(57)【要約】      （修正有）【課題】分泌量が少ないために希少だったヒト等の生理活性蛋白質を大量に調製したり、更には、このような生理活性蛋白質を大量に細胞外に分泌することを促進するための手段を提供すること。【解決手段】特定のアミノ酸配列から成る蛋白質に代表される、ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、及び、該遺伝子で形質転換した細胞（形質転換体）、及び、該形質転換体を用いて他の蛋白質を製造する方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有し、分子量が１０−５０kDである蛋白質。
【請求項２】
脊椎動物由来である、請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
アフリカツメガエル、ヒト、又はマウス由来である、請求項２記載の蛋白質。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質：
（ａ）配列番号２，４又は６のいずれかに示されるアミノ酸配列から成る蛋白質、
（ｂ）（ａ）記載のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と２０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
【請求項５】
ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有し、分子量が１０−５０kDである蛋白質をコードする核酸。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質をコードする核酸：
（ａ）配列番号２，４又は６のいずれかに示されるアミノ酸配列から成る蛋白質、
（ｂ）（ａ）記載のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と２０％以上の相同性を有するアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸：
（ａ）配列番号１、３又は５のいずれかに記載の塩基配列から成る核酸、
（ｂ）上記（ａ）に記載の塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の核酸を含む発現用組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１０】
哺乳類細胞である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
哺乳類細胞が、チャイニーズハムスター、サル、又は、ヒト由来の細胞株である、請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
アフリカツメガエル細胞である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項９〜１２項のいずれか一項に形質転換体を培養して、本発明の蛋白質を発現させ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進させる方法。
【請求項１４】
請求項９〜１２項のいずれか一項に形質転換体を培養して、本発明の蛋白質を発現させ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進させ、培地中に分泌された該他の蛋白質を回収することから成る、該他の蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
他の蛋白質が分泌性蛋白質である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
他の蛋白質が細胞受容体リガンドである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１７】
他の蛋白質が外来性蛋白質である、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項６又は７に記載の核酸及び該他の蛋白質をコードする外来性遺伝子で共形質転換（コトランスフェクション）されている形質転換体を使用する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する新規な蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子、及び、該遺伝子で形質転換した細胞（形質転換体）、及び、該形質転換体を用いて他の蛋白質を製造する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の疾病を治療するために活用されている生理活性物質（すなわち薬剤）の多くは、低分子化合物だが、実際に利用されている薬剤の中には、例えば、インスリンなどのように、蛋白質をはじめとする高分子の生理活性化合物も少なくない。ただし、一般的に言えば、同じ生理活性を示す物質であれば、蛋白質よりも低分子化合物の方が、安定性や生体への投与方法などの面で遥かに優れている。そこで、薬剤を開発する方法として、生理活性蛋白質をそのまま利用するだけでなく、それら蛋白質をリード化合物としながら、同じ活性を示す低分子物質を探索する方法もよく採用されている。
【０００３】
一方、診断薬や試薬の開発では、生体にある物質そのものを使うのがよいので、この場合には、生理活性蛋白質をそのまま利用する。また、例えば、再生医療を目的とする研究現場では、未分化細胞の分化を誘導する因子などの生理活性蛋白質を大量に使用している。そのような因子として、特に、胚の初期発生を支配する主要な因子として知られるTransforming growth factorβ(TGFβ) スーパーファミリーの一員であるactivin A, Bone morphogenetic proteins (BMPs) やノーダル関連因子5（nodal-related gene 5, Nr5;カエルではXnr5）など、細胞膜受容体に結合して未分化細胞の分化を促進する因子、すなわち、細胞膜受容体のリガンド蛋白質類が多く知られている。このように、生理活性蛋白質は、薬剤開発だけでなく、治療法の開発、診断薬、ならびに、試薬の開発、さらには、再生医療でも必要である。 
