(57)【要約】      （修正有）【課題】星状細胞限定前駆細胞、前記細胞を含む医薬組成物および前記細胞の利用方法を提供する。【解決手段】ＣＤ４４免疫反応性であり、乏突起膠細胞ではなく星状細胞を発生する、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の単離された純粋均質集団、前記細胞の集団を神経組織又は神経細胞のソースから単離する方法、前記細胞の集団および薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物、および前記細胞を神経細胞へ投与することを含む神経系へ受傷した哺乳動物を処置する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団であって、前記哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の集団が、ＣＤ４４免疫反応性であり、乏突起膠細胞ではなく星状細胞を発生する、前記純粋均質集団。
【請求項２】
請求項１に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団を単離する方法であって、神経組織または神経細胞のソースから、ＣＤ４４免疫反応性を示す細胞の集団を単離することを含む、前記方法。
【請求項３】
請求項１に記載の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項４】
薬学的に許容し得る担体が、星状細胞限定前駆細胞が播種または被覆されているインプラントである、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
受傷した神経細胞を処置する方法であって、請求項３に記載の医薬組成物を受傷した神経細胞へ投与することを含む、前記方法。
【請求項６】
医薬組成物が、受傷した神経細胞への直接注入によって、受傷した神経細胞へ投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
医薬組成物が、星状細胞限定前駆細胞が播種または被覆されているインプラントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
医薬組成物が、受傷した神経細胞の部位またはその近くに移植される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
医薬組成物を受傷した神経細胞へ投与することで、受傷した神経細胞の髄鞘形成を増大させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
医薬組成物を受傷した神経細胞へ投与することで、受傷した神経細胞における瘢痕形成を減少させる、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本願は、本明細書にその全体が参照によって組込まれる２００２年１月２３日提出の米国仮出願No. 60/351,036からの優先権の利益を主張する。
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）の提供する基金によって、一部支援を受けた（承認No. 5R29NS35087-05）。したがって、米国政府も本発明においてある種の権利を有しうる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ＣＤ４４免疫反応性であり、乏突起膠細胞ではなく星状細胞を発生する、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞（astrocyte restricted precursor cells）の均質な純粋集団（pure population）に関する。本発明はまた、これら哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の均質な純粋集団を単離する方法に関する。加えて、本発明は、新しい移植技術の開発における哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の使用に関し、また動物への投与による髄鞘形成の増大および／またはネクロシスおよびグリア（glial）瘢痕形成の減少に関する。したがって、星状細胞限定前駆細胞およびそれを含む医薬組成物は、何らかの方法で神経組織を傷つける外傷性傷害（trauma）または疾患から生じる神経系の障害を処置するのに用いられ得る。当該細胞はまた、発生の選択されたステージに特異的な哺乳動物の遺伝子を同定するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
神経の発生は、げっ歯動物においてよく特徴づけられてきた。ネスチン免疫反応性であり、星状細胞、ニューロンおよび乏突起膠細胞に分化しうる多能性細胞は、発生の種々のステージにおいて多数の研究者によって同定されてきている。多能性前駆体に加えて、他のより限定された前駆体（restricted precursors）もまた同定されてきている。細胞の異なる集団は、培養条件、自己複製能、並びにそれらの移植後の一体化の能力（ability to integrate）および分化能の相違によって、判別することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ヒト組織を用いた同様の研究は、神経前駆体の多型の存在をも指し示している。多能性ヒト神経幹細胞（hNSCs）は、胎児および成体の組織から単離されてきた（Chalmers-Redman et al. Neuroscience 1997 76:1121-1128; Svendsen et al. J. Neuroscience Methods 1998 85:141-152; Vescovi et al. Exp. Neurology 1999 156:71-83; Carpenter et al. Exp. Neurology 1999 158:265-278; Quinn et al. J. Neuroscience Res. 1999 57:590-602; Piper et al. J. Neurophysiology 2000 84:534-548）。当該細胞は、グリアおよびニューロンを生じ、異なる培養条件下で増殖でき、そして異なる成長因子の要求を示す。
