(57)【要約】【課題】個体における局所化された固型腫瘍および乳頭腫、および転移性悪性腫瘍を措置するための新しい方法を提供すること。【解決手段】本発明は組換えアデノ ウィルス性ベクターあるいはその他のＤＮＡ輸送システムを用いて、個体内の自殺遺伝子を腫瘍、乳頭腫または痩贅に伝達するステップを含んでいる。その後、薬品ガンシクロビルTMなどのプロドラッグをその個体に投与する。さらに、本発明は固型腫瘍、乳頭腫、および転移性悪性腫瘍を治療 する方法を提供するものであり、この方法は自殺遺伝子およびサイトカイン遺伝子を個体の腫瘍、乳頭腫、または疣贅に導入し、その後、その個体にプロドラッグを投与するステップを含んでいる。本発明による方法は、結腸悪性腫瘍、前立腺癌、乳癌、肺癌、黒色腫、ヘパトーマ、脳リンフォーマ、および頭部と首の癌を含む種々の異なったタイプの癌および乳頭腫の治療に用いることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的には遺伝子治療に関するものである。より具体的には、本発明は固型腫瘍、乳頭腫および疣贅をアデノウィルス性ベクター、複数のアデノウィルス性ベクターの組み合わせ、その他のウィルス性ベクター、そして非ウィルス性ＤＮＡトランスポーターシステムを用いて治療する新しい遺伝子治療方法に関す るものである。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明
インビボでの治療用遺伝子の悪性腫瘍への直接の導入によって、局所化された腫瘍の効果的な治療が可能になる。最近、いくつかの新しい措置法が試みられている。例えば、ひとつの措置法は、正常な腫瘍サプレッサー遺伝子および／または活性化された癌関連遺伝子を腫瘍細胞に直接伝達するステップを含んでいる。
第２の措置はサイトカイン遺伝子の導入によって、インビボでの腫瘍細胞の免疫原性を増強するステップを含んでいる。第３の措置は、腫瘍細胞に対して化学治療 剤への感受性を伝えることができる酵素をコード表現する遺伝子を導入するステップを含んでいる。ヘルペス単体ウィルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は特にヌクレオチドアナログ（ガンシクロビル）を毒性中間体に転換して分裂性細胞の死をもたらす。最近、Culverらによって（Science 256：1550−1552，1992）、レトロウィルス性形質導入によるＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の伝達後、ガンシクロビル措置が効果的に実験動物における脳腫瘍の退縮をもたらしたことが報告されている。局所化された腫瘍に対するこの措置の魅力的な特徴は、いわゆる“局外者”効果である。この“局外者”効果で は、ＨＳＶ−ＴＫ表現腫瘍細胞はガンシクロビルの存在下で、隣接した非形質導入腫瘍細胞の成長を妨げる。したがって、効果的な癌治療のためには、すべての腫瘍細胞がＨＳＶ−ＴＫを表現しなければならないわけではない。
Culverらが用いたＨＳＶ−ＴＫレトロウィルスは、低ウイルスタイターによって 制限された。したがって、脳腫瘍を効果的に治療するためには、ウィルス単離体自体よりウィルス生産細胞を動物の体内に接種することが必要であった。加えて、レトロウィルスおよびガンシクロビルで措置したシネルゲニッグ（synergeneic）ラットを用いての以前の実験で、それらの腫瘍は壊死性で、マ クロファージおよびリンパ球によって侵された。以下に示す例１で、アシミック（athymic）マウスが用いられ、細胞免疫反応の明白な関与なしに、腫瘍細胞が破壊された。先行技術では、固型腫瘍の治療のための効率的な遺伝子治療技術は十分ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の要約
本発明の目的は、ヒトおよび動物における新しい遺伝子治療方法である。
【０００４】
本発明の別の目的は、プロドラッグ、つまり非毒性の化合物を毒性化合物に酵素的に転換することができる蛋白質をコード表現するアデノウィルス性ベクターを導入し、その後、そのプロドラッグを投与することによる癌治療方法である。
【０００５】
本発明のさらに別の目的は、インターロイキン−２遺伝子などの“サイトカイン”と共に投与される、プロドラッグを転換することができる蛋白質である“自殺 遺伝子”を有するアデノウィルス性ベクターを用い、その後でそのプロドラッグを投与することによる組み合わせ遺伝子治療方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、上に述べた目的を達成するために、本発明のひとつの側面にしたがって、動物またはヒトにおける固型腫瘍、乳頭腫、または疣贅の治療方法において、プロモーター、５′mＲＮＡリーダー配列、開始部位、表現されるべき自殺遺伝子配列を含んだ核酸カセット、３′非翻訳領域、そしてポリアデニル化信号の諸要素を機能的な表現のために適切な距離で順列的に結合して構成されたアデノウィルス性ベクターを固型腫瘍に直接導入するステップと、プロドラッグを動 物またはヒトに投与し、そのプロドラッグがインビボで毒性化合物に転換されるステップとで構成された治療法が提供される。
【０００７】
