(57)【要約】【課題】  唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ１遺伝子が発現される場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する、酵母株を提供する。【解決手段】  唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ１遺伝子が発現される場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する、酵母株であって、プロモーターの機能的な制御下に発現可能なＧＬＵＴ１遺伝子を含む酵母株。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の処理工程：
ａ）唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ１遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する、酵母で発現することができるプロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を含む酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供すること、
ｂ）ａ）に従って提供された株により摂取されたヘキソースの量を測定すること、
ｃ）化合物を提供すること、
ｄ）ａ）に従って提供された酵母の株と、ｃ）に従って提供された化合物とを接触させること、
ｅ）ｄ）に従って接触させた後、酵母株に摂取されたヘキソースの量を測定すること、
ｆ）ｄ）に従って接触させる前と後で、ｂ）およびｅ）に従って測定された株に摂取されたヘキソースの量を比較することによって、ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定すること、
を含む、ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物の同定に用いることができる方法。
【請求項２】
株番号ＤＳＭ１４０２６、ＤＳＭ１４０２７またはＤＳＭ１４０３３を有する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが、ａ）に従って提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を処方するための、請求項１または２に記載の方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物、および、アジュバントを含む医薬。
【請求項４】
糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を調製するための、請求項１または２に記載の方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物の使用。
【請求項５】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに受入番号ＤＳＭ１４０２６またはＤＳＭ１４０２７で寄託された、酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。
【請求項６】
ａ）唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、該株でＧＬＵＴ４遺伝子が発現される場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する酵母を提供すること、
ｂ）配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列を含むプラスミドにより、ａ）の酵母を形質転換すること、
ｃ）ｂ）に従って形質転換された株を唯一の炭素源としてグルコースを含む培地にプレーティングすること、
ｄ）ｃ）に従ってプレーティングされ、この培地で生育した株を単離すること、
によって得られる、請求項５に記載のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の世代。
【請求項７】
アミノ酸配列の６９位においてバリンがメチオニンで置換されたＧＬＵＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項８】
配列番号１３の配列を含む、請求項７に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項９】
請求項７または８に記載のポリヌクレオチド配列によりコードするＧＬＵＴ１タンパク質。
【請求項１０】
アミノ酸配列の７０位においてバリンがメチオニンで置換されたＧＬＵＴ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項１１】
配列番号１４の配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載のポリヌクレオチド配列によりコードされたＧＬＵＴ１タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム配列の欠失のためにヘキソース輸送体が合成されなくなり、その結果として、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、それがＧＬＵＴ４遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する、酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関する。
【背景技術】
【０００２】
従属栄養細胞の多くは、特定の輸送体タンパク質を介して細胞内部にグルコースを輸送する。様々な生物において、グルコース輸送を仲介する異なるメカニズム、すなわちプロトンシンポートシステム、Ｎａ+グルコース共輸送体、結合タンパク質依存性システム、ホスホトランスフェラーゼシステム、および、拡散を促進するシステムが発展している。真核生物の場合、グルコース輸送体ファミリー（哺乳動物ではＧＬＵＴ遺伝子がコードし、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＨＸＴ遺伝子がコードする）は、拡散の促進によりグルコース摂取を仲介する。これら輸送体は、大きい糖輸送のスーパーファミリーに属し、１２回膜貫通ヘリックスと、複数の保存されたアミノ酸残基およびモチーフの存在を特徴とする。
【０００３】
哺乳動物におけるグルコース輸送は、そのプロセスの知識が、例えば糖尿病またはファンコーニ−ビッケル症候群のような不十分なグルコース恒常性に関する病気において非常に重要であるために、数多くの研究の焦点であった。８種のグルコース輸送体（ＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９／ＳＬＣ２Ａ９、ＧＬＵＴ９（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｙ１７８０３））がこれまで同定されており、これら全てはグルコースの摂取の促進に寄与する。これら輸送体の主要な役割としては、様々な組織へのグルコース摂取、それらの肝臓での貯蔵、それらの筋肉細胞および脂肪細胞へのインスリン依存性摂取、ならびに、膵臓のβ−細胞によるグルコース測定が挙げられる。
【０００４】
ＧＬＵＴ１は、赤血球への、および血液−脳関門の横断におけるグルコース輸送を仲介するが、多くの他の組織でも発現され、その一方でＧＬＵＴ４はインスリン依存性組織、主として筋肉組織および脂肪組織に限定される。これらインスリン依存性組織において、ＧＬＵＴ４輸送体の細胞内区画または細胞質膜区画へのターゲティングの制御は、グルコース摂取を調節するのに重要なメカニズムを構成する。インスリン存在下で、グルコース摂取を促進するために細胞内のＧＬＵＴ４を細胞質膜に再分配する。ＧＬＵＴ１はまた、これらインスリン依存性組織で発現され、その細胞内分配はまたインスリンにより影響を受けるが、より少ない程度である。加えて、ＧＬＵＴ１またはＧＬＵＴ４が糖の輸送を触媒する相対的な効果は、各輸送体が細胞表面に標的化される程度だけでなく、それらの力学的特性によっても決定される。