【０００４】
しかしながら、生理活性蛋白質には、上述の如く、不安定なものが多く、かつ、生体への投与方法が難しいという欠点だけでなく、生体から大量に調製することが出来ないという欠点もある。その理由は、本来、生体で作られる（発現される）量が少ない場合と、生体では大量に作られているものの細胞の外に分泌される量が少ないために、その後の調製が難しい場合がある。この問題を回避する方法としてよく採用されているのは、目的とする遺伝子を大腸菌などの原核生物に入れたいわゆる組み換え生物内で大量に発現させてから抽出する方法である。インターフェロンや種々の抗体など、現在市販されている蛋白質製剤の多くが、そのような方法で調製されている。
【０００５】
しかし、これらの蛋白質製剤の中には、何らかの理由で、期待される生理活性を示さないものもある。その理由として、生理活性蛋白質が期待される生理活性を示すためには、例えば、糖鎖付加などの翻訳後の修飾が必要であるが、大腸菌など原核生物は、そのような修飾ができない、ことが考えられている。この問題は、ヒトと同じ脊椎動物で発現した蛋白質であれば、大腸菌など原核生物で起こるこのような翻訳後修飾の問題を根本的に回避できる。また、組み換え大腸菌内で不溶化するために、この方法では大量に調製できない生理活性蛋白質も少なくない。
【０００６】
以上に述べた如く、大腸菌などではなく、ヒトと同じ脊椎動物で発現させた生理活性蛋白質を大量に調製できれば、それらを、これまでよりも安価かつ容易に入手できるので、創薬、治療法開発、診断薬開発、試薬開発、さらには、再生医療などを、より強力に推進することができる。
尚、これまで、酵母のＳＦＴ２ファミリー遺伝子に関する報告がされている（非特許文献１〜３）。
【非特許文献１】A SNARE-like protein required for traffic through the Golgi complex David K. Banfield, Michael J. Lewis & Hugh R. B. Pelham, Nature 375, 806-809 (1995)
【非特許文献２】Got1p and Sft2p: membrane proteins involved in traffic to the Golgi complex Sophie Conchon, Xiachun Cao, Charles Barlowe & Hugh R.B. Pelham, The EMBO Journal Vol. 18 No. 14 pp. 3934-3946 (1999)
【非特許文献３】Role for Gcs1p in regulation of Arl1p at Trans-Golgi compartments Ya-Wen Liu, Chun-Fang Huang, Kai-Bin Huang & Fang-Jen S. Lee Molecular Biology of the Cell Vol. 16, 4124-4033 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の主な目的は、これまで知られていない、生理活性蛋白質を大量に細胞外に分泌することを促進するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
今回、発明者は、ヒトと同じ脊椎動物であるアフリカツメガエルに着目して、アフリカツメガエルの未分化細胞をactivin Aで処理して初期分化を誘導し、その細胞からcDNAライブラリーを作成することによって、生理活性蛋白質の細胞外分泌を促進する蛋白質をコードする新規な遺伝子を単離することに成功し、係る知見に基づき本発明を完成された。
【０００９】
即ち、本発明は以下の各態様に係るものである。
［１］   ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有し、分子量が
１０−５０kDである、蛋白質。
［２］上記蛋白質をコードする核酸（遺伝子）。
［３］上記核酸を含む発現用組換えベクター。
［４］上記組換えベクターを含む形質転換体。
［５］上記形質転換体を培養して、本発明の蛋白質を発現させ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進させる方法。
［６］上記形質転換体を培養して、本発明の蛋白質を発現させ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進させ、培地中に分泌された他の目的蛋白質を回収することから成る、該他の蛋白質の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の新規な蛋白質をコードする遺伝子は、両生類と哺乳類の種間を越えて広く分布し、その遺伝子産物は、自身の細胞だけでなく、他の種類の細胞の生理活性蛋白質の分泌を促進する作用を持つことが分かった。この遺伝子を利用することによって、従来、分泌量が少ないために希少だったヒトの生理活性蛋白質を大量に調製したり、更には、その存在が知られていなかった新規のヒト生理活性蛋白質を調製したりすることが可能となる。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明第一の態様は、ＳＦＴ２ファミリーに属し、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有し、分子量が１０−５０kDである、蛋白質に係る。この蛋白質をコードする遺伝子の一部配列（ＥＳＴ）は、「SFT2D2」という遺伝子名で登録されており、更に、似た遺伝子としてSFT2D1とSFT2D3（National Center for Biotechnology Information (NCBI)  http://www.ncbi.nlm.nih.gov/  ）も登録されているが、SFT2ファミリーの機能はまったく不明だった。
【００１２】
本発明において、本発明の蛋白質は、脊椎動物、例えば、アフリカツメガエル等の両生類、並びに、チャイニーズハムスター、マウス、サル及びヒトという哺乳動物のような種間で広く保存されていることが判明した。
【００１３】
