(57)【要約】      （修正有）【課題】ＴＨ１リンパ球を検出、同定、単離、並びに選択的に標識及びターゲッティングする方法及び感染性疾患、癌、Ｔｈ１−仲介疾患及びＴｈ１及びＴｈ２細胞の不均衡を伴う疾患の治療方法の提供。【解決手段】リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）は、ヒト活性化Ｔ及びＮＫ細胞中で選択的に転写される免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。Ｔｈ１リンパ球の表面上におけるＬＡＧ−３の存在をマーカーとして使用して、Ｔｈ１リンパ球を検出および同定し、それらをＴｈ２リンパ球から判別することができる。ＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体は、Ｔｈ１細胞を検出及び単離する方法、並びにＴｈ１仲介疾患の診断方法で使用される。また感染性疾患、癌、及びＴｈ１／Ｔｈ２不均衡を伴う疾患を治療する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療すべき患者からＴｈ１およびＴｈ２細胞を含む試料を得る工程；
治療すべき患者から、下記（１）又は（２）に記載の方法に従って試料からＴｈ１細胞を単離する工程：
（１）Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む試料を、Ｔｈ１細胞を結合するために固体担体上に固体化したＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントを有する固体担体と接触させる工程；
固体担体上に固体化した抗体またはそのフラグメントに結合したＴｈ１細胞を単離する工程を含む方法；
（２）ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントを蛍光化合物で標識する工程： Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む試料を、Ｔｈ１細胞に、標識抗体またはそのフラグメントを結合するために、ＬＡＧ−３に特異的な標識抗体またはそのフラグメントと接触させる工程；
蛍光活性化セルソーティング装置によって標識抗体に結合したＴｈ１細胞を単離する工程を含む方法。；
単離したＴｈ１細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖する工程；および 治療すべき患者に再注入によって増殖したＴｈ１細胞を投与して、患者の食細胞依存性宿主防御を増大する工程を含む、感染性疾患、癌およびＴｈ１およびＴｈ２細胞の集団の不均衡を伴う異常を治療する方法。
【請求項２】
治療すべき患者からＴｈ１およびＴｈ２細胞を含む試料を得る工程；
ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントを、抗体またはそのフラグメントにＴｈ１細胞を結合するために試料と接触させる工程；
結合したＴｈ１細胞からＴｈ２細胞を分離する工程；
未結合のＴｈ２細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖する工程；
治療すべき患者に再注入によって増殖したＴｈ２細胞を投与して、患者の食細胞非依存性宿主防御を増大する工程を含む、感染性疾患、癌およびＴｈ１およびＴｈ２細胞の集団の不均衡を伴う異常を治療する方法。
【請求項３】
分離工程が蛍光活性化セルソーティング装置によって行われる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
上記接触工程において、ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントが固体担体上に固体化されている、請求項２記載の方法。
【請求項５】
固体担体がアフィニティークロマトグラフィーカラムである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
固体担体が磁気または常磁気ビーズである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
リンパ球をその表面上でのＬＡＧ−３タンパク質の発現についてアッセイすることを含み、それによって上記ＬＡＧ−３タンパク質の存在の検出がリンパ球がＴｈ１型であることを示す、Ｔｈ１リンパ球の存在を検出する方法。
【請求項８】
上記アッセイ工程がさらに、 ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントを蛍光化合物で標識する工程；
標識抗体またはそのフラグメントをＴｈ１細胞に結合するために、リンパ球を含む試料を標識抗体またはそのフラグメントと接触させる工程；
フローサイトメトリーによって試料中のＴｈ１細胞の量を測定する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ヒト液体試料を可溶性ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントと反応させる工程；および Ｔｈ１仲介疾患または異常の存在を診断するために、可溶性ＬＡＧ−３特異的抗体またはそのフラグメントに結合するヒト液体試料中の可溶性ＬＡＧ−３の量を測定する工程を含む、Ｔｈ１仲介疾患または異常を診断するための方法。
【請求項１０】
ＬＡＧ−３タンパク質をその表面上に発現する細胞に細胞毒性剤を向けて、Ｔｈ１リンパ球を選択的に殺すことを含む、Ｔｈ１仲介疾患を治療するための方法。
【請求項１１】
上記細胞毒性剤が、ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントに付着している、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
Ｔｈ１仲介免疫応答を増強する方法であって、それを必要とする被験者に、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化を極性化するために、ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与する工程を含む上記の方法。
【請求項１３】
Ｔｈ１仲介疾患の治療のための医薬の製造のための、ＬＡＧ−３タンパク質をその表面上に発現する細胞に向けられた細胞毒性剤の使用。
【請求項１４】
Ｔｈ１仲介免疫応答を増強するための医薬の製造のための、ＬＡＧ−３に特異的な抗体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１５】
感染性疾患、Ｔｈ１仲介疾患、癌、並びにＴｈ１およびＴｈ２細胞の集団の不均衡を伴う疾患および異常の治療のための医薬の製造のための、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖したＴｈ１またはＴｈ２細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＨ１リンパ球を検出、同定、単離、並びに選択的に標識およびターゲッティングする方法に関し、より詳細には、ＴＨ１リンパ球の同定のためのマーカーとしてその表面上のＬＡＧ−３タンパク質の存在を使用する前記方法に関する。本発明はまた、感染性疾患、癌、Ｔｈ１−仲介疾患およびＴｈ１およびＴｈ２細胞の不均衡を伴う疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）は、ヒト活性化Ｔ（ＣＤ４+およびＣＤ８+の両方）およびＮＫ細胞において選択的に転写されている免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である（Triebel他，１９９０；ＷＯ９１−１１０６８２も参照）。配列データ、比較したエキソン／イントロンの構成、および染色体における位置決定により、ＬＡＧ−３はＣＤ４に密接に関連していることが明らかになった（Baixeras他，１９９２）。ＬＡＧ−３とＣＤ４との密接な関連はさらに、両者が同一のリガンド、即ちＭＨＣクラスＩＩ分子を共有することが証明されたことによって強化された（Baixeras他，１９９２）。しかしながら、ＣＤ４とは対照的に、ＬＡＧ−３はヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０には結合しない（Baixeras他，１９９２）。インビボでのＬＡＧ−３の発現は、脾臓、粘膜付着リンパ組織または正常リンパ節などの一次リンパ器官中にはいずれも見られなかった。しかしながら、それは炎症を起こした扁桃腺、または濾胞性過形成を有するリンパ節では容易に検出され、インビボでさえ、ＬＡＧ−３は活性化後に発現するという考え方が裏付けている（Huard他，１９９４Ａ）。コードされたＬＡＧ−３タンパク質の生理的役割は依然不明である。抗−ＬＡＧ−３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の存在下でのＴ細胞クローンの抗原特異的刺激は、チミジン取り込みの増加、活性化マーカーＣＤ２５のより高度の発現、並びにサイトカイン産生の向上をもたらした（Huard他，１９９４Ｂ）。従って、可溶性組み換え体のＬＡＧ−３の添加により抗原特異的Ｔ細胞増殖は阻害され、ＣＤ４+Ｔリンパ球活性化におけるＬＡＧ−３の調節的役割が示唆された（Huard，１９９５）。
