(57)【要約】【課題】被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を簡便に高感度で判定する。【解決手段】対象となる動物種のCOXII遺伝子のうち動物種に特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチド用いて、動物種特異的核酸を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定する方法であって、対象となる動物種のチトクロムＣオキシダーゼサブユニットII遺伝子の塩基配列のうち該動物種に特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて該動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とする方法。
【請求項２】
対象となる動物種がウシ、家禽、ヒツジ、ブタ、及びウマから選ばれる1又は2種以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物種がウシであり、ウシ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号1に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記動物種が家禽であり、家禽特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号2に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記動物種がヒツジであり、ヒツジ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号3に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記動物種がブタであり、ブタ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号4に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記動物種がウマであり、ウマ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号5に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイゼーション法により動物種特異的核酸を検出する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定するキットであって、配列番号1〜5から選ばれる1又は2種以上の塩基配列又はそれらの部分配列を含む1又は2種以上のポリヌクレオチドが固定化された基板を含み、該ポリヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は飼料、飼料原料、化粧品、加工食品原料などの試料中に特定の動物種に由来する組織片等が混入しているか否かを判定するための方法及び該方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
牛の飼料に添加される牛由来の肉骨粉が狂牛病の感染源として有力視されている。狂牛病の拡大を防ぐ為にも、飼料への肉骨粉の混入を防ぐ必要がある。現在反芻動物由来の肉骨粉の輸入、製造、家畜などへの給与が禁止されているが、反芻動物用飼料への交差汚染の可能性は否定できない。その為、飼料への肉骨粉の混入の有無や、混入している動物種を確認する方法が望まれてきた。
【０００３】
これまでに、PCRにより動物由来のDNA断片を増幅させ、電気泳動によってPCR増幅産物の有無を確認し動物種を判定する方法があるが、この方法では動物種により異なるプライマーを用いる必要があるため、別々に反応させなければならず非常に手間を要する。
この手間を省く為にマルチプレックスPCR法を用いたキットも試薬会社から販売されている。しかしながら、これでも6種類の動物種を判別する為に複数回のPCR反応を行う必要がある。
また、1回のPCR反応で得た増幅産物を動物種特異的なプローブとハイブリダイズさせることにより動物種を特定する方法も報告されている（特許文献１）。この方法では、動物種の判定に、１２ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、又はチトクロムｂ遺伝子の塩基配列の違いが利用されている。しかしながら、この方法も検出感度などにおいて改善の余地が有り、より高感度かつ簡便に動物種を判定できる方法の開発が要望されていた。
【特許文献１】特開2003-189869号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は飼料、飼料原料、化粧品、加工食品原料などの試料中に特定の動物種に由来する組織片等が含有されているか否かを高感度に判定する方法、及び該方法に用いるためのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、チトクロムＣオキシダーゼサブユニットII（COXII）遺伝子の塩基配列のうち動物種に特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて検出することにより、被検試料中に、ウシ、家禽、ヒツジ、ブタ、またはウマに由来する成分が存在するかについて高感度で簡便に判定できることを見出した。これにより、本発明を完成させるに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定する方法であって、対象となる動物種のチトクロムＣオキシダーゼサブユニットII遺伝子の塩基配列のうち該動物種に特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて該動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とする方法。
