(57)【要約】【課題】  小麦における外国産品種、特にオーストラリア産麺用小麦銘柄の混入の有無を明らかにするため、その構成品種を判別するDNAマーカーを開発すること。【解決手段】  Glu-A1遺伝子座にコードされるオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによるオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別方法、当該遺伝子型を検出し得るオリゴヌクレオチド、並びに当該オリゴヌクレオチドを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用キットを提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Glu-A1遺伝子座にコードされるオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによる、オーストラリア産麺用小麦銘柄の判別方法。
【請求項２】
遺伝子型の判定を、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出することにより行なう、請求項１に記載の判別方法。
【請求項３】
変異の検出を、配列番号２〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を用いて行なう、請求項１又は２に記載の判別方法。
【請求項４】
変異の検出を、配列番号２〜１０に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種、及び配列番号１１〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種を組み合わせたプライマーセットを用いた、小麦試料から抽出した核酸を鋳型とする遺伝子増幅反応によって行なう、請求項１〜３のいずれかに記載の判別方法。
【請求項５】
配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出し得るオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号２〜２１のいずれかに示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなる請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
請求項５又は６に記載のオリゴヌクレオチドを含む、オーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小麦原料として用いられるオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦を用いた製品には、うどん、パン、中華麺など様々な製品がある。食品の安全性と信頼性への関心の高まりから、国産小麦への需要が高まっている。
しかし、国産小麦は外国産小麦に比べて加工品質が劣るものが多く、国産小麦１００％使用を銘打ちながら、外国産小麦をブレンドして加工品質を改良した製品が販売される偽装表示が大きな問題となっている。
それゆえ、原料小麦を明らかにする要望が、消費者をはじめとして小麦粉流通業者や食品加工業者などから高まっている。
【０００３】
ASWN (Australian Standard White Noodle)は、オーストラリア産の麺用小麦品種である「Arrino」や「Cadoux」、「Eradu」、「Calingiri」などがブレンドされた、オーストラリア産の日本麺用小麦銘柄である。このASWNは、うどんの主要原料であるほか、そうめんや即席麺の主原料としても広く流通しており、国産小麦への混入の可能性が高い小麦である。
【０００４】
小麦の判別については、いくつかの蛋白質の組成の違いを組み合わせて品種を判別する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、既知の検出手法は複雑な上、特定の外国産小麦を判別できるものではなかった。
そこで、ASWN等の外国産小麦を容易に判別できる方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開2005-69935号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、小麦における外国産品種、特にASWNの混入の有無を明らかにするため、その構成品種を判別するＤＮＡマーカーを開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グルテンを構成するタンパク質の１つである高分子量グルテニン・サブユニットの内、Glu-A1遺伝子座にコードされる新規な型の遺伝子を、ASWNにブレンドされるオーストラリアの軟質小麦品種であるCalingiriが持っていることを見出した（配列表の配列番号１参照）。そして、その新規な遺伝子型の塩基配列と、既知の配列とを比較することにより決定した多型（図１参照）をもとに、Calingiriを含むASWNの存在の有無を検出する方法を開発した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、Glu-A1遺伝子座にコードされるオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによる、オーストラリア産麺用小麦銘柄の判別方法である。
請求項２に記載の本発明は、遺伝子型の判定を、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出することにより行なう、請求項１に記載の判別方法である。
請求項３に記載の本発明は、変異の検出を、配列番号２〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を用いて行なう、請求項１又は２に記載の判別方法である。
請求項４に記載の本発明は、変異の検出を、配列番号２〜１０に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種、及び配列番号１１〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種を組み合わせたプライマーセットを用いた、小麦試料から抽出した核酸を鋳型とする遺伝子増幅反応によって行なう、請求項１〜３のいずれかに記載の判別方法である。
請求項５に記載の本発明は、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出し得るオリゴヌクレオチドである。
請求項６に記載の本発明は、配列番号２〜２１のいずれかに示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなる請求項５に記載のオリゴヌクレオチドである。
請求項７に記載の本発明は、請求項５又は６に記載のオリゴヌクレオチドを含む、オーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ASWNの構成品種を判別できるDNAマーカーを提供することにより、小麦におけるASWNの混入の有無を簡便かつ迅速に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のオーストラリア産の麺用小麦銘柄の判別方法は、Glu-A1遺伝子座にコードされるオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによってASWNを判別することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において「オーストラリア産の麺用小麦銘柄」とは、Australian Standard White Noodle（ASWN）を指す。ASWNは、上述のように、オーストラリアの麺用小麦品種のうちArrinoやCadoux、Eradu、Calingiriなど、うどんに適した品種をブレンドした日本麺用小麦銘柄である。
本発明において判別対象とするASWNとは、特に「Calingiri」または「Calingiri」と同じ遺伝子を持つ品種を含むものである。近年市場で流通しているASWNにおいては、Calingiriが極めて高い含量でブレンドされている。実際、下記の実施例では、2002〜2006年に輸入されたASWNからはCalingiri由来のGlu-A1遺伝子が検出され、特に2006年輸入のASWNでは半数をCalingiriが占めていることが分かった。
本発明の方法において小麦粉を試料とする場合には、試料中のCalingiri含有量は特に制限されず、極微量でもCalingiriが含まれていれば判別可能である。
本発明の方法によれば、国内品種であるか海外品種であるかを問わず、全ての小麦品種とCalingiriを区別することができる。
【００１２】
本発明の被検体である小麦試料とは、小麦植物体のどの組織でも使用可能である。例えば、種子、葉、茎などを試料とすることができ、小麦粉も使用可能である。
本発明において小麦試料から核酸を抽出する方法としては、通常用いられる方法を採用することができ、例えば、市販のDNA抽出キットなどを用いてそのプロトコルに従って行なう方法が挙げられる。
なお、本発明において核酸とは、DNAであってもRNAであってもよい。
【００１３】
Glu-A1遺伝子座には、１型、２*型及び欠失型と呼ばれる３種の遺伝子型が存在することが既に知られている。国内品種の「ホクシン」と「ハルユタカ」、オーストラリアの小麦品種である「Aroona」と「Eradu」が１型、「農林61号」をはじめとする農林登録品種の十数品種や、オーストラリアの麺用小麦品種である「Arrino」、「Cadoux」、北米のパン用品種である「AC Barrie」、「AC Domain」、「AC Majestic」、「Grandin」など大半の海外品種が２*型、「さぬきの夢2000」と「ふくさやか」を含む国産麺用小麦の大半が欠失型である。
【００１４】
本発明において、ASWNに特徴的に配合されているオーストラリアの麺用小麦品種である「Calingiri」のGlu-A1のDNA配列がはじめて決定され、当該配列が１型、２*型、欠失型の配列とは異なることが明らかとなった。そして、これらの４つの遺伝子型のDNA配列を比較した結果、配列表の配列番号１に示すCalingiriのGlu-A1のうち、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位において、Calingiriに特異的な一塩基多型を見出した（図１参照）。
本発明において、「Glu-A1遺伝子座にコードされるASWNに特異的な遺伝子型」とは、上記したCalingiri特有のGlu-A1遺伝子型のことである。
【００１５】
本発明の方法では、上記の一塩基多型を検出することによって、Glu-A1遺伝子座にコードされる遺伝子型を判定、つまり配列番号１に示すCalingiri特異的なGlu-A1遺伝子型の有無を判定する。すなわち、被検体である小麦の核酸について上記の多型部位の塩基を調べ、配列番号１の第１５１位がチミン、第２４１位がグアニン、第２５４位がアデニン、第２７８位がシトシン、第３３５位がシトシン、第３４２位がアデニン、第５１９位がグアニン、第７０２位がアデニン、第８０５位がアデニン、第８９４位がチミン、第１００１位がシトシン、第１０２９位がチミン、第１２６７位がアデニン、第１３０１位がアデニン、第１４０１位がアデニン、第１５７１位がチミン、第１６４９位がアデニン、第１７３０位がアデニン、第１７６６位がグアニン、第１７６８位がグアニン、第１９３８位がチミン、第１９４１位がグアニン、又は第１９７８位がアデニンであることが判明した場合には、当該被検体にCalingiri特異的遺伝子型が含まれていることが分かる。そして、当該遺伝子型が含まれていると認められた場合は、試料中にASWNが含まれていることが分かる。
【００１６】
