(57)【要約】【課題】フェノール配糖化酵素は高いフェノール配糖化率を有し、更に、糖の加水分解活性が非常に微弱である、という従来公知の糖質分解酵素とは異なる性質を有する新規な酵素、及び、該酵素を利用して各種のフェノール配糖体を高収率で製造すること。【解決手段】分子量20,000を有する、Bacillus subtilis菌由来のフェノール配糖化酵素、該フェノール配糖化酵素を使用するフェノール配糖体の製造方法、及び、該製造方法で製造されたフェノール配糖体を活性成分として含有する医薬組成物。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量20,000を有する、Bacillus subtilis菌由来のフェノール配糖化酵素。
【請求項２】
糖がキシロースである請求項１記載の酵素。
【請求項３】
キシロース供与体がキシラン特異的である、請求項２記載の酵素。
【請求項４】
フェノールが二価フェノール、三価フェノール、又は、フェノール性化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項５】
キシラナーゼ活性に対するカテコール配糖体活性が２８倍以上である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
アルコールに対しては配糖化しない請求項５記載の酵素。
【請求項７】
Bacillus subtilis菌がスギ葉圏又はヒノキ葉圏に生息するキシラン資化菌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
Bacillus subtilis菌がBacillus subtilis  KT12株である、請求項７記載の酵素。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェノール配糖化酵素を使用する、フェノール配糖体の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のフェノール配糖化酵素を用いるフェノールキシロシドの製造方法であって、キシロース供与体としてキシランを使用することを特徴とする、前記方法。
【請求項１１】
キシロース受容体がカテコール構造を有するフェノール性化合物である、請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
フェノール性化合物がＬ−ＤＯＰＡ又はドーパミンである、請求項１１記載の製造方法。
【請求項１３】
フェノール配糖体が、少なくとも１〜４糖のいずれかををグルコン部とする、請求項９記載の製造方法。
【請求項１４】
フェノール配糖化酵素がBacillus subtilis菌により菌体外酵素として構成的に生産されたものである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
Bacillus subtilis菌の培養培地中でフェノール配糖体が製造される、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
培養培地がブイヨン培地である、請求項１５記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法で製造されたフェノール配糖体を活性成分として含有する、食品、医薬、又は化粧品組成物。
【請求項１８】
活性成分がＬ−ＤＯＰＡキシロシドである、請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
パーキンソン治療薬である、請求項１８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なフェノール配糖化酵素及び該フェノール配糖化酵素を使用するフェノール配糖体の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシランはヘミセルロースの構成成分として知られており、β-D-キシロピラノースが直鎖状にβ-1,4グリコシド結合したものを骨格構造とする。自然界においてセルロースについで、二番目に多く存在する多糖であり農林産資源である(1,2)。これらバイオマスの利用として、キシランの加水分解を行うキシラナーゼを用いたキシロオリゴ糖の生産、キシロオリゴ糖やキシロースを原料としたキシリトールやエタノール生産など産業的利用がなされている。また、動物食料の調製、食品添加物、医薬品、パンなどの食物や飲料の生産、繊維においてセルロースパルプの漂白などに利用されている。
【０００３】
キシラン分解酵素の一部に配糖化反応を行うものがある。配糖化反応はアルコール・フェノール類を受容体とし配糖体が生産される。配糖化は化合物の可溶化(3)、安定化(4)といった修飾法として注目されている。また、配糖体には様々な生理活性 (3-5)が期待されるため、食料品・医薬品・化粧品などに幅広く利用され研究されている。微生物産生酵素による配糖化反応は、化学合成と比べ反応が温和な条件で進むこと、安全性が高いといった利点、植物培養細胞に比べ生育速度が速いことや高濃度処理が可能であることが挙げられる（6,7）。
【０００４】
これまで木質バイオマスであるキシランに着目し、その更なる利用法として配糖体合成を提唱している。本発明者らにより、Asperugillus属由来キシロシダーゼを利用して、キシランを供与体とした各種アルキルキシロシドの合成に成功しており、界面活性剤としての利用法が見出されている（非特許文献１）。また、水／ヘプタノールといった二層式の反応系において高収率で配糖体を得る方法を見出している（非特許文献２）。又、フェノールグルコシドを生成するBacillus subtilis由来アミラーゼが知られている（非特許文献３）。
【非特許文献１】H. Shinoyama, Y. Gama, H. Nakahara, Y. Ishigami, and T. Yasui: Surface active properties of heptyl-β-xyloside synthesized by utilizing the transxylsyl activity of β-xylosidase, Bull. Chem. Soc.  Jpn., 64, 291-292, 1991.
