(57)【要約】【課題】蛋白質分解能を有する新規微生物、特に魚類の蛋白質に対し優れた分解能を有する新規微生物を提供すること。更に、当該微生物を用いた魚類の蛋白質分解処理方法、及び当該微生物による分解物を利用した植物生長促進剤を提供すること。  【解決手段】蛋白質分解能を有する新規微生物ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67、前記新規微生物を魚類又は魚類破砕物に作用させて蛋白質を分解することを特徴とする魚類の蛋白質分解処理方法、及び前記新規微生物を魚類又は魚類破砕物に作用させて得られる蛋白質分解物を含む植物生長促進剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛋白質分解能を有する新規微生物ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67（受領番号FERM  AP−２１２７９）。
【請求項２】
蛋白質が、魚類由来の蛋白質である請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
魚類又は魚類破砕物に請求項１に記載の微生物を作用させて蛋白質を分解することを特徴とする魚類の蛋白質分解処理方法。
【請求項４】
魚類又は魚類破砕物に請求項１に記載の微生物を作用させて得られる蛋白質分解物を含む植物生長促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白質分解能を有する新規微生物、特に魚類由来の蛋白質分解能を有する新規微生物に関する。更に、当該微生物を用いて魚類又は魚類破砕物の蛋白質を分解処理する方法に関する。また、当該微生物を用いて得られる魚類又は魚類破砕物の蛋白質分解物を含む植物生長促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類は多種多様な形態に加工されており、その水産加工工程では、頭、骨、尻尾の部分や内臓などが魚アラ等として排出されており、一部は肥料や家畜の飼料として利用されているものの、大部分は経費をかけて廃棄処理を行っているのが現状である。
【０００３】
これら魚類の有用な処理方法として、有機肥料としての利用がある。化学肥料は永年の使用により、土中微生物の種類及び量が低減する結果、土壌の悪化を引き起こす。これに対し、有機肥料は、土中微生物にそのような悪影響をもたらすことがなく、良質の土壌を維持することができる。
【０００４】
一般的に魚類の破砕物をそのまま有機肥料として用いる場合には、他の一般的な有機肥料（油粕、鶏糞等）と同様に土中での分解に時間がかかるため、速効性（即効性）に欠けるという問題がある。そのため、微生物を利用して短時間で分解することも提案されている。
【０００５】
例えば、特許文献１及び２には、イワシの魚鱗に対して分解活性を有する微生物が記載されている。しかし、魚鱗という特殊な部位であり、他の部位に対する有効性は確認されていない。
【０００６】
また、特許文献３には、魚類分解能を有する微生物として、ブルーギルの表皮から採取されたブレビバチルス属に属する微生物が記載されている。しかし、魚類の種類により有効な微生物やその作用が異なることも考えられ、魚類の分解処理に有用な更なる微生物が求められていた。
【特許文献１】特開平０４−１７３０８７号公報
【特許文献２】特開平０４−１７３０８８号公報
【特許文献３】特開２００５−２８７３９５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の主な目的は、蛋白質分解能を有する新規微生物、特に魚類（魚アラ）の蛋白質に対し優れた分解能を有する新規微生物を提供することにある。更には、当該微生物を用いた魚類の蛋白質分解処理方法、及び当該微生物による分解物を利用した植物生長促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決することを主な目的として鋭意検討を重ねた結果、ステノトロフォモナス属に属する新規微生物が上記目的を達成し得ることを見出し、更に鋭意検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の新規微生物及びそれを用いる魚類の蛋白質分解処理方法ならびにその分解物を含む植物生長促進剤に係る。
【００１０】
