(57)【要約】      （修正有）【課題】環境試料中の広範な遺伝子源を対象として、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子を探索、採取するための、インテグロン・ジーンカセットシステム（ＩＧＣシステム）中のジーンカセット（IGC-GC）プライマーを提供する。【解決手段】特定な配列で示されるＤＮＡの混合物、又は該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物、若しくはこれらＤＮＡとそれぞれ相補のＲＮＡの混合物をインテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子を探索、採取するための上記プライマーとして用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるＤＮＡの混合物、あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物、若しくはこれらＤＮＡとそれぞれ相補のＲＮＡの混合物。
【請求項２】
配列番号２に示されＤＮＡの混合物あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物、若しくはこれらＤＮＡと相補のＲＮＡの混合物。
【請求項３】
塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、請求項１又は２に記載のＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物
【請求項４】
配列番号１に示されるＤＮＡの混合物、あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物からなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
【請求項５】
塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、請求項４に記載のインテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー
【請求項６】
配列番号２に示されるＤＮＡの混合物あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物からなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
【請求項７】
塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、請求項５に記載のインテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
【請求項８】
請求項４又は５に記載のプライマーと請求項６又は７に記載のプライマーとからなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプラーマーセット。
【請求項９】
請求項４または５に記載のプライマーをフォワード用プライマーとし、請求項６又は７に記載のプライマーをリバース用プライマーとすることを特徴とする請求項８に記載のＰＣＲプライマーセット。
【請求項１０】
マーカー分子により標識された請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡの混合物からなることを特徴とする、プローブ。
【請求項１１】
環境試料から抽出されたＤＮＡ溶液に請求項８又は９に記載のプライマーセットを含有せしめてＰＣＲを行い、増幅されたインテグロン・ジーンカセット中の塩基配列を解析することを特徴とする、機能遺伝子の探索方法。
【請求項１２】
環境試料が単一又は複数種の微生物細胞を含有するものであることを特徴とする、請求項１１に記載の機能遺伝子の探索方法。
【請求項１３】
環境試料が真核細胞あるいはウイルスを含有するものであることを特徴とする、請求項１１又は１２に記載の機能遺伝子の探索方法。
【請求項１４】
環境試料から抽出されたＤＮＡ溶液に請求項８又は９に記載のプライマーセットを含有せしめてＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物からなる、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子ライブラリー。
【請求項１５】
請求項１１〜１３に記載の方法により探索された機能遺伝子の配列情報に基づき機能遺伝子を合成することを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子の採取方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により採取された機能遺伝子を用いてベクターを組み換え、得られる組み換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、該形質転換体を培地に培養することにより、上記機能遺伝子由来の発現タンパク質を採取することを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子由来の発現タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海洋や土壌、地下圏、大気などの自然環境、及び貯水池や廃水処理槽、構造物内などの人工的な環境中より、主に微生物に由来すると推定される様々な機能性遺伝子（以下、機能遺伝子と云う）を、遺伝子増幅法を利用して効率よく採取するためのPCR プライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
