(57)【要約】【課題】食道癌に対する、遺伝子レベルの新たな検出方法を提供すること。  【解決手段】食道上皮細胞における特定の１０３種類の遺伝子の変異、例えば、（１）当該遺伝子発現値の低値若しくは高値への偏り、（２）当該遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化、又は、（３）当該遺伝子がコードする蛋白質レベルの低値若しくは高値への偏り、を指標として、当該食道上皮細胞の癌化を検出する、食道癌の検出方法を提供することにより、上記の課題を解決し得ることを見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道上皮細胞における下記の遺伝子：
BARHL2遺伝子、NES遺伝子、CRABP2遺伝子、ISG20L2遺伝子、MRPL24遺伝子、HDGF遺伝子、PRCC遺伝子、SH2D2A遺伝子、NTRK1遺伝子、LHX9遺伝子、TARBP1遺伝子、RMND5A遺伝子
、CD8A遺伝子、SLC2A9遺伝子、WDR1遺伝子、PCDH7遺伝子、FRAS1遺伝子、BTN1A1遺伝子、HMGN4遺伝子、ABT1遺伝子、ZNF184遺伝子、UNC5CL遺伝子、BZRPL1遺伝子、APOBEC2遺伝子、NFYA遺伝子、EYA4遺伝子、PHACTR2遺伝子、MEOX2遺伝子、PRR15遺伝子、TBX20遺伝子、FEZF1遺伝子、GATA4遺伝子、NEIL2遺伝子、FDFT1遺伝子、NFIB遺伝子、MELK遺伝子、PRUNE2遺伝子、FOXB2遺伝子、NIPSNAP3A遺伝子、NIPSNAP3B遺伝子、ADARB2遺伝子、ERCC6遺伝子、PGBD3遺伝子、COL13A1遺伝子、KCNMA1遺伝子、MPHOSPH遺伝子、PCGF5遺伝子、SEMA4G遺伝子、MRPL43遺伝子、PEO1遺伝子、BUB3遺伝子、HMX1遺伝子、FLJ46831遺伝子、CLRN3
遺伝子、PTPRE遺伝子、TRIM68遺伝子、CYP2R1遺伝子、CALCA遺伝子、ZBTB3遺伝子、POLR2G遺伝子、TAF6L遺伝子、NXF1遺伝子、STX5遺伝子、WDR74遺伝子、SLC3A2遺伝子、CHRM1遺伝子、KRT2遺伝子、KRT1遺伝子、SPG20遺伝子、CCNA1遺伝子、EGLN3遺伝子、TITF1遺伝子、NKX2-8遺伝子、PAX9遺伝子、PTGDR遺伝子、PTGER2遺伝子、ONECUP1遺伝子、IQCH遺伝子、LBXCOR1遺伝子、ETFA遺伝子、ISL2遺伝子、DNAJA4遺伝子、WDR61遺伝子、IREB2遺伝子
、NETO2遺伝子、JMJD5遺伝子、SALL1遺伝子、CMTM3遺伝子、LHX1遺伝子、AATF遺伝子、KRT33A遺伝子、KRT33B遺伝子、KRT34遺伝子、KRT31遺伝子、KRT37遺伝子、KRT38遺伝子、KRT32遺伝子、KRT35遺伝子、KRT36遺伝子、KRT13遺伝子、ONECUT2遺伝子、POU3F4遺伝子、
及び、PCDH19遺伝子；
からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子の変異を指標として、当該食道上皮細胞の癌化を検出する、食道癌の検出方法。
【請求項２】
前記検出方法において、食道上皮細胞における前記遺伝子の変異が、食道上皮細胞における、当該遺伝子のゲノムＤＮＡ、当該遺伝子を鋳型として発現するｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ、又は、当該遺伝子がコードする蛋白質、を介して検出される、請求項１記載の食道癌の検出方法。
【請求項３】
前記検出方法において、食道上皮細胞における前記遺伝子の変異が、（１）当該遺伝子発現値の低値若しくは高値への偏り、（２）当該遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化、又は、（３）当該遺伝子がコードする蛋白質レベルの低値若しくは高値への偏り、により検出される、請求項１又は２記載の食道癌の検出方法。
【請求項４】
前記検出方法において、下記（１）〜（３）の検出手段を行う、請求項３記載の食道癌の検出方法。
（１）食道上皮細胞における前記遺伝子発現値の低値若しくは高値への偏りの検出手段が、ＤＮＡチップ法、ノーザンブロット法、又は、ＲＴ−ＰＣＲ法である。
（２）前記遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化の検出手段が、ＣＧＨ法、マスアレイ法、MethylLight法、Methylation-specific ＰＣＲ法、サザンブロット法、Bisulfiteシーケン
ス法、メチレーションチップ法、ＣＯＢＲＡ法、又は、ＢＡＭＣＡ法である。
（３）前記遺伝子がコードする蛋白質レベルの低値若しくは高値への偏りの検出手段が、免疫染色法である。
【請求項５】
前記検出方法において、前記遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化が、CpGアイランドのメチ
ル化である、請求項３又は４記載の食道癌の検出方法。
【請求項６】
前記検出方法において、ＣＧＨ法を前記遺伝子のゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル
化の検出手段として用い、当該ＣＧＨ法において用いる検出用基板に定着させる複数種類のゲノムＤＮＡが、BAC DNA、YAC DNA、又は、PAC DNAの遺伝子増幅産物である、請求項
５記載の食道癌の検出方法。
【請求項７】
前記検出方法において、前記遺伝子のゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル化の検出手
