(57)【要約】      （修正有）【課題】口腔内に存在する乳酸桿菌数を短時間で測定することができるリアルタイムＰＣＲ法を提供する。【解決手段】特定の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むフォワードプライマーと、他の特定の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含むリバースプライマーとの組み合わせ、及び前記とは異なる特定の塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む口腔内の乳酸桿菌数測定用核酸プローブを使用する口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法によって解決することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＲＴＧＣＴＡＲＧＴＧＴＴＧＧＲＲＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１；但しＲは、Ａ又はＧである）、配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号２）、配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号３）、又は配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４）で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のフォワードプライマーと、配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＲＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号５；但しＲは、Ａ又はＧである）、配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号６）、又は配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号７）で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のリバースプライマーとの組み合わせからなる口腔内の乳酸桿菌数測定用プライマーセット。
【請求項２】
前記フォワードプライマーが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、若しくは配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号２６、配列番号２７、若しくは配列番号２８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のプライマーセットと、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＹＹＴＣＡＧＴＧＣＹＧＳＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号８；但し、ＹはＴ又はＣであり、ＳはＧ又はＣである）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号９）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１０）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１１）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＳＣＲＧＣＡＣＴＧＡＲＲＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１２；但し、ＲはＧ又はＡであり、ＳはＧ又はＣである）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１３）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）、又は配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１５）で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のプローブとからなる口腔内の乳酸桿菌数測定用プライマー及びプローブセット。
【請求項４】
前記プローブが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、若しくは配列番号３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである請求項３に記載のプライマー及びプローブセット。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法。
【請求項６】
請求項３又は４に記載のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のプライマーセットを含む、口腔内の乳酸桿菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット。
【請求項８】
請求項３又は４に記載のプライマー及びプローブセットを含む、口腔内の乳酸桿菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ法により口腔内に存在する口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法及びそれに用いるＰＣＲプライマー及びプローブセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
う蝕の発生は、ヒト口腔内のミュータンス連鎖球菌の存在と密接な関連があることが知られている。ミュータンス連鎖球菌は、自身の産生する不溶性グルカンを介して歯面に付着することができ、スクロースを代謝して乳酸を産生し、酸性環境下でも成育可能であるという特徴を有している。一方、歯面への付着能はないが、乳酸を産生し、酸性環境下でも成育可能である乳酸桿菌（ラクトバシラス）も、う蝕における原因菌であると考えられている（非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３）。特に、治療した歯における２次的なう蝕に関連するとの報告もある（非特許文献３）。
【０００３】
前記の非特許文献１〜３の報告では、乳酸桿菌数の測定のために、培養法を用いている。培養法によって測定された乳酸桿菌数の多い患者では、う蝕のリスクが高いと考えられており、乳酸桿菌数を測定することはう蝕のリスクを予測する上で重要である。しかしながら、従来の培養法では、測定結果を得るまでに２日以上を費やしており、またその操作も人手に頼っていた。
【０００４】
一方、培養法以外の乳酸桿菌数の測定方法としては、すべての乳酸桿菌の塩基配列に共通なプライマーを設計し、リアルタイムＰＣＲ法により、唾液や歯垢から短時間に菌数を測定する方法が開発されている（非特許文献４）。しかしながら、このプライマーはすべてのラクトバシラス属の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の共通な塩基配列部分に基づいて設計されているが、ラクトバシラス以外の菌の塩基配列と相同性の高い部分を含んでおり、特異性が低い可能性が考えられ、更に、培養法で測定される乳酸桿菌数との相関は明らかでなかった。
