性条件下で生育しないため、炭酸カルシウムやアンモニア、あるいは水酸化ナトリウムなどの中和剤を添加した培養を行わなければならず、中和工程や精製工程に多大なコストを要している。
【０００４】
一方、酸性条件下で生育可能な酵母を用いた有機酸の製造法が、複数、提案されている（特許文献１〜３および非特許文献１、２参照）。これらの提案によれば、本来乳酸生成能を持たない酵母に乳酸生成酵素遺伝子を導入し乳酸を生産させることにより、中和操作を軽減し、低コストの乳酸製造工程を構築することが可能である。さらに、酵母による乳酸を始めとする有機酸の生産能力を、遺伝子組み換え等の技術を用いて向上させることにより、より安価な有機酸の製造法を構築することが可能である。
【０００５】
しかしながら、上記の従来の生産方法では、炭酸カルシウム、アンモニア、水酸化ナトリウム等のアルカリ中和による乳酸菌の乳酸生産や遺伝子組み換え酵母による低酸性条件下での乳酸生産の際でも基質濃度１０％に対して２〜７％までしか乳酸生産ができない問題がある（非特許文献１〜４参照）。
【特許文献１】特開２００１−２０４４６８号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号パンフレット
【特許文献３】特開２００３−２５９８７８号公報
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー）、７１、１９６４（２００５）
【非特許文献２】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（アプライド  アンド  エンバイロンメンタル  マイクロバイオロジー）、７１、２７８９（２００５）
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニーアリング）、１０１，１７２（２００６）
【非特許文献４】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ（バイオテクノロジ  プログレス）１１、２９４（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
乳酸を安価に供給するためには、乳酸生産能力の高い微生物を創出するとともに、乳酸生産効率の高い培養条件を検討することが必要である。そこで本発明は、低コストで生産性及び収率を向上させる乳酸の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、酵母を用いた発酵による乳酸の製造方法であって、二価イオンの水酸化物を用いる乳酸の製造方法による低コストで生産性や収率を向上させる乳酸の製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、乳酸生産量や生産効率を向上させることができる。すなわち、本発明は乳酸合成能力を有する酵母および乳酸を高生産させるための効果的な中和操作を用いた乳酸の生産方法を提供するものである。さらに、これまでに行われている乳酸発酵において、例えば、バイオマス由来の糖を用いることで、低コストの乳酸生産ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、酵母を用いた発酵による乳酸の製造方法であって、二価イオンの水酸化物を用いる乳酸の製造方法である。本発明の乳酸の製造方法では、二価イオンの水酸化物は、通常、発酵液の中和操作に用いられる。
【００１０】
本発明の乳酸の製造方法では、好ましくは、二価イオンの水酸化物が、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化銅(二価)、水酸化バナジウム、水酸化ニッケル、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化カドミウム、水酸化ベリリウム、水酸化亜鉛、水酸化コバルト、水酸化鉄から選ばれる少なくとも１種類である。
【００１１】
本発明の乳酸の製造方法では、二価イオンの水酸化物が、水酸化カルシウム、または、水酸化マグネシウムであることが、より好ましく、二価イオンの水酸化物が、水酸化カルシウムであることが、特に好ましい。
【００１２】
本発明の乳酸の製造方法では、水酸化カルシウムの濃度は、好ましくは、水１ｋｇに対し、３．７ｇ以上３７０ｇ以下であり、より好ましくは、水１ｋｇに対し、７．４ｇ以上２９６ｇ以下であり、さらに特に好ましくは、水１ｋｇに対し、１８．５ｇ以上７４ｇ以下である。本発明の乳酸の製造方法では、水酸化カルシウムは、スラリー状でも使用可能である。
【００１３】
本発明の乳酸の製造方法では、水酸化マグネシウムの濃度は、好ましくは、水１ｋｇに対し、２．９ｇ以上２９２ｇ以下であり、より好ましくは、水１ｋｇに対し、５．８ｇ以上２３３ｇ以下であり、特に好ましくは、水１ｋｇに対し、１４．６ｇ以上５８ｇ以下である。本発明の乳酸の製造方法では、水酸化マグネシウムは、スラリー状でも使用可能である。
【００１４】
本発明の乳酸の製造方法において、二価イオンの水酸化物は、乳酸生産培地に含ませても良いし、醗酵培養液に培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。二価イオンの水酸化物が乳酸生産培地に含まれ、また、発酵培養液に培養中分割して、あるいは、連続的に添加する組み合わせの形でもできる。
【００１５】
本発明において、二価イオンの水酸化物は、培養中分割して、あるいは、連続的に添加することもできる。添加回数は、１回でも、２回以上であっても良い。
【００１６】
本発明で使用する乳酸生産培地での発酵原料は、酵母が資化し得る炭素源、窒素源および無機塩類等を含有し、酵母の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地および合成培地のいずれを用いても良い。
【００１７】
