(57)【要約】【課題】リガンドの表面からの脱着によりマイナス信号が発生することを防止し、リガンドとアナライトとの結合を示す信号の精度を向上させる方法を提供すること。【解決手段】反応基を有する担体に生体分子を固定化する方法において、(i)反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化する工程；(ii)生体分子を前記活性化させた反応基と反応させる工程；及び(iii)反応基の一部を再度活性化する工程；を上記の順で行うことを含む、生体分子の固定化方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応基を有する担体に生体分子を固定化する方法において、
(i)反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化する工程；
(ii)生体分子を前記活性化させた反応基と反応させる工程；及び
(iii)反応基の一部を再度活性化する工程；
を上記の順で行うことを含む、生体分子の固定化方法。
【請求項２】
工程(iii)における活性化の活性化度が、工程(i)における活性化の活性化度の0.01〜0.5倍であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応基が、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
反応基がカルボキシル基であり、反応基を活性化する工程が、カルボキシル基を活性エステル化する工程である、請求項１から３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
カルボキシル基を活性エステル化する工程が、カルボキシル基を、カルボジイミド又はその誘導体あるいはそれらの塩、含窒素化合物、又はフェノール誘導体で活性化する工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
カルボキシル基を活性エステル化する工程が、下記の何れかの式で表される化合物で活性化する工程を含む、請求項４又は５に記載の方法。
【化１】
2008107315.tif 000021
【請求項７】
反応基を有する担体が、反応基を有する親水性高分子化合物で被覆された担体である、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
反応基を有する親水性高分子化合物が、多糖類である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
反応基を有する親水性高分子化合物が、一般式A-1からなる自己組織化膜を介して担体上の金属膜に固定化されている、請求項７又は８に記載の方法。
【化２】
2008107315.tif 000022
(式中、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）
【請求項１０】
請求項１から９の何れかに記載の方法により得られた生体分子を固定化した担体と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生体分子と相互作用する物質を検出または測定する方法。
【請求項１１】
生体分子と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体分子と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の固定化方法、及びそれを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に関する。特に本発明は、表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いた生体分子間の相互作用を分析する方法に応用可能な生体分子の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、従来法では煩雑な操作や標識物質を必要とするため、標識物質を必要とすることなく、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術である。ＳＰＲ測定技術はチップの金属膜に接する有機機能膜近傍の屈折率変化を反射光波長のピークシフト又は一定波長における反射光量の変化を測定して求めることにより、表面近傍に起こる吸着及び脱着を検知する方法である。ＱＣＭ測定技術は水晶発振子の金電極（デバイス）上の物質の吸脱着による発振子の振動数変化から、ｎｇレベルで吸脱着質量を検出できる技術である。また、金の超微粒子（ｎｍレベル）表面を機能化させて、その上に生理活性物質を固定して、生理活性物質間の特異認識反応を行わせることによって、金微粒子の沈降、配列から生体関連物質の検出ができる。
【０００３】
上記した技術においては、いずれの場合も、生理活性物質を固定化する表面が重要である。以下、当技術分野で最も使われている表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を例として、説明する。
【０００４】
一般に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）、蒸着された金属膜、及びその上に生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜からなり、その官能基を介し、金属表面に生理活性物質を固定化する。該生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析する。
【０００５】
生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜としては、金属と結合する官能基、鎖長の原子数が１０以上のリンカー、及び生理活性物質と結合できる官能基を有する化合物を用いて、生理活性物質を固定化した測定チップが報告されている（特許文献１を参照）。また、金属膜と、該金属膜の上に形成されたプラズマ重合膜からなる測定チップが報告されている（特許文献２を参照）。上記のような測定チップ（バイオセンサー）の表面を作成する場合、水中でカルボン酸アミドを形成させる場合が多い（ポリマーとリンカーの反応、さらにタンパク質等の被検出物質との結合）。この反応を行うためには通常、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）を用いてカルボン酸を活性化させた後、アミンと反応させることで、カルボン酸アミドを形成することが一般的に行われている。
【０００６】
一般に、リガンドを表面に固定し、リガンドへのアナライトの結合を信号として検出する装置においては、リガンドの表面への固定が不十分な場合がある。この場合、リガンドの表面からの脱着により、マイナス信号が断続的に発生し（マイナスドリフトとも言う）、これがアナライトの結合を観測する際に影響し、本来得られるはずの値よりも低い信号量しか得られないことがある。特にＳＰＲのように近接場の屈折率変化を検出する装置において、リガンド蛋白に対する低分子アナライトの検出を行う場合、信号は分子量に依存するため、リガンド１分子の脱着が約１００分子分のアナライト結合信号に匹敵することがあり、結合信号がマイナスになってしまう問題がある。
【０００７】
【特許文献１】特許第２８１５１２０号
