(57)【要約】【課題】がんに対する治療効果を有するピラジン誘導体を提供する。【解決手段】式I【化１】2008179567.tif 000020（式中、nは、0-2の整数を表し、R1は、水素又はC1-C3の直鎖アルキル基を表し、Aは、特定の複素環基を表し、Eは、直接結合又は-NH-を表し、Eが-NH-の場合、Dは、チアゾリル基、又は特定の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、Eが直接結合の場合、Dは、特定の芳香族基である。）で表されるピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I
【化１】
2008179567.tif 000017
[式中、nは、0-2の整数を表し、R1は、水素又はC1-C3の直鎖アルキル基を表し、Aは、インドールジイル基、ピロールジイル基、フランジイル基、チオフェンジイル基、ピラゾールジイル基、イソオキサゾールジイル基、イソチアゾールジイル基、イミダゾールジイル基、オキサゾールジイル基、チアゾールジイル基又はトリアゾールジイル基を表し、Eは、直接結合又は-NH-を表し、Eが-NH-の場合、Dは、チアゾリル基、又はメトキシ基、ハロゲン、シアノ基、アミノ基、水酸基及びトリフルオロメチル基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、Eが直接結合の場合、Dは、フェニル基、2-フェノキシフェニル基、ナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、
式II
【化２】
2008179567.tif 000018
（式中、R2は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3、-SO2R3を表し、R3は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、又はハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基及びC3-C5の分岐アルコキシ基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）
で表される基、又は、式III
【化３】
2008179567.tif 000019
（式中、Xは、N又はCHであり、R4は、水素、メチル基、ハロゲン、水酸基、メトキシ基、トリフルオロメチル基、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe、アミノ基、-C(O)NHMe、シアノ基、-COOR1、-CH2COOR1、-CH2CH2COOR1(但し、R1は、前記定義と同じ)、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7で表され、Yは、直接結合、-O-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-(但し、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基である場合を除く)又は-C(O)-であり、R7は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、フェニル基、ピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基であり、R8は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3(但し、R3は、前記定義と同じ)、-SO2R3(但し、R3は、前記定義と同じ)を表し、m、oはそれぞれ0-3の整数であり（但し、Yが-O-又は-NH-であり、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又はR8で置換されていてもよいピペラジニル基の場合、oは、2又は3）、R5及びR6は、独立して水素、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基、C3-C5の分岐アルコキシ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7（但し、m、o、Y、R7は、前記定義と同じ）で表され、式IIIの4、5、6及び7位のいずれの位置に結合してもよい。）
で表される基である。]
で表されるピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【請求項２】
式I中、nが0又は1である請求項1記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【請求項３】
式I中、Eが直接結合であり、Dがインドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、又は式IIIで表される基である請求項２記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【請求項４】
式I中、Dがインドリル基、インダゾリル基、又は式IIIで表される基である請求項３記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【請求項５】
がんが結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、乳癌又は白血病である請求項1ないし4のいずれか1項に記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する抗がん剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、がんは日本人の死亡原因の第１位を占め、現在では死亡者の約３人に１人の割合ががんで死亡している。
【０００３】
がんには食道がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、歯肉がん、舌がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がん、骨・軟部腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫などがある。
【０００４】
今日のがん治療は、早期のがんについては手術療法、ホルモン療法および放射線療法が有効な治療手段として、転移したがんならびに再発したがんについては化学療法が有効な治療手段として頻用されている。現在がんの化学療法にはアルキル化剤、核酸代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、微小管阻害薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害薬および分子標的治療薬などが使用されているが、これらの抗がん剤ではがんを十分治療することは困難であり、抗がん剤として未だ十分に満足し得るような薬剤がないのが現状である。また、これらの抗がん剤には悪心・嘔吐を伴う消化器症状、骨髄抑制、肝機能障害、腎機能障害、間質性肺炎、心毒性、脱毛などの重篤な副作用が問題とされている。従って、副作用が少なくかつ顕著な抗がん作用を示す抗がん剤の開発が切望されている。
【０００５】
一方、抗がん作用を有するピラジン誘導体としては特許文献１が開示されているが、個体レベルでの腫瘍増殖抑制効果は十分とは言えない。また、特許文献２および特許文献３に開示されているピラジン誘導体はがんへの適応の可能性が述べられているが、特定のリン酸化酵素に対する阻害活性が示されているのみで、がん細胞の増殖抑制作用は全く開示されていない。
