(57)【要約】      （修正有）【課題】線虫及び/又はアリマキに対する耐性を与え得る遺伝子、および、それらに対して耐性を有する遺伝的に形質転換された植物を提供する。【解決手段】好ましい核酸は、特定の核酸又はその相同物の少なくとも一部であるDNA配列であり、植物中に存在し、発現されると該植物に線虫及び/又はアリマキに対する耐性を与えることができるMi耐性遺伝子を具備する核酸である。さらに、該核酸配列を具備するベクター、細胞、及び種子並びに線虫及び/又はアリマキに対して耐性を有する遺伝的に形質転換した植物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNA配列が、図５のDNA若しくはその一部、又は図５のDNA配列に相同なDNA配列である核酸。
【請求項２】
植物病原体に感受性がある宿主植物に移入されたときに、該宿主植物に前記植物病原体に対する耐性を与え得る請求項１の核酸。
【請求項３】
DNA配列が、図５に示されているDNA配列の少なくとも一部である核酸に相当するcDNAである核酸配列。
【請求項４】
宿主植物に移入されたときに、線虫に対する耐性を与えることができる請求項１又は３の核酸。
【請求項５】
宿主植物に移入されたときに、アリマキに対する耐性を与えることができる請求項１又は３の核酸。
【請求項６】
宿主植物に移入されたときに、線虫及びアリマキに対する耐性を与えることができる請求項１又は３の核酸。
【請求項７】
前記DNA配列が、図５の配列のヌクレオチド3263から始まり、ヌクレオチド7111に終わる配列又はこれと相同な任意のDNA配列に相当する核酸。
【請求項８】
前記DNA配列が、ヌクレオチド3263の5’上流に位置するプロモーター配列又はこれと相同な任意のDNA配列に相当する核酸。
【請求項９】
前記DNA配列が、コスミドMi-11中に存在するゲノムインサートの少なくとも一部又はこれと相同な任意のDNA配列に相当する請求項１又は３の核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の核酸を具備する組換えDNA構築物。
【請求項１１】
前記核酸が、植物細胞中で機能するプロモーターの調節下にあり、該プロモーターが前記植物細胞に内在しているか、又は外在しており、このような植物細胞中の前記DNA配列の転写を調節するのに有効である請求項１０の組換えDNA構築物。
【請求項１２】
前記プロモーターが、図５に示されているヌクレオチド3263の5’上流に位置するプロモーター配列又はこれに相同な任意のDNA配列に相当する請求項１１の組換えDNA構築物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載のDNA構築物を具備する植物細胞を形質転換するのに適したベクター。
【請求項１４】
番号CBS 822.96で寄託したプラスミドpKGMi-11。
【請求項１５】
番号CBS 821.96で寄託したプラスミドpKGMi-18。
【請求項１６】
請求項１３〜１５の何れか１項に記載のベクター又はプラスミドを具備する細菌細胞。
【請求項１７】
請求項１０〜１２の何れか1項に記載のDNA構築物が取り込まれ、該DNA構築物を具備する組換え植物ゲノム。
【請求項１８】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載のDNA構築物を具備する植物細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の植物細胞を具備する植物。
【請求項２０】
線虫に対して減少した感受性を有する請求項１９に記載の植物。
【請求項２１】
前記線虫が、根こぶ線虫、特にサツマイモネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）である植物。
【請求項２２】
アリマキ、特にマクロサイファム・ユーフォオービア（Macrosiphum euphorbiae）に対して減少した感受性を有する請求項１９に記載の植物。
【請求項２３】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載のDNA構築物を具備する種子。
【請求項２４】
植物細胞環境中に存在する請求項１７の組換え植物ゲノム。
【請求項２５】
病原体に対して減少した感受性を有する植物を得る方法であって、以下のステップ：
(1)請求項10〜12の何れか1項に記載のDNA構築物を植物細胞のゲノムに挿入することと、
(2)被形質転換細胞を得ることと、
(3)前記被形質転換細胞から遺伝的に形質転換された植物を再生すること、及び
(4)必要に応じて、前記植物を繁殖させること、
とを具備する方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記病原体が線虫、好ましくは、根こぶ線虫、特にサツマイモネコブセンチュウである方法。
【請求項２７】
前記病原体がアリマキ、好ましくはマクロサイファム・ユーフォービアである請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
栽培している植物を病原体の感染から守るための方法であって、
(1)請求項１０〜１２の何れか1項に記載のDNA構築物を植物のゲノムに供給することと、
(2)前記植物を増殖させること
とを具備する方法。
【請求項２９】
請求項１〜６の何れか１項に記載の核酸を単離する方法であって、以下のステップ：
(1)請求項１〜９の何れか1項に記載のDNA配列を用いて、植物のゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーをスクリーニングすることと、
(2)前記DNA配列にハイブリダイズするポジティブクローンを同定することと、
(3)前記ポジティブクローンを単離すること
とを具備する方法。
【請求項３０】
前記ライブリーが第一の植物に由来し、前記DNA配列が第二の植物に属する請求項２９の方法。
【請求項３１】
表３に図示されているAFLPマーカーPM02〜PM29のうちの少なくとも一つを同定するプライマーの組み合わせを用いて、請求項１〜９に記載の核酸を同定するための選択的制限断片増幅法。
【請求項３２】
前記プライマーの組み合わせがAFLPマーカーPM14を同定する請求項３１の方法。
【請求項３３】
請求項１〜９に記載の核酸の少なくとも一部に相当するDNA配列を具備するオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求項１〜９の何れか１項に記載のDNA配列に選択的にハイブリダイズするのに十分なサイズである請求項３３のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
前記DNA配列が、ヌクレオチド6921から始まり、ヌクレオチド7034で終わる配列に相当する請求項３４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
前記DNA配列が3’末端に存在し、好ましくは、DNAの合成を開始させ得る配列5’TGCAGGA-3’に相当する請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
前記DNA配列が3’末端に存在し、好ましくは、DNAの合成を開始させ得る配列5’TAATCT-3’に相当する請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３６に記載の第一のオリゴヌクレオチド及び請求項３７に記載の第二のヌクレオチドを具備するプライマーの組み合わせ。
【請求項３９】
請求項３３〜３７の何れか1項に記載のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを具備する診断用キット。
【請求項４０】
請求項３８に記載のプライマーの組み合わせを具備する診断用キット。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載の診断用キットを用いて、特に植物DNA中における請求項１〜９に記載のDNA配列の存在又は不存在を検出するための方法。
【請求項４２】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の組換えDNAの核酸の発現産物であるポリペプチド。
【請求項４３】
図7Aに示されている配列を有するアミノ酸配列、又は請求項１〜３の何れか1項に記載されている対応する相同性配列にコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１〜３の何れか１項のDNA配列の一部又は全部の転写物のリボ核酸配列を有するRNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐性遺伝子、DNA構築物、微生物、植物細胞、及び前記耐性遺伝子を具備する植物に関する。さらに、本発明は、線虫（nematodes）及び／又はアリマキ（aphids）に対して耐性を有する遺伝的に形質転換された植物に関する。さらに、本発明は、耐性遺伝子を同定するためのプライマー、前記プローブ及び／又はプライマーを具備する診断キットに関する。最後に、本発明は、前記耐性遺伝子によってコードされるポリペプチド及び該ポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病原体は、植物に感染することにより、植物及び植物の産物に多大な損害を与える原因となる。植物病原体又は害虫による感染の結果として引き起こされる植物の病気は、植物及び／又は植物の産物に損害を与え、生産量及び収穫を減少せしめ、ある地域において栽培し得る植物の種類を限られたものとし、その結果、栽培者に著しい（財産的）損害をもたらす。
【０００３】
植物の寄生性線虫は、全世界に分布し、それらの多くは、その生涯の大部分を表土層の中で過ごす。線虫が、植物の根を直接食べることによって引き起こされる損害は、さほど重要でないと考えられているが、いくつかの種（この中には、ネコブセンチュウ種（Meloidogyne）に属する根こぶ線虫、シストセンチュウ種（Heterodera種、Globodera種）に属するシスト線虫、及びNacobbus種のようなその他の線虫が含まれる）は、著しい損害及び経済的な穀物の損失をもたらす。根こぶ線虫も世界中に分布しているが、より暖かい気候の地域及び温室の中で、より頻繁に、且つより多く見出される。最も重要な根こぶ線虫種は、サツマイモネコブセンチュウ（M. incognita）、アレナリアネコブセンチュウ（M. arenaria）、キタネコブセンチュウ（M. hapla）、及びジャワネコブセンチュウ（M. javanica）、であり、このうちキタネコブセンチュウは、より温暖な気候の地域でもみられる。
【０００４】
機械による土壌の耕作、線虫駆除薬及び昆虫駆除薬を含む殺虫剤による化学的処理、又は輪作のような植物病原体を抑制するための種々の手段が存在する。しかし、ある種の植物病原体、特に線虫に対しては、これらの抑制手段は、感染及びその結果生じる病気から植物を保護するのには不十分である。唯一の有効な抑制手段は、植物宿主の耐性である（Russell, 1978, Plant Breeding for pest and disease resistance, Butterworths edit., 485pp）。一般的な植物病原体に対して耐性を有する栽培変種植物を開発して多量の殺虫剤を用いる必要を減らすこと、又は全くなくすことは、現代の植物育種家にとっての大きな最終目標の一つである。地中に投入された、又は穀物、樹木等に撒布された多量の殺虫剤の環境に対する悪影響は、毎年世界中で、著しいものとなっている。さらに、西洋諸国政府の規則は、ある種の殺虫剤の使用を規制し、又は禁止する場合さえある。それ故、一以上の病原体に対して耐性を有する植物、又は侵略者に対する感受性が減少した植物に対する必要性は、ますます切迫している。耐性植物の開発は、現代の植物栽培計画の重要な目標の一つである。ある病原体に対して感受性を有する植物の遺伝子型と耐性植物の遺伝子型と掛け合わせると、繁殖株（breeding line）の中に耐性表現型が導入される。
【０００５】
根こぶ線虫による損害は、主として、生殖力をもったメスに成長する幼生が、植物と共生し得る状態で植物の根に侵入することによって生じる。侵入後、幼生は、根細胞を巨大細胞に成長させ、その上で摂食する。感染すると、根に虫こぶ（gall）又は根こぶ（knot）が形成され、そうでなければ、植物の根は、妨害され、太くなり、成長が阻害される。このため根系は、水及び栄養素の吸収不全となり、植物の生育及び成長に損傷を与える。被感染植物に対する損傷は、弱った根組織を攻撃する寄生性の菌類によって、しばしば増大する。感染した植物は、成長が遅くなり、青白い色のより小さい葉を示し、矮小な低品質の果実、時には無果実となり、より暖かい気候においては、しおれてしまうことが多い（Agrios, 1988 in: Plant Pathology, Academic Press, Inc.）。根こぶ線虫によって引き起こされる損傷及び／又は収量の減少は、世界の全農業生産量に対して相当なものである。各植物群では、収量の損失は、25〜50%であり、作物が死滅することもあり得る。
【０００６】
温室では、根こぶ線虫は、線虫駆除薬による土壌の蒸気滅菌又は土壌の薫発消毒によって抑制することができる。田畑の条件下では、線虫駆除薬の使用によって抑制を達成し得る。しかし、このような使用は、ある場合には、きわめて継続的なものであり、化学物質は次第に議論の的となって、いくつかの国では、ある種の線虫駆除薬の使用が禁止されている場合すらある。
【０００７】
遺伝的に耐性遺伝子型を繁殖させることが、最も確実且つ有効な根こぶ病を抑制する方法である。多数の穀物種について、近縁の胚原質内の耐性を利用できることが報告されている（例えば、芋、綿、たばこ、麦、大豆、トマト、ナス、一般の豆類、及びアルファルファ）。第一に、利用可能な胚原質中の（既知の）耐性遺伝子の発生が限られていることにより、第二に栽培された穀物種と耐性保有近縁種間の掛け合わせに障害が存在することにより、第三に、線虫耐性vs.感受性スクリーニングテストは手間がかかり、多くの場合信頼性を欠くために、耐性繁殖（resistance breeding）の実現が妨げられる。それ故、耐性繁殖は、極めて困難又は達成不能であり、可能としても時間がかかる。
【０００８】
