(57)【要約】【課題】神経前駆細胞の傷害箇所への新しい遊走促進剤及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤を提供すること。【解決手段】バイカリン及び薬学的に許容することのできるその塩並びにそれらの水和物から選ばれる化合物を主成分とする遊走促進剤及び遊走促進因子遺伝子発現促進剤を開発した。バイカリン等は、標準群に比較して神経前駆細胞のアストラサイトへの遊走を１．５倍（ｐ＝０．０１２）、対照群に比較してＮＰＣの遊走を２．５倍にし、標準群と比較してＶＥＧＦのｍＲＮＡを２．７倍（ｐ＝０．０１２）、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡを８．２倍も増加した。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイカリン及びその薬学的に許容することのできる塩並びにそれらの水和物から選ばれる化合物を主成分とする神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤。
【請求項２】
バイカリン及びその薬学的に許容することのできる塩並びにそれらの水和物から選ばれる化合物を主成分とするアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤。
【請求項３】
遊走促進因子遺伝子が血管内皮増殖因子遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の遊走促進因子遺伝子発現促進剤。
【請求項４】
遊走促進因子遺伝子が単球遊走促進因子遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載の遊走促進因子遺伝子発現促進剤。
【請求項５】
アストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現を促進することを特徴とする請求項１に記載の神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤。
【請求項６】
神経前駆細胞の傷害箇所への遊走を促進することを特徴とする請求項２に記載の遊走促進因子遺伝子発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
平成13年度の厚生労働省の統計によれば、介護を要する65歳以上の高齢者94,750人に対し、介護が必要になった主な原因の１位は脳卒中等脳血管疾患24,749人、２位は骨折11,744人、３位は痴呆10,659人であり、脳卒中等脳血管疾患が飛びぬけて多い。従って、脳卒中等脳血管疾患の治療薬の開発が強く望まれている。
【０００３】
治療薬が傷害された神経のポストシナプスにくっついて、傷害された神経を修復するであろうという仮説の下に、神経のポストシナプスに存在する密度９５タンパク（ＰＤＺ−９５）に結合するか否かで、低酸素性又は虚血性脳障害の治療薬を選択する方法が提案され、その方法により、バイカリンがＰＤＺ−９５に結合することを発見し、その事実を証拠にバイカリンを投与する低酸素性又は虚血性脳障害の治療法とバイカリンを含む医薬組成が特許請求の範囲として請求されている
【特許文献１】。しかし、傷害された神経それ自体が薬により修復される証明がなく、かつ、現在の科学常識では傷害された神経それ自体が薬により修復されることは不可能であると考えられている。
【０００４】
そこで、傷害された神経を修復するのではなく、傷害された神経を健全な神経で置き換えることが治療法の一つとして想定される。幸い、脳卒中等脳血管疾患により脳神経に傷害が起こると、傷害を制限し、修復するために、脳に存在する神経前駆細胞が傷害領域に遊走されることが知られている。この神経前駆細胞の傷害箇所への遊走を促進すれば、脳卒中後遺症が起こりにくく、起きても軽傷で済む可能性がある。この遊走を促進する物質としては、スフィンゴシン１−燐酸
【非特許文献１】、マトリックス・メタロプロテナーゼ２（ＭＭＰ２）とＭＭＰ９
【非特許文献２】、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１）
【非特許文献３】、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）
