(57)【要約】【課題】  ＨＨＶ−６感染に感受性が高く、ガンシクロビル耐性の有無に関わらず、効率よくＨＨＶ−６を増殖させ得る細胞、およびＨＨＶ−６の感度の高い検出法を提供すること。【解決手段】  ヒトＭｏｌｔ３を処理し、ＨＨＶ−６に感受性の高いヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株を得る。また、この細胞を使用して、ＨＨＶ−６の既知あるいは未知の多様なタイプを効率よく迅速に検出できるような検出法が確立できる。さらに、ＰＣＲ用のプライマーをＨＨＶ−６のＵ６９内の特定の領域に設定することにより、ＨＨＶ−６を効率よく迅速に増幅させ、ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株との組合せにおいて、非常に優れたＨＨＶ−６の検出系の確立が可能となる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株であって、インビトロにおいてＨＨＶ−６による感染に感受性が高い細胞。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３＃１９である、請求項１に記載のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株。
【請求項３】
ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）を産生する方法であって、以下の工程を包含する方法：
・  請求項１または２に記載のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株を、ＨＨＶ−６と接触させ、それにより該Ｍｏｌｔ３誘導細胞株にＨＨＶ−６感染を生じさせる工程；および
・  該感染細胞をインキュベートする工程。
【請求項４】
前記ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株が、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３＃１９である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）が、ガンシクロビルに耐性を有する変異体である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記感染細胞をインキュベートする工程が、ガンシクロビルの存在下においてなされる請求項３から５までのいずれかに記載の方法。
【請求項７】
配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、５２２番から７１４番の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなる、ＨＨＶ−６を検出する為のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項８】
配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、５７２番から５９６番の塩基配列からなる請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項９】
配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、６３９番から６６４番の塩基配列に相補的な配列である請求項７に記載のオリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅反応を行うＨＨＶ−６の検出方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＨＨＶ−６の存在の有無を検出する方法。
【請求項１２】
請求項７〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてガンシクロビル存在下において産生されるＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＨＨＶ−６のガンシクロビル耐性の有無を検出する方法。
【請求項１３】