【０００６】
また、本発明の抗がん剤の有効成分であるピラジン誘導体は特許文献４に腎疾患治療薬として開示されているが、これまでにがんに対しての有効な効果は報告されていない。
【特許文献１】WO02/24681
【特許文献２】WO03/93297
【特許文献３】WO05/28444
【特許文献４】特開2006-045119
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の抗がん剤ではがんを十分治療することは困難であり、また、重篤な副作用が問題とされている。従って、副作用が少なくかつ顕著な抗がん作用を示す抗がん剤の開発が切望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討した結果、特定のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩が、がんの治療に有効であることを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）式I
【００１０】
【化１】
2008179567.tif 000002
【００１１】
[式中、nは、0-2の整数を表し、R1は、水素又はC1-C3の直鎖アルキル基を表し、Aは、インドールジイル基、ピロールジイル基、フランジイル基、チオフェンジイル基、ピラゾールジイル基、イソオキサゾールジイル基、イソチアゾールジイル基、イミダゾールジイル基、オキサゾールジイル基、チアゾールジイル基又はトリアゾールジイル基を表し、Eは、直接結合又は-NH-を表し、Eが-NH-の場合、Dは、チアゾリル基、又はメトキシ基、ハロゲン、シアノ基、アミノ基、水酸基及びトリフルオロメチル基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、Eが直接結合の場合、Dは、フェニル基、2-フェノキシフェニル基、ナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、
式II
【００１２】
【化２】
2008179567.tif 000003
【００１３】
（式中、R2は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3、-SO2R3を表し、R3は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、又はハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基及びC3-C5の分岐アルコキシ基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表す。）
で表される基、又は、式III
【００１４】
【化３】
2008179567.tif 000004
【００１５】
（式中、Xは、N又はCHであり、R4は、水素、メチル基、ハロゲン、水酸基、メトキシ基、トリフルオロメチル基、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe、アミノ基、-C(O)NHMe、シアノ基、-COOR1、-CH2COOR1、-CH2CH2COOR1(但し、R1は、前記定義と同じ)、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7で表され、Yは、直接結合、-O-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-(但し、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基である場合を除く)又は-C(O)-であり、R7は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、フェニル基、ピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基であり、R8は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3(但し、R3は、前記定義と同じ)、-SO2R3(但し、R3は、前記定義と同じ)を表し、m、oはそれぞれ0-3の整数であり（但し、Yが-O-又は-NH-であり、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又はR8で置換されていてもよいピペラジニル基の場合、oは、2又は3）、R5及びR6は、独立して水素、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基、C3-C5の分岐アルコキシ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7（但し、m、o、Y、R7は、前記定義と同じ）で表され、式IIIの4、5、6及び7位のいずれの位置に結合してもよい。）
で表される基である。]
で表されるピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
（２）式I中、nが0又は1である前記（１）に記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
（３）式I中、Eが直接結合であり、Dがインドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、又は式IIIで表される基である前記（２）に記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
（４）式I中、Dがインドリル基、インダゾリル基、又は式IIIで表される基である前記（３）に記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
（５）がんが結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、乳癌又は白血病である前記（１）ないし（４）のいずれかに記載のピラジン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、がんに対して十分な治療効果を示し、かつ副作用の少ない抗がん剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の抗がん剤の有効成分であるピラジン誘導体は、前記式Iで表される。
【００１８】
前記式Iにおいて、nは、0-2の整数を表す。
【００１９】
R1は、水素又はC1-C3の直鎖アルキル基を表し、好ましくは、水素、メチル基又はエチル基を表し、更に好ましくは、水素又はメチル基を表す。
【００２０】
Aは、インドールジイル基、ピロールジイル基、フランジイル基、チオフェンジイル基、ピラゾールジイル基、イソオキサゾールジイル基、イソチアゾールジイル基、イミダゾールジイル基、オキサゾールジイル基、チアゾールジイル基又はトリアゾールジイル基を表し、好ましくは、インドールジイル基、ピロールジイル基、チオフェンジイル基、ピラゾールジイル基、イソオキサゾールジイル基、イソチアゾールジイル基、イミダゾールジイル基、オキサゾールジイル基、チアゾールジイル基又はトリアゾールジイル基を表し、更に好ましくは、インドールジイル基、ピロールジイル基、ピラゾールジイル基、イソオキサゾールジイル基、イソチアゾールジイル基、イミダゾールジイル基、オキサゾールジイル基、チアゾールジイル基又はトリアゾールジイル基を表す。
【００２１】
