(57)【要約】【課題】核酸をハイブリダイゼーションさせる際に、ハイブリダイゼーション配列依存性を低下させ、かつ、反応速度を向上する反応溶液を提供すること。また、これを応用し一塩基多型の高精度の判別法を提供すること。【解決手段】核酸の融解温度調整剤とカチオン性高分子との共存下にて試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせることで、ハイブリダイゼーションを促進し、かつ、ハイブリダイゼーションの配列依存性を低下させる。また核酸プローブとして部分二重鎖核酸分子を用いて、より迅速・高精度の一塩基多型の判別法を実現させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をハイブリダイゼーションする際に使用する溶液であって、溶液中に核酸の融解温度調整剤とカチオン性高分子とを含む核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項２】
融解温度調整剤がＤＭＳＯ、プロリン、ベタイン、グリセロール、ホルムアミド、トリメチルアミンＮ−オキシド、テトラアルキルアンモニウム塩の少なくとも１つを含む請求項１記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項３】
カチオン性高分子が、カチオン性基を有する高分子鎖と、親水性高分子鎖から構成される共重合体であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項４】
カチオン性基を有する高分子鎖が、ポリリジン又はポリアリルアミンであることを特徴とする請求項３に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項５】
親水性高分子鎖が、デキストラン又はポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３または４に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項６】
カチオン性高分子が、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘの少なくとも１つを含む請求項１から５のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中において試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせることを含む、ハイブリダイゼーション方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中にて試料核酸のミスマッチを検出する方法であって、（ａ）試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｂ）基準核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてフルマッチのハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｃ）（ａ）の速度または率と（ｂ）の速度または率とを比較し、（ｄ）（ａ）の速度又は率が低いときに試料の単鎖核酸分子の配列にミスマッチがあると判定する工程を含む、試料核酸の配列を検出する方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中にて試料核酸のフルマッチを検出する方法であって、（ａ）試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｂ）基準核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてミスマッチのハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｃ）（ａ）の速度または率と（ｂ）の速度または率とを比較し、（ｄ）（ａ）の速度又は率が高いときに試料の核酸分子の配列がフルマッチであると判定する工程を含む、試料核酸の配列を検出する方法。
【請求項１０】
核酸プローブが部分二重鎖核酸分子であることを特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸をハイブリダイゼーションする際に用いるハイブリダイゼーション用溶液に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、一塩基多型（ＳＮＰｓ）のハイスループット（ＨＴ）解析が活発に開発されている。ＳＮＰｓが病気の遺伝的要因、薬効、副作用などの個体間の違いを知る手掛りとして期待されるためである。ＳＮＰｓを迅速、簡便、安価で検出する技術の発展が今後のテーラーメイド医療やゲノム創薬の飛躍的な進歩の鍵となる。また、感染症の治療に際しても、ウィルスや感染起炎菌のゲノタイプの判定を迅速かつ正確に行ない、その結果をもとに、治療法や薬剤を選択することが既に実践されている。いずれもゲノム核酸上の一塩基多型や変異配列を、正確・迅速・低コストにて検出する事が要求されており、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法などの核酸増幅に基づく検出方法、マイクロアレイやＤＮＡチップと呼ばれる方法、または、これらを組み合わせた方法が鋭意開発され盛んに報告されている。
【０００３】
核酸分子の大きな性質のひとつは、例えば二重鎖核酸分子の場合、７０〜１００℃程度の加熱操作により一度単鎖核酸分子に解離しても、反応液の温度を下げると相同性配列の核酸分子同士がアニーリングにて再度二重鎖核酸分子を形成する。この二重鎖核酸は、相補核酸分子間のＧ塩基とＣ塩基、Ａ塩基とＴ塩基間で形成される水素結合によって螺旋型をした安定な構造が形成される。
