(57)【要約】【解決すべき課題】  生体試料等に含まれる核酸を、煩雑な操作を必要とせず、簡単な操作で核酸を抽出し、増幅することができる試薬および方法を提供する。【解決手段】  本発明の核酸回収試薬は、無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩を含有し、該無機塩が核酸との沈殿を生成する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩を含有し、該無機塩が核酸との沈殿を生成する、核酸回収試薬。
【請求項２】
無機陽イオンが鉄イオンおよび／または銅イオンである、請求項１に記載の核酸回収試薬。
【請求項３】
無機陰イオンがリン酸イオンおよび／または水酸化物イオンである、請求項１または２に記載の核酸回収試薬。
【請求項４】
無機塩が水酸化鉄、リン酸鉄、水酸化銅およびリン酸銅からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸回収試薬。
【請求項５】
無機塩が水酸化鉄であり、さらに、マグネタイトを含有する、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸回収試薬。
【請求項６】
無機塩がアルカリ水溶液中に含まれる、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸回収試薬。
【請求項７】
さらに、アルブミン類を含有する、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸回収試薬。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の核酸回収試薬を含む、核酸増幅用試薬キット。
【請求項９】
核酸と無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩との沈殿現象を利用して核酸を回収する、核酸回収方法。
【請求項１０】
核酸と無機塩とを共沈させる、請求項９に記載の核酸回収方法。
【請求項１１】
無機塩の沈殿物を生成させた後、核酸を添加し、該無機塩の沈殿物に該核酸を吸着させる、請求項９に記載の核酸回収方法。
【請求項１２】
無機陽イオンが鉄イオンおよび／または銅イオンである、請求項９〜１１のいずれかに記載の核酸回収方法。
【請求項１３】
無機陰イオンがリン酸イオンおよび／または水酸化物イオンである、請求項９〜１２のいずれかに記載の核酸回収方法。
【請求項１４】
無機塩が水酸化鉄、リン酸鉄、水酸化銅およびリン酸銅からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項９〜１３のいずれかに記載の核酸回収方法。
【請求項１５】
無機塩として水酸化鉄を用い、水酸化鉄およびマグネタイトと核酸を接触させ、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体からなる沈殿物を生成させる、請求項９に記載の核酸回収方法。
【請求項１６】
さらに、アルブミン類を含有する、請求項９〜１５のいずれかに記載の核酸回収方法。
【請求項１７】
アルカリ性条件下で行う、請求項９〜１６のいずれかに記載の核酸回収方法。
【請求項１８】
請求項９〜１７のいずれかに記載の方法による核酸を含む沈殿物と、核酸増幅用試薬とを接触させる工程を含む、核酸増幅方法。
【請求項１９】
核酸以外の物質を洗浄除去する工程を含む、請求項１８に記載の核酸増幅方法。
【請求項２０】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法により回収した沈殿物について、以下の工程を施すことを含む、核酸増幅方法。
ａ）核酸を含む沈殿物を磁性体により吸着させ、核酸以外の物質を除去する工程、および
ｂ）核酸を含む沈殿物と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
【請求項２１】
ＬＡＭＰ法を用いる、請求項１８〜２０のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料等から核酸を回収する核酸回収試薬およびそれを用いた核酸増幅試薬キット、ならびに核酸回収方法およびそれを用いた核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いた核酸の増幅法の確立は、核酸の用途の拡大をもたらした。また、核酸をより高感受性で、またはより高速で分析するための技術（ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＡＭＰ等）の開発に伴い、核酸の増幅法は、研究のツール、診断ツール、治療剤等として、多様な用途において有用性が見出されている。そして、増幅法の出発材料または増幅産物である核酸をサンプル（体液、組織、細胞等）等から回収する技術も一層の改善が必要とされている。
【０００３】
核酸を含む生体試料から核酸を回収する方法として、これまで多くの技術が開発されている。代表的な方法としては、フェノール、クロロホルム等の有機溶媒によりタンパク質等の夾雑物を変性させて沈殿させた後、水相中の核酸を回収する有機抽出法、核酸を含む溶液に沈殿剤（エタノール、イソプロパノール等）または共沈剤（高分子多糖類）を加え、沈殿となった核酸を遠心分離によって回収する沈殿法等が知られており、簡易的な方法としては、イオン交換水で希釈した試料を凍結融解を繰り返し、アルカリ溶液を添加後、油液分離、加熱処理等を行うアルカリ溶解法、細胞または組織を煮沸するだけの方法等が知られている。
【０００４】
