(57)【要約】【課題】特に基礎研究の分野において、あらゆる細胞に遺伝子導入できる実験系を構築するための遺伝子導入方法を提供することを課題とする。また、該遺伝子導入方法に使用しうるトランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。さらには、従来開発されたアデノウイルス（Ad）ベクターに関し、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Adベクターと該Adベクターとの組み合わせにおいて、遺伝子を導入しうる細胞を用いた遺伝子導入方法を提供することを課題とする。【解決手段】抗タグ抗体発現細胞または抗タグ抗体発現非ヒトトランスジェニック動物による。タグ付与型Adベクターと、前記タグ付与型Adベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることによる。【選択図】図２
2008283882.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
抗タグ抗体が、抗ヒスチジン(His)タグ抗体、抗フラッグ(FLAG)タグ抗体、抗HAタグ抗体、抗Mycタグ抗体、抗HSVタグ抗体、抗CBDタグ抗体、抗Nusタグ抗体および抗GSTタグ抗体から選択される少なくとも１種の抗体である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３】
抗タグ抗体が、抗ヒスチジン(His)タグ抗体である請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４】
タグ付与型アデノウイルスベクターと、前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とするタグ付与型アデノウイルスベクター上の遺伝子の細胞への導入方法。
【請求項５】
前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が、該抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物由来である、請求項４に記載の遺伝子導入方法。
【請求項６】
前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、ヒスチジン(His)タグ、フラッグ(FLAG)タグ、HAタグ、Mycタグ、HSVタグ、CBDタグ、NusタグおよびGSTタグから選択される少なくとも１種である、請求項４または５に記載の遺伝子導入方法。
【請求項７】
前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、ヒスチジン(His)タグである、請求項４または５に記載の遺伝子導入方法。
【請求項８】
タグ付与型アデノウイルスベクターを、請求項１〜３のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与することを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タグ抗体発現細胞を含むタグ抗体発現トランスジェニック非ヒト動物に関する。さらには、アデノウイルスゲノムにタグペプチドをコードするDNAが付与されたタグ付与型アデノウイルスベクターおよび抗タグ抗体発現細胞を用いたアデノウイルスベクター上の遺伝子の細胞への導入方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、遺伝子治療のベクターとして用いられているアデノウイルスベクターは、サブグループＣ(sub-group C)に属した５型（あるいは２型）のヒトアデノウイルスを基盤としている。ヒトアデノウイルスはＡからＦまでのサブグループに分けられ、少なくとも５１種類の血清型(serotype)が知られているが、サブグループＢ(sub-group B)に属するウイルスを除き、多くのアデノウイルス（５型アデノウイルスを含む）はレセプターとしてcoxsackievirus and adenovirus receptor（CAR）を認識して細胞に感染する（非特許文献１）。
【０００３】
アデノウイルスはエンベロープを持たず、２５２個のカプソメアよりなる正２０面体構造をしている。そのうち頂点にある１２個のカプソメアは突起構造を持ったペントン（ペントンベースとファイバーから成る）と呼ばれ、他の２４０個はヘキソンと呼ばれる。ウイルスの細胞内への侵入（感染）は、ファイバーが受容体のCARに結合し（非特許文献１）、その後ペントンベースのRGDモチーフが細胞表面上のインテグリンに結合することによって起こる（非特許文献２、３）。エンドソームに達したウイルスは酸性条件下でカプシドタンパク質の構造変化を起こし、エンドソームを破壊して、細胞質内に侵入する。従って、細胞表面上の受容体であるCARにウイルスのファイバーが結合するのが、ウイルスが細胞へ導入される第一ステップであり、ファイバーを修飾することにより、ベクターの感染域を変えることができると考えられる（非特許文献４）。
【０００４】
CARの発現が乏しいために、従来の５型アデノウイルスベクターによる効率の良い遺伝子導入が困難な細胞種は意外と多く、そのような細胞として、造血幹細胞をはじめとする血液系細胞、樹状細胞、血管平滑筋細胞、骨格筋細胞、滑膜細胞などが知られている。
【０００５】
また、癌細胞は、悪性度の進行と共にCARの発現低下およびアデノウイルスベクターでの遺伝子導入効率が低下することが報告されており（非特許文献５、６）、アデノウイルスベクターを用いて癌を対象とした遺伝子治療臨床研究を進める上で、考慮すべき問題と考えられる。さらに気道上皮細胞はCARを発現しているものの、タイトジャンクション構成部位（あるいは側底膜側）に局在しているため、上皮側からアデノウイルスベクターを作用させてもCARとは接触できず、効率の良い遺伝子導入が困難である場合もある。
【０００６】