【０００５】
従って、口腔内に存在する乳酸桿菌数を測定してう蝕リスクを検査する方法としては、培養法が正確であるが、日数を要することや効率が悪いことから、例えば臨床検査センター等で多数検体を扱う場合はかなりの人力及び労力が必要であった。
【０００６】
【非特許文献１】「ジャーナル・オブ・クリニカル・ペディアトリック・デンティストリー（The Journal of Clinical Pediatric Dentistry）」（米国）２００５年、第２９巻、ｐ３２９−３３．
【非特許文献２】「コミュニティー・デンティストリー・アンド・オーラル・エピデミオロジー（Community Dentistry and Oral Epidemiology）」（デンマーク）１９８１年、第９巻、ｐ．１８２−９０．
【非特許文献３】「ジャーナル・オブ・オーラル・サイエンス（Journal of Oral Science）」（日本）２００６年、第４８巻、ｐ．２４５−５１．
【非特許文献４】「ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbiology）」（米国）２００４年、第４２巻、ｐ．３１２８−３６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者等は、前記非特許文献４に記載のプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ法により口腔内の乳酸桿菌数を測定したが、培養法で得られた結果と相関が見られなかった。そのため、口腔内に存在する乳酸桿菌数を短時間で正確に測定することができるリアルタイムＰＣＲ法について、鋭意研究した結果、原核生物リボソームの３０Ｓサブユニットに含まれるＲＮＡである１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子（以下、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子と称することがある）の配列に着目し、乳酸桿菌に共通して存在するいくつかの配列から、リアルタイムＰＣＲ法に使用可能なプライマー、並びにプライマー及びプローブを設計した。そのプライマー、並びにプライマー及びプローブを用いリアルタイムＰＣＲの検討を行い、培養法で測定した口腔内の乳酸桿菌数を正確に反映することのできる特定のプライマー及びプローブを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＲＴＧＣＴＡＲＧＴＧＴＴＧＧＲＲＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号１；但しＲは、Ａ又はＧである）、配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号２）、配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号３）、又は配列５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４）で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のフォワードプライマーと、配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＲＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号５；但しＲは、Ａ又はＧである）、配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号６）、又は配列５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＴＡ−３’（配列番号７）で表される塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のリバースプライマーとの組み合わせからなる口腔内の乳酸桿菌数測定用プライマーセットに関する。
本発明によるプライマーセットの好ましい態様においては、前記フォワードプライマーが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、若しくは配列番号２５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドであり、前記リバースプライマーが、配列番号２６、配列番号２７、若しくは配列番号２８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである。
また本発明は、前記プライマーセットと、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＹＹＴＣＡＧＴＧＣＹＧＳＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号８；但し、ＹはＴ又はＣであり、ＳはＧ又はＣである）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号９）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１０）、配列５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号１１）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＳＣＲＧＣＡＣＴＧＡＲＲＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１２；但し、ＲはＧ又はＡであり、ＳはＧ又はＣである）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１３）、配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１４）、又は配列５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１５）で表される塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分を含む少なくとも１種のプローブとからなる口腔内の乳酸桿菌数測定用プライマー及びプローブセットにも関する。
本発明によるプライマー及びプローブセットの好ましい態様においては、前記プローブが、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、若しくは配列番号３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又はそれらの２種以上のオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
また本発明は、前記プライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法、又は前記プライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法にも関する。
