(57)【要約】【課題】閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを提供すること。【解決手段】培地中のガス交換を行うためのガス透過膜が装着され培地の循環流路が設けられた閉鎖系細胞培養用容器を装着させ、その容器の培地出入口につなげられた配管を通して送液ポンプにより新鮮な培地の供給を制御すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中のガス交換を行うためのガス透過膜が装着され培地の循環流路が設けられた閉鎖系細胞培養用容器を装着でき、その容器の培地出入口につなげられた配管を通して送液ポンプにより新鮮な培地の供給制御ができる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム。
【請求項２】
常用の細胞培養用インキュベーター内で利用することを特徴とする請求項１記載の閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム。
【請求項３】
運搬車両内で利用することを特徴とする請求項１、２のいずれか１項記載の閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム。
【請求項４】
電源が蓄電池である、請求項１〜３のいずれか１項記載の閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学、医学等の分野における密閉系細胞培養容器を利用した閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
医療技術の著しい発展により、近年、治療困難となった臓器を他人の臓器と置き換えようとする臓器移植が一般化してきた。対象となる臓器も皮膚、角膜、腎臓、肝臓、心臓等と実に多様で、また、術後の経過も格段に良くなり、医療の一技術としてすでに確立されつつある。一例として角膜移植をあげると、約４０年前に日本にもアイバンクが設立され移植活動が始められた。しかしながら、未だにドナー数が少なく、国内だけでも角膜移植の必要な患者が年間約２万人いるのに対し、実際に移植治療が行える患者は約１／１０の２０００人程度でしかないといわれている。角膜移植というほぼ確立された技術があるにもかかわらず、ドナー不足という問題のため、次なる医療技術が求められているのが現状である。
【０００３】
このような背景のもと、以前より、人工代替物や細胞を培養して組織化させたものをそのまま移植しようという技術が注目されている。その代表的な例として、人工皮膚及び培養皮膚があげられよう。しかしながら、合成高分子を用いた人工皮膚は拒絶反応等が生じる可能性があり、移植用皮膚としては好ましくない。一方、培養皮膚は本人の正常な皮膚の一部を所望の大きさまで培養したものであるため、これを使用しても拒絶反応等の心配がなく、最も自然なマスキング剤と言える。
【０００４】
その細胞培養には、従来、器材として細胞培養用ディッシュ、マルチプレート、フラスコ等を用いられてきた。その際、例えばディッシュやマルチプレートを使用するときは、細胞培養時に通常、培養容器上部に蓋を乗せて行われる。また、フラスコを使用する場合では細胞培養時に蓋をゆるめて行われる。すなわち、何れの場合でも細胞が培養される空間が基本的に開放状態であり、細胞の代謝に必要な酸素は十分に確保できる反面、細菌汚染するリスクが極めて高い問題点があった。
【０００５】
こうした背景のもと、特表平１０−５０４７１０公報や特開平１０−２６２６４７公報ではガス透過膜を有する密閉型の細胞培養容器が提案されている。この方法によれば、密閉型の培養容器であるため、細胞培養中では容器外からの菌による汚染は抑制でき、また、密閉系容器で問題となる細胞が生存するための酸素もガス透過膜を介して、供給できるような構造を有している。しかしながら、これらの培養容器では細胞を培養するための培養面が１面だけのものであった。また、特開平１１−２８０８２号公報では、酸素透過性透明部材、シリコンゴム枠、分離膜から構成される多層式の細胞培養容器が記載されているが、この培養容器では宇宙空間で使用するため容器に細胞培養用液体培地の管状流路が設けられていないこと、またこの容器においても培養した細胞を剥離させる際には酵素処理を行わなくてはならず、ガス透過性を有し、しかも酵素処理が不要な膜技術は見出されていなかった。さらに、こうした密閉型の培養容器を使用する場合でも、培地交換は作業者によって行われており、必ずしも培養された細胞を最適な条件で培養されていなかった。また、培養細胞の培地交換毎に作業を行わなくてはならず時間的な制約が生じ、改善が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの密閉系細胞培養容器を利用した閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを提供することを目的とする。      
