(57)【要約】【課題】本発明は、分解性が高く、低毒性で環境に優しい、糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、水溶性の向上したバイオサーファクタントを製造する方法を提供することを目的とする。【解決手段】糖脂質型バイオサーファクタントのアシル基を、加水分解酵素を用いて位置選択的に切断する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖脂質型バイオサーファクタントの、アシル基を位置選択的に切断することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法
【請求項２】
上記糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【請求項３】
上記糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体が、式（Ｉ）
【化１】
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（式中、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示す）で表される糖脂質であることを特徴とする請求項２に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【請求項４】
糖脂質型バイオサーファクタントと加水分解酵素とを反応させることにより、エステル結合の切断を行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【請求項５】
上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種以上の加水分解酵素であることを特徴とする請求項４に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法に関するものである。より詳細には、微生物が生産する糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖脂質等のバイオサーファクタントは、生分解性が高く、低毒性で環境に優しく、新規な生理機能を持つといわれている。それゆえ、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及することが期待されており、そのためには、多くの種類のバイオサーファクタントが必要である。しかしながら、現在までに発見されているバイオサーファクタントの種類は、２０数種類と少ない。
【０００３】
糖脂質の一種であるマンノシルエリスリトールリピッド（以下、適宜「ＭＥＬ」と略記する）は酵母が作る天然系の界面活性剤であり種々の生理作用が報告されている（非特許文献１）。また最近ではエリスリトールがマンニトールに代わったマンノシルマンニトールリピッド（以下、適宜「ＭＭＬ」と略記する）が見出されている（特許文献１）。バイオサーファクタントの用途としては、抗炎症剤及び抗アレルギー剤（特許文献２）、養毛・育毛剤（特許文献３）としての有用性や、抗菌作用（特許文献４）や表面張力低下作用（特許文献５）が知られている。
【０００４】
ＭＥＬは、マンノースの４，６位がアセチル化されているかどうかで、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。つまり、ＭＥＬ−Ａは、マンノースの４，６位の両方がアセチル化されているものである。ＭＥＬ−Ｂは、上記６位がアセチル化され、ＭＥＬ−Ｃは、上記４位がアセチル化されているものである。ＭＥＬ−Ｄは、上記４，６位の両方がアセチル化されていないものである。
【０００５】
ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃは、アセチル基を有するため、水溶性が低い。それ故、水溶性を必要とする用途では使用し難いという欠点がある。
【０００６】
従って、水溶性を必要とする用途に関しては、脱アシル化を行いＭＥＬ−Ｄのような水酸基の多いＭＥＬを用いることが切望されている。
【０００７】
現在、ＭＥＬは、適切な培地を用いてＭＥＬを生産することができる酵母を培養することにより大量に生産することができる。例えば、大豆油を炭素源とする培地を用いて酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  Ｔ−３４株）を培養するという方法が見出されている（非特許文献２）。
【０００８】
しかしながら、この方法により生産されるＭＥＬは、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢまたはＭＥＬ−Ｃ等のアセチル基を含有するＭＥＬである。ＭＥＬ−Ｄは、上述の生産方法では、その痕跡のみが確認できる程度の極微量しか生産されない。
【特許文献１】特開２００５−１０４８３７号公報
【特許文献２】特開２００５−６８０１５号公報
【特許文献３】特開２００３−２６１４２４号公報
【特許文献４】特開昭５７−１４５８９６号公報
【特許文献５】特開昭６１−２０５４５０号公報
【非特許文献１】ジャーナル  オブ  バイオサイエンス  アンド  バイオエンジニアリング、９４，１８７（２００２）
