(57)【要約】【課題】ゲノムDNAの特定の遺伝子の増幅において、ゲノムDNAに大量に存在する余分な塩基配列の影響を低下させて、効率よく増幅させることを可能とする試薬を提供すること。【解決手段】ゲノムＤＮＡのＡｌｕ配列を断片化する複数の制限酵素からなるキットであって、複数の制限酵素の各々は、Ａｌｕ配列を切断するものであり、且つゲノムＤＮＡの塩基配列中に５塩基から７塩基の認識部位を有し、且つ複数の制限酵素によるＡｌｕ配列の切断部位は、互いに異なっており、更に、複数の制限酵素は、協働してＡｌｕ配列を１５０ｂｐ以下に断片化することを特徴とする制限酵素のキット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡのＡｌｕ配列を断片化する複数の制限酵素からなるキットであって、
該複数の制限酵素の各々は、該Ａｌｕ配列を互いに異なる切断部位で切断し、且つ認識部位として５乃至７塩基の塩基配列を認識するものであり、
該複数の制限酵素は、協働して該Ａｌｕ配列を１５０ｂｐ以下に断片化することを特徴とする制限酵素のキット。
【請求項２】
前記複数の制限酵素は、ゲノムＤＮＡのＡｌｕ配列以外の部位において、少なくとも６５０ｂｐ以上の長さの切断断片を生じさせる請求項１に記載の制限酵素キット。
【請求項３】
前記複数の制限酵素は、協働して該Ａｌｕ配列を１３５ｂｐ以下に断片化するものである請求項１または２に記載の制限酵素のキット。
【請求項４】
前記複数の制限酵素は、協働して該Ａｌｕ配列を１２０ｂｐ以下に断片化するものである請求項１または２に記載の制限酵素のキット。
【請求項５】
前記複数の制限酵素の組み合わせが、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｔｓＩ及びＨｐｈＩである請求項１乃至３の何れかに記載の制限酵素キット。
【請求項６】
（ｉ）請求項１乃至５の何れかに記載の制限酵素キットを用いてゲノムＤＮＡを断片化する工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた核酸断片のうち、標的塩基配列を含む核酸断片を増幅する工程と、
を有することを特徴とする標的塩基配列の増幅方法。
【請求項７】
前記工程（ｉｉ）が、ランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素を用いて増幅反応を行う工程を含む請求項６に記載の増幅方法。
【請求項８】
該ランダムプライマーが６ｍｅｒ以上８ｍｅｒ以下の塩基長を有している請求項７に記載の増幅方法。
【請求項９】
前記工程（ｉｉ）が、該標的塩基配列を有する核酸断片を標識する工程を含む請求項６乃至８の何れかに記載の増幅方法。
【請求項１０】
（ａ）請求項１乃至５の何れかに記載の制限酵素キットを用いてゲノムＤＮＡを断片化する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた核酸断片のうち、標的塩基配列を含む核酸断片を、Ａｌｕ配列由来の核酸断片の共存下でランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素により増幅する工程と、
（ｃ）前記工程（ｂ）によって得られた増幅産物を、該標的塩基配列に特異的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いて検出する工程と、
を有することを特徴とするヒトゲノムＤＮＡ中の標的塩基配列の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的核酸の増幅効率を向上させることのできる制限酵素キット、それを用いた標的核酸の増幅方法並びに検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的核酸の有無についてＤＮＡチップなどを用いて特異的に検出する際に、予め当該標的核酸の増幅を行うことは検出精度の向上に有効である。
【０００３】
特許文献１にはアレイ解析のための標的核酸の処理方法が開示されている。この処理方法では、ヒトゲノムＤＮＡに代表される長い核酸の核酸断片を作製し、増幅対象となる領域を有している核酸断片と、当該領域を有していない核酸断片とを分離した上で、当該増幅対象領域を有している核酸断片のみを増幅する。当該断片化の方法として、特許文献１の段落番号［００２７］には、制限酵素を用いた断片化が記載されている。それにはゲノムＤＮＡを試料源として使用する場合、制限酵素の特定の組み合わせにより、増幅に適した長さのゲノムＤＮＡ断片の割合が高くなり得るので、制限酵素の組み合わせを使用することが好ましいことが開示されている。そして段落番号［００７８］には、具体的な制限酵素の組み合わせとして、「ＥｃｏＲＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＨｐａＩＩ、Ｃｓｐ６ＡＩ、ＭｓｅＩ及びＢｆａＩ」が開示されている。
