(57)【要約】【課題】本発明は、網羅的な解析が可能であり、反応により得られる蛍光を高精度に検出できるリアルタイムＰＣＲ装置を提供すること。【解決手段】遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置１であって、複数の反応領域Ａ１と、前記反応領域Ａ１ごとに設けられ、温度制御機構を備えた熱源により前記反応領域を加熱する加熱部１６と、前記複数の反応領域全てに特定波長の励起光Ｌ１，Ｌ２を照射可能な光学手段と、前記反応領域ごとに設けられ、受光した蛍光Ｌ３の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を備える蛍光検出部１５と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置１とすること。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、
複数の反応領域と、
前記反応領域ごとに設けられ、温度制御機構を備えた熱源により前記反応領域を加熱する加熱部と、
前記複数の反応領域全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、
前記反応領域ごとに設けられ、受光した蛍光の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を備える蛍光検出部と、
を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項２】
前記蛍光検出部は、前記蛍光検出機構により検出された電気的信号を、あらかじめ記憶された電気的信号と遺伝子発現量の相関関係に基づいて演算処理する手段を備えることを特徴とする請求項１記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項３】
前記温度制御機構の制御媒体と、前記蛍光検出機構の検出媒体とは、同一画素内に設けられていることを特徴とする請求項１記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項４】
前記受光部の蛍光検出機構は、ＥＬ素子を用いることを特徴とする請求項１記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項５】
前記温度制御機構の制御媒体は、温度制御用薄膜トランジスタであり、
前記蛍光検出機構の検出媒体は、蛍光検出用薄膜トランジスタであることを特徴とする請求項３記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項６】
前記温度制御機構の制御媒体は、温度制御用ＥＬ素子であり、
前記蛍光検出機構の検出媒体は、蛍光検出用薄膜トランジスタであることを特徴とする請求項３記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置に関する。より詳細には遺伝子発現等を解析するリアルタイムＰＣＲ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多様のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。
【０００３】
そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行うことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量各酸の定量分析を行う方法である。
【０００５】
そして、リアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることができる。このような装置として、リアルタイムＰＣＲ装置がある。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲ装置は、試料にて増幅反応が進行する際に励起光を照射することで蛍光信号をリアルタイムにて検出することができる反応処理装置であり、化学反応を含め、医療現場や遺伝子解析の研究に用いられるゲノムＤＮＡの観測を行なう検出器等として使用することができる。
【０００７】
例えば、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法において、二本鎖ＤＮＡを特性する際に用いられる蛍光色素を標識した場合、その二本鎖ＤＮＡを加熱することで蛍光色素の変化を観察することができるが、リアルタイムＰＣＲには幾つかの検出方法がある。
【０００８】
例えば、特異性の高いプライマーにより目的のターゲットのみを増幅可能の場合には、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＧＲＥＥＮ  Ｉを用いるインターカレーター法が用いられる。
【０００９】
二本鎖ＤＮＡにに結合することで蛍光を発するインターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できる。
【００１０】
また、よく似た配列を区別して検出する必要や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合には、プローブ法を用いる。その一つに５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法がある。
【００１１】
ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光発光は抑制される。伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｗＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発光される。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
