(57)【要約】【課題】  細胞に所望の遺伝子を導入するに際して細胞外から細胞核内までの行程における最大の障壁である輸送小胞脱出を克服するための機能（輸送小胞脱出能）を有し効率的なトランスフェクションが確保できる新しい手法を提供する。【解決手段】  細胞に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質とカチオン性ポリマーとから成る複合体が、輸送小胞脱出促進性タンパク質と結合して形成される核酸構造体、および該核酸構造体を細胞と接触させる工程を含む、細胞に遺伝子を導入する方法による。好ましい態様は、細胞に導入すべき遺伝子を含む核酸物質がプラスミドＤＮＡであり、該プラスミドＤＮＡがビオチン化ポリエチレンイミンなどのビオチン化カチオン性ポリマーと複合化されており、さらに、輸送小胞脱出促進性タンパク質としてストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインと結合されているものである。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質とカチオン性ポリマーとから成る複合体が、輸送小胞脱出促進性タンパク質と結合して形成されることを特徴とする核酸構造体。
【請求項２】
核酸物質とカチオン性ポリマーとから成る複合体が輸送小胞脱出促進性タンパク質と非共有結合性の特異的相互作用を介して結合されていることを特徴とする請求項１に記載の核酸構造体。
【請求項３】
請求項１に記載の輸送小胞脱出促進性タンパク質がジフテリア毒素Tドメインであることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸構造体。
【請求項４】
非共有結合性の特異的相互作用がビオチン−アビジン相互作用であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の核酸構造体。
【請求項５】
ジフテリア毒素Ｔドメインがストレプトアビジン融合体化されていることを特徴とする請求項４に記載の核酸構造体。
【請求項６】
核酸物質がプラスミドＤＮＡであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸構造体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸構造体を細胞と接触させる工程を含むことを特徴とする細胞に遺伝子を導入する方法。
【請求項８】
ストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインおよびその発現プラスミドＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の細胞内動態において最も薬効を発揮する上での障壁であるエンドソーム（輸送小胞体）から細胞質への脱出過程を促進させる能力を備える物質を有する核酸構造体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
細胞に特定の外部遺伝子を導入するトランスフェクションは、その遺伝子の関与する作用機序を解析して疾病の治療や薬剤の開発などに有用な情報を得るために不可欠な手段であるが、最近は、生体への悪影響を回避するためトランスフェクション時の核酸キャリアーとして非ウィルスベクターを使用することが試みられている。従来より、非ウイルスベクターのトランスフェクション効率を向上させる際に大きな障壁として、輸送小胞脱出が挙げられてきた。
【非特許文献１】Marshall, E.(1999) Science 286, 2244-2245.
【非特許文献２】Hacein-Bey-Abina, S., Von Kalle, C., Schmidt, M., McCormack, M.P., Wulffrat, N., Leboulch, P., Lim,A., Osborne, C.S., Pawliuk, R., Morillon,E., Sorensen, R., Forster, A., Fraser, P., Cohen, J.I., de Saint Basile, G., Alexander, I., Wintergerst,U., Frebourg, T., Aurias,A., Stoppa-Lyonnet, D., Romana,S., Radford-Weiss, I., Gross, F., Valensi, F., Delabesse, E., Macintyre, E., Sigaux,F., Soulier, J., Leiva,L.E., Wissler, M., Prinz,C., Rabbitts, J., Le Deist, F., Fischer, A., and Cavazzana-Calvo, M. (2003) Science 302, 415-419.
【非特許文献３】Huang, L.,Hung, M.-C., and Wagner, E. (1999) Nonviral Vectorsfor Gene Therapy, Academic Press, San  Diego.
【非特許文献４】Rolland, A.(1999) Advanced Gene Delivery, Harwood Academic Publishers, Amsterdam.
【非特許文献５】Wiethoff, C. M., and Middaugh, C. R. (2003) J. Pharm. Sci., 92, 203-217.
