(57)【要約】【課題】漢方薬・生薬の成分の類縁体である抗腫瘍性の成分を提供する。【解決手段】下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）2008094815.tif 000021で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤。【選択図】図１
2008094815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化１】
2008094815.tif 000014
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤であって、
前記一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、
Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、
Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ５は、−Ｈ基、−ＯＨ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基であり、
Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化２】
2008094815.tif 000015
で示す構造単位である、
抗テロメレース剤。
【請求項２】
請求項１記載の抗テロメレース剤において、
前記複素環化合物は、下記一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）
【化３】
2008094815.tif 000016
からなる群から選ばれる１種以上の複素環化合物である、
抗テロメレース剤。
【請求項３】
請求項１または２記載の抗テロメレース剤において、
前記複素環化合物は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出されるマグノフロリンである、
抗テロメレース剤。
【請求項４】
請求項１または２記載の抗テロメレース剤において、
前記複素環化合物は、駒草から抽出されるディセントリンである、
抗テロメレース剤。
【請求項５】
請求項１乃至４いずれかに記載の抗テロメレース剤において、
前記抗テロメレース剤の有効投与量は、１〜１×１０３ｎＭの範囲内である、
抗テロメレース剤。
【請求項６】
下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化４】
2008094815.tif 000017
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤であって、
前記一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、
Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、
Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、
Ｘ５は、−Ｈ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基であり、
Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化５】
2008094815.tif 000018
で示す構造単位である、
抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項６記載の抗腫瘍剤において、
前記複素環化合物は、下記一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）、一般式（ＩＸ）、一般式（Ｘ）、一般式（ＸＩ）
【化６】
2008094815.tif 000019
【化７】
2008094815.tif 000020
からなる群から選ばれる１種以上の複素環化合物である、
抗腫瘍剤。
【請求項８】
請求項６または７記載の抗腫瘍剤において、
前記複素環化合物は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出されるマグノフロリンである、
抗腫瘍剤。
【請求項９】
請求項６または７記載の抗腫瘍剤において、
前記複素環化合物は、駒草から抽出されるディセントリンである、
抗腫瘍剤。
【請求項１０】
請求項６乃至９いずれかに記載の抗腫瘍剤において、
前記抗腫瘍剤の有効投与量は、１〜１×１０３ｎＭの範囲内である、
抗腫瘍剤。
【請求項１１】
天然物由来の抗テロメレース剤であって、
防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、
抗テロメレース剤。
【請求項１２】
天然物由来の抗腫瘍剤であって、
防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、
抗腫瘍剤。
【請求項１３】
天然物由来の抗テロメレース剤であって、
駒草からエーテル抽出される成分を含む、
抗テロメレース剤。
【請求項１４】
天然物由来の抗腫瘍剤であって、
駒草からエーテル抽出される成分を含む、
抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗テロメレース剤または抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんに対する化学療法は１９４０年代に窒素マスタード剤（アルキル化剤）と坑葉酸剤（代謝拮抗剤）に始まり、今日では抗がん剤市場は数兆円規模の市場に成長している。
【０００３】
がんはＤＮＡの突然変異による細胞の制御不能の増殖で、場合によっては、ある種の腫瘍を拡大させる傾向は遺伝する。広義には、ほとんどの化学療法剤は細胞分裂を阻害することで、短時間で分裂する細胞を効果的に標的にする。このような薬剤は細胞に障害を与えるので、細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）と書き表される。ある種の薬剤はアポトーシス（事実上の「細胞の自殺」）を引き起こす。
【０００４】
しかしながら、抗がん剤による治療は患者の身体的な拒絶を受けることが多い。現在の化学療法技術では、副作用の範囲は、主に身体の細胞分裂が亢進した細胞にたいして生じる。抗がん剤による重大な副作用としては、例えば、頭髪を失う、吐き気ならびに嘔吐、下痢または便秘、貧血、感染や敗血症を引き起こすほどの免疫系の抑制、出血、二次がん、心毒性、肝毒性、腎毒性などが挙げられる。
【０００５】
そこで、現在、副作用が少ないとされている漢方薬・生薬などの成分から抗腫瘍性の成分を探索する研究が行われている（非特許文献１）。この文献では、中国の伝統的漢方薬「益気養血扶正剤」（オウギ、ジュクジオウ、トウキ、ジュクシャ、タイソウ、ロクジョウの６種類から構成される）には、抗腫瘍効果があり、その作用機構の一つにＮＫ活性の亢進のあることが示唆されている。
【０００６】
一方、塩酸アポモルフィンは１８６９年に初めて催吐剤として使用されて以来、２０世紀前半には精神分裂病患者の鎮静剤として、またアルコール中毒患者や麻薬中毒患者の行動改善薬として使用されてきた。本邦においても日本薬局方初版（１８８６年発令）から第七改正日本薬局方第２部の改正時（１９６６年）までの間、日本薬局方あるいは国民医薬品集中に記載されており、高用量（常用量は５ｍｇ皮下投与、極量は２０ｍｇ皮下投与）で催吐剤、低用量（水剤、０．５〜１ｍｇ／回）で去痰剤として臨床使用されてきた。
【０００７】
塩酸アポモルフィンは１９６７年にはドーパミン作動薬としての効果が認められ、抗パーキンソン病薬として臨床で使用されるようになり、欧州では現在パーキンソン病の治療薬（皮下注射；１．５〜１０ｍｇ／回、２〜８回／日）等として臨床で使用されている（非特許文献２）。
【０００８】
