(57)【要約】      （修正有）【課題】電子メディエータ及び／又は酸化還元酵素を、高分散状態で導電性基材上に固定化し、電極性能に優れた酵素電極を提供する。【解決手段】外部回路に接続された導電性基材と、該導電性基材との間で電子伝達が可能な酸化還元酵素と、前記導電性基材と前記酸化還元酵素との間の電子伝達を媒介可能な電子メディエータと、を備える酵素電極の製造方法であって、前記電子メディエータは、有機高分子材料の高分子鎖にペンダント状に結合した複合体を形成しており、該複合体を誘電率が２４以下の溶媒に分散させた高分子−メディエータ溶液と、前記酸化還元酵素を分散させた酸化還元酵素溶液と、前記複合体の高分子鎖に前記酸化還元酵素を結合させる架橋試薬とを、前記導電性基材表面に塗布することによって、前記電子メディエータ及び該酸化還元酵素を前記導電性基材表面に固定化することを特徴とする、酵素電極の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部回路に接続された導電性基材と、該導電性基材との間で電子伝達が可能な酸化還元酵素と、前記導電性基材と前記酸化還元酵素との間の電子伝達を媒介可能な電子メディエータと、を備える酵素電極の製造方法であって、
前記電子メディエータは、有機高分子材料の高分子鎖にペンダント状に結合して高分子−メディエータ複合体を形成しており、
該高分子−メディエータ複合体を誘電率が２４以下の溶媒に分散させた高分子−メディエータ溶液を、前記導電性基材表面に塗布することによって、前記電子メディエータを該導電性基材表面に固定化することを特徴とする、酵素電極の製造方法。
【請求項２】
前記高分子−メディエータ溶液と、前記酸化還元酵素を分散させた酸化還元酵素溶液と、前記高分子−メディエータ複合体において前記電子メディエータが結合している高分子鎖に前記酸化還元酵素を結合させる架橋試薬とを、前記導電性基材表面に塗布することによって、該導電性基材表面において、前記高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に前記酸化還元酵素を結合させ、前記電子メディエータと共に前記酸化還元酵素を前記導電性基材表面に固定化する、請求項１に記載の酵素電極の製造方法。
【請求項３】
前記電子メディエータがオスミウム錯体である、請求項１又は２に記載の酵素電極の製造方法。
【請求項４】
前記電子メディエータが結合している有機高分子材料がポリビニルイミダゾールである、請求項１乃至３のいずれかに記載の酵素電極の製造方法。
【請求項５】
前記誘電率が２４以下の溶媒がエタノールである、請求項１乃至４のいずれかに記載の酵素電極の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素電極の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵素は、その高い基質特異性から種々の物質の存在量を測定する分析、例えば、酵素センサー等に利用されている。酵素を利用した酵素センサーとしては、例えば、分析の対象である対象物質（基質）と酵素（酸化還元酵素）との酸化還元反応により生じる電流を測定し、対象物質の定量を行うセンサーがある。具体的には、グルコースを酸化する酵素とグルコースとの間における酸化還元反応に伴って発生する電流が、グルコース濃度に比例することを利用したグルコースセンサーがある。
さらに、最近では、白金等の金属触媒に代わる燃料電池用新規触媒としても、酵素の研究開発が進められている。酵素と基質との酸化還元反応に伴い発生する電流を利用した酵素電極は、酵素センサーや燃料電池の他にも広範囲な分野においてその利用が期待されている。
【０００３】
一般的に、酵素は導電性基材より構成される電極表面で直接酸化還元されにくいため、酵素と電極間の電子伝達を媒介する電子メディエータを用いることによって電極反応の効率化が行われている。電子メディエータは、基質を酸化した酵素から受け取った電子を電極へ輸送、又は、電極から受け取った電子を、基質を還元する酵素へ輸送するものである。酵素−電子メディエータ−電極間のスムーズな電子輸送によって、酵素電極の電流値が増加し、充分な電流を取り出すことが可能な生物燃料電池が得られる。
酵素電極において、電子メディエータは、使用目的や研究目的等に応じて、酵素と共に電解液中に混合、分散したり、或いは、電極表面に固定することができるが、通常は、電極構成の簡易化や電極性能等の点から、酵素と共に又は電子メディエータのみが電極表面に固定化されることが多い。
【０００４】