【０００３】
大部分の非ウイルスベクターはエンドサイトーシスにより細胞膜を透過し細胞内に導入されるが、そのままでは酸加水分解されてしまい、発現効率が低下してしまう。そこで輸送小胞から細胞質への脱出を向上させるための手段として、これまでにpH感受性の膜融合ないし膜破壊物質を利用し、エンドソームやリソソームからの脱出能を向上させることが研究されており、効果が確認されている。
【非特許文献６】Cho, Y. W., Kim, J. D., and Park, K.(2003) J Pharm Pharmacol.,55(6), 721-34.
【０００４】
しかしながら、非ウイルスベクターにとっての細胞外から細胞核内までの行程における最大の障壁である輸送小胞脱出過程を克服するための機能（輸送小胞脱出能）については研究されているものの、それらが効果的に機能を発揮するような具体的な系は見いだされておらず、非ウイルスベクターの効率は満足する域に達していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、細胞に所望の遺伝子を導入するに際して細胞外から細胞核内までの行程における最大の障壁である輸送小胞脱出を克服するための機能（輸送小胞脱出能）を有し効率的なトランスフェクションが確保できる新しい手法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、核酸物質とこれに静電的に相互作用するカチオン性ポリマーとから成る複合体を調製するとともに、ジフテリア毒素Ｔドメインに代表される細胞の輸送小胞脱出促進性タンパク（質）を遺伝子工学的に調製し、核酸／ポリカチオン複合体とコンジュゲート化することで、被導入遺伝子と輸送小胞脱出能を有するタンパクとを結合させる手段を案出することにより効率的なトランスフェクションを達成したものである。
【０００７】
かくして、本発明は、細胞に導入されるべき遺伝子を含む核酸物質とカチオン性ポリマーとから成る複合体が、輸送小胞脱出促進性タンパク質と結合して形成されることを特徴とする核酸構造体を提供するものである。
さらに、本発明に従えば、上記の核酸構造体を細胞と接触させる工程を含むことを特徴とする細胞に遺伝子を導入する方法が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
被導入遺伝子がカチオン性ポリマーをリンカーとして輸送小胞脱出促進性タンパク質と結合してコンジュゲート体を含む核酸物質を形成している本発明の核酸構造体は、所定の細胞に接触させられると該細胞にエンドサイトーシスで取込まれた後、輸送小胞から効率よく細胞質へ脱出するので、その遺伝子を効率よく細胞内に導入・発現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において、輸送小胞脱出促進性タンパク質、すなわち、細胞外からエンドサイト−シスにより取り込まれた核酸物質が細胞内で有効に機能するために輸送小胞から細胞質へ効率的に核酸物質を脱出させる能力を有するタンパク質としては、合成ペプチド（例えば非特許文献６参照）も利用可能であるが、特に好ましいのはジフテリア毒素Ｔドメインである。ジフテリア毒素は図１に示すように本来の毒性を有するＡフラグメントと、それを細胞質まで輸送するためのＢフラグメントに分かれている。さらに、Ｂフラグメントは、レセプター結合能を有するRドメインとエンドソーム内で膜孔形成能を有するＴドメインに分かれており、Ｔフラグメントは毒素本体のＡフラグメントの輸送小胞内から細胞質への膜透過性を高める。
【非特許文献７】Donovan, J.J., Simon, M. J., Draper, R. K., and Montal, M.(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78, 172-176.
【非特許文献８】Kagan, B.L., Finkelstein, A., and Colombini, M. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 78, 4950-4954.
【非特許文献９】Ratts, R., Trujillo, C., Bharti, A., vanderSpek, J.,Harrison, R., and Murphy, J.R. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 102, 15635-15640.
