(57)【要約】【課題】細胞に対してマイクロピペットの刺入操作を容易に行える細胞インジェクション装置を提供する。【解決手段】供給路１ａ内を移動してきた細胞ＣＬを、アクチュエータ２ｃが円筒部２ｂを第１の位置に駆動することで、所定の刺入位置に確実に捕捉することができ、更に捕捉された細胞ＣＬは、導入路１ｂを介して挿入されたマイクロピペットＭＰにより容易に刺入されることができる。特に、２つの円筒部２ａで細胞ＣＬを保持するために、確実なマイクロピペットＭＰの刺入が可能になる。又、細胞ＣＬが供給路１ａの底に吸着した場合で、円筒部２ａを細胞ＣＬに物理的に接触させることで、供給路１ａ内を確実に移動させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が移動する供給路と、前記供給路に交差する導入路とを形成したハウジングと、
前記供給路内に侵入する第１の位置と、前記供給路より退避する第２の位置との間で移動可能なストッパ部材と、
前記ストッパ部材を前記第１の位置と前記第２の位置との間で駆動する駆動手段と、を有し、
前記供給路内において前記第１の位置に移動した前記ストッパ部材により捕捉された細胞は、前記導入路を介して挿入されたマイクロピペットにより刺入されることを特徴とする細胞インジェクション装置。
【請求項２】
前記ハウジングは、ガラス基板に白金を蒸着し、レジストを塗布した上で、前記供給路と前記導入路とをパターニングした後、エッチングすることで形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。
【請求項３】
前記ストッパ部材は、ガラス基板に光硬化樹脂又はレジストを成膜し、その上に半透明金属薄膜を蒸着し、一部を残してエッチングすることで形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。
【請求項４】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材にエッチングマスクとレジストとをこの順序で形成した後に、露光と現像とにより前記レジストの一部を除去し、更にエッチング処理により前記レジストと前記エッチングマスクとを除去することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。
【請求項５】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材に膜材料とエッチングマスクとレジストとをこの順序で形成した後に、露光と現像により前記レジストの一部を除去し、更にエッチング処理により前記レジストと前記エッチングマスクと前記膜材料の一部とを除去することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。
【請求項６】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材にレジストを形成した後に、露光と現像とにより前記レジストの一部を除去することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。
【請求項７】
前記供給路と前記導入路は、金型を用いて形成されることを特徴とする請求項１に記載の細胞インジェクション装置。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば遺伝子や蛋白質のような生体高分子からなる細胞内導入物質を動物生体組織や細胞内に導入するのに好適な細胞インジェクション装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子や蛋白質のような生体高分子からなる細胞内導入物質を動物生体組織や細胞内に導入するには、ガラス針（マイクロピペット）を動物細胞又は組織細胞に直接刺入して、そこから細胞内導入物質を注入するマイクロインジェクション法が利用されている。
