(57)【要約】【課題】  毛包形成、発毛、脱毛に関わる因子を提供するとともに、これらの因子を含む新規な発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓタンパク質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を介する情報伝達を調節することにより、細胞分化、発生、増殖を制御する物質であり、この細胞分化、発生、増殖を制御する物質を有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤である。さらに、本発明はこのような細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは細胞分化・発生・増殖調節剤を含む発毛剤、育毛剤、養毛剤ないしは脱毛剤を提供するものである。また、上記の細胞分化、発生、増殖を制御する物質としては、Ｗｎｔ５ａなどがあげられる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓを介する情報伝達を調節することにより、細胞分化、発生、増殖を制御する物質。
【請求項２】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓを介する情報伝達を調節することにより、細胞分化、発生、増殖を制御する物質を有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤。
【請求項３】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａを有効成分とする請求項２記載の細胞分化・発生・増殖調節剤。
【請求項４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進または抑制する物質が間接的に細胞の分化、発生、増殖を制御する請求項２記載の細胞分化・発生・増殖調節剤。
【請求項５】
請求項１記載の細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞分化・発生・増殖調節剤を含む発毛剤。
【請求項６】
請求項１記載の細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞分化・発生・増殖調節剤を含む育毛剤。
【請求項７】
請求項１記載の細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞分化・発生・増殖調節剤を含む養毛剤。
【請求項８】
請求項１記載の細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞分化・発生・増殖調節剤を含む脱毛剤。
【請求項９】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓを介する情報伝達を調節することにより細胞分化、発生、増殖を制御する、発毛方法、育毛方法、養毛方法、脱毛方法。
【請求項１０】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を調節することによる、発毛方法、育毛方法、養毛方法、脱毛方法。
【請求項１１】
細胞が毛乳頭細胞である、請求項２〜請求項４のいずれかに記載の細胞分化・発生・増殖調節剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓタンパク質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を介する情報伝達を調節することにより、細胞分化、発生、増殖を制御する物質に関するものであり、この細胞分化、発生、増殖を制御する物質を有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤に関するものである。また、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａを有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤に関するものであり、さらに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進または抑制する物質が間接的に細胞の分化、発生、増殖を制御する細胞分化・発生・増殖調節剤、特にこの細胞分化・発生・増殖調節剤は、特に毛乳頭細胞の分化、発生、増殖の制御に関するものである。
【０００２】
また、本発明は、Ｗｎｔ５ａを有効成分とする毛包細胞賦活剤に関し、さらに詳しくはＷｎｔ５ａはＦｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであって、Ｗｎｔ５ａがＦｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓタンパク質を介して細胞内に情報を伝達することにより毛包細胞が賦活される毛包細胞賦活剤、およびこれらの毛包細胞賦活剤を含有した発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
従来、うす毛や脱毛を改善する育毛剤の需要は高く、種々多用な養毛剤が上市されている。かかる育毛剤には、植物抽出物や、ビタミンＥおよびその誘導体、ニコチン酸ベンジル等の血行促進剤、トウガラシチンキ、カンタリスチンキ、カンフル、ノニル酸ワニリルアミド等の局所刺激剤、胎盤抽出物、感光素３０１、パントテン酸等の角質溶解剤、ヒノキチオール、塩化ベンザルコニウム、感光素２０１等の殺菌剤、グリチルレチン酸およびその誘導体、メントール等の消炎剤などが配合されており、さらに、男性型脱毛症の改善を目的には、テストステロン５α−リダクターゼの活性を阻害する種々の植物抽出物が用いられている。これらの育毛剤は、いずれも毛母細胞の機能低下、血流の低下、男性ホルモンに対する感受性の増大、皮脂腺機能の活性化、ストレスの増大などに対して、これらを抑制することにより育毛効果を発現するというものである。
【０００４】
また、最近では毛乳頭細胞を活性化したり、毛周期における休止期から成長期への移行を促進したり、成長期から退行期への移行を抑制するような毛周期調整効果を奏するような作用機序を有する養毛剤も提供されている。このような作用を奏するものとしては、例えば、タウリン（特開２００２−９７１１６号公報）、没食子酸誘導体（特開２００３−３２１３３０号公報）、ポリエチレンイミン系水溶性高分子（特開２００２−３７０９８７号公報）などが知られ、さらに毛包細胞に作用する因子やこれらの因子を産生促進する物質として、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）様の活性を有する物質であるマメ科カッシア族などの植物の抽出物（特開２０００−１５４１１８号公報）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生を促進する、オランダガラシ、シイタケやプルーン等の植物抽出物（特開２００２−１１９３３６号公報、特開２００４−３５４４４号公報）、繊維芽細胞増殖因子−５Ｓ（ＦＧＦ−５Ｓ）を誘導するモモノハナエキスのような植物抽出物（特開２００２−２９６２６７号公報）が知られている。
【０００５】
ところで、毛髪の成長に関与する物質として、胚発生に伴う形態形成を司るシグナル分子である細胞外分泌糖タンパク質のＷｎｔが知られており、このＷｎｔは胎児期の皮膚細胞を毛包に変化させ、その後生涯にわたり、毛包細胞の毛周期を刺激し毛髪を作りだしていることが知られている。このようなＷｎｔを用いたものとして、特表２００４−５００４０７号公報があり、ここではＷｎｔファミリーと知られるＷｎｔのうち、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７が好ましいものであることが記載されているが、実際に毛包細胞が賦活され、毛髪の成長が促進されたことは示されてはいない。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−９７１１６号公報
【特許文献２】特開２００３−３２１３３０号公報
【特許文献３】特開２００２−３７０９８７号公報
【特許文献４】特開２０００−１５４１１８号公報
【特許文献５】特開２００２−１１９３３６号公報
【特許文献６】特開２００４−３５４４４号公報
【特許文献７】特開２００２−２９６２６７号公報
