(57)【要約】【課題】異常な幹細胞周期を制御し、化学療法後の末梢血細胞の回復を早めるための幹細胞阻害因子の単離および使用のための方法を提供すること。さらに、自己免疫疾患、加齢、ガン、脊髄形成異常、前白血病、白血病、乾癬、または過剰増殖状態を含む他の疾患を有するヒトまたは動物の治療において、幹細胞の細胞周期を調節するための幹細胞増殖インヒビターの使用を提供すること。【解決手段】幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖阻害量の幹細胞増殖インヒビター(INPROL)とを接触させる工程を含む、方法。幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞とオピエートレセプターに結合し得る化合物とを接触させる工程を含む、方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オピエートレセプターに結合し得る化合物を含む、幹細胞増殖を阻害するための組成物。
【請求項２】
前記化合物がオピエートレセプターのμサブクラスについて選択性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物：
【化２】
2008088186.tif 000036
2008088186.tif 000037
【請求項４】
増殖刺激量のINPROLを含む、Ｂ細胞の増殖を刺激するための組成物。
【請求項５】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化３】
2008088186.tif 000038
【請求項７】
哺乳動物における癌を処置するための、幹細胞増殖阻害量のINPROLを含む、薬学的組成物。
【請求項８】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化４】
2008088186.tif 000039
【請求項１０】
放射線療法または化学療法と組み合わせて投与するための、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
放射線療法または化学療法の前に投与するための、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
放射線療法または学寮法の前後２４時間以内に投与するための、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
哺乳動物において癌を処置するために、該哺乳動物から取り出した造血細胞をエキソビボで処理するための、INPROLを含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１３に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化５】
2008088186.tif 000040
【請求項１６】
前記ガンが白血病である、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
幹細胞を損傷または破壊する薬剤に曝された哺乳動物において幹細胞分裂を阻害するための薬学的組成物であって、幹細胞増殖阻害量のINPROLを含む、組成物。
【請求項１８】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化６】
2008088186.tif 000041
【請求項２０】
前記薬剤が抗ウイルス剤である、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
哺乳動物造血幹細胞をエクスビボで維持するための薬学的組成物であって、幹細胞増殖阻害量のINPROLを含む、組成物。
【請求項２２】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化７】
2008088186.tif 000042
【請求項２４】
前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、および臍帯血細胞からなる群から選択される、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
骨髄増殖性疾患または自己免疫疾患あるいは上皮幹細胞過剰増殖を患う哺乳動物を処置するための薬学的組成物であって、過剰増殖減少量のINPROLを含む、薬学的組成物。
【請求項２６】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項２５に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化８】
2008088186.tif 000043
【請求項２８】
前記骨髄増殖性疾患が骨髄形成異常症候群である、請求項２５に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
哺乳動物において化学療法または放射線から正常幹細胞を区別して保護し、かつガン細胞を保護しないための薬学的組成物であって、幹細胞保護量のINPROLを投与する工程を含む、組成物。
【請求項３０】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項２９に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化９】
2008088186.tif 000044
【請求項３２】
前記正常幹細胞が細胞傷害性薬物または放射線に曝されることにより増殖するように誘導された後に投与するための、請求項２９に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
哺乳動物をワクチン接種するための薬学的組成物であって、アジュバントとしてINPROLを含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化１０】
2008088186.tif 000045
【請求項３６】
実質的に他のタンパク質性物質を含有しない幹細胞増殖インヒビターを精製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）単離した骨髄の抽出物から粒状物を除去する工程；
ｂ）該抽出物を加熱し、沈殿物を除去する工程；
ｃ）該抽出物を酸沈澱させ、沈澱物を回収する工程；および
ｄ）該インヒビターを逆相クロマトグラフィーにより単離する工程。
【請求項３７】
前記インヒビターが、請求項３６に記載の方法により見かけ上均一にまで精製される、精製された幹細胞増殖インヒビター。
【請求項３８】
幹細胞過剰増殖により引き起こされる免疫抑制を有する哺乳動物を処置するための薬学的組成物であって、過剰増殖後退量のINPROLを含む、組成物。
【請求項３９】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項３８に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化１１】
2008088186.tif 000046
【請求項４１】
哺乳動物の遺伝子療法のための、所定の遺伝子でトランスフェクトされた造血細胞をエキソビボで処理するための薬学的組成物であって、INPROLを含む、組成物。
【請求項４２】
前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、請求項４１に記載の組成物：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【化１２】
2008088186.tif 000047
【請求項４４】
幹細胞増殖を誘導する少なくとも１つの刺激性サイトカインをさらに含む、請求項４１に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項２３に記載の薬学的組成物で処理された造血細胞を移植した哺乳動物を処置するための、遺伝子治療のための薬学的組成物。
【請求項４６】
エクスビボで幹細胞拡張を実施する薬学的組成物であって、INPROLおよび少なくとも１つの刺激性サイトカインを含む、組成物。
【請求項４７】
前記造血細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、および移動末梢血細胞からなる群から選択される細胞である、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
以下：
（ａ）INPROL、ならびに
（ｂ）MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、ペンタペプチドであるピロGlu-Glu-Asp-Cys-Lys、テトラペプチドであるN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドであるグルタチオン（Gly-Cys-γGlu）からなる群から選択される少なくとも１つの阻害性化合物、
を含む、薬学的組成物。
【請求項４９】
以下：
（ａ）INPROL、ならびに
（ｂ）IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびflk2/flt3リガンドからなる群から選択される少なくとも１つの刺激性化合物、
を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、自己免疫疾患、加齢、ガン、脊髄形成異常、前白血病、白血病、乾癬、または過剰増殖状態を含む他の疾患を有するヒトまたは動物の治療において、幹細胞の細胞周期を調節するための幹細胞増殖インヒビターの使用に関する。本発明はまた、化学療法剤または細胞周期の進行している幹細胞に損傷を与える他の薬剤への曝露、あるいは放射線の照射を受けることが予想されるかまたは受けているヒトまたは動物の治療方法に関する。最後に、本発明は、自家移植および同種移植の手法あるいは遺伝子導入のための幹細胞の維持または拡大培養の改良に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
再生系のほとんどの終期細胞は、短命であり、そして一生を通じて連続的に置き換えられなければならない。例えば、血液細胞は、多能性造血幹細胞(HSC)の自己再生集団から生じる。造血幹細胞は造血細胞の亜集団である。造血細胞は、例えば、骨髄、臍帯血、または末梢血から得られ得る（造血細胞は、移動しないか、G-CSFのような因子によって移動される）。造血細胞は、幹細胞集団、前駆細胞、分化細胞、補助細胞、間質細胞、および成熟血液細胞の産生に必要な環境を構成する他の細胞を含む。造血幹細胞は造血系および免疫系のすべての成熟細胞の発育に必要であるので、化学療法剤または他の薬剤により治療される被験体における十分な機能的宿主防御系を再確立するために、造血幹細胞の生存は必須である。
【０００３】
造血細胞の産生は、造血細胞の増殖および分化を刺激する一連の因子によって調節され、それらのいくつか（例えば、エリスロポエチンおよびG-CSF）は、現在では臨床的な実用に用いられている。しかし、広範に特徴付けられていない制御ネットワークの一部分は、調節プロセスのネガティブアームを形成するフィードバック機構である(Eavesら、Blood78:110-117、1991)。
【０００４】
Lordおよびその共同研究者による初期の研究は、正常なマウスおよびブタの骨髄抽出物中に、HSCの細胞周期の進行を可逆的に阻害し得る可溶性タンパク質因子が存在することを示した(Lordら、Br.J.Haem.34:441-446、1976)。この阻害活性(分子量50〜100kD)は幹細胞インヒビター(SCI)と呼ばれた。
【０００５】
一次供給源からのこの因子の精製は、放射線照射された多数のマウスを必要とするインビボアッセイに固有の困難さにより達成されなかった。これらの問題を克服するための試みにおいて、Pragnellおよびその共同研究者は、原始造血細胞(CFU-A)のインビトロアッセイを開発し、そして阻害活性源としての細胞株をスクリーニングした（Grahamら、Nature344:442-444,1990参照）。
【０００６】
初期の研究はマクロファージをSCIの可能な供給源として同定していたので(Lordら、Blood Cells 6:581-593、1980)、マウスマクロファージ細胞株のJ774.2が選別された(Grahamら、Nature344:442-444、1990)。この細胞株からの調整培地が精製のために、Grahamらによって用いられた。阻害ペプチドが単離され、それは、前述のサイトカインマクロファージ炎症性タンパク質１−α(MIP-1α)と同一であることが証明された。従って、MIP-1αは、細胞株から単離されたのであって、一次材料から単離されたのではない。Grahamらは、MIP-1αに対する抗体が骨髄の粗抽出物の活性を失わせることを観察したが、他の研究者は、他の阻害活性が重要であることを示した。例えば、Grahamら(J.Exp.Med.178:925-32、1993)は、MIP-1αではなくTGFβが造血幹細胞の主要なインヒビターであることを示唆した。さらにEavesら(PNAS90:12015-19、1993)は、MIP-1αおよびTGFβの両方がやや最適のレベルで正常骨髄中に存在し、そして阻害にはこれら２つの因子間の相乗作用が必要であることを示唆した。
【０００７】
他の研究者は、さらなる幹細胞阻害因子を記載した。Frindelおよびその共同研究者は、ウシ胎児の骨髄および肝臓の抽出物から幹細胞阻害活性を有するテトラペプチドを単離した(Lenfantら、PNAS86:779-782、1989)。Paukovitsら(CancerRes.50:328-332、1990)は、ペンタペプチドを特徴付け、それはモノマー体ではインヒビターであり、そしてダイマー体では幹細胞の細胞周期の進行の刺激因子であるとしている。他の因子もまた、種々のインビトロ系において阻害性を有すると主張されている(Bailliere'sClinicalHaematology 第５巻（Bailliere Tinadall、Paris)、723〜39頁、1992のWrightおよびPragnell参照)。
【０００８】
Tsyrlovaら、SU1561261A1は、幹細胞増殖インヒビターのための精製プロセスを開示した。
【０００９】
現在までこれらの因子のいずれもが臨床的使用に対して認可されていない。しかし、効果的な幹細胞インヒビターの必要性は存在している。化学療法または放射線治療に関連する主要な毒性は正常増殖細胞の破壊であり、これにより骨髄の抑制または胃腸に対する毒性を生じ得る。効果的な幹細胞インヒビターは、これらの細胞を保護し、そしてこれらの治療レジメを最適化し得る。臨床状況に応じて種々の刺激性サイトカイン（すなわち、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、flk2/flt3リガンドなどのようなサイトカイン、これらは造血細胞の細胞周期進行を刺激する）が必要とされることが実証され、同様に異なる臨床上の必要性に関して種々の阻害因子が必要とされるようである。
【００１０】
ヘモグロビンは、高度に保存された四量体タンパク質であり、その分子量は約64,000ダルトンである。これは、２つのα鎖および２つのβ鎖からなる。各鎖は、ヘムの単一分子(フェロプロトポルフィリンIX)(鉄含有補欠分子族)に結合する。脊椎動物α鎖およびβ鎖は、おそらく、複製し、次いで分岐した１つの単一祖先遺伝子に由来した。この２つの鎖は、それら鎖間および種々の脊椎動物間で高度の配列同一性を保持している（図１６Ａ参照）。ヒトにおいて、第16染色体上のα鎖クラスターは、同一のポリペプチドをコードする２つのα遺伝子（α１およびα２）、ならびに他のα様鎖をコードする遺伝子（ζ、θ）およびいくつかの非転写偽遺伝子を含有する（ヒトα鎖のcDNA配列およびアミノ酸配列については図１６Ｂ参照）。第11染色体上のβ鎖クラスターは、β鎖遺伝子およびいくつかのβ様鎖遺伝子（δ、ε、Ｇγ、およびＡγ）、ならびに少なくとも２つの非発現偽遺伝子からなる（ヒトβ鎖のcDNA配列およびアミノ酸配列については図１６Ｃ参照）。
【００１１】
これらの遺伝子の発現は、発育の間で変化する。ヒトの造血（これは十分に特徴付けられている）において、胚赤芽球は、２つのζ鎖および２つのε鎖（Gower I）、２つのα鎖および２つのε鎖（Gower II）、または２つのζ鎖および２つのγ鎖（Hb Portland）からなる四量体を連続的に合成する。胚形成が進行するにつれて、優勢型は、２つのα鎖および２つのγ鎖で構成される胎児ヘモグロビン（HbF）からなる。成人ヘモグロビン（２つのα鎖および２つのβ鎖）は、胎児期の間に合成され始める。誕生時には、約50％のヘモグロビンが成人型であり、そしてその変化は約６カ月齢までに完了する。成人におけるヘモグロビンの大部分（約97％）は、２つのα鎖および２つのβ鎖からなる種（HbA）であり、少量のHbFまたはδ鎖（Hb A２）もまた検出され得る。
