(57)【要約】【課題】簡便かつ特異的にシアン化合物分解能を有する微生物を検出/同定する方法を提供する。【解決手段】ロダナーゼ遺伝子をシアン化合物分解能を有する微生物の指標として用いる、シアン化合物分解能を有する微生物の検出/同定方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアン化合物分解能を有する微生物の検出方法であって、微生物由来の核酸を鋳型として、以下のプライマー：
（ａ）センスプライマー
5’-GG(T/C/A/G/I)CA(T/C/I)AT(T/C/A/I)CC(T/C/A/G/I)GG(T/C/A/G/I)GC-3’（配列番号3）
（ｂ）アンチセンスプライマー
5’-(A/G/I)TT(T/C/A/G/I)CCCCA(T/C/I)TC(T/C/A/G/I)(C/G/I)(T/A/I)CCA-3’（配列番号4）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はリアルタイムPCRを行い、ロダナーゼ遺伝子増幅産物を検出することを含む、上記方法。
【請求項２】
前記増幅産物を、電気泳動によって検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記センスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-GGICA(T/C)AT(T/C/A)CCIGGIGC-3’（配列番号5）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-(A/G)TTICCCCA(T/C)TCI(C/G)(T/A)CCA-3’（配列番号6）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、請求項1又は２に記載の方法。
【請求項５】
上記増幅産物の塩基配列を決定することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
決定された塩基配列に基づいて微生物を同定することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法によって得られたロダナーゼ遺伝子増幅産物の配列が決定された核酸配列、その相補的配列又はその15塩基長以上の断片を用いて、微生物においてロダナーゼ遺伝子を検出することを含む、シアン化合物分解能を有する微生物の検出方法。
【請求項８】
ロダナーゼ遺伝子の検出を、前記核酸配列又はその15塩基長以上の断片が担体上に固定化されたマイクロアレイを用いて実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出を、PCR、リアルタイムPCR又はハイブリダイゼーションによって実施する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
シアン化合物分解能を有する微生物を検出するためのプライマーセットであって、以下のプライマー：
（ａ）センスプライマー
5’-GG(T/C/A/G/I)CA(T/C/I)AT(T/C/A/I)CC(T/C/A/G/I)GG(T/C/A/G/I)GC-3’（配列番号3）
（ｂ）アンチセンスプライマー
5’-(A/G/I)TT(T/C/A/G/I)CCCCA(T/C/I)TC(T/C/A/G/I)(C/G/I)(T/A/I)CCA-3’（配列番号4）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
を含む、上記プライマーセット。
【請求項１１】
前記センスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-GGICA(T/C)AT(T/C/A)CCIGGIGC-3’（配列番号5）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、請求項1０に記載のプライマーセット。
【請求項１２】