【非特許文献２】Shinoyama, H., A. Ando, T. Fujii, and T. Yasui. 1991. The possibility of enzymatic synthesis of a variety of β-xylosides using the transfer reaction of Aspergillus niger β-xylosidase. Agric. Biol. Chem. 55:849-850.
【非特許文献３】Nishimura T, Kometani T, Takii H, Terada Y, Okada S (1994) Purification and some properties of α-amylase from Bacillus subtilis X-23 that glucosylates phenolic compounds such as hydroquinone. J. Ferm. Bioeng. 78: 31-36.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一方，フェノールキシロシドについては収率の低さが問題となっている。そこで、本発明者は、微生物の検索を行った結果、キシランを供与体とした高いフェノール配糖化を行う酵素をBacillus subtilis菌から見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
即ち、本発明は、分子量20,000を有する、Bacillus subtilis菌由来のフェノール配糖化酵素、該フェノール配糖化酵素を使用するフェノール配糖体の製造方法、及び、該製造方法で製造されたフェノール配糖体を活性成分として含有する医薬組成物等に係るものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、フェノール配糖化酵素は高いフェノール配糖化率を有し、更に、糖の加水分解活性が非常に微弱である、という従来公知の糖質分解酵素とは異なる性質を有する新規な酵素が提供され、それを利用して各種のフェノール配糖体を高収率で製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の第一の態様は、分子量20,000を有する、Bacillus subtilis菌由来のフェノール配糖化酵素に係る。該酵素により配糖される糖の代表的例として、キシロース又はグルコースを挙げることが出来る。該酵素の特徴として、キシロース供与体がキシラン特異的である。即ち、キシローオリゴサッカライド、キシロトリオース、キシロビオース、キシロース、及びセルロース等はキシロース供与体として作用しないことが実験的に確認されている。
【０００９】
本明細書の実施例で示されるように、本発明のフェノール配糖化酵素の受容体としては、カテコール、ヒドロキノン及びレゾルシノール等の二価フェノール類、ピロガロール、ヒドロキシヒドロキノン、フロログルシノール等の三価フェノール、並びに、クマル酸、O-ニトロフェノール、クマリン、没食子酸、カテキン、及び、Ｌ−ＤＯＰＡ及びドーパミン等のカテコール構造を有する化合物等のフェノール性化合物を挙げることが出来る。一方で、メタノール及びエタノール等のアルコール類は本発明のフェノール配糖化酵素の受容体になることが出来ない。
【００１０】
本発明の酵素は、表１に示されるように、キシラナーゼ活性に対するカテコール配糖体活性が３０〜４０倍以上、例えば、３９倍であることを特徴とする。
【００１１】
本発明のフェノール配糖化酵素は、本明細書の記載及び当該技術分野の公知技術に基づき、当業者であれば、Bacillus subtilis菌から容易に単離・調製することができ、好ましくは、かかるBacillus subtilis菌はスギ葉圏又はヒノキ葉圏に生息するキシラン資化菌である。このような菌の好適例として、Bacillus subtilis  KT12株を挙げることが出来る。
【００１２】
本発明の第二の態様は、キシロース供与体としてキシランを使用し、該フェノール配糖化酵素を用いるフェノールキシロシドの製造方法に係る。特に、キシロース受容体として、パーキンソン治療薬であるＬ−ＤＯＰＡ又はドーパミン等のカテコール構造を有するフェノール性化合物を使用して配糖体を製造した場合には、該薬剤の可溶性及び安定性が向上させることが出来る。本発明の酵素を使用して得られるフェノール配糖体は、少なくとも１〜４糖のいずれか又はそれらの複数種類の組み合わせをグルコン部として有する構造を有する。