【特許文献２】特開平９−２６４８４３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は上記した従来技術の問題を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、リガンドの表面からの脱着によりマイナス信号が発生することを防止し、リガンドとアナライトとの結合を示す信号の精度を向上させる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、反応基を有する担体に生体分子を固定化する際に、反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化して生体分子を固定化した後に、反応基の一部を再度、活性化することによって、 生体分子（リガンド）の表面からの脱着によるマイナス信号の発生を防止することができ、これにより生体分子（リガンド）とアナライトとの結合を示す信号（ポジ信号）の精度を向上できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、反応基を有する担体に生体分子を固定化する方法において、
(i)反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化する工程；
(ii)生体分子を前記活性化させた反応基と反応させる工程；及び
(iii)反応基の一部を再度活性化する工程；
を上記の順で行うことを含む、生体分子の固定化方法が提供される。
【００１１】
好ましくは、工程(iii)における活性化の活性化度は、工程(i)における活性化の活性化度の0.01〜0.5倍である。
好ましくは、反応基は、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基である。
好ましくは、反応基はカルボキシル基であり、反応基を活性化する工程は、カルボキシル基を活性エステル化する工程である。
【００１２】
好ましくは、カルボキシル基を活性エステル化する工程は、カルボキシル基を、カルボジイミド又はその誘導体あるいはそれらの塩、含窒素化合物、又はフェノール誘導体で活性化する工程を含む。
好ましくは、カルボキシル基を活性エステル化する工程は、下記の何れかの式で表される化合物で活性化する工程を含む。
【化１】
2008107315.tif 000002
【００１３】
好ましくは、反応基を有する担体は、反応基を有する親水性高分子化合物で被覆された担体である。
好ましくは、反応基を有する親水性高分子化合物は、多糖類である。
好ましくは、反応基を有する親水性高分子化合物は、一般式A-1からなる自己組織化膜を介して担体上の金属膜に固定化されている。
【化２】
2008107315.tif 000003
(式中、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）
【００１４】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の方法により得られた生体分子を固定化した担体と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生体分子と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
好ましくは、生体分子と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定すし、さらに好ましくは、生体分子と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明においては、リガンドの表面からの脱着によるマイナス信号の発生を防止することができ、これにより生体分子（リガンド）とアナライトとの結合を示す信号の精度を向上できる。本発明においては、生体物質(蛋白質など)固定後の活性化をやり過ぎてしまうと、固定化した生体物質(蛋白質など)の被験物質との結合サイトが直接/間接的に塞がれてしまうことがある。このため、本発明では、固定後の活性化として最適な条件は生体物質の性質や固定量に依存するが、固定前の活性化よりも弱い活性化条件(活性化化合物濃度が低い/活性化時間が短い)であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明による生体分子の固定化方法は、反応基を有する担体に生体分子を固定化する方法において、(i)反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化する工程；
(ii)生体分子を前記活性化させた反応基と反応させる工程；及び(iii)反応基の一部を再度活性化する工程を上記の順で行うことを特徴とする。
【００１７】
本明細書において、「反応基の一部」とは、生体分子と共有結合を形成できるよう活性化を行った後に、該生体分子と反応することができるようになり得る基を示し、例えば、反応基全体を活性化処理した後、一部のみが活性化されていれば、活性化されていない反応基を有する場合も含まれる。また、上記(i)の工程と(iii)の工程における反応基は、同じであっても異なっていてもよい。
【００１８】
本発明で言う反応基とは、生体分子を結合するための官能基であり、その具体例としては、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1及びＲ2は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＨＯ、−ＮＲ3ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は互いに独立に水素原子又は低級アルキル基を示す）、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、エポキシ基、またはビニル基などが挙げられる。ここで、低級アルキル基における炭素数は特に限定されないが、一般的にはＣ１〜Ｃ１０程度であり、好ましくはＣ１〜Ｃ６である。反応基は、好ましくは、カルボキシル基、アミノ基又は水酸基である。
【００１９】
反応基がカルボキシル基である場合、反応基を活性化する工程としては、カルボキシル基を活性エステル化することが好ましい。反応基がカルボキシル基である場合、カルボジイミド（又はその誘導体、あるいはカルボジイミド又はその誘導体の塩）とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの組み合わせを用いて活性エステルを生成し、生体分子のアミノ基と共有結合を生成することができる。
【００２０】
また、反応基がアミノ基である場合、よく用いられる方法としては、グルタルアルデヒドを作用させた後に、生体分子のアミノ基と共有結合を生成する方法、生体分子を過ヨウ素酸塩で酸化してアミノ基と直接共有結合させる方法がある。
【００２１】
また、反応基が水酸基である場合、よく用いられる方法としては、ポリエポキシ化合物やエピクロロヒドリンを作用させた後に、生体分子のアミノ基と共有結合を生成する方法がある。なお、化学的には、ハロゲン化アルキルを用いた直接的なエーテル結合形成反応などもあるが、生体分子に適用する場合、生理活性を維持することが困難となる場合がある。
【００２２】
上記した通り、カルボキシル基（カルボン酸）を有するバイオセンサー表面は、公知の方法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）、又は、EDC単独により活性化され、アミノ基を有する生体分子を固定化することが可能となる。カルボン酸を活性化する別の手法としては、特開２００６−５８０７１号公報（特願２００４−２３８３９６号）の段落番号００１１〜００２２に記載の方法（即ち、担体の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特開２００６−９０７８１号公報（特願２００４−２７５０１２号）の段落番号００１１〜００１９に記載の方法（即ち、担体の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を用いることもできる。