そうした中、慢性アルコール依存症の治療に塩酸アポモルフィンを使用した臨床試験でその勃起効果が初めて報告されて以来、塩酸アポモルフィンが勃起に及ぼす効果について動物レベルで研究されてきた（非特許文献３）。塩酸アポモルフィンはドーパミン（Ｄ１／Ｄ２）受容体作動薬であり、視床下部に存在するＤ２受容体を刺激して視床下部一海馬のオキシトシン経路の活性化、中脳を経て下位勃起中枢（仙髄）を経由し、副交感神経に属する骨盤神経に伝えられる。さらにその刺激は非アドレナリン非コリン作動性神経終末より一酸化窒素（ＮＯ）を遊離させ、陰茎平滑筋でのグアニルサイグレースの活性化により、ｃＧＭＰが増加する。このｃＧＭＰによる陰茎深動脈・螺行動平滑筋の弛緩の結果、海綿体への血液流入が増加し勃起が誘発される。
【０００９】
【非特許文献１】Deng Hong, 中島かおり, Ma Xinling, 蓮見賢一郎, 赤塚俊隆, 和合治久, “中国の伝統的漢方薬「益気養血扶正剤」の抗腫瘍活性と免疫細胞機能に及ぼす影響”, 埼玉医科大学雑誌, 第28巻, 第3号, 平成13年7月, p.109-115
【非特許文献２】Andrew Lees and Kirsten Turner, “Apomorphine for Parkinson’s Disease”, Practical Neurology 2002;2;280-287
【非特許文献３】Heaton JP, Morales A, Adams MA, Johnston B, el-Rashidy R., “Recovery of erectile function by the oral administration of apomorphine.”, Urology. 1995 Feb;45(2):200-6.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上述のように、現在、漢方薬・生薬などの成分から抗腫瘍性の成分を探索する研究が行われている。しかし、漢方薬・生薬は多成分からなり、現在漢方薬・生薬が有効と報告されるＥＢＭも単一成分を検討した結果ではなく、本来の二重盲検の結果としては受け入れられていない。そのため、単一成分として正確に評価されるためには、配糖体から得られる単糖体だけでなくその活性体の同定と腸管吸収および代謝の影響を受けにくいアルカロイドの同定などの研究が不可欠であり、それらの活性作用を明らかにすることが早急に求められている。一方、現在のところ、塩酸アポモルフィンまたはその類縁体について、抗腫瘍性を有する旨の報告はない。
【００１１】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、漢方薬・生薬の成分由来である抗腫瘍性の成分を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、漢方薬・生薬の成分の類縁体である抗腫瘍性の成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明によれば、下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化８】
2008094815.tif 000003
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤が提供される。
【００１３】
ここで、上記の一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ５は、−Ｈ基、−ＯＨ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基である。
【００１４】
また、Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化９】
2008094815.tif 000004
で示す構造単位である。
【００１５】
本発明に係る抗テロメレース剤は、上記のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むため、優れたテロメレース抑制作用を示す。
【００１６】
本発明によれば、下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化１０】
2008094815.tif 000005
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤が提供される。
【００１７】
ここで、上記の一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ５は、−Ｈ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基である。
【００１８】
また、Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化１１】
2008094815.tif 000006
で示す構造単位である。
【００１９】
本発明に係る抗腫瘍剤は、上記のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むため、優れた抗腫瘍作用を示す。
【００２０】
本発明によれば、天然物由来の抗テロメレース剤であって、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、抗テロメレース剤が提供される。
【００２１】
本発明に係る抗テロメレース剤は、上記の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含むため、優れたテロメレース抑制作用を示す。
【００２２】
本発明によれば、天然物由来の抗腫瘍剤であって、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、抗腫瘍剤が提供される。
【００２３】
本発明に係る抗腫瘍剤は、上記の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含むため、優れた抗腫瘍作用を示す。
【００２４】
本発明によれば、天然物由来の抗テロメレース剤であって、駒草からエーテル抽出される成分を含む、抗テロメレース剤が提供される。
【００２５】
本発明に係る抗テロメレース剤は、上記の駒草からエーテル抽出される成分を含むため、優れたテロメレース抑制作用を示す。
【００２６】
本発明によれば、天然物由来の抗腫瘍剤であって、駒草からエーテル抽出される成分を含む、抗腫瘍剤が提供される。
【００２７】
本発明に係る抗腫瘍剤は、上記の駒草からエーテル抽出される成分を含むため、優れた抗腫瘍作用を示す。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係る抗テロメレース剤は、特定のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むか、あるいは特定の天然物から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含むため、優れたテロメレース抑制作用を示す。
【００２９】
本発明に係る抗腫瘍剤は、特定のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むか、あるいは特定の天然物から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含むため、優れた抗腫瘍作用を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００３１】
＜実施形態１：抗テロメレース剤＞
本実施形態に係る抗テロメレース剤は、下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化１２】
2008094815.tif 000007
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤である。
【００３２】
ここで、一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ５は、−Ｈ基、−ＯＨ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基である。
【００３３】