アデノウイルスベクターによる遺伝子導入時のCAR依存性を克服するために、ファイバータンパク質を改変した改良型ベクターの開発が進んでいる。ファイバータンパク質はテール、シャフト、ノブからなり、ノブ領域がCARと結合する。ファイバーノブの外来ペプチドの挿入部位として適したHIループやＣ末端領域に、１ステップのin vitroライゲーションで任意のペプチドコード遺伝子を挿入できるシステムが報告されており、極めて簡便に種々のペプチドをファイバーに表現した改変型アデノウイルスベクターが作製できるようになった（非特許文献７、８；特許文献１〜３）。例えば、αvインテグリンに親和性があるRGD(Arg-Gly-Asp)ペプチドや、ヘパラン硫酸に親和性があるポリリジン（KKKKKKK;Ｋ７（配列番号１））ペプチドをファイバー表面上に遺伝子工学的に表現させることにより、CARを発現していない細胞に対しても効率良く遺伝子を導入することができる。これらのベクターは、αvインテグリンやヘパラン硫酸が、多くの細胞で発現していることから、広範な細胞種・目的への適用が期待できる。一方、これらの分子を発現していない細胞も依然として存在している。RGDペプチド、ポリリジンペプチド、またはTAT（GRKKRRQRRRPQ（配列番号２））ペプチドを付与したAdベクターでも遺伝子導入が困難な細胞は種々存在する。あらゆる細胞に遺伝子導入できる実験系の開発は、遺伝子治療のみならず、遺伝子の機能解析を目的とした基礎研究の遂行にとって重要な基盤技術となる。
【０００７】
従来より、複数のタンパク質が混在する溶液中から所望のタンパク質のみを分離精製するために、タグと呼ばれるオリゴペプチドが使用されている。例えば或るタンパク質を大腸菌などの微生物に作らせる場合、そのタンパク質をコードする遺伝子にタグをコードする遺伝子を連結させ、得られた遺伝子を微生物に導入すると、タグ付きのタンパク質が微生物中で産生される。微生物中では他のタンパク質も産生されるので、そのタグを利用して複数のタンパク質から前記タンパク質を分離精製することができる。例えば、ヒスチジン(His)タグ（以下単に「Hisタグ」という。）を使用する場合は、ニッケルアガロースカラムにタンパク質が混在する溶液を接触させることで前記カラムにHisタグが結合するので、前記タンパク質がHisタグを介してカラムに付着する。そこで前記タンパク質のみを分離することができる。フラッグ(FLAG)ペプチドをタグとして使用する場合（以下単に「FLAGタグ」という）は、抗FLAGタグ抗体を結合させたカラムにタンパク質が混在する溶液を接触させることで、FLAGタグと抗FLAGタグ抗体とが結合することを利用して、Hisタグの場合と同様に前記タンパク質のみを分離することができる。このような、タグを用いたタンパク質の精製は、タグとその反応物質とのアフィニティーを利用することによる。
【非特許文献１】Science 275: 1320-1323, 1997
【非特許文献２】J Virol 67: 5198-5205, 1993
【非特許文献３】Cell 73: 309-319, 1993
【非特許文献４】Hum Gene Ther 10: 2575-2576, 1999
【非特許文献５】Cancer Res. 61: 6592-6600, 2001
【非特許文献６】Cancer Res. 62: 3812-3818, 2002
【非特許文献７】Gene Ther. 8: 730-735, 2001
【非特許文献８】J. Gene Med., 5: 267-276, 2003
【特許文献１】米国出願  09/845,160
【特許文献２】特許第３６３５４６２号公報
【特許文献３】特開２００３−２５０５６６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、特に基礎研究の分野において、あらゆる細胞に遺伝子導入できる実験系を構築するための遺伝子導入方法を提供することを課題とする。また、該遺伝子導入方法に使用しうるトランスジェニック非ヒト動物を提供することを課題とする。さらには、従来開発されたアデノウイルス（以下、「Ad」という。）ベクターに関し、より効果的に各種細胞に遺伝子導入可能な改変型Adベクターと該Adベクターとの組み合わせにおいて、遺伝子を導入しうる細胞を用いた遺伝子導入方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Adベクター側の改変のみならず、Adベクターと反応させる細胞についても改変を行うことに着目し、鋭意研究を重ねた結果、より効果的に細胞に遺伝子を導入しうることを見出だし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下よりなる。
１．抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物。
２．抗タグ抗体が、抗Hisタグ抗体、抗FLAGタグ抗体、抗HAタグ抗体、抗Mycタグ抗体、抗HSVタグ抗体、抗CBDタグ抗体、抗Nusタグ抗体および抗GSTタグ抗体から選択される少なくとも１種の抗体である前項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
３．抗タグ抗体が、抗Hisタグ抗体である前項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
４．タグ付与型アデノウイルスベクターと、前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とするタグ付与型アデノウイルスベクター上の遺伝子の細胞への導入方法。
５．前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が、該抗タグ抗体を発現しうるトランスジェニック非ヒト動物由来である、前項４に記載の遺伝子導入方法。
６．前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、Hisタグ、FLAGタグ、HAタグ、Mycタグ、HSVタグ、CBDタグ、NusタグおよびGSTタグから選択される少なくとも１種である、前項４または５に記載の遺伝子導入方法。
７．前記タグ付与型アデノウイルスベクターに付与したタグが、Hisタグである、前項４または５に記載の遺伝子導入方法。