（２）対象となる動物種がウシ、家禽、ヒツジ、ブタ、及びウマから選ばれる1又は2種以上である（１）の方法。
（３）前記動物種がウシであり、ウシ特異的塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番
号1に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、（１）または（２）の方法。
（４）前記動物種が家禽であり、家禽特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号2に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、（１）または（２）の方法。
（５）前記動物種がヒツジであり、ヒツジ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号3に示す塩基配列の一部または全部を含むヌクレオチドである、（１）または（２）の方法。
（６）前記動物種がブタであり、ブタ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号4に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、（１）または（２）の方法。
（７）前記動物種がウマであり、ウマ特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが配列番号5に示す塩基配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドである、（１）または（２）の方法。
（８）ハイブリダイゼーション法により動物種特異的核酸を検出する、（1）〜（7）のいずれかの方法。
（９）被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定するキットであって、配列番号1〜5から選ばれる1又は2種以上の塩基配列又はそれらの部分配列を含む1又は2種以上のポリヌクレオチドが固定化された基板を含み、該ポリヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とするキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、飼料、飼料原料、化粧品、加工食品原料などの試料中に特定の動物種に由来する組織片等が含有されているか否かを高感度かつ簡便に判定することが出来る。例えば、牛用配合飼料に0.0001%牛DNAが混入していただけであっても検出することが出来る。また、複数の動物種が混ざっていた場合も、感度良く動物種を特定することが出来る。
さらに、本発明のキットを用いることにより、サンプル調製後数時間という短時間で結果を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の方法は、被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定する方法であって、対象となる動物種のCOXII遺伝子の塩基配列のうち該動物種に特異的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いて該動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とする方法である。
被検試料は動物由来成分の混入の可能性のある試料であれば特に制限されないが、飼料、飼料原料、化粧品、加工食品原料などが挙げられる。
COXII遺伝子は、チトクロムＣオキシダーゼのサブユニットII をコードする遺伝子であるが、例えば、ウシ、家禽（ニワトリ）、ヒツジ、ブタ、ウマのCOXII遺伝子としては、それぞれ、GenBankにアクセッション番号  AF384026、AP003317、AF010406、AF486874、U83503で登録されている遺伝子が挙げられる。ただし、COXII遺伝子は種内で変異が存在する可能性があるため、これらの配列を有する遺伝子には限定されない。
本発明の方法では、ウシ、家禽、ヒツジ、ブタ、ウマそれぞれのCOXII遺伝子において、その動物種に特異的であり、種内変異の無い塩基配列を有するポリヌクレオチドを用いる。ポリヌクレオチドの長さについては、長すぎると特異性が下がり、短すぎると反応性が下がるので好ましくは10から50塩基、更に好ましくは12から25塩基である。
【０００９】
上記のような動物種特異的な塩基配列としては、例えば、ウシでは配列番号１、家禽では配列番号２、ヒツジでは配列番号３、ブタでは配列番号４、ウマでは配列番号５の塩基配列が挙げられる。したがって、配列番号１〜５から選ばれる1又は2種以上の塩基配列の全長または部分配列を含む1又は2種以上のポリヌクレオチドを用いることができる。なお、該ポリヌクレオチドは、上記塩基配列の全長または部分配列を含む限り、他の配列が付加されたものであってもよい。
【００１０】
動物種特異的核酸を検出する方法は特に制限されないが、上記ポリヌクレオチドをフォワードプライマーもしくはリバースプライマーとして使用し、動物種特異的に核酸を増幅して検出する方法や、上記ポリヌクレオチドをキャプチャーオリゴヌクレオチドとして基盤に固定し、キャプチャーオリゴヌクレオチドと被検試料由来PCR増幅産物の特異的ハイブリダイゼーションによって、動物種を決定する方法などが挙げられる。
