(57)【要約】【課題】簡便かつ迅速な抗癌剤スクリーニング方法を提供することを目的とする。【解決手段】被験物質の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを接触させ、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定し、該結合を低減する被験物質を抗癌剤候補として選択することを特徴とする抗癌剤候補のスクリーニング方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験物質の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを接触させ、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定し、該結合を低減する被験物質を抗癌剤候補として選択することを特徴とする抗癌剤候補のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｃｄｔ１タンパク質又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質のいずれか一方が固相化されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
選択した抗癌剤候補を癌細胞に投与し、癌細胞の増殖の変化を観察することをさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
Ｃｄｔ１タンパク質及びＧｅｍｉｎｉｎタンパク質を含むことを特徴とする抗癌剤候補のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便かつ迅速な抗癌性物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃｄｔ１は染色体ＤＮＡの複製に必須のタンパク質であり、ＯＲＣ、ＣＤＣ６と協調して複製ヘリカーゼであるＭＣＭ複合体を染色体に結合させる役割を担っている。このＭＣＭはＤＮＡ複製反応に必須であり、ＭＣＭのローディングはＤＮＡ合成期（Ｓ期）に先立つＧ１期に行われる。染色体ＤＮＡを正確に一度だけ倍加させるためには（すなわちＭＣＭのＳ期以降の再ローディング、そして再複製を抑制するためには）、Ｃｄｔ１の活性はＳ期以降に十分に抑制されなければならない。当初、その抑制はＣｄｔ１に対するＧｅｍｉｎｉｎと称するタンパク質の結合によると考えられていた（非特許文献１及び２）。よって当初は、Ｇｅｍｉｎｉｎは細胞増殖に対して抑制的であり、癌抑制遺伝子の可能性もあると考えられていた。実際に、Ｇｅｍｉｎｉｎを過剰に発現させると細胞増殖は抑制される（非特許文献３）。
【０００３】
一方、本発明者はそれまでの研究から、Ｃｄｋが再複製抑制においても中心的な役割を演じていると考えてきた。すなわち、Ｃｄｋは複製をオンにすると同時に、再複製を抑制するためにＯＲＣ、ＣＤＣ６をリン酸化し機能抑制することがわかっていた。そこで、Ｃｄｔ１もＧｅｍｉｎｉｎ結合とは独立してＣｄｋにより制御されているのではないかと考えて検討を行った。そして、Ｃｄｔ１もＣｄｋによりリン酸化され、その結果ＤＮＡ結合能が低下するとともに、ＳＣＦ−Ｓｋｐ２によるユビキチン化を介したタンパク質分解に導かれることを明らかにした（非特許文献４）。さらには、複製と共役する形でＣｕｌ４−ＤＤＢ１−ＰＣＮＡによるユビキチン化を介したタンパク質分解を受けていることも明らかにした（非特許文献５）。
【０００４】
すなわち、Ｓ期以降Ｃｄｔ１は複数の機構で厳密に抑制制御されており、これはＣｄｔ１制御が複製の細胞周期制御において中心的であることを示すものと思われる。そこで、Ｃｄｔ１脱制御の影響を調べるため、Ｃｄｔ１を正常ヒト細胞に過剰発現させたところ、軽度ながら有意な染色体障害が引き起こされ、染色体不安定性が誘導されることがわかった（非特許文献６）。ＯＲＣ１やＣＤＣ６の過剰発現ではそのような現象は観察されず、Ｃｄｔ１の重要性を示している。そして、Ｃｄｔ１が細胞の癌化を促進し得るという報告（非特許文献７）と併せて考えると、Ｃｄｔ１の脱制御は、染色体不安定性から癌化に至る新たな分子機構であると言えるであろう。
【０００５】
一方、癌は三大死因の１つであり、数多くの治療薬及び治療方法が研究されている。しかしながら、現在の治療薬又は治療方法は、特定の患者には有効であっても、一部の患者には有効ではない場合があり、また致命的な副作用を与えるものもある。例えば、現在までの治療薬の主流は、ＤＮＡや細胞に対する毒性を非特異的に示す物質を抗癌剤として用いるもので、副作用も大きい。近年、癌細胞と正常細胞の差異を分子レベルで明らかにし、それを標的に抗癌剤を開発する、いわゆる分子標的剤が幾つか開発されており、有効な抗癌剤となっている。このように、様々な種類の治療薬及び治療方法を探索し、できる限り多くの患者に対して有効な手段を開発することが求められている。
【０００６】
【非特許文献１】Wohlschlegel, J. A. et al. Science290, 2309-2312, 2000
【非特許文献２】Tada, S. et al. Nat. Cell Biol. 3, 107-113, 2001
【非特許文献３】Shreeram, S. et al. Oncogene21, 6624-6632, 2002
