(57)【要約】      （修正有）【課題】ケラチノサイト増殖因子-2（KGFー2）タンパク質の改変体および化学的誘導体を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸残基Cys37〜Ser208を含むタンパク質の改変体であって、該改変体が、ΔN41KGF-2、ΔN40 KGF-2、ΔN39 KGF-2、ΔN38 KGF-2、ΔN37 KGF-2、ΔN36 KGF-2、およびΔN35 KGF-2、またはR1-[Asn71-Pro203]-COOHタンパク質を含む改変体からなる群から選択される。また、このような改変体をコードする核酸分子、ならびにこのような改変体および化学的誘導体を使用して上皮細胞増殖を刺激する方法が開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組換えDNA技術およびタンパク質工学に関する。特に、本発明は、ケラチノサイト増殖因子-2（KGF-2）の改変体および誘導体、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
組織生成（generation）および再生の複雑なプロセスは、時々、軟組織増殖因子といわれる、多数のタンパク質因子により媒介される。これらの分子は、一般に１つの細胞型により放出され、そして他の細胞型の増殖に影響を与えるように作用する（Rubinら（1989）,Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 86:802-806）。その細胞自体がこのような増殖因子に応答する能力を有する細胞から放出されるいくつかの増殖因子もまた存在する。いくつかの軟組織増殖因子は特定の細胞型により分泌され、そして多細胞生物の発生において、応答性細胞の増殖、分化、および／または成熟に影響を与える（Finchら（1989）,Science. 245:752-755）。生物の発生におけるそれらの役割に加えて、いくつかの軟組織増殖因子は、健康の維持およびさらなる成熟系の維持において重要である。例えば、哺乳動物において、迅速な細胞代謝回転が起こる多くの系が存在する。このような系には、皮膚および胃腸管が含まれ、両方とも上皮細胞を含む。線維芽細胞増殖因子（FGF）のタンパク質ファミリーが、この群の軟組織増殖因子に含まれる。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子（FGF）ファミリーは、少なくとも14のメンバー、つまり、FGF-1〜FGF-10および相同な因子FHF-1〜FHF-4からなることが現在知られており、これらは：塩基性線維芽細胞増殖因子、bFGF（Abrahamら（1986）、EMBOJ.,5:2523-2528）；酸性線維芽細胞増殖因子、aFGF（Jayeら（1986）, Science, 233:541-545）；int-2遺伝子産物、int-2（Dickson& Peters（1987）, Nature, 326:833）；hst/kFGF（Delli-Boviら（1987）, Cell,50:729-737およびYoshidaら（1987）, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7305-7309）；FGF-5（Zhanら（1988）,Mol. Cell. Biol., 8:3487-3495）；FGF-6（Maricsら（1989）, Oncogene, 4:335-340）；ケラチノサイト増殖因子、KGF（Finchら（1989）,Science, 24:752-755）；ヒスアクトフィリン（Habazzettlら（1992）, Nature, 359:855-858）；FGF-9（Miyamotoら（1993）,Mol. Cell Biol., 13(7):4251-4259）；ならびに線維芽細胞増殖因子-10（ケラチノサイト増殖因子-2、KGF-2（PCT特許出願WO96/25422、この開示は本明細書中に参考として援用される）としても知られ、一次構造間で関連性を共有する。より最近では、４つの相同な因子（すなわち「FHF」）は、ランダムなcDNA配列の組合せ、配列データーベースの存在の検索、および相同性に基づくポリメラーゼ連鎖反応により、ヒト網膜から同定された（Smallwoodら（1996）,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:9850-9857）。FHF-1、FHF-2、FHF-3、およびFHF-4が、それぞれFGF-11、FGF-12、FGF-13、およびFGF-14と称されるべきであることが、NomenclatureCommitteeの推奨によって提唱されている（Coulierら（1997）, Journal of Molecular Evolution, 44:43-56、この開示は本明細書中に参考として援用される）。
【０００４】
WO 96/25422は、細菌発現系（例えば、E. coli.）および真核生物発現系（例えば、バキュロウイルスおよびCOS細胞）において、全長KGF-2（シグナル配列、配列番号２の残基Cys37〜Ser208を伴う）および成熟KGF-2（シグナル配列、配列番号２の残基Cys37〜Ser208を除く）のクローニング、発現、および精製を記載する。この参考文献は、KGF-2ga,細胞増殖、および新しい血管増殖もしくは血管形成の増殖、脱毛の防止、皮膚創傷の治癒、ならびに筋細胞、神経組織、前立腺細胞、および肺細胞の分化を刺激するのに有用あり得ることをさらに教示する。
【０００５】
KGF-2に関して理解されるべきことが多く存続し、KGF-2のいくらかまたは全ての生物学的活性を保持する変異体および誘導体を生成するためになされ得る変異が含まれる。一般には、任意の特異的なアミノ酸変化または化学的誘導体化のタンパク質の生物学的活性への効果は、多数の因子に依存して変化し、これは、変異がタンパク質の三次構造またはレセプター結合部位に影響を及ぼすか否かを含む。KGF-2の三次構造もレセプター結合部位も発表されていないので、当該分野の範囲内の知識は、KGF-2に対する特異的なアミノ酸改変体または化学的誘導体化の効果についての一般化を許容しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
KGF-2のいくらかまたは全ての生物学的活性を保持するKGF-2の改変体および誘導体を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、下記のようにKGF-2タンパク質産物に関する。これらのKGF-2タンパク質産物は一般的な適用性を有し、そしてKGF-2のいくらかまたは全ての生物学的活性を保持し得る。
【０００８】
１つの局面において、KGF-2の改変体は、組換え遺伝子操作技術により生成される。別の実施態様において、KGF-2の改変体は、化学技術または組換え技術と化学技術の組合せにより合成される。KGF-2の改変体は、グリコシル化形態または非グリコシル化形態で作製され得る。
【０００９】
本発明のなお別の局面には、KGF-2の改変体をコードする種々のポリヌクレオチドが含まれる。このようなヌクレオチド配列の各々は、真核生物または原核生物の宿主細胞中で、KGF-2の改変体の発現に使用され得る。ポリヌクレオチドはまた、細胞治療適用または遺伝子治療適用において使用され得る。
【００１０】
本発明のさらなる局面には、増幅および／または発現制御配列に作動可能に連結されたKGF-2の改変体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターが含まれる。
【００１１】
本発明のなおさらなる局面は、KGF-2の改変体をコードする組換えポリヌクレオチドを含む原核生物および真核生物の宿主細胞の両方に関連する。
【００１２】
別の局面において、本発明には、KGF-2の改変体の組換え的生成がさらに含まれ、ここで、組家宿主細胞は適切な栄養培地で増殖され、そしてここで、この細胞によって発現されるKGF-2の改変体は、必要に応じて宿主細胞および／または栄養培地から単離される。
【００１３】
本発明のなおさらに別の局面には、下記のように水溶性ポリマーに結合したKGF-2タンパク質が含まれる。例えば、KGF-2の改変体は、分子の見かけの分子量を増大することにより薬物動態学的性能を改良するために、１つ以上のポリエチレングリコール分子に結合される。
【００１４】
本発明の別の局面には、KGF-2の改変体、またはKGF-2タンパク質の化学的誘導体を含む薬学的組成物が含まれる。代表的には、KGF-2の改変体は、薬学的に受容可能なビヒクルと合わせて処方され得る。他の処方物質の改変体は、製造、貯蔵、操作、送達、および／またはKGF-2の改変体の効力を容易にするために使用され得る。
【００１５】
なお別の局面は、上皮細胞の増殖および分化を調節する方法に関する。特に、上皮細胞の刺激（細胞保護作用、増殖、および／または分化を含む）の必要な患者に、治療有効量または予防有効量の、KGF-2の改変体またはKGF-2タンパク質の化学的誘導体が投与される。
【００１６】
本発明のさらなる局面および利点は、本発明の実施を詳述する下記の理解に基づいて当業者に明らかである。
【００１７】
１．配列番号２のアミノ酸残基Cys37〜Ser208を含むタンパク質の改変体であって、該改変体が、
ΔN41 KGF-2、ΔN40 KGF-2、ΔN39 KGF-2、ΔN38KGF-2、ΔN37 KGF-2、ΔN36 KGF-2、およびΔN35 KGF-2、またはR1-[Asn71-Pro203]-COOHタンパク質を含む改変体からなる群から選択され、ここで、[Asn71-Pro203]が配列番号２の残基71〜203を示し；ここで、R1は、Asn71または以下のアミノ末端アミノ酸残基の、メチオニル化アミノ基もしくは非メチオニル化アミノ基を示し：
【００１８】
【化１０１】
2008283980.tif 000002
【００１９】
【化１０２】
2008283980.tif 000003
【００２０】
【化１０３】
2008283980.tif 000004
【００２１】
そして、R2は、Pro203のカルボキシ基、または以下のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を示し：
【００２２】
【化１０４】
2008283980.tif 000005
【００２３】
しかし、R1およびR2が配列番号２のCys37〜Ser208を再構築するようには選択されない、改変体；
配列番号２のAsn168〜Met176内欠失されたかまたは非天然アミノ酸で置換されたで少なくとも１つのアミノ酸残基を含む改変体；
配列番号２のAsn168〜Met176内に付加される少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む改変体、およびその化学的誘導体；
配列番号２のアミノ酸85〜198内で欠失されたか、または中性残基もしくは負に帯電した残基で置換され、それにより還元された正電荷を有する電荷変化タンパク質が生成される、少なくとも１つの中性もしくは正に帯電したアミノ酸残基を含む改変体、およびその化学的誘導体；
配列番号２のアミノ酸残基160〜164の推定ループ形成領域内で、より低いループ形性能を有するアミノ酸に対するより高度なループ形性能での、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む改変体、およびその化学的誘導体；
配列番号２の37位、106位、または150位で欠失されたかまたは非天然アミノ酸残基で置換された少なくとも１つの天然に存在するシステインを含む改変体、およびその化学的誘導体；
N-結合またはO-結合されたグリコシル化部位内で欠失されたかまたは非天然アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸を含み、それによってN-結合またはO-結合されたグリコシル化部位が変異された改変体、およびその誘導体；
N-結合またはO-結合されたグリコシル化部位を生成するための、少なくとも１つの非天然アミノ酸の付加または置換を含む改変体、およびその化学的誘導体；ならびに
ヒト免疫グロブリンの少なくとも１つのドメインの重鎖の定常領域のC-末端付加を含む改変体、またはその化学的誘導体。
２．ΔN36 KGF-2、ΔN35 KGF-2、ΔN34 KGF-2、ΔN33KGF-2、ΔN32 KGF-2、ΔN31 KGF-2、およびΔN30 KGF-2、ならびにそれらの化学的誘導体からなる群から選択される、項目１に記載のKGF-2の改変体。
３．NH2-Ala-Lys-Trp-Thr-His-Asn-Gly-Gly-Glu-Met-COOHで、配列番号２のAsn168〜Met176内の残基が置換される、項目１に記載のKGF-2の改変体。
４．配列番号２の残基Thr86、Gly182、Arg187、またはAsn196が、非天然アミノ酸で置換される、項目１に記載のKGF-2の改変体。
５．前記アミノ酸が、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびスレオニンである、項目４に記載のKGF-2の変異体。
６．前記アミノ酸配列がグリコシル化されていない、項目１〜５のいずれか１項に記載のKGF-2改変体。
７．前記アミノ酸配列がグリコシル化されている、項目１〜５のいずれか１項に記載のKGF-2の改変体。
８．項目１〜７のいずれか１項に記載のKGF-2の改変体に結合した水溶性ポリマーを含む、化学的誘導体。
９．配列番号２（KGF-2）のアミノ酸残基Cys37〜Sre208を含むKGF-2に結合体化した水溶性ポリマーを含む、化学的誘導体。
１０．項目１〜７のいずれか１項に記載のKGF-2の改変体をコードする、ポリヌクレオチド。
１１．発現制御配列に作動可能に連結された、項目１０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
１２．項目１０に記載のポリヌクレオチドを含む、原核生物または真核生物の宿主細胞。
１３．適切な栄養培地中で項目１２に記載の宿主細胞を増殖させる工程、および必要に応じて該細胞または該栄養培地からKGF-2の該改変体を単離する工程を包含する、方法。
１４．前記宿主細胞がE. coliである、項目１３に記載のKGF-2の改変体を生成するための方法。
１５．前記宿主細胞が、バキュロウイルス、COS細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞から選択される、項目１３に記載のKFD-2の改変体を生成するための方法。
１６．前記宿主細胞によってKGF-2の改変体の発現を可能にする条件下で培養された、項目１０に記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞からKGF-2の改変体を単離する工程を包含する、方法。
１７．KGF-2の単離された改変体を改変して上皮細胞の生成を刺激し得る化合物を生成する工程を包含する、項目１６に記載の方法。
１８．（a）項目１０に記載のポリヌクレオチドを含む原核生物または真核生物の宿主細胞を培養する工程；
（b）前記宿主細胞によりKGF-2の改変体を発現し得る条件下で該宿主細胞を維持する工程；および
（c）該宿主細胞により発現されるKGF-2の改変体を必要に応じて単離する工程、
を包含する、方法。
１９．項目１０に記載の外因性ポリヌクレオチドを含む、原核生物または真核生物の宿主細胞の該組換え発現産物である、項目１に記載のKGF-2改変体。
２０．薬学的に受容可能なビヒクルと結合した、項目１〜７のいずれか１項に記載のKGF-2の改変体を含む、薬学的組成物。
２１．薬学的に受容可能なビヒクルと結合した、項目１３に記載の方法で産生されるKGF-2の改変体を含む、薬学的組成物。
２２．薬学的に受容可能なビヒクルと結合した、項目１８に記載の方法で産生されるKGF-2の改変体を含む、薬学的組成物。
２３．上皮細胞の産生を刺激する方法であって、このような細胞を、項目１〜７に記載の有効量のKGF-2の改変体と接触させる工程を包含する、方法。
２４．上皮細胞の産生を刺激する方法であって、このような細胞を、項目８および９に記載の有効量の化学的誘導体と接触させる工程を包含する、方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
KGF-2タンパク質
本発明の用語に関連して、用語「KGF-2タンパク質」によって、配列番号２のアミノ酸Cys37〜Ser208（成熟KGF-2）およびその改変タンパク質により規定されるタンパク質が意味される。従って、用語「KGF-2タンパク質」は、配列番号２のアミノ酸配列（成熟KGF-2）内の残基から１つ以上のアミノ酸残基が欠失されている（「欠失改変体」）か、配列番号２のアミノ酸配列内の残基に挿入されている（「付加改変体」）か、および／または配列番号２のアミノ酸配列内の残基と置換されており（「置換改変体」）、そして生物学的活性を保持するタンパク質を含む。従って、タンパク質改変体の以下の記載が成熟KGF-2をいう場合、それに対するさらなる変異を除外しない。
【００２５】
本明細書中で使用される用語「生物学的活性」は、KGF-2タンパク質が、成熟KGF-2のいくらかの特性（全く同じ必要はなく、そして同じ程度である必要はない）を有することを意味する。目的の特定の特性の選択は、所望のKGF-2タンパク質の所望の使用に依存する。
【００２６】
最終のタンパク質が生物学的に活性である限り、欠失、挿入、および置換の多くの組合せがなされ得ることが当業者に理解される。アミノ酸配列改変体の構築における主要な改変は２つ存在する：変異部位の位置および変異の性質。改変体を設計する際に、変異部位の位置および変異の性質は、改変されるべき生化学的特徴に依存する。変異部位は、個々にまたは連続して改変され得る。例えば、（１）標的アミノ酸残基を欠失させること、（２）配置部位に隣接するアミノ酸残基を挿入すること、または（３）保存的アミノ酸選択でまず置換することによる。そして、達成される結果に依存して、より極端な選択で改変する。
【００２７】
アミノ酸配列欠失は、一般に、約40アミノ酸残基から、約30アミノ酸、約20アミノ酸、および代表的には約１〜10残基に及ぶ。成熟KGF-2のアミノ酸配列内の欠失が、例えば、FGFファミリーの他のメンバーの配列と低い相同性の領域において作製され得る。FGFファミリーの他のメンバーの配列と実質的に相同な領域における成熟KGF-2のアミノ酸配列内の欠失は、どうやら生物学的活性を有意に改変するようである。総欠失および／または連続的な欠失の数は、好ましくは、影響を受けるドメインにおける成熟KGF-2（配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208）の三次構造（例えば、システイン架橋）を保存するように選択される。
【００２８】
アミノ酸配列付加は、１〜100以上の残基の長さに及ぶアミノ末端および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数アミノ酸残基の内部配列内挿入を含み得る。内部付加は、好ましくは、約１〜10アミノ酸残基、より好ましくは約１〜５アミノ酸残基、そして最も好ましくは約１〜３アミノ酸残基に及び得る。成熟KGF-2のアミノ酸配列内の付加は、FGFファミリーの他のメンバーの配列との低い相同性の領域において作製され得る。FGFファミリーの他のメンバーの配列との実質的な相同性の領域における成熟KGF-2のアミノ酸配列内の付加は、どうやら生物学的活性を有意に改変するようである。挿入または付加は、好ましくは、他のFGFファミリーメンバーの配列に由来するアミノ酸配列を含む。
【００２９】
アミノ末端付加は、メチオニン付加（例えば、細菌性組換え細胞培養における直接発現の人為産物として）またはアミノ酸残基もしくは成熟KGF-2の配列を含むことが意図される。Ｎ末端付加のさらなる例は、組換え宿主細胞からのタンパク質の分泌を容易にするための成熟KGF-2のＮ末端へのシグナル配列の融合である。このようなシグナル配列は、一般に、意図される宿主細胞種から得られ、従ってその種に相同である。本発明に含まれるのは、未変性シグナル配列、例えば、配列番号２のアミノ酸Met1からThr36によって規定されるタンパク質の未変性シグナル配列または異種シグナル配列である。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識されそしてプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列であるはずである。未変性シグナル配列を認識も、プロセシングもしない原核生物宿主細胞のために、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列に置換され得る。酵母分泌について、シグナル配列は、例えば、酵母インバターゼ、α因子または酸ホスファターゼリーダー配列の群から選択され得る。哺乳動物細胞発現において、具体的に、全長KGF-2または他のFGFファミリーメンバーのシグナル配列（例えば、KGF）は、適切であり得る。
