(57)【要約】【課題】分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、高収率に細胞を得る。【解決手段】生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、消化酵素を溶媒に混合した消化液内に生体組織を浸漬させて生体組織の分解を開始する分解開始ステップＳ３２と、分解の開始後、所定の時期に、消化液内の消化酵素の濃度を低下させる酵素濃度低減ステップＳ３１とを備える生体組織分解方法を提供する。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、
消化酵素を溶媒に混合した消化液内に生体組織を浸漬させて生体組織の分解を開始する分解開始ステップと、
分解の開始後、所定の時期に、消化液内の消化酵素の濃度を低下させる酵素濃度低減ステップとを備える生体組織分解方法。
【請求項２】
前記分解開始ステップが、生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を溶媒に混合した消化液を用いて行われる請求項１に記載の生体組織分解方法。
【請求項３】
前記酵素濃度低減ステップが、消化液に溶媒を供給する請求項１または請求項２に記載の生体組織分解方法。
【請求項４】
分解開始から分解終了までの期間内に、所定時間にわたって連続的にあるいは段階的に、消化液内に溶媒を追加供給する請求項３に記載の生体組織分解方法。
【請求項５】
前記酵素濃度低減ステップが、分解開始時の消化液より酵素濃度の低い消化液を添加する請求項１に記載の生体組織分解方法。
【請求項６】
生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する総量決定ステップと、
決定された消化酵素の総量が生体組織の分解開始から分解終了までに供給されるように消化液を追加供給する酵素供給ステップとを備える請求項５に記載の生体組織分解方法。
【請求項７】
前記溶媒が、リンゲル液またはリン酸緩衝溶液からなる請求項１から請求項６のいずれかに記載の生体組織分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織分解方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、消化酵素を含む消化液内に生体組織を浸漬して攪拌することにより生体組織を分解する生体組織分解方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２００５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、生検処置具等を用いて採取した生体組織を分解する場合には、生体組織と処置具とが接触した部分においてせん断応力等の力学的負荷が作用して生体組織が変性しているので、消化液に晒されても分解が遅く、内部の細胞を取り出すのに時間がかかるという問題がある。
その一方で、消化液における酵素濃度を高くすると細胞表面のタンパク質が分解され、細胞の健全性が低下するという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、講習率に細胞を得ることができる生体組織分解方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体組織に消化酵素を作用させて分解する生体組織分解方法であって、消化酵素を溶媒に混合した消化液内に生体組織を浸漬させて生体組織の分解を開始する分解開始ステップと、分解の開始後、所定の時期に、消化液内の消化酵素の濃度を低下させる酵素濃度低減ステップとを備える生体組織分解方法を提供する。
【０００７】
本発明によれば、分解開始ステップにより生体組織の分解を開始すると、溶媒内に混合された消化酵素の作用により生体組織が分解されて個々の細胞が消化液中に放出される。この場合に、分解開始時に比較的高濃度の消化酵素を溶媒に混合しておくことにより、変性している切断面においても生体組織の分解を促進することができる。その結果、比較的早期に生体組織の塊から細胞の流出を開始させることができる。
【０００８】
そして、生体組織から分離されてきた細胞が消化液内に浮遊するようになる時期に、酵素濃度低減ステップにより、消化液内の消化酵素の濃度を低下させることにより、浮遊している細胞に高濃度の消化酵素が作用することを防止して細胞の健全性を維持することができる。したがって、短時間のうちに生体組織を分解して、健全な細胞の収率を向上することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記分解開始ステップが、生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を溶媒に混合した消化液を用いて行われることとしてもよい。
このようにすることで、生体組織に対して供給される消化酵素が、分解完了に必要な消化酵素の総量を超えることがなく、細胞の健全性を阻害せずに生体組織を分解することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記酵素濃度低減ステップが、消化液に溶媒を供給することとしてもよい。
このようにすることで、消化液内の消化酵素の濃度を簡易に低減させることができる。
また、上記発明においては、分解開始から分解終了までの期間内に、所定時間にわたって連続的にあるいは段階的に、消化液内に溶媒を追加供給することとしてもよい。
このようにすることで、消化液内の消化酵素の濃度を連続的にあるいは段階的に低減させていくことができ、生体組織の表層の変性している切断面における生体組織の減少に応じて消化酵素の濃度を低減していくことができる。
【００１１】
また、上記発明においては、前記酵素濃度低減ステップが、分解開始時の消化液より酵素濃度の低い消化液を添加することとしてもよい。
このようにすることによっても、消化液内の消化酵素の濃度を簡易に低減させることができる。
【００１２】
また、上記発明においては、生体組織の分解完了に必要な消化酵素の総量を決定する総量決定ステップと、決定された消化酵素の総量が生体組織の分解開始から分解終了までに供給されるように消化液を追加供給する酵素供給ステップとを備えることとしてもよい。
このようにすることで、総量決定ステップにより決定された消化酵素の総量が、分解開始から分解終了までに供給されるので、必要以上の消化酵素が添加されることがなく、分解終了後に活性の高い消化酵素が細胞に作用することが防止され、細胞の健全性を維持することができる。
【００１３】
また、上記発明においては、前記溶媒が、リンゲル液またはリン酸緩衝溶液からなることとしてもよい。
