(57)【要約】      （修正有）【課題】  白血病芽球の濃縮又は分離に応用できる、白血病芽球を特異的に検出する試薬の提供。【解決手段】一方のオリゴヌクレオチドにエネルギードナー蛍光色素が導入され、他方のオリゴヌクレオチドはエネルギーアクセプター蛍光色素が導入され、オリゴヌクレオチド対とＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて、２つの蛍光色素の距離は２〜２０塩基であるＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。ＷＴ１  ｍＲＮＡをＦＲＥＴ法で検出し白血病芽球を検出する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号２に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項２】
第１の蛍光色素が導入された配列番号３に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号４に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項３】
第１の蛍光色素が導入された配列番号９に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１０に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項４】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１１に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１２に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項５】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１３に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１４に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項６】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１５に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１６に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項７】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１７に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１８に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項８】
第１の蛍光色素が導入された配列番号１９に記載の塩基配列で表される第１のオリゴヌクレオチドと、第２の蛍光色素が導入された配列番号１８に記載の塩基配列で表される第２のオリゴヌクレオチドとからなり、
第１及び第２の蛍光色素のうち、一方がAlexa Fluor 488であり、他方がAlexa Fluor 647であり、
第１及び第２のオリゴヌクレオチドとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて第１及び第２の蛍光色素が２〜２０塩基離れた位置に存在する、
ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドから構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１０】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチドである、請求項９に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１１】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドが２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドである、請求項９に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドからなる群から選択される２種以上のヌクレオチドから構成されるキメラオリゴヌクレオチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート型ヌクレオチドである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブからなる白血病芽球検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ及び白血病芽球検出試薬に関する。より詳細には、本発明は、ＷＴ１  ｍＲＮＡをＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）により検出することを利用して、白血病芽球を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病の診断・治療にとって、白血病芽球（癌化した白血球）のキメラ染色体の解析が重要である。正確な解析を行うためには検体中の白血病芽球の比率（白血球全体に占める割合）が高いことが望ましいが、通常、その比率は数パーセント程度であり、正確な解析を行うには不十分である。そこで、種々の方法により白血病芽球の濃縮が試みられているが、臨床現場の要求を満足する充分な方法は存在しない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００１−２８６２８５号公報
【非特許文献１】InoueK et al., Blood, vol. 84, pp.3071-3079 (1994).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
