(57)【要約】【課題】副作用の危険のない抗炎症剤及びその製造方法を提供する。【解決手段】本発明の抗炎症剤は、ホヤ由来脂溶性油を有効成分として含有するので極めて高い抗炎症作用を示し、しかも副作用の危険はない。また、本発明の抗炎症剤における極めて高い抗炎症作用を示す活性本体であるホヤ由来カロテノイドではホヤ特有の香りや風味が低減されるので、これらのホヤの特徴を嫌って、ホヤの摂取を避けてきた人々或いは動物に対して利用する事ができる。逆に、ホヤ由来脂溶性油にはホヤ特有の香りや風味が残っている為、ホヤを珍味として消費してきた人々に対しての利用が有効となる。【選択図】図４
2008179545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホヤ由来脂溶性油を有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。
【請求項２】
ホヤ由来脂溶性油を食品及び飲料及びサプリメント及びペットフード及び化粧品及びサニタリー製品及び薬剤のうちのいずれかに添加してなることを特徴とする抗炎症剤。
【請求項３】
前記ホヤは、海鞘綱（学名：Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、第一目腸性類（学名：Ｅｎｔｅｒｏｇｏｎａ）、第一亜目無官類（学名：Ａｐｌｏｕｓｏｂｒａｎｃｈｉａ）、ポリクリニ科（学名：Ｐｏｌｙｃｌｉｎｉｄａｅ）、亜科Ｐｏｌｙｃｌｉｎｉｎａｅに属するマンジュウボヤ（学名：Ａｐｌｉｄｉｕｍ  ｐｌｉｃｉｆｅｒｕｍ）、コンボウボヤ（学名：Ｓｙｎｏｉｃｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、モヨウボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃｌｉｎｕｍ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、スナモチボヤ（学名：Ｓｉｄｎｅｉｏｉｄｅｓ  ｓｎａｍｏｔｉ）、亜科Ｅｕｈｅｒｄｍａｎｉｉｎａｅに属するイチゴボヤ（学名：Ｐｓｅｕｄｏｄｉｓｔｏｍａ  ｋａｎｏｋｏ）、ジデムニ科（学名：Ｄｉｄｅｍｎｉｄａｅ）に属するミナミウスボヤ（学名：Ｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、チャツボボヤ（学名：Ｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｍｏｌｌｅ）、ミスジジデムニ（学名：Ｔｒｉｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｓａｖｉｇｎｙｉｉ）、マダラボヤ（学名：Ｌｅｐｔｏｃｌｉｎｉｄｅｓ  ｍａｄａｒａ）、ネンエキボヤ（学名：Ｄｉｐｌｏｓｏｍａ  ｍｉｔｓｕｋｕｒｉｉ）、シトネボヤ（学名：Ｌｉｓｓｏｃｌｉｎｕｍ  ｐｕｌｖｉｎｕｍ）、ポリキトリ科（学名：Ｐｏｌｙｃｉｔｏｒｉｄａｅ）に属するコバルトクラベラ（学名：Ｃｌａｖｅｌｉｎａ  ｃｏｅｒｕｌｅａ）、ミドリカイメンボヤ（Ｅｕｄｉｓｔｏｍａ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ヘンゲボヤ（学名：Ｐｌｏｙｃｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｓ）、チラシボヤ（学名：Ｄｉｓｔａｐｌｉａ  ｄｕｂｉａ）、カンザシボヤ（学名：Ｓｙｃｏｚｏａ  ｋａｎｚａｓｉ）、コップボヤ（学名：Ｃｙａｔｈｏｃｏｒｍｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、第二亜目管鰓類（学名：Ｐｈｌｅｂｏｂｒａｎｃｈｉａ）、キオナ科（学名：Ｃｉｏｎｉｄａｅ）、亜科Ｄｉａｚｏｎｉｎａｅに属するボウズボヤ（学名：Ｓｙｎｄｉａｚｏｎａ  ｇｒａｎｄｉｓ）、亜科Ｃｉｏｎｉｎａｅに属するカタユウレイボヤ（学名：Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ユウレイボヤ（学名：Ｃｉｏｎａ  ｓａｖｉｇｎｙｉ）、ペロフォラ科（学名：Ｐｅｒｏｐｈｏｒｉｄａｅ）に属するタイワンマメボヤ（学名：Ｐｅｒｏｐｈｏｒａ  ｍｕｌｔｉｃｌａｔｈｒａｔａ）、アスキジア科（学名：Ａｓｃｉｄｉｉｄａｅ）に属するザラボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ｚａｒａ）、ナツメボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ａｈｏｄｏｒｉ）、バナジウムボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ｇｅｍｍａｔａ）、アグネシア科（学名：Ａｇｎｅｓｉｉｄａｅ）に属するヒメボヤ（学名：Ａｇｎｅｓｉａ  ｈｉｍｅｂｏｊａ）、コレラ科（学名：Ｃｏｒｅｌｌｉｄａｅ）に属するガマグチボヤ（学名：Ｒｈｏｄｏｓｏｍａ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、ドロボヤ（学名：Ｃｏｒｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、スボヤ（学名：Ｃｈｅｌｙｏｓｏｍａ  ｓｉｂｏｊａ）、オクタクネミ科（学名：Ｏｃｔａｃｎｅｍｉｄａｅ）に属するオオグチボヤ（学名：Ｍｅｇａｌｏｄｉｃｏｐｉａ  ｈｉａｎｓ）、第二目壁性類（学名：Ｐｌｅｕｒｏｇｏｎａ）、第一亜目褶鰓類（学名：Ｓｔｏｌｉｄｏｂｒａｎｃｈｉａ）、ボトリルス科（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｉｄａｅ）に属するキクイタボヤ（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｕｓ  ｔｕｂｅｒａｔｕｓ）、イタボヤ（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｏｉｄｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、スチエラ科（学名：Ｓｔｙｅｌｉｄａｅ）、亜科Ｐｏｌｙｚｏｉｎａｅに属するアラレボヤ（学名：Ｐｏｌｙｚｏａ  ｖｅｓｉｃｕｌｉｐｈｏｒａ）、コバンイタボヤ（学名：Ｓｙｍｐｌｅｇｍａ  ｒｅｐｔａｎｓ）、亜科Ｓｔｙｅｌｉｎａｅに属するクロボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃａｒｐａ  ｃｒｙｐｔｏｃａｒｐａ  ｋｒｏｂｏｊａ）、ニシキボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃａｒｐａ  ａｕｒａｔａ）、シロボヤ（学名：Ｓｔｙｅｌａ  ｐｌｉｃａｔａ）、エボヤ（学名：Ｓｔｙｅｌａ  ｃｌａｖａ）、シロボヤモドキ（学名：Ｃｎｅｍｉｄｏｃａｒｐａ  ａｒｅｏｌａｔａ）、ムラボヤ（学名：Ｄｅｎｄｒｏｄｏａ  ａｇｇｒｅｇａｔａ）、ピウラ科（学名：Ｐｙｕｒｉｄａｅ）に属するミハエルボヤ（学名：Ｐｙｕｒａ  ｓａｃｃｉｆｏｒｍｉｓ）、ハルトボヤ（学名：Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｕｓ  ｈａｒｔｍｅｙｅｒｉ）、ツリガネボヤ（学名：Ｃｕｌｅｏｌｕｓ  ｈｅｒｄｍａｎｉ）、イブリクシエラボヤ（学名：Ｂｏｌｔｅｎｉａ  ｅｃｈｉｎａｔａ  ｆ．  ｉｂｕｒｉ）、マボヤ（学名：Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ  ｒｏｒｅｔｚｉ）、アカボヤ（学名：Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、ネズミボヤ（学名：Ｈａｒｔｍｅｙｅｒｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ベニボヤ（学名：Ｈｅｒｄｍａｎｉａ  ｍｏｍｕｓ）、モルグラ科（学名：Ｍｏｌｇｕｌｉｄａｅ）に属するカンテンボヤ（学名：Ｅｕｇｙｒａ  ｇｌｕｔｉｎａｎｓ）、マンハッタンボヤ（学名：Ｍｏｌｇｕｌａ  ｍａｎｈａｔｔｅｎｓｉｓ）から選択された一種又は二種以上である請求項１又は請求項２に記載の抗炎症剤。
