(57)【要約】 【課題】  本発明は、膵島細胞を、その特異的機能を失うことなく長期間インビトロで培養できる方法を提供することを目的とする【解決手段】  細胞外基質でコーティングされた非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体を用意する工程ａ）、及び単離された膵島細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程ｂ）を含む、膵島細胞からなる３次元凝集体をインビトロで製造する方法。本発明の製造方法によれば、インビトロで培養しても単層化せず、３次元凝集体を形成させることで、インスリン分泌能などの膵島細胞としての機能を維持したままの膵島細胞凝集体を、トリプシン等のタンパク質消化酵素を使用せずに製造・回収することができ、この様な膵島細胞は膵島移植治療に有用である。また膵島細胞からなる３次元凝集体を保持したハニカム状多孔質体は、バイオ人工膵臓、セルチップあるいは膵島細胞の移植用担体として利用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外基質でコーティングされた非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体を用意する工程ａ）、及び単離された膵島細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程ｂ）を含む、膵島細胞からなる３次元凝集体をインビトロで製造する方法。
【請求項２】
孔径０．０１μｍ〜１００μｍならびに膜厚０．０１μｍ〜１００μｍを有するハニカム状多孔質体を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ハニカム状多孔質体の平面方向に存在する周囲の貫通孔と連通している構造を有するハニカム状多孔質体を用いる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
膵島移植治療用の膵島細胞からなる３次元凝集体を製造する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
セルチップ用の膵島細胞からなる３次元凝集体を製造する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
細胞外基質がラミニンである、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵島細胞からなる３次元凝集体の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ラミニンでコーティングされた非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体上で単離された膵島細胞を培養する、膵島細胞からなる３次元凝集体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、アミラーゼやリパーゼなどの消化酵素を分泌して消化吸収を助ける外分泌細胞と、インスリンやグルカゴンを分泌して血糖調節を行う内分泌細胞との２種類の、全く働きの異なる細胞群（組織）よりなる。外分泌細胞は膵臓の99％を占めており、これら細胞で作られる消化酵素は、導管を通って十二指腸に放出される。膵島は、膵外分泌組織の中に点々と散らばって存在している、直径約 0.1〜0.3 mm の球状の塊であり、α細胞、β細胞、その他ごく少数の働きの違う細胞が含まれている。β細胞は、血糖が上昇した場合に血糖を低下させるホルモンであるインスリンを分泌し、反対に血糖が低下し過ぎた時にはα細胞から血糖を上昇させる働きがあるグルカゴンが分泌される。
【０００３】
インスリン依存性の糖尿病の治療法として、生体膵臓から取り出した膵島を局所麻酔下に肝臓内の血管である門脈に注入するという細胞移植術が提唱されている。この移植治療法が成功すると、膵島細胞は肝臓内で生着し、血糖値に反応してインスリンを分泌する。しかし、この移植治療法は、移植手技自体は膵臓移植に比較すると簡単であるが、膵島を膵臓から外分泌細胞と区別して単離し、膵島の機能を維持したまま培養する技術が十分に確立されていないことから、単離された膵島を移植しても完全にインスリン非依存性にはならず、完治しない場合も少なくない。
【０００４】
生体より採取した膵島に含まれる細胞（膵島細胞）は、細胞−細胞外基質（Extracellular matrix）間又は細胞−細胞間の結合を失うことで、膵島特異機能を消失し、長期インビトロ培養下において細胞死を迎える。さらに、インビトロ培養下における膵島細胞の単層化は、細胞−細胞間の結合を失わせ、より急速な膵島特異機能の消失を招く。この膵島細胞のインビトロ培養における生理機能の低下を抑制する方法として、細胞外基質の一種であるラミニンをコーティングしたティシュカルチャーディッシュの利用が報告されており（非特許文献１、非特許文献２）、インスリン分泌量の改善ならびに細胞生存効果が報告されている。しかしながら、このラミニンによりコーティングされたティシュカルチャーディッシュの利用では、膵島細胞の単層化に伴う膵島細胞の特異機能の消失という問題は解消されない。
【０００５】
この、膵島細胞の単層化と特異機能の消失を回避し、生体内における膵島細胞間の立体構造を再現させて、膵島細胞が本来持つ生理機能を培養下にて再現する方法として、膵島細胞にコラーゲンゲル又はフィブリンゲル等からなる足場（scaffold）としての培養基材を提供し、膵島細胞の凝集形態を維持させることが行われている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００６】