本発明において、上記したCalingiri特異的な変異を検出する方法は特に限定されず、一般的に遺伝子多型を検出するために用いられている方法、例えばPCR法やリアルタイムPCR法などの遺伝子増幅法、遺伝子増幅反応と制限酵素処理を組み合わせる方法、ハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法などを採用することができる。
【００１７】
PCR法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、被検体から抽出した核酸を鋳型として、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計したプライマーを用いてPCRを行なった後、電気泳動によりCalingiri特異的な増幅産物が得られたか否かを調べることによって行うことができる。当該増幅断片が得られていた場合には、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいることが分かる。
【００１８】
このとき、PCR法は常法に従って行なうことができ、例えば、試料から抽出したDNAに、１組のプライマーセット、耐熱性DNAポリメラーゼ、反応用緩衝液およびdNTPsを加えた状態で、約90〜100℃の変性工程、約30〜75℃のアニーリング工程及び約70〜75℃の伸長工程の３工程を１サイクルとする反応を30〜40サイクル行なってDNAを増幅する。
なお、PCR条件のうち特にアニーリング温度は特異的増幅を行う上で重要であり、プライマーのGC含量に応じて、プライマーと鋳型とのハイブリッドが形成され、かつ、正しい塩基対の形成によらないミスマッチのハイブリッドが形成されないようなアニーリング温度を適宜選択する必要がある。
また、電気泳動法についても特に制限はなく、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法など、通常行われる方法で行えばよい。
【００１９】
上記の方法に替えて、SYBR Green I（Lonza社）などのインターカレーター（蛍光物質）を用いたリアルタイムPCR法によって、より簡便に変異を検出することもできる。
すなわち、反応液中に存在するインターカレーターは、PCRによって変異部位特異的に結合したプライマーを起点として合成された２本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。
なお、インターカレーターからの蛍光はCalingiri由来DNAの量に比例するので、予め試料中のCalingiri由来DNA量と蛍光強度の間の検量線を作成しておくことによって、小麦試料におけるCalingiriの混入率の推定も可能である。
【００２０】
本発明において、上記のCalingiri特異的変異を検出し得るプライマーとは、上述のようなPCR法や、インターカレーターを用いたリアルタイムPCR法などに用いられる、Calingiri特異的に増幅できるPCRプライマーを指す。
このようなプライマーとしては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を基に、３’末端側に上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれるように設計したオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば上流プライマーは、配列番号１の塩基配列の部分配列であって、その３’末端側に当該多型部位が少なくとも１箇所含まれるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また下流プライマーは、配列番号１の塩基配列の相補的配列のうち、その３’末端側に当該多型部位が少なくとも１箇所含まれるオリゴヌクレオチドを用いることができる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましく、また上記多型部位を２箇所以上含んでいることが好ましい。
なお、プライマーセットとして用いる上流プライマー及び下流プライマーの両方に当該多型部位が含まれていることがPCR増幅の特異性を高める点で望ましいが、いずれか一方のプライマーに多型部位が含まれていれば多型を検出することができる。また、一方のプライマーが上記多型部位を含んでいない場合でも、もう一方のプライマーに２個以上の多型部位を含んでいれば、PCR増幅の特異性は十分に担保されるものと思われる。
【００２１】
これらプライマーの具体例としては、本発明者らが図１に示す配列の違いに基づいて、コンピュータソフトウエアを使わずに設計した、以下の表１記載のものが挙げられる。表１の左欄にはプライマー名及び対応する配列表の配列番号を、中欄には配列番号１に示す塩基配列中の対応する部位を塩基番号で示す。なお、以下のプライマー配列は、下記の塩基配列の全長だけでなく、３’末端側の１５塩基以上からなる部分配列であっても使用可能である。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
これらのプライマーを用いる場合は、プライマー151,254,342,1001,1267,1301,1401,1649及び1768から選ばれたいずれか１つの上流側プライマーと、プライマー241c,335c,479c,519c,702c,805c,894c,1029c,1766c,1938c及び1978cから選ばれたいずれか１つの下流側プライマーとを組み合わせてなるプライマーセットとしてPCRに供する。このとき、得られる増幅長が１kbp未満となるようにする、特にリアルタイムPCR法に用いる場合は80〜250bpとなるようにするのが好ましい。
【００２４】
以下、各プライマーについて説明する。
（１）上流側プライマー151
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第134位〜第151位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー241c、335c、479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ130bp、222bp、367bp、407bp、590bp、693bp、782bp、917bpの増幅断片が得られる。
【００２５】
（２）上流側プライマー254
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第235位〜第254位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から７番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー335c、479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ121bp、266bp、306bp、489bp、592bp、681bp、816bpの増幅断片が得られる。なお、プライマー254/335cの組み合わせによるPCRでは、121bpのバンドの他にもう１つの増幅バンドが得られるが、その由来は不明である。
【００２６】
（３）上流側プライマー342
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第323位〜第342位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から13番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ178bp、218bp、401bp、504bp、593bp、728bpの増幅断片が得られる。
【００２７】
（４）上流側プライマー1001
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第982位〜第1001位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c又は1938cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ804bp、977bpの増幅断片が得られる。
【００２８】
（５）上流側プライマー1267
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1248位〜第1267位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ531bp、713bp、751bpの増幅断片が得られる。なお、前記のPCRでは、531bpのバンドの他にもう１つの増幅バンドが得られるが、その由来は不明である。
【００２９】
（６）上流側プライマー1301
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1282位〜第1301位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ504bp、679bp、717bpの増幅断片が得られる。
【００３０】
（７）上流側プライマー1401
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1382位〜第1401位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ404bp、579bp、617bpの増幅断片が得られる。
【００３１】
（８）上流側プライマー1649
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1630位〜第1649位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ156bp、331bp、369bpの増幅断片が得られる。
【００３２】
（９）上流側プライマー1768
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1749位〜第1768位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から18番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ211bp、249bpの増幅断片が得られる。
【００３３】
（１０）下流側プライマー241c
本プライマーは、配列番号１の第241位〜第261位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から8番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３４】
（１１）下流側プライマー335c
本プライマーは、配列番号１の第335位〜第353位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から12番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３５】
（１２）下流側プライマー479c
本プライマーは、配列番号１の第479位〜第498位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。本プライマーはCalingiri特異的多型部位を含んでいないが、当該多型部位を少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上含む上流側プライマーと組み合わせて使用することによって、Calingiri特異的に増幅断片が得られる。
【００３６】
（１３）下流側プライマー519c
本プライマーは、配列番号１の第519位〜第538位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３７】
（１４）下流側プライマー702c
本プライマーは、配列番号１の第702位〜第721位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３８】
（１５）下流側プライマー805c
本プライマーは、配列番号１の第805位〜第824位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３９】
