(57)【要約】【課題】ＩｇＧとの結合能力が高く、より感度よくＩｇＧを検出することができる、ＩｇＧ結合能を有するカルシウム結合発光蛋白質を提供すること。【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するプロテインＧと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質を用いる。本発明の融合蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定、ＩｇＧの検出などに利用することができる。【選択図】なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質。
【請求項２】
（１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、請求項１記載の融合蛋白質。
【請求項３】
（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質。
【請求項４】
さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項５】
配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項８】
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド。
【請求項９】
（１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１０記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項１３】
請求項１２記載の形質転換体を培養し、請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を含むキット。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。より具体的には、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するプロテインGドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルシウム結合発光蛋白質は、アポ蛋白質と、発光基質のペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する発光蛋白質である。カルシウム結合発光蛋白質は、カルシウムイオンと結合すると瞬間的に発光するという性質を有している。
カルシウム結合発光蛋白質としては、イクオリン、オべリン、クライチィン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインなどが知られている。なかでもイクオリンはカルシウム結合発光蛋白質の代表的なものであり、その高次構造および発光メカニズムなどが詳細に報告されている（例えば、非特許文献１：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158、非特許文献２：Head et al. (2000) Nature 405, 372-376など参照）。イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高いので、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムイオンの濃度変化の測定などに利用されている。
イクオリンは、アポイクオリンと、発光基質セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
【０００３】
プロテインGは、グループGの連鎖状球菌（Streptococci）細胞壁由来の蛋白質である。プロテインGは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域と特異的に結合し、その結合能はプロテインAより高いことが知られている（例えば、非特許文献３：J. Immunol. (1984)133：969-974）。ビオチン化イクオリンをビオチン化した抗体（ＩｇＧもしくはＩｇＭ）とストレプトアビジンを介して複合体を形成させ、プロテインＧを検出する方法や、ビオチン化イクオリンをビオチン化プロテインＧとストレプトアビジンを介して複合体を形成させ、抗体（ＩｇＧもしくはＩｇＭ）を検出する方法は報告されている（例えば、非特許文献４：J Biochem Biophys Methods. (1996) 32: 7-13など参照）。しかし、プロテインＧとイクオリンの融合蛋白質を用いたイムノアッセイ法の報告はなされていない。一方、ＩｇＧを認識するStaphylococcus aureus菌由来のプロテインAが知られているが、プロテインGは異なる動物種由来（ヤギ、ウシ、ヒツジ）のＩｇＧについての結合能がプロテインAより高く、またＩｇＧサブクラスへの結合能も異なる。
【非特許文献１】Inouye, S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158
【非特許文献２】Head, J. F. et al. (2000) Nature 405, 372-376
【非特許文献３】Bjorck, L and Kronvall, G (1984) J. Immunol. 133, 969-974
【非特許文献４】Paolo F. Zatta（1996）J Biochem Biophys Methods  32, 7-13
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記状況において、従来の融合蛋白質よりＩｇＧとの結合能力が高く、より感度よくＩｇＧを検出することができるカルシウム結合発光蛋白質が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するプロテインGドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるイクオリンとの融合蛋白質を効率良く作成し、従来の融合蛋白質より感度よくＩｇＧを検出することができる（すなわち、ＩｇＧの検出限界が低い）ことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
〔１〕  （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質、
〔２〕  （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記〔１〕記載の融合蛋白質、
〔３〕（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質、
〔４〕  さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合蛋白質、
〔５〕  配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質、
〔６〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質、
〔７〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔８〕  （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド、
〔９〕  （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜５個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記〔８〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１０〕  配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔１１〕  上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
〔１２〕  上記〔１０〕記載の組換えベクターが導入された形質転換体、
〔１３〕  上記〔１２〕記載の形質転換体を培養し、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法、
〔１４〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むキット、
〔１５〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
〔１６〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法
〔１７〕  上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法
などを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
さらに、本発明の融合蛋白質は、組換え蛋白質の発現系として広く用いられている原核細胞を宿主として用いることによって、細胞質中に可溶性タンパク質として発現させることができるので、効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明の融合蛋白質
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
【０００９】