【特許文献８】特表２００４−５００４０７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上のように、養毛剤、育毛剤ないしは発毛剤には、種々のものが知られているが、Ｗｎｔの場合を除き、これらはいずれもすでにある毛包の活性化を目的とするものである。これに対して、毛包形成自体に直接関与する成分であれば、毛包が萎縮したり失われてしまった場合においても、新たに毛包形成を促すことができる。このような毛包形成を促す物質として、Ｗｎｔが知られているが、Ｗｎｔは１９種類以上からなる大きなファミリーを形成しており、種々のＷｎｔが、胚発生の段階において、中枢神経系の発生、体軸の決定、四肢パターン形成、内臓器官の形成、表皮および毛包の形成など多くの形態形成に関与することが知られている。しかしながら、どのＷｎｔが毛包の形成に関与するのかはいまだ特定されていない。
【０００８】
また、Ｗｎｔの受容体となるＦｒｉｚｚｌｅｄは、７回膜貫通型タンパク質であり、１１種類以上からなる大きなファミリーを形成しており、ＷｎｔとＦｒｉｚｚｌｅｄとの結合の組み合わせについては未解明の状態である。さらに、ＷｎｔがＦｒｉｚｚｌｅｄと結合したことによる、細胞内におけるＷｎｔシグナル伝達もβ−カテニンを介するものの他、多くの経路が存在し、どのような経路でシグナルが伝達されるのかも未解明の状態となっている。すなわち、いくつかのＷｎｔのうち、毛包形成に係るＷｎｔやＦｒｉｚｚｌｅｄを解明し、そのシグナル伝達機構を解明することは、毛髪の生成を促進したり逆に抑制したりする薬剤の開発に必要なことである。
【０００９】
本発明は、毛包形成、発毛、脱毛に関わる因子を提供するとともに、これらの因子を含む新規な発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、上記の目的を達成するため、毛包形成、発毛、脱毛に関わる種々の因子をを探求し、その結果、毛包形成に関与するＦｒｉｚｚｌｅｄ３に対するリガンドが、Ｗｎｔとして知られるファミリーのうちでＷｎｔ５ａであり、Ｗｎｔ５ａが毛包細胞を賦活することを見出したもので、本発明はこの知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓタンパク質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を介する情報伝達を調節することにより、細胞分化、発生、増殖を制御する物質であり、この細胞分化、発生、増殖を制御する物質を有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤である。また、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａを有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤であり、さらに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を促進または抑制する物質が間接的に細胞の分化、発生、増殖を制御する細胞分化・発生・増殖調節剤である。そして、この細胞分化・発生・増殖調節剤は、特に毛乳頭細胞の分化、発生、増殖を制御するものである。
【００１１】
さらに、本発明は上記の細胞分化、発生、増殖を制御する物質あるいは細胞分化・発生・増殖調節剤を含む発毛剤、育毛剤、養毛剤ないしは脱毛剤であり、本発明には、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３からＧｓタンパク質（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を介する情報伝達を調節することにより細胞分化、発生、増殖を制御する、発毛方法、育毛方法、養毛方法、脱毛方法を包含し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであるＷｎｔ５ａの細胞からの分泌を調節することによる、発毛方法、育毛方法、養毛方法、脱毛方法も包含する。
【００１２】
また、本発明の別の態様としては、Ｗｎｔ５ａを有効成分とする毛包細胞賦活剤であり、このＷｎｔ５ａはＦｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドとして作用するものである。また、本発明の毛包細胞賦活剤は、Ｗｎｔ５ａを有効成分として含有し、このＷｎｔ５ａは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に結合し、Ｗｎｔ５ａの情報をＦｒｉｚｚｌｅｄ３を介して細胞内に伝達することにより、毛包細胞を賦活化するものである。さらに、本発明は、このようなＷｎｔ５ａを有効成分とする毛包細胞賦活剤を含有する発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明で用いるＷｎｔ５ａは、毛包形成、発毛、脱毛に関わる因子として重要なものであって、Ｗｎｔ５ａは毛包細胞の細胞賦活作用を奏し、Ｗｎｔ５ａを有効成分として含有する毛母細胞賦活剤が提供される。さらに本発明によれば、このようなＷｎｔ５ａを有効成分とする毛母細胞賦活剤が含まれることから、毛母細胞の賦活化に直接作用するという新たな発毛・育毛メカニズムに基づく新規な発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、Ｗｎｔ５ａが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドとして機能し、そしてこのＷｎｔ５ａが毛包の形成を促し、毛乳頭細胞を賦活化することを見出したことに基づくものであって、Ｗｎｔ５ａを有効成分とする細胞分化・発生・増殖調節剤ないしは毛乳頭細胞賦活化剤、およびこれらを含有する発毛剤、育毛剤ないしは養毛剤である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
発生と分化に関与する因子の一つとしてＷｎｔタンパク質と、そのレセプターであるＦｒｉｚｚｌｅｄタンパク質が知られている。このシグナル伝達経路はＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ経路と呼ばれている。Ｗｎｔはヒトで１９種類以上からなる大きなファミリーを形成しており、またＦｒｉｚｚｌｅｄも１０種類以上が確認されている。これらのＷｎｔとＦｒｉｚｚｌｅｄとの組み合わせに依存して、数通りのＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ経路が活性化される（図１）。
【００１６】
Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ経路は、発生と分化に大きく関与していることは明らかであるが、具体的にどのＷｎｔとＦｒｉｚｚｌｅｄの組み合わせがどのような働きを持つのかについては未だ解明されていない部分が多い。この中で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３は皮膚において毛包の形成時から形成後にかけて強く発現することが報告されており（Ｓｅｓｈａｍｍａ  Ｒｅｄｄｙら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１０７（２００１）６９−８２）、毛包の発生・分化に重要な関わりを持つことが示唆されている（図２）。そこで発明者らは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に結合するＷｎｔを同定することにより、毛包分化に関わるシグナルを解明することができ、育毛素材の開発に繋がると考えた。本発明では、毛包形成時に強く発現している７種類のＷｎｔをＦｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンド候補として選択した。
【００１７】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３は７回膜貫通型タンパク質であることから、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）として、シグナル伝達にＧタンパク質が関与していると考えられる。そこで、発明者らは、以下のような手法により、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に結合するＷｎｔを同定した。
【００１８】
Ｇタンパク質は、α、β、γの３つのサブユニットからなり、αサブユニットはＧＴＰに対する結合活性と、その加水分解能を持ち、それぞれのＧタンパク質に固有である。このαサブユニットは不活性型の状態ではＧＤＰを結合し、βγサブユニットとともに三量体を形成しているが、レセプターにリガンドが結合するとαサブユニットは活性化されてＧＴＰ結合型に変換され、βγサブユニットと解離して下流シグナルの活性化を引き起こす。やがてαサブユニットはＧＴＰを加水分解し、もとの不活性型に戻る（図３）。
【００１９】
