(57)【要約】【課題】必須微量元素を含む海洋ミネラル成分を有効利用したＮＫ細胞活性化剤を提供する。【解決手段】海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する海水の濃縮液を酢酸で処理し、塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去して得られる、キレート化されたミネラル分を含む残留物を有効成分とするＮＫ細胞活性化剤。カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を有効成分とするＮＫ細胞活性化剤が好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する海水の濃縮液を酢酸で処理し、塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去して得られる、キレート化されたミネラル分を含む残留物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を有効成分とするＮＫ細胞活性化剤。
【請求項２】
前記ミネラル分を含有する海水の濃縮液に酢酸カルシウムを加えて反応を進めながら、
（Ａ）セレニューム（セレン；Selenium）を、ペプシンと酢酸（容量比）＝ペプシン：酢酸＝３０〜５０：７０〜５０）の混合液に加えて置くことにより生成した白濁液状物を、前記反応液に対し３〜７容量％加えて反応させ、
（Ｂ）反応が沈静化した後、結晶化させることにより、
カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を含有する、請求項１に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項３】
炭酸カルシウムを焼成し、これに酢酸を投入することにより酢酸カルシウムに変化させ、これを、前記海水濃縮液に対し１０〜３０容量％投入して反応を進めることにより得られる、カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を含有する、請求項２に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項４】
原料海水を加熱濃縮し、ついで、この濃縮液から塩化ナトリウムを除去するとともに、水銀等の有毒成分を固形化物としてろ去し、ろ液から得られる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項５】
原料海水を加熱濃縮し、ついで、この濃縮液に対し酢酸と木炭粉を添加し、加熱後冷却して、固形化した塩化ナトリウムを主体とし水銀等の有毒成分を含む固形化物をろ去し、ろ液から得られる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項６】
ろ液について、（１）酢酸と木炭粉の添加、（２）加熱後冷却、および（３）固形化物のろ去、の（１）〜（３）の操作を繰り返し、最終ろ液を濃縮して得られる残留固形物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる請求項４または５に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項７】
海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する前記海水の濃縮液に木炭粉と酢酸を添加し、加熱後冷却することにより塩化ナトリウムと有毒成分を沈殿として除去し、得られるキレート化したミネラルを含む結晶性固体粉末からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を使用する請求項１〜６のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項８】
前記ミネラルを含む結晶性固体粉末からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）がプランクトン由来の有機成分を２０〜３０質量％含有する請求項７に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項９】
海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）が、常量元素としてのカルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびマグネシウム（Ｍｇ）のほかに、生体内必須微量元素を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項１０】
海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）が、生体内必須微量元素として、少なくともセレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、および珪素（Ｓｉ）のいずれか１以上を含む請求項９に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項１１】
海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を経口投与する請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【請求項１２】
海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物として用いる請求項１１に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋ミネラル成分からなる治療および／または予防剤に関する。更に詳しくは、海水濃縮液から塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去したミネラル複合体を有効成分とするＮＫ細胞活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微量ミネラル成分の欠乏と老化との関連が注目されている。老化症状と微量ミネラル欠乏症状との間には下記表１に示す類似性があるといわれている。
【０００３】
【表１】
2008094762.tif 000002
【０００４】
老化の病態学的背景には活性酸素・フリーラジカルの増加、免疫性の低下、血圧上昇や高脂血症などの循環疾患、耐糖能異常乃至発がん等があるが、多くの種類の微量ミネラル欠乏で同じ病態が引き起こされる。特に、フリーラジカルは生体内の代謝過程で発生して細胞を阻害する要素となり、このフリーラジカルの増加は老化、成人病、発がんのメカニズムに関与する事が判ってきた。通常はこれを消去する酵素（スーパーオキサイドジスムターゼ、ＳＯＤ）が働いて有害作用を抑えているが、老化した生体で微量ミネラルが欠乏するとこの酵素の働きが阻害される。このため、生体に備わる防御機構に狂いが生じて生体の活力が失われ、成人病が発生しやすくなるといわれている。これは老化や微量ミネラル欠乏によるＳＯＤの低下は微量ミネラルの添加で是正され、さらに実験的には高血圧、高脂肪症、糖尿病などの成人病が微量ミネラルの添加で改善されるとの事実から裏付けられている。又、セレン欠乏や亜鉛欠乏でがんの発生率が増加することは古くから疫学調査で報告されている。このように微量ミネラルの欠乏は老化や疫病と重要な関係にある。
