(57)【要約】【課題】ポンプを用いずに無菌状態で培養細胞液をサンプリングできると共にサンプリング時にサンプル採取管内に培養細胞液が残ることがない培養細胞サンプリング方法及びその装置を提供する。【解決手段】細胞培養中の培養容器１０内の培養細胞液１２を複数のサンプル容器２０にサンプリングするに際し、培養容器１０内にサンプル採取管２２をその培養細胞液１２に臨むように設けると共にサンプル採取管２２の他端をサンプリングすべきサンプル容器２０内に臨ませて設け、その培養細胞液１２内に酸素含有ガス１３を供給して培養容器１０内を加圧して培養細胞液１２をサンプル採取管２２を通してサンプル容器２０に移送し、サンプリング終了後に、培養容器１０内の圧力を減圧してサンプル採取管２２内に残った培養細胞液１２を培養容器１０内に回収する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養中の培養容器内の培養細胞液を複数のサンプル容器にサンプリングする培養細胞サンプリング方法において、培養容器内にサンプル採取管をその培養細胞液に臨むように設けると共にサンプル採取管の他端をサンプリングすべきサンプル容器内に臨ませて設け、その培養細胞液内に酸素含有ガスを供給して培養容器内を加圧して培養細胞液をサンプル採取管を通してサンプル容器に移送し、サンプリング終了後に、培養容器内の圧力を減圧してサンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収することを特徴とする培養細胞サンプリング方法。
【請求項２】
サンプル採取管には、サンプル容器毎に分岐管が接続され、その分岐管を開閉してサンプリングすべきサンプル容器に培養細胞液を移送する請求項１記載の培養細胞サンプリング方法。
【請求項３】
培養容器内には、供給された酸素含有ガス等を排気する主ベントラインが設けられ、サンプリングすべきサンプル容器には、その容器内を排気する副ベントラインが接続され、サンプリング時に、主ベントラインを閉じて培養容器を加圧し、サンプル採取管を通してサンプル容器内に培養細胞液を移送すると共に、培養細胞液を受け入れるべく副ベントラインからサンプル容器内の空気を排気する請求項１又は２記載の培養細胞サンプリング方法。
【請求項４】
主ベントラインと副ベントラインとが連通ラインで接続され、培養容器の培養細胞液の液面に対して、サンプル容器内のサンプル採取管の下端が高く保持され、サンプリング終了時に連通ラインを開いて培養容器内とサンプル容器内を均圧にしてサンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収する請求項３記載の培養細胞サンプリング方法。
【請求項５】
細胞培養中の培養容器内の培養細胞液を複数のサンプル容器にサンプリングする培養細胞サンプリング装置において、培養細胞液を収容する培養容器と、培養容器内の培養細胞液をサンプリングするための複数のサンプル容器と、培養容器内の培養細胞液内に酸素含有ガスを供給する酸素含有供給ラインと、一端が培養容器内の培養細胞液に臨むように設けられ、他端がサンプリングすべきサンプル容器内に臨ませて設けられるサンプル採取管と、培養容器に接続され、培養容器内に供給された酸素含有ガスを排気する主ベントラインと、主ベントラインに接続され、サンプリング時に主ベントラインを閉じて、培養容器内を酸素含有ガスで加圧して培養細胞液をサンプル採取管を通してサンプル容器に移送し、サンプリング終了後に、主ベントラインを開いて、培養容器内の酸素含有ガスを排気して培養容器内の圧力を減圧し、サンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収するための主ベントバルブとを備えたことを特徴とする培養細胞サンプリング装置。
【請求項６】
サンプル採取管には、サンプル容器毎に分岐管が接続され、その分岐管に培養細胞液をサンプル容器に移送するためのサンプリングバルブが接続される請求項５記載の培養細胞サンプリング装置。
【請求項７】