環境中から微生物等がもつ機能遺伝子を採取する方法としては、その環境から微生物を純粋分離・培養し、（１）得られた培養可能な微生物のみを対象に、一般的な全ゲノム解析手法により採取する方法や、（２）上記のような純粋分離・培養過程を経ず、環境試料中の微生物等より直接抽出して得られたDNA 試料を対象に、ある特定の目的機能遺伝子に着目し、その特異的で保存性の高い配列部位を標的として考案されたPCR プライマーを用い、その目的機能遺伝子（その部分配列を含む）を選択的に増幅し採取する方法、などが広く使われている。また、（３）最近では、上記（２）と同様に環境試料より直接抽出して得られた微生物等のDNA 試料を対象に、全微生物ゲノムの遺伝子塩基配列断片情報を幅広く収集してライブラリー化した後、相同性検索等のバイオインフォーマティクス的な解析により機能遺伝子を探索する手法や、発現産物の活性スクリーニングにより探索する手法など、いわゆる網羅的なメタゲノム解析手法を利用した採取法が登場している（非特許文献番号１、２）。そして現在、米国を中心に、様々な環境試料への適用、解析、利用が進められている（非特許文献番号３、４、５、６）。
【０００３】
一方、これらの方法とは違い、自然界で行われている遺伝子伝播現象を解析し、そのメカニズムを人為的、積極的に利用する採取法も登場している。
この中の一つに、インテグロン・ジーンカセットシステム（以下、IGC システムと言う）に着目した機能遺伝子採取法がある（非特許文献番号７、８、９）。このIGC システムは、様々な機能遺伝子を外部から微生物細胞内に取り込んで自己細胞内で機能させたり、取り込んで保持していたこれらの機能遺伝子を細胞外に放出（伝播）させる機能をもっており、微生物など原核生物に特徴的なシステムと見なされている（非特許文献番号１０）。
【０００４】
上記IGC システム中で、この遺伝子を動かす機能をもった酵素をインテグレースと言い、その作用で移動可能となる一つまたは複数の不特定機能遺伝子を含む遺伝子単位をジーンカセット（GC）と言う。
このIGC システム中のジーンカセット（以下、塩基のG,C と区別するためIGC-GC と言う）内に取り込まれている機能遺伝子の大部分は、各々が発現可能な単位（ORF: Open Reading Frame）として存在しており、発現可能な状態にあると考えられている。実際に最近、土壌試料等から直接抽出し調製したDNA 試料を対象に、この手法でいくつもの新規性の高い機能遺伝子が採取されはじめている（非特許文献番号７、８、９）。
【０００５】
すわなち、上記（２）に示したような、特定の機能遺伝子部位を標的としてPCRを行い同じタイプの機能遺伝子のみを探索するのではなく、このジーンカセット部位を標的としてPCR を行うことにより、これまでになく多種多様な機能遺伝子ORFを、効率よく採取することが可能な状況となっている（非特許文献番号７、８、９）。
【０００６】
また、上記（３）に示したような、網羅的なメタゲノム解析・機能遺伝子探索手法と比べ、より効率的かつ安価に採取することが可能な状況となっている。
しかし、この手法が、様々な環境試料に普遍的に利用可能かどうかは、まだ不明なままである。
補足として、このIGC システムについての研究は、これまで主に病原微生物を対象に進められてきたという背景があり、これら病原微生物による抗生物質等の薬剤耐性遺伝子の獲得に大きな役割を果たしている要因の一つと考えられている（非特許文献番号１１、１２、１３）。
【０００７】
【非特許文献１】津田雅彦ら、環境バイオテクノロジー学会誌、3 巻2 号69-78, 2004.
【非特許文献２】竹山春子ら、化学と生物、43 巻2 号199-208, 2005.
【非特許文献３】Henne et al., Appl. Environ. Microbiol,, 66, 3113-3116, 2000.
【非特許文献４】Ginolhac et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 5522-,2004.
【非特許文献５】Y. Kawarabayashi Y., In: Microbial Diversity (ed.; T. Satyanarayana and B.N. Johri),I. K. Inernational Pvt. Ltd., New Delhi, pp.25-41, 2005.
【非特許文献６】E. DeLong et al., Nature Rev. Microbiol., 3, 459-469. 2005.
【非特許文献７】H.W. Stokes et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 5240-5246, 2001.
【非特許文献８】A.J. Holmes et al., Environ. Microbiol., 5, 383-394, 2003.
【非特許文献９】B.S. Nield et al., Protein Science, 13, 1651-1659, 2004.
【非特許文献１０】D. Mazel, Nature Rev. Microbiol., 4, 608-620, 2006.
【非特許文献１１】S. Zhao et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 1558-1564, 2001.
【非特許文献１２】D.A. Rowe-Magnus et al., Pro. Nat. Acad. Scu, USA, 98, 652-657, 2001.
