(57)【要約】【課題】より正確な前駆イオンの質量対電荷比m/zと価数zの情報を取得することが可能な質量分析方法及び装置を実現する。【解決手段】マススペクトルデータに含まれる干渉ピークを判定し、その干渉ピークを過去のスペクトルデータを用いて分離することで、正確な質量対電荷比m/zと価数zの情報を取得し、MS2分析を行う前駆イオンの選択を可能とする。【選択図】図１
2008096353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をイオン化するイオン化部と、
前記イオン化部により生成されたイオンの中から特定のイオン種を選択して解離させる解離部と、
前記イオン化部によってイオン化されたイオンあるいは前記解離部によって生じたイオンを質量分析する質量分析部と、
前記質量分析部から継続的にマススペクトルデータを取得し、取得したマススペクトルデータに対して処理を行うと共に、装置各部を制御する制御部とを有し、
前記制御部は、前記イオン化部に試料分離手段によって成分に分離された試料が順次供給されているとき、前記質量分析部から取得したマススペクトルデータからピーク情報を抽出し、前記ピーク情報をもとにピークの干渉の有無を判断し、ピークの干渉がある場合、当該干渉ピークを過去に取得したマススペクトルデータを用いて分離し、前記干渉ピークを分離して得られたマススペクトルデータからイオンの価数を判定し、前記判定されたイオンの価数を用いて前記解離部で解離させるイオン種を選択する処理を行うことを特徴とする質量分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の質量分析装置において、表示部のマススペクトルを表示する画面に、当該マススペクトルのピークを構成するイオンに対して前記判定された価数及び干渉情報を表示することを特徴とする質量分析装置。
【請求項３】
請求項１記載の質量分析装置において、マススペクトル毎にピークを構成するイオンの質量対電荷比、前記判定された価数、信号強度、同位体情報、及び干渉情報を記憶部に記録することを特徴とする質量分析装置。
【請求項４】
請求項１記載の質量分析装置において、干渉しているピークを前駆イオンとして選択するか否かの指示を入力する入力部を有し、前記入力部に干渉しているピークを前駆イオンとして選択しない旨の指示が入力されたとき、前記解離部で解離させる前駆イオンを干渉ピークを除いた候補から選択することを特徴とする質量分析装置。
【請求項５】
請求項１記載の質量分析装置において、前記干渉ピークの分離は、前記干渉しているピークに対して、前記過去に取得したマススペクトルの同一ピークの強度を正規化して減算することで行うことを特徴とする質量分析装置。
【請求項６】
成分に分離されて供給される試料を順次イオン化し、生成されたイオンの中から特定のイオンを選択して解離させる工程を有する質量分析方法において、
イオンのマススペクトルデータを取得する工程と、
前記マススペクトルデータ中の干渉ピークを判定する工程と、
過去に取得したマススペクトルデータを用いて前記干渉ピークを分離する工程と、
前記干渉ピークを分離したマススペクトルデータを用いてイオンの価数を判定する工程と
を有することを特徴とする質量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析方法及び装置に係り、特に、質量分析装置におけるデータ取得に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
質量分析装置は、試料分子に電荷を付加してイオン化を行い、生成したイオンを電場又は磁場によりイオンの質量m、価数zの比である質量対電荷比m/z毎に分離し、その量を検出器にてイオン電流値として計測する機器である。ここで得られた質量対電荷比m/z単位のイオン電流値をマススペクトルと呼ぶ。このマススペクトルは測定する試料の構造によって異なり、そのマススペクトルのパターンから試料の構造の情報を得ることができる。
【０００３】