【００１３】
このような製造方法は、当業者に公知の任意の方法で行うことが出来る。例えば、本発明酵素の粗精製画分、又は精製された酵素を使用してもよい。或いは、フェノール配糖化酵素を生産するBacillus subtilis菌を培養し、それが菌体外酵素として構成的に生産した酵素が含まれる培養培地中で、フェノールキシロシドを製造することも可能である。培養条件及び培地の種類等は、使用するフェノール配糖化酵素の受容体の種類等に応じて、当業者が適宜選択することが出来る。
【００１４】
こうして製造される様々なフェノール配糖体は、食品、医薬、及び化粧品組成物の活性成分と使用することが出来る。
【００１５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１６】
試薬類:
ポテトデキストロース寒天（PDA）、酵母エキス（Bacto YEAST EXTRACT）はDIFCO社の製品を、乾燥ブイヨン（Nutrient Broth）は日本製薬株式会社（Nissui）の製品を、キシラン（Birchwood由来）はSIGMA社製の製品を使用した。その他の試薬類はすべて市販の特級、もしくはそれに準ずるものを使用した。
【００１７】
（１）キシラン資化微生物菌の分離
キシラン資化菌検索用培地は、2.0％(w/v%) キシラン、0.2％ ペプトン、0.1％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、0.04％ MgSO4・７H2O、2.0% 寒天、0.25(v/v%) 微量ミネラル＊（*蒸留水500mlにNaCl 0.25g、FeC6H5O7・xH2O 3.0g、ZnSO4・７H2O 1.0g、MnCl2・４H2O 0.05g、CoCl2・６H2O 0.05g、H3BO３ 0.1g、CaCl2・H2O 2.0gを溶解させたもの）にて調製した。その後、糸状菌はpH 5.6に、細菌はpH 7.0に調整した後、オートクレーブ滅菌（121℃、20分）し、使用した。ブイヨン培地は3.0％ブイヨンに調整後、オートクレーブ処理し使用した。スギ林よりスギ生葉を適当な大きさに切断し、未使用のファルコンに入れて持ち帰り、スギ生葉約1 gに対して5 mlの1.0％滅菌生理食塩水に懸濁し、そのうち100μlをキシラン資化菌検索用寒天培地にコンラージ棒を用いて均一に塗布した。また、残ったスギ生葉もそのまま静置を行い、3−7日間、30℃にて培養を行った。また、土壌からの検索においては土壌サンプル約0.1 gに5 mlの1.0％滅菌生理食塩水を加えた後、同様の操作を行った。その後、コロニーが生じたものをキシラン資化菌とし、単離を行った。
【００１８】
（２）フェノール配糖化菌のスクリーニング
次に、こうして得られたキシラン資化菌からフェノール配糖化菌をスクリーニングした。即ち、キシラン資化菌をキシラン分解酵素生産培地（上記のキシラン資化菌検索用培地から寒天を除いたもの）に、糸状菌ならジャイアントコロニーの端を1ブロック切り取り加え、細菌においては1白金耳を加えた後、7日間、30℃にて振とう培養を行った。培養後、冷却遠心分離（4℃、6、000×g、30 min）を行い、菌体と上清液に分離し、上清液について菌体外酵素として配糖化活性評価をTLCにより行った。尚、生成物の分離条件は次の通りである。ワットマンシリカゲルプレートLK6D（Whatman社製）を用いて、単糖、オリゴ糖、配糖体の確認の際は展開溶媒（酢酸エチル：酢酸：水＝3：1：1（v/v））を用いて展開した後、十分乾燥させた。その後、発色試薬として、有機化合物全般に対しては、硫酸：メタノール＝1：4（v/v）を十分に散布後、100℃、約5分間加熱を行った。
【００１９】
その結果、図１のようなカテコール配糖体を生じさせるフェノール配糖化菌が単離された。上記スクリーニングにおいて、スギ葉圏といった生育阻害物質が多量に存在する領域において、フェノール配糖化能を有する微生物が真菌においては79％、細菌においては27％の頻度で得られ、土壌と比較して、それぞれ約3倍から5倍であった。ヒノキ葉圏においても、同様の傾向が見られた。糸状菌に比べて細菌において配糖化酵素の諸性質の検討が行われていないことや培養期間が短く、経時的変化も追いやすいことから、以下、細菌3株（KT12株、YR12株、及びB-1株）を用いて検討することとした。尚、これら3株は細菌の中でも、特に高いカテコール配糖体の生産性が確認された（図２）。
【００２０】