更に、本発明は、前記プライマーセットを含む、口腔内の乳酸桿菌数測定用リアルタイムＰＣＲキット、又は前記プライマー及びプローブセットを含む、口腔内の乳酸桿菌数測定用リアルタイムＰＣＲキットにも関する。
なお、本明細書において、「測定」は「定量」を意味するが、定量することにより検出を行っており、本発明のプライマー及びプローブセット、並びに口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法が、定性的な検出に使用することを排除するものではない。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、口腔内に存在する乳酸桿菌数の菌数を正確に、且つ短時間に測定することが可能であり、本発明の方法により得られた乳酸桿菌数の菌数を測定することにより、口腔内の乳酸桿菌数の多い患者のう蝕のリスクを効率良く検出することが可能である。また、本発明の方法により、培養法と比較して多数の検体を処理することができ、臨床検査センター等における効率的な測定が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明のプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットは、口腔内に存在する乳酸桿菌数を測定するために使用することができる。これらのプライマーセット並びにプライマー及びプローブセットの塩基配列は、乳酸桿菌のリボソームの３０Ｓサブユニットに含まれるＲＮＡである１６ＳリボソームＲＮＡをコードする遺伝子の塩基配列に基づいたものである。
本明細書において、口腔内の乳酸桿菌とは、口腔内に存在することのできるすべての種類の乳酸桿菌を意味し、例えばラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）を含むが、これらの種に限定されるものではない。
本発明者等は、口腔内に多く見出されているラクトバシラス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバシラス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバシラス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバシラス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバシラス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバシラス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列において、相同性の高い塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマーを作製した。
しかしながら、単純にすべての乳酸桿菌において相同性の高い塩基配列のプライマーを選択するのみでは、培養法と正確に相関する結果は得られなかった。そのため、本発明者等は、特定の塩基配列からなるヌクレオチドの領域を選択し、プライマー並びにプライマー及びプローブを設計することによって、培養法で測定した口腔内の乳酸桿菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立した。
【００１２】
本発明のプライマーセットにおけるプライマーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分（以下、それぞれ、プライマーオリゴヌクレオチド部分１、プライマーオリゴヌクレオチド部分２、プライマーオリゴヌクレオチド部分３、プライマーオリゴヌクレオチド部分４、プライマーオリゴヌクレオチド部分５、プライマーオリゴヌクレオチド部分６、及びプライマーオリゴヌクレオチド部分７と称する）を含むプライマーである。また、プライマーオリゴヌクレオチド部分１、プライマーオリゴヌクレオチド部分２、プライマーオリゴヌクレオチド部分３、又はプライマーオリゴヌクレオチド部分４を含むプライマーを、領域１プライマー、プライマーオリゴヌクレオチド部分５、プライマーオリゴヌクレオチド部分６、又はプライマーオリゴヌクレオチド部分７を含むプライマーを、領域２プライマーと称することがある。それぞれのプライマーオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは１５ｍｅｒ以上、より好ましくは１６ｍｅｒ以上、最も好ましくは１８ｍｅｒ以上である。また、本発明のプライマー及びプローブセットにおけるプローブは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５の塩基配列における連続する少なくとも１０塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分（以下、それぞれ、プローブオリゴヌクレオチド部分８、プローブオリゴヌクレオチド部分９、プローブオリゴヌクレオチド部分１０、プローブオリゴヌクレオチド部分１１、プローブオリゴヌクレオチド部分１２、プローブオリゴヌクレオチド部分１３、プローブオリゴヌクレオチド部分１４、及びプローブオリゴヌクレオチド部分１５と称する）を含むプローブである。また、プローブオリゴヌクレオチド部分８、プローブオリゴヌクレオチド部分９、プローブオリゴヌクレオチド部分１０、又はプローブオリゴヌクレオチド部分１１を含むプローブを、領域３プローブ、プローブオリゴヌクレオチド部分１２、プローブオリゴヌクレオチド部分１３、プローブオリゴヌクレオチド部分１４、又はプローブオリゴヌクレオチド部分１５を含むプローブを領域４プローブと称することがある。それぞれのプローブオリゴヌクレオチド部分の長さは、好ましくは１０ｍｅｒ以上、より好ましくは１２ｍｅｒ以上、最も好ましくは１４ｍｅｒ以上である。また、本発明のプライマーセットにおけるプライマーとして、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド部分（以下、それぞれ、プライマーオリゴヌクレオチド部分８、プライマーオリゴヌクレオチド部分９、プライマーオリゴヌクレオチド部分１０、プライマーオリゴヌクレオチド部分１１、プライマーオリゴヌクレオチド部分１２、プライマーオリゴヌクレオチド部分１３、プライマーオリゴヌクレオチド部分１４、及びプライマーオリゴヌクレオチド部分１５と称する）を含むプライマーを使用することも可能である。また、プライマーオリゴヌクレオチド部分８、プライマーオリゴヌクレオチド部分９、プライマーオリゴヌクレオチド部分１０、又はプライマーオリゴヌクレオチド部分１１を含むプライマーを領域３プライマー、プライマーオリゴヌクレオチド部分１２、プライマーオリゴヌクレオチド部分１３、プライマーオリゴヌクレオチド部分１４、又はプライマーオリゴヌクレオチド部分１５を含むプライマーを領域４プライマーと称することがある。）以下に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５の塩基配列を示す。
配列番号１（領域１）：５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＲＴＧＣＴＡＲＧＴＧＴＴＧＧＲＲＧＧＴＴＴＣ−３’（但しＲは、Ａ又はＧである）
配列番号２（領域１）：５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’
