(57)【要約】      （修正有）【課題】各種タンパク質キナーゼの活性測定用の、基質ポリペプチドと、その測定方法を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列を有し、次の各種タンパク質キナーゼの優れた基質として、それらの活性測定に用いられるポリペプチド、およびその遺伝子：CaMK II、ERK2、JNK1、p38α、MAPKAP-K2、PKA、PKC-α、PKC-ζ、PKC-δ、Akt、Src、Abl、EGFR、INSR、JAK1。また、これらの基質ポリペプチドを用いる、各タンパク質キナーゼ活性の測定方法と測定用試薬、関連疾患の診断薬、および活性検出用ポリペプチドアレイ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、CaMK II（カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼ２型）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項２】
標識物質により標識化されている請求項1記載のポリペプチド。
【請求項３】
CaMK II活性の測定方法であって、
(a) 請求項1又は2記載のポリペプチドとCaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項４】
CaMK II活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項1又は2記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むCaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項５】
請求項1又は2記載のポリペプチドを含む、CaMK II活性の測定用試薬。
【請求項６】
請求項1又は2記載のポリペプチドを含む、CaMK II活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項７】
基板と、該基板上に固定化された請求項1又は2記載のポリペプチドとを含む、CaMK II活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項８】
請求項1記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、ERK2によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項１０】
標識物質により標識化されている請求項9記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ERK2活性の測定方法であって、
(a) 請求項9又は10記載のポリペプチドとERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１２】
ERK2活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項9又は10記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１３】
請求項9又は10記載のポリペプチドを含む、ERK2活性の測定用試薬。
【請求項１４】
請求項9又は10記載のポリペプチドを含む、ERK2活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項１５】
基板と、該基板上に固定化された請求項9又は10記載のポリペプチドとを含む、ERK2活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項１６】
請求項9記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１７】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JNK1によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項１８】
標識物質により標識化されている請求項17記載のポリペプチド。
【請求項１９】
JNK1活性の測定方法であって、
(a) 請求項17又は18記載のポリペプチドとJNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項２０】
JNK1活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項17又は18記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むJNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項２１】
請求項17又は18記載のポリペプチドを含む、JNK1活性の測定用試薬。
【請求項２２】
請求項17又は18記載のポリペプチドを含む、JNK1活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項２３】
基板と、該基板上に固定化された請求項17又は18記載のポリペプチドとを含む、JNK1活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項２４】
請求項17記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２５】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、p38αによりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項２６】
標識物質により標識化されている請求項25記載のポリペプチド。
【請求項２７】
p38α活性の測定方法であって、
(a) 請求項25又は26記載のポリペプチドとp38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項２８】
p38α活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項25又は26記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むp38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項２９】
請求項25又は26記載のポリペプチドを含む、p38α活性の測定用試薬。
【請求項３０】
請求項25又は26記載のポリペプチドを含む、p38α活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項３１】
基板と、該基板上に固定化された請求項25又は26記載のポリペプチドとを含む、p38α活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項３２】
請求項25記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３３】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、MAPKAP-K2によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項３４】
標識物質により標識化されている請求項33記載のポリペプチド。
【請求項３５】
MAPKAP-K2活性の測定方法であって、
(a) 請求項33又は34記載のポリペプチドとMAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項３６】
MAPKAP-K2活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項33又は34記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むMAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項３７】
請求項33又は34記載のポリペプチドを含む、MAPKAP-K2活性の測定用試薬。
【請求項３８】
請求項33又は34記載のポリペプチドを含む、MAPKAP-K2活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項３９】
基板と、該基板上に固定化された請求項33又は34記載のポリペプチドとを含む、MAPKAP-K2活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項４０】
請求項33記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４１】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKA（サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項４２】