しかしながら、コラーゲンゲル又はフィブリンゲル等を利用した膵島細胞培養法は、培養後の細胞を回収する際にトリプシン等のタンパク質分解酵素の利用を必要とすることから、細胞への毒性、細胞−細胞外基質あるいは細胞−細胞間結合が分解されるといった問題が指摘されている。また、前記方法で使用されるコラーゲンゲルは、ブタ等の非ヒト動物より抽出・合成されたものを利用するものであり、当該非ヒト動物からヒトへの感染症の危険性を排除することができない。
【０００７】
本発明者らは、非水溶性ポリマーからなるハニカム構造体、ハニカムパターン化フィルムあるいはハニカム状多孔質体と呼ばれる微細な多数の孔が規則的に配置された薄膜（以下、ハニカム状多孔質体とする）が、肝実質細胞、心筋細胞、軟骨細胞ならびに上皮系細胞などのインビトロでの培養において良好な足場となることを報告してきた（例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３など）。しかし、ハニカム状多孔質体は、細胞の種類によってはその増殖を却って抑制する（例えば特許文献４）ことも知られており、必ずしも任意の細胞の増殖に対して良好な足場として利用できるものではない。
【非特許文献１】Labriola Lら、Mol. Cell Endocrinol.、2007年、第15巻、第263号、第120-133頁
【非特許文献２】Bosco Dら、Diabetes、2000年、第49巻、第２号、第233-243頁
【非特許文献３】Nagata Nら、Cell Transplant.、2001年、第10巻、第4-5号、第447-451頁
【非特許文献４】Beattie GMら、Diabetes、2002年、第51巻、第12号、第3435-3439頁
【特許文献１】特開２００２−３３４９５９号公報
【特許文献２】特開２００２−１５２００５号公報
【特許文献３】特開２００７−６９８７号公報
【特許文献４】特開２００５−５２５２６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、膵島細胞を、その特異的機能を失うことなく長期間インビトロで培養できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、生体から単離された膵島細胞をインビトロで培養するに当たり、ラミニンで表面処理を行ったハニカム状多孔質体を培養基材として用いることで、膵島細胞の単層化を回避し、かつ細胞−細胞間の結合を維持させて、膵島特異機能を消失させることなく長期のインビトロ培養が可能であることを見いだし、以下の各発明を完成した。
【００１０】
（１）細胞外基質でコーティングされた非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体を用意する工程ａ）、及び単離された膵島細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程ｂ）を含む、膵島細胞からなる３次元凝集体をインビトロで製造する方法。
【００１１】
（２）孔径０．０１μｍ〜１００μｍならびに膜厚０．０１μｍ〜１００μｍを有するハニカム状多孔質体を用いる、（１）に記載の方法。
【００１２】
（３）ハニカム状多孔質体の平面方向に存在する周囲の貫通孔と連通している構造を有するハニカム状多孔質体を用いる、（２）に記載の方法。
【００１３】
（４）膵島移植治療用の膵島細胞からなる３次元凝集体を製造する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１４】
（５）セルチップ用の膵島細胞からなる３次元凝集体を製造する、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（６）細胞外基質がラミニンである、（１）〜（５）の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の製造方法によれば、インビトロで培養しても単層化せず、インスリン分泌能などの膵島細胞としての機能を維持したままの膵島細胞を、トリプシン等のタンパク質消化酵素を使用せずに製造することができ、この様な膵島細胞は膵島移植治療に有用である。また膵島細胞からなる３次元凝集体を保持したハニカム状多孔質体は、バイオ人工膵臓、セルチップあるいは膵島細胞の移植用担体として利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、細胞外基質でコーティングされた非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体を用意する工程ａ）、及び単離された膵島細胞を前記ハニカム状多孔質体上で培養する工程ｂ）を含む、膵島細胞からなる３次元凝集体をインビトロで製造する方法に関する。ここで非水溶性ポリマーからなるハニカム状多孔質体とは、高分子（ポリマー）でできた多孔性の薄膜であって、膜の垂直方向に向けられた微少な孔が膜の平面方向に蜂の巣状に（ハニカム状に）設けられているものを意味する。本発明で使用するハニカム状多孔質体の孔は、膜を垂直方向に貫通している孔（貫通孔）であってもよく、また貫通孔は薄膜の平面方向に存在する周囲の貫通孔と互いに連通していてもよい。
【００１８】
この様なハニカム状という規則的な配置で孔が設けられている多孔質の薄膜は、孔の孔径、形状あるいは深さなどがまちまちである不規則な孔を有する通常の多孔質体とは全く異なる構造体として理解される。また推論ではあるが、ハニカム状多孔質体の平面方向に存在する貫通孔同士が連通しているという構造は、ハニカム状多孔質体上で増殖する膵島細胞間の相互作用が発揮される、あるいは培地や溶存酸素の供給、老廃物の排出がスムーズに行われるなどの利点をもたらすと考えられる。