白血病芽球を白血球分画から濃縮又は分離する優れた方法が開発できれば、白血病をより正確に診断でき、より適切に治療できる。したがって、本発明の目的は、白血病芽球の濃縮又は分離に応用できる、白血病芽球を特異的に検出する試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
白血病芽球を特異的に検出するため、本発明者らはＷＴ１遺伝子に着目した。ＷＴ１遺伝子は、当初、小児の腎臓癌であるウィルムス腫瘍の原因遺伝子として見つかったが、その後、白血病芽球において高発現していることが分かっている（非特許文献１）。本発明者らは、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出することで白血病芽球が検出でき、セルソーター等と組み合わせることにより白血病芽球を分離することができると考えた。
【０００６】
そして、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している細胞を特異的に検出する方法として、ＦＲＥＴを利用した方法（特許文献１）を適用することとし、ＷＴ１  ｍＲＮＡを検出するためのＦＲＥＴプローブを開発した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のオリゴヌクレオチド対からなるＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ（ＦＲＥＴプローブ；一方はドナープローブで、他方はアクセプタープローブである）を提供する。
（１）5'-tgaaggagtgaggcggcg-3'及び5'-cagctcggctcctgtttga-3'（配列番号１及び２）。
（２）5'-gacagtgaaggcgctcaggc-3'及び5'-gtgaactggccggaaaagtg-3'（配列番号３及び４）。
（３）5'-tgagtggttggggaactg-3'及び5'-tgggatcctcatgcttgaa-3'（配列番号９及び１０）。
（４）5'-tccatttcactgagctgga-3'及び5'-tggttgctctgcccttctg-3'（配列番号１１及び１２）。
（５）5’-tattgggctccgcagagg-3'及び5'-accgtgcgtgtgtattctg-3'（配列番号１３及び１４）。
（６）5'-acagtccttgaagtcacact-3'及び5'-ggtatggtttctcaccagtg-3'（配列番号１５及び１６）。
（７）5'-gaagggcttttcacttgtttt-3'及び5'-acctgtatgagtcctggtg-3’（配列番号１７及び１８）。
（８）5'-gacagctgaagggcttttc-3'及び5'-acctgtatgagtcctggtg-3'（配列番号１９及び１８）。
ここで、オリゴヌクレオチド対のうち一方のオリゴヌクレオチドはAlexa Fluor 488であるエネルギードナー蛍光色素が導入され（ドナープローブ）、他方のオリゴヌクレオチドはAlexa Fluor647であるエネルギーアクセプター蛍光色素が導入されている（アクセプタープローブ）。また、オリゴヌクレオチド対とＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素とエネルギーアクセプター蛍光色素は２〜２０塩基離れた位置に存在する。
【０００８】
上記（１）〜（８）のＦＲＥＴプローブは、高い効率でＷＴ１  ｍＲＮＡにハイブリダイズするため、ＷＴ１  ｍＲＮＡを高感度に検出できる。
【０００９】
また、上記（１）〜（８）のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。また、オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよい。
【００１０】
また、本発明は、上記ＦＲＥＴプローブからなる白血病芽球検出試薬を提供する。白血病芽球はＷＴ１を高発現しているため、上記ＦＲＥＴプローブを用いてＷＴ１  ｍＲＮＡが高発現していることが確認できた細胞を白血病芽球であると同定することができる。
【００１１】
さらに、上記（７）及び（８）のＦＲＥＴプローブからなる白血病芽球検出試薬を用いることによって、ＷＴ１のKTSに関する異性体を判別して検出することが可能となる。ＷＴ１には異性体のうち第９エクソンの末尾のアミノ酸３残基（KTS）をコードする塩基配列がスプライシングを受けるものがあり、KTSを有する異性体ＷＴ１（KTS+）及びKTSを欠失する異性体ＷＴ１（KTS-）が通常１つの細胞内に存在する。また、KTSの有無が生理活性に影響を与え、ＷＴ１（KTS+）及びＷＴ１（KTS-）の両者のバランスが細胞のガン化に生理的な意味を持つことが示唆されている。したがって、ＷＴ１（KTS+）及びＷＴ１（KTS-）の両者を判別して検出することができ、両者を発現している白血病芽球を特異的に分離することができることは、診断・治療への応用という観点から有効である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブは、ＷＴ１  ｍＲＮＡを特異的かつ高感度に検出することができ、それにより、白血病芽球を検出することができる。したがって、本発明の白血病芽球検出試薬を利用して、白血病芽球を特異的に分離することができ、白血病の診断・治療に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブは、表１に示した塩基配列を有し、それぞれ１分子の蛍光色素で標識された１対のオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ対）からなる。
【００１４】
【表１】
2008187923.tif 000002
【００１５】
表１中、a, t, g,cはそれぞれ、アデニン、チミン、グアニン、シトシンのヌクレオチド塩基を表す（ただし、tは適宜u（ウラシル）と読み替えるものとする）。位置は、ＷＴ１  ｍＲＮＡの開始コドンのアデニンの位置を１としたときのＷＴ１  ｍＲＮＡにおける相対的な位置を表す。
【００１６】