前記標的核酸領域の増幅を検出する為のＨＨＶ−６が、請求項３または４に記載の方法で得られる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）に対する感染に感受性の高いヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株、およびそれを用いたＨＨＶ−６産生方法に関する。さらに、本発明は、ＨＨＶ−６検出の為のプライマー、およびそれらを用いたＨＨＶ−６の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＨＶ−６は、広く知られている８種のヒトヘルペスウイルス属の１つであり、１９８６年に、Saluhuddin等によって後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）患者、及びリンパ球系疾患患者のリンパ球より第６番目のヘルペスウイルスとして分離され（1986, Science, 234, 596-601 ）、１９８８年、山西等によって、他の型との分子レベルおよび免疫学的分析による比較がなされ、突発性発疹の原因ウイルスであることが明らかにされた（1988, Lancet, 1065-1067 ）。ＨＨＶ−６は、主にＣＤ４＋リンパ球に存在し、単球／マクロファージ系統の細胞に潜伏感染する。子どもには突発性発疹を引き起こすが大人に対しては、特に症状を引き起こさない場合も多い。
【０００３】
しかしながら、成人期にＨＨＶ６Ａが再活性化することで疾患が発現する可能性がある。通常、免疫機構によって再活性化が抑制されているが、このウイルスは潜在し再活性化する。成人期における再活性化は、単球増加症候群、自己免疫疾患および神経系疾患、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染と関連があると考えられている。
【０００４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している患者、あるいは臓器又は組織移植後の患者に対しては、感染により、骨髄機能の抑制または炎症が起こり、さらに、脳、肝臓あるいは肺などの組織に損傷が生じる可能性があるなど、重篤な症状を顕すことが確認されている。この為、ＨＨＶ−６の検出は、臨床上重要な意味を持つ。
【０００５】
現在ＨＨＶ−６感染の治療方法としては、サイトメガロウイルスにも有効なアシクロビル誘導体のガンシクロビルが作用し、効果をあげている。ガンシクロビルは、ヌクレオシドアナログであり、宿主細胞の酵素を使って活性のあるリン酸化型に変わる。このリン酸化型が、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼを阻害することにより、宿主内におけるウイルスの増殖が抑えられる。
【０００６】
近年このガンシクロビルの治療に反応しないサイトメガロウイルスやＨＨＶ−６の変異体も発見され（Manichanh ら, 2001, de Bolle ら, 2002, Safronetzら, 2003）、深刻な問題となっており、この面からもＨＨＶ−６の検出の必要性は高い。
【０００７】
ＨＨＶ−６を検出する為には、被検体に含まれるウイルスをある程度インビトロで増殖させる必要があるが、入手困難な臍帯血中の細胞など、ごく限られた細胞でしか増殖することができないなどの特殊な事情がある。
【非特許文献１】Saluhuddinら、1986, Science, 234, 596-601
【非特許文献２】Yamanishiら、1988, Lancet, 1065-1067
【非特許文献３】Manichanh ら, 2001, J.Gen. Virol. 82, 2767-2776
【非特許文献４】de Bolle ら, 2002, Mol. Pharmacol. 62, 714-721
【非特許文献５】Safronetzら, 2003, J. Med. Virol. 71, 434-439
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、ＨＨＶ−６は、小児における突発性発疹などの疾患の原因であり、かつ免疫不全患者において、重篤な症状を示す上、従来使用されている薬剤に対する耐性を持つ変異体の発見もなされ、迅速かつ簡単な検出方法の確立の必要性があったにもかかわらず、そのような迅速かつ簡単でありながら、変異体をも含めて確実に検出する方法は見出されていない。そのため、この解決法が要望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ＨＨＶ−６の変異体も含めたすべてのタイプを検出でき、かつ極微量のウイルスをも正確に検出するような検出方法を提供すべく鋭意研究を行った結果、ガンシクロビル耐性の有無に関わらずＨＨＶ−６のすべてのタイプに対する感染に感受性の高い細胞を見出した。また、ガンシクロビル耐性の有無に関わらずＨＨＶ−６のすべてのタイプを微量であっても効率よく検出することができるプライマーを見出し、これらを用いた検出方法等を確立して、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株は、ＨＨＶ−６感染に感受性が高い。