電子メディエータや酵素を電極（導電性基材）表面に固定化する方法としては、例えば、導電性基材上で酵素や電子メディエータを有機高分子材料と成形し、有機高分子材料の固化により形成されるポア内に酵素や電子メディエータを保持させることにより固定化する方法や、使用するｐＨにおいて酵素や電子メディエータと反対の電荷を持つイオン性の有機高分子材料等を用いて静電相互作用により導電性基材上に固定化する方法、酵素や電子メディエータを導電性基材に物理吸着させ固定化する方法、有機高分子材料等の官能基と酵素や電子メディエータの官能基とを共有結合させることにより固定化する方法、有機高分子材料と酵素や電子メディエータとの間に共有結合を形成する架橋試薬を用いて有機高分子材料と酵素や電子メディエータとを共有結合させることにより固定化する方法、等が挙げられる。
【０００５】
また、ポリイミダゾール等の有機高分子鎖に、オスミウム錯体等の電子メディエータをペンダント状に結合させたものを導電性基材表面に固定化した酵素電極も提案されており、高性能を示すことが知られている。さらには、このような電子メディエータが結合した高分子有機鎖（以下、高分子−メディエータ複合体ということがある）に酵素も結合させ、電子メディエータと酵素とを導電性基材表面に固定化した酵素電極も提案されている。
【０００６】
酵素や電子メディエータを固定した具体的な酵素電極としては、例えば、特許文献１や特許文献２に記載されているものが挙げられる。
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−７９００１号公報
【特許文献２】特開平６−１７４６７９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記したような酵素や電子メディエータを電極表面へ固定化する方法では、酵素や電子メディエータを溶媒に分散させた溶液を用いることが多い。このとき、溶液における各成分の分散性が悪いと、酵素や電子メディエータは電極表面に凝集した状態で固定化されてしまう。電極表面における酵素や電子メディエータの分散性が不十分であると、酵素−電子メディエータ−電極の電子伝達が円滑に進行しないため、得られる酵素電極は電極性能に劣るものとなる。
特に、電子メディエータを有機高分子鎖に結合させた高分子−メディエータ複合体は、有機高分子鎖部分の分散性が低く、有機高分子鎖と共に電子メディエータの分散性が悪くなりやすい。さらに、高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に酸化還元酵素も結合させる場合には、酵素と電子メディエータの分散性が共に悪くなり、酵素−電子メディエータ−電極の電子伝達が円滑に進行せず、有効に機能する酵素や電子メディエータが少ない、非効率的な酵素電極となってしまう。
【０００９】
しかしながら、従来、高分子−メディエータ複合体を用いる場合でも、この高分子−メディエータ複合体の分散性に優れた溶媒は特定されておらず、分散性が不十分な溶媒が用いられていたり、或いは、その都度、試行錯誤をして溶媒を選択するという手間を要していた。
【００１０】
上記特許文献１では、実施例において、ＡＥＡＣＰＶＫ３（2-{3-[N-(2-Aminoethyl)aminocarbonyl]propyl}-3-methyl-1,4-naphtoquinone）とジアフォラーゼ（Ｄｐ）とグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）とをポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＧＥ）を用いてポリビニルイミダゾール（ＰＶＩ）と共に電極上へ固定化する際に、ＡＥＡＣＰＶＫ3、Ｄｐ、ＧＤＨ、ＰＥＧＤＧＥ及びＰＶＩを含む緩衝溶液をグラッシーカーボン電極上に塗布し、反応させて硬化させている。
また、特許文献２では、実施例において、水不溶性高分子であるポリビニルブチラール樹脂と電子メディエータである１，１’−ジメチルフェロセンをエチルカルビトールに溶解した組成物やポリビニルブチラール樹脂とジメチルフェロセン−ＴＣＮＱ（7,7',8,8'‐テトラシアノキノジメタン）錯体とＴＣＱＮとをエチルカルビトールと混合した組成物を用いて酵素電極を作製している。
【００１１】