ところで、細胞内シグナル伝達に関与する三量体Ｇタンパク質は１２種類が大きく４つのファミリーに分類される（図４）。出力するシグナルも様々であるためすべてのシグナルについて追跡することは困難であった。この中で、Ｇｓのみが唯一アデニル酸シクラーゼを上昇させるという出力を持っていることに着目し作製されたのが、ハイブリッドＧｓタンパク質である。
【００２０】
すなわち、ハイブリッドＧｓタンパク質は、図５に示すように、Ｇｓタンパク質のレセプター認識部位のみを遺伝子操作により他のＧタンパク質のものと組み替えたタンパク質である。このハイブリッドＧｓタンパク質を構築することにより、リガンドがレセプターに結合する際に活性化されるどのＧタンパク質の出力するシグナルも、Ｇｓ唯一の出力であるアデニル酸シクラーゼの上昇に置き換えることができ、ｃＡＭＰの上昇を追跡するだけでどのリガンド−レセプター−Ｇタンパク質のシグナル伝達経路が特異的に活性化されるかのスクリーニングが可能となる（Ｋａｔｓｕｍｉ  Ｋｏｍａｔｓｕｚａｋｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、４０６、１６５−１７０（１９９７））。
【００２１】
つまり、Ｇｓ結合レセプターにリガンドが結合した時にはＧｓタンパク質を介してｃＡＭＰ値が上昇するわけだが、ハイブリッドＧｓ／ｘタンパク質（Ｇｓ／ｘ）を用いると、Ｇｘ結合レセプターがＧｓ／ｘを介してシグナルを伝達する場合には、Ｇｘ固有の出力ではなく、Ｇｓの場合と同じｃＡＭＰの上昇という出力が観察されることになる。このように全ての三量体Ｇタンパク質の出力がＧｓ／ｘを用いることによりｃＡＭＰの上昇のみになるため、例えば結合するＧタンパク質が未知のレセプターに対しても、それぞれのＧタンパク質に応じた出力の測定を行わずとも、ｃＡＭＰ値の追跡だけで全Ｇタンパク質に対する評価が可能になる。そこで、このＧｓ/ｘを用いてＦｒｉｚｚｌｅｄ３に結合する、すなわち毛包分化の過程に関与すると考えられるＷｎｔの同定を以下のようにして行った。
【００２２】
候補として選択されたＷｎｔ８種類と、Ｇタンパク質の全ファミリーを網羅した１０種類のＧｓ/ｘとを用い、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３の全ての組み合わせについて網羅的に評価を行った。各ＷｎｔおよびＧｓ／ｘ、さらにネガティブコントロールとしてＧｓ/ｘの発現ベクターを加えて、約１００通りの組み合わせについて順次ｃＡＭＰ値の測定による評価を行った（図６）。評価方法の概略は図７に示すとおりである。
【００２３】
すなわち、まず、動物組織より評価に必要なＷｎｔ及びＦｒｉｚｚｌｅｄ３のｃＤＮＡの作製を、一般的な遺伝子工学手法に従い行った（図７の１）。
【００２４】
次いで、Ｗｎｔタンパク質は活性型での精製が困難であるため、得られたｃＤＮＡを、たとえばＣＨＯ細胞に導入し、Ｗｎｔを発現し、分泌する細胞（Ｗｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＨＯ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ：Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞と呼ぶ）を作製した。この細胞を４日間培養し、培地中にＷｎｔが分泌された調製培地（ｃｏｎｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：ＣＭ）をＷｎｔの作用評価に用いた（図７の２）。一方、たとえば、ＣＯＳ−７細胞にＦｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子とＧｓ／ｘ遺伝子をリポフェクション法により形質導入し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３とＧｓ／ｘとを発現する細胞を調製した。次いで、この細胞を用いて、上記Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の培養により得られた調整培地を添加し、約５時間刺激した後、細胞内ｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて測定した（図７の３）。
【００２５】
以上のようにして、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３について、各種のＷｎｔと、Ｇｓ／ｘとについて評価したところ、Ｗｎｔ５ａとＧｓまたはＧｓ／ｉ１との組み合わせにおいてｃＡＭＰの生成が有意に上昇した。この結果により、Ｗｎｔ５ａはＦｒｉｚｚｌｅｄ３に結合し、ＧｓあるいはＧｉ１を介して、細胞内にシグナルを伝達していることがわかった。一方、その他に評価したＷｎｔは、ｃＡＭＰの生成は有意に上昇しないことから、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３とは結合しないことがわかった（図１２には、Ｗｎｔ５ａおよびＷｎｔ３の結果についてのみ示した）。
【００２６】
なお、上記の評価方法は、シグナル因子としてのＷｎｔと、その受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄ３、および受容体と共役するＧタンパク質を解析する場合に限らず、他のシグナル因子、その受容体およびこの受容体と共役するＧタンパク質を解析することができる。
【００２７】
すなわち、Ｇタンパク質の受容体からのシグナルを受け取る部分はαサブユニットのＣ末端領域であることから、αサブユニットのＧｓのＣ末端５残基をＧｓ以外のファミリーのメンバーのαサブユニットタンパク質の末端５残基に置換した本発明で用いるハイブリッドＧｓ／ｘタンパク質（Ｇｓ／ｘ）は、Ｇタンパク質と共役する受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であれば、必ず、いずれかのＧｓ／ｘと共役し、リガンドが受容体に結合することによる受容体からのシグナルは、Ｇｓ/ｘのＧｓ出力部位に基づいてアデニル酸シクラーゼの活性化という形で出力され、結果として細胞内のｃＡＭＰの濃度が上昇することになる。
【００２８】
具体的には、上記のそれぞれのＧｓ／ｘをコードするｃＤＮＡと、対象とする受容体のｃＤＮＡとを細胞に導入し、これらを発現させた細胞をリガンドで刺激し、細胞内のｃＡＭＰの濃度を測定するという操作のみで、受容体とこの受容体に結合するリガンドとの特定の組み合わせと、そして、この受容体と受容体に共役するＧタンパク質の種類と、をそれぞれ特定することができる。
【００２９】
興味の対象となる受容体とＧｓ/ｘとを発現させる細胞としては、両者のタンパク質を同時に発現できる細胞であれば、特に制限はないが、たとえば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞などが挙げられる。
【００３０】
また、受容体とＧｓ／ｘとを発現させる細胞を調製するには、Ｇｓのαサブユニットの１〜３９４のアミノ酸のうちＣ末端の３９０〜３９４の５アミノ酸を他のファミリーのＧタンパク質のαサブユニットのＣ末端５残基のアミノ酸に置換したハイブリッドタンパク質をコードするｃＤＮＡを、組換えＤＮＡ技術により作製するとともに、目的とする受容体をコードするｃＤＮＡを、例えばＩｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて組織より抽出したｍＲＮＡを用いた逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ法）によりｃＤＮＡライブラリーを得、そのライブラリーより目的とする受容体の既知情報をもとに作成したプライマーを用いたＰＣＲ法により作製し、次いでそれぞれのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やｐＵＳＥａｍｐ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）やｐＥＦ１／ｍｙｃ―Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等の発現ベクターに発現可能に組み込み、次いでこれらの発現ベクターを上記の細胞に、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、ウイルス法等により導入することにより作製することができる。
【００３１】
次いで、得られた細胞を培養し、培地にリガンドを添加し、その後、各細胞内のｃＡＭＰの量を、酵素抗体法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）などにより測定することにより、特定の「リガンド−受容体−Ｇタンパク質」の組み合わせを特定することができる。
【００３２】