【請求項４】
前記ホヤ由来脂溶性油は、天然物から抽出し精製された成分及び有機合成によって得られた成分及び微生物を介して合成された成分の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られたものである請求項１及至請求項３の何れか一に記載の抗炎症剤。
【請求項５】
請求項１及至請求項４の何れか一に記載の抗炎症剤の製造方法であって、ホヤから有機溶媒を用いて脂溶性油を抽出する第一工程と、第一工程で得られた抽出液から有機溶媒を除去する第二工程とからなることを特徴とする抗炎症剤の製造方法。
【請求項６】
一般式１（化１）で示されるアロキサンチン（Ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）が有効成分であることを特徴とする抗炎症剤。
（化１）
2008179545.tif 000005
【請求項７】
一般式１（化１）で示されるアロキサンチン（Ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）を食品及び飲料及びサプリメント及びペットフード及び化粧品及びサニタリー製品及び薬剤のうちのいずれか一に添加してなることを特徴とする抗炎症剤。
（化１）
2008179545.tif 000006
【請求項８】
前記アロキサンチンがトランス体及びシス体及びトランス体とシス体の混合物のうちのいずれか一である請求項６又は請求項７に記載の抗炎症剤。
【請求項９】
前記アロキサンチンは、天然生物から抽出し精製された成分及び有機合成によって得られた成分及び微生物を介して合成された成分の内から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られたものである請求項６及至請求項９のいずれか一に記載の抗炎症剤。
【請求項１０】
一般式２（化２）で示されるディアトキサンチン（Ｄｉａｔｏｘａｎｔｈｉｎ）が有効成分であることを特徴とする抗炎症剤
（化２）
2008179545.tif 000007
【請求項１１】
一般式２（化２）で示されるディアトキサンチン（Ｄｉａｔｏｘａｎｔｈｉｎ）を食品及び飲料及びサプリメント及びペットフード及び化粧品及びサニタリー製品及び薬剤のうちのいずれか一に添加してなることを特徴とする抗炎症剤。
（化２）
2008179545.tif 000008
【請求項１２】
前記ディアトキサンチンがトランス体及びシス体及びトランス体とシス体の混合物のうちのいずれか一である請求項１０又は請求項１１に記載の抗炎症剤
【請求項１３】
前記ディアトキサンチンは、天然生物から抽出し精製された成分及び有機合成によって得られた成分及び微生物を介して合成された成分の内から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られたものである請求項１０及至請求項１２のいずれか一に記載の抗炎症剤。
【請求項１４】
ホヤから有機溶媒を用いて脂溶性油を抽出する第一工程と、第一工程で得られた抽出液から有機溶媒を除去する第二工程と、第二工程後の抽出液をクロマトグラフィを用いて精製する第三工程とからなることを特徴とする請求項６及至９又は請求項１０及至請求項１３の何れか一に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が有機溶媒と水との混合溶媒として用いられる請求項５又は請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項１６】
前記有機溶媒は、アルコール類及びエーテル類及びケト類及び脂肪族炭化水素のハロゲン化合物及び脂肪族炭化水素及び芳芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた有機溶媒である請求項５又は請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項１７】
前記第一工程における抽出操作は、１０℃以上５０℃以下の温度で行われる請求項５又は請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項１８】
前記第一工程における抽出操作時間が３０分以上４８時間以下とされる請求項５又は請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項１９】
前記第三工程におけるクロマトグラフィに用いる充填剤は、順相系のシリカゲル及びセライト及びアルミナ及び水酸化カルシウム及び逆相系の直鎖アルキル基及び芳香族官能基及び親水性官能基及び極性内包型官能基がシルカゲルに化学結合したものの中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた充填剤である請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【請求項２０】
前記第三工程における前記クロマトグラフィで使用する展開溶媒が、水及びアルコール類及びエーテル類及びケト類及び脂肪族炭化水素のハロゲン化合物及び脂肪族炭化水素及び芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた展開溶媒である請求項１４に記載の抗炎症剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性油を有効成分とした抗炎症剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に炎症性の刺激が加わると、まず局所的に発赤、腫腸、熱感、疼痛といった炎症症状が現れる。これに続いて発熱、血沈亢進、ＣＲＰ上昇、白血球数の増多または減少、食欲不振、倦怠感、疼痛、ストレス反応などの全身症状が現れる（非特許文献１）。更に、最近では肥満やそれに誘発されるメタボリークシンドロームの発症過程に炎症作用が関与していることが報告されている（非特許文献２，３）。
【０００３】
通常、炎症性の刺激を受けると、シクロオキシナーゼ（ＣＯＸ）が酵素反応によりアラキドン酸から痛みを伝達する物質であるプロスタグランジン（ＰＧ）を産出する。炎症性の刺激に起因するこのような症状を抑える抗炎症剤として、非ステロイド系抗炎症剤（例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、エテンザミドなど）が開発され、市販薬として使用されている。この非ステロイド系抗炎症剤の存在下ではＣＯＸにこの非ステロイド系抗炎症剤が優先的に取り付くことにより炎症性の刺激を受けた際のＰＧ合成が阻害され、炎症性の刺激に起因する症状が抑制されると考えられている。