本発明は上記実情を鑑みて成し遂げられたものであり、電子メディエータ及び／又は酸化還元酵素を電極表面に固定化するための担体となる有機高分子材料に結合した電子メディエータを、高分散状態で導電性基材上に固定化し、電極性能に優れた酵素電極を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の酵素電極の製造方法は、外部回路に接続された導電性基材と、該導電性基材との間で電子伝達が可能な酸化還元酵素と、前記導電性基材と前記酸化還元酵素との間の電子伝達を媒介可能な電子メディエータと、を備える酵素電極の製造方法であって、前記電子メディエータは、有機高分子材料の高分子鎖にペンダント状に結合して高分子−メディエータ複合体を形成しており、該高分子−メディエータ複合体を誘電率が２４以下の溶媒に分散させた高分子−メディエータ溶液を、前記導電性基材表面に塗布することによって、前記電子メディエータを該導電性基材表面に固定化することを特徴とするものである。
【００１３】
本発明によれば、電子メディエータを電極表面に固定化するための担体である有機高分子材料を、高分散状態で電極表面に固定することが可能であり、これに伴い電子メディエータも高分散で電極表面に固定化される。
【００１４】
電子メディエータと共に酸化還元酵素も電極表面に固定化する場合には、前記高分子−メディエータ溶液と、前記酸化還元酵素を分散させた酸化還元酵素溶液と、前記高分子−メディエータ複合体において前記電子メディエータが結合している高分子鎖に前記酸化還元酵素を結合させる架橋試薬とを、前記導電性基材表面に塗布することによって、該導電性基材表面において、前記高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に前記酸化還元酵素を結合させ、前記電子メディエータと共に前記酸化還元酵素を前記導電性基材表面に固定化することができる。
【００１５】
この場合、酸化還元酵素及び電子メディエータの両方を電極表面に固定化するための担体である有機高分子が、高分散状態で電極表面に固定され、これに伴い電子メディエータ及び酸化還元酵素の両方が高分散状態で電極表面に固定化される。
【００１６】
前記電子メディエータとしては、例えば、オスミウム錯体が挙げられ、また、前記電子メディエータが結合している有機高分子鎖としては、ポリビニルイミダゾールが挙げられる。さらに、前記誘電率が２４以下の溶媒としては、例えば、エタノールが挙げられる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極間の電子伝達性に優れ、高い電極性能を発現する酵素電極を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の酵素電極の製造方法は、外部回路に接続された導電性基材と、該導電性基材との間で電子伝達が可能な酸化還元酵素と、前記導電性基材と前記酸化還元酵素との間の電子伝達を媒介可能な電子メディエータと、を備える酵素電極の製造方法であって、前記電子メディエータは、有機高分子材料の高分子鎖にペンダント状に結合して高分子−メディエータ複合体を形成しており、該高分子−メディエータ複合体を誘電率が２４以下の溶媒に分散させた高分子−メディエータ溶液を、前記導電性基材表面に塗布することによって、前記電子メディエータを該導電性基材表面に固定化することを特徴とするものである。
【００１９】
ここで、図１を用いて、本発明により得られる酵素電極（基質酸化型）を備えた生物燃料電池の一実施形態例を説明する。
まず、酸化酵素が燃料であるグルコース等の基質を酸化し、電子を受け取る。次に、電子を受け取った酸化酵素は、通常、該酸化酵素と電極との間の電子伝達を仲介する電子メディエータに電子を受け渡し、該電子メディエータによって導電性基材（アノード電極）へと電子が受け渡される。そして、アノード電極である導電性基材から外部回路を通ってカソード電極に電子が到達することで、電流が発生する。
上記過程において発生するプロトン（Ｈ＋）は、電解液内をカソード電極まで移動する。そして、カソード電極では、電解液内を移動してきて到達したプロトンと、外部回路を経てアノード側から移動してきた電子と、酸素や過酸化水素等の酸化剤（カソード側基質）とが反応して水が生成される。
【００２０】
酵素電極において、充分な電流値を得るためには、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極間の円滑な電子伝達が重要であり、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極の相互的な位置関係によって酵素電極の電極性能は大きく左右される。すなわち、酸化還元酵素や電子メディエータを電極表面へ固定化する際の分散状態を高めることが優れた電極性能を発現する酵素電極を得るために重要である。