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、ガス透過膜が装着され閉鎖系細胞培養用容器を用い、その容器の培地出入口につなげられた配管を通して送液ポンプにより培地を供給制御できる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、培地中のガス交換を行うためのガス透過膜が装着され培地の循環流路が設けられた閉鎖系細胞培養用容器を装着でき、その容器の培地出入口につなげられた配管を通して送液ポンプにより新鮮な培地の供給制御ができる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に記載される閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムであれば、クリーンベンチ内でなくともどのような場所においても細胞を培養させられ、細胞培養を汚染させることなく、簡便に、安全に行えるようになり、さらに培養細胞を培地供給システムごと移動させたい場所へ汚染させることなく、簡便に、安全に移動させられるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、培地中のガス交換を行うためのガス透過膜が装着され培地の循環流路が設けられた閉鎖系細胞培養用容器を装着でき、その容器の培地出入口につなげられた配管を通して送液ポンプにより新鮮な培地の供給制御ができる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムである。本発明は以下に記載するような閉鎖系細胞培養用容器を装着し、その容器の培地出入口に配管することで閉鎖系のシステムとしていることが特徴である。必要に応じて容器装着部にヒーターを取り付けても良い。容器と培地導入管との接合部は特に限定されるものではなく、その接合部から菌汚染が起こらなければ良く、容器側の止水弁に対しニードル、もしくはシリンジが装着された培地導入管を差し込む方法で良い。
【００１１】
本発明で用いる送液ポンプは特に限定されるものではないが、チューブポンプ、ギヤーポンプ、ロータリーポンプ等が挙げられる。本発明の目的が携帯型の細胞培養用培地供給システムであることを考えると、使用後に配管を廃棄できるチューブポンプを利用することが望ましい。また、閉鎖系細胞培養用容器から配管内にある培地を閉鎖する意味では、チューブポンプ、ギヤーポンプであればポンプ部のところで培地が遮断され閉鎖されることになり好ましい。
【００１２】
本発明では、閉鎖系細胞培養用容器に対し閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムによって培地交換をする。その培地交換する際は、容器内に気泡が残らないようにすることが好ましく、その方法としては特に限定されないが、培地導入入口側の配管と出口側の配管を一台以上のチューブポンプにつなげて培地の導入、排出を同時に行う方法、２台以上のギヤーポンプを用いて培地の導入、排出を同時に行う方法等が挙げられる。また、そのポンプの駆動電源も特に問われるものではないが、通常使われる交流電源、並びに蓄電池等が挙げられる。
【００１３】
本発明で供給される培地貯蔵槽は、本閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムに備え付けられていても分離されていても良く、特に制約されるものではないが、例えば、本システムをそのままインキュベーター内に装着する場合、培地が常に加温され好ましくなく、目的に応じて適宜システムを変更すれば良い。
【００１４】
本発明のシステムは、閉鎖系細胞培養用容器に対し培地供給をプログラム管理できるものである。その結果、培養される細胞に最適な条件で培地交換できるようになり、また、それを実施するための人手も不要であり、細胞を培養する上で極めて好都合なシステムである。また、本発明のシステムは、小型装置であるため常用の細胞培養用インキュベーター内で利用することも可能となる。さらに、運搬車両内に設置して培養細胞を移動させる際にも極めて好都合な装置である。
【００１５】
本発明では、細胞培養用液体培地の管状流路を設けた成型体にガス透過膜を固定することで密閉された細胞培養用空間を設け、必要に応じその空間を１枚以上の物質透過膜により分割した密閉系細胞培養容器を利用する。本発明に示す密閉系細胞培養容器とは、少なくとも細胞培養用液体培地の管状流路を設けた成型体にガス透過膜を固定することで密閉されたものである。そのガス透過膜とは酸素ガス透過性が０．５×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上、好ましくは０．８×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上、さらに好ましくは１．０×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上のものである。０．５×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以下であると、閉鎖系細胞培養容器内で培養されている細胞への酸素供給が不十分となりその生存に障害が生じ好ましくない。一方、通常、細胞培養の際には培地のｐＨを一定に保たせるために炭酸ガスが必要である。本閉鎖系細胞培養容器においてもその必要性は同様であり、従って本閉鎖系細胞培養容器に固定されているガス透過膜には炭酸ガスの透過性も必要である。その炭酸ガス透過性は３．０×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上、好ましくは４．５×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上、さらに好ましくは６．０×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以上のものである。３．