(57)【要約】      （修正有）【課題】酵母によって産生されるジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質、特に組換え分泌タンパク質の収率を増加させる方法を提供する。【解決手段】タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）酵素は分泌及び細胞表面タンパク質におけるジスルフィド結合の形成を触媒する。ここでは、ヒトＰＤＩ又は酵母ＰＤＩを調節的に過剰産生する酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの組換え株の構築を開示する。これらの株は、治療面で潜在的に重要なジスルフィド結合をもつタンパク質を極めて多量に分泌する。これらの株は、ジスルフィド結合をもつ種々のタンパク質の産生を増加させる可能性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ製造方法であって、
組換え酵母宿主細胞内で哺乳動物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含む一つ以上の組換え発現カセットから該組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現させること、および
前記宿主細胞内で組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現させることを含み、
該方法は、正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の生成量が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの過剰発現がないときに生成される正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の量よりも多いことを特徴とし、ただしタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子がヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするＤＮＡと連結した遺伝子ではなく、且つ該方法は酵母由来受容体タンパク質ＥＲＤ２をコードする遺伝子の組換え発現カセットからの発現を包含しないことを特徴とする、前記製造方法。
【請求項２】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットが宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットが自律的複製プラスミド上に含まれている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、一つ以上のプラスミドに含まれる一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が一つ以上のプラスミドに含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が一つ以上のプラスミドに含まれる一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が、宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットおよび組換え遺伝子が同じプラスミドに含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
組換え遺伝子がアンチスタシンである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
組換え遺伝子がマダニ抗凝血タンパク質である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ属の種である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ジスルフィド結合をもつ分泌される組換えタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ製造方法であって、
組換え酵母宿主細胞内で哺乳動物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含む組換え発現カセットから該組換えタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現させること、および
前記酵母宿主細胞内で組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現させることを含み、
ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質が培地中に分泌され、培地から回収されることを特徴とし、
該方法は、正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の生成量が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの過剰発現がないときに生成される正確に折り畳まれたジスルフィド結合をもつタンパク質の量よりも多いことを特徴とし、ただしタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子がヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするＤＮＡと連結した遺伝子ではなく、且つ該方法は酵母由来受容体タンパク質ＥＲＤ２をコードする遺伝子の組換え発現カセットからの発現を包含しないことを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え酵母宿主細胞が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットを一つ以上含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子が、一つ以上のプラスミド上に含まれている一つ以上の発現カセット内に含まれ、ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする組換え遺伝子が、一つ以上のプラスミドに含まれている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質を発現させるために、組換え酵母宿主細胞を３０℃未満の温度で増殖させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の株である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種の株である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットが、酵母宿主細胞ゲノムに組込まれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする組換え発現カセットが自律的複製プラスミド上に含まれている、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする発現カセットおよび組換え遺伝子が同じプラスミドに含まれている、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
ジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質を発現させるために、組換え酵母宿主細胞を２０℃から２６℃までの間の温度で増殖させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ジスルフィド結合をもつタンパク質がアンチスタシンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ジスルフィド結合をもつタンパク質がマダニ抗凝血タンパク質である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
組換え発現カセット中の哺乳動物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含み、異なる組換え発現カセットからタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ以外のジスルフィド結合をもつ一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の組換え遺伝子を過剰発現するベクターから組換え哺乳動物タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する酵母Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株であって、該タンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子がヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするＤＮＡと連結した遺伝子ではなく、且つ該酵母の株は酵母由来受容体タンパク質ＥＲＤ２をコードする遺伝子の組換え発現カセットからの発現を包含しないことを特徴とする、前記酵母Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え宿主細胞内でジスルフィド結合タンパク質を産生するための新規の方法と、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え酵母細胞とに関する。又、本発明は、ジスルフィド結合をもつ組換え分泌タンパク質の分泌を実質的に且つ予想外に増加させる組換え酵母宿主細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、分泌タンパク質及び細胞表面タンパク質におけるジスルフィド結合の触媒に関わる酵素である。脊椎動物ＰＤＩの保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）「チオレドキシン様」活性部位を検出するように設計されたオリゴヌクレオチド（ＷＣＧＨＣＫ）（配列番号：１）を用いて、本発明者らは下等真核生物Ｓａｃｃａｈｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｌｉａｅからＰＤＩをコードする遺伝子を単離した。クローニングした遺伝子のヌクレオチド配列及び推定読取り枠は、分子量５９，０８２及びｐＩ  ４．１の５３０アミノ酸からなるタンパク質を予測させるが、これらは哺乳動物ＰＤＩの物理的特徴である。また、アミノ酸配列は哺乳動物及び鳥類のＰＤＩ配列に対して３０〜３２％の同一性と５３〜５６％の類似性とを示し、全体的構造が極めて類似しており、特に、各々が反復性である二つの１００残基セグメントが存在する。哺乳動物及び鳥類のＰＤＩに対する最も大きな相同は、保存された「チオレドキシン様」活性部位を含む領域（ａ、ａ’）にある。Ｎ末端領域は開裂可能な分泌シグナル配列の特徴を有しており、Ｃ末端の４個のアミノ酸（−ＨＤＥＬ）（配列番号：２）は、該タンパク質がＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ小胞体（Ｅ．Ｒ．）の成分であるということと合致している。この遺伝子（ＰＤＩ１と称する）の複数のコピーを有する形質転換体は１０倍のＰＤＩ活性レベルを有し、予測された分子量のタンパク質を過剰発現する。ＰＤＩｌ遺伝子は酵母ゲノム内で非反復性であり、定常期細胞には存在せず、また熱誘導もできない単一の１．８ｋｂ転写体をコードする。ＰＤＩ１遺伝子の破壊はハプロ致死性（ｈａｐｌｏ−１ｅｔｈａｌ）であり、これは該遺伝子の産物が生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）にとって必須のものであることを意味する。
【０００３】
チオール：ジスルフィド交換反応を触媒する酵素であるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、分泌細胞のＥ．Ｒ．内腔（ｌｕｍｅｎ）の主な常在タンパク質成分である。該酵素の細胞分布、細胞下の位置及び発現特性に関して立証された一連の事項は、該酵素が分泌タンバク質の生合成である種の役割を果たすことを示唆しており（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，１９８４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．９，ｐｐ．４３８−４１）、これはその場での（ｉｎ  ｓｉｔｕ）直接的架橋結合の研究によって裏付けされている（Ｒｏｔｈ及びＰｉｅｒｃｅ，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６，ｐｐ．４１７９−８２）。ＰＤＩを欠失しているミクロソーム膜が同時翻訳（ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）タンパク質のジスルフィド形成の特異的欠如を示すという発見は（Ｂｕｌｌｅｉｄ及びＦｒｅｅｄｍａｎ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３５，ｐｐ．６４９−５１）、該酵素が分泌及び細胞表面タンパク質の生合成の問に天然ジスルフィド結合形成の触媒として機能することを意味する。この役割は、該酵素のｉｎ  ｖｉｔｒｏの触媒特性について知られている事実、即ち該酵素がチオール：：ジスルフィド交換反応を触媒して正味のタンパク質ジスルフィドの形成、破壊又は異性化を生起させ、且つ多岐にわたる還元され且つ折り畳みのないタンパク質基質においてタンパク質の折り畳み及び本来のジスルフィド結合の形成を触媒することができるという事実と一致している（Ｆｒｅｅｄｍａｎら、１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．，５５，ｐｐ．１６７−１９２）。該酵素のＤＮＡ及びアミノ酸配列は幾つかの種について知られており（Ｓｃｈｅｒｅｎｓ，Ｂ．ら，１９９１、Ｙｅａｓｔ，７，ｐｐ．１８５−１９３；Ｆａｒｑｕｈａｒ，Ｒ．，ら、１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８，ｐｐ．８１−８９）、哺乳動物の肝臓から精製して均質にした該酵素の作用のメカニズムに関する情報も増えている（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎら，１９８０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４２，ｐｐ．４３−６２；Ｆｒｅｅｄｍａｎら，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１６，ｐｐ．９６−９；Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８，ｐｐ．７２９８−７３０５；Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ及びＨｏｌｍｇｒｅｎ，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，ｐｐ．９１１４−９１２０；Ｈａｗｋｉｎｓ及びＦｒｅｅｄｍａｎ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２７５，ｐｐ．３３５−３３９）。細胞におけるタンパク質の折り畳み、アッセンブリー及びトランスロケーションの仲介物質として現在推定されている多くのタンパク質因子（Ｒｏｔｈｍａｎ，１９８９，Ｃｅｌｌ，５９，５９１−６０１）のうち、ＰＤＩは明確に規定された触媒活性を有するという点で希有である。
【０００４】
ＰＤＩは哺乳動物の組織から容易に単離され、均質酵素は特徴的な酸性ｐＩ（４．０〜４．５）を有するホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）（２×５７ｋＤ）である（Ｈｉｌｌｓｏｎら、１９８４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏ１，１０７，ｐｐ．２８１−２９２）。該酵素はコムギ及び藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｉｉからも精製された（Ｋａｓｋａら，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２６８，ｐｐ．６３−６８）。活性は広範囲の起源で検出されており、予備報告では、ＰＤＩ活性はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて検出可能であると断言された（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，１９６８，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．，２，ｐｐ．１３３−１３５）。最近になって、クローニングしたｃＤＮＡ配列に主として由来する多くのＰＤＩの完全アミノ酸配列が報告された。その中には、マウス由来（Ｅｄｍａｎら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１７，ｐｐ．２６７−２７０）、ウシ由来（Ｙａｍａｕｃｈｉら，１９８７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１４６，ｐｐ．１４８５−１４９２）、ヒト由来（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら，１９８７，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，ｐｐ．６４３−９）、酵母由来（Ｓｃｈｅｒｅｎｓ，Ｂ．ら，前出引用文献；Ｆａｒｑｕｈａｒ，Ｒ．ら，前出引用文献）及びヒヨコ由来（Ｐａｒｋｋｏｎｅら，１９８８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２５６，ｐｐ．１００５−１０１１）のＰＤＩがある。これらの脊椎動物種に由来するタンパク質は全体を通して高度の配列保存を示し、いずれも、最初にマウスＰＤＩ配列で観察された幾つかの総合的特徴を示す（Ｅｄｍａｎら，１９８５、前出引用文献）。最も顕著なものは、互いに極めて相同であり且つチオレドキシン、即ち隣接Ｃｙｓ残基の間に形成された活性部位ジスルフィド／ジチオール対を含む小さいレドックス活性タンパク質に密接に関連した配列を有する残基数約１００の二つの領域がＰＤＩ配列中に存在することである。チオレドキシンでは活性部位配列がＥＣＧＰＣＫ（配列番号：３）であり、ＰＤＩ中に二つ存在する対応する領域は配列ＷＣＧＨＣＫ（配列番号：１）を有する（ＰＤＩ配列中で同定された他の反復領域、モチーフ及び相同性については後で説明する）。
【０００５】
ＰＤＩに対応するか又は密接に関連した配列は、ジスルフィド結合の形成以外の機能の分析を目的とする研究で同定された。例えば、ＰＤＩが、Ｅ．Ｒ．内の新生（ｎａｓａｃｅｎｔ）すなわち新合成（ｎｅｗｌｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ）プロコラーゲンポリペプチドの主な翻訳後修飾を触媒する四量体α２β２酵素プロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットとして作用するという事実が立証されている（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら，１９８７，前出引用文献；Ｋｏｉｖｕら，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，ｐｐ．６４４７−４９）。また、ＰＤＩが同時翻訳のＮ−グリコシル化のシステムに関与することを示唆する事実もあり（Ｇｅｅｔｈａ−Ｈａｂｉｂら，１９８８，Ｃｅｌｌ，５４，ｐｐ．６３−６８）、最近では、該酵素が、トリグリセリドを新生分泌リボタンパク質に変換する複合体に関与しているという説も出ている（Ｗｈａｔｔｅｒａｕら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，ｐｐ．９８００−７）。このように、ＰＤＩは分泌タンパク質の同時翻訳及び翻訳後修飾で複数の機能を果たし得る（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，１９８９，Ｃｅｌｌ，５７，ｐｐ．１０６９−７２）。
