(57)【要約】      （修正有）【課題】悪性疾患（例えば、白血病および癌）の治療のための組成物および方法の提供。【解決手段】１以上のWT１ポリヌクレオチド、WT1ポリペプチド、WT1ポリペプチドを提示する抗原提示細胞、WT1ポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはWT1ポリペプチドと特異的に反応するT細胞を含む組成物であって、例えば転移性疾患の予防および処置のために使用され得る組成物。WT1ポリペプチドは、ネイティブのWT1の免疫原性部分またはその改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはT細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプチドは、ＷＴ１の一部またはその改変体を含み、該改変体は、１以上の置換、欠失、付加、および／もしくは挿入において異なり、その結果、該改変体がＷＴ１特異的Ｔ細胞株またはクローンと反応する能力が、ＷＴと比較して実質的に減少せず、ここで該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号１４４、配列番号２４１に示されるアミノ酸配列を少なくとも含むが、ＷＴ−１のアミノ酸１〜２８１より多くない、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリペプチドと融合パートナーとの融合物を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
前記融合パートナーが、Ｒａ１２、プロテインＤ、ＬＹＴＡ、ＨＩＳタグ、およびエンドソーム／リソソーム画分にポリペプチドを指向し得る標的化シグナルからなる群より選択される請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、配列番号３９３に示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
プロモーターに作動可能に連結される、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換されたか、またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、組成物。
【請求項９】
免疫刺激物質と組み合わせて請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ワクチン。
【請求項１０】
前記免疫刺激物質が、患者におけるＴ細胞応答を増強する、請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
請求項１０に記載のワクチンであって、ここで、前記免疫刺激物質が、ＭＰＬ、ＲＣ−５２９、ＡＧＰｓ、Ｓｅｐｐｉｃ  Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０、サイトカイン、ミクロスフェア、ＡＳ−２、ＱＳ２１、Ｒｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ系ベースのアジュバント、サポニンベースのアジュバント、および免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）ベースのアジュバントからなる群より選択される、ワクチン。
【請求項１２】
薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１３】
免疫刺激物質と組み合わせて、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ワクチン。
【請求項１４】
前記免疫刺激物質が、患者におけるＴ細胞応答を増強する、請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
請求項１４に記載のワクチンであって、前記免疫刺激物質が、ＭＰＬ、ＲＣ−５２９、ＡＧＰｓ、Ｓｅｐｐｉｃ  Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０、サイトカイン、ミクロスフェア、ＡＳ−２、ＱＳ２１、Ｒｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ系ベースのアジュバント、サポニンベースのアジュバント、および免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）ベースのアジュバントからなる群より選択される、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府の助成による研究または開発に関する提示）
本発明は、部分的に、ＮＩＨ  ＳＢＩＲ  第Ｉ期助成金番号ＩＲ４３  ＣＡ８１７５２−０１Ａ１のもとの政府支援によってなされた。政府は、本発明における特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は、一般に悪性疾患（例えば、白血病および癌）の免疫療法に関する。より詳細には、本発明は、ＷＴ１に対する免疫応答を生じるかまたは増強するための組成物、ならびに悪性疾患を予防および／または処置するためのそのような組成物の使用に関連する。
【０００３】
（関連技術の説明）
癌および白血病は、米国内および世界中で重大な健康問題である。そのような疾患の検出および処置における前進がなされてきたが、ワクチンまたは癌および白血病の予防または処置のための他の普遍的に首尾良い方法は、現在のところ利用可能ではない。これらの疾患の管理は、現在のところ、早期診断および積極的な処置の組合せに依存し、これは、種々の処置（例えば、手術、放射線治療、化学療法およびホルモン療法）のうちの１つ以上を含み得る。特定の癌のための処置方針は、特定の腫瘍マーカーの分析を含む種々の予後変数に基づいて頻繁に、選択される。しかし、確立されたマーカーの使用は、頻繁に、解釈するのが困難な結果を導き、そして多くの癌患者において高い致死率が観察され続けている。
【０００４】
免疫療法は、癌および白血病の処置および生存率を実質的に改善する能力を有する。最近のデータによって、白血病は、骨髄移植の関連で免疫療法（例えば、ドナーリンパ球注入）によって治癒され得ることが実証される。そのような治療は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答の生成または増強を含み得る。しかし、現在までのところ、比較的わずかなＴＡＡしか既知ではなく、そしてそのような抗原に対する免疫応答の生成は、まれに例外が存在するが、治療的に有益であるとは示されていない。
【０００５】
従って、白血病および癌の予防および治療のための改善された方法についての当該分野における必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
簡潔に述べると、本発明は、疾患（例えば、白血病および癌）の診断および治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、ネイティブのＷＴ１の免疫原性部分またはその改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）を含むポリペプチドを提供する。特定の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの１６を超えない連続したアミノ酸残基を含む。他の実施形態において、このポリペプチドは、ネイティブのＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸残基１〜１７４の免疫原性部分またはその改変体を含み、ここでこのポリペプチドは、このネイティブのＷＴ１ポリペプチドのアミノ酸１７５〜４４９内に存在する１６を超えない連続するアミノ酸残基を含む。この免疫原性部分は、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子および／またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。特定の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む：（ａ）表ＩＩ〜ＸＬＶＩのうちの任意の１つ以上において示される配列、（ｂ）前述の配列の改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）、および（ｃ）上記のポリペプチドの模倣物（抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物）。
【０００７】
他の実施形態において、このポリペプチドは、以下からなる群から選択される配列を含む：（ａ）ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）３４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９および配列番号２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９および配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号１９８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４７および配列番号２８４）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５および配列番号２５５）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５および配列番号２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（配列番号４１１）、（ｂ）前述の配列の改変体（これは、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入で異なる）、ならびに（ｃ）上記のポリペプチドの模倣物（抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその模倣物の能力が実質的に減少されないような模倣物）。模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物と組み合わせてアミノ酸を含み得るか、または完全に非ペプチド模倣物であり得る。
【０００８】
さらなる局面において、本発明は、ＷＴ１タンパク質の免疫原性部分の改変体を含むポリペプチドを提供し、ここでこの改変体は、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応するその改変体の能力がネイティブのＷＴ１タンパク質と比較して増強されるようなその免疫原性部分内の１位と３位との間のアミノ酸位置での置換に起因して、その免疫原性部分が異なる。
【０００９】
本発明は上記のＷＴ１ポリペプチドをコードするＷＴ１ポリヌクレオチドをさらに提供する。
【００１０】
他の局面において、本発明は、薬学的組成物およびワクチンを提供する。薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて、上記のポリペプチドもしくは模倣物および／または以下のうちの１つ以上を含み得る：（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合するその抗体またはその抗原結合フラグメント；（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞、あるいは（ｉｖ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞。ワクチンは、上記のポリペプチドおよび／または以下のうちの１つ以上を含む：（ｉ）ＷＴ１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、または（ｉｉｉ）抗イディオタイプ抗体、および非特異的免疫応答エンハンサー。特定の実施形態において、ネイティブのＷＴ１ポリペプチドの２３未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは１７未満のアミノ酸残基が、そのような薬学的組成物およびワクチン内に使用されるＷＴ１ポリペプチド内に存在する。免疫応答エンハンサーは、アジュバントであり得る。好ましくは、免疫応答エンハンサーは、Ｔ細胞応答を増強する。
【００１１】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを含む、患者において免疫応答を増強または誘導するための方法を提供する。特定の実施形態において、患者はヒトである。
【００１２】
本発明はさらに、患者に上記の薬学的組成物またはワクチンを投与することを含む、患者において悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。悪性疾患としては、白血病（例えば、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病）および癌（例えば、乳癌、肺癌、甲状腺癌もしくは胃腸癌、または黒色腫）が挙げられるがそれらに限定されない。この患者は、悪性疾患に罹患していてもよいが、罹患している必要はなく、そしてこの薬学的組成物またはワクチンの投与は、そのような疾患の発病を阻害し得るか、または既存の疾患の進行および／もしくは転移を阻害し得る。
【００１３】
本発明はさらに、他の局面において、骨髄および／もしくは末梢血またはその画分からＷＴ１を発現する細胞を除去するための方法を提供する。この方法は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分と、ＷＴ１ポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞とを接触させる工程を含み、ここでこの接触させる工程は、骨髄、末梢血または画分中の骨髄性細胞またはリンパ性細胞の数の１０％未満、好ましくは５％未満およびより好ましくは１％未満までのＷＴ１陽性細胞の除去を可能にするに十分な条件および時間で行われる。骨髄、末梢血および画分は、ＷＴ１発現と関連する疾患に罹患している患者から得られ得るか、またはそのような疾患に罹患していないヒトもしくは非ヒト哺乳動物から得られ得る。
【００１４】
関連する局面において、本発明は、上記のように調製された骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。そのような骨髄、末梢血または画分は、自己由来であり得るか、または関連するかもしくは関連しないヒトもしくは非ヒト動物（例えば、同系または同種異系）に由来し得る。
【００１５】
他の局面において、本発明は、Ｔ細胞の刺激（または、初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ））および／または拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にするに十分な条件下および時間でＷＴ１ポリペプチドとＴ細胞とを接触させることを含む、Ｔ細胞刺激および／または拡大のための方法を提供する。そのようなＴ細胞は、自己由来のＷＴ１特異的細胞、同種異系のＷＴ１特異的細胞、同系のＷＴ１特異的細胞または関連しないＷＴ１特異的細胞であり得、そしてインビトロまたはインビボで刺激され得る。特定の実施形態において、拡大されたＴ細胞は、骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分内に存在し得、そしてクローン性（ｃｌｏｎａｌ）であり得る（が、その必要はない）。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、刺激および／または拡大の間に哺乳動物中に存在し得る。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【００１６】
関連する局面において、上記で調製されたＴ細胞を患者に投与する工程を含む、患者における悪性疾患の発達を阻害するための方法が提供される。そのようなＴ細胞は、特定の実施形態において、自己由来、同系または同種異系であり得る。
【００１７】
本発明はさらに、他の局面において、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。そのような方法は、患者における抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答をモニタリングすることに基づく。特定のそのような局面において、方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）以下の、（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに第１の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの第１の生物学的サンプルは、治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、免疫複合体が形成するのを可能にするのに十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドと、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプルにおける抗体との間に形成される免疫複合体を検出する工程；（ｃ）治療または免疫の後に、同じ患者から得られる第２の生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）第１および第２の生物学的サンプルにおいて検出される免疫複合体の数を比較する工程、およびそれから、この患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【００１８】
上記の方法の特定の実施形態において、この検出する工程は以下を含む：（ａ）この免疫複合体に結合し得る検出試薬とともにこの免疫複合体をインキュベートする工程であって、ここでこの検出試薬はレポーター基を含む、工程、（ｂ）非結合検出試薬を除去する工程、および（ｃ）このレポーター基の存在または非存在を検出する工程。この検出試薬は、例えば、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合し得る、第２の抗体またはその抗原結合フラグメントあるいはプロテインＡのような分子を含み得る。他の実施形態において、レポーター基は、ＷＴ１ポリペプチドに結合し、そして検出する工程は、非結合ＷＴ１ポリペプチドを除去する工程、およびその後にこのレポーター基の存在または非存在を検出する工程を包含する。
【００１９】
さらなる局面において、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）以下（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに第１の生物学的サンプルをインキュベートする工程であって、ここでこの第１の生物学的サンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、そして治療または免疫の前に患者から得られ、そしてここでこのインキュベーションは、Ｔ細胞の、特異的な活性化、増殖および／または溶解を可能にするに十分な条件下および時間で行われる、工程；（ｂ）Ｔ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を検出する工程；（ｃ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む第２の生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程であって、ここでこの第２の生物学的サンプルは、治療または免疫後に同じ患者から得られる、工程；ならびに（ｄ）第１および第２の生物学的サンプル中のＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を比較する工程、およびそれによってこの患者におけるこの治療または免疫の有効性をモニタリングする工程。
【００２０】
本発明はさらに、患者におけるＷＴ１発現と関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞、のうちの１つ以上とともに、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、そのＴ細胞が増殖するようにインキュベートする工程；ならびに（ｂ）増殖されたＴ細胞の有効量をこの患者に投与する工程、およびそれからこの患者における悪性疾患の発達を阻害する工程。特定の実施形態において、Ｔ細胞をインキュベートする工程は、１回以上反復され得る。
【００２１】
他の局面においては、本発明は、患者内でのＷＴ１発現に関連する悪性疾患の発達を阻害するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、このＴ細胞が増殖するに、以下：（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの、１つ以上とともにインキュベートする工程；（ｂ）増殖した一つ以上の細胞をクローニングする工程；および（ｃ）患者に対してクローン化したＴ細胞の有効量を投与する工程。
【００２２】
他の局面においては、方法が、患者内でのＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するために提供され、これは以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を一つ以上の（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞とともにインキュベートする工程；および（ｂ）Ｔ細胞の特異的な活性化の存在または非存在を検出し、それによってＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態においては、検出の工程は、Ｔ細胞の増殖の存在または非存在を検出する工程を含む。
【００２３】
さらなる局面においては、本発明は、患者内でのＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するための方法を提供し、これは以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的なサンプルを、以下：（ｉ）ＷＴ１ポリペプチド；（ｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ）ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１以上とともにインキュベートする工程であって、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体が形成されるのを可能にするに十分な条件かつ時間で行われる、工程；および（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドとＷＴ１ポリペプチドと特異的に結合する生物学的なサンプル中の抗体との間に形成される免疫複合体を検出し、それによってＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定する工程。
【００２４】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付する図面を参照すれば明白になる。本明細書中に開示されたすべての参考文献は、各々が個々に援用されたかのようにその全体が参考として本明細書中に援用される。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
上述のように、本発明は、一般に、悪性疾患の免疫療法および診断のための組成物および方法に関する。本明細書中に記載される組成物としては、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えば、樹状細胞）、薬剤（例えば、ＷＴ１ポリペプチドに結合する抗体）および／またはＷＴ１に特異的な免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられ得る。本発明のＷＴ１ポリペプチドは、一般に、ウィルムス腫瘍遺伝子産物（ＷＴ１）またはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の核酸配列は、一般に、このようなポリペプチドの全てもしくは一部をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、あるいはこのような配列に相補的であるＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含む。抗体は、一般に、免疫系タンパク質またはその抗原結合フラグメントであり、これは、ＷＴ１ポリペプチドの一部に結合し得る。このような組成物内で使用され得るＴ細胞は、一般に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）である。本明細書中に記載される特定の方法は、さらに、本明細書中に提供されるようなＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を使用する。
【００２６】
本発明は、ウィルムス腫瘍（ＷＴ）遺伝子産物（例えば、ＷＴ１）に対して惹起される免疫応答が、ＷＴ１遺伝子の発現の増加によって特徴付けられる悪性疾患を患う患者に、予防的利益および／または治療的利益を提供し得るという知見に基づく。このような疾患としては、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および小児期ＡＬＬ）、ならびに多くの癌（例えば、肺、乳房、甲状腺および胃腸の癌、ならびに黒色腫）が挙げられるが、これらに限定されない。ＷＴ１遺伝子は、元々、ウィルムス腫瘍を有する患者の染色体１１ｐ１３における細胞性欠失に基づいて同定および単離された（Ｃａｌｌら、米国特許第５，３５０，８４０号を参照のこと）。この遺伝子は１０のエキソンからなり、そしてジンクフィンガー転写因子をコードし、そしてマウスＷＴ１タンパク質およびヒトＷＴ１タンパク質の配列は、図１ならびに配列番号３１９および３２０に提供される。
【００２７】
（ＷＴ１ポリペプチド）
本発明の文脈において、ＷＴ１ポリペプチドは、本明細書に記載される場合、ネイティブＷＴ１（すなわち、遺伝的に改変されていない生物によって発現されるＷＴ１タンパク質）またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドである。ＷＴ１ポリペプチドは、任意の長さであり得が、但し、ネイティブタンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含む。言い換えると、ＷＴ１ポリペプチドは、オリゴペプチド（すなわち、ペプチド結合によって連結される比較的少数のアミノ酸残基（例えば、８〜１０残基）からなる）、全長ＷＴ１タンパク質（例えば、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、マウス）内に存在する全長ＷＴ１タンパク質）あるいは中間のサイズのポリペプチドであり得る。特定の実施形態において、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの少数の連続するアミノ酸残基を含むＷＴ１ポリペプチドの使用が、好ましい。このようなポリペプチドは、Ｔ細胞応答の生成が所望される特定の使用のために好ましい。例えば、このようなＷＴ１ポリペプチドは、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの、２３未満の連続するアミノ酸残基、好ましくは１８以下の連続するアミノ酸残基、そしてより好ましくは１５以下の連続するアミノ酸残基を含み得る。ネイティブＷＴ１ポリペプチドの連続する９つのアミノ酸残基を含むポリペプチドは、一般に、このような目的のために適切である。ネイティブタンパク質由来のさらなる配列および／または異種配列は、任意のＷＴ１ポリペプチド内に存在し得、そしてこのような配列は、（必要ではないが）さらなる免疫原性特性または抗原性特性を保有し得る。本明細書中に提供されるようなポリペプチドは、さらに、他のポリペプチドまたは非ポリペプチド化合物と（共有結合的にかまたは非共有結合的に）会合され得る。
【００２８】
「免疫原性部分」は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞表面抗原レセプターおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）ポリペプチドの部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。本明細書中で使用される場合、免疫原性部分は、このような結合が当該分野で公知の任意のアッセイを使用して検出可能である場合、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子「に結合する」といわれる。例えば、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩに結合する能力は、１２５Ｉで標識されたβ２ミクログロブリン（β２ｍ）のＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体複合体への取り込みを促進する能力をモニターすることによって間接的に評価され得る（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４を参照のこと）。あるいは、当該分野で公知の機能的ペプチド競合アッセイが、使用され得る。特定の免疫原性部分は、表ＩＩ〜ＸＩＶの１つ以上に列挙される１つ以上の配列を有する。代表的な免疫原性部分には、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧ（ヒトＷＴ１残基６〜２２；配列番号１）、ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ（ヒトおよびマウスＷＴ１残基１１７〜１３９；それぞれ、配列番号２および３）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２６２；配列番号４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２５２；配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２３５〜２４３；それぞれ、配列番号４９および２５８）、ＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（マウスＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（ヒトＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号１９８）；ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２２５〜２３３；それぞれ、配列番号１４７および２８４）；ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（マウスＷＴ１残基１０〜１８；配列番号２５５）；またはＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基１２６〜１３４；それぞれ、配列番号１８５および配列番号２９３）、ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（ヒトＷＴ１残基３７〜４５；配列番号２４１）、またはＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（ヒトＷＴの残基３７〜４６；配列番号４１１）。
さらなる免疫原性部分は、本明細書中に提供され、そしてその他は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、２４３〜２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびその中に引用される参考文献において要約される技術）を使用して同定され得る。免疫原性部分を同定するための代表的な技術としては、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力についてのポリペプチドのスクリーニングが挙げられる。ネイティブＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）実質的に全長ＷＴ１の反応性以上であるレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。言い換えると、免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性に類似するかまたはそれよりも大きなレベルで、このようなアッセイにおいて反応し得る。このようなスクリーニングは、一般に、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９９８に記載されるような、当業者に周知の方法を使用して実施され得る。
【００２９】
