(57)【要約】【課題】二本鎖核酸の検出およびクローニングに際して、配列や核酸の形態による制限がなく、任意の二本鎖核酸上の任意の配列を配列特異的に高精度かつ効率的に認識できる技術の提供。【解決手段】配列特異的な二本鎖核酸の検出方法であって、二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列を有する第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成させる工程と、前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行う工程と、前記二本鎖核酸と結合した第２のオリゴヌクレオチドを検出する工程とを含む、二本鎖核酸の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的な二本鎖核酸の検出方法であって、
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成させる工程と、
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行う工程と、
前記二本鎖核酸と結合した第２のオリゴヌクレオチドを検出する工程とを含む、二本鎖核酸の検出方法。
【請求項２】
前記二本鎖核酸が、直鎖状である請求項１に記載の二本鎖核酸の検出方法。
【請求項３】
前記相同組換えタンパク質が、大腸菌由来のRecAタンパク質である請求項１又は２に記載の二本鎖核酸の検出方法。
【請求項４】
前記ポリメラーゼが、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼである請求項１〜３のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の検出方法。
【請求項５】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記二本鎖核酸上の前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む請求項１〜４のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の二本鎖核酸の検出方法を実施するための試薬を備えた、二本鎖核酸検出用キット。
【請求項７】
配列特異的な二本鎖核酸のクローニング方法であって、
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成させる工程と、
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行う工程と、
第２のオリゴヌクレオチドに結合した前記二本鎖核酸を分離する工程とを含む、二本鎖核酸のクローニング方法。
【請求項８】
前記二本鎖核酸が直鎖状である請求項７に記載の二本鎖核酸のクローニング方法。
【請求項９】
前記相同組換えタンパク質が、大腸菌由来のRecAタンパク質である請求項７又は８に記載の二本鎖核酸のクローニング方法
【請求項１０】
前記ポリメラーゼが、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼである請求項７〜９のいずれか一項に記載の二本鎖核酸のクローニング方法。
【請求項１１】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記二本鎖核酸上の前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載の二本鎖核酸のクローニング方法。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか一項に記載の二本鎖核酸のクローニング方法を実施するための試薬を備えた二本鎖核酸のクローニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二本鎖核酸の検出方法及びクローニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の発展は著しく、これらの蓄積された成果は生命科学現象の解明のみならず、医療分野における臨床的応用にまで大きく進みつつある。特に、生体試料から特定配列を有する核酸の検出及びクローニング等を含む核酸解析技術は、当該技術分野における基盤的技術である。したがって、その用途は多岐にわたり、例えば、遺伝子機能及び構造の解明や、新規遺伝子の探索等に利用されている、また、近年、一塩基多型等の遺伝子変異と病態や薬剤耐性の関係が解明されつつあり、遺伝子診断やテーラメード医療への利用が期待されており、核酸解析技術の利用価値は一層高まりつつまる。
【０００３】
従来、特定配列を有する核酸を検出、クローニングする方法としては、サザンハイブリダイゼーションに代表されるハイブリダイゼーション法が用いられている。しかしながら、ハイブリダイゼーション法では、検体から抽出した核酸を制限酵素で断片化した後、電気泳動等によりサイズ分画し、次いで一本鎖に変性するという煩雑な操作が必要であった。
【０００４】
これに対して、二本鎖核酸の所望の位置に、オリゴヌクレオチドをプローブとして配列特異的に結合させて、その結合体を安定化させることで、変性処理を施さず所与の塩基配列を有する二本鎖核酸を直接検出できる技術が報告されている。例えば、環状DNAと、ピリミジン類から排他的に構成されたオリゴヌクレオチドとの間で三本鎖構造体を形成した後、ソラレンで光架橋する技術が報告されている（非特許文献１を参照）。また、DNAに結合するが、特定の条件下では、DNAの切断を行わずに13bpの認識部位に対するタンパク質ラベルとして機能する制限酵素Sfilを利用する技術が報告されている（非特許文献３を参照）。しかしながら、これらの技術は、適用が特殊な塩基配列を有するものに限定される上、スーパーコイル状の二本鎖核酸のみへの適用に限定され直鎖状の核酸を含めた広範な核酸に適用できる技術ではないという問題点があった。更に、高温条件下で安定性を保持できない、酵素の存在下のみで安定である等、構造体の安定性の観点からも適用範囲や用途が限定されるものであった。しかも、架橋剤により三本鎖構造を安定化するため、プローブとして利用されるオリゴヌクレオチドと二本鎖核酸の相補性の程度が低い場合においても三本鎖構造体が形成されることから検出精度の点でも問題があった。
【０００５】
かかる技術に関し、南京錠型オリゴヌクレオチドを利用する技術も報告されている。これは、オリゴヌクレオチドを環状二本鎖DNAの標的配列の周りに巻きつけて三本鎖構造体を形成後、T4リガーゼを用いて環状化することで南京錠型オリゴヌクレオチドとし構造体を安定化するものである（非特許文献２を参照）。しかしながら、かかる技術の適用も、特殊な塩基配列を有し、かつスーパーコイル状の核酸に限定されることから、上記問題点を解決するものではなかった。更に、DNA連結反応を必要とする点からも、その適用範囲や用途が制限されるという問題点があった。
【０００６】
最近、二本鎖核酸の所望の位置に、２つのオリゴヌクレオチドプローブを配列特異的に結合することにより、安定な二重のD-ループを形成し、所与の塩基配列を有する二本鎖核酸を直接検出する技術が報告された（非特許文献４を参照）。具体的には、相同組換えタンパク質であるRecAタンパク質で被覆したオリゴヌクレオチドを標的二本鎖DNAと接触させて一重のD-ループを形成した後、更にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせて二重のD-ループを形成した後、タンパク質変性によりRecAタンパク質を失活させて安定な構造体を形成するものである。かかる技術は、二重のD-ループを形成することから、三本鎖構造体を形成する上記の技術とは本質的に区別される。さらに、二重D-ループ構造は実質的には三本鎖より高次の四本鎖構造であることから、その安定性には疑問があった。これに関して、本明細書中の実施例６で示すように本発明者の再現実験によっては安定な構造体を形成できず、二本鎖核酸を配列特異的に認識することができなかった。
【非特許文献１】Pfannschmidt C, Schaper A, Heim G, Jovin TM, Langowski J.著、Sequence-specific labeling of superhelical DNA by triple helix formation and psoralen crosslinking. Nucleic Acids Res. 1996年５月、第24巻、第９号、第1702〜1709頁
【非特許文献２】Roulon T., Coulaud D., Delain E., Le Cam E., Helene C., Escude C.著、Padlock oligonucleotides as a tool for labeling superhelical DNA. Nucleic Acids Res. 2002年２月、第30巻、第３号、E12.
【非特許文献３】Potaman VN., Lushnikov AY., Sinden RR., Lyubchenko YL.著、“Site-specific labeling of supercoiled DNA at the A+T rich sequences.”、Biochemistry、2002 年11月、第41巻、第44号、第13198〜13206頁
【非特許文献４】Rice MC., Heckman BM., Liu Y., Kmiec EB.著、“Fluorescent detection and isolation of DNA variants using stabilized RecA-coated oligonucleotides.”、Genome Research、2004年１月、第14巻、第１号、第116〜125頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述した通り、従来における、直接、二本鎖核酸を配列特異的に検出及びクローニングする技術は、特殊な配列を有し、かつスーパーコイル状の核酸に限定される等、その適用範囲は非常に限定されたものであった。また、構造体の安定性の点で問題があり、そして、架橋剤等を利用して三本鎖核酸を安定化するものであることからプローブとして利用するオリゴヌクレオチドの非特異的な結合を誘発し、検出精度の観点からも市場の要求を満足するものではなかった。したがって、二本鎖核酸の検出およびクローニングに際して、配列や核酸の形態による制限がなく、任意の二本鎖核酸上の任意の配列を配列特異的に高精度かつ効率的に認識できる技術の確立が依然として求められていた。
【０００８】
そこで、本発明は、以上の実情を鑑みて、二本鎖核酸の検出およびクローニングに際して、配列や核酸の形態による制限がなく、任意の二本鎖核酸上の任意の配列を配列特異的に高精度かつ効率的に認識できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意研究した結果、RecAタンパク質の介在下で形成された三本鎖構造体に、更にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、かかるアニーリング部位を起点として伸長反応を行うことにより、架橋剤の存在無しに安定した構造体を得ることができるとの知見を得た。また、かかる構造体は、２種類のオリゴヌクレオチドを配列特異的に結合させる工程を要するため、二重の配列認識を通した高精度な標的核酸の配列認識を実現できるとの知見をも得た。これらの知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、上記目的を達成するため本発明は、下記〔１〕〜〔５〕の二本鎖核酸の検出方法を提供する。