【非特許文献４】Sugimoto, N. et al. J. Biol. Chem. 279, 19691-19697, 2004
【非特許文献５】Nishitani, H. et al. EMBO J.25, 1126-1136, 2006
【非特許文献６】Tatsumi, Y. et al. J. Cell Sci., 119, 3128-3140, 2006
【非特許文献７】Arentson, E. et al. Oncogene21, 1150-1158, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便かつ迅速な抗癌剤スクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、ＤＮＡ複製機構に着目し、ＤＮＡの複製に必要なＣｄｔ１タンパク質と、その機能調節を担うタンパク質の１つであるＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を阻害することによって、癌細胞に傷害を与えることができるとの考えに基づき、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を阻害する物質を抗癌剤候補としてスクリーニング可能であるとの知見を得、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、被験物質の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを接触させ、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定し、該結合を低減する被験物質を抗癌剤候補として選択することを特徴とする抗癌剤候補のスクリーニング方法である。
【００１０】
上記スクリーニング方法において、例えばＣｄｔ１タンパク質又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質のいずれか一方は固相化されていることが好ましい。
【００１１】
また上記スクリーニング方法は、選択した抗癌剤候補を癌細胞に投与し、癌細胞の増殖の変化を観察することをさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明はまた、Ｃｄｔ１タンパク質及びＧｅｍｉｎｉｎタンパク質を含むことを特徴とする抗癌剤候補のスクリーニング用キットである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、抗癌剤のスクリーニング方法が提供される。かかるスクリーニング方法は、簡便かつ迅速に抗癌剤候補をスクリーニングすることができるため、数多くの被験物質をハイスループットでスクリーニングするための一次スクリーニングとして有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、被験物質の存在下におけるＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定し、その結合を阻害する被験物質を抗癌剤候補として選択することを含むスクリーニング方法に関する。本発明は、癌細胞と正常細胞の染色体ＤＮＡ複製制御の機構の差に着目し、新たな分子標的抗癌剤を開発しようとするものである。
【００１５】
上述したように、Ｃｄｔ１の機能過剰は正常細胞にとって有害な事象ではあるが、急激な細胞障害を引き起こすことは無かった。ところが同時期に、Ｇｅｍｉｎｉｎのタンパク質量をｓｉＲＮＡを用いて減少させると、細胞死に至るほどの著しい染色体障害／再複製が引き起こされることが報告された（Melixetian, M. et al. J. Cell Biol. 165, 473-482,2004; Zhu, W. et al. Mol. Cell Biol. 24, 7140-7150, 2004）。これは、Ｃｄｔ１が複数の機構で機能抑制されていること、そしてＣｄｋも複数の抑制経路を持っていることを考えると、一見不思議に思われた。実際に、上記したように正常細胞にＣｄｔ１を過剰発現させてもそこまでの細胞障害は認められない。そこで、これらｓｉＲＮＡの実験はほとんどすべてが癌細胞株を用いて行われているということと、多くの癌細胞株でＯＲＣ１、ＣＤＣ６、Ｃｄｔ１、ＭＣＭタンパク質が過剰発現していることを発見していること（Tatsumi, Y. et al. J. Cell Sci., 119, 3128-3140, 2006）から、癌細胞株ではＧｅｍｉｎｉｎ減少の影響が極めて強く出てしまうのだろうと考えた。このような背景から、本発明者は、Ｃｄｔ１とｇｅｍｉｎｉｎの結合を阻害する化合物が癌細胞に選択的に傷害を与える抗癌剤となる可能性があると考えた。例えば上述のように、癌細胞においてＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の発現をｓｉＲＮＡを利用して減少させた場合には染色体障害／再複製が引き起こされて細胞が死滅するが（Melixetian, M. et al.前掲、Zhu, W. et al.前掲）、これは、Ｇｅｍｉｎｉｎの減少によりＣｄｔ１の機能が過剰になったためと考えられる。よってＧｅｍｉｎｉｎとＣｄｔ１の結合を阻害しＣｄｔ１の機能が過剰になるようにすれば、癌細胞は死滅することが期待出来る。一方、正常細胞では他の制御機構が正常に機能しているため、同様にＧｅｍｉｎｉｎとＣｄｔ１の結合を阻害しＣｄｔ１の機能が過剰になったとしても、その影響は少ないことが期待される。実際に、正常細胞にＣｄｔ１を過剰発現させても比較的軽度の障害しか起こらないのに対し、癌細胞株に過剰発現させた場合は、より著しい染色体障害や細胞毒性が現れることが認められている（未発表データおよびVaziri, C. et al. Mol. Cell 11, 997-1008, 2003）。