【０００３】
マウスおよびヒトの両方のＣＤ４+Ｔ細胞クローンの研究により、ＣＤ４+Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞がそれらのプロフィールまたはサイトカイン産生に基づいて機能的に異種の集団を含むことが示された（Mosmann他，１９８６；Del Prete他，１９９１）。Ｔｈ１細胞はインターロイキン（ＩＬ）−２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−βを産生する一方、Ｔｈ２細胞はＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する。Ｔｈ１またはＴｈ２細胞の顕著な分化がない場合には、大部分のＣＤ４+Ｔ細胞は、Ｔｈ１−およびＴｈ２−型のサイトカインの両方を産生する（即ち、Ｔｈ０細胞）（Mosmann他，１９９６；Del Prete他，１９９１；Sher他，１９９２；Romagnani，S.，１９９４）。近年、本発明者はヒトＴｈ１およびＴｈ２クローンが異なる機能的特性を示すのみならず、ＴＮＦ受容体ファミリーに属する活性化マーカーである（Smith他，１９９０）ＣＤ３０の異なる発現（Del Prete他，１９９５Ａ）をも示すことを示した。
【０００４】
Ｔｈ１細胞は器官特異的自己免疫疾患の病原に寄与する一方、Ｔｈ２細胞はそれらを阻止していることが示唆されている（Liblau他，１９９５）。従って、Ｔｈ２細胞を除外してＴｈ１細胞を同定および単離するための簡単な方法を有することは有用であると考えられる。
【０００５】
本明細書中のいかなる文献の引用も、そのような文献が適切な従来技術であるとか本出願の請求の範囲の特許性に対する材料とみなされることを承認することを意図するものではない。いかなる文献の内容またはその日付に関するどの記載も、出願当時に出願人に入手可能な情報に基づくものであり、そのような記載の正確性に関する承認を意味するものではない。
【発明の開示】
【０００６】
ＬＡＧ−３の発現がＴｈ１型サイトカインの産生に向けられたＣＤ４+Ｔ細胞に優先的に付随していることが今回発見された。即ち、ＬＡＧ−３の発現は、Ｔｈ１リンパ球を検出および同定し、それらをＴｈ２リンパ球から判別するためのマ一カーとして使用することができる。ＬＡＧ−３に対するモノクローナル抗体を使用してＬＡＧ−３タンパク質を発現するＴｈ１リンパ球を検出し同定することができる。
【０００７】
さらに、ＬＡＧ−３マーカーを使用してＴｈ１細胞をＴｈ２細胞から単離することができる。例えば、Ｔｈ１細胞は器官特異的自己免疫疾患の病原に寄与する一方、Ｔｈ２細胞はそれらを阻止することが知られている。即ち、自己免疫疾患患者からの自己由来のＴ細胞を、ｅｘ ｖｉｖｏでＴｈ１およびＴｈ２富裕画分への分離に付し、Ｔｈ２細胞を再注入し、自己免疫疾患との闘病を助ける。同じことが、Ｔｈ１細胞によって優先的に仲介される任意の疾患または状態、例えば接触皮膚炎などにも当てはまる。
【０００８】
ＬＡＧ−３がＴｈ１リンパ球に対する選択的マーカーであるという知見を使用するもう一つ別の治療方法は、ＬＡＧ−３タンパク質の細胞外部分に特異的なモノクローナル抗体を使用するイムノトキシンによるものである。毒成分が当分野で周知の手段によってそのような抗体に付着されれば、Ｔｈ１リンパ球は破壊のために選択的にターゲッティングすることができる。Ｔｈ１型からＴｈ２型へＣＤ４+ヘルパーＴ細胞の均衡をこのように効率的に移動させることによって、Ｔｈ１仲介疾患を軽減することができる。
【０００９】
あるいは、抗−ＬＡＧ−３モノクローナル抗体を使用して、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞集団の均衡を調節して、Ｔｈ０細胞のＴｈ１細胞への分化の極性を与える。
ＬＡＧ−３に対する標識モノクローナル抗体を使用してＴｈ１細胞を選択的に標識することができる。即ち、放射活性標識を使用する場合、Ｔｈ１細胞の位置は適当な可視化手段によって追跡することができる。
本発明のもう一つ別の側面は、固体担体上に固定されているか、または蛍光化合物で標識された抗−ＬＡＧ−３抗体をＴｈ１細胞に結合して、Ｔｈ１細胞をＴｈ２細胞から分離することである。
【００１０】
本発明のさらに別の側面は、患者へ再注入するために単離または富裕化されたＴｈ１またはＴｈ２細胞を増殖することであり、各々食細胞依存性または食細胞非依存性の宿主防御を増加するために、その患者から上記細胞は得られる。
さらに、本発明はまた、患者からの液体試料中で可溶性ＬＡＧ−３特異的抗体に結合する可溶性ＬＡＧ−３の量を測定することによるＴｈ１仲介疾患または異常を診断するための方法を提供する。
従って、本発明は、ＬＡＧ−３タンパク質がＴｈ１リンパ球に優先的に付随しているという知見を使用する上記方法の全てに関する。
【００１１】
図面の簡単な説明
図１は、抗原活性化ヒトＴ細胞による膜ＬＡＧ−３またはＣＤ３０の発現およびサイトカイン産生の動態を示す。ＳＫ（上部）またはＤｅｒｐ１（下部）に特異的なＴ細胞株は、実施例１に記載されている通りに正常被験者のＰＢＭＣから生成された。０日目並びに培養後６、１０および１４日目に、生存可能なＴ細胞ブラスト（blasts）を洗浄し、計数し、新しい培地に再懸濁し、実施例１に記載し左側のグラフに示す通りに、フローサイトメトリーによって膜ＬＡＧ−３（●）とＣＤ３０（○）の両方の発現について評価した。同一の時間間隔で、各株からのＴ細胞（１０6／ｍｌ）もＰＭＡ＋抗−ＣＤ３抗体で２４時間再刺激し、培養上清を、実施例１に記載し右側のグラフに示す通りに、適切なＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ（●）およびＩＬ−４（○）の含有量について評価した。結果は、３種の異なるドナーからの細胞で得られた平均値±ＳＥを示す。
【００１２】
図２は、ＩＬ−１２による膜ＬＡＧ−３発現の上昇調節を示す。破傷風毒素（ＴＴ）に特異的なＴ細胞株を、実施例１に記載されている通りに、ＩＬ−４およびＩＬ−１２の不在下（□）またはＩＬ−４の存在下（目）またはＩＬ−１２（■）の存在下で、正常被験者のＰＢＭＣから生成した。培養１０日目に、生存可能なＴ細胞ブラストを、 図１に記載する通りに、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の産生並びにＬＡＧ−３の発現について評価した。コラムは３回の別個の実験で得られた平均値（±ＳＥ）を示す。
【００１３】
図３は、４種のＣＤ４+Ｔ細胞クローンによる膜ＬＡＧ−３およびＣＤ３０発現の動態を示す。ＣＤ４+Ｔ細胞クローンは実施例１に記載されている通りに、正常ドナーのＰＢＭＣから生成した。各クローンのサイトカインプロフィールを評価するために、Ｔ細胞ブラスト（１０8／ｍｌ）をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）プラス抗−ＣＤ３抗体（１００ｎｇ／ｍｌ）で３６時間刺激し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を実施例１に記載する通りに、培養上清中で定量した。ＩＦＮ−γを産生できるがＩＬ−４を産生できないＴ細胞クローンをＴｈ１様と分類し；ＩＬ−４を産生するがＩＦＮ−γを産生しないＴ細胞クローンをＴｈ２様と分類し；ＩＬ−４とＩＦＮ−γの両方を産生するＴ細胞クローンをＴｈ０様と分類した。
【００１４】