標識物質により標識化されている請求項41記載のポリペプチド。
【請求項４３】
PKA活性の測定方法であって、
(a) 請求項41又は42記載のポリペプチドとPKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項４４】
PKA活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項41又は42記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項４５】
請求項41又は42記載のポリペプチドを含む、PKA活性の測定用試薬。
【請求項４６】
請求項41又は42記載のポリペプチドを含む、PKA活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項４７】
基板と、該基板上に固定化された請求項41又は42記載のポリペプチドとを含む、PKA活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項４８】
請求項41記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４９】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-α（プロテインキナーゼＣのαサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項５０】
標識物質により標識化されている請求項49記載のポリペプチド。
【請求項５１】
PKC-α活性の測定方法であって、
(a) 請求項49又は50記載のポリペプチドとPKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項５２】
PKC-α活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項49又は50記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項５３】
請求項49又は50記載のポリペプチドを含む、PKC-α活性の測定用試薬。
【請求項５４】
請求項49又は50記載のポリペプチドを含む、PKC-α活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項５５】
基板と、該基板上に固定化された請求項49又は50記載のポリペプチドとを含む、PKC-α活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項５６】
請求項49記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項５７】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-ζ（プロテインキナーゼＣのゼータサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項５８】
標識物質により標識化されている請求項57記載のポリペプチド。
【請求項５９】
PKC-ζ活性の測定方法であって、
(a) 請求項57又は58記載のポリペプチドとPKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項６０】
PKC-ζ活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項57又は58記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項６１】
請求項57又は58記載のポリペプチドを含む、PKC-ζ活性の測定用試薬。
【請求項６２】
請求項57又は58記載のポリペプチドを含む、PKC-ζ活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項６３】
基板と、該基板上に固定化された請求項57又は58記載のポリペプチドとを含む、PKC-ζ活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項６４】
請求項57記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項６５】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-δ（プロテインキナーゼＣのデルタサブタイプ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項６６】
標識物質により標識化されている請求項65記載のポリペプチド。
【請求項６７】
PKC-δ活性の測定方法であって、
(a) 請求項65又は66記載のポリペプチドとPKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項６８】
PKC-δ活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項65又は66記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むPKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項６９】
請求項65又は66記載のポリペプチドを含む、PKC-δ活性の測定用試薬。
【請求項７０】
請求項65又は66記載のポリペプチドを含む、PKC-δ活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項７１】
基板と、該基板上に固定化された請求項65又は66記載のポリペプチドとを含む、PKC-δ活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項７２】
請求項65記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項７３】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Aktによりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項７４】
標識物質により標識化されている請求項73記載のポリペプチド。
【請求項７５】
Akt活性の測定方法であって、
(a) 請求項73又は74記載のポリペプチドとAkt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項７６】
Akt活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項73又は74記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むAkt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項７７】
請求項73又は74記載のポリペプチドを含む、Akt活性の測定用試薬。
【請求項７８】
請求項73又は74記載のポリペプチドを含む、Akt活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項７９】
基板と、該基板上に固定化された請求項73又は74記載のポリペプチドとを含む、Akt活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項８０】
請求項73記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８１】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Srcによりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項８２】
標識物質により標識化されている請求項81記載のポリペプチド。
【請求項８３】
Src活性の測定方法であって、
(a) 請求項81又は82記載のポリペプチドとSrc活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項８４】
Src活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項81又は82記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むSrc活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項８５】
請求項81又は82記載のポリペプチドを含む、Src活性の測定用試薬。
【請求項８６】
請求項81又は82記載のポリペプチドを含む、Src活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項８７】
