(57)【要約】      （修正有）【課題】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ由来）の保存安定性を著しく向上させる手段を提供する。【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物と、界面活性剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、
ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、
２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物と、
界面活性剤と、
を含むポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記ポリオール脱水素酵素はグリセロールを基質とする、請求項１に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物は、マグネシウムを含む化合物およびカルシウムを含む化合物からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１または２に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
前記界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリオール脱水素酵素組成物、または請求項５に記載のポリオール測定試薬をポリオールと反応させる段階を有する、ポリオールの定量方法。
【請求項７】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物、ならびに界面活性剤を添加して組成物を調製する段階を含む、ポリオール脱水素酵素の安定化方法。
【請求項８】
前記組成物を調製する段階の後に、前記組成物を凍結乾燥する段階をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリオール脱水素酵素組成物に関し、さらに詳細には、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の保存安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の保存安定性を向上させたポリオール脱水素酵素組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または「ポリオール脱水素酵素」とも称する）は、バクテリアの細胞膜に存在し、グルコノバクター属の細菌などから抽出、精製する方法が知られており、グリセロールやソルビトール、マンニトールなどの定量に利用されている。
【０００３】
従来、例えば、グリセロールに関しては、下記式（１）および式（２）で示すような、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）とグリセロール−３−リン酸オキシダーゼ（ＧＰＯ）またはグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤＨ）とを用いることによる定量方法が知られている。
【０００４】
【化１】
2008245533.tif 000002
【０００５】
しかしながら、この方法は二種類の酵素を用いるため反応が煩雑であった。さらに、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼを用いた場合は溶存酸素の影響を受けるという問題点があり、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いた場合は、高価なＮＡＤ＋を添加する必要がある。溶存酸素の影響を受けず、一種類の酵素を用いる方法としては、下記式（３）で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いる方法が知られている。
【０００６】
【化２】
2008245533.tif 000003
【０００７】
しかし、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤ＋を添加しなければならない。より安価で簡便なグリセロールの定量法として、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素が知られている。補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を用いるグリセロールの定量方法は、下記式（４）の反応によって行われる。
【０００８】
【化３】
2008245533.tif 000004
【０００９】
しかしながら、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は膜結合型酵素であるため、保存安定性が悪いという問題点がある。このため、上記のＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上させることが重要な課題となる。
【００１０】
従来の酵素の安定化剤としては、牛血清アルブミン、人血清アルブミン、卵白アルブミンなどのタンパク質、グルコース、トレハロース、ラフィノースなどの糖、グリセロール、エチレングリコールなどの多価アルコール、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの塩類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などが知られている。しかし、これらの安定化剤が、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して効果があるかは知られていない。
【００１１】
特許文献１には、前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨと類似する補欠分子族としてＰＱＱを含むグルコース脱水素酵素に対して、（ｉ）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリン、およびこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物、ならびに（ｉｉ）アルブミンを含む安定化剤を添加することにより、従来に比べてはるかに安定な酵素組成物が得られることが開示されている。
【特許文献１】特開２００１−２２４３６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、前記特許文献１に記載の安定化剤では、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることはできない。
【００１３】
そこで、本発明は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を著しく向上させる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記従来の問題点に鑑み、鋭意研究を積み重ねた結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に対して、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物、ならびに界面活性剤を添加することにより、ポリオール脱水素酵素の安定性、特に凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が著しく向上されうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物と、界面活性剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの経時的な酵素活性の低下、特に凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を抑制・防止し、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を著しく向上させうる。特に、ストレプトマイシンおよび／またはジヒドロストレプトマイシンを用い、また、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物としてカルシウムを含む化合物および／またはマグネシウムを含む化合物を用い、さらに界面活性剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）（トライトン）Ｘ−１００を使用した場合に、上記の効果が顕著に得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素と、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方と、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物と、界面活性剤と、を含むポリオール脱水素酵素組成物である。
