(57)【要約】【課題】  本発明は、制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡとオリゴＤＮＡアダプターを用い、少ない工程と簡単な構成からなり、かつ精度の高い未知配列の増幅を可能にする、ＤＮＡ断片の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】  上記課題の解決のため、本発明は、ゲノムＤＮＡを突出末端を形成する制限酵素で切断する工程と、制限酵素が形成する突出末端と相補的な突出末端を持ち、制限酵素断片の切欠き部または突出末端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて制限酵素断片に結合させる工程を含む、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
（ｉ）ゲノムＤＮＡを、突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（ｉｉ）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、前記突出末端の突出先端または切欠き部に、前記制限酵素断片の切欠き部または突出先端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（ｉ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【請求項２】
被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
（１）ゲノムＤＮＡを、５’突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（２）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその突出先端に前記制限酵素断片の切欠き部に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、該塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（１）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【請求項３】
下記工程を含むことを特徴とする、請求項２に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
（３）工程（１）で得られた制限酵素断片の５’突出末端を、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化する工程
【請求項４】
工程（２）が下記工程で置き換えられることを特徴とする、請求項２に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
（２’）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその切欠き部に前記制限酵素断片の突出先端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、該塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（１）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【請求項５】
被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むこと特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
（Ａ）ゲノムＤＮＡを、３’突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（Ｂ）前記制限酵素が形成する３’突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその突出先端に前記制限酵素断片の切欠き部に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（Ａ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【請求項６】
工程（Ｂ）が、下記工程で置き換えられることを特徴とする、請求項５に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法
（Ｃ）前記制限酵素が形成する３’突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその切欠き部に前記制限酵素断片の突出末端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、前記付加された塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（Ａ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【請求項７】
制限酵素が、ＡｃｃＩ，ＡｆｌＩＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｓｎＩ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｌａＩ，ＤｄｅＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐａＩＩ，ＭｌｕＩ，ＭｓｅＩ，ＭｓｐＩ，ＭｖａＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｉＩ，ＮｅｏＩ，ＮｄｅＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｃｒＦＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩのうちいずれかより選択される、請求項２から請求項４のうちいずれか１項に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
【請求項８】
制限酵素が、ＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｇｌＩ，ＢｓｍＩ，ＣｆｏＩ，ＨａｅＩＩ，ＨｈａＩ，ＫｐｎＩ，ＫｓｐＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｓｔＩＩのうちいずれかより選択される、請求項５または請求項６に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
【請求項９】
ＤＮＡリガーゼがＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼである、請求項１から請求項８のうちいずれか１項に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のうちいずれか１項に記載の方法で製造されたアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型にし、ＤＮＡ断片を増幅させることを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１１】