【０００４】
単鎖核酸プローブによる核酸の検出反応は、この性質を利用したものである。例えば１５〜５０残基の合成オリゴヌクレオチドをＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素、32Ｐ等の放射性同位元素（ラジオアイソトープ）、ビオチン−ＨＲＰ等の酵素にて標識したものをプローブとして、溶液中、または、固相上の目的核酸とハイブリダイゼーションさせて二重鎖核酸を形成させ、余分なプローブを除いた後、蛍光スキャナー、蛍光プレートリーダー、吸光度計、オートラジオグラフィー等にて残存プローブ検出する方法である。この際に目的とする核酸配列と相補的な１５〜５０残基程度の核酸をプローブ核酸として用いるが、一塩基多型を判別したり特異的な配列だけを検出・判別したりするには、核酸プローブの長さ、ＧＣの含有率、塩濃度、ｐＨ等の条件設定を厳密に行なわなければならない。特に複数の核酸の配列を判別するには、全てのプローブ核酸の融解温度（Ｔｍ値）がほぼ同一になるよう核酸プローブを設計し、かつ、反応条件の設定を厳密に行なわなければならない。
【０００５】
ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等の核酸増幅法にて核酸を増幅させ、その増幅産物の有無にて一塩基多型を判別する方法においても、プライマーと呼ばれる１０残基〜３０残基程度の合成オリゴヌクレオチドと目的とする核酸とをハイブイリダイゼーションさせ、ハイブリダイゼーションしたプライマーの３’端からポリメラーゼにて伸長反応を行ない核酸の増幅を行なう。通常のＰＣＲ法の場合、一対プラマーセットが用いられ、ＬＡＭＰ法の場合目的とする核酸の４ないし６領域の配列またはその相補配列とから構成されるプライマーが用いられる。この場合においても、使用するプラマーの融解温度を検定し、各種反応条件を厳密に設定する必要がある。また、目的とする核酸に類似配列が存在する場合や、一塩基多型を判別する場合には、プライマーの融解温度を踏まえて適切なプライマー配列を設計し、かつ、反応条件の設定を厳密に行なわなければならない。
【０００６】
ワレースらによって、ストリンジェンシーを正確にコントロールすることによって１個のヌクレオチドの相違を検出する方法が報告されている（非特許文献１）。これはプローブが標的配列と異なる配列とハイブリダイゼーションし二重鎖核酸を形成（ミスマッチ）した場合、プローブと目的配列との二重鎖核酸（フルマッチ）よりもその融解温度が低下することから、これを厳密な温度コンロトールのもとで判別している。多くの場合、これら一塩基のミスマッチ二重鎖核酸とフルマッチ二重鎖核酸との融解温度の違いは１〜３℃程度であるとされている。
【０００７】
日本特許第２７８３５６８号（国際特許公開番号ＷＯ８９／０１０４９）（特許文献１）では、このストリンジェンシーの制御をより簡便に行なう方法が開示されているが、それでもなお厳密な温度コントロールが必要とされている。
【０００８】
日本公開特許２００５−５８１０７号（特許文献２）には、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリッドの融解曲線を解析する方法が開示されており、核酸プローブを一塩基多型の部分に設定した場合、融解温度の決定により多型の型を判別できるとしている。しかしこれも厳密な温度の制御を必要とするため温度制御可能な高精度の恒温装置が必要とされる。
【０００９】
日本公表特許２００３−５２８６２６号（国際特許公開番号ＷＯ０１／０７３１１８号）（特許文献３）では、ビーコンと呼ばれる特殊な核酸プローブを用いてＳＮＰｓを検出・判別する方法が開示されている。この方法では形成されたミスマッチ核酸分子とフルマッチ核酸分子の反応温度を変えて蛍光強度を記録して融解温度曲線を描画し、その融解温度の違いからＳＮＰｓの判別を行っているが、融解温度曲線を得るには高精度の温度コントロールと蛍光検出を行なえる高精度の装置を必要としている。
【００１０】
国際公開特許ＷＯ２００４／０２５２５７（特許文献４）には、特定の塩濃度下において核酸プローブの融解温度を推定する方法が報告されている。
【００１１】
融解温度（Ｔｍ）とは、ハイブリダイゼーションした二重鎖核酸の50％が単鎖核酸に解離する温度であり、溶液の塩条件、核酸の長さ、ＧＣ配列の含有量、組成、および配列に依存する。核酸の配列においては、ＧＣ含有量（率）が高いと融解温度が高くなる傾向にある。複数のハイブリダイゼーションを同一条件下で行う場合には、核酸プローブの融解温度を一定にした方がよいが、各核酸プローブの特異性を失わずにプローブの設計を行うことが困難な場合が生じる。このような時に核酸の二重鎖を不安定化し、融解温度を調節する役割を果たす融解温度調整剤がしばしば用いられる。その代表的なものとしてベタイン（トリメチルグリシン）が挙げられる。日本国公開特許２００２−３４５４９９号（特許文献５）においては、ベタインのほかにプロリン、ジメチルスルホキシド、およびトリメチルアミンＮ−オキシドが融解温度調整剤として使用されている。日本国公開特許２００５−１６０３８７号（特許文献６）には、ベタインの他にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミドもしくはグリセロールが融解温度調整剤として開示されている。融解温度調整剤の至適濃度は、反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を設定する。一般的には０．５〜５Ｍ程度の濃度のベタインが用いられる。
【００１２】
