(57)【要約】【課題】簡易に塹壕熱病原体を検出できる方法及びこの方法に利用できる検出用キットを提供。【解決手段】被検体を、塹壕熱病原体遺伝子のITS1の領域を鋳型として増幅し得る２つのＰＣＲプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、ＤＮＡ増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出する方法。ＰＣＲプライマーセット、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含む塹壕熱病原体遺伝子の検出用キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体を、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として増幅し得る２つのＰＣＲプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、ＤＮＡ増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法。
【請求項２】
前記プライマーセットが、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなる請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
前記プローブがTaqManMGBプローブである請求項１または２に記載の検出方法。
【請求項４】
前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するＤＮＡである請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項５】
前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
前記サーマルサイクルが、蛍光発光検出用サーマルサイクラーを用いて行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項７】
配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなる少なくとも1種のＰＣＲプライマーセット、
5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キット。
【請求項８】
前記プローブは前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有する請求項７に記載の検出用キット。
【請求項９】
前記プローブがTaqManMGBプローブである請求項７または８に記載の検出用キット。
【請求項１０】
前記プローブが、配列表の配列番号５または６で示される塩基配列を有するＤＮＡである請求項７または８に記載の検出用キット。
【請求項１１】
前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである請求項７〜９のいずれか１項に記載の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シラミ媒介性感染症として知られる塹壕熱の病原体である塹壕熱病原体（Bartonella quintana）遺伝子の検出方法及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国をはじめとする国々において路上生活者の増加が大きな社会問題となっている。第一次世界大戦に大きな問題となった塹壕熱が、再興感染症として路上生活者を中心にフランス、ロシア、アメリカあるいはブルンジの難民、チリの田舎に住む人々などで問題となっている。そこで、塹壕熱病原体（Bartonella quintana）を検出することが必要とされ、分離培養やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による検出が行われている（非特許文献１参照）。
【非特許文献１】Journal of Clinical Microbiology, Mar. 1999, p596-599
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、上記の分離培養には１から３ヶ月の月日を要し技術的に困難な面もある。また、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による検出が行われているが、シークエンシングをして遺伝子の配列を読まなければ塹壕熱病原体（Bartonella quintana）と同定できない。そこで、本発明は分離培養やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物のシークエンシングによる検出によらない、より簡易に塹壕熱病原体（Bartonella quintana）を検出できる方法及びこの方法に利用できる検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前記の課題を解決するために、本発明者は、TaqManプローブ法を用いたPCR法より速い塹壕熱病原体（Bartonella quintana）を迅速かつ確実に検出できる方法及び検出用キットについて検討し、塹壕熱病原体（Bartonella quintana）のintergenic spacer region (ITS)1の領域を対象としたリアルタイムPCR法によって、上記課題が解決できることを見いだして本発明を完成させた。
【０００５】
本発明は、以下の通りである。
[１]被検体を、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として増幅し得る２つのＰＣＲプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、ＤＮＡ増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法。
[２]前記プライマーセットが、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなる[１]に記載の検出方法。
[３]前記プローブがTaqManMGBプローブである[１]または[２]に記載の検出方法。
[４]前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するＤＮＡである[１]〜[３]のいずれかに記載の検出方法。
[５]前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである[１]〜[４]のいずれかに記載の検出方法。
[６]前記サーマルサイクルが、蛍光発光検出用サーマルサイクラーを用いて行われる[１]〜[５]のいずれかに記載の検出方法。
[７]配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなる少なくとも1種のＰＣＲプライマーセット、
5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キット。
[８]前記プローブは前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有する[７]に記載の検出用キット。
[９]前記プローブがTaqManMGBプローブである[７]または[８]に記載の検出用キット。
[１０]前記プローブが、配列表の配列番号５または６で示される塩基配列を有するＤＮＡである[７]または[８]に記載の検出用キット。
[１１]前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである[７]〜[９]のいずれか１項に記載の検出用キット。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、塹壕熱病原体の検出が培養やPCRによる方法より迅速に行われることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
[検出方法]