【０００６】
哺乳動物分泌タンパク質の大多数は、複数の分子内及び／又は分子間ジスルフィド結合を有している。非限定的具体例としては、下垂体ホルモン、インターロイキン、免疫グロブリン、プロテアーゼ及びその阻害物質、並びに他の血清タンパク質が挙げられる。この種のタンパク質は商業的遺伝子工学の主要標的の一つであるが、細菌及び酵母内でのこれらタンパク質の発現における初期の体験では、これらのタンパク質を機能的に活性な組換え産物として得る上で多くの問題があることが強調された。その結果、一般的には翻訳後修飾、特定的にはタンパク質の折り畳み及びジスルフィド結合形成をより深く解明する必要が重視されるようになった。
【０００７】
単一の折り畳みドメインを有するジスルフィド結合をもつタンパク質は通常、正確にジスルフィド結合した状態を妥当な収率で形成するために、完全に還元、変性し、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生することができる。このプロセスでは、ゆっくり異性化して天然のジスルフィド結合を生起する多くの様々にジスルフィド結合した形態の混合集団が迅速に形成される。該プロセスは、チオール／ジスルフィド酸化還元緩衝液（例えばＧＳＨ及びＧＳＳＧ）及びアルカリ性ｐＨによって触媒される。沈殿及び鎖間ジスルフィド形成を防止するためには、タンパク質濃度を低くする必要がある。通常は、天然タンパク質の生成速度及び実現可能な最適収率はどちらも、分子内ジスルフィド数の増加に伴って低下する。この問題は、各ドメインが折り畳まれてそれぞれの天然ジスルフィド結合を独立して形成しなければならない複数のジスルフィド結合ドメインを含むタンパク質（例えば組織プラスミノーゲン活性化因子）ではより重大である。
【０００８】
ｉｎ  ｖｉｖｏのジスルフィド結合形成プロセスは、翻訳と同時に、又は極めて早期の翻訳後事象として生起する。哺乳動物細胞のＥ．Ｒ．内腔の新生及び新合成分泌タンパク質の研究では、天然ジスルフィド結合が既に形成されていることが判明している。ｉｎ  ｖｉｖｏのプロセスは、分泌細胞内に豊富に存在するタンパク質であり小胞体の内腔面（ｌｕｍｉｎａｌ  ｆａｃｅ）に局在する酵素、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼによって触媒されると思われる［Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．，１９８４，Ｔｒｅｎｄ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９，４３８−４４１］。この酵素はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、広範囲のタンパク質基質においてチオール：タンパク質−ジスルフィド交換反応を触媒し、天然タンパク質ジスルフィド形成の細胞触媒に必要とされる特性を有する［Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．ら，１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１２，９３９−９４２］。該酵素の役割を明らかにする別の事項としては、（ｉ）該酵素の組織分布がジスルフィド結合をもつ分泌タンパク質の合成のそれと合致するという事実［Ｂｒｏｃｋｗａｙ，Ｂ．Ｅ．ら，１９８０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９１，８７３−８７６］、及び（ｉｉ）多くの系で、存在する酵素の量が、ジスルフィド結合をもつ分泌タンパク質の合成速度の生理学的変化に平行して変化するという事実［Ｂｒｏｃｋｗａｙ，Ｂ．Ｅ．ら，１９８０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９１，８７３−８７６；Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．ら，１９８３，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ”，Ａ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｓ．Ｏｒｒｅｎｉｕｓ，Ａ．Ｈｏｌｍｇｒｅｎ  ＆  Ｂ．Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２７１−２８２；Ｐａｖｅｒ，Ｊ．Ｌ．ら，１９８９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４２，ｐｐ．３５７−３６２］が挙げられる。
【０００９】
該酵素の特徴は、多くの動物源［Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｎ．及びＦｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２１３，ｐｐ．２２５−２３４］及びコムギ［ｄｅ  Ａｚｅｖｅｄｏ，Ｇ．Ｍ．Ｖ．ら，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１２，１０４３］で解明されており、分子特性及び動力学的特性の顕著な保存が観察された［Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．ら，１９８４・Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．１２，ｐｐ．９３９−９４２；Ｂｒｏｃｋｗａｙ，Ｂ．Ｅ．及びＦｒｅｅｄｍａｎ，Ｒ．Ｂ．，１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，２１９，５１−５９］。しかしながら、該酵素は、下等真核生物又は細菌においてはまだ十分に研究されていない。少なくとも一部の酵母分泌タンパク質（例えばキラー毒素）はジスルフィド結合を含んでいるため、酵母と高等真核生物との間の、分泌に関与するメカニズム及び分子成分の高度の相同性は、該酵素又は類似体が酵母内に存在することを強く示唆させる。
【００１０】
商業的に重要な哺乳動物タンパク質の発現のための万能宿主（ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｈｏｓｔ）としての酵母の使用は、酵母分泌系の限定された能力、及び該能力と高等真核生物のそれとの相違（例えばグリコシル化における相違）によって、ある程度の妥協を強いられる。
【００１１】
本発明は、酵素タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え宿主細胞内でジスルフィド結合タンパク質を産生するための新規の方法と、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを過剰発現する組換え酵母細胞とを提供する。本発明は、ジスルフィド結合をもつ組換え分泌タンパク質の分泌を実質的に且つ予想外に増加させる組換え酵母宿主細胞も提供する。
【００１２】
発明の概要
ヒト及び酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするＤＮＡを単離し、プロモーターと転写ターミネーターとを含む発現カセット又はベクターにクローニングする。ＰＤＩをコードするＤＮＡを含む発現カセット又はベクターを宿主細胞内にトランスファーすると、該細胞はＰＤＩタンパク質を過剰産生する。これらのＰＤＩ過剰産生細胞を、ジスルフィド結合をもつタンパク質の発現のための組換え宿主として使用する。ジスルフィド結合をもつタンパク質の分泌は、ＰＤＩ過剰産生宿主細胞では、通常レベルのＰＤＩを産生する宿主細胞と比べて実質的に増加する。
【００１３】
発明の詳細な説明
酵母におけるタンパク質の折り畳み及び分泌のプロセスは極めて複雑であり、遺伝子研究に基づいて言えば、３０以上の遺伝子産物が関与している（Ｆｒａｎｚｕｓｏｆｆ，Ａ．ら，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，ｐｐ．６６２−６７４）。これらの産物としては、ペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ、ＰＤＩ及び他のチオレドキシン様タンパク質、ＢｉＰ、種々の分子シャペロン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）（ｈｓｐ７０、ｈｓｐ６０等）、シグナルペプチダーゼ、シグナル認識タンパク質、Ｅ．Ｒ．への前駆体のトランスロケーションに関与する種々のタンパク質、ＥＲの種々の構造及び機能成分、ゴルジ（Ｇｏｌｇｉ）、並びにまだ特徴が解明されていない分泌小胞及び多くのタンパク質が挙げられる（Ｆｒａｎｚｕｏｆｆ，Ａ．ら，１９９１，前出引用文献；Ｒｏｔｈｍａｎ，Ｊ．Ｅ．及びＯｒｃｉ  Ｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，ｐｐ．４０９−４１５；Ｇｅｔｈｉｎｇ，Ｍ．Ｇ．及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｇ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，ｐｐ．３３−４５）。このような複雑さに鑑みて、単一の成分（即ちＰＤＩ）の量が増加するだけで特定の異種タンパク質の分泌が実質的に増加するという可能性は、当業者には極めて想到しにくいことと思われる。そこで本発明は、ＰＤＩの量が増加しただけで、例えばアンチスタシンのような分泌タンパク質の量が有意に且つ実質的に増加するという極めて意外な結果を提示した。これは、タンパク質の折り畳み及び／又はジスルフィド結合形成の促進に関連していると思われる現象である。
【００１４】
本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードするＤＮＡを過剰発現させることにより、組換え宿主細胞による組換えタンパク質の産生を増加させる方法を提供する。本明細書中のＰＤＩは、分子内及び分子間ジスルフィド結合の形成を特異的に触媒する酵素を意味する。
【００１５】
幾つかの種に由来するＰＤＩ遺伝子のＤＮＡ配列は当業界で知られている。これらの種の非限定的具体例としては、ヒト、ウシ、ラット、ニワトリ及び酵母が挙げられる。［Ｍｉｚｕｎａｇａら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，ｐｐ．８４６−８５１；Ｓｃｈｅｒｅｎｓら，１９９１，Ｙｅａｓｔ，７，ｐｐ．１８５−１９３］。
【００１６】
ＰＤＩをコードするＤＮＡの単離における出発材料は任意の種類の細胞又は組織であってよく、非限定的具体例としては、哺乳動物及び他の脊椎動物の細胞及び組織、並びに下等真核生物の細胞及び組織が挙げられる。ここでは本発明を、組換え酵母宿主細胞内で発現される酵母及びヒトＰＤＩを用いて説明する。当業者には容易に理解されるように、本発明では別の発現宿主、例えば非限定的具体例として哺乳動物細胞、植物細胞、細菌のような原核生物の細胞、昆虫細胞、並びに酵母及び糸状菌類のような下等真核生物の細胞も使用し得る。また、これも当業者には明らかなように、酵母及びヒ卜細胞以外の起源に由来するＰＤＩコーディングＤＮＡの使用も本発明の範囲内に包含される。ＰＤＩコーディングＤＮＡの別の起源の非限定的具体例としては、ヒト以外の脊椎動物、例えばラット及びマウス、非脊椎動物、例えば昆虫、並びに下等真核生物、例えば菌類が挙げられる。
【００１７】
Ｒｏｔｈｂｌａｔｔ及びＭｅｙｅｒの方法（１９８６，Ｃｅｌｌ，４４，ｐｐ．６１９−２８）の方法でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから調製したミクロソーム膜フラクションは低レベルのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性を有していたが、該レベルは音波処理によって８〜２０倍増如した。これは、脊椎動物の同じ細胞コンパートメントに存在するＰＤＩ（Ｍｉｌｌｓら，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，２１３，ｐｐ．２４５−８）；Ｌａｍｂｅｒｔ及びＦｒｅｅｄｍａｎ，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｊ．２２８，ｐｐ．６３５−４５）及びコムギの同じ細胞コンパートメントに存在するＰＤＩ（Ｒｏｄｅｎら，１９８２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１３８，ｐｐ．１２１−４）と類似の酵素が、該酵母の小胞体の内腔に存在することを示唆するものであった。高等真核生物酵素に対して相同の、ＰＤＩをコードする遺伝子をクローニングした。高度の保存を示す可能性が最も高い領域は、脊椎動物ＰＤＩにおいて高度に保存されており、特に二つの機能性ジチオール活性部位の領域でチオレドキシンに対して極めて強い相同を示すａ及びａ’ドメインであると思われる。活性部位の共通配列はＦＹＡＰＷＣＧＨＣＫ（配列番号：４）である（Ｐａｒｋｏｎｎｅｎら，１９８８，前出引用文献）。非還元性３０マーオリゴヌクレオチドを酵母コドンバイアス（ｂｉａｓ）に基づいて設計し（Ｓｈａｒｐら，１９８６，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４，ｐｐ．５１２５−４３）、これを末端標識して、マルチコピーＹＥｐプラスミドｐＭＡ３ａ内で構築した酵母ゲノムライブラリーのスクリーニングに使用した（Ｃｒｏｕｚｅｔ及びＴｕｉｔｅ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０，ｐｐ．５８１−３）。スクリーンから二つの極めて陽性のクローン（Ｃ７及びＣ１０と称する）が回収され、予備制限地図を作成した結果、挿入体サイズはそれぞれ１４ｋｂ及び１４．５ｋｂであり、二つの挿入物は共通の制限部位をいくつか有することが判明した。クローンＣ７の挿入物を更に分析した。
【００１８】
クローンＣ７が確かにＰＤＩをコードすることを確認するために、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＤ４０／４［α ｔｒｐ１  ｕｒａ２  ｈｉｓ３  ｌｅｕ  ２；Ｔｕｉｔｅら，１９８６，Ｅ．Ｍ．Ｂ．０．Ｊ．，１，ｐｐ．６０３−６０８］をクローン７及び親プラスミドｐＭＡ３ａで形質転換した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、Ｃ７形質転換体は、主要５８ｋＤａポリペプチドを過剰発現し、おそらくは約７７ｋＤａの第二のポリペプチドも過剰発現することが判明した（第１図）。また、二つの株の無細胞溶解液をＰＤＩ活性についてアッセイしたところ、Ｃ７形質転換体は１０倍のＰＤＩ活性レベル（３８．６×１０−５Ｕ／μｇタンパク質）を示した。これら二つの事実は、活性部位配列ＷＣＧＰＣＫ（配列番号：３）を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチオレドキシンは分子量が約１２ｋＤａであるため（Ｐｏｒｑｕｅら、１９７０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４５，ｐｐ．２３６３−７０）、Ｃ７クローンがＰＤＩをコードし、チオレドキシンをコードしないという見方を裏付けるものであった。
【００１９】
推定上のＰＤＩコーディング配列の位置を決定する（ｌｏｃａｌｉｓｅ）ために、Ｃ７クローンを種々の制限酵素で消化し、消化産物をニトロセルロースにトランスファーし、前述の３０マー「活性部位」オリゴヌクレオチドでプローブした。この操作では、５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメントと、それぞれ５．０及び４．５ｋｂの二つの明らかに隣接しているＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとが同定された。後者のパターンは、活性部位のコピーを二つ含むＰＤＩについて予測されるであろうように、「活性部位」プローブの標的が二つ存在し得ることを示唆するものであった。二つのＨｉｎｄＩＩＩ部位からの予備ＤＮＡ配列分析では、脊椎動物ＰＤＩに対して弱い相同性を示す読取り枠（ＯＲＦ）の存在が明らかにされたが、これらは連続配列ではないため、他にもＨｉｎｄＩＩＩ部位が存在するに違いないことも判明した。この推測は、詳細な制限地図の作成とＤＮＡ配列決定とによって確認された。天然の制限部位とオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、二つの隣接ＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む２．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの配列決定を両方の鎖で行った。
【００２０】
ＤＮＡ配列は、予測された分子量５９，０８２の、５３０アミノ酸をもつポリペプチドをコードすることができる１５９３ｂｐの単一読取り枠の存在を予測させた（Ｆａｒｑｕｈａｒ，Ｒ．，ら，前出引用文献、第２図参照）。該読取り枠は、適度に多いタンパク質をコードする酵母ｍＲＮＡに典型的なコドンバイアスを有していた（Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ及びＨａｌｌ，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，ｐｐ．３０２９−３０３１）。コドンバイアス指数（ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｉｎｄｅｘ）の計算値は０．６０であった。
【００２１】
決定されたヌクレオチド配列の分析は、多数の標準的酵母プロモーター及びターミネーターモチーフを明らかにした（Ｆａｒｑｕｈａｒ，Ｒ．，ら，前出引用文献，第２図参照）。これらのモチーフは、読取り枠に対して−１００と−１２８との問に位置する（ＴＡ）１４配列の一部分としてのＴＡＴＡボックス相同部位と、位置−２０１と−２３８との間のピリミジンに富んだ領域（３７ヌクレオチドのうちの３４）とを含む。読取り枠の３’末端には、ＴＡＡ翻訳ターミネーターに続いて、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での転写終結及び／又はポリアデニル化のシグナルと仮定される配列（Ｚａｒｅｔ及びＳｈｅｒｍａｎ，１９８２，Ｃｅｌｌ，２８，ｐｐ．５６３−７３）、並びに真核生物ポリアデニル化部位（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ及びＢｒｏｗｎ１ｅｅ，１９７６，Ｎａｔｕｒｅ，２６４，ｐｐ．２１１−４）の両方に対する相同が存在する。
【００２２】