蛍光色素の導入位置は、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１  ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、エネルギードナー蛍光色素（Alexa Fluor 488）からエネルギーアクセプター蛍光色素（Alexa Fluor 647）に有意の効率でＦＲＥＴが生じるように決定する。ハイブリッド上において２つの蛍光色素の距離が２〜２０塩基であるときにこのような条件を満足することが、先行技術文献において明らかである（Tsujiet al., Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J.,vol. 81, pp.501-515 (2001) 等）。また、蛍光色素の導入位置は、５’末端、３’末端及び鎖内のいずれでもよい（Tsuji et al.,Biophys. J., vol. 78, pp.3260-3274 (2000) 及び Tsuji et al., Biophys. J., vol.81, pp.501-515 (2001) 等）。高い効率でＦＲＥＴを生じさせるためには、２つの蛍光色素の距離は、２〜４塩基であることが好ましい。
【００１７】
エネルギードナー蛍光色素は、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。エネルギーアクセプター蛍光色素も、直接又はヘキシルアミノ基などのリンカーを介して結合している。本発明においては、エネルギードナー蛍光色素としてはAlexa Fluor 488を用い、エネルギーアクセプター蛍光色素としてはAlexa Fluor 647を用いることを特徴とする。
【００１８】
ここで、AlexaFluor 488とは、モレキュラープローブス社から入手可能なAlexa Fluor（商標）シリーズの１つであり、以下の式（Ｉ）で表わされる、最大吸収波長：494nm、最大蛍光波長：517nmの蛍光色素である。図１は、AlexaFluor 488の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。さらに、スクシンイミジルエステルではなく、テトラフルオロフェニルエステルである、式（ＩＩ）で表される蛍光色素等もAlexaFluor 488に含まれる。
【００１９】
【化１】
2008187923.tif 000003
【００２０】
【化２】
2008187923.tif 000004
【００２１】
また、AlexaFluor 647とは、モレキュラープローブス社から入手可能なAlexa Fluor（商標）シリーズの１つであり、構造式は公開されていないが分子量約1250 MW、最大吸収波長：649nm、最大蛍光波長：666nmの蛍光色素である。図２は、AlexaFluor 647の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。
【００２２】
上記のＦＲＥＴプローブは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド及び２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチド（２’−Ｏ−４’−Ｃ−メチレン架橋ヌクレオチド、２’−Ｏ−４’−Ｃ−エチレン架橋ヌクレオチドなど）からなる群から選択されるいずれかのヌクレオチド、またはこれらのヌクレオチドの任意の組合せからなる２種以上のヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドである。
【００２３】
デオキシリボヌクレオチドから構成されるプローブはＤＮＡプローブであり、リボヌクレオチドから構成されるプローブはＲＮＡプローブである。
【００２４】
２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基がメチル化されており、そのオリゴヌクレオチドから構成されるプローブは、ＤＮＡプローブやＲＮＡプローブに比べてヌクレアーゼに対する安定性等が向上している。
【００２５】
２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドは、リボヌクレオチドのリボースの２’−Ｏと４’−Ｃとがアルキレン鎖（メチレン、エチレンなど）で架橋されているヌクレオチドであり、Locked Nucleic Acid（ＬＮＡ）とも呼ばれる。架橋によってリボース環のフレキシビリティが制限され、それにより、ハイブリダイゼーション能が向上し（Ｔｍ値の増加）、ヌクレアーゼに対する安定性も向上している。
【００２６】
また、上記オリゴヌクレオチドは、通常のホスホジエステル型ではなく、ホスホロチオエート型であってもよく、そのようなオリゴヌクレオチドをＳ−オリゴという。オリゴヌクレオチドは、通常、ホスホジエステル結合を介してリボース同士が結合しているが、その結合がホスホロチオエート基に置き換わったＳ−オリゴは、ヌクレアーゼに対する安定性が向上している。デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドのみならず、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチドや２’−Ｏ−４’−Ｃ−架橋ヌクレオチドがホスホロチオエート基で結合したオリゴヌクレオチドも、ＦＲＥＴプローブとして機能し得る。
【００２７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、公知の方法（例えば、ホスホロアミダイト法、βシアノエチルアミダイト法、ホスホロチオエート法）に従って合成することが可能である。目的とするオリゴヌクレオチドの種類に応じて、必要な試薬（ホスホロアミダイト試薬等）を使い分けることができ、そのような試薬は市販されている。
【００２８】
以上、本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブ及びＦＲＥＴプローブの合成方法について説明してきたが、ＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを用いた白血病芽球の検出方法について以下で説明する。
【００２９】
