(57)【要約】【課題】高血糖状態を長期間維持し得る糖尿病モデル動物であって、雌雄間の表現型に差異のないモデル動物と該モデル動物の作成方法の提供。【解決手段】ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のホモ欠損によりＭａｆＡを発現しない非ヒト動物と、該非ヒト動物を作出するため親動物として、ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のヘテロ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物を提供する。さらに、これらの非ヒト動物を得る方法を提供する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のホモ欠損によりＭａｆＡを発現しない非ヒト動物。
【請求項２】
高血糖状態を終生維持して生存可能な請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項３】
糸球体硬化像を伴う糖尿病性腎症を発症することを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記プロモーター配列は、Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  １配列であることを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項５】
ラット又はマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒト動物。
【請求項６】
請求項１記載の非ヒト動物を作出するための親動物として使用するための非ヒト動物であって、ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のヘテロ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物。
【請求項７】
請求項１記載の非ヒト動物に由来する細胞。
【請求項８】
卵、精子、受精卵、又は、胚性幹細胞のいずれかから選択されることを特徴とする請求項７記載の細胞。
【請求項９】
膵臓ベータ細胞であることを特徴とする請求項７記載の細胞。
【請求項１０】
請求項６記載の非ヒト動物を交配させて、請求項１記載の非ヒト動物を得る方法。
【請求項１１】
ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現する生存可能な非ヒト動物と、
ＭａｆＡ遺伝子のホモ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物と、を交配させて、
請求項６記載の非ヒト動物を得る方法。
【請求項１２】
請求項１記載の非ヒト動物に試験物質を投与して、該試験物質の薬理効果を評価する薬理試験方法。
【請求項１３】
血糖値の変化に基づいて薬理効果を評価することを特徴とする請求項１２記載の薬理試験方法。
【請求項１４】
前記糖尿病性腎症の改善に基づいて薬理効果を評価することを特徴とする請求項１２記載の薬理試験方法。
【請求項１５】
請求項１記載の非ヒト動物に由来する細胞に試験物質を投与して、該試験物質の薬理効果を評価する薬理試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭａｆＫ／ＭａｆＡ遺伝子改変非ヒト動物に関する。より詳しくは、ＭａｆＫを過剰発現し、かつ、ＭａｆＡを発現しない非ヒト動物と該非ヒト動物の作成方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は血糖値が正常範囲を大きく超えて上昇する疾患であり、大別すると、膵臓のインスリン産生細胞（ベータ細胞）が破壊されて引き起こされるＩ型糖尿病と、肝臓や筋肉などの細胞のインスリン反応性が低下して引き起こされるII型糖尿病がある。わが国についてみると、糖尿病患者の９５％以上は後者のII型糖尿病である。
【０００３】
Ｉ型糖尿病、II型糖尿病のいずれにおいても、糖尿病患者のＱＯＬを著しく低下させる要因となっているのは、高血糖状態が長期に続くことによって引き起こされる糖尿病合併症である。糖尿病合併症のうち代表的なものとしては、糖尿病神経障害、糖尿病網膜症、糖尿病腎症があり、これらは三大合併症と呼ばれている。
【０００４】
このうち、糖尿病神経障害は、最も初期に現れる合併症であり、細小血管の血流が悪くなって末梢神経に障害が生じ、手足のしびれ、痛みや冷熱に対する感覚鈍麻、筋力低下といった知覚・運動神経異常、さらには、発汗異常や内臓の不調、立ちくらみ等の自律神経異常が現れる。この他、免疫力の低下による細菌感染が伴い足先などの潰瘍・壊疽によって足の切断に至るケースもある。
【０００５】
また、糖尿病網膜症は、網膜の血管が障害されることで、視力低下や失明が引き起こされるもので、日本国内では年間３，０００人もの患者が発生し、成人失明原因の第一位となっている。糖尿病腎症では、不要物や老廃物を濾過する腎臓内の毛細血管（糸球体）が障害されることで、タンパク質が尿中に排出されるネフローゼ症候群や、尿毒症が引き起こされる。さらに、症状が進行した場合には腎不全となり、血液透析が必要となる。糖尿病による腎臓障害で人工透析を始める人は、年間1万人以上にものぼっている。