該クローン化遺伝子が転写されたかどうかを調べるために、読取り枠に対して内側の８００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントを用いて、二つの異なる炭素源、グルコース及びアセテートで、異なる増殖サイクル段階まで増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの二つの異なる株（ＭＤ４０／４ｃ及びＳＫＱ２ｎ［α／ａ  ａｄｅｌ／＋ａｄｅ２／＋ｈｉｓ１／＋；Ｇａｓｉｏｎら，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，ｐｐ．３９６５−３９６９］）から調製した全ＲＮＡ試料のノーザンブロットをプローブした。指数増殖細胞では、グルコース及びアセテート増殖細胞で単一の１．８ｋｂ転写体が検出されたが、非増殖細胞では転写体は殆ど検出できなかった。転写体のサイズは、ｍＲＮＡの５’及び３’領域内の非翻訳配列の約２００ヌクレオチドを考慮に入れて、読取り枠により予測された通りであった。
【００２３】
予測されたアミノ酸配列は、下記の理由によって該配列が正にＰＤＩであることを強く示唆した：
（ｉ）予測された５９ｋＤａの分子量と、哺乳動物ＰＤＩに特徴的なｐＩ（４．１）とを有していた；
（ｉｉ）該アミノ酸配列は、ＢＥＳＴＦＩＴソフトウェア（ＵＷＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって決定されたように、先に報告された哺乳動物及び鳥類のＰＤＩ配列に対して、３０〜３２％の全体的同一性と、５３〜５６％の全体的類似性とを示した；
（ｉｉｉ）該アミノ酸配列中の位置５８〜６５及び４０３〜４１０に「チオレドキシン様」活性部位の二つのコピーを含んでいた。また、これらの配列は、哺乳動物ＰＤＩ内の重複ａ／ａ’領域に対して高度のアミノ酸同一性を示す約１００アミノ酸のより大きい内部重複（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の一部分であった（第２図）。酵母及び哺乳動物ＰＤＩ配列を並べると（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）、ａ及びａ’領域の外側に、大きな相同を示す別の領域が存在することも明らかになった（第２図）。
【００２４】
また、コードされたポリペプチドの別の二つの特徴は、これがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ小胞体の成分であることを示唆している。該タンパク質は、推定上の分泌シグナルの特徴を有する著しく疎水性のＮ−末端配列をコードし（Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，ｐｐ．９２３−９３０）、四つのＣ末端アミノ酸は酵母ＢｉＰのそれと同じであり（Ｎｏｒｍｉｎｇｔｏｎら，１９８９，Ｃｅｌｌ，５７，ｐｐ．１２２３−３６）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの小胞体保持シグナルであると報告されている（Ｐｅｌｈａｍら，１９８８，ＥＭＢＯＪ．，７，ｐｐ．１７５７−６２）。
【００２５】
本発明者らは、クローン化Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＰＤＩ遺伝子をＰＤＩ１と命名した。このＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＰＤＩ１遺伝子はゲノム内のただ一つのコピーに存在する。これは、前述の０．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｔｕ１フラグメントを種々のゲノム消化産物に対するブロープとして用いる高緊縮ハイブリダイゼーションにより確認された。
【００２６】
単一のＰＤＩ１遺伝子が生存能力にとって必須であるかどうかを調べるために、ＨＩＳ３遺伝子［Ｍｏｎｔｉｅｌ，Ｇ．Ｆ．ら，１９８１４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，ｐｐ．１０４９−１０６８］を有する１．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントがＰＤＩ１コーディング配列内のＥｃｏＲＶ部位に挿入されている（第３図）ヌル（ｎｕｌｌ）対立遺伝子を構築した。ｈｉｓ  ３二倍体酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（ＡＳ３３２４；［Ｓｐａｌｄｉｎｇ，Ａ．，１９８８，Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔ］）を、ｐｄｉ１：：ＨＩＳ破壊を有するＤＮＡフラグメントで形質転換して、ＰＤＩ１遺伝子の二つの染色体コピーのうちの一つを前記非機能性対立遺伝子で置換した。三つのＨＩＳ＋ＡＳ３３  ２４形質転換体（Ｙｌ、Ｙ２及びＹ３）を更に調べた。いずれの場合も、二倍体の胞子形成は四分子当たり二つの生存可能胞子を産生しただけであり（第３図）、これらは総てｈｉｓ−であった。この結果は、致死表現型がｐｄｉ１：：ＨＩＳ３突然変異に関連していたことを示すものである。正確な遺伝子置換がＨＩＳ＋形質転換体Ｙｌ及びＹ２において生起したことは、８００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩフラグメントをブロープとして用いる、ＰｓｔＩで消化したプロットされた酵母ゲノムＤＮＡへのサザンハイブリダイゼーションにより確認された。ＰＤＩ１遺伝子は内部ＰｓｔＩ部位を含まないが（第３図）、ＨＩＳ３遺伝子は単一ＰｓｔＩ部位を含むため（第３図）、これでｐｄｉ１：：ＨＩＳ３対立遺伝子は簡単に同定される筈である。予測されたように、非形質転換株ＡＳ３３２４では単一の９ｋｂ  ＰｓＩフラグメントが検出されたが、Ｙ１及びＹ２形質転換体では９ｋｂ及び２．２ｋｂという二つのバンドが、由来の異なる二つのバンドからなると推測される９ｋｂバンドと共に検出された。これらのデータは、二つの染色体のうち一方の染色体上のＰＤＩ１遺伝子がＨＩＳ３対立遺伝子で置換され、このような事象がハプロ致死性であることを立証するものである。
【００２７】
酵母ＰＤＩをコードするＤＮＡを分子的にクローニングするためには、種々の方法のうち任意のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例としては、適当な発現ベクター系内でのＰＤＩ含有ＤＮＡライブラリーの構築に次ぐ、ＰＤＩ遺伝子の直接的機能発現が挙げられる。別の方法は、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したＰＤＩ含有ＤＮＡライブラリーを、ＰＤＩタンパク質のアミノ酸配列から設計した標識付きオリゴヌクレオチドプローブでスクリーニングすることからなる。好ましい方法は、プラスミドシャトルベクター内で構築したヒト又は酵母ＰＤＩ含有ゲノムＤＮＡライブラリーを、酵素活性部位の既知のアミノ酸配列をコードする推定ＤＮＡプローブでスクリーニングすることからなる。
【００２８】
当業者には容易に理解されるように、別のタイプのライブラリー、及び別の細胞又は細胞タイプから構築したライブラリーもＰＤＩをコードするＤＮＡの単離に有用であり得る。別のタイプのライブラリーの非限定的具体例としては、酵母細胞以外の別のヒト、脊椎動物及び下等真核生物細胞又は細胞系に由来するｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【００２９】
当業者には明らかなように、適当なライブラリーは、ＰＤＩ活性を有する細胞又は細胞系から調製し得る。ＰＤＩ  ｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの形成で使用するための細胞又は細胞系の選択は、前述の方法を用いて、最初に細胞結合ＰＤＩ活性を測定することにより実施し得る。
【００３０】
ｃＤＮＡライブラリーの形成は当業者に良く知られている標準的方法で実施できる。良く知られているｃＤＮＡライブラリー構築方法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｃｈ・Ｅ・Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ，１９８２）に記載されている。
【００３１】
ＰＤＩをコードするＤＮＡを適当なゲノムＤＮＡライブラリーから単離し得ることも当業者には明らかであろう。
【００３２】
ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は当業者に良く知られている標準的方法で実施できる。良く知られているゲノムＤＮＡライブラリー構築方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｆｒｉｔｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕｅｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ，１９８２）に記載されている。
【００３３】
前述の方法で得たクローン化ＰＤＩは、組換えＰＤＩを産生するために、適当なプロモーターと別の適当な転写詞節エレメントとを含む発現ベクターヘの分子クローニングにより組換え的に発現し、原核生物又は真核生物宿主細胞内にトランスファーし得る。この種の操作を行うための技術は、前出のＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らの文献に詳述されており、当業者には良く知られている。
【００３４】
本明細書では、発現ベクターは、遺伝子のクローン化コピーの転写と、ｍＲＮＡの適当な宿主内での翻訳とに必要なＤＮＡ配列であると定義される。この種のベクターは、細菌、藍藻、植物細胞、菌類、昆虫細胞及び動物細胞のような種々の宿主内で真核生物遺伝子を発現させるのに使用し得る。
【００３５】
特異的に設計したベクターは、宿主間、例えば細菌−酵母又は細菌−動物細胞問のＤＮＡのシャトリングを可能にする。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内の自律的複製のための複製起点と、選択可能なマーカーと、限定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数へのポテンシャルと、活性プロモーターとを含んでいる必要がある。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であると定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡが高頻度でイニシエートされるようにするプロモーターである。発現ベクターの非限定的具体例としては、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド又はウイルスが挙げられる。
【００３６】
哺乳動物細胞内で組換えＰＤＩを発現させるためには、種々の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えＰＤＩ発現に適し得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限定的具体例としては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳ−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ  ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ  ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ  ３７４６０）及びｇＺＤ３５（ＡＴＣＣ  ３７５６５）が挙げられる。
【００３７】
ＰＤＩをコードするＤＮＡはまた、種々の組換え宿主細胞内での発現のために発現ベクターにクローニングし得る。組換え宿主細胞は原核生物、例えば非限定的具体例として細菌、又は真核生物、例えば非限定的具体例として酵母、哺乳動物細胞、例えば非限定的具体例としてヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類動物に由来する細胞系、並びに昆虫細胞、例えば非限定的具体例としてＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来細胞系、及び組換えバキュロウイルス発現系と共に使用されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＳＦ９）昆虫細胞であってよい。適当なものとして使用し得る市販の哺乳動物種由来細胞系の非限定的具体例としては、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １７１）が挙げられる。
【００３８】
酵母活性プロモーターは酵母宿主内でのＰＤＩ遺伝子の転写を開始させる。従って、当業者には容易に理解されるように、任意の酵母活性プロモーター配列、例えば非限定的具体例として、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＰＨＯ５及びＧＡＰ４９１（ＴＤＨ３）を利用し得る。また、組換え宿主内でのＰＤＩの発現をアッセイするために、適当なアッセイシステム、例えばイムノブロット又はＲＩＡもしくはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）を使用し得ることも当業者には明らかであろう。
【００３９】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、増殖用炭素源としてのガラクトースの利用に関与している酵素をコードする遺伝子を五つ有している。ＧＡＬｌ、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０はそれぞれ、ガラクトキナーゼ、ガラクトースペルメアーゼ、ホスホグルコムターゼの主要アイソザイム、α−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフエラーゼ及びウリジンジホスホガラクトース−４−エピメラーゼをコードする。ガラクトースが存在しないと、これらの酵素の発現はほとんど検出されない。細胞をグルコースで増殖し、次いでガラクトースを培養物に加えると、これら３種類の酵素はＲＮＡ転写のレベルで、少なくとも１，０００倍だけ（ＧＡＬ５は例外であって、約５倍に誘導される）協調的に誘導される。ＧＡＬ１、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０遺伝子を分子的にクローニングし配列決定した。それぞれのコーディング領域の５’側の調節及びプロモーター配列は、１ａｃＺ遺伝子のコーディング領域に隣接して配置した。これらの実験で、ガラクトースの誘導に必要十分なプロモーター及び調節配列が決定された。
【００４０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅはまた、各々がＡＤＨのアイソザイムをコードする三つの遺伝子を有する。これらの酵素のうちの一つであるＡＤＨＩＩは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが酸化的増殖時にエタノールを炭素源として利用する能力に関与している。ＡＤＨＩＩアイソザイムをコードするＡＤＨ２遺伝子の発現はグルコースにより異化代謝産物抑制されるため、０．１％（ｗ／ｖ）のレベルのグルコースの存在下では発酵的増殖時のＡＤＨ２遺伝子の転写は実質的に行われない。グルコースが欠失しており且つ非抑制炭素源が存在すると、ＡＤＨ２遺伝子の転写は１００〜１０００倍誘導される。この遺伝子を分子的にクローニングして配列決定し、転写の抑制解除（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）に必要十分な調節及びプロモーター配列を決定した。
【００４１】
アルファ接合因子（ａｌｐｈａ  ｍａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）は、ＭＡＴα細胞とＭＡＴａ細胞との間の接合に必要とされるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ性フェロモンである。このトリデカペプチドは、粗面小胞体内に送られ、グリコシル化され、タンパク質分解的にプロセシングされて、細胞から分泌される最終成熟形態となるプレプロフェロモンとして発現される。この生化学的経路は、外来ポリペプチドの発現ストラテジーとして利用されてきた。アルファ接合因子遺伝子は分子的にクローニングされ、プレプロリーダー配列を有する該遺伝子のプロモーターは種々のポリペプチドの発現及び分泌に利用されてきた。また、ＰＨＯ５遺伝子プロモーターは低濃度ホスフェートによって誘導し得ることが判明した。これは、酵母内での外来タンパク質の生理学的に調節された発現にとっても有用である。
【００４２】
アルファ接合因子プロモーターは、表現型的にαである細胞内でのみ活性を示す。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにはＳＩＲとして知られている四つの遺伝子座があり、これらはａ及びα情報の通常サイレントの別のコピーの抑制に必要なタンパク質を合成する。この抑制事象を妨害する温度感受性（ｔｓ）障害が、これらの遺伝子座のうち少なくとも一つの座の遺伝子産物内に存在する。この突然変異体では、３５℃での増殖が抑制を阻止し、その結果、アルファ接合因子プロモーターが不活性である表現型的にａ／αの細胞が生じる。温度を２３℃にシフトすると、細胞は表現型的にαに戻り、その結果プロモーターが活性になる。ｔｓ  ＳＩＲ障害を有する株の使用は、幾つかの外来ポリペプチドの制御された発現について説明されてきた。
【００４３】
当業者には容易に理解されるように、ＰＤＩの発現のための適当な酵母株は広範囲の候補の中から選択される。適当な酵母株の非限定的具体例としては、プロテアーゼ欠失及び変化したグリコシル化能力といったような遺伝子型的及び表現型的特徴を有するものが挙げられる。
【００４４】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属は様々な種からなる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは種々の外来ポリペプチドの組換えＤＮＡ仲介発現のための宿主として最も一般的に使用されている。しかしながら、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の他の種の問の区別は必ずしも明確ではない。これらの種の多くはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅと交雑することができ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのプロモーターと類似の又は同じプロモーターを有していると思われる。従って、当業者には容易に理解されるように、ＰＤＩ発現のための宿主株の選択範囲は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属の別の種、例えば非限定的具体例としてｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、ｅｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｓ、ｋｌｕｙｖｅｒｉ、ｍｏｎｔａｎｕｓ、ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ、ｒｏｕｘｉｉ及びｕｖａｒｕｍにまで広がる。
【００４５】
