(57)【要約】      （修正有）【課題】炭素原子数40個以上の天然ゴムに類似する高分子cis−イソプレノイド類の、新規な製造方法を提供する。【解決手段】ファルネシル二リン酸（炭素原子数15）、イソペンテニル二リン酸（炭素原子数５）等の、炭素原子数20個以下の低分子イソプレノイド化合物の存在下で、インドゴムノキ等の植物の組織培養を行う、フィカプレノールＣ５５、フィカプレノールＣ６０等の、炭素原子数40個以上の高分子cis−イソプレノイド類の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素原子数20個以下の低分子イソプレノイド化合物の存在下で植物の組織培養を行うことを特徴とする、炭素原子数40個以上の高分子cis−イソプレノイド類の製造方法。
【請求項２】
前記植物がゴムノキである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゴムノキがインドゴムノキである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記低分子イソプレノイド化合物が、ファルネシル二リン酸（炭素原子数15）又はイソペンテニル二リン酸（炭素原子数５）あるいはこれらの両者である、請求項１〜３のいずれか１項の記載の方法。
【請求項５】
前記高分子cis−イソプレノイド類が、フィカプレノール（ficaprenol）C55（炭素原子数55）又はフィカプレノールC60（炭素原子数60）あるいはこれらの両者である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ファルネシル二リン酸及びイソペンテニル二リン酸の存在下でゴムノキの組織培養を行うことを特徴とする、フィカプレノールC55及びフィカプレノールC60の製造方法。
【請求項７】
前記ゴムノキが、インドゴムノキである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の組織培養を用いて低分子イソプレノイド化合物から、天然ゴムに類似する高分子cis−イソプレノイド類を合成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレノイド系化合物とは炭素数5個のイソプレン単位を基本骨格として繰り返し重合した物質で、イソプレノール（炭素原子数5個）、続いてイソプレノールを単量体とする重合体であるゲラニオール（炭素原子数10個）、ファルネソール（炭素原子数15個）及びゲラニルゲラニオール（炭素原子数20個）などのほか、更に高分子の化合物が知られておりそれらの生理活性のために医薬活性物質などとして有望視されている。
【０００３】
イソプレノイド系化合物を出発物質とし、これらを重合させることにより更に高分子のイソプレノイド系化合物を得る方法としては、微生物系を用いる方法が知られているが、植物の組織培養系では、イソプレノイド系化合物は植物細胞内に取り込まれにくいため、組織培養系によるイソプレノイド系化合物の製造は困難であると考えられてきた。
【０００４】
しかし、くりあじカボチャの組織培養を用いてゲラニル二リン酸（GPP:炭素原子数10個）とイソペンテニル二リン酸（IPP:炭素原子数5個）より、ファルネソール（FOH:炭素原子数15個）、ゲラニルゲラニオール（GGOH:炭素原子数20個）などが生成されることが確認され、植物組織培養系によりトランス（trans）型イソプレノイド系化合物が生成されることがわかっている(特願2006-042177）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
インドゴムノキから天然ゴムが採取されることが知られている。天然ゴムは、炭素数5個のイソプレン単位がシス型に重合した長鎖のイソプレノイド化合物である。本発明は、植物の組織培養を用いて低分子イソプレノイド化合物から高分子のシス型イソプレノイド類を合成するための新規な方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記の課題を解決すべく種々検討した結果、ゴムノキなどの植物の組織培養により、低分子イソプレノイド化合物から高分子のシス型イソプレノイド類を合成することが出来ることを見出し本発明を完成した。
従って本発明は、炭素原子数20個以下の低分子イソプレノイド化合物の存在下で植物の組織培養を行うことを特徴とする、炭素原子数40個以上の高分子cis−イソプレノイド類の製造方法を提供する。
【０００７】
前記植物は好ましくはゴムノキであり、例えばインドゴムノキである。前記低分子イソプレノイド化合物は、例えばファルネシル二リン酸（炭素原子数15）又はイソペンテニル二リン酸（炭素原子数５）あるいはこれらの両者である。前記分子cis−イソプレノイド類は、例えば、フィカプレノール（ficaprenol）C55（炭素原子数55）又はフィカプレノール（ficaprenol）C60（炭素原子数60）あるいはこれらの両者である。
【０００８】