【００１２】
ヘムは、造血に対するその影響に関して十分に試験されてきた（概説についてS. Sassa、Seminars Hemat. 25:312-20, 1988およびN. Abrahamら、Int. J.CellCloning ９:185-210, 1991を参照のこと）。ヘムは、赤芽球の成熟に必要とされる。インビトロにおいて、ヘミン（クロロフェロプロトポルフィリンIX−すなわち、付加塩化物イオンを有するヘム）は、CFU-GEMM、BFU-E、およびCFU-Eの増殖を増大させる。同様に、ヘミンは、長期骨髄培養物において細胞充実性を増大させる。
【００１３】
（I．ガンの化学療法および放射線療法）
刺激性増殖因子についての豊富な研究は、多くのこれらの因子（エリスロポエチン、G-CSF、GM-CSFなど）の臨床的な使用をもたらした。これらの因子は化学療法および放射線照射治療に関連した死亡率および罹患率を低下させた。化学療法または放射線照射を受けている患者に対するさらなる臨床的利点が、幹細胞が細胞周期に入ることをブロックし、それによって幹細胞を有毒な副作用から保護する別のストラテジーにより認識され得た。
【００１４】
（II．骨髄移植）
骨髄移植(BMT)は、種々の血液疾患、自己免疫疾患および悪性疾患にとって有用な治療である。現在の治療法は、臍帯血または末梢血、ならびに骨髄から得られた造血細胞（移動しないか、またはG-CSFのような因子によって移動される）を含む。造血細胞のエクスビボ操作は、現在では、原始幹細胞を移植に適した集団に拡大するために用いられている。この手順を最適化するには以下のことが必要である：（１）造血の長期の再構築を維持し得るのに十分な数の幹細胞；（２）対宿主性移植片が誘導するＴリンパ球の涸渇、および；（３）悪性細胞の残留がないこと。この手法は、エクスビボ拡大のための幹細胞インヒビターを含むことにより最適化され得る。
【００１５】
残留の悪性細胞を排除するために細胞傷害性薬物を用いて造血細胞をパージ（purge）することの効果は、正常な造血細胞および特に幹細胞に対するこれらの化合物の毒性により制限される。パージ中は、正常細胞を効果的に保護する必要性がある。保護は、効果的なインヒビターを用いて、幹細胞をその細胞周期からはずすことにより与えられ得る。
【００１６】
（III．末梢幹細胞の採取）
末梢血幹細胞(PBSC)は、自家移植に対して骨髄よりも多くの潜在的な利点を提供する。腫瘍の保持、または以前の放射線治療により適切な骨髄採取部位を持たない患者は、さらにPBSC採集を受け得る。血液幹細胞の使用は、一般的な麻酔法および外科的手段に十分に耐えられない患者におけるそれらの必要性を排除する。血液細胞を採集するのに必要な血液成分分離技術は、効率的であり、そしてほとんどの主要な医療センターで広く利用可能である。この方法の主な制限事項は、末梢血中の幹細胞が正常な定常状態にある頻度が低いこと、および薬物または増殖因子（例えば、シクロホスファミド、G-CSF、幹細胞因子）を用いた移動処置の後では細胞周期の進行が速いことの両方である。効果的な幹細胞インヒビターは、そのような細胞を休止状態に戻すために有用であり、それによって分化の間にそれら細胞が消失することを防ぐ。
【００１７】
（IV．過剰増殖性疾患の治療）
多くの疾患は、調節異常の幹細胞が、終期の細胞の過剰生産を引き起こす過剰増殖状態によって特徴付けられる。このような病態は、表皮細胞の過剰生産である乾癬、および腸ポリープの出現を特徴とする胃腸管における前悪性状態を包含するが、それらに限定されることはない。幹細胞インヒビターはこのような状態の治療に有用である。
【００１８】
（Ｖ．遺伝子導入）
遺伝情報を造血細胞に導入する能力は、現在では、臨床的設定に利用されている。利用の容易さ、エクスビボでこの組織を操作し処理する幅広い経験のため、および血液細胞が組織に浸透する能力のため、造血細胞は遺伝子治療の有用な標的である。さらに、特定のヒトの遺伝子欠損の修正は機能的遺伝子をヒト造血系の原始幹細胞に挿入することにより可能であり得る。
【００１９】
レトロウイルスベクターまたは遺伝子導入の物理的技術のいずれかを用いて、遺伝子をヒト造血細胞に導入することにはいくつかの制限がある：（１）造血組織中の幹細胞の頻度の低さは、効率の高い遺伝子導入技術の開発を必要とする；および（２）より迅速に細胞周期の進行している幹細胞はベクターの感染をより受けやすくなることが証明されたが、成長因子による幹細胞増殖の刺激によって感染頻度が増加することは、導入遺伝子を含む細胞が不可逆的に分化させられ、そしてそれらの自己再生ができなくなるので、長期の遺伝子発現にネガティブな影響を与える。これらの問題は、幹細胞インヒビターの使用によって改善され、分化および自己再生の損失を妨げ得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
（発明の要旨）
本発明は、幹細胞増殖インヒビター（「INPROL」)であるポリペプチドおよびそれらの使用に関する。
【００２１】
本発明は、以下の性質により特徴付けられる幹細胞増殖インヒビターを包含する：
(a)マウスコロニー形成脾臓(CFU-S)アッセイにおいて比活性(IC５０)が20ng/ml以下である（実施例４を参照のこと）、
(b)（限外濾過により）分子量が10,000ダルトンより大きく、かつ100,000ダルトンより小さい、
(c)活性がトリプシンによる分解に対して感受性である、
(d)MIP-1αまたはTGFβよりも疎水性であり、そして逆相クロマトグラフィーにより両方から分離可能である（実施例12を参照のこと）、
(e)水溶液中で37℃、55℃または75℃で１時間加熱した後でも生物学的活性が保持されている、および
(f)１％塩酸のアセトン溶液を用いて沈澱させた後でも生物学的活性が保持されている。
【００２２】
本発明はさらに、短時間のプレインキュベーションの後のインビトロアッセイにおける阻害の達成能力によって特徴付けられ、そして他の幹細胞インヒビター候補（例えば、MIP-1α、TGFβ、および種々のオリゴペプチド）と区別される（実施例５を参照のこと）。
【００２３】
本発明はまた、種々の疾患の治療のためのINPROLを含有する薬学的組成物を包含する。
【００２４】
本発明は、幹細胞を死滅させるかまたは損傷し得る薬剤に曝されることが予想される被験体に有効量の幹細胞阻害性組成物を投与することにより、その被験体を治療する方法を提供する。この方法によって保護された幹細胞は、通常は骨髄中に存在し、そして骨髄中で分裂している造血幹細胞であり得る。あるいは、幹細胞は上皮性（例えば腸管または頭皮または身体の他の領域に位置する）であり得るか、あるいは生殖器官内に位置する生殖細胞であり得る。本発明の方法は、望ましくは、ヒトに用いられ得るが、動物の治療もまた、本方法に包含される。本明細書で用いられる用語「被験体」または「患者」は、動物（例えば哺乳動物（ヒトを含む））を指す。
【００２５】
他の局面では、本発明は、化学療法を受けている患者の造血幹細胞系、免疫幹細胞系または他の幹細胞系を保護し、かつ回復させる方法を提供する。この方法は患者に有効量のINPROLを投与する工程を含む。
【００２６】
なおさらなる局面では、本発明は、ガンを有する患者に有効量のINPROLを投与して、骨髄、胃腸管、または他の器官の幹細胞を、化学療法または放射線療法の有害な作用から保護することにより、固形腫瘍によって特徴付けられるガンを含むあらゆるガンを補助的に治療する方法を包含する。
【００２７】
本発明のさらに別の局面は、正常幹細胞の増殖を阻害するために、増殖性白血病細胞を内部に有する造血細胞を有効量のINPROLで処理する工程、および白血病細胞を破壊するために、細胞傷害性薬剤で骨髄を処理する工程を含む白血病の治療を包含する。この方法は、骨髄の増殖を刺激する他の薬剤（例えば、コロニー刺激因子）で骨髄を継続処置することによって効果が高まり得る。１つの実施態様において、この方法はインビボで行われる。あるいは、この方法はまた、移植のためにエクスビボで造血細胞をパージし拡大するのに有用である。
【００２８】
なおさらなる別の局面では、この方法は、増殖幹細胞によって引き起こされるあらゆる疾患を有する被験体を治療する工程を含む。乾癬、脊髄形成異常、ある種の自己免疫疾患、加齢による免疫低下のような疾患は、被験体に有効量のINPROLを投与して問題の幹細胞の増殖を部分的に阻害することにより治療される。
【００２９】
本発明は、幹細胞を死滅させるかまたは損傷し得る細胞傷害性薬剤由来の損傷から幹細胞を可逆的に保護する方法を提供する。この方法は、そのような薬剤に曝されることが予想される被験体に有効量のINPROLを投与する工程を含む。
【００３０】
本発明はまた以下を提供する：
以下の手順によってブタまたは他の骨髄から単離された幹細胞増殖インヒビター（実施例12を参照のこと）：
(a)骨髄を抽出し、そして濾過によって粒子状物質を除去する；
(b)56℃で40分間熱処理した後、氷浴で冷却する；
(c)４℃で30分間10,000ｇで遠心分離することによって沈澱物を除去する；
(d)10容量の撹拌された氷冷アセトン（１容量％の濃塩酸を含む）に上清を添加し、そして４℃で16時間インキュベーションすることにより酸沈澱させる；
(e)４℃で30分間20,000ｇで遠心分離することにより沈澱物を単離し、そして冷アセトンで洗浄した後、乾燥させる；
(f)逆相クロマトグラフィーによって単離し、そして5-フルオロウラシルで前処理し、マウスIL-3存在下でインキュベートした骨髄細胞によるコロニー形成の阻害、ならびに280nmにおける吸光度およびSDS-PAGEにより活性をモニターする。
【００３１】
本発明はまた以下を提供する：
実質的に他のタンパク性物質を含まない幹細胞増殖インヒビターを精製する方法であって、前記の工程を包含し、さらに以下により詳細に記載される方法。
【００３２】
本発明はまた以下を提供する：
幹細胞増殖インヒビターが、幹細胞の過剰増殖によって引き起こされる免疫抑制を改善するように作用する、ヒトまたは動物を治療する方法。
【００３３】
本発明はまた以下を提供する：
前記幹細胞増殖インヒビターが、細胞傷害性薬物または放射線照射手順に曝されることによって幹細胞が増殖するように誘導された後、投与される、ヒトまたは動物を治療する方法。幹細胞は通常は休止しているが、化学療法後、細胞周期に入るように刺激される。これによって幹細胞は２回目の化学療法剤の投与に対してより感受性となる；本方法はこの治療から幹細胞を保護する。
【００３４】
本発明はまた以下を提供する：
前記幹細胞増殖インヒビターが、免疫応答を増大させるためにワクチン接種の前または同時にアジュバントとして投与される、ヒトまたは動物を治療する方法。
【００３５】
本発明はまた以下を提供する：
幹細胞を損傷から保護するために有効量の幹細胞増殖インヒビターを投与する工程を含む、細胞傷害性薬物または放射線治療を受けたヒトまたは動物を治療する方法。
【００３６】
本発明はまた、ヘモグロビンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を含む。
【００３７】
本発明はまた、（ａ）ヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択されるポリペプチド、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を包含する。このような薬学的組成物は、ヘムと共にまたはヘムを有さずに、上記群から選択される単一ポリペプチド、上記群から選択されるポリペプチドの混合物、または上記群から選択される二量体または多量体の形態のポリペプチドで構成され得る。
【００３８】
本発明はまた、以下の配列を有するペプチドを包含する：
【００３９】
【化１３】
2008088186.tif 000002
ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成しており、
【００４０】
【化１４】
2008088186.tif 000003
ここで、２つのCys残基は炭素架橋により結合されており、および
【００４１】
【化１５】
2008088186.tif 000004
上記の同定されたペプチドをコードするDNA配列、そのDNA配列を含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞もまた、本発明に包含される。これらのペプチドは、標準的な化学技術（例えば、固相合成）を用いるか、または組換え技術（例えば、融合システム（例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（D.B.SmithおよびK.S.Johnson、Gene67:31-40,1988）、チオレドキシン（LaVallieら、Biotechnology 11:187-193、1993）、またはユビキチン（Buttら、PNAS86:2540-4、1989；米国特許第5,391,490号）を用いる融合システム））を用いることにより合成され得る。
【００４２】
さらに、本発明は、幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と、オピエートレセプター、好都合には、オピエートレセプターのμサブクラスに結合し得る化合物とを接触させる工程を含む方法を包含する。オピエート様活性を示すペプチド（「ヘモルフィン(hemorphin)」と呼ばれる）が、ヘモグロビンから単離されている（例えば、Brantlら、Eur. J. Pharm.、125:309-10、1986；Davisら、Peptides10:747-51、1989；Karelinら、Bioch.Biophys. Res. Comm、202:410-5、1994；Zhaoら、Ann.N.Y. Acad. Sci 750:452-8、1995）。これらの論文のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。
【００４３】
本発明はまた、幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と、以下の配列を有するヘモルフィンペプチドの群から選択されるペプチドとを接触させる工程を含む方法を包含する：
【００４４】
【化１６】
2008088186.tif 000005
2008088186.tif 000006
上記ペプチドは、他のオピエート様ペプチド（例えば、Tyr-MIF-1ファミリー（概説についてはReedら、Neurosci. Biobehav. Rev. 18:519-25、1994を参照のこと）、カゼイン由来カソモルフィン(casomorphin)（Brantlら、Hoppe-Seyler'sZ.Physiol. Chem. 360:1211-16、1979；Loukasら、Biochem. 22:4567-4573、1983；FiatおよびJolles、Mol.Cell.Biochem.87:5-30、1989）、シトクロームｂ由来のペプチド（シトクロフィン(cytochrophin)と称される）（Brantlら、Eur.J. Pharm.111:293-4、1985）、ならびにオピエートレセプターへの結合についてスクリーニングされたコンビナトリアルライブラリー由来ペプチド（概説についてはDooleyら、PeptideResearch８:124-137、1995を参照のこと）に対して配列類似性を有する。これらの論文のそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。
【００４５】
本発明はまた、幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と、Tyr-MIF-1関連ペプチド、カソモルフィン、およびシトクロフィンからなる群から選択されるペプチドとを接触させる工程を含む方法を包含する。以下の配列を有するTyr-MIF-1ペプチドが特に含まれる：
【００４６】
【化１７】
2008088186.tif 000007
本発明はまた、哺乳動物において遺伝子治療を実施する方法を包含し、この方法は以下の工程を含む：
ａ）上記哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
ｂ）必要に応じて、エクスビボで上記造血細胞を少なくとも１つの刺激性サイトカインで処理し、幹細胞増殖を誘導する工程、
ｃ）予め決定された遺伝子で上記造血細胞をトランスフェクトする工程、
ｄ）エクスビボで上記トランスフェクト造血細胞とINPROLとを接触させる工程、
ｅ）哺乳動物に工程ｄ）の造血細胞を移植する工程、