幾つかの酵母属、例えばＣａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓは、唯一の増殖用炭素源としてのメタノールの利用について類似の代謝経路を有することが判明した。この代謝経路に関与する酵素であるアルコールオキシダーゼの遺伝子はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓから単離されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓアルコールオキシダーゼプロモーターは単離されて、発現のメタノール誘導に敏感であることが判明した。このような誘導可能プロモーターは、酵母内でのポリペプチド発現に有用である。特に、このプロモーターは、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ内での異種遺伝子の誘導可能な発現用のプラミド上で活性であることが判明した。この観察は、別の酵母属が活性型のポリペプチドの組換えＤＮＡ仲介発現のための宿主として機能する可能性を強調するものである。従って、当業者には容易に理解されるように、ＰＤＩ発現のための宿主の選択範囲は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ科及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ料の別の酵母属の種、例えば非限定的具体例としてＣａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｏｐｓｉｓ及びＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓにまで広がる。
【００４６】
発現ベクターは、多くの方法、例えば非限定的具体例として形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合法及び電気穿孔法のうち任意の方法を用いて宿主細胞内に導入し得る。発現ベクター含有細胞はクローン的に増殖し、個々に分析して、ＰＤＩタンパク質を産生するかどうかを調べる。ＰＤＩ発現宿主細胞クローンの同定は、幾つかの方法、例えば非限定的具体例として抗ＰＤＩ抗体に対する免疫学的反応性、及び宿主細胞結合ＰＤＩ活性の存在によって実施し得る。
【００４７】
ＰＤＩ  ＤＮＡの発現はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生した合成ｍＲＮＡを用いて実施し得る。合成ｍＲＮＡは種々の無細胞システム、例えば非限定的具体例としてコムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞ベースのシステム、例えば非限定的具体例としてカエル卵母細胞内へのマイクロインジェクションで効率的に翻訳できる。
【００４８】
当業者には容易に理解されるように、ＰＤＩは、細胞当たり単一のコピー又は複数のコピーで、宿主細胞ゲノムに組込まれた組換え発現カセットに由来する組換え宿主内で発現され得る。また、これも当業者には明らかであろうが、ＰＤＩは、細胞当たり単一のコピー又は複数のコピーで自律的複製プラスミド上に存在する組換え発現カセットに由来する組換え宿主内で発現され得る。
【００４９】
組換えＰＤＩを発現する組換え宿主細胞は、別の組換え遺伝子の発現のための宿主として使用し得る。本発明の新規の方法は、組換えＰＤＩを産生する宿主細胞内で、ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質をコードするＤＮＡを発現させることにより、ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の収率を実質的に増加させる。当業者には容易に理解されるように、本発明の方法ではジスルフィド結合をもつ種々のタンパク質が産生され得る。ジスルフィド結合をもつタンパク質の非限定的具体例としては、分泌されるか又は細胞結合状態を保持するタンパク質が挙げられる。ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質の発現のための組換えＤＮＡ構築物は、ＰＤＩについて詳述した方法によって形成し得る。当業者には明らかなように、ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質をコードするＤＮＡは、細胞当たり単一のコピー又は複数のコピーで、宿主細胞ゲノムに組込まれた組換え発現カセットから発現され得る。また、これも当業者には明らかであろうが、ジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質をコードするＤＮＡは、細胞当たり単一のコピー又は複数のコピーで、自律的複製プラスミド上に存在する組換え発現カセットから発現され得る。更に、これも当業者には容易に理解されることであるが、ＰＤＩをコードするＤＮＡ及びジスルフィド結合をもつ組換えタンパク質をコードするＤＮＡは、細胞当たり単一のコピー又は複数のコピーで、同一プラスミド上に存在し得る。ジスルフィド結合をもつ二つ以上のタンパク質が、組込まれたカセットもしくはプラスミド上のカセット、又はこれらの組合わせから同時発現され得ることも当業者には明らかであろう。
【００５０】
組換え宿主細胞内でのＰＤＩの発現後は、ＰＤＩタンパク質を回収して、タンパク質中のジスルフィド結合の形成を触媒することができる活性型の精製ＰＤＩを取得し得る。ＰＤＩ精製方法は幾つか存在し、使用に適している。天然起源に由来するＰＤＩの精製について前述したように、組換えＰＤＩは細胞溶解物及び抽出物、又はならし培養培地から、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィーを様々に組合わせて又は個々に使用して精製し得る。
【００５１】
更に、組換えＰＤＩは、ＰＤＩに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて形成したイムノアフィニティカラムを用いて、別の細胞タンパク質から分離することができる。
【００５２】
ＰＤＩに対する単一特異性抗体を、ＰＤＩに対して反応性を示す抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載の方法を用いて、ＰＤＩに対して反応性を示すモノクローナル抗体として製遺する。本明細書中の単一特異性抗体は、ＰＤＩに対する均一結合特性を有する単一の抗体種又は複数の抗体種であると定義される。本明細書中の均一結合（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ）という用語は、抗体種が特定の抗原又はエピトープ、例えば前述のようなＰＤＩと結合する能力を指す。酵素特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ等の動物、好ましくはウサギを、免疫アジュバントを用いて又は用いないで、適当な濃度のＰＤＩで免疫感作することにより産生する。
【００５３】
最初の免疫感作の前に免疫前血清を回収する。許容し得る免疫アジュバントと組合わせたＰＤＩを約０．１ｍｇ〜１０００ｍｇで各動物に投与する。許容し得る免疫アジュバントの非限定的具体例としては、フロインドの完全アジュバント、フロインドの不完全アジュバント、ミョウバン沈降物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ及びｔＲＮＡを含む油中水エマルジョンが挙げられる。最初の免疫感作は、好ましくはフロインドの完全アジュバント中の酵素を、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又はその両方で複数の部位に注射することからなる。各動物から一定の時間間隔、好ましくは一過間間隔で採血して、抗体力価を測定する。動物には、最初の免疫感作後に、ブースター注射をしてもしなくてもよい。ブースター注射をした動物には、通常、同量のフロインド完全アジュバント中酵素を同一経路で与える。ブースター注射は、最大力価が得られるまで約３週間の間隔で行う。各ブースター感作から約７日後、又は単一免疫感作の後で約１週間毎に動物から採血し、血清を回収し、アリコートを約−２０℃で貯蔵する。
【００５４】
近交系マウス、好ましくはＢａｌｂ／ｃをＰＤＩで免疫感作して、ＰＤＩと反応するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を製造する。マウスは、前述のように、ＩＰ又はＳＣ経路で、同量の許容し得るアジュバントに混入した約０．５ｍｌの緩衝液又は生理食塩水中約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１ｍｇのＰＤＩで免疫感作する。好ましくはフロインドの完全アジュバントを使用する。マウスは０日日に最初の免疫感作を施し、約３〜約３０週間にわたって休息させる。免疫感作したマウスには、リン酸塩緩衝生理食塩水のような緩衝溶液中約０．１〜約１０ｍｇのＰＤＩの投与からなる一回以上のブースター免疫感作を、静脈注射（ＩＶ）によって施す。抗体陽性マウスに由来するリンパ球、好ましくは脾臓リンパ球を、当業者に公知の標準的方法で免疫マウスから脾臓を除去することによって得る。脾臓リンパ球と適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞とを、安定なハイブリドーマを形成させる条件下で混合して、ハイブリドーマ細胞を製造する。融合相手の非限定的具体例としては、マウス骨髄腫Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１；ＭＰＣ−１１；Ｓ−１９４及びＳｐ２／０が挙げられるが、好ましいのはＳｐ２／０である。抗体産生細胞及び骨髄腫細胞を、約３０％〜約５０％の濃度で、約１０００ｍｏｌ．ｗｔ．のポリエチレングリコール中で融合させる。当業者に公知の方法で、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを添加したダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）での増殖により、融合したハイブリドーマ細胞を選択する。約１４、１８及び２１日目に増殖陽性ウェルから上清液を回収し、ＰＤＩを抗原として用いる固相イムノラジオアッセイ（ＳＰＩＲＡ）のようなイムノアッセイによってスクリーニングし、抗体の産生を調べる。ｍＡｂのアイソタイプを調べるために、培養液をＯｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ沈降アッセイでも検査する。抗体陽性ウェルからのハイブリドーマ細胞を、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎの軟質寒天技術（Ｓｏｆｔ  Ａｇａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｋｒｕｓｅ及びＰａｔｅｒｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７３）によりクローニングする。
【００５５】
初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）から約４日後、プリスタン感作Ｂａｌｂ／ｃマウスに、マウス当たり約０．５ｍｌで、約２×１０６〜約６×１０６のハイブリドーマ細胞を注射することにより、モノクローナル抗体をｉｎ  ｖｉｖｏで産生する。細胞のトランスファーから約８〜１２日後に腹水を回収し、当業者に公知の方法でモノクローナル抗体を精製する。
【００５６】
約２％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させてｉｎ  ｖｉｔｒｏのｍＡｂ産生を行い、十分な量の特異的ｍＡｂを得る。該ｍＡｂを当業者に公知の方法で精製する。
【００５７】
腹水又はハイブリドーマ培養液の抗体価を、種々の血清学的又は免疫学的アッセイ、例えば非限定的具体例として、沈降法、受動凝集、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で測定する。類似のアッセイを用いて、体液又は組織及び細胞抽出物中のＰＤＩの存在を検出する。
【００５８】
当業者には容易に理解されるように、単一特異性抗体を製造するための前述の方法は、ＰＤＩポリペプチドフラグメント又は完全長さのＰＤＩポリペプチドに特異的な抗体の産生に使用し得る。
【００５９】
抗体がアガロースゲルビーズ支持体との共有結合を形成するようにＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで予備活性化したゲル支持体であるＡｆｆｉｇｅｌ−１０（Ｂｉｏｒａｄ）に抗体を加えて、ＰＤＩ抗体アフィニティカラムを形成する。抗体は、スペーサーアームとのアミド結合を介してゲルに結合する。次いで、残りの活性化エステルを１Ｍ  エタノールアミンＨＣｌ（ｐＨ８）でクエンチする。カラムを水及び０．２３Ｍ  グリシンＨＣｌ（ｐＨ２．６）で順次洗浄して、非結合抗体又は外来タンパク質を除去する。次いでカラムをリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．３）中で平衡化し、ＰＤＩを含む細胞培養上清又は細胞抽出物をゆっくりとカラムに通す。該カラムをリン酸塩緩衝生理食塩水で光学密度（Ａ２８０）がバックグラウンドに低下するまで洗浄し、次いでタンパク質を０．２３Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．６）で溶離する。次いで、精製ＰＤＩタンパク質をリン酸塩緩衝生理食塩水に対して透析する。
【００６０】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６１】
株及び増殖条件
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＭＤ４０／４Ｃ（ＭＡＴα、ｌｅｕ２−３−１１２、ｕｒａ２、ｈｉｓ３−１１、−１５、ｔｒｐ１）及びＡＳ３３２４（ＭＡＴα／ＭＡＴ“ａ”ｈｉｓ３／ｈｉｓ３、ｌｅｕ２／ｌｅｕ２、ｕｒａ３／ｕｒａ３、ｔｒｐ１／ｔｒｐ１）を、ＹＥＰＤ（１％バクトペプトン、１％酵母抽出物、２％グルコース）又はｐＨ５．８緩衝最少培地（０．６７％アミノ酸無含有酵母窒素ベース、２％グルコース、１％コハク酸、０．６％  ＮａＯＨ、５０μｇ／ｍｌメソ−イノシトール）に必要な塩基及びアミノ酸を加えたものの中で３０℃で増殖させた。
【００６２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲＹ１８８（ＭＡＴα、ｓｉｒ３−８、ｌｅｕ２−１１２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｈｉｓ４；Ｂｒａｋｅ，Ａ．Ｊ．ら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，ｐｐ・４６４２−４６４６）及びＢＪ１９９５（ＭＡＴα、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ１−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｇａｌ２；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｗ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，ｐｐ．４２８−４５３）をＰＤＩ過剰発現の評価に使用し、適当な実施例に記載のように増殖させた。
【００６３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α（ｓｕｐＥ４４ΔｌａｃＵ１６９（φ８０ｌａｃ  ＺΔＭ１５）ｈｓｄ  Ｒ１７  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｒｅｌＡ１）をプラスミドスクリーニング操作に使用した。
【実施例２】
【００６４】
ＤＮＡ操作
制限ヌクレアーゼ消化及びＤＮＡ連結を、酵素製造業者（ＢＣＬ、ＢＲＬ）の指示に従って実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換の棲準的プロトコル（Ｃｏｈｅｎら，１９７２，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，６９，ｐｐ．２１１０−９）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換の標準的プロトコル（Ｂｅｇｇｓ，１９７８  Ｎａｔｕｒｅ，２７５，ｐｐ．１０４−９；Ｉｔｏら，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，ｐｐ．１６３−８）を実施した。Ｈｏｌｍらの方法（１９８６，Ｇｅｎｅ，４２，ｐｐ．１６９−７３）でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからゲノムＤＮＡを製造した。
【実施例３】
【００６５】
ＰＤＩ１遺伝子の単離
高コピー数ＬＥＵ２−ｄ、２ミクロンベースベクターｐＭＡ３ａ（Ｃｒｏｕｚｅｔ及びＴｕｉｔｅ，１９８７，前出引用文献）のＢａｍＨＩ部位にクローニングしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＳＫＱ２ｎ［α／ａ  ａｄｅｌ／＋ａｄｅ２／＋ｈｉｓ１／＋；Ｇａｓｉｏｎら、前出引用文献］に由来するＤＮＡの部分的Ｓａｕ３Ａフラグメントを含む酵母ゲノムライブラリーを、ＰＤＩ１遺伝子についてのスクリーニングに使用した。３０マーオリゴヌクレオチド（５’ＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＴＡＧＡＡ３’）（配列番号：５）を、高度に保存されている「チオレドキシン様」活性部位（ＦＹＡＰＷＣＧＨＣＫ）（配列番号：４）に対して、但し酵母コドンバイアスを用いて（Ｓｈａｒｐら，１９８６，前出引用文献）合成した。
【００６６】
非組込みヌクレオチドから標識オリゴヌクレオチドを分離すべくＤＥ−５２クロマトグラフィーを使用して、前記ライブラリーをスクリーニングするために、前記オリゴヌクレオチド５０ｎｇを［γ−３２ｐ］ｄＡＴＰ［Ａｍｅｒｓｈａｍ，３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ．］及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端標識した。次のようなコロニーハイブリダイゼーションにより、約２０，０００  ＤＨ５α組換えコロニーをニトロセルロースフィルターでスクリーニングした：各ニトロセルロースフィルターを、３５％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、１×デンハート溶液、２５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳ中で、３７℃で１６時間にわたり予備ハイブリダイズした。標識オリゴヌクレオチド（比活性４．８×１０９ｄｐｍ／μｇ）を９０℃で３分間変性し、次いで予備ハイブリダイゼーション緩衝液中で２ｎｇ／ｍｌに希釈し、フィルターに加えた。３７℃で更に１６時間インキュベートした後、フィルターを除去し、４×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２分間濯いだ。該フィルターを一晩オートラジオグラフイーにかけた。
【００６７】
３９個の潜在的陽性コロニーが同定され、これらを前述のスクリーニングに更に２画かけると、その後で１０個の陽性クローン（標識付きＣ１〜Ｃ１０）が得られた。これらのクローンのうちの二つ（Ｃ７及びＣ１０）の制限地図を作成し、クローンＣ７を後続の研究のために選択した。
【実施例４】
【００６８】
ＤＮＡ配列の解析
配列決定に適した大きさのフラグメントを同定するために、クローンＣ７を一連の制限酵素で消化し、１％アガロースゲル上でフラグメントを分離し、真空プロッティング装置（Ｈｙｂａｉｄ  Ｌｔｄ．）を用いてＧｅｎｅｓｃｒｅｅｎ  Ｐｌｕｓメンブラン（ＤｕＰｏｎｔ）にトランスファーした。次いで、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（１９８２、前出引用文献）に実質的に従ってフィルターを予備ハイブリダイズし、その後、前述のように末端標識し変性した３０マーオリゴヌクレオチドプローブを加えた。ハイブリダイゼーションを６×ＳＳＣ中４３℃で２４時間実施し、次いで２回の洗浄を２００ｍｌの２×ＳＳＣ中室温で５分間行い、更に２回の洗浄を２００ｍｌの２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で１時間行い、最後に５００ｍｌの０．１×ＳＳＣ中で室温で１回洗浄した。次いでフィルターを−７０℃で４８時間オートラジオグラフイーにかけた。
