(57)【要約】【課題】生物学的構造に特異的に結合するために適しており、特に有効に鉄と結合する磁気共鳴造影剤を提供する。【解決手段】結合成分によって、哺乳動物の体内の生物学的構造に結合しうる磁気共鳴造影剤であって、前記結合成分は、単離ポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体の第一のアミノ酸配列を含有してなり、前記細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体は、鉄結合活性を有する磁気共鳴造影剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
結合成分によって、哺乳動物の体内の生物学的構造に結合しうる磁気共鳴造影剤であって、前記結合成分は、単離ポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体の第一のアミノ酸配列を含有してなり、前記細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体が、鉄結合活性を有するものである磁気共鳴造影剤。
【請求項２】
前記結合成分がタンパク質に結合する請求項１に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項３】
前記結合成分が細胞膜タンパク質のためのリガンドを有する請求項２に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項４】
前記結合成分が細胞糖タンパク質のためのリガンドを有する請求項２または３に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項５】
前記結合成分が抗体または抗体の抗原結合性断片を有する請求項１から４のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項６】
前記結合成分が腫瘍抗原に結合する請求項１から５のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項７】
前記生物学的構造に結合する前記結合成分が第二のアミノ酸配列を有する請求項１から６のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項８】
結合成分に包含される前記の第二のアミノ酸配列が、ポリペプチドの一部を形成している請求項７に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、第一および第二のアミノ酸配列の間に位置するように設計されているリンカーアミノ酸配列を有する請求項８に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１０】
前記細菌性鉄結合性タンパク質がシデロフォアである請求項１から９のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１１】
前記細菌性鉄結合性タンパク質が、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ科のＦｅ（ＩＩＩ）結合性タンパク質（Ｆｂｐ）または主鉄結合性タンパク質（ＭＩＲＰ）である請求項１から１０のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１２】
前記細菌性鉄結合性タンパク質が、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｎ．ｋｏｃｈｉｉまたはＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ種のＦｅ（ＩＩＩ）結合性タンパク質（Ｆｂｐ）である請求項１から１１のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１３】
前記の第一のアミノ酸配列が、
ａ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、ストリンジェントな条件下に、配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成している核酸分子によりコードされる）；
ｄ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列；および
ｅ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも６０％相同である核酸分子によりコードされる）
からなる群から選択されるものである請求項１から１２のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１４】
前記の第二のアミノ酸配列がアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有する請求項７から１３のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１５】
前記の第二のアミノ酸配列が配列番号４または配列番号５による配列を包含してなる請求項１４に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１６】
前記の第二のアミノ酸配列が、
ａ）配列番号３によるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３によるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、ストリンジェントな条件下に、配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成している核酸分子によりコードされる）；
