(57)【要約】【課題】外因性ホルモンを投与することなく雌ウナギを成熟させることを可能にする、ウナギ雌魚の催熟方法を提供すること。【解決手段】卵巣が産卵可能な状態に成熟していない雌ウナギの卵巣を成熟させるウナギの催熟方法であって：海水養殖池環境中において、該養殖池の養殖環境を構成する要素を所定の時間サイクルに従って周期的に変動させながら前記雌ウナギを飼育することにより、該雌ウナギの卵巣を成熟させる工程を含み、前記周期的に変動される要素には、所定の温度範囲で変化する前記海水の温度が含まれることを特徴とする方法。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
成熟開始の引き金が引かれ且つ卵巣が産卵可能な状態にまで成熟していない雌ウナギの卵巣を成熟させるためのウナギの催熟方法であって：
海水養殖池環境中において、該養殖池の養殖環境を構成する要素を所定の時間サイクルに従って周期的に変動させながら前記雌ウナギを飼育することにより、該雌ウナギの卵巣を成熟させる工程を含み、前記周期的に変動される要素には、所定の温度範囲で変化する前記海水の温度が含まれることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記周期的に変動される要素に明暗条件を含める共に、前記雌ウナギが明状態では低温を経験し暗状態では高温を経験するように、前記明暗条件および前記海水の温度条件の周期的変動を同期させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記海水の温度を５℃〜１５℃の間で変化させることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記海水養殖池環境において、流速１０〜２０ｃｍ／秒の一定の水流を維持することを特徴とする、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウナギの養殖技術に関し、特に、雌ウナギの卵巣を成熟させるための催熟方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニホンウナギ（学名Ａｎｇｕｉｌｌａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）は、水産養殖産業において重要な魚種の１つであり、東アジアで広く養殖されている。しかし、未だ種苗生産技術が確立されていないため、養殖用の種苗は全て天然で捕獲されるシラスウナギでまかなわれている。しかしながら、ここ約３０年の間にシラスウナギの捕獲量は減少し、その価格上昇がウナギの養殖産業に深刻な影響を及ぼしている。そのため、日本では１９６０年代から種苗生産技術の確立を目指し、ウナギを人為的に成熟させる研究が始まった。ウナギは飼育条件下では成熟しないため、外因性ホルモンを多回投与する方法が開発された。その結果、１９７３年に世界で初めて受精卵および仔魚を得ることに成功した。その後、外因性ホルモンの投与方法が改良され、現在ではコンスタントに受精卵および仔魚を得ることが可能になっている。そして、２００３年にはついに、ホルモン投与法によって得られた仔魚をシラスウナギにまで成長させることに成功している。
【０００３】
上記の現在行われているウナギの実用種苗を得る方法を要約すると、天然のシラスウナギを雌化養成して採卵用親魚を得る段階１と、この産卵用親魚をホルモン催熟させて産卵させることにより養殖用ウナギ卵を得る段階２と、このウナギ卵を受精、孵化および飼育して、実用種苗としての養殖用シラスウナギを得る段階３と、この実用種苗を育成して商業的ウナギ成体を得る段階４に分けられる。ウナギは無作為に飼育すると全て雄化するので、段階１では、産卵用の雌魚を得るために、既述のように雌性ホルモン（例えばエストラジオール１７β）を飼料に混入して投与することにより、雌化処理を行なうことが必要とされる。こうして得られた雌魚も、そのまま飼育したのでは産卵可能な状態にまで成熟しない。そこで、次の段階２でも、生殖腺刺激ホルモン（ＧＴＨ）を投与することにより催熟させて、卵巣を産卵可能な状態にまで発達させなければならない。こうして催熟された雌魚から採卵を行い、雄魚から採取した精液と混合して受精させ、得られた受精卵を孵化および成長させることにより、商業的養殖用のシラスウナギ（実用種苗）が得られる。
【０００４】