ｆ）必要に応じて、インビボで上記哺乳動物をINPROLで治療する工程。
【００４７】
本発明はまた、エクスビボで幹細胞拡大を実施する方法であって、この造血細胞をINPROLおよび少なくとも１つの刺激性サイトカインで処理する工程を含む方法を包含する。INPROLは、刺激性サイトカインと接触させる前、間、および／または後で、造血細胞と接触させられる。
【００４８】
本発明はまた、（ａ）INPROLおよび（ｂ）少なくとも１つの阻害性化合物（MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、ペンタペプチドであるピロGlu-Glu-Asp-Cys-Lys、テトラペプチドであるN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドであるグルタチオン（Gly-Cys-γGlu）からなる群から選択される）を含む薬学的組成物を包含する。
【００４９】
本発明はまた、（ａ）INPROLおよび（ｂ）少なくとも１つの刺激性化合物（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびflk2/flt3リガンドからなる群から選択される）を含む薬学的組成物を包含する。
【００５０】
本発明は、INPROLと呼ばれる幹細胞インヒビターを記載する。このインヒビターは、MIP-1α、TGFβ、Frindelおよびその共同研究者のテトラペプチド、またはPaukovitsおよびその共同研究者のペンタペプチド(Wright&Pragnell、1992（前出)参照)のような当該分野で公知のインヒビターとは異なる。天然に存在するINPROLは、INPROLとテトラペプチドおよびペンタペプチドとを区別する限外濾過によれば、10,000ダルトンを超える分子量を有する。天然INPROLは、逆相クロマトグラフィーシステムにおいてはMIP-1αまたはTGFβよりも疎水性であり、天然INPROLをそれらのサイトカインと区別する。さらに、その作用様式は、プレインキュベーションの期間でのみ用いられる場合に、インビトロアッセイで活性である点において、前記のいずれのインヒビターの作用様式とも異なる。例えば、MIP-1αは、プレインキュベーションの期間でのみ用いられる場合、効果的ではない（実施例５）。さらに、天然に存在するINPROLは、「高増殖性潜在細胞(highproliferativepotential cells)」(HPP-PFC)を測定するアッセイにおいて活性であるが、MIP-1αは活性ではない（実施例６）。
【００５１】
従って、本発明は、以下を提供する：
項目１．ヘモグロビンおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【００５２】
項目２．（ａ）ヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択されるポリペプチド、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【００５３】
項目３．ヘモグロビンのα鎖および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【００５４】
項目４．ヘモグロビンのβ鎖および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【００５５】
項目５．ヘモグロビンのβ鎖をさらに含む、項目３に記載の薬学的組成物。
【００５６】
項目６．項目２に挙げられた群から選択される少なくとも１つのポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【００５７】
項目７．前記組成物が２つのポリペプチドを含む、項目６に記載の薬学的組成物。
【００５８】
項目８．前記２つのポリペプチドが、ヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される２つのポリペプチドを含む二量体である、項目７に記載の薬学的組成物。
【００５９】
項目９．ヘモグロビンのα鎖−ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのα鎖−ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのα鎖−ヘモグロビンのδ鎖、およびヘモグロビンのδ鎖−ヘモグロビンのδ鎖からなる群から選択される、項目８に記載の薬学的組成物。
【００６０】
項目１０．配列Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Valを有するペプチド。
【００６１】
項目１１．配列Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cysを有し、その２つのCys残基がジスルフィド結合を形成する、環状ペプチド。
【００６２】
項目１２．配列Asp-Ala-Leu-Thr-Asn-Ala-Val-Ala-His-Val-Asp-Asp-Met-Pro-Asn-Ala-Leu-Ser-Alaを有するペプチド。
【００６３】
項目１３．単位投与量形態の項目１から１２に記載の薬学的組成物。
【００６４】
項目１４．ヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、およびζ鎖からなる群から選択される１つまたは２つの化合物を0.1mg〜６ｇで含む、項目１３に記載の薬学的組成物。
【００６５】
項目１５．幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖阻害量の幹細胞増殖インヒビター(INPROL)とを接触させる工程を含む、方法。
【００６６】
項目１６．前記INPROLがヘモグロビンのα鎖、ヘモグロビンのβ鎖、ヘモグロビンのγ鎖、ヘモグロビンのδ鎖、ヘモグロビンのε鎖、およびヘモグロビンのζ鎖からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
項目１７．前記INPROLが、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、項目１５に記載の方法：
Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val
Cys-Phe-Pro-His-Phe-Asp-Leu-Ser-His-Gly-Ser-Ala-Gln-Val-Cys
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合を形成している）、
【００６７】
【化２４】
2008088186.tif 000008
項目１８．幹細胞増殖を阻害する方法であって、造血細胞とオピエートレセプターに結合し得る化合物とを接触させる工程を含む、方法。
【００６８】
項目  １９．前記化合物がオピエートレセプターのμサブクラスについて選択性を有する、項目１８に記載の方法。
【００６９】
項目２０．前記化合物が、以下の配列を有するペプチドからなる群から選択される、項目１８に記載の方法：
【００７０】
【化２５】
2008088186.tif 000009
2008088186.tif 000010
項目２１．Ｂ細胞の増殖を刺激する方法であって、造血細胞と増殖刺激量のINPROLとを接触させる工程を含む、方法。
【００７１】
項目２２．ガンを患う哺乳動物においてガンを治療する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）放射線療法または化学療法を施す工程、および
ｂ）幹細胞増殖阻害量のINPROLを投与する工程。
【００７２】
項目２３．工程ａ）およびｂ）が１回以上繰り返される、項目２２に記載の方法。
【００７３】
項目２４．工程ａ）が工程ｂ）の後に実施される、項目２２に記載の方法。
【００７４】
項目２５．工程ｂ）が工程ａ）の前後２４時間以内に実施される、項目２２に記載の方法。
【００７５】
項目２６．哺乳動物においてガンを治療する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）該哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
ｂ）エクスビボで該造血細胞をINPROLで処理する工程、
ｃ）工程ｂ）の該造血細胞を化学療法または放射線で処理する工程、
ｄ）該哺乳動物において骨髄切除処置を実施する工程、および
ｅ）該哺乳動物中に工程ｃ）の造血細胞を移植する工程。
【００７６】
項目２７．前記ガンが白血病である、項目２６に記載の方法。
【００７７】
項目２８．幹細胞を損傷または破壊する薬剤に曝された哺乳動物において幹細胞分裂を阻害する方法であって、幹細胞増殖阻害量のINPROLを投与する工程を含む、方法。
【００７８】
項目２９．前記薬剤が抗ウイルス剤である、項目２８に記載の方法。
【００７９】
項目３０．哺乳動物造血幹細胞をエクスビボで維持する方法であって、造血細胞と幹細胞増殖阻害量のINPROLとを接触させる工程を含む、方法。
【００８０】
項目３１．前記造血細胞が、骨髄細胞、末梢血細胞、移動末梢血細胞、および臍帯血細胞からなる群から選択される、項目３０に記載の方法。
【００８１】
項目３２．骨髄増殖性疾患または自己免疫疾患あるいは上皮幹細胞過剰増殖を患う哺乳動物において治療する方法であって、過剰増殖減少量のINPROLを投与する工程を含む、方法。
【００８２】
項目３３．前記骨髄増殖性疾患が骨髄形成異常症候群である、項目３２に記載の方法。
【００８３】
項目３４．哺乳動物において化学療法または放射線から正常幹細胞を区別して保護し、そしてガン細胞を保護しない方法であって、幹細胞保護量のINPROLを投与する工程を含む、方法。
【００８４】
項目３５．前記INPROLが、前記正常幹細胞が細胞傷害性薬物または放射線に曝されることにより増殖するように誘導された後に投与される、項目３４に記載の方法。
【００８５】
項目３６．哺乳動物をワクチン接種する方法であって、ワクチンの投与の前、間、または後にアジュバントとしてINPROLを投与する工程を含む、方法。
【００８６】
項目３７．実質的に他のタンパク質性物質を含有しない幹細胞増殖インヒビターを精製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）骨髄を単離し、抽出物から粒状物を除去する工程；
ｂ）該抽出物を加熱し、沈殿物を除去する工程；
ｃ）該抽出物を酸沈澱させ、沈澱物を回収する工程；および
ｄ）該インヒビターを逆相クロマトグラフィーにより単離する工程。
【００８７】
項目３８．前記インヒビターが、項目３７に記載の方法により見かけ上均一にまで精製される、精製された幹細胞増殖インヒビター。
【００８８】
項目３９．幹細胞過剰増殖により引き起こされる免疫抑制を有する哺乳動物を治療する方法であって、該哺乳動物に過剰増殖後退量のINPROLを投与する工程を含む、方法。
【００８９】
項目４０．哺乳動物において遺伝子療法を実施する方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）該哺乳動物から造血細胞を取り出す工程、
ｂ）予め決定された遺伝子で該造血細胞をトランスフェクトする工程、
ｃ）エクスビボで該トランスフェクト造血細胞とINPROLとを接触させる工程、
ｄ）該哺乳動物中に工程ｃ）の造血細胞を移植する工程。
【００９０】
項目４１．工程ａ）の後に、該造血細胞を少なくとも１つの刺激性サイトカインで処理し、幹細胞増殖を誘導する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
【００９１】
項目４２．工程ｄ）の後に、インビボで該哺乳動物をINPROLで処理する工程をさらに含む、項目４０に記載の方法。
【００９２】
項目４３．エクスビボで幹細胞拡張を実施する方法であって、造血細胞とINPROLおよび少なくとも１つの刺激性サイトカインとを接触させる工程を含む、方法。
【００９３】
項目４４．前記造血細胞が、骨髄細胞、臍帯血細胞、末梢血細胞、および移動末梢血細胞からなる群から選択される細胞である、項目４３に記載の方法。
【００９４】
項目４５．（ａ）INPROL、および（ｂ）MIP-1α、TGFβ、TNFα、INFα、INFβ、INFγ、ペンタペプチドであるピロGlu-Glu-Asp-Cys-Lys、テトラペプチドであるN-アセチル-Ser-Asp-Lys-Pro、およびトリペプチドであるグルタチオン（Gly-Cys-γGlu）からなる群から選択される少なくとも１つの阻害性化合物を含む、薬学的組成物。
【００９５】
項目４６．（ａ）INPROL、および（ｂ）IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-14、IL-15、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、エリスロポエチン、トロンボポエチン、幹細胞因子、およびflk2/flt3リガンドからなる群から選択される少なくとも１つの刺激性化合物を含む、薬学的組成物。
【００９６】
本明細書中に記載される本発明がより十分に理解され得るために、以下の詳細な説明を記載する。この説明は、本発明の例示であるが、本発明を特に限定すると解釈されるべきではなく、そして当業者の理解範囲であるような変化は本発明の範囲に入ると考えられるべきである。
【００９７】
（好適な実施態様の詳細な説明）
INPROLは、可逆的に幹細胞の分裂を阻害する。特に、INPROLは、造血幹細胞の細胞分裂を一時的に阻害することに効果的である。従って、本発明の方法は、ガンまたはウイルスに感染した細胞を破壊するために用いられる化学療法剤または放射線によって引き起こされる損傷から幹細胞を保護することによって、患者の造血系、骨髄系および免疫系に関する化学療法の望ましくない副作用を軽減することに用いられ得る。本発明の一つの実施態様では、INPROLは、化学療法剤が疾患細胞に作用している間に、幹細胞分裂を阻害するのに十分な用量で患者に投与される。化学療法剤がその機能を発揮した後、INPROLによって阻害された幹細胞は、さらなる治療を受けずに分裂細胞に戻る。造血再生を高めることが所望されるならば、刺激性成長因子またはサイトカインがさらに用いられ得る。
【００９８】
本明細書中で用いられる用語「INPROL」は、実施例におけるように精製された哺乳動物タンパク質、ヘモグロビン、ヘモグロビンのα鎖（ヘム族を有するかまたは有しない）、ヘモグロビンのβ鎖（ヘム族を有するかまたは有しない）、α鎖およびβ鎖の混合物（ヘム族を有するかまたは有しない）、およびこれらのタンパク質のフラグメントまたはアナログ（例えば、α、β、γ、δ、ε、またはζ鎖、単独あるいは混合物、二量体または多量体として、ヘム族を有するかまたは有しない）を包含する。このようなフラグメントまたはアナログは、胚型、胎児型、または成人型を包含し、幹細胞増殖阻害能を有する。用語「INPROL」は、これらのタンパク質の天然に存在する形態ならびに天然に存在しない（例えば、組換えにより生成された）形態を包含する。
【００９９】
代表的な臨床状況においては、INPROLは、例えば、0.01〜100mg/kg、好都合には0.1〜1.0mg/kgのINPROLを、例えば標準的化学療法または放射線治療の４〜60時間前に投与する
ことを用いて、単位投与量形態で静脈注射または点滴により日毎に、患者に投与される。
【０１００】
本発明の別の実施態様では、INPROLによる前処理により、患者が通常耐えられる用量を上回る量の化学療法剤用量または放射線量の増大が可能になる。
【０１０１】
大部分の造血幹細胞は通常休止状態（非周期進行性）である。しかし、化学療法誘導性造血損傷に対する代償応答として、多くの割合の幹細胞が化学療法後に細胞周期に入る。それにより、細胞は、特に、次の細胞傷害性化学療法または治療的放射線照射に対して抵抗力のないものとなる。このような幹細胞の周期進行を阻害することにより、INPROL処理によって、次の細胞傷害性化学療法をより早くまたはより頻度を高くして投与すること（従来用量または高用量で）が可能になる。
【０１０２】
本発明の１つの実施態様では、INPROL（0.1mg〜６ｇ−好都合には1.0〜60mg）は、化学療法の初回投与から24時間から10日後に投与される。さらに４〜60時間後、好都合には24〜48時間後、次回の化学療法が投与される。この化学療法とINPROLとを交互に行うサイクルは、治療上の利点に従って続けられる。化学療法剤および投与プロトコルは、標準的な医療実施における特定の腫瘍タイプに対する適合性に従って選択される。必要に応じて、G-CSF、幹細胞因子のような刺激性成長因子が、化学療法または放射線治療の後に用いられて、さらに造血再構築を改良する。
