(57)【要約】【課題】結晶の環境の変化に際して、不溶性かつ安定な形態から可溶性かつ活性な形態へ変化する能力によって特徴づけられる架橋タンパク質結晶を提供すること。【解決手段】結晶の環境の変化に際して、不溶性かつ安定な形態から可溶性かつ活性な形態へ変化する能力によって特徴づけられる架橋タンパク質結晶。上記変化は、温度変化、pH変化、化学組成の変化、濃縮から希釈形態への変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射線の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の架橋タンパク質結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術的分野
本発明は、その結晶を取り巻く環境の変化に際して不溶性かつ安定型から可溶性かつ活性型に変化する能力によって特徴付けられる架橋タンパク質結晶に関し、その変化は、温度の変化、pHの変化、化学組成の変化、濃縮型から希釈型への変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤の濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される変化である。本発明の１つの実施態様に従って、そのような架橋タンパク質結晶は、制御された速度でそれらのタンパク質活性を放出し得る。本発明はまた、そのような架橋タンパク質結晶を作製する方法、それらを使用するタンパク質送達の方法、それらを洗浄剤（界面活性剤を含む）、治療的処方物、薬学的組成物、ワクチン、パーソナルケア組成物（化粧品を含む）、獣医学的組成物、食料、飼料、診断薬、および汚染除去のための処方物中で使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質は、化学工業、医薬品、獣医学的な産物、化粧品、ならびに他の消費財、食料、飼料、診断薬、および汚染除去の分野において、広い範囲の応用に使用されている。時折、そのような使用は、タンパク質自身に固有の制約によって制限されるか、またはそれらが使用される環境もしくは媒体によって課せられてきた。そのような制約は、タンパク質の乏しい安定性、実行の可変性または高コストを生じ得る。タンパク質にとってそれらが使用される分野においてそれらの十分な潜在能力を実現するために、それらを取り巻く環境による過度の介入なしに機能することが可能でなければならない。過去において、環境要素はタンパク質の広範囲な使用に対する障壁をしばしば引き起こしてきた。
【０００３】
これらの障壁に打ち勝つための種々のアプローチが利用されてきた。しかし、これらのアプローチは、タンパク質活性の損失、またはタンパク質安定化キャリアーもしくは処方物のさらなる出費のいずれかをこうむってきた。
【０００４】
広範なタンパク質の使用に対する障壁に打ち勝つための１つの独特なアプローチは、架橋した酵素結晶（「CLECTM」）技術である［N.L.St.ClairおよびM.A.Navia、J.Am.Chem.Soc.,114,4314-16頁（1992）］。架橋した酵素結晶は、通常は酵素機能に適合しない環境においてその活性を保持する。このような環境には、プロテアーゼおよび他のタンパク質分解剤に長期的に曝露すること、高温、または極端なpHが挙げられる。このような環境において、架橋された酵素結晶は不溶性で安定である。
【０００５】
タンパク質の制御された放出または溶解に導くタンパク質の可溶性は、多くの工業的および医学的分野において重要である。このような分野には、界面活性剤を含む洗浄剤、治療剤およびワクチンを含む医薬品、消費財およびパーソナルケア製品、獣医学的産物、食料、飼料、診断薬、ならびに汚染除去に関連する分野が挙げられる。放出を制御するための種々のアプローチが提案されてきた。これらは、米国特許第4,579,779号および同第5,550,223号に記載されるようなカプセル化を含む。他のアプローチは、機械的または電気的供給装置および浸透圧ポンプの使用を含む。
【０００６】
医薬品分野における制御された放出は、種々の手段によって取り組まれてきた。米国特許第5,569,467号は、生体適合ポリマーおよび薬剤を含有する微粒子の持続された放出の使用について言及し、これは、ポリマーが分解するに従って放出される。米国特許第5,603,956号は、架橋したアミラーゼ、α-アミラーゼ、および薬剤を含む、固形の、徐放性薬剤用量単位について言及する。米国特許第4,606,909号は、経口の、制御化放出性複合単位処方物について言及し、ここでは、均質なコアを含む可溶性の予備の活性成分の粒子が、pH感受性の腐食性の被膜でコートされている。米国特許第5,593,697号は、生物学的に活性な物質を含む薬学的または獣医学的な移植物、少なくとも１つの水溶性物質および少なくとも１つの水に不溶性の物質を含む賦形剤、ならびに、移植後の所定の期間に破裂するように適用されるポリマーフィルムコーティングについて言及する。
【０００７】
しかし、制御されたタンパク質の放出の目的は、タンパク質自身が貯蔵状態下で安定でないかもしれないという事実とバランスが取られなくてなならない。タンパク質の安定性はまた、それが含まれる処方物の他の成分によって悪影響され得る。例えば、強力な液体界面活性剤は、成分酵素にとって敵対的な環境を構成する。そのような問題は、改善された酸化的安定性を有すると言われている変異型ズブチリシンプロテアーゼの使用を通してアプローチされてきた。米国特許第4,760,025号およびPCT特許出願WO89/06279を参照のこと。界面活性剤中で最も広範に使用される酵素であるタンパク質は、それら自身の分解を触媒する。プロテアーゼインヒビター（例えば、グリコールを伴うボレート）の添加または水の活性の低下のようなストラテジーは、部分的に効果的なのみであった。
【０００８】
米国特許第5,385,959号に記載される別のアプローチは、その希釈放出を可能にする、複合性のエマルジョンポリマーのカプセル中の分解感受性界面活性剤成分のカプセル化である。米国特許第5,286,404号は、改善された酵素可溶性を有し、その上酵素活性を持続すると言われる液体界面活性剤組成物に言及する。改善は、アルデヒド処理、アシル化、またはアルキル化を介する酵素溶液における遊離の一級アミノ基の化学修飾に起因する。
【０００９】
このようなタンパク質技術の進歩にもかかわらず、一般的には、タンパク質が保存の条件下で安定であり、その上使用の条件下で活性である必要性がまだ存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の開示
本発明は、結晶を取り囲む環境中における変化に際して、不溶性かつ安定型から可溶性かつ活性型に変化する能力によって特徴付けられる架橋タンパク質結晶に関し、その変化は、温度の変化、pHの変化、化学組成の変化、濃縮型から希釈型への変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤の濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される変化である。本発明の１つの実施態様に従って、そのような架橋タンパク質結晶は、制御された割合でそれらのタンパク質活性を放出し得る。
【００１１】
有利なことに、本発明に従う架橋タンパク質結晶は、貯蔵条件下では不溶性かつ安定であり、そして使用条件下では可溶性かつ活性である。
【００１２】
本発明はまた、洗浄剤（界面活性剤を含む）、治療的タンパク質薬学的組成物、ワクチン、パーソナルケア組成物（化粧品を含む）、獣医学的組成物、食料、飼料、診断薬、および汚染除去のための処方物を提供する。さらに、本発明は、そのような架橋タンパク質結晶を作製する方法、およびそれらを使用するタンパク質送達の方法を含む。
【００１３】
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
１．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶は、該結晶をとり囲む環境の変化に際して、不溶性かつ安定な形態から可溶性かつ活性な形態へ変化し得、該変化は、温度変化、pH変化、化学組成の変化、濃縮形態から希釈形態への変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤の濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、架橋タンパク質結晶。
２．前記濃縮形態から希釈形態への変化が、溶質の濃度の変化を含む、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
３．前記溶質の濃度の変化が、塩濃度の増加または減少を含む、項目２に記載の架橋タンパク質結晶。
４．前記溶質の濃度の変化が、塩濃度の減少を含む、項目３に記載の架橋タンパク質結晶。
５．前記溶質の濃度の変化が、水の濃度の増加または減少を含む、項目２に記載の架橋タンパク質結晶。
６．前記溶質の濃度の変化が、水の濃度の増加を含む、項目５に記載の架橋タンパク質結晶。
７．前記溶質の濃度の変化が、有機溶媒の濃度の増加または減少を含む、項目２に記載の架橋タンパク質結晶。
８．前記溶質の濃度の変化が、界面活性剤の濃度の減少を含む、項目２に記載の架橋タンパク質結晶。
９．前記溶質の濃度の変化が、タンパク質の濃度の減少を含む、項目２に記載の架橋タンパク質結晶。
１０．前記濃縮形態から希釈形態への変化が、約２倍〜約10,000倍までの、全ての溶質の濃度の変化を含む、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
１１．前記濃縮形態から希釈形態への変化が、約２倍〜約700倍までの、全ての溶質の濃度の変化を含む、項目１０に記載の架橋タンパク質結晶。
１２．前記pH変化が、酸性pHから塩基性pHへの変化を含む、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
１３．前記pH変化が、塩基性pHから酸性pHへの変化を含む、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
１４．前記温度変化が、温度の上昇または低下を含む、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
１５．前記温度変化が、約０℃と約20℃との間の低温から約25℃と約70℃との間の高温までの温度の上昇である、項目１４に記載の架橋タンパク質結晶。
１６．前記タンパク質の前記活性形態が、高分子基質に対して活性な形態である、項目１に記載の架橋タンパク質結晶。
１７．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶が、架橋された該結晶を形成するように結晶化された該タンパク質の可溶性形態の活性半減期の少なくとも２倍よりも大きい保存条件下での活性半減期、および使用の条件下で該タンパク質の可溶性形態の活性と類似する活性を有する、架橋タンパク質結晶。
１８．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶が、該結晶をとり囲む環境の変化に曝露された際に、そのタンパク質活性を制御された速度で放出し得、該変化が、pH変化、溶質の濃度の変化、温度変化、化学組成の変化、該結晶に作用する剪断力の変化、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、架橋タンパク質結晶。
１９．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化された該タンパク質の可溶性形態と比較して、高分子基質、２相基質、または低分子基質のいずれか１つに対する５〜10倍高いタンパク質活性を有する、架橋タンパク質結晶。
２０．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化された該タンパク質の可溶性形態と比較して、高分子基質、２相基質、または低分子基質のいずれか１つに対する２〜３倍高いタンパク質活性を有する、架橋タンパク質結晶。
２１．架橋タンパク質結晶であって、該タンパク質結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化された酵素の可溶性形態と比較して、高分子基質、２相基質、または低分子基質に対する少なくとも１．２倍高いタンパク質活性を有する、架橋タンパク質結晶。
２２．架橋されたリパーゼ結晶であって、該リパーゼ結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化されたリパーゼの可溶性形態と比較して、２相オリーブ油基質の加水分解についての５〜10倍高い酵素活性を有する、架橋されたリパーゼ結晶。
２３．前記リパーゼ結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化されたリパーゼの可溶性形態と比較して、２相オリーブ油基質の加水分解についての２〜３倍高い酵素活性を有する、項目２２に記載の架橋されたリパーゼ結晶。
２４．前記リパーゼ結晶が、架橋された結晶を形成するように結晶化されたリパーゼの可溶性形態と比較して、２相オリーブ油基質の加水分解についての少なくとも２倍高いタンパク質活性を有する、項目２３に記載の架橋されたリパーゼ結晶。
２５．前記タンパク質が、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ）トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT）によって架橋された、項目２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
２６．前記タンパク質が、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド(EDC）によって架橋された、項目２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
２７．前記リパーゼが、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ）トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT）によって架橋された、項目２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の架橋されたリパーゼ結晶。
２８．前記リパーゼが、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド(EDC）、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP)、ビスマレイミドヘキサン（BMH）、NHS-PEG-ビニルスルホン（NHS-PEG-VS)およびジスクシンイミジルグルタレート（DSG）からなる群より選択される架橋剤によって架橋された、項目２２、２３、または２４のいずれか１項に記載の架橋されたリパーゼ結晶。
２９．前記タンパク質が、ホモ２官能性架橋剤によって架橋された、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
３０．前記タンパク質が、ヘテロ２官能性架橋剤によって架橋された、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
３１．前記放出されるタンパク質活性の制御された速度が、前記架橋タンパク質結晶の架橋の程度、タンパク質結晶の架橋剤への曝露時間の長さ、該架橋に関与するアミノ酸残基、該架橋剤がホモ２官能性であるかまたはヘテロ２官能性であるか、該タンパク質結晶への架橋剤の添加の速度、該架橋剤の性質、該架橋剤の鎖の長さ、該架橋タンパク質結晶の表面積、該架橋タンパク質結晶のサイズ、該架橋タンパク質結晶の形状、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される因子によって決定される、項目１８に記載の架橋タンパク質結晶。
３２．前記結晶が、１日あたり約0.1％と１日あたり約100％との間のタンパク質活性放出速度を有する、項目１８に記載の架橋タンパク質結晶。
３３．前記結晶が、１時間あたり約0.01％と１時間あたり約100％との間のタンパク質活性放出速度を有する、項目１８に記載の架橋タンパク質結晶。
３４．前記結晶が、１分あたり約1％と１分あたり約50％との間のタンパク質活性放出速度を有する、項目１８に記載の架橋タンパク質結晶。
３５．前記タンパク質結晶が、保存条件下で組成物中で、実質的に不溶性かつ安定であり、そして該組成物の使用条件下で実質的に可溶性でかつ活性である、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
３６．前記組成物が、洗浄剤、界面活性剤、パーソナルケア組成物、化粧品、医薬品、獣医学用化合物、ワクチン、食品、飼料、診断薬、および汚染除去のための処方物からなる群から選択される、項目３５に記載の架橋タンパク質結晶。
３７．前記界面活性剤が、粉末化界面活性剤、液体界面活性剤、漂白剤、家庭用洗浄剤、固い表面の洗浄剤、産業用洗浄剤、カーペットシャンプー、および室内装飾品シャンプーからなる群から選択される、項目３６に記載の架橋タンパク質結晶。
３８．前記化粧品が、クリーム、エマルジョン、ローション、泡沫、ウォッシュ、ゲル、コンパクト、ムース、日焼け止め、スラリー、粉末、スプレー、泡沫、ペースト、軟膏、膏薬、バルム、シャンプー、および滴薬からなる群から選択される、項目３６に記載の架橋タンパク質結晶。
３９．前記タンパク質が酵素である、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４０．前記酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、およびオキシドレダクターゼからなる群から選択される、項目３９に記載の架橋タンパク質結晶。
４１．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、およびオキシダーゼからなる群から選択される、項目４０に記載の架橋タンパク質結晶。
４２．前記タンパク質が、治療用タンパク質、洗浄剤タンパク質、パーソナルケアタンパク質、獣医学用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質、および汚染除去用タンパク質からなる群から選択される、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４３．前記タンパク質が、ホルモン、抗体、インヒビター、成長因子、栄養因子、サイトカイン、リンホカイン、トキソイド、成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形成タンパク質、トキソイド、ビタミンおよび栄養素からなる群から選択される、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４４．前記タンパク質が、インスリン、アミリン、エリスロポエチン、第VIII因子、TPA、ドルナーゼα、α-1-アンチトリプシン、ウレアーゼ、稔性ホルモン、FSH、LSH、postridicalホルモン、破傷風トキソイド、およびジフテリアトキソイドからなる群から選択される、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４５．前記結晶が、約0.01μmと約500μmとの間の最長寸法を有する、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４６．前記結晶が、約0.1μmと約50μmとの間の最長寸法を有する、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４７．前記結晶が、球、針、棒、平板、偏菱形、立方体、両錐体、および角柱からなる群から選択される形状を有する、項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶。
４８．前記組成物が、洗浄剤、界面活性剤、パーソナルケア組成物、化粧品、医薬品、獣医学用化合物、ワクチン、食品、飼料、診断薬、および汚染除去のための処方物からなる群から選択される、項目１、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む組成物。
４９．前記界面活性剤が、粉末化界面活性剤、液体界面活性剤、漂白剤、家庭用洗浄剤、固い表面の洗浄剤、産業用洗浄剤、カーペットシャンプー、および室内装飾品シャンプーからなる群から選択される、項目に４８に記載の組成物。
５０．前記化粧品が、クリーム、エマルジョン、ローション、泡沫、ウォッシュ、ゲル、コンパクト、スラリー、粉末、スプレー、泡沫、ペースト、軟膏、膏薬、バルム、シャンプー、日焼け止め、および滴薬からなる群から選択される、項目４８に記載の組成物。
５１．項目１、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、タンパク質送達システム。
５２．前記タンパク質が、洗浄剤酵素、化粧品タンパク質、薬学的タンパク質、農業用タンパク質、ワクチンタンパク質、および汚染除去用タンパク質からなる群から選択される、項目５１に記載のタンパク質送達システム。
５３．前記タンパク質送達システムが、微小粒子タンパク質送達システムである、項目５２に記載のタンパク質送達システム。
５４．前記微小粒子タンパク質送達システムが、約0.01μmと約500μmとの間の最長寸法を有する架橋タンパク質結晶を含む、項目５３に記載のタンパク質送達システム。
５５．前記微小粒子タンパク質送達システムが、約0.1μmと約50μmとの間の最長寸法を有する架橋タンパク質結晶を含む、項目５４に記載のタンパク質送達システム。
５６．前記微小粒子タンパク質送達システムが、球、針、棒、平板、偏菱形、立方体、両錐体、および角柱からなる群から選択される形状を有する架橋タンパク質結晶を含む、項目５３に記載のタンパク質送達システム。
５７．項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、界面活性剤処方物。
５８．項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、徐放性処方物。
５９．項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、薬学的徐放性処方物。
６０．架橋タンパク質結晶を含む薬学的徐放性処方物であって、該結晶が、保存条件下で実質的に不溶性であり、そしてインビボで制御された速度でそのタンパク質活性を放出し得る、薬学的徐放性処方物。
６１．前記医薬品が、非経口的または経口的な経路で投与され得る、項目５９に記載の薬学的徐放性処方物。
６２．前記医薬品が、口、肺、鼻、耳、肛門、皮膚、眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、粘膜、舌下、皮下、または頭蓋内の経路によって投与され得る、項目６１に記載の薬学的徐放性処方物。
６３．前記医薬品が、経口経路によって投与され得、そして前記架橋タンパク質結晶が、胃のpH条件下で実質的に不溶性であり、そして小腸のpH条件下で実質的に可溶性である、項目５９に記載の薬学的徐放性処方物。
６４．項目１、１７、１８、１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、ワクチン。
６５．前記処方物が、錠剤、リポソーム、顆粒、球、ミクロスフェア、微小粒子、およびカプセルからなる群から選択される、項目１、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を含む、処方物。
６６．架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、タンパク質結晶を、第一の架橋剤、または第一の架橋剤および少なくとも第二の架橋剤と、得られる架橋された結晶が、環境の変化の際に不溶性かつ安定な形態から可溶性かつ活性な形態に変化する能力によって特徴付けられる程度まで、該結晶の架橋を誘導するのに十分な条件下で反応させる工程を包含し、ここで該変化が、温度変化、pH変化、化学組成の変化、濃縮形態から希釈形態への変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射線の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