【００１６】
従って、本発明においては、被験物質の存在下におけるＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定し、その結合を阻害する被験物質を抗癌剤候補として選択する。具体的には、本発明のスクリーニング方法は、被験物質の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを接触させるステップ、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定するステップ、及び該被験物質の非存在下において測定した場合又は他の物質の存在下において測定した場合と比較して、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を低減する被験物質を抗癌剤候補として選択するステップを含む。
【００１７】
Ｃｄｔ１タンパク質は、当技術分野で公知の任意の方法により入手することができる。例えば、公のデータベースに登録されている塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０３０９２８（ｃＤＮＡ）及びＮＰ＿１１２１９０．１（タンパク質）；配列番号１及び２）に基づいて、当技術分野で公知の方法（例えば遺伝子組換え法）を用いて作製することができる。また、Ｃｄｔ１タンパク質は、Ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合能を維持する限り、そのタンパク質断片であってもよい。そのようなタンパク質断片は、上記の塩基配列に基づいて任意のペプチドを作製し、そのペプチドのＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合能を確認することにより容易に作製することができる。
【００１８】
また、Ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質も同様に、当技術分野で公知の任意の方法により入手することができ、例えば公のデータベースに登録されている塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５８９５（ｃＤＮＡ）及びＮＰ＿０５６９７９．１（タンパク質）；配列番号３及び４）に基づいて作製することができる。また同様に、Ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質は、Ｃｄｔ１タンパク質との結合能を有する限り、そのタンパク質断片であってもよい。
【００１９】
Ｃｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質は、精製を容易にするため又は後述するスクリーニング試験の簡便性のため、これらのタンパク質同士が結合する限り、融合タンパク質として準備してもよい。例えば、公知のアフィニティタグ、具体的にはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグなどとの融合タンパク質を作製することができる。
【００２０】
また、Ｃｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質は、単離された形態であってもよいし、細胞抽出液中などの形態であってもよい。
【００２１】
本発明において用いる被験物質の種類は特に限定されるものではない。例えば、被験物質は、任意の物質的因子、具体的には、天然に生じる分子、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）等）など；天然に生じない分子、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作成した低分子有機化合物（無機及び有機化合物ライブラリー、又はコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また被験物質は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、転写因子等であってもよい。抗癌剤として使用することを考慮した場合には、細胞に取り込まれやすい小さな化合物、例えば無機化合物又は有機化合物であることが好ましい。
【００２２】
また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）、ペプチドライブラリー（コンビナトリアルライブラリーなど）などが挙げられる。
【００２３】