【００１０】
本発明に従い遺伝子を含む核酸物質とカチオン性ポリマーとの複合体と輸送小胞脱出促進性タンパク質との結合は、共有結合または非共有結合性の特異的相互作用を介して行なわれる。
共有結合を用いる具体例としては、二官能性のジカルボン酸活性エステルなど汎用の二官能性反応剤を用い連結させることによりコンジュゲート体とすることなどが挙げられる。しかし、化学量論比の制御が困難な点が難点である。
【００１１】
本発明において、細胞の核内に導入すべき遺伝子を含む核酸物質と結合してコンジュゲート体を形成する輸送小胞脱出促進性タンパクとの結合法としては、生化学の分野で従来より多用されている反応系を利用することができるので、非共有結合性の特異的相互作用を介して行われる方が、共有結合による場合よりも好ましい。具体的にはＧＳＴタンパク−グルタチオン、ヒスチジンタグ−ニッケル錯体、ビオチン−アビジン（ストレプトアビジン）等を挙げることができる。これらの反応系を利用すれば、例えば、遺伝子を含む核酸／ポリカチオン複合体をＧＳＴタンパク、ヒスチジンタグまたはビオチンで修飾するとともに、輸送小胞脱出促進性タンパクをグルタチオン、ニッケル錯体またはアビジンと連結させることにより、それぞれの反応系の特異的相互作用を介して核酸／ポリカチオン複合体と輸送小胞脱出促進性タンパクから成るコンジュゲート体を得ることができる。
【００１２】
非共有結合性の特異的相互作用を発揮するものとして以上に例示した反応系の中でも、その結合力が特に大きいビオチン−アビジンが好ましい。特に、ストレプトアビジンはテトラマーを形成し、ビオチンと非常に安定な結合（解離定数：＜10-15）を形成する。従って、輸送小胞脱出促進タンパクをストレプトアビジン融合化させ、核酸物質と静電的に相互作用するカチオン性ポリマーを化学修飾によりビオチン化することで、被導入遺伝子と輸送小胞脱出促進タンパクを結合させる本発明の輸送小胞脱出性核酸構造体が得られる。
【非特許文献１０】Green, N. M.(1975) Adv. Prot. Chem. 29, 85-133.
【００１３】
かくして、本発明は、その別の視点から、ストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインおよびその発現プラスミドＤＮＡも提供する。
また、本発明において用いられるカチオン性ポリマーの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン、キトサン、ポリアミドアミンデンドリマー等のポリアミン類が挙げられ、特に好ましいのは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。これらのカチオン性ポリマーは、特に好ましい態様として、ビオチン化（ビオチンラベル化）カチオン性ポリマー（例えば、ビオチン化ＰＥＩ）として、上述のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインとともに用いられて、本発明の核酸構造体を形成することができる。
【００１４】
本発明において、核酸物質とは、細胞内に導入されるべき遺伝子自体または該遺伝子を含む核酸類であり、既述のような手段によりカチオン性ポリマーと結合されるものであればどのような形態でも良く、ＲＮＡ、オリゴＤＮＡ、１本鎖核酸、２本鎖核酸、プラスミドＤＮＡなどが包含されるが、実用的見地から特に好適な核酸物質はプラスミドＤＮＡである。ここで、プラスミドＤＮＡとは、発現ベクター、すなわち、発現するタンパクをプロモーターの下流にコードするものという意味で用いており、その具体的な塩基配列については目的タンパクによって異なる。
【００１５】
かくして、本発明の人工ウイルス性核酸構造体の特に好ましい態様は、細胞に導入すべき遺伝子を含む核酸物質がプラスミドＤＮＡであり、該プラスミドＤＮＡがビオチン化ポリエチレンイミンなどのビオチン化カチオン性ポリマーと複合化されており、さらにストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインと結合されているものである。
【００１６】
本発明の輸送小胞脱出性核酸構造体は所定の細胞と接触させる（具体的には、例えば、所定の遺伝子を含むプラスミドＤＮＡ、ビオチン化ＰＥＩ、およびストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインを含有する水溶液を細胞に添加する）ことにより、細胞に特定の遺伝子を注入したり、その遺伝子をクローニングしたり、または該遺伝子がコードするタンパク質を発現させるために用いることができるが、対象とされる細胞は限定されるものではなく、本発明の原理はあらゆる種類の真核細胞、特に動物細胞に適用することができる。