ｄ）配列番号３によるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列；および
ｅ）配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも６０％相同である核酸分子によりコードされる）
からなる群から選択されるものである請求項１から１４のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項１７】
細菌性鉄結合性タンパク質または鉄結合活性を有するその誘導体の第一のアミノ酸配列を有する第一のドメインを有し、且つ第二のアミノ酸配列を有し、哺乳動物の体内の生物学的構造に結合するための結合成分として作用する第二のドメインを有する、単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項１９】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の磁気共鳴造影剤および薬学的に使用可能な担体を有する医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄結合性タンパク質または鉄結合活性を有するその誘導体を有する磁気共鳴造影剤に関する。さらに本発明は、対応する単離ポリペプチド、対応連する単離核酸および本発明の磁気共鳴造影剤を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴（ＭＲ）法または核スピン法を使用するイメージング法では、常磁性金属、例えば鉄を含有する造影剤を使用することが知られている。造影剤の有効性を高めるために、例えば生物学的構造に結合することにより、体内の特異的な構造を認識することができるようにする特異的な造影剤を使用することが知られている。このことは、例えば、常磁性または超常磁性シグナル発生分子を有する造影剤による磁場の局所的変化により生じる。第一に（例えば抗原−抗体結合により）生物学的構造に結合することができ、第二に常磁性金属を有する特異的な造影剤を使用することが知られている。例えば、Ｋｕｒｉｕらは、常磁性金属に共役しているモノクローナル抗体を有する造影剤を開示している（非特許文献１）。
【０００３】
官能化されうる常磁性または超常磁性酸化鉄ナノ粒子も、特に適したＭＲ造影剤であることが判明している（非特許文献２）。
【非特許文献１】Ｋｕｒｉｕ  Ｙ、Ｏｔｓｕｊｉ  Ｅ、Ｋｉｎ  Ｓ、Ｎａｋａｓｅ  Ｙ、Ｆｕｋｕｄａ  ＫＩ、Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｋ、Ｈａｇｉｗａｒａ  Ａ、Ｙａｍａｇｉｓｈｉ  Ｈ；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｏ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ.  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  Ｊｕｌ  １７；９４（２）：１４４〜１４８）
【非特許文献２】Ｈ，Ｌｅｅ  Ｅ、Ｋｉｍ  ｄｏ  Ｋ、Ｊａｎｇ  ＮＫ、Ｊｅｏｎｇ  ＹＹ、Ｊｏｎ  Ｓ．、Ａｎｔｉｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００６  Ｊｕｎ  ７；１２８（２２）：７３８３〜９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、生物学的構造に特異的に結合するために適しており、特に有効に鉄と結合する磁気共鳴造影剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、結合成分によって、哺乳動物の体内の生物学的構造に結合しうる磁気共鳴造影剤を提供するが、ここで、前記結合成分は、単離ポリペプチドを有し、前記ポリペプチドは、細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体の第一のアミノ酸配列を含有してなり、前記細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体は、鉄結合活性を有する。
【０００６】
用語「鉄結合」は、鉄元素の結合に限られず、元素としての、イオンとしての、酸化物としての、粒子またはナノ粒子の形態等の、あらゆる形態の鉄元素の結合を包含することを特記する。
【０００７】
ポリペプチドは、定義された配列を有する一連のアミノ酸を有する。単離ポリペプチドとは、実質的に他のポリペプチドを含まない形態で存在するポリペプチドを意味する。
【０００８】
哺乳動物の体内の生物学的構造に結合する結合成分は、十分な特異性および親和性をもって、生物学的構造に結合して、該生物学的構造が位置する場所での検出可能な造影剤の集積を可能にする成分である。生物学的構造とは、結合成分により結合し得るあらゆる内因性の構造を意味する。結合成分の例の非確定的リストには、抗体、受容体のためのリガンド、細胞膜タンパク質のためのリガンド、糖タンパク質のためのリガンドが包含され、ここで、リガンドは、天然由来のものでも（例えば受容体の天然リガンドまたは天然リガンドの変性された形態）、人工由来のものでもよく、抗体断片、一本鎖抗体などであってもよい。生物学的構造の例には（確定的ではないが）、タンパク質、特に膜タンパク質、糖タンパク質、炭水化物、核酸、リポタンパク質、腫瘍抗原などが包含される。
【０００９】
