(57)【要約】【課題】たんぱく性薬物について投与初期の過剰放出を抑制し、さらに安定した徐放性を保持し、かつ、投与局所傷害の少ない徐放性微粒子組成物を得ること。【解決手段】多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とたんぱく性薬物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の含有量が該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなることからなる。又、製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中にたんぱく性薬物を飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有させた該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と水溶性２価金属化合物水溶液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とたんぱく性薬物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量が該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項２】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子、たんぱく性薬物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量が該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項３】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を基剤として、たんぱく性薬物、水溶性２価金属化合物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量が、該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項４】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を基剤としてたんぱく性薬物、水溶性２価金属化合物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該水溶性２価金属化合物が塩化亜鉛であり、塩化亜鉛の含有量が組成物に対し２から１５重量％であることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項５】
前記多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子が多孔性ヒドロキシアパタイトの構成成分であるカルシウム原子の一部を亜鉛原子に置換した多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項６】
前記多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中のカルシウム原子数と亜鉛原子数の比が、９９：１〜４：１であることを特徴とする請求項５に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項７】
前記多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子の平均粒子径が０．５から30μmであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項８】
前記多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子が１５０℃から６００℃で処理されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項９】
前記多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中のたんぱく性薬物吸着量が組成物に対し４から２５重量％であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１０】
前記水溶性２価金属化合物が亜鉛化合物であることを特徴とする請求項３又は４のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１１】
前記亜鉛化合物が塩化亜鉛、酢酸亜鉛または炭酸亜鉛であることを特徴とする請求項１０記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１２】
前記水親和性生体内消失性高分子化合物がポリエチレングリコールとポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるブロックコポリマーであることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１３】
前記ポリエチレングリコールとポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるブロックコポリマーがポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸―ポリエチレングリコール―ポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるトリブロックコポリマーであることを特徴とする請求項１２記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１４】
前記ポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸―ポリエチレングリコール―ポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるトリブロックコポリマーの重量平均分子量が５，０００から１２，０００であることを特徴とする請求項１３記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【請求項１５】
前記ポリエチレングリコールとポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるブロックコポリマーのうち、ポリエチレングリコールの重量割合が20から90重量%であることを特徴とする請求項１２記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物