【００１９】
本発明で利用されるハニカム状多孔質体の形状は、膜厚が0.01μｍ〜100μｍ、好ましくは0.1μｍ〜50μｍ、より好ましくは１μｍ〜20μｍであり、孔径が0.01μｍ〜100μｍ、好ましくは0.1μｍ〜50μｍ、より好ましくは１μｍ〜20μｍ、特に好ましくは５μｍ〜15μｍである。
【００２０】
この様な構造的特徴を有するハニカム状多孔質体は、種々の公知の方法に従って製造することができる。例えばフォトリソグラフィーやソフトリソグラフィー（ホワイトサイドら、Angew. Chem. Int. Ed.、1998年、第37巻、第550−575頁）、ブロックコポリマーの相分離（アルブレヒトら、Macromolecules、2002年、第35巻、第8106−8110頁）、サブミクロンのコロイド微粒子を集積することで２次元、３次元の周期構造を作製する方法（グら、Langmuir、第17巻）、これを鋳型にしてインバースドオパール構造を作製する方法（カルソら、Langmuir、1999年、第15巻、第8276−8281頁）などを挙げることができる。
【００２１】
また、これらの方法と製造原理を大きく異にする方法である特開平８−３１１２３１号公報、特開２００１−１５７４７５号公報、特開２００２−３４７１０７号公報あるいは特開２００２−３３５９４９号公報に記載された方法も使用することができる。これらの方法は、高分子の水不溶性有機溶媒溶液表面上に水滴を結露させ、該水滴を鋳型としてハニカム状多孔質体を調製するものであり、製造コストや効率等の点でその他の製造法に比べて有利である。以下、さらに詳しく説明する。
【００２２】
この方法では、水不溶性有機溶媒、特に50dyn／cm以下の表面張力γＬを有する水不溶性有機溶媒に非水溶性ポリマーを溶解した非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を、表面の表面張力をγＳとし、塗布される水不溶性有機溶媒の表面張力γＬならびに該基板と該溶媒との間の表面張力γＬＳとした場合にγＳ−γＳＬ＞γＬの関係を満たす基板の表面に塗布し、さらに相対湿度30％以上の空気の存在下で基板上に塗布された非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を蒸発させることが好ましい。
【００２３】
ここにいう水不溶性有機溶媒は、50dyn／cm以下の表面張力を有し、かつ該溶液表面に結露した水滴を保持し得る程度の水不溶性と、大気圧下で０〜150℃、好ましくは10〜90℃の沸点を有する有機溶媒を言う。例えば四塩化炭素、ジクロロメタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、メチルイソブチルケトン等の非水溶性のケトン類、二硫化炭素などを挙げることができる。
【００２４】
また非水溶性ポリマーは、水に不溶性でかつ上記の水不溶性有機溶媒に可溶な、あるいは適当な界面活性剤の存在下で水不溶性有機溶媒に溶解し得るポリマーであれば特別の制限はなく、適宜選択して使用することができる。例えば、ポリ乳酸やポリヒドロキシ酪酸のような生分解性ポリマー、脂肪族ポリカーボネート、両親媒性ポリマー、光機能性ポリマー、電子機能性ポリマーなどを挙げることができる。
【００２５】
具体的な例示としては、ポリブタジエン、ポリイソプレン、スチレン−ブタジエン共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体などの共役ジエン系高分子；ポリε−カプロラクトン；ポリウレタン；酢酸セルロース、セルロイド、硝酸セルロース、アセチルセルロース、セロファンなどのセルロース系高分子；ポリアミド６、ポリアミド66、ポリアミド610、ポリアミド612、ポリアミド12、ポリアミド46などのポリアミド系高分子；ポリテトラフルオロエチレン、ポリトリフルオロエチレン、パーフルオロエチレン−プロピレン共重合体などのフッ素系高分子；ポリスチレン、スチレン−エチレン−プロピレン共重合体、スチレン−エチレン−ブチレン共重合体、スチレン−イソプレン共重合体、塩素化ポリエチレン−アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸エステル−スチレン共重合体、スチレン−アクリロニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、アクリル酸エステル−アクリロニトリル−スチレン共重合体などのスチレン系高分子；ポリエチレン、塩素化ポリエチレン、エチレン−α−オレフィン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、エチレン−塩化ビニル共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリプロピレン、オレフィン−ビニルアルコール共重合体、ポリメチルペンテンなどのオレフィン系高分子；フェノール樹脂、アミノ樹脂、尿素樹脂、メラミン樹脂、ベンゾグアナミン樹脂などのホルムアルデヒド系高分子；ポリブチレンテレフタレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル系高分子；エポキシ樹脂；ポリ（メタ）アクリル酸エステル、ポリ−２−ヒドロキシエチルアクリレート、メタクリル酸エステル−酢酸ビニル共重合体などの（メタ）アクリル系高分子；ノルボルネン系樹脂；シリコン樹脂；ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリグリコール酸などのヒドロキシカルボン酸の重合体などが挙げられる。これらは単独で使用されても組み合わせて使用されてもよい。
