(57)【要約】      （修正有）【課題】テレフタル酸から3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸を工業的スケールで発酵生産すること。【解決手段】微生物細胞の染色体ＤＮＡ上の、（ａ）特定のアミノ酸配列；又は（ｂ）特定のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子が破壊された、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株；Tph遺伝子及びプロトカテク酸 3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド；該破壊株に、該組換えプラスミドを導入してなる形質転換体；並びに、テレフタル酸の存在下に、該形質転換体を培養することを特徴とする、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列、
をコードする遺伝子が破壊された、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株。
【請求項２】
微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号２もしくは４に記載の塩基配列；又は
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列であって、かつプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列、
を有する遺伝子が破壊された、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株。
【請求項３】
微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列、
をコードする遺伝子と相同組換えを起こすことができるＤＮＡ配列を有し、かつ、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を喪失している相同組換え用ＤＮＡと、当該遺伝子との相同組換えにより、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素遺伝子が破壊された、請求項１又は２記載の遺伝子破壊株。
【請求項４】
プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素遺伝子破壊株の親株が、コマモナス属（Comamonas sp.）細菌である、請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝子破壊株。
【請求項５】
前記コマモナス属細菌が、Comamonas sp. E6株である、請求項４記載の遺伝子破壊株。
【請求項６】
テレフタレート・ジオキシゲナーゼ遺伝子（TPA-DOX遺伝子）、NADPH-レダクターゼ遺伝子、1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボキシレート・デヒドロゲナーゼ遺伝子（DCD dehydrogenase遺伝子）、ポジティブレギュレーター遺伝子、テレフタレート・トランスポーター遺伝子（TPA transporter遺伝子）、及びプロトカテク酸 3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子（pcaHG遺伝子）を含む、組換えプラスミド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の遺伝子破壊株に、請求項６記載の組換えプラスミドを導入してなる形質転換体。
【請求項８】
テレフタル酸の存在下に、請求項６記載の形質転換体を培養することを特徴とする、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株、テレフタル酸からプロトカテク酸を経由して、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを発酵生産するための多段反応プロセスを構成する酵素をコードする遺伝子を含む組換えプラスミド、前記組換えプラスミドを前記破壊株に導入した形質転換体、及びそれを用いる3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの工業的製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
テレフタル酸は石油成分から分離される芳香族化合物で、PET原料として大量かつ安価に生産されている。テレフタル酸を原料に生分解性を持つ新しい機能性プラスチックスを開発することができれば、PET等の石油系高分子材料との共重合などにより生分解性に優れた高分子材料の開発が可能となる。
【０００３】
一方、本発明者らは、テレフタル酸分解微生物Comamonas sp. E6株が、テレフタル酸を一旦プロトカテク酸に変換した後、2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸を経て完全に分解できることを見出している（特許文献１）。また、当該微生物の染色体DNAから、プロトカテク酸4,5-ジオキシゲナーゼ及び4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を取り除くことにより、テレフタレート・ジオキシゲナーゼ（TPA-DOX）、1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボキシレート・デヒドロゲナーゼ（DCD-dehydrogenase）、テレフタレート・トランスポーター（TPA transporter)及びポジティブレギュレーター（positive regulator）をそれぞれコードする遺伝子を含む組換えベクター、それを含む形質転換細胞、並びに当該形質転換細胞を用いるテレフタル酸からの2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸の製造法を報告している（特許文献１）。