【０００５】
ヒトニューロン限定前駆体もまた記述されてきた（Piper et al. J. Neurophysiol. 2000 84:534-548）。パイパーら（Piper et al.）は、ニューロン前駆細胞を単離するためにＥ−ＮＣＡＭ免疫反応性を用い、一方で、ゴールドマン（Goldman）および共同研究者らは、ニューロン前駆体を単離するためにニューロン特異的プロモーターを用いた（Roy et al. Nat. Med. 2000 6(3):271-7; Roy et al. J. Neurosci. Res. 2000 59(3):321-31; Wang et al. Dev. Neurosci. 2000 22(1-2):167-76）。ヒトニューロン限定前駆細胞は、成体の脳室領域（ventricular zone）および海馬から、並びに、発達の多段階における胎児の組織から単離されてきた。当該細胞は、そのＮＣＡＭ、アルファ−１チューブリンおよびベータ−ＩＩＩチューブリンなどの初期の神経のマーカーの発現によって、ヒト神経上皮細胞と異なる。
【０００６】
増殖性成体ヒト乏突起膠細胞前駆体は、成体白質（Prabhakar et al. Brain Res. 1995 672(1-2):159-69, Raine et al. Lab. Invest. 1981 45(6):534-46; Scolding et al. Neuroreport 1995 6(3):441-5; Scolding et al. Neuroscience 1999 89(1):1-4）から、細胞表面マーカーを用いて単離されてきた。他に、乏突起膠細胞およびその前駆体を胎児および成体組織から単離するために、プロモーター−レポーター構築物を用いてきた。Ａ２Ｂ５免疫反応性は、星状細胞および乏突起膠細胞に分化し得るグリア前駆体を単離するために活用されてきた（米国特許第6,235,527号）。
【０００７】
クイン（Quinn）および共同研究者ら（J. Neurosci. Res. 1999 57:590-602）は、長期培養後、性質が変化し得る多能性幹細胞の混合集団を記載している。当該細胞は、星状細胞限定前駆細胞であると示唆されてきた。しかしながら、乏突起膠細胞の分化は、試験されていない。さらに、抗原の発現、サイトカイン依存性、増殖因子に対する応答、ＧＦＡＰ／Ｓ１００の発現またはＡ２Ｂ５に関する有用な情報はない。クインらの細胞は、培養したヒト脊髄組織から、逐次継代（sequentially passaging）によって多能性幹細胞を得た。
【０００８】
推定される星状細胞前駆細胞もまた、バレスら（Barres et al.）によって記載されている（J. Neurosci. 1999 19(3):1049-61）。この細胞は、視神経から単離され、脳の他のどの場所においても、その存在は知られていない。この細胞は、Ａ２Ｂ５免疫反応性であり、したがって、乏突起膠細胞前駆体Ｏ２Ａに似ている。該細胞は、主に、Ｏ２Ａ細胞が容易に乏突起膠細胞を発生する条件下で、乏突起膠細胞に発達し損なうことによって、Ｏ２Ａ細胞と区別することができる。この細胞は、Ｐａｘ−６陽性であり、血清に曝されると死ぬ。ＣＤ４４との免疫反応性は知られていない。
【０００９】
シードマンら（Siedman et al.）（Brain Res. 1997 753(1):18-26）もまた、不死化したグリア前駆細胞由来の星状細胞細胞系を記載している。この不死化前駆細胞についての利用できる情報は少なく、その抗原的特徴およびニューロンへの分化の可能性は開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、星状細胞限定前駆細胞、それを含む医薬組成物、および神経系へ受傷した哺乳動物を処置するための星状細胞限定前駆細胞の利用方法に関する。本発明の星状細胞限定前駆細胞は、不死化されていない。該細胞はＡ２Ｂ５を発現しない。さらに該細胞は、幹細胞集団および先駆細胞集団と、ＣＤ４４の発現および他の集団がニューロンまたは乏突起膠細胞に分化する条件下で、星状細胞に分化する能力によって異なる。
したがって、本発明の１つの面は、ＣＤ４４免疫反応性であり、乏突起膠細胞ではなく星状細胞を発生することができる、単離された、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団に関する。
【００１１】
本発明の他の面は、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団を単離するための方法に関する。本発明の方法において、星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団は、ＣＤ４４免疫反応性を介して、哺乳動物細胞の異種または混合集団から単離される。
本発明の他の面は、これら哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞を用いた新しい移植技術の開発のための方法に関する。
【００１２】