【０００４】
しかし、現在までに開発された多数の非ステロイド系抗炎症剤には副作用の生じるものもあり、そのような副作用が生じることのない天然物由来の抗炎症剤の開発が急がれている。また、核内転写因子ＮＦ−κＢの機能に作用することで炎症性サイトカインの発現を阻害する方法も提案されている。
【０００５】
天然物由来の非ステロイド系抗炎症剤としてカロテノイド（特許文献１、特許文献２）、カロテノイドの一種であるアスタキサンチン（特許文献３）及びアスタキサンチンエステル体（特許文献４）などが挙げられる。
【０００６】
皮膚外用剤を開示する特許文献１で想定されているカロテノイドはα−カロテン、β−カロテン、γ−カロテン、リコペン、クリプトキサンチン、ルテイン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、ロドキサンチン、カプサンチン、クロセチン、ビオラキサンチン、スピリロキサンチン、スフェロイデンなど、と記載している。これらのカロテノイドを産出する生物として緑色植物やある種のカビ、酵母、キノコ、細菌など、とも記載している。
【０００７】
また、カロテノイドは高い抗酸化能力又は／及びラジカル消去能力を示すため、炎症を含む様々な病気の発生の抑制に用いられている。この点については、例えば、病気の抑制と改善の為の構造上のカロチノイド類自体を開示する特許文献５などが挙げられる。この活性酸素、過酸化物によって引き起こされる炎症の改善或いは予防に対するカロテノイドの作用機構は、フリーラジカルや一重項酸素などの活性酸素種を直接的に消去することで生体への損傷を防ぐものである。したがって、炎症刺激に伴いＣＯＸから産出されるＰＧ生産の抑制や炎症性サイトカインの発現抑制が行われる非ステロイド系抗炎症剤の抗炎症作用機構とは本質的に異なる。
【０００８】
一方、ホヤエキス及びホヤ抽出物を利用したものとして、ホヤエキスの抽出方法及び抽出成分を含有する健康食品を開示した（特許文献６）や美肌用組成物を開示した（特許文献７、特許文献８）などが挙げられる。
【０００９】
特許文献６では、ホヤの筋膜体及び内臓の原材料を用いて摂氏５０〜７０度の温熱水中又は摂氏５０〜７０度の温度域でアルコールと反応させてホヤエキスを抽出する、と記載されている。また、このような工程を含んで抽出されたホヤエキスには、主成分としてバナジウム、タウリン、ビタミンＢ１２などが含まれている、とも記載されている。
【００１０】
さらにホヤエキスに含まれるバナジウムは、糖尿病の改善に有効で、タウリンは免疫力の増進に役立ち、ビタミンＢ１２は神経痛、関節痛、筋肉痛の改善に役立ち、葉酸は赤血球の造血作用を促進すると記載している。加えて、実施例において、粉末ホヤエキスの有効成分として、バナジウムは微量、タウリン２．９５ｍｇ／１００ｍｇ、ビタミンＢ１２は０．１８ｍｇ／１００ｍｇ、葉酸は０．８５ｇ／１００ｍｇ、ミネラルは鉄分が０．１５ｍｇ／１００ｍｇ、亜鉛が０．１４ｍｇ／１００ｍｇ、カルシュウムが０．８５ｍｇ／１００ｍｇであると記載されている。
【００１１】
特許文献７では、ホヤ及び／又はその抽出物、特許文献８では、ホヤ及び／又はその抽出物、ウツボ及び／又はその抽出物、ナマコ及び／又はその抽出物から選択される２種以上を併用して、経口若しくは経皮で摂取することにより、高い美肌効果を発揮し、シワ、たるみ、肌荒れといった肌の老化状態を防止するとしている。また、特許文献７及び特許文献８では、これらの肌荒れや小じわ等を予防・改善するためには肌の潤いと張りを保持する事が重要であるとし、肌の保湿性や弾力性の維持効果を有する成分としてホヤ及び／又はその抽出物を利用しているものと考えられる。
【００１２】
【非特許文献１】別冊・医学のあゆみ「サイトカイン−基礎から臨床応用まで」医歯薬出版、１９９２
【非特許文献２】Ｊ．  Ｐ．  Ｂａｓｔａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．，  １７  （２００６）  ４−１２．
【非特許文献３】Ａ．  Ｂｏｕｌｏｕｍｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｃａｒｅ，  ８  （２００５）  ３４７−３５４．
【特許文献１】特開２００２−１６１０３１号公報
【特許文献２】特表２００３−５２８１３９号公報
【特許文献３】特開２００４−３３１５１２号公報
【特許文献４】特開平７−３００４２１号公報
【特許文献５】特表２００６−５１７１９７号公報
【特許文献６】特開２００４−２９８１６１号公報
【特許文献７】特開２００６−８３１１５号公報
【特許文献８】特開２００６−８９３８５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来、炎症性の疾患を予防する或いは改善する様々な薬剤が開発されていた。しかしこれらの薬剤には副作用の危険性がある為、その危険のない天然物由来の抗炎症剤が望まれていた。
本発明は以上の従来技術における問題に鑑み、副作用の危険のない抗炎症剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者等は上記課題について鋭意検討を行った結果、ホヤ由来脂溶性油に含まれるカロテノイドであるアロキサンチン及びディアトキサンチンをマウス由来マクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４．７に添加し、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）で炎症誘導したところ、有意に各種炎症性サイトカインの産生が抑制されることを見出し、抗炎症剤として報告されているアスタキサンチンと比較して、ホヤ由来脂溶性油に含まれるアロキサンチン及びディアトキサンチンがより高い抗炎症作用を示すことを見出した。
【００１５】
すなわち本発明の抗炎症剤は、ホヤ由来脂溶性油を有効成分として含有することを特徴とする。
【００１６】
また一般式１（化１）で示され、抗炎症作用を示す活性本体であるアロキサンチン（Ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）及び／又は一般式２（化２）で示され、抗炎症作用を示す活性本体であるディアトキサンチン（Ｄｉａｔｏｘａｎｔｈｉｎ）が抗炎症剤の有効成分であることを特徴とする。
【００１７】
（化１）
2008179545.tif 000003
【００１８】
（化２）
2008179545.tif 000004
【００１９】
前記ホヤ由来脂溶性油または一般式１（化１）で示されるアロキサンチン及び／又は一般式２（化２）で示されるディアトキサンチンを食品及び飲料及びサプリメント及びペットフード及び化粧品及びサニタリー製品及び薬剤のうちのいずれかに添加してなる抗炎症剤としてもよい。
【００２０】
また前記アロキサンチン及びディアトキサンチンは、ホヤ等の天然物から抽出し精製された成分及び有機合成によって得られた成分及び微生物を介して合成された成分の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られたものであってもよい。また前記アロキサンチン及びディアトキサンチンは全トランス体又はシス体又はその混合物であってもよい。