８．タグ付与型アデノウイルスベクターを、前項１〜３のいずれか１に記載のトランスジェニック非ヒト動物に投与することを特徴とする、前項５〜７のいずれかに記載の遺伝子導入方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明はタグ付与型Adベクターと、前記タグ付与型Adベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とする遺伝子導入方法であり、タグと抗タグ抗体のアフィニティーを利用することにより、従来は細胞内にAdベクターを導入するのが困難な場合でも、容易に細胞に導入することができる。
抗タグ抗体を発現しうる細胞として、in  vitroでの細胞や、本発明のトランスジェニック非ヒト動物を用いると、タグ付与型Adベクターに担持した遺伝子をトランスジェニック動物に導入することで、より効果的に遺伝子を細胞に導入させることが可能となり、導入した遺伝子の作用解明など、基礎研究の分野において、効果が期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の遺伝子導入方法には、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が必要である。そこで、以下、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞について説明し、さらに本発明の遺伝子導入方法について説明する。
【００１３】
（タグ付与型Adベクター）
本発明において、タグ付与型Adベクターは、Adゲノムのカプシドタンパク質のいずれかをコードする遺伝子配列の部位に、タグペプチドをコードするDNAをライゲーション等により挿入させることにより構成される。タグ付与型Adベクターは、自体公知の方法により調製することができる。例えは、FLAGタグを付与したAdベクターについてはJ. VIROLOGY, Mar., 1844-1852 (1998)やGeneTherapy 14, 266-274 (2007)に記載のものを利用することができる。また、本発明においては、これに限定されるものではなく、以下の方法により調製したものを利用することができる。
【００１４】
本発明において、Adとはアデノウイルスをさし、本発明において使用可能なAdは、in vivoまたはin vitroでDNAやRNAなどの核酸配列を種々のタイプの細胞へ導入するビヒクルとしての機能を達成しうるものであれば良く、特に限定されない。代表的には、ヒトを宿主とする２型、５型、１１型、３５型の各Ad、ヒト以外を宿主とするサルAd、マウスAd、イヌAd、ヒツジAdおよびトリAdなどが挙げられる。
【００１５】
本発明においてAdゲノムとは特に限定されないが、特定の細胞種でのみ複製できるようにしたAdのゲノム、具体的にはＥ１領域欠損型Adや、制限増殖型Adのゲノムなどが好適であり、特に好適にはＥ１領域欠損型のAdゲノムが挙げられる。特定の細胞種でのみ複製できるとは、例えばＥ１領域欠損型Adについては２９３細胞で、制限増殖型Adについては２９３細胞や癌細胞でのみ増殖できることをいう。２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞を５型AdのＥ１遺伝子によりトランスフォーメーションして樹立された細胞株であり、Ｅ１タンパク質を恒常的に発現している。
【００１６】
Ｅ１領域欠損型Adゲノムとは、Ｅ１領域を欠損するAdゲノムをいい、制限酵素によりＥ１領域を切断し、欠損させたAdゲノムをいう。Ｅ１領域欠損とは、Ｅ１タンパク質をコードする領域を機能的に欠損させることを意味する。機能的に欠損させるとは、例えば、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現させないようにすることであり、Ｅ１タンパク質をコードする遺伝子のすべてを欠損している必要はない。
一般に、AdにおいてＥ１領域を欠損させると、Ｅ１タンパク質を発現している細胞（例えば、２９３細胞）以外では増殖することができない。
【００１７】
５型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）の場合において、Ｅ１領域とは、具体的には３４２〜３２５３番目に相当する。したがって、本発明のAdベクタープラスミドは、宿主細胞内で機能するＥ１タンパク質を発現しないのであれば、３４２〜３２５３番目の領域の一部を有するものであってもよい。
【００１８】
本発明の改変型Adベクタープラスミドは、Ｅ１領域の他に、例えばＥ３領域を欠損させた５型Adゲノムの一部または全部であっても良い。５型Adゲノム（GenBank Accession番号：M73260, M29978）のＥ３領域とは、２８１３３〜３０８１８番目または２７８６５〜３０９９５番目に相当する部位をいう。
【００１９】
制限増殖型Adは、Ｅ１タンパク質の発現が例えば癌細胞でのみ起こるAdであり、NATURE MEDICINE, 7, 781-787 (2001)に報告されているものを例示することができる。
【００２０】
本発明において、Adゲノムのカプシドタンパク質とは、ウイルスゲノムの表面タンパク質をいい、具体的にはファイバー、ヘキソン、ペントンベース、ｐＩＸ（プロテインＩＸ）などが挙げられる。ファイバータンパク質は、ノブ、シャフト、テールより構成され、ファイバーノブ、ファイバーシャフト、ファイバーテールともいう。カプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位とは、これらのタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位であればよく、特に限定されないが、好適にはファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列の部位が挙げられる。
【００２１】
ファイバーノブのHIループコード遺伝子配列とは、Adのファイバー分子のアミノ酸５３７から５４９までの領域をコードする塩基配列をさす。HIループのアミノ酸は大部分が親水基であり、ノブ領域の外側に配向している。この領域に、外来ペプチドをコードするDNAが挿入されてもファイバーの３量体形成には影響を及ぼさない。例えば、５型Adでは、該ウイルスのゲノムDNAの３２６４３〜３２６８５番目に相当する。
【００２２】