本発明蛋白質によって、その細胞外分泌が促進される他の蛋白質の種類に特に制限はない。その代表例として、分泌性蛋白質、特に、本明細書の実施例に記載されているような細胞受容体リガンドのような生理活性物質等を挙げることができる。更に、本明細書の実施例に示されるように、本発明の蛋白質は、それによって細胞外分泌が促進される他の蛋白質と由来する細胞の種類が同じでも又は異なっていても、本発明の効果を奏効することができる。
【００１４】
本発明の蛋白質の一例として、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に記載の蛋白質を挙げることができる。
（ａ）配列番号２，４又は６のいずれかに示されるアミノ酸配列から成る蛋白質、
（ｂ）（ａ）記載のアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
（ｃ）（ａ）記載のアミノ酸配列と２０％以上、好ましくは３０％以上、更に好ましく６０％以上、より好ましくは８０％以上の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列から成り、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質。
【００１５】
ここで、配列番号２、４又は６は、夫々、アフリカツメガエル、マウス、及びヒト由来の本発明蛋白質のアミノ酸配列を表している。
【００１６】
ここで、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌクレオチド配列（あるいは塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる）なる用語は、当業者には周知である (例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988);Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994);von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press,New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991) 等) 。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一般的な方法には、Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Press, San Diego, (1994);Carillo, H. & Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) 等に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
本発明の核酸（遺伝子）は、上記の蛋白質をコードするものである。ここで、「コードする」とは、本発明の蛋白質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、本発明のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は本発明の蛋白質を適当な介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者を含んでいる。
【００１８】
「核酸」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はいずれの核酸の修飾体をも含む。また、核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡを含んでいる。
【００１９】
本発明の蛋白質をコードする核酸の例として、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載の核酸を挙げることができる。
（ａ）配列番号１、３又は５のいずれかに記載の塩基配列から成る核酸、
（ｂ）上記（ａ）に記載の塩基配列から成る核酸と相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、他の蛋白質の細胞外分泌を促進する活性を有する蛋白質をコードする核酸。
【００２０】
ここで、配列番号１、３又は５は、夫々、アフリカツメガエル、マウス、及びヒト由来の本発明遺伝子の塩基配列を表している。
【００２１】
本明細書において、「ストリンジェント（stringent）な条件」とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。更に、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。
【００２２】
従って、「ストリンジェントな条件」とは、各塩基配列間の相同性の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上であるような、高い相同性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリッドが形成されるような条件を意味する。具体的には、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度150〜900mM、好ましくは600〜900mM、pH 6〜8であるような条件を挙げることが出来る。ストリンジェントな条件の一具体例としては、5 x SSC (750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、1% SDS、5 x デンハルト溶液50% ホルムアルデヒド、及び42℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、0.1 x SSC (15 mM NaCl、1.5 mM クエン酸三ナトリウム)、0.1% SDS、及び55℃の条件で洗浄を行うものである。
【００２３】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００２４】