特異的増幅による方法は、上記のポリヌクレオチドをプライマーとして用いることができる方法であれば特に制限されないが、PCR（RT-PCR法を含む）、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書)、ICAN法（特開2002-233379号公報）などが挙げられる。この中ではPCR法が特に好ましい。反応条件は通常の条件を採用することができ、試料中の標的核酸の濃度などに応じて適宜変更することができる。増幅に用いる鋳型はゲノム、プラスミド、RNAなど特に制限されない。核酸の調製は、通常核酸の調製に用いられている方法であれば良く、市販のキットを採用することもできる。例えばEasy-DNA kit (Invitrogen)を使用しても良い。
【００１１】
より高感度に検出するためには、本発明の方法は、動物種に特異的な前記ポリヌクレオチドをキャプチャーオリゴヌクレオチドとして基盤に固定化したDNAマイクロアレイを作製し、被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、動物種を決定する方法が好ましい。
以下、DNAマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う方法を例示する。
DNAマイクロアレイを用いてハイブリダイゼーションを行う方法では、例えば、1枚の基板上に配列番号1〜5から選ばれる1又は2種以上の塩基配列又はその部分配列を含む1又は2種以上のポリヌクレオチド（キャプチャーオリゴヌクレオチド）が固定化されたDNAマイクロアレイを用いる。
上記5種類のポリヌクレオチドが一枚の基板上に固定化されたものを用いると、試料中に含まれる核酸がどの動物種に由来するかを1回のハイブリダイゼーション反応により検出できるため、上記5種類のポリヌクレオチドが一枚の基板上に固定化されたものを用いることが好ましい。
【００１２】
キャプチャーオリゴヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドをそのまま固定化してもよいが、上記配列にハイブリダイゼーションを妨げる要因である２次構造的障害がある場合などは、ハイブリダイゼーションに影響を与えない任意の塩基をスペーサー化合物で置換するか、任意の塩基にスペーサー化合物を付加することにより、前記障害を回避することもできる。このようなスペーサー化合物としては、いずれの種類の塩基との相補結合性を有しない核酸骨格等が挙げられる。
キャプチャーオリゴヌクレオチドとして用いるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、またはロックド核酸のいずれであってもよい。また、標識されたものであってもよい。キャプチャーオリゴヌクレオチドの合成方法は、通常のオリゴヌクレオチドと同様にして、例えば市販のＤＮＡ合成機を用いる方法等によって、行うことができる。
【００１３】
上記のようにして基板上に固定化されたキャプチャーオリゴヌクレオチドに対し、被検試料より調製したプローブDNAをハイブリダイズさせる。
プローブDNAは、例えば、キャプチャーオリゴDNAと相補的な配列を含む領域を増幅する
ように設計したプライマーを用いて被検試料から調製した核酸を鋳型にPCRなどの遺伝子増幅を行うことによって得られる。ここで用いるプライマーは、各動物種に特異的配列を有するプライマーであっても、それらのいくつかの種または全種に共通の配列を有するプライマーであってもよい。被検試料からの核酸の調製は、通常の核酸の調製法と同様にして行うことができる。例えば、ＤＮＡは、R-F.Wangが紹介する方法に従って抽出することができる(Molecular and Cellular Probes(2000) 14, 1-5)。これは標準的な調製法であるが、多くの代替法があり、いずれを採用しても良い。
標識化されたＤＮＡプローブを得るために、ＰＣＲに用いるプライマーを予め標識しておくことが可能であり、またはＰＣＲ反応中、あるいは反応後にＤＮＡプローブを標識してもよい。標識物質には、蛍光物質またはハプテン等、通常のハイブリダイゼーションに用いるプローブと同様の標識物質を使用することができる。具体的には、蛍光物質としてはフルオレセイン(FITC)、ローダミン(Rodamine)、フィコエリスリン(PE)、テキサスレッド（Texas Red）、シアニン系蛍光色素等が、ハプテンとしてはビオチン(BIOTIN)、ジゴキシゲニン(Dig)、ジニトロフェニル(DNP)、フルオレセインなどが挙げられる。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは、通常の核酸のハイブリダイゼーションと同様にして行うことができる。以下に具体的な方法を例示する。
ＳＳＣ（Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｓａｌｉｎｅ Ｃｉｔｒａｔｅ）などの塩溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミンなどのブロッキング溶液、および反応促進のための添加剤からなる混合液に増幅フラグメントを加える。増幅フラグメントが２本鎖の場合は熱などによる変性を行う。支持体上に増幅フラグメント溶液を数μＬ滴下した後、数時間加熱操作（通常３０℃〜８０℃）を行い、支持体上に固定化されているキャプチャーオリゴヌクレオチドと増幅フラグメントでハイブリッドを形成させる。
適当な濃度のＳＳＣ溶液またはテトラメチルアンモニウムクロリド溶液中に支持体を沈め、加熱（通常３７℃〜７０℃）し、特異的なハイブリッドのみを選択的に支持体上に残す。このとき、ＳＤＳなどを加えても良い。
【００１５】