【０００４】
また、本発明者らは、植物由来成分であるバニリン、バニリン酸、プロトカテク酸等から、多段階の酵素反応を介して、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを発酵生産する方法を報告している（特許文献２）。
【特許文献１】特願2005-298242号明細書
【特許文献２】特願2006-218524号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、テレフタル酸から3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを発酵生産する方法は知られていない。
従って、本発明は、テレフタル酸からプロトカテク酸に変換した後に、プロトカテク酸から4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを経る2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸への変換プロセスを経ることなく、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを工業的スケールで発酵生産する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、プロトカテク酸はその4,5-結合がプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素（プロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ）によって開環することから、4,5-環開裂活性を破壊すればプロトカテク酸から2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸への変換プロセスが完全に破壊されると考え、プロトカテク酸の4,5-環開裂酵素の活性を破壊したプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株を作製した。そして、この破壊株を用いることにより、テレフタル酸から3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを高収率かつ安価に製造できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、（１）本発明は、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列、
をコードする遺伝子が破壊された、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株を提供する。
【０００８】
（２）本発明はまた、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号２もしくは４に記載の塩基配列；又は
（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列であって、かつプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列、
を有する遺伝子が破壊された、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子破壊株を提供する。
【０００９】
（３）本発明はまた、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：
（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は
（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において、１又は２以上の塩基が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列、
をコードする遺伝子と相同組換えを起こすことができるＤＮＡ配列を有し、かつ、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を喪失している相同組換え用ＤＮＡと、当該遺伝子との相同組換えにより、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素遺伝子が破壊された、（１）又は（２）記載の遺伝子破壊株を提供する。
【００１０】
（４）本発明はまた、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素遺伝子破壊株の親株が、コマモナス属（Comamonas sp.）細菌である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の遺伝子破壊株を提供する。
【００１１】
（５）本発明はまた、前記コマモナス属細菌が、Comamonas sp. E6株である、（４）記載の遺伝子破壊株を提供する。
【００１２】
（６）本発明はまた、テレフタレート・ジオキシゲナーゼ遺伝子（TPA-DOX遺伝子）、NADPH-レダクターゼ遺伝子、1,2-ジヒドロキシ-3,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジカルボキシレート・デヒドロゲナーゼ遺伝子（DCD dehydrogenase遺伝子）、ポジティブレギュレーター遺伝子、テレフタレート・トランスポーター遺伝子（TPA transporter遺伝子）、及びプロトカテク酸 3,4-ジオキシゲナーゼ遺伝子（pcaHG遺伝子）を含む、組換えプラスミドを提供する。
【００１３】
（７）本発明はまた、（１）〜（５）のいずれか１に記載の遺伝子破壊株に、（６）の組換えプラスミドを導入してなる形質転換体を提供する。
【００１４】