Eは、直接結合又は-NH-を表し、Eが-NH-の場合、Dは、チアゾリル基、又はメトキシ基、ハロゲン、シアノ基、アミノ基、水酸基及びトリフルオロメチル基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基であり、好ましくは、チアゾリル基、又はメトキシ基、ハロゲン、シアノ基、アミノ基、水酸基及びトリフルオロメチル基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されたフェニル基を表し、更に好ましくは、チアゾリル基、又は塩素、フッ素、シアノ基、アミノ基及びトリフルオロメチル基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されたフェニル基を表す。
【００２２】
Eが結合の場合、Dは、フェニル基、2-フェノキシフェニル基、ナフチル基、キノリル基、イソキノリル基、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、又は前記式IIもしくは前記式IIIで表される基を表し、好ましくは、インドリル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、ピロリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、又は前記式IIもしくは前記式IIIで表される基を表し、更に好ましくは、インドリル基、インダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、７−アザインドリル基、又は前記式IIもしくは前記式IIIで表される基を表す。
【００２３】
前記式IIにおいて、R2は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3、-SO2R3を表し、好ましくは、水素、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、-C(O)R3、-SO2R3を表し、更に好ましくは、水素、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、-C(O)R3、-SO2R3表す。
【００２４】
R3は、水素、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、又はハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基及びC3-C5の分岐アルコキシ基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されていてもよいフェニル基を表し、好ましくは、水素、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、又はハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基及びイソブチルオキシ基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されたフェニル基を表し、更に好ましくは、水素、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、又は塩素、フッ素、シアノ基、アミノ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、メトキシ基、イソプロピルオキシ基及びイソブチルオキシ基から選ばれる1又は2個の置換基で置換されたフェニル基を表す。
【００２５】
前記式IIIにおいて、Xは、N又はCHを表す。
【００２６】
R4は、水素、メチル基、ハロゲン、水酸基、メトキシ基、トリフルオロメチル基、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe、アミノ基、-C(O)NHMe、シアノ基、-COOR1、-CH2COOR1、-CH2CH2COOR1(但し、R1は、前記定義と同じ)、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7を表し、好ましくは、水素、メチル基、塩素、フッ素、メトキシ基、トリフルオロメチル基、-OCH2CH2OH、-OCH2CH2OMe、アミノ基、-C(O)NHMe、シアノ基、-COOH、-CH2COOH、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7を表し、更に好ましくは、水素、塩素、フッ素、トリフルオロメチル基、アミノ基、-C(O)NHMe、シアノ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7を表す。
【００２７】
Yは、直接結合、-O-、-NH-、-NHC(O)-、-C(O)NH-(但し、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基である場合を除く)又は-C(O)-を表す。
【００２８】
R7は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、フェニル基、ピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基を表し、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、フェニル基、ピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又は、R8で置換されていてもよいピペラジニル基を表し、更に好ましくは、メチル基、イソプロピル基、イソブチル基、ピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又はR8で置換されていてもよいピペラジニル基を表す。
【００２９】
R8は、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、-C(O)R3(但し、R3は、前記定義と同じ)、-SO2R3(但し、R3は、前記定義と同じ)を表し、好ましくは、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、-C(O)R3(但し、R3は、前記定義と同じ)、-SO2R3(但し、R3は、前記定義と同じ)を表し、更に好ましくは、メチル基、エチル基、-C(O)R3(但し、R3は、前記定義と同じ)、-SO2R3(但し、R3は、前記定義と同じ)を表す。
【００３０】
m、oはそれぞれ0-3の整数（但し、Yが-O-、-NH-であり、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又はR8で置換されたピペラジニル基の場合、oは、2,3）を表す。好ましくは、m、oは、それぞれ0-2の整数（但し、Yが-O-又は-NH-であり、R7がピペリジル基、ピロリジニル基、モルホリニル基、又はR8で置換されていてもよいピペラジニル基の場合、oは、2又は3）を表す。
【００３１】