【０００６】
これらの糖尿病合併症の病態機序には、糖尿病下における高血糖状態が長期に続くことによる微小血管の障害が共通して関与していることから、糖尿病合併症の発症を防止するためには、この高血糖状態による微小血管障害を防止することが必要となる。
【０００７】
高血糖下における血管障害のメカニズムを明らかにし、治療薬等の開発を行なうためには、長期にわたって高血糖状態を持続する糖尿病モデル動物が必要となる。糖尿病モデル動物には、高脂肪食の給餌により作出されるもの、薬物投与により作出されるもの、遺伝的に糖尿病を発症するもの等、各種のモデル動物が開発されている。しかしながら、一旦発症した高血糖状態を長期にわたって維持させることができるモデルは多くない。
【０００８】
糖尿病における高血糖病態をよく反映したモデルとしては、糖尿病を自然発症した個体から分離された系統であるＡＫＩＴＡマウスが知られている。ＡＫＩＴＡマウスは、１９９７年に秋田大学の小泉らによって発見されたＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを起源とする非肥満性の糖尿病動物である（非特許文献１参照）。常染色体優性遺伝により、生後６−１０週で高度の耐糖能異常を伴う（空腹時血糖で５００−６００ｍｇ／ｄｌ）糖尿病を発症する。
【非特許文献１】Diabetes. 1997 May;46(5):887-94.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＡＫＩＴＡマウスは、生後６−１０週という早い段階で顕著な耐糖能異常を呈し、終生高血糖状態を維持する。さらに生後３０週齢以降では、上述の三大合併症のうち、糖尿病神経障害及び糖尿病性腎症を発症することから、II型糖尿病のモデルとして、その病態の解明、治療法の開発、治療薬の評価等に使用されている。
【００１０】
しかし、ＡＫＩＴＡマウスは雄個体においては上記のような典型的な糖尿病及び糖尿病合併症の症状が認められるものの、雌個体における症状は軽微である。従って、各種試験には雄個体のみを選別して供する必要があり、繁殖効率上の問題があった。
【００１１】
また、ヒトのII型糖尿病においては、性別による発症頻度の差はほとんどないのに対して、ＡＫＩＴＡマウスにおいては雌雄間での表現型に大きな差異があることから、ＡＫＩＴＡマウスの病態機序には、ヒトII型糖尿病と異なり、性ホルモンが大きく関与しているものと考えられる。
【００１２】
そこで、本願発明者らは、高血糖状態を長期間維持し得る糖尿病モデル動物であって、雌雄間の表現型に差異のないモデル動物を確立することを目的として、遺伝子改変により新たな糖尿病モデル動物を作出し、本願発明を完成させるに到った。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、雌雄ともに生後数週から終生高血糖状態を維持する糖尿病モデル動物として、ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のホモ欠損によりＭａｆＡを発現しない非ヒト動物を提供する。該非ヒト動物は、高血糖状態を維持し生存が可能であり、糸球体硬化像を伴う糖尿病性腎症を発症する。前記非ヒト動物は、ラット又はマウスとすることができる。
【００１４】
前記プロモーター配列には、Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  １配列を用いることができる。
【００１５】
また、本発明は、上記の非ヒト動物を作出するため、ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現し、かつ、ＭａｆＡ遺伝子のヘテロ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト親動物を提供する。
【００１６】
同時に、ＭａｆＫ遺伝子及びプロモーター配列をコードするトランスジーンをゲノム中に有することによりＭａｆＫを発現する生存可能な非ヒト動物と、ＭａｆＡ遺伝子のホモ欠損の遺伝子型を有する生存可能な非ヒト動物と、を交配させて前記非ヒト親動物を得る方法と、該非ヒト親動物同士を交配して上記の非ヒト動物を得る方法をも提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、上記の非ヒト動物に由来する細胞、より具体的には、卵、精子、受精卵、又は、胚性幹細胞のいずれかから選択される細胞及び膵臓ベータ細胞を提供する。
【００１８】
最後に本発明は、上記の非ヒト動物及び該非ヒト動物に由来する細胞に、試験物質を投与して、該試験物質の薬理効果を評価する薬理試験方法を提供する。該薬理試験は、前記試験物質を投与した前記非ヒト動物の血糖値の変化及び糖尿病性腎症の改善に基づいて、薬理評価を行うことが可能である。
【００１９】