耐性遺伝子を上手く導入することは、トマトで実現されている。胚培養を用いて、近縁の野生種L. peruvianum(PI 128657)と掛け合わせた後に、耐性遺伝子Mi（Meloidogyne incognita）は、栽培されたトマト（Lycopersicon esculentum）の中に導入された。該Mi遺伝子は、様々なネコブセンチュウ種に対して耐性を与える（Fassuliotis, 1991 in: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.）。Mi耐性遺伝子は、単一遺伝子の優性遺伝子であり（Gilbert and McGuire, 1956, Proc. Am. Soc. Hortic. Sci. 68, 437-442）、トマトの第６染色体上に存在すると報告されている。Mi遺伝子座を具備する遺伝子移入された領域は、ポテトアリマキに対する耐性の供与に関連していることも推測されている（Macro- siphum euphorbia）（Kaloshianら、1995、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 622-625）。
【０００９】
植物は、病原体による侵害及び感染に対して複雑な防御機構を発達させてきた。これまでのところ、それらの防御系の正確な機構は、未だ解明されていない。
【００１０】
トマトの線虫耐性は、浸透した後に発現される。若い幼生が根に入り、摂食部位に固着した後に、線虫の頭に隣接して過敏性反応（HR;hypersensitive reaction）を引き起こし、その結果宿主細胞の局所的な死亡がもたらされる。このHRによって、線虫も被害を受け、死亡する（Fassuliotis, 1991, in: Genetic Improvement of Tomato, Springer Verlag edit.）。耐性がHR不適合性に基づいている他の病原体−植物の関係においてしばしばみられるように、sensu Flor遺伝子−遺伝子関係（gene-for-gene relationship）（1956, Adv. Gen. 8, 29-54）が存在するか否かは知られていない。
【００１１】
植物種のゲノムサイズが非常に大きいために（例えば、トマトは1000Mb（109塩基対の核DNA）のゲノムサイズ、トウモロコシは3000Mbのゲノムサイズ、麦は16×109塩基対以上にも及ぶゲノムサイズを有する）、遺伝子産物が未知の植物遺伝子を単離することは、極めて骨が折れ、困難である。これらの何十億もの塩基対の中から特異的な遺伝子を探索するのは、
(i) 所望の遺伝子に十分な分子マーカーが強固に結合してるとき、及び
(ii)利用可能な良い遺伝物質があるとき（Tanksleyら、1995、Trends in Genetics, 11, p63-68）
のみ実施可能である。
【００１２】
２、３の耐性遺伝子の単離が報告されているが、これらの耐性遺伝子の中には、線虫又はアリマキに対して耐性を有する宿主植物を与え得るものはない。このような耐性遺伝子の例は、アラビドプシスから得られたRPS2（avrRpt2を発現しているPseudomonas syringaeに対する耐性）、タバコから得られたN（タバコモザイクウイルスに対する耐性）、トマトから得られたCf-9（avr9を担持する、葉の菌類病原体Cladosporium fulvumに対する）、及びアマから得られたL6（葉さび病真菌レースに対する耐性）（Dangl, 1995, Cell 80, 363-366）である。
【００１３】
本発明は、単離された線虫耐性遺伝子を初めて提供し、さらに単離されたアリマキ耐性遺伝子を初めて提供する。さらに、本発明は、線虫とアリマキ、好ましくは、それぞれMeloidogyne incognitaとMacrosiphum euphorbiaeに対して減少した感受性を与える二重機能耐性遺伝子に関する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、植物中に存在し、発現されると、該植物に線虫及び/又はアリマキに対する耐性を与えることができるMi耐性遺伝子を具備する核酸に関する。さらに、本発明は、そのDNA配列が本明細書で開示されているMi耐性遺伝子に関する。本発明は、Mi耐性遺伝子によってコードされる遺伝子産物にも関する。さらに、本発明は、Mi耐性遺伝子を具備するDNA構築物、コスミド、ベクター、細菌株、酵母細胞、及び植物細胞に関する。別の側面では、本発明は、非形質転換植物に感染し得る線虫に対して耐性を有する遺伝的に形質転換された植物に関する。さらに、本発明は、Mi耐性遺伝子に相同な耐性遺伝子に関し、該遺伝子は、植物中に存在すると、病原体による感染に対する耐性を該植物に与えることができる。
【００１５】
さらに、本発明は、植物中に存在すると、該植物にアリマキに対して減少した感受性を与え得るMeu-1耐性遺伝子を具備する核酸に関する。特に、Meu-1耐性遺伝子は、Mi耐性遺伝子に相当する。とりわけ、Meu-1耐性遺伝子は、Mi耐性遺伝子と同一のヌクレオチド配列を有している。このように、本発明は、遺伝的に形質転換された植物にも関し、該植物は、アリマキ、特にポテトアリマキに対して減少した感受性を有し、好ましくは耐性を有する。
【００１６】
最後に、本発明は、前記耐性遺伝子の配列又はその一部に相当するオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドを具備する検出用キットに関する。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
以下の記述及び例の中で、多数の用語が明細書で使用される。このような用語に与えられる範囲を含めて、明細書及び請求の範囲の理解を明確且つ一貫したものにするために、以下の定義が与えられる。
【００１８】
−核酸：二本鎖DNA分子。核酸は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又はその他の任意のDNAであり得る；
−オリゴヌクレオチド：短い一本鎖DNA分子；
−プライマー：一般的に、プライマーという語は、DNAの合成を開始させることができる一本鎖DNA分子を指す。
【００１９】
−核酸ハイブリダイゼーション：ナイロン膜又はニトロセルロースろ紙のような支持体上の一本鎖DNAをハイブリダイズすることによって関連するDNA配列を検出する方法。相補的な塩基配列を有する核酸分子は、適切な条件下において、溶液中で混合されると二本鎖構造を再生する。たとえ、一方が支持体上に固定化されていても、二つの相補的一本鎖核酸の間で、二本鎖構造が形成されるであろう。サザンハイブリダイゼーション操作では、後者の状況が起こる；
−ハイブリダイゼーションプローブ：サザンハイブリダイゼーション操作で、あるDNA配列を検出するために、ラベルされたDNA分子又はハイブリダイゼーションプローブを、ナイロン膜又はニトロセルロースろ紙のような支持体に結合された分画したDNAと反応させる。前記ラベルされたDNAプローブと相補的なDNA配列を担持するフィルター上の領域は、リアニーリング反応の結果、それ自身がラベルされる。このようなラベリングを示すフィルター上の領域は、続いて、用いたラベルのタイプに従って、検出することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、一般的には、特異的なDNA配列を分子クローニングすることによって、又は合成オリゴヌクレオチドを合成することによって作成される。
【００２０】
−相同な配列：特定の配列と、少なくとも50%、好ましくは60%、より好ましくは70%、最も好ましくは80%、さらには90%の配列の同一性を有する配列であって、核酸に対して比較される配列の長さが、一般的には少なくとも120ヌクレオチド、好ましくは200ヌクレオチド、より好ましくは300ヌクレオチドであり、ポリペプチドに対して比較される配列の長さが、一般的に少なくとも40アミノ酸残基、好ましくは65アミノ酸残基、及びより好ましくは100アミノ酸残基である配列。あるいは、相同な配列とは、ストリンジェントな条件下で、ある配列とハイブリダイズし得る配列、及び／又は、あるDNA配列によってコードされるポリペプチドと実質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードするDNA配列、及び／又は、あるDNA配列によってコードされるポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列、及び／又は、前記ポリペプチドの主要な特性に実質的に影響を与えずに、あるポリペプチドのアミノ酸配列の中の幾つかのアミノ酸残基が変化したアミノ酸配列を指す；
−ストリンジェントな条件とは、ある配列に核酸配列をハイブリダイズさせる得るハイブリダイゼーション条件を指す。一般的には、高いストリンジェントな条件とは、約1Mの塩、好ましくは6×SSCを具備する溶液中、又は同様のイオン強度を有する任意の他の溶液中において、及び約0,1M若しくはそれ以下の塩、好ましくは0,2×SSCを具備する溶液中、又は同様のイオン強度を有する任意の他の溶液中において65℃で洗浄すると、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは約200又はそれ以上のヌクレオチドの核酸配列をある配列と約65℃でハイブリダイズさせ得るハイブリダイゼーション条件を指す。これらの条件は、約90%以上の配列同一性を有する配列の検出を可能とする。一般的には、より低いストリンジェントな条件とは、約1Mの塩、好ましくは6×SSCを具備する溶液中、又は同様のイオン強度を有する任意の他の溶液中において、及び約1Mの塩、好ましくは6×SSCを具備する溶液中、又は同様のイオン強度を有する任意の他の溶液中において室温で洗浄すると、少なくとも50ヌクレオチド、好ましくは約200又はそれ以上のヌクレオチドの核酸配列をある配列と約45℃でハイブリダイズさせ得るハイブリダイゼーション条件を指す。これらの条件は、50%までの配列同一性を有する配列の検出を可能とする。当業者であれば、これらのハイブリダイゼーション条件を修飾して、50〜90%の間の同一性を有する配列を同定することができるであろう；
−プロモーター：隣接したコード配列の転写に必要な制御配列を含有するコード配列の上流にある転写制御領域であり、5’未翻訳領域又は所謂mRNAのリーダー配列を含む；
−ターミネーター：転写を終結に導くコード配列の下流の領域であり、3’未翻訳領域とも呼ばれ、ポリアデニル化シグナルを含む；
−耐性遺伝子：図５に図示されているようなコード配列を具備する核酸、又はその一部、又は任意の対応する若しくは相同な配列；
−線虫(類)：サツマイモネコブセンチュウ、アレナリアネコブセンチュウ、又はジャワネコブセンチュウのようなネコブセンチュウ種、又はキタネコブセンチュウのような他の根こぶ線虫、Heterodera種、又はGlobodera種のようなシスト線虫、若しくはNacobbus種のような他の線虫、ポテトアリマキのような昆虫、又は他の任意の植物病原体若しくは害虫等の、本発明による耐性遺伝子を有する宿主を感染させることができない他の任意の遺伝子型（これらに限定されない）；
−耐性遺伝子産物；図５に図示されているようなアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその一部、又は任意の相同なアミノ酸配列；
−R0植物：形質転換実験から得られた一次再生体（primary regenerant）、形質転換された植物又はトランスジェニック植物とも表記される；
−R1株：自己増殖したR0植物の子孫；
−R2株：自己増殖したR1植物の子孫；
−R1BC株：R1植物と最初に形質転換実験に用いた遺伝子型の植物との戻し交雑の子孫。
【００２１】
本発明において、我々は、サツマイモネコブセンチュウ(Mi;Meloidogyne incognita)耐性遺伝子を同定し、単離することができた。該遺伝子は、サツマイモネコブセンチュウに耐性を有するトマトの遺伝子型からクローニングされた。本発明の単離されたMi耐性遺伝子は、アグロバクターを介した形質転換、又は他の任意の公知の形質転換法を用いて、感染性の宿主植物に転位することができ、植物病原体、特に線虫に対する耐性を宿主植物に与えることに関与している。宿主植物は、トマト、又は前記植物病原体によって感染される他の任意の遺伝子型であり得る。
【００２２】
本発明は、図５に図示されているMi耐性遺伝子を具備する核酸配列も提供する。
【００２３】
本発明のMi耐性遺伝子を用いると、該遺伝子は、感受性植物の遺伝子型を形質転換することにより、植物病原体又は害虫に対して減少した感受性又は好ましくは耐性を有する遺伝的に形質転換された植物が産生できるので、植物病原体及び／又は害虫に対する有効な抑制手段が得られる。特に、本発明のMi耐性遺伝子で遺伝的に形質転換された植物は、根こぶ線虫に対して減少した感受性を有する。
【００２４】
好適な実施態様では、Mi耐性遺伝子は、図５に示されたコード配列、又は任意の対応する若しくは相同な配列、又はcDNA配列、その前に存在するプロモーター領域、及びその後ろに存在するターミネーター領域を具備する。プロモーター領域は、植物細胞内で機能し得なければならず、Mi耐性遺伝子のネイティブなプロモーター領域に相当することが好ましい。しかしながら、植物細胞中で機能できれば、任意の異種性プロモーター領域をコード配列とともに使用できることを認識すべきである。CaMV 35 Sプロモーター又はT-DNAプロモーターのような構成性プロモーターを用いることが好ましく、全て当業者に周知である。さらに、適切なターミネーター領域は、植物細胞中で機能できなければならず、全て当業者に周知である。
【００２５】
さらに、本発明は、本発明のMi耐性遺伝子によってコードされ、図５及び図7Aに示されている推定アミノ酸配列を有するMi耐性遺伝子産物、又は推定アミノ酸配列の相同物、若しくはその一部に関する。さらに、Mi耐性遺伝子産物又は図7Bの末端切断されたポリペプチドは、これに対する抗体を作成するために使用することができ、該抗体は、Mi耐性遺伝子産物の存在を検出するために使用し得る。
【００２６】
本発明の別の側面では、Mi耐性遺伝子は、図5に記載されたDNA配列の一本鎖に相補的なオリゴヌクレオチド又はその一部であり、従って、検出を可能とするためにラベルされた状態で、相同な遺伝子を得るためにゲノムDNAライブラリー又はcDNAライブラリーをスクリーニングをするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用することができるオリゴヌクレオチド又はその一部をデザインするのに使用し得る。ストリンジェントな条件下で、プローブにハイブリダイズすることができ、通常の状態では植物に感染する植物病原体に対する該植物の感受性を減少させるか、又は植物に耐性を与えることに関与する遺伝子産物をコードする相同な配列は、本発明の範囲に属する。
【００２７】