前記アンチセンスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-(A/G)TTICCCCA(T/C)TCI(C/G)(T/A)CCA-3’（配列番号6）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、請求項1０に記載のプライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学・各種産業(食品・化学等)領域及び環境保全(汚染物質の生物分解・水処理)において、有害物質を無害化する役割を担う微生物を遺伝子レベルで検出及び同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアン化合物により汚染された土壌・地下水を修復（無害化）する技術として、微生物のシアン分解能力を利用したバイオレメディエーションが研究されている（特許文献１、２）。このような技術を適用して汚染環境の修復を行う場合、浄化対象とするシアン化合物の濃度分析を行うことで修復具合を評価してきた。しかし本方法のみでは、汚染プルームからのシアン化合物の拡散や、毒性の強いシアン化水素ガスへの気化などの、物理化学的な見かけ上のシアン化合物の減少とバイオレメディエーションの効果とを区別することはできなかった。従って、別の手法で環境中のシアン化合物が微生物により分解・無害化される根拠を示すことが必要であった。
【０００３】
石油汚染サイトでの生物学的修復技術では、顕微鏡観察による全菌数計測や呼吸活性のモニタリングにより、石油成分を浄化する微生物の活性を測定する方法が取られてきた。このようなモニタリング方法は、汚染物質由来の有機物量が充分に存在し、人為的に土壌環境中の微生物活性を十分に高めることが可能な場合に有効である。一方、毒性が強いシアン化合物の微生物浄化は、微生物自体もシアン化合物による増殖阻害を受けるため、浄化の適用条件は低濃度汚染の場合に限定される。そのため、上記の検出方法ではシアン化合物を浄化する微生物の活性を検出することは困難であった。
【０００４】
また、全菌数計測ではモニタリングの対象外となる微生物や、増殖を行わない死菌も同時に計測されてしまう問題がある。生菌数を計測する手法としては、プレート法やＭＰＮ法が存在するが、実験操作が煩雑でかつ１ヶ月程度の試験期間を必要とすることから、迅速なモニタリングが求められる浄化事業に適用できなかった。
【０００５】
一方で、特定の機能を有した細菌群を検出またはモニタリングするためには、遺伝子レベルでの比較・検出を行うことが精度の高さの面で望ましいとされており、近年では１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を用いて微生物を同定している。しかし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子はすべての微生物が保有している遺伝子であるため、代謝機構による特定の微生物群を検出することは困難であった。このため、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を対象として特定の微生物を検出するためには、ＰＣＲで増幅された断片を１つずつクローニングし、シーケンスを行うといった煩雑な操作を踏む必要があった。
【０００６】
それに代わる手法として、汚染物質の浄化に関わる遺伝子をターゲットとした特定の微生物の同定、検出、モニタリング法が開発されており、芳香族ジオキシゲナーゼ遺伝子や塩化ビニルレダクターゼ遺伝子等で既にその報告がなされている（特許文献３、４）。しかし、シアン化合物を浄化する遺伝子は既に知られてはいるものの、当該遺伝子をターゲットとしたシアン化合物を浄化する微生物を同定、検出、モニタリングする方法はこれまでになかった。
【０００７】
現在までに、微生物によるシアン浄化メカニズムについて以下の三種類：(i)酸素を消費する完全分解（2HCN＋2H2O＋O2→2NH3＋2CO2＋2H2O）(ii)アルデヒドによる無害化（6CN-＋6CH2O＋13.5O2→6CO2＋3N2＋3H2O＋6HCO3−）；(iii)チオ硫酸サルファートランスフェラーゼ（以下、「ロダナーゼ」と称する。）による解毒化（CN-＋S2O32-→SCN-＋SO32-）が提唱されている。
【０００８】
これらの経路のうち、(iii)の浄化経路については、シアン化合物を含んだ人工地下水を使用した浄化試験において、試験培養液へのチオ硫酸塩の添加により、微生物による浄化活性が向上することが確認されており（特許文献２）、これはロダナーゼがシアン分解に深く関っていることを示唆している。
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−１８０５８３
【特許文献２】特開２００６−２８１０５３
【特許文献３】特開平９−２３４０７０
【特許文献４】特開２００７−４９９４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、迅速で、簡便かつ特異的にシアン化合物分解能を有する微生物を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、所与の微生物間で高度に保存されているロダナーゼ遺伝子内のアミノ酸配列を特定し、これをシアン化合物分解能を有する微生物についての指標として使用することを基礎とする。
【００１２】
すなわち本発明は以下の特徴を包含する：