６７．架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、タンパク質結晶を、第一の架橋剤、または第一の架橋剤および少なくとも第二の架橋剤と、得られる架橋された結晶が、該架橋された結晶を形成するように結晶化された該タンパク質の可溶性形態の活性半減期の少なくとも２倍より大きい保存条件下での活性半減期、ならびに使用の条件下で、該タンパク質の可溶性形態の活性と類似の活性によって特徴付けられる程度まで、該結晶の架橋を誘導するのに十分な条件下で反応させる工程を包含する、方法。
６８．架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、タンパク質結晶を、第一の架橋剤、または第一の架橋剤および少なくとも第二の架橋剤と、得られる架橋された結晶が、環境の変化に曝露された際に、制御された速度でそのタンパク質活性を放出し得ることによって特徴付けられる程度まで、該結晶の架橋を誘導するのに十分な条件下で反応させる工程を包含し、該変化が、pH変化、可溶濃度の変化、温度変化、化学組成の変化、結晶に作用する剪断力の変化、溶液の酸化還元電位の変化、入射放射線の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
６９．前記タンパク質結晶を、前記第一の架橋剤および前記少なくとも第二の架橋剤と、同時にかまたは連続的に反応させる工程を包含する、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７０．タンパク質結晶を前記架橋剤と反応させる工程の前に、前記方法が、前記タンパク質を結晶化させる工程をさらに包含する、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７１．項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、前記架橋を誘導するのに十分な条件が、前記架橋タンパク質結晶の架橋の程度、タンパク質結晶を前記架橋剤に曝露する時間の長さ、該タンパク質結晶に該架橋剤を添加する速度、該架橋剤の性質、該架橋剤の鎖の長さ、該架橋タンパク質結晶の表面積、該架橋タンパク質結晶のサイズ、該架橋タンパク質結晶の形状、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される因子に依存する、方法。
７２．項目６８に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、タンパク質活性を放出する前記制御された速度が、該架橋タンパク質結晶の架橋の程度、該架橋剤へのタンパク質結晶の曝露時間の長さ、該タンパク質結晶への該架橋剤の添加の速度、該架橋剤の性質、該架橋剤の鎖の長さ、該架橋タンパク質結晶の表面積、該架橋タンパク質結晶のサイズ、該架橋タンパク質結晶の形状、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される因子によって決定される、方法。
７３．前記架橋剤が、多官能性架橋剤である、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７４．前記架橋剤が、２官能性架橋剤である、項目７３に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７５．前記架橋剤が、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサールからなる群から選択される、項目７３に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７６．項目７３に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法であって、前記架橋剤が、ハロトリアジン、ハロピリミジン、脂肪族または芳香族のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸の無水物、脂肪族または芳香族のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸のハロゲン化物、N-メチロール化合物、ジイソシアネート、ジイソチオシアネート、およびアジリジンからなる群から選択される、方法。
７７．前記架橋剤がエポキシドである、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７８．前記エポキシドが、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエポキシド、トリエポキシド、およびテトラエポキシドからなる群から選択される、項目７７に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
７９．前記架橋剤が、0.0076％〜0.5％のグルタルアルデヒドであり、前記架橋を誘導するのに十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約３分と約120分との間の時間反応させることを含む、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８０．前記架橋剤が、0.005％のグルタルアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するのに十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約10分と約30分との間の時間反応させることを含む、項目７９に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８１．前記タンパク質結晶との反応の前に、前記グルタルアルデヒドが、60℃での緩衝液との１時間のインキュベーションにより前処理される、項目７９に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８２．前記架橋剤が、0.01％〜１％のグリオキサールであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約30分と約60分との間の時間反応させることを含む、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８３．前記架橋剤が、0.05％〜１％のオクタンジアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約30分と約16時間との間の時間反応させることを含む、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８４．前記架橋剤が、１％のオクタンジアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約１時間と約３時間との間の時間反応させることを含む、項目８３に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８５．前記架橋剤が、１％のスクシンアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、タンパク質結晶を架橋剤と、約30分と約３時間との間の時間反応させることを含む、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８６．前記第一の架橋剤が、0.01％〜４％のエポキシドであり、そして前記第二の架橋剤が、0.1％〜0.2％のグルタルアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、前記タンパク質結晶を該第一の架橋剤と、約１時間と約72時間との間の時間反応させ、そして該タンパク質結晶を該第二の架橋剤と、約１時間と約５時間との間の時間反応させることを含む、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８７．前記第一の架橋剤が、0.01％のエポキシドであり、そして前記第二の架橋剤が、0.1％のグルタルアルデヒドであり、そして前記架橋を誘導するために十分な条件が、前記タンパク質結晶を該第一の架橋剤と約５時間反応させ、そして該タンパク質結晶を該第二の架橋剤と約1.5時間反応させることを含む、項目８６に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８８．前記タンパク質が酵素である、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
８９．前記架橋剤が、可逆的架橋剤である、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９０．前記可逆的架橋剤が、ジスルフィド架橋剤である、項目８９に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９１．前記ジスルフィド架橋剤が、ホモ２官能性架橋剤かまたはヘテロ２官能性架橋剤である、項目９０に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９２．前記タンパク質が酵素である、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９３．前記酵素が、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、およびオキシドレダクターゼからなる群から選択される、項目９２に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９４．前記酵素が、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、およびオキシダーゼからなる群から選択される、項目９３に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９５．前記タンパク質が、治療用タンパク質、洗浄剤タンパク質、パーソナルケアタンパク質、獣医学用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質、および汚染除去用タンパク質からなる群から選択される、項目６６、６７、または６８のいずれか１項に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
９６．前記タンパク質が、ホルモン、抗体、インヒビター、成長因子、栄養因子、サイトカイン、リンホカイン、トキソイド、成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形成タンパク質、トキソイド、ビタミンおよび栄養素からなる群から選択される、項目９５に記載の架橋タンパク質結晶を産生するための方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載される発明が、より十分に理解され得るために、以下の詳細な説明が示される。この説明において、以下の用語または句が使用される：
水性有機溶媒混合物--ｎ％有機溶媒を含み、そしてm％水性である混合物であって、ここでｎは１と99との間であり、ｍは100−ｎである。
【００１５】
２相基質--液体/固体または液体/液体相のいずれかの２つの明確な異なる相を有する基質の溶液であって、そのうちの１つは、架橋タンパク質結晶のタンパク質構成要素によって触媒される反応のための基質を含む。分離した水相および有機相を含む水溶液中のオリーブ油のエマルジョンは、リパーゼの架橋された結晶の基質の例である。
【００１６】
触媒的有効量--ある時間にわたって本発明の架橋タンパク質結晶が適用される領域を、処理、保護、修復、または解毒するために効果的な、本発明の架橋タンパク質結晶の量。
【００１７】
化学組成の変化--環境または架橋剤に影響を与える架橋タンパク質結晶を取り囲む環境の化学組成の任意の変化であって、化学試薬の添加、光、マイクロ波、または放射線の形態のエネルギーの環境への適用によって誘導される化学変化、架橋剤に影響を及ぼす化学事象、およびこれらの組み合わせを含む。
【００１８】
結晶に対して作用する剪断力の変化--使用の条件下での架橋タンパク質結晶を取り囲む環境の因子の任意の変化（例えば、正および負両方の機械的な圧力の変化、回転撹拌（revolution  stirring)、遠心分離、タンブリング、機械的撹拌（mechanical  agitation）、ならびに濾過ポンピング）。
【００１９】
制御溶解--（１）結晶を取り囲む環境の変化によって誘発され、ここでこの変化は、温度変化、pH変化、化学組成の変化、濃縮から希釈形態への変化、溶液の酸化-還元電位の変化、入射放射線の変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物（flouride）濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤濃度の変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびこれらの組み合わせからなる群から選択され、そして（２）以下からなる群から選択される因子：この架橋タンパク質結晶の架橋の程度、架橋に関与するアミノ酸残基（架橋剤がホモ２官能性またはヘテロ２官能性に関わらず）、タンパク質結晶の架橋剤への曝露時間の長さ、このタンパク質結晶への架橋剤の添加の速度、架橋剤の性質、架橋剤の鎖の長さ、この架橋タンパク質結晶の表面積、この架橋タンパク質結晶のサイズ、この架橋タンパク質結晶の形状、およびこれらの組み合わせによって制御される、架橋タンパク質結晶の溶解、または結晶状態から可溶性状態へのタンパク質構成要素の放出。本明細書中で使用される句「制御溶解」には、浸出（leaching）は含まれない。
【００２０】
制御溶解架橋タンパク質結晶--所定のトリガーに曝露された後にゆっくりと溶解し、そして可溶性形態のタンパク質を溶液中に放出する架橋タンパク質結晶。制御溶解架橋タンパク質結晶の活性は、主に結晶から放出された可溶性形態のタンパク質から生じる。
【００２１】
架橋（された）結晶形態のタンパク質--溶液に添加された場合に、不溶性でかつ固体状態のままである架橋されたタンパク質結晶。
【００２２】
増強されたタンパク質活性--可溶性形態のタンパク質と比較して増強された架橋結晶形態のタンパク質の活性。本発明の種々の実施態様によって、増強されたタンパク質活性は、以下の任意の１つによって示される：可溶性形態のタンパク質の活性よりも200〜300倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも100〜200倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも10〜100倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも20〜50倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも10〜20倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも20〜30倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも５〜10倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも２〜３倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも少なくとも３倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも少なくとも２倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも少なくとも25〜99％高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；可溶性形態のタンパク質の活性よりも少なくとも25〜30％倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質；または可溶性形態のタンパク質の活性よりも少なくとも20％倍高い活性を有する架橋結晶形態のタンパク質。
【００２３】
汚染除去のための処方物--化学廃棄物の汚染除去のための処方物、除草剤の汚染除去のための処方物、殺虫剤（insecticide)の汚染除去のための処方物、農薬（pesticide)の汚染除去のための処方物、環境危険物（environmental  hazard)の汚染除去のための処方物、および化学兵器の汚染除去のための処方物からなる群から選択される処方物。
【００２４】
タンパク質の不溶性かつ安定な形態--水性溶媒、有機溶媒、または水性有機溶媒混合物において不溶性であり、そして可溶性形態のタンパク質より大きい安定性を示すタンパク質の形態。本発明の代替の実施態様に従って、句「タンパク質の不溶性かつ安定な形態」とは、乾燥処方物において不溶性であるが、湿潤処方物において可溶性であるタンパク質であり得る。任意の実施態様において、架橋タンパク質結晶は、不溶性形態において活性であり得る。そして１つの実施態様において、架橋タンパク質結晶は、不溶性形態で活性であり、一旦その機能が完了すると、次いで溶解するか、または除去されるかもしくは消化され得る。
【００２５】
高分子基質--少なくとも600〜700ダルトンの分子量を有するタンパク質または炭水化物のような大きな生体分子であって、この分子はまた、架橋タンパク質結晶のタンパク質構成要素によって触媒される反応の基質である。
【００２６】
有機溶媒--非水性起源の任意の溶媒。
【００２７】
薬学的有効量--ある時間にわたって投与される、個体における状態を処置するために有効である架橋タンパク質結晶の量。
【００２８】
予防有効量--ある時間にわたって投与される、個体における状態を予防するために有効である架橋タンパク質結晶の量。
【００２９】
タンパク質--タンパク質、あるいは、糖タンパク質、あるいは、３次構造を有する任意のペプチド。
【００３０】
本発明の架橋タンパク質結晶処方物のタンパク質構成要素は、天然にまたは合成的に改変され得る。それらは、糖タンパク質、リンタンパク質、含硫タンパク質、ヨードタンパク質、メチル化タンパク質、非修飾タンパク質であり得るか、または他の改変を含有し得る。
【００３１】
本発明の架橋タンパク質結晶処方物のタンパク質構成要素は、例えば、ホルモン（例えば、副甲状腺ホルモン）、酵素、抗体、ウイルスレセプター、ウイルス表面糖タンパク質、寄生虫糖タンパク質、寄生虫レセプター、Ｔ細胞レセプター、MHC分子、免疫修飾因子、腫瘍抗原、ムチン、インヒビター、成長因子、栄養因子、サイトカイン、リンホカイン、サイトカイン、トキソイド、神経成長ホルモン、血液凝固因子、接着分子、多剤耐性タンパク質、アデニレートシクラーゼ、骨形成タンパク質、およびレクチンを含む任意のタンパク質であり得る。
【００３２】
また、タンパク質のなかに含まれるのは、糖タンパク質ホルモンおよびサイトカインである。ホルモンの例には、小胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、ならびにこれらのホルモンのヒツジ、ウシ、ブタ、マウス、およびラットの対立遺伝子が含まれる。サイトカイン糖タンパク質の例には、αインターフェロン、リンホトキシン、およびインターロイキン-2が含まれる。また、糖タンパク質腫瘍結合抗原（例えば、癌胎児抗原(CEA)、ヒトムチン、her-2/neu、および前立腺特異的抗原（PSA）（R.A.HendersonおよびO.J.Finn,Advances  in  Immunology,62、第217-56頁(1996)）も含まれる。
【００３３】
タンパク質活性--結合、触媒、またはタンパク質が使用される環境内で機能的応答（例えば、免疫応答および免疫原性の誘導、またはリパーゼ欠失個体の脂質の加水分解）を生成する活性、あるいはそれらの組み合わせからなる群から選択される活性。
【００３４】
タンパク質活性放出速度--単位時間あたり溶解するタンパク質の量。
【００３５】
可溶性形態のタンパク質--溶液中の個々のタンパク質分子および結晶格子から溶解された形態。
【００３６】
低分子基質--一般に600ダルトン未満の分子量を有する分子であって、架橋タンパク質結晶のタンパク質構成要素によって触媒される反応の基質でもある、分子。
【００３７】
治療用タンパク質--薬学的な処方および様式において、患者に投与されるタンパク質。治療用タンパク質には、例えば、ホルモン、酵素（リパーゼを含む）、抗体、ウイルスレセプター、Ｔ細胞レセプター、ケモカイン、ケモカインレセプター、MHC分子、腫瘍抗原、ムチン、インヒビター、成長因子、栄養因子、サイトカイン、リンホカイン、トキソイド、神経成長ホルモン、血液凝固因子、接着分子、多剤耐性タンパク質、アデニレートシクラーゼ、および骨形成タンパク質が含まれる。
【００３８】
ワクチン抗原--ウイルス、寄生虫、または腫瘍抗原のような感染性因子に由来するタンパク質。このようなワクチン抗原のタンパク質活性は、感染性因子に対する防護免疫を誘導する。
【００３９】
本発明の架橋タンパク質結晶は、特に有利である。なぜなら、それらは、それらが用いられる、またはそれらの保存条件において、処方物もしくは組成物により課される過酷な環境において安定であるからである。同時に、これらの架橋タンパク質結晶は、それらの環境における１つ以上の誘因に曝された場合、制御溶解またはそれらの活性の放出が可能である。このような誘因は、温度変化、ｐH変化、化学組成の変化、濃縮形態から希釈形態への変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。本発明による架橋タンパク質結晶の制御溶解または活性の放出はまた、時間の変化にわたって誘発され得る。
【００４０】
このような誘因の特定の例には、温度の上昇または低下（例えば、約０℃〜約20℃の低温から約25℃〜約70℃の高温への温度上昇）が挙げられる。他の誘因には、酸性pHから塩基性pHへの変化および塩基性pHから酸性pHへの変化が挙げられる。濃縮形態から希釈形態への変化の誘因の例には、例えば、溶質濃度の変化、全溶質の約２倍〜約10,000倍の濃度変化、全溶質の約２倍〜約700倍の濃度変化、塩濃度の上昇または低下、水の濃度の上昇または低下、有機溶媒濃度の上昇および低下、タンパク質濃度の低下、および界面活性剤濃度の低下が挙げられる。
【００４１】
さらなる誘因には、環境または架橋剤自身に影響を与える架橋タンパク質結晶を囲む環境の化学的組成の変化を含む。このような変化には、例えば、化学薬品の添加、有機溶媒濃度の上昇または低下、架橋剤に影響を与える化学的な事象、光、マイクロ波または放射線を含むエネルギーの適用により誘導される化学変化が挙げられる。上記に説明したように、これらの誘因のいずれもが、１つ以上の他の誘因との組み合わせまたは連続で作用し得る。
【００４２】
本発明による架橋タンパク質結晶の制御溶解はまた、約0.1%/日〜約100%/日のタンパク質活性放出速度を可能にするのに十分な時間における変化、約0.01%/時間〜約100%/時間のタンパク質活性放出速度を可能にするのに十分な時間における変化、および約１%/分〜約50%/分のタンパク質活性放出速度を可能にするのに十分な時間における変化によりもたらされ得る。
【００４３】
従って、本発明による架橋タンパク質結晶は、それらの環境の変化に曝された際に、制御された速度でそれらのタンパク質活性を放出し得る架橋タンパク質結晶を含み、前記の変化は、ｐH変化、溶質濃度の変化、温度変化、化学組成の変化、結晶に作用する剪断力の変化およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記タンパク質活性の制御された放出速度は、以下からなる群から選択される因子により決定され得る：架橋タンパク質結晶の架橋度、架橋剤に対するタンパク質結晶の曝露時間の長さ、タンパク質結晶に対する架橋剤の添加速度、架橋剤の性質、架橋剤の鎖長、架橋に関与するアミノ酸残基、架橋剤がホモ二官能性であるかまたはヘテロ二官能性試薬であるかどうか、架橋タンパク質結晶の表面積、架橋タンパク質結晶の大きさ、架橋タンパク質結晶の形状、およびそれらの組み合わせ。