本実施形態のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを用いた白血病芽球の検出方法は以下の４工程を備える。
（１）ＦＲＥＴプローブを合成する工程
（２）ＷＴ１  ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴプローブの定量性を確認する工程
（３）細胞内へＦＲＥＴプローブを導入する工程
（４）導入されたＦＲＥＴプローブのフローサイトメーターによる検出と分離する工程
【００３０】
工程（１）は、上述のＦＲＥＴプローブの合成方法を用いればよい。
【００３１】
次の工程（２）では、ＦＲＥＴプローブの定量性を確認するために、ＷＴ１  ｍＲＮＡに対するＦＲＥＴによる蛍光強度変化を溶液中で測定する。具体的には、以下の方法を挙げることができる。対象となるｍＲＮＡ（ＷＴ１  ｍＲＮＡ）はIn vitro 転写によって調製することができる。ドナープローブ及びアクセプタープローブを添加した溶液に、対象となるｍＲＮＡを一定量ずつ加える。この操作の過程において、AlexaFluor 488/647に対応する励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定し、ＦＲＥＴプローブと対象となるｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察する。ＦＲＥＴによる蛍光強度変化が対象となるｍＲＮＡの用量依存的であることを確認する。
【００３２】
工程（３）では、本発明のＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを生細胞（白血球）に導入する。導入方法は公知の方法、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法などが適用可能である。また、ストレプトリシンＯなどの細菌毒素で膜穿孔処理する方法も適用できる。
【００３３】
細胞内にＷＴ１  ｍＲＮＡ検出プローブを導入した後は、ドナープローブ及びアクセプタープローブをＷＴ１  ｍＲＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、白血病芽球検出試薬を導入した細胞を室温において数分間インキュベーションすればよい。
【００３４】
ストレプトリシンＯなどで膜穿孔処理をした場合、ハイブリダイゼーション後に膜の再封入（血清を含む培地で数分間インキュベーションする）を行うことが好ましい。
【００３５】
工程（４）では、まず、ドナープローブ及びアクセプタープローブとＷＴ１  ｍＲＮＡとのハイブリッドが存在する細胞を検出する。ドナープローブに結合している蛍光色素の励起光を細胞に照射し、ＦＲＥＴに基づくアクセプタープローブに結合している蛍光色素からの蛍光を観測することで、白血病芽球が検出できる。
【００３６】
励起光の照射によって、ｍＲＮＡとハイブリダイズしているドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も、ｍＲＮＡとハイブリダイズしていないドナープローブのエネルギードナー蛍光色素も同時に励起されるが、ドナープローブに近接してアクセプタープローブがハイブリダイズしている場合にのみＦＲＥＴが生じ、このときはアクセプタープローブのエネルギーアクセプター蛍光色素から蛍光が生じる。すなわち、エネルギーアクセプター蛍光色素からの蛍光の観察は、ドナープローブとアクセプタープローブが近接していることを意味し、生細胞中にＷＴ１  ｍＲＮＡが発現していることがわかる。
【００３７】
このようにして検出されたＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞が選択的に分離される。分離方法に関しては特に制限はないが、セルソーター（Fluorescence Activated Cell Sorter、ＦＡＣＳ）を用いて、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞を検出するとともに、選択的に分離することが好ましい。
【００３８】
セルソーターは、フローサイトメーターと細胞分取装置とを備えたものであり、特定物質を蛍光標識プローブで染色した個々の細胞に、細い流路の途中でレーザー光を照射することにより、散乱光（前方散乱光や側方散乱光）や蛍光のシグナル情報を個々の細胞ごとに測定し、その結果を、例えば度数分布（ドットプロット）として表示する機能を有しており、特定のシグナル情報を発する細胞にゲートをかけ所望の細胞を分取することができる。以上のような方法はフローサイトメトリーと呼ばれている。
【００３９】
例えば以下に述べる方法を適用して、ＷＴ１  ｍＲＮＡを発現している生細胞を分離することができる。すなわち、セルソーターにより個々の生細胞における、エネルギードナー蛍光色素（Alexa Fluor 488）を励起するレーザーを照射したときの同蛍光色素の相対的蛍光強度、及びＦＲＥＴに基づくエネルギーアクセプター蛍光色素（AlexaFluor 647）の相対的蛍光強度のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、後者が高い値をとる細胞群を選択し、Ｒ２として領域指定する。さらに、測定対象の生細胞の細胞サイズに基づく前方散乱光と、生細胞の内部構造の複雑さに基づく側方散乱光のシグナル情報を得て、例えば、前者を横軸、後者を縦軸としてドットプロットを行い、測定対象の生細胞を表わしていると考えられる細胞群を選択し、Ｒ１として領域指定する。そして、Ｒ１及びＲ２の両選択条件を満たす（Ｒ１かつＲ２に属する）生細胞のみを分取できるようにセルソーターをセッティングすることにより、ＷＴ１  ｍＲＮＡが発現している細胞のみを選択的に分離することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に制限するものではない。
【００４１】
（実施例１：ＦＲＥＴプローブの設計）