段として、マスアレイ法、Methylation-specific ＰＣＲ法、Bisulfiteシーケンス法、メチレーションチップ法、ＣＯＢＲＡ法、又は、ＢＡＭＣＡ法を用いる、請求項５記載の食道癌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の癌関連遺伝子を指標として用いる癌の検出方法に関する発明である。より具体的には、食道上皮細胞を検体として用いて、当該検体における癌関連遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化等の変異を検出して、食道癌を検出することを特徴とする食道癌の検出方法に関する発明である。
【背景技術】
【０００２】
食道癌（Esophageal carcinoma）は、食道に発生する上皮性由来の腫瘍（癌）である。組織学的分類では、扁平上皮癌（Esophageal Squamous-cell Carcinoma）と腺癌がある。前者は食道の粘膜上皮細胞が癌化するもので、全体の９０％以上を占める。日本人では食道癌全体の９３％を占める。後者は食道腺の細胞が癌化するもので、両者を合わせると食道癌全体の９５％以上を占める。診断法としては、食道造影、内視鏡、超音波内視鏡検査、ＣＴ（コンピュータトモグラフィー）、ＰＥＴ（ポジトロン放射断層撮影装置）等の画像所見とＳＣＣ（扁平上皮癌関連抗原）及びＣＥＡ（癌胎児抗原）等の腫瘍マーカーに基づく方法が知られているが、精度が高いとはいえず、初期に悪性度を含めて診断する事は困難な状況である。一方、食道癌は初期の診断が困難である事も一因であるが、その予後が極めて悪く、手術或いは放射線・化学療法の奏効率が悪い癌である。これはリンパ節転移が多い事と、食道は他の消化器臓器と異なり、漿膜（外膜）を有していないために、比較的周囲に浸潤しやすいことが上げられる。
【０００３】
ごく最近、Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 1B (LRP1B)の発現低下或いは当該ゲノム遺伝子の欠失が食道癌の診断に使用できることが報告された（非特許文献１）。
【非特許文献１】Sonoda I, Imoto I, Inoue J, Shibata T, Shimada Y, Chin K, Imamura M, Amagasa T, Gray J W, Hirohashi S, and Inazawa J: Frequent Silencing of Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein1B(LRP1B) Expression by Genetic and Epigenetic Mechanisms in Esophaseal Squamous Cell Carcinoma, Cancer Research 64, 3741-3747, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現状において、食道癌の遺伝子検査法については、非特許文献１の技術が公知となっているものの、さらに新たな遺伝子検査法を見出し、それらを用いた総合的な食道癌の検出手段の確立が要望されている状況である。すなわち、本発明が解決すべき課題は、食道癌に対する、さらに新たな遺伝子レベルの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一般に、癌細胞では、遺伝子の変異、例えば、ゲノム遺伝子の欠失及び増幅、CpGアイ
ランドのメチル化による発現抑制、ヒストン蛋白質の脱アセチル化による遺伝子の発現抑制、遺伝子点突然変異等、が起こっている場合が多くの例で報告されている。食道癌細胞において、染色体ＤＮＡ及び遺伝子発現について詳細に検討し、食道癌の悪性度及び早期診断に結びつく遺伝子群を探索し、診断の決め手となる遺伝子を見出す事は極めて重要である。さらに、食道癌細胞で特徴的な遺伝子の変化を見出し、遺伝子変化と癌の臨床病理学的所見との相関を解析することにより、食道癌の診断法を確立することができると考えられる。
【０００６】
本発明者等は、ゲノム上での食道上皮細胞由来の癌細胞株でのメチル化の亢進を、ＢＡＭＣＡ法を用いて網羅的に解析した。ＢＡＭＣＡ法は、Bacterial Artificial chromosome array-based Methylated CpG island Amplificationの略称である。本方法の概略を示せば、まず、食道癌細胞と正常食道細胞よりＤＮＡを調製し、制限酵素SmaI（メチル化感受性制限酵素）で消化する。SmaIサイトがメチル化されている場合には、SmaIで消化されないために、次のステップのXmaI（メチル化非感受性制限酵素）消化、アダプターライゲーション、ＰＣＲによる増幅の過程で特異的に標識される。その結果、食道癌細胞由来のゲノムＤＮＡを蛍光色素Cy３で標識し、正常食道細胞に由来するＤＮＡを蛍光色素Cy５で標識し、全染色体を網羅的に解析することが可能な４５２３種類の BAC(Bacterial Artificial Chromosome) DNAを搭載した高密度ゲノムアレイであるMCG Whole Genome Array-4500上で競合ハイブリダイゼーション（Comparative Genomic Hybridization：ＣＧＨ）を行うと、食道癌細胞においてメチル化されたゲノムＤＮＡが存在する場合に、Cy3/Cy5の比が上昇する。この値が特定値以上（例えば、１．５以上）であることを指標として、癌で特異的にメチル化されたＤＮＡ断片に一致する配列を含むBACクローンを同定することができる。この一連のＢＡＭＣＡ法の過程を図１に示す。