配列番号３（領域１）：５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＴＧＴＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＣ−３’
配列番号４（領域１）：５‘−ＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＧＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣ−３’
配列番号５（領域２）：５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＲＴＧＣＴＴＡ−３’（但しＲは、Ａ又はＧである）
配列番号６（領域２）：５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＡＴＧＣＴＴＡ−３’
配列番号７（領域２）：５‘−ＴＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＧＣＴＴＡ−３’
配列番号８（領域３）：５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＹＹＴＣＡＧＴＧＣＹＧＳＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号８；但し、ＹはＴ又はＣであり、ＳはＧ又はＣである）
配列番号９（領域３）：５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’、
配列番号１０（領域３）：５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’、
配列番号１１（領域３）：５‘−ＧＧＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＴＣＡＧＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＡ−３’
配列番号１２（領域４）：５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＳＣＲＧＣＡＣＴＧＡＲＲＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１２；但し、ＲはＧ又はＡであり、ＳはＧ又はＣである）、
配列番号１３（領域４）：５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’
配列番号１４（領域４）：５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’
配列番号１５（領域４）：５‘−ＴＧＣＧＴＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣ−３’
【００１３】
配列番号４７は、口腔内に存在する乳酸桿菌の１つであるラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖のＤＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ６７５２５４）を示している。
配列番号２で表される塩基配列は、配列番号４７で表される塩基配列の８２７〜８６２番の領域に相当し、ラクトバシラス・カゼイ及びラクトバシラス・サリバリウスも同じ塩基配列を有する。また、配列番号３で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタスの塩基配列であり、配列番号４で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ファーメンタムの塩基配列であり、配列番号１で表される塩基配列は、それらのコンセンサス配列である。
配列番号６で表される塩基配列は、配列番号４７で表される塩基配列の８９０〜９１９番の領域の相補鎖の塩基配列に相当し、ラクトバシラス・カゼイ及びラクトバシラス・サリバリウスも同じ塩基配列を有する。また、配列番号７で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタス、ラクトバシラス・ファーメンタムの塩基配列であり、配列番号５で表される塩基配列は、それらのコンセンサス配列である。
配列番号９で表される塩基配列は、配列番号４７で表される塩基配列の８５７〜８８８番の領域に相当し、ラクトバシラス・カゼイ及びラクトバシラス・サリバリウスも同じ塩基配列を有する。また、配列番号１０で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタスの塩基配列であり、配列番号１１で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ファーメンタムの塩基配列であり、配列番号８で表される塩基配列は、それらのコンセンサス配列である。
配列番号１３で表される塩基配列は、配列番号４７で表される塩基配列８５７〜８８８番領域の相補鎖の塩基配列に相当し、ラクトバシラス・カゼイ及びラクトバシラス・サリバリウスも同じ塩基配列を有する。また、配列番号１４で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタスの塩基配列であり、配列番号１５で表される塩基配列は、相当するラクトバシラス・ファーメンタムの塩基配列であり、配列番号１２で表される塩基配列は、それらのコンセンサス配列である。
１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子のヌクレオチドから、領域１プライマー、領域２プライマー、領域３プライマー及び領域４プライマーを選択すること、及び領域３プローブ又は領域４プローブを選択することにより、口腔内の乳酸桿菌数を正確に把握することのできる測定方法を確立することが可能である。
【００１４】
プライマーは、配列番号１〜１５のいずれかで表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、又はそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドでもよく、好ましくは、配列番号２及び配列番号６で表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、最も好ましくは、配列番号２に示される塩基配列の８〜３６番、又は配列番号６に示される塩基配列の９〜２８番の塩基配列における連続する少なくとも１５塩基、又はそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。具体的には、配列番号１６〜２５のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド又は配列番号２６〜２８のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。表１及び表２に配列番号１６〜２８のプライマーを示す。
【００１５】
【表１】
2008271955.tif 000002
【００１６】
【表２】
2008271955.tif 000003
【００１７】