【００２１】
本発明者らは、高分子−メディエータ複合体を構成する有機高分子の電極表面における分散性を高めることによって、電子メディエータの電極表面における分散性も向上させることが可能であることに着目した。そして、高分子−メディエータ複合体の分散溶液を導電性基材表面に塗布することにより電子メディエータを電極表面に固定化する方法において、高分子−メディエータ溶液における高分子−メディエータ複合体の有機高分子材料の分散性を向上させることによって、該有機高分子材料を高分散状態で電極表面へ固定化することを実現した。
具体的には、高分子−メディエータ複合体を分散させる溶媒として、誘電率が２４以下の溶媒を用いることによって、高分子−メディエータ複合体を構成する有機高分子材料の分散性が向上することを見出した。
【００２２】
本発明において、電子メディエータは、該電子メディエータを電極表面に固定化するための担体である有機高分子材料に予め結合されているため、有機高分子材料の電極表面での分散性が向上することによって、電子メディエータの電極表面における分散性も向上する。
以上のように、本発明の製造方法により得られる酵素電極は、電子メディエータが高分散状態で電極表面に固定されているため、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極間の電子伝達性が高く、電極特性に優れている。従って、例えば、本発明の酵素電極を生物燃料電池の電極として用いることによって、大電流を得ることが可能な発電性能に優れた生物燃料電池を提供することが可能である。
【００２３】
前記高分子−メディエータ溶液と共に、酸化還元酵素を分散させた酸化還元酵素溶液と、高分子−メディエータ複合体において電子メディエータが結合している高分子鎖に酸化還元酵素を結合させる架橋試薬とを、導電性基材表面に塗布する場合には、該導電性基材表面において、高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に酸化還元酵素を結合させることができるため、高分子−メディエータ複合体の有機高分子を担体として、電子メディエータと共に酸化還元酵素を導電性基材表面に固定化することができる。
【００２４】
このように、電極表面において、高分子−メディエータ複合体を構成する有機高分子材料と酸化還元酵素とを反応させて結合させる場合、担体である有機高分子材料の電極表面での分散性が向上することによって、酸化還元酵素の電極表面における分散性も向上する。従って、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極間の電子伝達性をさらに高めることができる。
【００２５】
以下、本発明の酵素電極の製造方法について詳しく説明していく。
導電性基材は電極を構成する基材であり、特に限定されず、一般的なものを用いることができる。例えば、グラファイト、カーボンブラック、活性炭等の導電性炭素質からなるものや、金、チタン等の金属からなるものを用いることができる。
【００２６】
本発明においては、有機高分子材料の高分子鎖に予め電子メディエータを結合させた高分子−メディエータ複合体を用いる。そして、電極である導電性基材表面で、高分子−メディエータ複合体の有機高分子材料の高分子鎖に、酸化還元酵素も結合させることにより、電子メディエータと共に酸化還元酵素を電極表面に固定化する。
【００２７】
電子メディエータとしては、特に限定されず、有機高分子鎖に結合することができるものであればよく、用いる酸化還元酵素に応じて一般的に用いられている物質の中から適宜選択すればよい。例えば、Ｏｓ、Ｆｅ、Ｒｕ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｖ、Ｍｏ、Ｃｒ、Ｍｎ、Ｐｔ、Ｗ等の金属元素を中心金属とする金属錯体；ビオローゲン等の複素環式化合物等が挙げられる。中でも、配位子を選択することで酸化還元電位を制御可能であり、用いる酸化還元酵素に最適な酸化還元電位にすることが可能であることから、オスミウムを中心金属とするオスミウム錯体が好ましい。好ましいＯｓ錯体の具体例としては、以下の式（１）、（２）で表される二座配位子がオスミウムに配位したものが挙げられる。
【００２８】
【化１】
2008096352.tif 000002
【００２９】