【０００７】
本発明者等は、上記の要領による食道上皮細胞由来の癌細胞株の網羅的な解析の結果、食道癌細胞で、CpGアイランドがメチル化されている６１種類のBAC DNAが同定され、その結果よりヒト染色体の２４ヶ所の染色体座位を同定した。さらに、その領域に局在する遺伝子を調べた結果、１０３種類のゲノム遺伝子の同定に成功した。
【０００８】
すなわち、RP11-99A8 (1p22.2)、RP11-82E1 (1p22.2)、RP11-66D17 (1q23.1)、RP11-180B22 (1q23.1)、RP11-73D7 (1q31.3)、RP11-123I5 (1q42.2)、RP11-81F3 (2q11.2)、RP11-17I9 (4p16.1)、RP11-205N12 (4p15.1)、RP11-17P19 (4q21.21)、RP11-81L1 (5q23.2)、RP11-183F3 (6p22.1)、RP11-451M2 (6p22.1)、RP11-71C20 (6p21.33)、RP11-79J5 (6p21.1)、RP11-177M14 (6q23.2)、RP11-436I24 (6p24.2)、RP11-89B15 (7p21.2)、RP11-34N11(7p15.1)、RP11-115G23 (7p14.3)、RP11-97P11 (7p11.2)、RP11-48O1 (7q31.32)、RP11-235I5 (8p23.1)、RP11-413C16 (9p22.3)、RP11-12P15 (9p13.2)、RP11-159H20 (9q21.13)、RP11-413C10 (9q31.1)、RP11-79H9 (10p15.3)、RP11-66F24 (10p12.31-12.2)、RP11-92I18 (10q11.23)、RP11-52K17 (10q21.3)、RP11-17O5 (10q22.3)、RP11-428P16 (10q22.3)、RP11-248C1 (10q23.3)、RP11-90B18(10q23.3)、RP11-37L21 (10q24.3)、RP11-162A23 (10q26.12)、RP11-88B12 (10q26.2)、RP11-90P9 (11p15.4)、RP11-91I5 (11p15.2)、RP11-49D19 (11q12.3) 、 RP11-97N16 (12q13.1) 、RP11-91K18 (13q13.3) 、RP11-105F9 (14q13.1) 、RP11-458A21 (14q13.3) 、RP11-262M8 (14q22.1) 、RP11-209K10 (15q21.2) 、RP11-85E15 (15q23) 、RP11-207J8 (15q23) 、RP11-79J21 (15q24) 、RP11-10K12 (15q24) 、RP11-215M5 (16q12.1)、RP11-209I14 (16q12.1)、RP11-424K7 (16q12.1)、RP11-3A9 (16q21)、RP11-81D5 (17q12)、RP11-29C11 (17q21.2)、RP11-79L5 (18q21.31)、RP11-124D1 (20q13.1)、RP11-246G22 (Xq21.1)、RP11-99E24 (Xq22.1)のBAC DNAが、上述した網羅的検討により見出された。
【０００９】
そして、これらのBAC DNAの中に含まれる１０３種のゲノム遺伝子、具体的には、BARHL2遺伝子（GenBank番号：NM_020063.1）、NES遺伝子（GenBank番号：NM_006617.1）、CRABP2遺伝子（GenBank番号：NM_001878.2）、ISG20L2遺伝子（GenBank番号：NM_030980.1）、MRPL24遺伝子（GenBank番号：NM_145729.1）、HDGF遺伝子（GenBank番号：NM_004494.1）、PRCC遺伝子（GenBank番号：NM_199416.1）、SH2D2A遺伝子（GenBank番号：NM_003975.2）、NTRK1遺伝子（GenBank番号：NM_001007792.1）、LHX9遺伝子（GenBank番号：NM_001014434.1）、TARBP1遺伝子（GenBank番号：NM_005646.3）、RMND5A遺伝子（GenBank番号：NM_022780.2）、CD8A遺伝子（GenBank番号：NM_001768.5）、SLC2A9遺伝子（GenBank番号：NM_020041.2）、WDR1遺伝子（GenBank番号：NM_005112.4）、PCDH7遺伝子（GenBank番号：NM_032457.1）、FRAS1遺伝子（GenBank番号：NM_025074.4）、BTN1A1遺伝子（GenBank番号：NM_001732.1）、HMGN4遺伝子（GenBank番号：NM_006353.2）、ABT1遺伝子（GenBank番号：NM_013375.2）、ZNF184遺伝子（GenBank番号：NM_007149.1）、UNC5CL遺伝子（GenBank番号：NM_173561.1）、BZRPL1遺伝子（GenBank番号：NM_001010873.1）、APOBEC2遺伝子（GenBank番号：NM_006789.2）、NFYA遺伝子（GenBank番号：NM_021705.2）、EYA4遺伝子（GenBank番号：NM_172105.2）、PHACTR2遺伝子（GenBank番号：NM_014721.1）、MEOX2遺伝子（GenBank番号：NM_005924.4）、PRR15遺伝子（GenBank番号：NM_175887.2）、TBX20遺伝子（GenBank番号：NM_001077653.1）、FEZF1遺伝子（GenBank