発酵原料に含有される炭素源は、シュクロース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトース等の糖類、これら糖類を含有するデンプン、及び、デンプン加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖、ケーンジュースからの精製または結晶化された精製糖、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリン等の糖の原料、またはこれらから選ばれる少なくとも１種類を含むものが好ましい。
【００１８】
前記の炭素源は、培養開始時に一括して添加してもよいし、培養中分割してあるいは連続的に添加することもできる。
【００１９】
本発明において炭素源の濃度は、好ましくは、１Ｌ培養液に１０ｇ以上１０００ｇ以下であり、より好ましくは、１Ｌ培養液に５０ｇ以上３００ｇ以下であり、特に好ましくは、１Ｌ培養液に５０ｇ以上２００ｇ以下である。炭素源の濃度が、１L培養液に１０ｇ以上１０００ｇ以下であると、乳酸合成能力を有する酵母が正常に生育し、酵母の乳酸生産が効率的であるので、好ましい。
【００２０】
本発明では、乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地が、シュクロース、フラクトース、グルコース、ガラクトース、ラクトース、マルトースから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地であることが、より好ましい。また、乳酸の製造方法で使用する乳酸生産培地が、デンプン、及び、デンプン加水分解物、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、ケーンジュース、ケーンジュース抽出物または濃縮液、ケーンジュースからの精製または結晶化された原料糖、ケーンジュースからの精製または結晶化された精製糖、酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンから選ばれる少なくとも１種類を含む乳酸生産培地であることが、より好ましい。本発明では、これら発酵原料を必要に応じて希釈して用いることができる。
【００２１】
また、発酵原料に含有される窒素源は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが好ましく使用される。
【００２２】
また、発酵原料に含有される無機塩として、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。
【００２３】
本発明で使用する乳酸生産培地は、必要に応じて、消泡剤を使用することができる。
【００２４】
本発明で使用する乳酸生産培地は、好ましくは、微生物が生育のために特定の栄養素、または、特定の栄養素を含有する天然物として添加する。
【００２５】
本発明は、酵母を用いた発酵による乳酸の製造方法であり、乳酸は、Ｌ−乳酸であることが好ましい。
【００２６】
本発明で使用する酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属又はクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が挙げられ、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する酵母が、より好ましく、さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。本発明で使用する酵母は、具体的には、ＮＢＲＣ１０５０５株、ＮＢＲＣ１０５０６株が、特に好ましい。
【００２７】
本発明の乳酸の製造方法では、酵母が、乳酸合成酵素遺伝子を導入した酵母であることが好ましい。本発明において、乳酸合成酵素遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）とは、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）とピルビン酸を乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）に変換する活性を持つ乳酸脱水素酵素をコードしている遺伝子である。本発明においては、乳酸合成酵素遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）は、乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）遺伝子である。
【００２８】
乳酸脱水素酵素遺伝子は、生物の種類に応じてもしくは生体内においても各種同族体が存在する。本発明における乳酸脱水素酵素遺伝子としては、天然由来の乳酸合成酵素遺伝子の他、化学合成的あるいは遺伝子工学的手法で人工的に合成された乳酸脱水素酵素遺伝子でもよい。
【００２９】
本発明では、酵母に導入する乳酸合成酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、酵素活性の強い乳酸合成酵素をコードするＤＮＡが好ましい。
【００３０】
天然由来の乳酸合成酵素遺伝子は、例えば、乳酸菌などの原核生物もしくはカビなどの真核微生物由来のもの、さらにウシ、人などの哺乳類を含む高等真核生物由来の乳酸合成酵素遺伝子を挙げることができる。
【００３１】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子として、例えば、カエル由来では、アオガエル科（Ｒｈａｃｏｐｈｏｒｉｄａｅ）、アカガエル科（Ｒａｎｉｄａｅ）、アマガエル科（Ｈｙｌｉｄａｅ）、ジムグリガエル科（Ｍｉｃｒｏｈｙｌｉｄａｅ）、ヒキガエル科（Ｂｕｆｏｎｉｄａｅ）、クサガエル科（Ｈｙｐｅｒｏｌｉｉｄａｅ）、スキアシガエル科（Ｐｅｌｏｂａｔｉｎａｅ）、スズガエル科（Ｄｉｓｃｏｇｌｏｓｓｉｄａｅ）、コモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属する乳酸脱水素酵素遺伝子が挙げられる。これらの中でも、コモリガエル科（Ｐｉｐｉｄａｅ）に属する乳酸脱水素酵素遺伝子を用いることが好ましく、コモリガエル科に属するカエルの中でも、入手が容易であるゼノプス・レービス由来の乳酸脱水素酵素遺伝子であることが好ましい。