（８）本発明は更に、テレフタル酸の存在下に、（７）記載の形質転換体を培養することを特徴とする、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、テレフタル酸から、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンを高収率かつ安価に発酵生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（Ｉ）プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子の獲得
本発明では、プロトカテク酸 4,5-環開裂系酵素遺伝子群を「pmd遺伝子群」と称するが、当該pmd遺伝子群の内、特に、プロトカテク酸 4,5-環を開裂し4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドに変換するジオキシゲナーゼ活性を有する酵素のα-サブユニットをコードする遺伝子を「pmdA1」（アミノ酸配列を配列番号３で、塩基配列を配列番号４で示す）、β-サブユニットをコードする遺伝子を「pmdB1」（アミノ酸配列を配列番号１で、塩基配列を配列番号２で示す）と称する。
また、4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドを開環し2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸に変換するデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を「pmdC」と称する。
【００１７】
プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されず、例えば、当該遺伝子の塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて、菌株のｃＤＮＡライブラリーやゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。
【００１８】
プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子をＰＣＲ法により取得することもできる。菌株の染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、当該遺伝子の塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを使用してＰＣＲを行えばよい。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、94℃で30秒間（変性）、55℃で30秒〜１分間（アニーリング）、72℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば30サイクル行った後、72℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、適切なベクター中にクローニングすることができる。ベクターとしては、大腸菌で自立複製し、Comamonas属株において染色体外では自立複製できないベクターを選択することが好ましい。
【００１９】
上記のブローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及び目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に公知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement pp.1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載された方法に準じて行うことができる。
【００２０】
（ＩＩ）遺伝子破壊株の作製
本発明の遺伝子破壊株は、プロトカテク酸4,5-環開裂を選択的に破壊する破壊株である。より詳細には、微生物細胞の染色体ＤＮＡ上に存在する下記：（ａ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列；又は（ｂ）配列番号１もしくは３に記載のアミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されているアミノ酸配列であって、プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有するアミノ酸配列、をコードする遺伝子が破壊されている。
【００２１】
上記の遺伝子としては、（ａ）配列番号２もしくは４に記載の塩基配列；又は（ｂ）（ａ）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する酵素をコードする塩基配列、を有する遺伝子が挙げられる。
【００２２】
具体的には、破壊する遺伝子としては、配列番号２で示されるpmdB1遺伝子でも、配列番号４で示されるpmdA1遺伝子でもよく、またこれら双方の遺伝子を破壊してもよい。
【００２３】
本明細書において、「アミノ酸配列において１又は２以上のアミノ酸が欠失、置換、付加及び/又は挿入されているアミノ酸配列」における「２以上」の範囲は特には限定されないが、例えば、１〜20、好ましくは１〜10、より好ましくは１〜７、特に好ましくは１〜３程度を意味する。
【００２４】