被検細胞のゲノムＤＮＡにおける既知配列の５’上流または３’下流に存在する未知配列を含むアダプター結合ＤＮＡ断片を製造する方法であって、請求項１から請求項９のうちいずれか１項に記載の方法で製造されたアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型とし、既知配列から設計されたプライマーＸと、アダプター上に設計されたプライマーＹとを用い、両プライマーに挟まれた領域を増幅することを特徴とする、未知配列を含んだアダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする、請求項１１に記載の未知配列を含んだＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の方法で増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とし、既知配列から設計されたプライマーＸの更に下流の配列より設計されたプライマーＸ’と、アダプター上に設計されたプライマーＹの更に下流の配列より設計されたプライマーＹ’とを用い、両プライマーに挟まれた領域を増幅することを特徴とする、未知配列を含んだＤＮＡ断片の製造方法。
【請求項１４】
制限酵素がＥｃｏＲＩである、請求項７に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
【請求項１５】
配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるアダプターを用いることを特徴とする、請求項１４に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法。
【請求項１６】
１塩基以上１０塩基以下の突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）の、突出末端どうしの結合反応において、（ａ）の突出末端または切欠き部に（ｂ）の切欠き部または突出末端に存在する１塩基と同一種の塩基が重複して存在するとき、前記重複した塩基を削除する活性を有する、エキソヌクレアーゼ。
【請求項１７】
エキソヌクレアーゼがＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼである、請求項１５に記載のエキソヌクレアーゼ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、制限酵素とオリゴＤＮＡからなるアダプターを用いたＤＮＡ断片の製造方法に関し、より詳しくは、突出末端を形成する制限酵素と、前記突出末端と相補的な突出末端を持ちかつ突出先端または切欠き部に重複した１塩基が存在する２本鎖のオリゴＤＮＡアダプターとを用いたＤＮＡ断片の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の機能や性質の解析において、ＤＮＡやＲＮＡなどの遺伝子情報を利用した分子遺伝学的解析は、極めて有用な手段として様々な場面で用いられている。それらの最も基礎的な技術として、目的とする遺伝子がコードする塩基配列の情報を明らかにすることが必要である。ヒトやシロイヌナズナ、大腸菌など、すでにゲノムの全塩基配列が決定された生物であれば、これらの配列のデータベースを用いることができるが、地球上のほとんどの生物は未だ断片的な遺伝情報しか明らかにされておらず、新規な有用微生物や特定の生命現象を示すモデル生物など、これらの生物の解析には未知の遺伝子情報を明らかにする必要がある。
【０００３】
ゲノム情報が明らかではないこれらの生物から遺伝情報を得る手段として、現在ＰＣＲを介した技術が広く用いられている。同一の機能を有する酵素タンパク質では生物種間で特定のアミノ酸配列が保存されていることに着目し、これらのアミノ酸配列をそのアミノ酸配列をコードする塩基配列に変換し、これをプライマーとして、この配列の上流または下流に位置する別の保存されたアミノ酸配列から同様にプライマーを作成し、両プライマーで挟まれた領域を増幅するというものである。しかしながらこの方法は、保存性の高い２以上の領域に挟まれた配列を明らかにするためには利用できるが、保存性の低い領域、特に遺伝子の５’側上流域や３’側下流域などを明らかにするためには使えないという問題点があった。
【０００４】
上記の問題点を解決するため、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡがｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを持つことを利用し、ｐｏｌｙ  Ｔプライマーを用いた逆転写を行ったり、逆転写で得られたｃＤＮＡの末端にアダプターと呼ばれるオリゴＤＮＡを結合させ、この配列上に設計したプライマーを用いて増幅反応を行う「ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）」と呼ばれる手法が開発されてきている（非特許文献１）。しかしＲＡＣＥ法はｍＲＮＡを増幅の出発点としているため、転写調節因子など非アミノ酸配列領域や繰り返し配列等のモチーフの解析には用いることができず、またｐｏｌｙ  Ｔプライマーを用いる場合には、全てのｍＲＮＡがｐｏｌｙ  Ａ  ｔａｉｌを有するため特異性に問題があった。
【０００５】
一方でｍＲＮＡやｃＤＮＡを出発点とせず、ゲノムＤＮＡから未知配列を検出するための様々な手法も、開発されてきている。ＲＡＣＥ法をゲノムＤＮＡに応用したＲＡＧＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｎｄｓ）法（非特許文献２，７）、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法（非特許文献３）、カセットＰＣＲ法（非特許文献４−６）などがそれであり、特にカセットＰＣＲ法は任意のオリゴＤＮＡアダプターを切断したゲノムＤＮＡに結合させることから、設計が容易であるため多数の改良がなされている（特許文献１−３）。
しかしながら、カセットＰＣＲ法においては、制限酵素で切断したゲノムＤＮＡ全てに対してアダプターを結合させるため、標的配列を増幅させる際の特異性に大きな問題点があった。突出末端を形成する様に設計されたアダプターは、アダプター同士も相補的な配列を有しているため結合可能であり、アダプター同士の結合が標的配列とアダプターとの結合を著しく低下させるおそれがあるのと同時に、例えばＰＣＲなどで標的配列を増幅させようとする場合に非特異的産物として増幅され、解析を妨げるおそれがあった。この問題点を回避するためには複数の制限酵素による処理や複雑な形状のアダプター設計、多数の工程を経る必要があるなど、未だ十分な正確さと利便性を有しているとは言えないのが現状であった。
【特許文献１】特開平８−２４２８９７  遺伝子の複製及び増幅方法
【特許文献２】特開平１１−１９６８７４  ＤＮＡ断片分析法
【特許文献３】特開２００１−０６１４８６  選択的な制限断片増幅：一般的なＤＮＡフィンガプリント法
【非特許文献１】Ｏｈａｒａ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５６７３−５６７７．