R5及びR6は、独立して水素、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、水酸基、トリフルオロメチル基、C1-C3の直鎖アルキル基、C3-C5の分岐アルキル基、C1-C3の直鎖アルコキシ基、C3-C5の分岐アルコキシ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7（但し、m、o、Y、R7は、前記定義と同じ）を表し、式IIIの4、5、6及び7位のいずれの位置に結合してもよく、好ましくは、独立して水素、塩素、フッ素、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、トリフルオロメチル基、メチル基、エチル基、イソプロピル基、イソブチル基、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、イソブチルオキシ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7（但し、m、o、Y、R7は、前記定義と同じ）を表し、更に好ましくは、独立して水素、塩素、フッ素、ニトロ基、シアノ基、アミノ基、トリフルオロメチル基、メチル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、又は、-(CH2)m-Y-(CH2)o-R7（但し、m、o、Y、R7は、前記定義と同じ）を表す。
【００３２】
前記式Iで表される化合物の好ましい具体例としては、特開2006-045119の表１〜表13および実施例に記載された化合物、それらの薬学的に許容される塩、及び参考例に記載した化合物が挙げられるが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３３】
前記式Iで表される化合物は、特開2006-045119に記載の方法で製造することができるが、それらに限定されるものではない。
【００３４】
前記式Iで表される化合物の薬学的に許容される塩としては、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、及びマグネシウム塩）などの無機塩基塩、又はジシクロヘキシルアミン塩、 N-メチル-D-グルカミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ジイソプロパノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機塩基塩、リジン塩、アルギニン塩などのアミノ酸塩、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルキルスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、乳酸塩、アスコルビン酸塩のような有機酸塩などが挙げられる。
【００３５】
本発明の抗がん剤の有効ながんとしては、食道がん、胃がん、大腸がん、肝臓がん、胆嚢がん、膵臓がん、乳がん、歯肉がん、舌がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がん、骨・軟部腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫などの種々のがんが挙げられ、これらには限定されないが、好ましくは結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝癌、乳癌又は白血病であり、より好ましくは結腸癌である。
【００３６】
本発明の抗がん剤の抗がん作用は、各種の培養されたがん細胞株に対する増殖抑制作用、および各種の坦がん動物における腫瘍増殖抑制作用あるいは生存日数の延長作用により評価することができる。しかし、評価方法はこれらには限定されない。  本発明の抗がん剤の有効成分である式Iで表される化合物及びその薬学的に許容される塩は、そのまま粉末剤として、又は適当な剤形の医薬組成物として哺乳動物（たとえば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル、ウシ、ヒツジ、ヒト等）に対して経口的又は非経口的（例えば経皮投与、静脈投与、直腸内投与、吸入投与、点鼻投与、点眼投与など）に投与することができる。
【００３７】
投与のための剤形としては、具体的には錠剤、散剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、液剤、注射剤、乳剤、懸濁剤、坐剤などが挙げられる。かかる剤形は自体公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる各種担体を含有するものである。例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、無痛化剤などが挙げられる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤などの添加物を用いることもできる。また公知の持続型製剤も含む。
【００３８】
賦形剤としては、例えば乳糖、D-マンニトール、澱粉、ショ糖、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。結合剤としては、例えば結晶セルロース、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、澱粉、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、L-ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。溶剤としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、D-マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えばステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、又はポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。等張化剤としては、例えばブドウ糖、塩化ナトリウム、D-ソルビトール、D-マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤としては、例えばベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤としては、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば亜硫酸塩、アスコルビン酸などが挙げられる。
【００３９】
本発明の抗がん剤は上記成分を０．００１〜９９重量％、より好ましくは０．０１〜９９重量％含有することが望ましい。本発明の抗がん剤の有効成分である式Iで表される化合物又はその薬学的に許容される塩の有効投与量及び投与回数は投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度によっても異なるが、通常成人１日当り1〜1000 mgを、好ましくは1〜300 mgを１回又は数回に分けて投与することができる。
【００４０】
なお、本発明の抗がん剤の治療効果の補完または増強、投与量の低減のために他の薬剤と適量配合もしくは併用して使用することもでき、本発明の抗がん剤は、化学療法剤、免疫療法剤、悪液質改善薬剤などの薬剤（以下、併用薬剤と略記する）と組み合わせて用いることができる。この際、本発明抗がん剤及び併用薬剤の投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。該併用薬剤は、低分子化合物であってもよく、また高分子の蛋白、ポリペプチド、抗体であるか、あるいはワクチン等であってもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。
【００４１】
また、本発明抗がん剤と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば投与対象がヒトである場合、本発明抗がん剤の有効成分1に対し、併用薬剤を0.01ないし100用いればよい。