標的となるＷＴ１  ｍＲＮＡ(Homosapiens Wilms tumor 1, transcript variant D, mRNA、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：NM_024426)の全塩基配列はＮＣＢＩ（NationalCenter for Biotechnology Information）の公開データーベースより入手した。この配列をもとにして、以下の手順でＦＲＥＴプローブの設計を行った。
【００４２】
まず、RNAが取り得る高次構造のパターンの中で個々の核酸塩基が鎖内で相補鎖形成にかかわらない場合の数（SS-count値）を公開プログラム（ｍFold）により計算し、その値を40塩基分連続する核酸塩基について平均をとった。その結果を図３に示す。図３は、横軸にＷＴ１  ｍＲＮＡの塩基番号、縦軸に各塩基下流40塩基の平均SS-Count値を示した図である。
【００４３】
次に、平均SS-count値が高い（RNA鎖内で熱的に不安定である）領域をＦＲＥＴプローブの標的配列としドナープローブ、アクセプタープローブのTmがほぼ一致するような配列を17塩基から21塩基の長さに収まるように2分して6組の検出用ＦＲＥＴプローブの配列を決定した。すなわち、WT1Ex1a/Aプローブ、WT1Ex1b/Aプローブ、WT1Ex2/Aプローブ、WT1Ex5/Aプローブ、WT1Ex6/Aプローブ、WT1Ex8/Aプローブの6組のプローブである。
【００４４】
また、上記ＦＲＥＴプローブの設計方法によるＦＲＥＴプローブの比較対照として、以下の通り、ＦＲＥＴプローブの設計を行った。平均SS-Count値が一定して低い（RNA鎖内で熱的に安定である）領域をハイブリダイゼーションが起き難い配列として設定し同様に1組のコントロール用ＦＲＥＴプローブの配列として決定した。すなわち、配列番号５及び６に記載の配列を有するWT1Ex1b(2)/Aプローブ、並びに、配列番号７及び８に記載の配列を有するWT1Ex1c/Aプローブの2組のプローブである。
【００４５】
さらに、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出するために、以下の通りにＦＲＥＴプローブを設計した。ＷＴ１のKTSに関する異性体は、第９エクソンの末尾のアミノ酸３残基（KTS）をコードする塩基配列のオルタナティブスプライシングにより生じる。この第９エクソン末尾のオルタナティブスプライシング部位を挟むようにドナープローブ及びアクセプタープローブを配するようにプローブを設計した。具体的には、両者で共通の配列（配列番号１８）をアクセプタープローブに設定した。そして、ＷＴ１（KTS+）ｍＲＮＡ上でアクセプタープローブと隣接するドナープローブ（WT1KTS+）に設定し、ＷＴ１（KTS-）ｍＲＮＡ上でアクセプタープローブと隣接するドナープローブ（WT1KTS-）に設定した。すなわち、ＷＴ１（KTS+）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブ及びＷＴ１（KTS-）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブの2組のプローブである。
【００４６】
以下に、ＷＴ１  ｍＲＮＡに対する各ＦＲＥＴプローブの配列とその標的部位の一覧（表２）を示す。なお、表２で用いられているa, t, g, cはそれぞれアデニン、チミン、グアニン、シトシンの核酸塩基を意味しており、T, G, AはFRETによる蛍光検出でドナーとなる蛍光色素（AlexaFluor 488）で修飾されている塩基を示し、T及びAはアクセプターとなる蛍光色素（Alexa Fluor 647）が修飾されている塩基は示す。ハイブリダイゼーション部位は、ＷＴ1のｍＲＮＡにおいて翻訳開始点（スタートコドン）のアデニンを１としたときの相対的な塩基番号である。
【００４７】
【表２】
2008187923.tif 000005
【００４８】
なお、ドナープローブ、アクセプタープローブ及びＷＴ１  ｍＲＮＡの３者により形成されるハイブリッドにおいて、ドナー色素によって修飾されたヌクレオチドとアクセプター色素によって修飾されたヌクレオチドの間に4塩基を挟むように設計した。しかし、蛍光色素によって修飾されたヌクレオチド間の距離は４塩基に限定されるものではない。
【００４９】
（実施例２：ＦＲＥＴプローブの合成）
表２に記載した配列を有するドナープローブのうち、５’末端の塩基がAlexa Fluor 488によって修飾されているドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。AlexaFluor 488色素（インビトロジェン社製Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit  Cat.NoA20191）を７μLのDMSOに溶かした。
【００５０】
一方、DNA/RNAシンセサイザー（PerkinElmer社製モデル394又はPerceptive Biosystems社製モデル8909）を用いて、βシアノエチルアミダイト法により、表２に記載の塩基配列を有するオリゴDNAを合成した。合成したオリゴDNAの5'末端に、６−（トリフルオロアセチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを用いてヘキシルアミノ基を導入し、凍結乾燥した。これを25μg/μLの濃度で0.5MNa2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。
【００５１】
AlexaFluor488色素DMSO溶液7μL、0.1Mホウ酸ナトリウムpH8.5を41μL、合成オリゴヌクレオチド水溶液（25μg/μL）を2μL混合して一晩室温で反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素取り除いた後に20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で目的のオリゴヌクレオチドプローブを得た。
【００５２】