サンプル容器には、その容器内を排気する副ベントラインが接続され、その副ベントラインには、サンプリング時にサンプル容器内の空気を排気して培養細胞液を受け入れるための副ベントバルブが接続される請求項５又は６記載の培養細胞サンプリング装置。
【請求項８】
主ベントラインと副ベントラインとが連通ラインで接続され、培養容器の培養細胞液の液面に対して、サンプル容器内のサンプル採取管の下端を高く保持する昇降装置が設けられ、連通ラインには、サンプリング終了時に連通ラインを開いて培養容器内とサンプル容器内を均圧にする連通バルブが接続される請求項７記載の培養細胞サンプリング装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養容器内で細胞培養中の培養液を無菌状態でサンプリングするための培養細胞サンプリング方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞を培養する場合には、滅菌したスピナーフラスコ等の培養容器に滅菌した培地を入れて、これに細胞の種液を投入して、一定時間無菌で保持しながら培養する。
【０００３】
培養試験期間中、適宜培養細胞液をサンプリングし、細胞数測定や培地成分濃度分析などを行う必要がある。
【０００４】
これまでは、スピナーフラスコ等の培養容器をクリーンベンチ内に運び、培養容器の蓋を開けて、滅菌済みピペットで培地をサンプリングしていた。
【０００５】
しかし、大容量のスピナーフラスコ等の培養容器に培地を入れた場合、重量が重くなり、クリーンベンチへの持ち運びが不便であった。またクリーンベンチ内であっても、培養容器の蓋を開けてピペットを容器に入れる作業は、容器中に微生物を混入させる危険性が高かった。
【０００６】
このため、特許文献１〜３に示されるように、培養容器内の培養細胞液をポンプにて吸い込み、これをサンプリング容器に移送して、無菌状態でサンプリングする装置が提案されている。
【０００７】
【特許文献１】特開昭６４−８０２７９号公報
【特許文献２】特公平７−３４７３７号公報
【特許文献３】特開平１０−２６７８０４号公報
【特許文献４】特開２００４−２０８６６４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、培養細胞液をポンプで移送したのでは、培養細胞液中の細胞がポンプでダメージを受けやすく、真の状態の細胞のサンプリングとはいえない問題がある。
【０００９】
また培養容器からサンプリング容器間のサンプル採取管内には、培養細胞液が、そのまま残ることとなり、サンプリングを数日にわたって行う場合には、次回のサンプリングの際に、サンプル採取管内に残存した培養細胞液がそのままサンプリング容器に流れ込むこととなり、サンプリング時点での培養容器内の培養細胞液をそのまま採取できない問題もある。
【００１０】
そこで、本発明の目的は、上記課題を解決し、ポンプを用いずに無菌状態で培養細胞液をサンプリングできると共にサンプリング時にサンプル採取管内に培養細胞液が残ることがない培養細胞サンプリング方法及びその装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために請求項１の発明は、細胞培養中の培養容器内の培養細胞液を複数のサンプル容器にサンプリングする培養細胞サンプリング方法において、培養容器内にサンプル採取管をその培養細胞液に臨むように設けると共にサンプル採取管の他端をサンプリングすべきサンプル容器内に臨ませて設け、その培養細胞液内に酸素含有ガスを供給して培養容器内を加圧して培養細胞液をサンプル採取管を通してサンプル容器に移送し、サンプリング終了後に、培養容器内の圧力を減圧してサンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収することを特徴とする培養細胞サンプリング方法である。
【００１２】
請求項２の発明は、サンプル採取管には、サンプル容器毎に分岐管が接続され、その分岐管を開閉してサンプリングすべきサンプル容器に培養細胞液を移送する請求項１記載の培養細胞サンプリング方法である。