項１：蛋白質分解能を有する新規微生物ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67（受領番号FERM  AP−２１２７９）。
【００１１】
項２：蛋白質が、魚類由来の蛋白質である項１に記載の微生物。
【００１２】
好ましくは、魚類由来の蛋白質分解能を有する新規微生物ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67（受領番号FERM  AP−２１２７９）。
好ましくは、魚類がスズキ目サバ亜目の魚類である項２に記載の微生物。
【００１３】
項３：魚類又は魚類破砕物に項１に記載の微生物を作用させて蛋白質を分解することを特徴とする魚類の蛋白質分解処理方法。
好ましくは、魚類がスズキ目サバ亜目の魚類である項３に記載の処理方法。
【００１４】
項４：魚類又は魚類破砕物に項１に記載の微生物を作用させて得られる蛋白質分解物を含む植物生長促進剤。
好ましくは、魚類又は魚類破砕物に項１に記載の微生物を作用させて得られる蛋白質分解物を有効成分として含む植物生長促進剤。
好ましくは、魚類が、スズキ目サバ亜目の魚類である項４に記載の植物生長促進剤。
【００１５】
以下、本発明について、より詳細に説明する。
【００１６】
１．新規微生物ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67
本発明の微生物は、ステノトロフォモナス属に属する微生物であって、蛋白質分解能、特に魚類の蛋白質分解能に優れる微生物である。
【００１７】
後述の実施例に示すように、本発明の微生物は同定結果からステノトロフォモナス（Stenotrophomonas）属 に属すると認められ、更に該当種が判明しないことから、ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）に属せしめるのが適当であると認められる。また、後述の実施例に示すように、本発明の微生物は優れた蛋白質分解能を有するが、ステノトロフォモナス属においてこのような性質を有するものはこれまで知られていない。そのため、本発明の微生物を新規微生物と認定し、ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67と命名した。
【００１８】
当該新規微生物は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566茨城県つくば市東1-1-1中央第6）に、受領番号 FERM AP−２１２７９（通知年月日：平成19年3月26日）として寄託された。
【００１９】
本発明の微生物（細菌）は、蛋白質分解能を有し、特に魚類由来の蛋白質分解能に優れている。
【００２０】
更に、本発明の微生物は、リパーゼ活性、換言すると脂肪分解能を有し、脂肪と蛋白質とが併存する場合であっても、蛋白質の分解を効率よく行うことができる。
【００２１】
一般に、蛋白質分解菌を、蛋白質と脂肪の混合物に作用させると、脂肪により、菌の繁殖が阻害され、蛋白質の分解能力は低下すると考えられる。
【００２２】
しかし、本発明の微生物は、脂肪分の存在によって菌の繁殖がほとんど阻害されず、蛋白質を効率よく分解し得る。このため、本発明の微生物は、体脂肪分の多い魚類の分解処理においても好適に適用し得る。
【００２３】
本発明微生物で分解の対象となる魚類は限定的でなく、例えばスズキ目等をはじめ、各種の魚類に適用することが可能である。これらは、淡水魚又は海水魚のいずれであってもよい。特に、本発明では、体脂肪分の多い魚類にも好適に用いることができる。
【００２４】
体脂肪分の多い魚類としては、例えば、スズキ目サバ亜目のサバ等が挙げられる。
【００２５】
分解の対象となる蛋白質は、魚類又は魚類破砕物に含まれた形態であってもよい。例えば、魚類を前処理せず一匹丸ごと粉砕したものの処理あるいは魚類の破砕物にも適用することができる。
【００２６】
また、魚類由来の蛋白質を含むものであれば、魚類の部位は特に限定されず、筋肉、内臓、表皮等又はそれらの混合物等を対象とすることができる。また、食用等に用いた後の不要な部分（魚アラ）の分解処理にも有効である。
【００２７】
２．魚類の蛋白質分解処理方法
本発明の魚類の蛋白質分解処理方法は、本発明の微生物を魚類又は魚類破砕物に作用させることを特徴とする。
【００２８】
好ましくは、本発明の分解処理方法においては、微生物を魚類破砕物に作用させる。これによって、より短時間で魚類の蛋白質の分解処理を行うことができる。