あるいは、免疫原性部分は、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｅｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３〜１００、１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５〜１５５、１９９６を参照のこと）のようなコンピュータ分析を使用して同定され得、このコンピュータ分析は、Ｔｈ応答を誘発する可能性を有するペプチドモチーフについて検索する。マウスクラスＩ  ＭＨＣまたはクラスＩＩ  ＭＨＣおよびヒトクラスＩ  ＭＨＣまたはクラスＩＩ  ＭＨＣへの結合について適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３、１９９４）および他のＨＬＡペプチド結合予測分析に従って同定され得る。免疫原性を確認するために、ペプチドは、ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスモデル、および／または樹状細胞、線維芽細胞もしくは末梢血細胞を使用するインビトロ刺激アッセイを使用して、試験され得る。
【００３０】
上述のように、組成物は、ネイティブＷＴ１タンパク質の改変体を含み得る。ポリペプチド「改変体」は、本明細書中で使用される場合、そのポリペプチドの免疫原性が保持されるように、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入においてネイティブポリペプチドと異なる（すなわち、この改変体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して実質的に減少されない）、ポリペプチドである。言い換えると、改変体が抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブポリペプチドに対して増強され得るかまたは不変であり得るか、あるいはネイティブポリペプチドに対して５０％未満、そして好ましくは２０％未満減少され得る。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載されるように、上記のポリペプチド配列の１つを改変すること、および改変されたポリペプチドと抗血清および／またはＴ細胞との反応性を評価することによって、同定され得る。本発明の関連において、ＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分内の比較的少数の置換（例えば、１〜３）は、ポリペプチドが免疫応答を誘発する能力を増強するように作用し得ることが、見出されている。適切な置換は、一般に、上記のようにコンピュータプログラムを使用することによって同定され得、そしてその効果は、本明細書中に記載されるように、改変されたポリペプチドと抗血清および／またはＴ細胞との反応性に基づいて確認される。従って、特定の好ましい実施形態において、ＷＴ１ポリペプチドは、免疫原性部分内の１〜３アミノ酸残基が置換され、その結果、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が、改変されていないポリペプチドに対するその能力よりも統計学的に大きい、改変体を含む。このような置換は、好ましくは、このポリペプチドＭＨＣ結合部位内に位置され、これは、上記の通りに同定され得る。好ましい置換は、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を増加させる。
【００３１】
特定の改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換される置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造およびハイドロパシーの性質が実質的に変化していないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そして類似の親水性値を有する荷電していない極性ヘッド（ｈｅａｄ）基を持つアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシン、が挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の基としては、以下が挙げられる：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。改変体はまた（または、あるいは改変体は）非保存的変化を含む。改変体はまた（または、あるいは改変体は）、例えば、このポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性性質に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。
【００３２】
好ましい実施形態において、ＷＴ１のＮ末端（アミノ酸１〜２４９）の改変体ペプチドが構築され、ここで、この改変体ポリペプチドは、全長ＷＴ１ポリペプチドおよび／またはＷＴ１のＮ末端ポリペプチドを認識する抗体に結合可能である。抗体の非限定的な例は、抗ＷＴ１抗体ＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）である。
【００３３】
上述のように、ＷＴ１ポリペプチドは、翻訳と同時（ｃｏ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）にタンパク質の移行を指向するタンパク質のＮ末端において、シグナル（またはリーダー）配列に結合体化され得る。ポリペプチドはまた（または、あるいはポリペプチドは）、このポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製または同定の容易さのために、あるいはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカーもしくは他の配列に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合体化され得る。
【００３４】
ＷＴ１ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。本明細書中に記載されるようなＷＴ１ポリヌクレオチドによってコードされる組換えポリペプチドは、このポリヌクレオチドから容易に調製され得る。一般に、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、組換えＷＴ１ポリペプチドを発現し得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを用いて形質転換されたか、またはこの発現ベクターを用いてトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株、酵母細胞株または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳもしくはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地へ分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、まず、市販のフィルターを使用して濃縮され得る。次いで、この濃縮物は、適切な精製マトリクス（例えば、アフィニティーマトリクスまたはイオン交換樹脂）に適用され得る。最終的に、１つ以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。このような技術を使用して、ネイティブポリペプチドまたはその改変体を調製し得る。例えば、ネイティブポリペプチドの改変体をコードするポリヌクレオチドは、一般に、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発）を使用して調製され得、そしてＤＮＡ配列の切片は、短縮型ポリペプチドの調製を許容するように除去され得る。
【００３５】
特定の部分および他の改変体はまた、当業者に周知の技術を使用する合成手段によって生成され得る。例えば、約５００未満のアミノ酸、好ましくは約１００未満のアミノ酸、そしてより好ましくは約５０未満のアミノ酸を有するポリペプチドが、合成され得る。ポリペプチドは、メリーフィールド固相合成法（アミノ酸が、成長するアミノ酸鎖に連続的に付加される）のような任意の商業的に利用可能な固相技術を使用して合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化合成のための装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給業者から市販されており、そして製造業者の指示書に従って操作され得る。
【００３６】
一般に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドが、単離される。「単離された」ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、その元々の環境から取り出されたものである。例えば、その天然系に共存するいくつかまたは全ての物質から分離される場合に、天然に存在するタンパク質が、単離される。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。例えば、天然の環境の一部でないベクター中にクローニングされる場合に、ポリヌクレオチドは、単離されたとみなされる。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、ＷＴ１ポリペプチドの模倣物を提供する。このような模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物と連結したアミノ酸を含み得るか（すなわち、ＷＴ１タンパク質内の１つ以上のアミノ酸が、アミノ酸模倣物により置換され得る）または全体的に非ペプチド模倣物であり得る。アミノ酸模倣物はアミノ酸と立体配置的に類似する化合物であるが故に、そのアミノ酸模倣物は、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株あるいはクローンと反応する能力を実質的に減少させずにＷＴ１ポリペプチド内のアミノ酸と置換され得る。非ペプチド模倣物はアミノ酸を含まない化合物であり、そしてＷＴ１ポリペプチドと類似する全体的な配座を有するが故に、ＷＴ１特異的抗血清および／またはＴ細胞株あるいはクローンと反応する模倣物の能力は、ＷＴ１ポリペプチドの能力と比較して実質的に減少されない。このような模倣物は、ペプチド配列の三次元構造を評価する標準的な技術（例えば、核磁気共鳴技術および計算的技術）に基づき設計され得る。ＷＴ１ポリペプチドの１つ以上の側鎖官能基が、必ずしも同じサイズまたは容積を有しないが、類似の化学的および／または物理的特性（これは、類似する生物学的応答を生じる）を有する基により置換される場合に、模倣物が設計され得る。本明細書中に記載される実施形態において、模倣物が、ＷＴ１ポリペプチドに置換され得ることが理解されるべきである。
【００３８】
他の例示的な実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含む融合ポリペプチドであるか、または本明細書中に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび無関係な配列（例えば、既知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、好ましくは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供することを補助し得るか、またはこの融合パートナーは、ネイティブ組換えタンパク質よりも高収量でこのタンパク質（発現エンハンサー）を発現させることを補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、このポリペプチドの溶解度を上昇させるか、またはこのポリペプチドが所望の細胞内画分に標的化されるように、選択され得る。なお、さらなる融合パートナーとしては、このポリペプチドの精製を容易にする親和性タグが挙げられる。
【００３９】
融合ポリペプチドは、一般に、化学的結合体化を含む標準的な技術を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、組換えポリペプチドとして発現され、発現系において、非融合性ポリペプチドに比べて、増大したレベルの産生を可能にする。簡潔には、このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、別々に集められ、そして適切な発現ベクターに連結され得る。１以上のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを伴ってかまたはこれを伴わずして、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端と連結し得、その結果、この配列のリーディングフレームのフェーズ（相）が一致する。このことによって、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへと翻訳されることを可能にする。
【００４０】
ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドの各々がその２次構造および３次構造にフォールドすることを確実にするのに十分な距離だけ、第１のポリペプチド成分および第２のポリペプチド成分を分離するのに使用され得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野において周知の標準的な技術を使用して、融合ポリペプチドに組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下に因子に基いて選択される：（１）これらのペプチドリンカーが可撓性の延びたコンフォメーションを選定し得ること；（２）これらのペプチドリンカーが、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド上に機能的なエピトープと相互作用し得る２次構造を採用し得ないこと；および（３）このポリペプチド機能性エピトープと反応し得る、疎水性残基および荷電した残基の欠如。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基、およびＳｅｒ残基を含む。他のほぼ中性のアミノ酸（例えば、ＴｈｒおよびＡｌａ）はまた、このリンカー配列に使用される。
アミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９〜４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８〜８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されたアミノ酸配列を含むリンカーとして有用に使用され得る配列である。このリンカー配列は、一般的に、１〜約５０のアミノ酸酸長であり得る。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドが、非必須のＮ末端アミノ酸領域を有し、このアミノ酸領域が機能的ドメインを分離し、空間的な干渉を阻止するのに使用され得る場合、リンカー配列は必要とされない。
【００４１】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに作動可能に連結する。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１のポリペプチドをコードするＤＮＡに５’末端でのみ位置付けられる。同様に、翻訳を終止するための終止コドンおよび転写終止シグナルは、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’にのみ存在する。
【００４２】
この融合ポリペプチドは、関連性のない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起することが可能な免疫原性タンパク質）とともに、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質、および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１、１９９７を参照のこと）。
【００４３】
１つの好ましい実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来である（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物および異種のポリヌクレオチド／ポリペプチドの配列の発現および／または免疫原性を増強するためのこれらの使用方法が、米国特許出願  ６０／１５８，５８５に記載され、この開示が、本明細書中で、全体が参考として援用される。簡潔には、Ｒａ１２とは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＭＴＢ３２Ａの核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および非毒性株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａの核酸配列およびアミノ酸配列は、（例えば、米国特許出願  ６０／１５８，５８５；Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７（これらは、本明細書中で参考として援用されている）に）記述されている。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは、高いレベルで発現し、そしてこの精製プロセスに全体をとおして可溶性のポリペプチドであり得る。さらに、Ｒａ１２は、これらが融合された異種の免疫ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリペプチドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの部分をコードする、少なくとも約１５の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードする内因性配列）を含み得るか、またはこのような配列の改変体を含み得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の、置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得、その結果、このコードされる融合ポリペプチドの生物学的活性は、ネイティブＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して実質的に減少しない。改変体
は、好ましくは、ネイティブのＲａ１２ポリペプチドまたはその一部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【００４４】
他の好ましい実施形態において、免疫学的融合バートナーは、プロテインＤ、グラム陰性細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質から誘導される（ＷＯ  ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質の約３分の１（例えば、はじめのＮ末端の１００〜１１０のアミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基がＮ末端において含まれ得、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供し、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現レベルを増大する（従って、発現エンハンサーとして機能し得る）。この脂質テイルは、抗原提示細胞の最適な抗原提示を確実にする。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質である、ＮＳ１（血球凝集素）が挙げられる。代表的には、このＮ末端の８１アミノ酸が使用さるが、Ｔ細胞エピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【００４５】
別の実施形態において、この免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして既知のタンパク質またはその部分（好ましくは、Ｃ末端部分）である。ＬＹＴＡは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来し、そしてこれは、アミダーゼＬＹＴＡ（これは、ＬｙｔＡ遺伝子にコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２、１９８６）として既知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格において特定の結合を特異的に溶かす自己溶解素である。このＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この特性は、融合タンパク質の発現に有用なプラスミドを発現するＥ．ｃｏｌｉのＣ−ＬＹＴＡの開発について活用されてきた。Ｃ−ＬＹＴＡフラグメントをアミノ末端領域に含むハイブリッドタンパク質の精製が記載された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８、１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分が融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域において見出される。特定の好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を取り込む。
【００４６】
さらに別の例示的な実施例としては、融合ポリペプチド、およびこれらをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のように、エンドソーム画分またはリソソーム画分にポリペプチドを指向し得る標的化シグナルを含む。本発明の免疫学的なポリペプチドは、この標的化シグナルと融合される場合に、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に会合し、そして、それによって、このポリペプチドに対して特異的であるＣＤ４＋Ｔ細胞の増強されたインビボ刺激を提供する。
【００４７】
本発明は、融合パートナーの付加をすることなしにＥ．ｃｏｌｉにおいて組換え的に発現され得るＷＴ１ポリペプチドの短縮形態を提供する。これらの短縮形態の例は、配列番号３４２〜３４６に示され、そしてこれらは配列番号３３７〜３４１に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。これらの短縮のバリーションにおいて、ＷＴ１の最初の７６アミノ酸は、このタンパク質のＣ末端に融合され得、Ｅ．ｃｃｏｌｉにおいてより容易に発現する組換えタンパク質を生成し得る。Ｅ．ｃｏｌｉに加えて、例えば、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのような他の宿主がまた使用され得る。このタンパク質は、さらにヒスチジンタグを用いずに調製され得る。
【００４８】
他の実施形態において、異なるサブユニットが作製され、そしてネイティブＷＴ１の順番とは異なる順番で共に融合され得る。さらに、融合が例えば、Ｒａ１２と共になされ得る。例示的な融合タンパク質は、配列番号３３２〜３３６において示され、そしてこれらは配列番号３２７〜３３１に示されるポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００４９】
（ＷＴ１ポリヌクレオチド）
本明細書中に記載されるＷＴ１ポリペプチドをコードする任意のポリヌクレオチドは、本発明により含まれるＷＴ１ポリヌクレオチドである。このようなポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に連結され得るが、連結される必要はない。
【００５０】
ＷＴ１ポリヌクレオチドは、ネイティブなＷＴ１タンパク質をコードし得るか、または本明細書中に記載されるＷＴ１の改変体をコードし得る。ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブなＷＴ１タンパク質と比較して、コードされるポリペプチドの免疫原性が減少されないような１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされるポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般的に本明細書中に記載されるように評価され得る。好ましい改変体は、ネイティブなＷＴ１配列の免疫原性部分をコードするヌクレオチド位置、２０％以下、好ましくは、１０％以下でヌクレオチド置換、欠失、挿入および／または付加を含む。特定の改変体は、ネイティブな遺伝子またはその一部と実質的に相同的である。このようなポリヌクレオチド改変体は、ＷＴ１ポリペプチド（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列と、中程度のストリンジェント条件下でハイブリダイズし得る。適切な中程度のストリンジェントな条件は以下を含む：５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液での前洗浄；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣにおける一晩のハイブリダイゼーション；続いて、それぞれ０．１％ＳＤＳ含有２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣ、および０．２×ＳＳＣを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄。このようにハイブリダイズするＤＮＡ配列はまた、本発明の範囲内である。
【００５１】
遺伝コードの縮重の結果として、ＷＴ１ポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者に理解される。いくつかのこれらのポリヌクレオチドは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用頻度における差異に起因して変動するポリヌクレオチドが、特に本発明により意図される。
【００５２】
一旦、上記のようにＷＴ１の免疫原性部分が同定されると、ＷＴ１ポリヌクレオチドが、任意の種々の技術を使用して調製され得る。例えば、ＷＴ１ポリヌクレオチドが、ＷＴ１を発現する細胞から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、免疫原性部分の配列に基づいて設計され得、そして購入され得るか、または合成され得る。例えば、ヒトＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のための適切なプライマーには以下が挙げられる：第１工程−Ｐ１１８：１４３４−１４１４：５’ＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＧＡＧＴ３’（配列番号５）およびＰ１３５：５’ＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣ３’（配列番号６）；第２工程−Ｐ１３６：５’ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧ３’（配列番号７）およびＰ１３７：５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＣＣＣＧＡ３’（配列番号８）。マウスＷＴ１遺伝子のＰＣＲ増幅のためのプライマーには以下が挙げられる：第１工程−Ｐ１３８：５’ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧ３’（配列番号９）およびＰ１３９：５’ＧＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧ３’（配列番号１０）；第２工程−Ｐ１４０：５’ＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧ３’（配列番号１１）およびＰ１４１：５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴ３’（配列番号１２）。
【００５３】
次いで、増幅された部分を使用して、全長遺伝子が、周知の技術を使用してヒトゲノムＤＮＡライブラリーまたは適切なｃＤＮＡライブラリーから単離され得る。あるいは、全長遺伝子が、複数のＰＣＲフラグメントから構築され得る。ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド成分を合成し、そして完全なポリヌクレオチドを産生するために共に成分を連結することにより調製され得る。
【００５４】
ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、当該分野において公知の任意の方法によって合成され得、その方法には化学合成が挙げられる（例えば、固相ホスホラミダイト化学合成）。ポリヌクレオチド配列における改変はまた、標準的な変異誘発技術（例えば、オリゴヌクレオチド指向性、部位特異的変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ  ２：１８３、１９８３を参照のこと）、を使用して導入され得る。
あるいは、ＤＮＡが適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）とともにベクターに組み込まれる場合、ＲＮＡ分子は、ＷＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のインビトロまたはインビボでの転写により産生され得る。特定の部分を使用して、本明細書中に記載されるような、コードされるポリペプチドを調製し得る。さらに、またはあるいは、コードされるポリペプチドがインビボで産生されるように、患者に対して一部が投与され得る（例えば、ＷＴ１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ構築物を有する樹状細胞のような抗原提示細胞をトランスフェクトし、そしてそのトランスフェクトされた細胞を患者に投与することによる）。
【００５５】
ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは一般的に、インビトロまたはインビボにおいてそのポリペプチドを産生するために使用され得る。コード配列に相補的なＷＴ１ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）はまた、プローブとしてまたはＷＴ１発現を阻害するために使用され得る。アンチセンスＲＮＡに転写され得るｃＤＮＡ構築物もまた、組織の細胞に導入され、アンチセンスＲＮＡの産生を促進し得る。
【００５６】
任意のポリヌクレオチドがさらに改変され、インビボにおける安定性を増加し得る。可能な改変には以下が挙げられるが、これらに限定されない；５’および／または３’末端における隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合に代わるホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；および／または非伝統的な塩基（例えば、イノシン、キュェオシンおよびワイブトシン）、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル形態、メチル形態、チオ形態および他の改変形態の包含。
【００５７】
本明細書中に記載されるようなヌクレオチド配列が、確立された組換えＤＮＡ技術を使用して、種々の他のヌクレオチド配列に結合され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、任意の種々のクローニングベクターにクローン化され得る、そのベクターには、プラスミド、ファージミド、λファージ誘導体およびコスミドが挙げられる。特定の目的のベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ産生ベクターおよび配列決定ベクターが挙げられる。一般的には、ベクターは、少なくとも１つの生物体において機能的な複製起点、都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位および１つ以上の選択マーカーを含む。他のエレメントは、所望される用途に依存し、そして当業者において明らかである。
【００５８】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞に入り、そしてそこで発現することを可能にするように処方され得る。以下に記載されるように、このような処方物は、治療目的のために特に有用である。当業者は、標的細胞においてポリヌクレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在すること、および任意の適切な方法が使用され得ることを理解する。例えば、ポリヌクレオチドがウイルスベクター（例えば、限定しないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスまたはワクシニアウイルスまたは他にポックスウイルス（例えば鳥類ポックスウイルス））に組み込まれ得る。ＤＮＡをこのようなべクターに組み込むための技術は、当業者において周知である。さらにレトロウイルスベクターは、選択マーカー（形質導入された細胞の同定または選択を援助するために）についての遺伝子および／またはベクターを標的特異的にするための標的部分（例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする遺伝子）を伝達または組み込み得る。標的化はまた、当業者において公知の方法により、抗体を使用して達成され得る。例えば、腫瘍防御および養子免疫療法実験（腫瘍あるいは白血病増殖阻害またはこのような細胞の溶解を実証するため）を実施するために使用され得るＷＴ１陽性腫瘍モデルを樹立する際の使用のために、そのようなベクター内のｃＤＮＡ構築物を使用して、ヒトまたは動物細胞株にトランスフェクトし得る。
【００５９】