また、Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化１３】
2008094815.tif 000008
で示す構造単位である。
【００３４】
本実施形態に係る抗テロメレース剤は、上記のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むため、優れたテロメレース抑制作用を示す。
【００３５】
本実施形態に係る抗テロメレース剤において、上記の複素環化合物は、下記一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）
【化１４】
2008094815.tif 000009
からなる群から選ばれる１種以上の複素環化合物であることが好ましい。
【００３６】
なぜなら、これらの、一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）で示されるアポモルヒネ類縁体は、後述する実施例において、優れたテロメレース抑制作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００３７】
本実施形態に係る抗テロメレース剤において、上記の複素環化合物は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出されるマグノフロリンであることが好ましい。あるいは、本実施形態に係る抗テロメレース剤は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、天然物由来の抗テロメレース剤であってもよい。
【００３８】
なぜなら、一般式（Ｖ）で示されるマグノフロリンは、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出する抽出方法が確立されており、後述する実施例において、特に優れたテロメレース抑制作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００３９】
本実施形態に係る抗テロメレース剤において、上記の複素環化合物は、駒草から抽出されるディセントリンであることが好ましい。あるいは、本実施形態に係る抗テロメース剤は、駒草からエーテル抽出される成分を含む、天然物由来の抗テロメレース剤であってもよい。
【００４０】
なぜなら、一般式（ＶＩ）で示されるディセントリンは、駒草から抽出する抽出方法が確立されており、後述する実施例において、特に優れたテロメレース抑制作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００４１】
本実施形態に係る抗テロメレース剤において、上記の抗テロメレース剤の有効投与量は、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内であることが好ましく、１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内であることが特に好ましい。
【００４２】
なぜなら、上記の抗テロメレース剤の有効投与量が上述の範囲内であれば、後述する実施例において、特に優れたテロメレース抑制作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００４３】
＜実施形態２：抗腫瘍剤＞
本実施形態に係る抗腫瘍剤は、下記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）
【化１５】
2008094815.tif 000010
で示すアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗腫瘍剤である。
【００４４】
ここで、上記の一般式（Ｉ）および一般式（ＩＩ）中、Ｘ１は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ２は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ３は、−Ｈ基または−ＯＨ基であり、Ｘ４は、−ＯＨ基または−Ｏ−ＣＨ３基であり、Ｘ５は、−Ｈ基、−Ｏ−ＣＨ３基からなる群から選ばれる１種以上の官能基である。
【００４５】
また、Ｙは、下記一般式（ＩＩＩ）または一般式（ＩＶ）
【化１６】
2008094815.tif 000011
で示す構造単位である。
【００４６】
本実施形態に係る抗腫瘍剤は、上記のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含むため、優れた抗腫瘍作用を示す。
【００４７】
本実施形態に係る抗腫瘍剤において、上記の複素環化合物は、下記一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）、一般式（ＩＸ）、一般式（Ｘ）、一般式（ＸＩ）
【化１７】
2008094815.tif 000012
【化１８】
2008094815.tif 000013
からなる群から選ばれる１種以上の複素環化合物であることが好ましい。
【００４８】
なぜなら、これらの、一般式（Ｖ）、一般式（ＶＩ）、一般式（ＶＩＩ）、一般式（ＶＩＩＩ）、一般式（ＩＸ）、一般式（Ｘ）、一般式（ＸＩ）で示されるアポモルヒネ類縁体は、後述する実施例において、優れた抗腫瘍作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００４９】
本実施形態に係る抗腫瘍剤において、上記の複素環化合物は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出されるマグノフロリンであることが好ましい。あるいは、本実施形態に係る抗腫瘍剤は、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から熱水抽出またはエーテル抽出される成分を含む、天然物由来の抗腫瘍剤であってもよい。
【００５０】
なぜなら、一般式（Ｖ）で示されるマグノフロリンは、防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴からなる群より選ばれる１種以上の生薬から抽出する抽出方法が確立されており、後述する実施例において、特に優れた抗腫瘍作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００５１】
本実施形態に係る抗腫瘍剤において、上記の複素環化合物は、駒草から抽出されるディセントリンであることが好ましい。あるいは、本実施形態に係る抗腫瘍剤は、駒草からエーテル抽出される成分を含む、天然物由来の抗腫瘍剤であってもよい。
【００５２】
なぜなら、一般式（ＶＩ）で示されるディセントリンは、駒草から抽出する抽出方法が確立されており、後述する実施例において、特に優れた抗腫瘍作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００５３】
本実施形態に係る抗腫瘍剤において、上記の抗腫瘍剤の有効投与量は、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内であることが好ましく、１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内であることが特に好ましい。
【００５４】
なぜなら、上記の抗腫瘍剤の有効投与量が上述の範囲内であれば、後述する実施例において、特に優れた抗腫瘍作用を示すことが実験データにより実証されているためである。
【００５５】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【００５６】
例えば、上記実施の形態では、抗テロメレース剤または抗腫瘍剤は、単に特定の構造のアポモルフィン骨格を有する複素環化合物またはその塩を含む抗テロメレース剤または抗腫瘍剤としたが、それ以外の生理的に許容しうる一般的に薬剤に含まれる成分を含んでもよい。
【００５７】
また、抗テロメレース剤または抗腫瘍剤は、どのような剤型を有しても良く、例えば、経口剤、貼付剤、点眼剤、点鼻剤、浣腸剤、注射剤などの多様な剤型を好適に取り得る。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５９】
