(57)【要約】【課題】本発明は、肝細胞の複製を促進させる薬剤および方法を提供すること、ならびに、インスリン抵抗性を改善させる薬剤および方法を提供することを課題とする。【解決手段】ヘパリン結合性タンパク質であるケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）のサブファミリーに属するＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を肝細胞に投与し、肝細胞の複製を促進する。ＣＸＣＬ１０に対する中和剤としては、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子またはＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子などが好適に用いられる。障害を有する肝組織に上記中和剤を投与することにより、肝組織を修復、再生し得る。一方、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を肝細胞に投与することにより、２型糖尿病、メタボリック症候群等におけるインスリン抵抗性を改善する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分とする肝細胞複製促進剤。
【請求項２】
少なくとも成熟肝細胞の複製を促進することを特徴とする、請求項１に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項３】
損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進することを特徴とする、請求項１または２に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項４】
前記損傷が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原体を原因とする損傷からなる群より選択される損傷である、請求項１から３のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項５】
前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障害からなる群より選ばれる疾患による損傷である、請求項４に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項６】
前記病原体が肝炎ウイルスである、請求項１から３のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項７】
前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除からなる群より選ばれる原因による損傷である、請求項４に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項８】
前記損傷が、脂肪性肝炎による損傷である、請求項４に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項９】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である請求項１から８のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項１０】
前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である請求項９に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項１１】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である請求項１から８のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項１２】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である請求項１から８のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
【請求項１３】
ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の、肝細胞複製促進剤を製造するための利用。
【請求項１４】
ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与する工程を含む、肝細胞の増殖促進方法。
【請求項１５】
ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。
【請求項１６】
メタボリック症候群におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、請求項１５に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項１７】
２型糖尿病におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、請求項１５に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項１８】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である請求項１５から１７のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項１９】
前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である請求項１８に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項２０】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である請求項１５から１７のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項２１】
前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である請求項１５から１７のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【請求項２２】
ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の、インスリン抵抗性改善剤を製造するための利用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞の複製を促進する薬剤に関し、詳しくは、障害を有する肝組織において、肝細胞を再生または修復することに寄与し得る肝細胞複製促進剤およびこれを用いた肝細胞の増殖促進方法に関する。また、本発明は、インスリン抵抗性を改善する薬剤に関し、詳しくは、インスリン抵抗性を呈する患者において、インスリン抵抗性を改善し耐糖能の正常化に寄与しうるインスリン抵抗性改善剤およびこれを用いたインスリン抵抗性の改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝臓はアミノ酸代謝、アンモニア代謝および化学物質の解毒を行う重要な臓器であり、主に肝細胞で機能される。従って、外傷、毒物による損傷あるいは疾病による肝機能障害は、生体にとって生命に関わる重篤な状態を招く場合がある。ことに肝細胞障害による急性肝不全に陥った患者は高い死亡率を有し、血漿交換を含む保存的治療のみを行った場合の救命率は３０％以下とされている。現在まで決定的な保存的治療法はなく、肝臓移植が生存率を改善する唯一の確立された治療法と考えられている。しかしながら、免疫抑制剤の長期間使用と感染の危険、高いコスト、ドナー不足あるいは未知の副作用などの問題が解決されておらず、ＱＯＬ（ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｆｅ）が著しく低下するという欠点を持つ。これらのことから肝移植に勝る方法として、肝再生に基づいた治療法の開発が近年ますます盛んになっている。そもそも肝臓は古くから再生能の高い臓器として知られており、肝細胞の増殖、分化機序もＩＬ−６（インターロイキン６）やＨＧＦ（肝細胞増殖因子）を中心に、詳細に検討されつつある。それにもかかわらず、実際の生体内で肝細胞の再生を最初に誘発する因子や、再生過程における肝細胞索構築や機能を維持せしめる因子は未だ大きな疑問として立ちはだかっている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００３】
正常時の肝細胞はほとんどが休止期の状態であり、ＤＮＡ合成している肝細胞は数％以下で、生理的ターンオーバーも数年とする説が支配的である。しかしながら、障害時にはそのターンオーバーは加速し、例えば７０％肝切除の場合は１週間で回復することが証明されている。新たに作られる肝細胞の供給源として、現在４つのソースが推定されている。解剖学的には、類洞領域の成熟肝細胞、門脈領域Ｈｅｒｉｎｇ管周囲の小型肝細胞（オーバル細胞と呼ばれる肝組織幹細胞と考えられている集団）、胆管上皮細胞、そして骨髄由来の細胞である。これらの細胞集団の起源や貢献度、相互作用を知る事は、肝再生を制御するための基礎的研究課題であるが、未だ十分解明されていない。
【０００４】
障害時に肝機能を維持するため臨床的に最も重要なのは、如何に胆汁鬱帯を防ぐか、すなわち胆汁排泄機構を獲得させるか、という課題であり、近年の人工肝臓補助装置開発の最大のネックにもなっている。単一の肝細胞レベルではなく、３次元的な肝細胞索構築としての胆汁排泄機構が問題となっており、その点で肝細胞の移動様式は重要な意義をもつ。現在、肝再生における分化依存的な肝細胞の移動には２つの説が提唱されている。門脈領域の肝組織幹細胞が分化に伴って類洞から中心静脈領域に移動するという「ストリーミング説」と、分化に伴いクラスターを形成しながら、一塊となってランダムに移動するという「モザイク説」であり、現在「モザイク説」が優勢だが完全な決着はついていない（非特許文献３）。更に、肝細胞の配列を決定する因子と供給源としての幹細胞の関わり方についてはほとんど報告がない。
【０００５】
現在の肝再生療法開発においては、成長因子やサイトカインによる再生促進療法と、幹細胞を利用した方法が主流である。前者は肝細胞の増殖を刺激する因子として、ＩＬ−６、ＨＧＦの他、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子）、ｕＰＡ（ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子）、プラスミノーゲン、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）が候補として研究されている。しかしながら、半減期が短い事、全身に作用する事に起因する副作用の問題がある。決定的には肝細胞索の配列形成に関する作用が不明である。後者の主流は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、骨髄幹細胞、あるいは組織幹細胞を試験管内で操作し、生体内に戻す方法である。しかしながら、ソースの品質維持、倫理的問題、長期的な癌化リスクというハードルがある。これも決定的には実際の生体肝内でどのように肝細胞索形成に関わってくるのかが全く不明である（非特許文献４）。
【０００６】
ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）は、生体内で産生される白血球遊走・活性化作用を有する塩基性の、ヘパリン結合性タンパク質の総称である。一次構造上保存された部位に４つのシステイン残基があり、最初の２つのシステイン残基の部位により、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ、ＣＸ３Ｃと４つのサブファミリーに分類されている。その受容体もＣＸＣＲ１−６、ＣＣＲ１−１０、ＣＲ１−２、ＣＸ３ＣＲ１と現在まで１９種類報告されている。各受容体は特定の細胞上に特異的に発現しており、免疫担当細胞の特定の場所への遊走・定着が、ケモカインとケモカイン受容体によって制御されている。さらに、例えば受容体ＣＸＣＲ３のリガンドには、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１の３種類が報告されているが、これら３種類のケモカインの作用が必ずしも同一ではないことも明らかになっている。したがって、同じケモカインファミリーであっても個々の役割は極めて多様性があるため一括して考える事は不可能であり、生体内で実際にどのような機能を果たしているかというのは未だ十分解明されていない。