ポリヌクレオチドについての他の治療的処方物は、コロイド分散系（例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ）および脂質ベースの系（Ｏ／Ｗエマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソーム）を含む。インビトロおよびインビボにおける送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソームである（すなわち、人工膜小胞）。このような系の調製および使用は、当該分野において周知である。
【００６０】
（抗体およびそのフラグメント）
本発明は、さらにＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する結合薬剤（例えば、抗体、およびその抗原結合フラグメント）を提供する。本明細書中で使用されるように、薬剤がＷＴ１ポリペプチドと検出可能なレベル（例えば、ＥＬＩＳＡ内）で反応し、類似の条件下で、関連しないタンパク質と検出可能に反応しない場合、薬剤はＷＴ１ポリペプチドに「特異的に結合する」と言われる。本明細書中で使用される場合、「結合」とは、「複合体」が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合的会合を言う。結合する能力は、例えは、その複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。この結合定数は、その複合体の濃度をその成分濃度の積で除算して得られた値である。一般的に、複合体形成についての結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、２つの化合物は、本発明の文脈中において「結合する」と言われる。この結合定数は、当該分野において周知の方法を使用して決定され得る。
【００６１】
上記の要求を満足する任意の薬剤が結合薬剤となり得る。好ましい実施形態において、結合薬剤は、抗体であるか、またはその抗原結合フラグメントである。特定の抗体が、例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から商業的に入手可能である。あるいは、抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、抗体は、細胞培養技術により産生され得、その技術には本明細書中に記載されるようなモノクローナル抗体の産生、または組換え抗体の産生を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主に抗体遺伝子をトランスフェクトすることによるものが挙げられる。１つの技術において、ポリペプチドを含む免疫原は、初めに任意の広範な種々の哺乳動物に注射される（マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）。この工程において、本発明のポリペプチドは改変を伴わずに免疫原として作用し得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドに対して、ポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。この免疫原は、好ましくは、１つ以上のブースター免疫を組み込んだ予め決定されたスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は定期的に採血される。次いで、このペプチドに対して特異的なポリクローナル抗体は、そのような抗血清から、例えば適切な固形支持体と結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。
【００６２】
目的の抗原性ポリペプチドに対して特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６）の技術およびそのさらに改善された技術を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望される特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株が、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、この脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、この免疫化された動物と同系である）との融合により不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞を数分間非イオン性界面活性剤と組み合わせ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地上に低密度でプレートし得る。好ましい選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常、約１〜２週間）の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてその培養上清が、そのポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【００６３】
モノクローナル抗体が、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔内へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収率を増強するために使用され得る。次いで、モノクローナル抗体が腹水または血液から収集され得る。混入物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲルろ過、沈澱および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、精製プロセス（例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程）において使用され得る。
【００６４】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好まれ得る。そのようなフラグメントには、Ｆａｂフラグメントが挙げれるが、これは標準的な技術を使用して調製され得る。手短に言うと、免疫グロブリンが、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより、ウサギ血清から精製され得（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）、そしてＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを産生するためにパパインにより消化され得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントが、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより分離され得る。
【００６５】
モノクローナル抗体およびそのフラグメントは、１以上の治療剤に結合され得る。この点に関して適切な薬剤は、例えば、自己骨髄をインビトロでパージするために使用され得る、放射性トレーサーおよび化学療法剤を含む。代表的な治療剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉを含む。好ましい薬物は、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログを含む。好ましい分化誘導剤は、ホルボールエステルおよび酪酸を含む。好ましい毒素は、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質を含む。診断目的については、放射性薬剤の結合が、転移の追跡を容易にするためか、またはＷＴ１−陽性腫瘍の位置を決定するために、使用され得る。
【００６６】
治療剤は、直接的または間接的（例えば、リンカー基を通じて）のいずれかで、適切なモノクローナル抗体に結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他方と反応し得る置換基を保有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物または酸ハライド）と、または他方に対する良好な脱離基（例えば、ハライド）を含むアルキル基と反応することが可能であり得る。
【００６７】
あるいは、治療剤および抗体をリンカー基を通じて結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合能力を妨害することを回避するために、薬剤から抗体を離すスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学反応性を増大させるように働き得、それにより結合効率を増大させる。化学反応性における増大はまた、薬剤、または薬剤上の官能基の使用を容易にし得るが、これは、そうでなければ可能ではない。
【００６８】
種々の二官能性試薬または多官能性試薬（ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方）（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬのカタログに記載されるもの）が、リンカー基として用いられ得ることは、当業者に明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基または酸化した糖質残基を通じてもたらされ得る。このような方法論を記載している多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【００６９】
本発明の免疫結合体の抗体部分を含まないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインタナリゼーションの間またはその際に切断可能であるリンカー基を使用することが所望され得る。多くの異なる切断可能なリンカー基が、記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元による切断（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒに対する米国特許第４，４８９，７１０号）、光不安定結合の照射による切断（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらに対する米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解による切断（Ｋｏｈｎらに対する米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介加水分解による切断（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解による切断（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらに対する米国特許第４，５６９，７８９号）を含む。
【００７０】
１よりも多くの薬剤を抗体に結合させることが所望され得る。１つの実施形態では、薬剤の複数の分子が、１つの抗体分子に結合され得る。別の実施形態では、１よりも多い型の薬剤が、１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態にも関わらず、１よりも多い薬剤を有する免疫結合体が、種々の様式で調製され得る。
例えば、１よりも多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のために複数の部位を提供するリンカーが、使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。キャリアは、種々の様式において薬剤を保有し得、この様式は、直接的かまたはリンカー基を通じてかのいずれかでの共有結合を含む。適切なキャリアは、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらに対する米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチドおよびアミノデキストランのようなポリサッカリド（Ｓｈｉｈらに対する米国特許第４，６９９，７８４号）を含む。キャリアはまた、非共有結合によってか、または例えば、リポソームビヒクル内でのカプセル化によって薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３，０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示している。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためにドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらに対する米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示している。
【００７１】
抗体および免疫結合体について、種々の投与経路が使用され得る。代表的には、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除された腫瘍のベッドにおいてである。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、腫瘍上の抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変動することが明らかである。
【００７２】
また、ＷＴ１の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体が、本明細書中に提供される。このような抗体は、周知の技術を使用して、ＷＴ１の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに対して惹起され得る。ＷＴ１の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体は、本明細書中に記載されるように、ＷＴ１の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原結合フラグメントに結合する抗体である。
【００７３】
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、またはあるいは、ＷＴ１に特異的なＴ細胞を含む。このような細胞は、一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離系（例えば、ＣｅｌｌＰｒｏ  Ｉｎｃ．Ｂｏｔｈｅｌｌ  ＷＡから入手可能なＣＥＰＲＡＴＥＴＭ系）を使用して、哺乳動物（例えば、患者）の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分内に存在し得る（またはそれらから単離され得る）（米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）。あるいは、Ｔ細胞は、関連しているかまたは関連していない、ヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来し得る。
【００７４】
Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得る。このような刺激は、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を許容するに十分な条件下および時間で行われる。好ましくは、ＷＴ１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗原特異的Ｔ細胞の生成を容易にするために、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）内に存在する。簡潔には、Ｔ細胞は、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって）、患者または関連しているかもしくは関連していないドナーから単離され得、ＷＴ１ポリペプチドとインキュベートされる。例えば、Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチド（例えば、５μｇ〜２５μｇ／ｍｌ）または匹敵する量のＷＴ１ポリペプチドを合成する細胞とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）インビトロでインキュベートされ得る。コントロールとして働くＷＴ１ポリペプチドの非存在下で、Ｔ細胞サンプルの別々のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
【００７５】
Ｔ細胞は、このＴ細胞がＷＴ１ポリペプチドでコーティングされているか、またはこのようなポリペプチドをコードする遺伝子を発現している標的細胞を殺傷する場合に、ＷＴ１ポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞の特異性は、任意の種々の標準的な技術を使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいては、陰性コントロールと比較して、溶解および／または増殖における刺激指数の２倍を超える上昇は、Ｔ細胞特異性を示す。
このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５〜１０７０、１９９４に記載されるように行われ得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出が、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の上昇した速度を測定することによって（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡ中に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）検出され得る。Ｔ細胞増殖を検出する他の様式は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、Ｃａ２＋フラックス、または色素（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム）の取り込みにおける上昇を測定することを包含する。あるいは、リンホカイン（例えば、インターフェロンγ）の合成が、測定され得るか、またはＷＴ１ポリペプチドに応答し得るＴ細胞の相対数が、定量され得る。サイトカイン放出（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）のレベルにおける２倍の上昇がＴ細胞活性化を示す標準的なサイトカインアッセイを使用して測定した場合に、ＷＴ１ポリペプチド（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との３〜７日間の接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の上昇を生じるはずであり、そして／または上記のような２〜３時間の接触は、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、このＴ細胞は、患者または関連しているか、もしくは関連していないドナーに由来し、そして刺激および拡大の後に患者に投与される。
【００７６】
ＷＴ１ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化が、種々の様式で検出され得る。特異的Ｔ細胞活性化を検出するための方法は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成（すなわち、ＷＴ１に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成）を検出することを包含する。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋細胞については、特異的Ｔ細胞活性化を検出するために好ましい方法は、細胞溶解性活性の生成の検出である。
【００７７】
治療目的のために、ＷＴ１ポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで数の上では増殖され得る。インビトロでのこのようなＴ細胞の増殖は、種々の様式で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）、および／またはＷＴ１ポリペプチドを合成する刺激性細胞を添加してか、または添加することなく、ＷＴ１ポリペプチドに再び曝露され得る。刺激性細胞の添加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する場合に好ましい。Ｔ細胞は、ＷＴ１ポリペプチドでの断続的な再刺激に応答する特異性を保持したまま、インビトロで多数に増殖され得る。簡潔には、一次的なインビトロ刺激（ＩＶＳ）については、多数のリンパ球（例えば、４×１０７よりも多い）が、ヒト血清を含む培地を有するフラスコ中に置かれ得る。ＷＴ１ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌでのペプチド）が、破傷風毒素（例えば、５μｇ／ｍｌ）とともに、直接的に添加され得る。次いで、これらのフラスコが、インキュベートされ得る（例えば、３７℃で７日間）。第２のＩＶＳについては、次いで、Ｔ細胞が収集され、そして２〜３×１０７の照射された末梢血単核細胞を有する新しいフラスコ中に置かれる。ＷＴ１ポリペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌ）が、直接的に添加される。これらのフラスコが、３７℃で７日間インキュベートされる。第２のＩＶＳの２日および４日後に、２〜５単位のインターロイキン−２（ＩＬ−２）が、添加され得る。第３のＩＶＳについては、Ｔ細胞は、ウェル中に置かれ得、そしてこのペプチドでコーティングされた、個体独自のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞で刺激され得る。ＩＬ−２が、各々の周期の２日目および４日目に添加され得る。これらの細胞が特異的な細胞傷害性Ｔ細胞であることが示されるとすぐに、これらは、２日目、４日目および６日目で、より多いＩＬ−２（２０単位）を用いて、１０日の刺激周期を使用して拡大され得る。
【００７８】
あるいは、ＷＴ１ポリペプチドの存在下で増殖する１以上のＴ細胞が、クローニングによって、数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野において周知であり、そして限界希釈を含む。応答性Ｔ細胞は、密度勾配遠心分離およびヒツジ赤血球細胞ロゼッティングにより感作された患者の末梢血から精製され得、そして照射された自己充填細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｆｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）の存在下で名目上の抗原で刺激することによって培養物中で樹立され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドが、抗原性刺激として使用され、そしてエプスタイン−バーウイルスでの感染により不死化された自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）またはリンパ芽球腫細胞株（ＬＣＬ）は、抗原提示細胞として使用される。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生成するために、ＷＴ１ポリペプチドを産生する発現ベクターでトランスフェクトされた自己抗原提示細胞が、刺激性細胞として使用され得る。樹立されたＴ細胞株は、１×１０６の照射されたＰＢＬ細胞またはＬＣＬ細胞および組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（５０Ｕ／ｍｌ）を有する９６ウェル平底プレートに、１ウェルあたり０．５の細胞の頻度で、刺激されたＴ細胞をプレートすることによって抗原刺激の２〜４日後にクローニングされ得る。樹立されたクローン増殖を有するウェルは、最初のプレーティングのおよそ２〜３週間後に同定され、そして自己抗原提示細胞の存在下で適切な抗原で再刺激され、次いで、抗原刺激の２〜３日後での低用量のｒＩＬ２（１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって拡大され得る。Ｔ細胞クローンは、およそ２週間毎の抗原およびｒＩＬ２での定期的な再刺激によって２４ウェルプレートにおいて維持され得る。
【００７９】
特定の実施形態では、同種異系Ｔ細胞が、インビボおよび／またはインビトロで初回免疫され得る（すなわち、ＷＴ１に感作される）。このような初回免疫は、ＷＴ１ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリペプチドを産生する細胞と、Ｔ細胞とを、Ｔ細胞を初回免疫することを許容する条件下かつ時間で、接触させることによって達成され得る。一般に、Ｔ細胞は、例えば、本明細書中に記載される標準的な増殖、クロム放出アッセイおよび／またはサイトカイン放出アッセイにより測定されるように、ＷＴ１ポリペプチドとの接触がＴ細胞の増殖および／または活性化を生じる場合に、初回免疫されるとみなされる。陰性コントロールと比較して、増殖または溶解における２倍よりも大きい上昇、およびサイトカインレベルにおける３倍よりも大きい上昇の刺激指数は、Ｔ細胞特異性を示す。インビトロで初回免疫された細胞は、例えば、骨髄移植において、またはドナーリンパ球注入として、用いられ得る。
【００８０】
ＷＴ１に特異的なＴ細胞は、ＷＴ１タンパク質を発現する細胞を殺傷する。ＷＴ１のためのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖をコードする遺伝子の導入は、ＷＴ１を保有する、白血病細胞および癌細胞に対する応答を量的かつ質的に改善する手段として使用される。ＷＴ１陽性細胞と反応し得るＴ細胞の数を増加させるためのワクチンは、ＷＴ１を保有する細胞を標的化するための一つの方法である。ＷＴ１に特異的なＴ細胞を用いたＴ細胞療法は別の方法である。代替的な方法は、ＷＴ１に特異的なＴＣＲ鎖をＴ細胞または溶解能を有する他の細胞に導入することである。適切な実施形態において、このＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＷＯ９６／３０５１６（これは、本明細書中において、参考として援用される）に記載されるように、ＷＴ１特異的Ｔ細胞株からクローン化され、そして養子Ｔ細胞治療のために使用される。
【００８１】
（薬学的組成物およびワクチン）
特定の局面において、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および／またはＴ細胞が、薬学的組成物またはワクチンに組み込まれ得る。あるいは、薬学的組成物は、ＷＴ１ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得、この結果、この抗原提示細胞は、ＷＴ１ポリペプチドを発現する。薬学的組成物は、１以上のこのような化合物または細胞、および薬理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。特定のワクチンは、１以上のそのような化合物または細胞、および非特異的免疫応答エンハンサー（例えば、アジュバントまたはリポソーム（これらの中に化合物が取り込まれる））を含み得る。薬学的組成物およびワクチンは、送達系（例えば、米国特許第４，８９７，２６８号および同第５，０７５，１０９号に開示される生分解性ミクロスフェアのような）をさらに含み得る。本発明の範囲内の薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性または不活性であり得る、他の化合物を含み得る。
【００８２】
特定の実施形態において、薬学的組成物およびワクチンは、患者（例えば、ヒト）においてＷＴ１ポリペプチドに特異的なＴ細胞応答を誘発するように設計される。一般的に、Ｔ細胞応答は、比較的短いポリペプチド（例えば、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの２３未満の連続アミノ酸残基、好ましくは４〜１６の連続残基、より好ましくは、８〜１６の連続残基、およびなおより好ましくは、８〜１０の連続残基を含む）の使用を介して支持され得る。あるいは、またはさらに、ワクチンは、Ｔ細胞応答を優先的に増強する非特異的免疫応答エンハンサーを含み得る。換言すると、この免疫応答エンハンサーは、ＷＴ１ポリペプチドに対するＴ細胞応答のレベルを、抗体応答が増強される量より比例的により多い量に増強し得る。例えば、標準的なオイルベースのアジュバント（例えば、ＣＦＡ）と比較する場合、Ｔ細胞応答を優先的に増強する免疫応答エンハンサーは、ＷＴ１陰性コントロール細胞株に比べて増殖性Ｔ細胞応答を少なくとも２倍、溶解性応答を少なくとも１０％、および／またはＴ細胞の活性化を少なくとも２倍増強し得るが、抗体応答を検出可能に増強しない。ＷＴ１ポリペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答が増強される量は、一般的に、当該分野で公知の任意の代表的技術（例えば、本明細書中に提供される技術）を使用して決定され得る。
【００８３】
薬学的組成物またはワクチンは、上記のようなポリペプチドの１以上をコードするＤＮＡを含み得、その結果、このポリペプチドはインサイチュで生成される。上記のように、ＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系のいずれかの中に存在し得、これらの送達系としては、核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系ならびに哺乳動物発現系が挙げられる。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。細菌送達系は、細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み、その細菌は、その細胞表面上でポリペプチドの免疫原性部分を発現する。好ましい実施形態において、このＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、あるいはアデノウイルス）を使用して導入され得、これらの発現系は、非病原性（欠損性）の複製コンピテントなウイルスの使用を含み得る。このような発現系にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２、１９９３に総説されるように、「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にこのＤＮＡをコートすることによって増加され得る。
【００８４】
上記のように、薬学的組成物またはワクチンは、ＷＴ１ポリペプチドを発現する抗原提示細胞を含み得る。治療目的のために、本明細書中に記載されるように、抗原提示細胞は、好ましくは、自己の樹状細胞である。このような細胞は、Ｒｅｅｖｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：５６７２−５６７７，１９９６；Ｔｕｔｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１１３９−１１４７，１９９８；およびＮａｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３６４−３６９，１９９８に記載のような、標準的な技術を使用して調製およびトランスフェクトされ得る。抗原提示細胞の表面上のＷＴ１ポリペプチドの発現は、本明細書中に記載のような、インビトロ刺激および標準的な増殖、ならびにクロム放出アッセイによって確証され得る。
【００８５】
当業者に公知の任意の適切なキャリアは、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、キャリアの型は、投与形態に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与形式（例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与を含む）について処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、キャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含む。経口投与のために、上記のキャリアのいずれか、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）が、使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコール酸）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。特定の局所適用のために、周知の成分を使用するクリームまたはローションとしての処方物が、好ましい。
【００８６】
このような組成物はまた、緩衝液（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。本発明の１つの実施形態において、組成物は、以下を含むがこれらに限定されない糖の１つ以上を含む緩衝液を含み、これらの各々は、一般的に約１％と２５％との間の濃度にあり、代表的には約７％と約１３％との間の濃度にある：トレハロース、マルトース、スクロース、フルクトース、およびグルコース。さらなる実施形態において、この濃度は約８％と約１２％との間である。さらなる実施形態において、この濃度は、約１０％である。本発明のさらなる局面において、この組成物は、エタノールアミン；システイン；またはＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０を含み得、これらは一般に、この処方物の、効力、安定性および／または溶解性を増強するのに有効な濃度にある。