【００２６】
なお、本発明で使用するハニカム状多孔質体を構成するポリマーは必ずしも生分解性である必要はないが、膵島細胞の3次元凝集体を製造するための非水溶性ポリマーとしては、ポリスチレン、ポリ乳酸、ポリ（ε-カプロラクトン）を挙げることができる。
【００２７】
また本発明で利用されるハニカム状多孔質体は、両親媒性ポリマーを含んで調製されることが好ましい。好ましい両親媒性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、アクリルアミドポリマーを主鎖骨格とし疎水性側鎖としてドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基またはカルボキシル基を併せ持つ両親媒性樹脂、ヘパリンやデキストラン硫酸、核酸（DNAやRNA）などのアニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩とのイオンコンプレックス、ゼラチン、コラーゲン、アルブミンなどの水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性樹脂、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリε−カプロラクトン−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリリンゴ酸−ポリリンゴ酸アルキルエステルブロック共重合体などの両親媒性樹脂などが挙げられるが、これらに限定されない。 
上記の水不溶性有機溶媒と非水溶性ポリマーとの具体的な組み合わせの例としては、例えばポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアルキルシロキサン、ポリメタクリル酸メチルなどのポリアルキルメタクリレートまたはポリアルキルアクリレート、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリ−Ｎ−ビニルカルバゾール、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリアルキルアクリルアミド、およびこれらの共重合体よりなる群から選ばれるポリマーに対しては、四塩化炭素、ジクロロメタン、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレン、二硫化炭素などの有機溶媒を組み合わせて使用することができる。また、フッ素化アルキルを側鎖に持つアクリレート、メタクリレートおよびこれらの共重合体よりなる群から選ばれるポリマーに対しては、AK-225（旭硝子株式会社製）などのフッ化炭素溶媒、トリフルオロベンゼン、フルオロエーテル類などの使用も良好な結果を与える。これらの中から、具体的に使用する非水溶性ポリマーに対する溶解性を考慮して、適宜選択して使用することができる。
【００２８】
また、フッ素化アルキルを側鎖に持つポリアクリレートやメタクリレートの側鎖の水素をフッ素に置換したフッ素系ポリマーを用いてハニカム状多孔質体を製造する際には、フッ素系の有機溶媒（AK-225等）の使用も良好な結果を与える。
【００２９】
水不溶性有機溶媒溶液中の非水溶性ポリマー濃度は、製造されるハニカム状多孔質体に求める特性、物性並びに使用する水不溶性有機溶媒に応じて、適宜定めることができる。本発明で使用する貫通孔を有するハニカム状多孔質体の作製に際しては、水不溶性有機溶媒溶液中の非水溶性ポリマーの濃度を0.1ｇ／Ｌ〜10ｇ／Ｌ、特に0.5ｇ／Ｌ〜6.0ｇ／Ｌとすることが好ましい。
【００３０】
非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板は、例えば、紙、ガラス板、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン等）がラミネートされた紙、金属板（例えば、アルミニウム、亜鉛、銅等）、プラスチックフィルム（例えば、二酢酸セルロース、三酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリビニルアセタール等）、シリコン製板等が挙げられる。
【００３１】
さらにかかる非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板は、基板表面の表面張力γＳと塗布される水不溶性有機溶媒の表面張力γＬならびに該基板と該溶媒との間の表面張力γＬＳとの間で、γＳ−γＳＬ＞γＬの関係を満たす基板を選択して用いることが望ましい。これは、非水溶性ポリマー溶液の水不溶性有機溶媒溶液を塗布する基板自体の水不溶性有機溶媒に対する濡れ性が、基板上に形成される液膜の厚みに影響を与え得るためである。基板には、塗布される非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液との親和性が高いものであることが好ましい。具体的には、水不溶性有機溶媒の表面張力γＬを指標にして上記式で表すことのできる表面張力を示す表面を有する基板を利用すればよい。そのような基板の好適な例としては、ガラス板、シリコン製板あるいは金属板などを挙げることができる。
【００３２】