【０００７】
肝細胞、胆管上皮細胞にも複数のケモカイン・ケモカイン受容体が発現する事が報告されており、炎症時の免疫細胞浸潤を制御している事が推定されている（非特許文献５）。しかしながら、肝細胞の複製や、分化依存的な移動にどのように関わってくるのかは、全く知られていない。
【０００８】
ケモカイン受容体であるＣＸＣＲ３およびそのリガンドＣＸＣＬ１０に関しては、活性化Ｔ細胞、特にＴ−ｈｅｌｐｅｒ−１細胞（Ｔｈ１細胞）の遊走に関わる分子であり、ウイルス・細菌等の感染症、移植片拒絶反応、自己免疫疾患など、いわゆるＴｈ１優位疾患に対して役割を果たしていることが明かされつつある（非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。ウイルス肝炎を含む様々なＴｈ１優位疾患でＣＸＣＬ１０のｍＲＮＡの発現が増強する事が報告されている。しかしながら、実際の肝障害でＣＸＣＬ１０の中和剤等による阻害実験が今まで行われていないため、その発現意義に関しては、生体にとって好ましいものなのか、あるいは逆に好ましくないものなのか、という点がいまだに不明である。さらには、Ｔｈ１細胞のみならず、肝細胞自体に何らかの作用を及ぼすかどうかに関しては、実験的証左がないだけでなく、ほとんど想定すらされていない。
【０００９】
一方、糖尿病は血糖降下作用をもつホルモンであるインスリンの相対的不足によって引き起こされる疾患で、インスリン依存性である１型（ＩＤＤＭ）とインスリン非依存性である２型（ＮＩＤＤＭ）に分けることができる。１型糖尿病（ＩＤＤＭ）は自己免疫などにより、先天的にインスリンを産生する膵β細胞が破壊されている状態をいう。これに対して２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、遺伝因子に肥満や運動不足などの環境因子が加わることによって発症する、いわばインスリン非依存性糖尿病である。厚生省調査研究班の報告によると、インスリン非依存性糖尿病（２型ＮＩＤＤＭ）の有病率は４０歳以上の人口の約１０％、日本全体では約６００万人に達している。食事の欧米化や運動不足といったライフスタイルの変化、高齢化社会になりつつあることが糖尿病増加を加速させ、今後も増加の一途をたどると予測されている。治療は、食事療法、運動療法を基本とし、薬物療法としてインスリン関連酵素、インスリンレセプターなどをターゲットとした薬剤であるナテグリニド、α−グルコシダーゼ阻害剤、スルホニル尿素剤（ＳＵ剤）、ビグアナイド剤（ＢＧ剤）、チアゾリジン系薬剤などの経口糖尿病薬が臨床現場で用いられている。しかしながら、インスリン抵抗性に関する機序は多彩であり、未だ決定的にインスリン抵抗性を改善するための方法は乏しい（非特許文献１１及び１２及び１３及び１４及び１５）。また、２型糖尿病を中心とした生活習慣病は、メタボリック症候群という総称でまとめられつつある。「２１世紀病」として近年ようやく研究が盛んになってきた領域に位置する疾病であるが、潜在的な患者が多数存在することが指摘されることから、その治療、症状改善のための手段を早期に提供する必要性が重要視されている。
【００１０】
肝臓は、血中からのブドウ糖の取り込みならびに血中へのブドウ糖の放出、すなわち血糖値を制御する重要な臓器である。インスリンは、肝細胞に発現するインスリン受容体に作用する事で、ブドウ糖をグリコーゲンに変え（グリコーゲン合成促進）肝臓内に貯蔵し、血中へのブドウ糖の放出（糖新生）を抑制する。これにより血中のブドウ糖を取り込む（非特許文献１６）。したがって、インスリンに対する肝臓の反応が低下することが、インスリン抵抗性を来す極めて重要な原因となる（非特許文献１７及び１８）。
【００１１】
【非特許文献１】最新総説；Ｆａｕｓｔｉ  Ｎ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９：１４７７，  ２００４
【非特許文献２】Ｔａｕｂ  Ｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８３６，  ２００４
【非特許文献３】Ｚａｊｉｃｅｋ  Ｇ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １４６：７７２，  １９９５
【非特許文献４】最新総説；Ｔａｕｂ  Ｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：８３６，  ２００４
【非特許文献５】総説；Ｓｉｍｐｓｏｎ  ＫＪ，  ｅｔ  ａｌ．．  Ｃｌｉｎ．  Ｓｃｉ．  １０４：４７，  ２００３
【非特許文献６】Ｋｈａｎ  ＩＡ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １２：４８３，  ２０００
【非特許文献７】Ｌｉｕ  ＭＴ  ｅｔ  Ａｌ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：１７５０，  ２００１
【非特許文献８】Ｈａｎｃｏｃｋ  ＷＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：１５１５，  ２０００，
【非特許文献９】Ｈａｎｃｏｃｋ  ＷＷ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９３：９７５，  ２００１
【非特許文献１０】Ｎａｒｕｍｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：１７８４，  ２００２
【非特許文献１１】Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （１９９６）  ５２  ４０７−４１１
【非特許文献１２】Ｔｓｕｋｕｄａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  （１９９８）  ３０  ４２−４９
【非特許文献１３】Ｆｕｊｉｔａｎｉ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ（１９９６）４５  １８４−１８９
【非特許文献１４】Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ（１９９７）１００  １８６３−１８６９
【非特許文献１５】Ｏｌｅｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９７）４６  １６７８−１６８３
【非特許文献１６】Ｃｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ  ＡＤ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１１９８−１２１４，  １９９９．
【非特許文献１７】ＤｅＦｒｏｎｚｏ  ＲＡ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｒｅｖ  ５：１７７−２６９，１９９７．
【非特許文献１８】Ｍｉｃｈａｅｌ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６：８７−９７，２０００，
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述したように、肝組織損傷に関連する、損傷した肝細胞とその機能障害を修復するためには、移植療法や細胞療法に変わる、あるいは併用しうる更なる治療方法が求められる。このような状況の下、本発明は、肝細胞を増殖する薬剤およびそれを用いた肝細胞の増殖方法を提供することを課題とする。また、本発明は、従来の糖尿病薬に代わりうる、メタボリック症候群に対しても有用な、肝細胞のインスリン抵抗性を改善する薬剤およびそれを用いたインスリンの抵抗性改善方法を提供することをも課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ３に対するリガンドの１種であり、ケモカインのサブファミリーＣＸＣに分類されるタンパク質の１種であるＣＸＣＬ１０が肝細胞の再生に大きく関与しているという知見を得た。さらにＣＸＣＬ１０について研究を進め、ＣＸＣＬ１０は肝細胞の複製を抑制することを見出すと共に、ＣＸＣＬ１０の機能を抑制することによって肝細胞の複製を促進し得るという着想を得た。そして、本発明者等はＣＸＣＬ１０の機能を抑制する中和剤が実際に肝細胞の複製を促進するという実証を得て、本発明を完成するに至った。本発明は、具現化された態様として下記肝細胞複製促進剤および肝細胞の増殖促進方法等を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明者らは、インスリン抵抗性を呈している個体において、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が肝細胞の複製を促進するのみならず、共通と推測される作用機序により肝細胞のインスリンに対する反応性・感受性が有意に増加し、耐糖能異常も有意に改善するという実証も得た。この知見から、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤は肝細胞に働きかけてインスリンに対する反応性等を増強させるという全く新しい機序に基づくインスリン抵抗性改善剤としても有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、具現化された態様として下記インスリン抵抗性改善剤およびインスリン抵抗性の改善方法等をも提供するものである。
【００１５】
〔１〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分とする肝細胞複製促進剤。より具体的には、ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含む肝細胞複製促進剤。
〔２〕少なくとも成熟肝細胞の複製を促進することを特徴とする、〔１〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔３〕損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進することを特徴とする、上記〔１〕または〔２〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔４〕前記損傷が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原体を原因とする損傷からなる群より選択される損傷である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔５〕前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障害からなる群より選ばれる疾患による損傷である、上記〔４〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔６〕前記病原体が肝炎ウイルスである、上記〔４〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔７〕前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除からなる群より選ばれる原因による損傷である、上記〔４〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔８〕前記損傷が、脂肪性肝炎による損傷である、上記〔１〕から〔３〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔９〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である、上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔１０〕前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である、上記〔９〕に記載の肝細胞複製促進剤。