【００１２】
このような方法によって、遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する原理を以下に述べる。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型として使用してＰＣＲを行なう。そして、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸に、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットして、検量線を作成する。
【００１３】
未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のＤＮＡ量が測定できることになる。
【００１４】
そして、これらに関する技術として、特許文献１や特許文献２には増幅反応時の温度制御等に関する技術が開示されている。
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８号公報。
【特許文献２】特開２００４−０２５４２６号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このようなＰＣＲ装置は、遺伝子発現量の検出において定量性に優れているといった特徴を有する。しかし、以下の問題点がある。まず、一度に解析できるサンプル数が少なく、網羅的な解析ができない。また、励起光照射や蛍光検出の際には、反射鏡を用いた反射型光学系構造等が用いられているが、このような場合、検出される蛍光等は微弱になるため、信号増幅器等を別途用いる必要がある。そのため、検出器の構造が複雑化したり、高価になったりするという問題がある。
【００１６】
そこで、本発明は、網羅的な解析が可能であり、反応により得られる蛍光を高精度に検出できるリアルタイムＰＣＲ装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、複数の反応領域と、前記反応領域ごとに設けられ、温度制御機構を備えた熱源により前記反応領域を加熱する加熱部と、前記複数の反応領域全てに特定波長の励起光を照射可能な光学手段と、前記反応領域ごとに設けられ、受光した蛍光の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を有する蛍光検出部と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。
蛍光検出部を反応領域ごとに設け、かつ蛍光の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を備えることで、高精度かつリアルタイムに蛍光検出することができる。そして、各反応領域について個別に温度制御と検出制御を行なうこと等によって高精度の解析を行なうことができる。
そして、本発明は、前記蛍光検出部は、前記蛍光検出機構により検出された電気的信号を、あらかじめ記憶された電気的信号と遺伝子発現量の相関関係に基づいて演算処理する手段を備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。かかる相関関係に基づいて蛍光検出機構により検出された電気的信号を演算処理することで、反応領域ごとに高精度の蛍光検出を行うことができる。
続いて、本発明は、前記温度制御機構の制御媒体と、前記蛍光検出機構の検出媒体とは、同一画素内に設けたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。温度制御機構の制御媒体と、蛍光検出機構の検出媒体とを同一画素内に設けることで、各反応領域に対応した高精度の反応制御と蛍光検出を行なうことができるとともにデバイスとしての小型化をより容易にすることができる。
また、本発明は、前記受光部の蛍光検出機構にＥＬ素子（Electro Luminescence）を用いたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。ＥＬ素子を蛍光検出機構に用いることで、前記電気的信号に早く応答できるため、より高精度の蛍光検出を行なうことができる。
さらに、本発明は、前記温度制御機構の制御媒体として温度制御用薄膜トランジスタ（ＴＦＴ：Thin Film Transistor）を用い、前記蛍光検出機構の検出媒体として蛍光検出用薄膜トランジスタを用いるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。
また、本発明は、前記温度制御機構の制御媒体として温度制御用ＥＬ素子を用い、前記蛍光検出機構の検出媒体として蛍光検出用薄膜トランジスタを用いるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置によれば、本発明は、網羅的な解析が可能であり、反応により得られる蛍光を高精度に検出できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００２０】
図１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。図２は、同実施形態において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した一例の概念図である。図３は、同実施形態において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した回路図の一例である。なお、以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。
【００２１】
図１中の符号１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置を示している。このリアルタイムＰＣＲ装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、リアルタイムＰＣＲ装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更可能である。