〔１〕配列特異的な二本鎖核酸の検出方法であって、
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成させる工程と、
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行う工程と、
前記二本鎖核酸と結合した第２のオリゴヌクレオチドを検出する工程とを含む、二本鎖核酸の検出方法。
〔２〕前記二本鎖核酸が、直鎖状である上記〔１〕の二本鎖核酸の検出方法。
〔３〕前記相同組換えタンパク質が、大腸菌由来のRecAタンパク質である上記〔１〕又は〔２〕の二本鎖核酸の検出方法。
〔４〕前記ポリメラーゼが、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼである上記〔１〕〜〔３〕のいずれかの二本鎖核酸の検出方法。
〔５〕前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記二本鎖核酸上の前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの二本鎖核酸の検出方法。
【００１１】
上記〔１〕〜〔５〕の構成によれば、二本鎖核酸を一本鎖に変性させることなく、安定な二本鎖核酸の形態で配列特異的に検出することができる。そして、標的核酸の塩基配列、及びその形態に制限はなく任意の核酸配列を標的とすることができることから、広範な用途への適用が可能である。また、二種類のオリゴヌクレオチドによる二重の配列認識により、標的核酸の配列特異的な高精度な検出を可能とし、さらに、最終的な構造体の安定化のために架橋剤を使用しないことからも、精度の高い検出が可能となる。そして、プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの改変等を通して、使用目的に応じて検出感度を調節することができる実用性の高い技術である。
【００１２】
さらに、上記目的を達成するため本発明は、下記〔６〕の二本鎖核酸の検出用キットを提供する。
〔６〕上記〔１〕〜〔５〕のいずれかの二本鎖核酸の検出方法を実施するための試薬を備えた、二本鎖核酸検出用キット。
【００１３】
上記〔６〕の構成によれば、二本鎖核酸の検出方法の実施のために必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な二本鎖核酸の検出が可能となる。
【００１４】
また、上記目的を達成するため本発明は、下記〔７〕〜〔１１〕の二本鎖核酸のクローニング方法を提供する。
〔７〕配列特異的な二本鎖核酸のクローニング方法、
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成させる工程と、
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行う工程と、
第２のオリゴヌクレオチドに結合した前記二本鎖核酸を分離する工程とを含む、二本鎖核酸のクローニング方法。
〔８〕前記二本鎖核酸が、直鎖状である上記〔７〕の二本鎖核酸のクローニング方法。
〔９〕前記相同組換えタンパク質が、大腸菌由来のRecAタンパク質である上記〔７〕又は〔８〕の二本鎖核酸のクローニング方法。
〔１０〕前記ポリメラーゼが、Bacillus stearothermophilus由来のDNAポリメラーゼである上記〔７〕〜〔９〕のいずれかの二本鎖核酸の検出方法。
〔１１〕前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記二本鎖核酸上の前記第２のオリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかの二本鎖核酸のクローニング方法。
【００１５】
上記〔７〕〜〔１１〕の構成によれば、二本鎖核酸を一本鎖に変性させることなく、安定な二本鎖核酸の形態で配列特異的にクローニングすることができる。そして、標的核酸の塩基配列、及びその形態に制限はなく任意の核酸配列を標的とすることができることから、広範な用途への適用が可能である。また、二種類のオリゴヌクレオチドによる二重の配列認識により、標的核酸の配列特異的な高精度なクローニングを可能とし、さらに、最終的な構造体の安定化のために架橋剤を使用しないことからも、高精度なクローニングが可能である。
【００１６】
さらに、上記目的を達成するため本発明は、下記〔１２〕の二本鎖核酸の検出用キットを提供する。
〔１２〕上記〔７〕〜〔１１〕のいずれかの二本鎖のクローニング方法を実施するための試薬を備えた、二本鎖核酸のクローニングキット。
【００１７】
上記〔１２〕の構成によれば、二本鎖核酸のクローニング方法の実施のために必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な二本鎖核酸のクローニングが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の二本鎖核酸の検出方法及びクローニング方法は、標的核酸を二本鎖核酸の状態のままで配列特異的に検出及びクローニングするものである。具体的には、相同組換えタンパク質の介在下で形成された三本鎖領域若しくはその近接領域に、更にオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、かかるアニーリング部位を起点として伸長反応を行い、標的二本鎖核酸を配列特異的に検出及びクローニングする。ここで、本発明の二本鎖核酸の検出方法及びクローニング方法の原理を図１に模式的に示す。
【００１９】
本発明において標的二本鎖核酸は、二本鎖核酸である限り標的核酸の鎖長及び塩基配列等に対する制限ない。直鎖状、環状の別を問わないが、好ましくは直鎖状DNAである。具体的には、生物のゲノムDNAでもよく、或いは、該ゲノムDNAを物理的手段若しくは制限酵素消化により切断された断片であっても良い。更に、DNA断片をプラスミド、ファージ等に挿入したものに対しても好適に利用できる。また、PCR法等によって標的核酸を単離、濃縮又は増幅したDNA断片、当該技術分野で常用されている核酸自動合成機等を使用して合成されたDNA断片、mRNAを鋳型にして合成したcDNA断片等の人工的産物等、いずれも標的核酸となり得る。
【００２０】
検出の対象となる標的二本鎖核酸上の標的配列についても、塩基配列やその位置については特に制限はなく、任意の配列を標的配列とすることができる。
【００２１】
ここで、核酸試料としては、標的二本鎖核酸を含む、もしくは標的二本鎖核酸を含む可能性のある試料であれば特に制限はない。したがって、生体試料、環境試料、食品等の他、DNA合成技術等による人工産物試料をも含む。生体試料として動物由来の血液、尿、糞、唾液、組織、細胞培養物等、及び植物由来の根、茎、葉、花、果実等が、環境試料として土壌、地下水、河川水、湖沼水、海水等が、食品として肉、卵、加工食品等が例示される。
【００２２】
核酸試料は、直接、本発明の方法に適用してもよく、また、標的二本鎖核酸を顕在化せしめることを目的として、必要に応じて公知の核酸抽出、精製等の処理を行った後に適用してもよい。核酸の抽出、精製は、任意の方法で行うことができる。例えば、被検体から細胞、原虫、真菌、細菌、ウイルス等を分離し、次に核酸を抽出することによって行うことができ、必要に応じて精製を行ってもよい。核酸の抽出方法としては、SDS等の界面活性剤処理、リゾチーム及びプロテインナーゼ等の酵素処理、熱処理、超音波処理、カオトロピック塩等、或いはこれらの組み合わせにより細胞等を破壊し、フェノール／クロロホルム等の常法に基づいて核酸を抽出することにより行うことができる。
【００２３】
以下、本発明の好適な形態につき詳細に説明するが、これに限定するものではない。
【００２４】
［配列特異的な二本鎖核酸の検出方法］
本発明の二本鎖核酸の検出方法は、以下の工程から構成される。
【００２５】
１．三本鎖領域形成工程
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、またはその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成する。
２．ポリメラーゼ反応工程
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を有する第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、かかるアニーリング部位を起点として、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行い、二本鎖核酸の標的配列をマーキングする。
３．除タンパク工程
相同組換えタンパク質を失活させることで構造体を安定化させる。
４．検出工程
前記二本鎖核酸と結合した第２のオリゴヌクレオチドを検出することで、標的二本鎖核酸を検出することができる。
【００２６】
以下に各工程につき詳細に説明する。なお、上記「オリゴヌクレオチド」につき、以下の本明細書において、その機能から「プローブ」と称し、「第１のオリゴヌクレオチド」と、「第２のオリゴヌクレオチド」を区別するべく、夫々「１次プローブ」、「２次プローブ」と称する場合がある。したがって、「第１のオリゴヌクレオチド」及び「１次プローブ」、「第２のオリゴヌクレオチド」及び「２次プローブ」は、それぞれ同義である。
【００２７】
（三本鎖領域形成工程）
三本鎖領域形成工程は、二本鎖核酸と、１次プローブとを、相同組換えタンパク質の存在下に接触させることにより行う。相同組換えタンパク質の働きで、相補的な塩基を対合させ、オリゴヌクレオチドを相同な二本鎖核酸に挿入し、三本鎖領域を形成する。これはオリゴヌクレオチドと二本鎖核酸が、塩基対合則に従って特異的に結合し三本鎖領域を形成するものであり、二本鎖核酸に一本鎖のオリゴヌクレオチドが挿入されD-ループ構造体を形成していると推定される。
【００２８】