（１）シアン化合物分解能を有する微生物の検出方法であって、微生物由来の核酸を鋳型として、以下のプライマー：
（ａ）センスプライマー
5’-GG(T/C/A/G/I)CA(T/C/I)AT(T/C/A/I)CC(T/C/A/G/I)GG(T/C/A/G/I)GC-3’（配列番号3）
（ｂ）アンチセンスプライマー
5’-(A/G/I)TT(T/C/A/G/I)CCCCA(T/C/I)TC(T/C/A/G/I)(C/G/I)(T/A/I)CCA-3’（配列番号4）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)又はリアルタイムPCRを行い、ロダナーゼ遺伝子増幅産物を検出することを含む、上記方法。
（２）前記増幅産物を、電気泳動によって検出する、（１）に記載の方法。
（３）前記センスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-GGICA(T/C)AT(T/C/A)CCIGGIGC-3’（配列番号5）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記アンチセンスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-(A/G)TTICCCCA(T/C)TCI(C/G)(T/A)CCA-3’（配列番号6）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、（１）又は（２）に記載の方法。
（５）上記増幅産物の塩基配列を決定することをさらに含む、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）決定された塩基配列に基づいて微生物を同定することをさらに含む、（５）に記載の方法。
（７）（１）〜（６）のいずれかに記載の方法によって得られたロダナーゼ遺伝子増幅産物の配列が決定された核酸配列、その相補的配列又はその15塩基長以上の断片を用いて、微生物においてロダナーゼ遺伝子を検出することを含む、シアン化合物分解能を有する微生物の検出方法。
（８）ロダナーゼ遺伝子の検出を、前記核酸配列又はその15塩基長以上の断片が担体上に固定化されたマイクロアレイを用いて実施する、（７）に記載の方法。
（９）前記検出を、PCR、リアルタイムPCR又はハイブリダイゼーションによって実施する、（７）に記載の方法。
（１０）シアン化合物分解能を有する微生物を検出するためのプライマーセットであって、以下のプライマー：
（ａ）センスプライマー
5’-GG(T/C/A/G/I)CA(T/C/I)AT(T/C/A/I)CC(T/C/A/G/I)GG(T/C/A/G/I)GC-3’（配列番号3）
（ｂ）アンチセンスプライマー
5’-(A/G/I)TT(T/C/A/G/I)CCCCA(T/C/I)TC(T/C/A/G/I)(C/G/I)(T/A/I)CCA-3’（配列番号4）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
を含む、上記プライマーセット。
（１１）
前記センスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-GGICA(T/C)AT(T/C/A)CCIGGIGC-3’（配列番号5）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、（１０）に記載のプライマーセット。
（１２）前記アンチセンスプライマーが、以下の塩基配列：
5’-(A/G)TTICCCCA(T/C)TCI(C/G)(T/A)CCA-3’（配列番号6）
(ここで、Iはイノシンを表す。)
からなる、（１０）に記載のプライマーセット。
【００１３】
本明細書中、センス及びアンチセンスプライマーの配列において、例えば（T/C/A/G/I）なる表記は、T、C、A、G及びIのいずれか1つの塩基又はそれらの2つ以上の塩基のミックスを表す。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の検出方法を用いることにより、シアン化合物分解能を有する微生物を特異的に検出することができるため、バイオレメディエーションプロセスにおける微生物の浄化適合性を判断すること、及び微生物の浄化活性のモニタリングが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ロダナーゼは、チオ硫酸塩とシアン化水素からチオシアン塩と亜硫酸への反応を触媒する公知の酵素である。したがって、本発明で使用する「シアン化合物分解能を有する微生物」とは、ロダナーゼを産生する微生物を指す。
【００１６】