本明細書中、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域を、「プロテインGドメイン」と称することがある。配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域を、「アポイクオリン」または「アポＡＱ」と称することがある。
【００１０】
本発明の融合蛋白質はさらに翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのペプチド配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００１１】
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。
【００１２】
本発明の融合蛋白質を、発光基質であるセレンテラジンまたはその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、ｆ-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）と、酸素存在下に接触させることにより、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を得ることができる。以下、「セレンテラジンまたはその誘導体」を、単に「セレンテラジン」と称することがある。本明細書中、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明のホロ蛋白質」または「プロテインG−イクオリン」もしくは「ProG−ＡＱ」と称することがある。また、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明の発光蛋白質」と称することもある。
【００１３】
本発明のホロ蛋白質としては、（１）本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、（２）本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とcl-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンとから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。より具体的には、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Biochem. J. 261, 913-920 (1989)などに記載の製造方法に準じる方法によって製造することができる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体（本発明の発光蛋白質）を形成した状態で存在する。前記複合体（本発明の発光蛋白質）にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
【００１４】
（第１の領域）
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能は、例えば、ウエスタンブロティング法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
【００１５】
第１の領域としては、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
【００１６】
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる活性もしくは機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
【００１７】
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
【００１８】
（第２の領域）
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジンもしくはセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200(アトー社製)、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。
【００１９】
第２の領域としては、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域；（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。ここで、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。
【００２０】
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第２の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（i）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、または（ii）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。
【００２１】
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
【００２２】
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドには、（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
【００２４】
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００２６】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００２７】
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
【００２８】
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。
【００２９】
あるアミノ酸配列に対して、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
【００３０】
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
【００３１】
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００３４】
３．本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
【００３５】
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。
【００３６】
また、本発明においては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。後述の実施例などに具体的に示されているように、これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性タンパク質として産生させることができる。
【００３７】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
【００３８】
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
【００３９】
また、本発明の組換えベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
【００４０】
（２）形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
【００４１】
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
【００４２】
４．本発明の融合蛋白質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
【００４３】
（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。
【００４４】
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
【００４５】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
【００４６】
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４７】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４８】
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
【００４９】
（本発明の融合蛋白質の分離・精製）
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
【００５０】
具体的には、本発明の融合蛋白質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明の融合蛋白質の粗抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により目的蛋白質を含む抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明の融合蛋白質を含む培養上清を得ることができる。