【非特許文献２】Ｃｏｒｍａｃｋ  Ｒ．Ｓ．＆Ｓｏｍｓｓｉｃｈ．Ｉ．Ｅ．１９９７．Ｇｅｎｅ  １９４：２７３−２７６．
【非特許文献３】Ｏｃｈｍａｎ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９８８．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６２１−６２３．
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｔａｌ  Ａ．＆Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｓ．Ｃ．１９９０．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８（１０）：３０９５−３０９６．
【非特許文献５】Ｓｉｅｂｅｒｔ  Ｐ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．１９９５．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（６）：１０８７−１０８８．
【非特許文献６】Ｌａｇｉｎｇ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９（２）ｅ８．
【非特許文献７】Ｐａｒｋ  Ｄ．Ｊ．２００５．Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．８  Ｎｏ．２．
【非特許文献８】Ｈｉｗａｔａｓｈｉ  Ｋ．１９６８．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５８：３７３−３８６．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の現状に鑑み、本発明は、制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡとオリゴＤＮＡアダプターを用い、少ない工程と簡単な構成からなり、かつ精度の高い未知配列の増幅を可能にする、ＤＮＡ断片の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題の解決のため、本発明者らは、突出末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ  ｅｎｄ）を形成する制限酵素を用い、この制限酵素が形成する末端と相補的な突出末端を形成する２本鎖のオリゴＤＮＡアダプターを設計し、ＤＮＡリガーゼによる結合を行って、アダプター結合ＤＮＡ断片の製造を試みた。この過程において、従来の様に制限酵素切断による突出末端とアダプターが形成する末端が完全に相補的な形状ではなく、アダプターの突出末端の突出先端に、ゲノムＤＮＡの制限酵素断片の切欠き部に存在する１塩基が重複して存在するよう設計した場合、リガーゼが条件特異的エキソヌクレアーゼ活性を示して重複する塩基を削除し、突出末端同士の結合を行ってアダプター結合ＤＮＡ断片を形成すること、更にこの様に設計されたアダプター同士はリガーゼによっても結合せず、特異的に標的とする遺伝子断片を増幅可能であるという事実を見いだし、この概念をアダプターの突出末端の突出先端または切欠き部にゲノムＤＮＡの制限酵素断片の切欠き部または突出末端の突出先端に存在する塩基と同一種の塩基を１塩基重複して存在させておく場合にまで拡張し、実際に原生動物の一種ミドリゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａ）からの新規なカタラーゼ遺伝子及びその上下流に存在する調節領域の単離を行って、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち本発明の第１の態様は、被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ製造方法を提供する。
（ｉ）ゲノムＤＮＡを、突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（ｉｉ）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、前記突出末端の突出先端または切欠き部に、前記制限酵素断片の切欠き部または突出単に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（ｉ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【０００９】
本発明の第２の態様は、被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むことを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
（１）ゲノムＤＮＡを、５’突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（２）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその突出先端に前記制限酵素断片の切欠き部に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、該塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（１）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【００１０】
本発明の第３の態様は、下記工程を含むことを特徴とする、第２の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
（３）工程（１）で得られた制限酵素断片の５’突出末端を、アルカリフォスファターゼで脱リン酸化する工程
【００１１】
本発明の第４の態様は、工程（２）が下記工程で置き換えられることを特徴とする、第２の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
（２’）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその切欠き部に前記制限酵素断片の突出先端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、該塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（１）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【００１２】
本発明の第５の態様は、被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、下記工程を含むこと特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
（Ａ）ゲノムＤＮＡを、３’突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程
