(57)【要約】【課題】エラスチン線維異常による病理病態の原因解明においても、エラスチン線維分解抑制効果を有する素材の開発においても、弾性線維分解の度合いを客観的に評価しうる、真皮線維芽細胞の細胞外のエラスチン線維の分解の程度を簡便かつ正確に評価するシステムを提供すること。【解決手段】組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを用いてエラスチン線維を構築し、その線維の様態観察によって分解と構築の度合いを評価する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（６）のステップを備えたエラスチン線維分解活性の評価方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；
（４）培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；
（５）培養上清中のタグの量を測定するステップ；
（６）被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が多い場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；
【請求項２】
以下の（１）〜（５）のステップを備えたエラスチン線維分解活性の評価方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；
（４）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；
（５）被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が少ない場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；
【請求項３】
以下の（１）〜（６）のステップを備えたエラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；
（４）培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；
（５）培養上清中のタグの量を測定するステップ；
（６）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；
【請求項４】
以下の（１）〜（５）のステップを備えたエラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；
（４）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；
（５）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；
【請求項５】
以下の（１）〜（４）のステップを備えたエラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養上清中のタグの量を測定するステップ；
（４）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；
【請求項６】
以下の（１）〜（４）のステップを備えたエラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法。
（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；
（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；
（３）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；
（４）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；
【請求項７】
タグとして、ペプチドタグを用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の方法。
【請求項８】
ペプチドタグとして、Ｖ５を用いることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
組換えトロポエラスチンが、組換えヒトトロポエラスチンであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の方法。
【請求項１０】
真皮線維芽細胞が、ヒト由来の真皮線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の方法。
【請求項１１】
ヒト由来の真皮線維芽細胞が、胎児又は新生児の真皮由来の真皮線維芽細胞であることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タグ化した組換えトロポエラスチンを用いる、エラスチン線維分解活性の評価方法や、エラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法や、エラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内の血管・靭帯・肺・皮膚をはじめとする、ほぼ全身の臓器・組織に分布する弾性線維の中で、特にトロポエラスチンが架橋することによって作られた線維をエラスチン線維と呼び、器官の柔軟性維持に重要な役割を担うことが知られている。同時にエラスチン線維の石灰化などの異常が病理病態の要因であることから、数多くの研究が報告されている。
【０００３】
エラスチン線維は、皮膚では真皮に存在し、乳頭層の最下部で表皮面に平行に走る線維と乳頭層の中ほどの線維（elaunin fiber）、さらにそこから細い終末の線維が出て表皮の基底膜まで垂直に上がるもの（oxytalan fiber）がある。
