(57)【要約】【課題】  インテインを利用した効率的な蛋白質の製造方法を提供する。【解決手段】  下記の工程ａ）〜ｄ）を含む、２種以上の融合タンパク質から組み換えタンパク質を製造する方法；ａ）特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドのアミノ酸配列と、製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列と、インテインのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、ｂ）製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列と、前記ａ）のペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、ｃ）工程ａ）ｂ)で提供される融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及びｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質を回収する工程。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程ａ）〜ｄ）を含む、２種以上の融合タンパク質から組み換えタンパク質を製造する方法；
ａ）特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドのアミノ酸配列と、製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列と、インテインのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｂ）製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列と、前記ａ）のペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｃ）工程ａ）ｂ）で提供される融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及び
ｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質を回収する工程。
【請求項２】
下記の工程ａ）〜ｄ）を含む、２種以上の融合タンパク質から組み換えタンパク質を製造する方法；
ａ）特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列と、製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列と、インテインのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｂ）製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列と、前記ａ）のペプチドリガンドのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｃ）工程ａ）ｂ）で提供される融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及び
ｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質を回収する工程。
【請求項３】
ａ）及び／又はｂ）の工程で提供される融合タンパク質が、該融合タンパク質の水溶性を高める機能を有するアミノ酸配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
ａ）及び／又はｂ）の工程で提供される融合タンパク質が、特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼによって認識される当該アミノ酸配列をさらに有する、請求項１〜３の何れかに記載の製造方法
【請求項５】
特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼによって認識される当該アミノ酸配列が、ｂ）の工程で提供される融合タンパク質における製造されるタンパク質の他方の一部のアミノ酸配列のＮ末端側に隣接している、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼがシステイン残基のＮ末端側でペプチド結合を切断するプロテアーゼである、請求項４又は５に記載の製造方法。    
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種以上の融合タンパク質間でのペプチド鎖の組み換えを行ってタンパク質を製造する方法に関し、より詳細には、インテインを利用して２種以上の融合タンパク質間でのペプチド鎖の組み換えを行うにあたり、融合タンパク質間に特異的相互作用を発生させることでペプチド鎖の組み換え効率を向上させたタンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等生物などの真核生物の細胞において、mRNAの遺伝情報がイントロンとエクソンからなり、イントロンの除去とエクソンの再結合が行われる（スプライシング）ことは古くから知られている。このスプライシングはmRNAという核酸レベルの現象であるが、ｍRNAから翻訳されたタンパク質レベルでも、スプライシングに似た反応が見いだされている。この反応は、一つのアミノ酸配列からなるタンパク質が翻訳された後、当該タンパク質の途中に存在する特定のアミノ酸配列部分が当該タンパク質から除去され、その除去部分の前後のアミノ酸配列が連結され、新たなタンパク質が形成される、という反応である。この反応はタンパク質スプライシングと呼ばれ、またタンパク質スプライシングで除去されるアミノ酸配列部分はインテイン、連結されるアミノ酸配列部分はエクステインとそれぞれ呼ばれている。その後の研究で、タンパク質スプライシングは、インテインが自己反応的に自身をタンパク質から切断すると共に、エクステイン間のペプチド結合を形成する反応を触媒することが分かり、この反応を利用した新たな蛋白質の製造方法が開発されている。
【０００３】
インテインによる反応を利用した蛋白質の製造方法は、Native Chemical Ligation（NCL）と呼ばれる方法（特許文献１、特許文献２）と、スプリットインテインと呼ばれる方法（非特許文献１）とに大別される。NCLの反応メカニズムを図１に、スプリットインテインの反応メカニズムを図２に、それぞれ模式的に示す。
【０００４】