【００１１】
上記ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３＃１９であり得る。
【００１２】
本発明のヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）を産生する方法は、以下の工程を包含する。
・  上記のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株を、ＨＨＶ−６と接触させ、それにより該Ｍｏｌｔ３誘導細胞株にＨＨＶ−６感染を生じさせる工程；および
・  上記感染感染細胞をインキュベートする工程。
【００１３】
前記ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３＃１９であり得る。
【００１４】
上記ヒトヘルペスウイルス６型（ＨＨＶ−６）は、ガンシクロビルに耐性を有する変異体であり得る。
【００１５】
前記感染細胞をインキュベートする工程は、ガンシクロビルの存在下または不存在下においてなされ得る。
【００１６】
本発明のＨＨＶ−６を検出する為のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、５２２番から７１４番の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなる。
【００１７】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、配列表の配列番号１の５７２番から６６４番の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなり得る。
【００１８】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、５７２番から５９６番の塩基配列からなるプライマーであり得る。
【００１９】
上記オリゴヌクレオチドプライマーは、配列表の配列番号１で示されるＨＨＶ−６のＵ６９に由来する塩基配列の、６３９番から６６４番の塩基配列に相補的な配列であるプライマーであり得る。
【００２０】
本発明のＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅反応を行うＨＨＶ−６の検出方法は、上記いずれかのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅反応を行う方法である。
【００２１】
本発明のＨＨＶ−６の存在の有無を検出する方法では、上記いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅を検出することにより、ＨＨＶ−６の存在の有無を検出する。
【００２２】
本発明のＨＨＶ−６のガンシクロビル耐性の有無を検出する方法では、上記いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてガンシクロビル存在下において産生されるＨＨＶ−６の標的核酸領域の増幅を検出する。
【００２３】
上記標的核酸領域の増幅を検出する為のＨＨＶ−６は、Ｍｏｌｔ３誘導細胞株を用いて産生されるＨＨＶ−６であり得る。
【発明の効果】
【００２４】
本発明のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株は、ＨＨＶ−６感染に感受性が高く、ガンシクロビル耐性の有無に関わらず、効率よくＨＨＶ−６を増殖させ得る。その為、この細胞を使用する検出方法においては、ＨＨＶ−６の既知あるいは未知の多様なタイプを効率よく迅速に検出できる。さらに、本発明のプライマーは、例えばＰＣＲ法において、ＨＨＶ−６を効率よく迅速に増幅させ得るプライマーであり、特に上記のヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株との組合せにおいて、非常に優れたＨＨＶ−６の検出系の確立が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２６】