【非特許文献２】バイオテクノロジー  レター、２３，１７０９（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−ＢおよびＭＥＬ−Ｃについては、大量生産する方法が見出されていたが、ＭＥＬ−Ｄのような水酸基数を増した脱アシルＭＥＬについては大量生産する方法が見出されていなかった。
【００１０】
本発明は上記事情に鑑みなされたもので、分解性が高く、低毒性で環境に優しい、糖脂質等のバイオサーファクタントを、食品工業、化粧品工業、医薬品工業、化学工業、環境分野等に広く普及をはかるため、水溶性の向上したバイオサーファクタントを製造する方法を提供することを目的とする。より具体的には、マンノシルエリスリトールリッピドのアシル基を加水分解して水溶性を高めたＭＥＬの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、糖脂質型バイオサーファクタントのアシル基を切断することにより、脱アシル体を高効率かつ安価に製造することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
【００１３】
（１）糖脂質型バイオサーファクタントの、アシル基を位置選択的に切断することを特徴とする糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【００１４】
（２）上記糖脂質型バイオサーファクタントが、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）またはマンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）であることを特徴とする（１）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【００１５】
（３）上記糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体が、式（Ｉ）
【００１６】
【化１】
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【００１７】
（式中、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示す）で表される糖脂質であることを特徴とする（２）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【００１８】
（４）糖脂質型バイオサーファクタントと加水分解酵素とを反応させることにより、上記エステル結合の切断を行うことを特徴とする（１）〜（３）のいずれか１項に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【００１９】
（５）上記加水分解酵素が、リパーゼ、プロテアーゼおよびエステラーゼからなる群より選ばれる少なくとも１種以上の加水分解酵素であることを特徴とする（４）に記載の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、糖脂質型バイオサーファクタントの、脱アシル体を高効率かつ安価に製造することができる。
【００２１】
特に、ＭＥＬの４位および／または６位に付加しているアセチル基を、脱アセチル化して水溶性が向上したＭＥＬの脱アセチル体であるＭＥＬ−Ｄに変換することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明を詳述する。なお、本明細書中に記載された非特許文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【００２３】
本発明の糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の製造方法（以下、「本発明の製造方法」と略記する）は、糖脂質型バイオサーファクタントのアシル基を位置選択的に切断するものであればよい。
【００２４】
「バイオサーファクタント」とは生物によって生み出される界面活性能力や乳化能力を有する物質の総称であり、優れた界面活性や、高い生分解性を示すばかりでなく、様々な生理作用を有していることから合成界面活性剤とは異なる挙動・機能を発現する可能性がある。
【００２５】
バイオサーファクタントのうち、糖と、エステル結合を介して糖に結合した脂肪酸とを備えるバイオサーファクタントを「糖脂質型バイオサーファクタント」という。なお、本明細書において、「脂肪酸」には酢酸を含むものとする。
【００２６】
本明細書において、「糖脂質型バイオサーファクタントのアシル基を位置選択的に切断する」とは、脂肪酸と糖との間に形成されている上記エステル結合を、糖の炭素の位置によって選択的に加水分解することによって、脂肪酸に含まれるアシル基を切断することを意味する。
【００２７】
それゆえ、本発明の製造方法によって製造される「糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体」は、糖の炭素の特定の位置のアシル基が脱離している構成の糖脂質型バイオサーファクタントである。なお、「糖脂質型バイオサーファクタントのアシル基を切断する」ことと、「糖脂質型バイオサーファクタントを脱アシル化する」ということとは同義である。
【００２８】
アシル基とは、「ＲＣＯ−（Ｒは、炭化水素基を表す。）」で表される官能基であり、例えば、アセチル基等を挙げることができる。
【００２９】