ここで、本発明に係る非ヒト動物において遺伝子改変を行ったＭａｆＫ及びＭａｆＡ遺伝子について説明する。
【００２０】
Ｍａｆ遺伝子は、当初、鳥類の筋腱膜繊維肉腫から単離されたトリレトロウイルスＡＳ４２のトランスフォーミング遺伝子として分離同定された遺伝子である。Ｍａｆ遺伝子ファミリーに属する遺伝子には、現在までに、ラージＭａｆと称されるＭａｆＡ，Ｌ−Ｍａｆ，ＳＭａｆ，ＭａｆＢ，ｃ−Ｍａｆ，ＮｒｌとスモールＭａｆと称されるＭａｆＫ，ＭａｆＦ，ＭａｆＧが同定されている。これらＭａｆファミリータンパクは共通してそのＣ末端にＤＮＡ結合配列を有している。
【００２１】
上記Ｃ末端ＤＮＡ結合配列に加えて、ラージＭａｆは、Ｎ末端に転写活性化部位を有している。ラージＭａｆは、このＮ末端転写活性化部位により、細胞分化や組織形成の調節に重要な機能を果たしている。ラージＭａｆに分類されるＭａｆＡは、インスリンのプロモーターのＲＩＰＥ３ｂ／Ｃ１エレメントに結合する転写因子として従来から知られていたＲＩＰＥ３ｂ／Ｃ１アクチベーターと同一であることが明かにされている。ＭａｆＡは、膵島においてはベータ細胞にのみ発現が認められ、血中のグルコース濃度の上昇に反応して、インスリンの転写活性を上昇させる機能を有すると考えられている。
【００２２】
一方、ＭａｆＫを含むスモールＭａｆは、上記Ｃ末端ＤＮＡ結合配列は有するものの、Ｎ末端には転写活性化部位を持たない。このため、Ｃ末端ＤＮＡ結合配列により、ラージＭａｆと共通のＤＮＡ配列に結合すると、ラージＭａｆの転写活性化機能を競合的に阻害し、リプレッサーとして機能する。
【００２３】
以上説明したように、ＭａｆＡは、膵島ベータ細胞において、血中のグルコース濃度の上昇に反応してインスリン産生促進機能を果たし、一方、ＭａｆＫは、ＭａｆＡのリプレッサーとしてインスリン産生阻害機能を有する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明により、高血糖状態を長期間維持し、雌雄間の表現型に差異のない糖尿病モデル動物を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本願発明者は、まずＭａｆＡのインスリン産生促進機能に注目し、新たな糖尿病モデル動物の作出を企図して、ＭａｆＡ欠損非ヒト動物（以下、ＭａｆＡ−／−非ヒト動物とも表記する）を作出した（作出方法については後述する）。ＭａｆＡ−／−非ヒト動物では、血中のグルコース濃度が上昇しても、膵島ベータ細胞でのインスリン産生が増加せず、耐糖能異常を呈すると考えられたためである。
【００２６】
また、本願発明者は、ＭａｆＫのインスリン産生阻害機能にも注目し、ＭａｆＫを過剰発現するトランスジェニック非ヒト動物（以下、ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物とも表記する）を作出した（作出方法については後述する）。ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物では、過剰発現されたＭａｆＫが、ＭａｆＡのインスリン転写活性化機能を競合的に阻害するため、血中のグルコース濃度が上昇しても、膵島ベータ細胞でのインスリン産生が増加せず、耐糖能異常を呈すると考えられたためである。
【００２７】
本発明において、「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物を意味し、例えばヒトを除く哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等）、鳥類（例えば、ニワトリ等）、両生類（例えば、カエル等）、爬虫類又は昆虫が挙げられる。
【００２８】
ＭａｆＡ−／−非ヒト動物は、次に示すような通常用いられている方法により得ることができる。まず例えば相同組換えにより少なくとも一方の対立遺伝子を破壊した胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞とも表記する）を、受精卵の胚盤胞に注入してキメラ非ヒト動物を得る。得られたキメラ動物を相当する野生型（ＭａｆＡ＋／＋）非ヒト動物と交配させて、対立遺伝子の一方のみが破壊されたヘテロ接合体（ＭａｆＡ＋／−）非ヒト動物を作出する。さらにこれら得られたＭａｆＡ＋／−非ヒト動物を交配させて、両方の対立遺伝子が破壊されたホモ接合体（ＭａｆＡ−／−）非ヒト動物を作出することができる。
【００２９】
ＥＳ細胞として、マウスの場合には、Ｅ１４、ＣＣＥ、Ｊ１又はＴＴ２等を用いることができる。ＥＳ細胞の相同組換えは、例えばＭａｆＡ発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列を挿入した組換えＤＮＡを、ＥＳ細胞に導入することにより行うことができる。ＭａｆＡ発現を妨害し得る任意のＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡのＥＳ細胞への導入を確認できるような薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ））等を用いるのが好ましく、またレポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ））等を用いるのが好ましいが、特に限定されない。