本発明の塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として、２つのＰＣＲプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いてＤＮＡを増幅し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする。
【０００８】
塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の塩基配列は、既に、公知であり、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&qty=1&c_start=1&list_uids=49239191&uids=&dopt=gb&dispmax=5&sendto=&fmt_mask=0&extrafeatpresent=1に掲載されている。その内のintergenic spacer region (ITS)1の領域は、16S rRNA遺伝子と23S rRNA遺伝子に挟まれた変異の多い領域である。
【０００９】
本発明では、変異の多い領域であり、細菌の型判別に好都合であるという観点から、上記ITS1領域を鋳型として、リアルタイムPCR法を行い、蛍光発色によって、検体中の塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の存在の有無、あるいは存在の程度を検出する。
【００１０】
本発明の方法に用いる２つのＰＣＲプライマー(プライマーセット)は、例えば、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡのセット、または配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡのセットであることができる。配列番号1〜4で示される塩基配列を有するＤＮＡは、本発明の方法においてプライマーとして機能し得る範囲において、塩基数が配列表に示された数より、少ないＤＮＡであっても、多いＤＮＡであっても良い。塩基数が配列表に示された数より少ないＤＮＡの場合、具体的には、1、2、3、4または5個塩基が少ないＤＮＡであることができる。塩基数が配列表に示された数より多いＤＮＡの場合、具体的には、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個塩基が多い(追加された)ＤＮＡであることができる。但し、多いＤＮＡの場合、追加される各塩基は、鋳型であるITS1領域の塩基配列と相補的である塩基とする。ＰＣＲプライマーは、配列表に示された塩基配列に従って公知の方法により合成することができる。
【００１１】
前記プローブは、使用されるＰＣＲプライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブである。使用されるＰＣＲプライマーセットが、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡのセットである場合、前記プローブは、配列表の配列番号５で示される塩基配列を有するＤＮＡであることができる。使用されるＰＣＲプライマーセットが、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡのセットである場合、前記プローブは、配列表の配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡであることができる。
【００１２】
上記配列番号１〜６の各ＤＮＡの、ITS1領域(配列番号11)における対応関係を図１〜３に示す。配列番号１〜６の各ＤＮＡの塩基配列は、特に、図３に示すように、異なる株に由来する塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のITS1領域のいずれについても共通する。さらに、上記配列番号１〜４のプライマーセット用の各ＤＮＡの塩基配列は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)と類似する猫引っかき病（Bartonella  henselae）のITS1領域とは、配列が異なり、その結果、本発明の方法は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の検出に高い特異性を示す。この点は後述の実施例において具体的に示す。
【００１３】
蛍光タグ及びクエンチャーは、公知の材料から適宜選択できる。前記プローブは、例えば、TaqManMGBプローブであることができる。TaqManMGBプローブは、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から提供されているリアルタイムPCR法用のプローブである。このプローブは、Tm EnhancerであるMGB(Minor Groove Binder)構造を有し、Tm値70℃のプローブを20塩基以下の長さで設計することができる。さらに、短いプローブ長により1塩基置換のTm差がより顕著に出る。Non Fluorescent Quencherによりバックグラウンドが低くなるため、定量解析にも有効である。
【００１４】
前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、サーマルサイクルに耐え得る耐熱性を有するポリメラーゼであれば、いずれのポリメラーゼも使用できる。そのような5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとしては、例えば、Taqポリメラーゼを挙げることができる。
【００１５】
本発明の方法では、被検体を、上記プライマーセット、プローブ及びポリメラーゼを用いた、ＤＮＡ増幅のためのサーマルサイクルに供し、上記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出する。被検体は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)への感染が疑われる者から採取した生物試料であることができ、そのような生物試料としては、例えば、血液やコロモジラミ等を挙げることができる。この生物試料は、前処理を施した後に、上記サーマルサイクルに供する。前処理としては、例えば、DNA抽出等を挙げることができる。サーマルサイクルに供する生物試料（未処理）の量は、検出感度等を考慮して、コロモジラミ1匹以上、好ましくは１〜２０匹の範囲、凍結血液は、300μl以上、好ましくは300〜1000lの範囲とすることができる。
【００１６】
上記プライマーセット、プローブ及びポリメラーゼの１回のサーマルサイクルでの使用量は、使用する生物試料やそこに含まれる塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のITS1領域の量を考慮して適宜決定できる。塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子（ITS1領域）の量が例えば、10コピー以上である場合、プライマーセット、プローブ及びポリメラーゼの量は、例えば、以下の範囲にすることができる。
プライマーセット0.1〜1μM
プローブ0.1〜1μM
ポリメラーゼ10〜100U/ml
【００１７】
前記サーマルサイクルは、蛍光発光検出用サーマルサイクラーを用いて行うことができる。蛍光発光検出用サーマルサイクラーは市販品を用いることができる。このサーマルサイクラーによれば、ＤＮＡの増幅と発色の検出をしつつ装置で実施することができる。サーマルサイクルの条件は、通常のリアルタイムPCR法で採用される条件と同様とすることができ、例えば、９５℃１０秒を１サイクル、９５℃５秒及び６０℃３１秒を４５サイクルとすることができる。
【００１８】
［検出用キット］
本発明は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キットを包含する。本発明の検出用キットは、
（１）配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するＤＮＡである２つのＰＣＲプライマーからなる少なくとも1種のＰＣＲプライマーセット、
（２）5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