【００１３】
請求項３の発明は、培養容器内には、供給された酸素含有ガス等を排気する主ベントラインが設けられ、サンプリングすべきサンプル容器には、その容器内を排気する副ベントラインが接続され、サンプリング時に、主ベントラインを閉じて培養容器を加圧し、サンプル採取管を通してサンプル容器内に培養細胞液を移送すると共に、培養細胞液を受け入れるべく副ベントラインからサンプル容器内の空気を排気する請求項１又は２記載の培養細胞サンプリング方法である。
【００１４】
請求項４の発明は、主ベントラインと副ベントラインとが連通ラインで接続され、培養容器の培養細胞液の液面に対して、サンプル容器内のサンプル採取管の下端が高く保持され、サンプリング終了時に連通ラインを開いて培養容器内とサンプル容器内を均圧にしてサンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収する請求項３記載の培養細胞サンプリング方法である。
【００１５】
請求項５の発明は、細胞培養中の培養容器内の培養細胞液を複数のサンプル容器にサンプリングする培養細胞サンプリング装置において、培養細胞液を収容する培養容器と、培養容器内の培養細胞液をサンプリングするための複数のサンプル容器と、培養容器内の培養細胞液内に酸素含有ガスを供給する酸素含有供給ラインと、一端が培養容器内の培養細胞液に臨むように設けられ、他端がサンプリングすべきサンプル容器内に臨ませて設けられるサンプル採取管と、培養容器に接続され、培養容器内に供給された酸素含有ガスを排気する主ベントラインと、主ベントラインに接続され、サンプリング時に主ベントラインを閉じて、培養容器内を酸素供給ガスで加圧して培養細胞液をサンプル採取管を通してサンプル容器に移送し、サンプリング終了後に、主ベントラインを開いて、培養容器内の酸素含有ガスを排気して培養容器内の圧力を減圧し、サンプル採取管内に残った培養細胞液を培養容器内に回収するための主ベントバルブとを備えたことを特徴とする培養細胞サンプリング装置である。
【００１６】
請求項６の発明は、サンプル採取管には、サンプル容器毎に分岐管が接続され、その分岐管に培養細胞液をサンプル容器に移送するためのサンプリングバルブが接続される請求項５記載の培養細胞サンプリング装置である。
【００１７】
請求項７の発明は、サンプル容器には、その容器内を排気する副ベントラインが接続され、その副ベントラインには、サンプリング時にサンプル容器内の空気を排気して培養細胞液を受け入れるための副ベントバルブが接続される請求項５又は６記載の培養細胞サンプリング装置である。
【００１８】
請求項８の発明は、主ベントラインと副ベントラインとが連通ラインで接続され、培養容器の培養細胞液の液面に対して、サンプル容器内のサンプル採取管の下端を高く保持する昇降装置が設けられ、連通ラインには、サンプリング終了時に連通ラインを開いて培養容器内とサンプル容器内を均圧する連通バルブが接続される請求項７記載の培養細胞サンプリング装置である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、ポンプを用いずに細胞にダメージを与えずにサンプリングできると共に、サンプリング後にサンプル採取管に残った培養細胞液を培養容器に回収することができるという優れた効果を発揮するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な一実施の形態を添付図面に基づいて詳述する。
【００２１】
図１において、１０はスピナーフラスコ（１０Ｌ）等の培養容器で、上部に開閉用の蓋１１を有し、その中に細胞の種液を投入した培養細胞液１２が収容されている。
【００２２】
この培養容器１０には、細胞培養のための酸素含有ガス１３を供給する酸素含有ガス供給ライン１４が、蓋１１を通して培養容器１０の底部に臨むように設けられる。酸素含有ガス供給ライン１４には、減菌フィルタ１５が接続され、培養細胞液１２中に吹き込む酸素含有ガス１３中に微生物やゴミなどが混入しないようにされる。
【００２３】