細菌性鉄結合性タンパク質とは、高い特異性（例えば＞１０15ｍｏｌ-1、好ましくは＞１０18ｍｏｌ-1の結合定数）で鉄と結合する、細菌由来であるタンパク質を意味する。細菌性鉄結合性タンパク質の誘導体とは、天然タンパク質に由来し、その天然タンパク質に対して配列相同性を有し、それ自体、高い結合定数（例えば＞１０15ｍｏｌ-1、好ましくは＞１０18ｍｏｌ-1の結合定数）で鉄結合活性を有するポリペプチドを意味する。
【００１０】
鉄は、生体にとって重要な微量元素であり、このことは、まず第一には、この元素が環境に豊富に存在することの結果であり、第二に、その化学的特性から生じている。それというのも、鉄は、例えば呼吸鎖（Ａｔｅｍｋｅｔｔｅ）内でのレドックスプロセスに関与するのに良好に適した、相互に転換可能な２種の安定な酸化状態（＋ＩＩ／＋ＩＩＩ）を有しているためである。鉄はタンパク質内で様々な構造で、例えばヘム基として、鉄−イオウクラスターとして、鉄−ニッケルとして、二鉄として、または単核鉄として存在しうる。これは、多くの酵素の補因子として、重要な代謝プロセスに関与している。しかしながら、Ｆｅ（ＩＩ）およびＦｅ（ＩＩＩ）の低い溶解度積の故に、細胞にとっては利用しにくい。さらに、Ｆｅ（ＩＩＩ）は水性環境では加水分解して、生理学的条件下では沈殿し得る高分子水酸化物を形成する。さらに鉄は、遊離ラジカルの形成を触媒するので、著しい毒作用をも有する。この理由から、体内での鉄の使用可能性は著しく制限され、鉄は生体に特有な鉄結合性タンパク質、例えばトランスフェリン、フェリチンにより結合され、細胞内部へ輸送されうる。
【００１１】
哺乳動物の体にコロニーを作っている細菌にとって、鉄は重要な資源である。この理由から、細菌は多数の鉄結合性タンパク質を放出しており、これらは、細菌にとって、鉄を結合し、細菌が利用することができるようにする。これらの細菌性鉄結合性タンパク質は、極めて高い鉄定数、例えば＞１０15ｍｏｌ-1または＞１０18ｍｏｌ-1によって特徴づけられる（Ｂｒｉａｔ  Ｊ．−Ｆ．（１９９２）．Ｉｒｏｎ  ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：２４７５〜２４８３、Ｇｕｅｒｉｎｏｔ，Ｍ．Ｌ．（１９９４）Ｍｉｃｏｂｉａｌ  ｉｒｏｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（４８）：７４３〜７７２）。従って、細菌性鉄結合性タンパク質は、極めて有効な鉄キレート化剤である。
【００１２】
本発明の原理は、造影剤の検出可能な局所的濃度の上昇を増進させるために、鉄結合性官能基を細菌性鉄結合性タンパク質の形態で、生物学的構造を特異的に認識する結合成分に結合させることに基づく。好ましくは、結合成分は、タンパク質と結合しうる。特に好ましくは、結合成分は、細胞膜タンパク質のためのリガンド、細胞糖タンパク質のためのリガンド、抗体または抗体の抗原結合断片を有するか、かつ／または腫瘍抗原と結合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の好ましい一態様では、結合成分は、第二のアミノ酸配列を包含する。
【００１４】
結合成分は、例えば共有結合により、または安定な錯体の形態において、鉄結合性官能基と結合している。
【００１５】
本発明の好ましい一態様では、結合成分に包含される第二のアミノ酸配列は好ましくは、ポリペプチドの一部を形成しており、このポリペプチドは、また、細菌性鉄結合性タンパク質またはその誘導体を有する第一のアミノ酸配列を包含する。したがって、この好ましい態様では、該ポリペプチドは、結合成分および鉄結合性官能基の両方を包含する。
【００１６】
好ましくは、ポリペプチドは、第一および第二のアミノ酸配列の間に位置するように設計されているスペーサーまたはリンカーアミノ酸配列を有する。このスペーサーアミノ酸配列は例えば、１０から２０個のアミノ酸長さであってよく、ここで、スペーサーアミノ酸配列としての使用に適している常用のアミノ酸配列は、当業者によく知られており、例えばポリグリシン配列などである。
【００１７】
好ましくは、細菌性鉄結合性タンパク質は、シデロフォアである。シデロフォアは、高親和性細胞外鉄（ＩＩＩ）キレート化剤である。
【００１８】
好ましくは、細菌性鉄結合性タンパク質は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ、ＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ科のＦｅ（ＩＩＩ）結合性タンパク質質（Ｆｂｐ）または主鉄結合性タンパク質（ＭＩＲＰ）である。さらに好ましくは、細菌性鉄結合性タンパク質は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｎ．ｋｏｃｈｉｉまたはＮ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ種のＦｅ（ＩＩＩ）結合性タンパク質質（Ｆｂｐ）である。
【００１９】
本発明の好ましい一態様では、第一のアミノ酸配列は、
ａ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５個、好ましくは３０個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、ストリンジェントな条件下に、配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成している核酸分子によりコードされる）；
ｄ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列；および