以下、本発明のシアン化合物分解能を有する微生物の検出方法及び該方法に使用するためのプライマーセットについて説明する。
【００１７】
本発明のシアン化合物分解能を有する微生物の検出方法は、所与の微生物属間で高度に保存されているロダナーゼ遺伝子内のアミノ酸配列を特定したことを基礎とする。したがって、本発明のシアン化合物分解能を有する微生物の検出方法は、微生物由来の核酸を鋳型とし、上記の保存されたアミノ酸配列をコードする核酸配列をプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（以下、単に「PCR」という）又はリアルタイムPCRを行い、ロダナーゼ遺伝子増幅産物を検出することを含む。
【００１８】
ここで、本明細書で使用する「検出」という用語は、単にサンプル中に特定の微生物が存在するかどうかを判定することだけでなく、特定の微生物がサンプル中にどのくらい存在するのかを判定すること（すなわち定量的検出）をも含むことを意味する。
【００１９】
本発明者らは、ノカルジオイデス(Nocardioides)属、アースロバクター(Arthrobacter)属、ミコバクテリウム(Mycobacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属を含む異なる微生物のロダナーゼ遺伝子間で高度に保存されている配列、(a)Gly-His-Ile-Pro-Gly-Ala（配列番号1）で表されるアミノ酸配列と(b)Trp-Thr-Glu-Trp-Gly-Asn（配列番号2）で表されるアミノ酸配列を見出した。
【００２０】
また、上記アミノ酸配列に対応する核酸配列は以下の通りである：
【００２１】
【化１】
2008283890.tif 000002
【００２２】
【化２】
2008283890.tif 000003
【００２３】
上記の配列番号1及び2のアミノ酸配列を構成する核アミノ酸に対応したコドンに基づいて、それぞれ下記のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを設計することができる：
【００２４】
【化３】
2008283890.tif 000004
【００２５】
【化４】
2008283890.tif 000005
【００２６】
上に示すように、センスプライマーではC末端側のアラニンに対応するコドンの3番目の塩基が削除されている。また17merからなるセンスプライマー及び18merからなるアンチセンスプライマーの配列のうち、複数の塩基を指定する箇所では、A・G・C・Tの塩基に加えてN・R・S・Y・W・Hで表示されるミックス塩基や、ユニバーサル塩基であるイノシン（I）を挿入してもよい。
【００２７】
したがって、本発明の検出方法では、微生物由来の核酸を鋳型とし、配列番号3をセンスプライマー、配列番号4をアンチセンスプライマーとして用いたPCRを行うことによって、ロダナーゼ遺伝子増幅産物を検出することができる。
【００２８】
配列番号3で特定されるセンスプライマーは複数の塩基を指定する箇所を含むことから複数種類の核酸配列が特定され得るが、本発明においてはそのうちの1種類のみを使用してもよいし、複数種類の核酸配列を含むランダムプライマーの形態で使用してもよい。これは配列番号4のアンチセンスプライマーについても同様である。
【００２９】
本発明の検出方法において、鋳型とする微生物由来の核酸は常法に従って調製することができ、特別な方法を用いる必要はない。例えば、鋳型DNAは、微生物の破壊液から常法に従って全RNAを取得し、オリゴdTカラムにてmRNAを回収し、逆転写酵素の存在下でcDNA合成を行うことによって得ることができる。
【００３０】
本発明で使用する上記プライマーは、例えば適当な配列のクローニング及び制限酵素による切断、ホスホトリエステル法（例えばNarangら，1979年，Meth.Enzymol.，第６８巻，p90〜99参照）、ホスホジエステル法（例えばＢｒｏｗｎら，1979年、Meth.Enzymol.，第68巻，p109〜151参照）、エチルホスホアミダイト法（例えばBeaucageら，1981年，Tetrahedron Lett.，第22巻，p1859〜1862参照）などの方法により、直接的に合成することができる。市販の自動DNA合成装置を使用することによって目的のプライマーを合成してもよい。
【００３１】