１次プローブは、標的二本鎖核酸上の標的配列又はその近接配列の、全部又は一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含むよう設計される。好ましくは、標的二本鎖核酸上の標的配列の全部又は一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含むよう設計される。したがって、１次プローブは、標的二本鎖核酸上の標的配列の全部又はその一部の塩基配列、若しくはその相補配列を含んで構成される。ただし、１次プローブは、上記条件に加えて、２次プローブの配列情報を鑑みて設計することが好ましい。具体的には、標的二本鎖核酸上に形成された三本鎖形成領域、又はその近接領域に、２次プローブがアニーリングできるよう、１次プローブを設計することが好ましい。したがって、１次プローブは、二本鎖核酸上の２次プローブに相補的な塩基配列又はその近接配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含むように設計することが好ましい。特には、１次プローブは、二本鎖核酸上の２次プローブに相補的な塩基配列の全部若しくは一部に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含むように設計することが好ましい。したがって、１次プローブは、標的二本鎖核酸上の２次プローブが相補性を示す塩基配列の全部又はその一部の塩基配列、若しくはその相補配列を含んで構成される。また、１次プローブとして、二本鎖核酸上の２次プローブに相補的な塩基配列の５´側、若しくは３´側のいずれか一方で隣接する塩基配列、又はその相補配列を含むものも好ましく例示される。１次プローブと２次プローブは、二本鎖核酸上の同一鎖に対して相補的であっても、また、異なる鎖に対して相補的であってもよい。
【００２９】
なお、ここで、近接配列又は近接領域とは、二本鎖核酸上の２次プローブに相補的な塩基配列から５´側、又は３´側にそれぞれ１〜50塩基程度離間した配列若しくは領域を指す。そして、相補配列とは、塩基対合則により結合し得る塩基配列を指すものとする。
【００３０】
また、ここで、相補的とは、相同組換えタンパク質の介在の下、１次プローブと標的二本鎖核酸の一方の鎖とが塩基対合則に従って特異的に結合することで、三本鎖領域を形成できることを意味するものとする。必要とされる相補性の程度は、好ましくは100％である。しかしながら、相同組換えタンパク質の介在の下に、１次プローブと標的二本鎖核酸が三本鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。具体的には、相補性領域の長さや、塩基対ミスマッチの分布等により変動するが、一般的には、70％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上である。
【００３１】
１次プローブの鎖長は、標的核酸を特異的に認識し、三本鎖領域を形成するために十分に長くなければならない。適当な鎖長はGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定される。好ましくは、40塩基以上の長さが必要であり、更に好ましくは50塩基以上であり、特に好ましくは、50〜200塩基長である。
【００３２】
１次プローブは、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法等により調製され、必要に応じてHPLC等の手段により精製される。化学合成に際しては、市販の自動合成装置を利用することも可能である。化学合成法に基づきプライマーを調製する場合には、合成に先立って標的核酸の配列情報に基づいて設計され、標的核酸の配列を予め調査し決定される。標的核酸の塩基配列の調査には、GeneBank、EBI等のデータベースを好適に利用できる。また、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。
【００３３】
相同組換えタンパク質としては、一本鎖核酸に協同的に結合し、相補的な二本鎖核酸と対合させ、三本鎖形成領域を含むタンパク質−核酸複合体を形成できる限り、特に制限はない。ここで形成される三本鎖構造は、相同組換えタンパク質の存在下では安定なものである必要がある。好ましくは、タンパク質分解酵素等により相同組換えタンパク質を失活させると、かかる一本鎖核酸と二本鎖核酸の結合が解離する。具体的に、相同組換えタンパク質としてはRecAタンパク質が含まれる。RecAタンパク質は、種々の生物体から単離されており、その起源に制限はなくいずれをも使用することができる。しかしながら、好ましくは、大腸菌由来のRecAタンパク質、高度好熱菌由来RecAタンパク質であり、特に好ましくは、大腸菌由来のRecAタンパク質である。なお、高度好熱菌由来RecAタンパク質としては、サーマス（Thermus）属、サーモコッカス（Thermococcus）属、ピロコッカス（Pyrococcus）属、サーモトーガ（Thermotoga）属等由来のRecAタンパク質が例示される。具体的には、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のRecAタンパク質が例示される。
【００３４】
これらの相同組換えタンパク質は、天然由来のタンパク質の他、化学合成的もしくは遺伝子工学的に人工的に合成されたタンパク質も包含し、常法に基づいて調製したものの他、市販品を利用することができる。例えば、Thermus thermophilus 由来のRecAタンパク質の場合、Kato R, Kuramitsu S.他著、“RecA protein from an extremely thermophilic bacterium, Thermus thermophilus HB8.” J Biochem、1993年、東京、第114巻、第６号、第926〜929頁に記載の方法により製造することができる。また、大腸菌由来RecAタンパク質としては、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社から製品番号1449567として市販されているものを利用することができる。
【００３５】
更に、相同組換えタンパク質としては、上記生物学的機能を保持する限り、上記相同組換えタンパク質の変異体であってもよい。このような相同組換えタンパク質としては、自然界に存在するもの他、人為的な変異誘発または遺伝子組換えにより改変されたものをも含むことが意図される。相同組換えタンパク質の活性、安定性、耐熱性等が改良された変異体が例示される。また、上記生物学的機能を保持する限り、タンパク質断片であってもよく、タンパク質の必要とする活性をもたらす構造のみを取り出した断片が例示される。例えば、上記した天然由来の大腸菌由来のRecAタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記した大腸菌由来のRecAタンパク質と生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の生物学的機能が維持される限り制限されない。アミノ酸配列に対する改変は、改変しようとするアミノ酸配列に部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10、pp6487、1982年）等の公知の変異操作手段を用いて人工的に行うことができる。更には、自然界におけるアミノ酸の変異によって生じた改変体をも含む。
【００３６】
三本鎖領域形成工程で使用する試薬としては、相同組換えタンパク質の機能の発現に必要な試薬を含めて構成される。例えば、RecAタンパク質の機能発現に際しては、アデノシン５´−三リン酸（ATP）、若しくはデオキシアデノシン５´−三リン酸（dATP）を必要とすることが公知であるため、ATP若しくはdATPを適当な緩衝液中に含んで調製される。そして、相同組換えタンパク質の機能を阻害しない限りにおいて、これらの類似物質をも使用することができる。例えば、デオキシヌクレオチドの誘導体、７−デアザ−dATP、アデノシン５´−Ｏ−３−チオ三リン酸（ATP-γS）等を利用することができる。また、アデニンに代えて、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応するヌクレオチドを使用してもよい。
【００３７】
上記試薬に加えて、反応及び核酸の安定性を保つため、適当な緩衝液を添加することができる。緩衝液としては、通常、当該分野で用いられるpH緩衝液を使用することができる。具体的は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、Tris-塩酸緩衝液、Tris-酢酸緩衝液等が例示される。緩衝成分の最終濃度は５mM〜100mMの範囲で、pH6.0〜9.5の範囲内で調製される。また、マグネシウム塩を適宜添加するものとする。マグネシウム塩としては特に制限はないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等を適宜使用でき、特には酢酸マグネシウムが好ましい。
【００３８】
また、反応液量、並びに各成分の使用濃度については、当業者は適宜設定することができる。例えば、反応液は100μl以下、特には、10〜50μlの範囲で調製することが好ましい。また、標的核酸は、好ましくは100μl当り10〜20μMの濃度で、１次プローブは好ましくは、最終濃度10〜20μMの濃度に調製される。更に、相同組換えタンパク質は、好ましくは最終濃度5〜10μMで使用する。そして、ATPは、好ましくは最終濃度1〜5mMに調製する。このとき、マグネシウム塩は最終濃度で5〜15mMの範囲に調製することが好ましい。
【００３９】
反応温度は、使用する相同組換えタンパク質に応じその最適な温度を設定することができる。相同組換えタンパク質として大腸菌由来のRecAタンパク質を使用する場合、好ましくは、30〜40℃で、30〜120分間反応させる。相同組換えタンパク質として、高度好熱菌由来のRecAタンパク質を使用する場合には、40℃より高い温度でも好適に実施することができるが、二本鎖核酸が一本鎖に解離しない温度に設定される。
【００４０】
具体的な、反応条件については、特に１次プローブの長さ、ＧＣヌクレオチド配列の含有量に応じて経験的に適宜選択して設定され、プローブと相同性の高い塩基配列とが特異的に対合し、十分な特異性を示す条件を適宜選択することができる。特には、実施例に記載した条件が好ましく例示される。
【００４１】
（ポリメラーゼ反応工程）
ポリメラーゼ反応工程は、アニーリング工程と伸長反応工程からなる。具体的には、ポリメラーゼ反応は、三本鎖領域形成後の標的二本鎖核酸に、二本鎖核酸の標的配列に相補的な配列を有する２次プローブを接触させ、二本鎖核酸に２次プローブをアニーリングさせた後、伸長反応を行う。２次プローブを二本鎖核酸にアニーリングさせることにより形成されたアニーリング部位を起点として、５'→３'の方向に、デオキシヌクレオシド３リン酸（dNTP）を材料として、標的核酸を鋳型にして相補的な伸長反応を行う。
【００４２】
２次プローブは、標的二本鎖核酸上の標的配列の全部又はその一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列、又はその相補配列を含むよう設計される。好ましくは、標的二本鎖核酸上の標的配列の全部又はその一部に対して相補的な塩基配列を含むよう設計される。したがって、２次プローブは、標的二本鎖核酸上の標的配列の全部又はその一部の塩基配列、又はその相補配列を含んで構成される。２次プローブは、１次プローブとの結合により標的二本鎖核酸上に形成された三本鎖形成領域、若しくはその近接領域にアニーリングし、伸長反応を開始する。したがって、２次プローブは、標的二本鎖核酸上の１次プローブが相補的に結合する領域に、５´末端若しくは３´末端がアニーリングするように設計することが好ましい。ここで相補的とは、２次プローブと標的二本鎖核酸の一方の鎖とが、塩基対合則に従って特異的に結合し得ることを意味する。必要とされる相補性の程度は、好ましくは100％である。しかしながら、１次プローブと標的二本鎖核酸が三本鎖構造を形成し得るのに十分である限り、いくつかの核酸塩基のみが塩基対合則に沿って適合する部分的な相補性であっても許容される。具体的には、相補性領域の長さや、塩基対ミスマッチの分布等により変動するが、一般的には、70％以上、好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上である。ただし、２次プローブの配列特異的な結合に際しては、相同組換えタンパク質は介在しないため、１次プローブの結合に際して必要とされる相補性の程度より高い相補性が必要である。したがって、本発明の二本鎖核酸の検出方法は、架橋剤の介在しない２次プローブによる配列認識を含めたことから高精度な検出を可能とする。