【００２１】
さらに本発明の抗炎症剤の製造方法は、ホヤから有機溶媒を用いて脂溶性油を抽出する第一工程と、第一工程で得られた抽出液から有機溶媒を除去する第二工程とからなる様にすることができる。
【００２２】
加えて本発明のホヤ由来カロテノイドの製造方法はホヤから有機溶媒を用いて脂溶性油を抽出する第一工程と、第一工程で得られた抽出液から有機溶媒を除去する第二工程と、第二工程後の抽出液をクロマトグラフィを用いて精製する第三工程とからなる様にしても良い。
【００２３】
前記有機溶媒は有機溶媒と水との混合溶媒として用いることができる。
【００２４】
前記有機溶媒はアルコール類及びエーテル類及びケト類及び脂肪族炭化水素のハロゲン化合物及び脂肪族炭化水素及び芳芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた有機溶媒であっても良い。
【００２５】
前記前記第一工程における抽出操作は、ホヤ由来カロテノイドの分解を最小限にする為に、１０℃以上５０℃以下の温度で行われる様にすることが望まれる。
【００２６】
また前記第一工程における抽出操作時間は、ホヤ由来カロテノイドの分解を最小限にする為に、３０分以上４８時間以下とするのが良い。
【００２７】
第三工程のクロマトグラフィで使用する充填剤は、順相系のシリカゲル及びセライト及びアルミナ及び水酸化カルシウム及び逆相系の直鎖アルキル基及び芳香族官能基及び親水性官能基及び極性内包型官能基がシルカゲルに化学結合したものの中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた充填剤であっても良い。
【００２８】
また第三工程のクロマトグラフィで使用する展開溶媒が、水及びアルコール類及びエーテル類及びケト類及び脂肪族炭化水素のハロゲン化合物及び脂肪族炭化水素及び芳香族炭化水素の中から選ばれた一種又は二種以上の組み合わせによって得られた展開溶媒であっても良い。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、極めて高い抗炎症作用を示し、副作用の危険のない天然物由来の抗炎症剤を提供することができる。しかも、本発明の抗炎症剤における極めて高い抗炎症作用を示す活性本体であるホヤ由来カロテノイドではホヤ特有の香りや風味が低減されるので、これらのホヤの特徴を嫌って、ホヤの摂取を避けてきた人々或いは動物に対して利用する事ができる。逆に、ホヤ由来脂溶性油にはホヤ特有の香りや風味が残っている為、ホヤを珍味として消費してきた人々に対しての利用が有効となる。
【００３０】
ホヤ脂溶性油の中にはアロキサンチン及びディアトキサンチン以外にもフコキサンチン及びフコキサンチノール及びハロシンチアキサンチンなどのカロテノイドが存在する。これらのカロテノイドは抗肥満作用、ガン細胞増殖抑制作用を示すことが分かっており、ホヤ由来脂溶性油は抗炎症剤としての有効成分のみに留まらず、抗肥満剤やガン細胞増殖抑制剤などの効果も備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明を実施するための最良の形態について具体的に説明するが、本発明がこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００３２】
本発明の抗炎症剤の有効成分であり抗炎症作用を示す活性本体であるアロキサンチン及びディアトキサンチンは、ホヤに含まれるものに限られず、例えばホタテ等の生物に含まれるものであっても良い。
【００３３】
前記ホヤは、海鞘綱（学名：Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、第一目腸性類（学名：Ｅｎｔｅｒｏｇｏｎａ）、第一亜目無官類（学名：Ａｐｌｏｕｓｏｂｒａｎｃｈｉａ）、ポリクリニ科（学名：Ｐｏｌｙｃｌｉｎｉｄａｅ）、亜科Ｐｏｌｙｃｌｉｎｉｎａｅに属するマンジュウボヤ（学名：Ａｐｌｉｄｉｕｍ  ｐｌｉｃｉｆｅｒｕｍ）、コンボウボヤ（学名：Ｓｙｎｏｉｃｕｍ  ｃｌａｖａｔｕｍ）、モヨウボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃｌｉｎｕｍ  ｃｏｎｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、スナモチボヤ（学名：Ｓｉｄｎｅｉｏｉｄｅｓ  ｓｎａｍｏｔｉ）、亜科Ｅｕｈｅｒｄｍａｎｉｉｎａｅに属するイチゴボヤ（学名：Ｐｓｅｕｄｏｄｉｓｔｏｍａ  ｋａｎｏｋｏ）、ジデムニ科（学名：Ｄｉｄｅｍｎｉｄａｅ）に属するミナミウスボヤ（学名：Ｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、チャツボボヤ（学名：Ｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｍｏｌｌｅ）、ミスジジデムニ（学名：Ｔｒｉｄｉｄｅｍｎｕｍ  ｓａｖｉｇｎｙｉｉ）、マダラボヤ（学名：Ｌｅｐｔｏｃｌｉｎｉｄｅｓ  ｍａｄａｒａ）、ネンエキボヤ（学名：Ｄｉｐｌｏｓｏｍａ  ｍｉｔｓｕｋｕｒｉｉ）、シトネボヤ（学名：Ｌｉｓｓｏｃｌｉｎｕｍ  ｐｕｌｖｉｎｕｍ）、ポリキトリ科（学名：Ｐｏｌｙｃｉｔｏｒｉｄａｅ）に属するコバルトクラベラ（学名：Ｃｌａｖｅｌｉｎａ  ｃｏｅｒｕｌｅａ）、ミドリカイメンボヤ（Ｅｕｄｉｓｔｏｍａ  ｇｌａｕｃｕｓ）、ヘンゲボヤ（学名：Ｐｌｏｙｃｉｔｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒｕｓ）、チラシボヤ（学名：Ｄｉｓｔａｐｌｉａ  ｄｕｂｉａ）、カンザシボヤ（学名：Ｓｙｃｏｚｏａ  ｋａｎｚａｓｉ）、コップボヤ（学名：Ｃｙａｔｈｏｃｏｒｍｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、第二亜目管鰓類（学名：Ｐｈｌｅｂｏｂｒａｎｃｈｉａ）、キオナ科（学名：Ｃｉｏｎｉｄａｅ）、亜科Ｄｉａｚｏｎｉｎａｅに属するボウズボヤ（学名：Ｓｙｎｄｉａｚｏｎａ  ｇｒａｎｄｉｓ）、亜科Ｃｉｏｎｉｎａｅに属するカタユウレイボヤ（学名：Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ユウレイボヤ（学名：Ｃｉｏｎａ  ｓａｖｉｇｎｙｉ）、ペロフォラ科（学名：Ｐｅｒｏｐｈｏｒｉｄａｅ）に属するタイワンマメボヤ（学名：Ｐｅｒｏｐｈｏｒａ  ｍｕｌｔｉｃｌａｔｈｒａｔａ）、アスキジア科（学名：Ａｓｃｉｄｉｉｄａｅ）に属するザラボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ｚａｒａ）、ナツメボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ａｈｏｄｏｒｉ）、バナジウムボヤ（学名：Ａｓｃｉｄｉａ  ｇｅｍｍａｔａ）、アグネシア科（学名：Ａｇｎｅｓｉｉｄａｅ）に属するヒメボヤ（学名：Ａｇｎｅｓｉａ  ｈｉｍｅｂｏｊａ）、コレラ科（学名：Ｃｏｒｅｌｌｉｄａｅ）に属するガマグチボヤ（学名：Ｒｈｏｄｏｓｏｍａ  ｔｕｒｃｉｃｕｍ）、ドロボヤ（学名：Ｃｏｒｅｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、スボヤ（学名：Ｃｈｅｌｙｏｓｏｍａ  