＜本発明の経緯＞
図１は、本発明者がアルカロイド及びテロメレースに注目した理由を説明するための概念図である。本発明者は、アルカロイド及びテロメレースに注目して、抗腫瘍成分を探索した。すなわち、アルカロイド（直接的作用を検討できる）を主成分とする薬での抗腫瘍作用の報告が散見される中、本発明者はアルカロイド類の中に、新規作用機序で薬効を示すと予想される抗テロメレース薬を見出す目的で、後述の実施例で示すように、テロメレース遺伝子発現及び活性の評価を指標にし、検討した。
【００６０】
本発明者が生薬に注目した理由は以下の通りである。すなわち、一般の抗腫瘍薬は、図１左に示すように、その癌抑制作用から、細胞増殖に影響するようなものがほとんどで、正常細胞にも短期に効果が出る。そのため、一般の抗腫瘍剤は、副作用が激しく、長い歴史的な経過の中で、生薬の成分としてはドロップしてきたと考えられる。しかし、抗テロメレース成分であれば、図１右に示すように、正常細胞に対する副作用が比較的マイルドであるため、一般の生薬中に存在していると考えたためである。
【００６１】
一般の抗腫瘍薬は、１週間以内など極めて短期間にアポトーシスの誘導による細胞死により、その効果を判定する（図１左）。一方、抗テロメレース薬は、その阻害程度の強さにもよるが、テロメレース阻害後の約１ヶ月間程度は細胞増殖を続ける。その間にテロメアは短小化し、正常細胞と同様の有限の寿命を有する状態に類似した挙動を示す。従って、図１右のようにアポトーシスに導かれるまでに約２ヶ月程度は要することになる。
【００６２】
上述の考えに基づいて、本発明者は、生薬における抗腫瘍成分を同定するために、アルカロイドに注目して、生薬の抽出液による感受性試験を行い、肝がん細胞の増殖抑制およびテロメレース抑制を共通して誘導するアルカロイドの成分をデータベースから見出した。さらに、本発明者は、この化学物質だけでなく、これと共通の構造を有するいくつかのアルカロイドを検討したところ、さらに強力な抗腫瘍効果を有する成分を同定した。
【００６３】
これまで、本発明者は、一貫して腫瘍分子学、特に癌組織の９０％に発現する酵素テロメレースを主題として研究に取り組んできた。またこの酵素を抑制する遺伝子のクローニングを手掛けてきた。世界に先駆けてその局在を１０番ヒト染色体短腕の一部（１０ｐ１５．３）に同定し、その制御遺伝子の存在を明らかにしてきた。
【００６４】
また、本発明者は、従来からテロメレース抑制薬及び癌抑制薬の研究に着手している。本発明者は、具体的には、この２年間、未知の抗腫瘍性成分及び抗テロメレース成分の同定をアルカロイド及び配糖体について試みてきた。その結果、本発明者は、アルカロイドについては、過去に抗腫瘍性成分として報告がなされたベルベリンの人工合成過程にある物質と、その共通構造体３種類にテロメレース抑制作用があることを、実施例において後述するように明らかにした。また、本発明者は、この計４種類（マグノフロリン、ディセントリン、ミケプレシン、グラウシン）についてはＩＣ５０を算出し、増殖抑制作用やテロメレース発現抑制作用を、分子生物学的手法及び臨床薬理的手法を駆使した作用機序の解析を行い、創薬への具体化を推進している。
【００６５】
＜候補化合物の選定＞
本発明者は、上述の考えに基づいて、生薬のエキス末を煎じたエキス液の肝がん細胞抑制効果について多く検討し、細辛、辛夷、厚朴、防已、黄蓮に肝がん細胞抑制効果を認めた。図２は、抗腫瘍効果を誘導した生薬中エキス液に共通に含まれることを、データベースから見出したアルカロイドの成分を一部抜粋して示す図である。なお、図２には、それぞれの成分の分子量および開発コードなどを併せて示す。
【００６６】
そして、本発明者は、図２に示すように、抗腫瘍効果を誘導した生薬中エキス液に共通に含まれる、データベースから見出したアルカロイドの成分の一部を抜粋して、（＋）−ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ  ＨＣｌ、ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ、（＋）−ｂｏｌｄｉｎｅ、ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ、ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ、ｇｌａｕｃｉｎｅ、Ｂｕｌｂｏｃａｐｎｉｎｅ  ＨＣｌ、ｄｅｈｙｄｒｏｘｙ  ｄｉｈｙｄｒｏｔａｘｉｌａｍｉｎｅ、ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅからなる９種類の抗腫瘍剤の候補化合物を選定した。本発明者は、この中から、後述の実施例で示すように、薬剤感受性試験を行い、抗腫瘍性成分を検討した。
【００６７】
＜実験方法の概要＞
本発明者は、上述の９種類の候補化合物について、薬剤感受性試験を用いて、テロメレース遺伝子の発現および活性をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、テロメレース活性測定および老化誘導検出法、アポトーシス検出法により検討した。
【００６８】
また、本発明者は、これらの９種類のアルカロイドについては、煎じた後、ろ過精製し、細胞株に添加することで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖や遺伝子発現効果を細胞生物学的、分子腫瘍学的、薬理学的に判定した。さらには、本発明者は、有効な制癌効果を認めた薬剤に対し、薬化学的にも成分の同定を試みた。
【００６９】
＜候補化合物の化学構造＞
図３は、テロメレース抑制作用および抗腫瘍作用を示す４種類の候補化合物の化学構造を示す図である。図３（ａ）は、Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ（マグノフロリン、開発コード：Ｔ０５８２７）の化学構造を示す。図３（ｂ）は、Ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ（ディセントリン、開発コード：Ｔ３０６２６）の化学構造を示す。図３（ｃ）は、Ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅ（ミシェプレッシン、開発コード：Ｌ２９１５０）の化学構造を示す。図３（ｄ）は、（＋）−Ｇｌａｕｃｉｎｅ（（＋）−グラウシン、開発コード：Ｔ００８５８）の化学構造を示す。図３（ｅ）は、Ａｐｏｍｏｒｐｈｉｎｅ（アポモルフィン、別名アポモルヒネ）基本骨格の化学構造を示す。これらの４種類の候補化合物は、後述する実施例で示すように、いずれもテロメレース抑制作用および抗腫瘍作用を示した。
【００７０】
図４は、抗腫瘍作用を示す３種類の候補化合物および抗腫瘍作用のポジティブコントロール化合物の化学構造を示す図である。図４（ｆ）は、抗腫瘍作用のポジティブコントロール化合物であるＢｅｒｂｅｒｉｎｅ（ベルベリン）の化学構造を示す。図４（ｇ）は、（＋）−ｂｏｌｄｉｎｅ（（＋）−ボルジン、開発コード：Ｔ２２４３０）の化学構造を示す。図４（ｈ）は、Ｂｕｌｂｏｃａｐｎｉｎｅ  ＨＣｌ（塩酸ブルボカプニン、開発コード：Ｔ２２３９９）の化学構造を示す。図４（ｉ）は、（＋）−ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ−ＨＣｌ（塩酸（＋）−イソコリジン、開発コード：Ｔ１５３９１）の化学構造を示す。これらの３種類の候補化合物および抗腫瘍作用のポジティブコントロール化合物は、いずれも抗腫瘍作用を示したが、ベルベリン以外はテロメレース抑制誘導をしなかった。
【００７１】
＜ヒト肝癌細胞株の形態変化＞
図５は、１ｎＭのマグノフロリンによるヒト肝癌細胞株の形態変化および老化誘導の状態を示す図である。本発明者は、上述のマグノフロリンについて、ヒト肝癌細胞株の形態変化の抑制効果を調べる実験を行った。具体的には、未処理のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓ（ヒト肝癌細胞株）に対して、１ｎＭのマグノフロリンを添加し、形態変化および癌抑制効果を調べた。さらに、ＳｉｇｍａのＳｃｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて染色し、β−ｇａｌ染色による老化誘導の状態を観察した。