【００３２】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子は、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が好ましい。
【００３３】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子は、ゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が好ましい。
【００３４】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子は、より好ましくは、配列番号１に示す核酸配列を有する乳酸脱水素酵素遺伝子であり、さらに好ましくは、カエル由来のＬ−乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子であって、配列番号１に示す核酸配列を有する遺伝子である。
【００３５】
本発明の乳酸の製造方法では、乳酸脱水素酵素遺伝子は、Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が好ましく、Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子の発現を可能とするプロモーターの下流に導入されていることが、より好ましい。さらに、本発明の乳酸の製造方法では、Ｌ-乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子が、染色体上のピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子のプロモーターの下流に発現可能な状態で導入されているより好ましい。
【００３６】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子には、遺伝的多型性や、変異誘発などによる変異型の遺伝子も含まれる。ここでいう遺伝的多型性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものである。また、変異誘発とは、人工的に遺伝子に変異を導入することをいい、例えば、部位特異的変異導入用キット（Ｍｕｔａｎｔ−Ｋ（タカラバイオ社製））を用いる方法や、ランダム変異導入用キット（ＢＤ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製））を用いる方法などがある。
【００３７】
さらに酵素活性が強化された乳酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、例えば、部位特異的変異導入法を用いた変異手法によって得られる酵素活性が強い乳酸合成酵素をコードするＤＮＡや、強力なプロモーターの支配下に乳酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結したＤＮＡなどを挙げることができる。
【００３８】
本発明の乳酸の製造方法に用いられる酵母は、好ましくは、乳酸合成酵素（乳酸脱水素酵素、Ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子を遺伝子組み換え等の手法を用いて導入することにより製造することができる。また、酵母が、既に目的とする乳酸合成酵素をコードする遺伝子を有している場合は、必ずしも該遺伝子を導入する必要はない。
【００３９】
本発明で使用する酵母は、１倍体で良いが、倍数体でもよい。染色体が１組であることが１倍体、複数組を倍数体である。例えば、染色体が２組あれば２倍体と呼ぶ。
【００４０】
本発明の乳酸の製造方法では、乳酸脱水素酵素をコードする遺伝子を酵母に導入する方法としては、例えば、乳酸脱水素酵素遺伝子をクローニングし、クローニングした該遺伝子を組み込んだ発現ベクターを酵母に形質転換する方法、クローニングした該遺伝子を染色体上の目的箇所に相同組換えで挿入する方法等が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００４１】
本発明で好ましく使用する乳酸脱水素酵素遺伝子をクローニングする方法としては、特に制限はなく、既知の手法を用いることができる。例えば、既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法や、ゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。また、既知のタンパク質情報に基づき化学合成的又は遺伝子工学的に合成する方法も可能である。
【００４２】
クローニングした乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込む発現ベクターとしては、酵母で汎用的に利用される発現ベクターを用いることができる。酵母で汎用的に利用される発現ベクターとは、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列、大腸菌細胞内での自立的複製に必要な配列、酵母選択マーカー及び大腸菌選択マーカーを有しており、また、組み込んだ乳酸脱水素酵素遺伝子を発現させるために、その発現を調節するオペレーター、プロモーター、ターミネーター又はエンハンサー等のいわゆる調節配列をも有していることが望ましい。
【００４３】
ここで、酵母細胞内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、酵母の自立複製開始点（ＡＲＳ１）とセントロメア配列の対もしくは酵母の２μmプラスミドの複製開始点であり、大腸菌内での自立的複製に必要な配列とは、例えば、大腸菌のＣｏｌＥ１複製開始点である。また、酵母選択マーカーとしては、ＵＲＡ３又はＴＲＰ１等の栄養要求性相補的遺伝子もしくはＧ４１８耐性遺伝子又はネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられ、大腸菌の選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子又はカナマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。調節配列としては、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＧＡＰＤＨターミネーターが挙げられる。しかしながら、発現ベクターはこれらに限定されるものではない。