本発明の他の面は、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞を含む医薬組成物および当該組成物を神経系の損傷を有する患者の処置のために使用する方法に関する。一態様において、該組成物および方法は、哺乳動物のニューロン細胞の髄鞘形成を増強するために用いられる。他の態様において、前記組成物および方法は、グリアの瘢痕形成およびネクロシスを減少するために用いられる。
本発明の他の面は、これら星状細胞限定前駆細胞を用いた発達の選択されたステージに特異的な哺乳動物の遺伝子を同定する方法に関する。
【００１３】
発明の詳細な記述
神経系における細胞置換のためには、分化した細胞が究極的に要求される。しかしながら、多数の研究によって、分化した細胞は移植の後、あまり生存しないことが示された。そのため、数人の研究者は、前駆細胞の使用に焦点を絞り、前駆細胞が無傷または受傷した脳で生存し、一体化することを示している。
【００１４】
本発明は、哺乳動物の胚性または胎児組織、哺乳動物の胚性幹（ＥＳ）細胞培養物およびグリア限定前駆細胞など、これらに限定されないが、種々の哺乳動物の神経組織および／または細胞のソースから単離され得る、哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋な均質集団に関する。本発明はまた、前記のような組織や細胞から、星状細胞限定前駆細胞の純粋な均質集団を単離する方法に関する。
本発明の目的のために、「純粋」によって、同じ特性のものが９５％以上、より好ましくは９９％以上存在する細胞の集団が意味される。
【００１５】
好ましい態様において、星状細胞限定前駆細胞が単離される哺乳動物の組織または細胞は、げっ歯動物またはヒトのものである。しかしながら、本開示を読めば当業者が理解するであろうとおり、本明細書において教示する単離の方法もまた、これらに限定されないが、ヒト以外の霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジなどを含む他の哺乳動物由来の細胞または組織にも、日常的に適合できる。
【００１６】
本明細書に示したとおり、本発明の星状細胞限定前駆細胞はＣＤ４４を発現する。分化の前に、当該細胞はネスチンもまた発現する。バレスら（Barres et al.）(J.  Neurosci 1999 19(3):1049-61)の推定の星状細胞限定細胞と異なり、本発明の星状細胞限定前駆細胞は、Ａ２Ｂ５を発現しない。本発明の細胞はまた、ＰＳＡＮＣＡＭを発現しない。本発明の細胞は、ＦＧＦおよびＥＧＦにおいて、良好に増殖する。本発明のＣＤ４４陽性細胞は、当初は、ＧＦＡＰ、ビメンチンまたはＳ−１００を発現しないが、ＧＦＡＰ、ビメンチンおよび／またはＳ−１００陽性細胞へ分化する潜在能力を有する。分化すると、本発明の細胞は、そのＣＤ４４免疫反応性は維持するが、ネスチンの発現は失う。
【００１７】
したがって、本発明のＣＤ４４陽性細胞は、グリア限定前駆細胞、多能性幹細胞、神経前駆体およびバレスら（Barres et al.）（J. Neurosci. 1999 19(3):1049-61）によって記載された推定の星状細胞前駆体から、抗原発現、サイトカイン依存性および分化能に基づいて、容易に判別できる。バレスらの細胞と本発明の星状細胞限定前駆（ＡＲＰ）細胞の特徴の対比を提示する表１を参照。
【表１】
2008289486.tif 000002
【００１８】
星状細胞限定前駆細胞は、ＧＦＡＰ免疫反応性の獲得の前に、発達している哺乳動物の脳において存在する。加えて、ＣＤ４４＋星状細胞限定前駆細胞は、グリア限定前駆体（ＧＲＰ）から生じ得、ＧＲＰ細胞とは、抗原発現、サイトカイン依存性および分化能によって判別され得る。
クローン分析（Clonal analysis）は、培養において増殖しているときにはＧＦＡＰ−であるネスチン＋細胞の部分集団（subset）は、星状細胞へのみ分化することを示している。この部分集団はかなり大きく、分析した細胞のおよそ１１％を構成する。
【００１９】
該ネスチン＋／ＧＦＡＰ−細胞集団を標識するであろう細胞表面マーカーを同定するために、種々のマーカーを試験した。ＣＤ４４が当該グリア集団に特異的であることを見出した。ＣＤ４４の発現は、ＧＦＡＰおよびＳ−１００などの星状細胞のマーカーとともに局在した。ＣＤ４４＋細胞は、ＲＣ１陰性であり、Ａ２Ｂ５を共発現しなかった。ＣＤ４４＋細胞の小さな部分集団は、ネスチン免疫反応性であるが、ＧＦＡＰ陰性であり、したがって、当該細胞が星状細胞前駆細胞集団に相当することが示された。
【００２０】
ＣＤ４４陽性細胞の数は少なく、一般的にＥ１５から成体の任意の発達ステージに存在する細胞数の１〜１０％の範囲であり、星状細胞が分化する条件下での培養の後、増加する。ＣＤ４４陽性細胞は、培養中、分裂し、ＧＦＡＰを低レベルで発現する。ＧＦＡＰの発現は分化の後に増大し、一方、ＣＤ４４の発現は下方調節される。ＣＤ４４陽性細胞は、Ａ２Ｂ５またはＰＬＰを発現せず、したがって、二分化能のグリア制限前駆細胞から判別され得る。ＣＤ４４の発現は、マクロファージおよび損傷後の星状細胞など他の細胞型において記述されているが、本明細書中で用いた分化条件下、ＣＤ４４発現は、星状細胞に制限されているから、本明細書で教示した手法にしたがって星状細胞限定前駆細胞を同定するのに用いることができる。
【００２１】
したがって、本明細書に示すとおり、ＣＤ４４発現は、限定されないが、哺乳動物のＥＳ細胞培養物などを含む神経組織および哺乳動物胎児性または胚性組織並びにグリア限定前駆細胞の種々のソースから星状限定前駆細胞を同定および単離するために用いることができ、また、グリア限定前駆細胞を単離するためのＧＲＰＳ法は、米国特許第6,235,527号に記載され、その教示はその全体が参照として本明細書に組込まれる。星状細胞限定前駆細胞のこの集団は、不死化されない。さらに、細胞集団は、Ａ２Ｂ５を発現せず、そのＣＤ４４の発現および他の集団がニューロンまたは乏突起膠細胞へ分化する条件下で星状細胞へ分化する能力において、幹集団および前駆集団と異なる。