【０００５】
異なるグルコース輸送体アイソフォームが共発現され、グルコースが迅速に代謝されるために、これらインスリン依存性組織における各グルコース輸送体アイソフォームの役割および詳細な特性の研究は、複雑な仕事であり続けた。アフリカツメガエル卵母細胞、組織培養細胞、昆虫細胞および酵母細胞のような異種発現系が、これらの問題を解決するために用いられてきた。しかしながら、これらの系は、異種で発現された輸送体の弱すぎる活性、これらの系に固有のグルコース輸送体、多くの輸送体の細胞内での保持、また実際には不活性な輸送体の産生などの困難を有することが明らかになった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまで、異種かつ機能的なＧＬＵＴ４グルコース輸送タンパク質以外に、ヘキソース輸送タンパク質、特に固有のヘキソース輸送タンパク質をさらに発現しない生物は知られていない。このことは、ＧＬＵＴ４タンパク質の輸送特性を改変することができる化合物の探索において一連の不利益をもたらす。ＧＬＵＴ４は、インスリンや他の因子と共に血中グルコース濃度を低めるのに重要な役割を果たすことが知られているため、このような化合物は医薬成分としてかなり興味深い。機能的なＧＬＵＴ４輸送タンパク質を発現する生物は、直接的にＧＬＵＴ４輸送体に作用する化合物の探索を可能にする。このような化合物は、シグナル−因子−仲介副作用が生じないために、あまり副作用が報告されない。その上、酵母株が利用可能であれば、材料の扱いと提供がかなり簡易化され得る。それゆえに、本発明の目的は、機能的なＧＬＵＴ４タンパク質を発現する酵母株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ４遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関する。このような株は、例えば関連するゲノム配列を変異または欠失させることによって生産され得る。ヘキソースは、６個の炭素原子を有するアルドース（例えばグルコース、ガラクトースまたはマンノース）、および６個の炭素原子を有するケトース（例えばフルクトースまたはソルボース）の意味とみなされる。
【０００８】
さらに、本発明は、上述の酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関し、この株はＧＬＵＴ４遺伝子を含む。
【０００９】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、１７種のヘキソース輸送体、加えて３種のマルトース輸送体が知られており、これらは、十分強く発現された場合、ヘキソースを酵母に輸送することができる。ヘキソースを扱うことができる全ての輸送体が欠失により除去された株が知られている。この株は現在、２種の遺伝子、ＭＰＨ２およびＭＰＨ３のみを含み、これら遺伝子はマルトース輸送タンパク質と相同である。２種の遺伝子、ＭＰＨ２およびＭＰＨ３は、グルコースが培地に存在する場合に抑制される。この酵母株の世代および特徴付けは、Wieczorke et al, FEBS Lett. 464, 123-128(1999)に記載されている。この株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質では成長できない。変異体は、適切なベクターに基づき機能的にＧＬＵＴ１を発現するこの株（ｈｘｔ  ｆｇｙ１−１株）から選択することができる。しかしながら、酵母プロモーターの制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有するプラスミドベクターが酵母株ｈｘｔ  ｆｇｙ１−１に形質転換されても、非常に少量のグルコースしか輸送されない。ＧＬＵＴ４の機能的な発現は、ＧＬＵＴ４による顕著なグルコース輸送を可能にするための、さらなるこの酵母株の適応を必要とする。このような、単一のグルコース輸送体ＧＬＵＴ４により細胞にグルコースを摂取させる酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質で単離することができる。この目的のために、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母株ｈｘｔ  ｆｇｙ１−１が、形質転換される。この方式で形質転換されたこれら酵母細胞は、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地にプレーティングされ、その上でインキュベートされる。例えば３０℃で２〜３日インキュベートした後、個々のコロニーの成長を観察する。これらコロニーの一つを単離する。酵母プラスミドをこのコロニーから除去する場合、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地では成長は起こらない。酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ベクターが、このベクタープラスミドをまだ含まない株に再形質転換される場合、この株の唯一の炭素源としてグルコースを含む培地で成長する能力が回復する。ＧＬＵＴ４輸送体によりグルコース摂取を可能にするＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の世代が、実施例で詳細に説明される。この株は、酵母ヘキソース輸送体を発現せず、ＧＬＵＴ４輸送体に関する遺伝子、例えばこの株に形質転換された遺伝子により、ヘキソース、特にグルコースを細胞に摂取させることができる。この特徴を有する酵母株は、特許手続きを目的とした微生物寄託の国際的に認められたブダペスト条約の規約に従って、番号ＤＳＭ１４０３５、ＤＳＭ１４０３６またはＤＳＭ１４０３７として、ブラウンシュワイク市のＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，（ＤＳＭＺ）に寄託されている（表１）。
【００１０】
本発明のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株の好ましい実施形態において、酵母発現プロモーターの機能的な制御下でＧＬＵＴ４遺伝子が発現される。当業者は、適切な酵母発現プロモーターについて熟知している。それらは、例えば、ＳＯＤ１プロモーター（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＤＨプロモーター（アルコールデヒドロゲナーゼ）、酸性ホスファターゼ遺伝子用のプロモーター、ＨＸＴ２プロモーター（グルコース輸送体２）、ＨＸＴ７プロモーター（グルコース輸送体７）、ＧＡＬ２プロモーター（ガラクトース輸送体）などである。発現の目的のために、酵母発現プロモーターとＧＬＵＴ４遺伝子とからなる構築物は、酵母ベクターの一部である。発現を実行するために、この酵母ベクターは、酵母ゲノムとは独立した自己複製粒子として存在してもよいし、または、酵母ゲノムに安定して組み込まれてもよい。原則的に、適切な酵母ベクターは、酵母中での増殖が可能な全てのポリヌクレオチド配列である。特に用いることができる酵母ベクターは、酵母プラスミドまたは酵母人工染色体である。酵母ベクターは、原則的に、複製を開始するための複製起点（２μ、ａｒｓ）と、通常は栄養要求性マーカーまたは抗生物質耐性遺伝子からなる選択マーカーとを含む。当業者に知られている酵母ベクターは、例えば、ＢＭ２７２、ｐＣＳ１９、ｐＥＭＢＣＹｅ２３、ｐＦＬ２６、ｐＧ６、ｐＮＮ４１４、ｐＴＶ３などである。原則的に、いかなる種のＧＬＵＴ４遺伝子でも発現させることができる。好ましくは、ヒト、マウスまたはラットからのＧＬＵＴ４遺伝子が発現される。