【００４４】
上記発現ベクターのプロモーター下流に乳酸脱水素酵素遺伝子を導入することにより、該遺伝子を発現可能なベクターが得られる。得られた乳酸脱水素酵素遺伝子発現ベクターを、後述する方法により酵母に形質転換することにより、乳酸脱水素酵素遺伝子を酵母に導入することができる。
【００４５】
乳酸脱水素酵素遺伝子を染色体上の目的箇所に、好ましくは、ｐｄｃ１遺伝子のプロモーターの下流に相同組み換えで挿入する方法としては、乳酸脱水素酵素遺伝子の上流及び下流に、導入目的箇所に相同的な部分を付加するようにデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ断片を後述する方法により酵母に形質転換する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、形質転換株の選択を容易にするために、上記ＰＣＲ断片には酵母選択マーカーが含まれることが好ましい。
【００４６】
ここで用いるＰＣＲ断片を調整する方法は、例えば、下記（１）〜（３）のステップ１〜３の工程により行うことができる。その概略を図１に示す。
【００４７】
（１）ステップ１：乳酸脱水素酵素遺伝子の下流にターミネーターがつながったプラスミドを鋳型とし、プライマー１，２をセットとして、乳酸脱水素酵素遺伝子及びターミネーターを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー１は、導入目的箇所の上流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインし、プライマー２は、ターミネーターより下流のプラスミド由来の配列をもとにデザインする。好ましくは、プライマー１に付加する導入目的箇所の上流側に相同的な配列は、ピルビン酸脱炭酸酵素１遺伝子（ｐｄｃ１遺伝子）の上流に相同的な配列である。
【００４８】
（２）ステップ２：酵母選択マーカーを持つプラスミド、例えばｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２６等を鋳型として、プライマー３，４をセットとして酵母選択マーカーを含む断片をＰＣＲで増幅する。プライマー３は、ステップ１のＰＣＲ断片のターミネーターより下流の配列と相同性のある配列が３０ｂｐ以上を付加するようにデザインし、プライマー４には、導入目的箇所の下流側に相同的な配列４０ｂｐ以上を付加するようデザインする。好ましくは、プライマー４に付加する導入目的箇所の下流側に相同的な配列は、ｐｄｃ１遺伝子の下流に相同的な配列である。
【００４９】
（３）ステップ３：ステップ１，２で得られたＰＣＲ断片を混合したものを鋳型とし、プライマー１，４をセットとしてＰＣＲを行うことにより、両末端に導入目的箇所の上流側及び下流側に相同的な配列が付加された、乳酸脱水素酵素遺伝子、ターミネーター及び酵母選択マーカーを含むＰＣＲ断片が得られる。好ましくは、前記ＰＣＲ断片は、両末端にｐｄｃ１遺伝子の上流及び下流に相同的な配列が付加された、ｌｄｈ遺伝子、ターミネーター及びマーカー遺伝子を含むＰＣＲ断片である。
【００５０】
上記で得られた乳酸脱水素酵素遺伝子発現ベクターまたはＰＣＲ断片を酵母に導入するには、形質転換、形質導入、トランスフェクション、コトランスフェクションまたはエレクトロポレーション等の方法を用いることができる。具体的には、例えば、酢酸リチウムを用いる方法やプロトプラスト法等がある。
【００５１】
得られた形質転換株の培養方法としては、例えば、「Ｍ．Ｄ．  Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ"，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９０）」等に記載されている既知の方法を用いることができる。乳酸脱水素酵素遺伝子発現ベクター又はＰＣＲ断片が導入された酵母は、発現ベクター又はＰＣＲ断片が有する酵母選択マーカーによって、栄養非添加培地又は薬剤添加培地で培養することにより選択することができる。
【００５２】
本発明で好ましく用いられる乳酸脱水素酵素遺伝子が導入された酵母を培養することにより、培地中に乳酸を製造することができる。
【００５３】
導入する発現ベクターを酵母内に保持させるのであれば、選択マーカーによる選択圧をかけた培地を用いることが好ましい。培地としては、例えば、ベクターの持つ選択マーカーに符号するアミノ酸を除去した合成培地などが挙げられる。特に好ましい培地は、炭素源としてグルコースを１〜１０％、窒素源としてＹｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  （ＤＩＦＣＯ社製）を０．６７％含有し、適切なアミノ酸を添加した合成培地である。
【００５４】
培養は、振とう培養もしくは撹拌培養などで行うことができる。さらに、培養形態として、回分培養、半回分培養、連続培養などで行うことができる。酸素供給条件は特に限定されるものではないが、好気的条件下あるいは微好気条件下で行うことができる。培養温度は摂氏２０〜４０度がよく、好ましくは２５〜３７度、より好ましくは３０〜３４度がよい。培養時間は、通常２４時間〜５日間である。培養中の培養液のｐＨは２．０〜１０．０に保持することが望ましく、好ましくは２．５〜８、より好ましくは５に保持することがよい。このｐＨの調整は、アルカリ溶液、アンモニア、炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等を用いて行うことができる。
【００５５】