本発明の別の側面では、オリゴヌクレオチドは、サザン分析のハイブリダイゼーションプローブとして使用できるようにMi耐性遺伝子配列に基づいてデザインされる。これらのプローブは、耐性遺伝子を有する植物の遺伝子型と耐性遺伝子を欠く植物の遺伝子型を区別するための分子マーカーとして使用することができる。このようなプローブは、選別における付属的なツールとして使用し得る。本発明の好適な実施態様では、オリゴヌクレオチドは、増幅産物の形成が、ある植物の遺伝子型におけるMi耐性遺伝子の存在の指標となる、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅反応でプライマーとして使用できるように、Mi耐性遺伝子配列に基づいてデザインされる。本発明のある実施態様では、前記プライマーは、Mi耐性遺伝子配列に近接して連鎖した多型断片（所謂分子マーカー）を増幅せしめる。
【００２８】
好適な実施態様では、前記プライマーは、Mi耐性遺伝子に近接して連鎖したAFLPマーカーを同定するための選択的制限断片増幅において用いられる。本発明は、調査している遺伝子型にMi耐性遺伝子が存在するか否かを検出するための、本発明のオリゴヌクレオチドを具備する診断キットにも関する。このような診断キットによって、遺伝子型が耐性遺伝子を有しているかどうかをスクリーニングするために、骨の折れる疾病アッセイの使用が回避される。
【００２９】
さらに、本発明は、Mi耐性遺伝子のコード配列及び植物細胞中で機能できる制御配列に相当するDNA配列を具備するDNA構築物に関し、前記DNA配列は、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、又は他の任意の起源のDNAであり得る。前記制御配列は、Mi耐性遺伝子のコード配列と同種又は異種の何れでもよい。前記DNA構築物は、配列が図5に示されている核酸、又はその一部を具備する。
【００３０】
本発明は、制御配列、より好ましくは前記制御配列とは異種性の構造遺伝子配列とともに、Mi耐性遺伝子のプロモーター領域を具備するDNA構築物にも関する。
【００３１】
本発明は、本発明のDNA構築物を具備するDNAベクターにも関する。適切なベクターは、クローニングベクター、形質転換ベクター、発現ベクターなどであり得、これらは当業者に周知である。
【００３２】
さらに、図５に記載されている配列に相当するDNA配列又はその一部を具備するベクターを保有する細胞、又はこれに相同な細胞は、本発明の範囲にある。さらに、本発明のDNA構築物を担持する細胞は、本発明の範囲にある。
【００３３】
本発明の好適な実施態様では、線虫に感受性を有する植物のゲノム中にMi耐性遺伝子を導入することによって、標準的な形質転換技術を用いて、遺伝的に形質転換された植物を得ることができ、該遺伝的に形質転換された植物は、線虫に対して耐性を有する。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、Mi耐性遺伝子は、一般的に知られた形質転換技術を用いて、メロン、タバコ、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、ポテト、砂糖大根、セイヨウアブラナの種子(rapeseed)、キュウリ、コショウ、ナスのような異種性システム（これらに限定されない）に転位することができる。異種性システム（heterologous system）とは、そこから耐性遺伝子が単離された植物種とは別の植物種を指す。
【００３５】
本発明のさらに別の実施態様では、Mi耐性遺伝子は、Macrosiphum euphorbia (Meu-1)耐性遺伝子に相当し、本発明の遺伝子で形質転換された植物に、昆虫、特にアリマキに対する耐性を与えることに関与する。
【００３６】
本発明で与えられるMi耐性遺伝子を具備するDNA配列には、多数の利用法があり、その中の幾つかは、本明細書に記載されているが、これは本発明の範囲を限定するものではない。
【００３７】
本発明は、根こぶ線虫に対して耐性を有するトマト株に存在するMi耐性遺伝子の単離の観点から、さらに詳細に記述する。Mi耐性遺伝子を単離するために、我々は、以下のステップ：
(1)Mi耐性遺伝子に連鎖した分子マーカーの同定、
(2)高分子量ゲノムYACライブラリーの構築、
(3)YACクローン上の分子マーカーの物理的地図及びYACコンティグの建築、
(4)前記連鎖した分子マーカーを保有するTACクローンのコスミドライブラリーの構築、
(5)物理的精密地図及びコスミドコンティグの建築、
(6)根こぶ線虫に感受性を有するトマト突然変異体の遺伝学的特定、
(7)コンティグを形成しているコスミドによる感受性植物の形質転換、
(8)相補性分析
を具備する地図に基づいたクローニング（位置のクローニング）戦略を用いた。
【００３８】
分子マーカーを同定するために、我々は、選択的制限断片増幅技術を用いたが（以下AFLPTM技術と称する）、これは、多数のDNA断片の複雑な混合物からDNA断片のサブセットをランダムに増幅し、該増幅された断片が、分析され得るフィンガープリントを作出する。一般的には、同一の植物種の異なる遺伝子型のトータルDNAにAFLP技術を適用し、異なる遺伝子型から得られた異なるAFLPフィンガープリントを比較する。ある遺伝子型に存在し、別の遺伝子型には存在しない断片は、多型断片であり、AFLPマーカーと呼ばれる。AFLP反応における選択性は、制限酵素部位のヌクレオチドに直接隣接したPCRプライマーの3’末端のランダムに選ばれた選択的ヌクレオチドを用いることによって得られる。AFLPスクリーニングでは、調べるDNAに様々なプライマーの組み合わせを適用する。異なるプライマーの総量は、3’末端に付加された選択的ヌクレオチドの数によって決定される（1つの選択的ヌクレオチドで4プライマー、2つの選択的ヌクレオチドで16プライマー、3つの選択的ヌクレオチドで64プライマー）。もし、二つの異なる制限酵素を用いれば、プライマーの量は2倍である。これらのプライマーは、異なる組み合わせで用いることができる。もし、全ての可能な組み合わせがAFLPスクリーニングで用いられるならば、存在する全ての断片は、該プライマーの組み合わせの一つによって増幅されねばならないであろう（Zabeau＆Vos, EP 0534858）。
【００３９】
Mi耐性遺伝子に連鎖したAFLPマーカーを同定するために、種々のトマト株をAFLPスクリーニングにかけた。第一のステップでは、以下のプライマー：
PstI-プライマー： 5’-GACTGCGTACATGCAGNN-3’
MesI-プライマー： 5’-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3’
を用いるAFLPフィンガープリンティングによって分析した。
【００４０】
Nは、選択的可変ヌクレオチドを示す。AFLPスクリーニングでは、PstIプライマーについては16個の可能なプライマー、MseIプライマーについては64個の可能なプライマーを全て、殆ど同質遺伝子的な二組の株に対して用いた（合計16×64＝1024のプライマーの組み合わせをテストした）。全てのAFLPフィンガープリントを分析すると、Mi耐性遺伝子に連鎖した合計30のAFLPマーカーの候補が同定された。続いて、確認のため、及びMi遺伝子座への連鎖距離を求めるために、一群の線虫耐性トマト株及び線虫感受性トマト株に対して、これらの候補マーカーをテストした。Mi耐性遺伝子は、1944年にLycopersicon peruvianumから栽培されたトマトに遺伝子移入された。Mi耐性遺伝子を有するLycopersicon peruvianumから小さな遺伝子移入された領域が得られることを予期して、現在の線虫耐性トマト株には、多くの回数のかけあわせが行われてきた。AFLPマーカー候補をこれらの現代のトマト遺伝子型に対してテストすれば、Mi遺伝子座との近接な連鎖を評価するための良いテストになると予想される。7個の耐性トマト遺伝子型及び11個の感受性トマト遺伝子型は、候補AFLPマーカーを用いてテストした。合計20のAFLPマーカーは、全ての耐性株中に存在するようであり、全ての感受性株中に存在していないようであったので、Mi連鎖AFLPマーカーと称する。
【００４１】
次に、高分子量ゲノムライブラリー上で、該AFLPマーカーのうち4つをスクリーニングした。酵母中の巨大人工染色体として、極めて大きなDNAのセグメントをクローニングすることは、ポジショナルクローニングを介した遺伝子を単離する上での不可欠なステップとなっている。YACベクターのクローニング能力は、100万塩基対に達する長さのDNA断片の単離を可能とする。YACライブラリーを構築するために、DNAの入手源として、Mi遺伝子座がホモ接合であるトマト株Lycopersicon peruvianum E22を用いた。我々は、平均挿入サイズ520kbの3840クローンを含有し、トマトゲノムの約2.2ゲノム分に相当するYACライブラリーを得た。Mi連鎖AFLPマーカーによるAFLPスクリーニングの後に、3つの陽性YACクローン1/1084、1/1172、及び2/1256を得た。次に、3つのYACクローンの中で、Miに連鎖した全AFLPマーカーの存在を確認した。全てのマーカーが、該3つのYACクローンのうちの１つ以上に存在しているようであり、これによって、様々なMi連鎖AFLPマーカーのポジショニングが初めて可能となった。AFLPデータは、該3つのYACクローンは、約1.4Mbの重複するコンティグを構成していることを示していた（図1参照）。
【００４２】
Mi連鎖AFLPマーカーを具備し、YACクローン1/1084、1/1172、及び/又は2/1256中に含まれたMi遺伝子座の物理的サイズを決定するために、YACコンティグの広域制限地図を構築した。これによって、全Mi連鎖AFLPマーカーが存在する約700kbのMi遺伝子座を具備するDNAセグメントが決定された（図１参照）。
【００４３】
700kbのサイズは、Mi耐性遺伝子の位置を直接決定するには、まだ大きすぎる。このような大きな挿入物は、植物細胞中に直接形質転換することができない。それ故、アグロバクターを介した形質転換に適するコスミドベクターを用いて、YAC 1/1172を含有する酵母株のコスミドライブラリー、及びYAC 2/1256を含有する酵母株のコスミドライブラリーを構築した。該バイナリーコスミドベクターのサイズは、29kbであり、図２に図示されている。λファージパッケージング抽出物を用いると、該バイナリーコスミドベクターのクローニング能力は、9〜24kbの範囲である。サイズ分画した酵母DNAから、各々約250,000コスミドのクローンのバンクを二つ得た。ラベルしたYACの制限断片をプローブとして用いて、コロニーハイブリダイゼーションによりコスミドバンクをスクリーニングした。ポジティブコスミドクローンを同定し、さらにMi領域をカバーする明らかになった７つの領域に、該コスミドをグルーピングした。
【００４４】
次のステップで、制限断片増幅を用いて。該７つの明らかになった領域のコスミドの組みにフィンガープリントを施し、それらの相対的な順序を決定した。約700kbのDNAセグメントをカバーするコスミドコンティグを構築することができた。続いて、該コスミドコンティグ中に、Mi連鎖AFLPマーカーが存在することが確かめられた。様々なMi連鎖AFLPマーカーの位置とともに、Mi耐性遺伝子を具備するDNAセグメントの物理的地図を得た（図３参照）。
【００４５】
合計96の重なり合うコスミドは、Mi耐性遺伝子を具備するDNAセグメントを構成していた。このような多数の組のコスミドを用いて、Mi耐性遺伝子を同定するための相補性分析は、きわめて骨の折れる仕事である。それ故、コスミドコンティグ上のMi耐性遺伝子の位置は、変異トマト株を用いて決定した。これらの変異株は、共通の祖先から生じたファミリーのメンバーであり、突然変異した線虫感受性表現型以外は野生型（線虫耐性）Mi遺伝子型を含有していた。Mi連鎖AFLPマーカーの組を用いて、これら多数の変異株に対して分析を行うと、殆どの突然変異体で３つのMi連鎖AFLPマーカーが欠如しているようであった。それ故、これらのAFLPマーカーは、他の全ての17個のAFLPマーカーとは対照的に、AFLP Mi遺伝子型とMi表現型に良い相関を示した。これらのAFLPマーカーのうち２つ（PM14とPM25）は、隣接しており、これらのマーカーの周囲の領域は、Mi耐性遺伝子の位置である可能性が最も高いと思われた。相補性分析のために、AFLPマーカーPM14とPM25周囲の約50kbのDNAセグメントを決定する６組の重複するコスミドを選択した（図４参照）。
【００４６】
ポジショナルクローニングを介したMi耐性遺伝子の同定における最初のステップは、対応する感受性表現系の相補性である。三親性の（tri-parental）接合性移入を通じてMi領域候補から取得した6つのコスミドを根頭がんしゅ病菌に導入した。根頭がんしゅ病菌株にコスミドが存在することは、根頭がんしゅ病菌株の様々な制限酵素パターン及びDNAフィンガープリントと該コスミドを含有する大腸菌株とを比較して決定した。対応する大腸菌培養と同一のDNAパターンを有するコスミドを保有する根頭がんしゅ病菌培養のみを用いて、感受性トマト株を形質転換した。標準的形質転換法を用いて、コスミドMi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01、及びMi-14により感受性トマト株を形質転換した。
【００４７】
耐性遺伝子を有するコスミドを同定するために、インビトロで栽培した被形質転換R0植物の根に対して、疾病の症候をテストした。ペトリザラ中の固形培地上に根の外植体を移して、根こぶ線虫であるサツマイモネコブセンチュウの無菌線虫培養から得た10個の根こぶを接種した。接種後6週間、疾病の症候のスコアをつける。トランスジェニック植物の根培養上に、根こぶが全く見られないとき、又は1個見られるとき、耐性であると考えられる。トランスジェニック植物の根培養上に、根こぶが少なくとも２個生じているときには、感受性であると考えられる。インビトロ疾病アッセイの観察によって、2つのコスミドが感受性表現型を相補し得ることが明らかとなった。耐性R0植物中に、AFLPマーカーPM14が存在することは、コスミドMi-11とMi-18中に存在するゲノムインサートが、R0植物中にも存在し、サツマイモネコブセンチュウに耐性なR0植物を与えることに関与していることを示していた。
【００４８】
R1株を得るための種子を得るために、形質転換実験の初代再生体（R0植物）を温室の中で育て、R1株に対して疾病の症候をテストした。該疾病アッセイは、苗木上で行う。それ故、サツマイモネコブセンチュウに感染させた土壌の中に、種を蒔くか、又は小根にした苗を移し、接種後4〜８週後に、疾病の症候のスコアを付ける。３個以下の根こぶが根に見られるときに、植物を耐性であると考える。３個を超える根こぶが根に形成されているときに、植物を感受性であるとする。インビボ疾病アッセイの観察により、耐性R0植物がコスミドMi-11形質転換体に相当することが明らかとなった。