【００８７】
任意の種々の非特異的免疫応答エンハンサー（例えば、アジュバント）が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。多くのアジュバントは、迅速な異化から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）、および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導タンパク質）を含む。適切な非特異的免疫応答エンハンサーとしては、以下が挙げられる：ミョウバンベースのアジュバント（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ、リン酸アルミニウム、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、水酸化アルミニウム）；オイルベースのアジュバント（フロイントアジュバント（ＦＡ）、Ｓｐｅｃｏｌ、ＲＩＢＩ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０またはＭｏｎｔａｎｉｄｅ（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）ＩＳＡ  ７２０）；サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌａｔ３リガンド）；ミクロスフェア；非イオン性ブロックコポリマーベースのアジュバント；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）ベースのアジュバントＡＳ−１、ＡＳ−２（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）；Ｒｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ系ベースのアジュバント：ＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ）；サポニンベースのアジュバント（粗サポニン、サポニンＱｕｉｌ  Ａ）；ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）ベースのアジュバント（例えば、ＳＡＦ（微小流動体化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄ）形態のＳｙｎｔｅｘアジュバント（ＳＡＦ−ｍ）））；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）；ヒト補体ベースのアジュバントｍ．ｖａｃｃａｅおよび誘導体；免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）ベースのアジュバント；不活性化毒素；および弱毒化した感染因子（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。
【００８８】
本発明の薬学的組成物の用途のためのさらなる例示的なアジュバントとしては、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能な、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ  ４−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願番号０８／８５３，８２６および同０９／０７４，７２０（これらの開示は、本明細書中において全体が参考として援用される）において記載されるようなＡＧＰ）、ならびに例えば、ＷＯ９９／５２５４９Ａ１に記載されるもののようなポリオキシエチレンエーテルアジュバントが挙げられる。
【００８９】
他の好ましいアジュバントとしては、以下の一般式のアジュバン分子が挙げられる：
（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ、  ここで、ｎは１〜５０であり、Ａは結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、ＲはＣ１〜５０アルキルまたはフェニルＣ１〜５０アルキルである。
【００９０】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは１と５０との間であり、好ましくは４〜２４であり、最も好ましくは９であり；Ｒ成分は、Ｃ１〜５０であり、好ましくは、Ｃ４〜Ｃ２０アルキル、および最も好ましくはＣ１２アルキルであり、そしてＡは結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％、および最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−９−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインディックス（１２版：エントリー７７１７）に記載されている。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【００９１】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと結合され得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願ＧＢ９８２０９５６．２に記載されるようなＣｐＧとである。
【００９２】
上記のように、特定の実施形態において、免疫応答エンハンサーは、ＷＴ１ポリペプチドに対するＴ細胞応答（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋）を優先的に誘発または増強する、それらの能力について選択される。このような免疫応答エンハンサーは、当該分野で周知であり、そしてこれには、以下が挙げられる（しかし、これらに限定されない）：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０、Ｓｅｐｐｉｃ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ７２０、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌａｔ３リガンド）、ミクロスフェア、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）ベースのアジュバント、ＡＳ−１（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、ＡＳ−２（Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｒｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ系ベースのアジュバント、ＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ）、サポニンベースのアジュバント（粗サポニン、サポニンＱｕｉｌ  Ａ）、微小流動体化形態のＳｙｎｔｅｘアジュバント（ＳＡＦ−ｍ）、ＭＶ、ｄｄＭＶ（Ｇｅｎｅｓｉｓ）、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）ベースのアジュバントおよび不活性化毒素。
【００９３】
本発明の別の局面において、組成物は、主要なＴｈ−１型応答の惹起のためのアジュバントを含み得る。主要なＴｈ−１型応答の惹起のための特定の好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリル脂質Ａ、好ましくは、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと、アルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（例えば、ＭＰＬ−ＳＥ）は、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同４，８７７，６１１号；４，８８６，０３４号および４，９１２，０９４号（これらは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと；）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（この中において、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、主にＴｈ１応答を誘導する。そのようなオリゴヌクレオチドは、周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８および米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号において、記載される。免疫刺激性ＤＮＡ配列はまた、例えば、Ｓａｔｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ）またはＱＳ２１およびＱＳ７を含むその誘導体（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ；あるいはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａサポニンまたはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ（例えば、少なくとも２つの、以下からなる群より選択される組み合わせ：ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ  Ａ、β−エスシン（β−ｅｓｃｉｎ）またはジギトニン）中の１以上のサポニンが挙げられる。
【００９４】
本明細書中に記載される組成物およびワクチンは、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物の緩やかな放出をもたらす、カプセルまたはスポンジのような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術を使用して調製され得、そして例えば、経口、直腸または皮下の埋め込みによるか、または所望の標的部位への埋め込みによって投与され得る。徐放性処方物は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体または細胞を含み得、これらは、キャリアマトリックス中に分散されるか、そして／または速度制御性の膜に囲まれたリザーバ内に含まれる。このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得；好ましくは、処方物は、比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、埋め込み部位、速度および予想される放出時間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【００９５】
（悪性疾患の治療）
本発明のさらなる局面において、本明細書中に記載の組成物およびワクチンは、悪性疾患（例えば、進行性または転移性の疾患、あるいは小さい腫瘍負荷（例えば、最小の残留性疾患）によって特徴付けられる疾患）の発症を阻害するために使用され得る。一般的に、このような方法は、ＷＴ１発現に関連する疾患を予防、遅延または処置するために使用され得る。換言すると、本明細書中に提供される治療方法は、既存のＷＴ１関連疾患を処置するために使用され得るか、あるいは疾患を有さない患者において、またはＷＴ１発現に未だ関連付けられていない疾患に罹患している患者において、このような疾患の発症を予防または遅延させるために使用され得る。
【００９６】
本明細書中で使用される場合、疾患の経過の間のいずれかの時点で疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）が、その同じ組織の正常細胞より検出可能に高レベルでＷＴ１ポリペプチドを生成する場合、その疾患は、「ＷＴ１発現に関連する」。ＷＴ１発現の悪性疾患との関連は、ＷＴ１が腫瘍上に存在することを必要としない。例えば、ＷＴ１の過剰発現は、腫瘍の開始に関連し得るが、そのタンパク質の発現は、その後消失し得る。あるいは、ＷＴ１発現の増加によって特徴付けられない悪性疾患は、後の時点で、ＷＴ１発現の増加によって特徴付けられる疾患に進行し得る。従って、疾患細胞が、増加レベルのＷＴ１を先に発現したか、現在発現するか、または後に発現することが予想される任意の悪性疾患は、「ＷＴ１発現に関連する」するとみなされる。
【００９７】
免疫治療は、任意の種々の技術を使用して実行され得、ここで、本明細書中に提供される化合物または細胞は、患者からＷＴ１発現細胞を除去するように機能する。このような除去は、ＷＴ１またはＷＴ１を発現する細胞に特異的な免疫応答を患者において増強または誘導する結果として生じ得る。あるいは、ＷＴ１発現細胞は、エキソビボで除去され得る（例えば、自己骨髄、末梢血、あるいは骨髄または末梢血の画分の処置によって）。骨髄または末梢血の画分は、当該分野の任意の標準的技術を使用して得られ得る。
【００９８】
このような方法において、薬学的組成物およびワクチンは、患者に投与され得る。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくは、ヒト）をいう。患者は、悪性疾患に罹患していてもよいし、していなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、疾患の発生を予防するために（すなわち、予防的に）使用され得るか、または疾患に罹患した患者を処置するために（例えば、既存の疾患の進行および／または転移を、予防または遅延させるために）使用され得る。疾患に罹患した患者は、最小の残留性疾患（例えば、完全または部分的寛解における白血病患者中の低い腫瘍負荷、あるいは外科的な放射線療法および／または化学療法後の腫瘍負荷の減少後の癌患者）を有し得る。このような患者は、再発を阻害するために免疫化され得る（すなわち、再発を予防または遅延させるか、あるいは再発の重篤度を低下させる）。特定の好ましい実施形態において、患者は、白血病（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬまたは幼少期ＡＬＬ）、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）または癌（例えば、胃腸癌、肺癌、甲状腺癌または乳癌、あるいは黒色腫）に罹患し、ここで、白血病の癌は、ＷＴ１陽性（すなわち、本明細書中に提供されるような、抗ＷＴ１抗体と検出可能に反応するか、または本明細書中に記載されるように、ＲＴ−ＰＣＲによって検出可能なレベルでＷＴ１  ｍＲＮＡを発現する）か、またはＷＴ１発現細胞に対する自己免疫疾患に罹患する。
【００９９】
ＷＴ１の過剰発現に関連する他の疾患としては、Ｓａｔｏｈ  Ｆ．ら、Ｐａｔｈｏｌ．Ｉｎｔ．５０（６）：４５８〜７１（２０００）およびＣａｍｐｂｅｌｌ  Ｃ．Ｅ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７８（２）：１８２〜８（１９９８）に記載されるような腎臓癌（例えば、腎細胞癌腫またはウィルムス腫瘍）；およびＡｍｉｎ，Ｋ．Ｍ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６（２）：３４４〜５６（１９９５）に記載されるような中皮腫が挙げられる。Ｈａｒａｄａら（Ｍｏｌ．Ｕｒｏｌ．３（４）：３５７〜３６４（１９９９））は、ヒト精巣の生殖細胞腫瘍におけるＷＴ１遺伝子発現を記述している。Ｎｏｎｏｍｕｒａら、Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ  Ｋｉｙｏ  ４５（８）：５９３〜７（１９９９）によって、精巣癌特異的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を使用して精巣癌の分子的な足場（ｓｔａｇｉｎｇ）が記載される。Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．１９（２）：１５８〜６３（２０００）によって、上皮卵巣腫瘍におけるこのウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の免疫組織化学的検出が記載される。
【０１００】
ＷＴ１過剰発現はまた、Ｂａｒｎｏｕｄ、Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｐａｔｈｏｌ．２４（６）：８３０〜６（２０００）およびＰａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９４（１０）：６９３〜７００（１９９８）によって、繊維形成性小円形細胞腫瘍において記載されている。神経膠腫および他の癌におけるＷＴ１過剰発現が、Ｍｅｎｓｓｅｎ，Ｈ．Ｄ．ら，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１２６（４）：２２６〜３２（２０００）”Ｗｉｌｍｓ’  ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ（ＷＴ１）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｔｏ  ｆｒｅｓｈｌｙ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ”によって、記載されている。ＷＴ１過剰発現を示す他の疾患としては、ＥＢＶ関連疾患（例えば、バーキットリンパ腫および鼻咽腔癌）（Ｓｐｉｎｓａｎｔｉ  Ｐ．ら、Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ３８（５〜６）：６１１〜９（２０００），”Ｗｉｌｍｓ’ｔｕｍｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｈｙｐｈｏｃｙｔｅｓ”）が挙げられる。
【０１０１】
Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４（９）：１６３４〜４（２０００）において、Ｐａｎらは、白血病または脊髄形成異常症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）を有する患者由来の末梢血単核細胞のインビトロＩＬ−１２処置を記載し、そして細胞傷害性の増加およびＷＴ１遺伝子発現における減少を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３（６）：８９１〜９００（１９９９）において、Ｐａｔｍａｓｉｒｉｗａｔらは、脊髄形成異常症候群および急性白血病におけるＷＴ１およびＧＡＴＡ１の発現を報告した。Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １３（３）：３９３〜９（１９９９）において、Ｔａｍａｋｉらは、ウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１が、脊髄形成異常症候群の疾患の進行の診断についての良好なマーカーであることを報告した。固形癌におけるウィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１の発現、および腫瘍細胞増殖におけるその改善が、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌の細胞株、生殖細胞の腫瘍細胞株、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌細胞株の細胞、肝臓細胞癌腫の関連において、Ｏｊｉら  Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９０（２）：１９４〜２０４（１９９９）で議論されている。
【０１０２】
本明細書中に提供される組成物は、単独か、あるいは手術、照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種異系または無関係の）のような従来の治療レジメンと組み合わせて使用され得る。以下により詳細に議論されるように、本明細書中に提供される結合剤およびＴ細胞は、自己性の幹細胞をパージするために使用され得る。このようなパージング（ｐｕｒｇｉｎｇ）は、例えば、骨髄移植あるいは血液またはその成分の輸血の前に有益であり得る。本明細書中に提供される結合剤、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および組成物は、さらに、インビトロおよび／またはインビボで、自己、同系、同種異系または無関係のＷＴ１特異的Ｔ細胞を、拡大および刺激（または初回刺激）するために使用され得る。このようなＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入において使用され得る。
【０１０３】
投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的な技術を使用して容易に確立され得る。一般的に、薬学的組成物およびワクチンは、注射によって（例えば、皮内、筋肉内、静脈内または皮下）か、鼻内（例えば、吸入によって）にか、または経口的に投与され得る。いくつかの腫瘍において、薬学的組成物またはワクチンは、局所的に（例えば、直腸鏡検査（ｒｅｃｔｏｃｏｌｏｓｃｏｐｙ）、胃鏡検査、ビデオ内視鏡検査（ｖｉｄｅｏｅｎｄｏｓｃｏｐｙ）、血管造影または当該分野で公知の他の方法によって）投与され得る。好ましくは、１〜１０用量が、５２週の期間にわたって投与され得る。好ましくは、６用量が、１ヶ月間隔で投与され、そしてブースターワクチン接種が、その後定期的に与えられ得る。代替的プロトコルは、個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与される場合に、基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％大きい、抗腫瘍免疫応答を促進し得る化合物の量である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することによってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、非ワクチン接種患者と比較した場合に、ワクチン接種した患者において改善された臨床結果（例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、あるいはより長い無疾患および／または全体的生存）を導く免疫応答を引き起こし得るべきである。
一般的に、１以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、１用量に存在する各ポリペプチドの量は、約１００μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、約０．１ｍＬ〜５ｍＬの範囲である。
【０１０４】
一般的には、適切な投薬量および治療レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するに十分な量で活性な化合物を提供する。このような応答は、改善された臨床的な結果（例えば、より頻繁な完全または部分的寛解、またはより長く疾患がないこと、および／もしくは全体的な生存）を達成することによって、処置されていない患者と比較して処置された患者においてモニターされ得る。前から存在するＷＴ１に対する免疫応答の増加は、一般的に、改善された臨床的な結果と相関する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖、細胞傷害性、またはサイトカインアッセイを使用して評価され得る。これらは、処置の前後に患者から得られたサンプルを使用して実行され得る。
【０１０５】
さらなる局面において、ＷＴ１発現と関連する悪性疾患の発症を阻害するための方法は、上記のように、ＷＴ１ポリペプチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化された自系のＴ細胞の投与を包含する。このようなＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得、そして上記のように増殖され得る。Ｔ細胞は、悪性疾患の発症を阻害するに有効な量で個体に投与され得る。代表的には、約１×１０９〜１×１０１１Ｔ細胞／Ｍ２が、静脈内、腔内、または切除された腫瘍のベッド中で投与される。細胞の数および投与の頻度が患者の応答に依存することは、当業者に明白である。
【０１０６】
特定の実施形態において、Ｔ細胞は、自系の骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロの刺激については、患者から得られた骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）は、上記のようなＴ細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０１０７】
関連する実施形態において、関連するドナーまたは関連しないドナーのＴ細胞は、同系または同種異系の（関連するかまたは関連しない）骨髄移植の前に刺激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。インビトロの刺激については、関連するドナーまたは関連しないドナーから得られた骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）は、上記のようなＴ細胞の刺激を可能にするに十分な条件下および時間の間、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣと接触され得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞、および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０１０８】
他の実施形態において、本明細書中に記載されるＷＴ１特異的Ｔ細胞は、自系の骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分（例えば、患者への投与前のＣＤ３４＋富化末梢血（ＰＢ））からＷＴ１を発現する細胞を取り除くために使用され得る。このような方法は、ＷＴ１を発現する細胞を、骨髄または末梢血中での骨髄細胞またはリンパ細胞の総数に対して１０％未満まで、好ましくは５％未満まで、そしてより好ましくは１％未満までの減少させることを可能にするに十分な条件下で、またはそれを可能にするに十分な時間、骨髄またはＰＢをそのようなＴ細胞と接触されることによって実行され得る。このような細胞が取り除かれた程度は、例えば、定性的および定量的ＰＣＲ分析、形態学、免疫組織化学、およびＦＡＣＳ分析のような標準的な方法によって容易に決定され得る。次いで、骨髄またはＰＢ（またはそれらの画分）は、標準的な技術を使用して、患者に投与され得る。
【０１０９】
（診断的方法）
本発明はさらに、ＷＴ１発現と関連する悪性疾患を検出するための方法、およびそのような疾患のための免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法を提供する。このような方法は、ＷＴ１タンパク質に特異的な免疫応答がこのような疾患に罹患した患者において検出され得、そしてこのような免疫応答を増強する方法は、予防的または治療的利点を提供し得るという、本発明における発見に基づく。
【０１１０】
ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するために、患者は、ＷＴ１に特異的なＴ細胞のレベルについて試験され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣとともにインキュベートされ得、そして本明細書中に記載されるように、Ｔ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルには、単離されたＴ細胞が含まれるが、これには限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的な技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、インビトロで、ＷＴ１ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）と３７℃で、２〜９日間（代表的には４日間）インキュベートされ得る。コントロールとして機能するために、ＷＴ１ポリペプチドの非存在下でＴ細胞サンプルの別のアリコートをインキュベートさせることが所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、活性化は、好ましくはＴ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋Ｔ細胞については、活性化は、好ましくは細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患を有しない患者における、少なくとも２倍多い増殖のレベルおよび／または少なくとも２０％多い細胞溶解性活性のレベルは、ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在を示す。増殖のレベルおよび／または細胞溶解性活性と、治療に対する予想された応答との間のさらなる相関は、当該分野で周知の方法を用いて作製され得る。特に、より高い抗体応答、増殖応答、および／または溶解性応答を示す患者は、治療に対するより高い応答を示すことが予測され得る。
【０１１１】
他の方法において、患者から得られた生物学的サンプルは、ＷＴ１に特異的な抗体のレベルについて試験される。生物学的サンプルは、免疫複合体を形成するに十分な条件下および時間の間、ＷＴ１ポリペプチド、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣとともにインキュベートされる。次いで、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する生物学的サンプル中でＷＴ１ポリペプチドと抗体との間に形成された免疫複合体が、検出される。このような方法における使用のための生物学的サンプルは、抗体を含むことが予想される患者から得られた任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルには、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液を含む。
【０１１２】
生物学的サンプルは、ＷＴ１ポリペプチドと、ＷＴ１に特異的な抗体との間で免疫複合体を形成するに十分な条件下および時間の間、反応混合液中で、ＷＴ１ポリペプチドとともにインキュベートされる。例えば、生物学的サンプルおよびＷＴ１ポリペプチドは、４℃で２４〜４８時間インキュベートされ得る。
【０１１３】
インキュベーション後、反応混合液は、免疫複合体の存在について試験される。ＷＴ１ポリペプチドと、生物学的サンプル中に存在する抗体との間に形成された免疫複合体の検出は、種々の公知の技術（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ））によって達成され得る。適切なアッセイは、当該分野で周知であり、そして科学文献および特許文献に十分に記載される（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。使用され得るアッセイには、以下が含まれるがこれらに限定されない：Ｄａｖｉｄら（米国特許第４，３７６，１１０号）の二重モノクローナル抗体サンドイッチムノアッセイ技術；モノクローナル−ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、ＫｉｒｋｈａｍおよびＨｕｎｔｅｒ編，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍａｔｈｏｄｓ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，１９７０）；Ｇｏｒｄｏｎらの「ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識したリガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−４９８３，１９８０）；例えば、ＲａｉｎｅｓおよびＲｏｓｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５１５４−５１６０，１９８２）によって記載される酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学技術（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｌｉｎ，Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：４７７，１９８０）；および活性の中和（Ｂｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１；２３９６−２４００，１９８４）。他のイムノアッセイには以下の米国特許に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない：米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；および同第４，０９８，８７６号。
【０１１４】