（Ｂ）前記制限酵素が形成する３’突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその突出先端に前記制限酵素断片の切欠き部に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（Ａ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【００１３】
本発明の第６の態様は、工程（Ｂ）が、下記工程で置き換えられることを特徴とする、第５の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
（Ｃ）前記制限酵素が形成する３’突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、更にその切欠き部に前記制限酵素断片の突出末端に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加され、前記付加された塩基がリン酸化された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（Ａ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程
【００１４】
本発明の第７の態様は、制限酵素が、ＡｃｃＩ，ＡｆｌＩＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｓｎＩ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｌａＩ，ＤｄｅＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐａＩＩ，ＭｌｕＩ，ＭｓｅＩ，ＭｓｐＩ，ＭｖａＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｉＩ，ＮｅｏＩ，ＮｄｅＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｃｒＦＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩのうちいずれかより選択される、第２から第４の態様のうちいずれか１つに記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
【００１５】
本発明の第８の態様は、制限酵素が、ＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｇｌＩ，ＢｓｍＩ，ＣｆｏＩ，ＨａｅＩＩ，ＨｈａＩ，ＫｐｎＩ，ＫｓｐＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｓｔＩＩのうちいずれかより選択される、第５または第６の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
【００１６】
本発明の第９の態様は、ＤＮＡリガーゼがＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼである、第１から第８の態様のうちいずれか１つに記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
【００１７】
本発明の第１０の態様は、第１から第９の態様のうちいずれか１つに記載の方法で製造されたアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型にし、ＤＮＡ断片を増幅させることを特徴とする、アダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法を提供する。
【００１８】
本発明の第１１の態様は、被検細胞のゲノムＤＮＡにおける既知配列の５’上流または３’下流に存在する未知配列を含むアダプター結合ＤＮＡ断片を製造する方法であって、第１から第９の態様のうちいずれか１つに記載の方法で製造されたアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型とし、既知配列から設計されたプライマーＸと、アダプター上に設計されたプライマーＹとを用い、両プライマーに挟まれた領域を増幅することを特徴とする、未知配列を含んだアダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明の第１２の態様は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることを特徴とする、第１１の態様に記載の未知配列を含んだＤＮＡ断片の製造方法を提供する。
【００２０】
本発明の第１３の態様は、第１１または第１２の態様に記載の方法で増幅されたＤＮＡ断片を鋳型とし、既知配列から設計されたプライマーＸの更に下流の配列より設計されたプライマーＸ’と、アダプター上に設計されたプライマーＹの更に下流の配列より設計されたプライマーＹ’とを用い、両プライマーに挟まれた領域を増幅することを特徴とする、未知配列を含んだＤＮＡ断片の製造方法を提供する。
【００２１】
本発明の第１４の態様は、制限酵素がＥｃｏＲＩである、第７の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
【００２２】
本発明の第１５の態様は、配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるアダプターを用いることを特徴とする、第１４の態様に記載のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法を提供する。
【００２３】
本発明の第１６の態様は、１塩基以上１０塩基以下の突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）の、突出末端どうしの結合反応において、（ａ）の突出末端または切欠き部に（ｂ）の切欠き部または突出末端に存在する１塩基と同一種の塩基が重複して存在するとき、前記重複した塩基を削除する活性を有する、エキソヌクレアーゼを提供する。
【００２４】
本発明の第１７の態様は、エキソヌクレアーゼがＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼである、第１６の態様に記載のエキソヌクレアーゼを提供する。
【発明の効果】
【００２５】