乳酸の製造に際しては、まず、本発明の酵母を前培養し、前培養液を新しい培地に移して本培養することにより、培養液中に乳酸を製造することができる。培養温度は、菌株の増殖が実質的に阻害されず乳酸を生産し得る範囲であれば特に制限されるものでないが、好ましくは摂氏２０〜４０度の範囲の温度であり、より好ましくは摂氏２５〜３７度の範囲の温度であり、さらに好ましくは摂氏３０〜３４度である。培養には、静置、撹拌または振とうのいずれの方法も採用し得る。
【００５６】
上記のような条件で培養することにより、培地中に１〜２０％の乳酸を得ることができる。得られた乳酸の測定法に特に制限はないが、例えば、ＨＰＬＣを用いる方法や、Ｆ-キット（ロシュ社製）を用いる方法などがある。
【００５７】
本発明において、乳酸脱水素酵素活性とは、ピルビン酸とＮＡＤＨを乳酸とＮＡＤ＋に変換する活性を示す。また限定されるわけではないが、乳酸脱水素酵素活性は比活性を指標として比較できる。すなわち、ｌｄｈ遺伝子導入方法及び遺伝的バックグラウンドが同じ酵母を同条件で培養し、培養菌体から抽出したタンパク質を用いてＮＡＤＨの減少に伴う３４０ｎｍにおける吸光度の変化を測定する。その際に、室温において１分間当たりに１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ）と定義する事により、乳酸脱水素酵素の比活性は式（１）であらわせる。ここで、Δ３４０は１分間あたりの３４０ｎｍの吸光度の減少量、６．２２はＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数である。
【００５８】
【数１】
2008283917.tif 000002
【００５９】
得られた培養液中の乳酸は、従来から知られている方法によって、精製することができる。例えば、微生物を遠心分離した発酵液をｐＨ１以下にしてからジエチルエーテルや酢酸エチル等で抽出する方法、イオン交換樹脂に吸着、洗浄した後、溶出する方法、酸触媒の存在下でアルコールと反応させてエステルとしてから蒸留する方法、カルシウム塩やリチウム塩として晶析する方法などがある。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
【００６１】
以下、乳酸脱水素酵素遺伝子としてカエルの乳酸脱水素酵素遺伝子、酵母としてサッカロミセス・セレビセ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を選定して具体的な実施形態を示し、本発明をより詳細に説明する。
【００６２】
参考例１（乳酸合成能力を持つ酵母の造成）
乳酸脱水素酵素（ｌｄｈ）遺伝子として、配列番号１に示す核酸配列を有するゼノプス・レービス（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）由来の乳酸脱水素酵素遺伝子を使用した。乳酸脱水素酵素遺伝子のクローニングはＰＣＲ法により行った。ＰＣＲには、ゼノプス・レービスの腎臓由来ｃＤＮＡライブラリー（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）より付属のプロトコールに従い調製したファージミドＤＮＡを鋳型とした。
【００６３】
ＰＣＲ増幅反応には、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）を用い、反応バッファー、ｄＮＴＰｍｉｘなどは付属のものを使用した。上記のように付属のプロトコールに従い調整したファージミドＤＮＡを５０ｎｇ／サンプル、プライマーを５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１ユニット／サンプルになるように５０μlの反応系に調製した。反応溶液をＰＣＲ増幅装置ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）により９４℃の温度で５分熱変成させた後、９４℃（熱変成）：３０秒、５５℃（プライマーのアニール）：３０秒、６８℃（相補鎖の伸張）：１分を１サイクルとして３０サイクル行い、その後４℃の温度に冷却した。なお、遺伝子増幅用プライマー（配列番号２，３）には、５末端側にはＳａｌＩ認識配列、3末端側にはＮｏｔＩ認識配列がそれぞれ付加されるようにして作製した。
【００６４】
ＰＣＲ増幅断片を精製し、末端をＴ４  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ（タカラバイオ社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて行った。ライゲーション溶液を大腸菌ＤＨ５αのコンピテント細胞（タカラバイオ社製）に形質転換し、抗生物質アンピシリンを５０μｇ／ｍＬを含むＬＢプレートに蒔いて一晩培養した。生育したコロニーについて、ミニプレップでプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｌｄｈ遺伝子が挿入されているプラスミドを選抜した。これら一連の操作は、全て付属のプロトコールに従い行った。
【００６５】
上記乳酸脱水素酵素遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８ベクターを制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動により分離、定法に従い、乳酸脱水素酵素遺伝子を含む断片を精製した。得られた乳酸脱水素酵素遺伝子を含む断片を、図２に示す発現ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位にライゲーションし、上記と同様な方法でプラスミドＤＮＡを回収し、制限酵素ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩで切断することにより、乳酸脱水素酵素遺伝子が挿入された発現ベクターを選抜した。以後、このようにして作成した乳酸脱水素酵素遺伝子を組み込んだ発現ベクターをｐＴＲＳ１０２とした。
【００６６】