ハイブリッドの検出にはプローブDNAに標識されている蛍光物質またはハプテン等を使用することが好ましい。蛍光物質を使用する場合は、専用の蛍光スキャナーを用いて検出することができる。
ハプテンを使用する場合は、ハプテンを認識するタンパクまたはそれに結合するタンパクと、アルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの結合体（酵素コンジュゲート）を含む溶液を支持体上に加え、室温で数１０分間反応させる。なお、このハプテンと酵素コンジュゲートの結合反応を行う前に、キャプチャーオリゴヌクレオチドを固定した領域以外の支持体の領域をカゼインやウシ血清アルブミンなどのタンパクを用いて被覆することによって酵素コンジュゲートと支持体の非特異的吸着を阻止することができる。この処置は、オリゴヌクレオチドを固定した後、支持体上にカゼインなどのタンパクの溶液を加え、室温で数１０分間放置することによって行うことができる。
酵素コンジュゲートと核酸プローブのハプテンとの結合反応後、ハプテンと結合しなかった酵素コンジュゲートを、界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄することによって、支持体上には増幅フラグメントのハプテンと結合した酵素コンジュゲートのみが残ることになる。
この後酵素コンジュゲートに結合されたアルカリフォスファターゼまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼなどの酵素によって発色し、沈着するような化合物を添加することでハイブリッドを形成している部分だけが可視化される。
ここで用いられる化合物としては、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸−ｐ−トルイジン塩）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンチジンなどが用いられる。
【００１６】
本発明はまた、上記方法に用いることのできる動物種判定キットを提供する。
具体的には、被検試料中に含まれる動物に由来する成分の有無または同成分が由来する動物種を判定するキットであって、配列番号1〜5から選ばれる1又は2種以上の塩基配列又はその部分配列を含む1又は2種以上のポリヌクレオチドが固定化された基板（DNAマイクロアレイ）を含み、該ポリヌクレオチドと被検試料に由来する核酸とのハイブリダイゼーションにより、前記動物種に特異的な核酸を検出することを特徴とするキットを提供する。
【００１７】
固定化されるポリヌクレオチドの長さ及び態様は上述したとおりである。
なお、基板上には、上記5種類以外の動物種のポリヌクレオチドや、COXII以外の遺伝子の塩基配列を有するポリヌクレオチドがさらに固定化されていてもよい。
オリゴヌクレオチドを固定化する基板の材質は、オリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであれば良く、例えば、ガラス、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂が挙げられる。基板の形態は特に制限されないが、板状またはフィルム状が挙げられる。
【００１８】
オリゴヌクレオチドの基板への固定化は、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダイゼーション法に用いられる手法が利用可能であるが、本発明では、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材を使用し（米国特許：ＵＳ５，９０８，７４６、特開平８−２３９７５号）、紫外線照射処理を行うことにより、オリゴヌクレオチドを固定化した。本発明者らは、表面にカルボジイミド基またはイソシアネート基を有する基材に紫外線照射することで固定化効率を大幅に上げることに成功している（特開２００１−１０３９８１号）。
【００１９】
オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとＤＮＡプローブとの間の充分な反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは、技術的な問題と同時にコストがかかり、かつＤＮＡプローブの蛍光標識や、化学発色などを用いたハイブリダイゼーションの有無の判定にも、より精密で高額な検出装置（代表的にはスキャナー）を必要とすることになる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径１０〜１，０００μｍのサイズにスポットすることが好ましい。例えば、スポッティングマシーンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることができる。オリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。
【００２０】
また、本発明のキットは、ＤＮＡプローブを作製するためのプライマーまたは標識化ＤＮＡプローブ、緩衝液、ハプテンを認識する酵素コンジュゲート等のハイブリダイゼーション用の試薬等を含むものであってもよい。
【実施例１】
【００２１】
＜１＞オリゴヌクレオチドの合成
キャプチャー及びプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドは定法に従い、オリゴヌクレオチド合成機（PerkinElmer Applied biosystems）を用いて作製した。キャプチャーオリゴヌクレオチドは５'末端にオリゴＤＮＡ固定化用リンカーを結合させ、プライマーは５'末端にビオチンを結合させた。これらのオリゴヌクレオチドを10mM Tris-HCl(ｐH7.5)、1mM EDTA緩衝液に溶解させ、100pmol/μlのオリゴヌクレオチド溶液を調製した。