【０１０３】
エクスビボ適用のために、10６細胞/ml当たり0.1ng〜100ng、好都合には10６細胞/ml当たり20〜50ngのINPROLが用いられる。
【０１０４】
本発明の別の実施態様では、INPROLは、移植のための自家造血細胞を調製する方法において用いられる。造血細胞は、有効量のINPROLでエクスビボで処理されて、幹細胞分裂を阻害し、次いで骨髄培養物に有効量の化学療法剤または放射線を投与することによってガン性細胞をパージする。細胞周期が進行している細胞に特異性を有する化学療法剤が好ましい。このように処理された骨髄は、自家ドナー内に再注射される。必要に応じて、患者は、造血を刺激することが知られている薬剤で治療されて、患者の造血再構築を改善する。
【０１０５】
本発明の別の実施態様では、INPROLは、白血病治療の補助的な治療として用いられる。例えば、白血病細胞がINPROLに応答しない病態において、白血病の造血細胞がエクスビボでINPROLにより処理される。正常幹細胞の増殖はINPROLの投与により妨げられる。従って、増殖する白血病細胞が細胞周期に特異的な細胞傷害性薬剤により処理されている間は、正常幹細胞の集団は損傷から保護される。さらに、IL-3またはGM-CSFのような刺激性サイトカインは、薬物治療または放射線治療の間に必要に応じて投与されて白血病細胞における細胞周期の進行を誘導するが、正常幹細胞はINPROLにより保護される。患者は、白血病細胞を破壊するために化学療法剤または放射線により治療され、次いで除去された骨髄は、造血再構築を確立するために患者内に移植されて戻される。
【０１０６】
同様に、重篤なウイルス感染（例えば、HIV感染）にかかった患者（血液細胞または白
血球を含む）を治療するための本発明の別の実施態様においては、造血細胞はエクスビボでINPROLにより処理され、その後抗ウイルス剤、感染細胞を破壊する薬物、または感染細胞を排除するための抗体に基づく系により処理される。患者からウイルスの宿主細胞を根絶するために、骨髄切除(myeloablative)抗ウイルス剤または骨髄切除化学療法の後、INPROL処理した骨髄は患者に戻される。
【０１０７】
本発明の別の実施態様では、INPROLは過剰増殖性幹細胞に関連した疾患を治療するために用いられる。例えば、乾癬は、皮膚の過剰増殖する上皮細胞によって引き起こされる疾患であり、時には細胞傷害性薬物により治療される。幹細胞増殖を含む他の前腫瘍性病変はまた、幹細胞の増殖を全体的にまたは部分的に阻害するために用いられる有効量のINPROLに影響されやすい。これらの使用のため、INPROLを含む局所的または経皮的な送達組成物（例えば、軟膏、ローション剤、ゲル剤、または賦形剤）は、非経口投与の代わりとして、適切な箇所で用いられる。ほとんどの白血病の場合、白血病前駆細胞は、INPROLにより影響を受けない分化細胞集団であり、従って上記のようなINPROLを用いる方法によって処理される分化細胞集団である。白血病前駆細胞が非常に原始期のものであり、INPROLによる阻害に対して直接的に感受性である場合には、白血病細胞の増殖は有効量のINPROLの投与によって弱められる。
【０１０８】
モノクローナルまたはポリクローナルである抗体は、INPROLポリペプチドに対して標準的な技術によって生成される。これらの抗体またはINPROLポリペプチドは、当該分野で公知の多くのタイプの検出可能な標識により標識される。次いで、標識されたINPROLまたは抗INPROL抗体は、幹細胞マーカーとして用いられ、診断を目的として患者に直接それらを投与することによって幹細胞を同定および単離する。あるいは、これらの標識されたポリペプチドまたは抗体はエクスビボで用いられ、骨髄中の新組織形成細胞を除去する前にそれらを除き得るように造血細胞調製物中の幹細胞を同定する。同様の方法で、このような標識されたポリペプチドまたは抗体は、上皮性または他の幹細胞を単離および同定するために用いられる。さらに、標識されるかまたは標識されていないこのような抗体は、INPROL活性の中和化によって治療的に、または循環しているINPROLレベルを検出することによって診断的に用いられる。
【０１０９】
INPROLは、標準的な技術を用いて、ヒト遺伝子または組換えヒトINPROLの発現用のcDNAライブラリーからクローニングされ得る。例えば、精製タンパク質から得られる配列情報を用いて、例えば32-リンで標識され得るオリゴヌクレオチドプローブが構築され、そし
て適切なcDNAライブラリー（例えば、骨髄由来）をスクリーニングするために用いられる。あるいは、適切な供給源（例えば、骨髄）由来の発現ライブラリーは、抗体を用いて、または適切な機能的アッセイ（例えば、実施例２に記載されるようなアッセイ）を用いて、INPROLをコードするcDNAについてスクリーニングされる。ヘモグロビン自体、ならびに個々のα鎖およびβ鎖は、当該分野において公知の方法を用いてクローニングおよび発現されている（Pagnierら、Rev.Fr.Transfus. Hemobiol. 35:407-15, 1992；Lookerら、Nature 356:258-60, 1992；MethodsinEnzymology 231巻, 1994）。これらの論文のそれぞ
れは、本明細書中で参考として援用される。
【０１１０】
本発明は、以下を含むDNA配列を包含する：選択された非哺乳動物宿主による発現に「好ましい」コドンの取り込み；制限エンドヌクレアーゼ酵素による切断部位の供給；および付加的な開始、末端、または中間のDNA配列の供給、これらの配列はヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および／またはζ鎖の容易に発現されるベクターの構築、あるいは生成または精製を容易にする。
【０１１１】
本発明はまた、ヘモグロビンα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および／またはζ鎖のポリペプチドアナログまたは誘導体をコードするDNA配列を提供する。これらアナログまたは誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して天然に存在する形態と異なり（すなわち、欠失アナログ、記載の全残基より少ない残基を含有する；置換アナログ、記載の１つ以上の残基が他の残基により置換される；および付加アナログ、１つ以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端または中間部分に付加される）、かつ天然に存在する形態の一部または全ての特性を共有する。
【０１１２】
好都合な実施態様では、INPROLは、ゲノムクローニングもしくはcDNAクローニング、または遺伝子合成により得られた外因性DNA配列の原核生物または真核生物宿主発現（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物培養細胞による）の産物である。すなわち、好都合な実施態様では、INPROLは「組換えINPROL」である。代表的な酵母（例えば、Saccharomycescerevisiae）または原核生物（例えば、E.coli）宿主細胞における発現産物は、いずれの哺乳動物タンパク質とも関連しない。脊椎動物（例えば、ヒトではない哺乳動物（例えば、COSまたはCHO)および鳥類）細胞における発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも関連しない。用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコシル化され得るか、またはグリコシル化され得ない。本発明のポリペプチドは、必要に応じて開始メチオニンアミノ酸残基（−１位）もまた含む。
【０１１３】
本発明は、ヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および／またはζ鎖のポリペプチドアナログのような他の産物もまた包含する。このようなアナログは、ヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および／またはζ鎖のフラグメントを包含する。周知の手順に従って、当業者は、本明細書中に記載の１つ以上の残基の同一性または位置に関して天然に存在する形態と異なる（例えば、置換、末端および中間における付加、および欠失）一次配列を有する微生物発現ポリペプチドをコードする遺伝子を容易に設計および製造し得る。あるいは、cDNA遺伝子およびゲノム遺伝子の改変は、周知の部位特異的変異誘発技術により容易に達成され得、そしてヘモグロビンのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、またはζ鎖のアナログおよび誘導体を生成するために用いられ得る。このような産物は、少なくとも１つのINPROLの生物学的特性を共有するが、他は異なり得る。例として、本発明の産物は、以下のようなα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、またはζ鎖を包含する：例えば、欠失により短縮される；または加水分解により安定である（従って、天然に存在するよりもより顕著なまたはより長期間持続する効果を有し得る）；あるいはO-グリコシル化および／またはN-グリコシル化のための１つ以上の潜在的な部位を欠失または付加するように改変されたか、あるいは欠失または置換（例えば、アラニンまたはセリン残基により）された１つ以上のシステイン残基を有しており、そして微生物系から活性形態でより容易に単離される；あるいはフェニルアラニンにより置換される１つ以上のチロシン残基を有し、そして標的タンパク質または標的細胞上のレセプターにある程度容易に結合する。α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、またはζ鎖内の連続アミノ酸配列または二次コンフォメーションの一部のみを複製するポリペプチドフラグメントもまた包含される。これらのフラグメントは、INPROLの１つの特性（例えば、レセプター結合性）を有し、そして他（例えば、幹細胞阻害活性）は有さない。本発明の産物のいずれか１つ以上が治療有用性（Weilandら、Blut44:173-5,1982を参照のこと）または他の情況（例えば、阻害因子拮抗作用のアッセイ）における有用性を有するために、活性は必要でないことは注目すべきことである。競合的アンタゴニストは、幹細胞インヒビターまたはそのレセプターの過剰生産の場合において有用である。
【０１１４】
さらに、生物学的活性を保持するタンパク質配列に由来するペプチドは、標準的な方法に従って化学的に合成され得る。本発明はまた、ヘモグロビンα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖、ε鎖、および／またはζ鎖のペプチドアナログまたは誘導体をコードする配列を提供する。これらアナログまたは誘導体は、１つ以上のアミノ酸残基の同一性または位置に関して天然に存在する形態と異なり（例えば、欠失アナログ、記載の全残基より少ない残基を含有する；置換アナログ、記載の１つ以上の残基が他の残基、天然に存在するかまたは当該分野で公知の他のアナログ（例えば、D-アミノ酸）のいずれかにより置換される；および付加アナログ、１つ以上のアミノ酸残基が、安定性、溶解度、および／またはタンパク質分解に対する耐性を増大させるように化学修飾される）、かつ天然に存在する形態の特性の一部または全ての特性を共有する。
【０１１５】
上記のようなペプチド配列は、種々の方法により同定され得る。アッセイにおいて活性な天然ヘモグロビン鎖（例えば、α鎖）の三次元構造と不活性な構造的に関連したタンパク質（例えば、ミオグロビン）との比較は、三次元空間において異なるコンフォメーションを有し、従って活性ペプチドの候補領域である領域を同定し得る。別のアプローチは選択的タンパク質分解を用いる。このタンパク質分解では、タンパク質分解酵素は、ヘモグロビン鎖の限定消化において用いられる。この消化は、例えば逆相HPLCにより分離され、次いで幹細胞阻害についてアッセイされ得るペプチドを生じる。ペプチドはまた、化学合成（例えば、固相合成）によっても生成され得る。目的のヘモグロビン鎖（例えば、α鎖）の配列を含む一連の重複ペプチド（例えば、15マー）は、容易に生成され得、そして幹細胞アッセイにおいて試験され得る。コンビナトリアルライブラリーが生成され得、このライブラリーでは、複数の化学合成が実施され、かつ選択されたアミノ酸位置を変えることが可能であり、その結果、多くのスクリーニング用ペプチドアナログを生じる（例えば、Dooleyら、PeptideResearch８:124-137, 1995）。あるいは、組換え法が用いられ得る。部位特異的変異誘発は、特定のヘモグロビン鎖の活性に必要な必須残基を同定するために用いられ得る。幹細胞インヒビターとして活性であると知られる鎖（例えば、α鎖）の領域は、関連するが不活性なタンパク質（例えば、ミオグロビン）の領域と置換され得、そして幹細胞アッセイにおいて試験され得、これにより活性に必要な領域の同定が可能になる。このような同定された領域は、ペプチドとして発現され得る、幹細胞周期アッセイにおいて活性について試験され得る。
【０１１６】
他の種に由来するINPROLの同種または類似のバージョンは、上記の本発明の治療上の実施態様と同様に、種々の獣医学的使用に用いられる。
【０１１７】
INPROLは、細胞周期の進行している幹細胞を分裂しない「休止」期に可逆的に移行させることによって、それらに作用する。休止している幹細胞を刺激して分裂させることが望ましい場合（例えば、ガンの化学療法剤または放射線により患者を治療した後）、コロニー刺激因子および他の造血刺激因子が被験体に投与される。このような因子の例としては以下のものが挙げられるが、それらに限定されない：M-CSF（CSF-1）、GM-CSF、G-CSF、巨核球-CSF、トロンボポエチン、幹細胞因子、または他のサイトカイン（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、あるいはエリスロポエチン）。
【０１１８】
INPROLポリペプチドまたは幹細胞阻害活性を有する活性フラグメントは、下記のプロトコルで例示されるように、精製されるか、または幹細胞阻害活性用の適切なバイオアッセイを組み合わせた従来の化学的プロセスによって合成される。
【０１１９】
本発明の１つの実施態様では、治療的に有効な量のINPROLタンパク質または治療的に有効なそれらのフラグメントは、薬学的に受容可能なキャリアと混合して用いられる。このINPROL組成物は、一般的に、非経口的注射または点滴によって投与される。皮下注射、静脈注射、または筋肉内注射の経路が、達成される治療的効果によって選択される。
【０１２０】
全身投与される場合、本発明における使用のための治療用組成物は、発熱物質非含有の非経口的に受容可能な水溶液の形態である。薬学的に受容可能な滅菌タンパク質溶液は、pH、等張性、安定性、キャリアタンパク質などに関する要件を有し、当該分野の技術に属する。
【０１２１】
INPROL療法において有用な適切な希釈剤、保存剤、安定化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはキャリアと共に、治療的に有効な量の本発明のポリペプチド産物を含む薬学的組成物もまた、本発明により包含される。本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」は、所定の条件および投与レジメで治療効果を提供する量を指す。このような組成物は、液剤、ゲル剤、軟膏、または凍結乾燥処方物もしくは他の乾燥処方物であり、そして種々の緩衝液内容物（例えば、Tris-HCl、酢酸、リン酸）の希釈物、pHおよびイオン強度、表面吸着防止のための添加剤（例えば、アルブミンまたはゼラチン）、界面活性剤（例えば、Tween20、Tween80、Pluronic F68、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物または張度改変剤（例えば、ラクトース、マンニトール）を含み、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）のタンパク質への共有結合、金属イオンとの複合体化、あるいは物質のポリマー性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、水性ゲルなど）の粒状調製物中または上へのまたはリポソーム、ニオソーム(niosome)、マイクロエマルジョン、ミセル、単ラメラ小胞または多重ラメラ小胞、生分解性注入マイクロカプセルまたはマイクロスフェア、またはタンパク質マトリックス、赤血球影、スフェロプラスト、皮膚賦形剤、または薬剤を放出またはパッケージングする他の公知の方法中の取り込みを含む。このような組成物は、INPROLの物理的状態、溶解度、安定度、インビボ放出速度、およびインビボ消失速度に影響を及ぼし得る。徐放性組成物または持続放出性組成物は、親油性デポ剤（例えば、脂肪酸、ワックス、オイル）中の処方物を包含する。ポリマー（例えば、ポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された粒状組成物および組織特異的レセプター、リガンド、または抗原に対する抗体に結合されたINPROL、あるいは組織特異的レセプターのリガンドに結合されたINPROLもまた、本発明により包含される。本発明の組成物の他の実施態様は、種々の投与経路のために、粒状形態の保護コーティング、プロテアーゼ阻害性因子、または浸透増強剤を取り込む。この投与経路としては、非経口投与、経肺投与、鼻内投与、局所（皮膚または粘膜）投与、および経口投与が挙げられる。別の実施態様では、INPROLを含有する組成物は、局所的にまたは経皮賦形剤を介して投与される。