（１６）下流側プライマー894c
本プライマーは、配列番号１の第894位〜第913位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４０】
（１７）下流側プライマー1029c
本プライマーは、配列番号１の第1029位〜第1048位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４１】
（１８）下流側プライマー1766c
本プライマーは、配列番号１の第1766位〜第1783位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から16番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４２】
（１９）下流側プライマー1938c
本プライマーは、配列番号１の第1938位〜第1958位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から17番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４３】
（２０）下流側プライマー1978c
本プライマーは、配列番号１の第1978位〜第1996位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４４】
次に、本発明において、PCRと制限酵素処理を組み合わせる方法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、被検体から抽出したDNAを鋳型として、変異部位を含む遺伝子領域を増幅するように設計したプライマーを用いてPCRを行なった後、PCR産物に含まれる変異部位を認識する制限酵素で処理し、次いで電気泳動および臭化エチジウム染色を行なって、そのバンドパターンにより制限酵素による切断の有無を調べる。制限酵素により切断されている場合は、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいると分かる。
【００４５】
ここでプライマーとしては、上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれる任意の遺伝子領域の５’末端側の部分配列からなるオリゴヌクレオチド（上流プライマー）、及び当該遺伝子領域の３’末端側の部分配列に対する相補鎖からなるオリゴヌクレオチド（下流プライマー）であって、上記多型部位を含まないものを用いることができる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましい。
また、PCRについては前述した通りの方法で行えばよい。制限酵素処理や電気泳動法についても常法に従って行なうことができ、特に制限はない。
【００４６】
本発明において、ハイブリダイゼーション法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計したプローブを蛍光色素や放射性同位元素などで標識し、一本鎖化した被検体DNAをメンブレンフィルター等に固定したものとハイブリダイズさせた後、被検体のDNAとプローブとの結合の有無を調べることによって行うことができる。プローブと結合していた場合には、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいることが分かる。
このとき、プローブの標識および検出は常法に従って行なうことができ、特に制限はない。
【００４７】
上記の方法に替えて、TaqManプローブなどのプローブとプライマーを併用したリアルタイムPCR法によって、より簡便に変異を検出することもできる。
すなわち、プローブとしては、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計し、かつ５’末端にレポーター蛍光色素および３’末端に消光物質を結合させたオリゴヌクレオチドを用いる。レポーター色素と消光物質がプローブに結合した状態では、励起光を照射してもレポーター色素からの蛍光は検出されない。
プライマーとしては、変異部位を含む遺伝子領域を増幅できる１組のプライマーセットを用意する。具体的には、変異部位が少なくとも１箇所含まれる任意の遺伝子領域の５’末端側の部分配列からなるオリゴヌクレオチド（上流プライマー）、及び当該遺伝子領域の３’末端側の部分配列に対する相補鎖からなるオリゴヌクレオチド（下流プライマー）であって、上記多型部位を含まないものを用いる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましい。
上記のプローブおよびプライマーを用いて、被検体のゲノムDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを行なう。被検体にCalingiriが含まれる場合は、鋳型DNAに結合しているプローブがDNAポリメラーゼによる伸長反応により分解されることにより、消光物質から遊離したレポーター色素の蛍光が検出されるようになる。この蛍光強度を測定することによって増幅産物の生成量をモニターできる。
なお、レポーターからの蛍光はCalingiri由来DNAの量に比例するので、予め試料中のCalingiri由来DNA量と蛍光強度の間の検量線を作成しておくことによって、小麦試料におけるCalingiriの混入率の推定も可能である。
【００４８】
上記のハイブリダイゼーション法や、プローブとプライマーを併用したリアルタイムPCR法などに用いられる、Calingiri特異的にハイブリダイズするプローブとしては、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれる任意の部分配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。これらのプローブは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましく、また上記多型部位を２箇所以上含んでいることが好ましい。なお、表１に示したプライマーは、上記の変異検出法におけるプローブとしても使用することができる。
なお、ハイブリッド形成の際の反応温度は反応の特異性を保つ上で重要であり、プローブのGC含量に応じて、プローブと鋳型とのハイブリッドが形成され、かつ、正しい塩基対の形成によらないミスマッチのハイブリッドが形成されないような温度を適宜選択する必要がある。
【００４９】
本発明において、塩基配列決定法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えばダイレクトシークエンス法、サーマルサイクルシークエンス法、自動DNA塩基配列決定法などにより上記したCalingiri特異的変異部位の塩基を決定すればよい。
【００５０】
本発明はさらに、上述のプライマーあるいはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を含むASWNの判別用キットを提供する。このキットは、本発明のASWNの判別方法に用いるためのキットである。
本発明のASWNの判別用キットは、上記オリゴヌクレオチドの他に、DNAポリメラーゼや緩衝液などのPCR用試薬なども含んでいて良い。
【実施例】
【００５１】
以下に、試験例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００５２】
試験例１
CalingiriのGlu-A1遺伝子を以下の方法で増幅した。
CalingiriのDNA抽出はDellaportaら(1983)の方法に従って行った。グラインダーで小麦種子２粒から削り取った胚にDNA抽出バッファー（100mM Tris-Cl, 50mM EDTA, 500mM NaCl, 1.25％ SDS (w/v) pH 8.0）を500μl加え、よく攪拌し、65℃で15分間置いた。次に、160mlの5M 酢酸カリウムを加えてよく混ぜ、氷上に10分間置いた後、12500rpm, 5分間の遠心分離を行った。上澄み500mlを新しいチューブに移し、330μlのイソプロパノールを加えてよく混ぜ、氷上に5分間以上置いた後、12500rpm, 5分間の遠心分離を行った。上澄みを捨て、500mlの70％ エタノールを加え、12500rpm, 1分間の遠心分離を行った。上澄みを捨て、スピードバックで5分間乾燥後、RNase (6μg/ml)を含むTE（10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）を50μlずつ加え、よく攪拌した。これを65℃で10分間インキュベートし、−20℃で保存したもの1μlをPCR反応に用いた。
【００５３】
PCR条件は、94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、55℃, 30秒間、72℃, 3分間）×35サイクル、72℃, 5分間で行い、反応液組成（25μL）はTaKaRa LA Taq 0.5U ,15mM MgCl２, 1×LA Taq bufferとした。増幅に利用したプライマー配列は、上流プライマー：5'-GACTAAGCGGTTGGTTCTT（配列表の配列番号22）、下流プライマー：5'-AGGTAGTACCCTGATTGCAG（配列番号23）である。
【００５４】
PCRにより増幅されたDNA断片の配列を決定し、配列表の配列番号１に示す。既知のGlu-A1遺伝子との比較により、当該配列は、CalingiriのGlu-A1遺伝子のうち、開始コドンから48番目の塩基から始まる部分配列であることが分かった。
また、図１（図１−１〜５）に、配列番号１に示すCalingiriのGlu-A1遺伝子の部分配列と、それに対応するGlu-A1遺伝子の各遺伝子型である１型（Glu-A1a）、２*型（Glu-A1b）、及び欠失型（Glu-A1c）の塩基配列との比較を示す。図１中、＊は４種類の遺伝子型で一致する塩基を、括弧内の数字は開始コドンからの位置を示す。
図１に示すように、CalingiriのGlu-A1遺伝子配列は第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位の塩基において他の遺伝子型と相違しており、１型、２*型、欠失型のどれにも対応しない新しい遺伝子型であることが分かった。
【００５５】
実施例１
図１に示す配列の違いに基づいて、前記表１に記載のプライマーを用いてPCRを行った。鋳型DNAとして、国産小麦21品種及び海外小麦11品種から、試験例１に記載した方法で抽出したDNAを用いた。
PCR条件及び用いたプライマーセットは以下の通りである。
【００５６】
PCR条件：
図２，図３，図１３，図１４：94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、64℃, 30秒間、72℃, 30秒間）×35サイクル、72℃, 5分間、AmpliTaq Gold 0.5U, 15mM MgCl２, 1×AmpliTaq Gold buffer、反応液量25μL
図４〜１２、図１５，図１６：94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、55℃, 30秒間、72℃, 3分間）×35サイクル、72℃, 5分間、TaKaRa LA Taq 0.5U, 15mM MgCl２, 1×LA Taq buffer、反応液量25μL
【００５７】
上流プライマー／下流プライマー：
図２：342/479c、図３：342/805c、図４：151/241c、図５：254/335c、図６：254/519c、図７：254/702c、図８：1649/1766c、図９：1768/1938c、図１０：1768/1978c、図１１：254/894c、図１２：254/1029c、図１３：1001/1776c、図１４：1267/1776c、図１５：1301/1776c、図１６：1041/1766c
【００５８】
PCR後の電気泳動パターンを図２〜１６に示す。