本発明のＨＨＶ−６ウイルスは、限定はされないが、例えば突発性発疹の患者から単離される。本発明でＨＨＶ−６ウイルスというときは、ＨＨＶ６ＡおよびＨＨＶ６Ｂの２種類の亜型のいずれも含む。また、ガンシクロビル感受性のタイプのみならず、ガンシクロビル耐性の変異タイプも含む。さらに、天然に存在するか、改変されるか、または組換え体であるかに関わらず、すべてを含む。
【００２７】
本発明の「ＨＨＶ−６感染に感受性の高いヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株」とは、ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３から派生した細胞であって、インビトロの一定の感染効率（ＭＯＩ）での培養条件下において、ＨＨＶ−６で感染させることができ、細胞内でＨＨＶ−６を増殖させ、かつＨＨＶ−６をビリオンとして細胞外に放出し得るような細胞をいう。
【００２８】
このような細胞は、通常のＭｏｌｔ３細胞を、継代培養し、例えば限界希釈法により各株を分離して得ることができる。このようにして得られたヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株のうち、特に独立行政法人産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３＃１９は、ＨＨＶ−６に対する感染効率がよく、また、ガンシクロビル耐性の有無に関わらず、ＨＨＶ−６の多様なタイプを増殖し得る。
【００２９】
本発明においては、このようなヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株を用いて、ＨＨＶ−６の効率のよい産生が可能である。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、細胞とウイルスとを「接触させる」とは、このウイルスを細胞の培養物中に置き、その結果、このウイルスがこの細胞と接触するような状況におかれることをいう。ヒトＴ細胞Ｍｏｌｔ３誘導細胞株に対するＨＨＶ−６産生の過程における接触は、遠心法を用いて行うことができる。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ウイルス感染」とは、ウイルスの細胞への侵入を指すが、その後の細胞内でのウイルスの複製をも含めていう場合もある。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「感染効率」（ＭＯＩ）は、ウイルスが細胞と接触するために使用される場合のウイルスの数対細胞の数の比をいう。
【００３３】
通常のＭｏｌｔ３細胞は、ＨＨＶ−６感染に感受性ではない。ＨＨＶ−６は、天然に存在する臍帯血白血球細胞や末梢血単球などにはインビトロにおいて感染し得る。しかし、これらは入手し難く、インビトロの系で使いづらいという欠点がある。より入手しやすく感染効率の高い細胞を開発する本発明者らの試みにおいて、種々検討を行った結果、Ｍｏｌｔ３細胞から限定希釈法によって見出されるＭｏｌｔ３細胞誘導株が非常に効率的であると証明された。Ｍｏｌｔ３細胞誘導株を増殖させ、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１および１の感染効率（ＭＯＩ）でレトロウイルスと感染させた。ウイルスの収量を、感染後、種々の時間で決定した。驚くべきことに、Ｍｏｌｔ３細胞誘導株、特に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されているＭｏｌｔ３細胞誘導株Ｍｏｌｔ３＃１９は、感染の７２時間後、いずれの感染効率においても、少なくとも培養細胞から得られるものとして、リアルタイムＰＣＲ法で感知できるほどのウイルスを生成する。
【００３４】
これらの結果により、Ｍｏｌｔ３細胞誘導株は、ＨＨＶ−６の産生について非常に効率的な系であり、産生の効率化を可能にすることが示される。
【００３５】
ＨＨＶ−６の産生はまた、任意にガンシクロビルの存在下で細胞を培養することによっても行われ得る。この場合は、特にガンシクロビルの耐性があるＨＨＶ−６のタイプの検出に有用である。
【００３６】
このような本発明の細胞で増殖され、産生されるＨＨＶ−６のうち、キナーゼに関与するＵ６９の特定の領域に、ＰＣＲプライマーを設定することにより、ＨＨＶ−６の非常に検出感度の高い検出法を確立することができることが見出された。
【００３７】