２つのＴｈ１様および２つのＴｈ２様ＣＤ４+Ｔ細胞クローンをＰＨＡ（１％ｖ／ｖ）プラスＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）で刺激し、実施例１に記載されている通りに、フローサイトメトリーによってＬＡＧ−３とＣＤ３０の両方の発現について２４時間間隔で評価した。
【００１５】
図４は、８４のＣＤ４+Ｔ細胞クローン（３３のＴｈ１様、３３のＴｈ０様、そして１８のＴｈ２様）による膜ＬＡＧ−３の発現を示す。ＣＤ４+Ｔ細胞クローンを生成し、 図３に記載する通り、Ｔｈ１様、Ｔｈ０様そしてＴｈ２様と類別した。値は、ＰＨＡプラスＩＬ−２による活性化後４日目に膜ＬＡＧ−３発現を示す、各クローンからのＴ細胞ブラストの割合を示す。
【００１６】
図５は、ＰＨＡプラスＩＬ−２で刺激したＣＤ４+Ｔｈ１様クローンによる可溶性ＬＡＧ−３産生の動態を示す。Ｔ細胞ブラストによる膜ＬＡＧ−３（ｍＬＡＧ−３）の発現をフローサイトメトリーによって評価した（図１も参照）。可溶性ＬＡＧ−３を、実施例１に記載する通り、適切なＥＬＩＳＡによって無細胞上清中において測定した。結果は、５種の異なるＴ細胞クローンからの平均値±ＳＥを示す。
【００１７】
図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞クローンによって産生された可溶性ＬＡＧ−３、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度間の相関を示す。全部で１４６のＣＤ４+Ｔ細胞クローンを、ＰＨＡプラスＩＬ−２で４日間刺激し、無細胞上清中に放出された可溶性ＬＡＧ−３、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度を 図１および４に記載する通りに測定した。
【００１８】
図７Ａおよび７Ｂは、破傷風毒素を皮内に受けたサルの遅延型過敏性（ＤＴＨ）スコアを示す。最初のＤＴＨ（図７Ａ）は、ＴＴのみを受けた３頭の動物の２群を使用して行った。２番目のＤＴＨ（図７Ｂ）は、抗−ＬＡＧ−３モノクローナル抗体またはアイソタイプ適合した負のコントロールとして抗−ＦＳＨ抗体を予め投与した動物で行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ＬＡＧ−３発現は、ＣＤ３０と同様に、サイトカイン分泌のＴｈ１表現型に優先的に関係する。試験結果は、ＬＡＧ−３が抗原刺激Ｔ細胞においてＩＦＮ−γ産生に相関するが、ＩＬ−４産生に相関せず、それがバルク培養においてＩＬ−１２の添加によって上昇調節されることを実証した。さらに、大部分のＴｈ１およびＴｈ０クローンは、膜ＬＡＧ−３を発現し、検出可能な量の可溶性ＬＡＧ−３を放出する一方、わずかのＴｈ２クローンのみがＬＡＧ−３の発現と放出を示す。即ち、ＬＡＧ−３の発現は、Ｔｈ１型サイトカインの産生に指向したＣＤ４+Ｔ細胞に優先的に付随している。
【００２０】
本実施例に記載した結果は、活性化ヒトＴおよびＮＫ細胞上で選択的に転写されるＩｇスーパーファミリーの一員であるＬＡＧ−３が（Triebel他，１９９０）、Ｔｈ１型サイトカインを産生するＣＤ４+Ｔ細胞によって優先的に発現されていることを実証している。まず第一に、短期間培養物でのＬＡＧ−３発現は、抗原活性化Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生する能力に相関していたが、ＩＬ−４産生とは相関していなかった。第二に、抗原刺激化Ｔ細胞上へのＬＡＧ−３の出現は、強力なＴｈ１誘導サイトカインであるＩＬ−１２（Manetti他，１９９３；Manetti他，１９９４）によって上昇調節される一方、それは、対照的にＴｈ２細胞の発達を促進するＩＬ−４（Maggi，１９９２）によって影響を受けなかった。最も重要なことに、ＬＡＧ−３はサイトカイン分泌の確立したＴｈ１またはＴｈ０プロフィールを有するＣＤ４+Ｔ細胞クローンの大部分によって発現されていたが、それはＴｈ２クローンにおいては実質的に不在であった。最後に、ＬＡＧ−３関連可溶性分子は、ＩＦＮ−γまたはＩＦＮ−γとＩＬ−４との両方を産生することができる活性化ＣＤ４+Ｔ細胞によって放出されたが、ＩＬ−４のみの産生を誘導できるＣＤ４+Ｔ細胞によっては放出されなかった。
【００２１】
ＬＡＧ−３はＣＤ４と密接な関連を示し、両方の分子が共通する進化上の祖先に由来していることを示唆している（Triebel他，１９９０）。さらに、ＬＡＧ−３およびＣＤ４タンパク質は共通のリガンド（即ち、ＭＨＣクラスＩＩ抗原）を共有する（Baixeras，１９９２）。即ち、ＬＡＧ−３は、表面上に多数のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現することが知られている抗原提示細胞との活性化Ｔ細胞の相互作用の調節への貢献において有効であるかもしれない。一方、活性化Ｔ細胞もクラスＩＩ分子を発現するので、この分子もＴ細胞／Ｔ細胞相互作用を調節するかもしれない。活性化Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生できる能力、並びにＩＬ−４の選択的産生に指向した活性化Ｔ細胞によるその損失とＬＡＧ−３発現との強い関係は、ＬＡＧ−３とＩＦＮ−γの両方の遺伝子転写の共通するかまたは交差した調節を示唆している。
【００２２】
Ｔｈ１型サイトカインを産生することができるＣＤ４+Ｔ細胞によって、ＬＡＧ−３が優先的に発現し、その可溶形態が放出されていることの実証によりさらに、Ｔｈ１またはＴｈ２経路の発達に関与する機構への洞察も可能になるかもしれない。Ｔｈ１およびＴｈ２細胞は実際に外生の攻撃剤に対する２つの非常に極性化した形態のエフェクター免疫応答を示す（Mosmann他，１９８６；Del Prete，１９９１；Sher他，１９９２；Romagnani，S．，１９９４）。Ｔｈ１細胞はマクロファージ活性化（ＩＦＮ−γを介する）および遅延型過敏性反応に責任があり、そしてマウス系では、食作用のために補体を活性化し、抗原をオプソニン化する際に有効であるＩｇＧ２ａクラスの抗体の産生を刺激する（Sher他，１９９２；Romagnani，S.,１９９４）。即ち、Ｔｈ１細胞は主に細胞内微生物による感染に対する食細胞仲介宿主防御を開始させ、その細胞内微生物が今度はＴｈ１型応答を誘導する傾向がある（Sher他，１９９２；Romagnani，S.,１９９４）。一方、Ｔｈ２細胞はＩｇＥおよびＩｇＧ１抗体の産生を（ＩＬ−４およびＩＬ−１３を介して）誘導し、マスト細胞の成長（ＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−１０を介して）、好酸球の分化および活性化（ＩＬ−５を介して）を促進し、幾つかのマクロファージ作用（ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＬ−１０を介して）を阻害することができる。従って、Ｔｈ２細胞は普遍的に、例えば寄生虫に対する食細胞非依存性宿主防御、並びにＩｇＥ抗体および好酸球によって仲介される普通の環境アレルゲンに対するアトピー性の人の応答に関与している（Sher他，１９９２；Romagnani，S.,１９９４）。Ｔｈ１またはＴｈ２極性化シグナルの性質は未だ十分には理解されていない。マウスおよびヒトの両方において、マクロファージおよびＢ細胞によって産生されたＩＬ−１２はＴｈ１分化を誘導する一方（Manetti他，１９９３；Manetti他，１９９４；Hsieh他，１９９３）、抗原提示の時点での初期のＩＬ−４産生は、生成したばかりのＴｈ細胞のＴｈ２極性化の可能性を決定する際の最も有力な因子であるように見える（Maggi他，１９９２；Swain，S.L.,１９９３；Seder他，１９９２）。しかしながら、抗原提示細胞およびそれらの同時刺激剤の役割もまた示唆されている（Reiner他，１９９３）。この点、Ｔｈ０／Ｔｈ２細胞の優先的マーカーであるＣＤ３０（Del Prete他，１９９５Ａ）と、Ｔ細胞のみならずマクロファージおよびＢ細胞でも発現しているＣＤ３０リガンド（Smith他，１９９０；Maggi他，１９９５）との相互作用がＴｈ２型サイトカインを産生するＴ細胞のインビトロでの優先的な発達を促進することは注目に値する（Del Prete，１９９５Ｂ）。ＬＡＧ−３発現はＴｈ１型サイトカインを産生するＴ細胞の選択的分化および／または活性化経路を反映しているので、Ｔ細胞による複数の細胞表面分子およびサイトカインの発現の調節におけるＬＡＧ−３およびそのリガンドの機能を決定することは興味深いことであろう。
【００２３】