得られた発現ベクターｐＴＳ１０２を増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号４，５）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、乳酸脱水素酵素遺伝子及びＧＡＰＤＨターミネーター配列を含む１．３ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した（図１のステップ１に相当）。ここで配列番号４は、ｐｄｃ１遺伝子の上流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【００６７】
次に、プラスミド酵母選択用マーカーを持つプラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド（配列番号６，７）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、酵母選択マーカーであるＴＲＰ１遺伝子を含む１．２ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。ここで、配列番号７は、ｐｄｃ１遺伝子の下流６５ｂｐに相同性のある配列が付加されるようデザインした。
【００６８】
それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた各１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号：４，７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法によって、乳酸脱水素酵素遺伝子、ＧＡＰＤＨターミネーター及びＴＲＰ１遺伝子が連結された約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅した。
【００６９】
上記のＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製後、酵母サッカロミセス・セレビセＮＢＲＣ１０５０５株に形質転換し、トリプトファン非添加培地で培養することにより、ｌｄｈ遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている形質転換株を選択した。
【００７０】
上記のようにして得られた形質転換株が、乳酸脱水素酵素遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入されている酵母であることの確認は下記のように行った。まず、形質転換株のゲノムＤＮＡをゲノムＤＮＡ抽出キットＧｅｎとるくん（タカラバイオ社製）により調製し、これを増幅鋳型とし、オリゴヌクレオチド（配列番号７，８）をプライマーセットとしたＰＣＲにより、約２．８ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。なお、非形質転換株では、上記ＰＣＲによって約２．１ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られる。以下、上記乳酸脱水素酵素遺伝子が染色体上のｐｄｃ１遺伝子プロモーターの下流に導入された形質転換株を、Ｂ２株とする。
【００７１】
実施例１
参考例１において作製したＢ２株を用いて、乳酸発酵試験を行った。
【００７２】
表１に示したケーンジュースを含む培地（以下、天然培地と略す）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、天然培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、前々培養液をそれぞれ全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、天然培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、１Ｎの水酸化カルシウム水溶液による中和操作をしながら培養した。培養は攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして行った（本培養）。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、下記に示す条件でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。
【００７３】
【表１】
2008283917.tif 000003
【００７４】
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＰＲ−Ｈ（島津社製）
移動相：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
反応液：５ｍＭ ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM ＥＤＴＡ・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
検出方法：電気伝導度
温度：４５℃。
【００７５】
測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に示し、対糖収率を表２に示す。１Ｎの水酸化カルシウム水溶液による天然培地での乳酸発酵では乳酸の生産収率は８３．５％まで向上した。
【００７６】
実施例２
１Ｎの水酸化カルシウム水溶液の代わりに、１Ｎの水酸化マグネシウム水溶液を用いた他は、実施例１と同様にして、乳酸発酵試験を行った。
【００７７】
１Ｎの水酸化マグネシウム水溶液による天然培地での乳酸発酵では、乳酸の生産収率は７４．９％であった。
【００７８】
比較例１
参考例１において作製したＢ２株を用いて、水酸化ナトリウムを用いた乳酸発酵試験を行った。
【００７９】
天然培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、天然培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、前々培養液を全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、天然培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液による中和操作をしながら培養した。攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、実施例１と同様の方法でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。