【００３０】
上述のＤＮＡ導入法としては、例えば電気穿孔法又はマイクロインジェクション法が挙げられる。ＥＳ細胞におけるＭａｆＡ遺伝子破壊は、常法に従って、例えばＰＣＲ法やサザンブロット法により確認することができる。
【００３１】
相同組換えによりＭａｆＡ遺伝子を破壊したＥＳ細胞を有するキメラ非ヒト動物の作出方法は、例えば胚盤胞マイクロインジェクション法等が挙げられる。胚盤胞インジェクション法は、非ヒト動物の胚盤胞にＭａｆＡを破壊したＥＳ細胞をマイクロインジェクションし、処理した胚盤胞を擬妊娠非ヒト動物に移植することにより所望のキメラ非ヒト動物を作出することができる。
【００３２】
得られたキメラ非ヒト動物を相当するＭａｆＡ＋／＋非ヒト動物に交配させることで得られるＭａｆＡ＋／−非ヒト動物、あるいは該ＭａｆＡ＋／−非ヒト動物を更に交配させることで得られるＭａｆＡ−／−非ヒト動物は、例えば、尾部から採取したＤＮＡを用いたＰＣＲ法やサザンブロット法によりその遺伝子型を判定することができる。
【００３３】
また、ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物は、次に示すような通常用いられている方法により得ることができる。まず、過剰発現させたいＭａｆＫ遺伝子のｃＤＮＡをプロモーター配列の下流につなぎ、発現ベクターに挿入して、トランスジェニックコンストラクトを作製する。この際、トランスジーンの発現確認を容易とするために、ＭａｆＫｃＤＮＡには、ＦＬＡＧ配列やＨｉｓ−Ｔａｇ配列などをつないで、これら標識ペプチドとのフュージョンタンパクとして発現させることが好ましい。
【００３４】
作製されたコンストラクトを、非ヒト動物の受精卵の前核にマイクロインジェクション法により注入し、該受精卵を偽妊娠非ヒト動物に移植することによりＭａｆＫＴｇ非ヒト動物を作出することができる。
【００３５】
トランスジーンの発現確認は、該トランスジーンのｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲ法により確認する方法や、ＦＬＡＧペプチドやＨｉｓ−Ｔａｇに対する抗体を用いたウェスタンブロット法や免疫染色法により行なうことが可能である。
【００３６】
また、本発明は、ＭａｆＡ−／−非ヒト動物とＭａｆＫＴｇ非ヒト動物を交配させて、生存可能なＭａｆＡ＋／−，ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物を作出する方法を提供する。さらに、これにより作出したＭａｆＡ＋／−，ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物同士を交配させて、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇ非ヒト動物を作出する方法を提供する。これらの交配は、通常の自然交配により行うことができ、出生仔の遺伝子型判別及びトランスジーンの発現確認については上記と同様の方法で行うことが可能である。
【００３７】
以下、実施例に従って、本発明をより詳細に説明するが、これによって如何なる意味においても本発明の範囲を限定されると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１：ＭａｆＡ欠損マウスの作出＞
本願発明者は、まずＭａｆＡのインスリン産生促進機能に注目し、新たな糖尿病モデル動物の作出を企図して、ＭａｆＡ欠損マウス（以下、ＭａｆＡ−／−マウスとも表記する）を作出した（Mol Cell Biol. 2005 Jun;25(12):4969-76.参照）。以下に、ＭａｆＡ−／−マウスの作出方法について簡単に説明する（詳細については前掲の文献を参照）。
【００３９】
（１）ターゲティングベクターの作製
マウスＭａｆＡ遺伝子のｃＤＮＡ断片をプローブとして、１２９／ＳｖＪマウスゲノムライブラリー（ストラタジーン社）をスクリーニングすることにより、完全長のＭａｆＡゲノム遺伝子とターゲティングベクターを作製するのに十分な長さの５’及び３’フランキング配列を含むファージクローンを分離した。
【００４０】
得られたファージクローンを用いて、プラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：ストラタジーン社）にクローン化してターゲティングベクターを作製した（図１（Ｂ）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ参照）。このターゲティングベクターは、核移行シグナル（Nuclear localization Signal：以下、ＮＬＳとも表記する）−β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子をＥｃｏＲＩサイトとＥｃｏＲＶサイト間のＭａｆＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）領域に挿入している。また形質転換体を選択するために、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子をＮＬＳ−ｌａｃＺ遺伝子下流に配置し、更に非相同性組換え体のネガティブ選択のために、ジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）遺伝子（ＭＣ１−ＤＴ３）をＭａｆＡ遺伝子下流に挿入している。