この特定ないしは測定方法は特に、すべてのＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に適用でき、唯一、一種類のみｃＡＭＰを上昇させる出力を有するＧｓを用いることで、Ｇタンパク質に複数種類が存在するアウトプットのうち、ｃＡＭＰ量のモニターのみで行うことができるものであり、操作効率などの面でも応用性が高いものである。
【００３３】
次いで、上記の方法により、毛包形成に関与することが予想されるＷｎｔ５ａなどに関して、毛包細胞に対する賦活試験を以下のようにして行い、Ｗｎｔ５ａの細胞分化・発生・増殖調節作用ないしは毛包細胞賦活作用を確認した。
【００３４】
毛包細胞は真皮由来の毛乳頭細胞と、それを取り巻く上皮由来の毛母細胞とから構成されている（図２）。そして、毛乳頭細胞は、毛器官の発生や伸長に関与する線維芽細胞様細胞であり、成長期も毛球部の毛乳頭内で互いに突起を伸ばして接着したネットワークを形成し、何らかのサイトカインを放出し、毛母の機能や増殖を調整するものである。また、毛周期の成長期→退行期→休止期→成長期の繰り返しにおいて、休止期から成長期への移行は、バルジ部に引き寄せられ、萎縮していた毛乳頭細胞が再び活動を開始し、毛乳頭細胞からの刺激によって毛包構造が再構築され毛幹が再び伸長し始めることから、毛乳頭細胞は毛母細胞の増殖の調整はもとより、その他の機能についての調整の司令塔として機能しているものである。そして、毛乳頭細胞からの刺激を受けることにより、毛根部に毛母細胞が形成され、毛乳頭細胞に隣接している一番底の毛母細胞が生きた細胞として成長し、新たに毛母細胞が形成されるにつれて、毛母細胞は、表皮細胞と同様に核が無くなり角化（ケラチン化）し、毛幹が形成されていくことになる。したがって、毛乳頭細胞に対する賦活作用が、毛母細胞の増殖、ひいては発毛、育毛、養毛の基本となることから、本発明においては、毛乳頭細胞に対する賦活作用を詳細に検討した。
【００３５】
毛包細胞の賦活作用の確認には、Ｗｎｔ５ａの他、他のＷｎｔについても行い、各Ｗｎｔは上述したそれぞれのＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の培養から得られた調整培地を用いた。また、毛乳頭細胞の賦活作用は、毛乳頭細胞を培養し、この調整培地を各Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の培養から得られた培養液上澄を添加し、刺激することにより毛乳頭細胞の賦活作用を評価することができ、細胞賦活作用は、例えば、毛乳頭細胞細胞内に蓄積されるブルーホルマザン量を指標として、あるいは［３Ｈ］−チミジン取り込み量を指標として細胞の増殖性を求めることにより、細胞賦活化の程度を評価することができる。
【００３６】
以上のようにして、毛乳頭細胞の賦活作用を評価したところ、Ｗｎｔ５ａが有意に細胞の増殖性、すなわち賦活作用を示し、これによりＷｎｔ５ａは毛乳頭細胞の賦活化作用を有するものであることが判明した。
【００３７】
以上のことを総合すると、Ｗｎｔ５ａは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のリガンドであり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３はＧｓまたはＧｉ１と共役してＷｎｔ５ａのシグナルを細胞内部に伝達していること、そして、Ｗｎｔ５ａが毛包形成に係わる直接の因子であり、Ｗｎｔ５ａにより毛乳頭細胞が賦活化されることで毛母細胞も活性化され、結果として発毛、育毛ないしは養毛が達成されることがわかった。
【００３８】
本発明は、このようなＷｎｔ５ａを有効成分として含有する、発毛、育毛ないしは養毛剤である。本発明の発毛、育毛ないしは養毛剤は、液状、乳剤状、ゲル状、クリーム状、軟膏状、フォーム状、ミスト状など種々の剤型で、ヘアトニック、ヘアジェル、ヘアクリーム、ヘアトリートメントローション、ヘアフォーム、ヘアミスト、ヘアシャンプー、ヘアリンスなどとして提供することができる。また、本発明に係る発毛、育毛ないしは養毛剤には、本発明の作用を損なわない範囲で、油性成分、界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、血行促進剤、局所刺激剤、毛包賦活剤、抗脂漏剤、抗炎症剤、香料、色素、防菌防黴剤などの一般的な育毛剤用添加剤を含有させることができる。本発明の発毛、育毛ないしは養毛剤の有効成分であるＷｎｔ５ａの配合量としては、発毛、育毛ないしは養毛剤全量に対して、１０−７〜１０−１重量％、好ましくは１０−７〜１０−４重量％、さらには１０−６〜１０−４重量％程度とするのが好ましい。
【００３９】
本発明で用いるＷｎｔ５ａは、そのアミノ酸配列あるいは塩基配列が、例えば、ヒト（Ｃｌａｒｋら，１９９３，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；１８（２）：２４９−６０）、マウス（Ｇａｖｉｎら，１９９０，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．；４（１２Ｂ）：２３１９−２３３２）、ラット（Ｃａｓｔｅｌｏ−Ｂｒａｎｃｏ，２００３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ；１００（２２）：１２７４７−１２７５２などに示されているような、主には形態形成能を有する公知の分泌性のタンパク質であり、特定の生物種に限定されるものではない。そして、本発明で用いることができるＷｎｔ５ａとしては、上記のアミノ酸配列で示されるＷｎｔ５ａに限らず、毛乳頭細胞の賦活効果があれば、各アミノ酸配列において、数個のアミノ酸が置換、挿入、付加、欠失があるものであっても本発明の毛母細胞賦活剤および発毛、育毛ないしは養毛剤として使用できる。なお、生物種に由来するＷｎｔ５ａとしては、効果効能の点からヒト、マウスに由来するものが好ましい。
【００４０】
また、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３は、そのアミノ酸配列あるいは塩基配列が、Ｗｎａｇらの報告（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．；２７１（８）：４４６８−４４７６）に示されているような公知の７回膜貫通型受容体タンパク質である。
【実施例】
【００４１】
以下、実験例により、本発明をさらに詳しく説明する。
（Ａ）Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に対するリガンドおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ３と共役するＧタンパク質の特定
１．ＷｎｔおよびＦｒｉｚｚｌｅｄのｃＤＮＡ作製
Ｗｎｔ、ＦｒｉｚｚｌｅｄのｃＤＮＡは、一部のＷｎｔが市販されているのみであったため、評価に必要なＷｎｔの一部は市販品を購入、市販されていないものについては動物組織よりｃＤＮＡを作成した。すなわち、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のｃＤＮＡは、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いてマウスの脳組織からｍＲＮＡを抽出し、既知のＤＮＡ配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ  ０２１４５８）から約２０塩基よりなるプライマーを作製し、ＰＣＲ法によりｃＤＮＡを得た。また、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１のｃＤＮＡも同様に、マウスの皮膚組織からｍＲＮＡを抽出し、Ｗｎｔの既知のＤＮＡ配列（（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ  ００９５１８；Ｗｎｔ１０ａ）、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＮＭ  ０１１７１８；Ｗｎｔ１０ｂ）、（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＸＭ  １２４９６１；Ｗｎｔ１１））をもとに、それぞれのプライマーを作製し、ＰＣＲ法によりそれぞれのｃＤＮＡを得た。一方、残りのＷｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａのｃＤＮＡについては、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社より購入（カタログ番号２１−１２１、２１−１２３、２１−１２４、２１−１２５、２１−１３３）した。
【００４２】
２．Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞の作製
