(57)【要約】【課題】二本鎖のオリゴヌクレオチドの安定性がよい中性付近で、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを用いて核酸内の変異を認識する。【解決手段】ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼとを、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中で反応させて、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断し、核酸内の変異を認識する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸内の変異を認識する方法であって、ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼとを、該一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中で反応させて、前記二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断し、前記変異を認識することを特徴とする核酸内の変異認識方法。
【請求項２】
前記切断後に、電気泳動することを特徴とする請求項１記載の核酸内の変異認識方法。
【請求項３】
前記試薬が２−メルカプトエタノールであることを特徴とする請求項１または２記載の核酸内の変異認識方法。
【請求項４】
前記一本鎖核酸切断ヌクレアーゼが、Ｓ１ヌクレアーゼ 、マングビーンヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩからなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項１、２または３記載の核酸内の変異認識方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を判別するための認識方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＳＮＰはゲノム上に存在する多型のうちでもっともよく見られ、数百〜一千塩基対に一箇所の割合で存在していると推測されている。ＳＮＰは他のＤＮＡマーカーと比べるとゲノム全体をカバーしており、これにより、何らかの疾患を持つグループと正常人のグループとのＳＮＰのパターンや頻度を比較することによって、ＳＮＰがどの病気と関連しているかという情報が得られ、マーカーとしての意義を有する。
【０００３】
また、ある薬剤がひとによってまったく効き具合が違うことはよく知られており、この原因の１つは個人間で身体に発現している蛋白質の量や質が微妙に違うと考えられているが、これにＳＮＰが関与していると考えられている。このような場合、ＳＮＰそのものを病気のかかりやすさの診断、薬剤に対する代謝分布動態、薬剤に対する感受性の違いや副作用の違いの判定に利用することができる。従ってＳＮＰの探索や研究を行うことは非常に有用である。
【０００４】
もっとも直接的なＳＮＰの検出方法は２人以上のヒトのゲノムの塩基配列を直接決定し、比較することであり、これには、ゲノムＤＮＡを小さいフラグメントにしてランダムに塩基配列を決定し、コンピュータ処理によってつなぎ合わせる方法（ショットガンシークエンス）と、特定の遺伝子について塩基配列を決定する方法がある。また、オリゴヌクレオチドアレイを用いたＤＮＡチップ（例えば特許文献１）や、一本鎖ＤＮＡが適当な条件下ではＤＮＡ鎖の基本配列に依存して二本鎖となることを利用し、この変化を非変性ゲルでサンプルを電気泳動することによって検出するＳＳＣＰ法、ＤＮＡが陰性荷電しているのに対してカラム・カートリッジが中性であること、陽性荷電したトリエチル・アンモニウムイオン（ＴＥＡＡ)が両者を結合させることを基本原理とし、一本鎖のＤＮＡ断片は陰性荷電の程度が減少しており、二本鎖断片に比較して早く、カラムから溶離することを利用したＤＨＰＬＣ（熱変性高速液体クロマトグラフィ）法などが知られている。
【０００５】
一方、酵素反応を用いたＳＮＰの検出方法としては、Ｓ１ヌクレアーゼなどの一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを用いる方法が知られている。Ｓ１ヌクレアーゼを用いる方法は、Ｓ１ヌクレアーゼが１本鎖のＤＮＡやＲＮＡを分解する酵素であることを利用し、目的の遺伝子のワイルドタイプとミュータントのＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、ハイブリダイゼーションにてミスマッチを含む二本鎖をつくり、これにＳ１ヌクレアーゼを作用させ、ミスマッチの部分を切断、電気泳動にて検出するもので、この方法は非常に簡便であるという利点を有する。
【特許文献１】特開２００５−１０２５７９公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記Ｓ１ヌクレアーゼに代表される一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの至適ｐＨはｐＨ４付近の酸性域であったり、ｐＨ１０付近のアルカリ性域であるため、二本鎖ＤＮＡは解離を起こしやすい。このため、例えばＳ１ヌクレアーゼの至適ｐＨは４．５程度であるが、このｐＨ域でＳＮＰの検出を試みた場合、ミスマッチ部分である一本鎖を認識して切断しているのか、二本鎖ＤＮＡが不安定になって解離を起こして一本鎖となり、この一本鎖部分を認識して切断しているのかわからないため、正確にＳＮＰを認識しているかどうか疑わしいという問題がある。そうといって、二本鎖ＤＮＡの安定性がよい中性付近では、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼは働かないため、ＳＮＰを検出することはできない。
【０００７】
本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、二本鎖核酸の安定性がよい中性付近で、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを用いて核酸内の変異を認識する方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の核酸内の変異認識方法は、ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼとを、該一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中で反応させて、前記二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断し、前記変異を認識することを特徴とするものである。