本発明の遺伝子は、本明細書に記載の塩基配列に基づき作製したプライマー又はプローブ等を用いて、当業者に公知の任意の方法で調製することが出来る。例えば、各種のＰＣＲ、並びに、その他のNASBA（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法及びSDA（Strand Displacement Amplification）法等の当業者に公知の任意ＤＮＡ増幅技術を用いることにより、該遺伝子のｃＤＮＡとして容易に得ることが可能である。
【００２５】
或いは、上記遺伝子は当業者に周知の方法により、本明細書に記載のcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。更に、該遺伝子のcDNAに、当業者に公知の部位特異的突然変異誘発に基づき、市販のミューテーションシステム等を用いて塩基変異を導入して調製することも可能である。
【００２６】
又、上記遺伝子は、公知の方法（例えば、Carruthers（1982）Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418;Adams（1983）J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov（1997）Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel（1995）Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers（1994）Biochemistry 33:7886-7896; Narang（1979）Meth. Enzymol. 68:90; Brown（1979）Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage（1981）Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて合成することもできる。また、本発明のポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断する等の方法によって作製することもできる。
【００２７】
本発明の遺伝子は、当業者に公知の任意の方法で細胞に導入し、該細胞を形質転換し、形質転換体を得ることが出来る。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、トランスフェリン受容体を使用する方法、ペネトラチン等の膜透過性ペプチドを使用する方法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション及びパーティクルガン等の物理的方法、更には、レトロウイルス及びアデノウイルス等の適当なウイルスを用いる方法を挙げることが出来る。
【００２８】
上記の各種形質転換法に応じて、各遺伝子は、そのまま単独の形態（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ分子）、又は適当なベクター（同じベクター又は別のベクター）に組み込まれた形態で導入される。例えば、このようなベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター等の各種ウィルスベクター、非ウィルス型ベクター又は混成型ベクター等を挙げることが出来る。このようなベクターには、発現調節配列には、適当なプロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、タンパク質をコードする遺伝子における開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ポリアデニル化部位、及びストップコドン等の各種の遺伝子発現調節配列、クローニング部位、薬剤耐性遺伝子等の各種要素が適宜含まれており、当業者に公知の任意の方法で作製することができる。
【００２９】
本発明の方法において、本発明のＳＦＴ２ファミリー蛋白質によって細胞外分泌を促進される他の蛋白質の種類等に特に制限がなく、既に記載したように、分泌性蛋白質、例えば、細胞受容体リガンドのような生理活性物質等を挙げることができる。このような他の蛋白質は、形質転換される細胞で元来発現されるもの（内因性蛋白質）に加えて、該他の蛋白質をコードする外来性遺伝子が発現するもの（外来性蛋白質）でも良い。更に、形質転換体は本発明の蛋白質が由来する細胞種とは異なるものでも良い。従って、本発明の遺伝子及び該他の蛋白質をコードする外来性遺伝子で細胞を共形質転換（コトランスフェクション）させることが好ましい。
【００３０】
形質転換体の培養の諸条件及びそれに用いる培地は、培養する細胞の種類、細胞外分泌を促進させたい目的の蛋白質の種類、及び使用する発現ベクターの構成（プロモーターの種類等）等に応じて適当なものを適宜選択することができる
【００３１】
又、培地中に分泌された目的蛋白質の回収は、例えば、クロマトグラフ分離、硫安沈殿、抗原又は抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体）を利用した免疫学的な分離方法、及び各種のクロマトグラフィ等の当業者に公知の任意の単離又は精製手段によって行うことが出来る。
【００３２】
例えば、その蛋白質を微生物から精製するには、例えばニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程で純化するための標識をタンパク質の配列中に持たせることによって単純化できる。そのような標識としては、例えば、複数個（好ましくは、５個〜１５個）のヒスチジン残基からなるポリヒスチジン標識を本発明のアミノ末端又はカルボキシル末端に組み込むことができる。そのようなポリヒスチジン標識によって、ニッケルキレートクロマトグラフィを用いて、一つの工程でタンパク質の単離を効率よく行うことができる。本発明のタンパク質には、回収を良好にする目的で、適当な酵素の切断部位を含むように設計することもできる。
【００３３】
又、目的蛋白質は、精製操作及び検出等の便宜の為に、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、及びｍｙｃタグ等の当業者に公知の任意のタグとの融合蛋白質として産生させることも可能である。更には、蛋白質の測定・検出の便宜の為に、ＧＳＴなどの酵素、及び各種の蛍光蛋白質との融合蛋白質として産生することも可能である。