有機抽出法はタンパク質の除去能力が高いので、夾雑物を大量に含むサンプル（例えば、組織、血液等）から核酸を回収する場合によく使用されている。有機抽出法としては、例えば、回収率を高めるために、水不溶性の高分子化合物を含む有機溶媒を使用して核酸を水相に入りやすくし、核酸を水相に移行した後、水相にアルコールを加えて沈殿させ、遠心分離で回収する方法（特許文献１）が提案されている。しかし、有機抽出法は、フェノール等の毒性の強い有機溶媒を使用するため、試薬の取り扱いに注意が必要である。また、遠心分離後すみやかに液層を分取する必要があり、その手順は、特にサンプル数が多い場合複雑となる。
【０００５】
沈殿法としては高分子多糖類（デキストランまたはグリコーゲン）等の共沈剤を加えて沈殿を行う方法（特許文献２）、陽イオン洗浄剤を用いて核酸を有機相（アルコール等）に溶解し、無機塩溶液を加えて沈殿させる方法（特許文献３）、２価以上の遷移金属イオンを接触させることにより、試料中の夾雑物を沈殿させ、上清に残るＲＮＡを回収する方法（特許文献４）等が提案されている。沈殿法は、例えばアルコール沈殿の場合、高い回収率を得るために長時間の冷却または共沈剤の添加を必要とし、沈殿を回収するために高速遠心分離と乾燥を必要とする。また、回収される核酸は不溶化しているので、使用するためには再可溶化しなければならない。
【０００６】
また、核酸をより簡易に回収するための方法として、様々な固相抽出法が開発されている。固相抽出法は、核酸と可逆的に結合する特性を有する固相担体に核酸を吸着させ、次いで担体を回収することによって、サンプル中の夾雑物から核酸を分離する方法であり、必要であれば、核酸を担体から分離する工程がさらに加えられる。固相抽出のための担体として、ガラス粉末、ガラス繊維、シリカ粒子、セライト、不織布等が知られている。固相抽出法としては、例えばＢｏｏｍ法が挙げられ、カオトロピック剤による核酸の溶解およびヌクレアーゼの不活化と、シリカ粒子または珪藻の核酸吸着作用とを組み合わせた核酸回収法（特許文献５）が提案されている。また、ゲル電気泳動によって核酸を分離し、不織布で吸着させて透析精製する方法も開発されている（非特許文献１）。対象とする核酸がｍＲＮＡの場合、ＲＮＡのポリペプチド配列の５’末端ポリＡ配列に相補的に結合するポリＴ配列を成分として含む担体を使用して、ｍＲＮＡのみを回収することができる（例えば、オリゴｄＴカラムとして知られている）。さらに、特許文献６には、カオチン性基を結合させた固相担体に核酸を吸着させ、次いでアニオン性物質で処理することによって核酸とカオチン性担体とを分離する方法が開示されており、磁性を有する担体に核酸吸着特性を持たせる手段も開発されている。特許文献７には、酸化鉄等の常磁性粒子に核酸を吸着させ、磁場の作用を利用して常磁性粒子を回収する方法が開示されている。
【０００７】
固相抽出法の場合、核酸の回収率は、担体の性質および担体の表面積に依存する。すなわち、繊維、粒子等の固相担体を用いる場合、使用可能な担体の量は溶液の容積に制限され、それによって吸着可能な核酸の量が制限される。したがって、サンプルが少量である場合、または目的とする核酸がサンプル中に微量しか存在しない場合等においては、核酸精製の段階で高い回収率を得ることが必要となる。
【０００８】
以上のように、核酸を含む試料の種類あるいは抽出された核酸の使用目的により、様々な核酸抽出法が提案されているが、いずれの場合においても、沈殿、分離、洗浄、精製等の煩雑な操作を組み合わせて行う必要であり、簡易的と言われるアルカリ溶解法や煮沸法でも凍結、煮沸等の温度制御が要求される。また、ＤＮＡが回収できてもＲＮＡの回収率が低い場合、あるいはその逆にＤＮＡの回収率が低い場合や、短鎖の核酸の回収率が低い場合もあり、効率的で簡易な核酸回収法の開発が望まれている。
【特許文献１】特開平１１−２５３１５８号公報
【特許文献２】特開平７−２３６４９９号公報
【特許文献３】特許２７９１３６７号公報
【特許文献４】特表２００１−５１６７６３号公報
【特許文献５】米国特許第５，２３４，８０９号
【特許文献６】特開２００１−３５２９７９号公報
【特許文献７】特開２０００−１５９７９１号公報
【非特許文献１】渡辺および大竹、「アガロースゲルからの新しいＤＮＡ回収法―透析膜と不織布を用いたＤＮＡ回収チップの開発」、蛋白質核酸酵素、１９９９年、第４４巻、第１０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従って、本発明の目的は、生体試料等に含まれる核酸を、従来のような煩雑な操作を必要とせず、簡単な操作で核酸を抽出し、増幅することができる試薬および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は、無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩と核酸を接触させると、核酸を含有する沈殿が生成し、夾雑物を含む試料等から核酸を効率的に回収できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩を含有し、該無機塩が核酸との沈殿を生成する、核酸回収試薬に関する。
【００１２】
また、本発明は、無機陽イオンが鉄イオンおよび／または銅イオンである、前記核酸回収試薬に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、無機陰イオンがリン酸イオンおよび／または水酸化物イオンである、前記核酸回収試薬に関する。
【００１４】
また、本発明は、無機塩が水酸化鉄、リン酸鉄、水酸化銅およびリン酸銅からなる群から選択される少なくとも１種である、前記核酸回収試薬に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、無機塩が水酸化鉄であり、さらに、マグネタイトを含有する、前記核酸回収試薬に関する。