番号：NM_001024613.1）、GATA4遺伝子（GenBank番号：NM_002052.2）、NEIL2遺伝子（GenBank番号：NM_145043.1）、FDFT1遺伝子（GenBank番号：NM_004462.3）、NFIB遺伝子（GenBank番号：NM_005596.2）、MELK遺伝子（GenBank番号：NM_014791.2）、PRUNE2遺伝子（GenBank番号：NM_138818.2）、FOXB2遺伝子（GenBank番号：NM_001013735.1）、NIPSNAP3A遺伝子（GenBank番号：NM_015469.1）、NIPSNAP3B遺伝子（GenBank番号：NM_018376.2）、ADARB2遺伝子（GenBank番号：NM_018702.1）、ERCC6遺伝子（GenBank番号：NM_000124.1）、PGBD3遺伝子（GenBank番号：NM_170753.1）、COL13A1遺伝子（GenBank番号：NM_080814.2）、KCNMA1遺伝子（GenBank番号：NM_002247.2）、MPHOSPH遺伝子（GenBank番号：NM_016195.2）、PCGF5遺伝子（GenBank番号：NM_032373.3）、SEMA4G遺伝子（GenBank番号：NM_017893.2）、MRPL43遺伝子（GenBank番号：NM_176792.1）、PEO1遺伝子（GenBank番号：NM_021830.3）、BUB3遺伝子（GenBank番号：NM_004725.2）、HMX1遺伝子（GenBank番号：NM_005519.1）、FLJ46831遺伝子（GenBank番号：NM_207426.1）、CLRN3遺伝子（GenBank番号：NM_152311.1）、PTPRE遺伝子（GenBank番号：NM_006504.3）、TRIM68遺伝子（GenBank番号：NM_018073.5）、CYP2R1遺伝子（GenBank番号：NM_024514.4）、CALCA遺伝子（GenBank番号：NM_001741.2）、ZBTB3遺伝子（GenBank番号：NM_024784.2）、POLR2G遺伝子（GenBank番号：NM_002696.1）、TAF6L遺伝子（GenBank番号：NM_006473.2）、NXF1遺伝子（GenBank番号：NM_006362.3）、STX5遺伝子（GenBank番号：NM_003164.3）、WDR74遺伝子（GenBank番号：NM_018093.1）、SLC3A2遺伝子（GenBank番号：NM_002394.4）、CHRM1遺伝子（GenBank番号：NM_000738.2）、KRT2遺伝子（GenBank番号：NM_000423.2）、KRT1遺伝子（GenBank番号：NM_006121.3）、SPG20遺伝子（GenBank番号：NM_015087.3）、CCNA1遺伝子（GenBank番号：NM_003914.2）、EGLN3遺伝子（GenBank番号：NM_022073.2）、TITF1遺伝子（GenBank番号：NM_001079668.1）、NKX2-B遺伝子（GenBank番号：NM_014360.2）、PAX9遺伝子（GenBank番号：NM_006194.1）、PTGDR遺伝子（GenBank番号：NM_000953.2）、PTGER2遺伝子（GenBank番号：NM_000956.2）、ONECUP1遺伝子（GenBank番号：NM_004498.1）、IQCH遺伝子（GenBank番号：NM_001031715.1）、LBXCOR1遺伝子（GenBank番号：NM_001031807.1）、ETFA遺伝子（GenBank番号：NM_000126.2）、ISL2遺伝子（GenBank番号：NM_145805.1）、DNAJA4遺伝子（GenBank番号：NM_018602.2）、WDR61遺伝子（GenBank番号：NM_025234.1）、IREB2遺伝子（GenBank番号：NM_004136.1）、NETO2遺伝子（GenBank番号：NM_018092.3）、JMJD5遺伝子（GenBank番号：NM_024773.1）、SALL1遺伝子（GenBank番号：NM_002968.2）、CMTM3遺伝子（GenBank番号：NM_181553.1）、LHX1遺伝子（GenBank番号：NM_005568.2）、AATF遺伝子（GenBank番号：NM_012138.3）、KRT33A遺伝子（GenBank番号：NM_004138.2）、KRT33B遺伝子（GenBank番号：NM_002279.3）、KRT34遺伝子（GenBank番号：NM_021013.3）、KRT31遺伝子（GenBank番号：NM_002277.2）、KRT37遺伝子（GenBank番号：NM_003770.4）、KRT38遺伝子（GenBank番号：NM_006771.3）、KRT32遺伝子（GenBank番号：NM_002278.3）、KRT35遺伝子（GenBank番号：NM_002280.4）、KRT36遺伝子（GenBank番号：NM_003771.4）、KRT13遺伝子（GenBank番号：NM_153490.1）、ONECUT2遺伝子（GenBank番号：NM_004852.2）、POU3F4遺伝子（GenBank番号：NM_000307.2）、及び、PCDH19遺伝子（GenBank番号：NM_020766.1）において、CpGアイランドが高頻度にメチル化されていることを見出した。
【００１０】