【０００９】
ここで、核酸とは、塩基、リン酸および糖からなるヌクレオチドを基本単位とし、このリン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合を作ることにより重合した鎖状のポリヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドを意味する。糖部分がリボースかデオキシリボースかによってＲＮＡとＤＮＡに分けられる。
【００１０】
ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸とは、一方の核酸の塩基がシトシン（Ｃ）に対し他方の核酸の塩基がＧ（グアニン）、一方の核酸の塩基がアデニン（Ａ）に対し他方の核酸の塩基がＴ（チミン）（あるいはＵ（ウラシル））という相補的な結合ではない組み合わせ、すなわち、Ｃ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｔ（Ｕ）、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｇという相補的でない塩基の組み合わせを有し、互いに相補的配列部分でハイブリダイズをした二本鎖核酸を意味する。Ｃ−Ｔ（Ｕ）、Ｇ−Ｔ（Ｕ）、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｇという相補的でない塩基の組み合わせは二本鎖核酸に１対であっても、複数対が連続して存在していてもよい。
【００１１】
本発明の核酸内の変異認識方法は、前記切断後に、電気泳動することが好ましい。前記試薬は２−メルカプトエタノールであることが好ましい。
【００１２】
前記一本鎖核酸切断ヌクレアーゼは、Ｓ１ヌクレアーゼ 、マングビーンヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩからなる群より選択されるいずれかであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の核酸内の変異認識方法は、ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼとを、該一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中で反応させるので、二本鎖核酸の解離を生じさせることなく、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を特異的に切断することができ、正確にＳＮＰ等の変異を認識することが可能である。
【００１４】
ジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中でミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを反応させると、なぜ、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの至適ｐＨではないｐＨ域で、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断することができるのか、そのメカニズムは明確ではないが、おそらく、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合が一部切断されることによって一本鎖核酸切断ヌクレアーゼの構造が微妙に変化して、二本鎖核酸の解離が生じないｐＨ域で働くようになったものと推測される。
【００１５】
本発明の核酸内の変異認識方法によれば、電気泳動等によってＳＮＰなどの遺伝子などの変異をより正確かつ簡易に発見することが可能となる。また、遺伝子発現モニタリング、遺伝子の塩基配列決定、遺伝子多型ＳＮＰの解析、癌における遺伝子増幅や欠失、癌等の疾患の分類、薬物応答性の予測、疾患遺伝子の探索など生命科学の広い範囲での応用が期待されているＤＮＡマイクロアレイでは、アレイ上のプローブＤＮＡと完全には相補的ではないが似たような配列をもったターゲットＤＮＡが、アレイ上のプローブＤＮＡと誤ってハイブリダイズする、いわゆるミスマッチ結合を起こす場合があり、このミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡは、検出の際に生じるノイズの一因となり検出精度を低下させるが、２−メルカプトエタノールを含むアルカリ性緩衝液中で一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを反応させることによって、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断することができるので、ミスマッチ結合しているターゲットＤＮＡ等のポリヌクレオチドのみを除去する除去方法としての適用も可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の核酸内の変異認識方法は、ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼとを、該一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬を含むアルカリ性緩衝液中で反応させて、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断し、前記変異を認識することを特徴とする。
【００１７】
アルカリ性緩衝液としては、０．１Ｍリン酸緩衝液（市販のもの、または、リン酸１水素ナトリウム水溶液とリン酸２水素ナトリウム水溶液を適量混合してｐＨを７．４に調整したもの）、または０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（０．１Ｍリン酸緩衝液1リットルにＮａＣｌ９ｇを溶解したもの）を用いることが好ましい。
【００１８】
一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬としては、２−メルカプトエタノールが好ましい。２−メルカプトエタノールの濃度はミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを反応させる温度にもよるが、アルカリ性緩衝液に対して０．００５〜０．０２質量％の濃度であることが好ましい。