【０００５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫に分類され、ウイルス感染細胞やがん細胞を発見すると、これらを破壊し排除する免疫細胞であり、異物が侵入すると最初にはたらく自然免疫細胞である。従って、ＮＫ細胞は、インフルエンザなどの感染症やがんの予防、治療に有効な免疫力を有する。ＮＫ細胞によって破壊されたがん細胞の破片を単球が貪食し、抗原が提示されて、キラーＴ細胞が活性化する。獲得免疫であるＴ細胞やＢ細胞は、がん細胞に対抗する中心的な免疫細胞である。Ｔ細胞は骨髄でつくられるが成熟する過程で胸腺に移動する。胸腺では、Ｔ細胞は２つの系統に分けられ、１つはヘルパーＴ細胞、もう１つは前記キラーＴ細胞である。活性化したキラーＴ細胞は、抗原に向かって攻撃をする。ヘルパーＴ細胞は、抗体をつくって異物を排除するＢ細胞を補助し、Ｂ細胞は抗体をつくりがん細胞を攻撃する。胸腺では、これらＴ細胞のそれぞれの機能が強化される。しかし、加齢とともに胸腺が小さくなる。これはＴ細胞の機能を低下させ、免疫機能の低下につながる。また、ＮＫ細胞は自律神経によって影響を受けるため、ストレスを受けるとその活性は低下する。
【０００６】
がん治療に於ける免疫力の活性化は有力な治療手段として現在注目を集めている。ＮＫ細胞は腫瘍細胞の増殖に対して、また、細菌感染症に対しての宿主の免疫防御能をはかる上での主要素として認識されている。様々な活性吻質でＮＫ細胞活性が増強するとの多くの報告がなされ、臨床医学および実験医学での様々な成果により、ＮＫ細胞が細胞レベルから人間個体のレベルに至るまでの制がん物質として重要であることが明らかにされつつある（非特許文献１〜３）。そして、ＮＫ細胞ががんに対する生体内の免疫監視機構における宿主の防衛機構の主体であることは、これまでの研究で解明されている。とくに、ＮＫ細胞の機構が、末期がんでは障害されていることが彼我の研究で明らかにされた（文献４〜９）。さらに、ＮＫ細胞機構は、手術や制がん化学療法、放射線療法でも障害されることが報告されている（非特許文献１０〜１１）。生物活性物質（ＢＭＲ）の多くは細菌か黴由来である事が知られている。細菌由来のものとしては、Corinebacterium parvum,ＢＣＧ，ＬＰＳなどがある（非特許文献４，１２，１３）。一方、黴由来のものでは、lentianan，Lentinus edodes,polysaccaride krestin,Cariolus versicolor，zumosanなどがある（非特許文献１４〜１９）。これらに加えて、vitamine（非特許文献２０）やインターフェロンおよびインターロイキン２などのサイトカインも強力な免疫力増強作用を持つ物質である（非特許文献２１〜２６）。１つのＢＭＲを単体で与えることでＮＫ細胞の活性能が有意に増強するとの報告は幾つかあるが，同じＢＭＲを繰り返して与えるとかえってその活性が抑制される場合がある（非特許文献２７〜３１）。
【０００７】
ＮＫ細胞の活性化を図った薬剤としては、前記のほか、例えば、レンチナン、シゾフィラン等の免疫増強剤とＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン等との併用（特開平06-279276；特許文献１）がある。しかし、レンチナンは、重大な副作用として、ショック（ふるえ、呼吸困難など）がおこることがあり、その他おこることがある副作用として、胸部圧迫感、咽頭狭窄感／発疹，発赤、じん麻疹、かゆみ／悪心，嘔吐、食欲不振／頭痛，頭重、めまい／多汗、発熱、潮紅、ほてり、脱力発作、痛みを伴う一過性の腰痛，背部痛、倦怠感があり、検査などでわかる副作用として、赤血球，血色素，白血球減少、好酸球増多／ＡＳＴ，ＡＬＴ，ＡＬ−Ｐ，ＬＤＨ，総ビリルビン上昇があることが知られている。また、シゾフィランは、重大な副作用として、ショック（ふるえ、呼吸困難など）がおこることがあり、その他おこることがある副作用として、アレルギー症状（発疹、気管支ぜんそく様症状）／発熱、悪寒／注射部位の疼痛，腫脹，発赤，硬結，熱感，かゆみ／食欲不振、吐きけ、嘔吐／リンパ節腫脹、顔面紅潮，発汗があり、検査などでわかる副作用として、血圧低下，上昇／ＡＳＴ，ＡＬＴ上昇があることが知られている。
【０００８】
【特許文献１】特開平０６−２７９２７６号公報
【非特許文献１】Herberman, RB., et al. Science；1981.214:24-30.
【非特許文献２】Herberman, RB., NK cells and other natural effector cells（Acad.Press, New York).1982.
【非特許文献３】Herberman, RB., et al. Ｊ.Biol.Resp.Ｍodif;1983.2:548-562.
【非特許文献４】Ghoneum, Ｍ., et al. Int. J. Immunopharm; 1987. 9:71-78.
【非特許文献５】Ghoneum, Ｍ., et al. J. Clean Technol.,Environ. Toxicol.＆Occup. Med ;1996.5,267-284.
【非特許文献６】Pross, H., et al. Int. J. Cancer; 1976.18:593-604.
【非特許文献７】Hersey, P., et al. Int. J. Cancer; 1980.25:187-194.
【非特許文献８】Takasugi, M., et al. Cancer Res.1977.37:413-418.
【非特許文献９】Wilmer, LS., et al. Cancer Res.;1984.44:852-856.
【非特許文献１０】Powell, CB., et al., Cancer;1990.65,466-472.
【非特許文献１１】Powell, CB., et al. Clin.Exp.Immunol.;1990.79:424-429.
【非特許文献１２】Lichtenstein, A., et al. J. Biol. Response Modif. ; 1984. 3: 371-378.
【非特許文献１３】Wolfe, SA., et al. Nature.1976.262,584-586.
【非特許文献１４】Miyakoshi, H., et al. Int. J. Immunopharmac. ; 1984. 4, 373-379.
【非特許文献１５】Yunoki, S., et al. Int. J. Immunopharmacol. ; 1994. 16, 123-130.
【非特許文献１６】Ebina, T., et al. Jpn. J. Cancer Res.;1992.83:775-82.
【非特許文献１７】Suo, J., et al. Acta Medica 0kayama;1994.48:237-42.
【非特許文献１８】Wojdani,A., et al. Int.J.Immunopharmac;1987.9:827-832.
【非特許文献１９】Marconi,P., et al. Infect. Immun.;1985.50:297-303.