これにより、食道癌細胞では、上記の遺伝子（以下、本明細書において、これらの遺伝子を「食道癌関連遺伝子」と記載する場合がある）のゲノムＤＮＡのCpGアイランドが高頻度にメチル化される変異が認められ、当該ゲノムＤＮＡのCpGアイランドにおけるメチル化を指標として、食道癌を検出することが可能であることが明らかになった。また、一般に、ゲノムＤＮＡのCpGアイランドにおけるメチル化は、当該ゲノムＤＮＡに係わる遺伝子の働きを不活性化することが知られており、CpGアイランドにおけるメチル化は、食道癌を示す指標となり得ることが明らかとなった。
【００１１】
すなわち、本発明は、食道上皮細胞における、上記の食道癌関連遺伝子から選ばれる１種以上における、当該遺伝子のゲノムＤＮＡにおけるCpGアイランドのメチル化等の変異を指標として、当該食道上皮細胞の癌化を検出する食道癌の検出方法（以下、本検出方法ともいう）を提供する発明である。
【００１２】
本検出方法において、上記の食道癌関連遺伝子の変異を検出する対象となる食道上皮細胞は、検体提供者の生検組織細胞が好適である。この検体組織細胞は、健常人の食道細胞か、食道癌患者の当該食道癌組織であるかを問わないが、現実的には、１）内視鏡検査等の結果、食道に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織、または、２）食道癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある食道癌の組織、等が主な対象となり得る。
【００１３】
後述するように、本検出方法における「食道癌関連遺伝子の変異」は、（１）食道上皮細胞における前記遺伝子発現値の低値若しくは高値への偏り、（２）食道癌関連遺伝子のゲノムＤＮＡのメチル化、（３）食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質レベルの低値若しくは高値への偏り、等として検出される。本検出方法により、「内視鏡検査等の結果、食道に癌化が疑われる病変部が認められた場合の当該病変組織」における、上記食道癌関連遺伝子の異常が認められた場合には、当該病変組織は癌化に向かって進行しているか或いは既に癌化の状態であり、かつ、悪性度が高くなりつつある可能性があることが判明し、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。また、「食道癌であることが確定しているが、その悪性度や進行度を判定する必要がある食道癌の組織」における、上記食道癌関連遺伝子の異常が認められた場合にも、当該食道癌組織の悪性度が高くなりつつあり、かつ、リンパ節転移が疑われる場合がある。よって、早急な本格的治療（手術等による病変部の除去、リンパ節隔清、本格的な化学療法等）を行う必要性が示される。検体として採取された食道細胞組織は、必要な処理、例えば、採取された組織からのＤＮＡ或いはＲＮＡの調製を行い、本検出方法を行う対象とすることができる。
【００１４】
本検出方法において、上記の食道癌関連遺伝子の変異は、食道上皮細胞における、当該遺伝子のゲノムＤＮＡ、当該遺伝子を鋳型として発現するｍＲＮＡ、当該ｍＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ、又は、当該遺伝子がコードする蛋白質、を介して検出される。
【００１５】
そして、当該変異の検出は、ＣＧＨ（Comparative Genomic Hybridization）法、マス
アレイ法、Methylation-specific ＰＣＲ法、MethylLight法、サザンブロット法、Bisulfiteシーケンス法、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法、ＢＡＭＣＡ（Bacterial artificial chromosome array-based methylated CpG island amplification）法、メチレーションチップ法（以上、ＤＮＡのメチル化の検出に好適な手段）；
ＤＮＡチップ法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法（以上、発現するｍＲＮＡレベルの検出に好適な手段）；免疫染色法（蛋白質レベルを検出）等の手段にて行うことができる。
【００１６】
本検出方法は、上述したように、食道上皮細胞における上記の食道癌関連遺伝子の異常を検出することにより、当該細胞の癌化を特定することが可能である。この食道癌関連遺伝子の異常の主要な原因の一つとして、当該遺伝子のゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル化が挙げられる。
【００１７】
CpGアイランドのメチル化による不活性化については、CpGリッチプロモーター及びエキソン領域を密にメチル化すると転写不活化がおこることが報告されている（Bird, A.P. &
Wolffe, A.P.: Methylation-induced repression-belts, braces, and chromatin, Cell
99, 451-454, 1999）。癌細胞では、CpGアイランドはそれ以外の領域と比較すると高い頻度で密にメチル化されており、プロモーター領域のHypermethylationは、ヒト癌での癌抑制遺伝子の不活化に深く関与している（Ehrlich, M., Jiang, G., Fiala, E., Dome, J.S., Yu, M.C., Long, T.I., Youn, B., Sohn, O.S., Widschwendter, M., Tomlinson, G.E., Chintagumpala, M., Champagne, M., Parham, D., Liang, G., Malik, K. & Laird,