（３）フェノール配糖化菌の同定
これら細菌３株について、ISOPLANT (Nippon Gne)を用いてＤＮＡを抽出した後、Primer ForwardとしてPRBA338f（ACTCCTACGGGAGGCAG：配列番号１）及びPrimer ReverseとしてPRUN518ｒ（CCAGCAGCC GCGGTAAT：配列番号２）を使用し、Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)供与の試薬を用いて、16Ｓ rDNA V3領域の遺伝子部分塩基配列のＰＣＲを行った。配列決定は、BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)及びABI3100 genetic analyzer (Applied Biosystems)を用いて行った。こうして決定した16Ｓ rDNA V3領域の塩基配列をBLASTデータベースに対してホモロジー検索した。更に、生化学的検査によって、これらの菌株がグラム陽性及び移動陽性であることが光学顕微鏡で確認した。以上の解析結果に基づいて検討の結果、3株ともにBacillus属であることが示された。特にKT12株とYR12株についてはBacillus subtilisとの相同性が100％であった。カテコール配糖体の生産量に富んだBacillus属３株について、以下の方法で、キシラナーゼ活性及び配糖化活性の比較を行った。
【００２１】
（４）酵素液のキシランに対する加水分解能（キシラナーゼ活性）の確認       
キシランに対する加水分解能は、キシラン0.02g、100mM 酢酸バッファー（pH 5.0）0.5 ml、酵素液1.5 mlを30℃にて24時間反応させ、上記の条件で薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いてオリゴ糖の遊離を確認した。発色試薬として、アニシジン発色（3％アニシジン塩酸塩メタノール溶液）を用いた。
【００２２】
次いで、キシラン 0.02g、100 mM 酢酸バッファー（pH 5.0）1.5 ml、酵素液 0.5 mlをL字管に加え30℃、0および20分間反応後、0.1 mlを分取し、生成する還元糖をSomogy-Nelson法により吸光度660 nmにてキシラナーゼ活性を測定した。この反応系において1分間に加水分解されて生成したキシロース相当の還元糖のμmol数をもってキシラナーゼ活性の単位（Ｕ）とした。
【００２３】
（５）酵素液のキシランを供与体としたフェノール配糖化活性の確認
キシランに対するフェノール配糖化能は、キシラン0.02g、フェノール類0.05g、100mM酢酸バッファー（pH 5.0）0.5 ml、酵素液1.5 mlを30℃にて24時間反応させ、上記の条件で薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いて、配糖体の生成を確認した。
【００２４】
次いで、キシラン 0.02 g、カテコール0.05 g、酵素液1.5 ml、100 mM酢酸塩緩衝液（pH 5.0）0.5 ml、を30℃、10分間反応後、25％トリクロロ酢酸（TCA）0.5mlを加えて反応を停止し、0.55 mM炭酸水素ナトリウム水溶液0.5 mlにて中和、内部標準物質としてバニリンを終濃度0.2 mg/mlとなるように加え、1.5ml容エッペンドルフチューブに移し変えた後、8000×g、4℃、10分間の遠心分離後、0.2μmフィルターろ過の後、カテコールキシロシドの生成量をHPLCにより測定した。なお、操作条件は次の通りである。分析計、D-7500型クロマトデータ処理装置（日立製作所社製）；カラム、YMC-Pack ODS-AQ(4。6×30 cm、YMC社製)；溶媒、アセトニトリル：水＝1：5（v/v）；流速、1.0 ml/min；検出波長、280 nm；試料量、5 μl、L-7400型UV検出器（日立製作所社製）。この反応系において1分間に生成するキシロビオシルカテコール、キシロトリオシルカテコール、キシロテトラオシルカテコールをHPLCを用いて測定し、キシロビオシルカテコール相当の配糖体のμmol数をもって、カテコール配糖化活性の単位（Ｕ）とした。
【００２５】
以上の活性測定の結果、TLCの結果と類似し、ともに高い配糖化活性、微弱な加水分解活性を有するといった結果が得られた（表１）。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