日本公開特許２００５−８７１０９号（特許文献７）には、核酸のハイブリダイゼーション反応の反応時間を短縮し効率的に行なえる核酸用緩衝液が開示されている。この緩衝液中にはリン脂質が含まれ、さらに好ましくは界面活性剤、核酸成分、ベタイン、ホルムアミド、及びデンハルト溶液のいずれかを添加した緩衝液が開示されている。しかし核酸のハイブリダイゼーションに反応温度６５℃にて３時間を要しており、また、一塩基多型等の判別については記載されていない。また、ハイブリダイゼーションの至適温度が３７〜７２℃と開示されている。
【００１３】
日本公開特許２００１−７８７６９号（特許文献８）やＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.，８，３−６（１９９７）（非特許文献２）にはヌクレオチド配列の間の交換を促進するためのカチオン性高分子ポリマーが開示されている。これはポリリジンやポリアルギニンンなどのカチオン性高分子を主鎖として、デキストランやポリエチレングリコール等を側鎖としてグラフト重合したポリマーである。その例として、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘが開示されている。本ポリマーの存在下では核酸の鎖交換反応やハイブリダイゼーション反応が促進することが報告されている。
【００１４】
【化１】
2008278779.tif 000002
【００１５】
デキストラン側鎖修飾α−ポリ（Ｌ−リジン）（以下、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘと略記する。）
【００１６】
【化２】
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【００１７】
デキストラン側鎖修飾ε−ポリ（Ｌ−リジン）（以下、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘと略記する）
【００１８】
【化３】
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【００１９】
デキストラン側鎖修飾型ポリアリルアミン（以下、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘと略記する）
【００２０】
さらには、国際公開特許ＷＯ２００３／０１８８４１号（特許文献９）では本ポリマー存在下で二重鎖核酸と単鎖核酸との間でハイブリダイゼーションを行なう際に、ミスマッチを含む二重鎖核酸を形成する反応速度とミスマッチを含まないフルマッチ二重鎖核酸を形成する反応速度との差から、迅速かつ容易に一塩基多型を判別する方法が開示されている。
【００２１】
【非特許文献１】Ａ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０，２７８−２８２（１９８３）
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.，８，３−６（１９９７）
【特許文献１】日本特許第２７８３５６８号（国際特許公開番号ＷＯ８９／０１０４９）
【特許文献２】日本公開特許２００５−５８１０７号
【特許文献３】日本公表特許２００３−５２８６２６号（国際特許公開番号ＷＯ０１／０７３１１８号）
【特許文献４】国際公開特許ＷＯ２００４／０２５２５７号
【特許文献５】日本国公開特許２００２−３４５４９９号
【特許文献６】日本国公開特許２００５−１６０３８７号
【特許文献７】日本公開特許２００５−８７１０９号
【特許文献８】日本公開特許２００１−７８７６９号
【特許文献９】国際公開特許ＷＯ２００３／０１８８４１号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、核酸をハイブリダイゼーションさせる際に、ハイブリダイゼーションする核酸の配列依存性を低下させ、かつ、反応速度を向上する反応溶液を提供することを解決すべき課題とした。また、本発明は、これを応用し一塩基多型の高精度の判別法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明者らはこれらの課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸の融解温度調整剤およびカチオン性高分子共存化にて、核酸プローブの配列依存性を低減させ、かつ、ハイブリダイゼーションの反応速度を向上する溶液を見出すに至った。さらに本発明者らは、本溶液を使用した緩衝液中にて、一塩基置換（ミスマッチ）を精度良く判別する方法を開発するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
【００２４】
（１）  核酸をハイブリダイゼーションする際に使用する溶液であって、溶液中に核酸の融解温度調整剤とカチオン性高分子とを含む核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００２５】
（２）  融解温度調整剤がＤＭＳＯ、プロリン、ベタイン、グリセロール、ホルムアミド、トリメチルアミンＮ−オキシド、テトラアルキルアンモニウム塩の少なくとも１つを含む（１）記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００２６】
（３）  カチオン性高分子が、カチオン性基を有する高分子鎖と、親水性高分子鎖から構成される共重合体であることを特徴とする（１）または（２）に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００２７】