表面ＬＡＧ−３発現の検出および／またはその可溶形態の測定を、異なる疾患の組織および／または生物学的液体中におけるＴｈ１／Ｔｈ０仲介免疫応答の認識のためのマーカーとして利用することができる。そのようなＴｈ１仲介疾患または異常の非限定的例は、MosmannおよびSad（１９９６）に概説されている。インビトロでの活性化Ｔｈ２様細胞の優先的マーカーであるＣＤ３０＋（Del Prete，１９９５Ａ）は、インビボの正常な被験体では決して発現していないが、多数のＣＤ４+ＣＤ３０+Ｔ細胞はオメン(Omenn's)症候群（Romagnani，１９９５；Chilosi他，提出）を伴う子供のリンパ節中、並びにアトピー性皮膚炎を伴う患者の損傷皮膚中に見出すことができる。さらに重要なことに、高レベルの可溶性ＣＤ３０が、オメン(Omenn's)症候群（Romagnani，１９９５）または重症のアトピー（Romagnani，１９９５）を伴う患者の血清中、並びに、ＨＩＶ感染（Pizzolo，１９９４）、全身性円板状エリテマトーデス（Cappio他，１９９５）および麻疹ウイスル感染（Vinante他）などの、Ｔｈ０／Ｔｈ２細胞の優勢な活性化が示唆されている（Clerici他，１９９３；Mills，J.A.,１９９４；Griffin他，１９９３）他の病理的状態を伴う被験者の血清中においても存在している。ＣＤ３０に関しては、ＬＡＧ−３は正常リンパ器官には一切見られなかったが、炎症を起こした扁桃腺または濾胞性過形成を有するリンパ節では容易に検出され（Huard他，１９９４）、インビボでさえそれは活性化後にのみ発現していることが示唆される。
【００２４】
興味深いことに、最近の実験で、本発明者の実験室は、Ｔｈ１仲介異常の原型と考えられる（Selmaj他，１９９１）、多発性硬化症を有する大部分の患者の血清中において可溶性ＬＡＧ−３のレベルが上昇しているが可溶性ＣＤ３０のレベルは上昇していないことを見出した。健康な人に対して多発性硬化症の患者の血液中において可溶性ＬＡＧ−３のレベルが上昇していることは、病状と体中での可溶性ＬＡＧ−３の産生との間に関係がある可能性を示唆している。逆に、高い割合のＴｈ１ＬＡＧ−３陽性ＣＤ４リンパ球が多発性硬化症の患者の脳脊髄液中に見出された（Annunziato他，１９９６）。多数のＴｈ１様Ｔ細胞クローンは実際、表面ＬＡＧ−３を一貫して発現し、高濃度の可溶性ＬＡＧ−３をその上清に放出するこの疾患を有する２人の患者の脳脊髄液から産生され得た。これらの知見に基づいて、可溶性ＣＤ３０と可溶性ＬＡＧ−３の測定の組み合わせは、Ｔｈ２またはＴｈ１プロフィールに向かうエフェクター免疫応答の不均衡を評価するための簡単な実用的な方法を示すものである。
【００２５】
ＬＡＧ−３の表面部分に対するモノクローナル抗体を、ＷＯ９１−１０６８２および１９９５年２月２４日出願の米国特許出願番号０８／３９４，４４２に記載された方法によって得ることができ、これらの全内容は引用により本明細書中に取り込まれる。そのようなモノクローナル抗体、あるいはＦａｂまたはＦ（ａｂ）２画分などのその画分、あるいはその重鎖または軽鎖の可変部分、あるいは一本鎖抗体、あるいはそのような抗体の結合部分を含む任意の他の分子を使用すれば、Ｔｈ１細胞はＬＡＧ−３を優先的に発現するので、Ｔｈ１細胞を同定、検出、標識および／またはターゲッティングすることができる。本発明は、当分野で周知であるような、免疫検出および標識の全ての既知の手段、例えば、酵素、蛍光、化学発光、生物発光または放射活性を包含することを意図する。そのような技術は、例えば、Harlow他，"Antibodies:A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor Laboratory，1988，"Current Protocols in Immunology"，Coligan他編.，Wiley & Sons社，1992-1996、および当業者に周知の多数の他の出典から既知である。即ち、Ｔｈ１細胞を検出し、Ｔｈ１仲介疾患または異常を診断するためのマーカーとして生物学的試料中でのＴｈ１細胞または可溶性ＬＡＧ−３の量の測定を利用することは十分に当業者の知識の範囲内である。
【００２６】
健康な人と比較して患者の血液中の可溶性ＬＡＧ−３のレベルが上昇していることを検出することは、Ｔｈ１仲介疾患または異常、そして特に多発性硬化症の存在を示す。上昇した可溶性ＬＡＧ−３のレベルがＴｈ１仲介疾患または異常とこのように相関することは、ヒト液体試料中での診断試験として使用することができる。試料を、可溶性ＬＡＧ−３に特異的な抗体、またはそのフラグメントと反応させ、特異的抗体に結合した可溶性ＬＡＧ−３の量を当分野で周知の技術によって測定する。
【００２７】
モノクローナル抗体の使用に加えて、十分に選択的なＬＡＧ−３に対するリガンドが見つかる場合には、そのようなリガンドも、本発明に従ってＴｈ１リンパ球の検出、同定、標識および／またはターゲッティングのために使用することができる。
【００２８】
ＬＡＧ−３に特異的な抗体は、固体担体、好ましくはクロマトグラフィーカラム、磁気または常磁気ビーズ、またはペトリ皿上に固定化することができ（Current Protocols in Immunology，Vol．2，unit 7.3および7.4，Wiley & Sons，Inc．1992-1996）、アフィニティー担体として使用して、固体担体上に固定化した抗ＬＡＧ−３抗体への結合に基づいてＴｈ１およびＴｈ２細胞を分離することができる。例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞の混合物を含有する試料を、Ｔｈ１細胞を結合するために固体担体上に固体化した抗ＬＡＧ−３抗体を有するそのような固体担体と接触させることができる。表面上にＬＡＧ−３を有さない試料中のＴｈ２および他の細胞は未結合のままであり、溶出、洗浄等によって容易に除去することができる。あるいは、磁気または常磁気ビーズ上に固体化した抗ＬＡＧ−３抗体に結合したＴｈ１細胞を代わりに除去して、単離または富裕化されたＴｈ１細胞を得ることができる。固体化した抗ＬＡＧ−３抗体に結合したＴｈ１細胞を次いで未結合にし、単離できる。同様に、固体化した抗ＬＡＧ−３抗体に結合していないＴｈ２細胞をＴｈ１細胞から分離し、ＬＡＧ-−Ｔｈ２細胞富裕化集団として使用することができる。
【００２９】
Ｔｈ１細胞を、Becton Dickinsonを含む様々な機器供給業者によって市販されている蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）装置によってＴｈ２細胞から分離することもできる。蛍光化合物で標識した抗ＬＡＧ−３抗体またはそのフラグメントをＴｈ１およびＴｈ２細胞を含有する試料と反応させてＴｈ１細胞に結合させる（Current Protocols in Immunology，unit 5,上掲）。標識抗体と反応した試料を通過させると、他の細胞、例えばＴｈ２細胞から、蛍光標識した抗体に結合した標識抗体Ｔｈ１細胞が分離される。これは、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を分離して、試料を得た患者への再注入によって患者の食細胞依存性宿主防御（Ｔｈ１再注入の場合）または食細胞非依存性宿主防御（Ｔｈ２再注入の場合）を増加させる疾患または異常の治療方法でのｅｘ ｖｉｖｏ増殖のためにＴｈ１（またはＴｈ２）富裕化集団を得るための別の非限定的例である。
【００３０】
さらに、本発明はまた、感染疾患、癌、Ｔｈ１とＴｈ２細胞の集団の不均衡を伴うＴｈ１仲介疾患および異常の治療方法に関する。MosmannおよびSadは（１９９６）は、これらの疾患および異常の幾つかを概説している。例えば、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、リューマチ性関節炎（ＲＡ）、および移植拒絶には、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞集団の不均衡（過多のＴｈ１）が関与している。従って、不均衡、即ち疾患または異常におけるＴｈ１またはＴｈ２細胞の相対的に低い量に依存して、治療すべき患者に由来するＴｈ１またはＴｈ２細胞の増幅したプールの投与を与えて、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞の不均衡を減少することができる。
【００３１】