【００１９】
本発明において、化学修飾される補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、いずれのポリオールを基質としてもよく、２つ以上のヒドロキシ基を有するアルコール（糖アルコールを含む）であれば、特に制限されないが、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来アルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。中でも好ましくは、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、ソルビトール（ピロロキノリンキノン依存性ソルビトール脱水素酵素）、およびマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）を基質として、より好ましくはグリセロールを基質とする。
【００２０】
本発明に用いられる補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（ＰＱＱ依存性ＰＤＨ）は、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。該酵素は、例えば、グルコノバクター属の細菌やシュードモナス属の細菌、アシネトバクター属の細菌など、様々な細菌から産生されることが知られている。本発明では、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌が産生するいかなるＰＱＱ依存性ＰＤＨであっても、好適に使用することができるが、容易に入手できるという観点から、グルコノバクター属の細菌から産生されるＰＱＱ依存性ＰＤＨがより好ましく、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３１３０、３１７１、３１７２、３１８９、３２４４、３２５０、３２５３、３２５５、３２５６、３２５７、３２５８、３２８５、３２８７、３２８９、３２９０、３２９１、３２９２、３２９３、３２９４、３４６２、３９９０、１２４６７、１４８１９；グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ  ３２５１、３２５４、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２７０、３２７１、３２７２、３２７３、３２７４、３２８６、１６６６９；グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ  ３２６２、３２６３、３２６６、３２６７、３２６９、３２７５、３２７６等を使用することができる。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを生産することができれば、これらの自然突然変異株または人為突然変異株を使用してもよい。人為突然変異処理方法は、当業者に周知の方法によって、同様にしてあるいは適宜修飾して、あるいはこれらの方法を適宜組み合わせて適用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、特にグルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＮＢＲＣ  ３２９１が好ましく使用される。
【００２１】
前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌からＰＱＱ依存性ＰＤＨを得るための具体的な方法は、特に制限されず、例えば、前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、得られた培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法が挙げられる。以下、前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、得られた培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する方法について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】
前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を培養する培地は、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、またはその他の必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地であっても天然培地であってもよい。前記炭素源の例としては、例えば、グルコース、グリセロール、ソルビトールなどが挙げられる。前記窒素源の例としては、例えば、ペプトン類、肉エキス、酵母エキスなどの窒素含有天然物、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどの無機窒素含有物が挙げられる。前記無機物の例としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。その他、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。前記炭素源、前記窒素源、前記無機物、および前記その他の必要な栄養素は、単独でもまたは２種以上組み合わせても用いられうる。培養は、振とう培養または通気撹拌培養で行うことが好ましい。培養温度は、好ましくは２０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃、さらに好ましくは２５℃〜３５℃である。培養ｐＨは、好ましくは５〜１０、より好ましくは５〜９である。前記のような条件以外の条件であっても、使用する菌株が生育することができれば適用することができる。培養期間は０．５〜５日が好ましい。なお、前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、前記培養によって得られた酵素であっても、またはＰＱＱ依存性ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００２３】
次いで、得られた培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを抽出する。抽出方法は、一般的に使用される抽出方法を用いることができ、例えば、超音波破砕法、フレンチプレス法、有機溶媒法、またはリゾチーム法などを用いることができる。抽出したＰＱＱ依存性ＰＤＨの精製方法は特に制限されず、例えば、硫安やぼう硝などを用いる塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどを用いる金属凝集法、ストレプトマイシンやポリエチレンイミンなどを用いる除核酸法、またはジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、カルボキシメチル（ＣＭ）−セファロースなどを用いるイオン交換クロマト法などを用いることができる。なお、これらの方法で得られた部分精製酵素や精製酵素液は、そのままの形態で使用されても、または化学修飾された形態で使用されてもよい。なお、本発明において、化学修飾された形態のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する場合には、上記のようにして得られた培養物由来のＰＱＱ依存性ＰＤＨを、例えば、特開２００６−２７１２５７号公報に記載されるような方法などを用いて適宜化学修飾して使用できる。なお、化学修飾方法は、上記公報に記載の方法に限定されるものではない。
【００２４】
本発明で用いられるストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させうる。
【００２５】
本発明の組成物中のストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方の量は、本発明の組成物に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１０〜１５０質量％、より好ましくは２０〜１００質量％、さらに好ましくは３０〜１００質量％である。組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方の量が１０質量％未満の場合、量が少なすぎてＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定化剤としての効果が十分に得られない場合があり、一方、１５０質量％を超えると、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、溶液の粘度が高くなりすぎる場合がある。