【００２２】
リアルタイムＰＣＲ装置１は、複数の反応領域Ａ１を有するウェル基板１１と、光源１２と、該光源１２より発せられた励起光Ｌ１，Ｌ２を導く励起光走査板１３とを備えている。そして、フィルター１４と、蛍光Ｌ３を検出する蛍光検出部１５と、前記反応領域Ａ１を加熱する加熱部１６と、が測定基板１７に設けられている。
【００２３】
リアルタイムＰＣＲ装置１では、光源１２より発せられた励起光Ｌ１が、励起光走査板１３を経て、励起光Ｌ２として各反応領域Ａ１に照射される。そして、反応領域Ａ１内から発光する蛍光Ｌ３を蛍光検出部１５により検出・測定される。この蛍光検出部１５は、蛍光Ｌ３を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を少なくとも備えている。
【００２４】
蛍光検出部１５を反応領域Ａ１ごとに設け、かつ蛍光Ｌ３の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を備えることで、各反応領域Ａ１の蛍光Ｌ３を個別かつ高精度にリアルタイムで解析することができる。
【００２５】
そして、後述するが、本発明では前記蛍光検出部１５の蛍光検出機構の検出媒体と、前記加熱部１６の温度制御機構の媒体を同一画素内に設けることができる。これにより、デバイスとしての小型化が可能となる。以下、リアルタイムＰＣＲ装置１の各構成について詳細に説明する。
【００２６】
ウェル基板１１は、複数の反応領域（ウェル）Ａ１を基板内に備えている。この反応領域Ａ１で所定の反応を行う。また、低蛍光発光プラスチック材料やガラスで形成され、例えば人の遺伝子数に匹敵する数をマトリクス状に配置することができる。
【００２７】
本発明では、ＰＣＲ反応のための反応領域（ウェル）はマイクロ空間であることが望ましい。例えば、ウエルを３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（約３０ｎＬ容量）とし、約４万個のウエルを並べるとすると、約６ｃｍ角の面積を有するデバイスとなる。
【００２８】
ここで、個々の反応領域Ａ１の形状は特に限定されず、前記直方体に限らず、反応溶液を保持できる形状であれば、どのような形状でもよい。励起光Ｌ１，Ｌ２を照射する光路や、蛍光Ｌ３を検出する光路等を考慮して適宜好適な形状を選択することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ装置２では、反応領域Ａ１内で前記蛍光Ｌ３を反射させるため、反応領域Ａ１は曲面部分を有している。
【００２９】
また、光散乱の影響および外光の影響による、検出感度の低下を抑制するために、反応領域Ａ１は、遮光する材質（例えば、ダイヤモンドライクカーボン等）にてコーティングされていることが望ましい。
【００３０】
本発明では、前記複数の反応領域Ａ１全てに特定波長の励起光Ｌ１，Ｌ２を照射可能な光学手段として、光源１２や、励起光Ｌ１，Ｌ２を各反応領域Ａ１に導入するための励起光走査板１３などを用いることができる。
【００３１】
光源１２は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましい。発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。
【００３２】
本発明では、光源１２の設置場所や光源数については特に限定されない。図示はしないが、各反応領域Ａ１に対応するように光源１２を複数設け、各光源１２が対応する各反応領域Ａ１に向かって励起光を直接照射する構造としてもよい。
【００３３】
この場合、各反応領域Ａ１を光源１２で直接照射できるため、励起光Ｌ１，Ｌ２の光量をより多くとることができるとともに、全ての反応領域Ａ１に均一な励起照射を行うことができる。さらには、各反応領域Ａ１に照射される励起光Ｌ１，Ｌ２の励起波長や光量を個別制御することができる。励起波長を個別制御するには、例えば、波長の異なる発光素子等を光源１２として複数使用することができる。
【００３４】
励起光走査板１３は、光源１２から発光する励起光Ｌ１をウェル基板１１内の各反応領域Ａ１に導くものである。前記励起光走査板１３内部のスペーサ１５１に光源１２から発せられる励起光Ｌ１が導入される。そして、前記励起光走査板１３の底部には反射膜１３１が設けられており、ウェル基板１１へ励起光Ｌ２を導入することができる。これにより、各反応領域Ａ１内の反応液中の蛍光物質を均一な光量で励起させることができる。前記反射膜１３１の材料等については特に限定されないが、好適には、ダイクロックミラーを用いることが望ましい。
【００３５】
また、本発明では、励起光走査板１３の上部に、前記励起光Ｌ１，Ｌ２の波長光のみを透過するフィルター１３３を設けることが望ましい。これにより、光源１２から発せられる光から励起光Ｌ２を効率よく取り出し、反応領域Ａ１へ導くことができる。このフィルター１３３としては、例えば偏光フィルターなどを用いることができる。
【００３６】
反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ２は、反応領域Ａ１内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３は反応領域Ａ１内の壁面で反射して、反応領域Ａ１の下方に設けられた蛍光検出部１５で検出・測定される。
【００３７】
また、本発明では、特定波長の光（蛍光Ｌ３等）を取り出すことができるように、反応領域Ａ１と蛍光検出部１５との間にもフィルター１４を配置することができる。前記フィルター１４は特定波長の光を取り出すことができればよく、その材料は限定されないが、例えば、ダイクロイックミラーを用いることができる。
【００３８】
蛍光検出部１５は、反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ２に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光を検出・測定する。