また、水不溶性有機溶媒溶液との親和性を高めることのできる加工を表面に施した基板の使用も可能である。この様な基板表面の濡れ性の改良は、基板と使用する水不溶性有機溶媒に合わせて、自体公知の方法、例えばガラス製や金属製の基板に対してはそれぞれシランカップリング処理やチオール化合物による単分子膜形成処理方法などを利用することができる。例えば、クロロホルムなどの疎水性有機溶媒を水不溶性有機溶媒として用いる場合の基板としては、十分に洗浄されたＳｉ基板や、アルキルシランカップリング剤などで表面を修飾したガラス基板などの使用が好ましい。また、フッ素系溶媒を用いる場合は、テフロン基板、あるいはフッ素化アルキルシランカップリング剤などで修飾したガラス基板などの使用が好ましい。
【００３３】
非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を基板に塗付して同溶液の液膜を形成させる際の液膜厚としては50μｍ〜5mｍ、好ましくは2mm以下とすることが望ましい。また基板に非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液を塗付する方法としては、基板に同溶液を滴下する方法の他、バーコート、ディップコート、スピンコート法などを挙げることができ、バッチ式、連続式の何れも利用することができる。
【００３４】
基板表面に塗布された非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液は、相対湿度30％以上の空気に接触させることによって蒸発させる。ここで溶媒の蒸発速度を非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液の基板表面への塗布時の液膜厚が20分以内に50μmにまで減少する速度とすることによって、1μｍ〜10μｍの孔径を有するハニカム状多孔質体を調製することができる。この蒸発速度は、基板上に塗布した非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液の液膜の面方向に対してほぼ平行ないし上方向に0.1L（リットル）／分以上の空気層の流れを形成して水不溶性有機溶媒を蒸発させる方法、水不溶性有機溶媒の沸点未満かつ液膜に接触する空気の露点未満で非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液が塗布された基板を加熱（例えばベルチェ素子を用いて加熱）して非水溶性有機溶媒を蒸発させる方法、あるいは水不溶性有機溶媒の沸点ならびに液膜に接触する空気の露点を超えないような減圧下に基板に塗布された非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液をおいて水不溶性有機溶媒を蒸発させる方法、等によって達成することができる。ここで、露点とは、ある温度におかれた空気の中に含まれている水蒸気が飽和に達して凝結する温度をいい、相対湿度と絶対温度に対して定まる値である。 好適な例としては、基板に塗布された非水溶性ポリマーの非水溶性有機溶媒溶液の液膜に対してほぼ平行ないし上方向に向けた、相対湿度30〜99％、風速0.01〜20ｍ／秒の範囲内で調節した気流に非水溶性ポリマーの水不溶性有機溶媒溶液の液膜を置くことが好ましい。
【００３５】
以上の方法によって、本発明で利用されるハニカム状多孔質体を作製することができる。まｔ、このハニカム状多孔質体は、例えば、ハニカム構造体フィルムの２以上の端をマイクロマニュピレーターやピンセットを用いて又は手でつまんで、伸長方向に引っ張ることによって延伸させることができ、この様な延伸されたハニカム状多孔質体も本発明で使用することができる。延伸は、一軸延伸、二軸延伸又は三軸延伸の何れでもよい。また延伸方向の伸長率は特に限定されないが、好ましくは1.1から10倍の範囲内である。
【００３６】
また、ハニカム状多孔質体に含まれる両親媒性物質は、細胞外基質によるハニカム状多孔質体のコーティングに先立って、ハニカム状多孔質体から除去しておくことが好ましい。両親媒性物質の除去は、ハニカム状多孔質体を１−プロパノールに数分〜10分程度浸浸することで行うことができる。また本発明で使用するハニカム状多孔質体は、ＵＶ照射、加熱処理、又はエタノール処理等によって滅菌して使用することが好ましい。
【００３７】
上記の方法によって作製されるハニカム状多孔質体、好ましくは両親媒性物質が除去され、滅菌されたハニカム状多孔質体は、さらに細胞外基質でコーティングして使用される。本発明で使用される細胞外基質は細胞間質とも呼ばれる、網目状構造を有する線維状タンパク質であり、グリコサミノグリカンまたはプロテオグリカンなどの多糖類を含んでいてもよい。細胞外基質としては、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン等を挙げることができるが、本発明で最も好ましい細胞外基質はラミニンである。
【００３８】
細胞外基質によるハニカム状多孔質体のコーティングは、細胞外基質が溶解又は懸濁された水あるいは適当な緩衝液にハニカム状多孔質体を浸浸することにより、行うことができる。細胞外基質のコーティング量は、ハニカム状多孔質体の単位面積（cｍ２）あたり、0.1μｇ〜10μｇの範囲内であればよく、このコーティング量は浸浸液に含まれる細胞外基質の濃度または浸浸時間を変更することで調節することができる。
【００３９】
細胞外基質でコーティングされたハニカム状多孔質体上における膵島細胞の培養は、生体から単離した膵島細胞を懸濁した適当な液体培地を、ハニカム状多孔質体にアプライし、インキュベーションすればよい。この培養によって、ハニカム状多孔質体上に膵島細胞からなる３次元凝集体を製造することができる。本発明における膵島細胞からなる３次元凝集体とは、複数の膵島細胞が、平面方向だけではなく膵島細胞同士が重なり合って上下方向にも接触してなる塊（細胞塊）を意味する。一般にこの様な細胞塊はスフェロイドと呼ばれる。
【００４０】