【非特許文献２０】Vojdani, A., et al. Nutrition Res.;1993.13:753-764.
【非特許文献２１】Einhorn, S.,et al. Int J. Cancer.;1978.22:405-409.
【非特許文献２２】Fresa, KL., et al. cancer Res。;1986.46:8l-8.
【非特許文献２３】Brunda, MJ., et al. Int. J. Cancer.;1987.40:365-41.
【非特許文献２４】Henny, CS., et al. Nature.;1981.291:335-339.
【非特許文献２５】Itoh, K.,et al. J.Immunol.;1985.134:802-807.
【非特許文献２６】Trinchieri, G., et al. J.Exp.Med.;1984.160:1147-1169.
【非特許文献２７】Borden, EC., et al. Ann. Intern.Med.;1982.97:1-6.
【非特許文献２８】Ernstoff, MS., et al. J. Biol. Resp.Modif.;1983.2:528-539.
【非特許文献２９】Golub, SH., et al. J. Natn. Can. Inst.;1982.5:703-710.
【非特許文献３０】Lotzova, E., et al. J. Natn. Cancer. Inst.;1983.71:903-910.
【非特許文献３１】Maluish, AE., et al J. Immunol.;1983.131:503-507.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
レンチナンやシゾフィランなどの薬剤を利用する従来のＮＫ細胞活性化剤には、前述のように、無視できない副作用やリスクが伴う場合や患者の負担が大きい場合がある。本発明の課題は、これらの問題点を解決しまたは軽減するＮＫ細胞活性化剤として、必須微量元素を含む海洋ミネラル成分を有効利用した治療および／または予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一般に中高年にさしかかると生体内の微量ミネラルは、摂取・吸収量の低下や代謝・排泄過程の障害でバランスが崩れ、慢性的な欠乏状態に陥るとされている。従って、微量ミネラルの摂取はこれから中高年にさしかかる人たちの健康維持・疫病予防に重要な役割を果たすことになる。
【００１１】
海水中には、地球誕生後３６億年間に海底の熱泉鉱床から湧き出したミネラルおよび陸地から流出したミネラルが溶解しており、上記老化症状に関係する微量元素はすべて含まれている。人体内に流れる血液あるいは体液の成分は、原始海洋成分に酷似するといわれており、微量元素が生体の生命活動を支える細胞レベルの代謝に必須な構成要素であることは以前から予想されている。
【００１２】
最近、生体内に低濃度しか存在しない元素の分析に必要な測定法が進歩し、また生化学的検討で種々の微量元素の機能が明らかにされ、微量元素の人体における必須性が確認されるようになっている。
【００１３】
蛋白質、核酸、血液等として、生体を構成している主要元素は、水素（Ｈ）、酸素（Ｏ）、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）であり、これに少量のリン（Ｐ）や硫黄（Ｓ）が含まれている。さらに骨や体液を構成する元素として、カルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、マグネシウム（Ｍｇ）、塩素（Ｃｌ）がある。これら常量元素に対して、生体内には必須微量元素が存在する。すなわち、セレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、ひ素（Ａｓ）、クロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、マンガン（Ｍｎ）、モリブデン（Ｍｏ）、珪素（Ｓｉ）、フッ素（Ｆ）、バナジウム（Ｖ）、ニッケル（Ｎｉ）、スズ（Ｓｎ）、よう素（Ｉ）等である。
【００１４】
これらの必須微量元素はいずれも荷電状態が変化しやすい遷移元素であり、生体内で電子授受による酸化還元反応の触媒となる酵素や補酵素の構成因子として働くものが多い。近年、クロムや亜鉛等の必須微量元素の欠乏で、インスリンを要求する糖代謝の障害やタンパク質、核酸代謝の異常が起こること等からこれらの微量元素の機能が明らかにされてきた（最新医学，45，808,(1990)等）。また、糖尿病については、実験糖尿病マウスに対する海水ミネラルの効果が確認されている（日本医事新報，第3675号、平成６年１０月１日発行）。
【００１５】
本発明者らは、海水中に含まれる海洋ミネラルの生体への作用について研究を進め、既に、海水濃縮液から塩化ナトリウムを可能な限り除去した後、さらに水銀等の有毒成分を除いた、常量及び微量元素含有ミネラル複合体（ Marina Crystal Mineral ；以下、ＭＣＭと略記することがある。）を有効成分とする、肝炎、高血圧、腫瘍、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などのアレルギーに有効な治療剤を提案している（特許第３２４７６２０号）。
【００１６】
ＮＫ細胞活性化剤に関しては、先に述べた通り、従来提案されているＮＫ細胞活性化剤は、副作用やリスク、患者負担に問題がある。
本発明者らは、副作用や患者負担の問題がなく適用できるＮＫ細胞活性化剤として、前記常量及び微量元素含有海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）に着目し鋭意研究の結果、ＭＣＭはＮＫ細胞の活性化に有効であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
また、生物学的な活性反応を調節する有力な物質を新たに確立するために、本発明者らは、海水由来の常量・微量元素の結晶体であるＭＣＭが持つ、ヒトＮＫ細胞活性を増強する能力を検討した結果、ＭＣＭはin vitroでもin vivoでもヒトＮＫ細胞の活性を有意に増強する強力な免疫活性物質である事を見出した。
