(57)【要約】【課題】ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能であり、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さない抗微生物活性増強ペプチドを提供すること。【解決手段】  本発明は、抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性増強ペプチドであって、前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基であるカルボキシル基がアミド基に変換されたものである抗微生物活性増強ペプチドである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性増強ペプチドであって、
前記前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものであることを特徴とする抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項２】
前記抗微生物ペプチド前駆体がセクロピン型に由来するものであることを特徴とする請求項１記載の抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項３】
前記抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものであることを特徴とする請求項１記載の抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項４】
前記カルボキシル基をすべてアミド基に変換したことを特徴とする請求項１記載の抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項５】
前記前駆領域ペプチドが下記配列番号１のアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項１記載の抗微生物活性増強ペプチド。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGluGluAlaSerLeuHisValLysThrAspGluLeuProSerProAspThrValArgGluGlnLeu（配列番号１）
【請求項６】
下記配列番号２のアミノ酸配列を有することを特徴とする抗微生物活性増強ペプチド。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu（配列番号２）
【請求項７】
微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と共に用いられ、
前記ペプチド性抗微生物物質がＡＳＡＢＦ、ナイシン、インドリシジン及びポリミキシンＢからなる群より選ばれる少なくとも１つであることを特徴とする請求項１又は６に記載の抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項８】
前記微生物が黄色ブドウ球菌、セラチア菌、ミクロコッカス菌又は大腸菌であることを特徴とする請求項７記載の抗微生物活性増強ペプチド。
【請求項９】
微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗微生物活性増強ペプチドと、を含むことを特徴とする抗微生物剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗微生物活性増強ペプチド及びそれを含む抗微生物剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
動植物は免疫機構の一部として、抗微生物ペプチドを産生し、微生物感染から身を守っていることが知られている。
このような抗微生物ペプチドは微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質として用いられ、９０℃以上の熱処理によっても生物活性を失わず、マイクロモル若しくはそれ以下の濃度であっても微生物に対して十分な毒性を示すので、抗微生物剤等の用途として薬学、食品等の分野において実用化されている。
また、上記ペプチド性抗微生物物質は、この濃度領域において、多細胞真核生物に対しては無害であることが知られている。
【０００３】
一方、細菌等の微生物は、従来の抗微生物剤に耐性を獲得すべく変異していることが知られている。このことにより、近年においては、従来は有効であった抗微生物剤の使用においても十分な抗微生物活性が得られない事態が生じている。
【０００４】
これに対し、抗微生物剤の抗微生物活性を増強させる方法として、異なる種類のペプチド性抗微生物物質及びリゾチームから選ばれる複数種類を同時に用いる方法が提案されている。
この方法によれば、複数種類のペプチド性抗微生物物質又はリゾチームの抗菌作用の相乗効果により、単独でペプチド性抗微生物物質又はリゾチームを用いた場合よりも優れた抗微生物活性が示されることが報告されている（例えば、非特許文献１又は２参照）。
【非特許文献１】J. Biol. Chem. 268, 12055-12061(1993)
【非特許文献２】J. Med. Microbiol. 47, 837-841(1998)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記非特許文献１又は２記載の異なる種類のペプチド性抗微生物物質及びリゾチームから選ばれる複数種類を用いる方法以外の抗微生物活性の増強方法は未だ十分に開発されていない。