被験物質の存在下でＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質を接触させる場合、その接触の条件は、特に限定されるものではなく、液相系又は固相系のいずれをも用いることができる。当業者であれば、被験物質の種類、Ｃｄｔ１タンパク質又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の形態（単離タンパク質、融合タンパク質、固相化タンパク質、タンパク質を発現する細胞など）に応じて適宜接触の条件を決定することができる。例えば、被験物質を含む溶液中にＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを添加し、それらを接触させてもよいし、固相化したＣｄｔ１タンパク質（又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質）に対して、被験物質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質（又はＣｄｔ１タンパク質）とを同時に接触させてもよい。
【００２４】
また、被験物質の効果は、いくつかの条件で検討することも可能である。そのような条件としては、被験物質を存在させる時間、量、回数などが挙げられる。例えば、被験物質の希釈系列を調製するなどして複数の用量を設定することができる。被験物質の存在時間も適宜設定することができるが、例えば、数分から数時間までの期間にわたって存在させることができる。
【００２５】
さらに、複数の物質の相加作用、相乗作用などを検討する場合には、被験物質を組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
接触後のＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合は、当技術分野で公知の任意の方法に従って測定することができる。例えば、免疫学的手法（免疫沈降法、ウエスタンブロット解析、サンドイッチ法などの方法）を利用することができる。
【００２７】
免疫沈降法を行う場合には、液相において被験物質の存在下でＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを接触させた後、これらの結合複合体を抗Ｃｄｔ１抗体又は抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体を利用して免疫沈降させる。次に、沈降した複合体に対して他方のタンパク質に対する抗体を用いてウエスタンブロット解析を行い、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を評価する。
【００２８】
サンドイッチ法を行う場合には、Ｃｄｔ１タンパク質又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質のいずれか一方を固相支持体（例えば膜、フィルター、マイクロタイタープレート、ビーズなど）に固定し、これに対してＧｅｍｉｎｉｎタンパク質又はＣｄｔ１タンパク質と被験物質を添加し反応させた後、未結合のタンパク質・被験物質を洗浄・除去し、続いて抗Ｃｄｔ１抗体又は抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体を反応させ、結合した又は結合しなかった抗Ｃｄｔ１抗体又は抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体の量を測定することによって、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を評価することができる。この場合、結合量は、例えば抗Ｃｄｔ１抗体又は抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体を直接標識し、その標識を検出することによって測定することができ、あるいは抗Ｃｄｔ１抗体又は抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体に対して標識二次抗体を反応させ、その標識を検出することによって測定することも可能である。このような標識としては、限定されるものではないが、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、ビオチン−アビジン系などが挙げられる。当業者であれば、反応条件に応じて適当な標識を選択し、使用することができる。標識シグナルの検出もまた、当技術分野で公知の方法に従って行うことができる。例えば、酵素標識を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。蛍光標識は、例えば蛍光顕微鏡、プレートリーダー等を用いて検出及び定量することができる。放射性標識を用いる場合には、放射性標識の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。
【００２９】
上述の測定法に使用する物質及び試薬は、市販品を利用してもよいし、当業者であれば適宜調製することも可能である。例えば抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体は、Santa Cruz Biotechnology Inc.より入手可能である。
【００３０】
あるいは、当技術分野で公知の別の方法、例えばツーハイブリッド法、表面プラズモン共鳴を利用したタンパク質結合の検出（ＢＩＡＣＯＲＥ等）などを用いて、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定することができる。