【００２６】
本発明で用いられる２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上でき、かつ、２価のイオンを形成する金属を含む化合物であれば、特に制限されない。前記２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００２７】
前記２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物の具体的な例としては、マグネシウムを含む化合物、カルシウムを含む化合物、バリウムを含む化合物、マンガンを含む化合物、鉄を含む化合物、銅を含む化合物、コバルトを含む化合物、ニッケルを含む化合物、水銀を含む化合物、鉛を含む化合物、または亜鉛を含む化合物などが挙げられ、これらは単独で使用されても、または２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらのうち、マグネシウムを含む化合物およびカルシウムを含む化合物から選択される少なくとも１種が好ましい。前記２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物の形態は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば前記のような金属のフッ化物、塩化物、臭化物、もしくはヨウ化物などのハロゲン化物、前記のような金属の硫酸塩、前記のような金属の硝酸塩、または前記のような金属のリン酸塩などが挙げられる。これらの中でも、塩化物、硫酸塩、および硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００２８】
本発明の組成物中の２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物の量は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％である。組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物の量が１質量％未満の場合、量が少なすぎるため安定化剤としての効果が十分に発揮されない場合があり、一方、３０質量％を超えると、添加に見合う安定化剤としての効果の向上が認められない場合があり、また、本発明の組成物を緩衝液等で再溶解する際、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物が溶解しきれない場合がある。
【００２９】
本発明で用いられる界面活性剤は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨや本発明の組成物の保存安定性を向上させ、また、本発明の組成物の保存安定性を向上させうる。
【００３０】
前記界面活性剤の種類は特に制限されず、膜タンパク質の可溶化に一般的に使用されているものであればいかなるものでもよい。具体的には、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）（トライトン）Ｘ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどが挙げられ、これらは単独で使用されても、または２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。これらの中でも、酵素活性を低下させないという観点から、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００がより好ましい。
【００３１】
本発明の組成物中に含まれる界面活性剤の量は、酵素の安定性が向上できる量であれば特に限定されないが、組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、好ましくは２０〜１０００質量％、より好ましくは２０〜５００質量％、さらに好ましくは５０〜５００質量％である。組成物中のＰＱＱ依存性ＰＤＨの総質量を１００質量％として、界面活性剤の量が２０質量％未満の場合、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを安定化させる効果が得られない場合があり、一方、１０００質量％を超えると、凍結乾燥後の組成物の粘度が高すぎる場合がある。
【００３２】
本発明の組成物は、酵素活性の低下を抑制するという理由から、安定なｐＨ緩衝液中で存在することが好ましい。前記ｐＨ緩衝液は、所望のｐＨを有するものであれば特に限定されず、公知の緩衝液が適宜使用されうる。前記ｐＨ緩衝液の例としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＯＰＳもしくはＨＥＰＥＳなどのＧｏｏｄの緩衝液、グリシン−ＮａＯＨなどのアミノ酸系緩衝液、ホウ酸緩衝液、またはイミダゾール緩衝液などが挙げられる。これらの中でも、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、またはＧｏｏｄの緩衝液が好ましい。前記ｐＨ緩衝液の濃度は特に制限されないが、好ましくは１〜５００ｍＭ、より好ましくは５〜４００ｍＭ、さらに好ましくは５〜３００ｍＭである。また、前記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、好ましくは４．０〜１１．０、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００３３】
本発明の組成物の製造方法は、特に制限されず、例えば、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、ストレプトマイシンおよびジヒドロストレプトマイシンの少なくとも一方、２価の金属イオンを形成する金属を含む化合物、ならびに界面活性剤を添加する方法が挙げられる。前記のような方法において、各成分の添加順序も特に制限されず、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに対して、各成分を順次に添加してもよく、各成分を同時に添加してもよい。
【００３４】
本発明の組成物を粉末にする場合、前記のような液状の組成物を凍結後、凍結乾燥等により粉末状にすることができる。この際、凍結乾燥の方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。
【００３５】
本発明の組成物は、本発明の目的を損なわない範囲内で、グルコースやトレハロース等の糖類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤、ピロロキノリンキノンなどを所望に応じて含有することができる。
【００３６】
本発明で用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明で用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に用いられる電子受容体の例としては、例えば、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ  ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルーなどが挙げられる。
【００３７】
また、本発明は、本発明の組成物を含むポリオール測定試薬である。さらに、本発明は、本発明の組成物または本発明の組成物を含むポリオール測定試薬を、ポリオールと反応させる段階を含む、ポリオールの定量方法である。本発明の組成物またはポリオール測定試薬に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールの定量性に優れ、ポリオール測定試薬の一成分として使用することができる。なお、本発明でいう「ポリオール」とは、２つ以上のヒドロキシ基を有するアルコールまたは糖アルコールを意味する。本発明のポリオールの定量方法によって定量されうるポリオールは特に制限されず、具体的な例としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ラクチトールなどの二糖由来のアルコール、グリセロールなどのトリオール、エリスリトールなどのテトリトール、アラビトール、キシリトール、リビトールなどのペンチトール、マンニトール、ソルビトールなどのヘキシトール、イノシトールなどのシクリトールなどが挙げられる。これらの中でも、好ましくはグリセロールである。
【００３８】
