(57)【要約】【課題】抗アレルギー活性を有する乳酸菌の利用に際して、種々の製品形態で及び種々の利用対象において有効に用いることができる、高い抗アレルギー活性と、安定した抗アレルギー活性を有する乳酸菌を提供すること。【解決手段】Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を、６０℃以上１００℃未満の温度で、１０分以上６０分未満の時間、加熱処理を行うことにより、該乳酸菌の抗アレルギー活性を飛躍的に高めるとともに、安定した抗アレルギー活性を持つ高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を製造する。本発明の加熱処理により、乳酸菌の抗アレルギー活性を飛躍的に高めた、また、安定した高抗アレルギー活性を持つ乳酸菌菌体を有効成分とする抗アレルギー用組成物を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を６０℃以上１００℃未満の温度で、１０分以上６０分未満の時間、加熱処理を行うことを特徴とする、高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体の製造方法。
【請求項２】
Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理が、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を培養した後、培養菌体を洗浄処理によって培地成分を除去した後、加熱処理を行うものであることを特徴とする請求項１記載の、高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体の製造方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の製造方法によって製造されたLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体。
【請求項４】
請求項１又は２記載の製造方法によって製造されたLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体を有効成分とする抗アレルギー用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌組成物及び該乳酸菌の製造方法、特に、優れた抗アレルギー活性を有する乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を加熱処理することにより、高い抗アレルギー活性を付与するとともに、安定した抗アレルギー活性を付与し、高抗アレルギー活性を有する乳酸菌菌体を製造する方法、及び、該高抗アレルギー活性を有する乳酸菌菌体を有効成分とする抗アレルギー用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。アレルギーの発症機構は通常Ｉ型からIV型の4つに分類される。Ｉ型アレルギーは、ＩｇＥ抗体が関与し、花粉症、喘息、じん麻疹、アナフィラキシーショックなどに代表される。II型アレルギーはＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体が関与し、補体系を活性化する細胞傷害性反応であり、胎児赤芽球症や自己免疫性溶血性貧血がこれにあたる。III型アレルギーは、抗原抗体複合体によって起こる組織傷害であり、アルックス反応や血清病、糸球体腎炎に代表される反応である。IV型アレルギーは、Ｔ細胞が関与する遅延型アレルギー（遅延型過敏症）であり、ツベルクリン反応や接触性皮膚炎に代表される反応である。アレルギーのうち、食物アレルギーの発症には、Ｉ型、II型及びIV型が関与するとされている。一方、環境アレルギー、すなわち花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などのアレルギーは、主としてＩ型の発症機構を持つことが知られている。
【０００３】
前記のＩ型アレルギーはアレルゲン特異的ＩｇＥの誘導とヒスタミンやロイコトリエン等のケミカルメディエーターの放出をその特徴とする。免疫応答は、種々の細胞による相互作用により生ずるが、これに関わる細胞の一種としてヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）がある。ヘルパーＴ細胞は、Ｔ細胞亜群に分類され、抗原を認識して各種サイトカイン（ヘルパー因子）を産生し、免疫応答誘導を調節する働きを持つ。ヘルパーＴ細胞は、そのサイトカイン産生能からＴｈ１細胞とＴｈ２細胞に分類される。Ｂ細胞において抗体のクラススイッチが起こり、ＩｇＥ抗体が産生されるようになるには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球にはＴｈ２細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞・マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部をＭＨＣ class II分子に結合した状態でＴ細胞に対して提示され、Ｔｈ２細胞が活性化・分化する。Ｔｈ２細胞が放出したＴｈ２サイトカインはＢ細胞のクラススイッチを誘導し、ＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃ・Ｒに結合する。アレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がのケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって、アレルギーの諸症状が現れる。
【０００４】
ＩｇＥやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防・治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーターの産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗アレルギー剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがある。しかし、そのいずれもが副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがない。
【０００５】
近年ＩｇＥを抑制するために、Ｔｈ２サイトカインの産生を調節する方法に注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌はＴｈ１免疫を増強することにより、Ｔｈ２免疫を抑制し、その結果ＩｇＥを低下させることが報告されている（臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁；特開平９−２９５９号公報）。
【０００６】
中でも乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌にＴｈ１免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗アレルギー乳酸菌としては、L. rhamnosus ＬＧＧ株が公知であり妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特開平９−２９５９号公報には、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、及びＬ．カゼイ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際のＩｇＥ産生量が３０ｎｇ／ｍｌ以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特開平１０−３０９１７８号公報には、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム及びビフィドバクテリウム・ビフィダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗アレルギー剤として用いることについて、及び、特開２０００−９５６９７号公報には、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトバシルス・ロイテリーなどの乳酸菌をアレルギ性気管支喘息、アレルギ性鼻炎及びアトピ−性皮膚炎等のＩ型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。
【０００７】
一方で、乳酸菌等が、Ｔｈ１免疫を増強することはＩＬ１２やＩＦＮ・ガンマーなどの産生を介してマクロファージやキラーＴ細胞、ＮＫ細胞の細胞性免疫の活性化を意味し、ウイルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的にはマクロファージが産生するＩＬ−１２は未分化のヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、単球・マクロファージ・ＮＫ細胞の活性化を通して、外敵・ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株は免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁；特開平７−２２８５３６号公報；特開２００２−８０３６４号公報）。
【０００８】
近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情である。
【０００９】
そのような状況に鑑みて、最近になって食餌によってアレルギーを抑えようとする研究が活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフェノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見い出して、それらを用いた対処が行われている。
【００１０】
抗アレルギー効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたヨーグルトや乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。この種の抗アレルギー用飲食品による予防或いは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。しかしながら、従来のものでは、その高抗アレルギー活性の菌株を選択取得する方法が明確にされていなかったため、有力な菌株が取得されておらず、実用上満足できるものではなかった。
【００１１】
そこで、先般、特定の数値以上のインターロイキン１２と、特定の数値未満のインターロイキン４の産生量を示す乳酸菌を見い出し、該乳酸菌からなる優れた抗アレルギー活性の抗アレルギー用組成物について開発し、開示した（特開２００５−１３９１６０号公報）。該乳酸菌としては、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株、Lactobacillus plantarum ＫＷ４１１０株、Lactobacillus paracasei ＫＷ３９２５株、Lactobacillus paracasei ＫＷ３９２６株、又はStreptococcus salivarius ＫＷ３２１０を挙げることができる。
また、同時に、該乳酸菌の中で、特に優れた抗アレルギー活性を有する乳酸菌として、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株及びその変異株を有効成分とする優れた抗アレルギー機能を有する飲食品について開発し、開示した（特開２００５−１３７３５７号公報；特許３５８５４８７号公報）。