【特許文献１】特開２００２−３３０７８３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、ヒトゲノムＤＮＡの標的核酸の増幅のために、特許文献１に開示の増幅方法を用いることを検討した。その結果、増幅対象領域を有している核酸断片を、当該領域を有していない核酸断片から分離する工程は、ヒトゲノムＤＮＡ中の標的核酸について迅速な増幅を行う上で律速となるとの知見を得た。
【０００５】
そこで、本発明者は、ヒトゲノムＤＮＡの断片化の後、標的核酸配列を有する核酸断片を、当該標的核酸配列部分を有しない核酸断片から分離することなしに当該標的核酸を効率的に増幅できる方法を得るべく検討を重ねた。当該検討の過程において、本発明者は、霊長類のゲノムＤＮＡ中に繰り返し表れる非特異的な塩基配列からなるＡｌｕ配列に着目した。即ち、特異的検出に必要な標的核酸配列を維持しつつ、Ａｌｕ配列を後のランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素を用いた増幅反応によっても増幅されない程度にまで細かく断片化する。そのように処理することで、標的核酸配列を有しない核酸断片を分離除去することなく標的核酸配列を効率的に増幅できるとの着想を得た。
【０００６】
このような着想に基づき、本発明者は、ランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素を用いた増幅反応において、標的核酸の増幅には影響を与えることなしに、Ａｌｕ配列を増幅されない程度にまで断片化する手段として、制限酵素を用いる実験をおこなった。そして、Ａｌｕ配列を切断する制限酵素のうち、認識部位として５〜７塩基の塩基配列を認識する制限酵素を複数組み合わせて、当該組み合わせを用いてゲノムＤＮＡの処理を行った。その結果、標的核酸の過度の断片化を抑えつつ、Ａｌｕ配列を後のランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素を用いた増幅反応によっても増幅が抑えられるように十分に断片化できることを見出した。
【０００７】
本願発明の目的は、ヒトゲノムＤＮＡ中の標的核酸を効率的に増幅させる為の、事前の当該ヒトゲノムＤＮＡの断片化に適した制限酵素キットを提供することにある。
【０００８】
また本願発明の他の目的は、ヒトゲノムＤＮＡの断片化の後、標的核酸配列を有する核酸断片を、当該標的核酸配列部分を有しない核酸断片から分離することなしに当該標的核酸を効率的に増幅できる方法を提供することにある。
【０００９】
更に本願発明の他の目的は、ヒトゲノムＤＮＡ中の標的核酸の高精度な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、ゲノムＤＮＡのＡｌｕ配列を断片化する複数の制限酵素からなるキットであって、該複数の制限酵素の各々は、該Ａｌｕ配列を互いに異なる切断部位で切断し、且つ認識部位として５乃至７塩基の塩基配列を認識するものであり、該複数の制限酵素は、協働して該Ａｌｕ配列を１５０ｂｐ以下に断片化することを特徴とする制限酵素のキットが提供される。
【００１１】
また本発明によれば、（ｉ）上記の制限酵素キットを用いてゲノムＤＮＡを断片化する工程と、（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた核酸断片のうち、標的塩基配列を含む核酸断片を増幅する工程と、を有することを特徴とする標的塩基配列の増幅方法が提供される。
【００１２】
また本発明によれば、（ａ）上記の制限酵素キットを用いてゲノムＤＮＡを断片化する工程と、（ｂ）上記工程（ａ）で得られた核酸断片のうち、標的塩基配列を含む核酸断片を、Ａｌｕ配列由来の核酸断片の共存下でランダムプライマーとＤＮＡ合成酵素により増幅する工程と、
（ｃ）上記工程（ｂ）によって得られた増幅産物を、該標的塩基配列に特異的な塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いて検出する工程と、を有することを特徴とするヒトゲノムＤＮＡ中の標的核酸の検出方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
（Ｉ）用語の定義
「ゲノム」とは、ある生物のＤＮＡにコードされていて、その生物が有する遺伝情報全体を意味する。例えばヒトゲノムとは、２２対の常染色体と性染色体のＸＸまたはＸＹに含まれる遺伝情報全体を指す。