脂肪酸は、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸とに分類することができる。
【００３０】
上記飽和脂肪酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、ヘプタン酸、カプロン酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリン酸、トリデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキン酸等を挙げることができる。
【００３１】
上記不飽和脂肪酸としては、例えば、デセン酸、ドデセン酸、テトラデセン酸、ヘキサデセン酸、オクタデセン酸、イコセン酸、デカジエン酸、ドデカジエン酸、ヘキサデカジエン酸、オクタデカジエン酸、リノレン酸、アラキドン酸等を挙げることができる。
【００３２】
糖脂質型バイオサーファクタントとしては、マンノシルエリスリトールリピッド（ＭＥＬ）、マンノシルマンニトールリピッド（ＭＭＬ）、ソホロリピッド、ラムノリピッド、トレハロースリピッドなどが知られている。
【００３３】
本発明の製造方法では、糖脂質型バイオサーファクタントの中でも、上記アシル基の一部が、アセチル基である糖脂質型バイオサーファクタント（以下、「アセチル基含有糖脂質型バイオサーファクタント」と略記する）を用いることが好適である。
【００３４】
上記アセチル基含有糖脂質型バイオサーファクタントとして、マンノシルエリスリトールリピッド（以下、「ＭＥＬ」と略記する）、マンノシルマンニトールリピッド（以下、「ＭＭＬ」と略記する）が知られているが、これに限定されない。
【００３５】
本発明の製造方法により製造される、糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体の具体的な構造としては、例えば、下記の式（Ｉ）
【００３６】
【化２】
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【００３７】
（式中、Ｒ１、およびＲ２は、それぞれ独立して炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示す）で表されるＭＥＬ−Ｄを挙げることができる。上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２の炭化水素基は、飽和結合のみを有していてもよく、不飽和結合を有していてもよい。不飽和結合を有している場合、複数の二重結合を有していてもよい。炭素鎖は直鎖状であってもよく分岐鎖状であってもよい。また、酸素原子含有炭化水素基の場合、含まれる酸素原子の数および位置は限定されない。
【００３８】
式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数が６〜２０であることが好ましい。Ｒ１およびＲ２は、脂肪族アシル基（ＲＣＯ−）としてマンノースの２位および３位の水酸基とエステル結合をしている。
【００３９】
以下本発明の製造方法の一例として、ＭＥＬのアシル基を位置選択的に切断して脱アシル体を製造する方法について説明する。しかし本発明の製造方法は、ＭＥＬに限定されること無く、ＭＭＬ等のアセチル基含有糖脂質型バイオサーファクタントも用いることができる。なぜならば、ＭＭＬの構造は、炭素数がエリスリトールより２つ多い糖アルコールを有している以外は、ＭＥＬと同様だからである。ゆえに、ＭＥＬにおいて脱アシル化が容易に進行すれば、ＭＭＬにおいても脱アシル化が容易に進行することを当業者は容易に理解する。
【００４０】
式（ＩＩ）にＭＥＬの構造を示す。式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２は、炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基を示す。Ｒ３およびＲ４はアセチル基またはＨを示す。さらにＭＥＬは、アセチル基の有無からＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃ、ＭＥＬ−Ｄの４種類が知られている。ＭＥＬ−Ａは、式（ＩＩ）中、Ｒ１およびＲ２が、炭素数６〜２０の炭化水素基または酸素原子含有炭化水素基であり、Ｒ３およびＲ４がアセチル基である化合物である。
【００４１】
【化３】
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【００４２】
なお、ＭＥＬ−Ｂは式（ＩＩ）においてＲ３およびＲ４がそれぞれＨおよびアセチル基であり、ＭＥＬ−Ｃは式（ＩＩ）においてＲ３およびＲ４がそれぞれアセチル基およびＨであり、ＭＥＬ−Ｄは式（ＩＩ）においてＲ３およびＲ４がいずれもＨである。本明細書では、アセチル基を有するＭＥＬ、すなわち、ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂ、ＭＥＬ−Ｃの３種類を総称してアセチル基含有ＭＥＬという。
【００４３】
上述したように「アシル基」は、「アセチル基」を含む官能基である。そこで、ＭＥＬのアシル基を位置選択的に切断するとは、具体的には、ＭＥＬのマンノースの２位のアシル基、３位のアシル基、４位のアセチル基、および６位のアセチル基からなる群より選ばれる官能基の１種以上を位置選択的に切断することを意味する。
【００４４】
＜ＭＥＬの製造方法＞