NCLは、任意のアミノ酸配列のＣ末端側にインテインのアミノ酸配列を連結した融合タンパク質を用意し、インテイン反応によってＣ末端がチオエステル化されたペプチド断片を得、このペプチド断片とＮ末端残基がCysであるペプチド断片とを反応させることにより、ペプチド断片同士を連結させる方法である。もう一つのスプリットインテイン法は、インテインを人為的に２つに分割し、連結されるペプチド断片と分割した一方のインテイン断片とからなる融合タンパク質を２種類用意し、これらを混合することで、２つの融合タンパク質に分割されたインテインを再会合させ、融合タンパク質間でペプチド鎖の組み換えを行わせて、タンパク質を製造する方法である。
【０００５】
しかし、NCLもスプリットインテインも、それぞれに解決すべき問題点が指摘されている。NCL法では、融合タンパク質を可溶性タンパク質として大腸菌等の宿主細胞を用いて発現させることが可能であるが、融合ペプチド間のペプチド鎖の組み換え反応効率が低く、十分な反応効率を得る、すなわち有効量のタンパク質を製造するためには、反応させる融合タンパク質を反応系に高濃度（数ｍM程度）で存在させる必要がある。そのため、溶解性が低く高濃度に存在させることが難しい融合タンパク質を用いた反応では、反応効率が著しく低く、事実上その様な反応を行うことができないという問題を有する。
【０００６】
後者のスプリットインテインは、連結反応の効率はNCLよりも高いが、本来は一つのアミノ酸配列として存在するインテインを２つの融合タンパク質に分割するために、組み換え細胞内で分割されたインテインを含む融合タンパク質が変性ペプチド鎖として発現されることになる。そのため、融合タンパク質は宿主細胞で不溶化し、不溶性顆粒（inclusion body）を形成してしまい、不溶性顆粒を変性剤溶液中で可溶化する作業、さらに２つの融合タンパク質間で反応させた後に、所望のタンパク質を再生（refolding）させる作業が必要となる（非特許文献２）。以上のように、NCL、スプリットインテイン何れの方法にも、反応効率又は操作性の改善が求められている。
【０００７】
一方、本発明者等は、基質タンパク質を、酵素タンパク質を用いて修飾する方法において、基質タンパク質と酵素タンパク質との親和性を高めることのできる蛋白質結合ドメインが付加されたキメラタンパク質を用いる前記修飾方法ないし修飾タンパク質の製造方法を開発し、特許出願を行った（国際特許出願PCT／JP2006／324761号）。この方法は、ペプチドリガンドと当該ペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチド間の親和性を利用して、キメラ蛋白質間の反応効率を向上させる技術である。
【０００８】
【非特許文献１】Muirら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、1998年、第95巻、第6705-6710頁
【非特許文献２】Otomoら、Biochemistry、1999年、第38巻、第16040-16044頁
【特許文献１】特表２００２−５２６３８７号公報
【特許文献２】特表２００３−５２５５８４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、NCLの欠点である低い反応効率を解消した、新規な蛋白質の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明では、特定のペプチドリガンドと該リガンドに対して特異的に結合するポリペプチドの組合せを融合タンパク質に配置することで、融合タンパク質間の親和性が高まり、NCLの反応効率を向上させることができることを見いだし、下記の発明を完成した。
【００１１】
（１）下記の工程ａ）〜ｄ）を含む、２種以上の融合タンパク質から組み換えタンパク質を製造する方法；
ａ）特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドのアミノ酸配列と、製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列と、インテインのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｂ）製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列と、前記ａ）のペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｃ）工程ａ）ｂ)で提供される融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及び
ｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質を回収する工程。
【００１２】
（２）下記の工程ａ）〜ｄ）を含む、２種以上の融合タンパク質から組み換えタンパク質を製造する方法；
ａ）特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列と、製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列と、インテインのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｂ）製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列と、前記ａ）のペプチドリガンドのアミノ酸配列とを、Ｎ末端側から前記の順序で有する融合タンパク質を提供する工程、
ｃ）工程ａ）ｂ）で提供される融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及び
ｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質を回収する工程。
【００１３】
（３）ａ）及び／又はｂ）の工程で提供される融合タンパク質が、該融合タンパク質の水溶性を高める機能を有するアミノ酸配列をさらに含む、（１）又は（２）に記載の製造方法。
【００１４】
（４）ａ）及び／又はｂ）の工程で提供される融合タンパク質が、特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼによって認識される当該アミノ酸配列をさらに有する、（１）〜（３）の何れかに記載の製造方法。
【００１５】
（５）特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼによって認識される当該アミノ酸配列が、ｂ）の工程で提供される融合タンパク質における製造されるタンパク質の他方の一部のアミノ酸配列のＮ末端側に隣接している、（４）に記載の製造方法。
【００１６】
（６）特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼがシステイン残基のＮ末端側でペプチド結合を切断するプロテアーゼである、（４）又は（５）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、スプリットインテインで見られるような融合タンパク質の不溶化を回避し、かつNCLの欠点である反応効率の低さを解消し、インテインを利用したタンパク質の製造を簡便かつ高効率に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の理解を容易にするため、本発明で使用する融合タンパク質を構成するアミノ酸配列を、下記の通りに記号化して説明する。