〔１１〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔１２〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である上記〔１〕から〔８〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進剤。
〔１３〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の、肝細胞複製促進剤を製造するための利用。
【００１６】
〔１４〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与する工程を含む、肝細胞の増殖促進方法。
〔１５〕前記肝細胞が哺乳動物の肝細胞である、上記〔１４〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔１６〕前記哺乳動物がヒトである、上記〔１５〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔１７〕障害を有する肝組織に、前記中和剤を投与する、上記〔１４〕から〔１６〕のいずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔１８〕前記障害が、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷および病原体を原因とする損傷よりなる群から選択される、上記〔１７〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔１９〕前記毒性物質を原因とする損傷が、アルコール性肝炎および薬剤誘発性肝障害からなる群より選ばれる疾患による損傷である、上記〔１８〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２０〕前記機械的傷害による損傷が、肝臓移植、細胞移植および外科的部分肝切除からなる群より選ばれる原因による損傷である、上記〔１８〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２１〕前記病原体が肝炎ウイルスである、上記〔１８〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２２〕前記障害が、脂肪性肝炎による損傷である、上記〔１４〕から〔１６〕のいずれか一項に記載の肝細胞複製促進方法。
〔２３〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である、上記〔１４〕から〔２２〕のいずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２４〕前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である、上記〔２３〕に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２５〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ケモカインＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である、上記〔１４〕から〔２２〕のいずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
〔２６〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である上記〔１４〕から〔２２〕のいずれか一項に記載の肝細胞の増殖促進方法。
【００１７】
〔２７〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分とするインスリン抵抗性改善剤。より具体的には、ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含むインスリン抵抗性改善剤。
〔２８〕メタボリック症候群におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、上記〔２７〕に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔２９〕２型糖尿病におけるインスリン抵抗性を改善することを特徴とする、上記〔２７〕に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔３０〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である上記〔２７〕から〔２９〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔３１〕前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である上記〔３０〕に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔３２〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である上記〔２７〕から〔２９〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔３３〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である〔２７〕から〔２９〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
〔３４〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の、インスリン抵抗性改善剤を製造するための利用。
【００１８】
〔３５〕ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与する工程を含む、インスリン抵抗性の改善方法。
〔３６〕前記肝細胞が哺乳動物の肝細胞である、上記〔３５〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔３７〕前記哺乳動物がヒトである、上記〔３６〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔３８〕前記哺乳動物がインスリン抵抗性を呈する患者である、上記〔３６〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔３９〕前記哺乳動物がメタボリック症候群の患者である、上記〔３６〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔４０〕前記哺乳動物が２型糖尿病患者である、上記〔３６〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔４１〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子である、上記〔３５〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔４２〕前記活性を抑制する因子が、抗ＣＸＣＬ１０抗体である、上記〔４１〕に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔４３〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ケモカインＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子である、上記〔３５〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性の改善方法。
〔４４〕前記ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤である〔３５〕から〔４０〕のいずれか一項に記載のインスリン抵抗性改善剤。
【００１９】
障害時の肝細胞では複数のケモカイン、ケモカイン受容体が発現する事が報告されており、その関与が推定されている。ＣＸＣＬ１０も炎症時において肝臓で強く発現する事が知られている。しかし、生体外から投与したＣＸＣＬ１０の中和剤が成熟肝細胞の複製に直接的に寄与する事は全く知られておらず、実際に肝再生を促進するという作用は、本発明者等によって初めて発見された事である。
【００２０】
更に、ＣＸＣＬ１０の中和剤が傷害後の肝細胞索の構築を迅速に回復させ、肝機能障害も軽度に留めておく事が、下記実施例２及び３において詳述される。
【００２１】
したがって本発明により、重症の肝組織障害や肝機能不全に陥った患者に対し、残存する成熟肝細胞の迅速な複製を促進する事で、肝組織構築を保持しながら機能的にも改善させるという、新規の生体内作用機転を有する治療法開発への道が拓かれたと言える。
【００２２】
これに加えて、生体外から投与したＣＸＣＬ１０が肝細胞のインスリン抵抗性の顕著な改善をもたらすことについても、従来知られていない、本発明者等により初めて明らかにされた知見である。したがって、本発明は、インスリン抵抗性を呈する患者、例えば２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者、メタボリック症候群患者等のための治療法の基礎ともなりうるものである。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、肝組織細胞の複製を促進することができる。したがって、本発明によれば、損傷を受けた肝組織を再生することができる。
さらに、本発明によれば、インスリン抵抗性を改善することができるので、インスリン抵抗性を呈する疾患、例えば２型糖尿病、メタボリック症候群の治療において有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は限られた数の実施形態に関して記載されたが、本発明の多くのバリエーション、改変及び他の適応を行う事ができる事は理解されたい。
【００２５】
本発明の肝細胞複製促進剤は、ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分として含有することを特徴とする。本発明の肝細胞複製促進剤は、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤および薬学的に受容可能なキャリアを含有する製剤とし得る。また、本発明の肝細胞の増殖促進方法は、ケモカインの１種であるＣＸＣＬ１０に対する中和剤の有効量を、肝細胞に投与する工程を含むものである。
【００２６】
本発明の好ましい一形態として、損傷した肝組織における肝細胞の複製を促進することが例示される。本発明の肝細胞複製促進剤は、損傷の原因によらず、肝細胞を増殖させること意図する場面において有用である。例えば、毒性物質を原因とする損傷、機械的傷害による損傷、病原体を原因とする損傷などを有する肝組織に本発明の肝細胞促進剤は好適に適用される。毒性物質を原因とする損傷としては例えば、アルコール性肝炎、薬剤誘発性肝障害などの疾患による損傷が挙げられる。また、病原体によるものとしては例えば肝炎ウイルスなどが例示される。また、機械的傷害による損傷としては、例えば肝臓移植、細胞移植、外科的部分肝切除などを原因とする損傷が例示される。更に、本発明の肝細胞複製促進剤は、脂肪性肝炎に適用可能である。脂肪性肝炎のうち特に、アルコール非依存性肝炎は、メタボリック症候群との関連性が指摘される生活習慣病の一つであるが、本発明はこのアルコール非依存性肝炎の治療にも有用である。
【００２７】