本発明のプライマーは、配列表の配列番号１で示される、ＨＨＶ−６のＵ６９に由来する配列のうち、特定の領域である、配列表の配列番号１の塩基配列の、５２２番から７１４番の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなる、ＨＨＶ−６を検出する為のオリゴヌクレオチドプライマーであり、特にＰＣＲ法に好適に用いられる。好ましくは、本発明のプライマーは、配列表の配列番号１で示される、ＨＨＶ−６のＵ６９に由来する配列のうち、特定の領域である、配列表の配列番号１の塩基配列の、５７２番から６６４番の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１５ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１５ヌクレオチドからなる、ＨＨＶ−６を検出する為のオリゴヌクレオチドプライマーである。より具体的には、このようなプライマーのうち、フォワード側プライマー及びリバース側プライマーの組み合わせを設定してリアルタイムPCR 法によりHＨＶ−６を特異的にかつ効率的に検出することができる。リアルタイム PCR 法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、用いるフォワード側プライマー、リバース側プライマー及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができる。本明細書において、「検出」とは、存在の有無を確認することの他、定量を行うことも含む。
【００３８】
検体としては、検査対象となる患者の末梢血等から単離し得る細胞等が使用できる。好ましくは、上記のＭｏｌｔ３細胞誘導株により産生されたＨＨＶ−６を含有している可能性のある培養上清および／または培養細胞が使用されるが、これに限定されるものではない。また、特にガンシクロビル存在下で培養した感染細胞を検体とすると、ＨＨＶ−６のガンシクロビル耐性の存在の有無を容易に検出することができる。ＨＨＶ−６DNAの抽出は、市販のDNA抽出試薬キットを用いた常法により行うことができる。
【００３９】
ＨＨＶ−６DNAのＵ６９塩基配列は公知であり(GenBank Accession No.ＡＪ２９３２３５)、配列表の配列番号１に示す。
【００４０】
本発明では、配列表の配列番号１の５２２番から７１４番の塩基配列に含まれる配列に着目し、特にフォワード側プライマーとしてＴＴＴＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＣ（配列表の配列番号２）及びリバース側プライマーＴＧＧＣＣＧＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣ（配列表の配列番号３）の組み合わせを設定してリアルタイム PCR法を行うことができる。
【００４１】
これらのフォワード側プライマー及びリバース側プライマーを用いることにより、HＨＶ−６DNAを、HＨVの遺伝子型にかかわらず、またガンシクロビル耐性の有無に関わらず、特異的かつ高感度に検出することができる。
【００４２】
本発明の方法には、さらに上記配列表の配列番号１の５２２番から７１４番の間の任意の場所に位置する塩基配列を有する核酸断片に例えばFAM等のリポーター色素と、例えばTAMRA、MGB等のクエンチャー色素が結合された核酸プローブを作ることもできる。リアルタイムPCR法に用いられるリポーター色素やクエンチャー色素自体は周知であり、市販のキットに含まれているので、それらを用いることができる。
【００４３】
本発明の方法に用いられる核酸プローブは、フォワード側プライマーと前記リバース側プライマーとの間に挟まれる領域（両プライマーよりも内側の領域で、プライマーとは重複しない）にハイブリダイズする１２ヌクレオチド以上のものであれば特に限定されず、(+)鎖にハイブリダイズするものでも(-)鎖にハイブリダイズするものでもよく、それらの混合物でもよい。ここで、「ハイブリダイズする」とは、通常のリアルタイム PCR 条件下においてハイブリダイズするという意味であり、配列番号１中の上記領域又はその相補鎖に相補的な塩基配列を持つ断片であることが好ましいが、全体の１０％以下程度のミスマッチがある場合でも通常使用可能である。好ましくは、配列番号１に示される塩基配列の６０９番から６２６番の領域若しくはその相補鎖に含まれる連続する少なくとも１２ヌクレオチドから成る。
【００４４】
上記の通り、リアルタイムPCR法自体は周知であり、そのためのキット及び装置も市販されているので、用いるフォワード側プライマー、リバース側プライマー及びプローブを合成すれば、市販のキット及び装置を用いて容易に実施することができ、下記実施例にも具体的に記載されている。