【００２３】
以下、特開２００６−９０７８１号公報（特願２００４−２７５０１２号）の段落番号００１１〜００１９に記載の方法について説明する。カルボジイミド誘導体又はその塩が水溶性であることが好ましく、具体的には、特開２００６−９０７８１号公報に記載された化合物１〜３を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物における含窒素ヘテロ芳香族化合物の種類は特に限定されないが、窒素原子を少なくとも１個以上（例えば、１個、２個又は３個）含む５または７員の飽和または不飽和の単環または縮合環を挙げることができる。水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物の具体例としては、特開２００６−９０７８１号公報に記載された化合物４〜１２を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
電子吸引性基を有するフェノール誘導体における電子吸引性基の具体例としては、−ＮＯ2、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、又は−Ｉ）、−Ｓ（ＣＨ3）2Ｘ-（Ｘは一価のアニオン（例えば、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-、Ａｔ-、ＢＦ4-、ＡｓＦ6-、ＰＦ6-、ＳｂＦ6-、ＳｂＣｌ6-、ＳｎＣｌ62-、ＦｅＣｌ4-、ＢｉＣｌ52-、ＣＦ3ＳＯ2-、ＣｌＯ4-、ＦＳＯ2-、Ｆ2ＰＯ2-等）を示す）、−ＣＯＯＨ、−ＣＮ、又は−ＣＨＯなどを挙げることができる。また、電子吸引性基のσ値は０．３以上であることが好ましい。好ましくは電子吸引性基のσ値は０．５以上であり、さらに好ましくは０．７以上である。σ値は、たとえば、稲本直樹著「ハメット測」丸善（１９８３年）の付表に総括されている。電子吸引性基を有するフェノール誘導体の具体例としては、特開２００６−９０７８１号公報に記載された化合物１３〜１６を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
チオール基（−ＳＨ）を有する芳香族化合物における芳香族化合物の種類は特に限定されず、アリール化合物（ベンゼン又はナフタレンなど）、又は少なくとも１以上のヘテロ原子を含むヘテロ環化合物でもよい。ヘテロ環化合物としては、窒素、酸素および硫黄原子からなる群より選ばれるヘテロ原子を１個以上含む５または７員の飽和または不飽和の単環または縮合環であるものが挙げられ、例えば、ピリジン、キノリン、イソキノリン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、フタラジン、トリアジン、フラン、チオフェン、ピロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンゾイミダゾール、チアジアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、７−アザベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジン等が挙げられる。チオール基を有する芳香族化合物の具体例としては、特開２００６−９０７８１号公報に記載された化合物１７〜１９を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
担体の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとする方法は特に限定されず、当業者に公知の常法により行うことができる。具体的には、表面にカルボキシル基を有する担体に、カルボジイミド誘導体又はその塩と、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物とを含む溶液（例えば、水溶液）を接触させることにより、エステル化を行うことができる。
【００２８】
上記した特開２００６−９０７８１号公報に記載された化合物１から３及び化合物４から１９は公知化合物であり常法により合成でき、又は市販品を使用することもできる。具体的には、化合物１から１９は、例えば、国産化学、Aldrich、酒井興業、又は同仁化学などから市販されており、あるいは文献（Bull.Chem.Soc.Jpn., 60,2409 (1987)., J.Polym.Sci., Polym.Chem.Ed.,17, 2013(1979). J.Polym.Sci., Polym.Chem.Ed.,16,475 (1978)  ）に記載の方法により合成することができる。
【００２９】
本発明では、上記のようにして形成した活性エステルにアミンを反応させることによりカルボン酸アミド基が形成されている。アミンとの反応の方法は特に限定されず、当業者に公知の常法により行うことができる。例えば、エタノールアミン・ＨＣｌ溶液を担体に接触させることにより反応を行えばよい。
【００３０】
また、カルボキシル基を活性化する別の方法として含窒素化合物を用いる方法があり、具体的には、下記一般式（Ｉａ）又は（Ｉｂ）[式中、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表し、Ｒ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成しても良く、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]に示される含窒素化合物を用いることもできる。
【００３１】
【化３】
2008107315.tif 000004
【００３２】
ここで、Ｒ1及びＲ2は、互いに独立して置換基を有しても良いカルボニル基、炭素原子、窒素原子を表すが、好ましくはＲ１及びＲ２は結合により５〜６員環を形成する。特に好ましくは、ヒドロキシコハク酸、ヒドロキシフタル酸、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３、４−ジヒドロキシ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１、２、３−ベンゾトリアジン、及びその誘導体が提供される。
【００３３】
また、好ましくは下記化合物７で示される含窒素化合物を用いることもできる。
【化４】
2008107315.tif 000005
【００３４】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩ）[式中、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表す]で表される化合物を用いることもできる。
【００３５】
【化５】
2008107315.tif 000006
【００３６】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００３７】
【化６】
2008107315.tif 000007
【００３８】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記の化合物を用いることもできる。
【００３９】
【化７】
2008107315.tif 000008