一方、複数種類のペプチド性抗微生物物質を用いる単純な抗微生物活性の相乗効果を利用する方法とは異なる原理に基づく増強方法が開発されれば、その新しい増強方法を単独、若しくは複数種類のペプチド性抗微生物物質を用いる方法と組み合わせる等して、さらに効率的に抗微生物活性を増強できるため、そのような新たな増強方法の開発が求められている。
【０００６】
本発明は、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能であり、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さない単純な抗微生物活性の相乗効果とは原理を異にする抗微生物活性増強ペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討したところ、動植物が抗微生物ペプチド前駆体を産生する際に除かれる前駆領域ペプチドが抗微生物活性を制御していることに着目した。そして、一般に抗微生物ペプチド前駆体は塩基性であるのに対し、前駆領域ペプチドにおいては酸性アミノ酸残基であるカルボン酸が多く存在していることを見出した。本発明者らは、更に鋭意研究を重ねた結果、このカルボン酸をアミド基に変換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、（１）抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性増強ペプチドであって、前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものである抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【０００９】
本発明は、（２）抗微生物ペプチド前駆体がセクロピン型に由来するものである上記（１）記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【００１０】
本発明は、（３）抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものである上記（１）記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【００１１】
本発明は、（４）カルボキシル基をすべてアミド基に変換した上記（１）記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【００１２】
本発明は、（５）前駆ペプチドが下記配列番号１のアミノ酸配列を有するものである上記（１）記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGluGluAlaSerLeuHisValLysThrAspGluLeuProSerProAspThrValArgGluGlnLeu（配列番号１）
【００１３】
本発明は、（６）下記配列番号２のアミノ酸配列を有する抗微生物活性増強ペプチドに存する。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu（配列番号２）
【００１４】
本発明は、（７）微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と共に用いられ、ペプチド性抗微生物物質がＡＳＡＢＦ、ナイシン、インドリシジン及びポリミキシンＢからなる群より選ばれる少なくとも１つである上記（１）又は（６）に記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【００１５】
本発明は、（８）微生物が黄色ブドウ球菌、セラチア菌、ミクロコッカス菌又は大腸菌である上記（７）に記載の抗微生物活性増強ペプチドに存する。
【００１６】
本発明は、（９）微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と、上記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の抗微生物活性増強ペプチドと、を含む抗微生物剤に存する。
【００１７】
なお、本発明の目的に添ったものであれば、上記（１）〜（８）を適宜組み合わせた構成も採用可能である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、前駆領域ペプチドに含まれる酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基をアミド基に変換することにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強する機能を発揮する。
すなわち、抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と抗微生物活性増強ペプチドとを共に用いることにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることができる。
【００１９】
また、上記抗微生物活性増強ペプチドは、前駆領域ペプチドのカルボキシル基をアミド基に変換しているが、前駆領域ペプチドと同様に抗微生物活性を殆ど示さない。
よって、上記抗微生物活性増強ペプチドによれば、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さずに、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能となる。
なお、上記抗微生物活性増強ペプチドは、上述した非特許文献１又は２記載の複数種類のペプチド性抗微生物物質又はリゾチームを用いる方法等と組み合わせて、さらに効率的に抗微生物活性を増強させることができる。
【００２０】
上記抗微生物活性増強ペプチドにおいて、上記カルボキシル基をすべてアミド基に変換すると、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより増強させることができる。