【０００４】
皮膚のエラスチン線維異常を伴う病態としては皮膚弛緩症や日光弾性線維症などが報告されている。皮膚弛緩症は皮膚の弾力が減退または消失し、たるみや皺が生じるとともに肺気腫、大動脈瘤、腸管拡張症などを引き起こす一連の症候群で、組織学的には皮膚等の弾性線維が減少ないし消失する病気である。日光弾性線維症は、主に日光に連続曝露された部位において、外観所見でなめし皮様の皮膚肥厚、深い皺、黄変色などが認められる。組織学的には真皮上層〜中層に弾性線維数の増加と肥厚を経て、塊状の無構造な物質（一般に非晶質と呼ぶ）になることが特徴である。更にこのことが皮膚の弾力性低下を誘発し、所謂しわやたるみといった老徴に至ることが推察されている。しかしながら、非晶質なエラスチンが線維前駆体であるトロポエラスチンの異常産生によるものなのか、単にエラスチン線維の分解物なのかは明らかになっていない。
【０００５】
一方エラスチン線維分解にはエラスターゼと呼ばれる酵素群が関与すると言われている。そのエラスターゼによる過剰な分解を阻害することがエラスチン線維の異常抑制につながるとして、エラスターゼの活性阻害効果を有する素材の研究も進められている。例えば、１，１０−オルトフェナントロリンや、トウダイグサ（Euphorbiaceae）科のフィランサス（Phyllanthus）属のメニラン（P.niruri L.）の抽出物（例えば、特許文献１参照）や、ショウキョウ、加水分解アーモンド、ワレモコウ、チョウジ、エイジツ、セイヨウサンザシ及びシラカバから選ばれる植物、又はその抽出物、水蒸気蒸留物、圧搾物（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００６】
そして、従来のエラスチン線維分解活性の評価には、エラスターゼ様作用を用いている、すなわち基質としてＮ−メトキシサクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ｐ−ニトロアニリド（例えば、特許文献３参照）やＮ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ｐ−ニトロアニリド（例えば、特許文献４参照）を用い、酵素タンパク質のＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ結合を切断する能力で評価しているため、厳密にはトロポエラスチン（エラスチン線維前駆分泌タンパク）の分解抑制評価であって、構築されたエラスチン線維自身の分解評価とはいえない。
【０００７】
また別のエラスチン線維分解活性の評価方法として、免疫染色手法でエラスチン線維の形態観察をすることも考えられるが、真皮線維芽細胞などトロポエラスチンを産生する細胞では、新たに作られるエラスチン線維量と分解されるエラスチン線維量が等しい場合に見かけ上変化が認められないことから評価には適していない。例えば、トロポエラスチンを産生する線維芽細胞では、培養液中のトロポエラスチン集合体が、細胞が分泌したトロポエラスチンに由来するかエラスチン線維の分解物なのか区別できない。また、エラスチン線維も、分解を受けていないものか新たに構築されたものか区別できない（図１参照）。
【０００８】
その他、ハイブリドーマHASG-30（FERM BP-08489）により産生されるモノクローナル抗体、又は、そのモノクローナル抗体と同等の、ヒト大動脈エラスチン分解物に対する特異性及び親和性を持つ抗体である第１抗体と、ハイブリドーマHASG-2（FERM BP-08488）により産生されるモノクローナル抗体、又は、そのモノクローナル抗体と同等の、ヒト大動脈エラスチン分解物に対する特異性及び親和性を持つ抗体である第２抗体とをエラスチン分解物に免疫学的に結合させることを含む、エラスチン分解物の免疫学的測定方法（例えば、特許文献５参照）が知られている。
【０００９】
以上のようにエラスチン線維異常による病理病態の原因解明においても、エラスチン線維分解抑制効果を有する素材の開発においても、線維分解の度合いを客観的に評価する手法が必要とされており、その開発は急務である。このような状況下で本発明者らは、リコンビナントトロポエラスチンと、自らはトロポエラスチンを産生しないＡＲＰＥ−１９細胞（ヒト網膜色素上皮細胞）を用いたIn vitro弾性線維モデルを構築し報告している（例えば、非特許文献１参照）。加えて本モデルを用いて各種エラスターゼなどの酵素のエラスチン線維分解活性についても検討を行なっている。
【００１０】
より具体的には、大腸菌組換えウシトロポエラスチン（ＢＴＥ）を２０μｇ／ｍＬの濃度でヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）に４８時間毎に４回添加し、エラスチン線維を再構築し、これに膵臓由来のpancreatic elastase、白血球由来のleukocyte elastaseまたは細胞外マトリックス分解酵素（ＭＭＰ）−２、ＭＭＰ−９を分泌する細胞の培養上清を１時間処理し、蛍光免疫染色によるエラスチン線維の形態観察、エラスチン線維の指標であるデスモシンの定量、培養上清のWestern blot assayを行なった。その結果、蛍光免疫染色法により、形成したエラスチン線維はpancreatic elastase、leukocyte elastaseの処理濃度依存的に減少した。エラスチン線維の成熟指標であるデスモシン量もpancreatic elastaseの処理濃度依存的に減少した。逆に培養上清ではエラスチン線維分解物が増加した。またＨＴ１０８０、ＴＨＰ−１の培養上清添加処理によりエラスチン線維の減少が確認された。
【００１１】
【特許文献１】特開平９−８７１３６号公報
【特許文献２】特開２０００−１１９１８９号公報
【特許文献３】特許第３７４９７６９号公報
【特許文献４】特開２００６−１０４２０９号公報
【特許文献５】特開２００６−９８４１４号公報