検出目的のために、ＷＴ１ポリペプチドは、標識されるか、または標識されないかのいずれかであり得る。標識されないＷＴ１ポリペプチドは、凝集アッセイにおいて、または免疫複合体に結合する標識された検出試薬（例えば、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する抗体に結合し得る、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ、もしくはレクチンおよび二次抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント）と組み合わせて使用され得る。ＷＴ１ポリペプチドが標識される場合、レポーター基は、当該分野で公知の、任意の適切なレポーター基であり得、これらは、放射性同位元素、蛍光基、発光基、酵素、ビオチン、および色素粒子であり得る。
【０１１５】
特定のアッセイにおいて、標識していないＷＴ１ポリペプチドは、固体支持体上に固定化される。この固体支持体は、ポリペプチドが結合され得る、当業者にとって公知の任意の物質であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェルまたはニトロセルロースもしくは他の適切なメンブレンであり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス、または、ポリスチレンもしくはポリビニルクロライドのようなプラスチック材料）であり得る。この支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示されるもののような）であり得る。ポリペプチドは、特許文献および科学文献に十分に記載される、当業者に公知である種々の技術を用いて、固体支持体上に固定化され得る。本発明の文脈において、用語「固定化」とは、非共有結合的な結合（例えば、吸着）および共有結合的な結合（これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接的な連結であり得るか、または架橋剤による連結であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたはメンブレンへの吸着による固定化が好ましい。このような場合において、吸着は、適切な緩衝液中で、適切な時間の間、ＷＴ１ポリペプチドを固体支持体と接触されることによって達成され得る。接触時間は温度によって変動し得るが、代表的には、約１時間と約１日間との間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロライド）のウェルを、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、および好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの量の範囲のポリペプチドと接触させることが、適切な量のポリペプチドを固定化するために十分である。
【０１１６】
固定化後に、支持体上の残存するタンパク質結合部位は、代表的にはブロックされる。当業者に公知である任意の適切なブロッキング剤（例えば、ウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、熱不活化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯ（脱脂粉乳の緩衝化溶液であり、これはまた、保存剤、塩、および消泡剤も含む））。次いで、その支持体は、特異的な抗体を含むことが疑われる生物学的サンプルとともにインキュベートされる。そのサンプルは、巧みに適用され得るか、または、より頻繁には、それは、通常、少量（重量で０．１％〜５．０％）のタンパク質（例えば、ＢＳＡ、ＮＧＳ、またはＢＬＯＴＴＯ）を含む緩衝溶液中で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、そのような抗体を含むサンプル中でＷＴ１を特異的に結合する抗体の存在を検出するに十分である時間の間である。好ましくは、その接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡において達成される、少なくとも約９５％の結合である結合のレベルを達成するに十分である。当業者は、平衡を達成するに十分な時間が、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって容易に決定され得ることを理解する。室温においては、約３０分間のインキュベーション時間が一般的に十分である。
【０１１７】
次いで、結合していないサンプルは、適切な緩衝液（例えば、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）で固体支持体を洗浄することによって除去され得る。次いで、免疫複合体を結合し、そしてレポーター基を含む検出試薬が添加され得る。その検出試薬は、結合抗体を検出するに十分な時間の間、免疫複合体とともにインキュベートされる。適切な時間の長さは、一般的に、時間の間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、結合していない検出試薬が除去され、そして結合した検出試薬が、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計数またはオートラジオグラフィー法が一般に適切である。分光学的な方法は、色素、発光基、および蛍光基を検出するために使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般に、放射活性基もしくは蛍光基、または酵素）に結合されたアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびグルコースオキシダーゼ）は、一般に、基質の添加（一般に、特定の時間の間）によって検出され得、続いて、反応生成物の分光学的分析または他の分析によって検出され得る。利用される特定の方法に関わらず、バックグラウンド（すなわち、疾患を有しない個体から得られた生物学的サンプルについて観察されたレベル）よりも少なくとも２倍大きい結合した検出試薬のレベルは、ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在を示す。
【０１１８】
一般的に、免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、患者におけるＷＴ１に特異的な抗体またはＴ細胞のレベルの変化をモニタリングする工程を含む。抗体レベルがモニタリングされる方法は、以下の工程を含み得る：（ａ）患者から得られた第１の生物学的サンプルを、治療および免疫の前に、ＷＴ１ポリペプチドとともにインキュベートする工程、ここで、このインキュベーションは、免疫複合体が形成するに十分な条件下および時間の間、行われる；（ｂ）ＷＴ１ポリペプチドと、ＷＴ１ポリペプチドに特異的に結合する、生物学的サンプル中の抗体との間で形成された免疫複合体を検出する工程；（ｃ）治療または免疫後の患者から取られた第２の生物学的サンプルを用いて、工程（ａ）および（ｂ）とを反復する工程；ならびに（ｄ）第１および第２の生物学的サンプル中で検出される免疫複合体の数を比較する工程。あるいは、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣが、ＷＴ１ポリペプチドの代わりに利用され得る。このような方法において、ポリヌクレオチドによってコードされるか、またはＡＰＣによって発現されＷＴ１ポリペプチドと、生物学的サンプル中の抗体との間の免疫複合体が検出される。
【０１１９】
Ｔ細胞活性化および／またはＷＴ１特異的前駆体の数をモニターする方法は、以下の工程を包含し得る：（ａ）治療または免疫前の患者から得られたＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞を含む第１の生物学的サンプル（例えば、骨髄、末梢血、またはそれらの画分）を、ＷＴ１ポリペプチドと共にインキュベートする工程であって、Ｔ細胞の特異的な活性化、増殖、および／または溶解を可能にするに十分な条件および時間で、このインキュベーションを実施する、工程；（ｂ）Ｔ細胞の活性化、増殖、および／または溶解の量を検出する工程；（ｃ）ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を含み、かつ治療または免疫後の同一患者から採取された第２の生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）第１の生物学的サンプルおよび第２の生物学的サンプルにおける、Ｔ細胞の活性化、増殖、および／または溶解の量を比較する工程。あるいは、ＷＴ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＷＴ１ポリペプチドを発現するＡＰＣを、ＷＴ１ポリペプチドの代わりに使用し得る。
【０１２０】
このような方法における使用のための生物学的サンプルは、抗体、ＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことが予期される患者から得られる任意のサンプルであり得る。適切な生物学的サンプルとしては、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液が挙げられる。第１の生物学的サンプルは、治療もしくは免疫の開始前に、または治療もしくはワクチン接種レジメンを通した途中（ｐａｒｔ  ｗａｙ）で獲得され得る。第２の生物学的サンプルは、類似の様式であるが、さらなる治療または免疫後の時点で獲得されるべきである。第２の生物学的サンプルは、第１の生物学的サンプルの単離と第２の生物学的サンプルの単離との間に、治療または免疫の少なくとも一部が行われるという条件で、治療もしくは免疫の完了時またはその途中で獲得され得る。
【０１２１】
両方のサンプルについてのインキュベーション工程および検出工程を、一般に、上記のように実施し得る。第１のサンプルに対する第２のサンプルにおける免疫複合体の数の統計的に有意な増加は、首尾よい治療または免疫を反映する。
【０１２２】
以下の実施例は例示のために提供され、制限のためではない。
【０１２３】
（実施例）
（実施例１）
（血液学的悪性疾患を有する患者における、ＷＴ１に対する免疫応答の同定）  本実施例は、血液学的悪性疾患を有する患者において存在する免疫応答の同定を例証する。
【０１２４】
患者において予め存在するＷＴ１特異的抗体応答を評価するため、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および重篤な再生不良性貧血を有する患者の血清を、ウェスタンブロット分析を用いて分析した。ヒト白血病性細胞株Ｋ５６２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）由来のＷＴ１を免疫沈降する能力について、血清を試験した。各々の場合において、免疫沈降物をゲル電気泳動により分離し、メンブレンに転写し、そして抗ＷＴ１抗体であるＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）でプローブした。このウェスタンブロット分析は、血液学的悪性疾患を有する患者において強力なＷＴ１特異的抗体を同定した。ＡＭＬを有する患者についての結果を示す代表的なウェスタンブロットを、図２に示す。この患者の血清を使用して生成された免疫沈降物中の５２ｋＤタンパク質を、ＷＴ１特異的抗体により認識した。５２ｋＤタンパク質は、陽性コントロールと同じサイズに移動した。
【０１２５】
さらなる研究によって、全長ＷＴタンパク質および切断されたＷＴタンパク質に対する抗体の存在について、ＡＭＬおよびＣＭＬを有する患者の血清を分析した。ヒトＷＴ１／全長（１〜４４９アミノ酸）、Ｎ末端（１〜２４９アミノ酸）（ＷＴ１／Ｎ末端）およびＣ末端（２６７〜４４９アミノ酸）（ＷＴ１／Ｃ末端）領域を表現するｃＤＮＡ構築物を、改変されたｐＥＴ２８ベクターへとサブクローニングした。このＷＴ１／全長タンパク質およびＷＴ１／Ｎ末端タンパク質を、Ｒａ１２融合タンパク質として発現した。Ｒａ１２は、分泌されたヒト結核菌タンパク質（ＭＴＢ３２Ｂとして示される）のＣ末端フラグメントである（Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６７；３９９８、１９９９）。Ｒａ１２−ＷＴ１／全長融合領域を、ヒスチジンタグにより改変されたｐＥＴ２８におけるヒスチジンタグの３’側にクローニングした。ＷＴ１／Ｎ末端領域を、その後にチオレドキシン（ＴＲＸ）−ＷＴ１／Ｎ末端融合領域が続きさらに３’ヒスチジンタグが後に続く５’ヒスチジンタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクターへとサブクローニングした。ＷＴ１／Ｃ末端コーディング領域を、融合パートナーを有さず、５’ヒスチジンタグおよび３’ヒスチジンタグのみを含有し、その後にトロンビンおよびＥＫ部位が続く、改変されたｐＥＴ２８ベクターへとサブクローニングした。
【０１２６】
ＢＬ２１  ｐＬｙｓＳ  Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を、３つのＷＴ１発現構築物を用いて形質転換し、一晩生育し、そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した。ＷＴ１タンパク質を、以下のように精製した：細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）中で、３７℃でＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔａｂｌｅｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたインキュベーションおよびその後の繰り返しの音波破砕によって収集および溶解した。封入体を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）を用いて２回洗浄した。次いでタンパク質を、ニッケルニトリロトリ酢酸樹脂をわたる（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ；Ｈｏｃｈｕｌｉら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：２１７、１９８９）金属キレート親和性クロマトグラフィーニッケルニトリロトリ酢酸樹脂およびその後のＳｏｕｒｃｅ  Ｑアニオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）でのクロマトグラフィーによって精製した。ＷＴ１タンパク質の同一を、Ｎ末端シークエンスによって確認した。
【０１２７】
デノボ（ｄｅ  ｎｏｖａ）ＡＭＬまたはＣＭＬを有する成人患者からの血清を、ＷＴ１特異的抗体の存在について試験した。組換えタンパク質を、ＴＣマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。プレートを、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いて洗浄し、そして１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を用いてブロックした。洗浄後、血清希釈溶液を、添加し、そして４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、そしてＤｏｎｋｅｙ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ第２抗体を添加し（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒａｖｅ、ＰＡ）、そして室温にて２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＡ）を用いてインキュベートし、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いて停止し、そして直ちに計測した（Ｃｙｔｏ−Ｆｌｕｏｒ  ２３５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｌｄ、ＭＡ）。
【０１２８】
血清学的調査に関して、ヒト血清を、ＥＬＩＳＡによって血清希釈液の１：５０〜１：２０，０００の範囲にわたって試験した。正常なドナーからの血清（ｎ＝９６）の規定の平均ＯＤ値を標準偏差の３倍分（ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｃ末端）超える血清の１：５００希釈のＯＤ値として、陽性反応を規定した。正常なドナーにおけるＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対するより高いバックグラウンドに起因して、ＷＴ１／Ｎ末端に対する陽性反応を、正常なドナーからの血清の規定のＯＤ値を標準偏差の４倍分超える血清の１：５００希釈のＯＤ値として規定した。患者のＡｂ応答が、ＷＴに対して指向され、かつ、このタンパク質の、Ｒａ１２またはＴＲＸ融合部分あるいは可能性なるＥ．ｃｏｌｉの夾雑タンパク質に対して指向しないことを確認するために、コントロールは、類似の方法で精製したＲａ１２およびＴＲＸのみを含んだ。Ｒａ１２タンパク質および／またはＴＲＸタンパク質に対する反応性を示す試料を、この分析から排除した。
【０１２９】
ＷＴ１に対する免疫性の存在について評価するために、正常な個体および白血病を有する患者の血清中の全長ＷＴ１組換えタンパク質および切断されたＷＴ１組換えタンパク質に対する抗体を決定した。抗体反応を、ＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質およびＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性によって分析した。
【０１３０】
９６人の正常なドナーのうち２人のみが、ＷＴ１／全長タンパク質に反応性の血清抗体を有していた（図１８）。これらの個体のうち１人は、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質に対する抗体を有し、１人は、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する抗体を有していた。対照的に、６３人のＡＭＬを有する患者のうち１６人（２５％）は、血清抗体ＷＴ１／全長タンパク質に対して反応性の血清抗体を有していた。著しく対照的に、６３人の患者のうち２人（３％）のみが、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有していた。８１人のＣＭＬを有する患者のうち１５人（１９％）は、ＷＴ１／全長タンパク質に反応性の血清抗体を有し、そして８１人の患者のうち１２人（１５％）は、ＷＴ１／Ｎ末端に反応性の血清抗体を有していた。８１人の患者のうち３人のみ（３％）が、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応性を有していた（図１６および図１７）。
【０１３１】
これらのデータは、ＷＴ１に対する抗体応答が、ＡＭＬを有するある患者およびＣＭＬを有する幾人かの患者において検出可能であることを示す。白血病を有する患者における抗体のより高い発生率は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫が、患者がＷＴ１を発現するか、またはある場合にはＷＴ１を発現した悪性疾患の結果として、生じたことの強力な証拠を提供する。ＷＴ１に対する観察された抗体応答がおそらく、患者が彼ら自身の白血病細胞上のＷＴ１に対して免疫性となった結果生じ、そしてこの応答が、ＷＴ１が「自分自身の」タンパク質であるにも関らず、ＷＴ１が抗原であり得ることの直接的な証拠を提供することが、特定の説に限定されること無く、考えられる。
【０１３２】
ＷＴ１に対する抗体の存在は、ある患者において、同時発生するヘルパーＴ細胞応答もまた存在することを強く意味する。ＷＴ１は、内在性タンパク質である。従って、ＣＴＬ応答は、白血病治療に関して最も効果的であり、かつ免疫の最も毒性の武器である傾向にある。従って、これらのデータは、ＷＴ１に対する治療的なワクチンが、ＷＴ１に対する免疫応答を誘発し得ることの証拠を提供する。
【０１３３】
患者の少数の部分群のみがＣ末端に対する弱い抗体応答を示した一方で、検出された抗体の多数は、Ｎ末端中のエピトープに反応性であった。これは、Ｃ末端由来の試験されたペプチドは、抗体応答も、Ｔ細胞応答も誘発さないが、Ｎ末端より誘導されたペプチドに対する免疫は、抗体応答、ヘルパーＴ細胞応答およびＣＴＬ応答を誘発する、という動物モデルにおける観察と一致する（Ｇａｉｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ９６：１３３４、２０００）。
【０１３４】
（実施例２）
（ＷＴ１発現細胞株で免疫されたマウスにおけるＷＴ１に対する抗体の誘導）  この実施例は、インビボでのＷＴ１特異的抗体応答を誘導するための細胞発現ＷＴ１の使用を例示する。
【０１３５】
白血病を有する患者におけるＷＴ１に対する、存在する抗体の検出は、ＷＴ１に対する免疫性を誘発するためにＷＴ１タンパク質に対する免疫し得ることを強く意味する。ＷＴ１に対する免疫性がワクチン接種によって生じたか否かを試験するために、マウスに、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（Ｂ６起源のＷＴ１陽性腫瘍細胞株）を注入した。すなわち、雄性Ｂ６マウスを、皮下に５×１０６のＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞を用いて免疫し、そして３週間の間隔で５×１０６の細胞を２回追加免疫した。最後の免疫の３週間後、血清を得、そして脾臓の単独の細胞懸濁液を、２５μＭのβ−２−メルカプトエタノール、２００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１０ｍＭ  のＬ−グルタミン酸、および１０％の仔ウシ血清を有するＲＰＭＩ  １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中に調製した。
【０１３６】
ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する免疫後、免疫化された動物におけるＷＴ１特異的抗体応答は、検出可能であった。代表的なウェスタンブロットを、図３中に示す。これらの結果は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫化が、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を誘発し得ることを示す。
【０１３７】
（実施例３）
（ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＴｈおよび抗体応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１に特異的な免疫応答を誘発するための、ＷＴ１ペプチドでの免疫の能力を例示する。
【０１３８】
Ａｂおよび増殖性Ｔ細胞応答を誘発するために適切なペプチドを、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフについて検索するＴｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．７：９３−１００、１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５−１５５、１９９６）に従って同定した。表Ｉに示されるペプチドを、合成および配列決定した。
【０１３９】
（表Ｉ）
（ＷＴ１ペプチド）
【０１４０】
【表１】
2008154588.tif 000002
2008154588.tif 000003
免疫のために、ペプチドを以下のようにグループ分けした：
群Ａ：ｐ６−２２ヒト：１ｍｌ中に１０．９ｍｇ（１０μｌ＝１００μｇ）
ｐ１１７−１３９ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．６ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
ｐ２４４−２６２ヒト：１ｍｌ中に４．６ｍｇ（２２μｌ＝１００μｇ） 
群Ｂ：ｐ２８７−３０１ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．２ｍｇ（１４μｌ＝１００μｇ）
マウスｐ２９９−３１３；１ｍｌ中に６．６ｍｇ（１５μｌ＝１００μｇ）
ｐ４２１−４３５ヒト／マウス：１ｍｌ中に３．３ｍｇ（３０μｌ＝１００μｇ）
コントロール：（ＦＢＬペプチド  １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ
コントロール：（ＣＤ４５ペプチド  １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ。
【０１４１】
群Ａは、ＷＴ１のアミノ末端部分内に存在するペプチド（エキソン１）を含んだ。そして群Ｂは、他のＤＮＡ結合タンパク質に対する配列相同性を有する４つのジンクフィンガー領域を含むカルボキシ末端内に存在するペプチドを含んだ。群Ｂの中で、ｐ２８７−３０１およびｐ２９９−３１３は、エキソン７（ジンクフィンガー１）由来であり、そしてｐ４２１−４３５は、エキソン１０（ジンクフィンガーＩＶ）由来であった。
【０１４２】
Ｂ６マウスを、ＷＴ１ペプチドの群またはコントロールペプチドで免疫した。ペプチドを、注射のために１ｍｌの滅菌水中に溶解し、そしてＢ６マウスを３週間の間隔で３回免疫した。使用したアジュバントは、ＣＦＡ／ＩＦＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＭｏｎｔｉｎｉｄｅであった。次いで、ＷＴ１に特異的な抗体の存在を、実施例１および２に記載のように決定し、そして増殖性Ｔ細胞応答を、標準的なチミジン取りこみアッセイを使用して評価した。このアッセイでは、細胞を抗原の存在下で培養し、そして取りこまれた放射能を測定することにより、増殖を評価した（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０、１９９４）。詳細には、リンパ球を、１ウェルあたり２×１０５細胞にて９６ウェルプレート中で培養し、このウェルは４×１０５の照射した（３０００ラド）同系脾臓細胞および明示されたペプチドを有した。
【０１４３】
群Ａとして明示されたペプチドの群によるマウスの免疫は、ＷＴ１に対する抗体応答を誘発した（図４）。ワクチンＢに対する免疫後に全く抗体は検出されず、これはワクチンＢでの免疫からのヘルパーＴ細胞応答の欠如と一致する。Ｐ１１７−１３９は、増殖性Ｔ細胞応答を誘発した（図５Ａ〜５Ｃ）。刺激指数（ＳＩ）は、８と７２との間を変動した。他のペプチド（Ｐ６−２２およびＰ２９９−３１３）もまた、増殖性Ｔ細胞応答を誘発することが示された。Ｐ６−２２での免疫は２．３の刺激指数（ＳＩ）を生じ、そしてＰ２９９−３１３での免疫は３．３のＳＩを生じた。陽性コントロールは、ＣｏｎＡ刺激したＴ細胞、ならびに既知の抗原（例えば、ＣＤ４５およびＦＢＬ）で刺激したＴ細胞、および同種異系Ｔ細胞株（ＤｅＢｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０、１９９１）を含んだ。
【０１４４】
図６Ａおよび６Ｂは、ワクチンＡ（図６Ａ）およびワクチンＢ（図６Ｂ）において各３つのペプチドについて観察された増殖性応答を示す。ワクチンＡは、３と８との間（バルク線）を変動する刺激指数（ＳＩ）で、免疫ペプチドｐ６−２２およびｐ１１７−１３９に対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発した。ｐ２４４−２６２に対する増殖応答は検出されなかった（図６Ａ）。
【０１４５】
引き続くインビトロ刺激を、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９のみを使用する単一ペプチド刺激として実施した。ｐ１１７−１３９でのワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激は、ｐ６−２２に対する応答を伴わずに、ｐ１１７−１３９に対する増殖を生じた（図７Ａ）。この株由来のクローンは、ｐ１１７−１３９に特異的であった（図７Ｂ）。対照的に、ｐ６−２２でのワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の刺激は、ｐ１１７−１３９に対する応答を伴わずに、ｐ６−２２に対する増殖を生じた（図７Ｃ）。この株由来のクローンは、ｐ６−２２に特異的であった（図７Ｄ）。
【０１４６】
これらの結果は、ＷＴ１ペプチドでのワクチン接種が、ＷＴ１タンパク質に対する抗体応答および免疫ペプチドに対する増殖性Ｔ細胞応答を誘発し得ることを示す。
【０１４７】
（実施例４：ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＣＴＬ応答の誘導）
本実施例は、ＷＴ１ペプチドのＣＴＬ免疫を誘発する能力を例示する。
【０１４８】
クラスＩ  ＭＨＣへの結合に適切なモチーフを有するペプチド（９マー）を、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３，１９９４）を用いて同定した。このような分析で同定したペプチドを、表ＩＩ〜ＸＬＩＶに示す。これらの表の各々において、スコアは、示したＭＨＣ分子に対するペプチドの理論的結合親和性（解離の半減期）を反映する。
【０１４９】
Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチーフを検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：９３−１００，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１４５−１５５，１９９６）を用いて同定したペプチドを、図８Ａおよび８Ｂ、ならびに表ＸＬＶにさらに示す。
【０１５０】
（表ＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５１】
【表２】
2008154588.tif 000004
2008154588.tif 000005
（表ＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ０２０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５２】
【表３】
2008154588.tif 000006
（表ＩＶ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ０２０５に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５３】
【表４】
2008154588.tif 000007
（表Ｖ：ヒトＨＬＡ  Ａ２４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５４】
【表５】
2008154588.tif 000008
2008154588.tif 000009
（表ＶＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ３に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５５】
【表６】
2008154588.tif 000010
2008154588.tif 000011
（表ＶＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ６８．１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５６】
【表７】
2008154588.tif 000012
（表ＶＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ａ  １１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５７】
【表８】
2008154588.tif 000013
（表ＩＸ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ３１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５８】
【表９】
2008154588.tif 000014
2008154588.tif 000015
（表Ｘ：ヒトＨＬＡ  Ａ  ３３０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１５９】
【表１０】
2008154588.tif 000016
2008154588.tif 000017
（表ＸＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ１４に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６０】
【表１１】
2008154588.tif 000018
（表ＸＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ４０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６１】
【表１２】
2008154588.tif 000019
（表ＸＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ６０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６２】
【表１３】
2008154588.tif 000020
2008154588.tif 000021
（表ＸＩＶ：ヒトＨＬＡ  Ｂ６１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６３】
【表１４】
2008154588.tif 000022
2008154588.tif 000023
（表ＸＶ：ヒトＨＬＡ  Ｂ６２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６４】
【表１５】
2008154588.tif 000024