【００１６】
また、本発明は、無機塩がアルカリ水溶液中に含まれる、前記核酸回収試薬に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、さらに、アルブミン類を含有する、前記核酸回収試薬に関する。
【００１８】
また、本発明は、前記核酸回収試薬を含む、核酸増幅用試薬キットに関する。
【００１９】
さらに、本発明は、核酸と無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩との沈殿現象を利用して核酸を回収する、核酸回収方法に関する。
【００２０】
また、本発明は、試料中の核酸と無機塩とを共沈させる、前記核酸回収方法に関する。
【００２１】
さらに、本発明は、無機塩の沈殿物を生成させた後、核酸を添加し、該無機塩の沈殿物に該核酸を吸着させる、前記核酸回収方法に関する。
【００２２】
また、本発明は、無機陽イオンが鉄イオンおよび／または銅イオンである、前記核酸回収方法に関する。
【００２３】
さらに、本発明は、無機陰イオンがリン酸イオンおよび／または水酸化物イオンである、前記核酸回収方法に関する。
【００２４】
また、本発明は、無機塩が水酸化鉄、リン酸鉄、水酸化銅およびリン酸銅からなる群から選択される少なくとも１種である、前記核酸回収方法に関する。
【００２５】
さらに、本発明は、無機塩として水酸化鉄を用い、水酸化鉄およびマグネタイトと核酸を接触させ、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体からなる沈殿物を生成させる、前記核酸回収方法に関する。
【００２６】
また、本発明は、さらに、アルブミン類を含有する、前記核酸回収方法に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、アルカリ性条件下で行う、前記核酸回収方法に関する。
【００２８】
また、本発明は、前記方法による核酸を含む沈殿物と核酸増幅用試薬とを接触させる工程を含む、核酸増幅方法に関する。
【００２９】
さらに、本発明は、核酸以外の物質を洗浄除去する工程を含む、前記核酸増幅方法に関する。
【００３０】
また、本発明は、前記方法により回収した沈殿物について、以下の工程を施すことを含む、核酸増幅方法に関する。
ａ）核酸を含む沈殿物を磁性体により吸着させ、核酸以外の物質を除去する工程、および
ｂ）核酸を含む沈殿物と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
【００３１】
さらに、本発明は、ＬＡＭＰ法を用いる、前記核酸増幅方法に関する。
【００３２】
本発明によれば、核酸と無機塩との沈殿現象を利用して核酸を簡易に回収することができる。特に、無機陽イオンとして鉄イオンを用いた無機塩は、核酸との沈殿生成速度が速く、核酸を含む混合物から核酸を効率よく回収することができる。核酸は沈殿した無機塩に吸着させてもよいが、核酸の存在下で無機塩を加え、核酸を巻き込んで沈殿させるのがより効率的である。また、無機塩として水酸化鉄を使用する場合には、さらに試薬成分としてマグネタイトを加え、水酸化鉄およびマグネタイトの存在下で核酸を添加し、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体からなる沈殿物を生成させるのが効果的である。このようにして生成した複合体は全体として磁性を有するため、磁気分離が可能であり、また、核酸増幅等の後の処理において核酸を含む沈殿物を磁性体で吸着し、核酸以外の物質を洗浄除去することが可能である。
【００３３】
さらに、本発明の重要な特徴は、生成した沈殿物から核酸を溶出させる操作を必要とせず、沈殿物に直接核酸増幅用試薬を作用させて沈殿物に含まれる核酸を増幅できることである。これは、本発明によって生成する核酸を含む沈殿物においては、核酸と無機塩による沈殿物を生成する場合、または核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体からなる沈殿物を生成する場合のいずれの場合も、核酸と無機塩または核酸と無機塩およびマグネタイトとがゆるやかな結合を形成するためであると考えられる。したがって、本発明によれば、より簡易に核酸を回収し、増幅することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
［Ｉ］核酸回収試薬
本発明の核酸回収試薬は、無機陽イオンおよび無機陰イオンから構成される無機塩を含有する。
【００３５】
（１）無機塩
無機塩は、核酸と沈殿を生成するものであればよい。無機塩を構成する無機陽イオンは、好ましくは周期律表第３族〜第１２族の遷移金属元素のイオンを含有する塩であり、より好ましくは鉄イオンおよび／または銅イオンを含有する塩であり、さらに好ましくは鉄イオンを含有する塩である。鉄イオンは２価であっても３価であってもよい。また、銅イオンは１価であっても２価であってもよいが、通常２価である。
【００３６】
無機塩を構成する無機陰イオンは、無機陽イオンとの組み合わせにより、核酸との反応で生成する沈殿の生成速度の速いものが好ましい。無機陰イオンとしては、例えば、水酸化物イオン、リン酸イオン、ピロリン酸イオン、炭酸イオン等が使用可能である。無機陰イオンは、核酸の回収率の観点から水酸化物イオンおよび／またはリン酸イオンが好ましく、磁気分離等の観点からは水酸化物イオンが好ましい。無機陽イオンおよび無機陰イオンは、それぞれ１種ずつ用いても２種以上を併用してもよい。
【００３７】