【００１２】
その後、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株の抗アレルギー作用に関しては、次のような報告がなされている。例えば、in vitro系試験において約１００株の乳酸菌から最も強いＩＬ−１２産生誘導能とＩＬ−４抑制能を有したLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株を選抜した。選抜したＫＷ３１１０株を用いて、ＯＶＡによってアレルギー感作したマウスによるin vivo試験を行ったところ、血中ＩｇＥ抑制やＩＬ−１２産生、ＩＬ−４抑制傾向などの抗アレルギー効果がみられたことが報告されている（Int. Arch. Allergy Immunol. ,135, 205, 2004）。また、抗アレルギー効果を有するＫＷ３１１０株或いはそれほど高い効果を持たないLactobacillus delbrueckii Ｂ株でヨーグルトを作製し、これらを用いて、ヒトについて試験を実施したところ、ＫＷ３１１０株で作製したヨーグルトは、Ｔｈ２細胞増殖及び好酸球の活性化抑制に関与することが確認されたことが報告されている（Allergology Int. 54, 143, 2005）。
【００１３】
上記のように、抗アレルギー活性を有する乳酸菌が各種知られる中で、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株は、特に優れた抗アレルギー作用を有するものであるが、しかしながら、該乳酸菌を有効成分として、種々の製品形態で、及び種々の利用対象に用いるに際して、その有効性を更に増大するために、該有効成分の更なる抗アレルギー活性の増大と、より安定した抗アレルギー活性成分としての開発が望まれるところである。
【００１４】
【特許文献１】特開平７−２２８５３６号公報。
【特許文献２】特開平９−２９５９号公報。
【特許文献３】特開平１０−３０９１７８号公報。
【特許文献４】特開２０００−９５６９７号公報。
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報。
【特許文献６】特開２００５−１３７３５７号公報。
【特許文献７】特開２００５−１３９１６０号公報。
【特許文献８】特許３５８５４８７号公報。
【非特許文献１】臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁。
【非特許文献２】インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁。
【非特許文献３】ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁。
【非特許文献４】キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁。
【非特許文献５】Int. Arch. Allergy Immunol. ,135, 205, 2004。
【非特許文献６】Allergology Int. 54, 143, 2005。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の課題は、抗アレルギー活性を有する乳酸菌の利用に際して、種々の製品形態で及び種々の利用対象において、その有効性を更に増大するために、該有効成分の抗アレルギー活性の増大と、より安定した抗アレルギー活性を有する乳酸菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、上記課題を解決すべく、乳酸菌からなる高抗アレルギー活性を有する有効成分について鋭意検討する中で、優れた抗アレルギー活性を有する乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株について、特定の温度範囲で、特定時間加熱処理を施すことによって、飛躍的にその抗アレルギー活性を高めることができ、また、乳酸菌自体の活動を停止し、しかも加熱処理による菌体自体の変性を極力防止して、安定した高抗アレルギー活性を持つ有効成分を得ることができることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を、６０℃以上１００℃未満の温度で、１０分以上６０分未満の時間、加熱処理を行うことにより、該乳酸菌の抗アレルギー活性を飛躍的に高めるとともに、安定した抗アレルギー活性を持つ高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を製造する方法からなる。また、本発明は、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理を、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を培養した後、培養菌体を洗浄処理によって培地成分を除去した後、加熱処理を行い、特に効果的な加熱処理により、安定した高抗アレルギー活性の乳酸菌菌体を取得する方法を包含する。
【００１８】
更に、本発明は、本発明の製造方法によって製造されたLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株からなる、安定した高抗アレルギー活性の乳酸菌菌体を有効成分とし、種々の製品形態で及び種々の利用対象において利用する場合に、その有効性を更に増大した抗アレルギー用組成物を提供する。
【００１９】