【非特許文献４】等生体内成分が知られている。しかし、医薬として容易に用いることのできる生体外成分はあまり知られていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、神経前駆細胞の傷害箇所への新しい遊走促進剤を提供すること及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、今回、発明者は医薬に容易に用いることの出来る生薬の個々の有効成分について、神経前駆細胞の遊走を促進する性質があるか否か、アストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現を促進する性質があるか否かを調べた。その結果、生薬オウゴンの成分の一つであるバイカリン（図１）に神経前駆細胞の遊走を強く促進する性質があること及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現を促進する性質があることを見つけ、この結果を基に更に種々研究した結果、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、「神経前駆細胞の傷害箇所への新しい遊走促進剤及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現の新しい促進剤を提供する」という課題に対し、「バイカリン及びその薬学的に許容することのできる塩並びにそれらの水和物から選ばれる化合物を主成分とする神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤」を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の薬剤は、神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤として有用であり、アストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤としても有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は神経前駆細胞の傷害箇所への新しい遊走促進剤及びアストロサイトの遊走促進因子遺伝子発現促進剤の発明である。本発明の２種類の薬剤の主成分は共にバイカリン及びその薬学的に許容することのできる塩並びにそれらの水和物から選ばれる化合物である。
【００１０】
バイカリンは、消炎、解熱などを目的として漢方で用いられる生薬オウゴン（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ・ｂｉｃａｌｅｎｓｉｓ、和名：シソ科コガネヤナギ又はゴマノハグサ科コガネバナの根）に含まれるフラボン誘導体で、バイカレインの７−Ｏ−グルクロナイドであり、試薬品会社等で市販されている。バイカリンは例えば、オウゴンの粗抽出物１２０ｍｇから２相溶液としてエチルアセテート・メタノール１％酢酸・水（５：０．５容量／容量）を用いて分取高速カウンター・カレント・クロマトグラフ（ＨＳＣＣＣ）で分離精製できる。その場合、エチルアセテート・メタノール１％酢酸・水（５：０．５容量／容量）の上層はＨＳＣＣＣの固相として使われる。純度９９．２％のバイカリンが1段操作で５８．１ｍｇ得られる。バイカリンの構造は１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲで同定できる
【非特許文献５】。この他、超臨界クロマトグラフを用いる方法等が知られている
【特許文献２】。しかし、これらの植物以外のバイカリン含有植物があれば、その植物から分離してもよく、合成が可能な場合は合成品でもよい。バイカリンの同定に必要なバイカリンの標準品は国立医薬品食品研究所等で市販されている。
【００１１】
バイカリンの塩は薬学的に許容することのできる塩に限られる。薬学的に許容することのできる塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム等のアンモニウム塩、トリエチルアミン、リジン、アルギニン等の有機アミンの塩、塩酸、臭化水素酸、硫酸等鉱酸との酸付加塩等が挙げられるが、それらに限らない。薬学的に許容することのできる塩であればよく、薬学的に許容することのできる限り、将来合成される有機化合物との塩でも差し支えない。バイカリンの水和物、薬学的に許容することのできるバイカリンの塩の水和物も本発明の主成分として用いることができる。
【００１２】