【００２２】
＜２＞基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティング
COXII遺伝子に基づく検出系（本発明）と12S rRNA遺伝子、16S rRNA遺伝子に基づく検出系を比較するために、同一のアレイ基板上にそれぞれのキャプチャーオリゴＤＮＡをス
ポットした。アレイのレイアウトを図１に示す。
キャプチャーオリゴヌクレオチドとして以下の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用した。
［COXII遺伝子］
ウシ    配列番号１の塩基番号２３〜４４
家禽    配列番号２の塩基番号１０〜２８
ヒツジ  配列番号３の塩基番号８〜２２
ブタ    配列番号４の塩基番号２５〜３８
ウマ    配列番号５の塩基番号８〜２６
［12S rRNA遺伝子］
ウシ    配列番号６
家禽    配列番号７
ヒツジ  配列番号８
ブタ    配列番号９
ウマ    配列番号１０
［16S rRNA遺伝子］
ウシ    配列番号１１
家禽    配列番号１２
ヒツジ  配列番号１３
ブタ    配列番号１４
ウマ    配列番号１５
スポッティングは次の通り行った。＜１＞で調製したキャプチャーオリゴヌクレオチド溶液10μlに対してマイクロスポッティング溶液（TeleChem International Inc.）を10μl混合し、マイクロタイタープレート（Greiner Laboratory Inc.）上に分注した。スポッティングマシンの所定の位置にカルボジイミド樹脂処理スライドグラス「カルボステーション（商標登録第4574974号、日清紡績株式会社）」を配置し、スポッティングマシンを作動させた。スポッティング終了後、スライドグラスに熱水からの蒸気を数秒間あて、その後紫外線を600mJ照射した。再度蒸気に数秒間曝露した後、ホットプレート上にスライドグラスを置いて水分を除去した。スライドグラスを3% BSA（ウシ血清アルブミン）を含む100mM Tris-HCl(pH7.5), 100mM NaCl，0.1% Triton X-100に30分間浸し、ブロッキングした。その後、10mM Tris-HCl(pH7.5), 1mM EDTA緩衝液で洗浄した。スライドグラスを室温で乾燥させ、使用まで乾燥状態で保存した。
【００２３】
＜３＞プローブ核酸の調製
市販のウシ、ニワトリ、ウマ、ブタ及びヒツジの肉からゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行うことでプローブ核酸溶液を得た。ゲノムＤＮＡの抽出にはEasy-DNA kit (Invitrogen)を使用し、ＰＣＲ反応にはMultiplex PCR Kit(QIAGEN)を用いた。
ＰＣＲ反応のプライマーには配列番号１６〜２８に示すものを使用した。このプライマーのうち、配列番号１６、２１はウシCOXII遺伝子、配列番号１７、２２は家禽COXII遺伝子、配列番号１８、２３はウマCOXII遺伝子、配列番号１９、２１はブタCOXII遺伝子、配列番号２０、２４はヒツジCOXII遺伝子を増幅するためのプライマーである。配列番号２５、２６のものは特開2003-189869に記載の12S rRNA遺伝子に基づく配列であって上記5種類の動物種の12S rRNA遺伝子に共通の配列、配列番号２７、２８のものは特開2003-189869に記載の16S rRNA遺伝子に基づく配列であって上記5種類の動物種の16S rRNA遺伝子に共通の配列である。
ＰＣＲ反応液の組成は、Multiplex PCR Master Mix  25μl、COXII遺伝子配列に基づくプライマー一式、または12S rRNA遺伝子配列に基づくプライマー一式、または16S rRNA遺伝子配列に基づくプライマー一式各25pmol、それぞれのゲノムDNA  100ng、から成り、これに滅菌水を加えて総量50μlとした。
エッペンドルフチューブに入れたこの溶液をサーマルサイクラーにセットして、95℃で15分間加熱した後、95℃：1分間、45℃：30秒間、72℃：30分間の反応を40サイクル行い、その後72℃で3分間反応させてＰＣＲ反応産物溶液を得た。
【００２４】
＜４＞ハイブリダイゼーション
＜３＞で調製したＰＣＲ反応産物溶液を4μlエッペンドルフチューブに取り、ディネイチャー処理として95℃で1分間加熱した後、氷中に1分間浸した。これを室温に戻し、ArrayIt Unihyb Hybridization Solution（TeleChem International Inc.）16μlを加えて混合し、プローブ核酸溶液とした。このプローブ核酸溶液を全量とり、＜2＞で作製したキャプチャーオリゴヌクレオチドを固定化した基板上に載せ、その上にカバーグラスを載せた。これを保湿箱に入れ、さらに37℃に設定した恒温器に入れて120分間静置した。その後基板を取り出し、すばやく室温下で2×SSC溶液（2×SSC：0.033M NaCl, 0.033Mクエン酸ナトリウム）に浸しながらカバーグラスを除去した後そのまま5分間浸してハイブリダイゼーションを終了させた。
【００２５】
＜５＞ハイブリダイゼーションシグナルの検出
ハイブリダイゼーションを終えた基板を2×SSCから取り出し、遠心機（Beckman社製）にセットし、2000rpmで１分間遠心した。次に、VECTASTAIN Elite ABC kit(VECTOR社)を用いて作製したアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を基板上に1.4ml滴下し、室温で30分間静置した。その後、この基板をTBST溶液（50mM Tris-HCl (pH7.6), 0.15M NaCl, 0.05% Tween20）中で洗浄し、余分なアビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体を除去した。発色反応は、TMB substrate kit for peroxidase (VECTOR社)を用いて作成した発色溶液を基板上に1.4ml滴下し、室温下で30分間静置することで行った。その後この基板を蒸留水で洗浄して発色反応を停止させた。