【請求項１６】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中にたんぱく性薬物を飽和吸着重量の４０から８０重量％を吸着させた該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と水溶性２価金属化合物水溶液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【請求項１７】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中にたんぱく性薬物を飽和吸着重量の４０から８０重量％を吸着させ、攪拌後、さらに凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【請求項１８】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有する該たんぱく性薬物水溶液または緩衝液とを混和し、水溶性２価金属化合物を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【請求項１９】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有する該たんぱく性薬物水溶液または緩衝液とを混和し、組成物に対し２から１５重量％の塩化亜鉛水溶液を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末と水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【請求項２０】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％のたんぱく性薬物を含有するpＨ４．０から６．９の弱酸性水溶液または緩衝液と多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とを混和し、組成物に対し２から１５重量％の塩化亜鉛水溶液を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末と、ポリ乳酸・グリコール酸―ポリエチレングリコール―ポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるトリブロックコポリマーのアセトン水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【請求項２１】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と組成物に対し２から１５重量％の塩化亜鉛水溶液とを混和し、攪拌後、該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着量の４０から８０重量％のたんぱく性薬物を含有するpＨ４．０から６．９の弱酸性水溶液または緩衝液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末と、ポリ乳酸・グリコール酸―ポリエチレングリコール―ポリ乳酸またはポリ乳酸・グリコール酸からなるトリブロックコポリマーのアセトン水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体内で緩徐に消失する多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体の微粒子を基剤とするたんぱく性薬物の徐放性微粒子組成物およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
たんぱく性薬物の長期にわたる徐放性注射用製剤は、これまでポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）を基剤にして検討されてきた（例えば、特許文献１、２、非特許文献１，２，３参照）。また、ヒト成長ホルモン（ｈGH）を含有するPLGAを基剤とした徐放性マイクロカプセルが米国において治療に使用されている（例えば、非特許文献４参照）。PLGAは、生体内で加水分解して徐々に消失する生体内消失性の基剤で、注射剤の基剤として好ましい性質を有している。一般的にはPLGAを使用する徐放性製剤を製造する際には、それを溶解する有機溶媒を使用する。一方、多くのたんぱく性薬物は、水溶性であり、PLGAを用いた徐放性微粒子製剤を製造するには有機溶媒溶液と水溶液とを使用することになる。
【０００３】
この２つの溶媒を同時に使用するとたんぱく性薬物は、変性して失活する。このような活性の低下は、有効性を損なうのみならず生体に対しても悪い影響をもたらす危険性がある。また、水溶性のたんぱく性薬物の徐放性微粒子製剤においては、投与初期（直後）に一過性の過剰放出をすることが避けられない。また、ヒドロキシアパタイトを用いたhGH（たんぱく性薬物）の徐放性微粒子製剤についての報告（例えば、非特許文献５、６,７および特許文献３参照）もあるが、非特許文献５、６は、いずれも2成分系であり、ヒドロキシアパタイトの粒子径も４０から８０μmあるいは２００μmと大きく、細い注射針による投与は困難である。さらに、in vivo における徐放効果は不明である。
【０００４】
また、ヒドロキシアパタイト中に含まれるhGH量も１％以下で少ないものであった。特許文献３および非特許文献７は、多孔性ヒドロキシアパタイト微粒子に存在する細孔に生物学的活性薬剤、ヒト血清たんぱく質、ムコ多糖類を充填し、2価金属イオンを加えて塞栓する又は水溶性のカルシウム塩を充填し、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム又は炭酸イオン水溶液を加えて該微粒子の外層を栓塞することにより徐放性組成物を製造する方法を提供しているが、微粒子製剤中のたんぱく性薬物の含量は、１％程度で、徐放期間も７日程度であり、臨床使用には該製剤の投与量を増加せざるを得ないため実用的な観点からは解決すべき問題点があった。
【０００５】
一般的にたんぱく性薬物の注射用徐放性製剤においては、投与後、薬物の放出が終了する頃に生体内から消失する生体内消失性の機能を有する基剤を選定しなければならない。また、たんぱく性薬物の製造に関しては水に混和しない有機溶媒と水溶液との同時併用は避け、たんぱく性薬物の変性を回避しなければならない。製剤の投与量が大きくなりすぎて細い注射針による投与が困難になる懸念を回避するため微粒子製剤中の薬物吸着量は、少なくとも5％以上が好ましい。さらに、多くの場合、当該微粒子製剤は、反復投与となるので、患者の負担を軽減するためにも細い注射針を通ることが好ましく、その徐放期間は、少なくとも１週間以上で、かつ、副作用の原因となり得る初期過剰放出を極力少なくしなければならない。
【０００６】
既に、このような問題点については多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体の微粒子を基剤として利用し、適量の水溶性2価金属化合物を使用すること（特許文献3および特許文献４参照）による解決方法が提出された。すなわち、これらの技術により生体内消失性および徐放性機能を併せ持ち、１週間以上にわたりほぼ一定速度で含有する薬物を徐放し、その薬物吸着量も５％以上であり、分解性、通針性も良好であるたんぱく性薬物の注射用徐放性微粒子製剤およびその製造法が明らかとなり、さらに、生体内消失性の水親和性の疎水性部と親水性部からなるブロックコポリマーで薬物含有微粒子を被覆することにより薬物の徐放性をより長く持続させ、好ましい徐放性を付与する技術も提出されている（特許文献５参照）。
【特許文献１】特開平10-231252
【特許文献２】米国特許5656297
【特許文献３】国際公開広報  WO2004/112827 A1
【特許文献４】国際公開広報  WO2004/112751 A1
【特許文献５】国際公開広報  WO2005/082405 A1
【非特許文献１】O.L. Johnson et al.: Nature Medicine, 2: 795-799 (1996).
【非特許文献２】M. Takenaga et al.: J. Pharmacy Pharmacology, 54: 1189-1194 (2002).
【非特許文献３】S. Takada et al.: J. Controlled Release, 88: 229-242 (2003).
【非特許文献４】NDA21-075
【非特許文献５】J. Guicheux et al.:  J. Biomedical Materials Research, 34:  165-170 (1997).