【００４０】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（ＩＩＩ）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｙ及びＺは、互いに独立してＣＨ、または窒素原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００４１】
【化８】
2008107315.tif 000009
【００４２】
ここで、Ａで表される炭素原子またはリン原子の置換基としては、置換基を有するアミノ基が好ましく、ジメチルアミノ基やピロリジノ基の様なジアルキルアミノ基が好ましい。Mで表される（n-1）価の元素は、リン原子、ホウ素原子、ヒ素原子などが挙げられるが、好ましくはリン原子があげられる。Xで表されるハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられるが、好ましくはフッ素原子が挙げられる。
【００４３】
また一般式（ＩＩＩ）で表される含窒素化合物の具体例としては、下記の化合物などが挙げられる。
【００４４】
【化９】
2008107315.tif 000010
【００４５】
また好ましくは、含窒素化合物としては、下記一般式（IV）[式中、Ａは置換基を有する炭素原子またはリン原子を表し、Ｍは（n-1）価の元素を表し、Ｘはハロゲン原子を表す]を用いることもできる。
【００４６】
【化１０】
2008107315.tif 000011
【００４７】
具体的には、下記の化合物などを用いることができる。
【００４８】
【化１１】
2008107315.tif 000012
【００４９】
また、カルボキシル基を活性化する方法として、電子吸引性基を有するフェノール誘導体を使用することも好ましく、更に電子吸引性基のσ値が0.3以上であることが好ましい。具体的には、下記化合物１６などを用いることができる。
【００５０】
【化１２】
2008107315.tif 000013
【００５１】
更に、カルボキシル基を活性化する方法では、別にカルボジイミド誘導体物を併用することができるが、好ましくは、水溶性カルボジイミド誘導体を併用する事ができ、更に好ましくは下記の化合物、（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride）を併用することができる。
【００５２】
【化１３】
2008107315.tif 000014
【００５３】
上記のカルボジイミド誘導体及び、含窒素化合物、またはフェノール誘導体は併用して使用するだけではなく、所望により、夫々、単独で用いることもできる。好ましくはカルボジイミド誘導体と含窒素化合物との併用である。
【００５４】
また、カルボキシル基を活性化する方法として、下記化合物を用いることもできる。該化合物は単独で用いることもできるが、カルボジイミド誘導体、含窒素化合物、フェノール誘導体と併用してもよい。
【００５５】
【化１４】
2008107315.tif 000015
【００５６】
本発明においては、上記したような反応基を活性化する工程を、生体分子を反応基と反応させる工程の前と後に行う。即ち、本発明においては、先ず、反応基の一部を生体分子と共有結合を形成できるよう活性化し、次いで、生体分子を前記活性化させた反応基と反応させ、その後にさらに、反応基の一部を再度活性化する。
【００５７】
本発明においては、[活性化化合物の濃度]と[活性化時間]の積を[活性化度]と定義し、リガンド固定後である本発明の二回目以降の活性化度は、リガンド固定前である一回目の活性化度の0.001倍以上1倍以下が好ましく、0.005倍以上0.8倍以下が更に好ましく、0.01倍以上0.5倍以下が最も好ましい。
【００５８】
本発明において、生体分子の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、カルボキシル基やアミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生体分子をあらかじめ固定し、この生体分子の上に、さらに下記に示すような生体分子を固定化する態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生体分子を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。
【００５９】
本発明で用いる担体は、金属表面又は金属膜であることが好ましい。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記担体への付着性を考慮して、担体と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００６０】
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０.１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０.１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。
【００６１】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００６２】
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００６３】
上記の基板は、測定ユニットの誘電ブロックに固定され、一体化されて測定チップを構成しており、この測定チップが交換可能に形成されていてもよい。以下にその例を示す。
【００６４】
図１は、ＳＰＲを利用した測定に用いられるセンサユニット１０の分解斜視図である。センサユニット１０は、透明な誘電体である全反射プリズム（光学ブロック）２０と、この全反射プリズム２０の上に取り付けられる流路部材３０とで構成される。流路部材３０は、図中奥側に位置する第１流路３１と、図中手前側に位置する第２流路３２との２種類の流路を有している。詳細は後述するが、センサユニット１０を用いて測定を行う際には、これら２つの流路３１、３２を１組として、１つの試料の測定が行われる。流路部材３０には、各流路３１、３２が、それぞれ長手方向に６つずつ設けられており、１つのセンサユニット１０で６つの試料を測定できるようにしている。なお、各流路３１、３２の数は、６つに限ることなく、５つ以下でもよいし７つ以上でもよい。
【００６５】
全反射プリズム２０は、長尺な台形柱状に形成されたプリズム本体２１と、このプリズム本体２１の一端に設けられた把持部２２と、プリズム本体２１の他端に設けられた突出部２３とからなる。この全反射プリズム２０は、例えば、押し出し法などによって型成形されるものであり、プリズム本体２１、把持部２２、突出部２３の各部は、一体に成形されている。
【００６６】
プリズム本体２１は、下底よりも上底の方が長い略台形の縦断面を有しており、底面側面から照射された光を上面２１ａに集光する。プリズム本体２１の上面２１ａには、ＳＰＲを励起するための金属膜（薄膜層）２５が設けられている。金属膜２５は、流路部材３０の各流路３１、３２と対面するように、長方形状をなしており、例えば、蒸着法などによって成形される。この金属膜２５としては、例えば、金や銀などが使用され、その膜厚は、例えば、５０ｎｍである。なお、金属膜２５の膜厚は、金属膜２５の素材や測定時に照射される光の波長などに応じて適宜選択される。
【００６７】
金属膜２５の上には、生理活性物質を固定化するための層２６が設けられている。疎水性高分子化合物又は親水性高分子化合物を含む層２６は、生理活性物質を固定させるための結合基を有するものであり、この疎水性高分子化合物又は親水性高分子化合物を含む層２６を介して金属膜２５上に生理活性物質が固定される。
【００６８】