以下に本発明の特徴をさらに具体的に示すため実施例を記すが、本発明は以下の実施例によって制限されるものではない。実施例１〜６は、本発明において用いられるストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴＳ）が輸送小胞脱出促進機能を有することを示すためのものである。実施例７〜１０は、ＤＴＳをプラスミドＤＮＡおよびビオチン化カチオン性ポリマー（ＰＥＩ）とともに用いることにより本発明の核酸構造体が形成され、目的の遺伝子が細胞質内に導入され、効果的なトランスフェクションが行われることを示すためのものである。
【実施例１】
【００１７】
ストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメイン発現ベクター(pGSH-DTt)の調製  タンパク質発現ベクターpβ197〔ジフテリア毒素変異体（Ｃドメイン内の変異による無毒化毒素CRM197）の発現ベクターであり、これをコードする遺伝子を含む：Nucleic Acids Research, 1984,
12, 4063-4069〕内のジフテリア毒素Ｔドメインを以下のようなプライマーを用いてPCR法により増幅した。このプライマーはジフテリア毒素Ｔドメインの断片が両末端にEcoRIサイトを有するように設計されている。
5’-CGGTCGGAATTCTCAGTAGGTAGCTCATTG-3’
5’-ATAAAAGAATTCCCCCGGAGAATACGCGGG-3’
増幅したジフテリア毒素Ｔドメインをフェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿により精製した。精製したジフテリア毒素Ｔドメイン及びストレプトアビジン-His tagの融合タンパク質発現ベクターpGSHをそれぞれEcoRIで処理した後、フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱により精製した。
EcoRIで処理済みのジフテリア毒素ＴドメインとpGSHをモル比で250:1となるように混合し、ligation high（Toyobo社製）を用いてpGSHのEcoRIサイトにジフテリア毒素Ｔドメインを挿入した。Ligation反応した混合溶液を大腸菌JM109株のコンピテントセル（Nippon gene社製）にトランスフォームし、LB寒天培地（100μg/mlアンピシリンを含む）上で得られたコロニーから目的のpGSH-DTtを精製した。この発現ベクターは5’末端からジフテリア毒素Ｔドメイン-ストレプトアビジン-His tagの遺伝子をコードしている（配列表：配列番号１）。
【実施例２】
【００１８】
ストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメイン（DTS）の発現と精製  pGSH-DTtをトランスフォームした大腸菌BL21（DE3）pLys〔タンパク質発現用大腸菌のコンピテントセル：Novagen（メルク社）〕を3mL LB培地（100mg/Lアンピシリン，1%グルコースを含む）で前培養し、これを500mL LB培地（100mg/Lアンピシリン，1%グルコースを含む）に加え、２時間培養後、20℃で15分間振とうし、100mM IPTG 500μLを加え、20℃で一晩振とうし、DTt-SAv融合タンパク質を発現させた。大腸菌は4℃，6000rpmで15分間遠心し、集菌した。0.9% NaCl 30mLで懸濁後、再度4℃, 6000rpmで15分間遠心し、集菌した。その後、Binding Buffer（20mM Sodium Phosphate, 500mM NaCl,100mM
Imidazole, pH 7.4）30mLで再懸濁し、5分間ソニケーションした後、4℃, 10000×gで30分間遠心し、不溶物を沈殿した。DTS融合タンパク質の精製は、His trap HP Kitを用いて行った。その後、PD-10でImidazoleの除去，PBSへのバッファー交換を行い、SDS-PAGEで確認した（図２）。
【実施例３】
【００１９】