図２〜１６中、Ｍは分子量マーカー（図２〜図１０：バイオラッド EZLoad Molecular Ruler 100bp、図１１〜図１６：φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜３２の小麦品種名は以下の通りである。
１：あやひかり，２：イワイノダイチ，３：キタノカオリ，４：きたもえ，５：きぬの波，６：さぬきの夢2000，７：シラネコムギ，８：シロガネコムギ，９：タマイズミ，１０：チクゴイズミ，１１：ダブリュ８号，１２：ナンブコムギ，１３：つるぴかり，１４：ニシノカオリ，１５：ニシホナミ，１６：農林61号，１７：ニシノカオリ，１８：春よ恋，１９：ふくさやか，２０：ホクシン，２１：ミナミノカオリ，２２：Calingiri，２３：Arrino，２４：Cadoux，２５：Eradu，２６：AC Barrie，２７：AC Domain，２８：AC Majestic，２９：Grandin，３０：Alturas，３１：Eden，３２：Jubilee
２２から２５はオーストラリアの麺用品種、２６から２９は北米のパン用品種、３０から３２は北米の菓子用品種である。
【００５９】
図２〜１６における矢印は、Calingiri特異的なPCR産物のバンドを指す。各図について、予想されるPCR産物のサイズを以下に示す。
図２：178bp、図３：504bp、図４：130bp、図５：121bp、図６：306bp、図７：489bp、図８：156bp、図９：211bp、図１０：249bp、図１１：681bp、図１２：816bp、図１３：804bp、図１４：531bp、図１５：504bp、図１６：404bp
なお、図５と図１４については、上記サイズのバンド以外に予想されないPCR産物も生じているが、その由来は不明である。
図２〜１６の結果から分かるように、上記プライマーを用いてCalingiri（レーン２２）特異的なPCR産物を得ることができた。
【００６０】
実施例２
過去３カ年に輸入したASWN及び農林61号から作られた小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。DNA抽出は小麦粉約20mgを用い、上記したDellaportaら(1983)の方法に従った。PCR条件及びプライマーは実施例１の図２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１７に示す。
図１７中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜４の小麦品種名は１：ASWN（2002年輸入），２：ASWN（2003年輸入），３：ASWN（2004年輸入），４：農林61号である。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１７から分かるように、2002〜2004年に輸入したASWN小麦粉の全てからCalingiri特異的遺伝子型が検出された。
【００６１】
実施例３
2006年輸入のASWNの種子10粒から個別に抽出したDNA、及び2005年輸入のASWN由来の小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。DNA抽出方法、PCR条件及びプライマーは実施例２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１８に示す。
図１８中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜１１は１〜１０：ASWN（2006年輸入）種子１粒ずつ，１１：ASWN小麦粉（2005年輸入）である。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１８の結果から、最近のASWNの種子中、半数が本発明の方法により検出されるGlu-A1遺伝子を持っていることが明らかとなった。2006年輸入のASWNについて、種子の硬度を測定する単一穀粒評価システム（SKCS）によって推定された軟質品種の構成割合は、軟質：硬質＝52：48であった。このことは、軟質小麦のほとんどがこの遺伝子型を持つことを示している。
【００６２】
実施例４
2006年輸入の種々の外国小麦銘柄及び群馬県産の農林61号の小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。各外国小麦銘柄は、カナダ産のパン用小麦銘柄である1CW（No.1 Canada Western Red Spring Wheat）、アメリカ産のパン用小麦銘柄であるHRW（Hard Red Winter）とDNS（Dark Northern Spring）、アメリカ産の菓子用小麦銘柄であるWW（Western White）、オーストラリア産の硬質小麦銘柄であるPH（Prime Hard）、及びASWNを用いた。DNA抽出方法、PCR条件及びプライマーは実施例２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１９に示す。
図１９中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜７の小麦銘柄は１：1CW，２：HRW，３：DNS，４：WW，５：農林61号，６：PH，７：ASWNである。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１９の結果から、ASWN（レーン７）以外の外国小麦銘柄にはCalingiriが含まれないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、従来の方法と異なり、簡便にASWNの混入が検出可能であり、製造メーカーや検査機関における製品の原材料の検査の有効かつ迅速な手法となるもので、広範な利用が期待できる。今後、試薬メーカーなどと共同で検査キットとして開発することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】CalingiriのGlu-A1遺伝子の部分塩基配列と、対応する１型（Glu-A1a）、２*型（Glu-A1b）、欠失型（Glu-A1c）との比較結果を示す図である。図中、＊は４つの配列とも同じ塩基を、括弧内の数字は開始コドンからの位置を示す。
【図１−２】上に同じ。
【図１−３】上に同じ。
【図１−４】上に同じ。
【図１−５】上に同じ。
【図２】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図３】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット342/805cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図４】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット151/241cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図５】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/335cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図６】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/519cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図７】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/702cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図８】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1649/1766cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図９】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1768/1938cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１０】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1768/1978cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１１】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/894cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１２】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/1029cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１３】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1001/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１４】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1267/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１５】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1301/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１６】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1041/1766cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１７】過去３カ年に輸入したASWN及び農林61号の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１８】2006年輸入のASWNの種子及び2005年輸入のASWN由来の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１９】2006年輸入の種々の外国小麦銘柄及び農林61号の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【符号の説明】
【００６５】
（図２〜１６）
Ｍ：分子量マーカー，１：あやひかり，２：イワイノダイチ，３：キタノカオリ，４：きたもえ，５：きぬの波，６：さぬきの夢2000，７：シラネコムギ，８：シロガネコムギ，９：タマイズミ，１０：チクゴイズミ，１１：ダブリュ８号，１２：ナンブコムギ，１３：つるぴかり，１４：ニシノカオリ，１５：ニシホナミ，１６：農林61号，１７：ニシノカオリ，１８：春よ恋，１９：ふくさやか，２０：ホクシン，２１：ミナミノカオリ，２２：Calingiri，２３：Arrino，２４：Cadoux，２５：Eradu，２６：AC Barrie，２７：AC Domain，２８：AC Majestic，２９：Grandin，３０：Alturas，３１：Eden，３２：Jubilee，矢印：Calingiri特異的なPCR産物
（図１７）
Ｍ：分子量マーカー，１：ASWN（2002年輸入），２：ASWN（2003年輸入），３：ASWN（2004年輸入），４：農林61号，矢印：Calingiri特異的なPCR産物（178 bp）
（図１８）
Ｍ：分子量マーカー，１〜１０：ASWN（2006年輸入）種子１粒ずつ，１１：ASWN小麦粉（2005年輸入）
（図１９）
Ｍ：分子量マーカー，１：1CW，２：HRW，３：DNS，４：WW，５：農林６１号，６：PH，７：ASWN