【００４４】
それらの結晶の性質の結果として、本発明の架橋タンパク質結晶は、架橋された結晶容積の全体にわたる均一性を達成する。この均一性は、分子間接触および結晶格子を構成するタンパク質分子間の化学的架橋により維持される。タンパク質分子は、お互いからの均一な距離を維持し、これは、架橋タンパク質結晶内に、そのタンパク質への基質の接近ならびに生成物の除去を容易にするはっきり定義された安定な孔を形成する。これらの架橋タンパク質結晶において、化学的な架橋により固定される場合、格子相互作用は、使用される結晶の組成物成分により作られる過酷な環境を含む条件下で、安定性の提供および変性の阻止（特に、保存中の）に特に重要である。同時に、タンパク質結晶は、使用条件下で遭遇するそれらの環境における誘因に曝露された際に、それらが溶解するかまたはそのタンパク質活性を放出するような様式で架橋される。従って、それらは、保存条件下の組成物において実質的に不溶性かつ安定であり、そして上記の組成物の使用条件下で実質的に可溶性かつ活性でりあり得る。
【００４５】
本発明による架橋タンパク質結晶のタンパク質活性放出速度に寄与する因子は、架橋タンパク質結晶の架橋度、架橋剤に対するタンパク質結晶の曝露時間の長さ、タンパク質結晶に対して架橋剤を添加する速度、架橋剤に対するタンパク質結晶の曝露時間の長さ、架橋剤の性質、架橋に関与するアミノ酸残基、架橋剤がホモ二官能性であるかまたはヘテロ二官能性であるかどうか、架橋剤の鎖長、架橋タンパク質結晶の表面積、架橋タンパク質結晶の大きさ、架橋タンパク質結晶の形状、およびそれらの組み合わせを含む。
【００４６】
それらの活性に加えて、本発明による架橋タンパク質結晶は特に、保存条件下で安定かつ不溶性であり、この保存条件は、付随する保存温度、保存pH、保存時間、保存濃縮形態、結晶に作用するほとんどないかもしくはない剪断力を含む保存、またはそれらの組み合わせを含む。有利なことには、これらの架橋タンパク質結晶は使用条件下で可溶性かつ活性である。この条件には、温度変化、pH変化、化学組成の変化、濃縮形態から希釈形態までの変化、結晶に作用する剪断力の変化、およびそれらの組み合わせに関与する条件を含む。このような特性は、界面活性剤を含む洗浄剤、治療用タンパク質、医薬品、化粧品を含むパーソナルケア薬剤もしくは組成物、ワクチン、獣医学用組成物、食品、飼料、診断薬、および汚染除去のための処方物の送達（delivery）のために特に有用である本発明の架橋タンパク質結晶を作製する。
【００４７】
１つの実施態様により、本発明の架橋タンパク質結晶は、架橋されている結晶を形成するために結晶化されているタンパク質の可溶性形態の活性の半減期の少なくとも２倍より大きい保存条件下での活性の半減期、および使用条件下でのタンパク質の可溶性形態と同様の活性の半減期により特徴づけられる。
【００４８】
本発明の１つの実施態様により、架橋タンパク質結晶は、使用条件下でのそれらの可溶性または架橋されていない結晶化された対応物（counterpart）の活性に類似の活性により特徴付けられている。しかし、都合の良いことに、本発明の架橋タンパク質結晶は、それらの可溶性または架橋されていない結晶化された対応物タンパク質と比較して、保存条件下で改善された安定性を示す。
【００４９】
制御溶解架橋タンパク質結晶の１つの利点は、結晶格子から可溶性形態のタンパク質を放出するために誘因が必要とされることである。従って、制御溶解架橋タンパク質結晶が調製され、そして誘因に遭遇するまで固体結晶状態におけるタンパク質活性を有する架橋タンパク質結晶として機能し得る。誘因が遭遇された後に、可溶性タンパク質が放出され、そして架橋された結晶形態、ならびにそのタンパク質の可溶性形態の両方からタンパク質活性が生じる。
【００５０】
本発明の１つの実施態様により、有利な性質が、制御溶解架橋タンパク質結晶として調製されるが、実質的には誘因に対して曝露されない、架橋タンパク質結晶から得られる。詳細には、溶解を開始するための適切な誘因の非存在下において、このような架橋タンパク質結晶は、それらの可溶性対応物と比較して、高分子基質、二相基質、または低分子基質に対して増強されたタンパク質活性を示し得る。例えば、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルアミド(toluamide)]ヘキサノエート（hexanoate）（スルホ-LC-SMPT）と架橋されたリパーゼ結晶（これは、引き続き-S-S-結合の架橋を破壊するための誘因に曝露されない）は、二相オリーブオイル基質に対して増強された加水分解活性を示す。
【００５１】
より詳細には、スルホ-LC-SMPTを用いて架橋されたリパーゼ結晶は、オリーブオイル基質の加水分解について、架橋されている結晶を形成するために結晶化されている可溶性形態のタンパク質より、約５〜10倍高いタンパク質活性により特徴付けられる。さらに、１-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピルイル]カルボジイミド塩酸塩（EDC）を用いて架橋されたリパーゼ結晶は、オリーブオイル基質の加水分解について、架橋されている結晶を形成するために結晶化されている可溶性形態のタンパク質より、ほとんど約２倍高いタンパク質活性により特徴付けられる。
【００５２】
本発明の架橋タンパク質結晶のタンパク質構成は、任意のタンパク質であり得、これには例えば、治療用タンパク質、抗体を含む予防的タンパク質、界面活性タンパク質を含む洗浄剤タンパク質、化粧品タンパク質を含むパーソナルケアタンパク質、獣医学用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質、ならびに汚染除去タンパク質が挙げられる。このようなタンパク質には、例えば、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、トランスフェラーゼ、およびオキシドレダクターゼのような酵素が挙げられる。ヒドロラーゼの例には、サーモリシン、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、サブチリナーゼ（subtilinase）、ヒダントイナーゼ（hydantoinase）、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、ズブチリシン、ならびに他のプロテアーゼおよびリゾチームが挙げられる。リアーゼの例には、アルドラーゼ、およびヒドロキシニトリル（hydroxynitrile）リアーゼが挙げられる。オキシドレダクターゼの例には、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、および他のデヒドロゲナーゼが挙げられる。結晶化され、そして架橋され得る他の酵素には、セルラーゼおよびオキシダーゼが挙げられる。
【００５３】
治療用タンパク質または予防的タンパク質の例には、ホルモン、リパーゼを含む酵素、抗体、インヒビター、増殖因子、栄養因子、サイトカイン、リンホカイン、トキソイド、エリスロポエチン、第VIII因子、インスリン、グルカゴン様ペプチドＩ（インスリノトロピン（insulinotropin））、アミリン、TPA、デオキシリボヌクレアーゼ（dornase）-α、α-1-抗トリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、骨形成タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、稔性（fertility）ホルモン、FSH、LSH、ポストリディカル（postridical）ホルモン、テタヌストキソイド、ジフテリアトキソイドが挙げられる。
【００５４】
本発明の架橋タンパク質結晶は、任意の多数の化学プロセスにおいて使用され得る。このようなプロセスは、産業および研究スケールのプロセス（例えば、特殊な化学薬品および医薬品の有機合成）を含む。酵素的な変換プロセスには、酸化、還元、付加（エステル化、エステル転移反応を含む）、加水分解、化学脱離、転移、ならびに不斉変換（asymmetric  conversion）（立体選択的、立体特異的、および位置選択的な反応を含む）を含む。
【００５５】
従って、本発明による架橋タンパク質結晶は、界面活性剤を含む洗浄剤、医薬品、治療剤、獣医学用化合物、化粧品を含むパーソナルケア組成物、食品、飼料、ワクチン、パルプ（pulp）、紙および織物加工品（processing）、診断薬、ならびに汚染除去のための処方物における従来の可溶性タンパク質または固定化されたタンパク質の代わりに、有利に使用され得る。
【００５６】
本発明による架橋タンパク質結晶はまた、種々の環境保護の適用（environmental  application）において使用され得る。それらは、環境災害（environmental  hazard）の広い領域の汚染除去のような環境保護の目的のための従来の可溶性タンパク質または固定化されたタンパク質の代わりに使用され得る。
【００５７】
あるいは、本発明の架橋タンパク質結晶は、以下からなる群から選択される洗浄剤において使用され得る：粉末界面活性剤および液体界面活性剤のような界面活性剤、漂白剤、家庭用洗浄剤、固い表面の洗浄剤、産業用洗浄剤、ならびにカーペットおよび室内装飾品シャンプー。
【００５８】
本発明による架橋タンパク質結晶を含む洗浄剤はまた、従来このような薬剤に含まれていた化合物を含み得る。例えば、Soaps  and  Detergents,A  Theoretical  and  Practical  Review,  Louis  Spitz（編）,AOCS  Press(Champlain,Illinois)(1996)を参照のこと。このような化合物には、陰イオン性、非イオン性、陽イオン性、もしくは双性イオン性の表面活性物質（surfactant）、またはそれらの混合物を含む。
【００５９】
陰イオン性表面活性物質は、アルキル硫酸塩、アルキルエーテル硫酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、アルキルエーテルリン酸塩、脂肪酸塩、石鹸、イソチオシアン酸塩、ならびにスルホン化不飽和エステルおよび酸により例示される。
【００６０】
非イオン性界面活性剤は、有機脂肪族疎水性化合物またはアルキル芳香族疎水性化合物と、アルキレンオキシド、アルキルポリグルコシド、および糖エステルとの凝集生成物によって例示される。
【００６１】
カチオン性界面活性剤は、少なくとも１つの長鎖（C８〜C２２）脂肪族基またはアルキル-アリール基を含む、第３級アルキルアミン、アミノアミド、アミノエステル、またはイミダゾリンの第４級アンモニウム塩によって例示され、ここでアルキルは約４〜12の炭素原子を含み、そしてアリールは、好ましくはフェニレン基である。
【００６２】
双性イオン性界面活性剤は、第４級アンモニウム化合物、第４級ホスホニウム化合物、または第３級スルホニウム化合物の誘導体、第２級アミンおよび第３級アミンの誘導体、ならびに複素環式第２級アミンおよび第３級アミンの誘導体によって例示される。
【００６３】
そして、本発明による架橋タンパク質結晶は、化粧品を含むパーソナルケア組成物（例えば、クリーム、ローション、エマルジョン、泡沫、ウォッシュ、コンパクト、ゲル、ムース、スラリー、粉末、スプレー、ペースト、軟膏、膏薬、バルム、滴薬、シャンプー、および日焼け止め）中の成分として使用され得る。例えば、局所的クリームおよびローションにおいて、それらは、湿潤剤として、または皮膚保護のため、柔軟剤、漂白剤、洗浄剤、タンパク質除去剤、脂質除去剤、湿潤剤、脱色剤、着色剤、または解毒剤として使用され得る。それらはまた、化粧品中の抗酸化剤として使用され得る。
【００６４】
本発明に従って、任意の個体（ヒトおよび他の哺乳動物を含む）は、一定の期間を通して投与される個体における状態を処置するに十分な時間、薬学的に有効な量または触媒的に有効な量の架橋タンパク質結晶で、薬学的に受容可能な様式で処置され得る。あるいは、個体は、一定期間投与される個体における状態を予防するに有効である、予防的に有効な量または触媒的に有効な量の本発明の架橋タンパク質結晶を受け得る。
【００６５】
そのような架橋タンパク質結晶は、単独、医薬品、パーソナルケアもしくは獣医学用製剤の一部として、または予防的製剤（例えば、ワクチン）の一部として、アジュバントを含むか、または含まずに投与され得る。それらは、非経口または経口経路によって投与され得る。例えば、それらは、経口、経肺、経鼻、経耳、肛門内、経皮、経眼、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、経粘膜、舌下、皮下、または頭蓋内経路で投与され得る。パーソナルケアまたは獣医学的適用のいずれの医薬品においても、架橋タンパク質結晶は、任意の上皮表面に局所的に投与され得る。そのような上皮表面は、結晶が適用される領域を処置、保護、修復、または解毒するために、口、眼、耳、肛門、および鼻の表面を含む。
【００６６】
本発明はまた、本発明による架橋タンパク質結晶を含む徐放性処方物を含む。そのような処方物において、架橋タンパク質結晶は、保存条件下で実質的に不溶性であり、そして制御された速度でインビボでそれらのタンパク質活性を放出し得る。例えば、本発明による、経口経路によって投与される薬学的に徐放性処方物は、成分の架橋タンパク質結晶が、胃のpH条件下で実質的に不溶性であり、そして小腸のpH条件下で実質的に可溶性であると特徴付けられる。あるいは、本発明のこれらの使用および他の使用のために、架橋タンパク質結晶は、不溶性形態で活性であり得、次いで溶解し、そして一旦それらの機能が完了すると、除去されるかまたは消化される。
【００６７】
本発明による架橋タンパク質結晶を含む、医薬品、パーソナルケア、獣医学用または予防的組成物はまた、錠剤、リポソーム、顆粒、スフェア、微粒子、ミクロスフェア、およびカプセルからなる群より選択され得る。
【００６８】
そのような使用、ならびに本発明による他の使用のために、架橋タンパク質結晶は、錠剤に処方され得る。そのような錠剤は、容易に取り扱われ、そして受容可能なレベルの活性を保持する、架橋タンパク質結晶保存物の、液体を含まない、ダストを含まない形態を構成する。
【００６９】
あるいは、架橋タンパク質結晶は、反応性組成物を提供する投与のために使用される従来の種々の貯蔵形態であり得る。これらは、例えば、固体、半固体、および液体の投与形態、例えば、液状溶液または懸濁液、ゲル、クリーム、バルム、エマルジョン、ローション、スラリー、粉末、スプレー、泡沫、ペースト、軟膏、膏薬、バルム、および滴薬を含む。
【００７０】
本発明の架橋タンパク質結晶を含む組成物または処方物はまた、医薬品、パーソナルケア組成物、または獣医学用処方物において使用される、任意の従来のキャリアまたはアジュバントを含み得る。これらのキャリアおよびアジュバントは、例えば、フロイントアジュバント、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、緩衝物質（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、または電解質（例えば、硫酸プロタミン）、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、マグネシウム、三ケイ酸塩、セルロースベース基質、およびポリエチレングリコールを含む。局所またはゲルベース形態のためのアジュバントは、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、およびウッドワックスアルコールを含み得る。
【００７１】
本発明の１つの実施態様によって、架橋タンパク質結晶は、徐放性投与のために使用される任意の従来物質と組み合わせられ得る。そのような物質は、例えば、コーティング剤、シェル、およびフィルム（例えば、腸コーティングおよびポリマーコーティングおよびフィルム）を含む。
【００７２】
本発明の架橋タンパク質結晶を含む処方物または組成物の、投与および投与レジメの最も有効な様式は、所望の効果、もしあれば以前の治療、個体の健康状態、または状態自体の状況、および架橋タンパク質結晶に対する応答、および処置する医師または臨床医の判断に依存する。架橋タンパク質結晶は、医薬品、パーソナルケア組成物、または獣医学用処方物について受容可能な任意の投与形態で、一度に、または一連の処置にわたって投与され得る。
【００７３】
単一投与形態を生じるキャリア物質と組み合わせられ得る架橋タンパク質結晶の量は、特定の投与形態、処方、投与量レベル、または投与頻度に依存して変化する。代表的な製剤は、約0.01％〜約99％の間、好ましくは約１％〜約50％の間の架橋タンパク質結晶（w/w）を含む。
【００７４】
個体の状態の改善の際に、架橋タンパク質結晶の維持投与量が、必要ならば投与され得る。引き続いて、投与量もしくは投与頻度、またはその両方は、症状の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得る。状態が所望のレベルまで軽減された場合、処置を中断すべきである。しかし、個体は、その状態または症状の任意の再発に基づく、長期の断続的処置を必要とし得る。
【００７５】
本発明の代替的な実施態様は、本明細書中に開示される架橋タンパク質結晶を含むタンパク質送達システムを含む。そのような系は、洗浄剤（例えば、界面活性剤）、パーソナルケア製品（例えば、化粧品）、医薬品（例えば、リパーゼ）、獣医学用組成物、ワクチン、食品、飼料、汚染除去のための診断および処方物に含まれるようなタンパク質を送達するために使用され得る。本発明のタンパク質送達システムは、処方物またはデバイス（例えば、移植可能なデバイス）であり得、微粒子タンパク質送達システムであり得、ここで架橋タンパク質結晶は、約0.01μm〜約500μmの間、あるいは約0.1μm〜約50μmの間という最長の寸法を有する。そのような系の架橋タンパク質結晶成分は、以下からなる群から選択される形状を有し得る：球、針、棒、平板（例えば、六角形および四角形）、偏菱形、立方体、両錐体（bipryamid）、および角柱。有益には、本発明のタンパク質の架橋結晶形態は、重量単位あたり約50％〜約90％タンパク質までの負荷が可能である。
【００７６】
本発明による保護されたタンパク質系の１つの例は、使用前に液体界面活性剤のような媒体中での保存に適切である。そのような系の架橋タンパク質結晶成分は、上記の媒体中での保存条件下で不溶性であり、これは、代表的には架橋される上記結晶を形成するために結晶化されるタンパク質の可溶性形態の分解を生じ、そして使用の条件下で可溶性である。
【００７７】
本発明に従って、架橋タンパク質結晶の調製は、タンパク質の結晶化および架橋の工程を包含する。これは、以下に例示されるように実施され得る。
【００７８】
架橋タンパク質結晶の調製−タンパク質結晶化
タンパク質結晶は、水性溶液または有機溶媒を含む水性溶液からのタンパク質の制御された結晶化によって成長される。制御されるべき条件には、例えば、溶媒の蒸発速度、適切な補助溶質および緩衝剤の存在、pH、ならびに温度が挙げられる。タンパク質の結晶化に影響を及ぼす種々の因子の包括的な概説は、McPherson,Methods  Enzymol,114,112-20頁(1985)によって刊行されている。
【００７９】
McPhersonおよびGilliland,J.Crystal  Growth,90,51-59頁(1988)は、結晶化されているタンパク質および核酸の包括的なリスト、およびそれらが結晶化された条件を編集している。結晶および結晶化レシピ、ならびに溶解されたタンパク質および核酸構造の同等物の保管の概要は、the  Protein  Data  Bank  at  the  Brookhaven  National  Laboratory  [http//www.pdb.bnl.gov;Bernsteinら、J.Mol.Biol.,112,535-42頁(1977)]によって維持される。これらの参考文献は、適切な架橋タンパク質結晶の形成の前段階として、タンパク質の結晶化に必要な条件を決定するために使用され得、そして他のタンパク質についての結晶化方策を導き得る。あるいは、知的な試験(intelligent  trial)および誤差探索の方策は、ほとんどの場合において、受容可能な純度レベルがそれらについて達成され得るという条件で多くのタンパク質についての適切な結晶化条件を生じ得る（例えば、C.W.Carter,Jr.およびC.W.Carter,  J.Biol.Chem.,254,12219-23頁(1979)を参照のこと）。
【００８０】
本発明による架橋タンパク質結晶における使用のために、Ｘ線回折分析に必要とされる大きな単結晶は必要とされない。マイクロクリスタリンシャワーが適切である。
【００８１】
例えば、架橋タンパク質結晶は、約0.01μm〜約500μmの間、または0.1μm〜約50μmの間で最長の寸法を有し得る。それらはまた、以下からなる群から選択される形状を有し得る：球、針、棒、平板（例えば、六角形および四角形）、偏菱形、立方体、両錐体、および角柱。
【００８２】
一般的に、結晶は、適切な水性溶媒または適切な結晶化剤（例えば、塩または有機溶媒）を含む水性溶媒と、結晶化されるべきタンパク質とを組み合わせることによって生成される。溶媒は、タンパク質と組み合わされ、そして結晶化の誘導に適切であり、そしてタンパク質活性および安定性の維持に受容可能であると実験的に決定される温度での攪拌に供され得る。溶媒は、必要に応じて、補助溶質（例えば、二価カチオン、補因子、またはカオトロープ（chaotrope）)、ならびにpHを制御する緩衝剤種を含み得る。補助溶質の必要性およびそれらの濃度は、結晶化を容易にするために実験的に決定される。
【００８３】
産業規模でのプロセスにおいて、結晶化につながる制御された沈殿は、バッチプロセスにおいてタンパク質、沈殿物、補助溶質、および必要に応じて緩衝剤という単純な組み合わせによって最良に実施され得る。別の選択として、タンパク質は、開始物質としてタンパク質沈殿物を用いることによって結晶化され得る。この場合において、タンパク質沈殿物は、結晶化溶液に添加され、そして結晶が形成するまでインキュベートされる。別の実験結晶化方法（例えば、透析または拡散蒸着）もまた適応され得る。McPherson（前出）およびGilliland（前出）は、結晶化文献の概説において、適切な条件の包括的リストを含む。
【００８４】
時折、架橋剤と結晶化媒体との間の不適合は、結晶を、より適切な溶媒系に交換することを必要とし得る。
【００８５】
結晶化条件がすでに記載されている多くのタンパク質を使用して、本発明の架橋タンパク質結晶を調製し得る。しかし、上記の参考文献のほとんどにおいて報告されている条件は、ほとんどの場合、いくつかの大きな回折性結晶（diffraction  quality  crystal)を生成するように最適化されていることに注意すべきである。従って、架橋タンパク質結晶を作製する際に使用されるより小さな結晶の大規模生成のための高収率プロセスを提供するこれらの条件の幾分の調整が必要であり得ることは、当業者に理解される。
【００８６】
架橋タンパク質結晶の調製−タンパク質結晶の架橋
一旦タンパク質結晶が適切な媒体中で成長されると、タンパク質結晶は架橋され得る。架橋は、結晶の構成タンパク質分子間に共有結合を導入することによって結晶格子の安定化を生じる。このことは、タンパク質を、そうでなければ、結晶格子の存在、またはインタクトなタンパク質の存在とさえ不適合であり得る別の環境に移し得る。
【００８７】
有利には、本発明による架橋は、保存の条件下で、架橋相互作用が、結晶中の成分タンパク質分子が溶液に戻ることを阻止し、タンパク質分子を効率的に不溶化するか、または微結晶性粒子に固定させるような方法で実行される。架橋タンパク質結晶の周辺の環境におけるトリガーへの曝露において（例えば、保存よりも使用の条件下で）、タンパク質分子は不溶であり、それらのタンパク質活性を放出する。解離速度は、１つ以上の以下の因子により制御され得る：架橋の度合い、タンパク質結晶の架橋剤への曝露時間の長さ、架橋に関与するアミノ酸残基、クロスリンカーがホモ二官能性またはヘテロ二官能性のどちらかであるか、架橋剤のタンパク質結晶への付加の速度、クロスリンカーの性質、クロスリンカーの鎖長、架橋タンパク質結晶の表面積、架橋タンパク質結晶のサイズ、架橋タンパク質結晶の形状およびその組合せ。
【００８８】
あるいは、制御された溶解架橋タンパク質結晶は、溶解を開始および維持するために必要とされる特定のトリガーの非存在下での架橋タンパク質結晶として機能する。
【００８９】