Ｔｈ１細胞のレベルを増加させることが所望される疾患および異常のためには、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞を含む治療すべき患者からの液体試料を得て、Ｔｈ１細胞を、固体化抗−ＬＡＧ−３抗体に結合し次いで固体担体を回収することによって、あるいは蛍光標識抗−ＬＡＧ−３抗体に結合してＦＡＣＳ装置に通過させて分別することによって、上記したように単離する。Ｔｈ２細胞から分離した、これらの単離したＴｈ１細胞を次いで当分野で周知の標準技術、即ちｅｘ ｖｉｖｏ骨髄原種増殖技術および養子治療用のＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増殖（Macatonia他，１９８９；De Bruijn他，１９９１；Oldstone他，１９８６；Kast他，１９８９；Riddell他，１９９２）によってｅｘ ｖｉｖｏで増殖し、次いで同一の患者に再注入してＴｈ１細胞のレベルを増加させることができる。このように、増殖したＴｈ１細胞の再注入は患者の食細胞宿主防御（細胞仲介免疫）を増加させる。
【００３２】
同様に、Ｔｈ２細胞のレベルを増加させることが所望される疾患および異常、即ち、アレルギーのためには、患者から得られＴｈ１およびＴｈ２細胞を含有する液体試料を固体化抗−ＬＡＧ−３抗体と接触させる。しかし、この場合、ｅｘｖｉｖｏ増殖で使用すべきものはＴｈ１細胞から分離した未結合のＴｈ２である。Ｔｈ２細胞を得た患者への増殖したＴｈ２細胞の再注入は、患者の食細胞非依存性宿主防御（体液性免疫）を増加させる。
【００３３】
本発明の方法で使用されるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、細胞毒性剤と結合してイムノトキシンとして使用することができ（例えば、Vitetta他，Science 238，1098-1104（1987）を参照）、あるいは抗Ｔ細胞薬剤または毒素を含有するリポソームの表面上に取り込んで、そのような薬剤または毒素をＴｈ１細胞に特異的にターゲッティングすることができる。本明細書で使用する限り、「イムノトキシン」という用語は、抗体と１以上の毒素、薬物、放射核種、または細胞毒性剤との結合体または構築体のことを言う。毒性成分は抗体に化学的に結合することができ、あるいは組み換えＤＮＡ技術によって連結することができる。そのような連結の場合、毒性タンパク質またはその活性フラグメントをコードするＤＮＡを、ｍＡｂ重鎖、軽鎖、またはその両方の完全または一部分をコードするＤＮＡに連結する。そのような遺伝的構築物およびそれらの製造方法は当分野で既知である。本発明の抗体に結合することができる毒素としては、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス毒素、腫瘍壊死因子α、および当分野で既知の他のものが挙げられる。
【００３４】
イムノトキシンとして抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂｓを使用する典型的治療では、抗体を、単独で全細胞に対して毒性であるリシンなどの毒素に結合させる。抗体に細胞毒性剤を結合することによって、高レベルの毒性効率を、抗体が結合しない隣接細胞に影響を与えずに、抗体が毒素を送達する標的Ｔｈ１細胞に対して、高度に局在化した様式で達成することができる。Ｔｈ１仲介疾患を、Ｔｈ１型からＴｈ２型へＣＤ４+ヘルパーＴ細胞の均衡を効率的に移動させることによって軽減することができる。
【００３５】
あるいは、抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂを使用してＴｈ１／Ｔｈ２細胞集団の均衡を調節することができる。この戦略はＢ７／ＣＴＬＡ４−ＣＤ２８リガンド受容体系により得られる実験によって例示される。簡単に言うと、Ｔリンパ球の誘導および活性化は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの２つのシグナルを必要とし、一つはＴ細胞受容体／主要組織適合性複合体の相互作用から伝達され、二番目のものは同時刺激性分子の相互作用によって伝達される。後者のシグナルには、ＡＰＣによって発現され、Ｂ７−１およびＢ７−２と命名される少なくとも２種の分子が含まれ、それらはＴ細胞によって発現されるそれらの対受容体、即ちＣＤ２８とＣＴＬＡ４と相互作用する。Ｂ７−１に対する抗体を使用して、生成したばかりのＴｈ前駆体はＴｈ２経路に駆動される一方、抗−Ｂ７−２抗体はＴｈ１の発達を促進することが報告されている（Kuchroo他，1995）。さらに、抗Ｂ７−１抗体の投与は、器官特異的自己免疫疾患、例えば、マウス実験系自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ、ヒト多発性硬化症の動物モデル）を軽減することを示した一方、抗−Ｂ７−２抗体の注入はＥＡＥの臨床兆候を有意に悪化させた。さらに、Ｔｈ２プロフィールを有するＴリンパ球を再注入するとＥＡＥの誘導を阻止できることが示された。
【００３６】
同様な方法で、抗−ＬＡＧ−３抗体、またはそのフラグメントの投与を使用して、Ｔｈ０前駆体細胞のＴｈ１細胞への分化を極性化することによってＴｈ１仲介免疫応答（食細胞依存性宿主防御）を増加させることができる。
【００３７】
本発明の目的のために使用される抗体は無傷な抗体、好ましくはヒトモノクローナル抗体でもよいが、所望の機能を付与するのは抗体のエピトープ結合部位であることは理解されるべきである。即ち、無傷の抗体に加えて、ＦａｂまたはＦ（ａｂ'）２フラグメントなどのそれらのタンパク質分解フラグメントを使用することができる。さらに、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを他の抗体に挿入してキメラ抗体を作製することができ（例えば、米国特許４，８１６，５６７号を参照）、あるいはＴ細胞受容体に挿入して同一範囲の特異性を有するＴ細胞を作製することができる（Eshhar，Z.他，Br．J．Cancer Suppl.，10:27-9(1990);Gross，G.他，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，86:10024-8(1989)を参照）。一本鎖抗体も作製し使用できる。一本鎖抗体は、抗原結合能力を有し、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域に相同または類似する一対のアミノ酸配列を含む、一本鎖複合ポリペプチドでもよい（リンクしたＶＨ−ＶＬまたは一本鎖ＦＶ）。ＶＨおよびＶＬは共に、天然のモノクローナル抗体配列をコピーしてもよいし、あるいは鎖の片方または両方は、米国特許５，０９１，５１３号（その全内容が引用により本明細書中に取り込まれる）に記載した型のＣＤＲ−ＦＲ構築体を含んでもよい。軽鎖および重鎖の可変領域に類似する別個のポリペプチドをポリペプチドリンカーによって一緒に保持する。そのような一本鎖抗体の作製方法は、特にＶＨおよびＶＬ鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが既知の場合、例えば米国特許４，９４６，７７８号、５，０９１，５１３号および５，０９６，８１５号に記載された方法に従って達成することができ、これらの各々の全内容は引用により本明細書中に取り込まれる。
【００３８】
本明細書および請求の範囲で使用する場合、「抗体の抗原結合部分を含む分子」という用語は、任意のアイソタイプのもので、任意の動物細胞株または微生物から生成した無傷の免疫グロブリン分子のみならず、それらの反応性画分をも包含することが意図され、それらにはＦａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、それらの重鎖および／または軽鎖の可変部分、およびそのような反応性画分を取り込んでいるキメラまたは一本鎖抗体、並びにそのような抗体反応画分が物理的に挿入された任意の他の型の分子または細胞、例えばキメラＴ細胞受容体またはそのような受容体を有するＴ細胞、またはそのような反応性画分を含有する分子の部分によって治療成分を送達するために開発した分子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００３９】
インビボでのＴｈ１／Ｔｈ２細胞の均衡を調節するための活性成分として、抗−ＬＡＧ−３抗体、またはそのフラグメントを含有する医薬組成物において、医薬組成物中における活性成分および薬学的に許容できる賦形剤または担体の量は当業者によって容易に決定できる。