本発明に用いる具体的な無機塩としては、水酸化鉄、リン酸鉄、水酸化銅、リン酸銅等を挙げることができる。これらの無機塩は単独で用いても２種以上を併用してもよい。本明細書において、水酸化鉄は水酸化第一鉄（水酸化鉄（ＩＩ））、水酸化第二鉄（水酸化鉄（ＩＩＩ））、水酸化第二鉄第一鉄（水酸化鉄（ＩＩＩ）鉄（ＩＩ））等を含み、リン酸鉄はリン酸第一鉄（リン酸鉄（ＩＩ））、リン酸第二鉄（リン酸鉄（ＩＩＩ））、リン酸鉄（ＩＩＩ）鉄（ＩＩ）、ピロリン酸鉄等を含む。また、水酸化銅は水酸化第一銅（水酸化銅（Ｉ））、水酸化第二銅（水酸化銅（ＩＩ））等を含み、リン酸銅はリン酸第二銅（リン酸銅（ＩＩ））、リン酸銅ナトリウム等を含む。核酸回収試薬に用いる無機塩の量は特に限定されず、試料中の核酸の量に応じて適宜調整してよい。
【００３８】
本発明の核酸回収試薬は、無機塩と試料中の核酸を接触させることができれば、試薬の形態はとくに限定されない。例えば、生体試料（血液、尿等）中に無機塩を直接添加する形態であっても、無機塩を含有する溶液（水溶液、バッファー（緩衝液）等）の形態であってもよい。無機塩が溶液中に含まれる場合、無機塩はその一部が無機陽イオンおよび無機陰イオンに解離していてもよい。
【００３９】
無機塩を含有する溶液はアルカリ水溶液であるのが好ましく、アルカリ水溶液は、好ましくはｐＨ７を超えて１４以下であり、より好ましくはｐＨ１０〜１３である。また、アルカリ水溶液は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を含有する水溶液であっても、リン酸バッファー、トリスバッファー等のアルカリ性のバッファーであってもよい。また、アルカリ水溶液にアルコール等の有機溶媒等を添加してもよい。
【００４０】
核酸回収試薬は上記の無機塩を直接含有してもよく、また安定性等を考慮して使用時に無機塩を調製してもよい。例えば、無機塩として水酸化鉄を用いる場合、塩化第二鉄（塩化鉄（ＩＩＩ））（例えば、塩化鉄を含有する水溶液）と水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ水溶液を用意し、塩化鉄（ＩＩＩ）にアルカリ水溶液を加えることにより水酸化鉄を調製してもよい。また、無機塩としてリン酸鉄を用いる場合は、塩化鉄（ＩＩＩ）にアルカリ水溶液としてリン酸バッファーを加えることによりリン酸鉄を調製してもよい。ここで用いるアルカリ水溶液は、上記のアルカリ水溶液の場合と同様でよく、例えば、ｐＨは好ましくはｐＨ７を超えて１４以下、より好ましくはｐＨ１０〜１３である。
【００４１】
（２）マグネタイト
無機塩が水酸化鉄の場合、核酸回収試薬の構成成分としてマグネタイトを加え、水酸化鉄およびマグネタイトと核酸試料とを接触させ、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトの複合体を生成させ、生成した核酸を含む沈殿物を磁気分離により溶液から分離することができる。マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）は、核酸と無機塩との複合体を形成する観点から微粒子であるのが好ましく、マグネタイトの粒径は好ましくは０．０１〜１０μｍ、より好ましくは０．２〜１μｍである。マグネタイトの粒径をかかる範囲に調整することにより、核酸および無機塩との適度な複合体が形成され、核酸の回収効率を高めることができる。
【００４２】
核酸回収試薬中のマグネタイトの量は特に限定されないが、核酸および無機塩との適度な複合体を形成する観点から、無機塩に対するモル比（無機塩：マグネタイト）が、好ましくは１：０．１〜１０、より好ましくは１：０．５〜２である。
【００４３】
（３）その他の成分
本発明の核酸回収試薬は、本発明の目的を損わない範囲で上記以外の成分を適宜含有してもよい。他の成分の例としては、ｐＨ緩衝剤、アルブミン類［牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等］等のタンパク質、界面活性剤、糖類等が挙げられる。特に、試薬にアルブミン類を添加すると沈殿生成の反応速度が速くなり、回収率が上昇するため好ましい。アルブミン類の添加量は、反応溶液の全質量に対し、好ましくは０．１〜２０質量％であり、より好ましくは０．５〜４質量％である。
【００４４】
本発明の核酸回収試薬は、例えば核酸増幅用試薬キットを構成する試薬として用いることもできる。本発明の核酸回収試薬で回収した核酸は、沈殿物から核酸を溶出する等の操作により分離する必要がなく、汎用性を有することから、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＬＡＭＰ等の任意の核酸増幅用試薬に用いることができる。
【００４５】
［ＩＩ］核酸回収方法
本発明の核酸回収方法は、無機陽イオンと無機陰イオンを組み合わせた無機塩と核酸とを接触させることにより、核酸と無機塩との沈殿物を生じさせて核酸を回収するものである。沈殿物は、溶液中、核酸と無機塩を接触させて生成させてもよいし、無機沈殿物自体に核酸の吸着性があるため、予め無機沈殿物を生成させた後に核酸試料を添加して吸着させてもよい。試験の結果では、溶液中で核酸と無機塩を接触させて沈殿物を生成させた方が、高い回収率を示している。これは、無機沈殿物が生成する際に核酸を取り込んで一緒に沈殿するためと考えられる。もちろん、無機沈殿物生成後に核酸試料を添加しても核酸検出等の実用に価する回収率を達成できる。
【００４６】
本発明の核酸回収方法は、溶液中、核酸と無機塩を接触させて沈殿物を生成させる場合、および予め無機沈殿を生成させた後に核酸を添加して吸着させる場合のいずれの場合も上記の本発明の核酸回収試薬を用いて行うことができる。
【００４７】