（上記式（１）及び（２）において、Ｒ1〜Ｒ8は、それぞれ独立してＨ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＮＯ2、ＣＮ、ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＮＨＮＨ2、ＳＨ、ＯＨ、ＮＨ2、或いは、置換若しくは未置換のアルコキシカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルカノイルアミノ、アリールカルボキシアミド、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ヒドロキシルアミノ、アルコキシルアミノ、アルキルチオ、アルケニル、アリール又はアルキルのいずれかである。）
【００３０】
オスミウム錯体において、中心金属に配位する配位子は、上記式の二座配位子に限定されず、その他の２座配位子や、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、Ｆ等の１座配位子等が挙げられる。
【００３１】
電子メディエータがその有機高分子鎖に結合する有機高分子材料としては、特に限定されず、例えば、スチレン／無水マレイン酸コポリマー、メチルビニルエーテル／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（４−ビニルベンジルクロライド）コポリマー、ポリ（アリルアミン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）コポリマー、ポリ（４−ビニルピリジン）、ポリビニルイミダゾール及びポリ（４−スチレンスルホネート）等が挙げられ、中でも、電子メディエータとして金属錯体を用いる場合、金属錯体の中心金属に直接配位できるという観点から、ポリビニルイミダゾール、ポリ（４−ビニルピリジン）が好ましい。
【００３２】
ポリビニルイミダゾールやポリ（４−ビニルピリジン）は、それぞれイミダゾール基やピリジン基が一座配位子として機能可能であり、金属錯体の中心金属に配位し得る。ここで、イミダゾール基やピリジン基のような配位性部位は、有機高分子材料の主鎖骨格の一部を形成するものでもよいし、或いは、主鎖骨格から連結基となる化学構造を介して又は主鎖骨格に直接ペンダント状に結合した構造でもよい。
【００３３】
高分子−メディエータ複合体において、電子メディエータは有機高分子材料の高分子鎖にペンダント状に結合している。ここで、高分子鎖にペンダント状に結合しているとは、有機高分子材料の主鎖又は側鎖に、電子メディエータが結合している状態である。電子メディエータの有機高分子鎖への結合は、直接でもよいし、或いは、スペーサー等を介した間接的なものでもよい。また、電子メディエータと高分子鎖との結合の種類に特に限定はなく、配位結合、共有結合等が挙げられる。
電子メディエータ及び有機高分子材料は、１種類のみを用いてもよいし、或いは、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
本発明の製造方法は、上記のような電子メディエータが有機高分子鎖に結合した高分子−メディエータ複合体を分散させる溶媒として、誘電率が２４以下のものを用いる点に大きな特徴を有する。このような誘電率を有する溶媒は、有機高分子材料の分散能が高いため、高分子−メディエータ複合体が高分散した高分子−メディエータ溶液を得ることが可能である。分散させる高分子−メディエータ複合体、特に高分子−メディエータ複合体の有機高分子材料によって、溶媒の最適な誘電率は異なるため、用いる高分子−メディエータ複合体に合わせて、適宜溶媒を選択すればよい。
【００３５】
誘電率が２４以下の溶媒としては、例えば、ヘキサン、エタノール、プロパノール、テトラヒドロフラン等が挙げられる。例えば、高分子有機材料としてポリビニルイミダゾールを用いる場合、特に、高分子材料としてポリビニルイミダゾールを用い、且つ、電子メディエータとしてＯｓ錯体を用いる場合には、エタノールが好適である。
【００３６】
酸化還元酵素としては、特に限定されず、基質に応じて適宜選択すればよい。例えば、基質酸化型酵素としては、デヒドロゲナーゼや、オキシダーゼ等を用いることができる。具体的には、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＤ）、アルデヒドオキシダーゼ等が挙げられる。管理の容易さや安全性の観点からＧＤＨ、ＡＤＨ、ＧＯＤ、ＡＯＤが好ましく用いられる。
また、ＧＤＨ、ＡＤＨ、ＧＯＤ、ＡＯＤ等は、本発明にかかる酵素電極を生物燃料電池に用いる場合、燃料である基質が入手しやすいという利点もある。また、基質還元型酵素としては、例えば、ラッカーゼ、ビリルビンオキシターゼ等が挙げられる。