バイカリンは水に溶けにくく、アルコールに容易に溶ける。バイカリンの水溶液を作るためには薬学的に許容することのできる可溶化剤を添加する。薬学的に許容することのできる可溶化剤としては、ポリオキシエチレンの附加したオキシ脂肪酸のグリセリンエステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンの附加したラノリン、胆汁酸類、サポニン等が挙げられる。可溶化剤がポリオキシエチレングループを含む場合は、ポリオキシエチレン部分がオキシエチレンが平均１０から２００モル重合したものが好ましく、平均２０から１００モル重合したものが特に好ましい。また、可溶化剤が脂肪酸またはオキシ脂肪酸残基を含む場合は、カプリン酸、オキシカプリン酸、ステアリン酸、オキシステアリン酸、アラギン酸、オキシアラギン酸等、脂肪酸残基またはオキシ脂肪酸残基の炭素原子数が１０から２０のものが好ましい。具体的には、平均重合度４０から１００モルのポリオキシエチレンの附加した硬化ヒマシ油または平均重合度４０から１００モルのポリオキシエチレンの附加したオキシステアリン酸のグリセリンエステルが特に好ましい。胆汁酸類としては、胆汁酸およびその塩であり、デオキシコール酸、デヒドロコール酸、コール酸、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ラゴデオキシコール酸、ヒオコール酸、ホケコール酸等の胆汁酸とその塩が挙げられる。その中では、デオキシコール酸とその塩がより好ましい。なお、胆汁酸の塩としては、アルカリ金属塩、アンモニウム塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩とプロカイン塩がより好ましい。
【００１３】
バイカリンは、酸素及び湿気のない状態では比較的安定である。しかし、バイカリンを保存する時は酸素や湿気の無い状態で保存することが好ましい。長期保存を考慮に入れると、本発明の遊走促進剤及び遊走促進因子遺伝子発現促進剤には有効成分の安定のため、他の抗酸化剤を添加することが好ましい。抗酸化剤としては薬学的に許容することのできる抗酸化剤に限られる。薬学的に許容することのできる抗酸化剤としては、アルファ・カロチン、ベータ・カロチン、リコペン、ルテイン、フラボノイド、カテキン、リザベラトール、イソフラボン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、セレン、亜鉛、補酵素Ｑ１０、グルタチオン、エンゾジノール等が挙げられる。これらの抗酸化剤は高温の水溶液中のバイカリンの変化を抑える。
【００１４】
本発明の遊走促進剤及び遊走促進因子遺伝子発現促進剤は、主成分が非高分子であることから、経口投与又は非経口投与（坐薬、筋肉内、皮下、静脈内、脳内など）のいずれでも投与できる。緊急を要する場合は脳内投与も想定される。  経口用製剤を調製する場合、賦形剤、さらに必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤及び前述の抗酸化剤などを加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、油性又は水性の懸濁液剤などとする。賦形剤としては、例えば、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルーロスなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
【００１５】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン未、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、デキストラン、ペクチンなどが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油などが挙げられる。着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものが使用できる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、竜脳、桂皮末などが使用できる。これらの錠剤は、顆粒剤には、糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングしてもよい。
【００１６】
注射剤を調製する場合、必要により、グルコースや生理的食塩水等の等調液、pH調整剤、緩衝剤、前述の可溶化剤、抗酸化剤及びその他の安定化剤、保存剤などを添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内、脳内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥などによって、固形製剤として、用事調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、多投与量を同一の容器に収納してもよい。溶液の場合、酸素や湿気を遮断する方がよい。そのため、場合によってはアンプル型の容器に入れ、空気を抜くか、窒素ガス等で空気を置換しておく方がよい。公知の方法でよい。
【００１７】