しかし、受精率および孵化率が安定しない問題、および仔魚の生残率が低い等の問題は解決されておらず、未だシラスウナギの量産化が難しい状況にある。これらの問題は、催熟のために投与された外因性ホルモンが、卵の質に悪影響を及ぼした結果であることが懸念されている。その一つの根拠として、外因性ホルモンを投与している間、成熟に関与するステロイドホルモンの血中プロファイルが、成熟過程にある他魚種のもとはかなり異なっているとの調査結果が報告されていることが挙げられる。さらに、ホルモン投与に対する消費者のイメージを考慮すると、現在のホルモン催熟技術で生産したシラスウナギの商品価値についても懸念される。以上のことから、外因性ホルモンを使用することなしにウナギの成熟を促進する技術を開発することが強く求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、外因性ホルモンを投与することなく雌ウナギを成熟させることにより、ウナギの養殖に不可欠な良質の受精卵および仔魚を得ることを可能にする、ウナギ雌魚の催熟方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を達成するために、本発明によるウナギの催熟方法は、成熟開始の引き金が引かれ且つ卵巣が産卵可能な状態にまで成熟していない雌ウナギを、海水養殖池環境中において、該養殖池の養殖環境を構成する要素を所定の時間サイクルに従って周期的に変動させながら前記雌ウナギを飼育することにより、該雌ウナギの卵巣を成熟させる工程を含み、前記周期的に変動される要素には、所定の温度範囲で変化する前記海水の温度が含まれることを特徴とするものである。
【０００７】
好ましくは、上記一定の条件には、前記海水の温度に加えて前記海水養殖池環境の光条件が含まれ、該光条件は、所定の時間サイクルに従って、遮光し且つ光照射を用いない状態（暗状態）と所定の光照射状態（明状態）との間で変化させることが含まれる。
【０００８】
更に好ましくは、前記海水養殖池の中の水流を制御して、下りウナギの回遊環境をシミュレートすることが含まれる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来のように外因性ホルモンを投与することなく雌ウナギを成熟させることができるので、健康な卵、健康な仔魚、および健康なシラスウナギを得ることが可能となり、従って商業的ウナギ養殖の生産効率向上に寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
ニホンウナギの産卵場はマリアナ諸島西方海域（北緯１５度，東経１４０度あたり）であることが明らかとなっている。そして、ここで生まれた仔魚（レプトケファルス）は、北赤道海流に乗って西へ運ばれた後、黒潮に乗り換えて東アジアまでやってくる過程でシラスウナギへと変態し、黒潮を離脱して接岸すると考えられている。その後、河川や池沼などで５〜１５年かけて成長したウナギは、秋から初冬に産卵のため降海し、回遊をはじめる。この時期に捕獲されるウナギは下りウナギ（または銀ウナギ）と呼ばれ、すでに成熟開始の引き金が引かれており、そのほとんどの個体において卵母細胞の発達段階は第一次卵黄球期に達している。現在のところ、下りウナギの産卵回遊ルートおよび遊泳水深は解明されておらず、沿岸域で捕獲される以上に成熟の進んだウナギも見つかっていないため、産卵回遊中どのような環境条件を経験することにより成熟が進展しているのかは全く不明である。このことは、雌ウナギの人工的催熟の研究を困難にしている一つの原因でもある。
【００１１】
発明者等は、雌ウナギを海水養殖池環境で飼育する際の水温および／または光の影響を研究する過程において、これらの環境因子の周期的変動が、雌ウナギの卵巣発達に影響することを突き止め、その知見に基づいて本発明に至ったものである。
【００１２】
本発明による催熟方法の適用対象、即ち、成熟開始の引き金が引かれ且つ卵巣が産卵可能な状態にまで成熟していない雌ウナギとは、その卵母細胞が油球期から第一次卵黄球期の段階にある雌ウナギである。なお、ウナギの卵形成ステージ（成熟段階）は、卵巣の組織標本観察により、以下の８段階（Ａ〜Ｈ）に区分されている。下りウナギの場合、卵形成ステージは油球期〜第一次卵黄球期である（大部分が第一次卵黄球期）。
【００１３】
１）第一次成長期
Ａ．染色仁期
Ｂ．周辺仁期
２）第二次成長期
Ｃ．油球期：直径約７０〜２００μｍ
Ｄ．第一次卵黄球期：直径約２００〜４００μｍ
Ｅ．第二次卵黄球期：直径約４００〜６００μｍ
Ｆ．第三次卵黄球期：直径約６００〜８００μｍ
３）成熟期
Ｇ．核移動期
Ｈ．成熟期
本発明において、海水養殖池環境とは、通常の組成を有する海水を満たした養殖環境を意味し、池、生簀、タンク、桶など、その種類および大きさを問わない。しかし、以下で詳述するように、環境条件を周期的に変化させるための手段を設ける必要がある。また、養殖池は、その中でウナギが円滑に回遊できるような形状が好ましく、特に円筒形が好ましい。特に好ましい培養池は、深さ２．４ｍ、直径３．０ｍの円筒形のタンクである。
【００１４】