【００１８】
がんの主たる治療様式に生体反応を変化させる物質を用いる方法があり、現在、注目を集めているが、この生体反応調節物質は、ＮＫ細胞活性を増強し、宿主のがんに対する免疫反応を強化して制がんをはかるという、新しい免疫療法になりうる可能性を持つ。ＭＣＭは海水から塩化ナトリウムを分離して結晶化させた常量および微量元素の集合体であり，新しい生体反応調節物質として知られている。本発明者らは、ＭＣＭが細胞レベルと生体レベルの両方でＮＫ細胞活性を増強させることを見出した。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下に示されるＮＫ細胞活性化剤の発明である。
１.海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する海水の濃縮液を酢酸で処理し、塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去して得られる、キレート化されたミネラル分を含む残留物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を有効成分とするＮＫ細胞活性化剤。
２.前記ミネラル分を含有する海水の濃縮液に酢酸カルシウムを加えて反応を進めながら、
（Ａ）セレニューム（セレン；Selenium）を、ペプシンと酢酸（容量比＝ペプシン：酢酸＝３０〜５０：７０〜５０）の混合液に加えて置くことにより生成した白濁液状物を、前記反応液に対し３〜７容量％加えて反応させ、
（Ｂ）反応が沈静化した後、結晶化させることにより、
カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を含有する、前記１に記載のＮＫ細胞活性化剤。
３.炭酸カルシウムを焼成し、これに酢酸を投入することにより酢酸カルシウムに変化させ、これを、前記海水濃縮液に対し１０〜３０容量％投入して反応を進めることにより得られる、カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を含有する、前記２に記載のＮＫ細胞活性化剤。
４.原料海水を加熱濃縮し、ついで、この濃縮液から塩化ナトリウムを除去するとともに、水銀等の有毒成分を固形化物としてろ去し、ろ液から得られる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる前記１〜３のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
５.原料海水を加熱濃縮し、ついで、この濃縮液に対し酢酸と木炭粉を添加し、加熱後冷却して、固形化した塩化ナトリウムを主体とし水銀等の有毒成分を含む固形化物をろ去し、ろ液から得られる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる前記１〜４のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
６.ろ液について、（１）酢酸と木炭粉の添加、（２）加熱後冷却、および（３）固形化物のろ去、の（１）〜（３）の操作を繰り返し、最終ろ液を濃縮して得られる残留固形物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を用いる前記４または５に記載のＮＫ細胞活性化剤。
７.海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する前記海水の濃縮液に木炭粉と酢酸を添加し、加熱後冷却することにより塩化ナトリウムと有毒成分を沈殿として除去し、得られるキレート化したミネラルを含む結晶性固体粉末からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を使用する前記１〜６のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
８.前記ミネラルを含む結晶性固体粉末からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）がプランクトン由来の有機成分を２０〜３０質量％含有する前記７に記載のＮＫ細胞活性化剤。
９.海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）が、常量元素としてのカルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、およびマグネシウム（Ｍｇ）のほかに、生体内必須微量元素を含む、前記１〜８のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
１０.海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）が、生体内必須微量元素として、少なくともセレン（Ｓｅ）、亜鉛（Ｚｎ）、鉄（Ｆｅ）、銅（Ｃｕ）、クロム（Ｃｒ）、マンガン（Ｍｎ）、および珪素（Ｓｉ）のいずれか１以上を含む請求項９に記載のＮＫ細胞活性化剤。
１１.海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を経口投与する前記１〜１０のいずれか１項に記載のＮＫ細胞活性化剤。
１２.海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物として用いる前記１１に記載のＮＫ細胞活性化剤。
【００２０】
本発明で用いる海水はプランクトンが棲息し得る海域におけるものであれば特に限定されないが、その成分の通年変化が少なくミネラル分に富んだ深層水が好ましい。ここで、深層水とは、水温躍層下の低温水である。特に好ましくは、プランクトンが豊富に生育している海域下の深層水であり、例えば、大洗海岸沖（茨城県・日本）などの太平洋沿岸の深層水が用いられる。例えば、３００リッターの海水より１ｋｇのＭＣＭが出来る。ＭＣＭは繰り返して与えてもＮＫ細胞活性を抑制しない点で注目に値する。ＭＣＭを１日に体重あたり２０ミリグラム服用させた場合、２ケ月間継続服用させた後でも免疫活性能は高いレベルに保たれていた。