【００６９】
ジデオキシ鎖ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒら，１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４，５４６３−６７）を用いて、クローンＣ７に由来する２．４ｋｂのＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを完全に配列決定した。配列決定に適した制限フラグメントを、Ｈｏｌｍｅｓ及びＱｕｉｇｌｅｙの迅速な方法（１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．１９３−７）を用いて配列決定用に製造したプラスミドＤＮＡとｐＵＣ１９とにサブクローニングした。更に、幾つかのフラグメントを一本鎖ベクターｍｐ１２又はｍｐ１３にクロ―ニングした（Ｍｅｓｓｉｎｇ，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１，ｐｐ．２０−７８）。一連の配列決定プライマー（１５〜１８マー）を合成した。これらのプライマーは、クローニングベクターのポリリンカー領域、又は予め推定した内部Ｃ７  ＤＮＡ配列にアニーリングする。プライマーのアニーリングに先立ち、プラスミドＤＮＡを０．２Ｍ  ＮａＯＨ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で３７℃で３０分間変性し、０．１容の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０の添加によって中和し、３容の９５％エタノールで−７０℃で１５分間沈降させた。［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＩＣＮ）を標識に使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの鎖伸長を行うために、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を製造業者の指示通りに使用した。反応を既に記述されている方法で解析した（Ｂｏｓｓｉｅｒら，１９８９，Ｇｅｎｅ，７８，ｐｐ．３２３−３０）。
【実施例５】
【００７０】
ＲＮＡの製造及び解析
株ＭＤ４０／４ｃの指数増殖細胞（５×１０６〜１×１０７細胞／ｍｌ）又は定常期細胞（２×１０８細胞／ｍｌ）から完全ＲＮＡを製造した。３０分間の熱衝撃（３０℃〜４２℃）にかけたＭＤ４０／４ｃの指数増殖細胞からもＲＮＡを抽出した。完全ＲＮＡは、本質的にＤｏｂｓｏｎらの方法（１９８３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１，２２８７−２３０２）に従って抽出した。
【００７１】
ノーザンプロット解析を次のように実施した：２０μｇの完全ＲＮＡを２０％ホルムアルデヒド、５０％脱イオンホルムアミド中で５５℃で１５分間加熱することにより変性し、次いで８％ホルムアルデヒドを含む１％アガロースゲル中で分離した。該ＲＮＡを真空プロッティングでニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ、Ｂ  Ａ８５）にトランスファーし、該フィルターを１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ中で５分間煮沸した。ハイブリダイゼーションを、１０×デンハート溶液、２×ＳＳＣ、５０ｍＭリン酸塩緩衛液ｐＨ６．５、４０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ、４００μｇ／ｍｌ熱変性サケ精子ＤＮＡ及び１〜５ｎｇ／ｍｌのプローブ中で４２℃で一晩実施した。フィルターを−７０℃で１〜５日間オートラジオグラフイーにかけた。使用したブロープは、ＰＤＩ１遺伝子に由来する０．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｔｕＩフラグメント（Ｆａｒｑｕｈａｒ，Ｒ．ら，前出引用文献、第２図参照）、並びにｐＢＲ３２２にクローニングしたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１８Ｓ及び２５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の一部分を含むプラスミドＳｃｐ７（Ｄｒ．Ｂ．Ｓ．Ｃｏｘ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄから入手）である。これらのブロープは、ランダムプライマー標識（ＢＣＬ）で製造業者の指示に従って標識した。
【実施例６】
【００７２】
Ｐ  ｄｉ１：：ＨＩＳ３対立遺伝子の構築
ＨＩＳ３遺伝子を有する１．８ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをプラスミドｐＭＡ７００から放出させ（Ｍｏｎｔｉｅｌら，１９８４、前出引用文献）、１％低融点アガロース（Ｓｉｇｍａ）上で精製した。該フラグメントのＢａｍＨＩ付着末端を、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（１９８２、前出引用文献）で、ｄＮＴＰｓとＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントとを用いて充填した。次いでＰＤＩ１遺伝子の１．２ｋｂ  ＤｒａＩ−ＢｇｌｌＩＩＩフラグメントを、プラスミドｐＵＣ１９のポリリンカー内のＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。最後に、ＨＩＳ３遺伝子を含む充填したＢａｍＨＩフラグメントを、ＰＤＩ１コーディング領域内の単一のＥｃｏＲＶ部位に連結した（第３図）。得られたｐｄｉ１：：ＨＩＳ３対立遺伝子を３．０ｋｂのＳａｌ１−ＥｃｏＲＩフラグメント上に遊離させ、低融点アガロ−ス上で精製し、Ｉｔｏらの酢酸リチウム形質転換プロトコル（１９８３、前出引用文献）を用いて二倍体株ＡＳ３３２４をＨｉｓ＋プロトトロフィ（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）に形質転換するのに使用した。
【実施例７】
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＰＤＩアッセイ
全タンパク質抽出物におけるＰＤＩ活性のアッセイを、Ｈｉｌｌｓｏらの方法（１９８４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０７，ｐｐ．２８１−９２）で実施した。
【００７４】
基質の調製
スクランブルリボヌクレアーゼ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、ランダムに形成されたジスルフィド結合を含む完全に酸化した混合物である。これは、市販の（Ｓｉｇｍａ）ウシ膵臓リボヌクレアーゼＡから下記の方法で調製する。
リボヌクレアーゼを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．６、８．９Ｍ尿素、１３０ｍＭジチオトレイトール（還元可能ジスルフィド結合に対して約１５倍モル過剰なジチオトレイトール）中３０ｍｇ／ｍｌ（約２．２ｍＭ）で、室温で１８時間〜２０時間、又は３５℃で１時間インキュベートする。
【００７５】
反応混合物を氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、その直後に、脱ガスした０．１Ｍ酢酸でＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムから溶離することにより、還元タンパク質を分離する。２８０ｎｍで溶離フラクションをモニターし、タンパク質含有フラクションをプールし、天然リボヌクレアーゼを標準として用いて、タンパク質濃度を分光光学的に又は化学的に測定する。
【００７６】
還元リボヌクレアーゼの試料を０．１Ｍ酢酸で約０．５ｍｇ／ｍｌに希釈する。固体尿素を最終濃度１０Ｍまで加え、塩酸サルコシンを０．１Ｍまで加える（サルコシンは濃厚尿素溶液中に存在するシアネートイオンと反応させるために加えられ、カルバミル化によってリボヌクレアーゼを不活性化し得る）。１ＭトリスでｐＨを８．５に調整し、暗所室温で２〜３日間インキュベートする。その間にタンパク質は大気Ｏ２によってランダムに再酸化される。このインキュベーションの後で、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）を用いて遊離チオール基を調べると、再酸化が完了していることが判明する（リボヌクレアーゼ分子当たり０．１以下の遊離チオール）。
【００７７】
氷酢酸でｐＨ４に酸性化し、０．１Ｍ  酢酸中でＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５から溶離することにより、スクランブル産物を回収する。タンパク質含有フラクションをプールし、１ＭトリスでｐＨ８に調整し、４℃で貯蔵する。
【００７８】
この方法によるスクランブルリボヌクレアーゼの収率は通常９０〜１００％である。該産物は溶液中４℃で６ヶ月まで安定であり、あるいは、５０ｍＭ  ＮＨ４・ＨＣＯ３、ｐＨ７．８中に透析し、次いで凍結乾燥して、−２０℃で無期限に貯蔵し得る白色綿毛状固体物質としてもよい。
【００７９】
アッセイの手順
基質、スクランブルリボヌクレアーゼは、約２％の天然リボヌクレアーゼ活性を有する高分子量ＲＮＡの加水分解開裂では本質的に不活性である。スクランブルリボヌクレアーゼ中の分子間及び分子内ジスルフィドの交換の触媒におけるＰＤＩの作用は、天然ジスルフィド結合、天然配座を回復させ、ＲＮＡに対するリボヌクレアーゼ活性を随伴的に回復させる（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｒｅｔｕｒｎ）。このようにして、ＰＤＩの活性を、処理中にアリコートが採取されるタイムコース（ｔｉｍｅ−ｃｏｕｒｓｅ）インキュベーションによってアッセイし、ＲＮＡに対するリボヌクレアーゼ活性を測定する。
【００８０】
タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼの試料を、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５に、最終量が９００μｌになるまで加え、１０−５Ｍジチオトレイトール（１０μ１の１ｍＭストック溶液、毎日新しく調製）と共に３０℃で２〜３分間予備インキュベートする。トリス−ＨＣｌ緩衝液も使用し得るが、その場合は活性が約２５％低下する。次いでアッセイを、スクランブルリボヌクレアーゼの１００μｌアリコート（１０ｍＭ酢酸中０．５ｍｇ／ｍｌストック溶液、毎日新しく調製）の添加により開始し、インキュベーション混合物を３０℃に維持する。より小さい規模で操作する場合は、前述の量を１／１０に減少して、最終アッセイ量を１００μ１とし得る。１０μ１アリコートを０．５分の時点で採取し、その後２〜３分間隔で１８分まで採取して、スクランブルリボヌクレアーゼの再活性化についてアッセイする。各アリコートは、３０℃で予め平衡化した石英キュベット内で、０．２５ｍｇの高度に重合した酵母ＲＮＡ（５０μｌの５ｍｇ／ｍｌストック溶液）を含む３ｍｌのＴＫＭ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５、２５ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）のアッセイ混合物に即座に加える。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ３５６分光光度計（バンド幅２．５ｎｍ）のデュアル波長モードを用いてリボヌクレアーゼ活性を３０℃でモニターし、Ａ２８０（ΔＡ）に対するＡ２６０の変化を測定する。ＲＮＡ加水分解速度（ΔＡ分−１）は１．５〜２分にわたって一定である。この速度に対してインキュベーションからのアリコートの採取時間をプロットしたグラフは、１５分まで直線である。時間推移（ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ）の該直線部分の勾配（ΔＡ分−１分−１）を三つ組みアッセイの線形回帰分析で計算し（相関係数は決まって≧０．９９である）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性の測定値とする。
【００８１】
ジチオトレイトールのみによるスクランブルリボヌクレアーゼの非酵素的再活性化の速度を測定するために、酵素試料を省略して対照インキュベーションを実施する。これらの速度は通常０．２×１０−３ΔＡ分−１分−１であり、酵素試料のタンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ活性の計算で差し引かれる。
【００８２】
１単位のタンパク質ジスルフィド−イソメラーゼ活性は、１リボヌクレアーゼ単位／分の速度でスクランブルリボヌクレアーゼの再活性化を触媒する量であると定義される。１リボヌクレアーゼ単位は、１吸収（ａｄｓｏｒｂａｎｃｅ）単位／分のＡ２８０に対するＡ２６０の変化を生起する量であると定義される。
【実施例８】
【００８３】
酵母ＬＹＳ２又はＵＲＡ３座にＰＤＩ発現カセットを組込むためのベクターの構築
ＬＹＳ２での組込みのためのベクターを下記の手順で構築した。プラスミドｐＵＣ１９をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、線形ベクターフラグメントをゲル精製した。次いでこのフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、得られた２．７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントをゲル精製した。該精製フラグメントを下記の合成オリゴヌクレオチドと連結した：
５′ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３′（配列番号：６）
３′−ＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＣＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＡ−５′（配列番号：７）
該オリゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩ付着末端と、ＮｏｔＩ部位と、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と、ＮｏｔＩ部位と、ＨｉｎｄＩＩＩ付着末端とをこの順序で含む。得られたプラスミドｐＵＣ−Ｎｏｔは、両端でＮｏｔＩ部位に直接フランキングされた単一のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。
【００８４】
ＵＲＡ３座に組込むべき発現カセットのターゲッティングのためのプラスミドを下記の手順で構築した。酵母ＵＲＡ３遺伝子源は、ＹＲｐ１０に由来する１．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩフラグメントであった［Ｐａｒｅｎｔ，Ｓ．Ａ．ら，１９８５，Ｙｅａｓｔ，１，ｐｐ．８３−１３８］。プラスミドｐＵＣ−ＮｏｔをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、１．１ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ  ＵＲＡ３フラグメントと連結して、プラスミドｐＵＣ−Ｎｏｔ−ＵＲＡ３を得た。
【００８５】
ＬＹＳ２座への発現カセットの組込みをターゲッティングするためのプラスミドを下記の手順で構築した。酵母ＬＹＳ２遺伝子を有するプラスミドＹＩｐ６００［Ｂａｒｎｅｓ，Ｄ．Ａ．及びＴｈｏｒｎｅｒ，Ｊ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６，ｐｐ．２８２８−２８３８］をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＬＹＳ２遺伝子を有する４．５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９にクローニングした。次いでこのプラスミドをＰｖｕＩＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、ＬＹＳ２遺伝子を有する３．７ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化した。プラスミドｐＵＣ−ＮｏｔをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、平滑末端化し、３．７ｋｂｐのＬＹＳ２フラグメントと連結した。所期の構造を有する得られたプラスミドをｐＵＣ−Ｎｏｔ−ＬＹＳ２（ｐＮＬとも称する）で消化した。
【００８６】
ＬＹＳ２での組込みのための第二のベクターも構築した。プラスミドＹＩｐ６００をＮｃｏＩで消化し、ＬＹＳ２タンパク質コーディング配列の大部分を含む３．０ｋｂｐのＮｃｏＩフラグメントをゲル精製し、平滑（ｆｌｕｓｈ）末端化した。プラスミドｐＵＣ１３をＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化し、３．０ｋｂｐのＬＹＳ２フラグメントと連結して、組込みベクターｐＵＣ１３−ＬＹＳ２を得た。
【実施例９】
【００８７】
酵母アルファ因子分泌リーダーに融合したヒトＰＤＩを過剰産生する酵母株の構築
ヒトＰＤＩコーディング配列源は、Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら（１９８７、前出引用文献）によって記載されている重複部分的ｃＤＮＡクローン、ｐ２１０及びｐ１であった。ヒトＰＤＩ  ｃＤＮＡの５’末端を有するｐ２１０に由来する０．４５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＵＣ１８にクローニングして、プラスミドｐＵＫＣ１５０を得た。次いで該プラスミドｐＵＫＣ１５０をＥｃｏＲＩ及びＡｖａＩで消化した（ＡｖａＩは成熟ヒトＰＤＩをコードする配列の第三のアミノ酸に対応する位置で切断する）。得られた３．１ｋｂｐのベクター主鎖（ｂａｃｋｂｏｎｅ）フラグメントをゲル精製し、下記の構造のオリゴヌクレオチドアダプターと連結した：
５′−ＡＡＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧＣＣＣ−３′（配列番号：８）
３′−ＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＧＧＧＣＴ−５′（配列番号：９）
該アダプターは成熟ＰＤＩコーディング配列の５末端を再構築し、所望の分泌リーダー配列への成熟ヒトＰＤＩ配列の正確な融合を可能にするような位置にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。
【００８８】