本明細書における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意に不一致な（mismatched）ＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された「高度にストリンジェントな条件」、又は「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりもより大きい程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖を形成し得る「中程度にストリンジェントな条件」を言う。「高度にストリンジェントな条件」の具体例としては、65〜68℃での、0.015 M 塩化ナトリウム、0.0015 M クエン酸ナトリウム、又は42℃での、0.015 M塩化ナトリウム、0.0015 Mクエン酸ナトリウム、及び50% ホルムアミドが挙げられる。「中程度にストリンジェントな条件」の具体例としては、50〜65℃での、0.015 M 塩化ナトリウム、0.0015 M クエン酸ナトリウム、又は37〜50℃での、0.015 M 塩化ナトリウム、0.0015 M クエン酸ナトリウム、及び20%ホルムアミドが挙げられる。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、BLAST〔Ｊ. Mol. Biol., 215, 403 （1990）〕、FASTA〔Method in Enzymology, 183, 63 （1990）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号２又は４の塩基配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは97％以上の相同性を有するＤＮＡを挙げることができる。
【００２５】
本明細書において「プロトカテク酸 4,5-環開裂活性を有する」とは、プロトカテク酸 4,5-環を開裂して、プロトカテク酸を4-カルボキシ-2-ヒドロキシムコン酸-6-セミアルデヒドに変換する酵素と同等の活性を有することを意味する。
【００２６】
本発明の遺伝子破壊株は、ＰＣＲ又はクローニングにより得られた上記のプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子に変異及び/又は選択マーカーを導入することによりプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を喪失したＤＮＡを得、次いで当該ＤＮＡを用いて相同組み換えを行うことにより作製できる。
【００２７】
プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子に選択マーカーを導入する方法としては、例えば、上記遺伝子を適当な制限酵素で切断した後に、無関係な遺伝子、好ましくは相同組換えを起こした菌株を選択できる選択マーカーの遺伝子を挿入する方法が挙げられる。適当な制限酵素部位がない場合にはＰＣＲ等により、適当な制限酵素部位を入れてもよい。選択マーカーとしては、薬剤耐性マーカーが好ましく、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００２８】
また、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子に変異を導入する方法としては、ＤＮＡの塩基配列を操作する組換えＤＮＡ技術（Sambruck, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）、ＰＣＲを応用した技術（Ling M.M. and Robinson BH., Anal. Biochem. 254(2): 157-78, 1997）等、多くの公知の方法が適用可能である。
【００２９】
本発明の遺伝子破壊株の作製に用いるプロトカテク酸 4,5-環開裂活性を喪失したＤＮＡは、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上の対応するプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素をコードする遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子を破壊することができる程度の相同性を有していればよい。このような相同性としては、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の相同性である。また、相同組換えに用いるＤＮＡは、生理的条件下、すなわち微生物細胞内で、染色体上の対応するプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子と相同組換えを起こすことができ、それによってプロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子を破壊することができれば、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子の一部であってもよい。ここで一部とは、好ましくは50塩基以上、より好ましくは100塩基以上の長さを有するものが挙げられる。
【００３０】
相同組み換えにより遺伝子破壊株を作製するためには、先ず、プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素の遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ又はその変異ＤＮＡ中に適当な選択マーカーを挿入した組み換えＤＮＡを構築する。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーを使用する場合には、相同組み換えを受ける前の野生型の菌株が感受性を示す薬剤の耐性遺伝子を選択することが必要である。そうすることにより相同組み換えを起こした菌株と起こさない菌株とを、抗生物質の存在下での生育の有無により判別することができる。次いで、上記の選択マーカーを遺伝子の配列中に挿入したＤＮＡを、エレクトロポレーション法等により菌体内に導入した後、マーカーで選択することにより、相同組換えによって目的遺伝子を宿主微生物染色体上へ組み込むことができる。
【００３１】