【００２９】
魚類破砕物は、魚類本体を破砕することにより得ることができる。
【００３０】
破砕方法としては限定的でなく、その程度も所望の分解時間等に応じて適宜設定すれば良い。破砕は、例えばミキサー、ニーダー、クラッシャー等の公知の装置を用いて実施することができる。破砕の程度は限定的でないが、水に分散できる程度に処理することが望ましい。例えば、破砕物がミンチ状となるまで破砕処理することが望ましい。また、不要な部位（例えば頭部、ウロコ、内臓等）を回収し、これだけを破砕したものを分解処理の対象とすることもできる。
【００３１】
処理においては、微生物を作用させるに先立って、破砕物を滅菌処理することが好ましい。滅菌処理することによって、本発明微生物による分解作用をより優先的に進行させることができる。またより効果的な植物生長促進剤を提供することができる。
【００３２】
滅菌処理の方法は限定的でなく、例えば高圧蒸気滅菌（オートクレーブ）等の公知の滅菌方法を採用することができる。また、公知又は市販の滅菌装置を用いて滅菌を行うこともできる。この場合、滅菌処理に先立って、予め破砕物に水を加えることが望ましい。
【００３３】
加える水の配合量は、目的に応じて適宜設定し得るが、魚類又は魚類破砕物１００重量部に対して、通常５００〜４０００重量部程度、好ましくは１０００〜２０００重量部とすれば良い。
【００３４】
次いで、破砕物の希釈物に本発明微生物を作用させて分解処理する。この場合、希釈物と本発明微生物とを混合し、一定時間培養すれば良い。一般的には、希釈物（培地）１００重量部に対して０．５〜１０重量部、好ましくは０．５〜３重量部の本発明微生物を添加（植菌）し、３５〜５５℃程度の温度下、好ましくは３５℃程度で２４〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間程度培養すれば良い。この場合、攪拌しながら培養することが好ましい。
【００３５】
攪拌の程度は、破砕物の固形分濃度等にもよるが、一般的に１００〜１５０ｒｐｍ程度の範囲内で適宜設定することができる。攪拌の度合いはフラスコの形状により異なるが、一般的には攪拌速度を上げて酸素供給を増やすことによって分解を促進することができる。
【００３６】
培養が完了した後、本発明微生物による分解物を回収し、精製することなくそのまま植物生長促進剤の有効成分として使用することができる。ただし、本発明では、必要に応じて精製工程、抽出工程等を実施することを妨げない。
【００３７】
３．植物生長促進剤
本発明の植物生長促進剤は、本発明の微生物を魚類乃至魚類破砕物に作用させることによって得られる魚類の蛋白質分解物を含むことを特徴とする。
【００３８】
当該魚類の蛋白質分解物は、本発明の微生物により魚類由来の蛋白質に作用させて得られるペプチド及び／又はアミノ酸を１種又は２種以上含有している。例えば、本発明の微生物をサバアラに作用させて得られるサバアラ分解物（本培養液）は、サバ由来蛋白質を本発明の微生物により分解して得られるペプチド及び／又はアミノ酸を含有している。
【００３９】
当該蛋白質分解物は、植物生長促進剤の有効成分として機能する。
【００４０】
本発明において、植物の生長を促進するとは、植物体の重量の増加及び外観の形状の拡大を含む。
【００４１】
本発明における植物生長の促進は、例えば、主根の短縮、根毛密度の増加及び側根の減少の少なくとも１つによって特徴付けることができる。ただし、これら特徴に限定されず、他の部分の増殖その他の特徴的な変化も、本発明の生長の概念に包含される。
【００４２】
本発明の植物生長促進剤は、上記蛋白質分解物自体からなるものであってもよく、上記蛋白質分解物を有効成分として含む組成物であってもよい。
【００４３】
本発明の植物生長促進剤には、必要に応じて上記蛋白質分解物のほか、公知又は市販の肥料に含まれている成分、例えば、カリ成分Ｋ2Ｏ、リン成分Ｐ2Ｏ5又は窒素成分Ｎ又はそれらの混合物を配合することもできる。また、例えばＭｎＳＯ4、Ｎａ2Ｂ4Ｏ7、ＺｎＳＯ4、ＣｕＳＯ4、（ＮＨ4）６Ｍｏ７Ｏ24、ＦｅＳＯ4、Ｎａ2-ＥＤＴＡ等も添加することができる。これらは無水物又は水和物の形態のいずれであっても良い。
【００４４】
さらに、本発明の植物生長促進剤は、市販の液体肥料等に添加して使用することもできる。
【００４５】
また、本発明の植物生長促進剤は、必要に応じて水によって希釈することもできる。水を配合する場合には、予め水を添加しておいても良いし、あるいは使用時に水で薄めて用いても良い。