しかし、試料中の構成成分が複雑な場合や、得られたマススペクトルの情報が成分の特定に不十分である場合がある。そこで、より詳細な構造情報を得るための方法としてMSn分析が考案された。このMSn分析では、質量分析計に導入されたイオンのうち、特定質量数のイオンを選択した（選択したイオンを前駆イオンと呼ぶ）後、選択したイオンと中性分子との衝突を起こすことにより、イオンの一部の結合を壊す（開裂させる）ことが行われる。これを衝突誘起解離（CID）と呼ぶ。その後、結合の切れたイオンを検出し、マススペクトルデータを得る。イオン取り込み、イオン選択、衝突誘起解離の一連の操作の、その繰返し回数によって、MS2やMS3などと呼ぶ。
【０００４】
MSn分析により、豊富な定性情報が得られるため、近年のライフサイエンス分野ではタンパク質の同定に質量分析装置が用いられている。特に、タンパク質の同定は前駆イオンを解離して得られたMS2スペクトルをタンパク質データベースと検索・照合することで行われている。このデータベース検索・照合時には前駆イオンの質量対電荷比m/zと価数zの情報が用いられる。そのため、高精度な同定を行うためには正確な質量対電荷比m/zと価数zの情報を取得し、MSn分析を行う前駆イオンを選択することが重要となる。特に、複数のタンパク質が混合されているような試料を測定する際には、複数のイオン種が同時に観測されるためピークの干渉が起こり、正確な質量対電荷比m/zと価数zを判定することが難しくなる。このような問題に対する方法として、特開2005-91344号公報には、予め、複数のイオン種のm/zが一致する場合を推定して同位体パターンを作成し、そのパターンとのマッチングを取ることにより複数のピークが混在するかを判定することが記載されている。
【０００５】
【特許文献１】特開2005-91344号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特開2005-91344号公報記載の技術では、予め、同位体パターンを作成してパターンマッチングを行うため、正確な同位体パターンを作成することは困難でありマッチング尤度を大きくする必要がある。そのため、同位体を誤認識する可能性もあり、正確な前駆イオンの情報を取得できない可能性がある。
【０００７】
本発明は上記の課題を解決し、より正確な前駆イオンの質量対電荷比m/zと価数zの情報を取得することが可能な質量分析方法及び装置を実現することを目的としたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による質量分析装置は、試料をイオン化するイオン化部と、イオン化部により生成されたイオンの中から特定のイオン種を選択して解離させる解離部と、イオン化部によってイオン化されたイオンあるいは解離部によって生じたイオンを質量分析する質量分析部と、質量分析部から継続的にマススペクトルデータを取得し、取得したマススペクトルデータに対して処理を行うと共に、装置各部を制御する制御部とを有し、制御部は、イオン化部に試料分離手段によって成分に分離された試料が順次供給されているとき、質量分析部から取得したマススペクトルデータからピーク情報を抽出し、そのピーク情報をもとにピークの干渉の有無を判断し、ピークの干渉がある場合、当該干渉ピークを過去に取得したマススペクトルデータを用いて分離し、干渉ピークを分離して得られたマススペクトルデータからイオンの価数を判定し、判定されたイオンの価数を用いて解離部で解離させるイオン種を選択する処理を行う。干渉ピークの分離は、干渉しているピークに対して、過去に取得したマススペクトルの同一ピークの強度を正規化して減算することで行う。
【０００９】
好ましくは、表示部のマススペクトルを表示する画面に、当該マススペクトルのピークを構成するイオンに対して前記判定された価数及び干渉情報を表示する。また、マススペクトル毎にピークを構成するイオンの質量対電荷比、判定された価数、信号強度、同位体情報、及び干渉情報を記憶部に記録する。また好ましくは、干渉しているピークを前駆イオンとして選択するか否かの指示を入力する入力部を有し、入力部に干渉しているピークを前駆イオンとして選択しない旨の指示が入力されたとき、解離部で解離させる前駆イオンを干渉ピークを除いた候補から選択する。
【００１０】