基板と、該基板上に固定化された請求項81又は82記載のポリペプチドとを含む、Src活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項８８】
請求項81記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８９】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Abl（アベルソンチロシンキナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項９０】
標識物質により標識化されている請求項89記載のポリペプチド。
【請求項９１】
Abl活性の測定方法であって、
(a) 請求項89又は90記載のポリペプチドとAbl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項９２】
Abl活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項89又は90記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むAbl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項９３】
請求項89又は90記載のポリペプチドを含む、Abl活性の測定用試薬。
【請求項９４】
請求項89又は90記載のポリペプチドを含む、Abl活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項９５】
基板と、該基板上に固定化された請求項89又は90記載のポリペプチドとを含む、Abl活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項９６】
請求項89記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９７】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、EGFR（上皮細胞成長因子受容体型キナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項９８】
標識物質により標識化されている請求項97記載のポリペプチド。
【請求項９９】
EGFR活性の測定方法であって、
(a) 請求項97又は98記載のポリペプチドとEGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１００】
EGFR活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項97又は98記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むEGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１０１】
請求項97又は98記載のポリペプチドを含む、EGFR活性の測定用試薬。
【請求項１０２】
請求項97又は98記載のポリペプチドを含む、EGFR活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項１０３】
基板と、該基板上に固定化された請求項97又は98記載のポリペプチドとを含む、EGFR活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項１０４】
請求項97記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１０５】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、INSR（インスリン受容体型キナーゼ）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項１０６】
標識物質により標識化されている請求項105記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
INSR活性の測定方法であって、
(a) 請求項105又は106記載のポリペプチドとINSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１０８】
INSR活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項105又は106記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むINSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１０９】
請求項105又は106記載のポリペプチドを含む、INSR活性の測定用試薬。
【請求項１１０】
請求項105又は106記載のポリペプチドを含む、INSR活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項１１１】
基板と、該基板上に固定化された請求項105又は106記載のポリペプチドとを含む、INSR活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項１１２】
請求項105記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１１３】
以下の(a)または(b)のポリペプチド：
(a) 配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JAK1（ヤヌスキナーゼ１型）によりリン酸化され得るポリペプチド。
【請求項１１４】
標識物質により標識化されている請求項113記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
JAK1活性の測定方法であって、
(a) 請求項113又は114記載のポリペプチドとJAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１１６】
JAK1活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 請求項113又は114記載のポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含むJAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法。
【請求項１１７】
請求項113又は114記載のポリペプチドを含む、JAK1活性の測定用試薬。
【請求項１１８】
請求項113又は114記載のポリペプチドを含む、JAK1活性に関連する疾患の診断薬。
【請求項１１９】
基板と、該基板上に固定化された請求項113又は114記載のポリペプチドとを含む、JAK1活性検出用ポリペプチドアレイ。
【請求項１２０】
請求項113記載のポリペプチドをコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は各種タンパク質キナーゼによりリン酸化される基質ポリペプチドおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼは細胞情報伝達の中核をなす、翻訳後修飾を担当する酵素群である。タンパク質キナーゼのアッセイは創薬、診断において極めて重要なものである。既に種々のキナーゼに関して幾つかの基質ポリペプチドが報告されており、市販もされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、タンパク質キナーゼの既存の基質ポリペプチドは必ずしも満足できるものではない。種々の能力を持った基質ポリペプチドの開発が望まれている。たとえば、基質を実際の細胞内キナーゼの計測に用いることは、診断や創薬に極めて有用であるが、細胞内キナーゼの量や活性は、細胞の種類や目的とする状態によって様々であるため、よりリン酸化されやすい基質のほうが良いというものではない。実際に目的の系に存在するキナーゼの量に適したリン酸化されやすさが必要である。すなわち、一つの酵素に対して一種類の基質があればいいということではなく、種々のリン酸化のされやすさをもつ多くの基質を用意することが重要である。
【０００４】
またタンパク質キナーゼの活性検出用の、基質ポリペプチドを基板上に固定化したポリペプチドアレイやバイオチップに用いるための基質ポリペプチドの開発も望まれている。基板上に固定化された状態でタンパク質キナーゼによりリン酸化されるのに適した基質ポリペプチドのアミノ酸配列は、溶液中でリン酸化されるのに適した基質ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なることが多いため、溶液中でのリン酸化反応に基づく従来の基質ポリペプチドのスクリーニング法ではポリペプチドアレイやバイオチップに用いるのに適した基質ポリペプチドを取得することが困難であった。