培養容器１０には、蓋１１を挿通して設けた主ベントライン１６が設けられ、その主ベントライン１６に減菌フィルタ１７、主ベントバルブＶ０が接続され、培養容器１０内の培養細胞液１２に吹き込まれた酸素含有ガス等を主ベントライン１６を通して排気できるようになっている。
【００２４】
サンプル容器２０−１〜２０−６は、ジャッキやテーブルリフタなどの昇降装置３０上に保持され、昇降装置３０にて高さ調整自在にされる。
【００２５】
培養容器１０とサンプル容器２０−１〜２０−６とは、可撓性のあるサンプル採取管２２にて接続される。サンプル採取管２２の培養容器１０側の端部２２ａは、蓋１１を通して培養細胞液１２中に臨むように設けられ、サンプル容器２０側は、その容器毎に分岐管Ｌ１〜Ｌ６が接続されると共に各分岐管Ｌ１〜Ｌ６にサンプリングバルブＶ１〜Ｖ６が接続される。
【００２６】
各分岐管Ｌ１〜Ｌ６の下端は、サンプル容器２０−１〜２０−６の蓋２１−１〜２１−６を挿通してサンプル容器２０−１〜２０−６内に臨むように設けられる。この各分岐管Ｌ１〜Ｌ６の下端は、培養容器１０の培養細胞液１２の液面１２Ｌよりも高くなる位置に保持される。
【００２７】
また各サンプル容器２０−１〜２０−６の蓋２１−１〜２１−６には、ベント用の無菌フィルタ２３−１〜２３−６が設けられ、その無菌フィルタ２３−１〜２３−６に可撓性のある副ベントライン２４が任意に接続できるようになっている。
【００２８】
副ベントライン２４と培養容器１０の減菌フィルタ１７の上流側（培養容器側）のベントライン１６とは可撓性のある連通ライン２５で接続され、その連通ライン２５に連通バルブＶ７が接続され、連通ライン２５の接続部の下流側の副ベントライン２４に副ベントバルブＶ８が接続される。
【００２９】
以上において、細胞培養中は、主ベントバルブＶ０を除いて、他のバルブＶ１〜Ｖ８は閉じられ、その状態で、酸素含有ガス１３が培養容器１０に供給されて細胞培養がなされ、余剰の酸素含有ガスや代謝ガスが主ベントライン１６を通して排気される。この際、培養容器１０内は、コンタミネーション防止のために大気圧に対してやや陽圧となるように主ベントライン１６の主ベントバルブＶ０の開度が設定されている。
【００３０】
次に、このサンプリング装置によるサンプリング方法を説明する。
【００３１】
本発明では、培養細胞液１２のサンプリングを、培養容器１０が設置された、その場で、閉鎖系で行えるようになっており、主ベントライン１６、サンプル容器２０、ベントライン１６の主ベントバルブＶ０の開閉により、培養容器１０内が加圧・減圧され、培養細胞液１２のサンプル容器２０への採取と、サンプル採取管２２内に残存した培養細胞液１２の培養容器１０への返送を行うようにしたものである。
【００３２】
予め、サンプル採取管２２、サンプル容器２０−１〜２０−６、主ベントライン１６は、培養容器１０に繋いだままとし、全体をオートクレーブ滅菌することにより、サンプリングライン中は全て無菌の状態になる。
【００３３】
各サンプリング容器２０−１〜２０−６にはサンプリングバルブＶ１〜Ｖ６を付けているため、その開閉により無菌でサンプリングできる。サンプル容器２０−１〜２０−６を取り外しても、サンプリングバルブＶ１〜Ｖ６が閉じているため、培養容器１０側に微生物が混入することはない。
【００３４】
サンプリング時は、ポンプを用いず、サンプル採取するサンプリング容器２０−１〜２０−６のサンプリングバルブＶ１〜Ｖ６を開き、主ベントライン１６の主ベントバルブＶ０を閉じることにより、培養容器１０内が加圧され、培養細胞液１２をサンプリング容器２０−１〜２０−６に回収する。これにより、細胞がポンプで潰されることなく、ポンプを用いて採取するよりも、真の状態の細胞をサンプリングすることができる。
【００３５】
サンプリング終了時は、主ベントライン１６の主ベントバルブＶ０を開け、サンプル容器２０−１〜２０−６のサンプリングバルブＶ１〜Ｖ６を開け、採取後は、サンプル容器２０−１〜２０−６のサンプリングバルブＶ１〜Ｖ６を閉じてサンプル容器２０−１〜２０−６を取り外すことにより、サンプリングライン中は無菌を保つことができる。