【００４９】
トランスジェニックR0植物のゲノム中にMi耐性遺伝子が安定に取り込まれていることを確認するために、R1株の耐性植物を自己増殖させて、R2株を得るための種子を得るために、温室中で育てた。R2株の苗木をインビボ線虫病アッセイに供した。得られた結果は、Mi耐性遺伝子が安定に遺伝されていることを示していた。
【００５０】
最後に、コスミドMi-11及びMi-18中のインサートの特性をさらに決定した。配列決定分析によって、3621ヌクレオチドの巨大な読み取り枠（ORF2）が明らかとなった。DNA配列は、図５に掲載されている。
【００５１】
さらに、イントロン配列の存在を決定するために、Mi耐性遺伝子を具備する該DNA配列を転写物のマッピング研究に供した。これらの転写物マッピング研究は、ゲノムDNA配列をcDNA配列と比較する、一般に知られた方法に従って行う。cDNA配列とゲノム配列の比較によって、Mi耐性遺伝子中に二つのイントロン配列が存在していることが明らかとなった。図５に図示されているように、1306ヌクレオチドの一方のイントロンは、ヌクレオチド位置1936〜3241位に位置し、75ヌクレオチドの他方のイントロンは、ヌクレオチド位置3305〜3379位に位置する。転写開始部位の位置は、1880位のヌクレオチド又はその上流に存在すると推測されている。第一のATG開始コドンは、ヌクレオチド位置3263に存在し、これは、第二のイントロンの52ヌクレオチド上流にあって、1257アミノ酸のポリペプチド（図7A）をコードする巨大な読み取り枠(ORF1)を与える。
【００５２】
相同性検索によって、本発明のポリペプチドが、LRRクラスの植物耐性タンパク質に属することが示された（Staskawiczら、1995、Science、 268、661〜667）。さらに、該タンパク質は、A〜Dと表示される4つの領域に分割することができ、領域Aは多量のロイシン残基を具備し、領域Bはヌクレオチド結合部位モチーフを具備し、領域Cは以下のコンセンサス配列：  a--a-NL--L-a-----a--a/S---（Jones & Jones、1997、Advances in Botanical Research, 24, 89-167）を有する13のリピートを具備するPRP領域であり、領域Dは何れの公知のタンパク質とも相同性を有していない。
【００５３】
本発明の範囲に属する相同性配列を同定し、単離するために、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Mi耐性遺伝子のコード配列をプローブとして用いて、ゲノムDNAライブラリー及びcDNAライブラリーをスクリーニングした。ポジティブクローンを単離して、相補性分析に用いた。
【００５４】
Mi耐性遺伝子のコード配列の内部PstI断片を用いて、YACコンティグ上でのサザンブロットハイブリダイゼーションを行った。さらに三つの相同性領域（二つはYAC 1/1172、及び一つはYAC 1/1084）を同定することができた。各領域は、2〜3のMi相同体を具備し、Mi遺伝子ファミリーが約10〜12のメンバーから構成されているという事実を示している。
【００５５】
驚くべきことに、アリマキ疾患アッセイによって、コスミドMi-11で形質転換したR0植物は、サツマイモネコブセンチュウ及びMacrosiphum euphorbiaeに耐性を示し、コスミドMi-11中に存在するゲノムインサートが、R0植物に線虫への耐性を与え、且つR0植物にアリマキへの耐性を与えるのに関与していることを示している。特に、本発明の耐性遺伝子を形質転換された植物は、少なくとも一以上の病原体、特に根こぶ線虫及び/又はアリマキに対して減少した感受性を有する。
【００５６】
アリマキ耐性の遺伝を確認するために、
(1)線虫耐性コスミドMi-11形質転換体に由来する、以前に得られたR1トマト株
(2)自己増殖した線虫耐性R1植物由来のR2株
(3)感受性トマト株52201と戻し交雑した線虫耐性R1植物から得たR1BC株
もM. euphorbiaeに対する耐性をテストした。得られた結果は、アリマキの耐性が遺伝することを示していた。
【００５７】
一般的に知られた形質転換法に従って、線虫感受性遺伝子型のタバコ及びポテトを形質転換するためにコスミドMi-11を用いた。インビトロで栽培した形質転換されたタバコ及びポテトのR0植物の根は、本明細書で先述したように疾病の症候をテストした。形質転換された植物の根培養に対する疾病アッセイの観察によって、形質転換された植物に、線虫への減少した感受性を与えるのにコスミドが関わっていることが示された。本発明の耐性遺伝子は、異種植物種の線虫、好ましくはネコブセンチュウ種、特にサツマイモネコブセンチュウに対する感受性を減少させる効果を有する。
【００５８】
さらに、タバコ形質転換体のアリマキ耐性についてもテストし、耐性R0植物を同定することができた。
【００５９】
本発明の耐性遺伝子は、二つの機能を有し、異種のシステム中で効果を有する。
【００６０】
コスミドMi-11は、プラスミドpKGMi-11として、1996年8月5日に、寄託番号CBS822.96.で、オランダ、バーン（Baarn）、のCBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）に寄託した。
【００６１】
コスミドMi-18は、プラスミドpKGMi-18として、1996年8月5日に、寄託番号CBS821.96.で、オランダ、バーン（Baarn）、のCBS（Centraalbureau voor Schimmelcultures）に寄託した。
【００６２】
以下の例は、本発明をさらに説明するためのものであり、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６３】
例１：疾病アッセイ
トマト栽培変種植物マネーメーカー（Moneymaker）の滅菌した根の上で、根こぶ線虫であるサツマイモネコブセンチュウの無菌培養を生育させる。2%のしょ糖を加え、ホルモンを除いた固形B5培地上で、該根培養を増殖させる（Gamborgら、1968、Experimental Cell Research 50: 151〜158）。
【００６４】
インビトロで栽培したトランスジェニックトマト植物から得た根の外植体（1〜5cm）を上記の固形B5培地上に移して、根培養を開始する。同時に、各根の外植体に無菌線虫培養からの根こぶを10個接種する。該根こぶは、根の外植体から2〜3cmのところに置く。根と根こぶを入れた該ペトリ皿を暗闇の中で25℃でインキュベートする。4〜6週間後、根の培養上に生じた根こぶの数をカウントすることによって、感染のレベルを決定する。
【００６５】
サツマイモネコブセンチュウに対する耐性／感受性の評価は以下のとおりである。すなわち、根の培養上に2未満の根こぶが見られるときには、トランスジェニック植物は耐性と考えられる。根の培養上に少なくとも二つの根こぶが生じたときには、トランスジェニック植物は感受性であると考えられる。
【００６６】
例２：Mi耐性遺伝子を具備するDNAセグメントに連鎖したAFLPマーカーの同定
トマト株（Lycopersicon esculentum）
AFLPマーカーを同定するために、サツマイモネコブセンチュウに耐性を示す計9個のトマト株、及びサツマイモネコブセンチュウに感受性を示す計13個のトマト株を用いた。最初に、二組の殆ど同質遺伝子的な株83M-R（耐性）と83M-S（感受性）、及びMotelle（耐性）とMobox（感受性）上で、AFLPスクリーニングを行った。該最初のスクリーニングから得られた候補マーカーは、７つのサツマイモネコブセンチュウ耐性株及び11のサツマイモネコブセンチュウ感受性株での第二のスクリーニングによって確認した。
【表Ａ】
2008289481.tif 000002
【表Ｂ】
2008289481.tif 000003
DNAの単離及び修飾
Bernatzki及びTanksley（Theor. Appl. Genet. 72, 314-321）によって記載されているように、上述した22株からのトマトの全DNAを幼若な葉から単離した。典型的な収量は、新鮮な葉材料1グラム当たり50〜100μgのDNAであった。Zabeau & Vos (European Patent Application, EP 0534858)によって記載され、以下で簡潔に述べられているように、PstI-MseIという酵素の組み合わせによるAFLP分析用のテンプレートDNAを調製した。
【００６７】
40μLの10mM Tris. HAc pH 7.5, 10mM MgAc, 50mM KAc, 5mM DTT, 50ng/μL BSA中のPstI５ユニット及びMseI５ユニットとともに、0.5μgのトマトDNAを37℃で1時間インキュベートした。次に、5pmolのPstI-アダプター、50pmolのMseI-アダプター、T4 DNAリガーゼ1ユニット、10mM Tris.HAc pH 7.5中の1mM ATP、50mM KAc、5mM DTT、50ng/μL BSAを含有する10μLの溶液を添加し、37℃で3時間インキュベーションを続けた。アダプターを以下に図示する。
【００６８】
PstI-アダプターの構造は、
5’-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3’
3’-CATCTGACGCATGT-5’
MseI-アダプターの構造は、
5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’
3’-TACTCAGGACTCAT-5’
アダプターは、等モル量の両鎖を添加することによって調製した。アダプターは、リン酸化しなかった。連結した後、10mM Tris. HCl, 0.1mM EDTA pH 8.0を用いて反応混合物を500μLまで希釈し、-20℃で保存した。該希釈した反応混合物は、さらにテンプレートDNAと称する。
【００６９】
AFLP反応
AFLPスクリーニングに用いたプライマーを以下に図示する。
【００７０】
PstI-プライマー：    5’-GACTGCGTACATGCAGNN-3’
MseI-プライマー：    5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3’
プライマー中のNは、プライマーの該部分が可変であることを示す。AFLPスクリーニングでは、16の可能なプライマーをPstI-プライマーとして用い、64の可能なプライマーをMseI-プライマーとして用いた。これによって、合計16×64、すなわち1024のPstI-及びMseI-プライマーの組み合わせが得られた。Mi連鎖AFLPマーカーのAFLPスクリーニングでは、全部で1024のプライマーの組み合わせを用いた。AFLP反応は、以下のとおりに行った。
【００７１】
AFLP反応には、放射線ラベルしたPstI-プライマー、及びラベルされていないMseI-プライマーを利用した。PstI-プライマーは、(γ-33P)ATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端標識した。ラベリング反応は、500ngのオリゴヌクレオチドプライマー、100μCi(γ-33P)ATP，及び10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、50μLの25mM Tris HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 5mM DTT, 0.5mM スペルミジン3HCl中で行った。AFLP分析のために、ラベルしたPstI-プライマー5ng（ラベリング反応混合物から0.5μL）、MseI-プライマー30ng、テンプレートDNA 5μL、Taqポリメラーゼ0.4ユニット、10mM Tris. HCl pH 8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.2mMの4種類全てのdNTPを含有する20μLの反応混合物を調製した。AFLP反応は、以下のサイクルプロフィール：「94℃でのDNA変性ステップ30秒、アニーリングステップ30秒（下記参照）、及び72℃での1分間の伸長ステップ」を用いて行った。第一サイクルでのアニーリング温度は65℃であり、引き続き、次の12サイクルでは各サイクルにつき0,7℃毎アニーリング温度を下げ、残りの23サイクルは56℃で続けた。全ての増幅反応は、PE-9600サーモサイクラー（パーキンエルマー社、Norwalk、CT、USA）で行った。
【００７２】
AFLP反応産物のゲル分析
増幅後、反応産物を等量(20μL)のホルムアミド色素（98%ホルムアミド、10mM EDTA pH 8.0、並びに追跡用色素としてブロモフェノールブルー及びキシレンシアノール）と混合した。得られた混合物を90℃で3分間加熱した後、氷上で急冷した。5%の変性（配列決定）ポリアクリルアミドゲル（マキサム＆ギルバート、Methods in Enzymology 65, 499〜560）に、2μLの各サンプルを載せた。50mM Tris.50mM ほう酸/1mM EDTA中の5%アクリルアミド、0.25%メチレンビスアクリル、7.5M尿素を用いて、ゲルマトリックスを調製した。100mLのゲル溶液に、500μLの10% APS及び100μLのTEMEDを加え、SequiGenの 38×50cmゲル装置（Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA）を用いて、ゲルを注ぎ込んだ。サメ歯型のコームを用いて、SequiGenゲルユニットに97個のレーンを得た。展開用緩衝液として100mM Tris/100mM ほう酸/2mM EDTAを用いた。電気泳動は、110Wの定電力で、約2時間行った。電気泳動後、10%の酢酸中で30分間ゲルを固定化し、ガラスプレート上で乾燥して、フジのホスホイメージスクリーンに16時間曝した。フィンガープリントパターンは、フジBAS-2000ホスホイメージ分析システムを用いて可視化した（フジ写真フィルム株式会社、日本）。
【００７３】
連鎖したマーカーのAFLPスクリーニング
ほぼ同質遺伝子の二組の株に対して、1024の可能なPstI-MseIプライマーの全組み合わせを用いて、AFLPスクリーニングを行った。目的は、両耐性株に存在し、両感受性株に存在しないAFLPマーカーを同定することであった。AFLPゲルは、4つの同質遺伝子株の24プライマーの組み合わせを含有し、合計43のゲルを与えた。両耐性株に存在し、両感受性株に存在しない合計30のAFLPマーカーが同定された。これらのマーカーは、Mi連鎖AFLPマーカー候補と称する。
【００７４】