【００４１】
ターゲティングベクターは、野生型ＭａｆＡ遺伝子座（図1（Ａ）Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ａｌｌｅｌｅ参照）との相同組換えにより、ＭａｆＡ遺伝子座を破壊する（図1（Ｃ）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ参照）。
【００４２】
（２）ターゲティングベクターのＥＳ細胞への導入と確認
得られたターゲティングベクター８０μｇをリニア化した後、ＥＳ細胞（Ｅ１４）約４ × １０７個の懸濁液に添加し、ジーンパルサー（バイオラッド）を用いて定法により遺伝子導入を行った。
【００４３】
遺伝子導入を行った細胞を、抗生物質G-418硫酸塩の存在下で、３７℃にて９日間培養し、ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）遺伝子を有する細胞コロニーを選択し、ＥＳ細胞クローンを得た。
【００４４】
（３）ＭａｆＡ−／−マウスの作出
得られたＥＳクローンをＣ５７ＢＬ／６Jマウスの胚盤胞に、マイクロインジェクションし、偽妊娠ＩＣＲマウスに移植してキメラマウスを作出した。次に、作出したキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Jと交配させて、Ｆ１仔を得た。ＰＣＲ法による遺伝子型判別を行い、Ｆ１仔における遺伝子導入の有無を確認し、ＭａｆＡヘテロ欠損体（以下、ＭａｆＡ＋／−マウスとも表記する）を選択した。さらに、ＭａｆＡ＋／−マウス同士を交配し、Ｆ２仔を作出し、同様に遺伝子型判別を行い、ＭａｆＡ−／−マウスを得た。
【００４５】
ＰＣＲ法に用いたプライマー配列は、組み換えＭａｆＡ遺伝子座（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）検出用として、５’−ＡＴＧＣＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧＣＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１参照）と５’−ＣＴＧＣＧＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＣＣＣＧＡＧＧＧＡＡＧ−３’ （配列番号２参照）を用いた。また、野生型ＭａｆＡ遺伝子座（Ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｌｌｅｌｅ）の検出用として、５’−ＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＣＧＧ−３’ （配列番号３参照）と５’−ＴＣＴＧＴＴＴＣＡＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣ−３’ （配列番号４参照）を用いた。組み換えＭａｆＡ遺伝子座検出用、野生型ＭａｆＡ遺伝子座検出用の上記プライマーセットは、それぞれ約７００ｂｐ、４００ｂｐのＰＣＲ産物を増幅する。
【００４６】
＜実施例２：ＭａＫ過剰発現マウスの作出＞
続いて、本発明者は、ＭａｆＫのインスリン産生阻害機能に注目し、ＭａｆＫを過剰発現するトランスジェニックマウス（以下、ＭａｆＫＴｇマウスとも表記する）を作出した（Biochem Biophys Res Commun. 2006 Aug 4;346(3):671-80. Epub 2006 Jun 8.参照）。以下に、ＭａｆＫＴｇマウスの作出方法について簡単に説明する（詳細については前掲の文献を参照）。
（１）トランスジェニックコンストラクトの作製
マウスＭａｆＫタンパクをコードする完全長ｃＤＮＡ（配列番号５参照）にＮ末端ＦＬＡＧ配列を付加した遺伝子（トランスジーン）を、発現用ベクターのＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １の下流に挿入した（図２（Ａ）mafK transgenic construct参照）。
【００４７】
ここでＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １について説明する。ラットインスリン遺伝子のプロモーターには、上記Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １とＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  ２の２種がある。これらは、膵島ベータ細胞において、ＮｅｕｒｏＤ，Ｐｄｘ１，Ｍａｆ等の転写因子の制御を受け、インスリンの転写調節に関与している。ただし、Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １にはＭａｆは結合しないことが知られている (Biochem.Biophys.Res.Commun. 2003 Dec19; 312(3): 831-42参照)。従って、上述のコンストラクトに挿入したトランスジーンは、膵島ベータ細胞特異的に発現し、かつ、Ｍａｆの転写制御から独立して発現することとなる。