本発明による質量分析方法は、成分に分離されて供給される試料を順次イオン化し、生成されたイオンの中から特定のイオンを選択して解離させる工程を有する質量分析方法において、イオンのマススペクトルデータを取得する工程と、マススペクトルデータ中の干渉ピークを判定する工程と、過去に取得したマススペクトルデータを用いて干渉ピークを分離する工程と、干渉ピークを分離したマススペクトルデータを用いてイオンの価数を判定する工程とを有する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、マススペクトルデータに含まれる干渉ピークを判定し、干渉ピークを分離することで、正確な質量対電荷比m/zと価数zの情報を取得し、MS2分析を行う前駆イオンを選択することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
図１から図１５を用いて、本発明の実施形態の一つについて説明する。
【００１３】
図１５は、本発明が適用される質量分析装置の構成例を示す全体外略図である。図１５において、試料はクロマトグラフ装置５１に導入され、クロマトグラフ装置５１に備えられたカラム(図示せず)にて成分単位に分離され、イオン源５２に送られる。そして、イオン源５２でイオン化された試料は、イオントラップ５４へ送られ特定の質量数を有するイオンが選択・解離され、イオン加速部５５及びリフレクトロン５６を備える飛行時間型質量分析部５８にてイオンの質量対電荷比(m/z)に応じて分離される。ここで、mはイオンの質量、zはイオンの帯電価数である。分離されたイオンは検出器５７で検出され、制御部５９を介してデータ処理部６１に送られ、データ処理が実行される。処理が実行されたデータは、表示部６０に表示される。また、データ処理部６１には、操作者が各種設定情報を入力するためのキーボードやデータ処理部６１上のカーソルを移動させるためのポインティングデバイスを備えた入力部６２を具備しており、イオントラップの制御の条件をユーザの入力に基づき制御部５９に送り、イオントラップをマイクロ秒オーダーの高速で制御することが可能である。
【００１４】
図１５に示した質量分析装置は、四重極イオントラップ-飛行時間型質量分析装置であり、MSn分析を行う際のイオンの選択・解離にイオントラップ５４を使用する。イオントラップ５４はリング電極と一対のエンドキャップ電極から構成されている。リング電極に高周波電圧を印加することで、リング電極と一対のエンドキャップ電極に囲まれた空間に、三次元四重極電界を形成する。イオン源５２でイオン化された試料は、イオン輸送部５３を介して、前記空間内に導かれ、形成された三次元四重極電界に一度保持される。その後、MS1データを取得する場合には、飛行時間型質量分析部５８にイオンを送り、飛行時間型質量分析部５８により質量分離され、検出器５７で検出される。検出された信号はデータ処理部６１に送られ、質量対電荷比(m/z)を横軸としたマススペクトルデータとして記録される。ここで、飛行時間型質量分析部５８は同時に加速したイオンが、質量対電荷比(m/z)に応じて検出器に到達するまでの時間差を正確に計測してマススペクトルを得る質量分析装置である。
【００１５】
また、MSnデータを取得する場合には、特定質量数のイオンをイオントラップ５４に残し、他のイオンを排除した状態（この状態は、エンドキャップ電極に排除したいイオンが共鳴状態となるような高周波電圧を印加することによって容易に作ることが出来る）で、このイオンの運動に共鳴する周波数の電圧（又は異なる周波数の電圧）を加えることによって、このイオンにエネルギーを与えて衝突誘起解離（Collision Induced Dissociation）反応を起こさせ、その結果解離したイオンを飛行時間型質量分析部５８に送る。次に、飛行時間型質量分析部５８により質量分離し、検出器５７で検出することで、上記MS1データと同様に、マススペクトルデータが得られる。
【００１６】
本実施例では、前駆イオンの解離方法として、衝突誘起解離法について説明したが、解離方法として、低エネルギーの電子を照射し、前駆イオンに多量の低エネルギー電子を捕獲させることにより、前駆イオンを解離させる電子捕獲解離(Electron Capture Dissociation)法を用いても良い。
【００１７】