さらに、上記の目的を達成するために、本発明の１つの側面にしたがって、動物またはヒトにおける固型腫瘍、乳頭腫、または疣贅の治療方法において、プロモーター、５′mＲＮＡリーダー配列、開始部位、表現されるべき自殺遺伝子配列を含んだ核酸カセット、３′非翻訳領域、そしてポリアデニル化信号の諸要素を機能的な表現のために適切な距離で順列的に結合して構成されたアデノウィルス性ベ クターを固型腫瘍に直接導入するステップと、同時に、プロモーター、５′ＲＮＡリーダー配列、開始部位、サイトカイン遺伝子を含んだ核酸カセット、３′非翻訳領域、そしてポリアデニル化信号を機能的表現のために適切な距離で順列的に結合して構成された第２のアデノウィルス性ベクターを導入するステップと、 そして、プロドラッグを動物またはヒトに投与し、プロドラッグがインビボで毒性化合物に投入するステップで構成された、固型腫瘍、乳頭腫そして疣贅を治療するための方法が提供される。
【０００８】
したがって、本発明は以下をも提供する。
１. 動物またはヒトにおける固型腫瘍、乳頭腫、または疣贅を措置するための方法において：該腫瘍、乳頭腫、または疣贅にアデノウィルス性ベクターを導入し、該ベクターが機能的な表現のために、適切な距離で結合されている、５′mＲＮＡリーダー 配列、開始部位、酵素的にプロドラッグを毒性化合物に転換することができる蛋白質をコード表現する表現されるべき自殺遺伝子を含む核酸と、３′非翻訳領域と、そしてポリアデニル化信号によって構成されているステップおよび該プロドラッグを該動物またはヒトに投与するステップによって構成され、該プロドラッ グがインビボで該毒性化合物に転換されることを特徴とする方法。
２. 該プロモータがラウスサルコーマウィルス−ロングターミナルリピート、サイトメガロウィルス性プロモーター、マウス白血病−ロングターミナルリピート、類 人猿ウィルス40初期および後期ブロモーター、およびヘルペス単一体ウィルス−チミジンキナーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
３. 上記遺伝子配列が、ヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼ、バリセラズスターウィルスのチミジンキナーゼ、およびバクテリア性サイトシンデアミナーゼで構成される蛋白質に関するコードを表現することを特徴をする項目１の方法。
４. 該プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビル、１−５−ヨードウラシル ＦＩＡＵ、５−フルオロサイトシン、６−メトキシプリンアラビノシド、およびそれらの誘導物で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
５. 固型腫瘍が、結腸、前立腺、乳房、肺、皮膚、骨、膵臓、子宮、睾丸、膀胱、腎臓、脳、頭部、および頚部部癌によって構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
６. 乳頭腫が、鱗状細胞乳頭腫、コロイド叢乳頭腫および喉頭乳頭腫で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
７. 該疣贅が、生殖器疣贅、疣贅状表皮異形成および悪性疣贅で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
８. 該ガンシクロビルが約１mg/日/kg〜約20mg/日/kg体重の投与量で投与されることを特徴とする項目５の方法。
９. 該アシクロビルが、約１mg/日/kg〜約100mg/日/kg体重の投与量で投与されることを特徴とする項目５の方法。
10. 該ＦＩＡＵが、約１mg/日/kg〜約50mg/日/kg体重の投与量で投与されていることを特徴とする項目５の方法。
11. 表現されるべき上記自殺遺伝子配列がヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼであり、プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵまたはその誘導体であることを特徴とする項目１の方法。
12. 表現されるべき上記自殺遺伝子配列がバクテリア性サイトシンデアミナーゼである、上記プロドラッグが５−フルオロサイトシンまたはその誘導体であることを特徴とする項目１の方法。
13. 表現されるべき上記自殺遺伝子配列がバリセラゾスターウィルスチミジンキナーゼであり、プロドラッグが６−メトキシプリンアラビノシド、またはその誘導体であることを特徴とする項目１の方法。
14. 該腫瘍が肝臓癌であり、該プロモーターがアルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインブロモーター、α−アンチトリプシンプロモーター、およびホス ホエノルピルベートカルボキシナーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
15. 該腫瘍が結腸癌であり、該プロモーターがカルボニックアンヒドラーゼＩプロモーター、または悪性腫発生抗原プロモーターであることを特徴とする項目１の方法。
16. 該腫瘍が子宮癌であり、該プロモーターがエストロゲンプロモーター、アロマターゼサイトクロームＰ450プロモーター、コレステロール側鎖切断Ｐ450、および17アルファ−ヒドロキシラーゼＰ450プロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
17. 該腫瘍が前立腺癌であり、該プロモーターが前立腺特異抗原プロモーター、gp91−ホックス遺伝子プロモーター、および前立腺固有カリクレインプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