本発明の遊走促進剤及び遊走促進因子遺伝子発現促進剤の投与量は、経口剤、坐薬、皮下注射剤、筋肉内注射剤、静脈内注射剤、脳内注射剤等剤型によって異なるが、ヒトの場合、成人１日当たり通常０．０１〜１０００ミリグラム、好ましくは、０．１〜１００ミリグラムの範囲で、１日量を１日１回、あるいは２〜４回に分けて投与する。なお、年齢、症状により適宜増減する。
【００１８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。アストロサイトの分離法と同定方法は
【非特許文献６】に、神経前駆細胞の分離方法と同定方法は
【非特許文献７】に記載されている。調整したアストロサイト又は神経前駆細胞含有液は、１次抗体として、ネスチン等神経前駆細胞特異マーカー、グリア繊維性酸性たんぱく質（ＧＦＡＰ）等アストロサイト特異マーカー等に対する特異抗体を用い、２次抗体として、これら特異マーカー特異抗体に対する蛍光色素標識した特異抗体を用いて、公知のネスチン免疫蛍光染色試験、ＧＦＡＰ等を行い、神経前駆細胞特異マーカー、アストロサイト特異マーカー等の存否等を検定する。なお、毒性試験、薬効試験に関し、急性毒性試験、亜急性毒性試験、催奇性毒性試験、変異原性試験、繁殖性試験中の白血球、リンパ、好中数、ヘモグロビン、GOT、血清総蛋白、アルブミン、トリグリセリド、コレステロール、グルコース、尿素、小核率、精子奇形率、復帰変異菌、死胎率、胎児体重・身長・尾長、胸骨欠失率等の分析は株式会社日本実権医学研究等毒性試験受託会社がルーチンに受託分析し、尿中NO2／NO3、クレアチニン、Na、K、Ca、Cl、Mg、血中アルブミン、グロブリン、GOT、GTP、ガンマ‐グルタミルトランスペプチダーゼ、尿素窒素、クレアチニン、Na、K、Ca、Cl、Mg、アンギオテンシン１転換酵素、アンギオテンシン２等の分析はシオノギ・バイオメディカル・ラボラトリーズ等臨床検査受託会社がルーチンに受託分析している。  以下に先行文献を特許文献と非特許文献に分けて表示する。
【特許文献１】米国特許２００５年０２３３３７７号公報
【特許文献２】特開平９−５９１７０号公報
【非特許文献１】Ａ．Ｋｉｍｕｒａら、Ｓｔｅｍ・Ｃｅｌｌｓ，２００６年９月２８日印刷前公表
【非特許文献２】Ｌ．Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００６年２６巻２２号５９９６頁‐６００３頁
【非特許文献３】Ｘ．Ｇｏｎｇら、Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．、２００６年３０巻５号４６６頁‐４７１頁
【非特許文献４】Ｋ．Ｆｏｒｓｂｅｒｇ−Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９９８年５３巻５号５２１頁‐５３０頁
【非特許文献５】Ｓ．Ｗｕ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．、２００５年１０６６巻１−２号２４３頁−２４７頁
【非特許文献６】Ｂ．Ｃ．Ｗａｒｆ等、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１年１１巻８号２４７７頁−２４８８頁
【非特許文献７】Ｍ．Ｋ／Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ等、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ・Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９９年１５８巻２６５頁−２７８頁
【実施例１】
【００１９】
純度９３．７％のバイカリンを中国天津市の天津中一製薬有限公司より、ＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液を米国カールスバットのギブコ社より、牛胎仔血清ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｂ２７、塩基性線維芽細胞成長因子ｂＦＧＦ、内皮細胞成長因子ＥＧＦと細胞賦活評価試験（ＭＴＴ）試薬を米国セントルイスのシグマーアルドリッチ社より、ここで使用する全ての抗体を米国サンタクルスのサンタクルスバイオテクノロジー社より、コスター・トランスウエル・インサーツ器具を米国コーニングのコーニング社より、トリゾール試薬を米国カールスバットのインビトロゲン社より、パワーＳＹＢＲグリーンＲＴ−ＰＣＲ試薬キットを米国フォスター市のアプライド・バイオシステム社より、ここで使用する他の試薬を大阪の和光純薬より購入した。