【０１２２】
１つの実施態様では、本発明の組成物は、単位投与量形態で滅菌バイアルまたはアンプル中にパッケージされる。
【０１２３】
本発明は、１つ以上の付加因子（例えば、化学療法剤（例えば、5-フルオロウラシル(5FU)、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、タキソール、アルキル化剤）、抗ウイルス剤（例えば、AZT、アシクロビル）、TNF、サイトカイン（例えば、インターロイキン）、抗増殖薬、代謝拮抗物質、およびDNA代謝に干渉する薬物）を含む組成物もまた包含する。
【０１２４】
そのような細胞傷害性薬剤に曝されることが予想される被験体を治療する方法または過剰増殖性幹細胞を処理する方法に含まれる投与量レジメは、担当の医師により、薬物の作用を改変する種々の要因（例えば、症状、体重、性別、患者の規定食、感染の重篤度、投与時間、および他の臨床的要因）を考慮して決定される。
【０１２５】
被験者が細胞傷害性薬剤または放射線に曝された後、本発明の治療方法は、必要に応じて、被験体に１種またはそれ以上のリンホカイン、コロニー刺激因子、または他のサイトカイン、造血素、インターロイキン、またはINPROLによる前処理により阻害される幹細胞（およびそれらの派生物）の成長および分裂を一般に刺激する成長因子を投与することを用いる。造血を促進するこのような治療剤としては、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、Meg-CSF、M-CSF（CSF-1）、GM-CSF、G-CSF、またはエリスロポエチンが挙げられる。これらの薬剤の投与量は、化学療法または造血幹細胞移植後の造血再構築の促進における効能に対する臨床試験にそれらを用いたときに得られる知見によって選択される。これらの投与量は、患者の身体状態の変化および被験体が曝された化学療法剤または放射線の量およびタイプを補整するように調整される。治療を受けた患者へのINPROLの投与によって引き起こされる幹細胞の阻害の回復の進行は、従来の方法によってモニターされる。
【０１２６】
白血病の治療では、正常な幹細胞の細胞周期の進行を阻害するINPROLおよびIL-3またはGM-CSFのような白血病細胞の成長の刺激因子の両方を、細胞傷害性薬物治療または放射線照射の間に同時に投与することが有利である。このプロトコルにより、正常細胞および白血病細胞の細胞周期の進行状態と薬物感受性との間に最も大きな違いを達成し得る。
【実施例】
【０１２７】
（実施例１：インビボ幹細胞増殖阻害アッセイ）
幹細胞増殖の検出のために、細胞周期のＳ期にあるCFU-Sの数を3H-チミジン「自殺(suicide)」法(Beckerら、Blood 26:296-308、1965)により測定した。
【０１２８】
未成熟の造血前駆細胞--脾コロニー形成単位(CFU-S)--は、致死量の放射線を照射したマウスの脾臓において肉眼で見えるコロニーを形成させることにより、インビボで、造血細胞の静脈注射の８〜12日後に検出し得る(Till&McCulloch、1961)。
【０１２９】
標準的CFU-S増殖アッセイに関しては、3H-チミジン「自殺」の方法が通常適用される(Beckerら、1965)。この方法は、DNAの前駆体である放射標識したチミジン(3H-チミジン)をDNA合成中の細胞内に取り込むことに基づいている。試験の時点で細胞周期のＳ期にあるこのCFU-Sは、高い放射活性により死滅しており、そのため脾臓ではコロニーを形成できない。従って、3H-チミジンなしでインキュベーションされた細胞サンプルと3H-チミジンとともにインキュベーションされた同じ細胞との間の、注射によって形成されるCFU-Sの数の違いは、元のサンプルにあった増殖性CFU-Sのパーセントを示す。
【０１３０】
インヒビター試験は、インヒビターが細胞周期が進行しているCFU-S（正常マウスの骨髄では全CFU-S集団の７〜10％程の低さ）にのみ影響する限り、刺激を受けていない動物由来の骨髄幹細胞集団を用いて行うことはできない。
【０１３１】
CFU-Sの増殖を刺激するために、フェニルヒドラジン(PHZ)刺激、または致死量以下（sublethal）の放射線照射を用いた(Lord、1976)。
【０１３２】
本発明者らは、テストステロンプロピオネート(TSP)がCFU-Sの細胞周期の進行に刺激効果を及ぼすこと(Byronら、Nature228:1204、1970)に基づいて、TSPを用いる方法を開発し、それによって試験は簡素化され、いかなる副作用も引き起こされなかった。TSPは、注射後20〜24時間以内にCFUーS増殖の刺激を誘導し、そしてその効果は少なくとも７日間見られ得た。
【０１３３】
インヒビターの精製の間に画分のスクリーニングに用いられた手順は以下の通りである：
マウス：全ての試験を通じてBDF1またはCBF1マウス種を用いた。
【０１３４】
30〜35％のCFU-SをＳ期に誘導するために、ドナーマウスを、0.2ml/マウスの腹腔内注射によって、10mg/100gの用量のTSPで処理した。
【０１３５】
24時間後、細胞懸濁調製のため骨髄を大腿骨から取り出す。次いで、１ml当たり5×106から10×106個の細胞を異なるコントロールおよび試験画分と、37℃で3.5時間水浴中でインキュベーションする（各グループにつき試験管２本ずつ、１つはホット（標識したもの）用およびもう１つはコールド（標識していないもの）用）。
【０１３６】
3.5時間後、3H-チミジン(１mCi/ml、比活性18〜25Ci/mmole)を、ホット用の各試験管に細胞懸濁液１ml当たり200μlずつの容量で添加し、コールド用の試験管には何も添加せず、37℃でさらに30分間インキュベーションし続ける。
【０１３７】
30分間のインキュベーションの後、400μg/mlの放射能活性のないチミジンを含む10mlの冷培地（４℃）を添加することにより、死滅反応を停止させる。細胞を十分に洗浄する（３回）。
【０１３８】
細胞を再懸濁し、そして注射に望ましい濃度、通常マウス１匹当たり0.3〜0.5ml中２〜４×104個細胞、まで希釈する。
【０１３９】
１グループ当たり８〜10匹のレシピエントマウスを注射の６時間以上前に放射線照射する。
【０１４０】
９〜12日目にレシピエントの脾臓を集め、そしてTellesnitsky溶液中で固定して、コロニー数を目で数える。式を用いてＳ期にある細胞のパーセントを計算する。
【０１４１】
【数１】
2008088186.tif 000011
ここで、a--3H-チミジンを有さないCFU-Sの数
ここで、b--3H-チミジンを有するCFU-Sの数
表１に示されるINPROLの試験データは、INPROLでの処理の後に細胞周期の進行している幹細胞が3H-チミジンの作用に対して耐性になることを示している。実施例１および以下の実施例の全てについて、用語「pINPROL」は、ブタ骨髄由来の精製タンパク質をいう。同じ保護が、Ｓ期特異的細胞障害性薬物であるシトシンアラビノシドおよびヒドロキシ尿素にも見られる（データは示していない）。次いで、処理された幹細胞を放射能活性のないチミジンを含む冷培地で洗浄した場合、生き残った幹細胞はマウス脾臓内で増殖して、正常にコロニーを形成する。
【０１４２】
（表１）骨髄細胞との４時間インキュベーションの間にpINPROLがCFU-S増殖に及ぼす阻害活性
【０１４３】
【表１】
2008088186.tif 000012
＊２×104細胞当たりのCFU-S。
【０１４４】
（実施例２：インビトロ幹細胞増殖阻害アッセイ）
以下の試験系(Lordら、TheInhibitorsof Hematopoiesis 227〜239頁、1987)を用いて、INPROLの直接的効果を示した。多系統(multilineage)因子(IL-3)依存性幹細胞系であるFDCPmixA4(A4)を、コロニー刺激性IL-3の供給源として、20％ウマ血清および10％WEHI-3馴化培地を補充したIMDM培地中で維持した。
【０１４５】
トリチウム化チミジン取り込みアッセイを使用して増殖を測定した：A4細胞（20％ウマ血清および50％WEHI-3 CMを有する100μlの培地中の５×104個）を、５％CO2中で37℃、16時間インキュベーションした。
【０１４６】
pINPROLまたは粗製のBME（画分IV）を開始時点で添加した。次いで、トリチウム化チミジン（（3H-Tdr）50μl中の3.7KBq、740GBq/mmole)を各グループに添加し、さらに３時間インキュベーションした。増殖レベルを集めた細胞によって測定し、そして阻害％を下記の式を用いて測定した。
【０１４７】
【数２】
2008088186.tif 000013
正常骨髄抽出物またはpINPROLを段階的な用量で存在させて成長したFDCPmix-A4細胞によるトリチウム化チミジン(3H-Tdr)取り込みを図６に示す。pINPROLの精製組成物は出発物質より少なくとも1000倍活性が高いことがわかった。曝露時間（16時間）は、効果的な阻害についての重要な因子であり、そしてA4細胞系の幹細胞に、pINPROLの直接的な効果を及ぼしている証拠を示している。
【０１４８】
（実施例３：インビボのINPROL注射によるCFU-S増殖の阻害：用量および効果の持続期間）
インビボで注射されたINPROLの効果の研究は、INPROLがCFU-Sの細胞周期への加入を効果的にブロックし得、これによりそれらの細胞をさらなる処理の細胞障害効果から保護し、その臨床使用への可能性を示すことを示した。
【０１４９】
実験プロトコルには２つの到達点がある：インビボで注射された場合にCFU-Sに対するINPROLの効果をチェックすること、および、細胞周期の進行している幹細胞に関してINPROL活性の有効持続期間を明確にすること。
【０１５０】
CFU-Sの増殖を刺激するために、上記の実施例１で述べた効果に基づいて、テストステロン-プロピオネートの注射を用いた。
【０１５１】
マウスBDF1をTSP(10mg/100g)と共に第０日に注射した；24時間後に、各実験グループのマウス（各グループ４匹）に０μg、５μg、10μg、および15μg／マウスの用量で腹腔内にpINPROL注射を１回行った。
【０１５２】
pINPROL注射の24時間後、マウスを屠殺し、そして細胞周期の進行しているCFU-Sのパーセントを実施例１に記載されたアッセイにより測定した。TSP注射は、約50％のCFU-Sを細胞周期に誘導したが、未処理のマウスでは７％であった。２μg／マウス程度に低い用量のpINPROLは、TSPで誘導される増殖を阻害して正常レベルまで下げ得た。
【０１５３】
有効持続期間の評価に関しては、一方のグループのマウス（１グループ当たりマウス21匹）にTSPのみを注射し、他方のグループにTSPとpINPROL（TSPの24時間後）の両方を注射した。CFU-Sの細胞周期の進行は、各グループから３匹ずつドナーを取り出して、記載した方法（実施例１参照）で骨髄のCFU-Sの細胞周期の状態を測定することにより、１週間、24時間毎に測定した。図７に示すデータは、TSPの有効持続期間は少なくとも７日間であるが、１回のINPROLの注射によりCFU-Sは休止期に入り、わずか48〜72時間は細胞周期に入らないようにすることができることを示している。ガンおよび白血病の化学療法に用いられる化学療法剤の大多数はインビボでの半減期は比較的短い（通常24時間より短い）ので、得られたデータによれば、INPROLの効果はシトシンアラビノシドまたはヒドロキシ尿素のような化学療法剤がインビボで活性である間は有効期間よりも長く維持される。さらに重要なことは、第１回目の処理（幹細胞に損傷を与えない）と第２回目の処理（CFU-Sに損傷を与える）との間により長い間隔（24時間より長く96時間より短い）を有する化学療法および放射線療法に対しては、化学療法剤または放射線照射の２回の適用の間の間隔にINPROLを１回注射すれば十分である。繰り返し行う数回の細胞傷害性治療または放射線照射に関しても、INPROL効果の持続期間に基づいて同じストラテジーを適用し得た。
【０１５４】
（実施例４：5-FUによる処理の後、迅速に周期に入るように刺激された最原始造血幹細胞は、INPROLにより第２回目の5-FU被曝から保護される）
薬剤5-フルオロウラシル(5-FU)は、骨髄およびリンパ球の区画(compartment)中の細胞数を劇的に減少させる。それは通常、細胞周期特異的であり、細胞周期のＳ期の間または前にヌクレオチドアナログをDNA内に取り込むことは細胞死となるので、増殖細胞を迅速に標的とすると考えられている。マウスの骨髄の長期生存および免疫造血再構築は、5-FUの１回の用量では影響を受けない；しかし、多能性造血幹細胞(PHSC)は最初の投薬後約３〜５日間という短い期間に第２回目の5-FUの投薬に対して攻撃されやすくなるということが示された(Harrisonら、Blood78:1237〜1240、1991)。PHSCは、通常、5-FUの１回の投薬に対して細胞周期が遅すぎて効果的ではなく、そして第１回目の5-FU処理の結果起こる刺激により刺激されて迅速に細胞周期に入ることが説明され得る。本発明者らは、PHSCは、INPROLにより遅い細胞周期状態に戻り得、これにより２回目の5-FU処理から保護され得るということを提案した。
【０１５５】
これらの実験に用いられたマウスは、BDF1雄マウスであった。5-FU(Sigma)の貯蔵液を生理食塩水中で10μg/mlの濃度に調製した。各処理マウスは、実験０日目に尾部静脈を介して体重10g当たり２mgの5-FUを受けた；24時間後、マウスにpINPROL(10μg/体重100g)を腹腔内注射し、そして３日目に第２回目の5-FUの用量を注射した。生存研究は、各々30匹のマウスからなる実験グループ（pINPROL処理）およびコントロールグループにおいて、マウスの死亡をモニターすることにより行った。生存曲線を図８に示す。
【０１５６】
（実施例５：骨髄細胞におけるINPROLでプレインキュベーションした場合とMIP1αでプレインキュベーションした場合の効果）
この実験の目的は、インビトロでのマウス骨髄細胞に対するpINPROLおよびMIP-1αでプレインキュベーションした場合の阻害効果を比較することであった。
【０１５７】
以下の手順を用いた：
インビボ：大腿骨から骨髄を採取する48時間前に、６〜15週齢のBDF1マウスに200mg/kgの5-FUを腹腔内に注射する。
【０１５８】
インビトロ：単一の細胞をプールした懸濁液を計数し、そして５×106細胞を、pINPROLまたはMIP-1αとともにまたはなしで、５％ウマ血清、L-グルタミン添加IMDM培地と総容量２mlとして、37℃および５％CO2で４時間インキュベーションする。次いで、細胞を２回洗浄し、そして再計数した。それらを以下の最終条件下でメチルセルロースに播種する：
0.8％  メチルセルロース
25％  ウマ血清
20ng/ml  組換え型マウスIL3
L-グルタミン添加
５×105細胞／ml
IMDM培地
プレートを11日間、37℃および湿度100％中５％CO2で、インキュベーションした。50細胞より多いコロニーを計数した。
表２
グループ コロニー数 コントロールに対する％
コントロール            31.0            100 ％
pINPROL            21.25            68.5％
MIP-1α            35.25            114％
（実施例６：INPROLはHPP-CFC増殖を阻害する）
マウス再構築幹細胞および初期前駆体を評価するインビトロアッセイは、高増殖性潜在コロニー(HPP-PFC)アッセイである；他の関連アッセイ、例えばCFU-A、CFU-GM、CFU-EおよびCFU-GEMMは、次第に制限された前駆細胞の集団を検出する(M.Moore、Blood177:2122-2128、1991)。この例は、pINPROLでの細胞の前処理が、それらの増殖を阻害するのに対し、MIP-1αは、これらの実験条件下では阻害しないということを示す。