【００２１】
ＭＣＭがリンパ球機能に対して抑制的な作用がないことはin vitroの検討で明らかにされている。また、ＰＨＡやＣｏｎＡ（Ｔ細胞分裂）、ＰＷＭ（Ｂ細胞分裂）などの分裂誘発物質がリンパ球を増殖させる効果を、トリチウムでラベルしたサイミヂンの取り込みを計測して検討した場合、ＭＣＭを加えて末梢血リンパ球を３日間培養しても変化がなかった。同様に、２週間ＭＣＭを与えてリンパ球数を計測してもＭＣＭ投与前と比較して変化がなかった。従って、ヒトに投与した際に観察されたＮＫ細胞活性の増大は、ＭＣＭの効果であるといえる。その理由として、
（１）ＭＣＭを継続的に服用させるとＮＫ細胞活性が高いレベルに保たれる、
（２）ＭＣＭ投与を終了するとＮＫ細胞活性が投与前値まで下がる、
ということが挙げられる。
【００２２】
ＭＣＭがＮＫ細胞活性を増強するメカニズムについては不明な点も多いが、in vitroの検討でＭＣＭとともに未梢血リンパ球を培養するとインターフェロンのレベルが８倍になったところから、インターフェロンの産生によるものと考えられる。様々な生物活性物質が大顆粒球からのインターフェロン産生を誘導し、産生したインターフェロンが大顆粒球の自己活性化を誘導する。フローサイトメトリーを用いてヒトのＮＫ細胞活性を計測すると、ＭＣＭ投与後は細胞数の増加が見られない反面、細胞１個あたりの細胞破壊能を増強させていることが明らかになった。
【００２３】
本発明では、セレンを強化した海洋ミネラル複合体、好ましくはカルシウムを補強すると共にセレンを強化した海洋ミネラル複合体により、ＮＫ細胞活性化効果を高めることができる。カルシウムには、白血球の食菌作用を助ける作用があることが知られている。セレンには、体の組織の老化を遅らせ、発がん・転移を抑制し、免疫機能を高める作用があることが知られている。本発明では、前記白血球の食菌作用を助けるカルシウムを補強すると共に前記免疫機能を高める作用があるセレンを強化した海洋ミネラル複合体により、ＮＫ細胞活性化効果を相加的、相乗的に高めることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明による海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）は、海水濃縮液から、塩化ナトリウム、有機水銀などの有毒成分を除去した成分から構成される常量元素としてのカルシウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウムのほかに生体内必須微量元素成分を含んでおり、ＮＫ細胞活性化剤として、副作用や患者負担の問題なく、原則個々の患者誰にでも適用できて、ＮＫ細胞の活性化において優れ、その活性化された非特異的な自然免疫を利用して、各種疾病、例えば、ウイルス、細菌、真菌などによる感染症やがんなどの腫瘍を有効に治療、予防、改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
［常量及び生体内必須微量元素含有ミネラル複合体（ＭＣＭ）の製造方法］
本発明のＮＫ細胞活性化剤では、海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する海水の濃縮液を酢酸で処理し、塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去して、キレート化されたミネラル分を含む残留物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を得、これをその有効成分とする。
【００２６】
本発明では、前記ミネラル分を含有する海水の濃縮液に酢酸カルシウムを加えて反応させ、これによりカルシウムを強化した海洋ミネラル複合体を作成することができる。カルシウムを補強するときは、好ましくは塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去後、前記海水濃縮液に酢酸カルシウムを加えて反応を進める。
【００２７】
好適には、炭酸カルシウムを焼成し、これに酢酸を投入することにより酢酸カルシウムに変化させ、これを、加熱した前記海水濃縮液に投入することによりカルシウムを強化した海洋ミネラル複合体を作成することができる。前記ミネラル分を含有する海水の濃縮液に、通常体積比１０〜３０％量、好ましくは２０％量の炭酸カルシウムを、通常約３００〜５００℃、好ましくは約４００℃に焼成しこれに通常含量約９０〜１００％、好ましくは９８〜９９．９％グレード酢酸を投入することにより酢酸カルシウムに変化させ、これを通常約１００〜２００℃、好ましくは約１５０℃の火源温度で加熱した前記海水濃縮液に、通常体積比１０〜３０％量、好ましくは２０％量投入し、反応を進める。
【００２８】
前記反応を進めながら、
（Ａ）セレニューム（セレン；Selenium）を、好ましくは、ペプシンと酢酸（容量比＝ペプシン：酢酸＝好ましくは３０〜５０：７０〜５０、特に好ましくはペプシン：酢酸＝４０：６０）の混合液に加えて置くことにより生成した白濁液状物を、前記反応液に対し好ましくは３〜７容量％、特に好ましくは５容量％加えて反応させ、
（Ｂ）反応が沈静化した後、結晶化させることにより、
カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を含有するＮＫ細胞活性化剤を得ることができる。なお、前記白濁液状物を生成させるために置いておく時間は、通常室温で６ヶ月〜１年６ヶ月、好ましくは１０ヶ月〜１年２ヶ月である。また、前記反応開始後、通常約２４〜１２０時間、好ましくは約４８〜９６時間放置することにより反応を沈静させ、これにより、前記カルシウムを補強すると共にセレニュームを強化した海洋ミネラル複合体を作成するのが好ましい。
【００２９】
本発明で使用する有効成分であるＭＣＭは、例えば水深約８０〜１２０ｍ程度の清浄な海水域から汲み上げた海水を原料として調製される。表２に、典型的な黒潮海域（大洗沖）の海面下約１００ｍで汲んだ清浄な海水１８リットルに含まれる主要元素とその割合を示す。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