本発明を利用することにより、種々の生物のゲノム上に存在する既知配列から、未知の配列を効率よく、しかも簡便に単離することが可能となる。これにより、新しい遺伝子の全長決定、遺伝子の上下流に位置する調節配列の探索、くり返しモチーフなど遺伝子をコードしない領域の探索など、これまで困難であった未知領域の塩基配列の解析が容易になると期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下に本発明を実施するための最良の形態を述べる。本発明の第１の態様は、被検細胞のゲノムＤＮＡから、既知配列からなるオリゴＤＮＡアダプターを結合したＤＮＡ断片を製造する方法であって、（ｉ）ゲノムＤＮＡを、突出末端を形成する制限酵素で切断し、制限酵素断片を得る工程、（ｉｉ）前記制限酵素が形成する突出末端と相補的な塩基配列を有する突出末端を持ち、前記突出末端の突出先端または切欠き部に、前記制限酵素断片の切欠き部または突出単に存在する塩基と同一種の塩基が１つ付加された１組の２本鎖オリゴＤＮＡからなるアダプターを、ＤＮＡリガーゼを用いて工程（ｉ）で得られた制限酵素断片に結合させる工程からなる、アダプター結合ＤＮＡ製造方法を提供する。本発明の最も基本的な構成は、制限酵素によって形成された相補的な突出末端同士のＤＮＡリガーゼを用いた結合であって、１塩基過多の（Ｏｎｅ−ｂａｓｅ−ｅｘｃｅｓｓ）２本鎖オリゴＤＮＡアダプターを用いるというものである。ＤＮＡリガーゼは突出末端、平滑末端の両方を、５’側のリン酸基と３’側の水酸基をリン酸結合を介して結合させる酵素であるが、突出末端同士が相補的な配列からなる場合、ＤＮＡリガーゼによる結合前に相補鎖同士がゆるやかな結合状態（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）にあると考えられ、ここにＤＮＡリガーゼが結合して末端同士を結合させるときに余分な（重複する）塩基がある場合、ＤＮＡリガーゼがこの重複する１塩基を削除するという条件特異的なエキソヌクレアーゼ活性を示すという新たな知見を利用するものである。アダプターの配列、制限酵素の種類、ＤＮＡリガーゼの種類やそれぞれの反応溶液、反応条件等は、必要に応じて適宜利用可能なものの中から選択すれば良く、本発明を限定するものではない。
【００２７】
本発明の第２から第４の態様は、５’突出末端を形成する制限酵素を用いたアダプター結合ＤＮＡ製造方法を提供する。図１に本態様の模式図を示す。図１ａは制限酵素で切断したＤＮＡ断片の一方（右側）と、これと同じ突出末端を有するオリゴＤＮＡアダプター（左側）を表す。ＤＮＡ鎖の上下流は５’、３’で表している。アダプターには突出末端の更に先端に、切欠き部側に存在する塩基と同一種の塩基（○で示す）が重複して存在しており、アダプター側の重複塩基はリン酸化（Ｐで表す）されている。５’リン酸化は制限酵素断片、アダプターどちらであっても良いが、調製の容易さからアダプター側がリン酸化されているのが好ましい。ここにＤＮＡリガーゼが作用することにより、相補鎖同士が結合しつつ、重複した塩基が１つ削除されて末端同士も結合する（図１ｂ）。一方、アダプター同士は、○で示した塩基のため相補的な結合が形成されず、ＤＮＡリガーゼによっても結合しない（図１ｃ）。この様な原理に基づいて、本発明は２本鎖オリゴＤＮＡアダプターと制限酵素断片とを結合させる方法を提供するものである。
一方、制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡは、両側の末端が同じ突出末端を有しており、ＤＮＡリガーゼはこの両端同士の結合（Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲにはこの結合が利用される）や切断されたＤＮＡ断片同士の結合も同様に触媒することが可能である。そこで、制限酵素断片同士を結合させず、アダプターと制限酵素断片とを確実に結合するための方法として、制限酵素断片の末端をアルカリフォスファターゼで処理する工程を含むことが有効である。アルカリフォスファターゼはＤＮＡの５’側に露出したリン酸基を切断するため、この処理を受けた断片同士はリガーゼによるリン酸結合を受けなくなり、アダプターの５’側リン酸基と制限酵素断片のみが結合できるようになる。アルカリフォスファターゼ処理工程は、制限酵素断片を得た後に適当な緩衝液中で行っても良いし、また制限酵素に比べて塩類溶液の条件が緩やかであることから、制限酵素処理と同時に制限酵素用反応溶液中で行っても良い。酵素処理の反応時間、反応条件などは利用可能なものの中から適宜選択すれば良く、本発明を限定するものではない。
【００２８】
アダプター上に設ける重複する塩基としては、前記の様に５’突出末端の更に先に切欠き部に存在する１塩基を重複させても良いし、反対にアダプターの切欠き部に制限酵素断片の突出先端に存在する１塩基を重複させても良い。
【００２９】
上記態様における５’突出末端を形成する制限酵素としては、ＡｃｃＩ，ＡｆｌＩＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｓｎＩ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＣｌａＩ，ＤｄｅＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＥｃｏＲＩＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＨｐａＩＩ，ＭｌｕＩ，ＭｓｅＩ，ＭｓｐＩ，ＭｖａＩ，ＮａｒＩ，ＮｃｉＩ，ＮｅｏＩ，ＮｄｅＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｃｒＦＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＴａｑＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩのうちいずれかより選択される制限酵素が好適である。これらは１〜５塩基の５’突出末端を形成する制限酵素であるが、突出部（Ｏｖｅｒｈａｎｇ）が多い方が相補的結合が強くなることが期待されるため、この中でも特にＡｆｌＩＩ，Ａｌｗ４４Ｉ，ＡｖａＩ，ＡｖａＩＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩＩ，ＢｌｎＩ，ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ，ＥｃｌＸＩ，ＥｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＭｌｕＩ，ＮｃｏＩ，ＮｈｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰｉｎＡＩ，ＳａｌＩ，ＳｐｅＩ，ＳｔｙＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩが好適であり、更に入手のしやすさからＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＮｏｔＩ，ＸｂａＩ，ＸｈｏＩが好適であって、特にＥｃｏＲＩは最も一般的な制限酵素の１種であり好適である。
【００３０】
上記に示した制限酵素を用いる際には、その認識する配列（制限酵素サイト）のゲノム中での出現頻度に注意する必要がある。ＥｃｏＲＩなど配列の出現頻度の高い制限酵素で切断した場合、相対的に短い制限酵素断片が多数形成され、逆に出現頻度の低い制限酵素（Ｒａｒｅ  ｃｕｔ）では相対的に長い制限酵素断片が小数形成される。この点を考慮し、製造しようとするアダプター結合ＤＮＡ断片に合わせて制限酵素は適宜選択すれば良い。
【００３１】
本発明の第５の態様は、３’突出末端を形成する制限酵素を用いたアダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法を提供する。図２ａに本態様の模式図を示す。３’突出末端を形成する制限酵素で切断されたゲノムＤＮＡ制限酵素断片（右側）と、前記突出末端に相補的な突出末端を持つアダプター（左側）とをＤＮＡリガーゼを用いて結合させる反応において、アダプターの３’突出末端に制限酵素断片の５’側切欠き部に存在する塩基（○で表す）が重複して存在している場合、ＤＮＡリガーゼがエキソヌクレアーゼ活性を示してこの重複塩基を削除し、突出末端同士を結合させる。アダプター同士が結合しないのは図１と同様である。