Ｗｎｔタンパク質は活性型での精製が困難であり、そのためＷｎｔを分泌する細胞（Ｗｎｔ分泌ｓｔａｂｌｅ細胞）をまず作製し、その細胞を４日間培養し、培地中にＷｎｔが分泌されたもの（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：調整培地）をＷｎｔの作用評価に用いた。
【００４３】
すなわち、得られた各ＷｎｔのｃＤＮＡを、ネオマイシン耐性を有する発現ベクターであるｐＵＳＥａｍｐに挿入してプラスミド（ｐＵＳＥａｍｐ−Ｗｎｔとする）を調製し、次いで、ｐＵＳＥａｍｐ−Ｗｎｔをリポフェクション法によりＣＨＯ細胞にトランスフェクションし、５００または７５０μｇ／ｍＬの抗生物質（Ｇ４１８）含有培地にて選別し、Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を得た。
【００４４】
得られたＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を、１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）と、５００または７５０μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＨａｍ’ｓＦ１２培地中で、直径１０ｃｍの培養皿に２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で播種し、３日間培養した。次いで、培地を無血清ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に代え、４日間培養した。培地を回収し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄（調整培地）を得た。一方、親株のＣＨＯ細胞を用いて、同様に培養し、遠心分離し、上澄（調整培地）を得、ネガティブコントロール（ＮＣ）として調製した。
【００４５】
得られた上澄（調整培地）を、Ａｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ１５（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、４０００ｇ×の条件で、５倍、１０倍、２０倍に濃縮した。
【００４６】
次に、得られた調整培地中へのＷｎｔの分泌を次のようにしてイムノブロット法により評価し、導入したＷｎｔが発現していることを確認した。
【００４７】
各Ｗｎｔの検出に用いた抗体には、パーオキシダーゼ結合抗ＨＡ、高親和性（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号Ｎｏ．２０１３８１９）抗体を用い、これを２０００倍にＰＢＳ−Ｔで希釈して用いた。
【００４８】
得られた調整培地を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル）にかけ、タンパク質を分離し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔｒａｎｓ  Ｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ社製）上に転写した。膜を１０％のスキムミルクを含有するＰＢＴ−Ｔで室温下１時間反応させてブロッキングし、２０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合抗ＨＡ、高親和性（３Ｆ１０）（Ｒｏｃｈｅ社製、カタログ番号Ｎｏ．２０１３８１９）抗体とともに室温下で２時間インキュベートし、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号Ｎｏ．ＲＰＮ２１０９）の試薬を用いた化学発光法により可視化した。その結果、調製した全てのＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞がＷｎｔを発現し、培地中に分泌していることが確認された。一例として、図８に、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ５ａの場合を示した。図中、「Ｗ５ａ  ｓｔｄ」は、購入したＷｎｔ５ａをそのまま電気泳動したものであり、「１×、５×」などはＷｎｔの濃縮倍率を示している。
【００４９】
３．Ｇｓ／ｘ  ｃＤＮＡの調製
Ｇｓ／ｘ遺伝子を含むプラスミドは、慶應義塾大学医学部薬理学教室より提供を受けた。
【００５０】
このＧｓ／ｘ  ｃＤＮＡおよびこのｃＤＮＡを含むプラスミドは、下記の論文示された手法にて作製されたものである（Ｉｋｅｚｕら、１９９６；ＥＭＢＯ．Ｊ．；１５（１０）：２４６８−２４７５）。
【００５１】
４．Ｇｓ／ｘ  ｃＤＮＡおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ３  ｃＤＮＡを含有するプラスミドの調製
次いで、得られたＧｓのＣ末端５残基分のアミノ酸配列の塩基配列が他のＧタンパク質（Ｇｉ１、Ｇｉ３、Ｇｏ、Ｇｚ、Ｇｑ、Ｇ１４、Ｇ１６、Ｇ１２、Ｇ１３）のＣ末端５残基分のアミノ酸配列の塩基配列に置換されたハイブリッドＧｓ／ｘタンパク質をコードするそれぞれのｃＤＮＡを、制限酵素であるＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）のマルチクローニングサイトに挿入し、Ｇｓ／ｘのｃＤＮＡを含むプラスミドを得、これを「ｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｓ／ｘ」と命名した。
【００５２】
一方、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のｃＤＮＡは、ＰＣＲ産物を一旦クローニングベクターであるｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、制限酵素であるＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩにて消化した後、発現ベクターであるｐＥＦ１−Ｍｙｃ／Ｈｉｓのマルチクローニングサイトに挿入し、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３のｃＤＮＡを含むプラスミドを得、これを「ｐＥＦ１−Ｆｚｄ３」と命名した。
【００５３】
５．Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３およびＧｓ／ｘのｃＤＮＡをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の作製
ＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に分散させ、６ウェルプレートに１．０×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、５％の二酸化炭素を含む加湿環境下で、３７℃、２４時間培養した。
【００５４】
次いで、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子とＧｓ／ｘ遺伝子をＣＯＳ−７細胞に共トランスフェクションするため、各ウェル当たり、１６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製、コード番号１０９６４−０１３）と８μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社製、コード番号１０９６４−０１３）、及びＧｓ／ｘ遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｓ／ｘを１．２５μｇとＦｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子が挿入されたｐＥＦ１−Ｆｚｄ３を０．７５μｇを用いてリポフェクション法を行い、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３およびＧｓ／ｘのｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ３−Ｇｓ／ｘという）を得た。導入したＧｓ／ｘは、それぞれＧｓ、Ｇｓ／ｉ１、Ｇｓ／ｉ３、Ｇｓ／ｚ、Ｇｓ／ｑ、Ｇｓ／１４、Ｇｓ／１６、Ｇｓ／１２およびＧｓ／１３である。
【００５５】
一方、Ｇｓ／ｘ遺伝子が挿入されたｐｃＤＮＡ３．１−Ｇｓ／ｘの代わりに、Ｇｓ／ｘが挿入されていない発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）を用いて、同様に共トランスフェクションし、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子のみが導入されたＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ３−Ｖｅｃという）を調製し、コントロールとして用いた。