本発明の一つの好ましい形態としては、肝組織損傷に関連する成熟肝細胞の損失と機能障害を有するか、またはそれを発症する可能性のある被験体に、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の治療学的有効量を投与する事によって、被験体における重篤な組織・機能障害の減少または回復を図ることが挙げられる。本発明は、臨床的には、例えば、急性肝不全、慢性肝不全、または神経性疾患に起因する肝障害などを有する肝組織の再生、修復に有用である。被験体としては、ヒトを含む哺乳類を対象とし得る。
【００２８】
本明細書において「ＣＸＣＬ１０に対する中和剤」は、ＣＸＣＬ１０の生理的機能の活性を抑制させる作用を有する薬剤のことをいう。ＣＸＣＬ１０の生理的機能とは、ＣＸＣＬ１０に起因して発揮される機能を意味し、例えばＣＸＣＬ１０が受容体、具体的には例えばＣＸＲ３に結合して発揮される機能が挙げられる。好ましい一形態として本発明における中和剤は、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制し、少なくとも成熟肝細胞の複製を促進する因子である。また、中和剤としては、ＣＸＣＬ１０に特異的に結合し、ＣＸＣＬ１０の活性を抑制する因子、およびＣＸＣＬ１０の発現を抑制する因子が例示される。
【００２９】
一つの形態として中和剤は、ＣＸＣＬ１０活性を減少するのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合する任意の分子であり得る。中和剤として好ましくは、ＣＸＣＬ１０に対する抗体（抗ＣＸＣＬ１０抗体）のような結合分子などが挙げられる。さらに、ＣＸＣＬ１０活性を低下させるのに十分な親和性でＣＸＣＬ１０に結合するＣＸＣＲ３受容体のフラグメントまたはペプチド模倣物なども例示される。さらには、ＣＸＣＬ１０を特異的に分解する酵素なども例示される。また、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤としては、ＣＸＣＬ１０に直接的に作用して活性を抑制させる物質だけでなく、ＣＸＣＬ１０以外の物質に作用することによりＣＸＣＬ１０の活性を阻害する物質を挙げることもできる。このような中和剤の例としては、ＣＸＣＬ１０に対する受容体の拮抗剤（アンタゴニスト）が示される。ＣＸＣＬ１０に対する受容体としては、肝細胞に存在する受容体を挙げることができる。例えばＣＸＣＲ３−Ａ、ＣＸＣＲ３−ＢなどのＣＸＣＲ３を挙げることができる。
【００３０】
抗ＣＸＣＬ１０抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として調製し得る。
ポリクローナル抗体を、例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物において惹起するための方法は当該分野で周知である。抗ペプチド抗体の産生は通常、ウサギ、マウス、モルモットまたはラットのような宿主動物の使用を含む。多量の血清が必要な場合には、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタまたはロバのようなより大きな動物が使用され得る。動物は通常、必要とされる抗血清の量に基づいて選択される。適切な動物としては、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターが挙げられる。これらの動物から得られる血清の量は、通常、１回の採血につき、ウサギの場合最大で２５ｍＬ、マウスの場合１００〜２００μＬ、その他の動物の場合１〜２ｍＬである。例えば、フロイント完全アジュバントのような適切なアジュバント中にある１５〜５０μｇの抗原を用いて、２〜４週間の間隔をあけて２回注射した後で、血液が収集され得、そして抗血清の分析がなされ得る。
【００３１】
さらに、モノクローナル抗体は、当該分野で周知でありかつ慣用的である方法を使用して入手され得る。免疫原として使用するためのタンパク質（例えば、ＣＸＣＬ１０）のペプチド部分は、当該分野で周知の方法によって決定され得る。ＣＸＣＬ１０で免疫されたマウスに由来する脾臓細胞が、適切な骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を生成し得る。クローン化されたハイブリドーマ細胞株は、抗ＣＸＣＬ１０抗体を分泌するクローンを同定するために、標識化ＣＸＣＬ１０タンパク質を用いてスクリーニングされ得る。所望の特異性および親和性を有する抗ＣＸＣＬ１０モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマが単離され得、そして抗体中和剤の持続的供給源として利用され得る。
【００３２】
組換え抗体、例えば、キメラおよびヒト化抗体をまたこの分野において知られている方法により得ることができる。ヒト化抗体は、ヒト抗体フレームワークに本質的に任意の抗原結合特異性を付与することによって構築され得る。ヒト化抗体を構築する方法は、本発明の方法を実施するため、そして治療的に使用される場合に抗体中和剤に対する宿主の免疫応答を回避するために適切な抗体中和剤を調製するために有用である。
【００３３】
さらに、中和剤は、ＣＸＣＬ１０の調節タンパク質または遺伝子領域の機能を阻害また促進し、そして、ＣＸＣＬ１０発現の程度、量または速度、あるいはその活性の減少を与える調節分子、または遺伝子領域に結合する任意の分子であり得る。さらに、ＣＸＣＬ１０発現の減少を与える中和剤の例としては、アンチセンス核酸、転写阻害剤などが挙げられ得る。
【００３４】
本発明の１つの実施形態としては、ＣＸＣＬ１０をコードするポリヌクレオチド、ＣＸＣＬ１０の発現もしくは活性を調節する調節分子、またはそれらの任意のフラグメント、あるいはアンチセンス分子が、中和剤として使用され得る。１つの局面では、ＣＸＣＬ１０のコード核酸に対するアンチセンス分子を使用して、そのｍＲＮＡの転写または翻訳をブロックし得る。詳細には、ＣＸＣＬ１０をコードする核酸に対して相補的な配列により、細胞が形質転換され得る。このような方法は当該分野で周知であり、そしてセンスまたはアンチセンスのオリゴヌクレオチドまたはより大きなフラグメントが、ＣＸＣＬ１０をコードする配列のコード領域または制御領域中の種々の位置から設計され得る。このようにして得られるアンチセンス分子を使用して、ＣＸＣＬ１０活性を中和し得るか、または遺伝子機能の調節を達成し得る。また、本発明においては、中和剤として、ＣＸＣＬ１０に対し特異的なリボザイム、ＲＮＡｉ活性分子（ｓｉＲＮＡ）などを用いてもよい。
【００３５】
本発明の肝細胞増殖促進方法は、治療目的、学術的目的などその目的によらず、肝細胞を増殖しようとするあらゆる場面において適用可能である。本発明の肝細胞の増殖促進方法の好ましい形態の一つとして、肝細胞に障害を有する被験者の治療、肝組織移植などにおける肝組織の提供者または、肝組織移植を受けた患者に対する肝細胞再生が挙げられる。
【００３６】
本発明において中和剤を投与する際には、中和剤の種類や目的に応じて有効な量、処方等の条件を適宜設定してよい。例えば、本発明の方法を実施するために有用な中和剤は、処置される肝細胞傷害の重篤度；傷害の速度または量；被験体の体重、性別、年齢および健康状態；特定の化合物の生化学的性質、生物活性、バイアビリティおよび副作用；ならびに併用する処置レジメンに適合する様式において適切な様式および量で、当業者により処方および投与され得る。適切な量および処方は、当該分野で公知の特定の障害に関する信頼性ある動物モデルから推定され得る。より低い結合親和性を有する中和剤に必要とされる投薬量と比較して、有意に、かつより高い結合親和性を示す中和剤がより少ない用量で投与され得るように、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の投薬量が、ＣＸＣＬ１０に対するその中和剤の結合親和性に基づいて調整されなければならないことが理解される。従って、適切な投薬量は、特定の処置に応じて、および所望される処置の期間に応じて変動する。通常、治療的処置のために適切な投薬量は、１日あたり体重１ｋｇあたりで約１０μｇと約１ｍｇとの範囲内で適宜定めることができる。また、例えば生理的に受容可能な組成物中において投与される場合の投与量は、一般に０．１μｇ／ｍｌ、好ましくは１．０μｇ／ｍｌ、より好ましくは約２μｇ／ｍｌ以上の血漿濃度を達成するために十分な範囲で定めることができる。具体的には、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、中でも約２μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、そして特に、５〜１０μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するために十分な範囲で定めることが望ましい。
【００３７】
本発明の肝細胞複製促進剤の有効成分たる中和剤は、当該分野で公知の多数の経路により被験体に投与され得る（例えば、全身投与（例えば、静脈内投与））。ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、当業者に公知の処方方法を使用して、薬学的に受容可能な処方物中にある、単離され実質的に精製されたポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの形態で提供され得る。これらの処方物は、標準的経路（局所経路、経皮経路、腹腔内経路、経口経路、直腸経路、または非経口経路（例えば、静脈内経路、皮下経路、もしくは肝動脈内経路）を含む）により投与され得る。ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の静脈内投与が、本発明の方法を実施するために特に適切な経路である。肝動脈内経路は、損傷部位または外傷部位に上記中和剤の送達を標的化するために実施され得る。さらに、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の改変体が、生分解性ポリマー中に組み込まれ得、これにより、肝障害を減少するために有用な化合物の徐放が可能になる。本発明の肝細胞複製促進剤は上記のような投与経路、投与方法などの条件に基づき、適切な剤型を選択し得る。
【００３８】
ＣＸＣＬ１０に対する中和剤は、薬学的に受容可能な媒体と一緒に溶液または懸濁物として投与され得る。そのような薬学的に受容可能な媒体は、例えば、滅菌水性溶媒（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、通常生理食塩水もしくはリンゲル溶液、または他の生理学的緩衝化生理食塩水）または他の溶媒もしくはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール、油（例えば、オリーブ油）もしくは注射可能な有機エステル）であり得る。薬学的に受容可能な媒体は、さらに、生理学的に受容可能な化合物（例えば、中和剤を安定化する化合物、その溶解度を増加する化合物、もしくはその吸収度を増加する化合物）を含み得る。そのような生理学的に受容可能な化合物としては、例えば、糖質（例えば、グルコース、スクロース、またはデキストラン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸またはグルタチオン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）（これは、微生物膜を破壊する）；二価金属イオン（例えば、カルシウムまたはマグネシウム）；低分子量タンパク質；脂質またはリポソーム；または他の安定化剤もしくは賦形剤が挙げられる。当業者は、薬学的に受容可能なキャリアの選択が、中和剤を含む化合物の投与経路、ならびにその特定の物理的特徴および化学的特徴に依存することを理解する。
【００３９】