ＧＬＵＴ４に関するポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、以下のＧｅｎｂａｎｋ受入番号：Ｍ２０７４７（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｄ２８５６１（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８２（ｃＤＮＡ；マウス）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１４６７２（タンパク質；ヒト）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１９３５７（タンパク質；ラット）およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１４１４２（タンパク質；マウス）が入手しやすい。特に好ましくは、ＧＬＵＴ４遺伝子は、ベクターＹＥｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ４（配列番号９）により発現される。このベクターのＧＬＵＴ４遺伝子は、ヒトオリジンに属する。当業者は、細胞中で発現させるためのＧＬＵＴ４遺伝子を含む酵母ベクターの生成について熟知している。このようなベクターの生成は、実施例で説明される。発現のための遺伝子を含む酵母ベクターは、遺伝子を発現させるために酵母に形質転換される。この目的に適した方法は、例えば、エレクトロポレーション、または、コンピテント細胞のベクターＤＮＡでのインキュベートである。形質転換は当業者が熟知している技術であり、外来ＤＮＡ、特にプラスミドまたはベクターを、酵母または細菌のような微生物に導入するのに役立つ。酵母の形質転換、酵母ベクター、酵母変異体の選択、または、酵母におけるタンパク質発現に関する詳細なプロトコールは、当業者によく知られたマニュアル「Methods in Yeast Genetics, 1997：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(Edt.)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN：0-87969-508-0」で見出される。ＧＬＵＴ４遺伝子が本発明に係る酵母で発現されるという証拠は、特に、ノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、グルコース摂取調査、および、グルコース変換調査または他の方法により提供することができる。ノーザンブロッティングは、研究される生物の単離されたＲＮＡを例えばニトロセルロースのような支持体に適用すること、および、上記ＲＮＡをそこに固定すること、続いて、生物のＲＮＡを含むこの支持体を放射標識または蛍光標識したＧＬＵＴ４ポリヌクレオチド配列のＤＮＡと一緒にインキュベートすることを伴う。本発明に係る酵母でのＧＬＵＴ４−ｍＲＮＡの発現は、黒い帯が出現することによって明白になる。相対的に、それ以外では同一であるが、ＧＬＵＴ４含有発現ベクターで形質転換されなかった酵母のＲＮＡでは、黒い帯は検出されない。ウェスタンブロッティングは、研究される生物のタンパク質抽出物をニトロセルロースのようなメンブレン支持体に適用することにより、抗体を介して発現されたタンパク質を明らかにすることを伴う。ＧＬＵＴ４タンパク質に関する抗体は、例えば、Alpha Diagnostic International, Inc., 5415 Lost Lane, San Antonio, TX 78238 USAから得ることができる。結合した抗体を検出するのに必要な分析システムもこの業者から得ることができる。発現されたＧＬＵＴ４タンパク質は、それ以外では同一であるがＧＬＵＴ４タンパク質を含まない酵母株と比較して検出することができる。グルコース摂取調査を行う場合、放射標識したグルコースが唯一の炭素源として試験生物に供給される。それ以外では同一であるがＧＬＵＴ４輸送体を含まないコントロール株とは対照的に、唯一のグルコース輸送体としてＧＬＵＴ４を含む酵母は、この放射標識したグルコースを細胞内部に輸送する。グルコース変換は、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地で試験することができる。それ以外では同一であるがＧＬＵＴ４輸送体を含まないコントロールとは対照的に、ＧＬＵＴ４輸送タンパク質を唯一のグルコース輸送体として含む酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む栄養培地で成長することができる。当業者は、上記で説明したこれら方法を熟知している。詳細な説明は、例えば、「Current Protocols in Molecular Biology；Edited by：F.M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. M. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl；出版元：John Wiley & Sons；2000(現在アップデ
ートされている)」で見出される。
【００１１】
好ましくは、本発明は、ヒト、マウスまたはラットからのＧＬＵＴ４遺伝子が発現される酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関する。
【００１２】
特に好ましくは、本発明は、ヒトＧＬＵＴ４遺伝子のコーディング領域を含むポリヌクレオチド配列が発現される酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに関する。
【００１３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、例えば、受入番号ＤＳＭ１４０３８、ＤＳＭ１４０３９またはＤＳＭ１４０４０で、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ブラウンシュワイク）に寄託された酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１またはそれ以上の株に関する。これら株は、表１に列挙される。このリストは、プラスミドが形質転換された使用酵母株に関する情報、プラスミドに関する情報、および、これら酵母の成長条件に関する情報を含む。
【００１４】
本発明はまた、本発明に従った酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの世代に関し、当該世代は、以下の処理工程：
ａ）唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できない酵母を提供すること；
ｂ）酵母で発現することができるプロモーターの機能的な制御下にあるＧＬＵＴ４遺伝子を含むプラスミドにより、ａ）の酵母を形質転換すること；
ｃ）ｂ）に従って形質転換された株を、唯一の炭素源としてヘキソースを含む培地にプレーティングすること；
ｄ）ｃ）に従ってプレーティングされ、この培地で生育し、ＧＬＵＴ４遺伝子によりヘキソース摂取がサポートされた株を選択すること、
によって得られる。本発明はまた、このような株を成長させることに関する。
【００１５】
本発明に従って酵母を提供するために、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ４遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、第一工程で単離する。これは、ヘキソース輸送体をコードする関連ゲノム配列を変異または欠失させることによって達成することができる。その上、酵母の提供は、この酵母を成長させることが必要である。成長させることは、適切な培地における微生物学の標準的な方法によりなされる。酵母成長に適した培地は、例えば、完全培地、特にＹＰＤ培地（酵母抽出物／ペプトン／デキストロース培地）または選択培地などである。酵母細胞は、これら培地中で成長し、成長後、遠心分離により培地から分離され、当該方法の目的のために、特に、緩衝物質、塩または他の添加剤を含む水性培地に懸濁し、水性懸濁液を得ることができる。当業者は、酵母成長に関する情報を、すでに上述した「Methods in Yeast Genetics, 1997：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(Edt.)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN：0-87969-508-0」で見出すであろう。