この原料海水を、常圧あるいは減圧下で加熱して、好ましくは容量が５０〜７０分の１程度、特に好ましくは６０分の１程度となるまで濃縮する。ついで、この濃縮液から可能な限り塩化ナトリウムを除去する。すなわち、濃縮液に対し、好ましくはほぼ等容量の特に好ましくは９９％グレード酢酸と木炭粉約0.5重量％を添加し、通常３００〜５００℃程度好ましくは４００℃程度に加熱した後、好ましくは−５℃〜−２０℃程度、特に好ましくは−１２℃程度まで冷却すると、塩化ナトリウムを主体とし水銀等の成分を含む成分が固形化する。この固形物をろ過する。ろ液について、上記と同様に、（１）酢酸と木炭粉の添加、（２）加熱後冷却、および（３）固形物のろ去（ろ過）の（１）〜（３）の操作を、数回好ましくは３〜５回程度、特に好ましくは４回程度繰り返し、最終ろ液を濃縮する。かくして得られる残留固形物からなる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）は、海水中の有機成分であるピコプランクトンによりキレート化されており、これをそのまま本発明の治療・予防剤に使用することができる。
【００３２】
ＭＣＭの化学組成を検討した。ＭＣＭは常量・微量元素で構成されているが、塩化ナトリウムは分離され、カドミウム、有機および無機鉛、有機水銀などの有害物質は計測されなかった。ＭＣＭは、免疫活性を増強する反面、特記すべき副作用が無い、がんに対する有力な免疫治療物質である。表３に塩化ナトリウムおよび有毒成分が除去され海水中の有機物でキレート化された結晶性固形分（ＭＣＭ）１ｇ中に含まれる元素成分を示す。前記ミネラルを含む結晶性固体粉末（ＭＣＭ）がプランクトン由来の有機成分を約２０〜３０質量％、特に好ましくは約２５質量％含有する治療および／または予防剤が好ましい。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
［毒性］
本発明の海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）の毒性は十分に低いものであり、医薬品として十分安全に使用できることが確認されている。
【００３５】
［医薬品への適用］
本発明のＮＫ細胞活性化剤は、海水中のピコプランクトンに由来する有機成分とその有機成分によりキレート化されたミネラル分を含有する海水の濃縮液を酢酸で処理し、塩化ナトリウムおよび有毒成分を除去して得られる、キレート化されたミネラル分を含む残留物、すなわちＭＣＭを有効成分とすることを特徴とする。すなわち、本発明にかかる海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）は、すでに知られている糖尿病、肝炎、高血圧、腫瘍、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎などのアレルギーのほか、ＮＫ細胞活性化剤として有効である。本発明のＮＫ細胞活性化剤は、ＮＫ細胞の活性化能において優れ、その活性化された非特異的な自然免疫力により、各種疾病、例えば、ウイルス、細菌、真菌などによる感染症やがんなどの腫瘍を有効に治療、予防、改善することができる。本発明のＮＫ細胞活性化剤は、特にがんの免疫細胞療法例えば採血した血液からＮＫ細胞を取り出し培養して体内に戻すＮＫ細胞療法や採血した血液からＮＫ細胞とＴ細胞の両方の性質を持ち合わせたＮＫＴ細胞を取り出し培養して体内に戻すＮＫＴ細胞療法に特に有用である。本発明による海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）をＮＫ細胞活性化剤として前記感染症やがんなどの腫瘍の治療・予防の目的で用いるには、通常、経口の形で投与される。投与量は、年齢、体重、症状、治療・予防効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人１人当たり、１回について、３００ｍｇから４００ｍｇの範囲で、１日１回から数回経口投与される。
【００３６】
本発明の海洋ミネラル複合体（ＭＣＭ）を投与する際には、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物として用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、シロップ剤、エリキシル剤、さらには不活性な希釈剤（例えば精製水、エタノール）を含有する。この組成物には、さらに湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有せしめてもよい。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明のＮＫ細胞活性化剤の効果を実施例に基づいて説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されない。
【００３８】
［ヒト生体内ＮＫ細胞免疫活性に対するＭＣＭの賦活作用］
健康体の２０人に２ケ月間、体重１キログラム当たり１日２０ミリグラムのＭＣＭを投与した。これらのヒトより求めたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性を標準51−Ｃｒ release assay法で検討した。次いでフローサイトメトリー法で、ＮＫ細胞ＣＤ１６比率とＣＤ５６／ＣＤ３比率を求めた。その結果、
（１）経口投与開始２週間後のＮＫ細胞活性レベルは投与前の２倍に増強した。この活性化は、経口投与開始１〜２ケ月後でも高レベルを維持していた。一方、ＭＣＭの投与を中断すると、ＮＫ細胞活性はＭＣＭ投与前のレベルに戻った。
（２）免疫細胞中のＮＫ細胞が占める割合の変化が無い一方で、ＮＫ細胞全体で活性化された。これは、ＭＣＭが細胞１個あたりのＮＫ細胞活性を増強した事を表す。
（３）抹梢血管から採血したヒトリンパ球をＭＣＭと１６日間培養した場合、培養液中のＭＣＭ濃度（２５μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ）に応じてＮＫ細胞の活性が１５５％、２１０％増強した。
（４）濃度１００μｇ／ｍＬのＭＣＭとともに抹梢血リンパ球を培養したところ、インターフェロン−γの産生が８倍増強した。