18. 該腫瘍が乳癌であり、上記プロモーターがerb−Ｂ2プロモーター、erb−Ｂ3プロモーター、β−カゼインプロモーター、ＷＡＢ（ウェイ酸性蛋白質）プロモーター、およびβ−ラクト−グロブリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
19. 該腫瘍が肺癌であり、上記プロモーターが、界面活性剤プロモーター、悪性腫瘍発生抗原プロモーター、およびウログロビンプロモーターによって構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
20. 該腫瘍は皮膚癌であり、上記プロモーターがヒトケラチン１プロモーター、ヒトケラチン６プロモーター、およびロイクリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
21. 該腫瘍が脳癌であり、上記プロモーターがグリアル（glial）繊維酸性蛋白質プロモーター、成熟した星状細胞特異蛋白質ミエリンプロモーター、およびチロシンヒドロキシダーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
22. 該腫瘍が膵臓癌であり、上記プロモーターがビリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、島アミロイドポリペプチド（アミリン）プロモーター、およびインシュリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
23. 該腫瘍が甲状腺癌であり、上記プロモーターがチログロブリンプロモーターおよびカルシトニンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
24. 該腫瘍が骨癌であり、上記プロモーターがアルファ１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター、およびシアログリコプロテインプロモーターで構成されるグルーブから選択されることを特徴とする項目１の方法。
25. 該腫瘍が腎臓癌である、上記プロモーターがレニンプロモーター、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスホターゼプロモーター、およびエリスロポイエチン（エポ）プロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目１の方法。
26. 動物またはヒトの固型腫瘍、乳頭腫、および疣贅を措置する方法において、ＤＮＡ伝達システムによって個体に、自殺遺伝子と１つまたは複数の細胞毒性遺伝子を投与し、該ＤＮＡ伝達システムがウィルス性ベクター、エピゾーム性ベタター、リポゾーム、陽イオン性脂質およびＤＮＡまたはＲＮＡなど細胞表面または抗原を識 別し、それに結合する分子構成、ＤＮＡ結合分子構成、およびそれら細胞表面から細胞質へのそれら複合体を輸送することができる溶解性分子構成で構成される非ウィルス性伝達システムで構成されるグループから選択されることを特徴とするステップおよび該動物またはヒトに対してプロドラッグを投与するステップと で構成され、該プロドラッグがインビボで該自殺遺伝子によって毒性化合物に転化されることを特徴とする方法。
27. 自殺遺伝子配列がヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼ、バリセラゾスターのチミジンキナーゼ、およびバクテリア性シトシンデアミナーゼで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目26の方法。
28. 該１つ、または複数のサイトカイン遺伝子配列がインターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイ キン−７、インターロイキン−10、インターロイキン−12、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−δ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、顆粒マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で構成されるグループから選択される ことを特徴とする項目26の方法。
29. 該プロドラッグがガンチクロビル、アシクロビル、１−５−ヨードウラシルＦＩＡＵ、５−フルオロシトシン、６−メトキプリンアラビノシドおよびその誘導体で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目26の方法。
30. 該腫瘍が結腸、前立腺、乳房、肺、皮膚、肝臓、骨、膵臓、子宮、睾丸、膀胱、腎臓、頭部、または頚部癌で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目26の方法。
31. 乳頭腫が鱗状細胞乳頭腫、脈絡膜叢乳頭腫、および喉頭乳頭腫で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目26の方法。
32. 該疣贅が生殖器疣贅、足裏疣贅、疣贅状表皮異形成および悪性疣贅で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目26の方法。
33. 該ガンシクロビルが約１mg/日/kg〜約20mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする項目29の方法。