【００４３】
鎖長は特に制限されるものではないが、標的核酸を特異的に認識するために十分に長くなければならないが、長すぎると逆に非特異的反応を誘発するので好ましくない。したがって、適当な長さはGC含量等の標的核酸の配列情報、並びに、反応温度、反応液中の塩濃度等のハイブリダイゼーション反応条件など多くの因子に依存して決定される。好ましくは、15〜50塩基長、より好ましくは15〜40塩基長、特に好ましくは20〜30塩基長とする。そして、２次プローブの調製は、１次プローブと同様、ホスホアミダイト法等に基づく化学合成法や、既に標的となる核酸が取得されている場合にはその制限酵素断片等が利用可能である。
【００４４】
２次プローブのアニーリング条件は、２次プローブの長さ、ＧＣヌクレオチド配列の含有量に応じて経験的に適宜選択して設定されるものであり、プローブと相同性の高い塩基配列とが、特異的にアニーリングし、十分な特異性を示す条件を適宜選択することができる。当該分野において、そのようなアニーリング条件のバリエーションのための十分に確立された公式は周知であり、例えば、Sambrook et al, "Molecular Cloning： A Laboratory Manual"， 第２版、p.9.47-9.51， Cold Spring Harbor, New York： Cold Spring Harbor Laboratory、1989年、等を参照することができる。特には、実施例に記載した条件が好ましく例示される。
【００４５】
ポリメラーゼ反応工程における伸長反応は、ポリメラーゼによって行われる。本発明において使用するポリメラーゼは、好ましくは、相補鎖合成活性と鎖置換活性を有する鎖置換型のDNAポリメラーゼである。このようなポリメラーゼは、鋳型核酸に沿って相補鎖を合成する際に、伸長方向における二本鎖領域の鎖を解離させる鎖置換活性により鋳型となる二本鎖核酸の変性を経ずとも相補鎖合成が可能である。常温性、中温性、若しくは耐熱性いずれでもよいが、好ましくは、中温性、若しくは耐熱性である。特には、至適反応温度が45〜60℃、特に好ましくは50〜55℃である。
【００４６】
鎖置換型のDNAポリメラーゼとしては、好熱性バチルス属細菌Bacillus stearothermophilus由来のBst DNA ポリメラーゼ、Bacillus caldotenax由来のBca DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis由来のVent（登録商標）DNAポリメラーゼ、枯草鎖置換活性菌ファージphi29（φ29）由来のφ29 DNAポリメラーゼ、大腸菌由来の DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片等が例示される。しかしながら、これに限定されるものではなく、公知の鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼを目的に応じて選択または組み合わせることが可能である。
【００４７】
使用に適したポリメラーゼとしては、上記生物学的機能を保持する限り、上記ポリメラーゼの変異体であってもよい。このようなポリメラーゼとしては、自然界に存在するもの他、人為的な変異誘発または遺伝子組換えにより改変されたものをも含むことが意図される。ポリメラーゼの触媒活性、安定性、耐熱性等が改良された変異体が例示される。特には、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が欠損した変異体が好ましい。また、上記生物学的機能を保持する限り、タンパク質断片であってもよく、上記ポリメラーゼの必要とする触媒活性をもたらす構造のみを取り出した断片が例示される。例えば、上記した天然由来のポリメラーゼのアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加されたアミノ酸配列を有し、かつ上記したポリメラーゼと生物学的機能が同等である改変体が包含し得る。なお、アミノ酸配列における変異の数は、もとのタンパク質の生物学的機能が維持される限り制限されない。アミノ酸配列に対する改変は、改変しようとするアミノ酸配列に部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10、pp6487、1982年）等の公知の変異操作手段を用いて人工的に行うことができる。更には、自然界におけるアミノ酸の変異によって生じた改変体をも含む。
【００４８】
ポリメラーゼ反応に使用する他の試薬としては、公知の試薬を使用することができ、また必要に応じて調製できる。特に、使用するポリメラーゼの種類に応じて適当な条件が設定されるが、具体的には、デオキシヌクレオチド５´−三リン酸（以下、「dNTP」と称する。）、並びに適当な緩衝液を含んで調製される。
【００４９】
dNTPとしては、アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に夫々対応する４種類のデオキシヌクレオチドが使用される。特には、dGTP、dATP、dTTP、dCTPの混合物が好ましく使用される。更に、ポリメラーゼ反応で伸長されるDNA分子中に、ポリメラーゼによって取り込まれ得る限りにおいては、デオキシヌクレオチドの誘導体をも含み得る。そのような誘導体として、７−デアザ−dGTP、７−デアザ−dATP等が例示され、例えば、夫々dGTP、dATPに代えて、若しくは、双方を共在させて使用することができる。したがって、核酸合成に必要なアデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの各塩基に対応する４種類が含まれる限り、いかなる誘導体の使用を排除するものではない。また、dNTPとして、標識ヌクレオチドを使用してもよい。
【００５０】
緩衝液としては、適当な緩衝成分およびマグネシウム塩等を含んで調製されたものを使用でき、特に制限はない。緩衝液としては、通常、当該分野で用いられるpH緩衝液を使用することができる。具体的は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、Tris-塩酸緩衝液、Tris-酢酸緩衝液等が例示される。緩衝成分の最終濃度は５mM〜100mMの範囲で、pH6.0〜9.5の範囲内で調製される。また、マグネシウム塩としては特に制限はないが、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等を適宜使用でき、特には酢酸マグネシウムが好ましい。更に、必要に応じて、KCl等のカリウム塩、DMSO、グリセロール、ベタイン、ゼラチン、Triton等を添加することができる。また、市販のポリメラーゼに添付の緩衝液を用いることができる。緩衝液の組成は、使用するポリメラーゼの種類等に応じて適宜変更することができる。特には、MgCl2、KCl等のイオン強度の影響、DMSO、グリセロール等のDNAの融解温度に影響を与える各種添加物並びにそれらの濃度を勘案して、適宜設定することができる。特には、実施例にて示す条件が好ましく例示される。
【００５１】
また、反応液量、並びに各成分の使用濃度については、ポリメラーゼ反応は公知であることから当業者は適宜設定することができる。例えば、標的核酸は、好ましくは100μl当り１ng〜１μgの濃度で、2次プローブは好ましくは、最終濃度10〜20μMの濃度に調製される。更に、DNAポリメラーゼは、好ましくは100μlあたり１〜100unitの範囲の濃度で使用する。また、マグネシウム塩は最終濃度で0.1〜50mM、特には、１〜５mMの範囲に調製することが好ましい。
【００５２】
ポリメラーゼ反応の反応温度は、使用するポリメラーゼに応じその最適な温度を設定することができる。好ましくは、相補鎖合成反応の特異性、鎖置換反応効率等を高めるため比較的高い温度が好ましい。具体的には、45〜60℃が好ましく、50〜55℃が特に好ましい。ここで、反応は等温で行うことができる。ここで、等温とは、ほぼ一定の温度を意味するが、設定温度を正確に保持することのみならず、酵素等の反応成分の実質的な機能を保持できる限りの温度の変化は許容される。
【００５３】
本発明で使用するプローブは、一本鎖のオリゴヌクレオチドである限り特に制限はなく、DNA、RNA、PNA等のいずれであってもよりが、好ましくはDNAである。そして、上記した標的二本鎖核酸と相補的な領域に加えて、他の化学構造が付加されていてもよい。
【００５４】
したがって、本発明で使用するプローブは、必要に応じて検出可能な標識物を導入することができ、好ましくは２次プローブが標識される。この場合、検出可能な標識物導入される位置は、アニーリング効率、及びそれに続く伸長反応の効率に大きく影響を与えない限り特に制限はないが、プローブの塩基配列や長さ等を考慮し適宜決定する。例えば、３'末端や５'末端の水酸基部分、塩基部分、リン酸ジエステル部分などを挙げることができ、特には５´末端の水素基部分が好ましい。
【００５５】
このような標識物質は公知であるので当業者は適宜選択して使用でき、反応において必要とされる安定性と機能性を保持できる限りは、公知のいずれをも使用できる。したがって、直接標識、間接標識の別を問わない。放射性同位体元素、酵素、蛍光色素、化学発光物質等が例示される。具体的には、適切な放射性同位元素標識として、32Ｐ、35Ｓ、131Ｉ、45Ｃａ、3Ｈ等が例示される。酵素標識として、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼが例示される。また、蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、テトラメチルローダミン（TAMRA）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRICA）、テキサスレッド、シアニン３（Cy3）およびシアニン５（Cy5）等のシアニン色素等が例示される。化学発光物質としては、アクリジウムエステル等が例示される。更に、ビオチン、ジオキシゲニン等のハプテンをも好適に利用できる。例えば、ジゴキシゲニンにより標識し、標識抗ジゴキシゲニン抗体により可視化することができる。また、ビオチンにより標識化し、標識抗ビオチン抗体によって、若しくは標識ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて可視化することができる。また、２次プローブと特異的に結合する核酸や核酸結合タンパク質等をも利用した標識も例示される。しかしながら、これらに限定するものではなく公知の標識技術を利用できる。
【００５６】