混合した細胞集団からＣＤ４４陽性星状細胞限定前駆細胞を単離するための種々の方法を用いることができる。
【００２２】
一態様において、哺乳動物の神経管は、星状細胞発達後のステージ、例えば、ヒトにおいて、１０週後またはげっ歯動物においてＥ１６後などに解離し、解離した細胞は、単細胞懸濁液に粉砕され、抗ＣＤ４４抗体で標識される。標識された細胞は、一次抗体を標的とする蛍光に標識された二次抗体を用いて視覚化され、標識された細胞は、選抜法を用いて単離される。
【００２３】
本発明に有用な選抜法の例としては、限定されないが、イムノパニング法（immunopanning）、磁気ビーズ法（magnetic bead sorting）および／またはＦＡＣＳ法（FACS sorting）が含まれる。本分野において、詳細な磁気ビーズ法およびＦＡＣＳ法のプロトコールはよく知られており、選択マーカーとしてのＣＤ４４の使用に日常的に適合させることができる。さらに、本開示を読めば当業者に理解されるであろうとおり、ネガティブ並びにポジティブ選択法を用いることができる。したがって、本発明の星状細胞限定前駆細胞の豊富化（enrichment）は、ＣＤ４４を発現し、Ａ２Ｂ５またはＥ−ＮＣＡＭを発現しない混合集団細胞、またその逆のものから再選抜することによって達成することができる。ポジティブおよびネガティブ選択法は、任意の配列で用いることができ、そして、Ａ２Ｂ５またはＥ−ＮＣＡＭに類似する結合プロフィールを有する抗体を用いることができる。
【００２４】
他の態様において、神経管は、神経管閉鎖（例えば、マウスにおいてＥ８．５、ラットにおいてＥ１０．５およびヒトにおいて妊娠５週など）後、任意のステージにおいて解離され、細胞は、５〜４０日間、接着培養によって維持される。次いで細胞を培養物から除去し、ＣＤ４４陽性細胞を、前段落に記載のとおり、選抜法を介して単離する。
【００２５】
他の態様において、Ａ２Ｂ５＋細胞は単離される。次いで細胞は、星状細胞促進条件での増殖によって、培養において分化が誘導される。星状細胞促進条件には、限定されないが、骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、オンコスタチンＭ、血清、白血病抑制因子／繊毛様神経栄養因子（ＬＩＦ／ＣＴＮＦ）並びに、インターロイキン−６などのサイトカイニンファミリーの他のメンバーが単独か最低３日間の組合せで含まれることを意味する。好ましい態様において、これらの剤は、１〜５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加される。次いで、ＣＤ４４＋細胞は、前述の選抜法を介して単離される。
【００２６】
近年、ヒト胎児組織由来の神経細胞が、Cambrex (East Rutherford, NJ)、Clonexpress (Gaithersberg, MD)、ScienCell Research Laboratories (San Diego, CA)およびClonetics (San Diego, CA)などの商業的供給源から利用可能になった。当該細胞は、本明細書で教示する方法により本発明の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の単離のための、神経組織および／または細胞のソースとして役立つ。
【００２７】
ヒトＥＳ細胞系の星状細胞限定前駆細胞のソースとしての使用もまた、３つのヒト細胞系（Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９）において示された。ヒトＥＳ細胞は、後に分化したニューロンを発生するニューロン前駆体へ分化することが、既に示されている（Carpenter et al. Exp. Neurol. 2001 172(2):383-97）。本発明において、ニューロンまたはグリアのマーカーを発現する分裂前駆細胞（dividing precursor cells）は、最初に、ＥＳ細胞において同定された。分化条件は、本明細書に記載され、ニューロンの発生に使われたものと類似する。
【００２８】
特に、ＥＳ細胞の分化の最初のステージは、１０μＭオールトランスＲＡ（all trans-RA）を添加または無添加のＦＢＳ培地において、胚体（ＥＢｓ）の形成によって誘導される。懸濁４日後、１０ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ、１ｎｇ／ｍＬ ｈＰＤＧＦ−ＡＡおよび１ｎｇ／ｍＬ ｈＩＧＦ−１を補った規定の増殖培地のフィブロネクチン被覆プレート上にＥＢｓを播いた。これらの条件で、ＥＢｓはプレートに接着し、細胞はプレート上で移動し、増殖し、単層を形成する。これらの条件で３日後、ニューロンの形態を備えた多くの細胞が存在した。同様の結果が各ヒトＥＳ細胞系についてみられた。
【００２９】
分裂細胞集団の複数のタイプは、細胞表面エピトープを認識する抗体に基づいて、分化ＥＳ細胞の培養において同定することができる。これらには、Ａ２Ｂ５＋細胞、ＰＳＡＮＣＡＭ＋細胞およびＣＤ４４＋細胞が含まれる。分化後の二重標識実験によって、ＥＳ細胞のＣＤ４４＋細胞が形態学的、抗原的およびその星状細胞への分化能において、神経組織および細胞の他のソースから単離された本願発明の星状細胞限定細胞と同様のユニークな細胞集団であったことが示された。
【００３０】
本発明の星状細胞限定前駆細胞は、種々の用途を有している。
例えば、当該細胞は、新規の移植技術の開発のために、ヒト以外の哺乳動物モデルにおいて用いることができる。
さらに、当該細胞は、神経損傷およびより具体的には星状細胞の変性（degeneration）によって特徴づけられる疾患において、哺乳動物、より好ましくはヒトに治療的に用いることができる。特に、本発明の星状細胞限定前駆細胞の投与は、ニューロンの髄鞘形成の増強に有用であることが予期される。当該細胞はまた、投与後、当該細胞の生存および増殖を増強する新規薬剤を同定することに有用である。