【非特許文献１３】H.W. Stokes et al., J. Bacteriol., 188, 5722-5730, 2006.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、IGC システム中のGC（IGC-GC）部分を標的として機能遺伝子を採取する方法は大変有効と考えられるが、これまでに開発されたプライマー（以下、IGC-GC プライマーと言う）は、一部の培養可能な微生物（病原微生物が中心）を対象に考案されたものである（上記非特許文献６、７）。したがって、培養困難な微生物が大多数（しばしば、全微生物の99.9％以上）を占める環境微生物試料全般に、幅広くこのプライマーが適用可能かどうかは疑問である。この採取法を幅広く利用可能にするためには、より有効なプライマーの開発が必要である。
【０００９】
これまでになく、より新奇な機能遺伝子を採取する方法の一つは、新奇生物遺伝子資源の宝庫と目されている極限環境試料（深海や海底熱水系、地下圏等からの試料）を対象とすることである。したがって、こういった極限環境試料に適用可能なIGC-GC プライマーの開発が必要不可欠である。
【００１０】
また、上記したように、これまでのIGC システムに関する研究は、病原微生物を中心に展開され、多くのデータが蓄積されており、その存在や消長には、人間活動の影響が強く反映していると考えられてきた（上記非特許文献番号１０、１１、１２、１３）。したがって、人間活動の影響がほとんど皆無と考えられる上記極限環境試料を対象に、その存在の有無を調べ、もし存在していればそこから得られる機能遺伝子の特性等を解明し、人間活動周辺環境由来のものと比較することは、医学や薬学、疾病予防、食品衛生的な観点からも大変重要な課題である。
そこで、本発明の課題は、上記極限環境試料等を含め、より広範な遺伝子源を対象として、新規機能遺伝子を探索、採取するためのIGC-GCプライマーを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため、日々増大している微生物等の全ゲノム情報をはじめ、これまでに得られているIGC システム関連の遺伝子塩基配列情報を精査し、病原微生物のみでなく、幅広く環境微生物全般に適応可能なプライマーを設計、合成した。そして該プライマーを用いて、実際に機能遺伝子の探索、採取実験を行い、該プライマーが新規機能遺伝子を得るためのIGC-GCプライマーとして極めて有用であることを確認し、本発明を完成するに至ったものである。
【００１２】
すなわち本発明は以下に示すとおりである。
（１）配列番号１に示されるＤＮＡの混合物、あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物、若しくはこれらＤＮＡとそれぞれ相補のＲＮＡの混合物。
（２）配列番号２に示されＤＮＡの混合物あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物、若しくはこれらＤＮＡと相補のＲＮＡの混合物。
（３）塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載のＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物
（４）配列番号１に示されるＤＮＡの混合物、あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物からなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
（５）塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、上記（４）に記載のインテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー
（６）配列番号２に示されるＤＮＡの混合物あるいは該ＤＮＡと相補のＤＮＡの混合物からなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
（７）塩基配列中の塩基が人工塩基により一部又は全部置き換えられていることを特徴とする、上記（５）に記載のインテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプライマー。
（８）上記（４）又は（５）に記載のプライマーと上記（６）又は（７）に記載のプライマーとからなることを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中に含まれる機能遺伝子探索用ＰＣＲプラーマーセット。
（９）上記請求項（４）又は（５）に記載のプライマーをフォワード用プライマーとし、上記（６）又は（７）に記載のプライマーをリバース用プライマーとすることを特徴とする上記（８）に記載のＰＣＲプライマーセット。
（１０）マーカー分子により標識された上記（１）〜（３）のいずれかに記載のＤＮＡまたはＲＮＡの混合物からなることを特徴とする、プローブ。
（１１）環境試料から抽出されたＤＮＡ溶液に請求項８又は９に記載のプライマーセットを含有せしめてＰＣＲを行い、増幅されたインテグロン・ジーンカセット中の塩基配列を解析することを特徴とする、機能遺伝子の探索方法。