【００５１】
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明の融合蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明の融合蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明の融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
【００５２】
精製した本発明のアポ蛋白質を、還元剤（たとえばメルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）および酸素の存在下、発光基質であるセレンテラジンもしくはその誘導体と低温でインキュベーションすることにより、カルシウムイオン濃度依存的に発光する本発明のホロ蛋白質（発光蛋白質）を調製することができる。
【００５３】
５．本発明の融合蛋白質などの利用
（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の融合蛋白質（アポ蛋白質）は、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができる。また、本発明のホロ蛋白質は、酸素存在下、カルシウムイオンの作用によって発光しうる複合体（本発明の発光蛋白質）として存在する。よって、本発明の融合蛋白質および本発明のホロ蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Centro LB９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、ホロ蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
【００５４】
（発光による検出マーカーとしての利用）
本発明の融合蛋白質は、上述のように、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができ、かつ、ＩｇＧに結合する機能を有するので、例えば、イムノアッセイにおけるＩｇＧの検出に利用することができる。このようなＩｇＧの検出は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させ、カルシウムイオンによって発光させることによりＩｇＧを検出することができる。また、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させた後、酸素存在下、本発明の融合蛋白質をセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させることにより、本発明の発光蛋白質を形成させ、カルシウムイオンによって発光させてもよい。
【００５５】
６．本発明のキット
本発明は、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
【００５６】
本発明のキットは、上述したカルシウムイオンの検出または定量、ＩｇＧの検出または定量などに利用することができる。
【００５７】
発明を実施するための最良の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００５８】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００５９】
実施例１  プロテインG−アポＡＱ融合遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌において組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質を発現させるために、プロテインG遺伝子およびイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるプロテインGドメインをコードする Protein G遺伝子はＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーディング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。プロテインG−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターの構築法は以下の通りである。
まず、pAM-HEを鋳型として2種のPCRプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5' CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3'（配列番号：７）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）および
AQ-C-SalI（5' cgcgtcgac-tta-ggg-gac-agc-tcc-acc-gta-gag-ctt 3'（配列番号：８）；SalI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／SalIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI／SalI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-AQを構築した。
一方、pCold II-K(6)-G(4)-proteinGを鋳型として2種のPCRプライマー：
ProG-N/XhoI（5' ｇｃｇ-CTC-GAG-GAC-ACT-TAC-AAA-TTA-ATC-CTT 3'（配列番号：９）；XhoI制限酵素部位はアンダーライン）および
ProG-C/EcoRI（5' ｃｇｃ-GAA-TTC-TTC-AGT-AAC-TGT-AAA-GGT-CTT 3'（配列番号：１０）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素XhoI／EcoRIにて消化した後、pCold-AQの制限酵素XhoI／EcoRI部位に連結することによって、図１に示す発現ベクターpCold-G-AQを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能なであり、発現したProtein G-apoAQは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
【００６０】
実施例２  組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の調製法
組換えプロテインG −AQ融合蛋白質の調製は、以下に記載するように、組換えプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質を大腸菌で発現させた後、発現した該融合蛋白質を抽出し、抽出した該融合蛋白質をニッケル−キレートクロマトグラフ法を用いて精製したのち、発光活性を有するProtein G−AQに変換した後、疎水性ブチルクロマト法に精製した。なお、精製過程における融合蛋白質の発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、50mM Tris-HCl (pH7.6)の緩衝液１ml 中で、Protein G−アポAQ融合蛋白質溶液、2−メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つProtein G−AQ融合蛋白質を調製した。得られたProtein G−ＡＱ融合蛋白質溶液に50mM CaCl2 100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（rlu）で評価した。
【００６１】
組換えプロテイン G−アポＡＱ融合蛋白質の大腸菌での発現
発現ベクターpCold-G-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を37℃で18時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（100μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地400 mlに添加して、37℃で2.5時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、5,000rpm（6000×g）で集菌した。
【００６２】
２）  培養菌体からのプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の抽出
上記１）で集菌した菌体を20 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル250）を各20秒間、3回行った後、菌体破砕液を10,000rpm（12,000×g）で20分間遠心分離した。遠心分離により得られた不溶解性画分を再度20 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（3分間、2回）し、遠心分離を行った。この作業をもう一度繰り返し、得られた溶解性画分をProtein G−アポAQ融合蛋白質精製の出発材料とした。
【００６３】
３）  ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法によるプロテインG−アポAQ融合蛋白質の精製