【００３１】
本細胞はまた、瘢痕の減退においても用いることができる。胎児星状細胞が移植された場合、脳に組込まれ得ることは、よく知られている。胎児細胞は、成体細胞とは対照的に、成体グリア細胞の増殖および瘢痕形成を減少し、これにより治癒を促進する。本発明の星状細胞限定前駆細胞は、内生の成体グリア細胞の増殖を減少し、瘢痕形成を減少するために病徴部位もしくは損傷領域か、またはそれらの近傍に、受傷後１週間〜数週間、投与することができる。
【００３２】
したがって、本発明はまた、神経損傷を有する哺乳動物の処置において用いるための、これら星状細胞限定前駆細胞を含む医薬組成物に関する。好ましい態様において、本細胞は、指向された軸索の再生を促進し、グリア瘢痕形成を減少するため、前脳および／または中枢神経径の受傷した脊髄の軸索において、注射可能な形状またはインプラントで提供される。かかる組成物は、ＣＮＳの神経再生の促進および／または髄鞘形成の増強および／またはグリア瘢痕形成の減少に有用である。
【００３３】
星状細胞限定前駆細胞を含む組成物は、以下に記載のとおり、種々の異なる処方で、神経の受傷の部位または領域へ適用することが可能である。かかる組成物は、限定されないが、トラウマ、手術、虚血、感染、代謝病、栄養失調、悪性腫瘍および腫瘍随伴症候群、毒薬および神経系の変性疾患などを含む種々の原因からの結果の神経系の受傷を有する哺乳動物へ投与され得る。本発明の組成物を用いて処置され得る神経変性障害の例としては、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上麻痺および末梢神経障害などが含まれる。
【００３４】
本発明の星状細胞限定前駆細胞を含む組成物はまた、瘢痕形成を減少するため、創傷に適用し得る。例えば、手術後、当該細胞を含む組成物は、例えば、動静脈奇形、ネクロシス、出血および二次的に癲癇に至り得る開頭術などに起因する病徴由来の瘢痕形成を減少するために、本発明にしたがって適用され得る。本発明の組成物はまた、癲癇病巣の安定化および瘢痕形成の減少による癲癇の処置に用いることができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、有効量の単離された本発明の星状細胞限定前駆細胞および薬学的に許容し得る担体を含む。「有効量（effective amount）」によって、およそ１００，０００から約１００万細胞が含まれる組成物を意味される。しかしながら、本開示を読めば当業者が理解するであろうとおり、細胞数は、選択した投与位置に依存して変化してもよい。薬学的に許容し得る担体の例には、限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水などの液体並びに半液体もしくはゲル様ビヒクルが含まれ、さらに受傷位置に細胞が局在するように少なくとも部分的に細胞の流動性を妨げる媒体を含んでもよい。代替的に、細胞を播種または被覆したインプラントなどの固体ビヒクルを含んでいてもよい。
【００３６】
本医薬組成物は、ＣＮＳ神経再生の促進、髄鞘形成の増強および／または瘢痕形成の減少のための広範な方法によって用いられ得る。本発明の組成物を用いるのに適合的な典型的な方法は、米国特許第5,202,120号明細書に述べられており、そこで教示されていることは、その全体が本明細書に参照として組込まれる。
【００３７】
一態様において、本細胞は、例えば、神経の受傷位置またはその近傍へビヒクル中の細胞の直接注射するなどの直接的な適用において用いられる。この態様において、受傷位置に細胞が局在するように少なくとも部分的に細胞の流動性を妨げる媒体を含むビヒクル中の細胞を送達するのが好ましいかもしれない。細胞の流動性を妨げる媒体の例としては、限定されないが、ペーストまたは、フィブリンもしくはヒドロゲルの生分解性ゲル様ポリマーなどのゲルが含まれる。これらの半固体媒体はまた、部位のフィブロブラストなどの間葉性成分を産生する瘢痕の移行を妨げるという利点も提供する。
【００３８】
他の態様において、本細胞は、ポリマー性インプラントを含む医薬組成物または外科的なバイパス技術を介し送達され得る。例えば、星状細胞限定前駆細胞は、ポリマー性インプラントに播種または被覆することができる。この態様において用いることができる組成、形状および孔サイズの異なる種々のポリマー性インプラントが記載されてきた。例としては、少しも限定されないが、ニトロセルロース、ポリ無水物（polyanhydrides）およびアクリルポリマーを含むインプラントなどが含まれる。好ましい態様において、少なくとも０．４５μｍの孔サイズを有するインプラントが用いられる。
【００３９】
インプラントの形状は、受傷位置での意図された使用に基づいて選択される。例えば、脊髄後根入り口領域で神経再生を促進するために細長い三角形のインプラントが選択され、脳梁で神経再生を促進するために五角形のインプラントが選択され得る。
【００４０】
他の態様において、ポリマーは、合成ブリッジの端または端の近傍へ星状細胞限定前駆細胞を適用することにより、神経再生が促進され、瘢痕形成が減少するような合成ブリッジとして利用され得る。例えば、１以上の端またはチューブ全体に本発明の星状細胞限定前駆細胞を備えたアクリルポリマーチューブは、例えば、脊髄などの病徴を吻方にブリッジするため、または病徴をブリッジするために用いることができ、全体に神経細胞を誘導し得る。このようなチューブの例は、欧州特許公報第286284号およびアエビシャーら（Aebischer et al.）(Brain Res. 1988 454:179-187 および Prog. Brain Res. 1988 78:599-603)並びにウィンら（Winn et al.）(Exp.  Neurol. 1989 105:244-250)による参照文献において述べられている。