次に、表２に記載したアクセプタープローブ及びAlexa Fluor 488によって５’末端以外の塩基が修飾されているドナープローブを特許文献１に記載の方法に準じて合成した。より詳細には、以下の通りである。AlexaFluor 488色素（インビトロジェン社製Alexa Fluor 488 Oligonucleotide Amine Labeling Kit  Cat.NoA20191）及びAlexa Fluor 647色素（インビトロジェン社製AlexaFluor647 Oligonucleotide AmineLabeling Kit  Cat.No A20196）を７μLのDMSOに溶かした。
【００５３】
一方、Uni-LinkAminoModifier (Clontech社製)を用いて表２に記載の塩基配列中、大文字表記（T, A又はT）の部分にヘキシルアミノ基修飾したヌクレオチドを導入したオリゴDNAを合成し、凍結乾燥した。これを25μg/μLの濃度で0.5MNa2HCO3/NaH2CO3緩衝液（pH9.3）に溶解した。
【００５４】
AlexaFluor488色素またはAlexaFluor647色素のDMSO溶液7μL、0.1Mホウ酸ナトリウムpH8.5を41μL、合成オリゴヌクレオチド水溶液（25μg/μL）を2μL混合して一晩室温で反応させた。反応液をゲル濾過して未反応の色素取り除いた後に20%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で目的のオリゴヌクレオチドプローブを得た。
【００５５】
（実施例３：ＷＴ1  ｍＲＮＡの調製）
ＦＲＥＴプローブとハイブリッド形成をするｍＲＮＡを調製するために、以下の手順でin vitro合成を行った。ヒトＷＴ1のｃＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＵＣＷＴ1；理化学研究所バイオリソースセンターから購入）を制限酵素EcoRI及びHincIIで切断し、ＷＴ1  ｃＤＮＡ断片を得た。ＷＴ1  ｃＤＮＡ断片を、ＲＮＡ合成用ベクターpBluescriptIIKS+のEcoRI/HincIIによる消化部位に、Ｔ７プロモーター下流に断片が位置するように、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させた。得られた組換えプラスミドを大腸菌JM109株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入し、得られた形質転換体を培養し組換えプラスミドを複製した。
【００５６】
複製したプラスミドをHincIIにより直鎖状にした後、ProteinaseK（タカラバイオ社製）及びフェノール・クロロホルムで処理し、変性、除タンパクを行った。このように精製した遺伝子断片を鋳型として、インビトロ転写キット（MegascriptT7 Kits：Ambion社）を用いてＲＮＡを合成した。ＲＮＡ溶液にDNaseI（タカラバイオ社製）を加えてプラスミドＤＮＡを消化した後、等量の塩化リチウム溶液と2倍量のエタノールを加えてＲＮＡを沈殿させ、70%エタノールで洗浄した後、乾燥した。RNaseを含有しない蒸留水にＲＮＡを溶解させて、以下の実験に用いた。
【００５７】
（実施例４：ＦＲＥＴプローブとＷＴ1  ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによる蛍光スペクトル変化）
ドナープローブとアクセプタープローブが近接してハイブリダイゼーションすることに伴うＦＲＥＴによる蛍光スペクトルの変化を測定した。ドナープローブ及びアクセプタープローブを終濃度1μMとなるように150μLの1xSSC（150mM塩化ナトリウム、17mMクエン酸ナトリウム、pH7.0）溶液に加え、37℃で15分放置した後、四面透過の石英製のキュベットに注入し、蛍光分光光度計（F4500；日立製作所製）により励起波長488nm、蛍光波長500-750nmの範囲で蛍光スペクトルを測定した。次に、この溶液にＷＴ1  ｍＲＮＡを50pmol添加し、30分放置した後、37℃における蛍光スペクトルを測定して、ハイブリダイゼーションに伴う蛍光スペクトルの変化を観察した。蛍光スペクトルを測定した後、さらにＷＴ1  ｍＲＮＡを50pmol添加し、再度、蛍光スペクトルを測定した。ＷＴ1  ｍＲＮＡの量が200pmolになるまで、同様の操作を繰り返し、蛍光スペクトルを測定した。
【００５８】
表２に列挙したプローブの蛍光スペクトルの変化を図４〜１５に示す。図４〜１１は、それぞれ、WT1Ex1a/Aプローブ（図４）、WT1Ex1b/Aプローブ（図５）、WT1Ex1b(2)/Aプローブ（図６）、WT1Ex1c/Aプローブ（図７）、WT1Ex2/Aプローブ（図８）、WT1Ex5/Aプローブ（図９）、WT1Ex6/Aプローブ（図１０）及びWT1Ex8/Aプローブ（図１１）を用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。WT1Ex1b(2)/Aプローブ及びWT1Ex1c/Aプローブを用いた場合（図６及び７）には蛍光スペクトルの変化が認められなかった。それ以外のＦＲＥＴプローブ、すなわち、WT1Ex1a/Aプローブ、WT1Ex1b/Aプローブ、WT1Ex2/Aプローブ、WT1Ex5/Aプローブ、WT1Ex6/Aプローブ及びWT1Ex8/Aプローブ（図４，５及び８〜１１）には蛍光スペクトルの変化が認められ、ＦＲＥＴに基づく蛍光強度がターゲットmRNAの用量依存的に増加することが分かった。これらのＦＲＥＴプローブは平均SS-count値が高い領域に設計したものであり、したがって、平均SS-count値が高い領域に位置するプローブがＷＴ１  ｍＲＮＡの検出に適用できることが確認できた。なお、図１６は、本実施例における各ＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。これらのＦＲＥＴプローブのうちWT1Ex6/Aプローブを用いたときが最も顕著に蛍光強度の変化を示すことが明らかとなった。
【００５９】