【０００３】
しかしながら、光学顕微鏡下で観察を行ないながらマイクロインジェクション法を実行する場合、細胞が平面的にしか見えないことから、実際にマイクロピペットを適切に刺入させることは困難である。特に、微細な細胞をトラップしてマイクロピペットの刺入操作を行うことは難しく、熟練者でないと効率の良い注入ができないことや、光顕微鏡を観察して画像観察しながら精密な位置決めを行なう必要があるという問題があった。
【０００４】
マイクロピペットの刺入操作の成功率を高めるために、基板面に細胞を確実にトラップする手法が提案されている。例えば、貫通穴を有する基板に吸引等を利用して細胞を固定する方法（特許文献１、２参照）や、基板の端面（側面）に粒子トラップ用開口端を有するマイクロチャネルアレイ装置を用いて細胞を吸入トラップし、顕微鏡観察の方向とその焦点深度内でのマイクロピペット先端の移動を可能にした技術（特許文献３参照）が開示されている。
【特許文献１】特開平１−１１２９７６号公報
【特許文献２】特開２０００−２３６５７号公報
【特許文献３】特開２００２−２７９６９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、従来技術においては細胞を所定位置に位置決めすることが難しく、従ってマイクロピペットの刺入操作は依然として困難であり、何らかの対策が求められていた。
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞に対してマイクロピペットの刺入操作を容易に行える細胞インジェクション装置を提供し、これにより画像観察に依存した精密な位置決めを行なう必要のない技術の提供を行い、また熟練者でなくても動物の細胞や受精卵等に、細胞内導入物質を導入できるようにし、更にインジェクション動作の高いスループットを得ることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞インジェクション装置は、
細胞が移動する供給路と、前記供給路に交差する導入路とを形成したハウジングと、
前記供給路内に侵入する第１の位置と、前記供給路より退避する第２の位置との間で移動可能なストッパ部材と、
前記ストッパ部材を前記第１の位置と前記第２の位置との間で駆動する駆動手段と、を有し、
前記供給路内において前記第１の位置に移動した前記ストッパ部材により捕捉された細胞は、前記導入路を介して挿入されたマイクロピペットにより刺入されることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞インジェクション装置は、細胞が移動する供給路と、前記供給路に交差する導入路とを形成したハウジングと、前記供給路内に侵入する第１の位置と、前記供給路より退避する第２の位置との間で移動可能なストッパ部材と、前記ストッパ部材を前記第１の位置と前記第２の位置との間で駆動する駆動手段と、を有するので、供給路内を移動してきた細胞を、前記駆動手段が前記ストッパ部材を前記第１の位置に駆動することで、所定の刺入位置に確実に捕捉することができ、更に捕捉された細胞は、前記導入路を介して挿入されたマイクロピペットにより容易に刺入されることができる。
【０００９】
本発明に係る細胞インジェクション装置に用いるハウジングに、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を利用して前記供給路と前記導入路を形成する場合、ガラスやシリコン基板、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）、セラミック材料を筐体の素材として、その表面に微小な溝を作製することで微細構造の製作が容易に可能であり、微細化、高い耐圧構造を極めて安価に実現できる上に、種々の材料を用いた設計が可能であるため耐薬品性にも優れた幅広い材料設計ができる。
【００１０】