34. 該アシクロビルが約１mg/日/kg〜約100mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする請求29の方法。
35. 該ＦＩＡＵが約１mg/日/kg〜約50mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする項目29の方法。
36. 上記表現されるべき自殺遺伝子配列がヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼであり、上記プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、またはその誘導体であることを特徴とする項目26の方法。
37. 上記表現されるべき自殺遺伝子がバクテリア性サイトシンデアミナーゼであり、上記プロドラッグが５−フルオロシトシンまたはその誘導体であることを特徴とする、項目26の方法。
38. 上記表現されるべき自殺遺伝子配列がバリセラゾスターウィルスチミジンキナーゼであり、上記プロドラッグが６−メトキシプリンアラビノシドまたはその誘導体であることを特徴とする項目26の方法。
39. 動物またはヒトの固型腫瘍、乳頭腫、または疣贅を措置する方法において、第１のアデノウィルス性ベクターと、機能的表現のために適当な距離で順次結合 されたプロモーター、５′mＲＮＡリーダー配列、開始部位、表現されるべき自殺遺伝子で、プロドラッグを毒性化合物に転化させることができる蛋白質をコード表現する自殺遺伝子を含んでいる核酸カセット、３′非翻訳領域およびポリアデニル化信号で構成される追加的アデノウィルス性ベクターを直接該腫瘍、乳頭 腫、または疣贅に導入するステップで、さらに該追加アデノウィルス性ベクターが機能的な表現のために適切な距離で結合されたプロモーター、５′mＲＮＡリーダー配列、開始部位、表現されるべき サイトカイン遺伝子を含んだ核酸、３′非翻訳領域、およびポリアデニル化信号で構成されているステップとおよび該動物またはヒトにプロドラッグを投与するステップとで構成され、該プロドラッグがインビボで該自殺遺伝子によって毒性物質に転化されることを特徴とする方法。
40. 該プロモーターがラウスサルコーマウィルス−ロングターミナルリピート、サイトメガロウィルス性プロモーター、マウス白血病ウィルス−長末端反復、霊長類 ウイルス40初期および後期プロモーター、およびヘルペス単一体ウィルス−チミジンキナーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする、項目39の方法。
41. 上記自殺遺伝子配列が、ヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼ、バリセラゾスターウィルス、およびバクテリア性サイトシンデアミナーゼで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
42. 上記アデノウィルス性ベクターがインターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−７、イン ターロイキン−10、インターロイキン−12、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−δ、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、顆粒細胞−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）で構成されるグループから選択される蛋白質をコード表現する１つ、または複数のサイトカイン遺伝子配列を含んでいることを特徴とする項目39の方法。
43. 該プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビル、１−５−ヨードウラシルＦＩＡＵ、 ５−フルオロシトシン、６−メトキシプリンアラビノシド、およびそれらの誘導体で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
44. 該腫瘍が結腸、前立腺、乳房、肺、皮膚、肝臓、骨、膵臓、子宮、睾丸、膀胱、腎臓、頭部、または頚部癌で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
45. 乳頭腫が鱗状細胞乳頭腫、脈絡膜叢乳頭腫、および喉頭乳頭腫で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
46. 該疣贅が生殖器疣贅、足裏疣贅、疣贅状表皮異形成および悪性疣贅で構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
47. 該ガンシクロビルが約１mg/日/kg〜約20mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする項目43の方法。
48. 該アシクロビルが約１mg/日/kg〜約100mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする項目43の方法。
49. 該ＦＴＩＵが約１mg/日/kg〜約50mg/日/kg体重の範囲の投与量で投与されることを特徴とする項目43の方法。