しかしながら、口腔内の乳酸桿菌数を正確に測定することが可能である限り、プライマーは前記のオリゴヌクレオチドに限定されるものではなく、配列番号１〜１５のいずれかで表された塩基配列における連続する少なくとも１５塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーでもよい。それらのオリゴヌクレオチドを含むプライマーの場合、前記配列番号１〜１５で表された塩基配列以外の乳酸桿菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよく、その他の人工的な塩基配列からなるヌクレオチドを含んでもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの５‘末端に１〜１０のヌクレオチド（例えば、制限酵素サイトの配列やタグ配列）を付加することができる。また、１〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は１０％以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することもできる。
【００１８】
プライマーの長さは、特に限定されないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３６ｍｅｒである。また、領域１プライマーの長さも、特に限定されないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３６ｍｅｒであり、より好ましくは、２０ｍｅｒ〜２９ｍｅｒであり、最も好ましくは、２１ｍｅｒ〜２３ｍｅｒである。領域２のプライマーの長さも、特に限定されるものではないが、好ましくは、１５ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、より好ましくは、１６ｍｅｒ〜２５ｍｅｒであり、最も好ましくは、１６ｍｅｒ〜２０ｍｅｒである。
【００１９】
本発明によるプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせからなる。プライマーセットにおけるフォワードプライマーは１種でも使用することが可能であるが、２種以上の組み合わせの混合物としても使用することができる。また、リバースプライマーも、１種でも使用することが可能であるが、２種以上の組み合わせの混合物としても使用することができる。
【００２０】
本発明のプライマー及びプローブセットは、前記プライマーセット及びプローブからなり、特にはフォワードプライマーである領域１プライマー及びリバースプライマーである領域２プライマー並びにプローブからなる。プライマー及びプローブセットにおけるプローブは、１種でも使用することが可能であるが、２種以上の組み合わせの混合物としても使用することができる。また、プライマー及びプローブセットにおけるフォワードプライマーも１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができ、リバースプライマーも１種でも、２種以上の組み合わせでも使用することができる。プローブは、ゲノムＤＮＡやｃＤＮＡ等をハイブリダイズの原理を用いた方法で検出するためのオリゴヌクレオチドであるが、好ましくは、リアルタイムＰＣＲ法であるＴａｑＭａｎ法において用いるプローブである。従って、プローブは、配列番号４７で表された塩基配列において、領域１プライマー及び領域２プライマーに挟まれた塩基配列の領域に設定することが可能であり、配列番号４７の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするものでも、その相補鎖のヌクレオチドにハイブリダイズするものでもよく、それらの混合物でもよい。配列番号４７の塩基配列からなるヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとしては、好ましくは領域３及び／又は領域４プローブを挙げることができる。
【００２１】
プローブは、配列番号８〜１５のいずれかで表された塩基配列における連続する少なくとも１０塩基、及びそれ以上の塩基の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプローブが好ましく、より好ましくは、配列番号２９〜３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
【００２２】
【表３】
2008271955.tif 000004
【００２３】
しかしながら、口腔内の乳酸桿菌数を正確に測定することが可能である限り、プローブはそれらに限定されるものではなく、１〜数個の塩基の置換を有するオリゴヌクレオチド、又は１０％以下程度のミスマッチがあるオリゴヌクレオチドを使用することもできる。本明細書において「ハイブリダイズ」とは、通常のリアルタイムＰＣＲ条件下で用いる「ハイブリダイズする」と同じ意味である。
【００２４】
ＴａｑＭａｎ法に用いられるプローブは、レポーター色素及びクエンチャー色素で標識されており、オリゴヌクレオチドの一端、例えば５’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば３’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用する。色素としては、ＰＣＲ法において従来より使用されている色素を特に限定せずに用いることができ、レポーター色素としては、例えば、６−カルボキシ−フルオレッセイン（ＦＡＭ）、テトラクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＴＥＴ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、ヘキソクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＨＥＸ）等を挙げることができる。また、クエンチャー色素の例としては、例えば、６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン（ＴＡＭＲＡ）、蛍光を発しないブラックホールクエンチャー（ＢＨＱ）等を挙げることができる。
【００２５】
プローブの長さは、特に限定されないが、好ましくは、１８ｍｅｒ〜３５ｍｅｒであり、より好ましくは、１８ｍｅｒ〜３０ｍｅｒであり、最も好ましくは、２１ｍｅｒ〜２５ｍｅｒである。
【００２６】
本発明の口腔内の乳酸桿菌を測定する方法には、ポリメレース重合反応（ＰＣＲ）を用いるが、特には、リアルタイムＰＣＲ法である。リアルタイムＰＣＲ法には、前記のプライマーセットを用い、二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発する化合物であるインターカレーター、例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩをＰＣＲの反応系に加えるインターカレーター法、並びにプライマーセットと５‘末端をレポーター色素で、３’末端をクエンチャー色素で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）とをＰＣＲの反応系に加えるＴａｑＭａｎ法等がある。このようなリアルタイムＰＣＲ法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、前記プライマーセット、又は前記領域１プライマー、前記領域２プライマー及び前記プローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。