（１２）環境試料が単一又は複数種の微生物細胞を含有するものであることを特徴とする、上記（１１）に記載の機能遺伝子の探索方法。
（１３）環境試料が真核細胞あるいはウイルスを含有するものであることを特徴とする、上記（１１）又は（１２）に記載の機能遺伝子の探索方法。
（１４）環境試料から抽出されたＤＮＡ溶液に上記（８）又は（９）に記載のプライマーセットを含有せしめてＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物からなる、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子ライブラリー。
（１５）上記（１１）〜（１３）に記載の方法により探索された機能遺伝子の配列情報に基づき機能遺伝子を合成することを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子の採取方法。
（１６）上記（１５）に記載の方法により採取された機能遺伝子を用いてベクターを組み換え、得られる組み換えベクターを宿主に導入して形質転換体を得、該形質転換体を培地に培養することにより、上記機能遺伝子由来の発現タンパク質を採取することを特徴とする、インテグロン・ジーンカセット中の機能遺伝子由来の発現タンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のIGC-GC プライマーは、幅広く環境試料全般に適応可能であり、本発明のIGC-GCプライマーを用いることにより、従来の人間活動周辺環境中からのみでなく、陸上や海洋、大気、地下圏等の極限環境、あるいはこれらの環境が人為的に汚染された場合を含む様々な環境中に生息あるいは存在する微生物、または微生物由来のゲノム遺伝子あるいはその遺伝子断片（DNA やRNA）の試料より、それらが内包する機能遺伝子、あるいは機能遺伝子ORF の塩基配列情報を、安価に効率よく収集することが可能となる。また、本願発明のIGC-GCプライマーは、その幅広い適応性により、微生物のみならず真核生物あるいはウイルス由来の遺伝子中の機能遺伝子を見いだす可能性があり、この点でも極めて有用である。
上記により、様々な環境試料を対象とし、それぞれの環境または試料を代表する機能遺伝子のライブラリーを、より安価に効率よく構築することが可能となる。
【００１４】
この機能遺伝子ライブラリーを用い、有用な機能性物質（酵素、抗生物質等）を探索、利用することで、医薬分野を含むバイオ産業の発展を促すことが可能となる。
この機能遺伝子ライブラリーを用い、その試料が由来する環境と、その環境中に存在したIGC-GC由来の遺伝子との関連性を解明することにより、その環境特性を微生物遺伝子特性として把握することが可能となり、環境や食品、健康、安全等に関わる様々な問題への対策を考案する上で重要な新しい情報を提供することが可能となる。したがって、関連する新しい産業の創出が期待できる。
この機能遺伝子ライブラリーを用い、上記のような環境や食品、健康、安全等に係わる様々な問題を解決するために有用な遺伝子ツール（プライマー、プローブ、DNA チップ等）や生化学ツール（酵素基質、抗体等）、およびこれらを含む検査薬や検査キット等を製造することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のIGC-GCプライマーは、以下（１）及び（２）の塩基配列で示される各ＤＮＡ分子の混合物である。
（１）5'-GCSGCTKANCTCVRRCGTTRRRY-3'（配列番号１）
（２）5'-TCSGCTKGARCGAMTTGTTRRRY-3'（配列番号２）
但し、上記（１）（２）の配列中、ＳはＧ又はＣを、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを、ＭはＡ又はＣを、ＫはＧ又はＴを、ＹはＴ又はＣを、ＶはＡ又はＧ又はＣを、ＲはＧ又はＡをそれぞれ表す。
以下、上記（１）及び（２）で示されるIGC-GCプライマーを、それぞれ、ＧＣＰ１及びＧＣＰ２という場合がある。
上記ＧＣＰ１は、上記各選択枝の組み合わせに係るそれぞれの塩基配列を有する３０７２通りの各ＤＮＡ分子の集合物であり、ＧＣＰ２も同様に２５６通りの各ＤＮＡ分子の集合物である。
【００１６】
IGC-GCは、その５’側末端及び３’側末端に、特有の保存された塩基配列を有するが、様々な変異を有し、上記IGC-GCプライマーの上記選択枝は、より広範IなGC-GCに対応させるために設計されたものである。本発明の上記IGC-GCプライマーはもとより、これに使用するＤＮＡ分子の混合物自体、既知報告には見いだせない新規なものである。
本願発明のIGC-GCプライマーは上記配列番号Ｉ及び２に示される塩基配列に係るもののみではなく、該塩基配列と各相補の塩基配列を有するＤＮＡ分子の混合物を包含する。またこれらＤＮＡ分子と相補のＲＮＡ分子の混合物も本願発明に包含される。すなわち転写、逆転写により配列番号１又は２のＤＮＡ混合物を直ちに製造しうるものは本願発明に含まれる。
【００１７】
