(57)【要約】      （修正有）【課題】アレルギー性皮膚炎の経過を正確に判断できる方法の提供。【解決手段】皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量を測定することを特徴とするアレルギー性皮膚炎の診断方法。診断が、アレルギー性皮膚炎の診断又はアレルギー性皮膚炎治療法の治療効果若しくは治療経過の判定であって、アレルギー性皮膚炎が、アトピー性皮膚炎である。皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量測定試薬を含有するアレルギー性皮膚炎診断薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量を測定することを特徴とするアレルギー性皮膚炎の診断方法。
【請求項２】
診断が、アレルギー性皮膚炎の診断又はアレルギー性皮膚炎治療法の治療効果若しくは治療経過の判定である請求項１記載の診断法。
【請求項３】
アレルギー性皮膚炎が、アトピー性皮膚炎である請求項１又は２記載の診断法。
【請求項４】
皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量測定試薬を含有するアレルギー性皮膚炎診断薬。
【請求項５】
診断が、アレルギー性皮膚炎の診断又はアレルギー性皮膚炎治療法の治療効果若しくは治療経過の判定である請求項４記載の診断薬。
【請求項６】
アレルギー性皮膚炎が、アトピー性皮膚炎である請求項４又は５記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー性皮膚炎の診断、治療効果の判定等が可能な診断法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎、かぶれ、湿疹等のアレルギー性皮膚炎は、皮膚の炎症やかぶれ、湿疹を呈する疾患である。このうち、アトピー性皮膚炎は増悪、寛解を繰り返す、かゆみのある湿疹を主病変とする慢性に経過する疾患であり、患者の多くはアトピー素因をもつとされている、難治性の疾患である。
【０００３】
アレルギー性皮膚炎の治療法には、ステロイド、抗ヒスタミン薬、その他の薬物療法の他、ＵＶＡ（紫外線Ａ波）を照射するＰＵＶＡ療法（非特許文献１）等がある。
【０００４】
アトピー性皮膚炎は、増悪、寛解を繰り返すため、治療効果の判定や治療経過の判断は困難であり、新たな診断法の開発が望まれている。
【非特許文献１】Henseler T, Wolff K, Honigsmann H, Christophers E., Lancet. 1981 Apr 18;1(8225):853-7.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、アトピー性皮膚炎を含むアレルギー性皮膚炎の経過を正確に判断できる診断法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、神経反発因子として知られているセマフォリン３Ａに注目し、健常人の皮膚及びアトピー性皮膚炎患者のＰＵＶＡ療法前後の皮膚中のセマフォリン３Ａ発現量を測定してきたところ、健常人と比較してアトピー性皮膚炎患者ではセマフォリン３Ａの発現量が少なく、ＰＵＶＡ療法後の患者ではセマフォリン３Ａの発現量が健常人のレベルにまで回復することを見出した。かかる知見に基づき、皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量を測定すればアレルギー性皮膚炎の治療経過等の診断が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量を測定することを特徴とするアレルギー性皮膚炎の診断方法を提供するものである。
また本発明は、皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量測定試薬を含有するアレルギー性皮膚炎診断薬を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の診断法によれば、アレルギー性皮膚炎、特に増悪、寛解を繰り返すアトピー性皮膚炎の治療経過、治療効果等が正確に判定できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
セマフォリン３Ａ（Sema 3A）は、ニューロピリン１及び神経軸索の伸張を抑制する反発因子として知られている（Raper JA, (2000), Curr Opin Neurobiol 10:88-94, Fujisawa H, (2004), J Neurobiol 59:24-33）。セマフォリン３Ａが正常ヒト表皮で発現することは知られているが、セマフォリン３Ａとアレルギー性皮膚炎との関連性は全く知られていない。
【００１０】
一方、セマフォリン３Ａ遺伝子はクローニングされている（Kolodkin,A.L., Matthes,D.J. and Goodman,C.S., Cell 75 (7), 1389-1399 (1993). Puschel AW; Adams RH; Betz H., Neuron 14,941-948, 1995）。
【００１１】
本発明の診断においては、皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子量を測定する。ここで、皮膚試料としては、ヒトの表皮を含む皮膚試料が好ましく、ヒト皮膚からバイオプシーにより採取できる。
【００１２】
皮膚試料中のセマフォリン３Ａ又はセマフォリン３Ａ遺伝子の測定手段としては、例えばセマフォリン３Ａを測定する場合には免疫染色等が採用できる。測定に用いる抗セマフォリン３Ａ抗体及びその標識体は市販品を用いることができる。
【００１３】
免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。セマフォリン３Ａ量の定量は、例えば蛍光強度を、市販のソフトウェアで定量することにより行うことができる。