Xn  ：製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列
Xc  ：製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列
PR  ：特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンドのアミノ酸配列
PBP ：前記ＰＲに対して特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列
Int  ：インテインのアミノ酸配列
SD  ：融合タンパク質の可溶性を高める機能を有するアミノ酸配列
CS  ：特定のアミノ酸配列を切断するプロテアーゼによって認識されるアミノ酸配列
CSC ：システイン残基のＮ末端側でペプチド結合を切断するプロテアーゼが認識するアミノ酸配列
【００１９】
＜上記各記号の説明＞
１）Xn、Xc
本発明の製造方法により製造されるタンパク質の種類には、特に制限はない。ただし、本発明の方法では、製造されるタンパク質は活性型タンパク質として組み換え細胞内で製造されるのではなく、当該タンパク質の部分アミノ酸配列を含む２以上の融合タンパク質が組み換え細胞内で発現されることから、本発明の製造方法は、活性型となることで宿主細胞に負の影響を与えることが想定されるタンパク質、例えば宿主細胞が細菌である場合の当該細菌に対する抗菌性タンパク質、宿主細胞の核酸を分解するおそれのある核酸分解酵素、宿主細胞のタンパク質を分解するおそれのあるタンパク質分解酵素、宿主細胞のシグナル伝達等に関与して宿主の生存、代謝調節に関与するタンパク質等の製造に適している。また本発明の製造方法は、宿主細胞の生理的条件下では不溶性顆粒（Inclusion body）を形成してしまうタンパク質を、当該タンパク質の可溶性顆粒の形成を経ずに製造することができる点で特に有利である。
【００２０】
Xnは、上述したような製造されるタンパク質のＮ末端側の部分アミノ酸配列であり、Xcは製造されるタンパク質のＣ末端側の部分アミノ酸配列である。後に説明する様に、XcのＮ末端はCys残基である必要がある。従って、XnとXcとの分岐点は、製造されるタンパク質のアミノ酸配列に元々存在しているシステイン残基を任意に選択し、そのCys残基のＮ末端側に設定すればよい。この場合、XnとXcのアミノ酸残基の個数や、各部分アミノ酸配列全体の疎水度、当該Cys残基の周囲のタンパク質の二次構造の有無その他の蛋白化学的な情報を考慮しながら、Cys残基の選択を行うことが好ましい。また、Cys残基がＮ末端部分又はＣ末端部分に偏在している等の理由から、あるいはまれに製造されるタンパク質がCys残基を含んでいない場合には、前記のような蛋白化学的な情報を考慮しながら、適当な位置にCysを付加するか、あるいは適当な部位にあるアミノ酸残基、好ましくはSer、Met、AlaなどをCysに置換させてもよい。
【００２１】
２）ＰＲとＰＢＰ
本発明の製造方法で利用されるPRとPBPは、特定のアミノ酸配列からなるペプチドリガンド（PR）と、これに特異的に結合するポリペプチド（PBP）である。本発明に言う「特異的に結合する」とは、ペプチドリガンド−ポリペプチド間の特異的な相互作用を発揮させる程度の結合（解離）定数をもって、ペプチドリガンドにポリペプチドが結合する性質をいう。この特異的な相互作用は、ペプチドリガンドとポリペプチドとの結合を核磁気共鳴（NMR）スペクトル、蛍光スペクトル、紫外吸収スペクトル、蛍光偏光法、表面プラズモン共鳴、プルダウンアッセイやELISAなど、またFRETを用いる方法等で測定することで調べることができる。
【００２２】
本発明で選択可能なペプチドリガンドのアミノ酸配列は、それ自体天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列であってもよく、またその様なタンパク質にペプチドリガンドとしての機能を与えているペプチドドメインのアミノ酸配列あるいはモチーフ配列と称される特定のアミノ酸配列であってもよい。一方、ペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドのアミノ酸配列は、それ自体天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列であってもよく、またその様なタンパク質にペプチドリガンドへの特異的な結合能を与えるペプチドドメインのアミノ酸配列であってもよい。よって、ペプチドリガンドとポリペプチドの組合せとしては、タンパク質とタンパク質、ペプチドドメインとタンパク質、モチーフ配列とタンパク質、タンパク質とペプチドドメイン、ペプチドドメインとペプチドドメイン、モチーフ配列とペプチドドメインの各アミノ酸配列があるが、融合タンパク質のサイズを考慮すれば、ペプチドドメインとペプチドドメインの各アミノ酸配列、あるいはモチーフ配列とペプチドドメインのアミノ酸配列の組合せが好ましい。
【００２３】
ペプチドリガンドと当該ペプチドリガンドに特異的に結合するポリペプチドの組合せはこれまでに多数報告されており、本発明ではその様な公知の組合せの何れも利用することができる。例えば、PB1ドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とPC（OPCA）モチーフ又は当該モチーフを含むタンパク質、SH3ドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とSH3ドメイン結合配列又は当該配列を含むタンパク質、PDZドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とPDZドメイン相互作用配列又は当該配列を含むタンパク質、カルモジュリンとMLCKなどのカルモジュリン結合タンパク質を挙げることができる。
【００２４】
本発明において好適な組合せの一つは、SH3ドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とSH3ドメイン結合配列又は当該配列を含むタンパク質である。SH3ドメインとは、50〜70程度のアミノ酸残基より構成され、ほぼ直角で互いに詰め込まれた２つの小さいβシートを有する、SH3ドメイン結合配列に親和性を示す機能性ドメインを意味する。その様なドメインは、Abl、Tec、Btk、Lyn、Frk、Srms、Blk、Hck、Txk、Vav、Crk、CrkL、CrkII、JNK、CSK、CasL、p130Cas、p47phox、p40phox、Pex13、Grb2、RasGAP、RhoGAP、Fyb、Fyn、PLCganmma、Intersectin、Ctk、ArfGAP、PI3K、PSD-95、Yes、Srk、Fgr、Nck、Gads、Zo-1、Zo-2、Zo-3、Spectrin、Drk、Sem-5等のタンパク質に含まれていることが知られている。これらのタンパク質はSH3ドメインを含むタンパク質の例でもある。