【００４６】
本発明の植物生長促進剤は、実質的にあらゆる種類の植物に適用することができる。例えば、アブラナ科（小松菜、キャベツ、カブ、白菜、水菜、ダイコン等）、バラ科（イチゴ、ビワ等）、キク科（レタス等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ等）、ウリ科（キュウリ、カボチャ等）、イネ科（イネ、ムギ等）、マメ科（大豆、小豆、ソラマメ等）等の各種の植物に適用できる。
【００４７】
本発明の植物生長促進剤による効果は、例えばポット栽培試験、農場試験等によって確認することができる。その他にも、試験管を用いる植物生長活性測定法（植物試験管法）を用いて植物生長促進効果を確認することができる。
【００４８】
本発明の植物生長促進剤により植物を育成する場合には、植物育成培地に本発明生長促進剤を含有させれば良い。例えば、植物育成培地が土壌である場合には、本発明生長促進剤を土壌に混入すれば良い。また、水耕栽培の場合には、例えば養液に本発明生長促進剤を溶解させたり、ロックウールに含浸させたりすれば良い。
【００４９】
また、本発明の植物生長促進剤は、育成前又は育成中のいずれの形態でも使用することができる。さらに、他の一般的な肥料（有機肥料又は化学肥料）とともに使用することもできる。
【００５０】
本発明植物生長促進剤の使用量は、対象とする植物の種類、土壌の質、栽培方法等に応じて適宜決定することができる。
【発明の効果】
【００５１】
本発明によれば、蛋白質分解、特に魚類の蛋白質分解に有用な微生物が提供される。
【００５２】
本発明の微生物は、脂肪分が存在する場合であっても、微生物の増殖が阻害されず、優れた蛋白質分解能を奏する。このため、体脂肪分の多い魚類又はその破砕物の分解処理においても、蛋白質を効率よく分解し得る。
【００５３】
また、本発明の微生物によれば、水産加工工場から排出される魚アラに含まれる蛋白質を効率よく分解できるのみならず、その分解によって植物の生長に有用な物質を作り出すことができる。
【００５４】
また、本発明の植物生長促進剤は、有機物であるため、化学肥料のように土壌環境を悪化させるようなことがなく、土中微生物に適した環境を維持することが可能である。
【００５５】
また、本発明の分解処理方法により、魚類を廃棄しなくても、農業等に再利用できる。また、食用に供される魚でも、その不要な部分を再利用することができる。このため、本発明は、資源の有効利用の促進にも大いに貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されない。
【００５７】
［実施例１］SB67株のスクリーニング
1-1．材料及び測定方法
(a)魚アラ(サバアラ)の調製
市販のサバを３枚におろし、身の部分を除いた、頭部、尻尾、内臓、骨の部分よりなる魚アラ(サバアラ)を得た。このサバアラは、同重量の蒸留水を加えて、ミキサーで破砕後冷凍保存(冷凍サバアラ)した。
【００５８】
(b)サバアラ培地の調製
以下に示す試薬を量り取り、それぞれ蒸留水で１０００mlにメスアップして溶液Ａ、溶液Ｂ、溶液Ｃを作成した。
溶液Ａ：(ＮＨ4)2ＳＯ4＝４０g、ＭｇＳＯ4＝４．９３g、ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ＝０．２９４g、ＮａＣｌ＝１０．０g
溶液Ｂ：Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＝７１．６g、ＫＨ2ＰＯ4＝２７．２g
溶液Ｃ：ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ＝２．０１g、(ＮＨ4)６Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ＝０．１５g、
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ＝０．２g、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ＝０．４g、
ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ＝１．４９g
続いて、解凍した前記(a)の冷凍サバアラを１００ml（約１００g）に対し、溶液Ａを５０ml、溶液Ｂを２００ml、溶液Ｃを１ml及び蒸留水649mLを加えて１０倍希釈し、サバアラ培地1000mlを作成した。