本発明における反応基を有する担体は、好ましくは、反応基を有する親水性高分子化合物で被覆された担体である。反応基を有する親水性高分子化合物は、上記したような金属表面又は金属膜に対して、直接又は中間層を介して結合することができる。
【００６９】
本発明で用いる親水性高分子化合物としては、例えば多糖類（例えばアガロース、デキストラン、カラギーナン、アルギン酸、デンプン、セルロース）、または合成高分子化合物（例えばポリビニルアルコール）などを挙げることができる。本発明においては、多糖類が好ましく用いられ、デキストランが最も好ましい。
【００７０】
本発明においては、好ましくは、平均分子量１万以上２００万以下の親水性高分子化合物が用いられる。好ましくは２万以上２００万以下、さらに好ましくは３万以上１００万以下、最も好ましくは２０万以上８０万以下の親水性高分子化合物を用いることができる。
【００７１】
本発明に使用する親水性高分子化合物は、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生体分子固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生体分子自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子化合物固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子化合物膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。
【００７２】
親水性高分子化合物の一例であるポリヒドロキシ化合物は、例えば塩基性条件下でブロモ酢酸と反応させることでカルボキシ化できる。反応条件の制御により、ポリヒドロキシ化合物が初期状態で含有するヒドロキシ基の一定の割合をカルボキシ化できる。本発明においては例えば、１〜９０％のヒドロキシ基をカルボキシ化することができる。なお、任意のポリヒドロキシ化合物で表面被覆された表面について、例えば、以下の方法でカルボキシ化率を算出することができる。膜表面をジ−tert−ブチルカルボジイミド／ピリジン触媒を用いてトリフルオロエタノールで50℃、16時間、気相修飾し、ＥＳＣＡ（electron spectroscopy for chemical analysis）でトリフルオロエタノール由来のフッ素量を測定し、膜表面の酸素量との比率（以下、Ｆ／Ｏ値と呼ぶ）を算出する。全てのヒドロキシ基がカルボキシ化された場合の理論的なＦ／Ｏ値をカルボキシ化率１００％とし、任意の条件でカルボキシ化した時のＦ／Ｏ値を測定することで、その時のカルボキシ化率を算出することができる。
【００７３】
本発明において、反応基を有する親水性高分子化合物は、金属表面又は金属膜に、直接又は中間層を介して結合することができる。ここで言う中間層としては、疎水性高分子化合物又は自己組織化膜から成る層などを使用することができる。以下、疎水性高分子化合物、及び自己組織化膜について説明する。
【００７４】
疎水性高分子化合物とは、吸水性を有しない高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）が１０％以下、より好ましくは１％以下、最も好ましくは０．１％以下である。
【００７５】
疎水性高分子化合物を形成する疎水性単量体としては、ビニルエステル類、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、オレフィン類、スチレン類、クロトン酸エステル類、イタコン酸ジエステル類、マレイン酸ジエステル類、フマル酸ジエステル類、アリル化合物類、ビニルエーテル類、ビニルケトン類等から任意に選ぶことができる。疎水性高分子化合物としては、１種類のモノマーから成るホモポリマーでも、２種類以上のモノマーから成るコポリマーでもよい。
【００７６】
本発明で好ましく用いられる疎水性高分子化合物としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルクロライド、ポリメチルメタクリレート、ポリエステル、ナイロンなどが挙げられる。
【００７７】
疎水性高分子化合物の担体へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００７８】
疎水性高分子化合物のコーティング厚さは特に限定されないが、好ましくは０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、特に好ましくは１ｎｍ以上３００ｎｍ以下である。
【００７９】
次に、自己組織化膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。即ち、本発明においては、親水性高分子化合物は、有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1を介して金属膜に付着させることができる。有機分子Ｘ1−Ｒ1−Ｙ1について詳細に説明する。
【００８０】
Ｘ1は金属膜に対する結合性を有する基である。具体的には、非対称又は対称スルフィド（−SSR11Ｙ11、−SSR1Y1）、スルフィド（−SR11Ｙ11、−SR1Y1）、ジセレニド（−SeSeR11Ｙ11、−SeSeR1Y1）、セレニド（SeR11Ｙ11、−SeR1Y1）、チオール（−SH）、ニトリル（−CN）、イソニトリル、ニトロ（−NO2）、セレノール（−SeH）、３価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸（−COSH、−CSSH）が好ましく用いられる。
【００８１】
Ｒ1（とＲ11）は場合によりヘテロ原子により中断されており、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。炭素鎖は場合により過弗素化されることができる。
【００８２】
Ｙ1とＹ11は親水性高分子化合物を結合させるための基である。Ｙ1とＹ11は好ましくは同一であり、親水性高分子化合物に直接又は活性化後結合できるような性質を持つ。具体的にはヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アルデヒド、ヒドラジド、カルボニル、エポキシ、又はビニル基などを用いることができる。
【００８３】
本発明では、例えば、自己組織化化合物として、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。
【００８４】
また、本発明においては、自己組織化膜を形成することができる分子として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を使用することができ、この分子により、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式Ａ−１においてＸに親水性高分子化合物を結合可能な官能基を有する化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、親水性高分子化合物と基板を結合させることが可能となる。
【００８５】
【化１５】
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【００８６】
また、本発明において、親水性高分子化合物と結合させるための基として、アミノ基を使用する場合、末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式Ａ−２）（一般式Ａ−２において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−３、Ａ−４）（一般式Ａ−３においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。