【００３２】
本発明の第６の態様は、３’突出末端を形成する制限酵素を用いたアダプター結合ＤＮＡ断片の製造方法の別態様を提供する。図２ｂに本態様の模式図を示す。第５の態様においては、アダプターにある重複する塩基（○で表す）が３’側の突出末端ではなく切欠き部に存在する。ＤＮＡリガーゼがエキソヌクレアーゼ活性を示して重複塩基を削除し、突出末端同士を結合させるのは第５の態様に同様である。
【００３３】
第５、第６の態様における３’突出末端を形成する制限酵素としては、ＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｇｌＩ，ＢｓｍＩ，ＣｆｏＩ，ＨａｅＩＩ，ＨｈａＩ，ＫｐｎＩ，ＫｓｐＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＰｖｕＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩ，ＳｓｔＩＩから選択される制限酵素があげられる。この中でも、突出末端の突出部が長い制限酵素であるＡｐａＩ，ＢａｎＩＩ，ＨａｅＩＩ，ＫｐｎＩ，ＮｓｉＩ，ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ，ＳｐｈＩ，ＳｓｔＩが好適であり、入手の容易さなどからＰｓｔＩ，ＳａｃＩなどが好適である。
【００３４】
本発明におけるＤＮＡリガーゼは、突出末端同士のＤＮＡを結合させる能力があればどの様なものでも良く、その由来などが本発明を限定するものではないが、ＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼが好ましく、特に分子生物学分野で広く用いられているＴ４  ＤＮＡリガーゼが好適である。
【００３５】
本発明の提供する方法で製造されるアダプター結合ＤＮＡ断片は、これを鋳型にしてＤＮＡ増幅を行うことにより、既知配列の情報から未知配列を含んだＤＮＡ断片を増幅させ、この配列コードする塩基配列を明らかにすることが可能である。図３ａには、本発明における１塩基過多（Ｏｎｅ−ｂａｓｅ−ｅｘｃｅｓｓ）２本鎖オリゴＤＮＡアダプターの構成例を示した。アダプターは任意のプライマーの配列を含むプライマー部分と、制限酵素によって形成される突出末端に相補的な配列を持つ制限酵素サイト、更に突出末端の切欠き部に存在する塩基と同種の５’リン酸化塩基（”余分な”塩基）からなる２本鎖オリゴＤＮＡである。図３ｂにはゲノムＤＮＡの制限酵素断片と１塩基過多アダプターを結合させたＤＮＡ断片と、これを鋳型にしたＤＮＡ断片の増幅方法の模式図を示した。アダプター上に設計されたプライマーＸと、既知配列から未知配列の方向に向かって設計されたプライマーＹとを用いることによって、この両プライマーに挟まれた領域のＤＮＡ、例えば未知領域を含んだＤＮＡ断片を増幅・製造することが可能である。ＤＮＡの増幅にはＰＣＲをはじめとする耐熱性ポリメラーゼを用いた方法が適している。
【００３６】
増幅されるＤＮＡ断片の特異性を更に高めるため、アダプター上に予め２種類のプライマーを設計しておき、１回目のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を鋳型にした２ｎｄＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）を行うことも有効である。図４にＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲの例を模式的に示した。アダプター上に予めプライマーＸ，その下流にＸ’を設計しておき、また既知配列からプライマーＹ，その下流にＹ’を設計しておき、ＸとＹを用いて１ｓｔＰＣＲを行う。こうして得られたＤＮＡ断片を鋳型に、プライマーＸ’とＹ’を用いて２ｎｄＰＣＲを行う。たとえ１ｓｔＰＣＲによって標的配列以外の非特異的な産物が増幅されることがあったとしても、２ｎｄＰＣＲを行うことにより特異性の高い領域を選択することが可能となり、未知配列（□で囲んだ領域）を含むＤＮＡ断片をより精度良く増幅することが可能である。
【００３７】
アダプターの配列、その上に設計するプライマー、制限酵素サイトなどは目的に応じて適宜設計すれば良く、何ら本発明を限定するものではないが、例えばプライマーは分子生物学分野において「ユニバーサルプライマー」と呼ばれる一連のプライマー、特に分子遺伝学で広く用いられているプラスミドの配列に対応したプライマーなどが好適である。このとき、増幅した断片をクローニングしてシークエンスなどを行う場合には、クローニングに用いるプラスミドには含まれない配列をプライマーとして設計する必要がある。アダプターの設計例として、ユニバーサルプライマーＧＬ１、ＥｃｏＲＩサイト、”余分な”１塩基を含んだ配列番号１及び配列番号２に記載の配列からなるアダプターを、図５に示した。プライマーの上流及びＥｃｏＲＩサイトとの間にある配列はいわば緩衝地帯ともいうべき任意の塩基配列であり、ある作用を示す塩基配列と塩基配列の間にはこうした緩衝部がある方が良いという分子生物学分野における経験則から設計・挿入されるものである。
制限酵素断片とアダプターとの結合における両者の比率などについても、材料に応じて適宜調製すればよく、本発明を限定するものではないが、例えば制限酵素断片をアルカリフォスファターゼ処理しない場合には、１μｇの制限酵素断片を含む５μｌの溶液に対して、０．００１−０．１ｐｍｏｌ、好適には０．００４−０．０４ｐｍｏｌのアダプターを加えて結合させるのが良い。
【００３８】
本発明は、突出末端同士の結合に関与するＤＮＡリガーゼについて、条件特異的なエキソヌクレアーゼ活性、すなわち、１塩基以上１０塩基以下の突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ａ）と、前記突出末端と相補的な突出末端を有する２本鎖ＤＮＡ（ｂ）の、突出末端どうしの結合反応において、（ａ）の突出末端または切欠き部に（ｂ）の切欠き部または突出末端に存在する１塩基と同一種の塩基が重複して存在するとき、前記重複した塩基を削除する活性を有する、エキソヌクレアーゼをも提供する。理論的には突出末端は何塩基であっても相補的ならば結合可能であるが、一般的には制限酵素が作り出す範囲付近の突出数、すなわち１塩基以上１０塩基以下の突出末端同士の結合に適用可能であり、より好ましくは２塩基以上５塩基以下の突出末端同士の結合に適用可能である。こうしたエキソヌクレアーゼの例としてはＡＴＰ要求性のＤＮＡリガーゼがあげられ、代表例はＴ４  ＤＮＡリガーゼである。以下に本発明の実施例を述べるが、本発明は実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