【非特許文献６】H. Gautier et al.:  J. Biomedical Materials Research, 40:  606-613 (1998).
【非特許文献７】Y. Mizushima et al: J. Controlled Release, 110:260-265 (2006).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のごとくたんぱく性薬物の注射用徐放性微粒子製剤においては投与初期の過剰放出が避けられないことはよく知られているが、可能な限り初期放出を抑制するためには抑制効果のある２価金属化合物が公知技術として利用されている。しかしながら、２価金属化合物のなかで効果の優れた亜鉛化合物を利用する場合、初期過剰放出の抑制とは裏腹に投与量の増加に伴い、場合により投与局所に傷害を引き起こす可能性がある。したがって、より安全性の高い徐放性製剤を得るためには初期の過剰放出を抑制し、かつ、人体に対しても投与局所の傷害を可能な限り少なくする必要がある。
【０００８】
このような状況下、さらに各種たんぱく性薬物について投与初期の過剰放出を極力小さくし、かつ、安定した徐放性を得る目的でさらなる検討を続けた結果、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子が本来たんぱく性薬物を吸着（含有）できる最大量を下回る量の該たんぱく性薬物を弱酸性状態で多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体に吸着させることによって、２価金属化合物の添加量を減量した場合でも投与初期の過剰放出を抑制し、さらに安定した徐放性を保持し、かつ、投与局所傷害の少ないたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物が得られることを見出した。
【０００９】
そこで、本発明の目的は、たんぱく性薬物について投与初期の過剰放出を抑制し、さらに安定した徐放性を保持し、かつ、投与局所傷害の少ない徐放性微粒子組成物を得ることである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するため、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とたんぱく性薬物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量（含有量）が該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなる。
【００１１】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子、たんぱく性薬物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量（含有量）が該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量の４０〜８０重量％からなることを特徴とするたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物。
【００１２】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を基剤として、たんぱく性薬物、水溶性２価金属化合物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該たんぱく性薬物の吸着量（含有量）が、該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子への飽和吸着重量（飽和含有重量）の４０〜８０重量％からなる。
【００１３】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を基剤としてたんぱく性薬物、水溶性２価金属化合物および水親和性生体内消失性高分子化合物からなる組成物であって、該水溶性２価金属化合物が塩化亜鉛であり、塩化亜鉛の含有量が組成物に対し２から１５重量％であることからなる。
【００１４】
ここに記載のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物を構成する多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とは、多孔性ヒドロキシアパタイトの構成成分であるカルシウム原子の一部を亜鉛原子に置換した化合物である。このときの亜鉛原子の置換率（モル比）は、モル比でカルシウム原子の１〜２０％（モル）が好ましい。換言すれば、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中のカルシウム原子数と亜鉛原子数の比が、９９：１〜４：１であることが好ましい。
例えば、カルシウム原子１０個のうち、０．５個を亜鉛原子に置換した誘導体微粒子は、Ca9.5Zn0.5(PO4)6(OH)2の分子式で表される。一般式はCa(10-x)Znx(PO4)6(OH)2  となり、式中、xは0.1-2.0が好ましいということになる。それぞれHAp-Zn-0.5、HAp-Zn-xと表記する。カルシウム原子と置換した亜鉛原子は、結晶格子中に存在するので水に懸濁した状態では溶出することはない。