組換え蛋白質はアミノ末端に6個のヒスチジン配列を有しているので、ニッケルキレートゲルによるアフィニティークロマト法により組換え蛋白質を精製した。
上記２）で得られた溶解性画分（50 ml）を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×4.3 ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを100 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を30 ｍｌの0.1 Mイミダゾール（和光純薬工業社製）を含む50mM Tris-HCl (pH7.6)、17 mlの0.2 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)、20 mlの0.3 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)にて溶出した。0.1 Mイミダゾールを含む50mM Tris-HCl (pH7.6)にて発光活性を有するプロテインG−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（40 ml ;プロテインG−アポAQ活性画分）。
【００６４】
４）  プロテインG−AQ融合蛋白質の調製法
ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法により得られたプロテインG−アポAQ融合蛋白質から発光活性を有するプロテインG−AQ融合蛋白質への変換を行った。精製プロテインG−アポAQ融合蛋白質（40 ml中30 mlを使用）を10mM DTTおよび、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 20 mlに溶解し、エタノールに溶解したセレンテラジン 500 μgを加え、4℃で一昼夜放置し、プロテインG−ＡＱ融合蛋白質へと変換した。このプロテインG−ＡＱ融合蛋白質に、硫酸アンモニウムを終濃度2 Mとなるよう添加し10,000rpm（12,000×g）で10分間遠心分離した。得られた不溶解性画分を6 mlの1.2 M硫酸アンモニウムを含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)に溶解した。
【００６５】
５）  ブチルカラムクロマトグラフ法によるProtein G−ＡＱ融合蛋白質の精製
上記４）で得られたプロテインG−ＡＱ活性画分の一部を、1.2 M硫酸アンモニウムを含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したブチルカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×7cm）に添加してプロテインG−ＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したProtein G−ＡＱ融合蛋白質を、0.8 M硫酸アンモニウム（和光純薬工業社製）を含む2 mM EDTA-10 mM Tris-HCl (pH7.6)で溶出した（20 ml ; Protein G−ＡＱ活性画分）。また、精製過程の試料を12％SDS−PAGE分析を行った結果、精製プロテインG-AQ 蛋白質の純度95％以上であることが明らかとなった（図２）。
【表１】
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【００６６】
実施例３  プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白量と発光量との直線性 
プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の濃度を100ピコグラムから1ナノグラムとして、50 mM CaCl2 100μlを注入し、発光測定装置Centro LB960（ベルトール社製）で発光活性を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図３に示した。発光強度とプロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質との間に直線性の相関が認められた。この結果から、プロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白質量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
【００６７】
実施例４  プロテインＧ−ＡＱ蛋白質を用いた競合法によるビオチンの定量法 
ビオチン化BSA（シグマ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（pH9.6）にて希釈し、5μｇ／ｍｌに調製した。得られた5μｇ／ｍｌのビオチン化BSA溶液を、96マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃437796）に100 μｌ／ウェル分注し、4℃にて一晩静置して、プレートをビオチン化BSAでコートした。静置後、前記プレートからビオチン化BSA溶液を除去した。前記プレートに、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳを200 μｌ／ウェル分注し、4℃で１6時間静置した。前記プレートから１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去した後、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、0.1％ＢＳＡ、2 ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、8 ｎｇ／ｍｌから1000 ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチンBSA溶液50 μｌと抗ビオチンモノクローナル抗体溶液（シグマ社製、１２０００倍希釈溶液を使用）50 μｌを順次添加し、30℃で1時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。次に、前記プレートにプロテインＧ−ＡＱ融合蛋白質（500 ｎｇ／ｍｌ）100 μｌを加え、25℃で１時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを 340 μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄したプレートに、50 ｍＭ ＣａＣｌ２を含有する50 ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6）を100 μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。その結果を図４に示した。この結果は、プロテインＧ−ＡＱ融合タンパク質によって、ビオチンに結合している抗ビオチンモノクローナル抗体が定量的に検出されたことを示している。すなわち、遊離ビオチンと固定化したビオチンとの間の、抗ビオチンモノクローナル抗体への結合の競合反応を利用することにより、遊離ビオチンの定量が可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本発明で用いられるプロテインＧ−アポイクオリン発現ベクターpCold-G -AQを示す概略図である。
【図２】図２は、プロテインＧ−アポイクオリンの精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１２％分離ゲル、９４℃、各レーンの試料は次の通りである。レーン１：蛋白質分子量マーカー（テフコ社）：β−ガラクトシダーゼ（116,000）、ホスホリパーゼＢ（97,400）、ウシ血清アルブミン（69,000）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（55,000）、乳酸デヒドロゲナーゼ（36,500）、炭酸脱水素酵素（29,000）、トリプシンインヒビター（20,100）、レーン２：組換えProtein G−アポＡＱを発現させた大腸菌の形質転換株の超音波破砕物を１２，０００ｇで遠心して得られた上清（蛋白質8.6μg）、レーン３：ニッケルキレートカラムからの溶出画分（蛋白質1.9μg）、レーン４：ブチルカラムからの溶出画分（蛋白質6.0μg）。
【図３】プロテインＧ−イクオリン融合蛋白質の、蛋白質量と最大発光強度との相関関係を示す図である。
【図４】プロテインＧ−イクオリン融合蛋白質を用いた、競合法によるビオチンの定量試験の結果を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００７０】
［配列番号：１］プロテインGドメインのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−G−ＡＱに挿入された、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡにコードされている、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−G−ＡＱに挿入された、プロテインG−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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