本発明におけるタグペプチドは、Adに対して外来ペプチドであり、タグとしての機能を有するペプチドであれば良く、特に限定されない。タグペプチドの例として、Hisタグ、FLAGタグ、HAタグ、Mycタグ、HSVタグ、CBDタグ、NusタグおよびGSTタグ等が挙げられる。
【００２３】
具体的には、以下で示されるペプチドが挙げられる。
Hisタグ：HHHHHH（配列番号３）
FLAGタグ：DYKDDDDK（配列番号４）
HAタグ：YPYDVPDYA（配列番号５）
c-mycタグ：EQKLISEEDL（配列番号６） 
HSVタグ：QPELAPEDPEA（配列番号７）
CBD（セルロース結合ドメイン）タグ
Nusタグ：MNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKKYEQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNLGDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIITGVVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPEARGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVKTNDKRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMAPADVASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVMTVDDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPMKELLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEGVDRDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNICWFGDEA（配列番号８））
GST（グルタチオン- S-トランスフェラーゼ）タグ：グルタチオンに結合する
T7タグ：MASMTGGQQMG（配列番号９）
V5タグ：GKPIPNPLLGLDST（配列番号１０）
VSV-Gタグ：水胞性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）のC-末端の5アミノ酸を含むエピトープ  YTDIEMNRLGK（配列番号１１）
タグとしての機能を有するのであれば、例えば、上記に具体的に例示した各ペプチドのうち、１〜２個程度のアミノ酸が置換、欠失、付加されたものであっても良い。
【００２４】
挿入するタグペプチドをコードするDNAの塩基配列は、具体的には上記に例示した各ペプチドをコードするものであればよく、どのような配列であっても良い。また、以下の配列からなるオリゴヌクレオチドDNAのほか、これらの配列のうち、１〜複数程度のヌクレオチドの置換、欠失、付加若しくは誘導されたもの、更にはそれらの塩基配列の相補的配列からなるオリゴヌクレオチドDNAであっても良い。
例えば、HisタグをコードするDNAの塩基配列は、以下が挙げられる。
オリゴヌクレオチド1 (5'- cat cac cat cac cat cac -3')（配列番号１２）
オリゴヌクレオチド2 (5'- gtg atg gtg atg gtg atg -3')（配列番号１３）
【００２５】
本発明の改変型Adベクターの作製方法は、Adゲノムのカプシドタンパク質の何れかをコードする遺伝子配列の部位に、外来ペプチドをコードするDNAとして、タグペプチドをコードするDNAを、ライゲーション反応により挿入することを特徴とする。タグペプチドをコードするDNAの導入は、Adのカプシドタンパク質、例えばファイバーノブのHIループコード遺伝子配列中および／若しくはＣ末端コード遺伝子配列中に、該遺伝子配列にユニークな制限酵素認識配列を挿入し、該遺伝子配列中にタグペプチドをコードするDNAを導入することにより達成される。
【００２６】
ユニークな制限酵素認識配列とは、AdゲノムDNAに本来存在しない制限酵素認識配列を意味し、例えば、制限酵素Csp45I、ClaI、SwaI、PacI、XbaI、I-CeuI、PI-SceI、I-PpoI、I-SceIにより認識される配列が挙げられる。
【００２７】
上記ユニークな制限酵素認識配列の、カプシドタンパク質、例えばファイバーノブのHIループコード遺伝子配列またはファイバーノブのＣ末端コード遺伝子配列への挿入は、例えば本実施例に記載したようにして実施することができる。また、タグペプチドをコードするDNAの導入は、例えば、該ペプチドコードDNAと上記のユニークな制限酵素認識配列とを有するオリゴヌクレオチドDNAを合成し、HIループコード領域またはＣ末端コード領域にあらかじめ挿入している制限酵素で切断することによって調製したDNA中に、直接ライゲーションすることによって達成することができる。
【００２８】
（抗タグ抗体）
本発明の遺伝子導入方法には、タグ付与型Adベクターおよび該付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞が必要である。ここで、抗タグ抗体は、通常のモノクローナル抗体を取得する方法により入手することができる。モノクローナル抗体は、本発明のタグペプチドに含まれるアミノ酸配列を含む抗原、具体的には、タグペプチドに含まれるアミノ酸のうち連続する少なくとも３つのアミノ酸配列もとにして、ケーラーとミルシュタインの方法（Kohler and Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)）等の公知の方法に従って作製することができる。
【００２９】
具体的には、骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトなど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製する方法も、公知の方法を採用することができ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。融合操作後の細胞は、公知の方法により選択培地で培養し、ハイブリドーマを選択することができる。生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るために、培養上清を採取して抗体価アッセイを自体公知の方法により行うことができる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、公知の凍結保護剤の共存下に凍結させて-193〜-70℃で保存することができる。ハイブリドーマの培養上清等からのモノクローナル抗体の精製は、自体公知の方法により行うことができる。