すなわち具体的には本発明は、（１）Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を６０℃以上１００℃未満の温度で、１０分以上６０分未満の時間、加熱処理を行うことを特徴とする、高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体の製造方法や、（２）Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理が、Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を培養した後、培養菌体を洗浄処理によって培地成分を除去した後、加熱処理を行うものであることを特徴とする上記（１）記載の、高抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体の製造方法や、（３）上記（１）又は（２）記載の製造方法によって製造されたLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体や、（４）上記（１）又は（２）記載の製造方法によって製造されたLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株の加熱処理菌体を有効成分とする抗アレルギー用組成物からなる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、優れた抗アレルギー活性を有する乳酸菌について、飛躍的にその抗アレルギー活性を高めた乳酸菌を提供することができ、更に、本願発明の特定の加熱処理により、乳酸菌自体の活動を停止し、しかも加熱処理による菌体自体の変性を極力防止して、安定した高抗アレルギー活性を持つ乳酸菌菌体を提供することができる。したがって、本発明により、安定した高い活性を持つ抗アレルギー用組成物の有効成分として、種々の製品形態で及び種々の利用対象において適合し、有効に利用することができる抗アレルギー用組成物を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、優れた抗アレルギー活性を有するLactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を、６０℃以上１００℃未満の温度で、１０分以上６０分未満の時間、加熱処理を行うことにより、該乳酸菌の抗アレルギー活性を飛躍的に高め、かつ、安定した高抗アレルギー活性を持つ乳酸菌を製造することからなる。
【００２２】
（本発明で用いる乳酸菌）
本発明において用いられる優れた抗アレルギー活性を有する乳酸菌であるLactobacillus paracasei (L. Paracasei) ＫＷ３１１０株は、L. casei Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、Ｌ１４株はL. caseiとの記載があるが、QUALICON社製リボプリンターを用いたＲＦＬＰ（Restriction Flagment Length Polymorphism）及びＡＦＬＰ（Amplified Flagment Length Polymorphism）を用いて解析したところ、当該株はL. Paracaseiと判断されたため、本発明においてはL. ｐaracaseiと記載した。本発明で抗アレルギー用組成物の有効成分として使用されるL. paracasei ＫＷ３１１０は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、更に、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３４として寄託されている。
【００２３】
本発明による有効成分たる乳酸菌は、Ｍ．Ｒ．Ｓ．（de Man, Rogosa, Sharpe）培地等の当業者に知られた乳酸菌培養用培地にて適宜培養増殖させた後、本発明の方法に従って、加熱処理を施し、必要によっては凍結乾燥或いはスプレードライして粉末化し、使用することができる。また、工程管理或いは製造した乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を測定するには、アレルゲンで感作させた動物脾臓由来リンパ球を当該アレルゲン含有培地に懸濁し、被検乳酸菌を添加して培養することにより産生されるＴｈ１誘導サイトカイン及び／又はＴｈ２誘導サイトカインの量を測定する乳酸菌の抗アレルギー活性の測定方法を用いることにより測定することができる。
【００２４】
本発明において用いる、L. paracasei ＫＷ３１１０の変異株は、該乳酸菌を変異させて、抗アレルギー活性等の高い変異株を作製し、用いることができる。菌株の変異手段としては、ＵＶ等の公知の変異手段を用いて行うことができる、例えば、L. paracasei ＫＷ３１１０を変異させて、本明細書に記載された乳酸菌の抗アレルギー活性の評価方法を用い、抗アレルギー活性の増加した変異株を取得して、用いることができる。
【００２５】
（派生株の選抜）
また、本発明では、本発明で取得した乳酸菌株から変異した形質の異なる菌株を派生株として選抜し、用いることができる。例えば、L. paracasei ＫＷ３１１０株をＭＲＳ培地のような培地を用いて、所定温度で、所定菌数に達するまで静置培養し、培養液を新鮮なＭＲＳ培地で、希釈した後、本菌体懸濁液を塩酸でｐＨを３．０にしたＰＢＳ（大日本製薬社タブレットを指定の濃度で溶解）に１０％分懸濁し、３７℃３時間インキュベートする。酸処理した菌体懸濁液をＰＢＳで希釈し、ＭＲＳプレート培地にまき、コロニーを形成させた。形成させたコロニーを色調等を指標に選抜し、この色調に基いて選抜したコロニーから更に１株を選抜し、ＭＲＳ培地で４８時間培養する。該培養物の抗アレルギー活性を実施例１に記載されている抗アレルギー活性の測定法で測定し、各コロニーの抗アレルギー活性を判定する。該方法により、試験菌株の中から高抗アレルギー活性の菌株を選抜取得する。本発明の実施例で、L.paracasei ＫＷ３１１０株の派生株として分離された株はＮｏ．９０株と命名され、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３５として寄託されている。