次に、30の候補マーカーの存在を決定するために、7つの耐性トマト株及び11の感受性トマト株に対してAFLP反応を行った。30のマーカー候補のうち、20マーカーが、7つの耐性株に存在し、且つ11の感受性株には存在しないと思われた。Mi耐性遺伝子をマップするために、さらなる研究で、これらの20のマーカーを用いた。20のPstI-MseIマーカーを同定するために必要とされるプライマーの組み合わせを表１に示す。プライマーの組み合わせの欄では、「PstI-」は配列5’-GACTGCGTACATGCAG-3’を表し、「MseI-」は配列 5’-GATGAGTCCTG AGTAA-3’を表す。例えば、マーカーPM14は、以下の配列： 5’-GACTGCGTACAT GCAGGA-3’を有するPstI-プライマー及び以下の配列：5’-GATGAGTCCTG AGTAATCT-3’を有するMseI-プライマーを用いて同定し得る。
【表Ｃ】
2008289481.tif 000004
例３：トマトYACライブラリーの構築及びスクリーニング
材料
YACライブラリーを構築するためのDNA源として、Mi遺伝子座がホモ接合のトマト株Lycopersicon esculentum E22（Enza Zaden）を用いた。2〜3週齢のインビトロ若芽の葉から、Van Daelenら（Plant Mol. Biol. 12, 341〜352）に記載されているように、プロトプラストを分離した。
【００７５】
生存可能なプロトプラスト（mL当たり5千万プロトプラストの濃度）を集めて、等容量のアガロースと混合し（1%、Seaplaque、FMC Bioproducts、Rockland, Maine, USA）、プラグを形成させた。溶解混合液（0.5M EDTA、1% N-ラウリルサルコシネート、及び1mg/mLプロテイナーゼK, pH=8.0）で、プラグ中に埋め込まれたプロトプラストを溶解させた。溶解後、使用するまで、該プラグを保存用緩衝液中（新鮮な溶解混合液）に4℃で保存した。約4.5μgの染色体DNAを得るために、プラグ当たり約３百万のプロトプラストをさらなる研究に用いた。ユニークなEcoRIクローニング部位を含有するプラスミドpYAC4をクローニングベクターとして使用し、プラスミド酵母株AB1380を宿主として用いた（Burkeら、Science 236, 806〜812）。
【００７６】
YACライブラリーの構築
高分子量DNAの単離、EcoRIメチラーゼ存在下でのEcoRIによる部分消化、ゲノムDNAへのベクターアームの連結、パルスフィールドゲル電気泳動によるサイズ選別、酵母宿主の形質転換は、Burkeら（Science 236, 806〜812）、及びLarinら（Proc Natl Acad Sci USA 88, 4123〜4127）に記載されているように行った。
【００７７】
標準的な操作は全て、Sambrookらの分子クローニング：ラボラトリーマニュアル（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているように行った。
【００７８】
最終的に、520kbの平均インサートサイズを有する3840（これは2.2ゲノム分に相当する）を得て、75μL YPD溶液（1%酵母抽出液、2%ペプトン、及び2%デキストロース）を含有する40個の96穴ミクロタイタープレート中に各クローンを保存した。
【００７９】
YACライブラリーのスクリーニング
扱うサンプルの数を減らすために、１つの96穴マイクロタイターの細胞をプールし（プレートプール）、Rossら（Nucleic Acids Res., 19, 6053）によって記載されているようにDNA単離のために用いた。2.2ゲノム相当のトマトYACライブラリーは、40の96穴ミクロタイターウェルからなり、その結果、例２に記載したAFLPプロトコールを用いて、該40個のプレートプールをAFLPマーカーPM10、PM13、PM21、及びPM25でスクリーニングした。YACプレートプールをスクリーニングするために、PM10、PM13、PM21、及びPM25を選択したが、これらのマーカーは、酵母株AB1380のバックグラウンドバンドを妨害しないからである。表２に示されているこれら４つのAFLPマーカーを用いて、40のプレートプールから３つのポジティブプレートが同定された。続いて、YACクローンの正確なアドレスを見出すために、４つのAFLPマーカー（PM10、PM13、PM21、及びPM25）を用いた、各プレートの96の各YACクローンの第二スクリーニングを使用した。３つの各YACクローンが同定され、1/1084、1/1172、及び2/1256（表2）と表記した。続いて、残りのAFLPマーカーを用いて、該３つの各YACクローンを分析した。同定されたマーカーPM02〜PM29は全て、一以上のこれら３つのYACクローン上に存在した（表３）。YACクローンのサイズは、CHEF（contour-clamped homogeneous electric field；Chuら、Science, 235, 1582〜1585）を用いたパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）によって決定し、それぞれ、470kb（1/1084）、570kb(1/1172)、及び500kb(2/1256)であると思われた。
【表Ｄ】
2008289481.tif 000005
【表Ｅ】
2008289481.tif 000006
例４：Mi YACコンティグの広域物理的地図の構築及びAFLPマーカーの位置
制限酵素SfiI及びBssHIIの濃度を徐々に増加させながら、3つのYACクローン1/1172、2/1256、及び1/1084を部分消化にかけた。PFGEによってサンプルを分画し、ジーン・スクリーン・プラス膜（DuPont NEN, Boston, MA, USA）に転写して、Burkeら（Science 236, 806〜812）に記載されているように、間接末端ラベルマッピングのプロトコールに従って、末端隣接配列プローブ（end-adjacent sequence probe）を用いるハイブリダイゼーションによってアッセイした。図１に示されているように、酵素SfiI及びBssHIIに対するYAC 1.1172、2/1256、及び1/1084の物理的地図を構築することができた。得られた制限断片を３つのYACクローンの消化物へのプローブとして用いるサザンブロット分析によって、様々なYACクローン間の重複が決定された。1.4Mbのサイズを有するYACコンティグを構築することができた。YAC断片を単離するために、該消化物をPFGEにかけた。SfiIによるYAC 1/1172の消化によって、２つの断片（200Kb及び370Kb）が生じた。BssHIIによるYAC 1/1084の消化によって、70Kbと400Kbのサイズを有する２つの断片が得られたのに対して、BssHIIによるYAC 2/1256の消化によって４つの断片（40Kb、90Kb、110Kb、及び260Kb）が生じた。その結果、1.4MbのYACコンティグを、完全なMi領域及び隣接した配列をカバーする、３つのYACクローンから得られた８つの制限断片に相当する8つの領域に分割することができた。
【００８０】
物理的地図上のこれら８つの領域内の様々なAFLPマーカーの位置を決定するために、YACクローン1/1172、2/1256、及び1/1084の部分的及び完全SfiI消化物及びBssHII消化物に対して、AFLPマーカーをハイブリダイゼーションプローブとして用いた。それ故、各AFLPマーカー断片を乾燥したゲルから切り出し、0.5M酢酸アンモニウム、10mM酢酸マグネシウム、1mM EDTA(pH=8.0)、0.1% SDSを含有する緩衝液中での拡散によって溶出して、対応する未標識のAFLPプライマーにより再増幅し、続いて、Feinberg及びVogelstein（Anal. Biochem. 132, 6〜10）のランダムプライマー法に従って、32Pでラベルした。表４及び図１に概説した８つの領域の中の１以上に、各AFLPマーカーを割り振ることができた。
【表Ｆ】
2008289481.tif 000007
例５：YACクローン1/1172及び2/1256のコスミドライブラリーの構築
材料
バイナリーコスミドベクターpJJ04541は、pJJ1881（Jonesら、Transgenic Research 1, 285〜297）の誘導体であり、大腸菌及び根頭がんしゅ病菌中での選別をするためのテトラサイクリン耐性遺伝子を含有するプラスミドpRK290をベースとしている。pRK290のユニークなEcoRI部位中に、
−バクテリオファージλのcos部位
−発現が、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター配列（Odellら、Mol Gen Genet 223, 369〜378）によって誘導されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Beckら、Gene 19, 327〜336）
−pBluescriptポリリンカー配列（Stratagene, La Jolla, California, USA）
が並列されたT-DNAを担持する配列（LB;左端リピート、RBは右端リピートを表す）。
【００８１】
pJJ04541のサイズは29kbであり、図２に図示されている。該バイナリーコスミドベクターのクローニング容量は、λファージパッケージング抽出物を用いると、9〜24kbの範囲内にある。
【００８２】
ライブラリーの構築
Green及びOlsen（Proc Natl Acad Sci USA 87, 1213〜1217）に従ってプロトプラストを作成するために、ザイモリアーゼを用いて、YAC 1/1172を含有するサッカロミセス・セレビシエ株 AB 1380の全DNA及びYAC 2/1256を含有するサッカロミセス・セレビシエ株 AB 1380の全DNAを単離した。
【００８３】
両DNAの分取試料をPFGE上で分析した。両DNA単離体は、≧100kbのサイズを有するようにみえた。
【００８４】
Sau3Aを用いて、約15μgの各DNAを部分消化すると、平均15〜25kbのサイズの分子が生じた。続いて、10〜35%のしょ糖勾配を通して、ベックマンSW41ローター中にて、20℃、22,000rpmで、22時間、該サンプルを遠心した。遠心チューブの底に刺した針を用いて、0.5mLの画分を集めた。これらの画分から分取して、0.7%アガロースゲル上で分析した。約20kbのサイズを有するDNA分子を含有する画分をプールして、エタノール沈殿で濃縮した。
【００８５】
続いて、Korch（Nucleic Acids Res. 15, 3199〜3220）及びLoftusら（Biotechniques 12, 172〜176）によって記載されているように、II型制限エンドヌクレアーゼによって産生されたDNAの5’伸長部を部分的に充填する戦略を用いて、dATP及びdGTPにより付着末端を部分的に埋めた。
【００８６】
XhoIを用いて、バイナリーコスミドベクターpJJ04541を完全に消化し、Korch（Nucleic Acids Res. 15, 3199〜3220）によって記載されているように、dTTPとdCTPにより該直鎖断片を部分的に埋めた。
【００８７】
20kb断片をコスミドベクターに連結し、ラムダファージ ギガパックII XLパッケージング抽出物（Stratagene, La Jolla, California, USA）を用いて、製造者が推奨するように、大腸菌株XL-1Blue MR（Stratagene, La Jolla, California, USA）に形質導入した。10mg/Lのテトラサイクリンを含有するLB（1%バクトトリプトン、0.5%バクト−酵母抽出物、及び1%NaCl、pH 7.5）寒天プレート上で、選別を行った。それぞれ2〜3μgのYACクローン1/1172及び2/1256のサイズ分画した酵母DNAから、バンク当たり約250,000コスミドクローンのバンク２つを作成した。
【００８８】
続いて、ミクロタイタープレート（96穴、10mg/Lのテトラサイクリンを含有する100μLのLB培地）のウェル中に、これらの形質転換体を保存した。ミクロタイタープレート中のコスミドクローンの96穴グリッドのレプリカを、ジーン・スクリーン・プラス膜フィルター（NEN Dupont）の上に押し付けて、コロニーになるまで培地上で培養した。Sambrookら（in：Molecular cloning: a laboratory manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）によって記載されているように、32PラベルされたYACクローン1/1172及び2/1256を用いて、コロニーハイブリダイゼーションを行うことにより、ポジティブコスミドが明らかとなった。約10,000のYAC1/1172コロニーから、約200のポジティブコスミドクローンが同定された。約20,000のYAC2/1256コロニーから、300のポジティブコスミドクローンが同定された。
【００８９】
例６：Mi耐性遺伝子セグメントの精密マッピング及びAFLPマーカーの位置決定
所定の領域へのコスミドの分割
コスミドを７つの所定の領域に割り振るために、YAC1/1172の200のポジティブコスミドクローン及びYAC 2/1256の300のポジティブコスミドクローンを、例４（表４及び図１参照）に略記されている８つの制限断片（YAC断片）のうち７つの断片とハイブリダイズさせた。各７つのYAC断片に対してポジティブなコスミドが同定された。さらに、二つの異なるYACクローンの重複する制限断片とポジティブに反応するコスミドを同定することができた。
【００９０】
Mi耐性遺伝子セグメントのコスミドコンティグの構築
様々な所定領域中の同定されたポジティブな全コスミドのコスミドコンティグを構築するために、制限断片増幅を用いた。テンプレートを調製するために約500ngの各コスミドを用い、制限断片の増幅におけるプライマーは、例２に記載した方法のとおり、選択的ヌクレオチドをもたないEcoRIプライマー5’-GACTGCGTACCAATTC-3’、及び選択的ヌクレオチドをもたないMesI-プライマー 5’-GATGAGTCCTGAGTAA-3’であった。EcoRIプライマーの5’末端はラベルされており、500のコスミドは全て、EcoRI/MesI-プライマーの組み合わせを用いて増幅した。DNAフィンガープリントは、約8〜20の増幅された断片を含有していた。各領域から、同一サイズの増幅された断片を含有するコスミドの組みを選択し、前記所定領域全体にわたる増幅された全断片の連続した列が構築できるまで、例２に記載されているポリアクリルアミドゲルに再度かけた。さらに、一つの領域のコスミドコンティグを隣接した領域と並べて、Mi遺伝子座のコスミドコンティグを構築した。このように、約800kbのMi遺伝子座をカバーする96コスミドのコスミドコンティグを構築した。