（４）  カチオン性基を有する高分子鎖が、ポリリジン又はポリアリルアミンであることを特徴とする（３）に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００２８】
（５）  親水性高分子鎖が、デキストラン又はポリエチレングリコールであることを特徴とする（３）または（４）に記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００２９】
（６）  カチオン性高分子が、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ε−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ、ＰＡＡ−ｇ−Ｄｅｘの少なくとも１つを含む（１）から（５）のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液。
【００３０】
（７）  （１）〜（６）のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中において試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせることを含む、ハイブリダイゼーション方法。
【００３１】
（８）  （１）〜（６）のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中にて試料核酸のミスマッチを検出する方法であって、（ａ）試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｂ）基準核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてフルマッチのハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｃ）（ａ）の速度または率と（ｂ）の速度または率とを比較し、（ｄ）（ａ）の速度又は率が低いときに試料の単鎖核酸分子の配列にミスマッチがあると判定する工程を含む、試料核酸の配列を検出する方法。
【００３２】
（９）  （１）〜（６）のいずれかに記載の核酸ハイブリダイゼーション用溶液中にて試料核酸のフルマッチを検出する方法であって、（ａ）試料核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｂ）基準核酸と核酸プローブとをハイブリダイゼーションさせてミスマッチのハイブリッドが形成される速度または率を測定し、（ｃ）（ａ）の速度または率と（ｂ）の速度または率とを比較し、（ｄ）（ａ）の速度又は率が高いときに試料の核酸分子の配列がフルマッチであると判定する工程を含む、試料核酸の配列を検出する方法。
【００３３】
（１０）  核酸プローブが部分二重鎖核酸分子である事を特徴とする（７）〜（９）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明の核酸用溶液は、溶液中に核酸の融解温度調整剤とカチオン性高分子とを含む核酸用溶液であって、試料核酸と核酸プローブとのハイブリダイゼーション時に配列依存性を低下しつつ、反応速度を促進することが可能であり、核酸プローブ法を用いた試料核酸の配列検出や一塩基多型を精度よく判別するのに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下、本発明について詳細に説明するが、これらに限定されない。
本発明において核酸とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸誘導体や修飾塩基の非天然型ヌクレオチドやＰＮＡ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４．１７００−１７０４（１９９６））と呼ばれる非天然型ヌクレオチド結合を含むものでもよい。また核酸は、限定しないかぎり単鎖核酸でも、二重鎖核酸、三重鎖核酸でもよい。二重鎖核酸とは、相補的な塩基対、例えば、ＤＮＡでは、アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）、ＲＮＡでは、Ａとウラシル（Ｕ）およびＧとＣとの対合により形成される高次構造体を意味する。ＤＮＡ単鎖／ＤＮＡ単鎖の二重鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ単鎖／ＲＮＡ単鎖の二重鎖ＲＮＡのほか、ＤＮＡ単鎖／ＲＮＡ単鎖のハイブリッド二重鎖核酸も挙げられる。また二重鎖部分を有する核酸として、単鎖核酸の自己分子内にて相補的な配列同士がアニーリングを起こして形成される二重鎖構造であってもよい。
【００３６】
核酸の一塩基多型には、核酸塩基の置換、欠失等が挙げられる。二重鎖核酸がフルマッチであるとは対象領域の互いの配列が相補的であることを意味し、ミスマッチがあるとは二重鎖を構成するどちらかの単鎖核酸に塩基の置換や欠失や追加が生じフルマッチではない状態を意味する。
【００３７】
核酸は、溶液の状態でもよく、ＥＬＩＳＡプレートや磁気ビーズのような固相表面上に固定化された状態でもよく、例えば、部分二重鎖プローブを９６穴や３８４穴プレート上に固定化し、ターゲット核酸を添加してハイブリダイゼーションを行なうことで、部分二重鎖プローブの蛍光強度の変化を測定するハイスループット評価系を構築することも出来る。
【００３８】