【００２１】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体がセクロピン型に由来するものであると、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を確実に増強させることができる。
【００２２】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものであると、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより確実に増強させることができる。
【００２３】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは前駆領域ペプチドが、上記配列番号１のアミノ酸配列を有すると、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより一層増強させることができる。
【００２４】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、上記配列番号２のアミノ酸配列を有するので、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強する機能を発揮する。
すなわち、抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と上記抗微生物活性増強ペプチドとを共に用いることにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることができる。
【００２５】
また、上記抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物活性を殆ど示さない。
よって、上記抗微生物活性増強ペプチドによれば、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さずに、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能となる。
なお、上記抗微生物活性増強ペプチドは、上述した非特許文献１又は２記載の異なる種類のペプチド性抗微生物物質及びリゾチームから選ばれる複数種類を用いる方法等と組み合わせて、さらに効率的に抗微生物活性を増強させることができる。
【００２６】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドが、微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質であるＡＳＡＢＦ、ナイシン（Nisin）、インドリシジン(Indolicidin)及びポリミキシンＢ（Polymyxin B）からなる群より選ばれる少なくとも１つと共に用いられると、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を更に増強させることができる。
また、これらのペプチド性抗微生物物質のうち、ナイシン及びポリミキシンＢは汎用性に優れることから、容易に入手可能である。
【００２７】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドをペプチド性抗微生物物質と共に用いた場合、微生物が黄色ブドウ球菌、セラチア菌、ミクロコッカス菌又は大腸菌であると、より効果的である。
例えば、微生物が黄色ブドウ球菌であると、黄色ブドウ球菌に起因する食中毒等を抑制することができ、微生物がセラチア菌であると、セラチア菌に起因する肺炎や尿路感染症を抑制することができ、微生物がミクロコッカス菌であると、ミクロコッカス菌に起因する食物腐敗等を防止でき、微生物が大腸菌であると、大腸菌に起因する腸管出血等を抑制することができる。
【００２８】
本発明の抗微生物剤は、微生物に対して抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と、上述した抗微生物活性増強ペプチドと、を含むので、抗微生物活性に優れるものとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体の前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を改変した抗微生物活性増強ペプチドである。
ここで、本発明において、抗微生物ペプチド前駆体とは、動植物が免疫機構の一部として抗微生物ペプチドを産生するときに最初に作られるプロセシングを受ける以前の翻訳産物を意味し、前駆領域ペプチドとは、抗微生物ペプチド前駆体がプロセシングされて成熟した抗微生物ペプチドが生ずる際に、除去される前駆部分のペプチドを意味する。
【００３０】
上記動植物としては、例えば、節足動物（昆虫、甲殻類など）、軟体動物（貝など）、脊椎動物、原索動物、線虫等が挙げられる。
これらの中でも、線虫であることがより好ましい。換言すると、抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体が線虫由来のものであることが好ましい。
この場合、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより確実に増強させることができる。
【００３１】
上記抗微生物ペプチド前駆体としては、例えば、アルファヘリクス型（セクロピン型を含む）、富システイン型、富プロリン型、富トリプトファン型、富ヒスチジン型、富グリシン型等に由来するものが挙げられ、これらの中でも、セクロピン型に由来するものであることが好ましい。
【００３２】
すなわち、抗微生物ペプチド前駆体は、線虫セクロピン由来のものであることがより好ましい。
【００３３】