本発明の製造方法に用いることのできるＭＥＬは、特に制限されるものではないが、微生物を用いた発酵方法を任意に選択して行うことにより製造することができる。微生物としては、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １０７３６、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．、Ｐ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。いずれの微生物でも容易にＭＥＬが得られることは周知の事実である。ＭＥＬを生産する能力を有する微生物としては特に限定するものではなく、目的に応じて適宜使用することができる。
【００４５】
なお、上記に例示した微生物の内、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １０７３６を用いることによりＭＥＬ−Ａを主に選択的に製造することができ、上記Ｐ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓを用いることにより、ＭＥＬ−Ｂを主に選択的に製造することができる。
【００４６】
上記ＭＥＬを生産することができる微生物の発酵培養に用いる培地は、酵母エキス、ペプトン等の窒素源、グルコース、フルクトース等の炭素源、および無機窒素源、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム７水塩等の無機塩類を含む培地に、油類および非水溶性基質を添加したものを使用することができる。なお、ミリスチン酸などの脂肪酸やそのエステル体を上記油類の代わりに用いても良い。
【００４７】
油脂類としては植物油脂が好ましい。植物油脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、大豆油、菜種油、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、パーム油、ヒマワリ油、トウモロコシ油、キャノーラ油、ココナッツ油などが挙げられ、これらの中でも、アセチル基含有ＭＥＬの生産効率（生産量、生産速度、および収率）を向上させることができる点で、大豆油が特に好ましい。また、これらの植物油脂は、１種を単独で用いても良いし、または、２種以上を併用しても構わない。
【００４８】
非水溶性基質としては、流動パラフィン、テトラデカン等の炭化水素等を用いることができる。これらの非水溶性基質は、１種を単独で用いても良いし、または、２種以上を併用しても構わない。
【００４９】
無機窒素源としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、硝酸アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム、塩化アンモニウム、硫安等が挙げられる。
【００５０】
発酵培養の条件（培養温度、培養時間、培地のｐＨなど）は用いる酵母に最適な条件を任意に設定できる。例えば、本発明者らは、下記の実施例１において、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １０７３６を３０℃、３００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて７〜１４日間培養している。
【００５１】
また、下記の実施例２において、Ｐ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓを２６℃、３００ｒｐｍ（攪拌回転）、１／４ＶＶＭ、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて８日間培養している。ただし、これらに限定されるものではない。
【００５２】
発酵後の培養液には、ＭＥＬが含まれている。そのため、発酵後の培養液をそのまま本発明の製造方法に用いることができる。さらに、発酵後の培養液を必要に応じて濾過、遠心分離、抽出、精製、滅菌等の操作を適宜加えることも可能であり、得られたエキスを希釈、濃縮、乾燥することもできる。
【００５３】
ＭＥＬの回収、精製方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、培養液を遠心分離して油分を回収し、酢酸エチルエステルで抽出濃縮することにより回収することができる。
【００５４】
抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、またはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独で或いは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができる。また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００５５】
なお、抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。このようにして、ＭＥＬの粗精製物を得ることができる。多くの場合は、当該粗精製物の状態で利用できるが、必要ならば、その効力に影響のない範囲で、脱臭、脱色等の精製処理を、さらに加えても良い。
【００５６】
脱臭・脱色等の精製処理の手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。このようにして純度の高いＭＥＬの精製物を得ることができる。また、必要に応じて、シリカゲルカラムを用いてさらに精製を行ってもよい。