【００３０】
カルボキシ末端付加の例には、ヒトイムノグロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインの全部または部分とのKGF-2の融合を含むキメラタンパク質が挙げられる。このようなキメラポリペプチドは、イムノグロブリン部分がヒトイムノグロブリン（例えば、IgG、IgA、IgM、またはIgE、特にIgG（例えばIgG1もしくはIgG3）の重鎖の定常領域の第一ドメインを除く全てのドメインを含む場合に好ましい。当業者は、イムノグロブリン部分の任意のアミノ酸が欠失され得るか、または１つ以上のアミノ酸によって置換され得るか、あるいは１つ以上のアミノ酸がKGF-2部分が上皮細胞をなお刺激し、そしてイムノグロブリン部分が１つ以上のその特徴的特性を示す限り、付加され得ることを理解する。
【００３１】
改変体の別の群は、成熟KGF-2のアミノ酸配列のアミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、配列番号２のCys37〜Ser208の配列において少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を有し、そしてその代わりに異なる残基が挿入されている。置換改変体は、対立遺伝子変異体を含む。対立遺伝子変異体は、種の集団における天然に存在するヌクレオチド配列変化によって特徴づけられ、これは、アミノ酸変化を伴うかまたは伴わなくてもよい。当業者は、潜在的な変異部位の選択におけるポリペプチドの結合部位または活性部位について公知の任意の情報を使用し得る。
【００３２】
変異誘発についてのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、CunninghamおよびWells（1989）、Science、244:1081-1085（この開示は本明細書中で参考として援用される）に記載されるような「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法において、アミノ酸残基または標的残基の群が同定され（例えば、Arg、Asp、His、Lys、およびGluのような荷電残基）、そして中性のまたは陰性に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、アミノ酸と細胞内または外側をとりまく水性環境との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対して機能的な感受性を示すこれらのドメインは、置換の部位におけるさらなる残基または代替残基を導入することにより洗練される。従って、アミノ酸配列改変を導入するための部位は、予備決定され、そして所定の部位での変異の能力を最適化するために、アラニンスキャニングまたはランダム変異誘発が行われ得、そして改変体は、所望の活性および活性の程度の最適の組合せについて、スクリーニングされ得る。
【００３３】
置換変異誘発についての最も興味深い部位は、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208内の特定の残基が、側鎖の量、電荷、および／または疎水性に関して、種々の種または他のFGFファミリーメンバーとは実質的に異なっている部位を含む。興味深い他の部位は、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208内の特定の残基が種々の種のまたは他のFGFファミリーメンバーの間で同一である部位を含む。このような位置は、一般に、タンパク質の生物学的な活性に重要である。従って、当業者は、これらの部位は当初は比較的保存された様式で置換によって改変されるべきであることを理解する。
【００３４】
このような保存的置換は表１において「好ましい置換」というタイトルで示される。このような置換が生物学的活性変化を生じる場合、より実質的な変化（置換例）が導入され得るか、そして／または他の付加／欠失がなされ得、そして得られる産物がスクリーニングされ得る。
【００３５】
【表１】
2008283980.tif 000006
【００３６】
等価な性質のこのような変化を作製する際に、アミノ酸の親水性疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を付与するのにおける親水性疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に、当該分野で理解される（KyteおよびDoolittle(1982)、J.Mol.Biol.,157:105-131。この開示は本明細書中で参考として援用される）。特定のアミノ酸が同様の親水性疎水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、そしてなお、同様の生物学的活性を有し得ることは公知である。
【００３７】
類似のアミノ酸の置換が、親水性をもとに有効に（特に、本発明の場合のように、それによって作製された生物学的機能が等価のタンパク質またはペプチドが、免疫学的実施態様における使用のために意図される場合）なされ得ることも当該分野において理解される。米国特許第4,554,101号（この開示は、本明細書中で参考として援用される）は、タンパク質の最大の局所平均親水性が、その隣接のアミノ酸の親水性に支配される場合、その免疫原性および抗原性と、すなわち、タンパク質の生物学的特性と相関している。
【００３８】
米国特許第4,554,101号はまた、親水性に基づく一次アミノ酸配列由来のエピトープの同定および調製を教示する。米国特許第4,554,101号に開示された方法を通じて、当業者は、エピトープ（例えば、KGF-2のアミノ酸配列内のエピトープ）を同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と言及される。多くの科学文献は、アミノ酸配列の分析からの、二次構造の予想、およびエピトープの同定に集中している（ChouおよびFasman(1974)、Biochemistry、13(2):222-245；ChouおよびFasman(1974)、Biochemstry13(2):211-222；ChouおよびFasman(1978)、Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol、47:45-148;ChouおよびFasman（1978）、Ann.Rev.Biochem.、47：251-276、ならびにChouおよびFasman（1979）、Biophys.J.、26：367-384、これらの開示は本明細書中で参考として援用される）。さらに、コンピュータープログラムは、現在、タンパク質の抗原性部分およびエピトープコア領域を予想することを補助するのに利用可能である。例には、Jameson-Wolf分析（JamesonおよびWolf（1988）、Comput.Appl.Biosci.、4(1):181-186、ならびにWolfら（1988）、Comput.Appl.Biosci.、4(1):187-191、これらの開示は本明細書中で参考として援用される）に基づくそれらのプログラム；プログラムPepPlot（登録商標）（Brutlagら、（1990）、CABS、6:237ー245およびWeinbergerら（1985）Science、228：740-742、これらの開示は本明細書中に参考として援用される）；ならびにタンパク質三次構造予想についての他の新たなプログラム（FetrowおよびBryant（1993）、BIOTECHNOLOGY、11:479-483、この開示は本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。
【００３９】
対照的に、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208の機能的および／または化学的特徴における実質的改変は、（a）置換の領域のポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせん構造）、（b）標的部位におけるタンパク質の相対電荷または疎水性、または（c）側鎖の暈を維持することにおけるそれらの効果において有意に異なる置換を選択することによって達成され得る。天然に存在する残基は、一般の側鎖特性に基づく群に分割される：
１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
２）中性親水性：Cys、Ser、Thr；
３）酸性：Asp、Glu；
４）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
５）鎖の方向に影響する残基：Gly、Pro；および
６）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【００４０】
非保存的置換は、これらの群の相互のメンバーの交換を含み得る。このような置換された残基は、例えば、ほかのFGFファミリーメンバーの領域と相同である配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208の領域、またはそのタンパク質の非相同領域に導入され得る。
【００４１】
特定の実施態様において、改変体ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208と実質的に相同である。本明細書中で用いられる用語「実質的に相同」は、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208に対して80％を超える、好ましくは90％を超えるか、より好ましくは95％を超えるか、そして最も好ましくは99％を超える程度の相同性（すなわち、アミノ酸残基の同一性）を有することを意味する。本明細書中に記載される相同性の百分率は、その整列を補助するために100アミノ酸長について４ギャップが導入され得る場合に、比較される配列における同一のアミノ酸残基と整列する２つの配列のより小さな方に見い出されるアミノ酸残基の百分率として計算される。これはDayhoff（1972）によって示されている（Atlasof Protein Sequence and Structure、5：124、National Biochemical ResearchFoundation、Washington、D.C.、この開示は本明細書中によって参考として援用される）。実質的に相同であるとしてはまた、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208に対する抗体との交叉反応性によって単離され得る配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208の改変体、またはその遺伝子が配列番号１のDNAもしくはそのセグメントとのハイブリダイゼーションを通して単離され得る改変体が挙げられる。
【００４２】
第一のクラスの改変体は、配列番号２のCys37からSer208の欠失改変体の群である。これらの改変体は、Ｒ１−[Asn71-Pro203]-COOHタンパク質を含み、そしてさらに以下を含むアミノ酸配列を含む：
【００４３】
【化１】
2008283980.tif 000007
【００４４】
ここで、各々、Ｎ末端がメチオニル化されていても、またはメチオニル化されていなくてもよく、しかし、但し配列番号２のCys37からSer208は除かれる。
【００４５】
「Ｒ１−[Asn71-Pro203]-COOH」とは、以下の欠失改変体群を意味する：ここで、[Asn71-Pro203]は、配列番号２の残基71から残基203までを表し；Ｒ１は、Asn71または以下の群から選択されるアミノ末端アミノ酸残基のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表す：
【００４６】
【化２】
2008283980.tif 000008
【００４７】
【化３】
2008283980.tif 000009
【００４８】
【化４】
2008283980.tif 000010
【００４９】
そして、Ｒ２は、Pro203または以下のカルボキシ末端アミノ酸残基のカルボキシ基を表す：
【００５０】
【化５】
2008283980.tif 000011
【００５１】
但し、Ｒ１およびＲ２は、配列番号２のCys37からSer208を再構築するようには選択されない。
【００５２】
このクラスの好ましい改変体は以下の分子を含む：ΔN36 KGF-2;ΔN35KGF-2;
【００５３】
【化６】
2008283980.tif 000012
【００５４】
メチオニル化されているか、またはメチオニル化されていないかのいずれかである。
【００５５】
第二のクラスの改変体は、配列番号２のAsn168からMet176に相当する領域を有する、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体の置換、欠失、または付加改変体の群であり、ここで配列番号２のAsn168からMet176に相当する領域内の少なくとも１つのアミノ酸残基は、欠失されているかもしくは非天然アミノ酸と置換されており、または非天然アミノ酸が配列番号２のAsn168からMet176に相当する領域内で付加される；この領域は、FGFファミリー間で独特であり、主に結合特異性を与え得る残基（Trp169およびHis171）ならびに主に領域の構造を安定化させ得る残基（Gly173およびMet176）を含む。特定の実施態様では、Asn168からMet176に相当する領域は、欠失されるか、または以下の配列と置換される：NH2-Ala-Lys-Trp-Thr-His-Asn-Gly-Gly-Glu-Met-COOH（この配列は、KGFの推定レセプター結合領域の配列である）。
【００５６】
第三のクラスの改変体は、配列番号２のPhe85からSer198に相当する領域を有する、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体の欠失または置換改変体の群であり、ここで、配列番号２のPhe85からSer198に相当する領域内の少なくとも１つの中性または正に荷電したアミノ酸残基は、欠失されているか、または減少された正の電荷を有する電荷変化タンパク質を生じるように選択される中性残基もしくは負に荷電した残基と置換されている。改変のための好ましい残基は、配列番号２のPhe85、Thr86、Asn159、Gly182、Arg187、Asn196、Thr197、Ser198に対応する残基であり、残基Thr86、Gly182、Arg187およびAsn196がより好ましい。置換のための好ましいアミノ酸は、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびトレオニンを含み；アラニン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、およびアスパラギンがより好ましく；そしてアラニンが最も好ましい。
【００５７】
第四のクラスの改変体は、推定表面ループ形成領域である配列番号２のAsn160からThr164に相当する領域を有する、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体および／または第三のクラスのKGF-2改変体の置換改変体の群であり、ここで、より高いループ形成能を有する少なくとも１つのアミノ酸が、配列番号２のAsn160からThr164に相当する領域内でより低いループ形成能を有する少なくとも１つのアミノ酸について置換されている。非天然アミノ酸が、タンパク質のこの領域を安定化させるために、そのより高いループ形成能について選択される。比較的高いループ形成能を有するアミノ酸は、グリシン、プロリン、チロシン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびセリンを含む。Leszcynskiら、Science、234、849-855（1986）（天然に存在する分子のループ構造における出現頻度に基づいて割り当てられたループ形成能の相対値）。好ましくは、より高いループ形成能を有する別のアミノ酸が、ループ形成配列中の配列番号２のThr164に対応するトレオニン残基を置換する。
【００５８】
第五のクラスの改変体は、配列番号２のCys37、Cys106またはCys150に相当するアミノ酸残基を有する、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体および／または第三のクラスのKGF-2改変体および／または第四のクラスのKGF-2改変体の置換改変体の群であり、ここで、配列番号２の37、106または150位に相当する位置の少なくとも１つの天然に存在するシステイン残基は、欠失されているか、または非天然アミノ酸残基（例えば、Ala、Leu、またはSer）と置換されている。
【００５９】
第六のクラスの改変体は、配列番号２のCys37からSer208内のN-結合またO-結合グリコシル化部位に相当する少なくとも１つのN-結合またはO-結合グリコシル化部位を有する、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体および／または第三のクラスのKGF-2改変体および／または第四のクラスのKGF-2改変体および／または第五のクラスのKGF-2改変体の置換または欠失改変体の群である。このような改変体は、N-結合またはO-結合グリコシル化部位を改変し、そしてグリコシル化が変化したタンパク質を生じるように、欠失されるかまたは非天然アミノ酸と置換される、配列番号２のCys37からSer208内のN-結合またO-結合グリコシル化部位に相当する領域内のN-結合またはO-結合グリコシル化部位内の少なくとも１つのアミノ酸を有する。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Serのいずれかであり、ここでXaaは、Pro以外の任意のアミノ酸であり得る。実証されたまたは推定のアスパラギン残基は、配列番号２のアミノ酸Cys37からSer208の51位および196位に存在する。種々のアミノ酸置換または欠失は、N-結合またはO-結合グリコシル化部位を改変するためになされ得る。
【００６０】
第七のクラスの改変体は、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体および／または第三のクラスのKGF-2改変体および／または第四のクラスのKGF-2改変体および／または第五のクラスのKGF-2改変体および／または第六のクラスのKGF-2改変体の付加改変体の群であり、ここで推定切断部位Asn128−Gly129および／またはAsn141−Gly142は、Asn128および／またはAsn141に対するアミノ酸（例えばGlnまたはSer）の置換により改変されている。
【００６１】
第八のクラスの改変体は、上記のKGF-2および／または第一のクラスのKGF-2改変体および／または第二のクラスのKGF-2改変体および／または第三のクラスのKGF-2改変体および／または第四のクラスのKGF-2改変体および／または第五のクラスのKGF-2改変体および／または第六のクラスのKGF-2改変体および／または第七のクラスのKGF-2改変体の付加改変体の群であり、ここでヒト免疫グロブリン（例えば、IgG、IgA、IgMまたはIgE（特にIgG、例えばIgG1またはIgG3）の重鎖の定常領域の少なくとも１つのドメインを含む免疫グロブリン部分（しかし、一般には、第一のドメインを除く）が、前述のタンパク質の１つのＣ末端に融合されている。
【００６２】
KGF-2およびKGF-2の改変体（特に、Ｒ１−[Asn71-Pro203]-COOHタンパク質、そしてより特定するとΔN36KGF-2、ΔN35 KGF-2、ΔN34 KGF-2、ΔN33 KGF-2、ΔN32 KGF-2、ΔN31 KGF-2、ΔN30 KGF-2、ΔN29KGF-2、ΔN28 KGF-2、ΔN27 KGF-2、およびΔN26 KGF-2、これらは、メチオニル化されているかまたはメチオニル化されていないかのいずれか）の置換例を、以下の表に記載する：