【００２６】
（本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー作用）
アレルギーは、抗原刺激によりＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体の組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃレセプターに結合し、次の抗原刺激（アレルゲンの再侵入）でマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成され、この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって諸症状が現れる。従って、アレルギーの治療・予防の為にＩｇＥを抑制すること、そしてその為にはＴｈ１免疫を増強しＴｈ２免疫を抑制することが必要となる。本発明による乳酸菌は、マウスリンパ球を用いたin vitroの系において、Ｔｈ１免疫の指標であるインターロイキン１２（ＩＬ−１２）産生を強く誘導するとともに、Ｔｈ２免疫の指標であるインターロイキン４（ＩＬ−４）産生を強く抑制する。従って、本発明による乳酸菌は、Ｔｈ１免疫を増強しＴｈ２免疫を抑制することにより、ＩｇＥ抗体産生を抑制するという作用機序に基づくアレルギーの治療・予防効果がある。
【００２７】
（本発明における加熱処理）
本発明においては、L. paracasei ＫＷ３１１０株若しくはその変異株を、所定温度で、所定時間加熱処理して、その抗アレルギー活性の増大を図る。加熱温度としては、６０℃以上１００℃未満の温度が用いられ、加熱時間としては、１０分以上６０分未満の時間が採用される。特に、好ましくは、６０〜８５℃、更に好ましくは、８５℃前後の温度で、１０分以上６０分未満の加熱処理時間が好ましい。本発明における加熱処理は、培養した乳酸菌菌体を、懸濁状態で、所定温度で所定時間、加熱処理を施すが、かかる場合の加熱手段としては、一般に用いられる手段を用いることができ、特に限定されない。例えば、タンク内に懸濁した菌体を熱交換器によって加熱することができる。本発明において、乳酸菌菌体の加熱処理に際しては、培養した菌体を、例えば、遠心分離機或いはセラミック製膜等を用いて、洗浄処理し、培地成分を除去し、濃縮した菌体を懸濁液の状態として、加熱処理を行なうのが、その有効な加熱処理効果を得るために特に好ましい。遠心或いはセラミック製膜による洗浄処理には、かかる目的のために、通常用いられている遠心分離機やフィルターろ過機を用いることができる。
【００２８】
（本発明の抗アレルギー用組成物）
本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物は、飛躍的に高められた高い抗アレルギー活性と、安定した高抗アレルギー活性を持ち、種々の製品形態で及び種々の利用対象において適合し、有効に利用することができる。例えば、本発明の加熱処理を施された乳酸菌は、本願発明の特定の加熱処理により、乳酸菌自体の活動を停止しているので、これを、抗アレルギー用組成物として、種々の飲食品等に添加した場合に、乳酸菌自体の生物活性による飲食品の本来の香味に対する影響を極力減少することができ、また、該抗アレルギー用組成物を種々の製剤形態に製剤化した場合にも、有効成分として安定した活性を維持することができる。
【００２９】
（本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物の適用）
本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物は、花粉症・アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎・気管支喘息などの環境アレルギーに対して特に効力を発揮する。本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物は、本発明による有効成分を生理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製剤化して、抗アレルギー剤として用いることができる。本発明の抗アレルギー剤は、経口的或いは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、丸剤、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される賦形剤、添加剤とともに製剤化することができる。なお、製剤化にあたっては、本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー組成物がその機能を生体内において適時的且つ効果的に発揮できるよう、即ち溶出開始時間を制御したり、苦味マスキング剤としての機能を付加したり、酸素や湿度に対する安定性を高めたりする形、例えば特許３３４９６７７記載の酵母細胞壁を主成分としたコーティング剤でコーティングされたコーティング処理物や定法に従って軟カプセルや硬カプセルによりカプセル化することで得られるカプセル剤として共に医薬製剤や健康食品等の分野で好ましく使用することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【００３０】
製剤は例えば次のようにして製造できる。すなわち、経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【００３１】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Tween）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【００３２】