図２は、タンパク質試料のMS2測定のフロー図である。タンパク質試料は、酵素消化などにより断片化されたペプチド試料となり、クロマトグラフ装置５１によって分離された後、イオン源５２によってイオン化される。その後、質量分析(MS1)を実施し、検出されたイオンの中からMS2分析を行う前駆イオンを選択する。選択された前駆イオンを解離した後、質量分析(MS2)を実施し、スペクトルデータ(MS2)を取得している。
【００１８】
図３は、従来法を用いた前駆イオンの決定方法のフロー図である。質量分析(MS1)により得られたスペクトルデータ(MS1)１に対して制御部５９にてピーク判定処理２を行い、ピーク情報（m/z，強度）を抽出する。得られたピーク情報より、価数計算処理３を行いそれぞれのピークに対して価数を決定する。価数は図４に示すように、隣のピークとの間隔Δm/zを求めることにより決定される。このとき、ピーク間隔がΔm/z＜1.1であり、同一価数のピークが同位体グループとして認識される。次に、同位体ピーク抽出処理５を行い、同位体グループの中から同位体を含まないピーク（モノアイソトピックピーク）を抽出し、前駆イオン選択候補６とする。この前駆イオン選択候補６の中から、信号強度順や過去に選択していないピークを選択するなど予め決められたルールに従い前駆イオンを決定する。
【００１９】
図１は、本発明による前駆イオンの決定方法のフロー図である。従来のフローである図３との違いは、価数計算処理３と同位体ピーク抽出処理５の間にピーク分割処理４を行う点である。このピーク分割処理４を含む図１の処理は、図１５の質量分析装置における制御部５９で実施される。
【００２０】
まず、従来法と同様に質量分析(MS1)により得られたスペクトルデータ(MS1)１に対して制御部５９にてピーク判定処理２と価数計算処理３を行い、それぞれのピークに対してピーク情報（m/z，強度，価数，同位体）を得る。次に、このピーク情報をもとにピークの干渉の有無を判断する。このピーク干渉の有無の判断は、得られたピーク情報を元に予測される同位体パターンを作成し、その同位体パターンとの一致度により行う方法がある。また、ピーク情報を元にモノアイソトピックピークからΔm/z＜1.1のピークが同一価数かどうかを調べることにより、ピーク干渉の有無を判断する方法もある。これらを組み合わせることにより、ピーク干渉の有無を正しく判断することができる。ピークの干渉がない場合は、従来法と同様に同位体ピーク抽出処理を行い、前駆イオンを決定する。ピークの干渉がある場合、干渉ピークの分離処理４-２を行う。この干渉ピークの分離処理４-２は、過去のMS1のピーク情報を用い、干渉しているピークに対して、過去に得られた同一ピークの強度を正規化して減算することで行う。このとき、過去のMS1のピーク情報とは、直前のスペクトルデータ(MS1)のものや、同じようなマススペクトルが時系列的に連続して得られたような場合にはその複数のスペクトルデータ(MS1)を平均化して得られたピーク情報である。その後、干渉ピークの分離処理４-２により得られたピーク情報を再度、価数計算処理４-３し、もとのピーク情報と合わせて同位体ピーク抽出処理５を行う。その後、前駆イオンを決定する。
【００２１】
図５〜７を用いて、従来法と本実施例での処理結果について説明する。図５は、ある時刻t0におけるマススペクトルである。このとき、同位体ピークのピーク間隔Δ１〜Δ４はすべて0.25であり、価数計算処理３により４価のピークとして判定される。図６はt0の直後の時刻t1に得られたマススペクトルである。ピーク１６，１７，１８，２０は図５のピーク１１〜１４と同じであるが、その間にピーク１９，２１，２２が新しく観測されている。
【００２２】
図６のマススペクトルを従来法で処理した場合、本来はピーク１８とピーク２０のピーク間隔を用いて価数を求める必要があるが、ピーク１８とピーク１９のピーク間隔Δ７で価数を求めてしまい、価数が９価となってしまう。
【００２３】