プロトカテク酸 4,5-環開裂酵素遺伝子破壊株の親株としては、土壌細菌であれば特に限定されず、例えばコマモナス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、サッカロミセス属、カンディダ属等が挙げられる。これらの中で、コマモナス属が好ましく、Comamonas sp. E6株が特に好ましい。親株としてComamonas sp. E6株を用いた場合には、バニリン酸等から2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸への発酵生産系（特開2005-278549号公報）や3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンへの発酵生産系（特願2006-218524号明細書）とほぼ同等の反応効率が達成された。
また、Pseudomonas putida PPY1100株も使用することができるが、Comamonas sp. E6株に比べて反応効率は若干低下した。
【００３２】
（ＩＩＩ）3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸の発酵生産プラスミドを導入した形質転換体の作製
当該プラスミドは、テレフタル酸からプロトカテク酸を経て3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸を生産する多段階プロセスを触媒する酵素遺伝子（ポジティブレギュレーター、TPA-トランスポーター、TPA-DOX、DCD-デヒドロゲナーゼ、NADPH-レダクターゼ、プロトカテク酸 3,4-環開裂遺伝子）を上流からこの順に含むプラスミドである（図８）。
【００３３】
上記のポジティブレギュレーター遺伝子（tphR）は、特願2005-298242号明細書に記載の配列番号１１に記載のＤＮＡ分子、TPA-トランスポーター遺伝子（tphC)は、同明細書に記載の配列番号１３に記載のＤＮＡ分子、TPA-DOX遺伝子（tphA2、tphA3）は、同明細書に記載のそれぞれ配列番号２、４に記載のＤＮＡ分子、DCD-デヒドロゲナーゼ遺伝子（tphB)は、同明細書に記載の配列番号６に記載のＤＮＡ分子、NADPH-レダクターゼ遺伝子（tphA1）は、同明細書に記載の配列番号８に記載のＤＮＡ分子である。また、本発明で使用するプロトカテク酸 3,4-環開裂遺伝子（pcaHG）は、Pesudomonas putida KT2440株から取得したＤＮＡ断片であり、特願2006-218524号明細書の配列番号１にPcaH遺伝子の塩基配列が、配列番号３にPcaG遺伝子の塩基配列がそれぞれ記載されている。尚、本明細書では、tphR、tphC、tphA2、tphA3、tphB及びtphA1を纏めて「Tph遺伝子クラスター」又は「Tph遺伝子群」と言うことがある。
【００３４】
本発明の、テレフタル酸からの3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸の発酵生産プラスミドは、具体的には図６〜８に記載のようにして作製できる。
（1）先ず、特願2006-218524号明細書に記載のPcaH遺伝子（配列番号１）及びPcaG遺伝子（配列番号２）を、公知のリガーゼを用いて、pBluescriptのLacZプロモーターの下流に存在するLacZのαフラグメントをコードする遺伝子内に存在するマルチクローニングサイトに連結することにより、組換えプラスミドpBluescript II SK-/pcaHGを作製する。
次に、pBluescript II SK-/pcaHGを制限酵素PvuII及びBamHIにより切断した後末端処理によって得られるＤＮＡ断片と、Ampプロモーターを含むプラスミドを制限酵素XbaIにより切断した後末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドpKHGを作製する（図６）。
（2）次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドを制限酵素Cfr13Iにより切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片と、pKHGを制限酵素KpnIによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドpKHG/Cを作製する（図７）。
（3）更に、特願2005-298242号明細書の図２に記載の、tphR、tphC、tphA2、tphA3、tphB及びtphA1を上流からこの順に連結した組換えプラスミドpHE96/pBluescript II SK(+)を制限酵素EcoRIで切断することによって得られるＤＮＡ断片と、（2）で得たpKHG/CをEcoRIによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドpKTphHG/Cを作製することができる。
【００３５】
（Ｉ）の遺伝子破壊株を組み換えプラスミドpKTphHG/Cを用いて形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いればよい。
【００３６】
形質転換体の選択は、用いたプラスミドの選択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。これらの形質転換体の中から目的の組換えプラスミドを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。このプローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等を用いることができる。
【００３７】
（ＩＩＩ）3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンの発酵生産
（ＩＩ）の本発明の形質転換体は、テレフタル酸の存在下で、炭素源、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。培地のpHは、形質転換体が生育し得る範囲のpHであればよく、pH 6〜8程度に調整するのが好適である。培養条件は、15〜40℃、好ましくは28〜37℃で２〜７日間振盪又は通気攪拌培養すればよい。
【００３８】