０×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ以下であると、閉鎖系細胞培養容器内で培養されている細胞への炭酸ガスの供給が不十分となりその生存に障害が生じ好ましくない。本発明で使用されるガス透過膜とは上述したガス透過性を有するものであれば何ら制約されるものではないが、本発明の目的が細胞を培養するためのものであることを考えるとガス透過膜は光学的に透明であることが好ましい。ガス透過膜の材質についても何ら制約されるものではないが、例えばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート等があげられる。ガス透過膜の膜厚についても上述したガス透過性を有すれば何ら制約されるものではないが、例えば３０μｍ以上、好ましくは５０μｍ以上、さらに好ましくは８０μｍ以上が好ましい。３０μｍ以下であると、閉鎖系空間を保たせることが困難となり好ましくない。本発明の閉鎖系細胞培養容器はガス透過膜を固定することで密閉された空間を有するものである。その際、ガス透過膜が固定される壁の形状、透明性、材質等には特に制約されるものはない。しかしながら、ガス透過膜と同じ材質の壁にすることで、ガス透過膜と壁との固定が強固となり好ましい。
【００１６】
本発明で示す閉鎖系細胞培養容器とは、ガス透過膜を固定することで密閉された細胞培養用空間に細胞培養用液体培地の管状流路を設けたものである。その管状流路は細胞培養用液体培地を注入、取り出しができれば形状や流路の管径等に特に制約されるものではない。しかしながら、閉鎖系細胞培養容器の閉鎖性を考えるとその管の直径は２．５ｍｍ以下、好ましくは２．０ｍｍ以下、さらに好ましくは１．５ｍｍ以下である。２．５ｍｍ以上であると閉鎖系空間からの培地の流出が起こりやすく好ましくない。
【００１７】
本発明の密閉系細胞培養容器においては、必要に応じその閉鎖された細胞培養用空間を１枚以上の物質透過膜により分割しても良い。その際、使用される物質透過膜の平均孔径は０．２〜３．０μｍの範囲が良く、好ましくは０．３〜２．０μｍの範囲、さらに好ましくは０．４〜１．０μｍの範囲が良い。平均孔径が０．２μｍ以下の場合は物質透過能力が低く、細胞の培養が効率良く行われない。また、３．０μｍ以上の平均孔径の場合にはその孔を介して細胞が物質透過膜を通過する可能性があり、物質透過膜により培養空間を分割するという目的を達成しておらず好ましくない。本発明で使用される物質透過膜とは上述したように多孔性であり物質透過性を有するものであれば何ら制約されるものではないが、本発明の目的が細胞を培養するためのものであることを考えると物質透過膜は光学的に透明であることが好ましい。物質透過膜の材質についても何ら制約されるものではないが、例えばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン、シリコーンポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート等があげられる。物質透過膜の膜厚についても上述した物質透過性を有すれば何ら制約されるものではないが、例えば５μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上、さらに好ましくは３０μｍ以上が好ましい。５μｍ以下であると、閉鎖系空間を保たせることが困難となり好ましくない。本発明の閉鎖系細胞培養容器は物質透過膜を固定することで密閉された空間を有するものである。その際、物質透過膜が固定される壁の形状、透明性、材質等には特に制約されるものはない。しかしながら、物質透過膜と同じ材質の壁にすることで、物質透過膜と壁との固定が強固となり好ましい。
【００１８】
以上より、細胞培養用液体培地の管状流路を設けた成型体に透過膜を固定することで密閉された細胞培養用空間を有した密閉系細胞培養容器が得られる。その際、必要に応じ１枚以上の物質透過膜により細胞培養用空間を分割しても良い。細胞の培養は、その密閉系細胞培養容器内の１つ以上の細胞培養用空間内で行われる。
【００１９】
密閉系細胞培養容器内に物質透過膜を使用した場合、その物質透過膜の両側を異なった細胞で培養すれば、細胞の通過が無く細胞が産生し培養液中に放出する液性因子だけが通過する培養系が構築でき、有用である。具体的には、物質透過膜を介して上層及び下層に培地を満たし、角膜上皮細胞を物質透過膜上で培養し、物質透過膜下層にフィーダー細胞を培養すれば、物質透過膜上の角膜上皮細胞は重層化することとなる。その際、フィーダー細胞は物質透過膜を通過することができず、物質透過膜上で培養される角膜上皮細胞に混合することなく好都合である。その際、使用されるフィーダー細胞としては、例えば線維芽細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞などが挙げられるが、特に制約されるものではない。また、上皮系細胞とフィーダー細胞は必ずしも同一種の動物由来のものでなくても良いが、得られた重層化上皮系細胞シートを移植に用いる場合は上皮系細胞とフィーダー細胞を同一種の動物由来のものとした方が望ましい。また、この重層化上皮系細胞シートをヒトの治療に用いる場合は上皮系細胞とフィーダー細胞をヒト由来の細胞を用いる方が望ましい。
【００２０】