ｅ）配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、配列番号１または配列番号２によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも６０％相同である核酸分子によりコードされる）
からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の文脈において、ストリンジェントなハイブリッド形成条件とは、対立変異体のハイブリッド形成を可能とするが、他の非関連遺伝子とのハイブリッド形成を不可能とする条件を意味する。この場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されている当業者に知られているような通常の条件が使用される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９）。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、例えば、約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続いて５０℃で２×ＳＳＣでの洗浄ステップである。
【００２１】
「相同な」という表現は、本発明の文脈においては、ＤＮＡまたはアミノ酸レベルにおける、少なくとも６０％、好ましくは７５％、特に好ましくは９０％の定義された相同性を意味し、これは既知の方法、例えば計算機支援配列比較、により決定することができる。この方法においては、その相同性を調査すべき２種の配列を計算機支援により相互に比較して（例えば、Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９９）、ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５またはＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）の「Ｇｌｏｂａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＧＡＰ）」により）、最大限可能な一致を生じさせ（「アラインメント」）、次いで、一致するヌクレオチドまたはアミノ酸の数を、その配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸それぞれの総数に対するパーセンテージ割合として表現する。
【００２２】
好ましくは、結合成分に包含される第二のアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ（ＲＧＤ）を有する。
【００２３】
ＡＲＧ−ＧＬＹ−ＡＳＰ（ＲＧＤ）結合部位を含むタンパク質は、例えば、血管の内皮細胞で発現されるインテグリンと結合しうる。ＲＧＤ配列は、細胞外マトリックス、血液および細胞表面の多数の接着タンパク質のための結合部位であり、接着タンパク質のインテグリン結合活性は、ＲＧＤ配列を含む短い合成ペプチドにより再現されうる。このようなペプチドは、細胞への接着を促進する。また、特別のインテグリンに特異的に結合するＲＧＤ配列を選択することもできる。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、１９９６；１２；６９７〜７１５も参照。
【００２４】
ＲＧＤ配列を含む結合成分は、造影剤を細胞インテグリンに特異的に結合させることができる。インテグリンと結合することができ、ＲＧＤ配列を含んでいるペプチドの２つの例を、配列番号４および配列番号５により示す。本発明の一つの実施形態では、第二のアミノ酸配列が、配列番号４または配列番号５による配列を包含することが好ましい。
【００２５】
結合成分として好適なＲＧＤ結合モチーフを有するさらなるペプチドは、例えば、米国特許出願公開第２００５００７０４６６Ａ１号明細書にも記載されている。
【００２６】
配列番号３には例示的に、ＲＧＤモチーフを有するインテグリン結合性タンパク質が記載されている（Ｍａｔｓｕｚａｋａ  Ｙ，Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｋ，Ｍａｂｕｃｈｉ  Ｔ，Ｉｉｚｕｋａ  Ｍ，Ｏｚａｗａ  Ａ，Ｏｋａ  Ａ，Ｔａｍｉｙａ  Ｇ，Ｋｕｌｓｋｉ  ＪＫ，Ｉｎｏｋｏ  Ｈ．、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＲＬＴＰＲ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ＲＧＤ  ｍｏｔｉｆ、ｔｒｏｐｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｎｅ／ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ．２００４  Ｄｅｃ  ２２；３４３（２）：２９１−３０４）参照）。
【００２７】
本発明の他の態様では、第二のアミノ酸配列は、
ａ）配列番号３によるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号３によるアミノ酸配列のうちの少なくとも１５個、好ましくは３０個の連続したアミノ酸を有するアミノ酸配列；
ｃ）配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、ストリンジェントな条件下に、配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子とハイブリッド形成している核酸分子によりコードされる）；
ｄ）配列番号３によるアミノ酸配列に対して少なくとも６０％相同であるアミノ酸配列；および