【００７２】
その結果、図５（ａ）に示すように、１ｎＭのマグノフロリンを添加して３０日後のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓの形態は、未処理の状態に比べて、明らかな膨化が観察され、β−ｇａｌ染色による老化誘導も観察された。このことから、１ｎＭのマグノフロリンを添加することにより、ＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓに対する抗腫瘍効果が生じていることがわかる。
【００７３】
図６は、１ｎＭのミシェプレッシンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。本発明者は、上述のミシェプレッシンについて、ヒト肝癌細胞株の形態変化の抑制効果を調べる実験を行った。具体的には、未処理のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓ（ヒト肝癌細胞株）に対して、１ｎＭのミシェプレッシンを添加し、形態変化を調べた。
【００７４】
その結果、図６に示すように、１ｎＭのミシェプレッシンを添加して３０日後のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓの形態は、未処理の状態に比べて、明らかな膨化が観察された。このことから、１ｎＭのミシェプレッシンを添加することにより、ＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓに対する抗腫瘍効果が生じていることがわかる。
【００７５】
図７は、１ｎＭの（＋）−グラウシンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。本発明者は、上述の（＋）−グラウシンについて、ヒト肝癌細胞株の形態変化の抑制効果を調べる実験を行った。具体的には、未処理のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓ（ヒト肝癌細胞株）に対して、１ｎＭの（＋）−グラウシンを添加し、形態変化を調べた。
【００７６】
その結果、図７に示すように、１ｎＭの（＋）−グラウシンを添加して３０日後のＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓの形態は、未処理の状態に比べて、明らかな膨化が観察された。このことから、１ｎＭの（＋）−グラウシンを添加することにより、ＨＬＦ  Ｃｅｌｌｓに対する抗腫瘍効果が生じていることがわかる。
【００７７】
図８は、ヒト肝癌細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。本発明者は、薬剤感受性の最適濃度を検討するために、上述の７種類の候補化合物およびネガティブコントロールを添加した場合について、ＭＴＴアッセイによりヒト肝癌細胞株の細胞増殖を調べた。なお、ＭＴＴアッセイによるヒト肝癌細胞株の細胞増殖は、Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅのＭＴＴ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｋｉｔを用いて、マイクロプレートリーダーにより測定した。このグラフの横軸は、添加された候補化合物の濃度（ｎＭ）を示す。このグラフの縦軸は、細胞増殖時の細胞内で産生されるホルマザン色素の発色を吸光度でカウントしたものである。このグラフでは、各化合物添加２日後のＮ数＝６の場合のそれぞれの平均値を示した。
【００７８】
その結果、図８に示すように、７種類の候補化合物のいずれにおいても、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内の添加量で細胞増殖の指標が低く、特に１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内の添加量で細胞増殖の指標が低かった。一方、ネガティブコントロールである、いかなる化合物によっても処理されなかったヒト肝癌細胞株については、細胞増殖の指標は特に変化しない。このことから、７種類の候補化合物のいずれにおいても、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内の添加量で薬剤感受性が向上し、特に１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内の添加量で薬剤感受性が最も高くなることがわかる。
【００７９】
図９は、ヒト肝癌細胞株に対して抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合および添加しない場合の増殖曲線のグラフである。本発明者は、ヒト肝癌細胞株に対して抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合の影響を検討するために、ヒト肝癌細胞株の増殖曲線を調べた。
【００８０】
図９（ａ）は、抗腫瘍剤の候補化合物を添加しない場合、Ｔ０５８２７（マグノフロリン）、Ｔ３０６２６（ディセントリン）、Ｌ２９１５０（ミシェプレッシン）、Ｔ００８５８（（＋）−グラウシン）の４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１ｎＭ添加した場合のヒト肝癌細胞株の細胞増殖曲線のグラフである。このグラフの横軸は、候補化合物添加後の日数を示し、このグラフの縦軸は、細胞数の対数を示す。
【００８１】
図９（ａ）の結果より、Ｔ０５８２７（マグノフロリン）、Ｔ３０６２６（ディセントリン）、Ｌ２９１５０（ミシェプレッシン）、Ｔ００８５８（（＋）−グラウシン）の４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１ｎＭ添加した場合、肝癌細胞株の細胞増殖が抑制されることが明らかである。このことから、これらの４種類の抗腫瘍剤の候補化合物には、抗腫瘍作用があることがわかる。
【００８２】
また、Ｔ０５８２７（マグノフロリン）、Ｔ３０６２６（ディセントリン）、Ｔ００８５８（（＋）−グラウシン）の３種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１ｎＭ添加した場合には、特に細胞増殖の抑制効果が優れている。このことから、これらの３種類の抗腫瘍剤の候補化合物には、特に優れた抗腫瘍作用があることがわかる。
【００８３】
さらに、図９（ｂ）は、抗腫瘍剤の候補化合物無添加の場合のヒト肝癌細胞株の形態を示す図である。図９（ｃ）は、１ｎＭのマグノフロリンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。図９（ｄ）は、１ｎＭのディセントリンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。
【００８４】
これらの図によれば、１ｎＭのマグノフロリン添加により、ヒト肝癌細胞株の明らかな膨化が認められる。このことから、１ｎＭのマグノフロリン添加により、ヒト肝癌細胞株に対する抗腫瘍効果が認められる。また、これらの図によれば、１ｎＭのディセントリン添加により、ヒト肝癌細胞株の明らかな白化（死亡）が認められる。このことから、１ｎＭのディセントリン添加により、ヒト肝癌細胞株に対する抗腫瘍効果が認められる。
【００８５】