【００４１】
本発明の細胞はまた、選択された領域における神経再生の促進および／または瘢痕形成を減少させるための外科的バイパス技術との組合せにおいて用いることもできる。このような本発明の組成物を使用するのに日常的に適合可能な技術の例は、米国特許第5,202,120号明細書に記載されており、その全体が参照として本明細書に組込まれる。
【００４２】
本発明の星状細胞限定前駆細胞はまた、選択された発達ステージに特異的な遺伝子の同定において有用でもある。一態様において、本細胞は、細胞のステージ段階に特異的なｃＤＮＡライブラリーの生成のためのｍＲＮＡのソースとして利用することができる。
本細胞はまた、細胞系並びに治療的および診断的にも用いる細胞特異的抗体の生成に用いることもできる。
以下に、本発明をさらに示す限定的でない例を提供する。
【実施例】
【００４３】
例
例１：ヒト神経幹細胞の培養
胎児組織由来のヒト神経前駆細胞をＣａｍｂｒｅｘより得た。凍結した一定分の細胞を融解し、フィブロネクチン／ラミニンで被覆したマルチウェルディッシュの、ヒト組換塩基性フィブロブラスト増殖因子、ヒト組換上皮細胞増殖因子、「神経生存因子（neural survival factors）」、５ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシン−Ｂ（Singlequots, Cambrex）を添加した神経前駆細胞基本培地（Neural Progenitor Cell Basal Medium (NPBM, Cambrex)）に置床した。培養物は、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、２４時間後に固定した。これらのウェルは、次いで、出発のＣａｍｂｒｅｘ細胞集団を評価するために免疫細胞化学用に処理した。並行して、Ｃａｍｂｒｅｘ細胞を融解し、すぐにフィブロネクチン／ラミニン被覆フラスコ（Greiner）に置床し、ボテンステインおよびサトウ（Bottenstein and Sato）に記載された添加剤を添加したＤＭＥＭ−Ｆ１２(Life Technologies)、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech, Rocky Hill, NJ）およびニワトリ胚抽出物（ＣＥＥ、１０％）からなる神経上皮前駆（Neuroepithelial Precursor；ＮＥＰ）培地で培養した。非接着細胞は、典型的には浮遊した球形物を形成した。培養２４時間後、球形物を除去し、穏やかに粉砕し、そして接着細胞と再結合させた。ＮＥＰ培地は、一日おきに交換した。
【００４４】
例２：ヒト神経上皮前駆細胞（ｈＮＥＰｓ）の単離
培養５日後、イムノパニング法およびＦＡＣＳ法（flow-activated cell sorting）をＥＮＣＡＭ＋、ＮＧ２＋およびＡ２Ｂ５＋細胞を除去するために用いた。簡単には、細胞を５ｍＭ ＥＤＴＡ（Life Technologies）で処理し、この懸濁液をＥＮＣＡＭ抗体（5A5, Developmental Studies Hybridoma Bank）被覆ディッシュに置床し、全てのＥＮＣＡＭ＋細胞がプレートと結合するようにした。ＥＮＣＡＭ抗体被覆ディッシュは、順次、組織培養ディッシュを非標識抗マウスＩｇＭ抗体（１０ｍｇ／ｍｌ）で一晩被覆し、ＤＰＢＳでディッシュをリンスし、次いで５Ａ５ハイブリドーマの上清で、１〜３時間、３７℃で被覆して調製した。プレートを、神経前駆細胞を置床する前に、ＤＰＢＳで２回洗浄した。
【００４５】
３０分の曝露期間の後、結合していない細胞（ＥＮＣＡＭ−細胞）を除去し、ＮＧ２に対する抗体で被覆したディッシュに３０分間置床した。ＮＧ２パニングディッシュは、１〜３時間、３７℃で、ＮＧ２抗体（１：１００）でディッシュを被覆することによって作製した。次いで、上清を除去し（ＥＮＣＡＭ−／ＮＧ２−細胞）、Ａ２Ｂ５に対して免疫染色した。細胞をＡ２Ｂ５に対する抗体（１：２、Developmental Studies Hybridoma Bank）に、１時間、３７℃、５％ＣＯ２でＮＥＰ培地において曝した。次いで、ヤギ抗マウスＩｇＭ−ＰＥ標識二次抗体を生存しているＡ２Ｂ５＋細胞の膜を染色するために適用した。全ての細胞を、ＦＡＣＳ装置（flow-activated cell sorter）にかけ、Ａ２Ｂ５＋細胞集団を除いた。ソーティングの後、陰性の集団（ヒトＮＥＰｓ）を、移植研究の前に、フィブロネクチン／ラミニン被覆したＴ−７５フラスコのＮＥＰ培地において増殖させた。ＮＥＰ培地は一日おきに交換した。
【００４６】
例３：ｈＮＥＰｓ由来のニューロン、乏突起膠細胞および星状細胞の発生
パニングされ／ソートされたヒトＮＥＰｓの集団を、分化を促進するための種々の条件で、フィブロネクチン／ラミニン被覆した１２ｍｍカバースリップに置床した。神経への分化を誘導するために、細胞をｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech）に曝した。培養５日後、固定した培養物をベータ−ＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いて染色し、これらの細胞がニューロンへ分化する能力を評価した。乏突起膠細胞への分化のためには、細胞をｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２日間置床し、次いで、ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Upstate Biotech., Waltham, MA）およびＴ３（５０ｎＭ）を含有する培地に７日間切り換えた。Ｏ４、ＧａｌＣおよびＭＢＰに対する抗体を培養物中の乏突起膠細胞を同定するために用いた。星状細胞への分化のためには、細胞をウシ胎児血清（１０％、Life Technologies）の存在下、５日間培養した。星状細胞は、ＣＤ４４、ＧＦＡＰおよびＳ−１００に対する抗体を用いて同定した。