【００６３】
【表２】
2008283980.tif 000013
【００６４】
【表２Ａ】
2008283980.tif 000014
【００６５】
最終KGF-2タンパク質が生物学的に活性である限り、欠失、挿入、および置換の多くの組み合わせがなされ得ることが、当業者に理解される。KGF-2の改変体は、その物理的特性を評価するために迅速にスクリーニングされ得る。例えば、生物学的活性（例えば、レセプター結合および／または親和性、分裂促進活性、細胞増殖活性、および／またはインビボ活性）のレベルは、種々のアッセイを用いて試験され得る。このような１つのアッセイは、分裂促進アッセイを含み、タンパク質がDNA合成を刺激する能力を試験する（Rubinら(1989)、前出、この開示はこれにより参考として援用される）。このような別のアッセイは、細胞増殖アッセイを含み、タンパク質が細胞増殖を刺激する能力を試験する（Falcoら、(1988)、Oncogene,2:573-578、この開示はこれにより参考として援用される）。
【００６６】
ポリペプチド誘導体
特性を改変するためにポリペプチドがポリマーに結合されているKGF-2タンパク質の化学改変誘導体（本明細書中で「誘導体」という）は、本発明の範囲内に含まれる。KGF-2タンパク質の化学改変誘導体は、本明細書中の開示が与えられれば、当業者によって調製され得る。結合体は、グリコシル化、非グリコシル化、または脱グリコシル化KGF-2タンパク質を用いて調製され得る。代表的には、非グリコシル化KGF-2タンパク質が使用される。
【００６７】
誘導体化に適切な化学部分には、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマー、各々が結合しているタンパク質が水性環境（例えば、生理学的環境）において沈澱しないので、所望される。好ましくは、ポリマーは、治療用製品または組成物の調製のために薬学的に受容可能である。当業者は、ポリマー／タンパク質結合体が治療的に使用されるかどうか、そしてその場合、治療的プロフィール（例えば、徐放の期間；タンパク質分解に対する耐性、もしあれば投薬、生物学的活性における効果；扱い易さ；抗原性の欠如の程度、および治療タンパク質における水溶性ポリマーの他の公知の効果）のような考慮事項に基づき所望のポリマーを選択し得る。
【００６８】
適切な臨床的に受容可能な水溶性ポリマーには、以下が挙げられるがそれらに限定されない：ポリエチレングリコール（PEG）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１、３、６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマー）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー（PPG）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（POG）（例えば、グリセロール）および他のポリオキシエチレン化ポリオール、ポリオキシエチレン化ソルビトール、またはポリオキシエチレン化グルコース,
コロン酸（colonic acid）もしくは他の炭水化物ポリマー、Ficollもしくはデキストラン、ならびにそれらの混合物。本明細書において使用される場合、ポリエチレングリコールとは、他のタンパク質（例えば、モノ−（C1−C10）アルコキシポリエチレングリコールまたはアリールオキシ--−ポリエチレングリコール）を誘導体化するために使用されている任意の形態を包含することが意味される。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性に起因して製造の際に利点を有し得る。
【００６９】
水溶性ポリマーは各々、任意の分子量であり得、そして分枝されていてもされていなくてもよい。一般に、分子量または分枝が増えるにつれ、ポリマー：タンパク質比は高くなる。水溶性ポリマーは各々、代表的に、約２kDa〜約100kDaの間の平均分子量を有する（用語「約」とは、水溶性ポリマーの調製の際、いくらかの分子は標示された分子量より重く、いくらかは軽いことを示す）。各水溶性ポリマーの平均分子量は、好ましくは約５kDa〜約40kDaの間で、より好ましくは、約10kDa〜約35kDaの間で、そして最も好ましくは、約15kDa〜約30kDaの間である。
【００７０】
当業者に利用可能な結合方法は多数存在し、これには、反応性水溶性分子を用いる（好ましくは、Ｎ末端化学改変タンパク質を生成するための）アシル化反応またはアルキル化反応が挙げられる。例えば、EP 0401 384を参照のこと。この開示は、本明細書中により参考として援用される；さらに、Malikら、（1992）Exp.Hematol.20:1028-1035；Francis（1992）、FocusOn Growth Factors、3(2)：4-10、Mediscript、Mountain Court、Friern Barnet Lane、LondonN20 ODL,UKにより発行；EP 0 154 316；EP 0 401 384；WO 92/16221；WO 95/34326；WO 95/13312；WO96/11953；PCT国際出願番号US96/19459；および本明細書中で引用されるPEG化（pegylation）に関連する他の刊行物（これらの開示は。本明細書により参考として援用する）を参照のこと。
【００７１】
本発明の特定の実施態様は、KGF-2タンパク質のＮ末端に還元アルキル化を介して結合体化している平均分子量約20kDaを有する非分枝モノメトキシ-−ポリエチレングリコールアルデヒド分子である。
【００７２】
多価形態
多価形態（すなわち、２つ以上の活性部分を含む分子）が構築され得る。１つの実施態様において、この分子は、複数のKGF-2タンパク質を有し得る。さらに、この分子は、少なくとも１つのKGF-2タンパク質および、多価形態の所望の特徴に依存して、少なくとも１つの他の分子を有し得る。
【００７３】
１つの実施態様において、KGF-2タンパク質は、化学結合され得る。例えば、KGF-2タンパク質は、上記のペジル化技術を介して二価の水溶性分子に化学結合され得る。さらに、KGF-2タンパク質は、ビオチンに化学結合され得、次いで結合体化されたビオチン／KGF-2タンパク質をアビジンに結合させて、四価のアビジン／ビオチン／KGF-2タンパク質を生じる。KGF-2タンパク質はまた、ジニトロフェノール（DNP）またはトリニトロフェノール（TNP）に共有結合され得、そして生じる結合体は、抗DNPまたは抗TNPIgMと沈澱させて、十量体の結合体を形成させ得る。
【００７４】
さらに別の実施態様において、KGF-2タンパク質を有する組換え融合タンパク質もまた、生成され得、ここで各組換えキメラ分子は、上記のように、イムノグロブリン分子重鎖および軽鎖のいずれかまたは両方の可変ドメインについて置換され、そして定常ドメインの全てまたは部分（であるが、ヒトイムノグロブリンの重鎖または軽鎖の少なくとも１つの定常ドメイン）を有するKGF-2タンパク質配列を有する。例えば、このようなキメラKGF-2タンパク質／IgG1融合タンパク質は各々、２つのキメラ遺伝子（KGF-2タンパク質／ヒトκ軽鎖キメラ（KGF-2タンパク質／Ck）およびKGF-2タンパク質／ヒトγ-1重鎖キメラ（KGF-2タンパク質/Cg-1）から生成され得る。以下に記載されるように、２つのキメラ遺伝子の転写および翻訳後に、二価を呈するKGF-2タンパク質を有する遺伝子産物を単一のキメラ分子として会合させ得る。このようなキメラ分子の構築に関するさらなる詳細は、米国特許第5,116,964号、PCT公開番号WO89/09622、PCT公開番号WO91/16437、およびEP311062に開示される。これらの開示は本明細書によって参考として援用される。
【００７５】
なおさらなる実施態様において、組換え融合タンパク質が産生され、ここで、組換えキメラ分子は各々、上記のように、少なくとも１つのKGF-2タンパク質、および欧州特許出願第96309363.8号に記載されるようにオステオプロテゲリン（osteoprotegerin）（OPG）の領域186-401の少なくとも一部を有する。
【００７６】
KGF-2タンパク質の産生は、以下にさらに詳細に記載される。このようなタンパク質は、例えば、所望のKGF-2タンパク質の、組換え技術またはインビトロ化学合成によって調製され得る。
【００７７】
ポリヌクレオチド
本記載に基づいて、そして普遍的コドン表を用いて、当業者は、KGF-2タンパク質のアミノ酸配列をコードする全ての核酸配列を容易に決定し得る。
【００７８】
下記に示す説明に従って行なわれる組換え発現技術を続けて行い、これらのポリヌクレオチドを生成して、コードされるタンパク質を発現させ得る。例えば、KGF-2タンパク質をコードする核酸配列を、適切なベクターに挿入することにより、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、配列を用いて検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、KGF-2タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することにより、所望のKGF-2タンパク質を多量に生成し得る。
【００７９】
本明細書中にさらに記載されるように、所望の核酸配列の増殖および／またはKGF-2タンパク質の生成に利用可能な多数の宿主／ベクター系が存在する。これらは、プラスミド、ウイルス、および挿入ベクター、ならびに原核生物宿主および真核生物宿主を包含するが、これらに限定されない。当業者は、異種DNAを増殖または発現し得る宿主／ベクター系を適応させて本発明の配列を産生または発現させ得る。
【００８０】
さらに、本開示を考慮すると、核酸配列は、配列番号１の核酸109〜624、ならびにその縮重核酸配列、成熟KGF-2の改変体をコードする核酸配列、および（下記のcDNAライブラリースクリーニングの節において開示されるハイブリダイゼーション条件または同等な条件もしくはよりストリンジェントな条件下で）配列番号１の核酸109〜624の核酸の相補体にハイブリダイズする核酸配列を含むことが当業者に認識される。
【００８１】
本発明により、KGF-2タンパク質をコードするDNA配列とともにベクターDNAを含む組換えDNA構築物もまた提供される。このようなDNA構築物の各々において、KGF-2タンパク質（シグナルペプチドを有するかまたは有さない）をコードする核酸配列は、選択された宿主においてKGF-2タンパク質の複製および／または発現を指向し得る適切な発現制御配列または発現調節配列と作動性に連結している。
【００８２】
ポリヌクレオチドの調製
KGF-2タンパク質をコードする核酸配列は、化学合成、cDNAもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはcDNAのPCR増幅を含むがこれらに限定されない、種々の方法において容易に入手され得る。このような核酸配列を単離するために有用であるこれらの方法および他の方法は、Sambrookら,(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY; Ausubelら編 (1994), Current Protocols in MolecularBiology, Current Protocols Press; ならびにBergerおよびKimmel (1987), Methods inEnzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, 第52巻, Academic Press, Inc.,San Diego, CAに示される。これらの開示は、本明細書中に参考として援用される。
【００８３】
所望のタンパク質をコードする核酸配列の化学合成は、当該分野で周知の方法（例えば、Engelsら(1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734およびWellsら (1985), Gene, 34:315（これらの開示は、本明細書中に参考として援用される）に示される方法）を用いて達成され得る。これらの方法は、特に、核酸配列合成のホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法を含む。大きな核酸配列、例えば、約100より大きなヌクレオチド長の核酸配列は、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、フラグメントは、一緒に連結されて適切な核酸配列を形成し得る。好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるポリマー支持合成である。
【００８４】
あるいは、適切な核酸配列は、適切なcDNAライブラリー（すなわち、このタンパク質を発現すると考えられる１つ以上の組織供給源から調製されたライブラリー）またはゲノムライブラリー（全ゲノムDNAから調製されたライブラリー）をスクリーニングすることにより入手され得る。cDNAライブラリーの供給源は、代表的には、妥当な量で所望のタンパク質を発現すると考えられる任意の種からの組織である。ゲノムライブラリーの供給源は、KGF-2タンパク質をコードする遺伝子を有すると考えられる任意の哺乳動物または他の種からの１種類または複数種類の任意の組織であり得る。
【００８５】
ハイブリダイゼーション媒体は、KGF-2タンパク質をコードするcDNAの存在について、ライブラリー中に存在するcDNAまたは遺伝子に選択的にハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブ（クローン化されるcDNAまたは遺伝子に対して受容可能なレベルの相同性を有するオリゴヌクレオチド、cDNA、またはゲノムDNAフラグメント）を用いてスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングに用いられるプローブは、代表的には、ライブラリーを調製した種と同じ種または類似の種からの小さな領域のDNA配列をコードする。あるいは、プローブは、本明細書中に議論されるように、縮重し得る。
【００８６】
ハイブリダイゼーションは、代表的には、オリゴヌクレオチドプローブまたはcDNAを、非特異的結合を防ぐがこのプローブまたはプライマーに有意なレベルの相同性を有するクローンの結合を可能にするストリンジェンシー条件下で、クローンにアニーリングさせることにより達成され得る。代表的なハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシー条件は、cDNAまたはオリゴヌクレオチドプローブのサイズ（すなわち、長さにおけるヌクレオチドの数）、およびこのプローブが縮重しているか否かに部分的に依存する。クローンを同定する確率はまた、ハイブリダイゼーション媒体を設計する際に考慮される（例えば、cDNAがスクリーニングされるか、またはゲノムライブラリーがスクリーニングされるか）。
【００８７】
DNAフラグメント（例えば、cDNA）がプローブとして用いられる場合、代表的なハイブリダイゼーション条件は、Ausubelら編(1994) 前出を含む。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション媒体は、いくつかの要素（例えば、プローブサイズ、クローンに対するプローブの予測される相同性、スクリーニングされるハイブリダイゼーション媒体、スクリーニングされるクローンの数など）に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄される。例示的なストリンジェントはハイブリダイゼーション条件は、４×SSC中62〜67℃でのハイブリダイゼーション、続いて0.1×SSC中62〜67℃での約１時間の洗浄である。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、45〜55％ホルムアミド中、４×SSC、40〜45℃でのハイブリダイゼーションである。図１に示す核酸配列に、弛緩したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつKGF-2タンパク質をコードするDNA配列もまた含まれる。このような弛緩したストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、４×SSC、45〜55℃、または30〜40％ホルムアミドにて40〜45℃でのハイブリダイゼーションである。Maniatisら(1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory,387-389頁を参照のこと。
【００８８】
オリゴヌクレオチドプローブを用いてハイブリダイゼーション培地をスクリーニングする、ストリンジェントな洗浄条件についての例示的なプロトコルが存在する。例えば、第１のプロトコルは、0.05％ピロリン酸ナトリウムを有する６×SSCを、プローブの長さに依存して、約35℃と約63℃との間の温度で使用する。例えば、14塩基のプローブは35℃〜40℃で、17塩基のプローブは45〜50℃で、20塩基のプローブは52〜57℃で、そして23塩基のプローブは57〜63℃で洗浄される。温度は、バックグラウンドの非特異的結合が高いようである場合、２〜３℃増加され得る。第２のプロトコルは、塩化テトラメチルアンモニウム（TMAC）を洗浄のために使用する。１つのこのようなストリンジェントな洗浄溶液は、３ＭTMAC、50mM Tris-HCl、pH8.0、および0.2％ SDSである。
【００８９】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。本方法において、cDNAは、ポリ(A)＋RNAまたは全RNAから、酵素逆転写酵素を用いて調製される。次いで、代表的には、KGF-2タンパク質をコードするcDNA（オリゴヌクレオチド）の２つの別々の領域に相補的な、２つのプライマーは、ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼ）とともにcDNAに添加され、そしてポリメラーゼは、２つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
【００９０】
プローブまたはプライマーとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、スクリーニングまたはPCR増幅の間に生じ得る非特異的結合の量を最少化するために適切な長さでかつ十分に明白であるものである。プローブまたはプライマーの実際の配列は、通常、保存されたまたは高度に相同な配列または領域に基づく。必要に応じて、プローブまたはプライマーは、完全にまたは部分的に縮重し得る。すなわち、そうするために全てが同じアミノ酸配列をコードするが異なるコドンを用いるプローブ／プライマーの混合物を含み得る。縮重プローブを調製するための別の方法は、イノシンを、種によって異なるコドンの位置のいくつかまたは全てに配置することである。オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、上記のようなDNAについての化学合成法により調製され得る。
【００９１】
ベクター
KGF-2タンパク質をコードするDNAは、さらにクローニングする（DNAの増幅）ためまたは発現のためにベクター中に挿入され得る。適切なベクターは市販されているか、またはベクターは、特異的に構築され得る。適切なベクターの選択または構築は、(1)ベクターがDNA増幅またはDNA発現に使用されるか否か、(2)ベクター中に挿入されるDNAのサイズ、および(3)ベクターで形質転換されることが意図される宿主細胞に依存する。
【００９２】
ベクターは、各々、選択された宿主細胞による所望のタンパク質の発現を指向するか、制御するか、さもなければ影響を与える１つ以上の以下の発現制御配列または調節配列に作動性に連結された所望のタンパク質をコードする核酸配列を含む。各ベクターは、その機能（DNAの増幅またはDNAの発現）および意図される宿主細胞とのその適合性に依存して種々の成分を含む。ベクター成分は、一般に、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上の選択またはマーカー遺伝子、プロモーター、エンハンサーエレメント、転写終結配列など。これらの成分は、天然の供給源から入手され得るか、または公知の手順により合成され得る。