図１０は、４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のテロメレース抑制作用を示すグラフである。本発明者は、４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１０Ｍ添加した場合のｈＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡ発現の抑制を調べる実験を行った。この実験は、Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ法でｈＴＥＲＴｍＲＮＡ定量化して行った。より具体的には、ＲｏｃｈｅのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ、ＱＩＡＧＥＮのＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを用いてライトサイクラーで定量した。その際、ＲＮＡコントロールはｈＴＥＲＴｍＲＮＡの１コピー〜１０７コピーを用いて検定線を描き、定量した。
【００８６】
このグラフの横軸は、サンプルの種類を表し、ａｔｔａｃｈｅｄとは支持体に固着した細胞における測定結果を示し、ｆｌｏａｔｉｎｇとは培養液中に剥離した細胞における測定結果を示す。このグラフの縦軸は、ｈＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡのコピー数を示す。
【００８７】
このグラフからわかるように、Ｔ０５８２７（マグノフロリン）、Ｔ３０６２６（ディセントリン）、Ｌ２９１５０（ミシェプレッシン）、Ｔ００８５８（（＋）−グラウシン）の４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１０ｎＭ添加した場合、明らかにｈＴＥＲＴ遺伝子のｍＲＮＡのコピー数が減少している。このことから、これらの抗腫瘍剤の候補化合物をヒト肝癌細胞に１０ｎＭ添加した場合、テロメレース抑制作用が得られることがわかる。
【００８８】
図１１は、ヒト肝癌細胞におけるテロメレース活性アッセイを示す図である。本発明者は、Ｔ０５８２７（マグノフロリン）、Ｔ３０６２６（ディセントリン）、Ｌ２９１５０（ミシェプレッシン）、Ｔ００８５８（（＋）−グラウシン）の４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１０ｎＭ添加した場合のヒト肝癌細胞におけるテロメレース活性アッセイを行った。より具体的には、ＴＯＹＯＢＯ社のＴｅｌｏＣｈａｓｅｒ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ  ｂｙ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて活性を測定した。
【００８９】
この図に示すゲル電気泳動の写真は、そのテロメレース活性アッセイの結果である。この図でＰＣとは、ＨＭｃ−Ｌｉ７  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａを示すものである。この図を見てわかるように、テロメレース活性の抑制作用は、ミシェプレッシン、グラウシン、ディセントリンを１０ｎＭ添加した場合の方が、マグノフロリンを１０ｎＭ添加した場合よりも抑制作用が強かった。しかし、この図を見てわかるように、マグノフロリンでさえ、一般の癌細胞の活性のほぼ１／１０のレベルに抑制されていることを示している。よって、マグノフロリン、ミシェプレッシン、グラウシン、ディセントリンのいずれも、ヒト肝癌細胞に対して強力なテロメレース抑制作用を示すことが明らかである。
【００９０】
図１２は、ヒト肝癌細胞に１ｎＭのディセントリンを添加した場合の老化誘導の状態を示す図である。本発明者は、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭのディセントリンを添加した場合の老化誘導の状態を調べるために、βガラクトシダーゼ染色を行った。図１２（ａ）は、１０ｎＭのディセントリンで処理されたヒト肝癌細胞の３０日後の写真である。図１２（ｂ）は、何の化合物も添加しなかった場合のヒト肝癌細胞の３０日後の写真である。なお、いずれも、Ｓｉｇｍａ社のＳｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて染色した。これらの図を見てわかるように、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭのディセントリンを添加した場合には、明らかに老化誘導が起こっていることがわかる。その結果、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭのディセントリンを添加した場合には、抗腫瘍効果が得られることは明らかである。
【００９１】
図１３は、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のアポトーシス誘導の状態を示すグラフである。本発明者は、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１０ｎＭ添加した場合のアポトーシス誘導について検討するため、キャスペース３活性のアッセイを行った。より具体的には、キャスペース３活性のアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを用いて、マイクロプレートリーダーにより測定した。
【００９２】
なお、このグラフは、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１０Ｍ添加した後１ヶ月後の結果を示している。このグラフの横軸は、添加された候補化合物の種類を示す。このグラフの縦軸は、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔの示すキャスペース３活性の指標（ＲＬＵ）を示す。このグラフで、Ｚ−ＶＡＤとは、ｐａｎｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（パンキャスペース  阻害剤）のことである。これらの図を見てわかるように、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭの４種類の抗腫瘍剤を添加した場合には、明らかにアポトーシス誘導が起こっていることがわかる。その結果、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭの４種類の抗腫瘍剤を添加した場合には、いずれの場合にも、抗腫瘍効果が得られることは明らかである。
【００９３】
図１４は、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のアポトーシス誘導の状態を示すグラフである。本発明者は、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１ｎＭ添加した場合のアポトーシス誘導について検討するため、ＤＮＡフラグメンテーションのアッセイを行った。より具体的には、Ｂｉｏ  ｖｉｓｉｏｎ社のＱｕｉｃｋ  Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、処理した細胞から抽出したＤＮＡを１％アガロースで電気泳動した。
【００９４】
なお、このグラフは、ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を１ｎＭ添加した後１ヶ月後および２ヶ月後の結果を示している。このグラフの横軸は、添加された候補化合物の種類を示す。このグラフの縦軸は、このグラフで、１Ｍとは、ａ  ｍｏｎｔｈ  ｌａｔｅｒ，  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ（化合物で継続的に処理されてから１ヶ月後）のことであり、２Ｍとは、２  ｍｏｎｔｈｓ  ｌａｔｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（化合物で継続的に処理されてから２ヶ月後）のことであり、Ｃとは、ＨＬＦ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ（ヒト肝癌由来のＨＬＦ細胞株）のことである。これらの図を見てわかるように、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭの４種類の抗腫瘍剤を添加した場合には、明らかにアポトーシス誘導が起こっていることがわかる。その結果、ヒト肝癌細胞に１０ｎＭの４種類の抗腫瘍剤を添加した場合には、いずれの場合にも、抗腫瘍効果が得られることは明らかである。