【実施例】
【００４０】
実施例１
材料および方法
試薬
破傷風毒素（ＴＴ）はIstituto Steroterapico Sclavo(Siena，Italy)から得た。ストレプトキナーゼ（ＳＫ）はBehringwerke（Malburg，Germany）から得た。Dermatophagoides pteronyssinusグループ１（Der pl）はLofarma Allergeni(Milano，Italy)から得た。ＰＨＡはＧＩＢＣＯラボラトリー（Grand Island,N.Y.）から購入した。抗ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ortho Pharmaceuticals（Raritan，N.J.）から購入した。抗ＣＤ４(Leu 3a，IgG1)、抗ＣＤ８(Leu 2a，IgG1)、抗ＣＤ５６(Leu 19，IgG1)および抗ＣＤ１４(Leu M1，IgG2b)ｍＡｂｓはBecton-Dickinson(Mountain View，Ca)から購入した。抗ＣＤ２０(B1，IgG2a)はKontron Instruments（Zurich，Switzerland）から購入した。抗ＣＤ３０(Ber-H2)ｍＡｂはDakoから購入した。ＬＡＧ−３分子の３種の異なるエピトープを認識する抗ＬＡＧ−３ｍＡｂｓ（１７Ｂ４，ＩｇＧ１；および１１Ｅ３，ＩｇＧ１）（Baixeras他，1992）はAres Serono（Geneve，Switzerland）から得た。ハイブリドーマ細胞株１７Ｂ４は番号Ｉ−１２４０の下、コレクション・ナショナル・ド・カルチャー・ド・マイクロオーガニズムス（ＣＮＣＭ）に１９９２年７月１０日に寄託され、ハイブリドーマ細胞株１１Ｅ３も番号Ｉ−１６１２の下１９９５年７月２０日にＣＮＣＭに寄託された。組み換えＩＬ−２はEurocetus（Milano，Italy）の寛大な寄贈物である。組み換えＩＬ−１２はG．Trinchieri(Wistar Institute;Philadelphia，PA)の親切な寄贈物である。
【００４１】
抗原特異的Ｔ細胞株およびクローンの作製
抗原特異的Ｔ細胞株を以前に記載された技術に従って作製した（Del Prete他，1991;Del Prete，1995A）。簡単に言うと、２ｍＭのＬ−グルタミン、２×１０-5Ｍの２−メルカプトエタノール、および５％のヒト血清を補充した２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地（完全培地）中の１０6個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抗原（ＳＫ，１００ＩＵ／ｍｌ；Ｄｅｒ ｐ １，１０μｇ／ｍｌ；ＴＴ，０．５μｇ／ｍｌ）で５日間２４穴平底プレート中で刺激した。ヒトＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）を次いで添加し、培養をさらに９日間継続した。生存可能なＴブラストを完全培地に再懸濁し、クローニング操作の前に抗原特異性について試験した。Ｔ細胞株の抗原特異性を評価するために、２×１０4個のＴブラストをマイクロプレートに接種し、培地単独または好適な抗原（ＳＫ，１００ＩＵ／ｍｌ；Ｄｅr ｐｌ，１０μｇ／ｍｌ；ＴＴ，０．５μｇ／ｍｌ）の存在下で、照射した（６，０００ｒａｄ）自己由来のＰＢＭＣ（５×１０4）と共に４８時間同時培養した。０．５μＣｉの3Ｈ−ＴｄＲ（Amersham International）で１６時間パルスした後、培養物を採取し、放射活性を液体シンチレーションで測定した。Ｔ細胞クローンを作製するために、抗原特異的株から得たＴブラストを、他で報告されている通り(Del Prete，1991;Del Prete，1995A)、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）および１０％ＦＣＳ（Hyclone Laboratories Inc.，Logan，UT)を補充した０．２ｍｌの最終容量の完全培地中に、１０5の照射した（６，０００ｒａｄ）同種ＰＢＭＣ細胞（フィーダー細胞として）およびＰＨＡ（１％容量／容量）を含む６個の丸底マイクロウエルプレート中に限界希釈条件下（０．３細胞／ウエル）で接種した。成長するマイクロ培養物に次いで、１週間隔でＩＬ−２（２０Ｕ／ｍ１）および１０5の照射フィーダー細胞を補充した。株およびクローンの表現型分布をフローサイトメーター分析によって評価した。クローンの抗原特異性を、ＭＨＣ制限条件下で適切な抗原で６０時間刺激した後3Ｈ−ＴｄＲ取り込みを測定することによって評価した１（Del Prete，1991;Del Prete，1995 A）。刺激インデックス（ＡＰＣプラス抗原で刺激した培養物中で得られた分当たりの平均カウントと、ＡＰＣ単独による培養物中で得られた分当たりの平均カウントとの間の比率）が１０より大きい場合に、応答を陽性とみなした。
【００４２】
Ｔ細胞株およびクローンによるサイトカイン産生の誘導と定量
サイトカイン産生を誘導するために、各株またはクローンからの１０6のＴブラストをＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）プラス抗ＣＤ３ｍＡｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。２４時間後、培養上清を回収し、濾過し、使用するまで−７０℃でアリコートで保存した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の定量的測定は市販のＥＬＩＳＡｓ（Cytoscreen，Biosource International，Camarillo ＩＦＮ−γ用、Quantikine R & D Systems，Minneapolis ＩＬ−４用）によって行った。照射したフィーダー細胞単独の刺激によって得たコントロール上清のものに対して３ＳＤのサイトカイン含有量の値を陽性とみなした。
【００４３】
表面ＬＡＧ−３およびＣＤ３０の検出
Ｔ細胞株およびクローンの細胞表面マーカーの分析をＦＩＴＣ結合抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８および抗−ＣＤ３０（Ｂｅｒ−Ｈ２；Dakopatts，Glostrup，Denmark）を使用することによってCytoron Absoluteサイトフルオリメーター（Ortho Pharmaceutical，Raritan，N.J．）で行った。ＬＡＧ−３を、未標識抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂと、その後にＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗血清（Southern Biotechnology Associates Inc.；Birmingham，AL）を使用する間接アッセイによって検出した。ＣＤ３０とＬＡＧの同時検出を、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ−３０ｍＡｂ（Ｂｅｒ−Ｈ２；Dako）および抗ＬＡＧ−３（１１Ｅ３）ｍＡｂと、その後にＰＥ結合抗マウスＩｇＧ１ヤギ抗血清（Southern Biotechnology Associates Inc.）を使用することによって行った。
【００４４】
ＬＡＧ−３のｍＲＮＡの発現
ＬＡＧ−３ｍＲＮＡの発現をＰＣＲ技術によってＴ細胞クローン中で評価した。ｍＲＮＡを、OligotexMダイレクトｍＲＮＡキット（Qiagen Inc.；Chatsworth，CA）によってＰＨＡ（１％ｖ／ｖ）およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）で１２時間刺激したＴ細胞ブラストから抽出した。第１鎖ｃＤＮＡを１００ｎｇのｍＲＮＡ、逆転写酵素、およびオリゴｄＴプライマーを使用して３７℃で１時間合成した（ＲＴ−ＰＣＲキット、Strategene;La Jolla，CA）。ＰＣＲ増幅は２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ、および１００ｎｇの各プライマーを使用して行い、３０サイクルの増幅から成り、各サイクルには９４℃で１分間の変性、６６℃で１分間のアニーリング、および７２℃で２分間の伸長が含まれる。前進方向プライマーはＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＧＡＣＴＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＧ（配列番号１）であり、逆方向プライマーはＴＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣ（配列番号２）であった。増幅産物は１．５％アガロースゲル上で泳動した。