【００４８】
（２）ＭａｆＫＴｇマウスの作出
得られたコンストラクトを、ＢＤＦ１マウスの受精卵の前核へマイクロインジェクションし、偽妊娠ＩＣＲマウスに移植した。トランスジーンの導入の有無をＲＴ−ＰＣＲ法により確認し、ＭａｆＫＴｇマウスを得た。
【００４９】
ＲＴ−ＰＣＲ法によるトランスジーンの発現確認は、定法により膵臓からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ：インビトロジェン社）を用いて該ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。プライマー配列には、Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １配列に対応する、５’−ＴＧＡＣＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴＣＡＴＡＧＡ−３’（配列番号６参照）と、ＭａｆＫｃＤＮＡ配列に対応する、５’−ＴＣＴＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＣＴＴＧＡＴＧＣ−３’ （配列番号７参照）を用いた。一方のプライマーをＲａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｐｒｏｍｏｔｏｒ  １配列内に設けたことにより、トランスジーンが導入されたマウスにおいてのみＰＣＲ増幅産物が検出され、該トランスジーンの導入の有無を確認することが可能となる。
【００５０】
＜実施例３：ＭａｆＡ−／−マウス及びＭａＫＴｇマウスの表現型の解析＞
（１）ＭａｆＡ−／−マウスの表現型
実施例１で得られたＭａｆＡ−／−マウスについて、血清グルコース濃度の測定を行い、糖尿病表現型の有無を評価した。血清グルコース濃度の測定は、Ｆｕｊｉ  Ｄｒｉｃｈｅｍ３５００（フジフィルム）を用いて行った。４週、８週、１２週齢における空腹時血糖の測定結果を図３に示す。図３中、＋／＋は野生型、＋／−はＭａｆＡヘテロ欠損型、−／−はＭａｆＡホモ欠損型を表す。
【００５１】
４週齢においては雌個体で、８週及び１２週齢においては雌雄両個体で、ＭａｆＡ−／−マウスにおける血清グルコース濃度の有意な上昇が認められた。なお、ＭａｆＡ＋／−は、ＭａｆＡ＋／＋マウスとＭａｆＡ−／−マウスの中間程度の血清グルコース濃度を呈した。本実験で観察されたＭａｆＡ−／−マウスにおける最大血糖値は、１２週齢の雌個体で認められた約１８０ｍｇ／ｄｌであった。
【００５２】
（２）ＭａＫＴｇマウスの表現型
実施例２で得られたＭａｆＫＴｇマウスについても、同様に血清グルコース濃度の測定を行い、糖尿病表現型の有無を評価した。５週及び２０週齢の雄個体の空腹時血糖の測定結果を図４に示す。図４中、Ｎｏｎ−Ｔｇは野生型マウス、ＴｇはＭａＫＴｇマウスを表す。
【００５３】
５週齢において、ＭａｆＫＴｇマウスで血清グルコース濃度の有意な上昇が認められた。しかし、２０週齢においては、有意な変化ではないものの、逆にＭａｆＫＴｇマウスで血清グルコース濃度が減少する傾向がみられた。本実験で観察されたＭａｆＫＴｇマウスにおける最大血糖値は、約１５０ｍｇ／ｄｌであった。
【００５４】
上述の通り、ＭａｆＡ−／−マウスにおいては、血清グルコース濃度の有意な上昇が認められた。しかしながら、従来公知のＡＫＩＴＡマウスにおいては、生後６−１０週で空腹時血糖が５００−６００ｍｇ／ｄｌと高度の耐糖能異常を呈するのに比べ、ＭａｆＡ−／−マウスにおいては、最大（１２週齢雌個体）でも２００ｍｇ／ｄｌ以下と、血清グルコース濃度の上昇は大きいものではなかった（図３参照）。また、ＭａｆＫＴｇマウスにおいては、生後早い段階（５週齢）では血清グルコース濃度は有意に高い状態にあるものの（２００ｍｇ／ｄｌ以下）、成体（２０週齢）では野生型マウスと同程度にまで治癒した。
【００５５】
＜実施例４：ＭａｆＡ欠損であって、かつ、ＭａＫを過剰発現するマウス（以下、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスとも表記する）の作成＞
（１）ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスの作成
ここで、本発明者は、ＭａｆＡ−／−マウスとＭａｆＫＴｇマウスの交配により作出される、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスが、驚いたことに顕著な耐糖能異常を呈することを見出した。ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫTｇマウスは、ＡＫＩＴＡマウスを上回る１０００ｍｇ／ｄｌ前後という極度の高血糖状態を呈した（後述図５参照）。なお、交配は通常の自然交配により行い、出生仔の遺伝子型判別及びトランスジーンの発現確認については、既に説明したようにＰＣＲ法及びＲＴ−ＰＣＲ法により行なった。