【非特許文献１】Clin. Biochem. 2005 Jul;38(7):643-53
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従来、ヒト真皮線維芽細胞が産生するエラスチン線維の分解程度を簡便かつ正確に評価するシステムが存在しなかった。例えば、ヒト真皮線維芽細胞の培養上清に含まれるトロポエラスチンを抗トロポエラスチン抗体で測定すればよいが、培養上清中のトロポエラスチンには、エラスチン線維分解物の他、ヒト真皮線維芽細胞が生成したトロポエラスチンが混入するため正確な評価はできない。上記非特許文献１記載の方法は、トロポエラスチン非産生上皮細胞だから生成トロポエラスチンが混入することはない優れた方法といいうるが、ヒト真皮線維芽細胞でないことから自然な系ではない。本発明の課題は、エラスチン線維異常による病理病態の原因解明においても、エラスチン線維分解抑制効果を有する素材の開発においても、線維分解の度合いを客観的に評価しうる、真皮線維芽細胞が産生するエラスチン線維の分解程度を簡便かつ正確に評価するシステムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、上記非特許文献１記載の弾性線維モデルを応用し、ヒト真皮線維芽細胞などのトロポエラスチンを産生する細胞においてもエラスチン線維の分解や構築の評価を可能とするために、組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを用いてエラスチン線維を構築し、その線維の様態観察によって分解と構築の度合いを評価しうることを見い出し（図２参照）、本発明を完成するに至った。図２には、ヒト真皮線維芽細胞の培養液中に人為的に作製したタグ化組換えトロポエラスチンを添加して、細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させた場合、培養液中のトロポエラスチン集合体が、細胞が作ったトロポエラスチンに由来するかエラスチン線維の分解物なのかの区別が可能となり、また、エラスチン線維も、分解を受けていないものか新たに構築されたものか区別が可能となる。
【００１４】
すなわち、本発明は、（１）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；［４］培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；［５］培養上清中のタグの量を測定するステップ；［６］被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が多い場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；を備えたエラスチン線維分解活性の評価方法や、（２）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；［４］培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；［５］被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が少ない場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；を備えたエラスチン線維分解活性の評価方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（３）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；［４］培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；［５］培養上清中のタグの量を測定するステップ；［６］被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；を備えたエラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法や、（４）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；［４］培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；［５］被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；を備えたエラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法に関する。
【００１６】
また本発明は、（５）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養上清中のタグの量を測定するステップ；［４］被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；を備えたエラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法や、（６）［１］組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；［２］培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；［３］培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；［４］被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；を備えたエラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１７】