前記ハウジングは、ガラス基板に白金を蒸着し、レジストを塗布した上で、前記供給路と前記導入路とをパターニングした後、エッチングすることで形成されると好ましい。
【００１１】
前記ストッパ部材は、ガラス基板に光硬化樹脂又はレジストを成膜し、その上に半透明金属薄膜を蒸着し、一部を残してエッチングすることで形成されると好ましい。
【００１２】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材にエッチングマスクとレジストとをこの順序で形成した後に、露光と現像とにより前記レジストの一部を除去し、更にエッチング処理により前記レジストと前記エッチングマスクとを除去することにより形成されると好ましい。
【００１３】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材に膜材料とエッチングマスクとレジストとをこの順序で形成した後に、露光と現像により前記レジストの一部を除去し、更にエッチング処理により前記レジストと前記エッチングマスクと前記膜材料の一部とを除去することにより形成されると好ましい。
【００１４】
前記供給路と前記導入路は、前記ハウジングの素材にレジストを形成した後に、露光と現像とにより前記レジストの一部を除去することにより形成されると好ましい。
【００１５】
前記供給路と前記導入路は、金型を用いて形成されると好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
次に、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。図１は、本実施の形態にかかる細胞インジェクション装置の斜視図であり、図２は、その上面図である。図１において、ハウジングを構成する基板１上には、左右方向に溝状の供給路１ａが延在し、供給路１ａの中央に交差するようにして溝状の導入路１ｂが手前側から延在している。供給路１ａの幅及び高さは、細胞ＣＬを１つ収容できる程度であり、一般的には１０μｍ〜１００μｍ程度である。供給路１ａの底面に、目盛りＭｋを設けると好ましい（図２参照）。供給路１ａに満たされた細胞培養液内を、複数の細胞ＣＬが１列に移動するようになっている。
【００１７】
駆動装置２は、供給路１ａに侵入可能な円筒部２ａと、円筒部２ａを先端に取り付けたアーム部２ｂと、アーム部２ｂを上下に駆動するアクチュエータ２ｃとをそれぞれ２組、導入路１ｂを挟んだ位置に設けてなる。ピエゾ素子、エアシリンダ、油圧シリンダ、ソレノイド等を駆動源とするアクチュエータ２ｃは、独立してアーム部２ｂを上下に駆動可能となっている。各アーム部２ｂはガラスから形成され、各円筒部２ａは底部を除いて光硬化樹脂で形成され、その底部は半透明金属が蒸着されている。円筒部２ａがストッパ部材を構成する。
【００１８】
先端の尖った中空のガラス製のマイクロピペットＭＰが、その先端を供給路１ａ内に侵入可能に、導入路１ｂに挿入されている。供給路１ａと導入路１ｂとの交差点の上部には、顕微鏡３を備えたＣＣＤカメラ４が配置されている。図示しないが、このほかに基板１下に置かれる移動ステージ、培養液を導入するシリンジポンプ、抽出装置、それらを結ぶ導入配管を備える。また、インジェクション動作を自動化するためのパソコンなどを設置してもよい。
【００１９】
次に、図１に示す細胞インジェクション装置の動作を説明する。まず、駆動装置２は、各アクチュエータ２ｃを駆動して、円筒部２ａを供給路１ａから退避した第２の位置におく。供給路１ａ内を細胞培養液で満たし、不図示のピペットにシリンジを接続してピストン部分を加圧し、供給側から細胞（動物の細胞や受精卵等）ＣＬの導入を行なう。このとき、供給路１ａよりサイズの小さな複数の細胞ＣＬは、電気泳動、圧力差、ピペットによる液流等によって、供給路１ａに沿って（ここでは右から左へと）１つずつ順に移動するようになっているが、円筒部２ａは供給路１ａから退避しているので、その通過を妨げることはない。作業者は、供給路１ａ上の目盛りＭＫを頼りに、ＣＣＤカメラ４で観察を行いながら、対象となる細胞ＣＬが接近するのを待つ。