生後０−４日の新生児ウイスター系ラットの脳皮質を分離し、組織を小片に切り刻み、パスツールピペットで吸い込み、吐き出す操作で細胞をばらばらにし、３０マイクロメータのメッシュのナイロンフィルターで濾し、ばらばらにした細胞を得た。１５％のＦＢＳと１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液でこの脳皮質から取り出した細胞を培養した。増殖が止まった時に混在する神経細胞とオリゴデンドロサイトを回転速度２６０ｒｐｍ、１８時間遠心することにより除いた。初代培養のアストロサイトの純度をグリア繊維性酸性タンパク質ＧＦＡＰに対する抗体との公知の免疫蛍光分析で確認した。即ち、培養細胞の一部を、スライドグラスの上の中央に１００マイクロリットルだけ小分けし、２時間放置したところ、細胞がスライドグラスに付着した。この付着細胞を、付着した状態で、Ｄ‐ハンクス液で洗浄し、洗浄後の付着細胞を４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００マイクロリットルに摂氏４度で３０分間浸す方法で固定した。この固定した細胞をＰＢＳに室温で３０分間浸す方法で３回洗浄した後、自然に乾燥させた。この乾燥させた固定化細胞に１ミリリットル当たり０．０５マイクログラムのタンパク分解酵素を加え、摂氏３７度で２分反応させた。引き続き、タンパク分解酵素処理をした固定化細胞を０．５％トリトン・エックス１００（ｔｒｉｔｏｎＸ１００）と５％ヤギ正常血清含有Ｄ‐ハンクス液（Ｄ‐ハンクスＴＳ液）１５０マイクロリットル中、摂氏３７度で３０分間浸した。次にこの固定した細胞に同液で１，０００倍に希釈したウサギの抗ラットグリア繊維性酸性たんぱく質抗体を加え、摂氏４度で一晩放置した。翌日、第１次抗体反応をさせた固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を同液に１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体で、室温で２時間浸した。この第２次抗体処理した固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この洗浄した固定化細胞を使用直前にアビジン‐ビオチン複合体溶液用の溶液Ａ１０マイクロリットルと溶液Ｂ１０マイクロリットルとＰＢＳ５００マイクロリットルを混合した液に室温で１時間浸し、直ちにＰＢＳで3回洗浄した。このＡＢＣ処理した固定化細胞を０．０５％３，３‘‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと０．１％過酸化水素を含むＰＢＳ２００マイクロリットルで室温で１０分間反応させた。ＤＡＢ処理をした固定化細胞をＰＢＳで室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を７０度のエチルアルコールに浸し、８０度、９０度、９５度、１００度のエチルアルコールに順次浸し、固定化細胞を脱水させた。キシレン１、キシレン２で各１０分処理した後にエンテラン及びカバーグラスで細胞を封入し、標本を作製した。この標本を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、標本が陽性に染色していることを確認した。この分析により、取得した細胞の９５％以上がＧＦＡＰ陽性であった。動物は１９８０年発行の実験動物の保護と使用ガイドラインに従って扱った。
【実施例２】
【００２０】
生後０−２日の新生児ウイスター系ラットの脳皮質を分離し、組織を小片に切り刻み、パスツールピペットで吸い込み、吐き出す操作で細胞をばらばらにし、３０マイクロメータのメッシュのナイロンフィルターで濾し、ばらばらにした細胞を得た。２％のＢ２７、２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと１％のペニシリン−ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液でこの脳皮質から取り出した細胞を培養した。ｂＦＧＦを２日毎に加え、４日毎に、培養液の半量を取り替えた。ニューロスフェアが見えてくるまで続けた。１０日毎にニューロスフェアをパスツールピペットで吸い込み、吐き出す操作で細胞をばらばらにし、３０マイクロメータのメッシュのナイロンフィルターで濾し、ばらばらにした細胞を得、再び培養した。プラスチックに付着して分化し始めた細胞はウエルから除き、培養を繰り返す操作から外した。このようにして神経前駆細胞ＮＰＣを得た。初代培養のニューロスフェアのコロニーをウエル当たり１個の細胞になるように希釈して、９６個のウエルに植え、５日後にネスチン用の抗体を用いて公知の免疫蛍光分析を行った。即ち、培養細胞の一部を、スライドグラスの上の中央に１００マイクロリットルだけ小分けし、２時間放置したところ、細胞がスライドグラスに付着した。