遺伝子破壊株の培養物から、3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸を単離精製するには、通常の有機化合物の単離、精製法を用いればよい。例えば、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。当該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、有機化合物の通常の単離精製法を用いて目的物を得ることができる。
【００３９】
上記により得られた3-カルボキシ-cis,cis-3-ムコン酸、又は未精製の3-カルボキシ-cis,cis-3-ムコン酸を含む培養液を酸処理することより、3-カルボキシムコノラクトンに収率良く変換することができる。酸としてはpH 1〜2程度の塩酸が好ましい。
【００４０】
本発明の製造法によって得られる3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸及び/又は3-カルボキシムコノラクトンは、プラスチック材料、化学製品材料等として、2H-ピラン-2-オン-4,6-ジカルボン酸とは異なった又は更に高機能の発現ができ、有用なプラスチック材料の製造が期待できる。
【実施例】
【００４１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００４２】
実施例１  pmd遺伝子群のクローニング
（１）PCRによるプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子の増幅と塩基配列の決定
Sphingomonas paucimobilis SYK-6株のligA遺伝子、Arthrobacter keyseri 12B株のpcmA遺伝子、Comamonas testosteroni BR6020株のpmdA1B1遺伝子、Sphingomonas sp LB126株のfldVU遺伝子から推定されるアミノ酸配列のアライメントから相同性の高い領域を見出し、Comamonas sp. E6株のプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼ遺伝子のE6株全DNAを鋳型として以下のαF/βRプライマーを用いてPCRを行った。
α-サブユニット内のαF (26 mer: ATGWSSCTGATGAARSCSGARAACCG；配列番号５)；
β-サブユニット内のβF (27 mer: GTSWTCCTGGTSTAYAACGAYCAYGCY；配列番号６)；及び
β-サブユニット内のβR (25 mer: CCCTGMARCTGRTGGCTCATGCCGC；配列番号７)。
【００４３】
その結果、予想される900 bpのサイズに増幅が見られた。次にこのPCR産物を鋳型に用いてnested primerであるβFを用いてβF-βR間でPCRを行った。その結果予想されるサイズである450 bpの断片の増幅を得た。得られたPCR産物をpT7Blueベクターにサブクローニングし、449 bp断片の塩基配列を決定した。相同性を示す配列をDDBJデーターベースで検索したところ、アミノ酸レベルでComamonas testosteroni BR6020株のプロトカテク酸 4,5-ジオキシゲナーゼβ-サブユニットをコードする遺伝子（DDBJ受入番号：AF305325）と99 %の同一性を示した。また、Sphingomonas paucimobilis SYK-6株のligB（DDBJ受入番号：AB035122）と68 %、Arthrobacter keyseri 12B株のpcmA（DDBJ受入番号：AF331043）、Sphingomonas sp. LB126株のfldU（DDBJ受入番号：AJ277295）のいずれとも66 %、の同一性を示した。
【００４４】
（２）プロトカテク酸 4,5-ジデオキシゲナーゼ遺伝子を含むコスミドの単離
E6株SalI部分消化断片を含むコスミドライブラリーから、PCR産物をプローブとしたコロニーハイブリダイゼーションによって陽性クローンを得た。得られた陽性クローンから抽出したコスミドをSalIで消化し、同プローブでサザンハイブリダイゼーションを行った結果、10 kbに交雑が認められ、本コスミドをpPV10と命名した。
【００４５】
（３）pPV10由来1.9-kb SalI-XhoI断片と3.2-kb XhoI断片の塩基配列
pPV10の10-kb SalI断片をpBluescript II KS(+)のlacプロモーター下流に正逆両方向に挿入したクローンpKS10F(R)を作製した。pKS10FをSalIとXhoIで消化して得られる、1.9 kb, 3.2 kb, 4.9 kbの3つの断片を平滑化しpBluescript II KS(+)のSmaIサイトに導入した。lacプロモーターの下流にこれら断片を正逆両方向に導入後、それぞれpK1SXF(R)、pK3XF(R)、pK4XSF(R)と命名した（図１）。pK1SXF(R)の1.9-kb SalI-XhoI断片とpK3Xに含まれる3.2-kb XhoI断片の全塩基配列を決定した。また、これら断片がXhoIを介して隣接していることをpKSTSの2.2-kb StuI断片のシークエンスから確認した（図１）。図１において、Placはlacプロモーターを、矢印は転写方向を示す。
【００４６】
（４）10-kb SalI断片上流域の単離
pPV10の10-kb SalI断片の上流域を単離するために、E6株の全DNAのSacI消化物をcharomid 9-36にクローン化したライブラリーを作製した。1.9-kb SalI-XhoI断片をSalIとEcoRI 消化して得られる1,150 bp断片を用いてコロニーハイブリダイゼーションによってpmdA1B1を含む10-kb SacI断片をもつpCS18を単離した(図２)。pSC18のpmdA1B1を含む2.1-kb SacII断片が6.1-kb SacI-SalI断片と隣接していることを塩基配列の決定により確認し、6.1-kb SacI-SalI断片を平滑化し、pBluescript II KS(+)のlacプロモーター下流EcoRVサイトに正逆両方向に挿入したクローンpSA2-6F(R)を作製し、全塩基配列の決定を行なった（図３）。配列番号８には、図３に記載のpmdJ（塩基番号1〜1029）、pmdK（塩基番号1162〜1845）、pmdI（塩基番号1942〜2934）、pmdA1（配列番号２）、pmdB1（配列番号４）及びpmdC（塩基番号4427〜5386）の各遺伝子を含む遺伝子配列を示す。