【００１５】
ヒドロキシアパタイト誘導体のナノ結晶は、水酸化カルシウムの水懸濁液中に所定量の塩化亜鉛を含むリン酸水溶液を滴下する湿式法で合成される。この反応は、酸とアルカリの中和反応であり、大きさ４０nm前後の亜鉛を含有するアパタイトナノ結晶が直接沈殿する。このようにして得られた亜鉛含有ヒドロキシアパタイトナノ結晶の懸濁液をスプレードライ法により噴霧・乾燥させることによりナノ粒子が多数集合した多孔質微粒子が得られる。さらにこの多孔質微粒子を高温で焼成処理して製造される(生駒俊之ら、PHARM TECH JAPAN 21: 2088-2090(2005).参照)。
【００１６】
多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子は、前述のとおり調製後、高温で焼成される。この焼成温度は、低いほうが水に溶けやすく、消失速度も速くなる。処理温度は、室温〜８００℃が用いられるが、１５０〜６００℃が好ましい。８００℃以上で焼成されると生体内では消失されなくなる。また、１００℃以下で処理すると粒子同士が凝集しやすくなり、通常の注射投与が困難となる。その粒子径は、平均値で５０μm以下が好ましく用いられる。しかし、あまり小さいとたんぱく性薬物の封入率が低下することが懸念され、０．１〜５０μmが好ましく、０．５〜３０μmがより好ましく使用される。また、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子にたんぱく性薬物を含有させる場合、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中のたんぱく性薬物吸着量（含有量）が４から２５％であることが好ましい。
【００１７】
たんぱく性薬物の初期過剰放出を抑制するために用いる水溶性２価金属化合物としては、亜鉛化合物であることが好ましく、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、炭酸亜鉛が挙げられる。なかでも塩化亜鉛が好ましく用いられる。塩化亜鉛に加えて、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムを併用してもよい。その使用量は、内封されるたんぱく性薬物によって異なるが、一般的には多孔性ハイドロキシアパタイト誘導体微粒子組成物の２〜２５重量％の範囲が好ましく用いられる。さらに好ましい範囲は２〜１５重量％である。
【００１８】
徐放性を持たせるために使用する水親和性のブロックコポリマーについては生体内消失性高分子化合物がよく、種々検討の結果、たんぱく性薬物の変性を避けるために親水性のポリエチレングリコール(PEG)にポリ乳酸（PLA）またはポリ乳酸・グリコール酸（PLGA）が結合したブロックコポリマーが好ましく、ブロックコポリマーは、PLAまたはPLGA―PEG―PLAまたはPLGAからなるブロックコポリマーであることがより好ましいと結論された。この親水性基を導入することによってタンパク性薬物を含有した多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体の微粒子を水系で処理することが可能となる。水系のみで処理すればタンパク性薬物の変性は避けられる。
【００１９】
このブロックコポリマー結合様式は、PEGの両末端の水酸基にPLAまたはPLGAがエステル結合した化合物(トリブロックコポリマー)でもよく、PEGの片末端にエステル結合した化合物でもよい。片末端エステルの場合、他の末端は、アルコキシ基などで保護されていることが好ましいが、アミノ基、カルボキシル基などの官能基が結合していてもよい。ブロックコポリマーの両末端または片末端にPEGとPLAまたはPLGAの比率は、PEGが重量比で２０〜９０％が好ましく、２５〜６５％がより好ましい。ブロックコポリマーの分子量は、３，０００〜２０，０００が好ましく、５，０００〜１２，０００がより好ましい。水親和性生体内消失性高分子化合物である該ブロックコポリマーは、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子の３〜１００重量％の範囲で使用されるが、好ましくは５〜３０％の範囲で用いられる。
【００２０】
たんぱく性薬物としてはその分子量が５，０００以上の化合物に適用される。例えば、ヒト成長ホルモン（hGH）、肝細胞成長因子（HGF）、繊維芽細胞成長因子（FGF）、IGF-1、NK4、VEGF、NGF、BDNF、BMP、アディポネクチン、インターフェロン類（IFN-α、IFN-β）、インターロイキン類（IL-２、IL-４、IL-５など）、エリスロポエチン（EPO）、顆粒球形成刺激因子（G-CSF、GM-CSF)、インスリン、ANP、TNF-α、抗体などが挙げられる。多孔性ヒドロキシアパタイトまたはその誘導体内への飽和封入される量は、アパタイトの５〜５０％が一般的である。
【００２１】