【００５６】
各ＣＯＳ−７細胞を、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地にて２０〜２４時間培養を続け、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３およびＧｓ／ｘのｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−７細胞を得た。
【００５７】
次いで、得られたＣＯＳ−７細胞について、以下のようにして、イムノブロット法によりＦｒｉｚｚｌｅｄ３およびＧｓ／ｘの発現を確認した。
【００５８】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３の検出は、一次抗体として、マウス抗ｍｙｃ抗体（マウスモノクローナル抗体ＩｇＧ１：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号Ｎｏ．Ｒ９５０−２５）をＰＢＳ−Ｔにより２０００倍に希釈して用いた。また、二次抗体として、パーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を、１０％のスキムミルクを含有するＰＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈して用いた。
【００５９】
Ｇｓ／ｘタンパク質の検出は、一次抗体として、ウサギ抗Ｇα−Ｓサブユニット（内部の４０〜５４残基、ＧＴＰ結合部領域を認識する）抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、カタログ番号Ｎｏ．３７１７３７）を、ＰＢＳ−Ｔで２０００倍に希釈して用いた。また、二次抗体として、パーオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧを、１０％のスキムミルクを含有するＰＢＳ−Ｔで５０００倍に希釈して用いた。
【００６０】
培養した各ＣＯＳ−７細胞をＲＩＰＡバッファーに溶解し、超音波処理し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動（８％アクリルアミドゲル）にかけ、タンパク質を分離し、分離されたタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  Ｆｌｕｏｒｏ  Ｔｒａｎｓ  Ｗ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ社製）上に転写した。膜を１０％のスキムミルクを含有するＰＢＴ−Ｔで室温下１時間反応させてブロックした。次いで、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３の場合は、上記の２０００倍に希釈されたマウス抗ｍｙｃ抗体を加え、２時間室温でインキュベートし、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３と反応させた。その後、膜を洗浄した後、二次抗体として、上記のスキムミルクを１％含有するＰＢＳ−Ｔに５０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体を添加し、１時間室温下でインキュベートした。次いで、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号Ｎｏ．ＲＰＮ２１０９）の試薬を用いた化学発光法により可視化した。
【００６１】
一方、Ｇｓ／ｘの場合は、上記の２０００倍に希釈されたウサギ抗Ｇα−Ｓサブユニット抗体を加え、２時間室温でインキュベートし、それぞれのＧｓ／ｘと反応させた。その後、膜を洗浄した後、二次抗体として、上記のスキムミルクを含有する５０００倍に希釈したパーオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体を添加し、１時間室温下でインキュベートした。次いで、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、カタログ番号Ｎｏ．ＲＰＮ２１０９）の試薬を用いた化学発光法により可視化した。
【００６２】
結果を図９および図１０に示した。図中「Ｖｅｃ」は、コントロールとして用いたＦｒｉｚｚｌｅｄ３とＧｓ/ｘの発現ベクターが導入されたＣＯＳ−７細胞である。図９および図１０から、ＣＯＳ−７細胞中に導入したＦｒｉｚｚｌｅｄ３とＧｓ／ｘとは全て発現していることが確認された。
【００６３】
６．リガンドとＧタンパク質の同定法の構築
リガンドとＧタンパク質の同定法を構築するために、以下の予備実験を行い、ｃＡＭＰの測定に基づく同定法の妥当性を検討した。検討に当たり、細胞内のｃＡＭＰのレベルはｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ社製、コード番号ＦＲＲＮ２２５）を用いて、後述するように測定した。
【００６４】
６−１．ｃＡＭＰ検出方法の確認
細胞内で産生されるｃＡＭＰの検出方法の確認は、作用機序が報告されている受容体のβ−アドレナリンレセプター（β−ＡＲ）とリガンドのイソプロテレノール（ＩＰＴ）を用いて行った。β−ＡＲは、ＩＰＴの刺激により細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることが報告されている（Ｒｏｂｉｓｏｎら，１９６７，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．；１３９：７０３）。
【００６５】
β−ＡＲをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞をＩＰＴで刺激し、ＣＯＳ−７細胞内のｃＡＭＰ量をｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて評価した。その結果、β−ＡＲを形質導入していない細胞（コントロール）に比べ、β−ＡＲを形質導入した細胞は、ＩＰＴの刺激で有意に細胞内ｃＡＭＰ量が上昇することが確認された。
【００６６】
以上の結果、細胞内で産生されるｃＡＭＰ量の増減をｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ  Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて検出することが可能であることを確認した。
【００６７】
６−２．ハイブリッドＧタンパク質を用いたＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達評価方法の確認
Ｇｏを介するシグナル伝達が、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２とＷｎｔ５ａとの結合により起こることが報告されている（Ｓｈｅｌｄａｈｌら，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．；９：６９５−６９８）。
【００６８】
この作用機序に着目し、ハイブリッドＧタンパク質を用いたＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達評価方法の構築を行った。
【００６９】
すなわち、上述したＦｒｉｚｚｌｅｄ３の場合と同様にして調製したＦｒｉｚｚｌｅｄ２遺伝子を含むプラスミドｐＥＦ１−Ｆｚｄ２を用いてＦｒｉｚｚｌｅｄ２遺伝子とＧｓ／ｏ遺伝子とが導入されたＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ２−Ｇｓ／ｏという）および、コントロールとして、ハイブリッドＧｓ／ｏ遺伝子が導入されておらずＦｒｉｚｚｌｅｄ２遺伝子のみが導入されたＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ２−Ｖｅｃという）を調製した。
【００７０】
Ｇｓ／ｏを導入していないＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ２−Ｖｅｃ）に、Ｗｎｔを含まない調整培地（ＮＣ）で１時間刺激したときのｃＡＭＰの値を基準（１００％）とし、Ｆｚｄ２−ＶｅｃおよびＦｚｄ２−Ｇｓ／ｏの両細胞に対して、Ｗｎｔ５ａを含むかあるいは含まない調整培地でそれぞれ１時間刺激した時の細胞内のｃＡＭＰ量の変化を測定した。
【００７１】