外用剤は、有効成分を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造することができる。例えば、上記固状の組成物は、有効成分をそのまま、あるいは賦形剤（例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロース、白糖）、増粘剤（例えば、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合体）などを添加、混合して粉状とすることにより製造できる。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様にして製造できる。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟骨状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれもｐＨ調節剤（例えば、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウム）、防腐剤（例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウム）などを含んでいてもよい。坐剤は、有効成分を油性または水性の固状、半固状あるいは液状の組成物とすることにより製造できる。該組成物に用いる油性基剤としては、高級脂肪酸のグリセリド〔例えば、カカオ脂、ウイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社製）〕、中級脂肪酸〔例えば、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社製）〕、あるいは植物油（例えば、ゴマ油、大豆油、綿実油）が挙げられる。水性基剤としては、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールが挙げられる。また、水性ゲル基剤としては、天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体が挙げられる。
【００３３】
（飲食品配合による利用）
本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物は、飲食品に配合し、抗アレルギー機能を有する飲食品として用いることができる。本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物を飲食品に配合して用いるには、その有効成分の有効量を飲食品の製造原料段階或いは製造した製品の段階等で添加、配合する。ここで「有効成分の有効量」とは、個々の飲食品において通常喫食される量を摂取した場合に、下記のような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。
【００３４】
すなわち、本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に依存して決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人１人当たり０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重）、非経口的に投与する場合は０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｋｇ体重）の範囲で一日１〜３回に分けて投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、
より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲食品の量に合わせて、各々の食品あたりの含有させる乳酸菌の菌数が決定される。
【００３５】
本発明においては、本発明により製造された乳酸菌の抗アレルギー用組成物の有効成分をそのまま、或いは前記のような製剤の形態で、飲食品に配合することができる。より具体的には、本発明の飲食品は、本発明の有効成分を適宜基材と配合して、そのまま飲食品として調製したもの、或いは、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、更には、一般の飲食品へ添加、配合したもの等、種々の利用形態を採ることができる。
【００３６】
従来より、乳酸菌を利用した飲食品の分野としては、その活用の態様分類としては、乳製品類、肉類、パン類、飲料、及び野菜類に大別される。これらの乳酸菌を利用した飲食品の場合には、製造した該飲食品用の添加物として、本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を用いて、該飲食品に抗アレルギー機能を付与することができる。
【００３７】
本発明における食品としては、抗アレルギー機能を持たせた、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、或いは病者用食品として調製することができる。また、特に、食品の形態に限定されるものではなく、抗アレルギー機能を持たせた飲料の形態であってもよい。本発明による有効成分は、抗アレルギー作用を有するため、日常摂取する食品やサプリメントとして摂取する健康食品や機能性食品等に本発明の有効成分を配合することにより、継続的に摂取可能な、アレルギーの発症の予防および治療といった機能を併せ持つ食品として提供することができる。本発明の高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を、例えば、茶類やドリンク剤或いはタブレットのような、その飲食品中にアレルギーを引き起こす成分を含まない飲食品中に配合して用いることにより、アレルギー問題から完全に遮断された抗アレルギー機能を有する飲食品を提供することができる。