（表ＸＶＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ７に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６５】
【表１６】
2008154588.tif 000025
（表ＸＶＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ８に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６６】
【表１７】
2008154588.tif 000026
2008154588.tif 000027
（表ＸＶＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ２７０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６７】
【表１８】
2008154588.tif 000028
2008154588.tif 000029
（表ＸＩＸ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ２７０５に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６８】
【表１９】
2008154588.tif 000030
（表ＸＸ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ３５０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１６９】
【表２０】
2008154588.tif 000031
（表ＸＸＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ３７０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７０】
【表２１】
2008154588.tif 000032
2008154588.tif 000033
（表ＸＸＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ３８０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７１】
【表２２】
2008154588.tif 000034
2008154588.tif 000035
（表ＸＸＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ３９０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７２】
【表２３】
2008154588.tif 000036
（表ＸＸＩＶ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ３９０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７３】
【表２４】
2008154588.tif 000037
（表ＸＸＶ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ４４０３に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７４】
【表２５】
2008154588.tif 000038
2008154588.tif 000039
（表ＸＸＶＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ５１０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７５】
【表２６】
2008154588.tif 000040
2008154588.tif 000041
（表ＸＸＶＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ５１０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７６】
【表２７】
2008154588.tif 000042
（表ＸＸＶＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ５２０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７７】
【表２８】
2008154588.tif 000043
（表ＸＸＩＸ：ヒトＨＬＡ  Ｂ  ５８０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７８】
【表２９】
2008154588.tif 000044
2008154588.tif 000045
（表ＸＸＸ：ヒトＨＬＡ  ＣＷ０３０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１７９】
【表３０】
2008154588.tif 000046
2008154588.tif 000047
（表ＸＸＸＩ：ヒトＨＬＡ  ＣＷ０４０１に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８０】
【表３１】
2008154588.tif 000048
（表ＸＸＸＩＩ：ヒトＨＬＡ  ＣＷ０６０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８１】
【表３２】
2008154588.tif 000049
（表ＸＸＸＩＩＩ：ヒトＨＬＡ  ＣＷ０７０２に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８２】
【表３３】
2008154588.tif 000050
2008154588.tif 000051
（表ＸＸＸＩＶ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｄｂに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８３】
【表３４】
2008154588.tif 000052
2008154588.tif 000053
（表ＸＸＸＶ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｄｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８４】
【表３５】
2008154588.tif 000054
（表ＸＸＸＶＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｂに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８５】
【表３６】
2008154588.tif 000055
（表ＸＸＸＶＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８６】
【表３７】
2008154588.tif 000056
2008154588.tif 000057
（表ＸＸＸＶＩＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｋに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８７】
【表３８】
2008154588.tif 000058
2008154588.tif 000059
（表ＸＸＸＩＸ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｌｄに対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８８】
【表３９】
2008154588.tif 000060
（表ＸＬ：ウシＨＬＡ  Ａ２０に対するヒトＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１８９】
【表４０】
2008154588.tif 000061
（表ＸＬＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ａ  ０２０１に対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１９０】
【表４１】
2008154588.tif 000062
2008154588.tif 000063
（表ＸＬＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｄｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１９１】
【表４２】
2008154588.tif 000064
2008154588.tif 000065
（表ＸＬＩＩＩ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｂに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１９２】
【表４３】
2008154588.tif 000066
（表ＸＬＩＶ：マウスＭＨＣ  クラスＩ  Ｋｄに対するマウスＷＴ１ペプチドの結合についての、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析の結果）
【０１９３】
【表４４】
2008154588.tif 000067
（表ＸＬＶ：ヘルパーＴ細胞応答を誘発し得るヒトＷＴ１ペプチドについての、ＴＳＩＴＥＳペプチド結合予測分析の結果）
【０１９４】
【表４５】
2008154588.tif 000068
2008154588.tif 000069
特定のＣＴＬペプチド（表ＸＬＶＩに示す）を、さらなる研究のために選択した。表ＸＬＶＩ中に各ペプチドについて、ＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて得られたスコアを、提供する。
【０１９５】
（表ＸＬＶＩ：ＷＴ１ペプチド配列およびＨＬＡペプチド結合予測）
【０１９６】
【表４６】
2008154588.tif 000070
Ｃ５７Ｂ１／６マウスＭＨＣに結合するペプチドを、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：４７６−４８０，１９９０に記載されるように、白血病細胞株ＲＭＡ−Ｓを用いて確認した。簡単には、ＲＭＡ−Ｓ細胞を、１％ＦＣＳを補充した完全培地中で２６℃にて７時間培養した。合計１０６のＲＭＡ−Ｓ細胞を、２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、そして単独か、または指定したペプチド（２５μｇ／ｍｌ）と共にのいずれかで２６℃にて１６時間インキュベートし、そして完全培地中で３７℃にてさらに３時間インキュベートした。次いで、細胞を３度洗浄し、そしてフルオレセインイソチオシアネート結合体化抗Ｄｂ抗体または抗Ｋｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。標識した細胞を２度洗浄し、再懸濁し、そして１％パラホルムアルデヒドを有する５００μｌのＰＢＳ中で固定し、そしてフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標））において蛍光強度について分析した。ＲＭＡ−Ｓ細胞の表面上でのＤｂまたはＫｂ分子の増加の割合を、培地単独でインキュベートした細胞の蛍光強度と比較した、ペプチドと共にインキュベートした細胞の平均蛍光強度の増加により測定した。
【０１９７】
マウスをマウスクラスＩ  ＭＨＣに結合し得るペプチドで免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてＷＴ１ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを、標準的なクロム放出アッセイ（Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４）で評価した。１０６の標的細胞を３７℃にて１５０μＣｉのナトリウム５１Ｃｒと共に９０分間、特定のペプチドの存在下または非存在下でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、そして５％ウシ胎仔血清を有するＲＰＭＩ中に再懸濁した。このアッセイのために、１０４の５１Ｃｒ標識化標的細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートにおいて２００μｌの最終容量で異なる濃度のエフェクター細胞と共にインキュベートした。上清を、３７℃にて４〜７時間後に取り除き、そして特異的溶解の％を、以下の式により決定した：
比溶解の割合＝１００×（実験の放出−自発的放出）／（最大の放出−自発的放出）。
【０１９８】
表ＸＬＶＩＩに示される結果は、いくつかのＷＴ１ペプチドが、ＣＴＬを生成するために不可欠であるクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合し得ることを示す。さらに、このペプチドのいくつかは、クロム放出アッセイを用いて決定されるように、ペプチド特異的ＣＴＬ（図９Ａおよび９Ｂ）を誘発し得た。ＣＴＬペプチドである、ｐ１０−１８ヒト、ｐ１３６−１４４ヒト、ｐ１３６−１４４マウスおよびｐ２３５−２４３に対する免疫の後、ペプチド特異的ＣＴＬ株を産生し、そしてクローンを樹立した。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬがＷＴ１を発現する悪性細胞を死滅させ得ることを示す。
【０１９９】
（表ＸＬＶＩＩ：マウスＢ６クラスＩ抗原に対するＷＴ１  ＣＴＬペプチドの結合）
【０２００】
【表４７】
2008154588.tif 000071
（実施例５：マウスにおいてＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発するためのＷＴ１ポリペプチドの使用）
本実施例は、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を死滅させ得るＣＴＬ免疫を誘発するための、代表的なＷＴ１ポリペプチドの能力を例示する。
【０２０１】
クラスＩ  ＭＨＣおよびクラスＩＩ  ＭＨＣへの結合に適切なモチーフを有するペプチドである、ｐ１１７−１３９を、ＴＳＩＴＥＳおよびＢＩＭＡＳ  ＨＬＡペプチド結合予測分析を用いて上記のように同定した。マウスを、実施例３に記載されるように免疫した。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そしてＷＴ１ペプチド、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞および陰性腫瘍細胞と共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを、標準的なクロム放出アッセイで評価した。図１０Ａ〜１０Ｄに示されるこの結果は、Ｐ１１７が、ＷＴ１陽性腫瘍細胞を死滅させ得るＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発し得るが、ＷＴ１陰性細胞の死滅は観察されなかったことを示す。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬが、実際にＷＴ１を発現する悪性細胞を死滅させること、およびワクチンおよびＴ細胞治療が、ＷＴ１を発現する悪性腫瘍に対して有効であることを実証する。
【０２０２】
類似の免疫を、９マーのクラスＩ  ＭＨＣ結合ペプチドである、ｐ１３６−１４４、ｐ２２５−２３３、ｐ２３５−２４３、ならびに２３マーペプチドである、ｐ１１７−１３９を用いて行った。免疫の後、脾臓細胞をインビトロで４つのペプチドの各々を用いて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬは、ｐ１３６−１４４、ｐ２３５−２４３、およびｐ１１７−１３９に特異的に生成されたが、ｐ２２５−２３３については生成されなかった。ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９についてのＣＴＬデータを、図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ペプチドｐ１３６−１４４およびｐ２２５−２３３についてのデータは示さない。
【０２０３】
ＣＴＬ溶解は、標的ＷＴ１ペプチドが、腫瘍細胞クラスＩ  ＭＨＣ分子に関連して、内因的にプロセシングおよび提示されることを要求する。上記のＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬを、ＷＴ１陰性腫瘍細胞株と対比してＷＴ１陽性腫瘍細胞株を溶解する能力について試験した。ｐ２３５−２４３に特異的なＣＴＬは、ｐ２３５−２４３ペプチドともにインキュベートした標的を溶解したが、ＷＴ１タンパク質を発現した細胞株を溶解することに失敗した（図１１Ａ）。著しく対照的に、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ｐ１１７−１３９ペプチドと共にインキュベートした標的を溶解し、そしてＷＴ１を発現する悪性細胞もまた溶解した（図１１Ｂ）。陰性コントロールとして、ｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬは、ＷＴ１陰性ＥＬ−４（本明細書中でＥ１０ともいわれる）を溶解しなかった。
【０２０４】
ＷＴ１特異的溶解の特異性を、非放射性標的阻害によって確認した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。エフェクター細胞を、種々のエフェクター：標的比で、９６ウェルＵ底プレートにプレートした。１０倍過剰（放射性標的と比べて）の５１Ｃｒ標識を有さない示されたペプチドをコートした標的を、添加した。最終的に、１ウェルあたり１０４の５１Ｃｒ標識化標的細胞を添加し、そしてプレートを３７℃にて４時間インキュベートした。１ウェルあたりの総容量は、２００μｌであった。
【０２０５】
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬによるＴＲＡＭＰ−Ｃの溶解を、関連性のあるペプチドｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、５８％〜３６％をブロックしたが、無関係なペプチドと共にインキュベートしたＥＬ−４ではブロックしなかった（図１２Ａ）。同様に、ＢＬＫ−ＳＶ４０の溶解は、関連性のあるペプチドｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、１８％〜０％をブロックした（図１２Ｂ）。結果は、ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬが、プロセスしたＷＴ１の認識により、悪性の細胞を特異的に死滅させることを確認する。
【０２０６】
推定のＣＴＬモチーフを有するいくつかのセグメントは、ｐ１１７−１３９内に含まれる。ＣＴＬエピトープの正確な配列を決定するために、ｐ１１７−１３９内の全ての潜在的な９マーペプチドを合成した（表ＸＬＶＩＩＩ）。これらのペプチドの２つ（ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８）は、Ｈ−２ｂクラスＩ分子に結合することを示した（表ＸＬＶＩＩＩ）。ｐ１１７−１３９での免疫により生成したＣＴＬは、ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８と共にインキュベートした標的を溶解したが、ｐ１１７−１３９内の他の９マーペプチドでは溶解しなかった（図１３Ａ）。
【０２０７】
ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬ株を、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８のいずれかで再刺激した。ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８で再刺激した後、両方のＴ細胞株は、ペプチド比溶解を実証したが、ｐ１３０−１３８特異的ＣＴＬのみが、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を示した（図１３Ｂおよび１３Ｃ）。従って、ｐ１３０−１３８は、天然でプロセスされるエピトープであるように思われる。
【０２０８】
（表ＸＬＶＩＩＩ：ｐ１１７−１３９内のＷＴ１  ＣＴＬ  ９マーペプチドのマウスＢ６クラスＩ抗原に対する結合）
【０２０９】
【表４８】
2008154588.tif 000072
（実施例６：マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１特異的ｍＲＮＡの同定）
本実施例は、細胞および細胞株においてＷＴ１特異的ｍＲＮＡを検出するための、ＲＴ−ＰＣＲの使用を例示する。
【０２１０】
単核細胞を、密度勾配遠心分離により単離し、そして直ちに凍結し、そしてＷＴ１特異的ｍＲＮＡの存在についてＲＴ−ＰＣＲにより分析するまで、−８０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲを、一般に、Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：４７０４−４７０６，１９９５に記載されるように行った。総ＲＮＡを、標準的な手順に従って１０７の細胞から抽出した。ＲＮＡペレットを、２５μＬジエチルピロカルボネート処理した水に再懸濁し、そして逆転写に直接用いた。ジンクフィンガー領域（エキソン７〜１０）を、３３０ｂｐのマウスｃＤＮＡとしてＰＣＲにより増幅した。増幅を、サーマルサイクラーにおいて、ＰＣＲの１回、または、必要な場合、連続した２回の間、行った。５０μｌの総反応容量において、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および２０ｐｍｏｌの各プライマーを用いた。ＰＣＲ産物の２０μＬのアリコートを、臭化エチジウムで染色した２％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲルを、Ｐｏｌａｒｏｉｄフィルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ  ６６７，Ｐｏｌａｒｏｉｄ  Ｌｔｄ．Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で写真撮影した。ＫｗｏｋおよびＨｉｇｕｃｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３９：２３７−２３８，１９８９の推奨に従って、相互汚染に対する予防策を取った。陰性コントロールは、各実験において、ｃＤＮＡの代わりに水を含有するｃＤＮＡ試薬およびＰＣＲ試薬混合物を含んだ。偽陰性を避けるために、インタクトなＲＮＡおよび適切なｃＤＮＡ産生の存在を、各サンプルについて、β−アクチンプライマーを用いるコントロールＰＣＲによって評価した。これらのプライマーで増幅されなかったサンプルを、分析から除いた。
【０２１１】
マウス細胞株における、ＷＴ１の増幅のためのプライマーは、以下であった：Ｐ１１５：１４５８−１４７８：５’  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ３’（順方向プライマー；配列番号２１）；およびＰ１１６：１７６７−１７８７：５’  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＴＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＴ  ３’（逆方向プライマー；配列番号２２）（Ｉｎｏｕｅら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：２２６７−２２７８，１９９６；Ｆｒａｉｚｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８６：４７０４−４７０６，１９９５を参照のこと）。
【０２１２】
コントロール反応に用いたβアクチンプライマーは、以下であった：５’  ＧＴＧ  ＧＧＧ  ＣＧＣ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＣ  ＣＡ  ３’（センスプライマー；配列番号２３）；および５’  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＣ  ＧＡＴ  ＴＴＣ  ３’（アンチセンスプライマー；配列番号２４）。
【０２１３】
ヒトＷＴ１を増幅するのに使用するためのプライマーは、以下を含む：Ｐ１１７：９５４−９７４：５’  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ３’（配列番号２５）；およびＰ１１８：１４３４−１４１４：５’  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＣＡＧＴ  ３’（配列番号５）。ネスティッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＲＴ−ＰＣＲについて、プライマーは、以下であり得る：Ｐ１１９：１０２３−１０４３：５’  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＡ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＡＴ  ＧＣＡ  ３’（配列番号２６）；およびＰ１２０：１３４５−１３６５：５’  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ３’（配列番号２７）。
【０２１４】
表ＸＬＶＩＩＩは、マウス腫瘍細胞株のＷＴ１  ＰＣＲ分析の結果を示す。表ＩＶにおいて、（＋＋＋）は、ＲＴ−ＰＣＲの第１工程における、強いＷＴ１  ＰＣＲ増幅産物を示し、（＋＋）は、ＷＴ１  ＲＴ−ＰＣＲの第１工程により検出可能であるＷＴ１増幅産物を示し、（＋）は、ＷＴ１  ＲＴ  ＰＣＲの第２工程においてのみ検出可能である、産物を示し、そして（−）は、ＷＴ１  ＰＣＲ陰性を示す。
【０２１５】
（表ＸＬＩＸ：マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１  ｍＲＮＡの検出）
【０２１６】
【表４９】
2008154588.tif 000073
（実施例７）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  ＴＲＸ融合構築物の発現）
短縮された、ＷＴ１のオープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ｂ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２から始まる順方向プライマー
【０２１７】
【化１】
2008154588.tif 000074
終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
【０２１８】
【化２】
2008154588.tif 000075
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３分×４０サイクル
７２℃４分
このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでｐＴｒｘ  ２Ｈベクター（Ｎ末端上のＴｒｘ融合およびＴｒｘ融合周辺の２つのＨｉｓタグによって改変されたｐＥＴ２８ベクター。Ｔｒｘ融合の後にトロンビンおよびエンテロキナーゼについてのプロテアーゼ開裂部位が存在する）にクローニングした。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞に形質転換した。
【０２１９】
（実施例８）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ａ  Ｈｉｓタグ融合構築物の発現）
ＷＴ１のＮ末端オープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ａ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２から始まる順方向プライマー
【０２２０】
【化３】
2008154588.tif 000076
アミノ酸２４９の後に配置された人工的終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
【０２２１】
【化４】
2008154588.tif 000077
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃１分２０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０２２２】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、ｐＰＤＭ（インフレームでＨｉｓタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。このＰＣＲ産物をまた、ｐＴｒｘ  ２Ｈベクターにも形質転換した。このｐＴｒｘ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞へと形質転換した。
【０２２３】
（実施例９）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ｂ  Ｈｉｓタグ融合構築物の発現）
ＷＴ１の切断されたオープンリーディングフレーム（ＷＴ１Ａ）を、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
アミノ酸２５０から始まる順方向プライマー
【０２２４】
【化５】
2008154588.tif 000078
終止コドンの後にＥｃｏＲＩ部位を作製する逆方向プライマー
【０２２５】
【化６】
2008154588.tif 000079
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μｌ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃１分３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０２２６】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されている、ｐＰＤＭ（インフレームでＨｉｓタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。このＰＣＲ産物をまた、ｐＴｒｘ  ２Ｈベクターにも形質転換した。このｐＴｒｘ  ２Ｈ構築物を、ＳｔｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化した。正しい構築物を、ＤＮＡ配列分析によって確認し、次いでＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ発現宿主細胞へと形質転換した。
【０２２７】
実施例７〜９について、以下の配列番号を開示する：
配列番号３２７は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ｂについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２８は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１＿Ａについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３２９は、Ｔｒｘ＿ＷＴ１について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３０は、ＷＴ１＿Ａについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３１は、ＷＴ１＿Ｂについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３２は、配列番号３２７によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３３は、配列番号３２８によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３４は、配列番号３２９によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３５は、配列番号３３０によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３３６は、配列番号３３１によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【０２２８】
（実施例１０）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現されたＷＴ１の切断された形態）
ＷＴ１の３つのリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
【０２２９】
【化７】
2008154588.tif 000080
【０２３０】
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０２３１】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、ゲル精製し、次いでＥｃｏ７２Ｉ制限酵素およびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓ（インフレームで５’末端にて、Ｈｉｓタグで改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。この構築物が正しいことを、配列分析を通じて確認し、そしてＢＬ２１  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬ２１  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞、またはＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲ  ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ細胞へと形質転換した。