非経口投与に適切な処方物としては、水性および非水性の滅菌注射溶液（例えば、上記の薬学的に受容可能な媒体）が挙げられる。その溶液は、さらに、例えば、緩衝剤、静菌剤、および処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含み得る。他の処方物としては、例えば、懸濁剤および濃化剤を含み得る、水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。その処方物は、単位用量容器または多用量容器（例えば、密封アンプルおよび密封バイアル）中に提示され得、そして使用直前に例えば滅菌液体キャリアの添加を必要とする凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時注射溶液および即時注射懸濁物が、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【００４０】
本発明の別の実施形態に従って、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤と、肝細胞傷害の重篤度を減少するための方法において使用するための指示書とを含む、治療システムが、好ましくは、キット形態で存在する。１つの実施形態において、例えば、その治療剤は、抗ＣＸＣＬ１０抗体である。
【００４１】
適切なキットは、少なくとも１つの治療適用に十分な量で、別個の包装された化学試薬として少なくとも１つのＣＸＣＬ１０中和剤（ＣＸＣＬ１０に対する中和剤）を含む。包装されたキットの使用のための指示書も含み得る。当業者は、ＣＸＣＬ１０中和剤を、本明細書中に記載されるような本発明の方法の実施のために適切な緩衝液および溶液と組み合わせてキットの形態に容易に組み込み得る。
【００４２】
一方、本発明者らは、前述したように、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、肝細胞の複製を促進すると同時にインスリンに対する反応性・感受性を増加させ耐糖能異常を改善する作用を有することを確認しており、インスリン抵抗性改善剤の有効成分としても有用であることを見出している。本発明は、別の一形態として、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤を有効成分として含有するインスリン抵抗性改善剤をも提供するものである。
【００４３】
本発明において、インスリンの抵抗性を改善するとは、肝臓の、具体的には肝細胞のインスリンに対する反応性や感受性を増強させることを意味する。特に、インスリン抵抗性を呈している個体において、肝細胞のインスリンに対する反応性、感受性を正常個体と同様或いは近いものとすることが挙げられる。ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が、インスリンの抵抗性を改善する作用機序は、以下の経路で進むものと推測される。まず、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤、例えば抗ＣＸＣＬ１０抗体を投与すると、少なくとも肝細胞（主に成熟肝細胞）においてＣＸＣＬ１０の受容体に対する結合が阻害されると同時に、肝細胞膜のタンパク質であるβカテニンが細胞内を核の方向へ移行する。続いて、タンパク質ｃ−Ｍｙｃの発現が活性化され、その結果、肝細胞のインスリン受容体へのインスリン結合量が増加する。すなわち、インスリンに対する肝臓の反応が向上し、肝臓の糖代謝の改善が促進される。尚、上述した肝細胞の複製促進の作用機序も、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の肝細胞に対する作用であるから、上記したインスリン抵抗性改善の作用機序と全部、又は少なくとも一部（例えばβカテニンシグナルの制御までの部分）が共通であるものと推測される。
【００４４】
本発明のインスリン抵抗性改善剤は、上記のように、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤が肝細胞に働きかけることにより、その結果としてインスリン抵抗性を改善させるものである。したがって、肝細胞を対象とする点で上述した肝細胞複製促進剤と同様であるから、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の使用量、投与条件などについては、上述した肝細胞複製促進剤の場合と同様とすることができる。
【００４５】
本発明の好ましい一形態としては、インスリン抵抗性を有する肝細胞、例えばヒトをはじめとする哺乳動物由来の肝細胞において、インスリン抵抗性を改善することが例示される。このような肝細胞としては、インスリン抵抗性を呈する個体から抽出、精製し培養したものを例示することができる。一方、本発明の別の好ましい形態としては、インスリン抵抗性を呈する被験体に、ＣＸＣＬ１０に対する中和剤の治療学的有効量を投与する事によって、被験体におけるインスリン抵抗性の改善を図ることが挙げられる。本発明は、臨床的には、例えば、インスリン抵抗性、例えば、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、メタボリック症候群などのインスリン抵抗性を呈する患者において、耐糖能異常の改善を図るために有用である。尚、メタボリック症候群の機序におけるインスリン抵抗性及び糖代謝異常（耐糖能の異常など）などの位置付けは科学的に解明されていないものの、これらが関与することは明らかである。メタボリック症候群の有病率はかなり高いものと見られることから、本発明はその症状緩和、治療に貢献するものとして有用である。
【実施例】
【００４６】
以下、非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。本発明の種々の実施形態の活性に実質的には影響を与えない改変もまた、本明細書中に提供される本発明の定義内に包含されることが、理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、本発明を限定することは意図されない。
【００４７】
［実施例１］四塩化炭素誘発肝障害モデルを用いた傷害肝細胞におけるＣＸＣＬ１０の発現増強
四塩化炭素誘発肝障害モデルを利用し、ＣＸＣＬ１０の発現について評価を行った。四塩化炭素誘発肝障害モデルは、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＧＲ．  Ａｒｃｈ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  １１１：４４８，  １９６５の記載に準じて構築した。この肝障害モデルはＴｈ１細胞の浸潤がないため、ＣＸＣＬ１０のＴｈ１細胞に対する影響を度外視でき、生体内での肝細胞の複製・再生を純粋に評価することができるという利点がある。なお、ＣＸＣＬ１０の塩基配列はＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）などのデータベースにおいて既に登録されたものがある。また、ＣＸＣＬ１０タンパク質および抗ＣＸＣＬ１０抗体は、それぞれ市販品として入手も可能である。
【００４８】
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雌、８−９週齢、日本クレア社製）に、四塩化炭素（ＣＣＬ４、０．５μＬ／ｇ体重；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を腹腔内に注射した。ＣＣＬ４投与前、ならびに投与の１、６、１２時間後、１、２、３、５、７、１０日後にマウスを屠殺、肝臓を採取した。肝臓の第１葉の一部をすぐに液体窒素で凍結し、全ＲＮＡを、ＲＮＡｚｏｌ試薬（ＢＩＯＴＥＣＸ  ＬＡＢ社製）を用いて抽出し、ｃＤＮＡまで逆転写した。ＣＸＣＬ１０の発現は、ＡＢＩ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、９５℃１５秒、５５℃１分３０秒という増幅サイクルを４０回行うリアルタイム定量ＰＣＲ法にて解析した。各々のサンプルのＣＸＣＬ１０の発現量を内因性コントロールであるＧＡＰＤＨの発現量で補正した後に、ＣＣＬ４投与前の発現量に対する相対的発現量を算出し、これを増強倍率とした。図１に増強倍率の経時的推移を示す。
【００４９】
また、肝臓の第２葉の一部はＯＣＴコンパウンド（Ｍｉｌｅｓ社製）に包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作成した。クライオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ社製）で６μｍの切片を作成し、抗ＣＸＣＬ１０抗体（ヤギポリクローナル抗体；２０μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）、抗ＣＸＣＲ３抗体（ヤギポリクローナル抗体；２０μｇ／ｍＬ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を用い室温で１時間反応させた。その後、Ａｌｅｘａ−５９４標識抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製；各１：２００希釈）で室温３０分更に反応させ、アンチフェード封入剤（ＤＡＫＯ社製）で封入後、共焦点蛍光レーザー顕微鏡（ＴＣＳ  ＳＰ２  ＡＯＢＳ；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で観察、撮影した。
【００５０】
定量的ＰＣＲの結果（増強倍率の経時的推移）を図１に示す。肝臓においてはＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡは恒常的に発現していたが、ＣＣＬ４投与によりその発現は劇的に増強した。ＣＣＬ４投与１時間後より増強し、１日後に第１の最高のピークを示し、一度減弱した後、５日後に第２のピークを示すという、２峰性の発現増強様式を呈した。
【００５１】
図２に免疫染色像（２００倍）を示す。図２中、左はＣＣＬ４投与前の組織の染色像を、右はＣＣＬ投与後（１日後）の組織の染色像を示す。また、図２中、Ｐは門脈部を示す。また、Ｆは染色された部位を示す。図２に示されるように、免疫染色でもＣＸＣＬ１０蛋白は肝細胞に恒常的に検出できたが、ＣＣＬ４投与６時間後より、ＣＸＣＬ１０陽性肝細胞は著明に増加し、１日後にその数はピークに達した。肝障害におけるＣＸＣＬ１０の劇的な発現増強を、ｍＲＮＡレベルならびに蛋白レベルで確認し、かつその局在が傷害肝細胞であることも示された。
【００５２】
［実施例２］
ＣＸＣＬ１０の発現増強が、生体にとって有益なのか、あるいは有害な現象なのかを解析する目的で、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（８週齢、雌、日本クレア社製）にＣＣＬ４を投与する直前に、１００μｇのモノクローナルＣＸＣＬ１０抗体（２００μＬの滅菌ＰＢＳ中に懸濁した）の尾静脈注射を１回与えた。これらの研究において使用したモノクローナル抗体は、ＣＸＣＬ１０に特異的であり、その受容体ＣＸＣＲ３の他のリガンドであるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１１とは免疫学的に交差しない。また中和活性としては、ＣＸＣＲ３陽性活性化Ｔリンパ球の走化性を抑制する。経時的にマウスを屠殺し、臨床的所見をコントロール抗体処置群と比較検討した。
【００５３】
なお、モノクローナル抗体は、当該分野で周知でありかつ慣用的である方法を使用して作製した。免疫原として使用するためのＣＸＣＬ１０タンパク質のペプチド部分は、当該分野で周知の方法によって決定し、ＣＸＣＬ１０組み替えタンパク質を作製した（このような組み換えタンパク質は、Ｒ＆Ｄ社などより容易に入手できる）。ＣＸＣＬ１０で免疫されたマウスに由来する脾臓細胞を骨髄腫細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を作製した。クローン化されたハイブリドーマ細胞株のうち、抗ＣＸＣＬ１０を分泌するクローンを同定するために、ビオチン標識化ＣＸＣＬ１０タンパク質を用いてスクリーニングした。これにより特異性および親和性を有する抗ＣＸＣＬ１０モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを単離し、持続的供給源として利用できる。
【００５４】