この付着細胞を、付着した状態で、Ｄ‐ハンクス液で洗浄し、洗浄後の付着細胞を４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ１００マイクロリットルに摂氏４度で３０分間浸す方法で固定した。この固定した細胞をＰＢＳに室温で３０分間浸す方法で３回洗浄した後、自然に乾燥させた。この乾燥させた固定化細胞に１ミリリットル当たり０．０５マイクログラムのタンパク分解酵素を加え、摂氏３７度で２分反応させた。引き続き、タンパク分解酵素処理をした固定化細胞を０．５％トリトン・エックス１００（ｔｒｉｔｏｎＸ１００）と５％ヤギ正常血清含有Ｄ‐ハンクス液（Ｄ‐ハンクスＴＳ液）１５０マイクロリットル中、摂氏３７度で３０分間浸した。次にこの固定した細胞に同液で１００倍に希釈したマウスの抗ラットネスチン抗体を加え、摂氏４度で一晩放置した。翌日、第１次抗体反応をさせた固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を同液に１ミリリットル当たり１０マイクログラムの第２次抗体であるビオチン標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で、室温で２時間浸した。この第２次抗体処理した固定化細胞をＤ‐ハンクスＴＳ液で室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この洗浄した固定化細胞を使用直前にアビジン‐ビオチン複合体溶液用の溶液Ａ１０マイクロリットルと溶液Ｂ１０マイクロリットルとＰＢＳ５００マイクロリットルを混合した液に室温で１時間浸し、直ちにＰＢＳで3回洗浄した。このＡＢＣ処理した固定化細胞を０．０５％３，３‘‐ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリドと０．１％過酸化水素を含むＰＢＳ２００マイクロリットルで室温で１０分間反応させた。ＤＡＢ処理をした固定化細胞をＰＢＳで室温で１０分間浸す方法で３回洗浄した。この固定した細胞を７０度のエチルアルコールに浸し、８０度、９０度、９５度、１００度のエチルアルコールに順次浸し、固定化細胞を脱水させた。キシレ��１、キシレン２で各１０分処理した後にエンテラン及びカバーグラスで細胞を封入し、標本を作製した。この標本を共焦点レーザー走査顕微鏡で観察し、標本が陽性に染色していることを確認した。結果を図２から図６に示す。図２から図５はモノクロなニューロスフェアが単一のＮＰＣ由来であることを示している。図６は得られた細胞がネスチン陽性であること、即ち、ＮＰＣであることを示している。写真中のスケール棒は１００マイクロメータである。
【実施例３】
【００２１】
初代培養のアストロサイトを６ウエルのプレート２枚に植え、１５％のＦＢＳを含む２．５ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液で培養した。アストロサイトの増殖が止まったとき、バイカリン群用として３個のウエルの培養液を２％のＦＢＳと１６０マイクログラム／ｍｌのバイカリンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液に変え、一方、標準群用として残りの３個のウエルの培養液を２％のＦＢＳのみ含み、バイカリンを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液に変えた。摂氏３７度で５％の炭酸ガスを含む空気中で６時間培養した後、実験群用として１枚のプレートを１％の酸素と５％の炭酸ガスと９４％の窒素ガスの混合ガスで低酸素状態で１８時間培養し、一方、対照群用として残りのもう１枚のプレートを５％の炭酸ガスを含む空気中で１８時間培養した。各培養液を別々に１０００ｇで５分間遠心して浮遊細胞を除き、１．２ｘ１０の６乗アストロサイト／ｍｌの上清液を得た。これをアストサイト調整液ＡＣＭとして遊走測定に使用するまで摂氏マイナス２０度で保存した。
【実施例４】
【００２２】