【０２３２】
（実施例１１）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ１  Ｃ（アミノ酸７１〜４３７）およびＷＴ１  Ｄ（アミノ酸９１〜４３７）の発現）
ＷＴ１  Ｃリーディングフレームを、以下のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した：
【０２３３】
【化８】
2008154588.tif 000081
このＰＣＲは、以下の条件下で実施した：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
５０ｎｇ  ＤＮＡ（ｐＰＤＭ  ＦＬ  ＷＴ１）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃２分×４０サイクル
７２℃４分。
【０２３４】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰを用いて同時形質転換（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）されたＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲへと形質転換した。
【０２３５】
（実施例１２）
（重複するオリゴのアニーリングによるＷＴ１  ＴＲ−１の合成的産生）
本実施例を、発現におけるプロリンコドン使用頻度を変化する効果を決定するために実施した。
【０２３６】
以下のオリゴの対をアニーリングした：
【０２３７】
【化９】
2008154588.tif 000082
2008154588.tif 000083
【０２３８】
各々のオリゴの対を、別々に組み合わせ、次いでアニーリングした。次いでこの対を、１つにライゲーションし、そして１μｌのライゲーション混合物を以下のＰＣＲ条件で用いた：
１０μｌ  １０×  Ｐｆｕ緩衝液
１μｌ  １０ｍＭ  ｄＮＴＰ
２μｌ  １０μＭ  各オリゴ
８３μＬ  滅菌水
１．５μｌ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
９６℃２分
９６℃２０秒  ６３℃１５秒  ７２℃３０秒×４０サイクル
７２℃４分。
【０２３９】
このＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、次いでＥｃｏ７２ＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、確認し、次いでＣｏｄｏｎＰｌｕｓ  ＲＰを用いて同時形質転換されたＢＬＲ  ｐＬｙｓ  ＳおよびＢＬＲへと形質転換した。
【０２４０】
実施例１０〜１２について、以下の配列番号を開示する：
配列番号３３７は、ＷＴ１＿Ｔｒ１について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３８は、ＷＴ１＿Ｔｒ２について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３３９は、ＷＴ１＿Ｔｒ３について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４０は、ＷＴ１＿Ｔｒ４について決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４１は、ＷＴ１＿Ｃについて決定したｃＤＮＡ配列である。
配列番号３４２は、配列番号３３７によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４３は、配列番号３３８によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４４は、配列番号３３９によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４５は、配列番号３４０によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
配列番号３４６は、配列番号３４１によってコードされた予測されるアミノ酸配列である。
【０２４１】
このＷＴ１  Ｃ配列は、ＴＲ２、ＴＲ３およびＴＲ４のコード領域を有するポリヌクレオチドを表現する。このＷＴ１  ＴＲ−１合成配列は、そこでプロリンの代替的なコドンがネイティブのコドンに代わり置換され、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＷＴ１  ＴＲ−１を発現し得るポリヌクレオチドを産生した、ポリヌクレオチドを表す。
【０２４２】
（実施例１３）
（マウスにおけるＷＴ１免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果の評価）
本実施例の目的は、ＷＴ１タンパク質免疫の免疫原性および潜在的な全身性の組織病理学的および毒物学的効果を、マウスにおける複数投与の滴定において分析することである。
【０２４３】
ＷＴ１タンパク質を用いたマウスの免疫についての実験の設計を、表Ｌに略説する。
【０２４４】
（表Ｌ）
（マウスにおけるＷＴ１免疫の実験的設計）
【０２４５】
【表５０】
2008154588.tif 000084
雌性Ｃ５７／Ｂ６マウスにおける複数投与滴定の研究（投与量は、ＷＴ１タンパク質、２５μｇ、１００μｇから１０００μｇで変化する）において、ＭＰＬ−ＳＥをアジュバントとして用いたＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種は、強いＷＴ１特異的抗体応答（図１９）および細胞性のＴ細胞応答（図２０）を誘発した。
【０２４６】
ＷＴ１タンパク質を用いた免疫の全身性の組織病理学的および毒物学的効果は、全く観察されなかった。以下の組織において、毒性についての組織学的な証拠は、全く見られなかった：副腎腺、脳、盲腸、結腸、十二指腸、眼、大腿骨および大腿骨骨髄、胆嚢、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉頭、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、食道、卵巣、膵臓、上皮小体、唾液腺、胸骨および胸骨骨髄、脾臓、胃、胸腺、気管、甲状腺、膀胱ならびに子宮。
【０２４７】
潜在的な造血毒性の評価に、特別重きを置いた。胸骨および大腿骨における骨髄／赤血球の比率は、正常であった。全ての評価可能な血液細胞数および血液化学（ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリン）は、通常の範囲内であった（表ＬＩ）。
【０２４８】
ＷＴ１に対して存在する免疫性が、何人かの白血病を有する患者において存在することおよびＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種が、マウスにおいて、正常な組織に対する毒性を有することなくＷＴ１特異的Ａｂ応答および細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得ることが得られ、これらの実験は、腫瘍／白血病ワクチンとしてＷＴ１を確認した。
【０２４９】
（表ＬＩ）
（臨床化学的および血液学的分析）
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５０】
【表５１】
2008154588.tif 000085
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５１】
【表５２】
2008154588.tif 000086
（表ＬＩ：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５２】
【表５３】
2008154588.tif 000087
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５３】
【表５４】
2008154588.tif 000088
2008154588.tif 000089
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５４】
【表５５】
2008154588.tif 000090
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５５】
【表５６】
2008154588.tif 000091
（表ＬＩ（続き）：ＷＴ１投与滴定研究）
（臨床化学分析および血液学的分析）
【０２５６】
【表５７】
2008154588.tif 000092
（略語）
ＷＢＣ：白血球；ＲＢＣ：赤血球；Ｈｇ．：血色素（ヘモグロビン）；ＨＣＴ：ヘマトクリット；ＭＣＶ：平均赤血球容積（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ）；ＭＣＨ：平均赤血球血色素量（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ）；ＭＣＨＣ：平均赤血球血色素濃度（ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）；Ｐｌｔ：血小板；Ａｂｓ：純粋な；Ｂａｓｏ：好塩基球；Ｅｏｓ：好酸球；Ａｂｓ．Ｂａｎｄｓ：未熟好中球；Ｐｏｌｙｓ：多核型細胞；Ｌｙｍｐｈ：リンパ球；Ｍｏｎｏ：単球；ＢＵＮ：血液尿素窒素。
【０２５７】
（実施例１４）
（インビトロでの全遺伝子の初回免疫によるヒトＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の誘発）
本実施例は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が、正常な個体の血液より惹起され得ることを実証する。
【０２５８】
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中での４〜１０日間の増殖によって正常なドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養の後、ＤＣを、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを５回のＭ．Ｏ．Ｉ．で用いて１６時間か、または組換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０回のＭ．Ｏ．Ｉ．で用いて３日間インフェクトした（図２１および２２）。ワクシニアウイルスを、Ｕ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いた陽性選択によって単離し、そして培養物の初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）を、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するようにアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染させた自己の樹状細胞を用いて、７〜１０日間毎に再刺激した。３〜６回の刺激の周期の後、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生するＣＤ８＋株を、同定し得た。これらの株のＷＴ１特異的活性を、さらなる刺激の周期の間、維持し得た。これらの株が、アデノＷＴ１またはワクシニアＷＴ１で感染された自己の樹状細胞を特異的に認識するが、アデノＥＧＦＰまたはワクシニアＥＧＦＰで感染された自己の樹状細胞を認識しないことを、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した（図２３）。
【０２５９】
（実施例１５）
（注射のためのＲＡ１２−ＷＴ１の処方：凍結乾燥した産生物を安定化するための賦形剤の使用）
本実施例は、凍結乾燥したＲａｌ１２−ＷＴ１の完全な可溶化を可能とする処方を記載する。
【０２６０】
以下の処方は、組換えタンパク質Ｒａ１２−ＷＴ１を、「凍結乾燥により乾燥された後に、水性培地に溶解させ得た。
【０２６１】
組換えＲａ１２−ＷＴ１濃度：０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：１０〜２０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ１０．０）；１．０〜５．０ｍＭシステイン；０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ−８０）；糖：１０％トレハロース（Ｔ５２５１、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％マルトース（Ｍ９１７１、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％スクロース（Ｓ７９０３，Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％フルクトース（Ｆ２５４３、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）  １０％グルコース（Ｇ７５２８、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）。
【０２６２】
糖賦形剤と共に凍結乾燥したタンパク質が、その糖賦形剤を伴わないものより十分に多く溶解し得ることを見出した。クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって、この溶解されたこの物質中に残存する固体のサインは示されなかった。
【０２６３】
（実施例１６）
（ＷＴ１タンパク質ワクチンの処方）
本実施例は、ＷＴ１タンパク質および２つの異なるアジュバントの処方物による免疫後のＷＴ１特異的応答の誘導を記載する。
【０２６４】
本実施例に従って、ＭＰＬ−ＳＥと組み合わせたＷＴ１タンパク質は、ＷＴ１に対する、強いＡｂ応答およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）応答を誘導する。以下に詳述されるのは、Ｃ５７／Ｂ６マウスにおいてアジュバントとしてＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎを用いた、ＷＴ１タンパク質免疫後にＷＴ特異的な免疫応答を誘導するために用いる方法である。
【０２６５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＰＬ−ＳＥまたはＥｎｈａｎｚｙｎアジュバントのいずれかを組み合わせた２０μｇのｒＲａ１２−ＷＴ１を用いて免疫した。３回の筋肉内（ＩＭ）免疫を、３週間間隔で与えた。一群のコントロールマウスを、アジュバントを伴わずにｒＲＡｌ１２−ＷＴ１を用いて免疫し、そして一群を、生理食塩水のみを用いて免疫した。脾臓および血清を、最後の免疫後２週間に収集した。血清を、Ｒａ１２−ＷＴ１融合、Ｒａｌ１２またはＷＴ１ＴＲＸでコートしたプレート上で、ＥＬＩＳＡによって、抗体応答について分析した。同様のレベルのＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体滴定量を、Ｒａ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥおよびＲａ１２−ＷＴ＋Ｅｎｈａｎｚｙｎを用いて免疫したマウスにおいて、観察した。アジュバントを伴わずにｒＲａ１２−ＷＴ１を用いて免疫したマウスは、低レベルのＩｇＧ２ａ抗体を示した。
【０２６６】
ＣＤ４応答を、インビトロでｒＲａ１２−ＷＴ１、ｒＲａ１２またはｐ６、ｐ１１７、およびｐ２８７のＷＴ１ペプチドを用いた球状赤血球の刺激後のインターフェロン−γ産生を測定することによって評価した。両方のアジュバントは、ｒＲＡ１２−ＷＴ１を単独で用いて免疫したマウスよりもＣＤ４応答を改善した。さらに、この結果は、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥがｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚｙｎが誘導するよりも強いＣＤ応答を誘導することを示した。ＩＦＮ−γ  ＯＤの読み値は、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋Ｅｎｈａｎｚａｎを用いて免疫したマウスにおいて１〜１．２であるのに対し、ｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥを用いて免疫したマウスにおいては１．４〜１．６で変化する。ペプチド応答は、ｐ１１７に対してのみ観察され、そしてそれはｒＲＡ１２−ＷＴ１＋ＭＰＬ−ＳＥを用いて免疫したマウスにおいてのみであった。陽性コントロール（ＣｏｎＡ）に対する強いＩＦＮ−γ応答を、全てのマウスにおいて観察した。生理食塩水を用いて免疫した陰性コントロールマウスにおいては、ＣｏｎＡに対してのみ応答を、観察し、これはこの応答がｒＲＡ１２−ＷＴ１に特異的であることを示した。
【０２６７】
（実施例１７）
（不規則な突然変異ＷＴ１ライブラリーの構築）
ヒトＷＴ１の核酸配列を、８−ｏｘｏ  ｄＧＴＰおよびｄＰＴＰの存在下でポリメラ−ゼ連鎖反応を用いて、不規則に突然変異させた（ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６；２５５：５８９−６０３）。スプライシングされていない完全なヒトＷＴ１遺伝子を配列番号３８０に開示し、対応するタンパク質配列を配列番号４０４に開示する。ＷＴ１のスプライス改変体を、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして用い、そして配列番号３８１（ＤＮＡ）および配列番号４０８（タンパク質）に開示する。条件を、核酸の変化の頻度が、アミノ酸配列の標的とする変化を導くように（通常はＰＣＲ産物の５〜３０％）、選択した。次いでこの突然変異ＰＣＲ産物を、ヌクレオチドアナログの非存在下で、４つの正常なｄＮＴＰを用いて増幅した。このＰＣＲ産物を、免疫のための哺乳動物の発現ベクターおよびウイルスベクターへとサブクローニングした。従って、このライブラリーは、不規則に突然変異したＷＴ１クローンの混合された集団を含有する。複数のクローンを、選択および配列決定した。この突然変異ＷＴ１改変体ＤＮＡ配列を、配列番号３７７〜３７９に開示し、この改変体の予測されるアミノ酸配列を、配列番号４０５〜４０７に示す。これらの変化した配列（およびライブラリーからの他の配列）を、癌細胞におけるＷＴ１タンパク質に対する強いＴ細胞応答を誘導するための免疫原として用い得る。
【０２６８】
（実施例１８）
（ＷＴ１−ＬＡＭＰ融合物の構築）
３つの部分からなる融合物を、ポリメラーゼ連鎖反応ならびにヒトリソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）配列およびヒトＷＴ１配列スプライス改変体の所望の結合部を含有する合成オリゴヌクレオチドを用いて構築した。これらの融合物に用いたＷＴ１のスプライス改変体およびＬＡＭＰ−１配列を、配列番号３８１および３８３に開示する。詳細には、ＬＡＭＰ−１のシグナルペプチド（ＬＡＭＰの塩基対１〜８７）を、ヒトＷＴ１オープンリーディングフレーム（１，２９０塩基対長）の５’末端に融合し、次いでＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン（ＬＡＭＰの塩基対１１６１〜１２８１）をＷＴ１配列の３’末端に融合した。得られたＷＴ−ＬＡＭＰ構築物の配列を、配列番号３８２（ＤＮＡ）および配列番号４０９（タンパク質）に開示する。この構築物を、それが真核生物細胞中で発現された場合に、シグナルペプチドが、このタンパク質を小胞体（ＥＲ）に指向し、ここで、ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン中の局在化シグナルが、リソソーム位置へのこの融合タンパク質の輸送を指向し、ここで、ペプチドが、クラスＩＩＭＨＣ分子に充填されるように設計した。
【０２６９】
（実施例１９）
（増強されたＭＨＣクラスＩ表現のためのＷＴ１ユビキチン融合物の構築）
ヒトユビキチンオープンリーディングフレーム（配列番号３８４）を、最後のアミノ酸をコードするヌクレオチドがグリシンの代わりにアラニンをコードするように突然変異させた。この突然変異オープンリーディングフレームを、ヒトＷＴ１（配列番号３８１および４０８（各々ＤＮＡおよびタンパク質））スプライス改変体の最初のコドンの直前に、インフレームでクローニングした。Ｇ−＞Ａ突然変異は、翻訳の間に通常ポリユビキチンをプロセシングするプロテアーゼによるなり始めのタンパク質の同時翻訳開裂を除去する。この得られる構築物のＤＮＡ配列および予想されるアミノ酸配列を、各々配列番号３８５および４１０に示す。得られたタンパク質は、ヒト細胞中で発現された場合に、減少された細胞性細胞毒性を示した。ネイティブのＷＴ１を発現する安定株を産生することは、不可能だが、融合タンパク質を発現する細胞株は、容易に得られた。得られたタンパク質が、付加されたユビキチン分子によってプロテオソームの標的とされることが予想される。これが、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるタンパク質のより効率的な認識を生じるのは当然である。
【０２７０】
（実施例２０）
（ヒトＷＴ１発現アデノウイルスベクターの構築）
全長ヒトＷＴ１遺伝子（配列番号３８１）のスプライス改変体を、Ｅ１およびＥ３欠失アデノウイルス血清型５ベクターへとクローニングした。ＷＴ１遺伝子の発現は、高レベルのＷＴ１タンパク質発現を媒介するＣＭＶプロモーターによって制御される。この試薬でのヒト細胞の感染は、高レベルのＷＴ１タンパク質の発現を導く。宿主細胞へと導入され、そして感染に続いて低レベルで産生されたアデノウイルスタンパク質の抗原性の性質は、免疫学的標的としてのＷＴ１の免疫学的監視および免疫学的認識を増加するように作用し得る。このベクターもまた、ヒト被験者に接種された場合、ＷＴ１タンパク質に対する免疫応答を惹起するために用いられ得る。これらの被験者が、ＷＴ１発現腫瘍細胞について陽性である場合、この免疫応答は、疾患の過程において治療的効果または治癒的効果を有し得る。
【０２７１】
（実施例２１）
（ヒトＷＴ１発現ワクシニアウイルスベクターの構築）
全長ヒトＷＴ１遺伝子（配列番号３８１）のスプライス改変体を、ｐＳＣ１１シャトルベクターを用いて、ワクシニアウイルスのＷｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ株のチミジンキナーゼ位置へとクローニングした。ＷＴ１遺伝子は、ワクシニアウイルス感染の過程を通じて遺伝子発現を媒介するハイブリッドワクシニアウイルスプロモーターの制御下にある。この試薬は、インビボまたはインビトロで、ヒト細胞におけるＷＴ１タンパク質を発現するために用いられ得る。ＷＴ１は、いくつかのヒト腫瘍細胞上で過剰発現される自己のタンパク質である。従って、タンパク質として送達されたＷＴ１に対する免疫応答は、主要組織適合性クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）を媒介するＷＴ１の認識を導く傾向にはない。しかし、ワクシニアウイルスベクターによる細胞内部分におけるタンパク質の発現は、高レベルのＭＨＣクラスＩ表現およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＷＴ１タンパク質の認識を可能とし得る。ワクシニアウイルスベクターによるＷＴ１タンパク質発現はまた、ＭＨＣクラスＩＩと関連するＷＴ１ペプチドの表現も導き、従ってＣＤ４＋Ｔ細胞による認識も導き得る。
【０２７２】
本発明の使用は、癌ワクチンとしてのその使用を含む。ＷＴ１陽性腫瘍を保有しているヒト被験者の免疫は、治療的または治癒的な応答を導き得る。細胞内でのＷＴ１の発現は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方によるタンパク質の認識を導き得る。
【０２７３】
（実施例２２）
（細胞全体の初回免疫を用いたＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの産生）  樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｇ  ＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中で４〜６日間増殖することによって正常な患者のＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養後、ＤＣを、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルス（実施例２１に記載）を５回の感染多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（ＭＯＩ）で用いて１６時間か、または組換えＷＴ１発現アデノウイルスを１０回のＭＯＩで用いて３日間、感染した。ワクシニアウイルスをＵ．Ｖ．照射によって不活性化した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、磁気ビーズを用いた陰性除去によって単離し、そして培養物の初回免疫を、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアルスで感染した自己の樹状細胞を用いて、７〜１０日間毎に再刺激した。４〜５回の刺激の周期の後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞株が、自己のＷＴ１発現樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γを特異的に産生することを同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてこれらの株が、ＥＧＦＰ形質導入された線維芽細胞ではなく、ＷＴ１形質導入された自己の線維芽細胞を特異的に認識することをＥｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した。
【０２７４】
ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）遺伝子は、白血病誘発物の一員であり、そしてほとんどのヒト白血病および複数の固形腫瘍において過剰発現される。ヒトに関する以前の研究は、研究されたＡＭＬ患者の１６／６３（２５％）およびＣＭＬ患者の１５／８１（１９％）においてＷＴ１特異的な抗体（Ａｂ）応答の存在を実証した。マウスに関する以前の研究は、ＷＴ１ペプチドに基づくワクチンが、ＷＴ１特異的な、Ａｂ、ＴｈおよびＣＴＬ応答を誘発することを示した。ヒトにおけるワクチンとしてのペプチドの使用は、それらのＨＬＡ制限、およびペプチド特異的応答を誘発しかつ少数の患者においてのみＣＴＬを誘発する傾向によって制限される。全遺伝子免疫の利点は、いくつかのヘルパーおよびＣＴＬエピトープが単一のワクチン中に含まれ、従って特定のＨＬＡ型に対するワクチンを制限し得ないことである。明細書中に開示されるデータは、インビトロでの全遺伝子の初回免疫を用いたＷＴ１特異的免疫応答の誘導、そしてＷＴ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを産生し得たこと、を実証する。ＷＴ１に対して存在する免疫性が、白血病を有する何人かの患者において存在すること、ならびにマウスおよびヒトのＷＴ１が、アミノ酸レベルで９６％同一でありそしてＷＴ１タンパク質、ＷＴ１  ＤＮＡまたはＷＴ１ペプチドに対するワクチン接種が、マウスにおける正常な組織に対する毒性を有すること無くＷＴ１特異的Ａｂ、および細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得ることから、これらインビトロでのヒト初回免疫実験は、腫瘍／白血病ワクチンとしてのＷＴ１のさらなる確認を提供する。さらに、ＷＴ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンを産生する能力は、遺伝子的に操作したＴ細胞を用いた、ＷＴ１過剰発現に関連する悪性疾患の処置を導き得る。
【０２７５】
（実施例２３）
（ＷＴ１の臨床的製造のための組換え構築物）
５つの構築物を、以下に詳述するように、臨床的グレードのＷＴ１の産生のために作製した。
【０２７６】
Ｒａｌ１２／ＷＴ−Ｅ（配列番号３８８（ｃＤＮＡ）および３９１（タンパク質））およびＨｉｓタグを有さないＷＴ−１Ｅ（配列番号３８６（ｃＤＮＡ）および３９５（タンパク質））の設計：
ＷＴ１  Ｅリーディングフレームを、非Ｈｉｓ非融合構築物のための以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２７７】
【化１０】
2008154588.tif 000093
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２μｌの１０μＭ各オリゴ、８３μＬ滅菌水  １．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、５０ｎｇのＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  非Ｈｉｓ）。反応を、最初９６℃で２分間変性し、その後９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間および７２℃で１分４０秒間を４０サイクル続けた。この後７２℃で４分間の最後の伸長を続けた。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し、次いでＮｄｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓ（改変されたｐＥＴ２８ベクター）へとクローニングした。この構築物を、配列分析を通して確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞へと形質転換した。次いでこの構築物−ｐＰＤＭ  ＷＴ−１を、ＮｃｏＩおよびＸｂａｌを用いて消化し、そしてｐＰＤＭ  Ｒａｌ１２  Ｗｔ−１  Ｆ（以下を参照のこと）からのＮｃｏＩおよびＸｂａＩ挿入のためのベクターの基幹部として用いた。この構築物を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬＹｓ  ＳおよびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０２７８】
Ｈｉｓタグを有さないＲａ１２−ＷＴ−１−Ｆ（ａ．ａ．１〜２８１）（配列番号３８９（ｃＤＮＡ）および３９３（タンパク質））の設計：
Ｒａ１２  ＷＴ１リーディングフレームを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２７９】
【化１１】
2008154588.tif 000094
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭのｄＮＴＰ、２μｌ  １０μＭの各オリゴ、８３μＬの滅菌水  １．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、５０ｎｇのＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  Ｈｉｓ非含有）。この反応を、最初９６℃で２分間変性し、その後９６℃で２０秒間、５８℃で１５秒間および７２℃で３分間を４０サイクル続けた。この後７２℃で４分間の最後の伸長を続けた。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩを用いて消化し、そしてＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０２８０】
（Ｈｉｓタグを有さないＲａ１２−ＷＴ−１（配列番号３９０（ｃＤＮＡ）および３９２（タンパク質））の設計：）
Ｒａ１２  ＷＴ−１リーディングフレームを以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２８１】
【化１２】
2008154588.tif 000095
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭのｄＮＴＰ、２μｌ  １０μＭの各オリゴ、８３μＬの滅菌水  １．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、５０ｎｇのＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  Ｈｉｓ非含有）。この反応を、最初９６℃で２分間変性し、その後９６℃で２０秒間、６８℃で１５秒間および７２℃で２分３０秒間の４０サイクルを続けた。この後７２℃で４分間の最後の伸長を続けた。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、次いでＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０２８２】
Ｈｉｓタグを有さないＥ．ｃｏｌｉにおけるＷＴ−１  Ｃ（ａ．ａ．６９〜４３０）の設計（配列番号３８７（ｃＤＮＡ）および３９４（タンパク質））：
ＷＴ−１  Ｃリーディングフレームを、以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
【０２８３】
【化１３】
2008154588.tif 000096