【００３４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。又、特に記載のない場合には、以下の実施例は、当該技術分野における常法及び当業者に公知の標準的な方法、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New   York, N.Y, 1995等に記載されている遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施した。又、本明細書中に参考文献などとして引用された文献の記載内容は本明細書の開示内容の一部を構成するものである。
【００３５】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。尚、本明細書中で引用される技術文献の内容は、本明細書の開示内容の一部と見なされる。
【実施例１】
【００３６】
［本発明遺伝子の単離］
アフリカツメガエル後期胞胚に存在する未分化で多分化能をもつ細胞からなるアニマルキャップを切り出し、細胞を解離してアニマルキャップの内層にある細胞のみを取り出し、activin A（1 ng/ml）で１時間処理した。この細胞を再集合させ、発生段階が神経胚期（ステージ15および16）に達するまで１日間培養した（Steinberg’s Solution (SS) ; 58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 0.34 mM Ca (NO3)2, 0.83 mM MgSO4, 3.0 mM hydroxyethylpiperazinyl ethanesulfonic acid, and 100 mg/l kanamycin sulfate, pH 7.4）。この神経胚期で、発現量の異なる遺伝子をスクリーニングすることを目的とし、PCRサブトラクション法を用いてcDNAライブラリーを作成してスクリーニングを行ったところ、新規遺伝子である遺伝子（配列番号１）の単離に成功した。 
【００３７】
この遺伝子は、160個のアミノ酸（配列番号２）をコードすることが予想された。この蛋白質をデータベース（National Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov）にあてたところ、SFT2D1、SFT2D2 及びSFT2D3という遺伝子名で登録されている、SFT2ファミリーに属する遺伝子であることが判明した。このSFT2ファミリーに属する他の動物種の遺伝子のアミノ酸配列と比較したところ、カエル由来の遺伝子とニワトリ、ゼブラフィッシュ、ハエ、マウス、及びヒトとの間で、すべて〜60%の相同性があった。すなわち、この SFT2ファミリーに属する遺伝子は、脊椎動物間で高く保存されていた。次に、SOSUIによる蛋白質の立体構造予測を行ったところ、該遺伝子がコードする蛋白質は、４回膜貫通型の蛋白質であることが予測された。 
【実施例２】
【００３８】
［アフリカツメガエル由来の本発明遺伝子の発現パターン］ 
遺伝子の時間的発現を調べるため、ツメガエル各発生段階におけるRT-PCRを行った。まず、ツメガエル胚をNieuwkoop & Faberの発生段階表に基づいてサンプリングした。選んだ発生段階は、未受精卵、受精卵、桑実胚、初期胞胚、後期胞胚、初期原腸胚、後期原腸胚、神経胚、尾芽胚、幼生期に分類される胚である。まず、これらの胚からトータルRNAを以下のようにして抽出した。サンプリングした胚をそれぞれ1.5 mlチューブに移し、ISOGEN（ニッポンジーン）500 μlを加えて強く撹拌し、ISOGEN溶液中に胚を溶かした。そこに100 μlのクロロホルムを加えて撹拌し、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清180 μlを新しい1.5 mlチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えて撹拌し、室温で20分静置した。その後、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。沈殿したRNAのペレットを確認し、上清をデカンテーションで捨て、400 μlの80%エタノールを加えて10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清を捨ててペレットを風乾し、20 μlのDNase/RNase Freeの水に沈殿を溶かした。これの濃度を測定した後、次にcDNA合成のステップに進んだ。トータルRNA 1μgを鋳型とし、oligo dT primer、逆転写酵素(superscript II reverse transcriptase, Invitrogen)、RNase inhibitor (TaKaRa)、5×1st strand buffer、0.1M dNTP Mixを混ぜ、42℃で逆転写反応を行った。反応後、65℃で10分処理し、逆転写酵素を失活させた後、氷上において急冷した。合成されたcDNAを1/5希釈したものを鋳型とし、登録されているツメガエルSFT2D2遺伝子ESTに基づき作製した特異的プライマー（F: 5’-CAA CAC ACG CCA TGG ATA AG-3’（配列番号７）、 R: 5’-CCA CAG AGC AGC ACA TAA CG-3’（配列番号８））を用いてPCRを行った。PCRの条件は、まず94℃で5分加熱したあと、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を28回繰り返し、72℃で7分処理したあと4℃で保管した。この反応には、サーマルサイクラーを用いた。これを3%のアガロースゲルで分電気泳動（100ボルト、30分）し、エチジウムブロマイドで10分処理し、FASでバンドを検出した。
【００３９】
その結果、上記の本発明遺伝子のmRNAは、アフリカツメガエルの卵母細胞から既に存在しており、初期発生中も胚全体で普遍的に強く発現していた。原腸胚では、前方予定神経領域において若干強い本発明遺伝子の発現が観察された。中期神経胚から尾芽胚では、脊索における該遺伝子の発現が見られた。 
【００４０】
［本発明遺伝子産物の細胞内局在］ 