【００４２】
化学療法剤としては、メルファラン、シクロフォスファミド、イフォスファミド、ブスルファン、ニムスチン、ラニムスチン、テモゾロマイドなどのアルキル化剤、メトトレキサート、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、カペシタビン、シタラビン、アンシタビン、エノシタビン、シタラビンオクホスファート、ゲムシタビン、メルカプトプリン、フルダラビンなどの核酸代謝拮抗薬、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、ペプロマイシンなどの抗腫瘍性抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセルなどの微小管阻害剤、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチンなどの白金製剤、イリノテカン、ノギテカン、エトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害薬、トラスツズマブ、リツキシマブ、イマニチブなどの分子標的治療薬などが挙げられるが、これらには限定されない。
【００４３】
免疫療法剤としては、ムラミルジペプチド誘導体、レンチナン、シゾフィラン、ウベニメクス、ピシバニール、クレスチン、インターフェロン、インターロイキン（IL）、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチンなどが挙げられる。
【００４４】
悪液質改善薬剤としては、インドメタシン、ジクロフェナックなどのシクロオキシゲナーゼ阻害剤、メゲステロールアセテートなどのプロゲステロン誘導体、デキサメサゾンなどの糖質ステロイド、メトクロプラミド系薬剤、テトラヒドロカンナビノール系薬剤、エイコサペンタエン酸などの脂肪代謝改善剤、成長ホルモン、IGF-1、あるいは悪液質を誘導する因子であるTNF−α、LIF、IL-6、オンコスタチンMに対する抗体などが挙げられる。
【実施例】
【００４５】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００４６】
参考例1
エチル1-[6-(6-フルオロ-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボキシレート
【００４７】
【化４】
2008179567.tif 000005
【００４８】
アルゴン雰囲気下、トランス-N, N’-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン10 mg、ヨウ化銅3.3 mg、6-フルオロ-1H-インドール57 mg、リン酸三カリウム・n水和物197 mg、エチル1-(6-ヨードピラジン-2-イル) -1H-ピラゾール-4-カルボキシレート120 mgをトルエン1.5 mLに懸濁させ、110℃で24時間攪拌した。反応混合物をシリカゲル(酢酸エチル)で濾過後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=5/1)で精製し、88 mgの表題化合物を微黄色固体として得た(収率71％)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ9.18 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.83 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.99 (dd, J=8.5, 2.0, 1H), 7.75 (d, J=4.0, 1H), 7.62 (dd, J=8.5, 2.4, 1H), 7.07 (dd, J=8.5, 1.8Hz, 1H), 6.81 (d, J=4.0, 1H), 4.39 (q, J=7.2, 2H), 1.42 (t, J=7.2, 3H).
参考例2
1-[6-(6-フルオロ-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボン酸
【００４９】
【化５】
2008179567.tif 000006
【００５０】
1-[6-(6-フルオロ-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボン酸 エチルエステル88 mgを1,4-ジオキサン5.0 mLに溶解し、1 M水酸化ナトリウム水溶液1.25 mLを加えて、室温で19時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、1 M水酸化ナトリウム水溶液を加えジエチルエーテルで抽出した。水層に1 M塩酸を加えpHが4以下であることを確認後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、41 mgの表題化合物を茶褐色固体として得た(収率50％)。
MS(ESI)：323(M+H)-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ12.85 (br s, 1H), 9.22 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 9.05 (s, 1H), 8.36-8.28 (m, 3H), 7.72 (dd, J=8.8,5.6, 1H), 7.16 (ddd, J=8.8, 8.8, 1.8, 1H), 6.92 (d, J=3.6, 1H).
参考例3
エチル2-(1-{6-[3-アミノ-6-(2-モルフォリノエトキシ)-1H-インダゾール-1-イル]ピラジン-2-イル}-1H-ピロ−ル-3-イル) アセテート
【００５１】
【化６】
2008179567.tif 000007
【００５２】
アルゴン雰囲気下、トランス-N, N’-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン9.5 mg、ヨウ化銅6.5 mg、6-(2-モルフォリノエトキシ)-1H-インダゾール-3-アミン106 mg、リン酸三カリウム・n水和物188 mg、エチル2-[1-(6-ヨードピラジン-2-イル) -1H-ピロ−ル-3-イル]アセテート120 mgをトルエン1.0 mLに懸濁させ、110℃で24時間攪拌した。反応混合物をNHシリカゲル(酢酸エチル)で濾過後、濃縮した。残渣をNHシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=1/1)で精製し、89 mgの表題化合物を微黄色固体として得た(収率54％)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ8.93 (s, 1H), 8.35 (s, 1H), 8.16 (d, J=1.8, 1H), 7.54-7.48 (m, 2H), 7.45 (d, J=8.8, 1H), 6.91 (dd, J=8.8, 2.4, 1H), 6.41-6.37 (m, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.30 (t, J=5.6, 2H), 4.20 (q, J=7.2, 2H), 3.76 (t, J=4.4, 4H), 3.58 (s, 2H), 2.91 (t, J=5.6, 2H), 2.63 (t, J=4.4, 4H), 1.31 (t, J=7.2, 3H).