次に、図６のマススペクトルを本発明で処理した場合、従来法と同様に価数を求め、ピーク干渉の有無を調べる。図６ではピーク１６からΔm/z＜1.1のピークの価数を調べ、ピーク１８，１９，２０の価数がピーク１６と異なるため、ピークが干渉していると判断する。その後、干渉ピークの影響を除くため、干渉ピークの分離処理４-２を行う。このとき干渉ピークの分離処理４-２に、図５に示したt0におけるマススペクトルを用いる。t0とt1のマススペクトルでは取得した時間が異なるため、それぞれのピークの強度は異なっている。そのため、単純にt1のピーク情報からt0のピーク情報を減算することはできない。そこで、t0のピーク１１を基準として同位体ピークの強度比を求め、その強度比からt1のピーク１６の強度を基準とした同位体ピークの強度を算出する。この補正したピーク１６の強度をt1の強度から減算することでt0から観測されていたピーク１１〜１５を分離することができる。ここで、残されたピークは図７に示すピーク２３，２４，２５となる。これを価数計算処理４-３することで、ピーク２３，２４，２５は３価のピークと判定される。すなわち、ピーク１９、２１，２２が３価のピークであることが分かる。また、ピーク１６，１７，１８，２０はt0とt1で同じm/zであるためt0のピーク情報をそのまま用いればよい。もしくは、t1から図７のピーク情報を減算したものを価数計算することでより正確な価数が求められる。
【００２４】
また、図８〜１０に図５〜７とは異なったピーク干渉の場合の処理結果を示す。図８はある時刻t2におけるマススペクトルである。このとき、同位体ピークのピーク間隔Δ１２〜Δ１６はすべて0.25であり、価数計算処理３により４価のピークとして判定される。図９はt2の直後の時刻t3に得られたマススペクトルである。図９のピーク３７〜４２は図８のピーク３１〜３６と同じm/zであるが、ピーク４０，４２の強度が高くなっている。これは、ピーク４０，４２，４３の２価のピークが干渉しているからである。
【００２５】
図９のマススペクトルを従来法で処理した場合、ピーク３７〜４２を４価の同位体グループとして認識してしまう。
【００２６】
一方、本発明で処理した場合には、図９のマススペクトルについてピーク干渉の有無を判断する。まず、先ほどの図５〜７の例と同様にピーク３７からΔm/z＜1.1の価数を調べる。図９ではピーク３７〜４１まで同じ価数であるためピーク干渉と判断されない。次に、ピーク３７を基準とした同位体パターンを作成し、そのパターンとの一致度を求めると、ピーク４０の一致度が悪いことが分かる。この結果より、ピーク干渉があると判断し、図８に示したt2のマススペクトルのピーク情報を用いて、図１０のように干渉ピークを分離することで、ピーク４０，４２，４３を２価と判定できる。
【００２７】
図１１は、本発明を用いて求めた価数をマススペクトル画面に表示した例である。モノアイソトピックピークには２価，４価のように価数を表示し、同位体ピークには２価+，４価+のように”+”を付加して表示し、干渉しているピークには２価*，４価*のように”*”を付加して表示している。このように表示することで、ユーザが動作中に価数計算処理の結果を認識することができる。この付加する記号は”+”、”*”に限るものではなく、モノアイソトピックピーク、同位体ピーク、干渉ピークを明確に分けられるものであれば良い。また、本実施例で求められた価数などの情報を制御部５９やデータ処理部６１に記録することで、測定データの解析時に再処理することなく価数情報を用いることができる。図１２に記録する情報の例を示す。各マススペクトル毎にピークのm/z、価数(z)、信号強度、同位体情報、干渉情報を記録している。
【００２８】
図１３は干渉ピークの選択の有無を設定する画面の表示例である。干渉しているピークを前駆イオンとして選択・解離した質量分析(MS2)のマススペクトルには、２種類のイオンの解離ピークが存在することになり、データベース検索やデータ解析の際に間違ってしまう可能性が高くなる。そのため、設定画面を表示することでユーザの判断により選択の有無を決めることができる。図１４に前駆イオン選択候補の例を示す。干渉ピークを選択する場合、干渉ピークを含めた候補から前駆イオンを信号強度順や価数などの予め決められたルールに基づいて選択する。例えば３価の最大信号強度のピークを選択する場合、m/z=507.2707のピークが選択される。一方、干渉ピークを選択しない場合は、干渉ピークを除いた候補からピークを選択する。先ほどと同様に３価の最大信号強度のピークを選択する場合、m/z=521.2895のピークが選択される。