さらに、本願発明のＤＮＡ混合物あるいはＲＮＡ混合物は、その配列中の一部又は全部の塩基が人工塩基に置換されていても良く、このような人工塩基としては、例えば LNA (Locked Nucleic Acids; D. Latorra et al., Molecular and Cellular Probes, 17, 253-259, 2003（文献１４）) や ENA (2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids; M. Koizumi, Cur. Opin. Mol. Ther.. 8, 144-149, 2006（文献１５））等が挙げられる。
以下に、本願発明の上記各IGC-GCプライマー及びこれらを組み合わせたプライマーセットの作製過程の概略を示す。
【００１８】
（ａ）まず、これまでに既知のIGC-GC の５’側保存領域の塩基配列を配置し、それと相同性の高い配列を、データベース上より、その由来によらず、また全ゲノム塩基配列情報の断片情報も含め、収集する。次に、専門のソフトウエアー（たとえば、Clustal W）を用い、各配列の中の、特にIGC-GCの保存領域に着目し、欠損や追加部位を考慮した上で、相互比較可能な形に配列化（アラインメント）する。
【００１９】
（ｂ）上記で再配列化した配列中、特にIGC-GC の保存領域の塩基配列間で、その個々の配列（A,T,G,C）のほとんどを網羅する配列を抽出し、規格化された共通表記手法（IUPAC nucleotide ambiguity codes; Cornish-Bowden, Nucl. Acids Res., 13, 3021-3030, 1985.（文献１６））に基づき記号化する。たとえば、比較する部位の塩基がA 又はTのいずれでもよいというように選択枝で構成されていればW という記号で表し順列化する。
【００２０】
（ｃ）上記（ｂ）で記号化された、IGC-GC の５.側保存領域の塩基配列情報より、その鋳型となる配列、選択枝記号の部分にあってはその元の配列の鋳型となる塩基の集合から鋳型の記号を求め、この領域を標的としたPCR プライマー配列を設計する。
【００２１】
（ｄ）一方、上記（ａ）〜（ｃ）で示した手法と同様に、IGC-GC の３.側保存領域の塩基配列を収集、配列化後、必要に応じて記号化する。これで得たIGC-GC の３.側保存領域の塩基配列や記号より、その鋳型となる塩基配列や記号を求め、この領域を標的としたPCR プライマー配列を設計する。
【００２２】
（ｅ）上記（ｃ）及び（ｄ）で設計されたIGC-GC 用PCR プライマー配列に基づき、DNA 合成装置等を用いて、５’側（フォワード）プライマー（ＧＣＰ１）および３’側（リバース）プライマー（ＧＣＰ２）を合成し、これらを組み合わせてIGC-GC用PCRプライマーセットとする。
【００２３】
上記ＧＣＰ１及びＧＣＰ２からなるIGC-GC 用PCR プライマーセットを用いて、新規機能遺伝子の探索、採取を行うには、以下の手法による。
（ａ）例えば、これまでIGC-GC システムの解析対象とされていない環境微生物試料（極限環境微生物試料など）のDNA 抽出試料溶液に、上記ＧＣＰ１及びＧＣＰ２からなるIGC-GC用PCR プライマーセットを加え、PCR 増幅を行い、増幅産物を得る。これにより、 使用したＤＮＡ抽出試料中にIGC-GC配列を含むＤＮＡがあれば、該IGC-GC配列が増幅され、この増幅された配列中には機能遺伝子の塩基配列が含まれる。 
【００２４】
（ｂ）次いで、該増幅産物の塩基配列を調べ、IGC-GC の５’側および３’側の両方の保存領域の塩基配列情報を含んでいることを確認する。
（ｃ）上記確認後、このIGC-GC の５’側および３’側の両方の保存領域に挟まれた塩基配列部位（機能遺伝子が位置するところ）に着目し、開始コドンおよび終了コドンの位置を探す。この際、開始コドンと終了コドンに挟まれた領域の順列は、５’→３’方向（正配列）であっても、３’５’方向（逆配列）であっても、それらが一つの配列内に重複して存在していてもよい。また、この開始コドンや終了コドンは、これら両保存領域に挟まれた部分に限らず、これらの保存領域内部にあってもよい。
【００２５】
（ｄ）上記IGC-GC の５’側および３’側の両方の保存領域の内側（保存領域内の配列を含む内側であってもよい）で、かつ開始コドンと終了コドンに挟まれた連続的な配列を抽出し、機能遺伝子の１単位（ORF: Open Reading Frame）の塩基配列情報とする。この際、一つのIGC-GC内に複数のORF が、５’→３’または３’→５’の方向を問わず、また、重なり合って存在してもよい。
（ｅ）上記（ｄ）で得られたORF の塩基配列情報から、アミノ酸配列を求め、そのアミノ酸配列に基づく相同性検索等により、そのタンパク質の機能や特徴を推定することができる。
【００２６】
以上の手法により、解析対象ＤＮＡ試料中の機能遺伝子の存在の有無、あるいはその機能、性質を推定することができるが、さらに、上記（ｄ）で得られた塩基配列情報（機能遺伝子の候補）に基づき、DNA 合成装置等を用いて人為的に機能遺伝子を合成し、該遺伝子を常法（J. Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.文献１７）により、大腸菌等に組み込みタンパク質を実際に発現させてもよい。
このような発現実験を行う場合、以下のようにして確認を行うことができる。
【００２７】
まず、発現産物を透析等で精製し、この精製産物をポリアクリルアミド電気泳動装置等を用いて解析する。