【００９３】
適切な原核生物クローニングベクターの例は、バクテリオファージ（例えば、λ誘導体）またはE.coliからのプラスミド（例えば、pBR322、col E1、pUC、Ｆ因子、およびBluescript(R)プラスミド誘導体（Stratagene,LaJolla, CA））を含む。他の適切な発現ベクター（多数の型の発現ベクターが、下記の宿主細胞について当該分野で公知である）はまた、この目的のために用いられ得る。
【００９４】
シグナル配列
シグナル配列をコードする核酸は、所望のタンパク質をコードする配列（例えば、これはベクターの成分であり得るかまたは所望のタンパク質をコードする核酸の一部であり得る）の5'に挿入され得る。KGF-2タンパク質の天然のシグナル配列をコードする核酸は、公知である（WO 96/25422）。
【００９５】
複製起点
発現およびクローニングベクターは、各々、一般に、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞において複製するのを可能にする核酸配列を含む。クローニングベクターにおいて、この配列は、代表的に、ベクターが宿主の染色体DNAとは独立して複製するのを可能にする配列であり、そして複製起点または自律的に複製する配列を含む。このような配列は周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌について適切であり、種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV、またはBPV）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターについて有用である。一般的に、複製起点は、哺乳動物ベクターについては必要でない（例えば、SV40起点は、しばしば、初期プロモーターを含むことからのみ用いられる）。
【００９６】
選択遺伝子
発現およびクローニングベクターは、各々、代表的には、選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培養培地において増殖させた場合に、形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要な「マーカー」タンパク質をコードする。ベクターで形質転換されていない宿主細胞は、選択遺伝子を含まず、それゆえ、これらはその培養培地で生存しない。代表的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を与えるか；(b)栄養素要求性欠損を相補するか；または(c)培養培地から利用可能でない必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
【００９７】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために用いられ得る。増幅は、増殖に必須のタンパク質の生成のためにより多く要求される遺伝子が、組換え細胞の継続した世代の染色体内にタンデムで反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼを含む。細胞形質転換体は、ベクター中に存在するマーカーのために形質転換体のみが唯一適応して生存する選択圧の下に置かれる。選択圧は、形質転換細胞を、培地中の選択薬剤の濃度が連続的に変化し、それにより選択遺伝子および所望のタンパク質をコードするDNAの両方の増幅をもたらす条件下で培養することにより負わされる。結果として、増加した量の所望のタンパク質は、増幅されたDNAから合成される。
【００９８】
例えば、DHFR選択遺伝子で形質転換した細胞は、全ての形質転換体を、メトトレキサート（DHFRの競合的アンタゴニスト）を含む培養培地中で培養することによりまず同定される。適切な宿主細胞は、野生型DHFRが用いられる場合、DHFR活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣細胞株（UrlaubおよびChasin(1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7):4216-4220、この開示は本明細書中に参考として援用される）である。次いで、形質転換された細胞は、増加したレベルのメトトレキサートに曝露される。これは、複数コピーのDHFR遺伝子および同時に発現ベクター中の複数コピーの他のDNA（例えば、所望のタンパク質をコードするDNA）の合成を導く。
【００９９】
プロモーター
発現およびクローニングベクターは、各々、代表的には、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、そして所望のタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される。プロモーターは、特定の核酸配列の転写および翻訳を制御する構造遺伝子の開始コドンの上流（5'）（一般に、約100〜1000bp内）に位置する翻訳されない配列である。プロモーターは、従来、誘導性プロモーターおよび構成性プロモーターを含む２つのクラスの一方にグループ分けされ得る。誘導性プロモーターは、培養条件における何らかの変化（例えば、栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化）に応答してその制御下でDNAからの増加したレベルの転写を開始する。種々の強力な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。プロモーターは、制限酵素消化により供給源DNAからプロモーターを除去し、そして所望のプロモーター配列を挿入することにより、所望のタンパク質をコードするDNAに作動可能に連結され得る。天然のKGF-2プロモーター配列は、所望のタンパク質をコードする増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、天然のプロモーターと比較して発現されるタンパク質のより大きな転写およびより多くの収量を可能にする場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合する場合は、異種プロモーターが好ましい。例えば、他のFGFファミリーのメンバーの任意の１つの天然のプロモーター配列は、所望のタンパク質をコードするDNAの増幅および／または発現を指向するために用いられ得る。
【０１００】
原核生物宿主での使用に適切なプロモーターとしては、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（trp）プロモーター系；細菌のルミネッセンス（luxR）遺伝子系；およびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた適切である。それらのヌクレオチド配列は公開されており、それにより当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するために必要であるリンカーまたはアダプターを用いて、それらを所望のDNA配列に連結し得る。
【０１０１】
酵母宿主での使用に適切なプロモーター配列もまた、当該分野において周知である。哺乳動物宿主細胞での使用に適切なプロモーターは周知であり、そしてポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Adenovirus 2）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくは、SimianVirus 40(SV40)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１０２】
エンハンサーエレメント
発現ベクターおよびクローニングベクターは、各々、代表的には、所望のタンパク質をコードするDNA配列の高等真核生物による転写を増大するためのエンハンサー配列を含む。エンハンサーは、DNAのシス作用性エレメントであり、通常、約10〜300bpの長さであり、その転写を増大するためにプロモーターにおいて作用する。
【０１０３】
エンハンサーは、比較的配向および位置とは無関係である。それらは、転写ユニットの5'および3'に見出された。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとともに有利に使用される。哺乳動物の遺伝子から入手可能であるいくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェト-タンパク質、およびインスリン）。さらに、ウイルスエンハンサー（例えば、SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサー）は、真核生物プロモーターの活性化のための例示的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーが所望のタンパク質をコードするDNAの5'または3'位置でベクターにスプライスされ得る場合、それは代表的にはプロモーターの5'部位に配置される。
【０１０４】
転写終結
真核生物宿主細胞に使用される発現ベクターは、各々、代表的には、転写の終結のため、そしてmRNAを安定化させるために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物のDNAまたはcDNAの5'および時には3'非翻訳領域から一般に入手可能である。これらの領域は、所望のタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１０５】
１以上の上記の成分（所望のコード配列とともに）を含む適切なベクターの構築は、標準的な連結技術によって達成される。単離されたプラスミドまたはDNAフラグメントは切断され、調整され、そして必要とされるベクターを生成するために所望の順番で再連結される。正確な配列が構築されたことを確認するために、連結混合物が使用されて、E.coliが形質転換され得、そして上首尾な形質転換体が上記のような公知の技術によって選択され得る。次いで、形質転換体から大量のベクターが調製され、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析され、そして/または所望の構築物の存在を確認するために配列決定される。
【０１０６】
哺乳動物細胞中の所望のタンパク質をコードするDNAの一過性発現を提供するベクターもまた使用され得る。一般に、一過性発現は、宿主細胞が多コピーの発現ベクターを蓄積し、次いでこの発現ベクターによってコードされる高レベルの所望のタンパク質を合成するように宿主細胞中で効率的に複製し得る発現ベクターの使用を含む。適切な発現ベクターおよび宿主細胞を含む各々の一過性発現系は、クローン化DNAによってコードされるタンパク質の簡便なポジティブ同定、ならびに所望の生物学的および生理学的特性についてこのようなタンパク質の迅速なスクリーニングを可能にする。
【０１０７】
宿主細胞
任意の種々の組換え宿主細胞（各々が所望のタンパク質を発現するのに使用するための核酸配列を含む）もまた、本発明によって提供される。例示的な原核生物および真核生物の宿主細胞としては、細菌、哺乳動物、真菌、昆虫、酵母または植物細胞が挙げられる。
【０１０８】
原核生物宿主細胞としては、グラム陰性またはグラム陽性の生物のような真正細菌（例えば、E.coli(HB101, DH5a, DH10およびMC1061); B.subtilisのようなBacillus; Pseudomonas種（例えば、P.aeruginosa）;Streptomyces spp.; Salmonella typhimurium; またはSerratia marcescans）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様として、KGF-2タンパク質がE.coliにおいて発現され得る
原核生物宿主細胞に加えて、KGFタンパク質は、多細胞生物に由来する多数の適切な宿主細胞の内のいずれか１つによってグリコシル化形態で発現され得る。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコシル化活性を有し得る。原則として、任意の高等真核生物の細胞培養（脊椎動物細胞、または植物および昆虫の細胞を含む無脊椎動物細胞を含もうと、含むまいと）が使用され得る。
【０１０９】
真核生物微生物（例えば、糸状真菌または酵母）は、KGF-2タンパク質の発現に適切な宿主であり得る。Saccharomycescerevisiae、または一般的なパン酵母が、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般に使用されるが、多数の他の属、種および株が周知であり、そして一般的に利用可能である。
【０１１０】
培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は周知の手順であるので、脊椎動物細胞が使用され得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（293細胞または懸濁培養における増殖のためにサブクローン化された293細胞）、新生仔ハムスター腎臓細胞およびチャイニーズハムスター卵巣細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物細胞株としては、Hela、マウスL-929細胞、Swiss、Balb-c、またはNIHマウス由来の3T3株、およびBHKまたはHaKハムスター細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施態様として、KGF-2タンパク質は、COS細胞またはバキュロウイルス細胞において発現され得る。
【０１１１】
宿主細胞は、トランスフェクトされ得、そして好ましくは核酸の発現を許容する適切な条件下で所望の核酸で形質転換され得る。適切な宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニングならびに産物の産生および精製のための方法は、当該分野で周知である（GethingおよびSambrook (1981), Nature, 293:620-625、あるいは、Kaufmanら、(1985),Mol.Cell.Biol., 5(7):1750-1759, または米国特許第4,419,446号、これらの開示は、参考として本明細書に援用される）。例えば、細胞壁を有さない哺乳動物細胞については、リン酸カルシウム沈殿法が使用され得る。エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび他の公知の技術もまた使用され得る。
【０１１２】
所望のタンパク質が、相同性組換えによって、またはKGF-2タンパク質をコードするDNAを既に含有する細胞に導入される制御エレメントを利用する組換え産生法で産生され得ることもまた可能である。相同性組換えは、本来は転写的に活性な遺伝子において変異を誘導するかまたは補正するように、遺伝子を標的化するために開発された技術である（Kucherlapati(1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol.Biol., 36:301、この開示は、参考として本明細書に援用される）。基本技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するため（Thomasら、(1986),Cell, 44:419-428; ThomasおよびCapecchi (1987), Cell, 51:503-512およびDoetschmanら、(1988),Proc.Natl.Acad.Sci., 85:8583-8587、この開示は参考として本明細書に援用される）または欠損遺伝子内の特定の変異を補正するため（Doetschmanら、(1987),Nature, 330:576-578, この開示は参考として本明細書に援用される）の方法として開発された。例示的技術は、米国特許第5,272,071号；WO92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650およびWO 94/31560に記載されている。これらの開示は参考として本明細書に援用される。
【０１１３】
宿主細胞の培養
所望のタンパク質の産生のために１以上の組換え宿主細胞の各々を培養する方法は、多くの要因および考慮に依存して変化する；所定の状況について最適な産生手順は、最小限の実験により当業者に明らかである。このような組換え宿主細胞は、適切な培地において培養され、次いで発現されるタンパク質は、必要に応じて、当業者に公知の適切な手段によって培養培地（または細胞内で発現される場合には、細胞）から回収され、単離され、そして精製される。
【０１１４】
詳細には、所望のタンパク質を産生するために使用される組換え細胞の各々は、プロモーターの誘導、適切な組換え宿主細胞の選択または所望のタンパク質をコードする遺伝子の増幅のために適切な培地において培養され得る。培地は、必要な場合には、ホルモンおよび/または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、HEPES）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、微量元素（通常、マイクロモル濃度の範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは別のエネルギー供給源を補充され得る。他の補充物はまた、当業者に理解されるように、適切な濃度で含まれ得る。適切な培養条件（例えば、温度、pHなど）はまた、選択された宿主細胞での使用について当業者に周知である。
【０１１５】
次いで、得られる発現産物は、当該分野で公知の手順を用いてほぼ均一になるまで精製され得る。例示的な精製技術は、公開されたPCT出願番号WO90/08771およびWO 96/11952に教示され、これらの開示は、参考として本明細書に援用される。
【０１１６】
使用
本明細書中に記載されるKGF-2の改変体、およびKGF-2の化学的に修飾された誘導体およびKGF-2タンパク質の改変体（集合的に、「KGF-2タンパク質産物」）は、研究試薬として、ならびに治療薬剤および診断薬剤として使用され得る。したがって、KGF-2タンパク質産物は、インビトロおよび/またはインビボ診断アッセイにおいて使用されて、組織または器官のサンプル中のKGF-2の量が定量化され得る。
【０１１７】
例えば、KGF-2タンパク質産物は、当該分野で公知の技術（WO 90/08771）を用いて種々の体液および組織のサンプル中のKGF-2タンパク質のレセプターの同定のために使用され得る。
【０１１８】
本発明はまた、KGF-2タンパク質産物（天然のKGF-2を含む）に対して作製される抗体の生成におけるKGF-2タンパク質産物の使用を意図する。当業者は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体あるいは組換え抗体を得るために周知の、刊行された手順を使用し得る。次いで、このような抗体は、KGF-2タンパク質産物（天然のKGF-2を含む）を精製および特徴付けるために使用され得る。
【０１１９】
薬学的組成物
本発明は、各々、治療的にまたは予防的に有効量のKGF-2タンパク質産物を含有する薬学的調製物を意図する。
【０１２０】
薬学的組成物は、各々、一般に、ビヒクルとの混合物として治療的に有効または予防的に有効な量のKGF-2タンパク質産物を含有する。ビヒクルは、好ましくは、KGF-2タンパク質産物との混合物として１以上の薬学的および生理学的に受容可能な処方物物質を含む。
【０１２１】
ビヒクル中の主な溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質であり得る。さらに、ビヒクルは、以下を改変または維持するための他の薬学的に受容可能な賦形剤を含有し得る：pH（例えば、クエン酸、リン酸、およびグリシンのようなアミノ酸のような緩衝液)；浸透圧（例えば、マンニトールおよび塩化ナトリウム)；粘性；明澄性；呈色；無菌性；安定性（例えば、スクロースおよびソルビトール);処方物のにおい；溶解の速度（例えば、アルコール、ポリエチレングリコールおよび塩化ナトリウムのような溶解剤または可溶化剤)；放出の速度；ならびに凍結乾燥処方物のためのバルク剤（例えば、マンニトールおよびグリシン)；界面活性剤（例えば、ポリソルベート20、ポリソルベート80、トリトン、およびプルーロニック)；抗酸化剤（例えば、硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム);保存剤（例えば、安息香酸およびサリチル酸); 香料および希釈剤；乳化剤；懸濁剤；溶媒；賦形剤；送達ビヒクル；希釈剤および/または薬学的アジュバント。他の有効な投与形態（例えば、非経口徐放物、吸入霧、経口活性処方物、または坐薬）もまた意図される。