【００３８】
（飲食品製剤形態での利用）
本発明において、本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品および機能性食品としては、各種のものをあげることができるが、それらの健康食品および機能性食品の製造に関しては、通常用いられる、食品素材、食品添加物に加え、賦形剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、分散剤、保存剤、湿潤化剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化材、カプセル基剤等の補助剤を用いた飲食品製剤形態で利用することができる。該補助剤の具体的な例示をすれば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはその塩、アラビアガム、ポリエチレングルコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウム、プルラン、カラギーナン、デキストリン、還元パラチノース、ソルビトール、キシリトール、ステビア、合成甘味料、クエン酸、アスコルビン酸、酸味料、重曹、ショ糖エステル、植物硬化油脂、塩化カリウム、サフラワー油、ミツロウ、大豆レシチン、香料等が配合できる。このような健康食品、機能性食品の製造に関しては、医薬品製剤の参考書、例えば「日本薬局方解説書（製剤総則）」（廣川書店）等を参考にすることができる。
【００３９】
本発明において、特に、健康食品および機能性食品に適した形状として、タブレット状、カプセル状、顆粒状、粉末状、懸濁液状、乳化液状のものが例示でき、特に本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する健康食品及び機能性食品は、本発明が解決しようとする課題から見て、アレルギー特定原材料を含まない原材料を組み合わせたものが好ましい。
【００４０】
タブレット状健康食品及び機能性食品の製造法を具体的に例示すれば、本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合した処方物を一定の形状に圧縮して製造するか、または水またはアルコールのような溶媒で湿潤させた練合物を、一定の形状にするか若しくは一定の型に流し込んで成型して製造したものがあげられる。カプセル状健康食品および機能性食品の製造法を具体的に例示すれば、本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合した処方物を液状、懸濁状、のり状、粉末状または顆粒上などの形でカプセルに充填するか、またはカプセル基剤で被包成型して製造したもので、硬カプセル剤および軟カプセル剤等があげられる。
【００４１】
（食品への配合）
また、本発明においては、本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を食品に配合して、抗アレルギー機能を持たせた食品として調製することができる。かかる飲食品として具体的には、プリン、クッキー、クラッカー、ポテトチップス、ビスケット、パン、ケーキ、チョコレート、ドーナツ、ゼリーなどの洋菓子、煎餅、羊羹、大福、おはぎ、その他の饅頭、カステラなどの和菓子、冷菓（飴等）、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば、きしめん等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ハム、ソーセージ、ハンバーグ、コーンビーフ等の畜肉製品や、塩、胡椒、みそ、しょう油、ソース、ドレッシング、マヨネーズ、ケチャップ、甘味料、辛味料等の調味類や、明石焼き、たこ焼き、もんじゃ焼き、お好み焼き、焼きそば、焼きうどん等の鉄板焼き食品や、チーズ、ハードタイプのヨーグルト等の乳製品や、納豆、厚揚げ、豆腐、こんにゃく、団子、漬物、佃煮、餃子、シューマイ、コロッケ、サンドイッチ、ピザ、ハンバーガー、サラダ等の各種総菜や、各種粉末（ビーフ、ポーク、チキン等畜産物、海老、帆立、蜆、昆布等水産物、野菜・果実類、植物、酵母、藻類等）や、油脂類・香料類（バニラ、柑橘類、かつお等）を粉末固形化したものや、粉末飲食品（インスタントコーヒー、インスタント紅茶、インスタントミルク、インスタントスープ、味噌汁等）等の各種食品が挙げることができるが、これらに特に制限されない。
【００４２】
（飲料への配合）
本発明により製造された乳酸菌の高抗アレルギー活性の組成物は、特に飲料の形で用いて、毎日継続摂取することが可能であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能を発揮する抗アレルギー機能を有する飲料として提供することができる。本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を飲料へ配合する場合に、乳酸菌の配合量は適宜決定することができるが、通常、飲料として継続的に摂取することができる量で、乳酸菌のもつ抗アレルギー活性を充分に発揮するための配合量が採用される。本発明における有効成分の飲食品への有効量の投与量または摂取量を、乳酸菌の菌数で表示すると、１日当たりの摂取量が５×１０9個以上が好ましく、より好ましくは１日あたり１×１０10個以上、更に好ましくは５×１０10個以上を摂取することが好ましい。したがって、通常１日あたり摂取される飲料の量に合わせて、上記指標により、各々の飲料あたりに含有させる乳酸菌の菌数が決定される。例えば、１日あたり１００ｇの飲料が摂取されるとすれば、飲料１００ｇあたり１０9個以上の菌数を添加することが好ましい。一方、乳酸菌の添加で、飲料の香味や外観を損なわない範囲を考えると、１０11個以下が好ましい。更に、５×１０10個以下がより好ましい。したがって、抗アレルギー機能を有し、かつ、安定性があり、嗜好性、保存性が高い飲料の乳酸菌の濃度としては、飲料１００ｇ当たり、１０9〜１０11個の範囲のものが特に好ましい。なお、乳酸菌の菌体数と乾燥菌体重量の関係については、L. paracasei ＫＷ３１１０株では、菌体数１０12個が乾燥菌体重量１ｇに相当する。