【００８７】
【化１６】
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【００８８】
A-2〜A-4のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。
【００８９】
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４‘−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式５）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式Ａ−５（一般式Ａ−５において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式Ａ−５において、n=2,m=1）である。
【００９０】
【化１７】
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【００９１】
これらのアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生体分子の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生体分子の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、水酸基を有するアルカンチオール（一般式Ａ−６）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式Ａ−７）（一般式Ａ−６において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式Ａ−７において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。
【００９２】
【化１８】
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【００９３】
数種類のアルカンチオールを混合して自己組織化膜を形成する場合、Ａ-２〜Ａ-４のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、Ａ-６,Ａ-７のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上10以下が最も好ましい。
【００９４】
本発明において担体に固定化される生体分子としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。
【００９５】
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。
【００９６】
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。
【００９７】
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
【００９８】
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
【００９９】
生体分子が抗体や酵素などの蛋白質又は核酸である場合、その固定化は、生体分子のアミノ基、チオール基等を利用し、担体上の反応基に共有結合させることで行うことができる。
【０１００】
これらの生体分子は、生体分子を含む溶液を親水性高分子化合物が固定された担体上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。
【０１０１】
生体分子を含む溶液（塗布液）の濃度は、担体表面に固定する生体分子の濃度が高い方が好ましい。生体分子により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。
【０１０２】
生体分子を含む溶液の乾燥過程において、生体分子は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより担体表面に固定される生体分子の量に分布が発生し好ましくない。担体表面の生体分子固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生体分子の担体表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生体分子の担体表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生体分子固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。
【０１０３】
本発明の乾燥する工程とは、生体分子を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生体分子を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生体分子固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生体分子の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生体分子が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。
【０１０４】
生体分子を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を担体上で一定速度、一定間隔で動作させることで担体上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、担体と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生体分子の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生体分子を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に担体を密閉容器に入れておくなどの方法で、担体周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。
【０１０５】
生体分子と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生体分子の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生体分子の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される担体表面の生体分子の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、担体表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生体分子を固定する前後のセンサー担体上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生体分子と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー担体に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生体分子の定量も可能である。
【０１０６】
また、本発明において、担体上に固定化した生体分子の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。