架橋は、二官能性試薬を含む広範な種々の多官能試薬の１つまたは組合せを、同時に（平行に）、または連続的に使用して実行され得る。周辺の環境におけるトリガーへの曝露において、または所定の期間を超えて、このような多官能性架橋剤と架橋されたタンパク質結晶の間の架橋は少なくなるか、または弱くなり、タンパク質の溶解、または活性の放出を導く。このような架橋剤には、グルタルアルデヒド、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびグリオキサールが挙げられる。さらなる多官能性架橋剤には、ハロ-トリアジン（例えば、塩化シアヌル）；ハロ-ピリミジン（例えば、2,4,6-トリクロロ／ブロモ-ピリミジン）；脂肪族または芳香族のモノカルボン酸またはジカルボン酸の無水物またはハロゲン化物（例えば、無水マレイン酸、（メタ）アクリロイドクロリド、塩化クロロアセチル；N-メチロール化合物（例えば、N-メチロール-クロロアセトアミド）；ジイソシアネートまたはジイソチオシアネート（例えば、フェニレン-1,4-ジ-イソシアネートおよびアジリジン）が挙げられる。他の架橋剤には、エポキシド（例えば、ジエポキシド、トリエポキシドおよびテトラエポキシド）が挙げられる。本発明の好ましい実施態様に従って、架橋剤は、単独でまたはエポキシドと連続的に使用されるグルタルアルデヒドである。他の使用可能な架橋剤の代表的なリストについては、例えば、Pierce  Chemical  Companyの1996年版のカタログを参照のこと。このような多官能性架橋剤もまた、同時に（平行に）または連続的に可逆的な架橋剤（例えば、以下に記載されるような架橋剤）と一緒に使用され得る。
【００９０】
本発明の種々の実施態様において有用であるクロスリンカーは、（１）タンパク質の１つのシステイン側鎖から別のシステイン側鎖への共有結合を生成するクロスリンカー、（２）タンパク質の１つのリジン側鎖から別への共有結合を生成するクロスリンカー、または（３）タンパク質の１つのシステイン側鎖からリジン側鎖への共有結合を生成するクロスリンカー。架橋は、分子間および分子内の共有結合的な架橋によって生じ得る。
【００９１】
タンパク質結晶は、制御された溶解架橋タンパク質結晶を生成するための以下のクロスリンカーの１つと架橋され得る：ジメチル3,3’-ジチオビスプロピオンイミデート・HCl(DTBP);ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP);ビスマレイミドヘキサン（BMH）；ビス[スルホスクシンイミジル]スベレート（BS);１,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン（DFDNB);ジメチルスベルイミデート・2HCl(DMS);ジスクシンイミジルグルタレート（DSG）；酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ-DST);1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド（EDC);エチレングリコールビス[スルホスクシンイミジルスクシネート]（スルホ-EGS）；N-[γ-マレイミド-ブチリルオキシ]スクシンイミドエステル(GMBS);N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミジル-4-アジドベンゾエート（スルホ-HSAB);スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-（2-ピリジルジチオ）トルアミド]ヘキサノエート（スルホ-LC-SMPT);ビス-[β-（4-アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド（BASED);およびNHS-PEG-ビニルスルホン（NHS-PEG-VS)。
【００９２】
本発明の別の実施態様に従って、架橋が、可逆的なクロスリンカーを、平行に、または連続的に使用して実行され得る。得られた架橋タンパク質結晶は、反応性の多官能性リンカーにより、特徴づけられ、そこに、トリガーは分離基として組み込まれる。反応性官能基は、タンパク質中の反応性のアミノ酸側鎖と一緒の連結に関与し、そしてトリガーは、周辺環境において１つ以上の条件（例えば、pH、温度、または熱力学的な水の活性）の変化により崩壊され得る結合からなる。これは、以下のように図示的に例示される：
X-Y-Z+2AA残基--→AA1-X-Y-Z-AA2
環境での変化--→AA1-X+Y-Z-AA2
--ここで、XおよびZは反応性官能性を有する基であり
--ここで、Yはトリガーであり
--ここで、AA１およびAA2は、同じタンパク質上、または２つの異なるタンパク質上の、反応性アミノ酸残基を表す。架橋剤とタンパク質との間の結合は、共有結合またはイオン結合または水素結合であり得る。周辺の環境における変化は、トリガー結合の破壊とタンパク質の溶解を生じる。従って、このような可逆的な架橋剤で架橋されたタンパク質結晶間の架橋は破壊し、タンパク質結晶の溶解、または活性の放出を導く。
【００９３】
あるいは、クロスリンカーおよびトリガーの反応性官能性は同じであり得：
X-Z+2AA残基--→AA1-X-Z-AA2
環境における変化--→AA1+X-Z-AA2。
【００９４】
クロスリンカーは、ホモ官能性(X=Y)、またはヘテロ官能性であり得る（XはYに等しくない）。反応性官能基のXおよびYは、以下の官能基であり得るが、これらに限定されない（ここで、R、R’、R’’、およびR’’’は、アルキル基、アリール基または水素基であり得る）：
I.反応性のアシルドナーが、カルボン酸エステルRCOOR’、アミドRCONHR’、アシルアジ化物RCON3、カルボジイミドR-N=C=N-R’、N-ヒドロキシイミドエステルRCO-O-NR’、イミドエステルR-C=NH2+(OR’)、無水物RCO-O-COR’、カーボネートRO-CO-O-R’、ウレタンRNHCONHR’、酸ハロゲン化物RCOHal（ここで、Hal＝ハロゲン）、アシルヒドラジドRCONNR’R’’、O-アシルイソウレアRCO-O-C=NR’(-NR’’R’’’)、により例示される。
【００９５】
II．反応性カルボニル基が、アルデヒドRCHOおよびケトンRCOR’、アセタールRCO(H2)R’、ケタールRR’CO2R’R’’により例示される。タンパク質固定化および架橋化の技術分野における当業者に周知である反応性カルボニル含有官能基は、文献[Pierce  catalog  and  Handbook、Pierce  Chemical  Company、Rockford、Illinois(1994);S.S.Wong,Chemistry  of  Protein  Conjugation  and  Cross-Linking,CRC  Press,Boca  Raton,Florida(1991)]中に記載されている。
【００９６】
III.アルキルドナーまたはアリールドナーは：ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリールR-Hal、アジ化物R-N3、硫酸エステルRSO3R’、リン酸エステルRPO(OR’3)、アルキルオキソニウム塩R3O+、スルホニウムR3S+、硝酸エステルRONO2、マイケル受容体RCR’=CR’”COR”、フッ化アリールArF、イソニトリルRN+≡C-、ハロアミンR2N-Hal、アルケンおよびアルキンにより例示される。
【００９７】
IV．硫黄含有基は、ジスルフィドRSSR’、スルフヒドリルRSH、エポキシド
【００９８】
【化１】
2008283976.tif 000002
【００９９】
により例示される。
【０１００】
V.塩は、アルキルまたはアリールアンモニウム塩R4N+、カルボキシレートRCOO-、硫酸塩ROSO3-、リン酸塩ROPO3”およびアミンR3Nにより例示される。
【０１０１】
以下の表は、放出機構により体系化されるトリガーの例を含む。この表において、R=は、アルキル、アリールまたは架橋タンパク質と反応し得る活性基を有する他の鎖であり得る、多官能性架橋剤である。これらの反応性基は、任意の種々の基（例えば、求核置換、フリーラジカル置換、または求電子置換を受けやすい基であり、ハロゲン化物、アルデヒド、カーボネート、ウレタン、キサンタン、とりわけエポキシドが挙げられる）であり得る。
【０１０２】
【化２】
2008283976.tif 000003
【０１０３】
【化３】
2008283976.tif 000004
【０１０４】
本発明の架橋タンパク質結晶の溶解は、適切なクロスリンカーおよび関連するトリガーを選択することにより制御され得る。物理的および化学的で入手可能なトリガーの例は以下のものを含む：温度変化、pH変化、化学組成変化、濃縮物から希釈形態への変化、溶液の酸化-還元電位の変化、入射放射での変化、遷移金属濃度の変化、フッ化物濃度の変化、フリーラジカル濃度の変化、金属キレート剤の濃度、結晶およびその組合せで作用する剪断力の変化。
【０１０５】
可逆的なクロスリンカーのさらなる例は、T.W.Green,Protective  Groups  in  Organic  Synthesis,  John  Wiley  &  Sons(編）（1981）において記載される。可逆的な保護基について使用される任意の種々のストラテジーが、可溶化が制御される可逆的であり得る架橋タンパク質結晶の生成について適切なクロスリンカー中に組み込まれ得る。種々のアプローチが、Angewante  Chemie  Inl.  Ed.  Engl.  35頁．2056(1996)での、この主題のWaldmannの総説中に列挙される。
【０１０６】
他の可逆的なクロスリンカーの型は、ジスルフィド結合含有クロスリンカーである。このようなクロスリンカーにより形成される架橋を破壊するトリガーは、架橋タンパク質結晶の環境への、還元剤（例えば、システイン）の付加である。
【０１０７】
ジスルフィドクロスリンカーは、Pierce  Catalog  and  Handbook(1994-1995)に記載される。
このようなクロスリンカーの例は以下を含む：
ホモ二官能性（対称）
DSP-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、Lomant試薬として公知。
DTSSP-  3-3’-ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）、DSPの水溶性バージョン。
DTBP-  ジメチル3,3’-ジチオビスプロピオンイミデート・HCl
BASED-  ビス-（β-[4-アジドサリチルアミド]エチル）ジスルフィド
DPDPB-  1,4-ジ-（3’-[2’-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド）ブタン。
【０１０８】
ヘテロ二官能性（非対称）
SPDP-  N-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオ）プロピオネート
LC-SPDP-  スクシンイミジル-6-（3-[2-ピリジルジチオ]プロピオネート）ヘキサノエート
スルホ-LC-SPDP-  スルホスクシンイミジル-6-（3-[2-ピリジルジチオ(pyridyldlthio)]プロピオネート）ヘキサノエート、LC-SPDPの水溶性バージョン
APDP-  N-(4-[p-アジドサリチルアミド]ブチル）-3’-（2’-ピリジルジチオ）プロピオンアミド
SADP-  N-スクシンイミジル（4-アジドフェニル）1,3’-ジチオプロピオネート
スルホ-SADP-  スルホスクシンイミジル（4-アジドフェニル）1,3’-ジチオプロピオネート、SADPの水溶性バージョン
SAED-  スルホスクシンイミジル-2-（7-アジド-4-メチクマリン(methycoumarin)-3-アセトアミド）エチル-1,3’ジチオプロピオネート
SAND-  スルホスクシンイミジル-2-（m-アジド-O-ニトロベンズアミド）エチル-1,3’-ジチオプロピオネート
SASD-  スルホスクシンイミジル-2-（p-アジドサリチルアミド）エチル-1,3’-ジチオプロピオネート
SMPB-  スクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート
スルホ-SMPB-  スルホスクシンイミジル-4-（p-マレイミドフェニル）ブチレート
SMPT-  4-スクシンイミジルオキシカルボニル-メチル-α-（2-ピリジルチオ）トルエン
スルホ-LC-SMPT-  スルホスクシンイミジル-6-（α-メチル-α-（2-ピリジルチオ）トルアミド）ヘキサノエート。
【０１０９】
本発明が、より良く理解され得るために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、実例のみの目的についてであり、そして本発明の範囲を制限するものとして任意の様式において構成されるものではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例１-架橋ズブチリシン結晶の調製
ズブチリシンの結晶化
１容量のアルカラーゼ2.5L（Alcalase  2.5L）（Novo  Nordisk  Bioindustrials,Franklinton,North  Carolina）を、30〜35℃で調製した２容量の15％硫酸ナトリウム溶液(pH5.5)に添加した。結晶溶液を、1/2,000〜1/500容量の播種（15％硫酸ナトリウム中の30mg/ｍｌの結晶のスラリー）（pH5.5）（pHは、NaOHを添加することによって5.5に維持した)で播種した。播種した結晶溶液を、一晩、磁気スターラーによって攪拌することによって、30〜35℃でインキュベートした。これは、24〜48時間後、60〜80％（活性として）の結晶棒（10〜50μm長、１〜３μm幅）を生成した。
【０１１１】
実施例２-ズブチリシン結晶体の架橋
ズブチリシン結晶を、以下を含む種々の架橋剤の１つを使用して架橋した：グルタルアルデヒド、グリオキサール、スクシンアルデヒド、オクタンジアルデヒド、およびエポキシド。
【０１１２】
グルタルアルデヒド架橋
グルタルアルデヒド（「GA」）（50％水溶液として、Aldrich  Chemical  Co.によって提供される）を、以下の表Iに列挙される種々の量で、４℃で、脱イオン水で希釈した。15％硫酸ナトリウム中のズブチリシン結晶（27mg/ml）の各mlについて、10μlの希釈グルタルアルデヒドを、低速でボルテックスで振盪させながら（5ml未満の量について）、または中程度の速度でオーバーヘッドスターラーで攪拌しながら（25ml〜500mlの量について）、スラリーに添加した。割り当てた架橋時間での混合の後、サンプルを、20秒間、最大速度で遠心分離し、上清を捨て、そして15％硫酸ナトリウムで置換した。この「洗浄」工程を、全部で５回繰り返した。最終再懸濁を、15％硫酸ナトリウム（900μl）で行なった。
【０１１３】
【化４】
2008283976.tif 000005
【０１１４】
グリオキサール架橋
グリオキサール（Aldrich  Chemical  Co.から40％水溶液として供給される）（「GY」）を、最終濃度0.01〜1.0％になるように、結晶懸濁液に添加した。15％硫酸ナトリウム中のズブチリシン結晶（27mg/ml）の各mlについて、0.25μl〜25ml（0.01〜１％）のグリオキサールを、周囲温度で磁気的に攪拌しながら、スラリーに添加した。1時間の攪拌の後、グルタルアルデヒド架橋について記載されるように、架橋結晶を遠心分離し、そして洗浄した。
【０１１５】
オクタンジアルデヒド架橋
下記の表IIに示される量で、オクタンジアルデヒド（「OA」）（DSM  Chemie  Linzによって100％として提供される）を、周囲温度で、磁気的に攪拌しながら、１mlのズブチリシン結晶スラリー（15％硫酸ナトリウム中27mg/ml）に希釈しないで添加した。攪拌を、グルタルアルデヒド架橋について記載されるように、架橋結晶を遠心分離および洗浄する前に、特定の時間（分または時間）継続した。
【０１１６】
【化５】
2008283976.tif 000006
【０１１７】
スクシンアルデヒド架橋
スクシンアルデヒド（「SA」）（DSM  Chemie  Linzによって40％として供給される）を、希釈しないで、以下の表IIIに示される量で、周囲温度で磁気的に攪拌しながら、１mlのズブチリシン結晶スラリー（15％硫酸ナトリウム中27mg/ml）に添加した。攪拌を、グルタルアルデヒド架橋について記載されるように、架橋結晶を遠心分離および洗浄する前に、特定の時間（分または時間）継続した。
【０１１８】
【化６】
2008283976.tif 000007
【０１１９】
エピクロロヒドリン架橋
エピクロロヒドリン（「EP」）（99％、Sigma  Chemical  Co.,St.Louis,Missouri）の10μlのアリコートを、希釈しないで、周囲温度で攪拌しながら、１mlのズブチリシン結晶スラリー（15％硫酸ナトリウム中27mg/ml）に添加した。攪拌を、グルタルアルデヒド架橋について記載されるように、架橋結晶を遠心分離および洗浄する前に、特定の時間（分または時間）継続した。
【０１２０】
エポキシド架橋
一般的手順
ズブチリシン架橋を、種々のエポキシドのうちの１つを使用して、個々に実施した。これらは以下を含む：
１）一般的な名称-DENACOL
ａ）DENACOL  EX-411
ｂ）DENACOL  EX-421
ｃ）DENACOL  EX-614
ｄ）DENACOL  EX-201
ｅ）DENACOL  EX-202；全てNagase  American  Corporationから入手される。
【０１２１】
２）Tokyo  Kasei  Inc.  Americaから入手される：
ａ）ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（N448）（「NP」）
ｂ）エチレングリコールジグリシジルエーテル（EO342）（「EG」）。
【０１２２】
エポキシドの濃度を0.01％と4.0％との間で変化させ、そして架橋時間を１時間から72時間に変更した。架橋剤への添加および酵素からの架橋剤の除去についての手順は、グルタルアルデヒド架橋についての上記のようであった。
【０１２３】
グルタルアルデヒド（0.01〜0.2％）での（１時間〜５時間の）続く架橋は、強く架橋した酵素結晶を生成し、これは水中で不溶性であるが、アゾカゼインアッセイにおいて活性であった。
【０１２４】
１mlのズブチリシン結晶スラリー（15％硫酸ナトリウム中の27mg/ml）のサンプルを、低速でボルテックスすることによって混合し、結晶の単一形態の懸濁物を確実にした。エポキシド（DMF中の10％溶液）を表IVに特定される量の結晶スラリーに添加し、そして混合物を周囲温度で振盪した。周囲温度での１時間と72時間との間の割り当てられた時間の後、グルタルアルデヒド（DMF中10％）をエポキシド/結晶混合物に添加し、そして攪拌を、周囲温度で、表IVに特定される時間継続した。得られた架橋酵素結晶を、１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2で2回、次いで、水で３回、そして最後に１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2で１回洗浄し、その後１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2中に再懸濁した。
【０１２５】
【化７】
2008283976.tif 000008
【０１２６】
好ましいエポキシドサンプルの大規模調製
架橋の前に、15％硫酸ナトリウム中の結晶ズブチリシン（27mg/ml）のサンプル（380ml）を、周囲温度でのオーバーヘッド攪拌によって、５分間混合し、結晶の単一形態の懸濁物を確実にした。ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（DMF中の3.838mlの10％溶液）を結晶スラリーに添加し、そして混合物を周囲温度で攪拌した。周囲温度での５時間後、3.838mlのグルタルアルデヒド（DMF中の10％）をエポキシド/結晶混合物に添加し、そして周囲温度で1.5時間、攪拌を継続した。得られた架橋酵素結晶を、１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2で2回、次いで水で３回、そして最後に１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2で１回洗浄し、その後１％(NH4)2SO4/10mM  CaCl2中に再懸濁した。
【０１２７】
実施例３-活性アッセイ
本発明による架橋タンパク質結晶、ならびに他の酵素サンプルの活性を試験するために、本発明者らは以下のアゾカゼインアッセイを開発した。
【０１２８】
材料：
2.0M  Tris緩衝液。500ppm  CaCl2
0.2M  Tris緩衝液。50ppm  CaCl2
50％尿素
アゾカゼイン
５％トリクロロ酢酸（「TCA」）
アルカラーゼ（2.5L）
ChiroCLEC-BLTM（架橋ズブチリシン結晶、Altus  Biologics,Inc.,  Cambridge,Massachusettsから入手可能）。
【０１２９】
アッセイを、使用の直前にアゾカゼインを調製し、600mgのアゾカゼインを10mlの50％尿素と溶解し、そして溶解を完全にするために軽くボルテックスすることによって実施した。次いで、10mlの2.0M  Trisを添加し、そしてボルテックスして混合し、脱イオン水を添加することによって容量を100mlまで増加させた。
【０１３０】
アッセイされるべき50μlのアリコートを提供するために、0.2M  Tris中の、アッセイされるべき酵素のストック溶液を、以下のように調製した：
界面活性剤なし：0.03mg/mlアルカラーゼ（可溶性、非架橋ズブチリシンカール
スバーグ（Carlsberg）80.3mg/ml）
3.0mg/ml  ChiroCLEC-BLTM。
【０１３１】
120μlの界面活性剤/ml溶液あり：0.03mg/mlアルカラーゼ
3.0mg/ml  ChiroCLEC-BLTM。
【０１３２】
本発明者らは、酵素の50μlアリコートを150μlの0.2M  Trisに添加し、そして混合物を５mlの試験管に微小攪拌子とともに配置した。次いで本発明者らは、試験管およびアゾカゼインの両方を、40℃で１分間、金属ヒーティングブロックを使用して暖めた。その後、本発明者らは、１mlのアゾカゼインを各試験管に添加し、そして40℃で15分間、ヒーティングブロックを攪拌スピード４で使用して攪拌した。次いで本発明者らは、各試験管に２mlのTCAを添加し、ボルテックスで混合し、そして試験管を氷浴中に即座に配置し、サンプルを０℃で20分間静置させた。本発明者らは、サンプルを５分間最大rpmで微量遠心し、そして必要であれば、微量ろ過した。本発明者らは、λ390での、abs・ユニット/mgタンパク質・分で表された活性の吸光度を測定した。このアッセイにおいて、全ての測定を三連で行った。コントロールには酵素を添加しなかったが、酵素がアッセイに存在する場合、界面活性剤を含有させた。必要である場合、この時間＝０アッセイを、時間＝15分および他の時間で反復した。
【０１３３】
種々のアッセイにおいて使用した界面活性剤には、Tide、WiskおよびCiba-Geigy界面活性剤＃15、＃16、および＃44（「Ciba界面活性剤」）が含まれる。Ciba界面活性剤＃15は、代表的な欧州の界面活性剤処方--15％アルキルベンゼンスルホネート、14％脂肪アルコールエトキシレート、および10％脂肪酸塩（石鹸）に基づく液体（水性）界面活性剤を構成する。Ciba界面活性剤＃16は、代表的な米国界面活性剤処方--7.5％アルキルベンゼンスルホネート、10％脂肪アルコールエトキシレート、および17％アルキルエーテル（either）スルフェートに基づく液体（水性）界面活性剤を構成する。Ciba界面活性剤＃44は、代表的なコンパクトな界面活性剤処方--６％脂肪アルコールエトキシレート、23％アルキルエーテルスルフェート、および10％クエン酸ナトリウムに基づく液体（水性）を構成する。Ciba界面活性剤＃15、＃16、および＃44は、Ciba  Specialty  Chemicals  Corp.,Division  Consumer  Care  Chemicals,Greensboro,North  Carolinaからの要求に基づいて得られ得る。
【０１３４】