【００１６】
上述の酵母株を提供することの好ましい実施形態において、酵母で発現することができるプロモーターの機能的な制御下のＧＬＵＴ４遺伝子は、形質転換に用いられる。形質転換を実行するために、すでに上述した「Methods in Yeast Genetics」が参考文献になり
得る。このような酵母株を生成するために形質転換に特に好ましく用いられるＧＬＵＴ４遺伝子は、ヒト、マウスまたはラットからのＧＬＵＴ４遺伝子である。その上、形質転換に特に好ましく用いられるＧＬＵＴ４遺伝子は、配列番号９または１０に示されるポリヌクレオチド配列に存在する遺伝子である。配列番号９は、酵母ベクターＹｅｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ４のポリヌクレオチド配列を開示する。このベクターは、ＨＸＴ７プロモーターの機能的な制御下にポリヌクレオチド配列を含み、ここで該ポリヌクレオチド配列はヒトＧＬＵＴ４遺伝子のアミノ酸配列をコードする。配列番号１０は、ベクターＨ２ｒｇ４ｇ２のポリヌクレオチド配列を含む。酵母プラスミドＨ２ｒｇ４ｇ２は、ＨＸＴ２プロモーターの機能的な制御下にラットのＧＬＵＴ４遺伝子を有する。プロモーターによるＧＬＵＴ４遺伝子の機能的な制御とは、プロモーターによりｍＲＮＡが転写され、それがＧＬＵＴ４タンパク質に翻訳され得ることを意味する。ＧＬＵＴ４配列および用いられた方法の開示に関して、すでに上述したものが参考文献になり得る。
【００１７】
さらに、本発明は、ＧＬＵＴ４タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定する方法に関し、以下の処理工程：
ａ）本発明に係る、ＧＬＵＴ４遺伝子を発現する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供すること；
ｂ）それが摂取したヘキソースの量を測定すること；
ｃ）化合物を提供すること；
ｄ）ａ）に従って提供された酵母の株と、ｃ）に従って提供された化合物とを接触させること；
ｅ）ｄ）に従って接触させた後、酵母株に摂取されたヘキソースの量を測定すること；
ｆ）ｄ）に従って接触させる前と後で、ｂ）およびｅ）に従って測定された株に摂取されたヘキソースの量を比較することによって、ＧＬＵＴ４タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定すること、
を含む。
【００１８】
本発明に係る酵母を提供するために、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ４遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長する能力が回復する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、第一工程で単離する。この酵母株は、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ４遺伝子を有する酵母ベクターにより形質転換される。このような酵母株の世代は、実施例で説明される。その上、酵母の提供は、この酵母を成長させることが必要である。成長させることは、適切な培地における微生物学の標準的な方法により生じる。酵母成長に適した培地は、例えば、完全培地、特にＹＰＤ培地（酵母抽出物／ペプトン／デキストロース培地）または選択培地などである。酵母細胞は、これら培地中で成長し、成長後、遠心分離により培地から分離され、当該方法の目的のために、特に、緩衝物質、塩または他の添加剤を含む水性培地に懸濁し、水性懸濁液を得ることができる。当業者は、酵母成長に関する情報を、すでに上述した「Methods in Yeast Genetics, 1997：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(Edt)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN：0-87969-508-0」で見出すであろう。
【００１９】
上述のように提供された酵母株により摂取されたヘキソースの量は、放射標識したグルコースを用いた摂取の調査により決定することができる。この目的のために、特定量の酵母細胞（例えば量が湿重量で６０ｍｇ／ｍｌ）を、例えば１００μｌの緩衝液に懸濁し、唯一の炭素源として14Ｃまたは3Ｈで標識したグルコースの定義された量で処理する。細胞をインキュベートし、定義された量の細胞を特定時間でサンプリングする。摂取されたグルコース量を、ＬＳＣ（液体シンチレーション計数器）を用いて測定する。しかしながら、上述のように提供された酵母株により摂取されたヘキソースの量はまた、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長試験により測定することもできる。この目的のために、化合物を添加した後、例えば培養物の光学密度を６００ｎｍで定期的に測定することにより、株の成長速度を測定し、この値をコントロール株（例えば酵母野生型株）の成長速度と比較する。
【００２０】
化合物を提供することは、特に、化学合成により、または、生物学的生物から化学物質を単離することによりなされる。化学合成は自動化してもよい。合成または単離により得られた化合物を、適切な溶媒に溶解することができる。適切な溶媒は、特に、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような特定量の有機溶媒を含む水溶液である。
【００２１】
ＧＬＵＴ４タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定するために、酵母の株と化合物とを接触させることは、特に、この目的のために提供された自動化された実験システムでなされる。このようなシステムは、凹部を有する特別に準備されたチャンバー、マイクロタイタープレート、エッペンドルフチューブまたは実験用ガラス器具から構成され得る。自動化された実験システムは、一般的に、高速大量処理速度を考慮して設計される。それゆえに、自動化された実験システムを用いて行われる上述した方法はまた、ＨＴＳ（高速大量処理スクリーニング）と呼ばれる。
【００２２】
酵母と化合物とを接触させた後、この条件下で酵母細胞により細胞内部に輸送されたヘキソースの量、特にグルコースの量を測定する。この目的のために、化合物と接触させていない株に関するグルコース摂取を測定することに関してすでに説明したのと同じ方法を用いることができる。
【００２３】
ＧＬＵＴ４タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物の同定は、それと化合物とを接触させる前後で、株に摂取されたヘキソースの量を比較することにより行われる。
【００２４】
さらに、本発明は、糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を調合するための、ＧＬＵＴ４遺伝子を用いて上記で説明された方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物およびアジュバントを含む医薬に関する。同定された化合物のさらなる開発とは、第一に、標的タンパク質（この場合ＧＬＵＴ４）に関する特異性が改良されること、第二に、動物体または人体における利用可能性が増加すること、および第三に、任意の既存の望まれない副作用が減少することを意味する。この目的のために、当業者は一連の方法を利用することができ、例えば、これらに限定されないが、糖尿病ラットまたはｏｂ／ｏｂマウスのような薬理学的な動物モデルの使用、生化学的なインビトロ測定の使用、化合物およびＧＬＵＴ４タンパク質の実際上の構造モデルの使用が挙げられる。医薬製剤用アジュバントは、用途に合わせる目的での活性物質の調節、問題の用途に対する活性成分の作用の分配および開発を可能にする。このようなアジュバントの例は、充填剤、結合剤、錠剤分解物質または滑剤であり、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、スターチ、リン酸二カルシウム、ポリグリコール、アルギネート、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、タルクまたは二酸化ケイ素が挙げられる。