参考例4
2-(1-{6-[3-アミノ-6-(2-モルフォリノエトキシ)-1H-インダゾ-ル-1-イル]ピラジン-2-イル}-1H-ピロ−ル-3-イル) 酢酸
【００５３】
【化７】
2008179567.tif 000008
【００５４】
2-(1-{6-[3-アミノ-6-(2-モルフォリノエトキシ)-1H-インダゾ-ル-1-イル]ピラジン-2-イル}-1H-ピロ−ル-3-イル) 酢酸 エチルエステル89 mgを1,4-ジオキサン2.7 mLに溶解し、1 M水酸化ナトリウム水溶液0.9 mLを加えて、室温で12時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、1 M水酸化ナトリウム水溶液を加えジエチルエーテルで抽出した。水層に1 M塩酸を加え中和後、析出した黄色固体を桐山濾過した。得られた固体を水で洗浄後、減圧下乾燥し、54 mgの表題化合物を黄色固体として得た(収率64％)。
MS(ESI)：464(M+H)-
1H-NMR(400MHz,CDCl3) :δ8.93 (s,1H), 8.35 (s,1H), 8.16 (d, J=1.8,1H), 7.54-7.48 (m,2H), 7.45 (d, J=8.8,1H), 6.91 (dd, J=8.8,2.4,1H), 6.41-6.37 (m,1H), 4.40 (s,2H), 4.30 (t, J=5.6,2H), 4.20 (q, J=7.2,2H), 3.76 (t, J=4.4,4H), 3.58 (s,2H), 2.91 (t, J=5.6,2H), 2.63 (t, J=4.4,4H), 1.31 (t, J=7.2,3H)
参考例5
エチル 2-{1-[6-(3-アミノ-6-クロロ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテート
【００５５】
【化８】
2008179567.tif 000009
【００５６】
アルゴン雰囲気下、トランス-N,N’-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン12 mg、ヨウ化銅4 mg、3-アミノ-6-クロロインダゾール84 mg、リン酸三カリウム・n水和物235 mg、エチル 2-[1-(6-ヨードピラジン-2-イル)ピロール-3-イル]アセテート150 mgをトルエン1 mLに懸濁させ、110℃で24時間攪拌した。反応混合物をシリカゲル(酢酸エチル)で濾過後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=1/1)で精製し、48 mgのエチル 2-{1-[6-(3-アミノ-6-クロロ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテートを得た(収率29％)。
MS(ESI)：397(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.31(3H,t,J=7.1),3.60(2H,s),4.46(2H,brs),6.44(1H,brs),7.24 (1H,d,J=10.0),7.45-7.52(3H,m),8.38(1H,s),8.61(1H,s),8.91(1H,s)
参考例6
2-{1-[6-(3-アミノ-6-クロロ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}酢酸
【００５７】
【化９】
2008179567.tif 000010
【００５８】
エチル 2-{1-[6-(3-アミノ-6-クロロ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテート48 mgをメタノール2 mL、1,4-ジオキサン2 mLに溶解し、1 M水酸化ナトリウム水溶液0.5 mLを加えて、室温で2時間攪拌した。反応溶液に1 M塩酸を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濃縮し、26 mgの2-{1-[6-(3-アミノ-6-クロロ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}酢酸を得た(収率59％)。
MS(ESI)：369(M+H)+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:3.44(2H,s),6.38(1H,brs),6.56(2H,brs),7.34(1H,d,J=7.3),7.61(1H,brs),7.65(1H,s),7.95(1H,d,J=8.5),8.49(1H,s),8.69(1H,s),8.73(1H,s)
参考例7
エチル 2-{1-[6-(6-シアノ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテート
【００５９】
【化１０】
2008179567.tif 000011
【００６０】
アルゴン雰囲気下、トランス-N,N’-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン14 mg、ヨウ化銅5 mg、6-シアノインダゾール102 mg、リン酸三カリウム・n水和物266 mg、エチル 2-[1-(6-ヨードピラジン-2-イル)ピロール-3-イル]アセテート170 mgをトルエン1 mLに懸濁させ、110℃で24時間攪拌した。反応混合物をシリカゲル(酢酸エチル)で濾過後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=75/25)で精製し、122 mgのエチル 2-{1-[6-(6-シアノ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテートを得た(収率69％)。
MS(ESI)：373(M+H)+
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:1.32(3H,t,J=7.1),3.62(2H,s),4.22(2H,q,J=7.1),6.49(1H,s),7.49-7.60(3H,m),7.94(1H,d,J=8.3),8.37(1H,s),8.61(1H,s),9.05(1H,s),9.19(1H,s)
参考例8
2-{1-[6-(6-シアノ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}酢酸
【００６１】
【化１１】
2008179567.tif 000012
【００６２】
エチル 2-{1-[6-(6-シアノ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}アセテート122 mgをメタノール2 mL、1,4-ジオキサン2 mLに溶解し、1 M水酸化ナトリウム水溶液1.3 mLを加えて、室温で2時間攪拌した。反応溶液に1 M塩酸を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濃縮し、79 mgの2-{1-[6-(6-シアノ-1H-インダゾリル)ピラジン-2-イル]ピロール-3-イル}酢酸を得た(収率70％)。
MS(ESI)：345(M+H)+
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.49(2H,s),6.42(1H,brs),7.71-7.76(3H,m),8.16(1H,d,J=8.3),8.73(1H,s),8.92(1H,s),8.98(1H,s),9.04(1H,s)
参考例9
エチル1-[6-(6-トリフルオロメチル-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボキシレート
【００６３】
【化１２】
2008179567.tif 000013
【００６４】
アルゴン雰囲気下、トランス-N, N’-ジメチル-1,2-シクロヘキサンジアミン12 mg、ヨウ化銅4 mg、6-トリフルオロメチル-1H-インダゾール105 mg、リン酸三カリウム・n水和物244 mg、エチル1-(6-ヨードピラジン-2-イル) -1H-ピラゾール-4-カルボキシレート150 mgをトルエン1.5 mLに懸濁させ、110℃で24時間攪拌した。反応混合物をシリカゲル(酢酸エチル)で濾過後、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン/酢酸エチル=5/1)で精製し、23 mgの表題化合物を微黄色固体として得た(収率13％)。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ9.42 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.98 (s, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.99 (d, J=8.3, 1H), 7.64 (d, J=8.3, 1H), 4.39 (q, J=7.2, 2H), 1.44 (t, J=7.2, 3H).