【００５７】
以下では、本発明の製造方法の一例として、ＭＥＬのマンノースの４位および６位のアセチル基を選択的に切断して脱アセチル体であるＭＥＬ−Ｄを製造する方法について説明する。
【００５８】
しかしＭＥＬの脱アシル体の製造方法は、これに限定されるものではない。ＭＥＬの脱アシル体の製造方法は、ＭＥＬのマンノースの２位のアシル基、３位のアシル基、４位のアセチル基、および６位のアセチル基からなる群より選ばれる官能基の１種以上を位置選択的に切断することにより、ＭＥＬの脱アシル体を製造することができればよい。
【００５９】
＜ＭＥＬ−Ｄの製造方法＞
ＭＥＬ−Ｄの製造方法では、上述したアセチル基含有ＭＥＬ（ＭＥＬ−Ａ、ＭＥＬ−Ｂおよび、ＭＥＬ−Ｃ）を好適に用いることができる。これらのアセチル基含有ＭＥＬの内、１種を単独で用いても良いし、または、２種以上を併用しても良い。
【００６０】
また、上記アセチル基含有ＭＥＬの態様としては、上述した発酵後の培養液、培養液中に生成する沈殿物、粗精製物、または精製物等である。
【００６１】
ＭＥＬ−Ｄの製造方法は、アセチル基含有ＭＥＬのマンノースの４位および６位のアセチル基を選択的に切断する工程を含むものであればよい。
【００６２】
上記アセチル基を選択的に切断する方法としては、例えば、「酸性またはアルカリ性の溶液中で、アセチル基含有ＭＥＬのアセチル基を加水分解する方法」、「酵素を用いる方法」等を挙げることができる。上記「酵素を用いる方法」とは、アセチル基含有ＭＥＬと加水分解酵素とを反応させる工程を含むものであれば良い。
【００６３】
上記加水分解酵素としては、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ等を好適に用いることができる。なかでも、リパーゼおよびエステラーゼが好ましく、リパーゼがさらに好ましい。これらの加水分解酵素を用いることにより、アセチル基含有ＭＥＬの脂肪酸部分を切断することなく、アセチル基のみを効率よく切断することができる。上記加水分解酵素の中から選択される少なくとも１種を用いてもよいし、複数の加水分解酵素を用いてもよい。
【００６４】
このように、上記加水分解酵素を用いることによりアセチル基含有ＭＥＬのアセチル基のみを選択的に切断して効率よくＭＥＬ−Ｄが製造できることは当業者ですら予想できないことであった。
【００６５】
アセチル基含有ＭＥＬと加水分解酵素とを反応させる方法は、特に限定されないが、例えば、アセチル基含有ＭＥＬを含む溶液に加水分解酵素を添加することにより実施することができる。
【００６６】
上記溶液としては、水溶液、有機溶媒、または水溶液と有機溶媒との混合溶液を用いることができる。上記水溶液としては、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７）、トリス緩衝溶液等の当業者にとって周知の水溶液を用いることができる。
【００６７】
上記有機溶媒としては、アセチル基含有ＭＥＬの全部または一部を可溶化できるものなら限定されない。また、有機溶媒は複数の有機溶媒の混合物でもよい。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、プロパノン、ブタノン、ペンタン−２−オン、１，２−エタンジオール、２，３−ブタンジオール、ジオキサン、アセトニトリル、２−メチル−ブタン−２−オール、第３級ブタノール、２−メチルプロパノール、および４−ヒドロキシ−２−メチルペンタノン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ピリジン、メチルエチルケトン等を挙げることができる。これら有機溶媒の中でも、メタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、第３級ブタノール、アセトニトリル、またはジオキサンが好ましく、メタノールまたは、アセトンがより好ましい。
【００６８】
１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で、アセチル基含有ＭＥＬを含む溶液に、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるように加水分解酵素を加えて攪拌して反応させることにより効率よくアセチル基を切断することができ、アセチル基含有ＭＥＬの脱アセチル体を製造することができる。
【００６９】
反応温度は、１０〜１００℃であることが好ましく、２０〜５０℃であることがより好ましく、２５〜４０℃であることがさらに好ましい。反応時間は、１時間〜７日間が好ましい。
【００７０】
上述の反応の後に、生じたＭＥＬ−Ｄを回収することができるが、回収の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができる。例えば、反応後の溶液に酢酸エチルエステルを加えて抽出濃縮することにより回収することができる。
【００７１】
抽出溶媒としては、水、アルコール類（例えば、メタノール、無水エタノール、エタノールなどの低級アルコール、またはプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール）、アセトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルムなどの有機溶媒を、単独で或いは２種類以上の混液を任意に組み合わせて使用することができる。また、各々の溶媒抽出物が組み合わされたものでも使用することができる。