ｓｉｂｏｊａ）、オクタクネミ科（学名：Ｏｃｔａｃｎｅｍｉｄａｅ）に属するオオグチボヤ（学名：Ｍｅｇａｌｏｄｉｃｏｐｉａ  ｈｉａｎｓ）、第二目壁性類（学名：Ｐｌｅｕｒｏｇｏｎａ）、第一亜目褶鰓類（学名：Ｓｔｏｌｉｄｏｂｒａｎｃｈｉａ）、ボトリルス科（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｉｄａｅ）に属するキクイタボヤ（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｕｓ  ｔｕｂｅｒａｔｕｓ）、イタボヤ（学名：Ｂｏｔｒｙｌｌｏｉｄｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、スチエラ科（学名：Ｓｔｙｅｌｉｄａｅ）、亜科Ｐｏｌｙｚｏｉｎａｅに属するアラレボヤ（学名：Ｐｏｌｙｚｏａ  ｖｅｓｉｃｕｌｉｐｈｏｒａ）、コバンイタボヤ（学名：Ｓｙｍｐｌｅｇｍａ  ｒｅｐｔａｎｓ）、亜科Ｓｔｙｅｌｉｎａｅに属するクロボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃａｒｐａ  ｃｒｙｐｔｏｃａｒｐａ  ｋｒｏｂｏｊａ）、ニシキボヤ（学名：Ｐｏｌｙｃａｒｐａ  ａｕｒａｔａ）、シロボヤ（学名：Ｓｔｙｅｌａ  ｐｌｉｃａｔａ）、エボヤ（学名：Ｓｔｙｅｌａ  ｃｌａｖａ）、シロボヤモドキ（学名：Ｃｎｅｍｉｄｏｃａｒｐａ  ａｒｅｏｌａｔａ）、ムラボヤ（学名：Ｄｅｎｄｒｏｄｏａ  ａｇｇｒｅｇａｔａ）、ピウラ科（学名：Ｐｙｕｒｉｄａｅ）に属するミハエルボヤ（学名：Ｐｙｕｒａ  ｓａｃｃｉｆｏｒｍｉｓ）、ハルトボヤ（学名：Ｍｉｃｒｏｃｏｓｍｕｓ  ｈａｒｔｍｅｙｅｒｉ）、ツリガネボヤ（学名：Ｃｕｌｅｏｌｕｓ  ｈｅｒｄｍａｎｉ）、イブリクシエラボヤ（学名：Ｂｏｌｔｅｎｉａ  ｅｃｈｉｎａｔａ  ｆ．  ｉｂｕｒｉ）、マボヤ（学名：Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ  ｒｏｒｅｔｚｉ）、アカボヤ（学名：Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａ  ａｕｒａｎｔｉｕｍ）、ネズミボヤ（学名：Ｈａｒｔｍｅｙｅｒｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ベニボヤ（学名：Ｈｅｒｄｍａｎｉａ  ｍｏｍｕｓ）、モルグラ科（学名：Ｍｏｌｇｕｌｉｄａｅ）に属するカンテンボヤ（学名：Ｅｕｇｙｒａ  ｇｌｕｔｉｎａｎｓ）、マンハッタンボヤ（学名：Ｍｏｌｇｕｌａ  ｍａｎｈａｔｔｅｎｓｉｓ）から選択された一種又は二種以上とすることができ、ホヤ由来カロテノイドを含むものが望ましい。
【００３４】
前記ホヤ由来脂溶性油及びアロキサンチン及びディアトキサンチンの形態は、粉末状態のもの、固体状態のもの、有機溶媒に溶解したもの、又は界面活性剤を用いて水溶性にしたものとすることができる。
【００３５】
ここで使用するホヤはフリーズドライ又はスプレードライ等を使用して乾燥した状態のものであっても良いし、生の状態であっても良い。さらに、粉砕機又は超臨界装置を使用して、抽出前のホヤが粉末状であっても良いし、切り分けられたものであっても良いし、小さくする何らかの処理をしない状態のものであっても良い。つまり、ホヤの物理、化学的状態がどのようなものであっても良い。
【００３６】
また使用するホヤの部位はホヤ由来カロテノイドが含まれていれば何れの部位でも良く、好ましくは、ホヤ由来カロテノイドが蓄積されている部位、例えば被嚢（外皮）が望まれる。
【００３７】
前記前記第一工程における抽出操作における温度が１０℃未満である場合には、抽出効率が悪く、５０℃を超える場合にはカロテノイドの分解がおこり、好ましくない。
【００３８】
また前記第一工程における抽出操作時間が３０分未満である場合には抽出効率が悪く、４８時間を超える場合にはカロテノイドの分解がおこり、好ましくない。
【００３９】
第二工程の有機溶媒又は有機溶媒及び水から成る混合溶媒の除去は、ホヤ由来カロテノイドの分解を最小限にする為に、エバポレータ等の減圧蒸留装置を使用して行うことができる。
【００４０】
以下に本発明の実施例につき説明する。一連の本実施例では、炎症性サイトカインの産生評価モデルとして一般的に使用されているマウス由来マクロファージ様細胞ＲＡＷ２６４．７について各試験を行った。
【００４１】
（実施例１）ホヤ脂溶性油の調製及びホヤ脂溶性油に含まれるカロテノイドの単離及び分析
ホヤ脂溶性油はエタノール抽出によって生のホヤより得た。このホヤ脂溶性油をシリカゲルの薄層クロマトグラフィ（展開溶媒はアセトン：ヘキサン＝２：３（ｖ／ｖ）を使用）に展開させることにより、４つの画分（フラクション１〜４）を得た。これを図１に示す。
【００４２】
図１において、（ａ）〜（ｄ）はそれぞれ、フラクション１〜４として分離し、フラクション３及び４はＮＭＲ測定により、それぞれハロシンチアキサンチン（Ｈａｌｏｃｙｎｔｈｉａｘａｎｔｈｉｎ）及びフコキサンチノール（Ｆｕｃｏｘａｎｔｈｉｎｏｌ）に同定され、これらのカロテノイドは前記操作により単離及び精製されることが分かった。
【００４３】
図２は薄層クロマトグラフィで分離された図１に（ｂ）で示すフラクション２画分のＨＰＬＣ分析結果を示す。図２に示す様に、フラクション２は高速液体クロマトグラフィ（充填剤はＯＤＳ、展開溶媒はアセトニトリル：メタノール＝３０：７０（ｖ／ｖ）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ）測定から、少なくとも５つのカロテノイド（フラクション２−１〜２−５）から構成される混合物であることが分かった。ＮＭＲ測定によりフラクション２−１は全トランスアロキサンチン（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）、フラクション２−２は全トランスディアトキサンチン（ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｄｉａｔｏｘｎａｈｉｎ）、フラクション２−３は９，９’シスアロキサンチン（９，９’−ｃｉｓ  ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）、フラクション２−４は９シスアロキサンチン（９−ｃｉｓ  ａｌｌｏｘａｎｔｈｉｎ）、フラクション２−５は９シスディアトキサンチン（９−ｃｉｓ  ｄｉａｔｏｘｎａｈｉｎ）に同定され、前記操作によりこれらのカロテノイドが単離及び精製されることが分かった。図３に本実施例で得られたカロテノイドの化学構造式を示した。
【００４４】
ホヤ脂溶性油の収率は、ホヤ（外殻を含む）乾燥重量４０６．３３ｇ（試料１）及び３２５．７８ｇ（試料２）からそれぞれ１４．１５９ｇ（３．４８重量％）及び１６．５０８ｇ（５．０７重量％）を得た。平均すると乾燥したホヤに対して４．２８重量％のホヤ脂溶性油が得られた。得られたホヤ脂溶性油をカラムクロマトグラフィ（充填剤はシリカゲル、展開溶媒はアセトン：ヘキサン＝２：３（ｖ／ｖ））に展開させることにより、試料１及び試料２から粗カロテノイド分画をそれぞれ８．３３６ｇ（２．０５重量％）及び１０．５０３ｇ（３．２２重量％）を得た。
【００４５】