【００１５】
「標的核酸」とは、ヒトゲノム中に含まれている多数の遺伝子領域の中で、特に検出対象とする遺伝子領域を意味する。例えば表１と表２における、ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor;上皮成長因子受容体）遺伝子領域やＰＴＥＮ(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10）遺伝子領域がこれに相当する。
【００１６】
「反復配列」とはゲノムにおいて、ある一定の長さの塩基配列を単位として繰り返し登場する配列のことを意味する。遺伝子をコードする領域は全領域中の１０％以下と言われており、残りの９０％以上については現在研究が進められている。その９０％の中に反復配列が存在する。反復単位が３００ｂｐ程度と短い場合はＳＩＮＥ（Short Interspersed Repetitive Element；短い散在反復配列）と分類される。一方、約４〜７ｋｂと長い場合にはＬＩＮＥ（long interspersed repetitive element；長い散在反復配列）と分類され、いずれもゲノム中に散在している。反復配列はヒトゲノムの約５０％を占めると言われているが、その機能はまだ不明である。
【００１７】
「Ａｌｕ配列」とは、ＳＩＮＥの一種であり、ヒト等の霊長類のゲノムＤＮＡにその存在が確認されている、３００ｂｐ程度の短い塩基配列の単位を指す。１００万以上ものコピーが存在し、ヒトゲノムの１０％以上を占めていると言われている。Ａｌｕ配列には複数の単位配列が存在するが、標的核酸によって有するＡｌｕ配列の種類が異なっている。本キットの制限酵素の組み合わせることで、所望の単位配列を断片化することができる。
【００１８】
「コピー数」とは、ゲノム中に含まれる標的核酸領域の個数を意味する。例えばＥＧＦＲを標的核酸とした場合、正常細胞のゲノムにおけるＥＧＦＲ領域の個数、つまりコピー数は１である。しかし癌などの疾患ではこのＥＧＦＲ領域が増加し、多い場合はゲノム中に数十個にまでなる場合もある。正常細胞中のコピー数に対して、癌細胞中のコピー数を比較し、その値をコピー数の比と呼ぶ。
【００１９】
「プローブ」という用語は一本鎖型のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、特定の限定がない限り、自然界に存在するヌクレオチドと同様に機能する天然ヌクレオチドの類似物を包含する。核酸は液相、固相合成などを含む様々な供給源に由来しうるが、これらに限定されるものではない。また、ヒトゲノムＤＮＡの全体、または一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされたものを指し、特に指定がない限り長さは制限されない。
【００２０】
（ＩＩ）技術的説明
本発明は、霊長類のゲノムＤＮＡ中の標的塩基配列部分を効率的に増幅するための前処理としての断片化工程に好適に用い得る、Ａｌｕ配列を断片化する制限酵素キットを提供する。さらに、当該制限酵素キットを用いて断片化されたゲノムＤＮＡを増幅する方法、および、増幅したゲノムＤＮＡをプローブで検出する方法を提供する。
【００２１】
以下本発明について詳細に説明する。
＜制限酵素＞
Ａｌｕ配列を切断する制限酵素は、認識部位として５塩基以上７塩基以下の塩基配列を認識するものが好ましい。認識部位が４塩基以下の場合、当該ゲノムＤＮＡ中の特異的塩基配列が過度に断片化されてしまう可能性がある。特に、断片化工程の後に行う増幅工程においてランダムプライマーを用いる場合、当該ランダムプライマーには６塩基から８塩基の長さのものが一般的に用いられる。６塩基長のプライマーの場合、理論的に４の６乗（＝４０９６）通りの配列が存在する。４０９６種類の配列から、例えば４種類の配列、ＧＣＡＴＧＣ、ＧＡＴＣＡＴ、ＴＡＣＧＧＡ、ＡＡＴＣＧＡ、ＡＴＧＡＴＴを選択し、これら４種類のプライマーミックスを増幅に用いて良い。また４種類に限らず、４０９６種類の中から任意の種類のプライマーをミックスし、増幅用プライマーミックスとして用いて良い。７塩基長の場合は１６３８４通り、８塩基長の場合は６５５３６通りの配列が存在するが、６塩基長の場合と同様に任意の種類のプライマーをミックスし、増幅用プライマーミックスとして用いて良い。ただし塩基長の異なるプライマーはミックスせず、増幅用プライマーミックスは同一の塩基長のプライマーで統一するものとする。制限酵素が認識部位として４塩基以下の塩基配列を認識するものである場合、切断断片がかなり短くなる。その場合切断断片の配列中に当該ランダムプライマーと相補的な配列が存在する確率は低くなり、結果として増幅が困難となる可能性がある。また、ランダムプライマーを用いない場合であっても、標的核酸の特異的増幅のためのプライマー設計の自由度が大幅に損なわれてしまう。