【００１４】
セマフォリン３Ａ遺伝子を測定する場合には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。また、セマフォリン３Ａ遺伝子の定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。
【００１５】
また、本発明の診断薬としては、上記の抗セマフォリン３Ａ抗体、その標識体、第２抗体、標識第２抗体などを含有するものが好ましい。さらに、緩衝剤等と組み合せた診断キットも、本発明の診断薬に含まれる。
【００１６】
本発明者が健常人の皮膚におけるセマフォリン３Ａを測定したところ、全ての健常人の皮膚、特に表皮上層のケラチノサイトにおいて観察された。一方、ＰＵＶＡ療法前のアトピー性皮膚炎患者表皮におけるセマフォリン３Ａは健常人と比して減少していた。これに対し、ＰＵＶＡ療法後のアトピー性皮膚炎患者表皮のセマフォリン３Ａは健常人のレベルにまで回復していた。
従って、皮膚、特に表皮のセマフォリン３Ａの変化量を観察すれば、アレルギー性皮膚炎の経過、治療効果、治療経過等の診断が可能である。
【実施例】
【００１７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１８】
Ａ．方法
（１）皮膚の採取
健常人のバイオプシーは、局所麻酔後３mmパンチを用いて腹部から採取した。
アトピー性皮膚炎患者からのバイオプシーは、局所麻酔後３mmパンチを用いて上腕、首、腹部など病変部から採取した。さらに、同様の患者からＰＵＶＡ療法後の皮膚検体を同様の部位から採取した。これらのバイオプシーは、液体窒素により凍結ブロックを作製し、−８０度で保存した。
【００１９】
（２）皮膚試料中のセマフォリン３Ａ発現の測定
皮膚検体はＯＣＴコンパウンドに包埋し、液体窒素により凍結ブロックを作製した。次に、CM1850 cryostatを用いて５μmの厚さで凍結切片を作製し、この切片をシランコートが施されたスライドグラスに貼り付けた。次に、これらのスライドグラスをアセトン溶液に浸し、１０分間、−２０度でインキュベーションを行い、組織切片を固定した。これらのスライドグラスをＰＢＳ（pH７．４）で２回洗浄し、洗浄後、５％ normal donkey serumと２％  ＢＳＡを含むＰＢＳ（ブロッキング液）を組織サンプルの上にのせ、１時間、室温でインキュベーションを行った。１時間後、スライドからブロッキング液を除去し、次にブロッキング液で希釈した１次抗体を組織サンプルの上にのせ、一晩（約１６時間）、４度でインキュベーションを行った。翌日、スライドから１次抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、ブロッキング液で希釈した蛍光物質が標識された２次抗体を組織サンプルの上にのせ、１時間、室温でインキュベーションを行った。２次抗体のインキュベーション後、スライドから２次抗体を除去し、ＰＢＳで３回洗浄後、vectashield mounting mediumにより封入を行った。そして、標本は共焦点レーザー顕微鏡ＤＭＩＲＥ２ (Leica社)を用いて観察し、写真撮影を行った。
【００２０】
本実験で用いた抗体を以下に示す。
１次抗体である抗Sema3A抗体は、Abcam社から購入したものである。
Rabbit anti-Sema3A polyclonal antibody, Cat. no. ab23393.
【００２１】
Sema3Aの検出のためには蛍光物質が結合している二次抗体を用いた。これらの二次抗体は、インビトロジェン社から購入した。
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG, Cat. no. A21206, インビトジェン社
【００２２】
Ｂ．結果
（１）正常ヒト皮膚におけるセマフォリン３Ａの発現分布免疫組織染色結果を図１に示す。図１中の緑色の部分がセマフォリン３Ａが染色された部分である。
図１より、正常ヒト表皮にはセマフォリン３Ａが多量発現していることが判明した。
【００２３】
（２）ＰＵＶＡ療法前後のアトピー性皮膚炎患者表皮におけるセマフォリン３Ａの発現
免疫組織染色結果を図２に示す。図２中、Normal（Ａ）が正常皮膚、ＡＤ（Ｂ）がＰＵＶＡ療法前のアトピー性皮膚炎患者皮膚、ＰＵＶＡ（Ｃ）がＰＵＶＡ療法後のアトピー性皮膚炎患者皮膚である。図２から明らかに、治療前のアトピー性皮膚炎患者の表皮ではセマフォリン３Ａが明確に減少しており、治療後のアトピー性皮膚炎患者の表皮ではヒト正常皮膚と同等までセマフォリン３Ａが回復していた。
また、正常者皮膚とアトピー性皮膚炎患者の皮膚からＲＮＡを回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った結果を図３に示す。
図３から、アトピー性皮膚炎患者において約８０％セマフォリン遺伝子の発現が減少していた。そして、治療後はこれが正常患者と同様に回復する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】正常ヒト皮膚のセマフォリン３Ａについての免疫組織染色結果を示す図である。
【図２】正常ヒト皮膚（Ａ）、治療前のアトピー性皮膚炎患者皮膚（Ｂ）、ＰＵＶＡ治療後のアトピー性皮膚炎患者皮膚（Ｃ）のセマフォリン３Ａについての免疫組織染色結果を示す図である。
【図３】正常ヒト皮膚（Nomal）、治療前のアトピー性皮膚炎患者（AD1-AD5）皮膚のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図３】
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【図１】
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【図２】
2008107275.tif 000004