【００５９】
(c)ペプチド・アミノ酸濃度測定方法
サバアラ培地に植菌し培養した培養液（本培養液）を1.5mLチューブにとり、12,000rpm(13,200G）、5分で遠心した上清1mLにトリクロロ酢酸を6%（v/v）加え水溶性タンパク質を変性させ、再び12,000rpm、5分で遠心して沈殿させた。この上清を適宜希釈し（200〜500倍）、希釈液1mLとニンヒドリン溶液1mLを混合して沸騰水中で15分反応させた後、50%エタノール5mLを加え氷水中で冷やし反応を停止させた。この反応液の570nmの吸光度（A570）を測定（Hack社製・DR/2010）し、下記式１に示すチロシンで作成した検量線を用いてペプチド・アミノ酸濃度を測定した。
【００６０】
［式１］ ペプチド・アミノ酸濃度（μg/mL）＝A570／0.0176×希釈倍
尚、上記ニンヒドリン溶液は、ニンヒドリン０．８ｇ、ヒドリンダンチン０．１２ｇにメチルセルソルブ３０ml、４Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）１０mlを加えて調製した。前記４Ｎ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）は、酢酸ナトリウム三水和物２７２ｇに氷酢酸５０ml加え、１Ｍ−ＮａＯＨでｐＨ５．５に調整し、全量を５００mlとして調製した。
【００６１】
(d)根毛活性評価試験
植物生長培地を次のように作成した。粉末状寒天（Agar Powder）を除く表1に示す全ての試薬を混合した後、微量栄養素を添加し、次いで蒸留水で１Ｌにメスアップして寒天を加えた。前記微量栄養素は、表２に示す試薬を混合後、蒸留水で２００ｍＬにメスアップし、培地１Ｌ当たり１ｍＬの量で添加した。加熱して寒天を溶かした後、得られた寒天培地を試験管に１０mlずつ分注した。分注後の培地をオートクレーブ滅菌した後、培地が固まる前に、本培養液をろ過滅菌した上清を、ペプチド・アミノ酸濃度が培地に対して約30μg／mlとなるように適宜希釈して添加して攪拌後、培地を固まらせ、植物生長寒天培地を作製した。また、植菌を行わなかった本培養液をろ過滅菌した上清でも同様に寒天培地を作製した。さらに比較用として、上清を加えなかった寒天培地（コントロール）も作成した。
【００６２】
【表１】
2008245596.tif 000002
【００６３】
【表２】
2008245596.tif 000003
【００６４】
滅菌したコマツナ種子を、上記のように作製した植物生長寒天培地上に１粒蒔き、植物培養器（製品名「グロースキャビネット」三洋電機製）中にて２５℃、１５０００luxで１週間生育させた。
【００６５】
１週間後、生育したコマツナを根ごと抜き取り、根毛をメチレンブルーで染色した後、撮影し、撮影した写真の画像処理により、根毛密度を求めた。
【００６６】
根毛密度は以下の手順に従って評価した。コマツナの根を染色液で５分間染色してから水道水で５分間脱色した。さらにもう一度同様に５分間脱色してから、主根の先端から約５〜１０ｍｍの範囲をコンピュータマイクロスコープで撮影し、パソコンに取り込んだ後、画像処理ソフトウェア（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０ アドビシステムズ社）を使用して、画像をグレースケール（白黒２５５段階）に変換して、写真の明るさを定量化した。定量化した明るさにより、根毛部分(黒色の画像)と空白部(白色の画像)の比率を求めて根毛密度を求めた。即ち、最も明るい画像（白色の画像）に２５５、最も暗い画像（黒色の画像）に０の値を与え、画像のバックグラウンド（根毛の無い余白部分）をＫ値が０になるよう補正してからヒストグラムを表示し、画像全体の明るさを表示して、次式により、根毛密度を求めた。
【００６７】
［式］  根毛密度＝（２５５−写真の明るさの平均値）
また、相対根毛密度は、コントロールの根毛密度を１００としたときの各サンプルの根
毛密度の相対値（％）として算出した。
【００６８】
1-2.一次スクリーニング
1-1の(ｂ）により作成したサバアラ培地を試験管に５ml入れ、オートクレーブ滅菌（１２１℃／１５分）を行った。そして、各地から採取した土壌０．１gを１mlの滅菌水で懸濁させ、上澄みを０．０５ml植菌し、３７℃・１６０rpmで４８時間振盪培養した。
【００６９】