本発明においては、核酸回収反応をアルカリ性条件で行うのが好ましい。また、遺伝子検査においては、測定対象のウイルス、細菌等をアルカリ（例えば、水酸化ナトリウム水溶液）で溶解して核酸を遊離させるという方法を用いることができるが、本発明によれば、アルカリ溶液を用いることにより核酸回収試薬が溶菌化試薬を兼ねることが可能であるため、操作がさらに簡便となる。
【００４８】
沈殿した核酸の回収方法は、最終的な利用形態によって選択することが可能である。例えば遠心分離、ろ紙によるろ過等の汎用されている方法を用いることもできる。
【００４９】
マグネタイトの存在下で、核酸を含む沈殿物を生成させる場合、マグネタイトだけでなく、沈殿物全体が磁性化するため、沈殿物の移送や核酸回収操作に磁力を用いることが可能となる。これは、マグネタイトの微粒子が効率的に沈殿物へ取り込まれるためと推察される。図１０に示すように、磁力によって核酸を含む無機沈殿物を回収する方法は、核酸増幅反応の阻害成分等の不溶成分の混入が少ないため、遠心分離等の方法より高い精製度を有する。
【００５０】
回収した無機沈殿物は、さらにバッファー等を用いて核酸以外の物質を洗浄することが可能である。核酸増幅反応等に供する場合、予め反応を阻害する物質を除去することが望ましい。
【００５１】
本発明の核酸回収方法は、核酸として長鎖のＤＮＡに限らず、ＲＮＡ等の短鎖の核酸も回収することができる。例えば、５４２ｂの短鎖核酸であるＳＡＲＳ管理検体も回収することが可能である。
【００５２】
このようにして抽出された核酸は、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の核酸増幅法やハイブリダイゼーション法等の公知の核酸分析等に利用できる。
【００５３】
［ＩＩＩ］核酸増幅法
代表的な核酸増幅法としてはＰＣＲ法が挙げられる。ＰＣＲ法は、標的配列の両端の一方のセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドと、両端の他方のアンチセンス鎖を認識するオリゴヌクレオチドを２種類のプライマーとして用いた核酸増幅法である。相補的な２本鎖核酸を熱処理により1本鎖核酸に変性させ、各々の１本鎖核酸に３’側からプライマーを相補的に結合（アニール）させ、引き続き、鋳型依存性核酸合成酵素により結合したプライマーからＤＮＡ伸長させる。ここまでのサイクルを繰り返し行うことによって、標的配列を指数関数的に増幅することができ、その増幅産物は、電気泳動法、蛍光性インターカレーター法等を用いて検出できる。ただし、ＰＣＲ法は各段階で反応温度が異なるため、反応の段階に応じて反応温度を制御する必要がある。
【００５４】
本発明に使用可能な核酸増幅法はＰＣＲ法に限られず、好適な方法として例えば、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）法と呼ばれるループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号等参照）が挙げられる。ＬＡＭＰ法は、鋳型となるヌクレオチドに自身の３'末端をアニールさせて相補鎖合成の起点とするとともに、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能とした核酸増幅法である。また、ＬＡＭＰ法では、プライマーの３'末端が常に試料に由来する領域に対してアニールするため、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能する。その結果、特異性の高い遺伝子配列の増幅反応が可能である。
【００５５】
ＬＡＭＰ法では、計６領域の塩基配列を認識する少なくとも４種類のオリゴヌクレオチドからなるプライマー（インナープライマーＦおよびＲとアウタープライマーＦおよびＲ）、鎖置換合成活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素、および基質を用い、熱変性を必要とせずに、終始等温で速やかに特異性の高い遺伝子増幅反応を進行させることができる。
【００５６】
本発明の核酸増幅法は、核酸を含む沈殿物と核酸増幅用試薬とを接触させる工程を含む。本発明の核酸回収試薬によって得られる沈殿物は、沈殿物から核酸を溶出させる操作を必要とせず、そのまま上記の核酸増幅法を用いて増幅させることができる。また、核酸増幅において、核酸以外の物質を洗浄除去する工程を含んでもよい。
【００５７】
本発明の核酸増幅方法の好ましい実施態様は、水酸化鉄およびマグネタイトの存在下で核酸試料を加え、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体を沈殿物として回収し、生成した核酸を含む沈殿物について以下の工程による処理を施すことを含む。
ａ）核酸を含む沈殿物を磁性体により吸着させ、核酸以外の物質を除去する工程、および
ｂ）核酸を含む沈殿物と核酸増幅用試薬とを接触させる工程。
【００５８】
この方法は、核酸、水酸化鉄およびマグネタイトを含む複合体からなる沈殿物が、沈殿物全体に磁性を有することを利用したものであり、これにより核酸以外の物質を洗浄除去することができる。また、本発明の回収方法により生成した沈殿物は、核酸が水酸化鉄およびマグネタイトにゆるやかに結合しているため、沈殿物を核酸増幅用試薬と直接接触させることにより、沈殿物に含まれる核酸を増幅することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００６０】
実施例１
リン酸鉄(ＩＩＩ)を用いた共沈法による核酸の回収およびＬＡＭＰ法による核酸増幅
１．１００ｍＭの塩化鉄(ＩＩＩ)水溶液（５０ｍＭのＨＣｌを含む）２．５μＬをＰＣＲチューブ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．  ８−ｓｔｒｉｐ  ０．２ｍＬ  ｔｈｉｎ−ｗａｌｌ  ｔｕｂｅｓ）に分注した。