【０１２２】
組成物はまた、バルク侵食ポリマーのようなポリマー化合物（例えば、ポリ(乳酸-コ-グリコール酸)(PLGA)コポリマー、PLGAポリマーブレンド、PEGのブロックコポリマー、および乳酸およびグリコール酸、ポリ(シアノアクリレート));表面侵食ポリマー（例えば、ポリ無水物）およびポリ(オルトエステル); ヒドロゲルエステル(例えば、プルーロニックポリオール、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、リンゴ酸無水アルキルビニルエーテルコポリマー、セルロース、ヒアルロン酸誘導体、アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、アルブミン、ならびに澱粉およびデキストラン)およびそれらの組成物の系）の粒子性調製物、あるいはリポソームまたはミクロスフェアの調製物を含む。このような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスに影響し得る。所望のタンパク質について最適な薬学的処方物は、投与の経路および所望の用量に応じて当業者に決定される。例示的な薬学的組成物は、Remington'sPharmaceutical Sciences, 第18版、(1990), Mack Publishing Co., Easton PA 18042,1435-1712頁；GombotzおよびPettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bayら、(1995),Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haasら、(1995), Clinical Immunologyand Immunopathology, 76(1):93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772およびWO 94/21235に開示されており、これらの開示は参考として本明細書に援用される。
【０１２３】
特定の持続放出組成物は、種々の供給会社（Depotech Corp.(DepofoamTM, 多小胞リポソーム); Alkermes, Inc. (ProLeaseTM, PLGAミクロスフェア)を含む）から入手可能である。本明細書中で使用される場合、ヒアルロナンは、ヒアルロナン、ヒアルロン酸、それらの塩（例えば、ヒアルロン酸ナトリウム）、エステル、エーテル、酵素的誘導体およびヒアルロン酸の架橋ゲル、ならびにヒアルロン酸の化学的に修飾された誘導体（例えば、ヒラン(hylan)）を含むことが意図される。ヒアルロナンの例示的な形態は、米国特許第4,582,865号、同第4,605,691号、同第4,636,524号、同第4,713,448号、同第4,716,154号、同第4,716,224号、同第4,772,419号、同第4,851,521号、同第4,957,774号、同第4,863,907号、同第5,128,326号、同第5,202,431号、同第5,336,767号、同第5,356,883号;欧州特許出願第0 507 604 A2号、同第0 718 312 A2; およびWO 96/05845に開示されており、これらの開示は参考として本明細書に援用される。ヒアルロナンの供給業者としては、BioMatrix,Inc. Ridgefield, NJ; Fidia S.p.A., Abano Terme, Italy; Kaken PharmaceuticalCo., Ltd., Tokyo, Japan; Pharmacia AB, Stockholm, Sweden; Genzyme Corporation,Cambridge, MA; Pronova Biopolymer, Inc. Postsmouth, NH; Calbiochem-NovabiochemAB, Lautelfingen, Switzerland; Intergen Company, Purchase, NY およびKyowa HakkoKogyo Co., Ltd., Tokyo, Japanが挙げられる。
【０１２４】
経口的徴候の処置および/または予防のために、液体溶液または懸濁物が口内洗浄剤と類似の様式で使用され得る。ここで、液体は、病変の処置を最大化するように口の周辺にひと振り（swish）される（米国特許第5,102,870号、この教示は、参考として本明細書に援用される）。粘膜表面とのより長い接触は、粘膜をコートし得る適切なビヒクルを選択することによって達成され得る。代表的な例は、OrabaseRegisteredTM(Colgate-Hoyt Laboratories, Norwood, MA)のような処方物、スクラルファート懸濁物、KaopectateおよびMagnesiaのMilkのような処方物を含有するペクチンである。処方物はまた、薬学的に受容可能な非毒性ビヒクルまたはキャリアを有する塗布可能なクリーム、ゲル、ローションまたは軟膏である。KGF-2タンパク質産物はまた、例えば、緩徐に溶解する錠剤またはトローチ、チューイングガムベース、または舌下錠あるいは後方臼歯にホックでとめられた緩徐送達補綴具中に取り込まれ得る。鎮痛剤および麻酔剤のような治療薬剤は、疼痛を軽減するために投与され得、そして例えば、抗感染剤、抗細菌剤、抗真菌剤、および防腐剤が、病変の二次感染を予防および/または処置するために投与され得る。
【０１２５】
一旦、薬学的組成物が処方されると、溶液、懸濁物、ゲル、乳液、固体、または脱水されたかもしくは凍結乾燥された粉末として無菌バイアル中で保存され得る。このような処方物は、調製済み形態または投与の前に再構築を必要とする形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで保存され得る。
【０１２６】
特定の実施態様において、本発明は、単一用量の投与単位を産生するためのキットに関する。キットは、各々、乾燥したタンパク質を有する第１のコンテナおよび水性処方物を有する第２のコンテナの両方を含有する。本発明の範囲内に含まれるキットは、単一および複数のチャンバーの予め充填されたシリンジ；例示的な予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ、およびLyo-Ject(R)、二重チャンバーの予め充填された分散シリンジ（lyosyringe）のような分散シリンジ）がVetter GmbH,Ravensburg, Germanyから入手可能である。
【０１２７】
本明細書中に記載されるKGF-2タンパク質産物処方物が、獣医学ならびにヒト適用のために使用され得、そして用語「患者」は限定的な様式で解釈されるべきでないことに留意すべきである。
【０１２８】
患者にKGF-2タンパク質産物を投与する頻度は、患者の疾患および状態、ならびに処方される場合にKGF-2タンパク質産物の薬学的動態学的パラメータ、および投与の経路に依存する。KGF-2タンパク質産物は、１回投与され得るか、毎日投与され得るか、または最初のボーラス投与、続く継続的投与または持続的送達により投与され得る。他の様式の継続的またはほぼ継続的投与が実施され得ることもまた意図される。例えば、化学的誘導体化は、決定された投与計画に基づいて、予想可能な量で、血流における継続的存在の作用を有するタンパク質の持続性放出形態を生じ得る。
【０１２９】
上皮細胞の刺激(細胞保護作用、増殖、および/または分化を含む)を必要とする患者は、KGF-2タンパク質産物の有効量を投与されて、患者において所望の応答を惹起し得、従って一般に担当医によって決定される。特定の状態を予防または処置する方法に関与する投与計画は、担当医によって、薬物の作用を改変する種々の要因(例えぱ、患者の年齢、状態、体重、性別、および食事)を考慮して、任意の感染の重篤度、投与の時間、および他の臨床的要因を決定される。適切な投与量は、適切な用量応答データと共に利用して投薬量を決定するための確立されたアッセイの使用を介して確かめられ得る。代表的な投薬量は、0.001mg/ｋｇ体重〜500mg/ｋｇ体重の範囲であり、好ましくは200mg/ｋｇ体重、より好ましくは100mg/ｋｇ体重である。
【０１３０】
KGF-2タンパク質産物は、局所的か、経腸的か、または非経口的な投与(静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角質下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射ならびに注入を限定されずに含む)投与され得る。KGF-2タンパク質産物は、経口投与または粘膜(すなわち、全身送達のための鼻腔内、舌下、頬側、直腸内の粘膜)を介して投与される。KGF-2タンパク質産物は、患者の疾患および状態に依存して単回使用され得るかまたは繰り返し投与され得る。いくつかの場合、KGF-2タンパク質産物は、他の治療に対するアジュバントとして、そしてまた他の薬学的調製物とともに投与され得る。
【０１３１】
別の実施態様において、細胞治療(例えば、KGF-2タンパク質を産生する細胞の移植)もまた、意図される。本発明のこの実施態様は、生物学的活性型のKGF-2タンパク質の合成および分泌し得る患者細胞への移植を含み得る。KGF-2タンパク質を産生するこのような細胞は、KGF-2タンパク質を正常に分泌しないが、KGF-2タンパク質の産生が改変されている細胞であり得るか、またはKGF-2タンパク質を産生する能力が、このようなタンパク質の発現および分泌に適したポリヌクレオチドでの形質転換によって増大されている細胞であり得る。外来種のKGF-2タンパク質を投与されている患者において潜在的な免疫学的反応を最小化するために、細胞が患者(例えぱ、ヒト)と同種であるか、または細胞が免疫学的認識に対して障害を与える物質でカプセル化されているか、免疫学的特権を与えられた解剖学的位置(例えば、精巣、眼、および中枢神経系)へ配置された細胞であることが好ましい。
【０１３２】
ヒトまたは非ヒト動物細胞は、患者において、KGF-2タンパク質の放出を可能にするが、患者の免疫系または周囲の組織由来の他の有害な因子による細胞の崩壊を妨げる生体適合的な、半透性の高分子封入物または膜において移植され得る。あるいは、KGF-2タンパク質を産生するようにエキソビボで形質転換された患者自身の細胞は、このようなカプセル化を有さない患者へ直接移植され得る。生存細胞の膜カプセル化の方法論は、当業者に精通しており、そしてカプセル化細胞の調製および患者におけるそれらの移植は、公知の技術(米国特許第4,892,538号；同第5,O11,472号；および同第5,106,627号、これらの開示は本明細書によって参考として援用される)を用いて達成され得る。
【０１３３】
なお別の実施態様において、インビボ遺伝子治療もまた想像され、ここでKGF-2タンパク質をコードする核酸配列は、直接患者に導入される。肝細胞への効率的かつ長期耐久性の遺伝子導入は、肝疾患の予防および/または処置するタンパク質の局所的発現のため、および/または他の器官または組織における疾患の予防および/または処置するタンパク質の分泌のための効率的な遺伝子治療を必要とする。
【０１３４】
DNA構築物は、DNAが、そのような組織で活性であるプロモーターに作動可能に連結されるならぱ、インビボで組み込まれそして発現される処置されるべき器官の組織へ直接注射され得る。DNA構築物はまた、細胞内の組み込みを助けるために、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、および/またはヘルペスウイルスベクターのようなそのようなベクター由来のベクター配列をさらに含み得る。物理的導入は、所望の核酸構築物または所望の核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所的な注射(例えぱ、リポソーム媒介導入、直接注射(裸のDNA)、レセプター媒介導入(リガンドDNA複合体)、または微粒子照射(遺伝子銃))によってインビボで達成され得る。肝臓における肝細胞のインビボ再生成のために、モロニーレトロウイルスベクターが、特に有効であり得る(Boschら(1996);ColdSpring Harbor,Gene Therapy Meeting,1996年9月25-29日;およびBoschら(1996),Joumal ofClinical Investigation, 98(12):2683-2687)。
【０１３５】
KGF-2タンパク質産物は、治療有効量および予防有効量で、損傷を有することによって特異的に特徴づけられる器官または組織に、または臨床的に不十分な数の上皮細胞に適用され得る。KGF-2タンパク質産物は、獣医学的におよびヒトへの適用に使用され得ること、ならびに用語「患者」は、限定的な様式に解釈されるべきではないことに留意すべきである。
【０１３６】
本発明に従って、KGF-2タンパク質産物は、インビボでの、目、耳、歯肉、髪、肺、皮膚、膵臓（エンドクリンおよびエキソクリン）、胸腺、甲状腺、膀胱、肝臓、および胃腸管（口腔の細胞、食道の細胞、腺胃および小腸の細胞、結腸および腸粘膜の細胞、直腸の細胞、ならびに肛門管の細胞を含む）を含むが、これらに限定されない上皮細胞の刺激（細胞保護作用、増殖、および/または分化を含む）、増殖、および/または分化を誘導するために使用され得る。KGF-2タンパク質産物が首尾良く投与され得る徴候には、以下が含まれるが、これらに限定されない：火傷および毛包、汗腺、および皮脂腺のような副腎構造の刺激を必要とする他の部分的および全厚（full-thickness）傷害；表皮水疱症によって引き起こされる病変（これは下層の真皮への表皮の接着における欠損であり、重篤な病的状態を引き起こし得る開口した有痛性の水疱を頻繁に生じる）；化学療法によって誘導される脱毛症および男性型ハゲ、または男性および女性における髪の進行性損失；胃および十二指腸潰瘍；放射線および化学療法処置養生法における腸毒性；びらん性胃炎、食道炎、食道逆流、またはクローン病のような炎症性腸疾患（主に小腸を冒す）および潰瘍性結腸炎（主に大腸を冒す）を含む胃腸管（例えば、食道、胃、および小腸）の侵食；放射腺/化学療法効果を含む唾液腺組織に対する障害または損傷、Sjogren症候群のような自己免疫疾患（これは、唾液腺機能不全（sicca症候群）を引き起こし得る）；胃腸管全体の粘液の機能不全的な産生；成人呼吸窮迫症候群（ARDS）、肺炎、未熟児のヒアリン膜症（すなわち、小児呼吸窮迫症候群および気管支肺の異形成）；吸入傷害（高酸素レベルを含む）に起因する急性または慢性の肺損傷または機能不全、気腫、化学療法、人工呼吸器外傷、または他の肺損傷環境に起因する肺損傷；肝硬変、激症の肝不全、急性のウイルス性肝炎によって引き起こされる損傷および/または肝臓に対する中毒性発作および/または胆管疾患、および肝臓へのウイルス媒介性遺伝子導入；化学薬品、細菌、またはウイルスに起因する角膜の剥離および/または角膜の潰瘍化；進行性歯肉疾患；鼓膜損傷；化学療法および/または感染から生じる状態を含む潰瘍および/または炎症；糖尿病（Ｉ型およびII型）、膵炎、嚢胞性線維症を含み、および島細胞移植における付属物（adjunct）としての膵臓障害および膵臓機能不全。
【０１３７】
従って、本発明は、これらの特定の細胞型に対する損傷かまたはその欠損の開始を低減、遅延、および/またはブロックするための、KGF-2の予防的および/または治療的使用によって特異的に特徴づけられるKGF-2タンパク質産物の適用を可能にするのに関する有意な意味を有する。以下は、本発明に従ってKGF-2タンパク質産物で処置され得る疾患および医学的状態のより特異的な記載である。
【０１３８】
KGF-2タンパク質産物の特異的使用は、本出願と同日にLacey、Ulich、DanilenkoおよびFarrellによって出願され、出願の送達レターに「ケラチノサイト増殖因子２の使用」（アトーニー書類番号A-422C-PCT）と題されたPCT特許出願第 号に開示され、その開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０１３９】
KGF-2タンパク質産物は、肝臓機能を増大させるための肝細胞保護、増殖、および/または分化を増大させるために有用である。KGF-2タンパク質産物は、肝硬変、激症の肝不全、急性ウイルス性肝炎によって引き起こされる損傷、肝臓および/または胆管障害に対する中毒性発作を処置ならびに/または予防するために有用である。
【０１４０】
肝硬変（ウイルス性肝炎および慢性のアルコール摂取に対して二次的である）は、罹患率および死亡率の有意な原因である。KGF-2タンパク質産物は、硬変の発症を処置および/または予防するために有用である。肝硬変の標準的なインビボモデルは、公知である（Tomaszewskiら（1991),J. Appl. Toxicol., 11:229-231、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４１】
激症の肝不全は、末期の硬変で生じる生命を危険にさらす状態であり、そして現在肝臓移植によってのみ処置し得る。KGF-2タンパク質産物は、激症の肝不全を処置および/または予防するために有用である。激症の肝不全の標準的なインビボモデルは、公知である（Mitchelら(1973),J. Pharmacol. Exp. Ther., 187:185-194; ThakoreおよびMehendale (1991), ToxicologicPathol., 19:47-58;およびHavillら (1994), FASEB Journal, 8(4-5):A930, Abstract 5387、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４２】
急性のウイルス性肝炎は、頻繁に不顕性で、そして自己制限的（self-limiting）である。しかし、少数の患者において、重篤な肝臓損傷は、数週間にわたって生じ得る。KGF-2タンパク質産物は、ウイルス性肝炎を予防および/または処置するにおいて有用である。肝細胞増殖の標準的なインビボモデルは、公知である（Housleyら(1994),Journal of Clinical Investigation, 94(5):1764-1777；およびHavillら(1994)、前出、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４３】
アセトアミノフェン、ハロタン、四塩化炭素、および他の毒素によって引き起こされる肝臓に対する中毒性発作は、KGF-2タンパク質産物によって予防および/または処置され得る。肝臓毒素の標準的なインビボモデルは、公知である（Mitchellら、(1973)、前出；ThakoreおよびMehendale(1991)、前出；およびHavillら(1994)、前出、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４４】
KGF-2タンパク質産物は、胃腸管（例えば、口腔、食道、胃、小腸、結腸、直腸、および肛門管）における上皮細胞の細胞保護、増殖、および/または分化を増大させるために有用である。本明細書中で定義されるように、用語「胃腸管」および「腸」は、当該分野で認識されている用語であり、そして交換可能に使用される。特に、KGF-2タンパク質産物は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、炎症性腸疾患、腸毒性、および胃腸管の侵食を処置および/または予防するために有用である。
【０１４５】
胃潰瘍は、有意な罹患率を引き起こし、比較的高い再発率を有し、そして粘膜