【００８０】
測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に示し、対糖収率を表２に示す。
【００８１】
比較例２
１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の代わりに、１Ｎの水酸化カリウム水溶液を用いた他は、実施例１と同様にして、乳酸発酵試験を行った。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図３に示し、対糖収率を表２に示す。
【００８２】
【表２】
2008283917.tif 000004
【００８３】
その結果、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液による天然培地での乳酸発酵（比較例１）では乳酸の生産収率が６５．０％であり、１Ｎの水酸化カリウム水溶液による天然培地での乳酸発酵（比較例２）では乳酸の生産収率は６２．１％であるのに対し、１Ｎの水酸化マグネシウム水溶液による天然培地での乳酸発酵では乳酸の生産収率は７４．９％であり（実施例２）、１Ｎの水酸化カルシウム水溶液による天然培地での乳酸発酵では乳酸の生産収率は８３．５％まで向上した（実施例１）。天然培地での二価イオンの水酸化物による中和が乳酸の生産収率に効果的であった。
【００８４】
実施例３
参考例１において作製したＢ２株を用いて、合成培地を用いた乳酸発酵試験を行った。
【００８５】
表３に示した組成の培地（以下、合成培地と略す）１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、合成培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、前々培養液を全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、合成培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。１Ｎの水酸化カルシウム水溶液による中和操作をしながら培養した。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、実施例１と同様の方法でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。
【００８６】
【表３】
2008283917.tif 000005
【００８７】
測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に示し、対糖収率を表４に示す。１Ｎの水酸化カルシウム水溶液を用いた合成培地での乳酸発酵では乳酸の生産収率は６９．１％まで向上した。
【００８８】
比較例３
参考例１において作製したＢ２株を用いて、合成培地を用いた乳酸発酵試験を行った。
【００８９】
合成培地１０ｍＬを試験管に取り、そこに少量のＢ２株を植菌し、３０℃で一晩培養した（前々培養）。次に、合成培地１００ｍＬを５００ｍｌ容三角フラスコにいれ、前々培養液を全量植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した（前培養）。続いて、合成培地を１Ｌ投入したミニジャーファメンター（丸菱バイオエンジ社製、容量５Ｌ）に、前培養開始から２４時間後の前培養液を全量植菌し、１Ｎ水酸化ナトリウムによる中和操作をしながら培養した。攪拌速度（１２０ｒｐｍ）、通気量（０．１Ｌ／ｍｉｎ）、温度（３０℃）、ｐＨ（ｐＨ５）を一定にして培養を行った（本培養）。本培養開始後１０時間毎の培養液を遠心分離し、得られた上清を膜濾過した後、実施例１と同様の方法でＨＰＬＣによりＬ−乳酸量を測定した。
【００９０】
測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に示し、対糖収率を表４に示す。
【００９１】
比較例４
１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液の代わりに、１Ｎの水酸化カリウム水溶液を用いた他は、実施例１と同様にして、乳酸発酵試験を行った。測定結果から算出したＬ−乳酸の生産量を図４に示し、対糖収率を表４に示す。
【００９２】
【表４】
2008283917.tif 000006
【００９３】
その結果、１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いた合成培地での乳酸発酵（比較例３）では乳酸の生産収率が６０．０％であり、１Ｎの水酸化カリウム水溶液を用いた合成培地での乳酸発酵（比較例４）では乳酸の生産収率は５８．８％であるのに対し、１Ｎの水酸化カルシウム水溶液を用いた合成培地での乳酸発酵では乳酸の生産収率は６９．１％まで向上した（実施例３）。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ｐｄｃ１遺伝子プロモーター下流に、乳酸脱水素酵素遺伝子（ｌｄｈ遺伝子）を導入する方法を説明する概略図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる酵母発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【図３】図３は、天然培地における乳酸生産量増加のグラフである。
【図４】図４は、合成培地における乳酸生産量増加のグラフである。
【図１】
2008283917.tif 000007
【図２】
2008283917.tif 000008
【図３】
2008283917.tif 000009
【図４】
2008283917.tif 000010
【配列表】
2008283917000001.app