以下のようにして、作製した抗体の中和活性、特異性を確認した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株に、マウスＣＸＣＲ３（ＣＸＣＬ１０の受容体）を当該分野で周知の方法によってトランスフェクションし、恒常的にＣＸＣＲ３を発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株を作製した。この細胞株にマウス組み換えタンパク質を添加し、カルシウム流入反応（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｎｆｌｕｘ  ａｓｓａｙ）でその効果を確認する実験系において、モノクローナルＣＸＣＬ１０抗体を添加することにより、カルシウム反応が阻害されることを確認した。また、免疫沈降試験により、モノクローナルＣＸＣＬ１０抗体は、他のＣＸＣＲ３リガンドであるＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０との交差性がない事も確認した。
【００５５】
また、コントロール抗体として、ＣＸＣＬ１０モノクローナル抗体のＩｇＧ１サブクラスを一致させた、ヒトｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ（副甲状腺）に対するモノクローナル抗体を用いた。この抗体は、サンタクルズ社、ケミコン社、など数社より容易に入手できる。尚、以下の実施例におけるコントロール抗体（対照抗体）でもこのモノクローナル抗体を同様に用いた。
【００５６】
マウス肝重量（肝組織重量）の推移を図３に示す。図３中「＊」は、ｔ−検定によるｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。コントロール抗体処置群では、ＣＣＬ４投与１日後まで急速に肝重量が減少し、３日後より徐々に回復した。一方、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群でもＣＣＬ４投与１日後には肝重量が減少するが、コントロール抗体投与群に比較し、速やかに回復した。これは、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置により、肝臓の傷害後の再生がより速やかに促進される事を示している。
【００５７】
マウス血清中ＡＬＴ（ａｌａｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）濃度（ＩＵ／Ｌ）の推移を図４に示す。図４中「＊」は、ｔ−検定によるｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。血清ＡＬＴは肝細胞傷害の程度をみる臨床的にも最も信頼度の高い指標であり、富士ドライケム・スライド（Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）にて測定した。コントロール抗体処置群では、ＣＣＬ４投与後劇的に上昇し、１日目にピークを示した後、３日目より徐々に減少し、７日目には正常範囲内まで回復した。一方、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群では、血清ＡＬＴ値の上昇は有意に抑制され、５日目には正常範囲内に回復した。抗ＣＸＣＬ１０抗体処置により、肝細胞傷害が劇的に抑制されている事が判明した。
【００５８】
［実施例３］
Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウス（８週齢、雌、日本クレア社製）にＣＣＬ４を投与する直前に、１００μｇのモノクローナルＣＸＣＬ１０抗体（２００μＬの滅菌ＰＢＳ中に懸濁した）もしくはコントロール抗体の尾静脈注射を１回与えた。経時的にマウスを屠殺し、組織病理学的所見をコントロール抗体処置群と比較検討した。肝臓の凍結切片を実施例１に記載の方法により作成し、免疫組織学的解析を行った。一次抗体として、ラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（２μｇ／ｍＬ；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）またはウサギ抗マウスＩＶ型コラーゲン・ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ社製；１：２５０希釈）を用い室温で１時間反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ラットまたはウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製；各１：２００希釈）で室温１時間更に反応させ、アルカリフォスファターゼ発色基質（ベクター・レッド；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）を使用して、抗体の結合を光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社製）で可視化した。
【００５９】
肝組織の壊死面積の推移を図５に示す。ＩＶ型コラーゲン染色により、実質的な肝細胞を特定することができる。ＩＶ型コラーゲン染色により肝細胞索の構築を明確にする事で細胞壊死範囲を決定し、ウインルーフ画像ソフトウエアを使用して、該範囲の面積を算出した。肝臓切片上少なくとも１５ｍｍ2の範囲に渡って計測した。コントロール抗体処置群では、ＣＣＬ４投与３日後に、中心静脈領域を中心とした多発性広範囲の肝細胞壊死が認められたのに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群では壊死範囲が劇的に減少していた。
【００６０】
ＣＤ３１抗体は血管内皮細胞に反応するモノクローナル抗体であり、肝臓では類洞内皮細胞を検出するのに用いられる。ＣＣＬ４投与３日目のＣＤ３１の免疫染色像（倍率２０倍）を図６に示す。コントロール抗体投与群（図６の上図）では、点線で囲まれた領域に現れているように、壊死により類洞壁の構築が崩壊しているのに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群（図６の下図）では類洞壁の構築が明確になってきている。これらの結果は、抗ＣＸＣＬ１０抗体が、病理学的にも肝細胞傷害を抑制し、なおかつ速やかに類洞の構築を再建させることを示している。
【００６１】
［実施例４］
生体内で実際に肝細胞の再生が起こっているかどうかを調べるため、増殖細胞の指標となるＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン／臭化デオキシウリジン）の取込みを解析した。ＢｒｄＵはチミジン類似体であり、細胞周期のＳ期の間にＤＮＡ中に取り込まれる。ＢｒｄＵで組織を標識するため、実施例２および３と同様にＣＣＬによる肝障害惹起後にＣＸＣＬ１０抗体処置またはコントロール抗体処置したマウスに、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ社製；５００μｇを１００μＬ中の滅菌ＰＢＳで懸濁した）を尾静脈注射し、１時間後に屠殺、肝臓第２葉を採取し、実施例１の方法で凍結切片を作成した。ＩＶ型コラーゲンを実施例３の方法で可視化した後、抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫染色（ＢｒｄＵ染色キット；Ｚｙｍｅｄ社製）を追加し、Ｓ期核を特異的に検出した。組織上の定量も、実施例３に記載のごとく行った。
【００６２】
定量データの結果を図７に示す。図７中、「＊」はｔ−検定によるｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。ＢｒｄＵ陽性細胞は、肝実質細胞のみならず、免疫細胞などの非実質細胞にも認められるため、ＩＶ型コラーゲンとの２重染色により、肝細胞だけを正確にカウントした。図７の縦軸（Ｂｒｄｕ＋ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（個数／ｍｍ2））は、ＢｒｄＵ抗体染色及びＩＶ型コラーゲン染色により２重染色された箇所を単位面積あたりの個数で示したものである。コントロール抗体処置群に比較して、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群で、ＢｒｄＵ陽性肝細胞が著明に増加していた。類洞領域について定量化したところ、類洞領域においては抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群では、ＣＣＬ４投与１から３日目までＢｒｄＵ陽性肝細胞が増加し、７から１０日目になるとむしろ逆にＢｒｄＵ陽性肝細胞の数が減少していた。この結果は、抗ＣＸＣＬ１０抗体により、肝細胞、それも類洞領域の成熟肝細胞が迅速に増殖し、肝細胞索が再建された後は速やかに休止期に戻る事を示している。つまり抗ＣＸＣＬ１０抗体は、傷害後の肝再生を促進させる事が、生体内レベルで実証された。
【００６３】
［実施例５］肝組織幹細胞に対する効果
新生仔マウスに、出生後３日から５日目までの３日間に渡って、ＢｒｄＵ（５０μｇを１０μＬ中の滅菌ＰＢＳで懸濁した）を１日２回ずつ皮下注射し、８週間経過を追うと、長期間に渡ってＢｒｄＵ標識が残存する、細胞周期の遅い肝細胞が検出される。このようなＢｒｄＵ標識長期残存細胞はＬａｂｅｌ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＬＲＣ）と呼ばれ、生後８週のマウスにおいては休止期の状態にあり、組織幹細胞としての性質をもつことが知られている（総説；Ｆｕｃｈｓ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １１６：７６９，  ２００４）。ＬＲＣは肝臓においては主に門脈域に極少数（全肝細胞の約７％）散見され、成熟肝細胞とは異なる肝組織幹細胞と考えられる。このような標識を施されたマウス（８週令）に実施例２から実施例４と同一の方法で抗ＣＸＣＬ１０抗体またはコントロール抗体投与後にＣＣＬ４誘導肝障害を惹起し、３日目に屠殺、肝臓第２葉を採取し、凍結切片を作成した。細胞周期のＳ期核を特異的に検出する抗サイクリンＡ（Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ）抗体（１００μｇ／ｍＬ；ヤギポリクローナル抗体；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）と抗ＢｒｄＵ抗体を用いた免疫２重染色により、屠殺時に増殖している肝細胞とＬＲＣを同時に検出した。２次抗体としては、Ａｌｅｘａ−４８８標識抗ヤギＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製；各１：２００希釈）とＡｌｅｘａ−５９４標識ストレプトアビジンを用いた。組織上の定量も、実施例３に記載のごとく行った。
【００６４】
定量的データの結果を図８に示す。図８中、上段は投与前の結果、中段はコントロール抗体処置群の結果、下段は抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群の結果を示す。図８中、標識インデックス（Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｉｎｄｅｘ）％は、画像中に表示された全肝細胞を１００％とし、これに対する各標識部位の面積割合を示したものである。コントロール抗体処置群のＣＣＬ４投与３日目（図８中中段の図参照）の肝臓における増殖肝細胞（サイクリンＡ（Ｃｙｃｌｉｎｅ  Ａ）陽性細胞）は、全肝細胞の６４．５％（平均値；ｎ＝５、１５ｍｍ2切片、以下同様）であった。このうち、ＬＲＣ由来の増殖細胞（サイクリンＡ陽性ＢｒｄＵ陽性）は３４．５％（全肝細胞の２２．３％）、成熟肝細胞由来と考えられる増殖細胞（サイクリンＡ陽性ＢｒｄＵ陰性）は６５．５％（全肝細胞の４２．３％）であり、実際に分裂直後の２核性成熟肝細胞も認められている。すなわち、肝障害後の肝細胞再生には、肝組織肝幹細胞（ＬＲＣ）のみならず、成熟肝細胞の迅速な分裂・複製が関与している事が明らかになった。これに対し抗ＣＸＣＬ１０抗体処置群（図８中下段の図参照）では実に８８．４％もの増殖肝細胞を認め、内訳はＬＲＣ由来が３０％（全肝細胞の２６．５％）、成熟肝細胞由来が７０％（全肝細胞の６１．８％）であった。抗ＣＸＣＬ１０抗体により、より有意に成熟肝細胞の複製が促進された事を示している。