【００３９】
そして、本発明では、蛍光検出部１５は、受光した蛍光Ｌ３の光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を備える。この蛍光検出機構によって、受光した蛍光Ｌ３の光量を電気的信号に変換することができ、この電気的信号に基づいて蛍光Ｌ３の光量を高精度で測定・検出することができる。また、この電気的信号を測定し続けることで、リアルタイムに蛍光Ｌ３の光量を検出することができるため、リアルタイムに遺伝子の発現量を測定できる。
【００４０】
また、本発明で検出する電気的信号の種類は特に限定されず、例えば電流値でもよいし、電圧値でもよい。さらに、本発明では、蛍光検出部１５の蛍光検出機構の検出媒体については、特に限定されないが、フォトダイオード等のフォトセンサーを用いることが望ましく、より好適にはＥＬ素子や薄膜トランジスタ等を用いることが望ましい。
【００４１】
フォトダイオードは、受光した光量と発生する電流量の比が安定しているため、高精度の受光素子として、リアルタイムＰＣＲ装置１に好適に使用することができる。さらに、ＥＬ素子を用いることで、応答速度が速く、蛍光受光による電流発生現象をすぐに感度検出できるため、リアルタイムで遺伝子発現量を高精度で分析できる。
【００４２】
さらに、本発明では、蛍光検出部１５の蛍光検出機構により検出された電気的信号を、予め記憶した遺伝子発現量と電気的信号との相関関係に基づいて演算処理する手段を設けることが望ましい。
【００４３】
前記演算処理手段としては、例えば、蛍光検出機構で受光した蛍光の光量を電気的信号（電流値や電圧値等）に変換し、その物理量と遺伝子増幅信号との相関をもった対応テーブル（対応表）を比較算出すること等が挙げられる。このように、各反応領域Ａ１における電気的信号とそれに対応する遺伝子増幅信号との相関関係を予め求めておき、この相関関係情報に基づいて実際の測定時に得た電気的信号量について演算処理することで、各反応領域Ａ１に即した高精度の解析を行うことができる。
【００４４】
また、あらかじめ記憶した前記電気的信号と遺伝子発現量の相関関係に基づいて演算処理する手段としては、特に限定されないが、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置１の内部（例えば、蛍光検出部１５や加熱部１６など）に記録媒体を組み込んでおき、この記録媒体に前記相関関係を記録しておく手法などを用いることができる。
【００４５】
そして、リアルタイムＰＣＲ装置１では、加熱部１６を各反応領域Ａ１にそれぞれ設けている。前記加熱部１６は温度制御機構を備えており、これにより前記加熱部１６により反応領域Ａ１の温度制御を行うことができる。これにより、例えば、ＰＣＲサイクルを行う場合、熱変性→アニーリング→伸長反応のステップについてより高精度の温度制御を行うことができる。
【００４６】
さらに、本発明によれば、前記反応領域Ａ１の加熱時間についても、前記反応領域Ａ１に対応する加熱部１６により個別に制御できることができる。前記加熱部１６により、前記反応領域Ａ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記反応領域Ａ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００４７】
従来のリアルタイムＰＣＲ法に用いられるサーマルサイクラー等による温度制御はグラディエント機構が付加されている場合もあるが、各サンプルの温度制御が個別にできないという問題等がある。これに対して、本発明では、各反応領域Ａ１にそれぞれ加熱部１６を設けることで、各反応領域Ａ１を個別に温度制御することができる。
【００４８】
更に、加熱部１６において、温度制御機構を備えた熱源を用いて各反応領域Ａ１を加熱することで、各反応領域Ａ１をより高精度に温度制御することができる。かかる温度制御機構としては、例えば、熱源の温度をスイッチング素子等を用いて制御する手段等が挙げられ、好適には、温度制御機構の制御媒体として薄膜トランジスタを用いることが望ましい。
【００４９】
即ち、薄膜トランジスタ等が有するスイッチング機能を利用して、各反応領域Ａ１に対応する熱源についての温度制御を個別に行うことができる。本発明において用いる前記薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００５０】
また、加熱部１６で使用する熱源としては発熱抵抗体を用いることができ、例えば、白金（Ｐｔ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、炭化珪素、モリブデンシリサイド、ニッケル−クロム合金、鉄−クロム−アルミニウム合金等を用いることができる。
【００５１】
熱源に流れる電流値や電圧値等の電気的信号を制御することで、高精度の温度制御が可能となる。例えば、薄膜トランジスタに印加する電圧をコントロールしてソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流値を可変とすることや、ソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流を定電流電源としてコントロールすること等によって、熱源の温度制御を行なうことができる。
【００５２】
蛍光検出部１５は、加熱部１６と同じ基板上に形成されており、蛍光検出部１５の蛍光検出機構と制御媒体と、加熱部の温度制御機構の制御媒体とが、同一画素内に形成されている。同一画素内に形成される形態については、平面的に形成されている状態だけでなく、蛍光検出部１５と加熱部１６とが積層された状態の場合であってもよい。このように同一画素内に蛍光検出部１５の蛍光検出機構の検出媒体と、加熱部１６の温度制御機構の制御媒体とを設けることで、デバイスとしての小型化を可能とすることができる。
【００５３】