ハイブリダイゼーション過程を測定する方法として、核酸をＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素にて標識する方法がよく用いられる。複数の蛍光物質を組み合わせて、ＦＲＥＴ法にて蛍光強度の変化を計測する方法も可能である。ＳＰＲ法にて分子量の変化を測定する方法も挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の溶液には、０．０１〜１０×ＳＳＣ緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝液；１×ＳＳＣ組成：０．１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、２〜１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（デンハルト溶液；５０×デンハルト溶液組成：１％Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、１％Ｆｉｃｏｌ、１％ｐｏｌｙｖｉｎｉｌ    ｐｉｒｏｒｉｄｏｎｅ）、ＰＢＳ緩衝液（１０  ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５  ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ，  ｐＨ  ７．２）、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  トリス塩酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８））などの一般的に用いられる核酸緩衝液を含むほうが好ましい。また、必要に応じて０．１〜３００ｍＭ程度の塩、例えばＮａＣｌを添加してもよい。また、マグネシウムイオンなどの２価カチオンには核酸の二重鎖を安定化させる働きを有するものもあり、例えば、１〜５ｍＭ程度のＭｇＣｌ2を添加してもよい。
【００４０】
また本溶液中には、界面活性剤を添加してもよい。とくに蛍光標識やラジオアイソトープ標識した核酸プローブの反応容器、メンブレン、磁気ビーズ等の固相への非特異吸着を低減する際に有効である。界面活性剤には主に、アニオン性、カチオン性、ノニオン性に分けられるが、ノニオン性、アニオン性がより好ましく、アニオン性がさらに好ましい。
ノニオン性界面活性剤として、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ポリエチレングリコールなどが良く用いられる。陰イオン性界面活性剤として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、Ｎ−ドデシルサルコシン酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩などが好適に用いられる。界面活性剤の最適な濃度は、概ね０．００１〜１０重量％程度であるが、緩衝液やハイブリダイゼーションの反応条件によって最適化される。
【００４１】
通常のハイブリダイゼーションの条件は、核酸プローブの融解温度付近の５０〜７０℃程度にて行われる。ホルムアミドの存在下では、１％のホルムアミド濃度あたり０．５〜０．６℃程度反応温度を低下させてハイブリダイゼーションを行なう。しかし、本発明の溶液にはα−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘなどハイブリダイゼーションを促進するカチオン性高分子を含むためより低温度でのハイブリダイゼーションが可能である。また、核酸プローブの融解温度付近にてハイブリダーゼーション反応を行なうと、二重鎖核酸の安定性が低いために、ハイブリダイゼーション効率やミスマッチ等の識別能が低下する恐れがある。逆に低温度では反応速度が低下する傾向がある。すなわち、本発明の溶液を用いたハイブリダイゼーションの反応温度は５〜５０℃が好ましく、１０〜３６℃がより好ましく、１５〜２５℃が最も好ましい。
【００４２】
本発明の溶液中のベタインの濃度は、０．１〜１０Ｍが好ましく、３〜７Ｍがより好ましく、４．１〜６Ｍが最も好ましい。
【００４３】
本発明の溶液中のカチオン性高分子の濃度は、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘの場合、以下で示される荷電比が0.01〜10000が好ましく、0.01〜1000がより好ましく、0.1〜1000  が最も好ましい。
【００４４】
【数１】
2008278779.tif 000005
【実施例】
【００４５】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
［実施例１］部分二重鎖核酸プローブの二重鎖部位のＧＣ含有量とハイブリダイゼーション速度
ターゲット核酸、および、核酸プローブ用のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は化学的に合成し、ＨＰＬＣ精製後使用した。オリゴデオキシヌクレオチドはＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．２）に溶解させた。また、ターゲット核酸、部分二重鎖核酸プローブ共に、＋鎖および−鎖のオリゴヌクレオチドを等量混合し、９０℃で１分間加熱後徐冷してアニーリングさせて作製した（図１）。部分二重鎖核酸プローブＰ−ｄ１５、Ｐ−ｄ５０、Ｐ−ｄ８５はそれぞれ二重鎖部位のＧＣ含有量が１５％、５０％、８５％である。ハイブリダイゼーションは、部分二重鎖核酸プローブ（終濃度：１２ｎＭ）にターゲット核酸（終濃度：６０ｎＭ）を添加して行った。さらに、カチオン性高分子（α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）は、日本公開特許２００１−７８７６９やＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ.，８，３−６（１９９７）に従い合成し、合成したカチオン性高分子（α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）や、ベタイン（トリメチルグリシン）を添加した条件下でハイブリダイゼーションを行った。核酸プローブ用のオリゴデオキシヌクレオチドの５’端や３’端はＴＡＭＲＡやＤＡＢＣＹＬ等の蛍光色素にて標識しており、ハイブリダイゼーションの進行は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し経時的に追跡した。その結果を図２に示す。