【００６５】
［実施例６］正常マウス肝臓における抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果
定常状態のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（雌、８週齢、日本クレア社製）に、抗ＣＸＣＬ１０抗体もしくはコントロール抗体を尾静脈注射し、６時間後に屠殺、肝臓第２葉を採取し、凍結切片を作成した。実施例４の方法で、屠殺の１時間前にＢｒｄＵ（５００μｇを１００μＬ中の滅菌ＰＢＳで懸濁した）を尾静脈注射しておき、抗ＢｒｄＵ抗体で免疫染色を行った。
【００６６】
結果を図９に示す。図９の縦軸（Ｂｒｄｕ＋ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（個数／ｍｍ2））は、２重染色された箇所を類洞領域の単位面積あたりの個数で示したものである。図９中、「＊」はｔ−検定によりｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。また、縦軸は、単位面積あたりの免疫染色箇所の数を示す。
【００６７】
通常、正常マウスの類洞領域においてはＢｒｄＵ陽性肝細胞はほとんど認められない（ＢｒｄＵ標識指数（標識インデックス：実施例８参照）；全肝細胞の２．０％）。しかし、抗ＣＸＣＬ１０抗体処置により、ＢｒｄＵ陽性肝細胞が有意に増加した（ＢｒｄＵ標識指数；全肝細胞の４．１％）。
【００６８】
［実施例７］正常マウス肝臓におけるＣＸＣＬ１０の効果
次に、逆にＣＸＣＬ１０蛋白が肝細胞の増殖や複製を抑制するかどうかを調べた。出生後４日目の新生仔マウスにＢｒｄＵ（５０μｇを１０μＬ中の滅菌ＰＢＳで懸濁した）を１回皮下注射し、１時間後ならびに７日目（ＢｒｄＵ投与３日後）に屠殺、肝臓第２葉を採取し、凍結切片を作成後免疫染色を行った。この際、出生３日から４日後までＣＸＣＬ１０の組み替え蛋白質（２ｍｇ／ｋｇ；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社製）もしくはＰＢＳを皮下注射しておいた。
【００６９】
定量データを図１０に示す。図１０の縦軸（Ｂｒｄｕ＋ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ（個数／ｍｍ2））は、２重染色された箇所を単位面積あたりの個数で示したものである。図１０中、「＊」はｔ−検定によりｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。ＰＢＳを投与したコントロール群では、ＢｒｄＵ投与１時間後（出生４日目：ｄ４）においてＢｒｄＵ標識細胞を多数認めるが、投与３日目（出生７日目：ｄ７）においてＢｒｄＵ標識細胞が激減していた。これに対し、ＣＸＣＬ１０組み替え蛋白質を投与した群では、投与３日目（ｄ７）においてＢｒｄＵ標識肝細胞が有意に残存していた。通常、ＢｒｄＵ標識は出生後の肝細胞の分裂に伴って迅速に減衰していく。したがって、ＣＸＣＬ１０の投与によって、出生後の肝細胞の分裂が抑制されたため、その結果としてＢｒｄＵ標識肝細胞が有意に残存したものと推察される。すなわちこの結果は、ＣＸＣＬ１０が実際に生体レベルで肝細胞の分裂を抑制する事を示している。
【００７０】
［実施例８］ヒト肝細胞株の増殖におけるＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果
ヒト肝細胞株の増殖におけるＣＸＣＬ１０、抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果。次に、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ社製；２ｘ１０4個）を９６穴平底プレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いて培養する実験系において、ヒトＣＸＣＬ１０組み替え蛋白質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、抗ヒトＣＸＣＬ１０抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、コントロール抗体をそれぞれ添加し、３日間培養した。培養後、ＷＳＴ−１溶液（Ｔａｋａｒａ社製）を２０μＬ／穴加え、１時間後に各穴の５５０ｎｍの吸光度を測定することにより、該肝細胞株の増殖を測定した。また、該肝細胞株のＲＮＡを実施例１の方法で抽出し、ヒトＣＸＣＬ１０の受容体であるＣＸＣＲ３−ＡとＣＸＣＲ３−Ｂの発現をＲＴ−ＰＣＲ（９４℃４５秒、５８℃４５秒、７２℃６０秒で、３０サイクル）で調べた。
【００７１】
ＣＸＣＬ１０を添加したヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２においてはＣＸＣＲ３−Ａが強く発現していたが、ＣＸＣＲ３−Ｂの発現は認めなかった（図１１）。すなわち、ＣＸＣＬ１０はＣＸＣＲ３−Ａを介してその機能を発揮する事を示している。
【００７２】
図１２に吸光度の測定結果を示す。図１２中では、吸光度を平均±ＳＤとして記載している。また、「＊」はｔ−検定によりｐ＜０．０５の有意差が認められたことを示す。マウスで投与した濃度の抗ＣＸＣＬ１０抗体は、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２の増殖を有意に促進した。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても高濃度のＣＸＣＬ１０が直接的にヒト肝細胞の分裂・増殖を制御している事を示すものである。
【００７３】
［実施例９］Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発性Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬ  ２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果：ブドウ糖負荷試験
妊娠１４日目のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生後２日令のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス  雌（日本クレア社製）の各々に、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  １０ｍｇ／ｍＬ（ＳＩＧＭＡ社製）を２０μＬ／ｈｅａｄ皮下注射した。４週令までＣＥ−２（日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、４週令よりＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、２週間飼育した。２週間目に、抗ＣＸＣＬ１０抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液を、２回／１週間、腹腔内投与（１ｓｈｏｔ／１週間）の４回（処置期間：２週間）投与する処置を行った。１４日目に抗体の効果を検討するための実験を施行した。
【００７４】
実験１３日目より、１５時間の絶食を施し、１４日目にＤ−グルコース（ＳＩＧＭＡ社製；２ｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射した。注射前（０分）、注射後３０分、１２０分後に眼窩採血を施行し、グルテストエース血糖値測定器（ボンビックス薬品社製）を用いて血糖値を測定した。
図１３に結果を示す。図１３は、正常（未処置）マウス群、ならびに２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群、対照抗体投与群における、ブドウ糖負荷後、０分後、３０分後、１２０分後の血糖値の変動を示す図である。図中、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）、横軸は負荷後の測定時間（ｍｉｎ）を示す。また、「＊」はｔ−検定によりｐ＜０．０５にて有意差があったことを示す。
【００７５】
対照抗体投与群ではグルコース負荷後３０分、１２０分の血糖値はそれぞれ６２０±１６８ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、４０５±１５６ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）と顕著に増加していた。１０週齢の未処置Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）においてはそれぞれ２７０±３６ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、１４７±２１ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）であり、これが正常値の範囲であることから、本実験モデルにおいて対照群マウスは、耐糖能異常を来している事が明らかになった。一方、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群では、それぞれ２８４±８０ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、１４８±４３ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）にとどまっており、対照群に比較して有意（有意差、各々ｐ＝０．０１７、ｐ＝０．０２６、t−検定）な低値を示した。したがって、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与により、ＮＩＤＤＭマウスモデルにおける耐糖能異常が有意に改善される事が判明した。
【００７６】
［実施例１０］  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発性  Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬ  ２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果：インスリン抵抗性試験
実施例９と同一の方法でＮＩＤＤＭモデルを作製し、インスリン抵抗性試験を行った。実施例９の飼育条件において、絶食処置無しに、実験１４日目に、Ｈｕｍａｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ（０．７５Ｕ／ｋｇ）を腹腔内投与処置した。０分後（インスリン投与前）、１５分後、６０分後の血糖値を、グルテストエース血糖値測定器（ボンビックス薬品社製）で測定した。図１４に結果を示す。図１４は、正常（未処置）マウス群、ならびに２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群、対照抗体投与群における、インスリン負荷後、０分後、１５分後、６０分後の血糖値の変動を示す図である。図１４中、縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄＬ）、横軸は負荷後の測定時間（ｍｉｎ）を示す。また、「＊＊」はt−検定においてｐ＜０．０１で有意差があったことを示す。
【００７７】