（３）5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む。
【００１９】
ＰＣＲプライマーセット、プローブ及びポリメラーゼは、前述の検出方法で説明したものと同様のものである。本発明の検出用キットは、上記各材料を、１回の検出に適した形態に分析用容器に適宜収納されたものであることができる。
【００２０】
さらに、１つ（１セット）の検出用キットには、前述の１回のサーマルサイクルでの使用量を考慮して決定した量のＰＣＲプライマーセット、プローブ及びポリメラーゼを含むことができる。即ち、
プライマーセット0.1〜1μM
プローブ0.1〜1μM
ポリメラーゼ10〜100U/ml
とすることができる。
【００２１】
本発明の検出用キットは、上記以外に本発明のキットの使用方法等を記載した説明書を含むこともできる。
【００２２】
実施例
次に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【００２３】
（ゲノム遺伝子の抽出）
コロモジラミ (Pediculus humanus humanus) をMixer Mill MM300 (Qiagen社製) により破砕し、IsoQuick (ORCA Research社製) を用いてゲノムDNAを抽出した。Bartonella henselaeの抽出は、ChargeSwitch gDNA Mini Bacteria Kit (Invitrogen社製)で行った。なお、Bartonella henselae (ATCC49882) は佐々木次雄博士（国立感染症研究所細菌二部）より供与を受けた。
【００２４】
（Bartonella quintanaの16S-23S rRNA intergenic spacer region (ITS) 1の増幅）
Bartonella quintanaのITS1の領域を増やすために、Bartonella 属特異的ITS1のプライマーであるQHVE1のプライマー(TTCAGATGATGATCCCAAGC)(配列番号７)とQHVE3のプライマー (AACATGTCTGAATATATCTTC) （配列番号８）を作製し、抽出したゲノムDNAを鋳型にしてAccu Power PCR PreMix (Bioneer社製)やα-TaqDNA polymerase (Bionex社製)を用いてPC701 (ASTEC社製)やMyCycler (Bio-Rad社製)でPCR反応を行った。さらに、PCR産物を鋳型にしてQHVE12プライマー (CCGGAGGGCTTGTAGCTCAG)（配列番号９）やQHVE14プライマー（CACAATTTCAATAGAAC）（配列番号１０）を用いたnested PCR反応を行った。その後、TAクローニングをpGEM-T Easy Vector with DH5 (Promega社製)を用いて行った。BigDye Terminator ver 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem社製)によって遺伝子配列を決定した。遺伝子配列から米国National Center for Biotechnology Information (NCBI) のblastnで相同性検索を行い、Bartonella quintanaのITS1であることを確認した。
【００２５】
（TaqMan Probe法）
ITS1のプラスミドを標準物とするため、プラスミドをEcoRIで切断しリニアにした。プローブとプライマーの配列は表１に示した。Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara社製)を試薬として用い、９５℃１０秒を１サイクル、９５℃５秒及び６０℃３１秒を４５サイクルの反応をiCycler (Bio-Rad社製)にて行った。各試薬の使用量は、プライマーセット0.2μM、プローブ0.2μM、Premix Ex Taq 1x concentration (ポリメラーゼ 25 U/ml)とした。
【００２６】
【表１】
2008154479.tif 000002
【００２７】
［検出］
図４に、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子のコピー数を変えて、リアルタイムPCR によって検出した結果を示す。AはプローブとしてITS1-pを用い、プライマーセットとしてITS1-ss1及びITS1-aa1を用いた結果である。BはプローブとしてITS1-p2を用い、プライマーセットとしてITS1-ss2及びITS1-aa2を用いた結果である。この結果から、いずれのプローブ及びプライマーセットを用いた場合にも、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子を、コピー数１０以上であれば、良好に検出できることが分かる。
【００２８】
［検出の特異性］
図５には、本発明のTaqManプローブ法に用いた塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子検出方法の特異性を検証するために、ネガティブサンプルとして2003年4月21日に路上生活者から採取され、PCRの検出で陰性のコロモジラミサンプル、ポジティブサンプルとして1999年10月27日に路上生活者から採取され、PCRの検出で陽性のコロモジラミサンプル、比較対象サンプルとして猫引っかき病（Bartonella  henselae）を用いて、図４の場合と同様のプローブ及びプライマーセットを用いてTaqManプローブ法を実施した。図５において、AはプローブとしてITS1-pを用い、プライマーセットとしてITS1-ss1及びITS1-aa1を用いた結果である。BはプローブとしてITS1-p2を用い、プライマーセットとしてITS1-ss2及びITS1-aa2を用いた結果である。この結果から、本発明の方法は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子検出に高い特異性を有することが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
塹壕熱病原体の迅速診断薬として利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】配列番号１〜６の各ＤＮＡの、ITS1領域（１本鎖）における対応関係を示す。
【図２】配列番号１〜６の各ＤＮＡの、ITS1領域（２本鎖）における対応関係を示す。
【図３−１】配列番号１〜６の各ＤＮＡの、由来が異なる３つの塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子及び猫引っかき病（Bartonella  henselae）のITS1領域における対応関係を示す。
【図３−２】配列番号１〜６の各ＤＮＡの、由来が異なる３つの塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子及び猫引っかき病（Bartonella  henselae）のITS1領域における対応関係を示す。
【図４】塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子をリアルタイムPCR によって検出するグラフである。A, ITS1-p, ITS1-ss1, ITS1-aa1; B, ITS1-p2, ITS1-ss2, ITS1-aa2
【図５】TaqManプローブ法に用いた塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子検出の特異性である。A, ITS1-p, ITS1-ss1, ITS1-aa1; B, ITS1-p2, ITS1-ss2, ITS1-aa2
【図１】
2008154479.tif 000003
【図２】
2008154479.tif 000004
【図３−１】
2008154479.tif 000005
【図３−２】
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【図４】
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【図５】
2008154479.tif 000008
【配列表】
2008154479000001.app