次いで、得られたプラスミドｐＵＫＣ１５９をＰｓｔＩで消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、ヒトＰＤＩコーディング配列の残部を有するプラスミドｐ１（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら，１９８７，前出参考文献）に由来する１．５ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントに連結して、プラスミドｐＵＫＣ１６０を得た。このプラスミドｐＵＫＣ１６０をＨｉｎｄＩＩ（前記オリゴアダプター内で切断する）で消化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化した。その結果得られた、成熟ヒトＰＤＩコーディング配列を有する１．９ｋｂｐのＨｉｎｄＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをゲル精製し、予めＳｔｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＧＳ４にサブクローニングした（ｐＧＳ４はアルファ接合因子（ＭＦα１）プレプロ分泌リーダー配列に融合した酵母ＧＡＬ１プロモーターを有する；Ｓｈａｗ，Ｋ．Ｊ．ら，１９８８，ＤＮＡ，１１７−１２６）。平滑末端化ＳｔｕＩ及びＨｉｎｄＩＩ末端の間に形成された接合部は、ＭＦα１プレプロリーダー配列とヒトＰＤＩ成熟部分との間の正確なインフレーム融合を再構築する（得られたプラスミドはｐＵＫＣ１６１と命名した；第４図）。
【００８９】
ＬＹＳ２組込みベクターｐＮＬ（ｐＵＣ−ＮｏｔＩ−ＬＹＳ２）をＳｔｕＩ及びＸｈｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって平滑末端化した。プラスミドｐＵＫＣ１６１をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、その結果得られた、ＧＡＬ１０プロモーター−アルファ因子プレプロリーダー − ヒトＰＤＩ発現カセットを有する２．８ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをゲル精製し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼでの処理によって平滑末端化した。前記平滑末端化ｐＮＬベクターフラグメントと該発現カセットフラグメントとを互いに連結し、該連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ  ３５６９１を形質転換した。所期の構造を有するプラスミドを含むものについて形質転換体をスクリーニングし、得られたプラスミドｐＮＬ−ＭＦα１−ｈＰＤＩを多量に製造した。ｐＮＬ−ＭＦα１−ｈＰＤＩをＮｏｔＩで消化すると、両端でＬＹＳ２  ＤＮＡ配列にフランキングされた６．２ｋｂｐの発現カセットが得られる。消化したＤＮＡを用いて、スフェロプラスト法で（Ｈｉｎｎｅｎ  Ａ．ら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，ｐｐ．１９２９−１９３３）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＢＪ１９９５及びＪＲＹ１８８を形質転換した。ＮｏｔＩ末端はターゲッティングデバイスとして作用しながら発現カセットを染色体ＬＹＳ２座に向かわせ、該座で前記カセットが相同組換えを介して組込まれた。形質転換体を、アルファアミノアジピン酸含有固体培地で増殖するものについてスクリーニングした（Ｃｈａｔｔｏｏ，Ｂ．Ｂ．ら，１９７９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９３，ｐｐ．５１；Ｂａｒｎｅｓ及びＴｈｏｒｎｅｒ，１９８６，前出参考文献）。このような増殖は、株がｌｙｓ−であることを意味する。ＬＹＳ２プローブを用いて行ったクローン単離体のサザンブロット分析で、発現カセットがＬＹＳ２座に組込まれたことが確認された。ＢｇｌＩＩで消化した染色体ＤＮＡ調製物は、ＬＹＳ２プローブとハイブリダイズするバンドについて、５．０から７．８ｋｂｐへの所期のサイズ変化を示した。その結果得られた、組込み発現カセットを含むＢＪ１９９５及びＪＲＹ１８８関連株を、それぞれＢＪ１９９５／アルファ−ｈＰＤＩ及びＪＲＹ１８８／アルファ−ｈＰＤＩ（株＃１０７２Ａ）と命名した。
【実施例１０】
【００９０】
酵母ＰＤＩ又はヒトＰＤＩシグナル配列を用いるヒトＰＤＩを過剰産生する酵母株の構築
ＰＤＩ  ｃＤＮＡクローンｐ１（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら，１９８７，前出引用文献）をＰｓｔＩで消化し、ヒトＰＤＩ  ｃＤＮＡの３’領域を有する１．５ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩフラグメントをゲル精製した。次いで該フラグメントをｐＵＫＣ１５０（前記実施例９に記載）のＰｓｔＩ部位に挿入してプラスミドｐＵＫＣ１５１を得た。該プラスミドは、完全な全長ヒトＰＤＩ  ｃＤＮＡを含んでいる。該ｐＵＫＣ１５１をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、適当なオリゴヌクレオチドアダプター（ＥｃｏＲＩ認識配列を含む）と連結して、ＰＤＩ  ｃＤＮＡの３’末端に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位をＥｃｏＲＩ部位に変換した。得られたプラスミドｐＵＫＣ１５３は、２．１ｋｂｐのＥｃｏＲＩフラグメント上の完全ヒトＰＤＩコーディング配列を含んでいる。該プラスミドｐＵＫＣ１５３をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化した。その結果得られた、ヒトＰＤＩ配列の５’部分及び３’部分をそれぞれ有する０．４７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント及び１．７ｋｂｐのＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをゲル精製した。ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、２．７ｋｂｐのベクターフラグメントをゲル精製し、次いで前述の０．４７ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントに連結した。該連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ３５６９１を形質転換した。所期の構造を有するプラスミドを含む形質転換体からプラスミドＤＮＡを製造した。該ＤＮＡをＡｖａＩ及びＰｓｔＩで消化し、ヒトＰＤＩ配列の５’部分を有する０．３８ｋｂｐフラグメントをゲル精製した。
【００９１】
ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、２．７ｋｂｐのベクターフラグメントをゲル精製した。下記のオリゴヌクレオチドを合成した：
【００９２】
【化１】
2008271976.tif 000002
【００９３】
オリゴヌクレオチド＃１５１６５−２２０及び１５１６５−２４９をキナーゼ処理し、次いでそれぞれオリゴヌクレオチド＃１５１６５−２２１及び１５１６５−２５０とアニーリングした。ヒトＰＤＩシグナルペプチド配列を有するヒトＰＤＩを再構築するために、下記の連結を行った：ｐＵＣ１９  ２．７ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを１．７ｋｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ  ｈＰＤＩ３’フラグメント、０．３８ｋｂｐ  ＰｓｔＩ−ＡｖａＩ  ５’−ｈＰＤＩフラグメント、並びにアニーリングしたリンカー１５１６５−２２０及び１５１６５−２２１と連結した。
【００９４】
酵母ＰＤＩシグナル配列を有するヒトＰＤＩを再構築するために、下記の連結混合物を形成した：ｐＵＣ１９  ２．７ｋｂｐ  ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを１．７ｋｂｐ  ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ  ｈＰＤＩ３’フラグメント、０．３８ｋｂｐ  ＰｓｔＩ−ＡｖａＩ  ５’−ｈＰＤＩフラグメント、並びにアニーリングしたリンカー１５１６５−２４９及び１５１６５−２５０と連結した。（アニーリングしたリンカーはＢａｍＨＩ及びＡｖａＩ付着末端を含み、指示されたシグナルペプチド配列及び酵母５’非翻訳リーダー配列をコードする）。
【００９５】
連結混合物をＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ３５６９１中に形質転換し、形質転換体を、所期の構造を有するプラスミドを含むものについてスクリーニングした。オリゴヌクレオチドリンカーとフランキングＤＮＡとを含む領域にわたって延びるＤＮＡ配列を、ジデオキシ配列決定法で確認した。酵母ＰＤＩシグナルペプチド又はヒトＰＤＩシグナルペプチドをを有するヒトＰＤＩコーディング配列を、それぞれｙＳＰ−ｈＰＤＩ及びｈＳＰ  ｈＰＤＩと命名した。これらのカセットを含むこのようにして得た二つのプラスミド（それぞれｐＵＣ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ［第５図］及びｐＵＣ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ）をＳｍａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、その結果得られた、ｈＰＤＩカセットを有する１．５ｋｂｐフラグメントをゲル精製し、平滑末端化した。
【００９６】
プラスミドｐ４０１（非反復ＢａｍＨＩ部位によって分離されたＧＡＬ１０プロモーター及びＡＤＨ１転写ターミネーターを含む；第６図）をＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化し、前述のカセットと連結して、それぞれプラスミドｐＧＡＬ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ及びｐＧＡＬ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩを得た。これら二つのプラスミドをＳｍａＩ、ＳｐｈＩ及びＳｃａＩで消化し、その結果得られた、ＧＡＬ１０ｐ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ及びＧＡＬ１０ｐ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ発現カセットを有する３．２ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、次いでＬＹＳ２組込みベクターｐＵＣ１３−ＬＹＳ２のＸｈｏＩ部位（平滑末端化した）に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれｐＬＹＳ２−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ及びｐＬＹＳ２−ｙＳＰ−ｈＰＤＩと命名した。
【００９７】
組込み形質転換のために、前記二つのプラスミドをＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化して、ＬＹＳ２フランキング末端を有する線形フラグメントを形成し、該線形フラグメントを用いて酵母株ＢＪ１９９５及びＪＲＹ１８８を形質転換した。所望の発現カセットをＬＹＳ２に組込んだ形質転換体を、ＢｇｌＩＩで消化したゲノムＤＮＡのサザンブロットによって同定し、次いでＬＹＳ２プローブとハイブリダイズした。得られた株は、ＢＪ１９９５／ｈＳＰ−ｈＰＤＩ、ＢＪ１９９５／ｙＳＰ−ｈＰＤＩ、ＪＲＹ１８８／ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（株＃１１４８）及びＪＲＹ１８８／ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（株＃１１５７）であった。
【実施例１１】
【００９８】
ヒトＰＤＩ又は酵母ＰＤＩシグナルペプチドを用いるヒトＰＤＩのＣ末端ＨＤＥＬ突然変異体を過剰産生する酵母株の構築
小胞体内に常在する酵母タンパク質は通常、小胞体内での保持のためのシグナルであるＣ末端ＨＤＥＬアミノ酸配列を含む（Ｐｅｌｈａｍら，１９８８，前出引用文献）。これに対し、ヒトＰＤＩは、酵母内でのＥＲ保持に関しては余り機能しないことが明らかにされた（Ｌｅｗｉｓ，Ｍ．Ｊ．ら，１９９０，Ｃｅｌｌ，６１，ｐｐ．１３５９−１３６３）Ｃ末端ＫＤＥＬ配列（Ｐｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉら，１９８７，前出引用文献）を有する。従って、Ｃ末端ＫＤＥＬがＨＤＥＬに変化している改変ヒトＰＤＩを構築することが望まれた。これは下記の方法で達成された。
【００９９】
二つのプラスミドｐＵＣ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ及びｐＵＣ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（実施例９）をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、その結果得られた、ベクター配列とｈＰＤＩ配列の５’部分とを含む４．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントと、ｈＰＤＩコーディン配列の中間部分を含む０．５ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩフラグメントとをゲル精製した。次いで下記のオリゴヌクレオチドアダプターを合成した：
【０１００】
【化２】
2008271976.tif 000003
【０１０１】
二つのオリゴのアニーリングに次いで、該アダプターをＸｈｏＩで消化し（ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ付着末端が得られる）、二つの別個の反応で、それぞれ５’−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ又は５’−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ配列を含む４．０ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩベクターフラグメントと連結した。得られた二つのプラスミドをＸｈｏＩで消化し、ｈＰＤＩコーディング配列の中間部分を含む前述の０．５ｋｂｐのＸｈｏＩ−ＸｈｏＩフラグメントと連結し、ヒトＰＤＩコーディング配列を再構築するためにＸｈｏＩフラグメントが正確な方向で挿入されたプラスミドｐＵＣ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）及びｐＵＣ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）を得た。これら二つのプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、発現カセットを有する二つの異なる１．５ｋｂｐ  ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、次いでｐ４０１のＢａｍＨＩ部位に挿入して、それぞれｐＵＣ−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）及びｐＵＣ−ＧＡＬ１０ｐ−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）を得た。これら二つのプラスミドをＳｍａＩ、ＳｐｈＩ及びＰｖｕＩで消化した。得られた二つの２．５ｋｂｐ  ＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、次いで、予めＸｈｏＩで消化しておいたｐＵＣ１３−ＬＹＳ２と連結し、平滑末端化した。得られた二つのプラスミドｐＬＹＳ２−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）及びｐＬＹＳ２−ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）をＨｐａＩ及びＥｃｏＲＶでの消化によって線形化し、次いで別個の反応で株ＢＪ１９９５及びＪＲＹ１８８の形質転換に使用した。Ｌｙｓ−形質転換体を、アルファアミノアジピン酸含有固体培地上で選択した。ＬＹＳ２座に組込んだ所望の発現カセットを含む単離体を、ゲノムＤＮＡのサザンブロット分析によって同定した。得られた株を、ＢＪ１９９５／ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）、ＢＪ１９９５／ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）、ＪＲＹ１８８／ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）（株＃１２６８）及びＪＲＹ１８８／ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）（株＃１２６７）と命名した。
【実施例１２】
【０１０２】
酵母アルファ因子分泌リーダーを用いるヒトＰＤＩのＣ末端ＨＤＥＬ突然変異体を過剰産生する酵母株の構築
プラスミドｐＵＫＣ１６１（第４図）をＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで消化し、アルファ因子プレプロリーダー配列とｈＰＤＩの５’−セグメントとを有する０．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメントをゲル精製した。プラスミドｐＵＣ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）（実施例１１に記載）をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ末端ＨＤＥＬ改変を有するｈＰＤＩの３’セグメントを含む１．０ｋｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをゲル精製した。ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、得られたベクターフラグメントを、０．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＣｌａＩフラグメント及び１．０ｋｂｐのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントの両方と連結してプラスミドｐＵＣ−ＭＦα１−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）を得た。該プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、ＰＤＩカセットを有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、プラスミドｐ４０１（第６図）のＢａｍＨＩ部位に挿入して、プラスミドｐＧＡＬ−ＭＦα１−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）を得た。次いで該プラスミドを酵素ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ及びＰｖｕＩで消化し、その結果得られた、発現カセットを有する２．６ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化した。ｐＵＣ１３−ＬＹＳ２ベクターをＸｈｏＩで消化し、平滑末端化し、次いで前述の２．６ｋｂｐ平滑末端化フラグメントに連結した。得られたプラスミドｐＬＹＳ２−ＭＦα１−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）をＨｐａＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、次いで株ＪＲＹ１８８及びＢＪ１９９５の形質転換に使用した。得られた形質転換体を（実施例９に記載のように）ゲノムＤＮＡのサザンブロットで評価し、所望の発現カセットがＬＹＳ２座に組込まれていることを確認した。ＪＲＹ１８８形質転換体を株＃１２７９と命名した。