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月19日(2007.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とし、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出することによって、配列番号１に示す塩基配列からなるGlu-A1遺伝子座にコードされるCalingiriを含むオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによる、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別方法。
【請求項２】
変異の検出を、配列番号２〜１２、１４〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を用いて行なう、請求項１に記載の判別方法。
【請求項３】
変異の検出を、配列番号２〜１０に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種、及び配列番号１１〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種を組み合わせたプライマーセットを用いた、小麦試料から抽出した核酸を鋳型とする遺伝子増幅反応によって行なう、請求項１又は２に記載の判別方法。
【請求項４】
日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とし、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出し得る、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用プライマー又はプローブ。
【請求項５】
配列番号２〜１２、１４〜２１のいずれかに示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなる請求項４に記載のプライマー又はプローブ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のプライマー又はプローブを含む、日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とする、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小麦原料として用いられるオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別に関する。
【背景技術】
【０００２】
小麦を用いた製品には、うどん、パン、中華麺など様々な製品がある。食品の安全性と信頼性への関心の高まりから、国産小麦への需要が高まっている。
しかし、国産小麦は外国産小麦に比べて加工品質が劣るものが多く、国産小麦１００％使用を銘打ちながら、外国産小麦をブレンドして加工品質を改良した製品が販売される偽装表示が大きな問題となっている。
それゆえ、原料小麦を明らかにする要望が、消費者をはじめとして小麦粉流通業者や食品加工業者などから高まっている。
【０００３】
ASWN (Australian Standard White Noodle)は、オーストラリア産の麺用小麦品種である「Arrino」や「Cadoux」、「Eradu」、「Calingiri」などがブレンドされた、オーストラリア産の日本麺用小麦銘柄である。このASWNは、うどんの主要原料であるほか、そうめんや即席麺の主原料としても広く流通しており、国産小麦への混入の可能性が高い小麦である。
【０００４】
小麦の判別については、いくつかの蛋白質の組成の違いを組み合わせて品種を判別する方法が開発されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、既知の検出手法は複雑な上、特定の外国産小麦を判別できるものではなかった。
そこで、ASWN等の外国産小麦を容易に判別できる方法の開発が望まれていた。
【０００５】
【特許文献１】特開2005-69935号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、小麦における外国産品種、特にASWNの混入の有無を明らかにするため、その構成品種を判別するＤＮＡマーカーを開発することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、グルテンを構成するタンパク質の１つである高分子量グルテニン・サブユニットの内、Glu-A1遺伝子座にコードされる新規な型の遺伝子を、ASWNにブレンドされるオーストラリアの軟質小麦品種であるCalingiriが持っていることを見出した（配列表の配列番号１参照）。そして、その新規な遺伝子型の塩基配列と、既知の配列とを比較することにより決定した多型（図１参照）をもとに、Calingiriを含むASWNの存在の有無を検出する方法を開発した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、請求項１に記載の本発明は、日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とし、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出することによって、Glu-A1遺伝子座にコードされるCalingiriを含むオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによる、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別方法である。
請求項２に記載の本発明は、変異の検出を、配列番号２〜１２、１４〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を用いて行なう、請求項１に記載の判別方法である。
請求項３に記載の本発明は、変異の検出を、配列番号２〜１０に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種、及び配列番号１１〜２１に示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなるオリゴヌクレオチドのうちいずれか１種を組み合わせたプライマーセットを用いた、小麦試料から抽出した核酸を鋳型とする遺伝子増幅反応によって行なう、請求項１又は２に記載の判別方法である。
請求項４に記載の本発明は、日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とし、配列番号１に示す塩基配列中、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位のうち少なくとも１箇所における変異を検出し得る、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用プライマー又はプローブである。
請求項５に記載の本発明は、配列番号２〜１２、１４〜２１のいずれかに示す塩基配列の全部又は３’末端側の１５塩基以上の部分からなる請求項４に記載のプライマー又はプローブである。
請求項６に記載の本発明は、請求項４又は５に記載のプライマー又はプローブを含む、日本国内で流通している小麦品種又は銘柄を対象とする、Calingiriを含むオーストラリア産麺用小麦銘柄の判別用キットである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、ASWNの構成品種を判別できるDNAマーカーを提供することにより、小麦におけるASWNの混入の有無を簡便かつ迅速に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のオーストラリア産の麺用小麦銘柄の判別方法は、Glu-A1遺伝子座にコードされるオーストラリア産の麺用小麦銘柄に特異的な遺伝子型を判定することによってASWNを判別することを特徴とするものである。
【００１１】
本発明において「オーストラリア産の麺用小麦銘柄」とは、Australian Standard White Noodle（ASWN）を指す。ASWNは、上述のように、オーストラリアの麺用小麦品種のうちArrinoやCadoux、Eradu、Calingiriなど、うどんに適した品種をブレンドした日本麺用小麦銘柄である。
本発明において判別対象とするASWNとは、特に「Calingiri」または「Calingiri」と同じ遺伝子を持つ品種を含むものである。近年市場で流通しているASWNにおいては、Calingiriが極めて高い含量でブレンドされている。実際、下記の実施例では、2002〜2006年に輸入されたASWNからはCalingiri由来のGlu-A1遺伝子が検出され、特に2006年輸入のASWNでは半数をCalingiriが占めていることが分かった。
本発明の方法において小麦粉を試料とする場合には、試料中のCalingiri含有量は特に制限されず、極微量でもCalingiriが含まれていれば判別可能である。
本発明の方法によれば、国内品種であるか海外品種であるかを問わず、全ての小麦品種とCalingiriを区別することができる。
【００１２】
本発明の被検体である小麦試料とは、小麦植物体のどの組織でも使用可能である。例えば、種子、葉、茎などを試料とすることができ、小麦粉も使用可能である。
本発明において小麦試料から核酸を抽出する方法としては、通常用いられる方法を採用することができ、例えば、市販のDNA抽出キットなどを用いてそのプロトコルに従って行なう方法が挙げられる。
なお、本発明において核酸とは、DNAであってもRNAであってもよい。
【００１３】
Glu-A1遺伝子座には、１型、２*型及び欠失型と呼ばれる３種の遺伝子型が存在することが既に知られている。国内品種の「ホクシン」と「ハルユタカ」、オーストラリアの小麦品種である「Aroona」と「Eradu」が１型、「農林61号」をはじめとする農林登録品種の十数品種や、オーストラリアの麺用小麦品種である「Arrino」、「Cadoux」、北米のパン用品種である「AC Barrie」、「AC Domain」、「AC Majestic」、「Grandin」など大半の海外品種が２*型、「さぬきの夢2000」と「ふくさやか」を含む国産麺用小麦の大半が欠失型である。
【００１４】
本発明において、ASWNに特徴的に配合されているオーストラリアの麺用小麦品種である「Calingiri」のGlu-A1のDNA配列がはじめて決定され、当該配列が１型、２*型、欠失型の配列とは異なることが明らかとなった。そして、これらの４つの遺伝子型のDNA配列を比較した結果、配列表の配列番号１に示すCalingiriのGlu-A1のうち、第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位において、Calingiriに特異的な一塩基多型を見出した（図１参照）。
本発明において、「Glu-A1遺伝子座にコードされるASWNに特異的な遺伝子型」とは、上記したCalingiri特有のGlu-A1遺伝子型のことである。
【００１５】
本発明の方法では、上記の一塩基多型を検出することによって、Glu-A1遺伝子座にコードされる遺伝子型を判定、つまり配列番号１に示すCalingiri特異的なGlu-A1遺伝子型の有無を判定する。すなわち、被検体である小麦の核酸について上記の多型部位の塩基を調べ、配列番号１の第１５１位がチミン、第２４１位がグアニン、第２５４位がアデニン、第２７８位がシトシン、第３３５位がシトシン、第３４２位がアデニン、第５１９位がグアニン、第７０２位がアデニン、第８０５位がアデニン、第８９４位がチミン、第１００１位がシトシン、第１０２９位がチミン、第１２６７位がアデニン、第１３０１位がアデニン、第１４０１位がアデニン、第１５７１位がチミン、第１６４９位がアデニン、第１７３０位がアデニン、第１７６６位がグアニン、第１７６８位がグアニン、第１９３８位がチミン、第１９４１位がグアニン、又は第１９７８位がアデニンであることが判明した場合には、当該被検体にCalingiri特異的遺伝子型が含まれていることが分かる。そして、当該遺伝子型が含まれていると認められた場合は、試料中にASWNが含まれていることが分かる。
【００１６】