【０１５９】
BDF1マウスを、それらの骨髄をHPP-CFC数に関してアッセイする前に、5-フルオロウラシル(200mg/kg腹腔内)で処理した。細胞を遠心分離により洗浄し、そして添加剤のない培地（コントロール）、pINPROL(25ng/ml)またはMIP-1α(200ng/ml)を含む培地のいずれかにおいて、106〜５×106/mlの密度で４時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、そして30％FCSと、5637細胞系およびWEHI-3B細胞系由来の組合せ馴化培地（7.5％の各馴化培地、Sharpら、1991の推奨による）とを有する寒天(0.3%)に播種した。播種濃度は、60mmの皿に５×104細胞／mlであった。14日目にコロニー数を計数し、そして結果を以下に示す。
表３
グループ          HPP-CFU      コントロールに対する％
コントロール        15.5±1.2        100 ％
pINPROL          8.3±0.7          53.5％
MIP-1α          15.8±0.9          101％
これらの結果により、MIP-1αは、プレインキュベーションの期間中にのみ存在した場合には、ほとんどの未成熟な前駆体の増殖を阻害しなかった。pINPROLは、これらの条件下で増殖を効果的に阻害し、生物学的活性という点から見るとINPROLとMIP-1αとの間には基本的な違いがあることを示している。
【０１６０】
（実施例７：放射線誘導性骨髄形成不全からの回復に対するINPROL処理の効果）
骨髄形成不全は、放射線ガン療法の一次的制限毒性(primary limiting toxicity)である。いくつかの増殖因子（例えば、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン）は、放射線誘導性骨髄形成不全からの回復を促進し得るということが示されてきた。幹細胞増殖のインヒビターの使用による保護という概念は、血液学的な損傷に上手く対処することにおける異なった補足的なアプローチである。初期に開発された処理手順（実施例３、４）に従い、致死量の放射線を照射されたマウスのモデルを確立した。９Gyのコバルト60を受けたマウスは10〜14日後に死亡し始め；30日目までには死亡率は約50％となる、ということは当該分野では公知である。この致死用量を、それを各4.5Gyずつの連続する２回の適用に分けて、投薬の間は３日間の間隔を置いて、本発明者らのモデルに用いた。予備データは、そのモデルの生存曲線が、９Gyによる１回の放射線照射で知られた生存曲線と非常に近いことを示した；さらに、CFU-S増殖に関する試験は、第１回目の放射線照射の24時間後に35〜50％のCFU-Sが増殖するように誘導されることを示した。このような細胞は、第２回目の投薬の前に送達される幹細胞インヒビターにより保護され得る。
【０１６１】
この可能性を試験するために、マウス（50匹／グループ）に０日目に4.5Gyを照射し、その24時間後に、１つのグループにはpINPROL（２μｇ／マウス、腹腔内）を投与し、別のコントロールグループには生理食塩水を注射した。そして第２回目の放射線の照射用量(4.5Gy)を３日目に与えた。
【０１６２】
図９は、pINPROLの１回の用量を投与した後の増大した生存を示す。モデルの状態は、固形腫瘍により特徴付けられるガンを含むいかなるガンの治療にも臨床的に有意義であり、このような治療は、放射線照射の２回続けた投与の間に有効用量のINPROLを送達することによりガンを有する患者に投与し、それによってガンの治療に用いられる放射線の照射線量をより多くすることができる。この様式は化学療法剤にも広げることが可能である。
【０１６３】
（実施例８：自己骨髄移植へのINPROLの使用）
骨髄移植は、いくつかの白血病(CML、AML、およびその他）にとっては唯一知られた治療的な療法である。輸注のための自己BMTのエクスビボ調整により、白血病細胞の混入のない正常幹細胞の潜在的な自己供給源が提供され、そしてレシピエントの造血系を再生させて(repopulate)、積極的で効果的な療法を可能にする。
【０１６４】
（１．INPROL効果の研究用の長期骨髄培養物L1210白血病モデルはAraCによるパージの間、正常な造血を保持する）
長期骨髄培養物(LTBMC)をToksozら(Blood55;931-936、1980)に従って確立し、そして白血病細胞系L1210を２週間LTBMCと共培養した。正常前駆細胞および白血病前駆細胞の同時増殖は、これらのLTBMC/L1210の混合培養物内で起こり、それは白血病患者の骨髄内と同様の状況である。正常なコロニー形成単位CFUと白血病CFUとの間の区別は、WEHI-3（マウスIL-3産生細胞株）由来の馴化培地の存在下または非存在下での寒天コロニーとしてそれらを増殖させることにより可能であった。正常細胞は、IL-3非存在下で、アポトーシスを受けるのに対し、白血病細胞はIL-3非存在下でコロニーを形成し得る。LTBMC-L1210組成物由来の懸濁細胞は、播種された50,000細胞当たり、IL-3存在下で約150個のコロニー（正常造血クローン）を生じ、IL-3なしで増殖した場合は70コロニー（白血病クローン）を生じた。
【０１６５】
パージ手順は、以下の通りであった：０日目に、全ての懸濁細胞および培地（10ml／フラスコ）をLTBMC-L1210の入っているフラスコから取り出し、そして200μgのシトシンアラビノシド(AraC)を含む２mlの培地で置き換えた(Tsyrlovaら、Leukemia:Advancesin Biology and Therapy、第35巻、1988)；20時間のインキュベーション後、フラスコを洗浄し、そして２mlの新鮮な培地のみ（コントロールグループ）または25ng/mlのpINPROLを含む培地で４時間置き換えた。このプレインキュベーションの後、細胞を100μg／フラスコのAraCとともに、37℃で３時間再びインキュベーションした。各グループは４本のフラスコを含んだ。LTBMC-L1210培養物を３回洗浄し、そして新鮮なLTBC培地で置き換えた；それらを再生研究のため前述のように３〜４週間維持した。
【０１６６】
データを図１０に示す。AraCのみで処理されたコントロール培養物には細胞の増殖が見られなかったが、INPROLで保護されたフラスコ内では、接着層由来の前駆細胞の増殖のため、造血再生がさらにより急速に起こった。さらに、実験グループ由来の細胞は、寒天に播種された場合、IL-3存在下では50,000細胞当たりわずか約100CFUしか増殖しなかった；少なくとも４週間の間には白血病細胞の増殖は観察されなかった。従って、エクスビボでINPROLと組み合わせて、有効量のAraCにより処理された骨髄は、ガン細胞はパージされ得るが、幹細胞は保護される。この様式は他の形態の化学療法または放射線治療に広げることが可能である。
【０１６７】
（２．骨髄再生能(MRA)および30日間放射線防御は、インビトロのINPROL処理により増大する）
MRAは、致死量の放射線を照射されたマウスの骨髄を再生する細胞の能力であり、30日間の放射線防御を付与する能力を伴っていて、骨髄抑制動物を救う潜在能力の直接的なインビボ測定である(Visserら、BloodCells14:369〜384、1988)。
【０１６８】
放射線防御研究に関して、BDF1マウスは9.5Gyで放射線照射され、テストステロンで刺激されたドナー由来の骨髄の移植により回復した。レシピエントの１グループは培地で（コントロール−グループＡ）、そして別のグループ（グループＢ）は25ng/mlのpINPROLで、４時間プレインキュベーションされた骨髄細胞により回復した。両グループの細胞を洗浄し、そしてマウス１匹当たり30,000個の細胞を放射線照射された動物に移植した。生存データを示す（図１１）。３つの実験の合計を、コントロールを100％に正規化して示す。30日目までに、pINPROLによるインキュベーションにより、マウスの生存をコントロールグループの36.5％から61.8％まで増加させた。
【０１６９】
INPROLによるプレインキュベーションによって誘導されるMRAの増加は、放射線防御を改善するメカニズムの１つであり得る。この仮説を試験するため、Visserら（前出）に従ってMRAを測定した。簡潔に記載すると、ドナーBDF１マウスをテストステロンで前処理し、それらの骨髄を培地またはpINPROLで４時間プレインキュベーションし、そして放射線照射された動物に注射した。13日目に、レシピエントの大腿骨由来の骨髄細胞を、20％ウマ血清、および10％WEHI-CMの存在下で、３つの異なる濃度（0.01、0.05、0.1当量の大腿骨）で寒天に接種した。７日目のコロニー数は、その時点のレシピエントの骨髄中のコロニー形成細胞がドナーの未成熟幹細胞の前駆細胞である限り、MRAを表す。
【０１７０】
図１２に見られ得るように、INPROLでプレインキュベーションされた細胞集団のMRAは、コントロールグループ(B)の場合より多い。
【０１７１】
（実施例９：INPROLの幹細胞への抗過剰増殖効果は、それらの分化の異常を変化させ得る）
CFU-Sの過剰増殖は、細胞障害性薬物または放射線照射からの回復中に見られるだけでなく、正常な加齢の結果としても見られ、そして骨髄異形成症候群(MDS)の主要な特徴であると考えられている。それは、顆粒球経路に沿った分化が減少する一方でを、赤血球分化が広まるような分化障害を伴う。
【０１７２】
骨髄細胞を25ng/mlのpINPROLまたは培地（コントロール）とともに37℃で４時間インキュベーションし、洗浄し、次いで20％ウマ血清、２U/mlエリスロポエチン、および10％WEHI-CMを有する寒天に播種した。BFU-EおよびGM-CFUコロニーの数を７日目に計数した。表４に示すデータは、３つの実験をまとめたものであり、各グループから各時点で４匹を取り出し；４枚の皿に播種した。
【０１７３】
表４から明らかなように、無傷の幼動物(８〜12週齢のBDF1)由来の正常骨髄(NBM)をINPROLとともにインキュベーションすることにより、異なるタイプのコロニーの数または比率は変化しなかった。テストステロンプロピオネート(TSP)で前処理されたBDF1ドナーは
、以前に示したように（実施例１、３、４）、CFU-S増殖における同じ増加、赤血球前駆細胞数(BFU-Eコロニー)におけるわずかな増加、およびGM-CFUにおける減少を示し、それはINPROLとのインキュベーションにより完全に妨げられた。さらに、異常に高いレベルのCFU-S増殖は、細胞周期のＳ期に10％のCFU-Sに戻った。CFU-Sの過剰増殖は、例えばBalb/cマウス（表４）のようにウイルス性白血病誘発を受けやすいある種のマウス種の特徴であることが知られており、そしてより高齢の動物においても観察され得る（表４）。TSP処理したBDF1マウスに見られた分化方向の決まった前駆細胞と同じ再分布が、Balb/cおよびより高齢（23〜25ヶ月齢）のBDF1において観察され、それは一般に異常に高いレベルのCFU-Sの増殖を有する。CFU-Sの増殖および分化の両方の修正は、INPROLとのインキュベーションによって誘導された。より一層臨床に適したものは、研究により、INPROLのインビボ注射(2μg／マウス）がCFU-Sの増殖ならびに赤血球(BFU-E)とGM-コロニーとの比率の両方に影響することが示された（表４）。
【０１７４】
（表４．分化方向の決定付けられた前駆細胞BFU-EおよびCFU-GMへのCFU-Sの分化に対するINPROLの効果）
【０１７５】
【表４】
2008088186.tif 000014
（実施例10：INPROLの免疫刺激活性）
増殖CFU-Sを高い比率で含む骨髄細胞とINPROLとのインキュベーションは、CFU-Sの周期を変えるだけでなく、それらの分化を、優勢な赤血球の分化から顆粒球およびリンパ球の前駆細胞へと切り換える。INPROLのこの特性は、細胞障害性の化学療法または放射線療法の免疫抑制的な副作用および過剰増殖幹細胞障害および加齢に伴う免疫抑制のために重要である。
【０１７６】
本実施例は、Wittlock&Witte(Ann.Rev.Immun.3:213〜35、1985)によって確立されたリンパ球長期培養(LLTC)由来の未成熟前駆体の前Ｂ前駆細胞への分化に対するINPROLの直接的な効果を示し、これはIL-7を含むメチルセルロース中のコロニー形成によって測定される。
【０１７７】
LLTCを、記載されたように確立し、そして新鮮なLLTC培地(TerryFoxLabs., Vancouver, Canada)を１週間に２回与えた。非接着細胞を１週間に１度採取し、因子を洗い流し、そして25ng/mlのpINPROL、またはコントロールとして培地のみと４時間インキュベーションした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして105細胞／mlの濃度で、30％FCSおよび10ng/mlのIL-7を含むメチルセルロース中に播種した。３週間のデータを図13に示す。大きなpre-Ｂコロニーの数はコントロール中で変化し、時間とともに増加したが、INPROLとのプレインキュベーションは、常にコロニーの増殖をコントロールレベルの４〜８倍に刺激した。このことは、免疫不全状態を修正し、そして例えばワクチン投与に対して所望の免疫応答を増加させるために有用であるINPROLの免疫刺激特性を示す。
【０１７８】
（実施例11：INPROLは幹細胞の再生能を改善する--CMLの患者由来の長期培養開始細胞）
慢性骨髄性白血病(CML)は、造血幹細胞の致死的な悪性疾患である。慢性期にあるCMLを単一薬剤による化学療法、組み合わせ化学療法、脾摘出、または脾臓への放射線照射を用いて処置することは、臨床的徴候および症状を制御し得るが、生存を有意に伸ばすことはない。CMLが慢性状態から促進状態に進むと、標準的な療法は効果的でない。現在では、骨髄移植(BMT)がCMLに対する唯一の既知の治療的療法である。血縁でないドナーのBMTを用いる治療は、組織不適合性の問題により困難である。適格なCML患者の40％未満にしか適切に適合する血縁のドナーがいない；従って自己移植が好ましい。長期培養(LTC)において増殖するPh陽性患者由来の非白血病(Ph-陰性)骨髄前駆細胞を選択する能力とともに、輸注のための自己BMTのエクスビボ調整は、正常幹細胞の自己供給源がCMLの積極的で効果的な治療を行い得る可能性を示唆する。
【０１７９】
BMTの状況においては、造血幹細胞は、長期間にわたって成熟した血液細胞を生成する能力を有する細胞として定義され得る。本発明者らは、C.Eaves&A.Eavesによって開発されたヒトLTC系を、幹細胞数の定量用およびそれらの治療的使用のための操作手段の両方で用いた。これは、予め確立され、放射線照射されたヒト骨髄接着層上に細胞を接種することを包含し；次いでこれらの培養物を５週間維持する。エンドポイント(endpoint)は、この期間の終わりに採取された培養物の総クローン原性細胞内容物（接着および非接着）である。このような条件下で生じたクローン原性細胞は、最初に添加された前駆細胞（長期培養開始細胞(LTC-IC)）の数と直線関係にある；個々のヒトLTC-ICから生じた平均は、１個のLTC-ICにつき４クローン原性前駆細胞である。CMLの患者由来の骨髄が同様の条件下に置かれた場合、白血病性（Ph陽性）クローン原性細胞は迅速に衰退することが以前に示されていた、CML患者の残った正常LTC-ICの定量を用いることにより、培養自己移植片の移植により支持される集中治療から利益を得やすい細胞を選択することが可能である(Phillipsら、BoneMarrowTransplantation  8:477〜487、1991)。
【０１８０】
以下の手順を用いて、CMLの患者の末梢血から確立された骨髄移植細胞中のクローン原性細胞(LTC-IC)の数に対するINPROLの効果を試験した。
【０１８１】
予め放射線照射した間質上の長期培養と同様に培養を開始した。健常ドナーの末梢血をコントロールとして用いた。CML患者由来の末梢血細胞を、pINPROL(25ng/ml)とともに、またはなしで４時間プレインキュベーションし、洗浄し、そしてLTC-IC系に５週間置き、LTC-ICのコントロール数を測定した。実験のために、別の平行培養を10日間確立した。10日間増殖させた培養物からの接着細胞および非接着細胞の混合物を、pINPROLとともに、またはなしでプレインキュベーションし、そしてさらに８週間予め確立したフィーダー上に置いた。各実験培養物由来のLTC-ICの数は、接着細胞および非接着細胞の両方を適当な増殖因子(TerryFoxLaboratories、Vancouver、Canada)を有するメチルセルロース中に播種し、そして得られた全コロニー形成細胞の数を計数することにより概算した。この手順を用いて得られたLTC-IC値は、下記の式を用いた全クローン原性細胞（CFC）内容物の評価に由来した：