【００２５】
SH3ドメイン結合配列は、上記のSH3ドメインがそれぞれ特異的に、あるいは共通して認識し、親和性を示すアミノ酸配列を意味する。SH3ドメイン結合配列はSH3ドメインの配列により異なる場合もあれば、あらゆるSH3ドメインが共通して結合する場合もある。あらゆるSH3ドメインが結合するアミノ酸配列の例としては、PxxP（ただしｘは任意のアミノ酸残基を示す）を含む10残基程度のアミノ酸配列が挙げられる。このアミノ酸配列は、５〜100μMの解離定数でSH3ドメインに結合する。SH3ドメイン結合配列は、さらに限定するとXΦPXΦPX（Ｒ，Ｋ）Ｘ（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Φは疎水性アミノ酸残基、さらに限定するとＩ、Ｌ、Ｖ、Ｐのいずれかを表す。）で表される。例えば、SH3ドメインが親和性を示すSH3ドメイン結合配列は、PXXPXZ、ZXXPXXP、PXXXRXXK（Ｘは任意のアミノ酸を表し、ＺはＫ又はＲを表す。）で表されるアミノ酸配列、又はPX［Ｖ又はＩ］［Ｄ又はＮ］RXXKP（Ｘは任意のアミノ酸を表す）で表される配列である。本発明では、これらの何れかの配列モチーフと該モチーフに対して特異的な親和性を示すSH3ドメインを利用することが好ましい。
【００２６】
本発明において好適な組合せのもう一つは、PB1ドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とPC（OPCA）モチーフ又は当該モチーフを含むタンパク質である。PCモチーフ（OPCAモチーフ）は、食細胞NADPHオキシダーゼ（Phox）の細胞質内因子であるp40phoxや出芽酵母の細胞極性を調節するCdc24pなどの、酵母から高等植物、ヒトに至る様々な細胞内シグナル伝達タンパク質において進化的に保存された、28アミノ酸からなる酸性残基に富んだ配列モチーフである。
【００２７】
PB1ドメインは、Cdc24p の結合タンパク質であるBem1p、p40phoxの結合因子であるp67phoxなどに含まれている、塩基性残基に富んだアミノ酸配列からなるドメインである。PB1ドメイン又は当該ドメインを含むタンパク質とPC（OPCA）モチーフ又は当該モチーフを含むタンパク質の組合せの例としては、p40ｐｈｏｘとp67ｐｈｏｘ、aPKCとPar6、p62 (Zip)とp62 (Zip)、p62 (Zip)とaPKC、Bem1pとCdc24pなどを挙げることができる。従って、本発明では、これらのタンパク質に含まれるPB1ドメインの何れも利用することができ、またこれらのタンパク質を、PB1ドメインを含むタンパク質の例とすることができる。
【００２８】
３）Int（インテイン）
インテインとは、真核動物、古細菌、真正細菌等から見いだされている、ペプチド鎖を自己触媒的に切断、再結合させるプロテインスプライシング活性を有するタンパク質の総称である。インテインは、通常、その両端にエクステインと称されるアミノ酸配列がつながったタンパク質の一部として発現され、自己触媒的作用によって自身のＮ末端及びＣ末端のペプチド結合を切断し、その結果生じるＮ末端側エクステインのＣ末端とＣ末端側のエクステインのＮ末端とをペプチド結合で連結させる反応を触媒する。
【００２９】
本発明の製造法において使用するインテインのアミノ酸配列は、天然に存在するインテインのアミノ酸の一部に改変が加えられ、DTT等の還元試薬依存性のペプチド結合切断活性を有する改変型インテインのアミノ酸配列である。その様な改変型インテインの例としては、Synechocystis sp．PCC6803株のDnaBヘリカーゼ由来のインテイン、Mycobacterium xenopiのジャイレースＡ由来のインテイン、Saccharomyces cerevisiaeの液胞膜ＡＴＰアーゼ由来のインテイン、又はMethanobacterium thermoautotrophicum由来のrリボヌクレオシドジホスフェーリダクターゼ由来のインテイン（Mth RIR1）において、それぞれ特定のアミノ酸が置換等された改変型インテインを挙げることができる。これら改変型インテインをコードする核酸は、インビトロタンパク質合成用試薬として既に市販されているIMPACTＴＭシステム又はIMPACT-TWINＴＭシステム（いずれも米国New England Biolabs（NEB）社）に含まれており、本発明はこれらの核酸を介してインテインを利用することができる。なお、本発明で使用されるインテインの特徴としては、DTT等の還元試薬依存性のペプチド結合切断活性の他は特に制限はなく、野生型インテインが有するペプチド鎖をつなぐライゲーション活性は、本発明において使用されるインテインには保持されていても、或いは失われていてもよい。
【００３０】
４）SD
SDは、当該アミノ酸配列を含むことによって、タンパク質全体の可溶性を高めることのできるアミノ酸配列である。その様なアミノ酸配列は、例えばチオレドキシン（Trx）、マルトース結合性タンパク質（MBP）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）等の様な、それ自体天然に存在する水溶性に富むタンパク質のアミノ酸配列であってよく、またその様なタンパク質由来の親水性ドメインのアミノ酸配列、あるいはセリン、スレオニン、フェニルアラニン、アルギニン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸あるいはヒスチジン等の電荷を有するアミノ酸を多く含む部分アミノ酸配列であってもよい。また、ポリリジンやポリアルギニン、又はポリグルタミン酸などの様な荷電性ポリペプチドのアミノ酸配列であってもよい。
【００３１】
本発明では、後に説明するように、製造されるタンパク質の部分アミノ酸配列を含む融合タンパク質を用意する工程を含むが、この様な部分アミノ酸配列を含む融合タンパク質は、その溶解性が低いと、組み換え細胞内で当該融合タンパク質が不溶性顆粒を形成したり、緩衝液中で不溶性の沈殿を生じたりする場合もあり得る。ＳＤは、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列に追加して含ませることにより、この様な融合タンパク質からなる不溶性顆粒や不溶性の沈殿の発生を防止することができることから、本発明の融合タンパク質に少なくとも一つのSDを加えておくことが好ましい。
【００３２】
５）CS、CSC