（ミドリゾウリムシからのゲノムＤＮＡの抽出）本実施例の材料として、淡水中に生息し細胞内にクロレラ属藻類を共生させる原生動物の一種、ミドリゾウリムシＰａｒａｍｅｃｉｕｍ  ｂｕｒｓａｒｉａを用い、ゲノムＤＮＡの抽出には、共生藻のゲノムの混入を防ぐため、暗所培養により細胞内から共生藻を取り除いた株であるＭｉｗ２ｗ株（採集地：宮城県亘理町）を用いた。Ｈｉｗａｔａｓｈｉの方法（非特許文献８）により試験管培養されたミドリゾウリムシ約数万細胞を、手回し遠心器で集めて１．５ｍｌチューブに移し、これを更に１００００ｒｐｍ、１分間遠心して上清を除き、ＤＮＡ抽出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，２５ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  ＳＤＳ）を４００μｌ加えて静かに懸濁させ、細胞を溶解した。ここに４００μｌのフェノール−クロロホルム（１：１）を加えて５分間静かに混合し、１４０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心し、水相を新しい１．５ｍｌチューブに移して前記フェノール−クロロホルムを加え、更に５分間静かに混合して遠心（１４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した。水相を新しい１．５ｍｌチューブに移し、エタノール沈澱を行ってＤＮＡペレットを得、これを乾燥させた後、３０μｌのＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｂｕｆｆｅｒ）に溶かして１０℃にて保存した。十分にＤＮＡが溶解した後、溶液中のＤＮＡ濃度を分光光度計を用いて測定した。
【００４０】
（ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ処理）およそ５μｇのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）を５Ｕ用い、Ｃｕｓｔｏｍｅｒ’ｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅに従って１０μｌの系で切断（３７℃、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）した。処理後、フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行ってＤＮＡの制限酵素断片をペレットにし、５μｌのＴＥを加えて溶解させた。
【００４１】
（アダプターの調製）ＥｃｏＲＩサイトを持ったオリゴＤＮＡアダプターとして、配列番号１及び配列番号２の配列を持つよう設計された合成オリゴＤＮＡ（Ｆａｓｍａｃ，ＪＰＮ）を用い、１００μＭとなるようＴＥで溶解した。これを原液とし、両溶液２０μｌずつを混合し、サーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００，Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．）を用い、［９５℃，５ｍｉｎ；６５℃，５ｍｉｎ］のプログラムで１本鎖のオリゴＤＮＡ２つを２本鎖化した。
【００４２】
（カタラーゼ遺伝子の保存領域の探索）ミドリゾウリムシのゲノムＤＮＡからカタラーゼ遺伝子を単離するため、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用い、既に塩基配列及びアミノ酸配列が明らかな複数種の生物、すなわちヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｌｕｓ）、ノルウェーラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、線虫の一種（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、イネ（Ｏｌｉｚａ  ｓａｔｉｖａ）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のアミノ酸配列情報を参照し、保存性の高い領域としてヒトカタラーゼの第６８−７９アミノ酸配列及び第３６３−３７１アミノ酸からプライマーを設計した（配列番号３，４）このプライマー及びゲノムＤＮＡ（未切断）、増幅用としてＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用い、表１ａの組成の反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いて表２ｂのプログラムでＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の反応溶液を１．５％アガロースゲルを用いて電気泳動し、臭化エチジウムで染色してトランスイルミネーターでバンドを確認した。以後塩基配列情報の解析には、ＤＮＡｓｙｓ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓｏｆｔ）、ＤＮＡｄｙｎａｍｏ（ＢｌｕｅＴｒａｃｔｏｒＳｏｆｔｗａｒｅ，Ｌｔｄ）、ＳｅｑＣｏｎｖ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｇｓｕｎ）を適宜用いた。
【表１】
2008154557.tif 000003
【００４３】
ＰＣＲの結果、９００−１０００ｂｐのシングルバンドが確認されたため、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いてクローニングし、ＡＢＩ３１００，ＡＢＩ３７７，ＡＢＩ３１０ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてその塩基配列を決定した。ここで明らかになった配列の５’側及び３’側から、上流向きプライマー（配列番号５）及び下流向きプライマー（配列番号６）を設計した。
【００４４】
（アダプターのライゲーション）上述の方法で作製したアダプター及びＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ（制限酵素断片）を用いて、アダプターのライゲーション反応を行った。ライゲーション反応は５μｌの系で行い、約１μｇの制限酵素断片、１．５ＵのＴ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｉｎｃ．）を含むよう調製した。アダプターの濃度の最適化を行うため、アダプターの終濃度が４μＭ、０．４μＭ、０．０４μＭ、０．００４μＭとなる４種類の反応溶液を調製し、またアダプター０．０４μＭのみを含むライゲーション溶液も合わせて調製した。ライゲーションは１０℃、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ（８ｈ〜）行った。
【００４５】
（カタラーゼ５’上流領域の増幅）ライゲーション反応後のアダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型とし、上述のＰＣＲと同じ系（鋳型のみ異なる）を用い、ユニバーサルプライマーＧＬ１と配列番号５のプライマーを用いて、カタラーゼの５’側既知配列とアダプターとで挟まれた領域のＰＣＲを行った。Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＥｃｏＲＩ未切断ゲノムを鋳型としたものも調製した。ＰＣＲのプログラムとしては、下記表２のプログラムを適用した。ＰＣＲ後の反応溶液は１．５％アガロースゲル電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色してトランスイルミネーターでバンドを確認した。
【表２】
2008154557.tif 000004