【００７２】
なお、抽出方法は特に制限されるものはないが、通常、常温から常圧下での溶媒の沸点の範囲であれば良く、抽出後は濾過またはイオン交換樹脂を用い、吸着・脱色・精製して溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状とすれば良い。このようにして、ＭＥＬ−Ｄの粗精製物を回収することができる。さらに必要に応じて、その効力に影響のない範囲で、脱臭、脱色等の精製処理を加えても良い。
【００７３】
脱臭・脱色等の精製処理の手段としては、活性炭カラムなどを用いればよく、抽出物質により一般的に適用される通常の手段を任意に選択して行えばよい。このようにして純度の高いＭＥＬ−Ｄの精製物を得ることができる。また、必要に応じて、シリカゲルカラムを用いてさらに精製を行ってもよい。
【００７４】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。以下の実施例により、本発明をさらに、詳細に説明するが、本発明は、これらに何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７５】
＜実施例１−加水分解酵素を用いたＭＥＬ―Ａの脱アセチル化方法＞
〔ＭＥＬ−Ａの製造〕
種菌培養はＰｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ  ＮＢＲＣ  １０７３６を種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に１ｒｏｏｐ植菌して実施した。３０℃にて一晩培養した。得られた培養液を種菌とした。種培地組成は４％  Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．３％  ＮａＮＯ３、０．０２％  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔとした。
【００７６】
培養は上記種菌７５ｍｌを生産培地１．５Ｌ（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、３０℃、３００ｒｐｍ（攪拌回転）、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で５Ｌ−ｊａｒを用いて７〜１４日間培養した。生産培地組成は、３％  大豆油、０．０２％  ＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．０２％  ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔとした。
【００７７】
得られた培養液２５０ｍＬを遠心分離（６５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）した。上清を取り除き、沈殿（菌体）を回収した。沈殿に、５０ｍｌの酢酸エチルを加え、十分攪拌後、遠心（８５００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）し、沈殿と上清に分け、上清をエバポーレーターで濃縮した。シリカゲルを用いて、ヘキサン：アセトン＝５：１、ヘキサン：アセトン＝１：２で溶出し、ＭＥＬ―Ａ画分を得た。
【００７８】
なお、ＮＭＲにより、ＭＥＬ―Ａであることを確認した。
【００７９】
〔ＭＥＬ−Ａの脱アセチル化〕
上述のように製造したＭＥＬ−Ａ  １ｇを下記１〜５の組成の混合溶液５０ｍｌに懸濁した。その後、リパーゼＬＰＬ−３１１（東洋紡）１ｇを添加し３０℃で１２時間振とうし反応させた。
【００８０】
１−メタノール
２−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）：メタノール＝１：３
３−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）：メタノール＝１：１
４−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）：メタノール＝３：１
５−０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）
反応後、酢酸エチルで抽出濃縮し、シリカゲル２０ｇを用いて、酢酸エチル：メタノール１０：１で生成物を単離し、無色油状の生成物１００ｍｇを得た。
【００８１】
図１は、反応後の各混合溶液のＴＬＣ（展開溶媒  酢酸エチル：メタノール：水＝８５：１０：５、硫酸発色）を示す図である。なお、６は、対照として用いたＭＥＬ−ＡのＴＬＣを示している。図１によれば、１〜５には、いずれもＭＥＬ−Ａよりも極性が高い生成物のスポットが一つ認められた。
【００８２】
ＭＥＬ−Ａよりも極性が高い生成物を粗単離し、その構造を１３Ｃ−ＮＭＲおよび１Ｈ−ＮＭＲで確認した。
【００８３】
表１は、ＭＥＬ−Ａと生成物（ＭＥＬ−Ｄ）との１３Ｃ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各炭素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を示す表である。なお、表１のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は下記式（ＩＩＩ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００８４】