（５）ＭＣＭは、ＰＨＡやＣｏｎＡ、ＰＷＭ等の白血球分化物質を与えてリンパ球を培養した場合でも、与えなかった場合でも、免疫機能を抑制しなかった。
以上のことから、ＭＣＭは、がんに対する免疫療法において有用であることが判る。
【００３９】
［方法：人体に対する使用と治療プロトコール］
１１人の健康体（女性６人および男性５人）が実験に参加した。人種はアジア系４人、白人４人、アフリカ系２人、ヒスパニツク１人である。年齢は２５才から６４才で、平均４３才である。被験者らは当実験に参加する少なくとも１週間前から薬物やビタミン類は摂取していない。さらに、被験者らは難治性疾患の既往歴がない。被験者からインフオームドコンセントを得た上で実験の施行を申請し、許可を得た。被験者全員に１日に体重１ｋｇあたり２０ｍｇのＭＣＭを２ケ月間継続して服用させた。投与前、投与２週間後、１ケ月後、２ケ月後、およびＭＣＭ投与終了後１ケ月を経て末梢血２０ｍＬを採血し、ＮＫ細胞活性を測定した。
【００４０】
［マリーナ・クリスタル・ミネラル（ＭＣＭ）］
黒潮海域（大洗沖）の海面下約１００ｍの清浄な海水を１８リットル採取し（成分は前記表２参照）、これを加熱濃縮後木炭粉と酢酸で処理し、塩化ナトリウムと有機水銀等の生体に有害な成分を除去し、加熱と凍結・除去を繰り返し、その海洋ミネラルを凝縮・結晶化させ、前記表３に示す粉末状の固体（ＭＣＭ）を調製した。このように、ＭＣＭは、典型的には、茨城県大洗海岸（日本）で採取した海水より塩化ナトリウムを分離し、常量および微量元素ないしその他の活性化物質を数度にわたって加熱・凍結乾燥して濃縮・結晶化した後に粉末体にしたものである。カドミウム、有機および無機鉛、有機水銀などの有害物質は、原子吸光度計測法による定量計測で検出されなかった（表３）。表４に、調製したＭＣＭの一例について食品分析をした結果を示す。
【００４１】
【表４】
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【００４２】
［培養液（ＣＭ）］
培養液には、牛胎児血清と抗生物質をそれぞれ最終濃度１０％と１％（１ｍＬにつきペニシリン１００ユニットとストレプトマイシン１００マイクログラム）になるようにＲＰＭＩ−１６４０に加えた。
【００４３】
［腫瘍細胞株］
腫瘍細胞株Ｋ５６２（赤白血病細胞株）をターゲット（target）として用いた。
【００４４】
［未梢血白血球の標本化（ＰＢＬ）］
ＰＢＬは、Ficol-Hypaque 密度勾配遠心機でヘパリン加末梢静脈血を遠心して作成した。細胞を３度Hankの調整塩溶液で洗い、ＣＭ１ｍＬあたりに細胞１０×１０６個を加えた。
【００４５】
［ＭＣＭをＰＢＬに加えての培養］
健常な５人から得たＰＢＬをＣＭ１ｍＬあたり１×１０６個に調整した。ＭＣＭ濃度を２５μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬに調整して１６時間培養した。ＰＢＬを２回洗浄し、effector:target比を１００対１としてＮＫ細胞活性を検討した。
【００４６】
［51Ｃｒ-release assay］
４時間放出標準51Ｃｒ-release assay法で測定した。要約すると、１×１０4個の51Ｃｒで標識した腫瘍細胞（標的：target）を0.1ｍＬのＣＭに入れ、小分けして微量線量計測板上に置いた。effector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比が12.5：１，２５：１，５０：１，１００：１になるようにeffector（ＰＢＬ）を調整して加えて３標本検定法で測定した。摂氏３７度で４時間インキュベーションした後、各測定板上の上澄みを集めてガンマ線量計測した。
アイソトープ放射線量の１００分率は次式で計算した。
【数１】
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腫瘍細胞からの自然放出量（Sp.Rel.）は、総放出量の通常８〜１０％であった。総放出量（Total.Rel.）は、0.1ｍＬのTritonＸを特定の計測板に加えて計測した。Exp.Rel.:各計測板で計測された線量。
【００４７】
［ＮＫ Subpopulations］
ＭＣＭ投与前とＭＣＭ投与１ケ月を経たヒト末梢血のＮＫ細胞活性を計測した。２波長光とともに前方および右屈折光弁別型単レーザーフローサイトメトリーを用いた。単核球の識別は直接免疫蛍光法、モノクローナル抗体による血液染色法、およびフローサイトメトリー法で行った（Fletcher, MA., et al. Diagn. Clin.Immunol.;1987.5,69-81.）。
【００４８】
［Total Lymphocite Counts（総リンパ球数の計測）］
ＭＣＭ投与前および投与２週間後に総リンパ球数を血球計測器で計測した。
【００４９】
［細胞分化・活性化の検討］
３人の健常被験者より採取した末梢血液中の、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、および正常単核細胞の増殖能力に対するＭＣＭの効果を、トリチュウムでラベルしたサイミヂンの取り込み能を計測して検討した。正常単核球を１０μｇ／ｍＬのＰＨＡ、ＣｏｎＡ、ＰＷＭ存在下および非存在下にＭＣＭ（０〜２００μｇ／ｍＬ）添加下に培養した。摂氏３７度で５％炭酸ガス飽和溶液に３日間培養した後にトリチュウムでラベルしたサイミヂンを加えて１６〜１８時間培養した。トリチュウムでラベルしたサイミヂンの取り込み能をシンチレーション計測した。
【００５０】
［ＥＬＩＳＡによるインターフェロン−γの計測］
３人の健常者から採取したＰＢＬをＭＣＭ（０〜２００μｇ／ｍＬ）を加えて１６時間培養した。培養上瀞液を集めてＥＬＩＳＡ法によりインターフェロン−γを解析した。インターフェロン−γの特異抗体を５０μＬ加えた計測皿にＰＢＬを加え、摂氏３７度で一晩培養した後、１０００倍希釈ポリクローナル抗インターフェロン−γ抗体５０μＬを加えた。アルカリフォスファターゼで沈殿させた山羊血清中に形成した抗ウサギＩｇ-Ｇ抗体を２０００倍希択で加えてさらに２時間インキュベートした。計測皿をアルカリフォスファターゼ基質でインキュベートした後にＥＬＩＳＡ解析機で測定した。