その配列長から推定される理論的な鎖長（分子サイズ）付近に、実際の発現産物のバンドが現れたかどうかを調べる。また、配列番号１または２に示される塩基配列を有する各ＤＮＡ分子の混合物、あるいは配列番号１又は２に示される塩基配列と相補の塩基配列を有する各ＤＮＡの混合物を、蛍光染色剤等のマーカーで標識してプローブとし、該プローブを用いて、サザン・ハイブリダイゼーション等を行うことにより、この精製産物を簡易同定することもできる。
【００２８】
このような発現実験により、導入した上記合成遺伝子由来の発現タンパク質の存在が確認できた場合、さらに、その塩基配列またはアミノ酸配列の相同性検索等から推定されるタンパク質の特徴や機能に着目し、実験的にその特徴や活性等を調べることで確認してもよい。
【００２９】
例えば、推定される発現産物がある種の酵素である場合、その基質となる可能性のある物質を用いて、その発現産物の機能の有無を実際に調べることで確認してもよい。また、その発現産物を結晶化し、Ｘ線解析等を用いた構造解析的手法により確認することもできる。
本発明においては、機能遺伝子の探索、採取のために使用する遺伝子試料の採取源として、単―微生物あるいは複数の微生物であるか、若しくはさらに真核生物又はウイルスを含有しているのかは問わない。本発明によれば、これら多様な生物が存在する環境そのものを機能遺伝子の探索、採取対象とすることができ、本発明のIGC-GCプライマーの幅広い適応性によれば、微生物以外の生物であっても、そのインテグロン・ジーンカセットを見いだし、その中の機能遺伝子を探索し得る可能性がある。
【００３０】
したがって、例えば、海洋等における極限環境において共生している微生物あるいは他の生物を分離することなく、環境試料からそのままＤＮＡを抽出し、本発明のIGC-GCプライマーを用いてＰＣＲ増幅して、機能遺伝子の探索、採取を行うことができる。また、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物は、それ自体で該極限環境において存在する生物全般が保有する機能遺伝子のライブラリーとなりうる。
【００３１】
本発明のIGC-GCプライマーを使用することにより、バイオインフォーマテフィクス的な機能遺伝子部位の探索、特定化、発現産物の推定、及び機能遺伝子の採取を効率的かつ容易に行うことができ、さらには、実際に、その発現産物の構造や機能、活性等に係わる実験的な確認作業により、より確実に機能遺伝子の同定ができ、本発明は、新規かつ有用な機能遺伝子の獲得に極めて有用な手段である。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。但し、本発明は実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００３２】
［実施例１］
インテグロン・ジーンカセット（IGC-GC）システムの保存領域と見なされている「59 塩基領域（59 base element）」を対象に、DNA データベース（http://srs.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html）より、病原細菌や一般微生物、環境クローン等に由来する全ての塩基配列情報約２００件を収集した。
【００３３】
配列化（アラインメント）後、既存のIGC-GC 用プライマー配列部位（「59 塩基領域」の中の一部で、HS287F [5'- GCSGCTKANCTCVRRCGTTAGSC -3']：非特許文献番号７）に注目し、IUPAC nucleotide ambiguity codes（文献１６）に照らして、その曖昧さ（ambiguity）を調べた。その結果、3'末端側の４塩基部分に不適合箇所を見いだした（HS287F 配列の下線AGSC 部分）。すなわち、主に病原菌等のデータに基づいて考案された既存プライマーの利用では、様々な環境微生物を対象に幅広く効率的に機能遺伝子情報を収集するという目的では、まだ問題があると考えられた。
【００３４】
そこで、収集した多くの配列データを比較検討しつつ、上記目的に適したプライマーの検討を行った。その結果、上記の不適合箇所（HS287F 配列の下線部分）において、既存のプライマーより適合性が広い「３ プリン塩基＋１ピリミジン塩基」からなる新しいプライマー配列（GCP1 [5'-GCSGCTKANCTCVRRCGTTRRRY-3']:配列番号１）を設計した。
【００３５】
同様に、既存のIGC-GC 用プライマー配列部位（「59 塩基領域」の中の一部で、HS286R [5'-TCSGCTKGARCGAMTTGTTAGVC-3']：非特許文献番号７）に注目し、IUPAC nucleotide ambiguity codes（文献１６）に照らして、その曖昧さ（ambiguity）を調べた。その結果、やはり3'末端側の４塩基部分に不適合箇所を見いだした（HS286R 配列の下線AGVC 部分）。すなわち、病原菌等で考案された当該プライマーでは、様々な環境微生物を対象に幅広く効率的に機能遺伝子情報を収集するという目的では、まだ問題があると考えられた。
【００３６】
そこで、可能な限り多くの配列データを比較検討しつつ、上記目的に適したプライマーの検討を行った。その結果、上記の不適合箇所（HS286R 配列の下線部分）において、HS287F プライマーの時と同様に、適合性が広い「３プリン塩基＋１ピリミジン塩基」からなる新しいプライマー配列（GCP2 [5'-TCSGCTKGARCGAMTTGTTRRRY-3']:配列番号２）を設計した。