さらに前記のＨＰＬＣ操作を行うことにより、試料１及び試料２から全トランスアロキサンチン０．３５２１ｇ（０．０８６重量％）及び０．３３０４ｇ（０．１０１重量％）、ハロシンチアキサンチン０．０４３０ｇ（０．０１１重量％）及び０．０４３２ｇ（０．０１３重量％）、フコキサンチノール０．０３１１ｇ（０．００８重量％）及び０．０３２１ｇ（０．００９重量％）を得た。
【００４６】
（実施例２）炎症性サイトカイン及び炎症関連酵素のｍＲＮＡ量
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を調製したＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＰＭＩ培地中で各ウェルに５ｍＬづつ６穴マイクロプレート中に分注した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した（前培養）。
【００４７】
各カロテノイド添加用の高濃度カロテノイドのエタノール溶液（全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチン５０μＭの１０００倍濃度（５０ｍＭ）の全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンのエタノール溶液）を調製した。
【００４８】
これらのカロテノイドのエタノール溶液を前培養したＲＡＷ２６４．７細胞培養液に添加した。その際、培地中のエタノールの濃度は細胞毒性を示さない０．１％以下になるように添加した（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）及びポジティブコントロール（ＬＰＳ＋）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液にはエタノールのみを添加した）。
【００４９】
マイクロプレートシェイカーを攪拌した後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養し、更にＬＰＳを終濃度０．１  ｍｇ／ｍＬとなるように添加し（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液には水のみを添加した）、所定の時間培養した。      
【００５０】
その後、ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を除去し、更に生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いてＲＡＷ２６４．７細胞を洗浄した。この操作を３回行った。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により炎症性サイトカインであるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６のｍＲＮＡ産生量および炎症関連酵素であるＣＯＸ−２、ｉＮＯＳのｍＲＮＡ発現量をＰＲＩＳＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて測定した。
【００５１】
その結果、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンのいずれのカロテノイドにおいても、ＬＰＳによって惹起されたＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαのｍＲＮＡ発現量（ＬＰＳのみを添加したポジティブコントロール）を顕著に抑制することが明らかとなった（図４、図５、図６）。
【００５２】
図４は全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を示す。
【００５３】
図５は全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−６遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を示す。
【００５４】
図６は全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＴＮＦ−α遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を示す。
【００５５】
また、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンのいずれのカロテノイドもＣＯＸ−２  ｍＲＮＡ発現量を抑制した（図７）。ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡに対しては全トランスアロキサンチン、９シスアロキサンチンがＬＰＳによって惹起されたｍＲＮＡ発現量を有意に抑制した（図８）。
【００５６】
図７は全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＣＯＸ−２遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を示す。
【００５７】
図８は全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のｉＮＯＳ遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を示す。
【００５８】
これらの結果は、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンが、炎症誘発物質によって惹起される炎症性サイトカイン及び炎症関連酵素をｍＲＮＡの発現レベルで抑制できることを示しており、それらの抗炎症作用が期待される結果である。
【００５９】
（実施例３）炎症性サイトカイン産生量
１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を調製したＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＰＭＩ培地中で各ウェルに５ｍＬづつ６穴マイクロプレート中に分注した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した（前培養）。全トランスアロキサンチン添加用の高濃度カロテノイドのエタノール溶液（５０μＭの１０００倍濃度（５０ｍＭ）の全トランスアロキサンチンのエタノール溶液）を調製した。
【００６０】
この全トランスアロキサンチンのエタノール溶液を前培養したＲＡＷ２６４．７細胞培養液に添加した。その際、培地中のエタノールの濃度は細胞毒性を示さない０．１％以下になるように添加した（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）及びポジティブコントロール（ＬＰＳ＋）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液にはエタノールのみを添加した）。
【００６１】
マイクロプレートシェイカーを攪拌した後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養し、更にＬＰＳを終濃度０．１  ｍｇ／ｍＬまたは１  ｍｇ／ｍＬとなるように添加し（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液には水のみを添加した）、更に２４時間培養した。その後、市販のＩＬ−１β、ＩＬ−６量測定ＥＬＩＳＡキット（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を用いて培養液中に分泌されたサイトカイン量を測定した。