標識物質の導入は既知の手法により行うことができる。例えば、５´末端を放射線同位体元素32Ｐにて標識する場合には、プローブと32Ｐ標識ヌクレオチド（γ-32Ｐ-ATP）を含む反応液に、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを添加することにより行うことができる。
【００５７】
また、本発明のプローブは、必要に応じて、固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入されたものであってもよい。好ましくは２次プローブに固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入される。固相担体上での標的核酸の捕捉を観察することで迅速な検出が可能となり、固相担体に捕捉された標的核酸のみを分離することで容易にクローニングができる。固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入される位置は、アニーリング効率、及びそれに続く伸長反応の効率に大きく影響を与えない限り特に制限はないが、プローブの塩基配列や長さ等を考慮し適宜決定する。例えば、３'末端や５'末端の水酸基部分、塩基部分、リン酸ジエステル部分などを挙げることができ、特には５´末端の水素基部分が好ましい。５´末端付近の水素基部分、塩基部分或いはリン酸ジエステル部分の活性基が好適である。
【００５８】
固相担体としては、通常の核酸のハイブリダイゼーションやポリメラーゼ反応に用いられる反応液に不溶性の担体であればいずれをも用いることができる。例えば、ガラス、シリカゲル、ベンナイト等の無機物質、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の合成高分子物質、アガロース、デキストラン、ポリサッカライド等の不溶性多糖が好ましく使用できる。また、これらの支持体は、球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレート、メンブラン等の形態で使用することができる。
【００５９】
固相担体への固定化は、公知の方法に従って行うことができ、プローブの種類、固相担体、固相担体表面の官能基等の種類に応じて最適な方法を選択すればよく、物理的な結合、化学的な結合いずれによるものでもよい。具体的には、DNAの荷電を利用してポリリシン、ポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで表面処理した固相担体に静電結合させる方法、アミノ基、アルデヒド基、エポキシ基等を有する各種シランカップリング剤で表面処理された固相担体に、末端に官能基としてアミノ基、アルデヒド基、SH基の反応活性基を予め導入されたDNAとを共有結合させる方法等を好ましく例示することができる。抗原（ハプテン）−抗体、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン、抗原−抗体、リガンド−レセプター、相互にハイブリダイズし得る核酸等を利用して固定化することもできる。さらに、プローブを標識し得る物質と、これに結合可能な物質を固定化された固相担体を利用して固定化することもできる。例えば、ビオチンで標識されたプローブとストレプトアビジンを固定化された固相担体とを利用することで、ビオチン−ストレプトアビジンの結合を介して、プローブを固相担体に固定化することができる。固定化に際しては、非特異的結合の抑制のため、必要に応じて紫外線照射によるクロスリンク形成、ブロッキング、洗浄等の処理を行うことができる。
【００６０】
（除タンパク質工程）
除タンパク質工程は、遺伝子工学分野において公知のタンパク質失活技術を利用できる。具体的には、タンパク質分解酵素、界面活性剤、キレート剤、カオトロピック物質、還元剤での処理が例示され、これらを組み合わせて利用してもよい。好ましくは、タンパク質分解酵素で処理を行う。タンパク質分解酵素として、プロティナーゼとペプチダーゼの別は問わないが、好ましくはプロティナーゼである、そして、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼいずれであってもよい。具体的には、トリプシン、キモトリプシン、スブチリシン、ペプシン等が例示され、２種以上の組み合わせであってもよい。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ポリオキシエチレンソルビタン系（Tween）、ポリエチレンエーテル系（Triton）、デオキシコール酸塩等が例示され、２種以上の組み合わせであってもよい。キレート剤としては、二価金属イオンをキレートするものが好ましく、エチレンジアミン四酢酸塩（EDTA）、エチレングリコールビス（β-アミノエチルエーテル）-Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'-四酢酸（EGTA）が例示され、２種以上の組み合わせであってもよい。
【００６１】
相同組換えタンパク質を失活させることにより、相同組換えタンパク質の介在の下、低い相同性により標的二本鎖核酸と結合していたプローブが遊離し、より高い配列特異性をもって標的核酸を高精度にマーキングすることができる。また、１次プローブは標的核酸より遊離すると考えられ、構造物の安定化を向上できる。
【００６２】
反応温度、及び反応時間は、使用するタンパク質分解酵素、界面活性剤、キレート剤、カオトロピック物質、還元剤に応じその最適な温度を設定することができる。タンパク質分解酵素を使用する場合、好ましくは、37〜56℃で、1〜3時間反応させる。
【００６３】
除タンパク工程において、核酸の安定性を保つため、適当な緩衝液を添加することができる。緩衝液としては、通常、当該分野で用いられるpH緩衝液を使用することができる。具体的は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液、Tris-塩酸緩衝液等が例示される。
【００６４】
また、タンパク質を失活させた後、必要に応じて、精製を行うことができ、公知の核酸精製技術を利用することができる。例えば、適当なカラムクロマトグラフィーにより核酸構造体のみを回収することにより行うことができる。このとき、未反応プローブの除去をも同時に行うことができるが、別途、未反応プローブを除去する工程を設けてもよい。
【００６５】
（検出工程）
二本鎖核酸に結合した２次プローブの検出を行い、その検出結果から、試料に含まれている標的配列を有する二本鎖核酸の存在、及びその量を求めることができる。更には、２次プローブを介して標的化された二本鎖核酸を分離することができる。
【００６６】
２次プローブとして標識化プローブを使用した場合、検出は使用する標識物に応じて一般的手法を用いればよい。例えば、標識物が放射線同位体である場合には、放射活性をシンチレーションカウンターで測定し、Ｘ線フィルムを感光させて放射活性を可視化することにより行うことができる。また、標識物が蛍光物質であれば、蛍光強度を蛍光光度計や共焦点顕微鏡等で測定することにより行うことができる。また、標識物が酵素である場合には、酵素反応により発色する酵素基質を用い、その発色を検出すればよい。直接検出可能な標識物以外の標識物を導入した場合には、その標識物を間接的に測定するための試薬が用いられる。例えば標識物がビオチンである場合には、例えば蛍光標識アビジン又はストレプトアビジンとの反応生成物等の測定により、或いは、標識物がハプテンである場合には、例えば、ハプテンと特異的に結合する蛍光標識抗体との反応生成物の測定により、間接的に測定することができる。ゲル電気泳動による分離と組み合わせてもよい。
【００６７】
また、２次プローブとして、固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入されたものを用いた場合には、２次プローブを介して固相上に捕捉された二本鎖核酸を検出することにより行うことができる。このとき、二本鎖核酸を標識し、標識を指標として固相上に捕捉された二本鎖核酸を検出することができる。これにより、核酸試料中の標的二本鎖核酸の存在及びその量を求めることができる。標識の検出については上記でも説明したが、マイクロアレイ等として構成した場合には、例えば、蛍光標識の場合は蛍光イメージスキャナーを、また放射性同位体標識の場合には、ＲＩイメージスキャナーで画像化し、コンピュータ解析により標識を検出することができる。
【００６８】
［クローニング方法］
本発明の二本鎖核酸のクローニング方法は、以下の工程から構成される。
１．三本鎖領域形成工程
二本鎖核酸と、前記二本鎖核酸の標的配列又はその近接配列に相補的な塩基配列、又はその相補配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを相同組換えタンパク質の存在下で接触させて三本鎖領域を形成する。
２．ポリメラーゼ反応工程
前記三本鎖領域が形成された二本鎖核酸に、前記標的配列に相補的な塩基配列を含む第２のオリゴヌクレオチドをアニーリングさせ、かかるアニーリング部位を起点として、鎖置換活性を有するポリメラーゼにより伸長反応を行い、二本鎖核酸の標的配列をマーキングする。
３．タンパク質失活工程
相同組換えタンパク質を失活させることで構造体を安定化させる。
４．単離工程
前記二本鎖核酸と結合した第２のオリゴヌクレオチドを単離することで、標的二本鎖核酸をクローニングすることができる。
【００６９】
各工程につき、以下に詳細に説明するが、上記した本発明の検出方法と重複する箇所については説明を省略する。
【００７０】
クローニングの対象となる標的核酸については、検出方法の項で説明した通りであり特に制限はなく、特にゲノムDNAやcDNAサンプルや、これらを適当なプラスミド等に挿入したものを好適に利用することができる。
【００７１】
前記２次プローブに結合した前記二本鎖核酸の単離は、技術分野において公知の方法を利用することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動や、HPLC解析等を利用することができる。また、２次プローブとして、固相担体に結合、若しくは結合可能な部位が導入ものを用いた場合には、標的核酸は２次プローブを介して該固相担体に捕獲されることから、洗浄操作により目的標的核酸以外の非特異的な核酸を除去することができ、標的核酸のみを単離することができる。その後、当該技術分野において公知の手段を用いて、２次プローブと固相担体との結合を開裂させ、標的核酸を固相担体から遊離することができる。
【００７２】
以上の通り、本発明の二本鎖核酸の検出方法及びクローニング方法は、二本鎖核酸を一本鎖に変性させることなく、安定な二本鎖核酸の形態で配列特異的に検出及びクローニングすることができる。そして、標的核酸の塩基配列、及びその形態に制限はなく任意の核酸配列を標的とすることができることから、広範な用途への適用が可能である。また、二種類のオリゴヌクレオチドによる二重の配列認識により、標的核酸の配列特異的な高精度な検出及びクローニングを可能とし、さらに、最終的な構造体の安定化のために架橋剤を使用しないことからも、精度の高い検出及びクローニングが可能となる。そして、プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの改変等を通して、使用目的に応じて検出感度を調節することができる実用性の高い技術である。