本発明におけるCSは、特定のアミノ酸配列を認識して、特定のアミノ酸残基のＮ末端側又はＣ末端側でペプチド結合を切断するプロテアーゼによって認識される、当該アミノ酸配列である。特定のアミノ酸配列を認識して、特定のアミノ酸残基のＮ末端側又はＣ末端側でペプチド結合を切断するプロテアーゼはこれまでに数多く報告されており、また試薬として広く利用されている。その様なプロテアーゼの代表例としては、トリプシン、ケキシン（Kexin）、フューリン（Furin）、エンテロペプチダーゼ、トロンビン、Xa因子、TEVプロテアーゼなどがある。
【００３３】
このうちTEVプロテアーゼは、Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Gly／Ser／Cys（Xは任意のアミノ酸を表す）を認識して、GlnのＣ末端側でペプチド結合を切断する（Vasantら、Nature Methods、2006年、第３巻、第５号、第429-438頁）。従って、このTEVプロテアーゼが認識、切断する前記アミノ酸配列をXcのＮ末端に配置すれば、XcのＮ末端にCys残基を露出させることができるので、CSCとして有用である。
【００３４】
＜融合タンパク質の構成＞
上記の各記号を用いた場合、本発明の工程ａ）で提供される融合タンパク質において最も単純な構成は、次の式で表すことができる。
式１：PR−Xn−Int
【００３５】
ただしこの場合は、PRのＣ末端とXnのＮ末端をつなぐペプチド結合が、最終的に化学的手法又は酵素学的手法によって切断可能であることが必要である。よってPRのＣ末端領域、XnのＮ末端領域またはPRとXnの境界をまたぐアミノ酸配列が化学的手法又は酵素学的手法による切断を可能とするアミノ酸配列でない場合には、PRとXnの間にCSを配置することが好ましい。このときの融合タンパク質のアミノ酸配列の配置は次の式で表される。
式２：PR−CS−Xn−Int
【００３６】
さらに、工程のａ）の融合タンパク質は、SD又は必要に応じてさらに異なるPR、PBP、CSを追加的に含んでいてもよい。その様な融合タンパク質のアミノ酸配列の配置は次のように表すことができる。
式３：（PR、PBP、SD）−CS−Xn−Int
【００３７】
ここで（PR、PBP、SD）は、括弧内の各アミノ酸配列の順序ならびに各配列の数には特に制限がないことを表す。また式３の括弧内には、さらに必要に応じてCSを配置してもよく、またヒスチジンタグその他のタンパク質の精製に有用なアミノ酸配列をさらに配置してもよい。
【００３８】
また、本発明の工程ｂ）で提供される融合タンパク質において最も単純な構成は、次の式で表すことができる。
式４：Xc−PBP
【００３９】
ただしこの場合は、後に説明する反応プロセスから理解されるように、XcのＮ末端アミノ酸残基がCysであることが必要である。Ｎ末端にCysを有するXcを設計できないときは、XcのＮ末端側にCSCを配置させればよい。また、XcのＣ末端とPBPのＮ末端をつなぐペプチド結合は、最終的に化学的手法又は酵素学的手法によって切断可能であることが必要である。よってXcのＣ末端領域、PBPのＮ末端領域またはXcとPBPの境界をまたぐアミノ酸配列が化学的手法又は酵素学的手法による切断を可能とするアミノ酸配列でない場合には、XcとPBPとの間にCSを配置することが好ましい。このときの融合タンパク質のアミノ酸配列の配置は、次の式で表される。
式５：CSC−Xc−CS−PBP
【００４０】
さらに、工程ｂ）の融合タンパク質は、任意の配列であるSD又は必要に応じてさらに異なるPBP、PR、CSを追加的に含んでいてもよい。その様な融合タンパク質のアミノ酸配列の配置は次のように表すことができる。その様な融合タンパク質のアミノ酸配列の配置は次のように表すことができる。
式６：CSC−Xc−CS−（PR、PBP、SD）
【００４１】
ここで式６の（PR、PBP、SD）は、括弧内の各アミノ酸配列の順序ならびに各配列の数には特に制限がないことを表す。また式３の括弧内には、さらに必要に応じてCSを配置してもよく、またヒスチジンタグその他のタンパク質の精製に有用なアミノ酸配列をさらに配置してもよい。
【００４２】
なお、本発明では、PRの代わりにPBPを配置した工程ａ）の融合タンパク質と、PBPの代わりにPRを配置した工程ｂ）の融合タンパク質とを組み合わせて使用することもできる。すなわち、PRとPBPは、互いに特異的な親和性を示す対として利用すればよく、工程ａ）ｂ）で提供される融合タンパク質のどちらに含まれていてもよい。
【００４３】
＜本発明の製造方法における反応プロセス＞
本発明の製造方法の一態様は、前記式１及び式４の最も簡単な構成を有する融合タンパク質を例にすれば、ａ）融合タンパク質PR−Xn−Intを提供する工程、ｂ）融合タンパク質Xc−PBPを提供する工程、ｃ）融合タンパク質PR−Xn−Intと融合タンパク質Xc−PBPとの間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及びｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパク質Xn−Xcを回収する工程、と表すことができる。
【００４４】
上記態様における反応プロセスは、i）融合タンパク質PR−Xn−Int（式１）がそこに含まれるIntと還元剤によってPR−Xn＊（Xn＊はXnのＣ末端にチオエステル基が存在することを表す）に変換される、ii）PR−Xn＊とXc−PBP（式４）がPRとPBPの間の特異的親和力により近接し、Xn＊のチオエステル基とXcのＮ末端のCys残基との反応によってペプチド鎖が形成され、PR−Xn−Xc−PBPが生成する、と説明することができる。上記の反応後、生成された新たなタンパク質を回収し、化学的手法又は酵素学的手法によってPRとPBPを切除すれば、タンパク質Xn−Xcを得ることができる。
【００４５】
また、工程ａ）で提供される融合タンパク質として前記式３の融合タンパク質を、工程ｂ）で提供される融合タンパク質として前記式６をそれぞれ例とすると、上記態様での反応は、i）（PBP、PR、SD）−CS−Xn−Int（式３）がそこに含まれるIntと還元剤によって（PBP、PR、SD）−CS−Xn＊へと変換される、ii）CSC−Xc−CS−（PBP、PR、SD）（式６）がCSCを認識して切断するプロテアーゼの作用によってCys−Xc−CS−（PBP、PR、SD）に変換される、iii）（PBP、PR、SD）−CS−Xn＊とCys−Xc−CS−（PBP、PR、SD）がPBPとPRの間の特異的相互作用により近接し、Xn＊のチオエステル基とCys残基との反応によってペプチド鎖の組み替えが行われ、（PBP、PR、SD）−CS−Xn−Cys−Xc−CS−（PBP、PR、SD）が生成される、と説明することができる。上記の反応後、生成された新たなタンパク質を回収し、CSを認識して切断するプロテアーゼによって（PBP、PR、SD）−CS−と−CS−（PBP、PR、SD）とを切除すれば、タンパク質Xn−Cys−Xcを得ることができる。
【００４６】