前駆領域ペプチドは、例えば、以下の方法によってアミノ酸配列が決定される。
例えば、動植物の抽出液から、抗微生物ペプチド前駆体を精製し、アミノ酸配列を決定する。そのアミノ酸配列をもとに、縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によって、精製した抗微生物ペプチド前駆体に対応するｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡから予測された前駆体のアミノ酸配列と、精製した抗微生物ペプチド前駆体とから直接決定された配列を比較して、ペプチドの成熟過程で除かれる前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【００３４】
なお、このとき、前駆領域ペプチドは、抗微生物ペプチド前駆体のＣ末端で除去されたものであることが好ましい。換言すると、上記前駆領域ペプチドは、Ｃ末端前駆領域ペプチドであることが好ましい。
【００３５】
こうして得られる前駆領域ペプチドは、酸性アミノ酸残基を複数有しており、具体的には、下記配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものであることが好ましい。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGluGluAlaSerLeuHisValLysThrAspGluLeuProSerProAspThrValArgGluGlnLeu（配列番号１）
【００３６】
ここで、上記アミノ酸配列において、Argはアルギニン、Pheはフェニルアラニン、Valはバリン、Alaはアラニン、Glnはグルタミン、Asnはアスパラギン、Ileはイソロイシン、Hisはヒスチジン、Serはセリン、Proはプロリン、Thrはトレオニン、Leuはロイシン、Glyはグリシン、Lysはリジン、Gluはグルタミン酸、Aspはアスパラギン酸を意味する。
【００３７】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、前駆領域ペプチドの酸性アミノ酸残基の側鎖にあるカルボキシル基がアミド基に変換されたものである。
すなわち、前駆ペプチドが上記配列番号１のアミノ酸配列におけるGlu（グルタミン酸）及び／又はAsp（アスパラギン酸）のカルボキシル基がアミド基に変換されたものである。
【００３８】
このカルボキシル基からアミド基への変換は、抗微生物活性増強ペプチドを化学的および生物的に合成する場合において、単にGluをGlnに、AspをAsnに置換することによって達成される。なお、かかる合成方法については後述する。
【００３９】
こうして得られる本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、ペプチド性抗微生物物質と共に用いることにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることができる。
【００４０】
また、上記抗微生物活性増強ペプチドは、前駆領域ペプチドのカルボキシル基をアミド基に変換しているが、前駆領域ペプチドと同様に抗微生物活性を殆ど示さない。
よって、上記抗微生物活性増強ペプチドによれば、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さずに、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能となる。
なお、上記抗微生物活性増強ペプチドは、上述した非特許文献１記載の複数種類のペプチド性抗微生物物質を用いる方法等と組み合わせて、さらに効率的に抗微生物活性を増強させることができる。
【００４１】
上記抗微生物活性増強ペプチドにおいて、カルボキシル基をすべてアミド基に変換することが好ましい。前駆ペプチドが上記配列番号１のアミノ酸配列を有する場合は、すべてのGluをGlnに、AspをAsnに置換することが好ましい。
この場合の抗微生物活性増強ペプチドは、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性をより増強させることができる。
【００４２】
また、本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、化学的又は生物的に合成により、下記配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド断片を有するものである。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu（配列番号２）
【００４３】
上記化学的な合成方法としては、固相法や液相法が挙げられる。
ここで、固相法とは、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズ等を固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、目的とするペプチドの配列が出来上がったら固相表面から切り出し、目的の物質を得る方法である。
また、液相法とは、合成しようするペプチドを固相に固定せず、液相で合成を行なうものであり、アミノ酸残基を１つ伸長するたびに精製を行なう方法である。
【００４４】
上記生物的な合成方法とは、大量発現にふさわしいプロモーターの支配下に合成しようとするペプチドの遺伝暗号をもつ翻訳領域を結合させた人工的なＤＮＡを構築し、大腸菌、酵母、昆虫もしくは脊椎動物の培養細胞に合成させる方法である。
なお、必ずしも生きた細胞を用いるとは限らず、遺伝子の転写および翻訳に関わる因子を全て含む細胞抽出物を用いた無細胞転写翻訳系を用いる場合を含む。
【００４５】
上記配列番号１の抗微生物活性増強ペプチドは、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強する機能を発揮する。