【００２９】
図１６は、本発明が適用される質量分析装置の他の構成例を示す図である。図１５に示した装置との違いは、イオンの選択・解離手段としてイオントラップ５４の代わりにリニアトラップ７１を採用している点である。イオントラップ５４と比較して、リニアトラップ７１は同等の機能を有するが、一度に電極空間に保持できるイオン量を増加させることができるため、高感度分析を行うことが可能である。そして、図１６に示した装置を用いても、図１５に示した装置を用いた場合と同様な効果を得ることができる。
【００３０】
図１７は、本発明が適用される質量分析装置の更に他の構成例を示す図である。図１５に示した装置との違いは、イオンの選択・解離手段及び質量分析部にイオントラップ５４のみを採用している点である。前述の通り、イオントラップ５４はリング電極と一対のエンドキャップ電極から構成されている。リング電極に高周波電圧を印加することで、リング電極と一対のエンドキャップ電極に囲まれた空間に、三次元四重極電界を形成する。イオン源５２でイオン化された試料は、イオン輸送部５３を介して、前記空間内に導かれ、形成された三次元四重極電界に一度保持される。その後、マススペクトルデータを取得する場合には、リング電極に印加された高周波電圧を走査することで、低い質量数のイオンから順に、検出器５７に対して放出され検出される。また、図１５に示した装置のイオントラップ５４と同様に、イオンの選択・解離を実施し、質量分析(MS2)を実施することもできる。飛行時間型質量分析計に比較して、イオントラップ５４は質量分析範囲、質量分解能や質量数精度が低いが、装置が小型化できる。そして、図１７に示した装置を用いても、図１５に示した装置を用いた場合と同様な効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本発明による前駆イオンの決定フローを示す図。
【図２】タンパク質試料のMS2測定のフローを示す図。
【図３】従来法の前駆イオンの決定フローを示す図。
【図４】価数計算処理を示す図。
【図５】時刻t0におけるマススペクトルを示す図。
【図６】時刻t1におけるマススペクトルを示す図。
【図７】図６のマススペクトルに対してピーク分割処理中のマススペクトルを示す図。
【図８】時刻t2におけるマススペクトルを示す図。
【図９】時刻t3におけるマススペクトルを示す図。
【図１０】図９のマススペクトルに対してピーク分割処理中のマススペクトルを示す図。
【図１１】処理結果の価数をマススペクトル画面に表示した例を示す図。
【図１２】処理結果の価数を記録する形式の例を示す図。
【図１３】干渉ピークの選択の有無を設定する画面の表示例を示す図。
【図１４】前駆イオン選択候補の例を示す図。
【図１５】本発明が適用される質量分析装置の構成例を示す図。
【図１６】本発明が適用される質量分析装置の構成例を示す図。
【図１７】本発明が適用される質量分析装置の構成例を示す図。
【符号の説明】
【００３２】
１…スペクトルデータ(MS1)、２…ピーク判定処理、３…価数計算処理、４…ピーク分割処理、５…同位体ピーク抽出処理、６…前駆イオン選択候補、７…前駆イオンの決定処理、１１，１２，１３，１４，１５…時刻t0におけるピーク、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２…時刻t1におけるピーク、２３，２４，２５…ピーク分割処理中のピーク、３１，３２，３３，３４，３５，３６…時刻t2におけるピーク、３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３…時刻t3におけるピーク、４４，４５，４６…ピーク分割処理中のピーク、５１…クロマトグラフ装置、５２…イオン源、５３…イオン輸送路、５４…イオントラップ、５５…イオン加速部、５６…リフレクトロン、５７…検出器、５８…飛行時間型質量分析部、５９…制御部、６０…表示部、６１…データ処理部、６２…入力部、７１…リニアトラップ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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