の裏打ちの上に瘢痕を形成することによって治癒する。KGF-2タンパク質産物は、腺の粘膜の分解を予防し、そしてより迅速に腺粘膜を再生するのに有用であり、例えば、胃潰瘍の処置における有意な治療的改善を提供する。胃潰瘍の標準的なインビボモデルは、公知である（Tarnawskiら、(1991)、「IndomethacinImpairs Quality of Experimental Gastric Ulcer Healing: A QuantitativeHistological and Ultrastructural Analysis」、Mechanisms of Injury, Protection andRepair of the Upper Gastrointestinal Tract、（編）GarnerおよびO'Brien, Wiley &Sons; Brondie (1968) Gastroenterology, 55:25; およびOhningら(1994),Gastroenterology, 106(4補遺）:A624、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４６】
十二指腸潰瘍は、胃潰瘍と同様に、有意な罹患率を引き起こし、そして比較的高い再発率を有する。KGF-2タンパク質産物は、十二指腸の粘膜の裏打ちの分解を予防し、そして十二指腸の粘膜の裏打ちを迅速に再生して、潰瘍を治癒してその再発を減少させるのに有用である。十二指腸潰瘍の標準的なインビボモデルは、公知である（Bergら(1949),Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 7:374-376; SzaboおよびPihan, Chronobiol. Int. (1987),6:31-42;およびRobertら(1970), Gastroenterology, 59:95-102、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４７】
腸毒性は、放射線（腹部、全身または局所（例えば、頭および首））および化学療法の両方でのガン処置に関連する主要な限定因子である。主な懸念は、以下を受けている患者である：ガン（例えば、白血病、乳ガン）のための化学療法または腫瘍の除去に対するアジュバントとして；頭および首のガンのための放射線治療；ならびに骨髄移植のための化学療法および放射線治療の組み合わせ。損傷の重篤度は、化学療法剤のタイプおよび用量、ならびに放射線治療のような平行療法に関連する。
【０１４８】
胃腸管の部分における粘膜炎は、これらの患者の有意な疼痛および不快感の原因となり得、そして重篤度は赤熱状態および腫脹からあからさまな潰瘍性病変までにわたる。病変は、しばしば二次的に感染され、そして治癒するのが一層困難になる。放射線誘導性の腸毒性の標準的なインビボモデルは、公知である（WithersおよびElkind (1970), Int. J. Radiat., 17(3):261-267、その開示が本明細書中で参考として援用される）。化学療法誘導性の腸毒性の標準的なインビボモデルは、公知である（Farrellら、TheAmerican Society of Hematology, 38th Annual Meeting (Orlando, FL), 1996年12月6〜8日；Sonisら（1990),Oral Surg. Oral Med & Oral Pathol., 69(4):437-443;およびMoore (1985), CancerChemotherapy Pharmacol., 15:11-15、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１４９】
例示的な化学療法剤には、BCNU、ブスルファン、カルボプラチン、シクロホスファミド、シスプラチン、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン（gemcytabine)、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、メトトレキセート、ナベルビン（navelbine)、トポテカン（topotecan)、タキソール、およびタキソテールが含まれるが、これらに限定さす、そして例示的な処置養生法には、BEAM（ブスルファン、エトポシド、シトシンアラビノシド、メトトレキセート）；シクロホスファミドおよび全身放射線照射；シクロホスファミド、全身放射線照射およびエトポシド；シクロホスファミドおよびブスルファン；ならびにロイコボリンまたはレバミソールを伴う5-フルオロウラシルが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５０】
KGF-2タンパク質産物での処置、前処置、および/または後処置は、例えば、小腸粘膜上での細胞保護効果または再生またはその両方を生成するのに有用であり、このような治療の増大した用量を可能にする一方、腸毒性の潜在的に致死的な副作用を低減する。
【０１５１】
KGF-2タンパク質産物は、以下の設定で優先的に投与され得る。結腸直腸の患者は、日常的に5-フルオロウラシルをロイコボリンとともに、１日目〜５日目に投与され得る；KGF-2タンパク質産物は、-2、-1、および0日目に投与され得る。頭部および頚部のガン患者は、７週間の期間にわたり低分画放射線治療ならびに5-フルオロウラシルおよびシスプラチンを日常的に投与される：KGF-2タンパク質産物は、-2、-1、および0日目に投与され得、そしてその後放射線治療が終わるまで週一回投与され得る。リンパ腫移植においては、患者はBEAM治療を６日間（１日目〜６日目）頻繁に投与される；KGF-2タンパク質産物は、-2、-1、および0日目に、そして３日間の後処置として投与され得る（７〜９日目）。
【０１５２】
特定の実施態様において、KGF-2タンパク質産物は、粘膜炎の発症（化学療法および/または放射線治療に起因する）を低減、遅延、および/またはブロックするために、血球減少の発症を遅延および/またはブロックするための１つ以上のサイトカインと組み合わせて、予防的に、および/または治療的に投与され得る。
【０１５３】
代表的には、骨髄、末梢血前駆細胞、または幹細胞（McNieceら(1989),Blood, 74:609-612およびMooreら(1979), Blood Cells, 5:297-311、その開示が本明細書中で参考として援用される）は、骨髄抑制性の細胞減少性の治療（化学療法単独または放射線治療との組み合わせ）の前に患者から除去され、次いでこのような治療の骨髄抑制性効果を相殺するために、細胞減少性の治療と同時にかまたはその後に患者に再び投与される。
【０１５４】
多くの異なるアプローチが、放射線または有毒な化学薬品の副作用から生体を保護するために行われている。１つのアプローチは、毒性が発生する前に骨髄細胞を置換することである。別のアプローチは、末梢血（PBPC）から前駆細胞を使用することである。これらのPBPCは、サイトカイン治療単独（G-CSFまたはGM-CSF）の後に、または化学療法もしくはサイトカインとともにの治療の後に、アフェレーシスまたは瀉血によって回収され得る。これらは、そのまま患者に戻され得るか、あるいは凍結保存され得る。所望であれば、細胞は、CD34+選択され得るか、Tn細胞涸渇され得るか、腫瘍細胞涸渇され得、または前駆細胞は、投与前に、当該分野で公知の手段によって増殖（増加を引き起こ）され得る。骨髄抑制性治療の後の自己または異種の前駆細胞の再注入の利点は、文献に記載されている（Morseら、(1992),Ann. Clin. Lab. Sci., 22:221-225; KessingerおよびArmitage (1991), Blood,77:211-213; Kessingerら、(1989), Blood, 74:1260-1265; Takamら（1989), Blood,74:1245-1251およびKessingerら（1988), Blood, 171:723-727）。
【０１５５】
本明細書中で使用される用語「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出されるタンパク質の総称である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリぺプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものには、インスリン様成長因子；ヒト成長ホルモン；N-メチオニルヒト成長因子ホルモン；ウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、濾胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH））；造血性増殖因子；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子αおよび腫瘍壊死因子β；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン；神経成長因子（例えば、NGF-β）；血小板増殖因子（例えば、TPOおよびMGDF）；トランスホーミング増殖因子（TGF）（例えば、TGF-αおよびTGF-β）；インスリン様増殖因子IおよびII；エリスロポエチン；骨誘導性（osteoinductive）因子；イターフェロン（例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、およびインターフェロンγ）；コロニー刺激因子（CSF）（例えば、マクロファージCSF（M-CSF）、顆粒球マクロファージCSF(GM-CSF)、および顆粒球CSF(G-CSF））；インターロイキン(IL)（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、およびIL-16）；ならびに他のポリぺプチド因子が挙げられる。サイトカインは、単独で、または組み合わせて、骨髄または細胞毒性因子に関連する造血性毒性に対して保護するために、緩和するために、および/または反転させるために使用され得る。
【０１５６】
KGF-2タンパク質産物の投与の態様、およびサイトカインは、調整および最適化されるべきである。状況に応じて、KGF-2タンパク質産物の適切な用量が、治療薬剤の投与の前、またはその後に投与され得る。例えば、考慮されるべきパラメーターは、サイトカインが、治療の経過の中で単回用量で、または複数回用量で投与されるか否かである。特定のサイトカインは、身体から迅速に除去され、そしてその効力が最大化されるために定期的なまたは連続的な投与を必要とする。投与の様式は、サイトカインの前処置または後処置が与えられるか否かにより異なり得る。例えば、サイトカインが細胞毒性因子の前に与えられる場合には、数時間の静脈内ボーラス注射によってサイトカインを投与すること、細胞毒性治療の完了の間および後に、このような投与を１日以上反復することが好ましい。
【０１５７】
特定の実施態様において、KGF-2タンパク質産物は、0.1〜500マイクログラム/kg/用量、好ましくは約200マイクログラム/kg/用量で、化学療法または放射線治療の前（例えば、１〜３日前）および/またはその後に投与（例えば、静脈内）され、そしてG-CSF（NeupogenTMまたはLenograstimTM）またはGM-CSF（SargramostimTM）は、5マイクログラム/kg/用量で、化学療法の後に１〜10日間（好ましくは、７〜10日間）投与（例えば、皮下で）される。
【０１５８】
胃腸管（例えば、食道、胃、および小腸）の侵食には、びらん性胃炎、食道炎、食道逆流、および炎症性腸疾患が含まれる。炎症性腸疾患（例えば、クローン病（おもに小腸を冒す）および潰瘍性結腸炎（主に大腸を冒す））は、未知の病因の慢性の疾患であり、これは粘膜表面の破壊、炎症、瘢痕、および修復の間の接着形成、ならびに罹患した個体に有意な罹患率を生じる。KGF-2タンパク質産物は、粘膜の裏打ちを再生し、そしてこれらの侵食の再発を減少させ、より早い治癒を生じるのに有用であり、そして疾患の進行を制御するのに有利である。胃腸管の侵食の標準的なインビボモデルは、公知である（Geisingerら（1990),Mod-Pathol., 3(5):619-624; Carlborgら（1983), Laryngoscope, 93(2):184-187;Carlborgら(1980) Eur-Surg-Res., 12(4):270-282; Keshavarzianら(1991),Alcohol-Clin-Exp-Res., 15(1):116-121; Katzら(1988), Dig-Dis-Sci., 33(2):217-224;およびZeehら(1996), Gastroenterology, 110(4):1077-1083、その開示が本明細書中で参考として援用される）。炎症性腸疾患の標準的なインビボモデルは、周知である（Morrisら、(1989),Gastroenterology, 96:795-803; Rachmilewtzら、(1989), Gastroenterology,97:326-327; Allgayerら、(1989), Gastroenterology, 96:1290-1300; ならびにKimおよびBorstad(1992), Scand. J. Gastroenterol, 27(7):529-537、その開示が本明細書中で参考として援用される）。
【０１５９】
動物研究は、全非経口栄養法（total parenteralnutrition)(TPN)と腸粘膜萎縮（intestinal mucosal atrophy）との間の関係を確立している（Buchmanら(1995),Journal of Parentral and Enteral Nutrition, 19:453-460)。腸絨毛の高さの減少は、栄養物の経口摂取によって提供される増殖刺激の欠如に起因する。これは、標識指標（増殖の尺度である）の低減に反映される。絨毛の高さの減少はまた、栄養の吸収に関与する酵素の特定の活動の減少に相関している。KGF-2タンパク質産物は、絶食の間の萎縮に対して保護するため、および/または経口的栄養物の再導入の際の再増殖を容易にするかのいずれかに有用である。
【０１６０】
成熟前乳児のヒアリン膜疾患は、肺内のII型肺細胞によって界面活性物質産生の不在を生じ、これにより肺胞の崩壊を生じる。KGF-2タンパク質産物は、ヒアリン膜疾患を処置および/または予防するのに有用である。
【０１６１】
煙の吸入は、細気管支上皮および肺胞の壊死により、火傷損傷の後の週における罹患率および死亡率の有意な原因である。KGF-2タンパク質産物は、吸入損傷を処置および/または予防するのに有用である。
【０１６２】
肺気腫は、肺胞の進行性の損失から生じる。KGF-2タンパク質産物は、肺気腫を処置および/または予防するのに有用である。
【０１６３】
膵臓の障害は、内分泌関連性（例えば、I型またはII型糖尿病）であり得るか、または外分泌性関連（例えば、膵炎および膵不全または嚢胞性線維症）であり得る。I型糖尿病と診断された患者は、絶え間ない外因性インスリン投与を必要とする。II型糖尿病と診断された患者は、インスリン耐性/不全性の変化する段階を介して進行し、最終的には同様に外因性インスリン投与を必要とする。KGF-2タンパク質産物は、糖尿病の持続性の症状を軽減、遅延および/または回避するのに、または変化する代謝的需要の間に血中グルコースレベルを規準化するため、さらに頻繁なまたは著明な低血糖を回避するために膵臓のβ細胞機能を誘導することによって島細胞移植の設定における補助剤として有用である。糖尿病の標準的なモデルが公知である（Junodら、(1967),Proc.Soc.Exp.Bio.Med. 126(1):201-205; Rerup (1970), Pharm.Rev., 22:485-518;Rossiniら、(1977), P.N.A.S., 74:2485-2489; およびAr'RajabおよびAhren (1993), Pancreas,8:50-57、これらの開示は参考として本明細書中に援用される）。脾臓細胞増殖の標準モデルが公知である（Yiら、(1994), AmericanJournal of Pathology, 145(1):80-85、これらの開示は参考として本明細書中に援用される）。
【０１６４】
角膜細胞は、化学薬品、細菌またはウイルスに起因する角膜剥離および/または角膜腫瘍化によって損傷され得る。KGF-2タンパク質産物は、角膜変性を処置および/または予防するのに有用である。角膜細胞再生の標準的インビボモデルが公知である（Inatomiら、(1994),Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4):1318, Abstract 299;Sotozonoら(1994), Investigative Opthalmology and Visual Science, 35(4):1941,Abstract 317; Wilsonら(1994) Investiative Opthalmology and Visual Science,35(4):1319, Abstract 317; Wilsonら、(1993), The FASEB Journal, 7(3):A493,Abstract 2857; Inatomiら、(1994), Investigative Ophthalmology & VisualScience, 35(4):1318; Wilsonら、(1994), Experimental Eye Research, 59(6):665-678; およびSotozonoら、(1995),Investigative Ophthalmology & Visual Science, 36(8):1524-1529, これらの開示は参考として本明細書中で援用される）。
【０１６５】
KGF-2タンパク質産物は、歯肉疾患を処置および/または予防するのに有用である。歯肉疾患の標準的インビボモデルが公知である。
【０１６６】
KGF-2タンパク質産物は、化学療法（上記のような）ならびに/または感染に関連する状態を含む潰瘍形成および/もしくは炎症状態を処置および/または予防するのに有用である。泌尿器膀胱損傷の標準的なインビボモデルが公知である（FordおよびHess(1976), Arch.Intern.Med., 136:616-619およびDrollerら、(1982), Urol., 20:256-258、これらの開示は、参考として本明細書中に援用される）。
【０１６７】
KGF-2タンパク質産物は、鼓膜損傷を処置および/もしくは予防するのに有用である。鼓膜穿孔の標準的なインビボモデルが公知である（Clymerら、(1996),Laryngoscope (USA), 106(3):280-285、この開示は参考として本明細書中で援用される）。
【０１６８】
KGF-2タンパク質産物は、唾液腺組織への障害または損傷（放射線/化学療法の効果（上記のような）および唾液腺不全（乾燥症候群）を引き起こし得るシェーグレン症候群のような自己免疫疾患を含む）を処置および/または予防するのに有用である。唾液腺組織損傷の標準的なインビボモデルが公知である。
【０１６９】
以下の実施例は、本発明のより完全に例示するために含まれる。改変が、示された手順において、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【実施例】
【０１７０】
実施例
以下の実施例において記載される多くの手順、または適切に改変された手順についての標準的方法は、例えぱ、Sambrookら(1989)(前出)およびAusubelら(1990)(前出)のような分子生物学の広く認められたマニュアルに提供される。全ての化学薬品は、分析グレードまたはUSPグレードのいずれかである。
【０１７１】
実施例1:タンパク質産生
以下の実施例は、以下のKGF-2タンパク質:dN29 hFGF10、dN20hFGF10、hFGF10、およびhFGF10 R149Qの産生を教示する。
【０１７２】
「dN」命名法のナンバリングは、ラット全長配列の正常N末端から欠失されたアミノ酸の数に基づく。ヒトFGF10は、ラットFGF10よりN末端でより少ないアミノ酸を有する。この数は、E.coli発現によって付加されたメチオニンを含まない。dN37rFGF10のアミノ酸配列は、dN29 hFGF10と同一である。dN28 rFGF10のアミノ酸配列は、dN20 hFGF10と同一である。
A.DNAの調製
pAMG21 dN29 rFGF10:
プラスミドpAMG21 dN29 hFGF10は、図2(dN29 hFGF10)に示されたアミノ酸配列をコードするDNAを含む。プラスミドpAMG21dN29 hFGF10は、以下のN末端アミノ酸配列を有する短縮を有する、成熟rFGF10配列由来の37アミノ末端残基をコードするDNAの短縮を含む:MSYNHLQ....(図2、Yamasakiら(1996)前出の残基76で開始する)。従って、dN29hFGF10は、配列番号2(△N32 KGF-2)のSer69〜Ser208の配列を有する。pAMG21 dN29hFGF10を、以下のように作製した。