また、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出するために設計したＦＲＥＴプローブを用い、その蛍光スペクトルの変化を測定した結果を図１２〜１５に示す。ターゲットｍRNA配列とプローブ配列とがミスマッチしている場合には蛍光スペクトルの変化が認められなかった。すなわち、WT1KTS+/AプローブとＷＴ１（KTS-）  ｍＲＮＡとの組み合わせ及びWT1KTS-/AプローブとＷＴ１（KTS+）  ｍＲＮＡとの組み合わせ（図１３及び１４）である。ターゲットｍRNA配列とプローブ配列とがマッチしている場合、すなわち、ＷＴ１（KTS+）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブ及びＷＴ１（KTS-）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブを用いた場合（図１２及び１５）には蛍光スペクトルの変化が認められ、ＦＲＥＴに基づく蛍光強度がターゲットmRNAの用量依存的に増加することが分かった。したがって、これらのＦＲＥＴプローブは、ＷＴ１(KTS+)及びＷＴ１(KTS-)の両者の異性体を区別して検出できることが確認できた。
【００６０】
（実施例５：細胞内へのＦＲＥＴプローブの導入方法の検討）
生細胞内へのＦＲＥＴプローブの導入方法として、ストレプトリシンＯ（SLO）による膜穿孔及び血清培地による再封入を利用した。SLO処理は、Giles RV et al., Nucleosides& Nucleotides, vol. 16, 1155-1163 (1997)、Palmer M et al., Eur J Biochem.1995 Jul 15; 231(2):388-95.、及び、Sekiya K et al., J Bacteriol. 1993 Sep;175(18):5953-61に記載の方法を参考にした。
【００６１】
ＦＲＥＴプローブを導入するための条件検索として、まずは、FITC-Dextran（分子量9300；シグマ社製）を用いて、SLO法の導入効率及び細胞毒性を検討した。
【００６２】
0.05% BSA（ウシ血清アルブミン；シグマ社製）を含む25mLのPBS（リン酸緩衝食塩水、pH7.2；インビトロジェン社製）に、SLO（シグマ社製）を溶解し、1mg/mLのSLO溶液を調製した。SLOを還元するため、膜穿孔処理の前に、終濃度5mMのDTT（ジチオスレイトール）を添加し、37℃で2時間放置した。
【００６３】
恒常的にＷＴ１を発現していると報告されているK562培養細胞株（ヒューマンサイエンス振興財団研究資源バンクから入手；JCRB0019）を10% FBS（ウシ胎児血清）及び1%Glu（グルタミン酸）を含むRPMI-1640培地（いずれもインビトロジェン社製）で培養し、必要数にまで増殖した細胞を遠心操作（800g、5分、室温；以下の遠心操作は同一条件）で回収し、PBSpH7.2で懸濁し、再び遠心し、血清成分を除去した。細胞をPBS pH7.2に懸濁し、遠心管１本あたり2 x 106個の細胞を含むように分注した。
【００６４】
遠心操作後に上清を除いて得られたペレット状の2 x 106個の細胞塊に、FITC-Dextranを終濃度10μMで加えたSLO溶液40μLを添加した。SLO溶液には、SLO量が0〜2μg/2x 106細胞となるよう各種濃度のSLO溶液を用いた。SLO及びFITC-Dextranを添加したK562細胞懸濁液を37℃15分インキュベーションして、細胞膜の膜穿孔とProbeの導入を行った。インキュベーション終了後、細胞懸濁液に、氷温に冷却したPBSpH7.2を1mL添加して4℃で30分間インキュベーションし、さらに終濃度10 μMとなるようにx100 濃度のPI（Propidium Iodide；シグマ社製）を加えて氷温で10分間インキュベーションした。PIはインターカレーターとして核内のDNAを染色する試薬である。PIは通常、細胞膜を透過できないため、SLOによって穿たれた細胞膜が再封入されたかを確認するために用いている。
【００６５】
インキュベーション後に細胞懸濁液を遠心して上清を除き、PBSに懸濁し、遠心洗浄した。沈降した細胞塊を1mLのPBSに懸濁し、蛍光顕微鏡観察による細胞群の透過像及び蛍光像からSLOによる膜穿孔処理及び再封入の過程における細胞損傷の有無を確認した。また、同時にFACS（FACSAria；日本BD社製）により、細胞のサイズ（FSC-Height：前方散乱光）、内部構造の複雑さ（SSC-Height：側方散乱光）、細胞に取り込まれたFITC-Dextranの蛍光として測定した。また、再封入が不完全な細胞数をPIの蛍光として測定した。
【００６６】
以上の測定結果より、K562細胞の膜穿孔処理によるプローブの導入効率が最も高く、かつ、不完全な膜の再封入過程による死細胞の発生が少ないと考えられる至適SLO濃度を実施毎に求めた。本実施例の条件においては、至適SLO濃度は7.5μg/2 x 106細胞であると考えられた。
【００６７】
（実施例６：K562細胞へのＷＴ1  ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの導入）
実施例１及び２で作製し、実施例３及び４で評価したＷＴ１  ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを細胞内に導入した。ＦＲＥＴプローブの導入方法は、実施例５の方法を用い、実施例５で決定した至適SLO濃度条件で行った。ただし、実施例５で用いたFITC-Dextranの代わりにＦＲＥＴプローブ（ドナープローブ及びアクセプタープローブ各々終濃度10μM）を用いた。ＦＲＥＴプローブ導入の手順は下記の通りである。遠心管１本あたり2x 106 cellのK562細胞にＦＲＥＴプローブを添加してSLOを加えて懸濁し、37℃15分間インキュベーションして膜穿孔を行った。プローブ導入を行った後、氷温PBSpH7.2を1mL加えて4℃30分間インキュベーションして再封入した。再封入した細胞を遠心して沈殿にした後、1mLのPBS pH7.2 に懸濁してFACSで解析を行った。
【００６８】
（実施例７：K562細胞に導入されたＦＲＥＴプローブのフローサイトメーターによる検出）
FACS解析の条件は下記の通りである。ＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光は488nmの励起光よる655nm〜735nm（PerCP-cy5.5）の蛍光としてドナープローブの蛍光（530nm：FITC）と同時にフローサイトメーター（FACSAria:日本BD社製）で測定した。FACS内の光電子増倍管に印加する電圧はFSC300V、SSC 275V、FITC 300V、PerCP-Cy5.5 350V の条件を用いて測定を行った。