本発明において、上記したCalingiri特異的な変異を検出する方法は特に限定されず、一般的に遺伝子多型を検出するために用いられている方法、例えばPCR法やリアルタイムPCR法などの遺伝子増幅法、遺伝子増幅反応と制限酵素処理を組み合わせる方法、ハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法などを採用することができる。
【００１７】
PCR法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、被検体から抽出した核酸を鋳型として、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計したプライマーを用いてPCRを行なった後、電気泳動によりCalingiri特異的な増幅産物が得られたか否かを調べることによって行うことができる。当該増幅断片が得られていた場合には、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいることが分かる。
【００１８】
このとき、PCR法は常法に従って行なうことができ、例えば、試料から抽出したDNAに、１組のプライマーセット、耐熱性DNAポリメラーゼ、反応用緩衝液およびdNTPsを加えた状態で、約90〜100℃の変性工程、約30〜75℃のアニーリング工程及び約70〜75℃の伸長工程の３工程を１サイクルとする反応を30〜40サイクル行なってDNAを増幅する。
なお、PCR条件のうち特にアニーリング温度は特異的増幅を行う上で重要であり、プライマーのGC含量に応じて、プライマーと鋳型とのハイブリッドが形成され、かつ、正しい塩基対の形成によらないミスマッチのハイブリッドが形成されないようなアニーリング温度を適宜選択する必要がある。
また、電気泳動法についても特に制限はなく、アガロースゲル電気泳動法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法など、通常行われる方法で行えばよい。
【００１９】
上記の方法に替えて、SYBR Green I（Lonza社）などのインターカレーター（蛍光物質）を用いたリアルタイムPCR法によって、より簡便に変異を検出することもできる。
すなわち、反応液中に存在するインターカレーターは、PCRによって変異部位特異的に結合したプライマーを起点として合成された２本鎖DNAに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量をモニターできる。
なお、インターカレーターからの蛍光はCalingiri由来DNAの量に比例するので、予め試料中のCalingiri由来DNA量と蛍光強度の間の検量線を作成しておくことによって、小麦試料におけるCalingiriの混入率の推定も可能である。
【００２０】
本発明において、上記のCalingiri特異的変異を検出し得るプライマーとは、上述のようなPCR法や、インターカレーターを用いたリアルタイムPCR法などに用いられる、Calingiri特異的に増幅できるPCRプライマーを指す。
このようなプライマーとしては、配列表の配列番号１に示す塩基配列を基に、３’末端側に上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれるように設計したオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば上流プライマーは、配列番号１の塩基配列の部分配列であって、その３’末端側に当該多型部位が少なくとも１箇所含まれるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また下流プライマーは、配列番号１の塩基配列の相補的配列のうち、その３’末端側に当該多型部位が少なくとも１箇所含まれるオリゴヌクレオチドを用いることができる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましく、また上記多型部位を２箇所以上含んでいることが好ましい。
なお、プライマーセットとして用いる上流プライマー及び下流プライマーの両方に当該多型部位が含まれていることがPCR増幅の特異性を高める点で望ましいが、いずれか一方のプライマーに多型部位が含まれていれば多型を検出することができる。また、一方のプライマーが上記多型部位を含んでいない場合でも、もう一方のプライマーに２個以上の多型部位を含んでいれば、PCR増幅の特異性は十分に担保されるものと思われる。
【００２１】
これらプライマーの具体例としては、本発明者らが図１に示す配列の違いに基づいて、コンピュータソフトウエアを使わずに設計した、以下の表１記載のものが挙げられる。表１の左欄にはプライマー名及び対応する配列表の配列番号を、中欄には配列番号１に示す塩基配列中の対応する部位を塩基番号で示す。なお、以下のプライマー配列は、下記の塩基配列の全長だけでなく、３’末端側の１５塩基以上からなる部分配列であっても使用可能である。
【００２２】
【表１】
2008271887.tif 000026
【００２３】
これらのプライマーを用いる場合は、プライマー151,254,342,1001,1267,1301,1401,1649及び1768から選ばれたいずれか１つの上流側プライマーと、プライマー241c,335c,479c,519c,702c,805c,894c,1029c,1766c,1938c及び1978cから選ばれたいずれか１つの下流側プライマーとを組み合わせてなるプライマーセットとしてPCRに供する。このとき、得られる増幅長が１kbp未満となるようにする、特にリアルタイムPCR法に用いる場合は80〜250bpとなるようにするのが好ましい。
【００２４】
以下、各プライマーについて説明する。
（１）上流側プライマー151
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第134位〜第151位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー241c、335c、479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ130bp、222bp、367bp、407bp、590bp、693bp、782bp、917bpの増幅断片が得られる。
【００２５】
（２）上流側プライマー254
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第235位〜第254位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から７番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー335c、479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ121bp、266bp、306bp、489bp、592bp、681bp、816bpの増幅断片が得られる。なお、プライマー254/335cの組み合わせによるPCRでは、121bpのバンドの他にもう１つの増幅バンドが得られるが、その由来は不明である。
【００２６】
（３）上流側プライマー342
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第323位〜第342位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から13番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー479c、519c、702c、805c、894c又は1029cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ178bp、218bp、401bp、504bp、593bp、728bpの増幅断片が得られる。
【００２７】
（４）上流側プライマー1001
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第982位〜第1001位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c又は1938cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ804bp、977bpの増幅断片が得られる。
【００２８】
（５）上流側プライマー1267
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1248位〜第1267位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ531bp、713bp、751bpの増幅断片が得られる。なお、前記のPCRでは、531bpのバンドの他にもう１つの増幅バンドが得られるが、その由来は不明である。
【００２９】
（６）上流側プライマー1301
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1282位〜第1301位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ504bp、679bp、717bpの増幅断片が得られる。
【００３０】
（７）上流側プライマー1401
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1382位〜第1401位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ404bp、579bp、617bpの増幅断片が得られる。
【００３１】
（８）上流側プライマー1649
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1630位〜第1649位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1766c、1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ156bp、331bp、369bpの増幅断片が得られる。
【００３２】
（９）上流側プライマー1768
本プライマーは、配列番号１の塩基配列の第1749位〜第1768位からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から18番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。本プライマーと下流側プライマー1938c又は1978cとを対で用いて遺伝子増幅反応を行なうと、Calingiri特異的にそれぞれ211bp、249bpの増幅断片が得られる。
【００３３】
（１０）下流側プライマー241c
本プライマーは、配列番号１の第241位〜第261位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から8番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３４】
（１１）下流側プライマー335c
本プライマーは、配列番号１の第335位〜第353位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から12番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３５】
（１２）下流側プライマー479c
本プライマーは、配列番号１の第479位〜第498位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。本プライマーはCalingiri特異的多型部位を含んでいないが、当該多型部位を少なくとも１箇所、好ましくは２箇所以上含む上流側プライマーと組み合わせて使用することによって、Calingiri特異的に増幅断片が得られる。
【００３６】
（１３）下流側プライマー519c
本プライマーは、配列番号１の第519位〜第538位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３７】