【表１】
2008187902.tif 000006
【００８５】
【化４】
2008187902.tif 000007
【００８６】
ＭＥＬ−Ａと比較し、生成物（ＭＥＬ−Ｄ）ではＭＥＬのマンノース残基の４位、６位炭素が高磁場シフトし、隣接する３位、５位炭素が低磁場シフトしている。このことから、ＭＥＬ−Ａのアセチル基が脱アセチル化されたことが確認された。
【００８７】
表２は、ＭＥＬ−Ａと生成物（ＭＥＬ−Ｄ）との１Ｈ−ＮＭＲ（溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ６における各水素原子のケミカルシフト値（ｐｐｍ）を示す表である。なお、表２のＥ１，Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ４，Ｍ５，Ｍ６は上記式（ＩＩＩ）のマンノシルエリスリトール骨格の炭素原子を示す。
【００８８】
【表２】
2008187902.tif 000008
【００８９】
１Ｈ−ＮＭＲから、生成物において、ＭＥＬ−Ａと比較して、アセチル基のピークが消失し、マンノースの６位の水酸基が出現、また、４位、６位プロトンが高磁場シフトしていることが分かった。表２に示したようにアサイメントした結果、生成物がＭＥＬ−Ｄであることを確認した。
【００９０】
＜実施例２−酵素を用いたＭＥＬ―Ｂの脱アセチル化方法＞
〔ＭＥＬ−Ｂの製造〕
０．２ｍｌのＰ．ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓのフローズンストックをＹＭ種培地（２０ｍｌ／５００ｍｌ容坂口フラスコ）に植菌し、２６℃、１８０ｒｐｍにて１晩培養した。得られた培養液を種菌とした。
【００９１】
培養は上記種菌２０ｍｌを２ＬのＹＭ培地（５Ｌ−ｊａｒ）に植菌し、２６℃、３００ｒｐｍ（攪拌回転）、１／４ＶＶＭ、０．５Ｌ／ｍｉｎ（Ａｉｒ）の条件で８日間培養した。
【００９２】
得られた培養液を５００ｍｌ容遠心管×６本に分注し、遠心分離（７９００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ、４℃）した。上清を取り除き、菌体（ＭＥＬ−Ｂを含む）を回収した。当該菌体画分×６本に、それぞれ８０ｍｌの酢酸エチルを加え、菌体が十分懸濁するように上下に攪拌した。攪拌後、遠心分離（７９００ｒｐｍ、６０ｍｉｎ、４℃）し、上清と沈殿とに分離した。
【００９３】
得られた上清を三角フラスコに回収した。再度、沈殿に８０ｍｌの酢酸エチルを加え、同様に遠心し沈殿と上清に分け、上清を上記三角フラスコに回収した。
【００９４】
得られた上清を分液ロートに入れ、上清と等量の飽和食塩水とを加え、十分攪拌した。水層を捨て、酢酸エチル層を得た。当該酢酸エチル層に無水硫酸Ｎａを適量加え、３０分間静置した。エバポレートすることによりＭＥＬ−Ｂ粗精製品を得た。
【００９５】
得られたＭＥＬ−Ｂ粗精製品（２０ｇ）をシリカカラム（２００ｇ、ヘキサン膨潤）に供し、ヘキサン：アセトン＝５：１（１５００ｍｌ）、ヘキサン：アセトン＝５：２（７００ｍｌ）、ヘキサン：アセトン＝１：１（１０００ｍｌ）でそれぞれ２００ｍｌずつ分取し、ＭＥＬ−Ｂ画分を得た。
【００９６】
なお、ＮＭＲにより、ＭＥＬ―Ｂであることを確認した。
【００９７】
〔ＭＥＬ―Ｂの脱アセチル化〕
上述のように製造したＭＥＬ−Ｂ  １ｇを用いて、実施例１と同様の方法で反応後、精製を行い無色油状の生成物９５ｍｇを得た。
【００９８】
図２は、反応後の混合溶液のＴＬＣ（展開溶媒  酢酸エチル：メタノール：水＝８５：１０：５、硫酸発色）を示す図である。図２中の１は、上記混合溶液の組成が、０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）：メタノール＝１：１であることを示す。また、２は、対照としてのＭＥＬ−ＡのＴＬＣを示し、３は、対照としてのＭＥＬ−ＢのＴＬＣを示す。
【００９９】
図２によれば、実施例１と同様、１にはＭＥＬ−Ａよりも極性が高い生成物のスポットが一つ認められ、ＭＥＬ−Ｄが生成していると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０１００】
本発明によって、糖脂質型バイオサーファクタントの脱アシル体を効率よく製造することができる。より具体的には、ＭＥＬと加水分解酵素とを反応させて、加水分解反応により脱アシル化することにより水溶性の向上したＭＥＬを製造することが出来る。
【０１０１】
つまり、本発明の製造方法により、ＭＥＬを応用していく上で、従来法では製造することができなかったＭＥＬ−Ｄを提供することができる。それゆえ、食品産業、化粧品産業、医薬品産業、化学産業、環境分野等の産業界に広く利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、実施例１で示した反応液のＴＬＣパターンを示す図である。
【図２】図２は、実施例２で示した反応液のＴＬＣパターンを示す図である。
【図１】
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【図２】
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