本発明のもう一つの態様は、PRの代わりにPBPを配置した工程ａ）の融合タンパク質と、PBPの代わりにPRを配置した工程ｂ）の融合タンパク質とを組み合わせて行うものであり、例えば工程ａ）の融合タンパク質にPRの代わりにPBPを、工程ｂ）の融合タンパク質のPBPの代わりにPRを配置した各融合タンパク質を例とすると、当該もう一つの態様は、ａ）融合タンパク質PBP−Xn−Intを提供する工程、ｂ）融合タンパク質Xc−PRを提供する工程、ｃ）融合タンパク質PBP−Xn−Intと融合タンパク質Xc−PRとの間でペプチド鎖の組み換えを行う工程、及びｄ）ペプチド鎖の組み換えにより製造されたタンパクXn−Xcを回収する工程、と表すことができる。この当該もう一つの態様における反応プロセスは、上記に説明したプロセスと同じである。
【００４７】
＜本発明で使用される融合タンパク質の調製＞
融合タンパク質の調製は、当該融合タンパク質を構成する各アミノ酸配列に従って、そのアミノ酸配列をコードする核酸、特にDNAの塩基配列を設計し、その塩基配列を有するDNAを化学合成し、適当な発現ベクターに当該DNAを組み換えて、大腸菌、古草菌、酵母、昆虫細胞、卵母細胞その他の適当な宿主細胞を形質転換し、宿主細胞内で発現ベクターにコードされる当該融合タンパク質を合成させればよい。あるいは各アミノ酸配列をコードする塩基配列を設計して合成する代わりに、各アミノ酸配列をコードしている既存の各種cDNA、ゲノムDNA、DNAライブラリーあるいは全RNA等の核酸を鋳型として、適当な塩基配列からなるプライマーDNAを用いたPCR反応やRT-PCR反応を行って、所望の塩基配列を有するＤＮＡを増幅させ、これを用いて発現ベクターを構築してもよい。
【００４８】
また、宿主細胞において発現、生成させた融合タンパク質は、酵素処理や超音波処理その他の手段によって宿主細胞を破壊した後、種々の手法を用いて精製することができる。融合タンパク質に、キチン結合ドメインやヒスチジンタグその他のタンパク質の精製に有用な任意のアミノ酸配列を追加した場合には、そのアミノ酸配列を利用して精製を容易に行うことができる。
【００４９】
上記のアミノ酸配列の決定、塩基配列の設計と合成、PCR反応、発現ベクターへの組み換えならびに宿主細胞での発現、並びに融合タンパク質の回収と精製などの遺伝子工学的手法ならびにタンパク質の生成、文責に関する手法は、J.Sambrookら（Molecular  Cloning、a Laboratory Manual、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、New York、1989年）を代表例とする、各種の実験操作マニュアルに記載された方法に従って行うことができる。
【００５０】
＜本発明の製造方法における反応条件＞
本発明の工程ｃ）は、工程ａ）ｂ）で提供された融合タンパク質の間でペプチド鎖の組み換えを行う工程である。具体的には、工程ａ）ｂ）で提供された融合タンパク質を適当な緩衝液に溶解し、還元剤を添加すればよい。また、還元剤の添加に先立って、必要に応じて工程ｂ）で提供される融合タンパク質をCSCから切断して、Ｎ末端にCys残基を遊離させておく。
【００５１】
ペプチド鎖の組み換え反応は、還元剤の添加によって工程ａ）で提供される融合タンパク質に含まれるインテインのペプチド切断活性が発現することにより開始される。インテインによってＣ末端がチオエステル化された融合タンパク質と、Ｎ末端にCys残基を有するもう一方の融合タンパク質との間でペプチド結合が形成され、ペプチド鎖の組み換えが行われる。還元剤の添加からペプチド鎖の組み換えまでは１バッチで行うことができる。
【００５２】
還元剤としては、ジチオスレイトール（DTT）、Sodium 2 - mercaptoethanesulfonate（MESNA）、チオフェノール、エタンチオールなどを利用することができ、特にMESNA、又はチオフェノールの利用が好ましい。反応系における還元剤の使用量は、概ね50μM以上の範囲内とすればよい。
【００５３】
ペプチド鎖の切断反応及びペプチド鎖の組み換えは、還元剤を添加する他は野生型インテインの反応条件にほぼ等しく、ｐＨは３〜10、好ましくは４〜８、特に好ましくは５〜７の範囲に適当な緩衝剤を用いて調節すればよい。また、反応温度は10℃〜55℃、好ましくは室温から40℃の範囲で、反応時間は２〜96時間の範囲で、使用する融合タンパク質の量やインテインの種類等に応じて適宜調節すればよい。
【００５４】
本発明の工程ｄ）は、工程ｃ）によって生成されたタンパク質を回収する工程である。この工程ｄ）は、工程ｃ）の組み換え反応後の反応液に含まれている、新たに形成されたペプチド結合を含むタンパク質を回収する工程であり、タンパク質を回収、生成する種々の方法、例えば遠心分離法、電気泳動法、クロマトグラフィー法、免疫沈降法その他の方法を利用することができる。特に、ペプチド鎖の組み換えによって新たに生成される融合タンパク質に含まれるPR、PBPあるいは任意に付加されたヒスチジンタグやキチン結合配列等を利用したアフィニティークロマトグラフィーを採用することで、生成をより容易に行うことができる。CSを認識するプロテアーゼによる切断、あるいは化学的手法によるペプチド鎖の切断は、それぞれの方法において当業者に知られた反応条件の下で当該切断反応を行えばよい。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の製造方法は、宿主細胞内で直接に発現させることが困難なタンパク質を製造することを可能にする。特に、Xn又はXcのいずれか一方のみに同位体標識を施し、また他方は非標識体として、これらを本発明の方法で連結させることで、区分安定同位体標識体の調製を行うことができる。また、Ｘｎ又はＸｃのいずれかに脂質修飾、リン酸化修飾、糖鎖修飾、蛍光標識その他の化学修飾又は標識化を施してから本発明の方法で連結することで、翻訳後修飾タンパク質の調製も行うことができる。
【００５６】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００５７】
下記の実施例は、前記式３のPR−CS−Xn−Intで表される融合タンパク質と、式６のSD−CSC−Xc−CS−PBPで表される融合タンパク質との間で反応させてXn−Xcを製造する方法に相当する。
【００５８】
下記の実施例において製造されるタンパク質は、ヒト由来のCrkII（図３）である。図３に示すように、CrkIIは1つのSH2ドメイン（配列番号１の５〜120番目）とそれに続く2つのSH3ドメイン（配列番号１の134〜191番目及び238〜293番目）により構成される。この2つのSH3ドメインに挟まれた領域に208G209Sがある。下記の実施例では、この２残基の間を連結部位とし、CrkIIの１〜208番目までのアミノ酸配列をXnとして、CrkIIの209〜293番目までのアミノ酸配列において、209番目のSerをCysに置換したアミノ酸配列をXｃとした。CrkIIのcDNAはMol. Cell. Biol.、第12巻、第3482-3489頁、1992年に記載された方法に従って調製した。
【００５９】