【００６９】
実施例６で得られたＷＴ1  ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブを導入したK562細胞を用いて細胞内ＦＲＥＴを測定した。結果を図１７及び１８に示す。図１７は、各ＦＲＥＴプローブを導入した細胞のFACSの解析結果を表す図である。横軸は、ドナープローブの蛍光強度を示し、縦軸は、ＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度を示す。図１８は、各ＦＲＥＴプローブを導入した細胞において、アクセプタープローブの蛍光強度が10以上の細胞集団について蛍光強度の平均をプロットして比較したグラフである。これらの結果から、本実施例で用いたＦＲＥＴプローブの中で、WT1Ex1a/AプローブのＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度が最も強いことが分かった。したがって、特にWT1Ex1a/Aプローブは細胞内ＦＲＥＴに適していることが分かった。
【００７０】
（実施例８：各種培養細胞へのＷＴ１  ｍＲＮＡ検出用ＦＲＥＴプローブの導入と実発現量の相関）
次に、ＷＴ１  ｍＲＮＡの発現量が異なると考えられる各種の培養細胞内にWT1Ex1a/Aプローブを導入して、細胞内ＦＲＥＴによるアクセプターの蛍光強度を測定した。また併せて、培養細胞内におけるＷＴ１  ｍＲＮＡの発現量を別途リアルタイムPCRにより計測し、ＷＴ１  ｍＲＮＡの発現量とＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度との関係を比較した。その結果を図１９に示す。横軸は、ngのRNA当りのＷＴ１  ｍＲＮＡのコピー数を示し、縦軸は、各種培養細胞における細胞内ＦＲＥＴの蛍光強度を示す。その結果、両者の間に一定の相関が認められ、異なる細胞種間においてもＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度がＷＴ１  ｍＲＮＡの発現量を反映することが確認できた。したがって、ヘテロな細胞集団を含む白血球リンパ球分画に対しても、実施例１〜８で選定した条件を適用できることが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、AlexaFluor 488の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。
【図２】図２は、AlexaFluor 647の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを表すグラフである。
【図３】図３は、ヒトＷＴ１  ｍＲＮＡの４０塩基平均ＳＳ−ｃｏｎｕｔ値及び本実施例におけるＦＲＥＴプローブの凡そのハイブリダイゼーション位置を表すグラフである。
【図４】図４は、WT1Ex1a/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図５】図５は、WT1Ex1b/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図６】図６は、WT1Ex1b(2)/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図７】図７は、WT1Ex1c/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図８】図８は、WT1Ex2/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図９】図９は、WT1Ex5/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１０】図１０は、WT1Ex6/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１１】図１１は、WT1Ex8/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１２】図１２は、ＷＴ１（KTS+）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１３】図１３は、ＷＴ１（KTS-）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS+/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１４】図１４は、ＷＴ１（KTS+）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１５】図１５は、ＷＴ１（KTS-）  ｍＲＮＡに対してWT1KTS-/Aプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１６】図１６は、本実施例における各ＦＲＥＴプローブを用いたときの蛍光スペクトル変化を表すグラフである。
【図１７】図１７は、本実施例における各ＦＲＥＴプローブを導入したK562細胞のFACSの解析結果を表す図である。（ａ）WT1Ex1a/Aプローブ添加、（ｂ）WT1Ex1b/Aプローブ添加、（ｃ）WT1Ex1b(2)/Aプローブ添加、（ｄ）WT1Ex1c/Aプローブ添加、（ｅ）WT1Ex2a/Aプローブ添加、（ｆ）WT1Ex5a/Aプローブ添加、（ｇ）WT1Ex6a/Aプローブ添加、（ｈ）WT1Ex8a/Aプローブ添加、（ｉ）WT1KTS+/Aプローブ添加、（ｊ）WT1KTS-/Aプローブ添加、（ｋ）SLO処理なし。
【図１８】図１８は、本実施例における各ＦＲＥＴプローブを導入したK562細胞の蛍光強度の平均を比較したグラフである。
【図１９】図１９は、各種培養細胞におけるＷＴ１  ｍＲＮＡの発現量とＦＲＥＴによるアクセプタープローブの蛍光強度との相関を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【配列表】
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