以下のＰＣＲサイクル条件を用いた：１０μｌの１０×Ｐｆｕ緩衝液、１μｌ  １０ｍＭのｄＮＴＰ、２μｌ  １０μＭの各オリゴ、８３μＬの滅菌水  １．５μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、５０ｎｇのＤＮＡ（ｐＰＤＭＲａ１２  ＷＴ−１  Ｈｉｓ非含有）。反応を、最初９６℃で２分間変性し、その後９６℃で２０秒間、６２℃で１５秒間および７２℃で２分間の４０サイクルを続けた。この後７２℃で４分間の最後の伸長を続けた。このＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩを用いて消化し、次いでＮｄｅＩおよびＥｃｏ７２Ｉで消化されているｐＰＤＭ  Ｈｉｓへとクローニングした。この配列を、配列分析を通じて確認し、次いでＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｓ細胞およびＨＭＳ  １７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞へと形質転換した。タンパク質発現を、クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＮ末端タンパク質配列分析によって確認した。
【０２８４】
（実施例２４）
（遺伝子全体の初回免疫を用いたＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンの産生およびＨＬＡ−Ａ２制限ＷＴ１エピトープの同定）
本実施例において、アデノ送達ビヒクルおよびワクシニアウイルス送達ビヒクルを、ＷＴ１特異的Ｔ細胞株を産生するために用いた。この株由来のＴ細胞クローンが、ＷＴ１特異的であることを示し、そしてさらにこのクローンによって認識されるエピトープを同定した。
【０２８５】
樹状細胞（ＤＣ）を、１０％のヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中での４〜６日間の増殖によって、正常なドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物より分化した。培養の後、ＤＣを、５回の感染多重度（ＭＯＩ）で、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを用いて１６時間か、または３〜１０回のＭＯＩで、組換えＷＴ１発現アデノウイルスを用いて２〜３日間で感染させた。ワクシニアウイルスを、ＵＶ照射によって不活性化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９およびＣＤ５６＋細胞に対する抗体を用いる陰性欠失によって、およびその後の、これらのＡｂのＦｃ部位に特異的な磁性ビーズによって単離した。
【０２８６】
培養物の初回免疫を、９６ウェルプレートにおいて開始した。培養物を、ＷＴ１を発現するように操作されたアデノウイルスまたはワクシニアウイルスでインフェクトした自己の樹状細胞を用いて、７〜１４日間毎に再刺激した。４〜５回の周期の刺激の後、自己のＷＴ１発現する、樹状細胞または線維芽細胞を用いて刺激された場合にインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を特異的に産生するＣＤ８＋株を、同定し得た。これらの株をクローニングし、そしてＷＴ１形質導入した自己の線維芽細胞を特異的に認識するが、コントロール形質導入した樹状細胞を制御しないことを、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって実証した。
【０２８７】
これらのＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンのＨＬＡ制限をさらに分析するために、Ｔ細胞クローンが樹立されるドナー（Ｄ３４９）とＨＬＡ−Ａ２対立遺伝子のみを共有する、さらなるドナー（Ｄ４７５）由来の線維芽細胞を、ＷＴ１を用いて形質導入した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞クローンによるこれらＤ４７５標的細胞の認識を実証した。ＨＬＡ  Ａ２制限をさらに実証し、そしてこのエピトープが、（悪性形質転換の一部として）ＷＴ１を「天然で」過剰発現する腫瘍細胞によって発現されることを実証するために、白血病細胞株Ｋ５６２を、試験した。Ｋ５６２を、ＨＬＡ  Ａ２分子を用いて形質導入し、そしてＨＬＡ−Ａ２陰性Ｋ５６２細胞を、非特異的ＩＦＮ−γの放出についてのコントロールとして用いた。ＥＬＩＳＰＯＴ分析は、Ｔ細胞がＡ２陽性Ｋ５６２細胞株を認識するが、Ａ２陰性Ｋ５６２細胞を認識しないことを実証した。この認識の特異性およびＨＬＡ−Ａ２制限のさらなる証拠を、ＨＬＡ−Ａ２抗体ブロッキング実験によって実証した。
【０２８８】
さらにＷＴ１エピトープを規定する為に、４つの切断したＷＴ１レトロウイルス構築物を、産生した。次いで、ドナー４７５線維芽細胞を、これらの構築物を用いて、形質導入した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、ＷＴ１  Ｔｒ１構築物（ａａ２〜ａａ９２）を用いて形質導入されたＤ４７５線維芽細胞の認識を実証し、従って、ＷＴ１エピトープが、ＷＴ１タンパク質の最初の９１Ｎ末端アミノ酸中に配置されていることを実証した。エピトープのマップを詳細にするために、１１アミノ酸が重複する、ＷＴ１タンパク質の１５マーペプチドを、合成した。ＷＴ１特異的Ｔ細胞クローンは、２つの重複する１５マーペプチド（ペプチド９（ＱＷＡＰＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡ）（配列番号４１２）およびペプチド１０（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳＡＹＧＳＬ）（配列番号４１３））を認識した。認識される最小限のエピトープをさらに特徴づけるために、これらの１５マーペプチドのうち共有される９マーおよび１０マーペプチド（合計５種）を、このクローンの特異性を分析するために用いた。このクローンは、９マー（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡ（配列番号２４１）、および１０マー（ＶＬＤＦＡＰＰＧＡＳ（配列番号４１１））を特異的に認識した。
【０２８９】
（実施例２５）
（ＷＴ１に特異的なＣＤ８  Ｔ細胞由来の、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のクローニングおよび配列決定）
ＷＴ１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞クローン由来のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のα鎖およびβ鎖をクローニングする。配列分析を、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖のファミリーの起源を実証する為に実施する。さらに、独特の多様性および結合セグメント（これは応答の特異性に寄与する）を同定する。
【０２９０】
ＷＴ１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞クローンからの２×１０６細胞からの総ｍＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて単離し、そしてｃＤＮＡをＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｇｏキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて合成した。クローン中のＶαおよびＶβ配列を決定するために、ＶαおよびＶβサブタイプ特異的プライマーのパネルを（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡによって産生されたプライマー配列に基づいて）合成し、そして各々のクローンから産生されたｃＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応に用いる。このＲＴ−ＰＣＲ反応によって、各々のクローンによってＶβ配列およびＶα配列のどちらが発現されるかが実証される。
【０２９１】
クローンから全長ＴＣＲαおよび全長ＴＣＲβ鎖をクローニングするために、開始因子および終末因子をコードするＴＣＲヌクレオチドをつなぐプライマーを設計する。標準的な３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応を、ＣＴＬクローンから合成されたｃＤＮＡおよび上記のプライマーを用い、プルーフリーディング熱安定性ポリメラーゼＰＷＯ（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて確立する。この生じた特異的バンド（αについては約８５０ｂｐそしてβについては約９５０ｂｐ）を、ＰＣＲ平滑ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）へとライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉへと形質転換した。全長のα鎖および全長β鎖を含むプラスミドで形質転換したＥ．ｃｏｌｉを同定し、対応するプラスミドの大規模調製をおこなった。次いで全長のＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含むプラスミドを、標準的な方法を用いて配列決定した。このようにして、ＴＣＲの特異性に寄与する多様性結合（ＤＪ）領域を決定した。
【０２９２】
前述から、本発明の特定の実施形態は、例示の目的のために本明細書中に記載されたが、種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、なされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除き、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０２９３】
【図１】図１は、マウス（ＭＯ）およびヒト（ＨＵ）のＷＴ１タンパク質配列（それぞれ配列番号３２０および３１９）の比較を示す。
【図２】図２は、血液学的な悪性疾患（ＡＭＬ）を有する患者におけるＷＴ１特異的抗体の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１は、分子量マーカーを示す；レーン２は、陽性コントロール（ＷＴ１特異的抗体を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性ヒト白血病細胞株）を示す；レーン３は、陰性コントロール（マウス血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株）を示す；そしてレーン４は、ＡＭＬを有する患者の血清を用いて免疫沈降されたＷＴ１陽性細胞株を示す。レーン２〜４に関して、免疫沈降は、ゲル電気泳動によって分離し、そしてＷＴ１特異的抗体によってプローブされた。
【図３】図３は、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＷＴ１陽性腫瘍細胞株）を用いて免疫されたＢ６マウスにおけるＷＴ１特異的抗体応答の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、そしてレーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチド、ウェスタンブロット上で５２ｋＤに移動する）を示す。用いた一次抗体は、レーン２においてはＷＴ１８０であり、レーン４においては免疫していないＢ６マウスの血清であり、そしてレーン６においては免疫したＢ６マウスの血清である。
【図４】図４は、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるＷＴ１特異的抗体の検出を示すウェスタンブロットである。レーン１、３および５は、分子量マーカーを示し、そしてレーン２、４および６は、ＷＴ１特異的陽性コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０アミノ酸におよぶポリペプチド、ウェスタンブロット上で５２ｋＤに移動する）を示す。用いた一次抗体は、レーン２においてはＷＴ１８０であり、レーン４においては免疫していないＢ６マウスの血清であり、そしてレーン６においては免疫したＢ６マウスの血清である。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を示すグラフである。チミジン取り込みアッセイを、表示されたように一つのＴ細胞株および二つの異なるクローンを用いて実施し、そして結果を、ｃｐｍとして表現した。Ｘ軸上に示されるコントロールは、抗原なし（Ａｇなし）およびＢ６／培地であり；用いられた抗原はヒトのｐ６〜２２（ｐ１）、ヒトのｐ１１７−１３９（ｐ２）またはヒトのｐ２４４−２６２（ｐ３）であった。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の刺激を図示するヒストグラムである。三回目の免疫の三週間後に、ワクチンＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、ペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワクチンＡ；図６Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図６Ｂ）でパルスしたＢ６脾臓細胞、および２５μｇ／ｍｌの無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスした脾臓細胞とともに培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均値によって除算した実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性Ｔ細胞株およびクローンの産生を図示したヒストグラムである。インビボの免疫に続いて、最初の３回のインビトロでの刺激（ＩＶＳ）を、それぞれワクチンＡまたはＢの３つのペプチドすべてを用いて実施した。引き続くＩＶＳを、二つの関連したペプチドｐ１１７−１３９およびｐ６−２２のみを用いた単一ペプチド刺激として実施した。クローンを、示されるようにｐ６−２２特異的Ｔ細胞株およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方から誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）または無関係のコントロールペプチド（無関係のペプチド）でパルスしたＢ６脾臓細胞と共に培養し、そして（３Ｈ）チミジン取り込みによって９６時間後に増殖についてアッセイした。棒は、コントロール（抗原なしの、Ｂ６脾臓細胞）の平均値によって除算された実験ウェルの平均値として計算された刺激指数（ＳＩ）を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトＷＴ１（配列番号３１９）のＴＳＩＴＥＳ分析の結果を示す。「Ａ」と示された領域は、ブロックのＡＭＰＨＩ中間点であり、「Ｒ」は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／Ｔａｙｌｏｒモチーフと一致する残基を示し、「Ｄ」は、ＩＡｄモチーフと一致する残基を示し、そして「ｄ」は、ＩＥｄモチーフと一致する残基を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドについてヒトＷＴ１（配列番号３１９）のＴＳＩＴＥＳ分析の結果を示す。「Ａ」と示された領域は、ブロックのＡＭＰＨＩ中間点であり、「Ｒ」は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ／Ｔａｙｌｏｒモチーフと一致する残基を示し、「Ｄ」は、ＩＡｄモチーフと一致する残基を示し、そして「ｄ」は、ＩＥｄモチーフと一致する残基を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＷＴ１ペプチドを用いて免疫されたマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を示すグラフである。図９Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を示し、そして図９Ｂは、ペプチドでコートされた細胞株の溶解を示す。各々の場合において、％溶解（標準的クロム放出アッセイによって決定されるような）は、３つの示したエフェクター：標的比で示される。結果は、リンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）ならびにＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について提供される。Ｅ１０細胞はまた、本明細書中でＥＬ−４細胞とも呼ばれる。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種後に、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を示すグラフである。図１０Ａは、免疫しないＢ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷しないことを示す。各々の場合において、％溶解（標準的クロム放出アッセイによって決定されたような）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｂは、同種異系細胞株による標的細胞の溶解を図示する。各々の場合において、％溶解（標準的クロム放出アッセイによって決定されたような）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、異なる二つの実験におけるＷＴ１陰性細胞株と比べたＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図１０Ｃは、ペプチドにコートされた細胞株（関連したＷＴ１ペプチドＰ１１７によってコートされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各々の場合において、％溶解（標準的クロム放出アッセイによって決定されたような）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７を用いたＢ６マウスのワクチン接種に引き続き、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株を殺傷するがＷＴ１陰性細胞株を殺傷しないＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬの誘発を図示するグラフである。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、異なる二つの実験におけるＷＴ１陰性細胞株と比べたＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図１０Ｄは、ペプチドにコートされた細胞株（関連したＷＴ１ペプチドＰ１１７によってコートされたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各々の場合において、％溶解（標準的クロム放出アッセイによって決定されたような）は、三つの示したエフェクター：標的の比において示される。結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換された繊維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）ならびにＥ１０＋Ｐ１１７について提供される。
【図１１Ａ】図１１Ａは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬがＷＴ１陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示したヒストグラムである。３回目の免疫の３週間後に、ペプチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドならびにＷＴ１陽性および陰性の腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１１Ａは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；関連する（免疫ならびに再刺激のために用いた）ペプチドｐ２３５−２４３でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ２３５）；無関連のペプチドｐ１１７−１３９をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）またはｐ１３０−１３８をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１３０）ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）に対する、ｐ２３５−２４３特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬがＷＴ１陽性腫瘍細胞を溶解する能力を示したヒストグラムである。３回目の免疫の３週間後に、ペプチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を、関連するペプチドを用いてインビトロにおいて刺激し、そしてＷＴ１ペプチドならびにＷＴ１陽性および陰性の腫瘍細胞と共にインキュベートされた標的を溶解する能力について試験した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１１Ｂは、示されるように、ＥＬ−４；関連するペプチドＰ１１７−１３９をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１１７）および無関連のペプチドｐ１２３−１３１をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、またはｐ１２８−１３６をパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ１２８）；ＢＬＫ−ＳＶ４０およびＴＲＡＭＰ−Ｃに対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、非放射性標的阻害によって実証されたような、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１２Ａは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）；５１Ｃｒ標識なしの関連するペプチドｐ１１７−１３９を適用した（放射性標的と比べて）１０倍過剰のＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋ｐ１１７非放射性標的）および５１Ｃｒ標識なしの無関連のペプチドをパルスしたＥＬ−４細胞とともにインキュベートされたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋無関係の非放射性標的）に対するｐ１１７〜１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、非放射性標的阻害によって実証されたような、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の溶解の特異性を示すヒストグラムである。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１２Ｂは、示されるように、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）；関連する非放射性標的とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋ｐ１１７非放射性標的）および無関連の非放射性標的とともにインキュベートされたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋無関係の非放射性標的）に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、アミノ酸１１７〜１３９内に適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１３Ａは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）およびペプチドｐ１１７−１３９をパルスしたｓＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ペプチドｐ１１９−１２７をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１９）、ペプチドｐ１２０−１２８をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ペプチドｐ１２３−１３１をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２３）、ペプチドｐ１２６−１３４をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ペプチドｐ１２８−１３６をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびペプチドｐ１３０−１３８をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１３０）に対するｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害性活性を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、アミノ酸１１７−１３９内に適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１３Ｂは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４をパルスしたＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１２６）およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対してｐ１２６−１３４を用いた再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害性の活性を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ｐ１１７−１３９内の９マーのＣＴＬエピトープの評価を示すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株を、アミノ酸１１７−１３９内に適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは欠如するペプチドに対して試験し、続いてｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８を用いて再刺激した。棒は、２５：１のＥ：Ｔ比で三連で実施されたクロム放出アッセイにおける平均％比溶解を示す。図１３Ｃは、ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９を適用したＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８を適用したＥＬ−４細胞（ＥＬ−４＋ｐ１３０）およびＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対するｐ１３０−１３８を用いた再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害性活性を示す。
【図１４】図１４は、ＡＭＬを有する６３人の患者における、ＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１/Ｎ末端タンパク質に対する血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。第１のレーンおよび第１および第２のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。第１のレーンおよび第１および第２のレーンは、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールを表す。市販されているＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールについて使用した。次の６３レーンは、患者個体由来の血清を使用した結果を表す。示されたＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡによった。この図は、３つの別個の実験からの累積データを含む。
【図１５】図１５は、ＡＭＬを有する２人の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｎ−末端、ＴＲＸタンパク質およびＲａ１２タンパク質に対する、血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する２人の患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。示されたＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡによった。ＡＭＬ−１およびＡＭＬ−２は、ＷＴ／全長に対する実証された抗体反応性を有する、図１における患者個体のうちの２人に由来する血清を示す。このＷＴ１全長タンパク質は、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。このＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。このコントロールＲａ１２タンパク質およびＴＲＸタンパク質は、類似の様式で精製される。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性は、このタンパク質のＷＴ１部分に指向されることが確認される。
【図１６】図１６は、ＣＭＬを有する８１人の患者におけるＷＴ１に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長タンパク質に対する血清抗体の反応性は、ＡＭＬを有する患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。この第１のレーンおよび第２のレーンは、それぞれ陽性コントロールおよび陰性コントロールを示す。市販されるＷＴ１特異的抗体ＷＴ１８０を陽性コントロールのために使用した。次の８１のレーンは、患者個体各々に由来する血清を使用した結果を表す。示されるＯＤ値は、１：５００の血清希釈を使用するＥＬＩＳＡによった。この図は、３つの別個の実験からの累積データを含む。
【図１７】図１７は、ＣＭＬを有する２人の患者におけるＷＴ１タンパク質およびコントロールタンパク質に対する血清抗体反応性を示す。ＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末端タンパク質、ＴＲＸタンパク質およびＲａ１２タンパク質に対する血清抗体反応性は、ＣＭＬを有する２人の患者においてＥＬＩＳＡによって評価された。示されたＯＤ値は、１：５００で血清希釈を使用するＥＬＩＳＡによった。ＣＭＬ−１およびＣＭＬ−２は、ＷＴ１／全長に対する実証された抗体反応性を有する図３における患者個体のうちの２人の血清を示す。このＷＴ１／Ｎ末端タンパク質は、Ｒａ１２との融合タンパク質として発現された。このＷＴ１／全長タンパク質は、ＴＲＸとの融合タンパク質として発現された。このコントロールのＲａ１２タンパク質およびＴＲＸタンパク質を類似の様式において精製した。この結果によって、ＷＴ１融合タンパク質に対する血清抗体反応性がこのタンパク質ＷＴ１部分に対して指向されることが確認される。
【図１８】図１８は、血清学的分析に使用される組換えＷＴ１タンパク質の特徴を提供する。
【図１９Ａ】図１９Ａは、異なった用量のＷＴタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、異なった用量のＷＴタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、異なった用量のＷＴタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｄ】図１９Ｄは、異なった用量のＷＴタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図１９Ｅ】図１９Ｅは、異なった用量のＷＴタンパク質でワクチン接種をすることによって誘発されたマウスにおける抗体応答を示す棒グラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、ＷＴ１タンパク質で免疫されたマウスにおける増殖性Ｔ細胞応答の棒グラフである。
【図２１】図２１は、蛍光顕微鏡によって検査されたヒトＤＣの写真であり、このヒトＤＣは、アデノＷＴ１感染およびワクシニア感染の後にＷＴ１を発現する。
【図２２】図２２は、ヒトＤＣにおけるＷＴ１発現が、アデノＷＴ１感染の後に再現可能であり、かつこのコントロールアデノ感染によって誘導されないことを実証する写真である。
【図２３】図２３は、ＷＴ１全遺伝子のインビトロでの初回免疫によって、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が誘発されることを示す、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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