【００３０】
本発明の抗体は、上記具体例に限定されるものではなく、タグペプチドを特異的に認識しうるモノクローナル抗体であればよい。
【００３１】
（抗タグ抗体発現細胞：培養細胞系）
抗タグ抗体発現細胞は、自体公知の抗体発現細胞の調製方法により達成することができる。特定の抗タグモノクローナル抗体を生産する特定のハイブリドーマより、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを有する動物細胞用発現ベクターに挿入して、抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより抗体を発現させることができる。
【００３２】
特定の抗タグ抗体発現ベクターとは、それぞれ特定の抗体をコードするcDNAが組み込まれた発現ベクターであり、発現ベクターに特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを挿入することにより構築することができる。ここにおいて、抗タグ抗体をコードする遺伝子は、特定の抗タグ抗体を発現しうる塩基配列からなるcDNAであればよい。そのような塩基配列としては、本発明の抗タグ抗体をコードする塩基配列からなるcDNAの他、遺伝子コドンと縮重のため、抗タグ抗体と同じアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAも含み、さらにそれらの相補鎖も含まれる。
【００３３】
発現ベクターとしては、抗体定常領域をコードするcDNAを組込み、発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133 (1990))、pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987))、pHSG274 (Gene, 27 ,223 (1984))、pKCR (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78, 1527 (1981))、pSG1βd2-4(Cytotechnology, 4, 173 (1990))等があげられる。例えば動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、自体公知のものを使用することができ、SV40の初期プロモーターとエンハンサー(J. Biochem. 101, 1307 (1987))、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR プロモーターとエンハンサー(Biochem. Biophys. Res. Comun., 149, 960 (1987))、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター((Cell, 41, 479 (1985))とエンハンサー((Cell, 33, 717 (1983))等があげられる。
【００３４】
宿主細胞への導入法として、特定の抗タグ抗体発現ベクターをエレクトロポレーション法(特開平2-257891、Cytotechnology, 3, 133 (1990))等により同時に宿主細胞に導入する方法と、抗体発現ベクター（タンデム発現ベクター）を構築し、これを宿主細胞に導入する方法(BIO/TECHNOLOGY, 9, 64 (1991))等があげられる。これにより、抗体発現細胞を得ることができる。
【００３５】
得られた形質転換株を培地中で培養することで培養液中に抗体を生成蓄積させることができる。得られた抗体の活性は酵素免疫抗体法（ELISA法: 抗体実験マニュアル、E. Harlowら編、Cold Spring Harbor Laboratory 刊、1988年）により測定することができる。
【００３６】
（抗タグ抗体発現細胞：非ヒトトランスジェニック動物）
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、特定の抗タグ抗体を発現させてなる非ヒトトランスジェニック動物である。
【００３７】
本発明における非ヒトトランスジェニック動物としては、ヒト以外の哺乳動物が挙げられ、例えば、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウスなどが挙げられる。特に、モルモット、ラット、マウスなどのげっ歯類が取扱いが容易であるため好ましく、中でもマウスが好ましい。
【００３８】
本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）において、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE-デキストラン法などにより導入遺伝子である特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入することにより作製することができる。また、該遺伝子導入方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする特定の抗タグ抗体をコードするcDNA遺伝子を転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもできる。さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞配合法により融合させることにより抗タグ抗体発現トランスジェニック動物を作製することができる。
【００３９】