DTSのビオチン結合能の確認  2nM FITCラベル化ビオチン溶液110μLに、DTS、またはストレプトアビジン（S. Av.）を加え、室温で5分間静置後、蛍光偏光度を測定した。コントロールとして、2nM FITC溶液に対しても同様の実験を行った。FITCラベル化ビオチン溶液にDTSを加えていった場合にはストレプトアビジンを添加した場合よりも大きな蛍光偏光度の増加つまり分子量の増大が確認でき、融合タンパクのストレプトアビジンがビオチン結合能を確保していることが示された（図３）。
【実施例４】
【００２０】
DTSの会合能におけるpH応答性  DTSがエンドサイトーシスで細胞内に導入された時に、pHに応答し、膜融合性や膜破壊能をもつ為には、DTSの疎水性のpH応答性が重要な因子となる。そこで、DTS（200mg/mL, in PBS）の粒径のpH依存性を測定し、比較物質となるタンパクBSAと比較した。まずそれぞれ、pH
7.8で粒径測定を行い、その後1M HClを添加することによって、pH 6.0に下げ、再び粒径測定を行った。それぞれの粒径測定は約10分ごとに約2時間測定し、粒径の変化を追跡した。（図４）。
【実施例５】
【００２１】
DTSの膜透過性促進能のpH応答性  DTSのpH応答性，膜孔形成能を評価するために、カルボキシフルオレセイン（CF）封入リポソームを用いて検討を行った。CF封入リポソームは、Coatsome EL-N-01（日本油脂）を用いて作製した。CF封入リポソームは、50mM CF溶液（in PBS, pH 7.4）2mLをCoatsome EL-N-01と混合し、作製した。その後、Sephadex G-50カラムにより、未封入CFを除去した。このとき、展開溶媒には、8.5% sucrose溶液を用いた。CF内封リポソームは、PBS（pH 7.4 or 6.5）で希釈し、脂質濃度約5mMのLiposome溶液を調製した。このLiposome溶液50μLと、DTS溶液（1μmol/μL）50μLと混合し、4℃で20分静置後、蛍光強度測定を行った。また、コントロールとしては、BSAを用いて同様の実験を行った。CF未漏出（Leakage Percent 0%）の蛍光強度はPBS 50μLと混合した時の蛍光強度、CF全漏出（Leakage
Percent 100 %）の蛍光強度は、TRITON（終濃度1%）を添加した時の蛍光強度を測定することにより測定した。
【００２２】
その結果、DTSで、pHの低下により大きなCF漏出量の増大が確認された。コントロールとして行ったBSAでは、大きなCF漏出量の変化は見られなかった。pH低下によるDTSの疎水性増大により、リポソーム膜にもぐり込み膜を不安定化させた結果であると考えられる。エンドソーム内でもpHに応答することにより、導入遺伝子の細胞質への移行を促進していると考えられる（図５）。
【実施例６】
【００２３】
DTSの輸送小胞脱出促進能の確認  エンドソームマーカーとして知られているFITC-DextranとDTSを共に細胞と接触させ、FITC-Dextranの細胞質内への拡散が確認できるかどうかでDTSによるエンドソーム脱出促進能を評価した。A549細胞（200,000cells/dish）を塩酸処理済みカバーガラスの入った35mmディッシュにまき、24時間インキュベートした。まず、カバーガラス上に、1.25×無血清DMEM培地120μL FITC-Dextran（2mg/mL）とを接触し、37℃で２時間インキュベートした。このときDTS溶液30μL（終濃度600nM）を乗せ、37℃、CO2存在下で30分間インキュベートした。インキュベート後、PBSで2回洗浄した。その後、Trypan Blue（1.2 g/L）in DMEM 150μLをカバーガラス上にのせ、室温で5分間インキュベートし、再びPBSで2回洗浄した。3.7%ホルムアルデヒド溶液につけて室温で15分間静置し固定化した後、蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、FITC-Dextranのみでは小胞状の蛍光が確認できるのに対して、DTSの添加よって小胞状の蛍光が減少し、細胞質に広がった蛍光が観察された（図６a, b）。また、DTS/Biotin-FITC複合体を細胞と接触させたところ、まず細胞膜への吸着が見られ、その後、わずかではあるがエンドソームへの局在が確認でき、DTSそれ自体はエンドソームから脱出していないことが明らかとなった（図６c）。
【実施例７】
【００２４】