この菌取得用培養液の濾液(濾紙は、ＡＤＶＡＮＴＥＣ Ｎｏ．２：保留粒子径５μｍ)は油脂で白濁していたので、濾液１mlを採取し、遠心分離機で沈殿物（菌体）を分離後、蒸留水１mlで再懸濁させて濁度を測定した。
【００７０】
別の土壌を用いた菌取得用培養液についても同様の操作を繰り返し、濁度（ＯＤ660）０．５０以上の菌取得用培養液を選択した。
【００７１】
選択した菌取得用培養液を攪拌後、培養液100μlを採取し、滅菌水で希釈し、サバアラ寒天プレート（上記と同様に作成したサバアラ培地に２重量％寒天を加え、オートクレーブ滅菌後、滅菌シャーレに約２０mlずつ分注して固化させたもの）上に塗布した。温度３７℃で４８時間静置培養後、現れた菌株を単離し、一次取得菌株とした。
【００７２】
この結果、１１０の土壌サンプルより、９０菌株の一次取得菌株を得た。
【００７３】
1-3.二次スクリーニング
一次取得菌株(９０菌株)をＬＣ寒天プレート（Difco Laboratories社製  LB Broth・Lennox２０g、カゼイン１０g、寒天２０gを蒸留水で溶いて１０００mlにメスアップし、オートクレーブ滅菌後、滅菌シャーレに２０mlずつ分注して固化させたもの）上に画線し、３７℃で２４時間静置培養し、ハロー形成の有無を確認した。この結果、９０菌株中８菌株でハロー形成が確認されたがハロー形成が確認された菌株の種類数が少ないため、全ての一次取得菌株(９０菌株)について、ペプチド・アミノ酸への分解能力による二次スクリーニングを行った。
【００７４】
まず、全ての一次取得菌株(９０菌株)をオートクレーブ滅菌したＬＢ液体培地（Difco Laboratories社製、LB Broth・Lennox２０gを蒸留水で溶いて１０００mlにメスアップしたもの）に植菌し、３７℃・１６０rpmで２４時間浸盪培養（前培養）し、この前培養液０．０５mlをサバアラ培地５mlに植菌し、３７℃・１６０rpmで４８時間、浸盪培養（本培養）した。
【００７５】
本培養後、遠心分離（12,000rpm×５分）し、上清にトリクロロ酢酸（終濃度６重量％相当量）を加え、再び遠心分離してタンパク質を除去した。そして、この上清を希釈し、この希釈液のペプチド・アミノ酸濃度をニンヒドリン法を用いて分析し、ペプチド・アミノ酸濃度が高いものから１５菌株を二次取得菌株として選択した。
【００７６】
選択された１５菌株を下記表３に示す。
【００７７】
【表３】
2008245596.tif 000004
【００７８】
1-4.三次スクリーニング
二次取得菌株(１５菌株)について根毛活性評価試験により三次スクリーニングを行った。
【００７９】
二次スクリーニングの場合と同様に、菌株をＬＢ液体培地に植菌して前培養し、この前培養液をサバアラ培地に植菌し本培養した。
【００８０】
この本培養液を遠心分離機にかけ、上清（以下、本培養液上清ともいう）を採取して冷凍保存した。また、サバアラ培地に前培養液を植菌せずに本培養と同様に浸盪させた液（培養は行われていないが、以下、便宜上、未植菌本培養液という）の上清も冷凍保存した。
【００８１】
上記１５菌株による本培養液及び未植菌本培養液の上清を用いて、上記ｄ)の根毛活性評価試験を行い、根毛活性を調べた。なお、比較のために、上清を加えなかった植物生長寒天培地（コントロール）の根毛活性も調べた。
【００８２】
１５菌株と未植菌による相対根毛密度の結果を表４に示す。表４の値は、各菌株に対し、各３個（回）の根毛試験を行い、その平均値を示した。
【００８３】
【表４】
2008245596.tif 000005
【００８４】
この結果、成績の良い、Ａ９、１２及び１４を選択した。また、表１に示される結果でペプチド・アミノ酸濃度の高かったＡ１０も候補株として残した。
【００８５】
なお、試験中に、Ａ１４には２種類の菌が混在していたことが確認されたため、培養後、改めて分離した。
【００８６】
Ａ１４を分離したＡ１４ａとＡ１４ｂについて、前記二次スクリーニングと同じ方法ペプチド・アミノ酸濃度を測定した。この結果Ａ１４ａのペプチド・アミノ酸濃度はＡ１４ｂの約３倍であり、Ａ１４aの方を選択した。
【００８７】
1-5.四次スクリーニング
三次スクリーニングで得られた４菌株について、ポット試験により四次スクリーニングを行った。
【００８８】
ポット試験は以下の手順で行った。
【００８９】
1/10000アールのノイバウエルポットを準備し、水洗した川砂を充填した。
【００９０】