本発明の検出方法において、PCRは常法に従って行うことができる。PCRは、例えば、微生物由来の鋳型DNA、上記センスプライマー及びアンチセンスプライマー、4種の塩基（dNTP）並びに耐熱性DNAポリメラーゼの存在下、変性、アニーリング及び伸長を１サイクルとして、通常20〜40サイクルを実施することを含む。変性は、二本鎖DNAを一本鎖に解離するための処理であり、通常94〜96℃、15秒〜5分間の処理を行う。アニーリングは、一本鎖の鋳型DNAに、それに相補的なプライマーをアニーリングする処理であり、使用するプライマーに応じて設定されるTm値以下の温度、例えば50〜65℃で、30秒〜2分間の処理を行う。伸長反応は、鋳型DNAに沿ってプライマーを伸長する反応であり、通常72℃で30秒〜10分間の処理を行う。Tm値は、使用するプライマーの塩基配列に基づいて当業者が適宜設定することができる。本発明の方法において、プライマーの特異的な結合を保証するために、アニーリングの温度はTm値−5℃以上の温度を使用することが好ましい。
【００３２】
本発明の検出方法において、ロダナーゼ遺伝子増幅産物を検出する方法に特に制限はない。例えば、増幅したDNA断片を電気泳動し、泳動したDNA断片を例えばエチジウムブロマイド等で染色し、予想されるサイズの断片の存否を検証することによってロダナーゼを検出することができる。
【００３３】
なお、本プライマーの組み合わせを使用してPCRを行った場合、増幅が期待されるDNA断片の長さは700bp程度である。このようにPCRを利用することにより、検出対象であるシアン化合物分解能を有する微生物数がかなり少ない場合でも高感度かつ特異的に該微生物の検出が可能である。
【００３４】
また、本プライマーの組み合わせを使用してリアルタイムPCRを行うことにより、シアン化合物分解能を有する微生物の定量的検出が可能である。リアルタイムPCRは、PCRによる増幅を継時的に測定することで、増幅率に基づいて鋳型となるDNAの定量を行う手法である。リアルタイムPCRは常法に従って実施することができ、例えば二本鎖DNAに結合して蛍光を発する試薬（インカレーター:SYBR（登録商標）Green I）を添加してPCRを実施する手法、5'末端を蛍光物質（FAMなど）、3'末端をクエンチャー物質（TAMRAなど）で修飾したオリゴヌクレオチドプローブをPCR反応系に添加する手法などによって実施することができる。
【００３５】
リアルタイムPCRの概要については、例えばHiguchi, R., Fockler, C., Dollinger, G.及びWatson, R. 1993. Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026−1030を参照されたい。
【００３６】
本発明の検出方法によって検出し得る微生物は、ロダナーゼ酵素を産生する任意の微生物であり、例えばこれに限定されるものではないが、ノカルジオイデス属、アースロバクター属、ミコバクテリウム属、シュードモナス属、チオバチルス属、アゾトバクター属、フェロバチルス属、アシネトバクター属、フェロバチルス属、エシェリヒア属、シゲラ属、シトロバクター属、クレブシエラ属、エンテロバクター属、ハフニア属、アシディチオバチルス属、ウォリネラ属に属する細菌が挙げられる。
【００３７】
本発明の検出方法では、上記のようにPCR増幅したロダナーゼ遺伝子産物の塩基配列を決定するステップをさらに含んでもよい。これにより、例えばGenBank、UniGeneなどの遺伝子データベースに登録された塩基配列を照会することにより、目的の遺伝子であるか否かを判別する、或いは微生物を確定することができる。本発明で使用する塩基配列の決定方法に特に制限はなく、例えばジデオキシ法等の公知の方法により実施することができる。
【００３８】
一般的に、ロダナーゼ遺伝子の塩基配列は微生物属間で顕著に異なるばかりでなく、同属種間又は株間でも異なっており、その相違度は同一種間で比較を行った場合、16S rRNAの塩基配列に比べて顕著に高く、そのため、16S rRNAのように複数のプライマーを用いて長い塩基配列を決定する必要がない。したがって、複雑な生化学検査を行うことなしに簡便かつ高精度に微生物の同定を行うことができる。また、決定した塩基配列をそのままプローブとして利用することもでき、さらには近縁の微生物種の塩基配列を同様に求めて多重比較を行うことにより、非常に高い特異性を有するプローブの作成が可能である。これらのプローブにより、未知の微生物を多数含む天然菌叢中でも目的とする微生物を特異的に検出できる。また、容易に微生物を遺伝子レベルで表現できるため、未同定の新種の記述を行うことが可能である。
【００３９】
したがって、本発明はさらに、上記の方法によって得られたロダナーゼ遺伝子増幅産物の配列が決定された核酸配列、その相補的配列又はその一部配列を用いて、ロダナーゼ遺伝子を検出することを含む、シアン化合物分解能を有する微生物の検出方法を提供する。
【００４０】
ここで、「その一部配列」とは、ロダナーゼをコードする塩基配列又はその相補的配列の少なくとも15塩基、好ましくは少なくとも20塩基、より好ましくは少なくとも25塩基、例えば少なくとも30塩基、少なくとも50塩基、少なくとも100塩基の長さの断片を指す。