【０００５】
すなわち本発明は、優れた能力を有する、好ましくはポリペプチドアレイの作成に適した、タンパク質キナーゼの基質ポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、独自に開発した蛍光ペプチドガラスアレイを用いて、タンパク質キナーゼによるリン酸化部位配列を持ちに設計した1300種の基質ポリペプチドから、15種のタンパク質キナーゼそれぞれに対する基質ポリペプチドをスクリーニングし、表１に示す基質ポリペプチドを見出した。
【０００７】
なお、表１における「lnk」は、基質を基板上に固定化する際に、基板からの距離を確保しつつ、同時に基質の運動性も確保することを目的として導入された柔軟なリンカーを指す。リンカーは具体的には８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸により構成される。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
本発明は、(a)各タンパク質キナーゼに対する表１に示すいずれか１つのアミノ酸配列を含む基質ポリペプチド、または(b) 上記(a)に示すアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、(a)に示すポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼによりリン酸化され得るポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明のポリペプチドは標識物質により標識化されていてもよい。
【００１１】
本発明はまた、表１に示す各タンパク質キナーゼの活性の測定方法であって、
(a) 活性測定対象タンパク質キナーゼに対する本発明の基質ポリペプチドと、該タンパク質キナーゼの活性を有する可能性のある試料とを、該タンパク質キナーゼが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、表１に示す各タンパク質のキナーゼ活性に関連する疾患の診断方法であって、
(a) 診断対象疾患に関連するタンパク質キナーゼに対する本発明の基質ポリペプチドと、哺乳動物から単離された成分を含む該タンパク質キナーゼの活性を有する可能性のある試料とを、該タンパク質キナーゼが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させる工程と、
(b) 工程(a)でリン酸化されたポリペプチドを定量する工程と
を含む前記方法に関する。
【００１３】
本発明はまた、本発明の基質ポリペプチドを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性の測定用試薬に関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明の基質ポリペプチドを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性に関連する疾患の診断薬に関する。
【００１５】
本発明はまた、基板と、該基板上に固定化された本発明の基質ポリペプチドとを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の基質ポリペプチドの使用により、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性測定を行うことができる。
【００１７】
本発明の基質ポリペプチドは、ポリペプチドアレイ上でのリン酸化反応に基づいてスクリーニングされたものであることから、タンパク質キナーゼの活性検出用ポリペプチドアレイでの使用にも適したものであると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明をより詳細に説明する。
(1) ポリペプチド
本発明は、CaMK II（カルシウムカルモジュリン依存性キナーゼ２型）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたCaMK II活性の測定方法と測定用試薬、CaMK II活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにCaMK II活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００１９】
CaMK IIによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号1〜9のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。CaMK IIによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、CaMK IIによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００２０】
本発明はまた、ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたERK2活性の測定方法と測定用試薬、ERK2活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにERK2活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００２１】
ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号10〜36のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。ERK2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、ERK2によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００２２】
本発明はまた、JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたJNK1活性の測定方法と測定用試薬、JNK1活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにJNK1活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００２３】
JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号37〜56のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。JNK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JNK1によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００２４】
本発明はまた、p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたp38α活性の測定方法と測定用試薬、p38α活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにp38α活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００２５】
p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号57〜70のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。p38αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、p38αによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００２６】
本発明はまた、MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたMAPKAP-K2活性の測定方法と測定用試薬、MAPKAP-K2活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにMAPKAP-K2活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００２７】
MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号71〜84のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。MAPKAP-K2によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、MAPKAP-K2によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００２８】