【０１７３】
初めに、プラスミドpAMG21dN6rFGF10を構築した。この構築のために、以下のNdeI部位を組み込む5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#1)、およびBamHI部位を組み込む3'オリゴヌクレオチドプライマー一(OLIGO#2)とともにベクターpGEM-T(Promega,Madison, WI)中の成熟ラットFGF10 cDNA(pGEM-T rFGF10と命名された)をテンプレートとして用いて、PCRを実施した(Yamasakiら(1996),J.Biol.Chem.,271(27):15918-15921, rFGF)。
OLIGO#1:(配列番号42)
5'- AAA CAA CAT ATG GTT TCT CCG GAG GCT ACCAAC TCC -3'
OLIGO#2:(配列番号43)
5'-AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCATGG GG-3'
この反応において生成されたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化した。525塩基対(bp)制限消化PCR産物をアガロースゲルから精製し、そして同様に精製された6キロベース(kb)BamHIとともにNdeIpAMG21ベクターDNAフラグメントへ連結した。[発現ベクターpAMG21(ATCC受託番号98113)は、luxPRプロモーターから下流に遺伝子の挿入のための適切な制限部位を含む(lux発現系の記載については、米国特許第5,169,318号を参照のこと)]。得られたコードされたrFGF-10タンパク質は、以下のアミノ末端(N末端)アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、最初の6アミノ末端アミノ酸残基から天然に存在するメチオニン残基の欠失によってrFGF10とは異なる:MVSPEAT....(図2、Yamasakiら(1996)前出の残基43で開始する)。
【０１７４】
次に、プラスミドpAMG21HisrFGF10を、pAMG21Hisベクターを用いて構築した。pAMG21Hisベクターは、以下のようにpAMG21とは異なる:pAMG21開始メチオ,ニンコドン(ATG)とそれに続く配列(GTTAACG...)との間に、以下の配列が「AAACAT CAT CAC CAT CAC CAT CAT GCT AGC」が挿入され、これは「KHHHHHHHAS」をコードする。7×Hisタグの後のAlaおよびSerのコドンの付加は、クローニングに都合のよい制限部位NheIを生じる。
【０１７５】
次いで、pAMG21 Hisプラスミドベクターのの4.7kb BstXI-NheIフラグメントを、pAMG21dN6 rFGF10の1.8kb BspEI-BstXIフラグメントならびに以下のオリゴヌクレオチドリンカーOLIGO#3およびOLIGO#4(NheI〜BspEI)を連結した。
OLIGO#3:(配列番号44)
5'- CTA GCG ATG ACG ATG ATA AAC AGG CTC TGGGTC AGG ACA TGG TTT CT -3'
OLIOO#4:(配列番号45)
5'- CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCC GAG CCTGTT TAT CAT CGT CAT CG -3'
得られたコードされたタンパク質は、ヒスチジンタグ(7×His)、続いて全長(成熟)N末端配列を(図1、Yamasakiら(1996)前出の残基37で開始する)およびエンテロキナーゼ切断部位を有することによってdN6rFGF10とは異なる。22アミノ酸を、以下のようにdN6 rFGF10のアミノ末端へ付加した:MKHHHHHHHASDDDDKQALGQD[MVSPEAT....]。
【０１７６】
pAMG21 His rFGF10を、以下の、NdeI部位を組み込んだ5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#5)、およびBamHI部位を組み込んだ3'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#6)を使用するPCR増幅のためのテンプレートとして使用した。
OLIGO#5:(配列番号46)
5'- GGA GGA ATA ACA TAT GTC CTA CAA TCA CCTGCA GGG AGA TGT CCG -3'
OLIGO#6:(配列番号47)
5'- AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCATGG GG-3'
この反応において生成されたPCR産物を精製し、次いで、以下の、XbaI部位を組み込んだ5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#7)、およびBamHI部位を組み込んだ3'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#8)を用いる続くPCR増幅のためのテンプレートとして使用した:
OLIGO#7:(配列番号48)
5'- TTA GAT TCT AGA TTT GTT TTA ACT AAT TAAAGG AGG AAT AAC ATA TG -3'
OLIGO#8:(配列番号49)
5'- AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCATGG GG-3'
この反応において生成されたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびXbaIで消化した。465bp制限消化産物をアガロースゲルから精製し、そして同様に精製された6キロベース(kb)pAMG21BamHI〜XbaI DNAフラグメントと連結して、pAMG21 dN29 hFGF10を形成した。
【０１７７】
E.coli宿主株GM120(ATCC受託番号55764)は、原栄養株E.coliK12宿主の宿主染色体中の第2の部位へ挿入されたlacIQプロモーターおよびlacI遺伝子を有する。この連結混合物を含むGM120 E.coli宿主の形質転換、および40μg/mlのカナマイシンを含むLuria寒天プレート上へのプレーティングは、組換え細菌コロニーを生じた。正しい組換えプラスミドを含む細菌クローンを、PCRスクリーニングによって同定した。プラスミドDNAを精製し、そして配列決定して挿入配列を確認した。遺伝子産物を発現するための組換え細菌培養物の増殖を、以下に記載する。
pAMG21 dN20 hFGF10:
プラスミドpAMG21 dN20 hFGF10は、図3(dN20 hFGF10)に示されたアミノ酸配列をコードするDNAを含む。プラスミドpAMG21dN20 hFGF10は、以下のN末端アミノ酸配列を生じる、成熟rFGF10配列の最初の28アミノ末端残基をコードするDNAの欠失を含む:MSSPSSA.....(図2、Yamasakiら(1996)前出の残基65で開始する)プラスミド。従って、dN20hFGF10は、配列番号2(△N21 KGF-2)のSer58〜Ser208の配列を有する。
【０１７８】
pAMG21 dN20 hFGF10を、以下のように構築した。
【０１７９】
6kb BamHI-NdeI pAMG21ベクターフラグメントを、以下のように生成したNdeI-BamHIdN20 hFGF10 PCR産物へ連結した：PCRを、テンプレートとしてpGEM-T rFGF10および以下の、rFGF10遺伝子の5'末端でNdeI部位を組み込み、そして最初の28アミノ酸のコドンを欠失する5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#9)、およびrFGF10遺伝子の3'末端でBamHI部位を組み込んだ3'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#10)を用いて実施した:
OLIGO#9:(配列番号50)
5'- AAA CAA CAT ATG TCT TCT CCT TCC TCT GCAGGT AGG CAT GTG CGG AGC TAC AA-3'
OLIGO#10:(配列番号51)
5'- AAA CAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCA CCATGG GG-3'
このPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIで消化し、そして上記のように6KbBamHI-NdeI pAMG21ベクターフラグメントヘ連結した。
【０１８０】
このpAMG21 dN20 hFGF10連結混合物を含むGM120E.coli宿主の形質転換、および40μg/mlのカナマイシンを含むLuria寒天プレート上へのプレーティングは、組換え細菌コロニーを生じた。正しい組換えプラスミドを含む細菌クローンを、PCRスクリーニングによって同定した。プラスミドDNAを精製し、そして配列決定して挿入配列を確認した。遺伝子産物を発現するための組換え細菌培養物の増殖を、以下に記載する。
【０１８１】
pAMG21 hFGF10 R149Q:
pAMG21 hFGF10 R149Qは、hFGF10(配列番号２のLeu40〜Ser208)中の149位でアルギニン残基をグルタミン残基へ置換する(図４)。pAMG21hFGF10 R149Qを以下のように構築した。
【０１８２】
プラスミドpAMG21 rFGF10を、以下のオリゴヌクレオチドリンカーOLIGO#11およびOLIGO#12(NdeIからBspEI)を有する、pAMG21His rFGF10の6.5Kb BspEI-NdeIフラグメントの連結によって作製した。
OLIGO#11:(配列番号52)
5'- TAT GCT GGG TCA GGA CAT GGT TTC T -3'
OLIGO#12:(配列番号53)
5'- CCG GAG AAA CCA TGT CCT GAC CCA GCA -3'
得られたコードされたタンパク質は、７×ヒスチジンタグの欠失、およびもとの成熟アミノ末端タンパク質配列(MLGQDM....)の修復によってHis rFGF10とは異なる。
【０１８３】
pAMG21 His rFGF10の4.8Kb BxtXI-BspEIフラグメントを、pAMG21dN20 hFGF10 PstI(導入された)一BstXIの1.8Kbフラグメント、およびラット配列から8つのセリンコドンを欠失させるために以下のOLIGO#13およびOLIGO#14オリゴヌクレオチドリンカー(PstIからBspEI)と連結した。
OLIGO#13:(配列番号54)
5'- CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGCTTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA -3'
OLIGO#14:(配列番号55)
5'- GAG CTA GGA GAG GAG AAG CTG CTG GAG CTAGAG TTG GTA GCC T-3'
pAMG21 hFGF10 R149Qを、6.1Kb pAMG21 hFGF10 BamHI-PstIフラグメントとhFGF10R149Q PstI-BamHI PCR産物を連結することによって構築した。このPCR産物を以下のように構築した。
PCR Aを、以下の5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#15)および3'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#16)(コドン変化AGA-->CAGを導入する)とともに、テンプレートとしてpAMG21dN29 hFGF10を用いて行った。
OLIGO#15:(配列番号56)
5'- AAC ACC TAT GCA TCT TTT AAC TGG C-3'
OLIGO#16:(配列番号57)
5'- GTC CCT GCC TGG GAG CTC CTT TTC CATTC-3'
PCR Bを、以下の5'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#17)(コドン変化を導入する)、および3'オリゴヌクレオチドプライマー(OLIGO#18)(BamHI部位を組み込む)とともに、テンプレートとしてpAMG21dN29 hFGF10を用いて行った。
OLIGO#17:(配列番号58)
5'- GCT CCC AGG CAG GGA CAA AAA ACA AGA AGG-3'
OLIGO#18:(配列番号59)
5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCACC-3'
上記のPCR増幅AおよびBの産物を精製し、そして続くPCRを、以下の5'オリゴヌクレオチドプライマーOLIGO#19およびOLIGO#20(BamHI部位を組み込む)とともに、テンプレートとしてこれらを用いて行った。
OLIGO#19:(配列番号60)
5'- AAC ACC TAT GCA TCT TTT AAC TGG C-3'
OLIGO#20:(配列番号61)
5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCACC-3'
この反応の産物もまた精製し、そして続くPCRを、以下の5'オリゴヌクレオチドプライマーOLIGO#21(BamHI部位を組み込む)およびOLIGO#22とともに、テンプレートとしてこれを用いて行った。
OLIGO#21:(配列番号62)
5'- AAC AAA GGA TCC TTT ATG AGT GGA CCACC-3'
OLIGO#22:(配列番号63)
5'- CCG GAG GCT ACC AAC TCT AGC TCC AGC AGCTTC TCC TCT CCT AGC TCT GCA -3'
この最終PCR産物を精製し、そして制限エンドヌクレアーゼPstIおよびBamHIで消化した。制限消化後に、440bpDNAフラグメントが、上記のようにゲル精製され、そして連結した。
この連結物を含むGM120 E.coli宿主の形質転換、および40μg/mlのカナマイシンを含むLuria寒天プレート上へのプレーティングは、組換え細菌コロニーを生じた。正しい組換えプラスミドを含む細菌クローンを、PCRスクリーニングによって同定した。プラスミドDNAを精製し、そして配列決定して挿入配列を確認した。遺伝子産物を発現するための組換え細菌培養物の増殖を、以下に記載する。
【０１８４】
Ｂ．E.coliにおける産生：
目的のDNA配列が確認されたプラスミド(それぞれ、pAMG21 dN29rFGF10およびpAMG21 hFGF10 R149Q)を含む組換えGM 20 E.coli細胞の培養は、各々、導入された遺伝子の発現を最適化するために、以下のように増殖させる：
Luria Broth＋カナマイシンの５百ミリリットルフラスコに細胞を接種し、そして10〜16時間30℃で増殖させた。500mLのすべてを、15Lファーメンター中のNZアミンを基礎にした培地の９L〜11 Lに添加した。すべてのバッチは、pH７および50％以上の溶存酸素酸素レベルで増殖させた。pAMG21dN29 rFGF10を含む細胞のバッチは、37℃で増殖および誘導され、およびpAMG21 hFGF10 R149Qを含む細胞のバッチは、30℃で増殖および誘導された。これらのバッチは、pH７および50％以上の溶存酸素酸素レベルで増殖させた。光学的な細胞密度が10±２に達したとき、自動インデューサー(autoinducer)をファーメンターに添加し、そして細胞を、12時間増殖させた。12時間後、培養液を15℃以下に冷却し、ファーメンターから廃液し、そして細胞を遠心分離により回収した。細胞ペーストを凍結した。
【０１８５】
Ｃ．精製
dN29 hFGF10：
dN29 hFGF10を、３つのクロマトグラフィー工程を用いて精製した：pH 7.5のS-Sepharose、pH7.5のHeparin-Sepharose、およびヒドロキシアパタイト。dN29 hFGF10を含む100グラムのE.coli細胞ペーストを、ホモジナイズし、そして上記のように正確に破壊した。15,300×gで３時間の遠心分離の後、可溶性dN29hFGF10を含む上清を、pH 7.5の１M Tris-HClの添加により、pH7.5、40mM Tris-HClに調整し、次いで、pH7.5、40 mMTris-HCl中に平衡化した300 mLのS-Sepharose FF カラムに付与した。カラムを平衡化緩衝液で洗浄して非結合タンパク質を除去した後、カラムを、40容量の、pH7.5の40 mM Tris-HCl中の０〜２M NaCl勾配で溶出した。dN29 hFGF10を含む0.9 Mと1.1 M NaClとの間で溶出する画分は、SDS-PAGE上で16kDaのバンドとして検出された。このバンドの正体は、N-末端配列決定により確認された。これらの画分をプールし、pH 7.5の40 mM Tris-HClで希釈し、NaCl濃度を0.4Mまで低減し、そしてpH 7.5の40 mM Tris-HClで平衡化した60 mLのHeparin-Sepharoseカラムに付与した。このカラムを、平衡化緩衝液で洗浄して非結合タンパク質を除去し、次いで80容量の、同緩衝液中の０〜３MNaClの勾配で溶出した。dN29 hFGF10は、1.0 Mと1.35 M NaClとの間で溶出された。これらの画分をプールし、そして40 mMTris-HCl、pH7.5に対して透析した。透析したサンプルを、40 mM Tris-HCl、pH7.5中に平衡化した50 mLのヒドロキシアパタイトカラムに付与した。サンプル付与の後、カラムを平衡緩衝液で洗浄して非結合タンパク質を除去し、次いで、40容量の、40mMの０〜0.5 M NaCl勾配で溶出した。0.24 M〜0.44 M NaCl間に溶出する画分がdN29 hFGF10を含んでいた。これらの画分をプールし、濃縮し、そしてPBSに緩衝液交換した。サンプル純度は、クマシーブルー染色SDSゲルにより97％より大きいと推定された。精製dN29hFGF10の収率は、100gの細胞ペーストから90mgであった。
【０１８６】
hGFG10 R149Q：
hGFG10 R149Qは、dN29 hFGF10についてに上記に記載したように正確に精製した。ヒトR149QFGF10は、dN29 hFGF10よりHeparin-Sepharoseに対して低い結合親和性を有しており、0.5〜0.8 M NaClの間で溶出した。hGFG10R149Qの同一性および純度を、N-末端配列決定、およびSDS-ゲル電気泳動により分析した。
【０１８７】
実施例２：インビトロバイオアッセイ
精製dN29 hFGF10の生物活性を、Balb/MKマウスケラチノサイト増殖アッセイにより評価した。これは比活性を測定するために設計されている。
【０１８８】
Balb/MKマウスケラチノサイト増殖アッセイには、PBS中のdN29 hFGF10の0.5mg/mLストック溶液を調製した。これらのサンプルを、アッセイ培地に連続的に希釈し、そして各希釈の50 mLを、180 mLのアッセイ培地中にBalb/MK細胞を含む組織培養ウェルに添加した。dN29hFGF10の最終濃度は、1.2×10-1 ng/mL〜2.2×104 ng/mLの範囲であった。細胞増殖は、トリチウム化チミジンの取り込みにより測定した。
【０１８９】
dN29 hFGF10に対する推定のED50値は46ng/mLであった。この結果は、dN29hFGF10がこのアッセイで有効であることを示す。
【０１９０】
実施例３：正常マウスにおける診査研究
最初の研究では、18匹の雌のBDF1マウスを、各々３マウスの６つの群に分割した(３つの時点の各々における１つの処置群および１つのコントロール群)。最初の２つの群は、１日に、５mg/kgdN29 hFGF10または緩衝液コントロールIVを受け、第２の２つの群は、３日間毎日、５mg/kg dN29 hFGF10または緩衝液コントロールIVを受け、そして第３の２つの群は、７日間毎日、５mg/kgdN29 hFGF10または緩衝液コントロールIVを受けた。すべてのマウスに、回収１時間前に、50 mg/kg BrdUを注射し、Ｘ線撮影し、そして屠殺した。体重および選択された器官重量(小腸のすべてのセグメントを含む)を計り、血液学および血清化学のために血液を引き抜き、そして組織学的分析およびBrdU標識のために器官を採集した。７日に胃、３日に肝臓、７日に空腸(jejenum)に、いんぶん上昇が見られた。胸腺には影響がなかった。血清化学は変動したが、急速に正常化する。