特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを対象動物に導入させる際、当該遺伝子を対象となる動物の細胞で発現させうるプロモーターの下流に連結した遺伝子構築物として導入することが好ましい。具体的には、目的とする特定の抗体をコードするcDNAを有する各種哺乳動物由来の特定の抗体をコードするcDNAに係る遺伝子を発現させうる各種プロモーターの下流に、該特定の抗体をコードするcDNAを連結したベクターを対象となる哺乳動物の受精卵（例えば、マウス受精卵）へマイクロインジェクションすることによって、目的とする特定の抗タグ抗体を高発現するトランスジェニック動物を作製することができる。
【００４０】
特定の抗タグ抗体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。遺伝子発現の調節を行うプロモーターとしては、たとえばウイルス（サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、など）由来遺伝子のプロモーター、各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）由来遺伝子［例えば、アルブミン、インスリンII、エリスロポエチン、エンドセリン、オステオカルシン、筋クレアチンキナーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1，K10およびＫ14、コラーゲンI型およびII型、心房ナトリウム利尿性因子、ドーパミンβ−水酸化酵素、内皮レセプターチロシンキナーゼ、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、MHCクラスI抗原、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子１α（EF-1α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、レニンなどの遺伝子］のプロモーターなどが挙げられる。上記ベクターは、トランスジェニック哺乳動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結するターミネターを有していてもよい。その他、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAをさらに高発現させる目的で、各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも所望により可能である。
【００４１】
受精卵細胞段階における特定の抗タグ抗体をコードするcDNAの導入は、対象動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保することが好ましい。遺伝子を受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに抗タグ抗体を過剰に有する。導入遺伝子を相同染色体の両方に持つホモ接合体の動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫について該遺伝子を安定に保持し、また、該遺伝子を過剰に有することを確認して、通常の飼育環境で繁殖継代することができる。
【００４２】
トランスジェニック対象動物が有する内在性の遺伝子とは異なる遺伝子である外来性特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを、好ましくはマウスなどの対象動物、またはその先祖の受精卵に転移する際に用いられる受精卵は、同種の雄哺乳動物と雌哺乳動物を交配させることによって得られる。受精卵は自然交配によっても得られるが、雌哺乳動物の性周期を人工的に調節した後、雄哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌哺乳動物の性周期を人工的に調節する方法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン(PMSG)）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン(hCG)）を例えば腹腔注射などにより投与する方法が好ましい。
【００４３】
得られた受精卵に前述の方法により外来性特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入した後、雌動物に人工的に移植、着床させることにより、外来性遺伝子を組み込んだDNAを有する非ヒト動物が得られる。好ましくは、黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）を投与後、雄動物と交配させることにより、受精能を誘起された偽妊娠雌動物に得られた受精卵を人工的に移植・着床させることができる。遺伝子を導入する全能性細胞としては、マウスの場合、受精卵や初期胚を用いることができる。また培養細胞への遺伝子導入法としては、トランスジェニック動物個体の産出高率や次代への導入遺伝子の伝達効率を考慮した場合、DNAのマイクロインジェクションが好ましい。
【００４４】
遺伝子を注入した受精卵は、次に仮親の卵管に移植され、個体まで発生し出生した動物を里親につけて飼育させたのち、体の一部（マウスの場合には、例えば、尾部先端）からDNAを抽出し、サザン解析やPCR法により導入遺伝子の存在を確認することができる。導入遺伝子の存在が確認された個体を初代（Founder）とすれば、導入遺伝子はその子（Ｆ１）の５０％に伝達される。さらに、このＦ１個体を野生型動物または他のＦ１動物と交配させることにより、２倍体染色体の片方（ヘテロ接合）または両方（ホモ接合）に導入遺伝子を有する個体（Ｆ２）を作成することができる。
【００４５】
あるいは、抗タグ抗体発現非ヒトトランスジェニック動物は、上記した特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入遺伝子としてES細胞に導入することによって作製することもできる。例えば、正常マウス胚盤胞に由来するHPRT陰性（ヒポキサンチングアニン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を欠いている）ES細胞(embryonic stem cell)に、特定の抗タグ抗体をコードするcDNAを導入する。特定の抗タグ抗体をコードするcDNAがマウス内在性遺伝子上にインテグレートされたES細胞をＨＡＴセレクション法により選別する。次いで、選別したES細胞を、別の正常マウスから取得した受精卵（胚盤胞）にマイクロインジェクションする。該胚盤胞を仮親としての別の正常マウスの子宮に移植する。そうして該仮親マウスから、キメラトランスジェニックマウスが生まれる。該キメラトランスジェニックマウスを正常マウスと交配させることによりヘテロトランスジェニックマウスを得ることができる。該ヘテロトランスジェニックマウス同士を交配することにより、ホモトランスジェニックマウスが得られる。