【００４５】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００４６】
１．ウイルスおよび細胞の調製
臍帯血単球（ＣＢＭＣ）をフィコール・コンレイ比重遠心法で分離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に移し、５uｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニンで２−３日刺激した。  
【００４７】
突発性発疹の患者から単離され、ＨＨＶ−６Ｂグループに属するＨＳＴ株を、新鮮なヒト末梢血単核球中で増殖させた。一方骨髄移植後の患者から単離され、ＨＨＶ−６Ｂグループに属するＨＨＶ−６の臨床上の株、ＡＢ６９、ＡＢ８４、ＢＴ３４４、ＢＴ３４８、ＢＴ４１５、ＢＴ４４９、ＢＴ４５１、ＢＴ４９９、ＢＴ５１９、ＢＴ５５２、およびＢＴ５６２と、突発性発疹の患者から単離された６４６６は、新鮮なＣＢＭＣ中で増殖させた。８０％以上の細胞が、細胞変性効果を示した段階で、培養物の凍結と解凍を2回繰り返し、１，５００×ｇで10分間遠心分離し、上清を無細胞ウイルスストックとして‐８０℃にて保存した。
【００４８】
Ｍｏｌｔ３細胞の誘導株確立の為に、もとのＭｏｌｔ３細胞（米国オハイオ州クリーブランド、クリーブランドクリニックファンデーションのペレット博士から入手）のストックから、限界希釈法により、Ｍｏｌｔ３＃１９を得た。得られたＭｏｌｔ３＃１９は、ＨＨＶ−６株に高い感受性を持つことが確認された。このＭｏｌｔ３＃１９は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２２８で寄託されている。
【００４９】
ウイルス感染した細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３−５×１０５細胞／ｍｌで懸濁し、３７℃にて５％ＣＯ２中でインキュベートした。インキュベートを８２時間行った後、この培養物を１，５００×ｇで10分間遠心分離した。得られたビリオンをＤ−ソルビトール勾配速度遠心分離法にてさらに精製した。簡単に言えば、ウルトラクリア遠心チューブ（ベックマン）中に、３０ｍｌの感染細胞の上清を、２０％Ｄ−ソルビトール、５０ｍＭトリスーＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭＭｇＣｌ２、および１００ｕｇ／ｍｌバシトラシンを含む７ｍＬソルビトールクッション上に上層した。次にビリオンを室温での１時間の５，５０００×ｇの遠心で沈澱させた。沈殿物を、ＲＰＭＩ１６４０培地に再度懸濁させ、精製ビリオンを作成した。
【００５０】
２．細胞の培養法
Ｍｏｌｔ３＃１９またはその他の細胞株を、ＨＨＶ−６で感染させ、その感染細胞を、ガンシクロビルの存在下または不存在下において、培養した。感染および無感染細胞を、培養０、１、２、３、４、５、および６日目のそれぞれにおいて、３×１０５細胞数で回収し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で２回洗浄した。
【００５１】
３．ＨＨＶ−６変異体の人為的作成
Ｍｏｌｔ３＃１９を、ＨＳＴ株、ＢＴ３４４、ＢＴ４５１あるいは６４６６株で感染させた。この感染した細胞を、ガンシクロビルの存在（３５ｕｇ／ｍｌ）下において培養した。ＨＨＶ−６感染の経時変化を見る為に、週に２回培養物のサンプリングを行い、その上清および細胞の両方を、以下の４に示すリアルタイムＰＣＲに供した。ポジティブシグナルで、細胞のベータアクチンＤＮＡに対するＨＨＶ−６ＤＮＡが、１０５より多いコピー数を示した時、細胞培養物を５つに分け、次に感染していないＭｏｌｔ３＃１９を１：１になるように加えた。これを７ヶ月３０代繰り返した結果、それぞれ、ＨＳＴ、ＢＴ３４４、ＢＴ４５１、および６４６６由来のＨＨＶ−６変異体である、ＨＳＴ  ＧＲ‐１、Ｃ３  ＧＲ‐１、Ｃ７  ＧＲ‐１、Ｃ１２  ＧＲ‐１と名づけられたガンシクロビル耐性変異体を得た。
【００５２】
４．ＨＨＶ−６ＤＮＡのＰＣＲによる定量分析
検体から、DNA抽出試薬キット、QIAamp DNA blood Mini Kit (50) 品番51304 (商品名、(株)キアゲン)を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出した。このＤＮＡサンプルを用いて、TaqMan PCRディテクション (パーキンエルマ社アプライドバイオシステムズ部門) を用い定量を行った。用いた細胞数は、３×１０５細胞である。PCR 反応のプライマーとしては以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【００５３】