本発明はまた、PKA（サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKA活性の測定方法と測定用試薬、PKA活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKA活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００２９】
PKAによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号85〜122のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKAによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKAによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００３０】
本発明はまた、PKC-α（プロテインキナーゼＣのαサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-α活性の測定方法と測定用試薬、PKC-α活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-α活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００３１】
PKC-αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号123〜137のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-αによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-αによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００３２】
本発明はまた、PKC-ζ（プロテインキナーゼＣのゼータサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-ζ活性の測定方法と測定用試薬、PKC-ζ活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-ζ活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００３３】
PKC-ζによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号138〜160のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-ζによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-ζによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００３４】
本発明はまた、PKC-δ（プロテインキナーゼＣのデルタサブタイプ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたPKC-δ活性の測定方法と測定用試薬、PKC-δ活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにPKC-δ活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００３５】
PKC-δによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号161〜172のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。PKC-δによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、PKC-δによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００３６】
本発明はまた、Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたAkt活性の測定方法と測定用試薬、Akt活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにAkt活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００３７】
Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号173〜177のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Aktによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Aktによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００３８】
本発明はまた、Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたSrc活性の測定方法と測定用試薬、Src活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにSrc活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００３９】
Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号178〜191のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Srcによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Srcによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００４０】
本発明はまた、Abl（アベルソンチロシンキナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたAbl活性の測定方法と測定用試薬、Abl活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにAbl活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００４１】
Ablによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号192〜206のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。Ablによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、Ablによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００４２】
本発明はまた、EGFR（上皮細胞成長因子受容体型キナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたEGFR活性の測定方法と測定用試薬、EGFR活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにEGFR活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００４３】
EGFRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号207〜221のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。EGFRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、EGFRによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００４４】
本発明はまた、INSR（インスリン受容体型キナーゼ）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたINSR活性の測定方法と測定用試薬、INSR活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにINSR活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００４５】
INSRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号222〜231のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。INSRによりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、INSRによりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００４６】