【００２６】
＜６＞判定
発色反応の結果を表１に示す。この結果から、COXII遺伝子に基づく検出系（本発明）は12S rRNA遺伝子に基づく検出系や16S rRNA遺伝子に基づく検出系と同様に５種類の動物種を判別できることがわかった。
【００２７】
【表１】
2008245523.tif 000002
【実施例２】
【００２８】
実施例１と同じオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティングを行った。
プローブ核酸の調製については、まず、市販の牛肉とウシ用配合飼料のそれぞれからゲノムＤＮＡを抽出した。抽出には実施例１と同様Easy-DNA kit (Invitrogen)を使用した。なお、ウシ用配合飼料にはウシ組織由来の成分は含まれていない。
次いで、抽出した牛肉由来ゲノムＤＮＡと飼料由来ゲノムDNAを表２の割合で混合し、これら６種類の組合せ混合物からそれぞれ100ngを採取し、鋳型とした。これら混合物について実施例１と同じプライマーを用い、Multiplex PCR Kit(QIAGEN)を用いてＰＣＲ反応を行い、増幅産物溶液を得た。
得られた増幅産物と上記キャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化された基板（DNAマイクロアレイ）を用い、ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は、実施例１と同様に行った。
ハイブリダイゼーションシグナルの検出は、実施例１と同様に行った。
【００２９】
結果を表２に示す。本発明のCOXII遺伝子に基づく検出系であれば、ウシ由来のＤＮＡが0.0001wt%以上含まれていれば検出することができたが、12S rRNA遺伝子に基づく検出系、16S rRNA遺伝子に基づく検出系では、その１０倍濃度の0.001wt%までしか検出することができなかった。即ち、本発明は従来の12S rRNA遺伝子に基づく検出系や16S rRNA遺伝子に基づく検出系より１０倍感度が高いことがわかった。
【００３０】
【表２】
2008245523.tif 000003
【実施例３】
【００３１】
実施例１と同じオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして基板へのキャプチャーオリゴヌクレオチドのスポッティングを行った。
プローブ核酸の調製については、まず、市販の牛肉と鶏肉のそれぞれからゲノムＤＮＡを抽出した。抽出には実施例１と同様Easy-DNA kit (Invitrogen)を使用した。
抽出した牛肉由来ゲノムＤＮＡと鶏肉由来ゲノムＤＮＡを表３の割合で混合し、これら７種類の組合せ混合物からそれぞれ100ng、10ng、1ngを採取し、鋳型とした。これらをＰＣＲ反応用のゲノムＤＮＡとして、実施例１と同じプライマーを用い、Multiplex PCR Kit(QIAGEN)を用いて、ＰＣＲ増幅産物溶液を得た。
得られた増幅産物と上記キャプチャーオリゴヌクレオチドが固定化された基板（DNAマイクロアレイ）を用い、ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応は、実施例１と同様に行った。
ハイブリダイゼーションシグナルの検出は、実施例１と同様に行った。
【００３２】
結果を表３に示す。本発明のCOXII遺伝子に基づく検出系であれば、出発試料中の総ゲノムＤＮＡ量が100ng、10ng、1ngの場合のいずれに対しても、そのうちの1wt%以上にウシ又はニワトリのゲノムＤＮＡが含まれていればウシ、ニワトリのどちらについても検出可能であった。一方、12S rRNA遺伝子に基づく検出系や16S rRNA遺伝子に基づく検出系の場合には、ウシとニワトリの場合で検出感度が異なり、ニワトリのゲノムＤＮＡの存在を検出するためには、出発試料中の総ゲノムＤＮＡ量が100ng、10ng、1ngの場合のいずれに対しても、ニワトリのゲノムＤＮＡが10wt%以上含まれていないと検出できず、ウシのゲノムＤＮＡの存在を検出するためには、出発試料中の総ゲノムＤＮＡ量が100ng、10ngの場合にはウシのゲノムＤＮＡが1wt%以上含まれていれば検出できたものの、出発試料中の総ゲノムＤＮＡ量が1ngの場合にはウシのゲノムＤＮＡが10wt%以上含まれていなければその存在を検出することができなかった。
このことから、本発明のCOXII遺伝子に基づく検出系が、従来の12S rRNA遺伝子に基づく検出系や16S rRNA遺伝子に基づく検出系に比べて感度よく検出できることが分かった。特に牛用配合飼料中に牛由来ゲノムDNAが混入した場合や、複数種の動物由来ゲノムDNAが混ざっていた場合に牛DNAの検出感度が向上したことから狂牛病蔓延の原因と言われている牛由来肉骨粉混入の有無を判定するのに有用であると言える。
【００３３】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明のキットに含まれるマイクロアレイの模式図。
【図１】
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【配列表】
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