【００３１】
被験物質の存在下におけるＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合が、被験物質の非存在下において測定した場合又は他の物質の存在下において測定した場合と比較して、低減している場合には、その被験物質を抗癌剤候補として選択する。ここで他の物質としては、陰性対照が含まれる。
【００３２】
また、上述のようにして選択した抗癌剤候補の抗癌剤としての活性をさらに評価するため、抗癌剤候補を癌細胞に投与して、その癌細胞の増殖の変化を観察してもよい。さらに、抗癌剤候補の正常細胞に対する影響を調べてもよい。
【００３３】
さらに上記スクリーニング方法は、キットを用いてより簡便に実施することができる。本発明のスクリーニング用キットは、上述したＣｄｔ１タンパク質及びＧｅｍｉｎｉｎタンパク質を含むものである。Ｃｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質の形態は、それらが結合し、その結合を評価できる限り、特に限定されるものではない。
【００３４】
スクリーニング用キットの形態は、特に限定されるものではないが、Ｃｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質を含む容器、Ｃｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎタンパク質が固定された固相（膜、フィルター、マイクロタイタープレート、ビーズなど）、凍結乾燥したＣｄｔ１タンパク質及び／又はＧｅｍｉｎｉｎを含む容器などの形態をとることができる。
【００３５】
また、Ｃｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質との結合を測定するための他の成分を含んでもよく、そのような成分としては、例えば、抗Ｃｄｔ１抗体、抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体、標識二次抗体などが挙げられる。
【００３６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３７】
［参考例１］
（１）ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）−Ｃｄｔ１融合タンパク質の作製と精製
ヒトＣｄｔ１のｃＤＮＡ（配列番号１）は、報告されている配列情報（ｃＤＮＡ：ＮＭ＿０３０９２８、タンパク質：ＮＰ＿１１２１９０．１）に基づいて、ヒト細胞ｍＲＮＡからクローニングした。このｃＤＮＡを、市販のＧＳＴ融合タンパク質発現ベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（アマシャム社）に挿入した。ｐＧＥＸ−６Ｐ−１−Ｃｄｔ１を大腸菌ＢＬ２１に導入し、１Ｌの培養液中でＯＤ６０００．７〜０．８程度になるまで３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）０．５ｍＭを加えて、発現誘導を２５℃で２〜３時間行った。
【００３８】
大腸菌を遠心で集菌し、溶菌バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌバッファー）４０ｍｌに懸濁した。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、終濃度１ｍＭ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ、最終濃度１ｍＭ）、プロテアーゼインヒビターミックス（ナカライ社）を添加後、冷却しながら音波処理（BRANSON SONIFIER）で溶菌を行った。最終濃度０．１％になるようにＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加え、１５分間氷上に静置した。その後、１００００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、上清を０．４５μｍフィルター（Whatman）に通して細胞抽出液を作製した。
【００３９】
グルタチオン−セファロース４Ｂ（アマシャム社）１．５ｍｌを、Ａバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）５ｍｌで、４℃、３０分間攪拌し平衡化を行った。平衡化したグルタチオン−セファロース４Ｂと細胞抽出液を混和し、４℃で２時間攪拌し結合させた。その後、１０ｍｌのＡバッファーでビーズの洗浄を３回行った。
【００４０】
溶出は、溶出バッファー（２０ｍＭ還元グルタチオン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ ＴＸ−１００）１ｍｌをビーズに添加し、室温で１０分間攪拌し、２０００ｒｐｍ、４℃で３分間遠心して上清を回収することで行った。これを５回繰り返した。Ｂバッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％グリセロール）を用いて透析を行い、最終標品を得た。
（２）Ｈｉｓ−ｇｅｍｉｎｉｎ融合タンパク質の作製と精製