【００２０】
ここで、対象となる細胞ＣＬが接近したときは、作業者は不図示のスイッチを投入し、排出側（図１で左側）のアクチュエータ２ｃを駆動して、アーム２ｂを介して円筒部２ａを供給路１ａに侵入する第１の位置へと移動させる（図１に示す状態）。これにより、図２（ａ）に示すように、対象となる細胞ＣＬが円筒部２ａにより通過を阻止され捕捉されることとなる。更に、作業者は不図示のスイッチを投入し、図２（ｂ）に示すように、供給側（図１で右側）のアクチュエータ２ｃを駆動して、アーム２ｂを介して円筒部２ａを供給路１ａに侵入する第１の位置へと移動させる。これにより、２つの円筒部２ａで細胞ＣＬを、導入路１ｂと交差する位置で挟持し捕捉することができる。尚、円筒部２ａの底部が半透明金属膜を持つため、流路基板上の目盛りＭＫによってＣＣＤカメラ４で観察を行いながら位置決めが容易になる。
【００２１】
かかる状態で、作業者が導入路１ｂからマイクロピペットＭＰを挿入すれば、導入路１ｂがガイドとなって、マイクロピペットＭＰの尖った先端を誘導し、円筒部２ａで挟持された細胞ＣＬに適切に刺入させることができ、それによりマイクロピペットＭＰ内の物質を細胞ＣＬ内に注入することができる。作業者は、注入後に細胞ＣＬの抽出用の装置（不図示）を用いて、注入した細胞ＣＬを抽出する。
【００２２】
図３は、アーム部２ｂと円筒部２ａの製作工程を示す図である。図３を参照して、アーム部２ｂと円筒部２ａの製作方法を示す。まず、アーム部２ｂを構成するガラス基板ＧＳ上に、光硬化樹脂やレジストなどの光感光樹脂ＯＲを成膜し、更にその上に半透明に反射率を調整した金属薄膜ＭＭを蒸着する（図３（ａ））。次に半透明の金属薄膜ＭＭをエッチングすることで一部のみ残して円筒部２ａの底部とし（図３（ｂ））、更に光硬化樹脂ＯＲをエッチングすることで一部のみ残して円筒部２ａの底部以外を形成し（図３（ｃ））、以上によりアーム部２ｂと円筒部２ａとを形成することができる（図３（ｄ））。
【００２３】
図４は、基板１の製作工程を示す図である。図４を参照して、基板１の製作方法を説明する。まず最初に、ガラス基板ＧＳ上に白金などにより、複数の目盛りＭＫを蒸着形成する（図４（ａ））。続いて、ガラスＧＳ上に、レジストＲＳを塗布する（図４（ｂ））。更に、供給路と導入路のパターニングを行った後に、エッチングし、供給路と導入路を形成する（図４（ｃ））。必要であればマイクロピペットＭＰの導入路１ｂを撥水剤などをもちいて疎水化処理してもよい。以上により、供給路１ａと導入路１ｂとを有する基板１を形成できる（図４（ｄ））。
【００２４】
基板１の別な製作方法について説明する。尚、以下の例では供給路の底面に白金による目盛りを形成していないが、上述と同様に設けることができる。
（１）エッチング流路加工法：
これは、基板Ｓに、ウエットエッチングまたはドライエッチングを用いて循環路用の供給路１ａと導入路１ｂを加工する方法である。図５に、エッチング流路加工法のプロセスフローを示す。まずエッチング部分以外を保護するためのエッチングマスク層ＥＭとして、クロムなどを真空蒸着やスパッタリングなどにより基板Ｓの上面に成膜する（図５（ａ）参照）。次にスピンコートによりレジストＲＳを、エッチングマスク層ＥＭの上面に均一の厚さで被覆する（図５（ｂ）参照）。その後、フォトリソグラフィーやその他の露光技術により、供給路１ａと導入路１ｂの形状にレジストのＲＳパターニング（パターン転写）を行った後（図５（ｃ）参照）、エッチングマスク層ＥＭをエッチングし（図５（ｄ）参照）、基板Ｓのエッチングを行い（図５（ｅ）参照）、最終的には、不要なエッチングマスク層ＥＭとレジストＲＳを除去して、基板Ｓに供給路１ａの形成を行う。導入路１ｂも同様にして形成できる。
【００２５】
エッチング流路加工法に用いる材料構成の実施例を以下に示す。