酸化還元酵素は、１種のみを単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３７】
高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に酸化還元酵素を結合させる場合、通常、該酸化還元酵素は、溶媒に分散させた酸化還元酵素溶液として導電性基材表面に塗布する。酸化還元酵素溶液において、酸化還元酵素を分散させる溶媒は特に限定されないが、通常は、酸化還元酵素の活性の維持や、酸化還元酵素の凝集を防止する観点から、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の緩衝液が用いられ、酸化還元酵素溶液のｐＨが最適値、例えば、ｐＨ７程度に維持される。
【００３８】
酸化還元酵素を有機高分子材料の高分子鎖に結合させる架橋試薬としては、特に限定されず、用いる有機高分子材料や酸化還元酵素に合わせて適宜選択することができる。例えば、酸化還元酵素と有機高分子材料とを共有結合させうる反応性基を有するポリエチレングリコールジグリシジル（ＰＥＧＤＥ）、グルタルアルデヒド等が挙げられる。
【００３９】
例えば、高分子−メディエータ複合体として、ポリビニルイミダゾール（ＰＶＩ）のイミダゾール基がＯｓ錯体に配位したもの（以下、ＰＶＩ−Ｏｓということがある。下記式（３）参照）、酸化還元酵素としてＧＤＨ、架橋試薬としてＰＥＧＤＥを用いた場合、電極表面上で、ＰＶＩ−ＯｓのＰＶＩにＧＤＨをＰＥＧＤＥを介して結合することができる。
【００４０】
架橋試薬もまた、通常、溶媒に分散させた状態で電極表面に塗布する。架橋試薬を分散させる溶媒は特に限定されず、例えば、エタノール等の有機溶媒、水系溶媒などが挙げられる。
【００４１】
尚、架橋試薬は、高分子−メディエータ溶液内に、高分子−メディエータ複合体と共に分散させてもよいし、或いは、酸化還元酵素溶液内に、酸化還元酵素と共に分散させてもよい。
尚、酸化還元酵素は、上記のような高分子−メディエータ複合体の高分子鎖に結合させる方法以外の方法で電極表面に固定してもよいし、或いは、電極表面に固定せず、電解液内に分散させてもよい。
【００４２】
本発明において、高分子−メディエータ溶液、酸化還元酵素溶液、架橋試薬溶液の導電性基材表面への塗布方法、塗布の順序に特に限定はない。これら溶液の塗布方法としては、例えば、滴下法等を利用することができる。導電性基材表面への塗布順序としては、電極−電子メディエータ−酸化還元酵素間の電子伝達性の観点から、酸化還元酵素−電子メディエータ−電極間の電子伝達順序に沿って、高分子−メディエータ溶液をまず塗布することが好ましく、さらに高分子−メディエータ溶液の塗布に続いて酸化還元酵素溶液を塗布し、その後、架橋試薬を塗布することが好ましい。
【００４３】
本発明により得られる酵素電極は、生物燃料電池の他、バイオセンサー等に用いることができる。例えば、本発明により得られる酵素電極を基質酸化型酵素電極として生物燃料電池に組み込む場合、燃料（基質）としては、一般的なものを広く利用することができ、例えば、アルコール類、アルデヒド類、糖類、ケトン類よりなる炭化水素系化合物の他、水素等が挙げられる。中でも、取り扱いの容易さ等の観点から、アルコール類、アルデヒド類、糖類及びケトン類よりなる炭化水素系化合物から選ばれる少なくとも１種が好適である。具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、グリセリン等のアルコール類；ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド等のアルデヒド類；グルコース、フルクトース、ソルボース等の糖類；ケトン類等が挙げられる。その他にも、脂肪類、タンパク質、糖等の代謝中間生成物、これら混合物などを用いることができる。
【００４４】
基質である燃料や酸化剤が分散又は溶解される電解液は、電極反応である酸化反応又は還元反応が効率よく定常的に進行するように、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の緩衝液によって、最適なｐＨ、例えば、ｐＨ７付近に維持されることが好ましい。また、電極反応が効率よく定常的に進行するようにするためには、例えば、２０〜３０℃程度に維持されていることが好ましい。
【００４５】