P.W.: Hypomethylation and hypermethylation of DNA in Wilms tumors, Oncogene, 21, 6694-6702, 2002）。
【００１８】
上記の食道癌関連遺伝子における変異が、ゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル化である場合には、ＣＧＨ法を用いることは、本検出方法の有利な形態の一つであり、さらに、当該ＣＧＨ法において用いる検出用基板に定着させる複数種類のゲノムＤＮＡが、BAC DNA、YAC(Yeast Artificial Chromosome) DNA、又は、PAC(Phage Artificial Chromosome) DNA（以下、BAC DNA等ともいう）の遺伝子増幅産物であることが有利である。
【００１９】
通常に得られるBAC DNA等は、ゲノムＤＮＡ定着基板を多数製造して実用化するには少量であるので、当該ＤＮＡを遺伝子増幅産物として得る必要がある（この遺伝子増幅行程を「無尽蔵化又は無尽資源化」ともいう）。無尽蔵化においては、まずBAC DNA等を、４塩基認識酵素、例えば、RsaI、DpnI、HaeIII等で消化した後、アダプターを加えてライゲーションを行う。アダプターは１０〜３０塩基、好適には１５〜２５塩基からなるオリゴヌクレオチドで、２本鎖は相補的配列を有し、アニーリング後、平滑末端を形成する側の3'-末端のオリゴヌクレオチドをリン酸化する必要がある。次に、アダプターの一方のオリゴヌクレオチドと同一配列部分を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅し、無尽蔵化することができる。一方、各BAC DNA等に特徴的な５０〜７０塩基のアミノ化オリゴヌクレオチドを、アレイ上にスポットし、検出基板上で使用することもできる。
【００２０】
このようにして無尽蔵化したBAC DNA等を基板上、好適には固体基板上に定着させるこ
とにより、所望するＤＮＡ定着基板を製造することができる。固体基板としては、ガラス、プラスチック、メンブレン、３次元アレイ等があげられ、スライドガラス等のガラス基板が好ましい。ガラス等の固体基板は、ポリ-L-リジン、アミノシラン、金・アルミニウム等の凝着により基板をコートすることがより好ましい。
【００２１】
上記の無尽蔵化したＤＮＡを基板上にスポットして乾燥させることにより、無尽蔵化したBAC DNA等を基板上、好適には固体基板上に定着させることにより、所望するＤＮＡ定着基板を製造することができる。
【００２２】
さらに、上記の食道癌関連遺伝子のゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル化の検出手段として、上記した遺伝子のメチル化の検出手段のうち、マスアレイ法、Methylation-specific ＰＣＲ法、Bisulfiteシーケンス法、メチレーションチップ法、ＣＯＢＲＡ法、及び、ＢＡＭＣＡ法等を好適に用いることができる。
【００２３】
マスアレイ法は、塩基特異的切断反応とMALDI-TOF MSを組み合わせた定量的ＤＮＡメチル化解析システムで、２００〜６００塩基対内の個々のCpGサイトのメチル化比率を定量可能であり、メチル化プロファイルの作成ができる。
【００２４】
Methylation-specific ＰＣＲ法は、ＤＮＡに対してBisulfite処理を行い、メチル化されていないシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換する。メチル化されたＣは変換されないので、それを認識するプライマーを用いてＰＣＲを行うと、メチル化された配列だけが増幅し検出できる。このMethylation-specific ＰＣＲ法を改良し、リアルタイムＰＣＲを用いて定量する方法としてMethylLight法が知られている。
【００２５】
Bisulfiteシーケンス法は、ＤＮＡをBisulfite処理することにより、メチル化されていないシトシン（Ｃ）はウラシル（Ｕ）となり、処理後のＤＮＡをＰＣＲで増幅するとメチル化されていないＣはチミン（Ｔ）となり、メチル化されたＣはＣのままとなるため、それをシーケンス解析により判定できる。
【００２６】
メチレーションチップ法は、ターゲットＤＮＡをBisulfite処理しビオチンを導入した試料をＰＣＲ法により作成し、異なる種類のＤＮＡオリゴマーを多数固定した基板でハイブリダイズさせる。次に、ストレプトアビジン-山葵パーオキシダーゼおよび発色基質溶液を用いて、特異的にハイブリダイズしたターゲットＤＮＡを発色反応により可視化する。これによりハイブリダイズする領域のメチルの程度を定量できる。
【００２７】
ＣＯＢＲＡ(Combined Bisulfite Restriction Analysis)法は、Methylation-specificＰＣＲ法と制限酵素での消化を組み合わせたメチル化ＤＮＡの定量法である。Methylation-specific ＰＣＲ法を行った後に制限酵素での消化を行いアガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分離する。制限酵素消化後の断片に含まれるCGCG配列のメチル化の定量について述べる。Ｃがメチル化されていない場合には、Bisulfite処理とその後のＰＣＲ反応によりＴに変換されるため、CGCG配列はTGTG配列に変化する。CGCG配列を認識する制限酵素BstUIで消化するとメチル化されている場合は本断片が消化され短くなった断片が生成する。しかし、メチル化されていない場合には消化されないため元のサイズの断片のままであり、この断片の大きさの違いをアガロースゲル電気泳動による分離で検出し、各断片の量を、デンシトメーター等にて定量する。また、ＢＡＭＣＡ法の説明は図１に記載した。