【０１０７】
一般に蛋白質などの生体分子は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、担体表面の親水性高分子化合物中に担持されている場合には、乾燥されることで生体分子同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生体分子の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生体分子を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。
【０１０８】
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で担体上の生体分子を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生体分子との混合溶液として担体表面に塗布しても良く、生体分子を担体表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生体分子との混合溶液として塗布した場合、生体分子の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で担体に添加することが好ましい。担体上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において担体上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。
【０１０９】
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生体分子を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。
【０１１０】
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。
【０１１１】
化合物Ｓの平均分子量が低いと担体表面で結晶化して、生体分子を固定した親水性高分子化合物層の破壊および生体分子の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生体分子の担体への固定の障害となったり、生体分子を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。
【０１１２】
担体上に固定した生体分子の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、担体上に固定した生体分子の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。
【０１１３】
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子化合物の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。
【０１１４】
担体上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子化合物の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子化合物層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生体分子の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。
【０１１５】
本発明の方法により生体分子を固定化した担体は、当該生体分子と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。即ち、本発明によれば、本発明の方法により得られた生体分子を固定化した担体と、被験物質とを接触させる工程を含む、該生体分子と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。
【０１１６】
被験物質としては例えば、上記した生体分子と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
【０１１７】
本発明の方法により生体分子を固定化した担体は、バイオセンサー又はその一部として用いることができる。本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。
【０１１８】
本発明では、生体分子と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【０１１９】
本発明の好ましい態様によれば、バイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。
【０１２０】
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生体分子を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。
【０１２１】
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。
【０１２２】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報の段落番号００１１参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１２３】
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。
【０１２４】
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。
【０１２５】
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報の段落番号００２５〜００３７に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。
【０１２６】
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。
【０１２７】
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【０１２８】
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。
【０１２９】
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。
【０１３０】
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。
【０１３１】
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。
【０１３２】
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰角（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１７２６９４号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。
【０１３３】
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。
【０１３４】