【００５６】
ＭａｆＡは、膵島ベータ細胞において、血中のグルコース濃度の上昇に反応してインスリン産生促進機能を果たし、一方、ＭａｆＫは、ＭａｆＡのリプレッサーとしてインスリン産生阻害機能を有する。従って、ＭａｆＡ−／−マウス及びＭａｆＫＴｇマウスは、ＭａｆＡによるインスリン産生促進機能が障害されるとう点で、共通の表現型を呈するものと考えられる。これは、ＭａｆＡを欠損させ、ＭａｆＫを過剰発現する特徴をあわせもつＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスにおいても同様と考えられた。
【００５７】
（２）ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスの表現型
しかしながら、上記の予想に反して、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスは、ＭａｆＡ−／−マウス及びＭａｆＫＴｇマウスをはるかに超える顕著な高血糖状態を呈した。
【００５８】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスについて、５週齢及び１０週齢時点での血清グルコース濃度の測定結果を図５に示す。図５中、（Ａ）は随時血糖、（Ｂ）は空腹時血糖の測定結果を示す。また、各測定時点において、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウス（図中黒塗り、右のバー）と併せて、対照としてＭａｆＫＴｇマウス（図中斜線、左のバー）の血清グルコース濃度を示した。
【００５９】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスは生後５週齢から、雄雌ともに随時血糖７００ｍｇ／ｄｌ以上、空腹時血糖４００ｍｇ／ｄｌ以上の著しい高血糖を示した。
【００６０】
これは、上述した、ＭａｆＡ−／−マウスの最大血糖値約１８０ｍｇ／ｄｌ（図３参照）及びＭａｆＫＴｇマウスの約１５０ｍｇ／ｄｌ（図４参照）をはるかに超える顕著な高血糖状態である。また、空腹時血糖で５００−６００ｍｇ／ｄｌ（生後６−１０週時点）を示すＡＫＩＴＡマウスに対しては同程度ないしは同程度以上の高血糖状態である。ここで、ＡＫＩＴＡマウスは上述の通り、雄個体でのみ高血糖状態が現れるのに対して、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスでは雌雄の区別なく高血糖状態が作出された。
【００６１】
表１に、より長期に血清グルコース濃度の測定を行なった結果を示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス（表中、Ｗｉｌｄ）、ＭａｆＡ−／−マウス（同、ＫＯ）、ＭａｆＫＴｇマウス（同、Ｔｇ）、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウス（同、ＫＯ Ｔｇ）について、３０週齢もしくは６０週齢時点まで、空腹時血糖（表中Fasted serum glucose）及び随時血糖（Fed Serum Glucose）の測定を行なった。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスは測定を行なった全ての時点において、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス、ＭａｆＡ−／−マウス、ＭａｆＫＴｇマウスに比して著しい高血糖を呈した。
【００６４】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスの雄は３０週令前後まで生存し、一部４０週齢まで生存する個体もみられた。雌は、３０週齢以後死亡する個体が散見されたが、多くは５０週齢前後まで生存し、６０週齢まで生存する個体もみられた。雌雄ともに死亡時点においても、随時血糖は７００ｍｇ／ｄｌ以上であり、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスが、終生高血糖状態を維持することが明らかとなった。
【００６５】
次に、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス、ＭａｆＡ−／−マウス、ＭａｆＫＴｇマウス、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスについて、腎糸球体の病理組織像を観察した。
【００６６】
糖尿病の三大合併症の１つである糖尿病腎症においては、腎糸球体の基底膜の肥厚やメサンギウム領域の拡大、間質の線維化を特徴とする糸球体硬化像と呼ばれる病理所見が観察される。
【００６７】