１０週齢の未処置Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）においては、０分、１５分、６０分値は各々、１２５±１２ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、６３．２±８．５ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、４７．８±７．７ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）であり、インスリン投与に反応して血糖値が良好に低下していた。対照抗体投与群では、各々、４４８．２±７２ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、４３３．８±１３８ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、３７１．８±７２ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）と、インスリン投与前から高血糖を示すのみならず、インスリンに対する反応性が低く、血糖値が高値のまま推移した。すなわち、本ＮＩＤＤＭモデルにおいては、インスリン感受性が悪い、つまりインスリン抵抗性を示していると判定できた。これに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群では、各々、４０９．３±３５ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、２１０．６±５９ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）、７５±１６ｍｇ／ｄＬ（ｎ＝５）と、インスリン投与前は高血糖を示すものの、インスリン投与に極めて良好に反応し血糖値が低下してきた。対照抗体投与群と比較すると、インスリン投与後の血糖値は有意差（有意差、各々ｐ＝０．３１、ｐ＝０．００５、ｐ＝０．０００５、t−検定）を持って低下していた。したがって、抗ＣＸＣＬ１０抗体は、インスリン抵抗性を改善させる効果を有している事が明らかになった。
【００７８】
［実施例１１］  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発性  Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬ  ２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける、肝臓インスリン受容体を介したインスリン取り込み能：
妊娠１４日目のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生後２日令のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス  雌（日本クレア社製）の各々に、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  １０ｍｇ／ｍＬ（ＳＩＧＭＡ社製）を２０μＬ／ｈｅａｄ皮下注射した。４週令までＣＥ−２（日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、４週令よりＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、２週間飼育した。２週間目に、抗ＣＸＣＬ１０抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体１００μｇ／１００μＬを含むリン酸緩衝液を腹腔内投与した。その２時間後に、肝臓におけるインスリン受容体が機能してくるかどうかを解析する目的で、ＦＩＴＣ標識インスリン（モレキュラープローブ社製；０．７５Ｕ／ｋｇ）を腹腔内投与し、３０分後に実施例１の方法に基づき、肝臓の凍結切片を作成した。
【００７９】
各切片を顕微鏡にて観察したところ、対照抗体投与群ではインスリンの肝臓への結合がほとんど認められないのに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群の肝臓では、インスリンの結合が顕著に増加していた。本実施例におけるインスリンの結合能は、インスリン受容体の機能を示すものと認められる。したがって、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与により、肝臓におけるインスリン取り込みの増加、すなわち、インスリン反応性・感受性が明確に改善していると結論できる。
【００８０】
［実施例１２］  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発性  Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬ  ２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける、肝細胞のβカテニンの細胞内移行：
妊娠１４日目  のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生後２日令のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス  雌（日本クレア社製）の各々に、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  １０ｍｇ／ｍＬ（ＳＩＧＭＡ社製）を２０μＬ／ｈｅａｄ皮下注射した。４週令までＣＥ−２（日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、４週令よりＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、２週間飼育した。２週間目に、抗ＣＸＣＬ１０抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体１００μｇ／１００μＬを含むリン酸緩衝液を腹腔内投与した。その２時間後に、実施例１の方法に基づき肝臓の凍結切片を作製し、実施例５と同様に、蛍光免疫２重染色で解析した。蛍光免疫２重染色は、一次抗体には抗βカテニン抗体（Ｒ＆Ｄ社製）、ＩＶ型コラーゲン抗体を使用し、各々Ａｌｅｘａ  ６４７標識抗ラビットＩｇＧ（モレキュラープローブ社製）、Ａｌｅｘａ  ５６４標識抗ラビットＩｇＧ（モレキュラープローブ社製）で青、赤として検出したほかは実施例５と同様にして行った。
【００８１】
免疫染色後の各切片を顕微鏡で観察したところ、対照群ではβカテニンが肝細胞膜で検出されるのに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群では、βカテニンが細胞質、一部細胞核内に移行している像が認められた。これは、抗ＣＸＣＬ１０抗体により、肝細胞膜のβカテニンが核内に移行してくる事を示す。すなわち、抗ＣＸＣＬ１０抗体による肝細胞複製の機序の一つとして、βカテニンの細胞内シグナルを制御しているという、全く新規の、予想外の機序が判明した。
【００８２】
［実施例１３］  Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発性  Ｃ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬ  ２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）モデルマウスにおける、肝細胞のｃ−Ｍｙｃ発現の増強：
妊娠１４日目  のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させた。出生後２日令のＣ５７ＢＬ６Ｊ／ＪｃＬマウス  雌（日本クレア社製）の各々に、Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ  １０ｍｇ／ｍＬ（ＳＩＧＭＡ社製）を２０μＬ／ｈｅａｄ皮下注射した。４週令までＣＥ−２（日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、４週令よりＨｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、２週間飼育した。２週間目に、抗ＣＸＣＬ１０抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液、ならびに対照抗体を１００μｇ／１００μＬ含むリン酸緩衝液を腹腔内投与した。その２時間後に、実施例１の方法に基づき肝臓の凍結切片を作製し、実施例５と同様に、免疫染色で解析した。免疫染色において、一次抗体には抗リン酸化ｃ−Ｍｙｃ抗体（バイオビジョン社製）を使用し、抗ラビットＩｇＧで青として検出したほかは実施例５と同様にして行った。
【００８３】
免疫染色後の各切片を顕微鏡で観察したところ、対照群ではｃ−Ｍｙｃのリン酸化がほとんど認められないのに対し、抗ＣＸＣＬ１０抗体投与群では、ｃ−Ｍｙｃのリン酸化所見が認められた。これは、抗ＣＸＣＬ１０抗体によるβカテニンの核内移行に伴い、ｃ−Ｍｙｃのリン酸化が起こってくる事を示している。肝細胞のｃ−Ｍｙｃの発現は、肝臓における糖代謝の改善を促進する事が報告されており（Ｖａｅｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ.９：１０６７−１０７８，１９９５．及びＲｉｕ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ.ｆｊ．０２−１１６３ｆｊｅ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ｊｕｌｙ  １８，２００３．）、この機序においても抗ＣＸＣＬ１０抗体が、肝臓の糖代謝を改善するための役割を果たしている事が判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明は、肝細胞を増殖しようとする場合に有用である。例えば、本発明は、さまざまな肝臓疾患等により、肝細胞を増殖させることが望ましい場合に有効である。また、肝組織の移植などにより、肝組織の再生を図る場合などにも有効である。
また、本発明は、インスリン抵抗性の改善を意図する場合にも有用である。例えば、２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）患者やメタボリック症候群患者のようなインスリン抵抗性を呈する患者において、肝細胞におけるインスリンの反応性や感受性を増強し、耐糖能異常の改善を図る場合に有効である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、ＣＣＬ４誘発肝障害におけるＣＸＣＬ１０  ｍＲＮＡ発現の推移を示す図である。
【図２】図２は、ＣＣＬ４誘発肝障害の免疫染色像を示す図である。
【図３】図３は、ＣＣＬ４誘発肝障害における肝重量の推移を示す図である。
【図４】図４は、ＣＣＬ４誘発肝障害における血清ＡＬＴの推移を示す図である。
【図５】図５は、ＣＣＬ４誘発肝障害における壊死面積の推移を示す図である。
【図６】図６は、ＣＣＬ４誘発肝障害（ＣＣＬ４投与３日後）の類洞領域におけるＣＤ３１陽性染色像を示す図である。
【図７】図７は、ＣＣＬ４誘発肝障害（ＣＣＬ４投与３日後）の類洞領域におけるＢｒｄＵ陽性増殖肝細胞の定量的データを示す図である。
【図８】図８は、肝組織幹細胞におけるＣＣＬ４誘発肝障害に対する抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果を示す図である。上段は生後８週目（８ｗ）、中段はＣＣＬ４投与後３日目（ｄ３）のコントロール、下段はＣＣＬ４投与後３日目（ｄ３）の抗ＣＸＣＬ１０抗体投与の試験結果を示す図である。
【図９】図９は、正常マウスにおける抗ＣＸＣＬ１０抗体投与の効果を示す図である。
【図１０】図１０は、正常マウスにおけるＣＸＣＬ１０組み替え蛋白質の効果を示す図である。
【図１１】図１１は、ヒト肝細胞株ＨｅｐＧ２におけるＣＸＣＬ１０の受容体の発現を検出する電気泳動像を示す図である。
【図１２】図１２は、ＨｅｐＧ２の増殖に対する抗ＣＸＣＬ１０抗体の効果を示す図である。
【図１３】図１３は、抗ＣＸＣＬ１０抗体による耐糖能異常の改善を示す図である。
【図１４】図１４は、抗ＣＸＣＬ１０抗体によるインスリン抵抗性の改善を示す図である。
【符号の説明】
【００８６】
Ｐ：門脈部
Ｆ：蛍光染色部
ＣＤ３１：ＣＤ３１陽性部位
Ｎｕｃｌｅｉ：核染色部位
ＮＤ：ｎｏｔ  ｄｏｎｅ
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図２】
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【図６】
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【図１１】
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