【００９５】
図１５は、ヒト肝癌細胞に（＋）−グラウシンを添加した場合の細胞周期特異的作用を示すグラフおよび表である。本発明者は、ヒト肝癌細胞に（＋）−グラウシンを１０ｎＭ添加した場合の細胞周期特異的作用を調べた。より具体的には、細胞周期特異的に作用しているアルカロイドの代表例として、（＋）−グラウシンの場合について、ＧＥ社のＧｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅを用いてＧＥ社の専用試薬を用いて測定した。その測定結果を図１５（ａ）〜図１５（ｃ）にまとめた。これらの図を見てわかるように、ヒト肝癌細胞に（＋）−グラウシンを１０ｎＭ添加した場合には、ｐｒｅＧ１（ｓｕｂＧ１）期に細胞が集中し、細胞増殖抑制が誘導されている。そのため、ヒト肝癌細胞に（＋）−グラウシンを１０ｎＭ添加した場合には、抗腫瘍作用が発揮されていることは明らかである。
【００９６】
図１６は、抗テロメレース作用を示した抗腫瘍剤の候補化合物を示した図である。この図は、図２に対応する抗腫瘍剤の候補化合物のうち、抗テロメレース作用を示した化合物を着色してまとめた図である。上述の各種実験結果より、抗腫瘍効果を誘導した生薬中アルカロイド成分は、Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ（マグノフロリン、開発コード：Ｔ０５８２７）、Ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ（ディセントリン、開発コード：Ｔ３０６２６）、Ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅ（ミシェプレッシン、開発コード：Ｌ２９１５０）、（＋）−Ｇｌａｕｃｉｎｅ（（＋）−グラウシン、開発コード：Ｔ００８５８）、（＋）−ｂｏｌｄｉｎｅ（（＋）−ボルジン、開発コード：Ｔ２２４３０）、Ｂｕｌｂｏｃａｐｎｉｎｅ  ＨＣｌ（塩酸ブルボカプニン、開発コード：Ｔ２２３９９）、（＋）−ｉｓｏｃｏｒｙｄｉｎｅ−ＨＣｌ（塩酸（＋）−イソコリジン、開発コード：Ｔ１５３９１）の７種類である。
【００９７】
ここで、上述の７種類の抗腫瘍作用を示した化合物のいずれにおいても、ヒト肝癌細胞において抗腫瘍性を示すための有効投与量は、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内であることが好ましく、１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内であることが特に好ましい。これらの範囲内であれば好適な抗腫瘍性を示すことが、上述の各種実験データにより実証されているためである。
【００９８】
また。この図にも示したように、上述の各種実験結果より、抗テロメレース効果を誘導した生薬中アルカロイド成分は、Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ（マグノフロリン、開発コード：Ｔ０５８２７）、Ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ（ディセントリン、開発コード：Ｔ３０６２６）、Ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅ（ミシェプレッシン、開発コード：Ｌ２９１５０）、（＋）−Ｇｌａｕｃｉｎｅ（（＋）−グラウシン、開発コード：Ｔ００８５８）の４種類である。
【００９９】
そして、抗テロメレース作用はこれらの４種類に認められたが、抗腫瘍作用という観点から見れば、もっとも強力な成分の順は、Ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ（ディセントリン、開発コード：Ｔ３０６２６）＝（＋）−Ｇｌａｕｃｉｎｅ（（＋）−グラウシン、開発コード：Ｔ００８５８）＝Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ（マグノフロリン、開発コード：Ｔ０５８２７）＞Ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅ（ミシェプレッシン、開発コード：Ｌ２９１５０）である。もっとも、これら４種類の化合物の抗腫瘍作用は、抗テロメレース作用にのみ基づくものであるとは限らない。４種類の化合物が、多少異なる細胞死の形態を示していることから、抗テロメレース作用以外の抗腫瘍作用を有している可能性がある。
【０１００】
ここで、上述の４種類の抗腫瘍作用および抗テロメレース作用を示した化合物のいずれにおいても、ヒト肝癌細胞において抗腫瘍性および抗テロメレース性を示すための有効投与量は、１ｎＭ〜１×１０３ｎＭの範囲内であることが好ましく、１ｎＭ〜１×１０ｎＭの範囲内であることが特に好ましい。これらの範囲内であれば好適な抗腫瘍性および抗テロメレース性を示すことが、上述の各種実験データにより実証されているためである。
【０１０１】
＜天然物由来の抗腫瘍性・抗テロメレース性化合物の抽出方法＞
図１７は、天然物由来の抗腫瘍性・抗テロメレース性化合物であるマグノフロリンおよびディセントリンの抽出方法を説明するためのフローチャート図である。この図に示すように、マグノフロリンおよびディセントリンは、化学合成が困難であるため、このフローチャートに示すように、熱水抽出またはエーテル抽出により抽出することが好ましい。
【０１０２】
図１７左は、マグノフロリンのエーテル抽出法を説明するフローチャートである。このように、マグノフロリンを得るには、まず、防已切裁片をメタノール抽出して、メタノール相を回収する。そして、メタノール相をＤｉａｉｏｎＨＰ２０カラムにかけて、水溶出部を廃棄し、５０％メタノール溶出部を回収する。さらに、５０％メタノール溶出部を０．１Ｎ  ＨＣｌ酢酸エチル分離し、酢酸エチル層を廃棄し、水相を回収する。そして、水相を１Ｎ  ＮＨ３ａｑ／ＣＨＣｌ３分離し、ＣＨＣｌ３相を廃棄し、水相を回収する。さらに、水相をＯＤＳカラムクロマトグラフィーにかけて、溶媒を水→２０％ＣＨ３ＣＮに切り替えて溶出させることにより、分離されたマグノフロリンを得る。
【０１０３】
図１７右は、ディセントリンのエーテル抽出法を説明するフローチャートである。このように、ディセントリンを得るには、まず、天然記念物である駒草を合法的ルートで入手した上で、駒草をメタノール抽出して、メタノール相を回収する。そして、メタノール相を２．５％酒石酸ａｑ／Ｅｔ２Ｏで分離して、Ｅｔ２Ｏ相を廃棄し、水相を回収する。さらに、水相を２．５％Ｋ２ＣＯ３ａｑ／Ｅｔ２Ｏで分離して、Ｅｔ２Ｏ相を廃棄し、水相を回収する。そして、相を０．５ＭＮａＣｌＯ３／ＣＨＣｌ３で分離して、水相を廃棄して、ＣＨＣｌ３相を回収する。そして、ＣＨＣｌ３相をＳｉＯ２吸着させて、溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ（９：２．５：０．５）→ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ（８：２：０．２）に切り替えて溶出させることにより、分離されたディセントリンを得る。
【０１０４】
図１８は、ヒト肝癌細胞に抗腫瘍作用および抗テロメレース作用を示す４種類の化合物を得るための方法を概略するための概念図である。マグノフロリン、ディセントリンの抽出方法については、一部上述の説明にて触れたが、ヒト肝癌細胞に抗腫瘍作用および抗テロメレース作用を示す４種類の化合物である、Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ（マグノフロリン、開発コード：Ｔ０５８２７）、Ｄｉｃｅｎｔｒｉｎｅ（ディセントリン、開発コード：Ｔ３０６２６）、Ｍｉｃｈｅｐｒｅｓｓｉｎｅ（ミシェプレッシン、開発コード：Ｌ２９１５０）、（＋）−Ｇｌａｕｃｉｎｅ（（＋）−グラウシン、開発コード：Ｔ００８５８）を得るには、この図に示す各種方法を用いることができる。
【０１０５】