【００４６】
図６に、アダプター結合ＤＮＡ断片を鋳型とし、アダプターと５’上流向きプライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。写真はトランスイルミネーターでの階調を反転させたものであり、レーン１，８は分子量マーカーとしてλ／ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを泳動したものであり、レーン８右側の数字は分子量（ｂｐ）を示す。レーン２はＮｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌとしてＥｃｏＲＩ未切断ゲノム断片を鋳型にしたＰＣＲの結果を表す。このレーンにバンドなどが見られないことから、アダプター上のプライマーと５’上流向きプライマーで増幅される領域はゲノム上には無いことが確認された。レーン３はアダプターのみをライゲーションさせたものを鋳型にしたものであり、このレーンでバンドが見られないことから、アダプター同士が結合したものを鋳型にして増幅されるＤＮＡ断片が無いことが確認された。レーン４−７はアダプターのライゲーション時の終濃度がそれぞれ０．００４μＭ、０．０４Ｍ、０．４Ｍ、４ＭとしたときのＰＣＲの結果であり、０．００４μＭ及び０．０４μＭのレーンにおいて、図中矢印で示した部分にバンドが確認された。０．４Ｍ、４Ｍと高濃度のアダプターを結合させたものではスメアーな産物が見られたが、これは低分子断片の両端にアダプターが結合したもの、及び低分子断片同士が結合したことによる影響と考えられた。シングルバンドが観察された０．０４μＭのＰＣＲ産物を上述のｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにクローニングし、前記同様にシークエンスを行って塩基配列を決定した。
【００４７】
下記表３に、配列番号７に記載の上記シークエンス結果を示す。本配列の５’側には、表中「Ｐｒｉｍｅｒ  ＧＬ１」及び「Ａｄａｐｔｏｒ」で示した配列があり、本配列が確かにアダプターから読まれている事が示された。更にアダプターの末端はＥｃｏＲＩサイトである「ＧＡＡＴＴＣ」があり、これはミドリゾウリムシのゲノムＤＮＡがＥｃｏＲＩで切断され、ここに同じ形のサイトを持つアダプターが結合したことを示している。更に、ＥｃｏＲＩサイト「ＧＡＡＴＴＣ」の最後のＣが重複していないことから、ライゲーションの際にこの重複する塩基が１つ削除された事が示された。ＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔによる解析の結果、本配列の下流には、１９３番目の開始コドンＡＴＧから始まるカタラーゼがコードされており、これ以降の配列には繊毛虫以外の生物では終止コドンとして用いられるＴＡＡ、ＴＡＧがグルタミン酸として含まれること、また４００番目付近にはＧＴ−ＡＧルールに従った２３塩基という繊毛虫特有の短いイントロンが含まれるなど、この配列がミドリゾウリムシのゲノム由来であることが示された。また開始コドンの上流にはＡＴリッチなＴＡＴＡ  ｂｏｘ様配列、ＧＡＴＡ配列などが見られ、本発明により遺伝子の上流に位置する調節領域の単離も行えることが示された。
【表３】
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【実施例２】
【００４８】
（カタラーゼ３’下流領域の増幅）５’上流領域の増幅に用いたのと同様のアダプター結合ゲノムＤＮＡ断片を新たに製造し、ユニバーサルプライマーＧＬ１と３’下流向きプライマー（配列番号６）とを用いたＰＣＲ反応を、上記と同様の条件にて行った。ＰＣＲの結果、５’上流の時と同様、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ及びアダプターのみライゲーションのサンプルではバンドが見られなかったのに対し、アダプター濃度が０．００４μＭ及び０．０４μＭのとき８００−９００ｂｐの付近にシングルバンドが確認され、０．４μＭ、４μＭではスメアーなバンドが見られた。０．０４μＭのＰＣＲ産物をクローニングし、シークエンスを行って塩基配列を決定した。
【００４９】
下記表４に、配列番号８に示すシークエンスの結果を示した。５’上流の解析と同様、本配列は設計したアダプターの配列を持っており、またＥｃｏＲＩサイトを有していることから、この配列が確かにＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡ断片とアダプターの結合による配列を増幅したものである事が示された。
【表４】
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【００５０】
表４の配列は相補鎖の配列であるため、このうちアダプターを除いた部分をコード鎖に変換したものを配列番号９及び下記表５に示した。この配列において、２８５番目のＴＧＡが終止コドンであり、終止コドンの下流にはＰｏｌｙ  Ａ付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）が存在していた。終止コドンの約６０塩基下流にＥｃｏＲＩサイトがあり、５’上流同様、遺伝子をコードした領域の下流に含まれる配列を、本発明の方法によって検出できることが示された。
【表５】
2008154557.tif 000007
【００５１】
本発明を用いたアダプター結合ＤＮＡ断片の解析結果と、保存性の高い領域の増幅の結果を合わせ、ミドリゾウリムシのゲノム中にコードされたカタラーゼ遺伝子の全長が明らかにされた。配列番号１０に、カタラーゼ遺伝子の全長を記す。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明を利用することにより、分子遺伝学分野において有用なゲノム解析手段を提供することが可能となる。有用な新規生物からの遺伝子の単離、遺伝子の調節領域の解析、くり返しモチーフなどの探索などに、広く応用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明におけるアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法（５’突出末端を形成する制限酵素を用いた場合）の模式図を示す。
【図２】本発明におけるアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法（３’突出末端を形成する制限酵素を用いた場合）の模式図を示す。
【図３】本発明におけるアダプターの構成と、このアダプターを結合させたＤＮＡ断片から未知配列を含んだＤＮＡを増幅させる方法の模式図を示す。
【図４】本発明における”Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ”を用いたＤＮＡ断片の増幅方法の模式図を示す。
【図５】本発明の実施例で用いたアダプターの構成と配列を示す。
【図６】本発明のアダプター結合ＤＮＡ断片製造方法をミドリゾウリムシのゲノムＤＮＡに適用し、カタラーゼ遺伝子の未知配列を増幅した電気泳動像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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