本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中にたんぱく性薬物を飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有させた該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と水溶性２価金属化合物水溶液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２２】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子中にたんぱく性薬物を飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有させ、攪拌後、さらに凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２３】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有する該たんぱく性薬物水溶液または緩衝液とを混和し、水溶性２価金属化合物を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末を水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液と混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２４】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％を含有する該たんぱく性薬物水溶液または緩衝液とを混和し、組成物に対し２〜１５重量％の塩化亜鉛水溶液を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末と水親和性生体内消失性高分子水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２５】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％のたんぱく性薬物を含有するpＨ４．０から６．９の弱酸性水溶液または緩衝液と多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とを混和し、組成物に対し２から１５重量％の塩化亜鉛水溶液を添加、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末とPLA-PEG-PLAの２０(W/V)％アセトン水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２６】
又、本発明のたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物の製造方法は、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と２から５重量％の塩化亜鉛水溶液とを混和し、攪拌後、該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％のたんぱく性薬物を含有するpＨ４．０から６．９の弱酸性水溶液または緩衝液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥して得られた粉末とPLA-PEG-PLAの２０(W/V)％アセトン水溶液または懸濁液とを混和し、攪拌後、凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末とすることからなる。
【００２７】
しかしながら、一般的には次のような操作からなる。多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を該多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着重量の４０から８０重量％のたんぱく性薬物を含む弱酸性溶液（好ましくはpHが３から７、より好ましくは４．０から６．９）と混和し、攪拌し、該たんぱく性薬物を吸着させ、遠心分離などによりたんぱく性薬物が吸着した該ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子を分取する。さらに、分取したたんぱく性薬物吸着該ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子と必要であれば２価金属化合物水溶液を混和、攪拌し、たんぱく性薬物を吸着した該ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子に2価金属化合物水溶液を浸潤させる。次いで、ろ過により得た沈殿部分を真空乾燥または凍結乾燥してたんぱく性薬物含有の粉末微粒子を得る。この粉末微粒子と必要であれば水親和性生体内消失性高分子化合物の水溶液または懸濁液または水混和性溶媒（例えば、アセトン、エタノールなど）を含む溶液とを混和し、攪拌後、必要に応じて安定化剤を加えて凍結乾燥または真空乾燥することによって粉末として製造する。
【００２８】
実際に投与するときには、この粉末微粒子を適当な分散媒中に分散させて皮下または筋肉内などに注射投与する。最終的に得られた徐放性微粒子組成物の粒子径は、通常の投与に用いられる注射針を通過すればよい。実際には注射針は、細いほど患者の恐怖心は小さいので、注射針の太さを表す国際基準で２５Gより細い針を通過することが好ましい。これらを満足する徐放性微粒子の平均粒子径は、０．５〜５０μmである。また、たんぱく性薬物の徐放期間は、薬物の種類にもよるが、一般的には１週間以上が好ましい。