本発明はまた、ファルネシル二リン酸及びイソペンテニル二リン酸の存在下でゴムノキの組織培養を行うことを特徴とする、フィカプレノールC55及びフィカプレノールC60の製造方法を提供する。この方法において、前記ゴムノキは、例えばインドゴムノキである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
植物
本発明において、組織培養を行うための植物は、当該組織培養により低分子イソプレノイド化合物から高分子のシス型イソプレノイド類を合成できるものであればよく、例えばゴムノキ、特にインドゴムノキである。
【００１０】
低分子イソプレノイド化合物
本発明の方法において使用する低分子イソプレノイド化合物としては、炭素原子数20個以下のイソプレノイド化合物、例えばジメチルアリル二リン酸（炭素原子数5個）、ゲラニル二リン酸（炭素原子数10個）、ファルネシル二リン酸（炭素原子数15個）及びゲラニルゲラニル二リン酸（炭素原子数20個）が挙げられる。これらは単独で使用してもよく、あるいは２種類以上組み合わせて使用してもよい。
【００１１】
高分子シス型イソプレノイド類
本発明の方法により得られる高分子シス型イソプレノイド類は、炭素原子数40個以上のものであり、例えば炭素原子数40〜500のものである。これらは通常、複数種類の高分子シス型イソプレノイドの混合物として得られる。例えば、フィカプレノールC55（炭素原子数55）又はフィカプレノールC60（炭素原子数60）あるいはこれらの混合物が挙げられる。
【００１２】
組織培養
本発明における組織培養を、植物の組織培養の常法に従って行うことが出来る。即ち、植物片を無菌的に培養して先ずカルスを形成させる。次に、カルスを分離することなくそれを培養した培地に、あるいはカルスを新たな培地に移した後当該新たな培地に、基質（前駆体）となる低分子イソプレノイド化合物を添加し、更に培養を続ける。この培養は固体培地上で、又は液体培地において行う。
【００１３】
培地としては、植物の組織培養において使用される常用の培地を用いればよい。培地の材料は大きく分けて、水、無機栄養素、有機栄養素、植物ホルモン、天然物質、及び支持材料から構成されている。
水としては、好ましくは、蒸留器・イオン交換樹脂・ろ過フィルターなどで、あるいはこれらを組み合わせて精製した純水が好ましい。
【００１４】
無機栄養素としては、窒素、リン、カリウム、カルシウム、マグネシウム及び硫黄の多量成分と、各種の微量成分とが必要である。用いる無機塩類の具体的な種類や量などは培地の種類により異なる。
有機栄養素としては、おもに糖とビタミンが加えられる。糖には、ショ糖、ブドウ糖、果糖などがあるが、主にショ糖が用いられる。ビタミンとしては、チアミンのほか、ピリドキシン、ニコチン酸なども補助的に用いられる。また、成長促進物質として、ミオイノシトールやアミノ酸なども加えられる。
【００１５】
植物ホルモンとしては、オーキシンとサイトカイニンが最もよく用いられている。オーキシンとしては、ナフタレン酢酸、インドール酪酸、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸などが用いられ、サイトカイニンとしてはベンジルアデニン、カイネチンなどがよく用いられる。これらは、いずれも人工的に合成された植物成長調節物質で、オートクレーブで加熱しても分解されにくい。
【００１６】
天然物質としては、ココナッツミルクやバナナ・トマトなどの搾汁、麦芽エキスなど、成長促進物質を含むものが使用され、合成培地だけでは培養の目的が果たせなかったときや、より大きな期待をするときによく用いられる。
固体培地の支持材料としては、寒天がもっともよく用いられる。
【００１７】
培養は好気的条件下で、たとえば振とう培養、通気・攪拌培養などにより行う。培養は暗所において行うのが好ましく、培養温度はおよそ25℃である。具体的な一例を以下の実施例において記載する。
【００１８】
高分子シス型イソプレノイド類の分離・採取
高分子シス型イソプレノイド類は水に不溶であり、主としてカルスを構成する培養細胞内に蓄積する。このため、高分子シス型イソプレノイドの分離は、有機溶剤抽出により行うのが好ましい。有機溶剤抽出は、カルスを含む培養液に対して行ってもよく、また培養液からカルスを分離した後にカルスに対して行ってもよい。分離したカルスからの抽出はカルスをそのまま用いて行ってもよく、またカルスを乾燥して水分を減少させてから行ってもよい。抽出効率を上げるため、カルスを粉砕した後に抽出を行ってもよい。
【００１９】
抽出のための有機溶剤は、水と非混和性であり、且つイソプレノイド類を溶解するものであればよく、ペンタン、ヘキサン、などの炭化水素類が好ましい。抽出温度は、使用する抽出溶剤の沸点以下において出来るだけ高温が好ましい。抽出後の有機溶剤は、静置、遠心分離などの常法に従って水相やカルスから分離する。分離した有機溶剤を飽和食塩水などにより洗浄することにより、不溶性の不純物を除去することが出来る。
【実施例】
【００２０】
次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１.