【００９１】
コスミドコンティグ上のMi連鎖AFLPマーカーの詳細なポジショニング
コスミドコンティグ上の20のMi連鎖AFLPマーカーの位置を決定するために、PstIを用いて96のコスミドを消化した後、サザン、J. Mol. Biol. 98, 503〜515に従ってサザンブロット分析を行った。
【００９２】
該96のコスミドのPstI消化物のサザンブロットに、該AFLPマーカーを例４で記載したハイブリダイゼーションプローブとして用いた。マーカーPM02以外のMi連鎖AFLPマーカーの正確な位置は、図3Aに略記されている。
【００９３】
例７：Mi変異体の遺伝学的分析
突然変異トマト株のファミリーが、Enza Zadenから入手することができた。これらの株は、Mi耐性遺伝子に関してヘテロ接合であり、Miにきわめて近接して連鎖する（Stevens & Rick, 1986, in: The Tomato Crop, Atherton & Rudich edit., Chapman and Hall, p/35〜109）Aps-1遺伝子（酸性ホスファターゼ-1をコードする）に関してヘテロ接合であるF1ハイブリッドに由来した。Aps-1遺伝子の種々の対立遺伝子は、アイソザイム分析によって決定することができる（Vallejos, 1983, in : Isozymes in plant genetics and breeding, Tanksley and Orton edit., part A, Elsevier, Amesterdam, 469〜515）。Aps-11対立遺伝子は、L. peruvianumに由来し、Mi耐性遺伝子と共分離（co-segregation）することによって、数種の線虫耐性トマト遺伝子型に遺伝子移入された。これらの変異株のスキームを以下に図示する。
【００９４】
F1−ハイブリッド（ヘテロ接合Aps-1，Mi耐性表現型）
↓自己増殖
F2−株（Aps-1 1:2:1に分離，Mi耐性3:1に分離）
↓ヘテロ接合（Aps-1）F2植物の自己増殖
F3−株（Aps-1 1:2:1に分離，Mi耐性3:1に分離）
↓ヘテロ接合（Aps-1）F3植物の自己増殖
F4−株（Aps-1 1:2:1に分離，Mi耐性3:1に分離）
↓ヘテロ接合（Aps-1）F4植物の自己増殖
F5−株（Aps-1 1:2:1に分離，Mi感受性）
↓ヘテロ接合（Aps-1）F5植物の自己増殖
F6−株（Aps-1 1:2:1に分離，Mi感受性）
↓ホモ接合（Aps-11）F6植物の自己増殖
F7−株（全てAps-11，Mi感受性）
↓ホモ接合（Aps-11）F7植物の自己増殖
F8−株（全てAps-11，Mi感受性）
【００９５】
該ファミリーのF1、F2、F3、F4株では、Aps-11対立遺伝子の存在は、Mi耐性表現型と相関するのに対して、Aps-11対立遺伝子の不存在は、Mi感受性表現型と相関する。F5以降の子孫では、該相関は失われる。全ての植物は、Aps-1対立遺伝子とは無関係に、線虫に対して感受性がある。
【００９６】
各F2、F3、F4、F1、F5、F6、F7及びF8世代から得られた12の個体の線虫耐性、Aps-1対立遺伝子の存在、及びMi連鎖AFLPマーカーの存在をテストした。苗木の線虫テストは、サツマイモネコブセンチュウの根こぶを混入せしめた土壌中で行った。F2、F3、F4植物では、上記スキームに示されているように、線虫耐性の結果は、3:1の分離であり、F5及びその子孫の群では感受性であった。Mi連鎖AFLPマーカーの多くは、Aps-1アイソザイムマーカーと同一のMi遺伝子型を示した。しかし、３つのAFLPマーカーPM14、PM16、及びPM25は、Mi表現型と分離しているようであった。多くのF5、F6、F7及びF8植物においては、Mi感受性は、これらのマーカーの不存在によって示された。AFLPマーカーPM14、PM16、及びPM25は、突然変異体の中でAFLPMi遺伝子型とMi表現型との間で相関を示した。マーカーPM14とPM25は、図3Bに示した物理的地図の上で隣り合っており、それ故、これらのAFLPマーカー周囲の領域は、Mi耐性遺伝子を含む良い候補物であると推測された。
【００９７】
例８：Mi耐性遺伝子を含む重複するコスミドクローンの物理的地図
Mi連鎖AFLPマーカーPM14及びPM25とハイブリダイズしているコスミドの同定は、例６で行った。PM14は、コスミドMi-11、Mi-18、及びMi-01を同定するのに対し、PM25はコスミドMi-18及びMi-01を同定する。
【００９８】
続いて、コスミドMi-11、Mi-18、及びMi-01周囲の小さいコスミドの列は、例６に記載したコスミドコンティグから選択した。3つの同定されたコスミド及び隣接するコスミドを具備する６つのコスミドのコンティグを選択した。これらの６つのコスミドは、Mi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01、及びMi-14である。これら６つのコスミドの物理的精密地図を作成するために、コスミドコンティグのDNAサンプルをPstIで消化した後、0.8%のアガロースゲル上での電気泳動を行った。様々なコスミド間の物理的重複を決定することができた。これらのデータと、コスミドコンティグ上のMi連鎖AFLPマーカーの詳細なポジショニングについて得たデータ（例６参照）を合わせると、PM14とPM25の位置についての物理的精密地図を図４に記載されているように構築することができた。AFLPマーカーPM14及びPM25の周囲のコスミドコンティグは、約50kbであると計算された。
【００９９】
例９：形質転換
コスミドの根頭がんしゅ病菌への移入
殆どDeblaereら（Methods in Enzymology 153, 277〜292）に従って、ヘルパー株HB101（pRK2013）との三親性交配による接合性移入によって、根頭がんしゅ病菌の中に、コスミドクローンMi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01、Mi-14、及び対照コスミドpJJ04541を導入した。大腸菌は、5mg/Lのテトラサイクリンを補充したLB培地（1%バクトトリプトン、0.5%バクト−酵母抽出物、及び1%NaCl、pH 7.5）中で、37℃で培養した。ヘルパー株HB101(pRK2013)は、100mg/Lカナマイシンサルフェートを補充したLB培地中で、同一の条件下で培養した。
【０１００】
根頭がんしゅ病菌株AGL1（Lazoら、Bio/Technology, 9, 963〜971, 1991）は、100mg/Lのカルベニシリンを補充したLB培地中で、28℃で培養した。一晩培養したものを、全く抗生物質を加えないLB培地に1:100で希釈し、6時間増殖させた後、0.1mLの各根頭がんしゅ病菌の培養液、ヘルパー株培養液、及びコスミド株培養液を混合して、抗生物質を加えていないLB寒天プレート上に播種した。28℃で一晩インキュベートした後、100mg/Lカルベニシリン及び10mg/Lテトラサイクリンを含有するLB培地寒天プレート上に該混合物を播種して、トランス接合体（transconjugant）をスクリーニングした。プレートを3〜4日間、28℃でインキュベートした。トランス接合体根頭がんしゅ病菌のシングルコロニーを選択するために、選択的寒天プレートを二回連続して通過させた。
【０１０１】
根頭がんしゅ病菌トランス接合体の特定
選択したコロニーから小規模培養を増殖させ、10mg/Lテトラサイクリンを含有するLB培地中で増殖させた。プラスミドDNAは、Ish-Horowiczら、（Nucl. Acids Res. 9, 2989〜2997, 1981）によって記載された方法を用いて、アルカリ溶解によって単離し、標準的手法を用いてBglIIにより消化した。さらに、根頭がんしゅ病菌のミニプレップDNAでの制限断片増幅は、EcoRI/MseIという酵素の組み合わせ、及び例６で示した選択的ヌクレオチドを持たないプライマーを用いて行った。続いて、BglII制限酵素パターン及び根頭がんしゅ病菌トランス接合体のDNAフィンガープリントを、コスミドを含有する大腸菌株のミニプレップDNAのそれと比較した。対応する大腸菌培養と同一のDNAパターンを有するコスミドを保有する根頭がんしゅ病菌トランス接合体のみを感受性トマト株を形質転換するのに用いた。
【０１０２】
感受性トマト株の形質転換
2%次亜塩素酸ナトリウム中で、感受性トマト株52201（Rijk Zwaan, De Lier, The Netherlands）の種子の表面を10分間殺菌し、無菌蒸留水中で3回リンスして、ガラス瓶又はポリプロピレン培養容器中の発芽用培地（1%(w/v)しょ糖、0.8%寒天を加えた、Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15, 473〜497によるMS培地の半分の強度からなる）に播種した。それらを8日間発芽させた。培養条件は、25℃、30μmol.m-2.s-1の光束密度、及び明期が16/24hであった。
【０１０３】
トマトの形質転換は、Koornneefら(1986)、In:トマト・バイオテクノロジー、169〜178、Alan R. Liss, Inc.,に従って行った。以下簡単に述べる。10.7μMα−ナフタレン酢酸及び4.4μM 6-ベンジルアミノプリンを補充したMS20培地（2%(w/v)しょ糖、0.8%寒天を加えた、Murashige & Skoog, (1962) Physiol. Plant. 15, 473〜497による培地）上に播種されたペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida）懸濁細胞のフィーダー層を含有するペトリ皿中で、8日齢の子葉因子外植体を24時間プレ培養した。コスミドクローンMi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01、及びMi-14又はコスミドベクターPJJ04541を含有する根頭がんしゅ病菌を一晩培養した希釈培養液に、該外植体を5〜10分間感染させ、滅菌したろ紙上でブロッティングして乾燥させ、元のフィーダー層プレート上で48時間、共培養した。培養条件は、上述のとおりであった。O.D.600が0.8になるように、液体MS20培地（2%(w/v)しょ糖を加えた、Murashige & Skoog, (1962)による培地、pH5.7）で、根頭がんしゅ病菌を一晩培養したものを希釈した。
【０１０４】
共栽培の後、4.56μMゼアチン（zeatin）、67.3μMバンコマイシン、418.9μMセフォタキシム、及び171.6μMカナマイシンサルフェートを補充したMS20からなる選択培地を加えたペトリ皿に、子葉因子外植体を移し、上記の培養条件で培養した。該外植体は、新鮮な培地上で、３週間毎に継代培養した。下に存在するカルスから、発生している新芽を切除し、ゼアチンを加えていない選択培地が入ったガラス瓶に移し、根を形成させた。カナマイシンサルフェートを含有する培地中での根の形成は、問題の新芽のトランスジェニックな性状の指標として認められた。ゼアチンを加えていない新鮮な選択培地の入ったガラス瓶の中に頂端分裂組織及び側芽（auxiliary bud）を継代培養することによって、真のトランスジェニック再生体をインビトロで増殖せしめた。
【０１０５】
例１０：相補性分析
形質転換した植物の根の耐性をスクリーニングすることによる、Mi耐性遺伝子を有するコスミドの同定
インビトロで増殖させた被形質転換R0植物の根を例1に記載した疾病アッセイに供した。各形質転換体から、二つの根外植体をアッセイした。全部で、7つの異なるコスミド形質転換の72のR0植物をテストした。６つのコスミドは、トマトインサートDNAを担持し、1つのコスミドpJJ04541は、トマトインサートDNAを有していない。結果を表１に示す。２つの根培養のうちの少なくとも一つで、根こぶが形成されたので、63のトランスジェニックR0植物が感受性であるように思われた。根培養上に全く根こぶを見出すことができなかったので、９つのR0植物は耐性であると評価した。７つの耐性植物は、コスミドMi-11による形質転換から生じたが、２つの耐性植物は、コスミドMi-18（コスミドMi-11と大部分が重複している）を用いたものから生じた。さらなる分子分析のために、コスミドMi-11及びMi-18を用いた。
【表１】
2008289481.tif 000008
【０１０６】
耐性表現型を有する被形質転換植物の分子分析
重複するコスミドMi-11及びMi-18を有するトランスジェニックR0植物の耐性表現型が、様々なコスミド中に存在するゲノムインサートによって決定されていることを実証するために、AFLPマーカーPM14によるAFLP分析を行った。コスミドMi-11及びMi-18で形質転換されたR0植物に対するマーカーPM14を同定するプライマーの組み合わせを用いて、選択的制限断片増幅を行った。得られたDNAフィンガープリントは、耐性植物中にマーカーPM14の存在を示し、コスミドMi-11及びMi-18中に存在するゲノムインサートが、R0植物中にも存在しており、同定された２つの重複するコスミドMi-11とMi-18がMi耐性遺伝子を具備していることを示していた。
【０１０７】
一方の側にコスミドMi-11及びMi-18中のインサート、及び隣接するコスミドMi-32、Mi-30中のインサートを、他方の側にコスミドMi-01及びMi-14をさらに特定した。コスミドMi-11とMi-18との重複に基づくMi耐性遺伝子を具備するDNA領域は、約16〜18kbであると概算された。コスミドMi-30中に存在するインサートを有するR0植物の感受性に基づいて、該領域を約12kbに狭めることができた。コスミドMi-30及びMi-11の右端に隣接した領域に相当する、Mi耐性遺伝子を具備するDNAセグメントの配列を決定した（図４参照）。
【０１０８】
例１１：トマトから得られたMi耐性遺伝子のヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
重複するDNAセグメントのサブクローニング