また、本発明のバイオセンサーは、例えば担体表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、担体表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。
【０１３５】
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。
【０１３６】
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって担体内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生体分子を固定化し得る層を用いることができる。
【０１３７】
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。
【０１３８】
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生体分子検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。
【０１３９】
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１４０】
実施例１
水溶解性の高いSAM化合物を用いて蛋白を固定できるヒドロゲル膜を作成し、蛋白質の固定量、および非特異吸着性能を評価した。
【０１４１】
（１）基板の作成
6-Amino-1-octanethiol, hydrochloride（同仁化学社製）の1mM水溶液を作成した。この溶液をA液と呼ぶ。
【０１４２】
次に、ゼオネックス（日本ゼオン社製）を射出成型して得られたプラスチックプリズムの上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空（ベースプレッシャー1×10−３-3Pa以下）に引いてからArガスを導入し（1Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、基板ホルダにRFパワー（0.5kW）を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理（基板エする。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し（0.5Pa）、基板ホルダを回転（10〜40rpm）させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー（0.2kW）を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、（0.5Pa）、基板ホルダを回転（20rpm）させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー（1kW）を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。
【０１４３】
上記で得られたAu薄膜を成膜したＢセンサースティックを、A液に40℃１時間浸漬し、超純水で5回洗浄した。
【０１４４】
（２）CMD(カルボキシメチルデキストラン)の活性エステル化
1重量%のCMD（名糖産業製：分子量100万、置換度0.65）溶液10gを溶解した後、0.02M EDC（1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride）、87.5mM HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)の混合水溶液10mlを加え、室温で1分間撹拌後、1時間静置した。
【０１４５】
（３）CMDの基板への結合反応
（１）で作成された基板の上に、（２）で作成された活性エステル化されたCMD溶液を1ml滴下し、1000 rpmで45 秒スピンコートすることで、アミノ基を有する基板上に活性エステル化されたカルボキシメチルデキストラン薄膜を形成させた。室温で15分間反応させた後、1 N NaOH水溶液に30分浸漬し、超純水で5回洗浄することで、CMD固定基板を得た。
【０１４６】
（４）CMD固定基板へのNeutrAvidinの結合反応
（３）で作成された基板を表面プラズモン共鳴装置にセットした。基板の上に0.2M EDC、0.05M NHS(N-Hydroxysuccinimide)の混合水溶液を乗せ、7分間静置した。基板表面をAcetate5.0(BIACORE製)で洗浄、エアブローした後、0.2mg/ml NeutrAvidin(PIERCE製)のAcetate5.0溶液を乗せ、15分静置した。基板表面を1M Ethanolamine水溶液(pH8.5に調整したもの)で洗浄し、そのまま7分静置した。さらに表面を1×PBS(pH7.4)で洗浄し、NeutrAvidinが固定された基板を得た。
【０１４７】
NeutrAvidinの固定前後の信号を表面プラズモン共鳴装置で測定したところ、NeutrAvidinの固定量は平均15000RVであった。ここでは、DMSO1％あたりの共鳴角の差を1500RVと表す。
【０１４８】
（５）NeutrAvidin固定基板の活性化処理
（４）で作成されたNeutrAvidin固定基板の上に0.2M EDC、0.05M NHSの混合水溶液を乗せ、表１に記載の時間静置した。基板表面を1×PBS(pH7.4)で洗浄した。
【０１４９】
比較例１  NaOH水溶液による洗浄
（４）で作成されたNeutrAvidin固定基板の上に10mM NaOH水溶液を乗せ、表１に記載の時間静置した。基板表面を1×PBS(pH7.4)で洗浄した。
【０１５０】
比較例２  HCl水溶液による洗浄
（４）で作成されたNeutrAvidin固定基板の上に100mM HCl水溶液を乗せ、表１に記載の時間静置した。基板表面を1×PBS(pH7.4)で洗浄した。
【０１５１】
実施例２  NeutrAvidin固定基板へのBiotinの結合反応
実施例２は、実施例１、比較例１及び比較例２で得られたセンサー試料に対するBiotinの結合に関するものである。
【０１５２】
実施例１、比較例１及び比較例２で作成した試料を表面プラズモン共鳴装置にセットした。1×PBS(pH7.4)を注入し、10分間静置してベースラインを確認した後（10分後の共鳴角を基準点とする）、0.2mg/ml Biotinの1×PBS(pH7.4)溶液を注入し、30分間静置した。静置後、1×PBS(pH7.4)を注入し1分静置し、この時の共鳴角と原点の共鳴角の差をBiotin結合量とした。
【０１５３】
各試料におけるベースライン変動値とBiotin結合量を表１に示す。
比較例の表面は、NeutrAvidinの剥離によるマイナスドリフトを抑えることができない、あるいはNeutrAvidinの活性を失わせてしまっているが、本発明の表面は、活性を保ったままNeutrAvidinの剥離を抑えることができた。
【０１５４】
【表１】
2008107315.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、センサユニットの概略構成を示す分解斜視図である。
【符号の説明】
【０１５６】
１０  センサユニット
２０  全反射プリズム（光学ブロック）
２１  プリズム本体
２１ａ  上面
２２  把持部
２２ａ  溝
２３  突出部
２５  金属膜（薄膜層）
２６  疎水性高分子化合物又は親水性高分子化合物を含む層
２７  系合爪
２８  係合部
２８ａ  系合面
２９ａ  基準平面
３０  流路部材
３１  第１流路
３２  第２流路
３３  本体部
３４  取付部
３５  系合孔
３６  開口
ＳＳ１  センサ面
ＳＳ２  センサ面
【図１】
2008107315.tif 000023