50. 上記表現されるべき自殺遺伝子配列がヘルペス単一体ウィルスのチミジンキナーゼであり、上記プロドラッグがガンシクロビル、アシクロビル、ＦＩＡＵ、またはその誘導体であることを特徴とする項目39の方法。
51. 上記表現されるべき自殺遺伝子がバクテリア性サイトシンデアミナーゼであり、上記プロドラッグが５−フルオロシトシンまたはその誘導体であることを特徴とする項目39の方法。
52. 上記表現されるべき自殺遺伝子配列がバリセラゾスターウィルスチミジンキナーセであり、上記プロドラッグが６−メトキシプリンアラビノシドまたはその誘導体であることを特徴とする項目39の方法。
53. 該腫瘍が肝臓癌であり、該プロモーターがアルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、α−アンチトリプシンプロモーターおよびホスホエノルピルベートカルボキシナーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
54. 該腫瘍が結腸癌であり、該プロモーターがカルボニックアンヒドラーゼＩプロモーター、または悪性腫発生抗原プロモーターであることを特徴とする項目39の方法。
55. 該腫瘍が子宮癌であり、該プロモーターがエストロゲンプロモーター、アロマターゼサイトクロームＰ450プロモーター、コレステロール側鎖切断Ｐ450、 および17アルファ−ヒドロキシラーゼＰ450プロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
56. 該腫瘍が前立腺癌であり、該プロモーターが前立腺特異抗原プロモーター、gp91−ホックス遺伝子プロモーター、および前立腺固有カリクレインプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
57. 該腫瘍が乳癌であり、上記プロモーターがerb−Ｂ2プロモーター、erb−Ｂ3プロモーター、β−カゼインプロモーター、ＷＡＢ（ウェイ酸性蛋白質）プロモーター、およびβ−ラクトーグロブリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
58. 該腫瘍が肺癌であり、上記プロモーターが、界面活性剤プロモーター、悪性腫瘍発生抗原プロモーター、およびウログロビンプロモーターによって構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
59. 該腫瘍は皮膚癌であり、上記プロモーターがヒトケラチン１プロモーター、ヒトケラチン６プロモーター、およびロイクリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
60. 該腫瘍が脳癌であり、上記プロモーターがグリカル（glial）繊維酸性蛋白質プロモーター、成熟した星状細胞特異蛋白質ミエリンプロモーター、およびチロシンヒドロキシダーゼプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
61. 該腫瘍が膵臓癌であり、上記プロモーターがビリンプロモーター、グルカゴンプロモーター、島アミロイドポリペプチド（アミリン）プロモーター、およびインシュリンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
62. 該腫瘍が甲状腺癌であり、上記プロモーターがチログロブリンプロモーターおよびカルシトニンプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
63. 該腫瘍が骨癌であり、上記プロモーターがアルファ１（Ｉ）コラーゲンプロモーター、オステオカルシンプロモーター、およびシアログリコプロテインプロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
64. 該腫瘍が腎臓癌である、上記プロモーターがレニンプロモーター、肝臓／骨／腎臓アルカリ性ホスホターゼプロモーター、およびエリスロポイエチン（エポ）プロモーターで構成されるグループから選択されることを特徴とする項目39の方法。
【０００９】
他の、そしてさらなる目的、特徴、そして利点は、開示の目的のために示される本発明の現時点での実施例に関する以下の説明と、関連図面を参照することで明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
発明の詳細な説明 本発明の範囲および精神を逸脱せずに、ここに述べられている発明に対して、種々の置き換えや修正が可能なことは当業者には明らかであろう。
ここで用いられている“ベクター”とい用語は標的とされる細胞の形質転換を行わせるようにデザインされた遺伝子的物質で構成された構造物を意味している。 ベクターは位置的にも配列的にも方向づけられた、つまり、核酸カセット内の核酸が転写され、そして必要な場合はトランスフェクトされた細胞内に翻訳されるように、他の必要な要素と操作的に結合された複数の遺伝子的要素を含んでいる。本発明において
【００１１】
【表１１】
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【００１２】
【表１２】
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【００１３】
【表１３】
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【００１４】
【表１４】
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【００１５】