参考例10
1-[6-(6-トリフルオロメチル-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボン酸
【００６５】
【化１３】
2008179567.tif 000014
【００６６】
1-[6-(6-フルオロ-1H-インドール-1-イル)ピラジン-2-イル]-1H-ピラゾール-4-カルボン酸 エチルエステル23 mgを1,4-ジオキサン5.0 mLに溶解し、1 M水酸化ナトリウム水溶液1.25 mLを加えて、室温で19時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、1 M水酸化ナトリウム水溶液を加えジエチルエーテルで抽出した。水層に1 M塩酸を加えpHが4以下であることを確認後、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去し、7 mgの表題化合物を茶褐色固体として得た(収率34％)。
MS(ESI)：375(M+H)-
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) : δ 9.31 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 9.07 (s, 1H), 8.97 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.31 (s, 1H), 8.23 (d, J=8.3, 1H), 7.74 (d, J=8.3, 1H)
実施例1
ピラジン誘導体の各種がん細胞における増殖抑制作用１
被験物質として特開2006-045119の実施例40（化合物1）、46（化合物2）、62（化合物3）および93（化合物4）と、前記参考例2、6および10、がん細胞株として白血病由来の細胞株（Jurkat、L1210）、前立腺癌由来の細胞株（PC-3）、結腸癌由来の細胞株（HCT116、Colon26）、肝癌由来の細胞株（PLC/PRF/5）を用いることで、ピラジン誘導体の各種がん細胞における増殖抑制作用を検討した。培養液には、Jurkat、L1210、PC-3およびColon26はRPMI1640（invitrogen）、HCT116はMcCoy’s 5A（invitrogen）、およびPLC/PRF/5はDMEM（invitrogen）にpenicillin Gを100 U/mL、streptomycinを0.1 mg/mLおよびウシ胎児血清（FCS、ハイクローン）を10%になるようにそれぞれ添加したものを用いた。まず、各がん細胞株を5×104個/mLの密度でそれぞれの培養液に懸濁させた液を100 μLずつ96ウェル平底プレートに播種し、5%CO2、37℃条件下で24時間培養した。被験物質をジメチルスルフォキシドに溶解し、30 mM、10 mMおよび3 mMの溶液を調製した。これらの溶液を5%FCS添加培地でそれぞれ希釈し、30 μM、10 μMおよび3 μM（ジメチルスルフォキシド最終濃度0.1%）の溶液を調製した。培養液を除去したウェルに化合物溶液を50 μL/ウェルとなるように分注し、5%CO2、37℃条件下で72時間培養した。培養終了後、WST-1溶液（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System、TaKaRa）を10 μL /ウェル添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（BioRad）を用いて、生細胞が産生するホルマザン色素に基づく、450 nmにおける吸光度を測定した。以下の式に基づき生細胞百分率（%）を算出した。
細胞増殖抑制百分率（%）＝（化合物添加・血清添加ウェルの吸光度−血清非添加ウェルの吸光度）/（化合物非添加・血清添加ウェルの吸光度−血清非添加ウェルの吸光度）×100
細胞増殖抑制作用の指標とするIC50値は、細胞増殖抑制百分率を50%減少させる濃度として、被験物質濃度の対数と細胞増殖抑制百分率をプロットしたグラフを作成して求めた。
【００６７】
表１から明らかな通り、各被験物質は、ヒトおよびマウスの各種がん細胞の増殖を明らかに抑制し、抗がん作用を有することが示された。
【００６８】
【表１】
2008179567.tif 000015
【００６９】
実施例2
ピラジン誘導体の各種がん細胞における増殖抑制作用２