【００２７】
本発明の口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法をインターカレーター法で行う場合には、領域１プライマー及び領域２プライマー、領域１プライマー及び領域４プライマー、又は領域３プライマー及び領域２プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることができるが、領域１プライマー及び領域２プライマーの組み合わせのプライマーセットを用いることが好ましい。また、ＴａｑＭａｎ法で行う場合には、フォワードプライマーである領域１プライマー及びリバースプライマーである領域２プライマーからなるプライマーセット並びに領域３プローブ及び／又は領域４プローブを用いることができる。いずれのリアルタイムＰＣＲ法も口腔内の乳酸桿菌数を正確に測定することが可能であるが、ＴａｑＭａｎ法が好ましい。ＴａｑＭａｎ法は、少なくとも２本のプライマーに加えて、プローブを用いるため、乳酸桿菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に対する特異性を上昇させることができ、口腔内の乳酸桿菌数をより正確に測定することが可能となるからである。
【００２８】
ＰＣＲ法は従来から広く行われている方法が使用可能であり、詳細には下記の３段階から成るＤＮＡ合成反応を繰り返して行う。
（１）まず、鋳型となるＤＮＡ二本鎖を加熱して変性し、一本鎖にする。
（２）次に、増幅したい特定部位のＤＮＡ鎖の両端に相補的な２種類のプライマーを反応系に過剰に加えた状態で温度を下げ、プライマーがＤＮＡ鎖の相補的な部位と２本鎖を形成する。
（３）この状態でＤＮＡ合成基質のデオキシヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼを作用させると、ポリメラーゼはプライマー部位からＤＮＡ相補鎖を合成していく。
インターカレーター法は、この反応系にＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等のインターカレーターを添加し、１サイクル毎に合成された二本鎖ＤＮＡに結合したインターカレーターの蛍光を測定する。ＴａｑＭａｎ法は、反応系にＴａｑＭａｎプローブを添加し、分解されたプローブから分離したレポーター色素が蛍光を発するため、その蛍光を１サイクル毎に測定する。
【００２９】
ＴａｑＭａｎ法は、前記のようにオリゴヌクレオチドの一端、例えば５’−末端にレポーター色素を結合させ、他端、例えば３’−末端にクエンチャー色素を結合させて標識したプローブを使用するが、レポーター色素は、例えば励起光の照射によって蛍光を発する化合物である。同一のオリゴヌクレオチドにレポーターとクエンチャーとが一緒に結合している場合、その距離が近いために、レポーターの吸収したエネルギーはエネルギー転移によりクエンチャーに吸収されてしまい、レポーターは励起されない。この結果、本来ならば生じるはずの蛍光が発生しないことになる（このことを蛍光の消光、クエンチングと言う）。クエンチングを起こしているプローブをＰＣＲ反応系に添加すると、アニーリングのステップで一本鎖の鋳型ＤＮＡの内部に結合する、Ｔａｑポリメラーゼは、プライマーの３’末端から新生鎖を合成していくが、その途中でプローブを分解する。こうしてニックトランスレーションが起こり、隣接していたレポーターとクエンチャーとが分解し、クエンチングの抑制を受けていたレポーターが蛍光を発するようになる。この反応はＰＣＲの１サイクルにおいて１分子当たり１回起こるので、レポーターの蛍光強度の増加はＰＣＲ反応、すなわちＰＣＲ生成物量に概ね比例することになる。このようなレポーター及びクエンチャーを利用した測定法では、ＰＣＲ後に反応成生物を分離することなく測定が行えるため、リアルタイムに測定が可能である。
【００３０】
本発明の方法で使用される被検試料としては、口腔内から採取した唾液や歯垢等が用いられ、測定に適した粘度に適宜調整して使用する。唾液は、被験者にパラフィン等を噛ませた後に採取することも可能である。歯垢は、例えば、探針又は爪楊枝を用いて採取することができる。
【００３１】
具体的には、本発明の口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法は、下記の工程を含む。
（１）被検試料からＤＮＡを抽出する工程、
（２）抽出されたＤＮＡを鋳型としてプライマーセット又はプライマー及びプローブセットを用いてＤＮＡを増幅する工程、
（３）増幅されたＤＮＡを検出する工程、
を含む。
【００３２】
前記工程（１）の口腔内から採取した唾液や歯垢に含まれるＤＮＡの抽出は、具体的には、市販のＤＮＡ抽出試薬キットを用い、添付のプロトコールに従って行うことができる。また、唾液や歯垢等を緩衝液又は界面活性剤等を含む溶菌液に混和し、８０℃〜１００℃で、１〜３０分保持し、乳酸桿菌を溶菌させ、そのまま又は遠心分離した上清を、ＤＮＡ試料として用いることも可能である。
工程（２）におけるＤＮＡ増幅工程においては、ＴａｑＭａｎ法の場合は、具体的には以下の反応が起こる。
（ａ）検体中に、乳酸桿菌が存在すると、乳酸桿菌のＤＮＡを鋳型として指数関数的に増幅が起きる。
（ｂ）増幅が起きる過程で、ＴａｑＭａｎプローブが鋳型ＤＮＡにハイブリダイズする。プライマーがハイブリダイズした鎖が鋳型となってその相補鎖がＤＮＡポリメラーゼにより形成される際、ＴａｑＭａｎプローブは、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解される。
（ｃ）このためＴａｑＭａｎプローブに結合しているレポーター色素とクエンチャー色素が離れ離れになり、レポーター色素が検出されるようになる。すなわち、検体中に乳酸桿菌が存在すればレポーター色素が検出され蛍光を発するようになる。
（ｄ）蛍光強度は、サイクル数に依存して指数関数的に増大する。
（ｅ）既知の菌濃度の標準試料を種々用意しておいて、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなるサイクル数であるｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ値（以下、Ｃｔ値と称する）を調べて、菌濃度の対数を横軸、Ｃｔ値を縦軸に取ると、ほぼ直線状の検量線が描かれる。
（ｆ）未知の菌濃度の試料についてもＣｔ値を調べ、（ｅ）で作成した検量線に当てはめれば、未知の菌濃度の試料について菌濃度を知ることができる。
工程（３）の増幅されたＤＮＡを検出する工程では、蛍光強度をＰＣＲのサイクル毎に測定する。これによってＰＣＲ産物の増加をリアルタイムに測定することが可能である。
【００３３】
本発明のキットは、本発明の口腔内の乳酸桿菌数を測定する方法に用いることのできるキットであり、少なくとも前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを含むことを特徴とする。より好ましくは、領域１プライマー及び領域２プライマーからなるプライマーセット、並びに領域３プローブ及び／又は領域４プローブを含む。
【００３４】
本発明のキットにおいてフォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブは、混合物として含まれてもよく、個別の試薬として含まれてもよい。また、本発明のキットは、プライマー及びプローブの他に、リアルタイムＰＣＲを行うのに必要な試薬及び／又は酵素を更に含むこともできる。