【表１５】
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【００１６】
【表１６】
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【００１７】
【表１７】
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【００１８】
【表１８】
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【００１９】
【表１９】
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【００２０】
【表２０】
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【００２１】
【表２１】
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【００２２】
【表２２】
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【００２３】
【表２３】
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【００２４】
【表２４】
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【００２５】
【表２５】
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【００２６】
【表２６】
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【００２７】
【表２７】
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【００２８】
【表２８】
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【００２９】
【表２９】
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【００３０】
【表３０】
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【００３１】
【表３１】
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【００３２】
【表３２】
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【００３３】
【表３３】
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【００３４】
【表３４】
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【００３５】
【表３５】
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【００３６】
【表３６】
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【００３７】
【表３７】
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【００３８】
【表３８】
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【００３９】
【表３９】
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【００４０】
【表４０】
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【００４１】
【表４１】
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【００４２】
【表４２】
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【００４３】
【表４３】
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【００４４】
【表４４】
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【００４５】
【表４５】
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【００４６】
【表４６】
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【００４７】
【表４７】
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【００４８】
【表４８】
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【００４９】
【表４９】
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【００５０】
【表５０】
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【００５１】
【表５１】
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【００５２】
【表５２】
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【００５３】
【表５３】
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【００５４】
【表５４】
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【００５５】
【表５５】
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【００５６】
【表５６】
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【００５７】
【表５７】
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【００５８】
【表５８】
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【００５９】
【表５９】
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【００６０】
【表６０】
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【００６１】
【表６１】
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【００６２】
【表６２】
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【００６３】
【表６３】
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【００６４】
【表６４】
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【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、ヘルペス単体ウィルスチミジンキナーゼ（ＨＶＳ−ＴＫ）遺伝子を含む組換えアデノウィルス性ベクターの構成を図式的に示すものである。
【図２】図２は、バクテリア性β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ガル）を含んだ組換えアデノウィルス性ベクターを用いた、インビトロでのＣ６神経膠腫細胞の効率的な形質導入を示している。パネルＡ：moi＝０；パネルＢ：moi＝125、パネルＣ：moi＝500、およびパネルＤ；moi＝2,0000。
【図３】図３は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含む組換えアデノウィルス性ベクターによる形質導入後のＣ６神経膠腫細胞におけるＨＳＶ−ＴＫ酵素活性を示している。
【図４】図４は、Ａｄ/ＲＳＶ−ＴＫ形質導入Ｃ６神経膠腫細胞のインビトロでのガンシクロビル毒性に対する感作性を示している。
【図５】図５は、ＨＳＶ−ＴＫを含む組換えアデノウィルス性ベクターを用いた脳腫瘍の遺伝子治療の基本的方針を示している。
【図６】図６は、一般的な固型腫瘍の遺伝子治療に関する基本的方針を示している。
【図７】図７は、Ｃ６神経膠腫細胞を脳に接種し、定位Ａｄ/ＲＳＶ−ＴＫ投与を行って20日後の実験動物を示している。左側の動物はＰＢＳを措置され、右側の動物はガンシクロビルで措置されたものである。
【図８】図８は、ＰＢＳ治療（左側）またはガンシクロビル治療（右側）のいずれか後の、図７に示したマウスの脳全体を示している。
【図９】図９は、ガンシクロビルによる措置とＨＳＶ−ＴＫ+乳頭腫（ＭＯＤ）退縮を示している。
【図１０】図10は、ＨＶＳ−ＴＫ+乳頭腫（ＭＯＤ）サイズに対するガンシクロビル治療の効果を示している。
【図１１】図11は、親の乳頭腫（ＭＯＤ）細胞およびＨＳＶ−ＴＶ遺伝子を含む腫瘍細胞を混合してマウスに皮下注射した場合の局外者効果を示している。
【図１２】図12は、マウスを100％親腫瘍細胞、腫瘍細胞を含む100％ＨＳＶ−ＴＫ、90％親／10％ＨＳＶ−ＴＫ腫瘍細胞または50％親／50％ＨＳＶ−ＴＫ乳頭腫（ＭＯＤ）細胞のいずれかによって措置された場合の、腫瘍のサイズに対するＰＢＳまたはガンシクロビルの影響を示している。
【図１３】図13は、アデノウィルス媒介遺伝子治療後の脳腫瘍サイズに対するガンシクロビル投与量の効果を示している。80mg/kg以下のガンシクロビルを投与されＡＤＶ/tkで措置したラットのいくつかの脳で、少量の残存腫瘍が観察された。誤差バー＝Ｓ.Ｄ.措置、平均腫瘍面積±Ｓ.Ｄ.およびサンプルサイズは：ＡＡＤＶ−tk＋ＰＢＳ，36.89±6.73mm2（ｎ＝３）；Ｂ ＡＤＶ−βgal＋150mg/kgガンシクロビル、28.75±0.55mm2（ｎ＝４）；Ｃ ＡＤＶ−tk＋150mg/kgガンシクロビル、−０mm2（ｎ＝２）；ＤＡＤＶ−tk＋100mg/kgガンシクロビル、０mm2（ｎ＝４）；Ｅ ＡＤＶ−tk＋80mg/kgガンシクロビル、０mm2（ｎ＝２）；Ｆ ＡＤＶ−tk＋50mg/kgガンシクロビル、0.25±0.29mm2（ｎ＝４）；ＧＡＤＶ−tk＋20mg/kgガンシクロビル、1.79±3.52mm2（ｎ＝４）；Ｈ ＡＤＶ−tk＋10mg/kgガンシクロビル、0.01±0.004mm2（ｎ＝４）。