ヒトｇｅｍｉｎｉｎのｃＤＮＡ（配列番号３）は、報告されている配列情報（ｃＤＮＡ：ＮＭ＿０１５８９５、タンパク質：ＮＰ＿０５６９７９．１）に基づいてヒト細胞ｍＲＮＡからクローニングした。このｃＤＮＡを、市販の６×ヒスチジン融合タンパク質発現ベクターであるｐＩＶＥＸ２．４ｂ  Ｎｄｅ（Roche社）に挿入した。このベクターをRoche社の試験管内タンパク質合成システムであるＲＴＳ５００と混合し、Ｈｉｓ−ｇｅｍｉｎｉｎタンパク質を発現させた。
【００４１】
ＨＩＳ−Ｓｅｌｅｃｔ  ＨＣ  ニッケルアフィニティゲル（Sigma社）０．５ｍｌをカラムにとり、Ｃバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）４ｍｌで平衡化した後上記反応液を加え、１時間ほどかけてカラムを通し結合させた。その後、１０ｍｌのＣバッファーで洗浄を行った。
【００４２】
溶出は２５０ｍＭイミダゾールを含むＣバッファー３ｍｌで行った。Ｄバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２５％グリセロール）を用いて透析を行い、最終標品を得た。
【実施例１】
【００４３】
Ｃｄｔ１−Ｇｅｍｉｎｉｎ結合阻害剤スクリーニング方法
本実施例においては、約５０種の阻害剤候補物質を用いて、Ｃｄｔ１−Ｇｅｍｉｎｉｎの結合を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。
【００４４】
まず、市販の９６穴プラスチックプレート（Becton Dickinson社、Falcon 35-3912）に、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３−Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．３）緩衝液で希釈したＧＳＴ−Ｃｄｔ１又はコントロールのＧＳＴ（２０μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／１穴）を入れた。続いて、常温で２時間静置することで、ＧＳＴ−Ｃｄｔ１をプレートに固定した。その後、プラスチックプレートをひっくり返して液体を捨て、ペーパータオルで拭いた。
【００４５】
１％スキムミルクをプラスチックプレートへ入れ（１００μ／１穴）、常温で１時間（もしくは４℃で一晩）静置することでプレートの表面をブロッキングした。プラスチックプレートをひっくり返して液体を捨て、ＰＢＳで１回洗浄後、ペーパータオルで拭いた。
【００４６】
ＰＢＳで希釈したＨｉｓ−ｇｅｍｉｎｉｎ（０．１２５μｇ／ｍｌの濃度で４５μｌ／１穴分）と、ＤＭＳＯに溶解させた阻害剤候補物質又はコントロールとしてＤＭＳＯのみ（５μｌ／１穴分）を混合した後、５分間、常温で静置（プレインキュベーション）した。なお、阻害剤候補物質は、１５μＭ、１５０μＭ及び１５００μＭの希釈系列を準備し、それぞれ反応させた。
【００４７】
プレインキュベート後の溶液を、上記のように調製したプラスチックプレートへ入れ（５０μｌ／１穴）、常温で１時間静置することで、Ｃｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎの複合体を形成させた。その後、プラスチックプレートをひっくり返して液体を捨て、ＰＢＳで２回洗浄後、ペーパータオルで拭いた。
【００４８】
続いて、１％スキムミルクで２０００倍希釈した市販の抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., FL-209:SC-13015）をプラスチックプレートへ入れ（５０μｌ／１穴）、常温で１時間静置することで、Ｇｅｍｉｎｉｎと抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体を結合させた。その後、プラスチックプレートをひっくり返して液体を捨て、１％Ｔｗｅｅｎ−２０入りＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄後、ペーパータオルで拭いた。
【００４９】
１％スキムミルクで１０００倍希釈した市販のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識−抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc., SC-2370）をプラスチックプレートへ入れ（５０μｌ／１穴）、常温で１時間静置することで、抗Ｇｅｍｉｎｉｎ抗体と二次抗体を結合させた。次にプラスチックプレートをひっくり返して液体を捨て、１％Ｔｗｅｅｎ−２０入りＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄後、ペーパータオルで拭いた。
【００５０】
続いて、ＥＬＩＳＡキット（日本エンバイロケミカルズ社，304-13161）を用いて発色を行い、５１５ｎｍで比色定量した。
【００５１】
結果を図１に示す。図１において、Ａ〜Ｊは以下の対照又は阻害剤候補物質である：
Ａ：陰性対照
Ｂ：ｃｉｓ−オレイン酸
Ｃ：ウルソール酸
Ｄ：１２−ＯＨ−ｃｉｓ−オレイン酸
Ｅ：ネルボン酸
Ｆ：陽性対照
Ｇ：ｔｒａｎｓ−オレイン酸
Ｈ：ＭＧＤＧ（モノガラクトシルジアシルグリセロール）
Ｉ：ＤＧＤＧ（ジガラクトシルジアシルグリセロール）
Ｊ：ＳＱＤＧ（スルホキノボシルジアシルグリセロール）