本発明のポリオール測定試薬は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオールを定量するために使用する試薬である。本発明のポリオール測定試薬は、ポリオール脱水素酵素としてＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば、特許第３０４１８４０号明細書、特許第３４５０９１１号明細書、または特許第３４９４３９８号明細書などに開示されているポリオールの定量方法で使用されるポリオール脱水素酵素として、本発明の組成物またはポリオール測定試薬に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用することができる。
【００３９】
本発明のポリオールの定量方法に用いられうる、ポリオールを含む試料の例としては、例えば、食品、血清、血漿、または全血などが挙げられる。また、本発明の組成物またはポリオール測定試薬に含まれるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、血清、血漿、または全血などに含まれる中性脂肪の定量にも使用することができる。すなわち、これらの試料に含まれる中性脂肪は、リポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールとに分解されるが、ここで生じたグリセロールを、前記ＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いて定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明で用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いてグリセロールを予め消去するか、またはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。なお、本発明で用いられるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、その溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【００４０】
本発明によれば、凍結乾燥時のＰＱＱ依存性ＰＤＨの失活を抑えるとともに、凍結乾燥後のＰＱＱ依存性ＰＤＨの保存安定性を向上させることができる。
【実施例】
【００４１】
次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明を何ら制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法により測定した。
【００４２】
（酵素活性）
５０μＭ  ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）、０．２ｍＭ  ＰＭＳ（１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェイト）、および４５０ｍＭ  グリセロールを含んだ０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に、酵素溶液を加え、酵素と基質との反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。
【００４３】
（実施例１）
ソルビトール  ２ｇ／１００ｍＬ、酵母エキス  ０．３ｇ／１００ｍＬ、肉エキス  ０．３ｇ／１００ｍＬ、コーンスティープリカー  ０．３ｇ／１００ｍＬ、ポリペプトン  １ｇ／１００ｍＬ、尿素  ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１ｇ／１００ｍＬ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／１００ｍＬ、およびＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／１００ｍＬからなり、ｐＨが７．０である培地１００ｍＬを調製し、５００ｍＬ容の坂口フラスコに該培地８０ｍＬを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理した。
【００４４】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）  ＮＢＲＣ  ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、１４０ｍｉｎ−１で振とう培養し、これを種培養液とした。
【００４５】
次に、上記と同じ組成で調製した培地５Ｌを８Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で５０分間オートクレーブ処理を行い、放冷後、種培養液２４０ｍＬを移した。これを、４００ｒｐｍ、通気量５Ｌ／ｍｉｎ、３０℃で２６時間培養した。
【００４６】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して集菌し、緩衝液で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（４，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００４７】
この膜画分を、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で懸濁し、終濃度が１ｇ／１００ｍＬとなるようにＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００４８】
この可溶化膜画分を、ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）にて、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ  ６ｍＬで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で一晩透析することにより、比活性１７Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００４９】
次いで、該グルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１７．０Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度：０．６２５ｍｇ／ｍＬ）４０ｍＬに、終濃度０．２ｇ／１００ｍＬになるように１ｇ／１００ｍＬ  グルタルアルデヒド溶液１０ｍＬを加え、２０℃で６０分間、穏やかに撹拌した。
【００５０】
次いで、０．５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を５０ｍＬ加え、２０℃で３０分反応させることにより架橋反応を停止した。反応終了後、０．１ｇ／１００ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を含む１０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で一晩透析することにより低分子量の夾雑物を取り除き、これを修飾ＰＤＨとした。
【００５１】
このようにして得られた修飾ＰＤＨを限外ろ過し、濃縮した。得られた濃縮修飾ＰＤＨ（比活性１６Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度２．０ｍｇ／ｍＬ）１００質量％に対して、表１に記載の成分を、表１に記載の割合となるようにそれぞれ加え、凍結後、凍結乾燥を２４時間行い粉末状の酵素組成物を得た。得られた酵素組成物を３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を測定し、その凍結乾燥直後の酵素組成物の酵素活性を１００％とした場合の、３７℃で１週間インキュベートした後の残存活性（単位：％）を算出した。結果を下記表１に示す。
【００５２】
（実施例２、比較例１〜２）
濃縮修飾ＰＤＨ（比活性１６Ｕ／ｍｇ蛋白、蛋白濃度２．０ｍｇ／ｍＬ）１００質量％に対して、表１に記載の成分を、表１に記載の割合となるようにそれぞれ加えたこと以外は、実施例１と同様の方法で残存活性を算出した。結果を下記表１に示す。
【００５３】
【表１】
2008245533.tif 000005
【００５４】
表１からわかるように、非還元糖であるトレハロースまたはラフィノースを含む比較例の組成物と比較して、ストレプトマイシンまたはジヒドロストレプトマイシンを含む実施例の本発明の組成物が、優れた保存安定性を示すことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明は、ポリオール脱水素酵素の関連分野に好適に用いられうる。