一般に、生体から単離された膵島細胞は、これを適当な培地に保存等しても伸展化あるいは単層化して細胞機能が著しく低下する。そのため、従来の培養方法では、移植治療に用いる十分な量の膵島細胞をインビトロ培養で準備することは困難であった。本発明の製造方法は、インビトロで生理機能が維持された膵島細胞を製造することが可能であり、この様な膵島細胞は移植治療に好適に利用することができる。あくまで推測ではあるが、ハニカム状多孔質体上で個々の膵島細胞が互いに再凝集することにより、平面方向に存在する周囲の貫通孔との連通部分を通じて膵島細胞同士が何らかの相互作用を及ぼすことにより、生体内における膵島の周辺環境（３次元的環境）を擬似的に再現し、その結果膵島細胞のハニカム状多孔質体に対する接着性が高まる、細胞機能の低下が抑制されるなどの効果が発揮されるものと考えられる。
【００４１】
生体からの膵島細胞の単離は、Suttonらの方法（Transplantation、1986年、第42巻、第6号、第689-691頁あるいはOkedaらの方法（Endocrinol. Jpn.、1979年、第26巻、第4号、第495-499頁）に準じて行うことができる。膵島細胞としては、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ブタ等に代表される各種動物由来の膵島細胞をいずれも利用できるが、ヒト膵島細胞の利用が特に好ましい。培地としては、Williams’E培地、F-10培地、RPMI1640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、またはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等）を選択することができる。培養は、0.5×105〜1.0×105個／mL程の膵島細胞懸濁液を、ウェルプレート又は適当な容器に置いたハニカム状多孔質体に播種し、pH6.0〜8.0、30〜40℃、５％CO２雰囲気下でインキュベーションすればよい。培養中は適当な間隔を置いて培地交換を行うことが好ましい。さらに、膜を垂直方向に貫通している孔（貫通孔）を有するハニカム膜を使用する場合、培養の途中でハニカム状多孔質体の裏表を反転させて、ハニカム状多孔質体の両面に膵島細胞の３次元凝集体を製造してもよい。また、本発明の製造方法では、膵島細胞をハニカム状多孔質体上で培養する工程において、遺伝子操作、薬剤添加およびサイトカイン処置といった細胞への操作を容易に行うことができる。
【００４２】
ハニカム状多孔質体上に形成された膵島細胞の３次元凝集体は、ピペッティング操作によってハニカム状多孔質体から剥離、回収することができる。このピペッティング操作には、従来技術であるコラーゲンゲルおよびフィブリンゲル等の支持組織上から膵島細胞を剥離、回収する際に必要となるトリプシン等の消化酵素を用いた処理を必要としないので、本発明は、従来技術における消化酵素に起因する細胞への毒性、細胞−細胞外基質間ならびに細胞−細胞間結合の消失並びに膵島移植後の生体内生着率の低下を回避することができる。ピペッティング操作で回収された膵島細胞の３次元凝集体は、必要に応じて細胞毎に分離して移植等に使用してもよい。
【００４３】
また、本発明によって製造される膵島細胞の３次元凝集体は、これを保持したハニカム状多孔質体と共に使用することで、人工膵臓として又はセルチップとして利用することもできる。本発明にいうセルチップとは、基板、好ましくは薄膜に生きた完全な膵島細胞を整列して保持させたバイオチップである。また保持とは、細胞と基板等が単に接触している状態ではなく、水や緩衝液等で基板上の細胞を洗浄しても容易には細胞が基板等から遊離しない程度に固着している状態を言う。膵島細胞の３次元凝集体やこれを保持したハニカム状多孔質体をセルチップとして用いることで、膵島細胞に対してインスリン分泌能を促す物質の探索その他の糖尿病治療薬や抗肥満薬の探索や評価を簡便に行うことが可能となる。
【００４４】
以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００４５】
１）ハニカム状多孔質体と平膜の作製
生分解性高分子であるポリ（ε-カプロラクトン）（PCL、和光純薬（株）製、分子量70,000〜100,000）と両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（dodecyl acrylamide、6-acrylamide-n-caproic acid、2,2’-azobis(isobutyronitrile) 、Cap）を重量比10：１で５mg／mLとなるようにクロロホルムに溶解した。ガラスシャーレ（φ90ｍｍ）内に直径22mm のカバーガラス（Fisher Scientific社）を敷き詰め、この上に前記PCLを含むクロロホルム溶液を5mLキャストし、相対湿度80％の雰囲気下でクロロホルムを蒸発させた。クロロホルムが完全に蒸発した後にカバーガラスをガラスシャーレから剥がし、両親媒性高分子を除去するために１−プロパノール中に10分間浸漬し、さらにエタノールで洗浄し、残留溶媒を除去するために真空下に3時間おいた。その後、UV 照射（約40 mW/cm2）を3時間行い、滅菌したハニカム状多孔質体を作製した。このハニカム状多孔質体は、孔径10μｍの孔を有していた。以下、このハニカム状多孔質体をPCL-10と表す。
【００４６】
また、上記の同様の操作をPCLとCap（重量比10：１）の濃度を5 mg／mLとしたクロロホルム溶液キャスト量8 mLを用いて行い、孔径15μｍの孔を有するハニカム状多孔質体（以下、PCL-15と表す）を作製した（図１）。
【００４７】