被験物質として特開2006-045119の実施例46（化合物2）と、前記参考例4および8、がん細胞株として白血病由来の細胞株（Jurkat、L1210）、前立腺癌由来の細胞株（PC-3）、結腸癌由来の細胞株（Colon26）、肺癌由来の細胞株（PC10、LLC）、乳癌由来の細胞株（SKBR3、Ehrlich）を用いることで、ピラジン誘導体の各種がん細胞における増殖抑制作用を検討した。培養液には、Jurkat、L1210、PC-3、Colon26、PC10、LLCおよびEhrlichはRPMI1640（invitrogen）およびSKBR3はMcCoy’s 5A（invitrogen）にpenicillin Gを100 U/mL、streptomycinを0.1 mg/mLおよびウシ胎児血清（FCS、ハイクローン）を10%になるようにそれぞれ添加したものを用いた。まず、各がん細胞株を96ウェル平底プレートに播種し、無血清培地で24〜48時間培養した。被験物質をジメチルスルフォキシドに溶解し、50 mM、10 mMおよび2 mMの溶液を調製した。これらの溶液を5%FCS添加培地でそれぞれ希釈し、50 μM、10 μMおよび2 μM（ジメチルスルフォキシド最終濃度0.1%）の溶液を調製した。これをプレートに分注し、5%CO2、37℃条件下で24〜48時間培養した。培養終了後、WST-1溶液（Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System、TaKaRa）を添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダー（BioRad）を用いて、生細胞が産生するホルマザン色素に基づく、450 nmにおける吸光度を測定した。以下の式に基づき生細胞百分率（%）を算出した。
細胞増殖抑制百分率（%）＝（化合物添加・血清添加ウェルの吸光度−血清非添加ウェルの吸光度）/（化合物非添加・血清添加ウェルの吸光度−血清非添加ウェルの吸光度）×100
細胞増殖抑制作用の指標とするIC50値は、細胞増殖抑制百分率を50%減少させる濃度として、被験物質濃度の対数と細胞増殖抑制百分率をプロットしたグラフを作成して求めた。
【００７０】
表２から明らかな通り、各被験物質は、ヒトおよびマウスの各種がん細胞の増殖を明らかに抑制し、抗がん作用を有することが示された。
【００７１】
【表２】
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【００７２】
実施例3
ピラジン誘導体として好ましい一例である参考例6の化合物のナトリウム塩を取り上げ、マウス結腸癌モデルを用いて、本発明である抗がん剤の投与による腫瘍増殖抑制効果を検討した。
【００７３】
マウス結腸癌細胞株であるColon26細胞由来の腫瘍をマウス（BALB/c系、雄性、7週齢、日本エスエルシー）の背部皮下に移植した。移植する腫瘍は、坦癌マウスより摘出した壊死してない部分を約2 mm角に切ったものを用いた。坦癌マウスはColon26細胞懸濁液（4×106個/200 μL RPMI 1640）をBALB/cマウスに皮内注射することにより作製した。腫瘍は、BALB/cマウスにおいて累代移植により維持した。移植5日後に体重、腫瘍径を測定し、推定腫瘍体積をもとに対照群（n=10）および参考例6化合物投与群（n=10）に群分けした。推定腫瘍体積は式：1/2×腫瘍長径×腫瘍短径2から算出した。参考例6化合物は生理食塩液（大塚）で溶解し、体重1 kgあたり50 mgの投与量で、群分け日および群分け日から1、2、5、7、9、12、14日目に1日1回ずつ静脈内に投与した。群分け日を投与開始日（0日）とし、投与開始後１日目、2日目、3日目、5日目および７日目に腫瘍径を測定して推定腫瘍体積を算出した。腫瘍増殖率（%）は式；（投与開始後の推定腫瘍体積）÷（投与開始後1日目の推定腫瘍体積）×100から算出した。
【００７４】
投与開始後5日目以降、参考例6化合物投与群の推定腫瘍体積は、対照群に比較して小さくなった（図１）。投与開始後7日目の腫瘍増殖率は、図２に示すように、対照群1068±197%に対し、参考例6化合物投与群では493±81%であり、有意に（P=0.02）抑制された。さらに、投与開始後15日目の腫瘍重量は、対照群では2.11±0.25 g、参考例6化合物投与群では1.57±0.31 gであり、参考例6化合物投与により25%減少した（P=0.20）。なお、試験終了時には参考例6化合物投与群と対照群間に体重の差はなく、また各臓器の障害は何ら認められなかった。以上の結果から、個体レベルにおいても参考例6化合物が副作用を示すことなく、腫瘍の増殖を抑制し抗がん作用を示すことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】マウス結腸癌モデルにおける推定腫瘍体積に対する参考例6化合物の効果を示すグラフである。
【図２】マウス結腸癌モデルにおける腫瘍増殖率に対する参考例6化合物の効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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