また、下記の実施例におけるPRとPBPの組合せは、p62/ZipのPB1ドメインの変異体であるK7A変異体およびD67A変異体の各アミノ酸配列である。p62/Zipに含まれる天然型PB1ドメインはそれ同士で特異的に多量体を形成する性質を有しているが、そのアミノ酸置換変異体であるK7A変異体とD67A変異体は、いずれも多量体形成能を失う代わりに、K7A変異体とD67A変異体の間で特異的に2量体を形成する性質を有するようになることが知られている（Wilsonら、Mol Cell.、2003年、第12巻、第39-50頁）。p62/ZipのcDNAはPulsらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、1997年、第94巻、第6191-6196頁）により調製した。
【００６０】
下記の実施例におけるインテインは、IMPACTＴＭシステム（NEB社）に含まれているMth RIR1である。このインテイン配列にはキチン結合ドメインが既に導入されているので、キチンを固相化した適当なビーズを用いて、このインテイン配列を含む融合タンパク質の精製が可能である。
【００６１】
その他、下記の実施例における融合タンパク質には、SDとしてチオレドキシンタンパク質（Trx）のアミノ酸配列が、CSとしてプレシジョンプロテアーゼのアミノ酸配列が、CSCとしてTEVプロテアーゼ認識アミノ酸配列が、それぞれ含まれている。
【００６２】
１）融合タンパク質の調製
ａ）Zip(K7A)-Crk23-Mth RIR1（配列番号２、配列番号１８）の提供
CrkIIのcDNA、dNTP 200μM、塩化マグネシウム1 mM、下記のプライマーそれぞれ300nM、KOD-Plus-polymerase １ユニット及び同酵素に添付されたバッファーを含む反応溶液100μlでPCR反応を行った。
プライマー GCGCCATGGCGGGCAACTTCGACTCGG：配列番号３
プライマー GGCTCGAGTCAGCTGAAGTCCTCTTCGGGATTCTG ：配列番号４
【００６３】
得られたDNA断片をNcoI 及びXhoIを用いて切断し、PCR purification kit（Quiagen社）を用いて精製した。
【００６４】
pProEXCrkII Htb（Quiagen社）をNcoI及びXhoIで切断処理して得たpProEX Htbのベクター断片に含まれるTevプロテアーゼ切断サイトを、Quick Change（Quiagene社）を用いてプレシジョンプロテアーゼ切断サイトに変異させpProEX Htb-Presを作成した。このベクターpProEX Htb-Presを再度NcoI及びXhoIで切断処理して得たpProEX Htb-Presのベクター断片と、上記で得たCrkII遺伝子を含むPCR断片とをTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、図４に示すプラスミド（pProEX-Pres-CrkII）を回収した。    
【００６５】
次に、pProEX-Pres-CrkIIを鋳型として以下のプライマーを用いてPCR反応を行い、得られた増幅断片をSacI及びSapIで切断した。
プライマー  CCGAGCTCATGTCGTACTACCATCACC：配列番号５
プライマー  GCTCTAGAGCTCTTCCGCAACCCTCCTGGTTAC：配列番号６
【００６６】
p62/ZipのcDNAを鋳型として、以下の2種類のプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片をSacI及びNdeIで切断した。
プライマー GGTCTAGACATATGGCTTCGCTCACGGT：配列番号７
プライマー GGTCTAGAGAGCTCCTCCTTCTTCTCTTTAATGTAGATGC：配列番号８
【００６７】
さらに、pTWIN2 （NEB社）を鋳型として、以下の2種類のプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片をSapIおよびNotIで切断した。
プライマー GCTCTAGAGCTCTTCCTGCGTATGCGGTGACACCATTGTAATGAC：配列番号９
プライマー CCTCTAGAGCGGCCGCTCATTGAAGCTGCCACAAG：配列番号１０
【００６８】
上記の3種類の増幅断片を、Takara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、さらにこれを鋳型として、配列番号７のプライマーと配列番号１０のプライマーを用いてPCRを行った。
【００６９】
PCR反応終了後、Gel Extraction kit（Quiagen社）を用いて増幅断片を精製し、NdeIおよびNotIで切断し、あらかじめNdeIおよびNotIで切断しておいたpET22b (Novagen社)のベクター断片とTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、図５に示すプラスミドpET22-ZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1を得た。
【００７０】
プラスミドpET22-ZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1で形質転換した大腸菌BL-21(DE3)を、100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地20 mlに植え、37℃で一晩培養した。この培養液を100μg/mlのアンピシリンを含んだ2xYT培地1000mLに植え継ぎし、600nmの濁度が0.4〜1.0の間で終濃度0.5 mMイソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシドを添加し、さらに25℃で一晩培養した。培養液を3600×g、4℃で15分遠心分離し、菌体を回収した。菌体をキチンビーズ緩衝液（20mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.5M NaCl pH8.5）に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを11900×g、4℃で60分遠心分離し、可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をキチンビーズ緩衝液で緩衝化したキチンビーズに吸着させた。カラムボリュームの20倍量の20mM トリス-塩酸緩衝液／1mM エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム / 0.5M NaCl水溶液（pH8.5）を流し、融合タンパク質ZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1が吸着したキチンビーズを得た。この融合タンパク質のK7AとCrk23の間には、ベクター由来のヒスチジンタグ及びプレシジョンプロテアーゼ切断部位が含まれている。