さらに本発明は、（７）タグとして、ペプチドタグを用いることを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれか記載の方法や、（８）ペプチドタグとして、Ｖ５を用いることを特徴とする前記（７）記載の方法や、（９）組換えトロポエラスチンが、組換えヒトトロポエラスチンであることを特徴とする前記（１）〜（８）のいずれか記載の方法や、（１０）真皮線維芽細胞が、ヒト由来の真皮線維芽細胞であることを特徴とする前記（１）〜（９）のいずれか記載の方法や、（１１）ヒト由来の真皮線維芽細胞が、胎児又は新生児の真皮由来の真皮線維芽細胞であることを特徴とする前記（１０）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、病理病態研究において、エラスチン線維の構築と分解の関係を明らかにすることが可能となり、また、エラスチン線維の恒常性維持に必要な薬剤、すなわちエラスチン線維の構築促進や分解抑制薬剤の開発が可能となることが期待され、これまで有効な対処法のなかった皮膚における弾性線維異常に対する原因究明、薬剤開発に大きく寄与するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のエラスチン線維分解活性の評価方法としては、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；（４）培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；（５）培養上清中のタグの量を測定するステップ；（６）被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が多い場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；の（１）〜（６）のステップを備えた方法や、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を所定時間接触させるステップ；（４）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；（５）被検物質非接触の陰性対照の測定値と比較して、タグの量が少ない場合、前記被検物質がエラスチン線維分解活性を有すると判定するステップ；の（１）〜（５）のステップを備えた方法であれば特に制限されず、ここで、エラスチン線維分解活性とは、トロポエラスチン集合体がマイクロフィブリル（線状の糖タンパク質）上に結合したエラスチン線維を分解する活性、より具体的には、エラスチン線維を分解してトロポエラスチン集合体を遊離させる活性をいう。また、評価の対象となる被検物質としては、エラスチン線維分解活性を有すると予想される候補物質が主として用いられる。培養液中で、部分タグ化エラスチン線維に被検物質を接触させる時間としては、特に制限されないが、通常２４〜４８時間を好適に例示することができる。
【００２０】
本発明のエラスチン線維分解抑制又は分解促進物質のスクリーニング方法としては、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養上清を除き新しい培養液を補充するステップ；（４）培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；（５）培養上清中のタグの量を測定するステップ；（６）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；の（１）〜（６）のステップを備えた方法や、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させ、真皮線維芽細胞（層）表面に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを所定時間接触させるステップ；（４）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；（５）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が、多いときに前記被検物質をエラスチン線維分解抑制物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維分解促進物質と判定するステップ；の（１）〜（５）のステップを備えた方法であれば特に制限されず、上記エラスチン線維分解抑制物質としてはエラスターゼ阻害物質と予想される候補物質が主として用いられ、またエラスチン線維分解促進物質としてはエラスターゼ作用を活性化しうると予想される候補物質が主として用いられる。エラスチン線維分解抑制物質は、エラスチン線維の分解を抑制することから、皮膚における弾性線維異常に対する予防・治療剤として有用である。また、エラスターゼとしては、膵臓由来のエラスターゼ（pancreatic elastase）や白血球由来のエラスターゼ（leukocyte elastase）など公知のエラスターゼも含め、ヒトのエラスチン線維分解活性を有するものであればどのようなものでも使用することができる。培養液中で、被検物質の存在下又は非存在下に、部分タグ化エラスチン線維にエラスターゼを接触させる時間としては、特に制限されないが、通常２４〜４８時間を好適に例示することができる。
【００２１】