（１４）下流側プライマー702c
本プライマーは、配列番号１の第702位〜第721位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３８】
（１５）下流側プライマー805c
本プライマーは、配列番号１の第805位〜第824位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００３９】
（１６）下流側プライマー894c
本プライマーは、配列番号１の第894位〜第913位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４０】
（１７）下流側プライマー1029c
本プライマーは、配列番号１の第1029位〜第1048位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４１】
（１８）下流側プライマー1766c
本プライマーは、配列番号１の第1766位〜第1783位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から16番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４２】
（１９）下流側プライマー1938c
本プライマーは、配列番号１の第1938位〜第1958位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端及び５’末端から17番目にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４３】
（２０）下流側プライマー1978c
本プライマーは、配列番号１の第1978位〜第1996位の相補的塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。３’末端にCalingiri特異的多型部位を含んでいるため、Calingiri由来Glu-A1に対して特異的にハイブリダイズする。
【００４４】
次に、本発明において、PCRと制限酵素処理を組み合わせる方法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、被検体から抽出したDNAを鋳型として、変異部位を含む遺伝子領域を増幅するように設計したプライマーを用いてPCRを行なった後、PCR産物に含まれる変異部位を認識する制限酵素で処理し、次いで電気泳動および臭化エチジウム染色を行なって、そのバンドパターンにより制限酵素による切断の有無を調べる。制限酵素により切断されている場合は、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいると分かる。
【００４５】
ここでプライマーとしては、上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれる任意の遺伝子領域の５’末端側の部分配列からなるオリゴヌクレオチド（上流プライマー）、及び当該遺伝子領域の３’末端側の部分配列に対する相補鎖からなるオリゴヌクレオチド（下流プライマー）であって、上記多型部位を含まないものを用いることができる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましい。
また、PCRについては前述した通りの方法で行えばよい。制限酵素処理や電気泳動法についても常法に従って行なうことができ、特に制限はない。
【００４６】
本発明において、ハイブリダイゼーション法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えば、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計したプローブを蛍光色素や放射性同位元素などで標識し、一本鎖化した被検体DNAをメンブレンフィルター等に固定したものとハイブリダイズさせた後、被検体のDNAとプローブとの結合の有無を調べることによって行うことができる。プローブと結合していた場合には、被検体がASWN（Calingiri）を含んでいることが分かる。
このとき、プローブの標識および検出は常法に従って行なうことができ、特に制限はない。
【００４７】
上記の方法に替えて、TaqManプローブなどのプローブとプライマーを併用したリアルタイムPCR法によって、より簡便に変異を検出することもできる。
すなわち、プローブとしては、変異部位を含む遺伝子領域に選択的に結合するように設計し、かつ５’末端にレポーター蛍光色素および３’末端に消光物質を結合させたオリゴヌクレオチドを用いる。レポーター色素と消光物質がプローブに結合した状態では、励起光を照射してもレポーター色素からの蛍光は検出されない。
プライマーとしては、変異部位を含む遺伝子領域を増幅できる１組のプライマーセットを用意する。具体的には、変異部位が少なくとも１箇所含まれる任意の遺伝子領域の５’末端側の部分配列からなるオリゴヌクレオチド（上流プライマー）、及び当該遺伝子領域の３’末端側の部分配列に対する相補鎖からなるオリゴヌクレオチド（下流プライマー）であって、上記多型部位を含まないものを用いる。これらのプライマーは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましい。
上記のプローブおよびプライマーを用いて、被検体のゲノムDNAを鋳型としてリアルタイムPCRを行なう。被検体にCalingiriが含まれる場合は、鋳型DNAに結合しているプローブがDNAポリメラーゼによる伸長反応により分解されることにより、消光物質から遊離したレポーター色素の蛍光が検出されるようになる。この蛍光強度を測定することによって増幅産物の生成量をモニターできる。
なお、レポーターからの蛍光はCalingiri由来DNAの量に比例するので、予め試料中のCalingiri由来DNA量と蛍光強度の間の検量線を作成しておくことによって、小麦試料におけるCalingiriの混入率の推定も可能である。
【００４８】
上記のハイブリダイゼーション法や、プローブとプライマーを併用したリアルタイムPCR法などに用いられる、Calingiri特異的にハイブリダイズするプローブとしては、配列表の配列番号１に示す塩基配列のうち、上記した多型部位が少なくとも１箇所含まれる任意の部分配列又はその相補的配列からなるオリゴヌクレオチドを用いることが好ましい。これらのプローブは１５〜３０塩基からなるものであることが好ましく、また上記多型部位を２箇所以上含んでいることが好ましい。なお、表１に示したプライマーは、上記の変異検出法におけるプローブとしても使用することができる。
なお、ハイブリッド形成の際の反応温度は反応の特異性を保つ上で重要であり、プローブのGC含量に応じて、プローブと鋳型とのハイブリッドが形成され、かつ、正しい塩基対の形成によらないミスマッチのハイブリッドが形成されないような温度を適宜選択する必要がある。
【００４９】
本発明において、塩基配列決定法による変異検出法は常法に従って行なえばよく、例えばダイレクトシークエンス法、サーマルサイクルシークエンス法、自動DNA塩基配列決定法などにより上記したCalingiri特異的変異部位の塩基を決定すればよい。
【００５０】
本発明はさらに、上述のプライマーあるいはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種を含むASWNの判別用キットを提供する。このキットは、本発明のASWNの判別方法に用いるためのキットである。
本発明のASWNの判別用キットは、上記オリゴヌクレオチドの他に、DNAポリメラーゼや緩衝液などのPCR用試薬なども含んでいて良い。
【実施例】
【００５１】
以下に、試験例および実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
【００５２】
試験例１
CalingiriのGlu-A1遺伝子を以下の方法で増幅した。
CalingiriのDNA抽出はDellaportaら(1983)の方法に従って行った。グラインダーで小麦種子２粒から削り取った胚にDNA抽出バッファー（100mM Tris-Cl, 50mM EDTA, 500mM NaCl, 1.25％ SDS (w/v) pH 8.0）を500μl加え、よく攪拌し、65℃で15分間置いた。次に、160mlの5M 酢酸カリウムを加えてよく混ぜ、氷上に10分間置いた後、12500rpm, 5分間の遠心分離を行った。上澄み500mlを新しいチューブに移し、330μlのイソプロパノールを加えてよく混ぜ、氷上に5分間以上置いた後、12500rpm, 5分間の遠心分離を行った。上澄みを捨て、500mlの70％ エタノールを加え、12500rpm, 1分間の遠心分離を行った。上澄みを捨て、スピードバックで5分間乾燥後、RNase (6μg/ml)を含むTE（10mM Tris-Cl, 1mM EDTA, pH8.0）を50μlずつ加え、よく攪拌した。これを65℃で10分間インキュベートし、−20℃で保存したもの1μlをPCR反応に用いた。
【００５３】
PCR条件は、94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、55℃, 30秒間、72℃, 3分間）×35サイクル、72℃, 5分間で行い、反応液組成（25μL）はTaKaRa LA Taq 0.5U ,15mM MgCl２, 1×LA Taq bufferとした。増幅に利用したプライマー配列は、上流プライマー：5'-GACTAAGCGGTTGGTTCTT（配列表の配列番号22）、下流プライマー：5'-AGGTAGTACCCTGATTGCAG（配列番号23）である。
【００５４】
PCRにより増幅されたDNA断片の配列を決定し、配列表の配列番号１に示す。既知のGlu-A1遺伝子との比較により、当該配列は、CalingiriのGlu-A1遺伝子のうち、開始コドンから48番目の塩基から始まる部分配列であることが分かった。
また、図１（図１−１〜５）に、配列番号１に示すCalingiriのGlu-A1遺伝子の部分配列と、それに対応するGlu-A1遺伝子の各遺伝子型である１型（Glu-A1a）、２*型（Glu-A1b）、及び欠失型（Glu-A1c）の塩基配列との比較を示す。図１中、＊は４種類の遺伝子型で一致する塩基を、括弧内の数字は開始コドンからの位置を示す。
図１に示すように、CalingiriのGlu-A1遺伝子配列は第１５１位、第２４１位、第２５４位、第２７８位、第３３５位、第３４２位、第５１９位、第７０２位、第８０５位、第８９４位、第１００１位、第１０２９位、第１２６７位、第１３０１位、第１４０１位、第１５７１位、第１６４９位、第１７３０位、第１７６６位、第１７６８位、第１９３８位、第１９４１位及び第１９７８位の塩基において他の遺伝子型と相違しており、１型、２*型、欠失型のどれにも対応しない新しい遺伝子型であることが分かった。
【００５５】
実施例１
図１に示す配列の違いに基づいて、前記表１に記載のプライマーを用いてPCRを行った。鋳型DNAとして、国産小麦21品種及び海外小麦11品種から、試験例１に記載した方法で抽出したDNAを用いた。
PCR条件及び用いたプライマーセットは以下の通りである。
【００５６】
PCR条件：
図２，図３，図１３，図１４：94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、64℃, 30秒間、72℃, 30秒間）×35サイクル、72℃, 5分間、AmpliTaq Gold 0.5U, 15mM MgCl２, 1×AmpliTaq Gold buffer、反応液量25μL
図４〜１２、図１５，図１６：94℃, 5分間、（94℃, 30秒間、55℃, 30秒間、72℃, 3分間）×35サイクル、72℃, 5分間、TaKaRa LA Taq 0.5U, 15mM MgCl２, 1×LA Taq buffer、反応液量25μL
【００５７】
上流プライマー／下流プライマー：