【００７１】
ｂ）融合タンパク質Trx-CrkCSH3- ZipPB1(D67A)（配列番号１１、配列番号１９）の調製
pET32b（Novagen社）を鋳型として以下のプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片をNdeI及びNcoIで切断した。
プライマー GCTCTAGACATATGAGCGATAAAATTATTC：配列番号１２
プライマー CGCCCATGGGGCCAGAACCAGAACCGG：配列番号１３
【００７２】
p62/ZipのcDNAを鋳型として以下の2種類のプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片をKpnI及びXhoIで切断した。
プライマー CCTCTAGAGGTACCAGCATGGCTTCGCTCACGGTG：配列番号１４
プライマー GGTCTAGACTCGAGCTCCTTCTTCTCTTTAATGTAGATGC：配列番号１５
【００７３】
pProEX-Pres-CrkIIを鋳型として以下の2種類のプライマーを用いてPCRを行い、得られた増幅断片をNcoIおよびKpnIで切断した。
プライマー GAGCCATGGAAAACCTGTATTTTCAGTGCCACCCACAGCCACTGG
：配列番号１６
プライマー CGCGGTACCGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGGCTGAAGTCCTC
：配列番号１７
【００７４】
上記の３種類の増幅断片をTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、これを鋳型として配列番号１４のプライマーと配列番号１７のプライマーを用いてPCRを行った。
【００７５】
次に、Gel Extraction kit（Quiagen社）を用いて目的の増幅断片を精製し、NdeIおよびXhoIで切断し、あらかじめNdeIおよびXhoIで切断しておいたpET22b（Novagen社）のベクター断片とTakara DNA Ligation kit（タカラ社）を用いて連結し、このベクターを用いて大腸菌DH5αを形質転換し、図６に示すプラスミド（pET22-Trx-CrkCSH3- Zip(D67A)）を得た。
【００７６】
プラスミドpET22-Trx-CrkCSH3- Zip(D67A)で形質転換した大腸菌BL-21(DE3)を100μg/mlのアンピシリンを含むLB培地20 mlに植え37℃で一晩培養した。この培養液を100μg/mlのアンピシリンを含んだ2xYT培地1000mLに植え継ぎし、600nmの濁度が0.4〜1.0の間で終濃度0.5 mMイソプロピル-β-D(−)-チオガラクトピラノシドを添加し、さらに25℃で一晩培養した。培養液を3600×g、4℃で15分遠心分離し、菌体を回収した。菌体をPBS緩衝液（NaCl ８ｇ、KCl 0.2ｇ、Na２HPO４・12H２O 14.5ｇ、KH２PO４ １gを合計１Ｌの蒸留水中に溶解させたもの）に縣濁し、氷中で超音波破砕した。これを11900×g、４℃で60分遠心分離し、可溶性画分と不溶性画分に分離し、可溶性画分をNi-NTAアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、キチンビーズ緩衝液で透析を行い、融合タンパク質Trx-CrkCSH3- ZipPB1(D67A)を得た。この融合タンパク質は、SDとしてTrxを、TrxとCrkCSH3の間及びCrkCSH3とZipPB1(D67A)の間に、ベクター由来のTEVプロテアーゼ切断部位及びプレシジョンプロテアーゼ切断部位がそれぞれ含まれている。
【００７７】
（２）連結反応及びタンパク質の分離
Trx-CrkCSH3- Zip(D67A)を、TEVプロテアーゼ（Invitrogen社）の推奨反応条件下で切断して、N末端にCysが露出した融合タンパク質CrkCSH3-Zip(D67A)を調製した。これを（１）のａ）で調製したZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1が結合したキチンビーズに加え、さらに10mM DTT、100mM MESNAを加え、室温で4日間軽く振盪させた。また、コントロールとして、TEVプロテアーゼ及びプレシジョンプロテアーゼを用い、それぞれの推奨反応条件下でTrx-CrkCSH3- Zip(D67A)を切断して、N末端にCysが露出した融合タンパク質CrkCSH3を用意し、これを（１）のａ）で調製したZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1が結合したキチンビーズに加え、さらに10mM DTT、100mM MESNAを加え、室温で4日間軽く振盪させた。反応終了後、キチンビーズを沈殿させ、上清を15% ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ＣＢＢ染色した（図７）。
【００７８】
その結果、Cysが露出した融合タンパク質CrkCSH3-Zip(D67A)とZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1との反応では想定される連結反応物（ZipPB1 (K7A)-CrkII-Zip(D67A)）の位置に明瞭なタンパク質のバンドが確認されるのに対し、コントロールでは当該位置あるいはCrkIIの位置にはタンパク質のバンドは確認されなかった。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】NCL（Native Chemical Ligation）の反応メカニズムを示す。
【図２】スプリットインテインの反応メカニズムを示す。
【図３】CrkIIのドメイン構造を表す。
【図４】プラスミドpProEX-pres-CrkIIの構築スキームを示す。
【図５】プラスミドpET22-ZipPB1 (K7A)-Crk23-MiR1の構築スキームを示す。
【図６】プラスミドpET22-Trx-CrkCSH3-ZipPB1 (D67A)の構築スキームを示す。
【図７】ペプチド鎖の組み換えにより生じたタンパク質のSDS-PAGE電気泳動に結果を示す。左から、レーン１はCrkIIタンパク質とプレシジョンプロテアーゼのバンド（位置コントロール）、レーン２はCrkIIタンパク質、レーン３は融合タンパク質CrkCSH3-Zip(D67A)とZipPB1 (K7A)-Crk23-MIR1との反応による組み換え産物、レーン４は反応コントロールを、それぞれ示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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