【００２２】
一方、認識部位が８塩基以上である制限酵素は、Ａｌｕ配列を切断する能力を有しないものが多く、本願発明において用いる実益が殆どない。
【００２３】
そして上記したように、Ａｌｕ配列を切断し、且つＤＮＡ配列の認識部位が５塩基以上７塩基以下である制限酵素の例には、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｅＹＩ、ＢｔｓＩ及びＨｐｈＩを含む。これらのＤＮＡの塩基配列の認識部位は、以下の通りである。
ＢｐｍＩ：ＣＴＧＧＡＧ（６塩基）
Ｂｐｕ１０Ｉ：ＣＣＴＮＡＧＣ（７塩基）
ＢｓｅＹＩ：ＧＣＴＧＧＧ（６塩基）
ＢｔｓＩ：ＧＣＡＧＴＧ（６塩基）
ＨｐｈＩ：ＧＧＴＧＡ（５塩基）
＜制限酵素の組み合わせ＞
ゲノムＤＮＡ中の標的核酸の過度の断片化を抑えつつ、後の増幅工程によってもＡｌｕ配列の増幅が抑制されるようにＡｌｕ配列を十分に断片化するためには、上記の制限酵素を１種用いただけでは困難である。そこで、制限酵素の切断部位が異なる複数の制限酵素を組み合わせることが必要である。そして、当該組み合わせとしては、当該組み合わせに係る制限酵素群によって、Ａｌｕ配列をプライマーを用いて増幅されない程度に短い断片に切断する組合せであって、好ましくは１５０ｂｐ以下、より好ましくは約１３５ｂｐ以下、さらに好ましくは１２０ｂｐ以下に切断する組合せを選択する。加えて、ゲノムＤＮＡのＡｌｕ配列以外の部位において６５０塩基以上の長さの核酸断片が生成するように制限酵素を組み合わせることが好ましい。
【００２４】
Ａｌｕ配列を１５０塩基以下に切断することにより、ランダムプライマーによるＡｌｕ配列部分が増幅される可能性を低減させることができる。また、ランダムプライマーを用いず、標的核酸が特異的に増幅されるようなプライマーを設計して用いる場合においても、プライマーの設計の自由度を向上させることができる。
【００２５】
更に、Ａｌｕ配列以外の部位において６５０塩基以上の長さの核酸断片を生じさせることで、後の増幅工程により標的核酸を増幅させることができる。
【００２６】
以下に、前記制限酵素及びそれらの組み合わせを用いてヒトゲノムＤＮＡの一部を断片化処理した例を表１と表２−１、表２−２に示す。表１には、ＥＧＦＲを標的核酸として制限酵素の各組み合わせを用いて切断した場合の、６５０ｂｐ以上の切断断片の個数が示されている。また、制限酵素を組み合わせてＡｌｕ配列を切断した場合の、各切断断片長も併せて示されている。同様に、表２−１、２−２にはＰＴＥＮを標的核酸とした場合の断片長などが示されている。標的核酸に含まれるＡｌｕ配列の種類は異なるので、測定対象とする標的核酸中のＡｌｕ配列に応じて、表中のいずれの制限酵素の組み合わせを用いても良い。
【００２７】
またＥＧＦＲやＰＴＥＮ以外の遺伝子を標的核酸として用いた場合、表に示した種類以外のＡｌｕ配列も含まれる可能性がある。その際には標的核酸およびＡｌｕ配列の塩基配列と制限酵素の認識部位を照合し、切断断片の長さを算出する。Ａｌｕ配列の切断断片の長さが１５０ｂｐ以下、好ましくは１３５ｂｐ以下であり、標的核酸の切断断片のうち少なくとも１種類は６５０ｂｐ以上となる制限酵素の組み合わせ、もしくは制限酵素単品を選択する。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
上記表１から、標的核酸がＥＧＦＲの場合、標的核酸中にＡｌｕ配列としてＡｌｕＪｏ、ＡｌｕＳｇ、ＡｌｕＳｑを有する。これらのＡｌｕ配列を１５０ｂｐ以下、更には１３５ｂｐ以下に断片化し、かつＡｌｕ配列以外の部分が６５０ｂｐ以上の塩基長を有する様に断片化できる制限酵素の組み合わせとしては以下のものがある。
（１）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（２）Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（３）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（４）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（５）Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ  ＋  Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  。
（６）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（７）Ｈｐｈ  Ｉ  ＋  Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ。