本発明はまた、JAK1（ヤヌスキナーゼ１型）によりリン酸化を受ける基質ポリペプチド、それを用いたJAK1活性の測定方法と測定用試薬、JAK1活性に関連する疾患の診断方法と診断薬、並びにJAK1活性検出用ポリペプチドアレイに関する。
【００４７】
JAK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしては、配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を含む、好ましくは20アミノ酸残基以下のポリペプチドが挙げられる。配列番号232〜246のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましい。JAK1によりリン酸化を受ける基質ポリペプチドとしてはまた、上記のポリペプチドが有するアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、付加、挿入または置換されたアミノ酸配列を含み、JAK1によりリン酸化され得るポリペプチドも好適に使用できる。ここで「1以上」とは通常は「1〜5個」であり、より典型的には「1〜3個」であり、最も好ましくは「1〜2個」である。
【００４８】
(2) ポリペプチドの合成
本発明のポリペプチドは公知のペプチド合成方法、例えば全自動ペプチド合成装置を用いた方法により製造することができる。
【００４９】
(3) タンパク質キナーゼの活性測定方法
本発明のポリペプチドは、それをリン酸化することができるタンパク質キナーゼの活性を測定するために用いることができる。
【００５０】
上記のCaMK II基質ポリペプチドと、CaMK II活性を有する可能性のある試料とを、CaMK IIが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりCaMK II活性を測定することができる。このときCaMK IIの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号1〜9によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む9種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５１】
上記のERK2基質ポリペプチドと、ERK2活性を有する可能性のある試料とを、ERK2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりERK2活性を測定することができる。このときERK2の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号10〜36によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む27種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５２】
上記のJNK1基質ポリペプチドと、JNK1活性を有する可能性のある試料とを、JNK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりJNK1活性を測定することができる。このときJNK1の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号37〜56によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む20種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５３】
上記のp38α基質ポリペプチドと、p38α活性を有する可能性のある試料とを、p38αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりp38α活性を測定することができる。このときp38αの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号57〜70によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５４】
上記のMAPKAP-K2基質ポリペプチドと、MAPKAP-K2活性を有する可能性のある試料とを、MAPKAP-K2が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりMAPKAP-K2活性を測定することができる。このときMAPKAP-K2の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号71〜84によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５５】
上記のPKA基質ポリペプチドと、PKA活性を有する可能性のある試料とを、PKAが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKA活性を測定することができる。このときPKAの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号85〜122によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む38種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５６】
上記のPKC-α基質ポリペプチドと、PKC-α活性を有する可能性のある試料とを、PKC-αが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-α活性を測定することができる。このときPKC-αの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号123〜137によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５７】
上記のPKC-ζ基質ポリペプチドと、PKC-ζ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-ζが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-ζ活性を測定することができる。このときPKC-ζの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号138〜160によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む23種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、より好ましくは20種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５８】
上記のPKC-δ基質ポリペプチドと、PKC-δ活性を有する可能性のある試料とを、PKC-δが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりPKC-δ活性を測定することができる。このときPKC-δの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号161〜172によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む12種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００５９】
上記のAkt基質ポリペプチドと、Akt活性を有する可能性のある試料とを、Aktが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりAkt活性を測定することができる。このときAktの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号173〜177によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む5種類のポリペプチドのうち3種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６０】
上記のSrc基質ポリペプチドと、Src活性を有する可能性のある試料とを、Srcが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりSrc活性を測定することができる。このときSrcの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号178〜191によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む14種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６１】