本発明者らは、希釈ストックからアッセイストック溶液を調製し、そしてアッセイを以下のように行なった。
【０１３５】
活性アッセイ-200×希釈-架橋ズブチリシン結晶、および強力な（heavy  duty）液体界面活性剤（Ciba＃15、Ciba＃44、TideおよびWisk）中の結晶ズブチリシン。
【０１３６】
ストックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを、10mlのネオプレンチューブ中で以下のように調製した。
ストックＡ：本発明に従って調製した架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml）。
【０１３７】
本発明者らは、架橋ズブチリシン結晶の37μlスラリー（１mgの架橋酵素結晶）を遠心分離して上清を除去し、１mlの界面活性剤を添加してボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlアリコートを9.95mlの水に添加し、最終濃度５μg/mlにした。
ストックＢ：非架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml）。
【０１３８】
本発明者らは、ズブチリシン結晶の37μlスラリー（１mgの酵素結晶と等しい）を遠心分離して上清を除去し、１mlの界面活性剤を添加し、そしてボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlアリコートを9.95mlの水に添加し、最終濃度５μg/mlにした。
ストックＣ：アルカラーゼ。
【０１３９】
本発明者らは、18.75μlのアルカラーゼ（80.3mg/ml）を３mlの界面活性剤に添加し、そしてボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlのアリコートを9.95mlの水に添加し、最終濃度2.5μg/mlにした。
ストックＤ：界面活性剤。
【０１４０】
界面活性剤の50μlのアリコートを9.95mlの水に添加した。
【０１４１】
アゾカゼインストック（６mg/ml）を上記のように調製した。ストックＡおよびＢの５μg/mlへの希釈の際、ｔ＝０アッセイを即座に設定し、そして使用したストックサンプルの量が、50μl+150μl  0.2M  Trisの代わりに、200μlであったことを除いて、上記のように行った。チューブを1分間40℃で加熱しながら、ストックＡ、Ｂ、およびＣの各々２mlの２つのさらなるサンプルを1.5mlの微量遠心管に配置し、加熱しながらの希釈の５分後および15分後にさらに試験するために、振盪しながら52℃に加熱した。
活性アッセイ-670×希釈-
架橋ズブチリシン結晶および界面活性剤濃縮物中の結晶ズブチリシン（Ciba  #16）。
【０１４２】
ストックＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを、以下のように10mlのネオプレンチューブ中で調製した。
ストックＡ：本発明によって調製した架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml）。
【０１４３】
本発明者らは、架橋ズブチリシン結晶の124μlスラリー（3.35mgの架橋酵素結晶に等しい）を遠心分離して上清を除去し、１mlの界面活性剤を添加し、そしてボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlアリコートを33.45mlの水に添加し、最終濃度5μg/mlにした。
ストックＢ：非架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml）。
【０１４４】
本発明者らは、ズブチリシン結晶の124μlスラリー（3.35mgの酵素結晶に等しい）を遠心分離して上清を除去し、１mlの界面活性剤を添加し、そしてボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlアリコートを33.45mlの水に添加し、最終濃度5μg/mlにした。
ストックＣ:アルカラーゼ。
【０１４５】
本発明者らは、167μlのアルカラーゼ（80.3mg/ml）を８mlの界面活性剤に添加し、そしてボルテックスして混合した。得られた混合物の50μlアリコートを33.45mlの水に添加し、最終濃度2.5μg/mlにした。
ストックＤ：界面活性剤。
【０１４６】
界面活性剤の50μlアリコートを33.45mlの水に添加した。
【０１４７】
アゾカゼインストック（６mg/ml）を上記のように調製した。ｔ＝０アッセイを即座に設定し、そして、使用したストックサンプルの量を、50μl+150μl  0.2M  Tris緩衝液の代わりに200μlにしたことを除いて、上記のように実施した。チューブを、1分間、40℃で加熱しながら、ストックＡ、Ｂ、およびＣの各２mlの２つのさらなるサンプルをエッペンドルフチューブに配置し、加熱しながらの希釈の５分後および15分後にさらに試験するために、振盪しながら40℃に加熱した。
【０１４８】
実施例４-安定性研究
本発明による架橋酵素結晶および他の酵素サンプルの安定性を試験するために、本発明者らは、以下のアッセイを開発した。
アゾカゼインアッセイ-安定性研究52℃。
【０１４９】
まず、本発明者らは、ネジ式キャップを有する２mlのエッペンドルフチューブ中で、界面活性剤中の酵素サンプルのストック溶液を調製した。52℃、適切な時間、水浴中で混合物をインキュベートした後、本発明者らは、各酵素サンプルチューブの１つに1.47mlの0.2M  Tris緩衝液を添加し、そしてよく混合した。適切な時間のインキュベーション後の希釈の後の活性をアッセイするために、本発明者らは各チューブから50μlのアリコートを取り出し、そして下記のようにアッセイした。酵素/界面活性剤ストックの残ったサンプルを52℃の水浴に配置し、特定の時間でアッセイのためにさらなるアリコートを取り出した。
【０１５０】
アッセイを、50μlの酵素サンプルを150μlの0.2M  Tris緩衝液に添加し、そして40℃で１分間加熱することによって、実施した。次いで、定常の40℃の温度で、本発明者らは、1.0mlのアゾカゼインストック（実施例１に記載されるように）を各サンプルに添加し、攪拌速度４でヒートブロックを使用することによって、15分間攪拌した。次いで、本発明者らは、各チューブに２mlのTCAを添加し、ボルテックスで混合し、そしてチューブを氷浴に即座に配置し、サンプルを０℃で20分間静置させた。本発明者らは、最大rpmで５分間サンプルを遠心分離し、そして必要である場合、微量ろ過した。本発明者らは、λ390で上清の吸光度を測定し、そして活性をabs・ユニット/mgタンパク質・分として表した。このアッセイにおいて、全ての測定を三連で行なった。コントロールには酵素を添加しなかったが、酵素がアッセイに存在する場合、界面活性剤を含有させた。
【０１５１】
52℃で実施した安定性研究の部分として活性を評価するために、本発明者らは、希釈ストックからアッセイストック溶液を調製し、そして以下のようにアッセイを実施した。
【０１５２】
アルカラーゼについて
ストック：
ストックＡ：市販の界面活性剤（TideまたはWisk、70℃での４時間の加熱によって非活性化される）中のアルカラーゼ（80.3mg/ml）-最終濃度＝0.25mg/ml。ストックを、31.2μlのアルカラーゼを9.97mlの界面活性剤に添加することによって調製した。得られた混合物の200μlアリコートを、数個の２mlエッペンドルフチューブの各々に配置した（ｔ＝０、30、およびその他について３×）。
ストックＢ：Ciba界面活性剤（Ciba  #15、Ciba  #16、またはCiba  #44）中のアルカラーゼ（80.3mg/ml）-最終濃度＝0.25mg/ml。ストックを、31.2μlのアルカラーゼを9.97mlの界面活性剤に添加することによって調製した。得られた混合物の200μlのアリコートを、数個の２mlエッペンドルフチューブの各々に配置した（ｔ＝０、１時間、および４〜６時間について３×）。
ストックＣ：市販の界面活性剤（TideまたはWisk、70℃で４時間加熱することによって非活性化される）３×（２mlのエッペンドルフチューブ中の上記の200μl）。
ストックＤ：Ciba界面活性剤（Ciba  #15、Ciba  #16、またはCiba  #44）３×（２mlのエッペンドルフチューブ中の上記の200μl）。
【０１５３】
ｔ＝０アッセイを、1.47mlの0.2M  Trisを、ストックＡ〜Ｄを含む各チューブの１つに添加し、内容物をよく混合した直後に実施した。残ったストックＡ〜Ｄのサンプルを水浴中に配置し、そして52℃に過熱した。そうでない場合、アッセイを上記のように実施した。
【０１５４】
架橋ズブチリシン結晶および結晶ズブチリシンに関して
ストックA,B,CおよびDを、以下のように、スクリューキャップ付きの2mlのエッペンドルフチューブで調製した。
ストックA：市販の界面活性剤中（変性TideまたはWisk）のChiroCLEC-BLTM  −  最終濃度  ＝  25mg/ml。3.12ｍlの酵素スラリーを遠心分離して水を除去することによって、次いで、酵素を界面活性剤で10mlまで希釈することによってストックを調製した。得られた混合物の200μlアリコートをいくつかの2mlのエッペンドルフチューブのそれぞれに入れた(ｔ＝0時間、24時間、48時間、および72時間については4倍)。
ストックB:  Ciba界面活性剤(Ciba#15、Ciba#16、またはCiba#44)中のChiroCLEC-BLTM  −  最終濃度  ＝  25mg/ml。3.12ｍlの酵素スラリーを遠心分離して水を除去することによって、次いで、酵素を界面活性剤で10mlまで希釈することによってストックを調製した。得られた混合物の200μlアリコートをいくつかの2mlのエッペンドルフチューブのそれぞれに入れた(52℃で、ｔ＝0時間、24時間、48時間、および72時間については4倍)。
ストックC：市販の界面活性剤（TideまたはWisk、4時間、70℃で加熱することによって非活性化）４×（2mlのエッペンドルフ中に200μlの界面活性剤）。
ストックD:Ciba-Geigy界面活性剤（Ciba#15、＃16または#44、どの界面活性剤をストックBのために選択したかに依存して）４倍（2mlのエッペンドルフチューブ中に200μlの界面活性剤）。
【０１５５】
t=0アッセイを、1.47mlの0.2M  TrisをストックA〜Dを含む各１つのチューブへ添加した後、直接配置し、そして含有物を十分に混合した。ストックA〜Dの残るサンプルをウオーターバス中に置き、そして52℃で加熱した。別の方法では、アッセイを上記のように実施した。
【０１５６】
架橋ズブチリシン結晶および結晶ズブチリシンに関して
ストックＡ、ＢおよびＣを以下のように、スクリューキャップ付きの2mlのエッペンドルフチューブで調製した。
ストックＡ：市販のCiba界面活性剤（Ciba#15、#1６または＃44）中の未架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml)−最終濃度  ＝約１mg/ml。50μlの結晶スラリーを遠心分離して上清を除去することによって、次いで、1.35mlの界面活性剤（Ciba#15、#1６または＃44）を1mg/mlの最終濃度まで添加することによって、ストックを調製した。得られた混合物の80μlアリコートをいくつかの2.0mlのエッペンドルフチューブのそれぞれに入れた(t＝0分、15分および他の時間については3倍)。
ストックB：Ciba界面活性剤（Ciba#15、#1６または＃44）中の本発明の架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml)−最終濃度＝約１mg/ml。50μlの結晶スラリーを遠心分離して上清を除去することによって、次いで、1.35mlの界面活性剤を1mg/mlの最終濃度まで添加することによってストックを調製した。得られた混合物の80μlアリコートをいくつかの2mlのエッペンドルフチューブのそれぞれに入れた(t＝0分、15分および他の時間については3倍)。
ストックC：Ciba界面活性剤（Ciba#15、#1６または＃44）−３×（2.0mlチューブに80μlの界面活性剤)。
【０１５７】
t=0アッセイを、1.8mlの水をストックA〜Cを含む各１つのチューブへ添加した後、直接配置し、そして含有物を十分に混合した。ストックA〜Cの残るサンプルをウオーターバス中に置き、そして52℃で加熱した。他の方法では、アッセイを、200μlの代わりに150μlの0.2M  Tris緩衝液を添加したことを除き、上記のように実施した。
【０１５８】
アゾカゼインアッセイ  -  ４０℃での安定性の研究
最初に、本発明者らは、スクリューキャップ付きの2mlのエッペンドルフチューブにおいて界面活性剤中の酵素サンプルのストック溶液を調製した。t=0での安定性をアッセイするために、本発明者らは、２５μlの各サンプルに対して1.8ｍｌの脱イオン水を加え、そして十分に混合した。本発明者らは各チューブから25μlのアリコートを取り出し、そして以下に記載されるようアッセイした。酵素/界面活性剤ストックの残っているサンプルを40℃のウオーターバス中に置き、そして特定の時点で、アッセイのためにさらなるアリコートと共に除去した。
【０１５９】
アッセイを、25μlの希釈酵素サンプルを175μlの0.2Mのトリス緩衝液へ添加することによって、そして1分間４０℃にて加熱することによって実施した。一定の４０℃の温度で、次いで本発明者らは、1.0ｍｌのアゾカゼインストック（実施例３に記載のように）を、回転スピード４でヒートブロックを使用して15分間攪拌しながら各サンプルに添加した。次いで、本発明者らは、ボルテックスによって混合しながら各チューブへ2mlのTCAを添加し、そして即座にそのチューブを氷バス中に置き、20分間０℃でサンプルを放置した。本発明者らは、最高のrpmで5分間サンプルを微量遠心し、必要に応じて、精密ろ過した。本発明者らはλ390で上清の吸光度を測定し、そして吸光度・単位/mgタンパク質・分として活性を示した。このアッセイにおいて全ての測定は、三連で行った。コントロールは酵素を含まないが、アッセイ中に界面活性剤が存在する場合、界面活性剤を含むものとした。40℃で実施した安定性研究の部分として活性を評価するために、本発明者らは、希釈物ストックからアッセイストック溶液を調整し、そして以下のようなアッセイを実施した。
ストックA：本発明による架橋ズブチリシン結晶（約27mg/ml）
本発明者らは、架橋ズブチリシン結晶（3.35mgの酵素結晶に相当する）の124μlスラリーを遠心分離して上清を除去し、1mlの界面活性剤を添加し、そしてボルテックスして混合し、最終濃度を3.35mg/mlとした。
ストックB：未架橋ズブチリシン結晶（〜27mg/ml）
本発明者らは、ズブチリシン結晶（3.35mgの酵素結晶に相当する）の124μl懸濁液を遠心分離して上清を除去し、1mlの界面活性剤を添加し、そしてボルテックスして混合し、最終濃度を3.35mg/mlとした。
ストックC:アルカラーゼ
本発明者らは、20.9μl(80.3mg/ml)のアルカラーゼを、1mlのCiba界面活性剤(Ciba#15、＃16またはCiba#44）および市販の界面活性剤（TideまたはWisk、4時間、70℃で加熱することによって非活性化された）へ添加し、そしてボルテックスして混合し、最終濃度を1.67mg/mlとした。
ストックD:界面活性剤
1mlの市販の界面活性剤（TideまたはWisk、4時間、70℃で加熱することによって非活性化された）およびCiba界面活性剤#15、＃16および#44。各ストックの25μlアリコートを1.8mlの脱イオン水へ添加し、そして十分に混合した。希釈ストックのさらなる25μlアリコートを各反応チューブへ添加した。
【０１６０】
t=0アッセイを、175μlの0.2M  Trisを25μlの種々のストックサンプルを含む各チューブへ添加した後、すぐに実施した。ストックA〜Dの残るサンプルをウオーターバス中に置き、そして40℃で加熱した。他の方法では、アッセイを、上記のように実施した。
【０１６１】
実施例５-溶解の研究
本発明者らはまた、以下で詳細にされるように、濃縮物の溶解および希釈に関して本発明による架橋酵素結晶および他の酵素サンプルの特徴を評価した。ストック溶液を上記に記載されるように調製しそして希釈した。生じる分散物を４０℃で加熱しそして溶解の進行について250倍で顕微鏡下にて分析した。
【０１６２】
実施例６-活性および安定性アッセイの結果
上記に記載するように、ズブチリシンの架橋酵素結晶ならびに可溶性酵素および他の市販酵素を、それら単独でおよび市販の界面活性剤の存在下で、アゾカゼインアッセイにおける活性について試験した。等価活性のための触媒濃度を、アルカラーゼ、ChiroCLEC-BLTM、活性プロテアーゼを有するWisk、および活性プロテアーゼを有するTideについて決定した：
ChiroCLEC-BLTM：150μl/6μl界面活性剤  0.4〜0.5吸光度単位
アルカラーゼ：15μl/6μl界面活性剤  0.5〜0.6吸光度単位
Tide：６μl界面活性剤  約0.6吸光度単位
Wisk：６μl界面活性剤  約0.6吸光度単位。
【０１６３】
希釈研究（前述にて議論）を、Ciba界面活性剤＃１５および＃１６中のアルカラーゼおよびアルカラーゼの未架橋結晶の活性を評価することによって着手した。最初の活性は同等であり、そして、約50%までの損失が52℃で１５分後に見られた。
【０１６４】
表Vは、変性したWiskまたはTide界面活性剤、または52℃でのCiba界面活性剤(＃15および＃1６)中のアルカラーゼ(0.25mg/ml)およびChiroCLEC-BLTM(25mg/ml)のサンプルの安定性を要約する。活性をアゾカゼインアッセイにより測定した。
【０１６５】
【化８】
2008283976.tif 000009
【０１６６】
本発明者らはまた、52℃でのCiba界面活性剤#15における種々の酵素の安定性を評価した。結果を以下の表VIに示す：
【０１６７】
【化９】
2008283976.tif 000010
【０１６８】
上記の表に記載されたように調製された全ての架橋結晶（界面活性剤濃縮物において約30分またはそれ以上の半減期を有する）はまた、良好な可溶性側面を有した。
【０１６９】
さらに、本発明者らは、40℃でのCiba界面活性剤#15対Ciba界面活性剤#16における種々の酵素の安定性を推測した。これらの結果は以下の表VIIに示される。
【０１７０】
【化１０】
2008283976.tif 000011
【０１７１】
本発明者らはまた、生じる架橋酵素結晶の活性および安定性への架橋時間の効果を推測した。これらの結果は、以下の表に記載される。表VIII
において、星印は2mlチューブ内で25μlをインキュベートすることによって測定された値を示し、そして「Xs」は未架橋タンパク質結晶を示す。
【０１７２】
表VIII、IX、Xに記載された架橋タンパク質結晶を調製することにおいて、タンパク質結晶を実施例１に記載されるように結晶化し、そして実施例２に示されるか、または表で特定される架橋時間およびグルタルアルデヒド濃度を使用して、実施例2に記載されるようにグルタルアルデヒドで架橋した。
表VIII
40℃でのCiba界面活性剤#16中のズブチリシンの安定性における架橋時間対グルタルアルデヒドの濃度
【０１７３】
【化１１−１】
2008283976.tif 000012
【０１７４】
【化１１−２】
2008283976.tif 000013
【０１７５】
表IXにおいて、星印は、結晶が架橋の間に崩壊されたことを示し、そして破線印はこれらの点において測定が行われなかったことを示す。全てのサンプルは1ml(27mg)スケールで調製した。
【０１７６】
【化１２】
2008283976.tif 000014
【０１７７】
表X
大量スケール架橋酵素結晶調製のための条件−40℃でのCiba界面活性剤#16中のグルタルアルデヒド架橋ズブチリシンの安定性
【０１７８】
【化１３】
2008283976.tif 000015
【０１７９】
表Xにおいて星印は架橋を1〜2ｇスケールで実施したことを示し、§は、以前に崩壊した結晶について、架橋を10ｇスケールで実施したことを示し、そして破線印はこれらの点において測定が実施されなかったことを示す。
【０１８０】
図１は、40℃でのCiba界面活性剤(＃16)中の本発明による架橋ズブチリシン結晶の10ｇスケール調製の安定性を図面で示す。図１において、「Altus  I」は2時間0.25％グルタルアルデヒドで架橋した結晶を示す；「Altus  II」は2時間0.20％グルタルアルデヒドで架橋した結晶を示す；「Altus  III」は2時間0.15％グルタルアルデヒドで架橋した結晶を示し、そして；「Altus  IV」は5時間0.1％ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテルで、続いて1.5時間0.1％のグルタルアルデヒドで架橋した結晶を示す。すべての架橋したサンプルは、Brinkman  Polytronホモジナイザーを使用して架橋する前に崩壊させ、次いで10gスケールで調製し、そして40℃で１週間にわたるアゾカゼインアッセイによってモニターした。
【０１８１】
実施例７-溶解研究の結果
溶解研究は、種々の架橋酵素結晶が濃縮物中に溶解するかどうかおよびそれらが使用の条件下（例えば、洗浄条件下）の希釈によって溶解するための程度を証明した。この試験の代表的な結果は、以下の表に含まれる。この表中で、「+」はサンプルが溶解したことを示し、「-」はサンプルが溶解しなかったことを示し、「-/+」は、サンプルがいくらか（界面活性剤液体中に1mg/ml）溶解したことを示す。この表において「GP」は、タンパク質結晶へ添加する前に希釈しなかった超高純度グルタルアルデヒド（Sigma  Chemical  Co.によって8％水溶液として供給される）を代わりに使用するGA架橋について以下に記載されるように架橋された結晶を示す。
【０１８２】
【化１４】
2008283976.tif 000016
【０１８３】
【化１５】
2008283976.tif 000017
【０１８４】
上記の表で示されるように、本発明による架橋酵素結晶は、濃縮された界面活性剤中で実質的に不溶性であり、そして洗浄条件下で希釈された界面活性剤中で実質的に可溶性である。
【０１８５】
実施例８−本発明の架橋酵素結晶の特徴の要旨
以下の表XIIIは、ジアルデヒドを使用して本発明によって調製された架橋ズブチリシン結晶のCiba界面活性剤#15における全体としての安定性/不安定性、活性および溶解性を要約する。
【０１８６】
【化１６】
2008283976.tif 000018
【０１８７】
上記の表XIIIで示されるように、本発明の架橋酵素結晶は不溶性でありそして、それゆえ保存条件下では安定であるが、使用の条件下でそれらの活性を急速になくす(release)。有利なことに、本発明の架橋酵素結晶は、使用の条件下でこれらの可溶性または未架橋結晶化対照物に類似の活性を示し、その上、５〜６倍の改良された安定性および好ましい溶解特性を示す。
【０１８８】
実施例９−架橋ズブチリシン結晶への化学的組成物の変化の効果
本発明者らは、実施例１に記載されるようにズブチリシンを結晶化し、そして実施例２に記載されるように１％のGAを使用して1時間、得られた結晶を架橋した。得られた架橋ズブチリシン結晶100μl(2.2mg)を1.5mlの33.3%のアセトニトリル/リン酸緩衝液(0.3M、pH7.5)中に懸濁した場合、結晶は40℃において45分後に完全に溶解した。
【０１８９】
同じ条件を使用して、1.2mlの16.7%アセトニトリル/緩衝液中で架橋ズブチリシン結晶を懸濁した。結晶は５時間後に完全に溶解した。
【０１９０】
活性(U)
【０１９１】
【化１７】
2008283976.tif 000019
【０１９２】
*  結晶を現時点で完全に溶解した。
**  結晶を完全に溶解しなかった。
【０１９３】
アッセイ：2.5mLリン酸緩衝液中の0.2mmol(75.8mg)のTAMEを、室温にて、各架橋ズブチリシン結晶サンプル(0.044mg酵素結晶に相当する)懸濁液（または溶液）とインキュベートした。１つの単位は、架橋結晶１mgあたりから、1分あたり1.0μmolのTAMEを加水分解した。
【０１９４】
上記の結果は、本発明の架橋タンパク質結晶の環境への有機溶媒の添加の誘因を示す。
【０１９５】
実施例10−架橋ズブチリシン結晶を含む界面活性剤の洗浄性能