その結果、Ｆｚｄ２−Ｇｓ／ｏをＷｎｔ５ａを含む調整培地で刺激した場合にのみ、有意（Ｔ検定においてｐ＜０．０１）にｃＡＭＰ量が上昇することが確認された（図１１）。ｃＡＭＰ量の上昇率は、Ｗｎｔ５ａを含む調整培地を１８倍（１８×）に濃縮することにより、未濃縮（１×）に比べて濃度依存的に上昇することも確認された。以上の結果、ハイブリッドＧタンパク質を用いることでＧタンパク質を介するＷｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達系の受容体とＧタンパク質の種類を同定できることがわかった。
【００７２】
７．Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に結合するＷｎｔと共役するＧタンパク質の同定
以上の結果に基づいて、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３に結合するＷｎｔと共役するＧタンパク質の同定を行った。Ｗｎｔは主に毛包分化の関与が示唆される８種類（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１）を用い、またＦｒｉｚｚｌｅｄ３を介するＧタンパク質の種類も未知であるため、全てのＧタンパク質ファミリーを用い、全ての組み合わせについて網羅的に行った。
【００７３】
リガンドとしてのＷｎｔは、上記のようにして調製された各Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を無血清ＣＤ  ＣＨＯ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）中で４日間培養し、培地を回収し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上澄を集め調整培地を得た。次いで、得られた調整培地をＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａ１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて４０００ｇで５倍に濃縮した。また、Ｗｎｔを含まない親ＣＨＯ細胞から、同様の操作により調整培地を調製し、ネガティブコントロール（ＮＣ）の調整培地として用いた。
【００７４】
次いで、５００ｍＭのＩＢＭＸのＤＭＳＯ溶液を、濃縮されたそれぞれの調製培地で１０００倍に希釈し、刺激用の試薬（リガンド）として０．５ｍＭのＩＢＭＸを含む調製培地を調製した。
【００７５】
一方、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３とＧｓ／ｘとが発現していることが確認されたＣＯＳ−７細胞を１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中に分散させ、９６ウェルプレートに３．０×１０４細胞／ウェルの密度で再播種し、２０〜２４時間培養した。培養した細胞に、０．５ｍＭのＩＢＭＸを含む調整培地を添加して刺激し、３７℃、５時間インキュベートした後、次のようにして細胞内ｃＡＭＰの量を測定した。
【００７６】
細胞内ｃＡＭＰの量は、ＢＩＯＴＲＡＫ  ｃＡＭＰ  Ｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製、コード番号ＦＲＰＮ２２５）を用いて、製品マニュアルに従って測定した。すなわち、培地を除き、２００μｌの希釈した細胞溶解試薬１Ｂ（ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １Ｂ）を添加し、１０分間震盪した。それぞれの標準試料溶液およびサンプル溶液の１００μｌをそれぞれのウェルに添加した。次いで、１００μｌの抗血清をブランクを除く全てのウェルに添加し、非特異性結合をブロックした。プレートをカバーし、穏やかに混合し、正確に２時間、３〜５℃でインキュベートした。ブランクを除いて５０μｌのｃＡＭＰ−パーオキシダーゼ結合物を加え、カバーをかけて正確に６０分間、３〜５℃でインキュベートした。全てのプレートを４００μｌの洗浄用バッファーで４回洗浄し、全てのウェルに１５０μｌの酵素基質を添加し、カバーをかけて１５〜３０℃、６０分間混合した。１．０Ｍの硫酸１００μｌを添加し、反応を停止し、３０分以内に４５０ｎｍで吸光度を測定した。その結果、Ｗｎｔ５ａで刺激した場合にのみ、ｃＡＭＰ量の有意な上昇が認められた。
【００７７】
図１２に、Ｗｎｔ５ａおよび一例として、Ｗｎｔ３の場合について結果を示した。図１２は、各Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子およびＧｓ／ｘ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ３−Ｇｓ／ｘ）において、Ｗｎｔを含まない調製培地（ＮＣ）で刺激したときのｃＡＭＰの量を基準（１００％）として、Ｗｎｔ３またはＷｎｔ５ａを含む調製培地で刺激したときのｃＡＭＰの量を相対的に示したものであり、バーは標準偏差を表し（ｎ＝４）、「＊＊」は、Ｔ検定において、ｐ＜０．０１で有意であったことを示している。
【００７８】
以上のことから、Ｗｎｔを含まない調製培地（ＮＣ）で刺激した場合と比較して、Ｗｎｔ５ａを含む調製培地で刺激した場合のみに、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３−ＧｓおよびＦｒｉｚｚｌｅｄ３−Ｇｓ／ｉ１導入細胞において有意にｃＡＭＰ値の上昇が見られ、この結果より、Ｗｎｔ５ａはＦｒｉｚｚｌｅｄ３に結合し、ＧｓあるいはＧｉ１を介して細胞内にシグナル伝達を行うことがわかった。
（Ｂ）毛乳頭細胞に対する細胞賦活作用
次いで、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３と結合することがわかった、Ｗｎｔ５ａの毛包細胞賦活作用について検討した。すなわち、発毛、育毛、養毛作用の評価を目的に、Ｗｎｔ５ａを含むＷｎｔ（Ｗｎｔ１、３、３ａ、４、１０ａ、１０ｂ、１１）を用いて毛乳頭細胞に対する細胞分化・発生・増殖調節作用ないしは細胞賦活作用を評価した。
【００７９】
１．Ｗｎｔ調整培地の作製
用いた各Ｗｎｔは、上述した方法と同様にして、Ｗｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳおよびＧ４１８を含むＨａｍＦ１２培地中、直径１０ｃｍの培養皿に６×１０６細胞となるように播種し、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で３日間培養した。ＰＢＳで３回洗浄後、１０ｍｌのＣＨＯ細胞培養用の無血清ＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に交換し、さらに４日間培養した。培養液を回収し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用い、４０００ｇ、４℃にて５、１０、２０倍に濃縮して、調整培地を調製した。コントロールとして、Ｗｎｔ遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞も同様の操作（濃縮操作も含む）を行いＷｎｔを含まない調整培地を作製した。
２．細胞賦活作用の評価
毛乳頭細胞の賦活作用は、細胞内に蓄積されるブルーホルマザン量を指標とする細胞増殖性についての検討を以下のようにして行った。
【００８０】
すなわち、ヒト頭皮毛乳頭細胞（東洋紡社製）を、ヒト頭皮毛乳頭細胞用低血清培地（東洋紡社製）中、Ｉ型コラーゲンコート用９６ウェルマイクロプレート（ＢＤ社製）に、各ウェルあたり１×１０４細胞となるように播種し、３７℃、５％の二酸化炭素存在下で、１日間培養した。次いで、培地を、１００μｌのＷｎｔを含む調整培地に交換し、さらに２日間培養を続けた。培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて、製品マニュアルに従い細胞内のブルーホルマザン量を測定した。すなわち、培養終了後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加し、炭酸ガスインキュベーター内で、１時間呈色反応を行い、４５０ｎｍで吸光度を測定した。
【００８１】
この結果、評価したＷｎｔのうちＷｎｔ５ａに顕著な細胞増殖性、すなわち細胞賦活効果が認められた。結果を図１３に示した。図１３は、各濃縮率でのＷｎｔを含まない調整培地（ＮＣ）で培養したときの値を基準（１００％）として、Ｗｎｔ５ａを含む調整培地で培養したときの値を相対的に示したものであり、バーは標準偏差を表し（ｎ＝４）、「＊＊」は、Ｔ検定において、ｐ＜０．０１で有意であったことを示している。図１３によると、Ｗｎｔ５ａは、濃縮率５倍以上で濃度依存的かつ有意な細胞賦活作用を示し、濃縮率２０倍では１４７％と最も高い細胞賦活作用を有していることがわかった。
【００８２】