尚、以上の実験で使用した「酵素液」は、各菌株をキシラン分解酵素生産培地及びブイヨン培地にて３０℃ 、48時間培養を行った後、冷却遠心分離（4℃，6,000×g，30 min）を行い、その上清液を酵素液とした。
【００２８】
（６）フェノールキシロシドの精製及び同定
フェノールキシロシドの精製及び同定は以下のとおり行った。
500 ml容三角フラスコに2.5% 供与体、2.5% 受容体を加えて、100 mM酢酸塩緩衝液50 mlに溶解させた後、各菌株から上記のように調製した酵素液（約75 U）150 mlを加え、30℃、24時間反応を行った。24時間反応後、それぞれの配糖体の生成をTLCによって、発色試薬としてアニシジン発色と硫酸発色を組み合わせることで確認した。その後、遠心分離（10,000×g、20分間）、吸引ろ過（No.131、ADVANTEC社製）を用いて不溶物質を除去し、反応ろ液を得た。活性炭カラム（25×300 mm i.d.）はエタノールで十分に洗浄後10倍量の蒸留水にて置換し使用した。反応ろ液に対して、活性炭カラムに吸着後、500 mlの10％メタノールにて洗浄（未反応フェノール性物質除去）を行った。その後、20、40％エタノール（ステップワイズ）にて溶出を行った。TLCにて配糖体の溶出が確認された20、40％エタノール画分を回収した。その後、エバポレーターを用いて、濃縮を行った後、少量の溶媒に溶解させた。セルロース分配カラム（25×5000 mm i.d.）は溶媒として使用するエタノール:1-ブタノール:水=1:10:2を一昼夜通液させたものを使用した。濃縮させたサンプルをのせ、セルロース分配カラムクロマトグラフィーを行った。各フラクラクションをフラクションコレクターにて10 mlずつ回収し、TLCにてそれぞれの配糖体の溶出が確認された画分をそれぞれ回収した。精製された配糖体を約1％濃度で蒸留水に溶解したものを試料とし、酸加水分解法によって構造解析を行った。試料500 μlを軟質ガラス小試験管に移し，トリフルオロ酢酸（TFA）25 μlを加えた。封管を行った後、100℃にて処理時間は0，5，15，120分間加熱処理を行い、加水分解され遊離するアグリコンおよびグルコンをTLCにて解析した。酸加水分解処理の結果、キシロースおよび２〜４糖のキシロオリゴ糖の遊離が確認された。従って、本発明の酵素を用い合成されたフェノール配糖体は１〜４糖、またはそれ以上のオリゴ糖をグルコン部とするこれまで報告の無い新規なフェノールキシロシドを合成することが可能であることが示された。
【００２９】
（７）各種フェノール類・アルコール類に対する受容体特異性
スクリーニングにおいて見出されたBacillus subtilis 3株をキシラン分解酵素生産培地中で、30℃、3日間培養し、各菌が産生するフェノール配糖化酵素の受容体特異性について検討を行った（表２）。受容体には、各種フェノール性化合物およびアルコール類を用いることとした。すなわち、二価フェノール類であるカテコール、ヒドロキノン、レゾルシノール、および三価フェノールであるピロガロール、ヒドロキシヒドロキノン、フロログルシノール、フェノール性化合物であるクマル酸、O-ニトロフェノール、クマリン、没食子酸、カテキンなど、さらに、アルコール類であるメタノール、エタノールを用いた。得られた細菌3株が産生するキシランを供与体としたフェノール配糖化酵素は二価及び三価のフェノール類に対して配糖化を示した。また、没食子酸、カフェー酸、カテキン、4-メトキシフェノールに対して配糖化を示した。しかし、アルコールに対しては配糖化を示さなかった。尚、表２中の各記号は配糖化の程度を示し、「＋＋」：強、「＋」：弱、「−」：検出されず、及び、「N.D」：データなし、を意味する。尚、配糖化活性評価は、フェノール配糖化菌のスクリーニングの場合と同様な方法（TLC）で実施した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
（８）糖の資化性およフェノール配糖化酵素の生産性