（実施例１）基板：石英又はガラス／エッチングマスク：Ｃｒ等／レジスト：フォトレジスト／マスクのエッチング液：Ｃｒエッチャント／基板エッチング：フッ酸溶液（ウエットエッチング）
（実施例２）基板：シリコン／エッチングマスク：ＳｉＯ2＋Ｃｒ等／レジスト：フォトレジスト／マスクのエッチング液：Ｃｒエッチャント（硝酸二アンモニウムセリウム＋過塩素酸）、ＳｉＯ2エッチャント（フッ酸緩衝溶液）／基板エッチング：ＫＯＨ又はＴＭＡＨを用いたウェットエッチング、又はＳＦ6を用いたドライエッチング、プラズマエッチング、ＲＩＥエッチング）
【００２６】
（２）膜材料を用いた流路加工法：
これは、基板に成膜した膜材料に流路用の微細な溝を加工する方法である。図６、７に膜材料を用いた流路加工法のプロセスフローを示す。本手法は、感光性の膜材料を露光することで微細な溝を形成できるｉ）感光材料を使用する場合と、ｉｉ)基板上の膜材料をエッチングで加工する非感光性材料を使用した場合などがある。
【００２７】
ｉ）感光材料を使用する場合は、基板Ｓ上にフォトレジストＰＲを塗布し（図６（ａ）参照）、フォトリソグラフィーやその他の露光技術でパターニングし（図６（ｂ）参照）、更に現像することで一部のフォトレジストＰＲを除去して供給路１ａと導入路１ｂを形成することができる（図６（ｃ）参照）。
【００２８】
ｉｉ)非感光材料を使用する場合は、図５を参照して説明したエッチング流路加工法に類似した作製方法を用いる。より具体的には、膜材料ＰＲとエッチングマスクＥＭとレジストＲＳを、この順序で基板Ｓの上面に成膜する（図７（ａ）参照）。次に、フォトリソグラフィーやその他の露光技術により、供給路１ａと導入路１ｂの形状にレジストのＲＳパターニング（パターン転写）を行った後（図７（ｂ）参照）、エッチングマスク層ＥＭをエッチングし（図７（ｃ）参照）、膜材料ＰＲのエッチングを行い（図７（ｄ）参照）、最終的には、不要なエッチングマスク層ＥＭとレジストＲＳを除去して、膜材料ＰＲに供給路１ａと導入路１ｂの形成を行う。収容部も同様にして形成できる。
【００２９】
膜材料を用いた流路加工法に用いる材料構成の実施例を以下に示す。なお、基板としてはガラス又はシリコンを用いることができるが、材料を特定せず非磁性材料であれば様々なものが使用できる。特に、膜材料にシリコンを用いる場合は、ＳＯＩ基板を使用することもできる。
【００３０】
（感光材料を使用する実施例１）膜材料：光硬化樹脂、厚膜レジスト又は感光性ポリミド
（非感光材料を使用する実施例２）膜材料：ＳｉＯ2ガラス等／レジスト：フォトレジスト／エッチングマスク：Ｃｒ等／膜のエッチング：フッ酸溶液（ウエットエッチング）
（非感光材料を使用する実施例３）膜材料：ポリミド等／レジスト：フォトレジスト／エッチングマスク：Ｃｒ、ＳｉＯ2等／膜のエッチング：ＫＯＨ又はＴＭＡＨを用いたウェットエッチング）
（非感光材料を使用する実施例４）膜材料：レジスト等／レジスト：フォトレジスト／エッチングマスク：ＳｉＯ2等／膜のエッチング：Ｏ2ガスを用いたドライエッチング
（非感光材料を使用する実施例５）膜材料：シリコン等／レジスト：フォトレジスト／エッチングマスク：Ｃｒ、ＳｉＯ2等／膜のエッチング：ＫＯＨ又はＴＭＡＨを用いたウェットエッチング、又はＳＦ6を用いたドライエッチング
【００３１】
なお、ＳｉＯ2エッチャントはフッ酸緩衝溶液であり、シリコン基板のエッチングは、ＫＯＨ又はＴＭＡＨを用いたウェットエッチング、又はＳＦ6を用いたドライエッチングが好適である。膜材料を用いた流路加工法においては、流路の深さが膜材料の膜厚より浅く加工されていてもよい。
【００３２】
（３）金型を用いた成形による流路加工法：
これは、流路用の微細な溝のパターンを転写するために準備した金型を利用して、金型の表面形状に相反する形状を転写することで流路用の微細な溝を作製する手法であるが、これは大量生産に適している。ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ‐ｄｉｍｅｔｈｙlｓｉｌｏｘａｎｅ）やシリコンゴムなどを金型の上で成型する成型手法とプラスチックに圧力をかけて金型に押しつけて成形する成形手法によってもよい。