ビオチン化ポリエチレンイミンの調製  プラスミドDNAとの結合因子として非ウイルスベクターとして多用されている分岐型ポリエチレンイミン（PEI、MW. 25000、アルドリッチ社製）を、また、ポリエチレングリコール鎖（MW. 3400）の末端にビオチン基とカルポン酸Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステル基をもつビオチンラベル化剤（Biotin−PEG−CO2−NHS、Nektor社製）を使用した。PEI（25mg）とBiotin−PEG−CO2−NHS（5mg）をDMSO（1050μL）に溶解し、室温で24時間振とうした。Centricon（MW. 10000、Amicon社製）の分子ふるいフィルターにのせ蒸留水（5mL）を加え、4℃、5000gで遠心し、低分子量成分および溶媒であるDMSOを除去した。
その後凍結乾燥を行い白色粉末のビオチン化PEI（14.3mg）を得た。
【００２５】
ビオチン導入数の決定  合成したビオチン化PEIの元素分析を行い、C，49.23％；H，11.02％；N，22.05％の結果を得た。この実測値より算出し、PEI−（PEG−Biotin）2.2・230H20の計算値C，49.20％；H，11.03％；N，22.10％と高い一致を示すことよりビオチンラベル数を2.2と決定した。また、図７に示すように1H−ＮＭRスペクトル（D20）のポリエチレンイミン（2.3〜2.7ppm）とポリエチレングリコール（3.5−3.6ppm）由来のプロトン比からもビオチンラベル数を確認した。
【実施例８】
【００２６】
プラスミドDNA/PEI/DTSコンジュゲート体の調製  ビオチン化PEIとDTSをビオチンとストレプトアビジンが等モルとなるように混合し、10分間室温で静置し、ビオチン化PEI/DTS複合体を形成した。その後、この溶液にプラスミドDNAとしてpCMVLuc〔ルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドDNA：特開2005-247765号記載の方法で調製した〕、PEIを順に加え、さらに10分間静置することで、プラスミドDNA/PEI/DTS複合体を形成した。DTSの導入量はビオチン化PEI，DTSの量で、N/P比（N/PはPEIの窒素原子数とDNAのリン酸残基数の比）はPEIの量を変えることによって調整した。
【００２７】
アガロースゲル電気泳動によるプラスミドDNA/PEI/DTSコンジュゲート体形成の確認  複合体は、トランスフェクション（後述の実施例10参照）でトランスフェクション効率の高かった条件で、複合体形成させた。複合体はアガロースゲル（１％）で電気泳動（100 V，40分間）した。その後、エチジウムブロマイド染色し、プラスミドDNA/PEI/DTS複合体に導入されていないプラスミドDNAを確認した。その結果、DTSの導入によっても、全てのプラスミドDNAが完全に複合体を形成していることが確認できた（図８）。
【００２８】
Native-PAGE電気泳動によるプラスミドDNA/PEI/DTSコンジュゲート体形成の確認  複合体は、トランスフェクション（後述の実施例10参照）でトランスフェクション効率の高かった条件で、複合体形成させた。また、PEIを添加しなかったサンプルも準備した（DTS-ポリプレックス−PEI）。さらに、ビオチン化PEIも添加していないDTS-ポリプレックス−PEI&ビオチン化PEI，ビオチン化PEIのかわりにPEIを添加したDTS-ポリプレックス−PEI&ビオチンも準備した。これらのサンプルをNative-PAGE（アクリルアミド濃度10％）で電気泳動（50V，30分間→100V，１時間半）した。その後、銀染色し、プラスミドDNA/PEI/DTS複合体に導入されていないDTSを確認した。その結果、DTSはビオチンを介してビオチン化PEIと複合体を形成しており、さらに全てのDTSがプラスミドDNA/PEI/DTS複合体に導入されていることが明らかとなった（図９）。
【実施例９】
【００２９】
DTSによる導入核酸複合体の輸送小胞脱出の確認  A549細胞とポリプレックス〔ビオチン化PEIとプラスミドDNA（FITC-pCMVLuc）とから成る複合体〕、またはDTS-ポリプレックス〔実施例８で調製したビオチン化PEIとプラスミドDNA（FITC-pCMVLuc）とジフテリア毒素Ｔドメインのストレプトアビジン融合体から成る複合体〕とを接触し（800ng pDNA/200mL無血清DMEM）、37℃で３時間インキュベートした。複合体は、トランスフェクション（後述の実施例10参照）でトランスフェクション効率の高かった条件で、FITC-pCMVLuc〔Mirus社製Fluoresceinラベル化キットを使用し、pCMVLucをFITCラベル化したもの〕を用いて複合体形成させた（N/P=10：N/PはPEIの窒素原子数とDNAのリン酸残基数の比）。複合体濃度は、トランスフェクション時と等濃度で接触させた。その後、培地を交換し、さらに12時間インキュベート後、Trypan Blue溶液（1.2g/L, in DMEM）下、室温で10分間インキュベートした。その後、PBSで洗浄し、リビングで蛍光顕微鏡観察を行った。その結果、DTS未導入のポリプレックスでは、まだエンドソーム・リソソーム内に多く局在しているのに対し、DTS-ポリプレックスでは、小胞状の蛍光の減少と共に、細胞質内への拡散が確認できた（図１０）。