本発明者らは、織物から汚れを除くための界面活性剤の能力を試験するために設計された洗浄アッセイを使用して、液体界面活性剤中の本発明の架橋酵素結晶の活性および保存安定性を評価した。
【０１９６】
洗浄アッセイ
織物の調製
同じサイズおよび重量の布地サンプルを同じ一反から切り取った：
5gの汚れた試験布地および
5ｇの汚れのない綿バラスト(ballast)（Ciba  No.1-3005）
サンプルを洗浄する前に、本発明者らは、汚れた織物サンプル（以下に記載されるような）により減退した光強度（＝明るさ）を測定した。
【０１９７】
界面活性剤溶液の調製
試験するための液体界面活性剤のサンプルを20℃で2時間フラスコ中で加熱した。次いで、サンプルを激しい振盪によってホモジナイズし、そして0.8ｇの界面活性剤をフラスコから除去し、さらに金属製ビーカー中の200mlの水道水(20℃)に加えた。界面活性剤水溶液を60秒間攪拌した。
【０１９８】
洗浄
汚れた試験布サンプルおよび汚れていないバラスト（ballast）サンプルをともに界面活性剤水溶液を含むビーカーに入れた。ビーカーを密封し、その直後に予熱（40℃）した洗浄機（Unitest,  Hereus製,  Switzerland）に入れた。洗浄プロセスの間、ビーカーを、40℃に熱された水浴中で、一定に回転した。結果として、ビーカーの含有物は、40℃の温度まで、連続的に暖められる。
【０１９９】
ファブリックが界面活性剤溶液中に置かれてから正確に２０分後、洗浄を停止し、その直後に洗浄されたファブリックを界面活性剤溶液から取り出し、冷水道水（13〜15℃）で30秒間リンスした。湿ったファブリックを遠心し、アイロンがけして皺を除き、同時に乾燥した。
【０２００】
洗浄効率の測定
洗浄しそして乾燥したファブリックの各サンプルを、Spectraflash500（Datacolor）を用いた460nmと700nm間の軽減測定（明るさＹ）により、汚れの除去について試験した。カットオフフィルターを用い、UV吸収物質の混入による潜在的な妨害を除去した。各試験布の明るさ値を５回測定し、平均を計算した。
【０２０１】
洗浄効率の増加に伴い、ファブリックの明るさが増加した。従って、洗浄効率は、明るさの差ΔＹで定義される：
ΔＹ＝洗浄後のファブリックの明るさ−洗浄前のファブリックの明るさ。
【０２０２】
実施例１１−架橋ズブチリシン結晶を含む界面活性剤の洗浄効果に対する架橋ズブチリシン結晶濃度の効果
本発明の架橋酵素結晶の洗浄効果を、下記の物質を用い、液体界面活性剤における濃度の関数として試験した。
試験ファブリック：血液、乳およびカーボンブラックの組み合わせで汚れたEMPA（Eidgenossische  Materialprufungs  und  Forschungsanstalt,  St.Gallen,Switzerland)  #116。
液体界面活性剤：Ciba界面活性剤#16。
酵素：−架橋酵素結晶；サンプルAltus  IV（実施例６に記載）
−非架橋酵素（アルカラーゼ（Alcalase））。
【０２０３】
液体界面活性剤中の酵素濃度：
酵素濃度は、0.05重量%〜0.9重量%（乾燥物質重量）の間であった。表XIVは、さらなる詳説を提供する。
【０２０４】
【化１８】
2008283976.tif 000020
【０２０５】
酵素をともなう液体界面活性剤の調製
酵素結晶の懸濁液の特定のアリコート（表XIVを参照）を、フラスコに加え、そして液体から結晶を分離するために遠心分離した。液体を捨て、結晶を懸濁し、そして液体界面活性剤中にホモジナイズした（量については、表XIVを参照のこと）。結果として生じた調製物を洗浄試験に用いた。
【０２０６】
酵素界面活性剤処方物の性能を評価するための洗浄試験を、上記のアッセイの記載のとおりに行った。研究の結果を図２に示す。図は、0.1重量％以上の酵素濃度において、Altus  IVで処方されたCiba液体界面活性剤#16の洗浄効果は、非架橋アルカラーゼ処方物の洗浄効果を超える。架橋酵素および非架橋酵素両方の効力は、0.1重量%未満の酵素濃度で、減少した。
【０２０７】
実施例１２−架橋ズブチリシン結晶を含む界面活性剤の保存安定性および洗浄性能
架橋酵素および非架橋酵素で処方した界面活性剤を、濃縮液体界面活性剤中の酵素安定性を試験するために、一定温度で保存した。界面活性剤処方物（各150g）を、実施例１０のサンプルと同様の手順で調製した。
液体界面活性剤：Ciba界面活性剤#16．
酵素：−架橋酵素結晶：サンプルAltus  IV（実施例６）
−非架橋酵素（アルカラーゼ）。
酵素濃度：液体界面活性剤中に0.3重量%（乾燥物質）。
【０２０８】
安定性研究のための保存温度：
全てのサンプルを30℃で、０日間と7日間の間、保存した。７日後、高温での安定性を研究するために、サンプルを２つの等量部分に分けた。１つの部分は、３０℃で保存を続け、一方、別の部分は、４０℃で保存した。
試験ファブリック：３つの異なる汚れたファブリックを使用した。これらの全ては、EMPAより入手可能な標準的な試験材料であった。
EMPA:
EMPA  #112:ココアで汚れたファブリック
EMPA  #116:血液、乳およびカーボンブラックで汚れたファブリック
EMPA  #111:血液で汚れたファブリック。
【０２０９】
ココアで汚れたファブリックの洗浄性能
種々の酵素で処方された液体界面活性剤の洗浄性能を、上記の洗浄アッセイを用い、ココアで汚れた試験ファブリックからココアの染みの除去に関して、研究した。保存安定性を、界面活性剤の保存期間中において、定期的に洗浄性能を評価することにより測定した（従って、保存温度の、液体界面活性剤中の酵素の性能に対する影響をモニターした）。このアッセイにおいて、液体界面活性剤の有効性は、酵素安定性が低下するにつれ、減少した。このアッセイの結果を、図３および４に示し、下記に考察する。
【０２１０】
３０℃での保存安定性
図３に示すように、アルカラーゼおよびAltus  IVの両方で処方した界面活性剤は、２日間の保存後において（初期値と比較して）改善された性能を示した。しかし、保存期間が増加するにつれ、アルカラーゼ処方物の性能は、時間とともに連続的に減少したが、Altus  IVで処方した界面活性剤は、28日間の保存の後であっても、低下を示さなかった。
【０２１１】
４０℃での保存安定性
図４に示すように、温度を３０℃から４０℃に上昇した場合、アルカラーゼで処方した界面活性剤は、２日間以内で活性を失ったが、Altus  IVで処方された界面活性剤は、わずかに低下し、４０℃での保存の２１日後であっても、試験ファブリックからのココアの汚れを顕著に除去した。
【０２１２】
血液、乳およびカーボンブラックの組み合わせで汚れたファブリック上での洗浄性能（EMPA  #116  試験ファブリック）
実験条件および界面活性剤は、染みをつけたファブリックを除き、ココアの染みの洗浄のものと同一であった。洗浄試験の結果を、図５および図６に示す。
【０２１３】
３０℃での保存安定性
図５は、２日間の３０℃保存の後に、アルカラーゼで処方した界面活性剤の洗浄性能が、減衰することを明らかに示す。しかし、Altus  IV酵素を含む液体界面活性剤は、２８日間保存の後であっても、当初の洗浄性能を維持していた。
【０２１４】
４０℃での保存安定性
図６に示すように、保存温度を３０℃から４０℃に上昇した場合、アルカラーゼで処方した界面活性剤は、２日以内でほとんどすべての洗浄性能を、失った。対照的に、Altus  IVを含む界面活性剤は、さらなる１４日間、洗浄力を維持した。
【０２１５】
血液で汚れたファブリック上での洗浄性能
血液の染みについての洗浄性能を、酵素を含む３０℃で保存した界面活性剤を用いて試験した。界面活性剤組成物、洗浄条件は、ココアの染みの洗浄の場合と同一であった。洗浄試験の結果を、図７に示す。
【０２１６】
アッセイは、アルカラーゼで処方したCiba  #16液体界面活性剤による血液の染みに対する洗浄効果が、酵素を含まない界面活性剤と比較して低いことを、示した。一方、Altus  IV処方物は、洗浄条件においてより活性であり、保存においてより安定であった。
【０２１７】
３０℃での保存安定性
アルカラーゼで処方した界面活性剤の洗浄効果は、保存期間にともない、急速に減少し、それに対しAltus  IVで処方した界面活性剤は、２８日間の保存後に、ほとんど完全にその十分な能力を維持した。
【０２１８】
実施例１３−３０℃および３７℃における架橋ズブチリシン結晶の溶解度
本発明者らは、グルタルアルデヒド(GA)、オクタンジアルデヒド(OA)、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル(NP)に続くグルタルアルデヒド、またはDENACOL  EX-411(411)に続くグルタルアルデヒドと架橋した種々のズブチリシン結晶の溶解度を研究した。
【０２１９】
1.5mlのエッペンドルフチューブ中で、非架橋ズブチリシン結晶サンプルおよび架橋ズブチリシン結晶スラリーサンプル（37.5mgの酵素と同等）を、5分間、5,000rpmで微量遠心し、上清液を捨てた。PBS緩衝液（0.01M  リン酸、0.0027M  塩化カリウム、0.137M  塩化ナトリウム、pH  7.4）の1.5mlアリコートを、各サンプルに添加し、ズブチリシンの濃度を25mg/mlとした。サンプルを2mlのスクリューキャップ付ガラスバイアルに磁石スターラーバーとともに移し、次に30℃または37℃でインキュベートした。定期的に50μlのスラリーを取り除き、5分間13,000rpmで微量遠心し、20μlのアリコートを取り除き、そして980μlの脱イオン水に入れ、次に280nmのUV吸収を測定することにより、溶解についてサンプルを研究した。
【０２２０】
以下のサンプルを研究した：
【０２２１】
【化１９】
2008283976.tif 000021
【０２２２】
サンプルの溶解度プロフィール（図８および図９に示す）は、架橋された結晶について、ことなる溶解速度を示す。
【０２２３】
実施例１４−可逆的架橋−ジスルフィド架橋ズブチリシン結晶
本発明者らは、ズブチリシン結晶化について以前に記載されたようにズブチリシン結晶（平均30〜40μm、Na2SO4中で27mg/ml）を調製した。
【０２２４】
次に本発明者らは、以下の架橋剤の１つを使用し、結晶を架橋した。
１）ジメチル3,3’-ジチオビスプロピオンイミダート・HCl-(DTBP)  (Pierce)
２）ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）-(DSP)  (Pierce)
３）3,3’-ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）-(DTSSP)  (Pierce)。
【０２２５】
架橋は、15mlネオプレンスクリューキャップチューブ中で、9.26mlの緩衝液（25mM  NaCO3/50mM  NaHCO3,pH8.0）中に740μlのズブチリシン結晶スラリー（20mg）を入れて、行った。１つの架橋剤を、以下のように各チューブに加えた：Ａ）93mg  DTBP(30mM)、Ｂ）100mg  DTSSP(16mM)、Ｃ）120mg  DSP(30mM)。
【０２２６】
全てのサンプルが32mM  NaOH（300μl  NaOH中に100μlサンプル）に不溶性であると判定するまで(5日間)、周囲温度（24〜26℃）でチューブを回転させた。非架橋サンプルは、同濃度で、32mM  NaOHに容易に溶解した。架橋を、1mlの1M  Tris(pH7.5)を添加し、停止した。サンプルを5分間、3,000rpmで遠心分離し、上清を除去し、5mlの100mM  Tris(pH7.5)で置き換えた。5分間の3,000rpmの遠心分離、それに続く上清の5mlの100mM  Tris(pH7.5)での置き換えを３回繰り返した。
【０２２７】
実施例１５−ジスルフィド結合含有架橋ズブチリシン結晶の溶解
200mMのシステイン溶液を、121mgのシステインを5mlの100mM  Tris(pH7.5)に溶解することにより調製した。システイン溶液の400μlアリコートを、750μlバイアル３本に加えた。100mM  Tris(pH7.5)の400μlアリコートを、別の750μlバイアル３本に加えた。各架橋したサンプル（100μl）を１つのシステインを含むバイアル、および１つのシステインを含まないバイアルに加えた。すべてのサンプルを、37℃でインキュベートし、そして架橋酵素結晶の溶解をモニターした（直視的観察および微視的観察）。
【０２２８】
37℃で３時間インキュベートした後、DTBPサンプルは、システイン存在下で完全に可溶性のようであり、システイン非存在下で不溶性のようである。DTSSPサンプルは、システイン存在下においてほとんど完全に可溶性のようであり、そしてシステイン非存在下において不溶性のようである。DSPサンプルは、システイン存在下でかろうじて可溶性であり、システイン存在下で不溶性である。
【０２２９】
実施例１６−Candida  Rugosaリパーゼの結晶化
Candida  rugosaリパーゼ（「CRL」）の粉末状（Meito）の5kgアリコートを、セライト5kgと混合し、102Lの蒸留脱イオン水中に溶解し、脱イオン水で容量を200Lとした。懸濁液を、Air  Drive  Lightning  Mixer中で室温で２時間混合し、次に0.5ミクロンフィルターを通してろ過し、セライトを除去した。次に、混合液を、3K中空繊維フィルターメンブレンカートリッジを用いて、限外濾過膜し、14L（469g）に濃縮した。固形酢酸カルシウムを、5mM  Ca(CH3COO)2の濃度まで加えた。必要な場合、濃酢酸を用いてpHをpH5.5に調整した。７リットルのアリコートを、1.75リットルの２-メチル-2,4-ペンタンジオール（「MPD」）の添加により、または3.5リットルの30%  PEG-8000溶液の添加により、結晶化した。得られた溶液を混合し、周囲温度で約17〜20時間、終夜、結晶化を続けさせた。結晶の収率は、約70％であった。
【０２３０】
再結晶化
Candida  rugosaリパーゼ結晶を、50mM  リン酸ナトリウム（pH5.2）の添加により溶解した。結晶化溶液の可溶性タンパク質濃度を、20mg/mlに調整した。MPDを、６時間にわたり、攪拌しながら徐々に添加し、終濃度を25％にした。得られた溶液を混合し、周囲温度で約20時間、結晶化を続けさせた。
【０２３１】
実施例１７−Candida  Rugosaリパーゼの結晶化
実施例１６に記載のとおりに調製したCandida  Rugosaリパーゼの結晶を、可溶化および再結晶化工程の前に、50mM酢酸ナトリウム（pH6.5）の添加により可溶化した。結晶溶液の可溶性タンパク質濃度を、20mg/mlに調整した。MPDを、６時間にわたり、攪拌しながら徐々に添加し、終濃度を20％にした。得られた溶液を混合し、周囲温度で約20時間、結晶化を続けさせた。
【０２３２】
実施例１８−Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１６に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、周囲温度で、8mlの攪拌したリパーゼ結晶（25mg/ml）に、１時間にわたり2mlの20%グルタルアルデヒドを段階的に40.5ml容量中に加えることによって、未処理のニートなグルタルアルデヒド（Sigma）を添加することにより、架橋した。架橋剤の終濃度は、4.0%であった。架橋は、２４時間にわたり続けられた。低速遠心分離により結晶を回収し、50mM  リン酸ナトリウム（pH5.2）中の25%  MPDで洗浄した。
【０２３３】
実施例１９−  Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１６に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、１時間にわたり2mlの20%グルタルアルデヒドを徐々に加えることによって、未処理のニートなグルタルアルデヒドを添加することにより、架橋した。結晶は、実施例１８に記載のように、架橋し、そして処理した。
【０２３４】
実施例２０−  Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１６に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、反応を24時間つづけさせることを除き、実施例19に記載のように架橋した。次に結晶を、実施例１８記載のとおりに処理した。
【０２３５】
実施例２１−  Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１７に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、グルタルアルデヒドを加えて終濃度4.0%にすることにより架橋した。架橋を、３時間続けさせた。結晶を、実施例１８記載のとおりに処理した。
【０２３６】
実施例２２−  Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１７に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、１時間にわたり、6.5%濃度のニートなグルタルアルデヒド中で架橋した。架橋および処理は、実施例１８記載のとおりに行った。
【０２３７】
実施例２３−  Candida  Rugosaリパーゼ結晶の架橋
実施例１７に記載のとおりに調製したCandida  rugosaリパーゼの結晶を、１時間にわたり、6.0%濃度のニートなグルタルアルデヒド中で架橋した。架橋および処理は、実施例１８記載のとおりに行った。
【０２３８】
実施例２４−架橋されたCandida  Rugosaリパーゼ結晶のpH制御された溶解性
種々の架橋されたCandida  rugosaリパーゼ結晶の溶解性を、6.5から9.0までpHの増加を追跡して研究した。結晶を、25％MPDを含む50mMリン酸ナトリウム(pH９)中に1mg/mlにてインキュベートした。撹拌しながら25℃で３時間および24時間インキュベートした後、アリコートを取り出した。活性および可溶性タンパク質の濃度を実施例２５に記載のように測定した。結果を以下の表に記載する。
【０２３９】
【化２０】
2008283976.tif 000022
【０２４０】
実施例２５−架橋されたCandida  Rugosaリパーゼ結晶のpH溶解性
種々の架橋されたCandida  rugosaリパーゼ結晶の溶解性を、5.2から7.5までpHの増加を追跡して研究した。結晶を、25％MPDを含む50mMリン酸ナトリウム(pH7.5)中に1mg/mlにてインキュベートした。撹拌しながら25℃で３時間および24時間インキュベートした後、アリコートを取り出した。不溶性物質を濾過(0.25ミクロン)により除去した。溶液中の活性を、パラニトロフェニルアセテート(Fluka)の加水分解を、400nmにてモニタリングすることにより分光光度的に測定した。基質濃度は1mMであった。このアッセイを、１ml容量の50mM酢酸ナトリウム(pH6.5)中で、25℃にて実施した。可溶性タンパク質の濃度を280nmにおける吸光度により測定した。結果を、以下の表に示す。
【０２４１】
【化２１】
2008283976.tif 000023
【０２４２】
実施例２６−ヒト血清アルブミンの結晶化
ヒト血清アルブミン(「HSA」)を、Sigma  Chemical  Companyより凍結乾燥粉末として購入した。本発明者らは、10gのタンパク質粉末を75mlの100mMリン酸緩衝液(４℃にてpH5.5)の撹拌溶液に添加した。最終タンパク質濃度は、120mg/mlであった(OD280から決定され、血清アルブミンについての吸光度係数は、１に等しいと仮定された)。脱イオン水中に調製した飽和硫酸アンモニウム溶液(767g/l)を、最終濃度が50％飽和(350g/l)になるまでタンパク質溶液に添加した。結晶化溶液を50％硫酸アンモニウム(pH5.5)中のアルブミン結晶(50mg/ml)1mlを用いて「播種」した。播種した結晶を100mMリン酸緩衝液(pH5.5)中の50％飽和硫酸アンモニウム溶液での沈殿物を含まない結晶のサンプルを洗浄することによって調製した。播種された結晶化溶液を、激しく回転する基板上で４℃にて一晩インキュベートした。結晶棒(20μ)は、一晩(16時間)で溶液中に出現した。
【０２４３】
実施例２７−ヒト血清アルブミン結晶の架橋
本発明者らは、実施例１８に記載のように調製したヒト血清アルブミン結晶を、上記に記載のように、結晶および50％飽和硫酸アンモニウムを含む母液の10mlの撹拌溶液中で、４℃にて架橋した。架橋の前に洗浄されていなかった結晶を、製造業者(Sigma)によって供給されるようなグルタルアルデヒドを用いて架橋した。グルタルアルデヒド(「GA」)(20％)を、最終濃度が0.5％になるまで15分間隔で、４回の等容量(62.5μl)で、撹拌された結晶化溶液に添加した(250μl  GA)。次いで、結晶を４℃でインキュベートした。0、30分、60分および４時間のインキュベート時間で、アリコートを取り出した。架橋アルブミン結晶を、低速遠心分離によって収集し、そしてpH7.5、100mM  Tris  HCl、４℃を用いて繰り返し洗浄した。洗浄工程は、結晶が凝集することなく高速で遠心分離され得る場合に停止した。
【０２４４】
実施例２８−ヒト血清アルブミン結晶の架橋
本発明者らは、ある改変を伴って、上記の実施例２７に記載のようにヒト血清アルブミン結晶を架橋した；グルタルアルデヒド(20％)を最終濃度が１％になるまで15分間隔で４回の等容量(131.3μl)で結晶化溶液に添加した(525μl  GA)。
【０２４５】
実施例２９−0.5％GA中、時間：０分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように0.5％グルタルアルデヒド中で０分間架橋したヒト血清アルブミンを、室温(「RT」)または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH  7.5)中で、撹拌しながら結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XVに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２４６】
【化２２】
2008283976.tif 000024
【０２４７】
実施例３０−0.5％GA中、時間：30分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように0.5％グルタルアルデヒド中で架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XVIに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２４８】
【化２３】
2008283976.tif 000025
【０２４９】
実施例３１−0.5％GA中、時間：60分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように0.5％グルタルアルデヒドを用いて架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XVIIに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２５０】
【化２４】
2008283976.tif 000026
【０２５１】
実施例３２−0.5％GA中、時間：240分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように0.5％グルタルアルデヒドを用いて架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、撹拌しながら結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XVIIIに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２５２】
【化２５】
2008283976.tif 000027
【０２５３】
実施例３３−1.0％GA中、時間：０分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XIXに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２５４】
【化２６】
2008283976.tif 000028
【０２５５】