図２：342/479c、図３：342/805c、図４：151/241c、図５：254/335c、図６：254/519c、図７：254/702c、図８：1649/1766c、図９：1768/1938c、図１０：1768/1978c、図１１：254/894c、図１２：254/1029c、図１３：1001/1776c、図１４：1267/1776c、図１５：1301/1776c、図１６：1041/1766c
【００５８】
PCR後の電気泳動パターンを図２〜１６に示す。
図２〜１６中、Ｍは分子量マーカー（図２〜図１０：バイオラッド EZLoad Molecular Ruler 100bp、図１１〜図１６：φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜３２の小麦品種名は以下の通りである。
１：あやひかり，２：イワイノダイチ，３：キタノカオリ，４：きたもえ，５：きぬの波，６：さぬきの夢2000，７：シラネコムギ，８：シロガネコムギ，９：タマイズミ，１０：チクゴイズミ，１１：ダブリュ８号，１２：ナンブコムギ，１３：つるぴかり，１４：ニシノカオリ，１５：ニシホナミ，１６：農林61号，１７：ニシノカオリ，１８：春よ恋，１９：ふくさやか，２０：ホクシン，２１：ミナミノカオリ，２２：Calingiri，２３：Arrino，２４：Cadoux，２５：Eradu，２６：AC Barrie，２７：AC Domain，２８：AC Majestic，２９：Grandin，３０：Alturas，３１：Eden，３２：Jubilee
２２から２５はオーストラリアの麺用品種、２６から２９は北米のパン用品種、３０から３２は北米の菓子用品種である。
【００５９】
図２〜１６における矢印は、Calingiri特異的なPCR産物のバンドを指す。各図について、予想されるPCR産物のサイズを以下に示す。
図２：178bp、図３：504bp、図４：130bp、図５：121bp、図６：306bp、図７：489bp、図８：156bp、図９：211bp、図１０：249bp、図１１：681bp、図１２：816bp、図１３：804bp、図１４：531bp、図１５：504bp、図１６：404bp
なお、図５と図１４については、上記サイズのバンド以外に予想されないPCR産物も生じているが、その由来は不明である。
図２〜１６の結果から分かるように、上記プライマーを用いてCalingiri（レーン２２）特異的なPCR産物を得ることができた。
【００６０】
実施例２
過去３カ年に輸入したASWN及び農林61号から作られた小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。DNA抽出は小麦粉約20mgを用い、上記したDellaportaら(1983)の方法に従った。PCR条件及びプライマーは実施例１の図２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１７に示す。
図１７中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜４の小麦品種名は１：ASWN（2002年輸入），２：ASWN（2003年輸入），３：ASWN（2004年輸入），４：農林61号である。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１７から分かるように、2002〜2004年に輸入したASWN小麦粉の全てからCalingiri特異的遺伝子型が検出された。
【００６１】
実施例３
2006年輸入のASWNの種子10粒から個別に抽出したDNA、及び2005年輸入のASWN由来の小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。DNA抽出方法、PCR条件及びプライマーは実施例２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１８に示す。
図１８中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜１１は１〜１０：ASWN（2006年輸入）種子１粒ずつ，１１：ASWN小麦粉（2005年輸入）である。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１８の結果から、最近のASWNの種子中、半数が本発明の方法により検出されるGlu-A1遺伝子を持っていることが明らかとなった。2006年輸入のASWNについて、種子の硬度を測定する単一穀粒評価システム（SKCS）によって推定された軟質品種の構成割合は、軟質：硬質＝52：48であった。このことは、軟質小麦のほとんどがこの遺伝子型を持つことを示している。
【００６２】
実施例４
2006年輸入の種々の外国小麦銘柄及び群馬県産の農林61号の小麦粉から抽出したDNAを用いてPCRを行った。各外国小麦銘柄は、カナダ産のパン用小麦銘柄である1CW（No.1 Canada Western Red Spring Wheat）、アメリカ産のパン用小麦銘柄であるHRW（Hard Red Winter）とDNS（Dark Northern Spring）、アメリカ産の菓子用小麦銘柄であるWW（Western White）、オーストラリア産の硬質小麦銘柄であるPH（Prime Hard）、及びASWNを用いた。DNA抽出方法、PCR条件及びプライマーは実施例２と同様である。PCR後の電気泳動パターンを図１９に示す。
図１９中、Ｍは分子量マーカー（φX174/HaeIII 処理物）を示す。各レーン１〜７の小麦銘柄は１：1CW，２：HRW，３：DNS，４：WW，５：農林61号，６：PH，７：ASWNである。矢印はCalingiri特異的なPCR産物のバンド（178 bp）を指す。
図１９の結果から、ASWN（レーン７）以外の外国小麦銘柄にはCalingiriが含まれないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、従来の方法と異なり、簡便にASWNの混入が検出可能であり、製造メーカーや検査機関における製品の原材料の検査の有効かつ迅速な手法となるもので、広範な利用が期待できる。今後、試薬メーカーなどと共同で検査キットとして開発することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１−１】CalingiriのGlu-A1遺伝子の部分塩基配列と、対応する１型（Glu-A1a）、２*型（Glu-A1b）、欠失型（Glu-A1c）との比較結果を示す図である。図中、＊は４つの配列とも同じ塩基を、括弧内の数字は開始コドンからの位置を示す。
【図１−２】上に同じ。
【図１−３】上に同じ。
【図１−４】上に同じ。
【図１−５】上に同じ。
【図２】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図３】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット342/805cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図４】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット151/241cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図５】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/335cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図６】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/519cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図７】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/702cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図８】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1649/1766cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図９】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1768/1938cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１０】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1768/1978cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１１】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/894cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１２】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット254/1029cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１３】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1001/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１４】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1267/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１５】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1301/1776cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１６】国産小麦品種及び海外小麦品種のDNAに対してプライマーセット1041/1766cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１７】過去３カ年に輸入したASWN及び農林61号の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１８】2006年輸入のASWNの種子及び2005年輸入のASWN由来の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【図１９】2006年輸入の種々の外国小麦銘柄及び農林61号の小麦粉のDNAに対してプライマーセット342/479cを用いてPCRを行った場合の電気泳動図である。
【符号の説明】
【００６５】
（図２〜１６）
Ｍ：分子量マーカー，１：あやひかり，２：イワイノダイチ，３：キタノカオリ，４：きたもえ，５：きぬの波，６：さぬきの夢2000，７：シラネコムギ，８：シロガネコムギ，９：タマイズミ，１０：チクゴイズミ，１１：ダブリュ８号，１２：ナンブコムギ，１３：つるぴかり，１４：ニシノカオリ，１５：ニシホナミ，１６：農林61号，１７：ニシノカオリ，１８：春よ恋，１９：ふくさやか，２０：ホクシン，２１：ミナミノカオリ，２２：Calingiri，２３：Arrino，２４：Cadoux，２５：Eradu，２６：AC Barrie，２７：AC Domain，２８：AC Majestic，２９：Grandin，３０：Alturas，３１：Eden，３２：Jubilee，矢印：Calingiri特異的なPCR産物
（図１７）
Ｍ：分子量マーカー，１：ASWN（2002年輸入），２：ASWN（2003年輸入），３：ASWN（2004年輸入），４：農林61号，矢印：Calingiri特異的なPCR産物（178 bp）
（図１８）
Ｍ：分子量マーカー，１〜１０：ASWN（2006年輸入）種子１粒ずつ，１１：ASWN小麦粉（2005年輸入）
（図１９）
Ｍ：分子量マーカー，１：1CW，２：HRW，３：DNS，４：WW，５：農林６１号，６：PH，７：ASWN