Mi耐性遺伝子を含有するコスミドMi-11及びMi-18中の重複するDNAセグメントの配列を決定するために、約2kbのインサートサイズを有するランダムサブクローンの組を作成した。水を満たしたカップホーン（タイプ431A）が取り付けれたMisonix（Misonix Inc., Farmingdale, NY, USA）ソニケーター（タイプXL2020）を用いて、（40μLの10mM Tris-アセテート, 10mM Mg-アセテート、及び50mM K-アセテート中の）15%のプローブパワー（probe power）で、4℃で10秒間、7.5μgのCsClで精製したコスミドMi-11及びMi-18のDNAを切断した。続いて、60℃で10分間該DNAを加熱し、室温まで冷却した。修復混合物（10mM Tris-アセテート, 10mM Mg-アセテート、及び50mM K-アセテート中、10UクレノウDNAポリメラーゼ、10U T4 DNAポリメラーゼ、及び2mMの4種類のdNTP全て）10μgを添加することによって、DNA断片の末端を修復した後、20℃で30分間インキュベートした。切断したDNAは、1%Seakem GTG アガロースゲル（FMC Bio Products, Rockland, ME, USA）上での電気泳動によって分離した。1.8〜2.2kbのサイズを有する画分をゲルから切り出し、続いて、製造者（New England Biolabs Inc, Beverly, MA, USA）のプロトコールに従って、該ゲルのスライスをβ−アガラーゼIで消化し、DNAを沈殿させた。
【０１０９】
該1.8〜2.2kb画分をクローニングするために、修飾したpUC19ベクター（pStucと表記）を用いた。２つのオリゴヌクレオチドプライマー、及びSambrookら（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている標準的クローニング手法を用いて、該ベクター中のpUC19のBamHI/SalI断片を、StuI、SpeI、及びSalI制限部位を含有するDNA断片によって置換した。StuI消化し、脱リン酸化されたpStucベクター中で、1.8〜2.2kb画分を16℃で連結した。続いて、該連結混合物をEpicurian Coli XL2-Blue MRF’ウルトラコンピテント細胞（Stratagene, La Jolla, CA, USA）に形質転換した。384穴のミクロタイタープレート（100mg/Lのカルベニシリンを含有する100μgのLB培地）中で各コロニーを増殖させ、保存した。
【０１１０】
Mi耐性遺伝子を含有するコスミドMi-11及びMi-18中の重複するDNA領域に相当するクローンを単離するために、コスミドクローンMi-18（図４参照）及びAFLPマーカーPM14の8.6kb及び4.5kb PstI断片をコロニーハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーションプローブとして用いた。それ故、ミクロタイタープレート中の384穴グリッドのレプリカをジーン・スクリーン・プラス膜フィルター（Dupont NEN, Boston, MA, USA）上に押し付けて、培地上でコロニーになるまで増殖せしめた。Ish-Horowiczら、1981、Nucl. Acids Res. 9, 2989〜2997によって記載されているアルカリ溶解法を用いてプラスミドDNAを単離するために、84のポジティブクローンを使用した。
【０１１１】
配列分析
ABI PRISM色素ターミネーターサイクルシークエンス法簡易反応キットを用いて、Gene-AmpPCRシステムモデル9600（パーキンエルマー、フォスターシティー、CA、USA）中でシークエンス反応を行った。標準M13フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いた。ABIプリズム377の48cmゲル上で、反応産物を分析した。標準フォワード及びリバースシークエンスプライマーを用いて、84の選択されたクローンのDNA配列を決定した。配列の配置及び分析は、STADEN配列分析プログラム（Dear & Staden, 1991, Nucl. Acids Res. 19, 3907〜3911）の1994年版を用いて行った。約9.9kbヌクレオチドの連続したDNA配列を形成することができ、図５に示されている。1206アミノ酸（図7B）の末端切断されたポリペプチドをコードする3621ヌクレオチドの巨大な読み取り枠(ORF2)を推定することができた。
【０１１２】
例１２：根こぶ線虫感染：土壌接種
根こぶ線虫（サツマイモネコブセンチュウ）を感染させた土壌を以下のように調製した。多数の菌こぶ（すなわち根こぶ）を有する重度感染トマト植物の根系を細かく切断して、新鮮な土壌を通じて混合した。
【０１１３】
該感染させた土壌の中に種を蒔くか、又は小根化した苗木を移植した。該植物を温度25℃の温室で育てた。4〜８週後に、植物を慎重に土壌から抜いて、付着した土を除去するために、根を水でリンスした。生じた根こぶの数を数えることによって、感染のレベルを決定した。
【０１１４】
根の上に３未満の根こぶが見られるときには、トランスジェニック植物は耐性であると考えた。根系の培養上に少なくとも３を超える根こぶが生じたときには、植物は感受性であると考えた。
【０１１５】
例１３：相補性分析
形質転換した植物の自己増殖子孫中の耐性をスクリーニングすることによるMi耐性遺伝子を有するコスミドの同定
形質転換実験の初代再生体（世代R0）は、種子を得るために温室で育てた。各コスミドについて、10〜15の再生体を育て、R1種子を収穫した。耐性遺伝子を有するコスミドを同定するために、各コスミドの少なくとも７つのR0植物のR1株のサツマイモネコブセンチュウに対する耐性をテストした。各R1株の20〜30の若木又は苗木を接種し、例１２に記載されているように評価した。
【０１１６】
合計で、７つの異なるコスミド形質転換（トマトインサートDNAを担持する６つのコスミド、及びトマトインサートDNAを持たない１つのコスミドpJJ04541）の63R1株をテストした。結果を表２に示す。テストした全てのR1植物の根系上に根こぶが形成されたので、54のトランスジェニックR0植物が感受性であるように思われた。各R1株の植物の少なくとも半分が３未満の根こぶを有していたので、９つのR0植物が耐性であると考えられる。１つのR1株は完全に耐性であり、６つのR1株は約3:1の比（耐性：感受性苗木）で分離し、２つのR0植物の子孫は1:1に分離した。９つの耐性R0植物全てが、コスミドMi-11による形質転換から生じていた。
【０１１７】
コスミドMi-11上にMi耐性遺伝子が存在することのさらなる遺伝学的証拠が、次の世代で得られた。耐性R1植物を自己増殖させた。４つの異なるR0植物に由来する、生じた14のR2株のサツマイモネコブセンチュウに対する耐性をテストした。各R2株の若木を20〜30植え付けて、例１２に記載されているように評価した。結果を表３に示す。５つのR2株が完全に耐性であり、親のR1植物が、Mi耐性遺伝子についてホモ接合であることを示していた。3:1の比で分離した８つのR2株は、それらの親のR1植物が、Mi耐性遺伝子についてヘテロ接合であることを示していた。１つのR2株は、約1:1の比で分離しており、完全に感受性である株は、テストした株の中には存在しないようであった。これらの結果は、コスミドMi-11で形質転換した数個の植物に由来する選択したR1植物が、機能的なMi耐性遺伝子を含有することを証明する。
【表２】
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【表３】
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【０１１８】
例１４：ポテトアリマキの感染アッセイ
5〜8匹のメスのアリマキを葉の上に置くことによって、小さいトマト植物（4週齢）にポテトアリマキ（Macrosiphum euphorbiae）を植え付けた。該植物を18〜20℃の温度で、温室の中で育てた。1〜2週間後に、新たに生まれたアリマキの数を数えることによって、耐性のレベルを決定した。
【０１１９】
茎又は葉の上に、生きたアリマキが全く存在していないときに、植物が耐性であると考えた。新たに生まれたアリマキが存在していたときには、植物は感受性であった。
【０１２０】
例１５：相補性分析
形質転換した植物の自己増殖させた子孫の耐性のスクリーニングによる、Meu-1耐性遺伝子を有するコスミドの同定
Meu-1耐性遺伝子を有するコスミドを同定するために、例１３で得られたR1株のサブセットのMacrosiphum euphorbiaeに対する耐性をテストした。各R1株の10〜15外植体に接種し、例１４に記載したように評価した。合計、７つの異なるコスミド形質転換（トマトインサートDNAを担持する６つのコスミド、及びトマトインサートDNAを持たない１つのコスミドpJJ04541）の41R1株をテストした。結果を表4に示す。各R1株の全ての植物又は殆どの植物上に何十ものアリマキが増殖していたので、36のトランスジェニックR0植物が感受性であるように思われた。各R1株の植物の少なくとも半分には生きたアリマキが存在していなかったので、5つのR0植物が耐性であると考えられる。これら５つの耐性R0植物全てが、コスミドMi-11で形質転換生されていた。
【０１２１】
得られた結果は、コスミドMi-11の形質転換で得られたR0植物が、機能的Meu-1耐性遺伝子を含有していることを強く示唆している。
【表４】
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【０１２２】
コスミドMi-11上にMeu-1耐性遺伝子が存在することのさらなる遺伝学的証拠が、次の世代で得られた。９つの異なるR0植物に由来する、線虫耐性R1植物（例１３参照）の自己増殖から得られた24のR2株のM. euphorbiaeに対する耐性をテストした。各R2株の11〜15苗木を接種し、例１４に記載されているように評価した。結果を表５に示す。１つのR2株が3:1の比で分離し、８つのR2株が約1:1の比で分離していた。これらの９つの株では、ポテトアリマキ耐性表現型は明確に見ることができる。５つの株では、完全に感受性であるようにみえた。残りの１０R2株は、約1:3の比で分離され、中間であると評価された。
【０１２３】
これらの結果は、サツマイモネコブセンチュウに耐性があり、コスミドMi-11で形質転換したR0植物に由来する数個のR1植物が、機能的なMeu-1耐性遺伝子を有することを証明するものである。
【０１２４】
さらに、遺伝子移入されたMeu-1耐性遺伝子の遺伝を確認するために、感受性トマト株52201と戻し交雑した線虫耐性R1植物から得られた８つのR1BC株のM. euphorbiaeに対する耐性をテストした。各R1BC株の苗木１２〜１５を植え付けて、例１４に記載したように評価した。結果を表６に示す。
【０１２５】
表５及び表６に示されている分離比は、耐性表現型の遺伝を説明するだけのものである。
【表５】
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【表６】
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【０１２６】
例１６：転写物のマッピング
Mi耐性遺伝子の5’末端及び3’末端をマッピングし、Mi耐性遺伝子がイントロンを含有しているかどうかを決定するために、転写物のマッピング研究を行った。Mi耐性遺伝子からの転写物の一部を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応が、この目的のために用いられた。
【０１２７】
Sambrookら（分子クローニング：ラボラトリーマニュアル、1989、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されているホット・フェノール法に従って、耐性トマト栽培変種植物E22の葉組織から得た全RNAを単離した。製造者の指示に従って、ダイナビーズM-280（Dynabeads M-280）ストレプトアビジン（DYNAL A.S., Oslo, Norway）に結合したビオチン化されたオリゴ(dT)を用いて、ポリA+ RNAを単離した。ライフテクノロジーズ社（Life technologies, Inc. Gaithersburg, MD, USA）のスーパースクリプトRnase Hリバーストランスクリプターゼ cDNAキット、及び製造者の供給するプロトコールを用いて、cDNAライブラリーを構築した。
【０１２８】
クロンテク（Clontech; Paolo Alto, CA, USA）のマラソン（Marathon）cDNA増幅キットを用いて、5’及び3’RACE産物を得た。用いたプライマーは、ゲノムMi-配列、特にORF2のコード配列の5’末端に基づいてデザインした。続いて、様々な5’及び3’RACE断片をTAクローニングベクターpCRII（Invitorogen Corporation, San Diego, CA, USA）の中にクローニングし、標準的なプロトコールを用いて配列決定した。得られたヌクレオチド配列を9.9kbのゲノム配列を並列することにより、Mi耐性遺伝子の5’末端に２つのイントロン配列を推定することができた。1306ヌクレオチドからなる1つのイントロンは、ヌクレオチド1936〜3241に位置し、もう1つのイントロンは、ヌクレオチド3305〜3379に位置していた（図５）。マラソンcDNA増幅キットで検出された最大のMi-転写物は、ヌクレオチド位置1880にマッピングされた。このため、我々は、Mi転写開始部位は、ヌクレオチド1880又はその上流に位置していると結論付ける。5’ cDNA中に検出することができた第一のATGコドンは、第二のイントロンの52ヌクレオチド上流にあるヌクレオチド3263に位置しており、1257アミノ酸のポリペプチドをコードする巨大な読み取り枠(ORF1)を推定することができ、図7Aに示してある。その結果、該第二のイントロンは、Mi耐性遺伝子産物のアミノ酸14とアミノ酸15の間に位置している。
【０１２９】
例１７：MI-11及びMI-18形質転換された植物のPCR分析
形質転換された植物の根の相補性分析から得られたデータ（例10）は、Mi耐性遺伝子が、コスミドMi-30に対応するDNAセグメント（この形質転換体は、全て感受性であった）を除いて、コスミドMi-11とMi-18との間で重複しているDNAセグメント上に位置することを示していた。該領域は、約12kbであると推測された。しかし、形質転換された植物を自己増殖させた子孫に対する相補性分析では、コスミドMi-11で形質転換された植物のみが、耐性であると評価された（例13と15）。Mi-18で形質転換した植物が何故に感受性であるのかという問いに答えるために、被形質転換Mi-11及びMi-18植物中に推定Mi-ORFが存在する否かについてPCR分析を行った。
【０１３０】
以下のDNAサンプルを分析した。
【０１３１】
1.YACクローン2/1256
2〜3.各々大腸菌及び根頭がんしゅ病菌中のコスミドMi-11
4〜5.各々大腸菌及び根頭がんしゅ病菌中のコスミドMi-18
6.トマト株E22（耐性）
7.トマト株52201（感受性）