なお、本発明の実験に用いたＷｎｔ５ａはマウス由来のものではあるが、マウス由来のＷｎｔ５ａはヒトのＷｎｔ５ａとの相同性が９９％以上と高いものであり、また、ヒトの毛乳頭細胞に対する細胞賦活作用を示すものであることから、マウス由来のＷｎｔ５ａの他、本発明にヒト由来のＷｎｔ５ａを用いることができることはいうまでもない。また、ヒトあるいはマウス由来のＷｎｔ５ａと相同性の高い他の生物種のＷｎｔ５ａとしては、ラットおよびその他の哺乳類に由来するものがあげられ、これらのＷｎｔ５ａも同様に本発明に使用できると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達経路の模式図であり、Ｆｒｉｚｚｌｅｄに結合したＷｎｔのシグナルは、Ｄｖｌを介して伝達されるＷｎｔ／β−カテニン経路、Ｗｎｔ／ＪＮＫ経路および、Ｇタンパク質を介して伝達されるＷｎｔ／Ｃａ２＋経路により、伝達される。本発明は、これらの経路のうちＧタンパク質を介するＷｎｔ／Ｃａ２＋経路に基づくものである。
【図２】図２は、毛包形成に関与するＦｒｉｚｚｌｅｄ３と各Ｗｎｔとを示したもので、図２の左側の４枚の写真は、毛包形成時に発現するＦｒｉｚｚｌｅｄ３の発現を胚の段階から出生後にかけて経時的に示したものである。また、図２の右側の図は、毛包の構造と、毛包付近に発現する各種のＷｎｔを示したものである。
【図３】図３は、７回膜貫通型受容体にリガンドが結合したときの受容体と共役する三量体Ｇタンパク質の挙動を模式的に示した図であり、受容体がリガンドと結合することにより、三量体のＧタンパク質は、αサブユニットにあるＧＤＰがＧＴＰへと変換され活性型となり、αサブユニットと、β・γサブユニットとに解離し、受容体に結合しているαサブユニットにより情報が伝達されることを示している。
【図４】図４は、Ｇタンパク質の種類とファミリーおよび各ファミリーを構成するメンバーを示した表である。Ｇタンパク質のうち、情報伝達の出力手段として、アデニル酸シクラーゼを活性化し、ｃＡＭＰの産生を促進するものはＧｓのみであることがわかる。
【図５】図５は、ハイブリッドＧｓタンパク質の模式図であり、ＧｓはαサブユニットのＧｓタンパク質であり、受容体と共役するＣ末端の５アミノ酸残基と、アデニル酸シクラーゼ活性化しｃＡＭＰの産生を促す出力領域とを有している。Ｇｘは、Ｇｓ以外のαサブユニットのＧαタンパク質であり、受容体と共役するＣ末端５アミノ酸残基と、そのＧαタンパク質固有の出力領域とを有している。Ｇｓ／ｘは、ＧｓのＣ末端５アミノ酸残基をＧｘのＣ末端５アミノ酸残基に置換して調製したハイブリッドＧｓタンパク質であり、Ｇｘに由来する、Ｇｓが認識する受容体とは異なる受容体と共役するＣ末端５アミノ酸残基と、Ｇｓに由来する、アデニル酸シクラーゼ活性化しｃＡＭＰの産生を促す出力領域とを有している。このＧｓ／ｘの構造により、Ｇｓ／ｘはＣ末端５アミノ酸残基領域によりいずれかの受容体と共役し、Ｇｉ、ＧｑあるいはＧ１２がある受容体と共役したときの本来固有の出力が、Ｇｓの有するアデニル酸シクラーゼの活性化、すなわちｃＡＭＰの産生という出力に変換される。
【図６】図６は、評価実験を行ったＷｎｔ・Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３・Ｇｓ／ｘの組み合わせを示す。すなわち、ネガティブコントロールを含めて、Ｗｎｔが９種類、Ｇタンパク質が１１種類であり、評価実験の組み合わせは全部で９×１１の９９通りである。
【図７】図７は、本発明における評価方法概略であり、基本的にＦｒｉｚｚｌｅｄ３とＧｓ／ｘとを導入した細胞をＷｎｔで刺激し、細胞内のｃＡＭＰの産生量を測定することにより行った。
【図８】図８は、Ｗｎｔ遺伝子を導入したＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞のＷｎｔ発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、Ｗｎｔ３（Ｗ３と表示）およびＷｎｔ５ａ（Ｗ５ａと表示）の場合を示した。図中、「Ｗ５ａ  ｓｔｄ」はＷｎｔ５ａをそのまま電気泳動したものであり、また「ＮＣ」はネガティブコントロールであって、Ｗｎｔ遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。また、「ｘ」は濃縮倍率を示し、「Ｍ」は分子量マーカーである。図より、Ｗｎｔ遺伝子を導入したＷｎｔ安定的発現ＣＨＯ細胞は、Ｗｎｔを発現していることがわかる。
【図９】図９は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子およびＧｓ／ｘ遺伝子を共トランスフェクションにより導入したＣＯＳ−７細胞による、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３の発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果であり、それぞれのＧｓ／ｘ遺伝子を導入した場合を示した。図中、「Ｖｅｃ」はＦｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子のみを導入したＣＯＳ−７細胞からのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、「Ｍ」は分子量マーカーである。図より、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞で、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３が安定に発現していることが分かる。
【図１０】図１０は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子およびＧｓ／ｘ遺伝子を共トランスフェクションにより導入したＣＯＳ−７細胞による、Ｇｓ／ｘの発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。図中、「Ｖｅｃ」はＦｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子のみを導入したＣＯＳ−７細胞からのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり、「Ｍ」は分子量マーカーである。図より、Ｇｓ／ｘ遺伝子を導入したＣＯＳ−７細胞でＧｓ／ｘが安定に発現していることがわかる。
【図１１】図１１は、Ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅｄシグナル伝達評価方法の構築のために行った予備実験結果を示したもので、Ｇｏを介するシグナル伝達がＦｒｉｚｚｌｅｄ２とＷｎｔ５ａの結合により起こることが知られていることから、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２遺伝子のみを導入したＣＯＳ−７細胞（Ｆｚｄ２−Ｖｅｃ）およびＦｒｉｚｚｌｅｄ２遺伝子とＧｓ／ｏ遺伝子とを導入したＣＯＳ−７細胞（Ｆｘｄ２−Ｇｓ／ｏ）をＷｎｔ５ａでそれぞれ刺激したときのｃＡＭＰ量の上昇を示したグラフである。図より、Ｇｏを介するＷｎｔ５ａ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ２のシグナル伝達が、Ｇｓ／ｏによりｃＡＭＰの産生量により評価できることがわかった。
【図１２】図１２は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ３遺伝子とＧｓ／ｘ遺伝子とを導入したＣＯＳ−７細胞を、各Ｗｎｔで刺激したときの細胞内ｃＡＭＰ値を測定した結果を示したグラフであり、Ｗｎｔ３およびＷｎｔ５ａの場合を示したものである。図より、Ｗｎｔ５ａの場合に、ＧｓおよびＧｓ／ｉ１のときに有意にｃＡＭＰの量が上昇していることがわかる。
【図１３】図１３は、各Ｗｎｔによる毛乳頭細胞の細胞増殖ないしは賦活作用を示すグラフであり、細胞増殖ないしは賦活作用を示したＷｎｔ５ａの場合を示したものである。図より、Ｗｎｔ５ａが毛母細胞賦活作用を有するものであることがわかる。
【図１】
2008179540.tif 000002
【図２】
2008179540.tif 000003
【図３】
2008179540.tif 000004
【図４】
2008179540.tif 000005
【図５】
2008179540.tif 000006
【図６】
2008179540.tif 000007
【図７】
2008179540.tif 000008
【図８】
2008179540.tif 000009
【図９】
2008179540.tif 000010
【図１０】
2008179540.tif 000011
【図１１】
2008179540.tif 000012
【図１２】
2008179540.tif 000013
【図１３】
2008179540.tif 000014