【０１９１】
実施例４：化学療法で誘導される肺線維症
約225グラムの雄のLewisラットは、５mg/kgのdN29 hFGF10またはビヒクル72のi.v.注射または気管内滴注を受け、そして気管内経路を介して2.5Ｕのブレオマイシンを投与する48時間前であった。ラット体重を続く15日の経過にわたってモニターし、その時点で、気管内経路を介してdN29hFGF10を受けたラットで肺機能テストを実施した。組織学には、各ラットの気管内にカテーテルを配置し、そして肺を、静水学的圧力を介して３mlのホルマリンで満たした。48時間の固定化後、肺を切片化および染色のためにパラフィン中に処理した。
【０１９２】
生理食塩水投与を受けたラットはそれらの体重の42％を失ったが、dN29 hFGF10で処理したラットは、ブレオマシン投与の日に比較してそれらの体重の129％であった。生理食塩水群の１匹のラットは、屠殺の時点の前に死亡し、この死亡は、肺に対するブレオマシインの傷害が原因であると仮定される。２つの群の間の肺の呼吸速度および１回呼吸量に有意な差異があった。生理食塩水で処理したラットは、dN29hFGF10群の247に対して、１分間あたり286呼吸の呼吸速度を有していた。非処理のコントロールラットは、１分間あたり216呼吸の呼吸速度を有していたが、それは、dN29hFGF10群に対してp<0.05レベルで有意である。
【０１９３】
組織学的には、生理食塩水処理群に肉眼的および顕微鏡的な変化があった。この群の肺は、屠殺の時点で観察したとき変形し、そして過剰炎症および線維症を有していた。dN29 hFGF10群の肺は、病巣の中程度の顕微鏡的炎症を有することを除いて非処置コントロールの肺と非常に類似していた。dN29hFGFラットと通常マウスとの間には区別し得る肉眼的差異はなかった。
【０１９４】
実施例５：照射誘導された粘膜炎症(Mucositis)モデル
粘膜炎症は、マウス中で、12 Gyの全体照射を用いて誘導される。マウスを、照射の前の日から始めて、照射後３日まで継続して、５mg/kg/日の組換えヒトKGF-2(ほぼWO96/25422、rhuKGF-2の教示に従って調製された)で毎日処理する。照射の４日後、マウスを剖検し、そして増殖性の陰窩(BUdR陽性細胞を含む)の数を計数する。
【０１９５】
rhuKGF-2処理は、非rhuKGF-2処理動物に比べて小腸の十二指腸、近位および遠位空腸における増殖性の陰窩の数を増大する。rhuKGF-2はまた、照射マウスにおける体重損失を低減し得る。
【０１９６】
実施例６：アドリアマイシン誘導炎症粘膜モデル
粘膜炎症は、24 mg/kgのアドリアマイシンの単回腹膜内用量で誘導される。マウスを、照射の前の日から始めて、照射後３日まで継続して、１mg/kg/日のrhuKGF-2で毎日処理する。照射の４日後、マウスを剖検し、そして増殖性の陰窩(BUdR陽性細胞を含む)の数を計数する。
【０１９７】
rhuKGF-2処理は、非rhuKGF-2処理動物に比べて十二指腸、空腸および回腸における増殖性の陰窩の数を増大する。
【０１９８】
実施例７：５-フルオロウラシル誘導粘膜炎症モデル
マウスに５-フルオロウラシル(5-FU、50 mg/kg/日×４日)を注射し、非処理動物における養生法は、20〜50％間の範囲に過ぎない生存を導く。後処理ではなく、rhuKGF-2前処理(５mg/kg/日×３日)は、非rhuKGF-2処理動物に対して生存を増大し、そして生存における改善は、0.5mg/kg/日もの低用量で観察される。肝膿瘍は、コントロールに一般に見出されるが、rhuKGF-2前処理生存マウスは、５-FUの毒性は一部GIバリア機能の損失に起因することを示す。さらに、rhuKGF-2前処理生存マウスは、５-FU処理期間の間に、体重の損失がより少なく、そしてより多くの食物および水を消費する。rhuKGF-2前処理はまた、カルボプラスチン(125mg/kg×１日)曝露後、マウスにおける体重損失を改善し、rhuKGFの効果が５-FU特異的である可能性を排除する。rhuKGF-2前処理はまた、150または300mg/kgのメトトレキセートの単回用量を注射し、次に１時間後に照射(６Gy)したときの、化学療法/照射の組合せ実験における生存および体重損失絶望状態を改善する。
【０１９９】
実施例８：大腸炎モデル
各10動物の２つの群で、50 mg/kg体重の用量で、エタノール中の2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸の結腸滴注により大腸炎を誘導する。rhuKGF-2が保護的メカニズムを通じて作用するか否か決定するために、１つの群(Ａ群)のラットを、５mg/kg(i.p.)の用量で、大腸炎の誘導前24時間および１時間にrhuKGF-2またはビヒクルで前処理し、そして動物を、損傷後８時間で屠殺する。可能な治癒効果を評価するために、rhuKGF-2またはビヒクル(同じ用量、i.p.)を、大腸炎の誘導後24時間に第２の群(Ｂ群)に注射し、そして処置を、１週間の間毎日継続する。組織損傷を顕微鏡により調べ、そして潰瘍またはびらんの割合として表現する。
【０２００】
結腸炎の誘導後にrhuKGF-2で処置する動物（Ｂ群）は、コントロール（Ａ群）と比較して、顕著に少ない潰瘍形成を示す。結腸炎の誘導前に処置した動物において侵食が存在するが、８時間という短い研究期間に起因して潰瘍は見られず、侵食は、コントロール（Ａ群）において見られる潰瘍とは顕著には異ならない。
【０２０１】
実施例９：デキストラン硫酸誘導結腸炎モデル
研究１：ラットに、水中４％および６％のDSSを１週間餌付けする。２週目の終わりに、結腸の末端の４cmを保存する。0.5cm間隔で８切片を調製し、そしてＨ＆Ｅで染色する。壊死（腺構造の破壊）を有する各結腸切片のパーセントを、ランダムかつコード化した様式で評価する。
【０２０２】
研究２：ラットに、14日間、IPビヒクルまたはrhuKGF-2（１mg/kg/日）を与え、そして水または４％デキストラン硫酸ナトリウムを餌付けする。結腸切片をPASで染色する。
【０２０３】
デキストラン硫酸ナトリウムは、結腸粘膜壊死において用量に関連する増加を誘導するようである。１mg/kg/日で14日間投与されたrhuKGF-2は、コントロール群ならびにデキストラン硫酸ナトリウム処置ラットにおける結腸ムチン産生を増加させる。
【０２０４】
実施例10：ラット肝硬変モデル
150〜175グラム重量の雄Sprague-Dawleyラットを使用する。研究の間に、動物を、飲料水中のフェノバルビトール(phenobarbitol)（0.35mg/ml)に曝す。光イソフルランス麻酔下にある間、動物にコーン油ビヒクル中のCCl4を毎週投与する。CCL4の開始用量はラットあたり40μlである。用量を、毎週、体重増加に基づいて40μlの増分内で多くまたは少なく調整する。10のコントロール動物を、飲料水中のフェノバルビトールに曝し、そしてコーン油ビヒクルで毎週洗浄する。肝臓機能を、ブロモスルホフタレイン(bromosulphopthylein)（BSP)クリアランス、血清トランスアミナーゼレベル、および血清アルブミンレベルの測定によって評価する。屠殺の時点にて、肝臓を取り出し、重量を測定し、そしてコラーゲン沈着および線維症の指標としてのヒドロキシプロリンレベルの定量のために処置する。
【０２０５】
動物を、上記の肝硬変誘導プロトコルに基づいて11週間維持する。11週において、動物を、コントロールおよびrhuKGF-2処置群にランダムに分ける。rhuKGF-2を、１mg/kgの用量での全15日間の皮下注射によって、１日あたり１回与える。15日のrhuKGF-2処置後、動物を安楽死させる。
【０２０６】
CCl4で肝硬変を誘導するラットは、血清BSP濃度における上昇を示し、この薬剤の障害性肝臓クリアランスを反映する。rhuKGF-2で処置されたラットは、非処置動物より低いBSP血清レベルを有し、障害性肝臓機能を示す。CCl4によって肝硬変にしたラットは、SGPTにおける上昇を示し、これはrhuKGF-2処置によって逆転される。rhuKGF-2処置は、血清アルブミンを上昇させ得る。rhuKGF-2処置は、肝臓対体重の比を増加させ、代償的な肝臓成長を反映する。
【０２０７】
実施例11：肝切除モデル
70％の部分的肝切除に供したラットは、１mg/kg/日 rhuKGF-2で処置する場合、非処置動物と比較した場合よりも迅速に、その元々の肝臓重量を回復する。
【０２０８】
実施例12：急性肝毒性モデル
急性肝毒性モデルにおいて、rhuKGF-2処置（興奮剤の３時間前または３時間後のいずれかでの１mg/kg)は、四塩化炭素、アセトアミノフェン、またはガラクトサミンのいずれかで誘導した急性肝不全を有するラット中の血清トランスアミナーゼレベルにおける増加を弱める。rhuKGF-2での前処置はまた、スルホブロモフタレイン(BSP)クリアランスによって測定される場合、アセトアミノフェン後の肝臓クリアランス機能における減少を妨げる。
【０２０９】
実施例13：インビボでのレトロウイルス媒介遺伝子移入モデル
マウスに、rhuKGF-2を静脈注入する（１〜５mg/kg)。rhuKGF-2の静脈注射の48時間後、非刺激肝臓と比較して、マウス肝細胞増殖は増加し、そして正常な増殖レベルに戻る。モジュールも微視的異常も、急性的にも５か月後にも観察されない。
【０２１０】
rhuKGF-2処置後にMoloneyレトロウイルスベクターを発現する高力価E.coliLacZの静脈注射を行う場合（１×108 cfu.ml）、β-ガラクトシダーゼ発現は、形質導入された肝細胞のパーセントを増加させる。数か月後、形質導入した肝細胞の一部は、X-galポジティブなままである。
【０２１１】
実施例14：糖尿病のインビボモデル
研究の開始にて200〜260グラム重量の雄ラットを、このモデルにおいて使用する（WO9611950)。糖尿病を、体重１kgあたりクエン酸ナトリウム緩衝液中50mgのストレプトゾトシンの単回静脈注射によって誘導する。非糖尿病コントロールラットは、コントロールの目的のために、クエン酸ナトリウム緩衝液の単回静脈注射を受ける。rhuKGF-2を、皮下注射として毎日投与する。rhuKGF-2用量は３または５mg/kg/日であり、実験に依存する。
【０２１２】
第１の実験において、rhuKGF-2治療を、糖尿病の２日前に開始し、誘導し、そして糖尿病誘導の導入後に全８回の注射を続ける。糖尿病誘導前にrhuKGF-2で処置し、rhuKGF-2がまた誘導後に続けられるそれらの糖尿病ラットは、糖尿病のより軽い形態を示す症状を示す。従って、rhuKGF-2治療は、ストレプトゾトシン誘導β細胞崩壊後、疾患の誘導を部分的に妨げるか、またはインスリン産生島細胞を回復する。
【０２１３】
第２および第３の実験において、皮下投与されるrhuKGF-2治療を、ストレプトゾトシンでの糖尿病の誘導の１日後に開始する。第２の研究において、水分摂取および尿排出の促進は、９日目の糖尿病ラットと比較した場合にrhuKGF-2処置糖尿病ラットにおいて顕著により少なく、これは、疾患状態の寛解をさらに示す。第３の研究において、rhuKGF-2治療は、塩化ナトリウム溶液で処置した糖尿病ラットと比較した場合、糖尿病ラットの膵臓中のインスリンおよびＣペプチドの総含量を増加し得る。
【０２１４】
４番目の実験において、rhuKGF-2治療の７日間過程を、ストレプトゾトシン処置の７日後に開始し、そして動物をさらに12週間実験を続ける。４番目の実験を除くすべての実験において、血中グルコースレベル、尿中グルコースレベル、および尿容量を、分析の終点として使用する。さらに、水分摂取、尿中Ｃペプチドレベル、または総膵臓インスリン、およびＣペプチド含量をいくつかの実験において測定する。４番目の実験において、血中グルコースが唯一の終点である。
【０２１５】
大きな画分のインスリンが、肝臓によって循環から除去されるために、末梢インスリン濃度の測定は、膵臓からのインスリン分泌ではなく、肝臓代謝後の事象を反映する。従って、Ｃペプチドの測定は頻繁になされ、そしてインスリン分泌の末梢マーカーとして使用される。Ｃペプチドは、プロインスリンのインスリンへのプロセスから産生される。インスリンおよびＣペプチドは、β細胞から等モル量で分泌され、そして少量のＣペプチドのみが肝臓によって抽出される。
【０２１６】
rhuKGF-2を受けた両方の群からのSTZ処置動物は、rhuKGF-2投与期間での血中グルコースにおける顕著な減衰を有する。
【０２１７】
実施例15：過酸素症誘導致死モデル
rhuKGF-2投与の過酸素症誘導肺損傷に対する効果を決定するために、ラットを気管内点滴によって処理し、そして120時間までの間、98％以上の酸素に曝す。部検にて、過酸素症曝露の120時間後、rhuKGF-2処置動物の肺は、過酸素曝露の55〜80時間致死の未処置ラットの肉眼的に出血性の肺と比較して、肉眼的に正常なようであり、胸膜表面上の穿刺出血の分散したわずかな領域を有している。
【０２１８】
組織病理学的に、非処置動物の肺は、大きな領域の出血および間質性浮腫を示す。肺胞内(intraaveolar)空間は赤血球細胞、炎症性細胞、およびタンパク質性(proteinaceous)浸出を含む。対照的に、過酸素中で120時間生存する、rhuKGF-2で処置された動物の肺における肺胞内浸出および出血の最小の証拠は存在しない。
【０２１９】
５および１mg/kgの用量にて、rhuKGF-2は、過酸素誘導致死率を有意に減少する。
【０２２０】
実施例16：急性肺損傷モデル
急性浸透性肺浮腫を、α-ナフチルチオウレアの注射で誘導し、そして肺性漏出を、180分にわたって、単離し灌流した肺モデルにおいて評価した。漏出を、湿潤／乾燥肺重量比を用いて確認し、そして肺胞液タンパク質濃度を、気管支肺胞洗浄後に測定する。rhuKGF-2での前処置（実験の48時間前に気管内注射する）の、α-ナフチルチオウレア誘導肺浮腫に対する効果を評価する（rhuKGF-2／α-ナフチルチオウレア群）。コントロール群（コントロールおよびrhuKGF-2／コントロール）もまた研究する。組織病理学を、４つの各群について実施する。
【０２２１】
α-ナフチルチオウレアは、単離し灌流した肺のモニタリングの180分のエキソビボ期間にわたって肺漏出によって検出される急性浸透性肺浮腫を生じる。rhuKGF-2での前処置は、これらの変数を顕著に減弱し、それは、コントロール群およびrhuKGF-2/コントロール群とは有意に異ならない。組織病理学は、rhuKGF-2で前処置した動物の肺における大量のII型肺胞細胞過形成、およびα-ナフチルチオウレアで前処置した動物における顕著な肺浮腫を示す。rhuKGF-2／α-ナフチルチオウレア群において、浮腫はあまり見られない。
【０２２２】
本発明は、一般的に、および好ましい実施態様によっての両方で先に記載されたが、上記の説明を考慮して、他の変異および改変が当業者に想像されることが理解される。
【０２２３】
（配列表）
【０２２４】
【表３】
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【０２２５】
【表４】
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【０２２６】
【表５】
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【０２２７】
【表６】
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【０２２８】
【表７】
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【０２２９】
【表８】
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【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
【表１０】
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【０２３２】
【表１１】
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【０２３３】
【表１２】
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【０２３４】
【表１３】
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【０２３５】
【表１４】
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【０２３６】
【表１５】
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【０２３７】
【表１６】
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【０２３８】
【表１７】
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【０２３９】
【表１８】
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【０２４０】
【表１９】
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【０２４１】
【表２０】
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【０２４２】
【表２１】
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【０２４３】
【表２２】
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【０２４４】
【表２３】
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【０２４５】
【表２４】
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【０２４６】
【表２５】
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【０２４７】
【表２６】
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【０２４８】
【表２７】
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【図面の簡単な説明】
【０２４９】
本発明の多数の局面および利点が、図面の参照に基づいて明らかになる。ここで：
【図１】図１は、全長の組換えヒトKGF-2をコードするcDNA配列（配列番号１）を示す。また、全長の組換えヒトKGF-2のアミノ酸配列（配列番号２）が示される。最初の36アミノ酸残基（Met1〜Thr36）は、全長KGF-2の推定リーダー配列を示し、そして配列番号２の残基Cys37〜Ser208は、成熟KGF-2を示す。全長および成熟形態は、集合的に「KGF-2」と呼ばれる。
【図１Ａ】図１Aは図１の続きである。
【図２】図２は、dN29 hFGF10をコードするcDNA配列（配列番号３）を示す。また、dN29hFGF10のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図２Ａ】図２Aは図２の続きである。
【図３】図３は、dN20 hFGF10をコードするcDNA配列（配列番号５）を示す。また、dN20hFGF10のアミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図３Ａ】図３Aは図３の続きである。
【図４】図４は、hFGF10 R149QをコードするcDNA配列（配列番号７）を示す。また、hFGF10R149Qのアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図４Ａ】図４Aは図４の続きである。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図４Ａ】
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