【実施例１３】
【０１０３】
ＬＹＳ２座の組込み発現カセットから酵母ＰＤＩタンパク質を過剰発現する酵母株の構築
完全酵母ＰＤＩ１遺伝子を有するプラスミドＣ７（実施例４に記載）をＥｃｏＲＶで消化し、酵母ＰＤＩ読取り枠（ＯＲＦ）のＣ末端部分（アミノ酸２２３からＯＲＦの末端まで）と３’非翻訳配列とを含む１．３ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶフラグメントをゲル精製し、プラスミドｐＡＴ１５３［Ｔｗｉｇｇ，Ａ．Ｇ．及びＳｈｅｒｒａｔｔ，Ｄ．，１９８０，Ｎａｔｕｒｅ，２８３，ｐｐ．２１６−２１８］のＥｃｏＲＶ部位に挿入して、ｐＵＫ１６９を得た。次いでプラスミドＣ７をＢａｎＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、酵母ＰＤＩ  ＯＲＦのアミノ酸６〜２２２をコードする０．６７ｋｂｐのＢａｎＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントをゲル精製し、下記の合成オリゴヌクレオチドアダプターと連結した：
５′−ＧＡＴＣＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＣＴＧＣＴＧ−３′（配列番号：１６）
３′−ＧＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧ−５′（配列番号：１７）
該オリゴヌクレオチドアダプターはそれぞれＢａｍＨＩ及びＢａｎＩ付着末端を有し、酵母ＰＤＩ  ＯＲＦのアミノ酸１〜５と１２塩基対の酵母５’非翻訳リーダー配列とをコードする。（ＡＴＧ開始コドンは下線で示されている）。得られた０．７ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントをゲル精製し、次いで、予めＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＡＴ１５３にサブクローニングして、プラスミドｐＵＫＣ１７０を得た。
【０１０４】
プラスミドｐＵＫＣ１６９をＥｃｏＲＶで消化し、その結果得られた、酵母ＰＤＩの前記Ｃ末端部分を有する１．３ｋｂｐのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＶフラグメントをゲル精製し、次いでｐＵＫＣ１７０の非反復ＥｃｏＲＶ部位に挿入し、それによって無傷の（完全な）酵母ＰＤＩ（ｙＰＤＩ）遺伝子を再生した。このようにして得たプラスミドをｐＵＫＣ１７５と命名した。
【０１０５】
ｐＵＫＣ１７５をＥｃｏＮＩで消化し、ｙＰＤＩ遺伝子を有する得られた２．１ｋｂｐフラグメントを平滑末端化し、ゲル精製した。ｐＵＣ１９をＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化し、平滑末端化し、前記平滑末端化ＥｃｏＮＩ  ｙＰＤＩフラグメントと連結した。該連結混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞を形質転換し、得られた形質転換体を、ｐＵＣ１９ポリリンカー内のＢａｍＨＩ部位がｙＰＤＩコーディング配列の３’末端に隣接して配置されるように適当な方向でｙＰＤＩ挿入体を有するプラスミドを含むものについてスクリーニングした。ＥｃｏＮＩフラグメント上のｙＰＤＩ  ＯＲＦの５’末端にはＢａｍＨＩ部位が既に存在していたため、該構築物（ｐＵＣ１９−ｙＰＤＩと命名）はこの時点で、１．９ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメント上にｙＰＤＩ  ＯＲＦを含む。ｐＵＣ１９−ｙＰＤＩをＢａｍＨＩで消化し、ｙＰＤＩ遺伝子を有する１．９  ＢａｍＨＩ  ｋｂｐフラグメントをゲル精製し、次いでベクターｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔ（ストック＃４０１）（第６図）のＢａｍＨＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ（第７図）はストック＃１０１５である。プラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔをＳｍａＩ、ＳｐｈＩ及びＳａｃＩで消化し、発現カセットを有する２．７ｋｂｐのＳｍａＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、次いでｐＵＫＣ１７１（ｐＵＫＣ１７１は、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化しておいたｐＵＣ１９にサブクローニングしたＹＩｐ６００（Ｂａｒｎｅｓ及びＴｈｏｒｎｅｒ，１９８６，前出引用文献）の４．５ｋ  ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ  ＬＹＳ２フラグメントを含む）の非反復ＳｔｕＩ部位にクローニングした。得られたｐＵＫＣ１７１−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩベクターをＥｃｏＲＩ及びＰｖｕＩＩで消化してＬＹＳ２−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ−ＬＹＳ２カセットを切除し、これを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＪＲＹ１８８及びＢＪ１９９５を形質転換した。得られたｌｙｓ−形質転換体を、実施例９に記載のように、ゲノムＤＮＡ調製物のサザンブロットにより評価した。ＬＹＳ２座に組込まれたＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩカセットを有する各株の単離体が検出された。得られた株をＢＪ１９９５／ｙＰＤＩ及びＪＲＹ１８８／ｙＰＤＩ（株＃１１５２）と命名した。
【実施例１４】
【０１０６】
ＵＲＡ３座への組込み発現カセットから酵母ＰＤＩを過剰産生する酵母株の構築
プラスミドｐＵＣ−Ｎｏｔ−ＵＲＡ３（実施例８）をＡｐａＩ及びＮｃｏＩで消化し（ＵＲＡ３遺伝子の一部分を欠失させるため）、平滑末端化した。プラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔをＥｃｏＲＩ、ＳｃａＩ及びＳｐｈＩで消化し、ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ発現カセットを有する２．８ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、前記ベクターフラグメントと連結して、プラスミドｐＮＵ−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩを得た。ＮｏｔＩでの消化により、ｐＮＵ−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩからＵＲＡ３−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３組込みカセットを切り出した。得られた線形フラグメントを用いて酵母株ＫＨＹ１０７を形質転換した。５−フルオロ−オロト酸含有固体培地上で（Ｂｏｅｋｅら，１９８４，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９７，ｐｐ．３４５）、ｕｒａ−形質転換体を選択した。得られたｕｒａ−形質転換体に由来するゲノムＤＮＡをＢｇ１ＩＩで消化し、ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔカセット由来の放射性標識したＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩフラグメントをプローブとして用いて、サザンブロットにより評価した。所望のＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ発現カセットをＵＲＡ３に組込んだ単離体が同定された。単離体Ｋ−Ｙ１は、ＵＲＡ３に組込まれた複数のコピーを有していた（株＃１１３６）。単離体Ｋ−Ｙ３は、ＵＲＡ３に組込まれたコピーを一つだけ有していた（株＃１１３７）。
【実施例１５】
【０１０７】
組換え宿主内のＰＤＩタンパク質量の評価
酵母株を、３×ＹＥＰＤ液体培地で、２３℃で２４時間増殖させた。２４時間が経過した後、培養物にガラクトースを最終濃度４．８％まで加えた。次いで培養物を２３℃で更に２４時間再インキュベートした。あるいは、酵母株を３×ＹＥＰＤで３０℃で２４時間培養した。細胞を回収し、無菌冷水で洗浄し、同量の３×ＹＥＰＤ−ガラクトース培地に再懸濁させた。酵母株を更に１６〜２５時間インキュベートし、その後回収し、タンパク質を抽出方法２（下記）で抽出した。
【０１０８】
タンパク質の抽出：
本質的にＭｅｌｌｏｒらの方法（１９８３，Ｇｅｎｅ，２４，ｐｐ．１〜１４）に従い、ガラスビーズ破壊法を用いて、指数増殖細胞又は定常期細胞からタンパク質を抽出した。
【０１０９】
方法１：２５ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７．０中のＰＭＳＦ（０．５ｍＭ）の存在下で細胞壁のガラスビーズ破壊を行い、次いで凍結−融解サイクルにかけてタンパク質を抽出し、１３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により可溶性タンパク質を回収した。ＰＥＧ（固体）、硫酸アンモニウム（０〜８０％）又は限外濾過膜（＜１００ｋＤａ）での濃縮の前又は後で、消費培養液の分析により最初に分泌を評価した。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄの方法（１９７６，Ａｎａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，ｐｐ．２４８−２５４）で測定した。
【０１１０】
方法２：方法１に従って、但し培養培地にＮａＯＨ及びβ−メルカプトエタノールを（それぞれ最終濃度０．２Ｍ及び１％で）加え、氷上に約１０分間放置し、その後ＴＣＡを最終濃度６％で加えて、細胞内試料を調製した。氷上で３０分間静置した後、遠心分離によってタンパク質を回収し、冷アセトンで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液に再懸濁させた。
【０１１１】
５０μｇの全可溶性タンパク質を、本質的にＳｃｈｕｌｔｚらの方法（１９８７，Ｇｅｎｅ，５４，ｐｐ．１１３−２３）に従って、一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％ポリアクリルアミド）とクーマシーブルー染色とで分析した。
【０１１２】
次の条件で電気泳動を実施した：１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル及びレーン当たり１０μｇのローディングされたタンパク質（タンパク質抽出方法１）。総てのゲル中でＳｉｇｍａ予備染色分子量標準を使用した。ゲルはＢｉｏＲａｄ  ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩゲルシステムで操作した。タンパク質濃度を計算せずに、細胞外抽出物をレーン当たり１５〜２０μｌでローディングした。電気泳動の間中、電圧は２００ボルト以下に維持した。
【０１１３】
Ｂｉｏｍｅｔｒａ半乾燥ウエスタンブロットシステムを用いて、タンパク質をニトロセルロースにトランスファーした。ニトロセルロース膜を５％（ｗ／ｖ）粉乳で１時間ブロックし、洗浄し、１：５００〜１：７５０の希釈度で３時間から一晩にわたり、抗ヒトＰＤＩポリクローナル抗体と共にインキュベートした。膜を洗浄し、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧを最終希釈度１：１００で加え、インキュベーションを１時間続けた。洗浄後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬキットを製造業者の指示通りに使用して、ブロットを発色した。
【０１１４】
最初のアッセイでは、株１０７２Ａが分泌ｈＰＤＩをウエスタンブロットで検出できるレベルで産生することが判明した。使用したＥＣＬプロトコルでは、検出レベルは０．０５μｇの精製ウシＰＤＩであった。この分泌ＰＤＩは、１００ｋＤａカットオフ限外濾過膜によって保持されたため、二量体であることが判明した。株１０７２Ａと対応するＨＤＥＬ変異株（１２７９）とを比較すると、ヒトＰＤＩは両方から分泌されていた。この実験では、最終培養／誘導条件を、増殖温度（℃）及び誘導期間について最適化した。前記二つの株は、２３℃で培養し次いで３０℃で１６時間誘導するか、又は３０℃で１６時間培養し誘導すると、より高いＰＤＩ合成レベルを示した。
【実施例１６】
【０１１５】
酵母内でアンチスタシンを発現させるためのベクターの調製
アンチスタシンは血液凝固因子Ｘａの強力なタンパク質阻害物質である。アンチスタシン（ＡＴＳ）は、メキシコヒルＨａｅｍｅｎｔｅｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの唾液腺から単離された（Ｎｕｔｔ，Ｅ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，ｐｐ．１０１６２−１０１６７）。その後、ＡＴＳをコードするｃＤＮＡがＨａｎ，Ｊ．Ｈ．らにより単離され、特徴が解明された（１９８９，Ｇｅｎｅ，７５，ｐｐ．４７−５７）。ＡＴＳは、組換え酵母によって分泌された異種タンパク質中の折り畳み及び適当なジスルフィド結合の形成に対する高レベルのＰＤＩ活性の影響を評価する上で理想的なリポータータンパク質である。なぜならＡＴＳは、タンパク質が生物学的活性を有するようにするために正確な対を形成しなければならない１０個のジスルフィド結合を有するからである。
【０１１６】
発現ベクターｐＫＨ４α２（Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ａ．ら，１９８９，Ｇｅｎｅ，８５，ｐｐ．５１１−５１６）を用いて、酵母内でＡＴＳを発現させた。前記ベクターは、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーターと、異種タンパク質の分泌を制御するための酵母ＭＦα１プレプロ分泌リーダー配列とを含む。ＡＴＳをコードする配列は、クローンλ５Ｃ−４（Ｈａｎ，Ｊ．Ｈ．ら，前出引用文献）に由来するサブクローニングしたＡＴＳ  ｃＤＮＡを基質として使用し且つ下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で単離した：
１．  ５′−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＧＡＴＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＧＧＡＣＣＣＧＧＧＴＧＴ−３′      （配列番号：１８）
２．  ５′−ＴＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＡＴＡＡＧＣＧＴＧＧＧＡＴＡＡＧＣＴＴ−３′      （配列番号：１９）
これらのプライマーは両方とも、ＰＣＲ産物のサブクローニングを容易にするためにＢａｍＨＩ部位を含む。第一のプライマーは、酵母ＫＥＸ２  ｙｓｃＦエンドプロテアーゼ開裂部位（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）Ｎ末端を、成熟ＡＴＳの第一アミノ酸残基に挿入する（酵母ｙｓｃＦエンドプロテアーゼは該配列中のＬｙｓ−Ａｒｇ部位のＣ末端側で開裂する）。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、次いでＢａｍＨＩ消化ｐＫＨ４α２に連結して、ｐＫＨ４α２／ＡＴＳ（Ｋ９９１）（第８図）を得た。次いでこの発現ベクターを用いて、スフェロプラスト法（Ｈｉｎｎｅｎら，１９７８，前出引用文献）で、表１に示す酵母宿主株を形質転換した。
【０１１７】
ロイシンを含まない合成固体培地（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｌ．ら，１９８７；Ｇｅｎｅ，６１，ｐｐ．１２３−１３３）上で形質転換体を選択し、クローン単離体についてストリークし、これらの単離体を後続の分析で使用した。株は、１７％グリセロール含有合成培地中で−７０℃で貯蔵することにより保存した。
【０１１８】
【表１】
2008271976.tif 000004
＋  ＰＤＩカセット及び株は次のように実施例に記述されている：アルファ−ｈＰＤＩ、実施例９；ｙｓＰ−ｈＰＤＩ及びｈＳＰ−ｈＰＤＩ、実施例１０；ｈＳＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）及びｙｓＰ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）、実施例１１；アルファ−ｈＰＤＩ（ＨＤＥＬ）、実施例１２；ｙＰＤＩ、実施例１３；ｙＰＤＩ−Ａ１及びｙＰＤＩ−Ａ３、実施例１４。
＊  形質転換株はＫ９９１アンチスタシン発現ベクターを含む。
【実施例１７】
【０１１９】
アンチスタシンの分泌に関する親株及びＰＤＩ過剰産生株の増殖及び評価
Ｋ９９１形質転換親ＪＲＹ１８８株と、酵母もしくはヒトＰＤＩを過剰産生する種々の形質転換誘導体とを、下記の方法でアンチスタシンの分泌に関して評価した。指示された株を−７０℃冷凍グリセロールストックからロイシン無含有合成寒天プレート上にストリークし、３０℃で３日間増殖させた。５ｍｌの３ｘＹＥＨＤ［６０ｇ  Ｄｉｆｃｏ酵母抽出物、３０ｇ  ＨｙＳｏｙペプトン、４８ｇグルコース／ｌ］培地を入れた培養管（１８×１５０ｍｍ）に小ループ一杯の細胞を接種し、組織培養ローラードラム上で２３℃で約１８時間インキュベートした。この段階で、ガラクトースを最終濃度４．８％（ｗ／ｖ）で加えて細胞を誘導し、培養物を２３℃で更に５日間インキュベートした。次いで、遠心分離で細胞を回収し、清澄化培地上清をアンチスタシン活性のアッセイのために保持し、該活性を因子Ｘａ活性の阻害によって測定した［Ｎｕｔｔ，Ｅ．ら，１９８８，前出引用文献］。該実験は三つ組みで実施した。結果を要約して表２に示す。
【０１２０】
【表２】
2008271976.tif 000005
【実施例１８】
【０１２１】
ＪＲＹ１８８及びＨＤＥＬ突然変異体形ヒトＰＤＩを過剰産生する関連株によるアンチスタシン分泌の評価
Ｋ９９１形質転換ＪＲＹ１８８と、三つの異なる分泌リーダーを有するＨＤＥＬ突然変異体形ヒトＰＤＩを過剰産生する形質転換誘導体株とを実施例１７に記載のように増殖し、清澄化培地上清を、実施例１７に記載のように因子Ｘａ阻害アッセイで分泌ＡＴＳレベルについて評価した。結果は表３に示す。
【０１２２】
【表３】
2008271976.tif 000006
【実施例１９】
【０１２３】
酵母株ＫＨＹ１０７及び酵母ＰＤＩを過剰産生する誘導体によるアンチスタシンの分泌
Ｋ９９１形質転換ＫＨＹ１０７と、酵母ＰＤＩを過剰産生する該株の形質転換誘導体とを増殖し、清澄化培地上清を、実施例１７に記載のように因子Ｘａ阻害アッセイで分泌ＡＴＳレベルについて評価した。結果は表４に要約して示す。
【０１２４】
【表４】
2008271976.tif 000007
Ｋ−Ｙ１は、ＵＲＡ３に多重コピーＧＡＬ−ｙＰＤＩを有するＫＨＹ１０７である。
Ｋ−Ｙ３は、ＵＲＡ３に単一コピーＧＡＬ−ｙＰＤＩを有するＫＨＹ１０７である。