（８）Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
【００３０】
これらの中で（３）および（６）〜（８）に示す組合せはＡｌｕ配列を１２０ｂｐ以下に断片化し、かつＡｌｕ配列以外の部分が６５０ｂｐ以上の塩基長を有する様に断片化できる制限酵素の組み合わせである。
【００３１】
【表２−１】
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【００３２】
【表２−２】
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【００３３】
上記表２−１、２−２から、標的核酸がＰＴＥＮの場合、標的核酸中にＡｌｕ配列としてＡｌｕＪｂ、ＡｌｕＪｏ、ＡｌｕＳｃ、ＡｌｕＳｇ、ＡｌｕＳｐ、ＡｌｕＳｑを有する。これらのＡｌｕ配列を１５０ｂｐ以下、更には１３５ｂｐ以下に断片化し、かつＡｌｕ配列以外の部分が６５０ｂｐ以上の塩基長を有する様に断片化できる制限酵素の組み合わせとしては以下のものがある。
（１）Ｂｐｍ  Ｉ  ＋Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（２）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（３）Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ  ＋  Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ。
（４）Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
（５）Ｈｐｈ  Ｉ  ＋  Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ。
（６）Ｂｐｍ  Ｉ  ＋  Ｂｐｕ  １０Ｉ  ＋  Ｂｓｅ  ＹＩ  ＋  Ｂｔｓ  Ｉ  ＋  Ｈｐｈ  Ｉ。
【００３４】
これらの中で（４）〜（６）に示す組合せはＡｌｕ配列を１２０ｂｐ以下に断片化し、かつＡｌｕ配列以外の部分が６５０ｂｐ以上の塩基長を有する様に断片化できる制限酵素の組み合わせである。
＜増幅工程＞
次に、標的塩基配列を有する核酸断片を用いて増幅反応を行う。DNA合成酵素を用いて増幅する場合、標的核酸に特異的なプライマー、もしくはランダムプライマーのいずれを用いても良い。ランダムプライマーは、連続した少なくとも４塩基からなるヌクレオチドを指す。プライマーの長さによって増幅反応の最適条件が変わるので、望ましい条件で反応を行うために長さを変えることができる。また、核酸断片に短鎖核酸タグを付加し、該短鎖核酸をプライマーの結合部位として用いても良い。
＜検出工程＞
上記増幅工程により得られた増幅産物は、マイクロアレイの検体として用いることができる。マイクロアレイに用いる際には予め核酸を標識しておくことが好ましい。標識化は、増幅時に行うことが望ましい。標識物質には例えば蛍光物質等を用いる。具体的には、１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ３；アマシャムバイオサイエンス社製）、１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドジカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネート（商品名：Ｃｙ５；アマシャムバイオサイエンス社製）は核酸標識用の蛍光物質として良く用いられ、これらの蛍光物質は本発明において好適に用いられる。また、モレキュラープローブ社の製造に係るＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏの商品名で市販されている標識物質もまた同様に、本発明において好適に用いられる。また、ビオチンや、アミノ基誘導体であるアミノアリル等も本発明の核酸標識には有効である。
【００３５】
ビオチンは１−（ε−カルボキシペンチル）−１’−エチル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニン−５，５’−ジサルフォネートに比べて分子の大きさが小さいので、標識化の際の立体障害は比較的少ない。ビオチン自体は蛍光を発しないが、ビオチン標識した核酸断片をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイズさせた後、ストレプトアビジンで標識した蛍光色素と反応させると、核酸断片がハイブリダイゼーションしたスポットのみ蛍光検出することができる。アミノアリル自身も蛍光は発しないが、ビオチン同様分子の大きさが小さいので、標識化の際の立体障害は比較的少ない。アミノアリル標識された核酸断片をマイクロアレイ上のプローブとハイブリダイゼーションさせた後、スクシニルイミドで標識された蛍光色素と反応させると、核酸断片がハイブリダイゼーションしたスポットのみ蛍光検出することができる。