ｅ）配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列（ここで、前記誘導体は、配列番号３によるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子に対して少なくとも６０％相同である核酸分子によりコードされる）
からなる群から選択されることが好ましい。
【００２８】
ポリペプチドの誘導体とは、天然タンパク質由来のポリペプチドであって、該天然タンパク質に対して配列相同性を有し、それ自体、結合成分として機能する、特定の生物学的構造に結合するものを意味する。
【００２９】
さらに本発明は、上述の変異体による第一のアミノ酸配列および第二のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドに関する。単離ポリペプチドとは、実質的に他のポリペプチドを含まない形態で存在するポリペプチドを意味する。
【００３０】
さらにポリペプチドは、他の成分または配列領域、例えば、リンカー配列またはポリペプチドを精製するためのマーカーを有してもよい。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、細菌性鉄結合性タンパク質の第一のアミノ酸配列または鉄結合活性を有する第一のアミノ酸配列の誘導体を有する第一のドメインを有し、また、該ポリペプチドは、第二のアミノ酸配列を有し、哺乳動物の体内の生物学的構造に結合するための結合成分として作用する第二のドメインを有する。
【００３２】
さらに本発明は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含有してなる単離核酸分子に関する。この核酸配列は、適切なベクター、例えば、特定の発現系に適した発現プラスミドの中に存在してもよい。単離核酸分子とは、実質的に他の核酸を含まない形態で存在する核酸分子を意味する。
【００３３】
さらに本発明は、薬学的に使用可能な形態にある本発明の磁気共鳴造影剤および薬学的に使用可能な担体を有する医薬組成物に関する。
【実施例】
【００３４】
本発明の実施形態の例
ポリペプチドの構築
第一に配列番号４または配列番号５によるインテグリン結合ペプチドおよび第二に配列番号１によるアミノ酸配列を有する融合タンパク質を調製することによって、本発明のポリペプチドを調製する。アミノ酸配列番号４および配列番号５は、同じアミノ酸配列を有するが、異なる結合ジスルフィド架橋を備えたインテグリン結合性ペプチドである。例えば１０〜２０個のアミノ酸長さを有するリンカーまたはスペーサーを用いて、インテグリン結合性ペプチドを有するドメインを、鉄結合性タンパク質を有するドメインから離すことができる。インテグリン結合性ドメイン、スペーサーおよび鉄結合性ドメインを有する融合ペプチドをコードしうる核酸を、当業者に知られている従来のクローニング技術に従って、適切な発現ベクター内でクローニングすることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８９参照）。ポリペプチドは、適切な発現系（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ、ＣＨＯ細胞など）で発現させることができる。引き続き、ポリペプチドを適切な方法で精製する。精製を促進するために、ポリペプチドにさらなる官能基、例えば、タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができるマーカー、例えばポリヒスチジン残基、いわゆる「Ｈｉｓ−Ｔａｇ」または当業者に知られている他のマーカー、を付与することが考えられる。
【００３５】
造影剤の製造
造影剤を製造するために先ず、単結晶または単分散酸化鉄粒子（直径１から１００ｎｍを有するナノ粒子）の分散液を製造する。この分散液を、ワンステップ合成で鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）塩から製造する。攪拌しながら、塩化鉄水溶液（ＦｅＣｌ2およびＦｅＣｌ3）にＮＨ3溶液またはＮａＯＨ溶液を添加する。溶液から、磁鉄鉱Ｆｅ3Ｏ4が沈殿する。攪拌および加温しながら、懸濁液にオレイン酸を添加すると、微細に分散した磁鉄鉱粒子が生じる（Ｐａｒｋら（２００５）、Ｏｎｅ−ｎａｎｏｍｅｔｅｒ−ｓｃａｌｅ−ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、４４、１９、２８７２〜２８７７も参照）。
【００３６】
精製の後に、第二のステップで、水溶液として鉄懸濁液に攪拌しながら滴定添加される融合タンパク質で、粒子をコーティングする。最後に、鉄ナノ粒子の未被覆表面を、例えばデキストラン、ＰＥＧ、デンプンなどで、封じなければならない。精製の後に、コーティングされた粒子を、ｐＨ−緩衝水溶液に入れる。造影剤の鉄濃度は、例えば、Ｆｅ０．１ｍｍｏｌから１．０ｍｍｏｌ／ｍｌであるのがよい。
【００３７】
造影剤の使用
造影剤を１〜２ｍｌボーラス注射として投与する。注射後数分から８時間までの蓄積相の間に、ＭＲ検査を実施することができ、例えばＴ２*数値決定またはＴ１数値決定グラジエントエコー（ＧＲＥ）による動的ＭＲＴイメージング法の使用が推奨される。
【００３８】
記載の実施例は、説明のために例示されたものに過ぎないことを強調しておく。特に、第一および場合により第二のアミノ酸配列の選択、鉄結合性官能基の結合および結合成分ならびに造影剤の特定の投与形態に関して、多くの変化および変更が、本発明の範囲内と考えられる。
【００３９】
＜配列表＞
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