本発明のエラスチン線維形成促進又は形成抑制物質のスクリーニング方法としては、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養上清中のタグの量を測定するステップ；（４）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；の（１）〜（４）のステップを備えた方法や、（１）組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンを調製するステップ；（２）培養液中の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを所定時間接触させ、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させるステップ；（３）培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定するステップ；（４）被検物質の非存在下の陰性対照の測定値と比較して、被検物質の存在下の場合のタグの量が多いときに前記被検物質をエラスチン線維形成促進物質と判定し、少ないときに前記被検物質をエラスチン線維形成抑制物質と判定するステップ；の（１）〜（４）のステップを備えた方法であれば特に制限されず、エラスチン線維形成促進物質は、エラスチン線維の構築を促進することから、皮膚における弾性線維異常に対する予防・治療剤として有用である。培養液中のヒト由来の真皮線維芽細胞（層）に、被検物質の存在下又は非存在下に、タグ化組換えトロポエラスチンを接触させる時間としては、特に制限されないが、通常２４〜４８時間を好適に例示することができる。
【００２２】
上記の本発明の評価方法やスクリーニング方法において用いられるタグ化組換えトロポエラスチンの調製に用いられるタグとしては、エラスチン線維の形成を妨げることがないように嵩高くないものが好ましく、また、簡便にタグ化することができるペプチドタグが好ましい。ペプチドタグとしては、例えば、Ｖ５、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に挙げることができる。
【００２３】
上記の本発明の評価方法やスクリーニング方法において用いられる組換えトロポエラスチンがタグ化されているタグ化組換えトロポエラスチンは、ペプチドタグの場合、ヒトのトロポエラスチンをコードするゲノムＤＮＡやｃＤＮＡのＮ末端側あるいはＣ末端側にペプチドタグをコードするＤＮＡを連結し、遺伝子組換え技術を利用して常法により調製することができる。また、ペプチドタグ以外のタグの場合など、ヒトのトロポエラスチンをコードするゲノムＤＮＡやｃＤＮＡを遺伝子組換え技術を利用して常法により発現させて組換えトロポエラスチンを作製し、得られた組換えトロポエラスチンにタグを化学的に結合させることにより調製することもできる。さらにＨｉｓタグ等でタグ化したタグ化組換えトロポエラスチンを調製し、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用して、タグ化組換えトロポエラスチンを精製することもできる。
【００２４】
上記の本発明の評価方法やスクリーニング方法において用いられる真皮線維芽細胞としては、ヒト由来の真皮線維芽細胞、中でも、胎児又は新生児の真皮由来の真皮線維芽細胞がエラスチン線維形成能力に優れている点で好ましい。これら真皮線維芽細胞の培養液としては、Ｌ−グルタミン酸とペニシリン・ストレプトマイシンと１０％ＣＣＳを含むＤＭＥＭ培地など、真皮線維芽細胞の培養液として公知の培養液を用いることができる。そして、タグ化組換えトロポエラスチンを添加するなどして接触させて５〜１４日間培養すると、真皮線維芽細胞から産生されるトロポエラスチンの集合体と添加したタグ化組換えトロポエラスチンの集合体が、マイクロフィブリル上にランダムに並んで結合して、真皮線維芽細胞（層）上に部分タグ化エラスチン線維を形成させることができる。なお、真皮線維芽細胞と組換えトロポエラスチンの由来は同じであることが好ましく、したがって、ヒト由来の真皮線維芽細胞を用いる場合、組換えトロポエラスチンとして、組換えヒトトロポエラスチンを用いることが好ましい。
【００２５】
上記の本発明の評価方法やスクリーニング方法において、培養上清中のタグの量を測定する方法としては、タグ物質に対する特異抗体を一次抗体として培養上清に加えて、培養上清中のタグ化トロポエラスチンと反応させ、次いで標識化抗ＩｇＧ抗体を二次抗体として加えてインキュベートし、二次抗体の標識に基づくＥＬＩＳＡ法等によりタグ化トロポエラスチンを定量する方法を挙げることができる。また、培養上清を除き、部分タグ化エラスチン線維中のタグの量を測定する方法としては、真皮線維芽細胞と部分タグ化エラスチン線維を一緒に可溶化し、その中のタグの量をＥＬＩＳＡ法等により定量する方法を挙げることができる。
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００２７】
［Ｖ５タグ付き組換えトロポエラスチンの作製］
前記非特許文献１記載の方法を一部改良（Ｖ５タグ化）して、Ｖ５タグ付き組換えトロポエラスチン［Ｖ５ＨＴＥ］を調製した。すなわち、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法を用いて、トロポエラスチンのエクソン２からエクソン３６の配列と、Ｃ末端側にＶ５配列（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号１）を持つｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを、Ｎ末端に６ｘＨｉｓタグがあるpTrcHis-TOPO ベクター（invitrogen製）に組み込み、それを大腸菌に遺伝子導入した。１ＭのＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactoside）を加えてトロポエラスチンの発現誘導をさせ、遠心分離でタンパク質を回収した後、８Ｍの尿素緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。得えられた溶解液をＮｉ２＋カラム樹脂（Ni-NTA agarose, QIAGEN製）を用いて単離した後、透析したトロポエラスチンを精製Ｖ５ＨＴＥとして使用した。また、トロポエラスチンを構成する３２個のエクソンのうち、デスモシン架橋を作るための１６番目のエクソンが欠損しているＶ５タグ付き組換えトロポエラスチン［Ｖ５Δ１６］をネガティブコントロールとして調製した。