本発明に使用される細胞は、例えば角膜上皮細胞、表皮角化細胞、口腔粘膜細胞、結膜上皮細胞、軟骨細胞、神経細胞、心筋細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、脂肪細胞及びそれらの幹細胞のいずれかもしくは２者以上の混合物が挙げられるが、その種類は、何ら制約されるものではない。また、その細胞の由来は特に制約されるものではないが、たとえばヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、ブタ、ヒツジなどが挙げられるが、本発明の培養細胞をヒトの治療に用いる場合はヒト由来の細胞を用いる方が望ましい。
【００２１】
本発明における細胞培養のための培地は培養される細胞に対し通常用いられるものを用いれば特に制約されるものではない。例えば、培地中に公知のウシ胎児血清（ＦＣＳ）等の血清が添加されている培地でもよく、また、このような血清が添加されていない無血清培地でもよい。しかしながら、得られた培養細胞をヒトの治療に用いる場合は用いる培地の成分は由来が明確なもの、もしくは医薬品として認められているものが望ましい。
【００２２】
［実施例］
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００２３】
図１に示すような寸法の各パーツからなる１台のチューブポンプからなる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを作成した。その装置内に成型体中央は空間となっている閉鎖系細胞培養用容器を装着した。その容器中央の上部、中央部、下部にそれぞれガス透過膜としてのポリカーボネート膜、物質透過膜、ガス透過膜としてのポリカーボネート膜を物質透過膜、ガス透過膜、ガス透過膜の順に成型体に熱融着させ、２層式の密閉系細胞培養容器を作製した。その際、ポリカーボネート膜のガス透過性は、酸素ガス透過性が１．４×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ、炭酸ガス透過性が８．０×１０１０ｃｃ・ｃｍ／ｃｍ２・ｓｅｃ・ｃｍＨｇであった。物質透過膜にはワットマン製のポアサイズ０．４μｍのサイクロポアメンブレンを使用した。
【００２４】
密閉系細胞培養容器の下層部にフィーダー細胞としてマイトマイシンＣ処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種した。密閉系細胞培養容器の上層部は培地のみを満たし、密閉系細胞培養容器を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に入れた。翌日、深麻酔下のウサギ角膜輪部から常法に従って角膜上皮組織を採取し、０．０５％トリプシン処理することで得られた細胞を、上記密閉系細胞培養容器の物質透過膜上（密閉系細胞培養容器の上層部）に２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種した。本閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム全体をインキュベーター内に入れ、培地としては、上層、下層共に角膜上皮細胞用として通常使われる５％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ系培地を使用した（３７℃、５％ＣＯ２）。培地交換は閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを利用し８時間毎に行った。培養開始１１日後には培養した細胞はコンフルエントの状態になっており、重層化していた。得られた重層化角膜上皮細胞シートは移植に使用できる十分な強度を有しており、本密閉系細胞培養容器が本発明として好ましいものであることが分かった。
【実施例２】
【００２５】
図２に示すような寸法の各パーツからなる２台のチューブポンプからなる閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムを使用する以外は、実施例１と同様な実験を行った。実施例１と同様にウサギ角膜上皮細胞を培養したところ、培養開始１１日後には培養した細胞はコンフルエントの状態になっており、重層化していた。得られた重層化角膜上皮細胞シートは移植に使用できる十分な強度を有しており、本密閉系細胞培養容器が本発明として好ましいものであることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明に記載される閉鎖系小型細胞培養用培地供給システムであれば、クリーンベンチ内でなくともどのような場所においても細胞を培養させられ、細胞培養を汚染させることなく、簡便に、安全に行えるようになり、さらに培養細胞を培地供給システムごと移動させたい場所へ汚染させることなく、簡便に、安全に移動させられるようになる。この方法で得られる培養細胞シートは、たとえば角膜移植、軟骨移植、皮膚移植、虚血性心疾患治療、角膜疾患治療、近視治療等の臨床応用が強く期待される。したがって、本発明は細胞工学、医用工学、などの医学、生物学等の分野における極めて有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１に示す閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム概略を示すものである。
【図２】実施例２に示す閉鎖系小型細胞培養用培地供給システム概略を示すものである。
【図１】
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【図２】
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