フォワード側プライマーとしてＴＴＴＧＴＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＣ（配列表の配列番号２）及びリバース側プライマーＴＧＧＣＣＧＴＣＴＴＴＡＴＧＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣ（配列表の配列番号３）。ＰＣＲを行うに当っては、上記プライマーの組み合わせと、核酸プローブとして、５‘末端に６−カルボキシフルオレセインのリポーター色素と、３’末端に６−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘Ｎ’−テトラメチルローダミンのクエンチャー色素を有するＡＧＴＧＧＧＴＧＣＣＴＡＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＴ（配列表の配列番号４）を用いた。
【００５４】
ＰＣＲの反応条件は、サンプル２．５uｌを用い、各プライマー５００ｎＭ（そのまま、および希釈率１０倍および１００倍）、１５０ｎＭのプローブを用いて行った。Ｔａｑポリメラーゼ 2.5単位となるように各組成を加え、最終２５uｌとして５０℃２分、９５℃１０分を４０サイクル、９５℃ １５秒、６０℃ ３０秒のサイクルを４０サイクル繰り返しＰＣＲを行った（パーキンエルマモデル７７００）。増幅産物は、ＳＤＳ１．６ソフトウエアパッケージ（パーキンエルマ社）にて分析した。ＰＣＲのコントロールとして、β―アクチンのＤＮＡを用い、コピー数の定量を行う。また、１０１から１０８コピー数のｐＡｃ−Ｈｉｓ−ＨＳＴＵ６９（Ｕ６９の全長をインサートに持つ）も同時にＰＣＲを行った。
【００５５】
５．アッセイ法
ＨＨＶ−６ＤＮＡ複製の速度は、感染細胞の培養物の細胞と上清から得られるウイルス数の増加を経時的に測定することによって調べた。２４ウエルプレート中のＭｏｌｔ３＃１９にＨＨＶ−６のＨＳＴ株を１、０．１、０．０１、０．００１、および０．０００１のＭＯＩで感染させた。ＨＨＶ−６ＤＮＡの上清および感染細胞を、リアルタイムＰＣＲで２４時間毎に測定した。
【００５６】
６．ガンシクロビル耐性検出法
ＨＨＶ−６感染細胞（ＭＯＩ０．０１）を、１００ｕＭのガンシクロビルの存在下または不存在下において、７２時間培養した。細胞培養物の上清および細胞から、DNA抽出試薬キット、QIAamp DNA blood Mini Kit (50) 品番51304 (商品名、(株)キアゲン)を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出し、上記４に示したＰＣＲに供した。
【００５７】
７．ガンシクロビル阻害活性（ＩＣ５０）のアッセイ
ＭＯＩのガンシクロビル阻害活性（ＩＣ５０）に与える影響について、ガンシクロビルの濃度を様々に変化させ、感染細胞を培養することによって行った。培養の３日目および６日目において、細胞培養物の上清および細胞から得られるＤＮＡをＰＣＲに供してＩＣ５０を求めた。
【００５８】
８．ＰＣＲを用いたガンシクロビル感受性テスト
ＭＯＩ０．０１で感染させた細胞（５００ｕ１、６Ｘ１０５  細胞数／ｍｌ）を、ガンシクロビル２．５から２５００ｕＭの範囲で存在させた、２４ウエル培養プレートで培養した。プレートを３７℃にて３日間インキュベートし、１ｍｌの培養上清と細胞とを回収し、細胞培養物の上清および細胞から、DNA抽出試薬キット、QIAamp DNA blood Mini Kit (50) 品番51304 (商品名、(株)キアゲン)を用い、キットマニュアルに従いＤＮＡを抽出し、上記４に示したＰＣＲに供した。
【００５９】
９．組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）リダクションアッセイ（ＴＲＡ）
ＭＯＩ０．０１で感染させた細胞（５００ｕ１、６Ｘ１０５  細胞数／ｍｌ）を、ガンシクロビル２．５から２５００ｕＭの範囲で存在させた、２４ウエル培養プレートで培養した。プレートを３７℃にて４日間インキュベートし、細胞変性が目視により観察された。細胞培養物の上清を回収して、段階１０倍希釈をＴＣＩＤ５０アッセイに供した。Ｍｏｌｔ３＃１９細胞（１Ｘ１０５ｃｅ１１ｓ）を９６ウエル培養プレートで、１０倍段階希釈法にて、１００ｕ１ずつ培養した。プレートは、３７℃で６日から７日行った。このとき、ガンシクロビルなしの培養条件では細胞変性が見られた。細胞をHHV-6の糖蛋白ｇＢおよびｇＨに対するモノクローナル抗体ＯＨＶ−１およびＯＨＶ−３と反応させ、FITCラベルの抗マウスIgG抗体で染色し、感染効率を求めた。ＩＣ５０は、ガンシクロビルなしの条件と比較して、ＴＣＩＤ５０を５０％減少させた濃度として求めた。