【００４７】
実施例２  pmdB1遺伝子破壊株の作製
（１）pmdB1遺伝子破壊プラスミドの作製
pmdA1B1C遺伝子を含む3.6-kb SalI-EcoRV断片をpKS10Fから切り出し、pBluescript II KS(+)をSalI-EcoRV消化したものに挿入し、pSDB36を得た。次にpmdB1遺伝子内にあるStuIで消化し、その間（配列番号１の下線で示した配列）にpIK03由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む1.2-kb EcoRV断片を挿入した。pBluescript II KS(+)のlacプロモーター転写方向と同じ向きに断片が挿入されたことをSmaI消化によって確認し、pKS78Fを得た。pKS78Fから4.9-kb SalI-EcoRV断片を切り出し、pK19mobsacBのSalI-SmaIサイトに挿入してpmdB1破壊株作製用プラスミドpDBKMを構築した(図４)。
【００４８】
（２）pmdB1遺伝子破壊株の作製
3 mlのLB培地で前培養したE6株を10 mlのLB培地に1 %植菌し、本培養した。OD 600=0.5に生育後、5,000 rpm、４℃、15分で遠心分離し、集菌した。1 mlの0.3 Mスクロースで２回洗浄し、1 mlの0.5 Mスクロースに懸濁した。100 μlの菌液に1 μg /μlに調製した遺伝子破壊プラスミドpDBKMを1 μl加えて、抵抗800 Ω、電圧12 V、静電容量25 μFの条件下でGene pulser (Bio-Rad)を用いてパルスをかけた。パルス後即座に1 mlのLB培地を加えて30℃で６時間培養した。300 μlを100 μg/ml カナマイシンを含むLB培地に塗布した。
【００４９】
得られたカナマイシン耐性株を1 mlのLB培地で集菌し、10 %スクロースを含む10 ml LB培地に植菌、12時間培養した。新しいLB培地に200 μlを植菌し、これを3回繰り返した。最後に培養液を100 μg/ml カナマイシンを含むLB培地に塗布し、得られたコロニーを遺伝子破壊株の候補とした。
【００５０】
（３）pmdB1遺伝子破壊の確認
遺伝子破壊株候補を100 μg/ml カナマイシンを含むLB培地3 mlで前培養し、同培地10 mlに1 %植菌し本培養した。その後、遺伝子破壊株候補の全DNAを回収し、EcoRVで消化後、pmdA1B1を含む3.4-kb HindIII-KpnI断片とpIK03由来のカナマイシン耐性遺伝子を含む1.2-kb EcoRV断片をプローブに用いるサザンハイブリダイゼーションを行った(図５)。レーン及び3は、EcoRV消化した野生型E6株の全DNA、レーン2及び4は、EcoRV消化した遺伝子破壊株の全DNAを示す。使用したプローブは、レーン1及び2については、pmdB1を含む3,4-kb HindIII-KpnI断片、レーン3及び4については、カナマイシン（Km）耐性遺伝子を含む1.2-kb EcoRV断片である。
【００５１】
実施例３  3-カルボキシムコノラクトンの製造
（１）3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸の組換えプラスミドpKTphHG/Cの作製
1-1）特願2006-218524号明細書に記載の組換えプラスミドpBluescript II SK-/pcaHGを制限酵素pvuII及びBamHIにより切断した後に末端平滑化によって得られるDNA断片と、特開2005-278549号公報に記載のpKT230MCを制限酵素XbaIにより切断した後に末端平滑化によって得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼ（ロシュ製）により結合させることにより、組換えプラスミドpKHGを作製した（図6）。
【００５２】
1-2）次いで、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含むプラスミドpHSG398（タカラ製）を制限酵素Cfr13Iにより切断した後に末端平滑化によって得られるDNA断片と、pKHGを制限酵素KpnIにより切断した後に末端平滑化によって得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼ（ロシュ製）により結合させることにより、組換えプラスミドpK HG/Cを作製した（図7）。
【００５３】
1-3）更に、特願2006-218524号明細書に記載の組換えプラスミドpHE96/pBluescript II SK (+)を制限酵素EcoRIで切断して得られるDNA断片と、pK HG/Cを制限酵素EcoRIで切断して得られるDNA断片とを、T4DNAリガーゼ（ロシュ製）により結合させることにより、組換えプラスミドpKTphHG/Cを作製した（図8）。
【００５４】
（２）形質転換
2-1）組換えプラスミドpKTphHG/Cを大腸菌HB101株に形質転換し、25 mg/Lのカナマイシンを含むLB培地（100 ml）で、37℃で18時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドpKTphHG/Cを抽出した。
【００５５】
2-2）実施例2で作製した遺伝子破壊株（Comamonas sp. EDB株）を、LB液体培地500 mlで、28℃で23時間培養し氷中で30分冷却した。４℃、10,000 rpm、10分で遠心集菌し、500 mlの０℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて250 mlの0℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。さらに125 mlの０℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、10 %グリセロールを含む蒸留水に懸濁し、０℃にて保持した。