【００７３】
したがって、本発明の方法は、様々な用途に利用可能である。例えば、医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等、核酸の検出およびクローニング技術が適用可能な用途であれば制限されることなく本発明の二本鎖核酸の検出方法及びクローニング方法を適用できる。
【００７４】
[標的二本鎖核酸の検出用キット]
また、本発明は、二本鎖核酸の検出用キットを提供する。本発明の二本鎖核酸の検出用キットは、本発明の二本鎖核酸の検出方法の実施に必要な試薬を含んで構成され、例えば、RecAタンパク質、DNAポリメラーゼ、dNTP等を含んで構成される。また、更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等の三本鎖領域形成反応、ポリメラーゼ反応に必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の二本鎖上の標的配列をもって病原体等を検出するためのキットのような場合には、所望の標的配列検出用に任意の１次プローブ、２次プローブを含ませてもよい。このように二本鎖核酸の検出方法の実施のために必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な二本鎖核酸の検出が可能となる。
【００７５】
[標的二本鎖核酸のクローニング用キット]
また、本発明は、標的二本鎖核酸のクローニング用キットを提供する。本発明の標的二本鎖核酸のクローニング用キットは、本発明の二本鎖核酸のクローニング方法の実施に必要な試薬を含んで構成され、例えば、RecAタンパク質、DNAポリメラーゼ、dNTP等を含んで構成される。また、更に、適当な緩衝液、マグネシウム塩等の三本鎖領域形成反応、ポリメラーゼ反応に必要な成分を適宜含んで構成してもよい。また、所望の二本鎖上の標的配列をもって有用遺伝子をクローニングするためのキットのような場合には、所望の標的配列検出用に任意の１次プローブ、２次プローブを含ませてもよい。このように二本鎖核酸のクローニング方法の実施のために必要な成分をキットして構成することにより、簡便且つ迅速な二本鎖核酸の検出が可能となる。
【００７６】
本発明の別実施の形態
本発明の検出方法を利用することにより、変異又は多型を有する核酸を迅速且つ正確に検出、定量することができる。自動化も可能となり、最前線の医療現場での要望に応えることができる。本発明の検出方法は配列特異的な検出を高精度に達成できるものであることから、特に検体中の遺伝子の変異や多型を有する核酸が極微量であったり、正常核酸と変異核酸がわずか一塩基である場合、一塩基多型である場合にあっても正確に簡易な操作で検出定量することができる。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例を示し、さらに本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００７８】
実施例１．標的二本鎖核酸の検出
本発明の二本鎖核酸の検出方法を用いて、標的二本鎖核酸の安定な二本鎖構造の状態での検出を試みた。また、本実施例では、１次プローブと２次プローブの標的二本鎖核酸上の相補領域の位置関係についての好適化を検討した。
【００７９】
〔材料〕
標的二本鎖核酸
プラスミドpSP64 DNAを制限酵素Sca Iで直鎖状にした二本鎖DNAを標的二本鎖核酸とした。配列情報につき、図２に示すと共に、配列表の配列認識番号１に示す。
【００８０】
１次プローブ
50-merの合成オリゴヌクレオチドを調製し、１次プローブした。以下に、配列情報を示すと共に、標的二本鎖核酸との相補性関係について図２に示す。
5'-gtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaata-3
（配列認識番号２）
１次プローブは、標的とする部位の配列を含んで構成した。
【００８１】
２次プローブ
２次プローブとして、以下の９種類の20-merのオリゴヌクレオチドを調製し、夫々、５’末端をT4 Polynucleotide kinaseと[γ-32Ｐ] ATPを用いて32Ｐで標識した。以下に、配列情報を示すと共に、各２次プローブと三本鎖形成領域の位置関係を図２及び図３に示す。
【００８２】
オリゴヌクレオチド１
5'-tggcttcattcagctccggt-3'（配列認識番号３）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の末端から61〜80塩基離間した領域に相補的である。
【００８３】
オリゴヌクレオチド２
5'-gtcacgctcgtcgtttggta-3'（配列認識番号４）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の末端から41〜60塩基離間した領域に相補的である。
【００８４】
オリゴヌクレオチド３
5'-attgctacaggcatcgtggt-3'（配列認識番号５）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の末端から21〜40塩基離間した領域に相補的である。
【００８５】
オリゴヌクレオチド４
5'-gtttgcgcaacgttgttgcc-3'（配列認識番号６）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の末端に隣接する領域に相補的なオリゴヌクレオチドであり、三本鎖形成領域の末端から１〜20塩基離間した領域に相補的である。
【００８６】
オリゴヌクレオチド５
5'-aagtagttcgccagttaata-3'（配列認識番号７）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域に相補的なオリゴヌクレオチドであり、三本鎖形成領域の末端側に相補的である。
【００８７】
オリゴヌクレオチド６
5'-tgttgccgggaagctagagt-3'（配列認識番号８）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域に相補的なオリゴヌクレオチドであり、三本鎖形成領域の中央部に相補的である。
【００８８】
オリゴヌクレオチド７
5'-cctccatccagtctattaat-3'（配列認識番号９）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の一部に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００８９】
オリゴヌクレオチド８
5'-tggtcctgcaactttatccg-3'（配列認識番号10）
二本鎖核酸上の三本鎖形成領域の末端側から、11塩基〜30塩基離間した領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。
【００９０】
〔方法〕
１．三本鎖領域の形成
相同組換えタンパク質の存在下で、標的二本鎖核酸と１次プローブを反応させ、三本鎖形成反応を行った。具体的には、500ngの標的二本鎖核酸、20pmolの１次プローブ、3.0 μgのE.coli RecAタンパク質（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、製品番号1449567）とを、2mM ATP-γS、20 mM 酢酸マグネシウム、30 mM Tris-酢酸緩衝液（pH7.2）を含む20μlの反応液に混合し、37℃で60分間保温した。
【００９１】
２．ポリメラーゼ反応工程
三本鎖領域が形成された標的核酸に、標識２次プローブをアニーリングさせ、かかるアニーリング部位を起点としてポリメラーゼ反応を行った。上記工程１の三本鎖領域形成後の反応液を、20mM Tris-塩酸緩衝液 (pH8.8)、10mM KCl、10mM (NH4)2SO4、2mM MgSO4、0.1% Triton X-100中に、5pmolの２次プローブ、8unitのDNAポリメラーゼ、2mM dNTP類を含む20μlの反応液と混合した。そして、反応液量を40μlとし、55℃で60分間保温することでポリメラーゼ反応を行った。ここで、DNAポリメラーゼとして、Bst DNA Polymerase (NEN社）を使用した。
【００９２】
３．除タンパク及び精製
相同組換えタンパク質を失活させ、標的核酸から解離したタンパク質及び未反応のプローブを除去するため、精製を行った。上記工程２のポリメラーゼ反応後の反応液に、2.5mM EDTA, 0.5% (W/Vol) SDS, 0.7 mg/ml プロティナーゼＫを加え、42℃で30分間保温することによりRecAタンパク質を失活させた。続いて、MicroSpin S-400 HR column（アマシャムバイオサイエンス社）で、標的核酸から解離したタンパク質及び未反応のプローブを除去すると共に、TE-BufferへBuffer交換を行った。
【００９３】
４．核酸の分離及び標識２次プローブからのシグナル検出
上記工程３の除タンパク及び精製後の反応液を電気泳動緩衝液と混合した。混合液から10ulを分取して、1％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後、エチジウムブロミドで染色し、DNAバンドを可視化した。続いて、電気泳動ゲルを濾紙の上に載せて乾燥させた後、オートラジオグラフィーにより標識プローブからのシグナルを検出した。
【００９４】
また、制限酵素Rsa I処理したサンプルについても、上記と同様に処理した。具体的には、工程３の除タンパク及び精製後の反応液20μlに対して、10mM Bis-Tris-Propane-HCl (pH7.0)、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol、10unit Rsa Iを混合し反応液量25μlとし、37℃で60分間保温する工程を追加することにより行った。ここで、制限酵素Rsa Iの認識部位と三本鎖形成領域との位置関係を図４に示す。
【００９５】
〔結果〕
結果を図５に示す。図５（Ａ）は、オートラジオグラフィーによって、標的核酸に結合した標識２次プローブからのシグナルを記録した結果を示し、図５（Ｂ）は、オートラジオグラフィーに先立った電気泳動後の電気泳動ゲルのエチジウムブロミド染色の結果を示す。
そして、図５（Ａ）、（Ｂ）、レーン１〜８は、夫々、２次プローブとして、オリゴヌクレオチド１〜８を使用した結果を示し、レーン９〜１８はRsa Iを処理した場合の結果を示し、夫々、２次プローブとして、オリゴヌクレオチド１〜８を使用した結果を示す。
【００９６】
２次プローブとして、オリゴヌクレオチド５〜８を使用した場合には、強いシグナルが確認された（図５（Ａ）、レーン５〜８）。一方、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド１を使用した場合には、弱いシグナルしか確認できなかった（図５（Ａ）、レーン１）。また、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド２、３を使用した場合にも、オリゴヌクレオチド５〜８を使用した場合には劣るが、やや強いシグナルが確認できた（図５（Ａ）、レーン２、３）。そして、制限酵素Rsa Iで処理した場合も同様の結果が得られた（図５（Ａ）、レーン９〜16）