Bacillus subtilis  KT12株をまずブイヨン培地で30℃、180 rpmで前培養し、培養物を660nm における光学密度OD(A660)0.1に希釈して、各種炭素源（2.0％）含有の液体培地（2.0％(w/v%)糖類、0.2％ ペプトン、0.1％ K2HPO4、0.2％ KH2PO4、0.04％ MgSO4・７H2O、0.25(v/v%) 微量ミネラル）に植菌し、更に７日間培養し、冷却遠心分離（4℃，6,000×g，30 min）し、その上清液を酵素液とし、それが生産する本発明のフェノール配糖化酵素の生産性を評価した。本菌はキシラン、デンプン、マルトース、スクロース、ラクトース、マンニトール、ブイヨン培地において得に良好な生育を示した。特に、キシラン及びブイヨン培地にて非常に良好な生育を示した。しかし、セルロース、キトサン、ペクチン、ソルビトール、リボース培地ではほとんど生育を示さなかった。それぞれ培養後の菌体外酵素に対し、キシランを供与体としたカテコール配糖化能について評価した（表３）。尚、菌体の増殖はA660で測定した。尚、表３中の各記号はフェノール配糖化活性の程度を示し、「＋＋」：強、「＋」：弱、及び、「−」：検出されず、を意味する。尚、配糖化活性評価は、フェノール配糖化菌のスクリーニングの場合と同様な方法（TLC）で実施した。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
本菌が産生するフェノール配糖化酵素は、キシランを炭素源とした培養時のみならず、良好に生育を示した培地全てにおいてキシランを供与体とした高いカテコール配糖化能を示した。一方で、キチン培地においては生育が弱かったものの高いカテコール配糖化能を示すといった結果も得られた。これら結果は、本菌が産生するフェノール配糖化酵素が、誘導的でなく、構成的生産であることを予想させた。キシランといった非常に高価な培地を用いることなく別の安価な各種培地において培養が可能であり、安定にフェノール配糖化酵素が産生された。
【００３４】
良好な酵素生産性が確認されたキシラン培地とブイヨン培地において、培養時の経時変化を観察した。それぞれの培地におけるカテコール配糖化活性およびキシラナーゼ活性を評価した。その結果、ブイヨン培地において、24時間培養時に約4から5倍のカテコール配糖化活性が確認された。これに対し、キシラナーゼ活性は逆に、1/4から1/5倍となった（図３）。
【００３５】
（９）L-DOPA及びドーパミンキシロシドの製造及び同定
本発明酵素を用いたL-DOPA及びドーパミンキシロシドの合成及び同定は以下のとおり行った。
反応条件はL字管に2.5% L-DOPA又はドーパミン、0.5-1M HCl溶液0.5 ｍｌ中にて完全に溶解させた後、5.0% キシラン、100 mM酢酸塩緩衝液 0.5mlに溶解させた後、精製酵素（カテコール配糖化活性 約1.5 U）を加え全量を2.0 mlにし、30℃、24時間反応を行った。反応後、それぞれの配糖体の生成をTLCによって，発色試薬としてアミノ基を検出するニンヒドリンを用いることで確認した（図４）。L-DOPAについての検討の結果、L-DOPAとは異なる二つから三つのバンドが確認された。同様の結果がドーパミンにおいても得られた。以上のことからDOPAキシロシド、ドーパミンキシロシドの生成が期待され、特にDOPAキシロシドについて精製を行った。
【００３６】
活性炭カラムの吸着画分を30％ 1-プロパノールにて溶出させた。それぞれの精製工程おいて得られたサンプルはエバポレーターを用いて、濃縮し、TLCにて検出を行った。ついで、シリカゲルクロマトグラフィーを行い、溶媒（1-Propanol : D.W. = 64 : 36）にて溶出させつつ、20 mlずつ分取した。最後にアンバーライトIR-120Bの吸着画分を1M HCｌにて溶出させた後、得られた精製産物がTLC上において単一であったことから、TFAを用いた酸加水分解による構造解析を行った。試料500μlを軟質ガラス小試験管に移し、トリフルオロ酢酸（TFA）25μlを加えた。封管を行った後、100℃にて処理時間は0、5、15、120、720分間加熱処理を行い、加水分解され遊離するアグリコンおよびグルコンをTLCにて解析した（図５）。処理後、それぞれの検出にニンヒドリン発色およびアニシジン発色を行った。720分間の酸加水分解の後TLCを行い、精製された反応性生物の未処理および酸処理後をニンヒドリン発色にて比較した。結果、精製された配糖体が加水分解され、DOPAの遊離が確認された。同様に0、5、15、120、720分間処理をおこなったものをアニシジン発色にて還元糖を検出した。検出の結果、キシロースと微量のキシロビオースが検出されたことと本発明酵素の諸性質を踏まえて、キシロビオシルDOPAの合成が示された。
【００３７】
（１０）L-DOPAキシロシドの溶解度の測定
次に、得られたキシロビオシルDOPAをエバポレーターにて乾固粉体とし、デシケーターにて乾燥させたのち、重量を測定した。その後、少量のDWを加えて、得られた配糖体を溶解させた。DOPAが水に対して1.7 mg/mlと非常に溶解性が低いのに対して、今回精製された配糖体330 mgは1 mlのDWに完全に溶解した（図６）。