【００３３】
図８は、金型からＰＤＭＳに微細な溝を形成するプロセスフローを示す図である。図８（ａ）において、微細な溝に対応する凸部を有する金型Ｍを製造する。続いて、図８（ｂ）に示すように、金型Ｍの凸部によりＰＤＭＳ上に供給路１ａ（及び導入路１ｂ）を転写形成する。更に図８（ｃ）に示すように、金型ＭよりＰＤＭＳを離型させることで、供給路１ａを有するハウジング等を形成できる。
【００３４】
図９は、金型から樹脂に微細な溝を形成するプロセスフローを示す図である。図９（ａ）において、微細な溝に対応する凸部を有する金型Ｍを製造する。続いて、図９（ｂ）に示すように、金型Ｍの凸部上に溶融した樹脂ＰＬをかぶせることで、供給路１ａを転写形成する。更に樹脂ＰＬが固化した後に、図９（ｃ）に示すように、金型Ｍより樹脂ＰＬを離型させることで、供給路１ａを有するハウジング等を形成できる。
【００３５】
以上述べたように、本実施の形態によれば、供給路１ａ内を移動してきた細胞ＣＬを、アクチュエータ２ｃが円筒部２ｂを第１の位置に駆動することで、所定の刺入位置に確実に捕捉することができ、更に捕捉された細胞ＣＬは、導入路１ｂを介して挿入されたマイクロピペットＭＰにより容易に刺入されることができる。特に、２つの円筒部２ａで細胞ＣＬを保持するために、確実なマイクロピペットＭＰの刺入が可能になる。又、細胞ＣＬが供給路１ａの底に吸着した場合で、円筒部２ａを細胞ＣＬに物理的に接触させることで、供給路１ａ内を確実に移動させることができる。
【００３６】
又、供給路１ａに設けられた目盛りＭＫによって、供給路１ａ内で細胞ＣＬを物理的に操作する円筒部２ａの位置決めを顕微鏡３の焦点深度に関係なく正確に実行することができる。供給路１ａは細いので、複数の細胞ＣＬを一列に導入できるために、マイクロピペットＭＰの刺入を１つずつ順に行なうことが可能である。マイクロピペットＭＰは導入路１ｂにガイドされるので、ＣＣＤカメラ４の顕微鏡画像に頼ることなく、マイクロピペットＭＰの位置決めを正確に行なえる。
【００３７】
以上、本発明を実施の形態を参照して説明してきたが、本発明は上記実施の形態に限定して解釈されるべきではなく、適宜変更・改良が可能であることはもちろんである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本実施の形態にかかる細胞インジェクション装置の斜視図である。
【図２】本実施の形態にかかる細胞インジェクション装置の上面図である。
【図３】アーム部２ｂと円筒部２ａの製作工程を示す図である。
【図４】基板１の製作工程を示す図である。
【図５】エッチング流路加工法のプロセスフローを示す図である。
【図６】感光性の膜材料を用いた流路加工法のプロセスフローを示す図である。
【図７】非感光性の膜材料を用いた流路加工法のプロセスフローを示す図である。
【図８】金型からＰＤＭＳに微細な溝を形成するプロセスフローを示す図である。
【図９】金型から樹脂に供給路及び導入路を形成するプロセスフローを示す図である。
【符号の説明】
【００３９】
１ 基板
１ａ 供給路
１ｂ 導入路
２ 駆動装置
２ａ 円筒部
２ｂ アーム部
２ｃ アクチュエータ
３ 顕微鏡
４ ＣＣＤカメラ
ＣＬ 細胞
ＥＭ エッチングマスク
ＧＳ ガラス
ＧＳ ガラス基板
Ｍ 金型
ＭＫ 目盛り
ＭＭ 金属薄膜
ＭＰ マイクロピペット
ＯＲ 光感光樹脂
ＯＲ 光硬化樹脂
ＰＬ 樹脂
ＰＲ フォトレジスト
ＰＲ 膜材料
ＲＳ レジスト
Ｓ 基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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