ツメガエル細胞における本発明遺伝子（配列番号１）産物の細胞内局在を調べるため、該遺伝子のORF（181ORF）をpCS2-EGFPベクター（pCS2ベクターにEGFPを導入した改変ベクター）に挿入した。EGFPは緑色に発色する蛍光タンパクである。具体的には、pCS2-EGFPプラスミドを制限酵素BamHIとClaIを用いて30℃で16時間、制限酵素処理を行い、精製した。インサート181ORFをPCRで増幅し、精製した。プライマーには、それぞれBamHIとClaI制限酵素サイトを付加したものを用いた（F: 5’-CGG GAT CCA TGG ATA AGC TAA  AGA  AAG TC-3’（配列番号９）、 R: 5’ CCA TCG ATG CTG AAA TAC ATG TTG TAA AG-3’（配列番号１０））。インサートと制限酵素処理したプラスミドを16℃30分でライゲーションした(Ver.II ligation kit, TaKaRa)。このようにしてコンストラクションしたpCS2 181-eGFPからmRNAを合成し、ツメガエル胚に微量注射し、後期胞胚に達するまで20℃で培養し、アニマルキャップを切り出した。これをカルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含まないSS (Ca++, Mg++ Free Steinberg’s Solution; 58 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 3.0 mM hydroxyethylpiperazinyl ethanesulfonic acid, and 100 mg/l kanamycin sulfate, pH 7.4)を100 μL満たした培養用の容器（例えば96穴の培養用ディッシュ）へ移し、20分間静置し、シート状のアニマルキャップの細胞を解離した。この細胞を、共焦点顕微鏡を用いて観察した。その結果、主にゴルジ体に局在することが分かった（図1左）。
【００４１】
更に、哺乳類の細胞における細胞内局在についても、共焦点顕微鏡を用いて観察した。細胞としてサル腎臓由来COS7細胞を用い、発現プラスミドpCS2 181-eGFPをリポフェクションにより導入した。トランスフェクション後２４−４８時間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、３．７％ホルマリン/ＰＢＳで室温30分間固定した。再度細胞をPBSで洗浄し、共焦点顕微鏡を用いて観察した。その結果、哺乳類細胞（CHO（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、COS7（サル腎臓細胞株）、HEK293T（ヒト腎臓細胞株）においても、同様に、主にゴルジ体に局在することが示された。 
【実施例３】
【００４２】
［アフリカツメガエル由来の本発明蛋白質の細胞外分泌促進活性］ 
ツメガエル卵母細胞を使って、アフリカツメガエル由来の本発明遺伝子（配列番号１）による生理活性蛋白質の細胞外への分泌促進効果を検討した。
はじめに、pCS2-flag（pCS2ベクターにFlagタグを導入した改変ベクター）を制限酵素XhoIで37℃にて16時間、制限酵素処理を行い、精製した。インサートBMP2を適当なプライマーを使用してPCRで増幅し、精製した。これらを16℃で30分ライゲーションした(Ver.II ligation kit, TaKaRa)。次に、pCS2ベクター（米国ミシガン州立大学 Dave turner博士・ドイツFriedrich-Miescher Laboratrium Rulph Rupp博士より譲渡されたもの。Turner DL, Weintraub H.,Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate., Genes Dev. 1994 8(12)1434-1447; Rupp RA, Snider L, Weintraub H.,Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD., Genes Dev. 1994 8(11) 1311-1323）に挿入されたBMP2-Flagを鋳型としてmRNAを合成するため、pCS2 BMP2-Flagを制限酵素NotIによって３７℃で１６時間制限酵素処理した。これによって、pCS2 BMP2-Flagに一カ所切れ目を入れ、環状プラスミドを直鎖状プラスミドにした。これをQIAQUICK Mini Elution kit(QIAGEN)を用いて精製した。これを鋳型とし、試験管内でmRNAを合成するキット(mMessage-Machine: AMBION)を用いて３７℃で３時間反応させた。合成されたmRNAは、RNA Elution Kit (QIAGEN)で精製した。その後、合成されたmRNAの濃度をNano-Dropを用いて測定し、-80℃にて保管した。本発明遺伝子ORF（181 ORF）のmRNAに関しても、プライマー( F 5’- ATG GAT AAG CTA AAG AAA GTC- 3’（配列番号１１）, R 5’-CAT TTA TGA AAT ACA TGT TG-3’ （配列番号１２）)を用いてＰＣＲで増幅した本発明遺伝子ORF（181 ORF）を用いて、上記の手順と同様にして作製した直鎖状プラスミド（pCS2 181ORF）からmRNAを合成した。こうして調製したmRNAを最終濃度が20 ng/mlになるように調整し、これを硝子管に充填し、インジェクター（NAEISHIGE）を用いて10 nl (total 200 pg)をツメガエル胚の各２割球に微量注射した。
【００４３】
以上のようにして、生理活性蛋白質であるツメガエル由来BMP2（Flagタグ付き；BMP2-Flag）のmRNAと、本発明遺伝子のmRNAを同時に強制発現させ、このツメガエル卵母細胞を、0.05% BSAを含むOR solution A (8.25 mM NaCl, 250 μM KCl, 100 μM CaCl2, 100 μM MgCl2, 500 μM HEPES, 100 μM Na2HPO4, 0.2% phenol red, pH7.2) 100 μl中で20℃にて16時間培養し、図２に示した要領で、細胞外（すなわち、培養上清）と卵母細胞に分離し、この培養上清（sup.）と卵母細胞（Oocyte）を分離回収して、それぞれに含まれるBMP2-flagを定量した。