図６に、各マウスの雄個体について２０週齢時点における腎糸球体の組織像を示す。図中、（Ａ）は野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス、（Ｂ）はＭａｆＫＴｇマウス、（Ｃ）は ＭａｆＡ−／−マウス、（Ｄ）はＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスの組織像である。
【００６８】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスでは、メサンギウム基質の拡大と糸球体径の増大を認め、典型的な糸球体硬化像が確認される（図６（Ｄ）参照）。野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス（Ａ）、ＭａｆＫＴｇマウス（Ｂ）、 ＭａｆＡ−／−マウス（Ｃ）においては糸球体に異常所見は認められなかった。
【００６９】
図７は、腎組織像に占める糸球体領域の面積を定量化した結果（Ａ）、及び体重に占める腎重量（Ｂ）を示した図である。（Ａ）において糸球体領域の面積は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウスにおける腎組織像に占める糸球体領域面積の割合を１として、その相対値として表示した。また（Ｂ）において、体重に占める腎重量は、腎重量（ｇ）を体重（ｇ）で除して算出した。
【００７０】
ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスでは、メサンギウム基質の拡大と糸球体径の増大に伴って、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウスに比べて、糸球体領域面積が約１．８倍に拡大した（図７（Ａ）参照）。また、糸球体基底膜の肥厚、間質の線維化に伴って、腎全体の体重に占める割合も増加している（同（Ｂ）参照）。
【００７１】
表２に、腎糸球体の組織像の観察と同時点（２０週齢）を含め、経時的に血清学的検査による腎機能の評価を行なった結果を示す。
【００７２】
【表２】
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【００７３】
２０週齢、雄個体のＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスにおける血清尿素窒素（ｓＢＵＮ）は４５．０±１３．５ｍｇ／ｄｌ、血清クレアチニン(ｓＣＲＥ)は０．４３±０．０６ｍｇ／ｄｌであり、野生型Ｃ５７ＢＬ／６JマウスのｓＢＵＮ２６．３±６．１５ｍｇ／ｄｌ、ｓＣＲＥ０．２３±０．０６ｍｇ／ｄｌと比べ上昇を認める。
【００７４】
血清クレアチニン(ｓＣＲＥ)及び血清尿素窒素（ｓＢＵＮ）は、腎糸球体から濾過され、尿中に排泄される物質であり、これらの血中濃度の上昇は、腎機能の低下を意味する。すなわち、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスにおいては高血糖状態の持続による腎機能障害が引き起こされていることが示された。
【００７５】
神経障害、網膜症等の他の糖尿病合併症については現在検討中であるが、ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスは極めて顕著な高血糖状態を長期に維持するため、これらの合併症も併発しているものと期待される。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明に係る非ヒト動物は、高血糖状態を長期間維持し、雌雄間の表現型に差異のないため、糖尿病モデル動物として好適に使用することができ、特にII型糖尿病のモデルとして、高血糖状態の持続による血管障害及びこれに起因する糖尿病合併症の病態機序の解明、治療法の開発、治療薬の評価等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】野生型ＭａｆＡ遺伝子座（Ａ）、ターゲティングベクター（Ｂ）、相同組換えにより破壊されたＭａｆＡ遺伝子座（組換え体）（Ｃ）の構造を示す図である。
【図２】ＭａｆＫトランスジェニックコンストラクトの構造を示す図である。
【図３】ＭａｆＡ−／−マウスにおける血清グルコース濃度の上昇を示す図である。
【図４】ＭａｆＫＴｇマウスにおける血清グルコース濃度の上昇を示す図である。
【図５】ＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスにおける血清グルコース濃度の上昇を示す図である。（Ａ）は随時血糖、（Ｂ）は空腹時血糖を示す。
【図６】２０週齢、雄個体の腎組織像を示す図である。（Ａ）は野生型Ｃ５７ＢＬ／６Jマウス、（Ｂ）はＭａｆＫＴｇマウス、（Ｃ）はＭａｆＡ−／−マウス、（Ｄ）はＭａｆＡ−／−，ＭａｆＫＴｇマウスの腎組織像を示す。
【図７】腎組織像に占める糸球体領域面積（Ａ）、及び体重に占める腎重量（Ｂ）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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