【００３８】
（１１）フェノール配糖化酵素の精製
Bacillus subtilis  KT12株から本発明酵素であるフェノール配糖化酵素を精製した。即ち、Bacillus subtilis  KT12株を3.0％ブイヨン培地で、30℃、2日間培養し、調製した本酵素の粗生成物を硫安分画（70％）、Phenyl-TOYOPEAL（吸着画分）、Bio-Gel P-30にて精製した（精製倍率7.7倍、及び活性収率3.3％）。その結果、12% SDS-PAGE（図７）とHPLCゲルろ過クロマトグラフィー（図８）において単一標品（分子量：約20,000）が得られ、精製された該酵素は配糖化比活性20.1 U/mgを示した。
【００３９】
尚、電気泳動法はNative-PAGEはDavis法（Davis, B.J. and Ann, N.: Electrophoresis of protein. Y. Acad. Sci. 121, 404-427(1964).)に基づいて行った。ゲルには8% アクリルアミドゲルを，泳動用バッファーには0.025 Mトリス-0.192 M グリシン溶液（pH 8.4）を用いた。泳動には30% グリセロールと0.01％ ブロモフェノールブルーを含む酵素液を使用した。約2時間（4℃），定電流（20 mA/ゲル）で泳動を行った後，ゲルを染色液（0.01% クマシーブリリアントブルーR-250，50％ メタノール，および10％ 酢酸混合液）を用いて30分間染色した。染色後、脱色液（20％ メタノールと7.5％ 酢酸混合液）を用いて脱色を行った。
【００４０】
SDS-PAGEはLaemmli法（Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 227, 680-685(1970)）に基づいて行った。ゲルには12% アクリルアミドゲルを、泳動用バッファーには0.025 Mトリス-0.192 M グリシン溶液（pH 8.4）を用いた。泳動には30% グリセロール，0.01％ ブロモフェノールブルー，2％ SDS，及び5％ 2-メルカプトエタノールを含む酵素液，また変性用分子量マーカー（各5 μl）を使用した。約2時間（4℃），定電流（20mA/ゲル）で泳動を行った後，ゲルを染色液（0.01% クマシーブリリアントブルー R-250，50％ メタノール，及び10％ 酢酸混合液）を用いて30分間染色した。染色後、脱色液（20％ メタノールと7.5％ 酢酸混合液）を用いて脱色を行った。
【００４１】
タンパク質の定量はBradford法（Bradford, M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254(1987))に従って行った。基準物質として，牛血清アルブミン（SIGMA社製）を用いた。また、カラム溶出液のタンパク量は280 nmの吸光度の測定により求めた。
【００４２】
本明細書中で番号が付された箇所の引用文献は以下のとおりである。
(1) M. L. T. M. Polizeli, A. C. S. Rizzatti, R. Monti .H. F. Terenzi, J. A. Jorge, and D. S. Amorim; Xylanases from fungi: properties and industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol, 67, 577-591(2005)
(2) Collins T, Gerday C, and Feller G; Xylanases, xylanases families and extremophilic xylanases. FEMS Microbiol Rev 29, 3-23(2005)
(3) Nakagawa, H., Yoshiyama, M., Shimura, S., Kirimura, K., and Usami, S.: Anomer selective formation of I-menthyl α-D-glucopyranoside by α-glucosidase-catalyzed reaction. Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 1914-1915 (1996).