（１）培地の調製
培地組成
本実施例は、MS（Murashige & Skoog）培地を作成してカルスの誘導、液体振とう培養に用いた。以下に培地の成分構成を示す。
【００２１】
【表１】
2008278759.tif 000002
【００２２】
培地の作製法（固体もしくは液体培地1l作製）
ビーカーに蒸留水を入れマグネチックスターラーで撹拌しながら、表１に示した無機栄養素、有機栄養素、植物ホルモンを所定量加え、培地のpHを NaOHまたはHClでpH 5.7〜5.8に調整し、蒸留水を加えて目的の量に調整した（固体培地では寒天を加えた）。この培地を100 ml三角フラスコに、20 mlづつ分注し、オートクレーブにかけ滅菌した後、保存した。
【００２３】
（２）カルスの誘導
インドゴムノキの葉を採り、70％エタノール、及び１％次亜塩素酸ナトリウムで消毒した。雑菌などが培地につかないようにクリーンベンチ内で、葉や新芽を5 mm×5 mm位の大きさに切り、固体MS培地の上に置き、蓋をきちんとして、24℃の培養室で培養した。１週間から１ヶ月の間にカルスの形成が見られた。安定なカルスを得るため、何代か継代培養を行った。
【００２４】
（３）液体培養とイソプレノイドの反応
雑菌が入らないようにクリーンベンチ内で固体培地からカルスを取り出し、取り出したカルスを、100 ml三角フラスコに入った液体培地に移し、24℃の暗室内で振とう暗培養を行った。上記の液体培養20 mlに、５mM ファルネシル二リン酸（FPP）0.5 ml、及び５mM イソペンテニル二リン酸（IPP）1.0 mlを添加して、20日間、24℃、毎分100回転（100rpm)で振とう暗培養した。
【００２５】
（４）高分子イソプレノイドの抽出
20日間振とう暗培養の後、生成した高分子イソプレノイドの抽出を行った。即ち、培養液１本(全量で21.5 ml)を100mlの分液ロートに入れ、この分液ロートにペンタン15mlを入れ、300回振り、30分静置させ、水層を別の100mlの分液ロートに移した。水層の入った分液ロートに、ペンタン15ml入れ300回振り、30分静置させ、水層と有機層とを分液した。この操作を5回繰り返した。
【００２６】
一緒にした有機層を入れた分液ロートに、飽和食塩水を20ml入れて軽く30回振り、静置してきれいに有機層と水層を分けた。分離した有機層に、さらに再蒸留水を20ml入れ、軽く20回振り、静置して有機層と水層とをきれいに分けた。この操作を２回繰り返した。分離した有機層に、MgSO4(無水)を入れ脱水した。分離した有機層をセライトにより濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮した。抽出物の粗収量は0.1365gであった。
【００２７】
（５）生成物の確認
HPLCによる分析
生成物の確認のため、生成物として予想されるフィカプレノール（ficaprenol）C55,60の標品と、上記（４）で得た反応生成物とを、HPLC分析により比較した。結果を図１に示す。図１のＡはフィカプレノール標品の分析結果であり、図１のＢは反応生成物の分析結果であり、そして図１のＣはフィカプレノール標品と反応生成物との混合物（Double injection）の分析結果である。これらの分析結果が一致したことから、生成物がフィカプレノールC55,60であることが確認された。
【００２８】
逆相TLCによる分析
生成物の確認をするため、生成物として予想されるフィカプレノール（ficaprenol）C55,60の標品と、上記（４）で得た反応性生物とを、逆相TLC（薄層クロマトグラフィー）分析により比較した。薄層板として逆相LKC18プレートシリカゲル60（WHATMAN社）を用い、展開液としてアセトン：水（9:1）混液を用いた。結果を図２、及び下記の表２に示す。フィカプレノールC55及びフィカプレノールC60のRf値がそれぞれ0.11及び0.08であるのに対し、反応生成物は0.11及び0.09のRf値を示し、反応生成物がフィカプレノールC55及びフィカプレノールC60の混合物であることが確認された。
【００２９】
【表２】
2008278759.tif 000003
【００３０】
なお、本発明に関連する物質の構造式を下に示す。
【化１】
2008278759.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、フィカプレノール（ficaprenol）C55,60の標品と、実施例で得た反応生成物との、HPLC分析の結果を示す図である。Ａはフィカプレノール標品の分析結果であり、Ｂは反応生成物の分析結果であり、そしてＣはフィカプレノール標品と反応生成物との混合物（Double injection）の分析結果である。
【図２】図２は、フィカプレノール（ficaprenol）C55,60の標品と、実施例で得た反応生成物とを、逆相TLC（薄層クロマトグラフィー）分析した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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