すなわち、抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と上記抗微生物活性増強ペプチドとを共に用いることにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることができる。
【００４６】
また、上記抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物活性を殆ど示さない。
よって、上記抗微生物活性増強ペプチドによれば、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さずに、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能である。
なお、上記抗微生物活性増強ペプチドは、上述した非特許文献１又は２記載の異なる種類のペプチド性抗微生物物質及びリゾチームから選ばれる複数種類を用いる方法等と組み合わせて、さらに効率的に抗微生物活性を増強させることができる。
【００４７】
本発明の抗微生物活性増強ペプチドが抗微生物活性を増強させるペプチド性抗微生物物質としては、アルファヘリクス型（セクロピン型を含む）、富システイン型、富プロリン型、富トリプトファン型、富ヒスチジン型、富グリシン型、バクテリオシン類、非遺伝子コード型ペプチド性抗生物質等が挙げられる。
なお、上述した抗微生物ペプチド前駆体から得られる抗微生物ペプチドと、上記ペプチド性抗微生物物質とは同一であっても、異なっていてもよい。
【００４８】
これらの中でも、ペプチド性抗微生物物質は、ＡＳＡＢＦ、ナイシン、インドリシジン及びポリミキシンＢからなる群より選ばれる少なくとも１つであることが好ましく、これらの中でも、汎用性に優れることから、ナイシン又はポリミキシンＢであることがより好ましい。
この場合、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を更に増強させることができる。
なお、ナイシンは特に食品業界において実績があるので、食品用抗微生物剤として好適に用いられる。また、ポリミキシンＢは内用および外用の抗菌剤として臨床の現場で広く用いられる。
【００４９】
また、この場合、抗微生物活性が増強される微生物としては、細菌、真菌、酵母、およびマイコバクテリア等が挙げられ、より具体的には、黄色ブドウ球菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、カンジタ菌、白癬菌、結核菌等が挙げられる。
【００５０】
これらの中でも、微生物が黄色ブドウ球菌、セラチア菌、ミクロコッカス菌又は大腸菌であると、より効果的である。
すなわち、微生物が黄色ブドウ球菌であると、黄色ブドウ球菌に起因する食中毒等を抑制することができ、微生物がセラチア菌であると、セラチア菌に起因する肺炎や尿路感染症を抑制することができ、微生物がミクロコッカス菌であると、ミクロコッカス菌に起因する食物腐敗等を防止でき、微生物が大腸菌であると、大腸菌に起因する腸管出血等を抑制することができる。
【００５１】
以上、述べてきたように、本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、抗微生物活性を示すペプチド性抗微生物物質と共に用いることにより、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることができる。
よって、抗微生物活性増強ペプチドと、ペプチド性抗微生物物質とを含む抗微生物剤として好適に用いられる。
なお、かかる抗微生物剤には、ｐＨバッファー等の添加剤が含まれていてもよい。
【００５２】
また、ペプチド性抗微生物物質による免疫を増強する薬剤の創薬素材としても利用できる。なお、ペプチド性抗微生物物質は、微生物に対する免疫機構の一部であることから、本発明の抗微生物活性増強ペプチドは、免疫増強剤としても期待できる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例で具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５４】
（実施例１）
［前駆領域ペプチドのアミノ酸配列の決定］
線虫セクロピンの成熟領域のアミノ酸配列をもとに、ＲＴ−ＰＣＲ法によって、精製した抗微生物ペプチド前駆体に対応するｃＤＮＡをクローニングした。ｃＤＮＡから予測された前駆体のアミノ酸配列と、精製した抗微生物ペプチド前駆体から直接決定された配列を比較して、ペプチドの成熟過程で除かれる前駆領域ペプチドのアミノ酸配列を決定した。
【００５５】
次いで、前駆領域ペプチドをコードするｃＤＮＡのアミノ酸配列を、コンピューター上で翻訳したところ、下記配列番号１のアミノ酸配列を有していることを確認した。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGluGluAlaSerLeuHisValLysThrAspGluLeuProSerProAspThrValArgGluGlnLeu（配列番号１）
【００５６】
［抗微生物活性増強ペプチドのデザイン］
得られた前駆領域ペプチドの配列に含まれるアミノ酸残基のうち、酸性アミノ酸残基であるGluおよびAspを、それぞれGlnおよびAsnに置換し、下記配列番号２のアミノ酸配列をデザインした。
HisArgArgSerValAlaHisGlnGlnGlnAlaSerLeuHisValLysThrAsnGlnLeuProSerProAsnThrValArgGlnGlnLeu（配列番号２）
【００５７】
［ペプチド合成（固相法）］