【００３５】
《作用》
本発明のプライマー及びプローブセット、並びに後述の比較例１〜３で用いたプライマー及びプローブセットは、いずれも口腔内に存在する乳酸桿菌であるラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタス及びラクトバシラス・ファーメンタムの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子に存在する相同性の高い塩基配列を有する領域から選択したプライマー及びプローブセットである。これらのプライマー及びプローブセットのうち、本発明のプライマー及びプローブセットを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、培養法と相関する口腔内に存在する乳酸桿菌数の測定が可能である。しかしながら、比較例１〜３で用いたプライマー及びプローブセットによるリアルタイムＰＣＲ法では、測定値が培養法で得られた乳酸桿菌数と相関しなかった。これらの理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
【００３６】
本発明のプライマー及びプローブセットは、１種類の乳酸桿菌に特異的な塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計するのではなく、乳酸桿菌に共通な塩基配列の領域にプライマー及びプローブを設計する必要がある。しかしながら、このような領域は、乳酸桿菌以外の口腔内の常在菌の塩基配列とも一致することもあり、選択されるプライマー又はプローブの領域によっては乳酸桿菌以外の口腔内の常在菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を検出することも考えられる。
また、プライマーの善し悪しは、そのプライマーの領域、配列、長さ、組み合わせなどによって、決定されると考えられる。本発明のプライマーセットに要求される条件としては、特に、リアルタイムＰＣＲで得られた乳酸桿菌数と培養法で得られる乳酸桿菌数との相関が良好なことである。この条件を満たすために重要なことは、特にプライマーの領域並びにフォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせであり、例えば、領域１プライマー及び領域２プライマーの組み合わせのプライマーセットにより、前記の目的を達成できると考えられる。実際に、比較例１〜３のプライマー及びプローブセットでは、培養法で得られる乳酸桿菌数との相関が得られておらず、プライマーの領域が重要であることがわかる。また、比較例２のＲ５プライマーは、領域２プライマーであるが、領域１プライマー以外のフォワードプライマーと組み合わせのために、充分な効果が得られておらず、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせも重要であることがわかる。
これらの原因としては、例えば、プライマーの領域の標的ＤＮＡが、ｄｅｎａｔｕｒｅされて一本鎖ＤＮＡとなったときに、ヘアピン構造等の２次構造を取りやすく、プライマーやプローブの結合が阻害されることが考えられる。またプライマー同士が結合してプライマーダイマーを形成したり、プライマーやプローブ自体が２次構造を取るようなことも考えられる。従って、正確な口腔内の乳酸桿菌数の測定を行うためにリアルタイムＰＣＲに適したプライマーやプローブを設計する領域は、単純にすべての乳酸桿菌に共通する塩基配列の領域を選択すればよいわけでなく、リアルタイムＰＣＲに適しており、正確に口腔内の乳酸桿菌数を測定することのできる領域である必要がある。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明の実施例に基づき、より具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００３８】
《ＤＮＡの抽出例》
５人の被験者の口腔内から唾液０．２ｍＬを採取し、粘度を調整するため滅菌水１．６ｍＬに懸濁後に遠心して沈殿物を回収し、ＤＮＡ抽出試薬キット（商品名  ＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  Ｓ；ＦＵＪＩＦＩＬＭ社）を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出し、０．２ｍＬのＤＮＡサンプルとした。
【００３９】
《実施例１》
領域１プライマー、領域２プライマー及び領域３プローブを用い、ＴａｑＭａｎ法により、乳酸桿菌数を測定した。
ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ株式会社）を用いて、１チューブあたり、ＤＮＡサンプル及び以下の量の試薬を混合して、全体の液量が２０μＬの反応液を調整した。
TaqMan Fast Universal PCR Mater Mix     ：１０μＬ
１０μＭのＦ９フォワードプライマー      ：０．４μＬ（終濃度２００ｎＭ）
１０μＭのＲ３リバースプライマー        ：０．４μＬ（終濃度２００ｎＭ）
５μＭのＰ４プローブ                    ：０．４μＬ（終濃度１００ｎＭ）
ＤＮＡサンプル                          ：１．０μＬ
滅菌水                                  ：７．８μＬ
反応液２０μＬの入ったチューブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムにセットしＰＣＲ反応を行った。前処理として９５℃、２０秒でインキュベートを行った後、９５℃、３秒、６０℃、３０秒を４５サイクル繰り返し、増幅サイクル毎に蛍光強度を測定した。なお、プライマーはオリゴＤＮＡを化学合成により作製した。プローブはオリゴＤＮＡを化学合成し、５‘末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを結合させたものを用いた。
標準曲線を作成するために、ラクトバシラス・ラムノサス  ＪＣＭ  １１３６株を培養して種々の菌濃度の標準試料を用意し、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなる閾値（Ｃｔ値）を予め調べて、菌濃度の対数を横軸にＣｔ値を縦軸に取って検量線を作成した。同時に検体についてもＣｔ値を調べ、検量線に当てはめることにより検体中の菌濃度を測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
《実施例２》
実施例１とは異なる領域１プライマー、領域２プライマー及び領域３プローブを用い、ＴａｑＭａｎ法により、乳酸桿菌数を測定した。
すなわち、フォワードプライマーとしてＦ６フォワードプライマーを、リバースプライマーとしてＲ１リバースプライマーを、プローブとしてＰ３プローブを用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。結果を表４に示す。
【００４１】
《比較例１》
領域１プライマー、領域２プライマー及び領域３プローブの組み合わせ以外のプライマー及びプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法により、乳酸桿菌数を測定した。