即ち、本発明では、加熱部１６の温度制御機構の制御媒体を、蛍光検出部１５の検出媒体と同一の画素回路内に設けることが望ましい。かかる構造とすることで、同じ画素レイヤで温度制御と蛍光検出を行うことができる。これによりデバイス作製上の複雑な工程を行う必要等を省略できるため、デバイスとしての小型化を可能とできるとともに、リアルタイムの検出が更に簡便かつ容易に行うことができる。
【００５４】
図２は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した一例の概念図である。即ち、前記温度制御機構の制御媒体である温度制御用媒体Ｔと、前記蛍光検出機構の検出媒体である蛍光検出用媒体Ｌを同一画素内に作り込まれている。そして、検出される前記電気的信号が比較回路にフィードバックされることによって、加熱制御される構造を有している。図２では、熱源Ｈが温度制御用媒体Ｔにより温度制御されており、その同一画素内に蛍光検出用媒体Ｌが設けられている。
【００５５】
このように前記熱制御用媒体Ｔと蛍光検出用媒体Ｌを同一画素内に設けることで、同じ画素レイヤで、熱制御と蛍光検出が可能になり、各反応領域Ａ１に対応した高精度の反応制御と蛍光検出を行なうことができるとともに、デバイス作成において積層構造等のような複雑な構造は不要となり、デバイスとしての小型化を更に容易にすることができる。
【００５６】
この温度制御用媒体Ｔと蛍光検出用媒体Ｌからなる画素は、反応領域Ａ１に対応しており、この画素をゲート線（例えば、Ｘ方向）とデータ線（例えば、Ｙ方向）に沿ってマトリクス状に複数配置させることもできる。即ち、各反応領域Ａ１（図１参照）に対応する画素を、測定基板１７（図１参照）にマトリクス状に配置することができる。
【００５７】
また、温度制御用媒体Ｔと蛍光検出用媒体Ｌとを保護層を解した２段構造として同一画素内に格納することもできる。
【００５８】
図３は、同実施形態において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した回路図の一例である。即ち、温度制御用媒体Ｔと蛍光検出用媒体Ｌとを同一回路内に形成した回路図の一例である。これにより、各画素において温度制御と蛍光検出を直接反応部近傍にて反応検出、および一括制御することができる。
【００５９】
本発明では、前記温度制御機構の制御媒体として温度制御用薄膜トランジスタを用い、かつ蛍光検出機構の検出媒体として蛍光検出用薄膜トランジスタを用いることが望ましい。各反応領域Ａ１について、温度制御用と蛍光検出用のそれぞれの薄膜トランジスタを同一画素内に設けることで、ウェルに密接に設置している熱制御と同時に蛍光検出を同一構成制御実現できることで、その反応検出手段を別途に、例えば検出基板などの別構成手段を設ける必要性が無くなる。同一構成上に検出手段を有することで、反応検出をより密接に直接検出することで検出精度が向上できる。さらに、熱制御配線および蛍光検出配線マトリクス構成を同一画素構成することで、現状、検出手段として別手段として必要しているデバイスよりも更にリアルタイムに検出信号を検出し、さらには小型化を実現することを可能にすることができる。
【００６０】
あるいは、本発明では、前記温度制御機構の制御媒体として温度制御用薄膜トランジスタを用い、かつ蛍光検出機構の検出媒体として蛍光検出用ＥＬ素子を用いることが望ましい。これにより、ウェルに密接に設置している熱制御と同時に蛍光検出を同一構成制御実現できることで、その反応検出手段を別途に、例えば検出基板などの別構成手段を設ける必要性が無くなる。同一構成上に検出手段を有することで、反応検出をより密接に直接検出することで検出精度が向上できる。さらに、熱制御配線および蛍光検出配線マトリクス構成を同一画素構成することで、現状、検出手段として別手段として必要しているデバイスよりも更にリアルタイムに検出信号を検出し、さらには、より小型化の実現を可能とすることができる。
【００６１】
このように前記熱制御媒体である薄膜トランジスタ素子Ｔの画素回路内に、受光専用のＥＬ素子Ｌの画素回路を設けることで、同じ画素レイヤで、熱制御と蛍光検出が可能になり、リアルタイムの検出を高精度で行なうことができる。また、デバイス作成において積層構造等のような複雑な構造は不要となり、デバイスとしての小型化を更に容易にすることができる。
【００６２】
本発明では、反応領域Ａ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１８を備えることが望ましい。ＰＣＲサイクルは、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要があるが、ペルチェ素子１８を設けることで、定温制御がより容易であり、高精度の温度制御を行なうことができる。例えば、予め、反応領域Ａ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。
【００６３】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。具体的には、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸、等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。
【００６４】
以下、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１を用いた測定手順の一例について説明する。
【００６５】
各反応領域Ａ１には、予め設計された異なる遺伝子配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各反応領域Ａ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。
【００６６】