上記のようなアノード（基質酸化型酵素電極）と対をなすカソードとしては、例えば、酸化剤の還元反応に有効な触媒である白金や白金合金等、燃料電池において一般的に用いられている電極触媒を、グラファイト、カーボンブラック、活性炭のような炭素質材料、又は金、チタン等からなる導電体に担持させたものや、白金や白金合金等の電極触媒そのものからなる導電体をカソード電極として用い、酸化剤を電極触媒に供給するような形態とすることができる。
【００４６】
或いは、上記のような基質酸化型酵素電極からなるアノードと対をなすカソードを、基質還元型酵素電極としてもよい。酸化剤を還元する酸化還元酵素としては、ラッカーゼやビリルビンオキシターゼ等の公知のものが挙げられる。酸化剤を還元する触媒として酸化還元酵素を用いる場合には、必要に応じて、公知の電子メディエータを用いてもよい。
酸化剤としては、酸素、過酸化水素等が挙げられる。カソードにおける電極反応を妨害する不純物による影響を回避するために、ジメチルポリシロキサン等の酸素選択性の膜をカソード電極の周囲に配置してもよい。
【実施例】
【００４７】
［基質酸化型酵素電極の作製］
（実施例１）
カーボンペーパー（１０ｍｍΦ）の表面に、マイクロピペットを用いて、まず、ポリ（１−ビニルイミダゾール）とＯｓ（２，２’−ビピリジルアミン）２Ｃｌとの複合体（以下、ＰＶＩ−Ｏｓとする。下記式（３））をエタノール（誘電率２４）に分散させた、ＰＶＩ−Ｏｓ１５ｍｇ／ｍｌエタノール溶液を８μｌ滴下した。続いて、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）の５ｍｇ／ｍＬリン酸緩衝溶液を８μｌ滴下した。次に、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧＤＥ）の３ｍｇ／ｍｌ水溶液を８μｌ滴下した。
【００４８】
これを常温で一晩放置して乾燥させ、ＰＶＩ−Ｏｓのポリビニルイミダゾール鎖にＰＥＧＤＥを介してＧＤＨを結合させることにより、カーボンシート表面に酵素であるＧＤＨとメディエータであるＰＶＩ−Ｏｓとを固定した。
図３に示すようにして、上記にて酸化還元酵素と電子メディエータとを固定したカーボンペーパーを、外部回路と接続されたカーボン芯を有する部材の先端に、ナイロン製ネット及びＯリングで固定し、基質酸化型酵素電極（試料極）とした。
【００４９】
【化２】
2008096352.tif 000003
【００５０】
（比較例１）
実施例１において、ＰＶＩ‐Ｏｓを水（誘電率８０）に分散させたＰＶＩ−Ｏｓ１５ｍｇ／ｍｌ水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして基質酸化型酵素電極を作製した。
【００５１】
［酵素電極の評価］
上記基質酸化型酵素電極を試料極として、下記条件下、発電試験（３電極式電気化学評価。図４参照）を行った。尚、参照極としてＡｇ／ＡｇＣｌ２、対極としてＰｔワイヤーを用いた。また、サイクリックボルタンメトリー法により得られた酸化還元ピークにより、各酵素電極の電気化学的表面積を求めた。結果を合わせて図２に示す。
【００５２】
＜試験条件＞
・温度：室温（約２７℃）
・電解液：ＭＯＰＳ  ３０ｍＭ、ＣａＣｌ２  ３ｍＭ、ＫＣｌ  １００ｍＭ、及びグルコース８０ｍＭを含む水溶液（ｐＨ７．０）
【００５３】
＜結果＞
図２に示すように、電子メディエータが結合した有機高分子材料（ＰＶＩ−Ｏｓ）を誘電率が２４以下の溶媒に分散させた実施例１の酵素電極は、ＰＶＩ−Ｏｓを誘電率が２４より大きい溶媒に分散させた比較例１の酵素電極と比較して、電流値及び電気化学表面積共に大きく、電極特性に優れたものだった。これは、電子メディエータ及び酸化還元酵素を結合し、電極表面に固定化する担体として機能するＰＶＩを、誘電率が２４以下の溶媒を用いて分散させることによって、分散溶液中におけるＰＶＩの分散性が向上し、その結果、電極表面にＰＶＩが高分散状態で付着され、これに伴いＰＶＩに結合するＯｓ錯体及びＧＤＨの電極表面における分散性も向上したためである。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の酵素電極を備えた生物燃料電池の一形態例を示す概念図である。
【図２】実施例における評価結果を示すグラフである。
【図３】実施例における酵素電極の作製方法を示す図である。
【図４】実施例における発電試験（三電極式電気化学評価）の評価系を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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