【００６２】
全トランスアロキサンチンは炎症性サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ−６の産生量をタンパク質レベルで抑制していた（図９、図１０）。このことより、ホヤ由来のカロテノイドが炎症物質により惹起された炎症性サイトカインの発現量を遺伝子のみならずタンパク質レベルで抑制しており、その有効性が確認された。
【００６３】
図９は全トランスアロキサンチンをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の、ＩＬ−１β蛋白質発現量の添加試料濃度依存性を示す。
図１０は全トランスアロキサンチンをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の、ＩＬ−６蛋白質発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す。
【００６４】
（実施例４）カロテノイドによる炎症性サイトカインのｍＲＮＡ量の比較
実施例４として、本発明の抗炎症剤の有効成分であるホヤ由来脂溶性油が含有する５０μＭの全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）及び全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量を測定した。またこれに対する比較例として特許文献１で緑色植物やある種のカビ、酵母、キノコ、細菌から産出されると指摘されたゼアキサンチン（Ｚｅａ）、βカロテン（β−ｃａｒ）、アスタキサンチン（Ａｓｔ）についても同様にＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量を測定した。
測定にあたって、１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を調製したＲＡＷ２６４．７細胞をＲＰＭＩ培地中で各ウェルに５ｍＬづつ６穴マイクロプレート中に分注した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した（前培養）。
【００６５】
一方、各カロテノイド添加用の高濃度カロテノイドのエタノール溶液またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液（全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチンはエタノール溶液、ゼアキサンチン、β−カロテン、アスタキサンチンはＤＭＳＯ溶液とした）を調製した。
【００６６】
これらのカロテノイド溶液を前培養したＲＡＷ２６４．７細胞培養液に添加した。その際、培地中のエタノールおよびＤＭＳＯの濃度は細胞毒性を示さない０．１％以下になるように添加した（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）及びポジティブコントロール（ＬＰＳ＋）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液にはエタノールまたはＤＭＳＯのみを添加した）。マイクロプレートシェイカーを攪拌した後、３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養し、更にＬＰＳを終濃度０．１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し（ネガティブコントロール（ＬＰＳ−）としたＲＡＷ２６４．７細胞培養液には水のみを添加した）、所定の時間培養した。
【００６７】
その後、ＲＡＷ２６４．７細胞培養液を除去し、更に生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いてＲＡＷ２６４．７細胞を洗浄した。この操作を３回行った。その後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ）を用いてＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲ法により炎症性サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ−６のｍＲＮＡ産生量をＰＲＩＳＭ７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社）にて測定した。その測定結果を図１１及び図１２に示す。
【００６８】
図１１は５０μＭの全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、ゼアキサンチン（Ｚｅａ）、βカロテン（β−ｃａｒ）、アスタキサンチン（Ａｓｔ）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量を測定した結果を示す。
図１２は５０μＭの全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、ゼアキサンチン（Ｚｅａ）、βカロテン（β−ｃａｒ）、アスタキサンチン（Ａｓｔ）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−６遺伝子発現量を測定した結果を示す。
【００６９】
図１１及び図１２に示される様に、本発明の抗炎症剤の有効成分であるホヤ由来脂溶性油が含有する全トランスアロキサンチンおよび全トランスディアトキサンチンによる、ＩＬ−１β、ＩＬ−６のｍＲＮＡ発現抑制効果は、特許文献１で緑色植物やある種のカビ、酵母、キノコ、細菌から産出されると指摘されたゼアキサンチン、β−カロテン、アスタキサンチンに比べて顕著な抑制効果であった。特に、これまで抗炎症作用が報告されているアスタキサンチンの効果より顕著であったことは、抗炎症剤としてホヤ由来のカロテノイドが有用であることを示すものである（図１１、図１２）。
【００７０】
（実施例５）ホヤ由来カロテノイドの添加による細胞に対する毒性試験
ＲＡＷ２６４．７細胞に対して細胞の生存に深刻な影響を及ぼさない、言い換えると細胞がアポトーシス或いはネクローシスを起こさないようなホヤ由来カロテノイドの添加量を調べた。
１０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬに濃度を調製したＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＰＭＩ培地中で各ウェルに１００μＬづつ９６穴マイクロプレート中に分注した。これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養した（前培養）。
【００７１】