実施例３４−1.0％GA中、時間：30分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように架橋されたヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XXに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２５６】
【化２７】
2008283976.tif 000029
【０２５７】
実施例３５−1.0％GA中、時間：60分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XXIに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２５８】
【化２８】
2008283976.tif 000030
【０２５９】
実施例３５−1.0％GA中、時間：240分のインキュベーションで架橋されたヒト血清アルブミン結晶の溶解性。温度の上昇によって誘導された溶解
実施例２６に記載のように結晶化され、かつ実施例２７に記載のように架橋したヒト血清アルブミンを、室温または37℃にてリン酸緩衝化生理食塩水溶液(pH7.5)中で、結晶(20mg/ml)をインキュベートすることによって、溶解性についてアッセイした。時間が0.5、１、４、および24時間にて、アッセイのためにアリコートを取り出した。不溶性物質を、遠心分離によって溶液から除去し、そして可溶性タンパク質の濃度を、表XXIIに示されるように、280nmにて分光光度的に測定した。
【０２６０】
【化２９】
2008283976.tif 000031
【０２６１】
実施例３６−サーモリシンの結晶化
サーモリシンをDiawa(日本)から凍結乾燥粉末として購入した。15gのタンパク質粉末を、周囲温度で10mM酢酸カルシウム(pH11)の100mlの撹拌溶液に添加した。2N  NaOHの添加によって、サーモリシンが完全に溶解するまでpHを11に維持した。次いで、2N  酢酸の添加によって、pHを7.5に調節した。結晶化を４℃で一晩続けた。最終的なタンパク質の濃度は、40mg/mlであった(OD280から決定され、サーモリシンについての吸光係数は、1.8に等しいと仮定された)。結晶を遠心分離によって回収し、そしてより均一の結晶サイズを得るために再結晶化した。最初の結晶化について記載されているものとほぼ同じ様式で、再結晶化を実施した。結晶(40mg/ml  タンパク質)を室温にて塩基を添加することによって溶解した。結晶化溶液のpHを6.5に調節し、そして結晶化を周囲温度にて続けた。結晶棒(50μ)は、一晩(16時間)で溶液中に出現した。
【０２６２】
実施例３７−サーモリシン結晶の架橋
実施例３６に記載のように調製されたサーモリシン結晶を、酢酸ナトリウムの50mM溶液(pH6.5)中に懸濁した(50mg/ml)。結晶を、製造業者(Sigma)によって供給されるようなグルタルアルデヒドを用いて架橋した。10mlのグルタルアルデヒド(10％)を、10mlの結晶の懸濁液になるまで、１時間にわたって撹拌しながら徐々に添加した。全てのグルタルアルデヒドを添加し終わった後、結晶化溶液を、周囲温度にてインキュベートした。0.5、１、および３時間のインキュベーション時間で、アリコートを取り出した。架橋された結晶を、低速遠心分離によって回収し、そして10mM酢酸カルシウムを含むpH7.5  50mM  Tris  HClを用いて徹底的に洗浄した。
【０２６３】
実施例３８−0.5時間にわたって架橋されたサーモリシン結晶の溶解性。EDTAによるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例３６に記載のように結晶化され、かつ実施例３７に記載されるように0.5時間にわたって架橋されたサーモリシンを、1mM  EDTA(Sigma)を含む10mM  Tris  HCl(pH7.2)中、40℃で、撹拌しながら結晶(1mg/ml)をインキュベートすることによって溶解性についてアッセイした。0.5、３および24時間にて、アッセイするために1mlのアリコートを取り出した。不溶性物質を、濾過により溶液から除去した。1mlの500mM  酢酸カルシウム(pH7.2)を、各アリコートに添加した。可溶性タンパク質の濃度を、280nmにて分光光度的に測定した。酵素活性を、ジペプチド基質のFAGLA(Feder)の加水分解をモニタリングすることによって、分光光度的に測定した。基質濃度は、1.67mMであった。１ユニットを、pH7.2、40℃にて１分間で１μモルの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義する。可溶性サーモリシンの活性は、27U/mgタンパク質であった。データを、表XXIIIに示す。
【０２６４】
【化３０】
2008283976.tif 000032
【０２６５】
実施例３９−１時間にわたって架橋されたサーモリシン結晶の溶解性。EDTAによるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例３６に記載のように結晶化され、かつ実施例３７に記載されるように１時間にわたって架橋されたサーモリシンを、1mM  EDTAを含む10mM  Tris  HCl(pH7.2)中、40℃で、撹拌しながら結晶(1mg/ml)をインキュベートすることによって溶解性についてアッセイした。0.5、３および24時間にて、アッセイするために1mlのアリコートを取り出した。不溶性物質を、濾過により溶液から除去した。1mlの500mM  酢酸カルシウム(pH7.2)を、各アリコートに添加した。可溶性タンパク質の濃度を、280nmにて分光光度的に測定した。酵素活性を、ジペプチド基質のFAGLA(Feder)の加水分解をモニタリングすることによって、分光光度的に測定した。基質濃度は、1.67mMであった。１ユニットを、pH7.2、40℃にて１分間で１μモルの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義する。可溶性サーモリシンの活性は、27U/mgタンパク質であった。データを、表XXIVに示す。
【０２６６】
【化３１】
2008283976.tif 000033
【０２６７】
実施例４０−３時間にわたって架橋されたサーモリシン結晶の溶解性。EDTAによるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例３６に記載のように結晶化され、かつ実施例３７に記載されるように３時間にわたって架橋されたサーモリシンを、1mM  EDTAを含む10mM  Tris  HCl(pH7.2)中、40℃で、撹拌しながら結晶(1mg/ml)をインキュベートすることによって溶解性についてアッセイした。0.5、３および24時間にて、アッセイするために1mlのアリコートを取り出した。不溶性結晶を、濾過により溶液から除去した。1mlの500mM  酢酸カルシウム(pH7.2)を、各アリコートに添加した。可溶性タンパク質の濃度を、280nmにて分光光度的に測定した。酵素活性を、ジペプチド基質のFAGLA(Feder)の加水分解をモニタリングすることによって、分光光度的に測定した。基質濃度は、1.67mMであった。１ユニットを、pH7.2、40℃にて１分間で１μモルの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義する。可溶性サーモリシンの活性は、27U/mgタンパク質であった。データを、表XXVに示す。
【０２６８】
【化３２】
2008283976.tif 000034
【０２６９】
実施例４１−３時間にわたって架橋されたサーモリシン結晶の溶解性。希釈によるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例３６に記載のように結晶化され、かつ実施例３７に記載されるように３時間にわたって架橋されたサーモリシン結晶を、カルシウムを含まない緩衝液で洗浄し、脱イオン水中で、撹拌しながら結晶(1mg/ml)をインキュベートすることによって溶解性についてアッセイした。0.5、３および24時間にて、アッセイするために1mlのアリコートを取り出した。不溶性結晶を、濾過により溶液から除去した。1mlの500mM  酢酸カルシウム(pH7.2)を、各アリコートに添加した。可溶性タンパク質の濃度を、280nmにて分光光度的に測定した。酵素活性を、ジペプチド基質のFAGLA(Feder)の加水分解をモニタリングすることによって、分光光度的に測定した。基質濃度は、1.67mMであった。１ユニットを、pH7.2、40℃にて１分間で１μモルの基質を加水分解するために必要な酵素の量として定義する。可溶性サーモリシンの活性は、27U/mgタンパク質であった。データを、表XXVIに示す。
【０２７０】
【化３３】
2008283976.tif 000035
【０２７１】
実施例４２−グルコースイソメラーゼの結晶化
グルコースイソメラーゼ(「GA」)を、結晶スラリーとしてCultor(フィンランド)より購入した。酵素を、15分間撹拌しながら50℃にて、50ml容量の結晶スラリーを可溶化することによって、再結晶化した。溶液を濾過することによって明澄化し、そしてゆっくりと室温で冷却した。50ミクロンの結晶は、５時間以内に出現した。結晶を低速遠心分離によって回収し、そして166mM硫酸マグネシウムを用いて洗浄した。
【０２７２】
実施例４３−グルコースイソメラーゼ結晶の架橋
実施例４２において記載されるように調製した５００ｍｇのグルコースイソメラーゼ結晶を５０ｍｌの１６６ｍＭ硫酸マグネシウム溶液中に懸濁した。結晶を、製造者（Ｓｉｇｍａ）によって供給されるようにグルタルアルデヒドで架橋した。５ｍｌのグルタルアルデヒド（１０％）を、１時間の期間をかけて、攪拌しながら徐々に５０ｍｌ懸濁物に加えた。グルタルアルデヒドをすべて加えた後、結晶化溶液を、周囲温度でインキュベートした。アリコートを１時間、３時間、および２４時間のインキュベーション時間で取り出した。架橋結晶を、低速遠心分離により収集し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で徹底的に洗浄した。
【０２７３】
実施例４４−１時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶の溶解度。５０℃での希釈によるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例４２に記載のように調製し、そして実施例４３に記載のように１時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶を、脱イオン水中で攪拌しながら結晶（１ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートすることによって溶解度についてアッセイした。１ｍｌのアリコートを、１時間、３時間、および２４時間の時間でアッセイのために取り出した。可溶性タンパク質濃度を、２８０ｎｍで分光光度的に測定した（ＯＤ２８０）（ＧＩについての吸光係数は１に等しいと仮定する）。酵素活性を、フルクトースからグルコースへの変換をモニターすることによって分光光度的に測定した。
【０２７４】
グルコース濃度を、へキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む結合酵素アッセイを用いて分光光度的に定量した。デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰを補因子として使用し、そして反応において形成されたＮＡＤＰＨの量は、基質（グルコース）の濃度と化学量論的である。このアッセイを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍからのキットとして購入し、そして製造者の指示に従って使用した。１ユニットを、ｐＨ７．０、６０℃で１分間に１マイクロモルのフルクトースをグルコースへ変換するのに必要な酵素の量と定義した。可溶性グルコースイソメラーゼの活性は、５１Ｕ／ｍｇタンパク質であった。データを表ＸＸＶＩＩに示す。
【０２７５】
【化３４】
2008283976.tif 000036
【０２７６】
実施例４５−３時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶の溶解度。５０℃での希釈によるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例４２に記載のように調製し、そして実施例４３に記載のように３時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶を、脱イオン水中で攪拌しながら結晶（１ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートすることによって溶解度についてアッセイした。１ｍｌのアリコートを、１時間、３時間、および２４時間の時間でアッセイのために取り出した。可溶性タンパク質濃度を、２８０ｎｍで分光光度的に測定した（ＯＤ２８０）（ＧＩについての吸光係数は１に等しいと仮定する）。酵素活性を、フルクトースからグルコースへの変換をモニターすることによって分光光度的に測定した。
【０２７７】
グルコース濃度を、実施例４４に記載のように、へキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む結合酵素アッセイを用いて分光光度的に定量した。データを表ＸＸＶＩＩＩに示す。
【０２７８】
【化３５】
2008283976.tif 000037
【０２７９】
実施例４６−２４時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶の溶解度。５０℃での希釈によるカルシウムイオンの除去によって誘導される溶解
実施例４２に記載のように調製し、そして実施例４３に記載のように１時間架橋したグルコースイソメラーゼ結晶を、脱イオン水中で攪拌しながら結晶（１ｍｇ／ｍｌ）をインキュベートすることによって溶解度についてアッセイした。１ｍｌのアリコートを、１時間、３時間、および２４時間の時間でアッセイのために取り出した。可溶性タンパク質濃度を、２８０ｎｍで分光光度的に測定した（ＯＤ２８０）（グルコースイソメラーゼについての吸光係数は１に等しいと仮定する）。酵素活性を、フルクトースからグルコースへの変換をモニターすることによって分光光度的に測定した。
【０２８０】
グルコース濃度を、実施例４４に記載のように、へキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む結合酵素アッセイを用いて分光光度的に定量した。データを表ＸＸＩＸに示す。
【０２８１】
【化３６】
2008283976.tif 000038
【０２８２】
実施例４７−本発明に従う架橋タンパク質結晶を含む錠剤の調製
本発明に従う架橋タンパク質結晶を含む錠剤を、以下のように調製し得る。架橋タンパク質結晶の懸濁物を０．１Ｍ酢酸ナトリウム、２０ｍＭ塩化カルシウムおよび緩衝剤（ｐＨ７）中に置き、そして３５℃で乾燥させる。得られる乾燥物質を、ソルビトールと、重量で５０：５０で混合し得、そしてＥｕｄｒａｇｉｔ  ＮＥ  ３０Ｄ（エチルアクリレートおよびメチルアクリレートに基づく中性コポリマー）、またはＥｕｄａｇｉｔ  ＲＬ  ３０Ｄ（アンモニオ−メタクリートコポリマー）を用いて顆粒化し得る。この顆粒を乾燥させ（例えば、４０℃で１６時間）そして、直径約５ｍｍおよび重量約１２５ｍｇの丸い錠剤へと圧縮する。このような固形調製物における架橋タンパク質結晶の含量は、重量で約４５％である。上記の調製物がソルビトールを用いずに作られる場合、得られる錠剤は、重量で約６３％の架橋タンパク質結晶を含む。
【０２８３】
水または水性緩衝液（例えば、上記の酢酸緩衝液）に導入される場合、すべての錠剤は、室温で穏和な振動下で約１０分間で崩壊し、サイズが１００μｍ未満（大部分は、４〜１０μｍの範囲内）の粒子を生成した。顕微鏡検査によって、主な種がポリマーを含まない単一のタンパク質結晶であることが明らかになる。錠剤を粉砕させることにより得られるスラリーを、２５℃（ｐＨ８．０）でのＮ（α）−ｐ−トシル  Ｌ−アルギニンメチルエステル（ＴＡＭＥ）の加水分解を用いて力価測定的にアッセイする。等量の架橋タンパク質の結晶（錠剤全体ではなく、架橋結晶の示された重量を数える）の約５０％と８０％との間の活性に対応する活性を得る。
【０２８４】
実施例４８−Ｃａｎｄｉｄａ  Ｒｕｇｏｓａリパーゼの結晶化
Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼを実施例１６に記載のように調製した。しかし、固体酢酸カルシウムを、５ｍＭへと添加した後、ｐＨを、必要に応じて濃酢酸を用いてｐＨ５．５の代わりに４．８に調整した。次に、７リットルのアリコートを１．４リットルのＭＰＤを加えることによって結晶化した。得られた溶液を混合し、そして結晶化を７２時間、４℃で促進させた。
【０２８５】
以下の実施例において、他に指示しない限り、リパーゼ結晶を、この実施例に従って調製した。
【０２８６】
実施例４９−リパーゼ結晶の架橋
リパーゼ結晶を、以下の架橋剤を用いて架橋した：ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）；ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）；ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）；ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）；ジメチルスベルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ）；ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）；ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホ−ＤＳＴ）；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル（proplyl）］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）；エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）；Ｎ−［γ−マレイミド−ブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（スルホ−ＨＳＡＢ）；スルホスクシンイミジル−６−［α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）；ビス−［β−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）；ＮＨＳ−ＰＥＧ−ビニルスルホン（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ）；およびグルタルアルデヒド（ＧＡ）。
【０２８７】
ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）架橋
ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート・ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）溶液を、２７．９ｍｇのＤＴＢＰを６０μｌの水に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ塩化カルシウムおよび２０％ＭＰＤを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液１．５ｍｌ中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＤＴＢＰ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２８８】
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）架橋
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）溶液を、３６ｍｇのＤＳＰを６０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＤＳＰ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２８９】
ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）架橋
ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）溶液を、１２ｍｇのＢＭＨを、４０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＢＭＨ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９０】
ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）架橋
ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート（ＢＳ）溶液を、２９ｍｇのＢＳを、５０μｌの水に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＢＳ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９１】
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）架橋
１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＦＤＮＢ）溶液を、１０ｍｇのＤＦＤＮＢを４０μｌのアセトンに溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＤＦＤＮＢ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９２】
ジメチルスベルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ）架橋
ジメチルスベルイミデート・２ＨＣｌ（ＤＭＳ）溶液を、３３ｍｇのＤＭＳを４０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＤＭＳ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９３】
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）架橋
ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）溶液を、１７ｍｇのＤＳＧを５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＤＳＧ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９４】
ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホ−ＤＳＴ）架橋
ジスルホスクシンイミジルタータレート（スルホ−ＤＳＴ）溶液を、２７ｍｇのスルホ−ＤＳＴを５０μｌの水に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のスルホ−ＤＳＴ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９５】
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）架橋
１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）溶液を、１０ｍｇのＥＤＣを１ｍｌの水に溶解することによって調製した。次に、２００μｌのこの溶液および５ｍｇの固体スルホ−ＮＨＳを、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ６の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量のＥＤＣ＋スルホ−ＮＨＳ溶液（２００μｌおよび５ｍｇスルホ−ＮＨＳ）を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９６】
エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）架橋
エチレングリコールビス［スルホスクシンイミジルスクシネート］（スルホ−ＥＧＳ）溶液を、３３ｍｇのスルホ−ＥＧＳを４０μｌの水に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のスルホ−ＥＧＳ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋反応を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９７】
Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）架橋
Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）溶液を、２３ｍｇのＧＭＢＳを５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。次に、４０μｌのこの溶液を、ｐＨ８．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１．５ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中の２１ｍｇのリパーゼ結晶に加えた。架橋反応を、周囲温度で、２４時間反転させながら行った。２４時間後、スラリーを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして上清を捨てた。次いで，ペレットを、ｐＨ７．５の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中に懸濁した。さらなる量（２０μｌ）のＧＭＢＳ溶液を加え、そして架橋をさらに２４時間継続した。架橋を、過剰の試薬を、ｐＨ４．８の、ならびに１０ｍＭ  塩化カルシウムおよび２０％  ＭＰＤを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で洗い流すことによって終結させた（１ｍｌの緩衝液での５回の洗浄）。
【０２９８】
N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾエート(スルホ-HSAB)架橋
N-ヒドロキシスルホスクシンイミジル-4-アジドベンゾエート(スルホ-HSAB)溶液を、40μlの水にスルホ-HSAB5mgを溶解することによって調製した。次に、この溶液の40μlを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH8.5の10mM  HEPES緩衝液1.5ml中のリパーゼ結晶21mgに添加した。架橋反応を、回転させながら24時間周囲温度で実行した。24時間後、スラリーを、5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。次にそのペレットを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH8.5の10mM  HEPES緩衝液に懸濁した。第２の架橋反応を、振盪しながら10分間周囲温度で、254nmのUV光を使用して実行した。UVランプを、サンプルから2.5cm放して保った。10分後、そのスラリーを、5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。架橋反応を、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH4.8の10mM  酢酸ナトリウム緩衝液を用いて過剰の試薬を洗浄することによって終結した(緩衝液1mlで5回洗浄)。
【０２９９】
スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル]-α-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT)架橋
スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ)トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT)溶液を、水60μl中にスルホ-LC-SMPT12mlを溶解することによって調製した。次に、この溶液の40μlを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH8.5の10mM  HEPES緩衝液1.5ml中のリパーゼ結晶21mgに添加した。架橋反応を、回転させながら24時間周囲温度で実行した。24時間後、そのスラリーを5分間3000rpmで遠心分離し、そして上清を捨てた。次に、そのペレットを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH7.5の10mM  HEPES緩衝液に懸濁した。スルホ-LC-SMPT溶液のさらなる量(20μl)を添加し、そして架橋を別の24時間、継続した。架橋反応を、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH4.8の10mM  酢酸ナトリウム緩衝液を用いて過剰の試薬を洗浄することによって終結した(緩衝液1mlで5回洗浄)。
【０３００】
ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド(BASED)架橋
ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド(BASED)溶液を、ジメチルスルホキシド(DMSO)40μlにBASED3mgを溶解することによって調製した。次に、この溶液の40μlを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH8.5の10mM  HEPES緩衝液1.5ml中のリパーゼ結晶21mgに添加した。架橋反応を、365nmのUV光下で攪拌しながら30分間周囲の温度で実行した。UVランプは、2.5cm離れたところからサンプルを見た。30分後、スラリーを5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。架橋反応を、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH4.8の10mM  酢酸ナトリウム緩衝液を用いて過剰の試薬を洗浄することによって終結した(緩衝液1mlで5回洗浄)。
【０３０１】
NHS-PEGビニルスルホン(NHS-PEG-VS)架橋
NHS-PEGビニルスルホン(NHS-PEG-VS)溶液を、50μlの水にNHS-PEG-VS20mgを溶解することによって調製した。次に、この溶液の50μlを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH8.5の10mM  HEPES緩衝液1.5ml中の実施例16において調製したリパーゼ結晶34mgに添加した。架橋反応を、回転させながら24時間周囲温度で実行した。24時間後、スラリーを、5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。次に、そのペレットを、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH7.5の10mM  HEPES緩衝液に懸濁した。GMBS溶液のさらなる量(25μl)を添加し、そして架橋を別の24時間で継続した。架橋を、10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH4.8の10mM  酢酸ナトリウム緩衝液を用いて過剰の試薬を洗浄することによって終結した(緩衝液1mlで5回洗浄)。
【０３０２】
グルタルアルデヒド(GA)架橋
Candida  rugosaリパーゼ結晶を実施例16に記載するように調製した。架橋反応を、0.3%または0.5%の最終架橋剤濃度を達成するために、結晶溶液に未処理のニートのグルタルアルデヒド(Sigma)を添加することによって開始した。次に架橋反応を1時間続けた。架橋した結晶を低速遠心分離によって回収し、10mM酢酸カルシウムおよび20%  MPDを含んでいるpH4.8の10mM  酢酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。
【０３０３】
実施例50-37℃における架橋したCandida  Rugosa  リパーゼ結晶のpH溶解性
実施例49で記載するような架橋したCandida  Rugosaリパーゼ結晶の溶解性を、評価した。以下の架橋剤と架橋した結晶は、ジメチル3,3’-ジチオビスプロピオンイミデート・HCl(DTBP),ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP),ビスマレイミドヘキサン(BMH),ビス[スルホスクシンイミジル]スベレート(BS),1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン(DFDNB),ジメチルスベリミデート・2HCl(DMS)、ジスクシンイミジルグルタレート(DSG),ジスルホスクシンイミジルタルタレート(tartarate)(スルホ-DST)、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミドヒドロクロリド(EDC)、エチレングリコールビス[スルホ-スクシンイミジルスクシネート](スルホ-EGS)、N-[γ-マレイミド-ブチリロキシ]スクシンイミドエステル(GMBS)、N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミジル-4-アジドベンゾエート(スルホ-HSAB)、スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ）トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT)、ビス-[β-(4-アジドサリチルアミド）エチル]ジスルフィド(BASED)およびグルタルアルデヒド(GA)を含む。
【０３０４】
未架橋リパーゼ結晶のサンプルは、実施例16のように調製し、そして結晶性酵素2.8mgと同等の架橋リパーゼ結晶スラリーは、1.5mlのエッペンドルフチューブに分配し、そして5分間3000rpmで微量遠心分離した。上清液体を取り除き、そして得られた結晶の溶解性をpH7.4およびpH2.0で評価した。
【０３０５】
pH7.4について、pH7.4(PBS)で0.0027M塩化カリウムおよび0.137M塩化ナトリウムを有する0.01Mリン酸緩衝液の200μlアリコートをそれぞれのサンプルに添加した。これらの条件下で、リパーゼの濃度は14mg/mlであった。次に、サンプルを、24時間37℃でインキュベートした。
【０３０６】
pH2.0の溶解測定のために、架橋結晶サンプルを最初に10mMグリシン・HCl緩衝液において平衡化した。平衡化緩衝液を、最終pH4.8のために、pH2.0の10mM塩化カルシウムおよび20%のMPDと10mMグリシン・HCl緩衝液の80%とを混合することによって調製した。平衡を、回転させながら終夜25℃で実行した。平衡化サンプルは、次に5分間300rpmで微量遠心分離し、そしてその上清液体を捨てた。そのサンプルを5分間3000rpmで遠心分離し、そのペレットをpH2.0のグリシン・HCl緩衝液200μlに懸濁した。これらの条件下で、リパーゼの濃度は14mg/mlであった。最終的にそのサンプルを5時間37℃でインキュベートした。
【０３０７】
pH2.0で5時間インキュベーションの期間の後に、またはpH7.4で24時間インキュベーション後、上清中の可溶性タンパク質の量を、Bio-Rad  微量タンパク質アッセイを使用して測定した。インキュベーション後、サンプルを5分間14,000rpmで遠心分離した。次に、その上清を0.22μmセルロースアセテートフィルター(Sigma  Chemical  Co.)を通して濾過した。次に可溶性タンパク質濃度を脱イオン水798μl中に濾過した上清2μlを希釈することによって測定した。次に、Bio-Radタンパク質アッセイ試薬の200μlをこのサンプルに加え、そして5分間周囲温度でインキュベートした。吸光度を595nmの波長で測定し、Pierceからのウシ血清アルブミン0〜20μgのタンパク質標準曲線と比較した。
【０３０８】
異なるトリガー単独、または組合わせてタンパク質の放出の動力学を決定する。以下のサンプルを研究し、その結果を、以下の表XXXに記載した。
【０３０９】
【化３７】
2008283976.tif 000039
【０３１０】
実施例51-オリーブオイルを使用してのリパーゼ活性として
種々の架橋酵素結晶の活性を、オリーブオイルを含む基質の加水分解を測定することによって評価した。反応の間、pHを、0.05M  NaOHで滴定することによって一定に保った。反応を、VIT90  Video  TitratorおよびABU91  Autoburetteによって制御したラジオメーターのpH-Stat(TitralabTM)電極を用いて行なった。
【０３１１】
手順:
まず第一に、オリーブオイルエマルジョンの20mlを反応容器に添加し、そして反応混合物を攪拌しながら37℃で平衡化した。次に、pHを0.05M  NaOHを使用してpH7.7に調整し、そして架橋結晶のアリコート(34mg)を添加した。混合物のpHをNaOHで滴定することによってpH7.7に維持した。塩基消費量対時間(ml/min)を記録し、そしてプロットした。曲線の最初の直線の部分の勾配を反応の初速度を決定するために使用した。
a)反応温度：アッセイ容器を反応の経過の間、37℃の水浴で平衡化しそして維持した。
b)計算：初速度=塩基消費=ml/min(NaOH)×min。
c)比活性(μモル/min/mgタンパク質)=初速度×1000×滴定剤濃度/酵素量(mg)。
d)ブランク:酵素なし-反応混合物における酵素の配置において使用した緩衝液。
【０３１２】
試薬:
a)3.0M  NaCl(溶液A):NaClの34.8グラムを蒸留水の150mlに添加し、そして攪拌した。最終容量を200mlまでにした。
b)75mM  CaCl2・2H2O(溶液B):CaCl2・2H2Oの220mgを攪拌した状態で蒸留水の150mlに添加した。ひとたび、CaCl2・2H2Oを溶解したら、その容量を200mlまでにした。
c)混合：溶液A(40ml)を溶液B(20ml)およびH2O(100ml)に添加した。
d)0.5%アルブミン:アルブミン500mg/蒸留水100mlを、穏やかに攪拌しながら(泡沫の生成を避ける)水中にウシ血清アルブミン分画V(Sigma)の1グラムを溶解することによって調製した。溶解後、その容量を200mlにまでにした。
e)オリーブオイルエマルジョンを、試薬等級の水130ml中においてアラビアゴム(Sigma)の16.5グラムを最初に溶解することによって調製した。ひとたびそのゴムを溶解したら、その容量を蒸留水で180mlに増加し、そしてその溶液を綿を通して濾過した。次に、オリーブオイル(Sigma)の20mlを添加し、そしてエマルジョンを3分間Quick  Prep  mixerで混合することによって生成した。
f)基質:オリーブオイルエマルジョンの50mlを混合液(C)の40mlおよび0.5%アルブミンの10mlに添加した。
【０３１３】
実施例52-架橋Candida  Rugosaリパーゼ結晶の活性
実施例51に記載したように架橋したCandida  rugosaリパーゼ結晶の活性を基質としてオリーブオイルを使用してアッセイした(表XXXI)。以下の架橋剤で架橋した結晶をアッセイした：ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP);ビスマレイミドヘキサン(BMH);NHS-PEG-ビニルスルホン(NHS-PEG-VS);ジスクシンイミジルグルタレート(DSG);1-エチル-3-[3-ジメチルアルニノプロピル]カルボジイミドハイドロクロライド(EDC);スルホスクシンイミジル-6-[α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ）トルアミド]ヘキサノエート(スルホ-LC-SMPT);およびグルタルアルデヒド(GA)。
【０３１４】
【化３８】
2008283976.tif 000040
【０３１５】
上記の表XXXIは、Candida  rugosaリパーゼ結晶において種々の架橋剤の影響および架橋の程度を実証する。アミノ／スルホ反応性ヘテロ２官能性架橋剤スルホ-LC-SMPTは、可溶性酵素と比較した時、オリーブオイル基質に対するリパーゼの活性(7倍より大きい)を劇的に増強した。アミノ反応性(DSP)またはスルフヒドリル反応性(BMH)ホモ２官能性架橋剤は、可溶性酵素と比較した時、それぞれ、活性のわずかな増強、および活性の約2倍の増強を示した。
【０３１６】
実施例53-可逆的な架橋剤-ジスルフィド架橋Candida  Rugosaリパーゼ結晶
Candida  rugosaリパーゼ結晶を実施例48に記載しているように調製した。平均サイズにおいて20〜30μMの結晶を含むサンプル、および42mg/mlの全量タンパク質を以下の可逆的な架橋剤のいずれかを使用して架橋した：
(1)ジメチル3,3’-ジチオビスプロピオンイミデート・HCl(DTBP)(Pierce)、または
(2)ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)(DSP)(Pierce)、
(3)ビス[2-(スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）-エチル]スルホン(スルホ-BSOCOES)(Pierce)。
【０３１７】
架橋反応を、pH8.5で10mM  HEPES,10mM酢酸カルシウム、20%MPDを含む緩衝液の500μlにリパーゼ結晶スラリー(11.5mg)の250μlを配置することによって２本の1.5ml微量遠心分離チューブ(USA/Scientific)において実行した。次に、架橋反応を以下のように、それぞれのチューブに１つの架橋剤溶液を添加することによって開始した：
A)50mM  DTBP-DTBPの27.9mgを60μlの水に溶解し、そしてこの溶液の20μlを結晶を有する１つのチューブに添加した；および
B)14.8mM  DSP-DSPの35.0mgをDMSOの120μlに溶解し、次にこの溶液の10μlを結晶を有する1つのチューブに添加した。
C)7.5mM  スルホ-BSOCOES-スルホ-BSOCOESの7.2mgを60μlの水に溶解し、次に、この溶液の20μlを結晶を有する１つのチューブに添加した。
【０３１８】
DTBPおよびDSPを有するチューブを、約２日間周囲温度(24〜26℃)でひっくり返し、またはサンプルが32mM  NaOHに不溶性であることを決定するまでひっくり返した。スルホ-BSOCOESを有するチューブを約２日間周囲温度(24〜26℃)でひっくり返した。溶解性試験は、32mM  NaOHの150μlにサンプルの50μlを添加することからなった。この試験において、未架橋サンプルは、同じ濃度で32mM  NaOHに容易に溶解した。架橋反応を、5分間3000rpmでサンプルを遠心分離することによって終結した。次に、その上清を捨て、pH7.0の10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含む10mM  Tris・HCl緩衝液の1mlで3回洗浄した。
【０３１９】
実施例54-架橋Candida  Rugosaリパーゼ結晶を含む-ジスルフィド結合の溶解
システインの200mM溶液を、pH7.0の10mM塩化カルシウムおよび20%  MPDを含む10mM  TRIS・HCl緩衝液の10ml中にシステインの242mgを溶解することによって調製した。架橋結晶スラリーの200μlのサンプルを5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。そのペレットをTRIS緩衝液を含むシステインの200μlに懸濁した。架橋サンプルの別の200μlをとり、そして5分間3000rpmで遠心分離し、その上清を捨てた。次に、このペレットをシステインを含まないpH7.0の10mM  Tris・HCl緩衝液の200μlに懸濁した。すべてのサンプルは、1時間37℃でインキュベートし、そして32mM  NaOH中での溶解について、直接的な目視観察および顕微鏡観察によってモニターした。
【０３２０】
DTBPに曝したサンプルは、200mMシステインの存在下で十分に可溶性であり、そして37℃で1時間インキュベーション後、その非存在下で不溶性であった。DSPサンプルは、システインの存在下で、１時間後、わずかに可溶性であり、そしてその非存在下で不溶性であった。
【０３２１】
実施例55-塩基開裂可能架橋Candida  Rugosaリパーゼ結晶による溶解
架橋結晶スラリーの200μlサンプルを、5分間3000rpmで遠心分離し、そしてその上清を捨てた。そのペレットをTris緩衝液の200μlおよび32mM  NaOHの600μlに懸濁した。架橋サンプルの別の200μlをとり、そして5分間3000rpmで遠心分離し、その上清を捨てた。次に、このペレットをpH7.0の10mM  Tris・HCl緩衝液の200μlに懸濁した。すべてのサンプルを1時間37℃でインキュベートし、そして32mM  NaOH中での溶解について、直接的な目視観察および顕微鏡観察によってモニターした。
【０３２２】
スルホ-BSOCOESに曝したサンプルは、NaOHの存在下で十分に可溶性であり、そしてその非存在下で不溶性であった。
【０３２３】
本発明者らは、本明細書中上記で多数の本発明の実施態様組成物を記載したが、本発明者らの基本的構成が本発明のプロセスおよび組成物を利用する他の実施態様を提供するために変化し得ることは明らかである。それ故に、本発明の範囲が、実施例により本明細書中上記に存在する特定の実施形態によるというよりは、添付の請求の範囲によって定義されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０３２４】
【図１】図１は、40℃におけるCiba界面活性剤#16中の種々の酵素の安定性を示すグラフである。
【図２】図２は、血液、牛乳、およびカーボンブラックで汚れた繊維上での、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の性能を示すグラフである。
【図３】図３は、ココアで汚れた繊維上での、30℃で貯蔵後、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の実行を示すグラフである。
【図４】図４は、ココアで汚れた繊維上での、40℃で貯蔵後、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の実行を示すグラフである。
【図５】図５は、血液、牛乳、およびカーボンブラックで汚れた繊維上での、30℃で貯蔵後、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の実行を示すグラフである。
【図６】図６は、血液、牛乳、およびカーボンブラックで汚れた繊維上での、40℃で貯蔵後、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の実行を示すグラフである。
【図７】図７は、血液で汚れた繊維上での、30℃で貯蔵後、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶を含む処方物を含有する、液体界面活性剤処方物の洗浄の実行を示すグラフである。
【図８】図８は、30℃における、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶の可溶性を示すグラフである。
【図９】図９は、37℃における、本発明に従う架橋したズブチリシン結晶の可溶性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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