２．検体液（鋳型核酸（１０４コピーのλＤＮＡ）を含む１００ｍＭのリン酸バッファー溶液ｐＨ８．０）５μＬを添加し、得られた前処理液をピペッティングで混合した。ただちに金属イオンが反応し、リン酸化物の沈殿を生じた。
３．卓上小型遠心分離機（６０００ｒｐｍ）により１０秒間遠心分離し、沈殿物をペレットにした。
４．洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ８．０、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）９２．５μＬを添加し、軽くピペッティングした。
５．卓上小型遠心分離機で軽くスピンダウンした後、添加した洗浄バッファー９５μＬを抜き取った（洗浄１回目）。
６．洗浄バッファー９５μＬを加え、軽くピペッティングした後に添加した洗浄バッファー９５μＬを抜き取った（洗浄２回目）。この操作を２回（２回洗浄）または４回（４回洗浄）繰り返した。洗浄したペレットを核酸増幅の試料とした。
７．ポジティブコントロール（ＰＣ）として、塩化鉄(ＩＩＩ)水溶液を添加せず、検体液のみを核酸増幅の試料とした。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０または水酸化ナトリウム水溶液０．２５Ｍ水溶液を核酸増幅の試料とした。
８．ＬＡＭＰ法による核酸増幅
以下に示すＬＡＭＰ反応液２０μＬを上記試料に添加し、ＡＢＩ−７７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて沈殿物に含まれる核酸を増幅した。
ＬＡＭＰ反応液（Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅キット、栄研化学（株）製）の基本組成
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８．８)            ２０ｍＭ
ＫＣｌ                                １０ｍＭ
(ＮＨ４)２ＳＯ４                        １０ｍＭ
ＭｇＳＯ４                              ８ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０                        ０．１％
ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）            ０．８Ｍ
ｄＮＴＰｓ                            ５．６ｍＭ
インナープライマー(ＦＩＰ，ＢＩＰ)    ３．２μＭ
アウタープライマー(Ｆ３，Ｂ３)        ０．８μＭ
(ループプライマー                      １．６μＭ)
ＹＯ（オキサゾールイエロー）          ０．２５μｇ／ｍＬ
Ｂｓｔポリメラーゼ                    ８Ｕ／ｔｕｂｅ
【００６１】
プライマー：
・ＤＮＡ増幅系  λＤＮＡ  ＬＨ４．３
FIP：AGGCCAAGCT GCTTGCGGTA GCCGGACGCT ACCAGCTTCT
BIP：CAGGACGCTG TGGCATTGCA GATCATAGGT AAAGCGCCAC GC
F3： AAAACTCAAAT CAACAGGCG
B3： GACGGATATCA CCACGATCA
鋳型
市販（タカラバイオ（株））のλＤＮＡ（４８．５ｋｂｐ）を希釈して使用した。
核酸増幅
検体液から回収した核酸を含む沈殿物に２０μＬに調製したＬＡＭＰ反応液（１．２５×）を添加し、そのままＡＢＩ−７７００を用いて反応温度６４℃で増幅した。図１に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６２】
実施例２
水酸化鉄（ＩＩＩ）を用いた共沈法による核酸の回収およびＬＡＭＰ法による核酸増幅
検体液としてリン酸バッファーの代わりに０．２５Ｍの水酸化ナトリウムを含む溶液を用いた以外、実施例１と同様にして実験を行った。図２に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６３】
実施例３
リン酸銅（ＩＩ）を用いた共沈法による核酸の回収およびＬＡＭＰ法による核酸増幅
塩化鉄の代わりに硫酸銅を用いた以外、実施例１と同様にして実験を行った。硫酸銅水溶液には５０ｍＭの硫酸を含む。図３に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６４】
実施例４
検体液からのＲＮＡの回収およびＬＡＭＰ法によるＲＮＡの増幅
検体をＳＡＲＳ管理検体へ変更し、核酸増幅をＲＮＡ増幅系で行った以外、実施例１と同様にして実験を行った。
ＬＡＭＰ反応液（Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＮＡ増幅キット、栄研化学（株）製）の基本組成
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．８)              ２０ｍＭ
ＫＣｌ                                  １０ｍＭ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                        １０ｍＭ
ＭｇＳＯ４                                ８ｍＭ
Ｔｗｅｅｎ２０                          ０．１％
ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）              ０．８Ｍ
ｄＮＴＰｓ                              ５．６ｍＭ
インナープライマー(ＦＩＰ，ＢＩＰ)      ３．２μＭ
アウタープライマー(Ｆ３，Ｂ３)          ０．８μＭ
(ループプライマー          １．６μＭ)
ＹＯ（オキサゾールイエロー）            ０．２５μｇ／ｍＬ
酵素混合物（ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘ）      １μＬ／ｔｕｂｅ
【００６５】
プライマー
・ＲＮＡ増幅系  ＳＡＲＳキット
FIP：TGCATGACAG CCCTCGAAGA AGCTATTCGT CAC
BIP：GCTGTGGGTA CTAACCTACC TGTCAACATA ACCAGTCGG
F3： CTAATATGTT TATCACCCGC
B3： CTCTGGTGAA TTCTGTGTT
FLP：AAAGCCAATC CACGC
BLP：CCAGCTAGGA TTTTCTACAG G
鋳型
ＳＡＲＳ管理検体（４００コピー／５μＬ;５４２ｂ）を使用
核酸増幅
検体液から回収した核酸を含む沈殿物に２０μＬに調製したＬＡＭＰ反応液（１．２５×）を添加し、そのままＡＢＩ−７７００を用いて反応温度６２．５℃で増幅した。図４に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６６】
実施例５
濾紙による核酸の回収
実施例１で生成した沈澱物を濾紙に回収する実験を行った。沈澱物を生成させた反応液を洗浄液で１ｍＬとした後、ろ過デバイスでろ過し、１ｍＬの洗浄バッファーで２回洗浄した後、その濾紙をＬＡＭＰ反応液へ投入した。ポジティブコントロール（ＰＣ）およびネガティブコントロール（ＮＣ）についても同様の操作を行った。蛍光リアルタイム測定機ロータージーンを用いて増幅を調べた。図５に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６７】
実施例６
吸着法による核酸の回収およびＬＡＭＰ法による核酸増幅
１．５０ｍＭのＨＣｌを含む１００ｍＭ塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液２．５μＬをＰＣＲチューブに分注した。
２．鋳型を含まない疑似検体液（１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０または水酸化ナトリウム水溶液０．２５Ｍ水溶液）５μＬを添加し、得られた前処理液をピペッティングで混合した。ただちに金属イオンが反応し沈殿（リン酸化物あるいは水酸化物）を生じた。
３．卓上小型遠心機（６０００ｒｐｍ）で１０秒間遠心分離し、沈殿をペレットにした。
４．上清５μＬ抜き取り、鋳型核酸（１０４コピーのλＤＮＡ）溶液５μＬ添加して軽くピペッティングし、１０分間放置することによって鋳型核酸を無機沈澱に吸着させた。
５．以下、実施例１のプロトコールと同様の操作で洗浄を行い、核酸増幅の試料とした。
６．ポジティブコントロール（ＰＣ）として、検体液のみを核酸増幅の試料とした。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０または水酸化ナトリウム水溶液０．２５Ｍ水溶液を核酸増幅の試料とした。
７．上記の試料をＬＡＭＰ反応に供した。実施例１および２の共沈法による場合と比較した結果を図６に示す。図６（Ａ）および（Ｂ）に示すように、無機塩としてリン酸鉄を用いた場合、水酸化鉄を用いた場合のいずれの場合においても核酸の増幅を確認した。
【００６８】
実施例７
マグネタイトを用いた核酸の回収
１．５０ｍＭのＨＣｌを含む１００ｍＭ塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液２．５μＬおよび０．２％マグネタイト懸濁液１μＬをＰＣＲチューブに分注した。
２．０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液、０．１５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む前処理液に鋳型核酸溶液（検体液）５μＬを添加し、９５℃で５分間加熱した後に室温で冷却したものを１のチューブに分注し、得られた液をピペッティングで混合した。
３．ネオジウム磁石上にチューブを配置し、沈殿を凝集させた。７．５μＬを残して上清を抜き取った。
４．ネオジウム磁石上で洗浄バッファー（１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）９２．５μＬを添加し、軽くピペッティングした後、添加した洗浄バッファー９５μＬを抜き取った。（洗浄１回目）
５．ネオジウム磁石上で洗浄バッファー９２．５μＬを添加し、軽くピペッティングした後、添加した洗浄バッファー９５μＬを抜き取った。（洗浄２回目）
６．対照として水酸化鉄を用いず、マグネタイトのみを添加した前処理液を調製し、これに検体液を加えて同様に処理した。また、ポジティブコントロール（ＰＣ）として、検体液のみを核酸増幅の試料とした。また、ネガティブコントロール（ＮＣ）として、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０または水酸化ナトリウム水溶液０．２５Ｍ水溶液を核酸増幅の試料とした。
７．以下、実施例１のプロトコールと同様の操作でＬＡＭＰ反応に供した。図７に示すように核酸の増幅を確認した。
【００６９】
実施例８