続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各反応領域Ａ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ  Ｉ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。
【００６７】
熱変性ステップでは、反応領域Ａ１内が９５℃となるように加熱部１６等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、反応領域Ａ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡ相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、反応領域Ａ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
【００６８】
このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各反応領域Ａ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各反応領域Ａ１にそれぞれ設置された加熱部１６によって、各反応領域Ａ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各反応領域Ａ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。
【００６９】
ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉがインターカレートする。このＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ２を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。
【００７０】
これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、光源１２からの光Ｌ１が励起光走査板１３を経由して励起光Ｌ２として、インターカレートしたＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｉを励起させて蛍光Ｌ３を発光させる。この蛍光Ｌ３の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１１で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。
【００７１】
図４は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。
【００７２】
このリアルタイムＰＣＲ装置２は、反応領域（ウェル）Ａ２ごとに蛍光検出部２５や加熱部２６や備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ２をウェル基板２１の上方から照射して、反応領域Ａ２内を透過した蛍光Ｌ３を検出する点等で相違する。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲ装置２では、光源２２から発せられる励起光Ｌ１が、励起光走査板２３によって反応領域Ａ２に導かれる。励起光走査板２３では、スペーサ２３１を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２３２とフィルター２３３によりウェル基板２１に励起光Ｌ２が導入される。
【００７４】
そして、該励起光Ｌ２は、反応領域Ａ２内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ３を発する。この蛍光Ｌ３は、反応領域Ａ２の下方に設けられた蛍光検出部２５で検出・測定される。
【００７５】
また、温度制御は、反応領域Ａ１下方に設けられた加熱部２６により行われ、ペルチェ素子２８などによって定温制御することができる。また、蛍光検出部２５と加熱部２６は測定基板２７に設けられる。
【００７６】
本発明によれば、個別温度制御と個別蛍光検出を行なうことで、網羅的に遺伝子の発現量を短時間で解析することができる。
【００７７】
一般的なリアルタイムＰＣＲ装置では、「熱変性→アニーリング→伸長反応」からなるサイクルを３０サイクル程度行なうために２５〜３０分の反応時間を要する。その際、約２℃／秒の温度制御を行っている。これに対して、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置では、２０℃以上／秒の温度制御が可能であるため、１サイクルあたり４０秒程度の時間短縮が可能となり、３０サイクル全体ではおよそ２５分以下の反応時間が達成できる。
【００７８】
また、プライマーの設計に応じて、アニーリング時間、伸長反応時間を高精度でコントロールすることができるため、増幅率を一定倍率（例えば２倍等）に揃えることができるため、遺伝子発現量の検出精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。
【図２】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した一例の概念図である。
【図３】同実施形態において温度制御機構の制御媒体と蛍光検出用機構の検出媒体とを同一回路内に形成した回路図の一例である。
【図４】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。
【符号の説明】
【００８０】
１，２  リアルタイムＰＣＲ装置
１１，２１  ウェル基板
１２，２２  光源
１３，２３  励起光走査板
１４，２４  フィルター
１５，２５  蛍光検出部
１６，２６  加熱部
１７，２７  測定基板
１８，２８  ペルチェ素子
【図１】
2008283870.tif 000003
【図２】
2008283870.tif 000004
【図３】
2008283870.tif 000005
【図４】
2008283870.tif 000006