【００５２】
Ａの陰性対照ではＧｅｍｉｎｉｎを添加しなかった。Ｆの陽性対照では阻害薬候補物質を添加せず、Ｇｅｍｉｎｉｎのみとした。なお、ＧＳＴはＨｉｓ−Ｇｅｍｉｎｉｎと反応しないことは確認済みである。この阻害剤候補物質の構造を図２に示す。図２において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６はそれぞれ独立して、炭素数１６〜１８でありかつ０〜３個の二重結合を含む脂肪酸である。
【００５３】
これらの結果から、ｃｉｓ−オレイン酸、ウルソール酸及び糖脂質の一種であるＳＱＤＧがＣｄｔ１−Ｇｅｍｉｎｉｎ結合を阻害することがわかった。
【実施例２】
【００５４】
本実施例においては、実施例１においてＣｄｔ１−Ｇｅｍｉｎｉｎ結合を阻害することを確認したＳＱＤＧを用いて、そのヒト願細胞増殖抑制活性を調べた。
【００５５】
本実験に用いた細胞は、ヒト子宮癌由来ＨｅＬａ−Ｓ３細胞（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団（東京都中央区）から購入）である。培地としてはイーグル最小必須培地（ＭＥＭ）（日水製薬(株)製）に、牛胎児血清１０％（ｖ／ｖ）、２５０μｇ／ｍｌファンギゾン、３００μｇ／ｍｌ Ｌ−グルタミン酸を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ２インキュベーターにて３７℃で行った。
【００５６】
上記に示した培地にＳＱＤＧを溶解した。ただしＳＱＤＧは水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、それを上記の培地に溶かした。なお、培地中のＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、本測定例で用いたＨｅＬａ−Ｓ３細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否定できる状態である。
【００５７】
本試験のための培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウエルに２．０×１０３個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウエルずつ与えた。またポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。
【００５８】
化合物を添加後は、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で２４時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献［「Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays」、Tim Mosmann, J. Immunol. Methods、６５巻、５５頁（１９８３）］に記載されているＭＴＴアッセイ法を用いた。即ち、上記２４時間後テトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、更に４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）で定量した。
【００５９】
細胞生存率は次の式により算出した：
細胞生存率（％）＝試験区のＯ．Ｄ．［５７０ｎｍ］／対照区のＯ．Ｄ．［５７０ｎｍ］
得られた結果を表１に示す。なお表１に示すデータは５ウエルの平均値である。
【００６０】
【表１】
2008096397.tif 000002
〔ＳＱＤＧが癌細胞増殖を阻害するという表１の実験結果は、Ohta K, Mizushina Y, Hirata N, Takemura M, Sugawara F, Matsukage A, Yoshida S, Sakaguchi K. Action of a new mammalian DNA polymerase inhibitor, sulfoquinovosyldiacylglycerol. Biol Pharm Bull. 1999, 22 (2) 111-116.において発表済である〕
【００６１】
この結果からＣｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎの結合を阻害するＳＱＤＧが、実際にヒト癌細胞株に対する細胞増殖抑制効果を発揮し、抗癌剤として利用し得ることが示された。
【実施例３】
【００６２】
本実施例においては、コエンザイムＱ群を用いてＣｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎとの結合阻害効果を試験し、また癌細胞増殖抑制活性について試験した。
（１）Ｃｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎとの結合阻害試験
実施例１と同様にして、コエンザイムＱ群について実験を行った。使用したコエンザイムＱ群の構造は以下の通りである。
【００６３】
【化１】
2008096397.tif 000003
〔式中、
コエンザイムＱ１において、ｎ＝１であり、
コエンザイムＱ２において、ｎ＝２であり、
コエンザイムＱ４において、ｎ＝４であり、
コエンザイムＱ６において、ｎ＝６であり、