【００３６】
標識されるリボヌクレオチドとしては、ウラシルやシトシンが一般に良く用いられ、対応する標識試薬も多く市販されており、本発明はそれを好適に用いることができる。
【００３７】
本発明の検体調製方法により調製された核酸断片は、固相上あるいは固相表面に固定されたプローブとのハイブリダイゼーションによって２本鎖を形成させ、標識物質のシグナルを測定することによって高感度に検出することができる。固相ハイブリダイゼーションを利用した高感度な検出デバイスとしては、様々な物質、形態が知られているが、本発明は制限なく適用可能である。このうち、ガラス基板に核酸を固定化したＤＮＡマイクロアレイはその代表例であり、本発明の検体調製方法によって作製されたターゲット核酸の検出に特に好適である。固相に用いられる材質としてはその他にも、樹脂、金属、金属薄膜、繊維などがある。またその概観上の形態も、微粒子、光ファイバー先端、多孔質材料、繊維などがある。
【００３８】
固相へのプローブの結合様式としては吸着、化学結合など様々な方式が存在するが、いずれの結合様式でも、本発明の標的核酸の検出に適用可能である。例えば、イオン結合では、アミノ基をコートしてあるガラス基板あるいは樹脂表面に対し、通常の核酸を供するだけでイオン的に結合させることができる。また、５’末端、３’末端にアミノ基、チオール基等の官能基を修飾した修飾オリゴヌクレオチドを用いて固定化することも可能である。例えばアミノ基を利用する場合、固相表面にアミノ基と効率的に反応するスクシイミド基を予め結合させておき、５’末端、もしくは３’末端にアミノ基を修飾したオリゴヌクレオチドを固相表面に供給することにより、容易に共有結合を形成させることができる。そのため、本発明の標的核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。またチオール基を用いる場合には、例えば固相にマレイミド基を結合させておくことにより、アミノ基の場合と同様、共有結合を容易に形成し、本発明の標的核酸を検出するためのプローブとして好適に用いることが可能である。
【００３９】
固相への供給方法としては、インクジェット法によってＤＮＡ溶液を固相に印字する方法などがある。このインクジェット法で作製されたＤＮＡマイクロアレイは、プローブのスポットが小さいことが特長であり、検出にはＳ／Ｎ比も重要なファクターになる。この点で本発明の検体調製方法による標的核酸は、核酸当たりの標識量が多いためＳ／Ｎ比の向上の効果もあり、特に効果的である。
【００４０】
本発明に係る方法で調製された核酸断片は、マイクロアレイだけでなく種々の分析に用いることができる。例えばノーザンハイブリダイゼーション実験、インサイチュハイブリダイゼーション実験などの検体として用いることができる。
【実施例】
【００４１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
ＥＧＦＲを標的核酸に用いて、Ａｌｕ配列を断片化したことによる標的塩基配列の増幅効率の向上の有無を、ハイブリダイゼーションによって確認する実験を行った。
【００４３】
（Ｉ）制限酵素の選択
ＥＧＦＲは、Ａｌｕ配列として、前記表１に示したとおり、ＡｌｕＪｏ、ＡｌｕＳｐおよびＡｌｕＳｑの３種を有している。そこで、これらＡｌｕ配列を１３５ｂｐ以下に断片化し、かつＡｌｕ配列以外の領域で６５０ｂｐ以上の核酸断片が生じるような制限酵素の組み合わせによって処理した。選択した組み合わせは（Ｂｐｕ１０Ｉ＋ＢｔｓＩ＋ＨｐｈＩ）および（Ｂｐｕ１０Ｉ＋ＢｔｓＩ＋ＨｐｈＩ＋ＢｓｅＹＩ＋ＢｐｍＩ）である。各組み合わせによって生じる断片長については、前記表１に記載されている。
【００４４】
（ＩＩ）ＥＧＦＲを含むヒトゲノムＤＮＡの調製
（１）ＥＧＦＲを含むヒトゲノムＤＮＡの抽出
ヒト類表皮癌標準細胞Ａ４３１（大日本製薬社製）から、ゲノムＤＮＡ抽出精製キット（商品名：ＤＮＥａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ；キアゲン社製）を用いて、以下のキット添付の使用説明書の方法に従って、ゲノムＤＮＡを抽出、精製した。
【００４５】