【発明の効果】
【００２９】
本発明により、初期放出量を低減し、薬物の有効濃度をより長期間持続でき、たんぱく性薬物の変性がなく、かつ、投与局所の炎症を極力抑えた好ましい徐放性を有するたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物およびその製造方法を提供することが出来た。すなわち、多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子に薬物を封入する工程において多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子に飽和吸着（最大吸着）されるたんぱく性薬物量の３０〜９０％、より好ましくは４０〜８０重量％、に相当する量の薬物を含む弱酸性水溶液または緩衝液（好ましくはpH＝３〜７、さらに好ましくは４．０〜６．９）と多孔性ヒドロキシアパタイト誘導体微粒子とを混和させ、亜鉛化合物水溶液、水親和性高分子化合物で処理することによりたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物を得ることを特徴とする新しい方法を見出した。なお、上記の製造工程中で予め水溶性２価金属化合物を多孔性ハイドロキシアパタイト誘導体微粒子に吸着させた後、該多孔性ハイドロキシアパタイト誘導体微粒子のたんぱく性薬物飽和吸着量の４０〜８０重量％を含有する弱酸性溶液または緩衝液とを混和し、その後、水親和性高分子化合物で処理してもよい。
【００３０】
本発明により得られたたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物は、たんぱく性薬物を少なくとも７日以上にわたり徐放し、初期の過剰放出が小さく、皮下投与２日目以降の血中濃度がたんぱく性薬物を飽和吸着させた徐放性微粒子組成物に比べて２倍〜１０倍高く保たれることおよびこれらの組成物を投与した場合、従来技術により作製した製剤に比べて水溶性2価金属化合物の配合量を３分の1程度まで少なくしても過剰放出は小さく、徐放性も十分に維持でき、これによって金属化合物による投与局所傷害をなくすことができることを見出した。また、得られた組成物は、２５Gまたは２７Gの注射針を通過した。最終的に凍結乾燥することで徐放化した微粒子製剤に調製でき、封入されたたんぱく性薬物も非常に安定していた。
【実施例】
【００３１】
以下に実施例により得られたたんぱく性薬物含有徐放性微粒子組成物を対照組成物と比較したin vitroおよびin vivoの徐放性試験結果を示すが、この例に限定されるものではない。
【００３２】
[試験例１]
蓋付プラスチック容器に４００℃で焼成したヒドロキシアパタイト誘導体微粒子（HAp-Zn-0.5、カルシウム１０原子のうち０．５原子を亜鉛原子に置換した誘導体、以下同様)１００mgをはかりとり、これとPD-10カラム（Amersham Pharmacia）を用いて脱塩処理して調製したヒト成長ホルモン（hGH）水溶液（１０．０７mg/mＬ）２．１８mL、精製水２．２２mLおよび１００mM酢酸アンモニウム緩衝液１．１０mLからなる混液５mLとを混和し、5分間攪拌した後、３，０００rpmで３分間遠心処理し、得られた沈殿に精製水１０mLを加えて１分間攪拌したのち、３，０００rpmで３分間遠心処理した。得られた沈殿と２０mg/mL塩化亜鉛水溶液（和光純薬、大阪）０．６８mL（塩化亜鉛は、HAp-Zn-0.5 １００ mgに対して１００μモルに相当）とを混和し、タッチミキサーで１分間攪拌した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥粉末とPLA-PEG-PLAの２０（W/V）％アセトン水溶液０．５mLとを混和し、タッチミキサーでよく攪拌した後、凍結乾燥した。なお、PLA-PEG-PLAは、分子量１１，４００、PEG比４５．６モル%のものを用いた。得られたhGH含有微粒子組成物のhGH含量をMicro BCA Protein Assay kit（Pierce）により定量したところhGHの吸着量は、２１．３mg（飽和吸着量の６３％）、該組成物中のhGH含量は、１３％であった。
対照製剤としてhGH溶液（１０．０７mg/mL）３．８mL、精製水０．６mLおよび１００mM酢酸アンモニウム緩衝液１．１０mLからなる混液５mLを用いて上記徐放性微粒子組成物と同様の方法で調製し、最終工程の凍結乾燥工程を経て、hGH含有徐放性微粒子組成物を作製した。hGHの吸着量は、３３．９mg（飽和吸着量）、該組成物中のhGH含量は、１９％であった。
【００３３】
作製したhGH含有徐放性微粒子組成物のin vitroにおける放出性を比較した。得られた各hGH含有徐放性微粒子組成物サンプル２．５mgを精秤し、これに水を０．２５mL添加し、８，０００rpmで３分間遠心処理し、沈殿に１/１０リン酸緩衝生理食塩水（PBS）０．２５mLを添加し、３７℃でインキュベート後、経時的に上清を回収し、ゲルろ過HPLC（TOSO G2000SW-xl）により上清中に放出されたhGH量を定量し、溶出率を算出した。この結果を表１に示す。飽和吸着量の６３％含有組成物の溶出率は、対照として作製した飽和吸着組成物に比べてPBS中へのhGH溶出が抑制されていた。
【００３４】