【００４５】
ＥＬＩＳＡによる可溶性ＬＡＧ−３産生の評価
Ｔ細胞クローンの上清中の可溶性ＬＡＧ−３の検出を、組み換え可溶性ＬＡＧ−３由来分子（ｓＬＡＧ−３Ｄ１−Ｄ２）の使用に基づいた適切なＥＬＩＳＡによって行った。ｓＬＡＧ−３Ｄ１−Ｄ２はＬＡＧ−３の２つの最初の免疫グロブリン様ドメインをコードするＰＣＲ増幅したＤＮＡフラグメントから得て、ｐＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲ発現ベクター中にサブクローニングした（Cole他，1993）。構築物を使用してＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（ＤＵＫＸ−Ｂ１１）をトランスフェクトした（UrlaubおよびChasin，1980）。ｓＬＡＧ−３Ｄ１−Ｄ２産生ＣＨＯ細胞をWheatonバイオリアクター中で培養し、ｓＬＡＧ−３Ｄ１−Ｄ２分子をファーストＳＰ−セファロースカラム上での捕獲工程により精製した後、１７Ｂ４ｍＡｂ−ＰｏｒｏｓＥＰカラム上で免疫精製した。得られたタンパク質はＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって＞９０％の純度であることが判明した。アッセイのために、プレートのウエルを抗−ＬＡＧ−３（１１Ｅ３；０．２Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）上で１０μｇ／ｍｌ）ｍＡｂでコートし、次いで試験試料または異なる希釈（０．１２から２５ｎｇ／ｍｌ）のｓＬＡＧ−３Ｄ１−Ｄ２と共に１２時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化した抗−ＬＡＧ−３（１７Ｂ４）ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍｌ）をさらに２時間添加し、プレートを基質溶液で染色し、反応を４９２ｎｍで判読した。
【００４６】
遅延型過敏性反応
約２〜３歳で、２．６〜２．９ｋｇ付近の重量の６頭の繁殖雌Cynomolgusサルをステンレスケージ中で別々に飼育した。０日目に、これらのサルを≧４０ＩＵ／サルの破傷風毒素（Tetatox Berna,ロット番号１３５８８）で筋肉内経路で一回ワクチン接種した。最初のＤＴＨ反応を、腹部の左側上にＴＴ抗原を含む市販の使い捨てアプリケーターMultitest IMC（Pasteur-Merieux，ロットＬ０１５７）を適用することによって２８日後に誘導した。サルを２０ｍｇ／ｋｇのケマチン塩酸塩（Inoketam"500"，Vibrac）の筋肉内注入によって麻酔し、それらの腹部を切り取り、洗浄し、乾燥した。製造業者の指示に従って、アプリケーターを少なくとも５秒間皮膚に固く押しつけた。
【００４７】
第２のＤＴＨ反応は第１のＤＴＨで使用したのと同一の操作を使用して５６日目に誘導したが、但し、サルは、腹部の右側上へのMultitest IMCの適用の３０分前に、１０ｍｇ／ｋｇ体重の抗ＬＡＧ−３ １１Ｅ３ｍＡｂ（ＩｇＧ１）または陰性コントロールとしての抗ＦＳＨｍＡｂ（ＩｇＧ１）のいずれかを静脈内経路によって受けた。
【００４８】
一般的な臨床上の兆候に関する毎日の観察を試験の終了まで行った。ＤＴＨ誘導後の皮膚の硬化を、カリパスを使用して第１および第２の誘導の両方の後に測定した。最大の長さの皮膚試験反応を測定し、その後最大幅により最初の測定を二分した。陰性の反応が得られるまで、両方の測定を誘導後２４時間後に開始して２回繰り返した。
【００４９】
結果
ＳＫ−およびＤｅｒｐ１活性化Ｔ細胞によるＬＡＧ−３の示差発現
２種の異なる抗原（ＳＫおよびＤｅｒ ｐ１）によってインビトロで活性化したＴ細胞によるＬＡＧ−３の発現の動態を調べ、サイトカイン産生のＴ細胞プロフィールと比較した。これらの抗原を選択した理由は、それらが各々優勢なＴｈ１様またはＴｈ２様プロフィールを有するＴ細胞を増殖することができるからである（Manetti他，1993;Manetti他，1994;Maggi他，1992）。この終了時に、３個のドナーの各々からのＰＢＭＣをＳＫまたはＤｅｒ ｐ１で刺激し、誘導した抗原特異的Ｔ細胞株を、抗原性刺激後５、１０および１５日目に、ＬＡＧ−３発現およびＩＬ−４およびＩＦＮ−γ産生能力の両方について試験した。ＳＫ特異的およびＤｅｒ ｐ１特異的Ｔ細胞株の両方を同一の時間間隔で、Ｔｈ２型サイトカインの産生に優先的に関連した活性化抗原である（Smith他，1990）、表面ＣＤ３０の発現についても試験した。図１に示す通り、ＳＫ特異的Ｔ細胞は高い量のＩＦＮ−γを産生したが、ＩＬ−４は全くまたは低量しか産生せず、強いＡＧ−３発現を示したが、ＣＤ３０の発現は弱かった。対照的に、ＩＦＮ−γに加えて高い量のＩＬ−４を産生したＤｅｒ ｐ１特異的Ｔ細胞は、ＳＫ−特異的Ｔ細胞よりも高いＣＤ３０の発現と低いＬＡＧ−３の発現を示した。二重染色実験により、ＳＫ−特異的Ｔ細胞株からの大部分のＴ細胞ブラストはＣＤ３０−ＬＡＧ−３+である一方、Ｄｅｒ ｐ１特異的Ｔ細胞株からの大部分のＴ細胞ブラストはＣＤ３０+ＬＡＧ−３−またはＣＤ３０+ＬＡＧ−３+であることが判明した。
【００５０】
ＩＬ−１２によるＬＡＧ−３発現の上昇調節
ＩＬ−１２はＴｈ１型細胞の発達を促進できる（Manetti，1993）。対照的に、ＩＬ−４はＴｈ２様細胞の優先的発達を促進する（Maggi，1992）。実験を行って、ＰＢＭＣバルク培養物中へのＩＬ−１２またはＩＬ−４の添加が抗原活性化Ｔ細胞によるＬＡＧ−３の発現に影響を与えることができるかどうかを測定した。これらの実験では、ＴＴを抗原として使用したが、その理由はサイトカイン産生の混合したプロフィールを有するＴ細胞（Ｔｈ０細胞）を優先的に増殖できるからである（Hsieh他，1993）。予期された通り、ＰＢＭＣ培養中へのＩＬ−１２の添加は、ＩＬ−１２の不在下で生成した対応するＴＴ特異的Ｔ細胞株よりも高い量のＩＦＮ−γと低い量のＩＬ−４を産生することができるＴＴ特異的Ｔ細胞の発達を促進した。従って、ＬＡＧ−３+細胞の割合は、ＩＬ−１２の不在下で生成した平行する株の場合よりもＩＬ−１２条件付けしたＴＴ特異的Ｔ細胞株の場合の方が有意に高かった（図２）。一方、ＩＬ−４のＰＢＭＣバルク培養中への添加は、コントロールＴＴ特異的Ｔ細胞株よりも高い量のＩＬ−４と低い量のＩＦＮ−γを産生するＴＴ特異的Ｔ細胞株の発達をもたらした。しかし、ＴＴ特異的Ｔ細胞株中におけるＬＡＧ−３+細胞の割合はＩＬ−４条件付けによって有意には影響を受けなかった（図２）。
【００５１】
Ｔｈ１型サイトカインを産生するＴ細胞クローンの膜上での優先的ＬＡＧ−３発現
サイトカイン産生の既に確立したプロフィールを有する４種のＣＤ４+Ｔ細胞クローン（２種のＴｈ１および２種のＴｈ２）による表面ＬＡＧ−３およびＣＤ３０発現の動態を次いで調べた。これらの実験の結果を図３に示す。休止状態で試験した場合（最後の刺激後１０日目）、全てのクローンはＣＤ３０発現もＬＡＧ−３発現も示さなかった。ＰＨＡプラスＩＬ−２による刺激後に、Ｔｈ２クローンからのＴ細胞ブラストの実質的割合は表面ＣＤ３０発現を示した一方、Ｔｈ１クローンからのＴ細胞ブラストは示さなかった。対照的に、同一の実験条件下で、ＬＡＧ−３発現は１日目に実質的割合のＴｈ１細胞上で既に検出可能であり、活性化後２日目と６日目の間に最大になった。Ｔ細胞クローンを不溶化した抗−ＣＤ３抗体またはＰＭＡプラスイオノマイシンで刺激した場合に、同様の結果が得られた。これらの知見に基づいて、確立したサイトカイン分泌プロフィールを有する総数で８４種のＣＤ４+Ｔ細胞クローン（３３種のＴｈ１、３３種のＴｈ０、および１８種のＴｈ２）を、ＰＨＡプラスＩＬ−２で刺激し、４日後に表面ＬＡＧ−３発現について評価した。これらの実験の結果を図４にまとめる。これらの実験条件下では、ＬＡＧ−３は大部分のＴｈ１およびＴｈ０クローンによって発現していた一方、大部分のＴｈ２クローンはＬＡＧ−３発現を全くまたはわずかしか示さなかった。これらの実験条件下で膜ＬＡＧ−３を発現しなかったＴｈ２クローンはまた、細胞をＰＨＡ（１％ｖ／ｖ）およびＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）で２４時間刺激した後にＰＣＲによって評価した場合に、ＬＡＧ−３ｍＲＮＡの発現も欠いていた。ＣＤ４+Ｔｈ１様およびＣＤ８+Ｔ細胞クローンはＬＡＧ−３ｍＲＮＡ発現を示した（アガロースゲル上で５７０ｂｐのバンド）。