(4)Yamamoto I, Muto N, Murakami K, Suga S, Yamaguchi H; L-Ascorbic acid α-glucoside formed by regioselective transglucosylation with rat intestinal and rice seed α-glucosidases: Its improved stability and structure determination. Chem Pharm Bull 38, 3020-3023 (1990)
(5) M. Funayama, H. Arakawa, R. Yamamoto, T. Nishino, T. Shin and S. Murao: Effects of α- and β-arbutin on activity of tyrosinases from mushroom, and mouse melanoma, Biosci. Biotech. Biochem., 59, 143-144(1995)
(6) M. Yokoyama, S. Inomata, S. Seto and M. Yanagi, Effects of Sugars on the Glucosylation of Exogenous Hydroquinone by Catharanthus roseus Cells in Suspension Culture, Plant Cell Physiol., 31, 551(1990)
(7) S. Inomata, M. Yokoyama, S. Seto and M. Yanagi, High-level production of arbutin from hydroquinone in suspension cultures of Catharanthus roseus plant cells, Appl. Microbiol. Biotechnol., 36, 315(1991)
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の新規なフェノール配糖化酵素は高い配糖化能を有し、幅広い受容体に作用し得ることから、薬剤等として有用な各種の配糖体合成への利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】上清液中の菌体外酵素の配糖化活性評価をTLCにより行った結果を示す。「M」：マーカー、「＋」：カテコール存在下、「−」：カテコール非存在下、「A」:アルブチン、「X1」：キソロース、「X2」：キシロビオース、「X3」:キシロトリオース、及び、矢印：カテコールキシロシド、を示す。
【図２】細菌3株（KT12株、YR12株、及びB-1株）に関する上清液中の菌体外酵素の配糖化活性評価をTLCにより行った結果を示す。図中の記号の意味は図１と同様である。
【図３】Bacillus subtilis  KT12株のキシラン培地とブイヨン培地おける培養時のフェノール配糖化酵素の活性の経時変化を示す。白バーはキシラン培地、黒バーはブイヨン培地で得られた結果を示す。
【図４】L-DOPAおよびドーパミンを受容体としたBacillus subtilis KT12由来配糖化酵素を用いたDOPAキシロシドおよびドーパミンキシロシドの合成能評価をTLCにより行った結果を示す。「M」：マーカー、「Do」：L-DOPA、「D」：ドーパミン、「X1」：キシロース、「X2」：キシロビオース、「X3」:キシロトリオース、及び、矢印：DOPAキシロシドおよびドーパミンキシロシド、を示す。
【図５】精製されたDOPAキシロシドを酸加水分解処理した結果を示す。（A）酸加水分解処理を720分間行ったのち、プレート上に5-20 μlのサンプルをそれぞれ添加し、TLCを行った。（B）酸加水分解処理を0-720分間行ったのち、プレート上に5μlのサンプルをそれぞれ添加し、TLCを行った。図中の記号の意味は図４と同様である。
【図６】精製されたキシロビオシルDOPAの粉体およびL-DOPAをDWに溶解させた結果を写真に示す。（A）キシロビオシルDOPAの粉体、（B）キシロビオシルDOPAおよびL-DOPAをDWに溶解させた。
【図７】本発明酵素が12% SDS-PAGEにおいて単一標品（分子量：約20,000）であることを示す泳動結果の写真である。レーン１は精製された本発明酵素、レーン２は分子量マーカー：オスホリラーゼｂ（94,000）、ウシ血清アルブミン（66,000）、オボアルブミン（43,000）及びカルボニックアンヒドラーゼ（20,100）である。
【図８】本発明酵素がHPLCゲルろ過クロマトグラフィーにおいて単一標品（分子量：約20,000）であることを示すグラフである。「○」は精製された本発明酵素、「□」は分量マーカー：アポフェリチン（443,000）、β−アミラーゼ（200,000）、アルドラーゼ（158,000）、ウシ血清アルブミン（66,000）、カルボニックアンヒドラーゼ（20,100）及びリボヌクレアーゼＡ（13,700）である。
【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【配列表】
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