【００４７】
例４：クローン培養およびクローン増殖
ヒト胎児細胞（懐胎１２〜２２週）の混合細胞培養物をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手し、ｂＦＧＦおよびＣＥＥ（１０％）の存在下でＴ８０フラスコに置床した。培養３日後、細胞をＡ２Ｂ５およびＮＧ−２で標識した。免疫陰性の細胞をＦＡＣＳソーティング分析によって収集し、ｂＦＧＦおよびＣＥＥの存在するフラスコへ置き換えた。２４時間後、細胞をＥ−ＮＣＡＭで標識し、ＦＡＣＳでソートし、そして陰性の細胞を、ｂＦＧＦおよびＣＥＥの存在する１０ｃｍディッシュにクローン密度（clonal density）で再置床した。対照のディッシュは２４時間後、Ａ２Ｂ５、Ｅ−ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰおよびＮＧ−２で標識した。この時点では、全体の９７％の細胞が試験した分化マーカーを何も発現していない。単独の細胞は、クローン密度５０〜２００細胞／３５ｍｍディッシュに増殖した。細胞を８〜１０日間、ＦＧＦおよびＣＥＥ中で維持し、次いで、分化を開始させるため、ＣＥＥをやめた。
【００４８】
乏突起膠細胞への分化のため、培養物をＰＤＧＦおよび甲状腺ホルモンに曝した。５〜７日後、培養物を抗ＧＦＡＰ抗体および抗ベータ−ＩＩＩチューブリン抗体で標識し、星状細胞およびニューロンへの分化をそれぞれ決定した。乏突起膠細胞の発生を分化の開始後７〜１５日まで評価した。ニューロンおよびグリアの分化を、抗ＧＦＡＰ抗体および抗ベータ−ＩＩＩチューブリン抗体を用いて評価した。乏突起膠細胞への分化のため、培養物をＰＤＧＦおよび甲状腺ホルモンに曝し、分化をＯ４およびＧａｌ−Ｃに対する抗体を用いて評価した。
【００４９】
例５：ｈＮＥＰｓからのニューロン、乏突起膠細胞および星状細胞の発生
パニングされ／ソートされたヒトＮＥＰｓの集団を、分化を促進するための種々の条件で、フィブロネクチン／ラミニン被覆した１２ｍｍカバースリップに置床した。神経への分化を誘導するために、細胞をｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＮＴ３（１０ｎｇ／ｍｌ、Peprotech）に曝した。培養５日後、固定した培養物をベータ−ＩＩＩチューブリンに対する抗体を用いて染色し、これらの細胞がニューロンへ分化する能力を評価した。乏突起膠細胞への分化のためには、細胞をｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）含有培地に２日間置床し、次いで、ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ、Upstate Biotech., Waltham, MA）およびＴ３（５０ｎＭ）を含有する培地に７日間切り換えた。Ｏ４、ＧａｌＣおよびＭＢＰに対する抗体を培養物中の乏突起膠細胞を同定するために用いた。星状細胞への分化のためには、細胞をウシ胎児血清（１０％、Life Technologies）の存在下、５日間培養した。星状細胞は、ＣＤ４４、ＧＦＡＰおよびＳ−１００βに対する抗体を用いて同定した(Morita et al. Dev. Neurosci. 1997 19:210-218; Gomes et al. Braz. J. Med. Biol. Res. 1999 32:619-631)。
【００５０】
例６：ヒトＥＳ細胞培養
男性（Ｈ１）および女性（Ｈ７およびＨ９）のｈｕＥＳ細胞系を、ＭＥＦ（マウス初期胚性フィブロブラスト）馴化培地（conditioned medium；ＣＭ）中のＭＡＴＲＩＧＥＬにおいて維持した。ＣＭは、８０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ）、２０％Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ （Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノール、１ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸を含み、４ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）添加したｈｕＥＳ細胞培地（ＥＳＭ）から生成した。培養物を２００ユニット／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ）中、約５〜１０分間、３７℃でインキュベーションによって継代し、次いで、ＣＭ中、小さなクラスターに穏やかに分離した。細胞は、約一週間おきに継代した。馴化培地は、ＭＥＦから生成され、日々回収され、すぐにＨｕＥＳ培養物に給餌するために用いられる。ＨｕＥＳ培養物への添加の前に、該馴化培地には、さらに４ｎｇ／ｍｌ ｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を添加した。ＣＭ生成のための細胞は、日々ＥＳＭで再給餌され、７〜１０日間用いられる。
【００５１】
例７：ｈｕＥＳ細胞の分化