【００２５】
糖尿病の徴候は、インスリン欠乏またはインスリン効果の減少による慢性的な代謝状態による血液グルコースレベルの異常な増加(高血糖症)と同時発生する尿と一緒のグルコース排出である。インスリン効果が欠乏または減少することにより、血中に放出されたグルコースの体細胞による吸収および変換が不十分になる。脂肪組織において、インスリン−拮抗ホルモンは、脂肪分解を増加させる効果を有し、当該効果は、遊離脂肪酸の血中レベルの増加を伴う。
【００２６】
脂肪症（肥満症）は、過剰なカロリー摂取によるエネルギー不均衡が原因で起こる異常な体重増加であり、これは、健康上の危険を構成する。
【００２７】
さらに、本発明は、糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を調製するための、ＧＬＵＴ４タンパク質を用いた方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物の使用に関する。医薬とは、ヒトおよび動物における病気または肉体的な機能不全の治療法のための、薬理学的に活性な物質の投薬形態のことである。例えば、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ロゼンジ、糖−糖コーティング錠剤、カプセル、液状抽出物、チンキ、および、シロップが、経口の治療法用に知られている。外用投与に用いられる例は、エアロゾル、スプレー、ゲル、軟膏または粉末である。注射可能な溶液または不溶解性の溶液は、バイアル、ビンまたは予め充填された注射器を用いる非経口投与を可能にする。これらおよび他の医薬が、製薬技術分野の当業者に知られている。
【００２８】
さらに、本発明は、ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定する方法に関し、当該方法は、以下の処理工程：
ａ）唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ１遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長するその能力が回復する、酵母で発現することができるプロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を含む酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供すること；
ｂ）ａ）に従って提供された株に摂取されたヘキソースの量を測定すること；
ｃ）化合物を提供すること；
ｄ）ａ）に従って提供された酵母の株と、ｃ）に従って提供された化合物とを接触させること；
ｅ）ｄ）に従って接触させた後、酵母株に摂取されたヘキソースの量を測定すること；
ｆ）ｄ）に従って接触させる前と後で、ｂ）およびｅ）に従って測定された株に摂取されたヘキソースの量を比較することによって、ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定すること、
を含む。
【００２９】
本発明に係る酵母を提供するために、ゲノム配列の欠失のためにヘキソース輸送体が形成されず、その結果として、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、ＧＬＵＴ１遺伝子を発現する場合、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長するその能力が回復する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、第一工程で単離する。このような株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに番号ＤＳＭ１４０３１、ＤＳＭ１４０３２またはＤＳＭ１４０３４で寄託される。
【００３０】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、１７種のヘキソース輸送体と、加えて３種のマルトース輸送体が知られており、これらはヘキソースを酵母へ輸送することができる。ヘキソース摂取が可能な全ての輸送体が欠失により除去された株が知られている。この酵母株の世代および特徴付けは、Wieczorke et al., FEBS Lett. 464, 123-128(1999)に記載されている。この株は、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できない。酵母プロモーターの制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を有するプラスミドベクターがこのような酵母株に形質転換される場合でも、グルコース輸送はそれにもかかわらず起こらない。ＧＬＵＴ１の機能的な発現は、この酵母株がＧＬＵＴ１によるグルコース輸送を可能にするためにさらに適応することが必要である。このような、単一のグルコース輸送体ＧＬＵＴ１によりグルコースを細胞に摂取する酵母株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む基質で単離することができる。この目的のために、完全なヘキソース−輸送タンパク質を発現しなくなった酵母株が、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を有する酵母ベクターで形質転換される。この方式で形質転換されたこれら酵母細胞は、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地にプレーティングされ、その上でインキュベートされる。例えば３０℃で２〜３日インキュベートした後、個々のコロニーの成長を観察する。これらコロニーの一つを単離する。酵母プラスミドをこのコロニーから除去する場合、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地では成長は起こらない。次に、酵母プロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を有する酵母ベクターがこの株（ベクタープラスミドをまだ含んでいない）に形質転換された場合、この株は、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地で成長する能力を回復させる。
【００３１】
酵母株を形質転換するために、ヒト、マウスまたはラットからのＧＬＵＴ１遺伝子が特に用いられる。ＧＬＵＴ１に関するポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が開示されており、以下のデータベースのコード番号が示される：ＥＭＢＬ：Ｍ２０６５３（ｃＤＮＡ；ヒト）、ＥＭＢＬ：Ｍ１３９７９（ｃＤＮＡ；ラット）、ＥＭＢＬ：Ｍ２３３８４（ｃＤＮＡ；マウス）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１１１６６（タンパク質；ヒト）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１１１６７（タンパク質；ラット）、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ：Ｐ１７８０９（タンパク質；マウス）。
【００３２】
このような酵母株の世代は、実施例で説明される。その上、酵母を提供することは、この酵母を成長させることが必要である。成長させることは、適切な培地における微生物学の標準的な方法により生じる。酵母成長に適した培地は、例えば、完全培地、特にＹＰＤ培地（酵母抽出物／ペプトン／デキストロース培地）または選択培地である。酵母細胞は、これら培地中で成長し、成長後、遠心分離により培地から分離され、当該方法の目的のために、特に、緩衝物質、塩または他の添加剤を含む水性培地に懸濁し、水性懸濁液を得ることができる。当業者は、酵母成長に関する情報を、すでに上述した「Methods in Yeast Genetics, 1997：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual；Adams Alison(Edt)；Cold Spring Harbor Laboratory；ISBN：0-87969-508-0」で見出すであろう。