【００１９】
一本鎖核酸切断ヌクレアーゼは、Ｓ１ヌクレアーゼ 、マングビーンヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼＩからなる群より選択されるいずれかであることが好ましく、これらの一本鎖核酸切断ヌクレアーゼは単独であっても、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断後、変異を認識する具体的方法としては、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲル等を担体とした電気泳動、キャピラリーを用いるキャピラリー電気泳動等の電気泳動によって分離認識する方法や、熱変性高速液体クロマトグラフィを利用して認識する方法（ＤＨＰＬＣ法）などがあげられる。電気泳動は、核酸サイズ断片の違いによる泳動速度の差が生じ、移動距離にバラつきが出ることを利用するもので、この方法により核酸を長さごとに分離でき、核酸内の変異を認識することができる。
【００２１】
以下、本発明の核酸内の変異認識方法を実施例によりさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２２】
（実施例１）
図１に示す塩基配列を有する７０ｍｅｒのターゲット、プローブ１、プローブ２、プローブ３、プローブ４（プローブ２、プローブ３、プローブ４の塩基配列の下線部分はターゲットに対してミスマッチ部分に相当）のオリゴヌクレオチドを合成し、ターゲットとプローブ１、ターゲットとプローブ２、ターゲットとプローブ３、ターゲットとプローブ４をそれぞれハイブリダイゼーションさせて２本鎖のオリゴヌクレオチド（ｄｕｐｌｅｘ）を得た。図２に、ターゲットに対するプローブ１、プローブ２、プローブ３、プローブ４との相補性の概略図を示す。
【００２３】
図１および２に示すように、プローブ１はターゲットオリゴヌクレオチドに対してパーフェクトマッチをする配列（パーフェクトマッチｄｕｐｌｅｘ−コントロール）、プローブ２は３’末端の下線部分７ｍｅｒ（全配列に対し１０％）がターゲットに対してミスマッチである配列（３’末端ミスマッチｄｕｐｌｅｘ）、プローブ３は５’末端の下線部分７ｍｅｒがターゲットに対してミスマッチである配列（５’末端ミスマッチｄｕｐｌｅｘ）、プローブ４は配列内の下線部分７ｍｅｒがターゲットに対してミスマッチである配列（配列内ミスマッチｄｕｐｌｅｘ）である。
【００２４】
０．０１質量％の２−メルカプトエタノールを添加したアルカリ性緩衝液（ｐＨ８．０）中で、上記４種類のｄｕｐｌｅｘのうち、パーフェクトマッチｄｕｐｌｅｘ、末端ミスマッチｄｕｐｌｅｘ２種に対して、Ｓ１ヌクレアーゼ反応（反応温度：３７℃および５０℃、反応時間：２時間）を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけそれぞれの断片の検出を行い、Ｓ１ヌクレアーゼ活性の評価を行った。
【００２５】
電気泳動の結果を図３に示す。それぞれの電気泳動は、左から順に反応前のｄｕｐｌｅｘ（コントロール）の電気泳動、３７℃でＳ１ヌクレアーゼ反応を行った後の電気泳動、５０度でＳ１ヌクレアーゼ反応を行った後の電気泳動である。パーフェクトマッチｄｕｐｌｅｘはどの条件でもＳ１ヌクレアーゼ活性は観察されなかったが、３’末端、５’末端にミスマッチ配列を有するｄｕｐｌｅｘは３７℃および５０℃の反応温度どちらにおいてもＳ１ヌクレアーゼ活性が観察された。このことからＳ１ヌクレアーゼ活性、特異性はｐＨ８でも維持されていたことが示された。
【００２６】
（実施例２）
上記で作製した配列内ミスマッチｄｕｐｌｅｘに対して、２−メルカプトエタノールの濃度を０．００３質量％および０．０１質量％と変えて、アルカリ性緩衝液（ｐＨ８．０）中、反応温度５０℃、反応時間２時間でそれぞれＳ１ヌクレアーゼ反応を行った後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけそれぞれの断片の検出を行い、Ｓ１ヌクレアーゼ活性の評価を行った。
【００２７】
図４にその結果を示す。図４に示す電気泳動は、左から順に、２−メルカプトエタノールの濃度０（コントロール）、２−メルカプトエタノールの濃度０．００３質量％、２−メルカプトエタノールの濃度０．０１質量％である。２−メルカプトエタノールが添加されていないコントロールのｄｅｐｌｅｘでは、配列内ミスマッチｄｕｐｌｅｘを検出することができなかった。一方、２−メルカプトエタノールの濃度０．００３質量％では、配列内ミスマッチが一部認識され、２−メルカプトエタノールの濃度０．０１質量％では配列内ミスマッチが完全に認識された。このことから、２−メルカプトエタノールが添加されていない場合には、ｐＨ８ではＳ１ヌクレアーゼ活性がなく、２−メルカプトエタノールが添加された場合には、本実施例における反応温度、反応時間では、２−メルカプトエタノールの濃度依存性は認められるものの、Ｓ１ヌクレアーゼ活性、特異性はｐＨ８でも維持されていたことが示された。
【００２８】
なお、本実施例においては相補的でない塩基の組み合わせが配列内に複数対連続したものについて示したが、本発明の核酸内の変異を認識する方法は相補的でない塩基の組み合わせが配列内に１対であっても、検出することができる。従って、ＳＮＰの検出にも有用である。
【００２９】
以上のように、本発明の核酸内の変異認識方法は、一本鎖核酸切断ヌクレアーゼのジスルフィド結合を一部切断する試薬、例えば２−メルカプトエタノールを含むアルカリ性緩衝液中で、ミスマッチ配列を有する二本鎖核酸と一本鎖核酸切断ヌクレアーゼを反応させるので、二本鎖核酸の安定性がよい中性付近で、二本鎖核酸に含まれるミスマッチ配列部分を切断することができ、ミスマッチ結合を正確に認識することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を示す図
【図２】ターゲットに対するプローブの相補性の概略図
【図３】ｄｕｐｌｅｘのＳ１ヌクレアーゼの活性を示す電気泳動
【図４】２−メルカプトエタノールの濃度によるＳ１ヌクレアーゼの活性変化を示す電気泳動
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月18日(2008.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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