【００４４】
その結果、BMP2-flagの卵母細胞の細胞外への分泌が、本発明遺伝子との共強制発現により有意に増加していた（図3-A）。次に、アフリカツメガエルの生理活性蛋白質であるNr5（すなわち、Xnr5）の遺伝子改変蛋白質であるpXnr5 （Xnr5のpro-regionをコードした配列に6個のmycタグを付加したもの;pXnr5-6myc）のmRNAを、本発明遺伝子と共に強制発現させて、同じようにして、pXnr5-6myc を定量したところ、BMP2-flagと同様に、卵母細胞の細胞外への分泌が促進されていた（図3-B）。 
【００４５】
［ツメガエル由来の本発明遺伝子産物による哺乳類生理活性蛋白質の細胞外への分泌促進］
同様の実験を、哺乳類培養細胞（CHO、COS7、HEK293T）とアフリカツメガエル由来の本発明遺伝子（181遺伝子）を用いて行った。まず、ツメガエル由来の本発明の181遺伝子（6個のmycタグ付き）、BMP4（HAタグ付き; BMP4-HA）、又はpXnr5-6mycを含むプラスミドを以下のように調製した。
【００４６】
即ち、pCS2-myc（pCS2ベクターにmycタグを導入した改変ベクター）を制限酵素ClaIで37℃にて16時間、制限酵素処理を行ったあと、末端を平滑化し、精製した。インサート181遺伝子をPCRで増幅し（ F 5’-CGG GAT CCA TGG ATA AGC TAA AGA AAG TC-  3’（配列番号１３）, R 5’-GGA TCG ATG TGA AAT ACA TGT TGT AAA GC-3’（配列番号１４）)、精製した。これらを16℃で30分でライゲーションした(Ver.II ligation kit, TaKaRa)。
次に、pCS2-HA（pCS2ベクターにHAタグを導入した改変ベクター）を制限酵素ClaIで37℃にて16時間、制限酵素処理を行ったあと、末端を平滑化し、精製した。インサートBMP4をPCRで増幅し（F: 5’-CCC GCT CGA GCA GAG ACC CCG TAA AAA -3’（配列番号１５）、R: 5’-CCC GCT CGA GAG CAT AAT CTG GCA CAT CAT ATG GAT ACT GTT GAC TTC TTT TTG -3’ （配列番号１６））、精製した。これらを16℃30分でライゲーションした(Ver.II ligation kit, TaKaRa)。
更に、pCS2-mycを制限酵素ClaIで37℃にて16時間、制限酵素処理を行ったあと、末端を平滑化し、精製した。インサートXnr5をPCRで増幅し（F: 5’-GAT ATG GCT GTG CTA GGC TT -3’ （配列番号１７）, R: 5’ -CTT GCC TGT TTC TCT GGT GT-3’ （配列番号１８））、精製した。これらを16℃で30分ライゲーションした(Ver.II ligation kit, TaKaRa)。
【００４７】
次に、それぞれの培養細胞に、こうして調製した、本発明の遺伝子（6個のmycタグ付き）、BMP4（HAタグ付き; BMP4-HA）、又はpXnr5-6mycを含むプラスミドをリポフェクションにより導入し、それらの細胞を、培地中（DMEM+10%FCS）にて37°Cで16時間培養した。この培養上清（sup.）と細胞（cell）を分離回収して、BMP4-HAあるいはpXnr5-6mycを定量した（図4）。その結果、ツメガエル卵母細胞で得られた結果と同様に、本発明遺伝子と強制発現した時に、それぞれの生理活性蛋白質が、細胞外に有意に分泌促進された。 
【００４８】
尚、BMP2-flag、BMP4-HA及びpXnr5-6myc蛋白質の測定は以下のようにして行った。即ち、培養上清は4倍量の-30℃メタノールを加え、16時間-30℃で静置し、13krpmで4℃にて10分間遠心した。上清を除き、ペレットに2×サンプルバッファー（0.125M Tris-Hcl pH 6.8, 10% 2-メルカプトエタノール, 4% SDS, 20% グリセロール, 0.01% BPB）を加え、撹拌した。これを95℃で5分処理し、氷上に置いた。ツメガエル胚及び培養細胞は、Lysis Buffer（20 mM Tris-Hcl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1% NP40, Complete (Roche) 80 μl）を加えて撹拌し、13krpmで4℃にて10分間遠心した。中間層を取って新しい1.5 mLチュープに移し、5×サンプルバッファーを混ぜて95℃で10分処理し、氷上に置いた。この蛋白質サンプルをSDS-PAGEにより分離後PVDF膜にトランスファーし、１時間〜３時間室温で5%スキムミルク/PBSを用いてBlokingした。抗Flag抗体(Cell Signaling)、抗HA抗体 (Roche)、抗myc抗体 (Cell Signaling)をそれぞれ1000倍に希釈し、上記PVDF膜を室温で１時間処理した後、washバッファー（10 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.05% NP-40）で洗浄した。その後、HRP標識付き二次抗体を室温にて１時間処理し、washバッファーで洗浄した。その後、HRPを化学発光法により発色させ、LASで検出した。
【実施例４】
【００４９】
［哺乳類由来の本発明蛋白質の細胞外分泌促進活性］ 
本発明遺伝子による生理活性蛋白質を細胞外への分泌を促進する効果が、種々の種間で保存されているか否か調べるため、以下のようにして、ヒト及びマウスから本発明遺伝子をそれぞれPCRクローニングし、それを含むプラスミドを調製した。
【００５０】