ポリスチレン（PS）とCapを重量比10：１で３mg／mLとなるようにクロロホルムに溶解した。ガラスシャーレ（φ90ｍｍ）内に直径22mm のカバーガラス（Fisher Scientific社）を敷き詰め、この上に前記PSを含むクロロホルム溶液を10mLキャストし、相対湿度80％の雰囲気下でクロロホルムを蒸発させた。クロロホルムが完全に蒸発した後にカバーガラスをガラスシャーレから剥がし、両親媒性高分子を除去するために１−プロパノール中に10分間浸漬し、さらにエタノールで洗浄し、残留溶媒を除去するために真空下に３時間おいた。その後、UV 照射（約40 mW／cm2）を3時間行い、滅菌したハニカム状多孔質体を作製した。このハニカム状多孔質体は、孔径８μｍの孔を有していた。以下、このハニカム状多孔質体をPS-8と表す。
【００４８】
PCLとCap（重量比10：１）の濃度を10 mg／mLとしたクロロホルム溶液1mLをスピンコーター（MIKASA 1H-D7、東京）のステージに設置したカバーガラス上にキャストし、1,000rpm、15秒の条件でステージを回転させて、膜厚が均一な平膜を作製し、当該平膜を、両親媒性高分子を除去するために１−プロパノール中に10分間浸漬し、さらにエタノールで洗浄し、残留溶媒を除去するために真空下に3時間おいた。その後、滅菌するためにUV 照射（約40 mW/cm2）を3時間行い、滅菌されたPCLの平膜を作製した。以下、この平膜をPCL-FLと表す。また、上記のPCLを同量のPSに代えて同様の操作を行い、滅菌されたPSの平膜を作製した。以下、この平膜をPS-FLと表す。
【００４９】
２）ラミニンコーティング
１）で作製した薄膜（PCL-10、PCL-15、PS-8、PCL-FL及びPS-FL）を別々に12ウェルプレートに挿入し、この上からウェルに勘合するガラスリング（外径22mm、内径18.5mm）を載せて薄膜をプレート底面に固定した（図２）。エタノールを各ウェルに加えて薄膜の脱気を行った後、エタノールを滅菌ミリQ水に置換した。さらに、Laminin水溶液をラミニン（Sigma社）が4μg／cm2となるように各ウェルに加えて、37℃で２時間インキュベートして、各薄膜をラミニンでコーティングした。
【００５０】
３）膵島細胞の調製
体重200〜250 g （６〜８週齢）の雄性Wistar ラット（ホクドー社）より、0.5 mM EGTAおよび1000 PU/ml dispase（合同酒精社）及びコラゲナーゼ（Worthington Biochemical社）を用いた消化法により、膵島を分離した。この膵島に対してFicoll-Conray（Sigma社）を用いた密度勾配法およびパスツールピペットを用いたハンドピックアップを行い、純度90％以上の膵島／10%FBS（Biosource社）及び10mMニコチンアミドを含むRPMI-1640培地（Sigma社）を調製した。
【００５１】
４）膵島細胞の培養
３）で調製した3×105 cells／mL の膵島細胞１mLを、前記２）で調製したラミニンでコーティングされた薄膜へ播種（7.89×104 cells／cm2）し、37℃、5% CO2 の条件下で14日間培養した。培地は、上記２）と同じ培地を用い、24 時間後ごとに半量ずつを新鮮な培地に交換した。
【００５２】
５）倒立型位相差顕微鏡による観察
各薄膜上へ膵島細胞を播種した直後及び培養開始から1日目、２日目、７日目及び１４日目において、倒立型位相差顕微鏡（OLYMPUS IX-71）を用いて、薄膜への膵島細胞の接着形態を観察し、同時に顕微鏡写真から膵島細胞の凝集塊の直径を測定した。
【００５３】
培養開始から1日目におけるPCL-FLおよびPS-FLでは、目算で70％の膵島細胞が接着しており、その半数程は伸展して強く接着し、他の半数は球状の形態で接着していることが観察された（図３）。
【００５４】
培養開始から２日目におけるPCL-FL及びPS-FLでは、培養開始から1日目とほぼ同様の接着形態が観察された（図４）。一方、培養開始から２日目におけるPCL-10、PCL-15及びPS-8では、膵島細胞からなる凝集塊の形成が観察された（図５）。
【００５５】
培養開始から７日目におけるPCL-FL及びPS-FLでは、一部に膵島細胞からなる細胞凝集塊の形成が確認されたが、大部分の膵島細胞は広範囲に伸展し菲薄化していた（図６）。一方、培養開始から７日目におけるPCL-10、PCL-15及びPS-8では、いずれも膵島細胞の単層化は抑制され、膵島細胞からなる凝集塊の形成が確認された（図７）。その直径は、PCL-10では34.7±15.0 μm、PCL-15では31.7±8.05 μm、PS-8では34.7±9.95μmであった。
【００５６】
培養開始から14日目におけるPCL-FL及びPS-FLでは、いずれも単層化した膵島細胞が確認された（図８）。また、培養開始から14日目におけるPCL-10、PCL-15及びPS-8では、いずれも膵島細胞の単層化は抑制され、膵島細胞からなる凝集塊の形成が確認された（図９）。その直径は、PCL-10では41.4±15.5μm、PCL-15では40.3±11.1μm、PS-8では47.2±16.8μmであった。
【００５７】
６）走査型電子顕微鏡による観察
PCL-FL及びPCL-10それぞれで７日間培養した膵島細胞を、2.5% グルタールアルデヒド溶液を用いて固定し、20%から100%のエタノールを用いて段階的に脱水した。さらに有機溶媒をtert-ブチルアルコールに置換した後、膵島細胞を凍結し、凍結真空乾燥装置（日立 ES-2030）を用いて乾燥させた。凍結乾燥後の膵島細胞にイオンスパッタリング装置（日立 E-1030）を用いて白金パラジウムを被覆させ、走査型電子顕微鏡（日立 S-3500N）を用いて観察した。
【００５８】