【００４１】
この方法では、比較的高い特異性を有するプローブを設計することができるときには、PCR、リアルタイムPCRのほか、サザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどの各種ハイブリダイゼーション法による直接的な検出又は定量的検出が可能である。
【００４２】
その際、上記核酸配列を放射性同位元素、酵素、蛍光物質等で標識することが好ましい。これにより、シアン化合物分解能を有する微生物の検出を簡便かつ容易にすることができる。本発明の核酸配列を標識する物質としては、放射性同位元素、蛍光物質など、これに限定されるものではないが例えば３２Ｐ、アルカリホスファターゼ、ＦＩＴＣ、ローダミン、フルオレサミン、ダンシル、ビオチン、ジゴキシゲニン、テトラメチルローダミン（TAMRA）、それらの誘導体などを挙げることができる。
【００４３】
本発明の検出方法においては、ロダナーゼ遺伝子の検出を、配列決定した上記核酸配列又はその一部が担体上に固定化されているDNAマイクロアレイを用いて実施することもできる。ここで使用できる担体として、これに限定されるものではないが、例えばガラス、金属、種々のプラスチック樹脂などの平面基板を挙げることができる。また固定化方法として、これに限定されるものではないが、例えば基盤の持つ電荷と核酸の電荷とを利用する吸着固定法や、ポリ−L-リジンなどを基盤表面にコートして固定効率を向上させる固定法などが挙げられる。この場合、検出対象である微生物由来の核酸を、例えばサイアニンなどにより蛍光標識することができる。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号3又は5で表されるセンスプライマーと配列番号4又は6で表されるアンチセンスとの組み合わせからなるプライマーセットを提供する。このプライマーセットは、センスプライマー、アンチセンスプライマー共に、上記のような複数種類の核酸配列を含むランダムプライマーの形態であってもよい。
【実施例１】
【００４５】
本実施例では、シアン化合物に対して浄化能力をもつノカルジオイデス・エスピー（Nocardioides sp.）HG-2株のゲノムDNAにおいて、配列番号3に示すセンスプライマーの配列を基にして作製したFwプライマー（5’-GGICAYATHCCIGGIGC-3’：配列番号5）と、配列番号4に示すアンチセンスプライマーの配列を基にして作製したRvプライマー（5’-RTTICCCCAYTCISWCCA-3’：配列番号6）を使用したロダナーゼ遺伝子のPCR増幅試験を行った。同様の試験を、シアン浄化能力を持たないエシェリシア・コリ（Escherichia coli） JM109株とサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritime）のゲノムDNAにおいても実施した。PCR反応液の組成は下記に示す通りである。
【００４６】
【表１】
2008283890.tif 000006
【００４７】
PCR反応では、まず反応液を96℃で3分間変性反応を行った。続いて変性反応96℃・30秒、アニ―リング反応50℃・30秒、伸張反応72℃・1分を1サイクルとした一連の反応を、30サイクル分実施した。
【００４８】
上記のPCR反応により増幅したDNA断片を2％のアガロースゲルにアプライし、TAEバッファーを使用して100Vの電圧をかけ30分間電気泳動を行った。続いて電気泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロミド溶液に浸し、ゲル中のDNA断片の染色を行った。
【００４９】
図１にアガロース電気泳動・エチジウムブロミド染色後のDNA断片の写真を示す。図1から分かる通り、ノカルジオイデス・エスピー由来のゲノムDNAを鋳型として用いた試験でのみ、700bpに付近にDNA断片が確認され、そのサイズのDNAの良好な増幅が起こったことが示された。ここで使用したプライマーでは696bpサイズのDNA断片が予想されていたことから、これと合致した実験結果が得られたことになる。つまり、本発明によるプライマーを使用することで、シアン浄化に関わるロダナーゼ遺伝子を特異的かつ効率よく検出できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】図１は、本発明に係る核酸配列をPCRプライマーとして使用したPCRにより、ノカルジオイデス・エスピー（Nocardioides sp.）HG-2株のロダナーゼの特異的な増幅が生じることを示す。
【図１】
2008283890.tif 000007
【配列表】
2008283890000001.app