上記のAbl基質ポリペプチドと、Abl活性を有する可能性のある試料とを、Ablが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりAbl活性を測定することができる。このときAblの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号192〜206によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６２】
上記のEGFR基質ポリペプチドと、EGFR活性を有する可能性のある試料とを、EGFRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりEGFR活性を測定することができる。このときEGFRの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号207〜221によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、最も好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６３】
上記のINSR基質ポリペプチドと、INSR活性を有する可能性のある試料とを、INSRが基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりINSR活性を測定することができる。このときINSRの基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号222〜231によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む10種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６４】
上記のJAK1基質ポリペプチドと、JAK1活性を有する可能性のある試料とを、JAK1が基質ポリペプチドをリン酸化可能な条件で反応させ、次いで、リン酸化されたポリペプチドを定量することによりJAK1活性を測定することができる。このときJAK1の基質ポリペプチドを複数種類組み合わせて用いるとより精度の高い活性測定が可能となる。例えば配列番号232〜246によりそれぞれ表されるアミノ酸配列を含む15種類のポリペプチドのうち5種類以上、好ましくは10種類以上、好ましくは全種類を用いて活性測定を行うことが好ましい。
【００６５】
リン酸化されたポリペプチドの定量は常法により行うことができる。例えば、リン酸化されたポリペプチドに結合する抗体を用いて免疫学的方法により定量することが可能である。
【００６６】
本発明のポリペプチドは、リン酸化されたポリペプチドの定量をより容易にする目的で標識物質により標識化されていてもよい。標識物質としては、通常の免疫学的測定方法に使用し得るものであれば特に限定されることなく使用できる。例えば、酵素、ビオチン、蛍光物質、放射性物質等を単独または組合せて使用することができる。酵素としてはペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、マイクロペルオキダーゼが挙げられる。蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリプロテイン、フィコエリスリン等が挙げられる。発光物質としてはイソルシノール、ルシゲニン等が挙げられる。放射性物質としては125I、131I、14C、3H 等が挙げられる。また、標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標識アビジンを用いることにより標識ビオチンの量を高い感度で測定できるので、好ましい。酵素標識アビジンの酵素としては、抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることができる。
【００６７】
また、リン酸化部位に結合する試薬を利用して間接的にリン酸化を検出する計測法も可能であり、この計測法がより好ましい。リン酸化された部位に結合する試薬としては、抗リン酸化セリン・スレオニン抗体、抗リン酸化チロシン抗体、フォスタグがある。フォスタグは、亜鉛の２核錯体であり、リン酸基そのものに結合する。これらの試薬を用いる場合は、抗体を用いる場合は、抗体そのもの、あるいは２次抗体を上述と同様の検出基で標識したものを利用する。フォスタグでは、分子内にビオチン基を有しており、アビジンおよびその類縁体、あるいは抗ビオチン抗体を上述したものと同様の検出基を標識して、ビオチン部位に結合させることによって検出に供する。
【００６８】
また、本発明の基質ポリペプチド群は他のあらゆるキナーゼ活性評価法にも利用可能である。例えば、放射性の３２Ｐを有するＡＴＰを利用したオートラジオグラフィーなどの放射化分析や、表面が負に帯電した金コロイドの凝集状態変化を利用したアッセイなどに利用できる。金コロイドを用いるアッセイでは、金コロイド表面の負荷電と、正荷電を有する基質ペプチドの静電相互作用による凝集が、ペプチドのリン酸化にともなうペプチド側の正荷電の減少による凝集能の低下により抑制されることに伴う色調の変化を利用する。
【００６９】
本発明のポリペプチドは測定用途で許容される担体または賦形剤等の任意の成分と組み合わせて、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼの活性の測定用試薬として提供されてもよい。また、当該測定用試薬は、検出用抗体などと組み合わせて測定用キットとして提供されてもよい。
【００７０】
タンパク質キナーゼの活性を測定するには、基板と、該基板上に固定化された本発明のポリペプチドとを含む、該ポリペプチドを基質とするタンパク質キナーゼ活性検出用ポリペプチドアレイを使用することができる。この場合には、ガラス、ポリジメチルシロキサン、金などの基板上に、化学修飾を介してペプチドを固定化する。基板の形状は、平板なもの、ピラーを並べたもの、ウェルを並べたものなど、これまでに報告されたいずれの基板にも適用可能である。これらの基板上にガラスではシランカップリング剤や、表面を多糖などでコートすることにより、ポリジメチルシロキサンでは、表面を多糖などでコートしたり、表面をプラズマなどで修飾することで、また、金ではチオール誘導体で修飾することにより、アミノ基、カルボキシル基などの官能基を導入する。これに架橋剤などを用いたり、末端カルボシキシル基を活性エステル化したり、ホルミル基やマレイミド基を導入後、ペプチド末端をシステイン残基として反応させることにより基質ペプチドを固定化することができる。このようにして多種類の基質を固定化したアレイを、酵素溶液や細胞破砕液で処理して、表面に固定化した基質をリン酸化して、抗リン酸化セリン・スレオニン抗体や抗リン酸化チロシン抗体、フォスタグなどをはじめとするリン酸基と結合する試薬を結合させてから、前述したものと同様の検出手段により、多くの基質のリン酸化の程度を同時に評価することが可能である。
【００７１】
(4) タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断方法
本発明のポリペプチドを用いて、哺乳動物（例えばヒト、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ）から単離された成分（例えば血液、尿、哺乳動物の任意の組織(脳、肝臓、心臓、筋肉、皮膚など)の溶解産物（lysate）、哺乳動物の正常または癌培養細胞の溶解産物、および哺乳動物に発生した癌組織の溶解産物）を含む試料中のタンパク質キナーゼ活性を測定することにより、タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患を診断することができる。本発明の診断方法は、投薬前診断、術中診断、臨床診断等の種々の診断に適用可能である。本発明のポリペプチドを用いたタンパク質キナーゼ活性測定方法については、上記(3)で詳述したのと同様である。
【００７２】
本発明において「CaMK II活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のCaMK II活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては心筋梗塞などの循環器疾患、脳神経疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７３】
本発明において「ERK2活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のERK2活性が相違するような疾患を指す。このような疾患として種々のガン、免疫疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７４】