本発明において、一定の周期的変動条件に含まれる要素には、温度、光等が含まれる。その中で決定的に重要な環境条件は温度である。即ち、本発明において最も重要な要件は、養殖池環境の水温を周期的に変動させることである。水温の変動範囲は、好ましくは高温と低温との差が約８℃〜約１２℃の範囲であり、好ましくは温度差が約１０℃になるようにする。また、変動周期は、通常は２４時間を１周期とするが、これに限定されない。コスト的な観点からは、催熟が達成される範囲内においてできるだけ長い周期が好ましい。このような水温制御は、例えば当業者に周知の温度制御機能を備えた加熱装置、および冷水添加による温度制御方法等を組合せて行えばよい。
【００１５】
上記のような周期的な温度変化の中で飼育された雌ウナギは、成熟を促され、卵巣が成熟することが確認された。しかし、１５℃を越える温度での飼育では、成熟は促進されずに卵母細胞は退行してしまうことが分かった。一方、５℃以下の低水温で飼育すると、退行卵の出現は抑制されるが、成熟は進展しなかいことが分かった。従って、周期的に変動させる温度範囲は、５℃〜１５℃が最適と考えられる。なお、退行卵とは、卵黄を蓄積した卵母細胞が退行、崩壊し、周辺の体細胞に吸収される過程の卵をいう。
【００１６】
本発明においては、上記のように飼育温度を周期的に変動させることに加えて、光による照明条件も周期的に変化させるのが好ましい。このような光条件の変化は、前記海水養殖池環境を遮光すると共に、遮光領域内に設けた適切な光源を周期的に点灯することにより、点灯状態（明状態）と消灯状態（暗状態）の間での切替えを行うことにより達成することができる。なお、ここでの明状態および暗状態は、必ずしも太陽周期による昼間および夜間と同期させる必要はない。更に好ましくは、明状態では低温を経験させ、暗状態では高温を経験させるように、温度および光条件の周期的変動を同期させるのがよい。例えば、昼間は照明を点灯して明状態とし、夜間は消灯して暗状態とする。この場合の照明は、好ましくは青色光源（波長４００〜５００ｎｍ）を用いて行い、調光器で明るさを制御する。明るさは、水槽内の最も明るい所（光源の直下）で２００ルクス以下が好ましい。このような照明装置は当業者に周知である。ここでの明度は、市販の照度計（株式会社トプコン、型式IM-5）を用いて測定した値である。
【００１７】
更に、本発明においては、前記海水養殖池の中の水流を制御して、下りウナギの回遊環境をシミュレートすることが好ましい。この場合の水流は、特に周期的に変動させることなく、流速１０〜２０ｃｍ／秒の一定の水流を維持するのがよい。
【００１８】
以下の実施例で説明するように、本発明の方法によれば、生殖腺指数（ＧＳＩ）および卵形成ステージ（成熟段階）で見た場合の雌ウナギの成熟を促進することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、実施例に従って本発明を更に詳細に説明する。
【００２０】
＜材料および方法＞
供試魚として、２００５年１１〜１２月に愛知県三河湾の定置網で捕獲された雌の下りウナギ（銀ウナギ）１０８尾を用いた。この１０８尾のウナギのうち１５尾は、捕獲時の成熟状態を把握するために、捕獲当日に解剖を行った（無処理区）。これらの個体は、２−フェノキシエタノールで麻酔後、体重を計測した。次いで卵巣を摘出して重量を測定し、生殖腺指数（ＧＳＩ：生殖腺重量／魚体重×１００）を算出した。また卵巣の一部は、卵母細胞直径（以下卵径）の測定、および卵母細胞の成熟段階を判定するための組織標本作成に用いた。
【００２１】
残り９３尾のウナギは１６〜２０尾ずつを、図１に示すように５つの実験区に分け、実験開始までは三河湾の水温および日長条件下で飼育した。飼育には屋内の円形水槽（直径３ｍ；深さ２．４ｍ）を使用し、水槽内に意図的に強制水流は形成しなかった。但し、ヒートポンプで温調するというシステム上の不可避的水流は排除しなかった。また、実験前および実験期間中ともに無給餌とした。実験は、２００６年１月２０日に開始した。各実験区における、実験期間中の海水（塩分濃度：３０〜３１‰）の温度および光周期（照明条件）は、図２および３に示した通りである。図中の曲線に付した番号は対応する実験区の番号を示しており、そのうち、３〜５（ａ）は２００６年１月２０日〜２００６年２月１６日までの実験区３〜５を示し、３〜５（ｂ）は２００６年２月１７日〜２００６年６月２０日までの実験区３〜５を示している。
【００２２】
なお、温度管理は三菱重工（株）社製のヒートポンプ（型式FDCSP140HD3）を使用して行った。また、照明には住友スリーエム（株）社製のLBH150SB（100V、1.6A）を用いた。図３における縦軸は、この使用した光源の最大能力での照射を１００％とした、相対的な数値で表した照明強度を示している。
【００２３】