フォワードプライマーとしてＦ１１フォワードプライマー（配列番号３９）を、リバースプライマーとしてＲ４リバースプライマー（配列番号４０）を、プローブとしてＰ１１プローブ（配列番号４１）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマー及びプローブは、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ガセリ、ラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタス及びラクトバシラス・ファーメンタムの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子において、相同性の高い配列を有する領域に設定した。特に、Ｆ１１フォワードプライマー及びＰ１１プローブは、前記のすべての乳酸桿菌で塩基配列が一致している領域に設定した。Ｆ１１フォワードプライマー、Ｒ４リバースプライマー、及びＰ１１プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号４７に示したラクトバシラス・ラムノサスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
Ｆ１１：５‘−ＧＣＡＧＣＡＧＴＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴＣＣＡ−３’（３６９−３８９）Ｒ４：５‘−ＴＴＡＡＧＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＣＡＣＡ−３’（６２１−６４０）
Ｐ１１：５‘−ＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣ−３’（５３２−５５４）
結果を表４に示す。
【００４２】
《比較例２》
領域１プライマー、領域２プライマー及び領域３プローブの組み合わせ以外のプライマー及びプローブを用いて、ＴａｑＭａｎ法により、乳酸桿菌数を測定した。
フォワードプライマーとしてＦ１２フォワードプライマー（配列番号４２）を、リバースプライマーとしてＲ５リバースプライマー（配列番号４３）を、プローブとしてＰ１２プローブ（配列番号４４）を用いたことを除いては、実施例１に記載の測定方法を繰り返した。各プライマー及びプローブは、ラクトバシラス・ラムノサス、ラクトバシラス・カゼイ、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバシラス・ガセリ、及びラクトバシラス・アシドフィルス、ラクトバシラス・クリスパタス及びラクトバシラス・ファーメンタムのｓ１６ＲＮＡ遺伝子において、相同性の高い配列を有する領域に設定した。特にＦ１２フォワードプライマーとＲ５リバースプライマーは前記のすべての乳酸桿菌で塩基配列が一致している領域に設定した。また、Ｒ５リバースプライマーは領域２プライマーに相当する。Ｆ１２フォワードプライマー、Ｒ５リバースプライマー、及びＰ１２プローブの塩基配列を以下に示す。括弧内は配列番号４７に示したラクトバシラス・ラムノサスの塩基配列における相当するヌクレオチド番号を示す。
Ｆ１２：５‘−ＡＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＧＴＧＧＣＧ−３’（７２６−７４５）
Ｒ５：５‘−ＧＣＧＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧ−３’（９０１−９１８）
Ｐ１２：５‘−ＣＣＧＴＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＧ−３’（８２８−８５７）
結果を表４に示す。
【００４３】
《比較例３》
非特許文献４に記載のプライマーを使用し、サイバーグリーン法により、乳酸桿菌数を測定した。
SYBR Green PCR Mater Mix（アプライド・バイオシステムズ株式会社）を用いて、１チューブあたり、ＤＮＡサンプル及び以下の量の試薬を混合して、全体の液量が２０μＬの反応液を調整した。
SYBR Green PCR Mater Mix                ：１０μＬ
１０μＭのLactoFフォワードプライマー    ：０．２μＬ（終濃度１００ｎＭ）
１０μＭのLactoRリバースプライマー      ：０．２μＬ（終濃度１００ｎＭ）
ＤＮＡサンプル                          ：１．０μＬ
滅菌水                                  ：８．６μＬ
ＬａｃｔｏＦプライマー（配列番号４５）、ＬａｃｔｏＲプライマー（配列番号４６）の塩基配列を以下に示す。
ＬａｃｔｏＦ：５‘−ＴＧＧＡＡＡＣＡＧＲＴＧＣＴＡＡＴＡＣＣＧ−３’
ＬａｃｔｏＲ：５‘−ＧＴＣＣＡＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＣＣＣ−３’
反応液２０μＬの入ったチューブを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムにセットしＰＣＲ反応を行った。反応は５０℃２分間、９５℃１０分間の後に、９５℃１５秒間、６２℃１分間を４５サイクル繰り返し、増幅サイクル毎に蛍光強度を測定した。なお、プライマーはオリゴＤＮＡを化学合成により作製した。
標準曲線を作成するために、ラクトバシラス・ラムノサスJCM 1136株を培養して種々の菌濃度の標準試料を用意し、各々の菌濃度について発光強度が急激に大きくなる閾値（Ｃｔ値）を予め調べて、菌濃度の対数を横軸にＣｔ値を縦軸に取って検量線を作成した。同時に検体についてもＣｔ値を調べ、検量線に当てはめることにより検体中の菌濃度を測定した。結果を表４に示す。
実施例１及び２、並びに比較例１〜３のリアルタイムＰＣＲによる測定値は、検量線から算出したが、単位はｃｅｌｌ／ｍＬとして示す。
【００４４】
また、被験者の口腔内から採取した唾液を適宜希釈し、ＲＯＧＯＳＡ寒天培地にて培養した後、コロニー数をカウントすることにより乳酸桿菌数を測定した結果も表４に纏めて示す。
【００４５】
【表４】
2008271955.tif 000005
【００４６】
表４に示す結果より、本発明によるプライマー及びプローブセットを用いることによって、口腔内に存在する乳酸桿菌数を短時間で測定することができ、培養法と相関する結果を得ることができた。従って、本発明の方法及びキットを用いれば、口腔内に存在する乳酸桿菌数を効率良く測定することができる。一方、比較例１、２のプライマー及びプローブを用いた場合には、培養法とは異なる結果となり口腔内に存在する乳酸桿菌数の測定を行うことができなかった。また、比較例３のプライマーを用いた場合も、培養法で得られた乳酸桿菌数との相関は得られなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のプライマー及びプローブセットを用いてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、口腔内の乳酸桿菌数を測定することが可能である。乳酸桿菌数を測定することによって、う蝕のリスクを検出することが可能であり、う蝕の予防及び治療に役立てることができる。また、本発明の方法は、培養法と比較して多数の検体を処理することができるため、臨床検査センター等における多数検体の処理が可能である。
【配列表】
2008271955000001.app