即ち、3x106細胞のHela細胞を1.5 mlチューブに移し、ISOGEN（ニッポンジーン）500 μlを加えて強く撹拌し、ISOGEN溶液中に細胞を溶解した。そこに100 μlのクロロホルムを加えて撹拌し、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清180 μlを新しい1.5 mlチューブに移し、等量のイソプロパノールを加えて撹拌し、室温で20分静置した。その後、10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。沈殿したRNAのペレットを確認し、上清をデカンテーションで捨て、400 μlの80%エタノールを加えて10分間15Krpm(4℃)で遠心を行った。上清を捨ててペレットを風乾し、20 μlのDNase/RNase Freeの水に沈殿を溶かした。これの濃度を測定した後、次にcDNA合成のステップに進んだ。トータルRNA 1μgを鋳型とし、oligo dT primer、逆転写酵素(superscriptII reverse transcriptase, Invitrogen)、RNase inhibitor (TaKaRa)、5×1st strand buffer、0.1M dNTP Mixを混ぜ、42℃で逆転写反応を行った。反応後、65℃で10分処理し、逆転写酵素を失活させた後、氷上において急冷した。合成されたcDNAを1/5希釈したものを鋳型とし、本発明のヒト由来の181遺伝子の特異的プライマー（F: 5’- GGG ATC CGC CGC CAT GGA CAA GCT G-3’（配列番号１９）、 R: 5’ - CTC CTC GAG TGC AAG ACA CAC GGC AAA ACA C-3’ （配列番号２０））を用いてPCRを行った。PCRの条件は、まず94℃で2分加熱したあと、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を25回繰り返し、72℃で10分処理したあと4℃で保管した。この反応には、サーマルサイクラーを用いた。これを3%のアガロースゲルで分電気泳動（100ボルト、30分）し、エチジウムブロマイドで10分処理し、FASで増幅されたヒト由来の１８１遺伝子のバンドを検出した。次に、pcDNA-HA-Flag（invitrogen社のpcDNA3ベクターにHA-Flagタグを導入した改変ベクター）を制限酵素BamHIとXhoIで30℃にて16時間、制限酵素処理を行い、精製した。上記の方法でPCR法により増幅されたヒト由来の181遺伝子を制限酵素BamHIとXhoIで30℃にて16時間制限酵素処理を行い、精製した。これらをライゲーションキット(Ver.II ligation kit, TaKaRa)を用いて16℃で30分でライゲーションし作成した。
【００５１】
一方、挿入するマウス由来の181遺伝子については、以下のプライマーを用いて（F: 5’- GGA ATT CGC CAC CAT GGA CAA GCT GAA GAA AGT TAT G-3’（配列番号２１）、R: 5’ -CTC CTC GAG TGC AAG ACA CAC AGC AAA GCA C-3’ （配列番号２２））、ヒト由来181遺伝子と同様のPCR法により増幅し、精製した。次に、pcDNA-HA-Flagを制限酵素EcoRIとXhoIで37℃にて16時間、制限酵素処理を行い、精製した。これらをライゲーションキット(Ver.II ligation kit, TaKaRa)を用いて16℃30分でライゲーションし作成した。
【００５２】
pXnr5-6mycを含むプラスミドと共に、ヒト（図5、human, lanes 1と2）、マウス（図5、mouse, lanes 3と4）、ツメガエル（図5、Xenopus, lanes 5と6）由来の本発明遺伝子をそれぞれ哺乳類培養細胞（CHO、COS7、HEK293T）にリポフェクションにより導入し、培地中（DMEM+10%FCS）にて37°Cで16時間培養した。この培養上清と細胞を分離回収し、それぞれに含まれるpXnr5-6mycを上記の方法で定量した。その結果、ツメガエル由来の本発明遺伝子で得られた結果と同様に、ヒト由来の本発明遺伝子とpXnr5-6myc遺伝子を共強制発現すると、pXnr5-6mycを単独で細胞に導入した場合と比較して、培養上清へのpXnr5-6mycの分泌量が増加した。さらに、マウス由来の本発明遺伝子においてもpXnr5-6mycを分泌促進する効果が認められた。このことから、ツメガエルライブラリーから単離した本発明の遺伝子の機能は種間で広く保存されていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の遺伝子を使用して、ヒト由来の生理活性蛋白質等の有用な蛋白質を大量に調製する方法は、創薬、治療法開発、診断薬開発、試薬開発、さらには、再生医療など、幅広い産業分野で実用化可能であり、その有用は高い。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明遺伝子の細胞内局在を示す写真である。181eGFP（緑色に光るコンストラクト）を導入したアニマルキャップ細胞（左）とCOS7細胞（右）。緑色に光っている部分が該遺伝子産物の局在する場所（白い矢頭）。
【図２】生理活性蛋白質の分泌促進を調べる実験系の概念図である。
【図３】アフリカツメガエル由来の本発明遺伝子による生理活性蛋白質の細胞外への分泌促進を示す電気泳動の結果の写真である。A: 培養上清（sup.）と卵母細胞（Oocyte）を比較すると、BMP2だけを強制発現したもの（対照試料、lane 1）よりも、181遺伝子と共に強制発現したもの（lane 2）では、培養上清でのBMP2の量が有意に増加するが、細胞内のBMP2の量には変化が無かった。しかし、これに181遺伝子の機能を阻害する物質181MOを加えると（lane 3）、培養上清中のBMP2の量が対照試料（lane1）と同等になった。B: 同様に、pXnr5-6mycだけを強制発現したもの（対照試料、lane 1）よりも、181遺伝子との共強制発現したもの（lane 2）の方が、培養上清中のpXnr5-6mycの量が有意に増加した。tubulinは添加量を確認するための標準試料。
【図４】アフリカツメガエル由来の181遺伝子発現産物による生理活性蛋白質のHEK293T細胞外への分泌促進を示す電気泳動の結果の写真である。
【図５】ヒト、マウス、及びツメガエル由来の181遺伝子発現産物による生理活性蛋白質のHEK293T細胞外への分泌促進を示す電気泳動の結果の写真である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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