＃LTC-IC＝＃CFC/4
図14に示したデータは、健常ドナーの骨髄から始めた最初の10日間の培養中ではLTC-ICに損失がなく、そして投入したLTC-IC数の約30％が５週間たってもなお培養中に存在していたことを示す。CML患者のLTC-IC数は、10日間の間に約８％にまで劇的に低減し、そしてさらなるインキュベーション中、元には戻らなかったが、INPROLとともに細胞をプレインキュベーションすると、最初の数の30％までLTC-ICレベルが増加し、そしてそれは８週間維持された。
【０１８２】
これらの予備データによって予想されるINPROLの臨床関連の適用は、新鮮なまたは培養されたの骨髄移植物の正常幹細胞内容物を選択的に改善するためのストラテジー、インビボの残存正常幹細胞の補充を高めるためのストラテジー、さらに患者へのさらなる移植のために新しい遺伝物質をヒト骨髄幹細胞に転移させるためのプロトコルにおけるそれらの使用を包含する。
【０１８３】
（実施例12A：骨髄調製物由来の幹細胞増殖の免疫活性インヒビターの単離方法）
骨髄はブタの肋骨から単離した。ブタの胴体から肋骨を分離して筋繊維および脂肪を除き、細片に刻んで骨髄をBiophyzpribor社製の水圧プレスによって抽出した。骨髄細胞を、遠心機K-70中で2,000rpmで20分間遠心分離することにより分離する。次いで、引き続き抽出上清をAmiconUSAメンブレンXM-100、PM30、PM-50により連続的に限外濾過にかける。電気泳動による分析によると、この生成物の主要な成分はアルブミンである（図１参照）。
【０１８４】
（生物化学的精製）
画分の骨髄抽出物およびタンパク質成分を、精製の各段階で、0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含む10％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。７％までのドデシル硫酸ナトリウムおよび0.5〜１％までのメルカプトエタノールをサンプルに添加し、そしてそのサンプルをゲルにロードする前に70℃で５分間インキュベーションした。
【０１８５】
電気泳動は20Ycmのゲルで５時間行った。次いで、ゲルを、エタノール：水：酢酸が５：５：１の混合物中の0.25％クーマシーCBBC250で20℃で１時間染色し、そして７％酢酸を数回交換して洗浄した。生成物の活性を造血幹細胞(CFU-S)増殖の阻害方法により評価した。この方法を以下に詳細に述べる。
【０１８６】
ステージ１．硫安沈澱による精製
活性を、表５の結果に基づいて選択された飽和度40〜80％で25％の硫安を用いて沈澱させることにより精製した。
【０１８７】
【表５】
2008088186.tif 000015
精製の各工程の後の試験に用いられる調製物の量は、精製レベルによって決定し、始めの生成物の２×10-2mgの用量と同じであった。活性を下式により決定した：
変化％＝Ｓa％−Ｓb％
ここで、Ｓa％は、コントロールのＳ％であり、
Ｓb％は、試験画分とのインキュベーション後のＳ％である。
【０１８８】
画分は、各活性試験の前、および次の各精製工程の前に硫安濃度を20倍低くするために脱塩した。
【０１８９】
ステージ２．ステージ１由来の不純物のあるインヒビターを、脱塩後にイオン交換クロマトグラフィー（この場合DEAE23セルロース）を利用して分画し、次いで酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)の勾配を用いて溶出する。
【０１９０】
インヒビターの活性画分は３〜５mMの間に溶出する。
【０１９１】
カラム容積は１mlであり、溶出速度は４ml／時間であった。検出はクロマトグラフMillicromeにより230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分１（図２参照）を単離し、５mM酢酸ナトリウム緩衝液中に溶出した（表６参照）。
【０１９２】
【表６】
2008088186.tif 000016
電気泳動のデータは、主なタンパク質混入物であるアルブミン（図３参照）がこの画分から除かれることを示し、さらに４回の精製に続く。
【０１９３】
ステージ３．ステージ２由来の部分精製されたインヒビターを直接G-75Sephadexカラムにかける。
【０１９４】
カラム体積は20ml(20×1)であり、溶出速度は2ml／時間である。溶出緩衝液は50mMNaCl、10mMTris-HCl、pH7.5である。検出はクロマトグラフMillichromeにより230および280nmで行った。最も高い活性を示した画分５を単離した。
【０１９５】
【表７】
2008088186.tif 000017
ステージ４．Pro-RECカラムを利用した逆相クロマトグラフィー(PharmaciaFPLCSystem)をUltrasfera matrix 上で行った。タンパク質は0.1％トリフルオロ酢酸のアセトニトリル勾配を用いて溶出した。
【０１９６】
分子量16〜17kDの生成物の均質度は、アクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウムゲルの分析において示されるように、90％に等しい（図６参照）。この結果を図４に示す。画分５についての活性を測定する。生成物の最終回収率は５％である。結果として、精製後の分子量16kDのタンパク質の総量は始めの生成物の650ng/mlである。精製プロセスの間、生成物は70℃の加熱インキュベーションを数分受けたが、生物学的活性の損失は検出されなかった。
【０１９７】
（実施例12B：より大量のINPROLを単離するための代替方法）
（最初の単離）
新鮮なブタの胴体から採取した肋骨から筋繊維および脂肪を除き、次いでこれを刻んで細かくし、リン酸緩化衝生理食塩水に1:1（重量／容量）の比率で浸漬する。得られた混合物を水圧プレスで粉砕し、固体骨物質から骨髄を分離する。
【０１９８】
骨髄細胞懸濁液を回収し、そして４層のチーズ・クロス(cheese-cloth)を通して固形粒子を濾過する。濾液を56℃で40分間インキュベーションし、次いで氷浴で４℃まで冷却する。得られた沈澱物を10,000gで30分間４℃で遠心分離することにより除去し、廃棄する。
【０１９９】
清澄化した上清を、１容量％の濃塩酸を含む10容量の撹拌された氷冷アセトンに30分間滴下して添加する。得られた混合物を４℃に16時間保存し、完全な沈澱物を形成させる。次いで、沈澱物を20,000gで30分間４℃で遠心分離することによりペレット化する。このペレットを冷アセトンにより洗浄し、そして乾燥する。
【０２００】
（HPLC精製）
ペレットを、５％アセトニトリル(MeCN)および0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)を含むHPLC溶出緩衝液Ａに溶かし、最終タンパク質濃度を８〜10mg/mlとする。この溶液(0.5〜0.6ml)を、PolisilODS-300(10mcm)が充填され、そして同じ緩衝液Ａにより平衡化された250×4.6mmのHPLCカラムにロードする。
【０２０１】
溶出は緩衝液Ａ中の緩衝液Ｂ(90％MeCN、0.1％TFA)の勾配により、流速1ml／分で、以下のプログラムに従って行う。
【０２０２】
時間、分        Ｂの％
０              ０
４              ０
５              25
25              90
100％の緩衝液Ｂを５分間流すさらなる工程を用いて再平衡化の前にカラムを洗浄する。次いで、カラムを開始時の状態に戻すため再び平衡化し、そして次の部分のタンパク質溶液をカラムにロードし得る。代表的なクロマトグラムを表５に示す。
【０２０３】
分離の間、カラム溶出物をタンパク質ピークの検出のため280nmでモニターする。タンパク質物質を含む画分を回収し、分離したピークをプールして、30℃でロータリーエバポレーターにかけて乾燥させる。得られた残渣を蒸留水に溶解し、生物活性試験およびSDS-PAGE(14％ゲル、還元条件）によりアッセイする。活性物質を含むピークは、緩衝液Ｂが70％と80％との間に溶出され、SDS-PAGEによってアッセイされたように、16kDの主要なタンパク質バンドおよび速く移動するタンパク質の痕跡を含む。
【０２０４】
第２の主要なＨＰＬＣピークのみを回収することにより得られた活性物質の分析を、図15（ＡおよびＣ）に示す。両方のピークを含む物質（例えば、表５）を、本明細書中ではpINPROL調製物１といい、そして第２のピークのみからなる物質をpINPROL調製物２という。500μgのこの活性な、精製pINPROL調製物２をC4逆相カラム(Vydac)にロードし、そして0.1％トリフルオロ酢酸中の５〜95％アセトニトリルの直線勾配を用いて溶出した。その物質は53％アセトニトリルで単一ピークとして溶出した（図15Ａ）。しかし、250μgのMIP-1α(R&D Systems)を同じ条件で流した場合、それは43.9％アセトニトリルで溶出した（図15Ｂ−14％アセトニトリルより前に溶出する初期のピークは人工的で検出器内の気泡によることを銘記されたい）。従って、天然に存在するINPROLは、実質的には、これらのような条件下ではMIP-1αより疎水性である。TGF-βはこれらの条件下ではpINPROLで観察される濃度より低い濃度で溶出することが知られている(Miyazonoら、J.Biol.Chem.263:6407〜15、1988)。
【０２０５】
溶出したpINPROL物質のゲルを図15Cに示す。レーン１は粗物質、レーン２は、分子量マーカー、そしてレーン３は精製物質である。２本の主要なバンドがあり、１本は約14kD、そしてもう１本は約35kDである。この35kDのバンドは14kDのバンドのマルチマー形態であると考えられる。
【０２０６】
（実施例13A：活性INPROL調製物は、ヘモグロビンβ鎖を含む）
pINPROLを、図５に示すように調製した（すなわち、pINPROL調製物１（実施例12Bを参照のこと））。物質をSDS-PAGEにかけ、そして標準的な技法を用いてニトロセルロースに移した。物質を、標準的な技術を用いて120AオンラインPTH-AA分析器を有するABI477Aタ
ンパク質シーケンサーを使用して、Ｎ末端配列分析に供した。以下のＮ末端配列が得られた：
【０２０７】
【化１８】
2008088186.tif 000018
タンパク質データベースのコンピューターサーチは、この配列がブタヘモグロビンのβ鎖のＮ末端配列と同一性を有することを明らかにする（図16Cを参照のこと）。
【０２０８】
（実施例13B：活性INPROL調製物はヘモグロビンα鎖を含む）
図15Ｃにおいて示されるように、タンパク質を図５に示されるように第２の主要なピークを回収することにより精製して（すなわち、pINPROL調製物２）、分子量約15Kおよび30Kに対応する２つの主要なバンド、ならびに幾つかのマイナーバンドを得た。SDS-PAGEゲルを、標準的な技術を用いてニトロセルロースに移し、そして個々のバンドを切り出して、実施例13Aに記載のように、Ｎ末端配列決定分析に供した。15kDのバンドについては以下のＮ末端配列が得られた：
【０２０９】
【化１９】
2008088186.tif 000019
30kDのバンドを、制限タンパク質分解消化に供し、そして以下の内部の配列を得た：
【０２１０】
【化２０】
2008088186.tif 000020
第１の配列は、ブタヘモグロビンα鎖のＮ末端配列と同一性を示し、一方第２の配列はブタヘモグロビンα鎖の残基43〜56と同一性を示した（ヒト、マウス、およびブタのαヘモグロンビン鎖およびβヘモグロビン鎖の配列比較については図16Cを参照のこと）。これらのバンドおよびいくつかのマイナーバンドの反復配列決定により、一貫して、αグロビン配列の部分を得た。従って、図15Cにおいて観察された種々のバンドは、ブタヘモグロビンα鎖のフラグメントまたは凝集体のいずれかを示す。
【０２１１】
（実施例13C：ブタINPROLのさらなる特徴付け）
pINPROLとブタヘモグロビンとをさらに比較するために、２回結晶化したブタヘモグロビンをSigmaChemicalCompanyから入手し、そして実施例12Bにおいて図15について記載したように、逆相HPLCに供した。図17において示され得るように、完全なヘモグロビンのHPLCクロマトグラムは、pINPROL調製物１について示されるクロマトグラムに類似する。さらに、直接比較において、図17Aにおいて示されるpINPROL調製物２（すなわち、図５の第２のピークに由来する）は、ブタヘモグロビンの第２の２つのピークの調製物（図17B）に重複することが見られ、主要ピークについての保持時間はそれぞれ52.51分および52.25分であった。ヘムが、この場合、49.153分で、ヘモグロビンにおける第１の主要ピークと共移動（co-migrate）することに注意すべきである；それゆえ、ヘムはpINPROL調製物１の成分であるが、調製物２の成分ではない。このことは、ヘムの存在について診断する波長575nmでのこのpINPROL調製物の吸光の欠失により確認される。
【０２１２】
ブタヘモグロビンα鎖およびβ鎖の推定分子量は、それぞれ、15038ダルトンおよび16034ダルトンである。図18のSDS-PAGEクロマトグラムにおいて示され得るように、第１の２つのピークはより高い分子量鎖から構成され、および第２の２つのピークはより低い分子量鎖からなる。したがって、第１の２つのピークはヘモグロビンβ鎖を示すようであり、および第２の２つのピークはヘモグロビンα鎖を示すようであった。
【０２１３】
ブタヘモグロビンのさらなる分離を、ゆるやかな溶出勾配を用いて行った（図21）。これらのピークのＮ末端分析は、第１のピークがブタα鎖であり、および第２のピークがブタβ鎖であることを示した。バイオアッセイ結果により、単離されたヘモグロビン鎖の両方が生物学的に活性であることが確認される（例えば、実施例14および15を参照のこと）。
【０２１４】
pINPROL調製物２およびヘモグロビンβ鎖のさらなる比較のために、２次元電気泳動を行った（図19）。１次元について、等電点を、9600ボルト時間について２％pH４〜８アンホラインを用いて、ガラスチューブ中で行った。トロポミオシン（分子量33kD、pI5.2）を、内部標準として用いた；その位置を最終的な2Dゲル上で矢印で記した。チューブゲルを緩衝液中で平衡化させ、そして12.5%アクリルアミドスラブゲルの上部のスタッキングゲルの上部にシールした。SDSスラブゲル電気泳動を４時間、12.5mA/ゲルで行った。ゲルを銀染色し、そして乾燥させた。
【０２１５】
2D電気泳動のパターンの比較により、HPLC精製ヘモグロビンβ鎖とpINPROL調製物２との間で異なるスポットは、１つまたは２つの少数のスポットのみであることを示した。抗ブタヘモグロビン抗体、および1Dまたは2D電気泳動のいずれかを用いたウエスタン分析により、調製物中にβヘモグロビンが存在することを確認する。したがって、活性pINPROL調製物２（実施例12Bにしたがって調製される）は、実質的にブタヘモグロビンβ鎖である。
【０２１６】
（実施例14：ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、または完全なヘモグロビンは、幹細胞阻害活性を示す）
ヘモグロビンβ鎖がINPROL活性を有することを確認するために、実施例１に記載したテストステロン処理したマウス由来の骨髄を用いて、実施例12Bにおけるように精製した物質を使用して実施例１に記載の方法論を用いて、自殺アッセイを行った。表８に示すように、正常なマウスの骨髄細胞の15％が、テストステロン処理動物の36％とは対照的に死滅された。予想されたように、このことはテストロン処理が、細胞周期における細胞のパーセントを増加させる（したがって、細胞がより死滅されやすくする、例えば、実施例１）ことを示している。より際だった対照において、40ng/mlでpINPROLまたは精製ヘモグロビンβ鎖のいずれかとともにインキュベーションしたテストステロン処理した動物由来の細胞は、細胞周期における細胞のパーセントが、36％から０％および７％に、それぞれ、劇的に減少することを示した。200ngのより高い用量は、両方のタンパク質についてほとんど効果がなかった。ポジティブコントロールとして、以前に特徴付けられた幹細胞インヒビターMIP-1αは、13％に細胞周期の進行を減少させた。
【０２１７】