たとえば、マグノフロリンを得るには、防己だけでなく、生薬成分：防己、細辛、辛夷、黄蓮、厚朴のいずれかからエーテル抽出や熱水抽出を行えばよい。もっとも、その後、精製のために、クロマトグラフィーなどで分離することが好ましい。一方、ディセントリンについては、現在のところ、駒草からエーテル抽出や熱水抽出を行う方法以外の効率的な方法は開発されていない。また、（＋）−グラウシン、ミシェプレッシンについては、一般的な化学合成により得ることができる。
【０１０６】
＜今後の課題＞
本発明者は、多くの癌腫由来の細胞株についても検討を行い、担癌マウスについても有効量を投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける造腫瘍性抑制作用および転移性抑制作用の有無を調べる予定である。なお、テロメレース抑制効果をもつ薬物候補化合物の一部については、人工合成が困難なため、天然物より成分抽出法及びクロマトグラフィーにより、成分精製を行って得られたものを用いる予定である。
【０１０７】
そして、本発明者は、将来的には、１）４種類の抗腫瘍成分に関して、創薬ソフト（ＤＳモデリング）を用いて、標的タンパクへの結合部位と結合様式を検討し、２）共通骨格及び標的蛋白の結合部位情報を基に新規派生化合物を創薬することなどを計画している。
【０１０８】
より具体的には、図１８にも示したように、１．ＤＳによる作用点の検索、２．１に基づく派生物質の開発を行う。そして、こうして候補化合物としてリストアップされた化合物を、化学合成し、１．ＭＴＴアッセイ（最適濃度ＩＣ５０を決定）、２．増殖曲線、３．テロメレース抑制効果（ｍＲＮＡ，  活性）、４．テロメア長、５．老化誘導（β−ｇａｌ染色）、６．アポトーシス（前期、中期、後期）（キャスペース活性、細胞周期、ミトコンドリア膜電位、ＤＮＡ断片化）などについて検討を行う。そして、１．がん細胞パネルによる各癌腫での感受性、２．Ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍移植マウスでの腫瘍抑制効果、３．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  薬物動態パラメーター  最小毒性濃度などを検討事項として、抗腫瘍効果および抗テロメレース効果を確認し、創薬としての開発を行い、厚生労働省認可を受けることを目的としている。
【０１０９】
そして、上記の各種検討を行うことにより、本発明者としては、上記の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で示したアポモルフィン骨格を有する複素環化合物は、いずれの抗腫瘍活性を有することが明らかになると考えている。もっとも、この点は、上記の既に行った各種実験データより、医学、薬学、生化学、分子生物学などの技術分野の当業者であれば、当然にそのような活性を有するものと想定するものである。
【０１１０】
＜上記の実施例から得られる有益な効果＞
近年、ハーブの臨床応用が積極的に行われ、国際学会でも多岐にわたる医療分野で報告がなされている。しかし生薬に含まれるか、人体内での活性成分などの単一成分を対象とした基礎的な研究報告は十分なされていない。現在臨床応用されている抗腫瘍薬の中、かなりの割合を生薬由来成分が占めることから、新規成分の単離は未知の将来性ある領域といえる。つまり、抗腫瘍作用の有無を、テロメレース関連遺伝子発現を指標にして検討し、関連派生物質を作り出すことで、創薬シーンの新規なトピックになり、がん患者
に対して選択肢を提供することにつながる。
【０１１１】
以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
【０１１２】
たとえば、上記実施例では、上記の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で示したアポモルフィン骨格を有する複素環化合物のうち、一部の化合物についてのみ実験データを示したが、それらの化合物のみが抗腫瘍活性または抗テロメレース活性を有すると限定する趣旨ではない。上記の既に行った各種実験データより、医学、薬学、生化学、分子生物学などの技術分野の当業者であれば、当然にそのような活性を有すると想定するものである。
【０１１３】
また、上記実施例では、ヒト肝癌細胞を用いたが、上記の抗腫瘍剤または抗テロメレース剤の対象をヒト肝癌に限定する趣旨ではない。たとえば、上記の抗テロメレース剤または抗腫瘍剤は、肝癌以外の多様な腫瘍に対しても用いることができ、あるいはヒト以外の哺乳動物の多様な腫瘍に対しても用いることができる。このようにすれば、これらの抗テロメレース剤または抗腫瘍剤を、ヒトをはじめとする哺乳動物のための医薬品として好適に用いることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本件発明に対する市場性、他の技術による回避可能性などについては、特に抗テロメレース作用を示す４種の化合物については、抗腫瘍薬として特異な作用機序であるため、その新規性により臨床応用が期待される。また、現在注目する上記の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で表される化学物質について、基本構造、側鎖、派生物質に関しても、同様の作用効果が得られると考える。そして、今後、腫瘍特異的蛋白の活性部位との相互作用を明らかにすれば、さらに有効な抗腫瘍薬を開発することができると考える。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】本発明者がアルカロイド及びテロメレースに注目した理由を説明するための概念図である。
【図２】抗腫瘍効果を誘導した生薬中エキス液に共通に含まれることを、データベースから見出したアルカロイドの成分を一部抜粋して示す図である。
【図３】テロメレース抑制作用および抗腫瘍作用を示す４種類の候補化合物とアポモルフィン基本骨格との化学構造を示す図である。
【図４】抗腫瘍作用を示す３種類の候補化合物および抗腫瘍作用のポジティブコントロール化合物の化学構造を示す図である。
【図５】１ｎＭのマグノフロリンによるヒト肝癌細胞株の形態変化および老化誘導の状態を示す図である。
【図６】１ｎＭのミシェプレッシンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。
【図７】１ｎＭの（＋）−グラウシンによるヒト肝癌細胞株の形態変化を示す図である。
【図８】ヒト肝癌細胞株に対するＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。
【図９】ヒト肝癌細胞株に対して抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合および添加しない場合の増殖曲線のグラフである。
【図１０】４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のテロメレース抑制作用を示すグラフである。
【図１１】ヒト肝癌細胞におけるテロメレース活性アッセイを示す図である。
【図１２】ヒト肝癌細胞に１０ｎＭのディセントリンを添加した場合の老化誘導の状態を示す図である。
【図１３】ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のアポトーシス誘導の状態を示すグラフである。
【図１４】ヒト肝癌細胞に４種類の抗腫瘍剤の候補化合物を添加した場合のアポトーシス誘導の状態を示すグラフである。
【図１５】ヒト肝癌細胞に（＋）−グラウシンを添加した場合の細胞周期特異的作用を示すグラフおよび表である。
【図１６】抗テロメレース作用を示した抗腫瘍剤の候補化合物を示した図である。
【図１７】天然物由来の抗腫瘍性・抗テロメレース性化合物であるマグノフロリンおよびディセントリンの抽出方法を説明するためのフローチャート図である。
【図１８】ヒト肝癌細胞に抗腫瘍作用および抗テロメレース作用を示す４種類の化合物を得るための方法を概略するための概念図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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