まず、ヒト類表皮癌標準細胞Ａ４３１の懸濁液（２×１０6個／２００μｌ）に、上記キットに含まれているＡＴＬ緩衝液を１８０μｌ加え、１５秒間攪拌した。次いでこの懸濁液に、上記キットに含まれているＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液を２０μｌ加え、攪拌した後、５５℃で３０分間加温した。さらに上記キットに含まれるＡＬ緩衝液を、４００μｌ加え、３０秒間攪拌後、７０℃で１０分間加熱した。エタノールを４００μｌ加えて１５秒間攪拌後、まず６００μｌをカラムに添加した。８，０００ｒｐｍで１分間遠心後、廃液を捨ててから残りの溶液をカラムに添加し、８，０００ｒｐｍで１分間遠心した。廃液を捨てた後、カラムに上記キットに含まれるＡＷ１緩衝液を５００μｌ添加し、８，０００ｒｐｍで１５秒間遠心、さらに上記キット中のＡＷ２緩衝液を５００μｌを加えて１４，０００ｒｐｍで３分間遠心した。廃液を捨て、何も添加せずに１５，０００ｒｐｍで１分間遠心した。新しいチューブにカラムをセットし、超純水を５０μｌ加えて１分間静置後、８，０００ｒｐｍで１分間遠心してゲノムＤＮＡを溶出した。ナノドロップ分光光度計（ナノドロップテクノロジー社製）を用いてこのゲノムＤＮＡ溶液の吸光度を測定し濃度を求めたところ、２５００ｎｇ／ｕｌだった。
【００４６】
（２）制限酵素による断片化
（２−１）検体１の調製
上記（１）で得たＡ４３１由来のゲノムＤＮＡについて、５種類の制限酵素（いずれも第一化学薬品株式会社）による断片化を以下の手順で行った。表３の混合液を３７℃で１時間インキュベートした後、８０℃で２０分間加熱して酵素を不活性化した。
【００４７】
【表３】
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【００４８】
また断片化した上記ゲノムＤＮＡについて、ＤＮＡ精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔＤＮＥａｓｙ  ；キアゲン社）を用いて以下の方法により精製した（手順は表４を参照）。
【００４９】
【表４】
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【００５０】
こうして得た検体を、検体１と称する。
（２−２）検体２の調製
断片化に用いる制限酵素として、上記検体１の調製の際に用いた５種の制限酵素のうちＢｐｕ１０Ｉ、ＨｐｈＩ及びＢｔｓＩのみ用い、上記（２−１）に記載の方法と同様にしてＡ４３１由来のゲノムＤＮＡの断片化ならび精製を行なった。得られた検体を検体２と称する。
（２−３）検体３の用意
対照として、断片化しないＡ４３１由来のゲノムＤＮＡを用意した。各々を検体３と称する。
【００５１】
（３）ランダムプライマ−による増幅
上記（２）で用意した各検体（検体１、２、３）と、増幅キット（商品名：ＢｉｏＰｒｉｍｅ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ  ；インビトロジェン社）を用いて以下の方法により、をそれぞれ増幅した（手順は表５を参照）。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
（４）精製
（３）で得た３種の増幅産物について、まずＤＮＡ精製キット（商品名：ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔＤＮＥａｓｙ  ；キアゲン社）を用いて精製した（手順は表４を参照）。以上の工程により、３種の検体（検体１、２、３）各々の増幅産物を得た。以降、各々の増幅産物を増幅産物１、２、３と称する。
続いて表６の溶液を調製し、エタノール沈殿精製を行った（手順は表７を参照）。
【００５４】
【表６】
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【００５５】
【表７】
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【００５６】
以上の工程により、増幅産物１を用いてエタノール沈殿精製を行った。このようにして得られた検体を精製検体１と称する。上記と同様にして、増幅産物２及び増幅産物３についてもそれぞれ混合しエタノール沈殿精製を行った。このようにして各増幅産物１、２、３を精製した検体を、それぞれ精製検体１、２、３と称する。
【００５７】
（ＩＩＩ）ＤＮＡチップの作製
上記各精製検体中におけるＥＧＦＲの標的塩基配列部分の増幅産物を検出するため、各種の６０ｍｅｒプローブを設定した。各プローブを設計する際、ＧＣ％は４１±２％、融解温度（Ｔｍ値）は８４±２℃（ＮｅａｒｅｓｔＮｅｉｇｈｂｏｒ法により計算、［Ｎａ+］＝９００ｍＭ）となる配列をまず選択した。さらに相同性検索プログラムを用いて検索を行い、他の遺伝子とクロスハイブリダイゼーションしない配列をプローブとして設定した。本実施例では米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが構築した相同性検索プログラム（ＢＬＡＳＴ；Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用いた。