【００５１】
［結果］
１.ＭＣＭ摂取によるＮＫ細胞活性の増強
ＭＣＭ摂取によるＮＫ細胞活性の増強を、ａ）effector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比、およびｂ）ＮＫ細胞数、を指標として解析した。
図１は、異なるeffector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比でのヒトＮＫ細胞活性に対するＭＣＭの効果を示す。ＮＫ細胞活性（NK cell Activity）を、各effector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比（Ｅ／Ｔ Ratio）毎に、ＭＣＭ服用前(Baseline)、服用２週間後(2 wk after treatment)、１ケ月後(1 month after treatment)、２ケ月後(2 month after treatment)、および服用終了１ケ月後(1 month after cessation of treatment)に計測した。１１人からの結果を平均値±標準誤差で表す。表３に示される化学組成のＭＣＭ（ＭＣＭは海水より作られた常量および微量元素の集合体である。塩化ナトリウムが除かれ有害物質は検出されなかった。）を用いた。図１では、effector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比を変えてＭＣＭのＮＫ細胞活性増強作用を検討している。２週間ＭＣＭ服用させた後のＮＫ細胞活性は、effector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比を１２：１、２５：１、５０：１、１００：１に調整した場合のすべてで、服用前に比べて２〜３倍に増強した。ＭＣＭを２ケ月間継続して服用した場合のＮＫ細胞活性は服用前に比べて増強し続けたが、服用を中止して１ケ月を経ると服用前の水準に減弱した。
【００５２】
２.ＮＫ細胞数の計測
ＭＣＭ服用後にＮＫ細胞の分画（ＣＤ１６およびＣＤ５６／ＣＤ３）の変化をフローサイトメトリーで計測、分析した。ＭＣＭの服用でＣＤ１６およびＣＤ５６／ＣＤ３は服用前（12.4±3.3および2.1±0.9）と比較して服用後（12.1±2.9および2.0±0.9）は変化が無かった。さらに、ＭＣＭ服用後のＮＫ細胞数も絶対数は変化がなかった。
【００５３】
３.リンパ球数の計測
ＭＣＭ服用前に比べて服用２週間後のリンパ球総数に変化は無かった。
【００５４】
４．ＭＣＭ含有培地による培養後のＮＫ細胞活性
ＮＫ細胞をＭＣＭ含有培地で培養後にeffector（ＰＢＬ）：Target（腫瘍細胞）比を１００：１にしてＮＫ細胞の活性を計測した。抹梢血白血球にＭＣＭを混入し１６時間培養した結果、混入したＭＣＭの濃度に依存してＮＫ細胞活性が増強した。ＭＣＭ濃度２５μｇ／ｍＬでは、ＮＫ細胞の活性は１５５％増強した。ＭＣＭ濃度を１００μｇ／ｍＬまで増やすと細胞活性が更に２１０％まで増大した（図２参照）。図２は、ＮＫ細胞活性（NK cell Activity）へのＭＣＭの効果を示す。抹梢血リンパ球を、ＭＣＭ濃度（concentration of MCM(μg/mL)）０（ＭＣＭを投与せず）、低濃度（２５μｇ／ｍＬ）、および高濃度（１００μｇ／ｍＬ）のＭＣＭを投与して、１６時間培養した。Ｅ：Ｔ比を１００：１にしてＮＫ細胞活性を計測した。５例における平均値±S.D.を表す。★有意差Ｐ＜0.01。
【００５５】
５．インターフェロン-γ生産
図３は、抹梢血リンパ球のインターフェロン-γ生産（ＩＦＮ-γ(pg/mL)）に対してのＭＣＭの効果を示す。抹梢血リンパ球を、ＭＣＭ濃度（concentration of MCM(μg/mL)）０〜２００μｇ／ｍＬのＭＣＭと共に１６時間培養し、上澄みのインターフェロン-γをＥＬＩＳＡ法でアッセイした。ＭＣＭで処理すると、与えたＭＣＭの濃度に依存してインターフェロン-γ生産量が有意に増大し、ＭＣＭ１００μｇ／ｍＬでは、コントロールの7.9倍まで増大した。しかし、ＭＣＭ２００μｇ／ｍＬでは、やや生産量が滅少した。
【００５６】
６．リンパ球増殖に対するＭＣＭの効果
表５は、リンパ球増殖へのＭＣＭの効果を示す。抹梢血単核球を様々な濃度のＭＣＭ（MCM(μg/mL)）とともに３日間培養し、トリチュウムでラベルしたサイミヂンの取り込み能（Thymidine Uptake(cpm)）を計測することでＰＨＡ（Phite Hemo Aglitinin）存在下および非存在下にＴ細胞分裂能を、ＰＷＭ存在下および非存在下にＴ細胞依存性Ｂ細胞分裂能を、ＣｏｎＡを１００μｇ／ｍＬまでの濃度のＭＣＭと共培養してＴ細胞分裂能を検討した。数値は３検体１分間平均線量の平均値±S.D.である。表５で、抹梢血リンパ球増殖に対して様々な濃度（０〜２００μｇ／ｍＬ）のＭＣＭが及ぼす効果を示す。ＰＨＡ（Phite Hemo Aglitinin）存在下および非存在下にＴ細胞分裂能を計測した。ＰＷＭ存在下および非存在下にＴ細胞依存性Ｂ細胞分裂能を計測した。何れの場合でもＭＣＭの効果を認めなかった。ＣｏｎＡを１００μｇ／ｍＬまでの濃度のＭＣＭと共培養してＴ細胞分裂能を検討したが、上記結果と同様だった。
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】異なるeffector（ＰＢＬ）：target（腫瘍細胞）比（Ｅ／Ｔ Ratio）でのヒトＮＫ細胞活性（NK cell Activity）に対するＭＣＭの効果を示すグラフ。
【図２】各ＭＣＭ濃度（concentration of MCM(μg/mL)）でのＮＫ細胞活性（NK cell Activity）へのＭＣＭの効果を示すグラフ。
【図３】各ＭＣＭ濃度（concentration of MCM(μg/mL)）での抹梢血リンパ球のインターフェロン-γ生産（ＩＦＮ-γ(pg/mL)）に対してのＭＣＭの効果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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