【００３６】
このサンプリングを更に詳しく説明する。
【００３７】
先ず、サンプル容器２０−１〜２０−６内のサンプル採取管２２の分岐管Ｌ１〜Ｌ６の下端が、培養容器１０の液面１２Ｌより上方になるように昇降装置３０にて保持させる。
【００３８】
培養１回目の培養細胞液１２をサンプリング容器２０−１にサンプリングする際には、副ベントライン２４を、図示のようにサンプリング容器２０−１の無菌フィルタ２３−１に接続し、分岐管Ｌ２〜Ｌ６のサンプリングバルブＶ２〜Ｖ６を閉じてサンプリングバルブＶ１を開いた後、主ベントライン１６の主ベントバルブＶ０と連通ライン２５の連通バルブＶ７を閉じ、副ベントライン２４の副ベントバルブＶ８を開く。
【００３９】
これにより、培養容器１０に酸素含有ガスライン１４から吹き込まれた酸素含有ガス１３により、培養容器１０内が加圧されるため、培養細胞液１２は、サンプル採取管２２を通り、サンプリングバルブＶ１の開いている分岐管Ｌ１を通ってサンプリング容器２０−１に流れ込み、そのサンプル容器２０−１に流れ込んだ培養細胞液１２と等量の空気が副ベントライン２４から排気されて、１回目のサンプルを適量採取する。
【００４０】
なお、サンプリング容器２０−１に流れ込む培養細胞液１２の流量は、培養容器１０内に吹き込まれる酸素含有ガスによる加圧程度により決まるが、昇降装置３０にて、培養細胞液１２の液面１２Ｌに対するサンプリング容器２０−１の高さ、すなわち分岐管Ｌ１の下端の高さを調整することで更に調整することができる。この場合、分岐管Ｌ１の下端の高さを液面１２Ｌより低くすることでサイフォン現象を利用してサンプリングすることもでき、過剰に酸素含有ガス１３を培養容器１０内に吹き込む必要がない。
【００４１】
サンプル採取後は、副ベントバルブＶ８及び主ベントバルブＶ０を開けて連通バルブＶ７を閉じ、培養容器１０とサンプル容器２０−１の内圧を連通ライン２５にて均一にさせる。これにより、分岐管Ｌ１の下端は、培養容器１０の液面１２Ｌより高い位置に保持することで、分岐管Ｌ１を含むサンプル採取管２２中に残存した培養細胞液１２は、培養容器１０に返送される。
【００４２】
この後、副ベントライン２４の副ベントバルブＶ８を開けた後、分岐管Ｌ１のサンプリングバルブＶ１を閉じて採取したサンプル容器２０−１を分岐管Ｌ１から取り外すと共に副ベントライン２４も無菌フィルタ２３−１から取り外す。
【００４３】
次の２回目のサンプリングの際には、副ベントライン２４を次回のサンプル容器２０−２の無菌フィルタ２３−２に取り付け、その状態で、以後、同様な操作をサンプリングバルブＶ２〜Ｖ６についても行う。
【００４４】
これにより、このシステムでは６回無菌でサンプリングすることができる。また、サンプル容器２０と分岐管ＬのサンプリングバルブＶを増やすことにより、長期培養時でもサンプリングを行うことが可能である。
【００４５】
また数次のサンプリングにより、培養容器１０内の培養細胞液１２の液面１２Ｌが下がってきたならば、昇降装置３０にてサンプル容器２０の高さを調整することで、培養容器１０内の培養細胞液１２を常に同じ条件でサンプリングすることができる。
【００４６】
培養容器１０は、コンタミネーション防止のため、加圧されている場合が多いため、培養容器１０の主ベントライン１６を閉じることで、培養細胞液１２をサンプル採取管２２を通して移送できる圧力を得ることが可能であり、また圧力差を利用して移送することで、培養細胞液１２にダメージを与えることもない。また、サンプリング終了時に、サンプル採取管２２内に残った培養細胞液１２も培養容器１０内の圧力を培養時に戻すことで、培養容器１０内に容易に回収することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施の形態を示す図である。
【符号の説明】
【００４８】
１０  培養容器
１２  培養細胞液
１３  酸素含有ガス
２０  サンプル容器
２２  サンプル採取管
【図１】
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