【図１４】図14は、ＡＤＶ−βgalまたはＡＤＶ−tkのいずれかで措置し、その後１日２度ずつ50mg/kgを６日間措置した動物の生残調査の結果を示している。Ａ：ＡＤＶ−βgal＋ガンシクロビルで措置したこれらの動物は、22日以内に死亡した
【化１】
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；Ｃ：ＡＤＶ−tk＋ガンシタロビルで措置を受けた第２のグループの動物は80日後も生き残っていた（----；ｎ＝５）。
【図１５】図15は、インビトロでＨＬａＣ−79ヒト鱗状癌細胞のＡＤＶ/ＲＳＶ−ＴＫ形質導入を行い、その後ＧＣＶ10ｕg/ml（実線バー）またはＰＢＳ（縞バー）で措置した場合を示している。細胞生残はＧＣＶ措置とＰＳＢの両方での形質導入後68時間と評価された。ＧＣＶで措置した場合、Ｍ.Ｏ.Ｉ.が非常に低くても85〜90ｘの癌細胞致死が見られた。形質導入を受けないコントロール（Ｍ.Ｏ.Ｉ.＝０）およびＰＢＳコントロールではＭ.Ｏ.Ｉ.を25に上げても毒性は認められなかった。
【図１６】図16は、各実験グループに関する、インビボでの鱗状癌腫瘍の壊死平均パーセントを示している。アデノウィルスの形質導入とガンシクロビルによる治療（ＴＫ＋Ｃ＋）後、コントロール（０〜2.2％壊死）と比較して、かなりの細胞毒性効果（41％）が認められた。ｔ−テスト分析での統計的優位度：ｐ＜.001。
【図１７】図17は、実験グループの各動物に対する全体的な臨床応答を示す腫瘍指数値（ドット）を示している。水平線以下のデータ（30以下の腫瘍指数）は、全腫瘍退縮に近い状況を示している。バーは各グループのメディアン値を示している。各コントロールグループ（マン−ホイットニー分析でｐ＜.001〜.02）と比較して、完全な措置を受けた動物（ＴＫ＋Ｇ＋）で劇的な臨床応答が認められた（マン−ホイットニー分析でｐ＜.001〜.02）。
【図１８】図18は組換えアデノウィルス性ベクターの機能的特徴付け：ＡＤＶ/ＲＳＶ−tkを形質導入されたＭＣＡ−26結腸細胞株のＧＣＶ感作性を示している。ＭＣＡ−26′細胞は種々の多重度でＡＤＶ/ＲＳＶ−tkによって形質導入され、その後、12時間後にＰＢＳまたは10ｕg/mlＧＣＶで措置した。３日後、トリパンブルー染色で成長可能な細胞についての判定が行われた。
【図１９】図19は、ＡＤＶ/ＲＳＶ−mＩＬ２を形質導入したＢ16細胞からの調整培養液のマウスＩＬ２バイオアッセイの結果を示している。調整培養液をマウスＴ−細胞株ＣＴＬＬ−２に加え、20時間培養した。3Ｈ：チミジンをさらに４時間加えて、ＰＨＤ細胞採取器を用いて、細胞を収集した。組み込まれた3Ｈ−チミジンは液体シンチレーションカウンティングで判定され、平均cpmが３倍であることが示されている。
【図２０】図20は、種々の遺伝子治療措置後の、動物に置ける生残腫瘍のサイズを示している。腫瘍の最大断面積をコンピュータ化モルフォメトリック分析によって測定した。２つの別個に行われた実験から得られた５つの措置グループにおける動物の延べ数は14（βgal）；８（mＩＬ２）；７（β−gal＋mＩＬ２）；12（tk）および10（tk＋mＩＬ２）であった。誤差バーは各措置グループにおける標準偏差を示している。
【図２１】図21は、末端分の１での親の腫瘍細胞による刺激に対しての全身性抗腫瘍性免疫を示している。腫瘍細胞を、全部で５つの措置グループに分けた動物に皮下注射で摂取した。１×105ＭＣＡ−26細胞を、ＧＣＶ措置の完了１日後に動物の右のわき腹に注射し、２×106ＭＯＤ乳頭腫細胞をそれら動物の左のわき腹に注射した。投与された量は、投与７日後に正常なＢＡＬＢ/ｃマウスにおいて同様のサイズの目に見える腫瘍をもたらすような、腫瘍を発生させるに十分な量であった。１週間後、刺激を与えた動物において皮下腫瘍の存在が目で確かめられた。ＭＣＡ−26によって刺激を与えられた動物の数は各グループ６匹ずつで、ＭＯＤによって刺激を与えられたものは１グループあたり２〜４匹の範囲であった。
【図２２】図22は、種々の遺伝子治療を行った後の、動物における細胞毒性Ｔリンパ球反応である。ＧＣＶ投与終了後３日目に種々の措置グループの動物から、脾臓細胞を分離した。51Ｃrリリースアッセイを行う前に、５×105の照射ずみＭＣＡ−26細胞と５日間共培養することによって、６×106個の脾臓細胞にインビトロで刺激を与えた。51Ｃr放出前の日毎のＭＣＡ−26標的細胞の割合を種々のエフェクター／標的細胞比率との関連で図示した。データは３倍体培養からの平均比51Ｃr放出を示している。
【図２３】図23は、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかに対するモノクローナル抗体を用いてのＣＴＬ応答のインビトロブロッキングを示している。ＡＤＶ/ＲＳＶ−tk＋ＡＤＶ／ＲＳＶ−mＩＬ２によって措置された動物からの脾臓細胞を図５Ａに示すようにインビトロで刺激を与え、次に、これらエフェクター細胞を種々の濃度の精製した、ナトリウムアジドを含まない抗体（ＣＤ４に対するモノクローナル抗体ＧＫ15、またはＣＤ８aに対する2.43モノクローナル抗体：Pharmingen）を用いて、−37℃の温度下で30分間培養した。51Ｃrリリースアッセイはエフェクター：標的細胞の比率を50/1として行われた。
【００６６】
図面は必ずしも実寸代ではない。本発明の一定の特徴は寸法を誇張して示されており、明瞭さと簡潔さのために図式的に示してある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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