【００４３】
本発明において、本発明により製造された高抗アレルギー活性を有する乳酸菌を配合する飲料としては、各種のものを挙げることができるが、それらの飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、香料、果汁、食品添加物などいずれも使用することが出来る。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。
【００４４】
配合する飲料を具体的に例示すれば、アルコール飲料（ウイスキー、バーボン、スピリッツ、リキュール、ワイン、果実酒、日本酒、中国酒、焼酎、ビール、アルコール度数１％以下のノンアルコールビール、発泡酒、酎ハイ等）や非アルコール飲料（ドリンクタイプのヨーグルト、リンゴ、ミカン、ブドウ、バナナ、ナシ、ウメ、スイカ等の果汁、トマト、ニンジン、セロリ、キュウリ等の野菜汁、清涼飲料、牛乳、豆乳、コーヒー、ココア、紅茶、緑茶、麦茶、玄米茶、煎茶、玉露茶、ほうじ茶、ウーロン茶、ウコン茶、プーアル茶、ルイボスティー茶、ローズ茶、キク茶、ミント茶、ジャスミン茶等の各種ハーブ茶、スポーツ飲料、ミネラルウオーター、栄養ドリンク等）の各種飲料が挙げられる。
【００４５】
飲料のカテゴリーによって例示すれば、緑茶、ウーロン茶、紅茶、麦茶、ブレンド茶などの茶系飲料と、コーヒー、果汁入り飲料、野菜飲料、スポーツ飲料、栄養ドリンクとが例示できる。
【００４６】
本発明において、抗アレルギー機能を有する飲料を製品化するに際しては、食品衛生法に定められた方法に従って、適宜、飲料の殺菌を行うことができる。該殺菌方法としては、飲料のｐＨによって、パストル殺菌、ホットパック殺菌、ＵＨＴ殺菌、レトルト殺菌等を使い分けることができる。
【００４７】
更に、製品形態としては、通常飲料の製品形態に使用されている密封容器入り飲料の形態が特に好ましく、該密封容器としては、缶、ビン、ＰＥＴ、紙容器のいずれの形態でもよい。また、容量についても特に制限はないが、一般的に、消費者が日常的に飲料として摂取している量と、配合する乳酸菌の菌数と１日の必要菌数を考慮して、適宜、決定することができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４９】
＜１．抗アレルギー活性測定方法＞
乳酸菌のin vitroにおける抗アレルギー活性はマウス脾臓リンパ球と混合培養を行った際に、培地中に放出されるＩＬ−１２量を測定することによって行った。７−１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）にｄａｙ０とｄａｙ６に卵白アルブミン（ＯＶＡ）１ｍｇをアジュバンドである水酸化アルミニウム２ｍｇと共に腹腔内注射した。Ｄａｙ１３に解剖し、脾臓の単離・リンパ球を調製した。脾臓リンパ球をＦＣＳ（ロシュ）とＯＶＡをそれぞれ終濃度１０％及び１ｍｇ／ｍｌになるように添加したＲＰＭＩ１６４０（ＳＩＧＭＡ）培地で細胞濃度が２．５×１０6ｃｅｌｌ／ｍｌになるように懸濁した。乳酸菌を上記培地に０．２５μｇ／ｍｌになるように添加し、１週間３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、ＯｐｔＥＩＡ  ＥＬＩＳＡ（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＩＬ−１２の測定は、を用いて測定した。
【００５０】
（実験結果の表示）
試料のＩＬ−１２産生量をコントロールとしたL. paracasei ＫＷ３１１０株のそれと比較して、相対値として示した。
【００５１】
（コントロール菌の作製）
ＭＲＳ培地を用いて、３７℃、４８時間静置培養したものを、滅菌水で３回洗浄し、滅菌水に懸濁後１００℃、３０分処理し、殺菌した。これを凍結乾燥し、ＰＢＳに懸濁した。
【００５２】
＜２．試料L. paracasei ＫＷ３１１０株の調製：培養＞
ＭＲＳ培地と同程度の窒素源および炭素源、無機物を含む培地を、５０Ｌタンクに投入し、１２０℃、２０分の蒸気殺菌した。これにＭＲＳ培地で適度に増殖した乳酸菌体を添加し、３２℃、６０ｒｐｍ、苛性ソーダでｐＨ５．５に調整しながら４８時間培養した。作製した培養液をとり、遠心洗浄し、菌体懸濁液を取得した。
【００５３】
＜３．加熱処理＞
上記２．で得られた菌体懸濁液を各温度で調整した湯浴にて加熱し、菌体懸濁液が各温度に達してから各々の時間にサンプルを回収した。回収したサンプルを凍結乾燥し、ＩＬ−１２産生活性評価に供した。
【００５４】
＜４．実験の結果＞
上記実験の結果を、図１及び表１に示す。なお、本実験では、８５℃の試験群では１回、６０℃の試験群では２回、その他の実験群では３回ずつ実験を繰り返し、その平均値を示した。「非加熱」は培養液を洗浄した後、凍結乾燥したものを示す。
図１は、各加熱条件に対するＩＬ−１２産生量の割合（コントロールに対する割合）を示す、また、表１は各加熱条件に対するＩＬ−１２産生活性値（コントロールに対する相対値（％））を示す。
【００５５】
【表１】
2008245569.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の実施例における、本発明の乳酸菌の加熱条件に対する抗アレルギー活性の測定の試験において、各加熱条件に対するＩＬ−１２産生量の割合（コントロールに対する割合）を示す図である。
【図１】
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