【００５６】
2-3）（１）のプラスミドpKTphHG/CのDNA約0.05 μgを含む蒸留水4 μlを0.2 cmのキュベットに入れ、2-2）の10 %グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液40 μlを加え、（25 μF、2500 V、12 msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。
【００５７】
2-4）上記処理した細胞全量を10 mlのLB液体培地に接種し、28℃で6時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め25 mg/Lのカナマイシン、50 mg/Lのアンピシリン、30 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB平板に展開し28℃で48時間培養し、プラスミドpKTphHG/Cを保持するクロラムフェニコール耐性を示す形質転換株を得た。本菌をpKTphHG/C/Comamonas sp. ECB株と名付けた。
【００５８】
2-5）pKTphHG/C/Comamonas sp. ECB株を、200 mlのLB液体培地（30 mg/Lのクロラムフェニコールを含む）に接種し、28℃で16時間培養し、前培養菌体懸濁液とした。5 LのLB液体培地及び消泡剤（Antiform A）3 mlを10 L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したpKTphHG/C/Comamonas sp. ECB株の前培養菌体懸濁液200 mlとテレフタル酸8 gを溶解した水溶液を混合し、28℃で500 rpm/分の通気攪拌下、OD 518＝3程度まで培養した（8時間〜12時間）。
【００５９】
2-6）10 L容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いた培養で、OD 518＝3に達した時点で、発酵槽から500 mlの培養液を三角フラスコに抜き取り、氷上で保存した。
【００６０】
2-7）OD 518＝3に達した発酵槽の培養液に、テレフタル酸42 gを0.1 N NaOH水溶液500 mlに溶解し（pH 8.5に調整）、ペリスタポンプを用いて10〜12時間かけて添加した。反応の進行に伴う3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸の生成により、培養液のpHの低下を防ぐため、pHセンサーに連結したペリスタポンプで0.1 NのNaOH溶液を添加して培養液のpHを維持した。反応の進行はHPLCによって確認した。36時間後、添加したテレフタル酸は殆ど消失した。2-5）で調製した氷冷菌体懸濁500 mlを発酵槽の培養液に加えて12時間培養を続けた。
【００６１】
2-8）反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移した。培養液から遠心分離（6000 rpm、20℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えることによりpH 1.0以下に低下させ低温で保存することにより3-カルボキシ-cis,cis-ムコン酸を3-カルボキシムコノラクトンに変換した。3-カルボキシムコノラクトンへの完全変換をGC-MSにより確認し、有機溶媒（酢酸エチル）により3-カルボキシムコノラクトンの抽出を行った。培養液1 Lから抽出乾固した3-カルボキシムコノラクトンは約9.8 gに達し、添加した基質（テレフタル酸）比87 %程度の収率で回収された。得られた3-カルボキシムコノラクトンを活性炭で処理し、その構造をNMR及びMSスペクトルによって確認した。
【００６２】
1H-NMR（400MHz, DMSOd6）δ: 2.67, 3.10, 5.55, 6.81, 12.5-13.0
13C-NMR（100MHz, DMSOd6）δ: 36.5, 78.5, 125.9, 157.9, 162.1, 170.4, 170.8
MS  m/z :330(M+)（3-カルボキシムコノラクトンのTMS（トリメチルシリル）体として）
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１は、5.1-kbSalI-XhoIの制限酵素及びORFマップを示す図である。
【図２】図２は、pCS18の10-kb SacI断片及びpPV10の10-kb SalI断片の位置関係を示す図である。
【図３】図３は、Comamonas sp. E6株由来のプロカテク酸 4,5-開裂系酵素遺伝子群を示す図である。
【図４】図４は、pmdB1破壊株プラスミドpDBKMを示す図である。
【図５】図５は、Comamonas sp. E6株におけるpmdB1遺伝子の破壊を示す図である。５（Ａ）は、E6株のpmdB1遺伝子破壊株の作製法を、５（Ｂ）は、pmdB1遺伝子破壊株のサザンハイブリダイゼーション解析の結果を示す図である。
【図６】図６は、組み換えプラスミドpKHGの作製を示す図である。
【図７】図７は、組み換えプラスミドpKHG/Cの作製を示す図である。
【図８】図８は、組み換えプラスミドpKTphHG/Cの作製を示す図である。
【図１】
2008278823.tif 000002
【図２】
2008278823.tif 000003
【図３】
2008278823.tif 000004
【図４】
2008278823.tif 000005
【図６】
2008278823.tif 000006
【図７】
2008278823.tif 000007
【図８】
2008278823.tif 000008
【図５】
2008278823.tif 000009
【配列表】
2008278823000001.app