【００３７】
上記GCP1 プライマー配列およびGCP2 プライマー配列に基づき、DNA 合成装置を用いて実際にその各々のDNA プライマーを合成した。
【００３８】
［実施例２］
実施例１で合成したDNA プライマー（GCP1, GCP2）を１つのセットとし、遺伝子増幅［PCR］用プライマーセットとした。このPCR プライマーセットの有効性を評価するため、海底熱水活動域より採取した熱水中微生物・懸濁物ろ過濃縮試料や微生物共生二枚貝試料を対象に、IGC-GC を標的とした遺伝子増幅を実施した。
【００３９】
用いた環境微生物試料は、伊豆小笠原弧の海底火山である水曜海山のカルデラ内海底熱水噴出孔（北緯28°56’、東経140°65’、水深約1,380 m（M. Sunamura et al., Appl. Environ. Microbiol., 70, 1190-1198, 2004.；文献１８、Y. Higashi et al., FEMS Microbiol. Ecol., 47, 327-336, 2004.；文献１９））やマリアナトラフの海底熱水噴出孔（北緯12°55.14’、東経143°38.92’、水深約2,000 m（M. Utsumi et al., Japan Earth and Planetary Science Joint Meeting, B002-016, 2004.；文献２０））より採取された熱水試料を元に、孔径0.2 um のメンブレンフィルターを用いてろ過濃縮して得られた。また、海底で採取された二枚貝の体内外を、洋上ラボ内で滅菌海水でよく洗浄し、遊離の微生物をできるだけ除去した後、共生細菌の生息が予想されるエラ部分のみ切断して得られた。
【００４０】
いずれの試料も、-30℃で凍結保存し、凍結状態のまま陸上ラボに輸送した後、常法に従ってDNAを抽出し（たとえば、C. Somerville et al., Appl. Environ. Microbiol., 55, 548-554, 1989.；文献２１、H. Elsaied et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 1751-1765, 2001；文献２２）、PCR 解析用試料とした。
【００４１】
上記試料を対象に、上記IGC-GC 部分の増幅用プライマーセットを用い、既報（H. Stokes et al., Appl. Environ. Microbiol., 67, 5240-5246, 2001.；文献２３）を参考にPCRを行った。このPCR 反応は、95℃３分で二本鎖DNA を遊離させた後、95℃１分、55℃40 秒、72℃３分の温度条件を30 回繰り返すことで実施され、最後に72℃10 分間処理された。
【００４２】
上記で得られたPCR 産物を、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen Life Technologies 社製, Carlsbad,Calif. USA）を用いて、その付属のマニュアルに従いながら、プラスミドベクターpCR2.1-TOPO にクローニング後、大腸菌TOP10 株に形質転換し、LB 培地（g/L; 10 g Bacto-tryptone, 5 g Bacto-eastextract, 5 g NaCl, pH 7.0-7.5）で一晩培養した。
【００４３】
上記の遺伝子組み換え大腸菌より、Qiagen Plasmid Purification kit (Qiagen, USA)を用いて、プラスミドDNA を精製および分取後、そのプラスミド中の挿入遺伝子塩基配列情報を、T7 プロモーターをプライマーとして、ABI Model 377 Sequencer (Applied Biosystems 社製、Foster City,USA)を用いて解読した。
【００４４】
得られた塩基配列情報については、以下の３つの基準でIGC-GC 領域からのものと断定した。すなわち、（１）PCR 増幅の標的とした59 塩基配列領域中の８塩基が存在すること（H. Stokes et al., Molecular Microbiology, 26, 731-745, 1997.文献２４）。（２）各々の端末にインテグレース（Integrase: Int）様配列が存在すること（文献２４）。（３）発現産物が50 アミノ酸以上で、ATG, GTG またはTTG 配列で始まるORF が存在すること。
【００４５】
上記（１）〜（３）の基準にかなった塩基配列情報については、FASTA による相同性検索を行い、相同性インデックス（ ｅ）が0.001 以下である場合に有為（検索対象に近似）と見なした。
実際には、上記海洋の極限環境由来の凍結DNA 試料のPCR 増幅試料の中で、任意に選抜した１５０クローンを母集団としてシークエンス解析した結果、その８０％以上（121 クローン）がIGC-GC と同定された。さらに、その中より、重複、近似、空の配列等をグループ化あるいは削除した結果、新しい機能遺伝子相当のものが４０％近く（46 個）にも達することがわかった（全てデータベース登録中）。