【００２８】
上記の食道癌関連遺伝子の変異の確認は、遺伝子の転写産物、すなわち、検体における、上記の食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質の存在又は不存在、あるいは、増量又は減量、すなわち、食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質レベルの低値若しくは高値への偏りを検出することにより行うことができる。代表的な方法として、免疫染色法を挙げることができる。すなわち、検体（代表的には食道癌組織の標本）における、上記の食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質を、当該蛋白質に対して特異的な抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体：既知の食道癌関連遺伝子又は当該食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質（通常は組換蛋白）を用いて常法により調製することが可能であり、対象遺伝子の種類によっては市販もされている）を用いて直接的（標識された上記の食道癌関連遺伝子がコードする蛋白質に対する抗体を用いた直接抗体結合法）、又は、好適には間接的に（標識された第２若しくは第３抗体を用いた二重抗体法又は三重抗体法）検出することが可能である。かかる免疫染色法は常法に従い行うことができる。
【００２９】
上記の食道癌関連遺伝子の欠失は、ゲノムＤＮＡのCpGアイランドのメチル化に比べれば、頻度はそれほど多くない。遺伝子欠失の検出を直接的に行うことができる代表的方法として、上記のＣＧＨ法とＦＩＳＨ法[蛍光in situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ:
Fluorescence in situ hybridization）: Yasui,K., Imoto,I., Fukuda,Y., Pimkahaokham,A., Yang,Z.Q., Naruto,T., Shimada,Y., Nakamura,Y., and Inazawa: Identification of target genes within an amplicon at 14q12-q13 in esophageal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 32, 112-118, 2001]を挙げることができる。
【００３０】
また、上記の食道癌関連遺伝子の欠失を直接的に検出する手段の一つとしてサザンブロット法を挙げることができる。サザンブロット法は、検体から得られるゲノムＤＮＡを制限酵素消化し、それを電気泳動後、ニトロセルロース膜上に固定し、これと、食道癌関連遺伝子とのハイブリダイズを検出することにより、検体中の当該遺伝子の存在を検出する方法である。また、検体から得られるｍＲＮＡをニトロセルロース膜に固定するノーザンブロット法を用いることも可能である。
【００３１】
このノーザンブロット法等のｍＲＮＡを基に食道癌関連遺伝子の欠失等を検出する場合に用いるｃＤＮＡは、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法により得られる遺伝子増幅産物を用いることができる。また、ｍＲＮＡを基に食道癌関連遺伝子の欠失等の検出には、ＤＮＡチップ法も好適である。すなわち、食道上皮細胞における前記遺伝子発現値の低値若しくは高値への偏りの検出に好適な手段として、ＤＮＡチップ法、ノーザンブロット法、又は、ＲＴ−ＰＣＲ法を挙げることができる。
【発明の効果】
【００３２】
本発明により、遺伝子解析による優れた食道癌の検出手段が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
［参考例１］多数の癌関連遺伝子を搭載した高密度ＣＧＨアレイの作製
National Cancer for Biotechnology Information及びUniversity of California Santa Cruz Biotechnologyのゲノムデータベースウエブサイト並びに選択されたＤＮＡのBLAST検索の結果から、ヒトゲノムのユークロマチン領域に存在する４５２３種類のBAC/PACクローンを選択した。
【００３４】
BAC及びPAC DNAをDpnI、RsaI、HaeIIIで消化し、その後アダプター合成オリゴヌクレオチドとのライゲーションを行った。次に、アダプターの配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを２回行った。このプロセスを無尽蔵化といい、得られたＤＮＡを無尽蔵化ＤＮＡと定義する。無尽蔵化ＤＮＡをインクジェットタイプのスポッター（GENESHOT、NGK Insulators、名古屋）を使用してDuplicateでアレイ上にスポットして、所望の高密度ＣＧＨアレイを作製した（MCG Whole Genome Array-4500）。
【００３５】
［実施例］  食道扁平上皮癌細胞のゲノムＤＮＡメチル化の状況
食道扁平上皮癌細胞でどのような染色体遺伝子が高度にメチル化されているかを、ＢＡＭＣＡ法を用いて調べた。図２は、ＢＡＭＣＡ法を用いた解析の要約と結果の一部を示している。ＢＡＭＣＡ法を用いた解析の実例は、[Misawa A., Inoue J., Sugino Y., Hosoi