PCL-FLでは、広範囲に接着伸展化し、単層化した膵島細胞が観察された（図１０）。一方、PCL-10では、一部に膵島細胞の伸展化が観察されるが、膵島細胞からなる凝集塊の形成が確認された（図１１）。その直径は34.7±15.0 μmであった。また、ハニカム状多孔質体内部への膵島細胞の浸潤が観察され、PCL-10上に観察された凝集塊がハニカム状多孔質体を介した立体構造を有する組織体であることが確認された。また、同様の操作をPS-FL及びPS-8で培養した膵島細胞に対して行った結果、PS-FLでは単層化した膵島細胞が、PS-8では球体化した凝集塊が、それぞれ観察された。
【００５９】
７）薄膜上の膵島細胞のインスリン分泌脳の測定
各薄膜上で７日間培養した後の膵島細胞のグルコース応答性インスリン分泌能を測定した。培地を50 mg／dLのグルコース（低グルコース）を含むクレブスリンガー液に置換して60分間インキュベーションした後の膵島細胞のインスリン分泌量を測定し、さらに300 mg／dLのグルコース（高グルコース）を含むクレブスリンガー液に置換して60分間インキュベーションした後の膵島細胞のインスリン分泌量を測定し、高グルコース及び低グルコースにおけるインスリン分泌量の比をstimulation index 値（SI値）として評価した。インスリン量は、インスリン測定用ELISAキット (Shibayagi Co., Ltd., Japan)を用いて測定した。また、測定データは平均±標準偏差として表し、群間比較においてはノンパラメトリックのt 検定で行い、p<0.05 を有位差ありとした。その結果を表１に示す。
【表１】
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【００６０】
表１に示されるように、PCL-FL及びPS-FLと比較して、PCL-15及びPS-8において膵島細胞機能が維持される傾向が確認された。
【００６１】
以上の実験から、PCL、PSいずれの材質からなるハニカム状多孔質体においても、ラミニンコーティングされたハニカム状多孔質体上で培養された膵島細胞の接着伸展化ならびに細胞機能の低下が抑制されると共に、膵島細胞からなる細胞凝集塊の形成が確認された。この様に、ラミニンコーティングされたハニカム状多孔質体は、膵島細胞の培養基材として、膵島細胞の接着形態ならびに機能制御を行うことができることが確認された。
【００６２】
８）ハニカム状多孔質体からの膵島細胞凝集塊の回収
PS-8上で14日間培養した膵島細胞を、パスツールピペットを用いたピペッティングを行ってPS-8から剥離させ、遠心分離で回収した。回収後の膵島細胞の位相差顕微鏡像を図１２に示す。図１２に示されるように、ピペッティングによるハニカム状多孔質体からの剥離と遠心分離による回収によっても、膵島細胞の３次元凝集体の形態は維持されていた。この様に、ハニカム状多孔質体は、膵島移植に用いるまでの膵島細胞用ストレージとしても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】実施例の１）で作製したPCLからなる孔径15μｍのハニカム状多孔質体（PCL-15）の電子顕微鏡写真である。写真左はPCL-15を面に対して垂直方向から見た構造を示し、写真右はPCL-15を面に対して65度の角度から見た構造を示す。
【図２】実施例の２）におけるラミニンコーティングを模式的に表した図である。
【図３】培養開始から１日目における平膜上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-FLを示し、写真右がPS-FLを示す。
【図４】培養開始から２日目における平膜上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-FLを示し、写真右がPS-FLを示す。
【図５】培養開始から２日目におけるハニカム状多孔質体上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-10を示し、写真中がPCL-15を示し、写真右がPS-8を示す。
【図６】培養開始から７日目における平膜上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-FLを示し、写真右がPS-FLを示す。
【図７】培養開始から７日目におけるハニカム状多孔質体上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-10を示し、写真中がPCL-15を示し、写真右がPS-8を示す。
【図８】培養開始から14日目における平膜上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-FLを示し、写真右がPS-FLを示す。
【図９】培養開始から14日目におけるハニカム状多孔質体上の膵島細胞の様子を示した位相差顕微鏡観察写真である。写真左がPCL-10を示し、写真中がPCL-15を示し、写真右がPS-8を示す。
【図１０】培養開始から７日目におけるPCL-FL上の膵島細胞の様子を示した走査型電子顕微鏡観察写真である。写真上は倍率100倍、写真中は倍率500倍、写真下は倍率500倍の別視野である。
【図１１】培養開始から７日目におけるPCL-10上の膵島細胞の様子を示した走査型電子顕微鏡観察写真である。写真上は倍率100倍、写真中は倍率2000倍、写真下は倍率4000倍の別視野である。
【図１２】ピペッティングによってハニカム状多孔質体から剥離、回収された膵島細胞を示した位相差顕微鏡観察写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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