８マイクロメータの穴のフィルターの付いた２４個のウエルからなるコスター・トランスウエル・インサーツ器具を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液中、摂氏３７度で２時間培養した。この培養したインサーツ器具の上層チャンバーに実施例２で得られたＮＰＣの１ｘ１０の５乗個を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液１００マイクロリットル中に懸濁したものを加え、下層チャンバーに実施例３で得られたＡＣＭを６００マイクロリットル加えた。このインサーツ器具を５％炭酸ガスを含む空気中、摂氏３７度で２１時間培養した後、上層チャンバーに居たＮＰＣが下層チャンバーのアストサイトにまで遊走した細胞数を顕微鏡下で無作為に１００フィールドで５回数えた。その結果を図７に示す。ＮＰＣの対照群ＡＣＭ（バイカリンを加えず、低酸素状態にしないアストロサイトから得た調整液）への自動遊走を１００％とした場合のＮＰＣの標準群ＡＣＭ（バイカリンを加えず、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液）への遊走、バイカリン群ＡＣＭ（バイカリンを加え、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液）への遊走を％で示す。数値はｎ数５の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示している。３回の独立した実験で同様の結果を得た。＊＊印は対照群と比較してｐが０．０１以下、＃印は標準群と比較してｐが０．０５以下であったことを示す。標準群は、対照群に比較して、ＮＰＣの遊走を１．７倍（ｐ＝０．００９）にした。バイカリン群は、標準群に比較してＮＰＣの遊走を１．５倍（ｐ＝０．０１２）、対照群に比較してＮＰＣの遊走を２．５倍にした。
【実施例５】
【００２３】
ＴＲＩＺＯＬ試薬を用いて、実施例３で得られ、実施例５で用いた残りの各群のＡＣＭの一部を取り、それからＲＮＡを抽出した。０．２マイクログラムのＲＮＡを１０マイクロリットルのタックマン逆転写試薬とオリゴ（Ｔ）１６プライマーに加え、ｃＤＮＡに逆転写した。なお、オリゴ（Ｔ）１６プライマーは、目的に応じ、ＧＡＰＤＨ用として順方向5’-CCCCCAATGTATCCGTTGTG-3’、逆方向5’-TAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3’、VEGF用として順方向5’-ATCATGCGGATCAAACCTCACC-3’、逆方向5’-GGTCTGCATTCACATCTGCTATGC-3’、MCP-1用として順方向5’-GCTGCTACTCATTCACTGGCAA-3’、逆方向、5’-TGCTGCTGGTGATTCTCTTGTA-3’をそれぞれ用いた。得られたｃＤＮＡの０．５マイクロリットルをリアルタイムＰＣＲのテンプレートに用いた。遺伝子発現の量、即ち、各遺伝子から発現された各ｍＲＮＡの量を測定するため、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスター混合試薬を用いて、リアルタイムＰＣＲをアップライ・バイオシステム社のＡＢＩ・ＰＲＩＳＭ７０００型ＤＮＡ塩基配列検出機で行った。その結果を図８に示す。縦軸は対照群の遺伝子発現を１とした場合の遺伝子発現の倍数を示す。数値はｎ数６の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示す。＊印は対照群と比較して、ｐが０．０５以下、＃印と＃＃印は、標準群と比較して、ｐがそれぞれ０．０５以下、０．０１以下であったことを示す。血管内皮増殖印紙ＶＥＧＦと単球遊走促進因子ＭＣＰ−１は、ＮＰＣの遊走を誘導する分子にシグナルを送ることが知られているが、図８より、低酸素状態の標準群と比較して低酸素状態のバイカリン群はＶＥＧＦのｍＲＮＡを２．７倍（ｐ＝０．０１２）、ＭＣＰ−１のｍＲＮＡを８．２倍も増加した。
【実施例６】
【００２４】
実施例３で得られ、実施例５と６で用いて残ったバイカリン群ＡＣＭの一部の１マイクログラム／ｍｌにＰＢＳ溶液に懸濁したＶＥＧＦの抗体又はＭＣＰ−１の抗体を加えた。対照群として抗体の入っていないＰＢＳ溶液を同量加えた。各群を３０分培養した後、実施例４においてバイカリン群ＡＣＭの代わりに、ＶＥＧＦの抗体又はＭＣＰ−１の抗体を加え、又はいずれの抗体も加えずに３０分培養処理をしたバイカリン群ＡＣＭを用いて遊走測定を行った。即ち、  ８マイクロメータの穴のフィルターの付いた２４個のウエルからなるコスター・トランスウエル・インサーツ器具を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液中、摂氏３７度で２時間培養した。この培養したインサーツ器具の上層チャンバーに実施例２で得られたＮＰＣの１ｘ１０の５乗個を２％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２溶液１００マイクロリットル中に懸濁したものを加え、下層チャンバーにＶＥＧＦの抗体又はＭＣＰ−１の抗体を加え、又はいずれの抗体も加えずに、３０分培養したバイカリン群ＡＣＭを６００マイクロリットル加えた。