【００５２】
Ｔｈ１型サイトカインを産生するＴ細胞クローンによる可溶性ＬＡＧ−３分子の放出
ＬＡＧ−３がＴ細胞クローン上清中に可溶性分子として放出される可能性も調べた。これは、ＬＡＧ−３分子の組み換え細胞外部分（Ｄ１−Ｄ２）を使用する好適なＥＬＩＳＡによって行った。図５は、５種の代表的クローン（３種のＴｈ１および２種のＴｈ０）による膜ＬＡＧ−３の発現および可溶性ＬＡＧ−３の産生の動態を示す。膜ＬＡＧ−３は、ＰＨＡプラスＩＬ−２による活性化後２日目と４日目の間に細胞膜上に十分に発現した後に衰退した一方、可溶性ＬＡＧ−３は既に２日目に上清中に見られ、その濃度は４日目と８日目の間に依然高くなった。次いで、可溶性ＬＡＧ−３の濃度を活性化ＣＤ４+Ｔ細胞クローンの大きなパネルの上清中で測定し、同一の上清中に存在するＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度と比較した。可溶性ＬＡＧ−３とＩＦＮ−γ濃度の間には有意の正の相関が存在した一方、可溶性ＬＡＧ−３とＩＬ−４の産生の間には逆の相関が見られた（図６）。
【００５３】
遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応
遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応は、細胞仲介免疫応答を評価する信頼性のある方法である。ＤＴＨは、抗原、例えば破傷風毒素の皮膚内注入後最大で２４〜２８時間後の紅斑性硬化した反応によって皮膚中に現れる。感染生物およびＤＴＨ反応の両方の排除は、特異的に感作したリンパ球（特にＴｈ１プロフィールを提示するＴ細胞）と特異的抗原との相互作用の結果として生じる。これにより細胞内生物を排除して炎症性仲介物質の分泌を生じるマクロファージを直接活性化するリンフォカインの分泌が誘導される。
【００５４】
６頭の雌のCynomolgusサルを筋肉内経路による破傷風毒素でワクチン化した。２８日後に、ワクチン化の効率を、Multitest ＣＭ１ Merieuxを使用してＤＴＨ反応を誘導することによって確認した。全動物で、硬化を、抗原投与後１〜７日目に破傷風毒素抗原およびツベルクリン抗原の注入部位で測定した。最初のＤＴＨの２８日後に、サルに１０ｍｇ／ｋｇの抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ（１１Ｅ３、群Ｉ）または抗ＦＳＨｍＡｂ（アイソタイプ陰性コントロールとして使用、群２）のいずれかを静脈内注入した。ＤＴＨ反応はMultitest ＣＭ１ Merieuxを使用して抗体注入後３０分後に誘導した。
【００５５】
紅斑をほとんどまたは全く有さない（評価できる硬化を有さない）ＴＴ注入の部位で陽性に反応した動物が、陰性コントロール、即ちMultitest ＣＭ１ Merieux中に存在するグリセリンコントロールの注入部位に観察された（図７Ａ）。最初のＤＴＨ後に、全動物の反応は２４時間の時点で最大で、次いで衰退し、そして注入の７日後には全て陰性であった。
【００５６】
第２のＤＴＨ誘導の後に、全動物はＴＴの注入の部位で陽性に反応した（図７Ｂ）。抗ＦＳＨ抗体を受けたコントロール群では、応答は最初のＤＴＨの間に見られたものと同様であった。抗−ＬＡＧ−３ｍＡｂ（１１Ｅ３）で処理した群では、２日目から５日目のＤＴＨスコアは、コントロール群のものより強く、持統し、即ち、反応がコントロール群で可視できない時点でも（６日目から８日目）依然検出された。
【００５７】
このデータは、抗−ＬＡＧ−３抗体が、生成したばかりのＴｈ細胞がインビボでＴｈ１に向かう分化を極性化でき、Ｔｈ１細胞に共通して付随するインビボ反応を調節できることを示している。この観察は、抗−ＬＡＧ−３抗体が抗原特異的Ｔ細胞クローンの増幅をインビトロで引き延ばすことができるという観察と一致する（Huard他，1996）。
【００５８】
さて本発明を十分に説明してきたが、本発明を本発明の精神および範囲から離れることなく、そして不当な実験なしに、広範囲の均等なパラメーター、濃度および条件の範囲内で実施できることは当業者により理解されるであろう。
【００５９】
本発明をその具体的態様に関連して説明したが、さらなる改良も可能であることが理解されるであろう。本出願は、本発明の任意の改変、使用または応用を包含することを意図しており、それらは、一般に本発明の原理に従うものであり、そして本発明が属する技術の範囲内の既知または慣用の習慣の範囲内に入るような、そして添付する請求の範囲の範囲内に以下に記載する本明細書中前記した構成要件に応用できるような本開示からの発展を含んでいる。
【００６０】
雑誌記事または要約、公開されたまたは対応する米国または外国特許出願、発行した米国または外国特許、またはいかなる他の文献を含む、本明細書中に引用した全ての文献は、引用文献中に提示された全てのデータ、表、図、および本文を含めて、引用により本明細書中に完全に取り込まれる。従って、本明細書中に引用された文献の中で引用された文献の全内容もまた引用により完全に取り込まれる。
【００６１】
既知の方法の工程、慣用の方法の工程、既知の方法または慣用の方法への言及は、本発明のいかなる側面、記載または態様が関連技術中に開示、教示または示唆されていることをいかなる意味においても承認するものではない。
具体的態様の前記説明は、他人が、当分野の知識（本明細書中に引用した文献の内容を含む）の範囲内の知識を適用することによって、不当な実験なしに、そして本発明の一般的概念から離れることなく、多様な応用のためにそのような具体的態様を容易に改良および／または適合することができるように十分に、本発明の一般的性質を明らかにするであろう。従って、そのような適合および改良は本明細書中に提示した教示および案内に基づいて、開示した態様の均等の意味および範囲の中であることが意図される。本明細書中の語句および用語は、説明の目的のためのものであり、限定の目的のためのものではなく、従って、本明細書の語句および用語は当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に提示した教示および案内に照らして当業者によって解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【００６２】
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【００６３】
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【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】図１は、抗原活性化ヒトＴ細胞による膜ＬＡＧ−３またはＣＤ３０の発現およびサイトカイン産生の動態を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１２による膜ＬＡＧ−３発現の上昇調節を示す。
【図３】図３は、４種のＣＤ４+Ｔ細胞クローンによる膜ＬＡＧ−３およびＣＤ３０発現の動態を示す。
【図４】図４は、８４のＣＤ４+Ｔ細胞クローン（３３のＴｈ１様、３３のＴｈ０様、そして１８のＴｈ２様）による膜ＬＡＧ−３の発現を示す。
【図５】図５は、ＰＨＡプラスＩＬ−２で刺激したＣＤ４+Ｔｈ１様クローンによる可溶性ＬＡＧ−３産生の動態を示す。
【図６】図６は、ＣＤ４+Ｔ細胞クローンによって産生された可溶性ＬＡＧ−３、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の濃度間の相関を示す。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、破傷風毒素を皮内に受けたサルの遅延型過敏性（ＤＴＨ）スコアを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2008150362.tif 000007
【図７】
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【配列表】
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