このようにすることで、生体組織をｐＨが中性付近に調整されたリンゲル液またはリン酸緩衝溶液と消化酵素との混合液により分解するので、分解後に得られた細胞の生存率の低下を防止することができる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、分解により得られる細胞の健全性を阻害することなく、短時間で生体組織を分解して、講習率に細胞を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の一実施形態に係る生体組織分解方法について、図１および図２を参照して説明する。
本実施形態に係る生体組織分解方法は、例えば、脂肪組織の分解方法であって、図１に示されるように、ステップＳ１〜ステップＳ７を備えている。
【００１６】
総量決定ステップＳ１は、分解する脂肪組織の総重量または体積に基づいて、分解完了に必要な消化液の量を決定し、該消化液を構成するための消化酵素の総量および溶媒、例えば、リンゲル液またはリン酸緩衝液の総量を決定するようになっている。
供給量決定ステップＳ２は、総量決定ステップＳ１において決定された溶媒の総量を複数回に分割して、各回の供給量を決定するようになっている。
【００１７】
分解ステップＳ３は、総量決定ステップＳ１において決定された総量の消化酵素と供給量決定ステップＳ２において決定された供給量のリンゲル液とを混合して消化液を調製する調製ステップＳ３１（酵素濃度低減ステップ）と、調製された消化液内に生体組織を浸漬させて攪拌する攪拌ステップＳ３２（分解開始ステップ）とを備えている。
【００１８】
判定ステップＳ４は、分解ステップＳ３の開始からの時間を計数し、所定時間経過したか否かを判定するようになっている。判定ステップＳ４において判定する経過時間は、リンゲル液を追加供給するための時間ｔａ（ａ＝１〜ｎ）および分解の終了時間（ｔｓ）である。判定ステップＳ４において、所定時間ｔａが経過したと判定された場合には、供給量決定ステップＳ２において予め決定された供給量のリンゲル液を消化液に追加供給するようになっている。また、分解の終了時間ｔｓが経過したと判定された場合には、分解を終了するようになっている。
【００１９】
このように構成された本実施形態に係る生体組織分解方法によれば、生体組織の分解開始時においては、総量決定ステップＳ１において決定された消化酵素の総量と、供給量決定ステップＳ２において決定されたリンゲル液の総量の一部とが混合されて、消化酵素の濃度が比較的高い消化液内に生体組織が浸漬される。したがって、そのような高濃度の消化液に浸漬された生体組織は消化され易くなる。特に、生体組織と処置具とが接触した部分においてせん断応力等の力学的負荷が作用して変性した生体組織に対して高濃度の消化液を作用させることにより、そのような生体組織の分解を促進することができる。
【００２０】
そして、分解開始後所定時間ｔａが経過したときには、予め定められた供給量のリンゲル液が消化液内に追加供給されるので、消化液内の酵素濃度が低減される。すなわち、変性した切断面における生体組織の分解が終了すれば、消化液内の酵素濃度を下げても生体組織を継続して分解できるようになる。さらに、生体組織が分解されて個々の細胞が分散した状態で消化液内に浮遊するようになるので、消化酵素の濃度が低減されることにより、細胞が高濃度の消化酵素に晒されないようにすることができる。
【００２１】
その結果、細胞表面のタンパク質がダメージを受ける不都合を防止して、回収される細胞を健全な状態に維持することができる。
さらに、分解開始時の消化酵素の濃度を高く設定することにより、分解開始直後の分解が促進されるので、全体として生体組織の分解に要する時間を短縮することができる。
そして、判定ステップＳ４において、分解終了時間ｔｓが経過したと判定されたときには、分解が終了される。
【００２２】
図２に、予め決定された消化酵素の総量とリンゲル液の総量とを混合して調製された消化液を用いた従来の分解方法（実線）と対比して、分解に要する時間と規格化収率との関係を示す。図中、破線で示されるのが、本実施形態に係る生体組織分解方法を適用したものである。この場合において、リンゲル液の総量の半分を分解開始時に供給し、残りの半分を所定時間ｔａ経過後に追加供給している。
【００２３】
この図によれば、高濃度の消化酵素を含有する消化液により、分解開始直後の生体組織の分解が実線で示される従来の場合と比較して大幅に向上し、早期に分解が行われていることがわかる。また、所定時間ｔａ経過時にリンゲル液が追加供給された後には、分解速度が低下するが、実線で示される従来の分解方法と比較すると十分に速い段階で同じ収率を達成することができ、分解時間を大幅に短縮することができることがわかる。
【００２４】
なお、本実施形態においては、分解完了に必要な消化酵素の総量を２回に分割して追加供給していくこととしたが、これに代えて、３回以上に分割して追加供給してもよく、また、リンゲル液の総量の範囲内において所定時間をかけて連続的に追加供給していくことにしてもよい。
【００２５】
さらに、本実施形態に係る生体組織分解方法によれば、分解完了までに消化液に供給される消化酵素の総量は、分解開始前にあらかじめ、生体組織の重量あるいは体積により決定されており、それを越えることがない。したがって、高い活性の残る消化酵素に、分解された細胞が接触することを防止して、得られる細胞の健全性を向上することができるという利点もある。
【００２６】
また、本実施形態においては、溶媒としてｐＨが中性付近に調整されたリンゲル液またはリン酸緩衝液を用いた。これにより、組織中に存在する細胞が分解に際してｐＨによる損傷を受けること無く回収することができる。なお、組織の分解に使用されるマトリックスメタロプロテアーゼはその活性の維持および向上に金属イオンを必要としており、使用される溶媒に必要な金属イオンを含む塩を加えることで活性を向上し、組織から分離される細胞の収率を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の一実施形態に係る生体組織分解方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の生体組織分解方法における規格化収率の時間変化を従来の分解方法との対比において示すグラフである。
【符号の説明】
【００２８】
Ｓ１  総量決定ステップ
Ｓ３１  追加供給ステップ（酵素濃度低減ステップ）
Ｓ３２  攪拌ステップ（分解開始ステップ）
【図１】
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【図２】
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