三次スクリーニングで得られた４菌株について、二次スクリーニングの場合と同様の方法で本培養液を作成した。すなわち、オートクレーブ滅菌したＬＢ液体培地に植菌し、３７℃・１６０rpmで２４時間浸盪培養（前培養）し、この前培養液１mlをサバアラ培地１００mlに植菌し、３７℃・１６０rpmで４８時間、浸盪培養（本培養）した。また、比較のために、同様の方法で、植菌を行わなかった未植菌本培養液も作成した。
【００９１】
本培養液の窒素分がポット当たり１００ｍｇとなるように、作成した本培養液を前記ポットに添加混合した。添加混合後、１週間後にコマツナ種子を２５粒播種し、播種後１週間で９株に間引いた。この９株をさらに２週間生育させた後、株径、重量（根の部分を除く）並びに最大葉長を測定した。
【００９２】
測定結果を下記表５に示す。
【００９３】
【表５】
2008245596.tif 000006
【００９４】
この結果、Ａ９が、株径、重量及び最大葉長の全てにおいて最も良い結果を示した。
【００９５】
［実施例2］菌株の同定
分離した菌株の同定は、簡易形態観察と、16S rDNAの相同性検索を実施することにより行った。
【００９６】
2-1．簡易形態観察結果
簡易形態観察を行った結果、以下の表現形質を有することがわかった。
【００９７】
（細胞形態）
桿菌                  （大きさ：0.7-0.8×1.5-2.5μm）
グラム染色                        −
コロニー色調（LB Agar平板培地） 黄色
（生理的性質）
酸素に対する態度                好気性
生育温度                    30−37℃で良好な生育
【００９８】
2-2．16S rDNAの相同性検索
本菌株の16S rDNAの一部をPCR法により増幅し、得られたDNA断片をクローニングして塩基配列を解析した。解析された本菌株の16S rDNA配列を配列表の配列番号１に示す。
解析された本菌株の16S rRNA配列について、国際塩基配列データベースBLASTを用いて細菌基準株データベースに対する相同性検索を行った。その結果、本菌株の16S rDNA部分塩基配列は、相同率99.0％でPseudomonas hibiscicola ATCC19867株に対し最も高い相同性を示すことがわかった。しかし、Anzaiら(Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, 50, pp1563-1589.)によれば、P. hibiscicolaは、他のPseudomonas属細菌とは系統的に異なり、XanthomonasグループのStenotrophomonas属細菌に近縁であることが知られている。また、2007年3月9日時点ではP. hibiscicolaはStenotrophomonas属には移籍していないものの、遺伝子解析の結果からは本菌株およびP. hibiscicolaは系統的に、属レベルでは、Stenotrophomonas属細菌に含めることが妥当と判断される。また、簡易形態観察の結果は、Stenotrophomonasの一般的な性状を示していると考えられる。このことから、本菌株をStenotrophomonas属に属せしめることが妥当と判断された。更に、種に関しては、100%の相同性を示すものは無かったため、sp.（スピーシーズ）とすることが妥当と考えられる。
【００９９】
このことから、最終的に本菌株をStenotrophomonas sp.と同定し、ステノトロフォモナス・スピーシーズ（Stenotrophomonas sp.）SB67株と命名した。以下、SB67株とも称する。
【０１００】
［実施例3］SB67株の特性
同定したSB67株ついて、以下の方法で、更に特性を調べた。
【０１０１】
3-1．試料の調製
LB培地で前培養したSB67株をサバアラ培地に1％相当量植菌し、37℃、120rpmで48時間振盪培養した。このとき、培養開始から6時間間隔で培養液を採取し、プロテアーゼ活性及びリパーゼ活性を測定した。
【０１０２】
3-2.プロテアーゼ活性
培養液を12,000rpmで5分間遠心分離した上清を、37℃恒温条件化でアゾカゼインと反応させ、その分解量を測定することによりプロテアーゼ活性を算出した。
【０１０３】