【００４６】
（遺伝子導入方法）
上記方法でクローニングされた抗タグ抗体をコードするcDNAを、適当なプロモーターに結合してプラスミドコンストラクションを行い、トランスジーンベクターを作製することができる。作製されたトランスジーンベクターを線状化し、マイクロインジェクション法やレトロウイルスを用いた感染等によって受精卵に導入することができる。
【００４７】
マイクロインジェクション後、一般的には、生まれた胚の１０−４０％に染色体への導入遺伝子の安定な組み込みが起こっている。選択されたマウス染色体に目的とする遺伝子の組み込みが起こっているかどうかをＰＣＲ法、サザンブロット法等により確認することが好ましい。このマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、本発明の本件抗タグ抗体発現マウスを作製することができる。
【００４８】
本件抗タグ抗体発現マウスが生起しているか否かを確認する方法としては、例えば、上記の方法により得られたマウスからRNAを単離してノーザンブロット法等により調べ、またはタンパク質を抽出してウェスタンブロット法等により調べる方法がある。
【００４９】
本発明は、Adベクターを用いた遺伝子導入方法の他、抗タグ抗体を発現しうる、トランスジェニック非ヒト動物にも及ぶ。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００５１】
（実施例１）Hisタグ付与Adベクターの調製
Hisタグ配列をファイバーC末端に付与したAdベクターは以下の方法により作製した。
ベクタープラスミドpAdHM41 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)をClaI処理し、オリゴヌクレオチド１（配列番号１４）およびオリゴヌクレオチド２（配列番号１５）を挿入した（pAdHM41-CHis1）。
【００５２】
オリゴヌクレオチド１：5'-c gga cca tca gcc tcc gca tct gct tcc gcc cct gga tcg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac taa taa gg-3'（配列番号１４）
オリゴヌクレオチド２：5'-c gcc tta tta gtg atg gtg atg gtg atg cga tcc tct cga tcc agg ggc gga agc aga tgc gga ggc tga tgg tc-3'（配列番号１５）
【００５３】
得られたpAdHM41-CHis1をI-CeuI/PI-SceIで消化し、CMVプロモーター制御下でルシフェラーゼを発現するpCMVL1 (J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)のI-CeuI/PI-SceI消化フラグメントとライゲーションし、改変型ベクタープラスミドpAdHM41-CHis1-L2を作製した。次に、pAdHM41-CHis1-L2をウイルスゲノム末端に存在する制限酵素PacIで切断して線状にし、市販のトランスフェクション試薬SuperFectTM(Qiagen社)を用いて２９３細胞にトランスフェクションした。約１０日間培養後、ルシフェラーゼ発現AdベクターAd-CHis1-L2を得た。野生型のファイバーをもったルシフェラーゼ発現AdベクターAd-L2は、以前作製したものを用いた(J. Gene Med., 5: 267-276, 2003)。作製したAdベクターを２９３細胞を用いて増幅し、塩化セシウム密度勾配遠心法にて精製した。各ベクターの粒子数 (vector particle; VP) の測定はSDS-OD260法で測定した。
【００５４】
（実施例２）抗Hisタグ抗体発現細胞の作製
１）抗Hisタグ抗体発現プラスミドの作製
市販のベクタープラスミドであるpDisplay TM（Invitrogen社）のSalI部位を、オリゴヌクレオチド３（配列番号１６）、オリゴヌクレオチド４（配列番号１７）を用いてSfiI認識部位に変更した。
上記pDisplay TM（Invitrogen社）は、カナマイシン耐性遺伝子を含み、シグナルペプチドとHA(hemagglutinin A)タグを含み、血小板由来増殖因子B (PDGFB)の膜貫通ドメイン(transmembrane domain)をコードした遺伝子を有する。該ベクタープラスミドを使用するのは、発現タンパク質を細胞表面に表示させるためである。
【００５５】
オリゴヌクレオチド３：5'-tcg agg cct cgg ggg cca-3'（配列番号１６）
オリゴヌクレオチド４：5'-t cga tgg ccc ccg agg gc-3'（配列番号１７）
【００５６】
上記ベクタープラスミドをSfiIで切断し、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体をコードした遺伝子を含むpAK100His2 (Dr. Andreas Plueckthun, Universitaet Zurich, Switzerland)のSfiI消化しフラグメントとライゲーションし、HAタグ抗体発現プラスミドであるpDis-Hisプラスミドを作製した。pDis-Hisは、シグナルペプチド・HAタグコード遺伝子とPDGFR膜貫通ドメインコード遺伝子の間に、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体遺伝子を含んでおり、CMVプロモーター制御下で、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現する。