図２に示すように、実験区１（曲線１）および実験区２（曲線２）では、それぞれ５〜１５℃および１０〜２０℃の水温変動を、２４時間周期で与えて飼育した。実験区３〜５（曲線３〜５）では、それぞれ５、１５および２０℃の一定水温条件下で飼育した。また、図３に示すように、昼間は照明を点灯し、夜間は暗黒とした。また、実験区３〜５では、照明の点灯および消灯時間を２月１７日に変更した（図３の３〜５（ａ）、３〜５（ｂ））。照明は全区とも青色光源（波長４００〜５００ｎｍ）を用い、調光器で明るさを制御した。実験開始後３ヵ月目（４月２０日）、４ヵ月目（５月１８日）、および５ヵ月目（６月２０日）に、それぞれの実験区からランダムに４〜１０尾を取り上げて解剖し、ＧＳＩ（生殖腺指数）および卵径の測定値に基づいて成熟進展の有無を調べた。
【００２４】
ＧＳＩおよび卵径のデータは、平均値±標準偏差で示した。比較する実験区のデータすべてに正規性かつ等分散性が認められなかったため、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて平均値の差を検定した。平均値に有意差が認められた場合は、多重比較法（Ｓｔｅｅｌ検定）により、無処理区と各実験区間との比較を行った。すべての統計解析において、有意水準は５％とした。
【００２５】
＜結果＞
実験開始から３ヵ月目（４月）、４ヵ月目（５月）、および５ヵ月目（６月）に解剖を行い、各実験区のウナギの成熟度を調べたが、図４〜図７および下記の表１に示すように、捕獲時（無処理区）に比べ有意に成熟が進んでいた（即ち、ＧＳＩおよび卵径の値が大きくなった）実験区はなかった。
【表１】
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【００２６】
しかしながら、図４および図６に示したように、実験区１（５〜１５℃変動）においては、ＧＳＩが８．４９で卵径が４１２μｍに達していた個体が、１尾ではあったが３ヵ月目の解剖時に確認できた。また、卵巣の組織学的観察によりこの個体の卵母細胞の発達段階を調べたところ、第二次卵黄球期に達していた。出願人の研究所では、１９９７年１０月から２００６年１月にかけて三河湾で捕獲された雌の下りウナギを約７００尾解剖しているが、それらのＧＳＩおよび卵径の平均値は、それぞれ約２．５（１．０〜５．２）および２３０μｍ（１５０〜３４０μｍ）であり、卵母細胞の発達段階は、油球期から第一次卵黄球期（大部分は第一次卵黄球期）であった。これらのことから、実験区１の飼育条件が成熟促進効果をもたらし、上述のような個体が出現したと考えられる。
【００２７】
さらに、解剖した全個体の卵巣の組織標本を観察したところ、下記の表２に示すように、実験区１では、３ヵ月目および４ヵ月目の解剖時においては、退行卵（水温、光周期、溶存酸素量などの環境条件の変動により引き起こされることが知られている）が観察された個体は２０％と低かったが、５ヵ月目になると８０％に増加していた（表２）。
【表２】
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【００２８】
実験区２（１０〜２０℃変動）は、実験区１と同様に１０℃の幅で水温を変動させ飼育を行ったが、水温帯を５℃高く設定したことが影響したためか、３ヵ月目の時点で既に８０％の個体の卵巣に退行卵が観察された。
【００２９】
また、高水温で飼育した実験区４（１５℃一定）、および実験区５（２０℃一定）では、３ヵ月目の解剖時にすべての個体の卵巣において退行卵が観察され、４ヵ月目および５ヵ月目も同様であった。一方、実験区３（５℃一定）で退行卵が観察されたのは、４ヵ月目および５ヵ月目に１尾ずつだけであった。このことから、１５℃以上の一定水温飼育では成熟は促進されずに卵母細胞は退行してしまうが、実験区３のように低水温で飼育することにより、退行卵の出現が抑制および遅延されることがわかった。しかしながら、低水温一定条件下では成熟は進展しなかった。
【００３０】
以上の結果から、周期的な水温変化がウナギの成熟促進に必要な条件であり、卵母細胞の退行を抑制するためには水温帯も重要であるとの結論が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、実施例で説明したウナギの催熟実験における各実験区の分類を示す図である。
【図２】図２は、各実験区における海水温の周期的変動を示す図である。
【図３】図３は、各実験区における照明制御を示す図である。
【図４】図４は、各実験区の各ウナギ個体における生殖腺指数（ＧＳＩ）の測定結果を示す図である。
【図５】図５は、各実験区におけるウナギ個体のＧＳＩ（平均値±標準偏差）を示す図である。
【図６】図６は、各実験区における各ウナギ個体の卵径の測定結果を示す図である。
【図７】図７は、各実験区の各ウナギ個体における卵径（平均値±標準偏差）を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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