H., Sugimoto T., Hosoda F., Ohki M., Imoto I., Inazawa J.: Methylation-associated silencing of the nuclear receptor 1I2 gene in advanced-type neuroblastomas, identified by bacterial artificial chromosome array-based methylated CpG island amplification, Cancer Research 65, 10233-10242, 2005]に報告されている。
【００３６】
食道扁平上皮癌細胞株としてTE-4、TE-5、KYSE-150、KYSE-510を用いた。正常な食道上皮細胞として正常食道上皮由来細胞株NEK2を用いた。癌細胞と正常細胞からＤＮＡを調製し、MCG Whole Genome Array-4500を用いてＢＡＭＣＡ法での解析を行った（図２の番号１と１１を参照）。上記４種類の食道扁平上皮癌細胞でCy3(癌細胞)/Cy5(コントロール正常細胞)の比が１．５以上を示す高度にメチル化されている染色体ＤＮＡに相当するBACクローンは６１種類でその中に１０３種類の遺伝子を含んでいた（図２の番号２を参照）。
【００３７】
表１−１〜９に、上記の要領で選択した６１種類のＢＡＣクローンとそれらのクローンに含まれる１０３種類の遺伝子群を表示する(No.(1st)で表示)。これらの１０３種類の遺伝子は、全て、食道癌関連遺伝子であると認められる。
【００３８】
【表１−１】
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【００３９】
【表１−２】
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【００４０】
【表１−３】
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【００４１】
【表１−４】
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【００４２】
【表１−５】
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【００４３】
【表１−６】
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【００４４】
【表１−７】
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【００４５】
【表１−８】
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【００４６】
【表１−９】
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【００４７】
また、図２の番号２１と３に示すように、当該表１−１〜９では、転写開始部位に近い領域おけるCpGアイランドの有無(有りはyes/無しはnoにて表示)と、当該近傍領域における制限酵素SmaI認識配列を有する遺伝子群の有無（有りは＋/無しは−で表示）を解析した結果を示している。この解析は、http://genome.ucsc.edu/を使用して行った。さらに多数の組織及び癌での発現プロファイルを、http://www.lsbm.org/database/index.html及びhttp://www.ncbi.nih.gov/index.htmlを使用して検討し、食道扁平上皮癌細胞で高度にメチル化されているために発現が著しく低下している５８種類の遺伝子を選び出した(No.(2nd)で表示)。上記表と重複するが、これら５８種類の遺伝子群を、下記に示す。これらの遺伝子群は、特に、食道癌関連遺伝子として、強い感受性を有する遺伝子であり、本願発明を構成する食道癌関連遺伝子の中でも、特に好適なものである。
【００４８】
「BARHL2遺伝子、NES遺伝子、CRABP2遺伝子、ISG20L2遺伝子、HDGF遺伝子、NTRK1遺伝子、LHX9遺伝子、TARBP1遺伝子、RMND5A遺伝子、CD8A遺伝子、WDR1遺伝子、PCDH7遺伝子、FRAS1遺伝子、HMGN4遺伝子、ABT1遺伝子、ZNF184遺伝子、NFYA遺伝子、EYA4遺伝子、PRR15遺伝子、TBX20遺伝子、GATA4遺伝子、NEIL2遺伝子、FDFT1遺伝子、NFIB遺伝子、PRUNE2遺伝子、FOXB2遺伝子、NIPSNAP3Ｂ遺伝子、ADARB2遺伝子、ERCC6遺伝子、COL13A1遺伝子、KCNMA1遺伝子、MPHOSPH遺伝子、PCGF5遺伝子、SEMA4G遺伝子、MRPL43遺伝子、PEO1遺伝子、HMX1遺伝子、FLJ46831遺伝子、PTPRE遺伝子、CYP2R1遺伝子、ZBTB3遺伝子、CCNA1遺伝子、EGLN3遺伝子、NKX2-8遺伝子、PTGDR遺伝子、PTGER2遺伝子、ONECUP1遺伝子、IQCH遺伝子、ETFA遺伝子、ISL2遺伝子、DNAJA4遺伝子、JMJD5遺伝子、SALL1遺伝子、CMTM3遺伝子、LHX1遺伝子、ONECUT2遺伝子、POU3F4遺伝子、PCDH19遺伝子」
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＢＡＭＣＡ法の手順の概略を示した図面である。
【図２】ＢＡＭＣＡ法を用いた解析の要約と結果の一部を示した図面である。
【図１】
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【図２】
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