【実施例１０】
【００３０】
in vitro トランスフェクション  実施例８で調製したビオチン化PEIとプラスミドDNA（pCMVLuc）とジフテリア毒素Ｔドメインのストレプトアビジン融合体から成る複合体溶液をトランスフェクション溶液として用いた。
24wellプレートに1wellあたりA549細胞懸濁液（50000cells/mL）1mLを入れ、37℃，CO2存在下で24時間インキュベートした。その後、培地を除去し、1wellあたり1.25×無血清DMEM 200μLを穏やかに入れ、そこにトランスフェクション溶液を1wellあたり50μLずつ穏やかに入れ、37℃，CO2存在下で3時間インキュベートし、細胞と接触させた。プラスミドDNA（pDNA）はpCMVLucプラスミド（1μg/well）を用いて複合体を作製し、無血清DMEM
250μL中で３時間接触後、培地交換し、さらに48時間インキュベート後、ルシフェラーゼアッセイによって評価した。なお、複合体は、キャリアーとして分岐PEI（MW25,000）をN/P=10として用い、pDNA 1コあたりDTSが0〜96コ導入されるように仕込んだ。トランスフェクション結果を図１１に示す。DTSの導入によって、トランスフェクション活性の向上が確認できた。ポリプレックスのエンドソームからの脱出が、トランスフェクション効率向上の一因となったことは明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、遺伝子治療をはじめとして種々の分野において細胞に所望の遺伝子を高効率に導入・発現するための新しい非ウィルス性の技術として利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ジフテリア毒素の毒性発現に至る細胞内輸送機構。
【図２】本発明の輸送小胞脱出性核酸構造体を作製するのに用いられるストレプトアビジン融合ジフテリア毒素ＴドメインのSDS PAGEの結果を示す（実施例２）。
【図３】本発明の輸送小胞脱出性核酸構造体を作製するのに用いられるストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインのビオチン結合能の検討結果を示す（実施例３）。
【図４】本発明のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインの粒径のpH依存性を示す（実施例４）。
【図５】本発明のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素ＴドメインによるDTSの膜透過性促進能のpH応答性を示す（実施例５）。
【図６】本発明のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素ＴドメインによるFITC-Dextranのエンドソーム脱出促進を示す（実施例６）。
【図７】ビオチン化ポリエチレンイミンの1H-NMRスペクトルを示す（実施例７）。
【図８】プラスミドDNA/PEI/DTSコンジュゲート体のアガロースゲル電気泳動結果を示す（実施例８）。
【図９】プラスミドDNA/PEI/DTSコンジュゲート体のnative PAGEゲル電気泳動結果を示す（実施例８）。
【図１０】本発明のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメインによる導入核酸複合体のエンドソーム脱出促進を示す（実施例９）。
【図１１】本発明のストレプトアビジン融合ジフテリア毒素Ｔドメイン／核酸構造体を用いたin vitroトランスフェクション結果を示す（実施例１０）。
【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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