【００３３】
この方法の好ましい実施形態において、酵母で発現することができるプロモーターの機能的な制御下にＧＬＵＴ１遺伝子を有する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが提供される。このような、該方法に適した株は、Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに番号ＤＳＭ１４０３３、ＤＳＭ１４０２６またはＤＳＭ１４０３３として寄託された。
【００３４】
プラスミドの構成要素としてのＧＬＵＴ１遺伝子が、配列番号１１または配列番号１２に開示されている。配列番号１１は、酵母ベクターＹｅｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴｌの配列を含む。このプラスミドは、ＨＸＴ７プロモーターの機能的な制御下にヒトＧＬＵＴ１遺伝子のポリヌクレオチド配列を含む。配列番号１２は、酵母ベクターＨ２ｒｇ１ｇ２のポリヌクレオチド配列を含む。このプラスミドは、ＨＸＴ２プロモーターの機能的な制御下にラットからのＧＬＵＴ１遺伝子のポリヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
上述した通りに提供された酵母株により摂取されるヘキソースの量は、放射標識したグルコースを用いた摂取の調査により測定することができる。この目的のために、特定量の酵母細胞（例えば湿重量で６０ｍｇの量）を、例えば１００μｌの緩衝液に懸濁し、唯一の炭素源として14Ｃまたは3Ｈで標識したグルコースの定義された量で処理する。細胞をインキュベートし、定義された量の細胞を特定時間でサンプリングする。摂取されたグルコース量を、ＬＳＣ（液体シンチレーション計数器）を用いて測定する。
【００３６】
化合物を提供することは、特に、化学合成により、または、生物学的生物から化学物質を単離することによりなされる。化学合成は自動化してもよい。合成または単離により得られた化合物を、適切な溶媒に溶解することができる。適切な溶媒は、特に、例えばＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような特定量の有機溶媒を含む水溶液である。
【００３７】
ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定するために、酵母の株と化合物とを接触させることは、特に、この目的のために提供された自動化された実験システムでなされる。このようなシステムは、凹部を有する特別に準備されたチャンバー、マイクロタイタープレート、エッペンドルフチューブまたは実験用ガラス器具から構成され得る。自動化された実験システムは、一般的に、高速大量処理速度を考慮して設計される。それゆえに、自動化された実験システムを用いて行われる上述した方法はまた、ＨＴＳ（高速大量処理スクリーニング）と呼ばれる。
【００３８】
酵母と化合物とを接触させた後、この条件下で酵母細胞により細胞内部に輸送されたヘキソースの量、特にグルコースの量を測定する。この目的のために、化合物と接触させていない株に関するグルコース摂取を測定することに関してすでに説明したのと同じ方法を用いることができる。
【００３９】
ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物の同定は、それと化合物とを接触させる前後で、株に摂取されたヘキソースの量を比較することにより行われる。
【００４０】
さらに、本発明は、糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を調合するための、ＧＬＵＴ１遺伝子を用いて上記で説明された方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物およびアジュバントを含む医薬に関する。同定された化合物のさらなる開発とは、第一に、標的タンパク質（この場合ＧＬＵＴ４）に関する特異性が改良されること、第二に、動物体または人体における利用可能性が増加すること、および第三に、任意の既存の望まれない副作用が減少することを意味する。この目的のために、当業者は一連の方法を利用することができ、例えば、これらに限定されないが、糖尿病ラットまたはｏｂ／ｏｂマウスのような薬理学的な動物モデルの使用、生化学的なインビトロ測定の使用、化合物およびＧＬＵＴ１タンパク質の実際上の構造モデルの使用が挙げられる。医薬製剤用アジュバントは、用途に合わせる目的での活性物質の調節、問題の用途に対する活性成分の作用の分配および開発を可能にする。このようなアジュバントの例は、充填剤、結合剤、錠剤分解物質または滑剤であり、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、スターチ、リン酸二カルシウム、ポリグリコール、アルギネート、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、タルクまたは二酸化ケイ素が挙げられる。
【００４１】
糖尿病の徴候は、インスリン欠乏またはインスリン効果の減少による慢性的な代謝状態による血液グルコースレベルの異常な増加（高血糖症）と同時発生する尿と一緒のグルコース排出である。インスリン効果が欠乏または減少することにより、血中に放出されたグルコースの体細胞による吸収および変換が不十分になる。脂肪組織において、インスリン−拮抗ホルモンは、脂肪分解を増加させる効果を有し、当該効果は、遊離脂肪酸の血中レベルの増加を伴う。
【００４２】
脂肪症（肥満症）は、過剰なカロリー摂取によるエネルギー不均衡が原因で起こる異常な体重増加であり、これは、健康上の危険を構成する。
【００４３】
さらに、本発明は、糖尿病または脂肪症を治療するための医薬を調製するための、ＧＬＵＴ１タンパク質を用いた方法により同定され、必要に応じてさらに開発された化合物の使用に関する。医薬とは、ヒトおよび動物における病気または肉体的な機能不全の治療法のための、薬理学的に活性な物質の投薬形態のことである。例えば、粉末、顆粒、錠剤、丸剤、ロゼンジ、糖衣錠剤、カプセル、液状抽出物、チンキ、および、シロップが、経口の治療法用に知られている。外用投与に用いられる例は、エアロゾル、スプレー、ゲル、軟膏または粉末である。注射可能な溶液または不溶解性の溶液は、バイアル、ビンまたは予め充填された注射器を用いる非経口投与を可能にする。これらおよび他の医薬が、製薬技術分野の当業者に知られている。
【００４４】
さらに、本発明は、配列番号１３のポリヌクレオチド配列、および、配列番号１４のポリヌクレオチド配列に関する。配列番号１３および１４のポリヌクレオチド配列は、ラットＧＬＵＴ１遺伝子の変異をコードしており、この変換が問題のタンパク質中の個々のアミノ酸の置換をもたらす。配列番号１３のポリヌクレオチド配列は、アミノ酸鎖の６９位でバリンがメチオニンで置換されたＧＬＵＴ１タンパク質をコードする。配列番号１４のポリヌクレオチド配列は、アミノ酸鎖の７０位でアラニンがメチオニンで置換されたＧＬＵＴ１タンパク質をコードする。両方のタンパク質変異体は、欠失によりそのヘキソース輸送体が失われた株においてもグルコース摂取をサポートするが、野生型ＧＬＵＴ１タンパク質によるグルコース摂取はサポートしない。このような変異体は、例えばサプレッサー変異での選択またはインビトロ変異誘発により得ることができる。その上、本発明は、配列番号１３または１４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＧＬＵＴ１タンパク質に関する。
【００４５】