次に、表面をアミノ基で修飾した直径０．１ｍｍ程度のポリスチレン高分子ゲルのビーズを固相として用い、ここから脱水反応によって1つずつアミノ酸鎖を伸長していき、上記配列番号２のアミノ酸配列とした。そして、固相表面から切り出し、抗微生物活性増強ペプチドを得た。
【００５８】
（評価１）
実施例１で得られた抗微生物活性増強ペプチド（以下「ＮＰ４Ｐ」ともいう。）にＡＳＡＢＦ型抗微生物ペプチド（ペプチド性抗微生物物質）を図１に示すモル比で混合し、黄色ブドウ球菌（微生物）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図１に示す。図１中、縦軸はＡＳＡＢＦ型抗微生物ペプチドの濃度（単位：μｇ／ｍｌ）を示し、横軸は抗微生物活性増強ペプチドとＡＳＡＢＦとのモル濃度比を示す。また、ｃｏｎｔｒｏｌはＡＳＡＢＦ=０を意味する。
【００５９】
（評価２）
２０μｇ／ｍｌのＮＰ４Ｐ存在下または非存在下において、図２に示す濃度のＡＳＡＢＦを、黄色ブドウ球菌（微生物、S.aureus IF012732）、マイクロコッカス菌（微生物、M.luteus IF012708）、セラチア菌（微生物、Serratia marcescens IFO3736）又は大腸菌（微生物、Escheritia coli JM109）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図２の（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）（以下「（ａ）〜（ｄ）」という。）にそれぞれに示す。なお、図２の（ａ）が黄色ブドウ球菌を用いた場合の結果であり、図２の（ｂ）がマイクロコッカス菌を用いた場合の結果であり、図２の（ｃ）がセラチア菌を用いた場合の結果であり、図２の（ｄ）が大腸菌を用いた場合の結果である。
【００６０】
図１及び図２の（ａ）〜（ｄ）に示す結果より、共存する抗微生物活性増強ペプチドの量が増えるにしたがって、ＡＳＡＢＦはより低濃度で抗微生物活性を示すことがわかった。
【００６１】
（評価３）
ナイシン（ペプチド性抗微生物物質）５μｇ／ｍｌに、実施例１で得られた抗微生物活性増強ペプチド（ＮＰ４Ｐ）を図２に示すモル比で混合し、黄色ブドウ球菌（微生物、S.aureus N315）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図３に示す。図３中、横軸は抗微生物活性増強ペプチドとナイシンとのモル濃度比を示す。
図３に示す結果より、共存する抗微生物活性増強ペプチドの量が増えるにしたがって、ナイシンはより低濃度で抗微生物活性を示すことがわかった。
【００６２】
（評価４）
インドリシジン（哺乳類の免疫防御を構成するペプチド性抗微生物物質）１０μｇ／ｍｌに、実施例１で得られた抗微生物活性増強ペプチド（ＮＰ４Ｐ）を図４に示すモル比で混合し、黄色ブドウ球菌（微生物、S.aureus N315）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図４に示す。図４中、横軸は抗微生物活性増強ペプチドとインドリシジンとのモル濃度比を示す。
図４に示す結果より、共存する抗微生物活性増強ペプチドの量が増えるにしたがって、インドリシジンはより低濃度で抗微生物活性を示すことがわかった。
【００６３】
（評価５）
ポリミキシンＢ（ペプチド性抗微生物物質）５μｇ／ｍｌに、実施例１で得られた抗微生物活性増強ペプチド（ＮＰ４Ｐ）に図５に示す割合で混合し、大腸菌（微生物、Escheritia coli JM109）又はセラチア菌（微生物、Serratia marcescens IFO3736）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図５の（ａ）及び（ｂ）に示す。なお、図５の（ａ）が大腸菌を用いた場合の結果であり、図５の（ｂ）がセラチア菌を用いた場合の結果である。図５の（ａ）中、横軸は抗微生物活性増強ペプチドとポリミキシンＢとのモル濃度比を示す。図５の（ｂ）中、横軸はポリミキシンＢの濃度を示す。
図５の（ａ）及び（ｂ）に示す結果より、共存する抗微生物活性増強ペプチドの量が増えるにしたがって、ポリミキシンＢはより低濃度で抗微生物活性を示すことがわかった。
【００６４】
（評価６）
実施例１で得られた抗微生物活性増強ペプチド（ＮＰ４Ｐ）を図６に示す濃度（μｇ／ｍｌ）で、黄色ブドウ球菌（微生物）と共に２時間処理した後、固形培地上に播種して、生存した菌の存在をコロニーとして検出した。
得られた結果を図６に示す。図６中、横軸は抗微生物活性増強ペプチドの濃度を示す。
図６に示す結果より、抗微生物活性増強ペプチドのみでは、抗微生物活性を示さないことがわかった。
【００６５】
以上より、いずれのペプチド抗微生物物質においても、本発明の抗微生物活性増強ペプチドが共存することによって、最小抗微生物濃度以下で抗微生物活性を示すようになった。
よって、本発明の抗微生物活性増強ペプチドによれば、ペプチド性抗微生物物質の抗微生物活性を増強させることが可能であり、それ自体は抗微生物活性を殆ど示さないことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は、本発明の実施例における評価１の結果を示した図である。
【図２】図２の（ａ）（ｂ）（ｃ）及び（ｄ）は、本発明の実施例における評価２の結果を示した図である。
【図３】図３は、本発明の実施例における評価３の結果を示した図である。
【図４】図４は、本発明の実施例における評価４の結果を示した図である。
【図５】図５の（ａ）及び（ｂ）は、本発明の実施例における評価５の結果を示した図である。
【図６】図６は、本発明の実施例における評価６の結果を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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