【００５８】
設定されたプローブの塩基配列およびＴｍ値を表８に示す。なお、表８に示されているＴｍ値は塩濃度が［Ｎａ＋］＝９００ｍＭの場合の値とする。
【００５９】
【表８】
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【００６０】
表８に記載の配列のプローブとガラス基板を用いてＤＮＡチップを作成する手順は、特開２００５−１８５１８３の段落番号［００５７］〜［００６６］に従った。
【００６１】
ＩＶ．ハイブリダイゼーション反応
ＩＩＩで作製した３枚のＤＮＡチップと、精製検体１、２、３とでハイブリダイゼーション反応を行った。
（１）ハイブリダイゼーション溶液の調製
下記表９の溶液を精製検体１、２、３の各々に加え、３７℃で３０分間、７０℃で１５分間、３７℃で１時間加温し、完全に溶解させた。
【００６２】
【表９】
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【００６３】
6×SSPE:NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、pH 7.4
SDS:Sodium Dodecyl Sulfate, BSA:Bovine Serum Albumin(ウシ血清アルフ゛ミン)
（２）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップにＴａｋａｒａ  ｓｌｉｄｅ  ｓｅａｌ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ（タカラ）を貼付し、（１）で調製したＤＮＡ溶液を枠内に滴下した。シールで密封した後、表１０に示す手順でハイブリダイゼーションを行った。
【００６４】
【表１０】
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【００６５】
2×SSC:tri-Sodium citrate・2H2O 30mM、NaCl 300mM)
（３）蛍光測定
洗浄、乾燥後、各々のＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（商品名：Ｇｅｎｅｐｉｘ  ４０００Ｂ；アキソン社製）を用いて、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。
【００６６】
プローブＤＮＡの各スポットにおいて、癌細胞（Ａ４３１）由来のＣｙ３の蛍光強度その結果を、図１中に棒グラフとして示す。図１の棒グラフから、制限酵素処理無しのときと比較して、３種類及び５種類の制限酵素で処理したときの蛍光強度が増大している。また、５種類の制限酵素で処理したときと比較して、３種類の制限酵素で処理したときの蛍光強度が増大した。
【００６７】
（４）考察
図１の検体は、３種類の制限酵素で処理した後にＰＣＲ増幅を行った検体であった。このことは、３種の制限酵素を用いた標的核酸の処理によって、標的核酸中のＡｌｕ配列が断片化され、後のＰＣＲで増幅されにくくなったことを示している。また、ゲノムを複数の制限酵素で切断すると６５０ｂｐ以下の断片が多数生じる。断片化後の精製ではカラムの特性により１００ｂｐ以下の核酸は除かれるので、断片化されたＡｌｕ配列の多くは除去される。よって、単位重量当たりの標的核酸量が無処理ゲノムよりも相対的に増加する。増幅処理を行う場合、単位重量当たりの核酸量に応じて増幅されるため、制限酵素処理を行ったことで結果的にハイブリダイゼーション溶液中のターゲット量も増加し、無処理ゲノムよりも蛍光強度が高くなると考えられる。
【００６８】
以上より、標的核酸に適した制限酵素の組み合わせを選択することで、ハイブリダイゼーションが効率よく進むことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】実施例１に係るヒトゲノムについて制限酵素による各種処理を行った後、ハイブリダイゼーションによって標的遺伝子ＥＧＦＲを検出した、ゲノムコピー数の相対比を示すグラフである。
【図１】
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【配列表】
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