すなわち、多大な労力と時間を要する現在の網羅的なゲノム解析法を介した新規/有用機能遺伝子の探索法に比べ、本発明のIGC-GCプライマーを用いた方法は、大変安価でかつ大変効率的であることが分かる。
【００４６】
また、今回の解析の結果得られたIGC-GC の59 配列保存領域部のみに注目した場合、図１に示すように、その配列はおおよそ１３タイプ（図１中、SuGC17〜25、PiG10〜12,15、MuGC6）に分けられ、その６０％以上（８タイプ）ものものが全く新規なもの（図１中、＊で示される。）であり、既存プライマー（文献２３）では検出困難な遺伝子に相当することが明らかとなった。
なお、図１中EGC066,CSは、既存のIGC-GC配列であり（非特許文献８参照）、また、図１中の網掛け部はインテグレース結合部位の左側（ＩＬと２Ｌ）と右側（１Ｒと２Ｒ）を示し、中央の数字はこれら左右の保存領域に挟まれて存在する塩基の配列数を示す。 
【００４７】
すなわち、本発明のIGC-GCプライマーを使用することにより、既存プライマーを用いた従来法に比べて倍以上の効率で、環境試料中より新規/有用機能遺伝子を探索することが可能となる。
【００４８】
［実施例３］
本願発明のIGC-GCプライマーその有効性を確認するため、採取された遺伝子ORF のいくつかを対象とし、これらが実際に微生物細胞内で発現され得る状態にあるのかどうかを調べた。
標的とするORF 遺伝子は、クローニングされたプラスミドベクターpCR2.1-Topo 試料からのPCR増幅により得られた。発現遺伝子のATG 開始コドン周辺部位およびTAA 終了コドンの後の部位で、かつその間に挟まれる遺伝子の発現を妨げない部位に、特異的な制限酵素作用部位が来るよう調整した。
【００４９】
標的遺伝子は、pQE-30 あるいはpQE-60（QIA express kits, no. 32149 or 32169, Qiagen, USA）のベクターにクローニング後、大腸菌SG13009 株を用いて、実際にタンパク質発現が見られるかどうかを調べた。このクローニングされた位置が適切であったかどうかは、シークエンス解析により別途確認した。
具体的には、上記組換え体（大腸菌）を、100 ug/ml アンピシリンと20 ug/ml カナマイシンを含むLB 液体培地中で37 ℃ で増殖させた。595 nm での吸光度が0.5-1.0 の時、1 mM のisoprophyl-B-D-thiogalactoside を添加し、その発現を誘導した。
【００５０】
上記組換え体を数時間から半日間培養後、高速遠心分離器で菌体を回収し、専用のバッファー（100 mM NaH2PO,10 mM Tris-HCl, 6M GuHCl, pH 8.0）中で溶菌させた。
遠心分離後、その上清からNi-NTA アフィニティー・クロマトグラフィー（QIAexpress kit）により、可溶化したHis タグ標識(His-tagged)タンパク質を回収し、セルロース・メンブラン透析膜（MWCO 8000, Spectrum Labs, USA）を用いて、透析用バッファー（25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1 mM B-mercaptoethanol, 0.1% Tween 20, 20% glycerol）中に透析し、精製した。その後、SDS-PAGE 解析により、精製物中のタンパク質の存在やサイズ特性等を調べた。
【００５１】
その結果を図２に示す。図中 、Mはマーカータンパク質Precision Plus proteins (catalog no. 161-0373,Bio-Rad)を示し、Ｉ〜Ｖは、導入した遺伝子由来の発現タンパク質を示し、図中の数字はその分子サイズ（キロダルトン）を示す。発現タンパク質の分子サイズはそれぞれ以下のとおりである。
【００５２】
I： MuGC1.Sym1.ORF1 (19.44 kD)、II；MuGC3.Sym3.ORF3 (22.33 kD)、III； MuGC2.Sym2.ORF2 (24.52 kD)、 IV； MuGC4.Sym4.ORF4 (29.77kD)、 V； MuGC6.Sym6.ORF6 (48.37 kD)
これにより、対象とした５種遺伝子の全てにおいて発現産物が確認され、それぞれの遺伝子サイズによく対応した大きさのタンパク質が、この大腸菌発現系により生産されたことが明らかとなった。
【００５３】
上記のうち、得られた遺伝子塩基配列情報からのアミノ酸配列の推定には、Transeq (European Bioinformatics, http://www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/)等を用いた。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】実施例２で得られた１３タイプの特徴的な59 塩基領域の保存部位の塩基配列と、既報の配列と並べて表示した図である。
【図２】実施例３で得られた、二枚貝共生菌に由来するIGC-GC 部分のORF 発現産物（精製タンパク質）のSDS-PAGE (12%)画像である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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