本発明において「JNK1活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のJNK1活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン、アポトーシスの関わる疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７５】
本発明において「p38α活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のp38α活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては間質性肺炎などの免疫性疾患、種々のガンや循環器疾患での血管新生等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７６】
本発明において「MAPKAP-K2活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のMAPKAP-K2活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガンや循環器疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７７】
本発明において「PKA活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKA活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７８】
本発明において「PKC-α活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-α活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００７９】
本発明において「PKC-ζ活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-ζ活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８０】
本発明において「PKC-δ活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のPKC-δ活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８１】
本発明において「Akt活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のAkt活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８２】
本発明において「Src活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のSrc活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガンや循環器疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８３】
本発明において「Abl活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のAbl活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては白血病など種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８４】
本発明において「EGFR活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のEGFR活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては種々のガン等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８５】
本発明において「INSR活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のINSR活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては糖尿病や慢性頭痛等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８６】
本発明において「JAK1活性に関連する疾患」とは、罹患患者と健常者との間で上記試料中のJAK1活性が相違するような疾患を指す。このような疾患としては白血病や免疫疾患等が挙げられるがこれらには限定されない。
【００８７】
本発明のポリペプチドは診断用途で許容される担体または賦形剤等の任意の成分と組み合わせてタンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断薬として提供されてもよい。また、当該診断薬は、検出用抗体などと組み合わせて診断用キットとして提供されてもよい。本発明の各種タンパク質キナーゼ活性検出用ポリペプチドアレイは、タンパク質キナーゼ活性に関連する疾患の診断の用途に使用することができる。
【００８８】
(5) 核酸
本発明はまた、上記の基質ポリペプチドをコードする核酸に関する。核酸としてはDNAまたはRNAが挙げられ、DNAが好ましい。当該核酸をベクターに導入し、生体内において本発明の基質ポリペプチドを発現させることが可能である。また、当該核酸と、マーカー分子（例えば抗原抗体反応を使って検出可能なマーカー分子）をコードする核酸とを融合した核酸配列をベクターに組み込み、生体内において本発明の基質ポリペプチドとマーカー分子との融合ポリペプチドを発現させることにより、生体内のキナーゼ活性をインビボで解析することができるものと期待される。
【実施例】
【００８９】
ぺプチレドアレイによる基質のスクリーニング
まず、ガラス基板を1% グルタルアルデヒド/50mM 炭酸buffer (pH9.5)溶液に浸漬し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベート後、基板を超純水に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を2回行い、未反応グルタルアルデヒドを除去した。次に、基質ポリペプチドの候補ポリペプチドとTCEPが終濃度0.1mM、TritonX-100が終濃度0.0002%となるように50mM 炭酸buffer (pH9.5)中で混合した溶液をGenex Arrayer（カケンジェネクス製；ピン先の直径が150μmのピンを使用）にて基板にスポットして、室温で一晩インキュベートし、ペプチドを固定化した。インキュベート後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を3回行い、未反応ペプチドを除去した。ペプチド固定化後、イオン交換水で5倍希釈したBocking One P溶液に基板を浸漬し、室温で40分インキュベートした。ブロッキング処理後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら3分間洗浄するという操作を3回行った。
【００９０】
続いて、各種のキナーゼ反応溶液〔ATP(+)及びATP(-)溶液〕をそれぞれ600μlずつ基板上に添加して、37℃で1時間インキュベートしてリン酸化反応を行った。反応終了後、TBS-S溶液に浸漬し超音波を当てながら5分間洗浄するという操作を3回、続いて超純水に浸漬し超音波を当てながら5分間洗浄するという操作を3回行った。そして、10μg/ml phos-tag/phos-tag buffer溶液を基板上に800μl添加して、室温で30分インキュベートした。インキュベート後、基板を超純水に浸漬し超音波を当てながら2分間洗浄した。続いて、2μg/ml Dylight647-streptavidin/Streptavidin buffer（Blocking One Pを10mM HEPES(pH7.3) で20倍希釈した溶液）を基板上に600μl添加して、室温で10分インキュベートした。インキュベート後、基板をTBS-T溶液に浸漬し超音波を当てながら2分間洗浄するという操作を2回行って、よく乾燥させた後、Scan Array Lite（PerkinElmer製）により蛍光イメージングを行った。
【００９１】
そして、phos-tagと蛍光標識ストレプトアビジンを用いて蛍光イメージングを行い、それぞれの基質ペプチドについて、ATP(+)から得られた蛍光強度からATP(-)から得られた蛍光強度を差し引いた値を算出した。それぞれのキナーゼについて2回ずつ実験を行い、この値の平均値が一定の基準以上を示したものをピックアップし、そのキナーゼの良好な基質として選定した。
【００９２】
こうして、表１に示す、各タンパク質キナーゼに対する基質ポリペプチド（配列番号1〜246）を決定した。 
【配列表】
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