希釈した培養上清100μlと基質（酵素緩衝液（50mMトリス塩酸塩pH7.0）に溶解した1.25％のアゾカゼイン）400μlとを混合撹拌後、37℃で20分間保温した。その後ただちに反応停止液（10％トリクロロ酢酸）1mlを加え、激しく撹拌後、12,000rpmで5分間遠心分離し、上清を得た。この上清の335nmにおける吸光度を測定することにより遊離のチロシン量を求めた。プロテアーゼ活性は1分間に1μgのチロシンを遊離する酵素量を1U/mlと定義し式に従ってプロテアーゼ活性を求めた。
【０１０４】
［式２］プロテアーゼ活性（U/ml）＝2924×吸光度×希釈倍÷20
尚、式中の2924は係数、20は酵素反応時間である。
【０１０５】
測定結果を図１に示す。
【０１０６】
図１に示されるように、SB67株は48時間後に１０００Ｕ／mlものプロテアーゼ活性を示し、高い活性を有することがわかった。また図１に示されるように、２４時間経過後にグラフ曲線が上昇していることから、培養時間は２４時間以上が適当であると考えられた。
【０１０７】
3-3．リパーゼ活性
培養液を12,000rpmで5分間遠心分離した上清を、リパーゼS キット（大日本住友製薬株式会社）を用いて37℃恒温条件化で基質液と反応させてリパーゼ活性を測定した。
【０１０８】
測定結果を図２に示す。
【０１０９】
図２に示されるように、リパーゼ活性が示されたことから、SB67は脂肪分解能力も有
すると考えられた。
【０１１０】
［実施例4］SB67株による分解物の解析
本発明の微生物SB67株をサバアラ培地に植菌して得られた本培養液の上清を、逆相クロマトグラフィーでパターンを調べて解析を行った。
【０１１１】
また、比較のために、未植菌液本培養液の上清、及び、根毛形成効果が報告されているBGM1株（特開2005-287395号公報に記載のBGM1株）をブルーギル培地に植菌して得られた本培養液の上清についても同様の解析を行った。
【０１１２】
4-1．試料の調製及び分析条件
(a)SB67株による本培養液及び未植菌液本培養液
SB67株による本培養液は、上記1-1.(b)で作成したサバアラ培地に、LB培地で前培養したSB67株を1％相当量植菌し、37℃、120rpmで48時間振盪培養して得た。
【０１１３】
また、未植菌液本培養液は、上記サバアラ培地に、菌を植菌しないで、37℃、120rpmで48時間振盪培養して得た。
【０１１４】
(b)BGM1株による本培養液
BGM1株による本培養液は、サバアラ培地に代えてブルーギル培地を用い、SB67株に代えてBGM1株を用いる以外は上記と同様にして得た。ブルーギル培地は、上記冷凍サバアラ（約100ｇ）の代わりに、丸ごとのブルーギルを粉砕後乾燥させた粉末（約50ｇ）を用いた以外は、サバアラ培地と同様の方法で得た。
【０１１５】
(c)分析条件
逆相クロマトグラフィーの分析条件は次のとおりとした：
流速：0.5mL/min
溶媒：0-5min：H2O＋0.05%TFA（トリフルオロ酢酸）
5-20min：H2O＋0.05%TFA  →  70％アセトニトリル
20-30min：70％アセトニトリル
カラム：Tsk gel ODS80Ts
検出波長：220nm
【０１１６】
4-2.解析結果
逆相クロマトグラムの解析結果を図３に示す。
図３に示すように、未植菌液本培養液の上清とSB67株による本培養液の上清のパターンを比較すると、ピークの検出時間に差があった。このことから、SB67菌の作用によって、サバアラ培地のペプチド組成に変化が生じていることがわかった。
【０１１７】
また、SB67株による本培養液の上清とBGM-1株によるブルーギル本培養液の上清とのパターンの比較においてもピークの検出時間に違いがみられた。この比較から、サバアラ分解物とブルーギル分解物とは異なるペプチドを含んでいると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】SB67株のプロテアーゼ活性の試験結果を示した図面である。横軸は培養時間、縦軸は酵素量（プロテアーゼ活性）を示す。
【図２】SB67株のリパーゼ活性の試験結果を示した図面である。横軸は培養時間、縦軸は酵素量（リパーゼ活性）を示す。
【図３】本培養液の上清を逆相クロマトグラフィーで分析した結果を示す図面である。上から、未植菌本培養液のクロマトグラム、SB67株による本培養液のクロマトグラム、BGM-1株による本培養液のクロマトグラムを示す。
【図１】
2008245596.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【配列表】
2008245596000001.app