【００９７】
以上の結果より、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド５、６、７、８を使用した場合に、二本鎖核酸を高い効率で標的化することができることが理解される。ここで、オリゴヌクレオチド５〜７は、標的二本鎖核酸上の三本鎖形成領域に相補的なオリゴヌクレオチドであり、また、オリゴヌクレオチド８は、標的二本鎖核酸上の三本鎖形成領域に近接する領域に相補的なオリゴヌクレオチドである。したがって、２次プローブのアニーリング位置を、１次プローブと標的核酸によって形成された三本鎖領域、若しくは近接領域とすることにより、高感度に標的二本鎖核酸を検出できるが判明した。そして、本発明の二本鎖核酸の検出方法を利用することで、配列特異的に二本鎖核酸を標的化し、検出できることが理解される。
【００９８】
実施例２．反応成分の検討
本発明の二本鎖核酸の検出方法の実施に付き必要な試薬について検討を行った。
【００９９】
（方法）
上記実施例１で使用した試薬を欠如した場合に、標的二本鎖核酸の検出が良好に実施できる否かを検討することにより、本発明の二本鎖核酸の検出方法の実施に付き必要な試薬について検討を行った。
【０１００】
具体的には、以下の試薬について検討を行い、実施例１の試薬で反応を行った場合と比較した。
（Ｉ）三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った。
（II）ポリメラーゼ反応に際して、DNA ポリメラーゼを添加せずに反応を行った。
（III）ポリメラーゼ反応に際して、dNTPを添加せずに反応を行った。
（IV）三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブとしてオリゴヌクレオチド10（5'-acaaatctccgttgtactttgtttcgcgcttggtataatcgctgggggtc-3'：配列認識番号11）を用いて反応を行った。なお、オリゴヌクレオチド10は、下記実施例６にて示すM13 mp18 RF DNAの配列であり、標的二本鎖核酸に相補的な配列を含まないオリゴヌクレオチドである。
（Ｖ）三本鎖領域形成反応に際して、未標識の１次プローブに代えて、５´末端を32Ｐで標識した１次プローブを用い、標識２次プローブに代えて未標識の２次プローブを添加して反応を行った。
【０１０１】
上記反応試薬を用いた以外は、実施例１の工程１〜４と同様の手順で反応を行い、オートラジオグラフィーにより２次プローブからの標識を検出した。なお、２次プローブとしては、実施例１で標的二本鎖核酸の効率的な検出が可能であることが判明しているオリゴヌクレオチド５を使用した。
【０１０２】
また、反応試薬（Ｉ）〜（III）については、制限酵素Rsa I処理したサンプルについても、上記と同様に処理した。制限酵素Rsa Iでの処理条件は実施例１に記載の通りである。
【０１０３】
〔結果〕
結果を図６に示す。
図６、レーン１〜６は、制限酵素Rsa Iで処理を行わなかった場合の結果を示す。
そして、レーン１は、図５（Ａ）中、レーン５に対応する。具体的には、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド５を使用して、実施例１の反応試薬を用いた結果を示す。
レーン２は、上記反応試薬（Ｉ）を用いた結果を示す。具体的には、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った結果を示す。
レーン３は、上記反応試薬（II）を用いた結果を示す。具体的には、ポリメラーゼ反応に際して、DNA ポリメラーゼを添加せずに反応を行った結果を示す。
レーン４は、上記反応試薬（III）を用いた結果を示す。具体的には、ポリメラーゼ反応の際して、dNTPを添加せずに反応を行った結果を示す。
レーン５は、上記反応試薬（IV）を用いた結果を示す。具体的には、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブとしてオリゴヌクレオチド10を用いて反応を行った結果を示す。
レーン６は、上記反応試薬（Ｖ）を用いた結果を示す。具体的には、三本鎖領域形成反応に際して、未標識の１次プローブに代えて、５´末端を32Ｐで標識した１次プローブを用い、標識２次プローブに代えて未標識の２次プローブを添加して反応を行った結果を示す。
図６、レーン７〜１０は、制限酵素Rsa Iで処理を行なった場合の結果を示す。
そして、レーン７は、図５（Ａ）中、レーン13に対応する。具体的には、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド５を使用して、実施例１の反応試薬を用いた結果を示す。
レーン８は、上記反応試薬（Ｉ）を用いた結果を示す。具体的には、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った結果を示す。
レーン９は、上記反応試薬（II）を用いた結果を示す。具体的には、ポリメラーゼ反応に際して、DNA ポリメラーゼを添加せずに反応を行った結果を示す。
レーン１０は、上記反応試薬（III）を用いた結果を示す。具体的には、ポリメラーゼ反応に際して、dNTPを添加せずに反応を行った結果を示す。
【０１０４】
実施例１の試薬を用いて反応させることで確認できたシグナルは、１次プローブ、２次プローブ、DNAポリメラーゼ、ｄNTPのいずれを欠如する場合においても確認することができなかった（レーン２〜５、８〜10）。以上の結果より、本発明の二本鎖核酸の検出方法は、１次プローブ、２次プローブ、DNAポリメラーゼ、ｄNTPに依存していることが判明した。
【０１０５】
また、１次プローブとして標識オリゴヌクレオチドを使用した場合には、標識由来のシグナルを確認することができなかった（レーン６）。したがって、１次プローブは、反応終了後に標的核酸から解離していることが理解される。
【０１０６】
実施例３.２次プローブからの伸長反応の確認
本発明の二本鎖核酸の検出方法における、２次プローブからの伸長反応について確認した。
【０１０７】
実施例１で得られた反応産物を一本鎖核酸に変性した後、ゲル電気泳動によりサイズ分画して２次プローブからの伸長反応の有無を確認した。具体的には、実施例１の工程３の除タンパク及び精製後の反応液10μlを、５μlの泳動緩衝液（95% Deionized Formamide, 20mM EDTA, 0.05% Bromophenol Blue, 0.05% Xylene Cyanol FF）に混合した。そして、95℃で3分間加熱した後に急冷して、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させた。変性後の反応液を6%アクリルアミドゲル電気泳動に供した。続いて、電気泳動ゲルを濾紙の上に載せて乾燥させた後、オートラジオグラフィーにより標識プローブからのシグナルを検出した。
【０１０８】
結果を図７に示す。
図７、レーン１〜８は、図５（Ａ）のレーン１〜８のサンプルを変性処理したものであり、詳細には、夫々、２次プローブとしてオリゴヌクレオチド１〜８を用いて得られた反応産物を一本鎖に変性した後、ゲル電気泳動した結果を示す。
【０１０９】
ゲル電気泳動の結果、反応産物はラダーとして検出された（特に、レーン５〜８）。したがって、様々な大きさの核酸断の存在が認められた。以上の結果より、２次プローブから伸長反応が生じていることが判明した。そして、２次プローブからの伸長反応が進行することで、安定した構造体が得られていることが理解される。
【０１１０】
実施例４.環状二本鎖核酸の検出
本発明の二本鎖核酸の検出方法の、実施例１で確認された直鎖状の二本鎖核酸に加えて、環状の二本鎖核酸への適用についても検討した。
【０１１１】
〔材料〕
標的二本鎖核酸
プラスミドpSP64 DNA（環状）を、標的二本鎖核酸とした。これは、実施例１にて使用した標的二本鎖核酸の制限酵素処理前の形態である。
【０１１２】
１次プローブ、及び２次プローブは、実施例１と同じものを使用した。
【０１１３】
〔方法〕
実施例１の工程１〜４の手順に従って、反応を行った後、オートラジオグラフィーによって標識プローブからのシグナルを検出した。なお、工程４に際しては、予め工程３の除タンパク及び精製後の反応液をRsa Iで処理したものを電気泳動に供した。Rsa I処理は、実施例１の手順に準じて行った。
【０１１４】
〔結果〕
結果を図８に示す。
図８は、オートラジオグラフィーによって、標的核酸に結合した標識２次プローブからのシグナルを記録した結果を示す。具体的には、レーン１〜８は、夫々、２次プローブとして、オリゴヌクレオチド１〜８を使用した結果を示す。
【０１１５】
２次プローブとして、オリゴヌクレオチド３、４、７、８を使用した場合には強いシグナルが観察された（レーン３、４、７、８）。したがって、本発明の二本鎖核酸の検出方法を利用することで、環状二本鎖核酸をも配列特異的に標的化し、検出できることが判明した。しかしながら、その他のオリゴヌクレオチドを用いた場合には、シグナルは確認できなった（レーン１、２、５、６）。したがって、環状二本鎖核酸を配列特異的に認識できない場合、及びその逆の場合もあることが想定された。以上の結果より、本発明の二本鎖核酸の検出方法は環状二本鎖核酸にも適用することができるが、検出精度の観点から直鎖状の二本鎖核酸への検出に特に好適な技術であることが理解される。
【０１１６】
実施例５.核酸試料からの標的二本鎖核酸の検出
本発明の二本鎖核酸の検出方法を用いて、標的二本鎖核酸の配列特異的な検出を試みた。
【０１１７】
〔材料〕
標的二本鎖核酸
標的二本鎖核酸として、λDNA（タカラバイオ社から購入）を使用した。
【０１１８】
１次プローブ
50merの合成オリゴヌクレオチドを調製し、１次プローブとした。以下に、配列情報を示す。
5'-agagtgtggcgcgtttctcctctgcatccggcgtggaggtggacaaggtc-3'
（配列認識番号12）
【０１１９】
２次プローブ
２次プローブとして、20-merのオリゴヌクレオチドを調製し、夫々、５’末端をT4 Polynucleotide kinaseと[γ-32Ｐ] ATPを用いて32Ｐで標識した。以下に、配列情報を示す。
5'-gcgtggaggtggacaaggtc-3'  （配列認識番号13）
【０１２０】
（方法）
実施例１の工程１〜４の手順に従って、反応を行った後、オートラジオグラフィーによって標識プローブからのシグナルを検出した。なお、工程４に際しては、工程３の除タンパク及び精製後の反応液を予め制限酵素BstP Iで処理したものを電気泳動に供した。なお、BstPI処理は、工程３の除タンパク及び精製後のサンプル20μlに対して、50mM Tris-HCl（pH7.9）、100mM NaCl、10mM MgCl2、1mM Dithiothreitol、10unit BstPIを混合して反応液量25ulとし、37℃で60分間保温することにより行った。
【０１２１】
また、以下の試薬を用いた場合についても検討を行った。
（Ｉ）三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った。