同様のアッセイを、CFU-Sの代わりにCFU-MIXの細胞周期の進行状態を用いて、インビトロで行い得る。高用量のトリチウム化されたチミジン（B.I.Lord、Haemopoiesis-APracticalApproach, N.G.TestaおよびG.Molineux（編）、IRL出版、1993；Pragnellら、CultureofHematopoietic Cells, R.I.Freshney, I.B. PragnellおよびM.G.Freshney（編）、WileyLiss1994）の代わりに、シトシンアラビノシド（Ara C, 30mg/ml）を細胞周期特異的毒性薬剤として用いた以外は、CFU-Sアッセイについて上述したようにアッセイを行い、そして早い内在性細胞周期速度を有するマウス系統（Balb/c）をテストステロンで処理したBDF1マウスの代わりに用いる。表９において示すように、高度に精製されたブタβ鎖、または高度に精製されたブタα鎖は、このアッセイにおいて両方とも活性であった。このアッセイにおいて注目すべき点は、pINPROLで処理した細胞についての細胞周期の進行レベルが、場合によってはネガティブな数を有し、このことは、非処理のプールよりもAraCで処理したプールにおいてより多くのコロニーが存在することを示している。
【０２１８】
実施例２に記載したように、pINPROLは、トリチウム化したチミジン取り込みアッセイにおいて、マウス幹細胞FDCP-MIX株の増殖を阻害する。図20は精製ヘモグロビンα鎖およびβ鎖が、２ng/ml未満で示される阻害を伴いつつ、このアッセイにおいて両方とも活性であることを示している。
【０２１９】
前述は、ブタヘモグロビンのβ鎖がINPROL活性を示すという証拠を提供する。他のデータ（例えば、表９、図20）は、単離されたα鎖、ならびに完全なヘモグロビンがまた、幹細胞インヒビターとして活性であることを示す。活性な調製物にはまた、α鎖およびβ鎖の混合物が含まれる（例えば、図５）。
【０２２０】
単離されたαグロビン鎖および／または単離されたβグロビン鎖が活性であるという観察は、本実施例で記載した活性が、完全な３次元ヘモグロビン構造を必要としないことを示している。α鎖およびβ鎖のフラグメントはまた、幹細胞インヒビターとして活性である。
【０２２１】
【表８】
2008088186.tif 000021
【０２２２】
【表９】
2008088186.tif 000022
１コントロール-Balb/cマウス由来の骨髄
２100ng/ml（図21のように精製）
（実施例15：精製INPROL、精製ブタαヘモグロビン、または精製ブタβヘモグロビンは、インビボで活性である）
精製したブタヘモグロビン鎖のインビボでの作用能力を試験するために、BDF1マウスに実施例１に記載のようにテストステロンプロピオネートを用いて注射した。24時間後、マウスに、pINPROL、ブタヘモグロビンα鎖(図21のように末梢血赤血球から精製した)、ブタヘモグロビンβ鎖(図21のように末梢赤血球から精製した)のいずれか500ng、あるいは等容量のキャリアを静脈内投与した。48時間後、各マウス由来の骨髄を採取し、そしてCFU-MIXアッセイを実施例14に記載のように行った。表10において示されるように、pINPROL、ブタα鎖およびブタβ鎖は、細胞周期におけるCFU-MIXのパーセントを基底レベルまで減少させ、全てインビボで活性であった。
【０２２３】
【表１０】
2008088186.tif 000023
１コントロール-テストステロン処理BDF1マウス由来の骨髄
２100ng/ml（図21のように精製）
３基底-未処理のBDF1マウス由来の骨髄。
【０２２４】
（実施例16：精製ヒトヘモグロビンα鎖、ビオチン化ヒトヘモグロビンα鎖、ビオチン化ヒトヘモグロビンβ鎖、ヒトヘモグロビンγ鎖、およびヒトヘモグロビンδ鎖は、全てインビトロで幹細胞阻害活性を示す）
ヒトヘモグロビンを、Sigma Chemical Corporationから入手するか、あるいは成人ヒト末梢血または臍帯血から標準的な手段により単離した。個々の鎖を、ブタα鎖およびβ鎖について上述したのと同様の様式で逆相HPLCにより単離した（B.MasalaおよびL.Manca,Methodsin Enzymology、第231巻、21〜44頁、1994を参照のこと）。精製α、β、γ、およびδ鎖を得た。ビオチン化したα鎖およびβ鎖について、１mgの成人ヒトヘモグロビンを、37μgのNHSLCビオチン（Pierce）を用いて処理し、そして上記のように逆相クロマトグラフィーにより鎖を分離した。
【０２２５】
表11、12、および13において示すように、精製ヒトαヘモグロビン鎖、ビオチン化ヒトαヘモグロビン鎖、ビオチン化ヒトβヘモグロビン鎖、ヒトγ鎖ヘモグロビン鎖、およびヒトδヘモグロビン鎖は、全て、CFU-MIX細胞周期の進行アッセイにおいて活性である。
【０２２６】
【表１１】
2008088186.tif 000024
１コントロール-Balb/cマウス由来の骨髄
２100ng/ml
【０２２７】
【表１２】
2008088186.tif 000025
１コントロール-Balb/cマウス由来の骨髄
２100ng/ml
【０２２８】
【表１３】
2008088186.tif 000026
１コントロール-Balb/cマウス由来の骨髄
２100ng/ml。
【０２２９】
（実施例17：精製ヒトα鎖、α-βダイマー、またはヘモグロビンは、インビボで活性である）
精製ヒトα鎖、α-βダイマー、またはヘモグロビンを実施例15に記載のようにインビボアッセイで試験した。表14に示したように、これらのそれぞれは濃度500ng/マウスで活性であった。
【０２３０】
【表１４】
2008088186.tif 000027
１コントロール-テストステロン処理BDF1マウス由来骨髄。
【０２３１】
（実施例18：ブタINPROLは、インビトロでヒト単核細胞またはCD34+臍帯血細胞において活性である）
ブタ骨髄由来の精製INPROLが、ヒト前駆細胞における細胞周期の進行に影響する能力を調べるために、臍帯血細胞を得た。Ficoll上で分離した後に得られた総単核細胞画分または抗CD34親和性カラム（CellProInc.）上での分画後に得られたCD34+画分のいずれかを使用した。初期の幹細胞が細胞周期にあることを確認するために細胞を、インターロイキン３（IL-3）および幹細胞因子（SCF）（各100ng/ml）の存在下でインビトロにおいて48時間インキュベーションした。このプレインキュベーション後、細胞周期の進行アッセイを、CFU-GEMM（CFU-MIXの代わりに）を播種後18日目に計数した以外は、実施例14に記載のようにマウスについて行った。表15において示すように、ブタINPROLは、大多数の単核細胞またはCD34+画分のいずれかにおいて、CFU-GEMMの細胞周期の進行を阻害した。
【０２３２】
【表１５】
2008088186.tif 000028
（実施例19：精製ヒトαヘモグロビンは、ヒトCFU-GEMMにおいて活性である）
ヒト臍帯血単核細胞を得、そしてIL-3およびSCF中でインキュベーションし、そして実施例18に記載のように細胞周期の進行アッセイに使用した。表16に示すように、骨髄から精製したブタINPROLおよび末梢血から精製したヒトαヘモグロビンは、このアッセイにおいて活性であった。
【０２３３】
【表１６】
2008088186.tif 000029
（実施例20：ヒトαヘモグロビンおよびヒトβヘモグロビン配列から得られたペプチドは活性である）
活性なペプチド配列を同定するために、ミオグロビンの３次元構造（本アッセイにおいて不活性である）を、コンピューターモデリングプログラムを用いて成人ヒトヘモグロビンにおいて存在するα鎖のネイティブな３次元構造に重ね合わせた。２つのペプチド（アミノ酸43〜55および64〜82で表される、これらは３次元空間においてミオグロビンと構造的に異なる領域である）を、CFU-MIX細胞周期の進行アッセイにおいて活性を有するとして同定した。ネイティブなα鎖において見出されるループをより近接に近づけるために、ペプチド43〜55の環状誘導体（c43〜55）（ジスルフィド結合を利用）をまた合成し、そして活性であることが見出された。
【０２３４】
これらのペプチドの配列は以下のようである：
【０２３５】
【化２１】
2008088186.tif 000030
（ここで、２つのCys残基はジスルフィド結合されている）
【０２３６】
【化２２】
2008088186.tif 000031
２つのヘモルフィン配列、ヘモルフィン10（β鎖配列のアミノ酸32〜41）およびヘモルフィン７（アミノ酸33〜40）を試験し、そして活性であることを見出した。
【０２３７】
配列は以下のようである：
【０２３８】
【化２３】
2008088186.tif 000032
これらの配列の活性を試験するために、CFU-MIX細胞周期の進行アッセイを実施例14に記載のように行った。表17〜19に示すように、これらのペプチドは全てこのアッセイにおいて活性である。
【０２３９】
【表１７】
2008088186.tif 000033
【０２４０】
【表１８】
2008088186.tif 000034
【０２４１】
【表１９】
2008088186.tif 000035
本発明を好ましい実施態様において記載してきたが、当業者には変形および改変が生じることが理解される。それゆえ、添付の請求の範囲は、請求されるような本発明の範囲内にある全てのこのような等価な変形に及ぶことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す。図１−レーン１はキモトリプシノーゲンであり、レーン２はオボアルブミンであり、レーン３はBSAであり、レーン４は30kD未満の画分であり、レーン５は30〜50kDの画分であり、そしてレーン６は50〜100kDの画分である。
【図２】図２は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す。図２−レーン１は硫酸アンモニウム沈澱後（40〜80％）であり、そしてレーン２〜５はDEAE画分である（レーン２は活性画分を表す）。
【図３】図３は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す。図３−レーン１は硫酸アンモニウム沈澱後の上清であり、そしてレーン２は活性DEAE画分であり、レーン３〜５はゲル濾過画分を表す（レーン５は活性画分を表す）。
【図４】図４は、各精製段階後の生成物のSDSポリアクリルアミドゲル泳動を示す。図４−レーン２は最終産物を表す。
【図５】図５は、最終精製物の逆相HPLCクロマトグラムを示す。
【図６】図６は、ブタ骨髄から精製された種々の濃度のINPROL（pINPROL）を含まない場合（コントロール＝０％阻害）および、含む場合のFDCP-mix細胞株内へのトリチウム化チミジンの取り込み(cpm)を示す。データは、コントロールの値に対して正規化される。
【図７】図７は、テストステロンプロピオネート(TSP)、TSP＋pINPROL、またはビヒクル（コントロール）を用いてマウスを処理した後の細胞周期のＳ期にある細胞の％を示す。各グループは25匹を含んだ（時点毎に３〜４匹）。
【図８】図８は、２用量の5-FUで処理され、pINPROL処理を受けたかまたは受けていないマウスの生存を示す。各グループは30匹を含んだ。
【図９】図９は、放射線照射され、pINPROL処理を受けた場合および受けていない場合のマウスの生存を示す。各グループは50匹を含んでいた。
【図１０Ａ】図１０Ａは、Ara-CまたはAra-C＋pINPROLで処理した後、１週間目の正常骨髄の長期培養細胞の再生を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、Ara-CまたはAra-C＋pINPROLで処理した後、３週間目の正常骨髄の長期培養細胞の再生を示す。
【図１１】図１１は、致死量の放射線照射を行い、培地（コントロール）またはpINPROL(25ng/ml)で４時間プレインキュベーションした後に、３×10４個の骨髄細胞を移植した後のマウス（各グループ当たり75匹）の生存を示す。生存は30日間モニターされた。
【図１２】図１２は、致死量の放射線照射を行い、pINPROLまたは培地で４時間プレインキュベートされたドナーの骨髄細胞により回復した後のマウスの骨髄細胞により14日後に培養物中で形成されたCFU-GMの数を示す。
【図１３】図１３は、毎週取り出し、洗浄し、そして培地またはpINPROLで４時間プレインキュベートした後にIL-7(10ng/ml)と共に接種されるリンパ球の長期培養物由来の懸濁細胞を示す。
【図１４】図１４は、pINPROLで処理された白血病の末梢血細胞の改善された再生能を示す。長期培養開始細胞(LTC-IC)は、粘着性および非粘着性LTC細胞をpINPROLと共に、およびpINPROLなしで接種し、そして７日目にCFU-GMの数を数えることにより測定された。データはコントロールの値に対して正規化される。
【図１５Ａ】図１５Ａは、53％アセトニトリルで溶出した精製pINPROLのＣ４逆相クロマトグラムを示す。レーン１は粗物質であり、レーン２は分子量マーカーであり、そしてレーン３は精製物質である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、43.9％アセトニトリルで溶出したMIP-1αのＣ４逆相クロマトグラムを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、pINPROLの粗調製物および逆相の後精製された調製物のSDS-PAGEクロマトグラムを示す。
【図１６Ａ】図１６は、ヘモグロビン配列を示す：図１６ＡはヒトαヘモグロビンのcDNA配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１６Ｂ】図１６ＢはヒトβヘモグロビンのcDNA配列およびアミノ酸配列を示す。番号付けはアミノ酸に従う。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ヒト、マウス、およびブタヘモグロビンのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列比較を示す。
【図１７】図１７は、pINPROL（図１７Ａ）および結晶化ブタヘモグロビン（図１７Ｂ）のＣ４逆相HPLCトレースの比較を示す。
【図１８】図１８は、結晶化ブタヘモグロビンのＣ４逆相HPLC分離からの画分のSDS-PAGEゲルを示す。レーン１は分子量マーカーを示し、レーン２は第１ピーク（47.11分）由来の画分48〜49を示し、レーン３は第２ピーク（49.153分）由来の画分50〜51を示し、レーン４は第３ピーク（52.25分）由来の画分54〜55を示し、そしてレーン５は第４ピーク（53.613分）由来の画分56〜57を示す。
【図１９】図１９は、pINPROL（図１９Ａ）および精製ブタβヘモグロビン（図１９Ｂ）の２次元ゲル電気泳動の比較を示す。
【図２０】図２０は、FDCP-MIXアッセイにおける精製ブタαヘモグロビン、βヘモグロビン、またはpINPROLの効果の比較を示す。
【図２１】図２１は、ゆるやかな溶出勾配を用いるブタヘモグロビンの逆相分離を示す。
【図１】
2008088186.tif 000048
【図２】
2008088186.tif 000049
【図３】
2008088186.tif 000050
【図４】
2008088186.tif 000051
【図５】
2008088186.tif 000052
【図６】
2008088186.tif 000053
【図７】
2008088186.tif 000054
【図８】
2008088186.tif 000055
【図９】
2008088186.tif 000056
【図１０Ａ】
2008088186.tif 000057
【図１０Ｂ】
2008088186.tif 000058
【図１１】
2008088186.tif 000059
【図１２】
2008088186.tif 000060
【図１３】
2008088186.tif 000061
【図１４】
2008088186.tif 000062
【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
2008088186.tif 000064
【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
2008088186.tif 000066
【図１６Ｂ】
2008088186.tif 000067
【図１６Ｃ】
2008088186.tif 000068
【図１７】
2008088186.tif 000069
【図１８】
2008088186.tif 000070
【図１９】
2008088186.tif 000071
【図２０】
2008088186.tif 000072
【図２１】
2008088186.tif 000073
【配列表】
2008088186000001.app