【００２８】
また、前記非特許文献１記載の方法に準じて、Ｖ５タグ付きでない組換えトロポエラスチン［ＨＴＥ ＨＴＥ］を調製した。すなわち、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法を用いて、トロポエラスチンのエクソン２からエクソン３６の配列を持つｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮＡを、N末端に６ｘＨｉｓタグがあるpTrcHis-TOPO ベクター（invitrogen製）に組み込み、それを大腸菌に遺伝子導入した。１ＭのＩＰＴＧ（isopropyl-β-D-thiogalactoside）を加えてトロポエラスチンの発現誘導をさせ、遠心分離でタンパク質を回収した後、８Ｍの尿素緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。得えられた溶解液をＮｉ２＋カラム樹脂（Ni-NTA agarose, QIAGEN製）を用いて単離した後、透析したトロポエラスチンを精製品として使用した。また、トロポエラスチンを構成する３２個のエクソンのうち、エラスチン線維特異的なデスモシン架橋を作るための１６番目のエクソンが欠損しているＶ５タグ付きでない組換えトロポエラスチン［ＨＴＥΔ１６］をネガティブコントロールとして調製した。
【実施例２】
【００２９】
［エラスチン線維の構築］
ヒト由来の真皮線維芽細胞（タカラバイオ社製）３×１０４を９６ウェルマイクロタイタープレート（FALCON）中のＬ−グルタミン酸とペニシリン・ストレプトマイシンと１０％ＣＣＳを含むＤＭＥＭ培地に接種し、４８時間後、真皮線維芽細胞を８日間０，１０，２０μｇ／ｍＬの各濃度のＶ５ＨＴＥ及びＶ５Δ１６をそれぞれ含む培地中で培養した。培地は２日おきに取り替えた。その後、細胞はＰＢＳで洗浄して固定した。ブロッキング剤と５０００倍に希釈した第一抗体（抗Ｖ５モノクローナル抗体（Invitrogen製））を加えた。その後、細胞層は数回ＰＢＳで洗浄され、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合第二抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）とインキュベートし、再度洗浄した。抗Ｖ５モノクローナル抗体によって認識されるＶ５ＨＴＥ及びＶ５Δ１６は、室温で１０分間ＴＭＢ（3,3',5,5'-tetramethylbenzidin）基質試薬（Fermentas）を用いた色素分析により定量された。培養プレートの個々のウェルは波長４５０ｎｍで読み取られた。結果を図３（左縦軸スケール；Ｖ５）に示す。
【００３０】
同様に、ヒト真皮由来の真皮線維芽細胞（タカラバイオ社製）３×１０４を９６ウェルマイクロタイタープレート（FALCON）中のＬ−グルタミン酸とペニシリン・ストレプトマイシンと１０％ＣＣＳを含むＤＭＥＭ培地に接種し、４８時間後、真皮線維芽細胞を８日間０，１０，２０μｇ／ｍＬの各濃度のＨＴＥ ＨＴＥ及びＨＴＥ Δ１６をそれぞれ含む培地中で培養した。培地は２日おきに取り替えた。その後、細胞はＰＢＳで洗浄して固定した。ブロッキング剤と１０００倍に希釈した第一抗体（ヒトトロポエラスチン特異的モノクローナル抗体（Chemicon製））を加えた。その後、細胞層は数回ＰＢＳで洗浄され、ＨＲＰ結合第二抗体（抗マウスＩｇＧ抗体）とインキュベートし、再度洗浄した。抗体によって認識されるエラスチン線維は、培養プレートの個々のウェルは波長４５０ｎｍで読み取られた。結果を図３（右縦軸スケール；ＨＴＥ ａｂ）に示す。
【００３１】
Ｖ５タグ付きのＨＴＥを用いた図３（左縦軸スケール；Ｖ５）から明らかなように、Ｖ５ＨＴＥを真皮線維芽細胞培養液に添加すると、濃度依存的にエラスチン線維が構築されるが、Ｖ５Δ１６においてはエラスチン線維の構築は認められなかった。また、Ｖ５タグ付きでないＨＴＥを用いた図３（右縦軸スケール；ＨＴＥ ａｂ）においても、濃度依存的にエラスチン線維が構築されるが、ＨＴＥ Δ１６においてはエラスチン線維の構築は認められなかった。これらの結果は、単なる化学的吸着などの非特異的な吸着ではなく、Ｖ５ＨＴＥを用いてもＨＴＥを用いた場合と同様にエラスチン線維が形成されたことを示している。
【実施例３】
【００３２】
［培養上清中のエラスチン線維分解物の分解形式解析］
Ｖ５タグ付き組換えトロポエラスチン［Ｖ５ＨＴＥ］を真皮線維芽細胞に添加し構築した実施例２記載のエラスチン線維に、被検物質として膵臓由来のエラスターゼ（pancreatic elastase）を０，１，３unit／ｍＬ及び白血球由来のエラスターゼ（leukocyte elastase）を０，１０，３０unit／ｍＬの各酵素単位で処理した。３７℃で１時間培養後、培養上清をＴＣＡ沈殿によりサンプル化し、抗Ｖ５抗体を用いてWestern blot assayで解析した。結果を図４に示す。本結果からエラスチン線維の分解に起因するＶ５タグ付き断片化物由来のバンドが認められ、エラスチン線維の分解度合いを測定できることが分かった。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】真皮線維芽細胞上のエラスチン線維の概要を示す図である。
【図２】タグ化組換えトロポエラスチンが組み込まれた真皮線維芽細胞上の部分タグ化エラスチン線維の概要を示す図である。
【図３】Ｖ５タグ化組換えトロポエラスチン添加時の部分タグ化エラスチン線維の構築量を示す図である。
【図４】培養上清中の部分タグ化エラスチン線維分解物の分解形式解析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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