また、CMVプロモーターをCAプロモーター(β-actin promoter/CMV enhancer with β-actin intron)（宮崎純一先生（大阪大学）より供与）に置き換えたHAタグ抗体発現プラスミドであるpDis-CAHis2プラスミドも作製した。
【００５７】
２）抗Hisタグ抗体発現細胞の作製
CHO（chinese hamster ovary）細胞5 ×103cellsを９６穴マイクロプレートに播種して、３時間３７℃で培養した。
その後、上記により得たベクタープラスミド（pDisplay TM(Invitrogen社)）、抗Hisタグ抗体発現プラスミド（pDis-His）、Hisタグ抗体発現プラスミド（pDis-CAHis2）を市販のトランスフェクション試薬であるSuperFectTM（キアゲン社）を用いてトランスフェクションし、抗Hisタグ抗体発現細胞を作製した。
【００５８】
（実験例１）Hisタグ抗体発現細胞への遺伝子導入効果
実施例２で作製したpDis-HisまたはpDis-CAHis2をトランスフェクションした抗Hisタグ抗体発現細胞を各々トランスフェクションの翌日に、Hisタグを付与していないAdベクター(Ad-L2)（対照コントロール）および実施例１で得たHisタグ付与Adベクター(Ad-CHis1-L2)を1000 VP/cellで1.5時間作用させ、培養した。24時間後に、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステム（ピッカジーンTMLT2.0、東洋インキ）を用いて測定した。
【００５９】
（結果）
CHO細胞にHisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現するプラスミド（pDisplay）をトランスフェクションし、Ad-L2およびAd-CHis1-L2（1000 VP/cell）を作用させたところ、Ad-CHis1-L2作用群はAd-L2作用群に比べ５１％の発現であった。
【００６０】
一方、CMVプロモーターを用いたpDis-His、またはCAプロモーターを用いたpDis-CAHis2をトランスフェクションした群では、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体を発現しており、対照コントロール(Ad-L2)を作用させた場合はルシフェラーゼ発現の上昇は認められなかったが、Hisタグ付与Adベクター(Ad-CHis1-L2)を作用させた場合は、それぞれ13.6倍、9.8倍のルシフェラーゼ発現の上昇が認められた。従って、Adベクターに付与したHisタグ配列と、Hisタグ配列に対する抗体遺伝子を発現する細胞とのセットで、ベクター上のルシフェラーゼ遺伝子の発現が上昇することが確認された（図１）。
【００６１】
（実施例３）Hisタグ抗体発現トランスジェニックマウスの作製
Hisタグ抗体発現プラスミド(pDis-CAHis2)をAvrII/ApaLI/SalIで切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動した。CAプロモーター・Hisタグ配列に対する一本鎖抗体遺伝子、PDGFR膜貫通ドメインコード遺伝子およびBovine Growth Hormon P(A)配列をコードした遺伝子を回収した。本遺伝子を用いて日本エスエルシー（株）にてトランスジェニックマウスを作製した。トランスジェニックマウスは、遺伝子を前核期受精卵の雄性前核にマイクロインジョクションし、２細胞期胚に発生した胚全てをレシピエントマウスに胚移植して産仔を得る定法に従って作製した。
【００６２】
（実験例２）ウエスタン・ブロッティング
実施例３で作製した抗Hisタグ抗体発現トランスジェニックマウスの脳、肝臓、脾臓、胸腺、肺、腎臓、筋肉、膵臓および心臓の各臓器を回収し、各臓器をホモジェネートしたものについて、lysis bufferで溶解した。溶解した各臓器10μgをSDS-PAGE処理後、ゲルをニトロセルロースメンブレンにブロッティングした。メンブレンをブロッキングした後、マウス抗HA抗体で反応させ、その後HRP標識抗マウスIgGで反応させた。ECL plus(Amercham Bioscience)にてchemiluminescenceを可視化した。Hisタグ配列に対する一本鎖抗体（抗Hisタグ抗体）の発現をウェスタンブロット法により確認した。
【００６３】
（結果）
作出したトランスジェニックマウスの各臓器における抗Hisタグ抗体の発現をウエスタン・ブロッティングで検討したところ、コントロールマウス（野生型マウス）はnegativeであったが、トランスジェニックマウスでは全ての臓器でバンドがみられ、Hisタグ配列に対する一本鎖抗体が確かに発現していることが確認された（図２）。
従って、本マウスは、ファイバーノブのC末端領域にHisタグ配列を付与したAdベクターを用いることで、より効率良く遺伝子発現することが期待される。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明はタグ付与型Adベクターと、前記タグ付与型Adベクターに付与したタグに対する抗タグ抗体を発現しうる細胞と反応させることを特徴とする遺伝子導入方法であり、タグと抗タグ抗体のアフィニティーを利用することにより、従来は細胞内にAdベクターを導入するのが困難な場合でも、容易に細胞に導入することができる。
また、トランスジェニックマウスでは、抗タグ抗体の発現が認められた。これにより、タグ付与型Adベクターに担持した遺伝子をトランスジェニックマウスに導入すると、より効果的に遺伝子を導入させることが可能となることが期待され、導入した遺伝子の作用解明など、基礎研究の分野において、効果が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】抗Hisタグ抗体発現細胞への遺伝子導入効果を示す図である。（実験例１）
【図２】ウエスタン・ブロッティングによるトランスジェニックマウスの各臓器における抗タグ抗体の発現結果を示す図である。（実験例２）
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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