8〜12.コスミドMi-11で形質転換された5つの植物
13-17.コスミドMi-18で形質転換された５つの植物
PstIでDNAを消化し、PstIアダプターを連結した。続いて、PCR分析は、PstI部位とこれに付加した３つの選択的ヌクレオチド又はマーカーPM14を同定するプライマー、及びPM14の上流に位置する様々なPCRプライマーによって、酵素rThポリメラーゼ（Gene Amp XL PCRキット;パーキンエルマー）を用いて、PCR分析を行った。生じた産物は、443〜6110bpの異なるサイズであり、推定Mi-ORFの完全なPM14上流領域を包含している（図６参照）。
【０１３２】
コスミドMi-18で形質転換された５つの植物を除き、全てのテンプレートが、予測されたサイズのPCR産物を生成しているようにみえた。最も小さいPCR産物(443bp)だけが、形成された。これらのデータは、完全なPM14上流領域の殆どは、コスミドMi-18で形質転換された植物中には存在しないことを示している。これらの欠失は、大腸菌又は根頭がんしゅ病菌に存在するコスミドMi-18には見られず、形質転換された植物中でのみ見られる。このため、我々は、これらの欠失が、Mi-18で形質転換された植物のサツマイモネコブセンチュウ及び/又は（マクロサイファム・ユーフォービア）Macrosiphum euphorbiaeに対する感受性表現型に関わっていると結論付けた。
【０１３３】
例１８：コスミドMI-11のヌクレオチド配列
コスミドMi-11で形質転換された植物のみが、耐性表現型を示したという観察は、Mi-11上に存在する別の読み取り枠が、線虫及び/又はアリマキに対する耐性をコードする候補物たり得ることを示すかもしれない。それ故、さらなる読み取り枠を同定するために、推定ORF1の上流領域のヌクレオチド配列を決定した。例１１で記載したものとほぼ同じコロニーハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーションプローブとして、コスミドクローンMi-11の2.1、4.7、及び2.9kb PstI断片を用いて、2kbのインサートサイズを有するランダムサブクローン群を単離した。
【０１３４】
標準的フォワード及びリバースシークエンスプライマーを用いて、該DNAの配列を決定するために、49のポジティブクローンを用いた。配列の配置及び分析は、例１１に記載されているように行った。
【０１３５】
5618bp(con25)、898bp(con10)、及び2495bp(con62)のサイズを有する３つの連続するDNAの連なりを推定することができた。PCRを用いて、これらのDNAの連なりと、推定Mi-ORF（図６）を含有する9870bpのDNA配列との間のギャップを計算すると、50〜200bpの間であった。
【０１３６】
あり得る６つの全フレーム中の停止コドンの分布を分析するために、決定された３つのコンティグ（con25、con10、及びcon62）を分析した。120アミノ酸又は、これを超えるサイズを有する顕著なORFフレームは、推測し得なかった。さらに、推定ORF1を有するDNA相同性は、全く検出されなかった。このように、コスミドMi-11上に存在する唯一の顕著なORFは、図５に記載したORF1であった。これらの結果に基づき、ORF1によってコードされるポリヌクレオチドは、線虫及びアリマキに耐性を与え、このため、Mi耐性遺伝子及びMeu-1耐性遺伝子は、図５に図示されているものと同一のコード配列を表していると結論することができる。
【０１３７】
例１９：タバコの形質転換及び相補性分析
タバコの形質転換
Horschら（Science 227, 1229〜1231、1985）に記載されているプロトコールを用いて、タバコ栽培変種植物プチハバナ（Petit Havana）、タイプSR1をコスミドMi-11又はコスミドベクターpJJ04541によって、形質転換した。
【０１３８】
相補性分析：被形質転換タバコ植物の根培養における線虫耐性のスクリーニング
インビトロで増殖したタバコの被形質転換R0植物の根を例１で記載した疾病アッセイに供した。各31形質転換体から、2以上の根外植体をアッセイした。さらに、823塩基対（ヌクレオチド4824〜5646位にわたる、図５参照）のサイズを有する内部断片をスクリーニングすることによって、17のMi-11形質転換体全てについて、推定Mi ORF1が存在するかどうかをPCRにより分析した。該断片に対する単純なPCRプライマーは、図５に示されいている配列から推定された。
【０１３９】
用いたプライマーは、以下の配列：
プライマーS21：5’-CCAAGGACAGAGGTCTAATCG-3’
プライマーS22：5’-TTGAGGTGATGTGGTAAATGG-3’
プライマーS21は、ヌクレオチド4824〜4844位からの配列を標的とし、プライマーS22は、ヌクレオチド5626〜5646位からの配列を標的とする（図５参照）。
【０１４０】
インビトロ疾病アッセイ及びPCR分析（内部PCR断片の存在「＋」又は不存在「−」）の結果は、図７に示されている。「Mi-11」は、推定Mi ORF1を具備する被形質転換植物をあらわし、「Mi-11Δ」は、PCR分析（上述）で決定された、推定Mi ORF1中に欠失を有する被形質転換植物を表す。テストした根培養の少なくとも１つに、根こぶが形成されたので、29のR0形質転換体は、感受性であるように思われた。一般的に、タバコの根の上での根こぶの形成速度は、感受性トマトの根の上での速度に比べて若干遅い。根培養上に全く菌こぶを見出すことができなかったので、２つのR0植物は、サツマイモネコブセンチュウに耐性があると評価された。両耐性植物は、内部PCR断片を具備するコスミドMi-11で形質転換されており、Mi耐性遺伝子の存在を示している。
【表７】
2008289481.tif 000014
【０１４１】
相補性分析：被形質転換タバコ植物の切片のアリマキ耐性のスクリーニング
タバコの被形質転換R0植物の根化切片（rooted cutting）を植え付け、例１４に記載したように評価した。23の各形質転換体のうち、2又は３の切片をマクロサイファム・ユーフォビアに対する耐性についてアッセイした。感染アッセイ及びPCR分析（上述したとおり）の結果を表８に示す。テストした根培養の少なくとも１つに、生きたアリマキが数匹計測されたので、21のR0植物は、感受性であると考えられた。一般的に、タバコの上でのアリマキの増殖レベル速度は、感受性トマト植物上での増殖に比べて低い。これらの植物の全切片には根培養上に生きたアリマキが全くいなかったので、２つのR0植物は、耐性であると評価された。内部PCR断片の存在によって示されたように、アリマキ耐性植物は、Mi耐性遺伝子を具備するコスミドMi-11で形質転換されていた。
【表８】
2008289481.tif 000015
【０１４２】
例２０  ポテトの形質転換及び相補性分析
ポテトの形質転換
形質転換には、ポテトの変種ディアマント（Diamant）（Cebeco Zaden B. V., Vlijmen, The Netherlands）を用いた。Oomsら（Theor. Appl. Genet. 73, 744〜750）によって記載されたプロトコールを用いて、インビトロで栽培した植物の節間外植体をコスミドMi-11又はコスミドベクターpJJ04541で形質転換した。
【０１４３】
相補性分析：被形質転換植物の根培養における線虫耐性のスクリーニング
インビトロで増殖したポテトの被形質転換R0植物の根を例１で記載した疾病アッセイに供した。各31形質転換体から、2以上の根外植体をアッセイした。さらに、例１９に記載されているプライマーS21及びS22を用いて、26のMi-11形質転換体全てをPCRによって分析した。インビトロ疾病アッセイ及びPCR分析（内部PCR断片の存在「＋」又は不存在「−」）の結果は、表９に示されている。「Mi-11」は、推定Mi ORF1を具備する被形質転換植物を表し、「Mi-11Δ」は、PCR分析（上述）で決定されたように、推定Mi ORF1中に欠失を有する被形質転換植物を表す。少なくとも１つの根培養上に根こぶが形成されたので、28のR0形質転換体は、感受性であった。一般的に、ポテトの根の上での根こぶの形成速度は、感受性トマトの根の上での速度に比べて遅い。根培養上に全く菌こぶを見出すことができなかったので、３つのR0植物は、サツマイモネコブセンチュウに耐性があると評価された。これらの耐性植物は全て、内部PCR断片を具備するコスミドMi-11で形質転換されており、Mi耐性遺伝子の存在を示している。
【表９】
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【０１４４】
相補性分析：被形質転換植物の切片の線虫耐性のスクリーニング
ポテトのMi-11被形質転換R0植物の根化切片を例１２に記載した疾病アッセイに供した。19の各形質転換体のうち、1〜３の切片をサツマイモネコブセンチュウに対する耐性についてアッセイした。結果を表１０に示す。さらに、形質転換されていないポテト植物（変種ディアマント）の36の根化切片を（感受性対照として）アッセイしたところ、全て感受性であった。根系に根こぶが見出せなかったので、１つのR0植物はサツマイモネコブセンチュウに耐性であると評価した。
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】図１は、それぞれ570、500、及び470kbのサイズを有するYAC 1/1172、YAC 2/1256、及びYAC 1/1084の物理的地図を示す。SfiI及びBssHII制限部位の位置、及び制限断片のサイズが示してある。制限断片上の様々なAFLPマーカーの位置が示してある。
【図２】図２は、YAC 1/546のコスミドライブラリーを構築するために用いられるバイナリーコスミドベクターPJJ04541の模式図を示す。初発のベクターとして、プラスミドpRK290（20kbの大きさ）（Dittaら、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347-7351）を用いた。「Tet」は、テトラサイクリンに対する耐性を与える遺伝子を表す。「LB」は、T-DNAの左端の反復配列を表し、「RB」は右端の反復を表している。カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター配列は、「p35S」として示されており、「ocs3」は、オクトピンシンターゼの3’末端を示している。「NPT」は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを示し、「cos」は、インビトロパッケージングを可能にするバクテリオファージλのcos部位を表している。「pDBS」は、pBluescriptのポリリンカーを示している（ストラタジーン、La Jolla, CA, USA）。
【図３Ａ】図3Aは、YAC 1/1172、YAC 2/1256、及びYAC 1/1084上のAFLPマーカーの詳細な位置を図示している。位置は、様々な所定の領域に対して構築されたコスミドコンティグに基づいている。
【図３Ｂ】図3Bは、Mi耐性遺伝子を具備する領域のコスミドコンティグを図示する。コスミドMi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01及びMi-14は、水平線で示されている。AFLPマーカーPM14及びPM25の位置が、示されている。
【図４】図４は、制限酵素PstIに対するコスミドMi-32、Mi-30、Mi-11、Mi-18、Mi-01、及びMi-14の物理的精密地図を示す。PstI断片のサイズが、示されている（kbで）。様々なコスミドを具備するR0植物のMi表現型（インビトロ疾病アッセイで同定される）が、図の右側末端部に示されている。ヌクレオチド配列を決定したDNAセグメントは、二方向の矢印を有する二重線で示されている。
【図５Ａ】図５は、AFLPマーカーPM14周囲の約9.9kbのDNAセグメントのヌクレオチド配列、及びMi耐性遺伝子の推定アミノ酸配列を示している。開始コドン（ATG位置3263〜3265）には下線が付され、停止コドン（TAG位置7109-7111）には二重線が付されており、1257アミノ酸のポリペプチド（図7A）をコードするオープンリーディングフレーム（ORF1）を示している。Mi耐性遺伝子は、二つのイントロン配列（一つのイントロンは、1936〜3241位の1306ヌクレオチド、一つのイントロンは、3305〜3379位の75ヌクレオチド）を具備している（イタリック体で示されている）。最初の開始コドンのフレーム内に存在する第二の開始コドン（ATG3491〜3493位）は、末端切断された1206アミノ酸のポリペプチドをコードする第二のオープンリーディングフレーム(ORF2)となる（図7B）。AFLPマーカーPM14の位置は、ヌクレオチド位置6921(5’-TGCAGGA-3’)〜7034(5’-AGATTA-3’)である。
【図５Ｂ】図５Ａの続き。
【図５Ｃ】図５Ｂの続き。
【図５Ｄ】図５Ｃ続き。
【図５Ｅ】図５Ｄの続き。
【図６】図６は、コスミドMi-11及びMi-18の物理的地図及びコスミドMi-11の決定されたヌクレオチド配列を示している。該配列は、４つのコンティグ：con25(5618 bp)、con10(898 kb)、con62(2495 bp)、及びMi(9870 bp)に分割される。図の下部には、図５のDNAセグメントの部分に対応する、様々な遺伝的バックグラウンド（YACクローン2/1256、コスミドMi-11を含有する大腸菌、コスミドMi-11を含有する根頭がんしゅ病菌（A. tumefaciens）、コスミドMi-18を含有する根頭がんしゅ病菌、耐性トマト株E22、感受性トマト株52201、コスミドMi-11で形質転換されたR0植物、及びコスミドMi-18で形質転換されたR0植物）中の幾つかのPCR断片（表の右側に異なる長さの水平線として示されている）の存在「＋」又は不存在「−」が図示されている。コスミドMi-11及びコスミドMi-18のヌクレオチド配列。種々のコンティグの分析。
【図７Ａ】図７AはORF1によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図７Ｂ】図７BはORF2によってコードされる末端切断されたポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、Mi-耐性遺伝子の構造を図示する。
【図９】図９は、Mi-耐性遺伝子ファミリーを図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【外国語明細書】
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