胚体（ＥＢｓ）は、３７℃、５〜１０分間の２００ｕ／ｍＬコラゲナーゼとのインキュベーションによって収穫された未分化ＥＳ培養物から形成される。該細胞を穏やかにディッシュから解体し、ＫＯ−ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸、１ｍＭグルタメートおよび０．１ｍＭベータ−メルカプトエタノールから構成される培地中、超低付着ポリスチレンプレート（Corning）に再懸濁した。いくつかの実験において、１０μＭオールトランスレチノイン酸を懸濁液中のＥＢｓへ添加した。懸濁液で４日後、ＥＢｓをＢ２７およびＮ２添加剤（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２および１０ｎｇ／ｍＬ ｈＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）、１ｎｇ／ｍＬ ｈＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｎｇ／ｍＬ ｈＩＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む増殖培地中、ポリ−ｌ−リシン／ＦＮ被覆プレートに置床した。この条件で３日後、細胞をトリプシンで収穫し、Ｂ２７、１０ｎｇ／ｍＬ ｈＮＴ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｎｇ／ｍＬ ｈＢＤＮＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）添加Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含んでなる分化培地に再置床した。これらの培養物は、１週間に３回給餌し、１４〜２１日後に固定した。
【００５２】
例８：免疫細胞化学（Immunocytochemistry）
培養物を、抗Ａ２Ｂ５抗体（１：２、Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗ＡＣ１３３／２抗体（１：１００、Miltenyi Biotec, Auburn, CA）、抗ベータ−チューブリン抗体（１：１０００、Sigma）、抗Ｅ−ＮＣＡＭ抗体（１：２、５Ａ５、Developmental Studies Hybridoma Bank）、抗ＧＦＡＰ抗体（１：２０００、Dako, Carpinteria, CA）、抗ＮＧ２抗体（１：１００）および抗Ｏ４抗体（１：２、Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いて染色した。固定に続いて、細胞内の抗原に迫るため、培養物をＰＢＳ中０．５％トリトン（Triton）Ｘ−１００（Sigma）で２分間処理した。固定したカバースリップまたはプレートを、次いで、１時間、室温で、ハンクス平衡塩液（Hank's balanced salt solution）および５％子ウシ血清を含むブロッキング溶液中の一次抗体で処理した。ＰＢＳで３回洗浄した後、培養物を、１時間、室温で、Texas RedまたはAlexa 488（Molecular Probes, Eugene, OR）と結合した適切な二次抗体（１：２２０）中、インキュベートした。ＡＣ１３３／２染色には、ビオチン化二次抗体での増幅が要求され、ストレプトアビジン−alexa 488結合三次抗体が続く。全ての培養物は、細胞核を同定するため、ＤＡＰＩ（Molecular Probes）で対比染色した。
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月27日(2008.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団であって、前記哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の集団が、哺乳動物の胚性もしくは胎児の組織もしくは細胞、哺乳動物の胚性幹（ＥＳ）細胞培養物、またはグリア限定前駆細胞から単離され、ＣＤ４４免疫反応性であり、ｂＦＧＦ含有培地に２日間置床し、次いで、ＰＤＧＦを含有する培地に切り替えるかまたはＰＤＧＦおよび甲状腺ホルモンに曝す乏突起膠細胞分化条件下において、乏突起膠細胞ではなく星状細胞を発生する、前記純粋均質集団。
【請求項２】
哺乳動物の胚性もしくは胎児の組織もしくは細胞が、神経管であり、星状細胞発達後のステージにおいて解離される、請求項１に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団。
【請求項３】
哺乳動物の胚性もしくは胎児の組織もしくは細胞が、神経管であり、神経管閉鎖後のステージにおいて解離され５〜４０日間接着培養において維持される、請求項１に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団。
【請求項４】
接着培養において維持された細胞が、ＣＤ４４免疫反応性を示す細胞の集団を単離する前に、Ｅ−ＮＣＡＭ−およびＡ２Ｂ５−免疫陰性であることについてさらに選抜される、請求項３に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団。
【請求項５】
接着培養において維持された細胞が、ＣＤ４４免疫反応性を示す細胞の集団を単離する前に、Ａ２Ｂ５＋免疫反応性であることについてさらに選抜され、星状細胞促進条件において培養される、請求項３に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団。
【請求項６】
ＥＳ細胞が、ＣＤ４４免疫反応性を示す細胞の集団を単離する前に、胚体誘導条件において培養され、その後接着条件において培養される、請求項１に記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の哺乳動物の星状細胞限定前駆細胞の純粋均質集団を単離するための方法であって、哺乳動物の胚性もしくは胎児の組織もしくは細胞、哺乳動物の胚性幹（ＥＳ）細胞培養物、またはグリア限定前駆細胞から、ＣＤ４４免疫反応性を示す細胞の集団を単離することを含む、前記方法。