【００４６】
ターゲット核酸と部分二重鎖核酸プローブのみでのハイブリダイゼーションでは、二重鎖部位のＧＣ含有率が増加するに従いハイブリダイゼーション速度が低下した。これはＧ−Ｃ塩基対と  Ａ−Ｔ塩基対の安定性の違いによるものと考えられた。次にＧ−Ｃ塩基対の安定性を下げる効果を持つベタイン（トリメチルグリシン）を最終濃度が５Ｍになるよう添加すると、ＧＣ含有率への依存性は抑えられたが反応速度が著しく低下した。α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘをベタインと共存させてハイブリダイゼーションを行うことで、ＧＣ含有率への依存性は抑えつつも、反応を速め、かつミスマッチとフルマッチの識別能も改善することを示す。
【００４７】
［実施例２］部分二重鎖核酸プローブの単鎖部位のＧＣ含有量とハイブリダイゼーション速度
ターゲット核酸、および、核酸プローブ用のオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は化学的に合成し、ＨＰＬＣ精製後使用した。オリゴデオキシヌクレオチドはＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，  ０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  ｐＨ７．２）に溶解させた。また、ターゲット核酸、部分二重鎖核酸プローブ共に、＋鎖および−鎖のオリゴヌクレオチドを等量混合し、９０℃で１分間加熱後徐冷してアニーリングさせて作製した（図３）。部分二重鎖核酸プローブＰ−ｓ０、Ｐ−ｓ４０、Ｐ−ｓ８０はそれぞれ単鎖部位のＧＣ含有量が０％、４０％、８０％である。ハイブリダイゼーションは、部分二重鎖核酸プローブ（終濃度：  １２ｎＭ）にターゲット核酸（終濃度：  ６０ｎＭ）を添加して行った。さらに、日本公開特許２００１−７８７６９に開示されているカチオン性グラフト共重合体（α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ）や、ベタイン（トリメチルグリシン）を添加した条件下でハイブリダイゼーションを行った。核酸プローブ用のオリゴデオキシヌクレオチドの５’端や３’端はＴＡＭＲＡやＤＡＢＣＹＬ等の蛍光色素にて標識しており、ハイブリダイゼーションの進行は蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用し経時的に追跡した。その結果を図４に示す。
【００４８】
部分二重鎖核酸プローブの単鎖部位のＧＣ含有率が増加するに伴い、ターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの安定性が増してハイブリダイゼーション速度が増加するが、ミスマッチとフルマッチの識別能が低下した。次にＧ−Ｃ  塩基対の安定性を下げる効果を持つベタイン（ベタイン）を最終濃度が５Ｍになるよう添加する、ＧＣ含有率が高い場合のミスマッチとフルマッチの識別能が向上したが、反応速度が著しく低下した。一方、α−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘをベタインと共存させてハイブリダイゼーションを行うことで、ＧＣ含有率への依存性は抑えつつミスマッチとフルマッチの識別能も改善し、かつ、ハイブリダイゼーション速度を増加させられることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本ハイブリダイゼーション用の溶液にて、核酸のハイブリダイゼーションの速度と精度を向上させることが可能となり、一塩基多型やゲノムタイピング等の診断に適用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、ターゲット核酸、および、部分二重鎖核酸プローブの配列を示す。
【図２】図２は、二重鎖部位のＧＣ含有量の異なる部分二重鎖核酸プローブによるハイブリダイゼーションを、ベタインやα−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で行った結果である。ハイブリダイゼーションをＦＲＥＴによる蛍光の増加にて検出。ターゲット核酸と部分二重鎖核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、■がフルマッチ、▲がミスマッチを示す。
【図３】図３は、ターゲット核酸、および、部分二重鎖核酸プローブの配列を示す。
【図４】図４は、二重鎖部位のＧＣ含有量の異なる部分二重鎖核酸プローブによるハイブリダイゼーションを、ベタインやα−ＰＬＬ−ｇ−Ｄｅｘ共存下で行った結果である。ハイブリダイゼーションをＦＲＥＴによる蛍光の増加にて検出。ターゲット核酸と部分二重鎖核酸プローブとのハイブリダイゼーションにおいて、■がフルマッチ、▲がミスマッチを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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