（II）ポリメラーゼ反応に際して、DNA ポリメラーゼを添加せずに反応を行った。
【０１２２】
さらに、上記核酸試料と標識２次プローブを混合したものについても同様に、電気泳動を行い、オートラジオグラフィーによって標識プローブからのシグナルを検出した。
【０１２３】
結果を図９に示す。図９（Ａ）は、オートラジオグラフィーによって、標的核酸に結合した標識２次プローブからのシグナルを記録した結果を示し、図９（Ｂ）は、オートラジオグラフィーに先立った電気泳動後の電気泳動ゲルのエチジウムブロミド染色の結果を示す。なお、図９（Ｃ）は、λDNAのλ-BstP I-処理によって得られたDNA断片の電気泳動パターンを示す。
レーン１は、本発明の二本鎖核酸の検出方法により、核酸試料中の標的二本鎖核酸を配列特異的に検出した結果を示す。
レーン２は、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った場合の結果を示す。
レーン３は、ポリメラーゼ反応に際して、DNA ポリメラーゼを添加せずに反応を行った場合の結果を示す。
レーン４は、上記核酸試料と標識２次プローブを混合しただけの場合の結果を示す。
【０１２４】
本発明の二本鎖核酸の検出方法により、λDNAに対して標的二本鎖核酸の配列特異的な検出を試みたところ、標的核酸由来のシグナルを確認できた（（Ａ）レーン１）。しかも、標的とした断片のみを検出することができた。したがって、本発明の二本鎖核酸の検出方法により、標的核酸を特異的に検出することができることが判明した。一方。反応試薬の一部を欠如する場合には、標的核酸由来のシグナルを確認できなかった（（Ａ）レーン２〜３）。かかる結果は、実施例２の結果を追認するものである。また、核酸試料と標識２次プローブを混合しただけでは、標的核酸を特異的に検出することはできなかった（（Ａ）レーン４）。以上の結果より、本発明の方法によって、標的二本鎖核酸を配列特異的に検出し、かつクローニングすることができることが判明した。
【０１２５】
実施例６.従前の二本鎖核酸の検出方法との比較
本発明の二本鎖核酸の検出方法の検出精度につき、従前に報告された二本鎖核酸の検出方法と比較した。
【０１２６】
本発明の二本鎖核酸の検出方法の検出精度につき、従前に報告されたGenome Research、2004年１月、第14巻、第１号、第116〜125頁に記載の二本鎖核酸の検出方法と比較した。かかる方法は、二本鎖核酸の所望の位置に、２つのオリゴヌクレオチドプローブを配列特異的に結合することにより、安定な二重のD-ループを形成することにより、所与の塩基配列を有する二本鎖核酸を直接検出するものである。
【０１２７】
〔材料〕
以下の２種類の標的二本鎖核酸の検出について比較した。
【０１２８】
標的二本鎖核酸−Ａ
M13 mp18 RF DNA（タカラバイオ社より購入）の制限酵素SnaB I処理により得られたDNA断片を標的二本鎖核酸とした。M13 mp18 RF DNA（GenBank：Accession No.X02513）の配列情報につき、配列認識番号14として示す。
そして、かかる標的二本鎖核酸の検出のためのプローブとして以下のプローブを使用した。１次プローブ、２次プローブの配列情報を以下に示す。
１次プローブ（M13 mp18 RF DNAの1151〜1200塩基）
5'-acaaatctccgttgtactttgtttcgcgcttggtataatcgctgggggtc-3'
（配列認識番号11）
２次プローブ（上記１次プローブの３´末端から６〜３０塩基の部分に結合）
5'-ccagcgattataccaagcgcgaaac-3'
（配列認識番号15）
【０１２９】
標的二本鎖核酸−Ｂ
標的核酸-Bは、実施例５で用いた、λDNAの制限酵素λ-BstP Iに処理によって得られたDNA断片を標的二本鎖核酸とした。そして、かかる標的二本鎖核酸の検出のためのプローブとして以下の2種類のプローブセットａ、ｂで検討した。
【０１３０】
プローブセットａ
プローブセットａは、λDNAの制限酵素λ-BstP Iに処理によって得られるDNA断片のうち、1264断片を検出するように設計された。
１次プローブ
5'-atacgcgggtacatgggaacgtcagccaccattacatccggtgagcagtc-3'
（配列認識番号16）
2次プローブ
5'-cggatgtaatggtggctgacgttcc-3'
（配列認識番号17）
【０１３１】
プローブセットｂ
プローブセットｂは、λDNAの制限酵素λ-BstP Iに処理によって得られるDNA断片のうち、8453断片を検出するように設計された。
1次プローブ
5'-tggtacaggccgtgcggttgatattgccaaaacagagctgtgggggagag-3'
（配列認識番号18）
2次プローブ
5'-ccccacagctctgttttggcaatat-3'
（配列認識番号19）
【０１３２】
〔方法〕
（本発明の二本鎖検出方法による二本鎖核酸の検出−実施例）
実施例１の工程１〜４の手順に従って、反応を行った後、オートラジオグラフィーによる標識プローブからのシグナルを検出した。
【０１３３】
（従前報告された方法による二本鎖核酸の検出−比較例）
上述したGenome Research、2004年１月、第14巻、第１号、第116〜125頁に記載の手順により、二本鎖核酸の検出を行った。詳細には、当該文献の第122頁、METHODSの記載、特にはIn Vitro Formation of Double D-Loops: Standard Assayに記載の方法に準じて行った。なお、Incoming oligonucleotideとして上記１次プローブを、Annealing oligonucleotidesとして上記2次プローブを、Target DNA（Duplex DNA）として上記標的核酸-AとBを用い、上記文献記載の方法により行った。代表的な具体的手順について簡潔にまとめると、1.1μlの蛍光標識１次プローブ（18μM）、２μLの10×Synaptic Buffer（250mM Tris-酢酸、50mM酢酸マグネシウム、10mM DTT、10mM ATP-γS）、水、及び12.9μMのRecAを、反応液量18μlで混合した。そして、この混合液を、37℃にて10分間インキュベートしてRecAタンパク質と１次プローブを結合させた。続いて、RecAタンパク質で被覆した１次プローブを１μMの標的二本鎖核酸と、反応液量19μlでインキュベートした後、37℃にて10分間反応させた。次に、1.0μlの２次プローブ（36.5μM）を添加し、37℃にて２分間インキュベートすることで、四本鎖核酸を形成した。
【０１３４】
〔結果〕
結果を図10に示す。図10（Ａ）は、オートラジオグラフィーによって、標的核酸に結合した標識２次プローブからのシグナルを記録した結果を示し、図10（Ｂ）は、オートラジオグラフィーに先立った電気泳動後の電気泳動ゲルのエチジウムブロミド染色の結果を示す。なお、図10（Ｃ）は、λDNAのλ-BstP I-処理によって得られたDNA断片の電気泳動パターンを示す。
そして、レーン１〜４は、本発明の二本鎖核酸の検出方法により標的二本鎖核酸を検出した結果を示す（実施例）。
具体的には、レーン１〜２は、標的二本鎖核酸としてM13 mp18 RF DNAの制限酵素SnaB I処理により得られたDNA断片（標的二本鎖核酸−Ａ）の検出を試みた結果を示す。ただし、レーン２は、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った場合の結果を示す。
レーン３〜４は、標的二本鎖核酸としてλDNAの制限酵素λ-BstP Iに処理によって得られたDNA断片（標的二本鎖核酸−Ｂ）の検出を試みた結果を示す。そして、レーン３は、１次プローブ及び２次プローブとしてプローブセットａを用いて検出した結果を示し、レーン４は、１次プローブ及び２次プローブとしてプローブセットｂを用いて検出した結果を示す。
【０１３５】
レーン５〜８は、従前報告された方法により標的二本鎖核酸を検出した結果を示す（比較例）。
具体的には、レーン５〜６は、標的二本鎖核酸としてM13 mp18 RF DNAの制限酵素SnaB I処理により得られたDNA断片（標的二本鎖核酸−Ａ）の検出を試みた結果を示す。ただし、レーン６は、三本鎖領域形成反応に際して、１次プローブを添加せずに反応を行った場合の結果を示す。
レーン７〜８は、標的二本鎖核酸としてλDNAの制限酵素λ-BstP Iに処理によって得られたDNA断片（標的二本鎖核酸−Ｂ）の検出を試みた結果を示す。そして、レーン７は、１次プローブ及び２次プローブとしてプローブセットａを用いて検出した結果を示し、レーン８は、１次プローブ及び２次プローブとしてプローブセットｂを用いて検出した結果を示す。
【０１３６】
本発明の二本鎖核酸の検出方法は、標的核酸の種類、１次プローブ及び２次プローブとして用いるオリゴヌクレオチドの配列情報に制限されることなく、標的二本鎖核酸を配列特異的に検出できることが判明した（レーン１、３、４）。一方、従前報告された二本鎖核酸の検出方法では、今回検討を行ったいずれの場合においても標的二本鎖核酸由来のシグナルを確認することができなかった（レーン５〜８）。以上の結果より、従前報告された二本鎖核酸の検出方法によっては、二本鎖核酸を検出できない場合があることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
医療分野、生物化学分野、環境分野、食品分野等において有用な核酸の検出方法及びクローニング方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】本発明の二本鎖核酸の検出方法及び二本鎖核酸のクローニング方法の原理を模式的に示す図
【図２】実施例１で検討した標的二本鎖核酸の、１次プローブによる三本鎖形成領域と、２次プローブのアニーリング領域との位置関係を示す図。
【図３】実施例１で検討した標的二本鎖核酸の、１次プローブによる三本鎖形成領域と、２次プローブのアニーリング領域との位置関係を模式的に示す図。
【図４】実施例１で標的二本鎖核酸として用いたプラスミドpSP64 DNAを制限酵素Sca Iで直鎖状にした二本鎖DNAの制限酵素Rsa Iの認識部位と三本鎖形成領域との位置関係を示す図
【図５】本発明の二本鎖核酸の検出方法を用いて、標的二本鎖核酸の安定な二本鎖構造の状態での検出、及び、１次プローブと２次プローブの標的二本鎖核酸上の相補領域の位置関係の好適化を検討した実施例１の結果を示す図。
【図６】本発明の二本鎖核酸の検出方法の実施に付き必要な試薬について検討を行った実施例２の結果を示す図。
【図７】本発明の二本鎖核酸の検出方法における、２次プローブからの伸長反応について確認した実施例３の結果を示す図。
【図８】本発明の二本鎖核酸の検出方法の環状の二本鎖核酸への適用を検討した実施例４の結果を示す図
【図９】本発明の二本鎖核酸の検出方法を用いて、核酸試料からの標的二本鎖核酸の配列特異的な検出を試みた実施例５の結果を示す図
【図１０】本発明の二本鎖核酸の検出方法の検出精度につき、従前に報告された二本鎖核酸の検出方法と比較した実施例６の結果を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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