各カロテノイド添加用の高濃度カロテノイドのエタノール溶液（全トランスハロシンチアキサンチン、全トランスフコキサンチン、全トランスフコキサンチノール、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチン、これらのカロテノイドには炎症誘導剤としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を終濃度が０．１  ｍｇ／ｍＬになるように調製して添加している、ネガティブコントロールとしてエタノールのみ（ＬＰＳ−）、ポジティブコントロールとしてＬＰＳのエタノール溶液（ＬＰＳ＋））を以下のように調製し、前培養後のＲＡＷ２６４．７細胞に添加した。
【００７２】
ハロシンチアキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノールは終濃度０．７５、１．５、３μＭの１０００倍濃度（０．７５、１．５、３ｍＭ）のハロシンチアキサンチン、フコキサンチン、フコキサンチノールのエタノール溶液を、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチン５０μＭの１０００倍濃度（５０ｍＭ）の全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンのエタノール溶液を調製した。
【００７３】
これらに９１倍量（ｖ）のＲＰＭＩ培地で希釈し、得られた溶液の１０μＬを前培養したＲＡＷ２６４．７細胞に添加した。このように添加したカロテノイドを調製する事により、培地中のエタノールの濃度は０．１％以下になる。９６穴マイクロプレートに取り分けた試料をプレートシェイカーで攪拌し、その後３７℃、５％ＣＯ２存在下で、所定の時間培養した。
【００７４】
測定の３時間前にＷＳＴ−１試薬を各ウェルに１０μＬずつ添加し、プレートシェーカーで均一に分散させた。さらに３時間培養後、マイクロプレートリーダーで、４５０ｎｍの吸光度（対照波長は６５０ｎｍ）を測定した。得られた吸光度の値を用いて、細胞生残率＝（（カロテノイドのエタノール溶液を添加した細胞溶液の吸光度）−（培地とカロテノイドのエタノール溶液の吸光度））／（（エタノールを添加した細胞溶液の吸光度）−（培地＋エタノール溶液の吸光度））の式から細胞生残率を見積もった。
【００７５】
その結果を図１３に示す。図１３は 全トランスアロキサンチン（Ｆ２−１）、全トランスディアトキサンチン（Ｆ２−２）、９，９’シスアロキサンチン（Ｆ２−３）、９シスアロキサンチン（Ｆ２−４）、９シスディアトキサンチン（Ｆ２−５）をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の細胞生残率の添加試料濃度依存性を見積もった結果を示す。
【００７６】
図１３に示される様に、炎症性サイトカインおよび炎症酵素の発現抑制効果を示したホヤ由来のカロテノイドである全トランスハロシンチアキサンチン、全トランスフコキサンチン、全トランスフコキサンチノール、全トランスアロキサンチン、全トランスディアトキサンチン、９シスアロキサンチン、９シスディアトキサンチンはＲＡＷ２６４．７細胞に対して５０ｐｐｍ以上まで細胞毒性を示さなかった。これらの結果はホヤ由来のカロテノイドが生体に対して適合性を有した抗炎症剤であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の抗炎症剤は、ホヤ由来脂溶性油を食品素材等に添加することで機能性食品素材として用いることができ、農業の分野での活用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施例１において抽出されたホヤ脂溶性油をシリカゲル担体に展開させることにより得られた薄層クロマトグラフィを示す図である。
【図２】本発明の実施例１において抽出されたホヤ脂溶性油薄層クロマトグラフィで分離されたフラクション２画分のＨＰＬＣ分析結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例１において抽出されたホヤ抽出脂溶性油中に含まれるカロテノイドの化学構造式を示す図である。
【図４】本発明の実施例２で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例２で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−６遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例２で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＴＮＦ−α遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例２で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＣＯＸ−２遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例２で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のｉＮＯＳ遺伝子発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例３で全トランスアロキサンチンをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の、ＩＬ−１β蛋白質発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例３で全トランスアロキサンチンをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の、ＩＬ−６蛋白質発現量の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例４で本発明の抗炎症剤の有効成分をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量と従来の抗炎症剤成分をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−１β遺伝子発現量を測定した結果を比較して示す図である。
【図１２】本発明の実施例４で本発明の抗炎症剤の有効成分をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−６遺伝子発現量と従来の抗炎症剤成分をＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時のＩＬ−６遺伝子発現量を測定した結果を比較して示す図である。
【図１３】本発明の実施例５で各カロテノイドをＲＡＷ２６４．７細胞に添加した時の細胞生残率の添加試料濃度依存性を測定した結果を示す図である。
【図１】
2008179545.tif 000009
【図２】
2008179545.tif 000010
【図３】
2008179545.tif 000011
【図４】
2008179545.tif 000012
【図５】
2008179545.tif 000013
【図６】
2008179545.tif 000014
【図７】
2008179545.tif 000015
【図８】
2008179545.tif 000016
【図９】
2008179545.tif 000017
【図１０】
2008179545.tif 000018
【図１１】
2008179545.tif 000019
【図１２】
2008179545.tif 000020
【図１３】
2008179545.tif 000021