本発明はまた、配列番号１３のポリヌクレオチド配列または配列番号１４のポリヌクレオチド配列を含む酵母株に関する。このような酵母株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｅｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨにＤＳＭ１４０２６およびＤＳＭ１４０２７として寄託される。これら株を生成するために、配列番号１３または１４に相当する酵母ベクターを、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質では成長できないが、唯一の炭素源としてヘキソースを含む基質で成長するその能力は、ＧＬＵＴ１遺伝子がこの株において発現される場合にやがては回復する酵母株に形質転換させる。続いて、形質転換後、細胞を、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地にプレーティングする。この培地で成長するコロニーを単離する。この方式で形質転換された酵母株は、例えば、ＧＬＵＴ１タンパク質により輸送されたヘキソースの量を増加または減少させる化合物を同定する方法を実行するのに適する。
【００４６】
略語
ＨＸＴ：ヘキソース輸送体、
ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム、
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応。
【００４７】
実施例
酵母株の成長
本明細書で説明された全ての酵母株は、株ＣＥＮ．ＰＫ２−１Ｃ（ＭＡＴａ  ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２ｔｒｐ１−２８９ｈｉｓ３Δ１ＭＡＬ２−８cＳＵＣ２）から得られた。ヘキソース輸送体遺伝子（ＨＸＴ）における欠失を有する酵母株の世代は、Wieczorke et al., FEBS Lett. 464. 123-128(1999)により説明されている：ＥＢＹ．１８ｇａ（ＭＡＴａ  Δｈｘｔ１−１７  Δｇａｌ２  Δａｇｔ１  Δｓｔｌ１  ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９  ｈｉｓ３−Δ１  ＭＡＬ２−８cＳＵＣ２）、ＥＢＹ．ＶＷ４０００（ＭＡＴａ  Δｈｘｔ１−１７  Δｇａｌ２  Δａｇｔ１  Δｍｐｈ２  Δｍｐｈ３  Δｓｔｌ１  ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１−２８９  ｈｉｓ３−Δ１  ＭＡＬ２−８cＳＵＣ２）。培地は、１％酵母抽出物と２％ペプトン（ＹＰ）を基本とし、一方で、最小培地は、０．６７％Ｄｉｆｃｏ酵母窒素ベース（アミノ酸を含まない）（ＹＮＢ）から成り、栄養要求性および異なる炭素源のための添加剤を含む。酵母細胞を、オービタルシェーカーまたは寒天プレート上で３０℃で好気的に成長させた。６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ600）を測定することによって細胞成長をモニターした。
【００４８】
グルコース摂取の測定
グルコース輸送を、Ｄ−［Ｕ−14Ｃ］−グルコース（アマシャム社）の摂取として測定し、Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅグラフから動力学的パラメーターを測定した。細胞を遠心し、リン酸緩衝液で洗浄し、濃度６０ｍｇ（新鮮な重量）／ｍｌのリン酸緩衝液に再懸濁した。０.２〜１００ｍＭのグルコース濃度でグルコース摂取を測定し、基質の特異的活性は、０.１〜５５.５ｋＢｑ  μｍｏｌ-1の範囲であった。細胞およびグルコース溶液を３０℃で５分間プレインキュベートした。細胞を放射性グルコースで処理することによりグルコース摂取を開始させた。５秒間インキュベートした後、１０ｍｌの氷冷した停止緩衝液（０.１Ｍ  ＫｉＰＯ4，ｐＨ６.５，５００ｍＭグルコース）を加え、細胞をグラ
スファイバーフィルター（直径＝２４ｍｍ，ワットマン社）で迅速にろ過した。フィルターを氷冷した緩衝液で３回迅速に洗浄し、取り込まれた放射能を液体シンチレーション計数器で測定した。サイトカラシンＢ（エタノールに溶解させ、最終濃度は２０μＭ）による阻害は、阻害剤存在下、または、溶媒のみで細胞を１５分間インキュベートした後に、５０ｍＭまたは１００ｍＭの放射性グルコースを用いた１５秒の摂取試験を行うことにより、測定された。
【００４９】
Ｈ２ｒｇ４ｇ２（配列番号１０）およびＨ２ｒｇ１ｇ２（配列番号１２）の構築
Ｈ２ｒｇ４ｇ２およびＨ２ｒｇ１ｇ２は、ラットからのＧＬＵＴ４遺伝子（配列番号１０中）またはＧＬＵＴ１遺伝子（配列番号１２中）に機能的に結合したＨＸＴ２プロモーター（酵母グルコース輸送タンパク質２のプロモーター）を含むＤＮＡ構築物である。プラスミドＧＬＵＴ１−ｐＴＶ３およびＧＬＵＴ４−ｐＴＶ３の０.５ｋｂのＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ−ＧＡＬ２プロモーター断片(Kasahara and Kasahara, Biochem J. 315, 177-182(1996)；Kasahara and Kasahara, Biochim. Biophys. Acta 857, 146-154(1997))が、それぞれの場合、−４５２ｂｐ〜＋９ｂｐの酵母ＨＸＴ２プロモーターを含む０.５ｋｂのＤＮＡ断片（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｐ２３５８５）の代わりに置換された。
【００５０】
ＹＥｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ１（配列番号１１）およびＹＥｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ４（配列番号９）の構築
ＹＥｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ１およびＹＥｐ４Ｈ７−ＨｓＧＬＵＴ４は、ＨＸＴ７プロモーター（ＨＸＴ７遺伝子のプロモーター）の−３９２〜−１位のプロモーター断片がヒトＧＬＵＴ１遺伝子（配列番号１１中）またはＧＬＵＴ４遺伝子（配列番号９中）に機能的に結合したプラスミドである。完全ＨＸＴ７プロモーターはグルコースにより抑制されるために、当該プロモーターの断片が用いられた。
【００５１】
ｐ４２６ＭＥＴ２５からの０.４ｋｂのＳａｃＩ／ＳｐｅＩ−ＭＥＴ２５プロモーター
断片（Mumberg et al., Nucleic Acids Res. 22, 5767-5768(1994)）を、−３９２〜−１位のＨＸＴ７プロモーター断片（テンプレートとしてＨＸＴ７遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｐ３９００４）から、プライマーＰ４２６Ｈ７−１（配列番号１）およびＰ４２６Ｈ７−２（配列番号２）を用いてＰＣＲで増幅された）を含む０.４ｋｂのＤＮＡ断片で置換し
、プラスミドＹＥｐ４Ｈ７（配列番号１５）を得た。ＧＬＵＴ１に対してはプライマー対ＨＳＧ１−Ｆ７／Ｔ２−ＨＳＧ１（配列番号３、４）、ＧＬＵＴ４に対してはプライマー対ＨＳＧ４−Ｆ７／Ｔ２−ＨＳＧ４（配列番号５、６）、ならびにテンプレートとしてヒトＧＬＵＴ１（ＥＭＢＬ：Ｍ２０６５３）およびヒトＧＬＵＴ４ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｍ２０７４７）を用いてＰＣＲを１０サイクル以上行うことにより、ヒトＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を増幅した。プライマーＴ７１−ＯＲＦ（配列番号７）と、Ｔ２−ＨＳＧ１（配列番号４）またはＴ２−ＨＳＧ４（配列番号６）とを用いて１０サイクル以上、ＰＣＲ産物を再増幅した。ＧＬＵＴのＯＲＦ配列の上流と下流、ＰＣＲ最終産物は、プラスミドＹＥｐ４Ｈ７のＨＸＴ７プロモーター領域またはＣＹＣ１末端領域（イソ−チトクロームｃ１）に相同な配列を含む。それらは、ＥｃｏＲＩで線形化されたＹＥｐ４Ｈ７と共に、酵母株ＥＢＹ．Ｆ４−１に形質転換され、続いて酵母で相同組換えが起こり、２％濃マルトース培地でウラシル原栄養性に関して形質転換産物を選択した。
【００５２】
ヘキソース−輸送欠損酵母株中でのラットからのＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４の発現