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【００３５】
作製したhGH含有徐放性微粒子組成物を０．５％CMC-Na、０．１％Tween80で懸濁し、タクロリムス(アステラス製薬、東京)投与により免疫抑制を施した各群4匹の雄性SD系ラットの背部皮下に１０．５mg/kg（３０IU/kg）投与した。なお、タクロリムスは、あらかじめ製剤投与３日前と前日に０．１mg/ラット、製剤投与開始後１日おきに０．１mg/ラットの投与量を背部皮下に投与した。
該組成物投与後、４，８、１２時間、以後１または２日ごとに尾静脈から採血し、hGHの血中濃度を全自動EIA装置AIA-６００II（東ソー株式会社）でEテスト「TOSOH」II（HGH）を用いて測定した。この結果および特許文献３実施例４の既技術により作製したhGH含有徐放性微粒子組成物（対照２組成物、hGHは飽和吸着量）のラット血中hGH濃度の成績を表２に示す。
飽和吸着量の６３％含有組成物は、塩化亜鉛が多孔性ハイドロキシアパタイト誘導体微粒子重量の１３．６重量％（対照２組成物の１／3）であるにもかかわらず、塩化亜鉛量は同量ではあるが、吸着量が飽和状態である対照１組成物に比べて投与初期の過剰放出が抑制され、投与３日目以降の血中濃度推移も塩化亜鉛量が４０．８重量％である対照２組成物と同様に良好で、好ましい徐放性を示した。
【００３６】
一方、投与局所の状態については、飽和吸着量の６３％含有組成物および対照１組成物は、いずれも塩化亜鉛量が対照２組成物より少ないため、外見上傷害は認められなかったが、対照２組成物では3倍量の塩化亜鉛が存在するため投与した全ての投与部位に弱い炎症が観察された。
なお、参考までに表２の血中濃度推移を図示する（表３）。
【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
[試験例２]
蓋付プラスチック容器に４００℃で焼成したヒドロキシアパタイト誘導体微粒子（HAp-Zn-0.5)２００mgをはかりとり、これとPD-10カラム（Amersham Pharmacia）を用いて脱塩処理して調製したインターフェロン-α（IFN-α）２０mM酢酸アンモニウム水溶液（１mg/mＬ）３０mLとを混和し、5分間攪拌した後、３，０００rpmで３分間遠心処理した。得られた沈殿と精製水１０mLとを混和して１分間攪拌したのち、３，０００rpmで３分間遠心処理した。分取した沈殿と２０．４mg/mL塩化亜鉛水溶液(和光純薬、大阪）１．３４mL（塩化亜鉛は、HAp-Zn-0.5 １００ mgに対して１００μモルに相当）とを混和し、タッチミキサーで１分間攪拌した後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥粉末とPLA-PEG-PLAの２０（W/V）％アセトン水溶液１mLとを混和し、タッチミキサーでよく攪拌した後、凍結乾燥して粉末状のサンプル１組成物を得た。なお、PLA-PEG-PLAは、分子量１１，４００、PEG比４５．６モル％のものを用いた。得られたIFN-α含有微粒子組成物中のIFN-α含量をMicro BCA Protein Assay kit（Pierce）により定量したところ、この組成物のIFN-αの吸着量は、１４．５mg（飽和吸着量の７２％）であり、該組成物中のIFN-α含量は、８．９％であった。
【００４０】
同様に調製したIFN-α２０mM酢酸アンモニウム水溶液（１mg/mＬ）２０mLを用いて、サンプル１組成物と同様に処理、作製し、粉末状の組成物サンプル２組成物を得た。得られた組成物のIFN-α吸着量は、９．９mg（飽和吸着量の４９％）であり、該組成物中のIFN-α含量は、６．２％であった。
【００４１】
対照として蓋付プラスチック容器に４００℃で焼成したHAp-Zn-0.5 １５０mgをはかりとり、これとIFN-α２０mM酢酸アンモニウム水溶液（１mg/mL）３７．５mLとを混和して同様に処理して粉末を得た。これとPLA-PEG-PLAの２０（W/V）％アセトン水溶液０．７５mLとを混和して以後同様に処理して粉末状のサンプル３組成物を作製した。この組成物のIFN-αの吸着量は、飽和吸着状態である２０mgであり、該組成物中のIFN-α含量は、１２．４％であった。
【００４２】
作製した各IFN-α含有徐放性微粒子組成物を０．５％CMC-Na、０．１％Tween80で懸濁し、タクロリムス(アステラス製薬、東京)投与により免疫抑制を施した各群4匹の雄性SD系ラットの背部皮下に１２mg/kgを投与した。なお、タクロリムスは、該組成物投与３日前と前日に０．１mg/ラット、該組成物投与開始後１日おきに０．１mg/ラットを背部皮下に投与した。
該組成物投与後、４、８、１２時間経過時、以後１または２日ごとに尾静脈から採血し、IFN-αの血中濃度をELISA法により測定した。この結果を表４に示す。飽和吸着量の７２％あるいは４９％含有組成物は、吸着量が飽和状態にある対照に比べて投与初期過剰放出が低値で、投与2日目以降の血中IFN-α濃度は、高値で持続し、より好ましい徐放性を示した。
なお、参考までに表４の血中濃度推移を図示する（表５）。
【００４３】
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【００４４】
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