【実施例２】
【００６０】
（ＨＨＶ−６ の産生のために最適な細胞株の決定）
感染の結果として産生されたＨＨＶ−６ の量において、Ｍｏｌｔ３＃１９と、Ｕ１、ＭＯＬＴ−20-2,  U937, MOLT-4細胞、ACH-2、CEM細胞、Vero、CV-1、FL、A549などのサルやヒトのfibroblast系の細胞とで差異が存在するか否かを決定するため、Ｍｏｌｔ３＃１９とこれらの異なる細胞を用いて、実施例１の２の方法で培養した後、産生されたＨＨＶ−６ の相対的な量についてアッセイした。
【００６１】
ウイルス産生の定量を、ウイルスと細胞との接触後種々の時点で培養物の細胞と上清を収集することにより達成した。実施例１の９に記載のＴＣＩＤ５０リダクションアッセイ（ＴＲＡ）方法に準じて、ウイルス感染の有無を決定した。この結果、Ｕ１、ＭＯＬＴ−２０−２、U937、MOLT-4細胞では１％以下の感染率、ACH-2、CEM細胞では、５−１０％の感染効率で、感染能のあるウイルスの生産は見出されなかった。また、Vero、CV-1、FL、A549などのサルやヒトのfibroblast系の細胞には感染しなかった。ウイルスの感染能、生産量共に、Ｍｏｌｔ３＃１９のみが顕著に多いことが示された。さらに、Ｍｏｌｔ３＃１９細胞は、ウイルスをより早く産生し、ＨＨＶ−６ の製造のための産生時間を短縮した。
【実施例３】
【００６２】
（最終ウイルス産生に対する開始感染効率の影響）
開始感染効率が、最終的なウイルス産生を決定するか否かを決定するため、Ｍｏｌｔ３＃１９細胞を、１、０．１、０．０１、０．００１、および０．０００１の開始感染効率（ＭＯＩ）で感染させ、５日培養した後、ＰＣＲ法によりウイルス量を検出した。その結果、開始ＭＯＩと最終ウイルス産生との間に実際に関連性が存在した（図１）。
【実施例４】
【００６３】
（アッセイ法の評価）
ＨＨＶ−６Ｕ６９の全長部位を鋳型に用いた場合と、各種タイプのＨＨＶ−６を鋳型に用いた場合のＰＣＲ法で、本発明の実施例１の４に記載のプライマーとプローブとを用いた場合、直線的相関関係が得られ、１０１から１０８コピーまで検知できた。
【実施例５】
【００６４】
（ＭＯＩと培養時間のガンシクロビルＩＣ５０に与える影響）
表１に示すようなＭＯＩと培養時間とで、Ｍｏｌｔ３＃１９細胞にＨＨＶ−６のＨＳＴ株を感染させ、培養し、それぞれガンシクロビルによるＩＣ５０をＰＣＲ法により調べた。
【表１】
2008154575.tif 000002
その結果、表１に示すように、ＭＯＩによりガンシクロビルＩＣ５０の差異が見受けられるが、培養時間による差異はそれ程ないこと、細胞からの抽出物と上清からの抽出物とで相関関係があること、上清からの抽出物の方が、ＭＯＩの違いによるガンシクロビルＩＣ５０の差異が大きいことなどがわかった。従って、本発明の検出法では迅速で正確な測定が可能である。
【実施例６】
【００６５】
（リアルタイムＰＣＲ法を用いた抗ウイルス剤に対する感受性テスト）
表２に示すＨＨＶ−６のタイプのすべてについて、Ｍｏｌｔ３＃１９感染細胞を用いて、ＰＣＲ法およびＴＣＩＤ５０リダクションアッセイによる感受性テストを行った。その結果を表２に示す。
【表２】
2008154575.tif 000003
この結果、本発明のＭｏｌｔ３＃１９感染細胞を用いて行うアッセイにおいては、ＰＣＲ法およびＴＣＩＤ５０リダクションアッセイの両方において、正確な検知、相関のよい結果が得られた。さらに、本発明のＰＣＲプライマーとプローブとを用いることにより、検出までの期間が３日ですみ、ＴＣＩＤ５０リダクションアッセイの１０日より迅速であり、かつ非常に感度がよいことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】異なるＭＯＩで感染させた後のＨＨＶ−６ＤＮＡの感染細胞からの収量の変化を示す図である。
【図２】異なるＭＯＩで感染させた後のＨＨＶ−６ＤＮＡの感染細胞培養物の上清からの収量の変化を示す図である。
【図１】
2008154575.tif 000004
【図２】
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【配列表】
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