酵母多コピー発現プラスミドＧＬＵＴ１−ｐＴＶ３ｅおよびＧＬＵＴ４−ｐＴＶ３ｅは、ガラクトース誘導およびグルコース抑制酵母ＧＡＬ２プロモーターの制御下にラットからのグルコース輸送体遺伝子ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４を有する。この２種の構築物において、ＧＡＬ２プロモーターは、グルコース誘導酵母ＨＸＴ２プロモーターで置換された。これらベクターは、酵母株ＥＢＹ．１８ｇａ（Δｈｘｔ）（これはいかなるヘキソースも摂取できないため、唯一の炭素源としてグルコースまたは他のヘキソースを含む培地では成長できない）に形質転換された。その細胞を、炭素源としてマルトースを含むトリプトファンを含まない合成培地にプレーティングした。形質転換体を、同じ基礎培地（但しマルトースを含まず、グルコース濃度が異なる（５ｍＭ，１０ｍＭ，５０ｍＭ，１００ｍＭ））に、レプリカ−プレーティング法を用いてプレーティングした。形質転換体は、異なるグルコース培地では成長せず、３０℃で１週間までインキュベートしても成長しなかった。これは、正常なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株では、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４グルコース輸送体はグルコース摂取をサポートしないことを証明する。
【００５３】
酵母細胞におけるＧＬＵＴ１輸送体を介したグルコース摂取
株ＥＢＹ．１８ｇａのＧＬＵＴ１形質転換体をグルコース培地で長期間インキュベートした後、コロニー（サプレッサー変異体、または、後述のサプレッサーコロニーと称される）が成長し、これらは明らかにグルコース摂取および変換が可能であったことを明らかにした。ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４形質転換体は、それゆえに、ＹＮＢ培地（唯一の炭素源として１０ｍＭのグルコースを含む）を含む寒天プレートにプレーティングされた。ＵＶ光線を亜致死量で照射した後、細胞を３０℃で７〜１４日間インキュベートした。ＧＬＵＴ４形質転換体ではサプレッサーコロニーは観察されなかったが、ＧＬＵＴ１形質転換体を用いた寒天プレートには、グルコースで成長可能な数個のサプレッサーコロニーが成長した。数個のＧＬＵＴ１サプレッサー変異体は、非選択的ＹＰマルトース培地で、１５世代を超過した。それらのプラスミドが失われた全ての細胞は、炭素源としてグルコースを含む培地では成長できなくなっていた。すなわち、唯一の炭素源としてグルコースで成長することは、ＧＬＵＴ１依存性であることを実証することができた。オリジナルの野生型Ｈ２ｒｇ１ｇ２プラスミドをこれら細胞に再形質転換した後、数個の酵母株の一つにおいてグルコースで成長する能力が回復する。これにより、この株が、機能的なＧＬＵＴ１発現の阻害作用を取り除く変異をそのゲノム中に含むことが確認される。変異対立遺伝子は、ｆｇｙ１−１（これは、「ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＬＵＴ１  ｉｎ  ｙｅａｓｔ（酵母におけるＧＬＵＴ１の機能的な発現）」の略語である）と称され、その株はＥＢＹ．Ｓ７と称される。
【００５４】
他のサプレッサー変異体からＨ２ｒｇ１ｇ２プラスミドを単離し、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅し、オリジナルのグルコース輸送が欠失した酵母株ＥＢＹ．１８ｇａ（Δｈｘｔ）に再形質転換した。数個のこれらプラスミドにより、唯一の炭素源として１０ｍＭのグルコースを含む合成培地での成長が可能になった。従って、これらＧＬＵＴ１配列は、酵母において対応するＧＬＵＴ１タンパク質を機能的なグルコース輸送体に変換する変異を含む。例えば、このような変異体としては、アミノ酸６９位（配列番号１３）におけるバリンのメチオニンでの置換、または、アミノ酸７０位（配列番号１４）におけるアラニンのメチオニンでの置換が挙げられる。配列番号１３の変異体は、上述の変異体のスクリーニングで見出された。配列番号１４の変異体は、以下に示すようなインビトロでの変異誘発で得られた。用いられたインビトロ変異誘発法の原理は、Boles and Miosga(1995)(Boles and Miosga, Curr Genet. 28, 197-198(1995))で説明されている。第一のＰＣＲ反応で、ＤＮＡテンプレートとしてプラスミドＹＥｐＨ２−ｒＧＬＵＴ１（２０ｎｇ）を、プライマーｓｅｑｈｘｔ２（配列番号１６）とｇｌｕｔｍｅｔ２（配列番号１７）（いずれの場合も１００ｐｍｏｌ）と共に用いた（ＰＣＲ条件：９５℃４５秒、５０℃３０秒、７２℃２分、２５サイクル、ｔａｑポリメラーゼ）。プライマーｇｌｕｔｍｅｔ２は、正常なＧＬＵＴ１遺伝子を改変し、ラットＧＬＵＴ１のアミノ酸７０位において、アラニンをメチオニンに置換させる塩基配列を含む。得られたＰＣＲ断片を、アガロースゲル電気泳動、続いてゲル抽出により精製した。第二のＰＣＲ反応において、精製ＰＣＲ断片（２０ｎｇ）を、ＤＮＡテンプレート（５０ｎｇ）としてプラスミドＧＬＵＴ１−ｐＴＶ３（Kasahara and Kasahara, Biochem J. 315, 177-182(1996)）（５０ｎｇ）、プライマーｓｅｑｈｘｔ２およびｓｅｑ２ｇａｌ２（配列番号１８）（いずれの場合も１００ｐｍｏｌ）と共に用いた（ＰＣＲ条件：９５℃４５秒、５４℃３０秒、７２℃２分、２０サイクル、ｔａｑポリメラーゼ）。プライマーｓｅｑｈｘｔ２のみが第一のＰＣＲ反応の断片に結合したことから、これらＤＮＡ配列のみがこの第二のＰＣＲ反応で増幅され、アミノ酸７０位におけるアラニンのメチオニンでの置換が得られた。得られた変異ＧＬＵＴ１遺伝子を含むＰＣＲ断片は、アガロースゲル電気泳動、続いてゲル抽出で精製され、プラスミドＹＥｐＨ２−ｒＧＬＵＴ１中の野生型ＧＬＵＴ１遺伝子と交換された。このプラスミド（配列番号１４）は、グルコース輸送欠失酵母株ＥＢＹ．１８ｇａ（Δｈｘｔ）に形質転換され、唯一の炭素源としてグルコースを含む合成培地で成長可能になった。
【００５５】
ＧＬＵＴ４輸送体を介してグルコースを摂取する酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
明らかに株ＥＢＹ．Ｓ７（Δｈｘｔ  ｆｇｙ１−１）は、ゲノム変異、すなわちｆｇｙ１−１を含み、それにより、ＧＬＵＴ１を酵母中で機能化させ、細胞質膜を通過して細胞へグルコースを摂取することをサポートすることが可能である。
【００５６】
Ｈ２ｒｇ４ｇ２による株ＥＢＹ．Ｓ７（Δｈｘｔ  ｆｇｙ１−１）の形質転換の後、唯一の炭素源としてグルコースを含む培地での成長が可能なサプレッサーコロニーを単離した。
【００５７】
これらＧＬＵＴ４サプレッサー変異体のうち９種が、非選択的ＹＰマルトース培地で１５世代を超過して成長した。それらのプラスミドが失われた全ての細胞は同様に１０ｍＭグルコース培地では成長できなくなり、これは、初期の成長がＧＬＵＴ４依存性であることを支持する。Ｈ２ｒｇ４ｇ２プラスミドを９種のサプレッサー株から再単離し、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅し、オリジナルのグルコース輸送欠失酵母株ＥＢＹ．Ｓ７に戻して形質転換した。プラスミドは、唯一の炭素源として１０ｍＭグルコースを含む合成培地での成長を可能にしなかった。これは、それらが、ＧＬＵＴ４の非「活性化」変異体型を含むことを実証した。オリジナルの野生型Ｈ２ｒｇ４ｇ２プラスミドを９種の目下プラスミドを含まないサプレッサー株に再形質転換した後、これら全ての株は、ＧＬＵＴ４輸送タンパク質遺伝子を含まないコントロールベクターを含む形質転換体とは対照的に、グルコースで成長する能力を回復した。相当するこの株の変異は、ｆｇｙ４−Ｘ（ｘ＝１〜９）と称された。変異対立遺伝子ｆｇｙ４−Ｘにより、これら株で発現されたＧＬＵＴ４遺伝子の機能的なＧＬＵＴ４発現が起こった。従って、本発明の目的は達成された。本発明に係る用いられた酵母株の大要は、表に示される。
【００５８】
表は、本発明で用いられた酵母株の大要を示し、遺伝子型、それらの成長に必要な成長条件、およびＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨにおけるそれぞれの寄託番号を示す。
【配列表】
2008245656000001.app