核酸回収における牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の効果
実施例１および６の前処理液（反応溶液）にＢＳＡを１質量％となるように添加し、実験を行った。図８（Ａ）および（Ｂ）に示すように、前処理液中にＢＳＡが存在してもリン酸鉄（ＩＩＩ）への鋳型ＤＮＡの吸着を阻害せず、逆に、ＢＳＡを前処理液に１質量％含有する共沈法においては、ＬＡＭＰ反応の立ち上がり時間がＰＣコントロールとほぼ等しく、見かけ上高い回収率を示すことが分った。
【００７０】
実施例９
検体液からの核酸の回収およびＰＣＲ法による核酸増幅
（１）実施例１と同様にして、検体液から核酸（鋳型ＤＮＡ）を含む沈殿物ペレットを回収した。得られた沈殿物ペレットに洗浄バッファー（１００ｍＭリン酸バッファー、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）１００μＬを加え、実施例１と同様にして洗浄した（この洗浄操作を４回繰り返した）。洗浄した沈殿物ペレットに以下のＰＣＲ反応液２５μＬを加え、以下の条件により核酸を増幅した。
ＰＣＲ反応液の基本組成：
ｄＮＴＰ                                1．８ｍＭ
Ｚ−Ｔａｑ（タカラバイオ（株）製）      １Ｕｎｉｔ  
プライマー                              ０．５μＭ
ＢＳＡ                                  １質量％
ＹＯ（オキサゾールイエロー）            ０．２５μｇ／ｍＬ
（Ｚ−Ｔａｑバッファー中）
ＰＣＲ装置：  ｉＣｙｃｌｅｒ（バイオラッド社製）
プライマー配列：
F      AAAACTCAAATCAACAGGCG
B      GACGATATCACCACGATCA
ＰＣＲ条件：
９５℃−６０℃−７２℃を４０サイクル行った。
【００７１】
（２）対照実験
（ａ）ポジティブコントロール：検体の代わりに以下の擬似検体を用いた以外、（１）と同様にして核酸を増幅した。
擬似検体：０．１質量％Ｔｗｅｅｎ２０、１質量％ＢＳＡ、鋳型ＤＮＡ（１０６コピー）を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ８．０）
（ｂ）ネガティブコントロール：検体の代わりに１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ８．０または水酸化ナトリウム水溶液０．２５Ｍ水溶液を用いた以外、（１）と同様にして核酸を増幅した。
（ｃ）リン酸鉄なし：１００ｍＭの塩化鉄(ＩＩＩ)水溶液（５０ｍＭのＨＣｌを含む）２．５μＬを添加しなかった以外、（１）と同様にして核酸を増幅した。
【００７２】
（３）結果
上記（１）および（２）により得られた結果を図９に示す。図９から明らかなように、リン酸鉄を用いた本発明のリン酸鉄共沈法の場合は、対照のリン酸鉄なしの場合より増幅サイクルが速かった。このことからリン酸鉄共沈法により回収された鋳型ＤＮＡを含む沈殿物から直接ＰＣＲ法により増幅できることがわかる。ポジティブコントロールの増幅サイクルから推定したリン酸鉄共沈法の回収率は１〜１０％であった。なお、ネガティブコントロールで起きている反応は非特異増幅と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】実施例１の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図２】実施例２の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図３】実施例３の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図４】実施例４の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図５】実施例５の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図６】実施例６の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフであり、（Ａ）はリン酸鉄を用いた場合を示し、（Ｂ）は水酸化鉄を用いた場合を示す。
【図７】実施例７の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図８】実施例８の方法による核酸増幅反応において、反応時間に対する蛍光強度の関係を示すグラフであり、（Ａ）は共沈法におけるＢＳＡの効果を示し、（Ｂ）は吸着法におけるＢＳＡの効果を示す。
【図９】実施例９の方法による核酸増幅反応において、サイクル数に対する蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図１０】（ａ）無機塩として水酸化鉄を用い、遠心分離によって核酸を回収する方法を示す概略図である。（ｂ）無機塩として水酸化鉄を用い、磁気分離によって核酸を回収する方法を示す概略図である。
【図１】
2008289376.tif 000002
【図２】
2008289376.tif 000003
【図３】
2008289376.tif 000004
【図４】
2008289376.tif 000005
【図５】
2008289376.tif 000006
【図６】
2008289376.tif 000007
【図７】
2008289376.tif 000008
【図８】
2008289376.tif 000009
【図９】
2008289376.tif 000010
【図１０】
2008289376.tif 000011
【配列表】
2008289376000001.app