コエンザイムＱ１０において、ｎ＝１０である〕。
【００６４】
これらの５種のコエンザイムＱを、１０００μＭ、１００μＭ、１０μＭ及び１μＭの濃度で使用した。陽性対照では阻害薬候補物質を添加せず、Ｇｅｍｉｎｉｎのみとした。また陰性対照として、ＧＳＴのみを使用したもの（陰性対照１）と、ＧＳＴ−Ｃｄｔ１を添加しなかったもの（陰性対照２）を用いた。
この実験結果を図３及び表２に示す。
【００６５】
【表２】
2008096397.tif 000004
【００６６】
この結果からＣｏＱ６とＣｏＱ１０はＣｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎの結合を阻害することがわかった。
【００６７】
（２）ヒト癌細胞増殖抑制活性の確認
上記（１）においてＣｄｔ１−Ｇｅｍｉｎｉｎ結合の抑制を示したＣｏＱ１０の癌細胞増殖抑制効果を実施例２に記載した方法（ＭＴＴアッセイ法）を用いて評価した。
【００６８】
得られた結果を表３に示す。なお表３に示すデータは５ウエルの平均値である。
【００６９】
【表３】
2008096397.tif 000005
【００７０】
この結果から、Ｃｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎの結合を阻害するＣｏＱ１０が、実際にヒト癌細胞株に対する細胞蔵相抑制効果を発揮し、抗癌剤として利用し得ることが示された。
【００７１】
（３）ヒト正常細胞への影響
ＣｏＱ１０のヒト正常細胞への影響を次の方法を用いて評価した。
本実験に用いた細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞由来ＨＵＶＥＣ細胞（クラボウ（株）（大阪）から購入）である。培地としてはＨｕＭｅｄｉａ  ＥＧ２（クラボウ（株）製）に、牛胎児血清２％（ｖ／ｖ）を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ２インキュベータにて３７℃で行った。
【００７２】
上記に示した培地にＣｏＱ１０を溶解した。ただしＣｏＱ１０は水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地中の培地内に存在するＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、本測定例で用いたＨＵＶＥＣ細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否定できる状態である。
【００７３】
本試験のための培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウエルに２．０×１０３個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウエルずつ与えた。またポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。
【００７４】
化合物の添加後は、５％ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で７日間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献［「Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assays for mammalian cell viability determinations」、Altman SA, Randers L, Rao G., Biotechnology Progress、９巻、６号、671-674頁(1993)］に記載されているトリパンブルー染色法を用いた。即ち、上記７日間後に０．３％トリパンブルー液を添加し、細胞浮遊液を適宜希釈して、速やかに計算盤に入れた。青く染色されている細胞が死細胞であり、生細胞、死細胞をそれぞれ数え、総細胞数と生細胞の割合を求めた。
得られた結果を表４に示す。なお表４に示すデータは５ウエルの平均値である。
【００７５】
【表４】
2008096397.tif 000006
【００７６】
この結果から、Ｃｄｔ１とＧｅｍｉｎｉｎの結合を阻害するＣｏＱ１０が、ヒト正常細胞株に対する細胞増殖抑制を示さないことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、抗癌剤のスクリーニング方法が提供される。かかるスクリーニング方法は、簡便かつ迅速に抗癌剤候補をスクリーニングすることができるため、数多くの被験物質をハイスループットでスクリーニングするための一次スクリーニングとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】阻害薬候補物質の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを結合させた結果を示す。
【図２】実施例において用いた阻害薬候補物質の構造を示す。
【図３】コエンザイムＱ群の存在下においてＣｄｔ１タンパク質とＧｅｍｉｎｉｎタンパク質とを結合させた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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