このインサーツ器具を５％炭酸ガスを含む空気中、摂氏３７度で２１時間培養した後、上層チャンバーに居たＮＰＣが下層チャンバーのアストサイトにまで遊走した細胞数を顕微鏡下で無作為に１００フィールドで５回数えた。その結果を図９に示す。バイカリンを加え、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液に遊走因子の抗体を加えずに３０分培養する前処置をしたバイカリン群へのＮＰＣの遊走数を１００％とした場合のＶＥＧＦの抗体を加えて３０分培養する前処置をしたＶＥＧＦ抗体群又は、ＭＣＰ−１の抗体を加えて３０分培養する前処置をしたＭＣＰ−１抗体群を％で示す。数値はｎ数５の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示している。３回の独立した実験で同様の結果を得た。＊印と＊＊印はバイカリン群と比較してｐが０．０５以下、０．０１以下であったことを示す。図９より、ＶＥＧＦ抗体群は、バイカリン群に比較して、ＮＰＣの遊走を３０％（ｐ＝０．０２１）阻害した。ＭＣＰ−１抗体群は、バイカリン群に比較して、ＮＰＣの遊走を４０％（ｐ＝０．００３）阻害した。この結果は、バイカリンが低酸素状態のアストロサイトのＶＥＧＦ遺伝子、ＭＣＰ−１遺伝子の発現を促し、発現したＶＥＧＦとＭＣＰ−１がＮＰＣのアストロサイトへの遊走を誘導する機序を示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明の薬剤は、神経前駆細胞の傷害箇所への遊走促進剤及びアストラサイトの遊走促進因子遺伝子発現の促進剤として利用される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】バイカリンの立体構造式。
【図２】実施例２における単一のＮＰＣの１２時間培養後の細胞の状態を示す。
【図３】実施例２における単一のＮＰＣの３６時間培養後の細胞の状態を示す。
【図４】実施例２における単一のＮＰＣの３日培養後の細胞の状態を示す。
【図５】実施例２における単一のＮＰＣの５日培養後の細胞の状態を示す。図２から図５より、モノクロなニューロスフェアが単一のＮＰＣ由来であることを示している。
【図６】実施例２において得られた細胞がネスチン陽性であること、即ち、ＮＰＣであることを示している。写真中のスケール棒は１００マイクロメータである。由来であることを示している。
【図７】実施例４における神経前駆細胞ＮＰＣのトランスウエルでの遊走を示す。縦軸はＮＰＣの対照群ＡＣＭ（バイカリンを加えず、低酸素状態にしないアストロサイトから得た調整液）への自動遊走を１００％とした場合のＮＰＣの標準群ＡＣＭ（バイカリンを加えず、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液）への遊走、バイカリン群ＡＣＭ（バイカリンを加え、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液）への遊走を％で示す（遊走数（対照群に対する％））。数値はｎ数５の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示している。３回の独立した実験で同様の結果を得た。＊＊印は対照群と比較してｐが０．０１以下、＃印は標準群と比較してｐが０．０５以下であったことを示す。
【図８】実施例５における低酸素状態により誘導されたＶＥＧＦとＭＣＰ−１のｍＲＮＡの発現に対するバイカリンの影響を示す。縦軸は対照群の遺伝子発現を１とした場合の遺伝子発現の倍数を示す。数値はｎ数６の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示す。＊印は対照群と比較して、ｐが０．０５以下、＃印と＃＃印は、標準群と比較して、ｐがそれぞれ０．０５以下、０．０１以下であったことを示す。
【図９】実施例６におけるバイカリンにより刺激されたアストサイトの化学遊走能力に対するＶＥＧＦ抗体とＭＣＰ−１抗体の影響を示す。バイカリンを加え、１８時間低酸素状態にしたアストロサイトから得た調整液に遊走因子の抗体を加えずに３０分培養する前処置をしたバイカリン群へのＮＰＣの遊走数を１００％とした場合のＶＥＧＦの抗体を加えて３０分培養する前処置をしたＶＥＧＦ抗体群又は、ＭＣＰ−１の抗体を加えて３０分培養する前処置をしたＭＣＰ−１抗体群を％で示す。数値はｎ数５の平均値プラスマイナスＳ．Ｅ．Ｍ．で示している。３回の独立した実験で同様の結果を得た。＊印と＊＊印はバイカリン群と比較してｐが０．０５以下、０．０１以下であったことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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