Ａ１、Ａ２及びＡ３は、平行して評価した指示された株の種々のクローン単離体を示す。
酵母ＰＤＩの過剰発現の結果、単離体Ｋ−Ｙ３−Ａ１の場合は、ＡＴＳ活性の分泌が細胞当たりベースで４倍に増加し、容積ベースで約９倍の分泌が観察される。
【実施例２０】
【０１２５】
多重コピープラスミドから酵母ＰＤＩ又はヒトＰＤＩを過剰産生する酵母宿主株の構築
多重コピー酵母シャトルベクターＹＥｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．ら，１９７９，Ｇｅｎｅ，８，ｐｐ．１７−２４）は、酵母２ミクロンＤＮＡ複製起点と、ウラシル無含有合成培地で選択するための酵母ＵＲＡ３遺伝子とを含む。ＹＥｐ２４をＢａｍＨＩで消化し、得られた７．８ｋｂｐのＢａｍＨＩベクターフラグメントをゲル精製した（フラグメントａ）。プラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ（＃１０１５）をＥｃｏＲＩ、ＳｐｈＩ及びＳｃａＩで消化した。その結果得られた、ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨ１ｔ発現カセットを有する２．８ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩフラグメントをゲル精製した（フラグメントｂ）。プラスミドｐＵＫＣ１６１をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＧＡＬ１ｐ−−ＭＦα１プレプロ−−ヒトＰＤＩ発現カセットを有する２．８ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをゲル精製した（フラグメントｃ）。前記三つのフラグメントを平滑末端化し、次いで下記の手順で互いに連結した：（１）ベクターフラグメントａ及びフラグメントｂを互いに連結してプラスミドＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ（第９図）を得る：（２）ベクターフラグメントａ及びフラグメントｃを互いに連結してプラスミドＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩ（第１０図）を得る。得られた前記二つのプラスミドＤＮＡの大規模ＣｓＣ１製造を行った。二つの別個の形質転換反応で、酵母株ＪＲＹ１８８をＡＴＳ発現ベクターＫ９９１（実施例１６）及びＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩもしくはＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩで同時形質転換した。両方のプラスミドを含む形質転換体を、ロイシン及びウラシルの両方を欠失した合成培地で選択し、単離した単集落（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｌｏｎｙ）を同一培地上で再ストリークしてクローン単離体を選択した。二つの元の同時形質転換の各々について５個の前記クローン単離体を、培養管内の５ｍｌの３ｘＹＥＨＤ培地に接種し、組織培養ローラードラムで２３℃で２４時間インキュベートした。２４時間が経過した後、ガラクトースを最終濃度４．８％で加え、培養物を２３℃で更に５日間インキュベートした。遠心分離によって細胞を回収し、清澄化培地上清を因子Ｘａ阻害アッセイでＡＴＳ活性レベルについてアッセイした。ＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩプラスミド及びＡＴＳ発現ベクターを含む同時形質転換体は、ＡＴＳ発現ベクターのみを含む親ＪＲＹ１８８株と比べると、単離体に応じて３〜２６倍の分泌ＡＴＳ活性レベルを示した。ＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩプラスミドとＡＴＳ発現ベクターとを含む同時形質転換体は、ＡＴＳ発現ベクターのみを含む親ＪＲＹ１８８株と比べて、２〜３倍の分泌ＡＴＳ活性レベルを示した。
【実施例２１】
【０１２６】
所望の異種タンパク質の発現に使用した同一発現ベクターから酵母又はヒトＰＤＩを過剰産生する酵母宿主株の構築及び評価
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０遺伝子を、分岐型（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）ＧＡＬ１及びＧＡＬ１０プロモーターとこれら二つのプロモーターのＴＡＴＡボックスの間に位置する共通ＧＡＬ４結合ドメインとを含む二つの構造遺伝子の間の領域から分岐的に（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ）転写した。プラスミドｐＢＭ２７２（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｍ．及びＤａｖｉｓ，Ｒ．，１９８４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４，ｐｐ．１４４０）は、この分岐型酵母ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０プロモーターを０．８５ｋｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント上に含む（ＨｉｎｄＩＩＩ部位に隣接した内部ＢａｍＨＩ部位も有する）。このプロモーターフラグメントを使用して、分岐型プロモーターカセットベクターｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０を構築した。該ベクターは次の特性を有する：非反復ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩ部位により、この順序で、酵母ＡＤＨ１転写ターミネーター（０．３５ｋｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｐｈＩフラグメント）から分離した酵母ＧＡＬ１０プロモーター。非反復ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位によりＡＤＨ１転写ターミネーターの第二のコピーから分離した酵母ＧＡＬ１プロモーター。二つのＡＤＨ１ターミネーターエレメントの３’末端は、分岐型プロモーター発現カセット全体をＳｐｈフラグメントとして単離できるように、ＳｐｈＩ部位によってフランキングされている。このプラスミド内のベクター主鎖は、ポリリンカーの代わりに前記発現カセットを有するｐＵＣ１８である。
【０１２７】
プラスミドｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製してフラグメント「ａ」を形成した。プラスミドｐＵＫＣ１６１をＢａｍＨＩで消化し、成熟ヒトＰＤＩコーディング配列にインフレーム融合したアルファ因子プレプロリーダーを有する１．９ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、ベクターフラグメントａに連結して、プラスミドｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｈＰＤＩを得た。該プラスミドでは、アルファ因子プレプロ−−ｈＰＤＩ融合がＧＡＬ１プロモーターの制御下にある。プラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨｌｔ（実施例１３）をＢａｍＨＩで消化し、その結果得られた、酵母ＰＤＩコーディング配列を有する１．７ｋｂｐのＢａｍＨＩフラグメントをゲル精製し、次いでベクターフラグメントａに連結して、プラスミドｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｙＰＤを得た。該プラスミドでは、ＧＡＬ１プロモーターが酵母ＰＤＩの発現を制御する。このようにして得た二つのプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、平滑末端化し、それぞれｈＰＤＩ及びｙＰＤＩカセットを有するベクターフラグメントｂ及びｃを得た。
【０１２８】
ＡＴＳ発現ベクター（Ｋ９９１）をＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、成熟ＡＴＳのコーディング配列にインフレーム融合したアルファ因子プレプロリーダーを有するＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントをゲル精製し、平滑末端化し、別個の反応で二つの平滑末端化ベクターフラグメントｂ及びｃに連結した。制限地図で調べて正確な構造を有する得られたプラスミドを、それぞれｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｈＰＤＩ／ＡＴＳ（第１１図）及びｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｙＰＤＩ／ＡＴＳ（第１２図）で消化した。これら二つのプラスミドをＳｐｈＩで消化して発現カセットを遊離させ、ｈＰＤＩ関連又はｙＰＤＩ関連発現カセットを有するフラグメントを、予めＳｐｈＩで消化した酵母シャトルベクターｐＣ１／１（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．ら，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，ｐｐ．７７−８０）と連結した。その結果、二つのプラスミド、ｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０−ｈＰＤＩ／ＡＴＳ及びｐＣ１／１−ＧＡＬ１／１０−ｙＰＤＩ／ＡＴＳが得られた。これらのプラスミドでは、ＡＴＳ及びＰＤＩ関連発現カセットが、それぞれＧＡＬ１０及びＧＡＬ１プロモーターの制御下で同一の高コピー数ベクター上に存在していた。
【０１２９】
次いでこれら二つの発現ベクターを用いて、酵母株ＪＲＹ１８８、ＢＪ１９９５及び他の適当な酵母宿主株を形質転換した。形質転換体をロイシン無含有培地上で選択し、得られた形質転換体を、上記実施例に記載のように、ＡＴＳ及びＰＤＩの発現／分泌について評価した。
【０１３０】
表５（下記）に示す結果から明らかなように、ｈＰＤＩを過剰産生する単離体は、ｐＫＨ４α２／ＡＴＳのみを含む対照株と比べて数倍高いレベルのアンチスタシンを分泌する。また、酵母ＰＤＩを過剰産生する単離体は、対照株と比べて３〜１７倍高いレベルのアンチスタシンを分泌した。
【０１３１】
【表５】
2008271976.tif 000008
＊  ２３℃で誘導後５日目の収率。
【実施例２２】
【０１３２】
ＰＤＩ過剰産生酵母宿主株によるアンチスタシン分泌の増加に対する温度の効果
アンチスタシン発現ベクターｐＫＨ４α２／ＡＴＳ及びＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩもしくはＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩで同時形質転換した株ＪＲＹ１８８の選択した単離体を、２３℃又は３０℃での増殖後にアンチスタシン分泌について評価した。アンチスタシン発現ベクターのみで形質転換した親株ＪＲＹ１８８を平行して増殖した。３ｘＹＥＨＤ培地で２３℃又は３０℃で一晩増殖した後、ガラクトースを最終濃度４．８％で加えて細胞培養物を誘導し、２３℃又は３０℃の適当な温度で更に５日間増殖した。誘導後３〜５日で採取した培地試料を、因子Ｘａ阻害アッセイにより分泌アンチスタシンレベルについて評価した。表６の結果から明かなように、アンチスタシン発現は、ＰＤＩを過剰発現する総ての単離体について、誘導後３日目及び５日目の両方で、温度を３０℃にした時よりも２３℃にした時の方が遥かに大きかった。
【０１３３】
【表６】
2008271976.tif 000009
＊  種々のｈＰＤＩ単離体は、アンチスタシン発現ベクターＫ９９１及びＹＥｐ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩの両方を含んでいた。ｙＰＤＩ単離体は、ベクターＫ９９１及びＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩの両方を含んでいた。
【実施例２３】
【０１３４】
ＰＤＩを過剰産生する組換え酵母株によるマダニ抗凝血ペプチド（ＴＡＰ）の分泌
マダニ抗凝血ペプチド（ＴＡＰ）は、血液凝固因子Ｘａの強力な高選択性阻害物質である［Ｗａｘｍａｎ，Ｌ．ら，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，ｐｐ．５９３−５９６）。ＴＡＰはマダニＯｒｎｉｔｈｉｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａから単離された新規のセリンプロテアーゼ阻害物質である。ＴＡＰは、６個のシステイン残基を含む６０個のアミノ酸からなる（Ｗａｘｍａｎら，１９９０，前出引用文献）。ＴＡＰは、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーターと、ＴＡＰをコードする合成遺伝子にインフレーム融合した酵母ＭＦα１プレプロ分泌リーダー配列とを含む発現ベクターｐＫＨ４−ＴＡＰを用いて、酵母内で発現された（Ｎｅｅｐｅｒ，Ｍ．ら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，ｐｐ．１７７４６−１７７５２）。このベクターは、プレプロリーダーのアミノ酸７９の位置に配置されたＢａｍＨＩクローニング部位の存在に起因して、少し改変されたＭＦα１プレプロリーダー配列を含む（Ｎｅｅｐｅｒら，１９９０，前出引用文献）。
【０１３５】
ＴＡＰをコードする合成遺伝子にインフレーム融合した真正（ａｕｔｈｅｎｔｉｃ）ＭＦα１プレプロリーダー配列を含む第二のＴＡＰ発現ベクターｐＫＨ４−３Ｂ／ＴＡＰを構築した。合成ＴＡＰ遺伝子を含むプラスミドｐＫＨ４−ＴＡＰ（Ｎｅｅｐｅｒら，１９９０，前出引用文献）を、合成ＴＡＰ遺伝子の５’末端及び３’末端をそれぞれ改変するために、下記の二つのオリゴヌクレオチドプライマー
５′−ＴＡＣＡＡＣＣＧＴＣ  ＴＧＴＧＣＡＴＣＡＡ−３′（配列番号：２０）及び
５′−ＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧ  ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴ  ＴＡＧＡＴＧＣＡＡＧ  ＣＧＴ−３′（配列番号：２１）
を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、ＤＮＡ鋳型として使用した。
【０１３６】
該ＰＣＲ反応は、当業者に良く知られている方法（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ら編，１９９０，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）で実施した。得られたＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、ＢａｍＨＩで消化し、次いでゲル精製して、ＴＡＰコーディング配列の正確な５’末端に平滑末端を有し且つ翻訳終結コドンの３’側に付着ＢａｍＨＩ末端を有する、０．２ｋｂｐのブラントＢａｍＨＩフラグメントを得た。
【０１３７】
ベクターｐＫＨ４−３Ｂ（Ｈｏｆｍａｎ，Ｋ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０１，ｐｐ．１０５−１１１）は、ＭＦα１プレプロリーダーコーディング配列の３’末端に非反復ＳｐｈＩ部位を含む。ｐＫＨ４−３ＢをＳｐｈＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端化し、ＢｇｌＩＩで消化した。得られたブラントＢｇｌＩＩベクターフラグメントをゲル精製し、前述の０．２ｋｂｐ  ブラント−ＢａｍＨＩ  ＴＡＰフラグメントに連結して、ベクターｐＫＨ４−３Ｂ／ＴＡＰを得た。
【０１３８】
別個の形質転換反応で、酵母株ＢＪ１９９５、ＪＲＹ１８８及びＵ９を、ベクターＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ及びｐＫＨ４−ＴＡＰもしくはｐＫＨ４−３Ｂ／ＴＡＰで同時形質転換した。両方のプラスミドを含む同時形質転換体を、ロイシン及びウラシルの両方を欠失した合成培地上で選択し、単離した単集落を同一培地上で再ストリークして、クローン単離体を選択した。種々のベクター／宿主同時形質転換の各々について三つの前記クローン単離体を、培養管内の５ｍｌの４％グルコース含有ウラシル欠失改質５ｘＬｅｕ−培地（５ｘＬｅｕ−Ｕｒａ−）に接種した。該培養物を組織培養ローラードラム内で３０℃で２４時間インキュベートした。２４時間が経過した後、細胞を遠心分離によって回収し、４％ガラクトースを含む５ｍｌの５ｘＬｅｕ−Ｕｒａ−培地に最懸濁させた。得られた培養物を３０℃で更に４８時間インキュベートした。次いで細胞を遠心分離によって回収し、清澄化培地試料をＳＣＸ−ＨＰＬＣ又は因子Ｘａ阻害アッセイにより分泌ＴＡＰレベルについて評価した（Ｗａｘｍａｎら，１９９０，前出引用文献）。別の方法として、組換え酵母細胞を２３℃で２４時間増殖し、ガラクトースを最終濃度４％で加えることにより誘導し、次いで２３℃で更に５日間インキュベートした。次いで、清澄化培地試料を前述のように分泌ＴＡＰレベルについて評価した。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】マルチコピープラスミド上に酵母ＰＤＩをコードする遺伝子を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ形質転換体の無細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。
【図２】「ＣＯＭＰＡＲＥ」及び「ＤＯＴＰＬＯＴ」ソフトウエア（ＵＷＧＣＧ）を用いた酵母ＰＤＩとラットＰＤＩとの問のドットプロットアラインメント（ｄｏｔ  Ｐｌｏｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示している。哺乳動物ＰＤＩのドメイン構造は同じ縮尺で前記アラインメントの下に示されている。
【図３ａ】酵母ＰＤＩ１遺伝子の破壊に関するストラテジー及び結果を示している。
【図３ｂ】ｐｄｉｌ：：ＨＩＳ３破壊に対して異型接合体のＨｉｓ＋  ＡＳ３３２４株の四分子（ｔｅｔｒａｄ）分析の結果を示す。
【図４】プラスミドｐＵＫＣ１６１の構造を示している。
【図５】プラスミドｐＵＣ−ｙＳＰ−ｈＰＤＩの構造を示している。
【図６】ｐＵＣ１８−ＧＡＬｌ０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔとしても知られているプラスミドｐ４０１の構造を示している。
【図７】プラスミドｐＵＣ１８−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩ−ＡＤＨｌｔの構造を示している。
【図８】Ｋ９９１としても知られているプラスミドｐＫＨ４α２／ＡＴＳの構造を示している。
【図９】ＹＥｐ２４−ＧＡＬ１０ｐ−ｙＰＤＩの構造を示している。
【図１０】ＹＥＰ２４−ＧＡＬ１ｐ−ＭＦα−ｈＰＤＩの構造を示している。
【図１１】ｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｈＰＤＩ／ＡＴＳの構造を示している。
【図１２】ｐＵＣ−ＧＡＬ１／１０−ｙＰＤＩ／ＡＴＳの構造を示している。
【０１４０】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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